(57)【要約】      （修正有）【課題】動物の成長及び／又は動物の健康を増強するための動物飼料組成物としてのディノコッカス又はその関連細菌とバイオマスとの混合物の使用方法を提供する。【解決手段】動物飼料の材料のためのデイノコッカス細菌の使用であって、前記デイノコッカス細菌は、アミノ酸源として用いられる。前記デイノコッカス細菌は、バイオマスとの混合物で用いられてよい。前記バイオマスは、前記デイノコッカス細菌により少なくとも部分的に消化されている。前記バイオマスは、リグノセルロース系バイオマスを含む。前記バイオマスと前記デイノコッカス細菌との混合物は、飼料へのタンパク質補給剤として用いられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物飼料の材料のためのデイノコッカス細菌の使用。
【請求項２】
前記デイノコッカス細菌は、アミノ酸源として用いられる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記デイノコッカス細菌は、バイオマスとの混合物で用いられる、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記バイオマスは、前記デイノコッカス細菌により少なくとも部分的に消化されている、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記バイオマスは、リグノセルロース系バイオマスを含む、請求項３又は４に記載の使用。
【請求項６】
請求項リグノセルロース系バイオマスは、コムギの実等の穀類の実、ナタネ及び大豆のキャトルケーキ等の植物性キャトルケーキ、サトウキビ及びその誘導体、トウモロコシ、テンサイ、ススキ、スイッチグラス、麻、ポプラ、ヤナギ、モロコシ、並びにユーカリからアブラヤシの範囲の樹木種を含む群から選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記バイオマスと前記デイノコッカス細菌との混合物は、飼料へのタンパク質補給剤として用いられる、請求項４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物の成長及び／又は動物の健康を増強するための動物用飼料組成物の材料に関する。また、本発明は、そのような材料を生成するための方法及び飼料組成物に関する。さらに、本発明の方法は、飼料組成物の嗜好性及び／又は消化率を改善させる。具体的に、本発明は、飼料組成物への有機成分の補充としてデイノコッカス（Deinococcus）又はその関連細菌とバイオマスとの混合物を用いることに関する。
【背景技術】
【０００２】
愛玩動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、家禽、商業用及び観賞用を含む魚、エビ及び他の甲殻類等の家畜の飼料は、動物育種及び農業食品産業の分野における不変の問題である。限られた生産設備及び生産技術の改良不足のため、動物育種はコスト及び時間の両方がかかる。動物育種の生産及び利益を改善するための、最も一般的な解決策は、少なくとも動物の食餌を完全なものとする産業的飼料組成物を提供することである。
【０００３】
飼料は一定組成でなく、いくつかの成分が栄養目標を満たすために必要である。実際に、飼料に対する生物反応は、該飼料からの有益な栄養を得るための動物の能力に依存するとしても、飼料供給に用いられる飼料は、一般に、消化可能なタンパク質、脂質、炭水化物及び繊維を含む。
【０００４】
動物飼料組成物は、通常、低コスト形態で調合される。格別重要なことは、限られた消化可能エネルギーの提供及び関連するコストである。最もコストが大きい栄養素は、必須アミノ酸を含むタンパク質及びアミノ酸である。しかしながら、大きいタンパク質比率を含む動物の生産は、世界の人口の増加に比例して必要となるだろう。
【０００５】
タンパク質原料としての魚粉又は肉及び骨粉の使用は、低コストであるため開発されてきた。実際に、肉及び骨粉は、約５０％のタンパク質及び８〜１２％の脂肪を含むレンダリング産業の製品である。それは、飼料のアミノ酸プロファイルを改善するために、動物飼料の調合に主に用いられる。しかしながら、タンパク質として骨粉をウシに与えることは、狂牛病を蔓延させる原因となると考えられている。従って、世界の大部分において、タンパク質の補充として骨粉を用いることは、反芻動物の飼料においてはもはや許されない。
【０００６】
反芻動物の飼料組成物の調製に用いられる他の原料は、セルロース系材料であり、これは安価であり、直接的に価値ある材料ではない。しかしながら、反芻動物における酵素がセルロースの消化ができるとしても、反芻動物による更なる消化を助けるために、及びこの原料の消化率を増大するために、セルロース及びヘミセルロースを部分的に加水分解するようにいくつかの前処理が行われる。例えば、セルロース系材料を含む飼料にセルラーゼ及びヘミセルラーゼ等の種々の外因性酵素を追加することは、ポリマーの結晶化度を低減すること、及びポリマー骨格へのアクセスを増強することに有利である。同様に、セルロース系材料の熱化学的前処理は、ヘミセルロース及びセルロース部分の部分的な加水分解を可能とする。
【０００７】
これらの処理は、炭水化物の消化率、及びより一般的にはセルロース系材料の栄養素の入手可能性を改善するが、それらは高価であり、経済的に止められ得る。さらに、前処理されたとしても、セルロース系材料は未だ不消化であり、ブタ及び家禽等の非反芻動物に栄養を提供することができない。さらに、これらの処理は、動物飼料組成物において最も高価な成分であるタンパク質を提供しない。
【０００８】
従って、反芻及び非反芻動物、商業的魚類及びエビ養殖、並びに愛玩動物を含む商業的農場及びケージの動物のための、高価でなく、より安全でより栄養が多い飼料が必要である。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、デイノコッカス又はその関連細菌と、動物性、植物性及び／又は藻類性バイオマス等のバイオマスとの混合物、並びに例えば動物飼料組成物の一部としての動物飼料におけるその混合物の使用に関する。また、本発明は、原料としてバイオマス及びデイノコッカス又はその関連細菌を用いて飼料を調製する方法に関する。また、本発明は、バイオマスの栄養価、嗜好性又は消化率を増大する方法に関する。本発明の組成物及び方法は、好ましくは家畜（反芻動物及び非反芻動物を含む）、飼育動物、鳥類、魚類又は伴侶動物を含む動物の栄養のために適する。
【００１０】
本発明らは、使用に適していないリグノセルロース系バイオマス等の原料とデイノコッカス又はその関連細菌との組み合わせが、動物にとって安全且つ低コストの栄養として用いられ得ることを発見した。両方の材料が高価値の飼料を生成するのに協力する。バイオマス及びデイノコッカス細菌の両方は、本発明によって低栄養価製品から有益な飼料材料に変換される。本発明は、デイノコッカス細菌が安全で価値ある栄養因子を含む飼料に用いられ得ることを示す。また、本発明は、バイオマスがデイノコッカス細菌の増殖培地となり、これによりそれらが拡大及び強化され、一方、デイノコッカス細菌がバイオマスを消化でき、これによりバイオマスを良好な消化性を有する高栄養価製品に変換することを示す。本発明に係る飼料材料は、動物及び魚の正常の代謝に用いられ、十分な量が合成されない又は必須アミノ酸等の合成されない必須栄養素を提供する有機化合物（例えば、タンパク質、アミノ酸、糖）及び無機化合物（例えば、ミネラル）を含む。
