(57)【要約】【課題】新規の核酸アレイ製造技術を提供する。【解決手段】（ａ）露光により酸を発生する光酸発生剤（ＰＡＧ）を含有する液体（ＰＡＧ液）を、酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相上に、供給する工程と、（ｂ）前記ＰＡＧ液の所望の位置を露光する工程と、（ｃ）前記の露光後のＰＡＧ液を除去する工程と、（ｄ）前記のＰＡＧ液を除去した固相を、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体と接触させる工程と、を含む核酸アレイの製造方法。【選択図】図１
2018110554.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）露光により酸を発生する光酸発生剤（ＰＡＧ）を含有する液体（ＰＡＧ液）を、酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相上に、供給する工程と、
（ｂ）前記ＰＡＧ液の所望の位置を露光する工程と、
（ｃ）前記の露光後のＰＡＧ液を除去する工程と、
（ｄ）前記のＰＡＧ液を除去した固相を、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体と接触させる工程と、を含む
核酸アレイの製造方法。
【請求項２】
前記ＰＡＧ液が、露光により塩基を発生する光塩基発生剤をさらに含有する、請求項１に記載の核酸アレイの製造方法。
【請求項３】
前記ＰＡＧの反応速度が、前記光塩基発生剤の反応速度より速い、請求項２に記載の核酸アレイの製造方法。
【請求項４】
前記光塩基発生剤が発生する塩基により、前記ＰＡＧが発生する酸を中和可能である、請求項２又は３に記載の核酸アレイの製造方法。
【請求項５】
前記（ｃ）の工程が、前記の露光後のＰＡＧ液を、洗浄液で置換することにより行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸アレイの製造方法。
【請求項６】
前記（ａ）〜（ｄ）の工程が、同一のフローセル内で行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸アレイの製造方法。
【請求項７】
前記ＰＡＧが、オニウム塩、ジアゾメタン、及びスルホン酸エステルからなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸アレイの製造方法。
【請求項８】
前記光塩基発生剤が、２−（９−オキソキサンテンー２−イル）プロピオン酸１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカー５−エンである、請求項２〜７のいずれか一項に記載の核酸アレイの製造方法。
【請求項９】
前記酸分解性保護基は、アセチル基（Ａｃ）、ベンゾイル基（Ｂｚ）、トリチル基（Ｔｒ）、モノメトキシトリチル基（ＭＭＴ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）、トリメトキシトリチル基（ＴＭＴ）、β‐メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、メトキシメチルエーテル基（ＭＯＭ）、テトラヒドロピラニル基（ＴＨＰ）、及びｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＳ）からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸アレイの製造方法。
【請求項１０】
前記（ａ）〜（ｄ）の工程を、任意の回数繰り返す、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸アレイの製造方法。
【請求項１１】
酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相を設置するための固相設置部と、
前記固相設置部に、露光により酸を発生する光酸発生剤（ＰＡＧ）を含有する液体（ＰＡＧ液）を供給するためのＰＡＧ液供給部と、
前記固相設置部に供給されたＰＡＧ液の所望の位置を露光するための光源と、
前記固相設置部から、ＰＡＧ液を排出するためのＰＡＧ液排出部と、
前記固相設置部に、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体を含有する液体（ヌクレオチド誘導体液）を供給するためのヌクレオチド誘導体液供給部と、
前記固相設置部から、前記ヌクレオチド誘導体液を排出するためのヌクレオチド誘導体液排出部と、を含む
核酸アレイ製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸アレイの製造方法、及び核酸アレイ製造装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡマイクロアレイの作製方法には、アフィメトリクス社によって開発されたアフィメトリクス型と、スタンフォード大学で開発されたスタンフォード型とがある。アフィメトリクス型は、感光性塩基を用いたフォトリソグラフィープロセスにより、基板上でＤＮＡを合成する方法である。一方、スタンフォード型は、ロボットプリンティング技術により、基板上にＤＮＡをスポットする方法である。
アフィメトリクス型によれば、より集積度の高いマイクロアレイを作製することができる。しかし、パターニングのための感光性塩基は特殊であり、量産性の観点からスループットに関わる光応答性も十分とは言えない（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９９７，  １１９  （２２），  ５０８１―５０９０
