(57)【要約】【課題】食品に混入した異物である虫体の形状を大きく破壊することなく、虫体に対する加熱履歴を反映する虫体におけるコリンエステラーゼ活性を測定する技術を提供する。【解決手段】本発明は、加熱処理を経て製造された食品に混入した虫体の混入時期を推定する方法であって、前記虫体から分離した基節又は基節を含む脚を検体としてコリンエステラーゼ活性を測定する工程１と、工程１においてコリンエステラーゼ活性が陽性である場合に、前記虫体は、前記加熱処理よりも後に混入したと推定する推定工程１とを含む方法を提供する。【選択図】図２
2018166461.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
加熱処理を経て製造された食品に混入した虫体の混入時期を推定する方法であって、
前記虫体から分離した基節又は基節を含む脚を検体としてコリンエステラーゼ活性を測定する工程１と、
工程１においてコリンエステラーゼ活性が陽性である場合に、前記虫体は、前記加熱処理よりも後に混入したと推定する推定工程１と
を含む方法。
【請求項２】
工程１においてコリンエステラーゼ活性が陰性である場合に、前記虫体の他の部分に対して、前記加熱処理を模擬した加熱処理を施す再現工程と、
前記他の部分の再現工程後の状態が、再現工程前の状態から変化した場合に、前記虫体は、前記加熱処理よりも後に混入したと推定し、前記他の部分の再現工程後の状態が、再現工程前の状態から変化していない場合に、前記虫体は、前記加熱処理以前に混入したと推定する推定工程２と
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
加熱処理を経て製造された食品が、該食品の中心部に７０℃、１分間以上に相当する熱が加わる処理を行う工程を経て製造された食品である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
虫体のコリンエステラーゼ活性を測定する方法であって、
前記虫体から分離した基節又は基節を含む脚を検体としてコリンエステラーゼ活性を測定することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品に混入した虫体の混入時期を推定する方法に関する。
本発明はまた、虫体におけるコリンエステラーゼ活性を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品に昆虫等の異物が混入する事故は食品メーカーの信用に関わる問題であることから、異物混入対策の徹底が求められている。異物混入対策においては、異物混入時期、つまり異物がどの段階で混入したかを知ることが重要である。
【０００３】
従来、広く生物が持つ過酸化水素を水と酸素とに分解する反応を触媒する酵素「カタラーゼ」の熱変性を利用して昆虫異物の加熱の有無を判定する方法が知られている。しかし、カタラーゼは微生物の中にも活性を持つものがあり、そのような微生物が虫体表面や虫の消化管内にも存在することがある。したがって、カタラーゼ活性陽性の場合に、それが昆虫に起因するものか、増殖した微生物に起因するものなのかの特定は困難である。
【０００４】
そこで、微生物中には存在せず、動物の神経細胞に分布する酵素活性であるコリンエステラーゼの活性を測定し、昆虫の加熱履歴を調べる方法が提案されている。また、一般的なカタラーゼ試験は虫体そのもの、又は虫体の一部を過酸化水素水に浸し、発生する酸素の泡を目視で観察するものであることからカタラーゼ活性を数値で表すことはできないのに対し、コリンエステラーゼ活性は分光光度計を用いた吸光度に基づき測定するため、結果を数値で表現することができる。
【０００５】
コリンエステラーゼ活性に着目して虫の死亡時期を判定する方法は、特許文献１、特許文献２、非特許文献１、非特許文献２に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平０８−０５６６９６号公報
【特許文献２】特開平１０−２５３６１１号公報
【特許文献３】特開２０１６−１６９９６５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】緒方一喜、光楽昭雄、「最新の異物混入防止技術  食品・薬品の混入異物対策（増補改訂版）」、Ｐ２６２−２６４、株式会社フジ・テクノシステム  ２０００年
【非特許文献２】中桐裕幸、佐久間修三、小岩雅弘、「生ビール中の昆虫の混入時期の判定方法」、食品衛生学雑誌  Ｖｏｌ．  ３６  Ｎｏ．  ３  １９９５年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献３には、コリンエステラーゼ活性を利用した判定方法の問題点が挙げられており、特に「昆虫全体をすり潰してしまうため、問題の検査対象としての昆虫の原型保全ができなくなる」という点が指摘されている。
