(57)【要約】【課題】アクリル樹脂原料となるメタクリル酸の製造に適用可能な耐性菌を得る。【解決手段】メタクリル酸存在下における比増殖速度が増大したメタクリル酸耐性微生物を提供する。本微生物は、実験室進化、又は変異型ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子を微生物に導入することによって製造することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子（pykF）を有する微生物において、
上記遺伝子に変異を有し、
上記変異が、コードされたピルビン酸キナーゼの活性が野生型微生物における活性と比較して低下をもたらす少なくとも１つの遺伝学的修飾であり、かつ
培地中にメタクリル酸が存在する条件下において増殖を維持する
ことを特徴とする非天然に生じる微生物。
【請求項２】
上記メタクリル酸がメタクリル酸塩として上記培地中に添加されている、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
上記メタクリル酸塩がナトリウム塩である、請求項２記載の微生物。
【請求項４】
ピルビン酸キナーゼ活性の低下が、野生型微生物と比較して30％以上である、請求項１〜３のいずれか１項記載の微生物。
【請求項５】
変異型ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子が導入された、請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物。
【請求項６】
細菌類、酵母類、及び真菌類から選択される、請求項１〜５のいずれか１項記載の微生物。
【請求項７】
メタクリル酸耐性微生物の製造方法であって、
細菌類、酵母類、及び真菌類から選択される微生物をメタクリル酸塩の存在下で培養し、
増殖した細胞からクローンを取得し、そして
該クローンを更に培養する、
ことを含む、上記方法。
【請求項８】
メタクリル酸耐性微生物の製造方法であって、
変異型ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子を細菌類、酵母類、及び真菌類から選択される微生物に導入し、そして
導入された変異型微生物を培養する、
ことを含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタクリル酸耐性微生物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタクリル酸は、刺激臭のある腐食性の液体であり、工業的にはエステルの形で、アクリル樹脂等の合成ポリマー原料としての用途に限らず、塗料や接着剤、塗料の溶剤等に広く使用される。例えば、アクリル樹脂は、透明度が高く、優れた耐候性を有することから、ガラスに代わる有用な素材として高い需要がある。
【０００３】
工業的に用いられるメタクリル酸の製造法において、従来の化学合成では収率が50％に過ぎない。
【０００４】
一方、持続可能社会の実現を目指し、石油をはじめとする化石資源に依存せず、バイオテクノロジーにより微生物や酵素の働きを利用して化学製品を生産する（バイオプロダクション）ための技術開発が進められている。例えば、微生物を用いて生産されるプラスチックは、カーボンニュートラルで再生可能であり、環境に優しい材料として期待されている。
【０００５】
近年、いわゆる実験室進化によって微生物を改変する手法が知られるようになった（例えば非特許文献１〜５）。実験室進化とは、ある環境下で長期間世代を経させることにより、その環境への適応過程を直接的に観察することを可能とする手法である。ハイスループット配列決定等の測定技術の進展によって、実験室進化における表現型及び遺伝子型の変化を定量することが可能となる。
【０００６】
実験室進化は、有用微生物の育種法としては、変異剤を用いた育種と比較して有害な変異や中立な変異の固定率を低減させることが可能であり、耐性化要素の同定が比較的容易であるという特徴を有する。しかしながら、適応進化のメカニズムや原理に関する知見は未だ十分に蓄積されておらず、どのような突然変異が起こると耐性に影響がもたらされるかを予想することは困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nat. Rev. Genet. 4, 457-69 (2003)