【発明の概要】
【０００４】
本発明の一実施態様は、（ａ）露光により酸を発生する光酸発生剤（ＰＡＧ）を含有する液体（ＰＡＧ液）を、酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相上に、供給する工程と、（ｂ）前記ＰＡＧ液の所望の位置を露光する工程と、（ｃ）前記の露光後のＰＡＧ液を除去する工程と、（ｄ）前記のＰＡＧ液を除去した固相を、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体と接触させる工程と、を含む核酸アレイの製造方法である。
【０００５】
また、本発明の一実施態様は、酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相を設置するための固相設置部と、前記固相設置部に、露光により酸を発生する光酸発生剤（ＰＡＧ）を含有する液体（ＰＡＧ液）を供給するためのＰＡＧ液供給部と、前記固相設置部に供給されたＰＡＧ液の所望の位置を露光するための光源と、前記固相設置部から、ＰＡＧ液を排出するためのＰＡＧ液排出部と、前記固相設置部に、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体を含有する液体（ヌクレオチド誘導体液）を供給するためのヌクレオチド誘導体液供給部と、前記固相設置部から、前記ヌクレオチド誘導体液を排出するためのヌクレオチド誘導体液排出部と、を含む核酸アレイ製造装置である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】本発明の１実施形態にかかる核酸アレイ製造方法の概略図である。
【図２】本発明の１実施形態にかかる核酸アレイ製造方法の概略図である。
【図３】本発明の１実施形態にかかる核酸アレイ製造装置の概略図である。
【図４】実施例で用いたフローセルの概略図である。
【図５】実施例で用いたシステムの概略図である。
【図６】飛行時間二次イオン質量分析計（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：ＴｏＦ−ＳＩＭＳ）を用いて、パターニング後の基板表面の有機化学構造の質量分布マッピング評価の結果である。酸による脱保護部分のＭＳスペクトルを示した。
【図７】脱保護されたリンカーの分子イオンピークを示す。
【図８】ＴｏＦ−ＳＩＭＳを用いて、パターニング（光塩基発生剤含有ＰＡＧ溶液使用）後の基板表面の有機化学構造の質量分布マッピング評価の結果である。酸による脱保護部分のＭＳスペクトルを示した。
【図９】ＴｏＦ−ＳＩＭＳを用いて、パターニング（溶剤としてイソプロパノールを用いたＰＡＧ溶液使用）後の基板表面の有機化学構造の質量分布マッピング評価の結果である。酸による脱保護部分のＭＳスペクトルを示した。
【図１０】光酸発生剤及び光塩基発生剤の露光量に対する反応効率の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
≪核酸アレイの製造方法≫
１実施形態において、本発明は、核酸アレイの製造方法を提供する。本実施形態の核酸製造方法は、（ａ）露光により酸を発生する光酸発生剤（ＰＡＧ）を含有する溶液（ＰＡＧ溶液）を、酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相上に、
供給する工程と、（ｂ）前記ＰＡＧ溶液の所望の位置を露光する工程と、（ｃ）前記の露光後のＰＡＧ溶液を除去する工程と、（ｄ）前記のＰＡＧ溶液を除去した固相を、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体と接触させる工程と、を含む。
【０００８】
図１（１）〜（７）に基づき、本実施形態の製造方法の概略を説明する。
まず、図１（１）に示すように、酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定された基板等の固相１を準備する。図１（１）の例では、酸分解性保護基で保護されている官能基は、水酸基（−ＯＨ）である。また、図中、「ＰＧ」は、酸分解性保護基である。次に、図１（２）に示すように、光酸発生剤（Ｐｈｏｔｏ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ：ＰＡＧ）を含有する液体（ＰＡＧ液）２を、固相１上に供給する。その後、図１（３）に示すように、ＰＡＧ液２に対してパターン露光を行う。これにより、露光された部分のＰＡＧ液中のＰＡＧが酸を発生し、図１（４）に示すように、酸分解性保護基が脱保護される。なお、図１（４）中、「３」は露光された部分のＰＡＧ液を示す。次に、露光後のＰＡＧ液２を、固相１上から除去する。図１（５）の例では、ＰＡＧ液２の除去は、洗浄液４で、ＰＡＧ液２を置換することにより行われている。洗浄液４を除去した後、図１（６）に示すように、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体５を、固相１上に供給する。なお、図１（６）の例では、ヌクレオチド誘導体５は、アデニンヌクレオチド誘導体である。また、ヌクレオチド誘導体５は、液体（ヌクレオチド誘導体液）６に含有された状態で固相１上に供給されている。固相１上に供給されたヌクレオチド誘導体５は、固相１上の脱保護された官能基と反応し、図１（７）に示すように、前記官能基を介して固相１上に保持される。
以下、各工程の詳細を説明する。
【０００９】
［ＰＡＧ液供給工程］
工程（ａ）は、露光により酸を発生する光酸発生剤（ＰＡＧ）を含有する液体（ＰＡＧ液）を、酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相上に、供給する工程である。
