(57)【要約】      （修正有）【課題】癌の処置における使用のための特定のアミノ酸配列からなる４Ｎ１Ｋペプチド又はその機能的保存的変異体を含む可溶性ペプチドの提供。【解決手段】可溶性ペプチドはＫＲＦＹＶＶＭＷＫＫのアミノ酸配列と少なくとも７５％同一性、さらにより好ましくは、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、少なくとも９７%を含み、依然として、腫瘍細胞増殖を減少することができる、又は、依然として、腫瘍細胞においてＰＣＤを誘発することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の処置における使用のためのアミノ酸配列：ＫＲＦＹＶＶＭＷＫＫ（配列番号１）又はその機能保存的変異体を含む可溶性ペプチド。
【請求項２】
可溶性ペプチドが、１、２、又は３アミノ酸、配列番号１と異なりうる、請求項１記載の使用のための可溶性ペプチド。
【請求項３】
可溶性ペプチドがアミノ酸配列配列番号１にある、請求項１記載の使用のための可溶性ペプチド。
【請求項４】
癌が白血病である、請求項１〜３のいずれかに記載の使用のための可溶性ペプチド。
【請求項５】
白血病がＢ慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）である、請求項４記載の使用のための可溶性ペプチド。
【請求項６】
ＣＬＬが難治性ＣＬＬである、請求項５記載の使用のための可溶性ペプチド。
【請求項７】
癌の防止又は処置における使用のための請求項１〜６のいずれかに記載の可溶性ペプチドをコードする核酸。
【請求項８】
癌の防止又は処置における使用のための請求項７記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項９】
癌の防止又は処置における使用のための請求項８記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項記載の少なくとも１つの可溶性ペプチド又は請求項７記載の少なくとも１つの核酸又は請求項８記載の少なくとも１つの発現ベクター、又は請求項９記載の少なくとも１つの宿主細胞及び医薬的に許容可能な担体を含む、癌の処置における使用のための医薬的組成物。
【請求項１１】
式（Ｉ）：
【化２４】
2018057394.tif 000030
の可溶性ペプチド。
【請求項１２】
式（ＩＩ）：
【化２５】
2018057394.tif 000031
の可溶性ペプチド。
【請求項１３】
式（ＩＩＩ）：
【化２６】
2018057394.tif 000032
の可溶性ペプチド。
【請求項１４】
癌の処置における使用のための請求項１１〜１３記載の可溶性ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、癌の処置における使用のためのアミノ酸配列：ＫＲＦＹＶＶＭＷＫＫ（配列番号１）又はその機能保存的変異体を含む可溶性ペプチドに関する。
【０００２】
本発明は、また、本発明に従った少なくとも１つの可溶性ペプチド又は本発明に従った少なくとも１つの核酸又は本発明に従った少なくとも１つの発現ベクター、又は本発明に従った少なくとも１つの宿主細胞及び医薬的に許容可能な担体を含む、癌の処置における使用のための医薬的組成物に関する。
【０００３】
発明の背景
癌は、悪性新生物であり、種々の疾患の広い群であり、全てが無秩序な細胞成長を含む。２００７年には、癌は、世界中の全てのヒトの死亡の約１３%（７９０万）の原因となった。率は、より多くの人々が老齢まで生きるにつれて、及び、大衆のライフスタイルの変化が開発途上世界において生じるにつれて、上昇している。
【０００４】
特に、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、西洋諸国において最も一般的な成人白血病であり、末梢血液、骨髄、及び二次リンパ器官におけるモノクローナルＣＤ５＋Ｂリンパ球の進行性の蓄積により特徴付けられる。結果として生じる鬱血は、免疫系及び造血系の進行性の不全に導く。ＣＬＬ進行の予測的な高リスク特質は、１７ｐ１３（ＴＰ５３）及び１１ｑ２２−ｑ２３（ＡＴＭ）の細胞遺伝学的特長の変異／欠失、ＩＧＨＶ非変異状態、ＺＡＰ７０の高発現、ＣＤ３８、可溶性ＣＤ２３増加、ならびにＮＯＴＣＨ１、ＭＹＤ８８、ＢＩＲＣ３、ＸＰＯ１、ＫＬＨＬ６、ＳＦ３Ｂ１、及びＰＯＴ１遺伝子における現在試験され、依然として検証されていない変異を含む［Gribben JG, 2010;Lanasa MC, 2010及びChiorazzi N. et al., 2005］。ＡＴＭ及びＴＰ５３遺伝子に関連する機能障害を伴う患者は、同種間幹細胞移植を含む特定の積極的治療を要求する最も不良な予後を有する［Pospisilova N, 2012］。ＣＬＬの特徴は；（ｉ）不治である。なぜなら、全ての患者が最終的に再発するからである。現在の処置の選択肢への疾患の耐性を強調する。（ｉｉ）まだ非最適な既存の処置への応答に関して非常に異質な疾患。（ｉｉｉ）薬物耐性は、ＣＬＬにおける処置の失敗ならびに疾患の長期の自然経過及び反復処置に起因するその不可避な運命の主要な原因のままであり、関連する社会及び健康問題を作る。（ｉｖ）主に高齢者に影響し、大半の年齢に関連する癌のパラダイム例と考えられる。（ｖ）処置への応答の予測的で頑強な特異的マーカーは、依然として不足しているが、リスクに適応し、個人化した処置を実施し、コストを最小限にしながら臨床的利益を最大化するために、緊急に必要とされる。
【０００５】
この悪性腫瘍の発生についての直接的の原因は、完全には理解されていないが、ＣＬＬが、増殖とプログラム細胞死（ＰＣＤ）の間での不均衡により起こされるヒト悪性腫瘍の完璧な例を表すことが、現在、十分に実証されている［Chiorazzi N, 2007］。このように、白血病性ＣＬＬ細胞の寿命を調節するＰＣＤ機構のより良い理解によって、この白血病における治療的介入のための重要な進歩が提供されるはずである。
【０００６】
ＰＣＤは、定型的な超微細構造の変化（ミトコンドリア変化、核及び細胞質の凝縮、膜小疱形成、及びホスファチジルセリンの外部呈示を含む）により特徴付けられる自己破壊プロセスである。過去１０年間において実施された集中的な研究によって、ＰＣＤの変調において含まれる多数の酵素及び他の調節タンパク質が同定されてきた。これらの試験では、大半の場合において、システインプロテアーゼ（カスパーゼとして公知である）のファミリーが活性化された場合、ＰＣＤが生じると結論付けられる。カスパーゼアクチベーターの使用を通じたアポトーシスの誘導は、理論的には、癌のための処置を構成しうるため、初期のアポトーシス促進抗癌治験では、カスパーゼ活性に焦点が当てられてきた。残念ながら、これらの試験の大半が、それらの低い効力のため、依然として前臨床開発中にある。部分的には、これは、カスパーゼカスケードが遮断された場合でさえ、ＰＣＤが進むことができるとの事実に起因しうる。この事実によって、カスパーゼ非依存性として定義される代替経路の存在が明らかにされている。カスパーゼ非依存性ＰＣＤ経路の包括的な分析によって、従って、ＣＬＬ及び他の腫瘍性疾患に対する治療的戦略の設計において新たな挑戦が提供される。
【０００７】
上に示した通り、薬物耐性が、ＣＬＬにおける処置の失敗の主要な原因のままである。実際には、現在の治療は、いくつかの副作用について責任があり、最終的には、大半の患者の幸福（生存率ではない場合）に影響しうる処置に関連する障害の出現を増加させる。今までは、治療の目標は、最善の生活の質を維持し、患者が彼らの疾患から症候性になった場合にだけ、処置を開始することであった。大多数の患者について、これは、疾患の進行の速度を決定し、症状の発生を評価するための「様子見（ｗａｉｔ−ａｎｄ−ｓｅｅ）」アプローチに従うことを意味する。ＣＬＬ患者のための初期処置には、ヌクレオシド類似体（フルダラビン）又はアルキル化薬剤（クロラムブシル）のいずれかが含まれてきた。この初期アプローチは、組み合わせレジメン、例えばフルダラビン及びシクロホスファミド（ＦＣ）など、又は、より最近では、標準的な最先端治療として受け入れられている、ＦＣ（ＦＣＲ処置）へのリツキシマブの追加により改善されてきた。代替処置が、耐性患者のために又は再発において開発されてきた（例えばベンダムスチン、プロテアソーム阻害剤、又はモノクローナル抗体（抗ＣＤ５２、最適化された抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２３など）など）。
【０００８】
現在の臨床治験に関して、より関連するのは、モノクローナル抗体（ＧＡ１０１、ルミリキシマブ、ルカツムマブ）、ＢＨ３模倣物（オバトクラックス、ＡＢＴ−２６３）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（フラボピリドール、ＳＮＳ−０３２）、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤（ダサチニブ、バフェチニブ）、低メチル化薬剤（アザシチジン、デシタビン）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（パロビナスタト（ｐａｒｏｂｉｎａｓｔａｔ））、プリン類似体（８クロロアデノシン、フォロデシン）、及び小モジュラー免疫薬剤（ＴＲＵ−０１６）の使用である。Ｂ細胞受容体ライゲーション後に下流のシグナル伝達を阻害する分子は、異なる標的で相互作用する新規の経口薬剤（ホスファチジルイノシトール３キナーゼ阻害剤（ＣＡＬ−１０１）、ブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）（ＰＣＩ−３２７６５）、及び脾臓チロシンキナーゼ（ＳＹＫ）阻害剤（ホスタミチニブ（ｆｏｓｔａｍｉｔｉｎｉｂ）を含む）である。
【０００９】
上に記載する化学療法的な処置の大半によって、カスパーゼ依存性機構を介した細胞傷害性が誘導され（上を参照のこと、ページ２）、かなり可変の転帰を伴い、多くの患者が、陽性反応を有するのに対し、他は難治性のままである（ＣＬＬ患者の１５〜２５%が、疾患の経過の間に難治性になる）。実際に、白血病性Ｂ細胞は、それらを、カスパーゼ依存性ＰＣＤ経路（ｐ５３不活化、抗アポトーシス性タンパク質、例えばＭｃｌ−１又はＢｃｌ−２などの過剰発現）に特に耐性にする分子欠損を提示するため、ＣＬＬ患者の有意な群が、現在の化学療法的な処置に難治性である。その理由のため、代替のカスパーゼ非依存性ＰＣＤ経路を介してＰＣＤを誘導する新たな薬物の導入によって、ＣＬＬ処置において使用される現在の治療的戦略を改善する新たな手段が提供されうる。
【００１０】
ＣＤ４７受容体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの広く発現されるメンバーであり、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）についての受容体として、ならびに膜貫通シグナル調節タンパク質ＳＩＲＰα及びγについてのリガンドとして機能する［Brown EJ et al., 2001］。これらの分子は、免疫系における種々の生物学的現象（血小板活性化、白血球遊走、マクロファージ多核化、及びＰＣＤを含む）を調節する。ＳＩＲＰα又はＳＩＲＰγのいずれもＣＤ４７誘導性ＰＣＤに関与しておらず、ＴＳＰ−１（そのＣＯＯＨ末端細胞結合ドメインを介してＣＤ４７に特異的に結合することが示されている）とは対照的である。多くの癌は、免疫回避の機構として、ＣＤ４７を上方制御するように見え、最近の研究では、ＣＤ４７は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の異なる型（ＣＬＬを含む）における予後因子及び潜在的な治療的標的であることが示された［Edris, B et al., 2012；Willingham, S.B et al., 2012；Chao, M.P et al., 2010；Jaiswal, S et al., 2009及びChao, M.P et al., 2011］。本発明者及び他は、最近、ＣＤ４７ライゲーション（固定化抗ＣＤ４７  ｍＡｂによる（可溶性抗ＣＤ４７によらない））によって、難治性患者からのＣＬＬ細胞中でさえ、カスパーゼ非依存性ＰＣＤが誘導されることを実証している［Mateo V et al., 1999；Roue G et al., 2003；Barbier S et al., 2009；Merle-Beral H et al., 2009；Bras M et al., 2007；Mateo V et al., 2002］。
【００１１】
発明の概要：
本発明者らは、４Ｎ１Ｋ（配列番号１）（ＴＳＰ−１のＣ末端ドメインを模倣する可溶性の一価デカペプチド）によるＣＤ４７ライゲーションによって、Ｂ慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）初代細胞においてカスパーゼ非依存性ＰＣＤが誘導されることを実証する。誘導されたＰＣＤに固定化される必要のある抗ＣＤ４７  ｍＡｂに反して、可溶性４Ｎ１Ｋペプチドは、カスパーゼ非依存性ＰＣＤを誘導するために、プラスチック上にコートする必要はない。ネガティブコントロールペプチド４ＮＧＧ（配列番号２−２つのアミノ酸において変異した４Ｎ１Ｋ−）は、ＰＣＤを誘導することはできず、４Ｎ１Ｋ  ＰＣＤ誘導の特異性を知らせる（図１）。さらに、４Ｎ１Ｋ及びその誘導体ＰＫＨＢ１によるＣＤ４７ライゲーションによって、ＣＬＬ患者から、白血病性Ｂ細胞が排除され、健常なＢリンパ球又は休止正常Ｂ細胞はされず（図２、５、及び６）、カスパーゼ依存性ＰＣＤよりも良い、死を誘導する手段を表す（死のこの形態は、１７ｐ１３又は１１ｑ２２−ｑ２３上に欠失を持つ薬物難治性の個人からのＣＬＬ細胞においてでさえ効果的である：ＡＴＭ／ＴＰ５３不活化、図２）。インビボでのマウス試験では、白血病性細胞においてＰＣＤを誘導する際での、このペプチド戦略の特異性が完全に確認される（図７及び８）。
