(57)【要約】      （修正有）【課題】特定の塩基配列を含み、血管内皮増殖因子と結合するポリヌクレオチド。【解決手段】公知のＶＥＧＦ結合性アプタマーよりもＶＥＧＦに対する親和性が高い新規な特定の塩基配列からなるＶＥＧＦ結合性アプタマー。公知のＶＥＧＦ結合性アプタマーから出発するコンピューター内進化法により、公知のＶＥＧＦ結合性アプタマーよりもＶＥＧＦとの親和性が高い、４種類のアプタマーを作出する方法。更に、得られたアプタマーの分子２個を、リンカーを介して連結することによりＶＥＧＦとの親和性がさらに高いアプタマーを得る、方法。特定の塩基配列を含み、血管内皮増殖因子と結合するポリヌクレオチド。前記ポリヌクレオチドとＶＥＧＦとを接触させ、その結合を測定することを含む被検試料中のＶＧＥＦの測定方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜４のいずれかに示される塩基配列を含み、血管内皮増殖因子と結合するポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１に示される塩基配列を含む請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１〜４のいずれかに示される塩基配列からなる請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１に示される塩基配列からなる請求項３記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１〜４のいずれかに示される塩基配列からなる複数個のポリヌクレオチド分子が直接又はリンカーを介して連結されてなる請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１に示される塩基配列からなる２個のポリヌクレオチドがリンカーを介して連結されてなる請求項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
血管内皮増殖因子に対する解離定数が3nM未満である請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
血管内皮増殖因子に対する解離定数が1nM未満である請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、血管内皮増殖因子とを接触させ、それらの結合を測定することを含む、被検試料中の血管内皮増殖因子の測定方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む血管内皮増殖因子の測定キット。
【請求項１１】
標識された前記ポリヌクレオチドを含む請求項１０記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor、以下、「ＶＥＧＦ」と呼ぶことがある）に結合する新規なアプタマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＶＥＧＦは、血管の内皮細胞に存在する受容体に結合し、内皮細胞の増殖を促すことで、血管新生を促進する。このためＶＥＧＦは、血管新生が重要な役割を果たす各種疾患との関連が注目されており、例えば、固形腫瘍患者の血清中での濃度上昇が報告されている。このため、ＶＥＧＦに結合する物質が得られれば、血管新生を伴うさまざまな疾患の診断を行ううえで有用なセンサー素子となることが期待される。
【０００３】
試料中のタンパク質等の被検物質の測定は、現在、主として免疫測定法により行なわれている。免疫測定法としては様々な方法が知られており、実用化されているが、いずれの方法においても、被検物質に対する特異抗体が用いられる。被検物質に対する特異抗体の作出は常法により行なうことができるが、手間がかかり、このため特異抗体は高価である。
【０００４】
