(57)【要約】      （修正有）【課題】抗菌剤を発見するための新規薬剤を提供する。【解決手段】多種の治療適応に有用な短いオリゴヌクレオチド及びその類縁体（例えば、ジ−、及びトリヌクレオチド化合物等）の設計に関する。化合物は抗ウィルス剤、抗癌剤等として用いることができると考えられる。化合物は免疫刺激経路及び非ＴＬＲ経路を調節できる。改変したオリゴヌクレオチドからオフターゲット効果を有しているヌクレオチド断片を除外することによる、治療適応のための改変オリゴヌクレオチドの設計にも関する。また、１つ又はそれ以上の化合物を包含している医薬組成物を提供する。化合物及び組成物は、ウィルス性疾患、自己免疫疾患（例えば、アレルギー、喘息、及び炎症性疾患等）及び癌を包含する、多種の疾患に対して治療有用性を有すると考えられる。【選択図】図１
2018010001.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
短鎖オリゴヌクレオチド化合物を投与された対象から採取された生体サンプル中で、短鎖オリゴヌクレオチド化合物によって細胞産生が誘導される抗微生物ペプチドの存在をバイオマーカーとして評価することを含んでなり、
該短鎖オリゴヌクレオチド化合物が、
式（Ｉ）：
2018010001.tif 000026
式（Ｉ）
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、−Ｏ−アルキル、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、−Ｏ−アリール、又は−Ｏ−ヘテロアリールアリールであり；
Ｒ３は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アルキル、及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アリールから選ばれ；
Ｂ１及びＢ２は、それぞれ独立して、アデニニル、グアニニル、チミニル、シトシニル、又はウラシリルであり；
ｍは、１、２、３、４、５又は６であり；
Ｒ４は、Ｈ、一リン酸、二リン酸、又は三リン酸基である）
で表される化合物、若しくはその薬学的に許容される塩、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、立体異性体若しくは互変異性体、又は、
式（ＩＩ）：
2018010001.tif 000027
式（ＩＩ）
（式中、Ｘは、存在しないか、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ、又はＳであり；
Ｘ１は、存在しないか、Ｏ、又はＮＨであり；
Ａは、存在しないか、アリール、又はアラルキルであり；
ｎは、０、１、２、３、４又は５であり；
Ｒは、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−ヘテロアリール、又はステロイド系であり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、−Ｏ−アルキル、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、−Ｏ−アリール、又は−Ｏ−ヘテロアリールアリールであり；
Ｒ３は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アルキル、及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アリールから選ばれ；
Ｂ１及びＢ２は、それぞれ独立して、アデニニル、グアニニル、チミニル、シトシニル、又はウラシリルであり；
ｍは、１、２、３、４、５又は６であり；
Ｒ４は、Ｈ、一リン酸、二リン酸、又は三リン酸基である）
で表される化合物、若しくはその薬学的に許容される塩、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、立体異性体若しくは互変異性体であり、
該抗微生物ペプチドが、細胞ＥＥＥＨタンパク質である、
微生物感染に罹っている対象における抗微生物応答を測定する方法。
【請求項２】
式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のそれぞれにおいて、Ｒ１がＨであり、Ｒ２が−Ｏ−アルキルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のそれぞれにおいて、Ｒ３がＨである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のそれぞれにおいて、Ｂ１がウラシリルであり、Ｂ２がアデニニルである、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のそれぞれにおいて、ｍが１である、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
式（ＩＩ）において、Ａが存在せず、ＸがＯである、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
式（ＩＩ）において、Ｘ１がＯであり、Ｒがアルキルである、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
式（ＩＩ）において、ｎが１である、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
式（Ｉ）で表される化合物が、
【化３】
2018010001.tif 000028
で表される化合物、又はその薬学的に許容される塩、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、立体異性体若しくは互変異性体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
式（ＩＩ）で表される化合物が、
【化４】
2018010001.tif 000029
で表される化合物、又はその薬学的に許容される塩、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、立体異性体若しくは互変異性体である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連種出願）
本出願は、２０１０年８月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／４０２，３８０号の優先権を主張する。上記出願の全教示は参照により本明細書に取り込まれている。
【背景技術】
【０００２】
先天性免疫は、ウィルス、細菌、真菌、寄生虫等のような原核生物及び真核生物の病原体に対する身体の防御において重要な役割を果たしている。実際に、ウィルスによって引き起こされる急性及び慢性感染は医学的必要性を有意に満たすことなく主要な世界的な公衆衛生危機を構成している。感染症に加えて、ウィルスはそれぞれが有意な死亡率及び罹患率をもたらす、肝臓、子宮頸、及び膵臓の癌を含む全世界の癌の１５〜２０％を引き起こす。人的被害に加えて、ウィルス疾患は圧倒的な医療費及び生産性の損失をまねく。例えば、全世界で５〜６億人がＨＢＶ及びＨＣＶに慢性的に感染していて、１〜２００万人がウィルスに誘発された肝硬変及び肝臓癌によって毎年死亡している。全世界で患者１０００人のうち１０人が肝臓移植が必要な状態である。ヒトパピローマウィルス感染が子宮頸癌を誘発して、ＨＩＶ感染に関連するカポシ肉腫の発現が万事文献に明らかにされている。汎発性インフルエンザは、ヒトにおける高いレベルの罹患率及び死亡率によって特徴付けられ、そしてその新規な抗原サブタイプに対する既存免疫の欠如に起因する感染及び発病の増大したレベルに関連している。抗ウィルス剤は汎発性インフルエンザの蔓延を潜在的に遅らせるだけではなく、最終的解決策であるかもしれない。
【０００３】
ワクチンは、限定された数のウィルスに対する予防薬として利用できるが、これらは既に感染したヒトに対して実際の治療的有用性を有していない。更に、ある特定のウィルスに対するワクチン（例えば、インフルエンザワクチン）は、確認された後に新規なヒト株に対する適切なワクチンの十分な用量を製造するのに時間を要する故に、汎発における死亡率に有意な影響を及ぼしにくい。
【０００４】
それ故に、我々の抗ウィルス防御は殆ど例外なく抗ウィルス薬の使用に依存している。あいにく、多くの医学的に重要なウィルス、特にＲＮＡウィルスは危険性が高く、モデル系で試験することができず、あるいは潜在的な候補薬の試験のために伝播させることができない。更に、ウィルスは連続的に巧みな戦略で進化して宿主の免疫応答を避けて多くのメカニズムを介して薬剤への耐性を生じることも指摘されている。
【０００５】
最近の抗ウィルス剤の多くは、ウィルスポリメラーゼ、プロテアーゼ、インテグラーゼ、及び侵入阻害剤として開発されている。しかし、ウィルスの生育を阻害するように設計された薬剤は、ウィルスのライフサイクルが正常な宿主細胞機能に関与するので、宿主細胞に悪影響を及ぼす。抗ウィルス剤介入の影響を受けやすい限られたウィルス標的は抗ウィルス剤の発見を更に悪化させている。従って、５０年に近い抗ウィルス研究にもかかわらず、有利な抗ウィルス剤は、世界市場に危機的に少ないわずか約３４の抗ウィルス剤が残っているだけで、その殆どが抗ＨＩＶ及びヘルペスウィルス剤である。その上、ＨＣＶ及びＨＢＤを含む幾つかの慢性ウィルス疾患のための現在の治療オプションは、非常に限定されたままで負荷のかかるものである。実際に、ウィルスは治療の中止によって回帰し、薬剤が誘発する毒性及び抗ウィルス剤の選択圧による耐性株の出現が現在の抗ウィルス治療において重大な問題を残している。現在の抗ウィルス治療は不適切で長続きしない抗ウィルス応答を生じるので、ウィルスの完全な撲滅はおよそ達成されず、最良でも患者のほんのわずかな群にだけである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
抗菌剤を発見するための代替的戦略を用いて新規薬剤の開発が実際に必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らはある特定の短鎖オリゴヌクレオチド化合物が先天性免疫応答を刺激してＩＲＦ３の活性化を引き起こし、細胞インターフェロンを産生し、そして抗微生物ペプチドの産生を誘導する能力を有していることを見出した。一実施態様では、本発明の化合物は、先天性免疫応答を刺激する能力を有しているジ−及びトリヌクレオチド化合物である。ある特定の実施態様では、本発明の短鎖オリゴヌクレオチド化合物は少なくとも１つの化学改変を含んでいる。
【０００８】
本発明の化合物は抗微生物活性を有していて、よって抗微生物剤として使用できると考えられる。一実施態様では、化合物は多数のウィルス遺伝子型及び耐性株に対して広域スペクトルの抗ウィルス活性を有している。
【０００９】
ある特定の例では、本発明の化合物はＲＮＡ及び／又はＤＮＡウィルスに対する阻害活性を有している。このようなＲＮＡ及び／又はＤＮＡは、例えば、肝炎ウィルス（例えば、ＨＣＶ及びＨＢＶ等）、ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）、センダイ、ワクシニア、インフルエンザ及びその他のフラビウィルスであってよい。
【００１０】
本発明の化合物、又はそれらの薬学的に許容される塩若しくは薬学的に許容される製剤は、肝臓の炎症、肝硬変、急性肝炎、劇症肝炎、慢性肝炎、及びその他の肝臓疾患のような、肝炎ウィルスに起因するウィルス感染症及びその他の疾患の予防及び治療に有用である。本発明の化合物及び製剤は肝炎に感染した個体における疾患の進行を阻止するために予防的に用いることもできる。
【００１１】
一実施態様は、本発明の化合物が免疫賦活特性を有していることを提供する。別の実施態様では、本発明の化合物は抗癌剤として有用であることを提供する。
【００１２】
別の実施態様では、化合物は併用療法に対して他の抗ウィルス剤と相乗作用すると考えられる。別の実施態様では、本発明の化合物は広域スペクトルの抗菌及び抗寄生虫活性を有している。
【００１３】
一態様では、本発明は式（Ｉ）の化合物、又はそれらの薬学的に許容される塩、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、立体異性体、若しくは互変異性体に関する。
【００１４】
【化１】
2018010001.tif 000003
【００１５】
式中の、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、−Ｏ−アルキル、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、−Ｏ−アリール、又はＯ−ヘテロアリールアリールであり；
Ｒ３は、水素、アルキル、置換アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アルキル、及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アリールから選ばれ；
Ｙ及びＺは、それぞれ独立して、Ｏ又はＳであり；
Ｂ１及びＢ２は、それぞれが生じた場合は、独立してアデニニル、グアニニル、チミニル、シトシニル、ウラシル、又は改変ヌクレオシド部分であり；
ｍは、１、２、３、４、５、又は６であり；
Ｒ４は、それぞれが生じた場合は、独立して一リン酸、二リン酸、又は三リン酸基である。
【００１６】
一実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、化合物５（以下を参照されたい）ではない。
【００１７】
一実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、抗微生物活性を有し、そしてインビトロ又はインビボにおいてペプチドの細胞産生を誘導する能力がある。
【００１８】
特に、化合物は、
【００１９】
【化２】
2018010001.tif 000004
【００２０】
（化合物５）、又はそれらの薬学的に許容される塩、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、立体異性体、若しくは互変異性体である。
【００２１】
別の態様では、本発明は式（ＩＩ）の化合物、又はそれらの薬学的に許容される塩、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、立体異性体、若しくは互変異性体を提供する。
【００２２】
【化３】
2018010001.tif 000005
【００２３】
式中の、Ｘは、欠如、Ｏ、ＮＨ、又はＳであり；
Ｘ１は、欠如、Ｏ、又はＮＨであり；
Ａは、欠如、アリール、又はアラルキルであり；
ｎは、０、１、２、３、４、又は５であり；
Ｒは、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−ヘテロアリール、又はステロイド系であり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、−Ｏ−アルキル、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、−Ｏ−アリール、又は-−Ｏ−ヘテロアリールアリールであり；
Ｒ３は、水素、アルキル、置換アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アルキル、及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アリールから選ばれ；
Ｙ及びＺは、それぞれ独立して、Ｏ又はＳであり；
Ｂ１及びＢ２は、それぞれが生じた場合は、独立してアデニニル、グアニニル、チミニル、シトシニル、ウラシル、又は改変ヌクレオシド部分であり；
