(57)【要約】【課題】植物等の細胞で目的遺伝子の発現量を向上させ、より多くの量の目的タンパク質を生産できる技術を提供すること。【解決手段】配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号１の塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含む、プロモーター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号１の塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含む、プロモーター。
【請求項２】
請求項１に記載のプロモーターを含む、ベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のプロモーターに発現可能に連結された目的遺伝子を含む、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
請求項２または３に記載のベクターで形質転換された、形質転換体。
【請求項５】
形質転換される宿主細胞が植物である、請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
形質転換される宿主細胞がレタスである、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体に目的遺伝子によってコードされるタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物細胞などを利用した遺伝子組み換え技術に関し、より詳しくは、植物細胞などを利用した遺伝子組み換えタンパク質の生産技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物細胞などの宿主細胞を利用して遺伝子組み換えにより有用タンパク質を生産する技術は古くより行われており、プロモーター配列、ターミネーター配列、シグナル配列などを改変することによりタンパク質をコードする遺伝子の発現量を増加させ、タンパク質の収量を向上させることが試みられている。
【０００３】
植物細胞においても研究は盛んに行われ、植物細胞で機能するプロモーターも多く報告されている。例えば、非特許文献１にはレタスユビキチン遺伝子プロモーターが開示されている。また、特許文献１では実施例においてキクｒｂｃＳ１プロモーターが使用されており、特許文献２ではアブラナ属由来のｒｂｃＳ１プロモーターが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第5517309号明細書
【特許文献２】特開2007-520196号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hirai et al., Plant Cell Rep. 2011, 30, 2255-2265
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、植物等の宿主細胞で機能しうるプロモーターは知られていたが、公知のプロモーターではレタス等の植物においては十分機能するかは不明で、より効率よく目的遺伝子を発現させることのできるプロモーターが求められていた。
したがって、本発明は、植物等の細胞で目的遺伝子の発現量を向上させ、より多くの量の目的タンパク質を生産できる技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、レタスRbcsプロモーターを単離することに成功し、このプロモーターが植物等の細胞で目的遺伝子を高効率に発現させることができ、タンパク質生産に好適であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明は以下を提供する。
[１] 配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号１の塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含む、プロモーター。
[２] [１]に記載のプロモーターを含む、ベクター。
[３] [１]に記載のプロモーターに発現可能に連結された目的遺伝子を含む、[２]に記載のベクター。
[４] [２]または[３]に記載のベクターで形質転換された、形質転換体。
[５] 形質転換される宿主細胞が植物である、[４]に記載の形質転換体。
[６] 形質転換される宿主細胞がレタスである、[５]に記載の形質転換体。
[７] [４]〜[６]のいずれかに記載の形質転換体を培養し、該形質転換体に目的遺伝子によってコードされるタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のプロモーターを用いることにより、植物等の細胞で目的遺伝子を高効率に発現させることができ、タンパク質生産の収率を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明のプロモーターと公知プロモーターとの配列アラインメントを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のプロモーターは、配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号１の塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは好ましくはDNAである。
【００１２】