【０００９】
虫異物の混入時期の判定を行う場合、虫体全体を破壊することは望ましくないと考えられる。なぜなら、虫異物の混入時期の判定は、分析の専門家が、食品メーカー等の依頼者の依頼を受けて行うことが通常であるが、依頼者は、判定後も虫異物が原形に近い形を留めていることを望むからである。虫異物が原形に近い形を留めていれば、依頼者は、更に別の専門家に分析を依頼することも可能となる。
【００１０】
しかしながら、従来、異物である虫体の形状を大きく破壊することなく、虫体におけるコリンエステラーゼ活性を測定する技術は提供されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、虫体の形状を大きく破壊することなく、虫体におけるコリンエステラーゼ活性を測定する技術、及び、該技術を用いた、虫体の混入時期の推定方法を提供する。本発明は、具体的には、以下の発明を包含する。
【００１２】
（１）加熱処理を経て製造された食品に混入した虫体の混入時期を推定する方法であって、
前記虫体から分離した基節又は基節を含む脚を検体としてコリンエステラーゼ活性を測定する工程１と、
工程１においてコリンエステラーゼ活性が陽性である場合に、前記虫体は、前記加熱処理よりも後に混入したと推定する推定工程１と
を含む方法。
（２）工程１においてコリンエステラーゼ活性が陰性である場合に、前記虫体の他の部分に対して、前記加熱処理を模擬した加熱処理を施す再現工程と、
前記他の部分の再現工程後の状態が、再現工程前の状態から変化した場合に、前記虫体は、前記加熱処理よりも後に混入したと推定し、前記他の部分の再現工程後の状態が、再現工程前の状態から変化していない場合に、前記虫体は、前記加熱処理以前に混入したと推定する推定工程２と
を更に含む、（１）に記載の方法。
（３）加熱処理を経て製造された食品が、該食品の中心部に７０℃、１分間以上に相当する熱が加わる処理を行う工程を経て製造された食品である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）虫体のコリンエステラーゼ活性を測定する方法であって、
前記虫体から分離した基節又は基節を含む脚を検体としてコリンエステラーゼ活性を測定することを含む方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の、食品への虫体の混入時期の推定方法によれば、混入した虫体の形状を大きく破壊することなく混入時期を推定することが可能である。
【００１４】
本発明の、虫体におけるコリンエステラーゼ活性の測定方法によれば、虫体の形状を大きく破壊することなくコリンエステラーゼ活性の測定が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、クロゴキブリの終齢幼虫の後脚の写真を示す。図１中に脚の部位の名称を示した。
【図２】図２は、本発明の虫体の混入時期を推定する方法の一実施形態の手順を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明において「虫体」とは、昆虫、クモ類等の、食品における虫異物となり得る虫の虫体を指す。特にゴキブリの虫体に対して、本発明は有効である。
【００１８】
本発明において「加熱処理を経て製造された食品」とは、殺菌のための加熱処理や、調理のための加熱処理がされた食品を指し、例えば、該食品の中心部に７０℃、１分間以上に相当する熱が加わる処理を行う工程を経て製造された食品が挙げられる。食品の範囲には飲料も含まれる。加熱処理としては、レトルト殺菌、湯殺菌、ホットパック等の加熱殺菌処理が例示できる。レトルト殺菌処理は、１０５〜１３０℃程度の温度で食品を加熱処理することを含む。レトルト殺菌処理がされた食品（レトルト食品）としては、レトルトパウチに封入された、カレー、シチュー等のスープが例示できる。湯殺菌処理は８０℃程度〜１００℃の温度で数分間〜数十分間加熱処理することを含む。湯殺菌処理された食品としては、容器に密封されたデザートやジャム、惣菜や漬物等が例示できる。ホットパックは８０℃程度以上の温度で加熱した食品を容器に充填、密封した後に冷却処理することを含む。ホットパック処理された食品としては、ドレッシング等の調味料、果実飲料、野菜飲料、清涼飲料水等の飲料が例示できる。調理のための加熱処理としては、ボイル、油ちょう、焼成、炒め、ロースト、オーブン調理等が挙げられる。
【００１９】
