(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト膵島アミロイドポリペプチド（アミリン、ＩＡＰＰ及びｐｒｏＩＡＰＰとも呼ばれる）の特異的な抗体又はそのフラグメント、及びそれらを用いた医薬組成物又は診断組成物の提供。【解決手段】ＩＡＰＰ結合フラグメントのＣＮＴＡＴＣＡアミノ酸配列を含むエピトープと特異的に結合する抗ＩＡＰＰヒトモノクローナル抗体であって、アミロイド−βペプチド（Ａβ１−４２）を認識せず、ＩＡＰＰのオリゴマー及び／又は原線維を含むＩＡＰＰ凝集物を生理学的ＩＡＰＰよりも優先的に認識する抗体、及びそれらを用いたＩＡＰＰ及び／又はｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる障害（２型糖尿病等）の予防的処置、その治療的処置、膵島アミロイドーシスの進行またはその処置に対する応答をモニターすることにおいて使用される組成物の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）ヒトモノクローナル抗体であって、
該抗体またはそのＩＡＰＰ結合フラグメントは、ＣＮＴＡＴＣＡ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むエピトープと特異的に結合する、抗体。
【請求項２】
ヒトＩＡＰＰおよび／またはヒトｐｒｏＩＡＰＰと結合することができる、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
アミロイド−βペプチド（Ａβ１−４２）を実質的に認識しない、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
生理学的ＩＡＰＰを実質的に認識しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
その可変領域に、以下の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（但し、１つ又は複数のＣＤＲが１つ又は２つのアミノ酸置換を含んでいてもよい）を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその結合フラグメント：
（ａ）ＶＨＣＤＲ１：  配列番号２０の位置２６−３７，
ＶＨＣＤＲ２：  配列番号２０の位置５２−６７，
ＶＨＣＤＲ３：  配列番号２０の位置１００−１１０，
ＶＫＣＤＲ１：  配列番号２２の位置２４−３８，
ＶＫＣＤＲ２：  配列番号２２の位置５４−６０，及び
ＶＫＣＤＲ３：  配列番号２２の位置９３−１０１；
又は
（ｂ）ＶＨＣＤＲ１：  配列番号２８の位置２６−３５，
ＶＨＣＤＲ２：  配列番号２８の位置５０−６６，
ＶＨＣＤＲ３：  配列番号２８の位置９９−１１３，
ＶＬＣＤＲ１：  配列番号３０の位置２３−３４，
ＶＬＣＤＲ２：  配列番号３０の位置５０−５６，及び
ＶＬＣＤＲ３：  配列番号３０の位置９３−１０１。
【請求項６】
（ａ）配列番号２０及び配列番号２２、及び
（ｂ）配列番号２８及び配列番号３０、
から選択されるＶＨ領域およびＶＫ／ＶＬ領域、あるいは、１つまたは２つのアミノ酸置換を含むそのＶＨ領域およびＶＫ／ＶＬ領域のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗体またはその結合フラグメント。
【請求項７】
ＩＡＰＰのオリゴマーおよび／または原線維を含むＩＡＰＰ凝集物を生理学的ＩＡＰＰよりも優先的に認識する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
齧歯類−ヒトのキメラ抗体または齧歯類化された抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
ヒトＩｇＧアイソタイプ抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに対する特異的な結合について、請求項１〜９のいずれか一項に記載される抗体と競合する抗体。
【請求項１１】
単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載される抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載されるポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載されるポリヌクレオチドまたは請求項１３に記載されるベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
抗ＩＡＰＰ抗体または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体を調製するための方法であって、
（ａ）請求項１４に記載される細胞を培養すること；および
（ｂ）前記抗体を培養物から単離すること
を含む方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるか、または、請求項１５に記載される方法によって得ることができる抗体。
【請求項１７】
検出可能に標識される、請求項１〜１１または１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
前記検出可能な標識が、酵素、放射性同位体、蛍光団および重金属からなる群から選択される、請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
薬物に結合させられる、請求項１〜１１または１６〜１８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
請求項１〜１１または１６〜１９のいずれか一項に記載される抗体、請求項１２に記載されるポリヌクレオチド、請求項１３に記載されるベクター、あるいは、請求項１４に記載される細胞を含む組成物。
【請求項２１】
医薬組成物であり、かつ、医薬的に許容されるキャリアをさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
ワクチンである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）を処置することのために、および／または、臨床での膵島移植の後における膵島拒絶を処置するか、もしくは防止することにおいて有用であるさらなる薬剤をさらに含む、請求項２１または２２に記載の組成物。
【請求項２４】
診断組成物であり、かつ、免疫または核酸に基づく診断方法において従来から使用される試薬を任意で含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる障害の予防的処置、その治療的処置、ならびに／あるいは、その進行またはその処置に対する応答をモニターすることにおいて使用されるための、請求項１〜１１もしくは１６〜１９のいずれか一項に記載される抗体、請求項１２に記載されるポリヌクレオチド、請求項１３に記載されるベクター、あるいは、請求項１４に記載される細胞、あるいは、前記のいずれか１つを含む医薬組成物または診断組成物。
【請求項２６】
対象における膵島アミロイドーシスの進行をモニターする方法であって、請求項１〜１１または１６〜１９のいずれか一項に記載される少なくとも１つの抗体を用いて、モニターされるべき前記対象からのサンプルにおけるＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのオリゴマー、凝集物または原線維の存在を明らかにすることを含み、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのオリゴマー、凝集物または原線維の存在により、前駆症状性、前駆または臨床上の２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、ならびに／あるいは、臨床での膵島移植の後におけるベータ細胞不全が暗示され、また、生理学的ＩＡＰＰのレベルと比較して、あるいは、健康なコントロール対象に由来する参照サンプル、または、同じ対象からのコントロールサンプルと比較して、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのオリゴマー、凝集物または原線維のレベルの増大により、前駆症状性、前駆または定着した２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、ならびに／あるいは、臨床での膵島移植の後におけるベータ細胞不全の進行が前記対象において暗示される、方法。
【請求項２７】
ヒトまたは動物の身体におけるＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのインビボ検出のための組成物、あるいは、治療剤および／または診断剤をヒトまたは動物の身体においてＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに対して標的化するための組成物を調製するための、請求項１〜１１または１６〜１９のいずれか一項に記載される抗体。
【請求項２８】
前記インビボ検出が、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光学的画像法または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
請求項２６に記載される方法において使用されるための請求項２７または２８に記載の抗体。
【請求項３０】
膵島アミロイドーシスを診断するか、またはその進行をモニターすることにおいて有用なキットであって、請求項１〜１１もしくは１６〜１９のいずれか一項に記載される少なくとも１つの抗体、請求項１２に記載されるポリヌクレオチド、請求項１３に記載されるベクター、あるいは、請求項１４に記載される細胞を、任意で、試薬および／または使用説明書と一緒に含むキット。
【請求項３１】
請求項１〜１１または１６〜１９のいずれか一項に記載される抗体を含み、無菌の水性若しくは非水性の溶液、懸濁物又はエマルションである、調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、ヒト膵島アミロイドポリペプチド（ｈＩＡＰＰ）（アミリンとしても知られている）に特異的に結合する新規な分子、および／または、その前駆体のｐｒｏ膵島アミロイドポリペプチド（ｐｒｏＩＡＰＰ）に関連し、具体的には、ＩＡＰＰタンパク質、ｐｒｏＩＡＰＰタンパク質、ＩＡＰＰの凝集型形態、ｐｒｏＩＡＰＰの凝集型形態および／またはＩＡＰＰ原線維を認識するヒト抗体、同様にまた、そのフラグメント、誘導体および変異体に関連する。加えて、本発明は、血漿中のＩＡＰＰ、ｐｒｏＩＡＰＰ、凝集型ＩＡＰＰ種、凝集型ｐｒｏＩＡＰＰ種および／またはＩＡＰＰ原線維を特定するための診断ツールとして、また、同様に、凝集型ＩＡＰＰ、凝集型ｐｒｏＩＡＰＰおよびＩＡＰＰ原線維に関連づけられる障害（例えば、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、および、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の個体への臨床での膵島移植の後における膵島拒絶など）を処置するための受動的ワクチン接種戦略においてそれらの両方で有益であるそのような結合性分子、抗体およびその模倣体を含む医薬組成物および診断組成物に関連する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の蓄積、修飾および凝集は、広く知られている神経変性疾患（例えば、ハンチントン病、アルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）など）を含む数多くの代謝疾患の病理学的側面である（非特許文献１）。病理学的なタンパク質凝集はまた、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、および、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の個体への臨床での膵島移植の後における膵島拒絶などの代謝疾患にも関与する。タンパク質の誤った折り畳みおよび凝集はアミロイド沈着物の発生を引き起こしており、これらの疾患において細胞毒性に直接的に関連づけられるようである。膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰまたはアミリン）は、膵臓においてβ細胞によってインスリンと同時に分泌される生理学的なペプチドであり、原線維凝集物をＴ２Ｄ患者の膵島（ランゲルハンス島とも呼ばれる）において形成し、また、この疾患の発症において役割を果たすことが示唆されている（非特許文献２）。さらには、前述の通り、ＩＡＰＰ凝集物が、単離された膵島を１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の患者に移植したときの膵島において見出されている。
ヒトＩＡＰＰ（ｈＩＡＰＰ）は、２位および７位のシステイン残基の間におけるジスルフィド架橋と、アミド化されたＣ末端とを有する、３７個のアミノ酸からなるペプチドホルモンである。膵島は６５％〜８０％がβ細胞から構成され、β細胞により、血中グルコースレベルおよび細胞代謝を調節するために不可欠なインスリンおよびＩＡＰＰが産生され、分泌される。ＩＡＰＰは、プレプロホルモンのｐｒｅｐｒｏＩＡＰＰ、すなわち、膵臓のβ細胞において産生される８９アミノ酸の前駆体からプロセシングされる。
【０００３】
ｐｒｅｐｒｏＩＡＰＰは、翻訳後、プロ膵島アミロイドポリペプチド（６７アミノ酸のペプチド）に速やかに切断され、このプロ膵島アミロイドポリペプチドはさらなるタンパク質分解および翻訳後修飾を受けて、ｈＩＡＰＰをもたらす。ｈＩＡＰＰの発現は、増大したインスリン産生が増大したｈＩＡＰＰレベルを引き起こすように、インスリンと共に調節される。ｈＩＡＰＰが膵臓のβ細胞から血液循環に放出され、胃排出および満腹の制御を介して血糖調節に、インスリンとの相乗作用で関与する。
【０００４】
ｈＩＡＰＰは生理学的状態のもとでは細胞代謝の調節因子として作用するが、ｈＩＡＰＰは凝集し、β細胞不全、増大したβ細胞死および低下したβ細胞量を伴うアミロイド原線維を形成することがある（ＩＡＰＰアミロイドーシス）。いくつかの証拠が、ｈＩＡＰＰアミロイドーシスをＴ２Ｄの病理発生についての主要な誘因として示している。第一に、ｈＩＡＰＰ原線維の沈着が２型糖尿病患者の９０％超において見出される（非特許文献３）。第二に、ｈＩＡＰＰ凝集はβ細胞にとって毒性であり、インスリン産生β細胞の減少と相関する（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。第三に、ｈＩＡＰＰを発現する遺伝子組換えマウスモデルは膵島でのアミロイド沈着物を示し、Ｔ２Ｄを自然発症する（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。それらは、このヒト疾患を、Ｔ２Ｄ患者からの組織において認められるのと同程度に、β細胞の機能不全、β細胞量の欠乏およびβ細胞の喪失を伴って再現する。ｈＩＡＰＰの発現およびアミロイドの形成がこれらのモデルにおいてβ細胞のアポトーシスおよび糖尿病の発症と直接的に相関しており、したがって、このことから、この疾患の発症におけるヒトＩＡＰＰの寄与についての証拠が提供される。そのうえ、ｈＩＡＰＰの凝集を妨げる処置は糖尿病性の表現型を改善し、かつ、動物の寿命を増大させた（非特許文献１３）。ｈＩＡＰＰの凝集およびアミロイドーシスは毒性のための必要条件である。アミロイド非形成性の齧歯類ＩＡＰＰ（ｒＩＡＰＰ）（これは、原線維を６つのアミノ酸置換の結果として形成することができない）はβ細胞に対して非毒性である。疾患の発症において、ヒト膵島において見出される病理学的なｈＩＡＰＰ凝集が、インスリン分泌が損なわれることに伴うβ細胞の機能不全および死を引き起こす場合がある。加えて、正常な血中グルコースレベルを維持するためのβ細胞量ならびにインスリン分泌およびアミリン分泌における代償的な増大が、毒性ｈＩＡＰＰオリゴマーの形成およびｈＩＡＰＰ原線維の沈着に有利に働く場合がある。初期のｈＩＡＰＰオリゴマーが主要な細胞毒性化学種として考えられるが、ｈＩＡＰＰ原線維の最終生成物もまた、β細胞の喪失において役割を果たしているかもしれない（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。ｈＩＡＰＰ原線維はまた、ドナーからの単離された膵島において認められ、１型糖尿病の個体への臨床での膵島移植の後におけるβ細胞喪失に関連している（非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９）。ｈＩＡＰＰの凝集およびアミロイドーシスをＴ２Ｄにおいて引き起こす正確な機序は不明である。Ｔ２Ｄにおけるインスリン抵抗性がインスリン分泌要求をｐｒｏＩＡＰＰ細胞含有量およびｈＩＡＰＰ放出と共に増大させており、この場合、アミロイドーシスをｈＩＡＰＰ原線維形成として誘発し得るものは濃度依存的である。別の提案された機序は、インスリン抵抗性の状況におけるタンパク質分解の不具合によって引き起こされるＮ末端のプロセシングされていないｐｒｏＩＡＰＰの蓄積および凝集であり、これは、ｐｒｏＩＡＰＰの部分的にプロセシングされた形態がアミロイド沈着物において見出さ��るからであり、具体的には、４８残基の中間体ｐｒｏＩＡＰＰ１−４８が見出される（非特許文献２０）。この関連において、ｐｒｏＩＡＰＰの異常なプロセシングがｈＩＡＰＰアミロイドーシスのための種として作用しているかもしれず、また、アミロイド形成を増大させているかもしれない（非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２０）。したがって、ｐｒｏＩＡＰＰはまた、適切な治療標的であると見なされる。
【０００５】
Ｔ２Ｄの臨床的特徴は、高い血中グルコースレベルならびにインスリン抵抗性および／またはインスリン欠乏である。糖尿病は、Ｔ１Ｄ、Ｔ２Ｄおよび妊娠糖尿病を含む一群の代謝疾患である。Ｔ２Ｄは、成人発症糖尿病、肥満関連糖尿病およびインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）とも呼ばれており、糖尿病の最も一般的な形態であり、全症例の約９０％を占める（非特許文献２３）。Ｔ２Ｄは、機能的なインスリン産生β細胞の数の低下によって特徴づけられる。病理が進行する間に、長期にわたる、心臓血管疾患、失明を引き起こす糖尿病性網膜症、腎不全、頻繁な感染症、および、循環不良によって引き起こされる切断などの合併症が引き起こされ得る。結果として、Ｔ２Ｄには、より短い平均余命が伴う。この疾患には、世界中で３億人を超える人々が冒されており、その結果、１００万人を超える死者が毎年生じている。遺伝的決定因子および環境的要因の両方がこの疾患の発症を引き起こしており、肥満、運動不足および加齢が主要原因であると考えられる（非特許文献２４）。
【０００６】
Ｔ２Ｄのための現在の処置には、生活様式の管理（食事および運動）、および、血中グルコースレベルを、膵臓を刺激してインスリンを放出させることによって、または、インスリン応答を増大させることによって低下させるための薬理学的介入（例えば、メトホルミンおよびインスリン供給など）が含まれる。これらの処置は糖尿病の症状改善に基づいており、永続性に欠けるという結果が伴う。実際、利用可能な処置のどれもがｈＩＡＰＰの凝集および膵臓β細胞の喪失を阻止しないことが示されている。グルカゴン−ペプチド１（ＧＬＰ−１）のアナログ（非特許文献２５）およびＧＬＰ−１不活性化酵素ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＤＰ４）の阻害剤を伴う新しい処置戦略は、ＧＬＰ−１の強力なインスリン分泌促進効果、および、β細胞の増殖を高めるその効果に基づいている。重要なことに、増大したインスリン放出はまた、増大したアミリン放出に連動する。実験的には、刺激されたインスリン分泌が膵島アミロイドーシスの発現を動物モデルにおいて促進させることが示されており、類似する影響がヒトにおいて予想され得る（非特許文献２６）。したがって、これらの処置は潜在的には膵島アミロイドーシスを悪化させ得るかもしれない。より最近の有望な戦略では、ＩＬ−１β経路を標的化する抗炎症性薬物または抗体の開発が伴う（非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３３）。注目すべき重要なこととして、最近の研究は、ｈＩＡＰＰが、インフラマソーム、すなわち、自然免疫系の活性化を引き起こすＩＬ−１β系を特異的に誘導することを示しており（非特許文献３４；非特許文献３５）、したがって、このことは、ｈＩＡＰＰ凝集を標的化する治療戦略を裏づけている。
【０００７】
これらの発見は、ｈＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰを標的化する能動的または受動的な免疫療法アプローチに伴う潜在的な利益を強調するものである。
【０００８】
上記をまとめると、有効かつ安全な治療により、凝集したｈＩＡＰＰタンパク質、ｐｒｏｈＩＡＰＰタンパク質ならびに／あるいはｈＩＡＰＰのオリゴマーおよび／または原線維に対処する新規な治療戦略が至急に求められている。
【０００９】
進化的に最適化され、かつ、ヒト免疫系による親和性成熟化を受けるヒト抗体による受動免疫化は、優れた効力および安全性についての大きい可能性を有する有望な新しい治療的手段をもたらすであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｔａｙｌｏｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６（２００５）、１９９１〜１９９５
【非特許文献２】Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ他（２０１１）、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．９１（３）：７９５〜８２６
【非特許文献３】Ｚｒａｉｋａ他（２０１０）、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５３（６）：１０４６〜１０５６
【非特許文献４】Ｂｕｔｌｅｒ他（２００３）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２（９）：２３０４〜２３１４
【非特許文献５】Ｒｉｔｚｅｌ他（２００７）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５６（１）：６５〜７１
【非特許文献６】Ｊｕｒｇｅｎｓ他（２０１１）、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７８（６）：２６３２〜２６４０
【非特許文献７】Ｊａｎｓｏｎ他（１９９６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（１４）：７２８３〜７２８８
【非特許文献８】Ｈｏｐｐｅｎｅｒ他（１９９９）、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４２（４）：４２７〜４３４
【非特許文献９】Ｈｕｌｌ他（２００３）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２（２）：３７２〜３７９
【非特許文献１０】Ｂｕｔｌｅｒ他（２００４）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３（６）：１５０９〜１５１６
【非特許文献１１】Ｍａｔｖｅｙｅｎｋｏ他（２００６）、ＩＬＡＲ  Ｊ．４７（３）：２２５〜２３３
【非特許文献１２】Ｈｏｐｐｅｎｅｒ他（２００８）、Ｅｘｐ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ．６９７０３５
【非特許文献１３】Ａｉｔｋｅｎ他（２００９）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５９（１）：１６１〜１７１
【非特許文献１４】Ｍｅｉｅｒ他（２００６）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２９１（６）：Ｅ１３１７〜１３２４
【非特許文献１５】Ｈａａｔａｊａ他（２００８）、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２９（３）：３０３〜３１６
【非特許文献１６】Ｅｎｇｅｌ他（２００８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５（１６）：６０３３〜６０３８
【非特許文献１７】Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ他（２００８）、Ｅｘｐ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ．５６２９８５
【非特許文献１８】Ｕｄａｙａｓａｎｋａｒ他（２００９）、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５２（１）：１４５〜１５３
【非特許文献１９】Ｂｏｈｍａｎ他（２０１２）、Ａｍｙｌｏｉｄ  １９（２）：８７〜９３
【非特許文献２０】Ｍａｒｚｂａｎ他（２００６）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５５（８）：２１９２〜２２０１
【非特許文献２１】Ｐａｕｌｓｓｏｎ他（２００５）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４（７）：２１１７〜２１２５
【非特許文献２２】Ｐａｕｌｓｓｏｎ他（２００６）、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４９（６）：１２３７〜１２４６
【非特許文献２３】Ｇｅｒｉｃｈ他（１９９８）、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１９（４）：４９１〜５０３
【非特許文献２４】Ｋａｈｎ他（２００６）、Ｎａｔｕｒｅ  ４４４（７１２１）：８４０〜８４６
【非特許文献２５】Ｂｕｔｌｅｒ他（２００９）、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５３（１）：１〜６
【非特許文献２６】Ａｓｔｏｎ−Ｍｏｕｒｎｅｙ他（２０１１）、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５４（７）：１７５６〜１７６５
【非特許文献２７】Ｄｏｎａｔｈ他（２００８）、Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．４（５）：２４０〜２４１
【非特許文献２８】Ｅｈｅｓ他（２００９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６（３３）：１３９９８〜１４００３
【非特許文献２９】Ｏｗｙａｎｇ他（２０１０）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １５１（６）：２５１５〜２５２７
【非特許文献３０】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ他（２０１０）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ．１７（４）：３１４〜３２１
【非特許文献３１】Ｂｏｎｉ−Ｓｃｈｎｅｔｚｌｅｒ他（２０１１）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．９３（１０）：４０６５〜４０７４
【非特許文献３２】Ｂｏｎｉ−Ｓｃｈｎｅｔｚｌｅｒ他（２０１２）、Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．
【非特許文献３３】Ｃａｖｅｌｔｉ−Ｗｅｄｅｒ他（２０１２）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ
【非特許文献３４】Ｍａｓｔｅｒｓ他（２０１０）、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（１０）：８９７〜９０４
【非特許文献３５】Ｍａｎｄｒｕｐ−Ｐｏｕｌｓｅｎ他（２０１０）、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（１０）：８８１〜８８３
【発明の概要】
【００１１】
本発明では、健康なヒト対象のｈＩＡＰＰ特異的な免疫応答が、天然の抗ｈＩＡＰＰ特異的ヒトモノクローナル抗体を単離するために使用される。具体的には、本発明に従って行われる実験は、モノクローナルｈＩＡＰＰ特異的抗体および／またはｐｒｏｈＩＡＰＰ特異的抗体を、健康なヒト対象のプールから、または、Ｔ２Ｄを発症する危険性が高いが、抗体単離時にはＴ２Ｄの徴候を何ら示さなかった肥満患者群および他の患者群のプールから単離することに成功した。
【００１２】
したがって、本発明は、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰを特異的に認識することができるヒト抗体、抗原結合フラグメントおよび類似する抗原結合性分子に関する。別途示されないならば、「ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰを特異的に認識する」、「ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに対して／ついて特異的な抗体」、ならびに、「抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体」によって、ＩＡＰＰの生来型モノマー形態に対する抗体、ＩＡＰＰのｐｒｏＩＡＰＰ前駆体形態に対する抗体、どちらの形態に対しても、すなわち、ＩＡＰＰおよびｐｒｏＩＡＰＰに対して特異的に結合する抗体、凝集型、オリゴマー状、原線維性および／または非原線維性のＩＡＰＰ種および／またはｐｒｏＩＡＰＰ種に結合する抗体が、具体的に、概して、また、総称的に意味される。本明細書中には、全長型形態および／または凝集型形態、例えば、オリゴマー形態、原線維性凝集型形態および非原線維性凝集型形態のＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰについて選択的であるヒト抗体が提供される。
【００１３】
本発明の特に好ましい実施形態において、ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントは、図１または図２に示される可変領域ＶＨおよび／または可変領域ＶＬによって特徴づけられる、抗体の免疫学的結合特性を明らかにする。
【００１４】
抗体の抗原結合フラグメントは、単鎖Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、または、どのような他の抗原結合フラグメントも可能である。具体的な実施形態において、とりわけ、抗体またはそのフラグメントはヒトＩｇＧアイソタイプ抗体である。代替では、抗体は、ヒト−齧歯類のキメラ抗体、または、齧歯類化された抗体、例えば、マウス抗体またはマウス化抗体、ラット抗体またはラット化抗体などであり、齧歯類型が、診断方法および動物における研究のために特に有用である。
【００１５】
さらには、本発明は、本発明の抗体またはその活性フラグメントを含む組成物、ならびに、ＩＡＰＰに関連づけられる障害（例えば、Ｔ２Ｄなど）の防止、診断または処置においてそのような組成物を使用する免疫治療法および免疫診断法であって、有効量の組成物がその必要性のある患者に投与される方法に関連する。
【００１６】
当然のことながら、本発明は、下記で定義されるような明確かつ独特の特徴を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する不死化されたヒトＢメモリーリンパ球およびヒトＢ細胞にまでそれぞれ拡大する。
【００１７】
本発明はまた、本発明の抗体の免疫グロブリン鎖の少なくとも可変領域をコードするポリヌクレオチドに関連する。好ましくは、前記可変領域は、図１または図２に示される可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００１８】
したがって、本発明はまた、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、および、該ベクターにより形質転換される宿主細胞ならびにＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに対して特異的である抗体および同等な結合性分子を製造するためのそれらの使用を包含する。抗体およびその模倣体を組換え製造するための様々な手段および方法ならびに競合する結合性分子（これは抗体であってもよく、または抗体でなくてもよい）についてスクリーニングするための様々な方法がこの技術分野では知られている。しかしながら、特にヒトにおける治療的適用に関して本明細書中に記載されるように、本発明の抗体は、当該抗体の適用が、キメラ抗体について、また、ヒト化抗体についても他の場合には認められるそのような抗体に対する免疫応答を実質的に有していないという意味で、ヒト抗体である。
【００１９】
さらには、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰをサンプルおよび／または生体内において特定するために使用することができる組成物および方法が本明細書中に開示される。開示された抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体あるいはそのＩＡＰＰ結合フラグメントおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合フラグメントは、ヒトの血液、血漿、血清、唾液、腹腔液、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）および尿を、例えば、ＥＬＩＳＡ型アッセイまたは表面適合化アッセイを使用することによってサンプル中のＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの存在についてスクリーニングするために使用することができる。１つの実施形態において、本発明は、対象におけるＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる障害を診断するか、またはその進行をモニターする方法であって、本発明の少なくとも１つの抗体あるいはそのいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＩＡＰＰ結合性分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子を用いて、診断されるべき対象からのサンプルにおけるＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのオリゴマー、凝集物または原線維の存在を明らかにすることを含み、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのオリゴマー、凝集物または原線維の存在により、前記障害が示される方法に関連する。
【００２０】
さらには、本発明の１つの実施形態において、開示された抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体あるいはそのＩＡＰＰ結合フラグメントおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合フラグメント、および／または、本発明の抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むＩＡＰＰ結合性分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子が、ヒトまたは動物の身体におけるＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのインビボ検出（インビボ画像化とも呼ばれる）のための、あるいは、治療剤および／または診断剤をヒトまたは動物の身体においてＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに対して標的化するための組成物を調製するために提供される。本明細書中に開示される方法および組成物は、ＩＡＰＰに関連づけられ、かつ、例えば、オリゴマー形態、原線維性凝集型形態および非原線維性凝集型形態のＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの出現によって特徴づけられる障害において、例えば、Ｔ２Ｄの診断などにおいて助けとなることができ、また、疾患の進行、および、対象に施される治療の治療効力を、例えば、インビボ画像化に関連する診断方法においてモニターするために使用することができる。したがって、１つの実施形態において、前記インビボ検出（画像化）が、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光学的画像法または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む本発明のＩＡＰＰ結合性分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子が提供される。
【００２１】
したがって、原線維性および／または非原線維性のオリゴマー状および／または凝集型のＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる疾患、例えば、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）などを処置するための、診断するための、または防止するための方法を提供することが、本発明の具体的な目的である。本発明の方法は、効果的な濃度のヒト抗体または抗体誘導体を、当該抗体がＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰを標的化する対象に投与することを含む。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体によって特異的に認識されるＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのエピトープを有するペプチドを提供する。前記ペプチドは、詳細な説明および実施例で下記において示されるようなアミノ酸配列、または、１つもしくは複数のアミノ酸が置換され、欠失され、および／または付加されるその改変された配列を含むか、あるいは、そのようなアミノ酸配列またはそのような改変された配列からなる。加えて、本発明は、Ｔ２ＤまたはＴ２Ｄを発症する危険性を対象において診断するための方法であって、前記ペプチドに結合する抗体の存在を前記対象の生物学的サンプルにおいて明らかにする工程を含む方法を提供する。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態が下記の説明および実施例から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】下記のヒトＩＡＰＰ抗体の可変領域、すなわち、重鎖およびカッパ／ラムダ軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列：ＮＩ−２０３．９Ａ２（Ａ）、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８（Ｂ）、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１（Ｃ）、ＮＩ−２０３．８Ｅ３（Ｄ）、ＮＩ−２０３．１１Ｂ１２（Ｅ）、ＮＩ−２０３．２０５Ｆ８（Ｆ）、ＮＩ−２０３．９Ｂ３（Ｇ）、ＮＩ−２０３．１９Ｆ２（Ｈ）およびＮＩ−２０３．１５Ｃ７（Ｉ）。フレームワーク領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が示され、ＣＤＲには下線が引かれる。重鎖連結領域（ＪＨ）および軽鎖連結領域（ＪＫ）も同様に示される。クローニング戦略に起因して、重鎖および軽鎖のＮ末端におけるアミノ酸配列は潜在的にはプライマー誘発変化をＦＲ１において含有する場合があり、しかしながら、この変化は抗体の生物学的活性には実質的な影響を与えない。コンセンサスなヒト抗体を提供するために、最初のクローンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をデータベースにおける該当するヒト生殖系列可変領域配列とアライメントし、それらと一致させた；例えば、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）によって提供されるＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を参照のこと。ヒト抗体のアミノ酸配列が示されており、ただし、この場合、Ｎ末端のアミノ酸は、潜在的にはＰＣＲプライマーに起因してコンセンサスな生殖系列配列に由来すると見なされ、したがって、プライマー誘発変異補正（ＰＩＭＣ）によって置き換えられている。ＰＩＭＣ改変のアミノ酸が配列上において太字で示される。
【図２】下記のヒトｐｒｏＩＡＰＰ抗体の可変領域、すなわち、重鎖およびカッパ／ラムダ軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列：ＮＩ−２０３．１Ｄ１０（Ａ）、ＮＩ−２０３．２Ａ１１（Ｂ）、ＮＩ−２０３．１０Ｃ４（Ｃ）、ＮＩ−２０３．２０Ｈ９（Ｄ）、ＮＩ−２０３．２６Ｄ２（Ｅ）およびＮＩ−２０３．６０Ｈ３（Ｆ）。フレームワーク領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が示され、ＣＤＲには下線が引かれる。重鎖連結領域（ＪＨ）および軽鎖連結領域（ＪＫ）も同様に示される。クローニング戦略に起因して、重鎖および軽鎖のＮ末端におけるアミノ酸配列は潜在的にはプライマー誘発変化をＦＲ１において含有する場合があり、しかしながら、この変化は抗体の生物学的活性には実質的な影響を与えない。コンセンサスなヒト抗体を提供するために、最初のクローンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をデータベースにおける該当するヒト生殖系列可変領域配列とアライメントし、それらと一致させた；例えば、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）によって提供されるＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を参照のこと。ヒト抗体のアミノ酸配列が示されており、ただし、この場合、Ｎ末端のアミノ酸は、潜在的にはＰＣＲプライマーに起因してコンセンサスな生殖系列配列に由来すると見なされ、したがって、プライマー誘発変異補正（ＰＩＭＣ）によって置き換えられている。ＰＩＭＣ改変のアミノ酸が配列上において太字で示される。
【図３】直接的ＥＬＩＳＡによって評価されるヒト組換え抗体のＩＡＰＰ結合特異性。（Ａ）ＥＬＩＳＡプレートの被覆のために使用されるＩＡＰＰ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）の電子顕微鏡法による画像。スケールバーは１μｍを表す。（Ｂ）組換え体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１およびＮＩ−２０３．８Ｅ３は、ヒトＩＡＰＰ（１０μｇ／ｍｌ）に対する特異的な結合を示した。ＢＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）を、非特異的結合を求めるためのコントロールとして使用した。データが、４５０ｎｍにおけるＯＤ値として表される。
【図４】ＩＡＰＰおよびｐｒｏＩＡＰＰについての組換えヒト由来抗ＩＡＰＰ抗体のＥＣ５０決定。（Ａ）ＥＬＩＳＡプレートの被覆のために使用されるＩＡＰＰ溶液およびｐｒｏＩＡＰＰ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）の電子顕微鏡法による画像。スケールバーは１μｍを表す。（Ｂ）プレートを、示された濃度の組換えヒト由来抗体（ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１またはＮＩ−２０３．８Ｅ３）とインキュベーションした。ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１およびＮＩ−２０３．８Ｅ３の抗体はヒトＩＡＰＰに対して大きい親和性で結合し（黒四角、１０μｇ／ｍｌ）、ＥＣ５０がそれぞれ、９ｎＭ、２２ｎＭ、６ｎＭおよび４ｎＭである。ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１はまた、ｐｒｏＩＡＰＰと結合し（白四角、１０μｇ／ｍｌ）、ＥＣ５０が２６０ｎＭである。測定を二回行い、ＢＳＡに対するバックグラウンド信号を引いた。データが、４５０ｎｍにおける平均ＯＤ値として表される。
【図５】ヒト由来の抗ＩＡＰＰ抗体はＩＡＰＰ原線維に対して特異的である。（Ａ）ＥＬＩＳＡプレートの被覆のために使用されるＩＡＰＰ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）および非原線維性ＩＡＰＰ溶液（５００μｇ／ｍｌ）の電子顕微鏡法による画像。ＩＡＰＰ溶液は原線維を含有するが、ＩＡＰＰ原線維が非原線維性ＩＡＰＰ溶液には存在しない。スケールバーは１μｍを表す。（Ｂ）プレートを、示された濃度の組換えヒト由来抗体（ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１またはＮＩ−２０３．８Ｅ３）とインキュベーションした。ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１およびＮＩ−２０３．８Ｅ３の抗体はＩＡＰＰ原線維に対して大きい親和性で結合し（ＩＡＰＰ溶液、黒四角、１０μｇ／ｍｌ）、非原線維性ＩＡＰＰに対しては非常に低い親和性で結合し（白三角、１０μｇ／ｍｌ）、このことから、ＩＡＰＰ原線維に対する特異性が示唆される。測定を二回行い、ＢＳＡに対するバックグラウンド信号を引いた。データが、４５０ｎｍにおける平均ＯＤ値として表される。
【図６】ペプスキャン（ｐｅｐｓｃａｎ）分析によって評価されるヒト組換え抗体のＩＡＰＰ結合エピトープ。（Ａ）ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の組換えヒト由来抗体（１μｇ／ｍｌ）のペプスキャン画像。ＮＩ−２０３．１９Ｈ８の結合が、アミノ酸１９〜アミノ酸２５を包含するペプチド６およびペプチド７（列Ａ）において生じた（ペプチド６：１６−ＬＶＨＳＳＮＮＦＧＡ−２５、配列番号６；ペプチド７：１９−ＳＳＮＮＦＧＡＩＬＳ−２８、配列番号８；コンセンサスな結合配列：１９−ＳＳＮＮＦＧＡ−２５、配列番号４）。ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の結合が、アミノ酸１〜アミノ酸１０を包含するペプチド１（列Ａ）において生じ（ペプチド１：１−ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱ−１０、配列番号９）、しかし、アミノ酸４〜アミノ酸１３を包含するペプチド２においては生じなかった（ペプチド２：４−ＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡ−１３、配列番号１０）。ペプチド３３〜ペプチド３９およびペプチド４１に対する残基２〜残基８におけるアラニン置換またはアラニン代替（列Ｃ）では、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の結合が損なわれた（ペプチド３３の変異：Ｃ２Ａ、ペプチド３４の変異：Ｎ３Ａ、ペプチド３５の変異：Ｔ４Ａ、ペプチド３６の変異：Ａ５Ｇ、ペプチド３７の変異：Ａ５Ｐ、ペプチド３８の変異：Ｔ６Ａ、ペプチド３９の変異：Ｃ７Ａ、ペプチド４１の変異：Ａ８Ｐ）。二次ＨＲＰコンジュゲート化ロバ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγのみ（１：２００００；ＩＩａｒｙ  Ａｂ）をコントロールとして使用した。（Ｂ）ヒトＩＡＰＰタンパク質配列の示されたアミノ酸の中における種々のヒト由来ＩＡＰＰ特異的抗体の特定された結合エピトープ。上段パネル：全長ヒトＩＡＰＰのアミノ酸配列（アミノ酸１〜アミノ酸３７）。ＮＩ：結合エピトープが特定されない。
【図７】ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の抗体は、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）と診断される患者の膵臓における病理学的なＩＡＰＰアミロイドを特異的に認識する。ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の抗体は、ＩＡＰＰ原線維（アミロイド）が負荷されるＴ２Ｄの膵島において染色を示し（Ａ、Ｂ）、しかし、ＩＡＰＰ原線維を欠くＴ２Ｄの膵島においては染色を示さない（Ｃ、Ｄ）。（Ａ）Ｔ２Ｄ患者の膵島におけるアミロイドのチオフラビンＳ染色（ＴｈｉｏＳ、左側パネル）およびコンゴーレッド染色（ＣＲ、右側パネル）。（Ｂ）ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の抗体（褐色−ＣＲ）を５０ｎＭ（大きいパネルおよび下段左側挿入図）および５ｎＭ（下段右側挿入図）で用いた、アミロイド陽性Ｔ２Ｄ膵島におけるＩＡＰＰ原線維の検出。（Ｃ）陰性のチオフラビンＳ染色（ＴｈｉｏＳ、左側パネル）およびコンゴーレッド染色（ＣＲ、右側パネル）によって示されるような、Ｔ２Ｄ患者の膵島におけるアミロイドの不在。（Ｄ）ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の抗体を５０ｎＭで用いた、アミロイド陰性Ｔ２Ｄ膵島に対する染色の不在。二次のロバ抗ヒト抗体のみ（ＩＩａｒｙ  Ａｂ）をコントロールとして使用した。下段挿入図：個々のヒト膵島の高倍率画像。ヒト膵島を抗インスリン抗体により染色し（原図（ｉ．ｏ．）では青色、本図では強い染色）、対比染色を行って、細胞核を可視化した（ｉ．ｏ．ではかすかな青色、本図ではかすかな染色）。
【図８】ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の抗体はヒトのコントロール膵臓における生理学的なＩＡＰＰを認識しない。ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の抗体（５０ｎＭ）は、ＩＡＰＰコントロール抗体（１：１００；コントロールＡｂ）と比較したとき、ヒトのコントロール膵島に対する弱い染色を示す。二次のロバ抗ヒト抗体のみ（ＩＩａｒｙ  Ａｂ）をコントロールとして使用した。ヒト膵島を抗インスリン抗体により染色し（原図（ｉ．ｏ．）では青色、本図では強い染色）、対比染色を行って、細胞核を可視化した（ｉ．ｏ．ではかすかな青色、本図ではかすかな染色）。
【図９】ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の抗体は糖尿病性ネコの膵臓における病理学的なＩＡＰＰ原線維を認識する。ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の抗体（５０ｎＭ、褐色−ＣＲ）を用いた、Ｔ２Ｄネコの膵島におけるＩＡＰＰ原線維の検出。ＩＡＰＰ原線維（アミロイド）がコンゴーレッド（ＣＲ）により染色された。二次のロバ抗ヒト抗体のみ（ＩＩａｒｙ  Ａｂ）をコントロールとして使用した。下段左側挿入図：個々のネコ膵島の高倍率画像。ネコ膵島を抗インスリン抗体により染色し（原図（ｉ．ｏ．）では青色、本図では強い染色）、対比染色を行って、細胞核を可視化した（ｉ．ｏ．ではかすかな青色、本図ではかすかな染色）。
【図１０】ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の抗体は、アルツハイマー病を有するヒトの脳における病理学的なＡβ沈着物を認識しない。Ａβ特異的抗体６Ｅ１０（１：２０００；コントロールＡｂ）とは反対に、ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の抗体（５０ｎＭ）による染色が存在しない。二次のロバ抗ヒト抗体のみ（ＩＩａｒｙ  Ａｂ）をコントロールとして使用した。対比染色を行って、細胞核を可視化した（ｉ．ｏ．ではかすかな青色、本図ではかすかな染色）。