一方、任意の分子と特異的に結合するポリヌクレオチド分子であるアプタマーが知られている。アプタマーは、市販の核酸合成機を用いて化学的に全合成できるので、特異抗体に比べてはるかに安価であり、修飾が容易であるため、センサー素子としての応用が期待されている。所望の標的分子と特異的に結合するアプタマーは、ＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment）と呼ばれる方法により作出可能である（非特許文献１）。この方法では、標的分子を担体に固定化し、これに膨大な種類のランダムな塩基配列を有する核酸からなる核酸ライブラリーを添加し、標的分子に結合する核酸を回収し、これをＰＣＲにより増幅して再び標的分子を固定化した担体に添加する。この工程を１０回程度繰り返すことにより、標的分子に対して結合力の高いアプタマーを濃縮し、その塩基配列を決定して、標的分子を認識するアプタマーを取得する。なお、上記核酸ライブラリーは、核酸の自動化学合成装置により、ランダムにヌクレオチドを結合していくことにより容易に調製可能である。このように、ランダムな塩基配列を有する核酸ライブラリーを用いた、偶然を積極的に利用する方法により、任意の標的物質と特異的に結合するアプタマーを作出できる。
【０００５】
本願発明者らは、先に、ＳＥＬＥＸにおいて、所望の標的物質と核酸ライブラリー中の核酸とを結合させる際に、非標的物質を固定化した担体を共存させ、所望の標的物質と結合した核酸のみを回収し、ＰＣＲにより増幅し、増幅物から一本鎖核酸を取得し、これを核酸ライブラリーとして、標的物質を固定化した領域に接触させ、固相に結合した核酸を回収し、同様にＰＣＲで増幅し、一本鎖を取得し、これを核酸ライブラリーとして再度、標的物質と非標的物質をそれぞれ固定化した領域と接触させ、以下同様にサイクルを繰り返す方法を駆使して、ＶＥＧＦに結合するアプタマーを得ることに成功している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2008-237042号公報
【特許文献２】国際公開第2005/049826号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tuerk, C. and Gold L. (1990), Science, 249, 505-510
【非特許文献２】Kazunori Ikebukuro et al., Nucleic Acids Research, 33(12), e108
【非特許文献３】Nasa Savory et al., Biosensors and Bioelectronics, Volume 26, Issue 4, 15 December 2010, Pages 1386-1391
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＶＥＧＦを高感度に測定するためには、ＶＥＧＦとの親和性が高いアプタマーが必要である。従って、本願発明の目的は、特許文献１に記載された公知のＶＥＧＦ結合性アプタマーよりもＶＥＧＦに対する親和性が高い（すなわち、解離定数が低い）、新規なＶＥＧＦ結合性アプタマーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ほとんどの標的物質に結合するアプタマーは、基本的にＳＥＬＥＸにより作出可能である。しかしながらＳＥＬＥＸでは、以下の理由によって、結合能力が高いアプタマーをスクリーニングすることに失敗する場合がある。ＳＥＬＥＸを行う際の実験操作では、ランダム化した配列プールの多様性が制限される２９。多くの例で配列プールの濃度は１μＭ未満（１．０×１０-６Ｍに等しい）であり、かつ、実験操作は１．５ｍＬ（１．５×１０-３Ｌに等しい）のサンプルチューブ内で行われる。その結果、操作した試料には、１．５×１０-９ｍｏｌ（１．０×１０１５分子に等しい）のヌクレオチドが含まれ得る。一方、３０−ｍｅｒのランダムライブラリーの多様性は４３０（およそ１０１８に同等）である。従って、一般的なＳＥＬＥＸの操作では、全候補の１０００分の１しか評価されない。加えて、オリゴヌクレオチドの二次構造がＰＣＲによる増幅効率に影響を及ぼす（下記関連文献３０、３１）。アプタマーは通常、それらに特異的な標的分子を認識するために必要な特定の二次構造をもち、高次構造をもつオリゴヌクレオチドは、ＳＥＬＥＸ中のＰＣＲでは容易に増幅できない可能性がある。従って、ＳＥＬＥＸによるそのような標的結合配列の取得効率は低くなる。
【００１０】
