(57)【要約】      （修正有）【課題】生来型の遺伝子操作されていないIgGに対する利用し易い二重細胞傷害性薬物コンジュゲート技術の提供。【解決手段】抗体および８個の共有結合された連結アセンブリ単位（LA）を含む多剤抗体薬物コンジュゲート（MD-ADC）であって、「直交的な」脱保護および薬物付加を介して部位特異的様式で構築される、MD-ADC。「直交的な」脱保護ならびにMD-ADCおよびLA単位の構築を可能にする、保護された連結アセンブリ単位。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体および8個の共有結合された連結アセンブリ単位（LA）を含む多剤抗体薬物コンジュゲート（MD-ADC）であって、該8個の共有結合された連結アセンブリ単位のそれぞれが、該抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じるチオールに結合し、かつ該共有結合された連結アセンブリ単位のそれぞれが、それに結合している2〜4個の薬物部分、および任意的分配剤（Y）を有する、上記抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２】
2種類の薬物部分が結合し、それらが第1の抗癌剤および第2の抗癌剤である、請求項1に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項３】
第1および第2の抗癌剤が、補完的活性プロフィールを有する、請求項2に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項４】
前記2種類の薬物部分がMMAEおよびMMAFである、請求項2に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項５】
2種類の薬物部分が結合し、それらがカンプトテシンおよびドキソルビシンである、請求項1に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項６】
前記連結アセンブリ単位が、分配剤をさらに含む、請求項1に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項７】
前記分配剤がポリエチレングリコール単位である、請求項6に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項８】
前記分配剤がシクロデキストリン単位である、請求項6に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項９】
式（I）の構造：
【化１】
2018118953.tif 000073
［式中：
Abは、非遺伝子操作型抗体である抗体であり；
Tは、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じるチオールに結合する係留基であり；
Q1は、第1の結合基であり；
Q2は、第2の結合基であり；
Xは、結合基リンカーであり；
D1は、第1の薬物部分であり；
D2は、第2の薬物部分であり；
L1は、D1とQ1とをつなぐ任意的連結基であり；
L2は、D2とQ2とをつなぐ任意的連結基であり；
下付き文字m1およびm2は、それぞれ独立に0および1から選択され；
Yは、L、Q1、X、Q2、L1またはL2上の部位に結合する分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である。］
を有する、請求項1に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１０】
Q1は、Q1中に存在するチオールにL1を介して結合したD1を有するシステイン基であり；かつQ2は、Q2中に存在するチオールにL2を介して結合したD2を有するシステイン基である、請求項9に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１１】
nが0である、請求項9に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１２】
nが1であり、かつYがポリエチレングリコール基を含む、請求項9に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１３】
Xがアミノ酸またはジペプチドもしくはトリペプチドである、請求項9に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１４】
X中に存在する各アミノ酸が、グリシンおよびアラニンからなる群より選択される、請求項13に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１５】
Tが自己安定化リンカーアセンブリである、請求項9に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１６】
L1およびL2のそれぞれが、マレイミド-カプロイル（mc）、マレイミド-カプロイル-バリン-シトルリン（mc-vc）、マレイミド-カプロイル-バリン-シトルリン-パラアミノベンジルオキシカルボニル（mc-vc-PABC）およびマレイミドジアミノプロピオニル-バリン-シトルリン（MDPr-vc）から独立に選択される、請求項9に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１７】
nが0であり、かつL1およびL2のうちの少なくとも一方が、結合された分配剤（Y）を含む、請求項9に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１８】
以下の構造：
【化２】
2018118953.tif 000074
［式中、P1はポリエチレングリコール基である。］
を有する、請求項9に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１９】
L1およびL2のそれぞれが、マレイミド-カプロイル（mc）、マレイミド-カプロイル-バリン-シトルリン（mc-vc）、およびマレイミド-カプロイル-バリン-シトルリン-パラアミノベンジルオキシカルボニル（mc-vc-PABC）からなる群より独立に選択される、請求項18に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２０】
D1およびD2が、MMAE、アウリスタチンT、MMAFおよびドラスタチン10からなる群より独立に選択される、請求項18に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２１】
D1およびD2が、MMAE、カンプトテシン、スペルドクス（Superdox）、ドラスタチン10、ビンブラスチンおよびシプロフロキサシンからなる群より独立に選択される、請求項18に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２２】
抗体および8個の共有結合された連結アセンブリ単位（LA）を含む多剤抗体薬物コンジュゲート（MD-ADC）であって、該8個の共有結合されたLA単位のそれぞれが、該抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じるチオールに結合し、かつ該共有結合されたLA単位のそれぞれが、それに結合している3個の薬物部分を有し、該薬物部分が第1の薬物部分（D1）と第2の薬物部分（D2）との2：1モル比で存在する、請求項1に記載の多剤抗体薬物コンジュゲート（MD-ADC）。
【請求項２３】
式（II）の構造：
【化３】
2018118953.tif 000075
［式中：
Abは、非遺伝子操作型抗体である抗体であり；
Tは、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じるチオールに結合する係留基であり；
Q1は、第1の結合基であり；
Q2は、第2の結合基であり；
Xは、結合基リンカーであり；
D1は、第1の薬物部分であり；
D2は、第2の薬物部分であり；
L1は、D1とQ1とをつなぐ任意的連結基であり；
L2は、D2とQ2とをつなぐ任意的連結基であり；
下付き文字m1およびm2は、それぞれ独立に0および1から選択され；
Yは、L、Q1、X、Q2、L1またはL2上の部位に結合する分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である。］
を有する、請求項22に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２４】
式（III）の構造：
【化４】
2018118953.tif 000076
［式中：
Abは、非遺伝子操作型抗体である抗体であり；
Tは、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じるチオールに結合する係留基であり；
各Q1は、独立に選択される第1の結合基であり；
Q2は、第2の結合基であり；
X1およびX2は、それぞれ結合基リンカーであり；
D1は、第1の薬物部分であり；
D2は、第2の薬物部分であり；
各L1は、D1とQ1とをつなぐ任意的連結基であり；
L2は、D2とQ2とをつなぐ任意的連結基であり；
下付き文字m1およびm2は、それぞれ独立に0および1から選択され；
Yは、L、Q1、X1、X2、Q2、L1またはL2上の部位に結合する分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である。］
を有する、請求項22に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２５】
式（IV）の構造：
【化５】
2018118953.tif 000077
［式中：
Abは、非遺伝子操作型抗体である抗体であり；
Tは、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じるチオールに結合する係留基であり；
Q1は、独立に選択される第1の結合基であり；
各Q2は、第2の結合基であり；
X1およびX2は、それぞれ結合基リンカーであり；
D1は、第1の薬物部分であり；
D2は、第2の薬物部分であり；
L1は、D1とQ1とをつなぐ任意的連結基であり；
各L2は、D2とQ2とをつなぐ任意的連結基であり；
下付き文字m1およびm2は、それぞれ独立に0および1から選択され；
Yは、L、Q1、X1、X2、Q2、L1またはL2上の部位に結合する分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である。］
を有する、請求項22に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２６】
D1およびD2が、MMAE/MMAF、MMAE/カンプトテシン、スペルドクス/カンプトテシン、スペルドクス/MMAE、ドラスタチン10/MMAE、ドラスタチン10/MMAF、ビンブラスチン/MMAE、ビンブラスチン/MMAF、および    からなる群より選択される薬物ペアである、請求項9〜23のいずれか1項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２７】
式（Ia）を有する連結アセンブリ単位：
【化６】
2018118953.tif 000078
[式中、
Tは、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じるチオールに結合できる係留基であり；
Q1は、第1の結合基であり；
Q2は、第2の結合基であり；
Xは、結合基リンカーであり；
D1は、第1の薬物部分であり；
D2は、第2の薬物部分であり；
L1は、D1とQ1とをつなぐ任意的連結基であり；
L2は、D2とQ2とをつなぐ任意的連結基であり；
下付き文字m1およびm2は、それぞれ独立に0および1から選択され；
Yは、L、Q1、X、Q2、L1またはL2上の部位に結合する分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【請求項２８】
式（IIa）を有する連結アセンブリ単位：
【化７】
2018118953.tif 000079
[式中、
Tは、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じるチオールに結合できる係留基であり；
Q1は、第1の結合基であり；
Q2は、第2の結合基であり；
Xは、結合基リンカーであり；
D1は、第1の薬物部分であり；
D2は、第2の薬物部分であり；
L1は、D1とQ1とをつなぐ任意的連結基であり；
L2は、D2とQ2とをつなぐ任意的連結基であり；
下付き文字m1およびm2は、それぞれ独立に0および1から選択され；
Yは、L、Q1、X、Q2、L1またはL2上の部位に結合する分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【請求項２９】
式（IIIa）を有する連結アセンブリ単位：
【化８】
2018118953.tif 000080
[式中、
Tは、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じるチオールに結合できる係留基であり；
Q1は、第1の結合基であり；
Q2は、第2の結合基であり；
X1およびX2は、それぞれ結合基リンカーであり；
D1は、第1の薬物部分であり；
D2は、第2の薬物部分であり；
L1は、D1とQ1とをつなぐ任意的連結基であり；
L2は、D2とQ2とをつなぐ任意的連結基であり；
下付き文字m1およびm2は、それぞれ独立に0および1から選択され；
Yは、L、Q1、X1、Q2、X2、L1またはL2上の部位に結合する分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【請求項３０】
式（IVa）を有する連結アセンブリ単位：
【化９】
2018118953.tif 000081
[式中、
Tは、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じるチオールに結合できる係留基であり；
Q1は、第1の結合基であり；
Q2は、第2の結合基であり；
X1およびX2は、それぞれ結合基リンカーであり；
D1は、第1の薬物部分であり；
D2は、第2の薬物部分であり；
L1は、D1とQ1とをつなぐ任意的連結基であり；
L2は、D2とQ2とをつなぐ任意的連結基であり；
下付き文字m1およびm2は、それぞれ独立に0および1から選択され；
Yは、L、Q1、X1、Q2、X2、L1またはL2上の部位に結合する分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【請求項３１】
Lがマレイミド基を含む、請求項27、28、29または30のいずれか1項に記載の連結アセンブリ単位。
【請求項３２】
Lがマレイミド基を含み、かつX、X1、X2、Q1、およびQ2のそれぞれがアミノ酸である、請求項27、28、29または30のいずれか1項に記載の連結アセンブリ単位。
【請求項３３】
nが0であり、かつYが不在である、請求項32に記載の連結アセンブリ単位。
【請求項３４】
nが0であり、Yが不在であり、かつL1およびL2のそれぞれが、マレイミド-カプロイル（mc）、マレイミド-カプロイル-バリン-シトルリン（mc-vc）、およびマレイミド-カプロイル-バリン-シトルリン-パラアミノベンジルオキシカルボニル（mc-vc-PABC）からなる群より独立に選択される、請求項32に記載の連結アセンブリ単位。
【請求項３５】
Tが自己安定化リンカーである、請求項32に記載の連結アセンブリ単位。
【請求項３６】
TがMDPr-vcリンカーである、請求項32に記載の連結アセンブリ単位。
【請求項３７】
式（Ib）を有する直交的に保護されたADCリンカー：
【化１０】
2018118953.tif 000082
[式中、
Tは、末端マレイミド部分を有する係留基であり；
Q1は、第1のシステイン部分を含む第1の結合基であり；
Q2は、第2のシステイン部分を含む第2の結合基であり；
Xは、結合基リンカーであり；
P1は、第1のチオール保護基であり；
P2は、第2のチオール保護基であり、かつP1とP2とは異なり；
Yは、L、Q1、XまたはQ2に結合する分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【請求項３８】
式（IIb）を有する直交的に保護されたADCリンカー：
【化１１】
2018118953.tif 000083
[式中、
Tは、末端マレイミド部分を有する係留基であり；
Q1は、第1のシステイン部分を含む第1の結合基であり；
Q2は、第2のシステイン部分を含む第2の結合基であり；
Xは、結合基リンカーであり；
P1は、第1のチオール保護基であり；
P2は、第2のチオール保護基であり、かつP1とP2とは異なり；
Yは、L、Q1、XまたはQ2に結合する分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【請求項３９】
式（IIIb）を有する直交的に保護されたADCリンカー：
【化１２】
2018118953.tif 000084
[式中、
Tは、末端マレイミド部分を有する係留基であり；
Q1は、第1のシステイン部分を含む第1の結合基であり；
Q2は、第2のシステイン部分を含む第2の結合基であり；
Xは、結合基リンカーであり；
P1は、第1のチオール保護基であり；
P2は、第2のチオール保護基であり、かつP1とP2とは異なり；
Yは、L、Q1、XまたはQ2に結合する分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【請求項４０】
式（IVb）を有する直交的に保護されたADCリンカー：
【化１３】
2018118953.tif 000085
[式中、
Tは、末端マレイミド部分を有する係留基であり；
Q1は、第1のシステイン部分を含む第1の結合基であり；
Q2は、第2のシステイン部分を含む第2の結合基であり；
X1およびX2は、それぞれ結合基リンカーであり；
P1は、第1のチオール保護基であり；
P2は、第2のチオール保護基であり、かつP1とP2とは異なり；
Yは、L、Q1、XまたはQ2に結合する分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【請求項４１】
P1が-S-イソプロピル（SiPr）、-S-tert-ブチル（StBu）、および-S-メチル（SMe）からなる群より選択され；かつP2が-CH2NH-C(O)CH3（アセトアミドメチル）である、請求項37、38、39、または40のいずれか1項に記載の直交的に保護されたADCリンカー。
【請求項４２】
TがMDPr-Val-Cit-であり；P1が-S-イソプロピル（SiPr）、-S-tert-ブチル（StBu）、および-S-メチル（SMe）からなる群より選択され；かつP2が-CH2NH-C(O)CH3（アセトアミドメチル）である、請求項37、38、39、または40のいずれか1項に記載の直交的に保護されたADCリンカー。
【請求項４３】
Xがグリシンおよびアラニンからなる群より選択され；TがMDPr-Val-Cit-であり；P1が-S-イソプロピル（SiPr）、-S-tert-ブチル（StBu）、および-S-メチル（SMe）からなる群より選択され；かつP2が-CH2NH-C(O)CH3（アセトアミドメチル）である、請求項37、38、39、または40のいずれか1項に記載の直交的に保護されたADCリンカー。
【請求項４４】
TがMDPr-Val-Cit-であり；Q1およびQ2がそれぞれシステインであり；Xがグリシンであり；P1が-S-イソプロピル（SiPr）、-S-tert-ブチル（StBu）、および-S-メチル（SMe）からなる群より選択され；かつP2が-CH2NH-C(O)CH3（アセトアミドメチル）である、請求項37、38、39、または40のいずれか1項に記載の直交的に保護されたADCリンカー。
【請求項４５】
TがMDPr-Val-Cit-であり；Q1およびQ2がそれぞれシステインであり；Xがグリシンであり；P1が-S-イソプロピル（SiPr）、-S-tert-ブチル（StBu）、および-S-メチル（SMe）からなる群より選択され；P2が-CH2NH-C(O)CH3（アセトアミドメチル）であり；下付き文字nが1であり、かつYがPEG基またはシクロデキストリン基を含む、請求項37、38、39、または40のいずれか1項に記載の直交的に保護されたADCリンカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、多剤抗体薬物コンジュゲート（MD-ADC）に関する。
【０００２】
関連出願との相互参照
本出願は、2016年12月14日出願の米国特許仮出願第62/434,333号（その内容が、すべての目的に関して援用される）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
抗体-薬物コンジュゲート（ADC）は、モノクローナル抗体の腫瘍標的化特性を、細胞傷害性弾頭の強力な細胞殺傷活性と組み合わせる。ADCの近年の臨床的成功に部分的には起因して、再発ホジキンリンパ腫および未分化大細胞リンパ腫でのブレンツキシマブ・ベドチン（アドセトリス）、ならびにHER2陽性転移性乳癌でのアド-トラスツズマブ・エムタンシン（ado-trastuzumab mertansine）（カドサイラ）の承認をはじめとする、新規ADC製剤の設計に対して、急激に関心が高まって来ている[1]。これらの新規な手段の大部分は、不均一な薬物の付加、限定的な薬物-リンカーの安定性、および一部のセットの癌タイプに限定される活性を有する弾頭などの、既存の臨床的分子の欠点の一部を解決することに焦点が当てられている。改善されたADCを可能にするために、この分野では多大な目覚ましい進歩がなされてきた。これらのものとしては、均一な薬物付加を可能にする部位特異的薬物-リンカーコンジュゲート化戦略、改善された安定性を有する薬物-リンカーの結合様式、強力な新規ペイロード、および別の放出メカニズムを利用するリンカー戦略が挙げられる[1c、2]。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】R. P. Lyon, J. R. Setter, T. D. Bovee, S. O. Doronina, J. H. Hunter, M. E. Anderson, C. L. Balasubramanian, S. M. Duniho, C. I. Leiske, F. Li, P. D. Senter, Nat. Biotechnol. 2014, 32, 1059-1062.