【図１１】組換えヒト抗体および組換えマウスキメラ抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１はヒトＩＡＰＰに対して等しい親和性で結合する。（Ａ）ＩＡＰＰ（黒四角、１０μｇ／ｍｌ）およびＢＳＡ（白菱形、１０μｇ／ｍｌ）についての組換えヒト抗ＩＡＰＰ抗体および組換えマウスキメラ抗ＩＡＰＰ抗体のＥＣ５０決定。プレートを、示された濃度の抗体とインキュベーションした。測定を二回行った。データが、４５０ｎｍにおける平均ＯＤ値として表される。（Ｂ、Ｃ）ヒト抗体およびマウスキメラ抗体のＥＣ５０値。
【図１２】組換えマウスキメラ抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１は、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）と診断される患者の膵臓における病理学的なＩＡＰＰ原線維を認識する。ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１のキメラ抗体を５０ｎＭで用いた２名のヒトＴ２Ｄ患者（１および２）の膵島におけるＩＡＰＰ原線維の検出（ｉ．ｏ．では褐色、本図では強い暗色〜黒色の染色）。ヒト膵島を抗インスリン抗体により染色し（ｉ．ｏ．では青色、本図では強い染色）、対比染色を行って、細胞核を可視化した（ｉ．ｏ．ではかすかな青色、本図ではかすかな染色）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）において、遺伝的決定因子および環境的要因により、インスリン抵抗性の発現が引き起こされ、続いて、ベータ細胞量ならびにインスリン分泌およびアミリン（ｈＩＡＰＰ）分泌の代償的な増大が、正常な血中グルコースレベルを維持するために引き起こされる。その結果生じる高濃度のアミリンが、毒性のヒト膵島アミロイドポリペプチド（ｈＩＡＰＰ）オリゴマーの形成、および、２型糖尿病患者の９０％超に見出されるｈＩＡＰＰ原線維の沈着に有利に働いている。ｈＩＡＰＰの沈着はインスリン産生ベータ細胞の減少と相関しており、また、１型糖尿病の個体に移植された膵島におけるβ細胞の喪失についての役割を果たすこともまた提案されている。健康なドナーのプール、または、２型糖尿病についての危険性が高いが、疾患を有していない肥満ドナーのプールから得られるいくつかのヒト由来抗体が、国際特許出願公開ＷＯ２００８／０８１００８に詳しく記載されるようにインビトロで特定および特徴づけされ、クローン化され、そして、Ｎｅｕｒｉｍｍｕｎｅ’ｓ  ＲＴＭ（商標）技術によって組換え製造されており、また、本明細書中に提供される。様々なリード候補物が、ｈＩＡＰＰを発現し、かつ、高脂肪食にさらされる遺伝子組換えマウスにおいて有効性確認される。治療効力が、膵臓におけるベータ細胞量およびｈＩＡＰＰアミロイド負荷量ならびにｈＩＡＰＰの血漿中レベルを求めることによって、また、グルコース代謝およびインスリン分泌の機能的試験によって評価される。
【００２６】
２型糖尿病は糖尿病の最も一般的な形態であり、全症例の約９０％を占める。この疾患には、世界中で２億人を超える人々が冒されており、その結果、糖尿病による１００万人を超える死者が毎年生じている。３００、０００人を超える患者がスイスでは罹患している。糖尿病の有病率が、人口増加、加齢、都市化、ならびに、肥満および運動不足の増大する蔓延のために先進国および開発途上国の両方で劇的に増大し続けている。２５０億ＵＳドルという世界的な２型糖尿病市場が、２００９年から２０１６年までの間に６．４％の年複利成長率により２０１６年までに３５０億ＵＳドルに達すると予測されている。現在の処置には、食事管理、および、インスリン感受性を改善することによる、または、膵臓を刺激してインスリンを放出させることによる、血中グルコースレベルを低下させるための種々の経路に作用する薬理学的介入が含まれる。しかしながら、これらの利用可能な処置のどれもがｈＩＡＰＰの凝集および膵臓ベータ細胞の喪失を阻止することができない。２型糖尿病のための新しい処置戦略は、グルカゴン−ペプチド１（ＧＬＰ−１）のアナログ、および、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）（すなわち、内因性ＧＬＰ−１を不活性化する酵素）の阻害剤を伴う。これらの戦略は、ＧＬＰ−１の強力なインスリン分泌効果、および、ベータ細胞の増殖を高めるその効果に基づいている。重要なことに、増大したインスリン放出はまた、増大したアミリン放出に連動する。実験的には、刺激されたインスリン分泌が膵島アミロイドーシスの発現を動物モデルにおいて促進させることが示されており、類似する影響がヒトにおいて予想され得る。したがって、本発明のＩＡＰＰ結合性分子の特定の使用のほかに、さらなる提案された治療的取り組みは、これらの分子と上記で示された新規な処置との魅力的な併用療法であり得る。
【００２７】
Ｉ．定義
別途言及されない限り、本明細書中で使用されるような用語には、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年、２０００年改訂および２００３年再版、ＩＳＢＮ  ０  １９  ８５０６７３  ２）において提供されるような定義が与えられる。
【００２８】
用語「ａ」または「ａｎ」を伴う実体はそのような実体の１つまたは複数を示すことに留意しなければならない；例えば、「ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ」（抗体）は１つまたは複数の抗体を表すことが理解される。そのようなものとして、用語「ａ」（または「ａｎ」）、  「ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ」（１つまたは複数）および  「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ」（少なくとも１つ）は、本明細書中では交換可能に使用され得る。
【００２９】
別途具体的に示されない場合、用語「ＩＡＰＰ」は、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）の生来的なモノマー形態、オリゴマー形態、非原線維性形態および原線維性形態を具体的に示すために交換可能に使用される。用語「ＩＡＰＰ」はまた、ＩＡＰＰの他の配座異性体、例えば、ＩＡＰＰのオリゴマーおよび／または凝集物（例えば、ＩＡＰＰ原線維など）を一般的に特定するために使用される。
【００３０】
用語「ＩＡＰＰ」はまた、ＩＡＰＰのすべてのタイプおよび形態を総称的に示すために使用される。ｐｒｏＩＡＰＰの用語は、膵島アミロイドポリペプチドの前駆体ペプチド（ｐｒｏＩＡＰＰ）の生来的なモノマー形態、オリゴマー形態、原線維性形態および／または凝集型形態を具体的に示すために交換可能に使用される。ＩＡＰＰまたはｐｒｏＩＡＰＰの用語の前における追加の文字は、その具体的なオルソログが由来する生物を示すために使用され、例えば、ｈＩＡＰＰはヒトＩＡＰＰのために使用され、または、ｍＩＡＰＰはマウス起源のために使用される。
【００３１】
ヒトＩＡＰＰについての３７ａａのアミノ酸配列は、２位および７位のシステイン残基の間におけるジスルフィド架橋と、アミド化されたＣ末端とを有するＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＡＩＬＳＳＴＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号１）である。
【００３２】
ＩＡＰＰは、プレプロホルモンのｐｒｅｐｒｏＩＡＰＰ、すなわち、膵臓のβ細胞において産生される８９アミノ酸前駆体からプロセシングされる。ヒトｐｒｅｐｒｏＩＡＰＰについてのタンパク質配列が、ＭＧＩＬＫＬＱＶＦＬＩＶＬＳＶＡＬＮＨＬＫＡＴＰＩＥＳＨＱＶＥＫＲＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＡＩＬＳＳＴＮＶＧＳＮＴＹＧＫＲＮＡＶＥＶＬＫＲＥＰＬＮＹＬＰＬ（配列番号２）であり、そのような配列が、関連のあるデータベースにおいて、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースにおいても見出される場合がある（ＵｎｉＰｒｏｔＩＤ：Ｐ１０９９７（ＩＡＰＰ＿ＨＵＭＡＮ））。
【００３３】
ｐｒｅｐｒｏＩＡＰＰはプロ膵島アミロイドポリペプチドに翻訳後速やかに切断される。ヒトｐｒｏＩＡＰＰについてのタンパク質配列が、ＴＰＩＥＳＨＱＶＥＫＲＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＡＩＬＳＳＴＮＶＧＳＮＴＹＧＫＲＮＡＶＥＶＬＫＲＥＰＬＮＹＬＰＬ（配列番号３）であり、これは、さらなるタンパク質分解および翻訳後修飾を受けて、ｈＩＡＰＰをもたらす。
【００３４】
「野生型」または組換えのヒトＩＡＰＰ、ヒトｐｒｏＩＡＰＰおよびヒトｐｒｅｐｒｏＩＡＰＰのアミノ酸配列が、配列番号１〜配列番号３による上述の配列によって表される。
【００３５】
本明細書中に開示されるヒト抗ＩＡＰＰ抗体およびヒト抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体は、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰならびにそれらのエピトープと特異的に結合し、また、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰならびにそれらのエピトープの様々な立体配座に特異的に結合する。例えば、本明細書中には、病理学的に凝集したＩＡＰＰ形態および／またはｐｒｏＩＡＰＰ形態、例えば、非原線維性オリゴマーおよび／または原線維性オリゴマー／原線維、ならびに／あるいは、それらの混合形態からなる凝集物などと特異的に結合する抗体が開示される。ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの（病理学的に）凝集した／凝集物の用語は、上述の形態を具体的に示すために交換可能に使用される。（病理学的に）「凝集した形態（凝集型形態）」または「凝集物」の用語は、本明細書中で使用される場合、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの相互の誤った／病理学的な相互作用に起因する蓄積またはクラスター形成の産物を記述する。これらの凝集物、蓄積物またはクラスター形態は、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの両方、非原線維性オリゴマーおよび／または原線維性オリゴマーならびにそれらの原線維である場合があり、あるいは、そのようなものから実質的になる場合があり、あるいは、そのようなものからなる場合がある。本明細書中で使用される場合、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰと「特異的に結合する」、「選択的に結合する」、または、「優先的に結合する」抗体に対する言及は、関係のない他のタンパク質と結合しない抗体を示す。一例において、本明細書中に開示されるＩＡＰＰ抗体および／またはｐｒｏＩＡＰＰ抗体は、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰあるいはそのエピトープと結合することができ、かつ、他のタンパク質についてはバックグラウンドの約２倍を超える結合を示さない。所与のＩＡＰＰ配座異性体および／またはｐｒｏＩＡＰＰ配座異性体と「特異的に結合する」または「選択的に結合する」抗体は、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのすべての立体配座と結合するわけではない抗体、すなわち、少なくとも１つの他のＩＡＰＰ配座異性体および／またはｐｒｏＩＡＰＰ配座異性体と結合しない抗体を示す。例えば、本明細書中には、インビトロにおいて、また、明白なＴ２Ｄを有する患者、または、Ｔ２Ｄを発症する危険性がある患者から得られる組織においてそれらの両方で凝集型形態のＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに優先的に結合することができる抗体が開示される。本発明のヒトＩＡＰＰ抗体および／またはｐｒｏＩＡＰＰ抗体は、健康なヒト対象のプールから、あるいは、Ｔ２Ｄを発症する高まった危険性を有するが、抗体単離時にはＴ２Ｄの徴候を何ら示さなかった、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに特異的な免疫応答を示す肥満患者群および他の患者群のプールから単離されているので、本発明のＩＡＰＰ抗体および／またはｐｒｏＩＡＰＰ抗体はまた、そのような抗体が、実際に対象によって発現されたものであり、かつ、例えば、ヒト免疫グロブリン発現ファージライブラリー（これまでは、ヒト様抗体を提供しようとするための１つの一般的な方法を表していた）からは単離されていないことを強調するために「ヒト自己抗体」と呼ばれることもある。
【００３６】
用語「ペプチド」は、その意味の範囲内において、（時には本明細書中では交換可能に使用されることがある）用語「ポリペプチド」および用語「タンパク質」を包含することが理解される。同様に、タンパク質およびポリペプチドのフラグメントもまた包含され、タンパク質およびポリペプチドのフラグメントは本明細書中では「ペプチド」と称される場合がある。それにもかかわらず、用語「ペプチド」は好ましくは、少なくとも５個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味し、好ましくは少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味し、より好ましくは少なくとも１５個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味し、さらにより好ましくは少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味し、特に好ましくは少なくとも２５個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味する。加えて、本発明によるペプチドは典型的には、最大でも１００個の連続するアミノ酸を有し、好ましくは８０個未満の連続するアミノ酸を有し、より好ましくは５０個未満の連続するアミノ酸を有する。
【００３７】
ポリペプチド：
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、１つだけの「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直鎖状に連結されるモノマー（アミノ酸）から構成される分子を示す。用語「ポリペプチド」は、２個以上のアミノ酸の任意の鎖（１つまたは複数）を示し、生成物の特定の長さを示さない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または、２個以上のアミノ酸の鎖（１つまたは複数）を示すために使用される任意の他の用語が、「ポリペプチド」の定義の範囲に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、または、これらの用語のどれとも交換可能に使用される場合がある。
【００３８】
用語「ポリペプチド」はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、および、知られている保護基／ブロック基、タンパク質分解的切断による誘導体化、または、天然に存在しないアミノ酸による修飾を含めて、当該ポリペプチドの発現後修飾の産物を示すことが意図される。ポリペプチドは天然の生物学的供給源に由来してもよく、または、組換え技術によって産生されてもよいが、指定された核酸配列から必ずしも翻訳されない。ポリペプチドは、化学合成による様式を含めて、どのような様式において作製されてもよい。
【００３９】
本発明のポリペプチドは、約３個以上のアミノ酸のサイズ、５個以上のアミノ酸のサイズ、１０個以上のアミノ酸のサイズ、２０個以上のアミノ酸のサイズ、２５個以上のアミノ酸のサイズ、５０個以上のアミノ酸のサイズ、７５個以上のアミノ酸のサイズ、１００個以上のアミノ酸のサイズ、２００個以上のアミノ酸のサイズ、５００個以上のアミノ酸のサイズ、１，０００個以上のアミノ酸、または、２，０００個以上のアミノ酸のサイズである場合がある。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有する場合があるが、ポリペプチドはそのような構造を必ずしも有さない。規定された三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれたとして示される。規定された三次元構造を有するのではなく、むしろ、非常に多数の異なる立体配座を取ることができるポリペプチドは、折り畳まれていないとして示される。本明細書中で使用される場合、糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基（例えば、セリン残基またはアスパラギン残基）の酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介して当該タンパク質に結合する少なくとも１つの炭水化物成分に連結されるタンパク質を示す。
【００４０】
「単離された」ポリペプチドあるいはそのフラグメント、変異体または誘導体によって、その天然の環境に存在していないポリペプチドが意図される。特定の精製レベルは何ら要求されない。例えば、単離されたポリペプチドはその生来的な環境または天然の環境から取り出され得る。宿主細胞において発現される組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の好適な技術によって分離されているか、分画されているか、あるいは、部分的または実質的に精製されている生来的ポリペプチドまたは組換えポリペプチドのように、本発明の様々な目的のために単離されていると見なされる。
【００４１】
「組換え（の）ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質」は、組換えＤＮＡ技術によって産生される、すなわち、所望されるペプチドを含む融合タンパク質をコードする外因性の組換えＤＮＡ発現構築物によって形質転換される細胞（微生物細胞または哺乳動物細胞）から産生される、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を示す。ほとんどの細菌培養物において発現されるタンパク質またはペプチドは典型的にはグリカンを含まないであろう。酵母において発現されるタンパク質またはペプチドは、哺乳動物細胞において発現されるものとは異なるグリコシル化パターンを有する場合がある。
【００４２】
本発明のポリペプチドとして、前記ポリペプチドのフラグメント、誘導体、アナログまたは変異体、および、それらの任意の組合せも含まれる。用語「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」および「アナログ」には、天然ペプチドのアミノ酸配列に十分に類似するアミノ酸配列を有するペプチドおよびポリペプチドが含まれる。用語「十分に類似する」は、第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列が共通の構造的ドメインおよび／または共通の機能的活性を有するように、第２のアミノ酸配列に対する十分な数または最小数の同一アミノ酸残基または等価なアミノ酸残基を含有する第１のアミノ酸配列を意味する。例えば、共通の構造的ドメインを含むアミノ酸配列で、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または少なくとも約１００％が同一であるアミノ酸配列は、十分に類似するとして本明細書中では定義される。好ましくは、変異体は、本発明の好ましいペプチドのアミノ酸配列に、特に、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰ、あるいは、それらのどちらかのフラグメント、変異体、誘導体またはアナログのアミノ酸配列に十分に類似しているであろう。そのような変異体は一般に、本発明のペプチドの機能的活性を保持する。変異体には、１つまたは複数のアミノ酸欠失、アミノ酸付加および／またはアミノ酸置換によって生来型ペプチドおよびｗｔ型ペプチドとはアミノ酸配列においてそれぞれ異なるペプチドが含まれる。これらは、天然に存在する変異体、ならびに、人為的に設計された変異体である場合がある。
【００４３】
さらに、用語「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」および「アナログ」は、本発明の抗体または抗体ポリペプチドに言及するときには、対応する生来型の結合性分子、抗体またはポリペプチドの抗原結合特性の少なくとも一部を保持するどのようなポリペプチドも含まれる。本発明のポリペプチドのフラグメントには、本明細書中の他のところで議論される具体的な抗体フラグメントに加えて、タンパク質分解的フラグメント、ならびに、欠失フラグメントが含まれる。本発明の抗体および抗体ポリペプチドの変異体には、上記で記載されるようなフラグメント、および、アミノ酸の置換、欠失または挿入に起因する変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。変異体は天然に存在している場合があり、または、天然に存在していない場合がある。天然に存在していない変異体は、この技術分野において知られている変異誘発技術を使用して作製される場合がある。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸置換、アミノ酸欠失またはアミノ酸付加を含む場合がある。ＩＡＰＰ特異的および／またはｐｒｏＩＡＰＰ特異的な結合性分子の誘導体、例えば、本発明の抗体および抗体ポリペプチドの誘導体は、生来型ポリペプチドに対して見出されないさらなる特徴を示すように変化させられているポリペプチドである。例には、融合タンパク質が挙げられる。変異体ポリペプチドは、本明細書中では「ポリペプチドアナログ」として示される場合もある。本明細書中で使用される場合、結合性分子もしくはそのフラグメント、抗体または抗体ポリペプチドの「誘導体」は、官能側鎖基の反応によって化学的に誘導体化される１つまたは複数の残基を有する当該ポリペプチドを示す。また、「誘導体」として、２０個の標準的アミノ酸の１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するそのようなペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシｐｒｏリンがｐｒｏリンの代わりに使用されてもよい；５−ヒドロキシリシンがリシンの代わりに使用されてもよい；３−メチルヒスチジンがヒスチジンの代わりに使用されてもよい；ホモセリンがセリンの代わりに使用されてもよい；また、オルニチンがリシンの代わりに使用されてもよい。
【００４４】
分子の類似性および／または同一性の決定：
２つのペプチドの間における「類似性」が、一方のペプチドのアミノ酸配列を第２のペプチドの配列に対して比較することによって求められる。一方のペプチドのアミノ酸が同一であるか、または、保存的なアミノ酸置換であるならば、一方のペプチドのアミノ酸は第２のペプチドの対応するアミノ酸と類似している。保存的な置換には、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．編、Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７８））に記載される置換、および、Ａｒｇｏｓ、ＥＭＢＯ  Ｊ．８（１９８９）、７７９〜７８５に記載される置換が含まれる。例えば、下記の群の１つに属するアミノ酸は、保存的な変化または置換を表す：−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；および、−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
【００４５】
２つのポリヌクレオチドの間における「類似性」が、一方のポリヌクレオチドの核酸配列を所与のポリヌクレオチドの配列に対して比較することによって求められる。一方の核酸が同一であるならば、または、核酸がコード配列の一部である場合、当該核酸を含むそれぞれのトリプレットが、同じアミノ酸または保存的なアミノ酸置換をコードするならば、一方のポリヌクレオチドの核酸は第２のポリヌクレオチドの対応する核酸と類似している。
【００４６】
２つの配列の間におけるパーセント同一性またはパーセント類似性の決定が好ましくは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５８７７）の数学的アルゴリズムを使用して達成される。そのようなアルゴリズムが、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｅ）において利用可能なＡｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０）のＢＬＡＳＴｎプログラムおよびＢＬＡＳＴｐプログラムに組み込まれる。
【００４７】
パーセント同一性またはパーセント類似性の決定が、ＮＣＢＩのウエブページで推奨されるような、また、特定の長さおよび組成の配列に関しての「ＢＬＡＳＴ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ」に記載されるようなＢＬＡＳＴｎプログラムおよびＢＬＡＳＴｐプログラムの標準的なパラメーターを用いて行われる。
【００４８】
ＢＬＡＳＴポリヌクレオチド検索が、ＢＬＡＳＴｎプログラムを用いて行われる。
一般的なパラメーターについては、「Ｍａｘ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ボックスが１００に設定される場合があり、「Ｓｈｏｒｔ  ｑｕｅｒｉｅｓ」ボックスにチェックが入れられる場合があり、「Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」ボックスが１０００に設定される場合があり、「Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ」ボックスが７に設定される場合があり、これらはＮＣＢＩのウエブページにおいて短い配列（２０塩基未満）について推奨される通りである。より長い配列については、「Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」ボックスが１０に設定される場合があり、「Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ」ボックスが１１に設定される場合がある。スコア化パラメーターについては、「Ｍａｔｃｈ／ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｓｃｏｒｅｓ」が、１、−２に設定される場合があり、「Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ」ボックスが直線に設定される場合がある。フィルターおよびマスキングパラメーターについては、「Ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ」ボックスにチェックが入れられない場合があり、「Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ」ボックスにチェックが入れられない場合があり、「Ｍａｓｋ  ｆｏｒ  ｌｏｏｋｕｐ  ｔａｂｌｅ  ｏｎｌｙ」ボックスにチェックが入れられる場合があり、「ＤＵＳＴ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｓｅｔｔｉｎｇｓ」にチェックが入れられる場合があり、「Ｍａｓｋ  ｌｏｗｅｒ  ｃａｓｅ  ｌｅｔｔｅｒｓ」ボックスにチェックが入れられない場合がある。一般に、「Ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｈｏｒｔ  ｎｅａｒｌｙ  ｅｘａｃｔ  ｍａｔｃｈｅｓ」がこの点に関して使用される場合があり、これにより、上記で示された設定のほとんどが提供される。この点に関してのさらなる情報は、ＮＣＢＩのウエブページで公開される「ＢＬＡＳＴ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ」に見出される場合がある。
【００４９】
ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴｐプログラムを用いて行われる。一般的なパラメーターについては、「Ｍａｘ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ボックスが１００に設定される場合があり、「Ｓｈｏｒｔ  ｑｕｅｒｉｅｓ」ボックスにチェックが入れられる場合があり、「Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」ボックスが１０に設定される場合があり、「Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ」ボックスが「３」に設定される場合がある。スコア化パラメーターについては、「Ｍａｔｒｉｘ」ボックスが「ＢＬＯＳＵＭ６２」に設定される場合があり、「Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ」ボックスが「Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１」に設定される場合があり、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ”ボックスが“Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ”に設定される場合がある。フィルターおよびマスキングパラメーターについては、“Ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ」ボックスにチェックが入れられない場合があり、「Ｍａｓｋ  ｆｏｒ  ｌｏｏｋｕｐ  ｔａｂｌｅ  ｏｎｌｙ」ボックスにチェックが入れられない場合があり、「Ｍａｓｋ  ｌｏｗｅｒ  ｃａｓｅ  ｌｅｔｔｅｒｓ」ボックスにチェックが入れられない場合がある。
【００５０】
両方のプログラムの改変、例えば、検索された配列の長さに関しての改変は、ＮＣＢＩのウエブページにおいてＨＴＭＬ版およびＰＤＦ版で公開される「ＢＬＡＳＴ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ」における推奨に従って行われる。
【００５１】
ポリヌクレオチド：
用語「ポリヌクレオチド」は、１つだけの核酸ならびに複数の核酸を包含することが意図され、単離された核酸分子または核酸構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を示す。ポリヌクレオチドは、従来型のホスホジエステル結合または非従来型の結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見出されるアミド結合など）を含む場合がある。用語「核酸」は、ポリヌクレオチドに存在するいずれかの１つまたは複数の核酸セグメント（例えば、ＤＮＡフラグメントまたはＲＮＡフラグメント）を示す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドによって、その生来的環境から取り出されている核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が意図される。例えば、ベクターに含有される、抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の様々な目的のために単離されていると見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種の宿主細胞において維持される組換えポリヌクレオチド、または、溶液における（部分的または実質的に）精製されたポリペプチドが含まれる。単離されたＲＮＡ分子には、本発明のポリヌクレオチドのインビボＲＮＡ転写物またはインビトロＲＮＡ転写物が含まれる。本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸にはさらに、合成的に作製されるそのような分子が含まれる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節エレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位または転写ターミネーターなどである場合があり、あるいは、調節エレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位または転写ターミネーターなどを包含する場合がある。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないにもかかわらず、コード領域の一部であると見なされる場合があるが、近接配列はどれも、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどはコード領域の一部ではない。本発明の２つ以上のコード領域を、１つのポリヌクレオチド構築物において、例えば、１つのベクターに存在させることができ、または、別個のポリヌクレオチド構築物において、例えば、別個の（異なる）ベクターに存在させることができる。さらには、ベクターはどれも、１つだけのコード領域を含有する場合があり、または、２つ以上のコード領域を含む場合があり、例えば、１つのベクターが免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードする場合がある。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、結合性分子、抗体、あるいは、そのフラグメント、変異体または誘導体をコードする核酸に融合されて、または融合されずに、異種のコード領域をコードする場合がある。異種のコード領域には、限定されないが、特殊化されたエレメントまたはモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチドまたは異種の機能的ドメインなどが含まれる。
【００５３】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは通常、１つまたは複数のコード領域と操作可能に連係させられるプロモーターならびに／あるいは他の転写制御エレメントまたは翻訳制御エレメントを含む場合がある。操作可能連係は、遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）のためのコード領域が、当該遺伝子産物の発現を当該調節配列の影響下または制御下に置くような様式で１つまたは複数の調節配列と連係させられるときにおいてである。２つのＤＮＡフラグメント（例えば、ポリペプチドコード領域およびそれと連係させられるプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘導により、所望される遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が生じるならば、また、これら２つのＤＮＡフラグメントの間における連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現調節配列の能力を妨げないか、または、転写されるＤＮＡテンプレートの能力を妨げないならば、「操作可能に連係させられる」または「操作可能に連結される」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写を達成することができたならば、ポリペプチドをコードする核酸と操作可能に連係させられているであろう。プロモーターは、ＤＮＡの実質的な転写を所定の細胞においてのみ導く細胞特異的なプロモーターである場合がある。プロモーターのほかに、他の転写制御エレメントを、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終結シグナルを、細胞特異的な転写を導くためにポリヌクレオチドと操作可能に連係させることができる。好適なプロモーターおよび他の転写制御領域が本明細書中に開示される。
【００５４】
様々な転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、サイトメガロウイルス由来のプロモーターセグメントおよびエンハンサーセグメント（前初期プロモーター、イントロンＡとの併用で）、シミアンウイルス４０由来のプロモーターセグメントおよびエンハンサーセグメント（初期プロモーター）、ならびに、レトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーターセグメントおよびエンハンサーセグメントなど（これらに限定されない）が含まれる。他の転写制御領域には、脊椎動物の遺伝子（例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ−グロビンなど）に由来する転写制御領域ならびに遺伝子発現を真核生物細胞において制御することができる他の配列が含まれる。さらなる好適な転写制御領域には、組織特異的なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに、リンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能であるプロモーター）が含まれる。
【００５５】
同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始コドンおよび翻訳終結コドン、ならびに、ピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位、すなわち、ＩＲＥＳ、これはまたＣＩＴＥ配列とも称する）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードし、これにより、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を導くさらなるコード領域と連係させられる場合がある。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を横断する成長途中のタンパク質鎖の移行が開始されると、成熟型タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは一般に、当該ポリペプチドのＮ末端に融合されるシグナルペプチドで、当該ポリペプチドの分泌型形態または「成熟型」形態をもたらすために、完全なポリペプチドまたは「全長」のポリペプチドから切断されるシグナルペプチドを有することを承知している。特定の実施形態において、生来型のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖のシグナルペプチドが使用されるか、または、操作可能に連係させられるポリペプチドの分泌を導く能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。代替では、異種の哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能的誘導体が使用されてもよい。例えば、野生型のリーダー配列がヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列により置き換えられる場合がある。
【００５８】
「結合性分子」は、本発明に関連して使用される場合、主として抗体およびそのフラグメントに関し、しかし、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに結合する他の非抗体分子を示す場合もあり、これらには、ホルモン、受容体、リガンド、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、シャペロン（例えば、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）など）、ならびに、細胞・細胞接着分子（例えば、カドヘリンスーパーファミリー、インテグリンスーパーファミリー、Ｃ型レクチンスーパーファミリーおよび免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーなど）が含まれるが、これらに限定されない。したがって、明瞭性だけのために、また、本発明の範囲を限定することなく、下記の実施形態のほとんどが、治療剤および診断剤を開発するための好ましい結合性分子を代表する抗体および抗体様分子に関して議論される。
【００５９】
抗体：
用語「抗体」および用語「免疫グロブリン」は本明細書中では交換可能に使用される。抗体または免疫グロブリンは、重鎖の可変ドメインを少なくとも含み、かつ、通常の場合には重鎖および軽鎖の可変ドメインを少なくとも含むＩＡＰＰ結合性分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子である。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は比較的よく理解されている（例えば、Ｈａｒｌｏｗ他、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）を参照のこと）。
【００６０】
より詳しく下記で議論されるように、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に識別することができる様々な幅広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として、それらの中のいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）を伴って分類されることを理解するであろう。抗体の「クラス」を、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＥとしてそれぞれ決定するのが、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などが十分に特徴づけられており、また、機能的な特殊化を与えることが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの改変された型が、本開示を考慮して当業者には容易に認識可能であり、従って、本発明の範囲内である。すべての免疫グロブリンクラスが明らかに本発明の範囲内であり、下記の議論は一般に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関する。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量がおよそ２３，０００ダルトンである２つの同一の軽鎖ポリペプチドと、分子量が５３，０００〜７０，０００である２つの同一の重鎖ポリペプチドとを含む。これら４つの鎖は典型的には、軽鎖が、「Ｙ」字型の口部から始まり、可変領域の終わりまで続く腕木として重鎖を支える「Ｙ」字型の立体配置でジスルフィド結合によって結合される。
【００６１】
軽鎖はカッパまたはラムダ（κ、λ）のどちらかとして分類される。それぞれの重鎖クラスがカッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のどちらかと結合し得る。一般には、免疫グロブリンが、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、または、遺伝子操作された宿主細胞のどれかによって生じるとき、軽鎖および重鎖は互いに共有結合により結合し、２つの重鎖の「テール」部分が共有結合性のジスルフィド連結または非共有結合性の連結によって互いに結合する。重鎖において、アミノ酸配列が、Ｙ字型の立体配置の二叉末端におけるＮ末端から、それぞれの鎖の底部におけるＣ末端にまで延びる。
【００６２】
軽鎖および重鎖はともに、構造的および機能的に相同的である領域に分けられる。用語「定常」および「可変」が機能的に使用される。これに関連して、軽鎖部分および重鎖部分の両方の可変ドメイン（ＶＬおよびＶＨ）により、抗原認識および特異性が決定されることが理解されるであろう。逆に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）により、様々な重要な生物学的性質、例えば、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合および補体結合などが与えられる。慣例によって、定常領域ドメインの番号づけは、これらのドメインが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になるにつれて大きくなる。Ｎ末端部分が可変領域であり、Ｃ末端部分が定常領域である；ＣＨ３ドメインおよびＣＬドメインが実際に、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端をそれぞれ含む。
【００６３】
上記で示されるように、可変領域により、抗体は抗原上のエピトープを選択的に認識し、かつ、このエピトープと特異的に結合することができる。すなわち、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメイン、または、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、三次元の抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この四元抗体構造が、Ｙ字型のそれぞれのアームの端部に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位がＶＨ鎖およびＶＬ鎖のそれぞれにおける３つのＣＤＲによって規定される。ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに特異的に結合するための十分な構造を含有する抗体または免疫グロブリンフラグメントはどれも、本明細書中では交換可能に、「結合フラグメント」または「免疫特異性フラグメント」として示される。
【００６４】
天然に存在する抗体において、抗体は、抗体がその三次元立体配置を水性環境において取るような抗原結合ドメインを形成するために特異的に配置されるアミノ酸の短い不連続な配列である６つの超可変領域（これらは時には、それぞれの抗原結合ドメインに存在する「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる）を含む。「ＣＤＲ」には、分子間の変動性をそれほど示さない４つの比較的保存された「フレームワーク」領域または「ＦＲ」が近接する。これらのフレームワーク領域は主としてβ−シートの立体配座を取り、ＣＤＲにより、このβ−シート構造をつなぐ、また、時にはこのβ−シート構造の一部を形成するループが形成される。したがって、フレームワーク領域は、ＣＤＲを鎖間の非共有結合性の相互作用によって正しい配向で配置することを提供する足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインにより、免疫反応性抗原におけるエピトープに対して相補的な表面が規定される。この相補的な表面は、抗体がその同種エピトープに非共有結合的に結合することを促進させる。ＣＤＲおよびフレームワーク領域を構成するアミノ酸が、それらは正確に規定されているので、当業者によっていずれかの所与の重鎖可変領域または軽鎖可変領域についてそれぞれ容易に特定され得る；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｋａｂａｔ，Ｅ．他編、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９８３）、および、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）、９０１〜９１７を参照のこと（これらはその全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【００６５】
この技術分野において使用される、および／または受け入れられる用語の２つ以上の定義が存在する場合には、本明細書中で使用されるような当該用語の定義は、反するようなことが明示的に言及される場合を除き、すべてのそのような意味を包含することが意図される。具体的な一例が、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域の中に見出される不連続な抗原結合部位を記述するための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。この特定の領域が、Ｋａｂａｔ他、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって、また、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）、９０１〜９１７によって記載されており（これらは参照によって本明細書中に組み込まれる）、この場合、それらの定義は、互いに比較されたときにはアミノ酸残基の重複またはサブセットを包含する。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のＣＤＲを示すためのどちらかの定義の適用は、本明細書中で定義され、かつ使用されるようなこの用語の範囲内であることが意図される。上記で引用された参考文献のそれぞれによって定義されるようなＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基が、比較として下記において表１に示される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列およびサイズに依存して変わる。当業者は、どの残基が、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられる抗体のヒトＩｇＧサブタイプの特定の超可変領域またはＣＤＲを含むかを常法により決定することができる。
【００６６】
表１：ＣＤＲの定義１
【表１】
2018057381.tif 000002
１表１におけるすべてのＣＤＲ定義の番号表記は、Ｋａｂａｔ他によって示される番号表記慣例に従う（下記を参照のこと）。
【００６７】
Ｋａｂａｔ他はまた、どのような抗体に対しても適用可能である可変ドメイン配列のための番号表記システムを定義した。当業者は、「Ｋａｂａｔ番号表記」のこのシステムを、配列そのものを超える実験的データに何ら頼ることなく、どのような可変ドメイン配列に対してでも一義的に割り当てることができる。本明細書中で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号表記」は、Ｋａｂａｔ他、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって示される番号表記システムを示す。別途指定される場合を除き、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体における具体的なアミノ酸残基位置の番号表記に対する言及は、Ｋａｂａｔ番号表記システムに従っており、しかしながら、Ｋａｂａｔ番号表記システムは理論的であり、本発明のどの抗体にも等しく適用されない場合がある。例えば、最初のＣＤＲの位置に依存して、その後のＣＤＲはどちらかの方向でずれる場合がある。
【００６８】
本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、免疫特異性フラグメント、変異体または誘導体には、ポリクローナル性、モノクローナル性、多特異性、ヒト型、ヒト化型、霊長類化型、マウス化型またはキメラ型の抗体、単鎖抗体、エピトープ結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２）、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのどちらかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作製されるフラグメント、ならびに、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書中に開示される抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が含まれるが、これらに限定されない。ｓｃＦＶ分子がこの技術分野では知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載される。本発明の免疫グロブリン分子または抗体分子は、免疫グロブリン分子のどのようなタイプのものも（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、どのようなクラスのものも（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはどのようなサブクラスのものも可能である。
【００６９】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、五価構造を有するＩｇＭまたはその誘導体ではない。特に、本発明の具体的な適用において、とりわけ治療的使用において、ＩｇＭはＩｇＧおよび他の二価抗体または対応する結合性分子よりも有用でない。これは、ＩｇＭは、その五価構造のために、また、親和性成熟化の欠如のために、非特異的な交差反応性および非常に低い親和性を示すことが多いからである。
【００７０】
特に好ましい実施形態において、本発明の抗体はポリクローナル抗体でない。すなわち、本発明の抗体は、血漿の免疫グロブリンサンプルから得られる混合物ではなく、むしろ、１つの特定の抗体種から実質的になる。
【００７１】
単鎖抗体を含めて、抗体フラグメントは、可変領域（１つまたは複数）を単独で、あるいは、下記の全体または一部分との組合せで含む場合がある：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。また、本発明には、可変領域（１つまたは複数）と、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとのどのような組合せをも含むＩＡＰＰ結合フラグメントおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合フラグメントが含まれる。本発明の抗体またはその免疫特異性フラグメントは、鳥類および哺乳動物を含めて、どのような動物起源に由来してもよい。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマまたはニワトリの抗体である。別の実施形態において、可変領域が起源において（例えば、サメからの）コンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）である場合がある。
【００７２】
１つの態様において、本発明の抗体は、ヒトから単離されるヒトモノクローナル抗体である。場合により、ヒト抗体のフレームワーク領域がデータベースにおける該当するヒト生殖系列可変領域配列に従ってアライメントされ、それらと一致させられる；例えば、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）によって提供されるＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を参照のこと。例えば、真の生殖系列配列から潜在的に逸脱すると見なされるアミノ酸は、クローニング過程の期間中に組み込まれるＰＣＲプライマー配列に起因し得ると思われる。人為的に作製されたヒト様抗体、例えば、ファージディスプレーされた抗体ライブラリーまたは異種マウスに由来する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦＶ）などと比較した場合、本発明のヒトモノクローナル抗体は、（ｉ）代理動物の免疫応答ではなく、ヒトの免疫応答を使用して得られること、すなわち、抗体が、ヒト体内におけるその関連する立体配座における天然のＩＡＰＰまたはｐｒｏＩＡＰＰに対する応答で作製されていること、（ｉｉ）個体を保護しているか、あるいは、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの存在について少なくとも有意であること、そして、（ｉｉｉ）抗体がヒト起源であるので、自己抗原に対する交差反応性の危険性が最小限に抑えられることによって特徴づけられる。したがって、本発明によれば、用語「ヒトモノクローナル抗体」、「ヒトモノクローナル自己抗体」および「ヒト抗体」などは、ヒト起源である、すなわち、ヒト細胞（例えば、Ｂ細胞またはそのハイブリドーマなど）から単離されているか、あるいは、ｃＤＮＡがヒト細胞（例えば、ヒトメモリーＢ細胞）のｍＲＮＡから直接クローン化されているＩＡＰＰ結合性分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子を示すために使用される。ヒト抗体は、アミノ酸置換が、例えば、結合特性を改善するために、当該抗体においてたとえ行われるにしても、依然として「ヒト」である。
【００７３】
ヒト免疫グロブリンライブラリーに由来する抗体、あるいは、１つまたは複数のヒト免疫グロブリンについて遺伝子組換えであり、かつ、内因性免疫グロブリンを発現しない動物に由来する抗体（下記において、また、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ他）に記載されるような抗体）は、本発明の真のヒト抗体から区別するためにヒト様抗体として示される。
【００７４】
例えば、ヒト様抗体の重鎖および軽鎖の対形成、例えば、ファージディスプレーから典型的には単離される合成抗体および半合成抗体などは、その対形成が元々のヒトＢ細胞において生じていたような元の対形成を必ずしも反映していない。したがって、先行技術において一般に使用されるような組換え発現ライブラリーから得られるＦａｂフラグメントおよびｓｃＦｖフラグメントは、免疫原性および安定性に対するすべての可能な関連した影響に関して人為的であると見なされる。
【００７５】
対照的には、本発明は、その治療的有用性およびヒトにおけるその寛容性によって特徴づけられる、選択されたヒト対象から得られる単離された親和性成熟している抗体を提供する。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、用語「齧歯類化（された）抗体」または「齧歯類化（された）免疫グロブリン」は、本発明のヒト抗体に由来する１つまたは複数のＣＤＲと、齧歯類抗体配列に基づくアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含有するヒトフレームワーク領域とを含む抗体を示す。齧歯類を示すとき、好ましくは、マウスおよびラットに起源を有する配列が使用され、この場合、そのような配列を含む抗体は、「マウス化された」または「ラット化された」としてそれぞれ示される。ＣＤＲを提供するヒト免疫グロブリンは「親」または「アクセプター」と呼ばれ、フレームワークの変化を提供する齧歯類抗体は「ドナー」と呼ばれる。定常領域は存在している必要はないが、定常領域が存在するならば、定常領域は通常、齧歯類抗体の定常領域と実質的に同一であり、すなわち、少なくとも約８５％〜９０％が同一であり、好ましくは約９５％以上が同一である。したがって、いくつかの実施形態において、全長のマウス化されたヒト重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖免疫グロブリンは、マウスの定常領域、ヒトのＣＤＲ、および、いくつかの「マウス化する」アミノ酸置換を有する実質的にはヒトのフレームワークを含有する。典型的には、「マウス化抗体」は、マウス化された可変軽鎖および／またはマウス化された可変重鎖を含む抗体である。例えば、マウス化抗体は、例えば、キメラ抗体の可変領域全体が非マウス性であるので、典型的なキメラ抗体を包含しないであろう。「マウス化」のプロセスによって「マウス化」されている改変された抗体は、ＣＤＲを提供する親抗体と同じ抗原に結合し、かつ、通常の場合、マウスにおける免疫原性が、親抗体と比較してより低い。「マウス化」抗体に関しての上記説明は、他の「齧歯類化」抗体について、例えば、ラットの配列がマウスの代わりに使用される「ラット化抗体」などについて同様に当てはまる。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、用語「重鎖部分」には、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中央および／または下部のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインあるいはそれらの変異体またはフラグメントのうちの少なくとも１つを含む。例えば、本発明において使用されるための結合性ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、および、ＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、および、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；または、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む場合がある。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明において使用されるための結合性ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部分（例えば、ＣＨ２ドメインのすべてまたは一部）を欠く場合がある。上記で示されるように、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）は、天然に存在する免疫グロブリン分子からアミノ酸配列において異なるように改変され得ることが、当業者によって理解されるであろう。
【００７８】
本明細書中に開示されるある特定の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体において、マルチマーの１つのポリペプチド鎖の重鎖部分が、当該マルチマーの第２のポリペプチド鎖における重鎖部分と同一である。代替では、本発明の重鎖部分を含有するモノマーは同一でない。例えば、それぞれのモノマーが、異なる標的結合部位を含む場合があり、これにより、例えば、二重特異性抗体またはディアボディを形成する。
【００７９】
別の実施形態において、本明細書中に開示される抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体は、ただ１つのポリペプチド鎖から構成され（例えば、ｓｃＦｖ）、潜在的なインビボ治療適用および診断適用のために細胞内で発現させられることになる（細胞内抗体）。
【００８０】
本明細書中に開示される診断方法および処置方法において使用されるための結合性ポリペプチドの重鎖部分が、異なる免疫グロブリン分子に由来してもよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部分が、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域とを含む場合がある。別の例において、重鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、かつ、一部がＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例において、重鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、かつ、一部がＩｇＧ４分子に由来するキメラなヒンジを含むことができる。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、用語「軽鎖部分」には、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。好ましくは、軽鎖部分はＶＬドメインまたはＣＬドメインの少なくとも一方を含む。
【００８２】
抗体のためのペプチドまたはポリペプチドのエピトープの最小サイズは約４個〜５個のアミノ酸であると考えられる。ペプチドまたはポリペプチドのエピトープは好ましくは、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも９個、最も好ましくは少なくとも約１５個〜約３０個のアミノ酸を含有する。ＣＤＲが抗原性のペプチドまたはポリペプチドをその三次形態で認識できるので、エピトープを構成するアミノ酸は連続している必要はなく、場合によっては、同じペプチド鎖に存在していなくてもよい。本発明において、本発明の抗体によって認識されるペプチドまたはポリペプチドのエピトープは、ＩＡＰＰまたはｐｒｏＩＡＰＰの少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、または、約１５個〜約３０個の連続するアミノ酸または非連続なアミノ酸の配列を含有する。
【００８３】
「特異的に結合する」または「特異的に認識する」によって、これらは本明細書中では交換可能に使用されており、結合性分子、例えば、抗体が、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、および、この結合は、抗原結合ドメインとエピトープとの間における何らかの相補性を伴うことが一般に意味される。この定義によれば、抗体は、抗体がランダムな無関係なエピトープに結合するであろうよりも容易にその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合するとき、そのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、ある特定の抗体がある特定のエピトープに結合する相対的な親和性を限定するために本明細書中では使用される。例えば、抗体「Ａ」は、所与のエピトープについて、抗体「Ｂ」よりも大きい親和性を有すると見なされる場合があり、または、抗体「Ａ」は、関連したエピトープ「Ｄ」について有するよりも大きい特異性によりエピトープ「Ｃ」に結合すると言われる場合がある。
【００８４】
存在する場合、抗原との抗体の用語「免疫学的結合特性」または他の結合特性はその文法的形態のすべてで、抗体の特異性、親和性、交差反応性および他の結合特性を示す。
【００８５】
「優先的に結合する」によって、結合性分子、例えば、抗体が、関連したエピトープ、類似したエピトープ、相同的なエピトープまたは類似的なエピトープに結合するであろうよりも容易にエピトープに特異的に結合することが意味される。したがって、所与のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、そのような抗体が関連のエピトープと交差反応することがあるとしても、関連のエピトープよりもそのエピトープに結合する可能性が大きいであろう。
【００８６】
非限定的な例として、結合性分子、例えば、抗体は、この抗体が第２のエピトープについての抗体のＫＤよりも小さい解離定数（ＫＤ）により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。別の非限定的な例において、抗体は、この抗体が第２のエピトープについての抗体のＫＤよりも少なくとも１桁小さい親和性により第１のエピトープと結合するならば、この第１の抗原と優先的に結合すると見なされる場合がある。別の非限定的な例において、抗体は、この抗体が第２のエピトープについての抗体のＫＤよりも少なくとも２桁小さい親和性により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。
【００８７】
別の非限定的な例として、結合性分子、例えば、抗体は、この抗体が第２のエピトープについての抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも小さいオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。別の非限定的な例において、抗体は、この抗体が第２のエピトープについての抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも１桁小さい親和性により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。別の非限定的な例において、抗体は、この抗体が第２のエピトープについての抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも２桁小さい親和性により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。
【００８８】
結合性分子、例えば、本明細書中に開示される抗体あるいは抗原結合フラグメント、変異体または誘導体は、５×１０−２ｓｅｃ−１以下、１０−２ｓｅｃ−１以下、５×１０−３ｓｅｃ−１以下または１０−３ｓｅｃ−１以下であるオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））によりＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰあるいはそのフラグメント、変異体または特異的な立体配座と結合すると言われる場合がある。より好ましくは、本発明の抗体は、５×１０−４ｓｅｃ−１以下、１０−４ｓｅｃ−１以下、５×１０−５ｓｅｃ−１以下または１０−５ｓｅｃ−１以下、５×１０−６ｓｅｃ−１以下、１０−６ｓｅｃ−１以下、５×１０−７ｓｅｃ−１以下または１０−７ｓｅｃ−１以下であるオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））によりＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰあるいはそのフラグメント、変異体または特異的な立体配座と結合すると言われる場合がある。
【００８９】
結合性分子、例えば、本明細書中に開示される抗体あるいは抗原結合フラグメント、変異体または誘導体は、１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、５×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上または５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上であるオン速度（ｋ（ｏｎ））によりＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰあるいはそのフラグメント、変異体または特異的な立体配座と結合すると言われる場合がある。より好ましくは、本発明の抗体は、１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１以上または５ｘ１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１以上または１０７Ｍ−１ｓｅｃ−１以上であるオン速度（ｋ（ｏｎ））によりＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰあるいはそのフラグメント、変異体または特異的な立体配座と結合すると言われる場合がある。
【００９０】
結合性分子、例えば、抗体は、所与のエピトープに対する参照抗体の結合をある程度阻止する程度にそのエピトープに優先的に結合するならば、そのエピトープに対する参照抗体の結合を競合的に阻害すると言われる。競合的阻害が、この技術分野において知られているいずれかの方法によって、例えば、競合的ＥＬＩＳＡアッセイによって求められてもよい。抗体は、所与のエピトープに対する参照抗体の結合を、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％または少なくとも５０％競合的に阻害すると言われる場合がある。
【００９１】
本明細書中で使用される場合、用語「親和性」は、結合性分子（例えば、免疫グロブリン分子）のＣＤＲとの個々のエピトープの結合の強さの尺度を示す（例えば、Ｈａｒｌｏｗ他、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９８８）、２７頁〜２８頁を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「アビディティー」は、免疫グロブリンの集合と抗原との複合体の全般的な安定性、すなわち、抗原との免疫グロブリン混合物の機能的結合強度を示す（例えば、Ｈａｒｌｏｗ、２９頁〜３４頁を参照のこと）。アビディティーは、特異的なエピトープとの集団内の個々の免疫グロブリン分子の親和性に、およびまた、免疫グロブリンおよび抗原の結合価の両方に関連づけられる。例えば、二価のモノクローナル抗体と、高度に反復するエピトープ構造を有する抗原（例えば、ポリマーなど）との間における相互作用が、高いアビディティーの１つであろう。抗原についての抗体の親和性またはアビディティーを、いずれかの好適な方法（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ他、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）を参照のこと）および本明細書中に記載される方法を使用して実験的に求めることができる。抗原についての抗体の親和性を測定するための一般的な技術には、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよび表面プラズモン共鳴が含まれる。特定の抗体−抗原相互作用の測定された親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）のもとで測定されるならば異なる可能性がある。したがって、親和性および他の抗原結合パラメーター（例えば、ＫＤ、ＩＣ５０）の測定は好ましくは、抗体および抗原の標準化された溶液ならびに標準化された緩衝液を用いて行われる。
【００９２】
結合性分子、例えば、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体はまた、それらの交差反応性に関して記載または指定される場合がある。本明細書中で使用される場合、用語「交差反応性」は、抗体（これは１つの抗原について特異的である）が第２の抗原と反応する能力、すなわち、２つの異なる抗原性物質の間における関連度の度合いを示す。したがって、抗体は、その形成を誘導したエピトープとは異なるエピトープに結合するならば、交差反応性である。交差反応性エピトープは一般に、誘導用エピトープと同じ相補的な構造的特徴の多くを含有しており、また、場合により、実際には元のエピトープよりも良好にはまる場合がある。
【００９３】
例えば、ある種の抗体は、関連しているが、同一でないエピトープと結合するという点で、例えば、参照エピトープに対して（この技術分野で知られている方法および本明細書中に記載される方法を使用して計算されるように）少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および少なくとも５０％の同一性を有するエピトープと結合するという点で、ある程度の交差反応性を有する。抗体は、参照エピトープに対して（この技術分野で知られている方法および本明細書中に記載される方法を使用して計算されるように）９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性を有するエピトープと結合しないならば、交差反応性をほとんど有していないか、または全く有していないと言われる場合がある。抗体は、ある特定のエピトープのどのような他のアナログ、オルソログまたはホモログとも結合しないならば、そのエピトープについて「非常に特異的」であると見なされる場合がある。
【００９４】
結合性分子、例えば、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体はまた、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに対するそれらの結合親和性に関して記載または指定される場合がある。好ましい結合親和性には、解離定数つまりＫｄが５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満または１０−１５Ｍ未満である結合親和性が含まれる。
【００９５】
上記で示されたように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元立体配置が広く知られている。本明細書中で使用される場合、用語「ＶＨドメイン」には、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインが含まれ、用語「ＣＨ１ドメイン」には、免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ末端側の）定常領域ドメインが含まれる。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接しており、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端側である。
【００９６】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＨ２ドメイン」には、従来の番号表記スキームを使用して、例えば、抗体のおよそ残基２４４から残基３６０にまで広がる重鎖分子の一部分が含まれる（残基２４４〜残基３６０、Ｋａｂａｔ番号表記システム；残基２３１〜残基３４０、ＥＵ番号表記システム；Ｋａｂａｔ  ＥＡ他（前掲書中）を参照のこと）。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密に対形成しないという点で独特である。むしろ、２つのＮ−連結している分岐した炭水化物鎖が、無傷の生来型ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に置かれる。ＣＨ３ドメインがＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ末端にまで広がり、およそ１０８残基を含むこともまた広く記録されている。
【００９７】
本明細書中で使用される場合、用語「ヒンジ領域」には、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインにつなぐ重鎖分子の一部分が含まれる。このヒンジ領域はおよそ２５残基を含み、かつ、柔軟であり、したがって、２つのＮ末端の抗原結合領域が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は３つの異なったドメイン（上部、中央および下部のヒンジドメイン）に細分化することができる（Ｒｏｕｘ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（１９９８）、４０８３〜４０９０を参照のこと）。
【００９８】
本明細書中で使用される場合、用語「ジスルフィド結合」には、２つのイオウ原子の間に形成される共有結合性の結合が含まれる。アミノ酸のシステインは、ジスルフィド結合を形成することができるか、または、第２のチオール基と架橋することができるチオール基を含む。ほとんどの天然に存在するＩｇＧ分子において、ＣＨ１領域およびＣＬ領域がジスルフィド結合によって連結され、２つの重鎖が、Ｋａｂａｔ番号表記システムを使用して２３９位および２４２位（２２６位または２２９位、ＥＵ番号表記システム）に対応する位置での２つのスルフィド結合によって連結される。
【００９９】
本明細書中で使用される場合、用語「連結される」、「融合される」または「融合」は交換可能に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲート化または組換え手段を含むどのような手段によってでも、２つ以上の要素または成分を一緒につなぐことを示す。「インフレーム融合」は、２つ以上のポリヌクレオチド・オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、これらの元々のＯＲＦの正しい翻訳読み枠を維持する様式で、連続したより長いＯＲＦを形成するためにつなぐことを示す。したがって、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含有する単一タンパク質である（そのようなセグメントは通常、自然界ではそのようにつながれない）。したがって、読み枠が、融合されたセグメントの全体にわたって連続にされるにもかかわらず、これらのセグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的または空間的に隔てられる場合がある。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドが、インフレーム融合される場合があり、しかし、「融合された」ＣＤＲが、連続したポリペプチドの一部として共翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域またはさらなるＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって隔てられる場合がある。
【０１００】
用語「発現」は、本明細書中で使用される場合、遺伝子が生化学物質（例えば、ＲＮＡまたはポリペプチド）をもたらすプロセスを示す。このプロセスには、限定されないが、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現および安定的発現の両方を含めて、細胞内における遺伝子の機能的な存在のどのような顕在化も含まれる。このプロセスには、限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小さいヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小さい干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または何らかの他のＲＮＡ産物への遺伝子の転写、および、ポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳が含まれる。最終的な所望される産物が生化学物質であるならば、発現には、そのような生化学物質および何らかの前駆体を生じさせることが含まれる。遺伝子の発現により、「遺伝子産物」がもたらされる。本明細書中で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ、または、転写物から翻訳されるポリペプチドのどちらもが可能である。本明細書中に記載される遺伝子産物にはさらに、転写後修飾（例えば、ポリアデニル化）を伴う核酸、または、翻訳後修飾（例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、および、タンパク質分解的切断など）を伴うポリペプチドが含まれる。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」は、対象または患者から得られる任意の生物学的材料を示す。１つの態様において、サンプルは、血液、腹腔液、ＣＳＦ、唾液または尿を含むことができる。別の態様において、サンプルは、全血、血漿、血清、血液サンプルから富化されるＢ細胞、および、培養された細胞（例えば、対象からのＢ細胞）を含むことができる。サンプルにはまた、神経組織を含む生検サンプルまたは組織サンプルが含まれ得る。さらに他の態様において、サンプルは、細胞全体および／または細胞の溶解物を含むことができる。血液サンプルをこの技術分野において知られている方法によって集めることができる。１つの態様において、ペレットを、２００μｌの緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ．７．５）、０．５％のＮｏｎｉｄｅｔ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、０．１ＭのＮａＣｌ、ＩＸのＳｉｇｍａプロテアーゼ阻害剤、ならびに、ＩＸのＳｉｇｍａホスファターゼ阻害剤１および２）において４℃でボルテックス処理することによって再懸濁することができる。懸濁物は、断続的なボルテックス処理を行いながら２０分間、氷上に保つことができる。１５，０００×ｇにおいて５分間、約４℃で遠心分離した後、上清のアリコートを約−７０℃で貯蔵することができる。
【０１０２】
疾患：
別途言及される場合を除き、用語「障害」および「疾患」は本明細書中では交換可能に使用され、対象、動物、単離された器官、組織または細胞／細胞培養物における望まれない任意の生理学的変化を含む。
【０１０３】
Ｔ２Ｄにおいて、遺伝的決定因子および環境的要因により、インスリン抵抗性の発現が引き起こされ、続いて、ベータ細胞量ならびにインスリン分泌およびアミリン（ｈＩＡＰＰ）分泌の代償的な増大が、正常な血中グルコースレベルを維持するために引き起こされる。その結果生じる高濃度のアミリンが、毒性のｈＩＡＰＰオリゴマーの形成、および、Ｔ２Ｄ患者の９０％超に見出されるｈＩＡＰＰ原線維の沈着に有利に働いている。ｈＩＡＰＰの沈着はインスリン産生ベータ細胞の減少と相関しており、また、Ｔ１Ｄの個体に移植された膵島におけるβ細胞の喪失についての役割を果たすこともまた提案されている。本出願は、健康者ドナーのプール、または、Ｔ２Ｄについての大きい危険性を有するが、疾患を有していない肥満ドナーのプールからのいくつかのヒト由来抗体（これらは、より詳しくは本明細書中以下で記載されるようにクローン化および組換え産生された）を提供する。
【０１０４】
しかしながら、本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体、そのいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有する結合性分子、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、妊娠糖尿病、糖尿病前症、成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ；１．５型糖尿病）および／または２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）を含む糖尿病疾患の群からの疾患の予防的処置および治療的処置、そのような疾患の進行またはそのような疾患の処置に対する応答をモニターすること、ならびに／あるいは、そのような疾患の診断のための医薬組成物または診断組成物を調製するために使用される。
【０１０５】
好ましい実施形態において、本発明の抗体、そのいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有する結合性分子、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞は、膵臓に対する損傷を引き起こし、したがって、慢性膵炎、嚢胞性線維症、膵臓ガンを含む、糖尿病に至り得るかもしれない疾患を含む、Ｔ２Ｄに先行する、Ｔ２Ｄを引き起こす、および／または、Ｔ２Ｄと関係づけられる／Ｔ２Ｄに伴う、もしくは、Ｔ２Ｄに関連づけられる、代謝変化などの症状によって一般に特徴づけられる群の障害の予防的処置および治療的処置、そのような群の障害の進行またはそのような群の障害の処置に対する応答をモニターすること、ならびに／あるいは、そのような群の障害の診断のための医薬組成物または診断組成物を調製するために使用され、また、アルツハイマー病、ハンチントン病を含む、Ｔ２Ｄの危険性を増大させる疾患において使用され、ならびに／あるいは、肥満およびＴ２Ｄと関連づけられるか、または、関連づけられない心臓血管疾患において使用される。１つの好ましい実施形態において、上記で述べられた疾患を一般に特徴とする症状は、対象における乱れたインスリン感受性ならびにインスリンおよび／またはｈＩＡＰＰの増大した分泌を含む。
【０１０６】
１つの実施形態において、上記で述べられた具体的な症状に関連する群の障害には、妊娠糖尿病、糖尿病前症（高血糖がＴ２Ｄ閾値またはインスリン抵抗性に達する途中でないとき）；一般には、糖尿病を発症することについての危険性因子としての、または、糖尿病前に存在し得るかもしれない状態としての代謝症候群；一般には、糖尿病を発症することについての危険性因子としての、または、糖尿病前に存在し得るかもしれない状態としての膵島アミロイドーシス；一般には、糖尿病を発症することについての危険性因子としての、あるいは、糖尿病、および／または、臨床での膵島移植の後におけるベータ細胞不全の前に存在し得るかもしれない状態としての肥満が含まれる。
【０１０７】
さらには、本発明の抗体、そのいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有する結合性分子、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞は、Ｔ２Ｄの形態との比較における１型糖尿病、成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ、１．５型糖尿病）の鑑別診断において、健康な対象におけるアミリン分泌と比較して、変化した、すなわち、増大したまたは低下した、アミリン分泌を検出するための組成物を調製するために使用され、あるいは、明白なＴ２Ｄ（例えば、妊娠糖尿病または糖尿病前症など）に先行する障害において使用され、膵臓に対する損傷を引き起こし、したがって、糖尿病に至り得るかもしれない疾患、例えば、慢性膵炎、嚢胞性線維症、膵臓ガンなどにおいて使用され、Ｔ２Ｄの危険性を増大させる疾患、例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病などにおいて使用され、ならびに／あるいは、肥満およびＴ２Ｄと関連づけられるか、または、関連づけられない心臓血管疾患において使用される。
【０１０８】
肥満およびインスリン抵抗性／高インスリン血症などの障害が、Ｔ２Ｄの明白な形態に既に先立つ上昇した循環レベルの膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）を引き起こし得るＴ２Ｄの素因として、および／または、Ｔ２Ｄの症状としてしばしば認められる。アミリン（ｈＩＡＰＰ）のオリゴマー、原線維およびプラークが、肥満およびインスリン抵抗性を有する患者において、膵臓内および腎臓内だけでなく、心臓内にも同様に蓄積することが見出されている。この蓄積が、結果としてそのような患者における心臓の機能不全の一因になるかもしれない変化した細胞Ｃａ２＋恒常性の関連で認められている。
【０１０９】
したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体、そのいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有する結合性分子、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞は、Ｔ２Ｄに続くか、あるいは、Ｔ２Ｄに先行するおよび／またはＴ２Ｄを引き起こす代謝変化から生じる、すなわち、前糖尿病性状態において生じる代謝変化から生じる一群の障害の予防的処置および治療的処置、改善、そのような一群の障害の進行またはそのような一群の障害の処置に対する応答をモニターすること、ならびに／あるいは、そのような一群の障害の診断のための医薬組成物または診断組成物を調製するために使用され、この場合、前記一群の障害は、心臓疾患、卒中、糖尿病性網膜症、腎不全、腎不全、ケトアシドーシスおよび非ケトン性高浸透圧性昏睡を含む。
【０１１０】
２０を超える神経変性障害（例えば、Ｍ．Ｒｉｓｔｏｗ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ、８２（２００４）、５１０〜５２９における５１１頁の表１を参照のこと）が、糖尿病、増大したインスリン感受性および肥満、乱れたインスリン感受性、ならびに、過度な、または損なわれたインスリン分泌と関連することが知られている。したがって、本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体、そのいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有する結合性分子、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞は、アルツハイマー病（ＡＤ）、毛細血管拡張性失調症（ＡＴ）、バルデ・ビードル症候群（ＢＢＳ）、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、ナルコレプシー、パーキンソン病、プラダー・ウィリー症候群およびウェルナー症候群を含む神経変性障害の予防的処置および治療的処置、そのような神経変性障害の進行またはそのような神経変性障害の処置に対する応答をモニターすること、ならびに／あるいは、そのような神経変性障害の診断のための医薬組成物または診断組成物を調製するために使用される。
【０１１１】
耐糖能障害は、糖尿病について特徴的である合併症をほとんど誘導しないが、正常型よりも大きい糖尿病発症の危険度を有しており、このことが大血管性疾患の原因となる場合がある。
【０１１２】
「インスリン抵抗性」は、インスリンに対する低下した感受性の状態を意味する。インスリンは、より幅広い範囲の影響を示すことが知られており、例えば、グルコース代謝に対する影響に加えて、脂質代謝に対する影響、または、血管および腎臓に対する影響を示すことが知られている。インスリンに対する感受性が低下すると、グルコースの代謝異常だけなく、脂質の代謝異常、例えば、血管または腎臓に対するインスリン影響の異常としての高トリグリセリド血症、低下したＨＤＬ血漿中レベルまたは高血圧などが誘発される場合がある。
【０１１３】
本明細書中で使用される場合、ヒトにおける用語「糖尿病性（の）」は一般に、また、現在は、２００ｍｇ／ｄＬ以上（１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上）の無作為の血漿中グルコース濃度または血中グルコース濃度、あるいは、１２６ｍｇ／ｄＬ以上（７．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上）の空腹時血漿中グルコース、あるいは、経口ブドウ糖負荷試験時における２００ｍｇ／ｄＬ以上（１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上）の負荷後２時間のグルコースを意味する。加えて、または、代替において、用語「糖尿病性（の）」は、増大した口渇（多飲症）、頻繁な排尿（多尿症）、極端な空腹、不明な体重減少、疲労およびかすみ目、回復が遅いただれおよび頻繁な感染を受けやすいこと（膀胱、膣および歯肉ならびに／あるいは黒ずんだ皮膚（黒色表皮肥厚症）の領域の場合を含む）を含めて、糖尿病の臨床症状の１つまたは複数を示す対象のために使用される。
【０１１４】
本明細書中で使用される場合、ヒトにおける用語「非糖尿病性（の）」は一般に、また、現在は、１００ｍｇ／ｄＬ（５．６ｍｍｏｌ／ｄＬ）未満の空腹時血漿中グルコースレベル、または、経口ブドウ糖負荷試験時における１４０ｍｇ／ｄＬ未満（７．８ｍｍｏｌ／ｄＬ未満）の負荷後２時間のグルコースを意味する。
【０１１５】
本明細書中で使用される場合、ヒトにおける用語「前糖尿病性（の）」は一般に、また、現在は、１００〜１２５ｍｇ／ｄＬ（５．６〜６．９ｍｍｏｌ／ｄＬ）の空腹時血漿中グルコースレベル、または、経口ブドウ糖負荷試験時における１４０〜１９９ｍｇ／ｄＬ（７．８〜１１．１ｍｍｏｌ／ｄＬ）の負荷後２時間のグルコースを意味する。別途言及される場合を除き、用語「前糖尿病性（の）」、「前駆（の）」および「前駆症状性（の）」は本明細書中では交換可能に使用され、Ｔ２Ｄの前臨床段階を記述する。
【０１１６】
加えて、または、代替において、グリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）のレベルが、糖尿病を対象において診断する際に使用される場合がある。６．５％の閾値またはそれを超える上昇したＨｂＡ１ｃレベルにおいて、糖尿病の診断が行われる。すなわち、用語「糖尿病性（の）」は一般に、また、現在は、ヒトにおいて使用され、一方で、５．７％〜６．４％のレベルは、糖尿病および心臓血管疾患の両方を発症することについての大きい危険性を示しており、ヒトにおける「糖尿病前症」または「前糖尿病性／前駆症状性」状態のマーカーである。ヒトにおける用語「非糖尿病性（の）」は一般に、また、現在は、５．７％の閾値を下回るＨｂＡ１ｃレベルを意味する。
【０１１７】
薬物発見におけるＩＩ型糖尿病の齧歯類モデル
ＩＩ型糖尿病を自然発症する従来から報告されているモデル動物の例には、ＫＫ−Ａｙマウス（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｍ．、Ｅｘｐ．Ａｎｉｍ．１８、１４７〜１５７、１９６９）、ＮＳＹマウス（Ｕｅｄａ  Ｈ．他、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ３８、５０３〜５０８、１９９５）、ｄｂ／ｄｂマウス（Ｈｕｍｍｅｌ  Ｋ．Ｐ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５３、１１２７〜１１２８、１９６６）、ｏｂ／ｏｂマウス（Ｈｅｒｂｅｒｇ  Ｌ．＆Ｋｌｅｙ  Ｈ  Ｋ、Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．７、４１０〜５、１９７５）およびＡＫＩＴＡマウス（Ｙｏｓｈｉｏｋａ  Ｍ．他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６、８８７〜８９４、１９９７）が含まれる。
【０１１８】
これらの動物の中で、ＫＫ−ＡｙマウスおよびＮＳＹマウスが、肥満を伴うモデルであり、ｄｂ／ｄｂマウスおよびｏｂ／ｏｂマウスが、レプチン受容体またはレプチン産生における異常に起因する肥満を伴うモデルである。他方で、ＡＫＩＴＡマウスは、膵臓のβ細胞における異常によって引き起こされる糖尿病についてのモデルである。
【０１１９】
非肥満性のＩＩ型糖尿病モデル動物として、例えば、モデルマウスがこれまでのところ、特開第２００４−６５１８１号公報に報告される。このマウスは、正常でないインスリン分泌を示す。
【０１２０】
しかしながら、本発明の抗体は好ましくは、遺伝子組換え動物において、例えば、ｈＩＡＰＰを発現する齧歯類、例えば、Ｂｕｔｌｅｒ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３（２００４）、１５０９〜１５１６において、また、Ｍａｔｖｅｙｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｂｕｔｌｅｒ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５５（２００６）、２１０６〜２１１４において記載されるように膵臓β細胞においてヒトアミリンについて遺伝子組換えであるラット（ＨＩＰラット）などにおいて試験され、特徴づけられる。より好ましくは、ヒトＩＡＰＰを過剰発現する２型糖尿病マウスモデルが、Ｍａｔｖｅｙｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｂｕｔｌｅｒ（２００６）、ＩＬＡＲ  Ｊ．４７（３）：２２５〜２３３に記載されるように使用され、その２２８頁の表２に要約される。ｈＩＡＰＰ過剰発現のために、そのようなモデル動物は、Ｔ２Ｄ症状（例えば、高血糖性状態など）を正当に呈示する。一般に、用語「高血糖症」または「高血糖性状態」は、異なる時間間隔で行われる２回の連続した測定での、また、遺伝子組換えでないコントロール同腹子に対して比較されたときの有意に増大した空腹時血漿中グルコースレベルを示す。高血糖性動物において測定される絶対値は、使用される特定の動物モデルに依存しているかもしれず、例えば、ｈ−ＩＡＰＰ（ヘミ接合性）／ｏｂ／＋マウスでは約１５〜２０ｍＭ以上のグルコースであり、ｈ−ＩＡＰＰ（ホモ接合性）／ＦＶＢ／Ｎマウスでは約１１ｍＭ以上のグルコースである。
【０１２１】
糖尿病を研究するための方法は、健康な非糖尿病性動物との比較における糖尿病性動物の生理学的変化の測定および血液または血漿の分析を含む。これらの測定には、成長動力学、ボディーマス指数（ＢＭＩ）、除脂肪マス指数（ＬＭＩ）、食物摂取量および水分摂取量、性差、空腹時血中グルコースおよび無作為血中グルコース、トリグリセリド（ＴＧ）、リポタンパク質、コレステロール、肝臓重量および肝臓脂質、腎臓の大きさおよび機能、ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）、インスリン耐性試験（ＩＴＴ）、血中インスリン濃度、膵島細胞形態学、高脂肪食ならびにカロリー制限が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２２】
本明細書中で使用される場合、用語「無作為（の）」および用語「非絶食時」は一般に、最後の食事からの時間に関係なく、日中または夜間の任意の時間においてであることを意味する。
【０１２３】
本明細書中で使用される場合、用語「空腹（絶食）時」は一般に、カロリー摂取が少なくとも１２時間にわたってないことを意味する。
【０１２４】
これらの定義は、医師が一般には米国糖尿病協会（ＡＤＡ）およびドイツ糖尿病協会（ＧＤＡ）に従う現時点で受け入れられている指針であることが理解される。指針は時代とともに変化することがあり、また、地域または国によって変わることがあり、かつ、当業者に知られている指針を提供する団体または機関（例えば、ＡＤＡ、世界保健機関、ＮＩＤＤＫ／ＮＩＨ、ＣＤＣ、ＧＤＡなど）に依存することがある。医師はまた、診断および処置を決定するときには、臨床経験、患者の過去の病歴、および／または、他の情報を使用する場合がある。したがって、これらの定義は、科学および医学における進歩に従って時代とともに変化する場合がある。
【０１２５】
処置：
本明細書中で使用される場合、用語「処置する」または「処置」は治療的処置および予防的または防止的な対策の両方を示し、この場合、その目的が、望まれない生理学的変化または障害（例えば、糖尿病の発症など）を防止することまたは抑制すること（緩和すること）である。有益な臨床結果または所望される臨床結果には、検出可能であるか、または検出不能であるかにかかわりなく、症状の緩和、疾患の程度の減弱、疾患の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延または緩速化、疾患状態の改善または緩和、および、寛解（部分的または全体的を問わず）が含まれるが、これに限定されない。「処置」はまた、処置を受けない場合の予想された生存と比較して、生存を延ばすことを意味することができる。処置を必要としている人々には、状態または障害を既に有する人々ならびに状態または障害を有する傾向がある人々、あるいは、状態または障害の発現が防止されなければならない人々が含まれる。
【０１２６】
別途言及される場合を除き、用語「薬物」、「医薬」または「医薬品」は本明細書中では交換可能に使用され、下記のすべてを包含するものとするが、それに限定されない：（Ａ）体内使用または体外使用のための物品、医薬および調製物、ならびに、ヒトまたは他の動物のどちらかの疾患の診断、治療、緩和、処置または防止のために使用されることが意図されるあらゆる物質または物質の混合物；ならびに、（Ｂ）ヒトまたは他の動物の身体の構造またはどのような機能に対してでも影響を及ぼすことが意図される（食物以外）の物品、医薬および調製物；ならびに（Ｃ）条項（Ａ）および条項（Ｂ）において指定されるあらゆる物品の成分としての使用のために意図される物品。用語「薬物」、「医薬」または「医薬品」は、１つまたは複数の「薬剤」、「化合物」、「物質」または「（化学的）組成物」をフィラー、崩壊剤、滑剤、流動促進剤、バインダーとして、また、何らかの他の関連では、他の医薬的に不活性な賦形剤もまた、フィラー、崩壊剤、滑剤、流動促進剤、バインダーとして含有するか、あるいは、「薬物」、「医薬」または「医薬品」の容易な輸送、崩壊、解離、溶解および生物学的利用性を、ヒトまたは他の動物の体内の意図された標的場所（例えば、皮膚、胃内または腸内）において保証する、ヒトまたは他の動物のどちらかでの使用のために意図される調製物の完全な処方を包含するものとする。用語「薬剤」、「化合物」または「物質」は本明細書中では交換可能に使用され、より具体的な関連では、すべての薬理学的に活性な薬剤、すなわち、本発明の方法によって所望の生物学的または薬理学的な効果を誘発するか、あるいは、そのような可能な薬理学的効果を誘発することができることについて研究または試験される薬剤を包含するものとするが、これらに限定されない。
【０１２７】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」によって、診断、予後、防止または治療が望まれるあらゆる対象、特に哺乳動物対象、例えば、ヒト患者が意味される。
【０１２８】
医薬用キャリア：
