(57)【要約】【課題】チロソールを効率的に生産可能な微生物を提供する。【解決手段】アミノトランスフェラーゼの活性が強化された微生物、およびこれを用いたチロソールの製造方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノトランスフェラーゼの活性が強化された微生物。
【請求項２】
アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を染色体上に含む、
請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
アミノトランスフェラーゼが配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
請求項１または２に記載の微生物。
【請求項４】
アミノトランスフェラーゼが配列番号１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
請求項１または２に記載の微生物。
【請求項５】
細菌または酵母である、
請求項１〜４のいずれかに記載の微生物。
【請求項６】
さらに、アミノ酸トランスポーター、ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ、またはアルデヒドリダクターゼの活性が強化された、
請求項１〜５のいずれかに記載の微生物。
【請求項７】
さらに、フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性が抑制された、請求項１〜６のいずれかに記載の微生物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の微生物をチロシンを含む培地で培養する工程を含む、チロソールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノトランスフェラーゼの活性が強化された微生物、およびチロソールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チロソールはポリフェノールの一種であり、抗酸化活性や、メラニンの生成を抑制する活性を有することが知られている。チロソールはオリーブオイルに多く含まれるため、オリーブオイルからチロソールを回収することが可能である。より効率的な生産方法として、微生物によるチロソールの生産方法の開発も進められている。
【０００３】
非特許文献１は、微生物細胞内においてチアミンを経由する生合成経路によりチロソールを生産する方法を記載している。
【０００４】
非特許文献２は、ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼおよびアルデヒドリダクターゼの活性が強化された微生物の細胞内において、ヒドロキシフェニルピルビン酸、およびヒドロキシフェニルアルデヒドを経由する生合成経路によりチロソールを生産する方法を記載している。特許文献１は、ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼの活性が強化された微生物の細胞内において、非特許文献２と同様の生合成経路によりチロソールを生産する方法を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】中国特許出願公開第１０４０９９３７９号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２０１２，６０（４），ｐｐ９７９−９８４
【非特許文献２】Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１２  Ｓｅｐ；７８（１７），ｐｐ６２０３−１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の、微生物によるチロソールの生産方法では、生産効率が充分とはいえず、生産速度も遅いものであった。本発明は、微生物により効率的にチロソールを生産することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、アミノトランスフェラーゼの活性が強化された微生物をチロシンを含む培地で培養すると、チロソールを効率的に生産できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明はアミノトランスフェラーゼの活性が強化された微生物に関する。
【００１０】
前記微生物は、アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を染色体上に含むことが好ましい。
【００１１】
前記アミノトランスフェラーゼが配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００１２】
前記アミノトランスフェラーゼが配列番号１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００１３】
前記微生物が細菌または酵母であることが好ましい。
【００１４】
前記微生物は、さらに、アミノ酸トランスポーター、ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ、またはアルデヒドリダクターゼの活性が強化されていることが好ましい。
【００１５】
前記微生物は、さらに、フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性が抑制されたものであることが好ましい。
【００１６】
また、本発明は、前記微生物をチロシンを含む培地で培養する工程を含む、チロソールの製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の微生物は、アミノトランスフェラーゼの活性が強化されることにより、細胞内におけるチロシンからの４−ヒドロキシフェニルピルビン酸の生合成が強化され、チロソールの効率的な生産を実現する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の微生物における、チロシンからチロソールに至る生合成経路を示す。
【図２】実施例１のＰＡＲ−２５４株の培養液におけるチロシンの濃度の経時変化を示す。
【図３】実施例１のＰＡＲ−２５４株の培養液におけるチロソールの濃度の経時変化を示す。
【図４】実施例１のＰＡＲ−２５４株の培養液における２−フェニルエタノールの濃度の経時変化を示す。
【図５】実施例１のＰＡＲ−２５５株の培養液におけるチロシンの濃度の経時変化を示す。
【図６】実施例１のＰＡＲ−２５５株の培養液におけるチロソールの濃度の経時変化を示す。
【図７】実施例１のＰＡＲ−２５５株の培養液における２−フェニルエタノールの濃度の経時変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、アミノトランスフェラーゼの活性が強化された微生物に関する。微生物としては細菌、酵母が挙げられる。細菌としてはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、などのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｅやＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓやＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓなどのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓなどのＴｈｅｒｍｕｓ属などが挙げられる。酵母としてはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅなどのＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属が挙げられる。この中でも細菌が好ましく、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属がより好ましく、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）がさらに好ましい。