ｍは、１、２、３、４、５、又は６であり；
Ｒ４は、それぞれが生じた場合は、独立して一リン酸、二リン酸、又は三リン酸基である。
【００２４】
一実施態様では、式（ＩＩ）の化合物は化合物６ｋ（以下を参照されたい）ではない。別の実施態様では、Ｒ４は、ｍが２のときはＨではない。
【００２５】
一実施態様では、式（ＩＩ）の化合物は、抗微生物ペプチドの細胞産生を誘導する能力がある。
【００２６】
一例では、化合物は
【００２７】
【化４】
2018010001.tif 000006
【００２８】
（化合物６ｋ）、又はそれらの薬学的に許容される塩、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、立体異性体、若しくは互変異性体である。
【００２９】
本発明は、薬剤の抗菌活性の有効性を予測するためのバイオマーカーとしてある特定の細胞性ペプチドの使用にも関する。例えば、Ｃ型肝炎及びＢ型肝炎患者において、バイオマーカーの存在を抗ウィルス療法の有効性、例えば、インターフェロンの投与に続くウィルス減少及び持続したウィルス応答、を予測するために用いることができる。
【００３０】
一実施態様は、抗微生物感染に罹っている対象において、バイオマーカーとして細胞性ＥＥＥＨタンパク質を用いて抗微生物応答を測定する方法を提供する。
【００３１】
更に本発明は、対象における二本鎖ＲＮＡの免疫介在効果を調節する方法に関する。一実施態様では、方法は、本発明の化合物のジヌクレオチド断片（複数を含む）を有しているｓｉＲＮＡの有効量を対象に投与することを含んでいる。別の実施態様では、方法は、本発明の化合物のヌクレオチド突出を有しているｓｉＲＮＡの有効量を対象に投与することを含んでいる。
【００３２】
対象における一本鎖ＲＮＡの免疫介在効果を調節する方法も提供する。方法は、本発明の化合物のヌクレオチド断片（複数を含む）を有している化学的に改変したＲＮＡの有効量を対象に投与することを含んでいる。
【００３３】
別の実施態様では、本発明は、本発明の化合物のヌクレオチド断片（複数を含む）を有している化学的に改変したＲＮＡの有効量を対象に投与することによる、対象における一本鎖ＲＮＡの免疫介在効果を調節する方法を提供する。
【００３４】
本発明は、化学的に改変したヌクレオチド断片（複数を含む）を有している一本鎖ＲＮＡの免疫介在効果を調節する方法も提供する。一実施態様では、化学的に改変した末端（ｄＡ−ｐｓ−Ｕ２’ＯＭｅのような）を有するジヌクレオチドを用いる。
【００３５】
一態様では、本発明は、合成オリゴヌクレオチドのオフターゲット効果を最小化する方法に関する。方法は、
ａ）オリゴヌクレオチド上の化学改変を確認すること（ここで、当該化学改変は望ましくない免疫介在効果を有する改変オリゴヌクレオチドを生ずる）；及び
ｂ）治療適応のための合成オリゴヌクレオチドを設計する際に、当該化学改変を除くことを含む。
【００３６】
本発明の一態様は、対象における化学的に改変したオリゴヌクレオチドの抗癌効果を増強する方法を提供する。方法は、アポトーシス経路を刺激することのできる、本発明の化合物の有効量を対象に投与することを含む。
【００３７】
また本発明は、化学的に改変したオリゴヌクレオチドのオフターゲット効果を最小化する方法を提供し、これは断片が望ましくない免役介在効果を引き起こしていると確認されたときに、本発明の化合物の断片の使用を排除することを含んでいる。
【００３８】
一実施態様では、本発明は治療適応のための改変オリゴヌクレオチドを設計する方法に関する。方法は、
ａ）化合物のヌクレオチド断片（複数を含む）を提供すること、ここで当該化合物は
【００３９】
【化５】
2018010001.tif 000007
【００４０】
又はこれらの類縁体である；
ｂ）当該ヌクレオチド断片のオフターゲット効果を評価すること；及び
ｃ）改変オリゴヌクレオチドから当該ヌクレオチド断片を除去すること：
を含んでいる。
【００４１】
本発明は更に、本発明の化合物の何れかの有効量を対象に投与することを介して、対象におけるウィルス感染又は癌を治療する方法を提供する。
【００４２】
別の態様では、本発明は、本発明の化合物の有効量を含有している医薬組成物を含む、微生物活性を阻害するために用いる医薬組成物に関する。
【００４３】
薬学的に活性なその塩を含む本発明の化合物の有効量を、単独で又はその他の若しくは別の抗ウィルス剤（複数を含む）と組合わせて或いは連続して、投与することを含んでいる、ヒトを包含する宿主におけるウィルス感染症を治療する方法が開示されている。
【００４４】
薬学的に活性なその塩を含む本発明の化合物の有効量を、単独で又はその他の若しくは別の抗ウィルス剤（複数を含む）と組合わせて或いは連続して、投与することを含んでいる、ヒトを包含する宿主における細菌感染症を治療する方法も開示されている。
【００４５】
薬学的に活性なその塩を含む本発明の化合物の有効量を、単独で又はその他の若しくは別の薬剤（複数を含む）と組合わせて或いは連続して、投与することを含んでいる、ヒトを包含する宿主における寄生虫感染症を治療する方法も開示されている。
【００４６】
薬学的に活性なその塩を含む本発明の化合物の有効量を、単独で又はその他の若しくは別の抗ウィルス剤（複数を含む）と組合わせて或いは連続して、投与することを含んでいる、ヒトを包含する宿主における真菌感染症を治療する方法も開示されている。
【００４７】
本発明の化合物は、ジ−、及びトリ−ヌクレオチドを包含する。ジ−、及びトリ−ヌクレオチドのある特定の例は、これに限定されないが、３−ｄＡｐｓＵ２’−ＯＭｅ、３’−ｄＡｐｓＡ７ｄｅａｚａ、及び３’−ｄＡｐｓＴｐｓＣ並びにそれらの類縁体を包含し、ここで「ｐｓ」はホスホロチオエートヌクレオチド間結合を示す。
【００４８】
本明細書に記載されている化合物は、経口、静脈内、舌下、経鼻、局所などのような多様な送達経路で投与できる。
【００４９】
多くのインターフェロン関連遺伝子産物はアポトーシスを誘導できるので、化合物は微生物感染（例えば、ウィルス感染）細胞の選択的細胞死を誘導できる。同様に、細胞性抗微生物ペプチドの誘導は癌細胞の選択的アポトーシスも誘導できる。従って、本明細書に記載されている化合物及び組成物を単独で又は他の化合物と組合わせて抗癌剤として用いることができる。
【００５０】
本発明は、ＲＮＡ及びタンパク質及び受容体（アプタマー、免疫調節オリゴヌクレオチド）の改善された差別的な標的化のためにオリゴヌクレオチド（アンチセンス及びｓｉＲＮＡ）を最適に設計するためのヌクレオチド組成物の選択も当業者に教示している。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
下記の限定されない実施例を参照し、そして以下の図面を参照して本発明を下記に更に詳細に記載する。
【００５２】
【図１】図１は、化合物６ｋで処理したＢ型肝炎ウィルス感染トランスジェニックマウスにおける、抗ウィルスペプチドとしての赤血球外由来ヘモグロビン（ＥＥＥＨ）の増大した発現を示す。
【図２】図２は、トランスジェニックマウスにおいて、経口投与した化合物６ｋの抗ＨＢＶ活性が用量依存的にＥＥＥＨ発現と相関することを示す。
【図３】図３は、化合物５の舌下投与による抗菌タンパク質ＥＥＥＨの発現を示す。
【図４】図４は、舌下投与による化合物５の投与に続くウッドチャックにおけるＥＥＥＨ発現を示す。
【図５】図５は、化合物５及び６ｋがアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の模倣体であることを示している、分子モデルで作成したグラフである。
【図６】図６は、ＢＣＧの存在下での化合物５及び６ｋで処置したＰＢＭＣＳにおけるＩＮＦベータの誘導がマクロファージによるインターロイキン−２産生に影響を及ぼすことを示す顕微鏡写真である。
【図７】図７は、ＢＣＧで感作したマクロファージにおける、オリゴヌクレオチド類縁体（化合物５をＳＢ４０と示し、化合物６ｋをＳＢ４４と示す）によるＩＬ２発現に対する効果を表わす。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
ウィルスは多様なメカニズムを介して宿主の免疫応答を避け、そして薬剤への耐性を発現するために巧みな戦略で連続的に進化もしている。ＤＮＡ及びＲＮＡウィルスの両方がＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）産生を阻害することが確認されているので、ＩＦＮ応答を制御することが広範囲のウィルスの生存に必須であることが示唆されている（Akira, S. et al. Cell, 24, 783-801, 2006; 及び Katze et al. Nature Reviews, 2, 675, Sept 2002）。従って、有効な抗ウィルス治療の開発は、ウィルスの撲滅のために宿主の免疫応答を刺激するものを含む、それぞれに新規で、多数の作用メカニズムを有している新しいタイプの薬剤の組合わせの使用を伴っていなければならない。
【００５４】
脊椎動物系は侵入してくる微生物によって常に攻撃されていて、病原体を除去するための免疫介在防御を進化させている。哺乳動物の免疫システムは先天性及び後天性の免疫成分を含んでいる。先天性の免疫システムは、限られた数の生殖系細胞がコードする病原体認識受容体（ＰＲＲｓ）を介して微生物を認識する（Akira, S. et al. Cell, 24, 783-801, 2006; 及び Katze et al. Nature Reviews, 2, 675, Sept 2002）。マクロファージのような食細胞及び樹状細胞が先天性の免疫応答を介在する。後天性の免疫応答は、遺伝子再配列のようなメカニズムによって生成される抗原特異的受容体を運搬するリンパ球に関する特異性によって特徴付けられる。先天性免疫は肝臓損傷、線維症、及び再生の調整に重要な役割を果たしている。例えば、インターフェロンによるナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性化は肝臓線維症を治療するための新しい戦略であろう。これは、ＮＫ細胞の活性化は活性化した肝星細胞（ＨＳＣ）を特異的に殺傷するので、肝線維症及び肝腫瘍の形成を改善するためである。従って、本発明で開示されたオリゴヌクレオチド類縁体は肝線維症、及び肝癌の進展を阻止するために有用であろう。
【００５５】
細胞のウィルス感染がウィルス産物中の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）と結合する宿主のＰＲＲを介して免疫介在抗ウィルス応答を引き起こし、それによって細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらす（３、４）という認識が高まっている。トール様受容体（ＴＬＲｓ）は、種々の数のロイシンに富む反復（ＬＲＲ）モチーフを含有している細胞外ドメイン及びインターロイキン１受容体と同族の細胞質シグナル伝達ドメインによって特徴付けられる内在性膜糖タンパク質である。ＴＬＲは、寄生虫から哺乳動物に進化的に保存されている（Takeda, K. et al., International Immunology, 17, 1-14, 2005）。ＴＬＲｓは、リポ多糖類、植物ジテルペンであるパクリタクセル、ＲＳＶの融合タンパク質、フィブロネクチン及び全てが様々な構造を有している熱ショックタンパク質などの多種多様なリガンドを認識できる。ＴＬＲｓ１、２、４、５、及び６は細胞表面上で発現されるのに対して、ＴＬＲｓ３，及び７〜９はエンドソームのような細胞内区画内で発現される。ＴＬＲは、ミコバクテリアを含む細菌、真菌、寄生原虫及びウィルスを認識する。微生物ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、表面糖タンパク質、ムラミルジペプチドのような細胞壁成分を包含する各種ウィルス構造成分はＰＡＭＰｓとして認識される。ＴＬＲｓ３、７、８及び９はＤＮＡウィルスを含んでいるウィルス核酸の認識に関与している。ＴＬＲ９は、単純ヘルペスウィルス１、２及びＣｐＧ ＤＮＡモチーフに富んでいるネズミサイトメガロウィルスのゲノムを認識する。ＣｐＧ ＤＮＡがＴＬＲ９の刺激による炎症性サイトカイン及びＩ型ＩＮＦ分泌を活性化することが認識されている。従って、ＰＰＲｓによる核酸の認識が通常、抗微生物作用のために標的細胞を活性化できるＩ型ＩＦＮの産生を誘導する。
【００５６】
病原菌も宿主細胞を感染から保護する免疫応答を避けるように進化してきた。実際に、ＤＮＡ及びＲＮＡウィルスの両方は細胞のＩＦＮ産生（Ｉ型、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β）を阻害する。細胞内のＩＦＮｓは強力な抗ウィルスサイトカインであり、その発現／産生は未感染細胞の細胞質に存在している転写因子ＩＲＦ３（ＩＦＮ調節因子３）に介在されている。細胞が感染するとＩＲＦ３が活性化して、ウィルス成分（病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ、例えば、ウィルスゲノム、ウィルスタンパク質等）としても知られている）が特化したウィルスセンサー又はパターン認識受容体（ＰＲＲｓ）によって認識される。活性化したＩＲＦ３は細胞核へ移行してＩＦＮ遺伝子の発現を転写活性化する。ＩＦＮ産生は、多様なメカニズム、例えば、（ｉ）先天性及び適応性免疫応答の活性化、（ｉｉ）抗ウィルス性及び有益な炎症促進性因子の産生による細胞内の抗ウィルス状態の誘導、及び（ｉｉｉ）ウィルス感染細胞の制御されたアポトーシスなどを介して保護的抗ウィルス効果を誘導する。従って、ＰＲＰはＩＦＮ応答の必須成分である。つい最近、ヌクレオチドオリゴマー形成ドメイン（ＮＯＤ）タンパク質のファミリーメンバーである、ＮＯＤ２が、ＲＳＶ及びインフルエンザＡを包含する一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を検出するＰＲＲであることが見出されている。興味深いことに、ウィルスセンサーＲＩＧ−Ｉと同様に、ＮＯＤ２の活性化もＩＦＮ産生及びＮＦ−κβの誘導のためのシグナル伝達系を誘導し、これがＩＦＮの抗ウィルス作用を増強する制御された炎症促進応答を促進する。ＮＯＤ２はＲＳＶ及びインフルエンザＡのような広範囲のｓｓＲＮＡウィルスを検出するウィルスセンサーであるので、これは抗ウィルス剤の発見の標的及び抗ウィルス耐性と闘うための固有の宿主を提示する。
【００５７】
ＮＯＤ２と同様に、ＲＩＧ−Ｉは、二本鎖ウィルスＲＮＡを、１型のインターフェロン免疫防御を活性化することによって、ウィルスの複写を阻害し、そしてウィルス感染に関する細胞の寛容性も抑制するＰＡＭＰとして認識する宿主細胞質タンパク質である（例えば、Saito, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 10, No. 2, 582-587, 2007; Meylan, E. et al., Nature, 437, 1167-1172, 2005; Hiscott, J. et al. TRENDS in Molecular Medicine, 12, 53-56, 2006; Cui, S. et al., Molecular Cell, 29, 169-179, 2008; Yoneyama, M., et al., Nat. Immunol. 5, 730-737, 2004; Hornung, V. et al., Science, 314, 994-997, 2006; Pichlmair, A. et al., Science, 314, 997-1001, 2006; Myong, S. et al., Science, 323, 1070, 2009; 及び Gack, M. U., et al. Proc Natl Acad Sci U S A.105(43):16743-8, 2008 を参照されたい）。ＲＩＧ−Ｉは、Ｃ型肝炎ウィルス、センダイウィルス、インフルエンザウィルス、更に、水疱性口炎ウィルス、狂犬病ウィルス及び日本脳炎ウィルスを包含するフラビウィルスのような広範囲のＲＮＡウィルスを検出するウィルスセンサーである。これは広域スペクトルの抗ウィルス活性を標的とする固有の宿主を提示する。
