(57)【要約】【課題】好酸球の動態をより簡便に解析できるツールを提供すること。【解決手段】ゲノム内のEar2遺伝子エクソン2の一部又は全部の塩基配列が、レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列に置換されており、且つゲノム内のEar2遺伝子プロモーターの制御下で前記レポータータンパク質が発現可能である、マウス細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム内のEar2遺伝子エクソン2の一部又は全部の塩基配列が、レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列に置換されており、且つゲノム内のEar2遺伝子プロモーターの制御下で前記レポータータンパク質が発現可能である、マウス細胞。
【請求項２】
前記置換によりEar2遺伝子が破壊されている、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記レポータータンパク質がCreタンパク質融合型レポータータンパク質である、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
前記置換を対の染色体の片方にのみ有する、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞。
【請求項５】
前記置換を対の染色体の両方に有する、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞。
【請求項６】
ES細胞である、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の細胞を含む、マウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レポーター遺伝子がノックインされたマウス細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
好酸球は、白血球の一種であり、寄生虫等に対する生体防御反応を担っている一方で、生体自身に対しても悪影響を与えることがあり、アレルギー性疾患等の各種疾患の原因にもなり得る。好酸球は、表面タンパク質やレセプターの働きにより血管内から各組織へと浸潤していき、炎症反応の惹起や病変部位の形成に関与する。例えば、疾患好酸球性副鼻腔炎においては、鼻内部に多発するポリープ状の病変部位（鼻茸）に、好酸球が多数集積していることが知られている。このため、好酸球の動態をより簡便に解析できるツールの開発が望まれている。
【０００３】
このような解析ツールとして、非特許文献１には、好酸球が発現する遺伝子であるEpx遺伝子にCre遺伝子がノックインされたマウス細胞を作製したことが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Doyle AD, Jacobsen EA, Ochkur SI, Willetts L, Shim K, Neely J, Kloeber J, Lesuer WE, Pero RS, Lacy P, Moqbel R, Lee NA, Lee JJ. “Homologous recombination into the eosinophil peroxidase locus generates a strain of mice expressing Crerecombinase exclusively in eosinophils”Journal of Leukocyte Biology, July 2013, vol. 94, no.1, 17-24.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、好酸球の動態をより簡便に解析できるツールを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
Ear2遺伝子は、好酸球に発現する遺伝子として知られており、好酸球において特異的に発現する遺伝子である。本発明者は鋭意研究をした結果、この遺伝子に着目するに至った。
【０００７】
しかし、ゲノム内のEar2遺伝子近辺には、該遺伝子と塩基配列の同一性が高い遺伝子が複数存在している。さらに、これらの類似遺伝子の周辺領域も、Ear2遺伝子の周辺領域と同一性が高い。例えば、類似遺伝子であるEar1遺伝子のORFとEar2遺伝子のORFとの同一性は95％と非常に高い。このため、相同組換え等の手法によりEar2遺伝子を改変することは、現実的ではないと考えられていた。
【０００８】
