(57)【要約】      （修正有）【課題】対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）の診断および予知の方法の提供。【解決手段】対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を示す遺伝的変異の存在または非存在を検出するための方法であって、（ａ）前記対象からの試料を、ＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子から選択される遺伝子、またはその遺伝子産物内の遺伝的変異の存在または非存在を検出することができる試薬と接触させることと、（ｂ）前記遺伝的変異の存在または非存在を決定することであって、前記遺伝的変異の存在が、前記対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す、決定することと、を含む、方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を示す遺伝的変異の存在または非存在を検出するための方法であって、
（ａ）前記対象からの試料を、ＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子から選択される遺伝子、またはその遺伝子産物内の遺伝的変異の存在または非存在を検出することができる試薬と接触させることと、
（ｂ）前記遺伝的変異の存在または非存在を決定することであって、前記遺伝的変異の存在が、前記対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す、決定することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの遺伝的変異が、一塩基多型（ＳＮＰ）、対立遺伝子、ハプロタイプ、挿入、または欠失である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝的変異が、ＳＮＰである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝的変異が、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内でアミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝的変異が、ｒｓ２２２８１４５における「Ｃ」対立遺伝子である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝的変異が、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内でアミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝的変異が、ｒｓ１２１９１８４２７における「Ｔ」対立遺伝子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝的変異が、ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内でアミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝的変異が、ＵＮＣ５Ｃ（配列番号３）の８３５位のアミノ酸をコードするコドン内で、ＡをＧに置換するＳＮＰである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記試薬が、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、およびリボザイムから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記試薬が、標識される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの遺伝的変異が、ＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃから選択されるタンパク質内のアミノ酸置換、挿入、または欠失である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの遺伝的変異が、前記ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内のＤ３５８Ａ、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内のＲ２０６Ｗ、およびＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内のＴ８３５Ｍから選択されるアミノ酸置換である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記試薬が、前記遺伝的変異を含むタンパク質に特異的に結合する抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料が、脳脊髄液、血液、血清、痰、唾液、粘膜剥離物、組織検体、涙腺分泌物、精液、または汗のうちの１つから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｂ）の結果に基づいて、前記対象のＡＤを治療することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料中で少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの遺伝的変異の存在が、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在と一緒になると、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有し、前記少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在を欠く対象と比較して、ＡＤの若年齢診断の危険性の増加を示す、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を示す遺伝的変異を検出するための方法であって、
対象からの生体試料中のＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子から選択される遺伝子、またはその遺伝子産物内の遺伝的変異の存在もしくは非存在を決定することを含み、前記遺伝的変異の存在が、前記対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す、方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの遺伝的変異が、一塩基多型（ＳＮＰ）、対立遺伝子、ハプロタイプ、挿入、または欠失である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝的変異が、ＳＮＰである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝的変異が、前記ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内で前記アミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記遺伝的変異が、ｒｓ２２２８１４５における「Ｃ」対立遺伝子である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記遺伝的変異が、前記ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内で前記アミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記遺伝的変異が、ｒｓ１２１９１８４２７における「Ｔ」対立遺伝子である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記遺伝的変異が、前記ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内で前記アミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記遺伝的変異が、前記ＵＮＣ５Ｃ（配列番号３）の８３５位のアミノ酸をコードする前記コドン内で、ＧをＡの代わりに用いるＳＮＰである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記１つ以上の遺伝的変異の存在が、直接配列決定、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的プライマー伸長、対立遺伝子特異的増幅、対立遺伝子特異的ヌクレオチドの取り込み、５′ヌクレアーゼ分解、分子指標検定、オリゴヌクレオチド結紮検定、サイズ分析、および一本鎖高次構造多型からなる群から選択される過程により実行される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記１つ以上の遺伝的変異の存在を決定する前に、前記試料からの核酸が増幅される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの遺伝的変異が、ＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃから選択されるタンパク質内のアミノ酸置換、挿入、または欠失である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの遺伝的変異が、前記ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内のＤ３５８Ａ、前記ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内のＲ２０６Ｗ、および前記ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内のＴ８３５Ｍから選択されるアミノ酸置換である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記１つ以上の遺伝的変異の存在が、電気泳動、クロマトグラフィー、質量分析、タンパク分解、タンパク質配列決定、免疫親和性検定、またはこれらの組み合わせから選択される過程により実行される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記１つ以上の遺伝的変異の存在を決定する前に、前記タンパク質を結合する抗体またはペプチドを用いて、前記試料からのタンパク質が精製される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料が、脳脊髄液、血液、血清、痰、唾液、粘膜剥離物、組織検体、涙腺分泌物、精液、または汗のうちの１つから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
前記１つ以上の遺伝的変異の存在に基づいて、前記対象のＡＤを治療することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料中で少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在を検出することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの遺伝的変異の存在が、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在と一緒になると、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有し、前記少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在を欠く対象と比較して、ＡＤの若年齢診断の危険性の増加を示す、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
対象におけるＡＤを診断または予知するための方法であって、
（ａ）前記対象からの試料を、ＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子から選択される遺伝子、またはその遺伝子産物内の遺伝的変異の存在または非存在を検出することができる試薬と接触させることと、
（ｂ）前記遺伝的変異の存在または非存在を決定することであって、前記遺伝的変異の存在が、前記対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す、決定することと、を含む、方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの遺伝的変異が、一塩基多型（ＳＮＰ）、対立遺伝子、ハプロタイプ、挿入、または欠失である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記遺伝的変異が、ＳＮＰである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記遺伝的変異が、前記ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内の前記アミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰ、前記ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内の前記アミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰ、および前記ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内の前記アミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記遺伝的変異が、ｒｓ２２２８１４５における「Ｃ」対立遺伝子、ｒｓ１２１９１８４２７における「Ｔ」対立遺伝子、および前記ＵＮＣ５Ｃ（配列番号３）の８３５位のアミノ酸をコードする前記コドン内で、ＧをＡの代わりに用いるＳＮＰである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
前記試薬が、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、およびリボザイムから選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記試薬が、標識される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの遺伝的変異が、ＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃから選択されるタンパク質内のアミノ酸置換、挿入、または欠失である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記少なくとも１つの遺伝的変異が、前記ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内のＤ３５８Ａ、前記ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内のＲ２０６Ｗ、および前記ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内のＴ８３５Ｍから選択されるアミノ酸置換である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記試薬が、前記遺伝的変異を含むタンパク質に特異的に結合する抗体である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記試料が、脳脊髄液、血液、血清、痰、唾液、粘膜剥離物、組織検体、涙腺分泌物、精液、または汗のうちの１つから選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
ステップ（ｂ）の結果に基づいて、前記対象のＡＤを治療することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
前記試料中で少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在を検出することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項５１】
前記少なくとも１つの遺伝的変異の存在が、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在と一緒になると、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有し、前記少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在を欠く対象と比較して、ＡＤの若年齢診断の危険性の増加を示す、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象を、１つ以上の追加の遺伝子マーカーをスクリーニングすること、精神状態の検査を行うこと、または前記対象を撮像法に供することからなる群から選択される、ＡＤに関する１つ以上の追加の診断試験に供することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項５３】
前記試料を分析して、ＡＰＯＥ修飾因子である少なくとも１つの追加の遺伝子マーカーの存在を検出することをさらに含み、前記少なくとも１つの追加の遺伝子マーカーが、前記ＩＬ６Ｒをコードする遺伝子、前記ＮＴＦ４をコードする遺伝子、前記ＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子、および表３に列挙される遺伝子から選択される遺伝子内にある、請求項３８に記載の方法。
【請求項５４】
前記少なくとも１つの追加の遺伝子マーカーが、前記ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内の前記アミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰ、前記ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内の前記アミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰ、および前記ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内の前記アミノ酸置換Ｔ８３５ＷをもたらすＳＮＰ、または表３に列挙されるＳＮＰである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
対象におけるＡＤを診断または予知する方法であって、
対象からの生体試料中のＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子から選択される遺伝子、またはその遺伝子産物内の遺伝的変異の存在もしくは非存在を決定することを含み、前記遺伝的変異の存在が、前記対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す、方法。
【請求項５６】
前記少なくとも１つの遺伝的変異が、一塩基多型（ＳＮＰ）、対立遺伝子、ハプロタイプ、挿入、または欠失である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記遺伝的変異が、ＳＮＰである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記遺伝的変異が、前記ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内の前記アミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰ、前記ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内の前記アミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰ、および前記ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内の前記アミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰからなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記遺伝的変異が、ｒｓ２２２８１４５における「Ｃ」対立遺伝子、ｒｓ１２１９１８４２７における「Ｔ」対立遺伝子、および前記ＵＮＣ５Ｃ（配列番号３）の８３５位のアミノ酸をコードする前記コドン内で、ＧをＡの代わりに用いるＳＮＰである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記１つ以上の遺伝的変異の存在が、直接配列決定、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的プライマー伸長、対立遺伝子特異的増幅、対立遺伝子特異的ヌクレオチドの取り込み、５′ヌクレアーゼ分解、分子指標検定、オリゴヌクレオチド結紮検定、サイズ分析、および一本鎖高次構造多型からなる群から選択される過程により実行される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記１つ以上の遺伝的変異の存在を決定する前に、前記試料からの核酸が増幅される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記少なくとも１つの遺伝的変異が、ＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃから選択されるタンパク質内のアミノ酸置換、挿入、または欠失である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】
前記少なくとも１つの遺伝的変異が、前記ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内のＤ３５８Ａ、前記ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内のＲ２０６Ｗ、および前記ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内のＴ８３５Ｍから選択されるアミノ酸置換である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記１つ以上の遺伝的変異の存在が、電気泳動、クロマトグラフィー、質量分析、タンパク分解、タンパク質配列決定、免疫親和性検定、またはこれらの組み合わせから選択される過程により実行される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６５】
前記１つ以上の遺伝的変異の存在を決定する前に、前記タンパク質を結合する抗体またはペプチドを用いて、前記試料からのタンパク質が精製される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記試料が、脳脊髄液、血液、血清、痰、唾液、粘膜剥離物、組織検体、涙腺分泌物、精液、または汗のうちの１つから選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６７】
前記１つ以上の遺伝的変異の存在に基づいて、前記対象のＡＤを治療することをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項６８】
前記試料中で少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在を検出することをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項６９】
前記少なくとも１つの遺伝的変異の存在が、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在と一緒になると、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有し、前記少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在を欠く対象と比較して、ＡＤの若年齢診断の危険性の増加を示す、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記対象を、１つ以上の追加の遺伝子マーカーをスクリーニングすること、精神状態の検査を行うこと、または前記対象を撮像法に供することからなる群から選択される、ＡＤに関する１つ以上の追加の診断試験に供することをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項７１】