【非特許文献２】Mol. Syst. Biol. 7, 509 (2011)
【非特許文献３】Nature 461, 1243-1247 (2009)
【非特許文献４】Genome Biol. 10, R118 (2009)
【非特許文献５】Science 335, 457-461 (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
微生物を利用したプラスチック生産においては、有用微生物の発見や培養法の確立等の開発が求められている。しかしながら、例えばアクリル樹脂原料となるメタクリル酸を微生物で製造する場合、微生物にとってメタクリル酸が毒性を有し得ることがこの方法を困難にし得る。従って、メタクリル酸製造に適用可能な微生物を得ることが必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、生物学的な手法によって生産できる有用な候補物質として想定されるメタクリル酸に対して耐性を有する大腸菌を実験室進化によって育種し、耐性化に寄与する変異の同定とその評価を行った。
【００１０】
具体的には、メタクリル酸として、そのナトリウム塩を用い、一定濃度のメタクリル酸塩の存在下において、所定の時間（約９００時間）の植え継ぎ培養を行い、互いに独立する複数の系列で実験室進化を行い、比増殖速度を指標として耐性株を選択し、メタクリル酸に対する耐性化と変異の関係を調べたところ、顕著に高い比増殖速度を示した全ての耐性株において、解糖系酵素ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子pykFに変異が生じていることが判明した。次いで、この変異を親株に導入した組換え株をメタクリル酸ナトリウム添加培地で生育させたところ、比増殖速度の回復が見られた。更に、これら変異体においては、ピルビン酸キナーゼの活性がいずれも低下していることを見出した。
【００１１】
本発明者等は、上記の知見に基づき、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子（pykF）を有する微生物において、
上記遺伝子に変異を有し、
上記変異が、コードされたピルビン酸キナーゼの活性が野生型微生物における活性と比較して低下をもたらす少なくとも１つの遺伝学的修飾であり、かつ
培地中にメタクリル酸が存在する条件下において増殖を維持する
ことを特徴とする非天然に生じる微生物。
２．上記メタクリル酸がメタクリル酸塩として上記培地中に添加されている、上記１記載の微生物。
３．上記メタクリル酸塩がナトリウム塩である、上記２記載の微生物。
４．ピルビン酸キナーゼ活性の低下が、野生型微生物と比較して30％以上である、上記１〜３のいずれか記載の微生物。
５．変異型ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子が導入された、上記１〜４のいずれか記載の微生物。
６．細菌類、酵母類、及び真菌類から選択される、上記１〜５のいずれか記載の微生物。
【００１２】
７．メタクリル酸耐性微生物の製造方法であって、
細菌類、酵母類、及び真菌類から選択される微生物をメタクリル酸塩の存在下で培養し、
増殖した細胞からクローンを取得し、そして
該クローンを更に培養する、
ことを含む、上記方法。
８．メタクリル酸耐性微生物の製造方法であって、
変異型ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子を細菌類、酵母類、及び真菌類から選択される微生物に導入し、そして
導入された変異型微生物を培養する、
ことを含む、上記方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、メタクリル酸に対して耐性が向上した微生物が得られる。この微生物は、微生物によるプラスチック等の化学製品の生産に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】8.75 mMのメタクリル酸ナトリウム存在下で増殖させた細胞株（耐性株１〜５）の比増殖速度（1/h）を示す。
【図２】全ゲノム解析で見出されたメタクリル酸耐性株１〜５で変異のあった箇所を示す。
【図３】ピルビン酸キナーゼ酵素活性の測定に用いたアッセイ系を示す。