【００２０】
アミノトランスフェラーゼは、アミノ酸とα−ケト酸の間でアミノ基を転移する活性を有する酵素である。アミノトランスフェラーゼとしては、チロシンからアミノ基を脱離させ４−ヒドロキシフェニルピルビン酸を生成する活性を有するものが好ましい。チロシンから４−ヒドロキシフェニルピルビン酸を生成する活性が強化されることにより、チロソールを効率的に生産することができる。
【００２１】
アミノトランスフェラーゼの由来生物としてはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉやＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓなどの細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅなどの酵母が挙げられる。この中でも、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉやＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓなどの細菌に由来するアミノトランスフェラーゼが好ましい。
【００２２】
前記アミノトランスフェラーゼは、アミノ酸とα−ケト酸の間でアミノ基を転移する活性を有する限りその構造は特に限定されないが、配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。配列番号１に記載のアミノ酸配列との配列同一性は、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらにより好ましく、９７％以上が特に好ましい。アミノ酸配列の配列同一性は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と、評価対象のアミノ酸配列とを比較し、アミノ酸が一致した位置の数を総アミノ酸数で除して１００を乗じた値で表される。
【００２３】
また、前記アミノトランスフェラーゼは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加したアミノ酸配列からなり、アミノトランスフェラーゼ活性を有するものであることが好ましい。欠失、挿入、置換および／または付加されるアミノ酸の個数は、８０個以下であることが好ましく、６０個以下であることがより好ましく、４０個以下であることがさらに好ましく、２０個以下であることがさらにより好ましく、１０個以下であることが特に好ましい。
【００２４】
アミノトランスフェラーゼは、配列番号２に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子によりコードされるものであることが好ましい。この遺伝子の、配列番号２に記載の塩基配列との配列同一性は、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらにより好ましく、９７％以上が特に好ましい。塩基配列の配列同一性は、アミノ酸の配列同一性と同様に算出できる。なお、配列番号２に記載の塩基配列は大腸菌のｔｙｒＢ遺伝子のコード領域である。
【００２５】
また、アミノトランスフェラーゼは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。また、アミノトランスフェラーゼは、配列表の配列番号１１に示すアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加したアミノ酸配列からなり、アミノトランスフェラーゼ活性を有するものであることが好ましい。また、アミノトランスフェラーゼは、配列番号１２に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子によりコードされるものであることが好ましい。ここで、配列同一性、および欠失、挿入、置換および／または付加されるアミノ酸の個数は、配列番号１〜２についての前記の内容と同様である。なお、配列番号１２に記載の塩基配列は大腸菌のａｓｐＣ遺伝子のコード領域である。
【００２６】
アミノトランスフェラーゼの活性の強化は、アミノトランスフェラーゼの発現量の向上や、活性を強化する変異の導入により実現される。アミノトランスフェラーゼの発現量の向上は、アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の導入や高発現プロモーターの導入により実現される。
【００２７】
微生物にアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を微生物に導入する場合、導入された遺伝子は染色体外のプラスミド上に保持されていてもよく、染色体上に導入されていてもよい。染色体上に導入する場合、その方法としては、一般的な相同組換え（部位特異的組換え、部位非特異的組換え）、ファージによる遺伝子導入が挙げられる。大腸菌において相同組換えを行う場合には、Ｒｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅやＣｒｅ−ｌｏｘＰを用いた相同組換えを行うことが可能である。アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子をプラスミドに挿入し、そのプラスミドを微生物に導入する場合、プラスミドは特に限定されず、微生物において遺伝子を発現させられるものであればよい。
【００２８】
微生物の染色体上にアミノトランスフェラーゼ遺伝子を導入する場合には、染色体上の特定の遺伝子中のプロモーターやＯＲＦに導入することにより、その遺伝子の活性を抑制し、または失わせることも可能である。活性を抑制し、または失わせる遺伝子としては、フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子などが挙げられる。なお、大腸菌では、フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子としてはｆｅａＢ遺伝子が好ましく、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としてはｌｄｈＡ遺伝子が好ましく、コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としてはｔｙｒＡ遺伝子が好ましく、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子としてはａｄｈＥ遺伝子が好ましい。また、これらの遺伝子の活性を抑制し、または失わせる方法としては、そのプロモーターやＯＲＦに、アミノトランスフェラーゼ遺伝子以外の塩基配列を導入する方法も挙げられる。
【００２９】
また、フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、配列番号１０に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドから４−ヒドロキシフェニル酢酸を生成する酵素をコードするものが好ましい。この遺伝子の、配列番号１０に記載の塩基配列との配列同一性は、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらにより好ましく、９７％以上が特に好ましい。なお、配列番号１０に記載の塩基配列は大腸菌のｆｅａＢ遺伝子のコード領域である。