前記試料を分析して、ＡＰＯＥ修飾因子である少なくとも１つの追加の遺伝子マーカーの存在を検出することをさらに含み、前記少なくとも１つの追加の遺伝子マーカーが、前記ＩＬ６Ｒをコードする遺伝子、前記ＮＴＦ４をコードする遺伝子、前記ＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子、および表３に列挙される遺伝子から選択される遺伝子内にある、請求項５５に記載の方法。
【請求項７２】
前記少なくとも１つの追加の遺伝子マーカーが、前記ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内の前記アミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰ、前記ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内の前記アミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰ、および前記ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内の前記アミノ酸置換Ｔ８３５ＷをもたらすＳＮＰ、または表３に列挙されるＳＮＰである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
ＡＤの若年齢診断の危険性が増加した対象を識別する方法であって、
対象からの生体試料中のＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子から選択される遺伝子、またはその遺伝子産物内の遺伝的変異の存在もしくは非存在を決定することと、
少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在または非存在を決定することと、
前記遺伝的変異および少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在が、前記遺伝的変異および少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在を欠く対象と比較して、前記対象のＡＤの若年齢診断の危険性が増加したことを示す、方法。
【請求項７４】
対象におけるＡＤの亜表現型の予知を補助する方法であって、前記対象に由来する生体試料中で、前記ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内の前記アミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰの存在を検出することを含み、前記ＡＤの亜表現型が、１人以上の対照対象と比較して、前記対象に由来する生体試料中の可溶性ＩＬ６Ｒのレベルの増加により少なくとも部分的に特徴付けられる、方法。
【請求項７５】
ＩＬ６Ｒを標的とするＡＤ治療薬に対する対象の反応を予知する方法であって、前記対象から得られた生体試料中で、前記ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内の前記アミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰを検出することを含み、前記ＳＮＰの存在が、ＩＬ６Ｒを標的とする治療薬に対する反応を示す、方法。
【請求項７６】
前記治療薬が、抗ＩＬ６Ｒ抗体である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
対象におけるＡＤの亜表現型の予知を補助する方法であって、前記対象に由来する生体試料中で、前記ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内の前記アミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰの存在を検出することを含み、前記ＡＤの亜表現型が、１人以上の対照対象と比較して、前記対象に由来する生体試料中のＴｒｋＢの活性の減少により少なくとも部分的に特徴付けられる、方法。
【請求項７８】
ＴｒｋＢを標的とするＡＤ治療薬に対する対象の反応を予知する方法であって、前記対象から得られた生体試料中で、前記ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内の前記アミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰを検出することを含み、前記ＳＮＰの存在が、ＴｒｋＢを標的とする治療薬に対する反応を示す、方法。
【請求項７９】
前記治療薬が、ＴｒｋＢ作動薬である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
対象におけるＡＤの亜表現型の予知を補助する方法であって、前記対象に由来する生体試料中で、前記ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内の前記アミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰの存在を検出することを含み、前記ＡＤの亜表現型が、１人以上の対照対象と比較して、前記対象に由来する生体試料中のＵＮＣ５Ｃのアポトーシス活性の増加により少なくとも部分的に特徴付けられる、方法。
【請求項８１】
ＵＮＣ５Ｃを標的とするＡＤ治療薬に対する対象の反応を予知する方法であって、前記対象から得られた生体試料中で、前記ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内の前記アミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰを検出することを含み、前記ＳＮＰの存在が、ＵＮＣ５Ｃを標的とする治療薬に対する反応を示す、方法。
【請求項８２】
前記治療薬が、ＵＮＣ５Ｃ死ドメインを標的とする、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を診断または予知する方法であって、
（ａ）前記対象からの試料を、前記ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内の前記アミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰ、前記ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内の前記アミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰ、および前記ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内の前記アミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰからなる群から選択される、１つ以上のＳＮＰの存在または非存在を検出することができる試薬と接触させることと、
（ｂ）前記試料を分析して、前記１つ以上のＳＮＰの存在を検出することであって、前記試料中の前記１つ以上のＳＮＰの存在が、前記対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す、検出することと、を含む、方法。
【請求項８４】
表３に列挙される前記ＳＮＰから選択される１つ以上のＳＮＰを検出することをさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８５】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチド検出試薬を含み、前記オリゴヌクレオチド検出試薬が、前記１つ以上のＳＮＰにおける少なくとも２つの異なる対立遺伝子のそれぞれを区別する、請求項８３に記載の方法を実行するためのキット。
【請求項８６】
前記検出が、直接配列決定、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的プライマー伸長、対立遺伝子特異的増幅、配列決定、５′ヌクレアーゼ分解、分子指標検定、オリゴヌクレオチド結紮検定、サイズ分析、および一本鎖高次構造多型からなる群から選択される過程により実行される、請求項８５に記載のキット。
【請求項８７】
前記オリゴヌクレオチド検出試薬が、基質に固定化される、請求項８５に記載のキット。
【請求項８８】
前記オリゴヌクレオチド検出試薬が、一列に配置される、請求項８７に記載のキット。
【請求項８９】
対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を診断または予知する方法であって、
（ａ）前記対象からの試料を、前記ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内の前記アミノ酸置換Ｄ３５８Ａ、前記ＮＴＦ４のアミノ酸配列内の前記アミノ酸置換Ｒ２０６Ｗ、および前記ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内の前記アミノ酸置換Ｔ８３５Ｍからなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸置換の存在または非存在を検出することができる試薬と接触させることと、
（ｂ）前記試料を分析して、前記１つ以上のアミノ酸置換の存在を検出することであって、前記試料中の前記１つ以上のアミノ酸置換の存在が、前記対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す、検出することと、を含む、方法。
【請求項９０】
少なくとも１つの抗体検出試薬を含み、前記抗体検出試薬が、前記１つ以上のアミノ酸置換における少なくとも２つの異なるアミノ酸のそれぞれを区別する、請求項８９に記載の方法を実行するためのキット。
【請求項９１】
ＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃから選択される遺伝子によりコードされるタンパク質のうちの１つまたはそれらの組み合わせである、ＡＤの治療のための治療標的。
【請求項９２】
前記ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内の前記アミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰ、前記ＮＴＦ４のアミノ酸配列内の前記アミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰ、および前記ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内の前記アミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰを含む群から選択される、少なくとも２つのマーカーを直接または間接的に検出することができる少なくとも２つのプローブを含み、前記分子プローブが、１０００個を超える要素のマイクロアレイと関連付けられない、ＡＤを診断または予知するための一式の分子プローブ。
【請求項９３】
表３に列挙される前記ＳＮＰから選択される少なくとも２つのマーカーを直接または間接的に検出することができる１つ以上のプローブをさらに含む、請求項９２に記載の一式の分子プローブ。
【請求項９４】
少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する対象におけるＡＤの発症に対して有害または有益な影響を有する遺伝的変異をスクリーニングする方法であって、７５歳以上のＡＤのない、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する対照対象と比較して、６５歳未満のＡＤを有し、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する対象において、増加または減少した頻度で存在する遺伝的変異を識別することを含み、対照対象と比較して、ＡＤを有する対象における頻度の増加が、前記遺伝的変異が、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する対象における有害な影響と関連付けられることを示し、対照対象と比較して、ＡＤを有する対象における頻度の減少が、前記遺伝的変異が、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する対象における有益な影響と関連付けられることを示す、方法。
【請求項９５】
前記遺伝的変異が、ゲノム全領域関連走査を用いて識別される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記有害な影響が、ＡＤを発症する危険性の増加またはＡＤの発病年齢の低下である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記有益な影響が、ＡＤを発症する危険性の減少またはＡＤの発病年齢の遅延である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する対象におけるＡＤの発症に対して有害または有益な影響を有する遺伝的変異をスクリーニングする方法であって、
（ａ）６５歳未満のＡＤを有し、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する複数の対象の１つ以上の遺伝子座における遺伝子型を決定することと、
（ｂ）７５歳以上のＡＤを有しないが、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する複数の対照対象の１つ以上の遺伝子座における遺伝子型を決定することと、
（ｃ）対照対象と比較して、ＡＤを有する対象において増加または減少した頻度で存在する遺伝的変異を識別することであって、対照対象と比較して、ＡＤを有する対象における頻度の増加が、前記遺伝的変異が少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する対象における有害な影響と関連付けられることを示し、対照対象と比較して、ＡＤを有する対象における頻度の減少が、前記遺伝的変異が少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する対象における有益な影響と関連付けられることを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
アルツハイマー病（ＡＤ）のある特定の亜表現型を含む、ＡＤを識別、診断、および予知する方法、ならびに患者のある特定の亜集団を含む、ＡＤを治療する方法が提供される。また有効なＡＤ治療薬を識別し、ＡＤ治療薬に対する反応性を予測するための方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知および記憶機能の進行性喪失、および最終的に認知症と関連付けられる中枢神経系の神経変性疾患である。ＡＤは、先進国における認知症の最上位の、かつ最も一般的な原因であり、認知症の全症例の６０％以上を占める。生検ではＡＤ患者において２つの病理学的特徴：海馬、大脳皮質、および認知機能に必須の脳の他の領域内の細胞外プラークおよび細胞内もつれが観測される。プラークは主に、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に由来するペプチドである、アミロイドβ（Ａβ）の堆積から形成される。
【０００３】
ＡＤの頻度は、成人期の１０年毎に増加し、８５歳以上の集団の２０〜４０％に達する。ますます多くの人々が８０歳代および９０歳代まで生きるため、患者の数は、次の２０年間で３倍になると予想される。米国では５００万超の人々がＡＤに罹患し、年間８００，０００件の死亡がＡＤと関連付けられている。２０１１年に、ＡＤ患者の介護にかかる費用は、総額１，８３０億ドルになると推定される。またＡＤは、家族および介護者に重い精神的負担を課す（米国では約１，４９０万人がＡＤ患者の介護をしている）。ＡＤ患者は、診断後平均７〜１０年生き、在宅または養護施設のいずれかでの介護下で平均５年を過ごす。
【０００４】
早発型アルツハイマー病（ＥＯＡＤ）は、希少形態のアルツハイマー病であり、個人は６５歳前に疾患を診断される。全アルツハイマー病患者の１０％未満がＥＯＡＤを有する。ＥＯＡＤ症例の約半数が家族性であり、疾患の遺伝は常染色体優性形式に従う。明らかな遺伝形式が見出されないＡＤ症例は、「散発性」と呼ばれる。これまでに、家族性ＥＯＡＤを持つ家族において、染色体２１上のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、染色体１４上のプレセニリン１（ＰＳＥＮ１）、および染色体１上のプレセニリン２（ＰＳＥＮ２）を含む３つの遺伝子内の突然変異が識別されている。ＡＰＰおよびプレセニリン遺伝子内の病因性突然変異の大部分は、ＡＰＰの異常な処理と関連付けられ、アミロイドプラーク中の主成分であるＡβ４２の生成の増加をもたらす。
【０００５】
遅発型アルツハイマー病（ＬＯＡＤ）は、アルツハイマー病の最も一般的な形態であり、症例の約９０％を占め、通常６５歳以降に発生する。ＬＯＡＤは、８５歳以上の全個人のほぼ半数を襲い、典型的に散発性である。双生児研究に基づいて、疾患の遺伝率は７９％と推定されており、男女間で有病率または遺伝率に（年齢調整後の）差はない（Ｇａｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｇｅｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，６３：１６８−７４（２００６））。これまでに早発型アルツハイマー病と関連付けられるとして識別される単一遺伝子の突然変異は、遅発型アルツハイマーに関与しているとは思われない。
【０００６】
ＡＤの遅発型形態を引き起こす特定の遺伝子は見出されていないが、その疾患を発症する個人の危険性を増大させる１つの遺伝的危険因子は、染色体１９上で見出されるアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）遺伝子に関連する。ＡＤに関する以前の遺伝学的研究は、ＡＰＯＥ遺伝子を含む染色体１９上の同一領域との関係および関連を証明した（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔ．，４：９７−１０８（１９８７）；Ｐｅｒｉｃａｋ−Ｖａｎｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．，４８：１０３４−１０５０（１９９１））。ＡＰＯＥ遺伝子は、ε２、ε３、およびε４と指定される、３つの一般的な対立遺伝子を有する。一般的なε３対立遺伝子と比較して、ε４対立遺伝子は、ＡＤの危険性を増大させるが、ε２は、ＡＤの危険性を減少させる（Ｃｏｒｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：９２１−９２３；Ｃｏｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．７：１８０−１８４）。母集団の場合、８５歳までのＡＤの生涯リスク（ＬＴＲ）は１１〜１４％であるが、ＡＰＯＥ３／４保有者の場合、ＬＴＲは２３〜３５％、ＡＰＯＥ４／４保有者の場合は５１〜６８％に上昇する（Ｇｅｎｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １６：９０３−９０７）。ＡＰＯＥ２／４保有者のＡＤ危険性は、中立遺伝子型ＡＰＯＥ３／３を有する対象の場合と同じであるが、ＡＰＯＥ２／３保有者は、危険性が減少する。ＡＤ患者の４０〜６５％は、ＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の少なくとも１つの複製を有するが、ＡＰＯＥ−ε４は、ＡＤ患者の少なくとも３分の１が、ＡＰＯＥ−ε４陰性であり、いくつかのＡＰＯＥ−ε４ホモ接合体は、決して疾患を発症しないため、疾患の必要決定因子ではない。したがって、この対立遺伝子だけでは、ＡＤの診断に十分でない（Ｅｒｔｅｋｉｎ−Ｔａｎｅｒ（２００７）Ｎｅｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．２５：８１１）。
【０００７】
現在、ＡＤを診断する主流の方法は、詳細な患者の病歴を取ることと、記憶および心理検査を行うことと、一時的（例えば、うつ病もしくはビタミンＢ１２欠乏症）または永久的（例えば、脳卒中）な状態を含む、記憶喪失についての他の説明を除外することを伴う。この手法の下では、死後、検死により疾患の特徴である患者の脳内のアミロイドプラークおよび神経原線維のもつれが明らかになるまで、ＡＤを決定的に診断することはできない。さらに、臨床診断手順は、患者が著しい、異常な記憶喪失または人格変化を示し始めた後のみに役立つ。それまで、患者は何年もＡＤを有していた可能性がある。例えば、医師がＡＤを疾患過程の早期に識別するか、または疾患を発症する危険性の高い個人を識別することができる診断検査は、疾患過程の早期段階で介入するためのオプションを提供する。疾患過程における早期介入は、一般に、後期介入と比較して、疾患の発生または進行を遅らせることにより、より良好な治療結果をもたらす。したがって、ＡＤを診断する、およびその診断を補助する他の方法の必要性がある。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）の診断および予知の方法を提供し、この方法は、対象からの試料中の１つ以上の遺伝的変異の存在または非存在を検出することを含み、遺伝的変異の存在は、本明細書に開示されるように、対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する対象におけるＡＤの発症に対して有害または有益な影響を有する遺伝的変異をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、７５歳以上のＡＤのない、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する対照対象と比較して、６５歳未満のＡＤを有し、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する対象において、増加または減少した頻度で存在する遺伝的変異を識別することを含み、対照対象と比較して、ＡＤを有する対象における頻度の増加は、遺伝的変異が、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する対象における有害な影響と関連付けられることを示し、対照対象と比較して、ＡＤを有する対象における頻度の減少は、遺伝的変異が、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する対象における有益な影響と関連付けられることを示す。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、ゲノム全領域関連走査を用いて識別される。
【００１０】
本発明はさらに、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する対象におけるＡＤの発症に対して有害または有益な影響を有する遺伝的変異をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、（ａ）６５歳未満のＡＤを有し、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する複数の対象の１つ以上の遺伝子座における遺伝子型を決定することと、（ｂ）７５歳以上のＡＤを有しないが、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する複数の対照対象の１つ以上の遺伝子座における遺伝子型を決定することと、（ｃ）対照対象と比較して、ＡＤを有する対象において、増加または減少した頻度で存在する遺伝的変異を識別することと、を含み、対照対象と比較して、ＡＤを有する対象における頻度の増加は、遺伝的変異が、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する対象における有害な影響と関連付けられることを示し、対照対象と比較して、ＡＤを有する対象における頻度の減少は、遺伝的変異が、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有する対象における有益な影響と関連付けられることを示す。