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い二つのＤＮＡ同士、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有する２つのＤＮＡがハイブリダイズするが、それより同一性の低い２つのＤＮＡがハイブリダイズしない条件が挙げられる。例えば60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。すなわち、本発明のプロモーターは、プロモーター活性を有する限り、配列番号１の塩基配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を有するものであってもよい。
【００１３】
さらに、本発明のプロモーターは、プロモーター活性を有する限り、配列番号１の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、または付加を含む塩基配列を有するものであってもよい。ここで、１若しくは数個とは、例えば、１〜５０個、１〜３０個、１〜１０個、または１〜５個であることを意味する。本発明のプロモーターは、プロモーター活性を有する限り、配列番号１の塩基配列において、その５’末端側および／または３’末端側が欠失した部分配列であってもよい。
【００１４】
プロモーター活性は、プロモーター配列の３’側に目的遺伝子を連結し、宿主細胞に導入して目的遺伝子の発現を調べることによって検出することができる。
【００１５】
本発明のプロモーターに目的タンパク質をコードする遺伝子（目的遺伝子）を発現可能な状態で連結し、ベクターなどを利用して宿主細胞に導入することにより、目的タンパク質を宿主細胞で発現させることができる。
【００１６】
目的タンパク質の種類は宿主細胞で発現しうるものであれば特に制限されないが、成長因子、ホルモン、サイトカイン、血液タンパク質、酵素、抗原、抗体、転写因子、受容体またはそれらの部分ペプチドなどが挙げられる。タンパク質の由来は特に制限されず、例えば、ヒトなどの哺乳動物由来でもよいし、植物由来でもよいし、細菌や酵母由来でもよい。
【００１７】
酵素としては、例えば、リパーゼ、プロテアーゼ、ステロイド合成酵素、キナーゼ、フォスファターゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、酸化酵素、還元酵素、セルラーゼ、アロマターゼ、コラゲナーゼ、トランスグルタミナーゼ、グリコシダーゼおよびキチナーゼが挙
げられる。
【００１８】
成長因子としては、例えば、上皮成長因子（EGF）、インスリン様成長因子（IGF）、トランスフォーミング成長因子（TGF）、神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、血小板由来成長因子（PDGF）、エリスロポエチン（EPO）、トロンボポエチン（TPO）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、肝細胞増殖因子（HGF）が挙げられる。
【００１９】
ホルモンとしては、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、レプチン、カルシトニンが挙げられる。
【００２０】
サイトカインとしては、例えば、インターロイキン、インターフェロン（IFNα、IFNβ、IFNγ）、腫瘍壊死因子（TNF）が挙げられる。
【００２１】
血液タンパク質としては、例えば、トロンビン、血清アルブミン、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子、組織プラスミノゲン活性化因子が挙げられる。
【００２２】
抗体としては、例えば、完全抗体、Fab、F（ab'）、F（ab'）２、Fc、Fc融合タンパク質、重鎖（H鎖）、軽鎖（L鎖）、単鎖Fv（scFv）、sc（Fv）２、ジスルフィド結合Ｆｖ（sdFv）、Diabodyが挙げられる。
【００２３】
ワクチンとして使用される抗原タンパク質は、免疫応答を惹起できるものであれば特に制限されず、想定する免疫応答の対象に応じて適宜選択すればよいが、例えば、病原性細菌由来のタンパク質や病原性ウイルス由来のタンパク質が挙げられる。
【００２４】
目的タンパク質は、分泌生産用に、宿主細胞で機能する分泌シグナルペプチドが付加されていてもよい。分泌シグナルペプチドは、酵母を宿主細胞とする場合は、インベルターゼ分泌シグナル、P3分泌シグナル、α因子分泌シグナルなどが挙げられ、大腸菌を宿主細胞とする場合はPelB分泌シグナルが挙げられ、ブレビバチルスを宿主細胞とする場合はP22分泌シグナルが挙げられる。また、植物を宿主細胞とする場合、ナス科（Solanaceae）、バラ科（Rosaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、オランダイチゴ属（Fragaria）、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、オランダイチゴ（Fragaria×ananassa）、レタス(Lactuca sativa)等に由来する分泌シグナルが挙げられる。
【００２５】
さらに、目的タンパク質は、特定の細胞区画で発現させるために、小胞体残留シグナルペプチド、液胞移行シグナルペプチド等の輸送シグナルペプチドが付加されていてもよい。また、検出や精製の目的でHisタグ、FLAGタグ、GSTタグなどのタグ配列が付加されていてもよい。
【００２６】
目的タンパク質をコードするDNA（目的遺伝子）は、例えば、公知の塩基配列に基づいて、一般的な遺伝子工学的な手法により得ることができる。また、目的タンパク質をコードするDNAは、該タンパク質を生産させる宿主細胞に応じて、タンパク質の翻訳量が増大するように、タンパク質を構成するアミノ酸を示すコドンが適宜改変されてもよい。コドン改変の方法としては、例えばKang et al. (Protein Expr Purif. 2004 Nov;38(1):129-35.)の方法を参考にすることができる。また、宿主細胞において使用頻度の高いコドンを選択したり、GC含量が高いコドンを選択したり、宿主細胞のハウスキーピング遺伝子において使用頻度の高いコドンを選択したりする方法が挙げられる。