【非特許文献２】S. O. Doronina, B. E. Toki, M. Y. Torgov, B. A. Mendelsohn, C. G. Cerveny, D. F. Chace, R. L. DeBlanc, R. P. Gearing, T. D. Bovee, C. B. Siegall, J. A. Francisco, A. F. Wahl, D. L. Meyer, P. D. Senter, Nat. Biotechnol. 2003, 21, 778-784.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ほとんどすべての有効な癌化学療法は、不均一な腫瘍細胞集団内での薬物感受性の差異を克服するために設計されている、補完的な薬物の組み合わせを用いる[3]。この戦略が、近年ADCにも応用され、ADCは現在、コンジュゲート化されていない、臨床的に承認されている抗癌剤と組み合わせて試験されている[4]。加えて、ADCに関する新しい臨床データおよび前臨床データは、特定のADCに対する不感受性が、同じ抗体を用いて別の弾頭を送達することにより克服できることを実証している[5]。これらの理由から、ADC内での補完的薬物ペイロードが、標的化型薬物送達の分野での著明な進歩に貢献するであろうと考えられる。ここで、本発明者らは、生来型の遺伝子操作されていないIgGに対する利用し易い二重細胞傷害性薬物コンジュゲート技術を説明し、フォールディングされているタンパク質に対する直交的チオール保護基の最初の利用を実証する。本発明者らは、二重薬物ADCが、従来のADCと比較して増強されたin vitroおよびin vivo活性を有することを実証する最初のデータを提示する。
【０００６】
補完的な生理化学的特性を有する2種類の異なる非常に強力なアウリスタチン（auristatin）分子のコンジュゲート化は、不均一な細胞集団に対するADC活性を強化するための魅力的な経路を示す。一般的に用いられるアウリスタチン薬物-リンカーとしては、mc-MMAF (1)、mc-vc-MMAF (2)、およびmc-vc-MMAE (3)が挙げられる。mc-vc-MMAE薬物リンカーから放出される薬物であるモノメチルアウリスタチンE（MMAE）は細胞透過性であり、かつ、バイスタンダー活性、または隣接する抗原陰性細胞の殺傷を示す[7]。しかしながら、MMAEはまたMDR排出因子に対する基質でもあり、ポンプを高発現する細胞に対しては減弱した活性を有する[8]。逆に、mc-vc-MMAF ADCおよびmc-MMAF ADCからそれぞれ放出されるMMAFおよびcys-mcMMAFは薬物排出に対して感受性ではなく、MDR(+)細胞に対する活性を保持するが、細胞透過性は最小限である[7b、9]。つまり、それらは、バイスタンダー活性を示さず、抗原陰性腫瘍細胞に対してはほとんど活性を有しない。本発明者らは、これらのタイプの薬物の特徴を組み合わせることにより、癌に対して補完的な活性を提供することができ、それにより増強された細胞傷害性プロフィールを有するADCを得ることができると推論した。
【０００７】
現在、多剤コンジュゲートの1種類の例のみが報告されているが、この研究は抗体Fab断片に対して行われ、コンジュゲート化部位の部位特異的な区別を可能にするために、遺伝子操作されたシステイン残基の遺伝学的導入を必要とするものであった[10]。2種類の異なる薬剤を抗体に対して部位特異的にコンジュゲート化するための多数の他のアプローチが提示されている（最近、参考文献[11]に総説された）が、これらの方法のうちの大部分が、部位特異的アミノ酸突然変異を含む特別な試薬またはカスタムされた酵素を必要とし、2種類の別々のコンジュゲート化ハンドルを必要とする場合もある。これらの因子のすべてが、多剤ADCを作製およびスクリーニングするために必要とされる試薬の複雑性を増大させる。本発明者らの基準を満たす1種類の方法は、大部分が均一な生成物を構築するために、生来型抗体ジスルフィドのピリダジン-ジオン再架橋およびそれに続く二重クリック官能化を用いるが、この方法は蛍光団-薬物抗体コンジュゲートの作製にしか用いられなかった[12]。
【０００８】
必要なものは、両方の薬物の均一かつ部位特異的な付加を生じさせることができる二重薬物コンジュゲート化に対する優先される基準を有する方法論（およびADC）である。プロセスは、市販の抗体およびハイブリドーマ抗体ライブラリーをはじめとするIgGのアレイに対して薬物の組み合わせをスクリーニングすることができるように、遺伝子操作された抗体または酵素媒介コンジュゲート化を要するべきではない。本開示は、これらおよび他の必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
抗体および8個の共有結合された連結アセンブリ単位（LA）を含む多剤抗体薬物コンジュゲート（MD-ADC）が本明細書中に提供され、ここで、8個の共有結合された連結アセンブリ単位のそれぞれが、抗体中の鎖間ジスルフィド結合の還元により生成されるチオールに連結され、かつ、共有結合された連結アセンブリ単位のそれぞれが、それに連結された2〜4個の薬物部分および任意的な分配剤（Y）を有する。これらのMD-ADCの具体的な実施形態は、式(I)、(II)、(III)および(IV)に提供される。
【００１０】
式(Ia)、(IIa)、(IIIa)および(IVa)により具現化される、MD-ADCの調製で有用な連結アセンブリ単位もまた、本明細書中に提供される。
【００１１】
別の態様では、以下の式(Ib)、(IIb)、(IIIb)および(IVb)により具現化される、保護型連結アセンブリ単位（連結アセンブリ単位およびMD-ADCの調製で有用である）が本明細書中に提供される。
【００１２】
また別の態様では、記載されるMD-ADCを用いる医薬組成物、および疾患の治療方法が、本明細書中に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】コンジュゲート化後（A）および脱保護後（B）での軽鎖および重鎖抗体の逆相分離後の、全イオンクロマトグラム（TIC）およびUVクロマトグラム（280nm）を示す図である。主な軽鎖および重鎖分子種に対するデコンボリューションされた質量スペクトルが、示される質量予測値および実測値と共に、クロマトグラフの右側に示されている。N結合型グリカンの不均一性に起因して、複数の重鎖質量分子種が存在することに留意されたい。G0糖化型質量のみが、重鎖に関して記載される。LC＝軽鎖、HC＝重鎖。
【図２】QMP樹脂を用いる前処理を含む（A）かまたは含まない（B）、Acm脱保護およびそれに続くNEM付加後のcAC10-mc-Cysのデコンボリューションされた軽鎖質量を示す。遊離したチオールへのNEMの付加は、（A）のみで観察された。
【図３】水銀媒介Acm脱保護が、抗体鎖間ジスルフィドの完全性に影響しないことを示す図である。マレイミドカプロイル-Cys(Acm)を、抗体1個当たり2箇所のキャリアでcAC10(S239C)にコンジュゲート化した。このコンジュゲートは、すべての鎖間ジスルフィド結合が無傷であった。コンジュゲートを、水銀媒介Acm脱保護条件およびそれに続くNEMコンジュゲート化（約20モル当量）に供した。軽鎖および重鎖の逆相分離に続くデコンボリューションされた軽鎖および重鎖質量スペクトルを示す。この分析により、NEM分子が1個しか重鎖に付加されておらず、かつ軽鎖の修飾は起こっていなかったことが実証される。このことは、水銀処理が、抗体の鎖間ジスルフィドに影響しないことを示す。水銀処理がジスルフィド結合を破壊するのであれば、複数のNEM付加が予測されるであろう。N結合型グリカンの不均一性に起因して、複数の重鎖質量分子種が存在することに留意されたい。G0糖化型質量のみが、重鎖に関して記載される。LC＝軽鎖、HC＝重鎖。
【図４】キャリア4でのCys(SiPr)残基およびCys(Acm)残基の連続的脱マスキングおよびそれにより生じる部位特異的薬物-リンカーコンジュゲート化のための条件を含む反応模式図を示す。各コンジュゲートが、逆相UPLC-MSにより分析された。各中間体の下には、逆相分離後のUVクロマトグラムおよびデコンボリューションされた軽鎖質量が示される。各ステップは、近定量的変換を伴って進行し、大部分が単独の軽鎖および重鎖分子種が生じた。各コンジュゲートに関するデコンボリューションされた重鎖質量が、図6に提供される。
【図５】軽鎖および重鎖の逆相分離後の全イオンクロマトグラム（TIC）およびUVクロマトグラム（280nm）を示す図である。軽鎖および重鎖分子種に対するデコンボリューションされた質量スペクトルが、示される質量予測値および実測値と共に、クロマトグラフの右側に示されている。N結合型グリカンの不均一性に起因して、複数の重鎖質量分子種が存在することに留意されたい。G0糖化型質量のみが、重鎖に関して記載される。LC＝軽鎖、HC＝重鎖。
【図６】処理前（上段）ならびに-SiPr除去および1のコンジュゲート化の後（中段）、ならびに-Acm除去および3のコンジュゲート化の後（下段）の薬物-キャリアコンジュゲートcAC10-4のデコンボリューションされた重鎖質量を示す図である。各中間体に関するUVクロマトグラムは図4に示される。N結合型グリカンの不均一性に起因して、複数の重鎖質量分子種が存在することに留意されたい。G0糖化型質量のみが、重鎖に関して記載される。
【図７】薬物キャリア4を用いて調製された多剤ADCであるcAC10-1-3のSEC特性決定を示す図である。コンジュゲートは、98％が単量体（6.77分）であった。
【図８】CD30(+) L540cy細胞上での、cAC10抗体、cAC10-4-(3-1) ADC、または非結合性IgG1アイソタイプ対照の飽和結合を示す図である。cAC10裸抗体およびcAC10-4-3-1に関する計算上のKD値は、それぞれ0.35nMおよび0.50nMであった。cAC10およびcAC10-4-(3-1)のいずれも、CD30(-) U-266細胞には結合しなかった（図示していない）。
【図９】細胞株のパネルに対するcAC10 ADCのin vitro活性を示す図である。3種類すべてのADCが、多重化薬物キャリア4を用いる。単一薬物付加ADCに関しては、2番目のCys残基は8コピーのN-エチルマレイミドを用いてキャップされた。活性は、ADCのIC50（ng/mL）として報告されている。パネルAでは、ADCを用いて96時間、細胞を処理し、Cell TiterGlo（Promega社）を用いて細胞生存率を測定し、パネルBでは、Bright-Gloルシフェラーゼアッセイシステム（Promega社）を用いて細胞生存率を測定した。HL＝ホジキンリンパ腫、ALCL＝未分化大細胞リンパ腫。
【図１０】アイソタイプ対照ADC（IgG1-4-1-3）はCD30(+) L540cy細胞に対して不活性であったが、cAC10-4-1-3は活性が高かったことを示す図である。
【図１１】in vivo MDR(+) DEL-BVR異種移植片モデルに対する二重薬物ADCの活性を示す図である。各ADCは、薬物キャリア4を用いて調製された。単一薬物コンジュゲートに関しては、2番目のCys残基は8コピーのN-エチルマレイミドを用いてキャップされた。
【図１２】不均一なCD30発現を有するin vivo異種移植片モデルに対する二重薬物ADCの活性を示す図である。異種移植片モデルは、Karpas 299細胞（CD30+）とKarpas 35R細胞（CD30-）との1：1混合物からなる。各ADCは、薬物キャリア4を用いて調製された。単一薬物コンジュゲートに関しては、2番目のCys残基は8コピーのN-エチルマレイミドを用いてキャップされた。
【図１３】化合物Aaおよび化合物Abを含む多剤ADCが、単一薬物付加を有するADC（化合物Aaのみまたは化合物Abのみ）と比較して、慢性的処理アッセイでのADC抵抗性細胞の発生を制限することを示す図である。この実験は、JHH-7細胞を用いて行なわれた。
【図１４】化合物Aaおよび化合物Abを含む多剤ADCが、単一薬物付加を有するADC（化合物Aaのみまたは化合物Abのみ）または未処理細胞と比較して、コロニー形成アッセイでのADC抵抗性細胞の発生を制限することを示す図である。この実験は、JHH-7細胞を用いて行なわれた。
【図１５】化合物AaおよびMMAEを含む多剤ADCが、単一薬物付加を有するADC（化合物AaのみまたはMMAEのみ）または未処理細胞と比較して、コロニー形成アッセイでのADC抵抗性細胞の発生を制限することを示す図である。この実験は、MCF-7細胞を用いて行なわれた。
【図１６】16個＋8個の薬物付加のために3個のシステインを担持する薬物キャリアを調製するための分析データを示す図である。(A) 24個付加MD ADCの軽鎖および重鎖の逆相分離後のUVクロマトグラム（280nm）。単一の軽鎖および重鎖ピークが存在することに留意されたい。1.44分でのピーク溶出は、完全に付加された軽鎖（LC）である。1.91分でのピーク溶出は、完全に付加された重鎖（HC）である。(B) cAC10抗体上の薬物キャリア3を用いる24個（16個＋8個）付加MD ADCのデコンボリューションされた軽鎖質量。m/z実測値は、キャリア3を担持する完全にコンジュゲート化された軽鎖、および合計3個の薬物単位（2＋1に分割）に対応する。
【図１７Ａ】PEG基を含まずに、二重付加されたL49-連結アセンブリ単位Ab(8)-化合物Aj(8)-化合物Ak(8)を調製するための分析データを示す図である。(A) MD ADCの軽鎖および重鎖の逆相分離後のUVクロマトグラム（280nm）。1.07分でのピーク溶出は、完全に付加されたLCである。1.62分でのピーク溶出は、完全に付加されたHCである。1.46分でのピーク溶出は、2番目にコンジュゲート化される薬物に対して付加が不足している（HC 1個当たり3個ではなく2個の薬物）。
【図１７Ｂ】PEG基を含まずに、二重付加されたL49-連結アセンブリ単位Ab(8)-化合物Aj(8)-化合物Ak(8)を調製するための分析データを示す図である。(B) PEGアームを含まずに、薬物キャリアを用いた16個付加（8個＋8個）MD ADCのデコンボリューションされた軽鎖質量。
【図１７Ｃ】PEG基を含まずに、二重付加されたL49-連結アセンブリ単位Ab(8)-化合物Aj(8)-化合物Ak(8)を調製するための分析データを示す図である。(C) PEGアームを含まずに、薬物キャリアを用いて、完全にコンジュゲート化された16個付加（8個＋8個）MD ADCのデコンボリューションされた重鎖質量。
【図１７Ｄ】PEG基を含まずに、二重付加されたL49-連結アセンブリ単位Ab(8)-化合物Aj(8)-化合物Ak(8)を調製するための分析データを示す図である。(D) PEG基を含まないL49-連結アセンブリ単位Ab(8)-化合物Aj(8)-化合物Ak(8)のサイズ排除クロマトグラフィー。非PEG化スキャホールド上での共コンジュゲートは、最小限の凝集を有する。
【図１７Ｅ】PEG基を含まずに、二重付加されたL49-連結アセンブリ単位Ab(8)-化合物Aj(8)-化合物Ak(8)を調製するための分析データを示す図である。(E) PEG基を含まないL49-連結アセンブリ単位Ab(8)-化合物Aa(8)-化合物Ak(8)。非PEG化スキャホールド上での共コンジュゲートは、最小限の凝集を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
概要
均一な薬物付加（drug loading）（例えば、16個の薬物、24個の薬物または32個の薬物のバージョン）をもたらす部位特異的様式で構築され、かつ他の天然または非天然アミノ酸を導入するために遺伝子操作する必要がない抗体を用いて調製される、多剤抗体薬物コンジュゲート（MD-ADC）が、本明細書中に提供される。MD-ADCの調製は、決められたアセンブリでの高い薬物付加量と、それでいて薬物の様々な化学量論（薬物1と薬物2との比率）を可能にする柔軟性との両方を可能にするアプローチでの、直交的保護戦略を用いる。さらにまた、抗体に対する単一の連結化学のみが必要とされる。
【００１５】
本明細書中に提供されるMD-ADCは、複数の薬物を特定の結合部位にうまく標的化して、抗体に結合させることができるという利点をさらに提供し、かつ、例えば、ADC1/ADC2の組み合わせの送達に伴う困難性を克服する。例えば、ADC1とADC2との同時送達を含む方法では、(1)コンジュゲートが抗原結合性に関して競合し、それにより低い抗原コピー数を有する細胞に対する薬物送達および活性での大きな差異を引き起こすか、または(2)異なる速度で排出されて、同時に同じ細胞に2種類の薬物を送達することを困難にする。
【００１６】
定義
特に明記しない限り、本明細書中で用いられる場合、下記の用語および語句は、以下の意味を有することが意図される。本明細書中で商品名が用いられる場合、商品名は、文脈により別途示されない限り、製品製剤、ジェネリック薬、および商品名の製品の活性医薬成分を含む。
【００１７】
本明細書中で用いる場合、用語「抗体」とは、最も広い意味で用いられ、かつ、具体的には、完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および所望の生物学的活性を示す抗体断片（但し、抗体断片は、薬物-リンカーに対する必要な数の結合部位を有する）を網羅する。生来型の抗体は四量体であり、各対が1本の軽鎖および1本の重鎖を有する同じ2対の免疫グロブリン鎖からなる。各対では、軽鎖および重鎖可変領域（VLおよびVH）は一緒に、主に抗原に対する結合性を担う。軽鎖および重鎖可変ドメインは、「相補性決定領域」または「CDR」とも称される3箇所の超可変領域により中断されるフレームワーク領域からなる。定常領域は、免疫系により認識され、かつ免疫系と相互作用することができる（例えば、Janeway et al., 2001, Immuno. Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New Yorkを参照されたい）。抗体は、いずれのタイプ（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、およびIgA）、クラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2）またはサブクラスのものでもあり得る。抗体は、いずれかの好適な生物種に由来することができる。一部の態様では、抗体は、ヒトまたはネズミ由来のものである。抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【００１８】
本明細書中で用いる場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、集団を含む個々の抗体が、わずかに存在し得る天然に存在する突然変異の可能性を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原性部位を標的とするものである。修飾語「モノクローナル」とは、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特性を示し、いずれかの特定の方法による抗体の産生を要求するものと理解すべきではない。
【００１９】
「完全抗体」（intact antibody）とは、抗原結合性可変領域、ならびに抗体クラスに対して適切な軽鎖定常ドメイン（CL）および重鎖定常ドメインCH1、CH2、CH3およびCH4を含むものである。定常ドメインは、生来型配列の定常ドメイン（例えば、ヒト生来型配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であり得る。
【００２０】
「抗体断片」は、その抗原結合性領域または可変領域を含む、完全抗体の一部分を含む。本発明での使用のために、抗体断片は、薬物-リンカーに対する結合に要求される数の部位を有する必要がある。つまり、本開示の抗体断片は、完全に還元された場合に、各システインが薬物付加に対して利用可能になるように、天然の抗体で見出される4箇所のジスルフィド結合を形成する8個すべてのシステイン残基を含む必要がある。
【００２１】
「抗原」は、抗体が特異的に結合する物質である。
【００２２】
「特異的結合性」および「特異的に結合する」との用語は、抗体または抗体誘導体が、非常に選択的な様式で、その対応する標的抗原に結合し、多数の他の抗原とは結合しないであろうことを意味する。典型的には、抗体および抗体誘導体は、少なくとも約1×10-7M、好ましくは10-8M〜10-9M、10-10M、10-11M、または10-12Mの親和性で結合し、所定の抗原または近縁の抗原以外の非特異的抗原（例えば、BSA、カゼイン）に対する結合性についての親和性よりも少なくとも2倍高い親和性で所定の抗原に結合する。
【００２３】
「阻害する」または「〜の阻害」との用語は、測定可能な量だけ減少させることまたは完全に妨げることを意味する。
【００２４】
用語「治療上有効量」とは、哺乳動物での疾患または障害を治療するために有効なコンジュゲートの量を意味する。癌の場合には、治療上有効量のコンジュゲートは、癌細胞の数を減らし；腫瘍サイズを低下させ；周辺器官への癌細胞浸潤を阻害し（すなわち、ある程度まで減速させ、好ましくは停止させ）；腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度まで減速させ、好ましくは停止させ）；腫瘍増殖をある程度まで阻害し；かつ/または癌に関連する症状のうちの1種以上をある程度まで軽減させることができる。薬物が増殖を阻害し、かつ/または既存の癌細胞を死滅させることができる程度まで、薬物は細胞静止性かつ/または細胞傷害性であり得る。癌治療に関して、有効性は、例えば、疾患進行までの時間（TTP）を評価することおよび/または応答率（RR）を決定することにより、測定することができる。
【００２５】
文脈により別途示されない限り、「実質的な」または「実質的に」との用語は、集団、混合物またはサンプルのうちの大多数、すなわち、50％超、より好ましくは集団のうちの50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％超を意味する。
【００２６】
「細胞内で切断された」および「細胞内切断」との用語は、それにより薬物部分（D1またはD2）と連結アセンブリ単位（LA）または抗体（Ab）との間の共有結合が破壊され、それにより、細胞内で、その分解生成物をはじめとするMD-ADCから解離する遊離の薬物が生じる、MD-ADCに対する細胞内での代謝プロセスまたは反応を意味する。その解離から生じる部分は、つまり、細胞内代謝産物である。
【００２７】
用語「細胞傷害活性」とは、薬物またはMD-ADCもしくはMD-ADCの細胞内代謝産物の細胞殺傷効果を意味する。細胞傷害活性は、細胞傷害性薬剤に対する曝露を半数の細胞が生き延びる単位体積当たりの濃度（モル濃度または質量濃度）である、IC50値により表わすことができる。
【００２８】
用語「細胞静止活性」とは、細胞静止剤、またはその薬物単位もしくはその細胞内代謝産物（代謝産物が細胞静止剤である場合）として細胞静止剤を有するMD-ADCの、細胞殺傷性以外の増殖抑制効果を意味する。
【００２９】
本明細書中で用いる場合、「細胞傷害剤」との用語は、細胞傷害活性を有し、かつ細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。この用語は、放射性同位体（例えば、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、60C、およびLuの放射性同位体）、化学療法剤、ならびにその合成アナログおよび誘導体をはじめとする、小分子毒素または細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素的に活性な毒素を含むことが意図される。
【００３０】
本明細書中で用いる場合、「細胞静止剤」との用語は、細胞静止活性を有し、例えば、細胞生長もしくは増殖を担うかまたはそれに寄与する細胞の機能を阻害する物質を意味する。細胞静止剤としては、タンパク質阻害剤、例えば酵素阻害剤などの阻害剤が挙げられる。
【００３１】
「癌」および「癌性」との用語は、典型的には制御不能な細胞増殖により特徴付けられる哺乳動物での生理学的状態または障害を意味または説明する。「腫瘍」は、1種以上の癌性細胞を含む。
【００３２】
本明細書中での「自己免疫疾患」とは、個体自身の組織またはタンパク質により生起され、かつそれを標的とする疾患または障害である。
【００３３】
本明細書中で用いる場合、「患者」とは、MD-ADCが投与される被験体を意味する。「患者」の例としては、限定するものではないが、ヒト、ラット、マウス、モルモット、非ヒト霊長類、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類および家禽が挙げられる。典型的には、患者は、ラット、マウス、イヌ、非ヒト霊長類またはヒトである。一部の態様では、患者は、有効量のMD-ADCを必要とするヒトである。
【００３４】
「治療する」または「治療」との用語は、文脈により別途示されない限り、対象物が、例えば、癌の発達または拡大などの望ましくない生理学的変化もしくは障害を阻害するかまたは減速させる（減少させる）、治療的処置および再発を予防するための予防的手段を意味する。本発明の目的に関しては、有益または望まれる臨床結果としては、限定するものではないが、検出可能であるかまたは検出できないかにかかわらず、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的寛解または完全寛解のいずれか）が挙げられる。「治療」はまた、治療を受けていない場合に予測される生存と比較して、延長された生存も意味することができる。治療が必要な対象としては、既に状態または障害を有する対象、ならびに状態または障害を有し易い対象が挙げられる。
【００３５】
癌に関しては、用語「治療すること」とは、以下の行為のいずれかまたはすべてを含む：腫瘍細胞、癌細胞、もしくは腫瘍の増殖を阻害すること；腫瘍細胞もしくは癌細胞の複製を阻害すること、全体的な腫瘍量を減少させること、または癌性細胞の数を低下させること、および疾患に関連する1種以上の症状を改善させること。
【００３６】
自己免疫疾患に関して、用語「治療すること」とは、以下の行為のいずれかまたはすべてを含む：限定するものではないが、自己免疫抗体を産生する細胞をはじめとする自己免疫疾患状態に関連する細胞の複製を阻害すること、自己免疫抗体量を減少させること、および自己免疫疾患の1種以上の症状を改善させること。
【００３７】
本明細書中で用いる場合、「製薬上許容される塩」との語句は、化合物（例えば、薬物、連結アセンブリ単位、またはMD-ADC）の製薬上許容される有機塩または無機塩を意味する。化合物は、少なくとも1個のアミノ基を含有することができ、したがって、アミノ基を用いて酸付加塩を形成できる。例示的な塩としては、限定するものではないが、硫酸塩、トリフルオロ酢酸塩、クエン酸塩（citrate）、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、過リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩（acid citrate）、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩（bitartrate）、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、ゲンチジン酸塩（gentisinate）、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩（saccharate）、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩（ethanesulfonate）、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩（すなわち、1,1'-メチレン-ビス-(2-ヒドロキシ-3-ナフトエート)）が挙げられる。製薬上許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオンまたは他の対イオンなどの別の分子の含有を含むことができる。対イオンは、親化合物上の電荷を安定化させるいずれかの有機部分または無機部分であり得る。さらに、製薬上許容される塩は、その構造中に2個以上の荷電原子を有することができる。多重荷電原子が製薬上許容される塩である例は、複数の対イオンを有することができる。したがって、製薬上許容される塩は、1個以上の荷電原子および/または1個以上の対イオンを有することができる。
