(57)【要約】【課題】１，４−ジオキサン分解能に優れた、新規の活性汚泥を提供する。【解決手段】配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ａ、配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｂおよび配列番号：３の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｃからなる群から選択される少なくとも１種を含む、活性汚泥。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ａ、配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｂおよび配列番号：３の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｃからなる群から選択される少なくとも１種を含む、活性汚泥。
【請求項２】
配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ａおよび配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｂの少なくとも一方を含む、請求項１に記載の活性汚泥。
【請求項３】
配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ａ、配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｂおよび配列番号：３との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｃを含む、請求項１または２に記載の活性汚泥。
【請求項４】
配列番号：４の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｄ、配列番号：５の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｅ、および配列番号：６の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｆをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の活性汚泥。
【請求項５】
配列番号：７の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｇ、配列番号：８の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｈ、配列番号：９の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｉおよび配列番号：１０の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｊからなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の活性汚泥。
【請求項６】
配列番号：８の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｈおよび配列番号：９の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｉの少なくとも一方を含む、請求項５に記載の活性汚泥。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の活性汚泥を、１，４−ジオキサン含有排水に接触させることを含む、１，４−ジオキサン含有排水の処理方法。
【請求項８】
複数の微生物を含む試料における１，４−ジオキサン分解菌を同定する方法であって、
13Ｃ標識された１，４−ジオキサンの存在下で前記複数の微生物の培養を開始し、培養物を得ること；当該培養物から核酸を回収すること；当該核酸を超遠心分離し、高密度画分を得ること；および、当該高密度画分に存在する標的遺伝子の塩基配列を次世代シークエンサーにより解析し、各微生物の相対存在量（１）を求める工程Ａ、ならびに
13Ｃ非標識の１，４−ジオキサンの存在下で前記複数の微生物の培養を開始し、培養物を得ること；当該培養物から核酸を回収すること；当該核酸を超遠心分離し、高密度画分を得ること；および、当該高密度画分に存在する標的遺伝子の塩基配列を次世代シークエンサーにより解析し、各微生物の相対存在量（２）を求める工程Ｂを含み、
前記相対存在量（１）が前記相対存在量（２）より多い微生物を１，４−ジオキサン分解菌であると判断する、方法。
【請求項９】
１００〜３００ｍｇ／Ｌの前記13Ｃ標識された１，４−ジオキサンの存在下で前記複数の微生物の培養を開始する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程Ａおよび工程Ｂにおける培養を、２０〜４０℃で、６〜１０時間行う、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
工程Ａおよび工程Ｂにおいて、気密容器内で前記複数の微生物を好気的に培養し、前記容器内における気相のＣＯ2濃度を測定することを含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
気相の13ＣＯ2濃度を測定することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，４−ジオキサン分解菌を含む活性汚泥およびそれを用いた排水処理方法、ならびに１，４−ジオキサン分解菌を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，４−ジオキサンについて、日本国では平成２４年５月２５日から、一律排水基準（０．５ｍｇ／Ｌ以下）を設定している。
【０００３】
１，４−ジオキサンは、生物学的難分解性物質である。従来の排水処理施設で用いられる活性汚泥法、活性炭吸着法などでは、１，４−ジオキサンを十分に除去できないとされている。そこで、１，４−ジオキサンを除去する方法としては、オゾン処理、オゾン処理と過酸化水素処理との組み合わせ、オゾン処理と紫外線処理との組み合わせなど、促進酸化処理が知られている（特許文献１および特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−１０３４０１号公報
【特許文献２】特開２００５−５８８５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、促進酸化処理では、１，４−ジオキサン以外の有機物が存在すると、これらの有機物も分解されるため、必要オゾン注入量、薬品量などが多くなり、処理コストが高くなるおそれがある。
【０００６】
そこで本発明は、１，４−ジオキサン分解能に優れた、新規の活性汚泥およびこれを用いた排水処理方法、ならびに１，４−ジオキサン分解菌を同定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その過程で、驚くべきことに、活性汚泥において、それに含まれる微生物群集に対して、極めて低い相対存在量（％）である所定の微生物により、１，４−ジオキサンを分解できるという知見を得、この知見に基づき、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明の第１の形態によれば、配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ａ、配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｂおよび配列番号：３の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｃからなる群から選択される少なくとも１種を含む、活性汚泥が提供される。
【０００９】
本発明の一実施形態では、本発明の第１の形態に係る活性汚泥を、１，４−ジオキサン含有排水に接触させることを含む、１，４−ジオキサン含有排水の処理方法が提供される。
【００１０】
