(57)【要約】【課題】環境ストレスに対する耐性を有する植物（ストレス耐性植物）を提供する。【解決手段】人工的に制御された明暗サイクル下で、植物を栽培してストレス耐性植物を得る、ストレス耐性植物の製造方法であって、前記明暗サイクルは、前記植物に対して光が照射される明期と、前記植物に対して光が照射されないか、または、前記明期よりも少ない量の光が照射される暗期と、を有し、前記明暗サイクルは、前記植物を構成する複数の細胞の体内時計における概日リズムのバラツキを大きくするように制御される、ストレス耐性植物の製造方法。【選択図】図５
2018166480.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工的に制御された明暗サイクル下で、植物を栽培してストレス耐性植物を得る、ストレス耐性植物の製造方法であって、
前記明暗サイクルは、前記植物に対して光が照射される明期と、前記植物に対して光が照射されないか、または、前記明期よりも少ない量の光が照射される暗期と、を有し、
前記明暗サイクルは、前記植物を構成する複数の細胞の体内時計における概日リズムのバラツキを大きくするように制御される、ストレス耐性植物の製造方法。
【請求項２】
前記明暗サイクルは前記複数の細胞に対して一様であり、
前記暗期が、前記植物の主観的時刻において、前記複数の細胞の前記概日リズムのバラツキが最も大きくなる時刻の前後２時間のうちの少なくとも一部の時間を含むように設定される、請求項１に記載のストレス耐性植物の製造方法。
【請求項３】
前記暗期が、下記の（Ａ）工程および（Ｂ）工程によって定められた目標位相に相当する前記主観的時刻の前後２時間のうちの少なくとも一部の時間を含む、請求項２に記載のストレス耐性植物の製造方法。
（Ａ）  前記明暗サイクルが前記明期のみからなる場合に対して、前記明暗サイクルにおいて前記概日リズムの各々の位相から始まる単回の前記暗期を設けた場合における前記位相のシフト量から、前記暗期が始まる前記位相に対する前記位相のシフト量の変化を示す位相応答曲線を求める工程
（Ｂ）  （Ａ）で求められた位相応答曲線の微分曲線を求め、前記微分曲線において最大値を与える位相を目標位相として定める工程
【請求項４】
前記明暗サイクルは前記複数の細胞に対して一様でない、
請求項１に記載のストレス耐性植物の製造方法。
【請求項５】
前記暗期の時間が４時間以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のストレス耐性植物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレス耐性植物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工光植物工場や不規則変動する気象条件下において、植物は大きな環境ストレスを受けている。露地、施設園芸、植物工場等の全てにおいて、種々の環境ストレスによる植物の生育不良、収量および品質の低下等が問題となっている。
【０００３】
各種ストレス状況下において、その指標となるマーカー遺伝子が調べられており（約３０００種類）、公共データベース（ＴＡＩＲなど）により照会が可能である。また、オミクス解析により、ストレスマーカー遺伝子群の多くが概日リズム（サーカディアンリズム）を有することが分かっている［非特許文献１（Tanigaki  Y.,  et  al.:  Transcriptome  Analysis  of  Plant  Hormone-Related  Tomato  (Solanum  lycopersicum)  Genes  in  a  Sunlight-Type  Plant  Factory.  PLoS  one  DOI:10.1371/journal.pone.0143412,  2016）、非特許文献２（Higashi  T.,  et  al.:  Detection  of  Diurnal  Variation  of  Tomato  Transcriptome  through  the  Molecular  Timetable  Method  in  a  Sunlight-Type  Plant  Factory.  Front.  Plant  Sci.  7:87,  2016）、非特許文献３（Higashi  T,  et  al.:  Circadian  Oscillation  of  the  Lettuce  Transcriptome  under  Constant  Light  and  Light-Dark  Conditions.  Front.  Plant  Sci.  7:1114,  2016）参照］。