本発明者らは、驚くべきことに、基節は虫体に占める割合は小さいにも関わらず、虫体の頭部と同程度に、コリンエステラーゼ活性が高く、コリンエステラーゼ活性を測定するための検体として有用であることを見出した。分析しようとする虫体から基節のみ、又は、基節を含む脚のみを分離し、それを検体とすれば、虫体の全体の形状は原形を留めつつ、虫体のコリンエステラーゼ活性を測定することができる。図１は、クロゴキブリの終齢幼虫の後脚の写真を示す。虫体の基節は脚の付け根部分である。基節を含む脚は、図１に示すような基節を含む脚の全体であってもよいし、一部分であってもよい。例えば、虫体の脚のうち、基節と腿節とからなる部分、或いは、基節と腿節と脛節とからなる部分も、「基節を含む脚」の一例である。
【００２０】
昆虫の場合、脚は６つあるため、基節も６つある。１つの虫体から、１つの基節又は基節を含む脚を分離し、検体として用いてもよいし、複数の基節又は基節を含む脚を分離し、検体として用いてもよい。
【００２１】
虫体からの基節又は基節を含む脚の分離は、メス等の刃物を用いて行うことができる。分離された基節又は基節を含む脚は、水で十分に洗浄してから用いることが好ましい。
【００２２】
本発明において、虫体から分離した基節又は基節を含む脚を検体としてコリンエステラーゼ活性を測定する方法としては、基節又は基節を含む脚の、酵素含有抽出液を調製し、該抽出液のコリンエステラーゼ活性を測定する方法が挙げられる。虫体検体からの酵素含有抽出液の調製方法、及び、コリンエステラーゼ活性の測定方法としては、例えば、非特許文献１に記載の方法を採用することができる。
【００２３】
基節又は基節を含む脚の酵素含有抽出液は、基節又は基節を含む脚と抽出緩衝液との混合物をホモジナイザーで粉砕してホモジナイズし、上澄み液を回収することで調製することができる。このとき、抽出緩衝液としてはｐＨ６．５〜７．５の緩衝液が好ましい。抽出緩衝液はより好ましくはリン酸緩衝液である。抽出緩衝液は更に、コリンエステラーゼの抽出を促進するための界面活性剤を含むことが好ましい。界面活性剤としてはポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、又は、商品名Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００として市販の界面活性剤を用いることが好ましい。基節又は基節を含む脚は、虫体から分離したのち、凍結してから抽出緩衝液と混合すると、凍結と解凍により細胞が破壊されるため、コリンエステラーゼが抽出され易くなるため特に好ましい。前記混合物のホモジナイザーによる処理は、氷水中で氷冷しながら行うことが好ましい。上澄み液の回収は遠心分離により行うことができる。
【００２４】
調製された酵素含有抽出液のコリンエステラーゼ活性の測定方法は特に限定されない。例えば、アセチルコリンを基質として酵素含有抽出液と反応させる。このとき、酵素含有抽出液がコリンエステラーゼ活性を含む場合、アセチルチオコリンがチオコリンと酢酸とに加水分解される。加水分解反応により生じたチオコリンを定量することにより、コリンエステラーゼ活性を評価することができる。チオコリンの定量は、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）とチオコリンとの反応により生じる５−メルカプト−２ニトロ安息香酸に特徴的な波長４２０ｎｍ付近の光の吸光を分光光度計で検出することにより行うことができる。すなわち、検体からの酵素含有抽出液と、アセチルチオコリンと、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）とを混合し、混合後の波長４２０ｎｍ付近の吸光度の単位時間あたりの変化量（吸光度時間変化量）に基づいて、コリンエステラーゼ活性を測定することができる。
【００２５】
検体からの酵素含有抽出液の吸光度時間変化量Ｓ（シグナル）から、コリンエステラーゼ活性の陽性／陰性の可能性を判定する方法は特に限定されない。
【００２６】
例えば、検体と同じ種に属する虫体の、加熱処理を行っていない試料（コリンエステラーゼ陽性既知試料）を用いＳと同じ方法で求めた吸光度時間変化量、及び、加熱処理を行った試料（コリンエステラーゼ陰性既知試料）を用いＳと同じ方法で求めた吸光度時間変化量と比較することで、検体からのＳから、検体のコリンエステラーゼ活性の陽性／陰性の可能性を判定することができる。このとき、必要に応じて、コリンエステラーゼ陽性既知試料の吸光度時間変化量と、コリンエステラーゼ陰性既知試料の吸光度時間変化量とから、吸光度時間変化量の、陽性／陰性の可能性の判定基準値を予め設定し、検体からのＳと、判定基準値との関係から、検体のコリンエステラーゼ活性の陽性／陰性の可能性を判定してもよい。
【００２７】
