(57)【要約】【課題】感染性下痢症の原因であるノロウイルス及びロタウイルス、並びに肺炎の病原体として重要なマイコプラズマに対する抗微生物用組成物の提供。【解決手段】クロモジ抽出成分を有効成分とする、ウイルス及びマイコプラズマから選択される少なくとも一つの微生物に対する増殖抑制活性を有する抗微生物用組成物。詳しくは、前記ウイルスがロタウイルス、ノロウイルス、及びインフルエンザウイルスから選択される少なくとも一つである前記抗微生物用組成物。更に詳しくは、前記クロモジ抽出成分がプロアントシアニジンを含む、クロモジ抽出成分含有抗微生物用組成物、並びに、それを含有する食品、医薬、飼料及び衛生用品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロモジ抽出成分を有効成分とする、ウイルス及びマイコプラズマから選択される少なくとも一つの微生物に対する増殖抑制活性を有する抗微生物用組成物。
【請求項２】
前記ウイルスがロタウイルス、ノロウイルス、及びインフルエンザウイルスから選択される少なくとも一つである、請求項１に記載の抗微生物用組成物。
【請求項３】
前記クロモジ抽出成分がプロアントシアニジンを含む、請求項１又は２に記載の抗微生物用組成物。
【請求項４】
前記プロアントシアニジンがＡ型プロアントシアニジンである、請求項３に記載の抗微生物用組成物。
【請求項５】
前記Ａ型プロアントシアニジンが、化学式（ＩＩ）：
【化１】
2018118959.tif 000024
（式中、ｎ＝１〜６）で示される、５量体〜１０量体のＡ型プロアントシアニジンである、請求項４に記載の抗微生物用組成物。
【請求項６】
前記Ａ型プロアントシアニジンが、シンナムタンニンＤ１、シンナムタンニンＤ２、シンナムタンニンＢ１又はシンナムタンニンＢ２である、請求項４に記載の抗微生物用組成物。
【請求項７】
Ｍｎ−ＳＯＤ発現促進用組成物である、請求項１〜６のいずれか一つに記載の抗微生物用組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一つに記載の抗微生物用組成物を含む、ロタウイルス性疾患、ノロウイルス性疾患、インフルエンザウイルス性疾患、又はマイコプラズマ性疾患の予防若しくは改善用食品。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一つに記載の抗微生物用組成物を含む、ロタウイルス性疾患、ノロウイルス性疾患、インフルエンザウイルス性疾患、又はマイコプラズマ性疾患の、予防若しくは改善用医薬。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一つに記載の抗微生物用組成物を含む、ロタウイルス性疾患、ノロウイルス性疾患、インフルエンザウイルス性疾患、又はマイコプラズマ性疾患の、予防若しくは改善用飼料。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一つに記載の抗微生物用組成物を含む、ロタウイルス性疾患、ノロウイルス性疾患、インフルエンザウイルス性疾患、又はマイコプラズマ性疾患の、予防若しくは改善用衛生用品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物であるクロモジを原料とする抗微生物用組成物に関する。更に詳しくは、本発明は、クロモジ抽出成分を有効成分とする、ウイルス及びマイコプラズマから選択される少なくとも一つの微生物に対する増殖抑制活性を有する抗微生物用組成物、並びに、それを含有する食品、医薬、飼料、及び衛生用品に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロモジは、クスノキ科（樟科）の落葉低木であり、北海道の南部から九州まで広く分布している。その枝に芳香があることから楊枝などに利用されてきた。また、クロモジの幹枝はウショウ（烏樟）と呼ばれる生薬して用いられ、更に、健胃薬などの民間薬の原料としても使用されてきた。その成分としてはプロアントシアニジン（縮合型タンニンともいう）が含まれていることが知られている。プロアントシアニジンは、例えばカテキン、エピカテキン等のフラバン−３−オールを単位として構成されるオリゴマー、もしくは重合体である。フラバン−３−オール単位間の結合様式が４位と８位の結合であるものはＢ型プロアントシアニジン、４位と８位の結合に加えて、２位と７位の間でエーテル結合する結合様式を有するものはＡ型プロアントシアニジンに分類される。非特許文献１には、クロモジにはＡ型プロアントシアニジンであるシンナムタンニンＢ１、シンナムタンニンＢ２、シンナムタンニンＤ１及びシンナムタンニンＤ２が含まれることが開示されている（但し、非特許文献１の中ではシンナムタンニンＢ１をｔｒｉｍｅｒ  Ａ、シンナムタンニンＢ２をｃｉｎｎａｍｔａｎｎｉｎ  Ｂ１、シンナムタンニンＤ１をｔｒｉｍｅｒ  Ｂ、シンナムタンニンＤ２をｃｉｎｎａｍｔａｎｎｉｎ  Ｄ１と表記している）。
【０００３】
プロアントシアニジンの構成単位即ち、フラバン−３−オールとしては、少なくともカテキン、エピカテキン、ガロカテキン、及びエピガロカテキン、並びに、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、及びエピガロカテキンガレート等、並びにそれらの光学異性体があり、また、構成単位間の結合様式及び重合度も多様であることから、それらの組み合わせの結果である、個々のプロアントシアニジンの構造及び性質は非常に多様性に富み、その薬理活性も個々のプロアントシアニジンによって大きく異なる。
【０００４】
ウイルス疾患及びマイコプラズマ疾患に対しての有効な予防・治療薬は一般に限られており、更に多様で且つ有効な予防・治療薬の開発が待たれている。本発明者等は、これらの事情に鑑みて、既に幾つかの提案をしている。即ち、特許文献１では、アズキから抽出したプロアントシアニジンを含有する抗ウイルス剤を、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、疣贅ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ノーウォークウイルス、ロタウイルス、エコーウイルス、及びエンテロウイルスを対象ウイルスとして提案している。ここで使用しているアズキ抽出プロアントシアニジンの構造については開示していないが、非特許文献３の表２のｍ／ｚ値（［Ｍ−Ｈ］−）に基づけば、アズキのプロアントシアニジンはＢ型であると推定される。また、当該抗ウイルス剤のノロウイルス、ネコカリシウイルス、ロタウイルス、及びマイコプラズマに対する有効性を示す実施例は開示されていない。
【０００５】
特許文献２では、エピカテキン３量体及び／またはエピカテキン４量体を有効成分とする、ウイルスの細胞内増殖抑制剤、並びに、エピカテキン３量体及び／またはエピカテキン４量体を有効成分とする、Ｍｎ−ＳＯＤ活性化剤を提案している。同文献の段落００２３には、「エピカテキンｘ量体とはエピカテキン分子の４位と８位とが重縮合した化合物」との記載があるので、少なくともＡ型プロアントシアニジン以外の化学構造である。また、それらは化学合成して得たものである。具体的に試験しているウイルスはＳＡＲＳコロナウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、及びネコカリシウイルスである。
【０００６】
非特許文献４では、アズキ種子由来のプロアントシアニジン４、５量体画分の抗ウイルス増殖抑制作用（ＳＡＲＳコロナウイルス及びＡ型インフルエンザウイルスに対して）を開示している。但し、当該プロアントシアニジンの構造は同定されていない。
【０００７】
非特許文献５では、緑茶抽出物についてウイルス増殖抑制効果を開示しているが、ここでの対象ウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、及びネコカリシウイルスである。
【０００８】
特許文献４は、プロアントシアニジンまたはカテキンを有効成分とする抗ＳＡＲＳウイルス剤及びそれを含有する飲食品等を開示する。具体的にはブドウ種子またはリンゴの抽出物を、ＳＡＲＳコロナウイルス試験に用いているが、その抽出物の化学的特定はなされていない。非特許文献６及び非特許文献７によれば、ブドウ種子、リンゴ抽出物にはＢ型プロアントシアニジンが含まれるとされることから、特許文献４に開示されているプロアントシアニジンは、Ｂ型プロアントシアニジンと推定される。
【０００９】
特許文献５は、フコダイン又はプロアントシアニジンを有効成分とするウイルス増殖阻害剤及びそれを含有する機能性食品を開示する。具体的には、ピーナツ種皮から抽出したプロアントシアニジンをエイズウイルス及びＳＡＲＳウイルスに有効であるとしている。プロアントシアニジンの化学構造は特定されていないが、ピーナツ種皮から抽出していることから特許文献７の記載を勘案すれば、それに含まれる化合物のその化学構造は例えば化学式（Ｉ）：
【化１】