【００１２】
このように、本発明は、癌の処置における使用のためのアミノ酸配列：ＫＲＦＹＶＶＭＷＫＫ（配列番号１）又はその機能保存的変異体を含む可溶性ペプチドに関する。
【００１３】
本発明は、また、本発明に従った少なくとも１つの可溶性ペプチド又は本発明に従った少なくとも１つの核酸又は本発明に従った少なくとも１つの発現ベクター、又は本発明に従った少なくとも１つの宿主細胞及び医薬的に許容可能な担体を含む、癌の処置における使用のための医薬的組成物に関する。
【００１４】
発明の詳細な説明：
ペプチド及びその使用
本発明の第１の目的は、癌の処置における使用のためのアミノ酸配列：ＫＲＦＹＶＶＭＷＫＫ（配列番号１）又はその機能保存的変異体を含む可溶性ペプチドに関する。
【００１５】
本発明は、また、本明細書において上に記載する通りの、配列番号１を含む可溶性ペプチドの機能保存的変異体であるペプチドを包含する。
【００１６】
一実施態様において、本発明に従った可溶性ペプチドは、１、２、又は３アミノ酸、配列番号１と異なりうる。
【００１７】
別の実施態様において、本発明に従った可溶性ペプチドは、４又は５アミノ酸、配列番号１と異なりうる。
【００１８】
一実施態様において、本発明の可溶性ペプチドは、前記の配列番号１にわたる少なくとも７５%同一性、さらにより好ましくは、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、少なくとも９７%を含み、依然として、腫瘍細胞増殖を減少させることができる、又は、依然として、腫瘍細胞においてＰＣＤを誘導することができる。
【００１９】
一実施態様において、本発明の可溶性ペプチドは、配列番号１において示す通りのアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも７５%、好ましくは、少なくとも８０%、８５%、９０%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%又は９９．９%同一性を含むその変異体にあり、依然として、腫瘍細胞増殖を減少させることができる、又は、依然として、腫瘍細胞においてＰＣＤを誘導することができる。
【００２０】
新たに生成された可溶性ペプチドが、最初に特徴付けられたペプチド４Ｎ１Ｋと同じ型のカスパーゼ非依存性ＰＣＤを誘導するか否かを検証するために、フローサイトメトリー分析（例えば、図２において記載する通り）を、各々のペプチドを用いて実施してもよい。カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋを伴う／伴わない処置において得られた結果の比較によって、４Ｎ１Ｋ由来ペプチドにより誘導された細胞死の様式が、カスパーゼ非依存性であることが確証されうる。加えて、異なる腫瘍細胞において実施された時間経過及び用量応答によって、各々のペプチド及び各々の悪性細胞型のための最適な条件が決定されうる。
【００２１】
本発明の一実施態様において、前記の可溶性ペプチドは、本明細書で上に定義する通りの、アミノ酸配列配列番号１を含む５０未満のアミノ酸長のアミノ酸配列である。
【００２２】
本発明の別の実施態様において、前記の可溶性ペプチドは、本明細書で上に定義する通りの、アミノ酸配列配列番号１を含む４５未満のアミノ酸長のアミノ酸配列である。
【００２３】
本発明の別の実施態様において、前記の可溶性ペプチドは、本明細書で上に定義する通りの、アミノ酸配列配列番号１を含む４０未満のアミノ酸長のアミノ酸配列である。
【００２４】
本発明の別の実施態様において、前記の可溶性ペプチドは、本明細書で上に定義する通りの、アミノ酸配列配列番号１を含む３０未満のアミノ酸長のアミノ酸配列である。
【００２５】
本発明の別の実施態様において、前記の可溶性ペプチドは、本明細書で上に定義する通りの、アミノ酸配列配列番号１を含む２０未満のアミノ酸長のアミノ酸配列である。
【００２６】
本発明の別の実施態様において、前記の可溶性ペプチドは、本明細書で上に定義する通りの、アミノ酸配列配列番号１を含む１５未満のアミノ酸長のアミノ酸配列である。
【００２７】
本明細書において使用する通り、用語「機能保存的変異体」は、タンパク質又は酵素中の所与のアミノ酸残基が、ペプチドの全体的な立体構造を及び機能を変えることなく、変化（挿入、欠失、又は置換）されているものを指す。そのような変異体は、アミノ酸変化（例えば欠失、挿入、及び／又は置換など）を有するタンパク質を含む。「欠失」は、タンパク質中での１つ又は複数のアミノ酸の非存在を指す。「挿入」は、タンパク質中でのアミノ酸の１つ又は複数の付加を指す。「置換」は、タンパク質中での、１つ又は複数のアミノ酸の、別のアミノ酸残基による交換を指す。典型的には、所与のアミノ酸は、同様の特性（例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）を有するアミノ酸により交換される。この所与のアミノ酸は、天然アミノ酸又は非天然アミノ酸でありうる。保存されているとして示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、同様の機能の任意の２つのタンパク質間でのパーセントのタンパク質又はアミノ酸配列類似性が変動しうるように、又は、例えば、アライメントスキーム（例えばクラスター方法による、など）に従って決定される通りに７０%〜９９%でありうる（それにおいて類似性は、MEGALIGNアルゴリズムに基づく）ようにタンパク質において異なりうる。「機能保存変異体」は、また、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムにより決定される通り、少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７５%、より好ましくは少なくとも８５%、さらに好ましくは少なくとも９０%、及びさらにより好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、それらは、それと比較される天然又は親タンパク質と同じ又は実質的に同様の特性又は機能を有する。２つのアミノ酸配列は、より短い配列の全長にわたり、アミノ酸の８０%より大きく、好ましくは８５%より大きく、好ましくは９０%より大きく同一である、又は、９０%より大きく、好ましくは９５%より大きく同様である（機能的に同一である）場合、「実質的に相同」又は「実質的に同様」である。好ましくは、同様の又は相同な配列は、アラインメントにより、例えば、ＧＣＧ（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）パイルアッププログラム、又は配列比較アルゴリズム（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなど）のいずれかを使用して同定する。
【００２８】
典型的には、本発明は、配列番号１を含む可溶性ペプチドと実質的に同一である可溶性ペプチドを包含し、それにおいて、１つ又は複数の残基が、機能的に同様の残基を用いて保存的に置換されており、それは、本明細書において上に記載する通りの、配列番号１を含む可溶性ペプチドの機能的局面を表示し、即ち、依然として、所与のアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同じ方法で腫瘍細胞増殖を減少することができる。
【００２９】
保存的置換の例は、１つの非極性（疎水性）残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、又はメチオニンなど）の、別での置換、１つの極性（親水性）残基の、別での置換（例えばアルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、グリシンとセリンの間など）、１つの塩基性残基（例えばリジン、アルギニン、又はヒスチジンなど）の、別での置換、又は１つの酸性残基（例えばアスパラギン酸又はグルタミン酸又は別のものなど）の置換を含む。
【００３０】
用語「保存的置換」は、また、非誘導体化残基の代わりに、化学的誘導体化残基の使用を含む。「化学的誘導体」は、機能的な側基の反応により化学的に誘導体化された１つ又は複数の残基を有する被験ペプチドを指す。そのような誘導体化分子の例は、例えば、遊離アミノ基が誘導体化され、アミン塩酸塩、ｐトルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、又はホルミル基を形成するそれらの分子を含む。遊離カルボキシル基を誘導体化し、塩、メチルエステル及びエチルエステル又は他の型のエステルもしくはヒドラジドを形成しうる。遊離ヒドロキシル基は、誘導体化され、Ｏアシル又はＯアルキル誘導体を形成しうる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導体化され、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成しうる。化学的誘導体は、また、２０の標準的アミノ酸の１つ又は複数の自然に生じるアミノ酸誘導体を含むペプチドを含む。例えば、４ヒドロキシプロリンは、プロリンについて置換してもよい；５ヒドロキシリジンは、リジンについて置換してもよい；３メチルヒスチジンは、ヒスチジンについて置換してもよい；ホモセリンは、セリンについて置換してもよい；及び、オルニチンは、リジンについて置換してもよい。用語「保存的置換」は、また、ペプチド又はタンパク質の二次構造を制御及び安定化することを目的とした非天然アミノ酸の使用を含む。これらの非天然アミノ酸は、化学的に修飾されたアミノ酸、例えばプロリノアミノ酸、ベータ−アミノ酸、Ｎメチルアミノ酸、シクロプロピルアミノ酸、アルファ、アルファ置換アミノ酸などであり、本明細書において下に記載する通りである。これらの非天然アミノ酸は、また、フッ素化、塩素化、臭素化、又はヨウ素化された修飾アミノ酸を含みうる。
【００３１】
一実施態様において、本発明の可溶性ペプチドは、実施例２において記載される通りでありうる。
【００３２】
別の実施態様において、本発明の可溶性ペプチドは、実施例２及び３において記載する通りのＰＫＨＢ１ペプチドである。
【００３３】
別の実施態様において、本発明の可溶性ペプチドは、実施例２において記載する通りのＰＫＨＢ３ペプチドである。
【００３４】
別の実施態様において、本発明の可溶性ペプチドは、実施例２において記載する通りのＰＫＨＢ４ペプチドである。
【００３５】
別の実施態様において、本発明の可溶性ペプチドは、実施例２において記載する通りのＰＫＨＢ９ペプチドである。
【００３６】
別の実施態様において、本発明の可溶性ペプチドは、実施例２において記載する通りのＰＫＨＢ１０ペプチドである。
【００３７】
別の実施態様において、本発明の可溶性ペプチドは、実施例２において記載する通りのＰＫＨＢ１１ペプチドである。
【００３８】
一実施態様において、本発明の可溶性ペプチドは、タグを含みうる。タグは、可溶性ペプチドの精製のために有用でありうるエピトープ含有配列である。それを、種々の技術（例えば親和性クロマトグラフィーなど）により、免疫標識技術を使用した細胞又は組織サンプル内での前記ペプチド又はポリペプチドの局在化、免疫ブロットなどによる前記ペプチド又はポリペプチドの検出のために、付着させる。当技術分野において一般的に用いられるタグの例は、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）タグ、FLAG（商標）タグ、Strepタグ（商標）、Ｖ５タグ、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグなどである。
【００３９】
一実施態様において、本発明の可溶性ペプチドは、蛍光色素により標識されうる。色素標識蛍光ペプチドは、細胞試験において重要なツールである。ペプチドは、Ｎ末端側で又はＣ末端側で標識することができる。
【００４０】
アミン反応性蛍光色素を使用したＮ末端ペプチド標識：
アミン反応性蛍光プローブが、Ｎ末端のペプチド又はリジン残基を修飾するために広く使用される。多数の蛍光アミノ反応性色素が、種々のペプチドを標識するために開発されており、結果として得られた複合体は、生物学的適用において広く使用される。アミン反応性蛍光試薬の３つの主要なクラスが、現在、ペプチドを標識するために使用されている：スクシンイミジルエステル（ＳＥ）、イソチオシアネート、及び塩化スルホニル。
【００４１】
アミン含有蛍光色素を使用したＣ末端標識：
アミン含有色素を使用し、水溶性カルボジイミド（例えばＥＤＣなど）を使用してペプチドを修飾し、ペプチドのカルボキシ基をアミド基へ変換する。ＮＨＳ又はＮＨＳＳのいずれかを使用し、ＥＤＣ媒介性タンパク質−カルボン酸複合体化の共役効率を改善してもよい。
【００４２】
４Ｎ１Ｋから由来する標識ペプチドは、以下の一般的な式を有する：
【化１】
2018057394.tif 000002
【００４３】
式中、Ｘ及び／又はＹは、無あるいは水素及び／又はスペーサー及び／又は蛍光色素でありうる。
【００４４】
ＰＫＨＢ８（式（ＶＩＩ））は、この系列からのペプチドの例であって、式中、２つのベータ−アラニン残基及び蛍光色素（フルオレセイン）により形成されたスペーサーが、ペプチドのＮ末端側上に、リジン残基のアルファ−アミノ基上に導入されている：
【化２】
2018057394.tif 000003
【００４５】
別の実施態様において、本発明の可溶性ペプチドは、ＰＫＨＢ８ペプチドである。
【００４６】
特定の実施態様において、本発明の治療方法において使用される可溶性ペプチドは、それらの治療効力を改善するために修飾されうることが熟慮される。治療的化合物のそのような修飾を使用し、毒性を減少させる、循環時間を増加させる、又は体内分布を修飾させてもよい。例えば、潜在的に重要な治療的化合物の毒性を、体内分布を修飾する種々の薬物担体媒体の組み合わせにより有意に減少させることができる。