【００３０】
また、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、配列番号１４に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、アセトアルデヒドからエタノールを生成する酵素をコードするものが好ましい。この遺伝子の、配列番号１４に記載の塩基配列との配列同一性は、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらにより好ましく、９７％以上が特に好ましい。なお、配列番号１４に記載の塩基配列は大腸菌のａｄｈＥ遺伝子のコード領域である。
【００３１】
本発明の微生物は、アミノトランスフェラーゼの活性が強化されていることに加えて、アミノ酸トランスポーター、ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ、またはアルデヒドリダクターゼの活性が強化されていることが好ましい。これらの活性の強化方法としては、アミノトランスフェラーゼの活性の強化と同じ方法を用いることができる。
【００３２】
アミノ酸トランスポーターは、配列番号７に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、細胞壁を通してアミノ酸、特にチロシンを細胞内に運搬する活性を有するものであることが好ましい。配列番号７に記載のアミノ酸配列との配列同一性は、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらにより好ましく、９７％以上が特に好ましい。
【００３３】
また、アミノ酸トランスポーターは、配列番号８に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子によりコードされるものであることが好ましい。この遺伝子の、配列番号８に記載の塩基配列との配列同一性は、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらにより好ましく、９７％以上が特に好ましい。なお、配列番号８に記載の塩基配列は大腸菌のａｒｏＰ遺伝子のコード領域である。
【００３４】
ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼは、配列番号３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒドロキシフェニルピルビン酸に対する脱炭酸活性を有するものであることが好ましい。配列番号３に記載のアミノ酸配列との配列同一性は、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらにより好ましく、９７％以上が特に好ましい。
【００３５】
また、ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼは、配列番号４に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子によりコードされるものであることが好ましい。この遺伝子の、配列番号４に記載の塩基配列との配列同一性は、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらにより好ましく、９７％以上が特に好ましい。なお、配列番号４に記載の塩基配列は大腸菌Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅのｉｐｄＣ遺伝子のコード領域である。
【００３６】
また、ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼは、配列番号１６に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子によりコードされるものであることが好ましい。ここで、配列同一性は、配列番号４についての前記の内容と同様である。なお、配列番号１６に記載の塩基配列は酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＲＯ１０遺伝子のコード領域である。
【００３７】
アルデヒドリダクターゼは、配列番号５に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、芳香族アルデヒド、特にヒドロキシフェニルアセトアルデヒドに対する活性を有するものであることが好ましい。配列番号５に記載のアミノ酸配列との配列同一性は、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらにより好ましく、９７％以上が特に好ましい。
【００３８】
また、アルデヒドリダクターゼは、配列番号６に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子によりコードされるものであることが好ましい。この遺伝子の、配列番号６に記載の塩基配列との配列同一性は、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらにより好ましく、９７％以上が特に好ましい。なお、配列番号６に記載の塩基配列は大腸菌のｙａｈＫ遺伝子のコード領域である。
【００３９】
上記微生物を、チロシンを含む培地で培養することにより、チロソールを製造することができる。培地中のチロシンの濃度は、０．００４５〜４．５重量％が好ましく、０．００４５〜０．４５重量％がより好ましく、０．００４５〜０．０４５重量％がさらに好ましい。
【００４０】
微生物の増殖初期から、チロシンを含む培地で培養することにより、微生物の増殖とチロソールの製造を並行して行うことができる。また、高濃度のチロシンは微生物の増殖を抑制するおそれがあるので、微生物をチロシンを含まない培地で一定期間増殖させた後、チロシンを含む培地で培養してチロソールを製造することもできる。また、チロシンは水への溶解度が低いので、培地に継続的に添加しながらチロソールを製造することもできる。
【００４１】
微生物の培養のための培地は、チロシンに加えて、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有する培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いることもできる。
【００４２】
炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、キシロース、スクロース、ラフィノース、アラビノース、デンプン、糖蜜、廃糖蜜等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール、グリセロール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物が挙げられる。その他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等が挙げられる。このような成分を含む具体的な培地として、ＬＢ培地、Ｍ９培地、ＳＯＣ培地、ＹＭ培地や、これらの改変型培地が挙げられる。
【００４３】
微生物の培養時の温度は、２５〜４６℃が好ましく、２７〜３７℃がより好ましく、３０〜３７℃がさらに好ましく、３４〜３７℃がさらにより好ましい。２５℃未満では生育や生産速度が遅くなる傾向があり、４６℃を超えると生育や生産が困難となる傾向がある。微生物の培養は、通常、８〜１２０時間の範囲で行うことができる。