2018118959.tif 000002
であると推定される。
【００１０】
一方、前記以外にも、多様なウイルスの対策に必要な抗ウイルス剤の多様な原料を求めて、複数の技術が開示されている。
【００１１】
即ち、特許文献３は、クロモジ等の抽出物を有効成分とする抗インフルエンザウイルス剤及びそれを含む飲食物を開示するが、抽出成分の化学的特定には言及されていない。
【００１２】
特許文献６は、Ａ型及びＢ型のプロアントシアニジンの、特に５〜１０量体を有効成分とするＣ型肝炎ウイルスの産生抑制剤及びそれを含有する飲食組成物を開示する。
【００１３】
この様に、多種な化学種及び原料を用いた抗ウイルス剤及びそれを含有する食品類に関連する技術が開発されているが、ウイルスの多様性に対抗すべく、より安全で高活性な抗ウイルス剤は常に必要とされ、原料の多様性による抗ウイルス剤資源の確保は依然として課題となっている。
【００１４】
細菌を標的とする抗生物質の場合、その標的となる細菌は、細胞という構造を持ち、ある程度共通した生体分子を持つため、それを標的として細菌の生理過程を阻害することができることから、複数菌種に対する抗菌活性（抗菌スペクトラム）を持つことが多い。これに対して、ウイルスは、細菌とは、その進化的な起源からして大きく異なり、各種類のウイルスが持つ分子が共通の構造を持つことは珍しく、その生活環についても多様性は著しい。そのため、特定のウイルスに抗ウイルス活性を持つ物質が他のウイルスにも活性を持つことは稀であり（非特許文献２）、ますます、抗ウイルス剤資源の確保を困難なものにしている。
【００１５】
感染性下痢症の原因である、ノロウイルスはカリシウイルス科に分類される一本鎖ＲＮＡウイルスであり、冬季を中心に深刻な集団感染を引き起こし、一旦発症すると効果的な治療法は無く、簡単な消毒法も無く、強い感染力のため問題となっている。また、感染性下痢症のもうひとつの主要な原因であるロタウイルスは、レオウイルス科に分類される二本鎖ＲＮＡウイルスであり、感染力が極めて高く感染予防は困難であり、世界における乳幼児死亡の主な原因の一つとされている。また、日本においても、死亡に至ることは稀ではあるが、感染者数は非常に多く重要な問題となっている。更に、マイコプラズマは冬季に流行する肺炎の病原体として重要であり、マイコプラズマ肺炎は嘔吐や下痢といった消化器症状を併発することが多い。マイコプラズマ性疾患に対しては通常、抗生物質による治療が行われるが、近年、抗生物質による治療効果が乏しい耐性株の出現が問題となっている。非特許文献８はガガイモ科の低木、Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａのエキスが抗マイコプラズマ活性を有することを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２００８−１４３８４０号公報
【特許文献２】特開２０１５−２１４５０１号公報
【特許文献３】特開２００４−０５９４６３号公報
【特許文献４】特開２００５−３１４３１６号公報
【特許文献５】特開２００７−２１７４１０号公報
【特許文献６】特開２０１０−０５９０９６号公報
【特許文献７】特開２０１０−１６８３００号公報
【特許文献８】特許第５６１８２２８号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｅｚａｋｉ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  Ｌｉｎｄｅｒａｅ  ｕｍｂｅｌｌａｔａｅ  Ｒａｍｕｓ，  ＩＶ＊．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｔａｎｎｉｎ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｏｎ  Ｐｅｐｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｒｅｓｓ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ．”  Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．１９８５，５１（１），ｐ.３４−８．ＰＭＩＤ：１７３４０３９６．
【非特許文献２】生命科学のためのウイルス学−感染と宿主応答のしくみ、医療への応用、Ｄａｖｉｄ  Ｒ．Ｈａｒｐｅｒ著、南江堂、下遠野邦忠・瀬谷司監訳、２０１５年２月１０日発行、ｐ.１７３．
【非特許文献３】Ａｍａｒｏｗｉｃｚ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｏｆ  ａｄｚｕｋｉ  ｂｅａｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｆｒａｃｔｉｏｎｓ”  Ｊ．ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｌｉｐｉｄｓ，２００８，１５（１），ｐ.１１９−３６．
【非特許文献４】吉仲由之他、「日本ウイルス学会学術集会プログラム・抄録集、６１巻、ｐ.３０５、２０１３年１０月２９日発行、“タンニンの抗ウイルス作用の解析  ＩＩ” ．
【非特許文献５】吉仲由之他、日本ウイルス学会学術集会プログラム・抄録集、６２巻、ｐ.３７５、２０１４年１０月３１日発行、“緑茶カテキン中の微量成分によるインフルエンザウイルス増殖抑制”
【非特許文献６】Ｇｒａｓｅｓ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｏｎｓｕｍｉｎｇ  ａ  ｇｒａｐｅ  ｓｅｅｄ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａｂｕｎｄａｎｔ  ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｈｕｍａｎ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．”Ｎｕｔｒ．Ｊ．２０１５，１４：９４  ＰＭＩＤ：２６３５３７５６．
【非特許文献７】Ｍｅｎｄｏｚａ−Ｗｉｌｓｏｎ  ＡＭ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ−ｐｒｏｏｘｉｄａｎｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｅｘｔｒａｃｔ  ａｎｄ  ａ  ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ−ｒｉｃｈ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｐｌｅ  ｓｋｉｎ．”Ｈｅｌｉｙｏｎ．２０１６，２（２），ｅ０００７３．ＰＭＩＤ：２７４４１２５２．
【非特許文献８】Ｍｕｒａｉｎａ  ＩＡ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｍｙｃｏｐｌａｓｍａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  ｐｌａｎｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｎｉｇｅｒｉａ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ  ｕｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ．”Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｌ．２０１０，４８（１０），１１０３−７．ＰＭＩＤ：２０８１９０２５．
【非特許文献９】Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  ＣＡ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．”Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０１６，５（２），ｐ．３８−６２．  ＰＭＩＤ：  ２７１７５３４９  における４６ページから４７ページ。
