(57)【要約】【課題】汚染土壌に含まれる油分の分解を促進することが可能な汚染土壌の浄化方法を提供する。【解決手段】油分で汚染された汚染土壌を油分解細菌により浄化する方法であって、汚染土壌に対してジオレイン酸ポリエチレングリコールを添加する汚染土壌の浄化方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
油分で汚染された汚染土壌を油分解細菌により浄化する汚染土壌の浄化方法であって、
前記汚染土壌に対してジオレイン酸ポリエチレングリコールを添加する汚染土壌の浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、油分で汚染された土壌の浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
油分で汚染された土壌を浄化する方法として、土壌中に存在する微生物の油分解性能を利用したバイオレメディエーションが知られている。
【０００３】
バイオレメディエーションを行う際には、微生物自体を活性化させるために、土壌に窒素やリン酸のような栄養塩を添加することが一般的である。
【０００４】
また、バイオレメディエーションには、有機汚染物質の分解性能を備えた好気性微生物を活性化させて有機汚染物質を発酵分解させる、通気型の工法もある（特許文献１参照）。
【０００５】
このような通気型のバイオレメディエーションにおいて微生物自体を活性化させるための方法として、特許文献２には人工腐植土と糖類を利用する方法が開示されており、特許文献３には糟糠類を利用する方法が開示されている。また、特許文献４には、糟糠類を含有する発酵助材を添加した汚染土壌の温度を維持するために通気量を制御する方法も開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−１００４５９号公報
【特許文献２】特開２００２−１３０３号公報
【特許文献３】特開２００４−２５４５０８号公報
【特許文献４】特許第５１４５０３４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らの研究により、汚染土壌に特定の物質を添加することにより、油分の分解に寄与する細菌を増殖させ、油分の分解を促進できることが明らかとなった。
【０００８】
本発明は、汚染土壌に含まれる油分の分解を促進することが可能な汚染土壌の浄化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明の汚染土壌の浄化方法は、油分で汚染された汚染土壌を油分解細菌により浄化する方法であって、前記汚染土壌に対してジオレイン酸ポリエチレングリコールを添加する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、汚染土壌に含まれる油分の分解を促進できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１、比較例１及び比較例２における汚染土中の一般細菌数を示すグラフである。
【図２】実施例２、及び比較例３〜比較例５における汚染土中の一般細菌の遺伝子数を示すグラフである。
【図３】実施例２、及び比較例３〜比較例５における汚染土中の油分解細菌の遺伝子数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＝＝実施形態＝＝
本実施形態は、油分で汚染された汚染土壌を油分解細菌により浄化する汚染土壌の浄化方法に関する。本実施形態に係る浄化方法においては、汚染土壌に対して脂肪酸エステル系の薬剤を添加する。
【００１３】
［油分］
本実施形態に係る浄化方法が対象とする油分は、たとえば、ガソリン、灯油、軽油、重油、機械油、潤滑油、原油等の石油由来の油分や、タールやベンゼン等の石炭由来の油分、石油化学製品由来の油分である。
【００１４】
［油分解細菌］
油分解細菌は、土壌中に存在する一般的な細菌（一般細菌）のうち、上記の油分を分解することができる細菌である。具体的には、油分解細菌は、油分に含まれるアルカンを分解する酵素を有する細菌である。本実施形態に係る浄化方法では、土壌中に元々存在する油分解細菌を利用してもよいし、浄化方法を実施する際に新たな油分解細菌を土壌に添加することでもよい。
【００１５】
［脂肪酸エステル系の薬剤］
脂肪酸エステル型の薬剤は、オレイン酸系のポリエチレングリコールを用いることができる。本実施形態では、ジオレイン酸ポリエチレングリコールを用いる。ジオレイン酸ポリエチレングリコールは、油分に含まれるアルカンよりも土壌中における分解速度が速い。油分解細菌は、土壌中で分解したジオレイン酸ポリエチレングリコールを栄養源として増殖する。油分解細菌が増殖することにより、土壌中の油分の分解が促進される。