本発明の第２の形態によれば、複数の微生物を含む試料における１，４−ジオキサン分解菌を同定する方法であって、13Ｃ標識された１，４−ジオキサンの存在下で前記複数の微生物の培養を開始し、培養物を得ること；当該培養物から核酸を回収すること；当該核酸を超遠心分離し、高密度画分を得ること；および、当該高密度画分に存在する標的遺伝子の塩基配列を次世代シークエンサーにより解析し、各微生物の相対存在量（１）を求める工程Ａ、ならびに13Ｃ非標識の１，４−ジオキサンの存在下で前記複数の微生物の培養を開始し、培養物を得ること；当該培養物から核酸を回収すること；当該核酸を超遠心分離し、高密度画分を得ること；および、当該高密度画分に存在する標的遺伝子の塩基配列を次世代シークエンサーにより解析し、各微生物の相対存在量（２）を求める工程Ｂを含み、前記相対存在量（１）が前記相対存在量（２）より多い微生物を１，４−ジオキサン分解菌であると判断する、方法が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、１，４−ジオキサン分解能に優れた、新規の活性汚泥およびこれを用いた排水処理方法、ならびに１，４−ジオキサン分解菌を同定する方法の提供が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、１，４−ジオキサン濃度の測定方法を示す。
【図２】図２は、フルスケール活性汚泥システムの通年運転における化学分析データを示す。（Ａ）流入・流出水の１，４−ジオキサン濃度、１，４−ジオキサン除去率、（Ｂ）曝気槽の温度、（Ｃ）曝気槽のＤＯ、（Ｄ）曝気槽のｐＨ、（Ｅ）流入・流出水のＴＯＣ、（Ｆ）曝気槽のＣＯＤ−Ｃｒ。
【図３】図３は、フルスケール活性汚泥システムの曝気槽における微生物群集の年間推移（門／綱レベルでの系統分類）を示す。
【図４】図４は、本発明に係る１，４−ジオキサン分解菌を同定する方法の培養過程における測定データを示す。（13Ｃ標識区：実線、非標識区：点線）：（Ａ）ＣＯ2濃度、（Ｂ）13ＣＯ2濃度（●）、ＣＯ2の13Ｃ  ａｔｏｍ％（○）、（Ｃ）１，４−ジオキサン濃度、（Ｄ）ＣＯＤ−Ｃｒ。
【図５】図５は、本発明に係る１，４−ジオキサン分解菌を同定する方法により同定された１，４−ジオキサン分解菌の同定結果を示す。（Ａ）13Ｃ標識区および非標識区のＲＮＡ密度画分（１Ｈ、２Ｈ、３Ｈ、Ｌ）における微生物群集構造（門／綱レベルでの系統分類）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）13Ｃ標識区の高密度画分（１Ｈ（Ｂ）、２Ｈ（Ｃ）および３Ｈ（Ｄ））で非標識区の同等密度画分（２Ｈ）と比べ有意に相対存在量が上昇する微生物種（ＯＴＵ：ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｕｎｉｔ）、13Ｃ標識区と非標識区におけるＯＴＵの相対存在量をそれぞれ丸（●）と三角（▲）とで示す。
【図６−１】図６−１は、本発明に係る１，４−ジオキサン分解菌を同定する方法により同定された１，４−ジオキサン分解菌のフルスケール活性汚泥システム内における年間変動（実線：曝気槽由来、点線：返送ライン由来）を示す。（Ａ）ＯＴＵ２２３０、（Ｂ）ＯＴＵ８４７４、（Ｃ）ＯＴＵ１２２６６、（Ｄ）ＯＴＵ５１０４、（Ｅ）ＯＴＵ１３８５６、（Ｆ）ＯＴＵ２１９７。
【図６−２】図６−２は、本発明に係る１，４−ジオキサン分解菌を同定する方法により同定された１，４−ジオキサン分解菌のフルスケール活性汚泥システム内における年間変動（実線：曝気槽由来、点線：返送ライン由来）を示す。（Ｈ）ＯＴＵ１００（Ｉ）ＯＴＵ８３８５（Ｊ）ＯＴＵ８５３２。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の一形態に係る実施の形態を説明する。本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。
【００１４】
本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％ＲＨの条件で測定する。
【００１５】
＜活性汚泥＞
本発明の第１の形態は、配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ａ、配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｂおよび配列番号：３の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｃからなる群から選択される少なくとも１種を含む、活性汚泥である。
【００１６】
活性汚泥とは、一般的に、下水、排水などに連続通気撹拌して、それらの含有有機物に対する資化能、酸化能の高い種々の好気性細胞を増殖させて得られる泥状の物質をいう。活性汚泥は、微生物群集を含み、細菌に加えて糸状菌、原生動物が混在していてもよい。本明細書中、活性汚泥に含まれる微生物群集を「汚泥微生物群集」とも称する。
【００１７】
本発明者らは、活性汚泥における微生物群集の状態と１，４−ジオキサン分解との相関関係について、検討を行った。また、下記の１，４−ジオキサン分解菌を同定する方法により、汚泥微生物群集から高密度画分（１Ｈおよび２Ｈ）において、13Ｃ培養物で非標識培養物よりも有意に上昇する７種の１，４−ジオキサン分解菌を同定した。これらの１，４−ジオキサン分解菌は、汚泥微生物群集全体に対して、極めて低い相対存在量（例えば１．５％以下）であった。そして、驚くべきことに、１，４−ジオキサン分解菌の相対存在量が変動することにより、活性汚泥の１，４−ジオキサン処理性能も連動して変動することを見出した。
【００１８】
本発明の活性汚泥は、微生物群集中に、所定の１，４−ジオキサン分解菌を含む。かような活性汚泥を用いることにより、１，４−ジオキサンを安定して分解できる。
【００１９】
本発明の活性汚泥では、約３０，０００〜約１１０，０００の微生物種を系統的に特徴づけた。これらの微生物種において、微生物種の１，４−ジオキサン分解菌の相対存在量は、汚泥微生物群集全体に対して、極めて低くてもよい。１，４−ジオキサン分解菌の相対存在量は、汚泥微生物群集全体に対して、例えば０．００１％〜１．５００％である。
【００２０】
本発明では、後述するように、次世代シークエンサーを用いて、高速かつ大規模な塩基配列の解読を行い、汚泥微生物群集構造を解析した。これにより、汚泥微生物群集全体に対して、相対存在量が極めて低い１，４−ジオキサン分解菌の同定が可能である。下記の１，４−ジオキサン分解菌は、活性汚泥中の存在量が極めて少ないため、これらを単離することは、技術的理由により困難である。そのため、寄託機関に寄託を行っていない。しかし、本出願人は、本発明に係る１，４−ジオキサン分解菌を含む活性汚泥について、日本国特許法施行規則第２７条の３各号に該当する場合、各法令の順守を条件に、第三者に分譲することを保証する。
【００２１】
［１，４−ジオキサン分解菌］
本明細書において、１，４−ジオキサン分解菌とは、１，４−ジオキサンを単一炭素源として分解および資化できる菌、または１，４−ジオキサンを分解および同化できる菌を意味する。
【００２２】
以下、１，４−ジオキサンを単一炭素源として分解および資化できる菌、ならびに１，４−ジオキサンを分解および同化できる菌について説明する。
【００２３】
（１，４−ジオキサンを単一炭素源として分解および資化できる菌）
本発明に係る１，４−ジオキサン分解菌において、１，４−ジオキサンを単一炭素源として分解および資化できる菌（本明細書中、単に「ジオキサン資化菌」とも称する）とは、後述する「１，４−ジオキサン分解菌を同定する方法」により同定した微生物であり、具体的には、１Ｈおよび２Ｈの高密度画分において、13Ｃ培養物で非標識培養物よりも相対存在量が有意に上昇している微生物である。ジオキサン資化菌としては、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：３の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する菌が挙げられる。本発明に係る活性汚泥において、ジオキサン資化菌は、これらに限定されず、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：７の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する菌および従来公知のジオキサン資化菌から選択された菌がさらに含まれていてもよい。