医薬的に許容されるキャリアおよび投与経路を、当業者に知られている対応する文献から選ぶことができる。本発明の医薬組成物は、この技術分野において広く知られている方法に従って配合することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＩＳＢＮ０−６８３−３０６４７２）；Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２版（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、米国、２００３）；Ｂａｎｇａ、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第２版（Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ（２００６）、ＩＳＢＮ：０−８４９３−１６３０−８）を参照のこと）。好適な医薬用キャリアの例がこの技術分野では広く知られており、これらには、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水エマルションなど）、様々なタイプの湿潤化剤、無菌溶液などが含まれる。そのようなキャリアを含む組成物を、広く知られている従来の方法によって配合することができる。これらの医薬組成物は好適な用量で対象に投与することができる。好適な組成物の投与を種々の方式によって行うことができる。例には、医薬的に許容されるキャリアを含有する組成物を、経口方法、鼻腔内方法、直腸方法、局所的方法、腹腔内方法、静脈内方法、筋肉内方法、皮下方法、真皮下方法、経皮的方法、クモ膜下腔内方法および頭蓋内方法を介して投与することが含まれる。エアロゾル配合物、例えば、鼻腔噴霧配合物などには、保存剤および等張剤を伴う活性な薬剤の精製された水性溶液または他の溶液が含まれる。そのような配合物は好ましくは、鼻腔粘膜と適合し得るｐＨおよび等張性状態に調節される。経口投与用の医薬組成物、例えば、単一ドメイン抗体分子（例えば、「ナノボディー（商標）」）などもまた、本発明において想定される。そのような経口配合物は、錠剤、カプセル、粉末、液体または半固体の形態である場合がある。錠剤は、固体のキャリア、例えば、ゼラチンまたはアジュバントなどを含む場合がある。直腸投与または膣投与のための配合物が、好適なキャリアを伴う坐薬として提示される場合がある（Ｏ’Ｈａｇａｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２（９）（２００３）、７２７〜７３５もまた参照のこと）。様々なタイプの投与のために好適である配合物に関するさらなる指針を、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、第１７版（１９８５）および対応する更新版）において見出すことができる。薬物送達のための方法の簡単な総説については、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９（１９９０）、１５２７〜１５３３を参照のこと。
【０１２９】
ＩＩ．本発明の抗体
本発明は一般には、ヒト抗ＩＡＰＰ抗体およびその抗原結合フラグメントに関連し、この場合、これらは好ましくは、実施例において例示される抗体について概略されるような免疫学的結合特性および／または生物学的性質を明らかにする。本発明によれば、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰについて特異的であるヒトモノクローナル抗体が、健康なヒト対象のプールからクローン化された。
【０１３０】
本発明に従って行われた実験の過程において、ヒトメモリーＢ細胞培養物の馴化培地における抗体を、凝集したオリゴマー状、原線維性および／または非原線維性のＩＡＰＰタンパク質および／またはｐｒｏＩＡＰＰタンパク質に対する結合、ならびに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対する結合について並行してスクリーニングした。凝集したＩＡＰＰタンパク質および／またはｐｒｏＩＡＰＰタンパク質について陽性であり、しかし、ＢＳＡについては陽性でないＢ細胞培養物のみを抗体クローニングに供した。
【０１３１】
この手段に起因して、いくつかの抗体を単離することができた。選択された抗体をさらに、クラス決定および軽鎖サブクラス決定のために分析した。メモリーＢ細胞の培養物から得られる選択された関連する抗体メッセージがその後、ＲＴ−ＰＣＲによって転写され、クローン化され、組換え産生のための発現ベクターの中に結合される（添付された実施例を参照のこと）。ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞におけるヒト抗体の組換え発現、そして、ヒトＩＡＰＰタンパク質および／またはｐｒｏＩＡＰＰタンパク質に対するそれらの結合特異性の引き続いた特徴づけ（図３および図４；実施例１）、ならびに、その病理学的に凝集した形態に対するそれらの特徴的な結合（図５；実施例２）により、ＩＡＰＰタンパク質および／またはｐｒｏＩＡＰＰタンパク質について非常に特異的であり、かつ、病理学的に凝集した形態のＩＡＰＰタンパク質および／またはｐｒｏＩＡＰＰタンパク質（例えば、ＩＡＰＰ原線維など）を特徴的に認識するヒト抗体が今回初めてクローン化されたことが確認された。２回目の実験により、図７〜図９および実施例４に示されるような上記の知見が確認された。さらには、本発明に従って作製され、かつ、本発明のヒト抗体のＣＤＲドメインを含むマウスキメラ抗体は、図１１および図１２ならびに実施例６に示されるように、ヒト抗体と等しい、ヒトＩＡＰＰに対する結合親和性を示している。
【０１３２】
したがって、本発明は概して、単離された自然界に存在するヒトモノクローナル抗膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）抗体ならびにその結合フラグメント、誘導体および変異体に関連する。本発明の１つの実施形態において、抗体はヒトＩＡＰＰおよび／またはヒトｐｒｏＩＡＰＰと結合することができる。
【０１３３】
１つの実施形態において、本発明は、抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体あるいはそれらの抗原結合フラグメント、変異体または誘導体に関するものであり、この場合、当該抗体は、ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１、ＮＩ−２０３．８Ｅ３、ＮＩ−２０３．１１Ｂ１２、ＮＩ−２０３．２０５Ｆ８、ＮＩ−２０３．９Ｂ３、ＮＩ−２０３．１９Ｆ２およびＮＩ−２０３．１５Ｃ７からなる群から選択される参照抗体と同じＩＡＰＰのエピトープに特異的に結合する。エピトープマッピングにより、ａａ１９−ＳＳＮＮＦＧＡ−２５（配列番号４）を含むヒトＩＡＰＰ内の配列が、本発明の抗体ＮＩ−２０３．１９Ｈ８によって認識される独特な直鎖状エピトープとして特定され、ａａ２−ＣＮＴＡＴＣＡ−８（配列番号５）を含むヒトＩＡＰＰ内の配列が、本発明の抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１によって認識される独特な直鎖状エピトープとして特定され、そして、ａａ１０−ＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳ−１９（配列番号７１）を含むヒトＩＡＰＰ内の配列が、本発明の抗体ＮＩ−２０３．１５Ｃ７によって認識される独特な直鎖状エピトープとして特定された（図５Ａおよび図５Ｂならびに実施例３を参照のこと）。したがって、１つの実施形態において、ＳＳＮＮＦＧＡ（配列番号４）、ＣＮＴＡＴＣＡ（配列番号５）またはＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳ（配列番号７１）のアミノ酸配列を含むＩＡＰＰエピトープと特異的に結合する本発明の抗体が提供される。実施例３において詳しく記載されるように、組換えＩＡＰＰ抗体であるＮＩ−２０３．９Ａ２抗体、ＮＩ−２０３．８Ｅ３抗体およびＮＩ−２０３．１９Ｆ２抗体のエピトープは今までのところ特定することができなかった。このことは、これらの抗体はおそらくは非直鎖状のエピトープと結合することを示している。
【０１３４】
さらには、１つの実施形態において、本発明は、抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体あるいはそれらの抗原結合フラグメント、変異体または誘導体に関するものであり、この場合、当該抗体は、ＮＩ−２０３．１Ｄ１０、ＮＩ−２０３．２Ａ１１、ＮＩ−２０３．１０Ｃ４、ＮＩ−２０３．２０Ｈ９、ＮＩ−２０３．２６Ｄ２、ＮＩ−２０３．６０Ｈ３およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の抗体からなる群から選択される参照抗体と同じｐｒｏＩＡＰＰのエピトープに特異的に結合する。
【０１３５】
さらには、実施例４において記載され、図７に示されるような初期の実験的観察によって拘束されることは意図されないが、本発明のヒトモノクローナル抗ＩＡＰＰ抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１およびＮＩ−２０３．８Ｅ３は好ましくは、膵臓において、病理学的なＩＡＰＰ凝集物（この実施例では原線維）に特異的に結合し、生理学的形態でのＩＡＰＰを実質的に認識しないことにおいて特徴づけられる。同じことが、ヒトモノクローナル抗ＩＡＰＰ抗体のＮＩ−２０３．１９Ｆ２およびＮＩ−２０３．１５Ｃ７に当てはまることが予想される。したがって、本発明は、結合特異性を有し、したがって、診断目的および治療目的のために特に有用である一組のヒト抗ＩＡＰＰ抗体および／またはヒト抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体を提供する。したがって、１つの実施形態において、本発明は、病理学的に凝集した形態のＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰと特異的に結合することができる抗体を提供する（図５および図７〜図９ならびに実施例２および実施例４を参照のこと）。本発明の結合特異性に関してのさらなる詳細および要約する概略については、図７および図８ならびに以下の記載もまた参照のこと。
【０１３６】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、実施例において記載されるような例示的抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１、ＮＩ−２０３．８Ｅ３、ＮＩ−２０３．１９Ｆ２およびＮＩ−２０３．１５Ｃ７の結合性質を示す。加えて、または、代替において、本発明の抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体は、実施例２〜実施例４に従って分析されるときには特に、生理学的なＩＡＰＰモノマーおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰモノマーではなく、むしろ、病理学的に凝集した抗ＩＡＰＰおよび／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ（例えば、ＩＡＰＰ原線維など）を優先的に認識する。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体は、生理学的なＩＡＰＰを実質的に認識しない。用語「実質的に認識しない」は、特異的な標的分子、特異的な抗原、ならびに／あるいは、標的分子および／または抗原の特異的な立体配座についての抗体、そのフラグメントまたは結合性分子を含む群の分子の結合親和性を記述するために本出願において使用されるときには、上述の群の分子が、別の分子、抗原および／または立体配座と結合することについて、上述の群の分子の解離定数（ＫＤ）の少なくとも２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１または９分の１である結合親和性により、前記の分子、抗原および／または立体配座と結合することを意味する。好ましくは、用語「実質的に認識しない」は、本出願において使用されるときには、上述の群の分子が、別の分子、抗原および／または立体配座と結合することについて、上述の群の前記分子の解離定数（ＫＤ）の少なくとも１０分の１、２０分の１、５０分の１、１００分の１、１０００分の１または１００００分の１である結合親和性により、前記の分子、抗原および／または立体配座と結合することを意味する。加えて、または、代替において、本発明の抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体は、凝集型形態のヒト抗ＩＡＰＰおよび／またはヒト抗ｐｒｏＩＡＰＰを引き起こす疾患、特に実施例４において記載されるそのような疾患に結合する。この関連において、結合特異性が、図４、それぞれの図５において例示的抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１およびＮＩ−２０３．８Ｅ３について示されるような範囲である場合があり、すなわち、約１ｐＭ〜５００ｎＭの５０％最大有効濃度（ＥＣ５０）、好ましくは約１０ｐＭ〜１００ｎＭのＥＣ５０、最も好ましくは約１００ｐＭ〜５０ｎＭのＥＣ５０を、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８について示されるようにヒトＩＡＰＰについて有し、または、約１００ｐＭ〜１０ｎＭのＥＣ５０を、ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１およびＮＩ−２０３．８Ｅ３について示されるようにヒトＩＡＰＰについて有する。この関連において、実施例４において提供され、図４、それぞれの図５に示されるような実験結果もまた、加えて、または、代替において、本発明の抗ＩＡＰＰ抗体の一部が、例示的抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．８Ｅ３について示されるようにｐｒｏＩＡＰＰを実質的に認識しないことを示している。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体はｐｒｏＩＡＰＰを実質的に認識しない。
【０１３７】
加えて、または、代替において、本発明の抗ＩＡＰＰ抗体は、特に実施例１において記載されるように、成熟型ＩＡＰＰのほかに、前駆体形態のＩＡＰＰ、すなわち、ｐｒｏＩＡＰＰにも同様に特異的に結合する。この関連において、結合特異性が、図３、それぞれの図４において例示的抗体のＮＩ−２０３．２６Ｃ１１について示されるような範囲である場合があり、すなわち、約１ｐＭ〜５００ｎＭの５０％最大有効濃度（ＥＣ５０）、好ましくは約１０ｐＭ〜４００ｎＭのＥＣ５０、より好ましくは約１００ｐＭ〜４００ｎＭのＥＣ５０または約１００ｐＭ〜３００ｎＭのＥＣ５０、最も好ましくは約１ｎＭ〜３００ｎＭのＥＣ５０を、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１について示されるように凝集型ｐｒｏＩＡＰＰについて有する。
【０１３８】
加えて、または、代替において、本発明の抗ＩＡＰＰ抗体は、特に実施例１において記載されるように、成熟型ＩＡＰＰに特異的に結合し、前駆体形態のＩＡＰＰ、すなわち、ｐｒｏＩＡＰＰには結合しないか、または実質的に結合しない。この関連において、結合特異性が、図４、それぞれの図５において例示的抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．８Ｅ３について示されるような、また、上記で示されるような範囲である場合がある。
【０１３９】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、例示的抗体であるＮＩ−２０３．１Ｄ１０、ＮＩ−２０３．２Ａ１１、ＮＩ−２０３．１０Ｃ４、ＮＩ−２０３．２０Ｈ９、ＮＩ−２０３．２６Ｄ２およびＮＩ−２０３．６０Ｈ３の結合性質を示し、好ましくは、ｐｒｏＩＡＰＰを超えてｐｒｏＩＡＰＰと結合する。しかしながら、アミロイド形成および細胞死における、全長のｐｒｏＩＡＰＰペプチドではなく、むしろ、Ｎ末端がプロセシングされていないｐｒｏＩＡＰＰの役割についての何らかの証拠が存在するように、ｐｒｏＩＡＰＰ抗体は、ＩＡＰＰには存在しないｐｒｏＩＡＰＰのＮ末端近接領域に特異的に結合する抗体についてのスクリーニングによって得られている。その結果、１つの実施形態において、本発明の抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体、例えば、例示的抗体のＮＩ−２０３．１Ｄ１０、ＮＩ−２０３．２Ａ１１、ＮＩ−２０３．１０Ｃ４、ＮＩ−２０３．２０Ｈ９、ＮＩ−２０３．２６Ｄ２およびＮＩ−２０３．６０Ｈ３などはＩＡＰＰと実質的に結合しないか、または、ＩＡＰＰと結合しない。
【０１４０】
いくつかの精製された抗体が多様な生体分子（例えば、タンパク質）に結合する。当業者が理解するであろうように、特異的（な）の用語は、ＩＡＰＰタンパク質および／またはｐｒｏＩＡＰＰタンパク質あるいはそのフラグメントでない他の生体分子が、抗原結合性分子に、例えば、本発明の抗体の１つに有意に結合しないことを示すために本明細書中では使用される。好ましくは、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰとは異なる生体分子に対する結合のレベルにより、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに対する親和性の最大でもわずか２０％以下、１０％以下、わずか５％以下、わずか２％以下、または、わずか１％以下（すなわち、少なくとも５分の１、１０分の１、２０分の１、５０分の１、または、１００分の１）である結合親和性がそれぞれもたらされる（例えば、実施例１および図３を参照のこと）。さらには、本発明の抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体はＩＡＰＰ凝集物および／またはｐｒｏＩＡＰＰ凝集物に特異的に結合し、これは、本発明の抗体が、アルツハイマー病と診断される患者のパラフィン包埋された脳切片に対して例示的抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１により示されるように、また、直接的ＥＬＩＳＡ実験によって示されるように、アルツハイマー病のヒト脳における病理学的なＡβアミロイドを認識せず、かつ、誤った折り畳み／凝集の傾向を有するいくつかのタンパク質候補物に対するほんの最小限の交差反応的結合特性を有することを示す実験によって確認される通りである（実施例５および図１０を参照のこと）。したがって、１つの実施形態において、アミロイド−βペプチド（Ａβ１−４２）を実質的に認識しない本発明の抗体が提供される。
【０１４１】
１つの実施形態において、本発明の抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体は好ましくは、凝集型形態のＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰ、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの原線維および／またはオリゴマーに優先的に結合する；実施例２における直接的ＥＬＩＳＡによる実験結果、ならびに、実施例４において記載され、図７および図９にそれぞれ示される免疫組織化学的染色による、Ｔ２Ｄと診断される患者の膵臓における実験結果、および、糖尿病ネコの膵臓に対する実験結果を参照のこと。１つの実施形態において、本発明の抗体は、凝集物がＩＡＰＰの原線維形態および／または原線維オリゴマーを含むか、あるいは、ＩＡＰＰの原線維形態および／または原線維オリゴマーから本質的になるか、あるいは、ＩＡＰＰの原線維形態および／または原線維オリゴマーからなる、凝集型形態のＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに優先的に結合する。別の実施形態において、本発明の抗体は、凝集物がＩＡＰＰの非原線維形態および／または非原線維オリゴマーを含むか、あるいは、ＩＡＰＰの非原線維形態および／または非原線維オリゴマーから本質的になるか、あるいは、ＩＡＰＰの非原線維形態および／または非原線維オリゴマーからなる凝集型形態のＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに優先的に結合する。さらに別の実施形態において、本発明の抗体は、凝集物がＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの原線維形態および非原線維形態ならびに／あるいはＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの原線維オリゴマーおよび非原線維オリゴマーのどちらかを含むか、あるいは、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの原線維形態および非原線維形態ならびに／あるいはＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの原線維オリゴマーおよび非原線維オリゴマーのどちらかから本質的になるか、あるいは、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの原線維形態および非原線維形態ならびに／あるいはＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの原線維オリゴマーおよび非原線維オリゴマーのどちらかからなる凝集型形態のＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに優先的に結合する。なおさらに別の実施形態において、本発明の抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体は、生来型のＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰならびに病理学的凝集型形態のＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの両方に優先的に結合する；直接的ＥＬＩＳＡによって実施例２および実施例３において例示されるような実験結果を参照のこと。
【０１４２】
前記で述べられるように、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰを含む凝集物はまた、Ｔ２Ｄ患者の膵島におけるアミロイド沈着物に伴うことが見出され得る。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体はＴ２Ｄの処置において有用である場合がある。
【０１４３】
本発明はまた、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体に関するものであり、この場合、当該抗体は、ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１、ＮＩ−２０３．８Ｅ３、ＮＩ−２０３．１１Ｂ１２、ＮＩ−２０３．２０５Ｆ８、ＮＩ−２０３．９Ｂ３、ＮＩ−２０３．１９Ｆ２、ＮＩ−２０３．１５Ｃ７、ＮＩ−２０３．１Ｄ１０、ＮＩ−２０３．２Ａ１１、ＮＩ−２０３．１０Ｃ４、ＮＩ−２０３．２０Ｈ９、ＮＩ−２０３．２６Ｄ２およびＮＩ−２０３．６０Ｈ３からなる群から選択される抗体の抗原結合ドメインと同一の抗原結合ドメインを含む。
【０１４４】
本発明ではさらに、その可変領域において、例えば、結合ドメインにおいて、図１または図２に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＨ可変領域および／またはＶＬ可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことによって特徴づけられることがある、いくつかのそのような結合性分子、例えば、抗体およびその結合フラグメントが例示される。上記の可変領域をコードする対応するヌクレオチド配列が、下記において表２、表３にそれぞれ示される。ＶＨ領域および／またはＶＬ領域の上記アミノ酸配列のＣＤＲの例示的なセットが図１および図２に示される。しかしながら、下記において議論されるように、当業者は、加えて、または、代替において、様々なＣＤＲが使用されてもよく、この場合、これらのＣＤＲは、それらのアミノ酸配列において、図１、図２にそれぞれ示されるアミノ酸配列から、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の場合には１つ、２つ、３つ、または、それ以上のアミノ酸が異なるという事実を十分に承知している。したがって、１つの実施形態において、図１に示される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、および／または、図１に示されるＣＤＲに１つまたは複数のアミノ酸置換を含んでなるＣＤＲの１つまたは複数をその可変領域に含む本発明の抗体あるいはそのＩＡＰＰ結合フラグメントおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合フラグメントが提供される。
【０１４５】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、図１に示されるＶＨ領域および／またはＶＬ領域、あるいは、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むそのＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列を含む抗体のいずれか１つである。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトＢ細胞に存在したような重鎖および軽鎖の同族性の対形成の保存によって特徴づけられる。
【０１４６】
代替では、本発明の抗体は、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに対する結合について、図１に示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域を有する抗体の少なくとも１つと競合する抗体あるいはその抗原結合フラグメント、誘導体または変異体である。
【０１４７】
実施例４において提供される実験結果から、本発明の抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体のいくつかは、凝集型形態のヒト抗ＩＡＰＰおよび／またはヒト抗ｐｒｏＩＡＰＰを引き起こす疾患に、生理学的形態の当該タンパク質よりも優先的に結合することが示唆される。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体は、ＩＡＰＰ凝集物および／またはｐｒｏＩＡＰＰ凝集物を生理学的なＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰよりも優先的に認識する。さらには、１つの実施形態において、本発明の抗体は、ＩＡＰＰのオリゴマーおよび／または原線維を含むＩＡＰＰ凝集物を生理学的ＩＡＰＰよりも優先的に認識する。別の実施形態において、本発明の抗体は、非原線維性ＩＡＰＰおよび／または非原線維性ＩＡＰＰオリゴマーを含むＩＡＰＰ凝集物を生理学的ＩＡＰＰよりも優先的に認識する。
【０１４８】
前記で既に示されたように、本発明の抗体のいくつかは、ＩＡＰＰおよびその前駆体形態のｐｒｏＩＡＰＰの両方と結合することができることが示されている。さらには、本発明の抗体のいくつかが、ｐｒｏＩＡＰＰと結合することができるその能力のためにヒト患者から単離されている。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体はｐｒｏＩＡＰＰと結合することができる。
【０１４９】
したがって、代替において、または、上記に加えて、１つの実施形態において、図２に示される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、および／または、図２に示されるＣＤＲに１つまたは複数のアミノ酸置換を含んでなるＣＤＲの１つまたは複数をその可変領域に含む本発明の抗体あるいはそのＩＡＰＰ結合フラグメントおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合フラグメントが提供される。
【０１５０】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、図２に示されるＶＨ領域および／またはＶＬ領域、あるいは、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むそのＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列を含む抗体のいずれか１つである。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトＢ細胞に存在したような重鎖および軽鎖の同族性の対形成の保存によって特徴づけられる。
【０１５１】
代替では、本発明の抗体は、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに対する結合について、図２に示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域を有する抗体の少なくとも１つと競合する抗体あるいはその抗原結合フラグメント、誘導体または変異体である。
【０１５２】
本発明の抗体は、治療適用のためには特に、ヒトの抗体である場合がある。代替では、本発明の抗体は、動物における診断方法および研究のために特に有用である齧歯類抗体、齧歯類化抗体または齧歯類−ヒトのキメラ抗体、好ましくは、マウス抗体、マウス化抗体またはマウス−ヒトのキメラ抗体、あるいは、ラット抗体、ラット化抗体またはラット−ヒトのキメラ抗体である。１つの実施形態において、本発明の抗体は齧歯類−ヒトのキメラ抗体または齧歯類化抗体である。
【０１５３】
さらには、１つの実施形態において、本発明のキメラ抗体は、実施例において記載されるような例示的なマウスキメラ抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の結合性質を示す。さらに、本発明のマウスキメラ抗体は、実施例６において記載されるようなヒトＩＡＰＰ原線維に高い親和性で結合する。好ましくは、キメラ抗体の結合親和性はそれらのヒト対応物と類似している。この関連において、結合特異性が、例示的なマウスキメラ抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１について示されるような範囲である場合があり、ＥＣ５０が、実施例６において記載され、その図１１および表Ｃに示されるように、それぞれ、１８．６ｎＭ、２３．９ｎＭおよび１１．５ｎＭである。結合がＢＳＡに対しては何ら認められなかった。
【０１５４】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、培養される単一のＢ細胞またはオリゴクローナルなＢ細胞の培養物、および、前記Ｂ細胞によって産生される抗体を含有する培養物の上清によって提供され、それらにおける抗ＩＡＰＰ抗体および／またはｐｒｏＩＡＰＰ抗体の存在および親和性についてスクリーニングされる。スクリーニングプロセスは、配列番号１によって表されるアミノ酸配列の合成された全長型ｈＩＡＰＰペプチドに由来するｈＩＡＰＰのオリゴマーのような生来型モノマー凝集物、原線維性凝集物または非原線維性凝集物に対する結合についてのスクリーニング、ならびに／あるいは、配列番号７によって表されるアミノ酸配列ＴＰＩＥＳＨＱＶＥＫＲＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲのヒトｐｒｏＩＡＰＰに由来する合成ペプチド（Ｎ末端フラグメント）に対する結合についての別個で、かつ、独立したスクリーニングを含む。
【０１５５】
加えて、または、代替において、抗ＩＡＰＰ抗体および／またはｐｒｏＩＡＰＰ抗体の存在および親和性についてのスクリーニングプロセスは、ここでは膵島上のアミロイド沈着物について同様に行われる高感度な組織アミロイド斑免疫反応性（ＴＡＰＩＲ）アッセイ（例えば、国際特許出願公開ＷＯ２００４／０９５０３１（その開示内容が参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるアッセイなど）の工程を含む場合がある。さらには、または、代替において、抗ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに対する結合についての膵臓切片に対するスクリーニング、例えば、脳切片および脊髄切片について国際特許出願公開ＷＯ２００８／０８１００８に同様に記載されるスクリーニングなどが行われる場合がある。
【０１５６】
上記で述べられるように、ヒト免疫応答でのその生成のために、本発明のヒトモノクローナル抗体は、特定の病理学的関連性を有し、かつ、例えば、マウスモノクローナル抗体の作製のための免疫化プロセス、および、ファージディスプレーライブラリーのインビトロスクリーニングの場合には接近可能でないかもしれないか、またはより低い免疫原性であるかもしれないエピトープをそれぞれ認識するであろう。したがって、本発明のヒト抗ＩＡＰＰ抗体および／またはヒトｐｒｏＩＡＰＰ抗体のエピトープは独特であること、および、本発明のヒトモノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合することができる他の抗体が存在しないこと（図５Ａもまた参照のこと）を明記することは賢明であり、これらにより、本発明の抗体ＮＩ−２０３．１９Ｈ８および抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１のそれぞれの独特のエピトープが示される。本発明の抗体の独特さについてさらに示すものが、実施例３において示されるように、本発明の抗体ＮＩ−２０３．９Ａ２および抗体ＮＩ−２０３．８Ｅ３はＩＡＰＰ凝集物の想定され得る立体配座エピトープ（これは上記で示されるように、特定の病理学的関連性を有し、かつ、抗体作製のための通常的なプロセス（例えば、免疫化またはインビトロライブラリースクリーニングなど）によって同様に得ることができないかもしれない）と結合するという事実である。
【０１５７】
したがって、１つの実施形態において、本発明はまた、概して、ＩＡＰＰに対する特異的な結合について本発明のヒトモノクローナル抗体と競合する抗ＩＡＰＰ抗体およびＩＡＰＰ結合性分子にまで及ぶ。本発明は、より具体的には、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体に関するものであり、この場合、当該抗体は、ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１、ＮＩ−２０３．８Ｅ３、ＮＩ−２０３．１９Ｆ２およびＮＩ−２０３．１５Ｃ７からなる群から選択される参照抗体と同じＩＡＰＰのエピトープに特異的に結合する。
【０１５８】
さらには、１つの実施形態において、本発明はまた、概して、ｐｒｏＩＡＰＰに対する特異的な結合について本発明のヒトモノクローナル抗体と競合する抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体ならびにＩＡＰＰ結合性分子および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子にまで及ぶ。したがって、本発明は、より具体的にはまた、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体に関するものであり、この場合、当該抗体は、ＮＩ−２０３．１Ｄ１０、ＮＩ−２０３．２Ａ１１、ＮＩ−２０３．１０Ｃ４、ＮＩ−２０３．２０Ｈ９、ＮＩ−２０３．２６Ｄ２、ＮＩ−２０３．６０Ｈ３およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１からなる群から選択される参照抗体と同じｐｒｏＩＡＰＰのエピトープに特異的に結合する。
【０１５９】
加えて、または、代替において、本発明はまた、概して、ＩＡＰＰおよびｐｒｏＩＡＰＰの両方に対する特異的な結合について本発明のヒトモノクローナル抗体と競合する二重特異性の抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体ならびにＩＡＰＰ結合性分子および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子にまで及ぶ。したがって、本発明は、より具体的にはまた、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体に関するものであり、この場合、当該抗体は、例示的抗体のＮＩ−２０３．２６Ｃ１１と同じＩＡＰＰおよびｐｒｏＩＡＰＰのエピトープに特異的に結合する。したがって、上記を考慮して、１つの実施形態において、本発明はまた、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに対する特異的な結合について本発明の抗体と競合する抗体または抗原結合性分子に関する。
【０１６０】
抗体間の競合が、試験下にある免疫グロブリンが共通の抗原（例えば、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰなど）に対する参照抗体の特異的な結合を阻害するアッセイによって求められる。数多くのタイプの競合的結合アッセイが知られている：例えば、固相での直接的または間接的な放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、固相での直接的または間接的な酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９（１９８３）、２４２〜２５３を参照のこと）、固相での直接的なビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７（１９８６）、３６１４〜３６１９、および、Ｃｈｅｕｎｇ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６（１９９０）、５４６〜５５２を参照のこと）、固相での直接的な標識化アッセイ、固相での直接的な標識化サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照のこと）、Ｉ１２５標識を使用する固相での直接的な標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ他、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１９８８）、７〜１５、および、Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ他、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２（１９９０）、７７〜８２を参照のこと）。典型的には、そのようなアッセイは、精製されたＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰまたは凝集物（例えば、固体表面、または、これらのどちらかを有する細胞に結合させたオリゴマーおよび／またはその原線維など）と、標識されていない試験用免疫グロブリンおよび標識された参照用免疫グロブリン（すなわち、本発明のヒトモノクローナル抗体）とを使用することを伴う。競合的阻害が、試験用免疫グロブリンの存在下において固体表面または細胞に結合する標識の量を求めることによって測定される。通常、試験用免疫グロブリンは過剰に存在する。好ましくは、競合的結合アッセイが、添付された実施例においてＥＬＩＳＡアッセイについて記載されるような条件のもとで行われる。競合アッセイによって特定される抗体（競合抗体）には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、および、立体的障害が生じるために、参照抗体が結合するエピトープに十分に近い隣接エピトープに結合する抗体が含まれる。通常の場合、競合抗体が過剰に存在するときには、競合抗体により、共通の抗原に対する参照抗体の特異的な結合が少なくとも５０％または７５％阻害されるであろう。したがって、本発明はさらに、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体に関しており、この場合、当該抗体は、ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１、ＮＩ−２０３．８Ｅ３、ＮＩ−２０３．１９Ｆ２およびＮＩ−２０３．１５Ｃ７からなる群から選択される参照抗体がＩＡＰＰに結合することを競合的に阻害する。
【０１６１】
加えて、本発明はさらに、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体に関しており、この場合、当該抗体は、ＮＩ−２０３．１Ｄ１０、ＮＩ−２０３．２Ａ１１、ＮＩ−２０３．１０Ｃ４、ＮＩ−２０３．２０Ｈ９、ＮＩ−２０３．２６Ｄ２、ＮＩ−２０３．６０Ｈ３およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１からなる群から選択される参照抗体がｐｒｏＩＡＰＰに結合することを競合的に阻害する。
【０１６２】
さらに、加えて、または、代替において、本発明はさらに、二重特異性抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体に関しており、この場合、当該抗体は、参照抗体（例えば、例示的抗体のＮＩ−２０３．２６Ｃ１１など）がＩＡＰＰおよびｐｒｏＩＡＰのどちかに結合することを競合的に阻害する。
【０１６３】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）から本質的になる単離されたポリペプチド、または、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）からなる単離されたポリペプチドであって、重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも１つ、または、重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列またはＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である、そのような単離されたポリペプチドを提供する。代替において、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列またはＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、図１または図２にそれぞれ示される群に関連づけられるＶＨ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＨ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列およびＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。図１および図２は、Ｋａｂａｔシステムによって定義されるＶＨ−ＣＤＲを示すが、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステムによって定義されるＶＨ−ＣＤＲもまた本発明に含まれ、これらは、図１および図２に示されるデータを使用して当業者によって容易に特定され得る。
【０１６４】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）から本質的になる単離されたポリペプチド、または、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）からなる単離されたポリペプチドであって、ＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域およびＶＨ−ＣＤＲ３領域が、図１または図２にそれぞれ示されるＶＨ−ＣＤＲ１群、ＶＨ−ＣＤＲ２群およびＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、そのような単離されたポリペプチドを提供する。
【０１６５】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）から本質的になる単離されたポリペプチド、または、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）からなる単離されたポリペプチドであって、ＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域およびＶＨ−ＣＤＲ３領域が、いずれか１つのＶＨ−ＣＤＲにおける１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸置換を除いて、図１または図２にそれぞれ示されるＶＨ−ＣＤＲ１群、ＶＨ−ＣＤＲ２群およびＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、そのような単離されたポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、アミノ酸置換は保存的である。
【０１６６】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）から本質的になる単離されたポリペプチド、または、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる単離されたポリペプチドであって、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも１つ、または、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列またはＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である、そのような単離されたポリペプチドを提供する。代替において、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列またはＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、図１または図２にそれぞれ示されるポリペプチドに関連づけられるＶＬ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＬ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列およびＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。図１および図２は、Ｋａｂａｔシステムによって定義されるＶＬ−ＣＤＲを示すが、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステムによって定義されるＶＬ−ＣＤＲもまた本発明に含まれる。
【０１６７】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）から本質的になる単離されたポリペプチド、または、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる単離されたポリペプチドであって、ＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域およびＶＬ−ＣＤＲ３領域が、図１または図２にそれぞれ示されるＶＬ−ＣＤＲ１群、ＶＬ−ＣＤＲ２群およびＶＬ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、そのような単離されたポリペプチドを提供する。
【０１６８】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）から本質的になる単離されたポリペプチド、または、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）からなる単離されたポリペプチドであって、ＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域およびＶＬ−ＣＤＲ３領域が、いずれか１つのＶＬ−ＣＤＲにおける１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸置換を除いて、図１または図２にそれぞれ示されるＶＬ−ＣＤＲ１群、ＶＬ−ＣＤＲ２群およびＶＬ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、単離されたポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、アミノ酸置換は保存的である。
【０１６９】
免疫グロブリンまたはそのコードｃＤＮＡがさらに改変される場合がある。したがって、さらなる実施形態において、本発明の方法は、キメラ抗体、マウス化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、二重特異性抗体、融合抗体、標識化抗体、または、それらのいずれか１つのアナログを製造する工程のいずれか１つを含む。対応する様々な方法が当業者には知られており、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８８）に記載される。前記抗体の誘導体がファージディスプレー技術によって得られるとき、ＢＩＡｃｏｒｅシステムにおいて用いられるような表面プラズモン共鳴を、本明細書中に記載される抗体のいずれか１つのエピトープと同じエピトープに結合するファージ抗体の効率を増大させるために使用することができる（Ｓｃｈｉｅｒ、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７（１９９６）、９７〜１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３（１９９５）、７〜１３）。キメラ抗体の製造が、例えば、国際特許出願公開ＷＯ８９／０９６２２に記載される。ヒト化抗体を製造するための方法が、例えば、欧州特許出願ＥＰ−Ａ１０２３９４００および国際特許出願公開ＷＯ９０／０７８６１に記載される。本発明に従って利用されるための抗体のさらなる供給源は、いわゆる異種抗体である。異種抗体（例えば、ヒト様抗体）をマウスにおいて製造するための一般的原理が、例えば、国際特許出願公開ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６およびＷＯ９６／３３７３５に記載される。上記で議論されたように、本発明の抗体は、例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２を含めて、完全な抗体のほかに様々な形態で、ならびに、単鎖で存在する場合がある（例えば、国際特許出願公開ＷＯ８８／０９３４４を参照のこと）。したがって、１つの実施形態において、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントからなる群から選択される本発明の抗体が提供される。
【０１７０】
本発明の様々な抗体またはそれらの対応する免疫グロブリン鎖はさらに、この技術分野において知られている従来からの技術を使用して、例えば、この技術分野において知られているアミノ酸欠失、アミノ酸挿入、アミノ酸置換、アミノ酸付加および／または組換えならびに／あるいはいずれかの他の改変を単独または組合せでのどちらかで使用することによって改変することができる。そのような改変を免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の根底にあるＤＮＡ配列に導入するための方法が、当業者には広く知られている；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）、Ｎ．Ｙ．、および、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）を参照のこと。本発明の抗体の修飾には、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、および、炭水化物成分または脂質成分および補因子などの連結を含む側鎖修飾、骨格修飾、ならびに、Ｎ末端修飾およびＣ末端修飾を含めて、１つまたは複数の構成アミノ酸における化学的および／または酵素的な誘導体化が含まれる。同様に、本発明は、記載された抗体またはその何らかのフラグメントを異種分子（例えば、カルボキシル末端での免疫刺激リガンドなど）に融合されてアミノ末端において含むキメラなタンパク質の製造を包含する；対応する技術的詳細については、例えば、国際特許出願公開ＷＯ００／３０６８０を参照のこと。