【０００４】
概日リズムを生み出す概日時計研究が、近年進んでおり、病害応答や、ストレスマーカー遺伝子群と概日リズムの関係性が明らかにされつつある［非特許文献４（Goodspeed  D.,  et  al.,  :  Postharvest  Circadian  Entrainment  Enhances  Crop  Pest  Resistance  and  Phytochemical  Cycling.  Current  Biology,  2013）参照］。また、概日リズムの環境との同調状態は、植物の成長に影響を与えることが知られている［非特許文献５（Dodd  A.,  et  al.:  Plant  Circadian  Clocks  Increase  Photosynthesis,  Growth,  Survival,  and  Competitive  Advantage.  Science  309:630,  2005）、非特許文献６（Higashi  T.,  et  al.:  Evaluation  of  Growth  under  Non-24  h  Period  Lighting  Conditions  in  Lactuca  sativa  L.  Environ.  Control  Biol.,  53  (1),  712,  2015）参照］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Tanigaki  Y.,  et  al.:  Transcriptome  Analysis  of  Plant  Hormone-Related  Tomato  (Solanum  lycopersicum)  Genes  in  a  Sunlight-Type  Plant  Factory.  PLoS  one  DOI:10.1371/journal.pone.0143412,  2016
【非特許文献２】Higashi  T.,  et  al.:  Detection  of  Diurnal  Variation  of  Tomato  Transcriptome  through  the  Molecular  Timetable  Method  in  a  Sunlight-Type  Plant  Factory.  Front.  Plant  Sci.  7:87,  2016
【非特許文献３】Higashi  T.,  et  al.:  Circadian  Oscillation  of  the  Lettuce  Transcriptome  under  Constant  Light  and  Light-Dark  Conditions.  Front.  Plant  Sci.  7:1114,  2016
【非特許文献４】Goodspeed  D.,  et  al.:  Postharvest  Circadian  Entrainment  Enhances  Crop  Pest  Resistance  and  Phytochemical  Cycling.  Current  Biology,  2013
【非特許文献５】Dodd  A.,  et  al.:  Plant  Circadian  Clocks  Increase  Photosynthesis,  Growth,  Survival,  and  Competitive  Advantage.  Science  309:630,  2005
