(57)【要約】【課題】  Met−Lys−Proからなるトリペプチドを高含有で、かつ乳化性を有するカゼインの酵素処理物を効率よく製造する方法を提供すること。【解決手段】  原料であるカゼインに対してプロリン特異的エンドプロテアーゼ０．１〜３Ｕ／ｇ濃度を用いることを特徴とする、Met−Lys−Proからなるトリペプチドを含むカゼイン酵素処理物を製造する方法；Met−Lys−Proからなるトリペプチド含有量（ｍｇ／カゼイン酵素処理物１ｇ）が、０．９〜１．３ｍｇ／ｇであるカゼイン酵素処理物；前記カゼイン酵素処理物から、Met−Lys−Proからなるトリペプチドを含む分子量１，０００Ｄａ以下の画分を得る方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
原料であるカゼインに対してプロリン特異的エンドプロテアーゼ０．１〜３Ｕ／ｇ濃度を用いることを特徴とする、Met−Lys−Proからなるトリペプチドを含むカゼイン酵素処理物を製造する方法。
【請求項２】
前記プロリン特異的エンドプロテアーゼの使用量が、０．４〜２Ｕ／ｇ濃度である、請求項１記載のカゼイン酵素処理物を製造する方法。
【請求項３】
ＭＫＰモル収率が少なくとも７０％である、請求項１又は２記載のカゼイン酵素処理物を製造する方法。
【請求項４】
反応ｐＨが、中性領域である、請求項１〜３の何れか１項記載のカゼイン酵素処理物を製造する方法。
【請求項５】
前記請求項１〜４の何れか１項記載のカゼイン酵素処理物の製造方法を行った後に、当該カゼイン酵素処理物から、未分解カゼイン画分又は分子量１，０００Ｄａ超の画分を除去し、Met−Lys−Proからなるトリペプチドを含む分子量１，０００Ｄａ以下の画分を得る方法。
【請求項６】
Met−Lys−ProからなるトリペプチドＭＫＰ含有量（ｍｇ／カゼイン酵素処理物１ｇ）が、０．９〜１．３ｍｇ／ｇであるカゼイン酵素処理物。
【請求項７】
Met−Lys−ProからなるトリペプチドＭＫＰ含有量（ｍｇ／分子量１，０００Ｄａ以下の画分１ｇ）が、３ｍｇ／ｇ以上である、請求項６記載のカゼイン酵素処理物。
【請求項８】
未分解カゼインを含む、請求項６又は７記載のカゼイン酵素処理物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、Met−Lys−Proからなるトリペプチドを含むカゼイン酵素処理物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、オリゴペプチドの探索及びその機能性に関する研究が進み、この中から血圧降下作用及び血糖上昇抑制作用等の生理活性作用等を有するオリゴペプチドが数多く見出されている。
例えば、Met−Lys−Proからなるトリペプチド（配列番号１）には、アンジオテンシン変換酵素阻害作用、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害作用及びアルツハイマー型認知症等のアミロイド・ベータ蛋白質に起因する脳機能障害に対する予防又は治療が報告されている（特許文献１〜３）。
【０００３】
一般的に、オリゴペプチドの製造方法として、例えば、化学合成方法、タンパク質を加水分解する方法等が知られている。この加水分解方法として、例えば、酸処理、アルカリ処理、酵素処理等が知られている。
しかしながら、目的とするオリゴペプチドを工業ベースで製造する場合、化学合成方法では、大量合成方法の確立の他、化学反応で使用する溶媒や化学反応の副生成物の除去等を検討する必要がある。一方で、既知のタンパク質を原料として用いる加水分解方法を採用した場合、大量生産のための原料の量を確保することは容易であるものの、加水分解後、目的とするオリゴペプチドと、目的としていないポリペプチド及びオリゴペプチドとが種々雑多で混在するため、さらに多大な分離・精製工程が必要となる場合が多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００３／０４４０４４号
【特許文献２】国際公開第２０１３／１２５６２２号
【特許文献３】特開２０１６−６９３４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本技術は、Met−Lys−Proからなるトリペプチド（配列番号１）を高含有で、かつ乳化性を有するカゼインの酵素処理物を効率よく製造する方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一般的に、タンパク質を酵素分解し目的のオリゴペプチドを高濃度にする場合、性質の異なる複数のタンパク質分解酵素をいかに上手に組み合わせるかが、重要視されている。というのも、タンパク質は複雑な構造を有するため、１種類の酵素だけではなく、これとは性質の異なる酵素を１種以上併用することで、タンパク質を低分子化しつつ、目的のオリゴペプチドを切り出す必要があるためである。
ところが、本発明者らは、原材料にカゼインを選択し、このカゼインに対してプロリン特異的エンドプロテアーゼを特定量使用して加水分解したところ、Met−Lys−Proからなるトリペプチド（配列番号１；以下、「トリペプチドＭＫＰ」ともいう）を高濃度に含むカゼイン酵素処理物を得、このカゼイン酵素処理物は乳化性も有していることを見出した。
【０００７】
さらに、このカゼイン酵素処理物の乾燥粉末の分子量分布も検討した結果、このカゼイン酵素処理物中には、酵素分解を受けていない或いは酵素分解をほとんど受けていない未分解カゼインを含む画分が全体の半分以上であり、さらに１，０００Ｄａ超の画分は全体の約８割近くを占めていたことが判明した。
このようなことから、意外にも、このカゼイン酵素処理物からトリペプチドＭＫＰ（３７５Ｄａ）をより高濃度で含む画分を得ることができることも判明した。
このようにして、本発明者らは、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本技術は、
原料であるカゼインに対してプロリン特異的エンドプロテアーゼ０．１〜３Ｕ／ｇ濃度を用いることを特徴とする、Met−Lys−Proからなるトリペプチドを含むカゼイン酵素処理物を製造する方法を提供することができる。
【０００９】
また、本技術に係る製造方法において、前記プロリン特異的エンドプロテアーゼの使用量が、０．４Ｕ／ｇ以上２Ｕ／ｇ以下の濃度とすることができる。
また、本技術に係る製造方法において、ＭＫＰモル収率が少なくとも７０％とすることができる。
また、本技術に係る製造方法において、反応ｐＨは特に限定されないが、中性領域とすることができる。
【００１０】
また、本技術は、
前記カゼイン酵素処理物の製造方法を行った後に、当該カゼイン酵素処理物から、未分解カゼイン画分又は分子量１，０００Ｄａ超の画分を除去し、Met−Lys−Proからなるトリペプチドを含む分子量１，０００Ｄａ以下の画分を得る方法を提供することができる。
【００１１】
また、本技術は、
Met−Lys−ProからなるトリペプチドＭＫＰ含有量（ｍｇ／カゼイン酵素処理物１ｇ）が、０．９〜１．３ｍｇ／ｇであるカゼイン酵素処理物を提供することができる。
本技術に係るカゼイン酵素処理物において、Met−Lys−ProからなるトリペプチドＭＫＰ含有量（ｍｇ／分子量１，０００Ｄａ以下の画分１ｇ）が、３ｍｇ／ｇ以上とすることができる。
本技術に係るカゼイン酵素処理物は、未分解カゼインを含むことができる。
