(57)【要約】【課題】ヒトにおける百日咳菌感染において顕著な咳発作を忠実に再現し、安価で利便性が高く、医薬品の評価や製造、研究に用いることができる百日咳動物モデルの提供。【解決手段】本発明の百日咳モデル動物は、安価で利便性の高いマウスを用い、ヒトにおける百日咳菌感染において顕著な咳発作を忠実に再現する。本発明の動物モデルを用いることにより、咳発作メカニズムの解明や咳発作の誘発因子特定、百日咳に対する医薬品のスクリーニング評価や医薬品の製造に有用である。本発明の評価方法によれば、評価可能なワクチンの対象が拡大するとともに、感染拡大の抑制に直接関係する咳発作回数に基づく評価が可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
C57BL/6マウスに、百日咳菌Bp 18323株を含む菌液、もしくは百日咳菌Bp 18323株を含む菌体破砕液を接種する工程を含む、百日咳モデルマウスの作製方法。
【請求項２】
前記C57BL/6マウスが、成熟マウスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記菌液に0.5×108cfu/ml以上の百日咳菌Bp 18323株が含まれる、もしくは前記菌体破砕液に0.8 mg/ml以上の菌体成分が含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
被験物質の評価方法であって、
（１）C57BL/6マウスに被験物質を投与する工程、
（２）被験物質を投与したマウス、および被験物質を投与しないC57BL/6マウスに、百日咳菌Bp 18323株、もしくは百日咳菌Bp 18323株の菌体破砕液を接種する工程、
（３）前記被験物質を投与したマウスにおける咳発作回数を、前記被験物質を投与しないマウスおよび／または百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液を接種しないマウスにおける咳発作回数と比較する工程、および、
（４）前記（３）の工程により得られた結果に基づいて、被験物質の百日咳菌感染による咳発作の抑制作用における有効性を判定する工程、
を含む評価方法。
【請求項５】
前記被験物質が百日咳ワクチンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
百日咳菌Bp 18323株に感染したC57BL/6マウス、あるいは百日咳菌Bp 18323株の菌体破砕液を接種したC57BL/6マウスであって、咳発作を呈することを特徴とする、百日咳モデルマウス。
【請求項７】
百日咳菌の咳発作誘発因子の特定方法であって、
（１）百日咳菌Bp 18323株の１つの機能もしくは構造的因子をコードする遺伝子を欠損または発現を抑制するよう改変した百日咳菌Bp 18323株を作製する工程
（２）前記（１）の工程により得られた改変した百日咳菌Bp 18323株またはその菌体破砕液をC57BL/6マウスに投与する工程
（３）前記（２）のマウスにおける咳発作回数を、溶媒接種群および／または請求項６に記載の百日咳モデルマウスにおける咳発作回数と比較する工程、および、
（４）前記（３）の工程により得られた結果に基づいて、百日咳菌の咳発作誘発因子を特定する工程、
を含む特定方法。
【請求項８】
百日咳ワクチンの製造方法であって、
（１）百日咳菌の防御抗原を製造する工程
（２）百日咳菌Bp 18323株、もしくは百日咳菌Bp 18323株の菌体破砕液を接種したC57BL/6マウスを用いて前記百日咳菌の防御抗原の効力を測定する工程、および
（３）前記百日咳菌の防御抗原を製薬学的に許容される担体および／または他の免疫原性成分と混合し、単位用量製剤に製剤化する工程、
を含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、百日咳モデル動物およびその作製方法、百日咳モデル動物を用いた百日咳の予防または治療に用いられる医薬品の評価方法、咳発作誘発因子の特定方法、ならびに医薬品の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
百日咳は主として小児および10代の青少年に発生する伝染性の強い疾患で，百日咳菌（Bordetella pertussis）に起因する。症状は初め非特異的上気道感染様で，次に通常は長く高調の鶏鳴様吸気（笛声）で終わる発作性または痙攣性の咳が発現する。
百日咳菌感染により引き起こされる咳発作の発症メカニズムおよびその誘発因子は未だに解明されていない。その理由の一つに、現在まで百日咳菌感染における咳発作を忠実に再現する有用な動物モデルは開発されていない事が挙げられる。
これまで、マウスやラットといった小型で扱い易いげっ歯類を用いた感染モデルが報告されている。マウスでは百日咳菌経鼻投与による上下気道組織への菌体の定着や百日咳毒素が原因の白血球増多性を引き起こすが、肝心な発作性の咳嗽は生じないことが報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。
ラットは唯一、咳発作が報告されている小動物である（非特許文献３、非特許文献４）。これらの報告において用いられた実験系では、百日咳菌を封じ込めたアガロール粒子を作製し、これを外科的に露出させたラット気管支あるいは肺に直接投与したことが報告されている。非特許文献４では、投与9日後から咳発作が観察されている。またこの実験系で観察される咳発作は百日咳ワクチンで抑制される事があわせて報告されている（非特許文献５）。
しかし、上記実験系では気道等での菌体の定着を観察していないうえに、百日咳菌感染群の咳発作の回数が対照群に比べて有意ではなく、咳発作の回数を評価の対象とする感染モデルとしては十分ではない。また感染手法が非常に煩雑であるため他のグループからの追試報告はなく、汎用的で簡便な方法とは言い難いという問題がある。
ブタは類縁菌である気管支敗血症菌の自然宿主であるが、近年、百日咳菌経鼻投与により百日咳様症状を示す事が報告されているが、発作性の咳嗽は認められない（非特許文献６）。
現在、百日咳菌感染による咳発作を再現する動物モデルとしてヒヒ (Papio anubis)が注目されている。百日咳菌を経気道投与することで、感染3日後から激しい咳発作が生じる（非特許文献７）。また現行の百日咳ワクチン接種により咳発作の発症は抑制されることが報告されている（非特許文献８）。しかし、ヒヒ百日咳モデルは実験動物として凡用性は非常に低く、倫理的障害を考え合わせると容易に使用できる動物モデルではないという問題がある。
【０００３】
百日咳は、母親からの免疫（経胎盤移行抗体）が期待できないため、乳児期早期から罹患し、１歳以下の乳児、ことに生後6カ月以下ではそれ以上の乳児に比べ死に至る危険性も高い。百日咳ワクチンを含むDPT 三種混合ワクチン（ジフテリア・百日咳・破傷風）またはDPT-IPV四種混合ワクチン（ジフテリア・百日咳・破傷風・不活化ポリオ）の接種が我が国を含めて世界各国で実施されており、その普及とともに各国で百日咳の発生数は激減している。しかしながら、百日咳菌に対する終生免疫は獲得できないため、百日咳ワクチン接種の普及率が低下すれば、感染率が増加する。百日咳ワクチン接種の普及率を維持するためには、現在においても、安全で高力価な百日咳ワクチンの開発は重要な課題である。
現在の日本国内における、百日咳ワクチンの力価試験には1947年にKendrickにより開発されたIntracerebral challenge test (脳内攻撃試験)が採用されている(非特許文献９)。百日咳ワクチンの有効性評価にマウス脳内攻撃試験を用いることは、自然感染と感染経路が異なるものの、STANDFASTらによって実施された大規模な野外実験の結果、脳内攻撃試験で算出された全菌体百日咳ワクチンの力価と百日咳菌自然感染に対するワクチンの効果とが平行することが示されている(非特許文献１０)。このように脳内攻撃試験は、全菌体百日咳ワクチンの免疫効果を定量的に扱えることから広く普及し、現在に至っている。しかし近年、脳内攻撃試験は自然感染の状態を再現していない、現行の無細胞百日咳ワクチンの力価試験に適していないなど、当該試験についての是非が論じられている(非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４)。実際、2000年にNIBSCのワーキンググループにおいて無細胞百日咳ワクチン効力試験モデルについて議論が行われているものの、未だ脳内攻撃試験の代替となりうる試験法は確立されていない。