【００３８】
特に示さない限り、用語「アルキル」（それ自体、または別の用語の一部分として）は、示された数の炭素原子を有する、非置換直鎖または分岐鎖飽和炭化水素を意味する（すなわち、「-C1-C8アルキル」または「-C1-C10」アルキルとは、それぞれ、1〜8個または1〜10個の炭素原子を有するアルキル基を意味する）。炭素原子の数が示されていない場合、アルキル基は、1〜8個の炭素原子を有する。代表的な直鎖「-C1-C8アルキル」基としては、限定するものではないが、-メチル、-エチル、-n-プロピル、-n-ブチル、-n-ペンチル、-n-ヘキシル、-n-ヘプチルおよび-n-オクチルが挙げられ；分岐鎖-C1-C8アルキルとしては、限定するものではないが、-イソプロピル、-sec-ブチル、-イソブチル、-tert-ブチル、-イソペンチル、および-2-メチルブチルが挙げられ；用語「アルケニル」（それ自体、または別の用語の一部分として）は、不飽和-C2-C8アルキルを意味し、限定するものではないが、-ビニル、-アリル、-1-ブテニル、-2-ブテニル、-イソブチレニル、-1-ペンテニル、-2-ペンテニル、-3-メチル-1-ブテニル、-2-メチル-2-ブテニル、-2,3-ジメチル-2-ブテニル、-1-ヘキシレニル、2-ヘキシレニル、-3-ヘキシレニルが挙げられ、用語「アルキニル」（それ自体、または別の用語の一部分として）は、1箇所以上の三重結合を有する不飽和-C2-C8アルキル、例えば、-アセチレニル、-プロピニル、-1-ブチニル、-2-ブチニル、-1-ペンチニル、-2-ペンチニルおよび-3-メチル-1-ブチニルを意味する。
【００３９】
特に示さない限り、「アルキレン」（それ自体、または別の用語の一部分として）は、記載された数の炭素原子、典型的には1〜10個の炭素原子、および親アルカンの同じかまたは2個の異なる炭素原子からの2個の水素原子の除去により誘導される2個の一価ラジカル中心を有する、置換または非置換飽和または不飽和分岐鎖または直鎖または環状炭化水素基を意味する。典型的なアルキレン基としては、限定するものではないが：メチレン（-CH2-）、1,2-エチレン（-CH2CH2-）、1,3-プロピレン（-CH2CH2CH2-）、1,4-ブチレン（-CH2CH2CH2CH2-）などが挙げられる。好ましい態様では、アルキレンは、分岐鎖または直鎖炭化水素である（すなわち、環状炭化水素ではない）。本明細書中に提供される実施形態のうちのいずれかでは、アルキレンは飽和アルキレンであり得る。
【００４０】
特に示さない限り、「アリール」（それ自体、または別の用語の一部分として）は、親芳香族環系の単一の炭素原子からの1個の水素原子の除去により誘導される、6〜20個の炭素（好ましくは6〜14個の炭素）原子の、置換または非置換一価炭素環式芳香族炭化水素基を意味する。一部のアリール基は、例示的構造中では「Ar」と表わされる。典型的なアリール基としては、限定するものではないが、ベンゼン、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルから誘導される基が挙げられる。例示的なアリール基は、フェニル基である。
【００４１】
特に示さない限り、「アリーレン」（それ自体、または別の用語の一部分として）は、アリール基の水素原子のうちの1個が結合により置換されており（すなわち、二価であり）、かつ例示的な基としてフェニルを用いて以下の構造中に示されているオルト、メタ、またはパラ配向性であることができる、上記で定義される通りのアリール基である：
【化１】
2018118953.tif 000002
【００４２】
特に示さない限り、「C3-C8複素環」（それ自体、または別の用語の一部分として）は、3〜8個の炭素原子（環員とも称される）、およびN、O、PまたはSから独立に選択される1〜4個のヘテロ原子環員を有し、かつ親環系の環原子からの1個の水素原子の除去により誘導される、一価置換または非置換芳香族または非芳香族単環系または二環系を意味する。複素環中の1個以上のN、CまたはS原子が酸化されていることができる。ヘテロ原子を含む環は、芳香族または非芳香族であり得る。特に記載しない限り、複素環は、それにより安定な構造が生じるいずれかのヘテロ原子または炭素原子でのそのペンダント基に連結されている。C3-C8複素環の代表例としては、限定するものではないが、ピロリジニル、アゼチジニル、ピペリジニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェン、インドリル、ベンゾピラゾリル、ピロリル、チオフェニル（チオフェン）、フラニル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリミジニル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、イソチアゾリル、およびイソキサゾリルが挙げられる。
【００４３】
特に示さない限り、「C3-C8ヘテロシクロ」（それ自体、または別の用語の一部分として）は、複素環基の水素原子のうちの1個が結合により置換されている（すなわち、二価である）、上記で定義されたC3-C8複素環基を意味する。選択された実施形態では、例えば、連結アセンブリ単位の一部分がヘテロシクロを含む場合、ヘテロシクロは、複素環基の水素原子のうちの1個または2個が結合により置換されている（すなわち、ヘテロシクロが二価または三価であり得る）、上記で定義される複素環基である。
【００４４】
特に示さない限り、「C3-C8炭素環」（それ自体、または別の用語の一部分として）は、親環系の環原子からの1個の水素原子の除去により誘導される、3員、4員、5員、6員、7員または8員一価置換または非置換飽和または不飽和非芳香族単環式または二環式炭素環である。例示的なC3-C8炭素環としては、限定するものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンタジエニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、1,3-シクロヘキサジエニル、1,4-シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、1,3-シクロヘプタジエニル、1,3,5-シクロヘプタトリエニル、シクロオクチル、およびシクロオクタジエニルが挙げられる。
【００４５】
特に示さない限り、「C3-C8カルボシクロ（carbocyclo）」（それ自体、または別の用語の一部分として）は、炭素環基の水素原子のうちの別の1個が結合により置換されている（すなわち、二価である）、上記で定義されたC3-C8炭素環基を意味する。選択された実施形態では、例えば、連結アセンブリ単位の一部分がカルボシクロを含む場合、カルボシクロは、炭素環基の水素原子のうちの1個または2個が結合により置換されている（すなわち、カルボシクロが二価または三価であり得る）、上記で定義される炭素環基である。
【００４６】
特に示さない限り、用語「ヘテロアルキル」（それ自体、または別の用語との組み合わせで）は、特に記載しない限り、記載された数の炭素原子、ならびにO、N、SiおよびSからなる群より選択される1〜10個、好ましくは1〜3個のヘテロ原子からなる、完全に飽和しているかまたは1〜3の不飽和度を含む、安定な直鎖または分岐鎖炭化水素、またはそれらの組み合わせを意味し、このとき、窒素および硫黄原子は任意により酸化されていることができ、かつ窒素ヘテロ原子は任意により四級化されていることができる。ヘテロ原子O、NおよびSは、ヘテロアルキル基のいずれかの内側の位置、またはアルキル基が分子の残りの部分に結合する位置に配置されていることができる。ヘテロ原子Siは、アルキル基が分子の残りの部分に結合する位置をはじめとする、ヘテロアルキル基のいずれかの位置に配置されていることができる。例としては、-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH=CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-O-CH3、および-CH=CH-N(CH3)-CH3が挙げられる。最大で2個のヘテロ原子が連続しており、例えば、-CH2-NH-OCH3および-CH2-O-Si(CH3)3などである場合がある。好ましい実施形態では、C1〜C4ヘテロアルキルまたはヘテロアルキレンは1〜4個の炭素原子および1個または2個のヘテロ原子を有し、C1〜C3ヘテロアルキルまたはヘテロアルキレンは1〜3個の炭素原子および1個または2個のヘテロ原子を有する。一部の態様では、ヘテロアルキルまたはヘテロアルキレンは飽和している。
【００４７】
特に示さない限り、用語「ヘテロアルキレン」（それ自体、または別の置換基の一部分として）は、-CH2-CH2-S-CH2-CH2-および-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-により例示される通りの、ヘテロアルキル（上述の通り）から誘導される二価の基を意味する。ヘテロアルキレン基に関して、ヘテロ原子が、鎖の末端のうちのいずれかまたは両方を占めることもできる。またさらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基（linking group）に関して、連結基の配向性は暗示されていない。選択された実施形態では、例えば、結合基（Attachment Group）または係留基（Tethering Group）がヘテロアルキレンを含む場合、ヘテロアルキレンは、ヘテロアルキル基の水素原子のうちの1個または2個が結合により置換されている（すなわち、ヘテロアルキレンが二価または三価であり得る）、上記で定義されるヘテロアルキル基である。
【００４８】
「置換アルキル」または「置換アリール」とは、1個以上の水素原子がそれぞれ独立に置換基により置き換えられている、それぞれ、アルキルおよびアリールを意味する。典型的な置換基としては、限定するものではないが、-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S-、-NR2、-NR3、=NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N=C=O、-NCS、-NO、-NO2、=N2、-N3、-NRC(=O)R、-C(=O)R、-C(=O)NR2、-SO3-、-SO3H、-S(=O)2R、-OS(=O)2OR、-S(=O)2NR、-S(=O)R、-OP(=O)(OR)2、-P(=O)(OR)2、-PO-3、-PO3H2、-AsO2H2、-C(=O)R、-C(=O)X、-C(=S)R、-CO2R、-CO2-、-C(=S)OR、C(=O)SR、C(=S)SR、C(=O)NR2、C(=S)NR2、またはC(=NR)NR2が挙げられ、式中、各Xは独立にハロゲン：-F、-Cl、-Br、または-Iであり；各Rは独立に-H、-C1-C20アルキル、-C6-C20アリール、-C3-C14複素環、保護基またはプロドラッグ部分である。典型的な置換基（subsitutuetns）としてはまた、(=O)も挙げられる。上記のアルキレン基、炭素環基、カルボシクロ基、アリーレン基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルキレン基、複素環基、およびヘテロシクロ基もまた同様に、置換されていることができる。
【００４９】
本明細書中で用いる場合、用語「遊離薬物」とは、MD-ADCのいずれかの他の部分またはMD-ADCの分解生成物（degradant product）に直接的または間接的に共有結合していない、生物学的に活性な薬物部分を意味する。遊離薬物は、放出メカニズムを介する連結アセンブリ単位からの切断直後に存在する場合、MD-ADC中の任意的連結基、または引き続く細胞内変換もしくは代謝により提供されることができる薬物を意味することができる。一部の態様では、遊離薬物は、H-D形態を有するか、または荷電した部分として存在することができる。遊離薬物は、所望の生物学的効果を発揮し得る薬理学的に活性な分子種である。一部の態様では、薬理学的に活性な分子種（pharamacologically active species）は、親薬物でなくてもよく、引き続く細胞内代謝を受けていない連結アセンブリ単位の構成要素または痕跡を含む場合がある。
【００５０】
本明細書中で用いる場合、用語「分配剤」（Partitioning Agent）は、特定の薬物単位または連結アセンブリ単位の疎水性をマスクする構造単位である。「分配剤」は、含められる連結アセンブリ単位の親水特性を増大させるのに有用であり得る。一部の実施形態では、分配剤は、連結アセンブリ単位またはそれらが結合するMD-ADCの薬物動態特性を改善する。
【００５１】
本明細書中で用いる場合、用語「自己安定化リンカーアセンブリ」とは、置換型スクシンイミドの加水分解を触媒することが可能な、スクシンイミドに近接する塩基性官能基を有する置換型スクシンイミドを意味する。塩基性官能基による置換型スクシンイミドの加水分解は、自己安定化されたリンカーを形成する。自己安定化リンカーアセンブリのさらなる詳細は、国際公開第2013/173337号に記載されている。一部の実施形態では、自己安定化リンカーアセンブリはMDPrである。
【００５２】
態様および実施形態
多剤抗体薬物コンジュゲート（multi-drug antibody drug conjugate；MD-ADC、下記の通り）、ならびに薬物単位（D1およびD2）に結合している連結アセンブリ単位（LA）、および保護型連結アセンブリ単位（PLA）または抗体および2種以上の薬物単位への結合のための官能基を有するスキャホールドが、本明細書中に提供される。MD-ADC、LA単位またはPLA単位のそれぞれが、LAもしくはPLA単位の部位または構成要素あるいはMD-ADCの一部分に結合した分配剤（Y）を任意により有するであろう。
【００５３】
多剤抗体薬物コンジュゲート
一態様では、複数の薬物単位が治療プロトコールでの標的化された送達のために抗体に共有結合している、多剤抗体薬物コンジュゲート（MD-ADC）が本明細書中に提供される。各抗体に対して、薬物は、1：1比率、2：1比率または3：1比率で結合することができる。コンジュゲートのそれぞれに対して、抗体は、抗体1個当たり合計16個、24個または32個の薬物となる8個付加である。この付加を達成するために、抗体は、4箇所の鎖間ジスルフィド結合のそれぞれが切断されて、さらなる薬物単位の結合時の容易さおよび一貫性のために設計されている連結アセンブリ単位の結合に対して用いられる8箇所のチオールを生じるように、完全に還元されている。連結アセンブリ単位は、分配剤（例えば、PEG基）をつなげるための任意的な結合部位を有するようにさらに設計される。分配剤は、下記でさらに完全に論じられるであろう連結アセンブリ単位の様々な部位に結合させることができる。
【００５４】
アセンブリの容易さのために、連結アセンブリ単位（薬物単位が結合している）は、典型的には、抗体への結合前に構築され、薬物単位を含むアセンブルされた連結アセンブリ単位の文脈中で下記に考察される。しかしながら、当業者は、構築の順序が変わり得ることを理解するであろう。例えば、保護基を有する連結アセンブリ単位を抗体に結合させることができ、このとき、抗体の追加後に、保護基は除去され、薬物単位が追加される。
【００５５】
連結アセンブリ単位
連結アセンブリ（LA）単位は、以下の特色を特徴とする：(1)抗体チオールへのLAの結合を促進する抗体係留基；(2)薬物単位（D1およびD2）の共有結合を可能にする結合基（Q1およびQ2）；(3) 2個の結合基間の連結をもたらす結合基リンカー（X）；ならびに薬物連結基（L1およびL2）および分配剤（Y）をはじめとする任意的な基。
【００５６】
特定の実施形態では、LA単位は式（Ia）の構造を特徴とする：
【化２】
2018118953.tif 000003
[式中、
Tは、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じる抗体チオールへのLAの結合を促進する係留基であり；
Q1は、第1の薬物単位（D1）の共有結合を可能にする第1の結合基であり；
Q2は、第2の薬物単位（D2）の共有結合を可能にする第2の結合基であり；
Xは、2個の結合基同士の連結を提供するか、またはそれらの間に間隔をあける結合基リンカーであり；
D1は、第1の薬物部分であり；
D2は、第2の薬物部分であり；
L1は、D1とQ1とをつなぐ任意的連結基であり；
L2は、D2とQ2とをつなぐ任意的連結基であり；
下付き文字m1およびm2は、それぞれ独立に0および1から選択され；
Yは、分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【００５７】
別の群の実施形態では、LA単位は式（IIa）の構造を特徴とする：
【化３】
2018118953.tif 000004
[式中、
Tは、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じる抗体チオールへのLAの結合を促進する係留基であり；
各Q1は、第1の薬物単位（D1）の共有結合を可能にする第1の結合基であり；
Q2は、第2の薬物単位（D2）の共有結合を可能にする第2の結合基であり；
Xは、結合基リンカーであり；
D1は、第1の薬物部分であり；
D2は、第2の薬物部分であり；
L1は、D1とQ1とをつなぐ任意的連結基であり；
L2は、D2とQ2とをつなぐ任意的連結基であり；
下付き文字m1およびm2は、それぞれ独立に0および1から選択され；
Yは、分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【００５８】
また別の群の実施形態では、LA単位は式（IIIa）の構造を特徴とする：
【化４】
2018118953.tif 000005
[式中、
Tは、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じる抗体チオールへのLAの結合を促進する係留基であり；
各Q1は、独立に選択される第1の薬物単位（D1）の共有結合を可能にする、独立に選択される第1の結合基であり；
Q2は、第2の薬物単位（D2）の共有結合を可能にする第2の結合基であり；
X1およびX2は、それぞれ結合基リンカーであり；
D1は、第1の薬物部分であり；
D2は、第2の薬物部分であり；
L1は、D1とQ1とをつなぐ任意的連結基であり；
L2は、D2とQ2とをつなぐ任意的連結基であり；
下付き文字m1およびm2は、それぞれ独立に0および1から選択され；
Yは、分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【００５９】
また別の群の実施形態では、LA単位は式（IVa）の構造を特徴とする：
【化５】
2018118953.tif 000006
[式中、
Tは、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じる抗体チオールへのLAの結合を促進する係留基であり；
各Q1は、独立に選択される第1の薬物単位（D1）の共有結合を可能にする、独立に選択される第1の結合基であり；
Q2は、第2の薬物単位（D2）の共有結合を可能にする第2の結合基であり；
X1およびX2は、それぞれ結合基リンカーであり；
D1は、第1の薬物部分であり；
D2は、第2の薬物部分であり；
L1は、D1とQ1とをつなぐ任意的連結基であり；
L2は、D2とQ2とをつなぐ任意的連結基であり；
下付き文字m1およびm2は、それぞれ独立に0および1から選択され；
Yは、分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【００６０】
係留基（T）
係留基（T）の記号は、抗体チオールへの均一な共有結合のために好適な連結アセンブリの一部分を意味する。（T）の機能的要件は、抗体チオールに結合する官能基、および第1の結合基（Q1）に結合する官能基を含む。係留基（T）は、一部の実施形態では、分配剤（Y）の結合のための部位を有するであろう。
【００６１】
抗体の係留基として好適な多数の基が文献に記載されており、抗体中に存在するチオール部分に結合するために設計されている基が挙げられる。これらの基としては、マレイミドリンカー（maleimido linker）（例えば、マレイミドカプロイルリンカーおよびmDPRなどの自己安定化リンカー、国際公開第2013/173337号を参照されたい）が挙げられる。
【００６２】
本発明の開示の範囲内に入る係留基の例としては、式（V）および（VI）の基が挙げられる：
【化６】
2018118953.tif 000007
[式中、LGは脱離基であり、右側の波線は結合基（Q1およびQ2）であり、R19は以下で定義される通りである]。当業者は、式（V）のマレイミドは抗体のチオールと反応できること、および式VIを参照して、抗体のチオールは、脱離基（LG）を取り外すための求核攻撃を介して、LGを担持する炭素に対して共有結合することができることを認識するであろう。好適な脱離基は当業者に周知であり、ハロゲン、トシレート、およびメシレートが挙げられる。
【００６３】
一部の実施形態では、R19は、C1-C10アルキレン-、C1-C10ヘテロアルキレン-、C3-C8カルボシクロ-、-O-(C1-C8アルキル)-、-アリーレン-、C1-C10アルキレン-アリーレン-、-アリーレン-C1-C10アルキレン-、C1-C10アルキレン-(C3-C8カルボシクロ)-、(C3-C8カルボシクロ)-C1-C10アルキレン-、C3-C8ヘテロシクロ-、C1-C10アルキレン-(C3-C8ヘテロシクロ)、(C3-C8ヘテロシクロ)-C1-C10アルキレン-、C1-C10アルキレン-C(=O)-、C1-C10ヘテロアルキレン-C(=O)-、C3-C8カルボシクロ-C(=O)-、-O-(C1-C8アルキル)-C(=O)-、-アリーレン-C(=O)、C1-C10アルキレン-アリーレン-C(=O)-、-アリーレン-C1-C10アルキレン-C(=O)-、C1-C8アルキレン-(C3-C8カルボシクロ)-C(=O)-、(C3-C8カルボシクロ)-C1-C10アルキレン-C(=O)-、C3-C8ヘテロシクロ-C(=O)-、C1-C10アルキレン-(C3-C8ヘテロシクロ)-C(=O)-、(C3-C8ヘテロシクロ)-C1-C10アルキレン-C(=O)-、C1-C10アルキレン-NH-、C1-C10ヘテロアルキレン-NH-、C3-C8カルボシクロ-NH-、-O-(C1-C8アルキル)-NH-、-アリーレン-NH-、C1-C10アルキレン-アリーレン-NH-、-アリーレン-C1-C10アルキレン-NH-、C1-C10アルキレン-(C3-C8カルボシクロ)-NH-、(C3-C8カルボシクロ)-C1-C10アルキレン-NH-、C3-C8ヘテロシクロ-NH-、C1-C10アルキレン-(C3-C8ヘテロシクロ)-NH-、(C3-C8ヘテロシクロ)-C1-C10アルキレン-NH-、C1-C10アルキレン-S-、C1-C10ヘテロアルキレン-S-、C3-C8カルボシクロ-S-、-O-(C1-C8アルキル)-S-、-アリーレン-S-、C1-C10アルキレン-アリーレン-S-、-アリーレン-C1-C10アルキレン-S-、C1-C10アルキレン-(C3-C8カルボシクロ)-S-、(C3-C8カルボシクロ)-C1-C8アルキレン-S-、C3-C8ヘテロシクロ-S-、C1-C10アルキレン-(C3-C8ヘテロシクロ)-S-、または(C3-C8ヘテロシクロ)-C1-C10アルキレン-S-である。R19置換基のうちのいずれかが置換されているか、または非置換であることができる。一部の実施形態では、R19置換基は非置換である。
【００６４】
一部の実施形態では、係留基は式（VII）を有する：
【化７】
2018118953.tif 000008
[式中、RPRは水素または保護基であり、mは1または2であり、R23は、-NH-C1-5アルキレン-C(=O)-、またはモノ、ジ、トリ、テトラ、もしくはペンタペプチドである]。一部の実施形態では、R23は-NH-CH2-C(=O)-である。一部の実施形態では、R23はジペプチドまたはトリペプチドである。一部の実施形態では、R23のペプチド単位中のアミノ酸は、バリン、アラニン、グリシン、ロイシン、およびシトルリンから独立に選択される。
【００６５】
式（V）および式（VII）に示される置換型マレイミド（malimide）が、抗体チオールとの結合後に加水分解された形態で存在し得ることも理解される。つまり、それにより生じる置換型スクシンイミドは、以下に示される通りにヒドロキシル化されている場合がある：
【化８】
2018118953.tif 000009
【００６６】
一部の態様では、式（V）、（VI）、（VII）のR19置換基は任意により置換されている。一部の実施形態では、式（V）のR19置換基は、任意により、塩基性単位、例えば、(CH2)XNH2、(CH2)xNHRa、および(CH2)xNRa2により置換されている（式中、xは1〜4の整数であり、各RaはC1-C6アルキルおよびC1-C6ハロアルキルからなる群より独立に選択されるか、または2個のRa基がそれらの結合する窒素と組み合わさって、アゼチジニル基、ピロリジニル基もしくはピペリジニル基を形成する）。
【００６７】
一部の実施形態では、抗体チオールとの結合前の係留基（T）は、以下の基からなる群より選択される：
【化９】
2018118953.tif 000010
【００６８】
一部の選択された実施形態では、抗体チオールとの結合前の係留基（T）は、例えば、プロテアーゼにより切断可能なマレイミド（maleimido）含有リンカーである。したがって、本明細書中に記載されるMD-ADCとの使用のための、プロテアーゼにより切断可能な例示的T単位としては、以下のものが挙げられ、式中、Dは本明細書中に記載される通りのいずれかの薬物単位であり、Sは抗体チオールであり、右側の波線は結合基リンカーであり、左側の波線は抗体である：
【化１０】
2018118953.tif 000011
【００６９】
結合基（Q1およびQ2）
本明細書中に記載されるLA単位中で有用な結合基（Attachment Group）は、「直交的に」（orthogonally）保護されることができ、すなわち、薬物単位の結合が実行されているときに選択的脱保護を可能となるように保護されることができる官能基を有する基である。保護基（本開示のP1およびP2）は、これより後の節でより詳細に考察されている。
【００７０】
1つの群の実施形態では、結合基は、保護基、薬物単位、または任意的連結基を結合させるための反応性官能基を含む天然または非天然アミノ酸である。これには、チオール、アミン、ヒドロキシル、カルボン酸、またはアミドなどの官能基を有するアミノ酸、例えば、システイン、セリン、トレオニン、チロシン、リジン、シトルリン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。これらの官能基は、保護基、薬物単位、または任意的連結基上の好適な対応する基と反応して、連結アセンブリ単位へとそれらの単位を結合させることができる。
【００７１】
一部の実施形態では、結合基（Q1およびQ2）は、システイン、セリン、トレオニン、リジン、シトルリン、およびアルギニンなどのアミノ酸から独立に選択される。一部の実施形態では、結合基（Q1およびQ2）は、システイン、セリン、およびリジンからなる群より独立に選択される。一部の実施形態では、結合基（Q1およびQ2）はシステインである。