本発明者は、このような状況下で鋭意研究を進め、ターゲティングベクターを用いた相同組換え法により、ゲノム内のEar2遺伝子エクソン2の一部又は全部の塩基配列を、レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列に置換する等の種々の工夫により、ゲノム内のEar2遺伝子プロモーターの制御下で前記レポータータンパク質が発現可能なマウス細胞を開発するに至った。この細胞であれば、好酸球特異的に発現するレポータータンパク質を検出することにより、好酸球の動態をより簡便に解析することができる。
【０００９】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する：
項１．  ゲノム内のEar2遺伝子エクソン2の一部又は全部の塩基配列が、レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列に置換されており、且つゲノム内のEar2遺伝子プロモーターの制御下で前記レポータータンパク質が発現可能である、マウス細胞．
項２．  前記置換によりEar2遺伝子が破壊されている、項１に記載の細胞．
項３．  前記レポータータンパク質がCreタンパク質融合型レポータータンパク質である、項１又は２に記載の細胞．
項４．  前記置換を対の染色体の片方にのみ有する、項１〜３のいずれかに記載の細胞．
項５．  前記置換を対の染色体の両方に有する、項１〜３のいずれかに記載の細胞．
項６．  ES細胞である、項１〜５のいずれかに記載の細胞．
項７．  項１〜５のいずれかに記載の細胞を含む、マウス．
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、Ear2プロモーターの制御下で好酸球特異的にレポータータンパク質を発現することが可能なマウス細胞を提供することができる。この細胞を用いれば、好酸球特異的に発現するレポータータンパク質を検出することにより、好酸球の動態をより簡便に解析することができる。
【００１１】
また、この細胞の一態様である、対の染色体の両方においてEar2遺伝子が破壊された細胞を用い、この細胞の動態等を分析することにより、Ear2遺伝子の機能解析をより簡便に行うことができ、ひいては好酸球やそれに関連する疾患の解析をより簡便に行うことが可能となる。
【００１２】
さらには、この細胞の一態様である、レポータータンパク質としてCreタンパク質融合型レポータータンパク質を採用した細胞を生殖系列に有するマウスと、loxPマウスを掛け合わせることにより、好酸球特異的に各種遺伝子（例えば毒性遺伝子等）を発現するマウスや細胞を得ることができる。これらのマウスや細胞を用いることにより、好酸球やそれに関連する疾患の解析をより簡便に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ear2遺伝子破壊株の作製（実施例1）の設計図を示す。「Wilt Type allele」は、野生型マウスゲノムの破壊対象領域周辺の模式図を示す。「Wilt Type allele」上の2つのボックスの内、左側のボックスはEar2遺伝子のエクソン1を示し、右側のボックスはEar2遺伝子のエクソン2を示す。「Targeting Vector」は、遺伝子破壊に用いるターゲティングベクターの模式図を示す。「Wilt Type allele」上、「DTA」はDTAカセットを示し、「Cre-EGFP」はCreタンパク質融合型EGFPコード配列を示し、「FRT配列」はFlippase Recognition Target配列を示し、「Neo」はネオマイシン耐性遺伝子カセット（逆向き）を示す。「Targeting allele」は、遺伝子破壊後のマウスゲノムの模式図を示す。「Mutant allele」は、FRT配列を利用してネオマイシン耐性遺伝子発現カセットを除去した場合のマウスゲノムの模式図を示す。各模式図中、上方に示される数字は、左側（5´側）からの塩基対数を示し、5711〜10000までの領域はターゲティングベクターのLong arm及びそれに相当する領域を示し、10472〜12540までの領域はターゲティングベクターのShort arm及びそれに相当する領域を示し、各制限酵素名で示される位置は、その制限酵素の認識配列が存在する位置を示す。
【図２】ターゲティングベクターのベクターマップを示す。「DTA」はDTAカセットを示し、「Long」はLong armを示し、「Cre-EGFP」はCreタンパク質融合型EGFPコード配列を示し、「Neo」はネオマイシン耐性遺伝子カセット（逆向き）を示し、「Short」はShort armを示し、「Amp」はアンピシリン耐性遺伝子カセットを示す。各制限酵素名で示される位置は、その制限酵素の認識配列が存在する位置を示す。