【図４】親株及びメタクリル酸耐性株１〜５におけるピルビン酸キナーゼ酵素活性を示す。Ａ：ピルビン酸キナーゼ1mg/ml、フルクトース-1,6-ビスリン酸なし、Ｂ：ピルビン酸キナーゼ0.01mg/ml、フルクトース-1,6-ビスリン酸0.15mM、Ｃ：ピルビン酸キナーゼ0.01mg/ml、フルクトース-1,6-ビスリン酸1.5mM。
【図５】耐性株３の変異pykF（E71D）を親株に導入した組換え株のメタクリル酸（MCL）ストレス下での比増殖速度を親株及び耐性株３と共に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子（pykF）を有する微生物において、
上記遺伝子に変異を有し、
上記変異が、コードされたピルビン酸キナーゼの活性が野生型微生物における活性と比較して低下をもたらす少なくとも１つの遺伝学的修飾であり、かつ
培地中にメタクリル酸が存在する条件下において増殖を維持する
ことを特徴とする非天然に生じる微生物を提供する。
【００１６】
本発明の微生物は、ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子（pykF）を有し、上記遺伝子に変異を有する。ピルビン酸キナーゼは、中心代謝経路においてホスホエノールピルビン酸（PEP）からピルビン酸への変換を触媒する酵素である。
【００１７】
上記変異は、コードされたピルビン酸キナーゼの活性が野生型微生物における活性と比較して低下をもたらす少なくとも１つの遺伝学的修飾である。変異の種類は特に限定するものではないが、1個以上のヌクレオチドの置換・欠失・挿入によってコードされるアミノ酸配列に変更をもたらし、その結果活性が低下するものであり得る。例えば、ピルビン酸キナーゼは、二量体又は四量体を形成して複合体として活性を発揮し得る酵素であることが知られているが、活性低下をもたらす変異は、複合体形成を阻害する変異であり得る。また、活性低下をもたらす変異は、ピルビン酸キナーゼとその基質化合物、例えばATPとの結合を阻害する変異であり得る。
【００１８】
ピルビン酸キナーゼの酵素活性が低下する変異として、例えば配列番号１に示されるアミノ酸配列において、基質との結合に関与する領域にあるアミノ酸の1個以上に置換が生じている変異が挙げられる。かかるアミノ酸の置換位置としては、例えば9位、12位、71位、293位、321位等が挙げられる。従って、本発明の微生物は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、9位、12位、71位、293位、及び321位のアミノ酸の1個以上に変異を有するピルビン酸キナーゼを発現する微生物であり得る。しかしながら、上記変異は、酵素活性の低下をもたらすものであればいずれでも良く、上記の変異に限定されるものではなく、上記の変異と異なる変異を有するものであっても、上記の変異に加えて更なる変異を有するものであっても良い。
【００１９】
本発明の微生物は、野生型微生物と比較してピルビン酸キナーゼ活性が低下しており、活性の低下は、野生型微生物における活性と比較して30％以上、40％以上、又は50％以上であり得る。ピルビン酸キナーゼ活性は、例えばin vitroにおいて、ピルビン酸及びATPを基質としてホスホエノールピルビン酸（PEP）及びADPを生成する反応、又はPEP及びADPを基質としてピルビン酸及びATPを生成するその逆反応を触媒するピルビン酸キナーゼ活性を測定することによって決定することができる。また、これらの反応と更なる反応を組合せて、活性の検出が容易なアッセイ系を作製することができる。例えば、ピルビン酸が生成する反応と組合わせて、ピルビン酸及びNADHを基質として乳酸及びNAD+を生成する反応を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼを用いて、NADHの消費量又は消費速度を340nmにおける吸光度を測定することで、ピルビン酸キナーゼ活性を測定することができる（図３）。当業者であれば、ピルビン酸キナーゼ酵素活性を測定し得る適切な反応系を適宜構築することができる。
【００２０】
本発明の微生物はまた、培地中にメタクリル酸が存在する条件下において増殖を維持し得ることを特徴とする非天然に生じる微生物である。
【００２１】
本発明の微生物は、メタクリル酸がほとんど存在しない、微生物が生息する通常の自然環境に比べ、メタクリル酸が高濃度に存在する環境下で増殖可能であり、親株と比較して有意にメタクリル酸耐性が向上している。
【００２２】
