(57)【要約】【課題】ハロモナス属に属する好塩菌のＰＨＢ生産能力を向上すること。【解決手段】ハロモナス属に属する好塩菌を培養して、ポリ３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、又は３−ヒドロキシ酪酸塩を製造する製造方法であって、ハロモナス属に属する好塩菌用の培地に含有させる有機炭素源として二糖類を用いる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハロモナス属に属する好塩菌を培養して、ポリ３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、又は３−ヒドロキシ酪酸塩を製造する製造方法であって、
ハロモナス属に属する好塩菌用の培地に含有させる有機炭素源として二糖類を用いる製造方法。
【請求項２】
前記培地の浸透圧が、０．８８ＯＳｍｏｌ以下である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記培地の糖類濃度が２０ｇ／Ｌ以上、かつ、０．８８ｍｏｌ／Ｌ以下である請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記培地の糖類濃度が０．５８ｍｏｌ／Ｌ以下である請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記二糖類が、スクロースである請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、又は３−ヒドロキシ酪酸塩を製造する製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
３−ヒドロキシ酪酸やその塩（以下３ＨＢと称する場合がある）は、もともと人の体内に存在する物質であるため生体親和性が高く、糖質に代わる画期的なエネルギー源として期待されている。例えば、ココナツオイルに多く含まれる中鎖脂肪酸の摂取および体内での代謝により生成される３ＨＢが、脳や体内において糖質をうまく利用できないアルツハイマー病、糖尿病の患者の症状を改善させる効果を持つことが知られている。また３ＨＢは体内において糖質よりも速やかにエネルギーに変換されること、細胞への脂肪や糖の吸収を抑制する効果を有することからダイエット・健康食品分野への応用が期待できる。
【０００３】
また、３ＨＢは、人間では肝臓でアセチルＣｏＡから作られ、血中グルコース濃度が少ない時に脳のエネルギー源として使われること、また、腸内細菌の血中への転移を抑制することから、輸液、目薬等として、また、生分解性プラスチックの原料としての利用が検討されている。
【０００４】
３ＨＢの製造方法として、各種微生物にポリ３−ヒドロキシ酪酸（以下ＰＨＢと称する場合がある）を生産させたのち、得られたＰＨＢを酵素等により分解する方法が知られている（特許文献１）。また、このような微生物としてハロモナス菌が、好気条件でＰＨＢを蓄積し、嫌気条件に移行することでＰＨＢを分解して生成した３ＨＢを培地中に分泌産生することが見出されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１６８５９５号公報
【特許文献２】特開２０１３−０８１４０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、これらの方法は、いずれも３ＨＢを単離するのに煩雑な工程を要することから、工業的には、いまだ改善の余地があった。
そこで、微生物により生産される３ＨＢを、より効率よく人が摂取可能な形態として提供できる技術が求められている。
【０００７】
したがって、本発明は上記実状に鑑み、ハロモナス属に属する好塩菌によるＰＨＢの生産能力を向上する点にある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するための本発明のハロモナス属に属する好塩菌を培養して、ポリ３−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）、又は３−ヒドロキシ酪酸塩を製造する製造方法の特徴構成は、
ハロモナス属に属する好塩菌用の培地に含有させる有機炭素源として二糖類を用いる点にある。
【０００９】
