(57)【要約】      （修正有）【課題】トラスツズマブ−−ＤＭ１を用いた治療を含む、癌が有糸分裂阻害剤を用いた治療に対する耐性があるかどうかを決定するための方法の提供。【解決手段】患者の癌が有糸分裂阻害剤を用いた治療に対する耐性があるかどうかを決定するための方法において、患者からの試験癌サンプル中においてＡＢＣＣ３遺伝子が増幅されるかどうかの検出を含み、ここで、ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅が、癌が有糸分裂剤を用いた治療に耐性があることを示す方法。ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅の検出が、ＡＢＣＣ３遺伝子のコピー数の決定を含み、少なくとも３のコピー数がＡＢＣＣ３遺伝子増幅を示す。【選択図】図７
2018086000.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の癌が有糸分裂阻害剤を用いた治療に対する耐性があるかどうかを決定するための方法において、患者からの試験癌サンプル中においてＡＢＣＣ３遺伝子が増幅されるかどうかの検出を含み、ここで、ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅が、癌が有糸分裂剤を用いた治療に耐性があることを示す方法。
【請求項２】
ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅の検出が、ＡＢＣＣ３遺伝子のコピー数の決定を含み、少なくとも３のコピー数がＡＢＣＣ３遺伝子増幅を示す、請求項１の方法。
【請求項３】
少なくとも５のコピー数がＡＢＣＣ３遺伝子の増幅を示す、請求項２の方法。
【請求項４】
ＡＢＣＣ３遺伝子のコピー数が、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、サザンブロット、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーションに基づくマイクロアレイ、又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）によって決定される、請求項２又は３の方法。
【請求項５】
癌が乳癌、卵巣癌、及び結腸直腸癌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
試験癌サンプルが、癌腫瘍サンプルである、請求項１の方法。
【請求項７】
有糸分裂阻害剤が、タキサン、メイタンシノイド、及びアウリスタチン、及びそのアナログと誘導体である、請求項１の方法。
【請求項８】
タキサンがパクリタキセル及びドセタキセルからなる群から選択される、請求項７の方法。
【請求項９】
アウリスタチンが、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）からなる群から選択される、請求項７の方法。
【請求項１０】
メイタンシノイドがＤＭ１及びＤＭ４からなる群から選択される、請求項７の方法。
【請求項１１】
有糸分裂阻害剤が抗体にコンジュゲートされた、請求項７の方法。
【請求項１２】
有糸分裂阻害剤−抗体コンジュゲートが、メイタンシノイド−抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲートである、請求項１１の方法。
【請求項１３】
メイタンシノイド−抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲートがトラスツズマブ−ＤＭ１である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
患者の癌が有糸分裂阻害剤を用いた治療に対する耐性があるかどうかを決定するための方法において、ＡＢＣＣ３遺伝子が患者からの試験癌サンプルにおいて過剰発現するかどうかの検出を含み、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が、癌が有糸分裂阻害剤を用いた治療に対する耐性があることを示す方法。
【請求項１５】
ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現の検出が、ＡＢＣＣ３遺伝子からのｍＲＮＡ転写のレベルの決定を含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が、コントロールサンプルに対する、試験癌サンプル中における少なくとも５倍のＡＢＣＣ３遺伝子からのｍＲＮＡ転写レベル増加によって示される、請求項１５の方法。
【請求項１７】
ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が、コントロールサンプルに対する、試験癌サンプル中における少なくとも２５倍のＡＢＣＣ３遺伝子からのｍＲＮＡ転写レベル増加によって示される、請求項１５の方法。
【請求項１８】
ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現の検出が、ＡＢＣＣ３ポリペプチド発現レベルの決定を含む、請求項１４の方法。
【請求項１９】
ＡＢＣＣ３ポリペプチド発現レベルの決定が、試験癌サンプルを抗ＡＢＣＣ３抗体に接触させ、抗ＡＢＣＣ３抗体のＡＢＣＣ３ポリペプチドに対する結合を検出することを含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】
ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が、コントロールサンプルに対する、試験癌サンプル中における少なくとも２倍のＡＢＣＣ３ポリペプチドの発現レベルの増加によって示される、請求項１８の方法。
【請求項２１】
ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が、コントロールサンプルに対する、試験癌サンプル中における少なくとも１０倍のＡＢＣＣ３ポリペプチドの発現レベルの増加によって示される、請求項１８の方法。
【請求項２２】
癌が乳癌、卵巣癌、及び結腸癌からなる群から選択される癌である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
試験癌サンプルが、癌腫瘍サンプルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
有糸分裂阻害剤が、タキサン、メイタンシノイド、及びアウリスタチン、及びそのアナログと誘導体である、請求項１４の方法。
【請求項２５】
タキサンがパクリタキセル及びドセタキセルからなる群から選択される、請求項２４の方法。
【請求項２６】
アウリスタチンが、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）からなる群から選択される、請求項２４の方法。
【請求項２７】
メイタンシノイドがＤＭ１及びＤＭ４からなる群から選択される、請求項２４の方法。
【請求項２８】
有糸分裂阻害剤が抗体にコンジュゲートされた、請求項２４の方法。
【請求項２９】
有糸分裂阻害剤−抗体コンジュゲートが、メイタンシノイド−抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲートである、請求項２８の方法。
【請求項３０】
メイタンシノイド−抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲートがトラスツズマブ−ＤＭ１である、請求項２９の方法。
【請求項３１】
ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅が、乳癌が抗有糸分裂剤を用いた治療に耐性があることを示し、乳癌腫瘍サンプル中においてＡＢＣＣ３遺伝子が増幅されるかどうかの検出を含み、乳癌腫瘍が有糸分裂阻害剤を用いた治療に対する耐性があるかどうかを決定するための方法。
【請求項３２】
少なくとも３のコピー数がＡＢＣＣ３遺伝子増幅を示す、ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅の検出が、ＡＢＣＣ３遺伝子のコピー数の決定を含む、請求項３１の方法。
【請求項３３】
少なくとも５のコピー数がＡＢＣＣ３遺伝子の増幅を示す、請求項３２の方法。
【請求項３４】
ＡＢＣＣ３遺伝子のコピー数が、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、サザンブロット、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーションに基づくマイクロアレイ、又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）によって決定される、請求項３２又は３３の方法。
【請求項３５】
有糸分裂阻害剤が、タキサン、メイタンシノイド、及びアウリスタチン、及びそのアナログと誘導体である、請求項３１の方法。
【請求項３６】
タキサンがパクリタキセル及びドセタキセルからなる群から選択される、請求項３５の方法。
【請求項３７】
アウリスタチンが、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）からなる群から選択される、請求項３５の方法。
【請求項３８】
メイタンシノイドがＤＭ１及びＤＭ４からなる群から選択される、請求項３５の方法。
【請求項３９】
有糸分裂阻害剤が抗体にコンジュゲートされた、請求項３５の方法。
【請求項４０】
有糸分裂阻害剤−抗体コンジュゲートが、メイタンシノイド−抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲートである、請求項３９の方法。
【請求項４１】
メイタンシノイド−抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲートがトラスツズマブ−ＤＭ１である、請求項４０の方法。
【請求項４２】
ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が、癌が有糸分裂阻害剤を用いた治療に対する耐性があることを示す、ＡＢＣＣ３遺伝子が患者からの試験癌サンプルにおいて過剰発現するかどうかの検出を含む、患者の癌が有糸分裂阻害剤を用いた治療に対する耐性があるかどうかを決定するための方法。
【請求項４３】
ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現の検出が、ＡＢＣＣ３遺伝子からのｍＲＮＡ転写のレベルの決定を含む、請求項４２の方法。
【請求項４４】
ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が、コントロールサンプルに対する、乳癌腫瘍サンプル中における少なくとも５倍のＡＢＣＣ３遺伝子からのｍＲＮＡ転写レベル増加によって示される、請求項４３の方法。
【請求項４５】
ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が、コントロールサンプルに対する、乳癌腫瘍サンプル中における少なくとも２５倍のＡＢＣＣ３遺伝子からのｍＲＮＡ転写レベル増加によって示される、請求項４３の方法。
【請求項４６】
ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現の検出が、ＡＢＣＣ３ポリペプチド発現レベルの決定を含む、請求項４２の方法。
【請求項４７】
ＡＢＣＣ３ポリペプチド発現レベルの決定が、乳癌腫瘍サンプルを抗ＡＢＣＣ３抗体に接触させ、抗ＡＢＣＣ３抗体のＡＢＣＣ３ポリペプチドに対する結合を検出することを含む、請求項４６の方法。
【請求項４８】
ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が、コントロールサンプルに対する、乳癌腫瘍サンプル中における少なくとも２倍のＡＢＣＣ３ポリペプチドの発現レベルの増加によって示される、請求項４７の方法。
【請求項４９】
ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が、コントロールサンプルに対する、試験癌サンプル中における少なくとも１０倍のＡＢＣＣ３ポリペプチドの発現レベルの増加によって示される、請求項４７の方法。
【請求項５０】
有糸分裂阻害剤が、タキサン、メイタンシノイド、及びアウリスタチン、及びそのアナログと誘導体である、請求項４２の方法。
【請求項５１】
タキサンがパクリタキセル及びドセタキセルからなる群から選択される、請求項５０の方法。
【請求項５２】
アウリスタチンが、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）からなる群から選択される、請求項５０の方法。
【請求項５３】
メイタンシノイドがＤＭ１及びＤＭ４からなる群から選択される、請求項５０の方法。
【請求項５４】
有糸分裂阻害剤が抗体にコンジュゲートされた、請求項５０の方法。
【請求項５５】
有糸分裂阻害剤−抗体コンジュゲートが、メイタンシノイド−抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲートである、請求項５４の方法。
【請求項５６】
メイタンシノイド−抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲートがトラスツズマブ−ＤＭ１である、請求項５５の方法。
【請求項５７】
乳癌腫瘍がＨｅｒ２陽性乳癌腫瘍である、請求項４０、４１、５５又は５６の方法。
【請求項５８】
ａ）患者からの試験癌サンプル中でＡＢＣＣ３遺伝子が増幅されるかどうかを検出し、  ｂ）試験癌サンプル中で、ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅が検出されない場合、有糸分裂阻害剤ベースの化学療法のための患者を選択することを含む、
抗有糸分裂阻害ベースの化学療法のための乳癌患者を選択するための方法。
【請求項５９】
少なくとも３のコピー数がＡＢＣＣ３遺伝子増幅を示す、ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅の検出が、ＡＢＣＣ３遺伝子のコピー数の決定を含む、請求項５８の方法。
【請求項６０】
少なくとも５のコピー数がＡＢＣＣ３遺伝子の増幅を示す、請求項５８の方法。
【請求項６１】
ＡＢＣＣ３遺伝子のコピー数が、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、サザンブロット、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーションに基づくマイクロアレイ、又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）によって決定される、請求項５９又は６０の方法。
【請求項６２】
有糸分裂阻害剤が、タキサン、メイタンシノイド、及びアウリスタチン、及びそのアナログと誘導体である、請求項５８の方法。
【請求項６３】
タキサンがパクリタキセル及びドセタキセルからなる群から選択される、請求項６２の方法。
【請求項６４】
アウリスタチンが、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）からなる群から選択される、請求項６２の方法。
【請求項６５】
メイタンシノイドがＤＭ１及びＤＭ４からなる群から選択される、請求項６２の方法。
【請求項６６】
有糸分裂阻害剤が抗体にコンジュゲートされた、請求項５８の方法。
【請求項６７】
有糸分裂阻害剤−抗体コンジュゲートが、メイタンシノイド−抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲートである、請求項６６の方法。
【請求項６８】
メイタンシノイド−抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲートがトラスツズマブ−ＤＭ１である、請求項６７の方法。
【請求項６９】
乳癌患者がＨｅｒ２陽性乳癌腫瘍を有する、請求項５８の方法。
【請求項７０】
ａ）患者からの試験癌サンプル中でＡＢＣＣ３遺伝子が過剰発現されるかどうかを検出し、  ｂ）試験癌サンプル中で、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が検出されない場合、有糸分裂阻害剤ベースの化学療法のための患者を選択することを含む、
抗有糸分裂阻害ベースの化学療法のための乳癌患者を選択するための方法。
【請求項７１】
ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現の検出が、ＡＢＣＣ３遺伝子からのｍＲＮＡ転写のレベルの決定を含む、請求項７０の方法。
【請求項７２】
ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が、コントロールサンプルに対する、試験癌サンプル中における少なくとも５倍のＡＢＣＣ３遺伝子からのｍＲＮＡ転写レベル増加によって示される、請求項７１の方法。
【請求項７３】
ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が、コントロールサンプルに対する、試験癌サンプル中における少なくとも２５倍のＡＢＣＣ３遺伝子からのｍＲＮＡ転写レベル増加によって示される、請求項７１の方法。
【請求項７４】
ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現の検出が、ＡＢＣＣ３ポリペプチド発現レベルの決定を含む、請求項７０の方法。
【請求項７５】
ＡＢＣＣ３ポリペプチド発現レベルの決定が、試験癌サンプルを抗ＡＢＣＣ３抗体に接触させ、抗ＡＢＣＣ３抗体のＡＢＣＣ３ポリペプチドに対する結合を検出することを含む、請求項７４の方法。
【請求項７６】
ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が、コントロールサンプルに対する、試験癌サンプル中における少なくとも２倍のＡＢＣＣ３ポリペプチドの発現レベルの増加によって示される、請求項７５の方法。
【請求項７７】
ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が、コントロールサンプルに対する、試験癌サンプル中における少なくとも１０倍のＡＢＣＣ３ポリペプチドの発現レベルの増加によって示される、請求項７５の方法。
【請求項７８】
有糸分裂阻害剤が、タキサン、メイタンシノイド、及びアウリスタチン、及びそのアナログと誘導体である、請求項７０の方法。
【請求項７９】
タキサンがパクリタキセル及びドセタキセルからなる群から選択される、請求項７８の方法。
【請求項８０】
アウリスタチンが、モノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）及びものメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）からなる群から選択される、請求項７８の方法。
【請求項８１】
メイタンシノイドがＤＭ１及びＤＭ４からなる群から選択される、請求項７８の方法。
【請求項８２】
有糸分裂阻害剤が抗体にコンジュゲートされた、請求項７８の方法。
【請求項８３】
有糸分裂阻害剤−抗体コンジュゲートが、メイタンシノイド−抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲートである、請求項８２の方法。
【請求項８４】
メイタンシノイド−抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲートがトラスツズマブ−ＤＭ１である、請求項８３の方法。
【請求項８５】
乳癌患者がＨｅｒ２陽性乳癌腫瘍である、請求項７０の方法。
【請求項８６】
癌細胞をＡＢＣＣ３のアンタゴニストに接触させることを含む、癌細胞の有糸分裂阻害剤に対する耐性を減少する方法。
【請求項８７】
アンタゴニストが、ＡＢＣＣ３に結合するＡＢＣＣ３抗体及びｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項８６の方法。
【請求項８８】
患者にＡＢＣＣ３アンタゴニストと有糸分裂阻害剤の治療的な有効量を投与することを含む、有糸分裂阻害剤に耐性の癌を有する患者を治療する方法。 
【請求項８９】
アンタゴニストが、ＡＢＣＣ３に結合するＡＢＣＣ３抗体及びｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項８８の方法。
【請求項９０】
有糸分裂阻害剤が、タキサン、メイタンシノイド、及びアウリスタチン、及びそのアナログと誘導体である、請求項８９の方法。
【請求項９１】
有糸分裂阻害剤が抗体にコンジュゲートされた、請求項９０の方法。
【請求項９２】
有糸分裂阻害剤−抗体コンジュゲートが、メイタンシノイド−抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲートである、請求項９１の方法。
【請求項９３】
メイタンシノイド−抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲートがトラスツズマブ−ＤＭ１である、請求項９２の方法。
【請求項９４】
ａ）患者からの試験癌サンプル中においてＡＢＣＣ３遺伝子が、増幅又は過剰発現されるかどうかを検出し、
ｂ）ＡＢＣＣ遺伝子の増幅又は過剰発現が試験癌サンプル中で検出されない場合は、患者に治療的な有効量の有糸分裂阻害剤ベースの化学療法を施すこと、
を含む、患者の癌のＡＢＣＣ３増幅状態に基づく患者の癌の治療法。
【請求項９５】
患者がＨｅｒ２陽性の乳癌を有し、抗Ｈｅｒ２抗体−有糸分裂阻害剤コンジュゲートを投与される、請求項９４の方法。
【請求項９６】
抗Ｈｅｒ２抗体−有糸分裂阻害剤コンジュゲートが、トラスツズマブ−ＤＭ１又はトラスツズマブ−ＭＭＡＥである、請求項９５の方法。
【請求項９７】
ａ）患者の癌中でＡＢＣＣ３の増幅又は過剰発現がないことに基づいて患者を選択し、
ｂ）患者に治療的な有効量の有糸分裂阻害剤を投与すること
を含む、方法。
【請求項９８】
選択される患者がＨｅｒ２陽性乳癌を有する、請求項９７の方法。
【請求項９９】
有糸分裂阻害剤が、抗Ｈｅｒ２抗体−有糸分裂阻害剤コンジュゲートである、請求項９８の方法。
【請求項１００】
抗Ｈｅｒ２抗体−有糸分裂阻害剤コンジュゲートが、トラスツズマブ−ＤＭ１又はトラスツズマブ−ＭＭＡＥである、請求項９９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、開示の全体が出典明示によりここに援用される２００８年３月１４日出願の米国仮出願第６１／０３６８７４号及び２００８年５月１６日出願の米国仮出願第６１／０３６８７４号の優先権を主張する。