【００７２】
一部の実施形態では、結合基（Q1およびQ2）は、Cys(StBu)、H-Cys(Acm)-OH、H-Cys(Trt)-OH、H-Cys(StBu)-OH、H-Cys(Bzl)-OH、H-Cys(S-Et)-OH、H-Cys(SO3H)-OH、H-Cys(アミノエチル)-OH、H-Cys(カルバモイル)-OH、H-Cys(S-フェニル)-OH、H-Cys(Boc)-OH、およびH-Cys(ヒドロキシエチル)-OHなどのシステイン（Cys）誘導体から独立に選択される。
【００７３】
一部の実施形態では、結合基（Q1およびQ2）は、Cys(Stmp)、Cys(Mmt)、チアプロリン（Thiaproline）、Cys(Dpm)、Cys(Thp)、Cys(4-MeOBzl)、Cys(Npys)、Cys(Cys)などのシステイン（Cys）誘導体から独立に選択される。
【００７４】
一部の実施形態では、結合基（Q1およびQ2）は、β-2-Cys、β-3-Cys、ホモシステイン、およびN-メチルシステイン（N-methyl cystein）などのシステイン（Cys）誘導体から独立に選択される。
【００７５】
本明細書中に記載される結合基、保護基、薬物単位、または任意的連結基に従えば、結合基とそれらの基との間の好適な結合としては、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、ペプチド結合、ヒドラジン結合、エステル結合、またはカルバメート結合が挙げられる。
【００７６】
結合基がアミノ酸単位を含まなくてもよいことが理解される。結合基が「直交的に」保護/脱保護することができる官能基ならびに結合基リンカーおよび/または連結単位と結合できる化学基を含む限りは、その基は好適な構成要素であり得る。
【００７７】
結合基リンカー（X、X1およびX2）
結合基同士の間に好適な間隔をあけるために、本明細書中に提供される連結アセンブリ単位は、一部の実施形態では、結合基リンカー（X、X1およびX2）を含む。これらの結合基リンカーは、典型的には、結合基（Q1およびQ2）同士の間に間隔をあけることに加えて、組成物がin vivoで代謝される場合に、無害な成分を生じるであろう基である。典型的な結合基リンカーは、例えば、グリシン、アラニン、β-アラニン、およびジペプチドまたはトリペプチドである。これに関して様々なアミノ酸が有用であるが、好ましいアミノ酸は、LAの構築中に保護/脱保護ステップを必要としない側鎖を有するものである。例えば、LAの構築中に保護/脱保護ステップを必要としない好適なアミノ酸としては、グリシン、アラニン、β-アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、およびプロリンが挙げられる。結合基リンカーがアミノ酸である実施形態では、各アミノ酸のアミノ位は、置換または非置換であり得る。
【００７８】
一部の実施形態では、結合基リンカー（X、X1、またはX2）は、各ペプチドが、グリシン、アラニン、β-アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、およびプロリンからなる群より独立に選択されるジペプチドである。
【００７９】
一部の実施形態では、結合基リンカー（X、X1、またはX2）は、各ペプチドが、グリシン、アラニン、β-アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、およびプロリンからなる群より独立に選択されるトリペプチドである。
【００８０】
一部の実施形態では、各アミノ酸のアミノ位はメチル基により置換されていることができる。
【００８１】
結合基リンカーの役割を考えれば、アミノ酸単位が必要であることが理解される。結合基リンカーが連結アセンブリ単位（Linker Assembly Unit）中の2個以上の結合基（Q1およびQ2）を連結できる化学基を含む限りは、その基は好適な構成要素であり得る。
【００８２】
任意的連結基（L1およびL2）
連結アセンブリ単位のまた他の構成要素は、任意的連結基（L1およびL2）であり、これは、LA単位への薬物単位の結合を促進するか、または切断可能な連結基を導入するなどの理由のために含められる場合がある。一部の実施形態では、本開示の連結アセンブリ単位は、薬物単位と結合基（Q1またはQ2）との間に任意的連結基を含む。任意的連結基は、LA単位の結合前に薬物部分に結合されているか、または任意的連結基は、薬物部分の結合前にLA単位に結合されていることができることが理解される。
【００８３】
抗体中に存在する官能基またはリンカー上の部位への薬物の結合のための多数のリンカーが当技術分野で公知であり、かつ薬物単位を連結アセンブリ単位の結合基に結合させるために本明細書中で有用である。
【００８４】
一部の実施形態では、任意的連結基は、結合単位Q1またはQ2の間の確実な連結を可能にするために、末端マレイミドを含む。末端マレイミド官能基は、ヒドロキシル、チオール、またはアミンなどの求核基を含むQ1またはQ2部分を連結するために最も有用であることが理解される。係留基の節に記載される通り、結合されたマレイミド（すなわち、スクシンイミド）は、多数の加水分解された形態で存在することができ、またはアミンなどの塩基性基が置換型スクシンイミドの近傍に位置する場合、スクシンイミドが反応して、自己安定化アセンブリを形成することができる（国際公開第2013/173337号にさらに詳細に記載される通り）。
【００８５】
一部の実施形態では、任意的連結基は、薬物単位（D1またはD2）に連結するパラアミノベンジルオキシカルボニル（PABC）基を含む。PABC基は、任意により、グルコースなどの糖、またはその誘導体により置換されていることができる。
【００８６】
一部の実施形態では、任意的連結基は、式（VIII）または（IX）を有する：
【化１１】
2018118953.tif 000012
[式中、RRRは水素または保護基であり、nは1または2であり、pは1〜5の整数であり、かつR24は-NH-C1-5アルキレン-C(=O)-、-NH-C1-5アルキレン-C(=O)-NH-フェニレン-CH2-O-C(=O)-、-(ジペプチド)-NH-フェニレン-CH2-O-C(=O)-、またはモノ、ジ、トリ、テトラ、もしくはペンタペプチドである]。上記の基の中のフェニレンは、任意により、グルコースなどの糖、またはその誘導体により置換されていることができる。R24のアミン基はまた、Hの代わりにメチル（CH3）を含む場合もある。一部の実施形態では、R24はジペプチドまたはトリペプチドである。一部の実施形態では、R24は-NH-CH2-C(=O)-である。一部の実施形態では、R24のペプチド単位のアミノ酸は、バリン、アラニン、グリシン、ロイシン、およびシトルリンから独立に選択される。上記の式は、結合基（X）への連結前を示したものであることが理解される。「波線」は、薬物単位の連結位置を示す。薬物単位、および薬物単位と任意的連結基との間に用いられる連結化学に応じて、上記で列挙したR24基の末端部分はまた、末端カルボニルに連結された、アミンまたはヒドロキシルなどの求核基を含むこともできる。
【００８７】
一部の実施形態では、任意的連結基は、式（XI）または（XII）を有する：
【化１２】
2018118953.tif 000013
[式中、RRRは水素または保護基であり、nは1または2であり、pは1〜5の整数であり、かつR24は-NH-C1-5アルキレン-C(=O)-NH-フェニレン-CH2-O-C(=O)-ヘテロシクリル（heterocylyl）-C1-4アルキレン-b1-ヘテロシクリル-b2-；-(ジペプチド)-NH-フェニレン-CH2-O-C(=O)-ヘテロシクリル（heterocylyl）-C1-4アルキレン-b1-ヘテロシクリル-b2-であり；式中、b1およびb2は独立に、結合またはNHもしくはOから選択されるヘテロ原子であり、各ヘテロシクリル基は、N、O、およびSから選択される1〜3個のヘテロ原子環員を有する5員環または6員環であり；各ヘテロシクリル基は、C1-4アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、カルボキシ、および-C(=O)-C1-4アルキルから選択される1〜3個の基を用いて任意により置換されている]。一部の実施形態では、b1およびb2はそれぞれ、NHまたはOから選択されるヘテロ原子である。R24のアミン基はまた、Hの代わりにメチル（CH3）を含む場合もある。一部の実施形態では、R24はジペプチドまたはトリペプチドである。一部の実施形態では、R24は-NH-CH2-C(=O)-である。一部の実施形態では、R24のペプチド単位のアミノ酸は、バリン、アラニン、グリシン、ロイシン、およびシトルリンから独立に選択される。上記の式は、結合基（X）への連結前を示したものであることが理解される。「波線」は、薬物単位の連結位置を示す。
【００８８】
一部の実施形態では、任意的連結基は、放出可能連結基（Releaseable Linking Group）LR1またはLR2である。一部の他の態様では、任意的連結基は放出可能連結基を含まない。放出可能連結基を含まない実施形態では、薬物単位の放出は、全体的タンパク質分解経路（すなわち、非切断経路）を介する。
【００８９】
任意的連結基が放出可能連結基（LR1またはLR2）である実施形態に関して、放出可能連結基は、例えば、細胞傷害性または細胞静止性を誘導するために十分な、標的細胞での効率的な薬物の放出を可能にする。典型的には、放出可能連結基は、コンジュゲートが標的細胞中に内在化された際の、効率的な遊離薬物の放出のために設計されているが、放出可能連結基はまた、標的細胞近傍で遊離薬物を放出するために設計されていることもできる。切断のための好適な認識部位は、MD-ADCの薬物単位の効率的な放出を可能にするものである。典型的には、認識部位は、ペプチド切断部位（ペプチドベースの放出可能リンカーアセンブリ中など）、糖切断部位（糖ベースの放出可能リンカーアセンブリ中など）、またはジスルフィド切断部位（ジスルフィドベースの放出可能リンカーアセンブリ中など）である。ペプチド切断部位の例としては、リソソーム中に存在するものなどの細胞内プロテアーゼにより認識されるものが挙げられる。糖切断部位の例としては、β-グルクロニダーゼなどのグルクロニダーゼをはじめとするグリコシダーゼにより認識されるものが挙げられる。
【００９０】
一部の実施形態では、放出可能連結基（LR1およびLR2）はジペプチドである。一部の実施形態では、ジペプチドは、Val-Cit-、-Phe-Lys-または-Val-Alaである。
【００９１】
一部の実施形態では、L1またはL2は、マレイミド-カプロイル（mc）、マレイミド-カプロイル-バリン-シトルリン（mc-vc）、マレイミド-カプロイル-バリン-シトルリン-パラアミノベンジルオキシカルボニル（mc-vc-PABC）および（MDPr-vc）から独立に選択される。L1およびL2は、アミンなどの塩基性部分を用いてさらに置換されて、上記および国際公開第2013/173337号でより詳細に考察されている自己安定化スクシンイミドアセンブリを形成することができることが理解される。
【００９２】
薬物単位を任意的連結基（L1またはL2）に連結する一般的な方法は当技術分野で公知であり、かつ当技術分野で公知のリンカーを、本開示のMD-ADCと共に用いることができる。例えば、アウリスタチンADCおよびメイタンシン（maytansine）ADCが、現在、癌の治療に対して臨床開発中である。モノメチルアウリスタチンEは、プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーを介して抗体にコンジュゲート化され、モノメチルアウリスタチンFは、マレイミドカプロン酸を介して抗体に直接的にコンジュゲート化され、DM1はジスルフィドを介して、またはヘテロ二官能性SMCCリンカーを介して直接的にコンジュゲート化され、DM4はジスルフィドリンカーを介してコンジュゲート化される。これらのリンカーシステムは、本明細書中に記載されるMD-ADCと共に用いることができ、用いるリンカーシステムに応じて、切断可能または非切断可能なシステムによる薬物の放出をもたらす。ジスルフィド、チオエーテル、ペプチド、ヒドラジン、エステル、またはカルバメート結合が、薬物単位を第1または第2の任意的連結基（L1またはL2）に連結させるために用いることができる結合のすべての例である。
【００９３】
任意的分配剤（Y）を、任意的連結基のいずれかの好適な原子を介して連結させることができる。そのような連結をつくり出す方法は当技術分野で公知である。
【００９４】
任意的分配剤（Y）
本明細書中に記載されるMD-ADCはまた、結合された分配剤（Y）も含むことができる。分配剤は、例えば、特定の薬物単位または連結アセンブリ単位の疎水性をマスクするのに有用である。したがって、多数の分配剤が、それらが結合しているMD-ADCの親水特性を増大させるために機能するであろう。
【００９５】
代表的な分配剤としては、ポリエチレングリコール（PEG）単位、シクロデキストリン単位、ポリアミド、親水性ペプチド、多糖およびデンドリマーが挙げられる。
【００９６】
任意的分配剤がL、X、X1またはX2、Q1またはQ2の基のうちの1個以上に含められる場合、その基は、連結アセンブリ単位への分配性単位の機能的コンジュゲート化を可能にするリジン残基を含むことができる。
【００９７】
ポリエチレングリコール単位（PEG）
多分散PEG、単分散PEGおよび個別PEG（discrete PEG）を、本発明の化合物を作製するために用いることができる。多分散PEGはサイズおよび分子量の不均一な混合物であり、単分散PEGは典型的には不均一な混合物から精製され、したがって単一の鎖長および分子量で提供される。好ましいPEG単位は個別PEGであり、これは、段階的な方法で合成され、かつ重合プロセスを経て合成されていない化合物である。個別PEGは、既定の特定された鎖長を有する単一の分子を与える。
【００９８】
本明細書中で提供されるPEG単位は、1種または複数種のポリエチレングリコール鎖を含む。ポリエチレングリコール鎖同士を、例えば、直鎖、分岐鎖または星形配置で、一緒に連結させることができる。典型的には、PEG鎖のうちの少なくとも1種は連結アセンブリ単位の構成要素（例えば、Q1、Q2、X、X1もしくはX2、または任意的な薬物リンカー（L1またはL2））上の適切な部位への共有結合のために、一方の端部で誘導化される。連結アセンブリ単位への例示的な結合は、非条件的に切断可能な連結によるものであるか、または条件的に切断可能な連結を介する。例示的な結合は、アミド結合、エーテル結合、エステル結合、ヒドラゾン結合（hydrazone linkage）、オキシム結合、ジスルフィド結合、ペプチド結合またはトリアゾール結合を介する。一部の態様では、連結アセンブリ単位への結合は、非条件的に切断可能な連結によるものである。一部の態様では、連結アセンブリ単位への結合は、エステル結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、またはジスルフィド結合を介していない。一部の態様では、連結アセンブリ単位への結合は、ヒドラゾン結合を介していない。
【００９９】
条件的に切断可能な連結とは、血漿中を循環している間は切断に対して実質的に感受性でないが、細胞内または腫瘍内環境では切断に対して感受性である連結を意味する。非条件的に切断可能な連結とは、いずれの生物学的環境でも切断に対して実質的に感受性でないものである。ヒドラゾンの化学的加水分解、ジスルフィドの還元、およびペプチド結合またはグリコシド結合の酵素的切断が、条件的に切断可能な連結の例である。
【０１００】
PEG単位は、連結アセンブリ単位でMD-ADC（またはその中間体）に対して直接的に結合するであろう。PEG単位の他の末端（1箇所または複数個所）は遊離でありかつつなぎ留められておらず、メトキシ、カルボン酸、アルコールまたは他の好適な官能基の形態を採ることができる。メトキシ、カルボン酸、アルコールまたは他の好適な官能基は、PEG単位の末端PEGサブユニットに対するキャップとして機能する。つなぎ留められていない（untethered）とは、PEG単位が、そのつなぎ留められていない箇所では、薬物単位、抗体、または薬物単位および/もしくは抗体を連結する連結性構成要素に結合していないであろうことを意味する。PEG単位が2本以上のPEG鎖を含む実施形態に関しては、複数のPEG鎖は同じかまたは異なる化学的部分（例えば、異なる分子量またはサブユニット数のPEG）であり得る。複数のPEG鎖は、単一の結合部位で連結アセンブリ単位に結合する。当業者は、PEG単位が、反復ポリエチレングリコールサブユニットを含むことに加えて、非PEG物質を含むこともできる（例えば、複数のPEG鎖同士のカップリングを促すため、または連結アセンブリ単位へのカップリングを促すため）ことを理解するであろう。非PEG物質とは、反復する-CH2CH2O-サブユニットの一部分でないPEG単位中の原子を意味する。本明細書中に提供される実施形態では、PEG単位は、非PEG要素を介して互いに連結している2本の単量体PEG鎖を含むことができる。本明細書中に提供される他の実施形態では、PEG単位は、連結アセンブリ単位に結合している中心コアに結合する2本の直鎖状PEG鎖を含むことができる（すなわち、PEG単位そのものが分岐している）。
【０１０１】
当業者に利用可能な多数のPEG結合法がある［例えば、Goodson, et al. (1990) Bio/Technology 8:343（部位特異的突然変異誘発後のそのグリコシル化部位でのインターロイキン-2のPEG化）；欧州特許第0 401 384号（PEGとG-CSFとのカップリング）；Malik, et al., (1992) Exp. Hematol. 20:1028-1035（塩化トレシル（tresyl chloride）を用いるGM-CSFのPEG化）；国際公開第90/12874号（システイン特異的mPEG誘導体を用いる、組み換え的に導入されたシステイン残基を含有するエリスロポエチンのPEG化）；米国特許第5,757,078号（EPOペプチドのPEG化）；同第5,672,662号（ポリ(エチレングリコール)およびプロピオン酸またはブタン酸を用いて単置換された関連ポリマーならびにバイオ技術応用のためのその機能的誘導体）；同第6,077,939号（ペプチドのN末端α炭素のPEG化）；Veronese et al., (1985) Appl. Biochem. Bioechnol 11:141-142 （PEG-ニトロフェニルカーボネート（「PEG-NPC」）またはPEGトリクロロフェニルカーボネートを用いるペプチドのN末端α炭素のPEG化）；およびVeronese (2001) Biomaterials 22:405-417（ペプチドおよびタンパク質PEG化に関する総説記事）を参照されたい］。
【０１０２】
例えば、PEGは、反応性の基を介してアミノ酸残基に共有結合することができる。反応性の基は、活性化されたPEG分子が結合できるものである（例えば、遊離アミノ基またはカルボキシル基）。例えば、N末端アミノ酸残基およびリジン（K）残基は遊離アミノ基を有し；C末端アミノ酸残基は遊離カルボキシル基を有する。スルフヒドリル基（例えば、システイン残基に見出されるものなど）もまた、PEGを結合させるための反応性の基として用いることができる。加えて、ポリペプチドのC末端に特異的に、活性化された基（例えば、ヒドラジン、アルデヒド、および芳香族アミノ基）を導入するための酵素支援法が記載されている（Schwarz, et al. (1990) Methods Enzymol. 184:160；Rose, et al. (1991) Bioconjugate Chem. 2:154；およびGaertner, et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:7224を参照されたい）。
【０１０３】
一部の実施形態では、PEG分子は、様々な反応性部分を有するメトキシル化PEG（「mPEG」）を用いてアミノ基に結合させることができる。そのような反応性部分の非限定的な例としては、コハク酸スクシンイミジル（SS）、炭酸スクシンイミジル（SC）、mPEG-イミデート、パラ-ニトロフェニルカーボネート（NPC）、プロピオン酸スクシンイミジル（SPA）、および塩化シアヌルが挙げられる。そのようなmPEGの非限定的な例としては、mPEG-コハク酸スクシンイミジル（mPEG-SS）、mPEG2-コハク酸スクシンイミジル（mPEG2-SS）；mPEG-炭酸スクシンイミジル（mPEG-SC）、mPEG2-炭酸スクシンイミジル（mPEG2-SC）；mPEG-イミデート、mPEG-パラ-ニトロフェニルカーボネート（mPEG-NPC）、mPEG-イミデート；mPEG2-パラ-ニトロフェニルカーボネート（mPEG2-NPC）；mPEG-プロピオン酸スクシンイミジル（mPEG-SPA）；mPEG2-プロピオン酸スクシンイミジル（mPEG2-SPA）；mPEG-N-ヒドロキシ-スクシンイミド（mPEG-NHS）；mPEG2-N-ヒドロキシ-スクシンイミド（mPEG2-NHS）；mPEG-塩化シアヌル；mPEG2-塩化シアヌル；mPEG2-リシノール-NPC、およびmPEG2-Lys-NHSが挙げられる。
【０１０４】
一般的に、PEG単位を構成するPEG鎖のうちの少なくとも1本が、連結アセンブリ単位に結合できるように官能化されている。官能化は、例えば、アミン、チオール、NHSエステル、マレイミド、アルキン、アジド、カルボニル、または他の官能基を介したものであり得る。PEG単位は、連結アセンブリ単位へのカップリングを促すために、または2本以上のPEG鎖のカップリングを促すために、非PEG物質（すなわち、-CH2CH2O-により構成されない物質）をさらに含むことができる。
【０１０５】
広範囲のポリエチレングリコール（PEG）分子種を用いることができ、実質的にいかなる好適な反応性PEG試薬でも用いることができる。一部の実施形態では、反応性PEG試薬は、LPへの結合時にカルバメート結合またはアミド結合の形成を生じるであろう。以下のPEG試薬が、様々な実施形態で有用である：mPEG2-NHS、mPEG2-ALD、マルチアームPEG、mPEG(MAL)2、mPEG2(MAL）、mPEG-NH2、mPEG-SPA、mPEG-SBA、mPEG-チオエステル、mPEG-二重エステル、mPEG-BTC、mPEG-ButyrALD、mPEG-ACET、ヘテロ官能性PEG（NH2-PEG-COOH、Boc-PEG-NHS、Fmoc-PEG-NHS、NHS-PEG-VS、NHS-PEG-MAL）、PEGアクリレート（ACRL-PEG-NHS）、PEG-リン脂質（例えば、mPEG-DSPE）、SUNBRITETMシリーズのマルチアームPEG（当業者により選択された化学により活性化されたグリセリン系PEGのGLシリーズを含む）、SUNBRITE活性化型PEGのいずれか（限定するものではないが、カルボキシル-PEG、p-NP-PEG、トレシル-PEG、アルデヒドPEG、アセタール-PEG、アミノ-PEG、チオール-PEG、マレイミド-PEG、ヒドロキシル-PEG-アミン、アミノ-PEG-COOK、ヒドロキシル-PEG-アルデヒド、カルボン酸無水物型PEG、官能化PEG-リン脂質、およびそれらの特定の適用および用途に関して当業者により選択される通りの他の類似かつ/または好適な反応性PEGが挙げられる。
【０１０６】
PEG単位の追加は、それにより生じるMD-ADCの薬物動態に対して2つの考えられる影響を有し得る。望ましい影響は、薬物-リンカーの曝露された疎水性要素により引き起こされる非特異的相互作用の低減に起因するクリアランスの減少（および結果として曝露の増大）である。2番目の影響は望ましくない影響であり、MD-ADCの分子量の増大に起因し得る体積および分布速度の減少である。PEGサブユニット数の増加は、コンジュゲートの流体力学半径を増大させ、それにより拡散性を低下させる。次に、低下した拡散性は、MD-ADCが腫瘍内に浸透する能力を低下させ得る（Schmidt and Wittrup, Mol Cancer Ther 2009;8:2861-2871）。それら2つの競合する薬物動態学的効果を理由として、MD-ADCクリアランスを減少させ、それにより血漿中曝露を増加させるために十分大きく、しかしMD-ADCが意図される標的細胞集団に到達する能力を低下させる可能性がある、その拡散性の大幅な低下をもたらすほどには大きくないPEGを用いることが望ましい。特定の薬物-リンカーに対する最適なPEGサイズを選択するための方法に関しては、例を参照されたい（例えば、米国特許出願公開第2016/0310612号の実施例1、18、および21）。
【０１０７】
1つの群の実施形態では、PEG単位は、少なくとも6個のサブユニット、少なくとも7個のサブユニット、少なくとも8個のサブユニット、少なくとも9個のサブユニット、少なくとも10個のサブユニット、少なくとも11個のサブユニット、少なくとも12個のサブユニット、少なくとも13個のサブユニット、少なくとも14個のサブユニット、少なくとも15個のサブユニット、少なくとも16個のサブユニット、少なくとも17個のサブユニット、少なくとも18個のサブユニット、少なくとも19個のサブユニット、少なくとも20個のサブユニット、少なくとも21個のサブユニット、少なくとも22個のサブユニット、少なくとも23個のサブユニット、または少なくとも24個のサブユニットを含む。本明細書中で用いる場合、PEG単位に関する際のサブユニットとは、以下の式を有するポリエチレングリコールサブユニットを意味する：
【化１３】
2018118953.tif 000014
一部のそのような実施形態では、PEG単位は、約72個以下のサブユニットを含む。
【０１０８】
1つの群の実施形態では、PEG単位は、少なくとも2個のサブユニット、少なくとも3個のサブユニット、少なくとも4個のサブユニット、少なくとも5個のサブユニット、少なくとも6個のサブユニット、少なくとも7個のサブユニット、少なくとも8個のサブユニット、少なくとも9個のサブユニット、少なくとも10個のサブユニット、少なくとも11個のサブユニット、少なくとも12個のサブユニット、少なくとも13個のサブユニット、少なくとも14個のサブユニット、少なくとも15個のサブユニット、少なくとも16個のサブユニット、少なくとも17個のサブユニット、少なくとも18個のサブユニット、少なくとも19個のサブユニット、少なくとも20個のサブユニット、少なくとも21個のサブユニット、少なくとも22個のサブユニット、少なくとも23個のサブユニット、または少なくとも24個のサブユニットをそれぞれ有する1本以上の直鎖状PEG鎖を含む。好ましい実施形態では、PEG単位は、併せて合計で少なくとも6個のサブユニット、少なくとも8個、少なくとも10個のサブユニット、または少なくとも12個のサブユニットを含む。一部のそのような実施形態では、PEG単位は、併せて合計で約72個以下のサブユニット、好ましくは併せて合計で約36個以下のサブユニットを含む。
【０１０９】