つまり、好塩菌は培地中でＰＨＢを生産するが、その炭素源として糖類が用いられる。この糖類濃度が十分に高ければ、ＰＨＢ生産量が多くなる。しかし、ＰＨＢ生産量が多いとはいえ、その生産速度に関しては、糖類濃度によらずあまり変化はない。ところが本発明者らは、鋭意研究の結果、好塩菌用の培地に含有させる有機炭素源として二糖類を用いると、単糖類を用いた場合に比べてＰＨＢ生産速度を向上しうることを見出し、本発明を完成するに至った。ＰＨＢ生産速度が向上すると、同じエネルギー投入条件で比較してＰＨＢの生産能力が向上したことになり、より効率の良いＰＨＢ生産が可能となる。
【００１０】
理論に拘泥されるものではないが、この現象は、以下のように説明される。
ハロモナス菌がＰＨＢを生産する際、培地から糖類を吸収し、その糖類を資化することによりＰＨＢを生成する、ここで、ハロモナス菌が糖類を吸収する際に、培地の浸透圧が低いほど、糖類のハロモナス菌細胞膜透過速度が高くなるため、より効率よくＰＨＢを生産することができると考えられる。そして、所定質量％の単糖類を含む培地と、所定質量％の二糖類を含む培地とを比較した場合、所定質量％の二糖類を含む培地のほうが含有する糖質のモル濃度が低く、浸透圧が低いものとなっている。そのため、好塩菌用の培地に含有させる有機炭素源として二糖類を用いるほうがハロモナス属に属する好塩菌のＰＨＢ生産能力を向上できることになるのである。
【００１１】
なお、浸透圧は、微生物が高浸透圧の環境にさらされると、細胞内の水分が細胞外に移動するため生育が困難になるので、０．８８ＯＳｍｏｌ以下であることが好ましく、
糖類濃度は、ＰＨＢ生産量を確保するために、２０ｇ／Ｌ以上、を維持することが好ましく、低い浸透圧を維持するために０．８８ｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは、０．５８ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましい。
【００１２】
また、二糖類としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等が挙げられるが、中でもスクロースが好ましい。
比較のために単糖類としては、フルクトース、ソルボース、タガトース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース等の六炭糖；リブロース、キシルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、デオキシリボース等の五炭糖等が挙げられる。
【発明の効果】
【００１３】
したがって、ハロモナス属に属する好塩菌のＰＨＢ生産能力およびＰＨＢを経由して生産される３ＨＢや３ＨＢ塩の生産能力を向上することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】３−ヒドロキシ酪酸製造試験結果を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に、本発明の製造方法を説明する。尚、以下に好適な実施例を記すが、これら実施例はそれぞれ、本発明をより具体的に例示するために記載されたものであって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々変更が可能であり、本発明は、以下の記載に限定されるものではない。
【００１６】
〔３ＨＢ製造方法〕
ハロモナス属に属する好塩菌を培養して、３ＨＢ又はその塩を生産する場合に、ハロモナス属に属する好塩菌用の培地に含有させる有機炭素源として二糖類を用いる。
【００１７】
具体的には以下の工程に従って、培養を行う。
（１）ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程１、
（２）培地のｐＨ７以上に調整及び維持し、培地中に３ＨＢ又はその塩を産生させる工程２、及び
（３）工程２で得られる培地から、３ＨＢ又はその塩を回収する工程３。
【００１８】
本発明に係る製造方法によって製造される３ＨＢ又はその塩とは、生体内にて通常の光学活性を持った化合物であり、Ｄ体である。
【００１９】
また、３ＨＢの塩とは、製造時に使用するハロモナス属に属する好塩菌の培地中に含まれる成分に由来する陽イオン及び／又は菌体内に存在する陽イオンによって形成される塩であり、特に限定はされないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、コバルト塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、アンモニウム塩、リチウム塩、銀塩、水銀塩、ストロンチウム塩、バリウム塩、カドミウム塩、ニッケル塩、スズ塩、鉛塩、マンガン塩、アルミニウム塩等が挙げられる。