上記メタクリル酸が高濃度に存在する環境下とは、微生物の培養液中のメタクリル酸濃度により規定することができる。
【００２３】
メタクリル酸は、塩基と塩基付加塩を形成することができるが、本発明においては、メタクリル酸を通常使用される塩基付加塩として使用すればよい。該塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等を挙げることができ、特に限定されない。このうち、培地のｐＨ調節等の観点から、メタクリル酸ナトリウムが好ましい。従って、本発明の微生物は、培地中にメタクリル酸がメタクリル酸塩、例えばナトリウム塩として添加された条件下で増殖を維持する。
【００２４】
上記メタクリル酸濃度は、選択する微生物毎に、その微生物が生息する通常の自然環境中のメタクリル酸濃度を基準にして、適宜設定すればよい。例えば大腸菌を使用する場合、例えば培地中のメタクリル酸ナトリウム濃度は、大腸菌を死滅させることなく、比較的短期に耐性化を獲得させる観点から、4ｍM以上16ｍM以下の範囲に適宜設定されることが好ましく、8ｍM以上とされることがより好ましい。
【００２５】
本発明の微生物において、メタクリル酸耐性は、比増殖速度を指標として、取得したメタクリル酸耐性菌の使用条件に応じて適宜設定すればよい。
【００２６】
すなわち、上記「増殖を維持する」とは、例えば微生物の比増殖速度によって決定することができる。比増殖速度は、初期細胞濃度と最終細胞濃度から算出される増殖速度により決定される。
【００２７】
上記比増殖速度は、例えば培地中のメタクリル酸ナトリウム濃度を８ｍM以上とする場合、0.3（1/h）以上であれば良い。また、本発明において、上記比増殖速度が0.4（1/h）以上、更に0.5（1/h）以上のものを取得することができる。
【００２８】
pykF変異がメタクリル酸耐性に寄与するメカニズムは不明であるが、メタクリル酸ストレスによって引き起こされるピルビン酸の細胞内蓄積が耐性のメカニズムに関連している可能性がある。
【００２９】
PEP/ピルビン酸濃度比は、糖ホスホトランスフェラーゼ系（PTS）を介したグルコースの取り込みを含む、様々な代謝経路を調節する重要なパラメーターであるため、変異によるPykF活性の低下は、メタクリル酸ストレスによって崩れたPEP/ピルビン酸比の均衡を取り戻す役割を果たしている可能性がある。
【００３０】
本発明の微生物はまた、変異型ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子が導入された微生物であり得る。変異型ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子とは、例えば1個以上のヌクレオチドの置換・欠失・挿入等の少なくとも１つの遺伝学的修飾を有し、コードされるタンパク質のアミノ酸配列に変更をもたらし、その結果、ピルビン酸キナーゼ活性が低下するものであり得る。本発明の微生物は、好ましくはピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子が置き換わっており、野生型微生物と比較してピルビン酸キナーゼ活性が低下したものである。活性の低下は、野生型微生物における活性と比較して30％以上、40％以上、又は50％以上であり得る。
【００３１】
遺伝子配列を変異させる方法としては、遺伝子組換え技術を好適に用いることができる。遺伝子を導入するための方法として、限定するものではないが、例えば、実施例に記載するように、Posfai等によって開発されたマーカーレス組換え法（Posfai G. et al., Nucleic Acids Res., 1999, 27(22), 4409-4415）を用いることができる。尚、ピルビン酸キナーゼのアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列は、それぞれデータベースに登録されており、例えば大腸菌では全ゲノム配列が解読されており（GenBank: CP015085.1、NCBI Gene ID: 946179）、コードされるピルビン酸キナーゼのアミノ酸配列は例えばGenBank EGT68408.1に登録されている（配列番号１）。
【００３２】
野生型の微生物は、メタクリル酸存在下では増殖が顕著に低下するのに比較して、pykFに変異が導入された微生物は、メタクリル酸ナトリウム存在下での増殖が維持され、野生型微生物と比較してメタクリル酸耐性が有意に増大している。