【００２４】
本明細書において、塩基配列との同一性とは、特に記載した場合を除き、いずれの塩基配列においても、２つの配列を最適の態様で整列させた場合に、２つの配列間で共有する一致したヌクレオチドの個数の百分率を意味する。すなわち、同一性（％）＝（一致した位置の数／位置の全数）×１００で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５（１９９０）４０３−４１０に記載されるＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム中に組込まれている。より詳細には、塩基配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズムまたはプログラム（例えばＢＬＡＳＴＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷなど）により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメータは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。
【００２５】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：７の塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有するジオキサン資化菌を表１に示す。下記表１において、「相同性（％）」は、配列番号：１〜７の塩基配列について、ＮＣＢＩ（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎ）の塩基配列データベースのＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定した。
【００２６】
【表１】
2018057356.tif 000002
【００２７】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：５の塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌（ジオキサン資化菌）（ＯＴＵ２２３０、ＯＴＵ８４７４、ＯＴＵ５１０４またはＯＴＵ１３８５６）は、データベース上で最も近縁な微生物種に対して、配列相同性がそれぞれ８８．６％、９４．１％、９４．９％または９６．９％である。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いた解析では、既知種と相同性９７％以上を示す場合、同種であると定義できる。つまり、これらの１，４−ジオキサン分解菌（ジオキサン資化菌）は、既知の微生物種とは種が異なる微生物であると考えられる。
【００２８】
配列番号：３の塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌（ジオキサン資化菌）（ＯＴＵ１２２６６）は、ベンゼンやトルエン等の芳香族化合物の分解菌として知られるニトロソモナス・ウレアエ（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｕｒｅａｅ）に対して、配列相同性が９７．６％であり、ニトロソモナス・ウレアエ（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｕｒｅａｅ）の近縁種であると考えられる。
【００２９】
配列番号：６または配列番号：７の塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌（ジオキサン資化菌）（ＯＴＵ２１９７またはＯＴＵ６８２５）は、それぞれシュードノカルディア・ジオキサノヴォランス（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｄｉｏｘａｎｉｖｏｒａｎｓ）またはマイクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）であると考えられる。シュードノカルディア・ジオキサノヴォランス（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｄｉｏｘａｎｉｖｏｒａｎｓ）は、既知の１，４−ジオキサン分解菌である。
【００３０】
（１，４−ジオキサンを分解および同化できる菌）
本発明の活性汚泥は、１，４−ジオキサン分解菌として、上記ジオキサン資化菌に加えて、さらに１，４−ジオキサンを分解および同化できる菌を含むことができる。
【００３１】
本発明に係る１，４−ジオキサン分解菌において、１，４−ジオキサンを分解および同化できる菌（本明細書中、単に「ジオキサン同化菌」とも称する）とは、後述する「１，４−ジオキサン分解菌を同定する方法」により同定した微生物であり、具体的には、３Ｈの高密度画分において、13Ｃ培養物で非標識培養物よりも相対存在量が有意に上昇している微生物である。ジオキサン同化菌としては、配列番号：８、配列番号：９または配列番号：１０の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する菌が挙げられる。
【００３２】
配列番号：８、配列番号：９または配列番号：１０の塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有するジオキサン同化菌を表２に示す。下記表２において、「相同性（％）」は、配列番号：８〜１０の塩基配列について、上記と同様に、ＮＣＢＩ（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎ）の塩基配列データベースのＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定した。
【００３３】
【表２】
2018057356.tif 000003
【００３４】
配列番号：９または配列番号：１０の塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌（ジオキサン同化菌）（ＯＴＵ８３８５またはＯＴＵ８５３２）は、データベース上で最も近縁な微生物種に対して、配列相同性がそれぞれ９５．７％または８８．９％である。上述のとおり、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いた解析では、既知種と相同性９７％以上を示す場合、同種であると定義できる。つまり、これらの１，４−ジオキサン分解菌（ジオキサン同化菌）は、既知の微生物種とは種が異なる微生物であると考えられる。
【００３５】
配列番号：８の塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌（ジオキサン同化菌）（ＯＴＵ１００）は、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）であると考えられる。
【００３６】
本発明の一実施形態において、活性汚泥は、配列番号：１の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ａ（本明細書中、単に「１，４−ジオキサン分解菌Ａ」とも称す）、配列番号：２の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｂ（本明細書中、単に「１，４−ジオキサン分解菌Ｂ」とも称す）および配列番号：３の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｃ（本明細書中、単に「１，４−ジオキサン分解菌Ｃ」とも称す）からなる群から選択される少なくとも１種を含む。活性汚泥は、１，４−ジオキサン分解能の観点から、好ましくは１，４−ジオキサン分解菌Ａおよび１，４−ジオキサン分解菌Ｂの少なくとも一方を含み、より好ましくは１，４−ジオキサン分解菌Ａ、１，４−ジオキサン分解菌Ｂおよび１，４−ジオキサン分解菌Ｃをすべて含む。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態において、活性汚泥は、上記実施形態の１，４−ジオキサン分解菌に加えて、１，４−ジオキサン分解能の観点から、配列番号：４の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｄ（本明細書中、単に「１，４−ジオキサン分解菌Ｄ」とも称す）、配列番号：５の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｅ（本明細書中、単に「１，４−ジオキサン分解菌Ｅ」とも称す）、および配列番号：６の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｆ（本明細書中、単に「１，４−ジオキサン分解菌Ｆ」とも称す）をさらに含む。