【非特許文献６】Higashi  T.,  et  al.:  Evaluation  of  Growth  under  Non-24  h  Period  Lighting  Conditions  in  Lactuca  sativa  L.  Environ.  Control  Biol.,  53  (1),  712,  2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
温度ストレス（高温ストレス、低温ストレス）、光ストレス、水ストレス（乾燥ストレス）、塩ストレス、病害ストレス、飢餓ストレスなどの環境ストレスに耐性を持つ、ストレス耐性植物を用いて、植物の収量増加および品質向上を達成することが求められている。これらの環境ストレスは、時間的に一定である静的な環境ストレスであったり、時間変動する動的な環境ストレスであったりする。
【０００７】
したがって、本発明の課題は、環境ストレスに対する耐性を有する植物（ストレス耐性植物）を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
［１］  人工的に制御された明暗サイクル下で、植物を栽培してストレス耐性植物を得る、ストレス耐性植物の製造方法であって、
前記明暗サイクルは、前記植物に光が照射される明期と、前記植物に光が照射されないか、または、前記明期よりも少ない量の光が照射される暗期と、を有し、
前記明暗サイクルは、前記植物を構成する複数の細胞の体内時計における概日リズムのバラツキを大きくするように制御される、ストレス耐性植物の製造方法。
【０００９】
［２］  前記明暗サイクルは前記複数の細胞に対して一様であり、
前記暗期が、前記植物の主観的時刻において、前記複数の細胞の前記概日リズムのバラツキが最も大きくなる時刻の前後２時間のうちの少なくとも一部の時間を含むように設定される、［１］に記載のストレス耐性植物の製造方法。
【００１０】
［３］  前記暗期が、下記の（Ａ）工程および（Ｂ）工程によって定められた目標位相に相当する前記主観的時刻の前後２時間のうちの少なくとも一部の時間を含む、［２］に記載のストレス耐性植物の製造方法。
（Ａ）  前記明暗サイクルが前記明期のみからなる場合に対して、前記明暗サイクルにおいて前記概日リズムの各々の位相から始まる単回の前記暗期を設けた場合における前記位相のシフト量から、前記暗期が始まる前記位相に対する前記位相のシフト量の変化を示す位相応答曲線を求める工程
（Ｂ）  （Ａ）で求められた位相応答曲線の微分曲線を求め、前記微分曲線において最大値を与える位相を目標位相として定める工程
【００１１】
［４］  前記明暗サイクルは前記複数の細胞に対して一様でない、
［１］に記載のストレス耐性植物の製造方法。
【００１２】
［５］  前記暗期の時間が４時間以下である、［１］〜［４］のいずれかに記載のストレス耐性植物の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、環境ストレスに対する耐性を有する植物（ストレス耐性植物）を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ダークパルス（暗期）の強度を説明するための模式図である。
【図２】ダークパルスの強度を説明するための別の模式図である。
【図３】ダークパルスの強度を説明するための別の模式図である。
【図４】（ａ）は、位相応答曲線の一例を示す図である。（ｂ）は、暗期前の位相と暗期後の位相との関係を示す曲線を示すグラフである。
【図５】（ａ）は、実施例１の結果（３０時間後）を示す写真である。（ｂ）は、実施例１の結果（３０時間後）を示すグラフである。
【図６】（ａ）は、実施例１の結果（１５日後）を示す写真である。（ｂ）は、実施例１の結果（１５日後）を示すグラフである。
【図７】実施例２の結果を示すグラフである。
【図８】植物の主観的時刻と概日リズムの位相との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のストレス耐性植物の製造方法は、人工的に制御された明暗サイクル下で、植物を栽培してストレス耐性植物を得る、ストレス耐性植物の製造方法である。
【００１６】