【００３３】
本発明の微生物は、特に限定するものではないが、例えば大腸菌（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、枯草菌（Bacillus subtillis）等のバチルス属細菌、ストレプトミセス属、ストレプトコッカス属等の放線菌等の細菌類；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属酵母、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）等のピチア属酵母等の酵母類；アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）等のアスペルギルス属菌、糸状菌等の真菌類であり得る。
【００３４】
なかでも、工業的利用の観点から、圧力耐性や温度耐性を有する大腸菌、コリネバクテリウム属細菌、枯草菌、酵母類、真菌類、糸状菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。
【００３５】
微生物の培養条件は、選択する微生物に依存する。当業者であれば、種々の細菌類、酵母類、真菌類等の微生物に応じて適切な培地及び培養条件を選択することができ、特に限定するものではない。例えば大腸菌の培養条件は、以下及び実施例に記載した通りである。
【００３６】
具体的には、培地に添加する上記メタクリル酸としては、培地に添加できる形態であれば、特に限定されず、ナトリウム塩等の塩が使用可能である。
【００３７】
培地は液体培地であっても固体培地であってもよいが、菌体外に分泌される生成物の回収のし易さという観点から、液体培地であることが好ましい。培地は、微生物の培養に必要な成分の他、高生産させることを意図する芳香族化合物等の生合成の原料となり得る炭素源を含むものであればよい。
【００３８】
炭素源としては、特に限定するものではないが、好ましくは、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、グリセロール、グルコース-6-リン酸、フルクトース-6-リン酸、フルクトース-1,6-ビスリン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸、1,3-ビスホスホグリセリン酸、3-ホスホグリセリン酸、2-ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、アセチルCoA等であり、より再生可能資源であるバイオマスを原料に用いたクリーンな製造方法を提供するために、バイオマスの主成分であるグルコースがより好ましい。また、培地中に添加する炭素源の量は、炭素源の種類、微生物の種類等に応じて適宜調整され得るが、通常、20〜200 g/Lであり、好ましくは20〜50 g/Lである。
【００３９】
微生物の培養に必要な成分としては特に制限はないが、酵母抽出エキス、ポリペプトン、トリペプトン、カゼイン及びその代謝物、コーンスティープリカー、大豆タンパク質、肉エキス、魚肉エキス等の窒素源が挙げられる。また、マグネシウム塩、ナトリウム塩、鉄塩、マンガン塩等の金属塩が添加されていることが好ましい。金属塩としては、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸鉄(II)、硫酸鉄(III)、塩化鉄(II)、塩化鉄(III)、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム二水和物、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンが挙げられる。さらに必要に応じ、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシンといったビタミン類、核酸関連物質等を培地に添加してもよい。
【００４０】
また、培地には、タンパク質の発現を誘導するための物質、例えばIPTG等や、細胞の選択のために使用する抗生物質、例えば、ペニシリン系、β-ラクタム系、マクロライド系、クロラムフェニコール系、テトラサイクリン系、アミノグリコシド系、ケトライド系、ポリエンマクロライド系、グリコペプチド系、核酸系、ポリドンカルボン酸系等の抗生物質を添加してもよい。
【００４１】
