(57)【要約】      （修正有）【課題】糖タンパク質の凝集を低下させる方法の提供。【解決手段】糖タンパク質の凝集を低下させるためのＯ-結合型グリコシル化部位の数を最適化する方法。糖タンパク質が特定のアミノ酸配列の位置メチオニン又は位置２６のアラニンで開始して、位置３８３のリジンで終結するＣＴＬＡ４融合タンパク質を含み、Ｏ−結合型グリコシル化部位がＳ１５５及びＳ１６５であり、前記Ｓ１５５及びＳ１６５のセリンが、削除及び／又は置換する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上のＯ-結合型グリコシル化部位を除去することを特徴とする、糖タンパク質の凝集を低下させる方法であって、糖タンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の位置２７のメチオニンまたは位置２６のアラニンで開始して、位置３８３のリジンで終結する、ＣＴＬＡ４融合タンパク質を含み、ここでＯ-結合型グリコシル化部位が、Ｓ１５５およびＳ１６５から選択される、方法。
【請求項２】
Ｓ１５５およびＳ１６５の両方のＯ-結合型グリコシル化部位が置換および／または削除されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
削除および／または置換が下記から選択される、請求項１に記載の方法：
ａ．位置１５５のセリンが削除されている、
ｂ．位置１５５のセリンがグルタミンで置換されている、
ｃ．位置１５５のセリンがアラニンで置換されている、
ｄ．位置１６５のセリンが削除されている、
ｅ．位置１６５のセリンが、グルタミンで置換されている、
ｆ．位置１６５のセリンが、アラニンで置換されている、
ｇ．位置１５５および１６５のセリンが削除されている、
ｈ．位置１５５のセリンがグルタミンで置換されており、かつ位置１６５のセリンがアラニンで置換されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願全体にわたり、様々な刊行物を参照する。これら刊行物の開示内容のその全ては、本発明が関連する技術分野をより詳細に記述するために、参照により本発明に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本発明の分野
本発明は、Ｏ-結合型グリコシル化部位の数を最適化することにより糖タンパク質の凝集を低下させるための方法に関する。
【０００３】
本発明の背景
タンパク質のグリコシル化は、生物学的製剤の有効性および薬物動態的寿命の決定に関与する重要な性質である。各グリコシル化部位がタンパク質の全体的な機能にどのように影響を及ぼすかということを理解することは、最終製品の品質を最適化する一助となる。均一なグリコシル化プロファイルを達成することにより、製品の等価性を確保しつつ収量増加を実現できる。
【０００４】
Ｏ-結合型グリコシル化とは、糖類（Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロース）の一つが、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的にはセリンまたはスレオニン）に付加することをいう。Ｏ-結合型の糖残基は、Ｎ−結合型グリコシル化よりも構造的制約が少ないため、様々な種類の糖形態を作り出す。共通する認識配列がないために、Ｏ-結合型グリコシル化を予測することは困難である。しかし、ニューラルネットワークの手法が開発され、ムチン型Ｏ-結合部位の予測を向上させてきた(Julenius, K., et.al. 2005. Glycobiology 15, 153-164)。現在までに為された殆どの報告は、糖タンパク質の結合能またはそのペプチドバックボーンのマスキングに関するＯ−グリカンの役割を立証するものであるが、ある特定の症例研究は、Ｏ−結合部位を多く有する卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）アナログが、Ｎ−結合型グリコシル化部位を多く有するＦＳＨアナログよりも生物活性が低いということを実証している(Weenen, C. et al. 2004. J Clin Endocrinol Metab 89, 5204-5212)。Ｏ-結合型グリカンは、糖タンパク質ｇＣ−１の細胞表面の発現には重要でないことが示されてきたが、そのエピトープ結合ドメインおよびその結合能と干渉する可能性がある(Biller, M. et al. 2000. Glycobiology 10, 1259-1269)。
【０００５】
グリコシル化の存在は、免疫原性、有効性、溶解性および市販生物学的製剤の半減期に影響を及ぼすと考えられる(Lis, H. et.al.1993. Eur J Biochem 218, 1-27; Lowe, J.B. et.al. 2003. Annu Rev Biochem 72, 643-691; Van den Steen, P. et.al.1998. Crit Rev Biochem Mol Biol 33, 151-208)。しかし、殆どの文献は、Ｎ-結合型グリコシル化の効果に焦点を向けている(Hossler, P. et.al.2009. Glycobiology 19, 936-949)。タンパク質の品質に対するＯ-結合型グリコシル化の効果に関する情報は十分ではない；特に、タンパク質凝集に関して不十分である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
製造中のタンパク質治療薬の凝集は、望ましくなく、またその除去のためには終了段階で大掛かりな処理を必要とする。従って、タンパク質凝集を最小にして、製造コストを低減させ、かつ処理の最適化を促進させる必要がある。Ｏ-結合型グリコシル化と治療用糖タンパク質の凝集との関係性を見出すことにより、製造開発の早い段階において、製造者は治療用糖タンパク質を改変することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、Ｏ-結合型グリコシル化部位の数を最適化することにより糖タンパク質の凝集を低下させるための方法を提供するものである。糖タンパク質は、融合タンパク質であり得る。融合タンパク質は、ヒトイムノグロブリンのＦｃ領域のヒンジ部分を含み得る。ヒトイムノグロブリンは、ヒトＩｇＧであり得る。
【０００８】