本発明は、一般的には医薬耐性を予測する遺伝変異に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代分子腫瘍学の鍵である目的は、患者が最も恩恵が得られるであろう化学療法剤を用いた、標的療法を受けることができるようにするため、得られた腫瘍を特徴づける基本の遺伝学的及びゲノム変異を同定することである。乳癌は、西洋において女性の間で最も普及した形態の癌であり、世界規模で、毎年、推定１００万人が新たに診断され、４０００００人が死亡する（１）。エストロゲンレセプター陽性癌のためのタモキシフェン（２）及びＨＥＲ２癌遺伝子の増幅を含む腫瘍のためのハーセプチン（３）のような、標的療法の到来は、患者の生存に重大な影響を有するが、種々の化学療法は、乳癌治療の重要な要素を依然として構成する（４）。乳癌は、標的及び化学療法剤に対する異なる応答によって特徴付けられる異なる分子サブタイプを伴う不均一疾患である。化学療法は多くの場合優れた治療であるのに対し、推定５０％の患者は、先天的又は後天的な多剤耐性によって、効果がない。多剤耐性（ＭＤＲ）は、構造的及び機構的に無関係であり得る化学療法剤の複数のクラスに対する癌細胞の耐性を意味し、ＡＴＰ依存排出ポンプとして働く種々のタンパク質の過剰発現に関する（５）。乳癌におけるＭＤＲに寄与する分子的変化の理解は、施す治療に対する耐性を予測し、より効果的な治療剤を合理的に選択することが可能な診断試験の開発を可能にする、決定的な最初の段階である。
【０００３】
ＡＢＣＣ３の過剰発現は、以前の研究において、癌細胞株における後天性多剤耐性に関与した。例えば、Ｌｉｕ等は、ドキソルビシンの存在下の増殖についてのセレクションによって得られた細胞株であるＭＣＦ−７／ＡｄＶｐ３０００中において、親と比較して４５９倍のＡＢＣＣ３の過剰発現を報告している。更に、ビンクリスチンを用いた癌細胞株の治療は、これらの細胞において、ＡＢＣＣ２とＡＢＣＣ３転写物の有意な過剰発現の結果となることが最近示された（３７）。関連のポンプＡＢＣＣ２（ＭＲＰ２）とＡＢＣＣ１０（ＭＲＰ７）は、過剰発現させた際にパクリタキセル耐性を付与することが示され（３８）（３９）、ＡＢＣＣ２はインビボのマウスモデル中のパクリタキセルの薬物動態の重要な決定因子であることが示された（４０）。パクリタキセルは、以前にＡＢＣＣ３の基質でないことが以前に示され、実際、ＭＤＣＫ又はＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるＡＢＣＣ３の異所性過剰発現は、パクリタキセルに対する高い耐性を示さなかった（４１、４２）。注目すべきことに、他の公表された機能研究の報告は、この薬剤を輸送する際のＡＢＣＣ３の役割を示唆している（３６）にもかかわらず、ＡＢＣＣ３は、長期間のアッセイにおいて、ドキソルビシンに対する耐性を与えないことがまた示された（４１）。
【０００４】
これらの種々の所見は、乳癌が複数の機構を通じて化学療法から逃れることができる不均一疾患であるという事実を示し、それぞれの癌患者における治療的応答を予測するために使用することができるバイオメーカーパネルの必要性を強調している。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一態様は、ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅が、癌が有糸分裂阻害剤を用いた治療に耐性があることを示す、ＡＢＣＣ３遺伝子が、患者からの試験癌サンプルにおいて、増幅されるかどうかを検出することを含む、患者の癌が、有糸分裂阻害剤を用いた治療に耐性があるかどうかを決定するための方法を提供する。一実施態様では、試験癌サンプルは、癌腫瘍サンプルである。
【０００６】
ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅は、例えば、ＡＢＣＣ３遺伝子のコピー数の決定により検出される。幾つかの実施態様では、少なくとも３のコピー数は、ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅を示し、他の実施態様では、少なくとも５のコピー数は、ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅を示す。
【０００７】
ＡＢＣＣ３遺伝子のコピー数は、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、サザンブロット、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーションベースマイクロアレイ、又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）によって、決定される。
【０００８】
本発明の別の態様は、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が、有糸分裂阻害剤を用いた治療に耐性があることを示す、ＡＢＣＣ３遺伝子が、患者からの試験癌サンプルにおいて、過剰発現されるかどうかを検出することを含む、患者の癌が、有糸分裂阻害剤を用いた治療に耐性があるかどうかを決定するための方法を提供する。
【０００９】
一実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、ＡＢＣＣ３遺伝子からの、ｍＲＮＡ転写物のレベルの決定によって、検出される。幾つかの実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、試験癌サンプル中のＡＢＣＣ３遺伝子からの、コントロールサンプルと比較して少なくとも５倍のｍＲＮＡ転写物レベルの増加によって示される。他の実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、試験癌サンプル中のＡＢＣＣ３遺伝子からの、コントロールサンプルと比較して少なくとも２５倍のｍＲＮＡ転写物レベルの増加によって示される。 
【００１０】
他の実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、ＡＢＣＣ３ポリペプチドの発現のレベルを決定することにより検出される。幾つかの実施態様では、ＡＢＣＣ３ポリペプチド発現のレベルは、試験癌サンプルを抗ＡＢＣＣ３抗体に接触すること及び抗ＡＢＣＣ３抗体のＡＢＣＣ３ポリペプチドに対する結合を検出することを含む。幾つかの実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、試験癌サンプル中のＡＢＣＣ３遺伝子からの、コントロールサンプルと比較して少なくとも２倍のＡＢＣＣ３ポリペプチドのレベルの増加によって示される。他の実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、試験癌サンプル中のコントロールサンプルと比較して少なくとも１０倍のＡＢＣＣ３ポリペプチドの発現レベルの増加によって示される。
【００１１】
幾つかの実施態様では、癌は、乳癌、卵巣癌、及び結腸癌からなる群から選択される。
【００１２】
幾つかの実施態様では、有糸分裂阻害剤は、タキサン（例えば、パクリタキセルとドセタキセルを含む）、メイタンシノイド（例えば、ＤＭ１とＤＭ４を含む）、及びアウリスタチン（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）とモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を含む）、及びそのアナログ及び類似体からなる群から選択される。
【００１３】
幾つかの実施態様では、有糸分裂阻害剤は、抗体にコンジュゲートされる。一実施態様では、有糸分裂阻害剤−抗体コンジュゲートは、トラスツズマブ−ＤＭ１のような、メイタンシノイド−抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲートである。
【００１４】
本発明の別の態様は、ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅が、乳癌腫瘍が有糸分裂阻害剤を用いた治療に耐性があることを示す、ＡＢＣＣ３遺伝子が、乳癌腫瘍サンプルにおいて、増幅されるかどうかを検出することを含む、乳癌腫瘍が、有糸分裂阻害剤を用いた治療に耐性があるかどうかを決定するための方法を提供する。
【００１５】
ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅は、例えば、ＡＢＣＣ３遺伝子のコピー数の決定により検出される。幾つかの実施態様では、少なくとも３のコピー数は、ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅を示し、他の実施態様では、少なくとも５のコピー数は、ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅を示す。
【００１６】
ＡＢＣＣ３遺伝子のコピー数は、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、サザンブロット、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーションベースマイクロアレイ、又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）によって、決定される。 
【００１７】
本発明の別の態様は、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が、乳癌が有糸分裂阻害剤を用いた治療に耐性があることを示す、ＡＢＣＣ３遺伝子が、乳癌腫瘍サンプルにおいて、過剰発現されるかどうかを検出することを含む、乳癌腫瘍が、有糸分裂阻害剤を用いた治療に耐性があるかどうかを決定するための方法を提供する。
【００１８】
一実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、ＡＢＣＣ３遺伝子からの、ｍＲＮＡ転写物のレベルの決定によって、検出される。幾つかの実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、試験癌サンプル中のＡＢＣＣ３遺伝子からの、コントロールサンプルと比較して少なくとも５倍のｍＲＮＡ転写物レベルの増加によって示される。他の実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、試験癌サンプル中のＡＢＣＣ３遺伝子からの、コントロールサンプルと比較して少なくとも２５倍のｍＲＮＡ転写物レベルの増加によって示される。
【００１９】
他の実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、ＡＢＣＣ３ポリペプチドの発現のレベルを決定することにより検出される。幾つかの実施態様では、ＡＢＣＣ３ポリペプチド発現のレベルは、試験癌サンプルを抗ＡＢＣＣ３抗体に接触すること及び抗ＡＢＣＣ３抗体のＡＢＣＣ３ポリペプチドに対する結合を検出することを含む。幾つかの実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、試験癌サンプル中のＡＢＣＣ３遺伝子からの、コントロールサンプルと比較して少なくとも２倍のＡＢＣＣ３ポリペプチドのレベルの増加によって示される。幾つかの実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、試験癌サンプル中のＡＢＣＣ３遺伝子からの、コントロールサンプルと比較して少なくとも１０倍のＡＢＣＣ３ポリペプチドのレベルの増加によって示される。
【００２０】
幾つかの実施態様では、乳癌腫瘍は、Ｈｅｒ２陽性乳癌腫瘍である。
【００２１】
幾つかの実施態様では、有糸分裂阻害剤は、タキサン（例えば、パクリタキセルとドセタキセルを含む）、メイタンシノイド（例えば、ＤＭ１とＤＭ４を含む）、及びアウリスタチン（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）とモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を含む）、及びそのアナログ及び類似体からなる群から選択される。
【００２２】
幾つかの実施態様では、有糸分裂阻害剤は、抗体にコンジュゲートされる。一実施態様では、有糸分裂阻害剤−抗体コンジュゲートは、トラスツズマブ−ＤＭ１のような、メイタンシノイド−抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲートである。
【００２３】
本発明の別の態様は、ａ）ＡＢＣＣ３遺伝子が、患者からの試験癌サンプル中で増幅されるかどうかを検出すること、及びｂ）ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅が、試験癌サンプル中で検出されない場合に、有糸分裂阻害剤ベースの化学療法を選択することを含む、有糸分裂阻害剤ベースの化学療法のための乳癌患者を選択するための方法を提供する。
【００２４】
ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅は、例えば、ＡＢＣＣ３遺伝子のコピー数の決定により検出される。幾つかの実施態様では、少なくとも３のコピー数は、ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅を示し、他の実施態様では、少なくとも５のコピー数は、ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅を示す。
【００２５】
ＡＢＣＣ３遺伝子のコピー数は、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、サザンブロット、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーションベースマイクロアレイ、又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）によって、決定される。
【００２６】
本発明の別の態様は、ａ）ＡＢＣＣ３遺伝子が、患者からの試験癌サンプル中で過剰発現されるかどうかを検出すること、及びｂ）ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅が、試験癌サンプル中で検出されない場合に、有糸分裂阻害剤ベースの化学療法を選択することを含む、有糸分裂阻害剤ベースの化学療法のための乳癌患者を選択するための方法を提供する。
【００２７】
一実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、ＡＢＣＣ３遺伝子からの、ｍＲＮＡ転写物のレベルの決定によって、検出される。幾つかの実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、試験癌サンプル中のＡＢＣＣ３遺伝子からの、コントロールサンプルと比較して少なくとも５倍のｍＲＮＡ転写物レベルの増加によって示される。他の実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、試験癌サンプル中のＡＢＣＣ３遺伝子からの、コントロールサンプルと比較して少なくとも２５倍のｍＲＮＡ転写物レベルの増加によって示される。
【００２８】
他の実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、ＡＢＣＣ３ポリペプチドの発現のレベルを決定することにより検出される。幾つかの実施態様では、ＡＢＣＣ３ポリペプチド発現のレベルは、試験癌サンプルを抗ＡＢＣＣ３抗体に接触すること及び抗ＡＢＣＣ３抗体のＡＢＣＣ３ポリペプチドに対する結合を検出することを含む。幾つかの実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、試験癌サンプル中のＡＢＣＣ３遺伝子からの、コントロールサンプルと比較して少なくとも２倍のＡＢＣＣ３ポリペプチドのレベルの増加によって示される。幾つかの実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、試験癌サンプル中のＡＢＣＣ３遺伝子からの、コントロールサンプルと比較して少なくとも１０倍のＡＢＣＣ３ポリペプチドのレベルの増加によって示される。
【００２９】
幾つかの実施態様では、乳癌腫瘍は、Ｈｅｒ２陽性乳癌腫瘍である。
【００３０】
幾つかの実施態様では、有糸分裂阻害剤は、タキサン（例えば、パクリタキセルとドセタキセルを含む）、メイタンシノイド（例えば、ＤＭ１とＤＭ４を含む）、及びアウリスタチン（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）とモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を含む）、及びそのアナログ及び類似体からなる群から選択される。
【００３１】
幾つかの実施態様では、有糸分裂阻害剤は、抗体にコンジュゲートされる。一実施態様では、有糸分裂阻害剤−抗体コンジュゲートは、トラスツズマブ−ＤＭ１のような、メイタンシノイド−抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲートである。
【００３２】
本発明の別の態様は、癌細胞をＡＢＣＣ３のアンタゴニストに接触させることを含む、癌細胞の有糸分裂阻害剤に対する耐性を減少させる方法を提供する。幾つかの実施態様では、アンタゴニストは、ＡＢＣＣ３に結合する、ＡＢＣＣ３抗体又は、ｓｉＲＮＡである。
【００３３】
本発明の更に別の態様は、患者にＡＢＣＣ３のアンタゴニストと有糸分裂阻害剤の有効量を投与することを含む、有糸分裂阻害剤に耐性の癌を持つ患者の治療法を提供する。幾つかの実施態様では、有糸分裂阻害剤は、タキサン、メイタンシノイド、及びアウリスタチンからなる群から選択される有糸分裂阻害剤とそのアナログ及び誘導体である。幾つかの実施態様では、有糸分裂阻害剤は、抗体にコンジュゲートされる。一実施態様では、有糸分裂阻害剤−抗体コンジュゲートは、トラスツズマブ−ＤＭ１のような、メイタンシノイド−抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲートである。
【００３４】
本発明はまた癌のＡＢＣＣ３増幅状況に基づく癌患者の治療法を提供する。一実施態様では、該方法は、患者からの試験癌サンプルにおいて、ＡＢＣＣ３遺伝子が増幅又は過剰発現されるかどうかを検出し、試験癌サンプルにおいて、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が、検出されない場合は、患者に治療的な有効量の有糸分裂阻害剤ベースの化学療法が施すことを含む。一実施態様では、患者は、Ｈｅｒ２陽性乳癌を有し、トラスツズマブ−ＤＭ１又はトラスツズマブ−ＭＭＡＥのような、抗Ｈｅｒ２抗体−有糸分裂阻害剤コンジュゲートが投与される。
【００３５】
本発明の別の実施態様では、患者は、癌中のＡＢＣＣ３の増幅又は過剰発現が無いことに基づく、有糸分裂阻害剤ベースの化学療法を選択される。一実施態様では、選択した患者は、Ｈｅｒ２陽性乳癌を有し、トラスツズマブ−ＤＭ１又はトラスツズマブ−ＭＭＡＥのような抗Ｈｅｒ２抗体−有糸分裂阻害剤コンジュゲートを投与される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１ａは乳癌細胞株のＭＭＡＥに対するインビトロの応答を示す。図１ｂは乳癌細胞のパクリタキセルに対するインビトロの応答を示す。ｘ軸上で、細胞株は乳癌の主要な分子サブタイプに分類された。ｙ軸はインビトロのＩＣ５０値を示すか、又は細胞生存率５０％阻害の結果となる薬剤濃度を示す。水平線は与えたサブタイプの細胞株のためのそれぞれの薬剤に対する平均の感受性を示す。
【図２】図２ａはパクリタキセルに対するインビトロの耐性が、染色体１７ｑ２１領域の増幅に関連することを示す。図２ｂはＭＭＡＥに対するインビトロの耐性が、染色体１７ｑ２１領域の増幅と関連することを示す。細胞株は、左から右に薬剤感受性が増加する順に示す。ＳＮＰアレイデータの監督解析のために使用した分類（感受性、中間、耐性）と耐性のバイオメーカーの同定が、図の上部に記載される。ゲノムＤＮＡコピー数増幅を伴うそれらの細胞株は、菱形で示す。
【図３】図３は１７ｑ２１．３増幅を伴う細胞株中においてＡＢＣＣ３が過剰発現されることを示す。３１個の細胞株を、領域中の４のコピー数カットオフに基づき、増幅された及び増幅されなかった分類で、箱に入れた。箱髭図は、それぞれのグループにおけるＡＢＣＣ３の発現を示す。２０８１６１＿ｓ＿ａｔは、ＡＢＣＣ３を示す最も可変なアフィメトリクス発現プローブセットとして選択された。他のプローブセットは、類似の結果を与えた。中央の箱は、四分位範囲を示し、箱の中の線は、中央を示し、点の垂直線は、中央から最も離れるが、四分位範囲の１．５倍以内であるデータ点へ伸びる。点の垂直線の外側のデータ点は、それぞれの円によって示される。
【図４】図４ａ−４ｄは、ＡＢＣＣ３又はコントロールのｓｉＲＮＡ治療後の４個の異なる細胞株についてのパクリタキセル治療に応答する、分裂指数を示すグラフを示す。ＥＦＭ−１９２Ａ（ａ）とＺＲ−７５−３０（ｂ）細胞が、ＡＢＣＣ３の増幅と過剰発現を有し、ノックダウン後に高められた感受性（増加した分裂指数）を示し、一方でＨＣＣ−１４２８（ｃ）とＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ｄ）は、低いコピー数と発現を有し、感受性の増加は示さない。
【図５】図５は、安定なＡＢＣＣ３の過剰発現が、パクリタキセルとＭＭＡＥに対するインビトロ耐性の結果となることを示す。ＣＭＶプロモーターからＡＢＣＣ３を過剰発現する、単一細胞クローン由来の安定な細胞株又は空ベクターを伴うコントロール株を、パクリタキセル（図５ａ）又はＭＭＡＥ（図５ｂ）の増殖阻害効果について評価した。
【図６】図６は、ＭＭＡＥ（ａ）又はパクリタキセル（ｂ）を用いて処理した乳癌細胞株の増殖阻害を示す。点は、フィットした非線形投与応答曲線を伴う３８４ウェル中の４重ウェルの平均を示す。ｙ軸は、コントロールビヒクルで処理したウェルに対するパーセント細胞生存率を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図７】図７は、標準細胞生存率アッセイにおけるフリーのＤＭ１に対する感受性について分析した３個のＡＢＣＣ３過剰発現クローンとコントロール細胞株を示す。
【図８】図８は、トラスツズマブ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦで処理した際の、コントロール（ＮＴＣ）又はＡＢＣＣ３ｓｉＲＮＡで形質転換した分裂指標ＥＦＭ−１９２Ａ細胞を表すグラフを示す。
【図９】図９ａは、フリーのＤＭ１で処理した際の、コントロール（ＮＴＣ）又はＡＢＣＣ３ｓｉＲＮＡで形質転換したＥＦＭ−１９２Ａ細胞の分裂応答を示す。図９ｂは、Ｔ−ＤＭ１で処理した、コントロール（ＮＴＣ）又はｓｉＲＮＡで形質転換したＥＦＭ−１９２Ａの有糸分裂応答を示す
【図１０】図１０は、Ｔ−ＤＭ１フェーズＩＩ試験から得られたサンプルにおいて実施したＦＩＳＨ分析の結果を示す。
【図１１】図１１は、細胞株の分子サブタイプにおける情報とその有糸分裂阻害剤に対する感受性を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
１．定義
「遺伝子増幅」及び「遺伝子複製」なる語句（及び「遺伝子の増幅」又は「遺伝子の複製」のような変形例）は交換可能に用いられ、遺伝子又は遺伝子断片の複数のコピーが特定の細胞又は細胞系で形成されるプロセスを意味する。複製された領域（増幅されたＤＮＡのストレッチ）は、しばしば「アンプリコン」と呼ばれる。通常は、生成されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、つまり遺伝子発現レベルも、特定遺伝子の作成されたコピー数に比例して増加する。
【００３８】