【図３】ターゲティングベクターの作製途中で得られたベクター（pBS-L2-EGFP-creベクター）のベクターマップを示す。「Long 2」はLong arm 3´側配列を示し、「Cre-EGFP」はCreタンパク質融合型EGFPコード配列を示し、「Amp」はアンピシリン耐性遺伝子カセットを示す。各制限酵素名で示される位置は、その制限酵素の認識配列が存在する位置を示す。
【図４】ターゲティングベクターの作製途中で得られたベクター（Construct 1ベクター）のベクターマップを示す。「DTA」はDTAカセットを示し、「Long 1」はLong arm 5´側配列を示し、「Amp」はアンピシリン耐性遺伝子カセットを示す。各制限酵素名で示される位置は、その制限酵素の認識配列が存在する位置を示す。
【図５】ターゲティングベクターの作製途中で得られたベクター（Construct 2ベクター）のベクターマップを示す。「Neo」はネオマイシン耐性遺伝子カセット（逆向き）を示し、「Short」はShort armを示し、「Amp」はアンピシリン耐性遺伝子カセットを示す。各制限酵素名で示される位置は、その制限酵素の認識配列が存在する位置を示す。
【図６】実施例1-3のジェノタイピングに用いたプライマーの位置を示す。右向き矢印がフォワードプライマーの位置を示し、左向き矢印がリバースプライマーの位置を示す。「Long」はLong armを示し、「Cre-EGFP」はCreタンパク質融合型EGFPコード配列を示し、「Neo」はネオマイシン耐性遺伝子カセット（逆向き）を示し、「Short」はShort armを示す。
【図７】実施例1-4のジェノタイピングに用いたプライマーの位置を示す。右向き矢印がフォワードプライマーの位置を示し、左向き矢印がリバースプライマーの位置を示す。「Long」はLong armを示し、「Cre-EGFP」はCreタンパク質融合型EGFPコード配列を示し、「Neo」はネオマイシン耐性遺伝子カセット（逆向き）を示し、「Short」はShort armを示す。
【図８】実施例1-5のジェノタイピングに用いたプライマーの位置を示す。右向き矢印がフォワードプライマーの位置を示し、左向き矢印がリバースプライマーの位置を示す。「Long」はLong armを示し、「Cre-EGFP」はCreタンパク質融合型EGFPコード配列を示し、「Neo」はネオマイシン耐性遺伝子カセット（逆向き）を示し、「Short」はShort armを示す。
【図９】実施例1-6のジェノタイピングのサザンブロッティングにおける、泳動DNA調製用の制限酵素の認識配列の位置、及びプローブの位置を示す。「Wild Type allele」が野生型マウスゲノムの模式図を示し、「Targeting allele」が遺伝子破壊後のマウスゲノムの模式図を示す。各制限酵素名で示される位置は、その制限酵素の認識配列が存在する位置を示す。「EGFP probe」がサザンブロッティングに用いたプローブの位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００１５】
アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS，Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264−2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high−scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873−7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
【００１６】
本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
【００１７】
本発明は、ゲノム内のEar2遺伝子エクソン2の一部又は全部の塩基配列が、レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列に置換されており、且つゲノム内のEar2遺伝子プロモーターの制御下で前記レポータータンパク質が発現可能である、マウス細胞（本明細書において、「本発明のマウス細胞」と示すこともある。）、及び該マウス細胞を含むマウス（本明細書において、「本発明のマウス」と示すこともある。）に関する。
【００１８】
置換対象であるEar2遺伝子は、マウスゲノムDNA中に存在する内在性Ear2遺伝子である限り特に制限されない。マウスEar2遺伝子は、NCBIデータベース上ではGene ID: 13587として登録されている遺伝子であり、データベース上に登録されているmRNA配列はNCBI Reference Sequence: NM_007895.2（配列番号23）で示され、データベース上に登録されているアミノ酸配列はNCBI Reference Sequence: NP_031921.1（配列番号24）で示される遺伝子である。