【００２０】
工程１について
本発明に係る製造方法における工程１は、ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程である。
【００２１】
＜Ａ：好塩菌＞
本発明の製造方法の工程１にて用いる好塩菌は、下記の（ｉ）又は（ｉｉ）のいずれかによって示されるハロモナス属に属する好塩菌を用いればよい。
（ｉ）無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地にて好気的に増殖し、３ＨＢ又はその塩を菌体外の培地中に生産させることを特徴とする好塩菌。
（ｉｉ）無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地にて好気的に増殖し、ＰＨＢを自らの菌体内にて蓄積した後、ｐＨを調整することで、３ＨＢ又はその塩を菌体外の培地に分泌産生することを特徴とする好塩菌。
【００２２】
「無機塩」及び「有機炭素源」については、＜培地＞の欄にて後述する通りにすることができる。
【００２３】
上述のハロモナス属に属する好塩菌は、０．１〜１．０Ｍの塩濃度を適とする好塩性を有し、時には塩を含まない培地においても生育する細菌である。そして、上述のハロモナス属に属する好塩菌は、通常はｐＨ５〜１２程度の培地にて生育する。
【００２４】
上述のハロモナス属に属する好塩菌として、例えば、ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＭ−１株が挙げられる。ハロモナス・エスピーＫＭ−１株は、平成１９年７月１０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３１６として寄託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９９５である。当該ハロモナス・エスピーＫＭ−１株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、ＤＤＢＪにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ４７７０１５として登録されている。
【００２５】
また、上述したようなハロモナス属に属する好塩菌の生育特性等に鑑みて、本発明に係る製造方法において用いる好塩菌として、ハロモナス・エスピーＫＭ−１株以外に、ハロモナス・パンテラリエンシス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｐａｎｔｅｌｌｅｒｉｅｎｓｉｓ：ＡＴＣＣ  ７００２７３）、ハロモナス・カンピサリス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｉｓａｌｉｓ：ＡＴＣＣ  ７００５９７）等も挙げることができる。
【００２６】
さらに、１６ＳリボゾームＲＮＡ配列による分析から、上述のハロモナス属に属する好塩菌に限らず、ハロモナス・ニトリトフィルス、ハロモナス・アリメンタリア等も、本発明に係る製造方法にて用いるハロモナス属に属する好塩菌として使用してもよい。
【００２７】
なお、上述したハロモナス属に属する好塩菌には、遺伝子が導入されていてもよい。導入される遺伝子は、本発明に係る製造方法において、３ＨＢ又はその塩の生産効率等を向上させる機能を発現させるものであれば特に限定されない。例えば、ＰＨＢの発現量を増大させる遺伝子、ＰＨＢの該菌体内への蓄積を上昇させる機能を発現させる遺伝子；３ＨＢ又はその塩を培地にて生産する機能を増大させる遺伝子；３ＨＢ又はその塩の産生量を増大させる遺伝子；ＰＨＢを分解する遺伝子等が挙げられる。組換えＤＮＡの当該菌体への導入方法及びこれによる形質転換方法としては、一般的な各種方法を採用できる。
【００２８】
＜Ｂ：培地＞
工程１にて用いる培地は、無機塩と及び有機炭素源を含有する。培地のｐＨは特に限定されないが、上述した好塩菌の生育条件を満たすｐＨであることが好ましく、具体的にはｐＨ５〜１２程度にすればよい。より好ましくはｐＨ８．８〜１２の培地である。アルカリ性の培地を用いれば、他の菌のコンタミネーションをより効果的に防止することができ、また分泌された３ＨＢがクロトン酸へ変化するのを抑制するので好ましい。