【００５８】
ＨＢＶはＤＮＡウィルスであるが、これはＤＮＡ合成を開始するためのプレゲノムＲＮＡ鋳型を用い、そしてそのためにＲＩＧ−Ｉは潜在的にＨＢＶ ｐｇＲＮＡ受容体なのだろう。本発明者らは、ある特定のジヌクレオチド化合物が、先天性免疫の刺激及びＲＩＧ−Ｉ経路の活性化を介するインターフェロン産生の誘導の可能性を有していることを発見した。このような化合物はウィルス感染に対して予防的に有用でありそしてワクチンのアジュバントしても有用であろう。
【００５９】
ウィルスセンサーＲＩＧ−Ｉは、Ｃ−末端調節ドメイン（ＲＤ）、２つの末端カスパーゼ活性化及び動員ドメイン（ＣＡＲＤＳ）、更に、中央ＡＴＰアーゼドメインからなる多量体細胞質タンパク質である。ウィルス二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）及び５’−三リン酸は、ＲＩＧ−Ｉが病原性ＲＮＡ（三リン酸を有しているｄｓＲＮＡ及び有していないｄｓＲＮＡ）を宿主ＲＮＡ（これは通常末端に「Ｃａｐ」改変を有している）と区別できるようにする２つのＰＡＭＰである。更に、ＲＩＧ−Ｉは、転移現象を介してウィルスＲＮＡを感知する能力がある（Myong et al., Science 323, 1070. 2009）。ＲＩＧ−Ｉ転移及びウィルスゲノムのｄｓＲＮＡ上の繰り返しシャトリングはＲＩＧ−１が構造変化を受け、そのＡＴＰアーゼを活性化し、そしてＣＡＲＤＳをユビキチン化するための引き金である。次の段階で、ＣＡＲＤＳはミトコンドリアの抗ウィルスシグナル伝達（ＭＡＶＳ）［インターフェロンベータ刺激因子（ＩＰＳ−１）、又はＶＩＳＡとしても知られている］と相互作用してＩ型ＩＦＮ発現（ＩＦＮ−α、β）をもたらす下流信号伝達を引き起こす。
【００６０】
ＮＯＤ２及びＲＩＧ−Ｉは多量体タンパク質であり、これらは構造的にそして組織的に非常に類似している。従って、ＲＩＧ−Ｉと同様に、ＮＯＤ２はＣＡＲＤドメインを含んでいる。更に、ＲＩＧ−ＩとＮＯＤ２の両方はＮＢＤ内に位置するヌクレオチド結合ポケット（ヌクレオチド結合ドメイン）（ＮＯＤ２に）及びヘリカーゼ（ＲＩＧ−Ｉに）ドメインを有している。分子モデル研究は、ある特定のジヌクレオチド組成物がＮＢＤと結合するヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）構造の上で重ね合わせることができることを示した。短いオリゴヌクレオチドがＮＯＤ２（及びＲＩＧ−Ｉ）のＮＢＤと結合して下流の抗ウィルス作用に関するそれらの活性化を引き出すＮＴＰ模倣体として作用すると本発明者らは仮定する。
【００６１】
更に、アンチセンス化合物としてのオリゴヌクレオチド組成物は、ＲＮＡ干渉物及びミクロＲＮＡ化合物として、対応する標的メッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻害による標的タンパク質発現の発現を下方制御するために用いられている（例えば、 Iyer, R. P. et al., Drugs of the Future, 2003, 28, 51-59; Mirabelli, C. T. et al., S. T. Crooke and B. Lebleu (Eds.,) CRC Press, New York 1993, 7-35; 及び Szymkowski, D. E. et al., Drug. Disc. Today, 1996, 1, 415-28 を参照されたい）。標的メッセンジャーＲＮＡのハイブリダイゼーション誘導性阻害のメカニズムは当該技術分野において周知である。これらの化合物は他のオフターゲットメッセンジャーＲＮＡにハイブリダイズしてタンパク質の産生を阻害するであろうことも認識されている。
【００６２】
【化６】
2018010001.tif 000008
【００６３】
２〜３ヌクレオチド突出を有するｓｉＲＮＡはＲＮＡｉの効果的なメディエーターである。
【００６４】
核酸もＴＬＲ、ＲＩＧ−Ｉ、ＮＯＤ２等のようなウィルスセンサーと相互作用して、副作用及び毒性をもたらすオフターゲット効果を引き起こす。ある特定の例では、オリゴヌクレオチド組成物がアプタマーとして設計されていて、これは標的の異常タンパク質と特異的に結合してその活性を阻害することを目的としている。別の例では、ある特定のオリゴヌクレオチド組成物が、免疫経路を刺激することが知られている特定の構造モチーフ（例えば、ＣｐＧモチーフ）を含有している。オリゴヌクレオチドの治療適用を目的としているこれら全てにおいて、これらは配列特異的及び配列非特異的副作用及び「オフターゲット」効果を生じる。
【００６５】
特定のＲＮＡｉ用組成物及びアンチセンス活性及び／又は免疫経路を刺激することに加えて、オリゴヌクレオチドは理想的に１８〜２６ヌクレオチドの鎖長を有すべきであるというパラダイムが存在している。例えば、ｓｉＲＮＡによって誘導されるＲＮＡ干渉については、二本鎖ＲＮＡのそれぞれの断片が１９〜２８ヌクレオチドの長さでなければならない。アンチセンス適用のためには、一本鎖オリゴヌクレオチドの鎖の長さは１９〜２１辺りのヌクレオチドの長さでなければならない。しかし、より短いオリゴヌクレオチド断片が複雑な生物学的効果を有していることを本発明者らは見出した。これらの短い断片はより長いオリゴヌクレオチドの代謝に由来し、これは細胞に存在するエクソ及びエンドヌクレーアーゼを介して行われる。特定の構造特性を有するこれらの短い断片は、細胞に存在しているＲＩＧ−Ｉ、ＮＯＤ、又はＴＬＲ受容体との相互作用によってある特定の免疫経路を活性化する。このような相互作用はケモカイン及びサイトカイン発現の誘導、更に炎症促進及び抗炎症因子の誘導のような下流効果に起因するオフターゲット効果を生ずることができる。それ故に、より長いオリゴヌクレオチドに関連するオフターゲット効果及び副作用は、細胞タンパク質及び受容体と相互作用しているジ、トリ、テトラヌクレオチドのような代謝断片に由来しているものと関連しているのだろう。従って、オフターゲット効果はオリゴヌクレオチド内の天然の又は化学改変した断片の合理的な選択によって最小化できるだろう。
【００６６】
本発明は、オリゴヌクレオチド（ＲＮＡの標的化を改善するアンチセンス及びｓｉＲＮＡ）及びタンパク質及び受容体（アプタマー、免疫調節オリゴヌクレオチド）の最適な設計のためのヌクレオチド組成物の設計に関する。
【００６７】
本発明者らは、ある特定の短いオリゴヌクレオチド組成物が先天性の免疫応答を刺激してＩＲＦ３の活性を引き起こし、細胞性インターフェロンを産生し、そして抗微生物性ペプチドの産生を誘導する能力を有していることを見出した。ある特定の例では、いくつかのジ−、及びトリヌクレオチド化合物が先天性の免疫応答を刺激することができると考えられる。
【００６８】
（定義）
用語「抗微生物剤」は、ウィルス、細菌、真菌及び寄生虫感染に対して効果がある化合物を示すように意図されている。
【００６９】
用語「癌」は、浸潤によって局所的にそして転移によって全身的に広がる潜在的に無限に生育する悪性腫瘍を示す。
【００７０】
本明細書で用いられる用語「アリール」は、これに限定されないが、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、イデニルなどを包含する、１個又は２個の芳香環を有している単環式又は多環式の炭素環系を示す。
【００７１】
本明細書で用いられる用語「ヘテロアリール」は、そのうちの１個又はそれ以上の環員原子が、例えば、Ｓ、Ｏ及びＮから選ばれ；０、１又は２個の環員原子が、例えば、Ｓ、Ｏ及びＮから独立して選ばれる更なるヘテロ原子であり；そして残りの環員原子が炭素である、５〜１０個の環員原子を有している単環式又は多環式（例えば、２環式、３環式又はそれ以上）の芳香族基又は環を示し、ここで、環に含まれる何れのＮ又はＳも酸化されていてもよい。ヘテロアリールは、これに限定されないが、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、キノキサリニル等を包含する。
【００７２】
本発明によれば、本明細書に記載されているアリール、置換アリール、ヘテロアリール及び置換ヘテロアリールは何れも、何れかの芳香族基であってよい。芳香族基は置換されていても置換されていなくてもよい。
【００７３】
本明細書で用いられる用語「アルキル」は、それぞれ１〜６個又は１〜１２個の炭素原子を含んでいる飽和の、直鎖又は分岐鎖の炭化水素基を示す。Ｃ１〜Ｃ６アルキル基の例は、これに限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル及びｎ−ヘキシル基を包含し、そしてＣ１〜Ｃ１２アルキル基の例は、これに限定されないが、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル基を包含する。
【００７４】
用語「アラルキル」又は「アリールアルキル」は、ベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、フェニルエチル、及びジフェニルエチルのようなアリール置換アルキル基を包含する。
【００７５】
本明細書で用いられる用語「複素環」又は「ヘテロシクリル」は、非芳香性の５−、６−又は７員の環又は２環式又は３環式基の融合系であって、ここでは、（ｉ）それぞれの環は酸素、硫黄及び窒素から独立して選ばれる１〜３個のヘテロ原子を含有し、（ｉｉ）それぞれの５員環は０〜１個の二重結合を有し、そしてそれぞれの６員環は０〜２個の二重結合を有し、（ｉｉｉ）窒素及び硫黄ヘテロ原子は任意に酸化されていてもよく、（ｉｖ）窒素ヘテロ原子は任意に４級化されていてもよく、（ｉｖ）上記の環は何れもベンゼン環と融合していてもよく、そして（ｖ）残りの環員原子は任意にオキソ置換されていてもよい炭素原子である。代表的なヘテロシクロアルキル基は、これに限定されないが、［１，３］ジオキソラン、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、及びテトラヒドロフリルを包含する。このような複素環基は更に置換されていてもよい。
【００７６】
本明細書で用いられる用語「シクロアルキル」は、単環式又は多環式飽和炭素環化合物から１個の水素原子を除いて生じる１価の基を示す。例は、これに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、及びビシクロ［２．２．２］オクチルを包含する。
【００７７】
本明細書で用いられる用語「置換アリール」、「置換アルキル」、「置換シクロアルキル」は、その水素原子の１個、２個、又は３個或いはそれ以上を、これに限定されないが、  −Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、保護したヒドロキシル、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＮＨ２、保護したアミノ、−ＮＨ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、−ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＮＨ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、−ＮＨ−アリール、−ＮＨ−ヘテロアリール、−ＮＨ−ヘテロシクロアルキル、−ジアルキルアミノ、−ジアリールアミノ、−ジヘテロアリールアミノ、−Ｏ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、−Ｏ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−Ｏ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−Ｏ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、−Ｏ−アリール、−Ｏ−ヘテロアリール、−Ｏ−ヘテロシクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）−アリール、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロシクロアルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、−ＣＯＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＣＯＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＣＯＮＨ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、−ＣＯＮＨ−アリール、−ＣＯＮＨ−ヘテロアリール、−ＣＯＮＨ−ヘテロシクロアルキル、−ＯＣＯ２−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、−ＯＣＯ２−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＯＣＯ２−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＯＣＯ２−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、−ＯＣＯ２−アリール、−ＯＣＯ２−ヘテロアリール、−ＯＣＯ２−ヘテロシクロアルキル、−ＯＣＯＮＨ２、−ＯＣＯＮＨ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、−ＯＣＯＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＯＣＯＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＯＣＯＮＨ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、−ＯＣＯＮＨ−アリール、−ＯＣＯＮＨ−ヘテロアリール、−ＯＣＯＮＨ−ヘテロシクロアルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）−アリール、−ＮＨＣ（Ｏ）−ヘテロアリール、−ＮＨＣ（Ｏ）−ヘテロシクロアルキル、−ＮＨＣＯ２−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、−ＮＨＣＯ２−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＮＨＣＯ２−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＮＨＣＯ２−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、−ＮＨＣＯ２−アリール、−ＮＨＣＯ２−ヘテロアリール、−ＮＨＣＯ２−ヘテロシクロアルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−アリール、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−ヘテロアリール、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−ヘテロシクロアルキル、