(57)【要約】【課題】ｉＰＳ細胞等の幹細胞の培養を効率的に行うための技術の提供。【解決手段】幹細胞の生存及び増殖を促進する活性を示すＩＲＦ３（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ３）阻害ペプチドを含む幹細胞の培地、及び該培地で幹細胞を培養する手順を含む幹細胞の培養方法等を提供する。【選択図】図１
2018110531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む、幹細胞の培地。
【請求項２】
前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２〜１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、請求項１記載の培地。
【請求項３】
前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞である、請求項１又は２記載の培地。
【請求項４】
前記幹細胞が、ヒト由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の培地。
【請求項５】
配列番号２〜１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列からなるＩＲＦ３阻害ペプチド。
【請求項６】
ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む、幹細胞の増殖促進剤。
【請求項７】
ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する手順を含む、幹細胞の培養方法。
【請求項８】
ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する工程を含む、幹細胞の製造方法。
【請求項９】
ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する工程と、幹細胞の分化を誘導する工程、とを含む、分化細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞の培地、増殖促進剤及び培養方法等に関する。より詳しくは、幹細胞の生存及び増殖を促進する活性を示すＩＲＦ３（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ３）阻害ペプチドを含有する幹細胞培地等に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞は、再生医療技術のための細胞ソースとして有力な候補である。このうち、特にｉＰＳ細胞は、通常の細胞株と比較して、継代時に細胞死が起き易い上、分裂も非常に遅く、さらに分化が生じやすいという問題がある。そのため、ヒトｉＰＳ細胞を、未分化性を維持しながら効率的に培養するための技術が望まれている。
【０００３】
Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｑ１４６５３）は、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ分子の１つであり、ウイルスに誘導される細胞死等の生理現象を制御していることが知られている（非特許文献１）。非特許文献２には、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ３（以下「ＩＲＦ３」と称する）が、ｃａｓｐａｓｅの活性化を誘導し細胞死を制御することが報告されている。また、ＩＲＦ３については、ＤＮＡ損傷の制御に機能しているという報告（非特許文献３）もある。しかしながら、ＩＲＦ３の機能あるいはその阻害について、幹細胞の培養との関連での報告はいまだなされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０１０，２９，１０，１６２７-１６２８
【非特許文献２】Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０１１，８５，１０，５２２４-５２２７
【非特許文献３】Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００６，２５，３，３４９-３６０
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，１９９５，１，８９４‐９０１
【非特許文献５】Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００２，４６，３，２１１‐２１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ｉＰＳ細胞等の幹細胞の培養を効率的に行うための技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］〜［２３］を提供する。
［１］ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む、幹細胞の培地。
［２］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２〜１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、［１］の培地。