培養の条件としては、微生物が培地中で増殖することができ、かつ目的化合物を生合成できる条件であればよく、当業者であれば、大腸菌の種類、用いる培地等に合わせて、培養温度、空気の添加の有無、酸素の濃度、二酸化炭素の濃度、培地のpH、培養の際の振盪速度培養時間、湿度等を適宜調整し、設定することができるが、培養温度に関しては通常25℃〜40℃であり、大腸菌の増殖速度を最大にし易いという観点から、好ましくは37℃である。また、大腸菌を培養するために好適な培地のpHは7.0であり、培養の際の振盪速度としては、通常180〜300 rpmであり、好ましくは180〜200 rpmである。
【００４２】
本発明はまた、メタクリル酸耐性微生物の製造方法を提供する。
一実施形態において、本発明の方法は、
細菌類、酵母類、及び真菌類から選択される微生物をメタクリル酸塩の存在下で培養し、
増殖した細胞からクローンを取得し、そして
該クローンを更に培養する、
ことを含む。
【００４３】
別の実施形態において、本発明の方法は、
変異型ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子を細菌類、酵母類、及び真菌類から選択される微生物に導入し、そして
導入された変異型微生物を培養する、
ことを含む。
【００４４】
当業者であれば、本明細書の記載及び当分野における技術常識に基づいて、上記本発明の方法を適切に実施することができる。
【実施例】
【００４５】
［実施例１］実験室進化によるメタクリル酸ナトリウム耐性株の取得
野生型大腸菌を親株として用いて、実験室進化による耐性菌の取得を試みた。
大腸菌MDS42株（Scarab Genomics社より購入）を実験室進化の親株として使用した。細胞を、96ウェルマイクロタイタープレート（Corning Inc. 3595）を使用し、200μlのM9改変培地中で34℃で振とうしながら培養した（300回転/分）。全ての培養操作は、マイクロプレートリーダー（FilterMax F5; Molecular devices）、シェーカーインキュベーター（STX44; Liconic, Mauren, LI）及びマイクロプレートホテル（LPX220, Liconic, Mauren, LI）に接続したクリーンブース内のBiomek（登録商標）NX span8 laboratory automation workstation（Beckman Coulter）からなる自動培養システム（Horinouchi et al., J. lab. automation, 2014）で実施した。
【００４６】
細胞を6時間毎に新鮮な培地で希釈し、620nmの光学密度（OD620）で測定して細胞濃度がウェル当たり107個未満の細胞濃度として細胞を指数増殖期に維持するように調節した。
【００４７】
前培養において、実験室進化のための培養条件と同じ条件を使用し、比増殖速度は、毎日の希釈の初期細胞濃度及び最終細胞濃度に基づいて算出した。
【００４８】
次いで、メタクリル酸ナトリウムを8.75 mMの濃度となるように添加したM9合成培地中で約900時間の植え継ぎ培養を行った。メタクリル酸ナトリウムの濃度は、メタクリル酸ナトリウムのない条件と比較して細胞の増殖を約半分に抑制するような濃度を設定した。
【００４９】
そして、6時間毎に細胞をメタクリル酸ナトリウムを含有する新しい培地に移した。最終的な細胞濃度は、細胞を指数的増殖段階に維持するための閾値以下に調整した。初期細胞濃度と最終細胞濃度から増殖速度を決定し、これをストレス環境下での適応度の尺度として使用した。進化経路の再現性の評価のために、5種の独立した細胞株を並行して増殖させた。
【００５０】
上記の5つの系列において、合計906時間の増殖の後、増殖速度の有意な上昇が観察され、メタクリル酸ナトリウム存在下で親株よりも顕著に高い比増殖速度を示す耐性株を取得した（耐性株１〜５）。得られた5種の耐性株の比増殖速度を図１に示す。比増殖速度の算出は、指数増殖期を維持しながら60時間前培養した後に行った（およそ30〜60世代）。全ての耐性株について、少なくとも30世代の間、メタクリル酸ナトリウム不存在下で培養して、耐性が維持されることを確認した。
【００５１】
進化実験後の細胞は単独クローン化して-80℃でグリセロールストックとして保存して分析に使用した。
【００５２】
［実施例２］耐性株の変異の同定
