(57)【要約】      （修正有）【課題】アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を上昇させることにより、アルコール性肝障害、特に急性アルコール性肝障害を治療する方法の提供。【解決手段】共役リノール酸又は、共役リノール酸グリセリド、共役リノール酸エチルエステル、共役リノール酸カルシウム塩等から選択される共役リノール酸誘導体をアルデヒドデヒドロゲナーゼ促進剤として使用する。共役リノール酸又はその誘導体の用量は、０．０４〜０．０８ｇ／ｋｇ体重であることが好ましい。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ促進剤の調製における共役リノール酸又はその誘導体の応用。
【請求項２】
前記アルデヒドデヒドロゲナーゼ促進剤が生体内におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性／含有量を高めることができることを特徴とする請求項１に記載の応用。
【請求項３】
適用対象がアルコール摂取者であり、好ましくはアジア人種、或いは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子突然変異キャリアであることを特徴とする請求項１に記載の応用。
【請求項４】
前記誘導体が、共役リノール酸グリセリド、共役リノール酸エチルエステル、共役リノール酸カルシウム塩から選択される１種又は複数種の組み合わせであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の応用。
【請求項５】
前記誘導体が共役リノール酸グリセリドであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の応用。
【請求項６】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ促進剤に使用される前記共役リノール酸又はその誘導体の用量が０．０１ｇ／ｋｇ体重以上であり、好ましくは０．０２〜０．１２ｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０４〜０．０８ｇ／ｋｇ体重であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の応用。
【請求項７】
共役リノール酸又はその誘導体を含有し、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子突然変異キャリア、或いはアジア人種に適用されることが好ましく、東アジア人種に適用されることがより好ましいことを特徴とするアルコール性肝障害を軽減、治療する製剤。
【請求項８】
前記誘導体が共役リノール酸グリセリド、共役リノール酸エチルエステル、共役リノール酸カルシウム塩から選択される１種又は複数種の組み合わせであることを特徴とする請求項７に記載の製剤。
【請求項９】
前記誘導体が共役リノール酸グリセリドであることを特徴とする請求項７に記載の製剤。
【請求項１０】
アルコール性肝障害を軽減、治療するための用量が０．０１ｇ／ｋｇ体重以上であり、好ましくは０．０２〜０．１２ｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０４〜０．０８ｇ／ｋｇ体重であることを特徴とする請求項７に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ医薬分野に属し、アルデヒドデヒドロゲナーゼ促進剤の調製における共役リノール酸又はその誘導体の応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
中国の酒文化は悠久たる歴史を持ち、酒なくしては宴席にならないという説もある。しかし、アルコールは神経機能に支障をきたし、大量に飲むと酔ってしまうことがある。そして、アルコール又はその二次代謝産物が体内に蓄積するため、酒酔いの不快な症状をきたすほか、肝毒性を起こし、さらに肝がんを誘発する。
【０００３】
アルコールは、胃、腸で吸収されて血液に入り、血液中のアルコール濃度がアルコールの量を示し、アルコールは血液によって肝臓に運ばれて代謝される。アルコールの体内での代謝には、アルコールデヒドロゲナーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼを媒介とするゼロ次標準的経路、及び、アルコール高濃度時に働くミクロソームエタノール酸化系（主にＰ４５０２Ｅ１）とアルデヒドデヒドロゲナーゼを媒介とする１次代謝経路の２経路がある。アルコールはアルコールデヒドロゲナーゼ、Ｐ４５０２Ｅ１の作用でアセトアルデヒドに代謝された後、アルデヒドデヒドロゲナーゼの作用で酢酸に代謝されて、トリカルボン酸サイクルに入り、最終的に水と二酸化炭素に代謝される。したがって、アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｐ４５０２Ｅ１及びアルデヒドデヒドロゲナーゼはアルコール代謝における重要な律速酵素である。