【００３８】
本発明のさらに好ましい実施形態において、上記実施形態の１，４−ジオキサン分解菌に加えて、１，４−ジオキサンをより効率よく分解するとの観点から、活性汚泥は、配列番号：７の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌（本明細書中、単に「１，４−ジオキサン分解菌Ｇ」とも称す）、配列番号：８の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌（本明細書中、単に「１，４−ジオキサン分解菌Ｈ」とも称す）、配列番号：９の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌（本明細書中、単に「１，４−ジオキサン分解菌Ｉ」とも称す）および配列番号：１０の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌（本明細書中、単に「１，４−ジオキサン分解菌Ｊ」とも称す）からなる群から選択される少なくとも１種を含む。本実施形態に係る活性汚泥は、よりさらに好ましくは配列番号：８の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｈおよび配列番号：９の塩基配列との同一性が９７％以上である１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する１，４−ジオキサン分解菌Ｉの少なくとも一方を含む。
【００３９】
本発明の活性汚泥に含まれる１，４−ジオキサン分解菌において、ジオキサン資化菌（１，４−ジオキサン分解菌Ａ〜Ｇ）の相対存在量（％）は、本発明の効果を発現できる限り特に制限されないが、汚泥微生物群集全体に対して、例えば０．００１〜１．５００％である。また、ジオキサン同化菌（１，４−ジオキサン分解菌Ｈ〜Ｊ）の相対存在量（％）は、本発明の効果を発現できる限り特に制限されないが、汚泥微生物群集全体に対して、例えば０．００１〜５．７００％である。相対存在量の値は、実施例に記載の方法により求めた値である。
【００４０】
［１，４−ジオキサン含有排水の処理方法］
本発明の一実施形態によれば、上記第１の形態に係る活性汚泥を、１，４−ジオキサン含有排水に接触させることを有する、１，４−ジオキサン含有排水の処理方法が提供される。
【００４１】
１，４−ジオキサン含有排水の処理方法としては、上記活性汚泥を、１，４−ジオキサン含有排水に接触させることを有すれば、従来公知のいずれの方法も利用することができる。例えば、上記活性汚泥を収容した曝気槽に１，４−ジオキサン含有排水を加えることで、１，４−ジオキサンを分解できる。また、１，４−ジオキサン含有排水が入った容器に、上記活性汚泥を加えることでも、１，４−ジオキサンを分解できる。
【００４２】
１，４−ジオキサン含有排水としては、１，４−ジオキサンが含まれるものであれば、特に制限されない。１，４−ジオキサン含有排水には、有機化合物、窒素化合物、硫黄化合物などが含まれていてもよい。
【００４３】
活性汚泥を収容した曝気槽に１，４−ジオキサン含有排水を加える場合、ＭＬＳＳ（活性汚泥浮遊物質量；ｍｉｘｅｄ  ｌｉｑｕｏｒ  ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  ｓｏｌｉｄｓ）は、１，４−ジオキサン分解能の観点から、好ましくは４，０００ｍｇ／Ｌ〜１２，０００ｍｇ／Ｌである。
【００４４】
活性汚泥を収容した曝気槽において、運転および管理条件については、適宜調整すればよく、従来の知見を用いることができる。例えば、ｐＨは、６〜８、温度は、２０〜４０℃、溶存酸素量（ＤＯ：Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  Ｏｘｙｇｅｎ）は、２〜１０ｍｇ／Ｌであればよい。
【００４５】
１，４−ジオキサン含有排水に含まれる１，４−ジオキサンの濃度は、特に制限されない。本発明の活性汚泥を複数回利用することで、１，４−ジオキサンを十分に除去することができる。
【００４６】
＜１，４−ジオキサン分解菌を同定する方法＞
本発明の第２の形態は、複数の微生物を含む試料における１，４−ジオキサン分解菌を同定する方法であって、13Ｃ標識された１，４−ジオキサンの存在下で前記複数の微生物の培養を開始し、培養物を得ること；当該培養物から核酸を回収すること；当該核酸を超遠心分離し、高密度画分を得ること；および、当該高密度画分に存在する標的遺伝子の塩基配列を次世代シークエンサーにより解析し、各微生物の相対存在量（１）を求める工程Ａ、ならびに13Ｃ非標識の１，４−ジオキサンの存在下で前記複数の微生物の培養を開始し、培養物を得ること；当該培養物から核酸を回収すること；当該核酸を超遠心分離し、高密度画分を得ること；および、当該高密度画分に存在する標的遺伝子の塩基配列を次世代シークエンサーにより解析し、各微生物の相対存在量（２）を求める工程Ｂを含み、前記相対存在量（１）が前記相対存在量（２）より多い微生物を１，４−ジオキサン分解菌であると判断する、方法である。
【００４７】
複数の微生物を含む試料とは、例えば上述の活性汚泥のように、数万種程度の微生物が含まれるものが挙げられる。以下では、実環境から採取した活性汚泥を、複数の微生物を含む試料の例として、活性汚泥試料に含まれる１，４−ジオキサン分解菌を同定する方法について説明する。ただし、本形態に係る発明を限定するものではない。
【００４８】
［微生物の相対存在量を求める工程］
本発明の１，４−ジオキサン分解菌を同定する方法では、上記工程Ａにおいて13Ｃ標識された１，４−ジオキサンを用い、上記工程Ｂにおいて13Ｃ非標識の１，４−ジオキサンを用いる。上述のとおり、本明細書において、１，４−ジオキサン分解菌とは、１，４−ジオキサンを単一炭素源として分解および資化できる菌、または１，４−ジオキサンを分解および同化できる菌を意味する。13Ｃ標識された１，４−ジオキサンを取り込んだ１，４−ジオキサン分解菌は、13Ｃ非標識の１，４−ジオキサンを取り込んだ１，４−ジオキサン分解菌に比べて重くなる。例えば、13Ｃ標識された１，４−ジオキサンによる培養物（13Ｃ標識培養物）と13Ｃ非標識の１，４−ジオキサンによる培養物（非標識培養物）とを用意し、それぞれ培養物から得られた高密度画分における核酸（ＲＮＡ）の解析・比較を行うことができる。非標識培養物の高密度画分における相対存在量よりも、13Ｃ標識培養物における相対存在量が多い微生物は、13Ｃを取り込んで重くなった（より高密度画分に移行しやすくなった）微生物であると解される。これにより、13Ｃを著しく取り込む微生物（１，４−ジオキサン分解菌）を同定することができる。
【００４９】
本形態の同定方法に係る一実施形態において、微生物の相対存在量を求めるには、以下の４つの工程からなる。なお、工程Ａおよび工程Ｂにおいて、下記（ｉｉ）〜（ｉｖ）の工程は共通である。
【００５０】
（ｉ）13Ｃ標識された１，４−ジオキサン（工程Ａ）または13Ｃ非標識の１，４−ジオキサン（工程Ｂ）を活性汚泥試料に添加して、試料に含まれる微生物を培養すること；
（ｉｉ）それぞれの培養物から核酸（ＲＮＡ）を回収すること；
（ｉｉｉ）回収した核酸を超遠心で分離し、高密度画分を得ること；および
（ｉｖ）高密度画分に存在する標的核酸（ＲＮＡ）（例えば１６Ｓ  ｒＲＮＡ）の塩基配列を次世代シークエンサーにより解析すること。
【００５１】
従来微生物群集構造解析で用いられるＴ−ＲＦＬＰ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法では、検出に十分な13Ｃ標識ＲＮＡを得るために、高濃度の基質添加や長時間の培養時間がしばしば設定されていた。このことは、実環境条件と培養条件との間に隔たりを生み、実環境において代謝活性を有する微生物の同定を困難にするという問題がある。