【発明の効果】
【００１２】
本技術によれば、Met−Lys−Proからなるトリペプチドを高含有で、かつ乳化性を有するカゼインの酵素処理物を効率よく製造することができる。
なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本技術中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本技術を実施するための好適な実施形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１４】
本技術の製造方法は、原料であるカゼインに対してプロリン特異的エンドプロテアーゼを用いることを特徴とする、Met−Lys−Proからなるトリペプチド（配列番号１）を含むカゼイン酵素処理物を製造する方法である。
前記Met−Lys−Proからなるトリペプチドは、Met−Lys−Proのみからなるアミノ酸配列（配列番号１）であり、原料であるカゼインから切り出されるトリペプチドである。
【００１５】
（１）原料カゼイン
原料であるカゼインは、乳由来のタンパク質を主成分とするものである。当該カゼインは特に限定されないが、当該カゼインとして、市販品を使用してもよいし、乳からの分離精製品を使用してもよい。
前記カゼインとして、例えば、各種カゼイン、カゼイネート、レンネットカゼイン等が挙げられ、これらを１種又は２種以上組み合わせて使用することができる。
具体的には、乳酸カゼイン、硫酸カゼイン、塩酸カゼイン等の酸カゼイン；ナトリウムカゼイネート、カリウムカゼイネート、カルシウムカゼイネート、マグネシウムカゼイネート等のカゼイネート等又はこれらのうち２種以上組み合わせた混合物等が挙げられる。
また、牛乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳等から常法により分離精製したウシ由来のカゼイン等を利用することもできる。
【００１６】
ここで、一般的なカゼイン中の構成成分は、単一のタンパク質ではなく、大別してα−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼインの３種類に分類されることが知られている。本発明者らは、その中でも、α−カゼインのアミノ酸配列中に存在する−Met−Lys−Pro−（−Ｍ−Ｋ−Ｐ−）からなるアミノ酸配列部分から、トリペプチドＭＫＰの状態で効率よく切り出せることを確認した。したがって、本技術に係るカゼイン酵素処理物の製造方法において、トリペプチドＭＫＰを得る際、α−カゼインを主たる基質源とするのが好適である。
【００１７】
原料として使用されるカゼインは、乳由来のため、比較的安価で、安定して簡便に、しかも大量に入手できるという利点がある。したがって、カゼインを用いる本技術の製造方法によって、本技術のカゼイン酵素処理物を、比較的安価かつ安全で、安定して、簡便に、しかも大量に得ることができる。
【００１８】
（２）プロリン特異的エンドプロテアーゼ
本技術の製造方法において用いるプロリン特異的エンドプロテアーゼは、ペプチドのプロリン残基のカルボキシ末端側で切断し得るエンドプロテアーゼである。
前記プロリン特異的エンドプロテアーゼの由来は、特に限定されず、動物由来、植物由来、微生物由来の何れでもよい。また、これら動物等から、プロリン特異的エンドプロテアーゼを、常法により分離精製して使用してもよいし、通常、医薬品・食品において用いることができる市販品を使用してもよい。
これらのうち、微生物由来が好ましい。
微生物由来として、アスペルギルス（Aspergillus）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、アエロモナス(Aeromonas)属、ザントモナス（Xanthomonas）属、バクテロイド（Bacteroides）属等が挙げられ、これら由来を単独で又は複数組み合わせて使用することができる。
これら微生物由来のうち、アスペルギルス（Aspergillus）属由来が好ましく、さらにアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来が好ましい。
【００１９】
前記プロリン特異的エンドプロテアーゼにおいて、この酵素の理化学的性状は以下のものが好ましい。
前記酵素の作用は、ほぼ可溶性状態の動植物由来タンパク質に存在するプロリンのＣ末端を特異的に切断することが、好ましい。
前記酵素の作用は、タンパク質及びポリペプチドに存在するペプチド結合間を切断することが、好ましい；苦味形成なし又は過剰な加水分解なしで、タンパク質及びポリペプチドの大きさ、形状、鎖の長さを減少させることが、好ましい。
前記酵素の特性は、当該酵素がセリンプロテアーゼであることが、好ましい；当該酵素は、正規のプロテアーゼ阻害剤によって阻害されないことが、好ましい。
前記酵素は、真菌由来であることが好ましい。
前記酵素の至適ｐＨは、中性領域〜酸性領域（ｐＨ８付近〜１．５付近）であることが好ましい。
アスペルギルス属由来のエンドプロテアーゼの場合、至適ｐＨは、酸性領域（ｐＨ１．５付近〜７付近）であることが好ましく、このエンドプロテアーゼのさらに具体的な至適ｐＨは、７より低い酸性領域であることが好ましく、より好ましくは３．５〜６．５である。
前記酵素の作用するｐＨ範囲は、１．５〜７であることが好ましい。
前記酵素の至適温度は、５５℃付近（５０〜６０℃）であることが好ましい。
前記酵素の作用する温度範囲は、０〜７５℃であることが好ましい。
前記酵素の活性状態について、当該酵素は、５〜１０分間８０〜８５℃保持で失活すること；酵素の不活性は、ｐＨ及び基質濃度によって著しく影響されること；これら全てにおいて、酵素不活性化を確実にするため残存活性の測定を行うことが好ましい。
【００２０】
（３）カゼイン酵素処理物の製造方法
本技術に係るカゼイン酵素処理物の製造方法は、原料であるカゼインに対してプロリン特異的エンドプロテアーゼを用い、Met−Lys−Proからなるトリペプチド（配列番号１）を含むカゼイン酵素処理物を得ることができれば、詳細な工程については特に限定されない。
本技術に係る製造方法は、公知のカゼイン酵素処理物の製造方法で用いられている様々な工程を自由に選択して採択することができる。
以下、製造方法の一例について、具体的に説明する。
【００２１】
［原料溶液の調整］
カゼインを含む原料を、水等の溶媒に溶解又は分散させ、カゼイン含有溶液を調製する。
【００２２】
原料に使用するカゼインについては、上述のとおりである。当該カゼインはプロリン特異的エンドプロテアーゼの基質として使用される。
ガゼイン以外の原料として、例えば、ｐＨ調整剤、界面活性剤等が挙げられ、このうち、１種又は２種以上を選択することができる。
溶媒として、特に限定されないが、水として蒸留水等を用いることが好ましい。
また、前記カゼイン含有溶液中のカゼイン濃度は、特に限定されないが、通常、タンパク質換算で５〜１５質量％前後の濃度範囲とすることが、効率性及び操作性の点から、好ましい。
【００２３】
また、前記カゼイン含有溶液のｐＨは、ｐＨ４〜８とするのが好ましく、中性領域（ｐＨ６〜８）とするのがより好ましく、ｐＨ６．２〜７にするのがさらに好ましい。ｐＨ６．５〜７とするのが特に好ましい。