前述のように議論される背景には、ワクチン評価に適切な百日咳動物モデルが確立されていない事が理由の一つとして挙げられる。最近、ヒヒを用いた百日咳ワクチンの評価を行った研究成果が報告された(非特許文献７)ことは、先述べた通りである。この研究成果では、百日咳菌経気道投与ヒヒにおいて、無細胞百日咳ワクチン免疫群では上気道における菌体の排除こそはできないものの、咳発作は抑制される事が示されている。このことから、ヒヒ百日咳モデルは新たな動物モデルとして注目されている。しかし、先に述べたようにヒヒを百日咳ワクチン評価系として用いるには、実験動物として凡用性の低さや倫理的な問題、また費用面を考えると現実的ではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Shahin RD et al : Meth Enzymol 235 : 47-58, 1994
【非特許文献２】Widdicombe JG. Eur Respir J 8:1193-1202, 1995
【非特許文献３】Woods DE et al : Infect Immun 57 : 1018-1024, 1989
【非特許文献４】Hall E et al : J Med Microbiol 40 : 205-213, 1994
【非特許文献５】Hall E, et al: Vaccine 16(17)：1595-1603, 1998
【非特許文献６】Elashi S et al : Infect Immun 73 : 3636-3645, 2005
【非特許文献７】Warfel JM et al : Infect Immun 80 : 1530-1536, 2012
【非特許文献８】Warfel JM et al : Proc Natl Acad Sci USA 111 : 787-792, 2014
【非特許文献９】Kendrick PL et al : Amer. Z. Pub. Health 37 : 803, 1947
【非特許文献１０】Standfast AFB: Immunology 1(2) : 135-143, 1958
【非特許文献１１】Cameron J et al, Wardlaw AC, Parton R (Eds.). UK, 1988
【非特許文献１２】Xing DK et al, Vaccine 17(6) : 565-576, 1999
【非特許文献１３】Corbel MJ et al, Expert Rev Vaccines 3(1) : 89-101, 2004
【非特許文献１４】Watanabe M, Expert Rev Vaccines 4(2) : 173-184, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
百日咳菌感染により、ヒトでみられる顕著な咳発作を呈し、安価で利便性が高く、咳発作誘発因子の特定や医薬品の評価や製造にも用いることができる百日咳動物モデルの開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究の結果、顕著な咳発作を呈するマウスの百日咳モデル動物の開発に成功した。また、本発明の百日咳モデル動物の咳発作は、現行の百日咳ワクチンを含むDPT-IPVワクチンにより抑制される事を確認したことから、本発明により、新たな百日咳ワクチンなどの医薬品の有効性評価試験方法や、咳発作誘発因子の特定方法、当該評価方法を用いた医薬品の製造方法を提供することができる。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］
C57BL/6マウスに、百日咳菌Bp 18323株を含む菌液、もしくは百日咳菌Bp 18323株を含む菌体破砕液を接種する工程を含む、百日咳モデルマウスの作製方法。
［２］
前記C57BL/6マウスが、成熟マウスである、［１］に記載の方法。
［３］
前記菌液に0.5×108cfu/ml以上、好ましくは1×108cfu/ml以上、更に好ましくは2×10８cfu/ml以下の百日咳菌Bp 18323株が含まれる、もしくは前記菌体破砕液に0.8 mg/ml以上、好ましくは1.0 mg/ml以上、さらに好ましくは1.2 mg/ml以下の菌体成分が含まれる、［１］に記載の方法。
［４］
被験物質の評価方法であって、
（１）C57BL/6マウスに被験物質を投与する工程、
（２）被験物質を投与したマウス、および被験物質を投与しないC57BL/6マウスに、百日咳菌Bp 18323株、もしくは百日咳菌Bp 18323株の菌体破砕液を接種する工程、
（３）前記被験物質を投与したマウスにおける咳発作回数を、前記被験物質を投与しないマウスおよび／または百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液を接種しないマウスにおける咳発作回数と比較する工程、および、
（４）前記（３）の工程により得られた結果に基づいて、被験物質の百日咳菌感染による咳発作の抑制作用における有効性を判定する工程、
を含む評価方法。
［５］
前記被験物質が百日咳ワクチンである、［４］に記載の方法。
［６］
百日咳菌Bp 18323株に感染したC57BL/6マウス、あるいは百日咳菌Bp 18323株の菌体破砕液を接種したC57BL/6マウスであって、咳発作を呈することを特徴とする、百日咳モデルマウス。
［７］
百日咳菌の咳発作誘発因子の特定方法であって、
（１）百日咳菌Bp 18323株の１つの機能もしくは構造的因子をコードする遺伝子を欠損または発現を抑制するよう改変した百日咳菌Bp 18323株を作製する工程
（２）前記（１）の工程により得られた改変した百日咳菌Bp 18323株またはその菌体破砕液をC57BL/6マウスに投与する工程
（３）前記（２）のマウスにおける咳発作回数を、溶媒接種群および／または［６］に記載の百日咳モデルマウスにおける咳発作回数と比較する工程、および、
（４）前記（３）の工程により得られた結果に基づいて、百日咳菌の咳発作誘発因子を特定する工程、
を含む特定方法。
［８］
百日咳ワクチンの製造方法であって、
（１）百日咳菌の防御抗原を製造する工程
（２）百日咳菌Bp 18323株、もしくは百日咳菌Bp 18323株の菌体破砕液を接種したC57BL/6マウスを用いて前記百日咳菌の防御抗原の効力を測定する工程、および
（３）前記百日咳菌の防御抗原を製薬学的に許容される担体および／または他の免疫原性成分と混合し、単位用量製剤に製剤化する工程、
を含む、製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の百日咳モデル動物は、安価で利便性の高いマウスを用い、百日咳菌感染によりヒトと同様に顕著な咳発作を呈するから、本発明の動物モデルは、咳発作メカニズムの解明や咳発作の誘発因子同定、百日咳に対する医薬品のスクリーニング評価に有用である。また、本発明の評価方法は、従来のワクチン等の有効性評価試験に比べ、評価可能なワクチンの対象が拡大するとともに、感染拡大の抑制に直接関係する咳発作回数に基づく評価が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】百日咳菌Bp 18323株感染C57BL/6マウスの咳発作回数の推移（A）、対照群との6〜14日間の合計咳発作回数の比較（B）、気道への定着菌体数（C）、肺への定着菌体数（D）を示すグラフ（実施例１）。*P<0.0005、T test。
【図２】各種百日咳菌株感染C57BL/6マウスの咳発作回数の推移（A）、対照群との6〜14日間の合計咳発作回数の比較（B）、気道への定着菌体数（C）、肺への定着菌体数（D）を示すグラフ（比較例）。*P<0.05, **P<0.005、T test。
【図３】百日咳菌Bp 18323株感染Balb/cマウスの咳発作回数の推移（A）、対照群との6〜14日間の合計咳発作回数の比較（B）、気道への定着菌体数（C）、肺への定着菌体数（D）を示すグラフ（比較例）。*P<0.01、T test。
【図４】百日咳菌Bp 18323 PT遺伝子欠失変異株感染C57BL/6マウスの咳発作回数の推移（A）、対照群との6〜14日間の合計咳発作回数の比較（B）、気道への定着菌体数（C）、肺への定着菌体数（D）を示すグラフ（比較例）。*P<0.0001、T testもしくはMann-Whitney test。
