(57)【要約】      （修正有）【課題】睡眠効率の悪化抑制作用、睡眠困難改善作用、睡眠のＱＯＬの項目に基づく睡眠の改善作用、及び総覚醒回数の維持による中途覚醒増加の抑制作用を有するカキ肉エキスの提供。【解決手段】カキ肉から抽出された抽出物に含まれる３，５−ジヒドロキシ−４−メトキシベンジルアルコールを有効成分とするカキ肉エキス。生の状態では前記有効成分が検出されない生ガキ肉を、加熱することにより生成した前記化合物を有効成分とするカキ肉エキス。生ガキ肉を８０℃以上で３時間以上、好ましくは９８〜１００℃で６時間以上加熱処理したカキ肉エキス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カキ肉から抽出された抽出物に含有する3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分とする、
ことを特徴とする睡眠効率の悪化抑制作用と睡眠困難改善作用、ＱＯＬの睡眠の項目に基づく睡眠の改善、総覚醒回数の維持による中途覚醒増加の抑制を有するカキ肉エキス。
【請求項２】
生の状態では3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)が検出されない生ガキ肉を、加熱することにより、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を前記加熱処理したカキ肉液より生成し、前記生成された3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分とする、
ことを特徴とする睡眠効率の悪化抑制作用と睡眠困難改善作用、ＱＯＬの睡眠の項目に基づく睡眠の改善、総覚醒回数の維持による中途覚醒増加の抑制を有するカキ肉エキス。
【請求項３】
生の状態では3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)が検出されない生ガキ肉を、破砕し、その破砕物を後３時間以上、８０℃以上で加熱することにより、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を前記加熱処理したカキ肉液より生成し、前記生成された3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分とする、
ことを特徴とする睡眠効率の悪化抑制作用と睡眠困難改善作用、ＱＯＬの睡眠の項目に基づく睡眠の改善、総覚醒回数の維持による中途覚醒増加の抑制を有するカキ肉エキス。
【請求項４】
生の状態では3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)が検出されない生ガキ肉を、６時間以上、９８℃乃至１００℃で加熱することにより、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を前記加熱処理したカキ肉液より生成し、前記生成された3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分とする、
ことを特徴とする睡眠効率の悪化抑制作用と睡眠困難改善作用、ＱＯＬの睡眠の項目に基づく睡眠の改善、総覚醒回数の維持による中途覚醒増加の抑制を有するカキ肉エキス。
【請求項５】
生の状態では3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)が検出されない生ガキ肉を、少なくとも９時間以上、９０℃以上で加熱することにより、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を前記加熱処理したカキ肉液より生成し、前記生成された3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分とする、
ことを特徴とする睡眠効率の悪化抑制作用と睡眠困難改善作用、ＱＯＬの睡眠の項目に基づく睡眠の改善、総覚醒回数の維持による中途覚醒増加の抑制を有するカキ肉エキス。
【請求項６】
生の状態では3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)が検出されない生ガキ肉を、抽出溶液内に入れてカキ肉エキスを抽出し、抽出したカキ肉エキス抽出液を１気圧の状態で少なくとも１０時間以上、９０℃以上で加熱することにより、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を前記加熱したカキ肉抽出液より生成し、前記生成された3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分とする、
ことを特徴とする睡眠効率の悪化抑制作用と睡眠困難改善作用、ＱＯＬの睡眠の項目に基づく睡眠の改善、総覚醒回数の維持による中途覚醒増加の抑制を有するカキ肉エキス。
【請求項７】
生の状態では3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)が検出されない生ガキ肉を、１気圧以上の加圧状態で加熱することにより、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を前記加圧状態で加熱したカキ肉液より生成し、前記生成された3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分とする、
ことを特徴とする睡眠効率の悪化抑制作用と睡眠困難改善作用、ＱＯＬの睡眠の項目に基づく睡眠の改善、総覚醒回数の維持による中途覚醒増加の抑制を有するカキ肉エキス。
【請求項８】
生の状態では3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)が検出されない生ガキ肉を、３気圧以上の加圧状態で少なくとも１時間以上、９０℃以上で加熱することにより、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を前記加圧状態で加熱したカキ肉液より生成し、前記生成された3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分とする、
ことを特徴とする睡眠効率の悪化抑制作用と睡眠困難改善作用、ＱＯＬの睡眠の項目に基づく睡眠の改善、総覚醒回数の維持による中途覚醒増加の抑制を有するカキ肉エキス。
【請求項９】
酢酸エチルを用いてカキ肉から3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)分画を回収し、該回収した3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分とする、
ことを特徴とする睡眠効率の悪化抑制作用と睡眠困難改善作用、ＱＯＬの睡眠の項目に基づく睡眠の改善、総覚醒回数の維持による中途覚醒増加の抑制を有するカキ肉エキス。
【請求項１０】
酢酸エチルとエタノールを用いてカキ肉から3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)分画を回収し、該回収した3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分とする、
ことを特徴とする睡眠効率の悪化抑制作用と睡眠困難改善作用、ＱＯＬの睡眠の項目に基づく睡眠の改善、総覚醒回数の維持による中途覚醒増加の抑制を有するカキ肉エキス。
【請求項１１】
抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液に酢酸エチルを加えて、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)分画を回収し、該回収した3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分とする、
ことを特徴とする睡眠効率の悪化抑制作用と睡眠困難改善作用、ＱＯＬの睡眠の項目に基づく睡眠の改善、総覚醒回数の維持による中途覚醒増加の抑制を有するカキ肉エキス。
【請求項１２】
抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液に酢酸エチルとエタノールを加えて、3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)分画を回収し、該回収した3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分とする、
ことを特徴とする睡眠効率の悪化抑制作用と睡眠困難改善作用、ＱＯＬの睡眠の項目に基づく睡眠の改善、総覚醒回数の維持による中途覚醒増加の抑制を有するカキ肉エキス。