実施例１で得られた耐性株１〜５のゲノムDNAの解析を実施した。ゲノムDNAの調製は、以下のようにして実施した。
【００５３】
96ウェルプレート中200μlの改変M9培地中で34℃で23時間、メタクリル酸非存在下で保存株を振とう培養して前培養物を調製した。前培養した細胞を試験管中の10mLの新鮮な改変M9培地中でOD600が3×10-5となるまで希釈した。細胞培養は水浴中で1分間に150ストロークで振とうしながら34℃で23時間行った。
【００５４】
10mLの培養物を試験管に移し、OD600が1.0を超えていることを確認した。次にリファンピシン（最終濃度300μg/mL）を添加し、更に3時間培養してDNA複製の開始をブロックした。20,000×gで5分間、25℃で遠心分離して細胞を回収し、ペレット化した細胞をゲノムDNA調製まで-80℃で保存した。
【００５５】
ゲノムDNAは、Wizard（登録商標）Genomic DNA Purification Kit（Promega）を使用し、使用説明書に従って単離・精製した。ゲノムDNAの純度を高めるために、RNase処理の前後に更にフェノール抽出を行った。ゲノムDNAの量及び純度は、NanoDrop ND-2000を使用して、260nmにおける吸光度、及び260nmと280nmでの吸光度の比率（A260/280）からそれぞれ決定した。その結果、全てのサンプルでA260/280値が1.7より大きいことが確認された。精製したゲノムDNAは使用時まで-30℃で保存した。
【００５６】
ゲノム配列の解析は、次世代シーケンサーIllumina HiSeq Systemを使用して行った。使用説明書に従って150bpのライブラリーを作製し、配列決定して、耐性株１〜５の変異をそれぞれ同定した。結果を表１に示す。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
解析の結果、各耐性株は複数の変異を生じていたが、全ての耐性株でピルビン酸キナーゼをコードするpykFに変異が生じていた。図２に、各耐性株が有する変異のゲノム中の箇所をそれぞれ示す。
【００５９】
表１に示すように、耐性株１〜５において、pykFのアミノ酸配列で生じていた変異は、A293T、P321T、E71D、T9S、P12Tで示されるアミノ酸置換であり、それぞれ異なる部位での非同義一塩基置換によるものであり、ピルビン酸キナーゼ酵素活性の変化がメタクリル酸耐性に寄与している可能性が示された。
【００６０】
これらのアミノ酸位置は、親株の大腸菌及びヒトのピルビン酸キナーゼのアミノ酸配列のアライメントで確認したところ、いずれも同じアミノ酸が存在しており、広範囲の生物種で保存されていることが示唆された。また、ピルビン酸キナーゼの三次元構造解析で確認したところ、耐性株での変異は、基質との結合に関与する部位又は酵素複合体の形成に関与する部位での変異であり、酵素活性の発揮にとって重要な部位であることも示唆された。
【００６１】
これらの結果より、取得された耐性株に共通して、ピルビン酸キナーゼの活性に影響を及ぼす変異が含まれていることが明らかとなった。
【００６２】
［実施例３］ピルビン酸キナーゼ活性の評価
実施例１で得られたメタクリル酸耐性株におけるピルビン酸キナーゼ活性を測定した。
ホスホエノールピルビン酸（PEP）から脱リン酸化及び水素添加によって乳酸が産生する図３に示す経路を利用するようにピルビン酸キナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼの共役アッセイを行い、NADHの消費量を指標としてピルビン酸キナーゼの活性を測定した。
【００６３】
基質として0.5mM ADP、1mM PEP、0.4mM NADHを用い、アッセイバッファーとして50mM Tris-HCL pH7.5、10mM MgCl2、100mM KCl、酵素として3U/ml 乳酸デヒドロゲナーゼ（TOYOBO社）及び1mg/ml〜0.01mg/ml pykF、pykF活性化剤としてフルクトース-1,6-ビスリン酸（0、0.15又は1.5mM）を使用した。ピルビン酸キナーゼは、野生型及び変異型大腸菌においてIPTG誘導によって発現させた後、登録商標名TALON（タカラバイオ社）で精製したものを使用した。
【００６４】
96ウェルのマイクロタイタープレートに、pykF以外の基質、酵素及び活性化剤を含むアッセイバッファー100μlを入れ、これに10μlのpykF希釈液を添加して反応を開始した。反応は340nmの吸光度を測定してNADH量の減少を検出した。