【００１１】
従って、本発明の対象は、バイオマスとデイノコッカス又はその関連細菌との混合物を含む飼料材料に関し、該バイオマスは該デイノコッカス細菌又はその関連細菌により少なくとも部分的に消化される。
【００１２】
また、本発明は、飼料の調製のためのバイオマスとデイノコッカス細菌又はその関連細菌との混合物の使用に関する。
【００１３】
また、本発明は、上記の材料を含む飼料組成物に関する。通常、飼料組成物は、少なくとも１０重量％の前記材料を含む。その飼料組成物は、以下のものに限定されないが、アルファルファ、オオムギ、血粉／肉粉、脂肪が多い動物、家禽、ジャガイモ廃棄物又はトマト廃棄物等の追加の材料を含み得る。
【００１４】
本発明の更なる対象は、バイオマスとデイノコッカス細菌又はその関連細菌とを含む組成物の動物飼料のための使用に関する。
【００１５】
本発明の更なる対象は、バイオマスとデイノコッカス細菌又はその関連細菌との混合物の飼料材料としての使用に関し、該バイオマスは、該デイノコッカス細菌又はその関連細菌により少なくとも部分的に消化されている。
【００１６】
本発明の更なる対象は、バイオマスとデイノコッカス細菌又はその関連細菌との混合物の飼料に供給されるタンパク質としての使用に関し、該バイオマスは、該デイノコッカス細菌又はその関連細菌により少なくとも部分的に消化されている。実施例でさらに説明するように、デイノコッカス細菌はそれ自体が高タンパク源であり、さらに、その細菌はバイオマスのタンパク質を加水分解してアミノ酸を生成する。
【００１７】
また、本発明は、動物飼料におけるアミノ酸源としてのデイノコッカス細菌の使用に関する。
【００１８】
本発明は、デイノコッカス細菌又はその関連細菌によりバイオマスを少なくとも部分的に消化することと、飼料材料として少なくとも部分的に消化されたバイオマスと細菌との混合物を調製することとを含む飼料を調製する方法に関する。
【００１９】
特定の実施形態において、その方法は、一般に飼料のために用いられる他の材料をその混合物に加えるステップをさらに含む。
【００２０】
代替的実施形態において、その方法は、
（ａ）混合物を得るためにバイオマスとデイノコッカス細菌又はその関連細菌を組み合わせることと、
（ｂ）前記デイノコッカス細菌又はその関連細菌によってバイオマスが消化され得る条件下で混合物を保持することと、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の混合物を回収することと、
（ｄ）任意に（ｃ）の混合物と１つ又は複数の更なる材料とを混合することとを含む。
【００２１】
飼料は、適当な形態に梱包され得る、又は適当な容器に梱包され得る。
【００２２】
本発明における使用のためのバイオマスは、植物性バイオマス、動物性バイオマス及び／又は藻類性バイオマスを含み得る。特定の実施形態において、バイオマスは、リグノセルロース系バイオマスである。他の実施形態において、バイオマスは、タンパク質含有バイオマスである。バイオマスの消化は、好気条件又は嫌気条件で、好ましくは反応パラメータ（例えば、反応時間、温度又は原料の量）を容易に管理するために反応器内で行われ得る。
【００２３】
本発明は、バイオマスを少なくとも部分的に消化するためにデイノコッカス細菌又はその関連細菌により処理することを含むバイオマスの栄養価を改善する方法に関する。その方法は、少なくとも部分的に消化／加水分解されたバイオマスの栄養価を分析する又は制御するステップをさらに含み得る。
【００２４】
本発明の更なる対象は、バイオマスの複合糖類を少なくとも部分的に分解するために、デイノコッカス細菌又はそれに関する細菌によりバイオマスを少なくとも部分的に消化するための処理をすることを含むバイオマスの嗜好性及び／又は消化率を向上するための方法に関する。この方法は、複合糖類の分解を制御するステップをさらに含み得る。
【００２５】
本発明の組成物及び方法は、特に家畜（反芻動物及び非反芻動物を含む）、飼育動物、若しくは伴侶動物等の非ヒト動物、鳥類又は魚類等の動物のための栄養物又は栄養添加物として用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを含む又は含まない１％の前処理されたナタネわらにおけるＤＧ０１(D.Geothermalis 01)菌株の増殖を示す図である。
【図２】ＤＧ０１が播種された１％の前処理されたナタネわらから除かれたキシロース及びグルコースの消費を示すＴＬＣ分析の図である。コントロールは、細菌がいない前処理されたナタネわらである。酵素は、培地にＴ０の時点で加えられる（１ｇのセルロースに対して０．１１ｇのセルラーゼ、１ｇのセルロースに対して０．０５ｇのβ−グルコシダーゼ）。全ての酵素加水分解は、１ｇのセルロースに対して１．１ｇのセルラーゼ、１ｇのセルロースに対して０．５ｇのβ−グルコシダーゼ及び１ｇのヘミセルロースに対して５．５ｇのキシラナーゼを用いて行われる。
【図３】全粒粉（１％でありTermamyl（登録商標）を含む又は含まない、及び６％）、又は発酵残渣（６％）におけるＤＧ０１菌株の増殖で、培地に含まれるグルテンが消費（％）することを示す。ＤＧ０１菌株は、全粒粉又は発酵残渣からのグルテンを加水分解できる。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
概して、本発明は、バイオマスを含む動物飼料又は添加物を生成するためのデイノコッカス細菌又はその関連細菌の菌株の使用に関する。特に、本発明は、デイノコッカス細菌の増殖、及びバイオマスの分解／変換に基づいて、低コストで高レベルのタンパク質及びアミノ酸を供給させる。本発明に係るデイノコッカス細菌又はその関連細菌とバイオマスとの混合物は、低コスト及び／又は高レベルの有益な一価及び二価の酸、又はそれらの一価若しくは二価の酸由来の原料、バイオマスに含まれるキシラン又はヘミセルロースの加水分解産物等の糖類由来の代謝物の原料を動物に提供するために用いられ得る。本発明において、植物性、藻類性若しくは動物性バイオマス、又は加水分解された前処理済みバイオマス製品を本質的に含む二次バイオマスを含む生物由来の未処理材料は、滋養／栄養原料、動物飼料又は添加物としてデイノコッカス細菌と組み合わせて用いられ得る。
【００２８】
従って、本発明の対象は、バイオマスとデイノコッカス細菌又はその関連細菌との混合物を含む飼料の材料を提供することであり、該バイオマスは、デイノコッカス細菌により少なくとも部分的に消化されている。
【００２９】
本発明の更なる対象は、動物飼料のための、バイオマスとデイノコッカス細菌又はその関連細菌とを含む組成物の使用に関する。
【００３０】
定義