本発明は、１以上のＯ-結合型グリコシル化部位を除去することを特徴とする、糖タンパク質の凝集を低下させる方法を提供する。除去されるＯ-結合型グリコシル化部位は、Ｆｃドメインのヒンジ領域に存在し得る。
【０００９】
本発明は、アミノ酸置換および／または削除による１以上のＯ-結合型グリコシル化部位を除去することを特徴とする、糖タンパク質の凝集を低下させる方法を提供する。１以上の置換および／または削除されたＯ-結合型グリコシル化部位は、配列番号：５に示されるＦｃドメインのヒンジ領域に存在し得る。配列番号：５に示されるＦｃドメインのヒンジ領域において削除され得るＯ-結合型グリコシル化部位は、Ｓ２４８、Ｔ２５２、Ｔ２５４から選択される。１以上の置換および／または削除されたＯ-結合型グリコシル化部位は、配列番号：４に示される変異型Ｆｃドメインのヒンジ領域に存在し得る。配列番号：４に示されるＦｃドメインのヒンジ領域において削除され有るＯ-結合型グリコシル化部位は、Ｓ１２９、Ｓ１３０、Ｓ１３６、Ｓ１３９、Ｔ１３３、Ｔ１３５から選択される。
【００１０】
本発明は、Ｓ１２９、Ｓ１３０、Ｓ１３６、Ｓ１３９、Ｔ１３３、Ｔ１３５から選択される少なくとも１つのＯ-結合型グリコシル化部位の除去を含む図６に示されるＣＴＬＡ４Ｉｇ融合糖タンパク質を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａ−１Ｃは、ベラタセプトにおけるグリコシル化部位を示す。Ａは、公開データ(AMA 2008; Schwartz et al. 2001)から推定されるＮ−結合型グリコシル化およびＯ-結合型グリコシル化部位を示す。Ｂは、質量分光分析によりマッピングされたトリプシンのペプチドフラグメント（配列番号：３）上のＯ-結合型グリコシル化部位を示す。一つのＯ-結合型部位を、Ｓ１２９またはＳ１３０に正確に割り当てることは出来なかった。Ｃは、ニューラルネットワーク法NetOGlyc3.1により予想されたＯ-結合型グリコシル化部位を示す（配列番号：４）。図６に示されるベラタセプトのアミノ酸配列は、www.cbs.dtu.dk/services/netoglycのオンラインソフトウェアNetOGlyc3.1への入力データとして使用された。
【００１２】
【図２】図２は、推定Ｏ−結合部位数と全シアル酸含量との間には相関関係がないことを示す。３つの変異体（点線で囲まれた）にＯ-結合型グリコシル化が存在しなかった場合に、一貫した全シアリル化が検出された。
【００１３】
【図３】図３Ａ−３Ｄは、隠れた部位（hidden site）のＯ-結合型グリコシル化を同定するものである。  Ａは、共通するＯ−グリカン構造を示す略図である。括弧内の数字は分子量である。Ｇａｌ−ガラクトース；ＧａｌＮＡｃ−Ｎ−アセチルガラクトサミン。Ｂは、野生型ベラタセプトにおけるＯ-結合型グリコシル化を示すデコンボリューション処理済質量スペクトルデータである。Ｃは、Ｓ１２９、Ｓ１３０およびＳ１３９を有さなかった変異体におけるＯ-結合型グリコシル化を示すデコンボリューション処理済質量スペクトルデータである。Ｓ１２９、Ｓ１３０およびＳ１３９の三重削除後の変異体において、Ｔ１３３、Ｔ１３５およびＳ１３６でのＯ-結合型グリコシル化が検出出来る可能性が高かった。Ｄは、Ｓ１２９、Ｓ１３０およびＳ１３９を有さず、かつＴ１３３、Ｔ１３５およびＳ１３６がアラニンで置換された変異体において、Ｏ-結合型グリコシル化が存在しないことを示すデコンボリューション処理済質量スペクトルデータである。
【００１４】
【図４】図４Ａ−４Ｃは、同一部位での一つの変異による異なるＯ−糖形態の形成を示す。Ａは、Ｓ１２９の削除を有する変異体においてＯ-結合型グリコシル化を示すデコンボリューション処理済質量スペクトルデータである。Ｂは、位置１２９にグルタミン置換を有する変異体においてＯ-結合型グリコシル化を示すデコンボリューション処理済質量スペクトルデータである。Ｃは、位置Ｓ１２９にて置換なくそのままで、かつ位置１３０、１３３、１３５、１３６および１３９にてアラニン置換を有する変異体において、Ｏ-結合型グリコシル化が存在しないことを示すデコンボリューション処理済質量スペクトルデータである。
【００１５】
【図５】図５は、変異型Ｏ−結合部位に関して高分子量（ＨＭＷ）種の低下を％で示す；データを、野性型コントロールにて１００％に正規化した。６つの潜在的Ｏ−結合部位が存在しており、また１から６つ全てのグリコシル化部位を除去するよう変異体を作成した。
【００１６】
【図６】図６（配列番号：１および２）は、ベラタセプトの、シグナルペプチド（位置−１のアラニンから位置−２６のメチオニンまで）を含む細胞毒性Ｔ−リンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）融合タンパク質；位置＋１のメチオニンで開始して、位置＋１２４のアスパラギン酸で終結するか、または位置−１のアラニンで開始して、位置＋１２４のアスパラギン酸で終結するＣＴＬＡ４の変異型細胞外ドメイン；位置＋１２５のグルタミンリンカー；ならびに、位置＋１２６から＋３５７のヒトイムノグロブリンＧ１抗体のＦｃドメインのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図示している。配列番号：１および２は、ベラタセプトの２６個のアミノ酸シグナルペプチドを含むＣＴＬＡ４融合タンパク質；位置＋２７のメチオニンから開始して、位置＋１５０のアスパラギン酸で終結するか、または位置＋２６のアラニンで開始して、位置＋１５０のアスパラギン酸で終結するＣＴＬＡ４の変異型細胞外ドメイン；位置＋１５１のグルタミンリンカー；ならびに、位置＋１５２から＋３８３のヒトイムノグロブリンＧ１抗体のＦｃドメインのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（本発明の詳細な説明）
本願明細書において使用されるあらゆる科学用語および技術用語は、別段の記載が無ければ当分野で一般的に使用される意味を有する。本願明細書に使用されるとおり、以下の単語または表現は、特定の意味を有する。
【００１８】