【００２９】
工程１にて用いる培地に配合する無機塩は、特に限定されることは無く、例えばリン酸塩、硝酸塩、炭酸塩、硫酸塩、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、コバルト等の金属塩が挙げられる。
【００３０】
例えば、ナトリウムを無機塩として用いる場合は、ＮａＣｌ、ＮａＮＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３等を用いればよい。
【００３１】
これらの無機塩は、上述の好塩菌にとって窒素源やリン源となるような化合物を用いることが好ましい。
【００３２】
窒素源は、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素、アンモニウム塩等を用いればよく、特に限定はされないが、例えばＮａＮＯ３、ＮａＮＯ２、ＮＨ４Ｃｌ等の化合物を用いればよい。
【００３３】
窒素源の使用量は、菌体の生育に影響を及ぼすことなく、本発明の３ＨＢ又はその塩の生産目的が達成される範囲において適宜設定すればよく、具体的には、培養初期の培地１００ｍｌ当たり通常であれば硝酸塩として５００ｍｇ程度以上とすればよく、より好ましくは１０００ｍｇ程度以上、更に好ましくは１２５０ｍｇ程度以上である。
【００３４】
リン源は、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩等を用いればよく、特に限定はされないが、例えばＫ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４等の化合物を用いればよい。
【００３５】
リン源の使用量も、上記の窒素源の使用量と同様の観点から適宜設定すればよく、具体的には、リン酸二水素塩として培地１００ｍｌ当たり通常は５０〜４００ｍｇ程度とすればよく、より好ましくは１００〜２００ｍｇ程度である。
【００３６】
これらの無機塩は単一で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３７】
その他の化合物等も含めた無機塩は、総量で通常は０．１〜２．５Ｍ程度となる濃度で用いればよく、好ましくは０．２〜１．０Ｍ程度、より好ましくは０．２〜０．５Ｍ程度である。
【００３８】
工程１にて用いる培地に配合する有機炭素源として二糖類を用いる。二糖類は、特に限定はされないが、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等が挙げられる。これらの糖類濃度は、３ＨＢ又はその塩の生産量を確保するために、２０ｇ／Ｌ以上、を維持することが好ましく、低い浸透圧を維持するために０．８８ｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは、０．５８ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましい。
【００３９】
本発明に係る製造方法では、塩濃度が比較的高い条件の培地で、ハロモナス属に属する好塩菌を培養するので、他の菌体の混入、増殖の恐れ等がほとんどない。従って、上述の培地に対して滅菌処理等を行っても行わなくともよく、且つ、簡便な設備で培養することも可能である。
【００４０】
＜Ｃ：培養方法＞
工程１における上述のハロモナス属に属する好塩菌の培養は、好気培養を採用する。工程１における好気培養は、当該菌体が増殖し、且つ、該菌体内にＰＨＢが著量蓄積するような条件となる好気培養である限り、特に限定はされない。
【００４１】
具体的には、５ｍｌ程度の培地に当該好塩菌を植菌し、通常３０〜３７℃程度、攪拌速度は１２０〜１８０ｒｐｍ程度で１晩振盪しながら前培養を行う。続いて前培養して得られた菌体を、三角フラスコ、発酵槽、ジャーファーメンター等に入った培地中に１００倍程度に希釈し本培養する。
【００４２】
本培養は通常２０〜４５℃程度で可能であるが、３０〜３７℃程度で行うことが好ましい。この際の攪拌速度は通常は１５０〜２５０ｒｐｍ程度とすればよい。なお、培養環境は培地が空気に触れる環境とすればよく、培地表面に積極的に酸素を含む気体を吹き付ける方法や培地中に係る気体を吹き込む方法を採用してもよい。
【００４３】
工程１では、このような培養条件でハロモナス属に属する好塩菌を好気培養すればよい。具体的に好気培養時の培地中の溶存酸素濃度は、特に限定はされないが、通常は２ｍｇ／Ｌ以上とすればよく、５ｍｇ／Ｌ以上が好ましい。