【００２７】
また、宿主細胞における遺伝子発現を向上させるために、宿主細胞において機能するエンハンサー配列等をプロモーターに連結して使用してもよい。エンハンサーとしては、Kozak配列や植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域が挙げられる。
【００２８】
本発明のプロモーターとそれを含む組換えDNAは、一般的な遺伝子工学的手法により取得・作製することができ、例えば、本発明のプロモーターをコードするDNAをレタスゲノムDNA等からPCR等の手法で取得し、及び有用タンパク質をコードするDNA等をPCRやDNAリガーゼ等を用いて連結することで本発明のプロモーターを含む組換えDNAを構築することができる。
【００２９】
本発明の組換えベクターは、本発明のプロモーターを含み、目的遺伝子を宿主細胞で発現させるために使用される。本発明の組換えベクターは、好ましくは、前述したような目的遺伝子を含む。また、必要に応じ、ターミネーター配列も宿主細胞に応じて含めることができる。また、ベクターは薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを含むことが好ましい。
【００３０】
本発明の組換えベクター作製に用いる発現ベクターとしては、宿主細胞内で複製増殖可能であれば特に制限されるものではないが、プラスミドベクター、シャトルベクター、ウイルスベクターおよびファージベクターなどが挙げられる。
【００３１】
宿主細胞をエシェリヒア属細菌とする場合、プラスミドベクターとしては、pBR322、pUC18、pHSG298、pUC118、pSTV28、pTWV228、pHY300PLK、pKK223-3が挙げられる。また、ファージベクターとしては、λFixIIなどが挙げられる。
【００３２】
宿主細胞をバチルス属細菌とする場合、ベクターとしては、pUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが挙げられる。
【００３３】
宿主細胞をサッカロミセス属酵母とする場合、ベクターとしては、YRp系プラスミド、YEp系プラスミド、YCp系プラスミド、YIp系プラスミド、pESCベクターおよびpAURベクターなどが挙げられる。
【００３４】
また、宿主細胞をアスペルギルス属糸状菌とする場合、染色体挿入型のベクターを使用してもよいし、pPTRIIベクターやpAUR316（いずれもタカラバイオ）などのように細胞内で自立複製可能なプラスミドベクターなどを使用してもよい。
【００３５】
宿主細胞を植物細胞または植物体とする場合、染色体挿入型のベクターやタバコモザイクウィルスなどのウイルスベクターなどが使用できる。また、アグロバクテリウム属細菌を使用した形質転換の場合は、pBI121、pBI221、pBI101、pIG121Hm、pRI909、pRI910など、アグロバクテリウム属細菌において複製可能なプラスミドベクターも使用できる。
【００３６】
本発明の組換えベクターは、例えば、本発明のプロモーター、好ましくは本発明のプロモーターとそれに連結された目的遺伝子を適当な制限酵素で切断又はPCRによって制限酵素部位を付加し、ベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することによって作製することができる。
【００３７】
本発明の形質転換体は、前記組換えベクターで形質転換されていることを特徴とする。形質転換に用いられる宿主細胞は真核細胞及び原核細胞の何れでもよく、例えば、下記のような細菌、カビ、酵母、植物細胞などが例示される。ただし、これらには限定されず、昆虫細胞や哺乳動物細胞でもよい。
【００３８】
細菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）などのエシェリヒア（Escherichia）属細菌；バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）などのバチルス（Bacillus）属細菌；セラチア・マーセッセンス（Serratia marcescens）などのセラチア（Serratia）属細菌；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）などのシュードモナス（Pseudomonas）属細菌；コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）などのコリネ型細菌；ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）などのロドコッカス（Rhodococcus）属細菌；ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）などのラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）などのストレプトミセス（Streptomyces）属細菌；サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）などのサーマス（Thermus）属細菌；ストレプトコッカス・ラクティス（Streptococcus lactis）などのストレプトコッカス（Streptococcus）属細菌；放線菌（Actinomycetes）；が例示される。
【００３９】
糸状菌としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus nigar）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）などのアスペルギルス（Aspergillus）属菌；フザリウム・フジクロイ（Fusarium fujikuroi）などのフザリウム（Fusarium）属菌；が例示される。