【００４７】
薬物バイアビリティーを改善するための戦略は、水溶性ポリマーの利用である。種々の水溶性ポリマーは、体内分布を修飾し、細胞取り込みの様式を改善し、生理学的バリアを通じて透過性を変化させ、及び身体からのクリアランスの速度を修飾することが示されている。標的化効果又は持続放出効果のいずれかを達成するために、末端基として、骨格の一部として、又はポリマー鎖上のペンダント基として薬物部分を含む水溶性ポリマーが合成されている。
【００４８】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、その高い程度の生体適合性及び修飾の容易さを前提として、薬物担体として広く使用されてきた。種々の薬物、タンパク質、及びリポソームへの付着が、滞留時間を改善し、毒性を減少させることが示されてきた。ＰＥＧを、鎖の末端のヒドロキシル基を通じて、及び、他の化学的方法を介して、活性薬剤に共役させることができる；しかし、ＰＥＧ自体は１分子当たり多くて２つの活性薬剤に限定される。異なるアプローチにおいて、ＰＥＧとアミノ酸のコポリマーを、ＰＥＧの生体適合性の特性を保持しうるが、しかし、１分子当たりの多数の付着点（より大きな薬物負荷を提供する）という追加の利点を有しうる、種々の適用に適するように合成的に設計されうる、新規生体材料として探索した。
【００４９】
当業者は、薬物の効果的な修飾のためのＰＥＧ化技術を知っている。例えば、ＰＥＧ及び三官能性単量体（例えばリジンなど）の交互ポリマーからなる薬物送達ポリマーが、VectraMed（Plainsboro, N.J.）により使用されてきた。ＰＥＧ鎖（典型的には、２０００ダルトン又はそれ以下）が、安定したウレタン連結を通じて、リジンのａ及びｅアミノ基に連結される。そのようなコポリマーは、ＰＥＧの望ましい特性を保持し、ポリマー鎖に沿った、厳密に制御された既定の間隔で反応性ペンダント基（リジンのカルボン酸基）を提供する。反応性ペンダント基を、誘導体化、架橋、又は他の分子との複合体化のために使用することができる。これらのポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧセグメントの分子量、及び薬物とポリマーの間での開裂可能な連結を変動させることにより、安定した長期循環プロドラッグを産生する際に有用である。ＰＥＧセグメントの分子量は、薬物／連結基錯体のスペーシング及び複合体の分子量当たりの薬物の量に影響を与える（より小さいＰＥＧセグメントは、より大きな薬物負荷を提供する）。一般的には、ブロックコポリマー複合体の全体的な分子量を増加させることによって、複合体の循環半減期が増加する。それにもかかわらず、複合体は、容易に分解可能である、又は、閾値を限定する糸球体ろ過を下回る分子量（例、４５kDa未満）を有しなければならない。
【００５０】
また、循環半減期及び体内分布を維持する際に重要であるポリマー骨格に、リンカーを使用し、特定の誘因、典型的には、標的組織中での酵素活性により、骨格ポリマーから放出されるまで、治療的薬剤をプロドラッグ形態中に維持してもよい。例えば、この型の組織活性化薬物送達は、体内分布の特定部位への送達が要求され、治療的薬剤が病変の部位で又はその近くで放出される場合に特に有用である。活性化薬物送達における使用のための連結基ライブラリーは、当業者に公知であり、酵素反応速度、活性酵素の保有率、及び選択した疾患特異的酵素の切断特異性に基づきうる（例、VectraMed, Plainsboro, N.J.により確立された技術を参照のこと）。そのようなリンカーは、治療的送達のための、本明細書において記載する可溶性ペプチド由来物を修飾する際に使用しうる。
【００５１】
本発明に従い、可溶性ペプチドは、従来の自動化されたペプチド合成方法により又は組換え発現により産生されうる。タンパク質を設計及び作製するための一般的な原則は、当業者に周知である。
【００５２】
本発明の可溶性ペプチドは、従来技術に従って、溶液中で又は固体支持体上で合成してもよい。種々の自動シンセサイザーが、商業的に利用可能であり、Stewart and Young；Tam et al., 1983；Merrifield, 1986 and Barany and Merrifield, Gross and Meienhofer, 1979において記載される通りの公知のプロトコールに従って使用することができる。本発明の可溶性ペプチドは、また、例示的なペプチドシンセサイザー（例えばApplied Biosystems Inc.からのモデル433Aなど）を用いた固相技術により合成されうる。任意の所与のタンパク質の純度（自動化されたペプチド合成を通じて又は組換え方法を通じて生成された）を、逆相ＨＰＬＣ分析を使用して決定してもよい。各々のペプチドの化学的信憑性は、当業者に周知の任意の方法により確立されうる。
【００５３】
自動化されたペプチド合成への代替物として、組換えＤＮＡ技術を用いてもよく、それにおいて、選んだタンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現ベクター中に挿入し、適切な宿主細胞中に形質転換又はトランスフェクトし、発現のために適した条件下で培養する（本明細書において下に記載する通り）。組換え方法は、より長いポリペプチドを産生するために特に好ましい。
【００５４】
種々の発現ベクター／宿主系を利用し、ペプチド又はタンパク質をコードする配列を含み、発現させてもよい。これらは、しかし、限定しないが、微生物、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌；酵母発現ベクター（Giga-Hama et al., 1999）を用いて形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例、バキュロウイルス、Ghosh et al., 2002を参照のこと）を用いて感染された昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を用いてトランスフェクトされた又は細菌発現ベクター（例、Ｔｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド；例、Babe et al., 2000を参照のこと）を用いて形質転換された植物細胞系；又は動物細胞系を含む。当業者は、タンパク質の哺乳動物発現を最適化するための種々の技術を知っている（例、Kaufman, 2000; Colosimo et al., 2000を参照のこと）。組換えタンパク質産生において有用である哺乳動物細胞は、しかし、限定しないが、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＣＯＳ細胞（例えばＣＯＳ−７など）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、及び２９３細胞を含む。細菌、酵母、及び他の無脊椎動物におけるペプチド基質又は融合ポリペプチドの組換え発現のための例示的なプロトコールが、当業者に公知であり、本明細書において下に簡単に記載される。米国特許第６，５６９，６４５号；米国特許第６，０４３，３４４号；米国特許第６，０７４，８４９号；及び米国特許第６，５７９，５２０号は、可溶性ペプチドの組換え産生についての特定の例を提供し、これらの特許は、本明細書において、それらの教示についての参照により明示的に組み入れられる。組換えタンパク質の発現のための哺乳動物宿主系が、また、当業者に周知である。宿主細胞株は、発現タンパク質をプロセシングする、又は、タンパク質活性を提供する際に有用であろう特定の翻訳後修飾を産生する特定の能力について選ばれうる。ポリペプチドのそのような修飾は、しかし、限定しないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化を含む。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングは、また、正確な挿入、フォールディング、及び／又は機能のために重要でありうる。異なる宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８など）は、特定の細胞機構及びそのような翻訳後活性についての特徴的な機構を有し、導入された外来タンパク質の正確な修飾及びプロセシングを確実にするために選ばれうる。
【００５５】
本発明の可溶性ペプチド由来物の組換え産生において、可溶性ペプチド由来物をコードするためのポリヌクレオチド分子を含むベクターを用いることが必要であろう。そのようなベクターを調製し、ならびに、そのようなベクターを用いて形質転換された宿主細胞を産生する方法は、当業者に周知である。そのような努力において使用されるポリヌクレオチド分子をベクターに連結してもよく、それは、一般的に、宿主おいて伝播するための、選択可能マーカー及び複製起点を含む。発現コンストラクトのこれらのエレメントは、当業者に周知である。一般的に、発現ベクターは、適した転写又は翻訳調節配列（例えば、哺乳動物、微生物、ウイルス、又は昆虫の遺伝子から由来するものなど）に動作可能に連結されている所与のタンパク質をコードするＤＮＡを含む。調節配列の例は、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに転写及び翻訳を制御する適切な配列を含む。
【００５６】
用語「発現ベクター」、「発現コンストラクト」、又は「発現カセット」は、本明細書を通して互換的に使用され、遺伝子産物をコードする核酸を含む任意の型の遺伝子コンストラクトを含むことを意味し、それにおいて、配列をコードする核酸の部分又は全部を転写することが可能である。
【００５７】
本発明のペプチド又はポリペプチドの発現のための適した発現ベクターの選択は、もちろん、使用される特定の宿主細胞に依存し、当業者の技術の範囲内である。哺乳動物発現ベクターの構築のための方法は、例えば、Okayama and Berg, 1983；Cosman et al., 1986；Cosman et al., 1984；ＥＰ−Ａ−０３６７５６６；及びＷＯ  ９１／１８９８２において開示されている。発現ベクターを産生するための他の考察が、例えば、Makrides et al., 1999；Kost et al., 1999において詳述されている。Wurm et al., 1999が、組換えタンパク質産生のための哺乳動物細胞における大規模な一過性発現における考察のための教示因子として、本明細書において組み入れられる。
【００５８】
発現は、適当なシグナルがベクター中に提供されることを要求する（例えば、宿主細胞において目的の核酸の発現を駆動するために使用されうるウイルス及び哺乳類の両方の供給源からのエンハンサー／プロモーターなど）。通常、発現される核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、細胞の合成機構、又は導入された合成機構により認識されるＤＮＡ配列を指し、遺伝子の特異的な転写を開始するために要求される。ヌクレオチド配列は、調節配列が、目的のペプチド（即ち、４Ｎ１Ｋ、変異体など）をコードするＤＮＡに機能的に関連する場合、動作可能に連結される。このように、プロモーターヌクレオチド配列は、プロモーターヌクレオチド配列が、配列の転写に向ける場合、所与のＤＮＡ配列に動作可能に連結される。
【００５９】
同様に、語句「転写制御下」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼ開始及び遺伝子の発現を制御するための核酸に関して、正確な位置及び配向にあることを意味する。核酸の発現を駆動する任意のプロモーターを使用してもよい。目的の核酸配列の発現を制御するために用いられる特定のプロモーターは、それが標的細胞において核酸の発現に向けることが可能である限り、重要であるとは考えられない。このように、ヒト細胞を標的とする場合、核酸コード領域を、ヒト細胞において発現させることが可能であるプロモーターに隣接して及びその制御下に位置づけることが好ましい。一般的に言えば、そのようなプロモーターは、ヒトプロモーター又はウイルスプロモーターのいずれかを含みうる。一般的なプロモーターは、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復、［ベータ］−アクチン、ラットインスリンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターを含み、それらの全てが、当業者に周知であり、容易に利用可能であり、目的のコード配列の高レベル発現を得るために使用することができる。目的のコード化配列の発現を達成するための、当技術分野において周知である他のウイルス又は哺乳動物細胞又は細菌ファージのプロモーターの使用も、発現のレベルが目的のタンパク質の回収可能収率を産生するために十分であるという条件で、熟慮される。周知の特性を伴うプロモーターを用いることにより、トランスフェクション又は形質転換に続く目的のタンパク質の発現のレベル及びパターンを最適化することができる。誘導性プロモーターも使用してもよい。
【００６０】
タンパク質発現において使用される別の調節エレメントは、エンハンサーである。これらは、ＤＮＡの同一分子上の遠い位置に位置づけられるプロモーターからの転写を増加させる遺伝子エレメントである。発現コンストラクトにｃＤＮＡインサートを用いる場合、典型的には、遺伝子転写物の適当なポリアデニル化をもたらすためのポリアデニル化シグナル配列を含むことが望まれるであろう。選択したトランスジェニック動物種の細胞により認識される任意のポリアデニル化シグナル配列は、本発明の実行のために適している（例えばヒト又はウシ成長ホルモン及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルなど）。