【００１９】
置換対象であるEar2遺伝子は、内在性のEar2遺伝子である限りにおいて変異を有していてもよい。この変異は、タンパク質においてアミノ酸置換が生じない塩基置換や、タンパク質において保存的置換が生じる塩基置換が好ましい。この観点から、置換対象であるEar2遺伝子の発現産物（タンパク質）は、例えば、（a）配列番号24に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号24に示されるアミノ酸配列と98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ好酸球特異的に発現するタンパク質である。なお、ここで「好酸球特異的に発現する」とは、好酸球1個当たりの発現量が、他の種類の細胞において最も発現量の高い種類の細胞1個当たりの発現量よりも、例えば5倍、10倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍程度高いことを意味する。
【００２０】
マウスEar2遺伝子は、2つのエクソンを有する。レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列による置換対象部位は、この2つのエクソンの内の、3´側のエクソン（エクソン2）の一部又は全部である。この部位を置換対象部位とすることにより、他の類似遺伝子（ear1遺伝子等）の存在にも関わらず、レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列に置換することが可能となり、ゲノム内のEar2遺伝子プロモーターの制御下で前記レポータータンパク質が発現可能なマウス細胞の作製に成功することができる。置換対象部位は、好ましくはエクソン2の一部、具体的には配列番号23における5´末端から72〜542番目の塩基からなる塩基配列である。
【００２１】
レポータータンパク質コード配列は、レポータータンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列である限り特に制限されない。
【００２２】
レポータータンパク質としては、特に制限されず、例えば特定の基質と反応して発光（発色）する発光（発色）タンパク質、或いは励起光によって蛍光を発する蛍光タンパク質等が挙げられる。発光（発色）タンパク質としては、例えばルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βグルクロニダーゼ等が挙げられ、蛍光タンパク質としては、例えばGFP、Azami-Green、ZsGreen、GFP2、HyPer、Sirius、BFP、CFP、Turquoise、Cyan、TFP1、YFP、Venus、ZsYellow、Banana、KusabiraOrange、RFP、DsRed、AsRed、Strawberry、Jred、KillerRed、Cherry、HcRed、mPlum等が挙げられる。また、レポータータンパク質には、発光（発色）タンパク質や蛍光タンパク質と、他のタンパク質（例えばCreタンパク質）との融合タンパク質（例えば、Creタンパク質融合型レポータータンパク質）や、発光（発色）タンパク質や蛍光タンパク質に公知のタンパク質タグ、公知のシグナル配列等が付加されてなるタンパク質も包含される。
【００２３】
レポータータンパク質としてCreタンパク質融合型レポータータンパク質を採用した細胞を生殖系列に有するマウスと、loxPマウスを掛け合わせることにより、好酸球特異的に各種遺伝子（例えば毒性遺伝子等）を発現するマウスや細胞を得ることができる。これらのマウスや細胞を用いることにより、好酸球やそれに関連する疾患の解析をより簡便に行うことが可能となる。
【００２４】
「レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列」には、上記「レポータータンパク質コード配列」以外に、他の配列が含まれていてもよい。他の配列としては、例えば薬剤耐性遺伝子発現カセット、コザック配列等が挙げられる。
【００２５】