ｐＨの酸調整には、塩酸、硫酸等の無機酸；酢酸等の有機酸等を用いることができる。ｐＨのアルカリ調整には、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属塩；水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属塩等を用いることができる。これらを単独で又は複数組み合わせて使用することができる。
【００２４】
［酵素反応］
次に、前記カゼイン含有溶液に、プロリン特異的エンドプロテアーゼを添加する。
本技術において、プロリン特異的エンドプロテアーゼは、他の性質のタンパク質酵素と併用をせず、単独で用いることが特徴である。
従来、タンパク質分解酵素を複数併用しないと、目的のオリゴペプチドを多く効率よく生成できないと考えられていた。しかし、本技術では、プロリン特異的エンドプロテアーゼ以外のタンパク質分解酵素と併用すると、かえってカゼイン酵素処理物中に目的とするトリペプチドＭＫＰ含有比率が低下し、また、目的物を高含有画分で回収することも困難となる。通常であれば、さらに異なる酵素同士の組み合わせに固執し検討し続けるところ、本発明者らは、偶然にもプロリン特異的エンドプロテアーゼ単独で用いたことで、カゼインに対して高い効率でトリペプチドＭＫＰを切り出し、カゼイン酵素処理物中で高濃度化することができた。
【００２５】
本技術の酵素処理物は、水に溶けやすく、乳化性を有し、苦味もほとんどなかった。このような性質を有する本技術の酵素処理物は、そのもの自体でも価値が高いが、食品の添加剤としても利用価値が高い。
【００２６】
本技術のプロリン特異的エンドプロテアーゼの使用量は、原料であるカゼインに対して、０．１〜３Ｕ／ｇ濃度であることが好ましい。０．１Ｕ／ｇ濃度以上であれば、原料であるカゼインからトリペプチドＭＫＰを効率よく切り出すことができ、トリペプチドＭＫＰをカゼイン処理物中で高含有にすることができる。また、酵素が３Ｕ／ｇ濃度以下であれば、トリペプチドＭＫＰを効率よく切り出すことができる一方で、カゼインの未分解物も多く得ることができるので、好ましい。
さらに、前記プロリン特異的エンドプロテアーゼの使用量は、下限値として、好ましくは０．３Ｕ／ｇ濃度以上、より好ましくは０．４Ｕ／ｇ濃度以上、さらに好ましくは０．５Ｕ／ｇ濃度以上である。また、上限値として、好ましくは２．５Ｕ／ｇ濃度以下、より好ましくは２Ｕ／ｇ濃度以下、さらに好ましくは１．５Ｕ／ｇ濃度以下である。
また、前記プロリン特異的エンドプロテアーゼの使用量は、０．４〜２Ｕ／ｇ濃度であることが好ましく、０．５〜１Ｕ／ｇ濃度であることがより好ましい。この濃度範囲内により、原料であるカゼインに存在する−Ｍ−Ｋ−Ｐ−のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から、このアミノ酸配列（Ｍ−Ｋ−Ｐ）部分を効率よくトリペプチドＭＫＰとして切り出すことができ、またトリペプチドＭＫＰ含有量（ｍｇ／分子量１，０００Ｄａ以下の画分１ｇ）の含有量も高くすることができる。
【００２７】
また、本技術において、反応継続時間、反応温度、初発ｐＨ等の反応条件を調整することによって、酵素処理の進行状態を適宜調整することができる。
例えば、酵素反応をモニターすることにより、カゼイン酵素処理物の理化学的性質が所望の値になるように反応継続時間を決定することもできる。
なお、酵素反応のモニタリング方法としては、例えば、前記反応溶液の一部を採取し、タンパク質の分解率、ＭＫＰモル収率、トリペプチドＭＫＰ含有量等を測定する方法等が挙げられる。採取した反応溶液のまま測定して反応継続時間を決定してもよい。
【００２８】
本技術において、分解率が、好ましくは１０％以下、より好ましくは９％以下、さらに好ましくは８％以下になるように調整する。
【００２９】
本技術において、ＭＫＰモル収率が、好ましくは２０％以上、より好ましくは２４％以上、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは９５％以上になるように調整する。
【００３０】
本技術において、反応時間は、下限値として、好ましくは１時間以上、より好ましくは２時間以上、さらに好ましくは４時間以上、特に好ましくは６時間以上、極めて好ましくは９時間以上である。また、上限値として、好ましくは２４時間以下、より好ましくは２０時間以下、さらに好ましくは１６時間以下、特に好ましくは１５時間以下である。
また、反応時間は、好ましくは１〜２４時間であり、より好ましくは１〜２０時間であり、さらに好ましくは２〜１６時間であり、特に好ましくは４〜１５時間、極めて好ましくは６〜１５時間、より極めて好ましくは９〜１５時間である。
【００３１】
本技術において、反応ｐＨは、好ましくは中性領域（ｐＨ６〜８）であり、より好ましくは６．２〜７．５である。さらに好ましい上限値は７．０である。また、さらに好ましい下限値は、ｐＨ６．３である。反応ｐＨは、カゼインの酸沈殿を抑制するため、ｐＨ６以上が望ましい。
【００３２】
本技術において、反応温度は、下限値として、好ましくは２０℃以上、より好ましくは４０℃以上、さらに好ましくは５０℃以上である。上限値として、好ましくは６５℃以下、より好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは５５℃以下である。
また、反応温度は、好ましくは２０〜６５℃であり、より好ましくは４０〜６０℃であり、さらに好ましくは５０〜６０℃であり、特に好ましくは５０〜５５℃である。反応温度は、カゼインの熱変性を抑制するため、６０℃以下が望ましい。
【００３３】
次に、酵素反応を停止させる。
酵素反応の停止は、加水分解液中の酵素を失活させることにより行われる。失活処理は、常法、例えば、加熱失活処理等により実施することができる。
加熱失活処理の条件（加熱温度、加熱時間等）は、使用した酵素の熱安定性を考慮し、十分に失活できる条件を適宜設定することができる。
本技術において、一例として、５〜１０分間８０〜８５℃保持で酵素失活させることができる。
【００３４】
［分離・精製］
上述の酵素反応を行った酵素反応物を、常法の分離・精製法にて、分離・精製してもよい。酵素処理物は、溶液の状態であってもよい。
これにより、本技術の酵素処理物から、不純物を除去してもよい。本技術の酵素処理物から、所望の画分又は所望のペプチドを回収してもよい。
【００３５】
分離・精製として、例えば、沈殿法、膜分離法、ＨＰＬＣ分離精製法、イオン交換クロマト法、結晶法等が挙げられる。
分離・精製法として、例えば、ろ過法、精密ろ過法、限界濾過膜等の膜分離処理法、樹脂吸着分離法、カラムクロマトグラフィー法、ＨＰＬＣ分離精製法、沈殿法、結晶法等が挙げられ、これらから１種又は２種以上の組み合わせを選択することができる。
【００３６】
前記ろ過法は、公知の方法により実施することができ、例えば、珪藻土を用い、公知の装置により実施することができる。
【００３７】
前記膜分離処理法は、公知の装置を用いて行うことができる。公知の装置としては特に限定されないが、例えば、精密濾過モジュール等、限外濾過モジュールＰｅｌｌｉｃｏｎ２  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ（メルクミリポア社製、分画分子量１，０００Ｄａ）、限外濾過モジュールＳＥＰ１０５３（旭化成社製、分画分子量３，０００Ｄａ）、ＳＩＰ１０５３（旭化成社製、分画分子量６，０００Ｄａ）、ＳＬＰ１０５３（旭化成社製、分画分子量１０，０００Ｄａ）等が挙げられる。