【非特許文献１０】Ｄｏｕｌｔｒｅｅ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｌｉｎｅ  ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ，  ａ  Ｎｏｒｗａｌｋ  ｖｉｒｕｓ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ．”Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｉｎｆｅｃｔ．１９９９，４１（１），ｐ．５１−７．ＰＭＩＤ：９９４９９６５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従来の抗ウイルス剤及び抗マイコプラズマ剤は特許文献３及び非特許文献８にみられるように、ウイルス又はマイコプラズマに直接結合または作用して、不活化又はその増殖を阻害するものが主流である。このような抗ウイルス剤は、宿主の体内の環境とはかけ離れた条件でしか、その活性を示さないものや、毒性が問題となり、人体に使用するには適さないものがある。また、そうでなくても原理的にウイルス又はマイコプラズマに接触しないとそのウイルスによる疾病を防ぐことができないため、その使用機会は限られる。そのため、宿主となる細胞に働きかけて、ウイルス又はマイコプラズマの増殖を抑える活性を有することが望ましく、ウイルスに関しては、特許文献１、特許文献２、非特許文献４、非特許文献５、特許文献５及び特許文献６にあるような増殖抑制活性を有する抗ウイルス剤が提案されてきた。
【００１９】
そのなかでも、安全性や入手の容易さ、流行期間中の日常的・継続的な使用及び食品としての利用などの点から考えると、植物をその原料として容易に製造できることが望ましく、特許文献２のように有機化学的に合成された化合物を有効成分として含むものは安全に使用することは簡単ではなく、少なくとも食品として利用することは難しい。
【００２０】
非特許文献５では、緑茶の抽出物についてノロウイルス代替ウイルスのネコカリシウイルス増殖抑制効果を開示した。しかしながら、ウイルス性下痢症のもう一つの主要な原因であるロタウイルス及び、下痢症を合併することがあるマイコプラズマ性肺炎の原因であるマイコプラズマについては増殖抑制活性に関する記述はない。
【００２１】
特許文献３は、クロモジの抽出物を有効成分とする抗インフルエンザウイルス剤を開示し、特許文献６では、Ａ型及びＢ型のプロアントシアニジンを有効成分とするＣ型肝炎ウイルスの産生抑制剤は開示されたが、他のウイルスやマイコプラズマに作用があると容易に予測することは難しい。
【００２２】
また、特許文献１は他の多くのウイルスと共にロタウイルス及びノーウォークウイルス（ノロウイルスに分類される）を例示するのみで、当該抗ウイルス剤のノロウイルス、ネコカリシウイルス、ロタウイルス及びマイコプラズマに対する有効性についての記述はない。
【００２３】
また、非特許文献４、特許文献４及び特許文献５においても、当該抗ウイルス剤のノロウイルス、ネコカリシウイルス、ロタウイルス及びマイコプラズマに対する有効性についての記述はない。
【００２４】
また、特許文献３にあるように有効成分が全く不明なものは、通常、有効成分の存在量を指標に実施する、原料の選定・管理、及び製造時の品質管理を実質的に行うことができないだけでなく、当然、作用機序も不明となり、適切に使用する上での問題となる。また、特許文献１、特許文献２、非特許文献４、特許文献４、及び特許文献６は、その有効成分はプロアントシアニジンに分類される化合物であることは記述しているものの、単一の化合物の有効性については具体的に例示しておらず、プロアントシアニジンに分類される化合物は多様性に富むことから、前記の特許文献３と同様の問題を抱えている。このように、天然素材由来の多様なプロアントシアニジンの中でもウイルス及びマイコプラズマに対して有効性を持つ化合物は何かということについては解決されておらず、産業上の利用における障害となっている。
【００２５】
また、多様なウイルス及びマイコプラズマ並びに耐性株の出現に対抗すべく、より安全で高活性な抗ウイルス剤の開発と原料の多様性による抗ウイルス剤資源の確保は常に課題となっている。
【００２６】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、クロモジを原料とする抗ウイルス・抗マイコプラズマ剤及び抗ウイルス性・抗マイコプラズマ性食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
前記の目的を達成するためになされた本発明は、
［１］クロモジ抽出成分を有効成分とする、ウイルス及びマイコプラズマから選択される少なくとも一つの微生物に対する増殖抑制活性を有する抗微生物用組成物である。
［２］更に本発明は、前記ウイルスがロタウイルス、ノロウイルス、及びインフルエンザウイルスから選択される少なくとも一つである、［１］に記載の抗微生物用組成物である。
［３］更に本発明は、前記クロモジ抽出成分がプロアントシアニジンを含む、［１］又は［２］に記載の抗微生物用組成物である。
［４］更に本発明は、前記プロアントシアニジンがＡ型プロアントシアニジンである、［３］に記載の抗微生物用組成物である。
［５］更に本発明は、前記Ａ型プロアントシアニジンが化学式（ＩＩ）：
【化２】
2018118959.tif 000003
（式中、ｎ＝１〜６である）で示される、５量体〜１０量体のＡ型プロアントシアニジンである、［４］に記載の抗微生物用組成物である。
［６］更に本発明は、前記Ａ型プロアントシアニジンがシンナムタンニンＤ１、シンナムタンニンＤ２、シンナムタンニンＢ１又はシンナムタンニンＢ２である、［４］に記載の抗微生物用組成物である。
［７］更に本発明は、Ｍｎ−ＳＯＤ発現促進用組成物である、［１］〜［６］のいずれか一つに記載の抗微生物用組成物である。
［８］更に本発明は、［１］〜［７］のいずれか一つに記載の抗微生物用組成物を含む、ロタウイルス性疾患、ノロウイルス性疾患、インフルエンザウイルス性疾患、又はマイコプラズマ性疾患、の予防又は改善用食品である。
［９］更に本発明は、［１］〜［７］のいずれか一つに記載の抗微生物用組成物を含む、ロタウイルス性疾患、ノロウイルス性疾患、インフルエンザウイルス性疾患、又はマイコプラズマ性疾患の、予防若しくは改善用医薬である。
［１０］更に本発明は、［１］〜［７］のいずれか一つに記載の抗微生物用組成物を含む、ロタウイルス性疾患、ノロウイルス性疾患、インフルエンザウイルス性疾患、又はマイコプラズマ性疾患の、予防若しくは改善用飼料である。
［１１］更に本発明は、［１］〜［７］のいずれか一つに記載の抗微生物用組成物を含む、ロタウイルス性疾患、ノロウイルス性疾患、インフルエンザウイルス性疾患、又はマイコプラズマ性疾患の、予防若しくは改善用衛生用品である。
【発明の効果】
【００２８】
本発明のクロモジ抽出成分含有抗微生物用組成物は、冬季を中心に深刻な集団感染を引き起こす感染性下痢症の原因であるノロウイルス、感染力が極めて高く感染予防は困難である感染性下痢症のもうひとつの主要な原因であるロタウイルス、冬季を中心に集団感染を引き起こすインフルエンザウイルス、及び冬季に流行する肺炎の病原体として重要なマイコプラズマに対する増殖抑制活性を有する食品、医薬及び飼料への利用が可能である。
【００２９】
また、本発明の抗微生物用組成物は宿主に働きかける増殖抑制活性を持つことから、ウイルス感染前及び感染後に使用することができる。感染前の予防法及び感染後の治療法の選択肢が限られるノロウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス及びマイコプラズマ感染症に対する治療手段として極めて重要である。
【００３０】
更に、長年の喫食経験を持ち、安全性の高い、また、入手が容易な植物、クロモジを原料とした本発明の抗微生物用組成物は、継続的に使用しても安全な食品、医薬品、又は飼料として使用できる。また、その有効成分はＡ型プロアントシアニジンのシンナムタンニンＤ１、シンナムタンニンＤ２、シンナムタンニンＢ１及びシンナムタンニンＢ２であると明らかになっており、原料の選定・管理及び製造時の品質管理の点からも有用である。また、有効成分及び作用機序ともに明らかとなっており、適切な使用の観点からも極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本発明を適用する抗微生物用組成物中のクロモジプロアントシアニジン（ＰＲＥ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳデータである。
【図２】図２は、本発明を適用する抗微生物用組成物中のクロモジプロアントシアニジン（ＰＲＥ）の重合度別濃縮物のクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明の具体的実施態様を説明する。
本発明に用いられるクロモジとしては、クロモジ属に属するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、クロモジ（Ｌｉｎｄｅｒａ  ｕｍｂｅｌｌａｔａ  Ｔｈｕｎｂ．）、ケクロモジ（Ｌｉｎｄｅｒａ  ｓｅｒｉｃｅａ（Ｓｉｅｂ．ｅｔ  ｚｕｃｃ．）Ｂｌｕｍｅ）、ウスゲクロモジ（Ｌｉｎｄｅｒａ  ｓｅｒｉｃｅａ  ｖａｒ．ｇｌａｂｒａｔａ  Ｂｌｕｍｅ）、オオバクロモジ（Ｌｉｎｄｅｒａ  ｕｍｂｅｌｌａｔａ  ｖａｒ．ｍｅｍｂｒａｎａｃｅａ（Ｍａｘｉｍ．）Ｍｏｍｉｙａｍａ）、ヒメクロモジ（Ｌｉｎｄｅｒａ  ｕｍｂｅｌｌａｔａ  ｖａｒ．ｌａｎｃｅａ  Ｍｏｍｉｙａｍａ）及びアメリカクロモジ（Ｌｉｎｄｅｒａ  ｂｅｎｚｏｉｎ（Ｌ．）Ｂｌｕｍｅ）などが挙げられるが、特にクロモジ（Ｌｉｎｄｅｒａ  ｕｍｂｅｌｌａｔａ  Ｔｈｕｎｂ．）が好ましい。上記植物の使用部位としては、特に限定されるものではないが、例えば、葉、樹皮、幹、幹枝、花、果実、果皮、果肉、種子、芽、根及び根茎等が挙げられる。その中でも、特に幹枝が好ましい。