本発明に係る「バイオマス」の用語は、通常、生物材料を意味する。特に、バイオマスの用語は、植物、藻類又は動物由来を含む生物由来の有機材料を含み、それらは未処理又は前処理され得る。バイオマスの例は、以下のものに限られないが、用材又は紙製品に適さない成木、パルプ、再生紙、有機廃棄物含む林産物、草、わら、作物及び動物糞尿等の農業製品、並びに藻類及び海藻等の水産製品を含む。バイオマスの例は、ススキ、麻、スイッチグラス、テンサイ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、米、大豆、ナタネ（カノーラを含む）、モロコシ、サトウキビ、ラッカセイ、綿、ハウチワマメ、並びにユーカリからアブラヤシ、ポプラ、ヤナギに至る種々の樹木種の多くのタイプの植物由来の木材又は植物性材料を含む。具体的なバイオマス原料は、以下のものに限られないが、植物残渣、広葉樹又は針葉樹の幹、穂軸、わら、草、葉、種、紙等を含む（例えば、Sun et al.,Bioresource Technology 83 (2002) 1-11を参照）。バイオマスの用語は、変換されたバイオマス又は二次バイオマスを含み、それらは本質的に加水分解された前処理済みバイオマス製品を含む。好ましい実施形態において、本発明に係るバイオマスは、例えばセルロース、ヘミセルロース及び／又はキシランといったリグノセルロース系材料を含む。
【００３１】
本発明に係るバイオマスは、バイオマス原料及び／又は二次バイオマスを含み得る。「バイオマス原料」は、生物質由来の未処理材料である。その例は、以下のものに限られないが、用材又は紙製品に適さない成木等の林産物、草、作物及び動物糞尿等の農業製品、並びに藻類及び海藻等の水産製品を含む。「二次バイオマス」は、最初にバイオマス原料に由来する物質であり、それは有意な化学的及び物理的変更がなされている。その例は、以下のものに限られないが、紙、革、綿、麻、天然ゴム製品、食品加工の副産物、魚及び動物の粉、並びに使用済み料理油を含む。
【００３２】
本発明に係る「リグノセルロース系バイオマス」の用語は、リグニン、セルロース、ヘミセルロース及び／又はキシランを含む有機生物物質を意味する。リグノセルロース系バイオマスは、通常、例えばバイオマス原料等の生物由来の未処理物質を意味する。リグノセルロース系バイオマスの例は、以下のものに限られないが、ススキ、ナタネ、スイッチグラス、麻、テンサイ、コムギ、コムギわら、トウモロコシ、ポプラ、ヤナギ、モロコシ、サトウキビ及びユーカリからアブラヤシの範囲の種々の樹木種を含む多くのタイプの植物由来の木材又は植物性材料を含む。
【００３３】
本明細書で用いられるように、「バイオマス誘導体」の用語は、上記のバイオマス原料及び／又は二次バイオマス由来の全ての分子を意味する。
【００３４】
本願において、「デイノコッカス細菌」の用語は、デイノコッカスの野生型又は自然変異菌株を含み、例えば、ＤＮＡシャッフリング技術による促進的進化を介して得られた菌株、又は真核生物、原核生物及び／又は合成の核酸の挿入により得られた組換え菌株を含む。
【００３５】
デイノコッカスの「関連」細菌とは、(i)GTTACCCGGAATCACTGGGCGTA(SEQID NO :1)プライマー及びGGTATCTACGCATTCCACCGCTA (SEQ ID NO :2)プライマーを用いた増幅で、約１５８塩基対の断片を生じる１６ＳｒＤＮＡを含み、(ii)４ｍＪ／ｃｍ２のＵＶ処理に耐性を有する細菌を意味する。特定の実施形態において、デイノコッカス関連細菌は、デイノコッカスの１６ＳｒＤＮＡ配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の同一性を有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌である。
【００３６】
本発明において、「タンパク質」は、互いに結合されるアミノ酸残基の１つ又はそれ以上のポリマー鎖を含む全ての生化学化合物を意味する。本発明のタンパク質の供給は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、アミノ酸及びそれらに関連する誘導体を含む。
【００３７】
本発明において、「外来性タンパク質」等の「外来性成分」はバイオマス又は培養培地に由来する成分を意味し、反対に、「内在性成分」は細菌に由来する成分を意味する。
【００３８】
本発明において、「デンプン」は、１−４及び１−６グリコシド結合により互いに結合された多くのグルコースユニットからなる炭水化物を意味する。デンプンは、多くの植物及び細菌により蓄積されたエネルギー保存分子であり、デンプン分子は、半結晶性細粒状で植物内に存在する。
【００３９】
高価値の飼料を生成するための細菌によるバイオマスの消化
本発明は、特に、飼料に適する高栄養価で高消化率製品を生成するために協力するバイオマスとデイノコッカス細菌又はその関連細菌との組み合わせに基づく。本発明は、バイオマスが細菌の増殖及び拡大、混合物の栄養価の増大を支持する一方で、細菌がバイオマスを消化でき、混合物の栄養価、消化率及び嗜好性をさらに増大することを示す。
【００４０】
本発明において、バイオマスは、デイノコッカス細菌及び／又はその関連細菌により少なくとも部分的に消化され得る。
【００４１】
消化された又は消化の用語は、原料、細胞壁、ポリマー（例えば糖類、タンパク質）等のバイオマスの成分の分解又は加水分解等といったバイオマスの全ての生物学的変異又は変換を含む。消化は、バイオマスの成分の一部のみが概して５％、１０％又はそれ以上分解されることを部分的に意味し得る。部分的消化は、バイオマスの少なくとも一部が変異又は変換されることを意味し、それは、通常、栄養価、消化率又は嗜好性を増大させる。
【００４２】
デイノコッカス細菌又はその関連細菌は、デンプン、キシラン又はセルロース等の糖類ポリマー等のバイオマスの種々の成分を重合度がより小さいオリゴ糖類及び単糖類に分解することを有利に触媒し得る（又はその触媒作用に寄与し得る）。実際に、特定の酵素を発現する、及び／又はバイオマス原料を変換する能力を有するデイノコッカス細菌は、本技術分野において本出願人により開示されている。これに関して、本発明に用いるのに好ましいデイノコッカス細菌は、キシラナーゼ、セルラーゼ及び／又はアミラーゼを合成する。キシラナーゼは、広葉樹及び針葉樹のヘミセルロースの主要成分であるキシランの加水分解を触媒する酵素である。アミラーゼは、デンプンポリマーの加水分解に関わる。セルラーゼは、セルロース、又は広葉樹及び針葉樹の主要成分であるヘミセルロースの加水分解を触媒する酵素である。
【００４３】
特定の実施形態において、バイオマスの消化は、バイオマスのセルロース又はヘミセルロースのレベルの低減、好ましくは少なくとも５％低減することを意味する。そのような低減は、非反芻動物を含む全ての種の動物によるバイオマスの消化を容易にする。
【００４４】
好ましい実施形態において、バイオマスの消化は、バイオマス由来のヘミセルロースをオリゴ糖類、及び／又はキシロース、マンノース、アラビノース若しくはガラクトースに変換すること、並びに／又はバイオマス由来のセルロース及び／又はデンプンをグルコースに変換することを意味する。好ましくは、その消化は、バイオマス由来のヘミセルロース、セルロース又はデンプンの少なくとも５％を変換することを含む。