そこで、本願発明者らは、特許文献１に記載されたＶＥＧＦ結合性アプタマーであるＶＥａｐ１２１（配列番号５）の塩基配列中の一部の塩基を、コンピューター内進化（in silico maturation）法に付して、その塩基配列を改変することにより、遺伝子産物との親和性をさらに高めることに成功した。コンピューター内進化法は、本願共同発明者により発明された方法で、非特許文献２、非特許文献３や特許文献２に記載されている。すなわち、コンピューター内（in silico）で変異させ、変異させた種々の塩基配列を持つアプタマーを化学合成してＶＥＧＦとの結合性を測定し、結合親和性の高いアプタマーを選択してさらにin silicoで変異させ、化学合成し、ＶＥＧＦとの結合性を測定することを繰り返す方法である。特許文献１に記載されたＶＥａｐ１２１は、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造（以下、Ｇ−四重鎖構造という。）を持つと考えられるので、下記実施例に具体的に記載する方法により、Ｇ−四重鎖構造の維持に必要であると考えられるグアニン塩基以外の塩基の一部を変異させた。
【００１１】
ＶＥａｐ１２１から出発するコンピューター内進化法により、ＶＥａｐ１２１よりもＶＥＧＦとの親和性が高い、すなわち、解離定数が低い、４種類のアプタマーを作出することに成功した。さらに、得られたアプタマーの分子２個を、リンカーを介して連結することによりＶＥＧＦとの親和性がさらに高いアプタマーを得ることにも成功し、本願発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、配列番号１〜４のいずれかに示される塩基配列を含み、血管内皮増殖因子と結合するポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、上記本願発明のポリヌクレオチドと、血管内皮増殖因子とを接触させ、それらの結合を測定することを含む、被検試料中の血管内皮増殖因子の測定方法を提供する。さらに、本願発明は、上記本発明のポリヌクレオチドを含む血管内皮増殖因子の測定キットを提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本願発明により、公知のＶＥＧＦ結合性アプタマーよりもＶＥＧＦとの親和性が高い新規なＶＥＧＦ結合性アプタマーが提供された。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】下記実施例において行った、コンピューター内進化の三回の世代からのオリゴヌクレオチドのＶＥＧＦ結合能力を示す図である。Ｘ軸は、Ｋｄに基づく、各世代中のオリゴヌクレオチドの順位を示す。Ｙ軸は、各オリゴヌクレオチドの結合定数を示す。この図ではＶＥＧＦに対する結合能力をもたないオリゴヌクレオチドは示していない。
【図２】下記実施例において得られた、ＶＥＧＦ結合性アプタマーの動力学的プロットを示す図である。ＳＰＲ信号を測定することにより、全ての動力学的指標を算出した。Ｘ軸は解離速度定数を示し、Ｙ軸は会合速度定数を示す。
【図３】下記実施例において得られた、ＶＥＧＦ結合性アプタマーのＣＤスペクトルを示す図である。図３ａは、親配列（ＶＥａｐ１２１）と、コンピューター内進化で改良した配列（３Ｒ０２）の差を示している。図３ｂは、３Ｒ０２と３Ｒ０２二価の差を示している。３Ｒ０２二価の加工していないＣＤスペクトルから、Ｔ１０の加工していないＣＤスペクトルを差し引いた。差し引いたスペクトルをこの図に示した。Ｘ軸は周波数を示し、Ｙ軸は平均残基モル楕円率を示す。
【図４】下記実施例において行った、３Ｒ０２（ａ）又はＶＥａｐ１２１（ｂ）を用いたプレートアッセイによる、ＶＥＧＦの測定結果を示す図である。抗ＶＥＧＦ抗体を、アビジン-ビオチン相互作用により、ポリスチレンプレートの各ウェルに固定した。ＴＢＳに溶解した様々な濃度のＶＥＧＦを各ウェルに加えた。ＦＩＴＣで標識した３Ｒ０２又はＶＥａｐ１２１の溶液を各ウェルに加えた。ＦＩＴＣで標識した３Ｒ０２がＶＥＧＦに結合したことを表すＨＲＰ結合抗ＦＩＴＣ抗体由来の化学発光を検出した（ｎ＝３）。対照タンパク質としてはＢＳＡを用いた。化学発光の強度を秒あたりカウント（ＣＰＳ）として表す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ＶＥＧＦは、エクソンの選択的スプライシングによって形成される、複数のイソ型として分泌される。最も基礎的なイソ型はＶＥＧＦ１６５であり、これは強い生理活性をもつ。生物学的にはより弱い、２番目に基礎的なＶＥＧＦのイソ型はＶＥＧＦ１２１である。受容体結合ドメインは、ＶＥＧＦ１６５とＶＥＧＦ１２１の両方に共通であるが、ＶＥＧＦ１６５のみがヘパリン結合ドメインを有する。
【００１６】