【００３３】
本発明は、上記植物の抽出成分を有効成分とする、抗微生物用組成物である。具体的には、上記植物をそのまま、又は適度な大きさに粉砕し、エタノールまたはイソプロパノール等の低級アルコール、アセトン、それらの水溶液または水等を溶媒に用いて抽出し、その抽出物をクロモジ抽出成分として得る。また、上記植物をそのまま、又は適度な大きさに粉砕し、そのまま、食品、医薬品、又は飼料の原料とした上で、製造時に別に含まれる原料によって抽出される成分、又は、使用時に唾液、粘液、消化液、又は、その他分泌液によって抽出される成分を抽出成分とすることもできる。好ましくは、さらに、上記抽出物をカラムクロマトグラフ、薄層クロマトグラフまたは高圧液体クロマトグラフ等によって分画し、クロモジ抽出成分を得る。クロマトグラフに用いる担体は通常の担体でよく、特に限定されるものではないが、単離精製されたクロモジ抽出成分を得る場合には、ゲルろ過クロマトグラフィー用の担体が好ましく、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、ＭＣＩ−ＧＥＬ  ＣＨＰ−２０Ｐ（三菱化学社製）等が好ましい。一方、粗精製したものをクロモジ抽出成分として得る場合には、上記ゲルろ過クロマトグラフィー用の担体を用いることができるが、酸性物質分離用の担体が好ましく、例えば、バイオ・ラド社製のＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＣＭ担体、又は三菱化学社製のダイヤイオンＨＰ２ＭＧ等が好ましい。より好ましくは、カルボキシル基修飾シリカゲルが用いられる。例えば、富士シリシア社製のＣｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ  ＣＯＯＨシリーズ（ＡＣＤシリカＲ）担体が挙げられる。
【００３４】
本発明の抗微生物用組成物は、ノロウイルス、ロタウイルス、日本脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルス、エコーウイルス及びマイコプラズマなどに対する増殖抑制活性を期待して用いることができるが、特に、ノロウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、及びマイコプラズマに対する増殖抑制活性を期待して用いることができる。ヒトノロウイルスは、培養方法が確立されていないため、代替ウイルスとして同じカリシウイルス科に分類されているネコカリシウイルスを用いる方法が一般的に採用されている（特許文献８及び非特許文献１０）。従って、本発明では、ネコカリシウイルスをノロウイルスの代替ウイルスとして用い、その増殖抑制活性試験を行った。その結果としてネコカリシウイルス増殖抑制活性を示したクロモジ抽出成分を、ノロウイルス増殖抑制活性を有するものと判定した。
【００３５】
本発明で云う抗微生物用組成物は上記微生物に対する増殖抑制活性を有する。本発明で云う増殖抑制活性は、ウイルス又はマイコプラズマに直接結合する等してその活性を失わせる不活化、又は、ウイルス又はマイコプラズマに直接作用してその増殖を阻害する活性とは異なり、ウイルスに感染又はマイコプラズマが寄生した宿主の細胞における、ウイルス又はマイコプラズマの増殖を抑制する活性である。ウイルス又はマイコプラズマの不活化を利用して、又は、ウイルス又はマイコプラズマへの直接作用を利用して、宿主を防御しようとする場合、ウイルス又はマイコプラズマが標的細胞に感染又は寄生する前に直接、活性物質を作用させなくては効果的でなく、生体に投与する場合は、その効果的なタイミングが限られるという欠点がある。それに比べて、本発明の抗微生物用組成物を用いて、増殖抑制活性を利用する場合は、宿主細胞に作用させればよく、感染時及び感染後に投与しても有効であるし、感染前に予防的に投与することもできる。
【００３６】
更に本発明は、前記クロモジ抽出成分がプロアントシアニジンを含む、抗微生物用組成物である。即ち、上記クロモジ抽出物を、上記カラムクロマトグラフを用いて分画することにより、クロモジプロアントシアニジン（「ＰＲＥ」と略称することあり）を得て、これを、プロアントシアニジンを含むクロモジ抽出成分として、培養細胞系を用いた各種微生物増殖抑制活性試験を行った結果、ＰＲＥは、ロタウイルス、ネコカリシウイルス、日本脳炎ウイルス及びマイコプラズマについて増殖抑制活性を示した。さらに、ロタウイルスによる、ラットにおける下痢症をＰＲＥの経口投与は改善することを見出した。
【００３７】
本発明で云うプロアントシアニジンとは、ポリフェノール類の中の縮合型タンニン類に分類され、例えば、化学式（ＩＩＩ）：
【化３】
2018118959.tif 000004
（式中、ｎ＝０〜１０以上）で表される二量体、三量体からオリゴマー、ポリマーまでの分子量分布を持った形で存在し、その構成単位は例えば、化学式（ＩＶ）−１〜４：
【化４】
2018118959.tif 000005
【化５】
2018118959.tif 000006
【化６】
2018118959.tif 000007
【化７】
2018118959.tif 000008
で表されるフラバン−３−オールであるカテキン、エピカテキン、ガロカテキン及びエピガロカテキンに加えて、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、及びエピガロカテキンガレート並びにそれらの光学異性体から成る。
【００３８】
プロアントシアニジンは、その構成単位間の結合様式の違いから、４位と８位の間で結合する、主に化学式（ＩＩＩ）で表されるＢ型プロアントシアニジンと、４位と８位の結合に加えて、２位と７位の間でエーテル結合する結合様式を有する、例えば化学式（Ｖ）：
【化８】
2018118959.tif 000009
で表されるＡ型プロアントシアニジンに分類される。
【００３９】
更に本発明は、好ましくは、前記プロアントシアニジンがＡ型プロアントシアニジンである、抗微生物用組成物である。即ち、本発明者らは、ＰＲＥ中のプロアントシアニジンについて、ＬＣＭＳを用いて個別に定量を行った。その結果、Ａ型プロアントシアニジンがＰＲＥ中に含まれていることを確認した。また、ＰＲＥをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより確認したところ、Ａ型プロアントシアニジンの３量体から１１量体と推測されるピークが得られた。一方、ＰＲＥのＬＣＭＳ分析で、Ａ型プロアントシアニジン３量体のシンナムタンニンＢ１及びシンナムタンニンＤ１ならびにＡ型プロアントシアニジン４量体のシンナムタンニンＢ２及びシンナムタンニンＤ２が検出されていることを併せて考えると、これら４つの分子に、フラボン−３−オール単位が、一カ所、炭素−炭素結合する様式で、順次、同様に結合した重合体である、化学式（ＶＩ）：
【化９】
2018118959.tif 000010
（式中、ｎ＝０〜７）で表されるＡ型プロアントシアニジンが、ＰＲＥには含まれていることを見出した。
【００４０】
更に本発明は、さらに好ましくは、前記Ａ型プロアントシアニジンが、化学式（ＩＩ）：
【化１０】
2018118959.tif 000011
（式中、ｎ＝１〜６）で表される、５量体〜１０量体のＡ型プロアントシアニジンを含む抗微生物用組成物である。即ち発明者らは、ＰＲＥを、カラムクロマトグラフを用いて分画して、重合度別に濃縮した画分を複数得て、増殖抑制活性試験を行い、前記Ａ型プロアントシアニジンの５量体〜１０量体を濃縮した画分がウイルス増殖抑制作用を顕著に示すことを、本発明者等は見出したのである。
【００４１】
更に本発明は、前記Ａ型プロアントシアニジンが、シンナムタンニンＤ１、シンナムタンニンＤ２、シンナムタンニンＢ１又はシンナムタンニンＢ２である抗微生物用組成物である。即ち、本発明者等はＰＲＥの分析から、ＰＲＥ中にはＡ型プロアントシアニジンの一種である３量体シンナムタンニンＢ１及びシンナムタンニンＤ１、並びに４量体シンナムタンニンＢ２及びシンナムタンニンＤ２が含まれることを明らかにし、これらをクロモジから抽出し、クロマトグラフを用いて単離精製した。これらについて、増殖抑制活性試験を行った結果、ウイルス増殖抑制活性を顕著に示すことを見出したのである。
【００４２】
更に本発明は、Ｍｎ−ＳＯＤ（マンガンスーパーオキシドジスムターゼ）発現促進用組成物である、抗微生物用組成物である。即ち、本発明者等は、作用機序を解明するために、アフリカミドリザル由来Ｖｅｒｏ細胞の培養液中にＰＲＥを添加して、２４時間培養し、細胞よりタンパク質を抽出してウエスタンブロットにより、Ｍｎ−ＳＯＤの存在量を定量した。その結果、ＰＲＥ処理によるＭｎ−ＳＯＤ存在量の増加が確認された。ウイルスの宿主細胞に対する作用の発現には、感染したウイルスにより誘導された活性酸素種が重要な役割を果たす場合があることが知られている（非特許文献９）。従って、ＰＲＥはその活性酸素種を無毒化するＭｎ−ＳＯＤの発現を誘導することにより、結果としてウイルスの増殖を抑制すると考えられる。