【００３８】
前記樹脂吸着分離法は、公知の方法により実施することができ、例えば、酵素処理物を、樹脂と接触させることにより実施することができる。樹脂としては特に限定されないが、例えば、イオン交換樹脂、キレート樹脂、アフィニティー吸着樹脂、合成吸着剤、高速液体クロマトグラフィー用樹脂等が挙げられる。さらに具体的には、例えば、商品名：ダイヤイオン、セパビーズ（三菱化学社製）、アンバーライトＸＡＤ（オルガノ社製）、ＫＳ−３５（味の素ファインテクノ社製）等が挙げられる。
樹脂吸着分離法は、これらの樹脂をカラムに充填して前記酵素処理物を連続的に流入させ、流出させることによる連続方式で行うこともでき、また、前記酵素処理物中に樹脂を投入し、一定時間接触させた後、酵素処理物と樹脂とを分離するバッチ方式で行うこともできる。
【００３９】
前記沈殿法は、公知の方法により実施することができ、例えば、酸沈殿法、遠心分離法等が挙げられる。これらを単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。
【００４０】
［カゼイン酵素処理物の製造方法を行った後に各画分を得る方法］
本技術において、上述のカゼイン酵素処理物の製造方法を行った後に、当該製造方法にて得られた酵素処理物から、未分解カゼイン等を含む高分子画分又は分子量１，０００Ｄａ超の画分を除去し、トリペプチドＭＫＰを含む分子量１，０００Ｄａ以下の画分を得ることもできる。
これにより、トリペプチドＭＫＰをさらに高含有にした画分を得ることができる。
【００４１】
未分解カゼイン等を含む高分子画分を回収する場合、酸沈殿を行うことが望ましい。酸沈殿法により、上清にトリペプチドＭＫＰを含む画分が含有し、酸沈殿物にタンパク質及びポリペプチドを含む画分が含有する。上清及び酸沈殿物の分離は容易であるので、それぞれを効率よく回収することができる。
本技術における未分解カゼインを含む高分子画分として、概ね分子量１０，０００Ｄａ超のタンパク質及びポリペプチド等が挙げられる。
【００４２】
前記酸沈殿法において、酵素反応物を含む溶液のｐＨを、６以下にするのが好ましく、５．５以下にするのがより好ましい。これにより、タンパク質及びポリペプチドを沈殿させて、酵素処理物からタンパク質等を除去又は回収することができる。このときの酸沈殿した画分を回収し利用する場合、タンパク質変性を抑制するために、下限ｐＨは、４以上であるのが好ましい。
【００４３】
さらに、酸沈殿物を除去又は回収する場合、例えば、遠心分離法、膜分離法等にて行うことが望ましい。
遠心分離法は、簡便であるので、作業性及びコストの点で、好適である。遠心分離後に、上清を回収することで、トリペプチドＭＫＰをさらに高濃度に含む画分を得ることができる。
【００４４】
また、膜分離処理法は、分子量区分にて効率よく各画分を回収し易いので好適である。回収する分子量区分をより低分子化（好適には分子量１，０００Ｄａ以下）することにより、トリペプチドＭＫＰをさらに高濃度に含む画分を得ることができる。
さらに、膜分離処理法を行う前に、未分解カゼインを含む高分子画分を除去することが、作業効率及びコストの点で好ましい。具体的には、酸沈殿法、遠心分離法、膜分離法の順に行うのが好適である。これにより、トリペプチドＭＫＰを高濃度に含む画分を効率よく得ることができる。
【００４５】
［殺菌処理］
また、得られたカゼイン酵素処理物を殺菌してもよい。
殺菌方法は、常法による加熱処理方法等を用いることができる。
加熱処理時の加熱温度と保持時間は、充分に殺菌できる条件を適宜設定すればよく、例えば、７０〜１４０℃で２秒間〜３０分間加熱処理することにより殺菌できる。
加熱殺菌の方式は、バッチ方式、連続方式のいずれの方式も可能であり、連続方式においてもプレート熱交換方式、インフュージョン方式、インジェクション方式等の方式を用いることができる。
【００４６】
［濃縮処理・乾燥処理・粉末化処理・二次的処理］
更に、得られたカゼイン酵素処理物は、そのままの溶液の状態で使用することもでき、また、必要に応じて、該溶液を公知の方法により、濃縮した濃縮液として使用することもできる。また、該濃縮液を公知の方法により乾燥し、粉末にして使用することもできる。
【００４７】
（４）カゼイン酵素処理物
本技術に係るカゼイン酵素処理物は、上述のカゼイン酵素処理物の製造方法によって得ることができる。本技術のカゼイン酵素処理物は、軽度の分解条件によって、トリペプチドＭＫＰを高含有し、かつ乳化性を有するものであり、新規なものである。
【００４８】
本技術のカゼイン酵素処理物の乳化性を表す値（ＯＤ５００）は、好ましくは１以上、より好ましくは２以上である。
カゼインは水に溶けにくいが、本技術のカゼイン酵素処理物は、未分解物画分を有するものの、水溶性を有する。さらに、本技術のカゼイン酵素処理物は、タンパク質の乳化性を高いまま維持することができる。このため本技術のカゼイン酵素処理物は、種々の食品添加剤又は乳化剤としても利用可能である。
【００４９】
また、一般的にタンパク質を酵素処理し、疎水性アミノ酸を有するオリゴペプチドが高含有になると、苦味を促進するとされている。しかしながら、本技術において、プロリン特異的エンドプロテアーゼを用いたカゼイン酵素処理物は、苦味を感じない又はわずかに苦味を感じる程度である。
このように苦味を感じないカゼイン酵素処理物は、苦味除去を行う工程が必要ないため、低コストである。さらに、苦味除去は栄養学上重要なアミノ酸が欠乏する可能性があるが、本技術のカゼイン酵素処理物は苦味除去工程を行わなくともよいため、この欠乏の点も改善できる。
【００５０】
本技術のカゼイン酵素処理物中のＭＫＰモル収率は、２０％以上が好ましく、２４％以上がより好ましく、７０％以上がさらに好ましく、７３％以上が特に好ましく、９６％以上が極めて好ましい。
【００５１】
本技術のカゼイン酵素処理物の分解率は、１０％以下が好ましく、９％以下がより好ましく、８％以下がさらに好ましい。
【００５２】
前記カゼイン酵素処理物中のトリペプチドＭＫＰ含有量（ｍｇ／カゼイン酵素処理物１ｇ（以下、「処理物１ｇ」ともいう。））は、０．３ｍｇ／処理物１ｇ以上が好ましく、０．９ｍｇ／処理物１ｇ以上がより好ましく、１．２ｍｇ／処理物１ｇ以上がさらに好ましい。また、前記カゼイン酵素処理物中のトリペプチドＭＫＰ含有量の上限値は、論理値より、１．３（ｍｇ／処理物１ｇ）以下である。
【００５３】
前記カゼイン酵素処理物中のトリペプチドＭＫＰ含有量（ｍｇ／分子量１，０００Ｄａ以下画分１ｇ（以下、「画分１ｇ」ともいう。））は、１．４ｍｇ／画分１ｇ以上が好ましく、３．０ｍｇ／画分１ｇ以上がより好ましく、４．０ｍｇ／画分１ｇ以上がさらに好ましく、４．６ｍｇ／画分１ｇ以上が特に好ましい。また、前記カゼイン酵素処理物中のトリペプチドＭＫＰ含有量の上限値は、高いほどよいが、例えば５．２ｍｇ／画分１ｇ以下である。
【００５４】
さらに、ペプチドには種々の生理活性作用が認められているので、本技術のカゼイン酵素処理物は、適宜タンパク質及びペプチドを除去することにより、二次的処理物として、トリペプチドＭＫＰをより高含有とした二次的カゼイン酵素処理物（例えば、分子量１，０００Ｄａ以下の画分、上清画分等の分離・精製画分）とすることも可能である。
前記カゼイン酵素処理物から分離・精製された画分（以下、「分離・精製画分」ともいう）の固形分１ｇ中のトリペプチドＭＫＰ含有量を、上述の「前記カゼイン酵素処理物中のトリペプチドＭＫＰ含有量（ｍｇ／画分１ｇ）」又はそれ以上に調整することが可能である。