一般人はアルコールデヒドロゲナーゼの活性が強く、つまりエタノールが吸収後速いスピードでアセトアルデヒドに変換されるが、アルデヒドデヒドロゲナーゼの活性は人それぞれであり、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子突然変異によりアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性が低下し、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子突然変異キャリアのアセトアルデヒドに対する分解能が低下して、アセトアルデヒドが体内に蓄積し、明らかな飲酒による不快な反応が出る（典型的な反応は「アジアンフラッシュ（Ａｓｉａｎ  ｆｌｕｓｈ）」、動悸、吐き気などである）。
【０００４】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子突然変異は、主にアジア人種、特に東アジア人種に起こる。中国大陸地域において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子突然変異の分布には明らかな地域差が存在し、頻度の最も高いのは東南沿岸地域で、福建省を中心に、北西方向に行くにつれ減少していく。そのため、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子突然変異がほとんど起こらないヨーロッパ人種及びアフリカ人種に比較して、アジア人種の方が飲酒による不快な症状が出やすく、アルコールの肝毒性作用もより顕著である。
【０００５】
現在、アルデヒドデヒドロゲナーゼの取得が難しく、ほとんどは動物の肝臓、すい臓或いは肝細胞ミトコンドリアから抽出したものであり、資源が限られている上に値段が高いため、大規模生産が難しい。したがって、生体自体のアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性又は含有量を高めることはアルコールの分解に重要な意義がある。
【０００６】
しかし、従来の研究には、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を上昇できる化合物や製剤に関する報告が少ない。中国特許ＣＮ２０１３１０５４９５５２．３は、トリアゾール化合物のアルデヒドデヒドロゲナーゼ２活性化剤の調製における使用を開示し、体外実験でトリアゾール化合物がアルデヒドデヒドロゲナーゼ２活性を上昇できることを証明したが、複雑な生体の中で、トリアゾール化合物のアルデヒドデヒドロゲナーゼ２の活性促進効果は知ることができない。また、中国特許ＣＮ２０１３１０１２９２８１．６は、ａｌｄａ−１もアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性化剤として使用できることを開示したが、それは脳組織障害の治療に用いられるものである。したがって、アルコール分解に効果的に応用できるアルデヒドデヒドロゲナーゼ促進剤はまだない。
【０００７】
共役リノール酸は、必須脂肪酸であるリノール酸の共役ジエンの様々な位置異性体及び立体異性体の総称であり、一連の共役二重結合がＣ８とＣ１０、Ｃ９とＣ１１、Ｃ１０とＣ１１、Ｃ１１とＣ１３の位置において、位置異性体及び幾何異性体を有するオクタデカジエン酸からなる。天然の共役リノール酸は、牛、羊などの反芻動物の乳製品や肉製品に存在し、主にｃ９，ｔ１１−ＣＬＡ異性体の形で存在している。共役リノール酸グリセリド、共役リノール酸エチルエステル、共役リノール酸カルシウム塩などの共役リノール酸誘導体は、小腸内で共役リノール酸に加水分解されて腸粘膜細胞を介して吸収され、腸粘膜細胞内で共役リノール酸グリセリドに再合成され、リンパ系を通じて血液循環に入り、体内で機能する。したがって、共役リノール酸、共役リノール酸グリセリド、共役リノール酸エチルエステル又は共役リノール酸カルシウム塩は、いずれも同様な形態で体内で機能する。
【０００８】
従来の研究により、共役リノール酸は、抗がん、体脂肪減少、血中脂質低減、慢性炎症軽減など様々な生理的活性作用を有することが判明した。共役リノール酸グリセリドは天然の共役リノール酸の形で存在する。中国は共役リノール酸及び共役リノール酸グリセリドを新たな資源食品として、一般の食品に添加して使用することを承認し、さらに、共役リノール酸グリセリドはダイエット、心血管疾患や糖尿病などの予防のための健康食品としても用いられている。
【０００９】
共役リノール酸又はその誘導体には様々な健康機能があるが、今まで共役リノール酸又はその誘導体がアルコール代謝酵素の活性、特にアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性を上昇できることを見出した人はいない。さらに共役リノール酸又はその誘導体をアルコール性肝障害の治療剤として使用した人はなお更いない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性／含有量促進剤の調製における共役リノール酸又はその誘導体の応用を提供することを目的とする。
【００１１】