【００１０】
工程（ａ）では、まず、図１（１）に示されるように、酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相を準備する。固相としては、例えば、基板やビーズ、不織布や紙などの繊維等を用いることができる。基板を使用する場合、基板の材質としては、例えば、シリコン、ガラス、石英、ソーダ石灰ガラス、ポリアミド樹脂、プラスチックフィルム等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１１】
酸分解性保護基は、酸の作用により脱保護される基である。本実施形態において、酸分解性保護基は、特に限定されず、酸の作用により脱保護されるものであれば、特に制限なく使用することができる。酸分解性保護基としては、例えば、アセチル基（Ａｃ）；ベンゾイル基（Ｂｚ）；トリチル基（Ｔｒ）、モノメトキシトリチル基（ＭＭＴ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）、トリメトキシトリチル基（ＴＭＴ）などのエーテル系保護基；β‐メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、メトキシメチルエーテル基（ＭＯＭ）、テトラヒドロピラニル基（ＴＨＰ）などのアセタール系保護基；ｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＳ）などのシリルエーテル基等を挙げることができるがこれらに限定されない。これらの酸分解性保護基は、保護する官能基が水酸基である場合に用いられる。保護する官能基がアミノ基等である場合も、適宜好適な酸分解性保護基を選択して用いることができる。一例として、酸分解性保護基として、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基を挙げることができる。
【００１２】
本実施形態においては、固相上に固定化された分子の官能基が、酸分解性保護基で保護されている。官能基は、特に限定されず、後述するヌクレオチド誘導体と結合できるものであればよい。一例として、官能基として、水酸基を挙げることができる。
【００１３】
酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相を準備する方法は特に限定されないが、例えば、固相表面に有機シラン化合物分子を固定し、有機シラン化合物分子に酸分解性保護基を有する分子を結合させることによって行うことができる。固相表面に有機シラン化合物を固定する方法としては、例えば、酸素ガス等で固相表面のプラズマ処理を行った後、水又はエタノール中で有機シラン化合物を反応させる。前記方法で用いる有機シラン化合物としては、例えば、ヒドロキシアルキルシラン、ヒドロキシアルキルアミドシラン、ヒドロキシグリコールシラン等を挙げることができる。例えば、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド）等を用いることができる。
例えば、固相をプラズマ処理した後、有機シラン化合物溶液に浸漬して、７０〜１２０℃程度で５〜４０分程度加熱した後、イソプロパノール等の有機溶媒に浸漬して洗浄する。なお、洗浄の際には、超音波処理を行ってもよい。洗浄後、固相を乾燥し、１００〜１４０℃程度で１〜１０分程度加熱することにより、有機シラン化合物分子を固相に固定することができる。
【００１４】
続いて、固相に固定化されたシラン分子に、酸分解性保護基を有する分子を反応させる。酸分解性保護基を有する分子としては、例えば、酸分解性保護基を有するホスホロアミダイトヌクレオチド、５’又は３’の水酸基を酸分解性保護基で保護したヌクレオチド等、核酸人工合成法として知られるホスホロアミダイト法やリン酸エステル法に適用可能な核酸モノマー等を挙げることができる。そのような分子としては、一例として、ＤＭＴ−ホスホロアミダイトヌクレオチドを挙げることができる。例えば、有機シラン化合物を固定化した固相を、酸分解性保護基を有するホスホロアミダイトヌクレオチド溶液に浸漬し、１〜１５分程度揺動することにより、酸分解性保護基を有する分子を固相表面に固定化することができる。当該反応は、禁水条件下で行ってもよい。反応後、適宜アセトニトリル等の有機溶媒で洗浄してもよい。
なお、上記の例では、有機シラン化合物分子に酸分解性保護基を有する分子を結合させたが、有機シラン化合物分子を直接酸分性解保護基で保護してもよい。
【００１５】
上記のように準備した固相上に、図１（２）に示されるように、ＰＡＧを含有する液体（ＰＡＧ液）を供給し、固相上でＰＡＧ液を滞留させる。
【００１６】
ＰＡＧは、露光により酸を発生する分子である。本実施形態の製造方法において、ＰＡＧは、特に限定されず、レジスト組成物などに一般的に用いられるものを使用することができる。ＰＡＧとしては、スルホニウム塩、ヨードニウム塩等のオニウム塩、ジアゾメタン、スルホン酸エステル等が挙げられる。ジアゾメタンやスルホン酸エステル等のノニオン系よりも、オニウム塩等のイオン系の方が、強い酸を生成することができる。一例として、光酸発生剤は、オニウム塩である。オニウム塩としては、トリフルオロメタンスルホン酸トリフェニルスルホニウムなどのスルホニウム塩、パーフルオロプロパンスルホン酸ジフェニルヨードニウムなどのヨードニウム塩等が挙げられる。そのようなオニウム塩から生成される酸としては、フルオロアンチモネート（ＨｓｂＦ６）、ＦＡＰ（フルオロアルキルフォスフェート）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＣＦ３ＳＯ３Ｈ：ＴｆＯＨ）、パーフルオロプロパンスルホン酸等が挙げられる。