(57)【要約】      （修正有）【課題】蛋白質糖化反応による最終生成物（ＡＧＥｓ）、特に蛍光性ＡＧＥｓ及びペントシジンの生成を効率的に抑制する蛋白質糖化反応阻害剤の提供。【解決手段】マメ科植物である密花豆（ミツカトウ）の抽出物を有効成分とする蛋白質糖化反応阻害剤。密花豆のエタノール水溶液抽出物の合成吸着剤吸着物の１０〜５０％エタノール水溶液溶出物である蛋白質糖化反応阻害剤。密花豆抽出物を合成吸着剤で処理することにより、不快な臭いが弱く水への溶解性も改善された、密花豆の抽出物を有効成分とする蛋白質糖化反応阻害剤の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
密花豆（ミツカトウ）の溶媒抽出物を有効成分とする蛋白質糖化反応阻害剤。
【請求項２】
溶媒が、水又はアルコール類又はそれらの混合液であることを特徴とする、請求項１に記載の蛋白質糖化反応阻害剤。
【請求項３】
有効成分が、密花豆（ミツカトウ）のエタノール水溶液抽出物の合成吸着剤吸着物の１０〜５０％エタノール水溶液溶出物であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の蛋白質糖化反応阻害剤。
【請求項４】
合成吸着剤が、疎水性を示す芳香族系の合成吸着剤である請求項３に記載の蛋白質糖化反応阻害剤。
【請求項５】
合成吸着剤が、スチレン・ジビニルベンゼン共重合体であり細孔径の半径が２５〜１５０Åである請求項４に記載の蛋白質糖化反応阻害剤。
【請求項６】
前記密花豆（ミツカトウ）の溶媒抽出物の合成吸着剤処理物が、（Ｅ）−  シンナムアルデヒド、オイゲノール、（Ｅ）−  アネトール、３，５−ジメトキシトルエン、ヘキサン酸、オクタン酸及びノナン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種を含有しないことを特徴とする、請求項３〜５のいずれか１項に記載の蛋白質糖化反応阻害剤。
【請求項７】
前記密花豆（ミツカトウ）の溶媒抽出物の合成吸着剤処理物が、０．０１（ｗ／ｖ）％水溶液での波長６６０ｎｍ（１０ｍｍ石英セル）における吸光度が０．１０以下であることを特徴とする、請求項３〜６のいずれか１項に記載の蛋白質糖化反応阻害剤。
【請求項８】
密花豆（ミツカトウ）の抽出物を有効成分とする蛋白質糖化反応阻害剤の製造方法であって、
工程（ａ）：密花豆を、溶媒としての水又はアルコール類又はそれらの混合液で抽出する工程、
工程（ｂ）：工程（ａ）で得られた抽出液を合成吸着剤に通液して接触させる工程、
工程（ｃ）：合成吸着剤に水を通液して水溶出部を除去する工程、次いで、
工程（ｄ）：合成吸着剤に含水アルコール溶媒を通液して、合成吸着剤から有効成分を溶出させる工程、
を含むことを特徴とする上記の製造方法。
【請求項９】
工程（ｄ）の含水アルコール溶媒が、１０〜５０質量％のエタノール水溶液であることを特徴とする、請求項８に記載の蛋白質糖化反応阻害剤の製造方法。
【請求項１０】
合成吸着剤が、スチレン・ジビニルベンゼン共重合体であり細孔径の半径が２５〜１５０Åである請求項８又は９に記載の蛋白質糖化反応阻害剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質糖化反応による最終生成物（Advanced Glycation End Products：「AGEs」と略称され、「終末糖化産物」とも呼ばれる）の生成を阻害する、蛋白質糖化反応阻害剤、並びにその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化反応（Glycation）とは、グルコース等の還元糖とアミノ酸や蛋白質とのアミノ・カルボニル反応のことを指し、1912年にL.C.Maillardが発見したことから、メイラード反応とも呼ばれる。
この糖化反応は、かつては生体外、すなわち食品での研究が主に進められてきたが、1960年代頃から生体内でも同様の反応が起こることが明らかとなった。
さらに、生体内で糖化反応によって生成される糖化蛋白は、老化現象や糖尿病合併症、アルツハイマーなどに関係することが近年明らかとなっていることから、この糖化反応を阻害する研究が盛んに行われている。
【０００３】
糖化反応は大別すると、前期糖化反応と後期糖化反応がある。
前期糖化反応では、還元糖とアミノ酸や蛋白質のアミノ基との反応からシッフ塩基が生成後、エナミノールを経て、アマドリ転位によって安定なアマドリ化合物が生成する。
後期糖化反応においては、前期糖化反応により生成したアマドリ化合物が脱水、酸化、縮合、環状化などを経て、糖化反応最終生成物であるＡＧＥｓ（Advanced Glycation End
Products）が生成する。ＡＧＥｓとは、あくまでも糖化反応最終生成物の総称であり、一定の構造を示すものではない。これまでにＡＧＥｓとして、ペントシジン、ピロピリジン、クロスリン、カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）などが同定されている。
【０００４】
皮膚や骨に存在するＡＧＥｓの１種にペントシジン（Pentosidine）が報告されている。ペントシジンは糖尿病患者の皮膚中のコラーゲン、糸球体基底膜、血漿タンパク質に存在が確認されており、ペントシジンの生成を抑制することは皮膚の老化を予防する点において有効であると考えられる。