【００６１】
核酸、ベクター、組換え宿主細胞、及びそれらの使用
本発明の別の目的は、癌の防止又は処置における使用のための、本明細書において上に記載する通りの、配列番号１を含むアミノ酸配列又はその機能保存的変異体をコードする核酸に関する。
【００６２】
一実施態様において、配列番号１からなるアミノ酸配列をコードする前記核酸。
【００６３】
本発明の核酸は、当技術分野においてそれ自体が公知の任意の技術、例えば、限定を伴わず、任意の化学的、生物学的、遺伝的、又は酵素的技術などの単独又は組み合わせのいずれかにより産生されうる。
【００６４】
本発明の別の目的は、癌の防止又は処置における使用のための、本明細書において上に記載する通りの、配列番号１を含むアミノ配列又はその機能保存的変異体をコードする核酸配列を含む発現ベクターである。
【００６５】
本発明に従い、本発明における使用のために適した発現ベクターは、核酸配列に操作的に連結された少なくとも１つの発現制御エレメントを含みうる。発現制御エレメントをベクター中に挿入し、核酸配列の発現を制御及び調節する。発現制御エレメントの例は、しかし、限定しないが、ｌａｃ系、ファージラムダのオペレーター領域及びプロモーター領域、酵母プロモーター、ならびにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、又はＳＶ４０から由来するプロモーターを含む。追加の好ましい又は要求される操作エレメントは、しかし、限定しないが、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、及び宿主系における核酸配列の適切な転写及びその後の翻訳のために必要な又は好ましい任意の他の配列を含む。要求される又は好ましい発現制御エレメントの正確な組み合わせは、選ばれた宿主系に依存するであろうことが、当業者により理解されるであろう。発現ベクターは、宿主系における核酸配列を含む発現ベクターのトランスファー及びその後の複製のために必要な追加エレメントを含むはずであることが、さらに理解されるであろう。そのようなエレメントの例は、しかし、限定しないが、複製の起点及び選択可能マーカーを含む。そのようなベクターが、従来の方法を使用して簡単に構築される、又は商業的に利用可能であることは、当業者によりさらに理解されるであろう。
【００６６】
本発明の別の目的は、癌の防止又は処置における使用のための、本明細書において上に記載する通りの発現ベクターを含む宿主細胞である。
【００６７】
本発明に従い、使用してもよい宿主細胞の例は、真核細胞（例えば動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び酵母細胞など）及び原核細胞（例えば大腸菌など）である。遺伝子を運ぶベクターが細胞中に導入されうる手段は、しかし、限定しないが、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、形質導入、ＤＥＡＥデキストラン、リポフェクション、リン酸カルシウム、又は当業者に公知の他の手順を使用したトランスフェクションを含む。
【００６８】
別の実施態様において、真核細胞において機能する真核生物発現ベクターが使用される。そのようなベクターの例は、しかし、限定しないが、ウイルスベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス；レンチウイルスなど）、細菌発現ベクター、プラスミド（例えばｐｃＤＮＡ３など）又はバキュロウイルストランスファーベクターを含む。好ましい真核細胞株は、しかし、限定しないが、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、２９３細胞（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ１５７３）、Ｔ２細胞、樹状細胞、又は単球を含む。
【００６９】
治療的方法
特定の実施態様において、本発明の可溶性ペプチド、核酸、発現ベクター、又は宿主細胞は、副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、キャッスルマン疾患、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、ホジキン疾患、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭及び下咽頭癌、肝癌、肺癌、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔及び中咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、膣癌、外陰癌、ならびに子宮癌からなる群より選択される癌の処置において有用でありうる。
【００７０】
別の特定の実施態様において、本発明の可溶性ペプチド、核酸、発現ベクター、又は宿主細胞は、白血病及び特に急性リンパ芽球性白血病、Ｂ慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞型の前リンパ球性白血病又は骨髄性白血病の防止及び処置において有用でありうる。
【００７１】
一実施態様において、白血病はＢ慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。
【００７２】
特定の実施態様において、本発明の可溶性ペプチド、核酸、発現ベクター、又は宿主細胞は、難治性ＣＬＬの処置において有用でありうる。別の特定の実施態様において、本発明の可溶性ペプチド、核酸、発現ベクター、又は宿主細胞は、非変異ＩＧＨＶ、複雑な核型、ならびに機能不全又は変異ＴＰ５３、ＡＴＭ、ＮＯＴＨ１、ＭＹＤ８８、ＸＰＯ１、ＫＬＨＬ６、ＳＦ３Ｂ１、ＰＯＴ１、及びＢＩＲＣ３  Ｂ細胞を含む、不良な予後を伴う難治性ＣＬＬの処置において有用でありうる。
【００７３】
本明細書において使用する通り、用語「難治性ＣＬＬ」は、白血病に対して使用される一般的な処置に難治性であるＣＬＬを表示する（ページ２〜３に記載される）。
【００７４】
特定の実施態様において、本発明の可溶性ペプチド、核酸、発現ベクター、又は宿主細胞は、薬物耐性を許しうる内在性変異を提示する難治性ＣＬＬ（例、ＴＰ５３、ＡＴＭ、ＮＯＴＨ１、ＭＹＤ８８、ＸＰＯ１、ＫＬＨＬ６、ＳＦ３Ｂ１、ＰＯＴ１、及びＢＩＲＣ３遺伝子における変異／欠失又はページ２及び３において記載する処置に難治性）の処置において有用でありうる。
【００７５】
特定の実施態様において、本発明の可溶性ペプチド、核酸、発現ベクター、又は宿主細胞は、一般的な処置（抗ＣＤ２０、フルダラビン、又はクラドリビンなど）が作用していない難治性ＣＬＬの処置において有用でありうる。
【００７６】
本発明の別の目的は、それを必要とする被験者に、上に記載する通りの可溶性ペプチド又は本発明に従った核酸又は本発明に従った発現ベクター又は本発明に従った宿主細胞の治療的に効果的な量を投与することを含む、癌を処置するための方法に関する。
【００７７】
一局面において、本発明は、それを必要とする被験者に、配列番号１の可溶性ペプチド又は上に記載する通りのその機能保存的変異体の治療的に効果的な量を投与することを含む、癌を処置するための方法に関する。
【００７８】
別の実施態様において、本発明は、それを必要とする被験者に、本発明に従った可溶性ペプチドの治療的に効果的な量を投与することを含む、癌を処置するための方法に関する。
【００７９】
本明細書において使用する通り、用語「治療的に効果的な量」は、被験者に治療的利益を与えるために必要である、活性薬剤の最少量について意図される。例えば、被験者への「活性薬剤の治療的に効果的な量」は、被験者に影響する疾患に関連付けられる病理学的症状、疾患進行、又は身体状態において改善を誘導する、回復する、又は起こす活性薬剤の量である。
【００８０】
本明細書において使用する通り、用語、障害又は状態を「処置する」は、そのような障害又は状態の１つ又は複数の症状のプロセスを逆転、緩和、又は阻害することを指す。
【００８１】
本明細書において使用する通り、用語「被験者」は、哺乳動物（例えば齧歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類など）を表示する。好ましくは、本発明に従った被験者はヒトである。
【００８２】
医薬的組成物
本発明の別の目的は、癌の処置における使用のための医薬的組成物であって、以下を含む：
ａ）本発明に従った少なくとも１つの可溶性ペプチド；又は
ｂ）本発明に従った少なくとも１つの核酸；又は
ｃ）本発明に従った少なくとも１つの発現ベクター又は；
ｄ）本発明に従った少なくとも１つの宿主細胞
ｅ）及び医薬的に許容可能な担体。
【００８３】
一実施態様において、前記の医薬的組成物は、配列配列番号１を有する少なくとも１つの可溶性ペプチドを含む。
【００８４】
別の実施態様において、前記の医薬的組成物は、配列配列番号１を有するペプチドのその機能保存的変異体を含む。
【００８５】
さらに別の実施態様において、前記の医薬的組成物は、ペプチドＰＫＨＢ１を含む。
【００８６】
上に記載する通りの、本発明の任意の治療的薬剤は、医薬的に許容可能な賦形剤、及び、場合により、持続放出マトリックス（例えば生物分解性ポリマーなど）と組み合わせて、治療的組成物を形成しうる。
【００８７】
「医薬的に」又は「医薬的に許容可能な」は、哺乳動物、特にヒトに投与した場合（適切な場合）、有害の、アレルギー性の、又は他の厄介な反応を産生しない分子実体及び組成物を指す。医薬的に許容可能な担体又は賦形剤は、非毒性の固体、半固体、もしくは液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料、又は任意の型の製剤補助剤を指す。
【００８８】
医薬的組成物の形態、投与の経路、投与量及び投与計画は、自然に、処置される状態、疾病の重症度、患者の年齢、体重、及び性別などに依存する。
【００８９】
本発明の医薬的組成物を、局所、経口、鼻腔内、眼内、静脈内、筋肉内、又は皮下投与などのために製剤化することができる。
【００９０】
好ましくは、医薬的組成物は、注射することが可能な製剤用の医薬的に許容可能である賦形剤を含む。これらは、特に等張性の無菌生理食塩溶液（リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど、あるいはそのような塩の混合物）、又は乾燥した、特に凍結乾燥組成物でありうるが、それらは、場合に依存して、滅菌水又は生理学的食塩水の添加時に、注射用溶液の構成を許す。
【００９１】
投与のために使用される用量を、種々のパラメーターの関数として、特に、使用される投与の様式の、関連する病変の、又は、あるいは、処置の所望の持続期間の関数として適応することができる。
【００９２】
医薬的組成物を調製するために、本発明に従ったポリペプチド又は核酸の効果的な量を、医薬的に許容可能な担体又は水性媒質中に溶解又は分散させてもよい。
【００９３】
注射用の使用のために適した医薬的形態は、無菌水溶液又は分散剤；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌注射用溶液又は分散剤の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度まで液体でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば細菌及び真菌など）の混入作用に対して保存されなければならない。
【００９４】
遊離塩基又は薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えばヒドロキシプロピルセルロースなど）と適切に混合し、水中で調製することができる。分散剤は、また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、それらの混合物、及び油中で調製することができる。保存及び使用の普通の条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存剤を含む。
【００９５】
本発明に従ったそのペプチド又は核酸は、中性又は塩の形態で組成物中に製剤化することができる。医薬的に許容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含み、それらは、無機酸、例えば、塩酸又はリン酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩は、また、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄など、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から由来しうる。
【００９６】
担体は、また、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適した混合物、及び野菜油を含む溶媒又は分散媒質でありうる。適当な流動性は、例えば、コーティング（例えばレシチンなど）の使用により、要求される粒子サイズの維持により（分散剤の場合において）、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌薬剤及び抗真菌薬剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によりもたらすことができる。多くの場合において、等張薬剤（例えば、糖又は塩化ナトリウム）を含むことが好ましいであろう。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤の組成物（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）中での使用によりもたらすことができる。