ここで使用される「ＡＢＣＣ３」なる用語は、他に示さない場合、霊長類（例えば、ヒトやサル）及び齧歯類（例えば、マウスやラット）のような哺乳類を含む、任意の脊椎動物源からの任意のＡＢＣＣ３（ＭＲＰ−３としても知られる）を意味する。該用語は、細胞中のプロセシングの結果として生じる任意の形態のＡＢＣＣ３だけでなく、「全長」の処理されていないＡＢＣＣ３を含む。概用語は、また例えばスプライス変異体、対立変異体、及び他のアイソフォームのようなＡＢＣＣ３の自然発生変異体を含む。該用語は、またＡＢＣＣ３の少なくとも一つの生物学的活性を維持する天然のＡＢＣＣ３の断片又は変異体を含む。ＡＢＣＣ３の例は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３７８６（ヒト）及びＸＭ＿３５８３０６（マウス）で同定されるものを含む。Kiuchi等, FEBS Lett. 433:149-152 (1998)；及び Borst等, JNCI  92(16):1295-1302 (2000)をまた参照されたい。
【００３９】
「遺伝的変異」なる用語は、アミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列中における変異だけでなく遺伝子又はポリペプチドの増幅における変異を含む。
【００４０】
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
【００４１】
ここで使用される「腫瘍」は、悪性であれ良性であれ、全ての新生物細胞成長及び増殖、及び全ての前癌状態及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」はここで称される場合は相互に排他的ではない。
【００４２】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫（例えば非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌(squamous cell cancer)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓性癌及び様々なタイプの頭部及び頸部の癌が含まれる。
【００４３】
抗有糸分裂を用いた「治療に応答する」又は「治療に応答性の」癌患者は、抗有糸分裂剤を用いた治療の結果から又は結果として生じる臨床又は治療的な利点を示す。このような利点は、細胞又は生物学的応答、完全な応答、部分的な応答、病勢安定（進行又は回復なし）、又は治療に対する患者の応答又は再発に対する薬剤を用いた治療の結果を含む。
有糸分裂阻害剤を用いた「治療に耐性」である癌、癌細胞、又は癌腫瘍は、薬剤に対する統計的に有意な細胞学的又は生物学的応答、例えば細胞死又はアポトーシスの速度増加、又は薬剤で処理していない癌細胞又は腫瘍と比較した際の増幅又は成長の減少、を示さない腫瘍である。特定の実施態様では、癌、癌細胞、又は癌腫瘍は、ＩＣ５０がＭＭＡＥの３０ｎＭより大きいか、又はその代わりに５０ｎＭより大きいか、又はその代わりに１００ｎＭより大きい場合に、ＭＭＡＥを用いた治療に耐性がある。他の実施態様では、癌、癌細胞、又は癌腫瘍は、ＩＣ５０がパクリタキセルの５０ｎＭより大きいか、又はその代わりに１００ｎＭより大きいか、又はその代わりに５００ｎＭ、又はその代わりに１０００ｎＭより大きい場合に、パクリタキセルを用いた治療に耐性がある。
【００４４】
「有糸分裂阻害剤」は、有糸分裂を阻害、予防、又はさもなければ有糸分裂を壊す化合物である。有糸分裂阻害剤の具体的な例は、限定されるものではないが、パクリタキセル及びドセタキセル；ＤＭ１及びＤＭ４のようなメイタンシノイド；ドラスタチン１０；ドラスタチン１５；モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）；ビンブラスチン及びビンクリスチンのようなビンカアルカノイド；及びそれらのアナログ及び誘導体である。有糸分裂阻害剤は、抗体にコンジュゲートされていてもよい。
【００４５】
「治療する」及び「治療」なる用語は、治療処置と予防処置又は予防的処置との両方をいい、その目的は、望ましくない生理学的変化又は障害、例えば癌の発生又は広がりを予防するか又は遅くする(減らす)ことである。本発明の目的で、有利又は望ましい臨床結果としては、検出可能であれ検出不可能であれ、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の安定化された(すなわち、悪化しない)状態、疾患の進行の遅延又は減速、疾患状態の軽減又は緩和、及び寛解(部分的であれ全体的であれ)が挙げられるが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けない場合に予測される生存と比較される場合に、生存を延長することを意味し得る。治療を必要とするものには、その状態又は障害を既に有するもの、並びにその状態又は障害を有しやすいもの、あるいはその状態又は障害が予防されるべきであるものが挙げられる。
【００４６】
「個体」又は「患者」は脊椎動物である。特定の実施態様では、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物には、これに限定されないが、家畜(例えばウシ)、スポーツ用動物、愛玩動物（例えばネコ、イヌ及びウマ）、霊長類、マウス及びラットが含まれる。特定の実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【００４７】
「有効量」とは、所望される治療的又は予防的結果を達成するのに必要な期間、必要な用量での有効量を意味する。
【００４８】
本発明の物質／分子の「治療的有効量」は、病状、年齢、性別、個体の体重、及び個体に所望する反応を引き出すための物質／分子の能力等の要因に応じて変わり得る。また、治療的有効量とは、物質／分子の任意の毒性又は有害な影響を、治療的に有益な効果が上回る量である。「予防的有効量」は、所望する予防的結果を達成するのに必要な期間、用量で有効な量を意味する。必ずではないが、典型的には、予防的用量は、疾病の前又は初期の段階に患者に使用されるために、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
【００４９】
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を意味する。この用語は、放射性同位元素(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素)、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞毒性剤を以下に記載する。「殺腫瘍性」剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【００５０】
「毒素」は、細胞の成長又は増殖に対して有害な影響を有する任意の物質である。
【００５１】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。
【００５２】
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ＡＢＣＣ３のようなポリペプチドの生物学的活性、又はその転写もしくは翻訳を部分的又は完全に阻止、阻害、又は中和する任意の分子を含む。好適なアンタゴニスト分子には、限定されないが、アンタゴニスト抗体、ポリペプチド断片、オリゴペプチド、有機分子（低分子を含む）、及びｓｉＲＮＡを含む、アンチセンス核酸が含まれる。
【００５３】
「抗体」（Ａｂｓ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は同様の構造的特徴を有する糖タンパク質を意味する。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示す一方、免疫グロブリンは、抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の双方を含む。後者の種類のポリペプチドは例えばリンパ系によって低レベルで、またミエローマによって増加したレベルで生産される。
【００５４】
「抗体」及び「イムノグロブリン」なる用語は、広義の意味で交換可能に用いられ、モノクローナル抗体(例として完全長又はインタクトモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、多価抗体、及び多特異性抗体(例として所望の生物学的活性を示すかぎりの二重特異性抗体)が含まれ、特定の抗体断片(本明細書中においてより詳細に記載するもの)も含まれうる。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化、及び／又は親和性成熟したものでもよい。
【００５５】
「抗ＡＢＣＣ３抗体」又は「ＡＢＣＣ３に結合する抗体」は、抗体がＡＢＣＣ３をターゲッティングする際に診断用及び／又は治療用の薬剤として有用である程度に十分な親和性を有してＡＢＣＣ３を結合することが可能である抗体を指す。好ましくは、関係がなくＡＢＣＣ３でないタンパク質への抗ＡＢＣＣ３抗体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)によって測定するところの、ＡＢＣＣ３への抗体の結合のおよそ１０％未満である。ある実施態様では、ＡＢＣＣ３に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、又は≦０.１ｎＭの解離定数(Ｋｄ)を有する。ある実施態様では、抗ＡＢＣＣ３抗体は、異なる種のＡＢＣＣ３間で保存されるＰＲＯのエピトープに結合する。
【００５６】
「全長抗体」、「無傷抗体」及び「全抗体」なる用語は、以下に定義する抗体断片ではなく、その実質的に無傷の形態の抗体を意味するためにここでは交換可能に使用される。該用語は特にＦｃ領域を含む重鎖を持つ抗体を意味する。
【００５７】
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部のみを含有するものであり、この部分は、インタクト抗体中に存在する場合にその部分に通常伴う機能の少なくとも一、好ましくはほとんど又はすべてを保持する。一実施態様では、抗体断片は、インタクト抗体の抗原結合部位を含有するため、抗原結合能を有する。他の実施態様では、抗体断片、例えばＦｃ領域を含有するものは、完全抗体に存在するＦｃ領域が通常関連する生物学的機能の少なくとも一つ、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合を保持する。一実施態様では、抗体断片は、インタクト抗体と実質的に同じインビボ半減期を有する一価の抗体である。例えばそのような抗体断片は、該断片にインビボ安定性を供与しうるＦｃ配列に結合した抗原結合アーム上に含みうる。
【００５８】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
【００５９】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。一実施態様では、二本鎖Ｆｖ種は、緊密に非共有的に結合した一つの重鎖と一つの軽鎖の二量体からなる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインが、軽鎖及び重鎖が二本鎖Ｆｖ種におけるものに類似した「二量体」構造で結合できるように可撓性ペプチドリンカーによって共有的に結合されうる。各可変領域の３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を定めるのはこの配置においてである。まとめると、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲしか含まないＦｖの半分）でさえも抗原を認識しそれに結合する能力を持つが、結合部位全体よりは低い親和性でである。
【００６０】
Ｆａｂ断片は重鎖及び軽鎖可変ドメインを含み、また軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数残基が付加されている点でＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここでは定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ'を表す。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、元々は、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的結合もまた知られている。
【００６１】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般には、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦＶが抗原結合のために望ましい構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨ及びＶＬドメイン間に更に含む。ｓｃＦｖの概説については、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。
【００６２】
「ダイアボディ(diabodies)」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上で二つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補的ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位をつくり出す。ダイアボディは二価又は二重特異的でありうる。ダイアボディは、例えば、欧州特許出願公開第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；Hudson等, (2003) Nat. Med. 9:129-134；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)に、より十分に記載されている。トリアボディ（triabodies）及びテトラボディ（tetrabodies）もまたHudson等, (2003) Nat. Med. 9:129-134に記載されている。
【００６３】
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一である。従って、「モノクローナル」との形容は、個別の抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。このようなモノクローナル抗体は、通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスにより得られる。例えば、この選択プロセスは、雑種細胞クローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからの、唯一のクローンの選択とすることができる。重要なのは、選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的への親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養液中におけるその産生の向上、インビボでの免疫原性の低減、多選択性抗体の生成等が可能になること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることである。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の調製物は、それらが他の免疫グロブリンで通常汚染されていないという点で有利である。
【００６４】
「モノクローナル」との形容は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作製することができ、それらの技術には、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Kohler等、Nature, 256:495 (1975); Harlow等、Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４８１６５６７号参照）、ファージディスプレイ技術（例えば、Clackson等、Nature, 352:624-628 (1991); Marks等、J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Sidhu等、J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee等、J. Mol. Biol. 340(5);1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); 及びLee等、J. Immounol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)）、並びに、ヒト免疫グロブリン座位の一部又は全部、或るいはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物にヒト又はヒト様抗体を生成する技術（例えば、WO98/24893; WO96/34096; WO96/33735; WO91/10741; Jakobovits等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits等、Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann等、Year in Immunol. 7:33 (1993); 米国特許第５５４５８０７号; 同第５５４５８０６号; 同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号; 同第５６３３４２５号; 同第５６６１０１６号; Marks等、Bio.Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg等、Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild等、Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)参照）が含まれる。
【００６５】
ここでモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致するか又は類似するものである(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。
【００６６】
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施態様では、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び／又は能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。また次の文献とそこに引用されている文献を参考のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma &; Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
【００６７】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含むもの、及び／又はここに開示されたヒト抗体を作製する任意の技術を使用して製造されたものである。そのような技術には、ファージディスプレイのようなヒト由来組み合わせライブラリーのスクリーニング（Marks 等, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)及びHoogenboom 等, Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)参照）；ヒトモノクローナル抗体産生のためのヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株の使用(Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)及びBoerner等, J. Immunol., 147: 86 (1991)参照)；及び内因性の免疫グロブリンを産生しない、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）におけるモノクローナル抗体の生成(Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits等, Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann等, Year in Immunol., 7: 33 (1993)参照)が含まれる。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト動物由来の抗原結合残基を含むヒト化抗体を除く。
【００６８】
「親和成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じさせる、その一又は複数のＣＤＲにおいて一又は複数の改変を持つものである。一実施態様では、親和成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において知られている手順によって生産される。Marks et al., Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和成熟について記載している。ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘導は、Barbas et al., Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al., Gene, 169：147-155(1995)；Yelton et al., J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al., J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及びHawkins et al., J. Mol. Biol.226：889-896(1992)に記載されている。
【００６９】
「阻止」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害し又は減少させるものである。ある阻止抗体又はアンタゴニスト抗体は抗原の生物学的活性を部分的に又は完全に阻害する。
【００７０】
抗体「エフェクター機能」は抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を意味し、抗体アイソタイプと共に変わる。抗体エフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞毒性；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面レセプター（例えばＢ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化を含む。