またペントシジンは、骨の脆弱化因子としても知られており、ペントシジンの生成を抑制することは骨の脆弱化・骨粗鬆症を予防する点においても有効であると考えられる。
ペントシジンは、ペントースとアミノ酸のリジン、アルギニンから脱水、酸化反応等を経て生成するとされている。
【０００５】
ＡＧＥｓには物理化学的な特徴として蛍光性を示すものが複数あり、例えばピロピリジン（Pyrropyridine）、クロスリン（Crossline）などが挙げられる。
そのうち、ピロピリジンとクロスリンは、励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍの蛍光を示すことが知られている（以下この波長の蛍光を持つＡＧＥｓを「蛍光性ＡＧＥｓ」と記載することとする）。
従来のＡＧＥｓ産生阻害剤の評価方法はこの蛍光性ＡＧＥｓの蛍光強度を測定したものが一般的であった。
ただし、この手法は励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍに蛍光を持つ複数のＡＧＥの総蛍光量を検出しており、特定の化合物の生成を測定したものではない。
また、ペントシジンは上記の波長とは異なる蛍光を有し、励起波長約３３５ｎｍ、蛍光波長約３８５ｎｍの蛍光を示すことが知られている。
【０００６】
ＡＧＥｓ産生阻害剤としてアミノグアニジン（Aminoguanidine）が知られている。この化合物は、もともと糖尿病合併症の治療薬として開発が進められ、糖尿病合併症である網
膜症、腎障害、神経障害に有効であることがモデル動物で確認されている。しかし、アミノグアニジンの服用により種々の副作用が報告されている。
従って、重篤な副作用をもたらさない安全で効果の高いＡＧＥｓの産生を抑制する物質の研究が重要となっている。より高い安全性を図るためには、化学合成物よりも天然物、特に植物由来の成分である方が有利である。
【０００７】
そこで、植物に由来するＡＧＥｓ産生阻害剤の検討が従来からなされている。
例えば、特許文献１において、ボタン属植物抽出物、タツナミソウ属植物抽出物、セイヨウヤマハッカ属植物抽出物、ヒマワリ属植物抽出物、アロエ属植物抽出物、アマドコロ属植物抽出物、アマ属植物抽出物、バラ属植物抽出物、シナノキ属植物抽出物、カンアオイ属植物抽出物、ドクダミ属植物抽出物、カントウ属植物抽出物、ワレモコウ属植物抽出物、ハッカ属植物抽出物、ニワトコ属植物抽出物から選ばれるＡＧＥｓ生成抑制剤が提案されている。
【０００８】
また、特許文献２において、西洋バラ、ハイブリッドローズ、エイジツ、ブドウ葉、カキ葉、リンゴ葉、マリーゴールド花、モクレン葉の抽出物の抽出物を有効成分とするメイラード反応阻害剤が提案されている。
【０００９】
また、特許文献３において、アグリモニー、アシュワガンダ、アニス、アマチャヅル、甘葉懸鈎子、銀杏、ウイキョウ、ウイッチヘーゼル、ウコン、エキナセア、エゾウコギ、エルダー、エルバ・マテ、オリーブ、オレガノ、オレンジ、柿、カキドオシ、カミツレ、ガラナ、含羞草、菊、ギムネマ、キャッツクロー、キャットニップ、キラウェイ、キンギンカ、グァバ、クコヨウ、くまざさ、クミクスチン、黒大豆、くわ、シナモン、ケツメイシ、ゴーヤ、コーラナッツ、ゴカヒ、ゴツコラ、コリアンダー、コンフリー、サキシマスオウ、サフラワー、サラシア・オブロンガ、サンザシ、サンシチニンジン、しそ、ジュウヤク、ジュニパーベリー、ジンジャー、杉、スギナ、ステビア、スペアミント、セイジ、セイボリー、セイヨウサンザシ、仙査、タイム、タヒボ、ダンデライオン、チャービル、チャノキ、チャボトケイソウ、チョウジ、デイジー、ディル、トチュウ、ニクズク、南姜、ネトル、白猪母邱、白花蛇舌草、ハゴロモソウ、バジル、ハス、半枝連、ヒース、ピーチ、ヒソップ、びわ、フィーバーフュー、フクギ、藤、プランタゴ・サイリュウム、ブルーベリー、ブルーマロウ、ペニーロイヤル、ベニバナ、ペパーミント、ホップ、ポリジ、ポンドアップル、マシュマロー、マジョラム、マリーゴールド、マレイン、マロウスモール、マロウブルー、ミフクラギ、ミルクシスル、メデゥスイート、モッカ、ヤエヤマ  アオキ、ヤクルマギク、ヤローフラワー、ユーカリ、ヨクイニン、ヨモギ、ラズベリー、ラベンダー、リンデン、ルイボス、レモングラス、レモンタイム、レモンバーベナ、レモンバーム、ローズヒップ、ローズピンクバッツ、ローズマリー、ローズレッド、ローレル、羅布麻、ワイルドストロベリーより選ばれる植物抽出物を含有するグリケーション阻害剤が提案されている。
しかし、上記の抑制剤や阻害剤はいずれも、効果が十分ではない、植物由来の異臭が強い、水への溶解性が悪く食品や化粧品への使用が制限される、などといった課題を残していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００３−２１２７４９号公報
【特許文献２】特開２００６−２７３８１１号公報