【００９７】
無菌注射用溶液は、上に列挙する種々の他の成分を伴う適切な溶媒中に、要求される量で活性化合物を取り込ませることにより調製し、要求に応じて、ろ過滅菌が続く。一般的に、分散剤は、種々の滅菌活性成分を、基礎分散媒質及び上に列挙するものからの要求される他の成分を含む無菌賦形剤中に取り込ませることにより調製する。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合において、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それによって、活性成分＋以前に無菌ろ過されたその溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末がもたらされる。
【００９８】
直接注射用のより多くの、又は高度に濃縮された溶液の調製も熟慮され、そこでは、溶媒としてのＤＭＳＯの使用が、極めて迅速な浸透をもたらすことが想定され、高濃度の活性薬剤を、小さな腫瘍領域に送達する。
【００９９】
製剤化時に、溶液は、投与製剤と適合する様式で、治療的に効果的な量で投与されうる。製剤は、種々の投与形態（例えば上に記載する注射用溶液の型など）で容易に投与されるが、しかし、薬物放出カプセルなども用いることができる。
【０１００】
水溶液中での非経口投与のために、例えば、溶液は、適切に緩衝化し、液体希釈剤は、最初に、十分な生理食塩水又はグルコースを用いて等張にされうる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与のために特に適する。これに関連して、用いることができる無菌水性媒質は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、１投与量を、１mlの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶解し、１０００mlの皮下注入液に加える又は提案された注入部位に注射しうる（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照のこと）。投与量におけるいくらかの変動が、処置されている被験者の状態に依存して必ず生じる。投与について責任のある人は、任意の事象において、個々の被験者のために適切な用量を決定する。
【０１０１】
非経口投与（例えば静脈内又は筋肉内注射など）のために製剤化された化合物に加えて、他の医薬的に許容可能な形態は、例えば、経口投与のための錠剤又は他の固体；時間放出カプセル；及び現在使用されている任意の他の形態を含む。
【０１０２】
一実施態様において、医薬的組成物は、本発明に従ったペプチド又はその変異体を安定的に発現する細胞を含みうる。例えば、医薬的組成物は、本発明のポリペプチドのペプチドを安定的に発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞、又は本発明のペプチドを安定的に発現しているＨＣＴ１１６細胞を含みうる。細胞をアルギン酸ゲルビーズ中にカプセル化してもよく、Desille et al., 2001, 2002及びMahler et al., 2003において記載される通りである。このベクター化アプローチによって、本発明のポリペプチドの局在化された送達が可能になる。
【０１０３】
本発明の組成物は、さらなる治療的活性薬剤を含んでもよい。本発明は、また、本発明に従ったポリペプチド又は核酸及びさらなる治療的活性薬剤を含むキットに関する。
【０１０４】
一実施態様において、前記の治療的活性薬剤は抗癌剤である。例えば、前記の抗癌剤は、しかし、限定しないが、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メトトレキサート、タキソール、タキソテール、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシウレア、シタラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、白金錯体（例えばシスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンなど）、マイトマイシン、ダカルバジン、テノポシド、エトポシド、テニポシド、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ドキソルビシン、エピムビシン（ｅｐｉｍｂｉｃｍ）、５−フルオロウラシル、タキサン（例えばドセタキセル及びパクリタキセルなど）、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エストラムスチン、エトポシド、ナイトロジェンマスタード、ＢＣＮＵ、ニトロソウレア（例えばカルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｍｅ）及びロムスチンなど）、ビンカアルカロイド（例えばビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビンなど）、イマチニブメシラート（ｉｍａｔｉｍｂ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）、ヘキサメチレンアミン（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｈｎｅｌａｍｉｎｅ）、トポテカン、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、ＡＴＰアーゼ阻害剤、チルホスチン、プロテアーゼ阻害剤、阻害剤ハービマイシン（ｈｅｒｂｉｍｙｃｍ）Ａ、ゲニステイン、エルブスタチン、及びラベンダスチンＡを含む。一実施態様において、追加の抗癌剤は、しかし、限定しないが、以下のクラスの薬剤の１つ又は組み合わせより選択されうる：アルキル化薬剤、植物性アルカロイド、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、抗葉酸、ピリミジン類似体、プリン類似体、ＤＮＡ代謝拮抗剤、タキサン、ポドフィロトキシン、ホルモン治療、レチノイド、光増感剤又は光線力学的治療、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、イソプレニル化阻害剤、細胞周期阻害剤、アクチノマイシン、ブレオマイシン、アントラサイクリン、ＭＤＲ阻害剤、及びＣａ２＋  ＡＴＰａｓｅ阻害剤。
【０１０５】
追加の抗癌剤は、しかし、限定しないが、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、成長阻害因子、ホルモン、可溶性受容体、デコイ受容体、モノクローナル又はポリクローナル抗体、一特異性、二特異性、又は多特異性抗体、モノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ）、ポリボディ（ｐｏｌｙｂｏｄｉｅｓ）より選択されうる。
【０１０６】
追加の抗癌剤は、しかし、限定しないが、成長因子又は造血因子（例えばエリスロポエチン及びトロンボポエチンなど）及びそれらの成長因子模倣物より選択されうる。
【０１０７】
癌を処置するための本方法において、さらなる治療的活性薬剤は、制吐剤でありうる。適した制吐剤は、しかし、限定しないが、メトクロプロミド、ドンペリドン、プロクロルペラジン、プロメタジン、クロルプロマジン、トリメトベンズアミド、オンダンセトロン、グラニセトロン、ヒドロキシジン、アセチルロイシンモノエマノールアミン、アリザプリド、アザセトロン、ベンズキナミド、ビエタナウチン、ブロモプリド、ブクリジン、クレボプリド、シクリジン、ジメンヒドリナート（ｄｕｎｅｎｈｙｄｒｉｎａｔｅ）、ジフェニドール、ドラセトロン、メクリジン（ｍｅｃｌｉｚｍｅ）、メタラタール、メトピマジン、ナビロン、オキシペンジル、ピパマジン、スコポラミン、スルピリド、テトラヒドロカンナビノール、チエチルペラジン（ｔｈｉｅｆｈｙｌｐｅｒａｚｉｎｅ）、チオプロペラジン、及びトロピセトロンを含む。特定の実施態様において、制吐剤は、グラニセトロン又はオンダンセトロンである。
【０１０８】
別の実施態様において、さらなる治療的活性薬剤は、造血コロニー刺激因子でありうる。適した造血コロニー刺激因子は、しかし、限定しないが、フィルグラスチム、サルグラモスチム、モルグラモスチム、及びエポエチンアルファを含む。
【０１０９】
さらに別の実施態様において、他の治療的活性薬剤は、オピオイド又は非オピオイド鎮痛剤でありうる。適したオピオイド鎮痛剤は、しかし、限定しないが、モルヒネ、ヘロイン、ヒドロモルフォン、ヒドロコドン、オキシモルフォン、オキシコドン、メトポン、アポモルフィン、ノミオイフィン、エトイプビン、ブプレノルフィン、メペリジン、ロペラミド（ｌｏｐｅｒｍｉｄｅ）、アニレジン、エトヘプタジン、ピミニジン、ベタプロジン、ジフェノキシレート、フェンタニル、スフェンタニル、アルフェンタニル、レミフェンタニル、レボルファノール、デキストロメトルファン、フェナゾドン、ペマゾシン、シクラゾシン、メタドン、イソメタドン、及びプロポキシフェンを含む。適した非オピオイド鎮痛剤は、しかし、限定しないが、アスピリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、ジクロフェナク、ジフルシナル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、インドメタシン、ケトロラク、メクロフェナメート、メフェナム酸、ナブメトン、ナプロキセン、ピロキシカム及びスリンダクを含む。
【０１１０】
さらに別の実施態様において、さらなる治療的活性薬剤は、抗不安剤でありうる。適した抗不安剤は、しかし、限定しないが、ブスピロン、及びベンゾジアゼピン（例えばジアゼパム、ロラゼパム、オキサザパム、クロラゼペート、クロナゼパム、クロルジアゼポキシド、及びアルプラゾラムなど）を含む。
【０１１１】
本発明を、さらに、以下の図面及び実施例により例証する。しかし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものとして任意の方法で解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】３５人の異なるＣＬＬ患者（非変異ＩＧＨＶ、複雑な核型及び機能障害ＴＰ５３又はＡＴＭ遺伝子を含む、現在の治療法への内在性の耐性を伴う患者を含む）から単離されたＢ細胞を、固定化ＣＤ４７  ｍＡｂ（クローンＢ６Ｈ１２）、可溶性ＴＳＰ−１由来ペプチド４Ｎ１Ｋ（３００μM）、又はネガティブ可溶性コントロールペプチド４ＮＧＧ（２つのアミノ酸において変異した４Ｎ１Ｋ；配列：ＫＲＦＹＧＧＭＷＫＫ、配列番号２）の存在において１時間培養した。ホスファチジルセリンを曝露する細胞のパーセンテージ（アネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いて測定した）を記録し、プロットとして表現した。
【図２Ａ】（Ａ）パネルＣＬＬ患者から又はコントロール志願者から単離されたＢ細胞を、５０μMの広域カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋを用いてプレインキュベートし（１時間）又はせず、４Ｎ１Ｋ（３００μM）又はネガティブコントロールペプチド４ＮＧＧ（２つのアミノ酸において変異した４Ｎ１Ｋ；配列：ＫＲＦＹＧＧＭＷＫＫ、配列番号２）の存在において１時間培養した。ホスファチジルセリンを曝露する細胞のパーセンテージ（アネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いて測定した）を記録し、プロットとして表現した。＊＊＊、ｐ＜０．００１（ＣＬＬ細胞及び正常Ｂ細胞における４Ｎ１Ｋへの異なる応答）。ＮＳ、カスパーゼ阻害剤ＺＶＡＤを用いて処理された又はされていないＣＬＬ細胞の間での４Ｎ１Ｋ誘導性ＰＣＤにおける有意差はない。（Ｂ）ＣＬＬ患者からのＢ細胞のパネルを、機能的Ｐ５３活性により分析し、上の通りに、４Ｎ１Ｋの存在において１時間培養した。ＰＣＤを、アネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いて測定した。ＮＳ、機能的及び非機能的ＴＰ５３を提示するＣＬＬ細胞の間での４Ｎ１ＫへのＰＣＤ応答における有意差はない。
【図２Ｂ】（Ａ）パネルＣＬＬ患者から又はコントロール志願者から単離されたＢ細胞を、５０μMの広域カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋを用いてプレインキュベートし（１時間）又はせず、４Ｎ１Ｋ（３００μM）又はネガティブコントロールペプチド４ＮＧＧ（２つのアミノ酸において変異した４Ｎ１Ｋ；配列：ＫＲＦＹＧＧＭＷＫＫ、配列番号２）の存在において１時間培養した。ホスファチジルセリンを曝露する細胞のパーセンテージ（アネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いて測定した）を記録し、プロットとして表現した。＊＊＊、ｐ＜０．００１（ＣＬＬ細胞及び正常Ｂ細胞における４Ｎ１Ｋへの異なる応答）。ＮＳ、カスパーゼ阻害剤ＺＶＡＤを用いて処理された又はされていないＣＬＬ細胞の間での４Ｎ１Ｋ誘導性ＰＣＤにおける有意差はない。（Ｂ）ＣＬＬ患者からのＢ細胞のパネルを、機能的Ｐ５３活性により分析し、上の通りに、４Ｎ１Ｋの存在において１時間培養した。ＰＣＤを、アネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いて測定した。ＮＳ、機能的及び非機能的ＴＰ５３を提示するＣＬＬ細胞の間での４Ｎ１ＫへのＰＣＤ応答における有意差はない。