【００４０】
酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などのサッカロミセス（Saccharomyces）属酵母；ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などのピキア（Pichia）属酵母；キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）などのキャンディダ（Candida）属酵母；シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などのシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母；ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lypolitica）などのヤロウィア（Yarrowia）属酵母；が例示される。
【００４１】
植物細胞としては特に制限されないが、ナス科（Solanaceae）、バラ科（Rosaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)、またはアカザ科(Chenopodiaceae)等に属する植物が例示され、例えば、ヒマワリ、トマト、イチゴ、レタス、シロツメクサ、アブラナ、綿、ナタネ、ポプラ、シロイヌナズナ、イネ、トウモロコシ、ジャガイモ、タバコ、ダイズなどの細胞が挙げられる。植物細胞は、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。また、プロトプラスト、不定胚、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。
【００４２】
本発明の形質転換体は、一般的な遺伝子工学的手法を用いて、本発明の組換えベクターを宿主細胞に導入することにより作製することができる。例えば、エレクトロポレーション法（Tada, et al., 1990, Theor．Appl．Genet, 80：475）、プロトプラスト法(Gene, 39, 281-286(1985))、ポリエチレングリコール法（Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81：437）、アグロバクテリウムを利用した導入方法（Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2：218，Hiei, et al.，1994 Plant J. 6：271）、パーティクルガン法（Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci.tech. 5：27）、ポリカチオン法（Ohtsuki, et
al., FEBS Lett. 1998 May 29;428(3):235-40.）などの方法を用いることが可能である。なお、遺伝子発現は一過的発現でもよく、染色体に組み込まれる安定的発現でもよい。
【００４３】
本発明の組換えベクターを宿主細胞に導入した後、選択マーカーの表現型等を指標として形質転換体を選抜することができる。また、選抜した形質転換体を培養することにより、タンパク質を生産することができる。培養に用いる培地及び条件は、形質転換体の種に応じて適宜選択することができる。
また、宿主細胞が植物細胞の場合には、選抜した植物細胞を常法（例えば、Toki et al. (1995) Plant Physiol. 100:1503-1507）に従って培養することにより、植物体を再生することができ、植物細胞内又は植物細胞の細胞膜外に前記融合タンパク質を蓄積させる
ことができる。
【００４４】
培地や細胞内に蓄積した目的タンパク質は、当業者によく知られた方法に従って分離精製することができる。例えば、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニーティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、またはこれらを組み合わせることにより分離精製することができる。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【００４６】
（１）レタスルビスコスモールサブユニットプロモーターの単離
レタス(Lactuca sativa cv., Chungchima)ルビスコスモールサブユニット遺伝子のmRNA配列（GenBank Accession No. AF162195.1）を元に、インバースPCR法によるゲノム領域単離用のプライマーを設計した。すなわち、Rbcs-R (5’-CCTTCTTGGTGACAGGGAAA-3’：配列番号２)とRbcs-F (5’-TTTGCCCCCTCTATCTGATG-3’：配列番号３)である。レタス(Lactuca sativa cv., Greenwave)のゲノムをEcoRIで消化した後、T4 DNA ligaseを用いてライーゲーション反応を行い、ゲノムのEcoRI断片を環状化した。これを鋳型として用い、Rbcs-FプライマーおよびRbcs-Rプライマーを用いてインバースPCRを行って、ルビスコスモールサブユニット遺伝子の翻訳開始コドンよりも上流の1105 bpの配列を取得した（配列番号１）。
【００４７】
（２）プロモーターの配列比較
得られたゲノムDNA断片の機能性を評価するために、既知のルビスコスモールサブユニット遺伝子プロモーターとの配列比較を行った（図１）。その結果、転写活性に必要とされる転写因子結合配列が存在することを確認した。したがって、得られたレタスルビスコスモールサブユニットプロモーターはレタス等の植物細胞等で機能し得るプロモーターであることが示唆された。
【図１】
2018085979.tif 000002
【配列表】
2018085979000001.app