また、ブランク試験（検体からの酵素含有抽出液の代わりに抽出緩衝液で同様の操作を行う試験）を行い、Ｓと同じ方法によりブランク試験の吸光度時間変化量ＢＬを求め、ＳがＢＬよりも有意に大きい値である場合に検体のコリンエステラーゼ活性は陽性の可能性が高いと判定し、ＳとＢＬとで有意差がない場合に検体のコリンエステラーゼ活性は陰性の可能性が高いと判定することができる。ＳとＢＬとの差の有意性の判定は特に限定されず、統計学的に妥当な方法により行えばよい。例えば、ＢＬの測定値の変動幅をノイズＮとし、Ｓ／Ｎが好ましくは３以上、より好ましくは５以上のとき、検体からのＳは有意差があるとみなして採用することができる。ノイズＮは統計学的に妥当な方法で求めればよく、例えば、ブランク試験での吸光度の測定値より得られる回帰直線から、測定された吸光度時間変化量（傾き、ΔＥ／３０秒）の、ＢＬとの差の最大値（Ｎ＝ΔＥｍａｘ−ＢＬ）をノイズＮとすることができる。
【００２８】
本発明に係る、加熱処理を経て製造された食品に混入した虫体の混入時期を推定する方法は、
虫体から分離した基節又は基節を含む脚を検体としてコリンエステラーゼ活性を測定する工程１と、
工程１においてコリンエステラーゼ活性が陽性である場合に、前記虫体は、前記加熱処理よりも後に混入したと推定する推定工程１とを、少なくとも含む。
【００２９】
工程１の活性測定法は既述の通りである。工程１によれば、虫体の全体の形状は原形を留めつつ、虫体のコリンエステラーゼ活性を測定することができる。工程１は、図２に示すフローチャートのＳ１に対応する。
【００３０】
推定工程１は、工程１でのコリンエステラーゼ活性が陽性であれば、虫体は加熱処理を受けた可能性は低いことから、加熱処理後に混入したと推定する工程である。推定工程２は、前記フローチャートのＳ２、Ｓ３に対応する。
【００３１】
本発明に係る、加熱処理を経て製造された食品に混入した虫体の混入時期を推定する方法のより好ましい態様では、
工程１においてコリンエステラーゼ活性が陰性である場合に、前記虫体の他の部分に対して、前記加熱処理を模擬した加熱処理を施す再現工程と、
前記他の部分の再現工程後の状態が、再現工程前の状態から変化した場合に、前記虫体は、前記加熱処理よりも後に混入したと推定し、前記他の部分の再現工程後の状態が、再現工程前の状態から変化していない場合に、前記虫体は、前記加熱処理以前に混入したと推定する推定工程２と
を更に含む。
【００３２】
工程１においてコリンエステラーゼ活性が陰性である場合、虫体が加熱を受けたためにコリンエステラーゼ活性が失活した可能性があるが、虫体の死後時間の経過によりコリンエステラーゼ活性が失活した可能性も排除できない。そこで、再現工程と推定工程２を行うことにより、コリンエステラーゼ活性の失活が、虫体が加熱を受けたためにコリンエステラーゼ活性が失活したものなのか否かを推定する。
【００３３】
再現工程は、前記フローチャートの再現試験Ｓ５に対応する。
図示する実施形態では、再現試験Ｓ５に先立って、前記虫体の他の部分に対する前記加熱処理を模擬した加熱処理を施す再現試験が可能かどうかを判断し（前記フローチャートのＳ４）、再現試験が不可能な場合は、混入時期の推定ができないと結論付ける（前記フローチャートのＳ８）。
【００３４】
再現工程において、「前記加熱処理を模擬した加熱処理」とは、食品製造時に食品中に虫体が混入していたと仮定したとき食品製造時に虫体が受ける熱量に相当する熱量を、虫体の前記他の部分に加える条件での加熱処理を指す。例えば、虫体が混入した食品がレトルト食品であれば、虫体の他の部分に対して、食品製造時に食品中に虫体が混入していたと仮定したとき前記食品製造時のレトルト加熱殺菌時に虫体が受ける熱量に相当する熱量を与える温度、時間の加熱処理を施す。また、例えば、虫体が混入した食品が湯殺菌処理された食品であれば、虫体の他の部分に対して、食品製造時に食品中に虫体が混入していたと仮定したとき前記食品製造時の湯殺菌時に虫体が受ける熱量に相当する熱量を与える温度、時間の加熱処理を施す。さらに、例えば、虫体が混入した食品が油ちょうされた食品であれば、虫体の他の部分に対して、食品製造時に食品中に虫体が混入していたと仮定したとき前記食品製造時の油ちょうにより虫体が受ける熱量に相当する熱量を与える温度、時間の加熱処理を施す。
【００３５】
再現工程で用いる虫体の「他の部分」とは、工程１において検体として用いた基節又は基節を含む脚以外の部分を指す。例えば、工程１で検体として用いなかった虫体の脚の部分等が利用できる。
【００３６】
推定工程２は、前記フローチャートのＳ６、Ｓ３及びＳ７に対応する。
推定工程２において、前記他の部分の「状態」とは、色調、形状、物性等の、観察や、物理的試験により判別できる状態を指す。観察は、目視観察でもよいし、顕微鏡観察でもよい。顕微鏡としては実体顕微鏡、マイクロスコープ等が挙げられる。