下記実施例に具体的に記載する通り、特許文献１に記載されたＶＥａｐ１２１（ＶＥＧＦ１６５とＶＥＧＦ１２１の両方に結合する）から出発するコンピューター内進化法により、ＶＥａｐ１２１よりもＶＥＧＦとの親和性が高い、すなわち、解離定数が低い、４種類のアプタマーを作出することに成功した。これらの４種類のアプタマーの塩基配列を配列番号１〜配列番号４に示す。これらの中でも、配列番号１で示される塩基配列からなる３Ｒ０２と命名されたアプタマーは、ＶＥＧＦとの親和性が特に高く、好ましい。
【００１７】
下記実施例ではまた、配列番号１で示される塩基配列からなる３Ｒ０２の分子２個を、チミン１０個からなるリンカーを介して結合したアプタマーが、ＶＥＧＦに対する親和性が特に高いことが示された。このことから、配列番号１〜４のいずれかで示される塩基配列からなるアプタマーの構造をそっくり含んでいれば、末端に他の塩基配列を結合しても、配列番号１〜４で示される塩基配列からなる領域は、そのＶＥＧＦ結合性を維持する蓋然性が高いことがわかる。特に、配列番号１〜４で示される塩基配列からなる塩基配列の一端又は両端に各１個〜数個の塩基からなる塩基配列が連結されたものは、ＶＥＧＦとの親和性を維持する蓋然性が高いと考えられる。従って、本発明は、配列番号１〜４で示される塩基配列を含み、ＶＥＧＦと結合するポリヌクレオチドを提供するものである。
【００１８】
また、下記実施例からわかるように、配列番号１〜４のいずれかに示される塩基配列からなる複数個、好ましくは２個、のポリヌクレオチド分子が直接又はリンカーを介して連結されてなるポリヌクレオチドも好ましく、この場合、連結されるポリヌクレオチド単独よりもＶＥＧＦに対する親和性が向上する蓋然性が高い。特に、下記実施例で具体的に作製された、配列番号１に示される塩基配列からなる２個のポリヌクレオチドがリンカーを介して連結されてなるものが好ましい。複数個のポリヌクレオチド分子をリンカーで結合する場合、リンカーとしては、ＶＥＧＦに対する親和性に悪影響を与えない塩基配列であれば特に限定されず、ポリチミン（ｔ）のような同一の塩基からなるポリヌクレオチドが、それ自体で分子内ハイブリダイゼーションを起こしたりすることがないので好ましい。リンカーのサイズは特に限定されないが、通常、５塩基〜２０塩基程度である。なお、３個以上のポリヌクレオチド分子を連結する場合、必ずしも直線状に連結する必要はなく、例えば、放射状やデンドリマー状に連結したものでもよい。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドのＶＥＧＦとの解離定数は、３ｎＭ未満であることが好ましく、１ｎＭ未満であることがさらに好ましい。解離定数は、周知の方法により測定することができ、下記実施例にも記載されている。
【００２０】
本発明のＶＥＧＦ結合性アプタマーは、下記実施例に詳述する新規な方法により創製されたが、本発明によりその塩基配列が明らかとなったので、市販の核酸合成機を用いて容易に化学合成することができる。
【００２１】
本発明により、ＶＥＧＦに対する親和性が高い新規なアプタマーが提供されたので、これを用いて被検試料中のＶＥＧＦを高感度に測定することが可能になる。それ自体周知の方法により、標的物質であるＶＥＧＦの検出及び定量に使用することができる。被検試料としては血清や血漿等の体液やその希釈物を用いることができる。本発明のアプタマーを用いた、被検試料中のＶＥＧＦの検出又は定量は、アプタマーによる周知の通常の方法により行うことができ、例えば抗体の代わりに、本発明のアプタマーを利用した、免疫測定法（ELISA：Enzyme linked Immunosorbent Assay）を包含するサンドイッチ法、競合法、イムノクロマトグラフィー等で行うことが可能である。また、抗ＶＥＧＦ抗体は市販されているので、抗ＶＥＧＦ抗体と、本発明のアプタマーでＶＥＧＦをサンドイッチするサンドイッチ法も可能である。それだけでなく、本願発明者が開発した、アプタマーでしかできない測定法である、アプタマー酵素サブユニット（国際公開第2005/049826号）や、capturable aptamer（国際公開第2007/086403、国際公開第2008/038696）の測定方法を利用することによっても行うことができる。また、ＶＥＧＦの検出又は定量は、下記実施例に具体的に記載するアプタマーブロッティングや、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）等の周知の方法によっても行うことができる。
【００２２】