［３］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２〜１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである、［１］の培地。
［４］前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞である、［１］〜［３］のいずれかの培地。
［５］前記幹細胞が、霊長類由来である、［１］〜［４］のいずれかの培地。
［６］前記幹細胞が、ヒト由来である、［５］の培地。
【０００７】
［７］配列番号２〜１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列からなるＩＲＦ３阻害ペプチド。
［８］ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む、幹細胞の増殖促進剤。
［９］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２〜１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、［８］の増殖促進剤。
［１０］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２〜１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである、［８］の増殖促進剤。
［１１］前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞である、［８］〜［１０］のいずれかの増殖促進剤。
［１２］前記幹細胞が、霊長類由来である、［８］〜［１１］のいずれかの増殖促進剤。［１３］前記幹細胞が、ヒト由来である、［１２］の増殖促進剤。
【０００８】
［１２］ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する手順を含む、幹細胞の培養方法。
［１３］ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する工程を含む、幹細胞の製造方法。
［１４］ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む培地で幹細胞を培養する工程と、幹細胞の分化を誘導する工程、とを含む、分化細胞の製造方法。
［１５］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２〜１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、［１２］〜［１４］のいずれかの方法。
［１６］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２〜１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである、［１２］〜［１４］のいずれかの方法。
［１７］前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞である、［１２］〜［１６］のいずれかの方法。
［１８］前記幹細胞が、霊長類由来である、［１２］〜［１７］のいずれかの方法。
［１９］前記幹細胞が、ヒト由来である、［１８］の方法。
【０００９】
［１８］ＩＲＦ３阻害ペプチドと、幹細胞及び／又は幹細胞から誘導された分化細胞と、を含む細胞組成物。
［１９］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２〜１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、［１８］の細胞組成物。
［２０］前記ＩＲＦ３阻害ペプチドが、配列番号２〜１２記載のいずれか一つのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである、［１８］の細胞組成物。
［２１］前記幹細胞が、誘導性多能性幹細胞である、［１８］〜［２０］のいずれかの細胞組成物。
［２２］前記幹細胞が、霊長類由来である、［１８］〜［２１］のいずれかの細胞組成物。
［２３］前記幹細胞が、ヒト由来である、［２２］の細胞組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によりｉＰＳ細胞等の幹細胞の培養を効率的に行うための技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒトｉＰＳ細胞の培養においてＩＲＦ３阻害ペプチド１の細胞増殖促進活性を評価した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１３】
１．幹細胞の培地
［ＩＲＦ３阻害ペプチド］
本発明に係る幹細胞の培地は、ＩＲＦ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｑ１４６５３）の阻害ペプチドを含むことを特徴とする。
【００１４】