【図５】百日咳菌Bp 18323株、PT遺伝子欠失変異株もしくはFHA遺伝子欠失変異株由来菌体破砕液経鼻接種C57BL/6マウスの咳発作回数の推移（A）、対照群との6〜14日間の合計咳発作回数の比較（B）、百日咳菌Bp 18323株、PT遺伝子欠失変異株由来菌体破砕液、精製PTもしくは百日咳菌Bp 18323 PT遺伝子欠失変異株由来菌体破砕液＋精製PT経鼻接種C57BL/6マウスの咳発作回数の推移（C）、対照群との6〜14日間の合計咳発作回数の比較（D）を示すグラフ（実施例２）。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.005、****P<0.0005、T test
【図６】DTP-IPV免疫C57BL/6マウスにおける百日咳菌Bp 18323株感染の咳発作回数の推移（A）、対照群およびワクチン非投与群に対する6〜14日間の合計咳発作回数の比較（B）、気道への定着菌体数（C）、肺への定着菌体数（D）、PT-IgG抗体価の推移（E）を示すグラフ（実施例３）。*P<0.01、**P<0.005、***P<0.0005、T test
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（百日咳モデル動物）
本発明の百日咳モデル動物は、百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液の接種により顕著な咳発作を生じるマウスである。
「咳発作」とは、連続する咳が反復して生じることを意味する。
本発明の百日咳モデル動物は、接種後一定期間経過後に咳発作が生じる。好ましくは、接種後5日以上経過後に咳発作が生じ、約1週間以上咳発作が継続する。
「顕著な咳発作」とは、百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液の接種後一定期間の合計咳発作回数が、百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液を接種しない動物群（ネガティブコントロール群）に比較して、有意に増加することを意味する。好ましくは、接種後6〜14日間の一定期間の合計咳発作回数が、ネガティブコントロール群に比較して、有意に増加することを意味する。
本発明の百日咳モデル動物の咳発作は、有効量の百日咳ワクチンの投与により有意に抑制される。好ましくは、百日咳ワクチン投与群の百日咳菌接種後一定期間、より好ましくは6〜14日間の合計咳発作回数が、百日咳ワクチン非投与群と比較して、有意に少ないことを意味する。
【００１０】
（百日咳モデル動物の作製方法）
本発明の百日咳モデル動物の作製方法を以下に示す。
１．動物種
本発明に用いることができる動物は、市販あるいは研究機関から入手可能なC57BL/6系統のマウスである。C57BL/6系統のマウスには、さらにC57BL/6JとC57BL/6Nの亜系統があり、同様に用いることができる。
入手可能なC57BL/6亜系統の主な種類と入手先は以下の通りである。
C57BL/6J：Jackson Laboratory 
C57BL/6JMs：国立遺伝学研究所
C57BL/6JJcl：日本クレア
C57BL/6JNrs：放射線医学総合研究所
C57BL/6JJmsSlc：日本エスエルシー
C57BL/6NJcl：日本クレア
C57BL/6NCrlCrlj：日本チャールス・リバー
C57BL/6NCrl：日本チャールス・リバー
C57BL/6NCrSlc：日本エスエルシー
C57BL/6NSea：九動
C57BL/6JBomTac：Taconic Farms
C57BL/6JEiJ：Jackson Laboratory
C57BL/6JOlaHsd：Harlan
C57BL/6JRccHsd：Harlan
C57BL/6JSca：Scanbur A-S
C57BL/6NTac：Taconic Farms
C57BL/6NJ：Jackson Laboratory
C57BL/5NHsd：Harlan
C57BL/6NCrSim：Simonsen Laboratories
C57BL/6By：Jackson Laboratory
C57BL/6ByJ：Jackson Laboratory
好ましくは、C57BL/6Jマウスである。
本発明に用いることができるC57BL/6マウスは、体重10〜30ｇの成熟マウスであり、好ましくは百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液接種時点で7〜10週齢の雄マウスである。
２．百日咳菌
本発明に用いることができる百日咳菌は、WHOの参照株である18323株（以下、Bp 18323株と記載する）が好ましい。また、百日咳菌の菌体を破砕した、百日咳菌体破砕液も用いることができる。
３．百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液の接種方法
本発明において、百日咳菌を含む菌液、または百日咳菌体破砕液を動物に接種するには、噴霧による暴露や局所投与により行われるがこれに限定されるものではない。噴霧による暴露は、例えば、気密容器に動物を入れ、百日咳菌を含む菌液、または百日咳菌体破砕液をスプレー、ミストまたはエアロゾル等により気密容器内に充填し、感染に必要な時間暴露する方法が挙げられる。局所投与する場合は、百日咳菌を含む菌液、または百日咳菌体破砕液を、経鼻投与、経気道投与、または皮下投与することにより行うことができるが、これに限定されるものではない。経鼻もしくは経気道投与は、好ましくはマウスの鼻腔または気道内に菌液を噴霧するか、一定量を注射針から滴下して接種する。好ましくは経鼻投与である。
具体的には、百日咳菌の感染に十分な濃度、例えば、局所投与の場合、麻酔下で、0.5×108cfu/ml以上、好ましくは1×108cfu/ml以上、さらに好ましくは0.5〜2×10８cfu/mlの百日咳菌を含む菌液を作製し、接種する。噴霧の場合には、0.5×1010cfu/ml以上、好ましくは1〜2×1010cfu/mlの菌液を用いる。あるいは、百日咳菌体破砕液を用いるときは、局所投与の場合、麻酔下で、好ましくは0.8 mg/ml以上、より好ましくは1.0 mg/ml以上、さらに好ましくは0.8〜1.2 mg/mlの百日咳菌体破砕液を作製し、3〜7日間、好ましくは5日間連続接種する。噴霧の場合には、局所投与の濃度の2〜10倍程度の濃度の百日咳菌体破砕液を用い、5〜10日間暴露することにより接種する。
４．咳の評価
接種後、マウスを個別あるいは数匹毎に観察用のケージに入れ、通常の方法で飼育し、観察手順に従い咳発作を観察する。観察用のケージには、録音または動画の撮影機材を設置し、観察計画に基づき、ケージ内の音を一定時間録音または録画し、咳の回数をカウントする。観察用のケージには、咳以外の音を拾わないように、ケージの底に防音シートを設けても良い。
具体的な手順を以下に示すが、これに限定されるものではない。
（１）観察手順
観察用ケージのそばに、マイクロホンおよび／またはビデオカメラを設置し、ケージ内のマウスの様子を1日一匹ずつ一定時間記録する。あるいは、マイクロホンおよび／またはビデオカメラを設置したケージに、観察時間毎に観察するマウスを移動したり、ケージを観察時間毎に記録装置のそばに移動してもよい。
撮影後、録音または動画を再生し、咳音および／またはマウス動作を観察し、咳発作の回数を計測する。
（２）観察計画
観察期間中は、測定開始する時間を決め、毎日同じ時間に記録を開始し、一定時間、好ましくは5分間記録する。具体的には、観察は、接種後4〜6日目から咳発作がなくなるまで、または14日目まで行う。
【００１１】
本発明は、さらに百日咳モデル動物を用いる、百日咳の予防または治療に用いられる医薬品を評価またはスクリーニングするための方法を提供する。
本発明方法により評価可能な医薬品は、百日咳ワクチンなどの生物由来製剤のほか、様々な物質にも適用することができる。
本発明の医薬品の評価方法を以下に示す。
（百日咳モデル動物を用いた評価方法）
（１）被験物質を投与した百日咳モデル動物を作製する工程
前出の（百日咳モデル動物の作製方法）に従い、百日咳モデル動物を作製し、被験物質を投与する。あるいは、予め被験物質を投与した動物に、（百日咳モデル動物の作製方法）に従い、百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液を接種し、被験物質を投与した百日咳モデル動物を作製する。