【請求項１３】
抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液にエタノールを加えて、上澄み液と沈殿物とに分離し、前記分離された上澄み液を取り出すとともに、該上澄み液に酢酸エチルを加えて、酢酸エチル層と水層とに分離し、
分離した酢酸エチル層の溶液を揮発させ、濃縮して3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)分画を回収し、該回収した3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)を有効成分とする、
ことを特徴とする睡眠効率の悪化抑制作用と睡眠困難改善作用、ＱＯＬの睡眠の項目に基づく睡眠の改善、総覚醒回数の維持による中途覚醒増加の抑制を有するカキ肉エキス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はカキ肉より抽出された3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol：以下、Ｅ６と称する)を有効成分とした睡眠効率の悪化抑制作用と睡眠困難改善作用、ＱＯＬの睡眠の項目に基づく睡眠の改善、総覚醒回数の維持による中途覚醒増加の抑制を有するカキ肉エキスに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年において、日頃より、たえず疲労感を感じ、そして睡眠に問題を抱えている現代人が増加しているといわれている。
すなわち、睡眠の質や入眠時間、睡眠時間、日中覚醒困難について次第に悪化していると言われているのである。
【０００３】
ところで、活性酸素の生成は好気性の生活に起因し、脂質、タンパク質、核酸の酸化を生じ、細胞に障害を与えることが一般に知られている。
通常、生体の酸化レベルは活性酸素産生系と抗酸化物質による消去系のバランスでほぼ一定に保たれているが、薬物、放射線、虚血などの様々な要因によりこのバランスが崩れ、活性酸素産生系へ傾くのが酸化ストレスといわれている。
【０００４】
この酸化ストレスの蓄積が、がん、動脈硬化性疾患、虚血/再灌流障害、慢性関節リウマチ、糖尿病、アルツハイマー病やパーキンソン病の神経障害などの様々な疾患や老化の一因であると考えられているのである。
【０００５】
いわゆる抗酸化物質は構造から大きく二群に分類される。酵素性抗酸化物質としては、スーパーオキシドジスムターゼ(superoxidedismutase、ＳＯＤ)、カタラーゼ(catalase、ＣＡＴ)、グルタチオンペルオキシダーゼ(glutathioneperoxidase、ＧＰｘ)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(glutathioneS-transferase、ＧＳＴ)、グルタチオンリダクターゼ(glutathionereductase)、ペルオキシレドキシン(peroxiredoxin、Ｐｒｘ)などが挙げられる。一方、非酵素性抗酸化物質としては、アスコルビン酸(ascorbicacid)、α-トコフェロール(α-tocopherol)、グルタチオン(glutathione、ＧＳＨ)、カロテノイド(carotenoids)、フラボノイド(flavonoids)、メタロチオネイン(metallothionein)などを含む。
【０００６】
ここで、カキ、たとえばマガキ(Crassostrea gigas)はウグイスガイ目イタボガキ科に属する二枚貝で、その生息地は日本を初めとして東アジア全域に及んでいる。近年では、フランスやオーストラリアでもマガキが養殖されており、世界で最も食用に供さるカキとして名高い。
【０００７】
カキは、栄養価が高いことから古代より食用にされてきたが、前述したとおりグリコーゲンやタンパク質のほか、カルシウム、亜鉛、セレニウム、銅、マンガンなどのミネラルを多量に含むといわれている。
【０００８】
また、カキ由来の抗酸化物質として報告されているのは、酵素性抗酸化物質としてＳＯＤ、ＣＡＴ、ＧＰｘ、及びＰｒｘ６があり、非酵素性抗酸化物質としてはメタロチオネイン、uncouplingprotein5(ＵＣＰ５)、アスコルビン酸、α-トコフェロール、β-カロテンがあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１０−１９３７５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかして、本件発明の発明者らは、既に、カキ、特にマガキ軟体部からの優れた新規抗酸化物質を見出すことに成功し、さらにその化学構造を決定し、なおかつ前記抗酸化物質の化学合成を行うことにも成功し、そして、カキに由来しない、あるいはカキに由来する場合の双方での優れたいわゆる新規抗酸化剤及び抗酸化剤組成物の提供が行えることにも成功している。
【００１１】
さらに、ヒト低比重リポ蛋白（low-densitylipoproteins、ＬＤＬ)の酸化実験と、肝臓の株化細胞の酸化実験における当該物質の抗酸化能をも確認している。
【００１２】
かくして、今回は、前記マガキ軟体部から抽出したカキ肉エキスに、Ｅ６を有効成分とした睡眠効率の悪化抑制作用と睡眠困難改善作用、ＱＯＬの睡眠の項目に基づく睡眠の改善、総覚醒回数の維持による中途覚醒増加の抑制を見出すことに成功したものである。
【００１３】
よって、本発明は前記の様にして、マガキ軟体部から抽出したカキ肉抽出液より、Ｅ６を有効成分として含む睡眠効率の悪化抑制作用と睡眠困難改善作用、ＱＯＬの睡眠の項目に基づく睡眠の改善、総覚醒回数の維持による中途覚醒増加の抑制を有するカキ肉エキスを生成して提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明による睡眠効率の悪化抑制作用と睡眠困難改善作用、ＱＯＬの睡眠の項目に基づく睡眠の改善、総覚醒回数の維持による中途覚醒増加の抑制を有するカキ肉エキスは、
カキ肉から抽出された抽出物に含有するＥ６を有効成分とする、
ことを特徴とし、
または、
生の状態ではＥ６が検出されない生ガキ肉を、加熱することにより、Ｅ６を前記加熱処理したカキ肉液より生成し、前記生成されたＥ６を有効成分とする、
ことを特徴とし、
または、
生の状態ではＥ６が検出されない生ガキ肉を、破砕し、その破砕物を後３時間以上、８０℃以上で加熱することにより、Ｅ６を前記加熱処理したカキ肉液より生成し、前記生成されたＥ６を有効成分とする、
ことを特徴とし、
または、
生の状態ではＥ６が検出されない生ガキ肉を、６時間以上、９８℃乃至１００℃で加熱することにより、Ｅ６を前記加熱処理したカキ肉液より生成し、前記生成されたＥ６を有効成分とする、
ことを特徴とし、
または、
生の状態ではＥ６が検出されない生ガキ肉を、少なくとも９時間以上、９０℃以上で加熱することにより、Ｅ６を前記加熱処理したカキ肉液より生成し、前記生成されたＥ６を有効成分とする、
ことを特徴とし、
または、
生の状態ではＥ６が検出されない生ガキ肉を、抽出溶液内に入れてカキ肉エキスを抽出し、抽出したカキ肉エキス抽出液を１気圧の状態で少なくとも１０時間以上、９０℃以上で加熱することにより、Ｅ６を前記加熱したカキ肉抽出液より生成し、前記生成されたＥ６を有効成分とする、
ことを特徴とし、
または、
生の状態ではＥ６が検出されない生ガキ肉を、１気圧以上の加圧状態で加熱することにより、Ｅ６を前記加圧状態で加熱したカキ肉液より生成し、前記生成されたＥ６を有効成分とする、
ことを特徴とし、
または、
生の状態ではＥ６が検出されない生ガキ肉を、３気圧以上の加圧状態で少なくとも１時間以上、９０℃以上で加熱することにより、Ｅ６を前記加圧状態で加熱したカキ肉液より生成し、前記生成されたＥ６を有効成分とする、
ことを特徴とし、
または、
酢酸エチルを用いてカキ肉からＥ６分画を回収し、該回収したＥ６を有効成分とする、
ことを特徴とし、
または、
酢酸エチルとエタノールを用いてカキ肉からＥ６分画を回収し、該回収したＥ６を有効成分とする、
ことを特徴とし、
または、
抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液に酢酸エチルを加えて、Ｅ６分画を回収し、該回収したＥ６を有効成分とする、
ことを特徴とし、
または、
抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液に酢酸エチルとエタノールを加えて、Ｅ６分画を回収し、該回収したＥ６を有効成分とする、
ことを特徴とし、
または、