【特許文献３】特開２０１０−２４８２１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＡＧＥｓ、特に蛍光性ＡＧＥｓおよびペントシジンの生成を効果的に抑制しうる有効成分を含む蛋白質糖化反応阻害剤であって、蛋白質糖化反応阻害剤自体の異臭が少なく、水への溶解性が高い蛋白質糖化反応阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために、本発明者らは、種々の植物の蛋白質糖化反応阻害作用の有無、またその程度について鋭意検討した。その結果、マメ科植物の密花豆（ミツカトウ）の抽出物が蛋白質糖化反応に対する優れた阻害作用を示すことを見出した。
しかし、密花豆抽出物は密花豆に含まれる特有の不快な臭みと水に対する溶解性が悪いという問題点があり、食品や化粧品への使用が制限されることも見出した。
【００１３】
そこで、本発明者は、優れた蛋白質糖化反応阻害作用を有したまま、特有の臭みを低減でき、水溶性の向上を図ることが可能な密花豆抽出物の新たな製造方法の開発を鋭意検討した。
その結果、密花豆抽出物を合成吸着剤で処理することで蛋白質糖化反応阻害作用に優れ、さらに、不快な臭いが弱く、水への溶解性も改善された密花豆抽出物を得ることができることを見出した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕密花豆（ミツカトウ）の溶媒抽出物を有効成分とする蛋白質糖化反応阻害剤。
〔２〕溶媒が、水又はアルコール類又はそれらの混合液であることを特徴とする、上記の蛋白質糖化反応阻害剤。
〔３〕有効成分が、密花豆（ミツカトウ）のエタノール水溶液抽出物の合成吸着剤吸着物の１０〜５０％エタノール水溶液溶出物であることを特徴とする、上記の蛋白質糖化反応阻害剤。
〔４〕合成吸着剤が、疎水性を示す芳香族系の合成吸着剤である上記の蛋白質糖化反応阻害剤。
〔５〕合成吸着剤が、スチレン・ジビニルベンゼン共重合体であり細孔径の半径が２５〜１５０Åである上記の蛋白質糖化反応阻害剤。
〔６〕前記密花豆（ミツカトウ）の溶媒抽出物の合成吸着剤処理物が、(E)- シンナムアルデヒド、オイゲノール、(E)- アネトール、3,5-ジメトキシトルエン、ヘキサン酸、オクタン酸及びノナン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種を含有しないことを特徴とする、上記の蛋白質糖化反応阻害剤。
【００１５】
〔７〕前記密花豆（ミツカトウ）の溶媒抽出物の合成吸着剤処理物が、０．０１（ｗ／ｖ）％水溶液での波長６６０ｎｍ（１０ｍｍ石英セル）における吸光度が０．１０以下であることを特徴とする、上記の蛋白質糖化反応阻害剤。
〔８〕密花豆（ミツカトウ）の抽出物を有効成分とする蛋白質糖化反応阻害剤の製造方法であって、
工程（ａ）：密花豆を、溶媒としての水又はアルコール類又はそれらの混合液で抽出する工程、
工程（ｂ）：工程（ａ）で得られた抽出液を合成吸着剤に通液して接触させる工程、
工程（ｃ）：合成吸着剤に水を通液して水溶出部を除去する工程、次いで、
工程（ｄ）：合成吸着剤に含水アルコール溶媒を通液して、合成吸着剤から有効成分を溶出させる工程、
を含むことを特徴とする上記の製造方法。
〔９〕工程（ｄ）の含水アルコール溶媒が、１０〜５０質量％のエタノール水溶液であることを特徴とする、上記の蛋白質糖化反応阻害剤の製造方法。
〔１０〕合成吸着剤が、スチレン・ジビニルベンゼン共重合体であり細孔径の半径が２５〜１５０Åである上記の蛋白質糖化反応阻害剤の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、生体内で生成する糖化反応最終生成物である蛍光性ＡＧＥｓおよびペントシジンの生成を効果的に抑制する蛋白質糖化反応阻害剤を提供することが可能となる。
さらに原材料の密花豆に由来する特有の不快臭を低減した蛋白質糖化反応阻害剤を提供することができ、製剤化が容易で種々の形態の製剤に適用でき、医薬品、医薬部外品、食品や化粧品などへの応用範囲が広い。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１（コントロール）と３のサンプルの臭い強度を表したグラフである。
【図２】実施例１をコントロールとして。実施例２と４のサンプルの臭い強度を表したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（１）原材料
本発明で使用する密花豆（ミツカトウ）は、マメ科植物Spatholobus suberectus Dunn.である。その乾燥した茎は、生薬として血液循環の改善や鎮痛に用いられている。
本発明においては、使用する部位は茎に限定されず、葉、茎、根、花、種子あるいは全草を抽出対象として使用することができる。
また、密花豆の種類に関しては、Spatholobus suberectus Dunn.に限定されることなく、その変種、同属種も使用できる。
しかし、ＡＧＥｓに対する阻害活性、臭みの低減や水溶性の向上を総合的に考慮すると、Spatholobus suberectus Dunn.の乾燥した茎を抽出処理の対象とすることが最も好ましい。
【００１９】
（２）溶媒抽出