【００１１】
これらのスクリーニング法のいくつかの実施形態では、有害な影響は、ＡＤを発症する危険性の増加である。いくつかの実施形態では、有害な影響は、ＡＤの若年齢の発病である。いくつかの実施形態では、有益な影響は、ＡＤを発症する危険性の減少である。いくつかの実施形態では、有益な影響は、ＡＤの高年齢の発病である。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を示す遺伝的変異の存在または非存在を検出するための方法を提供し、この方法は、（ａ）対象からの試料を、ＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子から選択される遺伝子、またはその遺伝子産物内の遺伝的変異の存在または非存在を検出することができる試薬と接触させることと、（ｂ）遺伝的変異の存在または非存在を決定することと、を含み、遺伝的変異の存在が、対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す。
【００１３】
様々な実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）、対立遺伝子、ハプロタイプ、挿入、または欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、ＳＮＰである。一実施形態では、遺伝的変異は、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内でアミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰである。さらなる実施形態では、遺伝的変異は、ｒｓ２２２８１４５における「Ｃ」対立遺伝子である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内でアミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰである。さらなる実施形態では、遺伝的変異は、ｒｓ１２１９１８４２７における「Ｔ」対立遺伝子である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内でアミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰである。さらなる実施形態では、遺伝的変異は、ＵＮＣ５Ｃ（配列番号３）の８３５位のアミノ酸をコードするコドン内で、ＡをＧに置換するＳＮＰである。
【００１４】
他の実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異は、アミノ酸置換、挿入、または欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、アミノ酸置換である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内のアミノ酸置換Ｄ３５８Ａである。一実施形態では、遺伝的変異は、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内のアミノ酸置換Ｒ２０６Ｗである。一実施形態では、遺伝的変異は、ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内のアミノ酸置換Ｔ８３５Ｍである。
【００１５】
この方法のいくつかの実施形態では、試薬は、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、およびリボザイムから選択される。他の実施形態では、試薬は、遺伝的変異を含むタンパク質に特異的に結合する抗体である。いくつかの実施形態では、試薬は標識される。
【００１６】
この方法のいくつかの実施形態では、試料は、脳脊髄液、血液、血清、痰、唾液、粘膜剥離物、組織検体、涙腺分泌物、精液、または汗のうちの１つから選択される。
【００１７】
一実施形態では、この方法は、ステップ（ｂ）の結果に基づいて、対象のＡＤを治療することをさらに含む。一実施形態では、この方法は、試料中で少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在を検出することをさらに含む。一実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異の存在は、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在と一緒になると、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有し、少なくとも１つの遺伝子変異の存在を欠く対象と比較して、ＡＤの若年齢診断の危険性の増加を示す。
【００１８】
本発明はさらに、対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を示す遺伝的変異を検出するための方法を提供し、この方法は、対象からの生体試料中のＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子から選択される遺伝子、またはその遺伝子産物内の遺伝的変異の存在もしくは非存在を決定することを含み、遺伝的変異の存在が、対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す。
【００１９】
様々な実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）、対立遺伝子、ハプロタイプ、挿入、または欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、ＳＮＰである。一実施形態では、遺伝的変異は、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内でアミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰである。さらなる実施形態では、遺伝的変異は、ｒｓ２２２８１４５における「Ｃ」対立遺伝子である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内でアミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰである。さらなる実施形態では、遺伝的変異は、ｒｓ１２１９１８４２７における「Ｔ」対立遺伝子である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内でアミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰである。さらなる実施形態では、遺伝的変異は、ＵＮＣ５Ｃ（配列番号３）の８３５位のアミノ酸をコードするコドン内で、ＡをＧに置換するＳＮＰである。
【００２０】
他の実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異は、アミノ酸置換、挿入、または欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、アミノ酸置換である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内のアミノ酸置換Ｄ３５８Ａである。一実施形態では、遺伝的変異は、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内のアミノ酸置換Ｒ２０６Ｗである。一実施形態では、遺伝的変異は、ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内のアミノ酸置換Ｔ８３５Ｍである。
【００２１】
この方法の様々な実施形態では、１つ以上の遺伝的変異の存在の検出は、直接配列決定、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的プライマー伸長、対立遺伝子特異的増幅、対立遺伝子特異的ヌクレオチドの取り込み、５′ヌクレアーゼ分解、分子指標検定、オリゴヌクレオチド結紮検定、サイズ分析、および一本鎖高次構造多型からなる群から選択される過程により実行される。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝的変異の存在を決定する前に、試料からの核酸が増幅される。
【００２２】
この方法の他の実施形態では、タンパク質中の１つ以上の遺伝的変異の存在の検出は、電気泳動、クロマトグラフィー、質量分析、タンパク分解、タンパク質配列決定、免疫親和性検定、またはこれらの組み合わせから選択される過程により実行される。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝的変異の存在を決定する前に、タンパク質を結合する抗体またはペプチドを用いて、試料からのタンパク質が精製される。
【００２３】
この方法のいくつかの実施形態では、試料は、脳脊髄液、血液、血清、痰、唾液、粘膜剥離物、組織検体、涙腺分泌物、精液、または汗のうちの１つから選択される。
【００２４】
一実施形態では、この方法は、ステップ（ｂ）の結果に基づいて、対象のＡＤを治療することをさらに含む。一実施形態では、この方法は、試料中で少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在を検出することをさらに含む。一実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異の存在は、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在と一緒になると、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有し、少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在を欠く対象と比較して、ＡＤの若年齢診断の危険性の増加を示す。
【００２５】
本発明はさらに、対象におけるＡＤを診断または予知するための方法を提供し、この方法は、（ａ）対象からの試料を、ＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子から選択される遺伝子、またはその遺伝子産物内の遺伝的変異の存在または非存在を検出することができる試薬と接触させることと、（ｂ）遺伝的変異の存在または非存在を決定することと、を含み、遺伝的変異の存在が、対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す。
【００２６】
様々な実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）、対立遺伝子、ハプロタイプ、挿入、または欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、ＳＮＰである。一実施形態では、遺伝的変異は、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内でアミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰである。さらなる実施形態では、遺伝的変異は、ｒｓ２２２８１４５における「Ｃ」対立遺伝子である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内でアミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰである。さらなる実施形態では、遺伝的変異は、ｒｓ１２１９１８４２７における「Ｔ」対立遺伝子である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内でアミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰである。さらなる実施形態では、遺伝的変異は、ＵＮＣ５Ｃ（配列番号３）の８３５位のアミノ酸をコードするコドン内で、ＡをＧに置換するＳＮＰである。
【００２７】
他の実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異は、アミノ酸置換、挿入、または欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、アミノ酸置換である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内のアミノ酸置換Ｄ３５８Ａである。一実施形態では、遺伝的変異は、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内のアミノ酸置換Ｒ２０６Ｗである。一実施形態では、遺伝的変異は、ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内のアミノ酸置換Ｔ８３５Ｍである。
【００２８】
この方法のいくつかの実施形態では、試薬は、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、およびリボザイムから選択される。他の実施形態では、試薬は、遺伝的変異を含むタンパク質に特異的に結合する抗体である。いくつかの実施形態では、試薬は標識される。
【００２９】
この方法のいくつかの実施形態では、試料は、脳脊髄液、血液、血清、痰、唾液、粘膜剥離物、組織検体、涙腺分泌物、精液、または汗のうちの１つから選択される。
【００３０】
一実施形態では、この方法は、ステップ（ｂ）の結果に基づいて、対象のＡＤを治療することをさらに含む。一実施形態では、この方法は、試料中で少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在を検出することをさらに含む。一実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異の存在は、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在と一緒になると、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有し、少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在を欠く対象と比較して、ＡＤの若年齢診断の危険性の増加を示す。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本方法は、対象を、１つ以上の追加の遺伝子マーカーをスクリーニングすること、精神状態の検査を行うこと、または対象を撮像法に供することからなる群から選択される、ＡＤに関する１つ以上の追加の診断試験に供することをさらに含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、この方法は、試料を分析して、ＡＰＯＥ修飾因子である少なくとも１つの追加の遺伝子マーカーの存在を検出することをさらに含み、少なくとも１つの追加の遺伝子マーカーは、ＩＬ６Ｒをコードする遺伝子、ＮＴＦ４をコードする遺伝子、ＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子、および表３に列挙される遺伝子から選択される遺伝子内にある。様々な実施形態では、少なくとも１つの追加の遺伝子マーカーは、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内のアミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰ、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内のアミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰ、およびＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内のアミノ酸置換Ｔ８３５ＷをもたらすＳＮＰ、または表３に列挙されるＳＮＰである。
【００３３】
本発明はさらに、対象におけるＡＤを診断または予知する方法を提供し、この方法は、対象からの生体試料中のＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子から選択される遺伝子、またはその遺伝子産物内の遺伝的変異の存在もしくは非存在を決定することを含み、遺伝的変異の存在が、対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す。
【００３４】
様々な実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）、対立遺伝子、ハプロタイプ、挿入、または欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、ＳＮＰである。一実施形態では、遺伝的変異は、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内でアミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰである。さらなる実施形態では、遺伝的変異は、ｒｓ２２２８１４５における「Ｃ」対立遺伝子である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内でアミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰである。さらなる実施形態では、遺伝的変異は、ｒｓ１２１９１８４２７における「Ｔ」対立遺伝子である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内でアミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰである。さらなる実施形態では、遺伝的変異は、ＵＮＣ５Ｃ（配列番号３）の８３５位のアミノ酸をコードするコドン内で、ＡをＧに置換するＳＮＰである。
【００３５】
他の実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異は、アミノ酸置換、挿入、または欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、アミノ酸置換である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内のアミノ酸置換Ｄ３５８Ａである。一実施形態では、遺伝的変異は、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内のアミノ酸置換Ｒ２０６Ｗである。一実施形態では、遺伝的変異は、ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内のアミノ酸置換Ｔ８３５Ｍである。
【００３６】
この方法の様々な実施形態では、１つ以上の遺伝的変異の存在の検出は、直接配列決定、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的プライマー伸長、対立遺伝子特異的増幅、対立遺伝子特異的ヌクレオチドの取り込み、５′ヌクレアーゼ分解、分子指標検定、オリゴヌクレオチド結紮検定、サイズ分析、および一本鎖高次構造多型からなる群から選択される過程により実行される。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝的変異の存在を決定する前に、試料からの核酸が増幅される。
【００３７】
この方法の他の実施形態では、タンパク質中の１つ以上の遺伝的変異の存在の検出は、電気泳動、クロマトグラフィー、質量分析、タンパク分解、タンパク質配列決定、免疫親和性検定、またはこれらの組み合わせから選択される過程により実行される。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝的変異の存在を決定する前に、タンパク質を結合する抗体またはペプチドを用いて、試料からのタンパク質が精製される。
【００３８】
この方法のいくつかの実施形態では、試料は、脳脊髄液、血液、血清、痰、唾液、粘膜剥離物、組織検体、涙腺分泌物、精液、または汗のうちの１つから選択される。
【００３９】
一実施形態では、この方法は、ステップ（ｂ）の結果に基づいて、対象のＡＤを治療することをさらに含む。一実施形態では、この方法は、試料中で少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在を検出することをさらに含む。一実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異の存在は、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在と一緒になると、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有し、少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在を欠く対象と比較して、ＡＤの若年齢診断の危険性の増加を示す。
【００４０】
いくつかの実施形態において、この方法は、試料を分析して、ＡＰＯＥ修飾因子である少なくとも１つの追加の遺伝子マーカーの存在を検出することをさらに含み、少なくとも１つの追加の遺伝子マーカーは、ＩＬ６Ｒをコードする遺伝子、ＮＴＦ４をコードする遺伝子、ＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子、および表３に列挙される遺伝子から選択される遺伝子内にある。様々な実施形態では、少なくとも１つの追加の遺伝子マーカーは、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内のアミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰ、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内のアミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰ、およびＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内のアミノ酸置換Ｔ８３５ＷをもたらすＳＮＰ、または表３に列挙されるＳＮＰである。
【００４１】
本発明はさらに、ＡＤの若年齢の発病の危険性が増加した対象を識別する方法を提供し、この方法は、（ａ）対象からの生体試料中のＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子から選択される遺伝子、またはその遺伝子産物内の遺伝的変異の存在もしくは非存在を決定することと、（ｂ）少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在を決定することと、を含み、遺伝的変異および少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在が、遺伝的変異および少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在を欠く対象と比較して、対象のＡＤの若年齢診断の危険性が増加したことを示す。
【００４２】
様々な実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）、対立遺伝子、ハプロタイプ、挿入、または欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、ＳＮＰである。一実施形態では、遺伝的変異は、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内でアミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰである。さらなる実施形態では、遺伝的変異は、ｒｓ２２２８１４５における「Ｃ」対立遺伝子である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内でアミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰである。さらなる実施形態では、遺伝的変異は、ｒｓ１２１９１８４２７における「Ｔ」対立遺伝子である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内でアミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰである。さらなる実施形態では、遺伝的変異は、ＵＮＣ５Ｃ（配列番号３）の８３５位のアミノ酸をコードするコドン内で、ＡをＧに置換するＳＮＰである。