薬剤耐性遺伝子発現カセットは、薬剤耐性遺伝子を発現することができるために必要な配列（例えばプロモーター等）及び薬剤耐性タンパク質コード配列を有するものであれば特に制限されない。薬剤耐性遺伝子としては、例えばクロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。なお、薬剤耐性遺伝子発現カセットは、通常は、ターゲティングベクターを用いた相同組換え法により本発明のマウス細胞を作製する際に利用されるものであるが、一旦作製した後は不要となり得る。そこで、「レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列」が薬剤耐性遺伝子発現カセットを含む場合は、この薬剤耐性遺伝子発現カセットをFlippase等の酵素により除去可能なように、該カセットの両端に、Flippase等の酵素の認識配列（Flipase Recognition Target（FRT）配列等）を付加しておくことが望ましい。
【００２６】
本発明の細胞は、ゲノム内のEar2遺伝子プロモーターの制御下でレポータータンパク質が発現可能である。このため、レポータータンパク質コード配列から正しい読み枠でレポータータンパク質が発現できるように（或いはその効率を高めるために）、レポータータンパク質コード配列の開始コドンの5´側に隣接してコザック配列が配置されていることが好ましい。なお、「発現可能」とは、常に発現していることを意味するものではなく、内在性Ear2遺伝子が発現する条件下（例えば、細胞が好酸球に分化した状態）になれば発現することを意味する。
【００２７】
本発明のマウス細胞においては、上記で説明した「ゲノム内のEar2遺伝子エクソン2の一部又は全部の塩基配列」が、同じく上記で説明した「レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列」に置換されている。換言すれば、本発明のマウス細胞は、「ゲノム内のEar2遺伝子エクソン2の一部又は全部の塩基配列」が「レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列」に置換されてなるゲノムDNAを有する。
【００２８】
本発明のマウス細胞は、この「置換」を、対の染色体の片方のみに有していてもよいし、対の染色体の両方に有していてもよい。また、本発明のマウス細胞においては、この「置換」により、Ear2遺伝子が破壊されていなくともよいし、破壊されていてもよい。対の染色体の両方においてEar2遺伝子が破壊された細胞（Ear2 null細胞）を用い、この細胞の動態等を分析することにより、Ear2遺伝子の機能解析をより簡便に行うことができ、ひいては好酸球やそれに関連する疾患の解析をより簡便に行うことが可能となる。
【００２９】
また、本発明のマウスは、「レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列」を1つのみ有する。換言すれば、本発明のマウスは、上記置換により組み込まれた「レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列」以外に、「レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列」を有しない。したがって、本発明のマウス細胞においては、「レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列」の挿入により野生型細胞と異なる挙動を示すリスクが最小限に抑えられている。このため、本発明の細胞は、Ear2遺伝子の機能解析、ひいては好酸球やそれに関連する疾患の解析に好適に用いることができる。
【００３０】
本発明のマウス細胞の細胞種としては、特に制限されず、例えば血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子（精子、卵子）、受精卵、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、がん細胞等が挙げられる。
【００３１】
本発明のマウスは、本発明のマウス細胞を含む限りにおいて、特に制限されない。本発明のマウスは、本発明のマウス細胞のみからなるマウスであってもよいし、一部の細胞が本発明のマウス細胞であるマウスであってもよい。
【００３２】
本発明の細胞は、ターゲティングベクターを用いた相同組換え法により作製することができる。
【００３３】
ターゲティングベクターは、通常、5´側から、5´側ホモロジーアーム、上述の「レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列」、3´側ホモロジーアームが配置された塩基配列を含むDNAである。
【００３４】
5´側ホモロジーアーム及び3´側ホモロジーアームは、「レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列」に置換する対象部位であるゲノム内の「Ear2遺伝子エクソン2の一部又は全部の塩基配列」の5´側及び3´側に隣接する領域の塩基配列を意味する。これらのホモロジーアームを介した相同組換えにより、「ゲノム内のEar2遺伝子エクソン2の一部又は全部の塩基配列」を上述の「レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列」に置換することができる。