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＮＨ���（Ｓ）ＮＨ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−アリール、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−ヘテロアリール、−ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−ヘテロシクロアルキル、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ−アリール、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ−ヘテロアリール、−ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ−ヘテロシクロアルキル、−ＮＨＣ（ＮＨ）−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、−ＮＨＣ（ＮＨ）−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＮＨＣ（ＮＨ）−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＮＨＣ（ＮＨ）−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、−ＮＨＣ（ＮＨ）−アリール、−ＮＨＣ（ＮＨ）−ヘテロアリール、−ＮＨＣ（ＮＨ）−ヘテロシクロアルキル、−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ−アリール、−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ−ヘテロアリール、−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ−ヘテロシクロアルキル、−Ｓ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、−Ｓ（Ｏ）−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−Ｓ（Ｏ）−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−Ｓ（Ｏ）−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、−Ｓ（Ｏ）−アリール、−Ｓ（Ｏ）−ヘテロアリール、−Ｓ（Ｏ）−ヘテロシクロアルキル、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、−ＳＯ２ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＳＯ２ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＳＯ２ＮＨ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、−ＳＯ２ＮＨ−アリール、−ＳＯ２ＮＨ−ヘテロアリール、−ＳＯ２ＮＨ−ヘテロシクロアルキル、−ＮＨＳＯ２−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、−ＮＨＳＯ２−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＮＨＳＯ２−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−ＮＨＳＯ２−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、−ＮＨＳＯ２−アリール、−ＮＨＳＯ２−ヘテロアリール、−ＮＨＳＯ２−ヘテロシクロアルキル、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３、−アリール、−アリールアルキル、−ヘテロアリール、−ヘテロアリールアルキル、−ヘテロシクロアルキル、−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、ポリアルコキシアルキル、ポリアルコキシ、−メトキシメトキシ、−メトキシエトキシ、−ＳＨ、−Ｓ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、−Ｓ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−Ｓ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、−Ｓ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、−Ｓ−アリール、−Ｓ−ヘテロアリール、−Ｓ−ヘテロシクロアルキル、又はメチルチオメチルを包含する置換基で独立して置き換えて置換した、先に定義したアリール、アルキル及びシクロアルキル基を示す。アリール、ヘテロアリール、アルキル等は更に置換できることは理解される。
【００７８】
本明細書で用いられる用語「ステロイド」は、４つの環に配置された基礎となる１７個の炭素原子を有し、そしてステロール及び胆汁酸、副腎及び性ホルモン、ジギタリス化合物のようなある特定の天然薬剤、並びにある特定のビタミンの前駆体を包含する多くの天然又は合成脂溶性有機化合物の何れかを示す。ステロイド構造の例は、これに限定されないが、コレステロール、コレスタノール、３α−シクロ−５−α−コレスタン−６−β−オール、コール酸、ギ酸コレステリル、ギ酸コレステニルを包含する。
【００７９】
本明細書で用いられる用語「改変ヌクレオシド」は、改変した複素環塩基、改変した糖部分、又はこれらの組み合わせを含んでいる何れかのヌクレオシドを示す。ある実施態様では、改変ヌクレオシドは、本明細書に記載されているような非天然のピリミジン又はプリンヌクレオシドである。改変ヌクレオシドの例は、これに限定されないが、２’−置換リボヌクレオシド、アラビノヌクエオシド又は２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノシド、デアザ−アデニン、デアザグアニンを包含する。
【００８０】
用語「調節する」は、本発明の化合物への暴露に応答するパラメーターの減少又は増大を示す。
【００８１】
本発明の目的のために、用語「短いオリゴヌクレオチド（複数を含む）」（ＳＭＮＨ）は、１個から約６個の結合したヌクレオシド単位から形成されるモノ、ジ又はトリヌクレオシドを示す。このような短いオリゴヌクレオチドは、ゲノム又はｃＤＮＡを包含する既存の核酸源から得ることができるが、合成方法で産生するのが好ましい。ヌクレオシド残基を多種公知のヌクレオシド間結合によって互いに連結することができる。このようなヌクレオシド間の結合は改変しても改変しなくてもよく、そしてこれに限定されないが、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、及びスルホンヌクレオシド間結合を包含する。用語「短いヌクレオチド」も１つ又はそれ以上の立体特異的ヌクレオシド間結合（例えば、（Ｒｐ）−又は（Ｓｐ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、又はホスホルトリエステル結合）を有しているポリヌクレオシドを包含する。本発明の短いヌクレオチドは、結合がリン酸エステル基を含有していてもいなくても、このようなヌクレオシド間結合の何れかを含んでいる。ある特定の好ましい実施態様では、これらのヌクレオシド間結合は改変しても改変しなくてもよく、そしてこれに限定されないが、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエート結合、或いはこれらの組合わせを含んでいてよい。
【００８２】
用語「短いヌクレオチド（複数を含む）」は、これに限定されないが、タンパク質基、脂溶性基、挿入剤、ジアミン、葉酸、コレステロール及びアダマンタンを包含する更なる置換基も包含する。用語「短いヌクレオチド（複数を含む）」は、ポリマーを含有しているその他の核酸塩基も包含していて、これに限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）を包含する。
【００８３】
ＰＮＡ及びＬＮＡの例を以下に示す：
【００８４】
【化７】
2018010001.tif 000009
【００８５】
「ヌクレオチド」は、核酸のサブユニット［ＤＮＡ又はＲＮＡの何れか、或いはペプチド核酸（ＰＮＡ）及びロックド核酸（ＬＮＡ）のようなこれらの類縁体］を示し、これらはヌクレオチド間結合、糖基及び複素環塩基、更にこのようなサブユニットの類縁体を包含する。「ヌクレオシド」は、糖基及び複素環塩基を包含する核酸サブユニットに言及する。当然のことながら、本明細書で用いられる用語「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合のような天然のヌクレオチド間結合（「ヌクレオチド」に関して）；リボース及びデオキシリボース部分のような天然の糖部分；及びプリン及びピリミジン塩基等、例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はウラシル（Ｕ）のような天然の核酸塩基のみならず、改変ヌクレオチド間結合、改変糖部分、並びに改変プリン及びピリミジン塩基又はこれらの類縁体、或いは改変及び非改変ヌクレオチド間結合、糖部分並びにプリン及びピリミジン塩基の何れかの組合わせを含有しているそれらの部分を包含するだろう。改変ヌクレオシドの別の例はアシクロヌクレオシドを包含し、これはリボース及びデオキシリボース部分の開環バージョンからなっている。同様に、このような開環ヌクレオシドを改変ヌクレオシドの形成に用いることができる。改変ヌクレオシドのその他の例は、シュードイソシチジンのようなＣ−ヌクレオシド、及びペプチド核酸モノマー、及びロックド核酸モノマーのようなヌクレオシドイソスターを包含するヌクレオシド模倣体を包含する。
【００８６】
用語「対象」は、本明細書に記載されているような疾患又は病気に罹り得る有機体を包含する。対象は、ヒト及び非ヒト動物、細胞、又は何れかの生命体（例えば、ウィルス、真菌、微生物など）であってよい。ヒト動物は、本明細書に記載されているような、疾患又は病気に罹っているか罹りやすいヒト患者を包含する。非ヒト動物は全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、齧歯動物、例えば、マウス、及び非哺乳動物、非ヒト霊長類など、またヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、及びは虫類を包含する。生命体は連続生物系（例えば、動物、真菌、微生物など）の何れかである。少なくとも何らかの形で、全ての有機体は刺激、再生、生育及び発達に対する応答、及び安定な統一体としてホメオスタシスの維持が可能である。
【００８７】
（略語）
本願で用いられている略語は以下の通りである：
ＡｃＯＨは、酢酸を表わす；
Ｂｏｃ２Ｏは、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカーボネートを表わす；
Ｂｏｃは、ｔ−ブトキシカルボニルを表わす；
Ｂｐｏｃは、１−メチル−１−（４−ビフェニルイル）エチルカルボニルを表わす；
Ｂｚは、ベンゾイルを表わす；
ＢｏｃＮＨＯＨは、ｔｅｒｔ−ブチル Ｎ−ヒドロキシカルバメートを表わす；
ｔ−ＢｕＯＫは、カリウム・ｔｅｒｔ−ブトキシドを表わす；
Ｂｕ３ＳｎＨは、トリブチルスズ・ヒドリドを表わす；
ＣＤＩは、カルボニルジイミダゾールを表わす；
ＣＨ２Ｃｌ２は、ジクロロメタンを表わす；
ＣＨ３は、メチルを表わす；
ＣＨ３ＣＮは、アセトニトリルを表わす；
ＤＭＳＯは、ジメチルスルホキシドを表わす；
ＥｔＯＡｃは、酢酸エチルを表わす；
ＥｔＯＨは、エタノールを表わす；
Ｅｔ２Ｏは、ジエチルエーテルを表わす；
ＨＣｌは、塩化水素を表わす；
ＭｅＯＨは、メタノールを表わす；
ＭＯＭは、メトキシメチルを表わす；
Ｍｓは、メシル又は−ＳＯ２−ＣＨ３を表わす；
Ｍｓ２Ｏは、メタンスルホン酸無水物又はメシル無水物を表わす；
ＮａＣｌは、塩化ナトリウムを表わす；
ＮａＨは、水素化ナトリウムを表わす；
ＮａＨＣＯ３は、重炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを表わす；
Ｎａ２ＣＯ３は、炭酸ナトリウムを表わす；
ＮａＯＨは、水酸化ナトリウムを表わす；
Ｎａ２ＳＯ４は、硫酸ナトリウムを表わす；
ＮａＨＳＯ３は、二亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウムを表わす；
Ｎａ２Ｓ２Ｏ３は、チオ硫酸ナトリウムを表わす；
ＮＨ２ＮＨ２は、ヒドラジンを表わす；
ＮＨ４ＨＣＯ３は、重炭酸アンモニウムを表わす；
ＮＨ４Ｃｌは、塩化アンモニウムを表わす；
ＯＨは、ヒドロキシルを表わす；
ＯＭｅは、メトキシを表わす；
ＯＥｔは、エトキシを表わす；
ＴＥＡ又はＥｔ３Ｎは、トリエチルアミンを表わす；
ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸を表わす；
ＴＨＦは、テトラヒドロフランを表わす；
ＴＰＰ又はＰＰｈ３は、トリフェニルホスフィンを表わす；
Ｔｓは、トシル又は−ＳＯ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３を表わす；
Ｔｓ２Ｏは、トリスルホン酸無水物又はトシル無水物を表わす；
ＴｓＯＨは、ｐ−トリスルホン酸を表わす；
Ｐｈは、フェニルを表わす；
ＴＢＳは、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルを表わす；
ＴＭＳは、トリメチルシリルを表わす；
ＴＭＳＣｌは、クロロトリメチルシリルを表わす。
【００８８】
（化合物）
一態様では、本発明は式（Ｉ）の化合物、又はそれらの薬学的に許容される塩、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、立体異性体、若しくは互変異性体を提供する：
【００８９】
【化８】
2018010001.tif 000010
【００９０】
式中の、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、‐Ｏ‐アルキル、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、−Ｏ−アリール、又は−Ｏ−ヘテロアリールアリールであり；
Ｒ３は、水素、アルキル、置換アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アルキル、及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アリールから選ばれ；
Ｙ及びＺは、それぞれ独立して、Ｏ又はＳであり；
Ｂ１及びＢ２は、それぞれが生じた場合は、独立して、アデニニル、グアニニル、チミニル、シトシニル、ウラシル、又は改変ヌクレオシド部分であり；
ｍは、１、２、３、４、５、又は６であり；
Ｒ４は、それぞれが生じた場合は、独立して、一リン酸、二リン酸、又は三リン酸基である。
【００９１】
一実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、化合物５ではない。
【００９２】
別の態様では、本発明は式（ＩＩ）の化合物、又はそれらの薬学的に許容される塩、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、立体異性体、若しくは互変異性体を提供する：