密花豆の抽出処理に使用する抽出溶媒は、水、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールなどの炭素数１〜３の低級アルコール、あるいは１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、１，２−ペンタンジオール、１，３−プロパンジオールなどの多価アルコール）などを、単独或いは２種類以上の任意の混液として使用することができる。
【００２０】
抽出溶媒の中でも、本発明では水又はエタノール水溶液を用いることが、安全面から見て好ましく、効果の点からはエタノール水溶液を用いることが好ましく、通常は１０〜９５質量％エタノール水溶液、より好ましくは３０〜９５質量％エタノール水溶液、さらに好ましくは３０〜６０質量％エタノール水溶液が用いられる。
【００２１】
抽出溶媒としては、当該植物の乾燥体を基準として、通常は１〜５００倍量、好ましくは２〜２００倍量、より好ましくは４〜１００倍量、最も好ましくは５〜５０倍量用いられる。
用いる溶媒量が１倍量未満の場合は、抽出後の固液分離が困難になる場合があり、溶媒量が５００倍量を超えた場合は、使用目的に応じては濃縮する必要が出てくることがある。
【００２２】
抽出温度は、通常は０〜２００℃、好ましくは３０〜１５０℃、より好ましくは４０〜１００℃、さらに好ましくは５０〜９０℃で行われる。抽出溶媒が水又はエタノール水溶液の場合は、その沸騰温度で抽出することが好適である。
【００２３】
抽出時間は、抽出する温度にも依存するが、通常は０．１〜８時間、好ましくは０．２〜４時間、より好ましくは０．５〜２時間で行われる。抽出時間が０．１時間未満の場合は抽出が十分行われていない可能性があり、抽出時間が８時間を超える場合は、経済的でない場合がある。
好適には０．５〜２時間程度かけて５０〜９０℃で加熱還流抽出した後、濾紙などを用いて固液分離して密花豆抽出液を得る。
【００２４】
（３）吸着処理
前記密花豆抽出液は、そのままでも蛋白質糖化反応阻害剤として使用できるが、原材料の密花豆由来の不快臭を低減し、水への溶解性を高めるため、吸着処理することが好ましく、合成吸着剤による処理（具体的には、抽出液を合成吸着剤を充填したカラムに通液して接触させて有効成分等を吸着させる）が好適である。
アルコール水溶液、またはアルコール類で抽出した密花豆抽出液を合成吸着剤に吸着させる場合は、アルコールを除去した後、合成吸着剤に接触させることが好ましい。
【００２５】
本発明で使用する合成吸着剤としては、疎水性を示す多孔質の芳香族系合成樹脂吸着剤であって実質的にイオン交換能を有しないものあれば、特に限定されることはないが、好ましくは、その母体がスチレン系、具体的にはスチレン・ジビニルベンゼン共重合体、例えば「アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ−４」（オルガノ株式会社製）、「ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０」（三菱化学株式会社製）、「セパビーズ（登録商標）ＳＰ−７００」（三菱化学株式会社製）、メタクリル系、例えば「ダイヤイオンＨＰ−２ＭＧ」（三菱化学株式会社製）、デキストラン系、例えば「セファデックス（登録商標）Ｇ−２５」（ＧＥ ヘルスケア・ジャパン株式会社製）などを使用することができる。
多孔質の芳香族系合成樹脂吸着剤の細孔半径は、２５〜１５０Å、特に５０〜１００Åであることが好ましい。
【００２６】
最も好ましい多孔質合成樹脂吸着剤を例示すると、三菱化学株式会社製の「セパビーズ（登録商標）ＳＰ−７０」である。
セパビーズＳＰ−７０は、スチレンとジビニルベンゼンの共重合体であり、粒度分布が２５０μｍ以上（９０％以上）、有効径０．２５ｍｍ以上、均一係数が１．６以下、細孔容積が１．５ｍｌ／ｇ、比表面積が８７０ｍ2／ｇ、最頻度半径が７０Åである。
【００２７】
密花豆抽出液を合成吸着剤に吸着させる方法としては、密花豆抽出液に合成吸着剤を添加、撹拌し吸着後、濾過操作により合成吸着剤を回収するバッチ法、あるいは合成吸着剤を充填したカラムを用いて連続処理により吸着処理を行うカラム方式が採用されるが、生産性の点からカラムによる連続処理方法が好ましい。
【００２８】
合成吸着剤の使用量は、密花豆抽出液中に含まれる蛋白質糖化反応阻害成分の濃度にもよるが、密花豆抽出液に対して、０．１〜５０体積％であることが好ましい。
密花豆抽出液を、合成吸着剤を充填したカラムに通液する条件としては、ＳＶ（空間速度）＝０．５〜５［ｈ-1］、好ましくは１〜３［ｈ-1］の通液速度で、合成吸着剤に対する通液倍数（ＢＶ）＝１〜１０［ｖ／ｖ］で通液するのが、効率的に蛋白質糖化反応阻害成分を吸着できるので好ましい。
【００２９】
（４）水洗浄処理
密花豆抽出液中に含まれる蛋白質糖化反応阻害成分を吸着処理した後、そのまま溶出液を用いて、蛋白質糖化反応阻害成分を回収しても良いが、合成吸着樹脂に吸着されない成分は、蛋白質糖化反応阻害活性が弱いため、水洗浄処理により除去することが好ましい。
密花豆抽出液中の蛋白質糖化反応阻害成分は、合成吸着剤と良好な吸着性を呈する。したがって、水を通液しても蛋白質糖化反応阻害成分は溶出されないため、水洗浄工程の条
件は特に制限されないが、ＳＶ（空間速度）＝０．５〜５［ｈ-1］、好ましくは１〜３［ｈ-1］の通液速度で、合成吸着剤に対する通液倍数（ＢＶ）＝１〜１０［ｖ／ｖ］で通液するのが、効率的に水洗浄処理できるので好ましい。