【００４５】
基質として望まれないキシロース等のＣ５糖類はデイノコッカスにより消化されるため(Br Jnutr.2010 May; 103(10):1507-13)、そのような糖類の少なくとも部分的な消化は、バイオマスの消化率及び／又は嗜好性を改善する。
【００４６】
他の実施形態において、例えばモノマーとしてのキシロース、アラビノース、グルコース、ガラクトース又はフコース残基から選択されるトリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース及びヘプトース等のＤＰ３−ＤＰ７糖類（ＤＰ：重合度）を特に含む細胞の糖の酸化を含む。
【００４７】
バイオマスの分解／消化と同時に、細菌の増殖が促進する。結果として、混合物内で細菌レベルが増大するため、タンパク質及び脂質のレベルも増大する。本発明において、デイノコッカス細菌又はその関連細菌によるバイオマスの消化は、コムギの実又はカノーラの種のキャトルケーキ等の消化しにくいバイオマスであっても、動物のための直接的滋養成分を高いレベルで提供する。本発明は、消化しにくい及び／又は栄養価が低いため動物飼料に用いられない植物性バイオマスの多くに適用できる。例えば、大豆キャトルケーキと比較してタンパク質含量が低いナタネのキャトルケーキにも適用できる。そのようなバイオマスは、１〜６ｇ／Ｌの植物性タンパク質、及び微量の脂質を含む。本発明に係るデイノコッカス細菌又はその関連細菌によるそのバイオマスの部分的消化の後、約１２〜２５ｇ／Ｌのタンパク質及び約１〜２．５ｇ／Ｌの脂質を含むことが期待できる。同様に、家禽の羽等の産業的に関心がもたれないいくつかの動物性バイオマスは、動物飼料の材料を得るためにデイノコッカス細菌と混合されるバイオマスとして有利に用いられ得る。
【００４８】
さらに、デイノコッカスの一種が自然にカロテノイドを生成するため、本発明のバイオマス／デイノコッカス細菌の混合物は、視覚及び味覚の質の両方において、また、その混合物が与えられた動物の健康において、よい影響を与えるカロテノイドを含み得る。例えば、カロテノイドを含まない植物性バイオマスを用いて、その植物性バイオマスの部分的な消化及び細菌の増殖を行った後では、混合物中のカロテノイドの含量は約１５ｍｇ／ｋｇ程度期待できる。
【００４９】
デイノコッカス細菌により生成又は合成され、混合物において回収されるタンパク質、アミノ酸、脂質、ビタミン、カロテノイド等の最終量は、反応の性質及び条件、反応時間、細菌の最初の量並びに用いるバイオマスの種類等のいくつかの産業的パラメータに依存するであろう。種々の適応は、本発明の方法を要求に適合させ得ることは当業者には明らかであろう。
【００５０】
例えば、バイオマスの消化レベルは、産業的／経済的、及び／又は栄養に関する要求に依存し得る。高レベルの栄養成分が低コストの生成よりも好ましい場合、反応時間はバイオマスを完全に消化させるために増大できる。最終混合物において、ほぼ全体的に消化されたバイオマスを有する細菌であり、植物性分画がないことが期待できる。反対に、最小限のタンパク質を含む低コスト材料が要求されることも可能である。反応時間と栄養成分のレベルとのバランスは、容易に適合され得る。
【００５１】
本発明の混合物又は最終混合物は、残存バイオマス（細菌により加水分解／消化されていないバイオマスの一部）と、数が増加されたデイノコッカス細菌又はその関連細菌とを含む。
【００５２】
本発明の一実施形態において、用いられるデイノコッカス細菌又はその関連細菌は、バイオマスに含まれるタンパク質を少なくとも部分的に加水分解するのに特に有益なタンパク質分解活性を有する。
【００５３】
プロテイナーゼ又はタンパク質分解酵素としても知られているプロテアーゼは、ポリペプチド鎖におけるアミノ酸を互いに結ぶペプチド結合の加水分解によりタンパク質の異化を開始する酵素である。
【００５４】
本発明者らは、デイノコッカス細菌又はその関連細菌が高いタンパク質分解活性を有し得ることを発見した。本発明において、タンパク質分解活性を有するデイノコッカス細菌又はその関連細菌は、容易に消化可能なアミノ酸を得るためのタンパク質を含むいくつかの植物性、藻類性又は動物性バイオマスと組み合わせて有利に用いられ得る。その細菌は、タンパク質を加水分解し、動物により容易に吸収されるアミノ酸及びペプチドを生成する。得られた混合物は、外来性アミノ酸（及び／又はペプチド）とタンパク質及びアミノ酸を含む内在性栄養物（細菌自体由来）との両方を提供する飼料組成物の材料として用いられ得る。
【００５５】
例えば、デイノコッカス細菌は、その得られた混合物が有益なアミノ酸を含む飼料の材料として魚粉の代わりに用いられ得るように、ミクラクチニウムプシルム（Micratiniumpusilum）及び／又はクロレラの一種（Chlorella sp）等の藻類に接触され得る。
【００５６】
タンパク質を含むバイオマスの他の例は、ビートパルプ、大豆、アルファルファ及び家禽の羽を含む。
【００５７】
デイノコッカス細菌又はその関連細菌の使用は、バイオマス（植物性、動物性又は藻類性）の粘性を低減することができ、それは更なる利点を示す。実際に、デイノコッカス細菌又はその関連細菌のタンパク質分解活性は、ゼラチン含有バイオマスの粘性を低減する。また、デイノコッカス細菌又はその関連細菌のタンパク質分解活性は、ペクチン含有バイオマスの粘性を低減する。
【００５８】
本発明者らは、デイノコッカス細菌又はその関連細菌が高いタンパク質分解活性を有し得る。本発明において、ペクチナーゼを合成するデイノコッカス細菌又はその関連細菌は、バイオマスの粘性を低減し、その嗜好性を向上するために、ペクチンを含むバイオマス
と組み合わせて有利に用いられ得る。その細菌は、ペクチンを加水分解し、バイオマスの粘性を除去する。そのような粘性を有するバイオマスは、デイノコッカス細菌又はその関連細菌のための増殖培地として用いられることができ、得られた混合物は、飼料の材料として用いられ得る。
【００５９】
本発明の特定の実施形態において、飼料のための混合物に用いられるデイノコッカス細菌又はその関連細菌は、ペクチン分解活性を有し、特に、粘性を有するバイオマスに含まれるペクチンを少なくとも部分的に加水分解するのに有益である。
【００６０】
それは、例えば、高レベルのペクチン（１５〜２０重量％）を含むビートパルプの場合である。ビートパルプは、このバイオマスの粘性を生むペクチンのため、容易に利用できない原料である。そのような粘性を有するバイオマスを直接に動物に与えることはできず、好ましい飼料にするには、コストがかかる処理を必要とする。
【００６１】
一実施形態において、粘性を有するバイオマスは、混合物のバイオマスの一部のみである。例えば、用いられるバイオマスは、カノーラの種のキャトルケーキ等のリグノセルロース系バイオマスを６０％含み、ビートパルプ等の粘性を有するバイオマスを４０％含む。
【００６２】
混合物の調製プロセス