【００４４】
微生物の培養時の培地のｐＨは、ｐＨ５〜８が好ましく、ｐＨ６〜７．５がより好ましく、ｐＨ６．５〜７．２がさらに好ましい。ｐＨ５未満では生育や生産が困難となる傾向があり、ｐＨ８を超えると生育や生産速度が遅くなる傾向がある。培地のｐＨは、無機酸、有機酸、アルカリ溶液などを添加することにより調整できる。
【００４５】
試験管やフラスコを用いて培養する場合、微生物の培養時の培地の振とう速度は、２０〜３００ｒｐｍが好ましく、５０〜２８０ｒｐｍがより好ましく、１００〜２５０ｒｐｍがさらに好ましい。２０ｒｐｍ未満では酸素が不足して有機酸が蓄積する傾向がある。
【００４６】
微生物により製造されたチロソールは、培地中に蓄積する。チロソールは、培地から常法により回収できる。例えば、酢酸エチルなどの有機溶媒を用いて抽出する方法、凍結乾燥による方法、エバポレーターなどにより蒸留する方法、分離膜を用いる方法、またはそれらを併用する方法などが挙げられる。
【００４７】
培地中に蓄積されたチロソールの濃度は常法により測定できる。例えば、培地サンプルをＯＤＳカラムを装着したＨＰＬＣで分析し、チロソールの標品を用いて作成した検量線を用いて培地中のチロソールの濃度を定量する方法（非特許文献２）が挙げられる。培地中に蓄積された４−ヒドロキシフェニル酢酸、２−フェニルエタノール、フェニル酢酸の濃度も、同様の方法で測定できる。
【００４８】
図１に示すように、４−ヒドロキシフェニル酢酸は、４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドからチロソールとは別に生成され得る物質である。アミノトランスフェラーゼの活性の強化により、４−ヒドロキシフェニル酢酸の生産効率も向上し得るが、本発明では４−ヒドロキシフェニル酢酸の生産効率は一定程度に保ちつつ、チロソールの生産効率が改善することが好ましい。
【００４９】
フェニル酢酸は、フェニルアセトアルデヒドがフェニルアルデヒドデヒロドゲナーゼの作用を受けて生成する物質である。フェニルアセトアルデヒドは、培地に含まれるグルコースがフェニルピルビン酸へと変換された後に、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼまたはヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼの作用により生成する。本発明では、培地中に蓄積されるフェニル酢酸の濃度は低い方が好ましい。
【００５０】
２−フェニルエタノールは、フェニルアセトアルデヒドがアルデヒドリダクターゼの作用を受けて生成する物質である。フェニルアセトアルデヒドは、培地に含まれるグルコースがフェニルピルビン酸へと変換された後に、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼまたはヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼの作用により生成する。本発明では、培地中に蓄積される２−フェニルエタノールの濃度は低い方が好ましい。
【実施例】
【００５１】
（製造例１）遺伝子のクローニング
ｉｐｄＣ遺伝子はコドンを大腸菌用に最適化したものをＯｐｔｉｍｕｍ  Ｇｅｎｅ（登録商標）  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．）を用いて全合成した。合成した遺伝子をＮｄｅＩとＸｈｏＩを用いて３７℃で一晩消化したｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴベクターに連結し、ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ｉｐｄＣを得た。
【００５２】
ｙａｈＫ遺伝子は２種類のプライマー（５’−ＣＣＡＡＣＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧ−３’および５’−ＣＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＣＴＧＴＴＡＧＴＧＴＧＣＧ−３’）を用いて大腸菌ＢＷ２５１１３株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩとＸｈｏＩを用いて３７℃で一晩消化し、上記と同様に消化したｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴベクターとライゲーションして、ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ｙａｈＫを得た。
【００５３】
ｔｙｒＢ遺伝子は２種類のプライマー（５’−ＣＡＡＣＡＣＡＴＡＴＧＴＴＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＧＡＣＧＣ−３’および５’−ＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣ−３’）を用いて大腸菌ＢＷ２５１１３株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩとＸｈｏＩを用いて３７℃で一晩消化し、上記と同様に消化したｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴベクターとライゲーションして、ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ｔｙｒＢを得た。
【００５４】
ａｒｏＰ遺伝子は２種類のプライマー（５’−ＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＧＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧ−３’と５’−ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＧＣＧＣＴＴＴＴＡＣＧＧＣＴＴＴＧ−３’）を用いて、大腸菌Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物とＮｄｅＩとＸｈｏＩを用いて３７℃で一晩消化したｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴベクターをＧｉｂｓｏｎ反応により連結し、ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＰを得た。
【００５５】
なお、ＰＣＲ反応の酵素にはＰｈｕｓｉｏｎ  ＨＳ２ポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を用い、プロトコールに従って反応を行った。
【００５６】
（製造例２）アミノトランスフェラーゼ（ｔｙｒＢ）高発現株の作成
カナマイシン耐性遺伝子とＴ７プロモーターおよびＴ７ターミネーターに連結したｔｙｒＢの遺伝子カセット（ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ｔｙｒＢ−ＴＴ７）を増幅するために、ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ｔｙｒＢを鋳型として、２種類のプライマー（５’−ＴＣＧＣＴＧＣＧＴＡＣＡＣＴＧＡＡＡＴＣＡＣＡＣＴＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ−３’と５’−ＴＧＣＣＧＴＴＴＴＴＴＡＣＴＴＡＴＧＡＧＣＧＡＡＣＣＡＧＡＴＴＡＡＴＡＣＣＧＴＡＣＡＣＡＣＡＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧ−３’）を用いて同様にＰＣＲを行った。公知の方法（非特許文献２）に従って、遺伝子カセットを大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）株の染色体ＤＮＡ上のｆｅａＢの座位に導入し、Ｍ−ＡＲＧ−４９（ＭＧ１６５５（ＤＥ３）ｆｅａＢ：：ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ｔｙｒＢ−ＴＴ７）株を得た。