本明細書に使用されるとおり、「ベラタセプト」は、Ｉｇテイル（図６の配列番号：１および２に含まれる）に連結された、Ａ２９Ｙ（位置２９でアラニンに代わりチロシンのアミノ酸残基に置換する）およびＬ１０４Ｅ（位置＋１０４でロイシンに代わりグルタミン酸のアミノ酸残基に置換する）のアミノ酸の変更を有する野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含む可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇ変異体分子である融合タンパク質である；Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ−ＩｇをコードするＤＮＡは、ブタペスト条約の規定の下にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に、２０００年６月２０日に寄託された。それはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２１０４として受託されている。Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ−Ｉｇは、さらに２００６年８月２２日に発行された米国特許第７,０９４,８７４号に記述されており、その全ては参照により本明細書に組み込まれる。
【００１９】
本明細書に使用されるとおり、「凝集体」は、「高分子量種」と互換的に使用される。例えば、高分子量凝集体とは、テトラマー、ペンタマーまたはヘキサマーであり得る。
【００２０】
モノマー、ダイマーおよび糖タンパク質のＨＭＷ種は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分離され得る。ＳＥＣは、分子サイズを基準にして分子を分離する。分離は、カラム長に沿って分子が移動する場合に示差的な分子の排除または取り込みにより達成される。こうして、分離能は、カラム長に応じて高くなる。例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子サンプルは、直列に並べてTSK Gel（登録商標）G3000SWXL(300mm x 7.8mm)およびTSK Gel（登録商標）G3000SWXL(40mm x 6.0mm)カラム(Tosoh Bioscience, Montgomery, PA)を装備した2695 Alliance HPLC (Waters, Milford, MA)を用いて分離され得る。１０ｍｇ／ｍｌ（２０μｌアリコート）のサンプルは、１.０ｍｌ／分の流速で、０.２Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０.９％ ＮａＣ１（ｐＨ６.８）を含有する移動相を用いて分離される。サンプルは、Water's 2487二波長検出器を用いて２８０ｎｍにおける吸光度によりモニターされる。このシステムを用いると、ＨＭＷ種は７.５分間±１.０分間の保持時間を有する。各ピークは、そのピーク下面積のために積分される。ＨＭＷ種の％を、ＨＭＷピーク面積を全ピーク面積で割って算出した。
【００２１】
本明細書に使用されるとおり、用語「最適化」、「除去する」、「除去」および「除去される」は、用語「置換される」および／または「削除される」と互換的に使用される。
【００２２】
本明細書に使用されるとおり、ヒトイムノグロブリン抗体の「ヒンジ領域」は、ＦａｂアームをＦｃ領域に連結する。ヒンジ領域の柔軟性により、Ｆａｂアームは、様々な距離間隔のエピトープへの結合を可能とする広範な角度を選択できる。
【００２３】
ヒトＩｇＧイムノグロブリンのヒンジ領域は、アミノ酸配列：
２４５    ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦ    ２７２
（配列番号：５）
を含む。
【００２４】
ベラタセプトのヒンジ領域は、配列番号：２に示されるように、位置＋１５２のグルタミン酸から開始して、位置＋１７９のフェニルアラニンで終結するアミノ酸配列を含む。
【００２５】
本発明は、Ｏ-結合型グリコシル化部位の数を最適化することにより糖タンパク質の凝集を低下させるための方法に関する。糖タンパク質は、融合タンパク質であり得る。融合タンパク質は、ヒトイムノグロブリンのＦｃ領域のヒンジ部分を含み得る。ヒトイムノグロブリンは、ヒトＩｇＧであり得る。
【００２６】
一態様において、本発明は、Ｆｃドメインのヒンジ領域内に１以上のＯ-結合型グリコシル化部位を除去することを特徴とする糖タンパク質の凝集を低下させるための方法を提供する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、Ｆｃドメインのヒンジ領域内に少なくとも１つのＯ-結合型グリコシル化部位を置換および／または削除することを含んでなり、該Ｏ-結合型グリコシル化部位が、配列番号：５に示されるＳ２４８、Ｔ２５２、Ｔ２５４から選択される、糖タンパク質の凝集を低下させるための方法を提供するものである。
【００２８】
高分子量種（ＨＭＷ）の量は、生物学的製剤を製造する際に重要な品質制御パラメーターであり、そしてＨＭＷ形成は、タンパク質治療薬の発現システムにおいて望ましくない副次的影響である。ＨＭＷ種は、共有または非共有的に形成され、またタンパク質凝集体であると判断される。
【００２９】
タンパク質治療薬のＯ-結合型グリコシル化の影響をより良く理解するために、高度にグリコシル化されたモデルが、ベラタセプト(Nulojix(登録商標))である融合タンパク質ＣＴＬＡ４−Ｉｇを調べるために選択された。ベラタセプトについて既知のＮ−結合型およびＯ-結合型グリコシル化部位は、図１Ａに示される。アミノ酸配列決定およびペプチドマッピングにより、ベラタセプトおよびアバタセプトには３つのＮ−結合型および２つの優勢なＯ-結合型グリコシル化部位が存在することが確認されてきたが（図１Ｂ）、ニューラルネットワーク法NetOGlyc3.1から、Ｓ１２９からＳ１３９の間に密集した６つのＯ−結合部位が存在することが予想された（図１Ｃ）。この矛盾は、可変性の部位占有率（マクロ的不均一性）に関してＯ-結合型グリカンの不均一性を反映している。
【００３０】
実施例１に示されるように、タンパク質の凝集は、置換または削除によりＯ−結合部位を除去することによって低下された。このことはタンパク質製品中のＨＭＷ種の量の有意な低下により判定された。タンパク質凝集は、少なくとも１以上のＯ-結合型グリコシル化部位の除去により、５％〜９８％、８％〜６０％、８％〜３０％低下する。
【００３１】
一態様において、本発明は、配列番号：４に示されるヒンジ領域内の少なくとも１つのＯ-結合型グリコシル化部位の置換および／または削除を特徴とする糖タンパク質の凝集を低下させるための方法を提供する。