【００４４】
工程１での培養方法は、回分培養、半回分培養、連続培養等の培養方法が挙げられ、特に限定はされないが、３ＨＢ又はその塩を効率よく製造するには、本発明に係る方法によって用いる好塩菌が他の菌が混入する可能性が極めて低いことを考慮して長期の連続培養も可能である。そして、培養環境も特に限定はされず、非滅菌環境下であっても滅菌環境下であってもよい。
【００４５】
工程２について
本発明に係る製造方法における工程２は、培地のｐＨ７．０以上に調整及び維持し、培地中に３−ヒロドキシ酪酸又はその塩を産生させる工程である。
【００４６】
培養を継続した場合、有機酸の精製により、培地のｐＨは下がる傾向がある。この様な培地のｐＨは適宜公知のｐＨ測定用装置又はこれが付随したジャーファーメンター等によって確認することができる。
【００４７】
用語「調整及び維持」とは、上述のようなｐＨの確認を行いながら、ｐＨ調整剤を添加してｐＨ７．０以上の状態を保つことを意味する。
【００４８】
工程２にて調整及び維持するｐＨは好ましくは７．５以上、より好ましくは８．０以上、さらに好ましくは８．５以上である。
【００４９】
ハロモナス属に属する好塩菌は、通常は中程度の高塩濃度且つアルカリ条件下で培養することが可能であるため、夾雑菌の混入・繁殖（コンタミネーション）が少ない。しかしながら、一部乳酸菌には、中程度の高塩濃度且つｐＨ８．４以下の環境下において増殖可能な菌も存在し、このような菌が本発明の培養系にコンタミネーションすると、ハロモナス属に属する好塩菌が分泌した３ーヒドロキシ酪酸又はその塩を乳酸発酵の基質として消費してしまい、更には培地のｐＨの一段の低下を生じさせる恐れがある。
【００５０】
このため、本発明において培地を滅菌せず及び／又は非滅菌環境下でハロモナス属に属する好塩菌を培養して、３ＨＢ又はその塩を製造するためには、工程２における培地のｐＨの調整及び維持をｐＨ８．５程度以上とすることが好ましい。
【００５１】
ｐＨ調整剤としては、特に限定はされないが、例えば水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩等が挙げられる。より具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム、炭酸水素マグネシウム、アンモニア水等が挙げられ、中でも弱アルカリ性を示すものが好ましく、炭酸水素ナトリウム、アンモニア水が最も好ましい。
【００５２】
工程２において、「培地中に３ＨＢを生産させる」とは、工程１〜２にて培養して得られたハロモナス属に属する好塩菌体内から、その培地中に３ＨＢを分泌させることを意味する。
【００５３】
そして、「培地中に３ＨＢの塩を生産する」とは、工程１及び２にて培養して得られたハロモナス属に属する好塩菌体内から、その培地中に３ＨＢの塩を分泌させることのみならず、工程１及び２にて培養して得られたハロモナス属に属する好塩菌体内から培地中に分泌された３ＨＢが、培地中に存在する陽イオン成分と反応して、３ＨＢの塩を形成することも意味する。
【００５４】
陽イオン成分とは、培地中に含まれているものであれば、特に限定はされないが、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、コバルトイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン、モリブデンイオン、アンモニウムイオン、マンガンイオン等が挙げられる。
【００５５】
ｐＨの調製時期は、菌体内でのＰＨＢの蓄積量がほぼ一定となる時期であれば特に限定されないが、例えば、工程１によって得られるハロモナス属に属する好塩菌体中のＰＨＢの蓄積量が乾燥菌体１００重量部当たり１５重量部程度以上となる時期等が挙げられる。      
【００５６】
また、工程１によって得られるハロモナス属に属する好塩菌体の乾燥菌体重量が培地１Ｌ当たり３０重量部程度以上となる時期であってもよい。
【００５７】
具体的なハロモナス属に属する好塩菌体中のＰＨＢの蓄積量は、下記の実施例に示す方法を採用して測定する。
【００５８】
工程３について
本発明に係る製造方法における工程３は、上記工程２で得られた培地中から、３ＨＢ又はその塩を回収する工程である。ここで、回収とは培地中に３ＨＢ又はその塩が存在している時に上述の工程２の培養を停止し、３ＨＢ又はその塩を含む培地と、上記好塩菌体を分離すればよい。