明暗サイクルは、明期と暗期とを有する。「明期」とは、植物に光が照射される時間帯である。「暗期」とは、植物に光が照射されないか、または、明期よりも少ない量の光が照射される時間帯である。なお、照射される光の好ましい波長の範囲は、概日リズムに作用する波長であれば特に限定されないが、例えば、４００〜７００μｍである。
【００１７】
明暗サイクルは、植物を構成する複数の細胞の体内時計における概日リズムのバラツキを大きくするように制御される。なお、植物を構成する複数の細胞の概日リズムはある程度バラツキがある場合があるが、本発明の製造方法においては、バラツキをそれよりも更に大きくするように明暗サイクルが制御される。
【００１８】
「概日リズム」は、サーカディアンリズムとも呼ばれ、植物の体内時計に同調して（例えば２４時間の周期で）見られる植物の特定遺伝子（群）の発現量の増減、およびその結果として生起する様々な生理的な現象の変動を意味する。この生理現象としては、例えば、時計遺伝子により制御される植物体内での物質代謝が挙げられる。暗期の設定のための概日リズムの指標は、好ましくは時計遺伝子（ＣＣＡ１遺伝子など）の発現量である。なお、概日リズムは１つの指標の基づくものでもよく、また、複数の指標に基づくものでもよい。
【００１９】
明期や暗期は０．１〜４時間程度であってもよい。従って、本明細書における「明暗サイクル」は、連続照明下においてパルス状の暗期（ダークパルス）を周期的に設ける場合を含む。
【００２０】
明暗サイクルの周期は、概日リズムの固有の周期に応じて設定すればよく、例えば、２０〜２８時間であり、多くの場合、好ましくは２２〜２６時間であり、より好ましくは２３〜２５時間である。
【００２１】
概日リズムは、各々の細胞に備わる概日時計によって形成されているため、植物を構成する細胞集団の概日リズムの（位相の）同期状態が、個体レベルの概日リズムの形成において重要な要素となる。細胞集団の概日リズム（概日時計）を完全に非同期にすると、個体としての概日リズムが消失する（シンギュラリティ現象）ことが知られている［Fukuda, H., Murase, H. & Tokuda, I.T. Sci. Rep. 3, 1533; DOI:10.1038/srep01533 (2013)、および、Ukai, H. et al. Nat. Cell Biol. 9, 1327-1334 (2007)を参照］。さらに、非同期状態において、局所的な強い非同期状態あるとき、その非同期状態は安定化し継続する（強い非同期状態の継続効果がある）ことが知られている。局所的な強い非同期状態とは、例えば、トポロジカルチャージ（ＴＣ）が多数生じているような場合が挙げられる。トポロジカルチャージとは、ある点の周囲の細胞の概日リズムの位相が、例えば、異なる４つ以上の位相である場合におけるその点（位相特異点）を意味する。
【００２２】
本発明の効果は、植物を構成する複数の細胞の概日リズムのバラツキが大きくなることにより発揮され、特にＴＣが多数生じている場合により効果的に発揮されると考えられる。
【００２３】
栽培対象となる植物としては、特に限定されないが、例えば、食用のための植物や観賞用の植物、薬用植物が挙げられる。植物は、好ましくは食用のための植物であり、より好ましくは生育期間が短い食用のための植物である。食用のための植物としては、レタス、小松菜、ホウレンソウ、キュウリ、トマト、ピーマン、サンチュ、水菜、春菊等の野菜類；ルッコラ、バジル等のハーブ類、イチゴ、ミカン、マンゴー、ブドウ、ナシ等の果物類；コメ、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、トウモロコシ、モロコシ、アワ、ヒエ、キビ等の穀類が例示される。観賞用の植物としては、バラ、カーネーション、洋ラン、ガーベラ、トルコキキョウ等の花卉類；ポトス、セローム、アジアンタム等の観葉植物等が例示される。薬用植物としては、シソ、高麗人参、アロエ、トウキ、ツボクサ、甘草、センブリなどが例示される。
【００２４】
上記のような明暗サイクルの具体的な制御例について、以下に実施形態を挙げて説明する。
【００２５】
＜実施形態１＞
本実施形態においては、明暗サイクルは複数の細胞に対して一様である。そして、暗期は、植物の主観的時刻において、複数の細胞の概日リズムのバラツキが最も大きくなる時刻の前後２時間のうちの少なくとも一部の時間を含むように設定される。