抽出用溶液が貯留された抽出容器にカキ肉を収納してカキ肉抽出物入り溶液を採取し、採取されたカキ肉抽出物入り溶液にエタノールを加えて、上澄み液と沈殿物とに分離し、前記分離された上澄み液を取り出すとともに、該上澄み液に酢酸エチルを加えて、酢酸エチル層と水層とに分離し、
分離した酢酸エチル層の溶液を揮発させ、濃縮してＥ６分画を回収し、該回収したＥ６を有効成分とする、
ことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、カキ肉の抽出物から抽出したＥ６を有効成分とする睡眠効率の悪化抑制作用と睡眠困難改善作用、ＱＯＬの睡眠の項目に基づく睡眠の改善、総覚醒回数の維持による中途覚醒増加の抑制を有するカキ肉エキスを提供できるとの優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実験１による被験者の分類と内訳を説明する表である。
【図２】本発明の実験１による有効性解析対象者の背景を説明する表である。
【図３】本発明の実験１によるＡＩＳの合計点を説明する表である。
【図４】本発明の実験１によるＰＳＱＩ―Ｊの数値を説明する表である。
【図５】本発明の実験１によるＰＳＱＩ―Ｊの数値（５０歳未満の被験者層）を説明する表である。
【図６】本発明の概略構成を示す概略構成説明図（１）である。
【図７】本発明の概略構成を示す概略構成説明図（２）である。
【図８】本発明のフローチャートを説明する説明図である。
【図９】Ｅ６抽出のための有機溶媒の極性を段階的に高めていく状態を説明する説明図である。
【図１０】各抽出物の抗酸化活性試験の結果を示す説明図である。
【図１１】シリカオープンカラムによる抽出を説明する説明図である。
【図１２】酢酸エチル分画抽出を説明する説明図である。
【図１３】本発明により抽出されたＥ６の構造を説明する説明図である。
【図１４】ORAC法の測定原理を説明する説明図である。
【図１５】本発明によるＥ６の抗酸化能を説明する説明図である。
【図１６】本発明によるＥ６の構造解析を説明する説明図（１）である。
【図１７】本発明によるＥ６の構造解析を説明する説明図（２）である。
【図１８】本発明の実験２による有効性解析対象被験者の背景を説明する表である。
【図１９】本発明の実験２による脳波及びＯＳＡ−ＭＡ有効性解析対象被験者の背景を説明する表である。
【図２０】本発明の実験２によるＱＯＬ調査票を説明する表である。
【図２１】本発明の実験２による脳波（中途覚醒と睡眠効率）を説明する表である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を図に示す一実施例に基づいて説明する。
【実施例１】
【００１８】
図６、図７において、符号１は、抽出容器であり、該抽出容器１内には、カキ肉から抽出物を抽出するための抽出用溶液２が貯留される。そして、該抽出用溶液２が貯留されている抽出容器１内に生ガキ肉３を収納し、カキ肉の各種有効成分を含有する抽出物を抽出する工程が行われる。
【００１９】
ところで、従来では、カキ肉抽出物抽出時に、抽出容器１内のカキ肉３が収納された抽出用溶液２を攪拌し、抽出をより効率化することが従来行われていたことがあったが、カキ肉３自体を痛めることにもなり、この抽出工程時点での攪拌作業は行わない方が好ましい。
【００２０】
前述のようにしてカキ肉抽出物が抽出された抽出用溶液２を次は濃縮工程によって濃縮されるものとなる。
【００２１】
次に、この濃縮液６に、エタノール溶液４を加え、７０％程度のエタノール濃度の溶液とする。その後、攪拌すると共に、沈殿物７と上澄み液８とに分離する。
そして、図６から理解されるように、沈殿物７は乾燥させ、打錠し、最終的に健康食品などに供される。
【００２２】
ところで、従来では前記上澄み液８は、何らカキ肉抽出物の有効成分が入っていない、あるいは入っていてもきわめて微量であるとして廃棄していたことがある。しかし、その後、実験や研究の結果、この上澄み液８内にもカキ肉抽出物に関する多くの有効成分が存在していることが判明し、現在ではこの上澄み液８も廃棄することなく利用している。
【００２３】
近年では、この上澄み液８を再度濃縮するとともに、その濃縮液を最終的に乾燥させる。そして、その乾燥物は、完全な固形物状にはならないが、ペースト状には形成することができ、もってペースト状の健康食品とするなどして製造している。そして、このペースト状の健康食品は、需要者側において白湯などで溶いて飲料用健康食品に供されるのである。
【００２４】
まず、本実施例では、前記の上澄み液８を使用して後述するＥ６入りのカキ肉抽出物を回収するものである。
【００２５】
すなわち、前記のごとく沈殿物７と上澄み液８に分離した後、該上澄み液８につき、まず、エバポレータなどで前記上澄み液８のエタノール分を除去し、約半分の量になるまで濃縮する。
たとえば４０ｍＬ分の上澄み液８を濃縮して２０ｍＬの上澄み液８の濃縮液９を確保するがごときである。
【００２６】
次いで、その２０ｍＬの濃縮液を約５倍になるよう希釈して希釈液１０を生成する。たとえば１００ｍＬの希釈液１０の量にするがごときである。このような工程を経るのはなるべく不純物を除去するためである。
【００２７】
その後、たとえばこの１００ｍＬの希釈液１０の溶液に、たとえば酢酸エチル５を２００ｍＬ程度投入する。そして、その後攪拌するなどして、あるいは分離器を使用して水層１０ａと酢酸エチル層１１とに分離させる。すると、時間の経過と共に、この混合溶液は、水層１０ａ、そして酢酸エチル層１１とに分離して形成されるものとなる。
【００２８】
そして、分離した酢酸エチル層１１の溶液を揮発させ、濃縮すると、該酢酸エチル層１１内に後述するＥ６が存在していることが確認できた。
【００２９】
ここで、その確認できたＥ６の量であるが、具体的には、約２Ｌ分収集した酢酸エチル層１１から約３ｍｇのＥ６があることが確認できた。
【００３０】
次に、前記Ｅ６がどの様な工程でカキ肉抽出物から分離精製でき、もってカキ肉抽出物内での存在が確認できたのか、またＥ６はどのような構造から構成されているのか、さらにはＥ６の抗酸化作用がどの様に確認できたのかなどを以下に説明する。
【００３１】
まず、図８に示すフローチャートに従って説明する。
たとえば、エタノール溶液４を含んだ抽出用溶液２内にカキ肉３を投入してカキ肉有効成分抽出物の抽出を行なう（ステップ１００、ステップ１０２）。
【００３２】
抽出後はその抽出液を濃縮する（ステップ１０４）。そして、該濃縮液６にたとえば、エタノール溶液４を加え、７０％程度のエタノール濃度の溶液とする（ステップ１０６）。その後、攪拌し、沈殿物７と上澄み液８とに分離する（ステップ１０８）。
【００３３】
そして、前記上澄み液８を用い、Ｅ６抽出のための酢酸エチルを用いた抽出作業を行う。
【００３４】
図８から理解されるように、前記エタノール分をなくし（ステップ１１０）、かつ約５倍に希釈した上澄み液８におのおのヘキサンからクロロホルム、酢酸エチル、そしてブタノールを投入し、おのおのの分画を生成する。
例えば、ロータリーエバポレーターなどで１００ｍＬまで濃縮し、該濃縮液２０ｍＬに例えば蒸留水８０ｍＬを加えて分液ロートに移し、ヘキサン抽出を行う。
【００３５】
ヘキサン層(２００ｍＬ)を除去後に、水層からクロロホルム２００ｍＬ、酢酸エチル２００ｍＬ、ブタノール２００ｍＬの順で段階的に抽出する。
【００３６】
すなわち、Ｅ６抽出のための有機溶媒の極性を段階的に高めていってそれらをそれぞれ投入した分画を生成し、おのおのの分画にＥ６が抽出されているかを確認する（図９参照）。
【００３７】
次いで、前記それぞれの有機溶媒を投入した分画をたとえばエバポレータで濃縮した後、Thin-Layer-Chromatography（以下、ＴＬＣと称する。ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー）により観察すると共に、いわゆるＯＲＡＣ法（OxygenRadicalAbsorbanceCapacity法）による抗酸化力の検索を行うのである。
【００３８】
すると、その結果、ＴＬＣ像では、ヘキサンからクロロホルム、酢酸エチル、そしてブタノールにかけて極性の低いものから高いものへと溶出されていくことが確認できた。
【００３９】
また、ＯＲＡＣ法により酢酸エチル分画においてプラトーの部分が観察されて、当該酢酸エチル分画に高い抗酸化能が認められ、よって、この酢酸エチル分画にＥ６が存在していると判断されるのである（図１０参照、図８のステップ１１２）。
【００４０】
次いで、この酢酸エチル分画をエバポレータによりやはり濃縮した後、いわゆるシリカオープンカラムによる抽出を行い（図１１、図８のステップ１１６）、酢酸エチル：クロロホルムが３：２の割合での抽出分画を選択し（図１２参照）、最終的にその分画をＨＰＬＣ（逆相カラム）によって、Ｅ６を分離精製することができたのである（ステップ１１６）。