【００５２】
本発明者らは、次世代シークエンサーを用いることで、高濃度の基質添加や長時間の培養時間を必要とせず、より実環境に近い条件においても、標識ＲＮＡをより高感度で検出できることを見出し、本形態に係る発明を完成させるに至った。
【００５３】
以下、上記（ｉ）〜（ｉｖ）について具体的に説明する。
【００５４】
（ｉ）13Ｃ標識された１，４−ジオキサンまたは13Ｃ非標識の１，４−ジオキサンを活性汚泥試料に添加して、試料に含まれる微生物を培養すること
培養に用いる活性汚泥試料では、汚泥微生物群集の状態変化を抑制するとの観点から、活性汚泥試料の採取から、好ましくは１０時間以内、より好ましくは６時間以内、さらに好ましくは４時間以内に、微生物の培養を開始する。
【００５５】
微生物の培養は、活性汚泥試料と、13Ｃ標識された１，４−ジオキサンまたは13Ｃ非標識の１，４−ジオキサンとを混合して、１，４−ジオキサンの存在下で行う。本明細書において、13Ｃ標識された１，４−ジオキサンを添加して培養した培養物を「13Ｃ培養物」、13Ｃ非標識の１，４−ジオキサンを添加して培養した培養物を「非標識培養物」と称する。
【００５６】
微生物の培養は、汚泥微生物群集の状態を維持できるとの観点から、活性汚泥試料に対して、13Ｃ標識された１，４−ジオキサンまたは13Ｃ非標識の１，４−ジオキサンのみを添加して培養することが好ましい。ただし、必要に応じて、エチレングリコール等その他の成分を適宜添加してもよい。
【００５７】
13Ｃ標識されたまたは13Ｃ非標識の１，４−ジオキサンの濃度は、実環境での濃度変動（５〜７０ｍｇ／Ｌ）を踏まえて、適宜調整することができる。本形態に係る発明の一実施形態では、１００〜３００ｍｇ／Ｌの前記１，４−ジオキサンの存在下で前記複数の微生物の培養を開始する。培養開始時において、前記１，４−ジオキサンの濃度が１００ｍｇ／Ｌ以上であることにより、１，４−ジオキサン分解菌が下記の好ましい培養時間においても、１，４−ジオキサンを分解および資化、または分解および同化できる。前記１，４−ジオキサンの濃度が３００ｍｇ／Ｌ以下であることにより、汚泥微生物群集の状態変化を抑制できる。よって、本発明の１，４−ジオキサン分解菌を同定する方法において、１００〜３００ｍｇ／Ｌの前記13Ｃ標識された１，４−ジオキサンの存在下で前記複数の微生物の培養を開始することが好ましい。
【００５８】
微生物の培養温度は、実環境での年間温度変化を踏まえて、設定すればよい。微生物の培養温度は、実環境で活動する１，４−ジオキサン分解菌を検出できるとの観点から、好ましくは２０〜４０℃の範囲である。培養温度が２０℃以上であることにより、１，４−ジオキサン分解菌による１，４−ジオキサンの分解を確認できる。また、培養時間を下記の好ましい範囲にすることができる。培養温度が４０℃以下であることにより、汚泥微生物群集の状態変化を抑制できる。
【００５９】
微生物の培養時間は、例えば１２時間以下であり、好ましくは６〜１０時間である。培養時間が６時間以上であると、微生物の13Ｃ標識のために十分なジオキサン分解量を確保できる。培養時間が１０時間以下であると、13Ｃ標識された１，４−ジオキサンを分解して取り込んだ微生物から13Ｃが液相へ放出される前に核酸を回収でき、よって13Ｃの微生物間食物連鎖によるノイズ（非１，４−ジオキサン分解菌の検出）を抑制できる。
【００６０】
微生物を培養する間、培養液を撹拌または振とうしてもよい。
【００６１】
微生物の培養には、従来公知の培養器具を用いることができるが、以下の点を考慮して、気相体積を十分に確保したバイアル瓶を用いることが好ましい。気相体積を十分に確保することで、空気と活性汚泥との接触を促進できるという利点がある。また、バイアル瓶という密閉系で培養を行うことにより、気相の変化（13ＣＯ2の生成など）を厳密に追跡できるという利点がある。特に、微生物の培養に際し、気相部分の酸素濃度を測定し、十分量の酸素が確保されていることを確認する必要がある。本形態の同定方法において、微生物の培養では、好気的な１，４−ジオキサン分解菌を同定するため、通常、嫌気性菌の培養に用いられるバイアル瓶を使うことにより、上記のような利点を得ることができる。
【００６２】
すなわち、本発明の第２の形態の一実施形態では、１，４−ジオキサン分解菌を同定する方法は、工程Ａおよび工程Ｂにおいて、気密容器内で好気性微生物を好気的に培養し、前記容器内における気相のＣＯ2濃度を測定することを含むことが好ましい。気相のＣＯ2濃度を測定することで、１，４−ジオキサンの分解（無機化）を特定できる。
【００６３】
また、１，４−ジオキサン分解菌を同定する方法は、工程Ａおよび工程Ｂにおいて、気相の13ＣＯ2濃度を測定することをさらに含むことが好ましい。気相の13ＣＯ2濃度を測定することで、13Ｃ標識された１，４−ジオキサンの分解（無機化）を特定できる。
【００６４】
（ｉｉ）培養物から核酸を回収すること
（ｉ）で得られた13Ｃ標識培養物または非標識培養物から核酸を回収する方法は、特に制限されず、従来公知の方法を用いることができる。回収する核酸としては、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれであってもよいが、短時間でも高感度で微生物の代謝活性を検出するとの観点から、好ましくはＲＮＡである。
【００６５】
以下、ＲＮＡを回収する方法について説明する。
【００６６】
ＲＮＡを回収する方法としては、例えば、ビーズ（ガラスビーズ、ジルコニアとシリカの混合ビーズなど）による物理的破砕方法、超音波処理による破砕方法、フレンチプレスによる破砕方法、液体窒素で凍結した試料を乳鉢と乳棒とで破砕する方法などを用いて、微生物細胞を破壊する。その後、従来公知の方法（フェノール・クロロホルム抽出など）を用いて、タンパク質を除去し、ＤＮａｓｅを用いてＤＮＡを消化し、ＲＮＡを回収する。
【００６７】
（ｉｉｉ）回収したＲＮＡを超遠心で分離し、高密度画分を得ること
（ｉｉ）で回収したＲＮＡにおいて、超遠心分離（一例として、１２８，０００×ｇ、２０℃、４２〜６５時間）することにより、核酸の密度勾配（密度画分）を得ることができる。
【００６８】
ＲＮ密度画分は、屈折計を用いて、浮遊密度により決定する。具体的には、浮遊密度１．８０３〜１．８０８ｇ／ｍｌ、１．７９６〜１．８００ｇ／ｍｌ、１．７８８〜１．７９３ｇ／ｍｌ、および１．７６９〜１．７７１ｇ／ｍｌを示すＲＮＡ画分を、それぞれ１Ｈ、２Ｈ、３Ｈ、およびＬ画分と定義する。高密度画分とは、１Ｈ、２Ｈおよび３Ｈを示す。
【００６９】
（ｉｖ）高密度画分に存在する標的核酸（ＲＮＡ）の塩基配列を次世代シークエンサーにより解析すること
本形態の同定方法において、１，４−ジオキサン分解菌を同定するために用いる標的核酸（ＲＮＡ）としては、大規模な系統解析に適するとの観点から、好ましくは１６Ｓ  ｒＲＮＡである。
【００７０】
次世代シークエンサーとは、サンガー法を利用した蛍光キャピラリーシークエンサーである「第１世代シークエンサー」と対比させて用いられている用語であり、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼによる逐次的ＤＮＡ合成法を用いて、数千万から数億のＤＮＡ断片に対して数十〜数千ｂｐのリード長の断片を網羅的に解析することによって超並列的に塩基配列を決定するための装置を意味する。次世代シークエンサーでは、ジデオキシヌクレオチドを用いてＤＮＡポリメラーゼの伸長を止めるサンガー法を用いた第１世代シークエンサーと異なるシーケンシング原理が用いられている。このような原理として、合成シーケンシング法、パイロシーケンシング法、リガーゼ反応シーケンシング法などが挙げられる。これまでに、多くの企業や研究機関などから、多様な次世代シークエンサーが提供されており、例えば、ＨｉＳｅｑ２５００（イルミナ株式会社）、ＭｉＳｅｑ（イルミナ株式会社）、５５００ｘｌ  ＳＯＬｉＤ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）、Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）、Ｉｏｎ  ＰＧＭ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）、ＧＳ  ＦＬＸ＋（ロシュ・ダイアグノスティックス社）などが挙げられる。