【００３０】
（５）溶出処理
上記のようにして密花豆抽出液を合成吸着剤の吸着、水洗浄処理したのち、アルコール水溶液を通液させ、密花豆抽出物中の蛋白質糖化反応阻害成分を選択的に合成吸着剤から溶出させる。
アルコール水溶液は、水とアルコール類（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールなどの炭素数１〜３の低級アルコール、あるいは１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、１，２−ペンタンジオール、１，３−プロパンジオールなどの多価アルコール）などを、単独或いは２種類以上の任意の混液として使用することができる。
アルコール水溶液としては、水とエタノールの混合物が好ましく、１０〜５０質量％エタノール水溶液が好ましく、２０〜４０質量％エタノールがさらに好ましく、２５〜３５質量％が最も好ましい。エタノール濃度が５０％を超えると、水への溶解性が低く、密花豆由来の不快臭成分も同時に溶出されてしまうため不適である。
【００３１】
溶出工程の条件は特に制限されないが、ＳＶ（空間速度）＝０．５〜５［ｈ-1］、好ましくは１〜３［ｈ-1］の通液速度で、合成吸着剤に対する通液倍数（ＢＶ）＝１〜１０［ｖ／ｖ］で通液するのが、効率的に蛋白質糖化反応阻害成分を溶出できるので好ましい。
以上の処理を経て、密花豆に含まれる不快臭成分、水に不溶な雑成分が除去され、且つ蛋白質糖化反応阻害効果に優れる密花豆抽出物を選択的に得ることができる。
【００３２】
上記の製造方法によって得られる本発明の蛋白質糖化反応阻害剤は、原材料の密花豆に由来する特有の不快臭（スパイシー臭、フェノリック臭および脂肪酸臭）が低減又は除去されたものである。
具体的には、ガスクロマトグラフィー-質量分析-固相マイクロ抽出法（GC/MS SPME）分析による香気分析によって、不快臭の原因成分である(E)- シンナムアルデヒド、オイゲノール、(E)- アネトール、3,5-ジメトキシトルエン、ヘキサン酸、オクタン酸及びノナン酸のいずれか１種、好ましくは２種以上を含有しないこと、特に全成分を含有しないことが好ましい。ここで、「含有しない」とは、ガスクロマトグラフィー-質量分析-固相マイクロ抽出法（GC/MS SPME）分析による香気分析によって検出されない（S/N＝10以下）か、あるいは全香気成分のピーク面積に対する各成分のピーク面積の比率が０．０１％以下であることを示す。
【００３３】
また、上記の製造方法によって得られる本発明の蛋白質糖化反応阻害剤は、水溶性に優れるが、水溶性の評価は濁度の測定によって行うことができる。
具体的な評価方法としては、製造された蛋白質糖化反応阻害剤を水に溶解して０．０１（ｗ／ｖ）％水溶液を作製し、作製した水溶液について波長６６０ｎｍ（１０ｍｍ石英セル）における吸光度を測定し、この吸光度の値を濁度として評価することができる。良好な水溶解性を有するには、当該測定法による濁度が０．００〜０．１０であることが好適である。
【００３４】
ここで、上記の製造方法で得られた蛋白質糖化反応阻害剤には、他の植物の抽出物と同様に、有効成分以外の非常に多くの成分が含まれる。つまり、炭水化物、タンパク質、アミノ酸、脂肪、色素、ビタミン、香気成分など種々の成分が複雑な状態や配合比で含まれている組成物の状態で目的の蛋白質糖化反応阻害効果を発揮する。
従って、本発明の蛋白質糖化反応阻害剤を、構造や特定により直接特定するためには、構成成分の同定、定量が必須となるが、全ての構成成分を同定及び定量することは、技術
常識からみて到底不可能であるか、又はおおよそ実際的ではない。
従って、本発明の蛋白質糖化反応阻害剤は、製造方法で特定せざると得ない発明である。
【００３５】
前記の密花豆抽出物は、製造された状態のままでも蛋白質糖化反応阻害として十分に使用できるが、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、濃縮する、不可的成分を添加する、あるいは他の有効成分と組み合わせて合剤にする等、種々変形して実施可能である。
例えば、密花豆抽出物を公知の各種天然香料や合成香料と組み合わせて香料組成物にすることが例示される。
また、化粧品類などで通常使用される基剤、添加剤等を併用して、化粧品、医薬部外品用の製剤として使用できるほか、酸化防止剤（ビタミンＣ、ビタミンＥなど）や、糖類、甘味料、増粘安定剤、ｐＨ調整剤などと組み合わせて飲食品、健康食品、食品添加物、医薬品用の組成物としても使用できる。
さらに、本蛋白質糖化反応阻害剤は、液剤以外の形状、例えば乳液状、ベースト状、ゲル状、パウダー状（粉末状）、顆粒状、ペレット状、スティック状、固形状等の何れの形態として提供されてもよい。
【実施例】
【００３６】
次に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００３７】
〔製造例１〕（密花豆抽出物の製造）
生薬として市販されている中国産の密花豆の乾燥茎１０ｇに対して５０質量％エタノール水溶液を２００ｇ加え、２時間加熱還流下で抽出した。
その後、ろ過、減圧濃縮した後、凍結乾燥し、密花豆抽出物（実施例１）１．７２ｇを得た。