【００３５】
5´側ホモロジーアーム及び3´側ホモロジーアームは、いずれか一方が比較的長く（long arm）、他方は比較的短く（short arm）される。どちらをlong armとするかは、ジェノタイピングのサザンブロッティングで使用する制限酵素サイトの位置等に応じて選択することも可能であるが、本発明においては、目的の置換の効率をより高めるという観点から、5´側ホモロジーアームがlong armであり、3´側ホモロジーアームがshort armであることが好ましい。
【００３６】
long armの長さは、目的の置換の効率を現実的に作製可能な程度にまで高めることができるという観点から、例えば3990〜5000 bp、好ましくは3990〜4490 bp、より好ましくは4190〜4390 bp、さらに好ましくは4240〜4340 bpである。
【００３７】
short armの長さは、目的の置換の効率を現実的に作製可能な程度にまで高めることができるという観点から、例えば1770〜2370 bp、好ましくは1970〜2170 bp、より好ましくは2020〜2120 bpである。
【００３８】
ターゲティングベクターは、上記以外に、他の配列を有していてもよい。他の配列としては、例えば相同組換え法のネガティブセレクションマーカーの発現カセット（例えば、DTA（Diptheria Toxin A）カセット等）等が挙げられる。他の配列の長さは、目的の置換の効率を現実的に作製可能な程度にまで高めることができるという観点から、例えば4050〜4650 bp、好ましくは4250〜4450 bp、より好ましくは4300〜4400 bpである。他の配列は、5´側ホモロジーアームの5´側に隣接して存在することが好ましい。
【００３９】
相同組換え法においては、通常、ターゲティングベクターを、ES細胞に導入することにより行われる。導入方法は特に制限されないが、例えばエレクトロポレーション法が挙げられる。
【００４０】
ターゲティングベクターの導入後は、通常、「レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列」内の薬剤耐性遺伝子を利用して、薬剤による選別が行われる。この選別により得られたコロニーをジェノタイピングすることにより、目的の領域が「レポータータンパク質コード配列を含む塩基配列」に置換された本発明のマウス細胞を得ることができる。
【００４１】
ジェノタイピングは、本発明のマウス細胞であることを確認できる方法であれば特に制限されず、公知の方法に従って又は準じて行うことができる。ゲノム内のEar2遺伝子近辺には、該遺伝子と塩基配列の同一性が高い遺伝子が複数存在しており、さらに、これらの類似遺伝子の周辺領域も、Ear2遺伝子の周辺領域と同一性が高いことから、ジェノタイピングの1つとして、シークエンシング解析を行うことが望ましい。
【００４２】
さらに、定法に従って、得られた本発明の細胞（ES細胞）をマウス胚盤胞へ注入してキメラマウスを得る、該キメラマウスを掛け合わせてヘテロマウスを得る、該ヘテロマウスを掛け合わせてホモマウスを得る等を行い、各種細胞種の本発明の細胞や、本発明のマウスを得ることができる。
【実施例】
【００４３】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４４】
実施例1．Ear2遺伝子破壊株の作製
図１及び２に示すようにターゲティングベクターを設計し、これを用いた相同組み換えにより、ゲノム内のEar2遺伝子エクソン2の一部の塩基配列（Ear2遺伝子ORF全長）が、Creタンパク質融合型EGFPコード配列を含む塩基配列に置換したマウスES細胞を作製した。具体的には以下のように行った。
【００４５】
＜実施例1-1．ターゲティングベクターの作製＞
図２に示すターゲティングベクターを次のようにして作製した。なお、このベクターの配列構成を、図２における「DTA」（DTA（Diptheria Toxin A）カセット）を起点として、右回り方向に順に示す：
＜1＞DTAカセット（配列番号1）
＜2＞リンカー1（配列番号2：EcoRI認識配列及びPspOMI認識配列からなる配列）
＜3＞Long 1（Long arm 5´側配列）（配列番号3）
＜4＞リンカー2（5´-CCCGGG：XmaI認識配列）
＜5＞Long 2（Long arm 3´側配列）（配列番号4）
＜6＞Kozak配列（5´-GCCACC）
＜7＞Creタンパク質コード配列（配列番号5）
＜8＞リンカー3（配列番号6）
＜9＞EGFPコード配列（配列番号7）