被験物質としては、あらゆる公知物質または新規物質を用いることができる。例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、抗体、ワクチン、ペプチド、有機低分子化合物、有機高分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。
被験物質の投与量は、用いる被験物質の性質等に応じ、適宜決定される。
被験物質の投与時期は、被験物質の性質等に応じ、百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液の接種前または接種後に投与される。被験物質が、生体の免疫に作用するものである場合には、所望の免疫作用が発現される時間を考慮して、百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液の接種に先立って、投与することができる。
被験物質の投与回数についても、被験物質の性質、予定される用法等に応じ適宜決定される。
被験物質の投与経路については、被験物質の効果が最も発揮される方法、あるいは予定される投与方法に応じ、適宜選択される。投与方法は、被験物質の性質を考慮し、全身投与または局所投与が選択される。
対照として、被験物質のかわりに、被験物質投与の際に用いた溶媒などを投与し、被験物質を投与しない百日咳モデル動物を同様に作製する。
（２）被験物質を投与した百日咳モデル動物における咳発作回数を、被験物質を投与しない百日咳モデル動物（対照群）および／またはネガティブコントロール群における咳発作回数と比較する工程
被験物質の投与あるいは百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液を接種後（百日咳モデル動物の作製方法）の４．咳の評価に従って、一定期間咳発作を観察し、被験物質を投与した百日咳モデル動物における咳発作回数を対照群および／またはネガティブコントロール群と比較し、被験物質の投与により有意に咳発作回数が減少しているかを判定する。
（３）比較工程により得られた結果に基づいて、被験物質の有効性を判定する工程
比較工程（２）により、対照群と比較して有意に被験物質投与群の咳発作が減少している場合に、当該被験物質は、百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液の接種による咳発作を有意に抑制する効果を有すると評価することができるため、当該被験物質を百日咳治療または予防のための医薬品候補物質として選択することができる。
【００１２】
本発明の百日咳モデル動物を用いた評価方法は、百日咳ワクチンの評価に用いることができる。以下に具体的に説明する。
（百日咳ワクチンの評価方法）
（１）百日咳ワクチンを投与した動物を作製する工程
本発明の評価方法により評価可能な百日咳ワクチンは、単一の百日咳ワクチン、または百日咳ワクチンを含む混合ワクチンがあげられる。百日咳ワクチンは、全菌体ワクチン、あるいは無細胞ワクチン（acellular vaccine）であってもよく、ワクチン成分として、百日咳毒素（pertussis toxin, PT）および繊維状赤血球凝集素（filamentous hemagglutinin, FHA）の他、繊毛、外膜たん白（69KD抗原）などを含んでいても良い。
ここで、百日咳ワクチンを含む混合ワクチンは、百日咳菌以外のウイルスまたは菌に対する免疫原性成分を含む。具体的には、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを含むDPT、あるいは、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび不活化セービン株ポリオウイルスを含むDPT-IPVなどが挙げられる。
本発明の評価方法で用いられる百日咳ワクチンの投与量は百日咳ワクチンの力価に応じて決定され、高用量群または低用量群などの複数の用量群を設定し、各群ごとに投与してもよい。
本発明の評価方法で用いられる百日咳ワクチンの投与時期は、百日咳ワクチンによる免疫獲得に必要な期間を考慮して決定することができる。通常、百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液接種の3-4週間前、好ましくは4週間前である。
本発明の評価方法で用いられる百日咳ワクチンの投与回数は、好ましくは百日咳菌感染までの間に1〜2回である。
投与方法は、ワクチン投与により免疫が獲得できる方法であれば、全身投与でも局所投与でもよく、通常、予定されるワクチンの用法に応じて決定される。局所投与の場合、腹腔内投与が好ましい。
百日咳ワクチンによる免疫獲得に必要な期間経過後、百日咳ワクチンを投与した動物群および百日咳ワクチンを投与しない群（対照群）に百日咳菌もしくは百日咳菌体破砕液を接種し、（百日咳モデル動物の作製方法）の４．咳の評価に従って、咳発作を観察する。
（２）百日咳ワクチンを投与した百日咳モデル動物における咳発作回数を、対照群および／またはネガティブコントロール群における咳発作回数と比較する工程
ワクチンを投与した百日咳菌接種動物における咳発作を対照群等と比較し、有意に咳発作回数が減少しているかを判定する。
（３）比較工程により得られた結果に基づいて、百日咳ワクチンの有効性を判定する工程
比較工程（２）により、対照群と比較して有意に被験物質投与群の咳発作回数が減少している場合に、当該百日咳ワクチンは、充分な力価を有すると評価することができる。
【００１３】
本発明は、さらに百日咳菌の咳発作誘発因子の特定方法に関する。
本発明の百日咳菌の咳発作誘発因子の特定方法は、百日咳菌Bp 18323株の特定の機能もしくは構造的因子をコードする遺伝子を欠損、またはその発現を抑制するよう改変し、改変した百日咳菌Bp 18323株を用いてC57BL/6系統のマウスに感染させ、（百日咳モデル動物を用いた評価方法）に従い咳発作回数を評価し、どの遺伝子が咳発作の発現に影響を及ぼすのかを検討する。本発明の特定方法により、百日咳菌による咳発作を誘発する因子を特定することができる。
以下に、具体的に説明する。
（百日咳菌の咳発作誘発因子の特定方法）
（１）百日咳菌Bp 18323株の１つの機能もしくは構造的因子をコードする遺伝子を欠損または発現を抑制するよう改変した百日咳菌Bp 18323株を作製する工程
ここで、機能もしくは構造的因子とは、PT、FHA、易熱性皮膚壊死毒素、アデニル酸シクラーゼ、線毛、外膜たん白（69KD抗原）などが挙げられる。
機能もしくは構造的因子をコードする遺伝子を欠損または発現を抑制するよう改変した百日咳菌Bp 18323株は、例えば、EP 0,322,115、US 275,376や特許第2655583号に記載の方法など、公知の方法を用いて作製することができる。
具体的には、百日咳菌の機能もしくは構造的因子をコードする遺伝子を破壊したり、除去したりすることにより完全なmRNAを産生不能にする。機能もしくは構造的因子をコードする遺伝子を欠損させる具体的な手段としては、対象の遺伝子(ゲノムDNA)を常法に従って単離し、例えば、(1)そのコード領域(cds)やプロモーター領域に他のDNA断片(例えば、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子等)を挿入することによりcdsもしくはプロモーターの機能を破壊する方法、(2)当該遺伝子の全部または一部を切り出して該遺伝子を欠失させる (例えば、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子等で置換する)方法、(3)cds内に終止コドンを挿入して完全な蛋白質の翻訳を不能にする方法、(4)転写領域内部へ遺伝子の転写を終結させるDNA配列 (ターミネーター配列)を挿入して、完全なmRNAの合成を不能にする方法、あるいは(5)cds内の酵素活性に関わるアミノ酸を任意のアミノ酸に置換し、酵素活性を不活化する方法などによって、結果的に遺伝子を不活性化するように構築したDNA配列を有するDNA鎖 (以下、ターゲッティングベクターと略記する)を、相同組換えにより百日咳菌の当該機能を担う遺伝子座に組み込ませる方法などが用いられ得る。好ましくは、薬剤耐性遺伝子をcds内に挿入して対象の遺伝子を破壊する方法、または対象遺伝子の全部もしくは一部を薬剤耐性遺伝子で置換除去する方法が挙げられる。特に好ましくは、対象遺伝子の大部分を除去し、薬剤耐性遺伝子で置換する方法が挙げられる。
薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子などを用いることができる。これらの遺伝子は、上記プラスミドから適当な制限酵素により切り出すこともできるし、あるいは上記プラスミドを鋳型として、これらの遺伝子の上下流域の配列をプライマーに用い、PCR法により増幅してもよい。
（２）前記（１）の工程により得られた改変した百日咳菌Bp 18323株またはその菌体破砕液をC57BL/6マウスに投与する工程
前出の（百日咳モデル動物の作製方法）にしたがって、改変した百日咳菌Bp 18323株またはその菌体破砕液をC57BL/6マウスに投与する（改変群）。
対照として、改変した百日咳菌Bp 18323株またはその菌体破砕液のかわりに、それに用いた溶媒のみをC57BL/6マウスに投与する（溶媒接種群）。必要に応じ、改変しない百日咳菌Bp 18323株またはその菌体破砕液をC57BL/6マウスに投与する（ポジティブコントロール群）。
（３）前記（２）のマウスにおける咳発作回数を比較する工程
前出の（百日咳モデル動物を用いた評価方法）にしたがって、改変群、溶媒接種群、必要に応じポジティブコントロール群の咳発作回数を比較する。
（４）百日咳菌の咳発作誘発因子を特定する工程
咳発作回数に関し、溶媒投与群と比較し有意な差が見られなかった改変群、もしくはポジティブコントロール群と比較して有意に少なかった改変群の機能もしくは構造的因子が、咳発作の誘発因子であると特定できる。百日咳菌経鼻投与工程に限り、マウス気道への百日咳菌の定着菌数がポジティブコントロール群と比較して大きな差がない場合のみを適応改変群とする。
【００１４】
本発明の別の態様は、本発明の百日咳モデル動物を用いた百日咳の予防または治療用医薬品の製造方法に関するものである。
本発明の製造方法により得られる医薬品は、百日咳モデル動物を用いスクリーニングする工程により選択された、公知物質または新規物質を有効成分として含有する医薬品である。
以下に、具体的に説明する。
（医薬品の製造方法）
（１）百日咳モデル動物を用い化合物をスクリーニングする工程
前出の（百日咳モデル動物を用いた評価方法）に従い、咳発作を有意に抑制する化合物を選択する。スクリーニングに供される化合物としては、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、抗体、ワクチン、ペプチド、有機低分子化合物、有機高分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。
（２）上記（１）により得られた化合物に製薬学的に許容される担体を加える工程
「製薬学的に許容される担体」としては特に制限されることなく、公知の製剤学的方法に用いられる物質の中から適宜選択することができる。例えば、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられるが、これらに制限されない。
本発明の製造方法により得られる医薬品は、例えば、特に、局所、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路により投与することができる。
経口投与の剤型としては、散剤、細粒剤、顆粒、錠剤、カプセル剤が好ましく、常法により製造することができる。局所投与の剤型としては、注射剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、眼軟膏剤、点眼剤、点耳剤、うがい薬、およびエアロゾルの形態としてもよく、例えば、保存剤、薬剤浸透を促進する溶剤、および軟膏およびクリームでの軟化剤を含む適当な慣用的添加物を含んでよい。
本発明の製造方法により得られる医薬品の投与量は、投与対象者の年齢、体重など種々の条件に応じて適宜選択することができるが、活性成分の1日投与量が、0.001mg/kgないし1g/kg、好ましくは0.1mg/kgないし100mg/kgの範囲で用いられる。
【００１５】
本発明の更なる態様は、百日咳ワクチンの製造方法に関するものである。
本発明の製造方法により得られる百日咳ワクチンは、百日咳菌の防御抗原のみを含む百日咳単独ワクチン、百日咳菌の防御抗原のほかに、他の免疫原性成分等を含む混合ワクチンが含まれる。
以下に具体的に説明する。
（百日咳ワクチンの製造方法）
（１）百日咳菌の防御抗原を製造する工程
百日咳菌の防御抗原は、公知の方法、例えばWO 2008/044611の実施例５に記載の方法により製造することができる。具体的には、百日咳菌の防御抗原は、例えば、百日咳菌Ｉ相菌（東浜株）の培養液を硫安分画法・蔗糖密度勾配遠心分画法などの物理化学的方法で感染防御抗原画分を抽出・分離・精製したのち、残存する毒性をホルマリンで減毒することによって得ることもできる。
百日咳菌の防御抗原には、PT、FHA、外膜たん白（69KD抗原）、線毛（FB抗原、凝集原(FGG)とも呼ばれる）が含まれる。百日咳菌の防御抗原としては、必ずしも上記各抗原の全てを含んでいる必要はなく、これらの抗原のうち１種以上、好ましくは２種以上、より好ましくは３種以上を含んでいてもよい。
（２）百日咳菌の防御抗原の効力を測定する工程
上記（１）の工程により得られた百日咳菌の防御抗原を前出の（百日咳ワクチンの評価方法）に準じて、百日咳菌Bp 18323株、もしくは百日咳菌Bp 18323株の菌体破砕液を接種したマウスを用いて百日咳菌の防御抗原の効力を測定する。
具体的には、以下の工程を含む。
ｉ）C57BL/6マウスに百日咳菌の防御抗原を投与する工程
ｉｉａ）前記百日咳菌の防御抗原を投与したマウス、および前記百日咳菌の防御抗原を投与しないC57BL/6マウスに、百日咳菌Bp 18323株、もしくは百日咳菌Bp 18323株の菌体破砕液を接種する工程、あるいは、
ｉｉｂ）前記百日咳菌の防御抗原を投与したマウス、および標準品や参照品となる百日咳ワクチンを投与したC57BL/6マウスに、百日咳菌Bp 18323株、もしくは百日咳菌Bp 18323株の菌体破砕液を接種する工程
ｉｉｉａ）前記百日咳菌の防御抗原を投与したマウスにおける咳発作回数を、前記百日咳菌の防御抗原を投与しないマウス（対照群）および／またはネガティブコントロール群における咳発作回数と比較する工程、あるいは、
ｉｉｉｂ）前記百日咳菌の防御抗原を投与したマウスにおける咳発作回数を、標準品や参照品となる百日咳ワクチンを投与したマウスにおける咳発作回数と比較する工程、および、
ｉｖ）前記ｉｉｉａ）またはｉｉｉｂ）の工程により得られた結果に基づいて、前記百日咳菌の防御抗原の効果を評価する工程。
ここで、標準品となる百日咳ワクチンとしては、国際標準品または国内標準品を用いることができる。国際標準品とは国際単位（IU/mL）が定められたものをいい、国内標準品は対応する国際標準品がある場合は、それの区分に一致させたもの、対応する国際品のない場合は独立の国内単位を定めたものである。参照品としては、既にワクチンの効力が明らかとなっているワクチンを用いることができ、既に市販されている百日咳ワクチンが挙げられる。
（３）単位用量製剤に製剤化する工程
上記（２）の工程により測定された、所定の効力を有する百日咳菌の防御抗原に、適宜製薬学的に許容される担体および／または所望により他の免疫原性成分等と混合し、単位用量製剤を製造する。あるいは、単位用量製剤に製剤化してから上記（２）の工程を行っても良い。
製薬学的に許容される担体は、（医薬品の製造方法）の（２）に記載の通りである。
他の免疫原性成分としては、百日咳菌以外の免疫原性成分が挙げられる。そのような免疫原性成分としては、例えば、百日咳菌以外のウイルスまたは菌に対する免疫原性成分が挙げられる。免疫原性成分としては、例えば、トキソイド、弱毒化ウイルス、不活化ウイルス、タンパク質、ペプチド、ポリサッカライド、リポポリサッカライド、リポペプチド、またはこれらの組み合わせなどが挙げられる。百日咳菌以外のウイルスまたは菌としては、例えば、ポリオウイルス、ジフテリア菌、破傷風菌、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、ヘルペスウイルス、水疱瘡ウイルス、狂犬病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、肺炎双球菌、髄膜炎菌、チフス菌、インフルエンザｂ菌などが挙げられる。好ましくは、不活化セービン株ポリオウイルス、ジフテリアトキソイド、または破傷風トキソイドである。