本発明は、アルコール性肝障害、特に急性アルコール性肝障害を治療する製剤を提供することを他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明者は、研究により、共役リノール酸又はその誘導体がアルデヒドデヒドロゲナーゼの含有量を高めることができ、それによって、アルコールの代謝を促進できることを見出した。
【００１３】
体内に入ったエタノールのほとんどは肝臓で二つの独立した代謝経路を通じて代謝される。一つはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）経路で、この経路は肝細胞の間質液に存在し、ＡＤＨの触媒作用により、ＮＡＤ＋を補因子とし、エタノールを酸化してアセトアルデヒドを生成し、生成したアセトアルデヒドはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）の作用で、無害の酢酸に変換される。もう一つはミクロソームエタノール酸化系（ＭＥＯＳ）経路で、この経路は肝ミクロソームに存在し、肝組織内のエタノール濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌを超える場合、或いは長期飲酒者群において、ＭＥＯＳ経路が働き、エタノールの主な代謝経路になる。
【００１４】
アルコール代謝において、アルデヒドデヒドロゲナーゼはアルコール代謝の律速酵素である。ＡＤＨ経路でも、ＭＥＯＳ経路でも、アルデヒドデヒドロゲナーゼはいずれも重要な役割を果たす。アジア人種にとって、アルデヒドデヒドロゲナーゼは特に重要である。これは、アジア人種の半分以上でアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子２（ＡＬＤＨ２）の突然変異が起こり、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が低下して、正常で効率的なアルコール代謝を行うことができないからである。体内のアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性或いは含有量を高めることはアルコール代謝に重要な意義がある。しかし、現在、アルコール分解に効果的に応用できるアルデヒドデヒドロゲナーゼ促進剤はまだない。本発明は、共役リノール酸又はその誘導体がアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性を高めることができることを見出した。
【００１５】
本発明の動物実験において、共役リノール酸又はその誘導体を使用した実験群は、肝臓のＡＬＤＨの含有量が陽性群及び対照群と比較して顕著に上昇した。特に、実験群の低用量群の方がより顕著な効果を得た。低用量群のＡＬＤＨの含有量は投与していない対照群と比較して、３２．７％（Ｐ＜０．００１）増である。
【００１６】
ＭＥＯＳ経路では、チトクロームＰ４５０の存在とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の関与が必要である。ＭＥＯＳは様々なチトクロームＰ４５０ｓからなる。そのうち、ＣＹＰ２Ｅ１はエタノール代謝に対するＫｍ値が比較的低く、アルコールに誘導することができ、ＭＥＯＳエタノール代謝経路の重要な酵素であり、非アルコールデヒドロゲナーゼ酸化経路において重要な役割を果たす。
【００１７】
共役リノール酸又はその誘導体は、体内のアルデヒドデヒドロゲナーゼの含有量を高めることができるほか、チトクロームＰ４５０  ２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）の含有量を高めることもでき、体内のアルコール濃度が高過ぎるとき、アルコールの代謝を促進する。
【００１８】
本発明の動物実験において、共役リノール酸又はその誘導体は、酒酔いモデルのチトクロームＰ４５０２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）の含有量を高めることができ、また、低用量群と対照群とで有意な差があるが、陽性薬はＣＹＰ２Ｅ１含有量に特に作用しない。
【００１９】
実は、単なるチトクロームＰ４５０  ２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）の増加は肝障害を起こす可能性がある。例えば、エタノールの誘導により、ＣＹＰ２Ｅ１の遺伝子及びタンパク質の発現が増加し、反応性酸素やラジカルの生成が増加し、脂質過酸化反応を一層促進する。マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の生成を増加させ、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を消耗し、大量の過酸化脂質を生成し、抗酸化システムの保護作用を抑制し、体内の酸化−抗酸化のバランスを崩し、肝障害を引き起こす。
【００２０】
発明者は、共役リノール酸又はその誘導体を使用した実験群において、ＭＤＡが増加するどころか、減少することを見出した。ＭＤＡは生体内脂質過酸化物の最終代謝産物であり、その低減は生体内過酸化物の低減を示す。本発明の動物実験では、実験群と陽性群はどちらも肝臓のＭＤＡを低下させることができ、特に実験群のＧＬＡ−ＴＧ高用量群は肝臓のＭＤＡを低下させることができる。このことから、共役リノール酸又はその誘導体は、一定の酸化防止作用によって肝臓保護、二日酔い軽減の機能を発揮することができることが分かる。