【００３８】
〔製造例２〕（合成吸着樹脂による分離・精製）
実施例１の密花豆抽出物６０２ｍｇを水６０ｍｌに溶解し、三菱化学株社製の「セパビーズＳＰ７０（商品名）」が４０ｍｌ充填されたカラムに、ＳＶ＝１で通液した。
続いて、水（Ｈ2Ｏ）、３０質量％エタノール水溶液、５０質量％エタノール水溶液の順で各５００ｇずつＳＶ＝２で通液した。
得られた各溶出液を減圧濃縮後、凍結乾燥して、水（Ｈ2Ｏ）溶出部（２３３ｍｇ、回収率：３８．７％、「実施例２」）、３０質量％エタノール水溶液溶出部（３１９ｍｇ、回収率：５３．０％、「実施例３」）、５０質量％エタノール水溶液溶出部（３２．３ｍｇ、回収率：５．３７％、「実施例４」）を得た。
【００３９】
〔試験例１〕（蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制作用の測定）
実施例１〜４で得られた密花豆抽出物およびその吸着剤処理物について、以下の通り、蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制作用の測定を行った。
【００４０】
検体の調製
実施例１〜４で得られた試料をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）（以下「ＰＢＳ」と省略する。）に溶解して１％、０．１％、０．０１％溶液（最終固形分濃度  １ｍｇ／ｍＬ，０．１ｍｇ／ｍＬ，０．０１ｍｇ／ｍＬ）を作製した。（なお、ＰＢＳは、リン酸二水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム・１２水和物、塩化ナトリウム及び精製水から調製した。）
既知のＡＧＥｓ産生阻害剤であるアミノグアニジンも同様にして１％、０．１％、０．０１％溶液（最終固形分濃度  １ｍｇ／ｍＬ，０．１ｍｇ／ｍＬ，０．０１ｍｇ／ｍＬ）を作製した。（なお、アミノグアニジンは、和光純薬社製の試薬、塩酸アミノグアニジン
を使用した。）
【００４１】
試験の手順
ＰＢＳ６００μＬ、蛋白質として４０ｍｇ／ｍＬヒト血清アルブミン溶液（ＰＢＳに溶解、最終濃度８ｍｇ／ｍＬ）２００μＬ、還元糖として２Ｍグルコース水溶液（最終濃度
２００ｍＭ）１００μＬ、検体１００μＬを混合し、６０℃のインキュベータ中にて４８時間反応させた。（なお、アルブミンはSigma社製の「albumin from human serum」を使用した。グルコースは和光純薬社製の試薬を使用した。）
反応後、蛍光マイクロプレートリーダー（励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍ）にて蛍光強度を測定した（以下、糖（＋）・サンプルという）。
対照として、グルコースを添加せず、代わりにＰＢＳを添加したものを測定した（以下、糖（−）・サンプルという）。
コントロールとして、検体を含有しないもの（以下、糖（＋）・コントロールという）、検体及びグルコースを含有しないもの（以下、糖（−）・コントロールという）を測定した。
蛍光性ＡＧＥｓ生成率は、以下の式により算出した。
【００４２】
【数１】
2018118921.tif 000002
【００４３】
結果および実施例の効果
得られた結果を表１に示す。表１の結果から、実施例１の密花豆抽出物は濃度依存的に蛍光性ＡＧＥｓの生成を抑制し、既知の蛋白質糖化阻害剤であるアミノグアニジンよりも強い活性を示すことが明らかとなった。
また、密花豆抽出物を合成吸着樹脂により分画した実施例２〜４のうち、実施例３の３０質量％エタノール水溶液溶出部に強い蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制作用が認められ、合成吸着剤処理することにより効果が強まることが確認された。
【００４４】
【表１】
2018118921.tif 000003
【００４５】
〔試験例２〕ペントシジン生成抑制作用の測定
実施例１〜４で得られた密花豆抽出物およびその吸着剤処理物について、ＡＧＥｓの１種であるペントシジンの生成抑制作用の測定を行った。
ペントシジン生成抑制作用の測定は、酵素結合イムノソルベント活性（ＥＬＩＳＡ）法を用いた。
【００４６】
検体の調製
実施例１の試料およびアミノグアニジンをＰＢＳに溶解して１％、０．５％、０．２５％溶液（最終固形分濃度  １ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ）を作製した。
また、実施例２〜４については同様にＰＢＳに溶解して、０．２５％溶液（最終固形分濃度  ０．２５ｍｇ／ｍＬ）を作製した。
【００４７】
試験の手順
ＰＢＳを６００μＬ、蛋白質として１０ｍｇ／ｍＬヒト血清アルブミン溶液（ＰＢＳに溶解、最終濃度２ｍｇ／ｍＬ）２００μＬ、還元糖として１２５ｍＭ Ｄ（−）−リボース溶液（ＰＢＳに溶解、最終濃度１２．５ｍＭ）１００μＬ、検体１００μＬを混合した。（以下、糖（＋）・サンプルとする。）対照として、Ｄ（−）−リボース溶液を含まないものを調製した。（以下、糖（−）・サンプルとする。）
また、コントロールとして、検体を含有しないもの（以下、糖（＋）・コントロールという）、検体及びＤ（−）−リボース溶液を含有しないもの（以下、糖（−）・コントロールという）を調製した。これら調製したものを６０℃のインキュベータ中にて４８時間反応させた。