【００５７】
（製造例３）ヒドロキシフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｉｐｄＣ）高発現株の作成
カナマイシン耐性遺伝子とＴ７プロモーターおよびＴ７ターミネーターに連結したｉｐｄＣの遺伝子カセット（ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ｉｐｄＣ−ＴＴ７）を増幅するために、ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ｉｐｄＣを鋳型として、２種類のプライマー（５’−ＴＣＧＧＧＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＧＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＴＡＡＧＡＡＧＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ−３’と５’−ＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＴＴＧＧＡＴＴＡＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧ−３’）を用いてＰＣＲを行った。なお、カセットの増幅にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）を用い、プロトコールに従って反応を行った。増幅したＰＣＲ産物を用いて、Ｒｅｄ相同組換えを用いた公知の方法（非特許文献２）により、遺伝子カセットを大腸菌ＢＷ２５１１３（ＤＥ３）株の染色体ＤＮＡ上のｍｔｌＡの座位に導入し、ＡＲＧ−８４（ＢＷ２５１１３（ＤＥ３）ｍｔｌＡ：：ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ｉｐｄＣ−ＴＴ７）株を得た。
【００５８】
（製造例４）アルデヒドリダクターゼ（ｙａｈＫ）高発現株の作成
カナマイシン耐性遺伝子とＴ７プロモーターおよびＴ７ターミネーターに連結したｙａｈＫの遺伝子カセット（ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ｙａｈＫ−ＴＴ７）を増幅するために、ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ｙａｈＫを鋳型として、２種類のプライマー（５’−ＴＡＴＴＴＴＴＡＧＴＡＧＣＴＴＡＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ−３’と５’−ＣＴＣＣＣＣＴＧＧＡＡＴＧＣＡＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＡＡＧＡＴＴＡＡＡＣＣＡＧＴＴＣＧＴＴＣＧＧＧＣＡＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧ−３’）を用いて同様にＰＣＲを行った。同様の方法で、遺伝子カセットを大腸菌ＢＷ２５１１３（ＤＥ３）株の染色体ＤＮＡ上のｌｄｈＡの座位に導入し、ＡＲＧ−１２１（ＢＷ２５１１３（ＤＥ３）ｌｄｈＡ：：ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ｙａｈＫ−ＴＴ７）株を得た。
【００５９】
（製造例５）アミノ酸トランスポーター（ａｒｏＰ）高発現株の作成
カナマイシン耐性遺伝子とＴ７プロモーターおよびＴ７ターミネーターに連結したａｒｏＰの遺伝子カセット（ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ａｒｏＰ−ＴＴ７）を増幅するために、ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＰを鋳型として、２種類のプライマー（５’−ＧＡＴＧＡＴＧＴＧＡＡＴＣＡＴＣＣＧＧＣＡＣＴＧＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＧＣＧＡＴＴＧＴＣＡＴＴＣＧＣＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＧ−３’と５’−ＧＡＴＧＡＴＧＴＧＡＡＴＣＡＴＣＣＧＧＣＡＣＴＧＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＧＣＧＡＴＴＧＴＣＡＴＴＣＧＣＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧ−３’）を用いて同様にＰＣＲを行った。同様の方法で、遺伝子カセットを大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）株の染色体ＤＮＡ上のｔｙｒＡの座位に導入し、Ｍ−ＡＲＧ−６０（ＭＧ１６５５（ＤＥ３）ｔｙｒＡ：：ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ａｒｏＰ−ＴＴ７）株を得た。
【００６０】
（製造例６）多重遺伝子高発現株の作成
Ｐ１形質導入法（非特許文献２）を用いて、ｉｐｄＣ遺伝子を大腸菌ＢＷ２５１１３株の染色体に導入した。すなわち、ＢＷ２５１１３（ＤＥ３）のｍｔｌＡ座位にＡＲ−Ｇ８４株のＰ１ライセートを用いてＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ｉｐｄＣ−ＴＴ７カセットを挿入し、酵母フリパーゼをコードするｐＣＰ２０で形質転換してＫｍカセットを削除し、ＰＡＲ−２５２（ＢＷ２５１１３（ＤＥ３）ｍｔｌＡ：：ＰＴ７−ｉｐｄＣ−ＴＴ７）株を得た。
【００６１】
（製造例７）多重遺伝子高発現株の作成
Ｐ１形質導入法により、ＰＡＲ−２５２株のｌｄｈＡ座位にＡＲＧ−１２１株のＰ１ライセートを用いてＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ｙａｈＫ−ＴＴ７カセットを挿入し、酵母フリパーゼをコードするｐＣＰ２０で形質転換してＫｍカセットを削除し、ＰＡＲ−２５３（ｍｔｌＡ：：ＰＴ７−ｉｐｄＣ−ＴＴ７  ｌｄｈＡ：：ＰＴ７−ｙａｈＫ−ＴＴ７）株を得た。
【００６２】
（製造例８）多重遺伝子高発現株の作成
Ｐ１形質導入法により、ＰＡＲ−２５３株のｆｅａＢ座位にＭ−ＡＲＧ−４９株のＰ１ライセートを用いてＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ｔｙｒＢ−ＴＴ７カセットを挿入し、酵母フリパーゼをコードするｐＣＰ２０で形質転換してＫｍカセットを削除し、ＰＡＲ−２５４（ｍｔｌＡ：：ＰＴ７−ｉｐｄＣ−ＴＴ７  ｌｄｈＡ：：ＰＴ７−ｙａｈＫ−ＴＴ７  ｆｅａＢ：：ＰＴ７−ｔｙｒＢ−ＴＴ７）株を得た。なお、この微生物ではフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｆｅａＢ）の活性が失われている。
【００６３】
（製造例９）多重遺伝子高発現株の作成