【００２１】
本発明の共役リノール酸又はその誘導体の適用対象はアルコール摂取者である。特に大量飲酒者である。共役リノール酸又はその誘導体がＡＤＨ経路だけでなく、ＭＥＯＳ経路を速めることもできるからである。
【００２２】
また、本発明の共役リノール酸又はその誘導体は、飲酒後「アジアンフラッシュ」が出やすいアジア人種のようなＡＬＤＨ遺伝子突然変異キャリアに適用される。アジア人種の半分以上でＡＬＤＨ遺伝子突然変異が起こり、ＡＬＤＨの活性が比較的低い。本発明はアジア人種におけるＡＬＤＨ遺伝子突然変異群に特に適用される。
【００２３】
飲酒後、顔面紅潮、吐き気、動悸、頭痛など不快な反応が出やすい人は、飲酒前、飲酒途中或いは飲酒後に共役リノール酸又はその誘導体、或いは共役リノール酸又はその誘導体を含む混合製剤を摂取することにより、アルコールが速く代謝されて体外に排出され、飲酒による不快な症状が軽減され、肝機能が守られる。
【００２４】
本発明に記載の共役リノール酸誘導体は、共役リノール酸グリセリド、共役リノール酸エチルエステル、共役リノール酸カルシウム塩から選択される１種又は複数種の組み合わせである。
【００２５】
前記誘導体は共役リノール酸グリセリドが好ましい。
【００２６】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性促進剤に用いられる前記共役リノール酸又はその誘導体の用量は、０．０１ｇ／ｋｇ体重以上であり、好ましくは０．０２〜０．１２ｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０４〜０．０８ｇ／ｋｇ体重である。
【００２７】
本発明はさらに、共役リノール酸又はその誘導体がアルコール性肝障害に一定の軽減効果があることを見出した。
【００２８】
具体的に言えば、本発明は、マウスの急性アルコール性肝障害モデルを用い、肝機能及び肝臓病理検査を通じて、共役リノール酸又はその誘導体のマウス急性アルコール性肝障害への効果を評価した。十日連続でマウスに白酒を胃内投与した後、実験群の肝細胞腫大、脂肪変性などの病理変化が陽性群及び対照群と比べて比較的少なかった。また、陽性群及びモデル群と比較して実験群（被験物質ＣＬＡ−ＴＧ）では、総ビリルビン（ＴＢｉｌ）の含有量が明らかに減少し、正常群レベルを維持した（ＴＢｉｌの含有量の増加は肝障害が存在することを示す）。
【００２９】
これは、共役リノール酸又はその誘導体が、アルコール性肝障害、特に急性アルコール性肝障害のマウスに一定の治療効果があることを明らかにした。
【００３０】
本発明に記載の共役リノール酸誘導体は、共役リノール酸グリセリド、共役リノール酸エチルエステル、共役リノール酸カルシウム塩から選択される１種又は複数種の組み合わせである。
【００３１】
前記誘導体は共役リノール酸グリセリドが好ましい。
【００３２】
本発明に記載の陽性群は海王金樽投与群であり、海王金樽は酒酔い状態を改善し、酒酔いレベルを下げ、アルコールによる体の障害及び酒酔いによる様々な症状を軽減し、頭痛、脱力感、倦怠感、食欲不振など飲酒後の不快な症状を解消することができるとともに、アルコールによる生体の血液微小循環障害を改善し、ヒトの体内における各組織器官の代謝、生理的機能が正常に働くようにすることが判明した。
【００３３】
本発明は、共役リノール酸又はその誘導体を含む、アルコール性肝障害、特に急性アルコール性肝障害を軽減、治療する製剤を提供する。
【００３４】
前記製剤はさらに急性アルコール中毒による肝臓の病理変化を明らかに軽減することができる。
【００３５】
前記肝臓の病理変化は、例えば、肝細胞腫大、軽度の肝細胞脂肪変性、帯状肝細胞好酸性変性あるいは肝細胞炎症性細胞浸潤を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
前記アルコール性肝障害を軽減、治療する製剤の用量は、０．０１ｇ／ｋｇ体重以上であり、好ましくは０．０２〜０．１２ｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０４〜０．０８ｇ／ｋｇ体重である。
【００３７】
本発明は、共役リノール酸又はその誘導体がアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性を高めることによりアルコールの代謝を促進できることを見出した。これは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子突然変異のアジア人に対して大きな意義がある。そして、本発明はさらに、共役リノール酸又はその誘導体が肝保護効果を示し、アルコール性肝障害に一定の軽減、治療効果があることを見出した。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、酒酔いモデルマウスのマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）含有量に対するＣＬＡ−ＴＧの作用（Ｘ±ＳＤ．）及び対照群との比較（＊Ｐ＜０．０５）を示す。