例えば、タンパク質及びポリペプチド等の高分子画分を除去し、トリペプチドＭＫＰをより高含有にした画分を得、これを機能性食品等として用いることもできる。また、このトリペプチドＭＫＰ高含有画分は、酸性下でも水溶性であるので種々の食品に使用することができる
【００５５】
（５）カゼイン酵素処理物及び各分離・精製画分の用途
本技術に係る製造方法により得られたカゼイン酵素処理物及び各分離・精製画分は、様々な医薬品、飲食品、飼料等に使用することができる。
本技術に係る製造方法により得られたカゼイン酵素処理物又は各分離・精製画分は、乳由来の原料を用いているため、生体への安全性が高く、長期間、連続的な投与又は摂取にも適している。加えて、生体材料として比較的安価な乳由来の原料から生産しているため、安定して簡便に、しかも大量に製造することができ、需要者に対して安価に提供することも可能である。
【００５６】
カゼイン酵素処理物又は各分離・精製画分を医薬品に利用する場合、該医薬品は、経口投与及び非経口投与のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。非経口投与としては、例えば、注射（血液、皮膚、筋肉等）、直腸投与、吸入等が挙げられる。経口投与の剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、顆粒剤、散剤、軟膏等が挙げられる。
【００５７】
また、製剤化に際しては、カゼイン酵素処理物及び各分離・精製画分の他に、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤等の成分を用いることができる。更に、公知の又は将来的に見出される疾患の予防又は治療の効果を有する成分を、目的に応じて併用することも可能である。
【００５８】
更に、投与方法に応じて、適宜所望の剤形に製剤化することができる。例えば、経口投与の場合、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等に製剤化することができる。また、非経口投与の場合、座剤、噴霧剤、軟膏剤、貼付剤、注射剤等に製剤化することができる。
【００５９】
加えて、製剤化は剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、カゼイン酵素処理物のみ又は各分離・精製画分のみを製剤化してもよく、適宜、製剤担体を配合する等して製剤化してもよい。
【００６０】
また、前記製剤担体としては、剤形に応じて、各種有機又は無機の担体を用いることができる。固形製剤の場合の担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
【００６１】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられる。
【００６２】
結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マクロゴール等が挙げられる。
【００６３】
崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。
【００６４】
滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ピーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩類；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。
【００６５】
安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられる。
【００６６】
矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。
なお、経口投与用の液剤の場合に使用する担体としては、水等の溶剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
【００６７】
カゼイン酵素処理物又は各分離・精製画分をヒト若しくは動物用の飲食品に利用する場合、公知の飲食品に添加して調製することもできるし、飲食品の原料中混合して新たな飲食品を製造することもできる。
【００６８】
前記飲食品は、液状、ペースト状、固体、粉末等の形態を問わず、錠菓、流動食、飼料（ペット用を含む）等のほか、例えば、小麦粉製品、即席食品、農産加工品、水産加工品、畜産加工品、乳・乳製品、油脂類、基礎調味料、複合調味料・食品類、冷凍食品、菓子類、飲料、これら以外の市販品等が挙げられる。
【００６９】
小麦粉製品としては、例えば、パン、マカロニ、スパゲッティ、めん類、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等が挙げられる。
即席食品類としては、例えば、即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品、その他の即席食品等が挙げられる。
農産加工品としては、例えば、農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）等が挙げられる。
水産加工品としては、例えば、水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等が挙げられる。
畜産加工品としては、例えば、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等が挙げられる。
乳・乳製品としては、例えば、加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等が挙げられる。
油脂類としては、例えば、バター、マーガリン類、植物油等が挙げられる。
基礎調味料としては、例えば、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等が挙げられ、前記複合調味料・食品類として、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等が挙げられる。
冷凍食品としては、例えば、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等が挙げられる。
菓子類としては、例えば、キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、その他の菓子等が挙げられる。
飲料類としては、例えば、炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等が挙げられる。
上記以外の市販食品としては、例えば、ベビーフード、ふりかけ、お茶潰けのり等が挙げられる。
【００７０】
また、本技術で定義される飲食品は、保健用途が表示された飲食品として提供・販売されることも可能である。
「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、前記用途を想起・類推させうるような表現であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、全て本技術の「表示」行為に該当する。