【００５９】
具体的な分離の手法は、遠心操作、濾過等の公知の固液分離の操作を採用すればよい。また、培養の停止方法も特に限定はされず、例えば、上記工程２によって得られるハロモナス属に属する好塩菌を加熱、酸処理等の方法によって殺菌する方法、遠心操作、濾過等の公知の固液分離手段を用いて培地と前記好塩菌体を分離する方法等が挙げられる。
【００６０】
培地中に３ＨＢ又はその塩が含まれたまま培養をし続けて、特に培養条件が好気的になればなるほど、ハロモナス属に属する好塩菌体から培地中に分泌された３ＨＢ又はその塩が、当該好塩菌体内に再度取り込まれて利用される傾向となり、培地中の３ＨＢ又はその塩が減少し、最終的には培地からこれらが消失してしまう。
【００６１】
培地中の３ＨＢ又はその塩の存在を確認する方法は、菌種、培地成分、培養条件等により変わり得るものであるので、これらの要素を考慮して適宜決定する。例えば、継時的に培地を採取し、これをキャピラリー電気泳動等の分析方法を供して、培養を停止する時間を決定することもできる。
【００６２】
なお、回収される３ＨＢの塩は、培地中に含まれる無機塩に基づくナトリウム、カルシウム等のアルカリ金属；アルカリ土類金属陽イオン等と反応したアルカリ金属塩として回収される。従って、３ＨＢを製造するには、回収した培地を塩析等の常法に供すればよい。
【００６３】
また、回収した培地を適切なカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによって精製工程に供してもよい。これら以外の他の方法として、回収した培地のｐＨを適宜変更して、所望の３ＨＢ又はその塩のいずれかを精製工程に供してもよい。また、回収した培地に低級アルコール類を添加し、エステル化反応を経て、３ＨＢエステルとして蒸留等で精製することも可能である。
【００６４】
本発明に係る製造方法には、上記工程１の後であって及び工程２の前に、培地中に、窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する工程を含んでいてもよい。
【００６５】
すなわち、本発明に係る製造方法には、以下に示す工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む方法も包含される。
（Ａ）ハロモナス属に属する好塩菌を、有機炭素源及び無機塩を含有する培地中で好気培養する工程Ａ、
（Ｂ）窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する工程Ｂ、
（Ｃ）培地のｐＨ７以上に調整及び維持し、培地中に３−ヒロドキシ酪酸又はその塩を産生させる工程Ｃ、及び
（Ｄ）工程Ｃで得られる培地中から、３ＨＢ又はその塩を回収する工程Ｄ。
【００６６】
工程Ａは上記工程１と、工程Ｃは上記工程２と、そして工程Ｄは上記工程３と同様とすることができる。
【００６７】
工程Ｂは、窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する工程である。
【００６８】
すなわち、上記工程Ｂでは、窒素源のみを添加してもよいし、更に金属塩及び／又はホウ酸塩を添加してもよい。窒素源並びに金属塩及び／又はホウ酸塩の添加時期は、同一であっても異なっていてもよく、特に限定はされないが、異なる場合は窒素源の添加の後に金属塩及び／又はホウ酸塩を添加することが好ましい。
【００６９】
なお、金属塩及びホウ酸塩を添加する際の添加時期は、同一であっても、異なっていてもよく、特に限定はされない。
【００７０】
窒素源は、上記工程１（工程Ａ）において詳述した通りとすればよい。
【００７１】
金属塩は、特に限定はされないが、例えば亜鉛塩、モリブデン塩、マンガン塩、銅塩、コバルト塩等が挙げられる。これらの金属塩は適宜組み合わせて添加すればよく、特に限定はされないが、少なくともモリブデン塩を含む組み合わせとすることが好ましい。
【００７２】
具体的にはモリブデン塩、亜鉛塩、マンガン塩、銅塩、及びコバルト塩を含む金属塩；モリブデン塩、銅塩を含む金属塩；モリブデン塩、亜鉛塩を含む金属塩；モリブデン塩、マンガン塩を含む金属塩；モリブデン塩、コバルト塩を含む金属塩等の組み合わせが挙げられる。
【００７３】
ホウ酸塩は、特に限定はされないが例えばホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）、メタホウ酸（ＨＢＯ２）ｎ、過ホウ酸（ＨＢＯ３）、次ホウ酸（Ｈ４Ｂ２Ｏ４）、ボロン酸（Ｈ３ＢＯ２）、ボリン酸（Ｈ３ＢＯ）等が挙げられる。