【００４１】
このように、カキ肉抽出物を抽出した上澄み液８からＥ６を分離精製することができた。
【００４２】
なお、以下の操作によってもＥ６を分離精製することができる。
【００４３】
まず、0.075mol/Lリン酸緩衝液2.35mL、6.3x10-7mol/L Fluorescein(蛍光プローブ)0.3mL、7％(w/v)methylatedβ-cyclodextrin(Wako)の混合溶液に溶解したトロロックス(Wako)または被験試料0.05mLを37℃で10分間加温する。
【００４４】
予め37℃に加温した1.28x10-1mol/L
2、2’-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride(AAPH、Wako)0.3mLを加え、例えばスターラ―で撹拌しながら、分光蛍光光度計(FP-6500、JASCO、東京)で10秒おきに5,000秒まで蛍光強度(励起波長493nm、蛍光波長515nm)を測定する。
【００４５】
抗酸化活性は測定開始時点の蛍光測定値（例えば図１０中の縦軸）が維持される時間（同横軸）の長さで示され、その時間が長いほど抗酸化活性が強いことを意味するものである。
【００４６】
すると、やはり前記４種類の抽出画分の中では酢酸エチル抽出画分に抗酸化活性が確認された。
【００４７】
次いで、抗酸化活性が示された酢酸エチル抽出物について順相のシリカゲル薄層分取クロマトグラフィーを行う。シリカゲル薄層プレート（２００×２００ｍｍ、厚さ０．５ｍｍ、Merck、Darmstadt）を用い、移動相として酢酸エチル-クロロホルム(2:1、v/v)を用いた。展開後のプレートに紫外線ランプ（２５４ｎｍ）を照射し、紫外線吸収性の１１画分を得た。各画分の試料をゲル担体とともに分離し、例えばメタノールで溶出後に抗酸化活性を測定すると、低極性側から６番目の画分に抗酸化活性が観察された。
【００４８】
さらに、前記薄層クロマトグラフィーで抗酸化活性を示した画分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製する。ＨＰＬＣシステム（ポンプ：L-2130、UV検出器：L-2420、HITACHI、東京）、逆相カラム(APCELLPACC18、250×4.6mmI.D.、SHISEIDO、東京)、及び移動相５％アセトニトリル水溶液（流速1.0mL/min）を使用して室温で分離した。
【００４９】
しかして、この操作によっても原料の１６０ｍＬエタノール抽出液から最終的にＥ６ 3.0ｍｇが得られるものとなった。
【００５０】
ところで、前記Ｅ６の存在は、紫外線吸収スペクトル（V-530、JASCO）、核磁気共鳴スペクトル（NMR：AMX-500、Bruker、Karlsruhe）、マススペクトル（JMS-T100CS、JEOL、東京）を測定して、構造解析を行い（図１６、図１７）、その結果、前記の分離精製物の構造が、Ｅ６と推定されるのである。
【００５１】
条件
UV（EtOH）、λmax270nm；1H-NMR(500MHz、Acetone-d6)δH:7.82(2H、br.s、aromatic-OH)、6.40(2H、s、H-2、6)、4.42(2H、s、H-1’)、3.94(1H、br.s、-OH)、3.79(3H、s、-OMe)；13C-NMR(125MHz、Acetone-d6)δC:151.1(C-3、5)、139.4(C-1)、13、5.1(C-4)、106.5(C-2、6)、64.5(C-1’)、60.6(-OMe)；ESI-TOFMS、m/z153.05451[M-OH]+(calc.forC8H8O3、153.05517)、171.06911[M+H]+(calc.forC8H11O4、171.06573)。
【００５２】
ここで、分離精製されたＥ６の性状を説明すると、その性状は黄淡色の粉末で、脂溶性及び水溶性を示している。
【００５３】
また、当該Ｅ６は、図１３に示すようなフェノール性化合物であることが確認された。
【００５４】
本実施例では、ＯＲＡＣ法により抗酸化力を測定することとしている。
【００５５】
ところで、日本ではすでにＯＲＡＣ法の公定法化の研究を行う研究会(AntioxidantUnit研究会)が出来ている。ＯＲＡＣ法の利点としては水溶性、脂溶性のどちらのサンプルも測定でき、前述したどの有機溶媒分画も測定できることがあげられる。
また一回の測定で抗酸化作用の持続時間とその力価を合わせて評価でき、実験操作が容易であるなどから本実施例での測定に有利であったと考える。
【００５６】
ここで、ＯＲＡＣ法の測定原理について若干説明する。まず、一定の活性酸素種を発生させ、それによって分解される蛍光強度を測定し、経時的に減少する蛍光強度の曲線を描いた場合、この反応系に抗酸化物質が共存すると蛍光物質の蛍光強度の減少速度が遅延する。よって、この原理により抗酸化物質の存在が確認できるものとなるのである（図１４参照）。
【００５７】
しかして、本発明におけるＥ６を前記ＯＲＡＣ法によりその抗酸化能を観察したところ、いわゆる標準物質（Trolox）と同じように延滞期が存在し、強い抗酸化活性が観察できたのである（図１５参照）。
【００５８】
本実施例では、前述した上澄み液８から探査すべく、ＯＲＡＣ法を用い、酢酸エチル分画において高い抗酸化力を有するＥ６を発見できたのである。
【００５９】
続いて実施例２について説明する。
【実施例２】
【００６０】
従来、生のカキ肉内からは、Ｅ６は見出されてはおらず、生のカキ肉から、いかなる製造によって前記Ｅ６なる有効成分が生成されるかは未確認の状態であった。
【００６１】
しかしながら、本件発明者は生のカキ肉から多くの有効成分を含んだカキ肉エキスを生成するに際し、当初の生のカキ肉からは全く見出されなかった3、5-ジヒドロキシ-4-メトキシベンジルアルコール(3、5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol  ：以下E6と称する場合がある。)をカキ肉エキスの抽出段階で生成できる生成方法を見出すことに成功したのである。
そして、特願２０１４−１６９３１６号として特許出願するに至った。
【００６２】
（加熱実験）
加熱実験（加圧なし）では、１ｋｇの生ガキに１Ｌの純水を加えて標準気圧にて１時間、例えば９０℃以上で加熱した後、固形分（ゆでガキ）を取り除いたカキエキス（抽出液）を例えば90℃以上で長時間加熱した。
【００６３】
そして、前記加熱状態において、２時間おきにサンプリングを行い（１６時間から１９時間までは１時間おき）、そのサンプリングした抽出液に、該抽出液のエタノール濃度が例えば、７０％になるように１００％エタノールを加え、その抽出液を遠心分離（8100G、10分）し、上澄を得た。
【００６４】
そして、前記上澄を約100倍希釈し、約100倍希釈した上澄中のE6濃度をMRMによって測定したのである。
しかし、カキエキス抽出後の抽出液を標準気圧にて２時間加熱した場合に、E6は検出されなかった。
【００６５】
次に、標準気圧にて18時間加熱したサンプルにおけるE6のMRMクロマトグラムを参照すると、保持時間5.2乃至5.5分に単一のピークが確認され、E6が検出されたことが理解できた。
【００６６】
そして、E6濃度は4.86±0.10μg/mLであった。
さらに、18時間加熱した際の液量が125.38gであることより、生ガキ1kgから生成されたE6の総量は609±13μgであった。
【００６７】
また、加圧ありの加熱実験では、20kgのカキに対して20Lの純水を加えて標準気圧にて2時間加熱した後、固形分（ゆでガキ）を取り除き、圧力釜（カジワラ、OAMVPα-C-08EL）を用いて3気圧にて2時間加熱した。
【００６８】
1時間おきにサンプリングを行い、エタノール濃度が70%になるように100%エタノールを加えたものを遠心分離（8100G、10分）し、 上澄を得た。さらに、該上澄を約100倍希釈し、そのサンプル中のE6濃度をMRMによって測定した。
【００６９】
しかして、カキエキス抽出後の抽出液を3atmにて1時間加熱したサンプルにおけるE6のMRMクロマトグラムがしめされ、保持時間5.2乃至5.5分に単一のピークが確認され、E6が検出された。そして、E6濃度は、1.7±0.10μg/mLであった。
【００７０】
3気圧にて1時間加熱した際の液量が21.2kgであることより、生ガキ20kgから生成されたE6の総量は36040±2120μgであった。生ガキ1kg当たりに換算すると、生成されたE6は1802±106μgとなった。
【００７１】
加圧なしの加熱実験（標準気圧にて18時間加熱したカキ抽出エキス）に比べて、加圧有りの場合（3気圧にて1時間加熱したカキ抽出エキス）は、一見してE6濃度が低い。