【００７１】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記述する。ある実施態様では、ＦｃＲは天然ヒトＦｃＲである。ある実施態様では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマレセプター）と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態も含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性型レセプター」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害型レセプター」）が含まれ、これは、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ）を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ）を含んでいる（Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照）。ＦｃＲは、 Ravetch及びKinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)；Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲはここでの「ＦｃＲ」なる用語に包含される。
【００７２】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」なる用語には、母性ＩｇＧｓが胎児に受け継がれる要因（Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))及び免疫グロブリンのホメオスタシスの調節の要因となっている新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は知られている。インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質移入ヒト細胞株、又はＦｃ変異体ポリペプチドを投与された霊長類において、アッセイできる。
【００７３】
国際公開第００／４２０７２号（Presta）はＦｃＲへの結合が改善された又は減少した抗体変異体を記載している。該特許刊行物の内容は出典明示により特にここに援用される。またShields等 J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
【００７４】
「ヒトエフェクター細胞」は、一又は複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能をなす白血球である。ある実施態様では、該細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能をなす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞及び好中球が含まれる。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離できる。
【００７５】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害性」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲ)と結合した免疫グロブリンにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒素により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞毒性の形態を意味する。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞のＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同５８２１３３７号又はPrestaの米国特許第６７３７０５６号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が含まれる。別法として、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。
【００７６】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。古典的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているようにして、実施することができる。変異されたＦｃ領域アミノ酸配列を有しＣ１ｑ結合能が増加又は減少したポリペプチド変異体は米国特許第６１９４５５１Ｂ１号及び国際公開第９９／５１６４２号に記載されている。その特許刊行物の内容はここに出典明示により特に援用される。またIdusogie等J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
【００７７】
「Ｆｃ領域含有ポリペプチド」なる用語はＦｃ領域を含む抗体又はイムノアドヘシンのようなポリペプチドを意味する。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付け系による残基４４７）を、例えばポリペプチドの精製中に、又はポリペプチドをコードする核酸を組換え操作することによって、取り除くことができる。従って、本発明に係るＦｃ領域を有するポリペプチドを含有する組成物は、Ｋ４７７を持つポリペプチド、全てのＫ４７７が取り除かれたもの、又はＫ４４７残基を持つポリペプチドと持たないものの混合物を含みうる。  
【００７８】
「細胞障害性抗体」はエフェクター機能を示すことができ、及び／又はその抗原への結合時に細胞死を誘発することができる抗体である。
【００７９】
「免疫複合体」は一又は複数の細胞障害性剤にコンジュゲートされた抗体を意味する。
【００８０】
「小分子」又は「小有機分子」はここでは約５００ダルトン以下の分子量を有する有機分子として定義される。
【００８１】
「ＡＢＣＣ３結合オリゴペプチド」又は「ＡＢＣＣ３に結合するオリゴペプチド」又は「ＡＢＣＣ３ポリペプチド結合オリゴペプチド」は、ＡＢＣＣ３を標的とした診断薬及び／又は治療薬として有用な程度にＡＢＣＣ３と十分な親和性で結合可能なオリゴペプチドである。ある実施態様では、関連のない非ＡＢＣＣ３タンパク質へのＡＢＣＣ３結合オリゴペプチドの結合の程度は、ＡＢＣＣ３へのＡＢＣＣ３結合オリゴペプチドの結合の約１０％より低く、その程度は例えば表面プラズモン共鳴アッセイにより測定される。ある実施態様では、ＣＲＴＡＭ結合オリゴペプチドは、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ又は≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００８２】
「ＡＢＣＣ３結合有機分子」又は「ＡＢＣＣ３に結合する有機分子」は、ＡＢＣＣ３を標的とした診断薬及び／又は治療薬として有用な程度にＡＢＣＣ３と十分な親和性で結合可能な有機分子である。ある実施態様では、関連のない非ＡＢＣＣ３タンパク質へのＡＢＣＣ３結合有機分子の結合の程度は、ＡＢＣＣ３へのＡＢＣＣ３結合有機分子の結合の約１０％より低く、その程度は例えば表面プラズモン共鳴アッセイにより測定される。ある実施態様では、ＡＢＣＣ３結合有機分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ又は≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００８３】
標的ポリペプチドに結合する任意の分子の解離定数（Ｋｄ）は、便宜上表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定され得る。そのようなアッセイは、２５℃で、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した標的ポリペプチドＣＭ５チップと共に、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いてもよい。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。標的ポリペプチドを１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。標的ポリペプチドの注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈した結合分子(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。Chen, Y. et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照のこと。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる抗体の結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【００８４】
ここで使用される場合「標識」なる語句は検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自体が検出可能であり得（例えば放射性同位体標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合には、検出可能な産物を生じる基質化合物又は組成物の化学的変化を触媒しうる。検出可能な標識となりうる放射性核種は例えばＩ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、及びＰｄ−１０９を含む。
【００８５】
「単離された」生物学的分子、例えば核酸、ポリペプチド、又は抗体は、その天然環境の少なくとも一成分から同定され、分離され、及び／又は回収されたものである。
【００８６】
（実施態様の詳細な説明）
原発性乳癌は、遺伝子発現プロファイルによって、少なくとも３種類の主要なサブタイプに分類し得、サブタイプは、患者の生存という点において、異なる予後の結果を有する（９）。管腔乳癌は、典型的には、エストロジェンレセプター陽性であり、上皮特異的遺伝子の幾つかの発現、比較的良い予後、及び標的のホルモン治療に良い応答速度によって特徴付けられる。ＨＥＲ２陽性乳癌は、ＨＥＲ２癌遺伝子の高レベルの遺伝子増幅、未処理の場合、比較的、予後不良であること、及びＨＥＲ２を標的とするモノクローナル抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチン、ジェネンテック）から得られる有意な臨床上の有用性によって特徴付けられる（３）。基底様乳癌は、典型的には、ＨＥＲ２、ＥＲ及びプロゲステロンレセプターの発現が無く、したがって、「３重陰性」腫瘍と呼ばれることもある（１０、１１）。基底様乳癌は、比較的予後不良であり、現在、如何なる標的療法に対しても応答しないことが示されている（１２）。これらのサブタイプは、術前の化学療法に対して異なる応答を示すが（１３）、これらの違いの基本となる薬剤耐性機構の大部分は、未だ決定されていない。
【００８７】
近年の研究によって、乳癌細胞株の大部分が、ヒト乳癌腫瘍の遺伝及びゲノム特性の多くを反映し、したがって、分子異種性乳癌の割合のモデルシステムとして使用し得ることが明らかとなった（１４）。例えば、細胞は、遺伝子発現プロファイルサインに基づいて、基底様及び管腔サブタイプに分類し得、それらは、原発性腫瘍における不良の結果と関連する、高レベルの増幅と欠失のほとんどを維持する（１４）。
【００８８】
共通する特徴と類似の予後を有するサブタイプの乳癌の分子分類は、癌治療を個別化に注力し始めるための枠組みを提供する。本発明は、乳癌のサブタイプが、有糸分裂阻害剤に対する明らかに異なる応答を示し、基底様サブタイプが最も感受性が高いことを示す。この異なる応答の一つの機構は、基底様細胞株では観察されないが、管腔とＨＥＲ２増殖細胞のサブセットにおいては観察されるＡＢＣＣ３薬剤排出ポンプの増加である。
【００８９】
実施例に記載の通り、本発明は、２個の抗有糸分裂ベースの医薬である、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びパクリタキセルに対する応答における耐性機構とサブタイプの違いを製薬的な分析のためのモデルとして分子的に特徴付けられる乳癌細胞株のパネルを使用した。ＭＭＡＥは、癌治療のための幾つかのヒト臨床試験の対象であるペンタペプチド天然物である、ドラスタチン１０と構造的に関連し、チューブリンの重合を阻害することにより強力な抗腫瘍活性を示し、したがって、細胞の微小管を不安定化する（１５）。抗体による特定の抗原認識を通じた医薬の標的送達は、毒素から非標的発現組織を守る一方で、化学療法剤の効果を増加する結果となるという根拠に基づき、アウリスタチン−モノクローナル抗体コンジュゲートが作製される（１６）。
【００９０】
実施例に説明されたこれらの研究に基づき、１７番染色体（１７ｑ２１）の領域の増幅が、タキサンとアウリスタチンのインビトロの耐性に強く関連することが見出された。増幅の領域は、少なくとも１００個の遺伝子を有する。関連する遺伝子を同定するために、ＲＮＡｉ干渉からなる不偏アプローチとハイコンテント分析を、ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅と随伴性過剰発現が、パクリタキセルとＭＭＡＥに対する耐性を付与する最も可能背の高い原因であることを示すために使用した。このアンプリコンは、原発性の乳癌に存在し、増幅したＨＥＲ２と管腔腫瘍には共通であるが、基底様細胞には存在しないことが示された（図６及び９）。
【００９１】
したがって、本発明の一態様は、有糸分裂阻害剤を用いた治療に対して耐性であるかどうかを決定する方法を提供する。一実施態様では、該方法は、ＡＢＣＣ３遺伝子が、癌細胞のサンプル中で増幅されるかどうかを検出することを含む。ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅は、癌が有糸分裂阻害剤に耐性であることを示す。ＡＢＣＣ３遺伝子増幅の検出は、当該分野に周知の任意の方法によって実施され得る。一実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅は、ＡＢＣＣ３遺伝子のコピー数が、癌細胞のサンプル中で増幅されるかどうかを検出することによって実施される。幾つかの実施態様では、遺伝子は、コピー数が少なくとも３、又はその代わりに少なくとも４、又はその代わりに少なくとも５、又はその代わりに少なくとも７、又はその代わりに少なくとも９、又はその代わりに少なくとも１０である場合に増幅される。
【００９２】
遺伝子コピー数は、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、サザンブロット、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、マイクロアレイベース比較ゲノムハイブリダイゼーション、又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）等の、当該分野で知られている任意の方法によって決定され得る。例えば、Avison, M., Measuring Gene Expression, New York: Taylor & Francis Group, 2007, Allison, D. B.等, ed. DNA Microarrays and Related Genomics Techniques: Design, Analysis, and Interpretation of Experiments (Biostatistics), Boca Raton : Chapman & Hill/CRC, 2006; Hayat M. A., ed., Handbook of Immunohistochemistry and in Situ Hybridization of Human Carcinomas, Burlington: Elsevier Academic Press,  2004を参照されたい。
【００９３】
更なる実施態様では、癌が有糸分裂阻害剤に耐性であるかどうかを決定する方法は、ＡＢＣＣ３遺伝子が癌細胞のサンプル中で過剰発現しているかどうかを検出することを含む。ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、癌が有糸分裂阻害剤に対する耐性があることを示す。ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現の検出は、当該分野で知られている任意の方法によって実施され得る。一実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現は、ＡＢＣＣ３遺伝子からのｍＲＮＡ転写のレベルを決定することにより検出される。ｍＲＮＡ転写のレベルは、当業者に知られる種々の方法によって定量的又は定性的に決定され得る。ｍＲＮＡの転写レベルは、またｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡの検出レベルによって直接又は間接的に決定し得る。ｍＲＮＡの転写レベルを決定する例示的な方法は、限定するものではないが、ＰＣＲ、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ及びマイクロアレイベースアッセイ及びノザンブロットのようなフィルターベースアッセイを含むハイブリダイゼーションベースアッセイを含む。ある実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子は、ｍＲＮＡの転写レベルが、適切なコントロールサンプルと比較してｍＲＮＡの転写において、少なくとも３、５、７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０倍増加した場合、過剰発現する。
【００９４】
他の実施態様では、ＡＢＣＣ３遺伝子の発現は、ＡＢＣＣ３ポリペプチド発現のレベルの決定によって検出される。ＡＢＣＣ３ポリペプチドのレベルは、定量的又は定性的に、抗体ベース検出法を含む、当業者に知られた方法で決定し得る。一実施態様では、試験癌サンプル中でのＡＢＣＣ３遺伝子の発現の検出は、癌サンプルを抗ＡＢＣＣ３抗体に接触させ、抗ＡＢＣＣ３抗体のＡＢＣＣ３ポリペプチドに対する結合を検出することにより、試験癌サンプル中のＡＢＣＣ３の発現レベルを（定量的又は定性的に）決定することを含む。ある実施態様では、抗ＡＢＣＣ３抗体のＡＢＣＣ３ポリペプチドに対する結合は、限定されるものではないが、免疫組織化学、蛍光標示式細胞分取器、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ等を含む当業者に知られた種々の方法によって検出し得る。ある実施態様では、ＡＢＣＣ３の過剰発現は、ＡＢＣＣ３ポリペプチドレベルが、適切なコントロールサンプルと比較して、少なくとも３、５、７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０倍増加した場合、過剰発現する。
【００９５】
癌細胞または試験癌サンプルのサンプルは好ましくは、癌腫瘍から直接に採取した細胞から成るが、試験癌サンプルはまた、転移癌細胞、循環腫瘍細胞又は癌のＡＢＣＣ３遺伝子の増幅又は表現型を識別する細胞の任意の適切な試料に含まれ得る。試験され得る癌の実施例は、乳癌、卵巣がん、結腸直腸癌、前立腺ガン、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺胞上皮癌、腹膜癌、肝細胞性癌、消化器癌、膵癌、神経膠腫、子宮頸癌、肝癌、膀胱ガン、肝癌、大腸癌、直腸ガン、子宮内膜であるか子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝癌、外陰部癌、甲状腺ガン、肝癌、白血病及び他のリンパ増殖性障害の癌、種々の型の頭頸部、及び有糸分裂阻害剤を用いた治療のために適切な任意の他の癌を含む。
【００９６】
癌中のＡＢＣＣ３の過剰発現を決定するための適切な制御は、例えば、ＡＢＣＣ３の標準レベルを発現する細胞又は組織のコントロールサンプル中におけるＡＢＣＣ３の発現レベルを決定し、癌中のＡＢＣＣ３の発現レベルを、コントロールサンプル中のＡＢＣＣ３の発現レベルと比較することによって、なされ得る。その代わりに、コントロールは、ＡＢＣＣ３の過剰発現を決定するために使用される同じ試験癌サンプル中か、又はＡＢＣＣ３の過剰発現について、試験され得る同じ癌から得たサンプル中でのハウスキーピング遺伝子（アクチンファミリーメンバーのような）の発現を決定することにより、なされ得る。ハウスキーピング遺伝子は、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現を決定するためのコントロールとして機能する。
【００９７】
ＡＢＣＣ３の増幅及び／又は過剰発現は、したがって、癌に罹患した患者が癌を有効に治療するために最も見込みのある適切な治療法を選択することを可能にする。
【００９８】
したがって、有糸分裂阻害剤ベースの化学療法のための癌患者を選択する方法を提供することは、本発明の一態様である。癌がＡＢＣＣ３の増幅又は過剰発現を示す患者は、抗有糸分裂治療に代わる治療を追求すべきかどうかを主治医と共に決定するためにそのような情報を使用し得る。一実施態様では、該方法は、ＡＢＣＣ３遺伝子が患者から得られた私権癌サンプル中で増幅されているかどうかを検出し、ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅が試験癌サンプル中で検出されない場合は、有糸分裂阻害剤ベースの化学療法のための患者を選択することを含む。別の実施態様では、該方法は、ＡＢＣＣ３遺伝子が患者からの試験癌サンプル中で過剰発現しているかどうかを検出し、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が試験癌サンプル中で検出されない場合は、有糸分裂阻害剤ベースの化学療法のための患者を選択することを含む。
【００９９】
一実施態様では、患者は、乳癌患者である。更なる実施態様では、患者は、Ｈｅｒ２陽性乳癌を有する。乳癌（Ｈｅｒ２陽性乳癌）中のＨＥＲ２の発現又は増幅は、Ｈｅｒ２陰性、エストロジェンレセプター陽性、リンパ節転移陽性有癌（５２）の患者と比較して、ドキソルビシンを用いたアジュバント治療後の有糸分裂阻害剤であるパクリタキセルの添加より得られる臨床上のより大きな効果と関連する（５２）。しかし、ＨＥＲ２陽性腫瘍を有する女性の優位な割合が、この治療から得られる延命効果を示さず（５２）、パクリタキセル耐性機構は、ＨＥＲ２陽性腫瘍に比例して存在することを示唆する。有糸分裂阻害剤に対するこの耐性は、例えば、トラスツズマブ−ＤＭ１抗体コンジュゲートのような、有糸分裂阻害剤にコンジュゲートさせた抗Ｈｅｒ２抗体を使用する治療法に特に関係がある。実施例に示した通り、ＡＢＣＣ３の過剰発現は、トラスツズマブ−有糸分裂阻害剤コンジュゲートを用いた治療に対する耐性と関連がある。逆に、ｓｉＲＮＡを用いたＡＢＣＣ３遺伝子のノックダウンは、トラスツズマブ有糸分裂阻害剤コンジュゲートを用いた治療に対する細胞の感受性を増加させる。したがって、本発明は、抗Ｈｅｒ２抗体−有糸分裂阻害剤コンジュゲートを用いた治療のための、Ｈｅｒ２陽性乳癌細胞患者を選択する方法を提供する。一実施態様では、該方法は、ＡＢＣＣ３遺伝子が患者の試験乳癌サンプル中で増幅されるかどうかを検出し、ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅が試験乳癌サンプル中で検出されない場合、抗Ｈｅｒ抗体−有糸分裂阻害剤コンジュゲートを用いた治療のための患者を選択することを含む。別の実施態様では、該方法は、ＡＢＣＣ３遺伝子が患者の試験癌サンプル中で過剰発現されるかどうかを検出し、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が試験癌サンプル中で検出されない場合、抗Ｈｅｒ抗体−有糸分裂阻害剤コンジュゲートを用いた治療のための患者を選択することを含む。幾つかの実施態様では、該方法は、この情報が既に知られていない場合、患者がＨｅｒ２陽性乳癌を有しているかどうかを決定し、したがって、抗Ｈｅｒ２抗体治療のための適性を決定することを含む。幾つかの実施態様では、抗Ｈｅｒ２抗体−有糸分裂阻害剤コンジュゲートは、トラスツズマブ−ＤＭ１又はトラスツズマブ−ＭＭＡＥのようなトラスツズマブ−有糸分裂阻害剤コンジュゲートである。