【００４３】
更に本発明は、前記抗微生物用組成物を含む、ロタウイルス性疾患、ノロウイルス性疾患、インフルエンザウイルス性疾患、又はマイコプラズマ性疾患の予防又は改善用食品である。即ち、本発明の抗微生物用組成物を食品として摂取することも可能であり、その結果として、ロタウイルス性疾患、ノロウイルス性疾患、インフルエンザウイルス性疾患、又はマイコプラズマ性疾患の予防又は改善用食品として機能する。食品としては、ジュース等の非アルコール飲料、アルコール飲料、ヨーグルト等の発酵飲料、錠菓や飴等の固形菓子、ガムやグミ菓子糖のチュアブル菓子、並びに、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、蛋白等を含有する栄養補助食品等の形態が含まれる。また、機能的には、特定保健用食品（いわゆる、「トクホ」）、栄養機能食品、及び機能性表示食品等が含まれる。
【００４４】
更に本発明は、前記抗微生物用組成物を含む、ロタウイルス性疾患、ノロウイルス性疾患、インフルエンザウイルス性疾患、又はマイコプラズマ性疾患の、予防若しくは改善用医薬、又は予防若しくは改善用飼料である。即ち、本発明の抗微生物用組成物を医薬として経口投与または非経口（即ち、注射、経皮、経粘膜）投与することができ、投与形態に対応して、錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤、カプセル剤等の剤形を採用することができる。これらの製剤は、適宜製剤学的に許容される他の添加剤、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤等の担体と共に、常法にしたがって、製剤化することができる。また、甘味剤、着色剤等を添加して服用させることもできる。これらの製剤化にあたっては、日本薬局方の製剤総則に記載の方法によって行うことができる。
【００４５】
本発明の抗微生物用組成物において、有効成分として使用するクロモジ抽出成分は、その微生物増殖抑制活性を標準として、１日約０．１〜２ｇ程度、好ましくは、０．２〜１ｇ程度を摂取するのがよく、一般的には、１日１〜３回、好ましくは１日３回毎食直前に服用する有効成分の含有量を設定し、その用量を摂取する製剤として設計すればよい。
【００４６】
また、ＰＲＥそのものを含有する場合には、ＰＲＥを適当な溶媒で希釈し、液状組成物とし調製することもできる。また、ＰＲＥそのものを適当な担体、好ましくは脂肪酸トリグリセライド等と混合し、液状のままソフトカプセル等に充填し、調製することもできる。
【００４７】
本発明の抗微生物用組成物を飼料として用いる場合には、例えば、家畜飼料、ペットフードに混入して製造することができる。製造された飼料は家畜、哺乳動物、鶏、又は、ペット等に投与することができる。
【００４８】
上記の食品、医薬または飼料としての製剤化においては、通常使用されている賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、界面活性剤、溶解補助剤、還元剤、緩衝剤、吸着剤、流動化剤、帯電防止剤、抗酸化剤、甘味剤、矯味剤、清涼化剤、遮光剤、着香剤、香料、芳香剤、コーティング剤、可塑剤等の製剤添加物の一種または二種以上を適宜選択して添加することができる。
【００４９】
そのような製剤添加物としては、具体的には、例えば、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、クロスカルメロースナトリウム、マルトデキストリン、エチルセルロース、乳糖、ソルビトール、無水ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ステアリン酸、オレイン酸、流動パラフィン、第二リン酸カルシウム、セバチン酸ジブチル、マクロゴール、プロピレングリコール、コーンスターチ、デンプン、アルファー化デンプン、ゼラチン、ポピドン、クロスポピドン、グリセリン、ポリソルベート８０、クエン酸、アセスルファムカリウム、アスパルテーム、炭酸ナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム等を挙げることができる。
【００５０】
また、本発明の抗微生物用組成物としての製剤化にあたっては、有効成分であるクロモジ抽出成分が有する抗微生物活性を損なわない程度の質及び量の範囲で、ビタミン、ミネラル等の他の活性成分を添加することもできる。
【００５１】
また、本発明の抗微生物用組成物をスプレー、マスク、石鹸、ウエットティッシュ、ローション、及びクリーム等の衛生用品に添加することにより、前記微生物に対する抗微生物用衛生用品とすることができる。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５３】
実施例１．クロモジプロアントシアニジン（ＰＲＥ）の製造
クロモジ（学名：Ｌｉｎｄｅｒａ  ｕｍｂｅｌｌａｔａ  Ｔｈｕｎｂ．）の幹枝を３倍重量の３０％エタノールで抽出する。ロータリーエバポレーターを用いてエタノールを除き、エタノール濃度を５％以下とし、ろ紙を用いてろ過した。ろ液を、蒸留水で充填した１０分の１量のカルボキシル基修飾シリカゲル（「ＡＣＤシリカ」富士シリシア社製）カラムに通液し、カラム体積の１０倍量の蒸留水でカラムを洗浄した。３０％エタノールで保持された成分を溶出させ、エバポレーターを用いてエタノールを除き、凍結乾燥器（ＲＬＥＩＩ−１０３、共和真空技術社製）で減圧乾固させＰＲＥとした。
【００５４】
実施例２．クロモジ熱水抽出物からのプロアントシアニジン濃縮物の製造
クロモジの幹枝に１０倍量の水を加えて、９８℃で３時間加温抽出して、凍結乾燥器で減圧乾固してクロモジ熱水抽出物を得た。２倍量の３０％メタノール１００ｍＬを加えて懸濁し、１７００×ｇで１０分間、遠心分離し、上清をとり、３０％メタノールで充填したＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）カラム（φ５０×２７０ｍｍ）に通液した。続いてカラムの４容量の３０％メタノール、４容量の７０％メタノール、及び４容量の１００％メタノールで洗浄した。４容量の７０％アセトンで溶出し、減圧乾固してプロアントシアニジン濃縮物とした。
【００５５】
実施例３．重合度別濃縮
ＰＲＥ０．７５ｇを６倍量のエタノールに溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０をエタノールで充填したカラム（φ３０ｍｍ×３００ｍｍ）に通液した。エタノール及びメタノールを順に各２．１Ｌ、次いで７０％アセトンを０．９Ｌ用い順次溶出して、３００ｍＬ毎のフラクションとして、最初に溶出される画分をＦ１として、順にＦ１からＦ１７の計１７フラクションを得た。Ｆ１からＦ３、Ｆ４からＦ６、Ｆ７とＦ８、Ｆ１２からＦ１４、及び、Ｆ１５からＦ１７のフラクションはそれぞれまとめて混合し、それぞれＦ１−３画分、Ｆ４−６画分、Ｆ７−８画分、Ｆ１２−１４画分、及び、Ｆ１５−１７画分とした。Ｆ９、Ｆ１０、及び、Ｆ１１のフラクションはそのままＦ９画分、Ｆ１０画分、及び、Ｆ１１画分とした。それぞれロータリーエバポレーターで減圧乾固して、各画分を得た。
【００５６】
実施例４．ネコカリシウイルス（ノロウイルスの代替ウイルス）の増殖抑制活性試験
ヒトノロウイルスは、培養方法が確立されていないため、代替ウイルスとして同じカリシウイルス科に分類されているネコカリシウイルスを用いる方法が一般的に採用されている（特許文献８）。そこで、ネコカリシウイルスを用いて増殖抑制活性試験を行った。
ネコカリシウイルスは、Ｆ９株（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より購入）を用いた。培養細胞はＣＲＦＫ細胞（ネコ胎児腎由来、ＡＴＣＣより購入）を用い、培地はハイグルコース含有ダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）に１０％ウシ胎児血清（シグマアルドリッチ社製）及びＰＳｍ（１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、ナカライテスク社製）を添加したものを用い、５％ＣＯ２存在下において３７℃で培養した。ウイルスストック液は、細胞１個当たりのウイルス量が０．１（ＭＯＩ（感染多重度）＝０．１）となる条件で室温下に６０分間感染させ、感染後４８時間後に培地を回収し、０．４５μｍのフィルター（ミリポア社製）でろ過後、分注して、−７０℃で保管した。