【００７２】
しかしながら、加圧ありの場合は、サンプル中の水分蒸発量が少なく得られる液量が多いことから、カキ1kg当たりで比較すると加圧なしの場合よりもE6の収量が約3倍多かったことが理解できる。
【００７３】
カキエキス抽出後の抽出液につき、3atmにて2時間加熱したサンプルにおけるE6のMRMクロマトグラムを参照すると、保持時間5.2乃至5.5分に単一のピークが確認され、E6が検出されている。
そして、E6標準試料の検量線とMRMクロマトグラムの解析により、E6濃度は3.5±0.39μg/mLであった。
【００７４】
この様に、3気圧にて1時間加熱した際の液量が19.1kgであることより、生ガキ20kgから生成されたE6の総量は66850±7449μgであった。生ガキ1kg当たりに換算すると、生成されたE6は3343±373μgとなった。
【００７５】
加圧なしの加熱実験（標準気圧にて18時間加熱したカキ抽出エキス）に比べて、加圧有りの場合（3気圧にて2時間加熱したカキ抽出エキス）は、一見してE6濃度が低い。
【００７６】
しかしながら、加圧ありの場合は、サンプル中の水分蒸発量が少なく得られる液量が多いことから、カキ1kg当たりで比較すると加圧なしの場合よりもE6の収量が約5.5倍多かったのである。
【００７７】
これらのことより、E6は長時間の加熱によって生成され、さらに加圧することで収集量が多くなることが確認できたのである。
【００７８】
ここで、上記の分析結果を踏まえて本実施例を要約説明する。
まず、生ガキ肉を押圧し、潰して、液体化する。
そして、その液体化した生ガキ中に、いかなる濃度のＥ６が存在するか否かの測定を行った。
【００７９】
しかして、生ガキを押圧し、潰して、液体化した液体中からは、Ｅ６は全く検出されなかったのである。すなわち、生ガキ肉当初の細胞中には、Ｅ６が見出されないのである。
【００８０】
次いで、前記したように、抽出容器に約１対１の割合で生ガキ肉と、抽出用溶液体、例えば蒸留水とを入れ、前記生ガキ肉が入った抽出用液体を１気圧で１時間の間、例えば、９２℃乃至９４℃の高温で加熱抽出した。
【００８１】
いわゆる加熱抽出というカキ肉エキスの抽出方法であり、当該方法により、従来から生ガキ肉中に存する多くの有効成分を前記抽出用液体内に抽出できていた。ここで、生ガキ肉中に存する多くの有効成分が抽出されると共に、生カキ肉を取り除いた前記抽出用液体を抽出液というものとする。
【００８２】
続いて、前記の抽出液につき、その後、１気圧で２時間の加熱処理（前記同様９２℃乃至９４℃）を行った。当初の抽出時間を算入して、都合、３時間の加熱処理である。
【００８３】
しかし、その３時間の加熱処理を行った抽出液においても、Ｅ６の存在は認められなかった。
【００８４】
さらに、１気圧で４時間（抽出時間を入れると合計５時間）、前記抽出液につき、加熱処理（９２℃乃至９４℃）を行い、その抽出液中にＥ６が存在するか否かの測定を行った。
【００８５】
この５時間の加熱処理（９２℃乃至９４℃）においては、その抽出液内のＥ６の存在は０．０９（μｇ／ｍｌ）と濃度測定の数値においては定量限界以下の数値であり、Ｅ６が確実に存在するとの信頼性は得られなかった。
【００８６】
続いて、１気圧で６時間（抽出時間を入れると合計７時間）、前記抽出液につき、加熱処理（９２℃乃至９４℃）を行い、その抽出液中にＥ６が存在するか否かの測定を行ったが、その抽出液中においても、Ｅ６の存在は、０．１２（μｇ／ｍｌ）とやはり濃度数値としては定量限界以下の数値であり、この場合においても、Ｅ６が確実に存在するとの信頼性は得られなかった。
【００８７】
しかしながら、１気圧で６時間（抽出時間を入れると合計７時間）、前記抽出液につき、９８℃乃至１００℃の高温で加熱処理を行い、その抽出液中にＥ６が存在するか否かを評価するため、ＨＰＬＣ（Prominence LC-20A,Shimadzu）を用いて、E6の存在測定を行った。
【００８８】
そして、その抽出液中において、Ｅ６の存在を、濃度数値として定量限界以上の数値を見出すことが出来たのである。
すなわち、この場合において、Ｅ６が存在するとの信頼性が得られたのである。
【００８９】
この様に、１００℃近傍の高温で加熱処理を行った場合には、６時間以上の加熱処理によっても、Ｅ６、すなわち、E6について、濃度数値として定量限界以上の数値を見出すことが出来たのである。
【００９０】
さらに、１気圧で８時間（抽出時間を入れると９時間）、前記抽出液につき、加熱処理（９２℃乃至９４℃）を行い、その抽出液にＥ６が存在するか否かの測定を行った。
【００９１】
しかし、該抽出液中にもＥ６の存在は、確実には確認できなかった。すなわち、０．２９（μｇ／ｍｌ）との数値を得たが、やはり濃度測定の定量限界以下の数値であった。
【００９２】
次いで、１気圧で１０時間（抽出時間を入れると１１時間）、前記の抽出液につき、加熱処理（９２℃乃至９４℃）を行い、その抽出液にＥ６が存在するか否かの測定を行った。
【００９３】
そして、この長時間加熱処理（９２℃乃至９４℃）を行った抽出液内に所定濃度のＥ６の存在が認められるか否か確認した。
【００９４】
すると、０．５４（μｇ／ｍｌ）と初めて濃度測定の定量限界を超える数値を計測することができ、前記合計１１時間の加熱処理を行った抽出液内には、Ｅ６が明らかに存在するとの確認が得られたのである。これは、Ｅ６がカキ１ｋｇあたり２１５．８μｇ生成されたことを意味する。
【００９５】
さらに、１気圧で１２時間（当初の抽出時間を算入すると合計１３時間）、前記抽出液につき、加熱処理を行い、その抽出液に所定濃度のＥ６が存在するか否かの測定を行った。
【００９６】
そして、その抽出液内にＥ６の存在が認められるか否か確認したところ、０．８６（μｇ／ｍｌ）とさらに定量限界を超える増加した数値を測定することができた。
【００９７】
そして、これは、Ｅ６がカキ１ｋｇあたり２８８．４μｇ生成されたことを意味するのである。
【００９８】
さらに、１気圧で１４時間（前記抽出時間の１時間を算入すると合計１５時間）前記抽出液につき、加熱処理を行い、その抽出液に所定濃度のＥ６が存在するか否かの測定を行った。
【００９９】
そして、その抽出液内にＥ６の存在が認められるか否か確認したところ、１．４２（μｇ／ｍｌ）とさらに定量限界を超える数値を測定することができ、長時間加熱処理を行うと、抽出液内にＥ６がさらに増加して存在するとの確認が得られた。
【０１００】
そして、この場合には、Ｅ６がカキ１ｋｇあたり３７３．９μｇ生成されたことを意味する。
【０１０１】
次いで、１気圧で１６時間（抽出時間を算入して１７時間）、前記抽出液につき、加熱処理を行い、その抽出液に所定濃度のＥ６が存在するか否かの測定を行った。
【０１０２】
そして、その抽出液内にＥ６の存在が認められるか否か確認したところ、２．６３（μｇ／ｍｌ）との再び増加した数値を測定することができ、Ｅ６が、長時間か熱処理することにより、増加して存在するとの確認が得られた。
【０１０３】
この場合、Ｅ６がカキ１ｋｇあたり４７８．６μｇ生成されたことを意味する。
【０１０４】
さらに、１気圧で１７時間（抽出時間を算入して１８時間）、前記抽出液につき、加熱処理を行い、その抽出液に所定濃度のＥ６が存在するか否かの測定を行った。
【０１０５】
そして、その抽出液内にＥ６の存在が認められるか否か確認したところ、再び増加した３．４２（μｇ／ｍｌ）との数値を測定することができ、Ｅ６が存在するとの確認が得られた。
【０１０６】
この場合において、Ｅ６はカキ１ｋｇあたり５１９．５μｇ生成されたことを意味する。
【０１０７】
次いで、１気圧で１８時間（抽出時間を入れて１９時間）、前記抽出液につき、加熱処理を行い、その抽出液に所定濃度のＥ６が存在するか否かの測定を行った。
【０１０８】
すると、さらに増加した濃度数値である４．８６（μｇ／ｍｌ）との数値を測定することができた。
これは、Ｅ６がカキ１ｋｇあたり６０９．３μｇ生成されたことを意味する。
【０１０９】
さらに、１気圧で１９時間（抽出時間の１時間を算入して２０時間）、前記抽出液につき、長時間の加熱処理を行い、その抽出液にＥ６が存在するか否かの測定を行った。そして、その抽出液内に所定濃度のＥ６の存在が認められるか否か確認したところ、６．４９（μｇ／ｍｌ）との数値を測定することができ、Ｅ６がさらに増加して存在するとの確認が得られた。
【０１１０】
そして、この場合に、Ｅ６はカキ１ｋｇあたり５８１．３μｇ生成されたことを意味する。
【０１１１】
この様に、当初、Ｅ６は、生ガキ中には全く存在せず、また１気圧、１時間のカキ肉エキスの加熱抽出を行った抽出液においても全く存在せず、検出されなかったが、該抽出液をきわめて長時間、加熱すればするほど、また、加熱温度を１００℃近傍にするほど増加して生成されることが確認された。