本発明はまた、このようなＶＥＧＦの測定に用いられる、本発明のアプタマーを含むＶＥＧＦ測定キットをも提供する。このようなキットには、例えば、本発明のアプタマーを、蛍光標識、酵素標識、化学発光標識、放射標識等で標識したものや、本発明のアプタマーを固定した固相、必要な緩衝液等が含まれる。本発明のアプタマーを含むこと以外は、周知のキットと同様であってよい。
【００２３】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
材料
合成オリゴヌクレオチドは全て、Greiner Bio-One（日本）から購入した。組換えヒトＶＥＧＦ１６５（Ｓｆ２１昆虫細胞で発現している）とビオチン化抗ＶＥＧＦ抗体（ＢＡＦ２９３）は、R&D systems（米国）から購入した。ウシ胎仔血清（ＢＳＡ）はSIGMA-Aldrich（日本）から購入した。ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ（登録商標）Ｈｙｂｏｎｄ（登録商標）−ＥＣＬ）はGE Healthcare（米国）から購入した。イモビロンウェスタン化学発光（Immobilon Western chemiluminescent）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）基質はMerck Millipore（米国）から購入した。他の全ての化学試薬は、分析等級のものを用いた。
【００２５】
コンピューター内進化による、一連の突然変異体の生成
コンピューター内進化による配列制御の第１サイクルでは、Ｇ−四重鎖構造になるように折り畳まれると予測されたＶＥＧＦ結合アプタマー（ＶＥａｐ１２１：配列番号５）の配列中に、複数の突然変異を導入した。Ｇ−四重鎖構造を維持するためのグアニン塩基以外、ＶＥａｐ１２１の配列を無作為に変異させ、１０種のＶＥａｐ１２１突然変異体を生成した。これら１０種の突然変異体のＶＥＧＦ結合能を、以下に記載したように表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって評価した。突然変異体のうちの７種がＶＥＧＦに結合することが分かり、これら突然変異体をそれらのＫｄ値によって順位付けした。
【００２６】
コンピューター内進化によって第二世代を生成するために、第一世代から上位５種の突然変異体を選択し、Ｋｄによる順位に応じて異なる出現率により、これら突然変異体の配列を複製した。この複製配列から、ランダムな配列対を抽出した。各配列対を１つのランダムな点で交差させ、２種の一塩基突然変異を無作為に導入し、次世代用に一組２０種の新規配列を生成した。
【００２７】
第三世代を生成するために、第一世代と第二世代で評価した突然変異体から上位５種の突然変異体を選択した。この５種の突然変異体をランダムな点でＶＥａｐ１２１と交差させ、２種の単一点突然変異をこの配列に無作為に導入した。この過程を繰り返し、第三世代の２０種の配列を生成した。
【００２８】
表面プラズモン共鳴測定
オリゴヌクレオチドがＶＥＧＦに結合する能力を、Biacore T200（GE Healthcare Japan、日本）を用いてＣＭ５センサーチップ上のＳＰＲを測定することにより評価した。ＶＥＧＦを１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、ＶＥＧＦ（およそ１０００ＲＵ）を、アミン結合キットを用いてＣＭ５センサーチップ上に共有結合させた。標識していないオリゴヌクレオチド（１μＭ）をトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ：１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、９５℃で５分間加熱し、その後徐々に冷却した。これらの条件下では、各オリゴヌクレオチドはその特異的な二次構造に折り畳まれる。ＴＢＳで希釈した様々な濃度のオリゴヌクレオチドを、ＶＥＧＦを固定したＣＭ５チップ上に流速２０μｌ／分、２０℃で注入した。固定したＶＥＧＦとオリゴヌクレオチドとの結合を監視した。ＮａＣｌ（１Ｍ）を注入することでＣＭ５チップを再生させた。Biacore evaluationソフトウェアを用い、会合速度と解離速度を近似させることによりＫｄ値を算出した。
【００２９】
円二色性によるＶＥＧＦ結合アプタマーの評価