【図２】図２は、酒酔いモデルマウスのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）含有量に対するＣＬＡ−ＴＧの作用（Ｘ±ＳＤ．）及び対照群との比較（＊＊Ｐ＜０．０１）を示す。
【図３】図３は、酒酔いモデルマウスのチトクロームＰ４５０  ２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）含有量に対するＣＬＡ−ＴＧの作用（Ｘ±ＳＤ．）及び対照群との比較（＊＊＊Ｐ＜０．００１）を示す。
【図４】図４は、急性アルコール性肝障害モデルマウスのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）活性に対するＣＬＡ−ＴＧの作用（Ｘ±ＳＤ．）及び正常群との比較（▲Ｐ＜０．０５）を示す。
【図５】図５は、急性アルコール性肝障害モデルマウスの総ビリルビン（Ｔｂｉｌ）含有量に対するＣＬＡ−ＴＧの作用（Ｘ±ＳＤ．）を示す。
【図６】図６は、各群マウスの肝臓顕微鏡写真（ＨＥ，×１００）を示し、Ａ：正常対照群、Ｂ：アルコール性肝障害モデル群、Ｃ：陽性群、Ｄ：ＣＬＡ−ＴＧ低用量群、Ｅ：ＣＬＡ−ＴＧ中用量群、Ｆ：ＣＬＡ−ＴＧ高用量群である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、具体的な実施例により本発明の技術的手段を詳細に説明するが、本発明の保護範囲は具体的な実施例に限定されるものではない。本発明の精神によって実施された非実質的な修正及び変更はいずれも本発明の保護範囲に属する。
【００４０】
１．実験動物：ＫＭマウス、１８ｇ〜２０ｇ、ＳＰＦ級、北京華阜康生物科技股ふん有限公司により提供、実験動物品質合格証番号：ＳＣＸＫ（京）２０１４−０００４。
【００４１】
２．動物飼育条件：ＳＰＦ級動物バリア環境で、１ケージに１２匹ずつ収容して、通常固形飼料及び精製水を自由に摂取させて飼育した。動物施設許可証：ＳＹＸＫ（京）２０１３−００２３。
【００４２】
３．試薬及び試験材料
３．１被験物質
共役リノール酸グリセリド（ＣＬＡ−ＴＧ）、大連槿藏商貿有限公司により提供、ロット番号：Ｒ１４０７０６２、密封して冷蔵庫で冷蔵保存した。
【００４３】
３．２陽性薬
海王金樽片、深セン市海王健康発展有限公司製、ロット番号：２０１５０１０２、仕様：１ｇ＊３錠＊６包。
【００４４】
３．３その他の試薬及び試験材料
白酒：紅星二鍋頭白酒、北京紅星股ふん有限公司製、アルコール含有量５６％（Ｖ／Ｖ）、ロット番号：２０１５０３２８；塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、試薬グレード、５００ｇ入り、国薬集団化学試剤有限公司製、ロット番号：２０１４０５２９；トリクロロ酢酸、試薬グレード、北京化学試剤公司製、５００ｇ入り、ロット番号：０４１０１２；塩酸（ＨＣｌ）、試薬グレード、北京化工場製、５００ｍｌ入り、ロット番号：２００１０５３８；ＴＢＡ（チオバルビツール酸）、２５ｇ入り、国薬集団化学試剤有限公司製、ロット番号：ＹＦ２００６０６０８；カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）、ロット番号：０４０７０６、広東汕頭市西隴化工場製。
【００４５】
タンパク質定量キット（クマシーブリリアントブルー法）、製品番号：Ａ０４５−２、ロット番号：２０１５１２１６、有効期限：２０１６０６１５；グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＧＳＴ）測定キット、製品番号：Ａ００４、ロット番号：２０１５１２２６、有効期限：２０１６０６２５。上記キットは南京建成生物工程研究所により提供された。
【００４６】
マウスアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＡＬＤＨ）ＥＬＩＳＡキット、有効期限：２０１６０６、ＬＯＴ：２０１５１２、ＲＥＦ：ＳＢＪ−ＭＯ６９２；マウスチトクロームＰ４５０ファミリー２Ｅ１（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０２Ｅ１，ＣＹＰ２Ｅ１）ＥＬＩＳＡキット、有効期限：２０１６０６、ＬＯＴ：２０１５１２、ＲＥＦ：ＳＢＪ−ＭＯ６９３。上記キットは森貝伽（南京）生物科技有限公司により提供された。
【００４７】
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）測定キット、有効期限：２０１７０１０１、ＬＯＴ：ＡＵＺ２６７８；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）測定キット、有効期限：２０１７０１０１、ＬＯＴ：ＡＵＺ２６８６；総ビリルビン（ＴＢｉｌ）測定キット、有効期限：２０１６０４０１、ＬＯＴ：ＡＵＺ２７２４。上記キットはベックマン・コールター社（蘇州）により提供された。
【００４８】
３．４機器
ＩＫＡ  ＶＯＲＴＥＸ１シェーカー：ＩＫＡ（広州）儀器設備有限公司（ＩＫＡ中国）