ＩＲＦ３阻害ペプチドとしては、配列番号２〜１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。また、培養幹細胞の生存及び増殖を促進する活性（以下「増殖促進活性」と称する）を示す限りにおいて、上記アミノ酸配列を含んでなるペプチドもＩＲＦ３阻害ペプチドとして用いることができる。さらに、培養幹細胞に対する増殖促進活性が維持される限りにおいて、ＩＲＦ３阻害ペプチドは、上記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるもの、あるいは該アミノ酸配列を含んでなるものであってもよい。ＩＲＦ３阻害ペプチドは、好ましくは「ＧＶＧＤＦＳＱＰＤ」のアミノ酸配列を含んでなるペプチド（例えば、配列番号３）であり、より好ましくは同アミノ酸配列からなるペプチド（配列番号２）である。
【００１５】
付加されるアミノ酸として、例えば、細胞膜透過ペプチドのアミノ酸配列が例示される。細胞膜透過ペプチドとは、他のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質との融合分子として細胞の培養液に添加すると、融合分子を、細胞膜を透過させて細胞内に移行させることができるペプチドを意味する。細胞膜透過ペプチドとしては、例えば、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ-１）のＴａｔタンパク質ＲＮＡ結合領域（４８−６０位）由来の、
アルギニンに富む塩基性ペプチド（ＴＡＴペプチド）；アルギニン残基が６ないし１２個連続したオリゴホモペプチド；ショウジョウバエ由来の転写因子Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質のＤＮＡ結合領域由来の塩基性両親媒性ヘリックス構造を有するペプチド（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）が例示される。
【００１６】
ＩＲＦ３阻害ペプチドの長さは、アミノ酸残基数で、好ましくは９〜１１であるが、培養幹細胞に対する増殖促進活性が維持される限りにおいて、８以下又は１０以上であってもよく、例えば４〜８又は１０〜５０程度、あるいは６〜８又は１０〜２０程度であってよい。
【００１７】
ＩＲＦ３阻害ペプチドは、従来公知のペプチド合成ステップによって得ることができる。また、ＩＲＦ３阻害ペプチドには、ペプチドが有する官能基の１又は２以上を他の官能基置き換えたものも、培養幹細胞に対する増殖促進活性を備える限りにおいて、包含され得るものとする。
【００１８】
［基礎培地］
本発明に係る培地の組成は、ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む点を除いて、幹細胞の培養のために従来用いられている培地と同様であってよい。このような培地としては、例えば、ＲＰＭＩ-１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地、ＧＭＥ
Ｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ  ＭＥＭ）、α-ＭＥＭ、１９９培地、ＩＭＤＭ培地、ＤＭＥＭ
培地Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ培地（インビトロジェン社）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ培地（インビトロジェン社）、Ｈａｍ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｆ-１２、Ｈａｍ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  
Ｆ-１０、Ｈａｍ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｆ１２Ｋ、ＡＴＣＣ-ＣＲＣＭ３０、ＤＭ-１６０
、ＤＭ-２０１、ＢＭＥ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ
’ｓ  Ｌ-１５、ＲＩＴＣ８０-７、ＭＣＤＢ１０５、ＭＣＤＢ１０７、ＭＣＤＢ１３１、ＭＣＤＢ１５３、ＭＣＤＢ２０１、ＮＣＴＣ１０９、ＮＣＴＣ１３５、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ  ＭＢ７５２／１、ＣＭＲＬ-１０６６、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ、
Ｂｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ  ＢＭＯＣ-３  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｅ８  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｅ８  ｍｅ
ｄｉｕｍ、ＲｅｐｒｏＦＦ２（リプロセル社）、ＥＸ-ＣＥＬＬ  ３０２培地（ＳＡＦＣ
社）またはＥＸ-ＣＥＬＬ-ＣＤ-ＣＨＯ（ＳＡＦＣ社）及びこれらの混合物などを挙げる
ことができる。
【００１９】
本発明に係る培地は、これらの培地にＩＲＦ３阻害ペプチドを予め添加あるいは細胞培養中に添加することによって調製できる。培地へのＩＲＦ３阻害ペプチドの添加濃度は、培養幹細胞に対する増殖促進活性を示す限りにおいて特に限定されないが、例えば１〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜２００μｇ／ｍｌである。
【００２０】
また、培地には、必要に応じて細胞の生存又は増殖に必要な生理活性物質及び栄養因子などを添加できる。これらの添加物は、培地に予め添加されていてもよく、細胞培養中に添加されてもよい。培養中に添加する方法は、１溶液または２種以上の混合溶液などいかなる形態によってもよく、連続的または断続的な添加であってもよい。