Ｊ−７２０分光偏光計（ＪＡＳＣＯ、米国）を使用した円二色性（ＣＤ）スペクトルの測定により、アプタマーの構造を解析した。全アプタマー［最終濃度（ｆ．ｃ．）１０μＭ］をＴＢＳで希釈し、上述した熱処理によって折り畳んだ。０．１ｃｍセル中、２０℃でのスペクトルを記録した。各スペクトルは２０回のスキャンの平均とした。
【００３０】
改良したアプタマーを用いたＶＥＧＦ検出システムの構築
改良したアプタマーを用いて、ＶＥＧＦ検出システムを構築した。５’末端にＦＩＴＣを付加することにより、このアプタマーを修飾した。ＴＢＳを使用して、最終濃度４０ｎｇ／ｍＬのビオチン化抗ＶＥＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄsystems社製ＢＡＦ２９３（商品名）、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ７．３を用いた溶液として市販されている）溶液を調製した。希釈したＢＡＦ２９３（１００μＬ）を、ストレプトアビジンを固定した９６ウェルのポリスチレンプレート（Nunc Immobilizer（登録商標）＃４３６０１５、Ｎｕｎｃ）に加えた。このポリスチレンプレートを弱く撹拌しながら３０分間インキュベートし、上清を除去した。洗浄後、各ウェルを、５倍希釈した、５００ｎＭのビオチンを含む１００μＬのブロッキング試薬、Ｎ１０１（Nitiyu、日本）で満たし、３０分間インキュベートした。ブロッキング試薬（合成ポリマーを用いた試薬）は、ポリスチレンプレートへのタンパク質の非特異的な吸着を減少させるために加えた。ポリスチレンプレート上の過剰量のストレプトアビジンを阻害するためにビオチンを加えた。その後、ブロッキング試薬を各ウェルから除去した。洗浄後、様々な濃度のタンパク質（ＶＥＧＦ又はＢＳＡ）１００μＬをウェルに加え、３０分間インキュベートした。その後ウェルを３回洗浄した。加熱して折り畳んだ後にＴＢＳで調製したＦＩＴＣ標識アプタマー（１００μＬ、１０ｎＭ）を各ウェルに加え、３０分間インキュベートした。３回洗浄した後、ＨＲＰ結合抗ＦＩＴＣ抗体を各ウェルに加え、弱く撹拌しながら３０分間インキュベートした。各ウェルを洗浄し、イモビロンウェスタン化学発光西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）基質を加えた。ＨＲＰ活性をmultilabel plate counter（Wallac 1420 ARVO MX、Perkin Elmer）で測定した。このアッセイの間、ウェルはＴＢＳＴ（０．０５％（ｖ／ｖ）のツイーン２０を含むＴＢＳ）で洗浄した。全ての実験手順は室温で行った。
【００３１】
結果及び考察
コンピューター内進化による、ＶＥＧＦアプタマーの結合能力の改良
ＶＥＧＦ検出システムで認識素子として使用するためには、ＶＥＧＦとの結合能力が高いアプタマーが要求される。過去の研究２７で確認されたＶＥＧＦアプタマー（ＶＥａｐ１２１）のＫｄをＳＰＲアッセイによって再評価した（条件は上述）。算出されたＶＥａｐ１２１のＫｄ値が４．７ｎＭであったことは、高感度なＶＥＧＦ検出システムを構築するためには、ＶＥａｐ１２１の結合能力を改良する必要があると考えられた。そのため、本願発明者らはコンピューター内進化による、ＶＥａｐ１２１の結合能力の改良を試みた。コンピューター内進化には、親（鋳型）として機能し、それらから突然変異体を生成させる、複数の配列が必要である。コンピューター内進化の第一世代には、変異したＶＥａｐ１２１配列を親として使用した。ＶＥａｐ１２１配列中に無作為に変異を導入することにより、一組１０種のオリゴヌクレオチド突然変異体を生成した。グアニン塩基は変化させなかった。なぜならば、グアニン塩基はＶＥａｐ１２１をＧ−四重鎖構造に折り畳むために必要であると考えられているからである。合成した後、突然変異体のＶＥＧＦへの結合能力をＳＰＲにより評価した。それらのＫｄ値に従って、オリゴヌクレオチドを順位付けた。各世代のそれぞれのオリゴヌクレオチドのＶＥＧＦ結合能力を図１に示す。第一世代のＶＥａｐ１２１突然変異体１０種の内、７種がＶＥＧＦ結合能を示した。上位５種の突然変異体を、コンピューター内進化の第二世代の親として使用するために選択した。
【００３２】