Ｆ６／１０型ＦＬＵＫＯ高分散型ホモジナイザー：上海弗克流体機械製造有限公司
ＨＥＲＡＥＵＳ  Ｌａｂｏｆｕｇｅ４００Ｒ型低温遠心機：ＨＥＲＡＥＵＳ
【００４９】
ＴＧＬ−１６０ａＲ型高速低温遠心機：上海安亭科学儀器場
ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＭＱＸ２００型マイクロプレートリーダー：アメリカＢｉｏ−ＲＡＤ
ＡＵ４８０生化学自動分析装置：Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  （Ｃｈｉｎａ）  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．
【００５０】
＜実施例１＞
酒酔いモデルマウスに対するＣＬＡ−ＴＧの酔い覚まし効果メカニズムに関する研究
【００５１】
実験手順：
ＳＰＦ級ＫＭマウス、♂、体重１８〜２２ｇ。マウス６０匹を体重により、対照群、陽性群（海王金樽３ｇ／ｋｇ）及びＣＬＡ−ＴＧ高用量群（３ｇ／ｋｇ）、中用量群（２ｇ／ｋｇ）、低用量群（１ｇ／ｋｇ）の１２匹ずつの５群に無作為に分けた。陽性群マウスには（ｉｇ．）０．２ｍｌ／１０ｇ体重で１５％の海王金樽溶液、ＣＬＡ−ＴＧ高、中、低用量群マウスそれぞれには（ｉｇ．）０．２ｍｌ／１０ｇ体重で濃度１５％、１０％、５％のＣＬＡ−ＴＧ溶液（５％ＣＭＣで可溶化）、モデル群マウスには（ｉｇ．）等量のＣＭＣ溶液を１日１回、３日間連続で胃内投与した。行動観察実験前に一夜（１２ｈ）絶食させた。実験当日、投与から３０ｍｉｎ後、各群のマウス全てに（ｉｇ．）０．１６５ｍＬ／１０ｇで白酒を投与し、モデル作製から７ｈ後全部屠殺し肝臓を取り出し、−８０℃で保存した。凍結保存したマウスの肝臓で１０％肝ホモジネートを調製した後、３０００ｒｐｍで遠心分離して上清を取った。酵素法でマウス肝臓のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性及びマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）含有量を測定し、ＥＬＩＳＡ法でマウス肝臓のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）、チトクロームＰ４５０  ２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）含有量を測定した。
【００５２】
酵素法測定及びＥＬＩＳＡ法測定は『薬理実験方法学』第４版の関連内容を参考にした。
【００５３】
実験結果：
マウス肝臓のグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性及びマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）含有量に対するＣＬＡ−ＴＧの影響（表１及び図１）
【００５４】
マウス肝臓のグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性及びマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）含有量を測定した結果、被験物質ＣＬＡ−ＴＧ及び陽性薬の海王金樽は、酒酔いモデルマウスの肝臓のＧＳＴ活性に明らかな効果がなかったが、肝臓のＭＤＡ含有量を減少させ、ＣＬＡ−ＴＧ高用量群と対照群とで有意な差があった。
【００５５】
体内に入ったアルコール又はその代謝産物から生成した大量のラジカルにより肝細胞膜の脂質が過酸化されるので、抗酸化物質はアルコールによる肝組織障害を軽減し、エタノールの分解を促進することができる。マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）は生体内脂質過酸化物の最終代謝産物であり、ＭＤＡの低下は生体内過酸化物の減少を示す。我々の実験結果は、ＣＬＡ−ＴＧが酒酔いモデルマウスの肝臓中のＭＤＡ含有量を大幅に減少できることを示し、ＣＬＡ−ＴＧが一定の抗酸化作用により肝臓保護、酔い覚ましの機能を果たすことが判明した。
【００５６】
表１  マウス肝臓のＧＳＴ及びＭＤＡに対するＣＬＡ−ＴＧの作用（Ｘ±ＳＤ．）
【００５７】
2018048118.tif 000003
【００５８】
対照群との比較、＊Ｐ＜０．０５
【００５９】
マウス肝臓のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）、チトクロームＰ４５０２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）含有量に対するＣＬＡ−ＴＧの影響（表２及び図２−３）
【００６０】
表２から分かるように、被験物質ＣＬＡ−ＴＧは酒酔いモデルマウスのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）、チトクロームＰ４５０２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）含有量を高めることができ、そして低用量群と対照群とで有意な差があるが、陽性薬の海王金樽はＡＬＤＨとＣＹＰ２Ｅ１含有量に対し特に作用しない。