【００２１】
生理活性物質としては、インシュリン、ＩＧＦ−１、トランスフェリン、アルブミンまたは補酵素Ｑ10などが挙げられる。
栄養因子としては、糖、アミノ酸、ビタミン、加水分解物または脂質などが挙げられる。
糖としては、グルコース、マンノースまたはフルクトースなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。
アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンまたはＬ−バリンなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。
ビタミンとしては、ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピロドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミンまたはＤＬ−α―トコフェロールなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。
加水分解物としては、大豆、小麦、米、えんどう豆、とうもろこし、綿実、酵母抽出物などを加水分解したものが挙げられる。
脂質としては、コレステロール、リノール酸またはリノレイン酸などが挙げられる。
【００２２】
さらに、培地には、カナマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリンまたはハイグロマイシンなどの抗生物質を必要に応じて添加してもよい。シアル酸等の酸性物質を培地に添加する場合には、培地のｐＨを細胞の成育に適した中性域であるｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８に調整することが望ましい。
【００２３】
本発明に係る培地は、血清含培地であっても無血清培地であってもよい。異種動物由来成分の混入防止の観点からは血清を含有しないか、培養される幹細胞と同種動物由来の血清が用いられることが好ましい。ここで、無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。無血清培地は、精製された血液由来成分や増殖因子などの動物組織由来成分を含有していてもよい。
【００２４】
本発明に係る培地は、血清と同様に、血清代替物を含んでいても含んでいなくともよい
。血清代替物としては、例えば、アルブミン、脂質リッチアルブミン及び組換えアルブミン等のアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン、タンパク質加水分解物、トランスフェリン又は他の鉄輸送体、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２-
メルカプトエタノール、３’-チオグリセロールあるいはこれらの均等物などが挙げられ
る。血清代替物の具体例としては、例えば、国際公開第９８／３０６７９号記載の方法により調製されるものや、市販のｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ社）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ-ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒ
ａｔｅｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などが挙げられる。
【００２５】
［幹細胞］
本発明が対象とする「幹細胞」は、自己複成能及び分化増殖能を有する未熟な細胞をいい、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ)
、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ)、単能性幹細胞(ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ)等が含まれる。「幹細胞」は、一般に、未分化状態
を保持したまま増殖できる「自己再生能」と、三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞と定義されている。
多能性幹細胞とは、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
【００２６】
幹細胞の由来種も特に限定されず、例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などの細胞であってもよい。
【００２７】
幹細胞の具体例としては、筋芽細胞、血管内皮細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、心筋細胞、軟骨細胞等へ分化する間葉系幹細胞；ニューロンやグリア細胞へ分化する神経幹細胞；白血球、赤血球、血小板、肥満細胞、樹状細胞等へ分化する造血幹細胞又は骨髄幹細胞；スフェロイド状態から胚様体（ＥＢ体）と呼ばれる擬似的な胚の形成を経て様々な組織への分化・誘導のステップに進むことが知られている胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）や誘導性多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）、始原生殖細胞に由来する胚性生殖（ＥＧ）細胞、精巣組織からのＧＳ細胞の樹立培養過程で単離されるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｔｅｍ（ｍＧＳ）細胞、骨髄から単離されるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ 
ａｄｕｌｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ（ＭＡＰＣ）等の多能性幹細胞などが挙げられる。
【００２８】
多能性幹細胞としては、特に、上述のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を挙げることができる。体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した幹細胞も、多能性幹細胞としてまた好ましい（Ｎａｔｕｒｅ，１９９７，３８５，８１０；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８０，１２５６；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１７，４５６；Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９４，３６９；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９９，２２，１２７；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９，９６，１４９８４；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００，２４，１０９）。
【００２９】
ヒトＥＳ細胞株は、例えばＷＡ０１（Ｈ１）およびＷＡ０９（Ｈ９）は、ＷｉＣｅｌｌ
Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから、ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
【００３０】
ｉＰＳ細胞としては、例えば、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子（初期化因子）を導入して得られる、ＥＳ細胞同様の多分化能を獲得した細胞が挙げられる。例えばＯｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｃ-Ｍｙｃ遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによ
って得られるｉＰＳ細胞、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２６，１０１-１０６）等が挙げられる。初期化因子に含まれる遺伝子として
、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いて
も良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666
、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008),
Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9に記載の組み合わせが例示される。ｉＰＳ細胞は、所定の機関（
理研バイオリソースセンター、京都大学）より入手可能である。
【００３１】
複能性幹細胞としては、特に、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞及び生殖幹細胞等の体性幹細胞等が挙げられる。複能性幹細胞は、好ましくは間葉系幹細胞、より好ましくは骨髄間葉系幹細胞である。なお、間葉系幹細胞とは、骨芽細胞、軟骨芽細胞及び脂肪芽細胞等の間葉系の細胞全て又はいくつかへの分化が可能な幹細胞又はその前駆細胞の集団を広義に意味する。
【００３２】
本発明に係る培地は、いずれの幹細胞の増殖にも好適に使用することができるが、好ましくは、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の培養に、より好ましくはｉＰＳ細胞の培養に、特に好ましくはヒトｉＰＳ細胞の培養に使用することができる。ヒトｉＰＳ細胞としてより具体的には253G1株（理研セルバンクNo. HPS0002）、201B7株（理研セルバン
クNo. HPS0063）、409B2株（理研セルバンクNo. HPS0076）、454E2株（理研セルバンクNo. HPS0077）、HiPS-RIKEN-1A株（理研セルバンクNo. HPS0003）、HiPS-RIKEN-2A株（理研セルバンク No. HPS0009）、HiPS-RIKEN-12A株（理研セルバンク No. HPS0029）、Nips-B2株（理研セルバンクNo. HPS0223）などを挙げることができる。
【００３３】
２．幹細胞の培養方法
［培養方法］
本発明に係る幹細胞の培養方法は、ＩＲＦ３阻害ペプチドの存在下で、幹細胞を培養す