本発明の製造方法により得られるワクチンとしては、百日咳菌の防御抗原の他に、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを含むDPT、あるいは、百日咳菌の防御抗原に、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび不活化セービン株ポリオウイルスを含むDPT-IPVなどの2価以上の混合ワクチンが好ましい。
本発明の製造方法により得られる百日咳ワクチンは、１つの製剤中に１回分の投与量を含有する製剤であり、アンプルやシリンジなどが典型的な形態である。
本発明の製造方法により得られる百日咳ワクチンは、常套手段に従って、注射剤として製剤化することができる。注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記物質を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられる。調製された注射液は、通常、適当なアンプル、シリンジなどに充填される。
本発明の製造方法により得られる百日咳ワクチンは、必要に応じて、保存剤、抗酸化剤、キレート剤などの製剤添加剤を含有していてもよい。保存剤としては、例えば、チメロサール、２−フェノキシエタノールなどが挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸などが挙げられる。
本発明の製造方法により得られる百日咳ワクチンは、さらにアジュバントを含有していてもよい。アジュバント化剤としては、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウムなどが挙げられる。
本発明の製造方法により得られる百日咳ワクチンは、例えば、皮下注射もしくは筋肉注射によって、好ましくは皮下注射によって、非経口的に投与することができる。
本発明の製造方法により得られる百日咳ワクチンの１回投与量は、投与対象者の年齢、体重など種々の条件に応じて適宜選択することができる。通常、単位製剤中の百日咳菌の防御抗原は4国際単位以上含む。他の免疫原性成分を含む混合ワクチンの単位製剤中には、ジフテリアトキソイドを約15Lf、破傷風トキソイドを約2.5Lf、不活化セービンＩ型ポリオウイルスをＤ抗原として約2〜4単位（好ましくは約3単位）、不活化セービンＩＩ型ポリオウイルスをＤ抗原として約80〜120単位（好ましくは約100単位）、不活化セービンＩＩＩ型ポリオウイルスをＤ抗原として約80〜120単位（好ましくは約100単位）含有していてもよい。
本発明の製造方法により得られる百日咳ワクチンの投与回数は、例えば、初回免疫として、3〜8週の間隔で、2〜3回投与してもよい。初回免疫として本発明の百日咳ワクチンを2回投与した場合には、さらに3〜8週の間隔で1回投与するのが好ましい。追加免疫として、初回免疫後6ヶ月以上の間隔をおいて（例えば、初回免疫終了後12ヶ月から18ヶ月までの間に）、さらに1回投与してもよい。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これは一例であり、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
実施例１（C57BL/6Jマウスを用いた百日咳モデル動物の作製）
（１）百日咳菌感染モデル動物の作製
7週齢の雄のC57BL/6Jマウス（入手先：日本クレア株式会社、9匹数/群）に、0.5〜2×10８cfu/mlの百日咳菌（Bp 18323株、入手先：大阪大学）を含む菌液（組成：Stainer-Scholte（SS）液体培地〔Stainer, D. W., Scholte, M. J., J. Gen. Microbiol., 63, 211-220(1971)〕）を調製し、麻酔下で、注射針を用いてマウスの鼻腔内に50μl接種した。対照群(5匹数/群)として、百日咳菌を含まない溶媒（組成：SS液体培地、量50μl）を、麻酔下で、同様に接種した。
接種後、マウスを個別に観察用ケージに入れ、通常の飼育下で飼育した。
（２）咳発作の観察
観察手順に従いケージ内のマウスの様子を1日一匹当たり5分間撮影した。撮影した動画の再生によりマウスの動作および咳発作の音から咳発作症状を判別し、咳発作の回数を計測した。
咳発作は、感染後6日目から生じた。接種時を0日として経過日数と咳発作の回数をグラフ化した（図１のＡ）。実施例１の（１）で得られた感染動物の感染後6〜14日における45分間の咳発作の回数は、非感染動物と比較して有意に増加した（図１のＢ）。
＜観察手順＞
観察用ケージのそばに、マイクロホン接続ビデオカメラを設置し、ケージ内のマウスの様子を1日当たり5分間／匹記録する。観察は、接種後6日目から14日目まで行う。
撮影後、動画編集ソフトウェア（製品名：Adobe Premiere Pro、入手先：Adobe）で再生し、咳音とマウス動作を見て咳発作の回数を計測する。
（３）菌体定着確認試験
百日咳菌経鼻接種後6日目から14日目までの観察期間中、百日咳菌接種群の気道および肺へ菌体がどの程度定着しているかを確認するために定着菌体数確認試験を行った。
気道および肺への定着菌体数確認試験は、以下の手順で行った。
百日咳菌経鼻接種マウスより気道および肺を摘出後、各組織を均質化する。均質化液を任意の希釈倍率に希釈後、Bordet-Gengou血液寒天培地（極東製薬工業株式会社製）に播種し、37度で3-4日間培養する。形成されたコロニー数をカウントし、各組織に定着した菌体数を算出する。
結果を図１のＣおよびＤに示す。この結果から、気道および肺において十分な定着菌体数が確認できた。
【００１７】
比較例（各種条件により作製した百日咳菌経鼻接種による百日咳モデル動物の咳発作）
（１）種々の百日咳菌感染C57BL/6Jマウスの作製および咳発作評価
種々の百日咳菌株（BP140, BP141, BP142, BP144）(入手先：国立感染症研究所)およびTohama I株（入手先：大阪大学）を用い、実施例１と同様に百日咳菌感染C57BL/6マウスを作製し、一定時間の咳発作の回数をカウントした（図２のＡ）後、咳発作回数を解析し、菌株毎の比較を行った（図２のＢ）。また、気道およびへ肺の定着菌体数確認試験（図２のＣおよびＤ）を行った。
その結果、臨床分離株を感染させたマウスは、気道および肺において、いずれの臨床分離株も充分な菌数が定着していた。一方、咳発作の回数は非感染群と比較し有意な臨床分離株もみられたが、いずれもBp 18323株感染群より少なかった。Tohama I株感染C57BL/6マウスでは咳発作が認められなかった。
（２）百日咳菌Bp 18323株感染Balb/cマウスの作製および咳発作評価
7週齢のBalb/cマウス（入手先：日本エスエルシー、匹数：3匹/群）を用い実施例１と同様にBp 18323株を接種し、Bp 18323株感染Balb/cマウスを作製し、咳発作を観察（図３のＡ）し、実施例１において作製したBp 18323株感染C57BL/6マウスの咳発作と比較した（図３のＢ）。また、気道および肺への定着菌体数確認試験（図３のＣおよびＤ）を行った。
その結果、Bp 18323株はBalb/cマウスの肺および気道に、充分な菌数が定着しているにもかかわらず、咳発作の回数は非感染群と比較し有意ではなかった。
（３）百日咳菌Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株感染C57BL/6Jマウスの作製および咳発作評価
Bp 18323株を基に作製したBp 18323 PT遺伝子欠損変異株を用い、実施例１と同様に百日咳菌感染C57BL/6マウスを作製し、一定時間の咳発作の回数をカウントした（図４のＡ）後、咳発作回数を解析し、菌株毎の比較を行った（図４のＢ）。また、気道およびへ肺の定着菌体数確認試験（図４のＣおよびＤ）を行った。
その結果、咳発作の回数はBp 18323株感染群と比較し、Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株感染群では有意に減少した。一方、Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株を感染させたマウスは、気道および肺において、充分な菌数が定着していたものの、百日咳菌Bp 18323と比較すると各組織への定着菌体数は有意に減少していた。
＜Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株作製方法＞