【００６１】
表２  マウス肝臓のＡＬＤＨ及びＣＹＰ２Ｅ１に対するＣＬＡ−ＴＧの作用（Ｘ±ＳＤ．）
【００６２】
2018048118.tif 000004
【００６３】
対照群との比較、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１
【００６４】
体内に入ったエタノールのほとんどは、肝臓で二つの独立した代謝経路によりアセトアルデヒドに酸化されて代謝される。一つはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）経路で、この経路は肝細胞の間質液に存在し、ＡＤＨの触媒作用によって、ＮＡＤ＋を補因子とし、エタノールを酸化してアセトアルデヒドを生成し、生成したアセトアルデヒドを基質とし、さらにアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）の触媒作用により無害の酢酸に変換する。もう一つは、ミクロソームエタノール酸化系（ＭＥＯＳ）経路で、この経路は肝ミクロソームに存在し、チトクロームＰ４５０の存在とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の関与が必要である。実験結果は、ＣＬＡ−ＴＧが酒酔モデルマウスのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）、チトクロームＰ４５０２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）含有量を高めることができることを示し、ＣＬＡ−ＴＧが肝臓のＭＥＯＳとＡＬＤＨの活性を増強することでエタノールの酸化、分解、代謝を促進し、酔い覚まし効果を発揮することが判明した。
【００６５】
共役リノール酸グリセリド（ＣＬＡ−ＴＧ）は、肝ミクロソームのアルコールオキシダーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性を増強することでエタノールの酸化、分解、代謝を促進し、一定の抗酸化作用があり、肝保護、酔い覚ましの機能を発揮することができる。
【００６６】
＜実施例２＞
マウスのアルコール性肝障害に対するＣＬＡ−ＴＧの作用に関する研究
【００６７】
実験手順：
ＳＰＦ級ＩＣＲマウス、♂、体重１８〜２２ｇ、７２匹。体重によって、正常対照群、モデル対照群、陽性群（海王金樽３ｇ／ｋｇ）及びＣＬＡ−ＴＧ高用量群（３ｇ／ｋｇ）、中用量群（２ｇ／ｋｇ）、低用量群（１ｇ／ｋｇ）の１２匹ずつの６群に無作為に分けた。陽性群マウスには（ｉｇ．）０．２ｍｌ／１０ｇ体重で１５％の海王金樽溶液、ＣＬＡ−ＴＧ高、中、低用量群マウスそれぞれには（ｉｇ．）０．２ｍｌ／１０ｇ体重で濃度１５％、１０％、５％のＣＬＡ−ＴＧ溶液（５％ＣＭＣで可溶化）、正常群とモデル群には等量の精製水を胃内投与した。胃内投与してから１ｈ後、モデル群と各投与群には、５６度の白酒（１０ｍｌ／ｋｇ）を胃内投与して、急性アルコール性肝障害モデルを作った。１０日間連続した。毎日マウスの様子を観察し、毎週体重を計った。各群マウスに最後の胃内投与をした後、１２ｈ絶食（水は与える）させた後、血を取って血清を作り、血清のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の活性及び総ビリルビン（Ｔｂｉｌ）含有量を測定し、マウス屠殺後解剖し、肝組織を取り出し、重量を計り、肝臓指数を計算し、１０％パラホルムアルデヒドで肝左葉を固定し、パラフィンで包埋し、切り出し、通常のヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色を行い、顕微鏡で肝組織の病理変化を観察した。
【００６８】
実験結果：
マウスの体重及び肝臓指数に対するＣＬＡ−ＴＧの影響
１０日間連続してモデルを作製した後、モデル群マウスの体重は正常群マウスより明らかに低下し、肝臓指数は高くなっているが、有意な差はない。被験物質ＣＬＡ−ＴＧと陽性薬の海王金樽はモデルマウスの体重及び肝臓指数に特に影響がない（表３）。
【００６９】
表３  マウスの体重及び肝臓指数に対するＣＬＡ−ＴＧの影響（Ｘ±ＳＤ．）
【００７０】
2018048118.tif 000005
【００７１】
正常群との比較、▲▲Ｐ＜０．０１
【００７２】
マウスの血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の活性及び総ビリルビン（Ｔｂｉｌ）含有量に対するＣＬＡ−ＴＧの影響は表４及び図４−５に示した。
【００７３】
１０日間連続して白酒を胃内投与されたモデル群マウスの血清ＡＬＴ、ＡＳＴ活性は正常群マウスより明らかに高くなっていた。表４から分かるように、被験物質ＣＬＡ−ＴＧと陽性薬は血清ＡＬＴとＡＳＴの活性に明らかな低減効果がないが、ＣＬＡ−ＴＧ高用量は血清ＡＬＴ活性を大幅に上昇させることができる。実験群（被験物質ＣＬＡ−ＴＧ）は、陽性群とモデル群よりＴＢｉｌ含有量が明らかに低下し、正常群レベルを維持している（ＴＢｉｌ含有量の増加は肝障害があることを示す）。
【００７４】
表４  マウスの肝臓ＡＬＴ、ＡＳＴ及びＴＢｉｌに対するＣＬＡ−ＴＧの作用（Ｘ±ＳＤ．）