デイノコッカス細菌又はその関連細菌によるバイオマスの消化は、容易に反応パラメータを管理するために、反応器内で有利に行われ得る。反応は用いられる細菌の菌株及び／又はバイオマスに依存し、反応は好気性又は嫌気性反応器内で行われ得る。
【００６３】
一実施形態において、バイオマスは、細菌と共に一度に導入される。他の実施形態において、反応器には、プロセスの際にバイオマス又はバクテリアを再導入され得る。そのような場合において、バイオマスの性質及び量は、最終混合物における栄養物の最終含量を改善するように変更してもよい。最終混合物は、未だ加水分解／消化されていない残存したバイオマス、消化／加水分解により得られた産物（細菌により消費されたものを除く）、及び増殖された細菌を含んでもよい。
【００６４】
反応器内に加えられる液体の量は、最終組成物の形態、すなわち液体又は固体形態に依存し、バイオマスの水分含量に依存し得る。
【００６５】
他の実施形態において、本発明の混合物の調製は、広い土地で行われる。例えば、バイオマス、及びデイノコッカス細菌又はその関連細菌は、土壌に播かれる前にまず互いに混合される。この最初の混合物は、キャンバス地のシートで覆われ得る、又はその混合物は新鮮な空気に曝されてもよい。
【００６６】
本発明において、その混合物は、動物の飼料組成物の一部として直接に用いられ得る。他に、混合物は用いられる前に処理され得る（例えば、脱水、濾過、乾燥、粉砕等）。他の実施形態において、混合物は、細菌を殺す若しくは不活性化するように、又は残存するバイオマス原料を除去するように処理され得る。得られた産物は、細菌及び消化されたバイオマス成分を本質的に含み、直鎖状タンパク質及び脂質原料として用いられ得る。
【００６７】
本発明に係るバイオマスとデイノコッカス細菌又はその関連細菌との混合物は、動物飼料の組成物の材料として用いられ得る。その中で用いられる動物飼料組成物は、固体又は液体形態の動物の栄養のための組成物である。飼料は、動物において成長する及び適切な体調を維持するのに十分な栄養価を有する物質として定義され得る。例えば、動物の飼料組成物は、ペレット、粉体、粒体、押出成形又は膨張された粒体、タブレットパウダー、ボーラス形態又はそれらの混合体の形態であってもよい。
【００６８】
好ましくは、本発明の動物の飼料組成物は、細菌とバイオマスとの混合物は、国家食品管理局（例えばフランスのＡＦＳＳＡ、カナダのＡＣＩＡ又は米国のＦＡＤ）等の政府機関により承認される形態及び／又は組成物である。
【００６９】
好ましい実施形態において、本発明の動物の飼料組成物は、デイノコッカス細菌又はその関連細菌と少なくとも部分的に消化／加水分解されたバイオマスとの混合物を少なくとも１０重量％含む。動物の飼料組成物を形成するのに用いられる他の材料、及び（ペレット等の形状に）形態化後の飼料の物理的品質と要求される栄養的品質との両方における影響に依存して、本発明の混合物のレベルは、増大又は低減し得る。例えば、硬度及び耐久性に関して良好な品質基準を有するペレットを得るために、約４０％の予めゼラチン化されたデンプンが加えられ得る。自然なデンプンが用いられる場合、必要とされる量は高くなり得る。同様に、分散性タンパク質の量は、ペレット化飼料の硬度及び耐久性において良好に影響し得る。
【００７０】
これに関して、本発明は、バイオマスをデイノコッカス細菌又はその関連細菌により少なくとも部分的に消化させることと、飼料の材料として少なくとも部分的に消化されたバイオマスと細菌との混合物を調製することとを含む飼料を調製する方法に関する。
【００７１】
特定の実施形態において、その方法は、飼料に一般に用いられる他の材料を混合物に加えるステップをさらに含む。
【００７２】
代替的実施形態において、その方法は、
（ａ）混合物を得るためにバイオマスとデイノコッカス細菌又はその関連細菌を組み合わせることと、
（ｂ）前記デイノコッカス細菌又はその関連細菌によってバイオマスが消化され得る条件下で混合物を保持することと、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の混合物を回収することと、
（ｄ）任意に（ｃ）の混合物と１つ又は複数の更なる材料とを混合することとを含む。
【００７３】
飼料は、適当な形態に梱包され得る、又は適当な容器に梱包され得る。
【００７４】
混合物において、デイノコッカス細菌又はその関連細菌の一種又は株を用いること、又は種々の菌株、若しくはデイノコッカス細菌の同種若しくは異種を組み合わせることが可能である。また、デイノコッカス細菌又はその関連細菌に加えて、混合物又は飼料製品は、適切であれば更なる細菌又は酵母細胞を含み得る。さらに、酵素等の追加の因子がバイオマスに加えられ得る。
【００７５】
上記のように、本発明は、非ヒト動物に用いるのに適する飼料又は飼料添加物を生成するのに用いられ得る。それは、家畜（反芻動物及び非反芻動物を含む）、飼育動物、鳥類、魚又は伴侶動物に特に適する。具体的例としては、ウシ、ヒツジ、ブタ、家禽、魚、エビ及び甲殻類を含む。
【００７６】
本発明の更なる態様及び利点は、以下の実施例の項に開示され、それは本発明の例としてみなされるべきである。
【実施例】
【００７７】
実施例１：バイオマス分解活性を有する中温性及び好熱性デイノコッカス菌株の同定
本実施例は、属、種及び／又は細菌株が本発明に係る飼料の調製方法において機能できるか否かを決定するのに適する試験を開示する。特定の酵素活性を示す細菌を同定するために行われ得る試験の非限定的な例は、以下に示される。
【００７８】
材料及び方法
複合培地グルコース（ＣＭＧ）１％の組成
ペプトン：２ｇ／Ｌ
酵母エキス：５ｇ／Ｌ
１２１℃で１５分のオートクレーブ
グルコース：１０ｇ／Ｌ−濾過滅菌（０．２２μｍ）
さらに、ＭＯＰＳ、微量栄養素、ビタミン、FeCl3、K2HPO4を加える（以下を参照）。
【００７９】
培地（ＭＭ）の組成
１４ｇ／Ｌのアガーに７０４ｍｌの超純水を加える。それをオートクレーブにかける。その後、培地を冷却し、80 mlのMOPS 10×、 8 mlのFeCl3 100×、8 mlのK2HPO4100×、80μL の微量栄養素10000×及び80μLのビタミン 10000×を加える。
【００８０】
セルロース分解活性の固相スクリーニングのための培地の組成（５％ＡＺＯ−セルロース）
１４ｇ／Ｌのアガーに７０４ｍｌの超純水を加える。それをオートクレーブにかける。その後、培地を冷却し、80 mlのMOPS 10×、 8 mlのFeCl3 100×、8 mlのK2HPO4100×、80μL の微量栄養素10000×及び80μLのビタミン 10000×を加える。さらに、含量が５％となるようにＡＺＯ−セルロース溶液を加える。
【００８１】
タンパク質分解活性の固相スクリーニングのための培地の組成（１％ミルク）
１０ｇ／Ｌのミルクパウダー及び１４ｇ／Ｌのアガーに７０４ｍｌの超純水を加える。それをオートクレーブにかける。その後、培地を冷却し、80 mlのMOPS 10×、 8 mlのFeCl3 100×、8 mlのK2HPO4100×、80μL の微量栄養素10000×及び80μLのビタミン 10000×を加える。
【００８２】
アミロース分解活性の固相スクリーニングのための培地の組成（０．５％デンプン）