本実施形態の製造方法に用いるＰＡＧが生成する酸は、一例として、酸解離定数（ｐＫａ）が−３０〜５程度である。また、一例として、ｐＫａが−２５〜０である。ＰＡＧが生成する酸は、は、溶媒に対する溶解度が約１質量％以上のものを用いることができるが、溶解度がより高いものを用いてもよい。ＰＡＧとして、例えば、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート（ＰＧＭＥＡ）に対する溶解度が、３０質量％以上、４０質量％以上、又は５０質量％以上のものを用いてもよい。ＰＡＧは、レジスト用などに市販されているものを使用することもできる。一例として、サンアプロ社のＣＰＩ（登録商標）シリーズのＰＡＧを使用することができ、ＣＰＩ−２１０Ｓを例示することができる。
【００１７】
ＰＡＧ液は、ＰＡＧ以外の他の成分を含有していてもよい。他の成分としては、例えば、溶剤、光塩基発生剤（Ｐｈｏｔｏ  Ｂａｓｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ：ＰＢＧ）、熱塩基発生剤（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂａｓｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ：ＴＢＧ）、酸補足剤、界面活性剤、増感剤等を挙げることができる。
【００１８】
溶剤は、ＰＡＧを溶解できるものであることが好ましく、ＰＡＧの種類に応じて、適宜選択することができる。溶剤としては、例えば、メタノール、エタノール、ブタノール、イソプロピルアルコール、イソブチルアルコール、ベンジルアルコールなどのアルコール系溶剤；プロピレングリコールモノエチルエーテル（ＰＧＭＥ）、ＰＧＭＥＡ等のエーテル系溶剤；アセトン、シクロヘキサンなどのケトン系溶剤；酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸イソプロピルなどのエステル系溶剤；トルエン、キシレン、シクロヘキサンなどの炭化水素系溶剤等が挙げられるが、これらに限定されない。溶剤は、ＰＡＧ液の除去効率や固相との接触面における摩擦抵抗を考慮し、例えば、２０℃における粘度が３．０ｍＰａ／ｓ程度以下ものを使用してもよい。そのような溶剤としては、メタノール（０．６ｍＰａ／ｓ）、イソプロパノール（１．８ｍＰａ／ｓ）等を例示することができる。酸発生時の酸の拡散を抑制する場合には１０４ｍＰａ／ｓ以下の流動可能な高粘度の溶剤を用いてもよい。そのような溶剤としてはエチレングリコール（１６ｍＰａ／ｓ）やポリマー溶液等を用いることができる。
なお、溶剤は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上の混合溶剤であってもよい。
【００１９】
ＰＢＧは、露光により塩基を発生する分子である。ＰＢＧを、ＰＡＧと共存させることにより、ＰＡＧが発生した酸が、ＰＢＧが発生する塩基によって中和される。そのため、ＰＡＧが発生した酸の拡散を抑制することができる。
ＰＢＧとしては、ＰＡＧ液中に共存するＰＡＧが酸を発生する波長の光で、塩基を発生するものを例示することができるが、ＰＡＧとは異なる波長の光で塩基を発生するものであってもよい。ＰＢＧは、市販のものを用いることができ、使用するＰＡＧに応じて適宜選択することができる。
また、ＰＢＧは、ＰＡＧの酸発生速度よりも、僅かに遅い塩基発生速度を有するものを用いることができる。そのようなＰＢＧをＰＡＧと共に等量程度用いた場合、後述の露光工程において、露光開始直後は、ＰＡＧが発生する酸の方が、ＰＢＧが発生する塩基よりも多くなる。そのため、露光部分のＰＡＧ液は酸性となり、その部分の酸分解性保護基が脱保護される。その後、ＰＢＧが発生した塩基により、ＰＡＧが発生した酸は中和され、露光部以外への酸の拡散が抑制される。このようなＰＡＧとＰＢＧとの組合せとしては、酸としてＦＡＰを発生するＰＡＧと、塩基としてＴＢＤ（１，５，７−ビシクロ［４．４．０］デカー５−エン）を発生するＰＢＧとの組合せを例示することができる。酸としてＦＡＰを発生するＰＡＧとしては、サンアプロ社のＣＰＩ（登録商標）シリーズの光酸発生剤を例示することができる。また、塩基としてＴＢＤを発生するＰＢＧとしては、２−（９−オキソキサンテンー２−イル）プロピオン酸１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカー５−エンを例示することができる。
なお、ＰＢＧは、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。ＰＡＧとＰＢＧは必ずしも等量である必要はなく、ＰＡＧから発生した酸を中和できるものであればＰＢＧは少なくてもよく、多くてもよい。
【００２０】
またＴＢＧは、加熱により塩基を発生する分子である。ＴＢＧを、ＰＡＧと共存させることにより、ＰＡＧが発生した酸が、ＴＢＧが発生する塩基によって中和される。そのため、ＰＡＧが発生した酸の拡散を抑制することができる。例えば、生成させたい塩基のギ酸塩やスルホン酸塩などを添加することができる。また、ＰＢＧは、市販のものを用いることができ、使用するＰＡＧに応じて適宜選択することができる。
なお、ＴＢＧを用いる場合には、後述の露光工程において、ＰＡＧ液の露光を行なうとともに、ＴＢＧが酸を発生する温度にＰＡＧ液を加熱する。これにより、露光によってＰＡＧが発生する酸が、加熱によってＴＢＧが発生する塩基により中和され、露光部分以外への酸の拡散が抑制される。ＴＢＧは、上述したＰＢＧと同様に、ＰＡＧの酸発生速度よりも、僅かに遅い塩基発生速度を有するものを用いることができる。