【００２６】
暗期は、例えば、下記の（Ａ）工程および（Ｂ）工程によって定められた目標位相に相当する主観的時刻の前後２時間のうちの少なくとも一部の時間を含むように設定される。
（Ａ）  明暗サイクルが明期のみからなる場合に対して、明暗サイクルにおいて概日リズムの各々の位相から始まる単回の暗期を設けた場合における位相のシフト量から、暗期が始まる位相に対する位相のシフト量の変化を示す位相応答曲線を求める工程
（Ｂ）  （Ａ）で求められた位相応答曲線の微分曲線を求め、微分曲線において最大値を与える位相を目標位相として定める工程
【００２７】
（Ａ）工程としては、例えば、ダークパルス（暗期）の開始位相（植物の主観的時刻における開始時刻に相当する位相）に対する位相応答曲線Ｇ（φ）を得る。なお、位相応答曲線Ｇ（φ）は、ダークパルスの種類（条件）によって変化するため、ダークパルスの種類毎に得る必要がある。
【００２８】
（Ｂ）工程の一例（数理解析による方法）としては、（Ａ）工程で得た位相応答曲線の微分ｄＧ（φ）／ｄφを算出し、ｄＧ（φ）／ｄφが最大となる位相（目標位相φ＊）を算出する。このようにして、目標位相（φ＊）が定められる。
【００２９】
図４（ａ）は、明暗サイクルに単回の２時間（Δｔ＝２時間）の暗期（ダークパルス）を設けた場合についての位相応答曲線Ｇ（φ）の一例を示す図である。位相応答曲線において、縦軸は位相シフト量（ｒａｄ／２π）を示し、横軸は暗期（ダークパルス）の開始時刻（主観的時刻）に相当する位相（ｒａｄ／２π）を示す。位相シフト量とは、明暗サイクルが明期のみからなる場合に対して、明暗サイクルにおいて概日リズムの各々の位相から始まる単回の暗期を設けた場合における位相のシフト量（変化量）である。
【００３０】
なお、図４（ａ）は、フリーラン周期が２３時間である植物について実験によって得たものである。「フリーラン周期」とは、連続照明条件または連続暗条件下において観察される概日リズムの固有の周期を意味する。
【００３１】
図４（ｂ）のグラフは、図４（ａ）の位相応答曲線Ｇ（φ）から求めたグラフであり、暗期（ダークパルス）前の（概日リズムにおける）位相と暗期後の位相との関係を示す曲線を示している。この曲線の傾きが最も大きい位置（図４（ａ）の微分曲線の最大値に相当する位置であり、図４（ｂ）で「位相差拡散」と記載された位置）では、暗期を設けることによって細胞間の位相（概日リズム）の差が最も広がる。このような位置（位相）に相当する植物の概日リズムにおける主観的時刻に近い時刻に、暗期（ダークパルス）を設定することで、植物を構成する複数の細胞の体内時計における概日リズムの（位相の）バラツキを大きくすることができる。なお、図４（ｂ）で「位相差収束」と記載された位置に暗期を設けた場合は、逆に細胞間の概日リズムのバラツキが小さくなるため、本発明においては、このような位置（位相）に暗期を設けることは望ましくないと考えられる。
【００３２】
したがって、暗期（ダークパルス）を、このような細胞間の概日リズムのバラツキが最大となる位相（目標位相φ＊）に相当する主観的時刻を含むように設定することで、概日リズムの細胞間のバラツキが増大する。これにより、作用機序は明らかではないものの、意外にも植物がストレス耐性を獲得すると考えられる。
【００３３】
（Ｂ）工程の別の一例（数値シミュレーションによる方法）としては、（Ａ）工程で得た位相応答曲線Ｇ（φ）に基づいて、２次元振動子モデル（Fukuda  H.,  et  al.:  Synchronization  of  Plant  Circadian  Oscillators  with  a  Phase  Delay  Effect  of  the  Vein  Network.  Physical  Review  Letters  99:098102,  2007）を用いた数値シミュレーションを行い、位相シフトが最大となる目標位相（φ＊）を算出することができる。この場合、さらに、ダークパルスの入力回数（Ｎ）、入力周期（Ｔ）等の最適値を算出することもできる。
【００３４】