【００７１】
また、「表示」は、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装に前記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為等が挙げられる。
【００７２】
一方、表示内容としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示等）であることが好ましい。また、そのような表示内容を、包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ等の販売現場における宣伝材、その他の書類等へ付することが好ましい。
【００７３】
また、「表示」には、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、医薬用部外品等としての表示も挙げられる。この中でも特に、消費者庁によって認可される表示、例えば、特定保健用食品制度、これに類似する制度にて認可される表示等が挙げられる。後者の例としては、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク減少表示等を挙げることができる。より具体的には、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）及びこれに類する表示が典型的な例である。
【００７４】
カゼイン酵素処理物及び各分離・精製画分を飼料に利用する場合、公知の飼料に添加して調製することもできるし、飼料の原料中混合して新たな飼料を製造することもできる。
【００７５】
前記飼料の原料としては、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦等の穀類；ふすま、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類；脱脂粉乳、ホエー、魚粉、骨粉等の動物性飼料類；ビール酵母等の酵母類；リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油脂類；アミノ酸類；糖類等が挙げられる。また、前記飼料の形態としては、例えば、愛玩動物用飼料（ペットフード等）、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。
【００７６】
なお、本発明に係る製造方法により生産されたカゼイン酵素処理物又は各分離・精製画分を利用した、上記飲食品又は飼料は、低温殺菌又は滅菌することも可能である。
【００７７】
また、本技術のトリペプチドＭＫＰは、以下の効能が期待できる。このためこのトリペプチドＭＫＰを高含有するカゼイン酵素処理物及び各分離・精製画分も以下のことを期待できる。
【００７８】
トリペプチドＭＫＰは、アンジオテンシン変換酵素阻害剤の有効成分として使用することができる。このペプチドは、アンジオテンシン変換酵素阻害作用及びブラジキニン不活性化抑制作用を有し、血圧降下作用を示す。
したがって、トリペプチドＭＫＰは、高血圧に由来する種々の疾患（例えば脳出血、脳梗塞、狭心症、心筋梗塞、腎不全等）に対する予防剤又は治療剤（具体的には血圧降下剤等）として使用することができる。
また、アンジオテンシン変換酵素阻害剤は、原因不明の本態性高血圧にも効果があることが知られており、トリペプチドＭＫＰも本態性高血圧に対する治療又は予防効果を示すことが期待される。その他、アンジオテンシン変換酵素阻害剤が有効であることが知られている心肥大、狭心病等の疾患に対しても、治療、予防薬として、トリペプチドＭＫＰは使用することができる（特許文献１参照）。また、トリペプチドＭＫＰは、これら疾患の予備軍にも有益であると考える。
【００７９】
トリペプチドＭＫＰは、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害剤の有効成分として使用することができる。このペプチドは、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害を有し、高血糖抑制作用、血糖低下作用、血管内皮機能低下抑制作用、血管内皮障害抑制作用、血管障害抑制作用、血管内皮細胞の保護作用及び食欲抑制作用等を示す。また、トリペプチドＭＫＰは、食欲抑制及び血管内皮細胞の保護等も可能と考える。
したがって、トリペプチドＭＫＰは、高血糖に由来する種々の疾患（例えば高血糖症、糖尿病、糖尿病合併症、血管内皮障害、血管障害等）に対する予防剤又は治療剤（具体的には、血糖低下、血管内皮障害抑制及び抗糖尿病等）として、使用することもできる。
トリペプチドＭＫＰは、アンジオテンシン変換酵素阻害作用及びジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害作用の両方を併せ持つ、すなわち血糖低下作用及び血圧降下作用の２つの効能を併せ持つ非常に有益な化合物と言える（特許文献２）。
また、トリペプチドＭＫＰは、高血圧及び／又は高血糖等のこれら疾患の予備軍にも有益であると考える。
トリペプチドＭＫＰは、アミロイド・ベータ蛋白質に起因する脳機能障害を改善する作用を有するので、アルツハイマー型認知症等のアミロイド・ベータ蛋白質に起因する脳機能障害に対する予防剤又は治療剤として、使用することもできる（特許文献３）。
【００８０】
よって、本技術のトリペプチドＭＫＰ高含有のカゼイン酵素処理物及びトリペプチドＭＫＰ含有の各分離・精製画分は、アンジオテンシン変換酵素阻害用食品組成物、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害用食品組成物、アミロイド・ベータ蛋白質に起因する脳機能障害改善用食品組成物等として使用することができ、又は、これら食品組成物に含有させて使用することも可能である。
また、本技術のトリペプチドＭＫＰ高含有のカゼイン酵素処理物及びトリペプチドＭＫＰ含有の各分離・精製画分は、効能が期待できる各種疾患（予備軍含む）に対する予防法、改善法又は治療法のために使用することができ、又はこれら各種疾患に対する予防等のための成分として使用することができ、又はこれら各種疾患に対する予防等のための薬や食品の含有成分として使用することができ、又はこれら各種疾患に対する薬や食品等を製造するために使用することも可能である。
【００８１】
このように、本技術は、医薬品、食品、食品用組成物、皮膚外用剤及び機能性食品等の幅広い分野に利用することが可能である。
【００８２】
また、本技術は、以下の構成を採用することも可能である。
【００８３】
〔１〕  原料であるカゼインに対してプロリン特異的エンドプロテアーゼ０．１〜３Ｕ／ｇ濃度を用いることを特徴とする、Met−Lys−Proからなるトリペプチドを含むカゼイン酵素処理物を製造する方法。
〔２〕  前記プロリン特異的エンドプロテアーゼの使用量が、０．４〜２Ｕ／ｇ濃度である、前記〔１〕記載のカゼイン酵素処理物を製造する方法。
〔３〕  ＭＫＰモル収率が少なくとも７０％である、前記〔１〕又は〔２〕記載のカゼイン酵素処理物を製造する方法。
〔４〕  反応ｐＨが、中性領域である、〔１〕〜〔３〕の何れか１つ記載のカゼイン酵素処理物を製造する方法。
〔５〕  反応時間が、４〜１５時間である、〔１〕〜〔４〕の何れか１つ記載のカゼイン酵素処理物を製造する方法。前記反応時間は、好ましくは６〜１５時間、より好ましくは９〜１５時間である。