【００９３】
【化９】
2018010001.tif 000011
【００９４】
式中の、Ｘは、欠如、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ、又はＳであり；
Ｘ１は、欠如、Ｏ、又はＮＨであり；
Ａは、欠如、アリール、又はアラルキルであり；
ｎは、０、１、２、３、４、又は５であり；
Ｒは、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−ヘテロアリール、又はステロイド系であり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、−Ｏ−アルキル、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、−Ｏ−アリール、又はＯ−ヘテロアリールアリールであり；
Ｒ３は、水素、アルキル、置換アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アルキル、及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アリールから選ばれ；
Ｙ及びＺは、それぞれ独立して、Ｏ又はＳであり；
Ｂ１及びＢ２は、それぞれが生じた場合は、独立してアデニニル、グアニニル、チミニル、シトシニル、ウラシル、又は改変ヌクレオシド部分であり；
ｍは、１、２、３、４、５、又は６であり；
Ｒ４は、それぞれが生じた場合は、独立して一リン酸、二リン酸、又は三リン酸基である。
【００９５】
一実施態様では、式（ＩＩ）の化合物は化合物６ｋではない。別の実施態様では、ｍが２のときは、Ｒ４はＨではない。
【００９６】
ヌクレオシドユニットは、国際的に容認されている線画の慣例によって表わされる。以下の例では、２’−置換リボヌクレオシドは通常の構造及び対応する線画形式の両方で表わされる。
【００９７】
【化１０】
2018010001.tif 000012
【００９８】
ある特定の例では、本発明の化合物は化合物５又は化合物６ｋである。
【００９９】
α又はβＮ−、或いはＣ−ヌクレオシドをもたらすＢ１及びＢ２に結合する糖ユニットは、これに限定されないが、フラノース、デオキシリボフラノース、リボース、及びアラビノースを包含する。
【０１００】
ある特定の実施態様では、本発明の化合物は、「天然の」核酸上に１つ又はそれ以上の改変、すなわち、天然のヌクレオシド間結合、又は核酸塩基Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、Ａなどを含んでいる。改変は、例えば、ヌクレオチド間結合、塩基又は「天然の」核酸の糖部分の改変を包含する。
【０１０１】
核酸塩基は天然のプリン及びピリミジン核酸塩基、及びこれに限定されないが、メチル化プリン又はピリミジン、アシル化プリン又はピリミジン等を包含するか、或いはアセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリル、ベンゾイル等のような保護基の付加を包含する改変核酸塩基を包含する。プリン又はピリミジン塩基は前述の類縁体であってもよく、適切な類縁体は当業者に公知であって関連のある教科書及び文献に記載されている。一般的な類縁体は、これに限定されないが、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオーＮ−６−イソペンチルアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）ウラシル、５−（カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−（２−ブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、シュードウラシル、１−メチルシュードウラシル、キューオシン(queosine)、イノシン、１−メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリン、２，６−ジアミノプリン、５−トリフルオロメチルチミン、６−クロロアデニン、７−デアザアデニンを包含する。その他の例は、これに限定されないが、５−フルオロ−ウラシル、５−トリフルオロメチルチミン、６−クロロ−アデニン、２−シクロペンチルオキシ−アデニン、７−デアザ−アデニンを包含する。、
【０１０２】
ある特定の実施態様では、塩基はユニバーサル（universal）核酸塩基を包含する非天然の核酸塩基であってよい。このような塩基の例は、これに限定されないが、ジフルオロトリル、ニトロピロリル及びニトロ−イミダゾリル等を包含する。
【０１０３】
「改変塩基」は「改変核酸塩基」とも呼ばれ、複素環であってもなくてもよい窒素含有化合物を包含する。このような好ましい窒素含有化合物は、これに限定されないが、−ＮＨＲ１８を包含し、ここでＲ１８は水素、ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル、アリル、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換シクロアルキル、置換又は非置換アラルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、或いは複素環である。
【０１０４】
用語「改変核酸塩基」は更に、最も古典的な意味ではヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として機能できる複素環化合物を包含することが意図されている。このような化合物は、当該技術分野で公知の「ユニバーサル塩基」を包含する。ユニバーサル塩基は芳香環部分を含んでいて、これは窒素原子を含んでいてもいなくてもよい。ある実施態様では、ユニバーサル塩基はヌクレオシドのペントース糖のＣ−１’炭素に共有結合で結合されうる。ユニバーサル塩基の例は、３−メチル−プロピニルカルボスチリル（ＰＩＭ）、３−メチルイソカルボスチリル（ＭＩＣＳ）、及び５−メチルイソカルボスチリル部分を包含する。更なる例は、イノシン誘導体、アゾールカルボキサミド類縁体、ニトロアゾ−ル、及びニトロイミダゾールを包含する。
【０１０５】
改変ヌクレオチド及びヌクレオシド糖部分の例は、これに限定されないが、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’−置換ペントース部分、２’−Ｏ−置換ペントース部分、リボース、リキソース、及びキシロース、或いはヘキソース糖基を包含する。本発明のための、「２’−置換リボヌクレオシド」又は「２’−置換アラビノシド」のような指名された糖基の何れかの用語「２’−置換」は、ペントース部分の２’位のヒドロキシル基が置換されて、２’−置換又は２’−Ｏ−置換リボヌクレオシド又はアラビノヌクレオシドを生成するリボヌクレオシド又はアラビノヌクレオシドを包含する。このような置換は１〜６個の飽和又は不飽和炭素原子を含有している低級アルキル基、又は６〜１０個の炭素原子を有するアリール基を用いることが好ましく、このようなアルキル又はアリール基は非置換であるか、又は、例えば、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシ、又はアミノ基で置換されていてもよい。２’−Ｏ−置換リボヌクレオシド又は２’−Ｏ−置換−アラビノシドの例は、これに限定されないが、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド（本明細書では２’−ＯＭｅとも示される）又は２’−Ｏ−メチルアラビノシド、及び２’−Ｏ−メトキシリボヌクレオシド又は２’−Ｏ−メトキシエチルアラビノシドを包含する。用語「２’−置換リボヌクレオシド」又は「２’−置換アラビノシド」も２’−ヒドロキシル基が１〜６個の飽和又は不飽和炭素原子を含有している低級アルキル基、又はアミノ又はハロ基で置換されているリボヌクレオシド又はアラビノヌクレオシドを包含する。このような２’−置換リボヌクレオシド又は２’−置換アラビノシドの例は、これに限定されないが、２’−アミノ、２’−フルオロ、２’−アリル、及び２’−プロパルギルリボヌクレオシド又はアラビノシドを包含する。
【０１０６】
改変ヌクレオチド間結合の例は、これに限定されないが、置換又は非置換ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート及びスルホンヌクレオシド間結合を包含する。改変及び非改変ヌクレオチド間結合の置換は以下の部分を包含する；
【０１０７】
本発明の化合物は１つ又はそれ以上の不斉中心を含みうるので、ラセミ化合物及びラセミ混合物、単一エナンチオマー、ジアステレオマー混合物、並びに個々のジアステレオマーとして存在できる。本発明は、５員のフラノース環に対してβ−Ｄ立体化学配置を有している短いヌクレオチド化合物、すなわち、５員のフラノース環のＣ−１及びＣ−４位の置換基がβ−立体化学配置（本明細書に描かれている幾つかの式において太線で具体的に示されている「上」方向）である短いヌクレオチド化合物を包含するように意図されている。
【０１０８】
ある特定の実施態様では、本発明の化合物は、トール様受容体（ＴＬＲ）のような免役刺激経路、更には、レチノイン酸誘導遺伝子−１（ＲＩＧ−Ｉ）、及びヌクレオチドオリゴマー化タンパク質（ＮＯＤ）の活性化に関連するするもののような、非ＴＬＲ経路を調節することができる。これらの経路のそれぞれのリガンドによる活性化は、インターロイキン、インターフェロンのような、多種のサイトカイン及びケモカインの産生を誘導し、そしてある特定の細胞タンパク質の誘導も引き起こすので、抗微生物免役をもたらす。
【０１０９】
別の態様では、本発明は炎症経路を阻害できる化合物の設計に関する。本発明は具体的に設計された化合物の合成にも関する。設計され合成された化合物は自己免疫疾患に対する有益な効果を有している。
【０１１０】
ある特定の実施態様では、ウィルス性疾患、自己免疫疾患（アレルギー、喘息、炎症性疾患のような）、及び癌を包含する、多種の疾患に対して治療有用性を有している。
【０１１１】
ある特定の実施態様では、本発明の化合物は細胞内微生物センサーの活性化因子として作用して免疫応答の活性化を引き起こす。化合物は、ＨＣＶ及びＲＳＶのようなＤＮＡウィルス（ＨＢＶ）及びＲＮＡウィルスに対して抗ウィルス活性を示した。特許請求されている化合物は、作動薬として免疫応答を誘導するばかりではなく、自己免疫疾患における望ましくない免疫応答を阻害（拮抗）することもできると思われる。
【０１１２】
（医薬組成物）
本発明は、１つ又はそれ以上の本発明の化合物、又はその誘導体、及び薬学的に許容される担体を含んでいる医薬組成物にも関する。一実施態様では、本発明は上記化合物の何れかと薬学的に許容される担体とを混合して製造する医薬組成物を提供する。
【０１１３】
本発明の医薬組成物は、活性成分として少なくとも１つの本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩を包含し、そして薬学的に許容される担体及び賦形剤並びに随意にその他の治療成分も含むことができる。「薬学的に許容される」とは、担体、希釈剤、又は賦形剤が製剤の他の成分と適合し、そしてその服用者に有害であってはならないことを意味する。組成物は、経口、直腸、局所、非経口（皮下、筋肉内、及び静脈内を包含する）、眼内（眼科用）、経肺（経鼻又は口腔吸入）、又は経鼻投与に適している組成物を包含するが、どのような場合においても最も適している経路は治療する疾患の特性及び重症度並びに活性成分の特性によって決まるだろう。これらは好都合に単回投与剤形とすることでき、そして医薬の分野で周知の方法の何れかによって製造できる。
【０１１４】
ある特定の実施態様では、本発明の化合物は、従来の医薬混合技術に従い医薬担体との密接な混合物中の活性成分として混合することができる。担体は、投与法、例えば、経口又は非経口（静脈内を含む）に望ましい製剤の形態に応じて多種多様の形態をとることができる。経口製剤用の組成物の製造においては、例えば、懸濁液、エリキシル及び溶液のような、経口液体製剤の場合は、例えば、水、グリコール、油、アルコール、芳香剤、保存剤、着色剤等のような；又は、粉末、ハード及びソフトカプセル、並びに錠剤のような経口固形製剤の場合は、澱粉、蔗糖、微結晶性セルロース、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等のような担体などの通常の医薬媒質を用いることができるが、固形の経口製剤が液体製剤より好ましい。
【０１１５】
投与の容易さのため、錠剤及びカプセルが最も有利な経口単位剤形であって、この場合は固体の医薬担体が明らかに用いられる。所望により、水性又は非水性技術によって錠剤をコーティングすることができる。このような組成物及び製剤は少なくとも０．１パーセントの活性化合物を含有すべきである。これらの組成物における活性化合物のパーセントは、もちろん、変えることができ、好都合にはその単位の重量の約２パーセント〜約６０パーセントであろう。このような治療に有用な組成物中の活性化合物の量は、有効用量が得られるような量である。活性化合物を、例えば、液滴又はスプレーとして鼻腔内に投与することもでる。
【０１１６】
錠剤、ピル、カプセル等は、トラガカントガム、アカシアガム、トウモロコシ澱粉又はゼラチンのような結合剤；第二リン酸カルシウムのような賦形剤；トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、アルギン酸のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；及び蔗糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤も含有することができる。
【０１１７】
投与剤形がカプセルの場合は、上記のタイプの物質に加えて、脂肪油のような液体の担体を含有することができる。コーティング剤として又は剤形の物理学的形態を修正するために多種のその他の物質を存在させることができる。例えば、錠剤をシェラック、糖又は両方でコーティングできる。シロップ又はエリキシルは、活性成分に加えて、甘味剤として蔗糖を、保存料としてメチル及びプロピルパラベンを、チェリー及びオレンジフレーバーのような染料及び香味料を含有できる。活性医薬成分を分解に対して安定化させるために、アミノ酸又はポリアミン類のような、安定化剤を添加できる。その他の賦形剤は、これに限定されないが、ＰＥＧ４００、グリシン、ビタミンＥ誘導体、モノオレイン酸ソルビタン、キトサン、クエン酸コリン、モノステアリン酸ソルビタン、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ ６３０、Ｂｒｉｊ３５、ＮＰ−４０及びこれらの類縁誘導体を包含できる。
【０１１８】
本発明の化合物は非経口投与することもできる。これら活性化合物の溶液又は懸濁液は水中で、好適にヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と混合して製造できる。分散液もグリセロール、液体ポリエチレングリコール及びこれらの油中混合物中で製造できる。保管及び使用の通常条件下で、微生物の成育を阻止するためにこれらの調製物は保存料を含有する。注射用途に適している医薬形態は、無菌の水性溶液又は分散液、及び無菌注射溶液又は分散液の即時調製用の無菌粉末を包含する。いずれの場合も、剤形は好ましくは無菌であり、そして好ましくは容易に注射可能な存在である程度に液体である。これは製造及び保管の条件下で安定でなければならず、そして細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して防御されていなくてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）、これらの適切な混合物、及び植物油を含む、溶媒又は分散媒体であってよい。