Ｐ１形質導入法により、ＰＡＲ−２５４株のｔｙｒＡ座位にＭ−ＡＲＧ−６０のＰ１ライセートを用いてＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ａｒｏＰ−ＴＴ７カセットを挿入し、ＰＡＲ−２５５（ｍｔｌＡ：：ＰＴ７−ｉｐｄＣ−ＴＴ７  ｌｄｈＡ：：ＰＴ７−ｙａｈＫ−ＴＴ７  ｆｅａＢ：：ＰＴ７−ｔｙｒＢ−ＴＴ７  ｔｙｒＡ：：ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ａｒｏＰ−ＴＴ７）株を得た。なお、この微生物ではフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｆｅａＢ）の活性が失われている。
【００６４】
（実施例１）チロソールの生産
製造例８〜９の菌株を、ＬＢ培地を用いて２７℃で一晩前培養した。培養液１ｍｌを１．５ｍｌチューブに入れて１００００ｒｐｍで３分間遠心分離することによって菌体を沈殿回収した。回収した菌体を１ｍｌの改変Ｍ９培地に懸濁した。この懸濁液０．５ｍｌを、４．５ｍｌの改変Ｍ９培地に加え、さらに５０μｌの１００μＭ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドを加えて、２７℃で２００ｒｐｍで振とう培養した。振とう培養開始時の培養液の濁度（ＯＤ６６０）の値は０．５程度であった。
【００６５】
２４時間の培養後の、培地中のチロシン、チロソール、４−ヒドロキシフェニル酢酸、フェニル酢酸、２−フェニルエタノールの濃度を測定した。結果を表１に示す。
【００６６】
なお、改変Ｍ９培地は、下記の物質を１Ｌの純水に溶解し、フィルターでろ過除菌することにより作製した。
リン酸水素二ナトリウム  ６ｇ
リン酸二水素カリウム  ３ｇ
塩化ナトリウム  ０．５ｇ
塩化アンモニウム  ４ｇ
グルコース  １０ｇ
チロシン  ３６２ｍｇ
硫酸マグネシウム七水和物  ２４６．５ｍｇ
チアミン塩酸塩  １ｍｇ
硫酸鉄七水和物  ７．５５ｍｇ
塩化カルシウム  １１．１ｍｇ
七モリブデン酸六アンモニウム四水和物  ３７．１μｇ
ホウ酸  ２４７．３μｇ
塩化コバルト六水和物  ７１．４μｇ
硫酸銅五水和物  ２３．９μｇ
塩化マンガン四水和物  １５８．３μｇ
硫酸亜鉛七水和物  ２８．８μｇ
【００６７】
チロシン、チロソール、４−ヒドロキシフェニル酢酸、フェニル酢酸、２−フェニルエタノールは以下の方法で定量した。培養液０．５ｍｌを純水０．５ｍｌと混合し、２００μｌのメタノールと混合したものをＨＰＬＣの試料として用いた。分析機器にはフォトダイオードアレイを装備したＨＰＬＣ（ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ、島津株式会社）にオクタデシルシリカカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ  ｃｏｌｕｍｎ，３．０  ｂｙ  １５０ｍｍ，ナカライテスク株式会社）を取り付けたものを用いた。０．１％トリフルオロ酢酸溶液を溶離液Ａ、０．１％トリフルオロ酢酸に８０％のメタノールを含む溶液を溶離液Ｂとし、０．４ｍｌ／分の流速で２０％溶離液Ｂ（８０％溶離液Ａ）を流し、サンプル注入後は５分間かけて溶離液Ｂの濃度を２０％から１００％に上昇させ、その後８０％溶離液Ｂを１０分間流した。この条件で、チロシンは約３．８分、チロソールは約５．４分、４−ヒドロキシフェニル酢酸は約５．７分、フェニル酢酸は約７．２分、２−フェニルエタノールは約７．３分に溶出した。それぞれの試薬を用いて検量線を作成し、検量線を用いてカラム分離後に溶出したそれぞれの化合物を定量した（ただし、フェニル酢酸はフェニルエタノールの検量線を代用した）。その際に、チロシン、チロソール、４−ヒドロキシフェニル酢酸は２２２ｎｍ、フェニル酢酸と２−フェニルエタノールは２０６ｎｍの波長を用いて検出した。
【００６８】
培養液濁度は分光光度計（ＵＶ−１６０Ａ、島津株式会社）を用いて培養液の濁度をＯＤ６６０の値により測定して求め、各菌株の生育の指標とした。
【００６９】
（比較例１）チロソールの生産
製造例８〜９の菌株に代えて菌株を用いない（Ｂｌａｎｋ）、または親株であるＭＧ１６５５（ＤＥ３）を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行った。２４時間の培養後の、培地中のチロシン、チロソール、４−ヒドロキシフェニル酢酸、フェニル酢酸、２−フェニルエタノールの濃度を測定した。結果を表１に示す。
【００７０】
（比較例２）チロソールの生産
製造例８〜９の菌株に代えて製造例６〜７の菌株を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行った。２４時間の培養後の、培地中のチロシン、チロソール、４−ヒドロキシフェニル酢酸、フェニル酢酸、２−フェニルエタノールの濃度を測定した。結果を表１に示す。
【００７１】
【表１】
2018166473.tif 000002
【００７２】
（実施例２）チロソールの生産
製造例８〜９の菌株を用いてチロソールの生産を行った。培養条件は、２７℃、３０℃、３４℃、または３７℃の温度で培養した以外は実施例１に記載の条件を用いた。０時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間の培養後の、培地中のチロシン、チロソール、２−フェニルエタノールの濃度を測定した。製造例８の菌株を用いたときの測定結果を図２〜４に示し、製造例９の菌株を用いたときの測定結果を図５〜７に示す。
【００７３】
（製造例１０）遺伝子高発現株の作成
Ｐ１形質導入法（非特許文献２）を用いて、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＲＯ１０遺伝子を大腸菌ＢＷ２５１１３株の染色体に導入した。ＡＲＯ１０遺伝子を染色体上に含む菌株の作製法は下記の通りである。
【００７４】
ＡＲＯ１０遺伝子を含むプラスミドの作製：ＡＲＯ１０遺伝子は２種類のプライマー（５’−ＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＡＣＣＴＧＴＴＡＣＡＡＴＴＧＡＡＡＡＧ−３’および５’−ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＣＴＴＴＴＡＡＧＴＧＣＣＧＣ−３’）を用いて、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物と、ＮｄｅＩとＸｈｏＩで一晩消化したｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴベクターとをＧｉｂｓｏｎ試薬を用いて連結し、ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ＡＲＯ１０を得た。
【００７５】