ウイルス増殖抑制活性試験は、１％ウシ血清アルブミン（ベーリンガーインゲルハイム社製）を加えたＰＢＳ（−）（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋を含まない０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．０）で１００ＰＦＵ／０．２ｍＬのウイルス液を作成し、９０％の単層が形成されたそれぞれのウエル（６ウエルプレート、コーニング社製）に接種し、室温下に６０分間感染させた。感染後、種々の濃度の検体を添加したＤＭＥＭ（２％ウシ胎児血清、１．１％メチルセルロース含有）で３日間培養した。培養後、メチルセルロースを取り除き、細胞を２．５％クリスタルバイオレット（３０％エチルアルコール、１％シュウ酸アンモニウム中）で固定／染色し、ＰＢＳ（−）で３回洗浄／脱色後、プラーク数をカウントし、プラークを５０％減少させる被検物質のＩＣ５０値（ネコカリシウイルスの増殖を５０％阻害する濃度（μｇ／ｍＬ））を求めた。
【００５７】
実施例５．ロタウイルス（Ｇ１株）の増殖抑制活性試験
ロタウイルス（Ｇ１株）、感受性細胞株ＭＡ１０４（アフリカミドリザル腎細胞）はＡＴＣＣより購入した。細胞の培養は、５％ＣＯ２存在下に３７℃で、１０％ウシ胎児血清及びＰＳｍを添加したＤＭＥＭで行い、ウイルスストック液は培養細胞を、０．１％ウシ血清アルブミンを添加したＤＭＥＭで２回洗浄後、上記実施例４と同様にＭＯＩ＝０．１で感染させ、感染後４８時間後に培地を回収し０．４５μｍのフィルターでろ過後、分注し、−７０℃で保管した。
検体のウイルス増殖抑制活性は、１２ウェルプレートに９０％の単層が形成された培養細胞を０．１％のウシ血清アルブミンを添加したＤＭＥＭで２回洗浄後、１％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（−）で希釈したウイルスをＭＯＩ＝０．３〜０．５で、室温で６０分間感染させ、感染後、種々の濃度の検体と２．５μｇ／ｍＬのトリプシンを含有する同培地で４−５日培養を行った。培養後、細胞を２．５％クリスタルバイオレット溶液で固定／染色し、ＰＢＳ（−）で３回洗浄／脱色、紫外線下で殺菌乾燥して生存細胞を染色し、細胞の死滅を５０％阻害する被験物質の濃度をＩＣ５０値として求めた。
【００５８】
実施例６．マイコプラズマ増殖抑制活性試験
マイコプラズマの抑制試験は、Ｖｅｒｏ−Ｅ６４細胞（アフリカミドリザル腎細胞）と実験内で分離されたＭ．Ｓａｌｉｖａｒｉｕｍを用いた。６ウェルプレート（コーニング社製）上にＭ．Ｓａｌｉｖａｒｉｕｍが持続的に感染しているＶｅｒｏ細胞に各種濃度の検体を添加し、４８時間後に培地を回収し、それぞれ１０μＬを（Ｐ９）マイコプラズマＰＰＬＯ寒天培地（日研生物医学研究所社製）に塗布し、５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で２日間培養した。１ｍＬ中のマイコプラズマ量をＣＦＵ（コロニー形成単位（Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）」）／ｍＬとして算出し、ＣＦＵを５０％減少させる被検物質のＩＣ５０値（マイコプラズマの増殖を５０％阻害する濃度（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、（μｇ／ｍＬ））を求めた。
【００５９】
実施例７．日本脳炎ウイルス増殖抑制活性試験
日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ，中山株、神戸大医学部微生物学教室より分与された）は、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎細胞）を用い、ダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）に１０％ウシ胎児血清及びＰＳｍを添加した培地を用い、５％ＣＯ２存在下において３７℃で培養した。ウイルスストック液は、９０％単層が形成された培養細胞に、ＭＯＩ＝０．１で感染させ、４８時間後に培養上清を回収した。回収した培養液の上清を、１％ウシ血清アルブミンを加えたＰＢＳ（−）で１０倍階段希釈し、各段階の希釈液０．２ｍＬずつをそれぞれのウエル（６ウエルプレート）に接種した。２５℃で６０分間感染させた後１．０％メチルセルロースを加えたＤＭＥＭ（５％ウシ胎児血清含有）で７日間培養した。培養後、メチルセルロースを取り除き、細胞を２．５％クリスタルバイオレットで染色し、ＰＢＳ（−）で３回洗浄／脱色後、プラーク数を測定した。プラーク数を５０％減少させる検体濃度をＩＣ５０値として求めた。
【００６０】
実施例８．インフルエンザウイルス増殖抑制活性試験
Ａ型インフルエンザウイルス、ＰＲ８株はＡＴＣＣから購入した。ウイルスのプラークアッセイは、ＭＤＣＫ細胞を６ウェルプレート上に１０％牛胎児血清、及び抗生物質を加えたイーグル最小栄養培地（ＭＥＭ）で３７℃、５％ＣＯ２存在下で単層培養を準備した。細胞を０．１％  ＢＳＡ添加ＭＥＭで一回洗浄後、ウイルス原液を０．１％  ＢＳＡを加えたＭＥＭで１０−６倍希釈し、そのうち２００μＬ（約１００ＰＦＵ）をそれぞれのウエルに接種、室温で６０分感染させた。感染後、それぞれ４５℃に保温した等量の２％寒天水溶液と２倍濃度のＭＥＭ（０．２％ＢＳＡ、５０μｇ／ｍＬトリプシン、２００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２００Ｕ／ｍＬペニシリン含有）を混合した培地にそれぞれの濃度に検体を加えたものを細胞上に重層し３日間３７℃で培養した。
培養後、細胞をメタノール：酢酸＝５：１の溶液２ｍＬで固定後、寒天層を取り除き、上述した２．５％クリスタルバイオレット溶液で細胞を染色し、ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、プラーク数を計測し、ウイルス増殖を５０％阻害する被験物質の濃度をＩＣ５０値として求めた。
【００６１】
実施例９．ロタウイルス薬理試験
日本チャールス・リバー社より購入したＬＥＷ／ＣｒｌＣｒｌｊラット（４日齢）にＡＴＣＣより購入したロタウイルスを経口接種し、その１時間後から、実施例１で調製したＰＲＥを１日７０μｇ、毎日、定時に経口投与した。接種７日後の便性状を確認し、下痢発症の有無を確認した。
【００６２】
実施例１０．ＰＲＥのＭｎ−ＳＯＤ誘導活性に及ぼす効果の測定
６ウェルプレートに培養したＶｅｒｏ細胞（１ｗｅｌｌ当たり２．５ｍＬの培地、２×１０６個の細胞、ＡＴＣＣより購入）にＰＲＥを０または１００μｇ／ｍＬ加え、３７℃で培養し、２４時間後に全細胞を０．３ｍＬのポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）サンプルバッファーに回収し、全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。次いで泳動後のゲルをクーマシーブリリアントブルーＲ２５０（ＣＢＢ、シグマアルドリッチ社製）で染色し、その後７％酢酸で脱色した。画像をＣＣＤカメラ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）で撮影し画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェア、Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）により解析した。Ｍｎ−ＳＯＤ誘導の測定は、上述した全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（フッ化ポリビニリデン）膜、ミリポア社製）に転写し、１次抗体としてチューブリン（Ｔｕｂｕｌｉｎ：細胞全タンパク質の増減の指標、サンタクルズ社製）、及びＭｎ−ＳＯＤの抗体（細胞内抗酸化因子、ストレスゲン社製）を用い、２次抗体にはアルカリホスファターゼで標識した抗ウサギ−ヤギ抗体（サンタクルズ社製）を用いＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム塩、ベーリンガー社製）による発色で検出し、免疫ブロットを行った。上記と同様に画像解析から相対的な発現量を測定した。
【００６３】
実施例１１．ＰＲＥのプロアントシアニジン類分析
ＰＲＥのプロアントシアニジン類の分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ，  Ａｇｉｌｅｎｔ  ６１５０  ＬＣＭＳ（液体クロマトグラフ質量分析計、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）により行った。イオン源はＥＳＩ、ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅで観測した。カラムはｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＥＣ−Ｃ１８  φ：３．０×１５０ｍｍ、粒子径：２．７μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）、カラム温度は４０℃、流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎ、Ａ液は０．０５％蟻酸溶液、Ｂ液は０．０５％蟻酸を添加したアセトニトリルを移動相として、Ｂ液の割合を次のように変化させた。０分：５％、１２分：２０％、１５分：７０％、１６分：５％、１７分：５％。カテキン及びエピカテキンはｍ／ｚ＝２８９、シンナムタンニンＢ１及びシンナムタンニンＤ１はｍ／ｚ＝８６３、シンナムタンニンＤ２及びシンナムタンニンＢ２はｍ／ｚ＝１１５１のマスクロマトグラムを得てピーク面積値を定量し、標品により得られた検量線と比較して各物質の濃度を算出した。