【０１１９】
哺乳動物、特にヒトへ本発明の化合物の治療有効量を提供するために、適切な投与経路の何れかを採用することができる。用語、化合物「の投与」及び「を投与すること」は、本発明の化合物を必要とする個体へ提供することであると理解しなければならない。投与の経路は、例えば、これに限定されないが、経口、舌下、経粘膜、静脈内、皮下、鼻腔内、局所、膣内等を包含する。
【０１２０】
式１〜２で言及されている化合物は、これに限定されないが、アレルギー、炎症、自己免疫疾患、ＣＯＰＤ、喘息等を包含する宿主の免疫成分に関連している広範囲の治療分野において有用である。これらの化合物は多くのメカニズムを介する免疫応答の調節剤として作用するという事実によって、これらは自己免疫疾患における治療用途を有している。例えば、化合物は先天性免疫応答を刺激する能力を有しているので、これに限定されないが、メラノーマ、骨髄腫、細胞腫、神経膠芽腫及び肉腫を包含する多種の癌の治療に単独で又は他の薬剤と組合わせの何れかで用いることができる。例えば、ある特定のオリゴヌクレオチド化合物は免疫応答を抑制する能力を有しているので、これに限定されないが、アレルギー、喘息、ＣＯＰＤ及び多発性硬化症を包含する多種の自己免疫疾患の治療に単独で又は他の薬剤と組合わせの何れかで用いることができる。
【０１２１】
本発明の治療方法は、所望の結果を達成するのに必要であるような量でそしてそのような期間、本発明の化合物の治療有効量又は抑制する量を対象に投与することを含んでいる。本発明の更なる方法は、所望の結果を達成するのに必要であるような量でそしてそのような期間、本発明の組成物の化合物の抑制量で生体サンプルを処置することである。
【０１２２】
本発明で用いられる用語、本発明の化合物の「治療有効量」は、生体サンプル又は対象において有利な生体応答を産生するのに十分な化合物の量を意味する。医療においてよく理解されているように、本発明の化合物の治療有効量は、何れの治療にも適用可能である妥当なベネフィット・リスク比にあるだろう。
【０１２３】
本発明の化合物の抑制する量又は用量は約０．１ｍｇ／Ｋｇ〜約５００ｍｇ／Ｋｇ、或いは約１〜５０ｍｇ／Ｋｇの範囲でよい。抑制量又は用量は投与経路、更には他の薬剤との併用の可能性によっても変化するだろう。
【０１２４】
本明細書で用いられる用語「生体サンプル（複数を含む）」は、対象へ投与することを意図している生体起源の物質を意味する。生体サンプルの例は、これに限定されないが、血液及び血漿、血小板、血液細胞の下位個体群等のような血液成分；腎臓、肝臓、心臓、肺、脳等の臓器；精液及び卵子；骨髄及びその成分；又は幹細胞を包含する。従って、本発明の別の実施態様は、当該生体サンプルを抑制量の本発明の化合物又は医薬組成物と接触させることによって生体サンプルを処置する方法である。
【０１２５】
対象の疾患が改善すると、必要により、本発明の化合物、組成物又は組合わせの維持量を投与できる。続いて、投与用量又は頻度、或いはその両方を、症状に応じて、改善された疾患が維持されるレベルまで減少させ、症状が所望のレベルまで軽減されたら、治療を中止すべきである。しかしながら、対象は病状の何れかの再発に基づき長期の間欠的な治療が必要となることもある。しかし、本発明の化合物及び組成物の総１日用量は妥当な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されるだろう。特定の患者に対する特異的な抑制量は、治療している疾患及び疾患の重症度；用いられる特定化合物の活性；用いられる特定化合物；患者の年齢、体重、相対的な健康、性別及び食習慣；投与の時間、投与の経路、及び特定化合物の排泄速度；治療の期間；用いられる特定化合物と組合わせて或いは同時に用いる薬剤；及び医療分野で周知の同様の因子を包含する多種の因子によって変わる。
【０１２６】
患者に１度で、複数回で又は分割用量で投与される本発明化合物の総１日抑制用量は、例えば、０．０１〜５０ｍｇ／体重ｋｇ又は通常０．１〜２５ｍｇ／体重ｋｇの量でよい。
【０１２７】
単回投与組成物はこのような量、又は１日用量を構成するその約数を含むことができる。複数回投与は異なった時間間隔で投与される単回投与であってよい。一般に、本発明による治療計画は、本発明化合物（複数を含む）の１日当り約１０ｍｇ〜１０００ｍｇをこのような治療を必要としている患者に単回又は複数回投与で投与することを含んでいる。
【０１２８】
一態様では、本発明は、本明細書に記載されているような疾患又は病気を治療、調節、又は予防するためのキットを提供する。キットは本発明の化合物又はそのヌクレオチド断片、及びキットを使用するための説明書を包含できる。使用説明書は用量、送達の方法、キットの保管等に関する情報を包含できる。キットは、試薬、例えば、試験化合物、緩衝剤、培地（例えば、細胞生育培地）、細胞等も包含できる。試験化合物は公知の化合物又は新しく発見された化合物、例えば、化合物のコンビナトリアルライブラリーを包含できる。
【０１２９】
（併用治療）
本発明の別の態様は、１つ又はそれ以上の疾患の治療に有用な薬剤と組合わせた本発明の化合物による対象を治療する方法に関する。例えば、ラミブジン（３ＴＣ）、アデホビル、テノホビル、ガンシクロビル、アシクロビル、インターフェロン、リバビリン、テルビブジンを包含するウィルスに対して活性な薬剤；これに限定されないが、テオフィリン、アルベスコ（シクレソニド）、パタナーゼ（塩酸オラパチジン（Olapatidine））、レタイリス（アンブリセンタン）（Gilead）、ザイザル（レボセトリジン二塩酸塩）、ブロバナ（アルホルモテロール酒石酸塩）、スピリーバ（臭化チオトリピウム）、クラリネックス、プロピオン酸ベクロメタゾン、レモジュリン（トレプロステニル）、ゾペネックス、デュオネブ（アルブテロール及び臭化チオトリピウム）、フマール酸ホルメテロール、トラクリア（ボセンタン）、トリアムシノロンアセトニド、ブデソニド、シングレア、セレベント、チラーデ（吸入及び噴霧）、ジフロ、アコレート、セダックス、ジルテック、ハーセプチンを包含する、ＣＯＰＤ、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎に対するその他の薬剤。抗癌剤の中では、例えば、これに限定されないが、タキソール、パクリタクセル、シスプラチン、ハーセプチン、グリベック、インターフェロンなど。
【０１３０】
本発明の方法によると、組み合わせの個々の成分を治療期間の異なった時点に別々に、又は分割して若しくは単一の併用形態で同時に投与することができる。従って、本発明はこのような同時及び交互治療計画全てを包含していると理解され、用語「投与すること」は然るべく解釈される。本発明の化合物とその他の薬剤との組み合わせの範囲は、原則的に、ウィルス、細菌、寄生虫、真菌感染等を治療する何れかの医薬組成物との組み合わせの何れかを包含することが理解できるだろう。本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩を第二治療剤と組合わせて用いる場合は、それぞれの化合物の用量は化合物を単独で用いる場合の用量と同一であるか又は異なっているかの何れかである。
【０１３１】
本発明の化合物とその他の薬剤との組み合わせの範囲は、原則的に、ＣＯＰＤ、喘息、アレルギー性鼻炎、癌等を治療する何れかの医薬組成物との組み合わせの何れかを包含することが理解できるだろう。本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩が第２治療剤と組み合わせて用いられる場合、それぞれの化合物の用量は化合物を単独で用いる場合の用量と同一であるか又は異なっているかの何れかである。
【０１３２】
幾つかの抗微生物ペプチドは本明細書に記載されている化学組成物の化合物による免疫刺激によって誘導されることに注目されたい。その例は、これに限定されないが、赤血球外発現ヘモグロビン（ＥＥＨＰ）と呼ばれる抗微生物ペプチドを包含する。
【実施例】
【０１３３】
以下の実施例は、本発明の化合物の製造法及び／又は使用法、アッセイ、スクリーニング、及び治療方法の完全な開示及び記述を当業者に提供するために提示されていて、発明者が発明と見なしているものの範囲を限定することを意図していない。
【０１３４】
以下のある特定の実施例は本発明の抗ウィルス活性を説明する。そしていくつかの実施例は、抗ウィルス活性と抗ウィルス性ペプチドの細胞内産生との間の相関関係を説明している。
【０１３５】
Ｉ．化学実施例−合成及び製造法
本発明の化合物は、本項、実施例、及び化学文献（例えば、Iyer, R. P. et al., Antimicrob. Agents Chemother.  48(6): 2199 - 2205, 2004; Iyer, R. P. et al., Antimicrob Agents Chemother. 48(6):2318-20, 2004; Jin, Y. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 1921-25, 2000; Jin, Y. et al.,  Bioorg. Med. Chem. Lett. 11, 2057-2060, 2001; Iyer, R. P. et al., Current Protocols Unit 3.13, (Beaucage et al Eds,) John Wiley and Sons, 2006; Padmanabhan, S. et al., Tet. Lett. 46, 343-347, 2005; 及び Iyer, R. P. et al., Organic Preparations & Procedure International, 37, 205-212, 2005 等）に記載されている方法で合成できる。
【０１３６】
ヌクレオチド類縁体のライブラリーを製造するために、固相合成及び液相方法の両方を用いることができる。糖核酸塩基及びヌクレオチド間結合に改変を有しているライブラリーの合成にこの方法を用いることができる。
【０１３７】
更に、本発明者らはヌクレオチドライブラリーの合成を促進する幾つかの技術革新を行った：ａ）固相ホスホラミダイト及びＨ−ホスホン酸塩技術を用いるジヌクレオチドライブラリーの合成のために戦略が開発されている、ｂ）最近の技術革新をジヌクレオチド化合物及び類縁体の固相合成に適用した（上で引用した文献を参照されたい）。これら最近の技術革新は、例えば、（ｉ）マイクロ波支援方法を用いるアミノ−、及びカルボキシ官能性固体担体の超高速製造：（ｉｉ）ヌクレオシドを固体支持体に載せるための新規な方法を包含する。ヌクレオチド積載担体を大規模製造のための改善された方法が開発された。この方法は、溶媒としてジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の使用を含んでいる。担体の８０〜３００マイクロモル／ｇというヌクレオシド高積載が得られた；そして（ｉｉｉ）ジヌクレオチドの大規模合成を促進する固体担体の積載及び固相合成用の、ＬＯＴＵＳ（登録商標）と呼ばれる新規な反応器。ＬＯＴＵＳ（登録商標）は反応物の送達を制御するための空気弁を備えた多目的反応器である。
【０１３８】
化合物５及び６ｋについて実例となる合成手順を示す。
【０１３９】
実施例１．化合物５の合成
固相ホスホラミダイト化学（Beaucage, S. L.; Iyer, R. P. Tetrahedron 1993, 49, 1925）を特別に制作されたＬＯＴＵＳ反応器（登録商標）（Padmanabhan, S.; Coughlin, J. E.; Iyer, R. P. Tetrahedron Lett. 2005, 46, 343; Iyer, R. P.; Coughlin, J. E.; Padmanabhan, S. Org. Prep. Proc. Intl. 2005, 37, 205）と併用して、ホスホロチオエート類縁体３−ｄＡｐｓＵ２’−ＯMｅ（5）のＲｐ、Ｓｐ混合物を大量（１ミリモルのヌクレオシドを積載した制御された多孔性グラス（ＣＰＧ）支持体）に合成した。最近発見した固体支持体への超高速官能性付与及び積載法を用いて、ｄＡを結合したＣＰＧ支持体を製造した。ヌクレオチド間ジヌクレオシド亜リン酸結合産物を硫化するために、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシドの溶液（無水ＣＨ３ＣＮ中０．４Ｍ）を用いた（Iyer, R. P.; Regan, J. B.; Egan, W.; Beaucage, S. L. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 1253）。処理、クロマトグラフィー精製、及び凍結乾燥の後に、Ｒｐ，Ｓｐ５のナトリウム塩（〜６０：４０混合物）を純度＞９６％で得て、これを３１Ｐ及び１ＨＮＭＲで特徴付けた。
【０１４０】
このようにして、ジヌクレオチド化合物及び類縁体に焦点を絞ったライブラリーの固相合成を容易に行った。相補的戦略で、液相合成も化合物５の合成に用いた。このような手法は多種の化学修飾を有している化合物の合成を可能にする。
【０１４１】
実施例２．化合物６ｋの合成
【０１４２】
【化１１】
2018010001.tif 000013
【０１４３】
標的化合物６ｋを以下のように２工程で製造した：
工程１．炭酸ヨードメチルイソプロピルの製造：
無水ヨウ化ナトリウム（６ｇ、４０ミリモル）の無水アセトニトリル（２０ｍＬ）溶液に、無水アセトニトリル（１０ｍＬ）中の炭酸クロロメチルイソプロピル（２．９ｇ、１９ミリモル）を２０分かけて滴下した。アルミニウム箔で覆った（光から保護）反応混合物を室温で１晩撹拌した。分離した固体をろ過し、アセトニトリルで洗浄して、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣を水（１０ｍＬ）に溶解して有機層をエーテル（２５ｍＬ）で抽出した。エーテル抽出液を重亜硫酸ナトリウム（５％、１０ｍＬ）、その後食塩水（１０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮して高乾燥真空下で乾燥した。
収量：２．７２ｇ（収率５８％）
１Ｈ−ＮＭＲ；δ１．３（ｄ，６Ｈ）、４．９５（ｍ、１Ｈ）、５．９５（ｓ、２Ｈ）。
【０１４４】
工程２．化合物５のアルキル化
化合物５（６０ｍｇ、０．０９８ミリモル）の水（ＨＰＬＣ、４００ｍＬ）溶液に、撹拌下、炭酸ヨードメチルイソプロピル（８０ｍｇ、０．０１６６ミリモル、３．３３当量）のアセトン（１ｍＬ）溶液を加えた。追加のアセトン（１ｍＬ）を加え、澄明溶液を得て、アルキル化剤の油球の分離を避けた。アルミニウム箔で覆った反応混合物を３時間撹拌し、ロータリーエバポレーター条件下で濃縮し、その後高真空下で濃縮して、白色固体の反応混合物を得た。これを、最初にクロロホルム、そしてゆっくり２％から最後に８％のメタノールを含有するクロロホルムを用いる、シリカカラムクロマトグラフィーで精製した。主成分を含有している画分を合わせ、濃縮して、高真空下で１晩乾燥した。所望の純粋な産物、化合物６ｋが殆ど定量的な収率で単離された（６８ｍｇ）。
３１Ｐ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ４）δ２７．７、２８．６。
【０１４５】
ＩＩ．生物学的実施例及び化合物の設計
実施例１．ＨＢＶトランスジェニックマウスモデルにおける化合物６ｋの抗ＨＢＶ活性。
【０１４６】
【化１２】
2018010001.tif 000014
【０１４７】