別の群の実施形態では、PEG単位は、併せて合計で4〜72個、4〜60個、4〜48個、4〜36個もしくは4〜24個のサブユニット、5〜72個、5〜60個、5〜48個、5〜36個もしくは5〜24個のサブユニット、6〜72個、6〜60個、6〜48個、6〜36個もしくは6〜24個のサブユニット、7〜72個、7〜60個、7〜48個、7〜36個もしくは7〜24個のサブユニット、8〜72個、8〜60個、8〜48個、8〜36個もしくは8〜24個のサブユニット、9〜72個、9〜60個、9〜48個、9〜36個もしくは9〜24個のサブユニット、10〜72個、10〜60個、10〜48個、10〜36個もしくは10〜24個のサブユニット、11〜72個、11〜60個、11〜48個、11〜36個もしくは11〜24個のサブユニット、12〜72個、12〜60個、12〜48個、12〜36個もしくは12〜24個のサブユニット、13〜72個、13〜60個、13〜48個、13〜36個もしくは13〜24個のサブユニット、14〜72個、14〜60個、14〜48個、14〜36個もしくは14〜24個のサブユニット、15〜72個、15〜60個、15〜48個、15〜36個もしくは15〜24個のサブユニット、16〜72個、16〜60個、16〜48個、16〜36個もしくは16〜24個のサブユニット、17〜72個、17〜60個、17〜48個、17〜36個もしくは17〜24個のサブユニット、18〜72個、18〜60個、18〜48個、18〜36個もしくは18〜24個のサブユニット、19〜72個、19〜60個、19〜48個、19〜36個もしくは19〜24個のサブユニット、20〜72個、20〜60個、20〜48個、20〜36個もしくは20〜24個のサブユニット、21〜72個、21〜60個、21〜48個、21〜36個もしくは21〜24個のサブユニット、22〜72個、22〜60個、22〜48個、22〜36個もしくは22〜24個のサブユニット、23〜72個、23〜60個、23〜48個、23〜36個もしくは23〜24個のサブユニット、または24〜72個、24〜60個、24〜48個、24〜36個もしくは24個のサブユニットを含む。
【０１１０】
別の群の実施形態では、PEG単位は、併せて合計で4〜72個、4〜60個、4〜48個、4〜36個もしくは4〜24個のサブユニット、5〜72個、5〜60個、5〜48個、5〜36個もしくは5〜24個のサブユニット、6〜72個、6〜60個、6〜48個、6〜36個もしくは6〜24個のサブユニット、7〜72個、7〜60個、7〜48個、7〜36個もしくは7〜24個のサブユニット、8〜72個、8〜60個、8〜48個、8〜36個もしくは8〜24個のサブユニット、9〜72個、9〜60個、9〜48個、9〜36個もしくは9〜24個のサブユニット、10〜72個、10〜60個、10〜48個、10〜36個もしくは10〜24個のサブユニット、11〜72個、11〜60個、11〜48個、11〜36個もしくは11〜24個のサブユニット、12〜72個、12〜60個、12〜48個、12〜36個もしくは12〜24個のサブユニット、13〜72個、13〜60個、13〜48個、13〜36個もしくは13〜24個のサブユニット、14〜72個、14〜60個、14〜48個、14〜36個もしくは14〜24個のサブユニット、15〜72個、15〜60個、15〜48個、15〜36個もしくは15〜24個のサブユニット、16〜72個、16〜60個、16〜48個、16〜36個もしくは16〜24個のサブユニット、17〜72個、17〜60個、17〜48個、17〜36個もしくは17〜24個のサブユニット、18〜72個、18〜60個、18〜48個、18〜36個もしくは18〜24個のサブユニット、19〜72個、19〜60個、19〜48個、19〜36個もしくは19〜24個のサブユニット、20〜72個、20〜60個、20〜48個、20〜36個もしくは20〜24個のサブユニット、21〜72個、21〜60個、21〜48個、21〜36個もしくは21〜24個のサブユニット、22〜72個、22〜60個、22〜48個、22〜36個もしくは22〜24個のサブユニット、23〜72個、23〜60個、23〜48個、23〜36個もしくは23〜24個のサブユニット、または24〜72個、24〜60個、24〜48個、24〜36個もしくは24個のサブユニットを有する1本以上の直鎖状PEG鎖を含む。
【０１１１】
別の群の実施形態では、PEG単位は、少なくとも2個のサブユニット、少なくとも3個のサブユニット、少なくとも4個のサブユニット、少なくとも5個のサブユニット、少なくとも6個のサブユニット、少なくとも7個のサブユニット、少なくとも8個のサブユニット、少なくとも9個のサブユニット、少なくとも10個のサブユニット、少なくとも11個のサブユニット、少なくとも12個のサブユニット、少なくとも13個のサブユニット、少なくとも14個のサブユニット、少なくとも15個のサブユニット、少なくとも16個のサブユニット、少なくとも17個のサブユニット、少なくとも18個のサブユニット、少なくとも19個のサブユニット、少なくとも20個のサブユニット、少なくとも21個のサブユニット、少なくとも22個のサブユニット、少なくとも23個のサブユニット、または少なくとも24個のサブユニットを有する誘導体化された1本の直鎖状PEG鎖である。
【０１１２】
別の群の実施形態では、PEG単位は、6〜72個、6〜60個、6〜48個、6〜36個もしくは6〜24個のサブユニット、7〜72個、7〜60個、7〜48個、7〜36個もしくは7〜24個のサブユニット、8〜72個、8〜60個、8〜48個、8〜36個もしくは8〜24個のサブユニット、9〜72個、9〜60個、9〜48個、9〜36個もしくは9〜24個のサブユニット、10〜72個、10〜60個、10〜48個、10〜36個もしくは10〜24個のサブユニット、11〜72個、11〜60個、11〜48個、11〜36個もしくは11〜24個のサブユニット、12〜72個、12〜60個、12〜48個、12〜36個もしくは12〜24個のサブユニット、13〜72個、13〜60個、13〜48個、13〜36個もしくは13〜24個のサブユニット、14〜72個、14〜60個、14〜48個、14〜36個もしくは14〜24個のサブユニット、15〜72個、15〜60個、15〜48個、15〜36個もしくは15〜24個のサブユニット、16〜72個、16〜60個、16〜48個、16〜36個もしくは16〜24個のサブユニット、17〜72個、17〜60個、17〜48個、17〜36個もしくは17〜24個のサブユニット、18〜72個、18〜60個、18〜48個、18〜36個もしくは18〜24個のサブユニット、19〜72個、19〜60個、19〜48個、19〜36個もしくは19〜24個のサブユニット、20〜72個、20〜60個、20〜48個、20〜36個もしくは20〜24個のサブユニット、21〜72個、21〜60個、21〜48個、21〜36個もしくは21〜24個のサブユニット、22〜72個、22〜60個、22〜48個、22〜36個もしくは22〜24個のサブユニット、23〜72個、23〜60個、23〜48個、23〜36個もしくは23〜24個サブユニット、または24〜72個、24〜60個、24〜48個、24〜36個もしくは24個のサブユニットを有する誘導体化された1本の直鎖状PEG鎖である。
【０１１３】
別の群の実施形態では、PEG単位は、2〜72個、2〜60個、2〜48個、2〜36個または2〜24個のサブユニット、2〜72個、2〜60個、2〜48個、2〜36個または2〜24個のサブユニット、3〜72個、3〜60個、3〜48個、3〜36個または3〜24個のサブユニット、3〜72個、3〜60個、3〜48個、3〜36個または3〜24個のサブユニット、4〜72個、4〜60個、4〜48個、4〜36個または4〜24個のサブユニット、5〜72個、5〜60個、5〜48個、5〜36個または5〜24個のサブユニットを有する誘導体化された1本の直鎖状PEG鎖である。
【０１１４】
本明細書中に提供される実施形態のうちのいずれかで用いることができる例示的直鎖状PEG単位は、以下の通りである：
【化１４】
2018118953.tif 000015
[式中、波線は平行コネクター単位に結合する部位を示し、
R20はPEG結合単位であり；
R21はPEGキャップ化単位であり；
R22はPEGカップリング単位（すなわち、複数のPEGサブユニット鎖を一緒にカップリングするため）であり；
nは、2〜72（好ましくは4〜72、より好ましくは6〜72、8〜72、10〜72、12〜72または6〜24)から独立に選択され；
eは2〜5であり；
各n'は1〜72から独立に選択される]。好ましい実施形態では、PEG単位中に、少なくとも6個、好ましくは少なくとも8個、少なくとも10個、または少なくとも12個のPEGサブユニットがある。一部の実施形態では、PEG単位中に72個以下または36個以下のPEGサブユニットがある。
【０１１５】
好ましい実施形態では、nは8または約8、12または約12、24または約24である。
【０１１６】
PEG結合単位は、PEG単位の一部分であり、PEG単位を連結アセンブリ単位の他の部分に連結するために機能する。したがって、連結アセンブリ単位の一部分（T、Q1、L1、D1、X、Q2、L2、D2、X1またはX2）は、PEG単位との結合を形成する官能基を有する。連結アセンブリ単位上の部位へのPEG単位の結合のための官能基としては、ジスルフィド結合またはチオエーテル結合を形成するためのスルフヒドリル基、ヒドラゾン結合を形成するためのアルデヒド基、ケトン基、またはヒドラジン基、オキシム結合を形成するためのヒドロキシルアミン、ペプチド結合を形成するためのカルボン酸基またはアミノ基、エステル結合を形成するためのカルボン酸基またはヒドロキシ基、スルホンアミド結合を形成するためのスルホン酸、カルバメート結合を形成するためのアルコール、およびスルホンアミド結合またはカルバメート結合またはアミド結合を形成するためのアミンが挙げられる。したがって、PEG単位は、例えば、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、ペプチド結合、エステル結合、スルホンアミド結合、カルバメート結合、またはアミド結合を介して、連結アセンブリ単位上の部位に結合することができる。一部の実施形態では、PEG結合単位は、クリック化学（アジン官能基とアルキン官能基との間の付加環化の生成物）、付加反応、連結アセンブリ単位へとPEG単位を結合させる際に生じる付加/除去反応または置換反応を用いて結合する。
【０１１７】
PEGカップリング単位はPEG単位の一部分であり、反復CH2CH2O-サブユニットの2本以上の鎖を連結するために機能する非PEG物質である。例示的実施形態では、PEGカップリング単位R22は、-C1-10アルキレン-C(O)-NH-、-C1-10アルキレン-NH-C(O)-、-C2-10アルキレン-NH-、-C2-10アルキレン-O-、-C1-10アルキレン-S-、または-C2-10アルキレン-NH-である。
【０１１８】
例示的実施形態では、PEG結合単位R20は、-C(O)-、-O-、-S-、-S(O)-、-NH-、-C(O)O-、-C(O)C1-10アルキル、-C(O)C1-10アルキル-O-、-C(O)C1-10アルキル-CO2-、-C(O)C1-10アルキル-NH-、-C(O)C1-10アルキル-S-、-C(O)C1-10アルキル-C(O)-NH-、-C(O)C1-10アルキル-NH-C(O)-、-C1-10アルキル、-C1-10アルキル-O-、-C1-10アルキル-CO2-、-C1-10アルキル-NH-、-C1-10アルキル-S-、-C1-10アルキル-C(O)-NH-、-C1-10アルキル-NH-C(O)-、-CH2CH2SO2-C1-10アルキル-、-CH2C(O)-C1-10アルキル-、=N-(OまたはN)-C1-10アルキル-O-、=N-(OまたはN)-C1-10アルキル-NH-、=N-(OまたはN)-C1-10アルキル-CO2-、=N-(OまたはN)-C1-10アルキル-S-、
【化１５】
2018118953.tif 000016
であり；
各R21は独立に、-C1-10アルキル、-C2-10アルキル-CO2H、-C2-10アルキル-OH、-C2-10アルキル-NH2、C2-10アルキル-NH(C1-3アルキル)、またはC2-10アルキル-N(C1-3アルキル)2であり；かつ
各R22は独立に、-C1-10アルキル-C(O)-NH-、-C1-10アルキル-NH-C(O)-、-C2-10アルキル-NH-、-C2-10アルキル-O-、-C1-10アルキル-S-、または-C2-10アルキル-NH-である。
【０１１９】
一部の実施形態では、R20は、-NH-、-C(=O)-、トリアゾール結合基、または-S-、または
【化１６】
2018118953.tif 000017
などのマレイミド結合基（式中、波線は連結アセンブリ単位への結合部位を示し、星印はPEG単位との結合部位を示す）である。一部のそのような態様では、R21は、C1-10アルキル、-C2-10アルキル-CO2H、-C2-10アルキル-OH、または-C2-10アルキル-NH2である。
【０１２０】
本明細書中に提供される実施形態のうちのいずれかで用いることができる例示的直鎖状PEG単位は、以下の通りである：
【化１７】
2018118953.tif 000018
[式中、波線は連結アセンブリ単位への結合部位を示し、各nは、4〜72、6〜72、8〜72、10〜72、12〜72、6〜24、または8〜24から独立に選択される]。一部の態様では、nは約8、約12、または約24である。
【０１２１】
一部の実施形態では、PEG単位は、連結アセンブリ単位の末端結合基（Q）に付加される。これは、末端アミンを用いて誘導体化されたPEG単位を用いて達成することができる。一部の実施形態では、末端アミンを用いて誘導体化されたPEGは、1〜3個のアミノ酸（例えば、モノペプチド、ジペプチド、またはトリペプチド）を介して連結アセンブリ単位の末端結合基（Q）に連結される。例えば、一部の実施形態では、PEG単位は、式：Q-グリシンPEG単位を用いて末端結合基（Q）に連結される。
【０１２２】
本明細書中に記載される場合、PEG単位は、得られるMD-ADCのクリアランスを改善するが、コンジュゲートが腫瘍内へと浸透する能力に顕著に影響しないように選択される。MD-ADCの薬物単位および連結アセンブリ単位がマレイミド-グルクロニドMMAE薬物-リンカーのものと同等の疎水性を有する実施形態では、使用のために選択されるべきPEG単位は、好ましくは、8個のサブユニット〜約24個のサブユニット、より好ましくは約12個のサブユニットを有するであろう。MD-ADCの薬物単位および連結アセンブリ単位がマレイミド-グルクロニドMMAE薬物-リンカーのものよりも高い疎水性を有する実施形態では、さらに多くのサブユニットを有するPEG単位を選択することができる。
【０１２３】
本発明の好ましい実施形態では、PEG単位は、約300ダルトン〜約5キロダルトン；約300ダルトン〜約4キロダルトン；約300ダルトン〜約3キロダルトン；約300ダルトン〜約2キロダルトン；または約300ダルトン〜約1キロダルトンである。一部のそのような態様では、PEG単位は、少なくとも6個のサブユニットまたは少なくとも8個、10個もしくは12個のサブユニットを有する。一部のそのような態様では、PEG単位は、少なくとも6個のサブユニットまたは少なくとも8個、10個もしくは12個のサブユニットを有するが、72個以下のサブユニット、好ましくは36個以下のサブユニットを有する。
【０１２４】
本発明の好ましい実施形態では、PEG単位以外には、薬物-リンカー中には他のPEGサブユニットは存在しない（すなわち、本明細書中に提供されるコンジュゲートおよびリンカーの他の構成要素のいずれにもPEGサブユニットはない）。本発明の他の態様では、PEG単位以外には、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、2個以下、または1個以下の他のポリエチレングリコールサブユニットが、薬物-リンカー中に存在する（すなわち、本明細書中に提供されるコンジュゲートおよびリンカーの他の構成要素中に、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個、または1個以下の他のポリエチレングリコールサブユニットが存在する）。構成要素としては、ストレッチャー単位、平行コネクター単位、薬物単位、分岐単位、および放出可能アセンブリ単位が挙げられる。
【０１２５】
PEGサブユニットに関しては、および文脈に応じて、例えば、MD-ADCまたは中間体化合物の集団に言及する場合、および多分散PEGを用いる場合には、サブユニット数は平均数を表わすことができることが理解されるであろう。
【０１２６】
薬物単位（D1およびD2）
2個以上の薬物単位を、結合基（Q1またはQ2）を介してLA単位に共有結合させることができる。上記の節で言及される通り、LA単位は、任意的連結基（L1およびL2）を含むことができる。任意的連結基はLA単位の結合前に薬物部分に結合させることができるか、または任意的連結基は薬物部分の結合前にLA単位に結合させることができることが理解される。
【０１２７】
本発明の効果は、薬物が本来は疎水性である実施形態では、より明白であろう。したがって、本発明の薬物は、好ましくは、本来は疎水性である。
【０１２８】
薬物単位（D）は、本明細書中では細胞傷害剤、細胞静止剤または免疫抑制剤とも称される、細胞傷害性薬物、細胞静止性薬物または免疫抑制性薬物であり得る。薬物単位は、第1または第2の結合基（Q1またはQ2）との結合を形成できる原子を有する。一部の実施形態では、薬物単位Dは、第1または第2の結合基（Q1またはQ2）との結合を形成できる窒素原子を有する。他の実施形態では、薬物単位Dは、第1または第2の結合基（Q1またはQ2）との結合を形成できるカルボン酸を有する。他の実施形態では、薬物単位Dは、第1または第2の結合基（Q1またはQ2）との結合を形成できるスルフヒドリル基を有する。また他の実施形態では、薬物単位Dは、第1または第2の結合基（Q1またはQ2）との結合を形成できるヒドロキシル基またはケトンまたはアルコールを有する。
【０１２９】
有用なクラスの細胞傷害剤または免疫抑制剤としては、例えば、抗チューブリン剤、DNA副溝バインダー（DNA minor groove binder）、DNA複製阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド等が挙げられる。有用なクラスの細胞傷害剤の特定の例としては、例えば、DNA副溝バインダー、DNAアルキル化剤、およびチューブリン阻害剤が挙げられる。例示的細胞傷害剤としては、例えば、アウリスタチン、カンプトテシン、デュオカルマイシン、エトポシド、メイタンシンおよびメイタンシノイド（maytansinoid）、タキサン、ベンゾジアゼピンまたはベンゾジアゼピン含有薬（例えば、ピロロ[1,4]-ベンゾジアゼピン（PBD）、インドリノベンゾジアゼピン（indolinobenzodiazepine）、およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン）およびビンカアルカロイドが挙げられる。ベンゾジアゼピン含有薬の選択は、国際公開第2010/091150号、同第2012/112708号、同第2007/085930号、および同第2011/023883号に記載されている。
【０１３０】
特定の実施形態では、細胞傷害剤は、別のグループの抗チューブリン剤であるメイタンシンまたはメイタンシノイド（例えば、DM1、DM4）である（ImmunoGen社；Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131および米国特許第8,163,888号もまた参照されたい）。
【０１３１】
一部の実施形態では、薬物は、ベンゾジアゼピン（ベンゾジアゼピン含有薬、例えば、ピロロ[1,4]-ベンゾジアゼピン（PBD）、インドリノベンゾジアゼピン（indolinobenzodiazepine）、およびオキサゾリジノベンゾジアゼピンを含む）である。
【０１３２】
PBDは以下の一般的構造を有するが：
【化１８】
2018118953.tif 000019
その芳香族A環およびピロロC環の両方での置換基の数、タイプおよび位置、ならびにC環の飽和度は異なり得る。B環には、DNAのアルキル化を担う求電子中心であるN10-C11位に、イミン（N=C）、カルビノールアミン（NH-CH(OH)）、またはカルビノールアミンメチルエーテル（NH-CH(OMe)）がある。既知の天然生成物のすべてが、キラルC11a位での(S)配向性を有し、これは、C環からA環に向かって見た場合に、それらを右巻きにねじれさせる。これにより、天然生成物はB型DNAの副溝を有するイソヘリカル性（isohelicity）に関して適切な三次元形状を与えられ、それにより結合部位でぴったりとフィットする。副溝で付加化合物を形成するPBDの能力は、それらがDNAプロセシングを妨害することを可能にし、それにより抗腫瘍剤としてのその使用を可能にする。これらの分子の生物学的活性は、例えば、2個のPBD単位を、柔軟なアルキレンリンカーを介してそのC8/C'-ヒドロキシル官能基で一緒に併せることにより、強化することができる。PBD二量体は、それらの生物学的活性を主に担うと考えられる回文性5'-Pu-GATC-Py-3'鎖間架橋などの配列選択的DNA損傷を形成すると考えられている。
【０１３３】
薬物単位は、例えば、モノメチルアウリスタチンEと同等かまたはそれより高い疎水性を有するアウリスタチンまたは非アウリスタチン薬物であり得る。一部の態様では、薬物は、モノメチルアウリスタチンEと同等かまたはそれより高い疎水性を有するMMAEまたはアウリスタチンである。アウリスタチン薬物は、例えば、そのN末端またはC末端を介して、第1または第2の結合基（Q1またはQ2）に共有結合させることができる。MMAEは2.59のSlogP値を有する。一部の態様では、本発明で用いられる薬物は、1.5以上、2.0以上、または2.5以上のSlogP値を有するであろう。一部の態様では、本発明で用いられる薬物は、(a)約1.5、約2、もしくは2.5〜約7、(b)約1.5、約2、もしくは2.5〜約6、(c)約1.5、約2もしくは約2.5〜約5、(d)約1.5、約2、もしくは2.5〜約4、または(e)約1.5、約2もしくは約2.5〜約3のSlogP値を有するであろう。
【０１３４】
薬物単位は、以下の式DEを有することができ、式中、第1または第2の結合基（Q1またはQ2）に対する結合はN末端を介する：
【化１９】
2018118953.tif 000020
[式中、各位置で独立に：
R2は、HおよびC1-C8アルキルからなる群より選択され；
R3は、H、C1-C8アルキル、C3-C8炭素環、アリール、C1-C8アルキル-アリール、C1-C8アルキル-(C3-C8炭素環)、C3-C8複素環およびC1-C8アルキル-(C3-C8複素環)からなる群より選択され；
R4は、H、C1-C8アルキル、C3-C8炭素環、アリール、C1-C8アルキル-アリール、C1-C8アルキル-(C3-C8炭素環)、C3-C8複素環およびC1-C8アルキル-(C3-C8複素環)からなる群より選択され；
R5は、Hおよびメチルからなる群より選択され；
またはR4およびR5は結合して炭素環を形成し、かつ式(CRaRb)n（式中、RaおよびRbは、H、C1-C8アルキルおよびC3-C8炭素環からなる群より独立に選択され；nは2、3、4、5および6からなる群より選択される）を有し；
R6は、HおよびC1-C8アルキルからなる群より選択され；
R7は、H、C1-C8アルキル、C3-C8炭素環、アリール、C1-C8アルキル-アリール、C1-C8アルキル-(C3-C8炭素環)、C3-C8複素環およびC1-C8アルキル-(C3-C8複素環)からなる群より選択され；
各R8は、H、OH、C1-C8アルキル、C3-C8炭素環およびO-(C1-C8アルキル)からなる群より独立に選択され；
R9は、HおよびC1-C8アルキルからなる群より選択され；
R18は、-C(R8)2-C(R8)2-アリール、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8複素環)、および-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8炭素環)からなる群より選択される]。
【０１３５】
そのN末端を介してコンジュゲート化されたMMAEを、以下に示す：
【化２０】
2018118953.tif 000021
【０１３６】
一部の実施形態では、薬物単位はビンカ化合物、カンプトテシンまたはアントラサイクリン細胞傷害性化合物である。-L1-D1または-L2-D2部分に存在する場合のそれらの薬物単位の構造例は、薬物-リンカー中間体に関して本明細書中に記載されている。
【０１３７】
MD-ADCが細胞株に対して細胞静止作用または細胞傷害作用を発揮するか否かを決定するために用いることができる多数の様々なアッセイがある。MD-ADCが細胞株に対して細胞静止作用または細胞傷害作用を発揮するか否かを決定するための一例では、チミジン取り込みアッセイが用いられる。例えば、96ウェルプレートの5000細胞/ウェルの密度の細胞を、72時間培養し、72時間の最後の8時間の間、0.5μCiの3H-チミジンに曝露し、培養物の細胞への3H-チミジンの取り込みを、MD-ADCの存在下および非存在下で測定する。培養物の細胞が、MD-ADCと接触させない以外は同じ条件下で培養された同じ細胞株の細胞と比較して減少した3H-チミジン取り込みを有する場合、MD-ADCは細胞株に対して細胞静止作用または細胞傷害作用を有する。
【０１３８】
別の実施形態では、MD-ADCが細胞株に対して細胞静止作用または細胞傷害作用を発揮するか否かを決定するために、ニュートラルレッド、トリパンブルー、またはALAMARTMブルーなどの色素の取り込みを細胞で測定することにより、細胞生存率を計測する（例えば、Page et al., 1993, Intl. J. of Oncology 3:473-476を参照されたい）。そのようなアッセイでは、色素を含有する培地中で細胞をインキュベートし、細胞を洗浄し、細胞による色素の取り込みを反映する残留色素を、分光光度計を用いて測定する。タンパク質結合性色素であるスルホローダミンB（SRB）もまた、細胞傷害性を測定するために用いることができる（Skehan et al., 1990, J. Nat'l Cancer Inst. 82:1107-12）。好ましいMD-ADCは、細胞株に対して、1000ng/mL未満、好ましくは500ng/mL未満、より好ましくは100ng/mL未満、さらに最も好ましくは50ng/mL未満または10ng/mL未満でさえあるIC50値（50％細胞死滅をもたらすmAB濃度として定義される）を有するものである。
【０１３９】
薬物をリンカーに連結させるための一般的な手順は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第8,163,888号、同第7,659,241号、同第7,498,298号、米国特許出願公開第2011/0256157号および国際公開第2011/023883号および同第2005/112919号を参照されたい。
【０１４０】
抗体（Ab）
本明細書中に記載されるMD-ADCで有用な抗体は、4箇所の利用可能な鎖間ジスルフィド結合、またはそれらの鎖間ジスルフィド結合の還元により生じる8個のチオールを有する本質的にいずれかの抗体である。抗体は、一般的に、非遺伝子操作型抗体（追加のアミノ酸またはペプチドを導入するための改変が行なわれていない抗体）である。
【０１４１】
1つの群の実施形態では、多剤抗体薬物コンジュゲート（MD-ADC）は、式(I)により表わされる：
【化２１】
2018118953.tif 000022
[式中、
Abは、非遺伝子操作型抗体である抗体であり；
Tは、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じるチオールに結合する係留基であり；
Q1は、第1の結合基であり；
Q2は、第2の結合基であり；
Xは、結合基リンカーであり；
D1は、第1の薬物部分であり；
D2は、第2の薬物部分であり；
L1は、D1とQ1とをつなぐ任意的連結基であり；
L2は、D2とQ2とをつなぐ任意的連結基であり；
下付き文字m1およびm2は、それぞれ独立に0および1から選択され；
Yは、分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【０１４２】
別の群の実施形態では、MD-ADCは、式(II)により表わされる：
【化２２】
2018118953.tif 000023
[式中、
Abは、非遺伝子操作型抗体である抗体であり；