【００４８】
４８時間インキュベート後、各反応液を１００μＬずつ９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（nunc,immunoplateII maxisorp）に分注し、３７℃２時間インキュベートした。その後溶液を除去し、ウォッシングバッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０入りＰＢＳ）で洗浄後、ブロッキングバッファー（０．５％ゼラチン入りＰＢＳ）を１００μＬ／ウェルずつ添加して室温にて１時間インキュベートした。
【００４９】
その後溶液を除去、ウォッシングバッファーで洗浄後、０．１μｇ／ｍＬ抗ペントシジンマウスモノクローナル抗体溶液（ウォッシングバッファーに溶解）を１００μＬ／ウェ
ルずつ添加して室温にて１時間インキュベートした。
インキュベート後溶液を除去し、ウォッシングバッファーで洗浄後、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体溶液（ウォッシングバッファーに溶解）を１００μＬ／ウェルずつ添加して室温にて１時間インキュベートした。
【００５０】
溶液を除去、ウォッシングバッファーで洗浄後、発色基質（Sigma社製「Sigma Fast OPD（商品名）」）を２００μＬ／ウェルずつ添加し、３０分室温遮光下にてインキュベートした後、３Ｍ硫酸水溶液を５０μＬ／ウェルずつ添加し、直ちにマイクロプレートリーダーにて５０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００５１】
ペントシジン生成率は以下の式により算出した。
【００５２】
【数２】
2018118921.tif 000004
【００５３】
得られた結果を表２に示す。表２の結果から、実施例１の密花豆抽出物は濃度依存的にペントシジンの生成を抑制し、既知の蛋白質糖化阻害剤であるアミノグアニジンよりも強い活性を示すことが明らかとなった。
また、密花豆抽出物を合成吸着樹脂により分画・精製した実施例２〜４のうち、実施例３の３０質量％エタノール水溶液溶出部に強いペントシジン生成抑制作用が認められ、合成吸着剤処理することにより効果が強まることが確認された。
【００５４】
【表２】
2018118921.tif 000005
【００５５】
実施例１の密花豆抽出物は密花豆に含まれる特有の不快な臭みがあり、食品や化粧品へ
の使用が制限される問題点がある。
実施例３の蛋白質糖化反応阻害作用の評価において、合成吸着樹脂による吸着処理した後の実施例３が、実施例１よりも蛋白質糖化反応阻害作用が強まることが確認できたが、吸着処理により密花豆由来の不快臭がどの程度低減したかを官能評価、および分析手法により検証した。
【００５６】
〔試験例３］官能による密花豆抽出物の臭いの強度の評価（実施例１と実施例３の比較）
実施例１および実施例３の密花豆抽出物について、試料全体の臭いの強度について官能評価を行った。
【００５７】
試験方法
実施例１および３についてそれぞれ水に溶解し、０．１（ｗ／ｖ）％水溶液を作製した。作製した水溶液の臭いの強度について６名のパネルによる官能評価を行った。実施例１の臭いの強度をコントロールとして、実施例３がコントロールと比べ臭い強度が弱まったかを以下の評価基準により評価した。評価点の平均を図１に示した。
評価基準
評価点３：コントロールと同等
評価点２：コントロールよりやや臭いが弱い
評価点１：コントロールより臭いが弱い
評価点０：コントロールより臭いがかなり弱い
【００５８】
結  果
結果を図１に示す。実施例１の密花豆抽出物（吸着剤未処理）は、スパイシー臭、フェノリック臭、脂肪酸臭といった、密花豆由来の異臭が強く感じられたが、実施例３の密花豆抽出物は、ほとんど密花豆由来の異臭が感じられず、合成吸着樹脂による精製を行うことにより、密花豆由来の臭いの強度が弱まることを確認できた。
【００５９】
〔試験例４〕官能による密花豆抽出物の臭いの強度の評価（実施例１と実施例２、４の比較）
実施例１、２、４の密花豆抽出物について試料全体の臭いの強度について官能評価を行った。
【００６０】
試験方法
実施例１、２、４についてそれぞれ水に溶解し、０．０１（ｗ／ｖ）％水溶液を作製した。作製した水溶液の臭いの強度について６名のパネルによる官能評価を行った。実施例１の臭いの強度をコントロールとして、実施例２、４がコントロールと比べ臭い強度が弱まったかを以下の評価基準により評価した。評価点の平均を図２に示した。
評価基準
評価点＋３：コントロールよりかなり臭いが強い
評価点＋２：コントロールより臭いが強い
評価点＋１：コントロールより臭いがやや強い
評価点  ０：コントロールと同等
評価点−１：コントロールよりやや臭いが弱い
評価点−２：コントロールより臭いが弱い
評価点−３：コントロールよりかなり臭いが弱い
【００６１】
結  果
結果を図２に示す。実施例４の密花豆抽出物は、スパイシー臭、フェノリック臭、脂肪酸臭といった、密花豆由来の異臭が強く感じられたが、実施例２、密花豆抽出物は、ほとんど密花豆由来の異臭が感じられず、合成吸着樹脂による精製を行った実施例２、４のう