【０１００】
本発明はまた癌のＡＢＣＣ３増幅状態に基づく癌患者の治療法を提供する。一実施態様では、該方法は、ＡＢＣＣ３遺伝子が患者の試験癌サンプル中で増幅されるかどうかを検出し、ＡＢＣＣ３遺伝子の増幅が試験癌サンプル中で検出されない場合、患者に治療的有効量の有糸分裂阻害剤ベース化学療法を施すことを含む。別の実施態様では、該方法は、ＡＢＣＣ３遺伝子が患者の試験癌サンプル中で過剰発現されるかどうかを検出し、ＡＢＣＣ３遺伝子の過剰発現が試験癌サンプル中で検出されない場合、患者に治療的有効量の有糸分裂阻害剤ベース化学療法を施すことを含む。一実施態様では、患者はＨｅｒ２陽性乳癌を有し、試験癌サンプル中でＡＢＣＣ３遺伝子の増幅又は過剰発現が検出されない場合は、抗Ｈｅｒ２抗体−有糸分裂阻害剤コンジュゲートが投与される。幾つかの実施態様では、抗Ｈｅｒ２抗体−有糸分裂阻害剤コンジュゲートは、トラスツズマブ−ＤＭ１又はトラスツズマブ−ＭＭＡＥのような、トラスツズマブ−有糸分裂阻害剤コンジュゲートである。
【０１０１】
更に別の実施態様では、患者は、癌におけるＡＢＣＣ３の増幅又は過剰発現の欠損に基づく有糸分裂阻害剤ベース化学療法について選択され、治療的有効量の抗有糸分裂阻害ベース化学療法を投与される。一実施態様では、選択された患者は、Ｈｅｒ２陽性乳癌を有し、抗Ｈｅｒ２抗体−有糸分裂阻害剤コンジュゲートを投与される。幾つかの実施態様では、抗Ｈｅｒ２抗体−有糸分裂阻害剤コンジュゲートは、トラスツズマブ−ＤＭ１又はトラスツズマブ−ＭＭＡＥのような、トラスツズマブ−有糸分裂阻害剤コンジュゲートである。
【０１０２】
本発明の別の態様は、変化した医薬感受性に関連する遺伝子増幅変化を同定する方法を提供する。薬剤耐性の理解に向けられた殆どのインビトロプロファイリングの取り組みは、今日まで遺伝子発現解析に焦点が置かれた。本発明は、高密度ＳＮＰアレイプロファイル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の解析を用いた、変化した薬剤感受性に関連するＤＮＡコピー数変化の同定を記載する。高密度一塩基多型（ＳＮＰ）アレイは、ジェノタイピングにおけるそれらの意図した応用に加えて、ゲノムワイドＤＮＡコピー数変化とヒト癌中のヘテロ接合性欠失（１７）に検出に使用され得ることを、最近の研究は示した。これらのアレイは、反復欠失及び増幅した染色体領域（１８）を指摘することによる、腫瘍抑制因子と癌遺伝子座の同定において応用されることが示された。
【０１０３】
ここに示したデータは、アレイが治療薬の活性を調節し得る遺伝子を有する増幅された領域を同定するために使用され得ることを示す。このアプローチの鍵となる利点は、遺伝子増幅事象が、比較的安定であり、臨床試験から得られた保存サンプルにおいて最終的に評価され得ることである。保存サンプル中の遺伝子増幅事象を検出するための、一の特定の適切なアッセイは、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）である。ＦＩＳＨアッセイは、既にＨＥＲ２陽性ＭＢＣ（５０）の診断における所定の診療の一部であり、現在、Ｔａｒｃｅｖａ又はＥｒｂｉｔｕｘ（５１）への応答の見込みあるバイオマーカーとしてのＥＧＦＲ増幅を検出するための診断試験として評価されている。
【０１０４】
本発明の更に別の態様は、癌がＡＢＣＣ３の増幅と過剰発現を含む患者のための、有糸分裂阻害剤の適切な投与レベルを決定する方法を提供する。一実施態様では、該方法は、ＡＢＣＣ３が患者の試験癌サンプル中で増幅及び／又は過剰発現しているかどうかを決定し、ＡＢＣＣ３が増幅又は過剰発現している場合は、患者に有糸分裂阻害剤の増加した投与量を投与することを含む。有糸分裂阻害剤の投与量は、癌が有糸分裂阻害剤を用いた治療に応答を示す投与量まで増加させる。幾つかの実施態様では、患者に投与する有糸分裂阻害剤の投与量は、癌がＡＢＣＣ３の増幅及び／又は過剰発現を含まない患者に対する投与量の、少なくとも１．２倍、又はその代わりに１．３倍、又はその代わりに１．５倍、又はその代わりに２倍、又はその代わりに２．５倍、又はその代わりに３倍、又はその代わりに５倍、又はその代わりに１０倍である。
【０１０５】
本発明の更に別の態様は、癌細胞をＡＢＣＣ３のアンタゴニストに接触することを含む癌細胞の有糸分裂阻害剤に対する耐性を低減する方法を提供する。幾つかの実施態様では、ＡＢＣＣ３アンタゴニストは、ＡＢＣＣ３の増幅及び／又は過剰発現を防ぐために役立ち、増幅及び／又は過剰発現によって得られる薬剤耐性を低減する。他の実施態様では、ＡＢＣＣ３アンタゴニストは、ＡＢＣＣ３活性を阻害するために役立つ。該方法において有用なアンタゴニストは、ＡＢＣＣ３抗体、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ベースＡＢＣＣ３アンタゴニスト、特に、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡ、ＡＢＣＣ３ポリペプチド結合オリゴペプチド、ＡＢＣＣ３結合有機分子を含む。
【０１０６】
本発明の更なる態様は、患者にＡＢＣＣ３のアンタゴニストと有糸分裂阻害剤を投与することを含む、有糸分裂阻害剤に耐性の癌を有する患者を治療するための、併用療法を提供する。幾つかの実施態様では、アンタゴニストは、ＡＢＣＣ３抗体とＡＢＣＣ３に結合するｓｉＲＮＡからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、有糸分裂阻害剤は、タキサン、メイタンシノイド、及びアウリスタチンと、それらのアナログ及び誘導体からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、有糸分裂阻害剤は、例えば、トラスツズマブ−ＤＭ１のような、メイタンシノイド−抗−Ｈｅｒ２抗体コンジュゲートのように、抗体にコンジュゲートされる。一実施態様では、併用療法は、ＡＢＣＣ３とトラスツズマブ−ＤＭ１に結合するｓｉＲＮＡを用いた治療を含む。
【０１０７】
上記のような併用療法は、併用投与（２又は複数の治療薬が同じ又は別の製剤に含まれる）、及び分離投与、この場合、ＡＢＣＣ３アンタゴニストの投与は、有糸分裂阻害剤の投与の前、同時、及び／又は後になされ得る、を含む。
【０１０８】
一実施態様では、ＡＢＣＣ３アンタゴニストは、抗ＡＢＣＣポリペプチド抗体である。例示的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びヘテロコンジュゲート抗体を含む。
【０１０９】
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生される。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質へ、関連する抗原（特に、合成ペプチドが用いられる場合）を結合させるために有用である。例えば、この抗原を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて結合させることができる。ある実施態様では、抗体を作製するために使用される動物は、トランスジェニック動物であり得る。このようなある実施態様では、ＡＢＣＣ３をコードするポリヌクレオチドが完全に無いことを示し、ＡＢＣＣ３の発現を示さない（「ノックアウト」動物と呼ぶ）ようにするために、動物は改変され得る。このような動物を調製する方法は、当該分野でよく知られており、例えば、Snouwaert等, Science 257:1083, 1992; Lowell等, Nature 366:740-42, 1993; Capecchi, M. R., Science 244: 1288-1292, 1989を参照されたい。そのようなタンパク質又はペプチドのためのノックアウト動物中で特定のタンパク質又はペプチドに対する抗体を調製することは、当該分野で知られているように、抗体の産生及び／又は収率を低減し得る動物中での抗自己反応が起き得ないので、有利であり得る。
【０１１０】
動物は、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ（それぞれウサギ又はマウスに対して）をフロイント完全アジュバント３容積量と混合し、その溶液を複数部位において皮内投与注射することによって免疫される。１か月後に、動物は、複数部位での皮下注射によって、フロイント完全アジュバント中の抗原又はコンジュゲートの初期量の１／５から１／１０の量で追加免疫される。７−１４日後に、動物から採血し、血清の抗体力価を分析する。動物は抗体力価が一定になるまで追加免疫される。コンジュゲートはまたタンパク質融合体として組換え細胞培養において作成することができる。また、ミョウバンのような凝集剤が免疫反応を増強するために適宜用いられる。
【０１１１】
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作製することができる。
【０１１２】
本発明の抗ＡＢＣＣ３抗体は、更にヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全て或いはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全て或いはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。好ましくは、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【０１１３】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(Winter)及び共同研究者［Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、原型のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１１４】
抗体がヒトの治療用途を意図している場合、抗原性及びＨＡＭＡ反応(ヒト抗-マウス抗体)を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒトＶドメイン配列を同定し、その中のヒトフレームワーク（ＦＲ）をヒト化抗体のために受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【０１１５】
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０１１６】
ヒト化抗ＡＢＣＣ３ポリペプチド抗体の種々の形態が考えられる。例えばヒト化抗体は、免疫結合体を生成するために、状況に応じて一又は複数の細胞傷害剤(類)と結合していてもよい抗体断片、例えばＦａｂであってもよい。その代わりに、ヒト化抗体は無傷抗体、例えば無傷ＩｇＧ１抗体であってもよい。
【０１１７】
ヒト化の別法として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０６号、同５５６９８２５号、同５５９１６６９号（全てジェンファーム(GenPharm)）；同５５４５８０７号；及び国際公開第９７／１７８５２号を参照されたい。
【０１１８】
別法として、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553[1990])を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択に基づいても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照せよ。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリーから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
【０１１９】
上述したように、ヒト抗体はインビトロで活性化したＢ細胞により産生することができる(米国特許第５５６７６１０号及び同５２２９２７５号)。
【０１２０】
ある状況下では、抗体全体よりも、抗体断片を用いることに利点がある。より小さな大きさの断片によって迅速なクリアランスが可能となり、固形腫瘍への接近の改良につながり得る。
【０１２１】
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は、すべて大腸菌で発現させ分泌させることができ、従って、大量のこれら断片の産生が容易となった。抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリーから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。インビボ半減期が増した、サルベージレセプター結合性エピトープ残基を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２が、米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の連結部位を有する唯一の種である；従って、インビボで使用している間の減少した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のどちらかで、エフェクタータンパク質の融合体が生成されるように構成されてもよい。上掲のAntibody Engineering, Borrebaeck編を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。
【０１２２】
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)及び／又は補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)を増強することが望ましい。このことは、抗体のＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸置換基を導入することにより達成される。別に、又は付加的にシステイン残基(類)をＦｃ領域に導入して、この領域における鎖間ジスルイド結合を形成させる。このようにして産生されたホモダイマー抗体は改善された内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)を有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照されたい。抗腫瘍活性が高められたホモダイマー抗体は、Wolff等, Cancer Research 53:2560-2565(1993)に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。あるいは二重Ｆｃ領域を有し、よって増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能を有しうる抗体を設計することができる。Stevenson等, Anti-cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。アンタゴニストの血清半減期を延長するために、例として米国特許第5,739,277号に記載されているようにアンタゴニスト(特に抗体断片)内にサルベージレセプター結合エピトープを組み込む方法がある。ここで用いる、「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期延長に関与するＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを表す。
【０１２３】
別のＡＢＣＣ３ポリペプチドアンタゴニストとなり得るものは、アンチセンス技術により調製されたアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ構築物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズし、蛋白質の翻訳を阻害することにより直接ｍＲＮＡの翻訳を妨げるように働く。三本鎖形成、または、アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡによって、アンチセンス技術は遺伝子発現を調製するのに用いることができ、どちらの方法もポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでは成熟ＡＢＣＣ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード部分は、長さが約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するのに用いられる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、遺伝子の転写に関る領域に相補的に設計され（三本鎖―Leeet al., Nucleic Acids Res., 6:3073(1979）；Cooney et al., Science, 241:456(1988)；Dervan et al., Science, 251:1360(1991)参照）、それによりＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドの転写、および、産生を阻害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはイン・ビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子のＡＢＣＣ３ポリペプチドへの転写を妨げる（アンチセンス―Okano, Neurochem., 56:560(1991)；「Origodeoxynulcleotide as Antisense Inhibitors of Gene Expression」(CRC Press:Boca Raton, FL, 1988))。また、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがイン・ビボでＡＢＣＣ３ポリペプチドの産生を阻害するように発現されるように、上記オリゴヌクレオチドは細胞へ届けられ得る。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、例えば、標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０および＋１０位の間である翻訳開始部位由来のオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１２４】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、標的遺伝子の発現を低減する一般的には３０ヌクレオチド長より短い二重鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、小分子又は抗体のような伝統的なアンタゴニストが機能しない遺伝子発現調節の研究においてツールとして役立つことが証明されている(Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003))。インビトロで調製され、２１から２３ヌクレオチド長の二重鎖ＲＮＡは、干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）として機能し得、遺伝子発現を特異的に阻害し得る(Fire A., Trends in Genetics 391; 806-810 (1999))。これらのｓｉＲＮＡは、それらの標的ＲＮＡの消化を媒介することによって機能する。それらは、３０ヌクレオチド長より短いので、細胞抗ウイルス機構を開始しない。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、ＡＢＣＣ３コードポリヌクレオチド又はその構成要素のコード配列の部分と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のヌクレオチド相同性を有する。
【０１２５】
ＡＢＣＣ３ポリペプチド結合オリゴヌクレオチドはここで記載される様なＡＢＣＣ３ポリペプチドに好ましくは特異的に結合するオリゴペプチドである。ＡＢＣＣ３ポリペプチド結合オリゴペプチドは、既知のオリゴペプチド合成方法論を用いて化学的に合成することができ、あるいは組み換え技術を用いて調製及び精製することができる。ＡＢＣＣ３ポリペプチド結合オリゴペプチドは通常、少なくとも約５のアミノ酸長であり、或いは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００のアミノ酸長以上であり、このようなオリゴペプチドはここに記載される様なＡＢＣＣ３ポリペプチドに対して好ましくは特異的に結合する能力がある。ＡＢＣＣ３ポリペプチド結合オリゴペプチドは、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定することができる。この点において、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるオリゴペプチドのオリゴペプチドライブラリーを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えば、米国特許第５５５６７６２号、同第５７５０３７３号、同第４７０８８７１号、同第４８３３０９２号、同第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、同第５６６３１４３号；ＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０３５０６号、及びＷＯ８４／０３５６４号；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)；Geysen等, in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)；Geysen等, J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)；Schoofs等, J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla,S.E.等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378；Lowman,H.B.等 (1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson,T.等 (1991) Nature, 352:624；Marks,J.D.等 (1991) J. Mol. Biol., 222:581；Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363、及びSmith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668参照）。