Tは、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じるチオールに結合する係留基であり；
Q1は、第1の結合基であり；
Q2は、第2の結合基であり；
Xは、結合基リンカーであり；
D1は、第1の薬物部分であり；
D2は、第2の薬物部分であり；
L1は、D1とQ1とをつなぐ任意的連結基であり；
L2は、D2とQ2とをつなぐ任意的連結基であり；
下付き文字m1およびm2は、それぞれ独立に0および1から選択され；
Yは、分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【０１４３】
また別の群の実施形態では、MD-ADCは、式(III)により表わされる：
【化２３】
2018118953.tif 000024
[式中、
Abは、非遺伝子操作型抗体である抗体であり；
Tは、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じるチオールに結合する係留基であり；
各Q1は、独立に選択される第1の結合基であり；
Q2は、第2の結合基であり；
X1およびX2は、それぞれ結合基リンカーであり；
D1は、第1の薬物部分であり；
D2は、第2の薬物部分であり；
各L1は、D1とQ1とをつなぐ任意的連結基であり；
L2は、D2とQ2とをつなぐ任意的連結基であり；
下付き文字m1およびm2は、それぞれ独立に0および1から選択され；
Yは、分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【０１４４】
また別の群の実施形態では、MD-ADCは、式(IV)により表わされる：
【化２４】
2018118953.tif 000025
[式中、
Abは、非遺伝子操作型抗体である抗体であり；
Tは、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じるチオールに結合する係留基であり；
Q1は、独立に選択される第1の結合基であり；
各Q2は、第2の結合基であり；
X1およびX2は、それぞれ結合基リンカーであり；
D1は、第1の薬物部分であり；
D2は、第2の薬物部分であり；
L1は、D1とQ1とをつなぐ任意的連結基であり；
各L2は、D2とQ2とをつなぐ任意的連結基であり；
下付き文字m1およびm2は、それぞれ独立に0および1から選択され；
Yは、L、Q1、X1、X2、Q2、L1またはL2上の部位に結合する分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【０１４５】
上記の実施形態のそれぞれでは、L、Q1、Q2、X1、X2、L1、L2、D1、D2、およびYは、先行する節に記載された通りである。
【０１４６】
上記の式（I）、（II）、（III）、および（IV）に関して、好適な抗体（Ab）は完全抗体または完全に還元された抗体である。「完全に還元された」との用語は、4箇所すべての鎖間ジスルフィド結合が還元されて、係留基（T）に結合できる8個のチオールを生じている抗体を指すことを意味する。1つの群の実施形態では、抗体は、癌細胞抗原を標的とする。別の群の実施形態では、抗体は、細菌関連抗原を標的とする。また別の群の実施形態では、抗体は、自己免疫細胞抗原を標的とする。
【０１４７】
有用なポリクローナル抗体は、免疫化された動物の血清に由来する抗体分子の不均一な集団である。有用なモノクローナル抗体は、特定の抗原性決定基（例えば、癌細胞抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、タンパク質、ペプチド、炭水化物、化合物、核酸、またはそれらの断片）に対する抗体の均一な集団である。対象となる抗原に対するモノクローナル抗体（mAb）は、培養中の連続した細胞株からの抗体分子の産生を提供する当技術分野で公知のいずれかの技術を用いて調製できる。
【０１４８】
有用なモノクローナル抗体としては、限定するものではないが、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、またはキメラ型ヒト-マウス（または他の動物種）モノクローナル抗体が挙げられる。抗体は、全長抗体およびその抗原結合性断片を含む。ヒトモノクローナル抗体は、当技術分野で公知の多数の技術のうちのいずれかにより作製することができる（例えば、Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:7308-7312；Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72-79；およびOlsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16）。
【０１４９】
抗体は、標的細胞（例えば、癌細胞抗原、ウイルス抗原、または微生物抗原）に免疫特異的に結合する抗体または腫瘍細胞もしくはマトリックスに結合する他の抗体の機能的に活性な断片、誘導体またはアナログであり得る。これに関して、「機能的に活性な」とは、断片、誘導体またはアナログが、標的細胞に免疫特異的に結合できることを意味する。CDR配列が抗原に結合するか否かを決定するためには、CDR配列を含む合成ペプチドを、当技術分野で公知のいずれかの結合性アッセイ法（例えば、BIA coreアッセイ）による抗原との結合性アッセイで用いることができる（例えば、Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md；Kabat E et al., 1980, J. Immunology 125(3):961-969を参照されたい）。
【０１５０】
加えて、標準的な組み換えDNA技術を用いて作製できる、ヒト部分および非ヒト部分の両方を含むキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体などの組み換え抗体は、有用な抗体である。キメラ抗体は、例えば、ネズミモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなどの、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である（例えば、米国特許第4,816,567号；および同第4,816,397号を参照されたい（それらの全体で参照により本明細書中に組み入れられる））。ヒト化抗体は、非ヒト生物種由来の1個以上の相補性決定領域（CDR）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、非ヒト生物種由来の抗体分子である（例えば、米国特許第5,585,089号を参照されたい（その全体で参照により本明細書中に組み入れられる））。そのようなキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の組み換えDNA技術により、例えば、以下の文献に記載される方法を用いて作製することができる：国際公開第87/02671号；欧州特許公報第0 184 187号；同第0 171 496号；同第0 173 494号；国際公開第86/01533号；米国特許第4,816,567号；欧州特許公報第012 023号；Berter et al., 1988, Science 240:1041-1043；Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443；Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526；Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218；Nishimura et al., 1987, Cancer. Res. 47:999-1005；Wood et al., 1985, Nature 314:446-449；およびShaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559；Morrison, 1985, Science 229:1202-1207；Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214；米国特許第5,225,539号；Jones et al., 1986, Nature 321:552-525；Verhoeyan et al., 1988, Science 239:1534；およびBeidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060（これらのそれぞれが、その全体で参照により本明細書中に組み入れられる）。
【０１５１】
完全にヒトの抗体が特に望ましく、内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を発現することができないが、ヒトの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いて生成することができる。
【０１５２】
癌細胞抗原に対して免疫特異的な抗体は、商業的に入手するか、または、例えば、化学合成もしくは組み換え発現技術などの当業者に公知のいずれかの方法により生成することができる。癌細胞抗原に対して免疫特異的な抗体をコードするヌクレオチド配列は、例えば、GenBankデータベースもしくはそれと同様のデータベースから、文献から、または慣用のクローニングおよび配列決定により入手することができる。
【０１５３】
具体的な実施形態では、癌の治療用の公知の抗体を用いることができる。癌細胞抗原に対して免疫特異的な抗体は、商業的に入手するか、または、例えば、組み換え発現技術などの当業者に公知のいずれかの方法により生成することができる。癌細胞抗原に対して免疫特異的な抗体をコードするヌクレオチド配列は、例えば、GenBankデータベースもしくはそれと同様のデータベースから、文献から、または慣用のクローニングおよび配列決定により入手することができる。
【０１５４】
別の具体的な実施形態では、自己免疫疾患の治療用の抗体が、本発明の組成物および方法に従って用いられる。自己免疫抗体の産生を担う細胞の抗原に対して免疫特異的な抗体は、いずれかの機関（例えば、大学の研究者または企業）から入手するか、または、例えば、化学合成もしくは組み換え発現技術などの当業者に公知のいずれかの方法により生成することができる。
【０１５５】
特定の実施形態では、有用な抗体は、活性化されたリンパ球上に発現される受容体または受容体複合体に結合することができる。受容体または受容体複合体は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバー、TNF受容体スーパーファミリーのメンバー、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、主要組織適合性タンパク質、レクチン、または補体制御タンパク質を含むことができる。
【０１５６】
一部の態様では、抗体は、CD19、CD20、CD30、CD33、CD70、α-v-β-6、Liv-1またはルイスY抗原に特異的に結合するであろう。
【０１５７】
抗CD30抗体は、例えば、キメラ型AC10抗体であるブレンツキシマブであり得る。抗CD30抗体は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、配列番号7に示されるアミノ酸配列を有するヒトγI定常領域および配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するヒトκ定常領域をさらに含むことができる。
【０１５８】
抗CD30抗体は、例えば、ヒト化AC10抗体であり得る。抗CD30抗体は、配列番号9に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、配列番号10に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有することができる。抗体は、配列番号7に示されるアミノ酸配列を有するヒトγI定常領域（任意により239位（EUインデックスによる）でのセリンからシステインへの置換を有する）および配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するヒトκ定常領域を有することができる。
【０１５９】
抗CD70抗体は、例えば、ヒト化抗体であり得る（例えば、米国特許出願公開第2009/0148942号を参照されたい）。例示的実施形態では、抗CD70抗体は、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号4に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する。
【０１６０】
抗CD19抗体は、例えば、ヒト化抗体であり得る（例えば、米国特許出願公開第2009/0136526号（その全体で、かつすべての目的に関して、参照により本明細書中に組み入れられる）を参照されたい）。例示的実施形態では、hBU12抗体は、配列番号5に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号6に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する。
【０１６１】
抗体は、ヒト化抗CD33抗体（米国特許出願公開第2013/0309223号（その全体で、かつすべての目的に関して、参照により本明細書中に組み入れられる））、ヒト化抗β6抗体（例えば、国際公開第2013/123152号（その全体で、かつすべての目的に関して、参照により本明細書中に組み入れられる）を参照されたい）、ヒト化抗Liv-1抗体（例えば、米国特許出願公開第2013/0259860号（その全体で、かつすべての目的に関して、参照により本明細書中に組み入れられる）を参照されたい）、またはヒト化AC10抗体（例えば、米国特許第8,257,706号（その全体で、かつすべての目的に関して、参照により本明細書中に組み入れられる）を参照されたい）であり得る。
【０１６２】
抗体に対する例示的な結合は、チオエーテル結合を介する。
【０１６３】
癌細胞抗原部位
癌の治療のために利用可能な抗体の例としては、限定するものではないが、ヒト化抗HER2モノクローナル抗体であるハーセプチン(登録商標)（トラスツズマブ；Genentech社）（転移性乳癌を有する患者の治療のため）；リツキサン(登録商標)（リツキシマブ；Genentech社）（非ホジキンリンパ腫を有する患者の治療のためのキメラ型抗CD20モノクローナル抗体）；オバレックス（OvaRex；AltaRex Corporation, MA）（卵巣癌の治療のためのネズミ抗体）；パノレックス（Panorex；Glaxo Wellcome, NC）（結腸直腸癌の治療のためのネズミIgG2a抗体）；セツキシマブ・アービタックス（Cetuximab Erbitux；Imclone Systems Inc., NY）（頭頸部癌などの上皮増殖因子陽性癌の治療のための抗EGFR IgGキメラ抗体）；ビタキシン（Vitaxin；MedImmune, Inc., MD）（肉腫の治療のためのヒト化抗体）；キャンパスI/H（Campath I/H；Leukosite, MA）（慢性リンパ性白血病（CLL）の治療のためのヒト化IgG1抗体）；スマートMI95（Smart MI95；Protein Design Labs, Inc., CA）（急性骨髄性白血病（AML）の治療のためのヒト化抗CD33 IgG抗体；リンホシド（LymphoCide；Immunomedics, Inc., NJ）（非ホジキンリンパ腫の治療のためのヒト化抗CD22 IgG抗体）；スマートID10（Smart ID10；Protein Design Labs, Inc., CA）（非ホジキンリンパ腫の治療のためのヒト化抗HLA-DR抗体）；オンコリム（Oncolym；Techniclone, Inc., CA）（非ホジキンリンパ腫の治療のための放射性標識ネズミ抗HLA-Dr10抗体）；アロミューン（Allomune；BioTransplant, CA）（ホジキン病または非ホジキンリンパ腫の治療のためのヒト化抗CD2 mAb）；アバスチン（Avastin；Genentech, Inc., CA）（肺癌および結腸直腸癌の治療のための抗VEGFヒト化抗体）；エプラツズマブ（Epratuzamab；Immunomedics, Inc., NJおよびAmgen, CA）（非ホジキンリンパ腫の治療のための抗CD22抗体）；およびCEAcide（Immunomedics, NJ）（結腸直腸癌の治療のためのヒト化抗CEA抗体）が挙げられる。
【０１６４】
癌の治療で有用な他の抗体としては、限定するものではないが、以下の抗原に対する抗体が挙げられる：CA125（卵巣）、CA15-3（癌（carcinoma））、CA19-9（癌）、L6（癌）、ルイスY（癌）、ルイスX（癌）、αフェトプロテイン（癌）、CA 242（結腸直腸）、胎盤アルカリホスファターゼ（癌）、前立腺特異抗原（前立腺）、前立腺酸性ホスファターゼ（前立腺）、上皮増殖因子（癌）、MAGE-1（癌）、MAGE-2（癌）、MAGE-3（癌）、MAGE-4（癌）、抗トランスフェリン受容体（癌）、p97（黒色腫）、MUC1-KLH（乳癌）、CEA（結腸直腸）、gp100（黒色腫）、MART1（黒色腫）、PSA（前立腺）、IL-2受容体（T細胞白血病およびリンパ腫）、CD20（非ホジキンリンパ腫）、CD52（白血病）、CD33（白血病）、CD22（リンパ腫）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（癌）、CD38（多発性骨髄腫）、CD40（リンパ腫）、ムチン（癌）、P21（癌）、MPG（黒色腫）、およびNeu癌遺伝子産物（癌)。一部の具体的な有用抗体としては、限定するものではないが、BR96 mAb（Trail, P. A., Willner, D., Lasch, S. J., Henderson, A. J., Hofstead, S. J., Casazza, A. M., Firestone, R. A., Hellstrom, I., Hellstrom, K. E., “Cure of Xenografted Human Carcinomas by BR96-Doxorubicin Immunoconjugates” Science 1993, 261, 212-215）、BR64（Trail, PA, Willner, D, Knipe, J., Henderson, A. J., Lasch, S. J., Zoeckler, M. E., Trailsmith, M. D., Doyle, T. W., King, H. D., Casazza, A. M., Braslawsky, G. R., Brown, J. P., Hofstead, S. J., Greenfield, R. S., Firestone, R. A., Mosure, K., Kadow, D. F., Yang, M. B., Hellstrom, K. E., and Hellstrom, I. “Effect of Linker Variation on the Stability, Potency, and Efficacy of Carcinoma-reactive BR64-Doxorubicin Immunoconjugates” Cancer Research 1997, 57, 100 105）、S2C6 mAbなどのCD40抗原に対するmAb（Francisco, J. A., Donaldson, K. L., Chace, D., Siegall, C. B., and Wahl, A. F. “Agonistic properties and in vivo antitumor activity of the anti-CD-40 antibody, SGN-14” Cancer Res. 2000, 60, 3225-3231）、1F6 mAbおよび2F2 mAbなどのCD70抗原に対するmAb、ならびにAC10などのCD30抗原に対するmAb（Bowen, M. A., Olsen, K. J., Cheng, L., Avila, D., and Podack, E. R. “Functional effects of CD30 on a large granular lymphoma cell line YT” J. Immunol., 151, 5896-5906, 1993: Wahl et al., 2002 Cancer Res. 62(13):3736-42）が挙げられる。腫瘍関連抗原に結合する多数の他の内在化抗体を用いることができ、それらが総説されている（Franke, A. E., Sievers, E. L., and Scheinberg, D. A., “Cell surface receptor-targeted therapy of acute myeloid leukemia: a review” Cancer Biother Radiopharm. 2000,15, 459 76；Murray, J. L., “Monoclonal antibody treatment of solid tumors: a coming of age” Semin Oncol. 2000, 27, 64 70；Breitling, F., and Dubel, S., Recombinant Antibodies, John Wiley, and Sons, New York, 1998）。
【０１６５】
連結アセンブリ単位およびMD-ADCの選択実施形態
式Ib、IIb、IIb、またはIVb（式中、Tはマレイミド基を含む）により表わされる連結アセンブリ単位。
【０１６６】
式Ib、IIb、IIb、またはIVb（式中、Tはマレイミド基を含み、かつX、X1、X2、Q1、およびQ2のそれぞれはアミノ酸である）により表わされる連結アセンブリ単位。
【０１６７】
式Ib、IIb、IIb、またはIVb（式中、nは0であり、かつYは不在である）により表わされる連結アセンブリ単位。
【０１６８】
式Ia、IIa、IIa、またはIVa（式中nは0であり、Yは不在であり、かつL1およびL2のそれぞれは、マレイミド-カプロイル（mc）、マレイミド-カプロイル-バリン-シトルリン（mc-vc）、およびマレイミド-カプロイル-バリン-シトルリン-パラアミノベンジルオキシカルボニル（mc-vc-PABC）からなる群より独立に選択される）により表わされる連結アセンブリ単位。
【０１６９】
式Ia、IIa、IIa、またはIVa（式中、Tは自己安定化リンカーである）により表わされる連結アセンブリ単位。
【０１７０】
式Ia、IIa、IIa、またはIVa（式中、TはMDPr-vcリンカーである）により表わされる連結アセンブリ単位。
【０１７１】
本明細書中に提供される例示的連結アセンブリ単位は、2個の薬物単位（D1およびD2）を提供する単位であり、かつ以下の構造：
【化２５】
2018118953.tif 000026
および、式中、mc-VC-PABC-D1がmc-VA-PABC-D1もしくはmc-VA-D1またはいずれかの他のL1-D1単位により置き換えられおり；かつ/あるいはmc-VC-PABC-D2がmc-VA-PABC-D2もしくはmc-VA-D2またはいずれかの他のL2-D2単位により置き換えられており；かつ
式中、RPRは水素または保護基（例えば、酸に不安定な保護基（例えば、BOC））である
構造を有するものが挙げられる。
【０１７２】
本明細書中に記載される化合物およびアセンブリを参照し易くするために、構成要素mc-VC-PABC-Dは以下の構造を有し：
【化２６】
2018118953.tif 000027
構成要素mc-VA-PABC-Dは以下の構造を有し：
【化２７】
2018118953.tif 000028
構成要素mc-VA-Dは以下の構造を有し：
【化２８】
2018118953.tif 000029
かつ構成要素MDPr-MABC(gluc)-Dは以下の構造を有し：
【化２９】
2018118953.tif 000030
式中、mc-VC-PABC-D、mc-VA-PABC-D、mc-VA-D、およびMDPr-MABC(gluc)-Dは、結合基（Q1およびQ2）を用いて連結アセンブリ単位（LA）に結合している例示的-L1-D1部分または-L2-D2部分であり、波線はmcまたはMDPrのスクシンイミド環からQ1またはQ2のうちのいずれかに存在するチオールに対する共有結合を示す。
【０１７３】
一部の実施形態では、mc-VC-PABC-D、mc-VA-D、およびmc-VA-PABC-Dのmc部分（式中、mc部分は以下の構造を有し：
【化３０】
2018118953.tif 000031
式中、スクシンイミド部分への波線は結合基（Attachement group）（Q1およびQ2）を介する連結アセンブリ単位（LA）に対する共有結合を示し、かつカルボニルに隣接する波線は-Dの残りの部分に対する共有結合を示す）。上記の構造のうちのいずれかでは、mc部分は、以下の構造を有するMDPr部分を用いて置き換えられて：
【化３１】
2018118953.tif 000032
[式中、RPRは水素または保護基である]、さらなる例示的-L1-D1部分または-L2-D2部分であるMDPr-VC-PABC-D、MDPr-VA-DおよびMDPr-VA-PABC-Dを生じる。
【０１７４】
2×薬物付加を提供する本発明の他の例示的薬物-リンカー化合物としては、以下の化合物が挙げられる：
【化３２】
2018118953.tif 000033
[式中、mc-VA-D、mc-VC-PABC-D、mc-VA-PABC-DおよびMDPr-MABC(gluc)-Dは上記の2×薬物付加構造に関して説明される通りの例示的-L1-D1部分または-L2-D2部分であり、独立に選択されるPEGAおよびPEGBは、本明細書中に提供されるPEG単位に関する実施形態のいずれかに記載されている通りである]。一部の実施形態では、PEGAは以下の構造を有する非分散PEG単位であり：
【化３３】
2018118953.tif 000034
かつ/またはPEGBは以下の構造を有する非分散PEG単位であり：
【化３４】
2018118953.tif 000035
式中、R21は独立に選択されるPEGキャップ化単位であり、独立に選択されるnのそれぞれの例は8〜24または12〜38の範囲の整数である。好ましい実施形態では、1つのR21は-CH3であり、他のものは-CH2CH2CO2Hである。
【０１７５】
一部の実施形態では、mc部分が存在する場合の上記の構造のいずれかでは、以下の構造：
【化３５】
2018118953.tif 000036
を有するmc部分が、以下の構造：
【化３６】
2018118953.tif 000037
を有するMDPr部分を用いて置き換えられて（式中、RPRは水素または保護基である）、MDPr-VC-PABC-D、MDPr-VA-DおよびMDPr-VA-PABC-Dを-L1-D1または-L2-D2として生じる。
【０１７６】
他の実施形態では、MDPr部分が存在する場合の上記の構造中のMDPr部分は、mc部分により置き換えられて、mc-MABC(Gluc)Dを-L1-D1または-L2-D2として生じる。
【０１７７】
MDPrを含有する-L1-D1部分または-L2-D2部分のうちのいずれか1種でのMDPr中の置換型スクシンイミドは、加水分解された形態で存在することができる（すなわち、水分子が、カルボニル-窒素結合の一方を横断して付加されるが、両方は横断しない）ことが理解されるであろう。
【０１７８】
一部の実施形態では、-L1-D1部分または-L2-D2部分としてのMDPr-MABC(gluc)-Dは、mc-MABC(gluc)-Dを用いて置き換えられる。
【０１７９】