次に、上記の（Ａ）工程および（Ｂ）工程で得られた目標位相（φ＊）値に相当する植物の主観的時刻を含むように、暗期が設定される。なお、概日リズムにおける位相とは、例えば、概日リズムが式［Ａｃｏｓ（ωｔ＋φ０）］で表される場合のφ＝ωｔ＋φ０に相当する。なお、式中、Ａは概日リズムの振幅、ωは概日リズムの固有振動数（＝２π／固有周期）、ｔは時間、φ０は初期位相である。そして、例えば、図４（ａ）において、位相φ＝０（ｒａｄ／２π）が主観的時刻の朝（明期の開始）に相当し、φ＝０．２５（ｒａｄ／２π）が主観的時刻の正午頃に相当し、φ＝０．５（ｒａｄ／２π）が主観的時刻の夕方頃に相当し、位相φ＝０．７５（ｒａｄ／２π）が植物の主観的時刻の午前０時頃に相当する（図８参照）。
【００３５】
ここで主観的時刻とは、明期の開始時刻に相当する時刻を０：００とし、概日リズムの固有の周期をちょうど２４時間に見立てて、それを２４等分した時刻を意味する。主観的時刻は、概日時刻ともいう。
【００３６】
概日リズムの測定方法は上記のように既に公知である。また、位相応答曲線を求める方法も公知である（例えば、特許第６０１２９２８号公報参照）。位相応答曲線は、連続照明下における概日リズムの位相と、連続照明下において単回のダークパルスを付与した場合における概日リズムの位相との差（位相シフト量）と、ダークパルスを与える概日リズムの位相との関係を示す曲線である。なお、単回のダークパルスの付与により、植物の概日リズムの位相がシフトすることも公知である。
【００３７】
なお、ダークパルスの強度が弱くなると位相応答曲線のピークは低くなり、ダークパルスの強度が強くなると位相応答曲線の描く高さは高くなる。ダークパルスがある強度より強くなると、位相応答曲線は発散し、図４（ａ）に示されるような連続性のある曲線を描かなくなる。位相応答曲線が発散しても、図４（ｂ）を用いた上記の説明と同様にして、概日リズムのバラツキを増大する目標位相φ＊を決めることができる。
【００３８】
ダークパルスの強度は、暗期の時間、暗期と明期との光量の差、暗期の周期（回数）などによって決まる。暗期の時間が長い程（パルス幅Δｔ’が大きい程：図１および図２（ａ）参照）、暗期と明期との光量の差が大きい程（パルス振幅Ｉｐ’が大きい程：図１、図２（ｂ）および図３参照）、暗期の周期が短い程（暗期の回数が多い程）、ダークパルスの強度は強くなる。
【００３９】
暗期の時間は、好ましくは４時間以下であり、より好ましくは３時間以内であり、さらに好ましくは２時間以内である。この場合、ダークパルスの強度が、位相シフトが生じる範囲内の強度になり易い。
【００４０】
＜実施形態２＞
本実施形態においては、明暗サイクルは複数の細胞に対して一様でない。すなわち、複数の細胞のうちの少なくとも一部の細胞に対して、他の細胞とは異なる明暗サイクルが設定される。これにより、直接的に複数の細胞の概日リズムのバラツキを大きくすることができる。
【００４１】
このように、直接的に個々の細胞に対する明暗サイクルを異ならせることで、植物を構成する複数の細胞の概日リズムのバラツキを大きくする方法（局所制御法）としては、特に限定されないが、例えば、Seki  N.,  et  al.:  Entrainment  of  Cellular  Circadian  Rhythms  in  Lactuca  sativa  L.  Leaf  by  Spatially  Controlled  Illuminations.  J  Biosens  Bioelectron  6:  1000186,  2015に開示されたプロジェクタ光を用いる方法などが利用できる。
【００４２】
（栽培装置）
本発明のストレス耐性植物の製造方法に用いられる装置（植物栽培装置）は、例えば、植物を収容する筐体と、植物を栽培するための光（光）を照射する光源と、光源の点灯を制御する光源制御手段を備える。植物を収容する筐体は、人工的に制御された栽培環境が維持可能であれば、その構成は問われない。また、植物栽培装置は、植物を収容する空間内の湿度や温度を管理する空調設備、植物栽培用の培地を供給する培養設備などを備えていてもよい。
【００４３】
光源はＬＥＤや蛍光灯などから構成され、植物の生育に必要な波長の光を照射する。光源は固定された波長の光を照射する光源や複数の波長の光を照射する光源であり得る。照射する光の波長を制御可能な光源が好ましく用いられる。植物の成長は照射される光の波長によって影響されることも知られており、光の波長は適宜選択される。