る手順を含むことを特徴とする。より具体的には、本発明に係る培養方法は、ＩＲＦ３阻害ペプチドを含む培地で、幹細胞を培養する手順を含むことを特徴とする。本発明に係る培地によれば、ＩＲＦ３阻害ペプチドの作用によって、幹細胞の生存と増殖を促進することができる。すなわち、本発明において、ＩＲＦ３阻害ペプチドは、幹細胞の増殖促進剤として機能し得るものである。
【００３４】
ここで、本発明に係る培養方法に用いられる培養器は、特に限定されないが、フラスコ、ディッシュ、シャーレ、マイクロウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バックなどが挙げられ得る。これらの培養器の基材も、特に限定されず、ガラスや、ポリプロピレイン及びポリスチレンなどの各種プラスチックを用いることができる。
【００３５】
培養器は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよく、目的に応じて適宜選ばれる。細胞接着性の培養器は、培養器の表面と細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の任意の細胞支持用基質でコーティングされたものであり得る。細胞支持用基質は、幹細胞又はフィーダー細胞を用いる場合の接着を目的とする任意の物質であり得る。このような細胞支持用基質としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ-
Ｌ-リジン、ポリ-Ｄ-リジン、ラミニン又はラミニンの一部構造体、及びフィブロネクチ
ン並びにそれらの混合物、例えばマトリゲル、並びに溶解細胞膜調製物が挙げられる（Ｌａｎｃｅｔ，２００５，３６５，９４７１，１６３６-１６４１参照）。
【００３６】
ＩＲＦ３阻害ペプチドの存在下で培養される幹細胞は、分散細胞又は非分散細胞であり得る。分散細胞とは、細胞分散を促進するために処理された細胞をいう。分散細胞としては、例えば、２〜５０、２〜２０、又は２〜１０個の細胞からなる小さな細胞塊を形成している細胞が挙げられる。分散細胞は、浮遊（懸濁）細胞、又は接着細胞であり得る。
【００３７】
ＩＲＦ３阻害ペプチドの存在下における幹細胞の培養密度は、細胞の生存及び増殖を促進する効果を達成し得るような密度である限り特に限定されない。好ましくは１．０×１０1〜１．０×１０7細胞／ｍｌ、より好ましくは１．０×１０2〜１．０×１０7細胞／ｍｌ、さらにより好ましくは１．０×１０3〜１．０×１０7細胞／ｍｌ、最も好ましくは３．０×１０4〜１．０×１０7細胞／ｍｌである。
【００３８】
温度、ＣＯ2濃度、溶存酸素濃度及びｐＨなどの培養条件は、従来技術に基づいて適宜
設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが３０〜４０℃、好ましくは３７℃であり得る。ＣＯ2濃度は、１〜１０％、好ましくは２〜５％であり得る。酸
素分圧は、１〜１０％であり得る。
【００３９】
幹細胞の接着培養を行う場合、フィーダー細胞の存在下で培養してもよい。フィーダー細胞には、胎児線維芽細胞等のストローマ細胞を用いることができる（例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９４；Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，
Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３；Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，１９８１，７８，１２，７６３４−７６３８；Ｎａｔｕｒｅ，１９８１，２９２，５８１９，１５４−１５６；Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，１９６９，４，５，５４９−５５３；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，２７２，５２６２，７２２−７２４；Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９８２，１１２，１，８９−９５；国際公開第０１／０８８１００号；同第２００５／０８０５５４号参照）。
【００４０】
幹細胞の浮遊培養の態様としては、担体上での浮遊培養（Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，１３２，２，２２７−２３６）又はメチルセルロースなどの高分子ポリマーを用いた浮遊培養（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，２，５,７
３４−７４５）などが挙げられる。幹細胞の浮遊培養とは、培地中において、培養器又はフィーダー細胞を用いる場合に対して非接着性の条件下で幹細胞を培養することをいう。幹細胞の浮遊培養としては、幹細胞の分散培養及び幹細胞の凝集浮遊培養が挙げられる。幹細胞の分散培養とは、懸濁された幹細胞を培養することをいい、例えば、２〜２０個の幹細胞からなる小さな細胞塊の分散培養が挙げられる。分散培養を継続した場合、培養された分散細胞がより大きな幹細胞塊を形成し、その後凝集浮遊培養が実行され得る。このような凝集浮遊培養としては、胚様体培養法（Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９９５，７，６，８６２-８６９参照）、ＳＦＥＢ法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，８，３，２８８-２９６；国際公開第２００５／１２３