MDPrを含有する-L1-D1部分または-L2-D2部分のうちのいずれか1種でのMDPr中の置換型スクシンイミドは、加水分解された形態で存在することができる（すなわち、水分子が、カルボニル-窒素結合の一方を横断して付加されるが、両方は横断しない）ことが理解されるであろう。mcにより構成される-L1-D1部分または-L2-D2部分が、加水分解された形態でそのスクシンイミド環を有することもできる。
【０１８０】
使用方法
癌の治療
MD-ADCは、腫瘍細胞もしくは癌細胞の増殖を阻害するため、腫瘍細胞もしくは癌細胞でアポトーシスを引き起こすため、または患者での癌を治療するために有用である。MD-ADCは、癌の治療に対する様々な設定に従って用いることができる。MD-ADCは、腫瘍細胞または癌細胞に薬物を送達するために用いることができる。理論に拘泥することなく、一実施形態では、MD-ADCの抗体は、癌細胞関連抗原もしくは腫瘍細胞関連抗原に結合または会合し、かつMD-ADCは、受容体媒介エンドサイトーシスもしくは他の内在化メカニズムを通じて、腫瘍細胞または癌細胞の内部に取り込まれる（内在化する）ことができる。抗原は、腫瘍細胞もしくは癌細胞に結合することができるか、または腫瘍細胞もしくは癌細胞に関連する細胞外マトリックスタンパク質であり得る。細胞内部に入ると、切断メカニズムを介して、薬物が細胞内に放出される。代替的な実施形態では、薬物または薬物単位は腫瘍細胞もしくは癌細胞の外側でMD-ADCから切断され、その後に、薬物または薬物単位が細胞に浸透する。
【０１８１】
一実施形態では、抗体は、腫瘍細胞または癌細胞に結合する。
【０１８２】
別の実施形態では、抗体は、腫瘍細胞または癌細胞の表面上にある腫瘍細胞または癌細胞抗原に結合する。
【０１８３】
別の実施形態では、抗体は、腫瘍細胞または癌細胞に関連する細胞外マトリックスタンパク質である腫瘍細胞または癌細胞抗原に結合する。
【０１８４】
特定の腫瘍細胞または癌細胞に対する抗体の特異性は、最も効果的に治療される腫瘍または癌を決定するために重要であり得る。例えば、造血系の癌に存在する癌細胞抗原を標的とするMD-ADCは、血液悪性疾患を治療するために有用であり得る（例えば、抗CD30、抗CD70、抗CD19、抗CD33結合性抗体は、血液悪性疾患を治療するために有用であり得る）。固形腫瘍上に存在する癌細胞抗原を標的とするMD-ADCは、そのような固形腫瘍を治療するために有用であり得る。
【０１８５】
MD-ADCを用いて治療することができる癌としては、限定するものではないが、例えば、リンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）および白血病などの造血系の癌ならびに固形腫瘍が挙げられる。造血系の癌の例としては、濾胞性リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性骨髄芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、および多発性骨髄腫が挙げられる。固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（endotheliosarcoma）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（lymphangioendotheliosarcoma）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、骨癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、口腔癌、鼻腔癌、咽喉癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆道癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣腫瘍、小細胞肺癌、膀胱癌、肺癌、上皮癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、皮膚癌、黒色腫、神経芽腫、および網膜芽腫が挙げられる。
【０１８６】
癌に対する多様式療法
限定するものではないが、腫瘍、転移、または制御できない細胞増殖を特徴とする他の疾患もしくは障害をはじめとする癌は、MD-ADCの投与により治療または阻害できる。
【０１８７】
他の実施形態では、有効量のMD-ADCおよび化学療法剤を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、癌を治療するための方法が提供される。一実施形態では、化学療法剤は、それを用いる癌の治療が不応性であることが見出されていないものである。別の実施形態では、化学療法剤は、それを用いる癌の治療が不応性であることが見出されているものである。MD-ADCは、癌に対する治療として外科手術も受けている患者に投与することができる。
【０１８８】
一部の実施形態では、患者はまた、放射線療法なとの追加の治療も受ける。具体的な実施形態では、MD-ADCは、化学療法剤または放射線療法と同時に投与される。別の具体的な実施形態では、化学療法剤または放射線療法は、MD-ADCの投与に先立って、またはそれに続いて投与される。
【０１８９】
化学療法剤は、一連のセッションにわたって投与することができる。標準治療の化学療法剤などの化学療法剤のうちのいずれか1種または組み合わせを投与することができる。
【０１９０】
加えて、MD-ADCを用いる癌の治療方法は、化学療法または放射線療法が、毒性が強すぎる（例えば、治療対象の被験体に対して許容できないかまたは耐えられない副作用を生じる）ことが証明されているかまたは証明し得る場合に、化学療法または放射線療法の代替物として提供することができる。治療中の患者は、任意により、どの治療が許容可能または耐えられると見出されるかに応じて、外科手術、放射線療法または化学療法などの別の癌治療を用いて治療することができる。
【０１９１】
自己免疫疾患の治療
MD-ADCは、自己免疫疾患をもたらす細胞を死滅させるかもしくはその複製を阻害するために、または自己免疫疾患を治療するために有用である。したがって、MD-ADCは、患者での自己免疫疾患の治療に関する様々な設定で用いることができる。MD-ADCは、標的細胞に薬物を送達するために用いることができる。理論に拘泥することなく、一実施形態では、MD-ADCは、標的細胞の表面上の抗原に会合し、かつMD-ADCは、続いて、受容体媒介エンドサイトーシスを通じて、標的細胞の内部に取り込まれる。細胞内部に入ると、リンカー単位が切断され、薬物または薬物単位が放出される。続いて、放出された薬物が遊離となって細胞質中を移動し、細胞傷害活性または細胞静止活性を引き起こす。代替的な実施形態では、薬物は標的細胞の外側でMD-ADCから切断され、その後に、薬物または薬物単位が細胞に浸透する。
【０１９２】
一実施形態では、抗体は自己免疫抗原に結合する。一態様では、抗原は、自己免疫状態に関与する細胞の表面上にある。
【０１９３】
別の実施形態では、抗体は、細胞の表面上にある自己免疫抗原に結合する。
【０１９４】
一実施形態では、抗体は、自己免疫疾患状態に関連する活性化されたリンパ球に結合する。
【０１９５】
さらなる実施形態では、MD-ADCは、特定の自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞を死滅させるか、またはその増殖を阻害する。
【０１９６】
MD-ADCを用いて治療することができる自己免疫疾患の特定のタイプとしては、限定するものではないが、Th2リンパ球関連障害（例えば、アトピー性皮膚炎、アトピー性ぜんそく、鼻炎結膜炎（rhinoconjunctivitis）、アレルギー性鼻炎、オーメン症候群（Omenn's syndrome）、全身性硬化症、および移植片対宿主病）；Th1リンパ球関連障害（例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病（Grave's disease）、原発性胆汁性肝硬変、ウェゲナー肉芽腫症、および結核）；および活性型Bリンパ球関連障害（例えば、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、関節リウマチ、およびI型糖尿病）が挙げられる。
【０１９７】
自己免疫疾患の多剤療法
有効量のMD-ADCおよび自己免疫疾患の治療のために公知の別の療法剤を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、自己免疫疾患を治療するための方法もまた開示される。
【０１９８】
組成物および投与方法
本発明は、本明細書中に記載されるMD-ADCおよび製薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。MD-ADCは、抗体が結合する抗原の発現に関連する障害の治療のために、化合物を患者に投与することを可能にするいずれかの形態であり得る。例えば、コンジュゲートは、液体または固体の形態であり得る。好ましい投与経路は、非経口投与である。非経口投与としては、皮下注入、静脈内注入、筋内注入、胸骨下注入（intrasternal injection）または点滴技術が挙げられる。一態様では、組成物は非経口投与される。一態様では、コンジュゲートは、静脈内投与される。投与は、いずれかの慣用の経路によるもの、例えば、点滴またはボーラス注入によるものであり得る。
【０１９９】
医薬組成物は、患者への組成物の投与に際して化合物を生体利用可能とするために、製剤化することができる。組成物は、例えば、錠剤が単一投与単位であり得る場合に、1つ以上の投与単位の形態を採ることができる。
【０２００】
医薬組成物の調製で用いられる物質は、用いる量では無毒であり得る。医薬組成物中の活性成分の最適投与量は、様々な因子に依存するであろうことが、当業者には明らかであろう。重要な因子としては、限定するものではないが、動物の種類（例えば、ヒト）、化合物の詳細な形態、投与様式、および用いられる組成物が挙げられる。
【０２０１】
組成物は、例えば、液体形態であり得る。液体は、注入による送達のために有用であり得る。注入による投与のための組成物中には、界面活性剤、保存料、湿潤化剤、分散化剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤および等張化剤のうちの1種以上もまた含めることができる。
【０２０２】
液体組成物は、それらが溶液であるか、懸濁液であるか、または他の同様の形態であるかにかかわらず、以下の構成要素のうちの1種以上もまた含むことができる：注射用水、食塩溶液（好ましくは生理食塩液）、リンゲル液、等張塩化ナトリウム、溶媒または懸濁化媒体として機能し得る合成モノもしくはジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、シクロデキストリン、プロピレングリコール、または他の溶媒などの無菌希釈剤；抗細菌剤（ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど）；抗酸化剤（アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸など）；緩衝剤（アミノ酸、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩など）；界面活性剤（非イオン性界面活性剤、ポリオールなど）；および張性の調節のための薬剤（塩化ナトリウムまたはデキストロースなど）。非経口組成物は、ガラス、プラスチックまたは他の材料製の、アンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアル中に封入することができる。生理食塩液が例示的アジュバントである。注入可能な組成物は、好ましくは無菌である。
【０２０３】
特定の障害または状態の治療で有効なコンジュゲートの量は、障害または状態の性質に依存するであろうし、かつ、標準的な臨床上の技術により決定することができる。加えて、任意によりin vitroまたはin vivoアッセイを用いて、最適な投与量範囲の特定を補助することができる。組成物中で用いるべき正確な用量は、投与経路、および疾患または障害の重症度にも依存するであろうし、実務家の判断および各患者の事情に従って決定するべきである。
【０２０４】
組成物は、好適な投与量が得られるであろう有効量の化合物を含む。典型的には、この量は、組成物の重量に基づいて少なくとも約0.01％の化合物である。
【０２０５】
静脈内投与のためには、組成物は、動物の体重1kg当たり約0.01〜約100mgのMD-ADCを含むことができる。一態様では、組成物は、動物の体重1kg当たり約1〜約100mgのMD-ADCを含むことができる。別の態様では、投与される量は、約0.1〜約25mg/kg体重の化合物の範囲であろう。
【０２０６】
一般的に、患者に投与されるコンジュゲートの投与量は、典型的には約0.01mg/kg〜約100mg/kg被験体体重である。一部の実施形態では、患者に投与される投与量は、約0.01mg/kg〜約15mg/kg被験体体重である。一部の実施形態では、患者に投与される投与量は、約0.1mg/kg〜約15mg/kg被験体体重である。一部の実施形態では、患者に投与される投与量は、約0.1mg/kg〜約20mg/kg被験体体重である。一部の実施形態では、投与される投与量は、約0.1mg/kg〜約5mg/kgまたは約0.1mg/kg〜約10mg/kg被験体体重である。一部の実施形態では、投与される投与量は、約1mg/kg〜約15mg/kg被験体体重である。一部の実施形態では、投与される投与量は、約1mg/kg〜約10mg/kg被験体体重である。一部の実施形態では、投与される投与量は、治療サイクルにわたって、約0.1〜4mg/kg、さらにより好ましくは0.1〜3.2mg/kg、またはさらにより好ましくは0.1〜2.7mg/kg被験体体重である。
【０２０７】
用語「担体」とは、化合物と一緒に投与される希釈剤、アジュバントまたは賦形剤を意味する。そのような医薬担体は、水および石油由来、動物由来、植物由来または合成由来のものをはじめとする油（ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など）などの液体であり得る。担体は、生理食塩液、アラビアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素であり得る。加えて、助剤、安定化剤、増粘剤、滑沢剤および着色剤を用いることができる。一実施形態では、患者に投与される際に、化合物または組成物および製薬上許容される担体は無菌である。化合物が静脈内投与される場合、水が例示的な担体である。生理食塩液ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液もまた、特に注入可能な溶液に対して、液体担体として用いることができる。好適な医薬担体としてはまた、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどの賦形剤も挙げられる。所望であれば、本発明の組成物は、少量の湿潤化剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝化剤も含有することができる。
【０２０８】
一実施形態では、コンジュゲートは、動物、特にヒトに対する静脈内投与に適合している医薬組成物として、慣用の手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与用の担体またはビヒクルは、無菌等張緩衝水溶液である。必要な場合、組成物は、可溶化剤もまた含有することができる。静脈内投与用の組成物は、任意により、注入部位での痛みを和らげるために、リグノカインなどの局所麻酔剤を含むことができる。一般的には、成分は、例えば、活性剤の量を示したアンプルまたはサシェなどの密閉容器中の凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として、単位投与剤型で別個にまたは一緒に混合して供給される。コンジュゲートが点滴により投与される予定である場合、例えば、無菌の製薬グレードの水または生理食塩液が入った点滴瓶を用いて調剤することができる。コンジュゲートが注射により投与される場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用無菌水または生理食塩液のアンプルを提供することができる。
【０２０９】
医薬組成物は、一般的に、無菌で、実質的に等張であり、かつ米国の食品および薬物投与のすべての適正製造基準（GMP）を完全に順守して製剤化される。
【０２１０】
直交的に保護された抗体-薬物コンジュゲートリンカー
本開示は、「直交的に」保護された（すなわち、薬物単位の結合が行なわれているときに選択的脱保護を可能にするように保護されている）抗体-薬物コンジュゲート（ADC）リンカーを提供する。直交的に保護された抗体薬物コンジュゲート化リンカーは、各結合基（例えば、Q1およびQ2）上に保護基を含む連結アセンブリ（LA）単位として特徴付けられる。連結アセンブリ単位の節に記載される通り、結合基は、薬物単位の共有結合を可能にするが；しかしながら、本開示の保護基は、連結アセンブリに対する薬物部分の共有結合を遮断し、かつ特定の条件下では除去可能である。直交的に保護されたADCリンカーは、選択的脱保護および選択された薬物単位の付加を可能にする様々な保護基を取り込むために設計されている。
【０２１１】
特定の実施形態では、直交的に保護されたADCリンカーは、式（Ib）の構造を特徴とする：
【化３７】
2018118953.tif 000038
[式中、
Tは、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じる抗体チオールへの結合を促進する係留基であり；
Q1は、第1の薬物単位（D1）の共有結合を可能にする第1の結合基であり；
Q2は、第2の薬物単位（D2）の共有結合を可能にする第2の結合基であり；
P1は、第1の薬物単位（D1）の共有結合を遮断する第1の保護基であり；
P2は、第1の薬物単位（D1）の共有結合を遮断する第2の保護基であり、かつP1とP2とは異なり；
Xは、2個の結合基の間の連結をもたらす結合基リンカーであり；
Yは、分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【０２１２】
別の群の実施形態では、直交的に保護されたADCリンカーは、式（IIb）の構造を特徴とする：
【化３８】
2018118953.tif 000039
[式中、
Tは、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じる抗体チオールへの結合を促進する係留基であり；
各Q1は、第1の薬物単位（D1）の共有結合を可能にする第1の結合基であり；
Q2は、第2の薬物単位（D2）の共有結合を可能にする第2の結合基であり；
P1は、第1の薬物単位（D1）の共有結合を遮断する第1の保護基であり；
P2は、第1の薬物単位（D1）の共有結合を遮断する第2の保護基であり、かつP1とP2とは異なり；
Xは、結合基リンカーであり；
Yは、分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【０２１３】
また別の群の実施形態では、直交的に保護されたADCリンカーは、式（IIIb）の構造を特徴とする：
【化３９】
2018118953.tif 000040
[式中、
Tは、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元により生じる抗体チオールへの結合を促進する係留基であり；
各Q1は、独立に選択される第1の薬物単位（D1）の共有結合を可能にする独立に選択される第1の結合基であり；
Q2は、第2の薬物単位（D2）の共有結合を可能にする第2の結合基であり；
P1は、第1の薬物単位（D1）の共有結合を遮断する第1の保護基であり；
P2は、第1の薬物単位（D1）の共有結合を遮断する第2の保護基であり、かつP1とP2とは異なり；
X1およびX2は、それぞれ結合基リンカーであり；
Yは、分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【０２１４】
さらに別の群の実施形態では、直交的に保護されたADCリンカーは、式（IVb）の構造を特徴とする：
【化４０】
2018118953.tif 000041
[式中、
Tは、末端マレイミド部分を有する係留基であり；
Q1は、第1のシステイン部分を含む第1の結合基であり；
Q2は、第2のシステイン部分を含む第2の結合基であり；
X1およびX2は、それぞれ結合基リンカーであり；
P1は、第1のチオール保護基であり；
P2は、第2のチオール保護基であり、かつP1とP2とは異なり；
Yは、L、Q1、XまたはQ2に結合する分配剤であり；かつ
下付き文字nは、0または1である]。
【０２１５】
本明細書中に記載される直交的に保護されたADCリンカーでは、係留基（T）、結合基（Q1およびQ2）、結合基リンカー（X、X1、およびX2）、任意的分配剤（Y）は、先行する連結アセンブリ単位の節に定義される通りである。1個以上の保護基が選択的に除去されると、薬物単位を、選択的に脱保護されたリンカーへと付加することができる。連結アセンブリ単位の節に考察される通り、薬物単位は、任意的連結基L1およびL2を含むことができる。
【０２１６】
式Ib、IIb、IIIb、およびIVbの一部の実施形態では、
Tは、末端マレイミド部分を有する係留基である。
【０２１７】
式Ib、IIb、IIIb、およびIVbの一部の実施形態では、
Q1は、第1のシステイン部分を含む第1の結合基であり；
Q2は、第2のシステイン部分を含む第2の結合基であり；
P1は、第1のチオール保護基であり；かつ
P2は、第2のチオール保護基であり、かつP1とP2とは異なる。
【０２１８】
保護基（P1およびP2）
連結アセンブリ単位（Linker Assembly unit）の「直交的」脱保護（すなわち、選択的脱保護）は、特定の所望の薬物の比率およびこの所望の比率の薬物を標的部位へと均一に送達するためのメカニズムを有する連結アセンブリ単位（Linker Assembly unit）の合成を可能にする。そのように、保護基（P1およびP2）は、結合単位（Q1およびQ2）に結合できる、選択的に除去可能な単位である。「直交的」脱保護の目的で、P1とP2とは正体が異なる。
【０２１９】
一部の実施形態では、P1およびP2はチオール保護基である。一部の実施形態では、P1は、-S-イソプロピル（SiPr）、-S-tert-ブチル（StBu）、および-S-メチル（SMe）からなる群より選択され；P2は-CH2NH-C(O)CH3（アセトアミドメチル）である。
【０２２０】
一部の実施形態では、直交的に保護されたADCリンカーは式Ib、IIb、IIIb、またはIVbにより表わされ、TはMDPr-Val-Cit-であり；P1は、-S-イソプロピル（SiPr）、-S-tert-ブチル（StBu）、および-S-メチル（SMe）からなる群より選択され；P2は-CH2NH-C(O)CH3（アセトアミドメチル）である。
【０２２１】
一部の実施形態では、直交的に保護されたADCリンカーは式Ib、IIb、IIIb、またはIVbにより表わされ、Xはグリシンおよびアラニンからなる群より選択され、TはMDPr-Val-Cit-であり；P1は、-S-イソプロピル（SiPr）、-S-tert-ブチル（StBu）、および-S-メチル（SMe）からなる群より選択され；P2は-CH2NH-C(O)CH3（アセトアミドメチル）である。
【０２２２】
一部の実施形態では、直交的に保護されたADCリンカーは式Ib、IIb、IIIb、またはIVbにより表わされ、TはMDPr-Val-Cit-であり；Q1およびQ2はそれぞれシステインであり；Xはグリシンであり；P1は、-S-イソプロピル（SiPr）、-S-tert-ブチル（StBu）、および-S-メチル（SMe）からなる群より選択され；P2は-CH2NH-C(O)CH3（アセトアミドメチル）である。
【０２２３】
一部の実施形態では、直交的に保護されたADCリンカーは式Ib、IIb、IIIb、またはIVbにより表わされ、TはMDPr-Val-Cit-であり；Q1およびQ2はそれぞれシステインであり；Xはグリシンであり；P1は、-S-イソプロピル（SiPr）、-S-tert-ブチル（StBu）、および-S-メチル（SMe）からなる群より選択され；P2は-CH2NH-C(O)CH3（アセトアミドメチル）であり、下付き文字nは1であり、かつYはPEGまたはシクロデキストリン基を含む。
【実施例】
【０２２４】
特に記載しない限り、すべての溶媒および試薬は、可能な限り高純度で商業的供給源から購入し、使用前にさらに精製はしなかった。無水ジメチルホルムアミド（DMF）およびCH2Cl2はAldrich社から購入した。Fmoc保護型アミノ酸および2-Cl-トリチルクロリド樹脂（置換1mmol/g、200〜300メッシュ、1％DVB）はNovabiochem社から購入した。Fmoc保護型アミノ-dPEG24-COOHはQuanta Biodesign社から購入した。MDPrは以前に記載された通りに調製した[1]。マレイミドカプロイル-MMAF (1)、マレイミドカプロイル-Val-Cit-PABC-MMAF (2)、およびマレイミドカプロイル-Val-Cit-PABC-MMAE (3)は、以前に記載された通りに合成した[2] [3]。固相合成は、Fritware PE中級グレード多孔性シート（Scienceware社）から切り出したフィルターを装着したプラスチック製シリンジ（National Scientific社）で行なった。小分子LC-MSは、Acquity UPLC BEH C18 2.1×50mm、1.7μm逆相カラムを取り付けたWaters Acquity H-Class Ultra Performance LCに連結されたWaters Xevo G2 ToF質量分析計で行なった。酸性移動相（0.1％ギ酸）は、3％アセトニトリル/97％水から100％アセトニトリルの勾配（流速＝0.7mL/分）から構成された。調製的逆相HPLCは、Varian ProStar 330 PDA検出器とともに構成されたVarian ProStar 210溶媒送達システムで行なった。生成物を、Phenomenex Synergy MAX-RP 30.0×250mm、4μm、80Å逆相カラムを通して精製し、0.05％トリフルオロ酢酸（水中）（溶媒A）および0.05％トリフルオロ酢酸（アセトニトリル中）（溶媒B）を用いて溶出した。精製法は、概ね、90％水性溶媒Aから10％溶媒Aへと傾斜する、溶媒Aから溶媒Bへの線形勾配から構成された。流速は5.0mL/分であり、220nmでモニタリングした。
【０２２５】
【化４１】
2018118953.tif 000042
【０２２６】
実施例1：固相ペプチド合成
マレイミドカプロイル-Cys(Acm)（mc-Cys(Acm)）および薬物キャリア4を、Fmoc化学を用いて固相で合成した。
【０２２７】
ペプチド合成のための一般的手順：
樹脂ロード：10mL固相反応容器（PETフリットを有するプラスチック製シリンジ）に、0.15gの2-Cl-トリチルクロリド樹脂（0.225mmol）を加え、続いて、3mL無水CH2Cl2中のFmocアミノ酸またはFmoc-アミノ-PEG24-COOH（0.225mmol、1.0当量）およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）（0.338mmol、1.5当量）の溶液を加えた。容器を5分間振盪し、追加のDIPEA（0.225mmol、1.0当量）を加え、容器をさらに30分間振盪した。未反応の樹脂を、MeOH（1.0mL）を5分間加えることによりクエンチした。続いて、樹脂を、DMF（5×5mL）、CH2Cl2（5×5mL）、およびジエチルエーテル（5×5mL）を用いて洗浄し、真空下で乾燥させた。
【０２２８】