なお、ＴＢＧは、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。また、1種以上のＰＢＧと１種以上ＴＢＧとを組み合わせて用いることもできる。
【００２１】
また、ＰＡＧ液には、ＰＡＧ液を塩基性〜中性に保つための塩基性物質や界面活性剤などを添加することができる。ＰＡＧから発生する酸の熱拡散を抑制する目的のため、酸補足剤として塩基性物質を添加することもできる。塩基性物質として、例えば、アルキルアミンなどを添加することができる。
【００２２】
ＰＡＧ液は、例えば、ＰＡＧ、及び、必要に応じてＰＢＧ等の他の成分を、溶剤に溶解して撹拌することにより調製することができる。ＰＡＧ等を溶剤に溶解させる際には、超音波照射等を行ってもよい。
【００２３】
ＰＡＧ液において、ＰＡＧの含有量は特に限定されないが、例えば、ＰＡＧ液１００質量％に対して、０．００１〜２０質量％、０．１〜１５質量％、０．５〜１０質量部等とすることができる。また、ＰＢＧをＰＡＧ液に含有させる場合には、ＰＢＧのＰＡＧ液における濃度は、ＰＡＧの含有量に応じて、例えば、ＰＡＧと等モル濃度か、それ以上の濃度とすることができる。ＴＢＧや酸捕捉剤を添加する場合も同様である。
また、ＰＡＧ液におけるＰＢＧの含有量は、ＰＡＧが発生する酸を中和するのに十分な量とすることができる。例えば、ＰＢＧが発生する塩基が、ＰＡＧが発生する酸と同程度の強さである場合には、ＰＢＧのＰＡＧ液における濃度は、ＰＡＧと等モル濃度程度とすることができる。また、ＰＢＧが発生する塩基が、ＰＡＧが発生する酸よりも弱い場合には、ＰＢＧのＰＡＧ液における濃度は、ＰＡＧのモル濃度よりも高いモル濃度とすることができる。ＴＢＧや酸捕捉剤を添加する場合も同様である。
また、ＰＡＧ液におけるＰＡＧ及びＰＢＧの含有量については、両感光性材料の光に対する反応効率、すなわち量子効率に基づき任意の混合比とすることができる。例えば、ＰＢＧが発生する塩基が、ＰＡＧが発生する酸と同程度の強さである場合であっても、ＰＢＧの塩基発生の量子効率がＰＡＧの酸発生量子効率を大きく下回る場合には、ＰＢＧのＰＡＧ液における濃度はＰＡＧのモル濃度よりも高いモル濃度とすることができる。
【００２４】
固相上へのＰＡＧ液の供給方法は、特に限定されない。例えば、固相を配置した容器内に、送液ポンプ等を用いて、ＰＡＧ液を供給する方法、ＰＡＧ液を充たした容器内に、固相を浸漬する方法等を挙げることができる。
【００２５】
また、一例として、フローセルを利用する方法を挙げることができる。例えば、図３に示す例では、フローセル１０の開口部１１に固相１を固定し、送液ポンプ８０を稼働させて、ＰＡＧ液用タンク５０から、流路２１，２４，２７，２８を介して、固相１上にＰＡＧ液を供給する。フローセルを用いてＰＡＧ液を供給する際の流速は、特に限定されないが、例えば、０．１〜２００ｍｌ／分あるいは５〜１００ｍｌ／分とすることができる。流路２７，２８がＰＡＧ液で充たされた後、送液ポンプ８０を停止すれば、固相１上にＰＡＧ液を滞留させることができる。
【００２６】
固相上にＰＡＧ液を供給した後、工程（ｂ）を行う前に、ＰＡＧ液の移動が落ち着くまで、一定時間静置してもよい。例えば、ＰＡＧ液の固相付近での流速が、５μｍ／秒以下、又は３μｍ／秒以下となるまで静置することができる。静置する時間は、ＰＡＧ液の供給方法、露光時間や所望の解像性等にもよるが、例えば、２０秒以上、３０秒以上、５０秒以上、又は６０秒以上等を例示することができる。固相上にＰＡＧ液を供給後、一定時間静置することにより、工程（ｂ）における露光によってＰＡＧ液中で発生する酸の拡散を抑制することができる。静置時間の上限は、特に限定されないが、工程時間管理の観点から、１５分以下、１０分以下、５分以下、３分以下等を例示することができる。
また、ＰＡＧ液の供給を、フローセルを利用して行う場合には、ＰＩＶ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｉｍａｇｅ  Ｖｅｌｏｃｉｍｅｔｒｙ：粒子画像流速測定法）解析を行って、静置時間を決定してもよい。
【００２７】
また、フローセルを用いる場合、フローセルの入口または出口側での流路の高さを任意に設定することもできる。例えば、送液ポンプ８０を停止した後に入口側（流路２７側）へＰＡＧ液が戻る場合には、出口側（流路２９側）を入口側よりも低くすることができる。
また、フローセルの入口側又は出口側にチャックバルブ（逆止弁）を設けることができる。例えば、送液ポンプ８０を停止した後に入口側（流路２７側）へＰＡＧ液が戻る場合には、入口側にチャッキング弁等を設けることができる。
また、送液ポンプ８０を停止した後、フローセルの入口側または出口側で流路内の過剰な圧力を解放するための背圧弁を設けることができる。例えば、送液ポンプ８０を停止した後に入口側（流路２７側）へＰＡＧ液が戻る場合には、出口側（流路２９側）に背圧弁等を設け、ＰＡＧ液停止後に一時的に弁を開くようにしてもよい。
また、フローセルを用いる場合には、上記例示したチャックバルブや背圧弁に限らず、内圧コントロール機構を適宜設けることができる。
【００２８】
［露光工程］
工程（ｂ）は、上記工程（ａ）で、固相上に供給したＰＡＧ液の所望の位置を露光する工程である。
図１（３）に示すように、ＰＡＧ液２に対してパターン露光を行うと、露光部分のＰＡＧ液２に含まれるＰＡＧから酸が生成する。この酸により、露光部分の酸分解性保護基（ＰＧ）が脱保護され、酸分解性保護基で保護されていた官能基が露出する。なお、図１（４）は、露光後の状態を示している。図１（４）では、ＰＡＧ液２の露光部分３において酸が生成しており、その部分の酸分解性保護基が脱保護されて、官能基（−ＯＨ）が露出している。なお、ＰＡＧ液２がＰＢＧを含有する場合には、露光部分３における酸は、ＰＢＧが発生する塩基により中和される。