化合物６ｋを、ＨＢＶ感染のトランスジェニックマウスモデルにおける抗ＨＢＶ活性について評価した。７８〜１０８日の範囲の日齢である、ＨＢＶに感染させた雄性トランスジェニックマウスを用いた。化合物６ｋを、最初に３００ｍｇ／ｋｇの単回用量で経口強制投与により１４日間毎日投与して評価した。化合物をクエン酸中で投与し、アデホビルジピボキシルを陽性コントロールとして用いた。賦形剤を投与するコントロール群を陰性コントロールとして用いた。処置に続いて、マウスを屠殺して、肝臓組織をサウザンブロット分析を用いてＨＢＤ ＤＮＡについて分析した。Ｋｒｕｓｋａｌ−ＷａｌｌｉｓのノンパラメトリックＡＮＯＶＡを用いてデータを統計的に評価した。試験結果を以下の表１中に提供する。
【０１４８】
【表１】
2018010001.tif 000015
【０１４９】
表１に示されているように、化合物６ｋは非処置コントロールと比較して、肝臓ＨＢＶ ＤＮＡの２対数値以下の減少を引き起こし、これはｐ値０．０１〜０．００１で統計的に有意であった。
【０１５０】
実施例２．ＨＢＶトランスジェニックマウスモデルにおけるＢ型肝炎ウィルスに対する化合物６ａ及び６ｋの経口投与の効果。
（ａ）雄性及び雌性トランスジェニックマウス（ファウンダー１．３．３２）をヒトＢ型肝炎ウィルスに感染させた。感染後、動物に化合物６ｋ、又は０．０５Ｍ（ｐＨ２．０）クエン酸のプラセボを１日１回１４日間経口投与した。化合物６ｋの用量は３００ｍｇ／ｋｇ／ｄであった。陽性コントロール、ＡＤＶを１０ｍｇ／ｋｇ／ｄで投与した。データを表１（上に提供した）に要約した。
【０１５１】
プラセボ賦形剤と比較した統計的優位性を＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１と示した。この検討は、用いた高用量で化合物６ｋに明らかな毒性がないことも立証した。
【０１５２】
実施例３．トランスジェニックマウスにおけるＢ型肝炎ウィルスに対する化合物６ｋの経口投与の効果。
雄性及び雌性トランスジェニックマウス（ファウンダー１．３．３２）をヒトＢ型肝炎ウィルスに感染させた。感染後、動物に化合物６ｋ、又は０．０５Ｍ（ｐＨ２．０）クエン酸のプラセボを１日１回１４日間経口投与した。化合物６ｋの用量は１００、１０、５及び１ｍｇ／ｋｇ／ｄであった。陽性コントロール、ＡＤＶを１０ｍｇ／ｋｇ／ｄで投与した。処置群及びコントロール群における肝臓ＨＢＶ ＤＮＡのデータを表２に要約した
【０１５３】
プラセボ賦形剤と比較した統計的優位性を＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１と示した。血清ＨＢｅＡｇ、ＰＥＩの測定値は、国際免疫診断学標準化アッセイに従って、ポール・エールリッヒ国際単位（ＰＥＩＵ）を用いて報告する。この検討は、用いた高容量で明らかな毒性がないことも立証した（表２）。
【０１５４】
【表２】
2018010001.tif 000016
【０１５５】
実施例４．化合物６ｋで処置したＢ型肝炎に感染したトランスジェニックマウスにおける抗ウィルス性ペプチドとしての赤血球外由来ヘモグロビン（ＥＥＥＨ）の増大した発現。抗ＨＢＶ活性は抗微生物性ペプチドＥＥＥＨタンパク質の産生と相関する。
トランスジェニックマウスにおいて化合物６ｋの投与後に、血漿及び肝臓サンプルを採取し、ＳＤＳ ＰＡＧＥを実施して、先天性免疫系の活性化の一環として誘導される、抗微生物ペプチドである、赤血球外発現ヘモグロビン（ＥＥＥＨ）の存在を評価した。このタンパク質は分子量が約１５キロダルトンである。ＥＥＥＨ発現を図に示した。これは、表３に示したサンプルのＳＤＳ ＰＡＧＥプロファイルである。このように、化合物６ｋはＥＥＥＨタンパク質の発現を用量依存的に誘導する。図２は、経口投与された化合物６ｋの抗ＨＢＶ活性が用量依存的にＥＥＥＨ発現と相関していることを説明している。
【０１５６】
【表３】
2018010001.tif 000017
【０１５７】
実施例５．ウッドチャックにおける舌下経路による化合物５の投与に続くＥＥＥＨ発現の動力学。
トランスクトール中２０ｇ／ｋｇの用量で化合物５を舌下経路でウッドチャックに投与して、分析のために血液を周期的に採取した。試験結果を表４及び５並びに図３及び図４に提供する。
【０１５８】
【表４】
2018010001.tif 000018
【０１５９】
表４並びに図３及び図４に示された結果は、舌下経路を介して投与されたときに化合物５がＥＥＥＨ発現を誘導することを示唆している。
【０１６０】
【表５】
2018010001.tif 000019
【０１６１】
上から分かるように、舌下経路による化合物５の吸収に続くＥＥＥＨタンパク質の誘導は非常に速い。
【０１６２】
実施例６．ＥＥＥＨ発現は、二本鎖ＲＮＡ上のＲＩＧ−Ｉ転座と相関する。
ＥＥＥＨは抗ウィルス性ペプチドとして、インターフェロン介在遺伝子発現に応答して発現され、先天性免疫刺激の結果であると考えられる。
【０１６３】
ＲＩＧ−ＩはｄｓＲＮＡに沿って制限された速度で転座（移動）するが、その動きは５’−三リン酸塩の存在下で有意に加速され（＞２０倍）、それはＲＩＧ‐Ｉのウィルス特異的活性化と一致することが報告されている（Myong, S. et al., Science, 323, 1070, 2009）。インビトロにおける単一分子のＰＩＦＥ（タンパク質誘導蛍光増強）と呼ばれる蛍光アッセイを用いてこのような移動を観察した（Myong, S. et al., Science, 323, 1070, 2009）。化合物５の存在下で、ＲＩＧ−Ｉは用量依存的にｄｓＲＮＡ上で迅速な転座を示し、この化合物がＲＩＧ−Ｉの活性化を誘導することを示唆した。
【０１６４】
ＲＩＧ−Ｉの転座を定量するために、単一分子ＰＩＦＥ収率を推定した。単一分子ＰＩＦＥ収率を数百分子から同時に得て、統計的に信頼できるデータコレクションを可能にしている。更に、不活性及び活性（刺激された）転座シグナル間のデータ出力は有意に異なっていて、正確な判別を可能にした。
【０１６５】
異なった濃度のヌクレオチド化合物を用いて上記の転座を実施した。ＲＩＧ−Ｉ転座に対する化合物５の明確な用量依存性が観察された：化合物５の濃度を５μＭから１７０μＭへ増大すると、速い転座の割合において対応する増大がもたらされた。
【０１６６】
化合物５及び６ｋはそれぞれ２つの異性体の混合物であることも注意すべきである。転座アッセイにおいて、Ｒｐ５異性体［異性体１」として設計した化合物５の一方の異性体はＳｐ５異性体［異性体ＩＩ］より活性であった。しかしながら、Ｒｐ６ｋ異性体１はＳｐ６ｋ異性体ＩＩと同様の活性であった。化合物５及び６ｋの両方はＲＩＧ−Ｉ転座の強力な活性化因子であった。
【０１６７】
【化１３】
2018010001.tif 000020
【０１６８】
この結果は化合物５のＲＩＧ−Ｉ活性を刺激する効果を評価するために転座アッセイを用いることの正当性を立証したので、その他の類縁体に適用した。
【０１６９】
実施例７．ＲＩＧ−Ｉ転座の構造活性相関
構造的に異なる多数のヌクレオチド類縁体をＲＩＧ−Ｉアッセイで評価した（１４）。ヌクレオチド類縁体、ＳＢ５０、ＳＢ６０、ＳＢ７０、ＳＢ８０、ＳＢ９０、ＳＢ１００、及びＳＢ１１０は二本鎖ＲＮＡ上で様々な程度のＲＩＧ−Ｉ転座を示す。
【０１７０】
【化１４】
2018010001.tif 000021
【０１７１】
実施例８．活性対不活性ＲＩＧ−Ｉ転座の定量
標準ｄｓＲＮＡ（２５ｂｐ）をＲＩＧ−Ｉ転座アッセイの主要な基質として用いた。３’−Ｃｙ３フルオロフォア及び５’−ビオチンを有する必須のｄｓＲＮＡ基質は、Dharmacon Inc. で製造した。一連の実験はそれぞれ複数回のデータ獲得を含んでいて、それから明確な転座行動を示す数百の分子を収集した。化合物強度の見積において、迅速な（刺激された）転座と遅い転座の間の比率が説明されるだろう。化合物のＲＩＧ−Ｉ又はＲＮＡ基質に対する親和性を定量するために、各種濃度の化合物（１〜１００μＭの範囲）をこのアッセイで用いた。これは各化合物について結合／解離定数の算出を可能にして、これは化合物の有効性についての細胞に基づく評価に適用するために有用な測定であった。
【０１７２】
化合物を有しているか及び有していない５‐三リン酸塩部分を含む、ｄｓＲＮＡ上で同じ転座アッセイを用いた。転座した分子の数及び転座の速度に基づいて化合物を等級分けした。化合物５のＲｐ異性体（異性体１）が試験した全ての類縁体のうちで最も活性であった。
【０１７３】
実施例９．短いオリゴヌクレオチドによるＮＯＤ２の活性化を介する細胞内ＩＲＦ３の誘導。
最初のアッセイで、ＮＯＤ２を発現することが知られている、ＨＬＥ Ａ５４９細胞におけるＩＲＦ３発現の誘導に関してジ−及びトリヌクレオチド化合物を試験した。化合物５、ＳＢ４３及び６ｋは非処置コントロール細胞と比較して１５〜２０倍の感染を示した。ジヌクレオチドＳＢ５０、ＳＢ１１０、及びＳＢ６０のような関連する類縁体はそれ程ではないにせよＩＲＦ３活性化を誘導した。
【０１７４】
非処置（ＵＴ）及び本発明の化合物で処置したＨＬＥ Ａ５４９細胞におけるインターフェロン調節因子−３（ＩＲＦ３）−ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化。
ＨＬＥ細胞は通常内因的にＮＯＤ２を発現する。短いオリゴヌクレオチド化合物がＮＯＤ２を活性化するか否かを確認するために、ＩＲＦ３プラスミドをトランスフェクトしたＨＬＥ細胞用いた。ＩＲＦ３−ルシフェラーゼをトランスフェクトした細胞をＤＭＳＯのみ（ＵＴ）又は試験化合物（１μＭ）と培養した。１２時間培養した後、二段階ルシフェラーゼレポーターアッセイ系（Dual-Luciferase Reporter Assay System；Promega）を用い製造会社のプロトコールに従って、ルシフェラーゼ活性を測定した。トランスフェクション効率をウミシイタケルシフェラーゼ(renilla Luciferase)の発現を測定して正規化した。ルシフェラーゼユニット（すなわち、倍誘導）を標準的な手順で測定した。アッセイの結果を３回の独立した実験から平均値±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）で表わした。一般に、ジヌクレオチド化合物、３’−ｄＡｐｓ−２’−ＯＭｅＵ（５、一般構造Ｉも参照されたい）及びＳ−アルキル化誘導体ＳＢ４３及び６ｋはＩＲＦ３の１５〜２５倍の誘導を引き起こした。
【０１７５】
別の一連の実験では、通常ＮＯＤ２を発現しないＨＥＫ細胞にＮＯＤ２及びＩＲＧ３をトランスフェクトして短いオリゴヌクレオチド化合物で処置した。ＮＯＤ２欠損細胞は、化合物５及び６ｋで処置したときにＩＲＦ３を誘導しなかったのに対して、ＮＯＤ２をトランスフェクトした細胞はＩＲＦ３の誘導をもたらした。その他の幾つかの化合物はＮＯＤ２トランスフェクト細胞において異なった程度のＩＲＦ３活性化を示した。
【０１７６】
実施例１０．ヒト呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）感染に対する短いオリゴヌクレオチド化合物の抗ウィルス活性。
（Ａ）非処置及びＳＭＮＨ処置細胞におけるＲＳＶ感染性。
ヒト肺上皮細胞を、ＳＭＮＨ化合物の非存在下（ＤＭＳＯのみ）又は多種の存在下で、ＲＳＶ（０．５ＭＯＩ）で感染させた。感染後２４時間に、培地上澄液を集めて、ＣＶ−１細胞単層を用いるプラークアッセイ分析によって、上澄液中のウィルス力価を測定した。１００％ＲＳＶ感染はＤＮＳＯのみで培養した細胞（ＵＴ細胞）からのウィルス力価を表わす。値は３回の独立した定量についての平均値±Ｓ．Ｄを表わす。Ｓ．Ｄ．はエラーバーを示す。
【０１７７】
（Ｂ）ＵＴ及びＳＭＮＨ処置細胞におけるＲＳＶ感染性を示す典型的なプラークアッセイ。
ＲＳＶ感染細胞（＋／−ＳＭＮＨ）由来の培養上澄液を１×１０５の希釈でＣＶ−１細胞に加えた。プラークを観察してクリスタルバイオレット染色の後にメチルセルロース上で定量した。
【０１７８】
【表６】
2018010001.tif 000022
【０１７９】
多種の化合物のうち、ＮＯＤ２活性化因子５及び６ｋは１μＭ濃度でＲＳＶ感染の６０〜８０％抑制を引き起こす最大の抗ウィルス活性を導き、それとともにその他の化合物は様々な程度の抗ウィルス活性を示した（表６を参照されたい）。
【０１８０】
実施例１１．分子モデル化の検討：
分子モデル化を用いると、化合物５及び６ｋはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）模倣体であることを示した。化合物はうまくＡＴＰ構造に重なる。従って、化合物５及び６ｋはＲＩＧ−Ｉ及びＮＯＤ２中のヌクレオチド結合ドメインと結合することができ、これは次いでＩＦＮ経路の誘導をもたらすこれらのタンパク質の活性化を引き起こす。
【０１８１】
実施例１２．インビトロにおける肝炎ウィルスに対する抗ウィルス検討。
選択した化合物を、インビトロの細胞に基づくＨｅｐＧ２．２．１５ＨＢＶアッセイで評価した。化合物５及び６ｋは強力な抗ＨＢＶ化合物であって、０．３〜０．２μモルの範囲のＥＣ５０を有してインビトロで野生型及び薬剤耐性株の分子内ＨＢＶ複製を阻害することが分かった。
【０１８２】
抗ウィルス分析。
抗ウィルス分析のために、２．２．１５細胞の集密培養物を９６ウェル平底組織培養プレート上の２％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭ１１６４０培地中で保持した。培養物（２つの複製プレート上の各試験濃度あたり６個）を試験化合物の９日連続用量で処置した。培地を毎日新鮮な試験化合物と取り替えた。ＨＢＶ核酸及びタンパク質の濃度を最後の処置後２４時間に測定した。細胞外（ビリオン）ＨＢＶ ＤＮＡ濃度を定量的ブロットハイブリダイゼーションによって算定した。細胞内ＨＢＶ ＤＮＡ濃度を定量的サウザンブロットハイブリダイゼーションによって測定した。
【０１８３】
ニュートラルレッド色素の取り込みを、最後の処置後２４時間の毒性の相対的レベルを確認するために用いた。内在色素の５１０ｎＭの吸収（Ａ５１０）を半定量分析に用いた。値は、抗ウィルス分析に用いて同じ方法で保持したストック細胞の同一プールで同じ時間に蒔種した９６ウェルプレート上に保持した非処置細胞の９つの異なった培養物の平均Ａ５１０値（±標準偏差）のパーセントとして表わされている。合計３個の培養物を各濃度の試験化合物で処置した。抗ウィルスアッセイを野生型及び耐性遺伝子型の両方を用いて実施し、結果を表７に要約した。
【０１８４】
【表７】
2018010001.tif 000023
【０１８５】
実施例１３．インビボにおける抗ウィルス検討
（ａ）トランスジェニックマウスにおけるＢ型肝炎ウィルスに対する化合物５のｉ．ｐ．投与の効果。
Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）を発現しているトランスジェニックマウスにおいて化合物５を評価した。化合物５を１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で食塩水中又はクレマホール；エタノール：食塩水賦形剤中の何れかで、１日１回１４日間腹腔内投与し、肝臓ＨＢＶ ＤＮＡを有意に減少させた（Ｐ≦０．００１）。その活性はアデホビルジピボキシル（ＡＤＶ）の抗ＨＢＶ活性とも類似していたが、２つの化合物は異なったＨＢＶ ＤＮＡ種を抑制していると思われた。ＡＤＶはサザンブロット分析において、非常に低サイズのウィルス結合バンドを除去せずより高サイズのバンドを優先的に除去する。これに対して、化合物５はＡＤＶが通常残したバンドを含む、全てのＨＢＶ ＤＮＡ種を無差別に除去し、これは古典的なチェーンターミネーションとは違う作用機序を反映していると考えられる。血清ＨＢｅ、肝ＨＢｓ、及びＨＢｃは化合物５処置の影響を受けず、このことはトランスジェニックマウスにおける、ポリメラーゼ活性の阻害のような、ｍＲＮＡ合成より「下流の」ウィルス合成を阻害する化合物と一致する。最小有効用量を１．６〜０．５ｍｇ／ｋｇ／日と決定した。これはＡＤＶの最小有効用量である１．０ｍｇ／ｋｇ／日と同様であった（表８）。表８は１日１回１４日間腹腔内処置した雄性トランスジェニックマウスにおける化合物５のＨＢＶ ＤＮＡに対する効果を示す。