５ｇ／Ｌのデンプン及び１４ｇ／Ｌのアガーに７０４ｍｌの超純水を加える。それをオートクレーブにかける。その後、培地を冷却し、80 mlのMOPS 10×、 8 mlのFeCl3 100×、8 mlのK2HPO4100×、80μL の微量栄養素10000×及び80μLのビタミン 10000×を加える。
【００８３】
キシラン分解活性の固相スクリーニングのための培地の組成（５％ＡＺＯ−キシラン）
１４ｇ／Ｌのアガーに７０４ｍｌの超純水を加える。それをオートクレーブにかける。その後、培地を冷却し、80 mlのMOPS 10×、 8 mlのFeCl3 100×、8 mlのK2HPO4100×、80μL の微量栄養素10000×及び80μLのビタミン 10000Xを加える。さらに、含量が５％となるようにＡＺＯ−キシラン溶液を加える。
【００８４】
・ＭＯＰＳバッファー混合液１０×、ｐＨ７．０
酸性ＭＯＰＳ      ４００ｍＭ
ＮＨ４Ｃｌ         ２００ｍＭ
ＮａＯＨ          １００ｍＭ
ＫＯＨ            １００ｍＭ
ＣａＣｌ２         ５μＭ
Ｎａ２ＳＯ４        ２．７６ｍＭ
ＭｇＣｌ２         ５．２８ｍＭ
濾過滅菌（０．２２μｍ）。
【００８５】
・微量栄養素１００００×
（ＮＨ４）６（Ｍｏ７）Ｏ２４  ３０μＭ
Ｈ３ＢＯ３                  ４ｍＭ
ＣｏＣｌ２                 ３００μＭ
ＣｕＳＯ４                 １００μＭ
ＭｎＣｌ２                 ２．５ｍＭ
ＺｎＳＯ４                 １００μＭ
ＨＣｌによりｐＨを５に調整
濾過滅菌（０．２２μｍ）。
【００８６】
・ビタミン１００００×
Ｄ−ビオチン、ナイアシン（ニコチン酸）、ピリドキシン（ピリドキサル塩酸塩）Ｂ６，チアミン（ビタミンＢ１塩酸塩）をそれぞれ１０ｍｇ／Ｌ−ｐＨ４で保管−濾過滅菌（０．２２μｍ）。
【００８７】
・ＦｅＣｌ３１００×
２ｍＭクエン酸ナトリウムに含有された２ｍＭ ＦｅＣｌ３、濾過滅菌（０．２２μｍ）。
【００８８】
・Ｋ２ＨＰＯ４１００×
１００ｇ／Ｌであり、オートクレーブされる。
【００８９】
酵素活性の検出
セルロース分解活性の検出
固相スクリーニング（アガープレートによる試験）
単離されたクローンを、ＣＭＧ１％培地を含むマイクロプレート内で前培養した（２００μＬのＣＭＧ１％培地に５つのコロニー）。定常期から、５μＬの前培養液をＭＭ及び５％ＡＺＯ−セルロースを含むアガープレート上に滴下した。セルロース分解活性は、１日後、２日後及び５日後に加水分解ハローの径を測定することで判定した（１日毎に１つのプレートを用いた）。
【００９０】
液相スクリーニング
単離されたクローンを、ＣＭＧ１％培地を含むマイクロプレート内で前培養した（２００μＬのＣＭＧ１％培地に５つのコロニー）。定常期から、５μＬの前培養液を、２００μｌのＭＭ＋１％のＣＭＣ又は１％のＣＭＣ４Ｍ又は１％のセロビオースを含むマイクロプレートに加えた。セルロース分解酵素活性を、ＯＤ６００ｎｍでの増殖の判定により評価した（１日に２回の測定を５日間行った）。
【００９１】
タンパク質分解活性の検出
固相スクリーニング（アガープレートによる試験）
単離されたクローンを、ＣＭＧ１％培地を含むマイクロプレート内で前培養した（２００μＬのＣＭＧ１％培地に５つのコロニー）。定常期から、５μＬの前培養液をＭＭ及び１％ミルクを含むアガープレート上に滴下した。タンパク質分解活性は、１日後、２日後及び５日後に加水分解ハローの径を測定することで判定した（１日毎に１つのプレートを用いた）。
【００９２】
液相スクリーニング
単離されたクローンを、ＣＭＧ１％培地を含むマイクロプレート内で前培養した（２００μＬのＣＭＧ１％培地に５つのコロニー）。定常期から、５μＬの前培養液を、２００μｌのＭＭ＋１％のペプトン又は１％のカゼインを含むマイクロプレートに加えた。タンパク質分解酵素活性を、ＯＤ６００ｎｍでの増殖の判定により評価した（１日に２回の測定を５日間行った）。
【００９３】
アミロース分解活性の検出
固相スクリーニング（アガープレートによる試験）
単離されたクローンを、ＣＭＧ１％培地を含むマイクロプレート内で前培養した（２００μＬのＣＭＧ１％培地に５つのコロニー）。定常期から、５μＬの前培養液をＭＭ及び０．５％デンプンを含むアガープレート上に滴下した。アミロース分解活性は、１日後、２日後及び５日後に加水分解ハローの径を測定することで判定した（１日毎に１つのプレートを用いた）。デンプン含有アガープレート上で、加水分解ハローの顕色をグラムヨウ素試薬により行った（１日毎に１つのプレートを用いた）。
【００９４】
液相スクリーニング
単離されたクローンを、ＣＭＧ１％培地を含むマイクロプレート内で前培養した（２００μＬのＣＭＧ１％培地に５つのコロニー）。定常期から、５μＬの前培養液を、２００μｌのＭＭ＋０．５％のデンプンを含むマイクロプレートに加えた。アミロース分解酵素活性を、ＯＤ６００ｎｍでの増殖の判定により評価した（１日に２回の測定を５日間行った）。
【００９５】
キシラン分解活性の検出
固相スクリーニング（アガープレートによる試験）
単離されたクローンを、ＣＭＧ１％培地を含むマイクロプレート内で前培養した（２００μＬのＣＭＧ１％培地に５つのコロニー）。定常期から、５μＬの前培養液をＭＭ及び５％ＡＺＯ−キシランを含むアガープレート上に滴下した。キシラン分解活性は、１日後、２日後及び５日後に加水分解ハローの径を測定することで判定した（１日毎に１つのプレートを用いた）。
【００９６】
液相スクリーニング
単離されたクローンを、ＣＭＧ１％培地を含むマイクロプレート内で前培養した（２００μＬのＣＭＧ１％培地に５つのコロニー）。定常期から、５μＬの前培養液を、２００μｌのＭＭ＋０．５％のキシランを含むマイクロプレートに加えた。キシラン分解酵素活性を、ＯＤ６００ｎｍでの増殖の判定により評価した（１日に２回の測定を５日間行った）。
【００９７】
結果
下記表１は、固相スクリーニング試験で同定され、飼料の製造に用いるためのバイオマス消化活性を有する細菌の例を示す。加水分解ハローの径は、タンパク質分解活性及びアミロース分解活性については２日後、また、キシラン分解活性及びセルロース分解活性については５日後に測定されたもので評価した。より正確には、タンパク質分解活性について、加水分解ハローの径が２．４ｃｍを超えるものを高活性、加水分解ハローの径が２ｃｍ〜２．３５ｃｍのものを中活性、加水分解ハローの径が１．９５ｃｍ未満のものを低活性とした。アミロース分解活性について、加水分解ハローの径が２．４ｃｍを超えるものを高活性、加水分解ハローの径が２．１ｃｍ〜２．３５ｃｍのものを中活性、加水分解ハローの径が１．９ｃｍ未満のものを低活性とした。キシラン分解活性について、加水分解ハローの径が２．８ｃｍを超えるものを高活性、加水分解ハローの径が２．１ｃｍ〜２．７ｃｍのものを中活性、加水分解ハローの径が２．０５ｃｍ未満のものを低活性とした。セルロース分解活性について、加水分解ハローの径が１．６ｃｍを超えるものを高活性、加水分解ハローの径が１．１ｃｍ〜１．３５ｃｍのものを中活性、加水分解ハローの径が０．９ｃｍ未満のものを低活性とした。