【０１７１】
加えて、重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）は、より大きい度合いの可変性と、抗原−抗体相互作用における支配的な関与とを有する領域であることがしばしば認められているので、本発明は、上記で記載されるような結合性分子を含有するペプチド、例えば、述べられた抗体のいずれか１つの可変領域のＣＤＲ３領域（特に、重鎖のＣＤＲ３）を含有するペプチドを含むペプチドを包含する。そのようなペプチドが、本発明に従って有用である結合剤を製造するために容易に合成される場合があり、または、組換え手段によって製造される場合がある。そのような方法は当業者にはよく知られている。ペプチドを、例えば、市販されている自動化されたペプチド合成機を使用して合成することができる。ペプチドはまた、ペプチドを発現するＤＮＡを発現ベクターに組み込むこと、および、細胞を、ペプチドを産生させるために発現ベクターにより形質転換することによる組換え技術によって製造することができる。
【０１７２】
したがって、本発明は、本発明のヒト抗ＩＡＰＰ抗体および／またはヒト抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体に向けられ、かつ、述べられた性質を呈示する、すなわち、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰを特異的に認識するどのような結合性分子（例えば、抗体またはその結合フラグメント）にも関連する。そのような抗体および結合性分子は、本明細書中に記載されるようなＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学によってそれらの結合特異性および結合親和性について試験することができる（例えば、実施例を参照のこと）。抗体および結合性分子のこれらの特性はウエスタンブロットによって同様に試験することができる。本発明に従って行われたその後の実験の暫定的な結果から、本発明のヒト抗ＩＡＰＰ抗体および／またはヒト抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体、特に、ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１およびＮＩ−２０３．８Ｅ３の抗体はＥＬＩＳＡ試験においてＩＡＰＰ原線維に示差的に結合することができたことが明らかにされた。さらには、本発明の抗体の２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１は、ＴｈｉｏＳ染色およびコンゴーレッド染色によって可視化されるように、ヒトにおいて病変部に、例えば、病理学的なＩＡＰＰ原線維に対応する膵島における大きいアミロイド沈着物などに優先的に結合することが示されている（図７Ａを参照のこと）。同じ性質が、抗体ＮＩ−２０３．１９Ｆ２および抗体ＮＩ−２０３．１５Ｃ７に当てはまることが予想される。
【０１７３】
ヒト抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１はアミロイド陽性切片に対する際立った膵島染色を示したが、アミロイド沈着物を欠くＴ２Ｄ患者、および、Ｔ２Ｄと診断されないコントロール患者からの膵島に対しては染色を何ら示さなかった（実施例４および図７を参照のこと）。本発明の抗体はまた、膵島のアミロイド沈着物を示す糖尿病性ネコの膵臓に対する陽性の結果を与えた（図９を参照のこと）。ヒトおよび動物の組織における病理学的形態のＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに対するこの結合特異性は、本明細書で示される生化学的実験（実施例２および図５）のほかに、膵臓における凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの出現に伴う疾患の処置および診断における本発明の抗体の有用性を強調している。
【０１７４】
免疫グロブリンをＢ細胞またはＢメモリー細胞の培養から直接に得ることの代替として、これらの細胞を、その後の発現および／または遺伝子操作のための、再編成された重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の供給源として使用することができる。再編成された抗体遺伝子を、ｃＤＮＡを作製するために、適切なｍＲＮＡから逆転写することができる。所望されるならば、重鎖定常領域を異なるアイソタイプの重鎖定常領域に交換することができ、または、完全に除くことができる。可変領域を、単鎖のＦｖ領域をコードするために連結することができる。多数のＦｖ領域を、２つ以上の標的に対する結合能を与えるために連結することができ、または、重鎖および軽鎖のキメラな組合せを用いることができる。遺伝物質が入手可能であると、所望の標的と結合するそれらの能力をともに保持する上記で記載されるようなアナログの設計は簡単である。抗体可変領域のクローニングおよび組換え抗体の作製のための方法が当業者には知られており、例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ他、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ４７（１９９６）、１〜２０；Ｄｏｅｎｅｃｋｅ他、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １１（１９９７）、１７８７〜１７９２に記載される。
【０１７５】
適切な遺伝物質が得られ、かつ、所望されるならば、アナログをコードするために改変されると、コード配列（これは、最低でも重鎖および軽鎖の可変領域をコードする配列を含む）を、標準的な組換え宿主細胞にトランスフェクションされ得るベクターにおいて含有される発現系に挿入することができる。様々なそのような宿主細胞が使用してよい；しかしながら、効率的なプロセシングのためには、哺乳動物細胞が好ましい。この目的のために有用である典型的な哺乳動物細胞株には、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞またはＮＳＯ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７６】
抗体またはアナログの製造はその後、改変された組換え宿主を、宿主細胞の成長およびコード配列の発現のために適切である培養条件のもとで培養することによって着手される。その後、抗体が、抗体を培養物から単離することによって回収される。発現系は好ましくは、シグナルペプチドを含み、その結果、生じた抗体が培地中に分泌されるように設計される。しかしながら、細胞内産生もまた可能である。
【０１７７】
上記によれば、本発明はまた、本発明の抗体または同等な結合性分子をコードするポリヌクレオチドに関連し、抗体の場合には、好ましくは、上で記載される抗体の免疫グロブリン鎖の可変ドメインを少なくともコードするポリヌクレオチドに関連する。典型的には、ポリヌクレオチドによってコードされる前記可変領域は、前記抗体の可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０１７８】
当業者は、上記の可変ドメインを有する抗体の可変ドメインが、所望される特異性および生物学的機能の他のポリペプチドまたは抗体を構築するために使用され得ることを容易に理解するであろう。したがって、本発明はまた、上で記載された可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲを含み、かつ、添付された実施例において記載される抗体と実質的に同じまたは類似する結合性質を好都合には有するポリペプチドおよび抗体を包含する。当業者は、結合親和性が、アミノ酸置換をＣＤＲ内において、または、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲと部分的に重なる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）、９０１〜９１７）の内部において行うことによって強化され得ることを理解している（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２（１９８８）、３２３〜３２７を参照のこと）。したがって、本発明はまた、述べられたＣＤＲの１つまたは複数が１つまたは複数の、好ましくは２つ以下のアミノ酸置換を含む抗体に関連する。好ましくは、本発明の抗体は、その免疫グロブリン鎖の一方または両方において、図１に示されるような、または、図２にそれぞれ示されるような可変領域の２つのＣＤＲまたは３つすべてのＣＤＲを含む。
【０１７９】
結合性分子、例えば、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体は、当業者によって知られているように、１つまたは複数のエフェクター機能を媒介する定常領域を含むことができる。例えば、補体のＣ１成分が抗体の定常領域に結合することにより、補体系が活性化される場合がある。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解において重要である。補体の活性化は炎症応答をも刺激し、自己免疫の過敏性に関与することもある。さらに、抗体は、Ｆｃ領域を介して、すなわち、抗体のＦｃ領域におけるＦｃ受容体結合部位が細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合することにより様々な細胞における受容体に結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（イプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）およびＩｇＭ（ミュー受容体）を含めて、異なるクラスの抗体について特異的であるいくつかのＦｃ受容体が存在する。抗体が細胞表面のＦｃ受容体に結合することにより、抗体被覆粒子の貪食および破壊、免疫複合体の排除、キラー細胞による抗体被覆された標的細胞の溶解（これは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害またはＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症性媒介因子の放出、胎盤移行および免疫グロブリン産生の制御を含む多数の重要かつ多様な生物学的応答が誘発される。
【０１８０】
したがって、本発明の特定の実施形態には、少なくとも定常領域ドメインの１つまたは複数の一部が欠失されているか、さもなければ変化させられており、その結果、所望される生化学的特性を提供するように、例えば、およそ同じ免疫原性の完全な未変化抗体と比較したとき、低下したエフェクター機能、ダイマーを非共有結合により形成することができること、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの凝集および沈着の部位に局在化する増大した能力、低下した血清中半減期、あるいは、増大した血清中半減期などを提供するようにされている抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体が含まれる。例えば、本明細書中に記載される診断方法および処置方法において使用されるためのある種の抗体は、免疫グロブリン重鎖に類似するポリペプチド鎖を含むが、１つまたは複数の重鎖ドメインの少なくとも一部を欠くドメイン欠失抗体である。例えば、ある種の抗体では、改変された抗体の定常領域の１つのドメイン全体が欠失されるであろう。例えば、ＣＨ２ドメインのすべてまたは一部が欠失されるであろう。他の実施形態において、本明細書中に記載される診断方法および処置方法において使用されるためのある種の抗体は、グリコシル化を排除するために変化させられる定常領域（例えば、ＩｇＧ重鎖定常領域）を有しており、これは、本明細書中の他のところでは、非グルコシル化抗体または「ａｇｌｙ」抗体として示される。そのような「ａｇｌｙ」抗体は、酵素学的に、ならびに、定常領域におけるコンセンサスなグリコシル化部位を操作することによって調製されてもよい。理論によって拘束されることはないが、「ａｇｌｙ」抗体は生体内での安全性および安定性の改善されたｐｒｏフィルを有する場合があると考えられる。所望されるエフェクター機能を有する非グリコシル化抗体を製造する方法が、例えば、国際特許出願公開ＷＯ２００５／０１８５７２に見出される（その全体が参照によって組み込まれる）。
【０１８１】
本明細書中に記載されるある種の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体において、Ｆｃ部分が、この技術分野において知られている技術を使用して、エフェクター機能を低下させるために変異させられる場合がある。例えば、定常領域ドメインの（点変異または他の手段による）欠失または不活性化は、循環する改変された抗体のＦｃ受容体結合を低下させ、それにより、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの局在化を増大させる場合がある。他の場合には、本発明と一致する定常領域改変が補体結合を和らげ、したがって、抱合された細胞毒素の血清半減期および非特異的会合を低下させることがあるかもしれない。定常領域のさらに他の改変が、増大した抗原特異性または抗体柔軟性に起因する高まった局在化を可能にするジスルフィド連結またはオリゴ糖成分を改変するために使用される場合がある。そのような改変の得られた生理学的プロフィール、生物学的利用能および他の生化学的影響、例えば、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの局在化、生体分布および血清半減期などが、過度な実験を行うことなく、広く知られている免疫学的技術を使用して容易に測定および定量化され得る。
【０１８２】
本明細書中に記載されるある種の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体において、Ｆｃ部分が、例として、Ｆｃγ受容体、ＬＲＰまたはＴｈｙ１受容体を介する抗体の受容体媒介性エンドサイトーシスを高めることによって、あるいは、「ＳｕｐｅｒＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（これは、抗体が、生細胞を傷つけることなく生細胞内に往復させられることを可能にすると言われる）（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５）、２３７〜２４１）によって抗体の細胞取り込みを増大させるために変異させられる場合があり、または、代わりのタンパク質配列に交換される場合がある。例えば、抗体結合領域と、細胞表面受容体の同族タンパク質リガンドとの融合タンパク質、あるいは、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰならびに細胞表面受容体に結合する特異的な配列を有する二重特異性抗体または多特異性抗体の作製が、この技術分野において知られている技術を使用して設計される場合がある。
【０１８３】
本明細書中に記載されるある種の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体において、Ｆｃ部分が、その血液脳関門透過を増大させるために変異させられる場合があり、または、代わりのタンパク質配列に交換される場合があり、あるいは、抗体が化学的に改変される場合がある。
【０１８４】
本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体の改変された形態を、この技術分野において知られている技術を使用して完全な前駆体または親抗体から作製することができる。例示的な技術が本明細書中により詳しく議論される。本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体は、この技術分野において知られている技術を使用して作製または製造することができる。特定の実施形態において、抗体分子またはそのフラグメントが「組換え製造され」、すなわち、組換えＤＮＡ技術を使用して製造される。抗体分子またはそのフラグメントを作製するための例示的な技術が本明細書中の他のところでより詳しく議論される。
【０１８５】
本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体にはまた、例えば、共有結合による結合により、抗体がその同族エピトープに特異的に結合することが妨げられないように、どのようなタイプの分子でも抗体に共有結合により結合させることによって改変される誘導体が含まれる。例えば、しかし、限定としてではなく、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、知られている保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって改変されている抗体が含まれる。数多くの化学的修飾のどれもが、知られている技術によって行われる場合があり、これらには、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などが含まれるが、これらに限定されない。加えて、誘導体は１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有する場合がある。
【０１８６】
特に好ましい実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体は、有害な免疫応答を処置されるべき動物において、例えば、ヒトにおいて誘発しないであろう。特定の実施形態において、結合性分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは患者、例えば、ヒト患者に由来し、続いて、抗体またはその抗原結合フラグメントが由来する同じ種、例えば、ヒトにおいて使用され、これにより、有害な免疫応答の出現を緩和するか、または最小限に抑える。
【０１８７】
脱免疫化もまた、抗体の免疫原性を低下させるために使用することができる。本明細書中で使用される場合、用語「脱免疫化」は、Ｔ細胞エピトープを改変するための抗体の変化を包含する（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９８／５２９７６および同ＷＯ００／３４３１７を参照のこと）。例えば、出発抗体からのＶＨ配列およびＶＬ配列が分析され、そして、相補性決定領域（ＣＤＲ）との関連でのエピトープの所在位置、および、配列内の他の重要な残基を示すそれぞれのＶ領域からのヒトＴ細胞エピトープ「マップ」が分析される。Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープが、最終的な抗体の活性を変化させる危険性が低い代わりのアミノ酸置換を特定するために分析される。アミノ酸置換の組合せを含む様々な代替的なＶＨ配列およびＶＬ配列が設計され、これらの配列が続いて、本明細書中に開示される診断方法および処置方法における使用のために様々な結合性ポリペプチド（例えば、ＩＡＰＰ特異的抗体および／またはｐｒｏＩＡＰＰ特異的抗体あるいはそれらの免疫特異性フラグメント）に組み込まれ、その後、これらは機能について試験される。典型的には、１２個〜２４個の間の変化型抗体が作製され、試験される。改変されたＶ領域およびヒトＣ領域を含む完全な重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子がその後、発現ベクターにクローン化され、それに続くプラスミドが、完全な抗体の産生のために細胞株に導入される。その後、抗体が、適切な生化学的アッセイおよび生物学的アッセイにおいて比較され、最適な変異体が特定される。
【０１８８】
モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ技術、組換え技術およびファージディスプレー技術またはそれらの組合せの使用を含むこの技術分野において知られている広範囲の様々な技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体を、この技術分野において知られているハイブリドーマ技術、および、例えば、Ｈａｒｌｏｗ他、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、５６３〜６８１（１９８１）に教示されるハイブリドーマ技術を含む様々なハイブリドーマ技術を使用して製造することができる（前記参考文献はそれらの全体が参照によって組み込まれる）。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用される場合、ハイブリドーマ技術により製造される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、真核生物クローン、原核生物クローンまたはファージクローンのどのようなものも含めて、ただ１つのクローンに由来する抗体を示し、モノクローナル抗体が製造される方法に由来する抗体を示さない。したがって、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術により製造される抗体に限定されない。特定の実施形態において、本発明の抗体は、本明細書中に記載されるように、エプスタイン・バールウイルスによる形質転換により不死化されているヒトＢ細胞に由来する。
【０１８９】
広く知られているハイブリドーマプロセス（Ｋｏｈｌｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５）、４９５）では、哺乳動物から得られる比較的短命の、すなわち、いつかは死滅するリンパ球、例えば、本明細書中に記載されるようなヒト対象に由来するＢ細胞が、不死性の腫瘍細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）と融合され、このようにして、不死性であり、かつ、Ｂ細胞の遺伝子コードされた抗体を産生することができるハイブリッド細胞、すなわち、「ハイブリドーマ」がもたらされる。得られたハイブリッドは、選抜、希釈および再成長によって単一の遺伝的形質に分離され、それぞれの個々の株が単一抗体の形成のための特定の遺伝子を含む。それらにより、所望の抗原に対して均質であり、そして、それらの純粋な遺伝的起源に関連して、「モノクローナル」と呼ばれる抗体が産生される。
【０１９０】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、融合されていない元の骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つまたは複数の物質を好ましくは含有する好適な培養培地において播種され、成長させられる。当業者は、ハイブリドーマの形成、選抜および成長のための試薬、細胞株および培地がいくつかの供給源から市販されており、また、標準化されたプロトコルが十分に確立されていることを理解するであろう。一般に、ハイブリドーマ細胞が成長している培養培地が、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性が、インビトロアッセイによって、例えば、本明細書中に記載されるような免疫沈殿、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などによって求められる。所望される特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、当該クローンは限界希釈手法によってサブクローン化され、標準的な方法によって成長させられる場合がある（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、５９頁〜１０３頁（１９８６）を参照のこと）。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体が、従来からの精製手段によって、例えば、プロテインＡ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなどによって、培養培地、腹水または血清から分離され得ることがさらに理解されるであろう。
【０１９１】
別の実施形態において、リンパ球を顕微操作によって選択することができ、可変性遺伝子を単離することができる。例えば、末梢血単核細胞を、免疫化された哺乳動物または生まれつき免疫性の哺乳動物（例えば、ヒト）から単離し、約７日間にわたってインビトロ培養することができる。培養物を、スクリーニング基準を満たす特異的なＩｇＧについてスクリーニングすることができる。陽性のウェルからの細胞を単離することができる。個々のＩｇ産生Ｂ細胞を、ＦＡＣＳによって、または、Ｉｇ産生Ｂ細胞を補体媒介溶血プラークアッセイで特定することによって単離することができる。Ｉｇ産生Ｂ細胞をチューブの中に顕微操作することができ、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを使用して増幅することができる。ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を抗体発現ベクターにクローン化し、発現のための細胞（例えば、真核生物細胞または原核生物細胞）にトランスフェクションすることができる。
【０１９２】
代替では、抗体産生の細胞株が、当業者に広く知られている技術を使用して選択および培養される場合がある。そのような技術が様々な実験室マニュアルおよび一次刊行物に記載されている。これに関連して、下で記載されるような本発明における使用のために好適である技術が、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎ他編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載される（これは、増刊を含めて、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１９３】
特異的なエピトープを認識する抗体フラグメントが、知られている技術によって作製され得る。例えば、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントが、組換えによって、あるいは、例えば、パパイン（Ｆａｂフラグメントを製造するために）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを製造するために）などの酵素を使用する免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって製造され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。そのようなフラグメントは、例えば、免疫グロブリンの免疫特異性部分を検出用試薬（例えば、放射性同位体など）に連結することを伴う免疫診断手順における使用のために十分である。
【０１９４】
本明細書中に記載されるようなヒト抗体は、ヒト患者における治療的使用のために特に望ましい。本発明のヒト抗体が、例えば、太りすぎまたは肥満のために、代謝障害（例えば、Ｔ２Ｄ）を発症する危険性があると疑われることがある健康なヒト対象から、あるいは、障害を有するが、当該疾患の通常的でない安定した疾患経過または通常的でない軽症型を有する患者から単離される。しかしながら、抗体（例えば、本明細書中に記載される抗体など）が単離されることがある、代謝障害（例えば、Ｔ２Ｄ）を発症する危険性があると疑われる健康なヒト対象が、代謝障害（例えば、Ｔ２Ｄ）を発症する人の可能性を高めることが知られている他の危険性の存在に基づいて同様に選択されてもよい。前記の危険性が、代謝障害（例えば、Ｔ２Ｄ）の発症に関連する下記の危険因子についての人の検査から推定される場合がある：例えば、４５歳以上の年齢；太りすぎまたは肥満；糖尿病を有する近親者；家族背景が、アフリカ系アメリカ人、アラスカ先住民、アメリカ先住民、アジア系アメリカ人、ヒスパニック系／ラテン系、太平洋諸島系アメリカ人、アジア系またはアラブ系であること；妊娠糖尿病の病歴；体重が４．５ｋｇを超える少なくとも１名の新生児の出産；１４０／９０またはそれ以上の血圧；正常よりも高いコレステロールレベルで、例えば、４０ｍｇ／ｄＬ未満（１ｍｍｏｌ／Ｌ未満に相当）の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベル、または、２００〜４９９ｍｇ／ｍＬを超えるトリグリセリドレベル（２．３〜５．６ｍｍｏｌ／Ｌを超えるレベルに相当）を伴う場合；ほとんど体を動かさない生活様式；多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）の診断；事前検査での糖尿病前症の診断−５．７パーセント〜６．４パーセントのＡ１Ｃ（これはまた、ＨｂＡ１Ｃまたはグリコヘモグロビンとも呼ばれる）レベル、空腹時血中ブドウ糖不良（ＩＦＧ）または耐糖能障害（ＩＧＴ）；インスリン抵抗性に関連する他の臨床状態の診断、例えば、黒色表皮肥厚症など；心臓血管疾患の病歴など。
【０１９５】
人間の肥満または太りすぎが、代謝障害（例えば、Ｔ２Ｄ）を発症する人間の指標として使用される場合、肥満体の健康な対象および症状がない対象はそれぞれ、例えば、肥満としては分類されないが太りすぎとして、または、正常な体重の人間として分類されるので、危険性がそれほどでないと診断される対象よりも頻繁に保護的な抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体を発現させているであろうと予想することが賢明であるにもかかわらず、後者の２つの分類に属する対象が、本発明のヒト抗体を同様に得るための供給源として同様に使用されてもよい。
【０１９６】
対象が、対象の身長および体重の測定、および、対象のボディーマス指数を下記の計算に従って計算することに基づいて、正常な体重を有する、太りすぎである、または肥満であると分類されてもよい：ＢＭＩ＝体重［ｋｇ］／（身長［ｍ］）２。結果に基づいて、対象は、現行の世界保健機関基準に基づいて、正常な体重（ＢＭＩ、１８．５〜２４．９ｋｇ／ｍ２）、太りすぎ（２５．０〜２９．９ｋｇ／ｍ２）または肥満（≧３０ｋｇ／ｍ２）として分類される（世界保健機関（２０００）、「肥満：世界的蔓延の防止および管理．ＷＨＯ専門家会議報告書」、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｅｃｈ  Ｒｅｐ  Ｓｅｒ  ８９４：１．２５３）。代替において、または、加えて、対象の腹囲（ＷＣ）が測定されてもよく、そして、ＩｎｔｅｒＡｃｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、Ｌａｎｇｅｎｂｅｒｇ他、ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ．２０１２（Ｊｕｎ）、９（６）：ｅ１００１２３０に記載されるように、ＷＣを正常（男性では９４ｃｍ未満［３４．６インチ未満］および女性では８０ｃｍ未満［３１．５インチ未満］）、適度に増大した（男性では９４〜１０２ｃｍ［３４．６〜４０インチ］および女性では８０〜８８ｃｍ［３１．５〜３５インチ］）または大きい（男性では１０２ｃｍ以上［４０インチ以上］および女性では８８ｃｍ以上［３５インチ以上］）として定義するための性別特異的なカットオフに基づいて使用される場合があり、この場合、大きい腹囲（大きいＷＣ）を有する健康な対象は、肥満、すなわち、Ｔ２Ｄを発症する最大の危険性としての分類と同程度の保護的な抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体をより頻繁に発現させているであろうし、また、これらの抗体を単離するために好ましく使用される場合があり、しかし、適度に増大したＷＣまたは正常なＷＣを有する人間が、抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体を単離するために同様に使用される場合がある。
【０１９７】
１つの実施形態において、本発明の抗体は抗体分子の少なくとも１つの重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つまたは複数の抗体分子からの少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つまたは複数の抗体分子からの少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つまたは複数の抗体分子からの少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つまたは複数の抗体分子からの少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つまたは複数の抗体分子からの少なくとも６つのＣＤＲを含む。主題となるこれらの抗体に含まれ得る少なくとも１つのＣＤＲを含む例示的な抗体分子が本明細書中に記載される。
【０１９８】
本発明の抗体は、抗体を合成するためにこの技術分野において知られているいずれかの方法によって、特に、化学合成によって、または、好ましくは、本明細書中に記載されるような組換え発現技術によって製造することができる。
【０１９９】
１つの実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体は、１つまたは複数のドメインが部分的または完全に欠失される合成された定常領域を含む（「ドメイン欠失抗体」）。特定の実施形態において、適合し得る改変された抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が除かれているドメイン欠失の構築物または変異体（ΔＣＨ２構築物）を含むであろう。他の実施形態については、短い連結ペプチドが、動きの柔軟性および自由を可変領域に与えるために欠失ドメインの代わりに使用される場合がある。当業者は、そのような構築物が抗体の異化速度に対するＣＨ２ドメインの調節的特性のために特に好ましいことを理解するであろう。ドメイン欠失された構築物を、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクターを使用して得ることができる（例えば、国際特許出願公開ＷＯ０２／０６０９５５および同ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２を参照のこと）。このベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失し、かつ、ドメイン欠失されたＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを提供するために操作される。
【０２００】
特定の実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体はミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）である。ミニボディを、この技術分野において記載される方法を使用して作製することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号または国際特許出願公開ＷＯ９４／０９８１７を参照のこと）。
【０２０１】
１つの実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体は、モノマーサブユニット間の会合を可能にする限り、数個のアミノ酸の欠失もしくは置換、または、１個だけのアミノ酸の欠失もしくは置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域における１個だけのアミノ酸の変異が、Ｆｃ結合を実質的に低下させるために、そして、それにより、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの局在化を増大させるために十分である場合がある。同様に、調節されるべきエフェクター機能（例えば、補体結合）を制御する１つまたは複数の定常領域ドメインのその部分を単に欠失することが望ましい場合がある。定常領域のそのような部分的欠失は抗体の選択された特性（血清半減期）を改善し、一方で、当該定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を損なわないままにし得る。そのうえ、上記において暗に示されるように、開示された抗体の定常領域は、生じた構築物のプロフィールを高める１つまたは複数のアミノ酸の変異または置換により合成物である場合がある。これに関連して、改変された抗体の立体配置および免疫原性プロフィールを実質的に維持しながら、保存されている結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によって提供される活性を妨げることが可能である場合がある。さらに他の実施形態は、１つまたは複数のアミノ酸を、望ましい特性（例えば、エフェクター機能など）を高めるために、あるいは、細胞毒素または炭水化物のより多くの結合を提供するために定常領域に付加することを含む。そのような実施形態では、選択された定常領域ドメインに由来する特異的な配列を挿入すること、または複製することが望ましい場合がある。
【０２０２】
本発明はまた、本明細書中に記載される抗体分子（例えば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）を含む抗体、本明細書中に記載される抗体分子（例えば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）から本質的になる抗体、あるいは、本明細書中に記載される抗体分子（例えば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）からなる抗体を提供し、そのような抗体またはそのフラグメントはＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに免疫特異的に結合する。当業者に知られている様々な標準的技術を、抗体をコードするヌクレオチド配列に変異を導入するために使用することができ、そのような技術には、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、変異体（誘導体を含む）は、基準となるＶＨ領域、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＬ−ＣＤＲ３に対して５０未満のアミノ酸置換、４０未満のアミノ酸置換、３０未満のアミノ酸置換、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換または２未満のアミノ酸置換をコードする。「保存的（な）アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似する電荷を伴う側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えられるアミノ酸置換である。類似する電荷を伴う側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーがこの技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐した側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。代替において、変異を、例えば、飽和変異誘発などによってコード配列の全体または一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた変異体を、活性（例えば、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰと結合する能力）を保持する変異体を特定するために生物学的活性についてスクリーニングすることができる。
【０２０３】
例えば、変異を抗体分子のフレームワーク領域においてのみに、または、抗体分子のＣＤＲ領域においてのみに導入することが可能である。導入された変異はサイレント変異または中立のミスセンス変異である場合があり、例えば、抗体の抗原結合能に対する影響を全く有しないか、またはほとんど有しない場合があり、実際、いくつかのそのような変異はアミノ酸配列を全く変化させない。これらのタイプの変異は、コドン使用を最適化するために、または、ハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用である場合がある。本発明の抗体をコードするコドン最適化コード領域が本明細書中の他のところで開示される。代替において、非中立的なミスセンス変異により、抗体の抗原結合能が変化する場合がある。ほとんどのサイレント変異および中立的ミスセンス変異の位置はフレームワーク領域内である可能性が高く、一方、ほとんどの非中立的ミスセンス変異の位置はＣＤＲ内である可能性が高く、だが、このことは絶対的要件でない。当業者であれば、所望される性質、例えば、抗原結合活性における変化がないことまたは結合活性における変化（例えば、抗原結合活性における改善または抗体特異性における変化）などを有する変異体分子を設計し、試験することができるであろう。変異誘発後、コードされたタンパク質が常法により発現させられる場合があり、そして、コードされたタンパク質の機能的活性および／または生物学的活性（例えば、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの少なくとも１つのエピトープと免疫特異的に結合する能力）を、本明細書中に記載される技術を使用して、または、この技術分野において知られている技術を常法により改変することによって求めることができる。
【０２０４】
ＩＩＩ．抗体をコードするポリヌクレオチド
抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体をコードするポリヌクレオチドは、どのようなポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド（これらは非修飾のＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡである場合がある）からでも構成され得る。例えば、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、ならびに、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖である場合がある、あるいは、より典型的には、二本鎖である場合があるか、または、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物である場合があるＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。加えて、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体をコードするポリヌクレオチドはまた、安定性または他の理由のために改変される１つまたは複数の修飾された塩基あるいはＤＮＡ骨格またはＲＮＡ骨格を含有してもよい。「修飾（改変）（された）」塩基には、例えば、トリチル化塩基および非通常的塩基（例えば、イノシンなど）が含まれる。様々な修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに対して行うことができる；したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的または代謝的に改変された形態を包含する。
【０２０５】
免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリンの重鎖部分または軽鎖部分）に由来するポリペプチドの非天然型変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドを、１つまたは複数のアミノ酸置換、アミノ酸付加またはアミノ酸欠失が、コードされたタンパク質に導入されるように、１つまたは複数のヌクレオチド置換、ヌクレオチド付加またはヌクレオチド欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列に導入することによって作出することができる。変異は、標準的な技術によって、例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などによって導入される場合がある。好ましくは、保存的なアミノ酸置換が１つまたは複数の非必須アミノ酸残基において行われる。
【０２０６】
よく知られているように、ＲＮＡが、標準的な技術、例えば、イソチオシアン酸グアニジウム抽出および沈殿化、その後、遠心分離またはクロマトグラフィーなどによって、元のＢ細胞、ハイブリドーマ細胞または他の形質転換細胞から単離される場合がある。望ましい場合、ｍＲＮＡが、標準的な技術、例えば、オリゴｄＴセルロースでのクロマトグラフィーなどによって総ＲＮＡから単離される場合がある。好適な技術がこの技術分野では熟知されている。１つの実施形態において、抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡが、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼをよく知られている方法に従って使用して、同時または別個に作製される場合がある。ＰＣＲが、コンセンサスな定常領域プライマーによって、または、公開された重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーによって開始される場合がある。上記で議論されるように、ＰＣＲはまた、抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために使用される場合がある。この場合、ライブラリーが、コンセンサスなプライマーまたはより大きい相同的プローブ（例えば、ヒト定常領域プローブなど）によってスクリーニングされる場合がある。
【０２０７】
ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡが、この技術分野において知られている技術を使用して細胞から単離され、そして、例えば、組換えＤＮＡ技術に関連する前記の参考文献に詳しく示される標準的なよく知られている技術に従って制限酵素マッピングおよび配列決定に供される場合がある。当然のことながら、ＤＮＡは、単離プロセスまたはその後の分析の期間中のどの時点であっても、本発明に従う合成物である場合がある。
【０２０８】
この関連において、本発明はまた、本発明の抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメインまたは可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドに関連する。１つの実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチド、そのような核酸から本質的になる単離されたポリヌクレオチド、または、そのような核酸からなる単離されたポリヌクレオチドであって、重鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ、または、重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列またはＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である、そのような単離されたポリヌクレオチドを提供する。代替において、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域またはＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列またはＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、図１に示されるポリペプチド配列に関連づけられるＶＨ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＨ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列またはＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有し、あるいは、それぞれ、図２に示されるポリペプチド配列に関連づけられるＶＨ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＨ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列またはＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【０２０９】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチド、そのような核酸から本質的になる単離されたポリヌクレオチド、または、そのような核酸からなる単離されたポリヌクレオチドであって、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも１つ、または、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列またはＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である、そのような単離されたポリヌクレオチドを提供する。代替において、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域またはＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列またはＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、図１に示されるポリペプチド配列に関連づけられるＶＬ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＬ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列またはＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有し、あるいは、それぞれ、図２に示されるポリペプチド配列に関連づけられるＶＬ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＬ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列またはＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【０２１０】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチド、そのような核酸から本質的になる単離されたポリヌクレオチド、または、そのような核酸からなる単離されたポリヌクレオチドであって、ＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域およびＶＨ−ＣＤＲ３領域が、図１に示されるＶＨ−ＣＤＲ１群、ＶＨ−ＣＤＲ２群およびＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるか、または、それぞれ、図２に示されるようなＶＨ−ＣＤＲ１群、ＶＨ−ＣＤＲ２群およびＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、そのような単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２１１】
この技術分野において知られているように、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチドの間における「配列同一性」が、一方のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのアミノ酸配列または核酸配列を第２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列に対して比較することによって求められる。本明細書中で議論されるとき、任意の特定のポリペプチドが別のポリペプチドと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるかどうかを、この技術分野において知られている方法およびコンピュータープログラム／ソフトウエア（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、５３７１１）（これに限定されない）など）を使用して決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴでは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２（１９８１）、４８２〜４８９）の局所的相同性アルゴリズムを、２つの配列の間における相同性の最も良いセグメントを見出すために使用する。ＢＥＳＴＦＩＴまたはいずれかの他の配列アライメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明による参照配列と９５％同一であるかどうかを決定するときには、当然のことながら、同一性の百分率が参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算され、かつ、参照配列におけるアミノ酸の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。