ＡＲＯ１０遺伝子を染色体上に含む菌株の作製：カナマイシン耐性遺伝子とＴ７プロモーターおよびＴ７ターミネーターに連結したＡＲＯ１０の遺伝子カセット（ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ＡＲＯ１０−ＴＴ７）を増幅するために、ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ＡＲＯ１０を鋳型として、２種類のプライマー（５’−ＴＣＧＧＧＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＧＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＴＡＡＧＡＡＧＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ−３’と５’−ＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＴＴＧＧＡＴＴＡＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧ−３’）を用いてＰＣＲを行った。なお、カセットの増幅にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）を用い、プロトコールに従って反応を行った。増幅したＰＣＲ産物を用いて、Ｒｅｄ相同組換えを用いた方法（非特許文献２）により、遺伝子カセットを大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）株の染色体ＤＮＡ上のｍｔｌＡの座位に導入し、Ｍ−ＡＲＧ−７０（ＭＧ１６５５（ＤＥ３）ｍｔｌＡ：：ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ＡＲＯ１０−ＴＴ７）株を得た。Ｐ１形質導入法により、ＢＷ２５１１３（ＤＥ３）株のｍｔｌＡ座位にＭ−ＡＲＧ−７０株のＰ１ライセートを用いてＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ＡＲＯ１０−ＴＴ７カセットを挿入し、ＰＡＲ−２５６（ＢＷ２５１１３（ＤＥ３）ｍｔｌＡ：：ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ＡＲＯ１０−ＴＴ７）株を得た。
【００７６】
（製造例１１）多重遺伝子高発現株の作成
Ｐ１形質導入法により、ＡＲＧ−７０株のＰ１ライセートを用いて、ＰＡＲ−２５３株のｍｔｌＡ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ＡＲＯ１０−ＴＴ７カセットを挿入し、ＰＡＲ−２５７（ｍｔｌＡ：：ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ＡＲＯ１０−ＴＴ７  ｌｄｈＡ：：ＰＴ７−ｙａｈＫ−ＴＴ７）株を得た。
【００７７】
（製造例１２）多重遺伝子高発現株の作成
Ｐ１形質導入法により、Ｍ−ＡＲＧ−７０株のＰ１ライセートを用いて、ＰＡＲ−２５４株のｍｔｌＡ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ＡＲＯ１０−ＴＴ７カセットを挿入し、ＰＡＲ−２５８（ｍｔｌＡ：：ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ＡＲＯ１０−ＴＴ７  ｌｄｈＡ：：ＰＴ７−ｙａｈＫ−ＴＴ７  ｆｅａＢ：：ＰＴ７−ｔｙｒＢ−ＴＴ７）株を得た。なお、この微生物ではフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｆｅａＢ）の活性が失われている。
【００７８】
（実施例３）チロソールの生産
製造例８〜９の菌株に代えて製造例１２の菌株を用い、１３０ｒｐｍで培養した以外は、実施例１と同じ培養条件でチロソールの生産を行った。２４時間の培養後の、培地中のチロシン、チロソール、４−ヒドロキシフェニル酢酸、フェニル酢酸、２−フェニルエタノールの濃度を測定した。結果を表２に示す。
【００７９】
（比較例３）チロソールの生産
製造例８〜９の菌株に代えて製造例１０〜１１の菌株を用い、１３０ｒｐｍで培養した以外は、実施例１と同じ条件でチロソールの生産を行った。２４時間の培養後の、培地中のチロシン、チロソール、４−ヒドロキシフェニル酢酸、フェニル酢酸、２−フェニルエタノールの濃度を測定した。結果を表２に示す。
【００８０】
【表２】
2018166473.tif 000003
【００８１】
（製造例１３）多重遺伝子高発現株の作成
カナマイシン耐性遺伝子とＴ７プロモーターおよびＴ７ターミネーターに連結したｔｙｒＢの遺伝子カセット（ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ｔｙｒＢ−ＴＴ７）を増幅するために、ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ｔｙｒＢを鋳型として、２種類のプライマー（５’−ＣＧＡＧＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＡＣＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＣＡＴＴＡＴＣＡＧＧＡＧＡＧＣＡＴＴＡＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ−３’と５’−ＣＣＧＴＴＴＡＴＧＴＴＧＣＣＡＧＡＣＡＧＣＧＣＴＡＣＴＧＡＴＴＡＡＧＣＧＧＡＴＴＴＴＴＴＣＧＣＴＴＴＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧ−３’）を用いてＰＣＲを行った。なお、カセットの増幅にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）を用い、プロトコールに従って反応を行った。増幅したＰＣＲ産物を用いて、Ｒｅｄ相同組換えを用いた公知の方法（非特許文献２）により、遺伝子カセットを大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）株の染色体ＤＮＡ上のａｄｈＥの座位に導入し、Ｍ−ＡＲＧ−７１（ＭＧ１６５５（ＤＥ３）ａｄｈＥ：：ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ｔｙｒＢ−ＴＴ７）株を得た。Ｐ１形質導入法により、ＰＡＲ−２５２株のａｄｈＥ座位にＭ−ＡＲＧ−７１株のＰ１ライセートを用いてＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ｔｙｒＢ−ＴＴ７カセットを挿入し、ＰＡＲ−２５９（ｍｔｌＡ：：ＰＴ７−ｉｐｄＣ−ＴＴ７  ａｄｈＥ：：ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ｔｙｒＢ−ＴＴ７）株を得た。この微生物ではアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）の活性が失われている。
【００８２】
（製造例１４）多重遺伝子高発現株の作成
Ｐ１形質導入法により、ＰＡＲ−２５３株のａｄｈＥ座位にＭ−ＡＲＧ−７１株のＰ１ライセートを用いてＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ｔｙｒＢ−ＴＴ７カセットを挿入し、ＰＡＲ−２６０（ｍｔｌＡ：：ＰＴ７−ｉｐｄＣ−ＴＴ７  ａｄｈＥ：：ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ｔｙｒＢ−ＴＴ７  ｌｄｈＡ：：ＰＴ７−ｙａｈＫ−ＴＴ７）株を得た。この微生物ではアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）の活性が失われている。
【００８３】
（実施例４）チロソールの生産
製造例８〜９の菌株に代えて製造例１３〜１４の菌株を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行った。２４時間の培養後の、培地中のチロシン、チロソール、４−ヒドロキシフェニル酢酸、フェニル酢酸、２−フェニルエタノールの濃度を測定した。結果を表３に示す。
【００８４】
【表３】
2018166473.tif 000004
【００８５】
製造例１３のＰＡＲ−２５９株は、製造例６のＰＡＲ−２５２株（比較例２）よりも原料のチロシンを速やかに消費し、それに伴いチロソールの生産量が増加した。同様に、製造例１４のＰＡＲ−２６０株は、製造例７のＰＡＲ−２５３株（比較例２）よりも原料のチロシンを速やかに消費し、それに伴いチロソールの生産量が増加した。これらの結果は、ｔｙｒＢの高発現により微生物のチロソールの生産能力が向上していることを示す。