【０１２６】
この点において、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、大きなオリゴペプチドライブラリーを検索して、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるこれらライブラリーのメンバーを同定することを可能にするよく知られた技術の一つである。ファージディスプレイは、様々なポリペプチドがバクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質に融合タンパク質として表示されることによる技術である（Scott,J.K.及びSmith G. P. (1990) Science 249:386)。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異体（又はランダムクローンｃＤＮＡ）の大きなライブラリーを標的分子に高い親和性で結合するこれらの配列について素早く効果的に分類することができる点にある。ファージでのペプチド（Cwirla,S.E.等 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378）又はタンパク質（Lowman,H.B.ら (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson,T.ら (1991) Nature, 352: 624; Marks,J.D.等 (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363）ライブラーリのディスプレイは、特異的に結合する特性を有するものについて無数のポリペプチド又はオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている（Smith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668）。ランダム突然変異体のファージライブラリーの分類は、多数の変異体を構築して増殖させる方法、標的レセプターを用いた親和性精製の方法、及び結合増強の結果を評価する手段を必要とする。米国特許第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、及び同第５６６３１４３号。
【０１２７】
ペプチドライブラリーを作製し、これらのライブラリーをスクリーニングする方法は、また、米国特許第5,723,286号、同第5,432,018号、同5,580,717号、同5,427,908号、同5,498,530,号、同5,770,434,号、同5,734,018号、同5,698,426,号、同5,763,192号及び同5,723,323号に開示されている。
【０１２８】
ＡＢＣＣ３ポリペプチド結合小分子は、好ましくは特異的にＡＢＣＣ３ポリペプチドに結合する、本明細書で定義されるようなオリゴペプチド又は抗体以外の有機分子である。ＡＢＣＣ３ポリペプチド結合有機小分子は、公知の方法を用いて同定され、化学的に合成されてよい(例としてＰＣＴ国際公開第００／００８２３号および国際公開第００／３９５８５号参照)。ＡＢＣＣ３ポリペプチド結合有機小分子は通常、およそ２０００ダルトン未満の大きさ、あるいはおよそ１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトン未満の大きさであり、このようなＡＢＣＣ３ポリペプチドに好ましくは特異的に結合できる有機小分子は周知の技術を使用して過度の実験を行うことなく同定されてよい。この点に関して、ポリペプチド標的に結合することができる分子について有機小分子ライブラリをスクリーニングするための技術は当分野で周知である(例としてＰＣＴ国際公開００／００８２３および国際公開００／３９５８５参照)。ＡＢＣＣ３ポリペプチド結合有機小分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール類、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバミン酸エステル、炭酸塩、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、アリールスルホン酸塩、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホン酸塩、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニルクロリド、ジアゾ化合物、酸クロリド等であってよい。
【０１２９】
上記薬剤の何れかを含む薬学的製剤は、水溶液又は凍結乾燥されるか又は他の乾燥した形態で、好適な生理学的に受容可能な担体、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する抗体又は免疫コンジュゲートとを混合することにより、保存用に調整される(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed., (1980))。受容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸、ヒスチジン及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンゼトニウム）；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。インビトロ投与に使用される薬学的製剤は、一般的には無菌である。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより即時達成される。
【０１３０】
また薬剤は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリペプチド-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル、コロイド状ドラッグデリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、（Remington's Pharmaceutical sciences 16th edition, Osol, A. 編, (1980)に開示されている。
【０１３１】
徐放性製剤を調整してもよい。徐放性製剤の適切な例として、抗体を含む固形疎水性ポリマーの半透性基質を上げることができ、この基質は、有形物、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。徐放性基質の例には、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌグルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタミンの共重合体、非分解性エチレン−ビニルアセテート、LUPRON DEPOTTM（乳酸−グリコール酸共重合体及びリュープロリド酢酸塩からなる注射可能な微粒子）のような、分解性の乳酸−グリコール酸の共重合体、並びにポリ−Ｄ−（−）３−ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレンビニルアセテート及び乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日に亘る分子の放出を可能にし、一方、特定のハイドロゲルは、それよりも短期間に亘ってタンパク質を放出する。カプセル封入された抗体は、体内に長時間留まるとき、３７℃で水分に曝されることにより、変性又は凝集し、その結果生物学的活性を失い、場合によっては免疫原生が変化する。関与する機序に応じて、安定化のために合理的な戦略を講じることができる。例えば、凝集の機序が、チオ−ジスルフィド交換により分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが発見された場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液の凍結、水分含有率の制御、適切な添加剤の使用、及び特定のポリマー基質組成物の開発により、安定化させることができる。
【０１３２】
有糸分裂阻害剤
有糸分裂阻害剤は、有糸分裂を、阻害、予防、又はそうでなければ崩壊させる任意の化合物である。有糸分裂阻害剤の具体的な例は、限定されるものではないが、パクリタキセルとドセタキセルのようなタキサン、種々のメイタンシノールエステル、及びＤＭ１及びＤＭ４のような、メイタンシノール分子の芳香環又は他の部分において修飾されたメイタンシノールとメイタンシノールアナログを含むメイタンシノイド、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、及びモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）とモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）のようなアウリスタチン、ビンブラスタチンとビンクリスチンのような、ビンカアルカロイド及びそれらのアナログと誘導体を含む。
【０１３３】
タキサンは、イチイの木由来の抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、ブリストル-マイヤー スクウィブ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
【０１３４】
メイタンシノイドは、細胞を細胞周期のＧ２／Ｍ期に留め、最終的に細胞死に至らせる、強力な有糸分裂阻害剤である、チューブリン結合剤である。メイタンシノイドは、メイタンシンの誘導体であり、メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号及びKawai等(1984) Chem. Pharm. Bull. 3441-3451に開示されている。
【０１３５】
アウリスタチンは、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を含む、ドラスタチン１０（ペンタペプチド天然物）のアナログである。このファミリーの分子は、チューブリン重合を阻害する。一般的に、活性は、ドキソルビシンより１００から１０００倍強い（Pettit, G. R., The dolastatins. Progress in the Chemistry of Organic Natural Products 70, 1-79, 1997）。
【０１３６】
有糸分裂阻害剤は、抗体にコンジュゲートされていてもよい。
【０１３７】
抗体−薬剤コンジュゲートを調製するために、当該分野で知られている多くの結合基がある。抗体メイタンシノイドコンジュゲートは、文献中で広く記述されている。例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号及びChari等, Cancer Research 52:127-131 (1992)を参照されたい。抗体−薬剤コンジュゲートを作製するのに有用な結合基は、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸開裂基、光開裂基、ペプチド開裂基、又はエステラーゼ開裂基、上記の特許に記載の通り、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【０１３８】
抗体とメイタンシノイド、又は他の有糸分裂阻害剤とのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。ある実施態様では、カップリング剤は、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)又はＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])である。
【０１３９】
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。一実施態様では、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【０１４０】
有糸分裂阻害剤抗体コンジュゲートの例は、限定されるものでは無いが、トラスツズマブ−ＤＭ１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ、出典明示によりその全体がここに取り込まれる米国特許第７０９７８４０号において記載される）、トラスツズマブ−アウリスタチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／  Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、カンツズマブメルタンシン（ｈｕＣ２４２−ＤＭ１、ＳＢ−４０８０７５）（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）、ＢＢ−１０９０１（ｈｕＮ９０１−ＤＭ１）（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）、ＭＬＮ２７０４（ＤＭ１）（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ビバツズマブメルタンシン（ＤＭ１）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ｈｕＭｙ９−６−ＤＭ４（ＡＶＥ９６３３）（Ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓｃ）、ｈｕＣ２４２−ＤＭ４（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）、ＳＧＮ−３５（モノメチルアウリスタチン）（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＳＧＮ−７５（モノメチルアウリスタチン）（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、及びＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ（Ｃｕｒａｇｅｎ／Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を含む。
【０１４１】
トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１（Ｔ−ＤＭ１）（ＣＡＳ登録番号１３９５０４−５０−０）は、構造：
2018086000.tif 000003
を有し、ここで、Ｔｒは、リンカー部位であるＭＣＣを通してメイタンシノイド医薬部位であるＤＭ１（米国特許第５２０８０２０号；米国特許第６４４１１６３号）に結合させたトラスツズマブである。抗体に対する医薬の割合又は医薬の搭載は、トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１の上の構造においてｐによって表され、整数値の範囲は１から約８である。医薬の搭載値ｐは１から８である。トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１は、１、２、３、４、５、６、７、及び８の医薬部位が抗体のトラスツズマブに共有結合した（米国特許第７０９７８４０号；米国特許第２００５／０２７６８１２号；米国特許第２００５／０１６６９９３号）、種々に搭載し、結合した抗体医薬コンジュゲートの全ての混合物を含む。トラスツズマブは、マウス４Ｄ５抗体(１９９０年５月２４日の、ブダペスト条約の下、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852に寄託されたＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４６３である。ATCC CRL 10463, deposited with American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852 under the Budapest Treaty on May 24, 1990)の、又はマウス４Ｄ５抗体由来の抗原結合部位を有する抗体である。例示的なヒト化４Ｄ５抗体は、米国特許第５８２１３３７号中のような、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））である。
【０１４２】
トラスツズマブ−ＤＭ１（又はＴ−ＤＭ１）は、ＨＥＲ２過剰発現癌の、トラスツズマブ感受性及びトラスツズマブ非感受性モデルにおいて有効であることが示される。臨床研究が、ＨＥＲ２過剰発現乳癌を有する患者におけるＴ−ＤＭ１の安全性と効能を評価するために現在進行中である。
【実施例】
【０１４３】
実施例１−技術とアッセイ
細胞株と生存率実験
乳癌細胞株ＡＵ５６５、ＢＴ−４７４、ＢＴ−５４９、ＣＡＭＡ−１、ＤＵ４４７５、ＨＣＣ１１４３、ＨＣＣ１４１９、ＨＣＣ１４２８、ＨＣＣ２２１８、ＨＣＣ７０、Ｈｓ５７８Ｔ、ＫＰＬ−１、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｔ−４７Ｄ、ＵＡＣＣ−８１２、ＺＲ−７５−１及びＺＲ−７５−３０は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC, Manassas, VA）から得た。細胞株ＣＡＬ−１２０、ＣＡＬ−１４８、ＣＡＬ−５１、ＣＡＬ−８５−１、ＥＦＭ−１９、ＥＦＭ−１９２Ａ、ＥＶＳＡ−Ｔ、及びＭＴ−３は、the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Braunschweig, Germany)から得た。１０％のウシ胎児血清(Sigma, St. Louis, MO)、非必須アミノ酸及び２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０又はＤＭＥＭ中で維持した。乳癌細胞株として注釈付けられるが、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓは、実際には、分子及び遺伝学的基準（１９、２０）に基づき、メラノーマ起源及び結腸起源のＭＴ−３であり得る。これらの発見は、この研究の結果に影響を与えない。
【０１４４】
ＭＭＡＥとパクリタキセルのＩＣ５０の決定については、細胞は、通常の成長培地中、３８４ウェルプレートにおいて、ウェル毎に３０００細胞の密度で四重に播き、終夜付着させた。パクリタキセル（シグマ）又はＭＭＡＥ(Seattle Genetics, Seattle, WA)を、３倍希釈系列（パクリタキセルについて最大１μｍｏｌ／Ｌ又はＭＭＡＥについて最大０．１μｍｏｌ／Ｌ）に基づき、１０倍濃度添加した。
【０１４５】
細胞生存率をCelltiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega, Madison, WI)を使用して７２時間後に測定した。細胞生存率（ＩＣ５０）の５０％阻害の結果になる薬剤の濃度は、４パラメーター曲線解析（XLfit, IDBS software）から計算され、３回の実験の最小値から決定された。実施された実験の多数における薬剤治療に応答する細胞生存率の５０％の減少を示さなかった細胞株は、定義によるとＩＣ５０に達していないと見なされ、ＩＣ５０が、１００ｎＭ（ＭＭＡＥ）より多いか又は１０００ｎＭより多い(パクリタキセル)として記載される。図６は、６個の細胞株について、代表的な細胞生存率実験の実施例を提供する。細胞株ＥＦＭ１９２Ａ、ＮＤＡＭＢ３６１、及びＢＴ４７４は、バイオインフォマティック解析におけるそれぞれの薬剤に耐性があるとして分類された。ＡＵ５６５、ＥＦＭ１９、及びＭＤＡＭＢ４６８は、感受性として分類された。フィットした曲線からのＩＣ５０値は、それぞれの右側にチャートとして示される。
【０１４６】
ＩＣ５０に達していないＥＶＳＡ−Ｔ細胞株のＡＢＣＣ３過剰発現クローンについては、GraphPad Prism software (GraphPad Software, Inc)において、最大半量効果濃度、又はＥＣ５０、を計算した。図５のコントロール細胞株は、実際、空のベクターでトランスフェクション後のＥＶＳＡ−Ｔ由来のクローンであり、示された特定の実験ではＩＣ５０に達した。
【０１４７】
乳腺腫瘍サンプル
１４５個の独立した乳癌患者からの原発性乳癌は、Agilent Array CGH分析（２１）のためのゲノムＤＮＡを調製するために使用した。全ての腫瘍は新鮮に凍結され、７０％より大きな腫瘍内容物を含み、浸潤性乳管癌として分類された。ＡＢＣＣ３のＦＩＳＨ実験は、ジェネンテック腫瘍バンクからの６１個の付随的な独立した原発性乳癌腫瘍サンプルにおいて実施された。
【０１４８】
遺伝子発現マイクロアレイ実験
乳癌細胞株の遺伝子発現解析は、キアゲンＲＮＡａｓｙキットを使用し、サブコンフルエント細胞培養液からのＲＮＡ抽出物において実施された。ＲＮＡ品質は、Agilent Bioanalyzer 2100にいてサンプルを走らせることにより確かめ、十分な品質のサンプルは、アフィメトリクス HGU133Plus_2.0 chips (Santa Clara, CA)上でプロファイルした。相補ＲＮＡの調製、アレイハイブリダイゼーション、スキャニング及び続くアレイイメージデータ解析は、製造元の特定のプロトコルを使用してなされた。
【０１４９】
乳癌細胞株の監督されていない全体の階層型クラスタリング分析について、遺伝子発現データは、細部株を通じてわずかな変化を示すプローブセットを除くためにフィルターにかけた。簡潔には、サンプルを通じて少なくとも５倍の変化と（最大／最小＞１０）、少なくとも２５０（最大−最小＞２５０）の絶対強度の差異を示さなかったプローブを、階層型分析から抽出した。データ処理は、ログ変換と遺伝子発現値の中間値の算出を行い、その後、平均リンケージクラスタリングをCluster and TreeView software （２２）を使用して実施した。
【０１５０】
ＳＮＰアレイ及びアジレントａＣＧＨコピー数研究
細胞株コピー数分析を、キアゲンＤＮＡｅａｓｙキットを用いてサブコンフルエント細胞培養液から抽出したゲノムＤＮＡ上で実施した。それぞれの細胞株について、５００ｎｇのゲノムＤＮＡを製造元の指示書に従ってジーンチップ１００Ｋマッピングアレイ（Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA）にハイブリダイズさせた。これらのアレイは、２６ｋｂの平均マーカー距離を有する、全ヒト染色体（Ｙ染色体を除く）由来の１１６０００以上のＳＮＰ遺伝子座についてのプローブセットを含む（２３）。ＳＮＰコールとシグナル定量は、Gene Chip Operating Systemによって得られた。アジレントヒトゲノム２４４ＡＣＧＨマイクロアレイ及びアジレントフィーチャー抽出ソフトウェアを、製造元の指示書に従って実行し、それぞれのＳＮＰプローブについて、アフィメトリクス染色体コピー数解析ツール３．０（ＣＮＡＴ３．０）を用いて、ゲノム平滑化分析ＤＮＡコピー数（ＧＳＡ＿ＣＮ）をハイブリダイゼーション強度（両者のアレル強度の合計）に基づいて計算した。コピー数データは、ＧＬＡＣ区分アルゴリズム（２４）を用いて区分した。