〔６〕  〔１〕〜〔５〕の何れか１つ記載のカゼイン酵素処理物の製造方法を行った後に、当該カゼイン酵素処理物から、未分解カゼイン画分又は分子量１，０００Ｄａ超の画分を除去し、Met−Lys−Proからなるトリペプチドを含む分子量１，０００Ｄａ以下の画分を得る方法。
〔７〕  Met−Lys−ProからなるトリペプチドＭＫＰ含有量（ｍｇ／カゼイン酵素処理物１ｇ）が、０．９〜１．３ｍｇ／処理物１ｇであるカゼイン酵素処理物。
〔８〕  Met−Lys−ProからなるトリペプチドＭＫＰ含有量（ｍｇ／分子量１，０００Ｄａ以下の画分１ｇ）が、３ｍｇ／画分１ｇ以上である、〔７〕記載のカゼイン酵素処理物。
〔９〕  未分解カゼインを含む、〔７〕又は〔８〕記載のカゼイン酵素処理物。
〔１０〕  〔７〕〜〔９〕の何れか１つ記載のカゼイン酵素処理物から得られたMet−Lys−Proからなるトリペプチドを含む分子量１，０００Ｄａ以下の画分。
【実施例】
【００８４】
以下、実施例に基づいて本技術をさらに詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本技術の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
【００８５】
本技術において用いる測定方法を以下に示す。また、本実施例において、以下の測定方法を行い、各測定結果を得た。
（１）分解率の測定
試料粉末を１０％ｗ／ｗの濃度で脱イオン水に溶解し、溶解液８ｍＬに脱イオン水３０ｍＬを加え、スターラーで撹拌しながら、ｐＨメーターを用いて０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液あるいは０．１Ｍ塩酸溶液を滴下して、ｐＨを６．８０に調整する。これに、ｐＨ８．０に調整した３７％ホルマリン溶液５ｍＬを加えた後、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で滴定し、ｐＨ７．９０とした。（ｘｍＬ）それと同時に、糖度計を用いて、ペプチド溶液のＢｒｉｘ値（２５℃）を測定する。（ｚ％）
上記測定値をもとに、下記計算式より、ペプチドの分解率を数値化する。
分解率（％）＝ホルモール態窒素量÷全窒素量×１００
ホルモール態窒素量（ｍｇＮ／ｄｌ）＝１．４×ｘ×ｆ（水酸化ナトリウムの力価）×１００／８
全窒素量（ｍｇＮ／ｄｌ）＝ｚ×０．７×１０００／６．３８
【００８６】
（２）トリペプチドＭＫＰ含有量の測定
試料粉末を、１．０ｍｇ／ｍＬとなるように、０．２％ギ酸水溶液に希釈溶解し、１０分間超音波破砕したのち、０．２２μｍ口径のＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）でろ過して粉末溶液を調製する。これら調整サンプルに、Ｃ１３ラベルした化学合成内部標準ペプチド（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を０．５μｇ／ｍＬの濃度で添加し、下記測定条件によるＬＣ／ＭＳ分析を実施する。一方、トリペプチドＭＫＰの化学合成標準ペプチド（ペプチド研究所社製）の溶解液を０．２、０．６、１．０μｇ／ｍＬの濃度で作成する。これらにＣ１３ラベルした化学合成内部標準ペプチドを０．５μｇ／ｍＬの濃度で添加し、下記測定条件によるＬＣ／ＭＳ分析を実施し、検量線を作成する。前記粉末溶液の分析におけるピークのうち、標準ペプチドと分子量及びリテンションタイムが一致するものを、標準ペプチドと同一の配列として同定する。標準ペプチドのピークとピーク面積を対比することにより、前記粉末溶液中にトリペプチドＭＫＰの含有量を求める。
【００８７】
（３）ＬＣ／ＭＳ
＜ＬＣ／ＭＳ使用機器＞
質量分析計：ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）。
高速液体クロマトグラフ構成：システムコントローラー：ＣＢＭ−２０Ａ、オートインジェクター：ＳＩＬ−２０ＡＣ、送液ポンプ：ＬＣ−２０ＡＤ×２、カラムオーブン：ＣＴＯ−２０ＡＣ、ＵＶ／ＶＩＳ検出器：ＳＰＤ−２０Ａ、オンラインデガッサ：ＤＧＵ−２０Ａ５  （以上、島津製作所社製）、カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−１００Ｖ  ５μｍ（２．０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ  Ｌ）（東ソー社製）。
【００８８】
＜ＬＣ／ＭＳ測定条件＞
移動相Ａ：０．２重量％  ギ酸−水溶液
移動相Ｂ：０．２重量％  ギ酸−アセトニトリル溶液
タイムプログラム：２％Ｂ（０．０分）−２５％Ｂ（５．０分）−６５％Ｂ（５．１分）−６５％Ｂ（１０分）−８５％Ｂ（１０．１分）−８５％Ｂ（１３．０％）−２％Ｂ（１３．１分）−ＳＴＯＰ（３０．０分）。
試料注入量：１０μＬ、
カラム温度：４０℃、
イオン化モード：ＥＳＩ（＋）、
液体流量：２００μＬ／ｍｉｎ、
スプレー電圧：＋４．５ｋＶ、
キャピラリー温度：３２０℃、
シースガス圧：３０Ａｒｂ、
補助ガス圧：４Ａｒｂ、
分析モード：ＳＲＭ測定、
Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｍａｓｓ：ｍ／ｚ＝２６０．１０（Ｐａｒｅｎｔ  ｍ／ｚ  ＝  ３７５．２１）、
（Ｃ１３内部標準  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｍａｓｓ：ｍ／ｚ＝２６０．１０（Ｐａｒｅｎｔ  ｍ／ｚ＝３８１．２２））
【００８９】
（４）ＭＫＰモル収率（％）
ＭＫＰモル収率（％）＝（ペプチドＭＫＰ測定値／ペプチドＭＫＰ論理値）×１００
〔ペプチドＭＫＰ測定値〕は、上記（３）「ＬＣ／ＭＳ」にて、試料中のペプチドＭＫＰの測定を行った値である。
〔ペプチドＭＫＰ理論値〕＝〔カゼイン酵素処理物１０００ｍｇあたり〕×〔酵素処理物中のカゼインタンパク含量（８６．９ｇ／１００ｇ）〕×〔カゼインタンパク中のαｓ２−カゼイン含量（１０ｇ／１００ｇ）〕×〔αｓ２−カゼイン中のペプチドＭＫＰの質量比（３７５：２５２００）〕
＝１０００×０．８６９×０．１×３７５÷２５２００
＝１．２９３  ｍｇ／ｇ
【００９０】
（５）ＭＫＰ含有量（ｍｇ／カゼイン酵素処理物１ｇ）
ＭＫＰ含有量（ｍｇ／カゼイン酵素処理物１ｇ）＝〔得られたカゼイン酵素処理物中のトリペプチドＭＫＰ測定値（ｍｇ）〕／〔得られたカゼイン酵素分解物の質量（ｇ）〕
〔得られたカゼイン酵素処理物中のトリペプチドＭＫＰ測定値（ｍｇ）〕は、上記（３）「ＬＣ／ＭＳ」による、試料中のトリペプチドＭＫＰの測定値である。
【００９１】
（６）ＭＫＰ含有量（ｍｇ／分子量１，０００Ｄａ以下の画分１ｇ）
ＭＫＰ含有量（ｍｇ／分子量１，０００Ｄａ以下の画分１ｇ）＝〔得られたカゼイン酵素処理物中のトリペプチドＭＫＰ測定値（ｍｇ）〕／〔得られたカゼイン酵素処理物（ｇ）×分子量１，０００Ｄａ以下の画分割合〕
〔分子量１，０００Ｄａ以下の画分割合〕＝〔分子量分布における分子量１，０００Ｄａ以下の画分エリア〕／〔分子量分布におけるカゼイン酵素処理物の全エリア〕
〔得られたカゼイン酵素処理物中のトリペプチドＭＫＰ測定値（ｍｇ）〕は、上記（３）「ＬＣ／ＭＳ」による、試料中のトリペプチドＭＫＰの測定値（ｍｇ）である。