【０２１２】
本発明の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、表２または表３に示されるような抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体のＶＨ領域またはＶＬ領域のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、あるいは、そのような核酸から本質的になるか、あるいは、そのような核酸からなる。これに関連して、当業者は、軽鎖および／または重鎖の可変ドメインを少なくともコードするポリヌクレオチドが両方の免疫グロブリン鎖または一方の免疫グロブリン鎖のみの可変ドメインをコードし得ることを容易に理解するであろう。したがって、１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、表２に示されるような抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のポリヌクレオチド配列、あるいは、表３に示されるような抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域の配列を有する核酸を含むか、あるいは、そのような核酸から本質的になるか、あるいは、そのような核酸からなる。
【０２１３】
表２：ＩＡＰＰ抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のヌクレオチド配列
【表２−１】
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【０２１４】
【表２−２】
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【０２１５】
【表２−３】
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【０２１６】
【表２−４】
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【０２１７】
【表２−５】
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【０２１８】
【表２−６】
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【０２１９】
表３：プロＩＡＰＰ抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のヌクレオチド配列
【表３−１】
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【０２２０】
【表３−２】
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【０２２１】
【表３−３】
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【０２２２】
【表３−４】
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【０２２３】
本発明にはまた、他のところで記載されるように、本発明のポリヌクレオチドのフラグメントが含まれる。加えて、本明細書中に記載されるように、融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂフラグメントおよび他の誘導体をコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。
【０２２４】
ポリヌクレオチドは、この技術分野において知られているいずれかの方法によって作製または製造される場合がある。例えば、抗体のヌクレオチド配列が知られているならば、当該抗体をコードするポリヌクレオチドが、例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ他、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７（１９９４）、２４２に記載されるように、化学合成されたオリゴヌクレオチドから組み立てられる場合があり、これには、簡単に記載すると、抗体をコードする配列の一部分を含有する重複するオリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、ならびに、連結されたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を伴う。
【０２２５】
代替において、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体をコードするポリヌクレオチドが、好適な供給源から得られる核酸から作製される場合がある。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手できず、しかし、抗体分子の配列が知られているならば、当該抗体をコードする核酸が化学合成される場合があるか、あるいは、好適な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、あるいは、ＩＡＰＰ特異的抗体および／またはｐｒｏＩＡＰＰ特異的抗体を発現するいずれかの組織もしくは細胞（例えば、抗体を発現させるために選択されるハイブリドーマ細胞など）から作製されるｃＤＮＡライブラリー、または、そのようなものから単離される核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイゼーション可能である合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって得られる場合があり、または、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを特定するために特定の遺伝子配列について特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られる場合がある。ＰＣＲによって生じる増幅された核酸がその後、この技術分野において広く知られているいずれかの方法を使用して、複製可能なクローニングベクターにクローン化される場合がある。
【０２２６】
抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、そのヌクレオチド配列が、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製するために、例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入をもたらすために、ヌクレオチド配列の操作についてこの技術分野においてよく知られている方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなどを使用して操作される場合がある（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０）、および、Ａｕｓｕｂｅｌ他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９８）に記載される技術を参照のこと。これらはともに、それらの全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０２２７】
ＩＶ．抗体ポリペプチドの発現
単離された遺伝物質が、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体を提供するために操作された後、抗体をコードするポリヌクレオチドは典型的には、所望される量の抗体を産生させるために使用されることがある宿主細胞への導入のために発現ベクターに挿入される。抗体あるいはそのフラグメント、誘導体またはアナログ（例えば、標的分子に結合する抗体の重鎖または軽鎖）の組換え発現が本明細書中に記載される。本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖あるいはその一部分（好ましくは重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインを含有するその一部分）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子を産生させるためのベクターが、この技術分野においてよく知られている技術を使用する組換えＤＮＡ技術によって作製される場合がある。したがって、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製するための方法が本明細書中に記載される。当業者によく知られている方法を、抗体コード配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。したがって、本発明は、本発明の抗体分子あるいはその重鎖または軽鎖あるいは重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列をｐｒｏモーターに機能的に連結されて含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含む場合があり（例えば、国際特許出願公開ＷＯ８６／０５８０７およびＷＯ８９／０１０３６、ならびに、米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）、また、抗体の可変ドメインが、重鎖全体または軽鎖全体を発現させるためにそのようなベクターにクローン化される場合がある。
【０２２８】
用語「ベクター」または「発現ベクター」は、所望される遺伝子を宿主細胞に導入し、その遺伝子をその宿主細胞において発現させるためのビヒクルとして本発明に従って使用されるベクターを意味するために本明細書中では使用される。当業者には知られているように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から容易に選択される場合がある。一般に、本発明と適合し得るベクターは、選択マーカー、所望される遺伝子のクローニングを容易にするための適切な制限部位、ならびに、真核生物細胞または原核生物細胞における進入能および／または複製能を含む。本発明の目的のために、数多くの発現ベクター系が用いられる場合がある。例えば、１つのクラスのベクターでは、動物ウイルス、例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルスなどに由来するＤＮＡエレメントが利用される。他では、内部リボソーム結合部位を伴う多シストロン系の使用を伴う。加えて、ＤＮＡをその染色体に組み込んでいる細胞が、トランスフェクションされた宿主細胞の選択を可能にする１つまたは複数のマーカーを導入することによって選択される場合がある。マーカーにより、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤抵抗性（例えば、抗生物質）、または、重金属（例えば、銅など）に対する抵抗性が与えられる場合がある。選択マーカー遺伝子は、発現させられるＤＮＡ配列に直接に連結することができるか、または、共形質転換によって同じ細胞に導入することができる。さらなるエレメントがまた、ｍＲＮＡの最適な合成のために必要となる場合がある。これらのエレメントには、シグナル配列、スプライス信号ならびに転写プロモーター、エンハンサーおよび終結シグナルが含まれる場合がある。
【０２２９】
特に好ましい実施形態において、クローン化された可変領域遺伝子が、上記で議論されるような重鎖定常領域遺伝子および軽鎖定常領域遺伝子（好ましくはヒトの遺伝子）と一緒に発現ベクターに挿入される。１つの実施形態において、このことが、Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．の独自開発による発現ベクター（これはＮＥＯＳＰＬＡと称し、米国特許第６，１５９，７３０号に開示される）を使用して達成される。このベクターは、サイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー、マウスのベータグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０の複製起点、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのエキソン１およびエキソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼの遺伝子およびリーダー配列を含有する。このベクターは、可変領域遺伝子および定常領域遺伝子の取り込み、ＣＨＯ細胞におけるトランスフェクション、それに続く、Ｇ４１８含有培地における選択、および、メトトレキサート増幅を行ったとき、抗体の非常に高いレベルの発現をもたらすことが見出されている。当然のことながら、発現を真核生物細胞において誘発することができる発現ベクターはどれも、本発明において使用される場合がある。好適なベクターの例には、プラスミドのｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１およびｐＺｅｏＳＶ２（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能である）、ならびに、プラスミドのｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から入手可能である）が含まれるが、これらに限定されない。一般に、非常に多数の形質転換細胞を、好適に高レベルの免疫グロブリンの重鎖および軽鎖を発現する形質転換細胞についてスクリーニングすることは、例えば、ロボットシステムによって行うことができる日常的な実験である。ベクター系はまた、米国特許第５，７３６，１３７号および第５，６５８，５７０号に教示される（これらのそれぞれがその全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。この系は、例えば、３０ｐｇ／細胞／日を超える高い発現レベルを提供する。他の例示的なベクター系が、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示される。
【０２３０】
他の好ましい実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体が、多シストロン構築物、例えば、米国特許出願公開第２００３−０１５７６４１号Ａ１（その全体が本明細書中に組み込まれる）に開示される多シストロン構築物などを使用して発現させられる場合がある。これらの発現系において、目的とする多数の遺伝子産物（例えば、抗体の重鎖および軽鎖など）がただ１つの多シストロン構築物からもたらされる場合がある。これらの系では、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が、比較的高いレベルの抗体を提供するために都合よく使用される。適合し得るＩＲＥＳ配列が米国特許第６，１９３，９８０号（これもまた本明細書中に組み込まれる）に開示される。当業者は、そのような発現系が、本出願において開示される抗体の完全な範囲を効果的に産生するために使用されることがあることを理解するであろう。したがって、１つの実施形態において、本発明は、抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメインまたは可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドを、場合により、前記結合性分子の他の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドとの組合せで含むベクターを提供する。
【０２３１】
より一般的には、抗体のモノマーサブユニットをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が調製されると、発現ベクターが、適切な宿主細胞に導入される場合がある。宿主細胞へのプラスミドの導入を、当業者にはよく知られている様々な技術によって達成することができる。これらには、例えば、Ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）またはリポフェクタミンを使用するリポトランスフェクションを含むトランスフェクション、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、包まれたＤＮＡを用いた細胞融合、顕微注入、および、無傷のウイルスによる感染が含まれるが、これらに限定されない。典型的には、宿主へのプラスミド導入が、標準的なリン酸カルシウム共沈殿法により行われる。発現構築物を有する宿主細胞が、軽鎖および重鎖を産生させるために適切である条件のもとで成長させられ、重鎖および／または軽鎖のタンパク質合成についてアッセイされる。例示的なアッセイ技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または蛍光活性化細胞分取器分析（ＦＡＣＳ）および免疫組織化学などが含まれる。
【０２３２】
発現ベクターが従来からの技術によって宿主細胞に移され、トランスフェクションされた細胞がその後、抗体を本明細書中に記載される方法における使用のために産生させるため従来からの技術によって培養される。したがって、本発明には、好ましくは異種プロモーターに機能的に連結される、本発明の抗体またはその重鎖もしくは軽鎖、あるいは、少なくともその免疫グロブリンの結合ドメインまたは可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞が含まれる。加えて、または、代替において、本発明にはまた、抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメインまたは可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドを、場合により、前記結合性分子の他の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドとの組合せで含む本明細書中上記で定義されるようなベクターを含む宿主細胞が含まれる。二重鎖抗体を発現させるための好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードする単一のベクターまたは複数のベクターが、下記で詳述されるように、完全な免疫グロブリン分子の発現のために宿主細胞において共発現させられる場合がある。
【０２３３】
宿主細胞が本発明の２つの発現ベクターにより共トランスフェクションされる場合があり、この場合、第１のベクターが重鎖由来のポリペプチドをコードし、第２のベクターが軽鎖由来のポリペプチドをコードする。これら２つのベクターは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択マーカーを含有する場合がある。代替では、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方をコードするただ１つのベクターが使用される場合がある。そのような状況では、軽鎖が好都合には、毒性のない重鎖の過剰を避けるために重鎖の前に置かれる（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２（１９８６）、５２；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７（１９８０）、２１９７を参照のこと）。重鎖および軽鎖のためのコード配列がｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む場合がある。
【０２３４】
本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを有する細胞を示す。抗体を組換え宿主から単離するためのプロセスの記載において、用語「細胞」および「細胞培養（物）」が、別途明確に指定される場合を除き、抗体の供給源を示すために交換可能に使用される。別の言い方をすれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠心分離された細胞全体から、または、培地および懸濁された細胞の両方を含有する細胞培養物からのどちらをも意味する場合がある。
【０２３５】
様々な宿主−発現ベクター系が、本明細書中に記載される方法において使用されるための抗体分子を発現させるために利用される場合がある。そのような宿主−発現系は、目的とするコード配列が産生され、続いて精製されることがあるビヒクルを表し、しかし、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換またはトランスフェクションされたとき、本発明の抗体分子をその場で発現する細胞もまた表す。これらには、微生物、例えば、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換される細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換される酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）が感染させられる昆虫細胞系；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ；タバコモザイクウイルスＴＭＶ）が感染させられるか、または、抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）により形質転換される植物細胞系；あるいは、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＢＬＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、完全な組換え抗体分子の発現のためにはとりわけ、細菌細胞（例えば、大腸菌など）、より好ましくは真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ベクター（例えば、ヒトサイトメガロウイルスからの主要前初期遺伝子プロモーターエレメントなど）と併せての哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などが、抗体のための効果的な発現系である（例えば、Ｆｏｅｃｋｉｎｇ他、Ｇｅｎｅ  ４５（１９８６）、１０１；Ｃｏｃｋｅｔｔ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８（１９９０）、２を参照のこと）。
【０２３６】
タンパク質発現のために使用される宿主細胞株は多くの場合、哺乳動物起源である；当業者には、宿主細胞株において発現させられる所望の遺伝子産物のために最もよく適する特定の宿主細胞株を優先的に決定する能力があると思われる。例示的な宿主細胞株には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲ欠損）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸ガン）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０のＴ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）および２９３（ヒト腎臓）が含まれるが、これらに限定されない。ＣＨＯ細胞および２９３細胞が特に好ましい。宿主細胞株は典型的には、商用サービスから、すなわち、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能であり、または、発表された文献から入手可能である。
【０２３７】
加えて、挿入された配列の発現を調節するか、あるいは、遺伝子産物を所望される特定の様式で修飾し、また、プロセシングする宿主細胞系統が選ばれる場合がある。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）が当該タンパク質の機能のために重要である場合がある。種々の宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後のプロセシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系を、発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを保証するために選ぶことができる。この目的を達成するために、一次転写物の適正なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が使用される場合がある。
【０２３８】
組換えタンパク質の長期間にわたる高収量の産生のためには、安定的発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞株が操作される場合がある。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、むしろ、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーによって制御されるＤＮＡにより形質転換することができる。外来ＤＮＡを導入した後、操作された細胞は富化培地において１日間〜２日間にわたって成長させられる場合があり、その後、選択培地に切り換えられる。組換えプラスミドにおける選択マーカーは選択に対する抵抗性を与え、また、細胞がプラスミドをその染色体に安定的に組み込み、成長して、結果としてクローン化され、かつ、細胞株に拡大することができる増殖巣を形成することを可能にする。この方法は、抗体分子を安定的に発現する細胞株を操作するために都合よく使用される場合がある。
【０２３９】
数多くの選択システムが使用される場合があり、これらには、下記のものが含まれるが、それらに限定されない：単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ他、Ｃｅｌｌ  １１（１９７７）、２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８（１９９２）、２０２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙ他、Ｃｅｌｌ  ２２（１９８０）、８１７）をｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞またはａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ用いることができる。また、代謝拮抗物質抵抗性を下記の遺伝子のための選択の基礎として使用することができる：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する抵抗性を与える（Ｗｉｇｌｅｒ他、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７（１９８０）、３５７；Ｏ’Ｈａｒｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８（１９８１）、１５２７）；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する抵抗性を与える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８（１９８１）、２０７２）；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を与える（Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ他、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２（１９９３）、４８８〜５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３（１９９１）、８７〜９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２（１９９３）、５７３〜５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０（１９９３）、９２６〜９３２；ならびに、Ｍｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２（１９９３）、１９１〜２１７；ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（１９９３）、１５５〜２１５）；および、ｈｙｇｒｏ、これはヒグロマイシンに対する抵抗性を与える（Ｓａｎｔｅｒｒｅ他、Ｇｅｎｅ  ３０（１９８４）、１４７）。使用することができる、組換えＤＮＡ技術の技術分野において一般に知られている様々な方法が、Ａｕｓｕｂｅｌ他（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）に記載さされ、また、第１２章および第１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ他（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載される（これらはその全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０２４０】
抗体分子の発現レベルをベクター増幅によって増大させることができる（総説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第３巻（１９８７）を参照のこと）。抗体を発現させるベクター系におけるマーカーが増幅可能であるときには、宿主細胞の培養において存在する阻害剤のレベルにおける増大はマーカー遺伝子のコピー数を増大させるであろう。増幅された領域は抗体遺伝子に付随するので、抗体の産生もまた増大するであろう（Ｃｒｏｕｓｅ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３（１９８３）、２５７を参照のこと）。インビトロ産生では、スケールアップにより、多量の所望されるポリペプチドを与えることが可能である。組織培養条件のもとでの哺乳動物細胞培養のための様々な技術がこの技術分野において知られており、これらには、均一懸濁培養、例えば、エアーリフト型リアクターまたは連続撹拌槽リアクターにおける培養、あるいは、固定化細胞または包括化細胞の培養、例えば、中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズまたはセラミックカートリッジにおける培養が含まれる。必要および／または所望されるならば、ポリペプチドの溶液を、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的な生合成の後で、あるいは、本明細書中に記載されるＨＩＣクロマトグラフィー工程の前または後で、慣例的なクロマトグラフィー方法、例えば、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースでのクロマトグラフィー、または、（免疫）アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。
【０２４１】
本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体をコードする遺伝子はまた、哺乳動物以外の細胞、例えば、細菌細胞または昆虫細胞または酵母細胞または植物細胞において発現させることができる。核酸を容易に取り込む細菌には、腸内細菌科のメンバー、例えば、大腸菌またはサルモネラ属の菌株など；バチルス科、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など；肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）；連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）が含まれる。細菌において発現させられるとき、異種ポリペプチドは典型的には封入体の一部となることがさらに理解されるであろう。異種ポリペプチドは単離され、精製され、その後、機能的な分子に組み立てられなければならない。四価形態の抗体が所望される場合、そのサブユニットは四価抗体に自己集合するであろう（例えば、国際特許出願公開ＷＯ０２／０９６９４８を参照のこと）。
【０２４２】
細菌系において、多数の発現ベクターが、抗体分子が発現されるための意図される使用に依存して、都合よく選択される場合がある。例えば、多量のそのようなタンパク質が抗体分子の医薬組成物の作製のために産生させられることになるときには、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を導くベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターには、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．２（１９８３）、１７９１）（この場合、抗体コード配列がｌａｃＺコード領域とインフレームでベクターに個々に連結され、その結果、融合タンパク質が産生されるようにされる場合がある）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３（１９８５）、３１０１〜３１０９；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４（１９８９）、５５０３〜５５０９）などが含まれるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターもまた、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために使用される場合がある。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズのマトリックスへの吸着および結合、その後の遊離したグルタチオンの存在下での溶出によって溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは第Ｘａ因子のプロテアーゼ切断部位を含み、その結果、クローン化された標的遺伝子産物がＧＳＴ成分から放出され得るように設計される。
【０２４３】
原核生物に加えて、真核生物の微生物もまた使用される場合がある。サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、すなわち、普通のパン酵母が、真核生物の微生物の中で最も一般に使用されるが、多くの他の菌株が一般に利用可能である（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））。サッカロミセス属における発現のために、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ他、Ｎａｔｕｒｅ  ２８２（１９７９）、３９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ他、Ｇｅｎｅ  ７（１９７９）、１４１；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ他、Ｇｅｎｅ  １０（１９８０）、１５７）が一般に使用される。このプラスミドは、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母の変異菌株（例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５（１９７７）、１２））のための選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子を既に含有する。その場合、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１損傷の存在により、形質転換をトリプトファンの不在下での成長によって検出するための効果的な環境が提供される。
【０２４４】
昆虫系において、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が典型的には、外来タンパク質を発現させるためのベクターとして使用される。このウイルスはヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞において成長する。抗体コード配列がウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）の中に個々にクローン化され、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれる場合がある。
【０２４５】
本発明の抗体分子が組換え発現させられると、本発明の完全な抗体、それらのダイマー、個々の軽鎖および重鎖または他の免疫グロブリン形態を、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特に、プロテインＡの後での特異的抗原についてのアフィニティー、および、サイズ分画カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈澱）、または、タンパク質の精製のためのいずれかの他の標準的な技術によることを含めて、この技術分野の標準的な手順に従って精製することができる（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照のこと）。代替では、本発明の抗体の親和性を増大させるための好ましい方法が米国特許出願公開第２００２−０１２３０５７号Ａ１に開示される。したがって、１つの実施形態において、本発明はまた、抗ＩＡＰＰ抗体または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体あるいはその免疫グロブリン鎖を調製するための方法であって、
（ａ）本明細書中上記で定義されるようなポリヌクレオチドまたはベクターを含む本明細書中上記で定義されるような宿主細胞を培養すること、および
（ｂ）前記抗体またはその免疫グロブリン鎖を培養物から単離すること
を含む方法を提供する。
【０２４６】
さらには、１つの実施形態において、本発明はまた、本明細書中上記で定義されるようなポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはその免疫グロブリン鎖、あるいは、抗ＩＡＰＰ抗体もしくは抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体またはその免疫グロブリン鎖を調製するための前記方法によって得ることができる抗体またはその免疫グロブリン鎖に関連する。
【０２４７】
Ｖ．融合タンパク質およびコンジュゲート
特定の実施形態において、抗体ポリペプチドは、通常の場合には抗体に付随しないアミノ酸配列あるいは１つまたは複数の成分を含む。例示的な改変が下記においてより詳細に記載される。例えば、本発明の単鎖Ｆｖ抗体フラグメントは柔軟なリンカー配列を含む場合があり、または、機能的成分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素または標識（例えば、蛍光性、放射性、酵素、核磁気性および重金属など））を付加するために改変される場合がある。
【０２４８】
本発明の抗体ポリペプチドは融合タンパク質を含む場合があり、融合タンパク質から本質的になる場合があり、または、融合タンパク質からなる場合がある。融合タンパク質は、例えば、少なくとも１つの標的結合部位を伴う免疫グロブリンのＩＡＰＰ結合ドメインおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合ドメインと、少なくとも１つの異種部分、すなわち、自然界では生来的に連結されない部分とを含むキメラ分子である。これらのアミノ酸配列は、融合ポリペプチドにおいて一緒にされる別個のタンパク質において正常に存在する場合があり、または、同じタンパク質において正常に存在する場合があるが、融合ポリペプチドにおいては新しい配置で置かれる。融合タンパク質が、例えば、化学合成によって、または、ペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを作出し、翻訳することによって作出される場合がある。
【０２４９】
用語「異種（の）」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに適用される場合、当該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、比較されている実体の残部のものとは異なる実体に由来することを意味する。例えば、本明細書中で使用されるように、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体またはアナログに融合されるための“異種ポリペプチド”は、同じ種の非免疫グロブリンポリペプチド、あるいは、異なる種の免疫グロブリンポリペプチドまたは非免疫グロブリンポリペプチドに由来する。
【０２５０】
本明細書中の他のところでより詳細に議論されるように、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体はさらに、Ｎ末端またはＣ末端において異種ポリペプチドに組換え融合される場合があり、あるいは、ポリペプチドまたは他の組成物に化学的にコンジュゲート化される場合がある（共有結合によるコンジュゲート化および非共有結合によるコンジュゲート化を含む）。例えば、抗体が、検出アッセイにおいて標識として有用である分子に、また、エフェクター分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種または毒素など）に組換え融合されるか、またはコンジュゲート化される場合がある（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９２／０８４９５、ＷＯ９１／１４４３８、ＷＯ８９／１２６２４、米国特許第５，３１４，９９５号および欧州特許出願ＥＰ０３９６３８７を参照のこと）。
【０２５１】
本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体は、ペプチド結合または修飾型ペプチド結合（すなわち、ペプチドアイソスター）によって互いにつながれるアミノ酸から構成されることが可能であり、また、遺伝子によりコードされる２０個のアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有する場合がある。抗体は、天然のプロセス（例えば、翻訳後プロセシングなど）によって、または、この技術分野ではよく知られている化学的修飾技術によって改変される場合がある。そのような修飾が、基礎的な教本において、また、より詳しいモノグラフにおいて、ならびに、膨大な数の研究文献において十分に記載されている。修飾を、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含めて、抗体においてどこにでも、あるいは、炭水化物などの成分に対して行うことができる。同じタイプの修飾が、所与の抗体において、いくつかの部位において同じ程度または種々の程度で存在する場合があることが理解されるであろう。また、所与の抗体が多くのタイプの修飾を含有する場合がある。抗体は、例えば、ユビキチン化の結果として分岐する場合があり、また、分岐を伴って、または伴うことなく、環状である場合がある。環状の抗体、分岐した抗体、および、分岐した環状の抗体が、翻訳後の天然のプロセスから生じる場合があり、または、合成的方法によって作製される場合がある。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合連結、ヘム成分の共有結合連結、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合連結、脂質または脂質誘導体の共有結合連結、ホスファチジルイノシトールの共有結合連結、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加（例えば、アルギニル化など）、および、ユビキチン化が含まれる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第２版（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１頁〜１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２（１９９０）、６２６〜６４６；Ｒａｔｔａｎ他、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３（１９９２）、４８〜６２を参照のこと）。
【０２５２】
本発明はまた、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体と、異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体のＶＨ領域のいずれか１つまたは複数のアミノ酸配列、あるいは、本発明の抗体のＶＬ領域またはそのフラグメントもしくは変異体のいずれか１つまたは複数のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含むか、あるいは、そのようなポリペプチドから本質的になるか、あるいは、そのようなポリペプチドからなる。別の実施形態において、本明細書中に開示される診断方法および処置方法において使用されるための融合タンパク質は、抗体のＶＨ−ＣＤＲまたはそのフラグメント、変異体もしくは誘導体のいずれか１つ、２つ、３つのアミノ酸配列、あるいは、抗体のＶＬ−ＣＤＲまたはそのフラグメント、変異体もしくは誘導体のいずれか１つ、２つ、３つのアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含むか、あるいは、そのようなポリペプチドから本質的になるか、あるいは、そのようなポリペプチドからなる。１つの実施形態において、融合タンパク質は、本発明の抗体のＶＨ−ＣＤＲ３またはそのフラグメント、誘導体もしくは変異体のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含み、そのような融合タンパク質はＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに特異的に結合する。別の実施形態において、融合タンパク質は、本発明の抗体の少なくとも１つのＶＨ領域のアミノ酸配列と、本発明の抗体の少なくとも１つのＶＬ領域またはそのフラグメント、誘導体もしくは変異体のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む。好ましくは、融合タンパク質のＶＨ領域およびＶＬ領域は、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰと特異的に結合する単一供給源の抗体（あるいはｓｃＦｖフラグメントまたはＦａｂフラグメント）に対応する。さらに別の実施形態において、本明細書中に開示される診断方法および処置方法において使用されるための融合タンパク質は、抗体のＶＨＣＤＲのいずれか１つ、２つ、３つまたはそれ以上のアミノ酸配列と、抗体のＶＬＣＤＲまたはそのフラグメントもしくは変異体のいずれか１つ、２つ、３つまたそれ以上のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む。好ましくは、ＶＨ−ＣＤＲまたはＶＬ−ＣＤＲの２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上が、本発明の単一供給源の抗体（あるいはｓｃＦｖフラグメントまたはＦａｂフラグメント）に対応する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子もまた本発明によって包含される。
【０２５３】
文献に報告される例示的な融合タンパク質には、下記の融合物が含まれる：Ｔ細胞受容体（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４（１９８７）、２９３６〜２９４０）；ＣＤ４（Ｃａｐｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７（１９８９）、５２５〜５３１；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９（１９８９）、６８〜７０；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ他、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ  ９（１９９０）、３４７〜３５３；およびＢｙｒｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４（１９９０）、６６７〜６７０）；Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）（Ｗａｔｓｏｎ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０（１９９０）、２２２１〜２２２９；およびＷａｔｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９（１９９１）、１６４〜１６７）；ＣＤ４４（Ａｒｕｆｆｏ他、Ｃｅｌｌ  ６１（１９９０）、１３０３〜１３１３）；ＣＤ２８およびＢ７（Ｌｉｎｓｌｅｙ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３（１９９１）、７２１〜７３０）；ＣＴＬＡ−４（Ｌｉｓｌｅｙ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４（１９９１）、５６１〜５６９）；ＣＤ２２（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ他、Ｃｅｌｌ  ６６（１９９１）、１１３３〜１１４４）；ＴＮＦ受容体（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８（１９９１）、１０５３５〜１０５３９；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１９９１）、２８８３〜２８８６；およびＰｅｐｐｅｌ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４（１９９１）、１４８３〜１４８９（１９９１））；ならびにＩｇＥ受容体ａ（Ｒｉｄｇｗａｙ  ａｎｄ  Ｇｏｒｍａｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５（１９９１）、アブストラクト番号：１４４８）。
【０２５４】
本明細書中の他のところで議論されるように、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体は、ポリペプチドのインビボ半減期を増大させるために、または、この技術分野において知られている方法を使用する免疫アッセイにおける使用のために異種ポリペプチドに融合される場合がある。例えば、１つの実施形態において、ＰＥＧを、本発明の抗体に、その半減期をインビボにおいて増大させるためにコンジュゲート化することができる（例えば、Ｌｅｏｎｇ他、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１６（２００１）、１０６〜１１９；Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４（２００２）、５３１；またはＷｅｉｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０（２００２）、５１２を参照のこと）。