【００４３】
他の実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異は、アミノ酸置換、挿入、または欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、アミノ酸置換である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内のアミノ酸置換Ｄ３５８Ａである。一実施形態では、遺伝的変異は、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内のアミノ酸置換Ｒ２０６Ｗである。一実施形態では、遺伝的変異は、ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内のアミノ酸置換Ｔ８３５Ｍである。
【００４４】
この方法の様々な実施形態では、１つ以上の遺伝的変異の存在の検出は、直接配列決定、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的プライマー伸長、対立遺伝子特異的増幅、対立遺伝子特異的ヌクレオチドの取り込み、５′ヌクレアーゼ分解、分子指標検定、オリゴヌクレオチド結紮検定、サイズ分析、および一本鎖高次構造多型からなる群から選択される過程により実行される。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝的変異の存在を決定する前に、試料からの核酸が増幅される。
【００４５】
この方法の他の実施形態では、タンパク質中の１つ以上の遺伝的変異の存在の検出は、電気泳動、クロマトグラフィー、質量分析、タンパク分解、タンパク質配列決定、免疫親和性検定、またはこれらの組み合わせから選択される過程により実行される。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝的変異の存在を決定する前に、タンパク質を結合する抗体またはペプチドを用いて、試料からのタンパク質が精製される。
【００４６】
この方法のいくつかの実施形態では、試料は、脳脊髄液、血液、血清、痰、唾液、粘膜剥離物、組織検体、涙腺分泌物、精液、または汗のうちの１つから選択される。
【００４７】
本発明はさらに、対象におけるＡＤの亜表現型の予知を補助する方法を提供し、この方法は、対象に由来する生体試料中で、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内のアミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰの存在を検出することを含み、ＡＤの亜表現型は、１人以上の対照対象と比較して、対象に由来する生体試料中の可溶性ＩＬ６Ｒのレベルの増加により少なくとも部分的に特徴付けられる。
【００４８】
本発明はさらに、ＩＬ６Ｒを標的とするＡＤ治療薬に対する対象の反応を予知する方法を提供し、この方法は、対象から得られた生体試料中で、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内のアミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰを検出することを含み、ＳＮＰの存在が、ＩＬ６Ｒを標的とする治療薬に対する反応を示す。一実施形態では、治療薬は、抗ＩＬ６Ｒ抗体である。
【００４９】
本発明はさらに、対象におけるＡＤの亜表現型の予知を補助する方法を提供し、この方法は、対象に由来する生体試料中で、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内のアミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰの存在を検出することを含み、ＡＤの亜表現型が、１人以上の対照対象と比較して、対象に由来する生体試料中のＴｒｋＢの活性の減少により少なくとも部分的に特徴付けられる。
【００５０】
本発明はさらに、ＴｒｋＢを標的とするＡＤ治療薬に対する対象の反応を予知する方法を提供し、この方法は、対象から得られた生体試料中で、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内のアミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰを検出することを含み、ＳＮＰの存在が、ＴｒｋＢを標的とする治療薬に対する反応を示す。一実施形態では、治療薬は、ＴｒｋＢ作動薬である。
【００５１】
本発明はさらに、対象におけるＡＤの亜表現型の予知を補助する方法を提供し、この方法は、対象に由来する生体試料中で、ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内のアミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰの存在を検出することを含み、ＡＤの亜表現型は、１人以上の対照対象と比較して、対象に由来する生体試料中のＵＮＣ５Ｃのアポトーシス活性の増加により少なくとも部分的に特徴付けられる。
【００５２】
本発明はさらに、ＵＮＣ５Ｃを標的とするＡＤ治療薬に対する対象の反応を予知する方法を提供し、この方法は、対象から得られた生体試料中で、ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内のアミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰを検出することを含み、ＳＮＰの存在が、ＵＮＣ５Ｃを標的とする治療薬に対する反応を示す。一実施形態では、治療薬は、ＵＮＣ５Ｃ死ドメインを標的とする。
【００５３】
本発明はさらに、対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を診断または予知する方法を提供し、この方法は、（ａ）対象からの試料を、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内のアミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰ、ＮＴＦ４のアミノ酸配列内のアミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰ、およびＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内のアミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰからなる群から選択される、１つ以上のＳＮＰの存在または非存在を検出することができる試薬と接触させることと、（ｂ）試料を分析して、該１つ以上のＳＮＰの存在を検出することと、を含み、試料中の１つ以上のＳＮＰの存在が、対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す。一実施形態では、この方法は、表３に列挙されるＳＮＰから選択される１つ以上のＳＮＰを検出することをさらに含む。
【００５４】
本発明はさらに、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド検出試薬を含む、この方法を実行するためのキットを提供し、オリゴヌクレオチド検出試薬は、１つ以上のＳＮＰにおける少なくとも２つの異なる対立遺伝子のそれぞれを区別する。様々な実施形態では、検出は、直接配列決定、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的プライマー伸長、対立遺伝子特異的増幅、配列決定、５′ヌクレアーゼ分解、分子指標検定、オリゴヌクレオチド結紮検定、サイズ分析、および一本鎖高次構造多型からなる群から選択される過程により実行される。
【００５５】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド検出試薬は、基質に固定化される。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチド検出試薬は、一列に配置される。
【００５６】
本発明はさらに、対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を診断または予知する方法を提供し、この方法は、（ａ）対象からの試料を、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内のアミノ酸置換Ｄ３５８Ａ、ＮＴＦ４のアミノ酸配列内のアミノ酸置換Ｒ２０６Ｗ、およびＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内のアミノ酸置換Ｔ８３５Ｍからなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸置換の存在または非存在を検出することができる試薬と接触させることと、（ｂ）試料を分析して、該１つ以上のアミノ酸置換の存在を検出することと、を含み、試料中の１つ以上のアミノ酸置換の存在が、対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す。
【００５７】
本発明はさらに、少なくとも１つの抗体検出試薬を含む、方法を実行するためのキットを提供し、抗体検出試薬は、１つ以上のアミノ酸置換における少なくとも２つの異なるアミノ酸のそれぞれを区別する。本発明はさらに、少なくとも１つのペプチド検出試薬を含む、方法を実行するためのキットを提供し、ペプチド検出試薬は、１つ以上のアミノ酸置換における少なくとも２つの異なるアミノ酸のそれぞれを区別する。
【００５８】
本発明はさらに、ＡＤの治療のための治療標的を提供し、治療標的は、ＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃから選択される遺伝子によりコードされるタンパク質のうちの１つ、またはそれらの組み合わせである。
【００５９】
本発明はさらに、ＡＤを診断または予知するための一式の分子プローブを提供し、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内のアミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰ、ＮＴＦ４のアミノ酸配列内のアミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰ、およびＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内のアミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰを含む群から選択される、少なくとも２つのマーカーを直接または間接的に検出することができる少なくとも２つのプローブを含み、該分子プローブは、１０００個を超える要素のマイクロアレイと関連付けられない。一実施形態では、一式の分子プローブは、表３に列挙されるＳＮＰから選択される少なくとも２つのマーカーを直接または間接的に検出することができる１つ以上のプローブをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ＡＰＯＥ修飾因子スクリーニングで用いられる戦略を示す図である。
【図２】ヒト染色体１の一部分にわたる位置を示すマンハッタンプロットであり、ＡＤ症例試料対スーパー対照における遺伝的変異間に統計的に有意な差があった。ｐ値が低いほど、関連が強くなる。
【図３】ＮＩＡ／ＬＯＡＤ研究からの非選択アルツハイマー病症例（Ｎ＝９３２個体）および対照（Ｎ＝８３２個体）におけるｒｓ４１２９２６７のＴ対立遺伝子の頻度、ｒｓ２２２８１４５のＣ対立遺伝子のプロキシを示す図である。マイナー対立遺伝子の頻度は、ＡＤ症例の発病年齢および対照の年齢により層別される。
【図４】ＴＧＥＮプロジェクトからのデータの分析を示す（Ｗｅｂｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．８４：４４５−４５８）図である。ＡＤ（ＡＤ）を持つ対象の脳内の膜結合性および可溶性ＩＬ６Ｒの両方の発現レベルを、ＩＲ６Ｒ（ＮＭ＿０００５６５）の膜結合性形態のみを検出するプローブ、または膜結合性およびｓＩＬ６Ｒの両方を捕捉するプローブ（ＮＭ＿１８１３５９）のいずれかを用いて、対照（ＣＮ）と比較した。
【図５】ＬＯ１系統におけるノンパラメトリック連鎖分析の結果を示す図である。
【図６】アミノ酸残基Ｔ８５３の保存を示す、ＵＮＣ５ファミリーメンバーのアミノ酸配列アラインメントを提供する図である。
【図７】ヒト染色体１の一部分にわたる位置を示すマンハッタンプロットを示す図であり、遺伝的変異と脳脊髄液中の可溶性ＩＬ６Ｒとの間に統計的に有意な差があった。ｐ値が低いほど、関連が強くなる。
【図８】ＩＬ６ＲのＤ３５８またはＡ３５８構成体で形質転換され、１００ｎＭホルボールミリスチン酸酢酸塩（ＰＭＡ）で０、３０、６０、または１２０分間処理された２９３Ｔ細胞中のＩＬ６Ｒの相対膜結合率を示す図である。処理後細胞を採取し、ＩＬ６Ｒ−ＰＥ抗体で染色して、膜結合性ＩＬ６ＲをＦＡＣＳにより分析した。
【図９】１００ｎＭ ＰＭＡで６０分間の処理前後のＤ３５８またはＡ３５８のいずれかにホモ接合性であった、年齢、性別、および人種が一致するドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞中の膜結合性ＩＬ６Ｒの割合を示す図である。処理直後に細胞を採取し、ＩＬ６Ｒ−ＰＥ抗体で染色して、膜結合性ＩＬ６ＲをＦＡＣＳにより分析した。
【図１０】Ｄ３５８またはＡ３５８のいずれかにホモ接合性であった、年齢、性別、および人種が一致するドナーからのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の可溶性ＩＬ６Ｒを示す図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８上に置き、２４、４８、および７２時間後に総ＲＮＡ抽出のために採取して、上清を回収してＥＬＩＳＡによりｓＩＬ６Ｒレベルを決定した。グラフは、各時点における、Ｄ３５８に対してＡ３５８の可溶性ＩＬ６Ｒの倍率増加を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
定義
本明細書において同義的に用いられる、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによりポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体等の修飾ヌクレオチドを含んでよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組立て前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分との共役により、重合化後にさらに修飾され得る。他のタイプの修飾としては、例えば、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上を類似体と置換する「キャップ」、ヌクレオチド間修飾、例えば、非電荷性結合（例えば、メチルホスホン酸塩、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）によるもの、および電荷性結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）によるもの、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシン等）の懸垂部分を含むもの、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラーレン等）によるもの、キレート剤（例えば、金属、放射活性金属、ホウ素、酸化金属等）によるもの、アルキル化剤を含むもの、修飾結合（例えば、αアノマー核酸等）によるもの、ならびにポリヌクレオチド（複数可）の未修飾形態が挙げられる。さらに、糖内に通常存在するヒドロキシル基のうちのいずれかは、例えば、ホスホン酸基、リン酸基により置換されるか、標準保護基により保護されるか、もしくは活性化されて追加のヌクレオチドへの追加の結合を調製し得るか、または固体支持体に共役されてもよい。５′および３′末端ＯＨをリン酸化するか、またはアミンもしくは１〜２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分と置換することができる。他のヒドロキシルは、標準保護基に誘導体化されてもよい。ポリヌクレオチドは、一般に当該技術分野において既知のリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態を含むこともでき、例えば、２′−Ｏ−メチル−２′−Ｏ−アリル、２′−フルオロ−もしくは２′−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロース、もしくはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、および脱塩基ヌクレオシド類似体、例えば、メチルリボシドが挙げられる。１つ以上のホスホジエステル結合は、代替連結基に置き換えられてもよい。これらの代替連結基としては、限定されないが、リン酸塩がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、″（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ′、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）に置き換えられる実施形態を含み、各ＲまたはＲ′は、独立してＨであるか、または置換もしくは非置換アルキル（１−２０Ｃ）（任意にエーテル（−Ｏ−）結合を含む）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケ��ル、またはアラルジルである。ポリヌクレオチド内のすべての結合が同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書において言及される全てのポリヌクレオチドに適用する。
【００６２】
本明細書において用いられるとき、「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも約７ヌクレオチド長、約２５０ヌクレオチド長未満の短い一本鎖ポリヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドは合成であってもよい。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、相互排他的ではない。ポリヌクレオチドに関する上記の説明は、等しく完全にオリゴヌクレオチドに適用可能である。
【００６３】
用語「プライマー」は、核酸にハイブリダイズすることができ、一般に遊離３′−ＯＨ基を提供することにより相補的核酸の重合を可能にする、一本鎖ポリヌクレオチドを指す。
【００６４】
本明細書において用いられるとき、用語「遺伝子」は、ＤＮＡ配列であって、そのテンプレートまたはメッセンジャーＲＮＡを通じて、特定のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の特徴であるアミノ酸の配列をコードする、ＤＮＡ配列を指す。用語「遺伝子」は、ＲＮＡ産物をコードするＤＮＡ配列も指す。ゲノムＤＮＡを参照して本明細書において用いられるとき、用語「遺伝子」は、介在する非コード領域ならびに調節領域を含み、５′および３′末端を含むことができる。
【００６５】
用語「遺伝的変異」または「ヌクレオチド変異」は、参照配列（例えば、一般に見出される、および／もしくは野生型配列、ならびに／または主要対立遺伝子の配列）に対する、ヌクレオチド配列内の変化（例えば、１つ以上のヌクレオチド、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）の挿入、欠失、逆位、または置換）を指す。本用語は、別段の指示がない限り、ヌクレオチド配列の相補体の対応する変化も包含する。一実施形態では、遺伝的変異は、体細胞多型である。一実施形態では、遺伝的変異は、生殖細胞多型である。
【００６６】
「一塩基多型」、または「ＳＮＰ」は、異なる対立遺伝子、または代替ヌクレオチドが集団内に存在する、ＤＮＡ内の一塩基位置を指す。ＳＮＰ位置は、通常、その対立遺伝子の高度に保存された配列（例えば、集団の１／１００または１／１０００メンバー未満で異なる配列）により先行および後続される。個人は、各ＳＮＰ位置における対立遺伝子に対してホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。
【００６７】
用語「アミノ酸変異」は、参照配列に対するアミノ酸配列の変化（例えば、１つ以上のアミノ酸の挿入、置換、または欠失、例えば、内部欠失またはＮ末端もしくはＣ末端切断）を指す。
【００６８】
用語「変異」は、ヌクレオチド変異またはアミノ酸変異のいずれかを指す。
【００６９】
用語「ＳＮＰに対応するヌクレオチド位置における遺伝的変異」、「ＳＮＰに対応するヌクレオチド位置におけるヌクレオチド変異」、およびそれらの文法的変型は、ゲノム内の該ＳＮＰにより占拠される相対的な対応するＤＮＡ位置におけるポリヌクレオチド配列内のヌクレオチド変異を指す。本用語は、別段の指示がない限り、ヌクレオチド配列の相補体の対応する変化も包含する。
【００７０】
本明細書において用いられるとき、用語「対立遺伝子」は、染色体内の所定の遺伝子座で発生する遺伝子または非遺伝子領域の一対または一連の形態のうちの１つを指す。正常２倍体細胞内には、任意の１つの遺伝子（各親から１つ）の２つの対立遺伝子があり、相同染色体上の同一の相対位置（遺伝子座）を占拠する。集団内には、遺伝子の２つより多くの対立遺伝子が存在してもよい。ＳＮＰは、対立遺伝子、すなわちそのＳＮＰを特徴付ける２つ（以上）のヌクレオチドも有する。
【００７１】
本明細書において用いられるとき、用語「連鎖不均衡」または「ＬＤ」は、２つ以上の遺伝子座の対立遺伝子が、それらの個別の対立遺伝子頻度の積により予測される頻度で、集団からサンプリングされた個人において一緒に発生しなかった状況を指す。ＬＤにあるマーカーは、独立したランダム分離に関するメンデルの第二の法則に従わない。ＬＤは、いくつかの人口学的または集団アーチファクトのうちのいずれか、ならびにマーカー間の遺伝的連鎖の存在により引き起こされ得る。しかしながら、これらのアーチファクトがＬＤの起源として制御および排除されると、次にＬＤは、関与する遺伝子座が、異なるマーカー（ハプロタイプ）に対する対立遺伝子の特定の組み合わせが一緒に継承されるように、同一染色体上で互いの近くに位置するという事実から直接生じる。高ＬＤにあるマーカーは、互いの近くに位置すると想定することができ、遺伝的形質を持つ高ＬＤにあるマーカーまたはハプロタイプは、その形質に作用する遺伝子の近くに位置すると想定され得る。
【００７２】
本明細書において用いられるとき、用語「遺伝子座」は、染色体またはＤＮＡ配列に沿った特定の位置を指す。文脈に応じて、遺伝子座は、遺伝子、マーカー、染色体バンド、または１つ以上のヌクレオチドの特定配列であり得る。
【００７３】
用語「アレイ」または「マイクロアレイ」は、基質上のハイブリダイズ可能なアレイ要素の秩序配置、好ましくはポリヌクレオチドプローブ（例えば、オリゴヌクレオチド）を指す。基質は、ガラススライド等の固体基質、またはニトロセルロース膜等の半固体基質であり得る。
【００７４】
用語「増幅」は、参照核酸配列またはその相補体の１つ以上の複製を生成する過程を指す。増幅は、線形または指数関数的であってよい（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））。「複製」は、必ずしもテンプレート配列に対して完全な配列相補性または同一性を意味するとは限らない。例えば、複製は、デオキシイノシン等のヌクレオチド類似体、意図的な配列変異（テンプレートに対してハイブリダイズ可能であるが、完全に相補的ではない配列を含むプライマーを通じて導入される配列変異等）、および／または増幅中に発生する配列エラーを含み得る。
【００７５】
用語「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド変異（多くの場合、置換）を含む標的核酸の領域に対してハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指す。「対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション」は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドが、その標的核酸に対してハイブリダイズされるとき、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド内のヌクレオチドが、ヌクレオチド変異と特異的に塩基対合することを意味する。特定のヌクレオチド変異に関して対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションが可能な対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、その変異「に対して特異的」であると言われる。