【００３２】
別の態様において、本発明は、配列番号：４に示されるＳ１２９、Ｓ１３０、Ｓ１３６、Ｓ１３９、Ｔ１３３、Ｔ１３５から選択される少なくとも１つのＯ-結合型グリコシル化部位の置換および／または削除を特徴とする糖タンパク質の凝集を低下させるための方法を提供する。
【００３３】
別の態様において、本発明は、配列番号：４に示されるＯ-結合型グリコシル化部位のＳ１２９および／またはＳ１３９を置換および／または削除することを特徴とする糖タンパク質の凝集を低下させるための方法を提供する。
【００３４】
実施例１においては、部位特異的突然変異誘発は、アラニンまたはグルタミンによる完全な削除または置換のいずれかにより行われた。典型的には、分子表面の外側にある残基は、アラニンにより置換され、そして内没した残基は構造破綻を避けるためにグルタミンで置換される。機能タンパク質の作成に関して、アラニンとセリンとの間の唯一の相違は、水素のヒドロキシルによる置換であるが、これはタンパク質の一般構造を改変することにはならない。このモデルタンパク質において、アミノ酸が完全に削除されていても、依然として適切に折りたたまれたタンパク質が分泌された。
【００３５】
別の態様において、本発明は、Ｏ-結合型グリコシル化部位Ｓ１２９またはＳ１３９の削除を含む図６に示される融合タンパク質を提供する。
【００３６】
別の態様において、本発明は、Ｏ-結合型グリコシル化部位Ｓ１２９およびＳ１３９の削除を含む図６に示される融合タンパク質を提供する。
【００３７】
別の態様において、本発明は、Ｓ１２９のグルタミン（Ｑ）またはアラニン（Ａ）による置換を含む図６に示される融合タンパク質を提供する。
【００３８】
別の態様において、本発明は、Ｓ１３９のグルタミン（Ｑ）またはアラニン（Ａ）による置換を含む図６に示される融合タンパク質を提供する。
【００３９】
別の態様において、本発明は、Ａ１３０、Ａ１３３、Ａ１３５、Ａ１３６、Ａ１３９の置換を含む図６に示される融合タンパク質を提供する。
【００４０】
別の態様において、本発明は、Ａ１２９、Ａ１３３、Ａ１３５、Ａ１３６、Ａ１３９の置換を含む図６に示される融合タンパク質を提供する。
【００４１】
別の態様において、本発明は、アミノ酸Ｓ１２９、Ｓ１３０、Ｓ１３９の削除を含む図６に示される融合タンパク質を提供する。
【００４２】
別の態様において、本発明は、Ｓ１３０、Ｔ１３３、Ｔ１３５およびＳ１３６のアラニン（Ａ）による１以上の置換を含む図６に示される融合タンパク質を提供する。
【００４３】
本発明のＣＴＬＡ４Ｉｇ分子の製造方法
ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子は、原核生物細胞において発現させ得る。原核生物は、種々の細菌株により示されることが多い。その細菌は、グラム陽性またはグラム陰性であってもよい。通常、E.coliなどのグラム陰性細菌が好ましい。他の微生物株も使用され得る。
【００４４】
上記したように、ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子をコードしている配列は、外来配列をE.coliなどの原核生物細胞において発現するよう設計されたベクターに挿入され得る。これらのベクターは、リボゾーム結合部位配列と共に転写開始のためのプロモーター（所望によりオペレーターを有する）を含むように本明細書に規定される一般的に使用される原核生物のコントロール配列を含んでおり、この一般的に使用されるプロモーターをβ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系(Chang, et al., (1977) Nature 198:1056)、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系(Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acid Res. 8:4057)およびラムダ派生型ＰＬプロモーターおよびＮ−遺伝子リボゾーム結合部位(Shimatake, et al., (1981) Nature 292:128)として含む。
【００４５】
かかる発現ベクターは、複製起点および選択マーカー（例えば、抗生物質に対して耐性を付与するβ-ラクタマーゼまたはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）も含んでおり、これにより該ベクターは、細菌中で複製でき、プラスミドを担持する細胞を、抗生物質（例えば、アンピシリンまたはカナマイシン）存在下で育成させた場合に選抜することができる。
【００４６】
発現プラスミドは、例えばＣａＣｌ２−ショック(Cohen,(1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110, and Sambrook et al. (eds.), "Molecular Cloning: A laboratory Manual", 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press,(1989))および電気穿孔法を含むが、これらに限定しない様々な標準方法により、原核生物細胞に導入され得る。
【００４７】
本発明の実施によれば、真核生物細胞とは適切な宿主細胞でもある。真核生物細胞の例には、あらゆる動物細胞（初代または不死化細胞であっても）、酵母［例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)］ならびに植物細胞が挙げられる。骨髄腫、ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞は、宿主として使用できる動物細胞の例である。特定のＣＨＯ細胞には、ＤＧ４４(Chasin, et la., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901-10909)、ＣＨＯ−Ｋ１(ATCC No. CCL-61)、ＣＨＯ−Ｋ１ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞株(Clontech)、ＥＣＡＣＣ ８５０５０３０２であるＣＨＯ(CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)、ＣＨＯクローン１３(GEIMG, Genova, IT)、ＣＨＯクローンＢ(GEIMG, Genova, IT)、ＥＣＡＣＣ ９３０６１６０７であるＣＨＯ−Ｋ１／ＳＦ(CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)およびＥＣＡＣＣ ９２０５２１２９であるＲＲ−ＣＨＯＫ１(CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)が挙げられるが、これに限定するものではない。代表的な植物細胞には、タバコ(植物全体、細胞培養物またはカルス)、トウモロコシ、ダイズおよびコメの細胞が挙げられる。トウモロコシ、ダイズおよびコメの種もまた許容される。