【００８６】
（製造例１５）多重遺伝子高発現株の作成
Ｐ１形質導入法により、ａｓｐＣ遺伝子をＰＡＲ−２５３株のｆｅａＢ座位に導入した。ａｓｐＣ遺伝子を染色体上に含む菌株の作製法は下記の通りである。
【００８７】
ａｓｐＣ遺伝子を含むプラスミドの作製：ａｓｐＣ遺伝子を、２種類のプライマー（５’−ＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＴＡＣＣＧＣＣ−３’および５’−ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＡＴＣＧ−３’）を用いてＥｓｃｈｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物と、ＮｄｅＩとＸｈｏＩで一晩消化したｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴベクターとをＧｉｂｓｏｎ試薬を用いて連結し、ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｓｐＣを得た。
【００８８】
ａｓｐＣ遺伝子を染色体上に含む菌株の作製：カナマイシン耐性遺伝子とＴ７プロモーターおよびＴ７ターミネーターに連結したａｓｐＣの遺伝子カセット（ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ａｓｐＣ−ＴＴ７）を増幅するために、ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｓｐＣを鋳型として、２種類のプライマー（５’−ＴＣＧＣＴＧＣＧＴＡＣＡＣＴＧＡＡＡＴＣＡＣＡＣＴＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ−３’と５’−ＴＧＣＣＧＴＴＴＴＴＴＡＣＴＴＡＴＧＡＧＣＧＡＡＣＣＡＧＡＴＴＡＡＴＡＣＣＧＴＡＣＡＣＡＣＡＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧ−３’）を用いてＰＣＲを行った。なお、カセットの増幅にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）を用い、プロトコールに従って反応を行った。増幅したＰＣＲ産物を用いて、Ｒｅｄ相同組換えを用いた公知の方法（非特許文献２）により、遺伝子カセットを大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）株の染色体ＤＮＡ上のｆｅａＢの座位に導入し、Ｍ−ＡＲＧ−６２（ＭＧ１６５５（ＤＥ３）ｆｅａＢ：：ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ａｓｐＣ−ＴＴ７）株を得た。Ｐ１形質導入法により、Ｍ−ＡＲＧ−６２株のＰ１ライセートを用いて、ＰＡＲ−２５３株のｆｅａＢ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ａｓｐＣ−ＴＴ７カセットを挿入し、ＰＡＲ−２６１（ｍｔｌＡ：：ＰＴ７−ｉｐｄＣ−ＴＴ７  ｌｄｈＡ：：ＰＴ７−ｙａｈＫ−ＴＴ７  ｆｅａＢ：：ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰＴ７−ａｓｐＣ−ＴＴ７）株を得た。なお、この微生物ではフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｆｅａＢ）の活性が失われている。
【００８９】
（実施例５）チロソールの生産
製造例８〜９の菌株に代えて製造例１５の菌株を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行った。２４時間の培養後の、培地中のチロシン、チロソール、４−ヒドロキシフェニル酢酸、フェニル酢酸、２−フェニルエタノールの濃度を測定した。結果を表４に示す。
【００９０】
【表４】
2018166473.tif 000005
【００９１】
製造例１５のＰＡＲ−２６１株は、製造例７のＰＡＲ−２５３株（比較例２）よりも原料のチロシンを速やかに消費し、それに伴いチロソールの生産量が増加しており、製造例８のＰＡＲ−２５４株（実施例１〜２）と同様の傾向を示した。この結果は、ｔｙｒＢに限らずアミノトランスフェラーゼは一般に、微生物のチロソールの生産能力を向上させることを示す。
【００９２】
（製造例１６）多重遺伝子高発現株の作成
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＲＯ１０遺伝子をプラスミドベクターｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ（非特許文献２）に導入し、さらにこのプラスミドベクターｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ＡＲＯ１０を、大腸菌ＢＷ２５１１３（ＤＥ３）に導入して、ＢＷ２５１１３（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ＡＲＯ１０株を得た。
【００９３】
（製造例１７）多重遺伝子高発現株の作成
ｔｙｒＢ遺伝子をプラスミドベクターｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴに導入し、さらにこのプラスミドベクターｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ｔｙｒＢを、大腸菌ＰＡＲ−２５３株に導入して、ＰＡＲ−２５３／ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ｔｙｒＢ株を得た。
【００９４】
（実施例６）チロソールの生産
製造例８〜９の菌株に代えて製造例１７の菌株を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行った。２４時間の培養後の、培地中のチロシン、チロソール、４−ヒドロキシフェニル酢酸、フェニル酢酸、２−フェニルエタノールの濃度を測定した。結果を表５に示す。
【００９５】
（比較例４）チロソールの生産
製造例８〜９の菌株に代えて製造例１６の菌株を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行った。２４時間の培養後の、培地中のチロシン、チロソール、４−ヒドロキシフェニル酢酸、フェニル酢酸、２−フェニルエタノールの濃度を測定した。結果を表５に示す。
【００９６】
【表５】
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【００９７】
製造例１７のＰＡＲ−２５３／ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ｔｙｒＢ株は、製造例１６のＢＷ２５１１３（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ＡＲＯ１０株よりも原料のチロシンを速やかに消費し、それに伴いチロソールの生産量が増加しており、製造例８のＰＡＲ−２５４株（実施例１〜２）と同様の傾向を示した。この結果は、アミノトランスフェラーゼ遺伝子はプラスミドにより細胞内に導入された場合にも、微生物のチロソールの生産能力を向上させることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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