【００７６】
用語「対立遺伝子特異的プライマー」は、プライマーである対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを指す。
【００７７】
用語「プライマー伸長分析」は、ヌクレオチドが核酸に付加される分析を指し、直接または間接的に検出される、より長い核酸または「伸長産物」をもたらす。ヌクレオチドを付加して、核酸の５′または３′末端を伸長することができる。
【００７８】
用語「対立遺伝子特異的ヌクレオチド取り込み分析」は、プライマーが、（ａ）ヌクレオチド変異の３′または５′である領域において標的核酸にハイブリダイズされ、（ｂ）ポリメラーゼにより伸長され、それによりヌクレオチド変異に相補的なヌクレオチドを伸長産物に取り込む、プライマー伸長分析を指す。
【００７９】
用語「対立遺伝子特異的プライマー伸長分析」は、対立遺伝子特異的プライマーが標的核酸にハイブリダイズされて伸長される、プライマー伸長分析を指す。
【００８０】
用語「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション分析」は、（ａ）対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズされ、（ｂ）ハイブリダイゼーションが直接または間接的に検出される分析を指す。
【００８１】
用語「５′ヌクレアーゼ分析」は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの標的核酸に対するハイブリダイゼーションが、ハイブリダイズされたプローブの核酸分解切断を可能にし、検出可能なシグナルをもたらす分析を指す。
【００８２】
用語「分子指標を用いる分析」は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションが、遊離オリゴヌクレオチドにより放出される検出可能なシグナルのレベルよりも高い検出可能なシグナルのレベルをもたらす分析を指す。
【００８３】
用語「オリゴヌクレオチド結紮分析」は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが、標的核酸上で互いに隣接してハイブリダイズされ、（介在するヌクレオチドを通じて直接または間接的に）一緒に結紮され、その結紮産物が直接または間接的に検出される分析を指す。
【００８４】
用語「標的配列」、「標的核酸」、または「標的核酸配列」は、一般に、ヌクレオチド変異の存在が疑われるか、または知られている目的のポリヌクレオチド配列を指し、増幅により生成されたそのような標的核酸の複製を含む。
【００８５】
用語「検出」は、検出する任意の手段を含み、直接および間接的検出を含む。
【００８６】
用語「ＩＬ６Ｒ」は、インターロイキン−６受容体を指すために用いられ、ＩＬ−６Ｒ１、ＩＬ−６ＲＡ、ＩＬ−６Ｒα、インターロイキン−６受容体サブユニットα、およびＣＤ１２６としても知られる。この用語は、「完全長」未処理のＩＬ６Ｒ、ならびに細胞内の処理から生じるＩＬ６Ｒの任意の形態を包含する。この用語は、ＩＬ６Ｒの天然に存在する変異型、例えば、スプライス変異型または対立遺伝子変異型も包含する。例示のヒトＩＬ６Ｒのアミノ酸配列は、配列番号１に示される。
ＭＬＡＶＧＣＡＬＬＡＡＬＬＡＡＰＧＡＡＬＡＰＲＲＣＰＡＱＥＶＡＲＧＶＬＴＳＬＰＧＤＳＶＴＬＴＣＰＧＶＥＰＥＤＮＡＴＶＨＷＶＬＲＫＰＡＡＧＳＨＰＳＲＷＡＧＭＧＲＲＬＬＬＲＳＶＱＬＨＤＳＧＮＹＳＣＹＲＡＧＲＰＡＧＴＶＨＬＬＶＤＶＰＰＥＥＰＱＬＳＣＦＲＫＳＰＬＳＮＶＶＣＥＷＧＰＲＳＴＰＳＬＴＴＫＡＶＬＬＶＲＫＦＱＮＳＰＡＥＤＦＱＥＰＣＱＹＳＱＥＳＱＫＦＳＣＱＬＡＶＰＥＧＤＳＳＦＹＩＶＳＭＣＶＡＳＳＶＧＳＫＦＳＫＴＱＴＦＱＧＣＧＩＬＱＰＤＰＰＡＮＩＴＶＴＡＶＡＲＮＰＲＷＬＳＶＴＷＱＤＰＨＳＷＮＳＳＦＹＲＬＲＦＥＬＲＹＲＡＥＲＳＫＴＦＴＴＷＭＶＫＤＬＱＨＨＣＶＩＨＤＡＷＳＧＬＲＨＶＶＱＬＲＡＱＥＥＦＧＱＧＥＷＳＥＷＳＰＥＡＭＧＴＰＷＴＥＳＲＳＰＰＡＥＮＥＶＳＴＰＭＱＡＬＴＴＮＫＤＤＤＮＩＬＦＲＤＳＡＮＡＴＳＬＰＶＱＤＳＳＳＶＰＬＰＴＦＬＶＡＧＧＳＬＡＦＧＴＬＬＣＩＡＩＶＬＲＦＫＫＴＷＫＬＲＡＬＫＥＧＫＴＳＭＨＰＰＹＳＬＧＱＬＶＰＥＲＰＲＰＴＰＶＬＶＰＬＩＳＰＰＶＳＰＳＳＬＧＳＤＮＴＳＳＨＮＲＰＤＡＲＤＰＲＳＰＹＤＩＳＮＴＤＹＦＦＰＲ（配列番号１）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５６６）。
【００８７】
用語「ＮＴＦ４」は、ニューロトロフィン４（ｎｅｕｔｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ４）を指すために用いられ、これは、ニューロトロフィン５（ｎｅｕｔｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ５）、神経栄養因子４、神経栄養因子５、ＮＴ４、ＮＴ５、ＮＴ―４、ＮＴ―５、ＮＴＦ５、ＧＬＣ１０、およびＮＴ−４／５としても知られる。この用語は、「完全長」未処理のＮＴＦ４、ならびに細胞内の処理から生じるＮＴＦ４の任意の形態を包含する。この用語は、ＮＴＦ４の天然に存在する変異型、例えば、スプライス変異型または対立遺伝子変異型も包含する。例示のヒトＮＴＦ４のアミノ酸配列は、配列番号２に示される。
ＭＬＰＬＰＳＣＳＬＰＩＬＬＬＦＬＬＰＳＶＰＩＥＳＱＰＰＰＳＴＬＰＰＦＬＡＰＥＷＤＬＬＳＰＲＶＶＬＳＲＧＡＰＡＧＰＰＬＬＦＬＬＥＡＧＡＦＲＥＳＡＧＡＰＡＮＲＳＲＲＧＶＳＥＴＡＰＡＳＲＲＧＥＬＡＶＣＤＡＶＳＧＷＶＴＤＲＲＴＡＶＤＬＲＧＲＥＶＥＶＬＧＥＶＰＡＡＧＧＳＰＬＲＱＹＦＦＥＴＲＣＫＡＤＮＡＥＥＧＧＰＧＡＧＧＧＧＣＲＧＶＤＲＲＨＷＶＳＥＣＫＡＫＱＳＹＶＲＡＬＴＡＤＡＱＧＲＶＧＷＲＷＩＲＩＤＴＡＣＶＣＴＬＬＳＲＴＧＲＡ（配列番号２）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００６１７０）。
【００８８】
用語「ＵＮＣ５Ｃ」は、ネトリン受容体ＵＮＣ５Ｃを指すために用いられ、これは、ＵＮＣ−５相同体３、ＵＮＣ−５相同体Ｃ、およびＵＮＣ５Ｈ３としても知られる。この用語は、「完全長」未処理のＵＮＣ５Ｃ、ならびに細胞内の処理から生じるＵＮＣ５Ｃの任意の形態を包含する。この用語は、ＵＮＣ５Ｃの天然に存在する変異型、例えば、スプライス変異型または対立遺伝子変異型も包含する。例示のヒトＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列は、配列番号３に示される。
ＭＲＫＧＬＲＡＴＡＡＲＣＧＬＧＬＧＹＬＬＱＭＬＶＬＰＡＬＡＬＬＳＡＳＧＴＧＳＡＡＱＤＤＤＦＦＨＥＬＰＥＴＦＰＳＤＰＰＥＰＬＰＨＦＬＩＥＰＥＥＡＹＩＶＫＮＫＰＶＮＬＹＣＫＡＳＰＡＴＱＩＹＦＫＣＮＳＥＷＶＨＱＫＤＨＩＶＤＥＲＶＤＥＴＳＧＬＩＶＲＥＶＳＩＥＩＳＲＱＱＶＥＥＬＦＧＰＥＤＹＷＣＱＣＶＡＷＳＳＡＧＴＴＫＳＲＫＡＹＶＲＩＡＹＬＲＫＴＦＥＱＥＰＬＧＫＥＶＳＬＥＱＥＶＬＬＱＣＲＰＰＥＧＩＰＶＡＥＶＥＷＬＫＮＥＤＩＩＤＰＶＥＤＲＮＦＹＩＴＩＤＨＮＬＩＩＫＱＡＲＬＳＤＴＡＮＹＴＣＶＡＫＮＩＶＡＫＲＫＳＴＴＡＴＶＩＶＹＶＮＧＧＷＳＴＷＴＥＷＳＶＣＮＳＲＣＧＲＧＹＱＫＲＴＲＴＣＴＮＰＡＰＬＮＧＧＡＦＣＥＧＱＳＶＱＫＩＡＣＴＴＬＣＰＶＤＧＲＷＴＰＷＳＫＷＳＴＣＧＴＥＣＴＨＷＲＲＲＥＣＴＡＰＡＰＫＮＧＧＫＤＣＤＧＬＶＬＱＳＫＮＣＴＤＧＬＣＭＱＴＡＰＤＳＤＤＶＡＬＹＶＧＩＶＩＡＶＩＶＣＬＡＩＳＶＶＶＡＬＦＶＹＲＫＮＨＲＤＦＥＳＤＩＩＤＳＳＡＬＮＧＧＦＱＰＶＮＩＫＡＡＲＱＤＬＬＡＶＰＰＤＬＴＳＡＡＡＭＹＲＧＰＶＹＡＬＨＤＶＳＤＫＩＰＭＴＮＳＰＩＬＤＰＬＰＮＬＫＩＫＶＹＮＴＳＧＡＶＴＰＱＤＤＬＳＥＦＴＳＫＬＳＰＱＭＴＱＳＬＬＥＮＥＡＬＳＬＫＮＱＳＬＡＲＱＴＤＰＳＣＴＡＦＧＳＦＮＳＬＧＧＨＬＩＶＰＮＳＧＶＳＬＬＩＰＡＧＡＩＰＱＧＲＶＹＥＭＹＶＴＶＨＲＫＥＴＭＲＰＰＭＤＤＳＱＴＬＬＴＰＶＶＳＣＧＰＰＧＡＬＬＴＲＰＶＶＬＴＭＨＨＣＡＤＰＮＴＥＤＷＫＩＬＬＫＮＱＡＡＱＧＱＷＥＤＶＶＶＶＧＥＥＮＦＴＴＰＣＹＩＱＬＤＡＥＡＣＨＩＬＴＥＮＬＳＴＹＡＬＶＧＨＳＴＴＫＡＡＡＫＲＬＫＬＡＩＦＧＰＬＣＣＳＳＬＥＹＳＩＲＶＹＣＬＤＤＴＱＤＡＬＫＥＩＬＨＬＥＲＱＭＧＧＱＬＬＥＥＰＫＡＬＨＦＫＧＳＴＨＮＬＲＬＳＩＨＤＩＡＨＳＬＷＫＳＫＬＬＡＫＹＱＥＩＰＦＹＨＶＷＳＧＳＱＲＮＬＨＣＴＦＴＬＥＲＦＳＬＮＴＶＥＬＶＣＫＬＣＶＲＱＶＥＧＥＧＱＩＦＱＬＮＣＴＶＳＥＥＰＴＧＩＤＬＰＬＬＤＰＡＮＴＩＴＴＶＴＧＰＳＡＦＳＩＰＬＰＩＲＱＫＬＣＳＳＬＤＡＰＱＴＲＧＨＤＷＲＭＬＡＨＫＬＮＬＤＲＹＬＮＹＦＡＴＫＳＳＰＴＧＶＩＬＤＬＷＥＡＱＮＦＰＤＧＮＬＳＭＬＡＡＶＬＥＥＭＧＲＨＥＴＶＶＳＬＡＡＥＧＱＹ（配列番号３）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３７１９）。
【００８９】
本明細書において用いられるとき、用語「アルツハイマー病」（ＡＤ）は、早発型ＡＤおよび遅発型ＡＤの両方、ならびに家族性および散発性形態のＡＤの両方を指す。
【００９０】
本明細書において用いられるとき、アルツハイマー病を発症する「危険性のある」対象は、検出可能な疾患または疾患の症状を有していてもいなくてもよく、本明細書に記載される治療方法の前に、検出可能な疾患または疾患の症状を呈していてもいなくてもよい。「危険性のある」とは、対象が、本明細書に記載され、当該技術分野において既知のように、アルツハイマー病の発症と相関する測定可能なパラメータである、１つ以上の危険因子を有することを意味する。これらの危険因子のうちの１つ以上を有する対象は、これらの危険因子（複数可）のうちの１つ以上を有しない対象よりもアルツハイマー病を発症する可能性が高い。
【００９１】
用語「診断」は、本明細書において、分子または病理状態、疾患、もしくは状態、例えばＡＤの識別または分類を指すために用いられる。「診断」は、例えば、分子構造によるＡＤの特定の亜型（例えば、特定の遺伝子または核酸領域内の遺伝的変異（複数可）により特徴付けられる患者の亜集団）の分類も指し得る。
【００９２】
用語「診断を補助する」は、本明細書において、ＡＤの特定の種類の症状または状態の存在または性質に関する臨床決定を行うことを助ける方法を指すために用いられる。例えば、ＡＤの診断を補助する方法は、個人からの生体試料中のＡＤを示す１つ以上の遺伝子マーカーの存在もしくは非存在、またはＡＤを有する危険性の増加を測定することを含み得る。
【００９３】
用語「予知」は、本明細書において、例えば、記憶喪失および認知症を含む、ＡＤの症状を発症する可能性の予測を指すために用いられる。用語「予測」は、患者が薬物または一式の薬物に対して良好または不良に反応する可能性を指すために用いられる。一実施形態では、予測は、そのような反応の程度に関する。一実施形態では、予測は、患者が、例えば、特定の治療薬による治療等の治療後、および疾患の再発なしに一定期間生存もしくは改善するか否か、および／またはその可能性に関する。本発明の予測方法を用いて、任意の特定患者に対して最適な治療法を選択することにより、臨床的に治療決定を行うことができる。本発明の予測方法は、患者が、例えば、所定の治療薬もしくは組み合わせの投与、外科的介入、ステロイド治療等を含む所定の治療計画等の治療計画に対して良好に反応し得るか、または治療計画に続く患者の長期生存が起こり得るか否かを予測することにおいて有益なツールである。
【００９４】
本明細書において用いられるとき、「治療」は、治療される個人または細胞の自然経過を変更する試みにおける臨床的介入を指し、臨床病理学の経過前または経過中に行うことができる。治療の望ましい効果は、疾患または状態もしくはその症状の発生もしくは再発を予防することと、疾患の状態または症状を軽減することと、疾患の任意の直接または間接的病理的帰結を低下させることと、疾患の進行速度を減少させることと、疾患状態を軽減または緩和することと、寛解または予後改善を達成することと、を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、疾患または障害の発症を遅らせる試みにおいて有用である。
【００９５】
「ＡＤ治療薬」、「ＡＤを治療するために有効な治療薬」、およびその文法的変型は、本明細書において用いられるとき、有効な量で提供されるとＡＤを有する対象における治療利益を提供することが知られているか、臨床的に示されるか、または医師により予想される薬剤を指す。一実施形態では、この表現は、有効な量で提供されるとき、ＡＤを有する対象において治療効果を提供することが予想され、臨床的に許容されている薬剤として、臨床製造者により市販されているか、またはそうでなければ有資格の医師により用いられる、任意の薬剤を含む。様々な非限定的実施形態では、ＡＤ治療薬は、コリンエステラーゼ阻害薬、メマンチン、抗興奮薬、抗うつ薬、抗不安薬、またはアミロイド前駆体タンパク質、アミロイドβ、アミロイドプラーク、もしくは限定されないが、α−セクレターゼ、β−セクレターゼ、およびγ−セクレターゼを含む、アミロイド前駆体タンパク質を切断する酵素のいずれかを標的とする化合物を含む。
【００９６】
用語「薬学的製剤」は、有効であるようにその中に含まれる活性成分の生物活性を許すような形態であり、製剤が投与される対象に対して許容不可能に毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。
【００９７】
「薬学的に許容される担体」は、対象に対して非毒性である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存剤が挙げられる。
【００９８】
「治療効果」は、病気を患っていない個人における平均的または正常な状態よりも良好である状態の生成を指す（すなわち、影響を受けていないか、または無症候性の対象における正常または平均状態と比較して、ＣＮＳの機能に少なくとも部分的に起因する対象における、認知、記憶、気分、または他の特徴の改善等の超正常効果）。
【００９９】
「有効な量」は、所望の治療結果または予防結果を達成するために必要な用量および期間に有効な量を指す。治療薬の「治療上有効な量」は、個人の疾患状態、年齢、性別、および体重等の要因、ならびに個人における所望の反応を引き出す抗体の能力により変動し得る。治療上有効な量は、治療上有益な効果が、治療薬の任意の毒性または有害効果を上回るものでもある。「予防上有効な量」は、所望の予防結果を達成するために必要な用量および期間に有効な量を指す。典型的であって必ずしもそうではないが、疾患の早期段階前または早期段階で予防用量が対象において用いられるため、予防上有効な量は、治療上有効な量よりも少ない。
【０１００】
「個人」、「対象」、または「患者」は、脊椎動物である。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、哺乳類である。哺乳類としては、限定されないが、霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類を含む）ならびに齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられる。ある特定の実施形態では、哺乳類はヒトである。
【０１０１】
「患者亜集団」およびその文法的変型は、本明細書において用いられるとき、患者のサブセットを、それが属するより広範な疾患カテゴリー内の他のものから区別する１つ以上の特有の測定可能および／または識別可能な特徴を有するとして特徴付けられる患者のサブセットを指す。このような特徴は、疾患のサブカテゴリー、性別、ライフスタイル、既往歴、関与する器官／組織、治療歴等を含む。一実施形態では、患者亜集団は、特定のヌクレオチド位置および／または領域（例えば、ＳＮＰ）内の遺伝的変異を含む、遺伝子サインにより特徴付けられる。
【０１０２】
「対照対象」は、ＡＤを有するとして診断されていない、ＡＤと関連付けられた任意の兆候または症状を患っていない健常な対象を指す。
【０１０３】
用語「試料」は、本明細書において用いられるとき、例えば、物理的、生化学的、化学的、および／または生理学的特徴に基づいて特徴付けられる、および／または識別される細胞および／または他の分子的実体を含む、目的の対象から得られる、もしくはそれに由来する組成物を指す。例えば、表現「疾患試料」およびその変型は、特徴付けられる細胞および／もしくは分子的実体を含むことが予想されるか、または知られている目的の対象から得られる任意の試料を指す。
【０１０４】
「組織または細胞試料」は、対象または患者の組織から得られる同様の細胞の集合を意味する。組織または細胞試料の供給源は、新鮮な冷凍および／もしくは保存された器官または組織試料もしくは検体もしくは吸引物からの固体組織；血液もしくは任意の血液組成物；脳脊髄液、羊水、腹腔液、または間質液等の体液；対象の妊娠または発達における任意の時点からの細胞であってよい。組織試料は、一次または培養された細胞または細胞株であってもよい。任意に、組織または細胞試料は、疾患組織／器官から得られる。組織試料は、保存剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養素、抗生物質等の自然界で組織と自然に混合されない化合物を含んでよい。「参照試料」、「参照細胞」、「参照組織」、「対照試料」、「対照細胞」、または「対照組織」は、本明細書において用いられるとき、本発明の方法または組成物が識別に用いられる疾患または状態に罹患していないことが知られる、または罹患していないと考えられる供給源から得られる試料、細胞、または組織を指す。一実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、疾患または状態が、本発明の組成物または方法を用いて識別される同一対象または患者の身体の健常な部分から得られる。一実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、疾患または状態が、本発明の組成物または方法を用いて識別される対象または患者ではない個人の身体の健常な部分から得られる。
【０１０５】
本明細書における目的では、組織試料の「切片」は、組織試料の単一部分または単一片、例えば、組織試料から切断された組織または細胞の薄片を意味する。組織試料の複数の切片は、本発明に従って採取され、分析に供され得ることが理解されるが、但し、本発明は、組織試料の同一切片を、形態学的レベルおよび分子レベルの両方で分析するか、またはタンパク質および核酸の両方に関して分析する方法を含むことが理解される。
【０１０６】
「相関する」または「相関」は、任意の方法で、第１の分析またはプロトコルの性能および／もしくは結果を、第２の分析またはプロトコルの性能および／もしくは結果と比較することを意味する。例えば、第１の分析もしくはプロトコルの結果を第２のプロトコルを実行する際に用いてよく、および／または第１の分析もしくはプロトコルの結果を用いて、第２の分析もしくはプロトコルを行うべきか否かを決定してもよい。遺伝子発現分析またはプロトコルの実施形態に関して、この遺伝子発現分析またはプロトコルの結果を用いて、特定の治療計画を行うべきか否かを決定してもよい。
【０１０７】
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、最も広い意味で同義的に用いられ、モノクローナル抗体（例えば、完全長または正常なモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多特異的抗体（例えば、所望の生物活性を呈する限り二特異的抗体）を含み、（本明細書においてより詳細に説明されるように）ある特定の抗体断片を含んでもよい。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化、および／または親和性成熟であり得る。「抗体断片」は、正常な抗体の一部分を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成された多特異的抗体が挙げられる。
【０１０８】
「小分子」または「有機小分子」は、本明細書において、約５００ダルトン以下の分子量を有する有機分子として定義される。
【０１０９】
「標識」という語は、本明細書において用いられるとき、検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能であり得るか（例えば、放射性同位標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合、検出可能な産物をもたらす基質化合物または組成物の化学的変質を触媒し得る。検出可能な標識として機能し得る放射性核種としては、例えば、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、およびＰｄ−１０９が挙げられる。
【０１１０】
本明細書における「約」の値またはパラメータに対する言及は、その値またはパラメータ自体に向けられる実施形態を含む（および説明する）。例えば、「約Ｘ」について言及する説明は、「Ｘ」の説明を含む。
【０１１１】
用語「添付文書」は、治療薬の市販パッケージに習慣的に含まれる、適応、用途、用量、投与、複合療法、禁忌、および／またはそのような治療薬の使用に関する警告についての情報を含む指示書を指すために用いられる。
【０１１２】
本発明の組成物および方法
遺伝的変異
一態様では、本発明は、対象からの試料中のアルツハイマー病（ＡＤ）と関連付けられる遺伝的変異の存在または非存在を検出する方法、ならびに対象からの試料中のこれらの遺伝的変異の１つ以上の存在または非存在を検出することにより、ＡＤを診断および予知する方法を提供し、遺伝的変異の存在が、対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す。ＡＤの危険性と関連付けられた遺伝的変異は、ゲノム全領域関連研究、修飾因子スクリーニング、および家族ベースのスクリーニングを含む戦略を用いて識別された。
【０１１３】
本発明の方法において使用するための遺伝的変異は、インターロイキン−６受容体（ＩＬ６Ｒ）、神経栄養因子４（ＮＴＦ４）およびＵＮＣ５Ｃ、またはこれらのタンパク質をコードする遺伝子、ならびに表３に列挙される遺伝子のうちのいずれか、もしくはそれらがコードするタンパク質内の遺伝的変異を含む。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、遺伝子（またはその調節領域）をコードするゲノムＤＮＡ内にあり、この遺伝子は、インターロイキン−６受容体（ＩＬ６Ｒ）、神経栄養因子４（ＮＴＦ４）、およびＵＮＣ５Ｃ、ならびに表３に列挙される遺伝子のうちのいずれかをコードする遺伝子から選択される。様々な実施形態では、遺伝的変異は、ＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子、ならびに表３に列挙される遺伝子のいずれかにおけるＳＮＰ、対立遺伝子、ハプロタプ、挿入、または欠失である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内でアミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰである。一実施形態では、遺伝的変異は、ｒｓ２２２８１４５における「Ｃ」対立遺伝子である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内でアミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰである。一実施形態では、遺伝的変異は、ｒｓ１２１９１８４２７における「Ｔ」対立遺伝子である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内でアミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰである。実施形態では、遺伝的変異は、表３に列挙されるものから選択される遺伝子内のＳＮＰである。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、ｒｓ１２７３３５７８、ｒｓ４６５８９４５、ｒｓ１４７８１６１、ｒｓ１０２４５９１、ｒｓ７７９９０１０、ｒｓ１０９６９４７５、およびｒｓ１２９６１２５０から選択されるＳＮＰである。様々な実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異は、ＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、またはＵＮＣ５Ｃ内のアミノ酸置換、挿入、または欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、アミノ酸置換である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内のアミノ酸置換Ｄ３５８Ａである。一実施形態では、遺伝的変異は、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内のアミノ酸置換Ｒ２０６Ｗである。一実施形態では、遺伝的変異は、ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内のアミノ酸置換Ｔ８３５Ｍである。