【００６５】
図４に結果を示す。フルクトースビスリン酸の不存在下（図４Ａ）及び存在下（図４Ｂ及びＣ）のいずれにおいても、耐性菌１〜５では親株と比較してそれぞれ約30％以上のpykF活性の低下が確認された。酵素を含まない対照サンプルではNADHはほとんど消費されなかった。
【００６６】
［実施例４］組換え株の作製および評価
ピルビン酸キナーゼ活性の低下又は喪失によってメタクリル酸に対する耐性が得られる可能性が示唆されたため、ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子pykFに人為的に変異を導入して組換え株を作製した。
【００６７】
具体的には、メタクリル酸耐性株で見出された変異を遺伝子組み換えによって親株に導入した組換え株を作製し、メタクリル酸ナトリウム存在下での増殖を観察した。
【００６８】
実施例１で得られた耐性株３における変異pykF（E71D）を親株である大腸菌MDS42株に導入した。変異の導入は、Posfai等によって開発されたマーカーレス組換え法を用いた（Posfai G. et al., Nucleic Acids Res., 1999, 27(22), 4409-4415）。
【００６９】
具体的には、コーディング領域を欠失したDNA断片を構築するために、開始コドンに隣接する上流の領域を、親株のゲノムDNAを鋳型として使用し、EcoRI部位を含むフォワードプライマー及び終止コドンに隣接する下流領域と重複するリバースプライマーを用いるPCRによって増幅した。一方、下流の隣接領域は、上流の隣接領域との重複を含むフォワードプライマー及びKpnI部位を含むリバースプライマーを用いるPCRによって増幅した。
【００７０】
次いで、増幅産物をMinElute PCR Purification Kit（Qiagen）によって精製した後、重複伸長PCRによってPCR産物を組合せた。同定された変異が導入されたDNA断片を構築するために、耐性株のゲノムDNAを使用したPCRによってDNA断片を増幅した。各DNA断片をMinElute PCR Purification Kit（Qiagen）によって精製し、自殺プラスミド（suicide plasmid）pST76-K（Hungarian Academy of Sciences, Biological Research CentreのPosfai博士よりご供与頂いた）中にクローニングした。
【００７１】
サンガー法によってDNA断片の配列を確認した後、親株に導入し、DNA二本鎖切断によってDNA断片を置き換えた。変異株の構築の後、pykF遺伝子を含むゲノム領域をPCRによって増幅し、増幅産物をサンガー法で直接変異の導入を確認した。
【００７２】
得られた組換え株を、親株及び耐性株３と共に8.75 mM、10.625 mM、又は12.5 mMのメタクリル酸ナトリウム存在下において20時間培養して増殖を観察した結果、親株の増殖は大きく低下したのに比較して、変異が導入された組換え株は耐性株の40％程度まで増殖が回復し、親株と比較してメタクリル酸耐性が有意に増大することが実証された（図５）。すなわち、pykFの変異がメタクリル酸ナトリウム耐性に大きく関与していることが示された。
【００７３】
図５に示されるように、20時間培養した組換え株の比増殖速度は8.75 mMのメタクリル酸ナトリウム存在下で約0.3（1/h）以上、10.625 mM及び12.5 mMのメタクリル酸ナトリウム存在下で約0.2（1/h）以上であった。また、耐性株３の比増殖速度は、8.75 mM、10.625 mM、及び12.5 mMのメタクリル酸ナトリウム存在下で、いずれも約0.5（1/h）以上であった。
【００７４】
構築した組換え株は、導入したpykFの変異以外は親株と同じであるため、メタクリル酸ナトリウム生産株への転用に好適である。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明により、アクリル酸樹脂の原料となるメタクリル酸の製造に有用な微生物が提供され、微生物によるプラスチック生産の将来性が大きく開かれることとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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