＜10＞リンカー4（5´-ACGCGT：MluI認識配列）
＜11＞FRT（Flippase Recognition Target）配列（配列番号8）
＜12＞mouse PGK promoter-Neomycin耐性遺伝子カセット（逆向き）（配列番号9）
＜13＞FRT（Flippase Recognition Target）配列（配列番号8）
＜14＞リンカー5（配列番号10：XmaI認識配列を含む配列）
＜15＞Short arm（配列番号11）
＜16＞リンカー6（5´-CCGCGG：SacII認識配列）
＜17＞Back Ground配列（配列番号12）。
【００４６】
BACクローンより、5´-リンカー2−Long 2−リン酸基の配列構成からなるDNA断片1をPCRにより作製した。また、pCAG-Cre:GFPベクターより、5´-リン酸基−Kozak配列−Creタンパク質コード配列−リンカー3−EGFPコード配列−リンカー4の配列構成からなるDNA断片2を得た。pBlueScript II SK(+) ベクターをXmaI及びAcc651Iで消化し、そこへインサートとしてDNA断片1のXmaI消化物及びDNA断片2のAcc65I消化物を組み込んで、pBS-L2-EGFP-creベクターを得た。このベクターのベクターマップを図３に示す。
【００４７】
BACクローンより、リンカー1−Long 1−リンカー2の配列構成からなるDNA断片3をPCRにより作製した。pBS-DTA (KpnI) ベクターをPspOMI及びXmaIで消化し、そこへインサートとしてDNA断片3のPspOMI及びXmaI消化物を組み込んで、Construct 1ベクターを得た。このベクターのベクターマップを図４に示す。
【００４８】
BACクローンより、5´-リンカー5−Short arm−リンカー6−PspOMI認識配列の配列構成からなるDNA断片4をPCRにより作製した。pBS-loxP-FRT-Neo-FRTベクターをXmaI及びPspOMIで消化し、そこへインサートとしてDNA断片4のXmaI及びPspOMI消化物を組み込んで、Construct 2ベクターを得た。このベクターのベクターマップを図５に示す。
【００４９】
Construct 1ベクターをXmaI及びSacIIで消化して、そこへインサートとしてpBS-L2-EGFP-creベクターのXmaI及びMluI消化物、並びにConstruct 2ベクターのMluI及びSacII消化物を組み込んで、ターゲティングベクター（図２）を得た。
【００５０】
＜実施例1-2．ES細胞へのターゲティングベクターの導入＞
実施例1-2で得られたターゲティングベクターをSacIIでリニアライズし、これをエレクトロポレーション法によりマウス（C57BL/6）ES細胞に導入した。薬剤（ネオマイシン）含有培地で培養を続け、薬剤耐性の陽性クローンを93個得た。
【００５１】
＜実施例1-3．ジェノタイピング1＞
実施例1-2で得られた各陽性クローンのゲノムを鋳型とし、プライマーとして、ネオマイシン耐性遺伝子発現カセット内にアニーリングするように設計されたフォワードプライマー（GT-NEO-OUT-R2：5´-CGTGCAATCCATCTTGTTCAAT（配列番号13））、及びターゲティングベクターの外側の染色体DNA内にアニーリングするように設計されたリバースプライマー（R1：5´-CCTAGAACCCACATAGCGGTTA（配列番号14））を用いてPCRを行った。各プライマーのアニーリング位置については図６の模式図にも示す。PCRは、94℃ 2分間→（98℃ 10秒間→66℃ 5分間）×35サイクル→68℃ 5分間→4℃のサイクルで、ポリメラーゼとしてTaq（TOYOBO社製）KOD FXを用い、15μLの反応溶液量で行った。
【００５２】
PCR反応物をアガロースゲル電気泳動した結果、想定されるPCR断片のサイズ（4052 bp）の位置にバンドを確認できた陽性クローンが、14個（No.5, 7, 15, 30, 31, 45, 53, 56, 58, 65, 86, 87, 91, 92）得られた。
【００５３】
＜実施例1-4．ジェノタイピング2＞
実施例1-3で得られた各陽性クローンのゲノムを鋳型とし、プライマーとして、Creコード配列内にアニーリングするように設計されたフォワードプライマー（Cre-F1：5´-CGCGATTATCTTCTATATCTTCAGG（配列番号15））、及びネオマイシン耐性遺伝子発現カセット内にアニーリングするように設計されたリバースプライマー（GT-NEO-OUT-F1：5´-CTTCCTCGTGCTTTACGGTATC（配列番号16））を用いてPCRを行った。各プライマーのアニーリング位置については図７の模式図にも示す。PCRは、94℃ 2分間→（98℃ 10秒間→64℃ 3分間）×35サイクル→68℃ 5分間→4℃のサイクルで、ポリメラーゼとしてTaq（TOYOBO社製）KOD FXを用い、15μLの反応溶液量で行った。