第二世代の生成では、第一世代からの上位５種の配列を、ＶＥＧＦ結合能力に応じて比率の異なる４０種の配列に複製した。比率は以下の通り、１番目の配列の割合は１２／４０、２番目が１０／４０、３番目が８／４０、４番目と５番目が５／４０である。この複製プールから２つの配列を無作為に選択し、対合させた。この配列上でランダムな点を抽出し、この点で配列を交差させた。最後に、この配列対から無作為に配列を抽出し、２つの一塩基ランダム突然変異を導入した。この過程を繰り返して、２０種の配列を第二世代として得た。ＳＰＲを用いた評価から、突然変異体の内の５種がＶＥＧＦ結合能力を示すが、残りは結合能力を示さないことが明らかになった。しかしながら、５種の突然変異体の結合能はＶＥａｐ１２１の結合能よりも弱かった。これらの結果は、ＶＥａｐ１２１がＶＥＧＦと相互作用するために比較的最適化されている可能性を示した。
【００３３】
このように、ＶＥａｐ１２１を交差させることによって２０種の配列を生成し、第一世代と第二世代で結合能力を示した上位５種の突然変異体を第三世代用に選択した。各突然変異体を２つの配列に複製し、この複製配列をランダムな点でＶＥａｐ１２１と交差させた。この後、２つの一塩基突然変異をそれぞれの交差配列に導入した。この過程を繰り返すことで、２０種の配列を第三世代として生成した。第三世代から、ＶＥａｐ１２１よりも強くＶＥＧＦに結合する４種のオリゴヌクレオチド（３Ｒ０２、３Ｒ０３、３Ｒ０８、及び３Ｒ０９）を同定した。これらの塩基配列をそれぞれ配列番号１〜配列番号４に示す。なお、親として用いたＶＥａｐ１２１の塩基配列を配列番号５に示す。これらのオリゴヌクレオチドの各配列とＫｄを下記表１に示す。なお、３Ｒ０２、３Ｒ０３、３Ｒ０８、及び３Ｒ０９の各Ｋｄ値を、各塩基配列と共に下記表１に示す（表１中では、例えば、「３Ｒ０２」は「３Ｒ＃０２」のように示されている）。下記表１には、コンピューター内進化法において試験した、他のオリゴヌクレオチドのうちの一部のものの塩基配列とＫｄ値をも併せて示す。表１中、「ｎ．ｄ．」は、測定できなかったことを意味し、ＶＥＧＦとの結合性がないことを示す。また、各塩基配列中、太字、下線のGは、Ｇ−四重鎖構造に必要であると考えられるGである。なお、表１中の３Ｒ＃０１〜３Ｒ＃１０までの塩基配列をこの順に配列番号７〜配列番号１４に示す。
【００３４】
【表１】
2018085992.tif 000003
【００３５】
表１に示されるように、３Ｒ０２（配列番号１）がＶＥＧＦに対する最も強い結合能力を示した。３Ｒ０２のＫｄ値は３００ｐＭであり、このことはＶＥａｐ１２１より１６倍強い結合能力を有することを示している。３Ｒ０２の解離速度定数（ｋoff）は１．９２×１０-４（Ｍ-１）であり、ＶＥａｐ１２１のｋoffは４．９９×１０-３（Ｍ-１）であった（図２）。３Ｒ０２の結合速度定数（ｋon）は６．３９×１０５（Ｍ-１ｓ-１）であり、ＶＥａｐ１２１は１．０５×１０６（Ｍ-１ｓ-１）であった。その結果、ＶＥＧＦ結合能力の改良は、解離速度定数を下げることにより達成された。限られた数の候補を評価することから、ＳＥＬＥＸでは見逃された新規アプタマーを得た。このことは、コンピューター内進化に基づいたＳＥＬＥＸ後のスクリーニングが、アプタマーの機能を改良するために効果的な方法であることを示している。
【００３６】
二量体化による、ＶＥＧＦアプタマーの結合能力の改良
これまでの研究で本願発明者らは、二価アプタマーを設計することによるＶＥＧＦ結合アプタマーの改良を報告した（下記関連文献２７、３８）。そのため本研究で我々は、二価アプタマーを設計することにより、３Ｒ０２をさらに改良することも計画した。設計した二価アプタマーの配列（３Ｒ０２二価）は、配列番号６の塩基配列からなる。３Ｒ０２二価は、２つの単量体３Ｒ０２オリゴヌクレオチドと１０−ｍｅｒのチミンリンカーからなる。ＳＰＲの測定から、３Ｒ０２二価のＫｄ値は３０ｐＭであると算出された。３Ｒ０２を二量体化することにより、結合能力が１０倍に改良された。これは、これまでに報告されているＶＥＧＦ結合ＤＮＡアプタマーの中で最も結合能力が高く、抗ＶＥＧＦ治療薬として知られているＶＥＧＦ結合ＲＮＡアプタマーであるマクジェン（Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標））（下記関連文献４０）の結合能力に近い。
【００３７】
３Ｒ０２と３Ｒ０２二価のＣＤスペクトル測定