【００１６】
［浄化方法］
本実施形態に係る浄化方法は、油分で汚染された汚染土壌に対してジオレイン酸ポリエチレングリコールを添加することができれば特に限定されない。ジオレイン酸ポリエチレングリコールは、油分量よりも低い濃度となることが好ましく、土壌に対して重量比で０．０１〜１．０％添加することが好ましい。
【００１７】
＝＝実施例＝＝
［油分の分解試験］
土壌に含まれる油分の分解について、以下の試験（実施例１、比較例１、及び比較例２）により検証した。
【００１８】
試験用の汚染土として、軽油汚染土を使用した。軽油汚染土は、油分濃度が約２４５０ｍｇ／ｋｇのものを使用した。油分濃度は、ＴＰＨ試験法（油汚染対策ガイドライン（平成１８年３月）資料３  ＧＣ−ＦＩＤ法によるＴＰＨ試験方法参照）により求めた。
【００１９】
試験方法は、以下の通りである。
【００２０】
（実施例１：ジオレイン酸ポリエチレングリコール＋尿素＋過リン酸石灰）
軽油汚染土６ｋｇを容器に分取し、軽油汚染土に対して重量比で尿素肥料を０．１％、過リン酸石灰を０．９％、ジオレイン酸ポリエチレングリコール（原液）を０．９％添加し、撹拌・混合した。その後、軽油汚染土をワグネルポット（硬質樹脂製。容量１７Ｌ）に入れ、２０℃の温度下で保管し、１週間毎に撹拌をおこなった。
【００２１】
（比較例１：対象区）
軽油汚染土６ｋｇをワグネルポット（硬質樹脂製。容量１７Ｌ）に入れ、２０℃の温度下で保管し、１週間毎に撹拌をおこなった。
【００２２】
（比較例２：尿素＋過リン酸石灰）
軽油汚染土６ｋｇを容器に分取し、軽油汚染土に対して重量比で尿素肥料を０．１％、過リン酸石灰を０．９％添加し、撹拌・混合した。その後、軽油汚染土をワグネルポット（硬質樹脂製。容量１７Ｌ）に入れ、２０℃の温度下で保管し、１週間毎に撹拌をおこなった。
【００２３】
＜油分濃度の測定＞
実施例１、比較例１及び比較例２それぞれの汚染土について、７日後、５０日後の油分濃度を上記ＴＰＨ試験法により測定した。表１は、油分濃度の変化、及び５０日後の油分の残存率（５０日後の油分濃度／初期の油分濃度）を示したものである。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
＜一般細菌数の測定＞
また、実施例１、比較例１及び比較例２それぞれの汚染土における一般細菌数の変化を希釈平板法（日本土壌肥料学会監修、土壌環境分析法編集委員会編、「土壌環境分析法」、株式会社博友社、ｐ１３８−１４１。培地：アルブミン培地、温度：２８℃）により測定した。図１は、軽油汚染土中の一般細菌数を示すグラフである。縦軸は一般細菌数（個／ｇ・湿土）であり、横軸は試験開始からの経過日数である。
【００２６】
表１から明らかなように、実施例１においては７日経過時点で油分濃度が大きく低下し、５０日後には油分の残存率が０．３０まで減少した。
【００２７】
一方、比較例２においては、油分濃度の低下は見られたがその割合は小さく、実施例１のように、油分濃度が大きく減少することは無かった。
【００２８】
また、図１から明らかなように、実施例１においては、比較例１及び比較例２に比べて土中の一般細菌が大きく増殖した。また、増殖した一般細菌の数は、５０日経過後でもほとんど変わらないことが明らかとなった。
【００２９】
以上の結果から明らかなように、油で汚染された汚染土壌中にジオレイン酸ポリエチレングリコールを添加することにより一般細菌を増殖させることができ、その結果、油分の分解が促進することが明らかとなった。
【００３０】
［油分解細菌の増殖試験］
上述の通り、油分の分解試験の結果によりジオレイン酸ポリエチレングリコールを添加することで一般細菌が増殖することが明らかとなった。一方、油分の分解には一般細菌に含まれる油分解細菌が寄与していると考えられる。そこで、一般細菌の増殖及び油分解細菌の増殖に関して、以下の試験（実施例２、比較例３〜比較例５）により検証した。
【００３１】
試験用の汚染土として、実施例１等と同様の軽油汚染土を用いた。
【００３２】
また、ＮＨ４ＮＯ３：５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４：２．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：１．０ｇ、滅菌水１Ｌを混合・撹拌した後、オートクレーブ滅菌（１２１℃、１５分）を行うことにより作成した無機培地を用いた。
【００３３】
試験方法は、以下の通りである。
【００３４】
（実施例２：ジオレイン酸ポリエチレングリコール）
汚染土１ｇを滅菌した２００ｍＬ三角フラスコに分取し、無機培地１００ｍＬを添加した。その後、滅菌水で５％に希釈したジオレイン酸ポリエチレングリコール１０ｍＬを添加し、シリコ栓をした後、２５℃で３日間、振とう培養した（回転数：１２１ｒｐｍ）。