【００９８】
【表１】
2018085995.tif 000002
【００９９】
下記表２は、液相スクリーニング試験で同定され、飼料の製造に用いるための種々の酵素活性を有する細菌の例を示す。細菌の増殖は６００ｎｍでのＯＤの測定により判定する。
【０１００】
【表２】
2018085995.tif 000003
【０１０１】
本実施例は、適切な生物活性を有するデイノコッカス細菌が公的寄託機関から選択され、飼料の製造のために本発明で用いられ得る。
【０１０２】
実施例２：ナタネわら−デイノコッカス細菌の混合物の生成
ナタネわらとデイノコッカス細菌との混合物を調製した。特に、１％の前処理ナタネわらをデイノコッカス細菌（例えばＤＧ０１菌株）に接触させた。飼料に利用できる混合物を生成するための混合物の能力は、増殖して、単独で又は後の酵素添加でナタネわらを消化し、多量の栄養物を生成するデイノコッカス細菌の能力を検査することにより決定した。
【０１０３】
材料及び方法
ナタネわら
ナタネわらはSofiproteolから得て、それをブレンダーで挽いて、その後、１ｍｍ未満の長さの微細な断片を得るためにふるいに通した。
【０１０４】
セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼ
用いた市販の酵素は、トリコデルマリーゼイ（Trichodermareesei）からのセルラーゼ(SIGMA ref.C8546-5KU)、及びアーモンドからのβ−グルコシダーゼ(SIGMAref.49290-1G)である。
【０１０５】
Ｈ２ＳＯ４水熱前処理
前処理を、２０％ｗ／ｖのナタネわら及び０．５％ｗ／ｗのＨ２ＳＯ４を含む水道水を用いてエルレンフラスコ内で行った。この混合液に対して１２０℃で１０分間のオートクレーブ（サイクル時間：１．５時間）をし、最終ナタネわら濃縮物を得るために滅菌水道水で希釈した。２０ＭＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７に調整した（ｐＨ試験紙を用いて確認した）。播種前に、20mM NH4Cl及び5.7mMK2HPO4のミネラル溶液を加えた。
【０１０６】
カウントのプロトコール
−２ｍｌエッペンドルフチューブに１ｍＬの均質な培養液（ＣＭＧ、技術的基質（technicalsubstrate)）をとる。
−１０秒間のボルテックスの後、超音波処理器で１０分間の超音波処理をし、再度１０秒間のボルテックスを行う。
−９６ウェルマイクロプレートにおいて、１８０μＬのミリＱ水をトリプリケートで９ウェルに分注する。
−トリプリケートで、ウェルNo.1（純粋なサンプル）からウェルNo.10（１０−９希釈）まで１／１０段階希釈を行う。それは、２０μＬをとり、１８０μＬの滅菌ミリＱ水が入った次のウェルに入れ、混合し、３度ピペッティングを行う。各ウェルの間でチップを変える。
−マルチチャンネルピペットを用いて、５μＬの各希釈液をデュプリケートでＰＧＹ−アガープレートに滴下する。
−４５℃で２日間インキュベートする（好熱性デイノコッカスの場合）。
−カウントできる最初の希釈液においてコロニーの数をカウントする。希釈係数により構成された６つのスポットを平均し、ＣＦＵ／ｍＬの数値を得るために２００を掛ける。
【０１０７】
ＴＬＣプロトコール
−ＴＬＣシリカゲルに５μｌのサンプルを滴下する。
−ホットエアガンを用いて滴下したサンプルを乾燥する。
−ブタノール／アセトン／Ｈ２Ｏ＝４／５／１である溶媒でＴＬＣの移動を行う。
−移動の終了時に、ホットエアガンを用いてＴＬＣを乾燥する。
−１２ｇのモリブデン酸アンモニウム＋０．５ｇの硝酸アンモニウムセリウムを含む８０ｍＬの１０％Ｈ２ＳＯ４溶液を用いてＴＬＣを検出する。
【０１０８】
酵素による加水分解及び培養
ＤＧ０１において、酵素を、ポリマーを単糖に加水分解するために培養培地に加えた。ナタネわらは４０％セルロースを含む。酵素の添加は、１ｇのセルロースに対して０．１１ｇのセルラーゼ、１ｇのセルロースに対して０．０５ｇのβ−グルコシダーゼを用いた。酵素溶液は、培養液に導入する前に０．２２μｍのフィルタで濾過した。前培養は、ＣＭＧ１％で３日間行った。細胞ペレットを滅菌水で３度洗浄し、０．２のＤＯｉ、すなわち≒１０７ＣＦＵ／ｍＬで培養培地への播種に用いた。培養は９日間行い、ＤＲＨ４６では３０℃で、ＤＧ０１では４５℃で行った。
【０１０９】
増殖は、以下のプロトコールに従った最近のカウントにより制御する。
【０１１０】
結果
ＤＧ０１の増殖はカウントすることにより判定し（ＵＦＣ／ｍｌ）（図１）、糖の消費はＴＬＣ分析を用いて評価した（図２）。９日後、全ての遊離グルコース及びキシロースは、野生型ＤＧ０１により消費された。この消費が全糖において報告された、グルコース及びキシロースの大部分が消費されることが明らかとなった。これらの結果は、混合物が、低減されたキシロース量を含む部分的に消化されたバイオマスを含むことを示す。
【０１１１】
同様の結果は、ＤＲＨ０１、ＤＲＨ０２、ＤＲＨ０３又はＤＲＨ４６等の表１に挙げられた他のデイノコッカス細菌において得られる。
【０１１２】
培養液は凍結乾燥され、アミノ酸成分、可溶性窒素及びＮＤＦ／ＡＤＦ／ＡＤＬ繊維の測定が乾燥質量で行われた。以下の表３では、ナタネわらのアミノ酸成分（ｇ／ｋｇ乾燥質量）を、本発明の混合物のアミノ酸成分（ｇ／ｋｇ乾燥質量）と比較する。その結果は、本発明の混合物が最初のナタネわらの少なくとも２０倍の量のアミノ酸を含むことを示す。
【０１１３】
【表３】
2018085995.tif 000004
【０１１４】
本発明の混合物は、良好でない生物物質を、飼料のための良好で消化可能な混合物に変換する。
【０１１５】
実施例３：コムギ−デイノコッカス細菌混合物の生成
デイノコッカス細菌とコムギバイオマスとの混合物を、全粒粉（１％でさらにTermamylを含む又は含まない、６％）、又はNH4Cl20 mM及びK2HPO45.7mMが添加された発酵残渣（１％又は６％）からなる培地にＤＧ０１デイノコッカス菌株を播種することにより調製した。飼料に利用できる混合物を生成するための混合物の能力は、コムギにおいて増殖して、コムギのグルテン含量を低減するデイノコッカス細菌の能力を検査することにより決定した。
【０１１６】
グルテン消費は、酵素免疫測定法を用いたグリアジン（グルテンの可溶性分画）／グルテンの定量分析により評価した。この試験は、ＥＬＩＳＡの原理に基づく。
【０１１７】
プロトコール
タンパク質消費は、Libiosからの市販のキット(Ref GLI-E02)を用いて測定される。
【０１１８】
サンプル調製：１００ｍｇの細かく粉砕された凍結乾燥技術的基質（technicalsubstrate）を、１ｍｌの４０％ＥｔＯＨに再懸濁し、５分間混合し、３８００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。その上清をサンプル希釈バッファー１×で希釈する（１／５０００００）。
【０１１９】
ＥＬＩＳＡ試験
サンプル及び標準試薬をデュプリケートで試験する。