【００７４】
工程３における、窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する時期は、特に限定はされないが、例えば培地のＯＤ６００の値が５０以上となる時期にすればよい。ＯＤ６００の測定方法は、市販の分光光度計を用いて測定する。
【００７５】
窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加する時期は特に限定はされないが、工程Ａによって得られるハロモナス属に属する好塩菌体中のＰＨＢの蓄積量が乾燥菌体１００重量部当たり５重量部以上となる時期等が挙げられる。
【００７６】
また、工程Ａによって得られるハロモナス属に属する好塩菌体の乾燥菌体重量が培地１Ｌ当たり１５重量部以上となる時期であってもよい。
【００７７】
工程Ｂにおける窒素源の添加量は、特に限定はされないが、通常は１００重量部の培地に対して、硝酸ナトリウムとして０．１〜０．５重量部程度、尿素として０．０７〜０．３５重量部程度とすればよい。また、工程Ｂにおける金属塩の添加量は、特に限定はされないが、通常は１００重量部の培地に対して０．０２〜０．２５０重量部程度とすればよい。そして、工程Ｂにおけるホウ酸塩の添加量も、特に限定はされないが、通常は１００重量部の培地に対して０．１４３〜０．２８６重量部程度とすればよい。なお、金属塩及びホウ酸塩の添加量の合計は、１００重量部の培地に対して通常は０．０２〜０．２８６重量部程度とすればよい。
【００７８】
窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される、少なくとも１つを添加する回数は、特に限定はされないが、通常は１〜５回程度とすればよい。複数回添加する場合、上述の培養条件下であれば、３〜２４時間の間隔を空ければよい。
【００７９】
なお、上述した窒素源、金属塩、及びホウ酸塩からなる群より選択される少なくとも１つを添加した後、引き続いて行う工程Ｃまでの所定の時間は、上記工程１（工程Ａ）に示す培養条件と同様の培養条件にて培養を行えばよい。
【００８０】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。なお、本発明が実施例に限定されないことは言うまでも無い。
【実施例】
【００８１】
本実施例では、ハロモナス属に属する好塩菌を用いた３ＨＢ又はその塩を製造する方法について具体的に詳述する。
【００８２】
表１に示すＳＯＴ改５（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ  Ｍｅｄｉｕｍ改５）を基本にした培地を用いた。この培地は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（国立環境研究所のＨＰ）であり、ＮａＨＣＯ３及びＮａ２ＣＯ３の量を調整し、窒素源のＮａＮＯ３を５倍に、リン源のＫ２ＨＰＯ４を４倍に増加させて調整した。上記の培地を調整した後のｐＨは９．４±０．１であり、オートクレーブ等の滅菌操作は行わずにそのまま用いた。
【００８３】
培養の際には、上述の培地に対して各種有機炭素源を適宜追加して用いた。具体的な有機炭素源として、それぞれ培地中での終濃度が２０％もしくは２５％となるスクロースを使用した。
【００８４】
【表１】
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【００８５】
＜３ＨＢ又はその塩の測定＞
本実施例における培地にて生産される３ＨＢ又はその塩の測定は、〔Ｍｏｎｔｅｉｌ−Ｒｉｖｅｒａ  Ｆら．２００７  Ｊｕｎ  ２２；１１５４（１−２）：３４−４１  Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ〕に記載されたポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）分析の手法を応用した以下の方法にて行った。
【００８６】
培地を遠心分離して上清のみ採取し、５０μＬを乾燥させた。この上清乾燥物に、３ｖｏｌ％のＨ２ＳＯ４を含むメタノール０．５０ｍｌを加え１０５℃で１時間加熱し、３ＨＢまたはその塩をすべて３ＨＢメチルに変換した。
【００８７】