【００３５】
（比較例３：対象区）
汚染土１ｇを滅菌した２００ｍＬ三角フラスコに分取し、無機培地１００ｍＬを添加した。シリコ栓をした後、２５℃で３日間、振とう培養した（回転数：１２１ｒｐｍ）。
【００３６】
（比較例４：グルコース）
汚染土１ｇを滅菌した２００ｍＬ三角フラスコに分取し、無機培地１００ｍＬを添加した。その後、グルコース０．５ｇを添加し、シリコ栓をした後、２５℃で３日間、振とう培養した（回転数：１２１ｒｐｍ）。
【００３７】
（比較例５：軽油）
汚染土１ｇを滅菌した２００ｍＬ三角フラスコに分取し、無機培地１００ｍＬを添加した。その後、軽油０．５ｍＬを添加し、シリコ栓をした後、２５℃で３日間、振とう培養した（回転数：１２１ｒｐｍ）。
【００３８】
＜遺伝子数の測定＞
振とう培養後の懸濁液をスターラーで撹拌しながら、懸濁液の上澄みを土粒子ごと３００μＬ分取した。市販の抽出キッド（ＩＳＯＩＬ  ｆｏｒ  Ｂｅａｄｓ  Ｂｅａｔｉｎｇ、株式会社ニッポンジーン製）を用い、分取した懸濁液に含まれている細菌のＤＮＡを抽出した。
【００３９】
そして、抽出したＤＮＡを適切な濃度に希釈し、表２に示す反応条件により、リアルタイムＰＣＲ装置（Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑ、ＱＩＡＧＥＮ製）で細菌の遺伝子数を測定した。油分解細菌用としては、アルカンの分解酵素を特異的に判別するａｌｋＢ検出用プライマー（表３参照。出典：ＤｉｏＧＯ  Ｊｕｒｅｌｅｖｉｃｉｕｓ  ｅｔ．ａｌ．“Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｋＢ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  ｔｏ  Ｂｅｔｔｅｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  ｔｈｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｋａｎｅ−Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａ”  ＰＬＯＳ  ＯＮＥ，Ｖｏｌ．８（６）ｅ６６５６５（２０１３））を用いた。一般細菌用としては、１６ＳｒＤＮＡを用いた。増幅酵素は、ＴＩＴＡＮＩＵＭ（登録商標）  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）を用いた。蛍光酵素は、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（タカラバイオ株式会社製）を用いた。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
【表３】
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【００４２】
図２は、一般細菌の遺伝子数（１６Ｓリボゾームの遺伝子数）を示すグラフである。図３は、油分解細菌の遺伝子数（ａｌｋＢの遺伝子数）を示すグラフである。いずれのグラフも縦軸は遺伝子数（個／ｇ−ｗｅｔ）である。
【００４３】
図２及び図３から明らかなように、実施例２では、一般細菌が増殖すると共に、油分解細菌も増殖した。
【００４４】
一方、一般的に細菌の栄養源として広く知られているグルコースを添加した場合（比較例４）、一般細菌は実施例１の場合と同程度増殖しているが、油分解細菌はほとんど増殖しなかった。
【００４５】
また、油分解細菌の栄養源となりうる軽油を添加した場合（比較例５）、一般細菌数及び油分解細菌のいずれも対象区（比較例３）と同程度しか増殖しなかった。
【００４６】
以上の結果から、土壌にジオレイン酸ポリエチレングリコールを添加することにより、一般細菌に含まれる油分解細菌を特に増殖できることが明らかとなった。
【００４７】
上記実施例１〜２及び比較例１〜５の結果を総合すると、ジオレイン酸ポリエチレングリコールを油分で汚染された汚染土壌に添加することにより、油分解細菌の増殖を促し、その結果、土壌中の油分を効率よく分解できることが明らかとなった。
【００４８】
上記実施形態等は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定するものではない。上記の構成は、適宜組み合わせて実施することが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。上記実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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