−１００μｌの標準試薬及びサンプルを抗グリアジン抗体でコーティングされた９６ウェルマイクロプレートに加える。
−室温で２０分間インキュベートする。
−ウェルを３００μｌの洗浄溶液１×で３度洗浄する。
−空のウェルに１００μｌの標識二次抗体（抗グリアジンペルオキシダーゼ）を加える。−ウェルを３００μｌの洗浄溶液１×で３度洗浄する。
−１００μｌのＴＭＢ溶液（基質）を加える。
−暗所において室温で２０分間インキュベートする。
−１００μｌの停止溶液を加える（色が青から黄色になる）。
−均質化し、分光光度計を用いてＯＤ４５０ｎｍを測定する。
【０１２０】
結果
グリアジンの濃度は、試験サンプルの色彩強度に直接に比例する。コムギにおけるグリアジンとグルテンとが等量であるため、サンプルのグルテン濃度は係数２を掛けることにより算出される。図３に示すように、デイノコッカス細菌は全粒粉又はその発酵残渣由来のグルテンを加水分解でき、４５℃での２日間の増殖後にそれを消費できる。４８時間後、植物性バイオマスに含まれる全てのタンパク質は、デイノコッカス菌株により消費される。
【０１２１】
同様の結果は、ＤＲＨ０１、ＤＲＨ０３又はＤＲＨ４６等の表１に挙げられた他のデイノコッカス細菌を用いて得られる。
【０１２２】
これらの結果は、デイノコッカス菌株が飼料に用いるのに適するコムギからより多くの消化可能混合物を生じる強いタンパク質分解活性を示し得ることを明確に証明する。
【０１２３】
実施例４：デイノコッカスジオサーマリス（Deinococcus geothermalis）のアミノ酸成分の分析
デイノコッカスジオサーマリス（Ｍ３６−７Ｄ_２１菌株）のアミノ酸成分は、単一の炭素源としてペプトン及びグルコースを含む培地で細胞を増殖した後に測定した。その成分を、一般に穀類のアミノ酸及び／又はビタミンの不足を補うために魚の飼料で補助タンパク質源として、及び／又は動物飼料で栄養補助剤として用いられる酵母のアミノ酸成分と比較した。
【０１２４】
材料及び方法
・複合培地グルコース（ＣＭＧ）１％の組成
ペプトン  ２ｇ／Ｌ
酵母エキス  ５ｇ／Ｌ
グルコース  ５５ｍＭ（１０ｇ／Ｌ）
酸性ＭＯＰＳ  ４０ｍＭ
ＮＨ４Ｃｌ  ２０ｍＭ
ＮａＯＨ  １０ｍＭ
ＫＯＨ  １０ｍＭ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．５μＭ
Ｎａ２ＳＯ４・１０Ｈ２Ｏ  ０．２７６ｍＭ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．５２８ｍＭ
(ＮＨ４)６(Ｍｏ７)Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ  ３ｎＭ
Ｈ３ＢＯ３  ０．４μＭ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ３０ｎＭ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  １０ｎＭ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ｎＭ
Ｄ−ビオチン  １μｇ／Ｌ
ナイアシン（ニコチン酸）  １μｇ／Ｌ
ピリドキシン（ピリドキサルＨＣｌ、ビタミンＢ６）  １μｇ／Ｌ
チアミンＨＣｌ（ビタミンＢ１）
ＦｅＣｌ３  ２０μＭ
クエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ  ２０μＭ
Ｋ２ＨＰＯ４  ５．７ｍＭ
ＭｎＣｌ２の最終濃度は５．２５μＭである。
【０１２５】
細胞を、３．５Ｌの発酵装置内において４５℃で４００ｒｐｍの攪拌条件下で、６μｇ／ｍＬのブレオマイシンを含むＣＭＧ１％培地で増殖した。約１００〜２００ｍｌの培養培地を、対数期及び定常期において遠心分離（４０００ｒｐｍ、２０分、４℃）により回収し、凍結乾燥前に洗浄した。培養液を凍結乾燥し、アミノ酸成分は乾燥質量で表した。
【０１２６】
アミノ酸の組成及び定量は、ＨＰＬＣにより決定した。
【０１２７】
酵母エキスのアミノ酸成分の値は、S. Cortassa etal, 2002 (S.Cortassa et al, 2002, “An introduction to metabolicandcellular engineering” World scientific Publishing)に由来する。
【０１２８】
結果
下記表４は、デイノコッカスジオサーマリスのアミノ酸成分を酵母エキスのアミノ酸成分と比較する。量は、１００ｇの乾物に対するｇで示す。
【０１２９】
【表４】
2018085995.tif 000005
【０１３０】
これらのデータは、デイノコッカス細胞の総アミノ酸含量が対数期及び定常期のそれぞれの増殖期において４８％及び５４％（１００ｇの乾物におけるｇ）に達することを示す。これらの値は、どちらの増殖期においても酵母エキスで得られる値（３４％）よりも高い。デイノコッカス細菌の総タンパク質含量は、酵母エキスにおける含量よりも高い。さらに、酵母エキスと比較して、デイノコッカス細菌では、魚における必須アミノ酸であるアルギニン(H. George Ketola1982, Comp biochem physiol 73B, N°1, p17-24)の顕著な量が得られる。デイノコッカスバイオマスでは、酵母エキスと比較してより多くのチロシン及びロイシンが得られ、ロイシンは単胃の哺乳動物及び魚の両方における必須アミノ酸である。
【０１３１】
従って、デイノコッカス細菌は、飼料に良好に利用できるタンパク質及びアミノ酸の原料として用いられ、飼料組成物における酵母エキスと交換できる。
【０１３２】
実施例５：特定の培養条件の分析
カロテノイド生成可能な培養条件
デイノコッカスジオサーマリス菌株ＭＸ６−１Ｅを、１Ｌの培養装置において４５℃、０．３５Ｌ／ｍｉｎの空気導入の条件下で、２０ｇ／Ｌペプトン及び１０ｇ／Ｌ酵母エキスを含む１Ｌの培地で培養した。ＤＯを空気導入及び攪拌速度に基づくカスケード制御により２０％に制御した。２０時間後、培養培地は濃い赤色を示し、その培養培地中におけるカロテノイドの存在を示す。この試験は、デイノコッカス細菌が多量のカロテノイドを産生し得ることを確認する。さらに、デイノコッカス細菌は、それが対数期の増殖期にあるときに、酵母エキスよりも多くのメチオニンを生成し、メチオニンは、動物の必須アミノ酸であり、魚の成長にも必要である。
【０１３３】
実質的に拡大可能な培養条件
デイノコッカスジオサーマリス菌株ＭＸ６−１Ｅ−１４を、１Ｌの培養装置において４５℃で、２０ｇ／Ｌグルコースを含む（実施例４で示すような）１ＬのＣＭＧ１０％培地で培養した。
【０１３４】
その培養条件において、６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）は、細胞の強力な拡大を示す４０時間で値が２０に達する（具体的な増殖速度は０．５ｈ−１）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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