【００６４】
実施例１２．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計）による分析
ＣＨＣ（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）を含むマトリックス溶液を用い、ＰＲＥをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ  ｕｌｔｒａｆｌｅｘｔｒｅｍｅ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）を用いて常法により分析した。
【００６５】
実施例１３．標品の調製
カテキン及びエピカテキンはナカライテスク社から、プロシアニジンＣ１、シンナムタンニンＡ２はＰｈｙｔｏＬａｂ  ＧｍｂＨ＆ＣＯ．ＫＧ社から入手した。
クロモジの幹枝２０ｋｇを６０％アセトンで抽出し、抽出液を濃縮後、沈澱を濾別し、濃縮エキス（７２６．２ｇ）を得た。これを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０を充填したカラムに付し、メタノール水溶液を用い、メタノール濃度を０％から１００％まで変えながら通液することにより溶出して画分１（５１ｇ）、画分２（６７ｇ）、画分３（１１１ｇ）及び画分４（２１５ｇ）に分画した。画分３をＭＣＩ−ＧＥＬ  ＣＨＰ−２０Ｐ（三菱化学社製）を充填したカラムに付し、３０％メタノールで溶出して繰り返し精製し、シンナムタンニンＢ２（１．２ｇ）及びシンナムタンニンＤ２（４．５ｇ）を単離精製して標品とした。また、画分３をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０に付し、６０％メタノールで溶出して繰り返し精製し、シンナムタンニンＢ１（４．５ｇ）及びシンナムタンニンＤ１（１３．５ｇ）を単離精製して標品とした。
【００６６】
実施例１４．Ｄｉｏｌカラムを用いたＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ）による分析（ＰＲＥをＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０で分画したものについて分析した）
Ｋｅｌｍらの文献（Ｋｅｌｍ  ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００６，５４（５），ｐ．１５７１−６．ＰＭＩＤ：１６５０６８０２）に記された方法に準じた。すなわち、蛍光検出器を装備したＨＰＬＣ（Ｌａｃｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ，  Ｈｉｔａｃｈｉ社製）により行った。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＷＰ３００  Ｄｉｏｌ  ５μｍ（４．６×２５０ｍｍ）（ＧＬサイエンス社製）、カラム温度は３０℃、流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎ、Ａ液は酢酸：アセトニトリル（２：９８）、Ｂ液は酢酸：水：メタノール（２：３：９５）を移動相として用い、Ｂ液の割合を次のように変化させた。０分：０％、３５分：４０％、４０分：４０％、４５分：０％、５５分：０％。蛍光検出器の励起波長は２７６ｎｍ、測定波長は３１６ｎｍとしてクロマトグラムを得た。Ｋｅｌｍらの文献に示される通り、この条件では、重合度の小さい順に順次、各重合度のプロアントシアニジンが溶出され、各重合度のプロアントシアニジンの存在量を知ることができる。多価イオンの測定のために、Ａ液は酢酸：アセトニトリル（１：９９９）、Ｂ液はメタノール：水：酢酸（９４９：５０：１）を移動相とし、Ｂ液の割合を上記と同様に変化させ、前述のカラムの後にミキサーを接続し、水を０．５ｍＬ／ｍｉｎにて混合し、それを質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ  ６１５０、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）に接続して測定を行った。
【００６７】
実施例１５．クロモジの幹枝に１０倍重量の３３％または６６％のエタノール水溶液を加えて抽出し、減圧乾固してクロモジエタノール抽出物を得た。
【００６８】
＜結果及び考察＞
［１］クロモジプロアントシアニジン（ＰＲＥ）のウイルス・マイコプラズマ増殖抑制活性
クロモジ抽出物からＡＣＤシリカ充填カラムを利用してクロモジプロアントシアニジン（ＰＲＥ）を得た（実施例１）。これについて、培養細胞系を用いた増殖抑制活性試験を行った（実施例４〜８）。ＰＲＥは、ロタウイルス、ネコカリシウイルス、日本脳炎ウイルス、インフルエンザウイルス、及びマイコプラズマについて、３０μｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０を示し、増殖抑制活性を示した（表１）。
【００６９】
【表１】
2018118959.tif 000012
【００７０】
また、クロモジの熱水抽出物からＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムを用いて、プロアントシアニジン濃縮物を得た（実施例２）。この濃縮物について、同様に増殖抑制活性試験を行った結果（実施例４〜７）、日本脳炎ウイルス以外については、実施例１で得られたＰＲＥよりは活性が低いものの、ロタウイルス、ネコカリシウイルス、日本脳炎ウイルス及びマイコプラズマについて、３０μｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０を示し、活性が認められた（表２）。
【００７１】
【表２】
2018118959.tif 000013
【００７２】
[２]クロモジ抽出物のウイルス増殖抑制活性
クロモジ熱水抽出物及びクロモジエタノール抽出物を得て（実施例２）、この抽出物について、同様に増殖抑制活性試験を行った結果（実施例４（ネコカリシウイルス）、実施例８（インフルエンザウイルス））、１００ μｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０を示し、増殖抑制活性が認められた（表３及び表４）。
【００７３】
【表３】
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【００７４】
【表４】
2018118959.tif 000015
【００７５】
［３］ＰＲＥ中のプロアントシアニジンの各成分の定量
ＰＲＥ中の各種プロアントシアニジンについて、個別に定量を行った（実施例１１）。その結果、これらのプロアントシアニジンがＰＲＥ中に含まれていることが明らかになった（表５）。
【００７６】
【表５】
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【００７７】
プロアントシアニジン類の結合様式とカテキン又はエピカテキン単位の区別について纏めて表６に示す。
【００７８】
【表６】
2018118959.tif 000017
【００７９】
プロアントシアニジン類の構造を、化学式（ＶＩＩ）〜（ＶＩＩＩ）：
【化１１】
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【化１２】
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に示す。
【００８０】
［４］ＰＲＥのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ解析
クロモジから抽出精製したＰＲＥを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより確認した（実施例１１）。図１に示すように、３量体から１１量体のピークが得られた。例えば３量体のシンナムタンニンＢ１、シンナムタンニンＤ１（いずれもモノアイソトピック質量は８６４．２）のナトリウム付加イオンｍ／ｚ＝８８７．２がピークとして検出されている。また、例えば、４量体のシンナムタンニンＢ２、シンナムタンニンＤ２（いずれもモノアイソトピック質量は１１５２．３）のナトリウム付加イオンｍ／ｚ＝１１７５．３がピークとして検出されている。同様に５〜１１量体について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより得られた実測値は、予想される分子式から計算される理論値とよく一致する（表７）。