【００２９】
工程（ｂ）における露光は、ＰＡＧの種類に応じて、ｇ線、ｈ線、ｉ線、ＡｒＦエキシマレーザー、ＫｒＦエキシマレーザー、ＥＵＶ、ＶＵＶ、ＥＢ、Ｘ線等を放射する適切な光源を用いて行うことができる。例えば、ＡｒＦ用ＰＡＧを用いた場合には、ＡｒＦエキシマレーザーを用いて露光することができる。また、ｉ線用ＰＡＧを用いた場合には、ｉ線（例えば、３６５ｎｍ）を用いて露光することができる。
【００３０】
また、ＰＡＧ液がＰＢＧを含有する場合であって、該ＰＢＧがＰＡＧと異なる波長で塩基を発生する場合、ＰＢＧが塩基を発生する波長の光を照射できる光源を用いてもよい。また、ＴＢＧを含む場合には、ＴＢＧが塩基を発生する温度に加熱可能な赤外線などの熱線を放射できるようにしてもよい。あるいは、ＴＢＧが塩基を発生する温度に加熱しながら露光を行なってもよい。
【００３１】
なお、工程（ｂ）における露光において、露光量は特に限定されないが、例えば、１０〜１０００ｍＪ／ｃｍ２程度とすることができる。アフィメトリクス型のＤＮＡマイクロアレイの作製方法では、感光性塩基の脱保護のために数Ｊ以上が必要であり、本実施形態の製造方法では、アフィメトリクス型の方法と比較して、少ない露光量で核酸アレイの製造を行うことができる。
【００３２】
露光は、後述する酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体との接触工程において、当該ヌクレオチド誘導体を結合させたい位置のＰＡＧ液に対してのみ行う。このようなパターン露光を行うことにより、露光した部分の酸分解性保護基のみが脱保護され、未露光部分の酸分解性保護基は脱保護されずに維持される。このようなパターン露光には、例えば、フォトマスク等を用いて行う方法、レンズやミラーなどの光学系を用いたプロジェクション露光、空間光変調素子、レーザービームなどを用いたマスクレス露光等の手段を用いることができる。
【００３３】
固相上へのＰＡＧ液の供給を、フローセルを利用して行う場合、ＰＡＧ液の露光もフローセル上で行うことができる。例えば、図３に示す例では、固相１上の流路２８の上に、フォトマスク３０が設置されている。そして、光源４０から、フォトマスク３０を介して流路２８内のＰＡＧ液に対して光を照射して、露光を行う。図３の例では、流路を介したプロキシミティ露光により、露光を行っている。流路を極小とすることでコンタクト露光に近づけることができる。しかし、フローセルを利用して露光を行う方法はこれに限定されず、固相１が透明基板である場合には固相１の下にフォトマスクを設置し裏面から固相１を介して露光することができる。また、レンズ光学系やミラー光学系を用いてプロジェクション露光を行ってもよく、フォトマスクを介さずに直描露光を行ってもよい。
【００３４】
［ＰＡＧ液除去工程］
工程（ｃ）は、上記工程（ｂ）で露光した露光後のＰＡＧ液を除去する工程である。
図１（５）に示す例では、ＰＡＧ液２の除去は、ＰＡＧ液２を洗浄液４で置換することによって行われている。
【００３５】
ＰＡＧ液の除去の方法は、特に限定されないが、ＰＡＧ液を洗浄液で置換する方法、固相を保持する容器からＰＡＧ液を排出する方法、ＰＡＧ液の入った容器から固相を取り出す方法等を挙げることができる。
【００３６】
固相上へのＰＡＧ液の供給及び露光を、フローセルを用いて行う場合には、固相上の流路に存在するＰＡＧ液を、洗浄液で置換することにより、ＰＡＧ液の除去を行うことができる。例えば、図３に示す例では、送液ポンプ８０の送液タンクを洗浄液用タンク６０に切り替え、送液ポンプ８０を稼働させて、洗浄液用タンク６０から、流路２２，２５，２７を介して、固相１上の流路２８に洗浄液を供給し、流路２８内のＰＡＧ液を洗浄液に置換する。これにより、流路２８内に存在していたＰＡＧ液は、流路２９を介して廃液タンク９０に回収される。
【００３７】
ＰＡＧ液の置換に用いる洗浄液は、特に限定されないが、ＰＡＧ液で用いたものと同じ溶剤を洗浄液として用いてもよい。例えば、メタノール、エタノール、ブタノール、イソプロピルアルコール、イソブチルアルコール、ベンジルアルコールなどのアルコール系溶剤；プロピレングリコールモノエチルエーテル（ＰＧＭＥ）、ＰＧＭＥＡ等のエーテル系溶剤；アセトン、シクロヘキサンなどのケトン系溶剤；酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸イソプロピルなどのエステル系溶剤；トルエン、キシレン、シクロヘキサンなどの炭化水素系溶剤等が挙げられるが、これらに限定されない。洗浄液は、固相との接触面における摩擦抵抗を考慮し、例えば、２０℃における粘度が３．０ｍＰａ／ｓ程度以下ものを使用してもよい。そのような溶剤としては、メタノール、イソプロパノール等を例示することができる。また、ＰＡＧ液から、ＰＡＧを除いたものを洗浄液として用いてもよい。
【００３８】
ＰＡＧ液の除去に使用する洗浄液の量は、フローセルの流路中のＰＡＧ液を置換するのに十分な量であればよい。そのため、フローセルの流路径及び流路長に応じて、適宜洗浄液の量を調整することができる。例えば、ＰＩＶ解析により、流路中のＰＡＧ液を置換するのに十分な洗浄液の量を求めてもよい。なお、洗浄液の供給速度は、特に限定されないが、例えば、０．１〜２００ｍｌ／秒とすることができる。
また、洗浄液で置換する際に、流路を往復するようなピストン運動を行ってもよい。また、固相側を超音波で振動させてもよく、送液する洗浄液に超音波を伝搬させてもよい。これにより、洗浄効果を高めることができる。
【００３９】