【００７１】
次世代シークエンサーによる解析方法としては、付属説明書に従って実施することができる。これにより、１試料あたり数万から数十万の微生物種（ＯＴＵ）を同定、および各微生物種の相対存在量（％）を解析できる。
【００７２】
［１，４−ジオキサン分解菌であるとの判断方法］
複数の微生物を含む試料から、１，４−ジオキサン分解菌を判断するには、13Ｃ培養物におけるＲＮＡ高密度画分の微生物の相対存在量（１）と非標識培養物におけるＲＮＡ高密度画分の微生物の相対存在量（２）とを対比することで行うことができる。
【００７３】
具体的には、ＯＴＵのうち、高密度画分（１Ｈ、２Ｈおよび３Ｈ）において、13Ｃ培養物で非標識培養物よりも有意に上昇している微生物をＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（スチューデントのｔ検定）により特定する。
【００７４】
スチューデントのｔ検定とは、パラメトリック検定の一つである。ｔ検定はデータＸおよびデータＹの２つのデータ間の平均値に差があるかどうかを検定する方法である。スチューデントのｔ検定は特に、２つのデータ間に対応がなく、かつ２つのデータの分散に等分散性が仮定できるときに用いる方法である。
【００７５】
高密度画分において、相対存在量（１）が相対存在量（２）よりも有意に上昇している微生物は、13Ｃ標識された１，４−ジオキサンを取り込み、分解および資化する、または分解および同化することで、13Ｃ標識されて重くなったＲＮＡを有するため、そのような微生物を１，４−ジオキサン分解菌であると判断できる（図５参照）。
【実施例】
【００７６】
以下に、実施例および比較例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７７】
＜活性汚泥の評価＞
［化学分析］
株式会社日本触媒川崎製造所浮島工場（神奈川県川崎市川崎区浮島町１０−１２）のフルスケール活性汚泥システムにて１，４−ジオキサンを含む産業排水を処理し、その運転を約１年間継続した（２０１５年５月〜２０１６年４月：そのうち２０１５年８月２０日から９月２３日まで定期点検によりシステム停止）。汚泥滞留時間（ＳＲＴ：Ｓｏｌｉｄｓ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）と水理学的滞留時間（ＨＲＴ：Ｈｙｄｒａｕｌｉｃ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）とを１日に設定した。また、ＭＬＳＳが７，０００〜１０，０００ｍｇ／Ｌ程度となるように適宜調整した。溶存酸素（ＤＯ）をＤＯメーターＤＯ５５０９（株式会社ＦＵＳＯ製）、温度をサーモメーター（横河電機株式会社製）、ｐＨをｐＨメーターｐＨ２００Ｓ（横河電機株式会社製）により測定した。曝気槽における流入・流出水の全有機炭素（ＴＯＣ：Ｔｏｔａｌ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃａｒｂｏｎ）をＴＯＣ−４１１０（株式会社島津製作所製）により決定した。化学的酸素要求量（ＣＯＤ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｏｘｙｇｅｎ  ｄｅｍａｎｄ）−Ｃｒは、ＴＮＴ８２１キット（ハック社製）およびＣＯＤ分析装置（ＤＲＢ２００；ハック社製）により測定した。
【００７８】
曝気槽における流入・流出水の１，４−ジオキサン濃度は、図１の方法・条件により決定した。
【００７９】
化学分析の結果を図２に示す。
【００８０】
図２に示すように、年間を通して曝気槽における流入水の１，４−ジオキサン濃度は５〜７０ｍｇ／Ｌで変動した。測定の結果、試験開始から２０１５年７月１３日まで１，４−ジオキサン処理は良好であったが（除去率：約９７％）、その後、曝気槽内温度の上昇する期間（２０１５年７月２１日〜８月１０日）にＤＯの減少（＜１ｍｇ／Ｌ）および１，４−ジオキサン除去率の低下（＜６８％）が見られた。停止期間後のシステム再稼働時（２０１５年９月２４日〜１０月２６日）に１，４−ジオキサン処理の悪化が見られたものの（除去率：０％〜７４％）、その後回復し、２０１５年１１月２日から２０１６年３月２２日まで良好な１，４−ジオキサン処理が達成された（除去率：８７％〜９９％）。それ以降、１，４−ジオキサン処理性能の減少傾向が観察された（除去率：＜７２％）。また安定な１，４−ジオキサン処理性能が見られた期間は、その他の物理化学パラメータも大きく変化することなく推移した。
【００８１】
［微生物学解析］
活性汚泥システムより経時的に採取した４１時点の活性汚泥試料を用いて、微生物学解析を行った。
【００８２】
曝気槽の返送汚泥試料を遠心分離（２０，４００×ｇ、４℃、３〜５分）し、遠心沈殿物を得た。前記遠心沈殿物に対して、ジルコニアとシリカの混合ビーズ（Ｚｉｒｃｏｎｉａ／Ｓｉｌｉｃａ  Ｂｅａｄｓ；平均粒子径０．１ｍｍ）を加え、シェイクマスターオート（株式会社バイオメディカルサイエンス製）を用いて固相中の微生物細胞を破砕した後、フェノールとクロロホルムとを用いた精製ステップを経ることで共存するタンパク質を除去した。その後、Ｔｙｐｅ  ＩＩ−Ａ  ＲＮａｓｅ（シグマ−アルドリッチ社製）処理を行うことでＲＮＡを消化し、ＤＮＡを精製した。
【００８３】
精製ＤＮＡを鋳型に１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子Ｖ４領域（約３００塩基対）を標的として、Ｑ５  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）によるＤＮＡ増幅反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）を行った。
【００８４】
得られたＰＣＲ産物をＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  キット（ベックマン・コールター社製）およびＷｉｚａｒｄ（登録商標）  ＳＶ  ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（プロメガ社製）を用いて精製し、その濃度をＱｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  試薬・キット（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）と蛍光定量装置Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ３３００（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）とにより測定した。
【００８５】
最適量の精製産物をＭｉＳｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  キット３００サイクルと次世代シークエンサーＭｉＳｅｑ（イルミナ株式会社製）とを用いた大規模塩基配列解析に供した。各試料から遺伝子断片を数万リード解読し、ソフトウエアｍｏｔｈｕｒ（ｖｅｒ  １．３１．２）を用いて、非特異的配列を除去し、ソフトウエアＱＩＩＭＥ（ｖｅｒ  １．７．０）を用いて、微生物系統解析を行い、微生物種（ＯＴＵ）の同定と相対存在量（％）の解析とを行った。
【００８６】
次世代シークエンサーによる解析において、４１のライブラリを作成し、合計で約２８０００００の遺伝子配列を解析した（６８６１６配列／ライブラリ）。次世代シークエンスデータを高次の微生物分類レベル（門または綱）で系統解析した結果、汚泥微生物群集が年間を通して大きく変遷していることが分かる（図３）。
【００８７】
＜１，４−ジオキサン分解菌の同定＞
［１，４−ジオキサンによる汚泥微生物群集の培養］
株式会社日本触媒川崎製造所浮島工場にて２０１５年１２月１日午前に採取した活性汚泥試料を用いて、活性汚泥試料に含まれる微生物を培養した。活性汚泥試料の採取から培養開始までは、４時間以内であった。
【００８８】