【００４８】
上記したＣＴＬＡ４Ｉｇ分子をコードする核酸配列は、真核生物宿主において外来配列を発現するために設計されたベクターに挿入され得る。ベクターの調節エレメントは、特定の真核生物宿主に応じて変更できる。
【００４９】
発現ベクターにおいて使用するために一般的に使用される真核生物のコントロール配列には、哺乳類細胞と適合性のあるプロモーターおよびコントロール配列、例えばＣＭＶプロモーター（ＣＤＭ８ベクター）およびトリ肉腫ウイルス(ＡＳＶ)(πＬＮベクター)が挙げられる。他の一般的に使用されるプロモーターには、シミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）由来の初期および後期プロモーター(Fiers, et al., (1973) Nature 273:113)またはその他のウイルスプロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２およびウシ乳頭腫ウイルスから得られるもの）が挙げられる。誘導プロモーター、例えばｈＭＴＩＩ(Karin, et al., (1982) Nature 299:797-802)もまた使用し得る。
【００５０】
また真核生物においてＣＴＬＡ４Ｉｇ分子を発現するためのベクターは、いわゆるエンハンサー領域と呼ばれる配列を担持していてもよい。これらは、遺伝子発現を最適化する際に重要であり、プロモーター領域の上流または下流のいずれかに存在する。
【００５１】
真核細胞宿主細胞のための発現ベクターの例には、哺乳類宿主細胞のためのベクター、例えばＢＰＶ−１、ｐＨｙｇ、ｐＲＳＶ、ｐＳＶ２、ｐＴＫ２(Maniatis)；ｐＩＲＥＳ(Clontech)；ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＳＦＶ１(Life Technologies);ｐＶＰａｋｃベクター、ｐＣＭＶベクター、ｐＳＧ５ベクター(Stratagene))、レトロウイルスベクター、例えばｐＦＢベクター(Stratagene)、ｐＣＤＮＡ−３(Invitrogen)またはその改変型、アデノウイルスベクター；アデノ関連ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、酵母ベクター(例えば、ｐＥＳＣベクター(Stratagene)が挙げられるが、これに限定するものではない。
【００５２】
ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子をコードしている核酸配列は、真核生物宿主細胞のゲノムに取り込まれ、宿主ゲノム複製物として複製され得る。あるいは、ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子を担持するベクターは、染色体外の複製を可能とさせる複製起点を含有することができる。
【００５３】
サッカロマイセス・セレビシエにおいて核酸配列を発現させるために、内因性酵母プラスミド由来の複製起点の２μサークルを使用することができる(Broach, (1983) Meth. Enz. 101:307)。あるいは、自律複製を促進できる酵母ゲノム由来の配列を使用できる(例えば、Stinchcomb et al., (1979) Nature 282:39を参照されたい);Tschemper et al.,(1980) Gene 10:157; and Clarke et al., (1983) Meth. Enz. 101:300)。
【００５４】
酵母ベクターのための転写調節配列には、解糖系酵素を合成するためのプロモーターが挙げられる(Hess et al., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; Holland et al., (1978) Biochemistry 17:4900)。当分野において既知のさらなるプロモーターには、ＣＤＭ８ベクター内で提供されるＣＭＶプロモーター(Toyama and Okayama, (1990) FEBS 268:217-221)、３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター(Hitzeman et al., (1980) J. Biol. Chem. 255:2073)、および他の解糖系酵素のためのプロモーターもまた挙げられる。
【００５５】
その他のプロモーターは、環境的刺激または細胞の増殖培地によって制御され得ることから誘導性のプロモーターである。これらの誘導性プロモーターには、熱ショックタンパク質、アルコール脱水素酵素２、イソシトクロームＣ(isocytochrome C)、酸性ホスファターゼ、窒素異化作用関連酵素ならびにマルトースおよびガラクトースの利用に関与する酵素の遺伝子から得られるものが挙げられる。
【００５６】
調節配列は、コード配列の３'末端にも配置され得る。これらの配列は、メッセンジャーＲＮＡを安定化するように作用させ得る。そのような終結因子は、幾つかの酵母由来遺伝子および哺乳類遺伝子における３'の非翻訳領域に後続するコード配列に存在する。
【００５７】
植物および植物細胞のための代表的なベクターには、アグロバクテリウムＴｉプラスミド、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）ならびにトマト・ゴールデン・モザイク・ウイルス（ＴＧＭＶ）が挙げられるが、これらに限定するものではない。
【００５８】
哺乳類細胞は、例えばこれに限定しないがカルシウムリン酸塩存在下でのトランスフェクション、マイクロインジェクション、電気穿孔法またはウイルスベクターによる形質導入による方法により形質転換され得る。