【００８１】
【表７】
2018118959.tif 000020
【００８２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトル（図１）の主要ピークの質量の差は２８８で、フラバン−３−オール単位が、一カ所、炭素−炭素結合して重合している、構造の差異に相当する。ＬＣＭＳ分析で、３量体のシンナムタンニンＢ１及びシンナムタンニンＤ１、並びに、４量体のシンナムタンニンＢ２及びシンナムタンニンＤ２が検出されていることを合わせて考えると、４位と８位の炭素−炭素結合に加えて２位と７位との間でエーテル結合している結合様式を一カ所含む、これら４つの分子（シンナムタンニンＢ１、シンナムタンニンＤ１、シンナムタンニンＢ２及びシンナムタンニンＤ２）に、フラバン−３−オール単位が一カ所、炭素−炭素結合する様式で、順次、同様に結合した重合体（即ち、化学式（ＶＩ）：
【化１３】
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（式中、ｎ＝０〜７を表す。）で表されるＡ型のプロアントシアニジン）が、ＰＲＥには含まれていることが確認された。
【００８３】
［５］標品のウイルス増殖抑制活性試験
ＰＲＥに含まれている物質についてウイルス増殖抑制活性を確認するため、実施例１３により用意した、表８の標品に関して、ロタウイルス、ネコカリシウイルス及びインフルエンザウイルスについて、増殖抑制活性試験を行った。その結果、ロタウイルスについてはシンナムタンニンＢ１及びシンナムタンニンＢ２、並びに、ネコカリシウイルスについてはシンナムタンニンＢ１について強いウイルス増殖抑制活性が認められた。また、インフルエンザウイルスに対してはシンナムタンニンＤ１及びシンナムタンニンＤ２に強いウイルス増殖抑制活性が認められた。
【００８４】
【表８】
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【００８５】
［６］ゲルろ過カラムを用いた、ＰＲＥの重合度別濃縮
他、重合度が５以上などのプロアントシアニジン類についてのウイルス増殖抑制活性を検討するために、ＰＲＥを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０充填カラムによって分画した（実施例３）。その結果、ロタウイルス及びネコカリシウイルスに対してはＦ１０及びＦ１１画分、並びにインフルエンザウイルスに対してはＦ１１画分に特に高いウイルス増殖抑制活性が確認された（表９）。
【００８６】
【表９】
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【００８７】
表９の各画分の内、Ｆ７−８画分、Ｆ９画分、Ｆ１０画分、Ｆ１１画分及びＦ１２−１４画分について、Ｄｉｏｌカラムを用いたＨＰＬＣによって分析した（実施例１４）。図２に示すように、活性の高い画分のＦ１０画分及びＦ１１画分は、５量体、６量体、７量体、８量体、９量体、及び、１０量体の重合体を含むことが確認された。その内、５量体、６量体、及び、７量体については、ＬＣＭＳによってもその多価イオンのピーク（それぞれ、［Ｍ−２Ｈ］２−：ｍ／ｚ＝７１９、［Ｍ−２Ｈ］２−：ｍ／ｚ＝８６３、及び、［Ｍ−２Ｈ］２−：ｍ／ｚ＝１００７）が確認された。
【００８８】
［７］ロタウイルス薬理試験
ＬＥＷ／ＣｒｌＣｒｌｊラットにロタウイルスを経口接種し、感染後、ＰＲＥを毎日投与した（実施例９）。その結果、接種７日後、ＰＲＥを投与しなかった群では９匹中９匹が下痢を発症した。それに対して、ＰＲＥを投与した群では９匹中１匹のみが下痢を発症した。ＰＲＥ投与により、ロタウイルスによる下痢症状は抑制された。ＰＲＥの個体レベルにおけるウイルス増殖抑制活性及びロタウイルス性疾患の症状である下痢を改善する作用が確認された。
【００８９】
［８］作用機序の解析：Ｍｎ−ＳＯＤ発現解析
作用機序を解明するために、アフリカミドリザル由来Ｖｅｒｏ細胞の培養液中にＰＲＥを添加して２４時間培養し、細胞よりタンパク質を抽出してウエスタンブロットにより、Ｍｎ−ＳＯＤ（マンガンスーパーオキシドジスムターゼ）の存在量を定量した。このウエスタンブロットの画像を解析して、バンドの濃さを数値化し、チューブリンのバンドの濃さで標準化して、Ｍｎ−ＳＯＤの発現量変化を算出した（実施例１０）。その結果、ＰＲＥ処理によりＭｎ−ＳＯＤ存在量は１．２５倍に増加することが確認された。一般にウイルスの宿主細胞における増殖の過程では、感染したウイルスにより誘導された活性酸素種が重要な役割を果たす場合があることが知られており、ＰＲＥはそれを無毒化するＭｎ−ＳＯＤの発現を誘導することにより、ウイルスの増殖を抑制することが示唆された。
【００９０】
実施例１６．＜組成物配合処方例＞
以下、本発明の実施例１より得られたＰＲＥ、実施例２より得られたクロモジ熱水抽出物、実施例３より得られたＦ１１画分、又はクロモジ粉末を含有する組成物を製造した。各成分の混合割合は質量％である。
１．アルコール飲料
５０容量％エタノール  ３２．０％
砂糖                    ６．０％
香料                    ０．２％
ＰＲＥ                  ０．１％
水                    ６１．７％
２．ジュース
果汁                    ５．０％
果糖ブドウ糖液糖        １．０％
香料                    ０．２％
ＰＲＥ                  ０．１％
クエン酸                 ０．２％
水                    ９３．５％
３．飴
砂糖                  ５５．０  ％
水飴                  ２９．６５％
香料                    ０．２５％
水                    １５．０  ％
クロモジ熱水抽出物      ０．１  ％
４．錠菓
砂糖                  ７４．７％
グルコース            ２０．０％
香料                    ０．１％
Ｆ１１画分              ０．１％
Ｌ‐アスコルビン酸      ０．１％
水                      ５．０％
５．ヨーグルト飲料
発酵乳                １５．０％
果糖ブドウ糖液糖      １５．０％
乳酸                    １．０％
香料                    ０．１％
ＰＲＥ                  ０．１％
水                    ６８．８％
６．グミキャンディー
果汁                  ３０．０％
ゼラチン                ９．０％
砂糖                  ２５．０％
クロモジ粉末            １．０％
水                    ３５．０％
７．スプレー
エタノール            ２５．０％
香料                    １．０％
クロモジ熱水抽出物      ０．１％
水                    ７３．９％
８．うがい薬
エタノール                １．０％
香料                       ０．１％
セチルピリジニウム塩化物  ０．２５％
クロモジ熱水抽出物        ０．１％
水                      ９８．５５％
９．チューインガム
ガムベース             ２５．０％
キシリトール           ３５．０％
水飴                   ３８．０％
香料                    １．０％
クロモジ熱水抽出物      １．０％
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明のクロモジ抽出成分含有抗微生物用組成物は、冬季を中心に深刻な集団感染を引き起こす感染性下痢症の原因であるノロウイルス、感染力が極めて高く感染予防が困難である感染性下痢症のもう一つの主要な原因であるロタウイルス、冬季を中心に集団感染を引き起こすインフルエンザウイルス、及び冬季に流行する肺炎の病原体として重要なマイコプラズマに対する増殖抑制活性を有する食品、医薬、飼料、及び衛生用品への利用が期待される。
【図１】
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【図２】
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