【０１５１】
ＧＳＡ＿ＣＮコピー数と薬剤感受性の関係は、ｍａｘＴ処理バージョンを使用したＭａｔｌａｂソフトウェア（The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA）で同定した（２６）。それぞれの薬剤について、感受性におけるログ形質転換コピー数と耐性細胞株の差異を反映するそれぞれのＳＮＰについて、試験統計を計算した。感受性と耐性クラスの間に平均コピー数が１．７５倍より少ない差異であるそれらのＳＮＰについてゼロに設定していることを除き、統計は、標準ｔ統計（２サンプル、不等分散）の絶対値として計算された。次いで全てのＳＮＰに渡る最大試験統計の帰無分散を、１００００個のランダムな感受性ラベルの置換において、計算した。それぞれのＳＮＰのｐ値を、最大の試験統計が、ＳＮＰについて観察された統計より大きいか又は等しい置換の分数として計算した。得られたｐ値は、過誤率を制御し、試験したＳＮＰの数を考慮する。
【０１５２】
定量的ＲＴ  ＰＣＲを用いたＨＥＲ２コピー数の決定
定量的ＰＣＲをＡＢＩプリズム７７００配列決定システム(Applied Biosystems, Foster City, CA)を使用して、上記の通り調製したゲノムＤＮＡにおいて、実施した。ｑＲＴ−ＰＣＲを、Ｈｅｒ２について、プライマーＣＡＣＴＧＴＣＴＧＣＡＣＣＴＴＧＣＴＴＴＧ（配列番号：１）とＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＡＴＴＧＡＡＡＧＡＡＣＡＡ（配列番号：２）を、Ｌｉｎｅ−１反復配列について、ＡＡＡＧＣＣＧＣＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧ（配列番号：３）とＴＧＣＴＴＴＧＡＡＴＧＣＧＴＣＣＣＡＧＡＧ  （配列番号：４）を用いて実施した。Ｌｉｎｅ−１は、ヒトの正常と腫瘍細胞間のハプロイド毎の類似のコピー数を有する反復配列である。定量は、ヒト正常ゲノムＤＮＡの連続希釈からの標準曲線に基づいた。相対標的コピー数レベルは、また校正器として正常ヒトゲノムＤＮＡに正規化した。Ｌｉｎｅ−１と比較した標的遺伝子のコピー数変化と校正器は、Ｋｉｎｄｉｃｈ等（２８）によって記載された通り、式E-[(CPtarget - Cpref)control - (CPtarget - Cpref)test]を用いて決定された。定量的ＰＣＲ反応の条件は、Invitrogen Platinum（登録商標）SYBR（登録商標）Green qPCR SuperMix-UDG w/ROXパッケージ挿入物(カタログ番号11744-500)において記載された通りである。
【０１５３】
蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析
プローブ
ＡＢＣＣ３遺伝子座及び隣接領域（ＵＳＣＳゲノムブラウザー２００６年４月会議に基づく）を被覆する、ＣＴＤ−２６０５Ａ１とＣＴＤ−３００６Ｃ１３の２個の重複クローンを含む、細菌人工染色体（ＢＡＣ）コンティグをＦＩＳＨ実験のためのプローブとして使用した。商業的に利用可能なＨＥＲ２／ＣＥＰ１７(Pathvysion, Vysis/Abbott Laboratories, Des Plaines, IL)とＣＥＰ１７(Vysis/Abbott Laboratories, Des Plaines, IL)のためのプローブをまたＦＩＳＨ実験のために使用した。
【０１５４】
ＦＩＳＨ解析
細胞株を以前に記載の通り（２９）、０．１μｇ／ｍＬのＣｏｌｃｅｍｉｄ（インビトロジェン）に２から３時間インキュベートし、ＫＣｌ（０．０７５Ｍ）において浸透圧膨張させ、メタノール：酢酸（３：１）中で固定化することにより、細胞遺伝学的解析のために調製した。ＢＡＣクローンからのＤＮＡは、定法により抽出した。
抽出したＢＡＣ  ＤＮＡを直接スペクトルオレンジ、スペクトルグリーン(Vysis/Abbott Laboratories, Des Plaines, IL)、又はジエチルアミノクマリン（ＤＥＡＣ）（インビトロジェン）を用いて、製造元の指示書に従ってＶｙｓｉｓニックトランスレーションキット(Vysis/Abbott Laboratories)を使用してニックトランスレーションによりラベル化した。正常ヒト中期（Abbott Laboratories, Des Plaines, IL）に対するＦＩＳＨで、ＢＡＣクローンの遺伝子座を確認した。約３００ｎｇの標識化したプローブを、ＦＩＳＨ実験のため、過剰のヒトＣｏｔ−１ＤＮＡ（インビトロジェン）と超音波をかけたサケ精子ＤＮＡ（シグマ）中で沈殿させ、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、及び２’ＳＳＣハイブリダイゼーションバッファー（Vysis/Abbott Laboratories, Des Plaines, IL）中で再懸濁した。細胞遺伝学的製剤とホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織におけるＦＩＳＨは、幾つかの修正を加えて以前に記載した通り(Pandita等, 2004)に実施した。５０℃から６０℃で終夜インキュベーション後、スライドをそれぞれ５分、CitroSolvで３回洗浄、次いでアルコール中で２回洗浄中に脱パラフィンした。風乾後、スライドを１ＭのＮａＳＣＮ溶液に３０分間８０℃でインキュベートし、次いで水と連続エタノール中の付加的な洗浄に先立ちペプシンで処理した。乾燥したスライドを次いでプローブを用いて共変性（７６℃で６分間）させ、３７℃(ThermoBrite; Vysis, Downers Grove, IL)で終夜ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後の洗浄液と対染色を以前に記述の方法に類似の方法で行った。スライドをオリンパスＢＸ６１顕微鏡で可視化し、ＦＩＳＨＶｉｅｗソフトウェア（Applied Spectral Imaging, Vista CA）で解析した。コピー数解析とＨＥＲ２／ＡＢＣＣ３のＣＥＰ１７に対する比率は、製造元の指示書の通り実施した。
【０１５５】
機能変性実験
ハイコンテントスクリーニングアッセイをＡｒｒａｙｓｃａｎ  ＶＴＩ(Cellomics Inc, Pittsburgh, PA)において実施した。細胞を、ダーマコン  インクから購入したｓｉＲＮＡ「スマートプール」オリゴヌクレオチドとオリゴフェクタミン形質転換試薬を用いて、９６穴形式において形質転換した。機能実験のための遺伝子を優先するために、１７ｑ２１．３アンプリコンの４コピーより少ないものに比較して４コピーよりも多い細胞株中の遺伝子発現において有意な差がある遺伝子を同定するための、Ｒプログラム言語(http://www.r-project.org)を使用した両側ウィルコクスンの順位和検定を行った。この分析から現れた遺伝子の異なる発現の例である、ＡＢＣＣ３（ｐ＝０．００５３）を図３に示す。この解析は、ＥＦＭ−１９２Ａ細胞株における機能実験のための次の２４遺伝子：ＡＢＣＣ３、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＲＯＰ、ＥＡＰ、ＥＰＮ３、ＦＬＪ１３８５５、ＦＬＪ２０９２０、ＨＯＸＢ７、ＬＯＣ２０１１９１、ＩＴＧＢ３、ＫＩＡＡ０９２４、ＫＰＮＢ１、ＬＯＣ４００６０４、ＬＯＣ８１５５８、ＭＧＣ１１２４２、ＭＧＣ１５３９６、ＮＤＰ５２、ＰＤＫ２、ＰＨＢ、ＰＰ１Ｒ９Ｂ、ＳＬＣ３５Ｂ１、ＳＰＯＰ、ＴＯＢ１、ＷＮＴ３の選択につながるＲＮＡｉ実験のための試薬の効果と組み合わせた。ＡＢＣＣ３ｓｉＲＮＡを用いた追跡調査は、付加的な細胞株ＺＲ７５−３０、ＭＤＡＭＢ−４５３及びＨＣＣ−１４２８中で行った。ヒトゲノム中の如何なる配列に対しても有意な同一性を示さない非標的コントロール（ＮＴＣ）ｓｉＲＮＡを全てのＲＮＡｉ実験のネガティブコントロールとして使用した（www.dharmacon.comの技術所見における記載の通り）。３７℃で４８から７２時間のインキュベーション後、細胞を３．７％のホルムアルデヒド中で固定化し、０．１％のトリトンＸ−１００中で透過させ、次いで抗ホスホヒストンＨ３（ｐＨ３、Ｕｐｓｔａｔｅ）の１：５００希釈液、次いでアレクサ−フルオロ４８８（モレキュラープローブ）のヤギ抗ウサギ二次抗体の１：２５０希釈液でラベル化した。細胞は、細胞核を同定するために、ヘキスト３３２５８で対比染色し、次いで、中期指標としても知られる（３０）、核ｐＨ３免疫蛍光が陽性の細胞のパーセントを、少なくともウェル毎の１０００細胞について、Cellomics Target Activationソフトウェアを使用して定量した。全ての実験は、少なくとも３回繰り返した。ｓｉＲＮＡプールが、コントロールｓｉＲＮＡに対してＡＢＣＣ３の９０％のノックダウンの結果になることを確認するために、ＡＢＩ７９００において、ｑＲＴ−ＰＣＲ  （５’プライマーＧＡＴＴＣＣＡＧＣＣＧＣＴＴＣＡＧＴＴ  （配列番号：５）、３’プライマー  ＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＣＴＣＴＡＣＡＣＣＴ  （配列番号：６） を実施した。
【０１５６】
ＡＢＣＣ３過剰発現実験については、ＣＭＶプロモーター含有ベクターｐＣＭＶ５(Invitrogen, Carlsbad, CA)中でクローン化した全長ＡＢＣＣ３ｃＤＮＡを全長コード化シークエンスをシークエンスすることにより確かめた。コンストラクトをＥＶＳＡ−Ｔ細胞に形質転換し、安定クローンを１ｍｇ／ｍｌジェネティシン(Invitrogen Carlsbad, CA)における培養により選択した。安定クローンにおけるＡＢＣＣ３の過剰発現を、ｐＣＭＶ５−ＡＢＣＣ３、ｐＣＭＶ５ベクターのみ、又は親のＥＶＳＡ−Ｔ株を含む株由来のｃＤＮＡにおいてｑＲＴ−ＰＣＲで確認した。この報告において記載される全ての安定細胞株は、ベクターコントロール株又は親の細胞株よりもＡＢＣＣ３転写物が少なくとも２５−３５倍発現するために、ｑＲＴ−ＰＣＲ実験において決定した。
【０１５７】
実施例２−細胞株の分子特徴付け
アフィメトリクス遺伝子発現プロファイリングは、全長ｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ上で実施され、アフィメトリクス１００ＫＳＮＰアレイプロファイリングは、４４個の乳癌細胞株から得られたＤＮＡ上で行われた。細胞株パネルに渡る１１０００個のほとんど異なる発現の遺伝子を用いた監督されない分析を、遺伝子発現に基づき（図１１）、管腔及び基底様サブタイプに分類するために使用した。管腔として分類される細胞株は、高レベルのエストロジェンレセプターアルファ（ＥＲ）及びＧＡＴＡ３、ＨＮＦ３Ａ、ＩＧＦ１Ｒ及びＸＢＰ１を含む、ＥＲによって制御される多くの標的遺伝子を発現した。基底様として分類される細胞株は、幾つか又は全てのよく知られた基底マーカーである、ビメンチン、カベオリン、ＭＦＧＥ８及びＫＲＴ５のような基底サイトケラチンを発現した（３１）。ＨＥＲ２癌遺伝子の増幅は、細胞株中の全体の遺伝子発現の分類から明らかではない別の疾患のサブタイプを明らかに定義するため（１４）、ＨＥＲ２のコピー数は、ゲノムＤＮＡにおけるｑＲＴ−ＰＣＲによって決定され、全ての細胞株に対し、Ｌｉｎｅ−１のそれぞれの要素に対して規格化される(図１１）。これらの分析における４より大きな見かけのコピー数を示す細胞株は、図１１の表中に増幅されたＨＥＲ２として示される。図１１の合成分子サブタイプは、ＨＥＲ２コピー数解析並びに全体の遺伝子発現結果の両者から導かれた分類である。これらの発見は、以前の報告に一致し（１４）、この乳癌細胞株の回収は、ある程度、乳癌細胞サブタイプを定義し、ある程度、管腔、基底様、及びＨＥＲ２増幅腫瘍のような、サブタイプのモデルとして代表的な、転写の差異を反映する。細胞株パネル中のコピー数獲得及び欠失のゲノムワイドパターンは、乳癌細胞が、腫瘍に見られる有名なコピー数変化（例えば、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１、ＨＥＲ２獲得及びｐ１６、ＰＴＥＮ欠失）のほとんどを有することを示す。サブタイプ特異的な差異は、報告されている（３２）。本研究に関する発見は、１７ｑ２１．３における増幅は、ＨＥＲ２増幅及び管腔細胞株に共通するが、基底様細胞株に共通しない。
【０１５８】
実施例３−有糸分裂阻害剤に対するインビトロ感受性
３１個の乳癌細胞株をパクリタキセルとＭＭＡＣに対する感受性についてスクリーニングした。図１１は、全ての細胞株における標準ルシフェラーゼベース生存率アッセイにおける制帽生存率を５０％阻害するために必要な濃度として定義される、それぞれの化合物についてのＩＣ５０値を示す。注目すべきことは、細胞株のパネルを通じて、それぞれの薬剤に対する相対的な感受性の間に大きな相関があった（スピアマン順位相関係数、ｒｓ＝０．５５）。更に、図１は、基底様遺伝子発現サインを示す細胞株が、より低い平均ＩＣ５０値を有し、クラスカル・ウォリス検定（ＭＭＡＥについては、Ｐ値＝０．００２、パクリタキセルについては、Ｐ値＝０．００５）によって決定される通り、管腔又はＨＥＲ２増幅細胞株に比べ、それぞれの薬剤に対する感受性がより高いことを示す。
【０１５９】
実施例４−インビトロ感受性に相関するゲノム変異の同定
パクリタキセル又はＭＭＡＥに対する感受性に関連する染色体の獲得又は欠失の領域を、ＳＮＰアレイコピー数データの監督解析によって同定した。最初に、細胞株を、感受性データに基づき、感受性（ＩＣ５０＜１０ｎＭ）又は耐性（ＭＭＡＥ  ＩＣ５０＞１００ｎＭ、パクリタキセル  ＩＣ５０＞１０００ｎＭ）グループに分類した。次いで、最大Ｔアルゴリズム（２６）を、約１１５０００ＳＮＰからのデータを解析するために使用し、それぞれのＳＮＰをゲノムワイドの重要性を有する感受性及び耐性のクラスの間でどこが平均コピー数が異なるかを同定した。パクリタキセルの場合、１７番染色体のＳＮＰのグループは、染色体の位置４４３０３２１７から開始し、位置４４７２４３０１（１７ｑ２１から１７ｑ２１．２３）で終了し、感受性と耐性のクラスの間で統計的に有意なコピー数の差異を示した（ｒｓ２４１１３７７＝０．０４のＰ値）。同じグループのマーカーはまたコピー数とＭＭＡＥ感受性の間に有意な関連性を示した（ｒｓ２４１１３７７＝０．０５のＰ値）。図２ａは、パクリタキセルの感受性と１７番染色体のこの部位におけるゲノムＤＮＡコピー数の間に関係性があることを示す。パクリタキセルに耐性を示す有意な数の細胞株（１４のうち８）が、（菱形で示した）領域中の遺伝子増幅が増加した。分析により得られたヒートマップは、この領域において少なくとも４のゲノムＤＮＡのコピー数を示す。パクリタキセルに対する感受性を示す細胞株のうち、この領域において、ゲノムＤＮＡのコピー数が有意に増加したものは無かった。図２ｂは、ＭＭＡＥ感受性の類似のデータを示す。
【０１６０】
実施例５−インターバルの候補遺伝子の同定
１７ｑ２１．３１から１７ｑ２１．３３の染色体領域は、ＵＣサンタクルーズゲノムブラウザー(http://genome.ucsc.edu)によれば、約１００個の発現転写物をコードする。増幅の領域における機能的な関連遺伝子が、ｍＲＮＡ発現の付随的な増加を示すべきであるという原則に基づけば、このリストは、増幅において有意な過剰発現を示す２４遺伝子（ＡＢＣＣ３、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＲＯＰ、ＥＡＰ、ＥＰＮ３、ＦＬＪ１３８５５、ＦＬＪ２０９２０、ＨＯＸＢ７、ＬＯＣ２０１１９１、ＩＴＧＢ３、ＫＩＡＡ０９２４、ＫＰＮＢ１、ＬＯＣ４００６０４、ＬＯＣ８１５５８、ＭＧＣ１１２４２、ＭＧＣ１５３９６、ＮＤＰ５２、ＰＤＫ２、ＰＨＢ、ＰＰ１Ｒ９Ｂ、ＳＬＣ３５Ｂ１、ＳＰＯＰ、ＴＯＢ１、ＷＮＴ３）までフィルターダウンした。非増幅細胞株に比較して増幅された細胞株において、有意により高い候補遺伝子ＡＢＣＣ３の発現の例を、図３に示す。２４遺伝子をタキサンとアウリスタチンに耐性を付与する原因である遺伝子座を同定するための機能分析にかけた。 
【０１６１】
実施例６−ＲＮＡ干渉によるＡＢＣＣ３の機能検証
ＲＮＡ干渉戦略を増幅された細胞株におけるタキサンとアウリスタチンに対する耐性を伝達する原因である遺伝子を同定するために使用した。用いたアッセイは、パクリタキセル又はＭＭＡＥを用いた細胞の治療は、有糸分裂マーカーのリン酸化ヒストンＨ３（３３）の存在によって評価され得るＭ期における一連の細胞周期進行の結果となるという事実を利用した。ヒストンＨ３のＳｅｒ１０におけるリン酸化は、Ｍ期における染色体凝縮と強く関係し、ｐＨ３染色、又は分裂指数が陽性の細胞のパーセンテージは、免疫蛍光アッセイによって決定され得る。耐性を媒介する遺伝子の細胞ノックダウンは、パクリタキセルとＭＭＡＥに対する増幅のある細胞株の感受性を増加すべきであり、したがって、非増殖細胞と投与薬剤濃度におけるコントロール処理した細胞に比較してより高い分裂指数の蓄積の結果となる。より高い分裂指数は、他のアッセイ（ＣＯＢ及びＭＲＬ、発表されていない見解）によって決定される生存率と増殖の減少に関連するが、これらの薬剤の有糸分裂効果のより特異的な読み出しである。２４個の候補遺伝子のうち２３のＲＮＡｉは、再現性良く、非増殖細胞の蓄積の結果とならず、ＥＦＭ−１９２Ａ細胞中の分裂指数が増加したが、ＡＢＣＣ３のＲＮＡｉは、細胞株ＥＦＭ−１９２ＡとＺＲ７５−３０（図４ａ−ｂ）中の非標的コントロールｓｉＲＮＡを用いるコントロール治療に比較して分裂指数が２から３倍増加する結果となった。それに対し、ＡＢＣＣ３ＲＮＡｉは、非増殖細胞株ＨＣＣ−１４２８及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３において、明確に分裂指数を変化させなかった。類似の結果が、ＭＭＡＥについて得られた。
【０１６２】
実施例７−ＡＢＣＣ３の過剰発現がインビトロ多剤耐性を引き起こす
ＡＢＣＣ３増幅を示さず、ＡＢＣＣ３転写物を低いレベルで発現するので、ＥＶＳＡ−Ｔ細胞を、ＡＢＣＣ３過剰発現株を生じるモデルとして選択した。３個の独立した由来の株がＡＢＣＣ３転写物を過剰発現するのを確認し、ＡＴＢベースの発光アッセイを用いてパクリタキセルやＭＭＡＥに対するインビトロの感受性をスクリーニングした。この実験では、ＡＢＣＣ３過剰発現クローンの治療は、３日間のアッセイにおいて５０％の細胞生存率の減少の結果とならず、よって感受性の倍変化を、最大半量応答又はＥＣ５０の結果となる濃度を計算することにより評価した。パクリタキセルを用いて処理したベクターコントロールのＥＣ５０は、０．２ｎＭであり、一方で、ＡＢＣＣ３−発現株のＥＣ５０値は、それぞれ、５ｎＭ、１０ｎＭ、及び８０ｎＭであった。ＭＭＡＥで処理したベクターコントロールのＥＣ５０は、０．０５ｎＭであり、一方でＡＢＣＣ３発現株のＥＣ５０値は、それぞれ、１．５ｎＭ、１２ｎＭ、及び９０ｎＭであった。全ての３個の過剰細胞発現株は、ＥＣ５０値に基づき、少なくとも２０倍パクリタキセルやＭＭＡＥに対する感受性が低く、ＡＴＰベース発光アッセイ（図５）において、ベクターのみのコントロールの安定細胞株に比較して、細胞増殖のより少ない注目すべき阻害をまた示した。 
【０１６３】
実施例８−ＡＢＣＣ３の増幅が乳腺腫瘍中で起きる
細胞株１００ＫのＳＮＰアレイデータにおけるＨＥＲ２とＡＢＣＣ３を含む１７番染色体の領域の分析は、ＡＢＣＣ３アンプリコンが、ＨＥＲ２増幅サブタイプに殆ど共通して付随し、管腔又は基底様として分類される細胞株には見られないことを示唆した。
【０１６４】
ＡＢＣＣ３増幅が、細胞株特異的な現象ではないことを確かめるために、ＡＢＣＣ３遺伝子座におけるコピー数データを、１４５の原発性乳腺腫瘍のＤＮＡにおいて、アジレントアレイＣＧＨ（ａＣＧＨ）アレイを用いて特徴付けた。これらの腫瘍サンプルはまた、（３２）に記載した通り、ＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２の発現レベルに基づく予想を用いて、管腔、基底様、及びＨＥＲ２サブタイプに分類された。ＡＢＣＣ３コピー数獲得（３．５コピーよりも多い）は、増幅されたＨＥＲ２の２５％及び１１％の管腔において存在し、基底様腫瘍においては、存在しなかった。
【０１６５】
実施例９−ＦＩＳＨアッセイ
ＳＮＰとＣＧＨアレイによって観察される見かけのコピー数獲得の細胞遺伝学的基礎を確認するために、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイをＡＢＣＣ３遺伝子座に及ぶＢＡＣクローン（実施例１を参照されたい）を用いて開発し、ＦＩＳＨ解析を選択細胞株及びＨｅｒｃｅｐｔ試験（（３５）で検討されるＩＨＣアッセイ）に基づき過剰発現ＨＥＲ２として分類された６１個の原発性腫瘍において実施された。細胞株から得られたＦＩＳＨの結果は、ＳＮＰアッセイとｑＰＣＲ解析から得られたデータを裏付けた。ＳＮＰアレイから高いＡＢＣＣ３コピー数を有すると予想された乳癌細胞株ＥＦＭ−１９２Ａは、実際にＡＢＣＣ３の高レベルの増幅を示し、１７番染色体上のＨＥＲ２及びＡＢＣＣ３の単一コピーを維持する一方で、種々の染色体への単一又は複数のインテグレーションを伴う均一染色領域（ＨＳＲ）として明らかである。 ＳＮＰアレイ分析に基づきＡＢＣＣ３について２倍体と予想された細胞株は、ＣＥＰ１７とＡＢＣＣ３を用いたＦＩＳＨ分析に基づき２倍体であることが確認された。ＡＢＣＣ３増幅のためにスクリーニングされた６１個のＨＥＲ２陽性原発性腫瘍のＦＩＳＨ解析は、ＡＢＣＣ３における高いコピー数がＨＥＲ２陽性乳腺腫瘍に共通であることを確認した。高レベルの遺伝子増幅（ＡＢＣＣ３／ＣＥＰ１７の比が２．２より大きい）が２５％の腫瘍で観察され、一方で腫瘍のさらに１１％は、中程度のＡＢＣＣ３の増加を示した（ＡＢＣＣ３の３−７コピー）。興味深いことに、幾つかの腫瘍は、異種の証拠を示し、ＡＢＣＣ３の二倍体コピー数を有する細胞と共にＡＢＣＣ３の非常に高レベルの増幅を示した。
【０１６６】
実施例１０−ＡＢＣＣ３の過剰発現は、ＤＭ１に対する耐性を引き起こす
ＥＶＳＡ−Ｔ細胞を、ＡＢＣＣ３がサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから高レベルで発現する、ＡＢＣＣ３含有プラスミドで安定に形質転換した。次いで、３個の過剰発現クローンとコントロール細胞株を、通常の細胞生存率アッセイにおいて、フリーのＤＭ１に対する感受性について分析し、過剰発現クローンが、コントロール細胞株よりもＤＭ１に対する感受性が高いことが示され、ＡＢＣＣ３の過剰発現がこの薬剤の耐性につながることに一致した（図７）。
【０１６７】
実施例１１−ＡＢＣＣ３ＲＮＡｉは、ＭＭＡＦ抗体コンジュゲートに対する応答を高める
ＥＦＭ１９２Ａ細胞に、ＡＢＣＣ３ｓｉＲＮＡで形質転換し、リンカー試薬であるマレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ＰＡＢを用いてＭＭＡＦ（トラスツズマブ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ）にコンジュゲートしたトラスツズマブ（ハーセプチン）を用いた治療を施した。ＡＢＣＣ３ｓｉＲＮＡで形質転換したＥＦＭ−１９２Ａは、トラスツズマブ−ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦに対して、コントロールのｓｉＲＮＡを用いて形質転換した細胞よりも、感受性が高く、ＡＢＣＣ３発現レベルは、この薬剤に対する感受性に影響し得ることを示唆する（図８）。