【００５４】
PCR反応物をアガロースゲル電気泳動した結果、ジェノタイピングに供した全てのクローン（No.5, 7, 15, 30, 31, 45, 53, 56, 58, 65, 86, 87, 91, 92）について、想定されるPCR断片のサイズ（1792 bp）の位置にバンドを確認できた。この結果より、これらのクローンについては、Targeting Vectorによって組み込まれている Cre-EGFP Knock In 配列が相同組換えにより正しく挿入されていることが示された。
【００５５】
＜実施例1-5．ジェノタイピング3＞
実施例1-3及び実施例1-4で得られた各陽性クローンのゲノムを鋳型とし、プライマーとして、ネオマイシン耐性遺伝子発現カセット内にアニーリングするように設計されたフォワードプライマー（GT-NEO-OUT-R2：5´-CGTGCAATCCATCTTGTTCAAT（配列番号13））、並びに破壊目的のear2遺伝子及びこれと極めて同一性が高いear1遺伝子の共通配列内にアニーリングするように設計されたリバースプライマー（ec-3PCR-R2：5´-GAAATATACCAGCACAGAGAAAAGC（配列番号17））を用いてPCRを行った。各プライマーのアニーリング位置については図８の模式図にも示す。PCRは、94℃ 2分間→（98℃ 10秒間→64℃ 6分間）×35サイクル→68℃ 6分間→4℃のサイクルで、ポリメラーゼとしてTaq（TOYOBO社製）KOD FXを用い、15μLの反応溶液量で行った。
【００５６】
PCR反応物をアガロースゲル電気泳動した結果、ジェノタイピングに供した全てのクローン（No.5, 7, 15, 30, 31, 45, 53, 56, 58, 65, 86, 87, 91, 92）について、想定されるPCR断片のサイズ（3885 bp）の位置にバンドを確認できた。
【００５７】
得られたPCR断片について、Short arm上のear1遺伝子及びear2遺伝子の共通配列上で設計されたプライマー（ec-short-seq-R1：5´-GCCCCCAGGAGTGTTAGAAT（配列番号18））、及びShort arm外側のear1遺伝子及びear2遺伝子の共通配列上で設計されたプライマー（ec-3PCR-seq-F1：5´-AAGGCCATTTCTGGTGAGTG（配列番号19））を用いて、シークエンス解析した。なお、各プライマーのアニーリング位置については図８の模式図にも示す。
【００５８】
その結果、8個のクローン（No.5, 7, 15, 31, 53, 58, 65, 92）については、ear1遺伝子ではなく、目的のear2遺伝子において特異的に相同組み換えが起こっていることが確認できた。
【００５９】
＜実施例1-6．ジェノタイピング4＞
実施例1-5で得られた各陽性クローンのゲノムを、Long armの外側及びShort arm内を切断する制限酵素（BglII）（得られる断片の長さは約8.2 kbp）、又はLong arm内及びShort armの外側を切断する制限酵素（HindIII）（得られる断片の長さは約10.7 kbp）で消化し、得られた消化断片を泳動DNAとしてサザンブロッティングを行った。プローブとしては、Creタンパク質融合型EGFPコード配列内に設計されたフォワードプライマー（EGFP probe primer F1：5´-AGCTGACCCTGAAGTTCATCTG（配列番号20））及びリバースプライマー（EGFP probe primer R1：5´-TATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTT（配列番号21））を用いたPCRにより得られたプローブ（333 bp（配列番号22））を用いた。制限酵素切断位置及びプローブの位置については、図９の模式図にも示す。
【００６０】
その結果、6個のクローン（No.15, 31, 53, 58, 65, 92）について、BglII及びHindIIIいずれの消化断片を用いた場合においても、想定される位置（BglII：約8.2 kbp、HindIII：約10.7 kbp）にバンドが検出された。このことから、これらのクローンについては、Targeting Vectorによる相同組み換えが図１の「Targeted allele」に示されるように、目的の配列で正しく起こっていることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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