９０２号）、メッシュフィルターを用いて機械的処理により細胞株を継代させるスフェア培養法（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，２，５,７３４−７４５）が
挙げられる。
【００４１】
本発明に係る培養方法では、ＩＲＦ３阻害ペプチドの存在下で幹細胞を培養する手順によって幹細胞の生存と増殖を促進することができるので、幹細胞、特に分散及び分散後の浮遊培養等のストレスに弱いことが知られているｉＰＳ細胞を効率的に培養するために利用できる。本発明に係る培養方法により得られるＩＲＦ３阻害ペプチドと幹細胞とを含む細胞組成物は、さらなる幹細胞の培養のため、あるいは再生医療用の細胞ソースのために利用され得る。
【００４２】
［幹細胞又は分化細胞の製造方法］
本発明に係る培養方法は、幹細胞の製造方法あるいは幹細胞からの分化細胞の製造方法に応用できる。
【００４３】
本発明に係る幹細胞の製造方法は、上述したＩＲＦ３阻害ペプチドの存在下で幹細胞を培養する工程を含み、必要に応じて幹細胞を継代する工程を含む。また、本発明に係る幹細胞からの分化細胞の製造方法は、ＩＲＦ３阻害ペプチドの存在下で幹細胞を培養する工程と幹細胞の分化を誘導する工程を含み、必要に応じて細胞を継代する工程を含む。
【００４４】
幹細胞の継代や分化誘導は、従来公知の手法によって行えばよい。分化誘導剤には、ＢＭＰ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、Ｎｏｄａｌ阻害剤、レチノイン酸などを用いることができる。分化誘導は、例えば、軟骨細胞の分化誘導プロセスでは、分化誘導培地（９０％αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ-グルタミン、０．１μＭのデキサメタゾン）中で、間葉
系幹細胞を培養することによって行うことができる。
心筋細胞の分化誘導プロセスでは、例えば、心筋細胞をＳＴＥＭｄｉｆｆ  ＡＰＥＬ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）に０．５ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ-４を添加した培地で
１日培養後、ＳＴＥＭｄｉｆｆ  ＡＰＥＬ  Ｍｅｄｉｕｍに１０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ-４
、１０ｎｇ／ｍｌ  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦをそれぞれ添加した培地に交換して更に４日間培養を継続する。その後、ＳＴＥＭｄｉｆｆ  ＡＰＥＬ  Ｍｅｄｉｕｍに１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、１５０ｎｇ／ｍｌ  Ｄｋｋ１をそれぞれ添加した培地に交換して８日間培養後、ＳＴＥＭｄｉｆｆ  ＡＰＥＬ  Ｍｅｄｉｕｍに１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、１５０ｎｇ／ｍｌ  Ｄｋｋ１、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦをそれぞれ添加した培地に交換することで自律的な拍動を伴う心筋細胞を確認できる。
血小板分化誘導プロセスの過程で必要となる巨核球の形成には、血清含有培地（２０％ＦＣＳ）において誘導された胚葉体を経て、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン６（ＩＬ６）及び幹細胞因子（ＳＣＦ）等の因子が使用され得る。
また、レチノイン酸などの分化誘導剤を培地に添加することにより、幹細胞を神経系細胞などに分化させることが可能となる。
【００４５】
本発明に係る幹細胞及び分化細胞の製造方法では、ＩＲＦ３阻害ペプチドの存在下で幹細胞を培養する工程によって幹細胞の生存と増殖を促進することができるので、幹細胞及びこれから誘導される分化細胞を効率的に製造できる。本発明に係る幹細胞及び分化細胞の製造方法により得られるＩＲＦ３阻害ペプチドと、幹細胞及び／又は分化細胞とを含む細胞組成物は、さらなる幹細胞の培養のため、あるいは再生医療用の細胞ソースのために利用され得る。
【００４６】
ここで、本発明に係る細胞組成物は、小さな細胞塊のような分散した幹細胞を含む組成物であり得る。本発明に係る細胞組成物は、例えば、凍結保存による幹細胞の保存、輸送、及び継代に用いられ得る。凍結保存等の保存に用いられる場合、本発明に係る細胞組成物は、上述したような血清あるいはその代替物、又はＤＭＳＯ等の有機溶剤をさらに含んでいてもよい。この場合、血清又はその代替物の濃度は、特に限定されるものではないが、１〜５０％（ｖ／ｖ）、好ましくは５〜２０％（ｖ／ｖ）であり得る。有機溶剤の濃度は、特に限定されるものではないが、０〜５０％（ｖ／ｖ）、好ましくは５〜２０％（ｖ／ｖ）であり得る。本発明に係る細胞組成物は、フィーダー細胞を含むものであってもよい。
【実施例】
【００４７】
［実施例１：ｉＰＳ細胞に対するＩＲＦ３阻害ペプチドの増殖促進活性の評価］
ヒトｉＰＳ細胞の培養において、ＩＲＦ３阻害ペプチドが細胞の生存及び増殖促進活性を示すことを以下の手順により確認した。
【００４８】
（方法）
ヒトｉＰＳ細胞は、京都大学ｉＰＳ細胞研究所の山中伸弥教授が樹立したヒト誘導性多能性幹細胞（２０１Ｂ７及び４０９Ｂ２）を、理化学研究所セルバンク（No.HPS0063、No. HPS0076）より入手し使用した。ヒト多能性幹細胞培養の実践プロトコール（第２版）