【０１１４】
遺伝的変異の検出
本明細書に記載される検出方法のいずれかにおいて用いられる核酸は、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡから転写されるＲＮＡ、またはＲＮＡから生成されるｃＤＮＡであってよい。核酸は、脊椎動物、例えば、哺乳類に由来し得る。核酸は、その供給源から直接得られる場合、またはその供給源において見出される核酸の複製である場合、特定の供給源「に由来する」と言われる。
【０１１５】
核酸は、核酸の複製、例えば、増幅から生じる核酸の複製を含む。増幅は、場合によっては、例えば、変異を検出するための所望の量の材料を得るために望ましいことがある。次に、単位複製配列を、以下に記載されるもの等の変異検出法に供して、変異が単位複製配列内に存在するか否かを決定し得る。
【０１１６】
遺伝的変異は、当業者に知られているある特定の方法により検出され得る。このような方法としては、限定されないが、ＤＮＡ配列決定；対立遺伝子特異的ヌクレオチドの取り込み分析および対立遺伝子特異的プライマー伸長分析（例えば、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、対立遺伝子特異的結紮連鎖反応（ＬＣＲ）、およびギャップＬＣＲ）を含むプライマー伸長分析；対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション分析（例えば、オリゴヌクレオチド結紮分析）；切断剤からの保護を用いて核酸二本鎖内のミスマッチ塩基を検出する切断保護分析；ＭｕｔＳタンパク質結合の分析；変異型および野生型核酸分子の移動性を比較する電気泳動分析；変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ、例えば、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５）；ミスマッチ塩基対におけるＲＮａｓｅ切断の分析；ヘテロ二本鎖ＤＮＡの化学的または酵素的切断の分析；質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）；遺伝的ビット分析（ＧＢＡ）：５′ヌクレアーゼ分析（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標））；および分子指標を用いる分析が挙げられる。これらの方法のうちの一部は、以下でさらに詳述される。
【０１１７】
標的核酸内の変異の検出は、当該技術分野においてよく知られている技術を用いて、標的核酸の分子クローン化および配列決定により達成され得る。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の増幅技術を用いて、腫瘍組織からのゲノムＤＮＡ調製物から標的核酸配列を直接増幅させることができる。次に、増幅された配列の核酸配列を決定することができ、そこから変異を識別することができる。増幅技術は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応は、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７，１９８８、米国特許第４，６８３，２０３号および第４，６８３，１９５号に記載されている。
【０１１８】
当該技術分野において既知の結紮連鎖反応を用いて、標的核酸配列を増幅させることができる。例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０−５６９（１９８９）を参照されたい。さらに、対立遺伝子特異的ＰＣＲとして既知の技術を用いて、変異（例えば、置換）を検出することもできる。例えば、Ｒｕａｎｏ ａｎｄ Ｋｉｄｄ（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７：８３９２；ＭｃＣｌａｙ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０１：２００−２０６を参照されたい。この技術のある特定の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーが用いられ、このプライマーの３′末端ヌクレオチドは、標的核酸内の特定の変異に対して相補的（すなわち、それと特異的に塩基対合することができる）。特定の変異が存在しない場合、増幅産物は観測されない。増幅抵抗突然変異システム（ＡＲＭＳ）を用いて、変異（例えば、置換）を検出することもできる。ＡＲＭＳは、例えば、欧州特許出願公開第０３３２４３５号、およびＮｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：７，１９８９において説明されている。
【０１１９】
変異（例えば、置換）を検出するために有用な他の方法としては、限定されないが、（１）対立遺伝子特異的ヌクレオチド取込分析、例えば、一塩基伸長分析（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１０：５４９−５５７、Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１０：８５３−８６０、Ｐａｓｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６０６−６１４、およびＹｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．１７：３０５−３１６を参照）；（２）対立遺伝子特異的プライマー伸長分析（例えば、Ｙｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．１７：３０５−３１６、およびＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗ，ｖｏｌ．２３，Ｍａｒ．１５，２００３を参照）、対立遺伝子特異的ＰＣＲを含む；（３）５′ヌクレアーゼ分析（例えば、Ｄｅ Ｌａ Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３２：Ｓ４８−Ｓ５４（ＴａｑＭａｎ．ＲＴＭ．分析を説明する）、Ｒａｎａｄｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１：１２６２−１２６８、およびＳｈｉ（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：１６４−１７２を参照）；（４）分子指標を用いる分析（例えば、Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：４９−５３、およびＭｈｌａｎｇａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：４６３−７１を参照）；および（５）オリゴヌクレオチド結紮分析（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４５２７−４５３４、特許出願公開第ＵＳ２００３／０１１９００４Ａ１号、ＰＣＴ国際公開第０１／９２５７９Ａ２号、および米国特許第６，０２７，８８９号を参照）が挙げられる。
【０１２０】
変異は、ミスマッチ検出法により検出されてもよい。ミスマッチは、１００％相補性ではないハイブリダイズされた核酸二本鎖である。全相補性の欠如は、欠失、挿入、逆位、または置換に起因し得る。ミスマッチ検出法の一例は、例えば、Ｆａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１４７１７−１４７２２（２００５）、およびＦａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１６５７−１６６４（２００１）において説明されるミスマッチ修復検出（ＭＲＤ）分析である。ミスマッチ切断技術の別の例は、ＲＮａｓｅ保護法であり、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：７５７５，１９８５、およびＭｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２，１９８５において詳細に説明される。例えば、本発明の方法は、ヒト野生型標的核酸に相補的な標識リボプローブの使用を伴ってよい。組織試料に由来するリボプローブおよび標的核酸は、一緒にアニール（ハイブリダイズ）され、二本鎖ＲＮＡ構造内でいくつかのミスマッチを検出することができる、酵素ＲＮａｓｅ Ａで後次に分解される。ミスマッチがＲＮａｓｅ Ａにより検出される場合、それはミスマッチの部位において切断する。したがって、アニールされたＲＮＡ調製物が電気泳動ゲルマトリックス上で分離されるとき、ミスマッチが検出され、ＲＮａｓｅ Ａにより切断される場合、リボプローブおよびｍＲＮＡまたはＤＮＡの完全長二本鎖ＲＮＡより小さいＲＮＡ産物が見られる。リボプローブは、完全長の標的核酸である必要はなく、標的核酸の一部分であり得るが、但し、変異を有することが疑われる位置を包含する。
【０１２１】
同様の方法で、ＤＮＡプローブを用いて、例えば、酵素または化学的切断を通じてミスマッチを検出することができる。例えば、Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：４３９７，１９８８、およびＳｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２：９８９，１９７５を参照されたい。あるいは、ミスマッチは、マッチ二本鎖に対してミスマッチ二本鎖の電気泳動移動度のシフトにより検出され得る。例えば、Ｃａｒｉｅｌｌｏ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４２：７２６，１９８８を参照されたい。リボプローブまたはＤＮＡプローブのいずれかを用いて、変異を含むことが疑われる標的核酸は、ハイブリダイゼーション前に増幅されてよい。標的核酸の変化は、特にその変化が欠失および挿入等のグロス転位である場合、サザンハイブリダイゼーションを用いて検出することもできる。
【０１２２】
標的核酸または周囲のマーカー遺伝子の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）プローブを用いて、例えば、挿入または欠失等の変異を検出することができる。挿入および欠失は、標的核酸のクローニング、配列決定、および増幅により検出することもできる。一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析を用いて、対立遺伝子の塩基変化変異型を検出することもできる。例えば、Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２７６６−２７７０，１９８９、およびＧｅｎｏｍｉｃｓ，５：８７４−８７９，１９８９を参照されたい。ＳＳＣＰは、一本鎖ＰＣＲ産物の電気泳動易動度の変化による塩基差を識別する。一本鎖ＰＣＲ産物は、二本鎖ＰＣＲ産物を加熱するか、または他の方法で変性させることにより生成することができる。一本鎖核酸は、折り直すか、または塩基配列に部分的に依存する二次構造を形成してもよい。一本鎖増幅産物の異なる電気泳動移動度は、ＳＮＰ位置における塩基配列差に関係する。変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）は、多型ＤＮＡに固有の異なる配列依存性の安定性および溶解特性、および変性剤濃度勾配ゲル中の電気泳動易動度パターンの対応する差に基づいて、ＳＮＰ対立遺伝子を分化する。
【０１２３】
遺伝的変異は、マイクロアレイの使用により検出されてもよい。マイクロアレイは、典型的に、配列された一連の数千個の核酸プローブを用いて、例えば、ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ試料と高逼迫条件下でハイブリダイズする多重技術である。プローブ標的ハイブリダイゼーションは、典型的に、蛍光色素分子標識、銀標識、または化学発光標識された標的の検出により検出および定量され、標的中の核酸配列の相対存在度を決定する。典型的なマイクロアレイでは、プローブは、化学的マトリックスへの共有結合により（エポキシ−シラン、アミノ−シラン、リシン、ポリアクリルアミド、またはその他を介して）固体表面に付着する。個体表面は、例えば、ガラス、シリコンチップ、または微小ビーズである。様々なマイクロアレイは、市販されており、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．およびＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．により製造されるものを含む。
【０１２４】
ＳＮＰ遺伝子型決定の別の方法は、質量分析に基づく。質量分析は、ＤＮＡの４つのヌクレオチドのそれぞれの固有の質量を利用する。ＳＮＰは、代替ＳＮＰ対立遺伝子を有する核酸の質量の差を測定することにより、質量分析によって明確に遺伝子型決定することができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化‐飛行時間型）質量分析技術は、ＳＮＰ等の分子質量の極めて正確な決定に有用である。ＳＮＰ分析に対する多数の手法は、質量分析に基づいて開発された。ＳＮＰ遺伝子型決定の例示的な質量分析に基づく方法としては、プライマー伸長分析が挙げられ、伝統的なゲルに基づく形式およびマイクロアレイ等の他の手法との組み合わせで用いることもできる。
【０１２５】
配列特異的リボザイム（米国特許第５，４９８，５３１号）を用いて、リボザイム切断部位の発達または喪失に基づいてＳＮＰをスコアすることもできる。完全マッチ配列は、ヌクレアーゼ切断分解分析または溶解温度の差によりミスマッチ配列から区別することができる。ＳＮＰが制限酵素切断部位に影響する場合、ＳＮＰは、制限酵素分解パターンの変化により識別することができ、核酸断片長の対応する変化は、ゲル電気泳動により決定される。
【０１２６】
本発明の他の実施形態では、タンパク質に基づく検出技術を用いて、本明細書に記載される遺伝的変異を有する遺伝子よりコードされる変異型タンパク質を検出する。タンパク質の変異型形態の存在の決定は、当該技術分野において既知の任意の適した技術、例えば、電気泳動（例えば、変性または非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、２次元ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、および等電点分画電気泳動）、クロマトグラフィー（例えば、サイズクロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および陽イオン交換ＨＰＬＣ）、および質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析、およびタンデム質量分析）を用いて行うことができる。例えば、Ａｈｒｅｒ ａｎｄ Ｊｕｎｇａｂａｕｅｒ（２００６）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ｂ．Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．８４１：１１０−１２２、およびＷａｄａ（２００２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ｂ．７８１：２９１−３０１を参照されたい。適した技術は、検出される変異の性質に部分的に基づいて選択され得る。例えば、置換されたアミノ酸が、元のアミノ酸とは異なる電荷を有するアミノ酸置換をもたらす変異は、等電点電気泳動法により検出することができる。高電圧でのｐＨ勾配を有するゲルを通じたポリペプチドの等電点電気泳動法は、タンパク質をそれらのｐＩにより分離する。ｐＨ勾配ゲルを、野生型タンパク質を含む、同時に流れるゲルと比較することができる。変異が、新たなタンパク分解切断部位の生成、または既存のタンパク分解切断部位の排除をもたらす場合、試料は、タンパク分解に続いて、適切な電気泳動、クロマトグラフィー、または質量分析法を用いてペプチドマッピングに供される。変異の存在は、Ｅｄｍａｎ分解等のタンパク質配列決定法またはある特定の形態の質量分析を用いて検出されてもよい。
【０１２７】
これらの技術の組み合わせを用いる当該技術分野において既知の方法が用いられてもよい。例えば、ＨＰＬＣ顕微鏡タンデム質量分析法において、タンパク分解をタンパク質に対して行い、得られるペプチド混合物を、逆相クロマトグラフィー分離により分離する。次にタンデム質量分析を行い、そこから収集されたデータを分析する。（Ｇａｔｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７２：７５７−７６３）。別の実施例では、非分解ゲル電気泳動を、ＭＡＬＤＩ質量分析と組み合わせる（Ｍａｔｈｅｗ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１６：１３５−１３７）。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、タンパク質を特異的に結合する抗体またはペプチド等の試薬を用いて試料から単離され得、次に、上で開示される技術のいずれかを用いて、遺伝的変異の存在または非存在を決定するためにさらに分析され得る。
【０１２９】
あるいは、試料中の変異型タンパク質の存在は、本発明による遺伝的変異を有するタンパク質に特異的な抗体、つまり、変異を有するタンパク質に特異的に結合するが、変異を欠くタンパク質の形態には特異的に結合しない抗体に基づいて、免疫親和性分析により検出され得る。このような抗体は、当該技術分野において既知の任意の適した技術により生成することができる。抗体を用いて、溶液試料から特定のタンパク質を免疫沈降させるか、例えば、ポリアクリルアミドゲルにより分離されたタンパク質を免疫ブロットすることができる。免疫細胞化学的方法を、組織または細胞中の特定のタンパク質変異型を検出することにおいて用いることもできる。例えば、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫分析（ＲＩＡ）、免疫放射定量測定法（ＩＲＭＡ）、および免疫酵素分析（ＩＥＭＡ）を含む、他のよく知られた抗体に基づく技術を用いることもでき、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いるサンドウィッチ分析を含む。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号および第４，４８６，５３０号を参照されたい。
【０１３０】
追加の遺伝子マーカーの識別
開示される遺伝子マーカーは、ＡＤの発症と関連付けられる追加の遺伝子マーカーを識別するために有用である。例えば、本明細書において開示されるＳＮＰを用いて、連鎖不均衡にある追加のＳＮＰを識別することができる。実際に、ＡＤと関連付けられる第１のＳＮＰと連鎖不均衡にある任意のＳＮＰは、ＡＤと関連付けられる。所与のＳＮＰとＡＤとの間の関連が証明されると、ＡＤと関連付けられる追加のＳＮＰの発見は、この特定の領域内のＳＮＰの密度を増加させるために、大きな関心となり得る。
【０１３１】
追加のＳＮＰを識別し、連鎖不均衡分析を行うための方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、本明細書において開示されるＳＮＰとの連鎖不均衡にある追加のＳＮＰの識別は、（ａ）複数の個人からの第１のＳＮＰを含むか、または取り囲むゲノム領域からの断片を増幅させるステップと、（ｂ）該第１のＳＮＰを内包するか、または取り囲むゲノム領域内の第２のＳＮＰを識別するステップと、（ｃ）該第１のＳＮＰと第２のＳＮＰとの間で連鎖不均衡分析を行うステップと、（ｄ）該第１のマーカーと連鎖不均衡にあるとして該第２のＳＮＰを選択するステップと、を含み得る。
【０１３２】
組み合わせで使用するための追加の診断法
開示される遺伝子マーカーの検出は、対象がＡＤを有するとして、またはＡＤを発症する危険性が高いとして識別するための１つ以上の追加の診断手法と併せて用いられてもよい。例えば、対象は、本明細書において開示される遺伝子マーカーに加えて、追加の遺伝子マーカーについてスクリーニングすることができる。対象からの脳脊髄液は、ＡＤの特徴であるアミロイドβまたはτタンパク質のレベルの増加について分析され得る。対象は、記憶、集中力、および他の認知スキルを評価するために、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）等の精神状態の検査にも供され得る。対象は、アルツハイマー病を示す脳構造またはサイズの変化を識別するために、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴスキャン、またはＰＥＴスキャン等の撮像法にも供され得る。
【０１３３】
アルツハイマー病の診断、予知、および治療
本発明は、対象からの試料中の本明細書において開示されるＡＤと関連付けられる１つ以上の遺伝的変異の存在を検出することにより、対象におけるＡＤの診断および予知の方法を提供する。本発明の実施形態では、１つ以上の遺伝的変異は、インターロイキン−６受容体（ＩＬ６Ｒ）、神経栄養因子４（ＮＴＦ４）、およびＵＮＣ５Ｃ、ならびに表３に列挙される遺伝子のうちのいずれかをコードする遺伝子から選択される遺伝子内にある。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、遺伝子（またはその調節領域）をコードするゲノムＤＮＡ内にあり、この遺伝子は、インターロイキン−６受容体（ＩＬ６Ｒ）、神経栄養因子４（ＮＴＦ４）、およびＵＮＣ５Ｃ、ならびに表３に列挙される遺伝子のうちのいずれかをコードする遺伝子から選択される。様々な実施形態では、遺伝的変異は、インターロイキン−６受容体（ＩＬ６Ｒ）、神経栄養因子４（ＮＴＦ４）、およびＵＮＣ５Ｃ、ならびに表３に列挙される遺伝子のうちのいずれかをコードする遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子内のＳＮＰ、対立遺伝子、ハプロタイプ、挿入または欠失である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内でアミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰである。一実施形態では、遺伝的変異は、ｒｓ２２２８１４５における「Ｃ」対立遺伝子である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内でアミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰである。一実施形態では、遺伝的変異は、ｒｓ１２１９１８４２７における「Ｔ」対立遺伝子である。一実施形態では、遺伝的変異は、ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内でアミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰである。実施形態では、遺伝的変異は、表３に列挙されるものから選択される遺伝子内のＳＮＰである。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、ｒｓ１２７３３５７８、ｒｓ４６５８９４５、ｒｓ１４７８１６１、ｒｓ１０２４５９１、ｒｓ７７９９０１０、ｒｓ１０９６９４７５、およびｒｓ１２９６１２５０から選択されるＳＮＰである。これらの遺伝的変異のうちの任意の１つ以上は、以下に記載される検出、診断、および予知の方法のうちのいずれかにおいて用いられ得る。
【０１３４】
一実施形態では、本発明は、対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を示す遺伝的変異の存在または非存在を検出するための方法を提供し、この方法は、（ａ）対象からの試料を、ＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子から選択される遺伝子内の遺伝的変異の存在または非存在を検出することができる試薬と接触させることと、（ｂ）遺伝的変異の存在または非存在を決定することと、を含み、遺伝的変異の存在が、対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す。