【００３７】
推定工程２のために、再現工程の前に、前記他の部分の状態を記録しておくことが好ましい。
【００３８】
再現工程での加熱処理により、前記他の部分の状態が変化した場合、混入した虫体は、食品製造時の加熱処理を経ていなかったと判断できる。この場合、推定工程２では、前記虫体は加熱を受けた可能性が低く、食品製造時の加熱処理よりも後に混入したと推定する（前記フローチャートのＳ３）。この場合、虫体の死後時間の経過によりコリンエステラーゼ活性が失活した可能性が示唆される。
【００３９】
一方、再現工程での加熱処理により、前記他の部分の状態が変化しない場合、虫体は、食品製造時の加熱処理を経ていたと判断できる。この場合、推定工程２では、前記虫体は加熱を受けた可能性があり、食品製造時の加熱処理以前に混入したと推定する（前記フローチャートのＳ７）。
【実施例】
【００４０】
本発明を以下の実験結果に基づき具体的に説明するが本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００４１】
＜コリンエステラーゼ活性測定試験＞
虫体検体のコリンエステラーゼ活性の測定方法について以下に説明する。
【００４２】
（１）使用器具
ガラスマイクロホモジナイザー
１．５ｍＬ容量マイクロチューブ
標準石英セル：マイクロブラック２面透過（光路長１０ｍｍ、光路幅２ｍｍ）（アズワン（株））
２００μＬマイクロピペット
１０００μＬマイクロピペット
ガラス試験管
１ｍＬホールピペット
２ｍＬメスピペット
【００４３】
（２）試薬
特級塩酸（和光純薬工業）
特級リン酸水素二ナトリウム（和光純薬工業）
化学用ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬工業）
５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（和光純薬工業）
生化学用アセチルチオコリン＝ヨージド（ヨウ化アセチルチオコリン）（和光純薬工業）
【００４４】
（３）調製試薬
（３）−１：希塩酸（３ｍｏｌ／Ｌ）
蒸留水７５ｍＬに特級塩酸を２５ｍＬ加えた。
【００４５】
（３）−２：抽出緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液）
蒸留水約１００ｍＬに特級リン酸水素二ナトリウムを１．４２ｇ溶かし、希塩酸でｐＨ７．２に調整した。
【００４６】
リン酸緩衝液にポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルを２．５ｇ加えて撹拌した。
【００４７】
ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルが溶けた後、１００ｍＬメスフラスコで定容した。
【００４８】
（３）−３：反応液Ｉ（０．２６ｍＭ５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）溶液（５２ｍＭリン酸緩衝液中））
蒸留水約２００ｍＬに特級リン酸水素二ナトリウムを１．４８ｇ溶かし、希塩酸でｐＨ７．２に調整し、２００ｍＬメスフラスコで定容し、５２ｍＭリン酸緩衝液を調製した。
【００４９】
５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）を１０．３ｍｇ正確に量り、５２ｍＭリン酸緩衝液で、メスフラスコ中で１００ｍＬに定容した。
【００５０】
（３）−４：反応液ＩＩ（１５６ｍＭヨウ化アセチルチオコリン溶液）
ヨウ化アセチルチオコリンを４５．３ｍｇ正確に量り、ホールピペットで測った蒸留水１ｍＬを加えて撹拌した。
【００５１】
（４）使用機器
高速遠心分離機：ＭＸ−１００（ＴＯＭＹ製）
分光光度計：Ｕ−２８００型分光光度計（日立製）
分光光度計による測定条件
波長：４２０ｎｍ
セル：標準石英セル（光路長１ｃｍ）
温度：室温（空調設定：２６℃）
対照：蒸留水（対照セル内に入れる）
【００５２】
（５）測定方法
測定対象の虫体の測定部位（基節等）の重量を計測後、冷凍した。
高速遠心分離機の電源を入れ、庫内を冷却した。
反応液Ｉ、反応液ＩＩを２５℃にした。
【００５３】
重量を測定し冷凍した虫体の測定部位をガラスマイクロホモジナイザーに入れ、そこにマイクロピペットで測った抽出緩衝液を０．３ｍＬ加えた。
【００５４】
ガラスマイクロホモジナイザーでホモジナイズし、抽出緩衝液に抽出した。ホモジナイズ中は氷水中で試料を低温に保った。
【００５５】
抽出液をマイクロチューブに移して、高速遠心分離機で遠心分離（１００００ｒｐｍ、５分）した。上澄み液を検液とした。
【００５６】