【００５９】
外来ＤＮＡ配列を植物および酵母ゲノムに導入するための方法には、以下の方法が挙げられる：（１）機械的方法、例えば一つの細胞またはプロトプラストへのＤＮＡのマイクロインジェクション、細胞とガラスビーズとをＤＮＡの存在下でボルテックスにより混合すること、またはタングステンまたは金により被覆されたＤＮＡ粒を細胞またはプロトプラストに撃ち込む；（２）ポリエチレングリコール処理または高圧電気パルス（電気穿孔法）に供して、マクロ分子が細胞膜を透過出来るようにしてＤＮＡを導入すること；または（３）細胞膜に融合するリポソーム（ｃＤＮＡを含有する）の使用。
【００６０】
米国特許第７,５４１,１６４号および米国特許第７,３３２,３０３号は、動物または哺乳類細胞培養による本発明のタンパク質、特に特定の組換え糖タンパク質生成物の製造方法を教示しており、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
【００６１】
細胞培養過程のタンパク質産生段階の後に、ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子は、当業者には理解される技術を用いて細胞培養培地から回収される。特に、ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子は、分泌ポリペプチドとして培養培地から回収される。
【００６２】
培養培地は、細胞破片および粒子を除去するために最初に遠心分離される。次いで、所望のタンパク質が、当分野では十分に確立された以下の非限定的な精製方法を用いて、混在するＤＮＡ、可溶性タンパク質およびポリペプチドから精製される：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；エタノール沈殿；イムノアフィニティーカラムまたはイオン交換カラムでの分画；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはアニオン交換樹脂、例えばＱＡＥまたはＤＥＡＥのクロマトグラフィー；クロマト分画；例えば、Sephadex G-75TMカラムを用いるゲル濾過；ならびにＩｇＧなどの夾雑物を除去するためのタンパク質A Sepharose(商標登録)カラム。プロテアーゼ阻害剤、例えばフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）またはプロテアーゼ阻害剤カクテル混合液の添加は、精製中にタンパク質分解を阻害するためには有用であり得る。当業者は、目的とするタンパク質、例えば糖タンパク質に適切な精製方法には、組換え細胞培養により発現したタンパク質の特性変化に応じた変更が必要となり得ることを認識するであろう。
【００６３】
糖タンパク質の糖質群を選択する精製技術および方法は、本発明の範囲内においても利用できる。例えば、かかる技術には、どの糖質を選択するかに拠りカチオンまたはアニオン交換樹脂を用いるＨＰＬＣまたはイオン交換クロマトグラフィー（ここで、より塩基性の画分または酸性の画分が回収される）が挙げられる。そのような技術を使用することにより、混在物の同時除去が可能となる。
【００６４】
精製方法は、哺乳類細胞系の細胞培養培地中に存在する可能性のあるウイルスおよび／またはレトロウイルスを不活性化および／または除去する追加工程をさらに含むことができる。多くのウイルス排除工程は、カオトロープ、例えば尿素またはグアニジン、界面活性剤、追加の限外濾過／透析濾過工程、従来の分離、例えばイオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィー、ｐＨ限界、熱、プロテアーゼ、有機溶媒またはそのあらゆる組合せによる処理を利用することができるが、これに限定するものではない。
【００６５】
精製ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子は、貯蔵またはさらなる処理の前に、濃縮および緩衝液の交換が必要である。Pall Filtron TFF系は、濃縮するため、そして先の精製カラムからの溶出緩衝液を製剤原料について要求される最終緩衝液に交換するために使用できる。
【００６６】
一態様において、濃縮されており、かつ透析濾過工程に供された精製ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子は、２ＬのBiotainer(登録商標)ボトル、５０Ｌのバイオプロセス用バックまたは任意の適切な容器に入れられ得る。かかる容器内のＣＴＬＡ４Ｉｇ分子は、凍結前に約６０日間２℃〜８℃で貯蔵され得る。２℃〜８℃にて精製ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子の貯蔵が長期化すると、ＨＭＷ種の割合が増加する可能性がある。そのため、長期貯蔵のために、ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子を、貯蔵前に約−７０℃で凍結して、次いで約−４０℃の温度で貯蔵することができる。凍結温度は、約−５０℃〜約−９０℃に変更できる。凍結時間は変更することができ、またＣＴＬＡ４Ｉｇ分子を含有する容器の容量および凍結機に入れる容器の数に依拠して広範に変更できる。例えば、一実施態様において、ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子は、２ＬBiotainer(登録商標)ボトルに入れられる。４つ以下の２Ｌ Biotainer(登録商標)ボトルを凍結機に入れる場合には、約１４時間〜少なくとも１８時間の凍結時間が必要とされ得る。少なくとも４つのボトルを入れる場合には、約１８〜少なくとも２４時間の凍結時間が必要とされ得る。凍結ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子を含む容器は、約−３５℃〜約−５５℃の温度で貯蔵される。約−３５℃〜約−５５℃の温度での貯蔵時間は、変更することが可能であり、１８時間程度短縮することが可能である。凍結された製剤物質は、製剤を処方するための管理手法にて解凍され得る。
【００６７】
２００６年１２月１９日に提出した同時係属中の米国特許出願公開番号：ＵＳ２００９０２５２７４９およびＵＳ２０１００１６６７７４Ａ１は、動物または哺乳類の細胞培養による本発明のタンパク質、特に組換え糖タンパク質生成物の製造方法を教示しており、参照により本明細書の一部に組み込まれる。