その後、室温まで冷却し、次いでクロロホルム０．５０ｍｌ及び蒸留水０．２５ｍｌを加えて激しく攪拌した後、１分間遠心分離工程に供して１μｌのクロロホルム層サンプルとして分取した。そして、ガスクロマトグラフ装置を用いて、サンプル中の３ＨＢの量を測定した。
【００８８】
一方で、３ＨＢの標品を上清乾燥物と同様の処理等を行い、これを基準として培地１Ｌ当たりの３ＨＢ蓄積率（３ＨＢ（ｇ）／上清液（Ｌ））を求めた。また、「Ｆ−キット  Ｄ−３ＨＢ」（株式会社Ｊ．Ｋ．インターナショナル）のキットでは、Ｄ体のみが検出される。このキットでの測定値と、ガスクロマトグラフ装置での測定値が一致したことから、分泌された３ＨＢはほぼＤ体であることが確認された。
【００８９】
＜ＰＨＢ蓄積率測定＞
本実施例における菌体内に蓄積されたＰＨＢの蓄積量の測定は、〔Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １０２，Ｉｓｓｕｅ  １２，Ｊｕｎｅ  ２０１１，Ｐａｇｅｓ  ６７６６−６７６８  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｕ．Ｕｇｗｕ，Ｙｕｔａｋａ  Ｔｏｋｉｗａ  ａｎｄ  Ｔｏｓｈｉｏ  Ｉｃｈｉｂａ〕に記載の手法を適宜採用した以下に示す方法で行った。
【００９０】
上記培養した培地を遠心分離して菌体のみ採取し、蒸留水で数回洗浄したのち乾燥させた。この乾燥菌体１〜３ｍｇに、３ｖｏｌ％のＨ２ＳＯ４を含むメタノール０．５０ｍｌを加え１０５℃で３時間加熱した。その後、室温まで冷却した後、０．５０ｍｌのクロロホルム及び０．２５ｍｌの蒸留水を加えて激しく攪拌した。
【００９１】
その後、１分間遠心分離工程に供して１μｌのクロロホルム層サンプルとして分取したそして、ガスクロマトグラフ装置を用いて、サンプル中のＰＨＢの量を測定した。
【００９２】
一方で、ＰＨＢの標品を乾燥菌体と同様の処理等を行い、これを基準として乾燥菌体当たりのＰＨＢ蓄積率（ＰＨＢ（ｇ）／乾燥菌体重量（ｇ））を求めた。
【００９３】
＜ハロモナス属に属する好塩菌のプレ培養＞
ハロモナス属に属する好塩菌（ハロモナス・エスピーＫＭ−１株を、プレート培養より、１６．５ｍｍ径の試験管に５ｍｌの上記ＳＯＴ５改培地に炭素源として上述のグルコースではなく、１ｗ／ｖ％グルコースを加えて、３７℃で１晩振盪培養した。
【００９４】
＜ハロモナス属に属する好塩菌の培養、サンプルの回収等＞
製造例１
プレ培養した各種ハロモナス属に属する好塩菌体０．２ｍｌを、１００ｍｌ容の三角フラスコに入れた上記ＳＯＴ改５培地１５００ｍｌに混合して植菌し、シリコセンをした。これを、３３℃で撹拌速度を２００ｒｐｍとなる条件にて振盪培養し、２４時間後から、およそ１２時間おきに培地を０．５ｍｌずつ回収して、上清中の３ＨＢ又はその塩の量を測定した。
【００９５】
有機炭素源は２０重量％のグルコース（比較例）、スクロース（実施例１）となるように培地に添加した。なお、グルコースを用いた場合の培地の糖類ｍｏｌ濃度は、１．１１ｍｏｌ／Ｌであり、培地の浸透圧は、１．１１ＯＳｍｏｌであり、スクロースを用いた場合は、糖類ｍｏｌ濃度は、０．５８ｍｏｌ／Ｌであり、培地の浸透圧は、０．５８ＯＳｍｏｌであった。
【００９６】
培養当初は、撹拌速度を２００ｒｐｍと好気的な条件で培養した。培地は、サンプリング後、再度シリコセンをし、３３℃で振盪培養を継続し、回分培養した。
【００９７】
図１に示す結果から、有機炭素源としてスクロースを用いた実施例１では、グルコースを用いた比較例に比べて、急速なＰＨＢを含有する菌体の増加が見られた。また、図１において、各糖類の消費速度もスクロースを用いたものの方が早いことが分かった。
【００９８】
最適浸透圧下で培養を行うとより早くＰＨＢを蓄積することがわかった。蓄積したＰＨＢは全量３ＨＢへと分解されることより、３ＨＢ生産速度が向上することが期待される。
また、菌体増殖及び、ＰＨＢ蓄積が好適となる浸透圧０．８８ＯＳｍｏｌ以下を保ちながら、糖類濃度を２０ｇ／Ｌ以上とすることで、好適な培養によるＰＨＢ生産が実現できることも分かり、このような場合、二糖類としてスクロースが好適に用いられることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明の製造方法によると、効率よく３ＨＢを生産するのに利用することができる。
【図１】
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