【０１６８】
実施例１２−ＡＢＣＣ３ＲＮＡｉは、フリーのＤＭ１とトラスツズマブ−ｓｍｃｃ−ＤＭ１コンジュゲートに対する応答を高める
ＡＢＣＣ３ｓｉＲＮＡを用いて形質転換したＥＦＭ−１９２Ａ細胞は、フリーのＤＭ１又はトラスツズマブ−ｓｍｃｃ−ＤＭ１コンジュゲートに対して、ｓｉＲＮＡ（ＮＴＣ）を用いて形質転換した細胞よりも、感受性が高く、ＡＢＣＣ３発現レベルは、これらの薬剤に対する感受性に影響し得ることを示唆する（図９ａ及び９ｂ）。
【０１６９】
実施例１３−Ｔ−ＤＭ１活性に関するＡＢＣＣ３増幅状態
ＡＢＣＣ３ＦＩＳＨ分析は、ＨＥＲ２増幅乳腺腫瘍におけるＴ−ＤＭ１活性に対するＡＢＣＣ増幅の影響を調査するために、Ｔ−ＤＭ１フェーズＩＩ(TDM4258G)試験から得られたサンプルにおいて実施された。ＴＤＭ４２５８Ｇ試験は、ＨＥＲ２陽性転移乳癌の患者にＩＶ注入によって投与されたＴ−ＤＭ１の、多施設共同、オープンラベル、単一アーム、フェーズＩＩ試験である。試験中の患者は、ＨＥＲ２直接治療において事前増殖を示した。臨床試験からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）アーカイブ腫瘍組織サンプルは、適切なＩＲＢ承認と患者の同意を得た、臨床試験から得られた。
【０１７０】
ＦＩＳＨアッセイは、実施例１に記載の通り臨床試験サンプルにおいて実施された。図１０は、ＡＢＣＣ３／ＣＥＰ１７の比によって分類されたＦＩＳＨアッセイの分析からのデータを示す。ＡＢＣＣ３／ＣＰＥ１７比が１．８以上のサンプルを、ＡＢＣＣ３増幅を有すると見なす。サンプルがＡＢＣＣ３の増幅を示す患者の４０％（２／５）は、Ｔ−ＤＭ１ちりょうに応答した一方で、サンプルがＡＢＣＣ３の増幅を示さない患者の８０％（１２／１５）がＴ−ＤＭ１に対する治療に応答した。この分析は、ＡＢＣＣ３増幅状態がＴ−ＤＭ１を用いた治療に対する患者の推定される応答を決定する際に有用であることを示す。
【０１７１】
引用文献
1. O'Driscoll L, Clynes M. Biomarkers and multiple drug resistance in breast cancer. Curr Cancer Drug Targets 2006;6(5):365-84.
2. Cigler T, Goss PE. Breast cancer adjuvant endocrine therapy. Cancer journal (Sudbury, Mass 2007;13(3):148-55.
3. Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med 2001;344(11):783-92.
4. Guarneri V, Conte PF. The curability of breast cancer and the treatment of advanced disease. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2004;31 Suppl 1:S149-61.
5. Szakacs G, Paterson JK, Ludwig JA, Booth-Genthe C, Gottesman MM. Targeting multidrug resistance in cancer. Nature reviews 2006;5(3):219-34.
6. Katsnelson A. Cautious welcome for FDA pharmacogenomics guidance. Nat Biotechnol 2005;23(5):510.
7. Lee JK, Havaleshko DM, Cho H, et al. A strategy for predicting the chemosensitivity of human cancers and its application to drug discovery. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104(32):13086-91.
8. Szakacs G, Annereau JP, Lababidi S, et al. Predicting drug sensitivity and resistance: profiling ABC transporter genes in cancer cells. Cancer Cell 2004;6(2):129-37.
9. Sorlie T, Tibshirani R, Parker J, et al. Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100(14):8418-23.
10. Finnegan TJ, Carey LA. Gene-expression analysis and the basal-like breast cancer subtype. Future Oncol 2007;3(1):55-63.
11. Hu Z, Fan C, Oh DS, et al. The molecular portraits of breast tumors are conserved across microarray platforms. BMC Genomics 2006;7:96.
12. Kurt M, Harputluoglu H, Dede DS, Gullu IH, Altundag K. Potential molecular targeted therapies in the management of the basal-like subtype of breast cancer. Breast 2007;16(2):111-2.
13. Rouzier R, Perou CM, Symmans WF, et al. Breast cancer molecular subtypes respond differently to preoperative chemotherapy. Clin Cancer Res 2005;11(16):5678-85.
14. Neve RM, Chin K, Fridlyand J, et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell 2006;10(6):515-27.
15. Doronina SO, Toki BE, Torgov MY, et al. Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nat Biotechnol 2003;21(7):778-84.
16. Crown J, O'Leary M. The taxanes: an update. Lancet 2000;355(9210):1176-8.
17. Zhao X, Li C, Paez JG, et al. An integrated view of copy number and allelic alterations in the cancer genome using single nucleotide polymorphism arrays. Cancer Res 2004;64(9):3060-71.
18. Garraway LA, Widlund HR, Rubin MA, et al. Integrative genomic analyses identify MITF as a lineage survival oncogene amplified in malignant melanoma. Nature 2005;436(7047):117-22.
19. Gorringe KL, Chin SF, Pharoah P, et al. Evidence that both genetic instability and selection contribute to the accumulation of chromosome alterations in cancer. Carcinogenesis 2005;26(5):923-30.
20. Rae JM, Ramus SJ, Waltham M, et al. Common origins of MDA-MB-435 cells from various sources with those shown to have melanoma properties. Clin Exp Metastasis 2004;21(6):543-52.
21. Barrett MT, Scheffer A, Ben-Dor A, et al. Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarrays and total genomic DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101(51):17765-70.
22. Eisen MB, Spellman PT, Brown PO, Botstein D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95(25):14863-8.
23. Matsuzaki H, Dong S, Loi H, et al. Genotyping over 100,000 SNPs on a pair of oligonucleotide arrays. Nat Methods 2004;1(2):109-11.
24. Hupe P, Stransky N, Thiery JP, Radvanyi F, Barillot E. Analysis of array CGH data: from signal ratio to gain and loss of DNA regions. Bioinformatics 2004;20(18):3413-22.
25. Beroukhim R, Getz G, Nghiemphu L, et al. Assessing the significance of chromosomal aberrations in cancer: Methodology and application to glioma. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104(50):20007-12.
26. Westphal P, Young S. Resampling-based multiple testing: Examples and methods for p-value adjustment. : John Wiley & Sons
1993.
27. Fanning TG, Singer MF. LINE-1: a mammalian transposable element. Biochimica et biophysica acta 1987;910(3):203-12.
28. Kindich R, Florl AR, Jung V, et al. Application of a modified real-time PCR technique for relative gene copy number quantification to the determination of the relationship between NKX3.1 loss and MYC gain in prostate cancer. Clin Chem 2005;51(3):649-52.
29. Bayani J, Zielenska M, Marrano P, et al. Molecular cytogenetic analysis of medulloblastomas and supratentorial primitive neuroectodermal tumors by using conventional banding, comparative genomic hybridization, and spectral karyotyping. J Neurosurg 2000;93(3):437-48.
30. Grove LE, Ghosh RN. Quantitative characterization of mitosis-blocked tetraploid cells using high content analysis. Assay and drug development technologies 2006;4(4):421-42.
31. Livasy CA, Karaca G, Nanda R, et al. Phenotypic evaluation of the basal-like subtype of invasive breast carcinoma. Mod Pathol 2006;19(2):264-71.
32. Hu X SH, O'Brien C, Honchell , Wu T, Chant J,  Lackner M, Cavet G. Genetic alterations and oncogenic pathways associated with breast cancer subtypes. Molecular Cancer Research, in press (April, 2009). 
33. Gasparri F, Cappella P, Galvani A. Multiparametric cell cycle analysis by automated microscopy. J Biomol Screen 2006;11(6):586-98.
34. Borst P, Evers R, Kool M, Wijnholds J. A family of drug transporters: the multidrug resistance-associated proteins. J Natl Cancer Inst 2000;92(16):1295-302.
35. Carlsson J, Nordgren H, Sjostrom J, et al. HER2 expression in breast cancer primary tumours and corresponding metastases. Original data and literature review. Br J Cancer 2004;90(12):2344-8.
36. Liu Y, Peng H, Zhang JT. Expression profiling of ABC transporters in a drug-resistant breast cancer cell line using AmpArray. Mol Pharmacol 2005;68(2):430-8.
37. Huang R, Murry DJ, Kolwankar D, Hall SD, Foster DR. Vincristine transcriptional regulation of efflux drug transporters in carcinoma cell lines. Biochem Pharmacol 2006;71(12):1695-704.
38. Huisman MT, Chhatta AA, van Tellingen O, Beijnen JH, Schinkel AH. MRP2 (ABCC2) transports taxanes and confers paclitaxel resistance and both processes are stimulated by probenecid. Int J Cancer 2005;116(5):824-9.
39. Hopper-Borge E, Chen ZS, Shchaveleva I, Belinsky MG, Kruh GD. Analysis of the drug resistance profile of multidrug resistance protein 7 (ABCC10): resistance to docetaxel. Cancer Res 2004;64(14):4927-30.
40. Lagas JS, Vlaming ML, van Tellingen O, et al. Multidrug resistance protein 2 is an important determinant of paclitaxel pharmacokinetics. Clin Cancer Res 2006;12(20 Pt 1):6125-32.
41. Kool M, van der Linden M, de Haas M, et al. MRP3, an organic anion transporter able to transport anti-cancer drugs. Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96(12):6914-9.
42. Zeng H, Bain LJ, Belinsky MG, Kruh GD. Expression of multidrug resistance protein-3 (multispecific organic anion transporter-D) in human embryonic kidney 293 cells confers resistance to anticancer agents. Cancer Res 1999;59(23):5964-7.
43. Mahjoubi F, Hill RJ, Peters GB. Chromosome microdissection identifies genomic amplifications associated with drug resistance in a leukemia cell line: an approach to understanding drug resistance in cancer. Chromosome Res 2006;14(3):263-76.
44. Schmidt M, Bremer E, Hasenclever D, et al. Role of the progesterone receptor for paclitaxel resistance in primary breast cancer. Br J Cancer 2007;96(2):241-7.
45. Shajahan AN, Wang A, Decker M, Minshall RD, Liu MC, Clarke R. Caveolin-1 tyrosine phosphorylation enhances paclitaxel-mediated cytotoxicity. J Biol Chem 2006.
46. Pinilla SM, Honrado E, Hardisson D, Benitez J, Palacios J. Caveolin-1 expression is associated with a basal-like phenotype in sporadic and hereditary breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2006;99(1):85-90.
47. Savage K, Lambros MB, Robertson D, et al. Caveolin 1 is overexpressed and amplified in a subset of basal-like and metaplastic breast carcinomas: a morphologic, ultrastructural, immunohistochemical, and in situ hybridization analysis. Clin Cancer Res 2007;13(1):90-101.
48. Rouzier R, Rajan R, Wagner P, et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102(23):8315-20.
49. Wagner P, Wang B, Clark E, Lee H, Rouzier R, Pusztai L. Microtubule Associated Protein (MAP)-Tau: a novel mediator of paclitaxel sensitivity in vitro and in vivo. Cell Cycle 2005;4(9):1149-52.
50. Lambros MB, Natrajan R, Reis-Filho JS. Chromogenic and fluorescent in situ hybridization in breast cancer. Hum Pathol 2007;38(8):1105-22.
51. Hann CL, Brahmer JR. "Who should receive epidermal growth factor receptor inhibitors for non-small cell lung cancer and when?" Curr Treat Options Oncol 2007;8(1):28-37.
52. Hayes DF, Thor AD, Dressler LG, et al. HER2 and response to paclitaxel in node-positive breast cancer. N Engl J Med 2007;357(15):1496-506.
【０１７２】
本発明は、理解を明確にするための図説及び実施例によってある程度詳細に記載されているが、この説明及び実施例は本発明の権利範囲を限定するものとみなされるものではない。本明細書中において引用したすべての特許文献及び科学文献の開示内容は、出典明記によってその全体が特別に援用される。
【図１】
2018086000.tif 000004
【図２Ａ】
2018086000.tif 000005
【図２Ｂ】
2018086000.tif 000006
【図３】
2018086000.tif 000007
【図４】
2018086000.tif 000008
【図５】
2018086000.tif 000009
【図６Ａ】
2018086000.tif 000010
【図６Ｂ】
2018086000.tif 000011
【図７】
2018086000.tif 000012
【図８】
2018086000.tif 000013
【図９】
2018086000.tif 000014
【図１０】
2018086000.tif 000015
【図１１Ａ】
2018086000.tif 000016
【図１１Ｂ】
2018086000.tif 000017
【配列表】
2018086000000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月9日(2018.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2018086000000001.pdf