【実施例】
【００６８】
実施例１
本試験の目的は、Ｏ−結合部位の部位特異的突然変異誘発により均一なグリカンを有する糖タンパク質を設計すること、ならびにＯ−結合部位と凝集との関係性を明示することをゴールとしてマクロ的な不均一性の現象を理解することであった。
【００６９】
材料および方法
細胞系および培養条件
ヒト胎児腎臓の２９３−Ｆ(ＨＥＫ２９３−Ｆ)FreeStyle(Invitrogen)懸濁細胞を、血清不含FreeStyle293発現培地(Invitrogen)で生育させて、３日毎に振盪フラスコに継代した。細胞を、３７℃で空気中６％ＣＯ２のインキュベーターにおいて、１３０ｒｐｍにてオービタルシェーカープラットフォーム上でインキュベートした。
【００７０】
Ｏ-結合型グリコシル化部位のコンピューター予測
ベラタセプトのＯ-結合型グリコシル化部位を、www.cbs.dtu.dk/services/netoglycのニューラルネットワーク法NetOGlyc3.1により予測した。ベラタセプト野生型の結果を図１Ｃに示す。ベラタセプトのアミノ酸配列を、NetOGlyc3.1オンラインソフトウェアへの入力情報として使用した。出力情報から、ベラタセプトが、６つのＯ−結合部位、即ちＳ１２９、Ｓ１３０、Ｔ１３３、Ｔ１３５、Ｓ１３６およびＳ１３９を含有することが予想された。
【００７１】
融合タンパク質変異体の構築
部位特異的突然変異誘発を、完全な削除またはアラニンまたはグルタミンによる置換のいずれかにより行なった。この突然変異誘発反応を、テンプレートとしてメチル化ベラタセプトプラスミドＤＮＡおよび２つのオーバーラッピングプライマー（この一つは標的配列を含有する）を用いて行なった。突然変異誘発産物を、Ｅ.ｃｏｌｉコンピテント細胞にて形質転換した（ここで非メチル化線状変異ＤＮＡは環化かつ複製された）。プラスミドＤＮＡを、Maxi-prep plasmid kit(Qiagen, Mississauga, ON, Canada)で精製して、配列決定して、正しい変異体の存在を確認した(Cogenics, Houston, TX)。
【００７２】
ＨＥＫ−２９３Ｆ懸濁細胞におけるベラタセプトおよびその変異体の一過性発現
トランスフェクションの１日前に、細胞を、６,００,０００細胞／ｍｌで播種し、３７℃、６％ＣＯ２、１３５ｒｐｍにて振盪するオービタルシェーカープラットフォーム上で攪拌した。トランスフェクションの当日に、細胞を、１０,００,００細胞／ｍｌに希釈して、３０ｍｌの培養量で１２５ｍｌの振盪フラスコに添加した。４０μｇのプラスミドＤＮＡを、OptiPro SFM(Invitrogen)中で全容量０.６ｍｌに希釈して、混合した。分離管内で、FreeStyle MAX 試薬(Invitrogen)（４０μｌ）を、Opti-Pro SFMを用いて全容量０.６ｍｌに希釈した。希釈したＤＮＡ溶液および希釈したトランスフェクション試薬を、穏やかに混合して、室温で２０分間インキュベートした。次いで、ＤＮＡトランスフェクション試薬混合物を、１２５ｍｌのフラスコ中の新たに希釈した細胞にゆっくりと添加した。トランスフェクションした細胞を、１３５ｒｐｍで振盪するオービタルシェーカープラットフォーム上で、バッチモードにおいて７日間、３７℃、６％ＣＯ２にてインキュベートした。
【００７３】
ベラタセプト変異体濃度の決定および精製
サンプルを、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、この上清を生成物の力価アッセイの前に−２０℃で貯蔵した。融合タンパク質濃度を、製造元の指示書に従いOctet QK (ForteBio, Menlo Park, CA)で測定した。収集サンプルを、０.２〜０.３ｍｇ／ｍＬの終濃度としてタンパク質−Ａスピンカラム(Sartorius)を用いて精製した。
【００７４】
全てのシアリル化およびＮ-結合型シアリル化の決定
タンパク質−Ａで精製したサンプルを、ＰＮＧアーゼにより処理して、非シアリル化(asialylated)およびシアリル化Ｎ−結合型グリカンを、２−ＡＢ（アミノベンズアミド）で標識した。２−ＡＢ標識オリゴ糖を、Glyko-GlycoSep C Column(7.5 x 75 mm, Prozyme, San Leandro, CA)を用いる弱アニオン交換ＨＰＬＣ方法により、中性画分および酸性画分を分離した。移動相は、０.５Ｍギ酸アンモニウム溶液（ｐＨ４.５に調整した）および２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液により形成されるグラジエントからなる。流速は０.７５ｍＬ／分であり、蛍光検出を、３３０ｎｍの励起波長および４２０ｎｍの発光波長を用いて行なった。Ｎ−結合型シアリル酸を、非シアリル化およびシアリル化の糖形態の画分に基づいて算出した。
【００７５】
全シアリル酸含量を、以前に記載された方法により決定した(Jing, Y., et.al. 2010. Biotechnol Bioeng 107, 488-496)。Ｎ−結合型およびＯ-結合型グリコシル化由来のシアリル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸およびＮ−グリコリルノイラミン酸）を、部分酸加水分解により溶離させ、次いで逆相ＨＰＬＣにより分離した。Ｎ−グリコリルノイラミン酸は、全てのケースで検出限界以下であった（＜０.１ｍｏｌ／ｍｏｌ 糖タンパク質）。
【００７６】
上清サンプルを、タンパク質−Ａ捕捉物を用いて精製して、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）およびＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）を含むシアリル酸を、部分酸加水分解により溶離させ、次いで逆相ＨＰＬＣにより分離して、全シアリル酸含量（Ｎ−結合型およびＯ-結合型グリコシル化の両方から得られる）を決定した。
【００７７】
結合速度の決定
ＣＤ８０−Ｉｇを２００ＲＵ密度にてBIAコアセンサーチップ表面上に固定することにより、変異体および野生型の各々のＣＤ８０−Ｉｇに対する結合速度を決定した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０.００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）（ｐＨ７.４）中で１０〜２００ｎＭ範囲の濃度を、３０μＬ／分間の流速でセンサーチップ表面に流した。会合および解離データを、様々な濃度で各々３および５分間収集した。