【００７５】
2018048118.tif 000006
【００７６】
正常群との比較、▲Ｐ＜０．０５、▲▲▲Ｐ＜０．００１；モデル群との比較、＊＊＊Ｐ＜０．００１
【００７７】
マウスのアルコール性肝障害モデルの肝臓病理変化に対するＣＬＡ−ＴＧの治療作用
【００７８】
（１）正常群：肝臓に顕著な病理変化が見られない。
【００７９】
（２）アルコール性肝障害モデル群：軽度の肝細胞腫大２例（２／１２）、軽度の肝細胞脂肪変性、帯状肝細胞好酸性変性に炎症性細胞浸潤を伴う１例（１／１２）、一部肝細胞好酸性変性２例（１／１２）。
【００８０】
（３）陽性群：軽度の肝細胞脂肪変性１例（１／１２）、肝臓内局所炎症性細胞浸潤１例（１／１２）。
【００８１】
（４）ＣＬＡ−ＴＧ低用量群：軽度の肝細胞脂肪変性１例（１／１２）、中心静脈周囲の軽度の肝細胞腫大１例（１／１２）。
【００８２】
（５）ＣＬＡ−ＴＧ中用量群：軽度の肝細胞脂肪変性１例（１／１２）。
【００８３】
（６）ＣＬＡ−ＴＧ高用量群：肝臓内局所炎症性細胞浸潤２例（２／１２）。他の肝臓には顕著な病理変化が見られない。
【００８４】
顕微鏡観察結果（図６）
【００８５】
（１）正常群（表５．１）
肝臓：肝小葉構造がはっきり見られ、門脈域に肝線維組織増殖及び炎症性細胞浸潤が見られない。
【００８６】
（２）アルコール性肝障害モデル群（表５．２）
肝臓：軽度の肝細胞腫大２例。軽度の肝細胞脂肪変性、帯状肝細胞好酸性変性、細胞体積の縮小、細胞質好酸性の増強、核濃縮、炎症性細胞浸潤を伴う１例。一部肝細胞好酸性変性２例。他の動物は肝小葉の構造がはっきり見られ、門脈域に線維組織増殖及び炎症性細胞浸潤が見られない。
【００８７】
（３）陽性群（表５．３）
肝臓：軽度の肝細胞脂肪変性１例、肝臓内局所炎症性細胞浸潤１例。他の動物は肝小葉の構造がはっきり見られ、門脈域に線維組織増殖及び炎症性細胞浸潤が見られない。
【００８８】
（４）ＣＬＡ−ＴＧ低用量群（表５．４）
肝臓：軽度の肝細胞脂肪変性１例。中心静脈周囲の軽度の肝細胞腫大１例。他の動物は肝小葉の構造がはっきり見られ、門脈域に線維組織増殖及び炎症性細胞浸潤が見られない。
【００８９】
（５）ＣＬＡ−ＴＧ中用量群（表５．５）
肝臓：軽度の肝細胞脂肪変性１例。他の動物は肝小葉の構造がはっきり見られ、門脈域に線維組織増殖及び炎症性細胞浸潤が見られない。
【００９０】
（６）ＣＬＡ−ＴＧ高用量群（表５．６）
肝臓：肝臓内局所炎症性細胞浸潤２例。他の動物は肝小葉の構造がはっきり見られ、門脈域に線維組織増殖及び炎症性細胞浸潤が見られない。
【００９１】
表５．１  正常群の肝臓病理変化
【００９２】
2018048118.tif 000007
【００９３】
表５．２  アルコール性肝障害モデル群の肝臓病理変化
【００９４】
2018048118.tif 000008
【００９５】
表５．３  陽性群の肝臓病理変化
【００９６】
2018048118.tif 000009
【００９７】
表５．４  ＣＬＡ−ＴＧ低用量群の肝臓病理変化
【００９８】
2018048118.tif 000010
【００９９】
表５．５  ＣＬＡ−ＴＧ中用量群の肝臓病理変化
【０１００】
2018048118.tif 000011
【０１０１】
表５．６  ＣＬＡ−ＴＧ高用量群の肝臓病理変化
【０１０２】
2018048118.tif 000012
【０１０３】
注：−病理変化が見られない    ＋軽度病理変化
＋＋中度病理変化          ＋＋＋重度病理変化
【０１０４】
肝臓病理変化評価標準：
【０１０５】
軽度病理変化：病理変化範囲が肝小葉の１／３未満。
【０１０６】
中度病理変化：病理変化範囲が肝小葉の約１／３〜２／３。
【０１０７】
重度病理変化：病理変化範囲が肝小葉の２／３を超える。
【０１０８】
１０日間連続して白酒を胃内投与した後、モデル群マウスの血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の活性は、正常群マウスより顕著に上昇し、一部のマウスに軽度の肝細胞腫大、軽度の肝細胞脂肪変性、帯状肝細胞好酸性変性あるいは肝細胞炎症性細胞浸潤などの病理変化が出現した。本実験で作製した急性アルコール性肝障害マウスモデルが、血清ＡＬＴとＡＳＴの活性の上昇、ある程度の肝臓病理変化を有することを示している。被験物質の共役リノール酸グリセリド（ＣＬＡ−ＴＧ）は血清ＡＬＴとＡＳＴの活性に明らかな低減効果がないが、モデルマウスの肝細胞腫大、脂肪変性などの病理変化を大きく改善することができ、顕著な肝臓病理変化を出現するマウスの例数を減らした。したがって、共役リノール酸グリセリド（ＣＬＡ−ＴＧ）は急性アルコール性肝障害マウスに対し一定の治療効果があることが分かる。
【図１】
2018048118.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
2018048118.tif 000016
【図５】
2018048118.tif 000017
【図６】
2018048118.tif 000018
【外国語明細書】
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