Bp 18323遺伝子欠損変異株をNisikawa S et al, Microbiol Immunol 60 : 93-105, 2016に記載の方法を改変して作製した。以下使用したプライマーの入手先はInvitrogenである。S1からS5までのPT遺伝子オペロンの5'末端および3'-末端から約1000bpまでの領域(PT-UおよびPT-D)を、Bp 18323株のゲノムDNAをテンプレートとしてプライマーPT-U-F（gatccgagctctcccaacccgtcgtggtgcagaa；配列番号：１）とPT-U-R（ttagcttccttagctagtgcaacgccatcccgtc；配列番号：２）、およびPT-D-F（cgcgccatttaaatggcgtcgatatgctgagcc；配列番号：３）とPT-D-R（ttagcttccttagctagtgcaacgcatcccgtc；配列番号：４）を用いてPCRにて増幅させる。クロラムフェニコール耐性遺伝子（CmR）を、pKK232-8 DNA（入手先：大阪大学）をテンプレートとしてプライマーCmR-F（agctaaggaagctaaaatggag；配列番号：５）とCmR-R（catttaaatggcgcgcctt；配列番号：６）を用いてPCRにて増幅させる。pABB-CRS2-Gm（入手先：大阪大学）をテンプレートとしてプライマーpABB-CRS2-GmR-inverse-S（gggaattccacaaattgttatccg；配列番号：７）とpABB-CRS2-GmR- inverse-AS（gggagagctcggatccacta；配列番号：８）を用いてインバースPCR後、DpnI酵素処理したものをバックボーンベクターpABB-CRS2-GmRとする。PT-U、PT-DおよびCmRフラグメントをIn-Fusion HD cloning kit (入手先：Clontech Laboratories)を用いてバックボーンベクターpABB-CRS2-GmRに挿入結合させる。このベクターをΔPT-pABB-CRS2-GmRとする。ΔPT-pABB-CRS2-GmRを形質転換したE. coli DH5α λpir（入手先：大阪大学）とHB101/pRK2013プラスミド伝達ヘルパー株（入手先：大阪大学）を用いた三親接合伝達法を用いて Bp 18323株へのΔPT-pABB-CRS2-GmRのプラスミド挿入を行うことで、相同組換えによりPT遺伝子がCmRと置換されたBp 18323 PT遺伝子欠損変異株を作出する。
（４）結果の考察
これらの結果から、百日咳菌感染マウスの咳発作の程度は、百日咳菌の種類とマウスの系統の組合せによりばらつきがあり、Bp 18323株とC57BL/6マウスの組合せが、もっとも顕著に咳発作を呈することがわかった。また、Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株感染群ではBp 18323株感染群と比較して、気道および肺への定着菌体数は減少していたが、咳発作の回数はさらに顕著に減少した。このことから、PTは百日咳モデルマウスの咳発作発症に関与している可能性が示唆された。
【００１８】
実施例２（百日咳モデル動物を用いた咳発作誘発因子の特定）
（１）百日咳菌体破砕液の作製
Bp 18323株（入手先：大阪大学）並びに、Bp 18323株を基に作製したBp 18323株 PT遺伝子欠損変異株およびBp 18323株 FHA遺伝子欠損変異株を使用する。SS液体培地で液体培養したBp 18323株（病原性モード, Bvg+）、Bp 18323株 PT遺伝子欠損変異株およびBp 18323株 FHA遺伝子欠損変異株のそれぞれの菌液を作製する。ネガティブコントロール群として40 mM MgSO4を含むSS液体培地で液体培養したBp 18323株（非病原性モード, Bvg-）の菌液を使用する。Bvg+で培養した百日咳菌はPTおよびFHAを産生するが、Bvg-で培養した百日咳菌ではそれら因子は産生されない。各種菌液を遠心（8,000×g）後、上澄み液を除去し、137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, and 1.5 mM KH2PO4バッファー, pH 7.4 (D-PBS (-))にて沈殿菌体を懸濁し、超音波破砕器にて百日咳菌体を破砕する。各種菌体破砕液を遠心（8,000×g）後、上澄み液を回収し0.22μmフィルターにて菌体を完全に除去する。これを百日咳菌体破砕液とする。
＜Bp 18323 FHA遺伝子欠損変異株作製方法＞
Bp 18323株 FHA遺伝子欠損変異株は比較例（３）の＜Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株作製方法＞に準じて作製した。以下使用したプライマーの入手先はInvitrogenである。FHA遺伝子の5'末端および3'-末端から約1000bpまでの領域(FHA-UおよびFHA-D)を、Bp 18323株のゲノムDNAをテンプレートとしてプライマーFHA-U-F（gatccgagctctcccaagaacggcacctggac；配列番号：９）とFHA-U-R（ttagcttccttagctaaataggtagtcgcggcc；配列番号：１０）、およびFHA-D-F（cgcgccatttaaatgattccgaccagcgaagtg；配列番号：１１）とFHA-D-R（atttgtggaattccctcagcttctgcagcagg；配列番号：１２）を用いてPCRにて増幅させ、FHA-UおよびFHA-Dフラグメントを調製する。比較例（３）と同様の手法でCmRフラグメントおよびバックボーンベクターpABB-CRS2-GmRを調製する。FHA-U、FHA-DおよびCmRフラグメントをIn-Fusion HD cloning kit (入手先：Clontech Laboratories)を用いてバックボーンベクターpABB-CRS2-GmRに挿入結合させる。このベクターをΔFHA-pABB-CRS2-GmRとする。ΔFHA-pABB-CRS2-GmRを形質転換したE. coli DH5α λpir（入手先：大阪大学）とHB101/pRK2013プラスミド伝達ヘルパー株（入手先：大阪大学）を用いた三親接合伝達法を用いて Bp 18323株へのΔFHA-pABB-CRS2-GmRのプラスミド挿入を行うことで、相同組換えによりFHA遺伝子がCmRと置換されたBp 18323 FHA遺伝子欠損変異株を作出する。
（２）精製PTの作製
Skelton SK et al, J. Clin. Microbiol 28:1062-1065,1990に記載の方法に従いPTを精製した。具体的にはCL液体培地（Imaizumi A et al, Infect. Immun 41:1138-1143, 1983）で液体培養（37度、48時間）したBp18323株の培養液を遠心（12,000×g）後、上澄み液を回収し硫酸アンモニウムを終濃度で1 Mとなるように添加する。butyl-Sepharose 4 Fast Flow（入手先：Amersham）を1 M硫酸アンモニウム溶液で平衡化し、回収した上澄み液を添加する。10 mMリン酸ナトリウム-3 M塩化ナトリウム（pH 7.4）溶液でカラムを洗浄後、5 mMリン酸ナトリウム-50 mM塩化ナトリウム溶液（pH 7.4）で吸着画分を溶出回収する。Fetuin-Agarose (入手先：Sigma)を10 mMリン酸ナトリウム-0.15 M塩化ナトリウム（pH 7.4）溶液で平衡化し、回収した溶出画分を添加し、50 mMトリス塩酸-1 M塩化ナトリウム（pH 7.4）溶液でカラムを洗浄した後、50 mMトリス塩酸-4 M塩化マグネシウム（pH 7.4）溶液で吸着画分を溶出回収する。溶出画分をD-PBS(-)で透析後、限界濾過サイズが3.0 kDaのビバスビンターボ15 (入手先：ザルトリウス) を用いて遠心濃縮した。 
（３）百日咳菌体破砕液経鼻接種動物の作製
7週齢の雄のC57BL/6Jマウス（入手先：日本クレア株式会社、3匹数/群）に、1.0mg/mlの各種菌体破砕液（組成：D-PBS (-)）を、麻酔下で、注射針を用いてマウスの鼻腔内に50μl投与した。対照群(3匹数/群)として、百日咳菌体成分を含まない溶媒（組成：D-PBS (-)、量50μl）を、麻酔下で、同様に投与した（図５のＡおよびＢ）。