【０１１２】
この結果、カキ肉エキスの抽出液を１気圧で１９時間（抽出時間の１時間を入れると２０時間）、加熱処理した場合には、抽出液の比重を１とすると、生ガキ１ｋｇより５８１μｇ（６．４９μｇ×８９．５７ｇ）のＥ６が生成されたのである。
【０１１３】
さらに、前述したように、抽出液につき、１気圧で２時間乃至８時間加熱処理した場合には、所定濃度のＥ６は全く検出されなかったが、抽出液（生ガキを取り除いた抽出液体）につき、３気圧で１時間、加熱処理した場合には、Ｅ６の濃度が１．７（μｇ／ｍｌ）との数値が得られ、この数値からすると、生ガキ２０ｋｇから液量２１．２ｋｇを得て、前記抽出液の比重を１とすると、３気圧、１時間の加熱処理では、生ガキ１ｋｇよりＥ６が１８２０μｇ生成されたことになる。
【０１１４】
さらに、前記抽出液につき、３気圧で２時間、加熱処理した場合には、Ｅ６の濃度が３．５（μｇ／ｍｌ）との数値が得られ、この数値からすると、生ガキ２０ｋｇからは液量１９．１ｋｇを得て、前記抽出液の比重を１とすると、３気圧、２時間の加熱処理では生ガキ１ｋｇよりＥ６が３３４２．５μｇ生成されたことになる。
【０１１５】
尚、１気圧以上の加圧状態で所定時間、例えば５０分以上加熱処理をした場合、加熱温度が加圧により上昇することも相まって、Ｅ６の濃度数値として定量限界以上の数値が見出すことが出来るものとなる。
【０１１６】
この様に、本来生ガキ肉中には、見出されないＥ６を、前記加熱抽出を行ったカキ肉エキスの抽出液につき、加熱および／または加圧処理することにより明確に生成されることが判明したのである。しかも加熱時間を長時間にすればするほど、Ｅ６が増加して生成されることが判明したのである。
【０１１７】
さらに、３気圧の加圧処理を行った場合には、短時間の処理時間であってもＥ６が生成されることが確認できたのである。
【０１１８】
尚、本件発明者は、生の状態ではＥ６が検出されない生ガキ肉を、破砕し、ミンチ状態とした。そして、そのミンチにした破砕物を、（生ガキミンチ）３：（水）１の割合で３時間以上、８０℃以上で加熱することにより、Ｅ６を前記加熱処理したカキ肉液より生成した。
【０１１９】
生の状態ではＥ６が検出されない生ガキ肉を、破砕し、ミンチ状態とすることにより、比較的短い時間でＥ６を生成することが出来た（７０００ng/ｍＬ）。
【０１２０】
ここで、本件発明者らは、男女勤労者を対象としたＥ６含有カキ肉エキスの飲料摂取による睡眠改善効果検討を行った。
【０１２１】
（ヒト試験実験１）
本実験では、Ｅ６含有カキ肉エキス飲料を４週間連続摂取した時の睡眠の質の主観的評価への影響について検討するため、アテネ式不眠尺度（AIS）が６点以上であり、POMS短縮版（POMS-S）の「疲労」スコアが６０点以上かつ「活気」スコアが４０点以下の睡眠の問題やストレス、疲労を感じている３０歳以上６０歳以下の成人勤労男女８４名を対象に、プラセボ対照無作為化二重盲検並行群間比較試験を実施した。
【０１２２】
実験に組入れた８４名のうち、実験期間中に脱落した被験者はおらず８４名全員が所定のスケジュールを完遂した。そのうち、実験計画書に予め定めていた有効性解析除外基準に該当した６名（被験食品群（Ａ群）２名、プラセボ群（Ｐ群）４名）を除いた７８名（Ａ群４０名、Ｐ群３８名）で有効性解析を行った。
【０１２３】
主要評価項目である睡眠の主観的評価項目であるAISについて、摂取前からの変化量では、群間で有意な差は認められなかった。ピッツバーグ睡眠質問票日本語版（PSQI-j）について、睡眠効率の摂取前からの変化量は、Ａ群はＰ群と比較して有意に低値（Ａ群：0.4 ± 1.2、Ｐ群：1.1 ± 1.4）を示し、Ａ群は睡眠効率の悪化を抑制した（図４）。
【０１２４】
有効性解析対象者のうち５０歳未満の男女６１名（Ａ群：３１名、Ｐ群：３０名）を対象に、PSQI-jについて探索的な追加解析を行ったところ、PSQI-jでは睡眠困難の項目で有意な改善が見られた（図５）。
【０１２５】
以上の結果から、E6含有カキ肉エキス飲料を摂取することにより、E6は精神的なストレスや疲労感を緩和させるとともに、睡眠効率を維持する働きがあると考えられた。また、E6は、５０歳未満の勤労男女に対して、ストレス、疲労感、活力、睡眠困難の改善に特に効果を示した。また、本実験条件下ではE6含有カキ肉エキス飲料の安全性に問題はなかった。
【０１２６】
（実験の目的と背景）
本実験食品は、生ガキから抽出濃縮されたカキ肉エキスに、エタノール添加の後、得られた上澄みを濃縮させたカキ肉エキスである。必須アミノ酸をはじめ、さらに必須微量元素の亜鉛、銅、鉄、セレン、クロム、コバルトなどの天然ミネラル及び９種類のビタミンがバランス良く含まれている。また、カキ肉エキスに含まれるＥ６は新規抗酸化物質として実験が進められており、Ｅ６を含有するカキ肉エキスを用いた動物試験によってDNA抗酸化作用、脂質抗酸化作用、ストレス緩和作用、非アルコール性脂肪性肝炎改善等が認められている。
そこで、本実験では、睡眠の問題やストレス、疲労を感じている３０歳から６０歳の男女にE6含有カキ肉エキス飲料を４週間連続摂取させた時の睡眠の質、ストレス、疲労の主観的評価への影響について、プラセボを対照として比較検討した。
【０１２７】
実験の方法
実験デザイン
プラセボ対照無作為化二重盲検並行群間比較試験
【０１２８】
被験者数及び割付
被験者数
本実験に組入れた被験者数は、被験食品群４２名、プラセボ群４２名、合計８４名であった。
【０１２９】
割付方法
割付担当者は乱数を用いて割付表を作成し、実験食品に割付番号を付与した。割付表は割付担当者が封緘し、割付表開封時まで密封保管した。
【０１３０】
実験期間
２０１６年１月〜２０１６年４月に実施した。
【０１３１】
被験者の選択
以下の選択基準に合致する被験者を選択した。
【０１３２】
選択基準
（１）年齢が３０歳以上６０歳以下の成人男女勤労者
（２）事前検査時のアテネ式不眠尺度スコアが６点以上の者
（３）事前検査時のPOMS短縮版の「疲労」スコアが６０点以上かつ「活気」スコアが４０点以下の者
【０１３３】
実験対象食品（以下、実験食品）
実験食品の名称
被験食品：E6含有カキ肉エキス飲料
プラセボ：E6含有カキ肉エキス非含有飲料
【０１３４】
実験食品の食経験
株式会社渡辺オイスター研究所では、一年を通してカキを利用することを目的としてカキ肉加工食品の実験・開発を続けてきた。「ワタナベ活性型オイスタードリンク」は、発売以来１０年間を経過し、年間１６万本が消費され、子供から年配の方まで、健康の維持と増進の栄養補給に愛用されている。
【０１３５】
また、カキ肉エキスに含まれるE6 (3,5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol) は新規抗酸化物質として実験が進められており、E6を含有するカキ肉エキスを用いた動物試験によってDNA抗酸化作用、脂質抗酸化作用、ストレス緩和作用等が認められている。
【０１３６】
関与成分
E6 (3,5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)
【０１３７】
実験食品の摂取量、摂取方法、摂取期間
（１）実験食品の摂取量、摂取方法及び摂取期間
実験食品は、１日２回、朝１回、夜就寝１時間以上前に１回、１回あたり１本（５０ｍＬ）を摂取させた。研究期間中は日誌を毎日記録させた。摂取期間は４週間とした。
【０１３８】
実験スケジュール
（１）被験者候補を事前検査に来院させ、生活習慣アンケート、POMS短縮版（POMS-S）、ライフイベント調査票、アテネ式不眠尺度（AIS）への記入の各検査を実施した。
（２）事前検査結果から被験者を選択し、摂取前検査に来院させ、体調確認・計測、一般臨床検査、ピッツバーグ睡眠質問票（PSQI-j）への記入の各検査を実施した。
（３）摂取前検査結果から被験者を８４名選択した。被験者に実験食品、摂取期間中日誌を配布し、実験食品の摂取及び摂取期間中日誌の記録を開始させた。
（４）被験者を摂取から２週目（１５日目）、４週目（２９日目）に来院させ、体調確認・計測、POMS-S、ライフイベント調査票への記入の各検査を実施する。４週目検査ではAIS、PSQI-j、一般臨床検査も実施した。
（５）摂取開始後は１週目（８日目）、３週目（２２日目）でPOMS-S、ライフイベント調査票を自宅で記入させた。
（６）各検査来院前日及び自宅でのアンケート記入日前日は、禁酒し、夜１０時までに飲食を終え、夜１２時頃までに就寝し、十分に睡眠をとるよう指導した。
【０１３９】
有効性の評価
有効性の評価指標
主要評価項目：AIS、PSQI-j
【０１４０】
評価方法