ガラス試験管にメスピペットで測った反応液Ｉを１．５ｍＬ入れ、そこにマイクロピペットで測った遠心分離後の検液を５０μＬ、反応液ＩＩを５０μＬ順に入れた。ただちに撹拌し、混合した。
【００５７】
反応液Ｉ、検液、反応液ＩＩを混合した混合液でマイクロセル内部を共洗いした後、混合液の吸光度を分光光度計により測定した。
【００５８】
セルを分光光度計に入れた直後から０．５秒ごとに吸光度の値を自動測定し保存した。
保存された吸光度の値のうち、セルを分光光度計に入れた直後（０秒後）、３０秒後、６０秒後、９０秒後、１２０秒後の値を用い、３０秒ごとの吸光度の値の時間変化（ΔＥ／３０秒）を求め、それらの平均値を測定結果Ｓ（シグナル）とした。
【００５９】
ブランク試験として、検液の代わりに抽出緩衝液を用いた以外は同様の操作を行った。得られた３０秒ごとの吸光度の値の時間変化（ΔＥ／３０秒）の平均値を測定結果ＢＬ（ブランク）とした。
【００６０】
なお、非特許文献１の２６４頁左段５行目にも記載がある通り、検液の代わりに水を用いた場合にも３０秒ごとの吸光度の値の時間変化（ΔＥ／３０秒）の平均値はゼロではなく、０．００１程度の値を示し、ＢＬも０．００１〜０．００２５程度の値を示す。同様にコリンエステラーゼ活性が陰性である検液のＳも僅かに値が出る。
【００６１】
（６）測定結果の有用性の判断、陽性／陰性の判定
検液の測定結果Ｓが０．０１以上の場合にコリンエステラーゼ活性が「陽性」である可能性が高いと判定する。前記Ｓの値が０．０１未満である場合は、コリンエステラーゼ活性が「陰性」の可能性が高い、あるいは検体の重量が不足しているために、測定器の検出感度以下になっていると判定する。コリンエステラーゼ活性が「陰性」なのかどうかは最終的には下記（７）に記載の測定結果の換算を行うことにより検証できる。
【００６２】
（７）測定結果の換算
使用する虫体の測定部位（基節等）の重量Ｗ（ｇ）と、抽出緩衝液量Ｂ（ｍＬ）の違いに応じて検液の測定結果Ｓ（シグナル）の値が変動することを補正するために、検液の測定結果Ｓを、測定部位の重量１ｇに対して抽出緩衝液量が５０ｍＬである（すなわち虫体測定部位重量：抽出緩衝液量＝１：５０の）場合の値に換算したＳ’（＝抽出液量補正値）を得る。Ｓ’は次式により換算する。
【００６３】
Ｓ’＝［Ｓ×Ｂ（ｍＬ）］／［Ｗ（ｇ）×５０（ｍＬ）］
なお、上記手順では、抽出緩衝液量Ｂ（ｍＬ）は、０．３ｍＬに固定した。
【００６４】
また、上記抽出液量補正値Ｓ’からブランクの測定結果ＢＬを引いた差（Ｓ’− ＢＬ）は、相互比較が容易であるため、コリンエステラーゼ活性値の指標として有益である。本発明においては、Ｓ’−ＢＬが０．００２０に満たない場合、コリンエステラーゼ活性は陰性であると判定される。なお、上記の通り、ＢＬのＳは０．００１０〜０．００２５程度の値を示すため、コリンエステラーゼ活性が陰性である検液のＳ’−ＢＬはマイナスの値となる場合がある。
Ｓ’及びＳ’−ＢＬの値は、必要な場合は、１０００倍した値として示す。
【００６５】
＜実験１＞
虫体の測定部位として、クロゴキブリの終齢幼虫の触角１本、触角を除く頭部、及び、後脚（基節から爪まで）を用い、上記（１）〜（５）の手順でコリンエステラーゼ活性を測定した。ブランク試験も上記（１）〜（５）の手順で行った。図１に、クロゴキブリの終齢幼虫の後脚の写真を示す。図１中に脚の部位の名称を示した。
【００６６】
測定部位の重量は、触角１本が０．０００７ｇ、触角を除く頭部が０．０１６２ｇ、後脚が０．０２３４ｇであった。
【００６７】
上記（６）に記載の測定結果の有用性の判断、陽性／陰性判定を行った。ブランクのＢＬ（３０秒ごとの吸光度時間変化の平均値（ΔＥ／３０秒））は０．００１９３であった。
【００６８】
結果を表１に示す。
虫体の測定部位として、頭部及び後脚を用いた場合（表１）、ＳはＢＬよりも大きい値であり、コリンエステラーゼ活性が陽性である可能性が高いと判定した。更に＜コリンエステラーゼ活性測定試験＞に記載の上記（７）で説明した換算方法に沿って、Ｓの抽出液量補正値Ｓ’と、コリンエステラーゼ活性値の指標Ｓ’−ＢＬを算出した結果、コリンエステラーゼ活性が陽性であった。
【００６９】
虫体の測定部位として、触角を用いた場合（表１）、ＳはＢＬに近い値であり、コリンエステラーゼ活性に有意差がないと判定した。
【００７０】
この実験１から、コリンエステラーゼ活性を測定するための測定部位として虫体の脚が利用可能であることが明らかとなった。
【００７１】
【表１】
2018166461.tif 000003
【００７２】
＜実験２＞
次に虫体の脚の部位によるコリンエステラーゼ活性の違いを確認した。