【０１８６】
【表８】
2018010001.tif 000024
【０１８７】
実施例１４．Ｃ型肝炎ウィルスに対する化合物６ｋの抗ウィルス活性
ａ．第１次抗ＨＣＶアッセイ
ＨＣＶに対する抗ウィルス活性を、９６ウェルプレート上で半集密培養物として保持されているＨＣＶレプリコンを安定に発現している細胞株、ＡＶＡ５（サブゲノム（ＣＯＮ１）、遺伝子型１ｂ）（Blight, et al., 2000, Science 290:1972）を用いて、３日アッセイで評価した（Okuse, et al., 2005; Antiviral. Res. 65:23; Korba, et al., 2008, Antiviral Res. 77:56）。抗ウィルス活性を細胞内ＨＣＶ ＲＮＡ（それぞれの培養サンプル中で細胞Ｂ−アクチンＲＮＡのレベルに正規化した）のブロットハイブリダイゼーション分析で確認した。並行プレート中に保持されている培養物中に取り込まれたニュートラルレッド色素によって細胞毒性を評価した。
【０１８８】
ＥＣ５０、ＥＣ９０、及びＣＣ５０値を、全ての処置培養物を纏めたデータを用いる線形回帰分析（ＭＳ ＥＸＣＥＬ（登録商標）、ＱｕａｔｔｒｏＰｒｏ（登録商標））によって算出した（Korba & Gerin, 1992, Antivir. Res. 19:55; Okuse, et al., 2005, Antivir. Res. 65:23）。ＥＣ５０及びＥＣ９０）値についての標準偏差は回帰分析によって生じた標準誤差から算出する。ＥＣ５０及びＥＣ９０は、それぞれに細胞内ＨＣＶ ＲＮＡの２倍、又は１０倍低下（非処置培養物の平均濃度と比べて）が観察された薬剤濃度である。化合物６ｋは２μモルのＥＣ５０及び約８μモルのＥＣ９０を有していた。ニュートラルレッド染色取り込みの２倍低下（非処置培養物の平均濃度と比べて）が観察された薬剤濃度である、ＣＣ５０は＞１００μモルであった。組み換えヒトインターフェロン２ｂ（PBL laboratories, Inc.）をアッセイのコントロールとして用いる。化合物６ｋは１〜２μモルのＥＣ５０を有し；Ｓｐ６ｋは０．３μＭのＥＣ５０を有し；化合物５は約３μＭのＥＣ５０を有していた。Ｒｐ５は０．１６μＭのＥＣ５０を有していた。
【０１８９】
ｂ．第２次抗ＨＣＶアッセイ
このアッセイは第１次アッセイについて記載した形式を用いる更なる遺伝子型に対する活性を評価する、遺伝子型１ｂＨＣＶに対する活性は比較のために含めた。Ｈ／ＦＬ−Ｎｅｏ（遺伝子型１ａ（Ｈ７７）、全長構築物）Blight, et al., 2003, J. Virol. 77:3181）を含んでいるレプリコン細胞株を用いた。化合物６ｋは１μモルのＥＣ５０及び約６μモルのＥＣ９０を有していた。
【０１９０】
実施例１５．他の抗ウィルス剤と併用したときの化合物６ｋのＨＣＶに対する相乗活性
リード(化合物)が、他の抗ウィルス剤と相乗的に併用できることを明らかにするために、公知の抗ＨＣＶポリメラーゼ及びプロテアーゼ阻害剤、更に、リバビリン及びインターフェロンを用いる併用試験を行った。
【０１９１】
併用処置を既述のように実施した。すなわち、２つの薬剤を事前に決めた濃度比で混合した。個々の薬剤の相対比は各化合物の単剤療法値に基づいた（ＨＣＶ ＲＮＡの１０倍減少が観察される薬剤濃度［ＥＣ９０ｓ］）。薬剤のそれぞれの組合わせについては、等効力の抗ウィルス濃度での化合物の使用を中心にする、３種の濃度比を用いた。次いで、各希釈段階で残っている２つの薬剤の濃度比を用いて希釈系列（ほぼＥＣ９０ｓから始まる、３倍濃度を６段階）を作った。同じ濃度でそれぞれ個々の抗ウィルス剤を用いる単剤治療の異なった希釈系列も同じ実験で培養物を処理するために用いた。細胞毒性分析を単剤治療のために上記しているように実施した。併用検討における薬剤相互作用の分析をＣＡＬＣＵＳＹＮプログラム（Biosoft, Inc., Cambridge, United Kingdom）の使用によって確認した。このプログラムは、信頼限界をもたらすためのモンテカルロ技法を用いる統計分析を含むＣｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙ、分画影響信頼区間（fraction-affected-confidence interval；ＦＡ−ＣＩ）プロット、アイソボログラム、及び半有効プロットを包含する、幾つかの手法の使用によって、相乗作用、相加作用、又は拮抗作用を評価する［Belenkii, M. S. Schinazi, R. A method for the analysis of combination therapies with statistical analysis.  Antiviral Res. 25, 11, 2005］。
【０１９２】
化合物６ｋはＨＣＶ遺伝子型１ｂに対して活性であって（ＥＣ５０；約１〜２μモル）、他の種類の抗ＨＣＶ薬と併用すると、レプリコンアッセイで相乗効果を示した。結果を次の表に要約してある。
【０１９３】
【表９】
2018010001.tif 000025
【０１９４】
幾つかのその他の薬剤もレプリコンアッセイで様々な程度の抗ウィルス活性を示した。
【０１９５】
ヌクレオチド化合物は、インターフェロン刺激活性に加えて、ウィルス複製の阻害剤としてその他のウィルス標的にも直接作用できるので抗ウィルス作用の多数のメカニズムをもたらすことに言及するのは妥当である。従って、これらの化合物は他の抗ウィルス剤と相乗作用し、そしてウィルス撲滅の可能性を秘めて併用治療に使用できることが期待される。これらの化合物は多種のウィルス遺伝子型及び耐性株に対する広域スペクトルの抗ウィルス活性を有することも期待される。これらの化合物が免疫刺激能を有しているので、これらを予防薬及び／又はワクチンとのアジュバントとしても潜在的に使用できる。
【０１９６】
実施例１６：インフルエンザウィルスに対する化合物の抗ウィルス活性：
この化合物が、インビトロ及びインビボにおいてインフルエンザウィルスの複製を阻害するか否かを評価するために、マウスに適合したＨ１Ｎ１インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３及びＡ／ＰＲ８／３４ウィルスを用いる。インビトロ試験のために、細胞を各種濃度（０．５〜１０μＭ）の化合物で処置して、感染後の多種時点におけるＨＡ及びｐｆｕ力価を確認することによる単回及び複数回の複製試験においてインフルエンザウィルスの複製を阻害するこれらの細胞の能力を確認する。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Promega）によって細胞毒性を観察し、ＩＣ５０（ウィルス複製の５０％阻害をもたらす阻害濃度）を計算するために結果を用いた。阻害の陽性コントロールとして働き、そして比較目的のために、ＦＤＡに承認されたニューラミニダーゼ阻害剤であるオセルタミビルを用いる。
【０１９７】
インビボにおける化合物の抗ウィルス活性を調べるために、インフルエンザウィルス感染マウスモデルを用いる。Ｂａｌｂ／ｃマウスのインフルエンザＰＲ８ウィルスによる経鼻感染は、１０３ｐｆｕのＬＤ５０及び感染後７〜８日頃の死亡時期を有する重症の肺炎をもたらし、その時点で感染したマウスはその体重の２５％以上を失なって、その肺の病理組織は、肺構造の崩壊、高濃度の好中球、単球、及びリンパ球浸潤、並びに気管支ライニング内皮細胞の減少を明らかにしている。リード化合物のＭＥＤ（最小有効用量）及びＭＴＤ（最小耐性用量）を見積もるためにマウスでパイロット実験を実施する。例えば、Ｂ型肝炎トランスジェニックマウスモデルへ経口投与したときの化合物６ｋのＥＣ５０は約１０ｍｇ／ｋｇである。化合物のＭＴＤを見積もる目的で、１群当り５匹のマウス群に各種濃度のリード化合物を鼻腔内に毎日５日間投与し、１週間に渡って体重の測定によって耐性を観察する。その後マウスを屠殺して、その肺の病理組織スライドを作成して損傷の何れの兆候についても検査する。ＭＥＤ及びＭＴＤを確認したら、マウス１９匹の群にＰＲ８ウィルスの１０倍ＬＤ５０ｓで経鼻的に感染させて、化合物で毎日経鼻的に処置する。２、４、及び６日目にマウス３匹を屠殺してそれらの肺ウィルスの力価及び病理組織を確認する（各マウスについて一方の肺をウィルス力価に他方の肺を病理組織に用いる）。残りのマウス１０匹を生存を観察するために用いる。体重の減少を病気の指標として観察し、体重減少が２０％を超える場合は、現行のＩＡＣＵＣ（Institutional Animal Care and Use Committees）の提言に従い、マウスを安楽死させて死亡と記録する。非処置マウスとオセルタミビルで処置したマウスを対照とする。ＲＩＧ−Ｉシグナル伝達活性における化合物の作用の特異性を確認するために、ＲＩＧ−Ｉ−／−マウスをインビボ感染試験に含めた。化合物で処置した野生型マウスであるがＲＩＧ−Ｉ−／−マウスは増大した生存率並びに減少したウィルス力価、肺免疫病理、及び抗体陽転を示す。感染からの保護を評価するために設計された保護実験で、マウスをインフルエンザＰＲ８ウィルスに暴露した後の１、２及び３日目に化合物で処置する。
【０１９８】
実施例１７．肝臓、腎臓、骨髄及びミトコンドリア毒性が予測される細胞株のパネルを用いる化合物のインビトロ細胞毒性検討
化合物５及び６ｋは、多種の細胞中でＣＣ５０＞１０００μモルの優れた安全性プロフィールを有している。９６ウェルプレートリーダー（ThermoMax, Molecular devices）を併用するＰｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６非放射活性細胞増殖アッセイキット、及びＭＤＢＫ、Ｖｅｒｏ、及びＨＦＦ細胞株（ＡＴＣＣより入手）を用いて、標準的ＭＴＴアッセイを９６ウェルプレートで実施した。ヌクレオチド類縁体である３ＴＣ、ＡＺＴ、及びｄｄＣ、更には薬剤を含まない培地を包含する数種のコントロールを用いた。ＳＤＳを陽性細胞毒性コントロールとして用いた。化合物を１００、３００、及び１０００μＭの濃度で３通りに試験した。細胞を試験物質と２４時間培養した後、ＭＴＴアッセイを実施した。全ての試験化合物は化合物に対する高い安全性指標を示すＣＣ５０＞１０００μモルを示した。
【０１９９】
実施例１８．ＢＣＧ及び化合物で処置したＰＢＭＣにおけるインターフェロンの誘導
このアッセイのために、１ｍｌ当り１００万細胞のＰＢＭＣを２４ウェルプレートに載せた。プレート群をＢＣＧ、ＢＣＧ＋化合物で処置して２４時間培養した。細胞を溶解して上澄液を採取した。サイトカイン及び１型インターフェロンの産生を標準キットでＥＬＩＳＡアッセイを用いて評価した。ＢＣＧはその他のサイトカイン（ＩＬ−６、８、１０及びＴＮＦ）を同じ実験から誘導した。ＢＣＧと化合物で処置した細胞はＢＣＧ単独と比較して増大したＩＦＮの産生を誘導した。結果は図６に示されている。
【０２００】
実施例１９．マクロファージによるインターロイキン−２産生に対する化合物５及び６ｋの効果
化合物がインターロイキン２産生を誘導したことを確認するために、マクロファージをＢＣＧと共に化合物で処理した。使用したコントロール細胞は非処理細胞、及びＢＣＧで処理したものであった。１８時間の培養に続いて、マクロファージをＴ細胞で覆ってＬＩ−２レベルを定量した。化合物５及び６ｋは、ＢＣＧ単独と比較して、ＢＣＧも受けるこれらの細胞でＩＬ−２の誘導を示した（図７を参照されたい）。
【０２０１】
要約すると、本発明の化合物は細胞内微生物センサーの活性化因子として作用して、免疫応答の活性化をもたらす。化合物はＤＮＡウィルス（ＨＢＶ）並びにＨＣＶ及びＲＳＶのようなＲＮＡウィルスに対して抗ウィルス活性を示した。特許請求される化合物はアゴニストととして免疫応答を誘導するために用いることができるばかりではなく、自己免疫疾患における望ましくない免疫応答を阻害する（中和する）ためにも用いることができる。従って、これらの化合物は、これに限定されないが、癌及び自己免疫疾患を包含する多種の治療状況においても使用することができる。
【図１】
2018010001.tif 000030
【図２】
2018010001.tif 000031
【図３】
2018010001.tif 000032
【図４】
2018010001.tif 000033
【図５】
2018010001.tif 000034
【図６】
2018010001.tif 000035
【図７】
2018010001.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成29年9月14日(2017.9.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
短鎖オリゴヌクレオチド化合物を投与された対象から採取された生体サンプル中で、短鎖オリゴヌクレオチド化合物によって細胞産生が誘導される抗微生物ペプチドの存在をバイオマーカーとして評価することを含んでなり、
該短鎖オリゴヌクレオチド化合物が、
式（Ｉ）：
2018010001.tif 000037
式（Ｉ）
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、−Ｏ−アルキル、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、−Ｏ−アリール、又は−Ｏ−ヘテロアリールアリールであり；
Ｒ３は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アルキル、及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アリールから選ばれ；
Ｂ１及びＢ２は、それぞれ独立して、アデニニル、グアニニル、チミニル、シトシニル、又はウラシリルであり；
ｍは、１、２、３、４、５又は６であり；
Ｒ４は、Ｈ、一リン酸、二リン酸、又は三リン酸基である）
で表される化合物、若しくはその薬学的に許容される塩、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、立体異性体若しくは互変異性体、又は、
式（ＩＩ）：
2018010001.tif 000038
式（ＩＩ）
（式中、Ｘは、存在しないか、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ、又はＳであり；
Ｘ１は、存在しないか、Ｏ、又はＮＨであり；
Ａは、存在しないか、アリール、又はアラルキルであり；
ｎは、０、１、２、３、４又は５であり；
Ｒは、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−ヘテロアリール、又はステロイド系であり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、−Ｏ−アルキル、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、−Ｏ−アリール、又は−Ｏ−ヘテロアリールアリールであり；
Ｒ３は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アルキル、及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アリールから選ばれ；
Ｂ１及びＢ２は、それぞれ独立して、アデニニル、グアニニル、チミニル、シトシニル、又はウラシリルであり；
ｍは、１、２、３、４、５又は６であり；
Ｒ４は、Ｈ、一リン酸、二リン酸、又は三リン酸基である）
で表される化合物、若しくはその薬学的に許容される塩、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、立体異性体若しくは互変異性体であり、
該抗微生物ペプチドが、細胞ＥＥＥＨタンパク質である、
微生物感染に罹っている対象における抗微生物応答を測定する方法。