ＰＡＧ液を洗浄液で置換する方法以外の方法で、ＰＡＧ液を除去した場合も、ＰＡＧ液除去後の固相を洗浄液で洗浄してもよい。洗浄液には、上記と同様のものを使用することができる。この場合、洗浄効果を高めるために、洗浄操作中に固相に対して超音波照射を行ってもよい。また、溶剤蒸気を用いた蒸気洗浄を行ってもよい。
【００４０】
［ヌクレオチド誘導体反応工程］
工程（ｄ）は、上記工程（ｃ）でＰＡＧ液を除去した固相を、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体と接触させる工程である。
図１（６）及び（７）に示されるように、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体５を、ＰＡＧ液２除去後の固相１に接触させると、脱保護により露出した官能基（−ＯＨ）とカップリングして結合する。これにより、固相１上の所望の位置において、核酸合成を行うことができる。なお、図１（６）において、ヌクレオチド誘導体５は、ヌクレオチド誘導体液６に含有された状態で、固相１上に供給されている。
【００４１】
酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体は、一般的な核酸合成法に使用されるものを用いることができる。核酸合成法としては、一例として、ホスホロアミダイト法を挙げることができ、ヌクレオチド誘導体として、ホスホロアミダイト化されたヌクレオチド誘導体を用いることができる。また、酸分解性保護基は、酸の作用により脱保護されるものであれば、特に制限なく使用することができる。酸分解性保護基としては、例えば、上記「［ＰＡＧ液供給工程］」において記載したもの等を例示することができる。一例として、酸分解性保護基には、ＤＭＴを用いることができる。また、酸分解性保護基によって保護される官能基としては、リボース又はデオキシリボースの５位の炭素に結合する水酸基を挙げることができるが、これに限定されない。本工程で使用可能なヌクレオチド誘導体としては、例えば、ＤＭＴ−ｄＡホスホロアミダイト、ＤＭＴ−ｄＴホスホロアミダイト、ＤＭＴ−ｄＧホスホロアミダイト、ＤＭＴ−ｄＣホスホロアミダイト等を挙げることができるが、これらに限定されない。ヌクレオチド誘導体は、核酸合成用に市販されているものを用いてもよい。また、ヌクレオチド誘導体が由来するヌクレオチドは、ＲＮＡであってもよく、ＢＮＡ（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）やＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）等の人工核酸であってもよい。
【００４２】
ヌクレオチド誘導体として、ホスホロアミダイト化されたヌクレオチド誘導体を用いる場合、当該ヌクレオチド誘導体と固相上の官能基との反応は、一般的なホスホロアミダイト法で用いられる条件により行うことができる。例えば、ホスホロアミダイト法による核酸合成は、以下のような手順で行うことができる。
まず、ホスホロアミダイト化されたヌクレオチド誘導体をテトラゾール等により活性化し、当該ヌクレオチド誘導体を固相上の官能基とカップリングさせる。次に、未反応の官能基をアセチル化等によりキャッピングし、以降のサイクルに関与しないようにする。その後、固相上の官能基と前記ヌクレオチド誘導体との結合を、ヨードを用いて酸化し、３価のリンから５価のリン酸エステルに変換する。
これらの反応は公知であり、公知の条件で反応を行うことができる。また、これらの反応に用いる試薬は、市販のものを用いることができる。なお、上記の方法は、固相上の官能基とヌクレオチド誘導体との結合方法の一例であり、他の方法により結合反応を行ってもよい。
【００４３】
ヌクレオチド誘導体との反応を行う前に、固相は、乾燥させておいてもよい。乾燥には、例えば、乾燥アセトニトリルや窒素フロー等を使用することができる。また、固相上の官能基とヌクレオチド誘導体との結合反応は、禁水条件下で行ってもよい。
【００４４】
また、固相上へのＰＡＧ液の供給、露光、ＰＡＧ液の排出を、フローセルを用いて行う場合には、固相上へのヌクレオチド誘導体の供給も、フローセルを用いて行うことができる。例えば、図３に示す例では、送液ポンプ８０の送液タンクをヌクレオチド誘導体液用タンク７０に切り替え、送液ポンプ８０を稼働させて、ヌクレオチド誘導体液用タンク７０から、流路２３，２６，２７を介して、固相１上の流路２８にヌクレオチド誘導体液を供給する。これにより、流路２８内に存在していた洗浄液は、流路２９を介して廃液タンク９０に回収される。
【００４５】
上記の例において、ヌクレオチド誘導体液は、ヌクレオチド誘導体を含有する液体である。ヌクレオチド誘導体液は、例えば、一般的なホスホロアミダイト法で用いられるヌクレオチド誘導体溶液とすることができる。例えば、ヌクレオチド誘導体液は、ヌクレオチド誘導体を、テトラゾール含有アセトニトリル溶液に溶解させたものであってもよい。１つのヌクレオチド誘導体液が含有するヌクレオチド誘導体は１種類とし、各塩基について、別のヌクレオチド誘導体液を調製するようにする。
また、一般的なホスホロアミダイト法において行われるキャッピング及び酸化についても、フローセルを用いて行うことができる。例えば、キャッピング又は酸化に必要な反応液等を入れたタンクを送液ポンプ８０又は図示しない別の送液ポンプに接続し、それらの送液ポンプを稼働させて、固相１上の流路２８に、当該反応液等を供給するようにしてもよい。
また、ヌクレオチド誘導体との反応後、キャッピング及び酸化の前後で、前述の洗浄液を用いた手法によるフローセル、流路内及び固相１の洗浄を行ってもよい。
【００４６】
［核酸伸長］