【０２５５】
そのうえ、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体は、マーカー配列（例えば、それらの精製または検出を容易にするためのペプチドなど）に融合することができる。好ましい実施形態において、マーカーのアミノ酸配列は、多くのものが市販されているが、とりわけ、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（ＨＩＳ）であり、例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ．、９１３１１）において提供されるタグなどである。例えば、Ｇｅｎｔｚ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６（１９８９）、８２１〜８２４に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の便利な精製をもたらす。精製のために有用である他のペプチドタグには、「ＨＡ」タグ（これは、インフルエンザの赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する）（Ｗｉｌｓｏｎ他、Ｃｅｌｌ  ３７（１９８４）、７６７）、ＧＳＴ、ｃ−ｍｙｃおよび「ｆｌａｇ」タグが含まれるが、これらに限定されない（例えば、エピトープタグ化技術の総説については、Ｂｉｌｌ  Ｂｒｉｚｚａｒｄ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４４（２００８）、６９３〜６９５を、また本発明において使用可能である最も一般的なエピトープタグを列挙するその６９４頁における表１を参照のこと。これらの主題は、本明細書により明示的に、参照によって組み込まれる）。
【０２５６】
融合タンパク質を、この技術分野においてよく知られている方法を使用して調製することができる（例えば、米国特許第５，１１６，９６４号および第５，２２５，５３８号を参照のこと）。融合が行われるまさにその部位が、融合タンパク質の分泌または結合特性を最適化するために経験的に選択される場合がある。融合タンパク質をコードするＤＮＡがその後、本明細書中上で記載されるように行われる発現のために宿主細胞にトランスフェクションされる。
【０２５７】
本発明の抗体は非コンンジュゲート化形態で使用される場合があり、あるいは、例えば、分子の治療的性質を改善するために、標的検出を容易にするために、または、患者の画像化もしくは治療のために様々な分子の少なくとも１つにコンジュゲート化される場合がある。本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体は、精製が行われるときには精製前または精製後のどちらでも標識化またはコンジュゲート化することができる。特に、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節物質、医薬剤またはＰＥＧにコンジュゲート化される場合がある。
【０２５８】
従来の抗体を含む免疫毒素であるコンジュゲートがこの技術分野において幅広く記載されている。毒素が従来からのカップリング技術によって抗体にカップリングされる場合があり、または、タンパク質毒素部分を含有する免疫毒素を融合タンパク質として作製することができる。本発明の抗体は、そのような免疫毒素を得るための対応する方法で使用することができる。そのような免疫毒素を例示するものが、Ｂｙｅｒｓ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（１９９１）、５９〜７０、および、Ｆａｎｇｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １２（１９９１）、５１〜５４によって記載される免疫毒素である。
【０２５９】
当業者は、コンジュゲートがまた、コンジュゲート化されるための選択された薬剤に依存して様々な技術を使用して組み立てられ得ることを理解するであろう。例えば、ビオチンとのコンジュゲートが、例えば、ＩＡＰＰ結合ペプチドおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合ペプチドをビオチンの活性化エステル（例えば、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなど）と反応することによって調製される。同様に、蛍光性マーカーとのコンジュゲートがカップリング剤（例えば、本明細書中に列挙されるカップリング剤）の存在下で調製される場合があり、または、イソチオシアン酸塩との反応によって、好ましくはイソチオシアン酸フルオレセインとの反応によって調製される場合がある。本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体のコンジュゲートが同様な様式で調製される。
【０２６０】
本発明はさらに、診断剤または治療剤にコンジュゲート化される本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体を包含する。抗体を、例えば、代謝疾患（例えば、Ｔ２Ｄ）の存在を明らかにして代謝疾患に罹る危険性を示すために、代謝疾患（すなわち、凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの出現を示す疾患、あるいは、臨床検査手順の一部としての凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる疾患）の発症または進行をモニターして、例えば、所与の処置療法および／または防止療法の効力を明らかにするために、診断的に使用することができる。したがって、１つの実施形態において、本発明は、検出可能に標識される抗体に関連する。さらには、１つの実施形態において、本発明は、薬物に結合させられる抗体に関連する。検出を、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体を検出可能な物質にカップリングすることによって容易にすることができる。検出可能な物質または標識は一般に、酵素、重金属（好ましくは金）、色素（好ましくは蛍光性色素または発光性色素）または放射性標識である場合がある。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光性物質、発光性物質、生物発光性物質、放射性物質、様々な陽電子放出断層撮影法を使用する陽電子放出金属、および、非放射性常磁性金属イオンが含まれる（本発明に従って診断剤として使用されるために抗体にコンジュゲート化することができる金属イオンについては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと）。好適な酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；好適な補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；好適な蛍光性物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光性物質の一例として、ルミノールが挙げられる；生物発光性物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；好適な放射性物質の例として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが挙げられる。したがって、１つの実施形態において、本発明は、検出可能な標識が、酵素、放射性同位体、蛍光団および重金属からなる群から選択される検出可能に標識された抗体を提供する。
【０２６１】
抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体はまた、化学発光化合物にカップリングすることによって検出可能に標識することができる。化学発光標識された抗体の存在がその後、化学反応の経過の期間中に生じる発光の存在を検出することによって求められる。特に有用な化学発光性の標識用化合物の例が、ルミノール、イソルミノール、テロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【０２６２】
抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体が検出可能に標識され得る方法の１つは、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体を酵素に連結し、連結された生成物を酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）において使用することによってである（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．、「Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２（１９７８）、１〜７）；Ｖｏｌｌｅｒ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１（１９７８）、５０７〜５２０；Ｂｕｔｌｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（１９８１）、４８２〜５２３；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編）、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９８０）；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．他（編）、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ、Ｔｏｋｙｏ（１９８１））。酵素は、抗体に結合しているので、例えば、分光光度法的手段、蛍光定量法的手段または目視的手段によって検出することができる化学的成分を生成するような様式で、適切な基質（好ましくは発色性基質）と反応するであろう。抗体を検出可能に標識するために使用することができる酵素には、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されない。加えて、検出を、酵素のための発色性基質を用いる比色法によって達成することができる。検出はまた、類似して調製された標準物との比較における基質の酵素反応の程度の目視比較によって達成される場合がある。
【０２６３】
検出はまた、様々な他の免疫アッセイのいずれかを使用して達成される場合がある。例えば、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体を放射能標識することによって、抗体を放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）の使用により検出することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（Ｍａｒｃｈ、１９８６）を参照のこと。これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。放射性同位体を、ガンマカウンター、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィー（これらに限定されない）を含む手段によって検出することができる。
【０２６４】
抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体はまた、蛍光放射金属（例えば、ランタニド系列の１５２Ｅｕなど）を使用して検出可能に標識することができる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート化基を使用して抗体に結合させることができる。
【０２６５】
様々な成分を抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体にコンジュゲート化するための技術がよく知られている；例えば、Ａｒｎｏｎ他、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄ他（編）、２４３頁〜５６頁、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ他、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、６２３頁〜５３頁（１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａ他（編）、４７５頁〜５０６頁（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎ他（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、３０３頁〜１６頁（１９８５）、および、Ｔｈｏｒｐｅ他、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２（１９８２）、１１９〜１５８を参照のこと。
【０２６６】
述べられたように、特定の実施形態において、結合性分子、例えば、結合性ポリペプチド、例えば、抗体またはその免疫特異性フラグメントの安定性または効力を高める成分をコンジュゲート化することができる。例えば、１つの実施形態において、ＰＥＧを、本発明の結合性分子に、その半減期をインビボにおいて増大させるためにコンジュゲート化することができる。Ｌｅｏｎｇ他、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１６（２００１）、１０６；Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４（２００２）、５３１；または、Ｗｅｉｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０（２００２）、５１２。
【０２６７】
ＶＩ．有用な組成物および方法
本発明は、本明細書中先に定義されるように、上記のＩＡＰＰ結合性分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子（例えば、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメントまたは誘導体または変異体）、あるいは、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞を含む組成物に関連する。１つの実施形態において、本発明の組成物は医薬組成物であり、かつ、医薬的に許容されるキャリアをさらに含む。さらには、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図された使用に依存して、さらなる薬剤（例えば、インターロイキンまたはインターフェロンなど）を含む場合がある。凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの出現を示すか、あるいは、凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる代謝疾患（例えば、Ｔ２Ｄ）の処置における使用のために、さらなる薬剤が、小さい有機分子、抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体、ならびに、それらの組合せからなる群から選択される場合がある。したがって、特定の好ましい実施形態において、本発明は、代謝疾患の予防的処置および治療的処置、代謝疾患の進行または代謝疾患の処置に対する応答を対象においてモニターすること、あるいは、代謝疾患を発症することについての対象の危険性を明らかにすることのための医薬組成物または診断組成物を調製するための、ＩＡＰＰ結合性分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントまたは前記抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有する結合性分子、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞の使用に関連する。
【０２６８】
したがって、１つの実施形態において、本発明は、ランゲルハンス島におけるＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの異常な蓄積および／または沈着によって特徴づけられる代謝疾患を処置する方法であって、その必要性のある対象に、本発明の上記のＩＡＰＰ結合性分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子、抗体、ポリヌクレオチド、ベクターあるいは細胞のいずれか１つの治療有効量を投与することを含む方法に関連する。用語「代謝疾患」には、慢性膵炎、嚢胞性線維症、膵臓ガンを含む、膵臓に対する損傷を引き起こし、したがって、糖尿病に至り得るかもしれない疾患を含む、Ｔ２Ｄに先行する代謝変化、Ｔ２Ｄを引き起こす代謝変化、および／または、Ｔ２Ｄと関連がある／Ｔ２Ｄに付随する代謝変化、あるいは、Ｔ２Ｄに結びつけられる代謝変化などの症状によって一般には特徴づけられる一群の障害；アルツハイマー病、ハンチントン病を含む、Ｔ２Ｄの危険性を増大させる疾患；肥満およびＴ２Ｄに結びつけられるか、または結びつけられない心臓血管疾患；ならびに／あるいは、Ｔ２Ｄそのものが含まれるが、これらに限定されない。
【０２６９】
本発明の治療的取り組みの特定の利点は、本発明の抗体が、凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの出現を示すか、あるいは、凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる疾患（例えば、Ｔ２Ｄなど）の徴候を何ら有しない健康なヒト対象から得られるＢ細胞またはＢメモリー細胞に由来し、したがって、ある程度の確率で、凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる臨床的に明白な疾患を防止することができる、あるいは、そのような臨床的に明白な疾患の出現の危険性を減らすことができる、あるいは、そのような臨床的に明白な疾患の発症または進行を遅らせることができるという事実にある。典型的には、本発明の抗体はまた、体細胞変異、すなわち、抗体の可変領域の体細胞変化による、標的のＩＡＰＰ分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ分子に対する高親和性結合における選択性および有効性に関しての最適化を既に首尾良く経ている。
【０２７０】
そのような細胞は生体内において、例えば、ヒト体内において、自己免疫学的反応またはアレルギー反応の意味で、関連した、または他の生理学的なタンパク質または細胞構造によって、活性化されていないという認識はまた、臨床試験段階を首尾よく生き残る可能性が相当に増大したことがこれにより意味されるので、非常に医学的に重要である。いわば、効率、許容性および耐容性が、少なくとも１名のヒト対象において予防的抗体または治療的抗体の前臨床開発または臨床開発の前に既に実証されている。したがって、本発明のヒト抗ＩＡＰＰ抗体および／またはヒト抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体は、治療剤としてのその標的特異的効率と、副作用のその低下した可能性との両方により、その臨床的な成功の可能性を著しく増大させることが予想され得る。
【０２７１】
本発明はまた、上で記載された成分（例えば、本発明の抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体、その結合フラグメント、誘導体もしくは変異体、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞）の１つまたは複数により満たされる１つまたは複数の容器を含む医薬用および診断用のパックまたはキットをそれぞれ提供する。そのような容器には、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められる形式での通知が伴い得る（そのような通知は、製造、使用または販売の当局によるヒト投与のための承認を反映する）。加えて、または、代替において、キットは、適切な診断アッセイにおいて使用されるための試薬および／または説明書を含む。本発明の組成物、例えば、キットは、当然のことながら、凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの存在を伴う障害のリスク管理、診断、防止および処置のために特に好適であり、また、例えば、慢性膵炎、嚢胞性線維症、膵臓ガンを含む、膵臓に対する損傷を引き起こし、したがって、糖尿病に至り得るかもしれない疾患を含む、Ｔ２Ｄに先行する代謝変化、Ｔ２Ｄを引き起こす代謝変化、および／または、Ｔ２Ｄと関連がある／Ｔ２Ｄに付随する代謝変化、あるいは、Ｔ２Ｄに結びつけられる代謝変化などの症状によって一般には特徴づけられる障害を処置するために；アルツハイマー病、ハンチントン病を含む、Ｔ２Ｄの危険性を増大させる疾患において；肥満およびＴ２Ｄに結びつけられるか、または結びつけられない心臓血管疾患において、ならびに／あるいは、Ｔ２Ｄそのものに対して特に適用可能である。
【０２７２】
本発明の医薬組成物はこの技術分野においてよく知られている方法に従って配合することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＩＳＢＮ０−６８３−３０６４７２）を参照のこと）。好適な医薬用キャリアの例がこの技術分野ではよく知られており、これらには、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水エマルションなど）、様々なタイプの湿潤化剤、無菌溶液などが含まれる。そのようなキャリアを含む組成物を、よく知られている従来の方法によって配合することができる。これらの医薬組成物は好適な用量で対象に投与することができる。好適な組成物の投与が、種々の方法によって、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、局所的投与または皮内投与あるいは脊髄送達または脳送達によって行われる場合がある。エアロゾル配合物、例えば、鼻腔噴霧配合物などには、保存剤および等張剤を伴う活性な薬剤の精製された水性溶液または他の溶液が含まれる。そのような配合物は好ましくは、鼻腔粘膜と適合し得るｐＨおよび等張性状態に調節される。直腸投与または膣投与のための配合物が、好適なキャリアを伴う坐薬として提示される場合がある。
【０２７３】
投薬計画が主治医および臨床上の要因によって決定されるであろう。医療技術分野ではよく知られているように、どのような患者であれ、患者のための投薬量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与されるべき具体的な化合物、性別、投与時間および投与経路、全身の健康状態、ならびに、同時に投与されている他の薬物を含めて、多くの要因に依存する。典型的な用量が、例えば、０．００１μｇ〜１０００μｇの範囲（あるいは、この範囲における発現または発現阻害のための核酸の範囲）であり得る；しかしながら、この例示的な範囲よりも少ない用量または大きい用量が、とりわけ上述の要因を考慮して想定される。一般に、投薬量は、例えば、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲が可能であり、より通常的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）が可能である。例えば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重、あるいは、１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記範囲において中間的である用量もまた、本発明の範囲内で意図される。対象には、そのような用量を毎日、１日おきに、毎週、または、経験的分析によって決定されるいずれかの他のスケジュールに従って投与することができる。例示的な処置は、例えば、少なくとも６ヶ月の長期間にわたる多数回の投薬での投与を伴う。さらなる例示的な処置計画は、２週間毎に１回、または、１ヶ月に１回、または、３ヶ月毎〜６ヶ月毎に１回での投与を伴う。例示的な投薬スケジュールには、連続した毎日での１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ、１日おきでの３０ｍｇ／ｋｇ、あるいは、毎週での６０ｍｇ／ｋｇが含まれる。一部の方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、そのような場合、投与されるそれぞれの抗体の投薬量が、示される範囲内である。進行を定期的な評価によってモニターすることができる。非経口投与のための調製物には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁物およびエマルションが含まれる。非水性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油など）、および、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）が挙げられる。水性キャリアには、生理的食塩水および緩衝媒体を含めて、水、アルコール性溶液／水溶液、エマルションまたは懸濁物が含まれる。非経口用ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは固定油が含まれる。静脈内用ビヒクルには、流体および栄養補充液および電解質補充液（例えば、リンゲルブドウ糖に基づくものなど）などが含まれる。保存剤および他の添加剤もまた存在する場合がある（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなど）。さらには、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図された使用に依存して、さらなる薬剤（例えば、ドーパミンまたは精神薬理学的薬物など）を含む場合がある。
【０２７４】
さらには、本発明の好ましい実施形態において、例えば、本発明の医薬組成物が抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体あるいはその結合フラグメント、誘導体または変異体を受動免疫化のために含むならば、医薬組成物はワクチンとして配合される場合がある。背景の節で述べられたように、いくつかの証拠が示しているが、凝集したＩＡＰＰ種および／またはｐｒｏＩＡＰＰ種がＴ２Ｄの病理発生のための主要な誘因であることが示されており（Ｚｒａｉｋａ他（２０１０）、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５３（６）：１０４６〜１０５６；Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ他（２０１１）、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．９１（３）：７９５〜８２６；Ｊｕｒｇｅｎｓ他（２０１１）、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７８（６）：２６３２〜２６４０；Ｈｏｐｐｅｎｅｒ他（２００８）、Ｅｘｐ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ．６９７０３５）、また、ｈＩＡＰＰの凝集を妨げる処置が糖尿病性の表現型を改善し、かつ、動物の寿命を増大させたことが示されている（Ａｉｔｋｅｎ他（２００９）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５９（１）：１６１〜１７１）。したがって、本発明のヒト抗ＩＡＰＰ抗体および／またはヒト抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体ならびに同等なＩＡＰＰ結合性分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子による受動免疫化は、背景の節で既に議論されたような能動免疫化療法概念のいくつかの有害な影響を回避することを助けるであろうと予想することは賢明である。したがって、本発明のこの抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体ならびにそれらの同等物は、凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの存在を示すか、あるいは、凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰによって引き起こされる疾患、例えば、慢性膵炎、嚢胞性線維症、膵臓ガンを含む、膵臓に対する損傷を引き起こし、したがって、糖尿病に至り得るかもしれない疾患を含む、Ｔ２Ｄに先行する代謝変化、Ｔ２Ｄを引き起こす代謝変化、および／または、Ｔ２Ｄと関連がある／Ｔ２Ｄに付随する代謝変化、あるいは、Ｔ２Ｄに結びつけられる代謝変化などの防止または改善のためのワクチンとして；アルツハイマー病、ハンチントン病を含む、Ｔ２Ｄの危険性を増大させる疾患において；肥満およびＴ２Ｄに結びつけられるか、または結びつけられない心臓血管疾患において、ならびに／あるいは、Ｔ２Ｄそのものに対して特に有用であろう。
【０２７５】
１つの実施形態において、本発明の抗体の組換えの二重特異性構築物または多特異性構築物を使用することが有益である場合がある。参考については、Ｆｉｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｇｅｒ、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ、７４（２００７）、３〜１４を参照のこと。そのような二重特異性分子が、（例示的抗体のＮＩ−２０３．２６Ｃ１１について上記で示されるようにＩＡＰＰおよびｐｒｏＩＡＰＰに対して二重特異性である本発明の抗体とはほかに）、ＩＡＰＰを一方の結合アームにより標的化し、かつ、糖尿病の病理発生において知られている別の実体（例えば、ｐｒｏＩＡＰＰ）を第２のアームにより標的化するために設計されるかもしれない。あるいは、そのような二重特異性分子が、糖尿病の病理発生において知られている他の実体（例えば、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６など）を第２の結合アームと結合させるために、あるいは、ナトリウム−グルコース共輸送体−２（ＳＧＬＴ２）またはＣＤ３３を阻止することにより設計されるかもしれず、そのような介入は、適応可能な調節性Ｔ細胞の誘導によって糖尿病をＮＯＤマウスにおいて反転させると考えられる（Ａｂｌａｍｕｎｉｔｓ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６１（２０１２）、１４５〜１５４；Ｂｅｌｇｈｉｔｈ他、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９（２００３）、１２０２〜１２０８）。
【０２７６】
１つの実施形態において、本発明の抗体の組換えＦａｂフラグメント（ｒＦａｂ）および単鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）を使用することが有益である場合がある。これは、それらがより容易に細胞膜に浸透するかもしれないからである。例えば、Ｒｏｂｅｒｔ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２００８）（Ｏｃｔ  １６）；Ｓ１７４１−０１３４（これはオンライで事前に発表された）は、ＡβのＮ末端領域におけるエピトープを認識するモノクローナル抗体ＷＯ−２のキメラな組換えＦａｂフラグメント（ｒＦａｂ）および単鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）の使用を記載する。操作されたフラグメントは、（ｉ）アミロイド原線維化を防止することができ、（ｉｉ）事前に形成されたＡβ１−４２原線維を解凝集することができ、かつ、（ｉｉｉ）Ａβ１−４２オリゴマー媒介の神経毒性を完全なＩｇＧ分子と同じくらい効率的にインビトロで阻害することができた。エフェクター機能を欠く小さいＦａｂおよびｓｃＦｖの操作された抗体様式を使用することの認識された利点には、血液脳関門をより効率的に通過すること、および、炎症性の副反応を誘発する危険性を最小限に抑えることが含まれる。さらには、ｓｃＦＶおよび単鎖ドメイン抗体は全長抗体の結合特異性を保持することのほかに、それらは単一遺伝子として発現させることができ、また、折り畳み、相互作用、修飾、または、それらの標的の細胞内局在化の変化についての潜在的可能性が伴うが、細胞内抗体として哺乳動物細胞において細胞内に発現させることができる（総説については、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｓｓｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１２（２００５）、３９４〜４０１を参照のこと）。
【０２７７】
異なる取り組みにおいて、Ｍｕｌｌｅｒ他、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５）、２３７〜２４１は、抗体が、生細胞を傷づけることなく生細胞内に往復させられることを可能にすると言われる技術基盤（いわゆる「ＳｕｐｅｒＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」）を記載する。そのような細胞浸透抗体により、新しい診断範囲および治療範囲が開拓される。用語「ＴｒａｎｓＭａｂｓ」がこれらの抗体のために案出されている。
【０２７８】
さらなる実施形態において、凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの出現に関連づけられる疾患を処置するために有用である他の抗体の共投与または逐次投与が望ましい場合がある。１つの実施形態において、そのようなさらなる抗体が本発明の医薬組成物において含まれる。対象を処置するために使用することができる抗体の例には、ＣＤ３３、ＳＧＬＴ２、ＩＬ−６およびＩＬ−１を標的化する抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７９】
さらなる実施形態において、凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる、ならびに／あるいは、糖尿病に関連づけられる疾患を処置するために有用である他の薬剤の共投与または逐次投与が望ましい場合がある。１つの実施形態において、そのさらなる薬剤が本発明の医薬組成物において含まれる。対象を処置するために使用することができる薬剤の例には、下記のものが含まれるが、それらに限定されない：インスリンおよびインスリンアナログ；インスリンシグナル伝達経路調節因子、例えば、プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）の阻害剤、非小分子模倣化合物、および、グルタミン・フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）の阻害剤、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、脱調節された肝臓グルコース産生に影響を及ぼす薬剤、グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）の阻害剤のような薬剤、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ（Ｆ−１，６−ＢＰａｓｅ）の阻害剤、グリコーゲンホスホリラーゼ（ＧＰ）の阻害剤、グルカゴン受容体アンタゴニスト、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）の阻害剤、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＨＫ）阻害剤、インスリン感受性エンハンサー、インスリン分泌エンハンサー、α−グルコシダーゼ阻害剤、胃排出の阻害剤；グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体アゴニスト；スルホニルウレア剤；ビグアニド剤、例えば、メトホルミン；アルファ−グルコシダーゼ阻害剤；ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニスト；メグリチニド剤；ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）ＩＶ阻害剤；ＰＤＥ１、ＰＤＥ５、ＰＤＥ９、ＰＤＥ１０またはＰＤＥ１１（ＰＤＥ＝ホスホジエステラーゼ）の阻害剤；アミリンアゴニスト（例えば、プラムリンチドおよび他のアミリンアナログ）；シナモン；グルカゴン受容体アンタゴニスト；グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤；フルクトース−１，６−ビスホスファート阻害剤；カンナビノイド（ＣＢ１）受容体アンタゴニスト；抗肥満薬物、例えば、食欲抑制剤、満腹増大物質およびエネルギー消費増大薬物；抗炎症剤、または、それらの任意の組合せ。臨床での膵島移植の後における膵島拒絶を処置または防止するために使用されることがある薬剤の例には、シロリムス（ラパマイシン）、カルシニューリン阻害剤（例えば、タクロリムス）、シクロスポリン、ミコフェノール酸モフェチル、ＦＴＹ７２０、シクロスポリン、コルチコステロイド類および抗ＩＬ２受容体モノクローナル抗体（例えば、ダクリズマブ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体アゴニスト（例えば、Ｎｏｇｕｃｈｉ他、Ａｃｔａ  Ｍｅｄ．Ｏｋａｙａｍａ、６０（２００６）、および、国際特許出願公開ＷＯ２０１２０８８１５７を参照のこと）を含む群の薬剤が含まれるが、これらに限定されない。したがって、１つの実施形態において、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）を処置するために、および／または、臨床での膵島移植の後における膵島拒絶を処置するか、もしくは防止することにおいて有用であるさらなる薬剤をさらに含む組成物が提供される。本発明の医薬組成物と同時に使用されることがある他の薬剤の例がこの技術��野において記載されている（例えば、国際特許出願公開ＷＯ２００９００５６７２、ＷＯ２０１０１２８０９２、ＷＯ２０１２０８８１５７または欧州特許出願ＥＰ１１１５８２１２．８を参照のこと）。
【０２８０】
治療効果的な用量または量は、症状または状態を改善するために十分である有効成分のそのような量を示す。そのような化合物の治療効力および毒性を、細胞培養または実験動物における標準的な薬学手順によって、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療効果的な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）によって求めることができる。治療効果と毒性影響との間における用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。好ましくは、組成物における治療剤は、代謝障害（例えば、Ｔ２Ｄなど）の場合には正常な血糖制御および／またはインスリン応答を回復するか、または保つために十分である量で存在する。
【０２８１】
前記から、本発明は、上記抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むＩＡＰＰ結合性分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子のどのような使用をも包含し、特に、上で述べられるような凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる疾患（例えば、Ｔ２Ｄ）の診断および／または処置のためのそのような分子の使用を包含することが明らかである。好ましくは、前記結合性分子は本発明の抗体またはその免疫グロブリン鎖である。加えて、本発明は、本明細書中先に記載されている述べられた抗体のいずれかの抗イディオタイプ抗体に関連する。これらは、抗原結合部位の近くにおいて抗体の可変領域に位置する独特の抗原性ペプチド配列に結合する抗体または他の結合性分子であり、例えば、対象から得られるサンプルにおける抗ＩＡＰＰ抗体および／または抗ｐｒｏＩＡＰＰ抗体の検出のために有用である。したがって、１つの実施形態において、本発明は、本明細書中上記および下記で定義されるような抗体または前記抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＩＡＰＰ結合性分子および／もしくはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子、本明細書中で定義されるようなポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞、あるいは、それらのいずれか１つを含む医薬組成物または診断組成物で、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる障害の予防的処置、治療的処置、および／または、そのような障害の進行もしくは処置に対する応答をモニターことにおいて使用されるための医薬組成物または診断組成物を提供し、この場合、好ましくは、障害が、下記のものを含む群から選択される：糖尿病のすべてのタイプ、例えば、１型糖尿病、妊娠糖尿病、糖尿病前症（高い血中糖血症がＴ２Ｄ閾値またはインスリン抵抗性に達する途中でないとき）、および、成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）など；膵臓に対する損傷を引き起こし、したがって、糖尿病に至り得るかもしれないあらゆる疾患、例えば、慢性膵炎、嚢胞性線維症および膵臓ガンなど；Ｔ２Ｄの危険性を増大させるあらゆる疾患、例えば、糖尿病に伴うとして本明細書中で規定されているアルツハイマー病およびハンチントン病または他の神経変性疾患など；一般には、糖尿病を発症する危険因子としての、または、糖尿病の前に存在し得るかもしれない状態としての代謝症候群；一般には、糖尿病を発症する危険因子としての、または、糖尿病の前に存在し得るかもしれない状態としての膵島アミロイドーシス；一般には、糖尿病を発症する危険因子としての、または、糖尿病の前に存在し得るかもしれない状態としての肥満；肥満およびＴ２Ｄに結びつけられる、または結びつけられないあらゆる心臓血管疾患；糖尿病を発症する危険性もまた増大させることがあるＴ２Ｄの結果のすべて、例えば、心臓疾患、卒中、糖尿病性網膜症、腎不全、腎不全、ケトアシドーシスおよび非ケトン性高浸透圧性昏睡など。上記の障害群は、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる障害の群として示されるであろう。
【０２８２】
別の実施形態において、本発明は、本発明の上記で記載されたＩＡＰＰ結合性分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子、抗体、抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクターあるいは細胞のいずれか１つと、場合により、検出のための好適な手段（例えば、免疫または核酸に基づく診断方法において従来から使用される試薬など）とを含む診断組成物に関連する。本発明の抗体は、例えば、抗体を液相において利用することができるか、または、固相キャリアに結合させることができる免疫アッセイにおける使用のために適している。本発明の抗体を利用することができる免疫アッセイの例が、直接的様式または間接的様式でのどちらであれ、競合的免疫アッセイおよび非競合的免疫アッセイである。そのような免疫アッセイの例が、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチアッセイ（イムノメトリックアッセイ）、フローサイトメトリーアッセイおよびウエスタンブロットアッセイである。本発明の抗原および抗体は多くの異なるキャリアに結合させることができ、また、それらに特異的に結合する細胞を単離するために使用することができる。よく知られているキャリアの例には、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然セルロースおよび修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトが含まれる。キャリアの性質は本発明の目的のために可溶性または不溶性のどちらでも可能である。多くの異なる標識および標識化方法が当業者には知られている。本発明において使用することができる標識のタイプの例には、酵素、放射性同位体、コロイド状金属、蛍光性化合物、化学発光化合物および生物発光化合物が含まれる（本明細書中上記で議論された実施形態もまた参照のこと）。
【０２８３】
さらなる実施形態によって、ＩＡＰＰ結合性分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子はまた、特に、本発明の抗体はまた、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、リンパサンプルまたはいずれかの他の体液サンプル（例えば、唾液サンプルまたは尿サンプルなど）である場合がある体液サンプルを検査された個体から得ること、および、体液サンプルを、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件のもとで本発明の抗体と接触させることによって、障害を個体において診断するための方法において使用される場合がある。そのような複合体のレベルがその後、この技術分野において知られている方法によって求められ、コントロールサンプルにおいて形成されるレベルよりも有意に大きいレベルにより、疾患が、検査された個体において示される。同じ様式で、本発明の抗体が結合する特異的抗原もまた使用される場合がある。したがって、本発明は、結合性分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを含むインビトロ免疫アッセイに関連する。
【０２８４】
この関連において、本発明はまた、この目的のために具体的に設計される手段に関連する。例えば、抗体に基づくアレイが使用される場合があり、アレイには、例えば、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰを特異的に認識する本発明の抗体またはその同等な抗原結合性分子が負荷される。マイクロアレイでの免疫アッセイの設計が、Ｋｕｓｎｅｚｏｗ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５（２００６）、１６８１〜１６９６において要約される。したがって、本発明はまた、本発明に従って特定されるＩＡＰＰ結合性分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子が負荷されるマイクロアレイに関連する。
【０２８５】
１つの実施形態において、本発明は、凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる疾患を対象において診断する方法であって、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰならびに／あるいは凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの存在を、本発明の少なくとも１つの抗体、そのＩＡＰＰ結合フラグメントおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合フラグメント、あるいは、その抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＩＡＰＰ結合性分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子を用いて、診断されるべき対象からのサンプルにおいて明らかにすることを含み、病理学的に凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの存在により、前記対象における代謝障害（例えば、Ｔ２Ｄなど）が暗示され、また、生理学的なＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのモノマー形態のレベルとの比較において、病理学的に凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのレベルの増大により、前記対象における代謝障害の進行について暗示される方法に関連する。
【０２８６】
診断されるべき対象は疾患について無症候性または病状発現前である場合がある。好ましくは、コントロール対象は、凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる疾患、例えば、慢性膵炎、嚢胞性線維症、膵臓ガンを含む、膵臓に対する損傷を引き起こし、したがって、糖尿病に至り得るかもしれない疾患を含む、Ｔ２Ｄに先行する代謝変化、Ｔ２Ｄを引き起こす代謝変化、および／または、Ｔ２Ｄと関連がある／Ｔ２Ｄに付随する代謝変化、あるいは、Ｔ２Ｄに結びつけられる代謝変化；アルツハイマー病、ハンチントン病を含む、Ｔ２Ｄの危険性を増大させる疾患；肥満およびＴ２Ｄに結びつけられるか、または結びつけられない心臓血管疾患；ならびに／あるいは、Ｔ２Ｄそのものに関連づけられる疾患を有し、病理学的に凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのレベルと、参照標準物との間における類似性により、診断されるべき対象は代謝障害を有するか、または、代謝障害を発症する危険性があることが示される。代替において、または、加えて、第２のコントロールとして、コントロール対象は代謝障害を有しておらず、生理学的なＩＡＰＰモノマーおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰモノマーならびに／あるいは凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのレベルと、参照標準物との間における違いにより、診断されるべき対象は代謝障害を有するか、または、代謝障害を発症する危険性があることが示される。好ましくは、診断されるべき対象と、コントロール対象とは、年齢が一致している。分析されるべきサンプルは、病理学的に凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰを含有することが疑われる任意の体液、例えば、血液、血漿、血清、尿、腹腔液、唾液または脳脊髄液（ＣＳＦ）である場合がある。
【０２８７】
生理学的なＩＡＰＰモノマーおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰモノマーならびに／あるいは生理学的に凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのレベルが、例えば、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰを、ウエスタンブロット、免疫沈殿、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、二次元ゲル電気泳動、質量分析法（ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、表面増強レーザー脱離イオン化−飛行時間（ＳＥＬＤＩーＴＯＦ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、多次元液体クロマトグラフィー（ＬＣ）それに続くタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、および、レーザーデンシトメトリーから選ばれる１つまたは複数の技術によって分析することを含む、この技術分野において知られているいずれかの好適な方法によって評価される場合がある。好ましくは、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰの前記インビボ画像化は、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光学的画像法または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む。