【０１３５】
この方法において用いるための試薬は、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、およびリボザイムから選択され得る。いくつかの実施形態では、試薬は標識される。標識としては、例えば、放射性同位元素標識、蛍光標識、生物発光標識、または酵素標識が挙げられ得る。検出可能な標識として機能し得る放射性核種としては、例えば、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、およびＰｄ−１０９が挙げられる。
【０１３６】
本発明はさらに、対象におけるアルツハイマー病（ＡＤ）を示す遺伝的変異を検出するための方法を提供し、この方法は、対象からの生体試料中のＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子から選択される遺伝子内の遺伝的変異の存在もしくは非存在を決定することを含み、遺伝的変異の存在が、対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す。この方法の様々な実施形態では、１つ以上の遺伝的変異の存在の検出は、直接配列決定、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的プライマー伸長、対立遺伝子特異的増幅、対立遺伝子特異的ヌクレオチドの取り込み、５′ヌクレアーゼ分解、分子指標検定、オリゴヌクレオチド結紮検定、サイズ分析、および一本鎖高次構造多型からなる群から選択される過程により実行される。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝的変異の存在を決定する前に、試料からの核酸が増幅される。
【０１３７】
本発明はさらに、対象におけるＡＤを診断または予知するための方法を提供し、この方法は、（ａ）対象からの試料を、ＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子から選択される遺伝子内の遺伝的変異の存在または非存在を検出することができる試薬と接触させることと、（ｂ）遺伝的変異の存在または非存在を決定することと、を含み、遺伝的変異の存在が、対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す。
【０１３８】
本発明はさらに、対象におけるＡＤを診断または予知する方法を提供し、この方法は、対象からの生体試料中のＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子から選択される遺伝子内の遺伝的変異の存在もしくは非存在を決定することを含み、遺伝的変異の存在は、対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す。
【０１３９】
本発明は、対象におけるＡＤを診断または予知するための方法も提供し、この方法は、（ａ）対象からの試料を含む核酸を得ることと、（ｂ）試料を分析して、ＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子から選択される遺伝子内の少なくとも１つの遺伝的変異の存在または非存在を検出することと、を含み、遺伝的変異の存在は、対象がＡＤに罹患しているか、またはＡＤを発症する危険性があることを示す。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、診断または予知の方法は、対象をＡＤに関する１つ以上の追加の診断試験に供すること、例えば、１つ以上の追加の遺伝子マーカーをスクリーニングすること、精神状態の検査を行うこと、または対象を撮像法に供することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、試料を分析して、ＡＰＯＥ修飾因子である少なくとも１つの追加の遺伝子マーカーの存在を検出することをさらに含み、少なくとも１つの追加の遺伝子マーカーは、ＩＬ６Ｒをコードする遺伝子、ＮＴＦ４をコードする遺伝子、ＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子、および表３に列挙される遺伝子から選択される遺伝子内にある。
【０１４１】
上記方法のうちのいずれかは、方法の結果に基づいて、対象のＡＤを治療することをさらに含み得ることがさらに企図される。いくつかの実施形態では、上記方法は、試料中で少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在を検出することをさらに含む。一実施形態では、少なくとも１つの遺伝的変異の存在は、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在と一緒になると、少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子を有し、少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在を欠く対象と比較して、ＡＤの若年齢診断の危険性の増加を示す。
【０１４２】
ＡＤの若年齢の診断の危険性が増加した対象を識別する方法も提供され、この方法は、（ａ）対象からの生体試料中のＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、およびＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子から選択される遺伝子内の遺伝的変異の存在もしくは非存在を決定することと、（ｂ）少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在を決定することと、を含み、遺伝的変異および少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在が、遺伝的変異および少なくとも１つのＡＰＯＥ−ε４対立遺伝子の存在を欠く対象と比較して、対象のＡＤの若年齢診断の危険性が増加したことを示す。
【０１４３】
対象におけるＡＤの亜表現型の予知を補助する方法も提供され、対象に由来する生体試料中で、ＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、またはＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子内の遺伝的変異体の存在を検出することを含む。一実施形態では、遺伝的変異型は、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内のアミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰであり、ＡＤの亜表現型は、１人以上の対照対象と比較して、対象に由来する生体試料中の可溶性ＩＬ６Ｒのレベルの増加により少なくとも部分的に特徴付けられる。別の実施形態では、遺伝的変異は、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内のアミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰであり、ＡＤの亜表現型は、１人以上の対照対象と比較して、対象に由来する生体試料中のＴｒｋＢの活性の減少により少なくとも部分的に特徴付けられる。別の実施形態では、遺伝的変異は、ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内のアミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰであり、ＡＤの亜表現型は、１人以上の対照対象と比較して、対象に由来する生体試料中のＵＮＣ５Ｃのアポトーシス活性の増加により少なくとも部分的に特徴付けられる。
【０１４４】
本発明はさらに、ＩＬ６Ｒを標的とするＡＤ治療薬に対する対象の反応を予知する方法を提供し、この方法は、対象から得られた生体試料中で、ＩＬ６Ｒのアミノ酸配列（配列番号１）内のアミノ酸置換Ｄ３５８ＡをもたらすＳＮＰを検出することを含み、ＳＮＰの存在が、ＩＬ６Ｒを標的とする治療薬に対する反応を示す。一実施形態では、治療薬は、ＩＬ６Ｒ拮抗薬または結合剤、例えば、抗ＩＬ６Ｒ抗体である。
【０１４５】
本発明はさらに、ＴｒｋＢを標的とするＡＤ治療薬に対する対象の反応を予知する方法を提供し、この方法は、対象から得られた生体試料中で、ＮＴＦ４のアミノ酸配列（配列番号２）内のアミノ酸置換Ｒ２０６ＷをもたらすＳＮＰを検出することを含み、ＳＮＰの存在は、ＴｒｋＢを標的とする治療薬に対する反応を示す。一実施形態では、治療薬は、ＴｒｋＢ作動薬、例えば、ＴｒＫＢ作動薬抗体である。
【０１４６】
本発明はさらに、ＵＮＣ５Ｃを標的とするＡＤ治療薬に対する対象の反応を予知する方法を提供し、この方法は、対象から得られた生体試料中で、ＵＮＣ５Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）内のアミノ酸置換Ｔ８３５ＭをもたらすＳＮＰを検出することを含み、ＳＮＰの存在は、ＵＮＣ５Ｃを標的とする治療薬に対する反応を示す。一実施形態では、治療薬は、ＵＮＣ５Ｃ死ドメインを標的とする。
【０１４７】
上記の方法のうちのいずれかにおいて使用するための生体試料は、当業者に既知のある特定の方法を用いて得られてよい。生体試料は、脊椎動物、および特に哺乳類から得られてもよい。ある特定の実施形態では、生体試料は、脳脊髄液、神経細胞、または脳組織等の細胞または組織を含む。標的核酸（またはコードされたポリペプチド）内の変異は、組織試料から、または脳脊髄液、血液、血清、尿、痰、唾液、粘膜剥離物、涙腺分泌物、もしくは汗等の他の体液試料から検出され得る。このような体試料をスクリーニングすることにより、ＡＤ等の疾患について簡単な早期診断を行うことができる。さらに、治療の進行は、標的核酸（またはコードされたポリペプチド）内の変異について、このような体試料を試験することによりさらに容易に監視することができる。いくつかの実施形態では、生体試料は、ＡＤを有することが疑われる個人から得られる。
【０１４８】
対象、または対象から得られる生体試料が、本明細書において開示される遺伝的変異を含むという決定に続いて、対象におけるＡＤを治療するために、有効な量の適切なＡＤ治療薬が対象に投与され得ることが企図される。
【０１４９】
上記の方法により、本明細書において開示されるＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、またはＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子のうちの任意の１つ以上、または表３に列挙される遺伝子内に遺伝的変異を含む、核酸内の１つ以上の変異の存在を検出することにより、哺乳類におけるＡＤの診断を補助するための方法も提供される。
【０１５０】
別の実施形態では、上記の方法により、対象が本明細書において開示されるＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、もしくはＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子のうちの１つ以上、または表３に列挙される遺伝子内に変異を含むか否かを決定することにより、ＡＤを持つ対象が、治療薬に反応するか否かを予知するための方法が提供される。
【０１５１】
対象において、本明細書において開示されるＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、またはＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子のうちの任意の１つ以上、または表３に列挙される遺伝子内の遺伝的変異の存在または非存在を検出することにより、対象がＡＤを発症する傾向を評価するための方法も提供される。
【０１５２】
本明細書において開示されるＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、もしくはＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子のうちの任意の１つ以上、または表３に列挙される遺伝子内の遺伝的変異の存在を検出することを含む、哺乳類においてＡＤを亜分類する方法も提供される。
【０１５３】
患者亜集団におけるＡＤを治療するために有効な治療薬を識別する方法も提供され、本方法は、本明細書において開示されるＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、もしくはＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子のうちの任意の１つ以上、または表３に列挙される遺伝子内のＳＮＰに対応するヌクレオチド位置における遺伝的変異の存在と、薬剤の有効性とを相関させることを含む。
【０１５４】
追加の方法は、必要に応じて、適切な臨床介入ステップを決定するために有用な情報を提供する。したがって、本発明の方法の一実施形態では、この方法は、本明細書において開示されるＡＤと関連付けられる遺伝子内の変異の存在または非存在の評価の結果に基づいて、臨床介入ステップをさらに含む。例えば、適切な介入は、予防的および治療ステップ、または本発明の方法により得られる遺伝子情報に基づく任意の当時最新の予防的もしくは治療ステップの調整（複数可）を伴い得る。
【０１５５】
当業者に明らかとなるように、本明細書に記載される任意の方法で、変異の存在の検出は、疾患の特徴（例えば、疾患の存在または亜型）を陽性に示すが、変異の非検出もまた、疾患の相互特性化を提供することにより有益となる。
【０１５６】
なおもさらなる方法としては、哺乳類におけるＡＤを治療する方法を含み、哺乳類からの生体試料を得るステップと、その生体試料を本明細書において開示される変異の存在または非存在について検査するステップと、該組織または細胞試料中の変異の存在または非存在を決定したときに、有効な量の適切な治療薬を該哺乳類に投与するステップと、を含む。任意に、この方法は、有効な量の標的ＡＤ治療薬を該哺乳類に投与することを含む。
【０１５７】
本明細書において開示されるＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、もしくはＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子の任意の１つ以上、または表３に列挙される遺伝子内のＳＮＰに対応するヌクレオチド位置において遺伝的変異が存在することが知られている対象におけるＡＤを治療する方法も提供される。
【０１５８】
ＡＤを有する対象を治療する方法も提供され、この方法は、本明細書において開示されるＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、もしくはＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子のうちの任意の１つ以上、または表３に列挙される遺伝子内のＳＮＰに対応するヌクレオチド位置において遺伝的変異を有する対象の状態を治療するために有効であることが知られている治療薬を対象に投与することを含む。
【０１５９】
ＡＤを有する対象を治療する方法も提供され、この方法は、それぞれが、本明細書において開示されるＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、もしくはＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子のうちの任意の１つ以上、または表３に列挙される遺伝子内のＳＮＰに対応するヌクレオチド位置において遺伝的変異を有する少なくとも５人のヒト対象に薬剤が投与される、少なくとも１つの臨床研究において、該状態を治療するために有効であることが以前に示された治療薬を対象に投与することを含む。一実施形態では、少なくとも５人の対象は、少なくとも５人の対象群について、全体で２つ以上の異なるＳＮＰを有した。一実施形態では、少なくとも５人の対象は、少なくとも５人の対象群全体で同一のＳＮＰを有した。
【０１６０】
特異的なＡＤ患者亜集団である、ＡＤ対象を治療する方法も提供され、亜集団に対する治療薬として承認される有効な量の治療薬を対象に投与することを含み、亜集団は、本明細書において開示されるＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、もしくはＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子のうちの任意の１つ以上、または表３に列挙される遺伝子内のＳＮＰに対応するヌクレオチド位置における遺伝的変異との関連により少なくとも部分的に特徴付けられる。
【０１６１】
一実施形態では、亜集団はヨーロッパ系である。一実施形態では、本発明は、ＡＤ治療薬を製造することと、ＡＤを有するか、または有すると考えられ、本明細書において開示されるＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、もしくはＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子のうちの任意の１つ以上、または表３に列挙される遺伝子内のＳＮＰに対応する位置において遺伝的変異を有する対象にその薬剤を投与するための指示とともに、薬剤を包装することと、を含む、方法を提供する。
【０１６２】
ＡＤ治療薬で治療するためのＡＤを患う患者を選択するための方法も提供され、本明細書において開示されるＩＬ６Ｒ、ＮＴＦ４、もしくはＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子のうちの任意の１つ、または表３に列挙される遺伝子内のＳＮＰに対応するヌクレオチド位置における遺伝的変異の存在を検出することを含む。
【０１６３】
ＡＤの治療のための治療薬は、いくつかの実施形態では、製薬学的用途に適した組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、典型的に、ペプチドまたはポリペプチド、および許容される担体、例えば、薬学的に許容されるものを含む。「薬学的に許容される担体」としては、薬品投与に適合する任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等が挙げられる（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（２０００））。このような担体または希釈剤の例としては、限定されないが、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソームおよび不揮発性油等の非水性媒体が用いられてもよい。従来の媒体または薬剤が活性成分と適合しない場合を除いて、これらの組成物の使用が企図される。補足的活性成分を組成物に組み込むこともできる。
【０１６４】
本発明の治療薬（およびＡＤの治療のための任意の追加の治療薬）は、非経口、肺内、髄腔内、および鼻腔内を含み、局所治療の必要に応じて、病巣内投与を含む任意の適した手段により投与することができる。非経口注入としては、例えば、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。投薬は、投与が短期であるか、または長期であるかに部分的に依存して、任意の適した経路、例えば、静脈内または皮下注入等の注入によることができる。限定されないが、様々な時点での単回または複数回投与、ボーラス投与、およびパルス点滴を含む様々な投薬スケジュールが本明細書において企図される。
【０１６５】
本発明のある特定の実施形態は、血液−脳障壁を越えるＡＤ治療薬を提供する。いくつかの当該技術分野において既知の手法は、限定されないが、身体的方法、脂質に基づく方法、ならびに受容体およびチャネルに基づく方法を含む、血液−脳障壁を越えて分子を輸送するために存在する。
【０１６６】
血液−脳障壁を越えてＡＤ治療薬を輸送する身体的方法としては、限定されないが、血液−脳障壁を全体的に回避するか、または血液−脳障壁内に開口を形成することが挙げられる。回避法としては、限定されないが、脳への直接注入（例えば、Ｐａｐａｎａｓｔａｓｓｉｏｕｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ９：３９８−４０６（２００２）を参照）、および脳内に送達デバイスを埋め込むこと（例えば、Ｇｉｌｌｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：５８９−５９５（２００３）、およびＧｌｉａｄｅｌ Ｗａｆｅｒｓ（商標）Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌを参照）が挙げられる。障壁内に開口を形成する方法としては、限定されないが、超音波（例えば、米国特許公開第２００２／００３８０８６号参照）、浸透圧（例えば、高張マンニトールの投与による（Ｎｅｕｗｅｌｔ，Ｅ．Ａ．，Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，Ｖｏｌｓ １＆２，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））による）、例えば、ブラジキニンまたは透過剤Ａ−７による透過（例えば、米国特許第５，１１２，５９６号、第５，２６８，１６４号、第５，５０６，２０６号、および５，６８６，４１６号参照）、ならびに抗体またはその断片をコードする遺伝子を含むベクターとの血液−脳障壁をまたぐニューロンのトランスフェクション（例えば、米国特許公開第２００３／００８３２９９号を参照）が挙げられる。
【０１６７】
血液−脳障壁を越えてＡＤ治療薬を輸送する脂質に基づく方法としては、限定されないが、ＡＤ治療薬を、血液−脳障壁の血管内皮上の受容体に結合する抗体結合断片に連結するリポソーム内に被包すること（例えば、米国特許出願公開第２００２００２５３１３号を参照）、およびＡＤ治療薬を低密度リポタンパク質粒子（例えば、米国特許出願公開第２００４０２０４３５４号を参照）またはアポリポタンパク質Ｅ（例えば、米国特許出願公開第２００４０１３１６９２号を参照）でコーティングすることが挙げられる。
【０１６８】
血液−脳障壁を越えてＡＤ治療薬を輸送する受容体に基づく方法としては、限定されないが、血液−脳障壁において発現した受容体を認識するリガンドへのＡＤ治療薬の共役が挙げられ、受容体媒介性トランスサイトーシス後にそれらを血液−脳障壁を越えて運ぶ（Ｇａｂａｔｈｕｌｅｒ（２０１０）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ ３７；４８−５７）。これらのリガンドとしては、限定されないが、脳毛細血管内皮受容体、例えば、トランスフェリン受容体もしくはインスリン受容体に対するモノクローナル抗体、ヒストン、ビオチン、葉酸、ナイアシン、パントテン酸、またはグリコペプチドのリガンドが挙げられる。
【０１６９】
ＡＤ治療薬を投与するための有効な用量およびスケジュールは、経験的に決定されてよく、このような決定を行うことは、当該技術分野における技術の範囲内である。単回投与または複数回投与が用いられてもよい。ＡＤ治療薬のインビボ投与が用いられるとき、投与の経路に応じて、正常な用量は、哺乳類の体重１ｋｇ当たり約１０ｎｇ〜最大１００ｍｇ以上、好ましくは、１日当たり約１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇで異なり得る。送達の特定の用量および方法に関する案内は、文献において提供され、例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、または第５，２２５，２１２号を参照されたい。
【０１７０】
さらに追加の療法がこの方法において用いられ得ることが企図される。１つ以上の他の療法としては、限定されないが、追加のＡＤ治療薬、例えば、コリンエステラーゼ阻害薬、メマンチン、抗興奮薬、抗うつ薬、抗不安薬、またはアミロイド前駆体タンパク質、アミロイドβ、アミロイドプラーク、もしくは限定されないが、α−セクレターゼ、β−セクレターゼ、およびγ−セクレターゼ等を含む、アミロイド前駆体タンパク質を切断する酵素のいずれかの投与が挙げられ得る。
【０１７１】
キット