（理化学研究所  発生・再生科学総合研究センター  幹細胞研究支援・開発室作成  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｂ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｈｓｃｔ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ）に従い、細胞のフィーダー層としてマイトマイシン処理で不活化したマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を蒔いたプラスチック培養皿の上で未分化ヒトｉＰＳを培養した。
【００４９】
ＩＲＦ３阻害ペプチドは、株式会社蛋白科学研究所の受託サービスを利用して設計した。タンパク質のアミノ酸配列内には、センスペプチド・アンチセンスペプチドの関係によって相互に対応する配列情報を持つ部分が散在することが知られている（非特許文献４参照）。ＩＲＦ３の構造や活性に関わる部分に対応する相補性ペプチドを合成して作用させることで、ＩＲＦ３の機能を抑制できる。上記受託サービスにより、ＩＲＦ３のアミノ酸配列に基づいてその相補性ペプチドを、コンピュータプログラムＭＩＭＥＴＩＣ（非特許文献５参照）を用いて設計した。ＩＲＦ３の全長アミノ酸配列（配列番号１）に基づき設計されたＩＲＦ３阻害ペプチド１〜１１のアミノ酸配列を以下に示す。
【００５０】
【表１】
2018110531.tif 000003
【００５１】
Ｄ-ＭＥＭＦ１２（Ｓｉｇｍａ  Ｄ６４２１）に最終濃度２０％  ＫＳＲ（Ｌｉｆｅ  
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、最終濃度１％  ＮＯＮ-ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ＡＭＩＮＯ
ＡＣＩＤ（非必須アミノ酸；ＳＩＧＭＡ）、２ｍＭ  Ｌ-グルタミン酸及び８０μＭ  
２-メルカプトエタノールをそれぞれ添加した培地を用いて３７℃、５％  ＣＯ2下で培養を行い、３〜４日毎に継代を行った。リン酸バッファー緩衝生理学的食塩水に０．２５％トリプシン、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ液、１ｍＭ  ＣａＣｌ2を添加した解離液（
全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ｉＰＳ細胞をフィーダー層から解離し、ピペッティングで約５０-１００個の小細胞塊に分散させた後、前日にＭＥＦを播
種し形成させたフィーダー層の上に蒔いた。
【００５２】
上記のように培養したヒトｉＰＳ細胞を、フィーダー細胞から小細胞塊として解離し、混入するフィーダー細胞を除去するために０．１％  ゼラチンでコートした培養プレートに血清を含まないＥｓｓｅｎｔｉａｌ８アッセイ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して３７℃、１時間培養した。混入するフィーダー細胞を上記培養プレートの底に吸着させ、単離したｉＰＳ細胞塊をピペッティング操作により小細胞塊へ細かく砕いた後、４８ウェル培養プレートを用いて、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ）上に、１×１０5個／０．６５ｃｍ2／培地液量０．５ｍｌで播種した。ＩＲＦ３阻害ペプチド１（ＧＶＧＤＦＳＱＰＤ）及びネガティブコントロールペプチド（ＧＴＰＫＰＲＩＬＰＷＬ）は、２００μｇ／ｍｌの濃度で培地に添加した。ＩＲＦ３阻害ペプチド１を含むアッセイ培地で数日間培養後に、形成されたアルカリフォスファターゼ染色陽性（ＡＬＰ＋）のコロニー面積を生存細胞量として計測し、コントロール群と比較した。
【００５３】
（結果）
ペプチドを２００μｇ／ｍｌ含むアッセイ培地で４日間培養後、コロニー（ＡＬＰ＋）面積を測定した結果を図１に示す。実験群（ＩＲＦ３阻害ペプチド１）ではコントロール群に比べて、コロニー面積は３００％以上となり生存細胞数が有意に増加した。ＩＲＦ３阻害ペプチド１を含むアッセイ培地にて培養された細胞は、未分化胚性幹細胞のマーカーであるアルカリフォスファターゼを発現していた。
【００５４】
以上の結果から、ＩＲＦ３阻害ペプチド１は、分散培養開始直後において細胞の生存を促進する活性を示し、その後も生存した細胞の増殖を促進する活性を示すと考えられた。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号１：ＩＲＦ３のアミノ酸配列
配列番号２：ＩＲＦ３阻害ペプチド１のアミノ酸配列
配列番号３：ＩＲＦ３阻害ペプチド２のアミノ酸配列
配列番号４：ＩＲＦ３阻害ペプチド３のアミノ酸配列
配列番号５：ＩＲＦ３阻害ペプチド４のアミノ酸配列
配列番号６：ＩＲＦ３阻害ペプチド５のアミノ酸配列
配列番号７：ＩＲＦ３阻害ペプチド６のアミノ酸配列
配列番号８：ＩＲＦ３阻害ペプチド７のアミノ酸配列
配列番号９：ＩＲＦ３阻害ペプチド８のアミノ酸配列
配列番号１０：ＩＲＦ３阻害ペプチド９のアミノ酸配列
配列番号１１：ＩＲＦ３阻害ペプチド１０のアミノ酸配列
配列番号１２：ＩＲＦ３阻害ペプチド１１のアミノ酸配列
【図１】
2018110531.tif 000004
【配列表】
2018110531000001.app