ち、５０質量％エタノール水溶液で溶出した溶出部（実施例４）に密花豆由来の強い異臭成分が含まれていることが確認できた。つまり、蛋白質糖化反応阻害作用が強い実施例３は実施例１のうちの臭いの強い部分を取り除くことができたといえる。
【００６２】
〔試験例５〕密花豆抽出物の香気分析
実施例１および３についてガスクロマトグラフィー-質量分析-固相マイクロ抽出法（GC/MS SPME）分析による香気分析を行った。
【００６３】
試験方法
実施例１および実施例３の密花豆抽出物を水に溶解し、１０質量％水溶液を作製した。作製した試料を２０ｍＬヘッドスペース用バイアルに０．４ｇ添加して、６０℃１０分インキュベートした後、GC/MS SPME法により香気分析を行った。
【００６４】
SPME 抽出条件
Fiber                ：50/30μm DVB/Carboxen/PDMS (シグマ  アルドリッチ社製)
Pre incubation time  ：600s
Incubation temperature：60°C
Pre Inc Agitator speed：500rpm
Agitator on time     ：5s
Agitator off time    ：2s
Vial penetration in  ：22mm
Extraction time      ：900s
Injection penetration in：54mm
Desorption time      ：60s
【００６５】
測定条件
Column            ：DB-WAX(0.25mm i.d. × 60m, film thickness 0.25μm)
Carrier gas       ：He (1.0mL/min)
Oven temperature  ：80°C - 3°C/min.-  230°C  10min.hold 
Injection         ：250°C,   Split ratio 30 :1
Detector          ：230°C, MS（アジレント・テクノロジー株式会社製）
【００６６】
得られたクロマトグラムから各ピークの化合物を同定し、さらにそのピーク面積、及び全香気成分のピーク面積に対する各成分のピーク面積の比率を算出した。
【００６７】
結  果
同定された化合物のうち、合成吸着樹脂による吸着処理により、大きく減少した成分を表３に示す。
表３に示す化合物のうち、(E)-cinnamaldehyde（シンナムアルデヒド）、eugenol（オイゲノール）、(E)-anethole（アネトール）、及び3,5-dimethoxytoluene（ジメトキシトルエン）は、スパイシー、フェノリックといった臭い成分である。一方、hexanoic acid（ヘキサン酸）、octanoic acid（オクタン酸）、及びnonanoic acid（ノナン酸）は、脂肪酸臭といった臭い成分である。
表３に示すように、実施例１の密花豆抽出物には(E)-cinnamaldehydeやeugenol等のスパイシー臭、またhexanoic acid等の脂肪酸臭の成分が多く含まれているが、実施例３の密花豆抽出物では、前記成分はいずれも検出されなかった。
したがって、合成吸着樹脂で吸着処理することにより、密花豆由来の異臭成分が除去されていることを確認できた。
【００６８】
【表３】
2018118921.tif 000006
【００６９】
実施例１の密花豆抽出物は水への溶解性が悪く、食品や化粧品への使用が制限される問題点がある。実施例３の蛋白質糖化反応阻害作用の評価において、合成吸着樹脂による吸着処理をした後の実施例３が実施例１よりも蛋白質糖化反応阻害作用が強まることが確認できたが、吸着剤処理により水溶性の度合いがどの程度変化したかを検証した。
【００７０】
〔試験例６〕濁度の測定による水溶性の評価
実施例１〜４について濁度測定により水溶性の評価を行った。
【００７１】
試験方法
実施例１〜４をそれぞれ水に溶解し、０．０１（ｗ／ｖ）％水溶液を作製した。作製した水溶液について波長６６０ｎｍ（１０ｍｍ石英セル）における吸光度を測定し、この吸光度の値を濁度として評価した。
【００７２】
結  果
波長６６０ｎｍにおける吸光度の測定結果を表４に示す。
表４より蛋白質糖化反応阻害作用が強い実施例３は実施例１よりも濁度が小さく、水溶性が高まることが確認できた。
【００７３】
【表４】
2018118921.tif 000007
【００７４】
実施例１の密花豆抽出物を合成吸着樹脂により処理し、得られた実施例３（３０質量％エタノール溶出部）は実施例１と比較して、強い蛋白質糖化反応阻害作用を示し、さらに、臭いが弱く、水溶性にも優れているという評価が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明の蛋白質糖化反応阻害剤は蛍光性ＡＧＥｓ、およびペントシジン生成抑制作用を有し、蛋白質糖化反応による最終生成物（ＡＧＥｓ）等の蓄積によって引き起こされる老化現象や各種組織障害の予防及び治療・改善効果を得ることが期待される。
【図１】
2018118921.tif 000008
【図２】
2018118921.tif 000009