分子量分布は、下記「（７）分子量分布の測定」により、求める。
【００９２】
（７）分子量分布の測定
高速液体クロマトグラフィーにより分子量分布を測定する（宇井信生ら編、「タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー」、化学増刊第１０２号、第２４１頁、株式会社化学同人、１９８４年）。
具体的には、ポリハイドロキシエチル・アスパルタミド・カラム［Ｐｏｌｙ  Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  Ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ  Ｃｏｌｕｍｎ：ポリ・エル・シー（Ｐｏｌｙ  ＬＣ社製）。直径４．６ｍｍ及び長さ２２０ｍｍ］を用い、２０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭギ酸により溶出速度０．５ｍＬ／ｍｉｎで溶出する。
検出はＵＶ検出器（島津製作所社製）を用い、データ解析はＧＰＣ分析システム（島津製作所社製）を使用する。
〔各分子量範囲の割合（％）〕＝〔分子量分布における各分子量範囲の面積／分子量分布におけるカゼイン酵素処理物の全面積（全エリア）〕
【００９３】
（８）苦味の測定
試料粉末を５％ｗ／ｗの濃度で常温の脱イオン水に溶解し、６名の風味パネラーによる苦味の官能評価を実施する。苦味強度の評価は下記基準で数値化し、平均値を算出する。
・数値１：苦みを感じない（水と同等）
・数値２：わずかに苦味を感じる（０．０５％カフェイン水溶液と同等）
・数値３：苦味を感じる  （０．１０％カフェイン水溶液と同等）
・数値４：苦みをやや強く感じる（０．１５％カフェイン水溶液と同等）
・数値５：苦味をかなり強く感じる（０．２０％カフェイン水溶液と同等）
【００９４】
（９）乳化性の測定
試料粉末を１％ｗ／ｗの濃度で脱イオン水に溶解し、この１．４ｍＬに０．６ｍＬの大豆油を加え、超音波発生器で２０ＫＨｚ、４０Ｗ、１分間乳化を行ってエマルジョンを調整する。
調整したエマルジョンに、脱イオン水８ｍＬを加え、総量を１０ｍＬとした。これを０．１ｍＬとり、さらに１０ｍＬの０．１％ＳＤＳ水溶液に混合し、分光光度計にてＯＤ５００を測定する。濁度の値が高いものほど、高い乳化性を示す。（日本食品工業学会誌第２７巻第１２号，１９８０年１２月，「超音波処理と濁度による大豆蛋白質乳化性の微量測定法」に記載の方法に従う）
【００９５】
〔実施例１：本発明品１：プロリン特異的エンドプロテアーゼの単独分解〕
牛乳由来の乳酸カゼイン（フォンテラ社製）１０ｇに、約６０℃に調整した蒸留水９０ｇを加えて充分に撹拌した後、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ６．２〜７とし、基質溶液を調製した。得られた基質溶液に、プロリン特異的プロテアーゼ（ＤＳＭ社製）を、カゼインに対して０．３〜２Ｕ／ｇ濃度（０．３、０．４、０．５、１．０、２．０[Ｕ／ｇ]）で添加し、５５℃で１５時間インキュベートした。次いで８５℃で１０分間加熱して酵素を失活させたのち、得られた酵素処理物溶液を凍結乾燥し、粉末化した。
各粉末中のＭＫＰ含有量をＬＣ／ＭＳで測定した。その結果を表１に示す。
【００９６】
【表１】
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【００９７】
〔比較例１：比較品１：プロリン特異的エンドプロテアーゼとセリンエンドプロテアーゼの併用分解〕
牛乳由来の乳酸カゼイン（フォンテラ社製）１０ｇに、約６０℃に調整した蒸留水９０ｇを加えて充分に撹拌した後、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ９．０とし、基質溶液を調製した。得られた基質溶液に、セリンエンドプロテアーゼ（天野エンザイム社製）を、カゼインに対して１，５００Ｕ／ｇ濃度で添加し、直後に、プロリン特異的プロテアーゼ（ＤＳＭ社製）を、カゼインに対して０．５Ｕ／ｇ濃度で添加し、５５℃で１５時間インキュベートした。次いで８５℃で１０分間加熱して酵素を失活させたのち、得られた酵素処理物溶液を凍結乾燥し、粉末化した。
【００９８】
〔比較例２：比較品２：セリンエンドプロテアーゼの分解〕
牛乳由来の乳酸カゼイン（フォンテラ社製）１０ｇに、約６０℃に調整した蒸留水９０ｇを加えて充分に撹拌した後、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ９．０とし、基質溶液を調製した。得られた基質溶液に、セリンエンドプロテアーゼ（天野エンザイム社製）を、カゼインに対して１，５００Ｕ／ｇ濃度で添加し、５５℃で１５時間インキュベートした。次いで８５℃で１０分間加熱して酵素を失活させたのち、得られた酵素処理物溶液を凍結乾燥し、粉末化した。
【００９９】
各粉末中の分解率、トリペプチドＭＫＰ含有量、ＭＫＰモル収率、苦味、及び乳化性の評価結果を表２に示す。
また、各粉末の分子量分布を表３に示す。
【０１００】
【表２】
2018057346.tif 000003
【０１０１】
【表３】
2018057346.tif 000004
【０１０２】
本発明品１は、比較品１及び比較品２と比べると、必要最小限にしか分解が進んでいないにもかかわらず、ＭＫＰモル収率がほぼ１００％に近く、一方、酵素併用した比較品１は、ＭＫＰモル収率が１００％に近いであろうと考えていたが、却ってトリペプチドＭＫＰ含有量が低くなっている。
さらに、本発明品１は、良好な風味と乳化性をもたらす高分子画分がより多く残っていることがわかる。本発明品１中に存在するカゼインは、分子量分布からすると、未分解かほとんど分解されておらず、また易水溶性と考える。
さらに、本発明品１は、分子量分布からすると、分子量１０，０００Ｄａ超の高分子画分約６０％となっているため、高分子画分を除去しやすく、分子量１，０００Ｄａ以下の低分子画分を回収しやすい。そして、本発明品１では、比較品１及び２と比較しても、分子量１，０００Ｄａ以下の低分子画分中のトリペプチドＭＫＰの含有量も４倍以上高い。一方の比較品１は、分子量分布からすると、分子量１，０００Ｄａ以下の低分子画分約８０％であり、数多のペプチドが雑多に混在するため、この中からトリペプチドＭＫＰを回収しにくく、さらに高濃度にすることも難しい。
【０１０３】
このように、プロリン特異的エンドプロテアーゼ単独使用によって、トリペプチドＭＫＰが高含有のカゼイン酵素処理物を簡単に得ることができ、さらにトリペプチドＭＫＰを高含有にすることも容易である。
また、得られたカゼイン酵素処理物は、苦味がないか少ない、かつ乳化性が高いため、食品（例えば、機能性食品等）等として使用することもでき、さらに食品添加剤（例えば、風味向上剤、乳化剤等）として使用することもできる。
【０１０４】
また、本発明品１を含む水溶液を調整し、この溶液のｐＨを４．５に調整して酸沈殿を行い、遠心分離にて、酸沈殿物と上清とに分け、上清を回収した。この上清には、トリペプチドＭＫＰは水溶性であるため、トリペプチドＭＫＰが存在する。上清に含まれるトリペプチドＭＫＰの実測値は、７．１６ｍｇ／上清の固形分１ｇであった。酸沈殿物には、酸沈殿したタンパク質及びポリペプチドが存在する。
【配列表】
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