【００７８】
Ｏ-結合型糖形態の決定
タンパク質−Ａで精製したサンプルを、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７.６）に希釈して、終夜ＰＮＧａｓｅＦと共にインキュベートして、Ｎ-結合型オリゴ糖を除去した。次いで、サンプルを、インスリン内部標準と共に混合し、Waters Oasis HLB cartridge上に重層して、５％アセトニトリル中の０.１ギ酸溶液により洗浄し、次いでアセトニトリル中で０.１ギ酸によるグラジエントにより溶出した。キャピラリーおよびコーン電圧は、各々３ｋＶおよび３０Ｖであり、スキャンを８００〜２５００ｍ／ｚで行なった。スペクトルデータを、MaxEnt1 algorithmによりデコンボリューション処理して、分子質量およびＯ-結合型グリカン種を決定した。
【００７９】
サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)
ＳＥＣを使用して、前記方法により、野生型および変異型ベラタセプトサンプル中の高分子量（ＨＭＷ）種を同定した(Qian, Y., et.al. 2010 Biotechnol Prog 26, 1417-1423)。タンパク質−Ａで精製したサンプルおよび参照標準を、7.8x300 mm Toso Haas Biosep TSK G3000SWXLカラムを備えたＨＰＬＣに直接注入した。分離を、流速０.５ｍＬ／分にて３０分間室温でＰＢＳ（ｐＨ７.２）を用いて行なった。アイソクラティック溶出プロファイルを２８０ｎｍでモニターした。定量を、ゲル粒子外部容量とゲル粒子内部容量の間でＨＭＷ、モノマーおよび低分子量種（ＬＭＷ）の相対ピーク面積％を算出して行った。
【００８０】
結果
タンパク質発現、シアリル化および結合速度
野性型ベラタセプトおよびその変異体の両方は、ＨＥＫ一過性発現系において確実に発現しており、全ての変異体は１００〜１５０ｍｇ／Ｌの範囲でタンパク質を分泌していた；具体的には、６つ全ての推定Ｏ−結合部位が削除された変異体の合成および分泌の成功は、Ｏ-結合型グリコシル化がベラタセプト合成にとって重要ではないということを示している。
【００８１】
驚くべきことに、全てのシアリル化と利用可能なＯ−結合部位数との間に明白な相関関係はなかった（図２）。例えば、主なＯ−結合部位（Δ１２９Δ１３９またはΔ１２９Δ１３０Δ１３９）の削除を有する変異体は、野生型よりも全シアリル酸のレベルが有意に高い；５つのＯ−結合部位を除去した場合でさえ、高いシアリル化が、一つの変異体（Δ１２９Δ１３０Ａ１３３Ａ１３６Δ１３９）で依然として見ることができた。最も低い全シアリル酸含量を示す３つの変異体は、Ａ１３０Ａ１３３Ａ１３５Ａ１３６Ａ１３９、Ａ１２９Ａ１３３Ａ１３５Ａ１３６Ａ１３９およびΔ１２９Δ１３０Ａ１３３Ａ１３５Ａ１３６Δ１３９であった。
【００８２】
Ｏ-結合型シアリル化がこれら３つの変異体（次の章を参照されたい）において検出されなかったため、全てのシアリル酸は、Ｎ-結合型シアリル酸のみを含むと考えられた。
【００８３】
機能を確認するために、各変異体についての結合速度を、ＣＤ８０Ｉｇを用いて測定し、そして野生型および参照標準と同等であることが判った。１つおよび複数のＯ−結合部位を除去することにより、平衡定数および結合能という観点からＣＤ８０結合速度に対して有意な影響を及ぼすことはなかった。
【００８４】
Ｏ-結合型糖形態
隠れたＯ−結合部位のグリコシル化
図１Ｂおよび１Ｃに示したように、コンピューターによるＯ−グリコシル化ニューラルネットワーク法により予測された６つの部位が存在するが、一方でペプチドマッピングにより同定されたものは、２つの主要なＯ−結合部位のみであった。潜在的に隠れたＯ-結合型グリコシル化部位を明らかにするために、Ｓ１２９、Ｓ１３０およびＳ１３９を削除することによって既知の部位を妨げた。興味深いことに、Ｏ-結合型グリコシル化分析により、別のＯ−結合部位の存在が実証された（図３Ｃ）。このことは、ベラタセプトが、位置１３３、１３５および１３６のさらなる変異を含めて設計された場合にも確認された；しかし、この変異体は、合成、分泌、そしてＣＤ８０への結合が可能であったが、いずれのＯ-結合型グリコシル化も生じなかった（図３Ｄ）。
【００８５】
様々なＯ−糖形態の形成に対する隣接配列の効果
図２は、同じ位置での一つの変異が、全シアリル酸含量において有意な変動をもたらしたことを示した。この変動の原因を正確に示すために、それらの変異体をＯ−糖形態についてさらに分析した。全ての変異体のＯ-結合型グリコシル化は、野生型と比較して変化したことが判り、そしてさらに興味深いことに、これら変異体のＯ-結合型グリコシル化パターンは、その他の変異体と互いに相違した（図４）。アラニンの代わりにグルタミンで置換することにより、野生型タンパク質において従前には見られなかった複数の糖形態を生成したが、アラニンの置換により糖形態の数は制限された。これは、どのアミノ酸がその代理として存在するかに依存して、Ｏ−グリコシル化がその隣接配列により影響を受け得ることを示している。さらに、Ｓ１２９またはＳ１３０をそのまま残して、残りの５つの推定Ｏ−結合部位を、アラニンで各部位を置換することにより除去した場合に、Ｏ-結合型グリコシル化は形成され得なかった（図４Ｃ）。このことは、たとえ共通の認識配列が存在していなくても、Ｏ−糖形態の形成においてはミクロ環境が重要であることを支持している。
【００８６】
ＨＭＷ種
タンパク質の凝集は、置換または削除によりＯ−結合部位を除去することにより低下した。このことはタンパク質生成物中のＨＭＷ種量の有意な低下により判断された。Ｓ１２９またはＳ１３９のいずれかを変異させることにより、ＨＭＷ種の％が８％〜２９％の範囲で低下したが、一方で両方を変異させることにより、ＨＭＷは６０％低下した（図５）。３つ以上のＯ-結合型グリコシル化部位を除去することにより、二重削除変異体に見られた低下％を上回るＨＭＷ低下のさらなる増強はなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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