具体的には、採取した活性汚泥試料２０ｍｌを、１００ｍｌ容ガラスバイアル瓶に収容した。気相部分は空気とした。活性汚泥試料に対して、13Ｃ標識１，４−ジオキサン溶液（シグマ−アルドリッチ社製）または非標識１，４−ジオキサン溶液（和光純薬工業株式会社製）を１，４−ジオキサンの終濃度２００ｍｇ／Ｌとなるように添加した。その後、２５℃、暗所にて、１５０ｒｐｍの振とう速度で８時間の培養を行った。さらに、オートクレーブ滅菌（１２１℃、１時間の処理３回）を行った後、非標識１，４−ジオキサン溶液を添加した試験区を用意した。以下、13Ｃ標識１，４−ジオキサン溶液を添加した試験区を「13Ｃ標識区」、非標識１，４−ジオキサン溶液を添加した試験区を「非標識区」、およびオートクレーブ滅菌を行った試験区を「オートクレーブ区」と、それぞれ称する。
【００８９】
［化学分析］
13Ｃ標識区および非標識区において、培養０、２、４、６、８時間目の気相と液相とを採取し、化学分析へと供した。気相のＣＯ2およびＯ2の全濃度は、ＳｈｉｎＣａｒｂｏｎ  ＳＴカラム（信和化工株式会社製）を装着したＧＣ−１４Ｂ（株式会社島津製作所製）により測定し、ＣＯ2の13Ｃ画分はＧＣ  ＩｓｏＬｉｎｋ、ＣｏｎＦｌｏ  ＩＶ、Ｄｅｌｔａ  ｖ  ｐｌｕｓ  ＩＲＭＳからなるＧＣ−Ｃ−ＩＲＭＳ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）により決定した。液相の１，４−ジオキサン濃度は、ＤＢ−１カラム（アジレント・テクノロジー株式会社製）を装着したＧＣ−２０１０ｐｌｕｓ（株式会社島津製作所製）により決定した。なお、オートクレーブ系では、培養８時間後のみ１，４−ジオキサン濃度を測定した。ＣＯＤ−Ｃｒは、ＴＮＴ８２１キット（ハック社製）およびＣＯＤ分析装置（ＤＲＢ２００；ハック社製）により決定した。
【００９０】
13Ｃ標識区および非標識区において、気相のＣＯ2全濃度は、試験開始から増加し、終了時には、ＣＯ2全濃度が約１．７ｍｍｏｌ／Ｌとなった（図４（Ａ））。また、13Ｃ標識区では、13ＣＯ2の濃度が培養８時間目までに約１５０μｍｏｌ／Ｌへと上昇した（図４（Ｂ））。
【００９１】
13Ｃ標識区および非標識区において、液相の１，４−ジオキサン濃度は約５０ｍｇ／Ｌの減少を示した（図４（Ｃ））。これに伴いＣＯＤの減少も観察された（図４（Ｄ））。
【００９２】
一方、汚泥微生物群集を滅菌処理したオートクレーブ系では、１，４−ジオキサン濃度の減少が見られなかった（データ非掲載）。
【００９３】
以上から、添加した１，４−ジオキサンがＣＯ2にまで微生物分解されたと考えられる。
【００９４】
［微生物学解析］
13Ｃ標識区および非標識区について、培養８時間目の汚泥試料を遠心分離（２０，４００×ｇ、４℃、３〜５分）し、遠心沈殿物を得た。前記遠心沈殿物に対して、ジルコニアとシリカとの混合ビーズ（Ｚｉｒｃｏｎｉａ／Ｓｉｌｉｃａ  Ｂｅａｄｓ；平均粒子径０．１ｍｍ）を加え、シェイクマスターオート（株式会社バイオメディカルサイエンス製）を用いて固相中の微生物細胞を破砕した後、フェノールとクロロホルムとを用いた精製ステップを経ることで共存するタンパク質を除去した。その後、ＲＱ１  ＤＮａｓｅ（プロメガ社製）の処理を行うことでＤＮＡを消化し、ＲＮＡを精製した。ＲＮＡの全濃度は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）  ＲＮＡ定量キット（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）とマイクロプレートリーダー（ＳＨ−９００Ｌａｂ、コロナ電気株式会社製）とにより決定した。
【００９５】
５００ｎｇのＲＮＡをセシウムトリフルオロ酢酸溶液（和光純薬工業株式会社製）、ホルムアミド（和光純薬工業株式会社製）、勾配バッファー（Ｔｒｉｓ０．１Ｍ；ＫＣｌ０．１Ｍ；およびＥＤＴＡ１ｍＭ）に溶解し、１２８，０００×ｇ、２０℃で６０時間の超遠心分離に供した。
【００９６】
その後、ＲＮＡ密度勾配をペリスタポンプにより分取し、各画分の浮遊密度を屈折計ＡＲ２００（ライカート社製）を用いて決定した。浮遊密度１．８０３〜１．８０８ｇ／ｍｌ、１．７９６〜１．８００ｇ／ｍｌ、１．７８８〜１．７９３ｇ／ｍｌ、および１．７６９〜１．７７１ｇ／ｍｌを示すＲＮＡ画分を、それぞれ１Ｈ、２Ｈ、３Ｈ、およびＬ画分と定義する。
【００９７】
これらの精製ＲＮＡを鋳型に用い、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子Ｖ４領域（約３００塩基対）を標的として、Ａｃｃｅｓｓ  Ｑｕｉｃｋ  １段階ＲＴ−ＰＣＲシステム（プロメガ社）による逆転写および遺伝子増幅反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。
【００９８】
得られたＲＴ−ＰＣＲ産物をＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  キット（ベックマン・コールター社製）およびＷｉｚａｒｄ（登録商標）  ＳＶ  ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（プロメガ社製）を用いて精製し、その濃度をＱｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  試薬・キット（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）と蛍光定量装置Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ３３００（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）とにより測定した。
【００９９】
最適量の精製産物をＭｉＳｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  キット３００サイクルと次世代シークエンサーＭｉＳｅｑ（イルミナ株式会社製）とを用いた大規模塩基配列解析に供した。各試料から遺伝子断片を数万リード解読し、ソフトウエアｍｏｔｈｕｒ（ｖｅｒ  １．３１．２）を用いて、非特異的配列を除去し、ソフトウエアＱＩＩＭＥ（ｖｅｒ  １．７．０）を用いて、微生物系統解析を行い、微生物種（ＯＴＵ）の同定と相対存在量（％）の解析を行った。
【０１００】
得られたＯＴＵのうち１Ｈ、２Ｈおよび３Ｈの少なくとも１画分において13Ｃ標識区で非標識区よりも有意に上昇しているものをＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（スチューデントのｔ検定）により特定した。ＯＴＵの近縁種と遺伝子配列相同性をＮＣＢＩ塩基配列データベースのＢＬＡＳＴプログラムにより決定した。
【０１０１】
ＲＮＡ密度画分（１Ｈ、２Ｈ、３ＨおよびＬ）から２１のライブラリを作成し、合計で約１３４００００の遺伝子配列を解析した（６３９９９配列／ライブラリ）。なお、非標識区の１Ｈ画分（浮遊密度１．８０６ｇ／ｍｌ）では、ＲＮＡ回収量が低く、ＲＴ−ＰＣＲ増幅は観察されなかった（図５（Ａ））。次世代シークエンスデータを高次の微生物分類レベル（門または綱）で系統解析した結果、13Ｃ標識区では、非標識区に比べ密度増加に伴った微生物群集構造変化が顕著であった。
【０１０２】
次に、微生物種（ＯＴＵ）レベルで解析したところ、13Ｃ標識区の高密度画分（１Ｈ２Ｈ、および３Ｈ）で非標識区の同等密度画分（２Ｈ）と比べ有意に相対存在量が上昇する１０種の微生物を同定することができた（図５（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ））。
【０１０３】
ＯＴＵ２１９７（１，４−ジオキサン分解菌Ｆに属する）とＯＴＵ１３８５６（１，４−ジオキサン分解菌Ｅに属する）とは、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門に属する既知の１，４−ジオキサン分解菌であるシュードノカルディア・ジオキサノヴォランス（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｄｉｏｘａｎｉｖｏｒａｎｓ；ＮＲ０７４４６５）と系統学的に同一または近縁であった（それぞれ１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列相同性１００％と９６．９％とを示した）。