ＣＤスペクトルは、ＤＮＡの四重鎖構造に関わる情報の収集に有用である。ＶＥａｐ１２１、３Ｒ０２、及び３Ｒ０２二価のＣＤスペクトルを取得した。ＶＥａｐ１２１は２３９ｎｍと２８０ｎｍに負のピークを、２６２ｎｍと２９３ｎｍに正のピークを示し（図３ａ）、３Ｒ０２は２３８ｎｍと２７１ｎｍに負のピークを、２５６ｎｍと２８８ｎｍに正のピークを示した（図３ａ）。３Ｒ０２のＣＤスペクトル中で２６０ｎｍに近い位置にあった正のピークの強度は、ＶＥａｐ１２１のスペクトルのうち最も強度が強かったピークの２倍であった。ＱＧＲＳ Ｍａｐｐｅｒを利用した解析から、ＶＥａｐ１２１と３Ｒ０２の両方は、同じＧ−四重鎖モチーフ（Ｇ１：5'-nnnnggnnnggnnnggnnnggnnnn-3’）（配列番号１５）をもっていると予測された。しかしながら、ＣＤスペクトルから得られたデータは、それらのＧ−四重鎖構造は異なることを示唆していた。３Ｒ０２のＣＤスペクトルは、反平行Ｇ−四重鎖に折り畳まれる、ｄ（ggggtcaggctggggttgtgcaggtc）（配列番号１６、下記関連文献４１）のスペクトルと同様であった。そのため、３Ｒ０２が同様の反平行Ｇ−四重鎖構造をとる可能性があると仮定された。３Ｒ０２二価のＣＤスペクトルも取得した。３Ｒ０２二価が２つの３Ｒ０２一価配列と１０−ｍｅｒのチミンリンカー（Ｔ１０）を含むことから、３Ｒ０２二価スペクトルから、Ｔ１０スペクトルを差し引いた。差し引いたスペクトルを図３ｂに示す。差し引いたスペクトルは３Ｒ０２の同様のバンドパターンを示したが、スペクトルのピーク強度は、３Ｒ０２のピーク強度の２倍であった。その結果、３Ｒ０２二価は２つの独立した一価３Ｒ０２のＧ−四重鎖構造を含んでいる可能性がある。
【００３８】
ＶＥＧＦ検出システムの構築
我々は、改良したアプタマーを用いたＶＥＧＦ検出システムの感度の改良を試みた。抗ＶＥＧＦ抗体と３Ｒ０２（Ｋｄ＝３００ｐＭ）を用いて、ＶＥＧＦ検出システムを構築した。抗体をプレート上に固定し、その後ＶＥＧＦを加えた。次にＦＩＴＣで標識した３Ｒ０２をプレート上に加えた。ＦＩＴＣで標識した３Ｒ０２を、ＨＲＰ結合抗ＦＩＴＣ抗体で検出した。これにより、３Ｒ０２のＶＥＧＦへの結合を表し、かつ、ＶＥＧＦの濃度に依存するＨＲＰの化学発光信号が発生する。このアッセイのＬＯＤは６．７ｎＭであり（図４ａ）、ＬＯＤ＝３（ＳＤ／傾き）から算出した。「ＳＤ」は、ＶＥＧＦが０ｎＭの場合の反応の標準偏差と定義した。「傾き」は、検量線の傾きと定義した。プレート上にＢＳＡを加えた場合には信号の上昇は観察されなかった。プレートアッセイを、ＶＥａｐ１２１（Ｋｄ＝４．７ｎＭ）を用いても行った（図４ｂ）。アプタマーとＶＥＧＦの結合を示す西洋ワサビペルオキシダーゼの化学発光シグナルが取得されたが、信号は３Ｒ０２を用いて取得した信号の８分の１であった。さらに、ＶＥＧＦの濃度が１０ｎＭの時に信号は飽和したようであり、各データセットのエラーバーが重なり合った。そのため、ＶＥａｐ１２１のＬＯＤは算出できなかった。これらの結果は、３Ｒ０２を用いることで、ＶＥＧＦ検出システムの感受性が改良されたことを示した。
【００３９】
３Ｒ０２二価（Ｋｄ＝３０ｐＭ）を用いてもＶＥＧＦ検出システムを構築したが、結果は３Ｒ０２で得られたものと同様であった（支援情報の図Ｓ−５にデータを示す）。抗体が３Ｒ０２二価とＶＥＧＦとの結合に干渉しているのではないかと予測された。そのため我々は、異なるエピトープに結合するＶＥＧＦ抗体を使用することにより、検出システムの感度を改良することができるだろうと考えている。
【００４０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月25日(2018.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される塩基配列を含み、血管内皮増殖因子に対する解離定数が1nM以下であるポリヌクレオチド（ただし、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号１に示される塩基配列の一端又は両端に各１個〜数個の塩基からなる塩基配列が連結された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって血管内皮増殖因子に対する解離定数が300pMであるポリヌクレオチドを除く）。
【請求項２】
配列番号１に示される塩基配列を含む請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドと、血管内皮増殖因子とを接触させ、それらの結合を測定することを含む、被検試料中の血管内皮増殖因子の測定方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを含む血管内皮増殖因子の測定キット。
【請求項５】
標識された前記ポリヌクレオチドを含む請求項４記載のキット。