PSQI-jとAISは摂取後各時点の検査の値の摂取前値からの変化量について、被験食品摂取群とプラセボ摂取群とをMann-WhitneyのU検定を用いて比較した。なお、参考として各群それぞれにおいて摂取後各時点の摂取前からの変化量をWilcoxonの符号付き順位和検定を用いて評価した。
【０１４１】
数値の表示及び有意水準
数値は平均値±標準偏差で示し、検定の有意水準は両側５％とした。
【０１４２】
実験結果
以下では平均値がxxx、標準偏差がyyyの場合、xxx±yyyと示した。
【０１４３】
被験者の選択
被験者として男性３７名、女性４７名、合計８４名を選択し、実験を開始した。
【０１４４】
解析対象者の内訳
実験を開始した８４名の内、実験より脱落した被験者はおらず、所定のスケジュール及び検査内容を完遂した被験者は８４名であった。
８４名の内、有効性解析対象除外基準に該当した合計６名の被験者は、割付表を開封する前に当該被験者を有効性解析から除外することを決めた。したがって、有効性解析対象者は７８名とした（図１で説明するFig. 1）。
【０１４５】
有効性解析対象者の背景因子
図２で説明するTable 2-1に、有効性解析対象者の背景因子（性別、年齢、身長、体重、BMI、収縮期血圧、拡張期血圧、脈拍、POMS-S、AIS）を示した。選択基準として用いたAISに関しては、有意な差は認められなかった。
【０１４６】
有効性の評価
主要評価項目（AIS、PSQI-j）
図３で説明するTable 2-2-2、図４で説明するTable2-2-3に主要評価項目であるAIS、PSQI-jの推移を示した。
【０１４７】
AIS
摂取前からの変化量では、群間で有意な差は認められなかった（図３で説明するTable 2-2-2）。なお、群内比較では、両群とも変動（改善）した。
【０１４８】
PSQI-j
摂取前値および摂取開始４週目のPSQI-jのスコア、並びにその変化量を図４に示す。被験食品摂取群では、「睡眠効率」スコアの変化量が0.4 ± 1.2、プラセボ食品摂取群では1.1 ± 1.4と、被験食品摂取群において有意に低値であり、睡眠効率の悪化が抑制されていることが示された。
【０１４９】
各群の群内比較では、Ａ群においては合計スコア（Global Score）、睡眠の質、入眠時間、睡眠時間、睡眠困難、日中覚醒困難が摂取前と比較して有意に変動（改善）した。Ｐ群においては合計スコア、睡眠の質、入眠時間、睡眠時間、日中覚醒困難が摂取前と比較して有意に変動（改善）し、睡眠効率が摂取前と比較して有意に変動（悪化）した。
【０１５０】
探索的な有効性解析（PSQI-j）
若年者ほどストレス適応能が高いことが考えられるため、探索的な有効性解析として、有効性解析対象者のうち５０歳未満の男女６１名（Ａ群：３１名、Ｐ群：３０名）を対象とし、PSQI-jについて、追加解析を行った（図５で説明するTable2-2-5）。
PSQI-j
睡眠困難の摂取前からの変化量はＡ群はＰ群と比較して有意に低値（Ａ群：-0.3±0.4、Ｐ群：0.0±0.4）を示した。
【０１５１】
安全性の評価
有害事象
有害事象については、実験期間中にいくつかの自覚症状の訴えや他覚所見が観察されたが、すべての症状は軽度であり、重篤な有害事象は見られなかった。また、実施医師責任者によって研究食品との因果関係はないと、判断され、副次作用はなかった。
【０１５２】
考察
アテネ式不眠尺度が6点以上であり、POMS短縮版（POMS-S）の「疲労」スコアが６０点以上かつ「活気」スコアが４０点以下の睡眠の問題やストレス、疲労を感じている３０歳以上６０歳以下の成人勤労男女８４名を対象に、E6含有カキ肉エキス飲料を4週間連続摂取による睡眠の質、ストレス、疲労の主観的評価への影響について、プラセボを対照として比較検討を行った。
【０１５３】
睡眠の主観的評価項目であるAISについて、摂取前からの変化量では、群間で有意な差は認められなかった（図３として説明するTable 2-2-2）。PSQI-jについて、睡眠効率の摂取前からの変化量は、Ａ群はＰ群と比較して有意に低値（Ａ群：0.4 ± 1.2、Ｐ群：1.1 ± 1.4）を示したが（図４として説明するTable 2-2-3）、両群とも数値は悪化しているため、Ａ群は睡眠効率の悪化を抑制したといえる。
【０１５４】
睡眠効率の改善の一つの要因は、中途覚醒の減少と考えられる。健常人および不眠症患者において夕方の血漿コルチゾール値とその後の睡眠における中途覚醒の回数の間には正の相関があると報告されている。E6を含有するカキ肉エキスの経口投与により、マウスの入眠時に相当する時間の血漿中コルチコステロン値の減少作用を確認した。また、E6含有カキ肉エキスの飲料1本摂取におけるヒト睡眠時脳波測定試験によって、プラセボ摂取群と比較して被験食品摂取群では、中途覚醒の増加抑制作用を確認した。これらの知見より、本実験で見られた被験食品群における睡眠効率の悪化抑制効果は、E6の抗酸化作用による血漿コルチコステロン分泌抑制作用とそれにより誘導された中途覚醒抑制作用による可能性が考えられる。
【０１５５】
ストレスバイオマーカーの実験結果より、若年者ほどストレス適応能が高いことが考えられたため、有効性解析対象者のうち５０歳未満の男女６１名（Ａ群：３１名、Ｐ群：３０名）を対象に、PSQI-jについて探索的な追加解析を行った。
【０１５６】
PSQI-jでは、睡眠困難に関して、Ａ群はＰ群と比較して有意に改善が見られた。これらの結果から、E6含有カキ肉エキス飲料摂取により、ストレス適応能が比較的高いと考えられる５０歳未満の勤労男女に対して、ストレス、疲労感、活力、混乱、睡眠困難の改善に特に効果を発揮したといえる。
【０１５７】
結論
睡眠に問題を感じている３０歳から６０歳の勤労男女を対象としたプラセボ対照無作為化二重盲検並行群間比較試験の結果、E6含有カキ肉エキスの飲料摂取により、PSQI-jの睡眠効率のスコアの悪化を抑制した。よって、E6は、睡眠効率を維持する働きがあると考えられた。また、E6は、５０歳未満の勤労男女に対しては、睡眠困難の改善に特に効果を示した。
また、本実験条件下ではE6含有カキ肉エキス飲料の安全性に問題はなかった。
【０１５８】
（ヒト試験実験２）
本実験では、年齢30歳以上60歳以下の日頃からストレスや疲労を感じており、睡眠の満足度が低い勤労男女を対象として、Ｅ６含有カキ肉エキス飲料（被験食品）を4週間摂取させるプラセボ対照無作為化二重盲検並行群間比較試験を実施した。プラセボ食品はＥ６含有カキ肉エキス非含有飲料を用いた。
【０１５９】
性別、年齢および中途覚醒する者の割合が群間で不均衡とならないように割付けて組入れた被験者32名の内、実験の所定のスケジュールを完遂した被験者は31名であった。また、OSA睡眠調査票MA版（以下「OSA-MA」という。）を除くアンケートの有効性評価例は、被験食品摂取群（A群）：13名、プラセボ食品摂取群（P群）：15名の計28名、脳波及びOSA-MAの有効性評価例はA群：9名、P群：11名の計20名とした。
【０１６０】
アンケートでは、QOL調査票の睡眠の摂取前値から4週目までの変化量で、A群はP群と比較して、有意に低値（改善）を示した（図２０）。脳波では中途覚醒の時間の4週目の変化量、総覚醒回数の4週目の変化量において、A群は総覚醒回数を維持しP群と比較して有意に低値（悪化の抑制）を示した（図２１）。
【０１６１】
以上の結果より、日頃、疲労を感じ、睡眠に満足していない成人勤労男女に対し、Ｅ６含有カキ肉エキス飲料の摂取は、睡眠に関するQOLを向上させることが明らかとなった。また、P群では、実験期間中の中途覚醒が増加していたが、A群では観察されなかったことから、Ｅ６含有カキ肉エキス飲料の摂取によって、良好な睡眠状態の維持や改善効果が発揮されることが示唆された。
【０１６２】
（実験の目的と背景）
本件出願人は、以前に、睡眠に問題を感じている成人勤労男女に対し、このＥ６含有カキ肉エキス飲料を4週間摂取するオープン実験を実施したところ、睡眠に関する自覚症状や、睡眠時の脳波の第1周期のδパワー量で、回復・改善が示唆された。
このため、今回、Ｅ６含有カキ肉エキス飲料の連続摂取による睡眠改善効果を、睡眠に問題があると感じている勤労者男女を対象に、睡眠時の脳波及び主観的評価を指標として検討し、かつ脳波と主観的な評価との指標の比較検討を行うことを目的にＥ６含有カキ肉エキス非含有飲料を対照とした二重盲検並行群間比較試験を実施した。
【０１６３】
実験の方法
実験デザイン
二重盲検並行群間比較試験
【０１６４】
被験者数及び割付
被験者数
本実験に組入れた被験者数は、被験食品群１６名、プラセボ群１６名、合計３２名であった。
【０１６５】
割付方法
割付担当者は乱数を用いて割付表を作成し、試験食品に割付番号を付与した。割付表は割付担当者が封緘し、割付表開封時まで密封保管した。割付にあたっては、被験者の性別、年齢および中途覚醒する者の割合が群間で不均衡とならないように配慮した。