【０２８８】
ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰを検出するための抗体に基づく方法、ならびに、凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる疾患（例えば、Ｔ２Ｄ）を診断するか、またはその進行をモニターするための方法、ならびに、本発明に従って適合化されることがある抗体および関連した手段を使用するそのような疾患の処置をモニターするための方法がまた、国際特許出願公開ＷＯ２００３０９２６１９に記載される（その開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。それらの方法が、記載されるように適用される場合があるが、この場合には、本発明のＩＡＰＰ特異的および／またはｐｒｏＩＡＰＰ特異的な抗体、結合フラグメント、誘導体または変異体が用いられる。
【０２８９】
したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体またはその記抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＩＡＰＰ結合性分子および／もしくはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子、本明細書中上記で定義されるようなポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞、あるいは、それらのいずれか１つを含む医薬組成物または診断組成物が、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる障害の予防的処置、治療的処置、および／または、そのような障害の進行もしくは処置に対する応答をモニターすることにおける使用のために提供される。したがって、概して、本発明はまた、対象におけるＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる障害（例えば、膵島アミロイドーシス、および、通常の場合には膵島アミロイドーシスが先立つＴ２Ｄなど）を診断するか、またはその進行をモニターする方法であって、本発明の少なくとも１つの抗体あるいはその抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＩＡＰＰ結合性分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子を用いて、診断されるべき前記対象からのサンプルにおけるＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのオリゴマー、凝集物または原線維の存在を明らかにすることを含み、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのオリゴマー、凝集物または原線維の存在により、その障害が暗示される方法に関連する。１つの実施形態において、対象における膵島アミロイドーシスを診断するか、またはその進行をモニターする前記方法であって、本発明の少なくとも１つの抗体あるいはその抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＩＡＰＰ結合性分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子を用いて、診断されるべき前記対象からのサンプルにおけるＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのオリゴマー、凝集物または原線維の存在を明らかにすることを含み、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのオリゴマー、凝集物または原線維の存在により、前記対象における前駆症状性、前駆または臨床上の２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、および／あるいは、臨床での膵島移植の後におけるベータ細胞不全が暗示され、また、生理学的なＩＡＰＰのレベルに対する比較、または、健康なコントロール対象に由来する参照サンプル、もしくは、同じ対象に由来するコントロールサンプルに対する比較において、ＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのオリゴマー、凝集物または原線維のレベルの増大により、前記対象における前駆症状性、前駆または定着した２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、および／あるいは、臨床での膵島移植の後における膵島不全の進行について暗示される方法が提供される。１つの実施形態において、前記方法は、本明細書中上記で定義されるようなＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる障害の群からのいずれか他の障害を診断するか、またはその進行をモニターするために同様に使用されることが、当業者によって理解されるであろう。
【０２９０】
上記で示されるように、本発明の抗体、そのフラグメント、および、本発明の抗体およびそのフラグメントと同じ結合特異性の分子は、インビトロだけでなく、インビボにおいても同様に使用される場合があり、診断的適用のほかに、治療的適用が同様に実行される場合がある。したがって、１つの実施形態において、本発明はまた、ヒトまたは動物の身体におけるＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのインビボ検出のための組成物、あるいは、治療剤および／または診断剤をヒトまたは動物の身体においてＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに対して標的化するための組成物を調製するための、本発明の抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むＩＡＰＰ結合性分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子に関連する。潜在的可能性のある治療剤および／または診断剤が、本明細書中上記で示されるような、代謝障害（例えば、Ｔ２Ｄ）の処置において有用である治療剤、および、潜在的可能性のある標識の非網羅的な列挙から選ばれる場合がある。インビボ画像化に関して、１つの好ましい実施形態において、本発明は、本発明の抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含む前記ＩＡＰＰ結合性分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子を提供し、前記インビボ画像化が、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光学的画像法または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む。さらなる実施形態において、本発明はまた、本明細書中上記で定義されるように、対象におけるＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる障害を診断するか、またはその進行をモニターする方法において使用するための、本発明の抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含む前記ＩＡＰＰ結合性分子および／またはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子、あるいは、上記で指定されるインビボ画像化方法のための組成物を調製するための前記分子を提供する。
【０２９１】
ＶＩＩ．凝集特異的なＩＡＰＰエピトープを有するペプチド
さらなる態様において、本発明は、本発明のいずれかの抗体によって特異的に認識されるＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰのエピトープを有するペプチドに関連する。好ましくは、そのようなペプチドは、抗体、あるいは、１つまたは複数のアミノ酸が置換され、欠失され、および／または付加されるその改変された配列によって認識される独特な直鎖状エピトープとして、配列番号４、配列番号５または配列番号７１に示されるようなアミノ酸配列を含むか、または、そのようなアミノ酸配列からなり、ペプチドは本発明のいずれかの抗体によって認識され、好ましくは、抗体ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１または抗体ＮＩ−２０３．１５Ｃ７によってそれぞれ認識される。
【０２９２】
本発明の１つの実施形態において、そのようなペプチドは、対象における凝集したＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる疾患（例えば、Ｔ２Ｄ）を診断するために、またはモニターするために使用される場合があり、前記対象の生物学的サンプルにおけるペプチドに結合する抗体の存在を明らかにする工程と、本発明の上記ペプチドを認識する抗体のレベルを測定すること、および、測定結果を、比較可能な年齢および性別の健康な対象において見出されるレベルに対して比較することによって前記対象におけるそのような疾患の診断のために使用される工程とを含む。したがって、１つの実施形態において、本発明は、前駆症状性もしくは臨床上の２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、および／または、臨床での膵島移植の後におけるベータ細胞不全が対象において暗示される膵島アミロイドーシスを診断するための方法であって、上記で定義されるようなペプチドに結合する抗体の存在を前記対象の生物学的サンプルにおいて明らかにする工程を含む方法に関連する。この方法によれば、本発明の前記ペプチドについて特異的である測定された抗体の上昇したレベルが、前駆症状性もしく臨床上の２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、および／または、臨床での膵島移植の後におけるベータ細胞不全を前記対象において診断するために示され、あるいは、本明細書中上記で定義されるようなＩＡＰＰおよび／またはｐｒｏＩＡＰＰに関連づけられる障害の群からのいずれかの他の疾患を前記対象において診断するために示される。本発明のペプチドは、本明細書中先に記載されるように、アレイ、キットおよび組成物においてそれぞれ配合される場合がある。この関連において、本発明はまた、膵島アミロイドーシスを診断するか、またはその進行をモニターすることにおいて有用なキットであって、本発明の少なくとも１つの抗体またはその抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＩＡＰＰ結合性分子および／もしくはｐｒｏＩＡＰＰ結合性分子、本明細書中上記でそれぞれ定義されるようなポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞および／またはペプチドを、必要な場合には使用のための試薬および／または説明書と一緒に含むキットに関連する。
【０２９３】
これらの実施形態および他の実施形態が本発明の記載および実施例によって開示され、また、包含される。本発明に従って用いられるための材料、方法、使用法および化合物のいずれか１つに関するさらなる文献が、例えば、電子デバイスを使用して、公開されている図書館およびデータベースから検索され得る。例えば、公開されているデータベースの「Ｍｅｄｌｉｎｅ」が利用され得る（このデータベースは国立バイオテクノロジー情報センターおよび／または国立衛生研究所の国立医学図書館によって提供される）。さらなるデータベースおよびウェブアドレスが、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）（これは欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）の一部である）のデータベースなどが当業者には知られており、これらもまた、インターネット検索エンジンを使用して得ることができる。バイオテクノロジーにおける特許情報、ならびに、遡及的検索および現在の認識のために有用な特許情報の関連原典の調査の概略が、Ｂｅｒｋｓ、ＴＩＢＴＥＣＨ  １２（１９９４）、３５２〜３６４に示される。
【０２９４】
上記開示は本発明を概して記載する。別途言及されない限り、本明細書中で使用されるような用語には、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年、２０００年改訂および２００３年再版、ＩＳＢＮ  ０  １９  ８５０６７３  ２）において提供されるような定義が与えられる。いくつかの文書が本明細書の本文を通して引用される。完全な書誌的引用が請求項の直前において明細書の最後に見出される場合がある。すべての引用された参考文献（本出願明細書を通して引用されるような文献参照物、発行された特許、公開された特許出願、および、製造者の仕様書、説明書などを含む）の内容が、本明細書により明示的に、参照によって組み込まれる；しかしながら、どのような文書であれ、引用される文書は実際に本発明に関して先行技術であることを何ら認めるものではない。
【０２９５】
より完全な理解を、例示のみの目的のために本明細書中に提供され、かつ、本発明の範囲を限定するために意図されない下記の具体的な実施例を参照することによって得ることができる。
【実施例】
【０２９６】
実施例１：ヒトＩＡＰＰ抗体の標的および結合特異性の確認
ＩＡＰＰを単離された抗体の認識された標的として確認するために、直接的ＥＬＩＳＡアッセイを行った。例示的な組換えヒト抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１およびＮＩ−２０３．８Ｅ３について、９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）を炭酸塩のＥＬＩＳＡ被覆緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）で１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈されるヒトＩＡＰＰ溶液またはＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）により被覆し、抗体の結合効率を試験した。重要なことに、ＥＬＩＳＡアッセイのために使用されるヒトＩＡＰＰ溶液は、電子顕微鏡法によって示されるようにＩＡＰＰ原線維を含有していた（図３Ａを参照のこと）。例示的抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１およびＮＩ−２０３．８Ｅ３はＥＬＩＳＡによってヒトＩＡＰＰ原線維に特異的に結合する。結合がＢＳＡに対しては何ら認められない（図３Ｂを参照のこと）。同じ特徴がＮＩ−２０３．１９Ｆ２およびＮＩ−２０３．１５Ｃ７の各抗体に当てはまるようである。
【０２９７】
例示的抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１およびＮＩ−２０３．８Ｅ３の５０％最大有効濃度（ＥＣ５０）を求めるために、様々な抗体濃度によるさらなる直接的ＥＬＩＳＡ実験を行った。９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）を炭酸塩のＥＬＩＳＡ被覆緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）で１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈されるヒトＩＡＰＰ溶液およびヒトｐｒｏＩＡＰＰ溶液により被覆し、抗体の結合効率を試験した。ＥＬＩＳＡアッセイのために使用されるヒトＩＡＰＰ溶液はＩＡＰＰ原線維を含有するが、ヒトｐｒｏＩＡＰＰは、電子顕微鏡法によって明らかにされるように、大きい凝集物を溶液中で形成した（図４Ａを参照のこと）。結合を、ＨＲＰとコンジュゲート化されるロバ抗ヒトＩｇＧγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、英国）を使用して求め、その後、ＨＲＰ活性の測定を標準的な比色アッセイで行った。
【０２９８】
ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、米国）ソフトウエアを使用する非線形回帰によって推定した。組換えヒト由来抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１およびＮＩ−２０３．８Ｅ３はヒトＩＡＰＰ原線維に対して大きい親和性で結合し、ＥＣ５０がそれぞれ、９ｎＭ、２２ｎＭ、６ｎＭおよび４ｎＭである。加えて、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１はまた、凝集したヒトｐｒｏＩＡＰＰに結合し、ＥＣ５０がナノモル濃度の範囲（２６０ｎＭ）である（図４Ｂを参照のこと）。
【０２９９】
実施例２：非原線維性ヒトＩＡＰＰに対してではなく、したがって、立体配座エピトープに好ましくは結合する、ヒトＩＡＰＰ原線維に対する抗体特異性
例示的抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１およびＮＩ−２０３．８Ｅ３の、立体配座エピトープに対する結合能を明らかにするために、直接的ＥＬＩＳＡ実験を、炭酸塩のＥＬＩＳＡ被覆緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）で１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈されるヒトＩＡＰＰ溶液およびヒト非原線維性ＩＡＰＰ溶液を用いて行い、抗体の結合能を試験した。ＥＬＩＳＡアッセイのために使用されるヒトＩＡＰＰ溶液はＩＡＰＰ原線維を含有するが、ヒト非原線維性ＩＡＰＰ溶液は、電子顕微鏡法によって明らかにされるように、ＩＡＰＰ原線維を欠いており、小さい無定形の凝集物を示しただけであった（図５Ａを参照のこと）。結合を、ＨＲＰとコンジュゲート化されるロバ抗ヒトＩｇＧγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、英国）を使用して求め、その後、ＨＲＰ活性の測定を標準的な比色アッセイで行った。
【０３００】
組換え抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１およびＮＩ−２０３．８Ｅ３は、ＩＡＰＰ原線維に対する高い親和性結合を、ＩＡＰＰ溶液による被覆を行ったときに示し（図５Ｂ）、これは以前に認められた通りであった（図４）。親和性の喪失が、ＩＡＰＰ原線維と比較したとき、非原線維性ＩＡＰＰに対して認められ（図５Ｂ）、したがって、このことから、ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１およびＮＩ−２０３．８Ｅ３の各抗体のＩＡＰＰ原線維に対する優先的な結合が明らかにされた。予備的な結果は、抗体ＮＩ−２０３．１９Ｆ２および抗体ＮＩ−２０３．１５Ｃ７について、上で記載されるのと同じ影響を示す。
【０３０１】
これらの発見は、生理学的なヒトＩＡＰＰタンパク質立体配座に存在する直鎖状エピトープとは対照的に、大部分が露出しており、かつ、ＩＡＰＰ原線維形成のときには接近可能である、ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１、ＮＩ−２０３．８Ｅ３、ＮＩ−２０３．１９Ｆ２およびＮＩ−２０３．１５Ｃ７の抗体結合エピトープを強く示している。病理学的なＩＡＰＰ原線維がＴ２Ｄ患者の膵島において認められる。ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１、ＮＩ−２０３．８Ｅ３、ＮＩ−２０３．１９Ｆ２およびＮＩ−２０３．１５Ｃ７の抗体は、治療的に関連がある病理学的なヒトＩＡＰＰ原線維に対する際立った結合を示すので、これらのヒト由来抗体はＴ２Ｄにおいて治療的可能性を有する。
【０３０２】
実施例３：ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１、ＮＩ−２０３．８Ｅ３、ＮＩ−２０３．１９Ｆ２およびＮＩ−２０３．１５Ｃ７の各抗体の結合エピトープの評価
例示的抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１、ＮＩ−２０３．８Ｅ３、ＮＩ−２０３．１９Ｆ２およびＮＩ−２０３．１５Ｃ７の結合エピトープを明らかにするために、ペプスキャン（ｐｅｐｓｃａｎ）およびアラニンスキャン分析を、ヒトＩＡＰＰアミノ酸配列の全体にわたって位置する重複するペプチド、および、ｐｒｏＩＡＰＰの最初の２２アミノ酸におけるアラニン置換を用いて行った。抗体の結合能を、ニトロセルロースメンブラン（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）にスポットされるこれらのペプチドに対して、ＨＲＰコンジュゲート化されたロバ抗ヒトＩｇＧγ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、英国）を使用して試験し、その後、ＨＲＰ活性を検出した（図６Ａ）。
【０３０３】
組換え抗体のＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１およびＮＩ−２０３．１５Ｃ７（１μｇ／ｍｌ）は、ヒトＩＡＰＰにおける配列１９−ＳＳＮＮＦＧＡ−２５（配列番号４）、２−ＣＮＴＡＴＣＡ−８（配列番号５）および１０−ＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳ−１９（配列番号７１）に対する結合を示した（図６Ａおよび図６Ｂ）。したがって、これらの配列はこれらの抗体の推定される結合エピトープ配列に対応する。組換え抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．８Ｅ３およびＮＩ−２０３．１９Ｆ２（１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）のエピトープは特定されていない。
【０３０４】
実施例４：コントロール患者においてではなく、２型糖尿病と診断される患者の膵臓における病理学的なＩＡＰＰ原線維に対する、ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の各抗体の結合
２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）と診断される２名の患者のパラフィン包埋された膵臓切片を、ＴｈｉｏＳ染色およびコンゴーレッド染色のときに認められる膵島におけるアミロイド負荷に基づいて選択し、続いて、ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の例示的抗体の結合特徴づけのために使用した。２型糖尿病と診断されない患者のパラフィン包埋された膵臓切片をコントロールとして使用した。ギ酸前処理の後、切片をヒト抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１（５ｎＭおよび５０ｎＭ）またはマウスモノクローナル抗ＩＡＰＰ抗体（１：１００；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）とインキュベーションし、その後、ビオチン化されたロバ抗ヒト二次抗体（１：５００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、英国）またはビオチン化されたヤギ抗マウス二次抗体（１：５００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、英国）とインキュベーションした。抗体シグナルを、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ−ＡＰキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）により増幅し、ジアミノベンジジン基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）により検出した。アビジン／ビオチンブロッキング（Ａｖｉｄｉｎ／Ｂｉｏｔｉｎブロッキングキット、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）のとき、膵島β細胞を、ビオチン化されたロバ抗モルモット二次抗体（１：５００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）にカップリングされるポリクローナルなモルモット抗インスリン抗体（１：５；Ｄａｋｏ、米国）を使用して可視化し、抗体シグナルを、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ−ＡＰキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）により増幅し、アルカリホスファターゼ基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）により検出した。
【０３０５】
第１のＴ２Ｄ患者は、ＴｈｉｏＳ染色およびコンゴーレッド染色によって可視化されるように、病理学的なＩＡＰＰ原線維に対応する膵島における大きいアミロイド沈着物を示した（図７Ａ）。ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１のヒト抗体は、これらのアミロイド陽性切片に対する際立った膵島染色を示した（図７Ｂ）。抗体染色が５ｎＭにおいて認められ、５０ｎＭにおいて増大し、二次抗体のみを用いた場合には染色は何ら認められず、このことから、これらのヒトＩＡＰＰ抗体の特異的な結合が示唆された。これらの発見が、アミロイド沈着物を膵島において示す第２のＴ２Ｄ患者で確認された（データは示されず）。対照的に、ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１のヒト抗体は、染色を、アミロイド沈着物を欠く第３のＴ２Ｄ患者からの膵島において何ら示しておらず（図７Ｃおよび図７Ｄ）、また、Ｔ２Ｄと診断されないコントロール患者からの膵島において何ら示していなかった（図８）。市販されているマウスモノクローナル抗ＩＡＰＰ抗体は、非糖尿病性コントロール患者からの膵島における生理学的なＩＡＰＰを染色した（図８を参照のこと）。本発明の抗体はまた、膵島のアミロイド沈着物を示す糖尿病性ネコの膵臓において陽性の結果を与えた（図９を参照のこと）。同じ結合性質が、ＮＩ−２０３．１９Ｆ２およびＮＩ−２０３．１５Ｃ７の各抗体に当てはまるようである。
【０３０６】
これらのデータは、ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１、ＮＩ−２０３．１９Ｆ２およびＮＩ−２０３．１５Ｃ７の各抗体が、病理学的なＩＡＰＰ原線維を特異的に認識し、かつ、これらの抗体の生化学的な結合性質と一致しており、これらの抗体はインビトロにおけるＩＡＰＰ原線維に対する強い結合特異性を示すこと（図５）を明らかにする。
【０３０７】
実施例５：ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の抗体は、アルツハイマー病と診断される患者の脳における病理学的なＡβアミロイドに交差反応しない
アルツハイマー病と診断される患者のパラフィン包埋された脳切片を使用して、例示的抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の交差反応性を評価した。ギ酸前処理の後、切片をヒト抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１（５０ｎＭ）またはマウスモノクローナル抗βアミロイド抗体６Ｅ１０（１：２０００；Ｃｏｖａｎｃｅ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌｌ、スイス）とインキュベーションし、その後、ビオチン化されたロバ抗ヒト二次抗体（１：５００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、英国）またはビオチン化されたヤギ抗マウス二次抗体（１：５００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、英国）とインキュベーションした。抗体シグナルを、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ−ＡＰキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）により増幅し、ジアミノベンジジン基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）により検出した。
【０３０８】
ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の抗体は、抗βアミロイド特異的抗体６Ｅ１０とは対照的に、アルツハイマー病のヒト脳における病理学的なＡβアミロイドを認識しなかった（図１０）。同じことがＮＩ−２０３．１９Ｆ２およびＮＩ−２０３．１５Ｃ７の各抗体に当てはまるようである。
【０３０９】
これらのデータは、ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の抗体が病理学的なＡβアミロイドに対して交差反応性でないことを明らかにする。よって、最も顕著なアミロイド形成タンパク質（アルファ−シヌクレイン、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、タウおよびＴＡＲ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）を含むが、これらに限定されない）を含めて、誤った折り畳み／凝集傾向を有するいくつかのタンパク質候補物に対する、直接的ＥＬＩＳＡによる、ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の各抗体の最小限の交差反応的結合も明らかにされている。
【０３１０】
実施例６：マウスキメラ抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の品質管理
例示的なマウスキメラ抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１を確認するために、直接的ＥＬＩＳＡアッセイを上記のように行った。キメラ抗体を対応するヒト抗体と比較した。例示的な組換えキメラ抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１ならびにそれらの対応するヒト抗体について、９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）を炭酸塩のＥＬＩＳＡ被覆緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４２）で１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈されたヒトＩＡＰＰ溶液またはＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）により被覆し、キメラ抗体およびヒト抗体の結合効率を試験した。結合を、ＨＲＰとコンジュゲート化されるロバ抗ヒトＩｇＧγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、英国）を使用して求め、その後、ＨＲＰ活性の測定を標準的な比色アッセイで行った。重要なことに、ＥＬＩＳＡアッセイのために使用されるヒトＩＡＰＰ溶液は、電子顕微鏡法によって示されるようにＩＡＰＰ原線維を含有していた（図３Ａを参照のこと）。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、米国）ソフトウエアを使用する非線形回帰によって推定した。
【０３１１】
ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１のマウスキメラ抗体はヒトＩＡＰＰ原線維に対して高い親和性で結合し、ＥＣ５０がそれぞれ、１８．６ｎＭ、２３．９ｎＭおよび１１．５ｎＭである。結合はＢＳＡに対しては何ら認められなかった。キメラ抗体の結合親和性はそれらのヒト対応物と類似しており、ＥＣ５０が、ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１のヒト抗体についてはそれぞれ、９．４ｎＭ、２２．９ｎＭおよび６．８ｎＭであった（図１１を参照のこと）。
【０３１２】
例示的なマウスキメラ抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１をさらに、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）と診断され、かつ、膵島のアミロイド沈着物を示す２名の選択された患者のパラフィン包埋された膵臓切片に対して確認した。ギ酸前処理の後、切片をキメラ抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１（５０ｎＭ）とインキュベーションし、その後、ビオチン化されたロバ抗ヒト二次抗体（１：５００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、英国）とインキュベーションした。抗体シグナルを、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ−ＡＰキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）により増幅し、ジアミノベンジジン基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）により検出した。アビジン／ビオチンブロッキング（Ａｖｉｄｉｎ／Ｂｉｏｔｉｎブロッキングキット、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）のとき、膵島β細胞を、ビオチン化されたロバ抗モルモット二次抗体（１：５００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、英国）にカップリングされるポリクローナルなモルモット抗インスリン抗体（１：５；Ｄａｋｏ、米国）を使用して可視化し、抗体シグナルを、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ−ＡＰキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）により増幅し、アルカリホスファターゼ基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）により検出した。
【０３１３】
ＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１のキメラ抗体は、２名のＴ２Ｄ患者からのアミロイド陽性切片における際立った膵島染色を示した（図１２）。
【０３１４】
これらのデータは、キメラ抗体のＮＩ−２０３．９Ａ２、ＮＩ−２０３．１９Ｈ８およびＮＩ−２０３．２６Ｃ１１が、それらのヒト対応物と同程度の効率で、病理学的なＩＡＰＰ原線維を特異的に認識することを明らかにする（図１２）。
【０３１５】
実施例７：Ｔ２Ｄ動物モデルにおけるＩＡＰＰ抗体および／またはｐｒｏＩＡＰＰ抗体の治療効果のインビボ確認
リード抗体候補物が、ｈＩＡＰＰを発現する２つの遺伝子組換えマウスモデルおよびラットモデルにおいて確認される：１）高脂肪食にさらされるｈ−ＩＡＰＰ（ヘミ接合性）／Ｃ５７ＢＬ／６／ＤＢＡマウス（Ｈｕｌｌ他（２００３）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２：３７２〜３７９）；２）標準食にさらされるｈ−ＩＡＰＰ（ヘミ接合性）／Ａｖｙ／Ａマウス（Ｂｕｔｌｅｒ他（２００３）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２：２３０４〜２３１４）；３）標準食にさらされるｈ−ＩＡＰＰ（ホモ接合性）／ＣＤラット（Ｂｕｔｌｅｒ他（２００４）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３：１５０９〜１５１６）。治療効力が、膵臓におけるベータ細胞量およびｈＩＡＰＰアミロイド負荷量ならびにｈＩＡＰＰの血漿中レベルを求めることによって、また、グルコース代謝およびインスリン分泌の機能的試験によって評価される。
【０３１６】
１）生理学的特徴づけ
ＩＩ型糖尿病動物モデルの下記の生理学的特徴（ｉ）〜（ｖｉｉ）が、本特許出願の抗体の適用が防止効果および／または治療効果を示すかどうかを調べるために試験される。
【０３１７】
（ｉ）血中グルコース：
Ｔ２Ｄ動物モデルの血中グルコースレベルが試験され、非処置の動物および（Ｔ２Ｄモデルでない）正常な系統の動物に対して比較される。
【０３１８】
本明細書における「正常な系統のマウス」は特に限定されず、血中グルコースレベル、ウレア糖（ｕｒｅａ  ｓｕｇａｒ）およびインスリン分泌などにおいて何ら異常を示さない限り、どのようなマウスも可能である。「正常な系統のマウス」の好ましい例には、ＫＯＲマウス、ＮＣマウス、および、コンジェニックマウスを作製する際の反復親として使用される実験室マウス（例えば、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス、ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウス）が含まれる。
【０３１９】
本明細書における「正常な系統のラット」は特に限定されず、血中グルコースレベル、ウレア糖およびインスリン分泌などにおいて何ら異常を示さない限り、どのようなラットも可能である。
【０３２０】
これらのマウスモデルおよびラットモデルにおける糖尿病は好ましくは、ｈＩＡＰＰの遺伝子組換え発現によって誘導されるので、好ましくは、遺伝子組換え動物の作製のために最初に使用された系統と同じ系統がコントロールとして使用される。
【０３２１】
表現「正常な系統のマウス／ラットと比較して、より高い血中グルコースレベルを有する」は、空腹（絶食）時における血中グルコースレベル（血液におけるグルコース濃度）が空腹（絶食）時における正常な系統のマウス／ラットの血中グルコースレベルよりも高いことを意味する。１３０ｍｇ／ｄｌ以上、より好ましくは１４０ｍｇ／ｄｌ以上、さらに好ましくは２００ｍｇ／ｄｌ以上、さらにより好ましくは３００ｍｇ／ｄｌ以上の糖尿病性動物の血中グルコースレベルが、より高い血中グルコースとして分類される。さらに、用語「空腹（絶食）」は、本明細書中で使用される場合、マウス／ラットの絶食開始後約１２時間での状態を意味する。
【０３２２】
本発明において、「血中グルコースレベル」は、当業者に知られている従来からの方法によって、例えば、市販の測定装置（例えば、メディセーフリーダー；テルモ株式会社）を本明細書中下記の実施例に記載される方法に従って使用することによって測定することができる。
【０３２３】
血中グルコースレベルの例示的な測定方法
対象動物の血中グルコースレベル（血中グルコース濃度）が、市販の測定装置（例えば、メディセーフリーダー；テルモ株式会社）を使用して測定される。この装置の測定原理は下記のように説明される。測定は比色分析に基づく。測定用チップが準備され、チップ上に、グルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼが触媒として、また、４−アミノアンチピリンおよびＮ−エチル−Ｎ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジンが発色剤として置かれる。毛管現象により吸収される血液サンプルがこのチップに置かれると、血液中のグルコースがグルコースオキシダーゼによって酸化される。その後、チップ上の発色剤が、この時に生じる過酸化水素と、ペルオキシダーゼとによって酸化され、これにより、赤紫色が生じる。血液中のグルコースの量が、この色の濃淡の程度を測定することによって計算される。
【０３２４】
ここでは、４μｌの全血が血液サンプルとして対象動物から得られ、１８秒の測定時間を使用して測定される。
【０３２５】
（ｉｉ）グリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）濃度：
ＩＩ型糖尿病動物モデルが、増大した血中グリコシル化ヘモグロビン濃度について試験され、非処置のＴ２Ｄモデル動物および正常な非Ｔ２Ｄモデル動物に対して比較される。２．５％以上、２．６％以上、さらには２．８％以上、さらには３．０％以上の濃度が、増大した（増大している）として分類される。
【０３２６】
「グリコシル化ヘモグロビン濃度」は、本明細書中で使用される場合、赤血球における、グルコースが結合しているヘモグロビン分子の割合を意味する。グリコシル化ヘモグロビン濃度は、糖尿病患者についての治療的管理の妥当性を判断するための指標として使用することができ、現時点での血糖レベルよりも、１ヶ月前〜２ヶ月前の血糖レベルとより良く相関することが知られている。
【０３２７】
「グリコシル化ヘモグロビン濃度」は、当業者に知られている従来からの方法によって、例えば、市販の測定装置（例えば、ＤＣＡ  ２０００  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｂａｙｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｔｄ．）を本明細書中下記の実施例に記載される方法に従って使用することによって測定することができる。より具体的には、例えば、上述のＤＣＡ  ２０００  Ｓｙｓｔｅｍが測定装置として使用されるとき、総ヘモグロビンの量がチオシアン−メトヘモグロビン法によって測定され、グリコシル化ヘモグロビンの量がラテックス凝固阻害反応によって測定される。
【０３２８】
（ｉｉｉ）尿糖：
コントロール動物およびＴ２Ｄモデル動物の尿糖がここでは試験される。
用語「尿糖のための試験において陽性」は、本明細書中で使用される場合、動物によって排泄される尿におけるグルコース濃度が１００ｍｇ／ｄｌ以上であることを意味する。尿中グルコース濃度は、従来からの方法によって、例えば、市販のキット（例えば、プレテスト；和光純薬工業株式会社）を使用して、本明細書中下記の実施例に記載される方法によって測定することができる。具体的には、例えば、プレテストが測定用キットとして使用されるとき、動物の尿サンプルが最初にプレテストの試験紙に載せられ、３０秒後に、−から＋４にまで及ぶ５段階に分類するためのこのキットにおける指定されたカラーチャート表に従って判定が行われる。判定の結果から推定される尿中グルコース濃度は、＋１については１００〜２５０ｍｇ／ｄｌであり、＋２については２５０〜５００ｍｇ／ｄｌであり、＋３については５００〜２０００ｍｇ／ｄｌであり、＋４については２０００ｍｇ／ｄｌ以上である。＋１およびそれ以上の判定結果が、「尿糖のための試験において陽性」であると評価される。
【０３２９】
尿糖の例示的な測定方法
対象動物の尿中グルコース（尿糖）が、当業者に知られている方法によって、例えば、市販のキット（プレテスト；和光純薬工業株式会社）を使用することによって測定される。最初に、動物の尿サンプルが上述のプレテストの試験紙にブロットされ、３０秒後に、−から＋４にまで及ぶ５段階に分類するために指定される色彩表に従って判定が行われる。判定の結果から推定される尿中グルコース濃度は、＋１については１００〜２５０ｍｇ／ｄｌであり、＋２については２５０〜５００ｍｇ／ｄｌであり、＋３については５００〜２０００ｍｇ／ｄｌであり、＋４については２０００ｍｇ／ｄｌ以上である。＋１およびそれ以上の判定結果が、「尿糖のための試験において陽性」であると評価される。
【０３３０】
（ｉｖ）血中インスリン濃度：
ＩＩ型糖尿病動物モデルの血中インスリン濃度が、非処置動物および非糖尿病性コントロール動物（正常な系統の動物）におけるレベルと比較され、非処置動物の血中インスリン濃度および非糖尿病性コントロール動物（正常な系統の動物）の血中インスリン濃度と同等であるか、または、それよりも高いかどうかが試験される。
【０３３１】
血中インスリン濃度が「正常な系統の動物の血中インスリン濃度と同等であるか、または、それよりも高い」という表現は、空腹（絶食）時における血中インスリン濃度が、空腹（絶食）時における正常な系統の動物の血中インスリン濃度と同等であるか、または、それよりも高いこと、例えば、９０ｐｇ／ｍｌ以上または１１０ｐｇ／ｍｌ以上であることを意味する。
【０３３２】
本発明において、「血中インスリン濃度」は、従来からの方法によって、例えば、レビスインスリンアッセイキットＵタイプ（株式会社シバヤギ）を本明細書中下記の実施例に記載される方法に従って使用することによって測定することができる。より具体的には、例えば、抗インスリンモノクローナル抗体（マウス）がプレートに固定化され、サンプル中のインスリンがプレートに結合させられ、その後、インスリンの別の部位を認識するビオチン標識された抗インスリンモノクローナル抗体がプレートと反応させられ、ペルオキシダーゼ−アビジンのコンジュゲートがさらに、ビオチンに結合させるためにプレートに加えられ、最後に、発色基質が、インスリンを発色によって測定するために加えられる。
【０３３３】
血中インスリン濃度の例示的な測定方法
対象マウスの血中インスリン濃度が、当業者に知られている方法を使用して、例えば、市販のキット（レビスインスリンアッセイキットＵタイプ；株式会社シバヤギ）に組み込まれる方法を使用して測定される。インスリン濃度が下記の様式で測定される。抗インスリンモノクローナル抗体がプレートに固定化され、サンプル中のインスリンがプレートに結合させられ、その後、ビオチン標識された抗インスリンモノクローナル抗体（これはインスリンの別の部分を認識する）が反応させられ、ペルオキシダーゼ−アビジンのコンジュゲートがさらに、ビオチンに結合させるためにプレートに加えられ、最後に、発色基質が、インスリンを発色によって測定するために加えられる。測定範囲が一般に、正常な動物（マウス）については３９ｐｇ／ｍｌ〜２，５００ｐｇ／ｍｌである。
【０３３４】
（ｖ）耐糖能：
処置および非処置のＴ２Ｄモデル動物および正常な動物が、異常な耐糖能について試験される。
【０３３５】
動物の耐糖能が正常または異常であるかどうかを、ブドウ糖負荷試験によって確認することができる。ブドウ糖負荷試験を、当業者に知られている従来からの手順に従って、例えば、グルコースを体重１グラムにつき２ｍｇで絶食（少なくとも１２時間）動物に腹腔内投与し、動物の血中グルコースレベルをブドウ糖負荷試験期間中の特定の時間で（例えば、２４０分にわたって１５分毎に）測定することによって実施することができる。結果から、血中グルコースレベルが、正常なマウスについての血中グルコースレベルと比較して、経時的に低下する傾向を何ら示さないことが示されるとき、耐糖能は異常であると評価される。処置された動物における結果が、非処置動物についての結果と比較して、経時的に低下する傾向を示すとき、本発明の抗体による処置は有効であると分類される。
【０３３６】
耐糖能の例示的な評価方法
対象動物の耐糖能がブドウ糖負荷試験によって評価される。
【０３３７】
ブドウ糖負荷試験が、最初にグルコースを体重１グラムにつき２ｍｇで１２時間絶食動物に腹腔内投与し、その後、動物の血液（末梢血）におけるグルコースレベルを２４０分にわたって１５分毎に測定することによって実施される。血中グルコースレベルが上述の方法によって測定される。結果から、血中グルコースレベルが、正常なマウスについての血中グルコースレベルと比較して、経時的に低下する傾向を何ら示さないことが示されるとき、耐糖能は異常であると評価される。非処置のＴ２Ｄモデル動物と比較して、処置されたＴ２Ｄモデル動物における経時的なより速い低下が、本発明の処置の効率を示すものとして評価される。
【０３３８】
（ｖｉ）インスリン感受性：
処置動物および非処置のＴ２Ｄモデル動物および正常な動物が、異常なインスリン感受性について試験される。
【０３３９】
動物のインスリン感受性が正常または異常であるかどうかを、インスリン感受性試験によって確認することができる。インスリン感受性試験を、当業者に知られている従来からの手順に従って、例えば、インスリンを体重１ｋｇにつき０．５Ｕ〜０．８５Ｕで絶食動物に腹腔内投与し、動物の血中グルコースレベルをインスリン感受性試験期間中の特定の時間で（例えば、２４０分にわたって１５分毎に）測定することによって実施することができる。結果から、血中グルコースレベルが、正常なマウスについての血中グルコースレベルと比較して、経時的に低下する傾向を何ら示さないことが示されるとき、インスリン感受性は異常であると評価される。処置された動物における結果が、非処置動物についての結果と比較して、経時的に低下する傾向を示すとき、本発明の抗体による処置は有効であると分類される。
【０３４０】
インスリン感受性の例示的な評価方法
対象動物のインスリン感受性がインスリン感受性試験によって評価される。
【０３４１】
インスリン感受性試験は、最初にインスリンを体重１ｋｇにつき０．５Ｕ〜０．８５Ｕで１２時間絶食動物に腹腔内投与し、その後、動物の血液（末梢血）におけるグルコースレベルを２４０分にわたって１５分毎に測定することによって実施される。血中グルコースレベルが上述の方法によって測定される。結果から、血中グルコースレベルが、正常な動物についての血中グルコースレベルと比較して、経時的に低下する傾向を何ら示さないことが示されるとき、インスリン感受性は異常であると評価される。非処置のＴ２Ｄモデル動物と比較して、処置されたＴ２Ｄモデル動物における経時的なより速い低下が、本発明の処置の効率を示すものとして評価される。
【０３４２】
（ｖｉｉ）その他：
多飲症および多尿症の評価
ＩＩ型糖尿病モデル動物が、糖尿病発症後および本発明の抗体の処置の期間中、増大した水飲みおよび増大した排尿の傾向を示すことについて試験される。増大した水飲みの傾向を、例えば、飼育ケージに置かれる水差しにおける水量の減少速度を注意深くモニターし、正常な系統の動物についての減少速度、および、非処置動物のその減少速度と比較することによって確認することができる。さらに、増大した排尿の傾向を、例えば、飼育ケージにおける床シートの濡れの程度を観察し、前記で示されるように比較することによって確認することができる。
【０３４３】
マウスにおける肥満傾向の有無の判定
処置および非処置のＴ２Ｄモデル動物および正常な動物の体重が測定され、比較される。非処置動物と比較して処置動物の低下した重量、ならびに／または、処置動物および正常な動物の同程度の重量が、本発明の処置の効率を示すものとして評価される。
【０３４４】
２）組織病理学的検査
ＩＩ型糖尿病動物、非処置のＴ２Ｄモデルコントロール、および、正常な動物の膵臓組織が、膵島（ランゲルハンス島）β細胞におけるアミリンのアミロイド沈着物についての実施例４の方法に従って固定処理され、パラフィンに包埋され、染色され、分析される。同様に、β細胞のアポトーシスおよびβ細胞の生存が、適切なマーカーを使用する免疫染色によって評価される（例えば、アポトーシスについてはＴＵＮＥＬおよび切断型カスパーゼ−３の染色、β細胞領域についてはインスリン染色）。非処置動物との比較における処置動物での膵島におけるアミロイド沈着物および／もしくはβ細胞アポトーシスの低下ならびに／またはβ細胞生存における増大、あるいは、処置動物および正常な動物における同程度のレベルが、本発明の防止的および／または治療的な方法の効率を示すものとして評価される。
【０３４５】
３）動物の収容
ＩＩ型糖尿病動物モデルは、ＳＰＦ条件のもと、以前に記載された条件に従って維持される（Ｈｕｌｌ他（２００３）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２：３７２〜３７９；Ｂｕｔｌｅｒ他（２００３）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２：２３０４〜２３１４；Ｂｕｔｌｅｒ他（２００４）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３：１５０９〜１５１６）：６週齢において、ｈ−ＩＡＰＰ（ヘミ接合性）／Ｃ５７ＢＬ／６／ＤＢＡマウスが、膵島のアミロイド形成を促進させることが示される高脂肪食に割り当てられる（Ｈｕｌｌ他（２００３）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２：３７２〜３７９）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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