本明細書において説明または示唆される用途で用いるために、製造者のキットまたは物品も提供される。このようなキットは、厳重な管理下で、バイアル、管等の１つ以上の容器手段を受容するように区分化された担体手段を備えてよく、容器手段のそれぞれは、この方法において用いられる別個の要素のうちの１つを含む。例えば、容器手段のうちの１つは、検出可能に標識されるか、または標識され得るプローブを備えてよい。このようなプローブは、本明細書において開示されるＡＤと関連付けられる遺伝的変異を含むポリヌクレオチドに特異的なポリヌクレオチドであってよい。キットが核酸ハイブリダイゼーションを用いて標的核酸を検出する場合、キットは、標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチド（複数可）を含む容器、および／または酵素、蛍光、もしくは放射性同位元素標識等のレポーター分子に結合されるアビジンもしくはストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質等のレポーター手段を含む容器も有し得る。
【０１７２】
他の実施形態では、このキットは、本明細書において開示されるＡＤと関連付けられる遺伝的変異を含むポリヌクレオチドを検出することができる標識薬剤を含み得る。このような薬剤は、ポリペプチドを結合する抗体であり得る。このような薬剤は、ポリペプチドを結合するペプチドであり得る。このキットは、例えば、本明細書において開示される遺伝的変異型を含むポリペプチドに結合する第１の抗体（例えば、固体支持体に付着される）、およびポリペプチドまたは第１の抗体のいずれかに結合し、検出可能な標識に共役される、任意に第２の異なる抗体を含み得る。
【０１７３】
キットは、典型的に、上記の容器と、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用上の指示を伴う添付文書を含む、商業的およびユーザーの視点から望ましい材料を含む１つ以上の他の容器と、を備える。標識は、組成物が特定の治療または非治療的用途に用いられることを示すために容器上に提示され得、上記のもの等のインビボ使用またはインビトロ使用のいずれかに関する指示も示し得る。キットの他の任意の構成要素としては、１つ以上の緩衝剤（例えば、ブロック緩衝剤、洗浄緩衝剤、基質緩衝剤等）、酵素標識により化学的に変化する基質（例えば、クロモゲン）等の他の試薬、エピトープ抽出溶液、対照試料（正および／または負の対照）、対照スライド（複数可）等が挙げられる。
【０１７４】
マーケティングの方法
本明細書における発明は、ＡＤの診断または予知について開示された方法をマーケティングするための方法も包含し、対象とする顧客層に対して、開示された方法の使用を宣伝すること、指導すること、および／または指定することを含む。
【０１７５】
マーケティングは、一般に、スポンサーが特定され、メッセージが操作される、非個人的媒体を通じた有料の通信である。本明細書における目的で、マーケティングは、広告、広報、プロダクトプレースメント、スポンサーシップ、引受業務等を含む。この用語は、印刷通信媒体のいずれかにおいて現れる、スポンサー提供の情報公告も含む。
【０１７６】
本明細書における診断方法のマーケティングは、任意の手段により達成され得る。これらのメッセージを送達するために用いられるマーケティング媒体の例としては、テレビ、ラジオ、映画、雑誌、新聞、インターネット、および広告板を含み、放送メディア内に現れるメッセージである宣伝を含む。
【０１７７】
用いられるマーケティングの種類は、多くの要因、例えば、届けられる対象とする顧客層の性質、例えば、病院、保険会社、クリニック、医師、看護師、および患者、ならびに経費検討および医薬品および診断のマーケティングを統制する関連管轄法および規則に依存する。マーケティングは、サービス相互作用により定義されるユーザーの特徴、および／またはユーザーの人口学的および地理的位置等の他のデータに基づいて個別化またはカスタマイズされ得る。
【０１７８】
以下は、本発明の方法および組成物の例である。上で提供される一般的な説明を考慮すると、様々な他の実施形態が実践されてよいことが理解される。
【実施例】
【０１７９】
実施例１：ＡＰＯＥ修飾因子のスクリーニング
アルツハイマー病（ＡＤ）の発症に対するＡＰＯＥの影響を修飾する変異型を識別するために研究を設計した。この研究設計を図１に示す。６５歳未満のＡＤを有する対象から単離されたＤＮＡ、したがって恐らくリスク対立遺伝子に対して強化されたＤＮＡ（「症例」）を、７５または８０歳以上のＡＤを有しない、神経学的検査により正常な認知を持つ対象から単離されたＤＮＡ、したがって恐らく保護的対立遺伝子に対して強化されたＤＮＡ（「スーパー対照」）と比較した。全ての対象は、ＡＰＯＥ Ｅ４対立遺伝子に対してホモ接合性（Ｅ４／Ｅ４）またはヘテロ接合性（Ｅ３／Ｅ４）のいずれかであり、ヨーロッパ系子孫の米国在住者であり、アルツハイマー病全国細胞貯蓄所（ＮＣＲＡＤ）から得られた。表１に示されるように、コホート１の症例は、合計３１件の非関連Ｅ４／Ｅ４ホモ接合体症例、および５０件の認知症発症年齢５５歳超〜６５歳未満のＥ３／Ｅ４アルツハイマー症例を含んでいた。症例の約３分の１について、ＡＤの診断は剖検により確認した。コホート１のスーパー対照は、１９件の８０歳以上のＥ３／Ｅ４ヘテロ接合体、および５０件の７５歳異常のＥ４／Ｅ４ホモ接合体を含んでいた。全対照は、臨床認知症評価法（ＣＤＲ）スケールがゼロに等しく、最後の訪問で認知障害の証拠を示さなかった。試料のＡＰＯＥ対立遺伝子は、全ゲノム配列決定（ヘテロ接合体の場合）またはエクソーム配列決定（ホモ接合体の場合）により確認した。
【０１８０】
【表１】
2018166507.tif 000003
【０１８１】
ＡＰＯＥリスクの一般的修飾因子
ゲノム全領域関連走査をコホート１において行い、ＡＰＯＥリスクを修飾する一般的変異型を識別した。コホート１内の対象を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ １Ｍ ＳＮＰ配列を用いて遺伝子型決定した。遺伝子型決定データの品質制御は、Ｇａｔｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２００９） Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２００９Ｎｏｖ；４１（１１）：１２２８−１２３３に記載のとおり行った。コホート１（表１）を発見段階に用いた。ヒト染色体１上のＩＬ６Ｒ／ＳＨＥ／ＴＤＲ１０領域内の一般的変異型は、コホート１の８１件のＥ４＋症例対６８件のＥ４＋対照において著しい関連を示した（図２）。
【０１８２】
国立老化研究所の遅発型アルツハイマー病家族研究：感受性遺伝子座のゲノム全領域関連研究（ｄｂＧＡＰ研究ＩＤ：ｐｈｓ０００１６８．ｖ１．ｐ１）について、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトにおいて入手可能な遺伝子型および発現型（ｄｂＧＡＰ）のデータベースから複製データセットを得た。ＮＩＡ／ＬＯＡＤ研究は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ６１０Ｋ ＳＮＰ配列について遺伝子型決定されたヨーロッパ系アメリカ人子孫の９３２件のＡＤ症例、および８３６件の対照で構成された。２００件のＥ４ヘテロ接合体およびホモ接合体症例（診断年齢６５歳未満）、ならびに１４４件のＥ４ヘテロ接合体およびホモ接合体対照（最終訪問時の年齢７５歳以上）を選択した。
【０１８３】
表２に示されるように、ＩＬ６Ｒをコードする遺伝子内のＳＮＰ（ｒｓ２２２８１５４）は、発見および複製コホートの両方において、ＡＤと著しく関連付けられることが確認された。多型部位においてＣを有するＳＮＰ ｒｓ２２２８１４５の変異型（「Ｃ対立遺伝子」）は、対照と比較して、ＡＤ症例において優先的に見出された。この対立遺伝子は、ＩＬ６Ｒ内にアミノ酸置換Ｄ３５８Ａを含む。
【０１８４】
【表２】
2018166507.tif 000004
【０１８５】
ＩＬ６ＲのＡ３５８変異型対立遺伝子の分布は、ＮＩＡ／ＬＯＡＤ研究からの９３２件の非選択ＡＤ症例および８３６件の対照においてさらに検査した。ＮＩＡ／ＬＯＡＤ対象におけるＡＰＯＥ多型の臨床評価および遺伝子型決定は、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ．６５：１５１８−１５２６において説明されている。図３は、ＡＤ症例における発病年齢および対照における年齢により層別された、ＮＩＡ／ＬＯＡＤ研究からの非選択ＡＤ症例および対照におけるｒｓ４１２９２６７のＴ対立遺伝子、ｒｓ２２２８１４５のＣ対立遺伝子の代用の頻度を示す。Ａ３５８変異型対立遺伝子は、対照と比較して、早発型症例においてより頻繁に存在したが、対照と比較して、遅発型症例において低頻度であり、疾患修飾変異型と一致した。
【０１８６】
インターロイキン−６受容体（ＩＬ６Ｒ）は、細胞増殖および分化を調節し、免疫反応において重要な役割を果たす強力な多面的サイトカインである、サイトカインインターロイキン６（ＩＬ−６）の受容体である。ＩＬ６Ｒ Ａ３５８は、血清ＩＬ６Ｒレベルの増加と関連付けられる共通変異型対立遺伝子である（Ｇａｌｉｃｉａ ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５：５１３、Ｍａｒｉｎｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６９：１１９１）。Ａ３５８変異型対立遺伝子は、ＣＲＰ循環レベルの減少および冠動脈性心疾患リスクの減少（Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００９） ＪＡＭＡ ３０２：３７−４８）、ならびに喘息リスクの増加（Ｆｅｒｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１１） Ｌａｎｃｅｔ ３７８：１００６−１０１４）と関連付けられている。
【０１８７】
ＩＬ６Ｒ ｍＲＮＡの発現がＡＤにおいて上昇するか、および／または３５８位における遺伝子型により影響されるかを検査するために、ＴＧＥＮプロジェクトからのデータ（Ｗｅｂｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．８４：４４５−４５８）を分析し、対照と比較して、ＡＤを持つ対象の脳内の膜結合および可溶性ＩＬ６Ｒの両方の発現レベルを比較した。ＩＬ６Ｒ（ＮＭ＿０００５６５）の膜結合形態のみを検出するプローブを用いて、ＡＤ内または３５８位における遺伝子型による強化は観測されなかった。しかしながら、膜結合およびｓＩＬ６Ｒ（ＮＭ＿１８１３５９）ｍＲＮＡの両方を捕捉するプローブを用いて、対照と比較して、ＡＤ症例において、脳の側頭部内および３５８位の遺伝子型による著しい強化が観測された（図４）。
【０１８８】
さらに、ＩＬ６Ｒ領域に対して、表３に列挙される領域は、コホート１およびＮＩＡ／ＬＯＡＤデータセットにおいて著しい関連を示し、これらの遺伝子座が、ＡＰＯＥリスクの追加の一般的修飾因子であり得ることを示唆する。
【０１８９】
【表３】
2018166507.tif 000005
【０１９０】
ＡＰＯＥ修飾因子のスクリーニングにおける希少変異型
ニューロトロフィン４（ＮＴＦ４）
上で開示された共通変異型に加えて、ＡＰＯＥ修飾因子スクリーニングは、ＡＤと関連付けられた希少変異型の識別ももたらした。全体集団内で２％未満の対立遺伝子頻度を有する、これらの希少変異型は、ＮＴＦ４のＲ２０６Ｗ変異型を含んでいた。ＮＴＦ４のＲ２０６Ｗ変異型は、７８件のＡＤ症例のうち２件（２．６％）および６７件のスーパー対照のうち０件（０．０％）において見出された。さらに、Ｒ２０６Ｗ変異型は、試料採取の時点でＡＤを有しない１３００人のエクソーム配列決定されたヨーロッパ系アメリカ人（Ｐ＝１．８７ｘ１０−９）において、ＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクト（ＥＳＰ）エクソーム変異型サーバーから得られたデータを用いて観測されなかった。
【０１９１】
ＮＴＦ４のＲ２０６Ｗ変異型は、染色体１９上のＳＮＰ ｒｓ１２１９１８４２７の部位におけるＣからＴへの置換から生じる。ニューロトロフィン４は、哺乳類ニューロンの生存および分化を制御する、神経栄養因子、ニューロトロフィン（ＮＴ）のファミリーメンバーである。ニューロトロフィンは、特定のチロシンキナーゼ受容体、Ｔｒｋを担持するニューロンのサブセットの維持、増殖、および分化に関与する。ＮＴによるＴｒｋ活性化は、プログラム細胞死の否定を通じてニューロンの生存を促進する（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．８：２５８９−２５９７）。ＮＴＦ４は、末梢ニューロンおよび交感神経ニューロンの生存を促進し、ＴｒｋおよびＴｒｋＢの両方を活性化する（Ｂｅｒｋｅｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｎｅｕｒｏｎ ７：８５７−８６６）。
【０１９２】
ＮＴＦ４ Ｒ２０６Ｗ変異型は、対照と比較して、緑内障を持つ対象において過剰であることが以前に報告されている（（Ｐａｓｓｕｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．８５：４４７−４５６）、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．８６：４９８−４９９）。変化した残基は、チンパンジー、イヌ、マウス、およびラットにおける相同分子種の中で高度に保存され、ＴｒｋＢ結合部位内に位置する。変異型タンパク質は、ＴｒｋＢを活性化する能力が低減し、神経突起伸長において機能不全を示す。変異型タンパク質は、したがって、ニューロンの生存に影響を有することが予測される（Ｐａｓｓｕｔｏ ｅｔ ａｌ．上記）。
【０１９３】
ＡＰＯＥ４担体におけるＮＴＦ４のこの機能不全Ｒ２０６Ｗ変異型と早発型ＡＤとのこの新たに識別された関連は、ＮＴＦ４経路の活性化が、ＡＤの発症に対して保護的であり得ること、およびＴｒｋＢ受容体が、ＡＤの治療のための有力な治療法であり得ることを示唆する。
【０１９４】
実施例２：家族ベースのスクリーニング
Ａｌｉｓｏｎ Ｇｏａｔｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）との共同によりＬＯ１系統を入手した。ＬＯ１系統は、ＡＤの優性遺伝を示唆するパターンを示した。発端者は、５人の兄弟のうちの１人であり、うち２人はＡＤも有したが、別の兄弟のＡＤ状態は不明であった。発端者の母親はＡＤを有し、父親は有していなかった。発端者の片親が異なる兄弟、別の配偶者による発端者の父親の子供はＡＤを有していなかった。発端者および兄弟の子供のうち、４人がＡＤを有した。家族におけるＡＤ発病年齢は、５８歳から８７歳の範囲であった。ノンパラメトリック連鎖分析は、ＬＯ１系統の１６メンバーから得られたＩｌｌｕｍｉｎａ連鎖配列を用いて収集された遺伝子型データを用いて実行した。ＮＰＬ連鎖は、ＱＣｅｄデータセットを用いて、ＭＥＲＬＩＮソフトウェアを使用して実行した。ＬＯ１系統におけるノンパラメトリック連鎖分析の結果を図５に示し、１．５を超えるＮＰＬロッドスコアを持つ３つの領域が観測された。３つの連鎖間隔内の潜在的原因対立遺伝子を識別するために、発端者に対してエクソーム配列決定を行い（Ｉｌｌｕｍｉｎａショット読取技術）、分析は、１．５を越えるＬＯＤスコアを有するＮＰＬ連鎖ピークに制限した。新規性（ｄｂＳＮＰ内の存在または１００ゲノムプロジェクトデータとして定義される）、ヘテロ接合性、および推定機能に基づいて、得られた４，１５３変異型をランク付けした。別のＡＤ症例（発端者の姪）の遺伝子型は、完全ゲノム配列決定（ＣＧＩ）を用いて決定し、上位５つの変異型の存在または非存在を決定した。単一変異型はこの過程により識別され、染色体４内に位置する。この変異型の存在または非存在は、発端者、発端者の母親、３人の兄弟、および発端者および兄弟全員の子供を含む、ＬＯ１系統の１９人に対して決定した。１１人の保有者のうち、８人がＡＤを有したが、その他１人の疾患状態は不明であった。残り２人の保有者は、ＡＤを有していなかったが、７５歳未満であった。変異型を欠く８人の家族は誰もＡＤを有していなかった。
【０１９５】
変異型は、染色体４内のＧからＡへの置換であることが判明し、ＵＮＣ５Ｃをコードする遺伝子内のアミノ酸置換Ｔ８３５Ｍをもたらす。ＵＮＣ５Ｃは、ネトリン受容体のＵＮＣ５ファミリーメンバーであり、ネトリン１の受容体である。ＵＮＣ５Ｃは、海馬ニューロン内で高度に発現する。ＵＮＣ５Ａ、Ｂ、およびＣは、特定の軸索に対するネトリン１の化学反発作用を媒介する。これらの受容体は、それらのネトリン１リガンドに非結合するとき、アポトーシスを誘導する依存受容体でもある。これらの受容体のプロアポトーシス活性は、カスパーゼによる受容体の切断、および細胞内ドメインのＣ末端内の保存死ドメインの存在に依存する。
【０１９６】
ＳＩＦＴプログラム（Ｎｇ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：３８１２−３８１４）を用いて、このアミノ酸置換がタンパク質機能に影響することが予想されるか否かを予測した。０．０５未満のＳＩＦＴスコアは、有害な置換を示す。Ｔ８３５Ｍ変異型のＳＩＦＴスコアは、０．０１であり、この変異型が有害である可能性が高いことを示す。他のＵＮＣ５ファミリーメンバーに対する整列（図６）は、この変異型が保存されたモチーフ内に存在することを示す。ＵＮＣ５タンパク質の構造に基づいて、この変異型は、アポトーシスの下流調節因子と相互作用する領域である、死ドメインとＺＵ５ドメインとの間のヒンジ領域内にある（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１７４８３−１７４９０）。ネトリン受容体としてのＵＮＣ５Ｃの機能およびその海馬ニューロン内の高い発現を考慮すると、Ｔ８３５Ｍ変異型は、ＵＮＣ５Ｃの死ドメインが、開いた活性化状態で優先的に見出されるように、ＵＮＣ５Ｃシグナル伝達に作用し得、プロアポトーシスシグナル伝達およびニューロン細胞死の増加をもたらす。ＡＤを持つＵＮＣ５ＣのＴ８３５Ｍ変異型のこの新たに識別された関連は、このＵＮＣ５Ｃ変異型の異常なアポトーシスシグナル伝達が、ＡＤの治療のための潜在的な治療手法であり得ることを示唆する。
【０１９７】
実施例１に記載されるＡＰＯＥ修飾因子スクリーニングからのデータを、ＵＮＣ５ＣのＴ３８５Ｍ変異型の存在について評価した。ＵＮＣ５ＣのＴ８３５Ｍ変異型は、２／７８ＡＤ症例および１／６７対照において観測された。６，０００を越える追加の対照の遺伝子型決定は、ヨーロッパ系アメリカ人集団におけるＴ８２５Ｍの集団対立遺伝子頻度が０．０００７１（９／６３１５人がＴ８３５Ｍに対してヘテロ接合性）（表４）、ＡＤ症例頻度が０．０１３（Ｐ＝１．５ｘ１０−７）であることを確立した。このデータは、Ｔ８３５ＭがＡＤの危険性を増大させる希少変異型であることを示唆する。
【０１９８】
【表４】
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【０１９９】
実施例３：Ａ３５８と可溶性ＩＬ６Ｒレベルの増加との関連
アルツハイマー病脳画像診断先導的研究（ＡＤＮＩ；Ｗｅｉｎｅｒ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ′ｓ ＆ Ｄｅｍｅｎｔｉａ ６：２０２−２１１）からの２９１試料に対するデータにおいて、脳脊髄液（ＣＳＦ）中の可溶性ＩＬ６Ｒ（ｓＩＬ６Ｒ）レベルとＩＬ６Ｒ遺伝子領域内のＳＮＰにおける遺伝子型との間の関連について試験を行った。対象は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ’ｓ Ｈｕｍａｎ６１０Ｑｕａｄゲノム全領域ＳＮＰ配列を用いて遺伝子型決定し、ｓＩＬ６Ｒは、Ｒｕｌｅｓ Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＭｙｒｉａｄＲＢＭ）により開発されたＬｕｍｉｎｅｘ免疫測定技術に基づいて、免疫測定パネルを用いて測定した。各ＳＮＰにおいて、ｌｏｇ（ｓＩＬ６Ｒ）の線形回帰は、付加的にコードされるＳＮＰ遺伝子型（０、１、または２変異対立遺伝子）上で行い、遺伝子型のエフェクトサイズはゼロであるという帰無仮説を試験した。ＩＬ６Ｒ遺伝子内の変異型は、ＣＳＦ中のｓＩＬ６Ｒの増加との著しい関連を示し（図７）、ＳＮＰ ｒｓ４１２９２６７、ｒｓ２２２８１４５の代用との最も強い関連を示した。
【０２００】
上述のように、ＳＮＰ ｒｓ２２２８１４５の変異型は、ＩＬ６Ｒ内のアミノ酸置換Ｄ３５８Ａをもたらす。表５に示されるように、３５８位におけるＩＬ６Ｒ遺伝子型は、ＣＳＦ中の可溶性ＩＬ６Ｒレベルと相関し、Ａ３５８変異対立遺伝子の存在は、ＣＳＦ ｓＩＬ６Ｒのより高いレベルと関連付けられる。
【０２０１】
【表５】
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【０２０２】
ＩＬ６Ｒ脱落に対するＩＬ６Ｒ内のＡ３５８変異型の存在の影響を、インビトロおよびインビボの両方で試験した。インビトロ実験の場合、２９３Ｔ細胞をＩＬ６ＲのＤ３５８またはＡ３５８構成体でトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、媒質を変え、細胞を１００ｎＭホルボールミリスチン酸酢酸塩（ＰＭＡ）で０、３０、６０、および１２０分間処理した。治療後に細胞を採取し、ＩＬ６Ｒ−ＰＥ抗体で染色した（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ−５５１８５０）。膜結合ＩＬ６ＲをＦＡＣＳにより分析した。図８は、ＰＭＡによる処理後の連続的な時点における０分時点に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）率を示す。このデータは、検出される細胞結合ＩＬ６Ｒの量が、野生型Ｄ３５８含有試料内で検出されるものとは対照的に、変異型Ａ３５８含有試料内で顕著に減少したため、Ａ３５８変異型が、２９３Ｔ細胞内のＩＬ６Ｒの脱落の増加をもたらすことを示す。
【０２０３】
ＩＬ６Ｒ内のＡ３５８変異型対立遺伝子の存在が、一次Ｔ細胞内のＩＬ６Ｒの脱落の増加ももたらすか否かを決定するための実験も行った。健常なヒトボランティアを、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＴａｑＭａｎ ＳＮＰ遺伝子型決定分析（分析ＩＤ Ｃ＿１６１７０６６４＿１０）を用いて、実時間定量的ＰＣＲにより、ＩＬ６Ｒ ＳＮＰ ｒｓ２２２８１４５について遺伝子型決定した。年齢、性別、および人種が一致する一対のホモ接合性ドナー（それぞれ遺伝子型ＡＡおよびＣＣを持つドナー）からＦｉｃｏｌ勾配により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＥａｓｔＳｅｐ ＣＤ４＋Ｔ細胞強化キット（Ｃａｔ．Ｎｏ．１９０５２）を製造者により推奨されるように用いて、負の選択により精製した。次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、７２時間、ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ ＦＢＳ＋２−メルカプトエタノール中で培養し、１００ｎＭ ＰＭＡにより６０分間処理した。処理後すぐに細胞を採取し、ＩＬ６Ｒ−ＰＥ抗体で染色した（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ−５５１８５０）。膜結合ＩＬ６ＲをＦＡＣＳにより分析した。図９は、ＩＬ６Ｒの膜結合分画が、ＰＭＡによる活性化後、野生型Ｄ３５８ ＩＬ６Ｒとは反対に、Ａ３５８変異を持つＩＬ６Ｒを運ぶＣＤ４＋Ｔ細胞内で低いことを示し、Ａ３５８細胞内の脱落の増加を示す。
【０２０４】
別の実験では、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、プレート結合抗ｈＣＤ３（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ−５５５３２９、１０ｍｇ／ｍＬ）および抗ｈＣＤ２８（ＢＤ−Ｃａｔ Ｎｏ−５５５７２５、５ｍｇ／ｍＬ）、または同位体対照（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ５５４７２１−１５ｍｇ／ｍＬ）により活性化した。次に、全ＲＮＡ抽出のために、２４、４８、および７２時間後に細胞を採取し、上清を回収して、ＥＬＩＳＡによりヒトＩＬ−６Ｒα Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＲ６００）を用いて決定した。図１０は、各時点で、Ｄ３５８に対してＡ３５８の可溶性ＩＬ６Ｒにおける倍率増加を示す。可溶性ＩＬ６Ｒの量は、Ｄ３５８について経時的にほぼ一定であったが、Ａ３５８については実験の経過を通じて４倍増加した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年6月6日(2018.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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