クロゴキブリの終齢幼虫の中脚のうち「基節のみ」、及び、「腿節から爪まで」を用い、上記（１）〜（５）の手順でコリンエステラーゼ活性を測定した。ブランク試験も上記（１）〜（５）の手順で行った。中脚の各部位の名称は、図１に示す後脚の各部位の名称と同様である。
【００７３】
測定部位の重量は、中脚の基節のみが０．００９９ｇ、中脚の腿節から爪までが０．００４７ｇであった。ブランクのＢＬは０．００１４であった。
【００７４】
上記（６）に記載の測定結果の有用性の判断、陽性／陰性判定を行った。
結果を表２に示す。
【００７５】
虫体の測定部位として、中脚の基節のみを用いた場合（表２）、Ｓは０．０２３９３であり、ＢＬに比較して顕著に大きな値であり、コリンエステラーゼ活性が陽性であることが明確に判定できた。
【００７６】
虫体の測定部位として、中脚の腿節から爪までを用いた場合（表２）、Ｓは０．００９４８であり、ＢＬよりも高いものの、やや小さい値であった。更に＜コリンエステラーゼ活性測定試験＞に記載の上記（７）で説明した換算方法に沿って、Ｓの抽出液量補正値Ｓ’と、コリンエステラーゼ活性値の指標Ｓ’−ＢＬを算出した結果、コリンエステラーゼ活性は陽性であることは分かったものの、測定誤差を考慮すると、Ｓだけではコリンエステラーゼ活性が陽性であると容易に判定できないことが分かった。
【００７７】
この実験２から、コリンエステラーゼ活性を測定するための測定部位として、虫体の脚のなかでも特に基節の部分が適していることが明らかとなった。
【００７８】
【表２】
2018166461.tif 000004
【００７９】
＜実験３＞
次に、クロゴキブリの終齢幼虫の後脚（基節から爪まで）に、レトルト殺菌処理と同等の加熱処理を行ったとき、コリンエステラーゼ活性が陰性となることを確認した。加熱処理した後脚から調製した検液のコリンエステラーゼ活性の測定及びブランク試験は上記（１）〜（５）の手順で行った。
加熱処理は１２２℃で８分間行った。
上記（６）に記載の測定結果の有用性の判断、陽性／陰性判定を行った。ブランクのＢＬは０．００１４であった。
【００８０】
結果を表３に示す。
この実験３から、レトルト殺菌処理と同等の加熱処理を受けた虫体の脚では、Ｓが０．００２２であることからＢＬとの差が小さく、コリンエステラーゼ活性が失活している可能性が高いと判定でき、＜コリンエステラーゼ活性測定試験＞に記載の上記（７）で説明した換算方法に沿って、Ｓの抽出液量補正値Ｓ’と、コリンエステラーゼ活性値の指標Ｓ’−ＢＬを算出した結果、コリンエステラーゼ活性は陰性と判定されることが明らかとなった。
【００８１】
【表３】
2018166461.tif 000005
【００８２】
＜実験４＞
＜コリンエステラーゼ活性測定試験＞に記載の上記（７）で説明した換算方法の妥当性を確認するために、以下の試験を行った。
【００８３】
測定１として、実験１〜３と同様に、＜コリンエステラーゼ活性測定試験＞に記載の上記（１）〜（５）の手順に沿って、クロゴキブリの終齢幼虫の頭部（加熱なし）から調製した検液のコリンエステラーゼ活性を測定した。条件１で使用した抽出緩衝液量Ｂ１は、上記（５）の通り、０．３ｍＬであった。使用した頭部の重量Ｗ１は０．０１９８ｇであった。
【００８４】
測定２として、抽出緩衝液量Ｂ２が０．３ｍＬではなく０．９９ｍＬになるように測定１の抽出緩衝液で３．３倍に希釈して調製した検液のコリンエステラーゼ活性を測定した。
【００８５】
ブランク試験も同様に行った。
実験１〜３と同様の手順で吸光度時間変化平均値（ΔＥ／３０秒）を求め、ブランクの測定結果ＢＬ、測定１の測定結果Ｓ１、測定２の測定結果Ｓ２とした。結果を次表に示す。
【００８６】
【表４】
2018166461.tif 000006
【００８７】
上記Ｓ１を、＜コリンエステラーゼ活性測定試験＞に記載の上記（７）で説明した算式において、Ｓを上記Ｓ１、Ｂを上記Ｂ１、Ｗを上記Ｗ１として、抽出液量補正値に換算し、上記Ｓ１の抽出液量補正値Ｓ１’を求めた。Ｓ１’は０．０１９６（ΔＥ／３０秒）であった。また、＜コリンエステラーゼ活性測定試験＞に記載の上記（７）で説明した、コリンエステラーゼ活性値の指標Ｓ１’−ＢＬは、０．０１８１（ΔＥ／３０秒）であった。
【００８８】
同様に、上記Ｓ２を、＜コリンエステラーゼ活性測定試験＞に記載の上記（７）で説明した算式において、Ｓを上記Ｓ２、Ｂを上記Ｂ２、Ｗを上記Ｗ２として、抽出液量補正値に換算し、上記Ｓ２の抽出液量補正値Ｓ２’を求めた。Ｓ２’は０．０２０５（ΔＥ／３０秒）であった。また、コリンエステラーゼ活性値の指標Ｓ２’−ＢＬは、０．０１９０（ΔＥ／３０秒）であった。
【００８９】
測定１と測定２とでは抽出緩衝液量が異なるが、上記の通り、Ｓ１’−ＢＬとＳ２’−ＢＬはほぼ同じ値であった。このことから、＜コリンエステラーゼ活性測定試験＞に記載の上記（７）で説明した換算方法の妥当性が確認された。