Fmoc除去手順：Fmoc保護型ペプチドを含有する樹脂を、DMF中の20％ピペリジン（5×3mL）を用いて、合計で30分間処理した。続いて、樹脂を、さらなる操作の前に、DMF（5×5mL）を用いて洗浄した。
【０２２９】
標準的カップリング手順：脱保護型N末端アミノ酸（1当量）を含む樹脂に、DMF（5mL）中に、Fmocアミノ酸またはマレイミド酸（3当量）、HATU（3当量）、およびDIPEA（6当量）を含有する溶液を加えた。反応容器を、1時間振盪した。続いて、DMF（5×5mL）を用いて樹脂を洗浄した。Fmoc-Cysアミノ酸（1当量）を、Fmoc-Cys（4当量）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）（4当量）、およびN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）（4当量）を含有する溶液を添加することによりカップリングさせた。
【０２３０】
樹脂からの切断：乾燥させた樹脂に、2mLの10％トリフルオロ酢酸（TFA）（CH2Cl2中）の溶液（2.5％H2Oおよび2.5％トリイソプロピルシランも含有する）を5mLプラスチック製シリンジ中で加えた。1分間後、反応混合物を、20mLホウケイ酸ガラス製シンチレーションバイアルに移した。この手順を3回繰り返した。切断溶液をN2蒸気下で乾燥させ、0.5mLジエチルエーテルを用いて3回洗浄し、続いて真空下で乾燥させた。粗生成物を、引き続いて精製せずに用いるか、または上記の手順を用いる逆相HPLCにより精製した。
【０２３１】
薬物キャリア特性決定：
マレイミドカプロイル-Cys(Acm)：
予測精密質量：385.13；実測値m/z：384.3 (M+H)+、LC-MS tR＝0.66分。粗生成物は95％超の純度であると判断され、引き続く精製なしに抗体コンジュゲート化のために用いた。
【化４２】
2018118953.tif 000043
【０２３２】
薬物キャリア4：
予測精密質量：1833.9；実測値m/z：1835.1 (M+H)+、LC-MS tR＝0.88分、調製的LC tR＝24分。
【化４３】
2018118953.tif 000044
【０２３３】
実施例2：コンジュゲート化方法
材料および一般的方法
キメラ型抗CD30モノクローナル抗体であるcAC10を、以前に記載された通りに調製した[4]。タンパク質LC-MSデータは、Waters Acquity H-Class UPLCシステムと組み合わせたWaters Xevo GS-S QTOFで取得した。サンプルを、10mMジチオトレイトール（DTT）を用いて10分間、37℃で還元し、続いて、分析的逆相カラム（Agilent Technologies社、PLRP-S、300Å、2.1mm ID×50mm、3μm）に80℃で通してクロマトグラフィーに供し、0.05％水性TFA中、25％から65％の0.01％TFA（アセトニトリル中）の線形勾配を5分間にわたって用い、続いてイソクラチック65％0.01％TFA（アセトニトリル）を1.0mL/分の流速で0.5分間用いて溶出した。質量分析データは、500〜4000m/zの質量範囲を用いてESI+モードで取得し、MaxEnt1を用いてデコンボリューションし、得られたコンジュゲートの質量を決定した。コンジュゲートの凝集の程度を、分析的SECカラム（Sepax SRT-C 300 7.8mm ID×30cm、5μm）をWaters 2695 HPLCシステムで用いる、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により決定した。注入された物質を、92.5％25mMリン酸ナトリウム（pH6.8）、350mM NaCl、および7.5％イソプロピルアルコールのイソクラチック混合物を1mL/分の流速で用いて溶出した。
【０２３４】
ADCを、抗体鎖間ジスルフィドの還元およびそれに続く25〜100％過剰量マレイミドの添加により、以前に記載された通りに調製した[5]。抗体1分子当たり8箇所のチオールの完全な還元を、12当量のトリス(2-カルボキシエチル)-ホスフィン（TCEP）を抗体溶液（1〜10mg/mL、PBS中、pH7.4）に添加することにより達成した。抗体還元の程度を、逆相LC-MSによりモニタリングし、反応の完了に必要な場合には追加のTCEPを加えた。続いて、TCEPを限外ろ過により除去した（3×、PBS中の10倍希釈、pH7.4、1mM EDTA含有、4000×gで30-kDa MWCOフィルターを通して遠心分離）。PBS-EDTA中の完全に還元された抗体を、10mM DMSOストックとして薬物-リンカーまたは薬物-キャリアの10〜16モル当量（25〜100％過剰）を用いてコンジュゲート化した。得られた溶液を、ボルテックスにかけ、室温で10〜20分間静置した。コンジュゲート化の程度を、逆相LC-MSにより上記の通りに評価し、必要な場合には追加の薬物-リンカーまたは薬物-キャリアを加えた。すべての利用可能なCysチオールがアルキル化され、粗製ADC溶液を、Nap-5脱塩カラム（GE Healthcare社）を用いるPBSへのイオン交換により、または3〜5ラウンドの限外ろ過を介して精製した。最終的なADC濃度を、分光光度法により決定した。
【０２３５】
mc-Cys(Acm)のコンジュゲート化および試験的脱保護：
PBS-EDTA中の完全に還元されたcAC10抗体に、10当量のmc-Cys(Acm)を100mM DMSOストックから加えた。得られた溶液をボルテックスにかけ、室温で15分間静置した。この時点で、逆相LC-MSは、Acm保護基の忠実性を低下させない、抗体チオールの完全なアルキル化を示した。上記の手順に従った限外ろ過によりコンジュゲートを精製し、コンジュゲートのクロマトグラフィーおよび質量分析特性決定を図1Aに示す。抗体1分子当たり8個のキャリアを有する、得られたコンジュゲートcAC10-mc-Cys(Acm)を、続いて、脱保護条件に供した。PBS（pH7.4）中のコンジュゲートに、50当量の水性酢酸水銀（Hg(OAc)2）を10mMストックとして加えた。反応混合物を、室温で45分間インキュベートした。反応混合物に、Quadrasil MP樹脂の水性スラリー（Sigma Aldrich社、0.025mmol/gのチオール許容量、1当量の樹脂を1当量の酢酸水銀に添加）を加え、混合物を15分間激しくボルテックスにかけた。この時点で、混合物を13,200×gで2分間遠心分離し、上清を取り出した。上清に、10〜20当量のN-エチルマレイミド（NEM）を加えて、遊離（liberated）のシステインチオールをキャップした。修飾の程度を、LC-MSにより観察した。図1Bに示されている通り、8個すべてのAcm基が除去されており、それぞれの遊離チオールがNEMによりキャップされたコンジュゲートが生成された。
【０２３６】
実施例3：二重修飾型抗体コンジュゲートについての一般的手順
キャリア4のコンジュゲート化：PBS-EDTA中の完全に還元されたcAC10抗体に、16当量のキャリア4を10mM DMSOストックから加えた。得られた溶液をボルテックスにかけ、室温で15分間静置した。この時点で、逆相LC-MSは、Acm保護基の忠実性を低下させない、抗体チオールの完全なアルキル化を示した。上記の手順に従った限外ろ過により、コンジュゲートを精製した。
【０２３７】
Cys(SiPr)の脱保護：cAC10-4（8個のキャリア/抗体）に10〜12当量のTCEPを加えた。反応混合物を37℃で45分間インキュベートし、この時点で、逆相LC-MSは還元が完全であったことを示した（デコンボリューションされた軽鎖および重鎖質量の評価による；一例として、図2を参照されたい）。反応完了時に、過剰なTCEPおよび遊離のイソプロピルチオールを、上記の通りのPBS-EDTA中への3ラウンドの限外ろ過により除去した。
【０２３８】
第1のコンジュゲート化：完全に還元されたcAC10-4に、50％モル過剰量のマレイミド薬物-リンカーを10mM DMSOストックから加えた。得られた溶液をボルテックスにかけ、室温で15分間静置した。この時点で、逆相LC-MSを用いて反応の進行を判断し、すべてのチオールがアルキル化されるまで、必要であれば追加の薬物-リンカーまたはNEMを加えた。上記の手順に従うゲルろ過または限外ろ過により、コンジュゲートを精製した。
【０２３９】
Acm脱保護：cAC10-4-薬物/NEMを含有する溶液に、50当量の水性Hg(OAc)2を加えた。得られた溶液をボルテックスにかけ、室温で45分間静置した。反応混合物に、Quadrasil MP樹脂の水性スラリー（0.025mmol/gのチオール許容量、1当量の樹脂を1当量の酢酸水銀に添加）を加え、混合物を15分間激しくボルテックスにかけた。この時点で、混合物を13,200×gで2分間遠心分離し、上清を取り出した。8個の遊離チオールを担持するコンジュゲートを、引き続く精製なしで用いるか、または上記の通りのPBS-EDTA中への3ラウンドの限外ろ過により精製した。
【０２４０】
第2のコンジュゲート化：8個の遊離チオールを有するcAC10-4-薬物/NEMを含有する溶液に、50〜100％モル過剰量のマレイミド薬物-リンカーまたはNEMを10mM DMSOストックから加えた。得られた溶液をボルテックスにかけ、室温で15分間静置した。この時点で、逆相LC-MSを用いて反応の進行を判断し、すべてのチオールがアルキル化されるまで、必要であれば追加の薬物-リンカーまたはNEMを加えた。上記の手順に従うゲルろ過または限外ろ過により、コンジュゲートを精製した。
【０２４１】
コンジュゲート化プロセスの各ステップ中の抗体1分子当たりの平均薬物量は、逆相HPLCにより測定した場合に、完全な薬物付加（8個の薬物/mAb）の2.5％以内であった。
【０２４２】
本明細書中に記載されるコンジュゲート化ステップおよび脱保護ステップならびに分析的特性決定を、図4〜7にまとめる。
【０２４３】
コンジュゲートおよびコンジュゲート中間体の分析的特性決定：
cAC10-4：
軽鎖：tR＝1.41分；予測質量：25577、実測値：25577
重鎖：tR＝2.34分；予測質量：55880（重鎖＋3個のキャリア）、実測値：55880
cAC10-4(-SiPr)：
軽鎖：tR＝1.38分；予測質量：25503、実測値：25504
重鎖：tR＝2.34分；予測質量：55658（重鎖−3個の-SiPr）、実測値：55659
cAC10-4-1：
軽鎖：tR＝1.28分；予測質量：26429、実測値：26427
重鎖：tR＝1.84分；予測質量：58434（重鎖＋3個の薬物）、実測値：58430
cAC10-4-2：
軽鎖：tR＝1.49分；予測質量：26834、実測値：26382
重鎖：tR＝2.09分；予測質量：59651（重鎖＋3個の薬物）、実測値：59646
cAC10-4-NEM：
軽鎖：tR＝0.98分；予測質量：25629、実測値：25627
重鎖：tR＝1.38分；予測質量：56034（重鎖＋3個のNEM）、実測値：56031
cAC10-4-1-3：
軽鎖：tR＝1.83分；予測質量：27675、実測値：27673
重鎖：tR＝2.56分；予測質量：62172（重鎖＋3個の薬物）、実測値：62170
SEC tR＝6.77分、98.0％単量体
cAC10-4-2-3：
軽鎖：tR＝2.04分；予測質量：28080、実測値：28081
重鎖：tR＝2.76分；予測質量：63389（重鎖＋3個の薬物）、実測値：63389
SEC tR＝6.69分、95.0％単量体
cAC10-4-1-NEM：
軽鎖：tR＝1.33分；予測質量：26483、実測値：26482
重鎖：tR＝1.90分；予測質量：58596（重鎖＋3個のNEM）、実測値：58598
SEC tR＝6.91分、97.5％単量体
cAC10-4-2-NEM：
軽鎖：tR＝1.53分；予測質量：26888、実測値：26889
重鎖：tR＝2.14分；予測質量：59813（重鎖＋3個のNEM）、実測値：59815
SEC tR＝6.74分、97.4％単量体
cAC10-4-NEM-3：
軽鎖：tR＝1.55分；予測質量：26875、実測値：26875
重鎖：tR＝2.19分；予測質量：59772（重鎖＋3個の薬物）、実測値：59772
SEC tR＝7.03分、97.8％単量体
【０２４４】
実施例4：細胞結合性分析
細胞表面CD30に対する抗体またはADCの結合性を、CD30(+) L540cyホジキンリンパ腫細胞に対するフローサイトメトリーにより評価した。細胞（2×105個）を、フローバッファー（PBS、2％胎児ウシ血清、0.2％NaN3）中での各抗体処理の4倍連続希釈物と、合計体積100μLで併せた。細胞を氷上で30分間インキュベートし、続いて氷冷フローバッファーを用いて2回洗浄した。この時点で、FITC標識ヤギ抗ヒトFc二次抗体（109-095-098、Jackson ImmunoResearch社）を、推奨される希釈倍率で、合計体積100μLフローバッファー中に加えた。細胞を氷上で30分間インキュベートし、続いて氷冷フローバッファーを用いて2回洗浄した。標識された細胞を、Attune NxTフローサイトメーター（Thermo Fisher Scientific社）でフローサイトメトリーにより調べた。データを、FlowJoソフトウェアを用いて解析し、GraphPad Prism 6を用いてプロットした。結合定数を、一部位結合モデルを用いて非線形回帰により決定した。結果を図8に示す。
【０２４５】
実施例5：in vitro細胞傷害性実験
in vitro効力を、複数の癌細胞株で評価した：L540cy（ホジキンリンパ腫）およびDEL、およびDEL-BVR [6]（未分化大細胞リンパ腫）、U-266（多発性骨髄腫）。L540cyおよびDELはDSMZから入手し、U-266はATCCから入手した。細胞株の信頼性は、Cell Check 16パネル（IDEXX Bioresearch社）を用いて確認した。ホタルルシフェラーゼを安定的に発現するU-266細胞は、GenTarget社（San Diego, CA）からのin vivo readyレンチウイルス粒子（in vivo ready lentiviral particle）を用いて作製した。U-266細胞を1×106細胞/mL（＞90％生存）まで増殖させ、RPMI 1640培地＋10％FBS中で72時間、レンチウイルス粒子を用いて形質導入した。ネオマイシンの選択下で細胞を播種し、96ウェルプレートへの希釈クローニングにより安定なクローンを作製した。安定なU-266luc細胞株を、EnVisionマルチラベルプレートリーダー（Perkin Elmer社）を用いて、Bright-Gloルシフェラーゼアッセイシステム（Promega社）により選択した。すべての細胞傷害性実験に関して、細胞は指数相増殖で培養され、続いて10〜20％FBSを添加した150μL RPMI-1640を含有する96ウェルプレート中に24時間播種した。細胞培養培地中のADCの連続希釈物を、4×作業濃度で調製し、各希釈物のうち50μLを96ウェルプレートに加えた。ADCの添加後、細胞を37℃で4日間インキュベートした。96時間後、増殖阻害を、CellTiter-Glo（Promega社）により評価し、発光をEnvisionプレートリーダーで測定した。3回反復で測定したIC50値を、ここでは力価測定曲線の経過全体にわたる最大増殖阻害の半分を生じる濃度として定義する。in vitroバイスタンダーアッセイでは、L540cy細胞およびルシフェラーゼ(+) U-266細胞（U-266luc）を1：1比率で96ウェルプレートに播種した。試験物質希釈物を、上記に概説した通りに細胞に添加した。96時間後、U-266luc細胞の増殖阻害をBrightGloにより評価し、発光をEnvisionプレートリーダーで測定した。結果を図9および図10に示す。
【０２４６】
実施例6：2種類のADCの共投与と、1種類のADCへの2種類の薬物の共コンジュゲート化との比較
ADCを、同じ合計抗体濃度で細胞に加え、細胞傷害性を、上記に概説した通りに測定した。受容体結合性に関する競合は、共投与に対して活性の低下（抗体基準で）を引き起こす。低い受容体コピー数を有する細胞株に対しては、作用はより強調される可能性がある。
【０２４７】
【表１】
2018118953.tif 000045
【０２４８】
実施例7：in vivo異種移植実験
すべての実験は、実験動物ケア評価認証協会（Association and Accreditation of Laboratory Animal Care）による完全認証施設で、所内動物実験委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）に従って行なわれた。療法実験は、重症複合免疫不全（SCID）マウス（Harlan, Indianapolis, IN）に皮下移植されたDEL-BVR細胞、Karpas 299細胞、またはKarpas-35R細胞を用いて行なった。混合腫瘍モデルは、2,500,000個のKarpas 299細胞および2,500,000個のKarpas-35R細胞を含む混合物を移植された[7]。腫瘍の生着後、平均腫瘍体積が約100mm3に達したときにマウスを無作為化して研究群に分けた。ADCは、腹腔内注入により1回投与した。腫瘍体積が1000mm3に達したときに動物を安楽死させた。腫瘍体積は、式（体積＝1/2×長さ×幅×幅）を用いて算出した。長期にわたる退縮を示したマウスは、移植から40〜65日付近で打ち切った。結果を図11および図12に示す。
【０２４９】
実施例8：二重ADCと8個付加および/または16個付加単一薬物ADCとの比較
mcMMAF（化合物Aa）またはmc-vc-MMAE（化合物Ab）のいずれかを有するADCを、抗体1分子当たり16個の薬物の適合させた薬物付加量で化合物Aa/化合物Abを担持する二重アウリスタチンADCと比較した。大部分の細胞株で、異なる抗体を用いて、共コンジュゲート（化合物Aaおよび化合物Abを有する）は、hBU12-連結アセンブリ単位Aa (8)-化合物Aa (16)（薬物単位として化合物Aaのみを有する単一薬物16個付加ADC）と比較して同等のADC活性を有した。これは、顕著に低い活性を有したhBU12-連結アセンブリ単位Aa (8)-化合物Ab (16) ADC（薬物単位として化合物Abのみを有する単一薬物16個付加ADC）には当てはまらなかった。hLIV22抗体を含む、LIV-1を標的とする二重アウリスタチンADCは、いずれの単一薬物16個付加ADCと比較してもin vitroで顕著に高い活性を有した。このデータは、共コンジュゲート化されたアウリスタチンADCが、抗体または細胞株に依存することなく、改善された細胞傷害活性を示すことを実証する。
【０２５０】
アウリスタチン薬物を有する共コンジュゲート化ADCが幅広い活性を有することが示されたことに加えて、下記の表は、他のペイロードを送達する共コンジュゲート化ADCが高い活性を有し得ることも示す。例えば、カンプトテシン、ドラスタチン、およびビンブラスチンを共コンジュゲート化ADCに組み込み、活性を増強させることができる。
【０２５１】
【化４４】
2018118953.tif 000046
連結アセンブリ単位Aaは、MDPr、PEG24、1個のSiPr、および1個のAcm保護Cys残基を含む。
保護基（-S-iPrおよび-CH2-NH-C(=O)CH3）は個別に除去され、所望の薬物基が上記に示される連結アセンブリ単位に結合される。
【０２５２】
【表２】
2018118953.tif 000047
【０２５３】
【表３】
2018118953.tif 000048
【０２５４】
【表４】
2018118953.tif 000049
【０２５５】
【表５】
2018118953.tif 000050
【０２５６】
【化４５】
2018118953.tif 000051
【０２５７】
カンプトテシンおよびスペルドクス（superdox）ベースの共コンジュゲート
1. CD30を標的とするMMAE/カンプトテシンコンジュゲート
【化４６】
2018118953.tif 000052
【０２５８】
【表６】
2018118953.tif 000053
【０２５９】
2. 抗原1を標的とするスペルドクス/カンプトテシンコンジュゲート
【化４７】
2018118953.tif 000054
【化４８】
2018118953.tif 000055
【０２６０】
【表７】
2018118953.tif 000056
【０２６１】
3. MMAEと組み合わせられたスペルドクス：
【表８】
2018118953.tif 000057
【０２６２】
アウリスタチンを組み合わせられたドラスタチン10
【化４９】
2018118953.tif 000058
【０２６３】
【表９】
2018118953.tif 000059
【表１０】
2018118953.tif 000060
【０２６４】
ビンブラスチン/アウリスタチン共コンジュゲート
CD19を標的化
【化５０】
2018118953.tif 000061
【０２６５】
【表１１】
2018118953.tif 000062
【表１２】
2018118953.tif 000063
【０２６６】
実施例9：in vitro抵抗性アッセイ
2種類の異なるアッセイを用いて、二重アウリスタチンADCが、より有効にADC抵抗性細胞の発生を制限するか否かを評価した：慢性的曝露アッセイまたはコロニー形成アッセイ。この分析は、h25G5標的化またはhLIV22標的化二重アウリスタチンADCをそれぞれ用いて、JHH-7細胞（肝細胞癌細胞）またはMCF-7細胞（LIV-1陽性）のいずれかに対して行なった。Cell Titer Glo細胞増殖アッセイを16個付加mcMMAF ADCに対して用いて同様のIC50値がもたらされたにもかかわらず、肝細胞癌細胞を標的とする二重アウリスタチンコンジュゲートは、より有効に抵抗性細胞の発生を制限した。MCF-7細胞に対するLIV-1抗原を標的とする二重アウリスタチンADCもまた、単一薬物ADCと比較して、抵抗性コロニーの発生を低下させた。
【０２６７】
慢性的曝露アッセイ
慢性的曝露アッセイのために、10,000,000個の細胞を適切な細胞培地中でT225フラスコに播種した。ADCを100ng/mLの濃度で加えた。新鮮なADCを含有する培地を、4日毎に交換した。15日後、PBSを用いて細胞を洗浄し、3.7％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、続いてクリスタルバイオレットの0.5％溶液を用いて染色した。次に、残留細胞コロニー（5個超の細胞）の数をカウントした。
【０２６８】
【表１３】
2018118953.tif 000064
【０２６９】
上記の表中のデータは、図13に図示されている。
【０２７０】
コロニー形成アッセイ：
肝細胞癌細胞を標的とするADCを試験するために、JHH-7肝細胞癌細胞を、1000細胞/ウェルの密度で6ウェル組織培養プレートに播種した。ADCを、50ng/mLの濃度で48時間、細胞に添加した。この時点で、培地を除去し、PBSを用いて細胞を洗浄した。新鮮な培地を添加し、細胞を7〜9日間回復させた。続いて、PBSを用いて細胞を洗浄し、3.7％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、0.5％クリスタルバイオレットを用いて染色し、その後にカウントした。各条件について、N＝2で行なった。
【０２７１】
LIV-1を標的とするADCの試験のために、MCF-7乳癌細胞（ATCC）を、10,000細胞/ウェルの密度で6ウェル組織培養プレートに播種した。ADCを、100ng/mLの濃度で48時間、細胞に添加した。この時点で、培地を除去し、PBSを用いて細胞を洗浄した。新鮮な培地を添加し、細胞を7〜9日間回復させた。続いて、PBSを用いて細胞を洗浄し、3.7％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、0.5％クリスタルバイオレットを用いて染色し、その後にカウントした。各条件について、N＝2で行なった。
【０２７２】
【表１４】
2018118953.tif 000065
【０２７３】
【表１５】
2018118953.tif 000066
【０２７４】
上記の表中のデータは、それぞれ、図14および図15に図示されている。
【０２７５】
実施例10：16個＋8個の薬物付加のための3個のシステインを担持する薬物キャリア：
【化５１】
2018118953.tif 000067
【０２７６】
cAC10-連結アセンブリ単位Ac (8)-化合物Ai(16)-化合物Ah(8)の調製：
25当量のTCEPを-SiPr基の還元に用いたこと以外は、単一のCys(SiPr)残基を担持するキャリアを用いる二重コンジュゲート化に関するものと同じ手順に従った。特性決定データを図16Aおよび図16Bに示す。
【０２７７】
【化５２】
2018118953.tif 000068
【０２７８】
実施例11：PEGアームは親水性薬物を担持する二重コンジュゲートには必要でない
【化５３】
2018118953.tif 000069
予測精密質量：593.1；実測値m/z：593.2 (M+H)+、LC-MS tR＝0.68分。
【０２７９】
保護基（-S-iPrおよび-CH2-NH-C(=O)CH3）は個別に除去され、所望の薬物基が上記に示される連結アセンブリ単位に結合される。上述の二重コンジュゲートの調製のためのものと同じ手順に従った。化合物Ajおよび化合物Akを連結アセンブリ単位Abおよび抗体L49に組み込む共コンジュゲートの調製に関する分析データを、図17A〜Eに示す。
【０２８０】
【化５４】
2018118953.tif 000070
【０２８１】
実施例12：MFI2（p97）を標的とするL49抗体に対する二重アウリスタチンADCのin vitro細胞傷害性
種々の二重アウリスタチンADCのin vitro細胞傷害活性を、上記のものと同様の方法を用いて試験した。結果を以下の表に示す。
【０２８２】
【表１６】
2018118953.tif 000071
【０２８３】
参考文献
2018118953.tif 000072
【０２８４】
明確性および理解の目的のために説明および例示により幾分か詳細に上記で説明してきたが、ある程度の変更および改変が、添付の特許請求の範囲の範囲内で実行できることを、当業者は理解するであろう。加えて、本明細書中に提供される各参考文献は、各参照文献が参照により個別に組み入れられるのと同じ程度まで、その全体で参照により組み入れられる。
【配列表フリーテキスト】
【０２８５】
配列番号3〜6：タンパク質：人工的（ヒト化マウス配列）
配列番号9：タンパク質：人工的（重鎖可変領域）
配列番号10：タンパク質：人工的（軽鎖可変領域）
【図１】
2018118953.tif 000086
【図２】
2018118953.tif 000087
【図３】
2018118953.tif 000088
【図４】
2018118953.tif 000089
【図５】
2018118953.tif 000090
【図６】
2018118953.tif 000091
【図７】
2018118953.tif 000092
【図８】
2018118953.tif 000093
【図９】
2018118953.tif 000094
【図１０】
2018118953.tif 000095
【図１１】
2018118953.tif 000096
【図１２】
2018118953.tif 000097
【図１３】
2018118953.tif 000098
【図１４】
2018118953.tif 000099
【図１５】
2018118953.tif 000100
【図１６】
2018118953.tif 000101
【図１７Ａ】
2018118953.tif 000102
【図１７Ｂ】
2018118953.tif 000103
【図１７Ｃ】
2018118953.tif 000104
【図１７Ｄ】
2018118953.tif 000105
【図１７Ｅ】
2018118953.tif 000106
【配列表】
2018118953000001.app
【外国語明細書】
2018118953000001.pdf