【００４４】
光源制御手段は、例えばＲＡＭやハードディスク装置などの記憶装置、タイマー、光源のオンオフや光源の切り替えを行うスイッチ装置、キーボードやタッチセンサーなどの入力装置、これらを制御するためのコンピュータ装置などが適宜組み合わせて構成される。上記ストレス耐性植物の製造方法に従った明暗サイクル、および、栽培中の温度、湿度などの栽培に必要な情報は、例えば、入力装置から入力され、記憶装置に記憶される。光源制御手段は、入力された明暗サイクルに従って、光源のオンオフないし光量調整を行い、必要により光源を切り替える。
【００４５】
植物栽培装置は、さらに植物の体内時計の時刻（主観的時刻）を表示する時計（時刻表示装置）を備えていてもよい。
【実施例】
【００４６】
［実験例１］  塩ストレス耐性付与試験
植物として、レタス（フリルアイス）を用いて、以下の試験を行った。なお、試験中、温度は２２．０℃に維持された。
【００４７】
（播種）
レタス（フリルアイス）の種をスポンジ培地（水を含有するウレタンスポンジ）に播種後、１週間インキュベータ（光源：蛍光灯）で育苗した。なお、蛍光灯のＰＰＦＤ（光合成光量子束密度）は７０〜１００μｍｏｌｍ−２ｓ−１とした。
【００４８】
（定植）
上記の育苗後、濃度を調整した塩水にレタスを移植した。定植後、以下の明暗サイクルでの栽培を行った。なお、光源としては、ＬＥＤを用い、ＰＰＦＤ（光合成光量子束密度）は１８０μｍｏｌｍ−２ｓ−１とした。定植後の栽培において、ＣＯ２濃度は１０００ｐｐｍであり、湿度は５０％であった。定植後、水が少なくなったら、新しく作成した塩水と交換した。塩水の塩分濃度は、０，１００，２００ｍＭ（Ｎ＝６）および５０ｍＭ（Ｎ＝２８）とした。
【００４９】
（明暗サイクル）
実施例１は、植物の主観的時刻１０：３９（位相０．４４ｒａｄ／２π）から２時間の暗期刺激（ダークパルス：ＤＰ）を２４時間ごとに５回照射し（ＤＰ条件）、その後は恒明条件とした。このときの暗期は、実施形態１で説明した（Ａ）工程および（Ｂ）工程によって求められた目標位相φ＊（０．４８５ｒａｄ／２π）に相当する主観的時刻（１１：３８）の前後２時間のうちの少なくとも一部の時間を含んでいる。
比較例１は、恒明（連続照明）条件（ＬＬ条件）とした。
【００５０】
図５に、１回目のダークパルスの入力開始から３０時間後の結果（図５（ａ）の写真、図５（ｂ）の葉面積のグラフ）を示す。また、図６に、１５日後の結果（図６（ａ）の写真、図６（ｂ）の重量のグラフ）を示す。なお、図５の葉面積は、色彩情報に基づく画像解析によって測定した。図６における重量は、収穫した直後の植物の地上部の生重量である。
【００５１】
図５および図６に示される結果（特に、図６（ｂ）の塩水濃度５０および１００ｍＭの場合のグラフ）から、実施例１の本発明の明暗サイクルで栽培された苗は、比較例１と比べて、塩水（塩ストレス）に対する耐性が有意に高いことが分かる。生育が促進されることが確認された。したがって、本発明の製造方法によって製造されたストレス耐性植物（ストレス耐性苗）は、環境ストレスに耐性を有することで、ストレス条件においても生育が維持されると考えられる。
【００５２】
なお、塩水での培養による植物の耐性への影響も考えられるが、これまでのところ、植物を塩水で培養することで、植物がストレス耐性を獲得したという報告はない。また、共に塩水で培養が行われた実施例と比較例とで、耐性の結果に差が認められたため、塩水での培養によって植物にストレス耐性が付与されたのではなく、実施例１の明暗サイクルにより植物にストレス耐性が付与されたと考えられる。
【００５３】
一般に塩ストレスは乾燥ストレス（浸透圧ストレス）とみなすことができる。また、海水の塩分濃度は６００ｍＭであり、塩分濃度２００ｍＭは一般には植物の致死量である。
【００５４】
［実験例２］  連続照明ストレス耐性付与試験
植物として、シロイヌナズナ（A.thaliana：野生株  Ｃｏｌ−０）およびレタス（フリルアイス）を用いて、以下の試験を行った。なお、試験中、温度は２２．０℃に維持された。
【００５５】
（播種）