【図３】４Ｎ１Ｋ（ＣＤ４７）を用いて処理されていない（コントロール）又はインキュベートされたＣＬＬ細胞の電子顕微鏡写真。上パネルは、ミトコンドリア（ＭＴ）及びＥＲの正常な形態の典型的な例を実証する。下パネルは、ＣＤ４７  ｍＡｂ処理細胞において観察されたミトコンドリア形態及びＥＲ拡張を示す。
【図４】４Ｎ１Ｋを用いたＣＤ４７刺激後のコントロール志願者（ｎ＝４；左）からのＢリンパ球及び代表的なＣＬＬ患者（ｎ＝４；右）からのＢ細胞におけるＴｉｌｌフォトニクスによるＦｕｒａ−２  ＡＭを用いて評価された遊離Ｃａ２＋動員。イオノマイシン（Ｉｏｎｏ）は、ポジティブコントロールとして使用されたが、モニターされたＣａ２＋の最大値をシグナル化する。重要なことに、ＣＬＬにおいて、４Ｎ１Ｋにより誘導されたＣａ２＋動員は、基礎レベルには戻らず（正常Ｂ細胞において観察された通り）、４Ｎ１Ｋ処理ＣＬＬ細胞におけるカルシウム過負荷を明確に示した。
【図５】図２において描写するＣＬＬ患者からのＢ細胞の同じパネルを、上の通り、４Ｎ１ＫによるＰＣＤの誘導に先立ち、カルシウムキレーターＢＡＰＴＡ−ＡＭを用いてプレインキュベートした又はしなかった。＊＊＊、ｐ＜０．００１。ＢＡＰＴＡを用いた処理によって、４Ｎ１Ｋ媒介性ＰＣＤが抑止されることに注意すること。
【図６Ａ】（Ａ）ＣＬＬ患者から単離されたＢ細胞を、無処理で放置した（コントロール）、あるいは示した濃度での４Ｎ１Ｋ又は４Ｎ１Ｋ誘導体ペプチドＰＫＨＢ−１の存在において１時間培養した。ホスファチジルセリンを曝露する細胞のパーセンテージ（アネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いて測定した）を記録し、プロットとして表現した。データは、８つの非依存性の実験での平均値である。（Ｂ）同様の実験において、１４人の異なるＣＬＬ患者（非変異ＩＧＨＶ、複雑な核型、及び機能異常ＴＰ５３を伴う個人を含む）からのＢリンパ球を、無処理で放置した（コントロール）、あるいは４Ｎ１Ｋ（３００μM）又は４Ｎ１Ｋ誘導体ペプチドＰＫＨＢ−１（１５０μM）の存在において１時間培養した。ＰＣＤを、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ標識により、フローサイトメーターにおいて測定した。（Ｃ）細胞死を、Ａにおいて記載する通り、各々のＣＬＬ患者からフローサイトメトリーにより同定された４Ｎ１Ｋ又はＰＫＨＢ１処理ＣＤ１９＋／ＣＤ５−（残存Ｂ細胞）及びＣＤ１９＋／ＣＤ５＋  Ｂリンパ球（ＣＬＬ細胞）において決定した。データを、平均値±標準偏差として提示する（ｎ＝８患者）。（Ｄ）細胞死を、細胞内カルシウムキレーターＢＡＰＴＡ−ＡＭを用いてプレインキュベートした又はしていない４Ｎ１Ｋ又はＰＫＨＢ１処理ＣＬＬ細胞におけるアネキシンＶ陽性染色により測定した。データを、平均値±標準偏差として提示する（ｎ＝１０患者）。
【図６Ｂ】（Ａ）ＣＬＬ患者から単離されたＢ細胞を、無処理で放置した（コントロール）、あるいは示した濃度での４Ｎ１Ｋ又は４Ｎ１Ｋ誘導体ペプチドＰＫＨＢ−１の存在において１時間培養した。ホスファチジルセリンを曝露する細胞のパーセンテージ（アネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いて測定した）を記録し、プロットとして表現した。データは、８つの非依存性の実験での平均値である。（Ｂ）同様の実験において、１４人の異なるＣＬＬ患者（非変異ＩＧＨＶ、複雑な核型、及び機能異常ＴＰ５３を伴う個人を含む）からのＢリンパ球を、無処理で放置した（コントロール）、あるいは４Ｎ１Ｋ（３００μM）又は４Ｎ１Ｋ誘導体ペプチドＰＫＨＢ−１（１５０μM）の存在において１時間培養した。ＰＣＤを、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ標識により、フローサイトメーターにおいて測定した。（Ｃ）細胞死を、Ａにおいて記載する通り、各々のＣＬＬ患者からフローサイトメトリーにより同定された４Ｎ１Ｋ又はＰＫＨＢ１処理ＣＤ１９＋／ＣＤ５−（残存Ｂ細胞）及びＣＤ１９＋／ＣＤ５＋  Ｂリンパ球（ＣＬＬ細胞）において決定した。データを、平均値±標準偏差として提示する（ｎ＝８患者）。（Ｄ）細胞死を、細胞内カルシウムキレーターＢＡＰＴＡ−ＡＭを用いてプレインキュベートした又はしていない４Ｎ１Ｋ又はＰＫＨＢ１処理ＣＬＬ細胞におけるアネキシンＶ陽性染色により測定した。データを、平均値±標準偏差として提示する（ｎ＝１０患者）。
【図６Ｃ】（Ａ）ＣＬＬ患者から単離されたＢ細胞を、無処理で放置した（コントロール）、あるいは示した濃度での４Ｎ１Ｋ又は４Ｎ１Ｋ誘導体ペプチドＰＫＨＢ−１の存在において１時間培養した。ホスファチジルセリンを曝露する細胞のパーセンテージ（アネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いて測定した）を記録し、プロットとして表現した。データは、８つの非依存性の実験での平均値である。（Ｂ）同様の実験において、１４人の異なるＣＬＬ患者（非変異ＩＧＨＶ、複雑な核型、及び機能異常ＴＰ５３を伴う個人を含む）からのＢリンパ球を、無処理で放置した（コントロール）、あるいは４Ｎ１Ｋ（３００μM）又は４Ｎ１Ｋ誘導体ペプチドＰＫＨＢ−１（１５０μM）の存在において１時間培養した。ＰＣＤを、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ標識により、フローサイトメーターにおいて測定した。（Ｃ）細胞死を、Ａにおいて記載する通り、各々のＣＬＬ患者からフローサイトメトリーにより同定された４Ｎ１Ｋ又はＰＫＨＢ１処理ＣＤ１９＋／ＣＤ５−（残存Ｂ細胞）及びＣＤ１９＋／ＣＤ５＋  Ｂリンパ球（ＣＬＬ細胞）において決定した。データを、平均値±標準偏差として提示する（ｎ＝８患者）。（Ｄ）細胞死を、細胞内カルシウムキレーターＢＡＰＴＡ−ＡＭを用いてプレインキュベートした又はしていない４Ｎ１Ｋ又はＰＫＨＢ１処理ＣＬＬ細胞におけるアネキシンＶ陽性染色により測定した。データを、平均値±標準偏差として提示する（ｎ＝１０患者）。
【図６Ｄ】（Ａ）ＣＬＬ患者から単離されたＢ細胞を、無処理で放置した（コントロール）、あるいは示した濃度での４Ｎ１Ｋ又は４Ｎ１Ｋ誘導体ペプチドＰＫＨＢ−１の存在において１時間培養した。ホスファチジルセリンを曝露する細胞のパーセンテージ（アネキシンＶ−ＦＩＴＣを用いて測定した）を記録し、プロットとして表現した。データは、８つの非依存性の実験での平均値である。（Ｂ）同様の実験において、１４人の異なるＣＬＬ患者（非変異ＩＧＨＶ、複雑な核型、及び機能異常ＴＰ５３を伴う個人を含む）からのＢリンパ球を、無処理で放置した（コントロール）、あるいは４Ｎ１Ｋ（３００μM）又は４Ｎ１Ｋ誘導体ペプチドＰＫＨＢ−１（１５０μM）の存在において１時間培養した。ＰＣＤを、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ標識により、フローサイトメーターにおいて測定した。（Ｃ）細胞死を、Ａにおいて記載する通り、各々のＣＬＬ患者からフローサイトメトリーにより同定された４Ｎ１Ｋ又はＰＫＨＢ１処理ＣＤ１９＋／ＣＤ５−（残存Ｂ細胞）及びＣＤ１９＋／ＣＤ５＋  Ｂリンパ球（ＣＬＬ細胞）において決定した。データを、平均値±標準偏差として提示する（ｎ＝８患者）。（Ｄ）細胞死を、細胞内カルシウムキレーターＢＡＰＴＡ−ＡＭを用いてプレインキュベートした又はしていない４Ｎ１Ｋ又はＰＫＨＢ１処理ＣＬＬ細胞におけるアネキシンＶ陽性染色により測定した。データを、平均値±標準偏差として提示する（ｎ＝１０患者）。
【図７Ａ】（Ａ及びＢ）ＭＥＣ−１細胞を用いて皮下移植したＮＳＧマウス（ｎ＝８／群）は、４Ｎ１Ｋ、ＰＫＨＢ１、又はＰＢＳ（コントロール）の腹腔内注射を週３回受けた。腫瘍容積は、カリパスを用いて測定し、グラフとしてプロットした。（Ｃ）処理後の腫瘍成長も、写真において、グルコース取り込み２−ＤＧにより可視化した。カラースケールは、任意単位における蛍光強度を示す。
【図７Ｂ】（Ａ及びＢ）ＭＥＣ−１細胞を用いて皮下移植したＮＳＧマウス（ｎ＝８／群）は、４Ｎ１Ｋ、ＰＫＨＢ１、又はＰＢＳ（コントロール）の腹腔内注射を週３回受けた。腫瘍容積は、カリパスを用いて測定し、グラフとしてプロットした。（Ｃ）処理後の腫瘍成長も、写真において、グルコース取り込み２−ＤＧにより可視化した。カラースケールは、任意単位における蛍光強度を示す。
【図７Ｃ】（Ａ及びＢ）ＭＥＣ−１細胞を用いて皮下移植したＮＳＧマウス（ｎ＝８／群）は、４Ｎ１Ｋ、ＰＫＨＢ１、又はＰＢＳ（コントロール）の腹腔内注射を週３回受けた。腫瘍容積は、カリパスを用いて測定し、グラフとしてプロットした。（Ｃ）処理後の腫瘍成長も、写真において、グルコース取り込み２−ＤＧにより可視化した。カラースケールは、任意単位における蛍光強度を示す。
【図８】４Ｎ１Ｋ及びＰＫＨＢ１ペプチドの安定性を、ヒト血清中で、３７℃で６時間にわたり評価した。残りの可溶性ペプチドの相対濃度を、ＨＰＬＣにより、保持時間の関数としての２２０nmでの吸光度の統合により分析した。
【０１１３】
【表１】
2018057394.tif 000004
【０１１４】
【表２】
2018057394.tif 000005
【０１１５】
実施例
実施例１：治療的化合物としての４Ｎ１Ｋの使用
材料＆方法
患者、Ｂ細胞精製、及び培養条件。
公認の同意が形成された後、新鮮血サンプルを、Pitie-Salpetriere Hospital（Service d'Hematologie Biologique）での標準的な形態学的及び免疫表現型基準に従って診断されたＣＬＬ患者から収集する。正常なＢリンパ球を、ＥＦＳ（Etablisement Francais du Sang）から得る。Pitie-Salpetriere Hospitalでの施設内倫理委員会によって、本試験は承認された。単球細胞を、血液サンプルから、標準的なフィコール−ハイパック勾配を使用して精製し、Ｂ細胞を、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体（ポジティブ選択）に又は抗ＣＤ１６、ＣＤ３、及びＣＤ１４モノクローナル抗体（ネガティブ選択）（Miltenyi Biotech）に共役された磁気ビーズによりポジティブに又はネガティブに選択した。変化は、ポジティブ又はネガティブ選択された細胞の細胞死応答において見出されなかった。精製Ｂリンパ球を、完全培地（１０%ウシ胎児血清、２mM  Ｌ−グルタミン、１００U/mlペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地）中で培養した。特定されない限り、試薬はSigma-Aldrichからであった。
【０１１６】
細胞死誘導及び阻害。
細胞死を誘導するために、Ｂリンパ球を、ＴＳＰ−１由来ペプチド４Ｎ１Ｋ（３００μM；配列ＫＲＦＹＶＶＭＷＫＫ、配列番号１）、ネガティブコントロールペプチド４ＮＧＧ（３００μM；配列ＫＲＦＹＧＧＭＷＫＫ、配列番号２）、新たに開発されたペプチドＰＫＨＢ１（１５０μM；配列（Ｄ）Ｋ−Ｒ−Ｆ−Ｙ−Ｇ−Ｇ−Ｍ−Ｗ−（Ｄ）Ｋ）（式Ｉ）、又は抗ＣＤ４７  ｍＡｂを用いて１時間培養した（可溶化条件中又は固定化プレコートプレート中；５μg/ml；クローンＢ６Ｈ１２）。あるいは、Ｂ細胞を、細胞死の誘導前に、カルシウムキレーターＢＡＰＴＡ−ＡＭ（２０μM）、カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋ（５０μM）を用いて、３０分間にわたり前処理した。
【０１１７】
フローサイトメトリー。
本発明者らは、ホスファチジルセリン（ＰＳ）曝露の評価のために、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（BD Biosciences）を使用した。データ分析を、FACSCanto II（BD Biosciences）において、全細胞集団（１０，０００細胞）で行った。データを、FlowJoソフトウェア（TreeStar）を使用して分析した。
【０１１８】
Ｃａ２＋測定。
ポリリジンコートしたガラス底ペトリディッシュ中に付着した細胞を、Fura-2 AM（１μM／３０分／３７℃）を用いて負荷した。細胞を、次に、３４０及び３８０nmの波長で励起し、いくつかの細胞の蛍光放射を、５１０nmで、波長１Ｈｚで、TILL-Visionソフトウェアにより制御された二重励起蛍光イメージングシステム（TILLフォトニクス）を使用して同時に記録した。シグナルを、異なる波長（３４０／３８０nm）の蛍光強度の相対比率単位にコンピューター化した。個々の蛍光値を、次に、Originソフトウェアを用いて分析し、等式（Ｆ／Ｆ０）-１（式中、「Ｆ」は、特定の時間点での蛍光であり、「Ｆ０」は、時間０での蛍光である）に従った最初の値を用いて、蛍光を標準化した。
【０１１９】
電子顕微鏡法。
細胞を、リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．４）中の２%グルタルアルデヒドを用いて、２時間にわたり室温で固定し、洗浄し、Durcupan（商標）中に包埋する前に、２%  ＯｓＯ４中に後固定した。分析を、透過型電子顕微鏡（Carl Zeiss MicroImaging）を用いて、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛を用いて染色した超薄切片上で実施した。
【０１２０】
局在化ＣＬＬ異種移植モデルにおけるインビボ４Ｎ１Ｋ及びＰＫＨＢ−１処置。