【０１０４】
ＯＴＵ１２２６６（１，４−ジオキサン分解菌Ｃに属する）は、ベンゼンやトルエン等の芳香族化合物の分解菌として知られるニトロソモナス・ウレアエ（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｕｒｅａｅ；ＡＦ２７２４１４）に近縁であった（遺伝子配列相同性：９７．６％）。
【０１０５】
ＯＴＵ５１０４（１，４−ジオキサン分解菌Ｄに属する）とＯＴＵ６８２５（１，４−ジオキサン分解菌Ｇに属する）とは、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル分解菌であるメチロベルサチリス・ユニヴァサリス（Ｍｅｔｈｌｏｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌｉｓ；ＫＣ５７７６０７）とマイクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ；ＬＮ９９８０８１）とのそれぞれに対して遺伝子配列相同性９４．９％と１００％とを有していた。
【０１０６】
ＯＴＵ８４７４（１，４−ジオキサン分解菌Ｂに属する）は、芳香族化合物分解菌が多く分類されるバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）科に属し、キチニモナス・コリエンシス（Ｃｈｉｔｉｎｉｍｏｎａｓ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ；ＡＢ６８２４３７）に最近縁であった（配列相同性：９４．１％）。
【０１０７】
ＯＴＵ２２３０（１，４−ジオキサン分解菌Ａに属する）は、データベース上で最も近縁な微生物種アシディスリクス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｒｉｘ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ；ＫＣ２０８４９７）に対して、極めて低い配列相同性（８８．６％）を示し、これまで報告されているいずれの微生物とも系統学的に異なる新規な微生物であることが示唆された。
【０１０８】
ＯＴＵ１００（１，４−ジオキサン分解菌Ｈに属する）は、安息香酸分解能を有する微生物種ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ；ＫＴ１８０１９４）と系統学的に同一であった（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列相同性：１００％）。
【０１０９】
ＯＴＵ８３８５（１，４−ジオキサン分解菌Ｉに属する）は、１，４−ジオキサンの存在下でも増殖可能なブラストクロリス・ビリディス（Ｂｌａｓｔｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｖｉｒｉｄｉｓ）に最近縁であった（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列相同性：９５．７％）。
【０１１０】
ＯＴＵ８５３２（１，４−ジオキサン分解菌Ｊに属する）は、安息香酸の分解潜在性を示す微生物種バンピロビブリオ・クロレラボラス（Ｖａｍｐｉｒｏｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｌｏｒｅｌｌａｖｏｒｕｓ）に対して、極めて低い配列相同性（８８．９％）を示し、系統的に極めて新規な微生物であることが示唆された。
【０１１１】
以上から、活性汚泥システム中に存在する数万種の微生物のうち１０種の１，４−ジオキサン分解菌（７種のジオキサン資化菌および３種のジオキサン同化菌）を同定し、既知の１，４−ジオキサン分解菌であるシュードノカルディア・ジオキサノヴォランス（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｄｉｏｘａｎｉｖｏｒａｎｓ）だけではなく、系統学的に新規な微生物が活性汚泥に含まれることが分かる。
【０１１２】
さらに、汚泥微生物群集から１０種の１，４−ジオキサン分解菌について、それらの相対存在量を抽出した。曝気槽および返送ラインにおける相対存在量の年間変動を図６−１および図６−２に示す。ＯＴＵ６８２５の相対存在量（％）は、極めて低く検出限界未満であった。検出限界とは、次世代シークエンサーによる解析において、相対存在量が少なくとも０．００３％未満であることを意味する。
【０１１３】
前記相対存在量は、１つの試料（ライブラリ）を対象としたとき、ある１種の微生物種（１つのＯＴＵ）のシークエンス数をそのライブラリで得られた全シークエンス数（汚泥微生物群集全体）で割った数に１００をかけた値である。検出限界の０．００３％未満とは、実施例において最も少ない全シークエンス数（３３，４３６）を有する１つの試料（ライブラリ）を対象とした場合、そのシークエンス数が１個検出される微生物種の相対存在量、すなわち（１／３３４９６）×１００≒０．００３％よりも少ない数（０．００３％未満）から決定した。全シークエンス数は、ライブラリごとに異なり、次世代シークエンサーに供給される試料の調整上、シークエンス解析数（約３０，０００〜約１１０，０００）によって、検出限界には振れ幅があるためである。つまり、微生物種の相対存在量としては、０．００１％まで検出が可能な場合もあるが、本実施例では、０．００３％を閾値とし、０．００３％未満を検出限界とした。
【０１１４】
図６−１に示すように、汚泥微生物群集において、１，４−ジオキサン分解菌（ジオキサン資化菌）は、いずれも年間を通して相対存在量が１．５％以下の稀少微生物種であることが明らかになった。
【０１１５】
ＯＴＵ２２３０（図６−１（Ａ））は最も主要な１，４−ジオキサン分解菌として活性汚泥システム内に存在し、特に活性汚泥システム再稼働で１，４−ジオキサン濃度が上昇する期間にその相対存在量が著しく増加していた。このことから当該分解菌は蓄積された高濃度１，４−ジオキサンの分解に関与することが強く示唆された。
【０１１６】
また１，４−ジオキサン処理性能の悪化傾向が観察された試験終了時には、ＯＴＵ２２３０に加えて、ＯＴＵ１２２６６（図６−１（Ｃ））および８４７４（図６−１（Ｂ））の相対存在量が増加しており、１，４−ジオキサン分解菌Ｃおよび１，４−ジオキサン分解菌Ｂの活性化が活性汚泥システムの安定性に寄与している可能性が高いと考えられる。
【０１１７】
さらに、ＯＴＵ２１９７（図６−１（Ｆ））、ＯＴＵ５１０４（図６−１（Ｄ））およびＯＴＵ１３８５６（図６−１（Ｅ））は、相対存在量０．０５％以下で推移する極めて稀少な微生物種であったが、それぞれ異なる変遷パターンを示した。
【０１１８】
図６−２に示すように、汚泥微生物群集において、１，４−ジオキサン分解菌（ジオキサン同化菌）の相対存在量は、ジオキサン資化菌よりは多いものの、いずれも年間を通して相対存在量が５．７％以下であることが明らかになった。
【０１１９】
ジオキサン同化菌であるＯＴＵ１００（図６−２（Ｈ））、ＯＴＵ８３８５（（図６−２（Ｉ））およびＯＴＵ８５３２（図６−２（Ｊ））は、ジオキサン資化菌に比べ、13Ｃ集積度が小さいと考えられる。その理由として、これらのジオキサン同化菌は、実際の活性汚泥システムにおいて、１，４−ジオキサンだけを分解するのではなく、システム内に共存するモノエチレングリコール（ＭＥＧ）などの化合物も一緒に分解していることが考えられる。また、これらのジオキサン同化菌は、１，４−ジオキサンの分解中間物を分解しているとも考えられる。特に、ＯＴＵ１００およびＯＴＵ８３８５は、ジオキサン資化菌に比べて相対存在量が多かった。つまり、ＯＴＵ１００およびＯＴＵ８３８５は、１，４−ジオキサンだけではなく、１，４−ジオキサンよりもエネルギーリッチな他の有機物を分解することで、活性汚泥システム内での優位性を確保していると推察できる。
【０１２０】
以上から、活性汚泥中の１，４−ジオキサン分解菌は、活性汚泥システムの物理化学パラメータの変化と連動して劇的に変遷し、１，４−ジオキサン処理性能の維持に相補的に関与していることが強く示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【配列表】
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