【００９０】
＜実験５＞
実験１〜３と同様に、＜コリンエステラーゼ活性測定試験＞に記載の上記（１）〜（５）の手順に沿って、加熱していないクロゴキブリの終齢幼虫の虫体から基節のみを切り出し、２週間冷凍した検体から検液を調製し、吸光度時間変化平均値Ｓ（ΔＥ／３０秒）を求めた。この時の検体重量をＷ（ｇ）とした。抽出緩衝液量は０．３ｍＬに固定した。加熱されていない６つの虫体からそれぞれ前脚、中脚、後脚の基節を得て、検体とした。ブランク試験も実験１〜３と同様に行い、ブランクの吸光度時間変化平均値ＢＬ（ΔＥ／３０秒）を求めた。
【００９１】
更に、＜コリンエステラーゼ活性測定試験＞に記載の上記（７）で説明した換算方法に沿って、Ｓの抽出液量補正値Ｓ’と、コリンエステラーゼ活性値の指標Ｓ’−ＢＬを求めた。こうして求めた全検体からのＳ’及びＳ’−ＢＬの平均値を算出し、実験５のＳ’及びＳ’−ＢＬとして表５に示す。
【００９２】
＜実験６＞
実験１〜３と同様に、＜コリンエステラーゼ活性測定試験＞に記載の上記（１）〜（５）の手順に沿って、湯中で加熱処理（７０℃で、１分）がされたクロゴキブリの終齢幼虫の虫体から基節のみを切り出し、２週間冷凍した検体から検液を調製し、吸光度時間変化平均値Ｓ（ΔＥ／３０秒）を求めた。この時の検体重量をＷ（ｇ）とした。抽出緩衝液量Ｂは０．３ｍＬに固定した。上記の加熱処理がされた２つの虫体からそれぞれ前脚、中脚、後脚の基節を得て、検体とした。ブランク試験も実験１〜５と同様に行い、ブランクの吸光度時間変化平均値ＢＬ（ΔＥ／３０秒）を求めた。ＢＬは０．００２４８であった。
【００９３】
更に、＜コリンエステラーゼ活性測定試験＞に記載の上記（７）で説明した換算方法に沿って、Ｓの抽出液量補正値Ｓ’と、コリンエステラーゼ活性値の指標Ｓ’−ＢＬを求めた。こうして求めた全検体からのＳ’及びＳ’−ＢＬの平均値を算出し、実験６のＳ’及びＳ’−ＢＬとして表５に示す。
【００９４】
＜実験７＞
実験１〜３と同様に、＜コリンエステラーゼ活性測定試験＞に記載の上記（１）〜（５）の手順に沿って、レトルト殺菌処理と同等の加熱処理（１２１℃、８分間）がされたクロゴキブリの終齢幼虫の虫体から基節のみを切り出し、２週間冷凍した検体から検液を調製し、吸光度時間変化平均値Ｓ（ΔＥ／３０秒）を求めた。この時の検体重量をＷ（ｇ）とした。抽出緩衝液量Ｂは０．３ｍＬに固定した。上記の加熱処理がされた３つの虫体からそれぞれ前脚、中脚、後脚の基節を得て、検体とした。ブランク試験も実験１〜３と同様に行い、ブランクの吸光度時間変化平均値ＢＬ（ΔＥ／３０秒）を求めた。ブランク試験は虫体ごとに行った。
【００９５】
更に、＜コリンエステラーゼ活性測定試験＞に記載の上記（７）で説明した換算方法に沿って、Ｓの抽出液量補正値Ｓ’と、コリンエステラーゼ活性値の指標Ｓ’−ＢＬを求めた。こうして求めた全検体からのＳ’及びＳ’−ＢＬの平均値を算出し、実験７のＳ’及びＳ’−ＢＬとして表５に示す。
【００９６】
＜実験８＞
実験１〜３と同様に、＜コリンエステラーゼ活性測定試験＞に記載の上記（１）〜（５）の手順に沿って、加熱していないクロゴキブリの終齢幼虫の虫体の頭部の、２週間冷凍した検体から検液を調製し、吸光度時間変化平均値Ｓ（ΔＥ／３０秒）を求めた。この時の検体重量をＷ（ｇ）とした。抽出緩衝液量Ｂは０．３ｍＬに固定した。上記の加熱処理がされた４つの虫体からそれぞれ頭部を得て検液を調製した。ブランク試験も実験１〜３と同様に行い、ブランクの吸光度時間変化平均値ＢＬ（ΔＥ／３０秒）を求めた。ブランク試験は虫体ごとに行った。
【００９７】
更に、＜コリンエステラーゼ活性測定試験＞に記載の上記（７）で説明した換算方法に沿って、Ｓの抽出液量補正値Ｓ’と、コリンエステラーゼ活性値の指標Ｓ’−ＢＬを求めた。こうして求めた全検体からのＳ’及びＳ’−ＢＬの平均値を算出し、実験８のＳ’及びＳ’−ＢＬとして表５に示す。
【００９８】
【表５】
2018166461.tif 000007
【００９９】
＜実験５、６、７、８のまとめ＞
実験５と実験８で求めたＳ’−ＢＬの値から、基節のみから調製した検液のコリンエステラーゼ活性は、頭部から調製した検液のコリンエステラーゼ活性と同等であることが分かる。
【０１００】
また、実験６、７から、虫体が加熱処理を受けていることは、基節のみから調製した検液のコリンエステラーゼ活性が陰性であることを指標に判別可能であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明の方法は、加工食品に混入した虫体の混入時期を推定するために有用である。
【図１】
2018166461.tif 000008
【図２】
2018166461.tif 000009