【０１６６】
解析対象者及びデータ固定後、割付担当者は割付表を開封し情報を開示した。ただし重篤な有害事象が発生し、緊急を要する場合には、必要に応じて割付表を開封し、必要最低限の情報のみを開示することとした。
【０１６７】
実験期間
2013年3月から2013年6月に実施した。
【０１６８】
被験者の選択
以下の選択基準をすべて満たす被験者を登録した。
【０１６９】
選択基準
（１）年齢30歳以上60歳以下の成人勤労者男女
（２）血清Zn濃度が80 μg/dL未満を主とする
（３）普段の就寝時間がPM 9:00〜AM 1:00の間
（４）事前検査時のアテネ式不眠尺度スコアが6点以上
（５）POMS短縮版の「疲労」スコアが50点以上かつ「活気」スコアが50点以下
（６）睡眠中に中途覚醒する者（週に1〜3回程度）が全被験者の7割以上とする
【０１７０】
実験対象食品（以下、実験食品）
実験食品の名称
被験食品：Ｅ６含有カキ肉エキス飲料
プラセボ：Ｅ６含有カキ肉エキス非含有飲料
【０１７１】
実験食品の食経験
本実験で用いたＥ６含有カキ肉エキス飲料は「ワタナベ活性型オイスタードリンク」として、株式会社渡辺オイスター研究所より販売され、幅広い年代に愛飲されている。
【０１７２】
関与成分
E6 (3,5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol)
【０１７３】
摂取量、摂取方法および摂取期間
試験食品は、1日1本（50 mL）、就寝1時間前に摂取させた。試験食品を摂取した時刻と数量を日誌に記録するよう、被験者に指導した。摂取期間は4週間（28日間）とした。
【０１７４】
実験スケジュール
（１）同意を取得した被験者候補に事前1検査として、体調確認、身体計測、一般臨床検査、血清Zn濃度、血清Se濃度の各検査及び、生活習慣アンケート、POMS短縮版（POMS-S）、ライフイベント調査票、アテネ式不眠尺度（AIS）への記入の各検査を実施した。
（２）被験者候補を選択後、事前2検査として、POMS-S、ライフイベント調査票、AIS、ピッツバーグ睡眠質問票（PSQI-j）、QOL調査票、JUMACL、働く人のこころとからだの早期健康チェック（CHCW）への記入の各検査を実施した。
（３）組入れた被験者に対し、説明会で、携帯型脳波計の使用法の説明を行った。
（４）説明会当日から、毎日日誌の記載をさせた。また、試験食品摂取開始1週間前の月曜日の夜から金曜日の朝までの各4夜、携帯型脳波計で就寝から起床までの脳波を記録させるとともに、制限時間内にOSA睡眠調査票MA版（OSA-MA）に記入させた。
（５）試験食品摂取開始後も、毎日日誌の記載を行わせた。また、試験食品摂取1週目、2週目及び4週目の月曜日の夜から金曜日の朝までの各4夜、携帯型脳波計で就寝から起床までの脳波を記録させるとともに、制限時間内にOSA-MAに記入させた。
（６）1週後（摂取7日目）検査では、規定日にPOMS-Sに記入させた。
（７）2週後検査（摂取14日目）では、規定日に被験者を来院させ、体調確認、身体測定、QOL調査票への記入の各検査を実施した。
（８）4週後（摂取28日目）検査では、規定日に被験者を来院させ、体調確認、身体測定、QOL調査票への記入の各検査を実施した。
（９）各検査来院前日は禁酒し、できるだけ医薬品を服用しないように指導した。夜12時頃までに就床し、十分な睡眠をとるように努めさせた。
【０１７５】
評価方法
有効性評価指標
主要評価項目：QOL調査票スコア、脳波
【０１７６】
有効性評価方法
QOL調査票のスコアは、被験食品摂取群の摂取後各時点の摂取前からの変化量と、プラセボ食品群のそれとをMann-WhitneyのU検定を用いて比較した。また、各群で摂取後各時点の実測値を、1標本Wilcoxon検定を用いて摂取前と比較した。
【０１７７】
表示および有意水準
各検査値は平均値±標準偏差で示し、検定の有意水準はいずれも両側5%とした。
【０１７８】
実験結果
被験者の選択
被験者計32名を選択し、実験を開始した。
【０１７９】
解析除外対象基準に該当した、上記計3名（被験食品群：2名、プラセボ食品群：1名）を有効性解析対象者より除外した。その結果、有効性解析対象者は28名（被験食品群：13名、プラセボ食品群：15名）となった。
【０１８０】
脳波は各測定期間1週間のうち4日間測定したが、解析可能なデータが2日間未満であった被験食品群の４名及び、プラセボ食品群の４名の計8名を脳波の解析から除外し、計20名（被験食品群：9名、プラセボ食品群：11名）を脳波及びOSA-MAの有効性解析対象者とした。
【０１８１】
有効性解析対象者の背景因子
図１８で説明するTableII-1-1に有効性解析対象者28名、図１９で説明するTableII-1-2に脳波及びOSA-MAの解析対象者20名の背景因子として、年齢、性別、身長、体重、BMI、POMS-S F（疲労）、POMS-S V（活気）を示した。
【０１８２】
有効性の評価
主要評価項目（QOL調査票、脳波）
図２０で説明するTableII-2-５、図２１で説明するTableII-2-10に主要評価項目であるQOL調査票、脳波の推移を示した。
【０１８３】
QOL調査票
睡眠の摂取前値からの変化量の4週目で、A群はP群と比較して、有意に低値を示した（A群：-1.2±0.6、P群：-0.5±0.7）。
【０１８４】
中途覚醒と睡眠効率
図２１で説明するTableII-2-10から理解されるように、総覚醒回数の摂取前値からの変化量の4週目において、A群はP群と比較して有意に低値（A群：1.6±7.5 回、P群：19.9±24.1 回）を示した。
睡眠効率に関しては、摂取前値からの変化量で、群間差は確認されなかったが、P群のみ、実測値の摂取前88.2±7.1 %と比較して、4週目85.1±7.8 %で有意な低値を示した。一方、A群では、睡眠効率の低下は確認されなかった。
【０１８５】
考察
勤労者で、AISの合計点が6点以上、POMS-Sの「疲労（F）」Tスコアが50点以上、「活気（V）」Tスコアが50点以下の被験者32名を対象に、Ｅ６含有カキ肉エキス飲料を被験食品、Ｅ６含有カキ肉エキス非含有飲料をプラセボ食品とし、4週間（28日間）連続摂取させる二重盲検並行群間比較試験を実施した。
【０１８６】
性別、年齢および中途覚醒する者の割合が群間で不均衡とならないように配慮し、割付けて組入れた被験者32名のうち、31名が所定の実験スケジュールを完遂し、OSA-MAを除くアンケート及び血清Zn、血清Seの有効性解析対象者は28名、脳波計及びOSA-MAの有効性解析対象者は20名とした。
【０１８７】
アンケートに関しては、QOL調査票の睡眠の摂取前値からの変化量の4週目で、被験食品摂取群（A群）は、プラセボ食品摂取群（P群）と比較して、有意に低値（改善）を示した。
【０１８８】
脳波に関しては、4週目の中途覚醒時間の摂取前値からの変化量、4週目の総覚醒回数の摂取前値からの変化量において、A群はP群と比較して有意に低値を示した。
【０１８９】
結論
日頃、疲労を感じ、睡眠に満足していない成人勤労男女に対し、Ｅ６含有カキ肉エキス飲料の摂取は、睡眠に関するQOLを向上させることが明らかとなった。また、脳波解析から、P群で観察された、実験期間中の中途覚醒の増加がA群では観察されなかったことから、Ｅ６含有カキ肉エキス飲料によって、睡眠状態の悪化の抑制や睡眠状態の改善効果が発揮されることが示唆された。
また、本実験条件下ではE6含有カキ肉エキス飲料の安全性に問題はなかった。
【符号の説明】
【０１９０】
１      抽出容器
２      抽出用溶液
３      生カキ肉
４      エタノール溶液
５      酢酸エチル
６      濃縮液
７      沈殿物
８      上澄み液
９      上澄み液の濃縮液
１０    希釈液
１０ａ  水層
１１    酢酸エチル層
【図１】
2018118910.tif 000002
【図２】
2018118910.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2018118910.tif 000016
【図１６】
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【図１７】
2018118910.tif 000018
【図１８】
2018118910.tif 000019
【図１９】
2018118910.tif 000020
【図２０】
2018118910.tif 000021
【図２１】
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