３×１０６個のＭＥＣ−１細胞を、ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウス（Charles River）中に皮下注射した。腫瘍容積が０．１cm3に達した場合、マウスに、４ＮＩＫ又はＰＫＨＢ１（２００μl  ＰＢＳ中の４００μg）を用いて週３回、腹腔内注射した。腫瘍サイズを、２〜３日毎に、カリパーを用いて測定し、腫瘍容積（式（長さ×幅２）／２を使用して算出）をmm3として表現した。あるいは、処置の終わりに、マウスに、副鼻腔後眼窩中に、XenoLight RediJect 2-DG-750 Probe（Caliper）を用いて注射し、腫瘍細胞のグルコース取り込み（細胞増殖を反映する）を可視化した。蛍光を、In vivoイメージングシステムFX Pro（Kodak）により測定し、画像を、Carestream MIソフトウェアを用いて分析した。
【０１２１】
統計分析。
実験データ間での差の有意性を、対応のない観察について、スチューデントのｔ検定を、又は、異なる群の比較分析について、記載された通りのマン・ホイットニー検定を使用し、グラフパッドプリズムソフトウェアを使用して決定した。
【０１２２】
結果
ＣＬＬ患者からのＢ細胞に対する４Ｎ１Ｋペプチドの効果：
本発明者らは、最近、ＴＳＰ−１のＣ末端ドメインを模倣する４Ｎ１Ｋペプチド（配列番号１）の使用では、抗ＣＤ４７  ｍＡｂと比較した通り（図１）、及び、難治性患者（ＡＴＭ又はＴＰ５３変異／欠失、それらは、この白血病に対して使用される最も一般的な薬物処置、例えば抗ＣＤ２０、フルダラビン、又はクラドリビンに難治性である；図２）からのＣＬＬ細胞中でさえ、誘導されたカスパーゼ非依存性ＰＣＤに固定化される必要がないことを特定している。
【０１２３】
本発明者らの以前の結果では、ＣＤ４７媒介性カスパーゼ非依存性ＰＣＤが、ＣＬＬにおいて通常は遮断されるカスパーゼ依存性アポトーシスレギュレーターから非依存的である非定型的に調節されたミトコンドリア変化の誘導を介して進むことが示されている。実際に、ＣＤ４７に関するこれらの結果は、カスパーゼの関与を伴わずに誘導された大量のミトコンドリア変化の最初に発表された発生率である（図３）。また、コントロールドナーからの及び多数のＣＬＬ患者（今日まで１５０人を上回る）からのＢ細胞において実施された実験では、ＣＤ４７ライゲーションによって、細胞死が、迅速に、ＣＬＬ細胞中で、正常Ｂ細胞中よりも高い効力を伴い誘導されることが示されている。及び、それは、薬物難治性ＣＬＬ患者からのＢ白血病性細胞中でさえ。
【０１２４】
ＣＬＬにおいて４Ｎ１Ｋにより誘導されるカスパーゼ非依存性ＰＣＤ
１．細胞内オルガネラは、プログラム細胞死の調節における重要エレメントであり、本発明者らは、ＣＤ４７ライゲーション後にＣＬＬ細胞の超微細構造試験を実施してきた。ＣＤ４７誘発後、小胞体（ＥＲ）は膨張し、ミトコンドリアは膨らみ、形態学的変化を受ける（図３）。これらの変化は、Ｃａ２＋媒介性ＰＣＤの典型的な特質であり、ミトコンドリア及びＥＲが、主にカルシウムイオンを通じて、物理的に及び生理学的に相互接続されることを示すと思われる：（ｉ）ミトコンドリアは、細胞性アデノシン三リン酸の主な供給源であり、また、ＥＲのＣａ２＋シグナル伝達をモジュレート及び同期化する；（ｉｉ）イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）を生成する刺激は、ＥＲからのＣａ２＋の放出を起こし、それは、密接に並置されたミトコンドリアにより迅速に取り込まれる。
【０１２５】
Tillフォトニクスイメージング技術を使用し、本発明者らは、ＣＬＬ細胞中でのＣＤ４７のライゲーションに、細胞内遊離Ｃａ２＋動員が続くことを確認している。顕著には、正常Ｂ細胞と比較し、記録された細胞内Ｃａ２＋動員は、白血病性Ｂ細胞中で（しかし、正常Ｂリンパ球中ではない）より強く、持続される。実際に、ＣＬＬにおいて、４Ｎ１Ｋにより誘導されるＣａ２＋動員は、基礎レベルに戻らず、特にこれらの細胞中でのＣａ２＋過負荷を示している。これらの結果は、ＣＤ４７媒介性ＰＣＤへのＣＬＬ及び正常Ｂ細胞の異なる感受性に相関する（図２）。
【０１２６】
２．細胞内カルシウムキレーターＢＡＰＴＡ−ＡＭを用いたＢ細胞の前処理によって、ＣＤ４７媒介性ＰＣＤが遮断される（図５）。これは、４Ｎ１Ｋ誘発後にサイトゾル中へ放出されたＣａ２＋が、ＣＬＬ細胞中でのこの型のカスパーゼ非依存性ＰＣＤにおいて中心的な役割を果たすことを示す。
【０１２７】
重要なことには、本発明者らは、良い予後を伴う患者及び難治性ＣＬＬ（非変異ＩＧＨＶ遺伝子状態、高レベルのチミジンキナーゼ、可溶性ＣＤ２３、ＣＤ３８、及びＺＡＰ−７０発現、ならびにＡＴＭ又はＴＰ５３変異／欠失）を伴う患者からのＣＬＬ細胞中で、ＰＣＤ及び細胞内カルシウム動員を分析する場合、本発明者らは、悪い予後を伴う患者からの細胞（それらは、抗ＣＤ２０、フルダラビン、又はクラドリビンにより誘導されるカスパーゼ依存性ＰＣＤに耐性である）が、同様のレベルのＣＤ４７媒介性ＰＣＤ、及び、結果的に、同様のレベルの細胞内Ｃａ２＋動員をＣＤ４７誘発後に提示することを見出している。これらの結果は、ＣＤ４７により可能になるカルシウム経路が、難治性患者（欠損したカスパーゼ依存性ＰＣＤ経路を伴う）からのＣＬＬ細胞中でさえ機能的であることを示す。このように、４Ｎ１Ｋ媒介性カスパーゼ非依存性ＰＣＤが、健常ドナーからのＢリンパ球中よりもＣＬＬ細胞中でより効率的に生じ、カスパーゼ依存性ＰＣＤよりも、死を誘導するより良い手段を表す。
【０１２８】
３．本発明者らは、ＣＤ４７受容体のライゲーションが、健常ドナーからのＢリンパ球中よりもＣＬＬ細胞中でより効率的にＰＣＤを誘導し、カスパーゼ依存性ＰＣＤよりも、死を誘導する良い手段を表すことを示している。このように、本発明者らは、ＣＤ４７により誘導されるＣａ２＋媒介性カスパーゼ非依存性ＰＣＤ経路を使用し、インビボでＢ白血病性細胞を排除することができるとの仮説を立てている。この仮説を立証するために、本発明者らは、異種移植マウスモデルを開発し、インビボ実験を行ってきた（詳細については、材料及び方法ならびに図７）。コントロールとは対照的に、ＣＤ４７リガンド４Ｎ１Ｋ誘導体のＩＰ注射によって、腫瘍容積における低い低下が誘導される。
【０１２９】
これらの新たな知見は、４Ｎ１Ｋ誘導体（例えばＰＫＨＢ１など）の潜在的な適用、ＣＬＬのための処置としての治療を前提として、特に興味深い。この方法において、以下に注意することが重要である：（ｉ）４Ｎ１Ｋ誘導体ペプチドは、マウスにおいて毒性を発揮しない、及び（ｉｉ）４Ｎ１Ｋ誘導体処置は、「私を食べて（ｅａｔ  ｍｅ）シグナル」（例えばホスファチジルセリン又はカルレティキュリンなど）の外部曝露を引き起こす（データ示さず）。これによって、専門の食細胞による死細胞のその後の排除が促進される。
【０１３０】
癌細胞株及び原発癌細胞に対する４Ｎ１Ｋペプチドの効果：
本発明者らは、４Ｎ１Ｋを用いた刺激が、３５%を上回る細胞死誘導を、癌細胞株及び原発癌細胞に誘導するのに対し、４ＮＧＧ（コントロールペプチド）は、カスパーゼ非依存性ＰＣＤを誘導する際に非効率的であることを示す（表１及び２）。
【０１３１】
これらの結果は、可溶性ペプチド４Ｎ１Ｋ誘導体が、多種多様な腫瘍モデルにおいて使用することができうることを示す。
【０１３２】
実施例２：新たな可溶性ペプチドの合成
４Ｎ１Ｋペプチドの構造は、以下の通りである：
【化３】
2018057394.tif 000006
【０１３３】
４Ｎ１Ｋは、以下の配列を伴うウンデカペプチドである：Ｋ−Ｒ−Ｆ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｗ−Ｋ−Ｋ（配列番号１）。
【０１３４】
ペプチドの溶解性、安定性、及び薬理学的特性を改善するために、４Ｎ１Ｋを、以下の２つのモデルで確立されている化学的修飾により修飾する：
モデル１：
【化４】
2018057394.tif 000007
モデル２：
【化５】
2018057394.tif 000008
【０１３５】
モデルペプチド１において、Ａ（１から１０）は、無及び／又は天然アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸又はアミノ酸誘導体（例えば、プロリノアミノ酸（ｐｒｏｌｉｎｏａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ））［Mothes C et al., 2008］、ベータ−アミノ酸［Moumne R et al., 2007］、シクロプロピルアミノ酸［Joosten A et al., 2009］、Ｎメチルアミノ酸［Sagan S et al., 2004］、及び／又はアルファ−アルファ分布アミノ酸、及び／又は分布ベータ−アミノ酸（ベータ２，２、ベータ３，３  ｏｕベータ２，３）、及び／又はアザアミノ酸（Proulx, C et al., 2011）又はアジドリジン［Larregola M et al., 2001］に対応する。立体中心の絶対配置が示されていない。なぜなら、全てのアミノ酸が、天然アミノ酸又は合成的に得られたアミノ酸（鏡像異性的に（Ｌ）もしくは（Ｄ）系列まで、又はラセミ体として使用される）であるからである。
【０１３６】
モデル２について、立体中心の絶対配置が示されていない。なぜなら、全てのアミノ酸が、天然アミノ酸又は合成的に得られたアミノ酸（鏡像異性的に（Ｌ）もしくは（Ｄ）系列まで、又はラセミ体として使用される）であるからである。
【０１３７】
Ｒ基（１から１０）は、天然又は合成アミノ酸側鎖でありうるアミノ酸側鎖に対応する。グリシン残基について、この側鎖は水素原子に対応する。
【０１３８】
Ｐ１及びＰ２は、それぞれ、ペプチドのＮ末端側及びＣ末端側での機能に対応する。
【０１３９】
このように、Ｐ１は、アミン官能基（Ｐ１  ＝  −ＮＲ１１、式中、Ｒ１１は、水素原子又はアルキル（ａｌｋｙｌｅ）鎖（メチル、エチル、又はベンジルと同様）である）、カルボキシ官能基（Ｐ１  ＝  −ＣＯ２Ｈ）、カルボキサミド官能基（Ｐ１  ＝  −ＣＯＮＲ１２Ｒ１３、式中、Ｒ１２及びＲ１３は、水素原子及び／又はアルキル（ａｌｋｙｌｅ）鎖（メチル、エチル、又はベンジルと同様）である））又はアミン官能基、又はアジド官能基（Ｎ３）でありうる。
【０１４０】
このように、Ｐ２は、アミン官能基（Ｐ２  ＝  −ＮＲ１１、式中、Ｒ１１は、水素原子又はアルキル（ａｌｋｙｌｅ）鎖（メチル、エチル、又はベンジルと同様）である）、カルボキシ官能基（Ｐ２  ＝  −ＣＯ２Ｈ）、カルボキサミド官能基（Ｐ２  ＝  −ＣＯＮＲ１２Ｒ１３、式中、Ｒ１２及びＲ１３は、水素原子及び／又はアルキル（ａｌｋｙｌｅ）鎖（メチル、エチル、又はベンジルと同様）である））又はアミン官能基、又はアジド官能基（Ｎ３）でありうる。
【０１４１】
Ｙ基（１から１０）は、水素原子及び／又はメチル基、及び／又は天然アミノ酸側鎖に対応する。
【０１４２】
Ｙ１は、また、保護基（例えばアセトアミド、ベンズアミド、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、フェニルフルオレニルメトキシカルボニル保護基など）でありうる。
【０１４３】
ペプチド及び類似体は、ＳＰＰＳ又はＬＰＰＳにより、Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、又はＺ戦略を用いて合成される。全ての官能基（アミノ基、カルボキシル官能基、グアニジウム・・・）のプロトン化状態は、合成及び精製手順に依存しており、スキーム上に示されるものとは異なりうる。
【０１４４】
Ｉ−モデル１に基づく短い類似体：Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０
オクタペプチドＲ−Ｆ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｗ−Ｋ（配列番号３）の溶解性及び安定性を改善するために、以下の化学的修飾を実現する：
【０１４５】
ａ）混合塩：
【化６】
2018057394.tif 000009
【０１４６】
Ｎメチルモルホリン及びクロルハイドレート又はトリフルオロアセチルカルボキシレートの混合塩：
Ｒ７は、メチオニン、メチオニンスルホキシド（ｓｕｌｆｏｘｙｄｅ）、メチオニンスルホン又はアラニン又はブチルグリシン又はリジン側鎖を指す。
【０１４７】
Ａ２は、リジン又はアジドリジン又はアルギニン又はビス−オルニチン［Aussedat B et al., 2006］又はビス−アルギニン又はベータ−２−ホモリジン、又はベータ−２−ホモアルギニン又はベータ−２−ビス−ホモオルニチン又はベータ−２−ビス−ホモアルギニンを指す。Ｎ末端アミン官能基は、遊離でありうる又はＢｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、もしくはＣｂｚ基により保護されうる、及び／又はＮメチル化されうる。
【０１４８】
Ａ９は、リジン又はアルギニン又はビス−オルニチン又はビス−アルギニン又はベータ−３−ホモリジン、又はベータ−３−ホモアルギニン又はベータ−３−ビス−ホモオルニチン又はベータ−３−ビス−ホモアルギニンを指す。Ａ９カルボキシル官能基は、遊離である又はカルボキサミドとして保護される（Ｐ２  ＝  −ＣＯＮＲ１２Ｒ１３、式中、Ｒ１２及びＲ１３は、水素原子及び／又はアルキル基、例えばメチル基、エチル（ｅｔｈｙｌｅ）基、ベンジル基及びそれらの誘導体などである）。
【０１４９】
遊離の又はＮメチル化アミン官能基は、クロルハイドレート又はＴＦＡ塩として得ることができる（ｎは可変的であり、Ａ２、Ｒ７、又はＡ９の性質に依存する）。
【０１５０】
遊離のカルボキシル官能基は、Ｎメチルモルホリン塩（ｐ＝１）として得ることができる（しかし、必ずしもそうではない）。
【０１５１】
ＰＫＨＢ３は、これらの系列からのペプチドの例であり、そこでは、Ａ２及びＡ９は、それぞれ、ベータ−２−ホモアルギニン及びベータ−３−ホモリジンに対応する：
【化７】
2018057394.tif 000010
【０１５２】
ｂ）テトラフェニルボレート塩：
Ｒ７は、メチオニン、メチオニンスルホキシド（ｓｕｌｆｏｘｙｄｅ）、メチオニンスルホン又はアラニン又はブチルグリシン又はリジン側鎖を指す。