7週齢の雄のC57BL/6Jマウス（入手先：日本クレア株式会社、5匹数/群）に、1.0mg/mlの各種菌体破砕液（組成：D-PBS (-)）、精製PT（200ng、組成：D-PBS(-)）、または1.0mg/mlの百日咳菌PT遺伝子欠損菌体破砕液（組成：D-PBS -)）＋精製PT（200ng、組成：D-PBS (-)）を、麻酔下で、注射針を用いてマウスの鼻腔内に50μl投与した。対照群(5匹数/群)として、百日咳菌体成分を含まない溶媒（組成：D-PBS(-)、量50μl）を、麻酔下で、同様に投与した（図５のＣおよびＤ）。
接種後、マウスを個別に観察用ケージに入れ、通常の飼育下で飼育した。
（４）咳発作の観察
実施例１の（２）に従い、Bp 18323株（Bvg+）菌体破砕液接種群、Bp 18323株（Bvg-）菌体破砕液接種群、Bp 18323 FHA遺伝子欠損変異株菌体破砕液接種群、Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株菌体破砕液接種群、および溶媒接種群について、一定時間の咳発作の回数をカウントした（図５のＡ）。上記検体経鼻接種後6〜14日目の咳発作の回数を、Bp 18323株（Bvg+）菌体破砕液接種群と溶媒接種群または、各種菌体破砕液接種群で比較した（図５のＢ）。
その結果、Bp 18323株（Bvg+）菌体破砕液接種群は溶媒接種群と比較して咳発作回数が有意に増加した（図５のＢ）。Bp 18323株（Bvg-）菌体破砕液接種群では、Bp 18323株（Bvg+）菌体破砕液接種群と比較し咳発作回数が有意に減少した（図５のＢ）。またBp 18323株（Bvg+）菌体破砕液接種群と比較し、Bp 18323 FHA遺伝子欠損変異株菌体破砕液接種群では咳発作回数に有意な差が認められなかったのに対し、Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株菌体破砕液接種群では咳発作回数が有意に減少した（図５のＢ）。
実施例１の（２）に従い、百日咳菌18323株（Bvg+）菌体破砕液接種群、Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株菌体破砕液接種群、精製PT接種群、Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株菌体破砕液＋精製PT接種群および溶媒接種群について、一定時間の咳発作の回数をカウントした（図５のＣ）。上記検体経鼻接種後6〜14日目の咳発作の回数を、溶媒接種群、精製PT接種群、Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株菌体破砕液＋精製PT接種群および、その他菌体破砕液接種群で比較した（図５のＤ）。
その結果、溶媒接種群と比較し、精製PT接種群およびBp 18323 PT遺伝子欠損変異株菌体破砕液＋精製PT接種群では咳回数咳発作回数が有意に増加した（図５のＤ）。
（５）結果の考察
これまで百日咳感染症におけるPTの役割、つまりPTと病態の関係は不明なままであったが、本発明の咳発作誘発因子の特定方法により咳発作とPTの関係が明らかとなり、PTは咳発作を引き起こすために重要な因子の一つであることが示された。また精製PTの経鼻接種群において百日咳モデルマウスの咳発作の回数は溶媒群と比較して有意に増加したものの、精製PTのみでは誘発が不十分であることが示唆された。Bp 18323 PT遺伝子欠損変異株菌体破砕液＋精製PT接種群において咳発作が十分に誘導されたことを考え合わせると、菌体成分による宿主組織への炎症などを含む刺激反応が咳発作誘発に重要である可能性が考えられる。
【００１９】
実施例３（DTP-IPVワクチンの評価）
ワクチン投与群として、DTP-IPVワクチン（製品名：テトラビック、入手先：一般財団法人阪大微生物病研究会）用量：0.16IU/ｍL〜1IU/ｍLを、3週齢のC57BL/6Jマウス（入手先：日本クレア株式会社、5匹数/群）に腹腔内投与した。投与3週間後に同用量のDTP-IPVワクチンを腹腔内投与した。
対照として、同様に3週齢のC57BL/6Jマウス（日本クレア株式会社、4匹数/群）に、アルミニウムアジュバント(製品名：Imject（登録商標） Alum、入手先：Thermo scientific)用量 100μlを腹腔内投与した（非ワクチン投与群）。投与3週間後に同用量のアルミニウムアジュバントを腹腔内投与した。
ワクチン最終投与から7日目に、実施例１の（１）に従い、Bp 18323株（0.5〜2×10８cfu/ml）を含む菌液（組成：SS液体培地）をワクチン投与群および非ワクチン投与群４〜５匹/群のマウス鼻腔内に50μl接種し、百日咳モデル動物を作製した。非感染群は、溶媒（組成：SS液体培地）を鼻腔内に50μl接種した。
（１）咳発作の観察
実施例１の（２）に従い、ワクチン投与群、非ワクチン投与群および非感染群について、一定時間の咳発作の回数をカウントした（図６のＡ）。
百日咳菌経鼻接種後6〜14日目の咳発作の回数を、非感染群、非ワクチン投与群、ワクチン投与群で比較した（図６のＢ）。
その結果、DTP-IPVワクチンは、Bp 18323株に感染したC57BL/6マウスに生じる咳発作を有意に抑制した。またこの抑制は、接種したDTP-IPVワクチンの用量依存的であった。
（２）感染防御確認試験
DPT-IPVワクチン投与により、気道および肺において百日咳菌の感染がどの程度防御されたのかを確認するために、実施例１の（２）の方法に従い、ワクチン投与群について、感染後14日目に、気道および肺における定着菌体数を測定した（図６のＣおよびＤ）。
その結果、ワクチン投与群は百日咳菌の肺への定着菌体数は有意に減少した。気道への定着菌体数に有意差はなかった。
（３）抗体価の測定
ワクチン投与群について、ワクチン最終投与後7日目の血清中のマウスの抗PT抗体（抗PT-IgG抗体）価を下記の方法で測定した（図６のＥ）。
96wellプレートにPT（1.0μg/ml）を添加し、４度で１８時間以上反応させた。洗浄バッファー（組成：D-PBS (-)-0.05% Tween20）にて96wellプレートを洗浄後、ブロッキングバッファー（組成：D-PBS (-)-0.5% BSA）を各wellに添加し、37度で１時間反応させた。96wellプレートを洗浄バッファーにて洗浄後、任意の希釈倍率(100、1,000、10,000、100,000倍希釈)に希釈した免疫前のマウス抗血清および、DPT-IPV免疫マウス抗血清を各wellに添加し、37度で１時間反応させた。96wellプレートを洗浄バッファーにて洗浄後、5,000倍希釈した抗マウスIgG-HRP(入手先：Cappel) を各wellに添加し、37度で１時間反応させた。96wellプレートを洗浄バッファーにて洗浄後、TMB (3,39, 5, 59- tetramethylbenzidine) ペルオキシダーゼ酵素基質（入手先：和光純薬工業株式会社）含有溶液を各wellに添加し、室温で30分間反応させた。1.0 N H2SO4を各wellに添加し、反応を停止させた後、96wellプレートをMulti-Detection Microplate Reader (入手先：DSファーマバイオメディカル株式会社) を用いて 450 nm波長の吸光度を測定し、DPT-IPV免疫マウス抗血清中の抗PT-IgG抗体価を算出した。
その結果、ワクチン最終投与後7日目の血清中には、百日咳ワクチンの主成分であるPTに対する充分な抗体が存在していた。
（４）結果の考察
これらの結果から、マウスにおいて百日咳菌の気道への定着を抑制する効果を有さなくても、感染拡大の大きな要因である、咳発作を顕著に抑制できる物質が、ヒトの百日咳感染予防に有用であることが確認された。また、実施例2の（4）の記述と考え合わせると、百日咳ワクチン投与によりマウス体内で産生された抗PT-IgG抗体が、経鼻接種した百日咳菌が産生するPTと結合し、毒性機能阻害することで咳発作を抑制する可能性が示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明の百日咳モデル動物は、安価で利便性が高く、ヒトにおける百日咳菌感染でみられる顕著な咳発作を呈するため、咳発作メカニズムの解明や咳発作の誘発因子特定、百日咳に対する医薬品のスクリーニング評価に有用である。本発明の評価方法は、様々な被験物質を評価することができ、医薬品開発に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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