シロイヌナズナは、ＭＳ培地に播種後、２週間インキュベータで育苗した。レタス（フリルアイス）は、スポンジ培地（水耕養液を含有するウレタンスポンジ）に播種後、１週間インキュベータ（光源：蛍光灯）で育苗した。なお、蛍光灯のＰＰＦＤ（光合成光量子束密度）は１００μｍｏｌｍ−２ｓ−１とした。
【００５６】
（定植）
培養液として、大塚Ａ処方（ＥＣ  ０．２ｍＳ／ｃｍ，ｐＨ６．０）を使用し、シロイヌナズナはＭＳ培地からスポンジ培地に移植し、フリルアイスはそのままで、定植した。定植後、以下の明暗サイクルでの水耕栽培を行った。なお、光源としては、ＬＥＤを用い、ＰＰＦＤは１８０μｍｏｌｍ−２ｓ−１とした。定植後の栽培において、ＣＯ２濃度は１０００ｐｐｍであり、湿度は５０％であった。
【００５７】
（明暗サイクル）
実施例２（シロイヌナズナ：Ｎ＝４２，レタス：Ｎ＝４２）として、植物の主観的時刻１１：３９（位相０．４９ｒａｄ／２π）から２時間の暗期刺激（ダークパルス）を２４時間ごとに７回照射し（ＤＰ条件）、その後は恒明条件とした。このときの暗期は、実施形態１で説明した（Ａ）工程および（Ｂ）工程によって求められた目標位相φ＊（０．４８５ｒａｄ／２π）に相当する主観的時刻（１１：３８）の前後２時間のうちの少なくとも一部の時間を含んでいる。を含んでいる。
比較例２（シロイヌナズナ：Ｎ＝４２，レタス：Ｎ＝４２）は、恒明条件（ＬＬ条件）とした。
【００５８】
図７に、１回目のダークパルスの入力開始から１５日後の結果（重量のグラフ）を示す。なお、図７における重量は、収穫した直後の植物の地上部の重量である。図７に示される結果から、実施例２の本発明の明暗サイクル（ＤＰ条件）で栽培された苗は、比較例２と比べて、生育が促進されることが確認された。したがって、本発明の製造方法によって製造されたストレス耐性植物（ストレス耐性苗）は、恒明（連続照明）条件がもたらす環境ストレスに耐性を有する。
【００５９】
［実施例３］
（各種遺伝子発現の解析）
シロイヌナズナについて発現量の変動と機能を基に分類された遺伝子のデータベース（ＴＡＩＲ：The  Arabidopsis  Information  Resource、ＳＴＩＦＤＢ：Stress Responsive TranscrIption Factor Database）などがあり、この中から、老化、ストレスおよび分化に関与する遺伝子群を選択した。選択した遺伝子群について、本発明のストレス耐性植物の製造方法を適用した場合（ＴＣ形成）と、適用しなかった場合（ＴＣ非形成）とで、その発現量の変動を解析し、発現量が異なる遺伝子群を抽出した。その結果、老化に関与する遺伝子は２１５個、ストレスに関与する遺伝子は２１３個、分化に関与する遺伝子は８５個であった。また、ストレスおよび分化に関与せず老化のみに関与する遺伝子は１５２個であり、老化および分化に関与せずストレスのみに関与する遺伝子は１３９個であった。これらの遺伝子発現データの解析結果から、本発明のストレス耐性植物の製造方法は、多くの植物に共通する多くの遺伝子に影響を与えることが分かる。したがって、本発明のストレス耐性植物の製造方法によれば、種々の植物種についてストレス耐性植物を製造できると考えられる。
【００６０】
上述のシロイヌナズナの遺伝子のデータベースの中から、ストレスに関与する遺伝子群（ストレス関連遺伝子群）を選択した。そのストレス関連遺伝子群について、本発明のストレス耐性植物の製造方法を適用した場合（ＴＣ形成）と、適用しなかった場合（ＴＣ非形成）とで、その発現量の変動を解析し、発現量が異なる遺伝子群を抽出した。その結果、気孔開閉関連遺伝子が３１個、塩・乾燥関連遺伝子が１２３１個、光応答関連遺伝子が５１１個など、がＴＣ形成個体で有意（発現量が２倍以上の差）に変動していた。これらの遺伝子発現データの解析結果から、本発明のストレス耐性植物の製造方法は、多くのストレス関連遺伝子に影響を与えることが分かる。したがって、本発明のストレス耐性植物の製造方法によれば、種々のストレスに対して耐性を有するストレス耐性植物を製造できると考えられる。
【００６１】
今回開示された実施形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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