【０１５３】
Ａ２は、リジン又はアジドリジン又はアルギニン又はビス−オルニチン又はビス−アルギニン又はベータ−２−ホモリジン、又はベータ−２−ホモアルギニン又はベータ−２−ビス−ホモオルニチン又はベータ−２−ビス−ホモアルギニンを指す。遊離Ｎ末端アミン官能基は、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、もしくはＣｂｚ基により保護されうる、及び／又はＮメチル化されうる。
【０１５４】
Ａ９は、リジン又はアルギニン又はビス−オルニチン又はビス−アルギニン又はベータ−３−ホモリジン、又はベータ−３−ホモアルギニン又はベータ−３−ビス−ホモオルニチン又はベータ−３−ビス−ホモアルギニンを指す。Ａ９のカルボキシル官能基は、遊離である又はカルボキサミドとして保護される（Ｐ１  ＝  −ＣＯＮＲ１２Ｒ１３、式中、Ｒ１２及びＲ１３は、水素原子及び／又はアルキル基、例えばメチル、エチル、ベンジル誘導体などである）。
【０１５５】
遊離の又はＮメチル化アミン官能基は、テトラフェニルボレート塩として得られ、ｍは可変的であり、Ａ２、Ｒ７、又はＡ９に依存する。
【０１５６】
下のペプチドの構造及び合成を、例として与える：
【化８】
2018057394.tif 000011
【０１５７】
ｃ）Ｎ及びＣ末端保護：
上に記載するペプチドは、また、Ｎ及びＣ末端保護基を用いて調製される。
【０１５８】
ｄ）種々の化学的修飾：
【化９】
2018057394.tif 000012
【０１５９】
Ｎ末端アミノ酸を、本明細書において下に記載する通りに、種々の位置に導入する：
【化１０】
2018057394.tif 000013
【０１６０】
Ｒ７を上に記載する。
【０１６１】
ｅ）（Ｄ）アミノ酸：
ペプチド配列中での（Ｄ）アミノ酸の導入によって、タンパク質分解性の分解に向かって、ペプチドが安定化され、このように、その薬理学的特性が増強される。（Ｄ）アミノ酸は、Ｎ末端に及び／又は末端に及び／又はペプチド配列中の１、２、３、４、５、６、又は７残基の代わりに導入される：
【化１１】
2018057394.tif 000014
【０１６２】
ｆ）レトロ−インベルソ配列：
レトロ−インベルソ配列は、（Ｄ）アミノ酸を用いて部分的に又は完全に修飾され、しかし、決定的なアミノ酸側鎖の空間的配向を保つペプチドに導いた。以下のペプチドを調製し、Ｃ末端側及びＮ末端側にそれぞれ導入されたジアミン及び二酸の周りのペプチド極性を維持するために、一部の化学的修飾を組み入れる：
【化１２】
2018057394.tif 000015
【０１６３】
Ｒ４は、メチオニン側鎖又はアラニン側鎖又はブチルグリシン側鎖又はリジン側鎖に対応する。
【０１６４】
ｇ）修飾アミノ酸を取り込むモデル１：Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０に基づく一部の類似体：
Ａ１及びＡ１０は、（Ｄ）リジン残基又は（Ｄ）アルギニン残基あるいはベータ−２及び／又はベータ−３ホモリジン及び／又はベータ−２及び／又はベータ−３ホモアルギニン又はベータ２，２又はベータ３，３−ホモリジン又はベータ２，２又はベータ３，３−ホモアルギニンに対応しうる。ＰＫＨＢ４（式ＩＩＩ）は、この系列からの例であり、式中、Ａ１０は、（Ｄ）リジン残基により交換されている：
【化１３】
2018057394.tif 000016
【０１６５】
ＰＫＨＢ１１は、この系列からのペプチドの別の例であり、式中、Ａ１及びＡ２残基の両方が、ベータ−２，２ホモリジンにより交換されており、Ｄリジンが、ペプチドのＣ末端位置中に導入されている（例えば、ＰＫＨＢ１１（式（ＩＶ））を参照のこと）：
【化１４】
2018057394.tif 000017
【０１６６】
Ａ２は、アルギニン残基又はリジン残基に対応しうる。
Ｎメチル化アミノ酸又はシクロプロピルアミノ酸を、配列において、位置Ａ２及び／又はＡ３及び／又はＡ４及び／又はＡ５及び／又はＡ６及び／又はＡ７及び／又はＡ８及び／又はＡ９中に導入することができる。プロリノバリンを位置Ａ５及び／又はＡ６中に導入することができる。ＰＫＨＢ９（式Ｖ）及びＰＫＨＢ１０（式ＶＩ）は、両方とも、この系列からのペプチドの例である：
【化１５】
2018057394.tif 000018
【０１６７】
プロリノメチオニンを位置Ａ７中に導入することができる。プロリノトリプトファン又はプロリノホモトリプトファンを位置Ａ８中に導入することができる。プロリノリジンを位置Ａ９中に導入することができる。
【０１６８】
ＩＩ−モデル２に基づく類似体：
【化１６】
2018057394.tif 000019
【０１６９】
ａ）ペプチドのＮ及びＣ末端の保護
Ｐ１は、アミン官能基（Ｐ１  ＝  −ＮＲ１１、式中、Ｒ１１は、水素原子又はアルキル鎖、例えばメチル基などである）又はカルボン酸（Ｐ１  ＝  −ＣＯ２Ｈ）又はアジド基（Ｎ３）である。
【０１７０】
Ｐ２は、アミン官能基（Ｐ２  ＝  −ＮＲ１１、式中、Ｒ１１は、水素原子又はアルキル鎖、例えばメチル基などである）又はカルボン酸（Ｐ１  ＝  −ＣＯ２Ｈ）又はアジド基（Ｎ３）でありうる。
【０１７１】
以下のペプチドを例として与える：
【化１７】
2018057394.tif 000020
【０１７２】
アジド基がＮ末端側に存在する。Ｓ又はＲ配置を伴うアジド−リジンを導入する。Ｒ２基は、リジン側鎖又はアルギニン側鎖に対応する。Ｒ７基は、メチオニン側鎖、メチオニンスルホキシド側鎖、メチオニンスルホン側鎖又はメチル、又はｎ−ブチルもしくはリジン側鎖である。
【０１７３】
ｂ）アミノ酸配列の修飾
−（Ｄ）残基：
【０１７４】
ペプチド配列中での（Ｄ）アミノ酸の導入によって、タンパク質分解性の分解に向かって、ペプチドが安定化され、このように、その薬理学的特性が増強される。（Ｄ）アミノ酸は、Ｎ末端に及び／又はＣ末端に及び／又はペプチド配列中の１、２、３、４、５、６、７、８、又は９残基の代わりに導入される：
【化１８】
2018057394.tif 000021
【０１７５】
【化１９】
2018057394.tif 000022
【０１７６】
レトロ−インベルソ配列は、（Ｄ）アミノ酸を用いて部分的に又は完全に修飾され、しかし、決定的なアミノ酸側鎖の空間的配向を保つペプチドに導いた。以下のペプチドを調製し、Ｃ末端側及びＮ末端側にそれぞれ導入されたジアミン及び二酸の周りのペプチド極性を維持するために、一部の化学的修飾を組み入れる：
【化２０】
2018057394.tif 000023
【０１７７】
特定の化学的修飾を、ペプチド極性を保つために、レトロ−インベルソペプチド配列中に導入する。以下のペプチドを調製する：
【化２１】
2018057394.tif 000024
【０１７８】
このペプチドにおいて、（Ｄ）アミノ酸を、（Ｌ）アミノ酸の代わりに導入し、二酸（Ｎ末端）及びジアミン（Ｃ末端）が導入され、４Ｎ１Ｋペプチド極性が保たれているＮ末端及びＣ末端上を除く。
【０１７９】
ＩＩＩ−ポリマー類似体
ポリマー（二量体又は三量体）類似体は、ヒュスゲン型環化付加反応を通じて、アジドペプチド（短い又は長い類似体）を反応させることにより得られる：
【化２２】
2018057394.tif 000025
【０１８０】
例えば、三量体類似体は、アジドペプチド（短い又は長い類似体）をトリプロパルギルアミンと以下の通りに反応させることにより得られる：
【化２３】
2018057394.tif 000026
【０１８１】
Ｒ基は、本明細書において上に記載するアジドペプチドの配列に対応する。
【０１８２】
Ｖ−生成された可溶性ペプチドのテスト
１．新たに生成された可溶性ペプチドが、最初に特徴付けられたペプチド４Ｎ１Ｋと同じ型のカスパーゼ非依存性ＰＣＤを誘導するか否かを検証するために、フローサイトメトリー分析（例えば、図２において記載する通り）を、各々のペプチドを用いて実施する。カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ．ｆｍｋを伴う／伴わない処置において得られた結果の比較によって、４Ｎ１Ｋ由来ペプチドにより誘導された細胞死の様式が、カスパーゼ非依存性であることが確証される。加えて、異なる腫瘍細胞において実施された時間経過及び用量応答によって、各々のペプチド及び各々の悪性細胞型のための最適な条件が決定される。
【０１８３】
２．図３及び４において示す通り、４Ｎ１Ｋの誘導によって、カルシウム動員の強力で持続性の増加が誘導される。このＣａ２＋過負荷によって、オルガネラ（例えば、アポトーシスにおいて細胞を駆動するミトコンドリアなど）の形態学的構造が劇的に変化する。従って、本発明者らのイオン測定プラットフォームを使用し、本発明者らは、４Ｎ１Ｋ由来ペプチドにより誘発されるｆｕｒａ−２負荷ＣＬＬ細胞におけるＣａ２＋動員を評価する。
【０１８４】
３．本発明者らは、４Ｎ１Ｋ誘導体（例えばＰＫＨＢ１ペプチドなど）の注射を使用し、インビボでＢ白血病細胞を排除しうることを示しているため（図７）、本発明者らは、同じアプローチを使用し、新たに合成され、インビボで検証されたペプチドをテストする。その目的は、生成されたペプチドが、インビボで腫瘍退縮を誘導する際に効率的であるか否かを確証することである。そのようにするために、ＣＬＬ確立ＭＥＣ１  Ｂ細胞を、ＮＳＧ（ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ）マウス（最も適した免疫不全系統の１つ）の側腹部中に皮下注射する。確立されたリンパ腫を伴うマウスを、４週間にわたり週３回、４Ｎ１Ｋ誘導体又はＰＢＳコントロールの腹腔内注射により処置し、腫瘍の発生は、カリパー測定により、２−ＤＧ−７５０プローブを使用したKodakインビボイメージングシステムFX-Proにおいて実施した非侵襲的な光学的分析により追跡調査する（腫瘍容積を一日おきにモニターする）。
【０１８５】
実施例３：治療的化合物としてのＰＫＨＢ１の使用
ＰＫＨＢ１化合物は、実施例２パートＩＩｂ）において説明する通りの（Ｄ）アミノ酸（右旋性アミノ酸）バージョンにおいてアミノ酸Ｃ末端及びＮ末端（配列番号１のＡ１及びＡ１０）を伴うペプチド４Ｎ１Ｋ（配列番号１）に対応する。
【０１８６】
ＰＫＨＢ１ペプチドは、ヒト血清実験において分解されず、６時間にわたり安定であることが証明されている（図８）。
【０１８７】
ＰＫＨＢ１ペプチドは、ＣＬＬ患者から単離されたＢ細胞上で、４Ｎ１Ｋペプチドよりも明らかに良い効率を示す（図６Ａ）。これは、多様な予後特長（非変異ＩＧＨＶ、複雑な核型、及び機能異常ＴＰ５３を含む）を伴う１４人のＣＬＬ患者のコホートにおいて検証した（図６Ｂ、４Ｎ１Ｋは、３００μMでのＣＬＬ細胞における細胞死の約４５%を誘導したのに対し、ＰＫＨＢ１は、１５０μMでの同様の死亡率を誘導した）。さらに、４Ｎ１Ｋとして、ＰＫＨＢ１は、悪性細胞において（しかし、正常Ｂリンパ球においてではない）細胞傷害性を誘導した（図６Ｃ、ＰＫＨＢ１は、ＣＤ１９＋／ＣＤ５＋腫瘍細胞を有意に殺したが、しかし、残存ＣＤ１９＋／ＣＤ５−  Ｂリンパ球は、このペプチドに耐性であった、ｎ＝８）。最後に、本発明者らは、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ（細胞内Ｃａ２＋キレーター）を用いたＣＬＬ細胞の前処理によって、ＣＬＬ細胞中のＰＫＨＢ１媒介性ＰＣＤが有意に減少したことを確証している（図６Ｄ、ｎ＝１０）。これらの結果によって、ＰＫＨＢ１が、ＣＬＬにおいて、４Ｎ１Ｋと同様の方法で、細胞内カルシウム動員を介して、細胞死を誘導することが確認された。全体的に、ＰＫＨＢ１に関する本発明者らの結果によって、４Ｎ１Ｋのペプチド配列中での（Ｄ）アミノ酸の導入によって、その薬理学的な細胞死活性が増強されることが確認された。
【０１８８】
ＰＫＨＢ１がより良い安定性及びインビトロ効果を有したため、本発明者らは、腫瘍成長におけるＰＫＨＢ１のインビボでの役割をテストした。図７において描写する通り、ＰＫＨＢ１注射のわずか数日後、本発明者らは、コントロールマウスと比較し、腫瘍成長及びグルコース取り込みの両方の低下を観察した。これらのインビボでの結果は、腫瘍細胞の根絶のための治療的ツールとしての４Ｎ１Ｋ誘導体（ＰＫＢＨ１など）の使用を強調する。
【０１８９】
参考文献：
本願を通して、種々の参考文献で、本発明が関係する技術分野の状態が記載される。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により、本明細書により組み入れられる。
【０１９０】
【表３】
2018057394.tif 000027
2018057394.tif 000028
2018057394.tif 000029
【図１】
2018057394.tif 000033
【図２Ａ】
2018057394.tif 000034
【図２Ｂ】
2018057394.tif 000035
【図３】
2018057394.tif 000036
【図４】
2018057394.tif 000037
【図５】
2018057394.tif 000038
【図６Ａ】
2018057394.tif 000039
【図６Ｂ】
2018057394.tif 000040
【図６Ｃ】
2018057394.tif 000041
【図６Ｄ】
2018057394.tif 000042
【図７Ａ】
2018057394.tif 000043
【図７Ｂ】
2018057394.tif 000044
【図７Ｃ】
2018057394.tif 000045
【図８】
2018057394.tif 000046
【配列表】
2018057394000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月22日(2017.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2018057394000001.pdf