本実施形態の製造方法は、工程（ａ）〜工程（ｄ）を任意の回数繰り返すことにより、固相上で核酸伸長を行い、所望の配列及び塩基長を有する核酸アレイを製造することができる。例えば、ＤＮＡアレイを製造する場合には、アデニン、チミン、シトシン、及びグアニンを塩基としてそれぞれ有する４種類のヌクレオチド誘導体を使用して、工程（ａ）〜工程（ｃ）を繰り返すことにより、任意の配列及び塩基長を有するＤＮＡを固相１上で合成し、ＤＮＡアレイを製造することができる。
以下、固相上でのＤＮＡの合成例について、図１（１）〜（１３）及び図２（１）〜（１２）を参照して説明する。
【００４７】
図１（１）〜（７）は、１巡目の工程（ａ）〜（ｄ）を示す。詳細は、上述したとおりである。図１（１）〜（７）では、ヌクレオチド誘導体５として、アデニンヌクレオチド誘導体を固相１上の官能基（−ＯＨ）に結合している。
【００４８】
図１（８）〜（１３）は、２巡目の工程（ａ）〜（ｄ）を示す。図１（８）では、１巡目の工程（ａ）〜（ｄ）でアデニンヌクレオチド誘導体が結合された固相１に対して、再度ＰＡＧ液２の供給を行っている（工程（ａ））。図１（９）では、ＰＡＧ液２に対して露光を行っており、これにより露光された部分のＰＡＧ液２中のＰＡＧが酸を発生し、図１（１０）に示すように、酸分解性保護基（ＰＧ）が脱保護される（工程（ｂ））。次に、図１（１１）に示すように、露光後のＰＡＧ液２を除去する（工程（ｃ））。図１（１１）の例では、露光後のＰＡＧ液２が、洗浄液４での置換により除去されている。そして、図１（１２）に示すように、ＰＡＧ液２を除去した固相１を酸分解性保護基（ＰＧ）を有するヌクレオチド誘導体５と接触させる（工程（ｄ））。図１（１２）の例では、ヌクレオチド誘導体５として、チミジンヌクレオチド誘導体を、固相１上の官能基（−ＯＨ）に作用させている。その結果、図１（１３）に示すように、固相１上の官能基にチミジンヌクレオチド誘導体が結合する。
【００４９】
図２（１）〜（６）は、３巡目の工程（ａ）〜（ｄ）を示す。図２（１）では、１巡目でアデニンヌクレオチド誘導体、２巡目でチミジンヌクレオチドが結合された固相１に対して、再度ＰＡＧ液２の供給を行っている（工程（ａ））。図２（１）では、ＰＡＧ液２に対して露光を行っており、これにより露光された部分のＰＡＧ液２中のＰＡＧが酸を発生し、図２（３）に示すように、酸分解性保護基（ＰＧ）が脱保護される（工程（ｂ））。次に、図２（４）に示すように、露光後のＰＡＧ液２を除去する（工程（ｃ））。図２（４）の例では、露光後のＰＡＧ液２が洗浄液４での置換により除去されている。そして、図２（５）に示すように、ＰＡＧ液２を除去した固相１を酸分解性保護基（ＰＧ）を有するヌクレオチド誘導体５と接触させる（工程（ｄ））。図２（５）の例では、ヌクレオチド誘導体５として、グアニンヌクレオチド誘導体を、固相１上の官能基（−ＯＨ）に作用させている。その結果、図２（６）に示すように、固相１上の官能基（−ＯＨ）にグアニンヌクレオチド誘導体が結合する。
【００５０】
図２（７）〜（１２）は、４巡目の工程（ａ）〜（ｄ）を示す。図２（７）では、１巡目でアデニンヌクレオチド誘導体、２巡目でチミジンヌクレオチド、３巡目でグアニンヌクレオチドが結合された固相１に対して、再度ＰＡＧ液２の供給を行っている（工程（ａ））。図２（８）では、ＰＡＧ液２に対して露光を行っており、これにより露光された部分のＰＡＧ液２中のＰＡＧが酸を発生し、図２（９）に示すように、酸分解性保護基（ＰＧ）が脱保護される（工程（ｂ））。次に、図２（１０）に示すように、露光後のＰＡＧ液２を除去する（工程（ｃ））。図２（１０）の例では、露光後のＰＡＧ液２が洗浄液４での置換により除去されている。そして、図２（１１）に示すように、ＰＡＧ液２を除去した固相１を酸分解性保護基（ＰＧ）を有するヌクレオチド誘導体５と接触させる（工程（ｄ））。図２（１１）の例では、ヌクレオチド誘導体５として、シトシンヌクレオチド誘導体を、固相１上の官能基（−ＯＨ）に作用させている。その結果、図２（１２）に示すように、固相１上の官能基（−ＯＨ）にシトシンヌクレオチド誘導体が結合する。
【００５１】
上記のようにして、図１及び図２の例では、工程（ａ）〜（ｄ）を４回繰り返すことにより、１段目のヌクレオチドを固相１に結合させている。同様にして、工程（ａ）〜（ｄ）をさらに４回繰り返すことにより、１段目のヌクレオチドに対して、２段目のヌクレオチドを結合させることができる。同様にして、工程（ａ）〜（ｄ）をさらに４回繰り返すことにより、２段目のヌクレオチドに対して、３段目のヌクレオチドを結合させることができる。このように、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンの各ヌクレオチド誘導体を各回で用いる４回の工程（ａ）〜（ｄ）を１セットとして、当該セットを所望の回数行うことにより、所望の塩基長の配列を固相１上に合成することができる。例えば、前記セットを１０回行うことにより、１０塩基のＤＮＡを固相１上に合成することができる。
【００５２】
このように、工程（ａ）〜（ｄ）を任意の回数繰り返すことにより、固相１上の所望の位置に、所望の配列を有する核酸を合成することができる。このようにして、固相１上に、例えば、任意の配列を有する１０〜１００塩基の核酸を合成し、核酸アレイを製造することができる。
【００５３】
なお、図１及び図２の例では、アデニン、チミン、グアニン、シトシンの順にヌクレオチド誘導体を反応させているが、ヌクレオチド誘導体を反応させる順序はこれに限定されず、これらのヌクレオチド誘導体を任意の順序で反応させることができる。また、ヌクレオチド誘導体を反応させる順序は、各セット間で同じである必要はなく、セット毎に異なる順序でヌクレオチド誘導体を反応させてもよい。
【００５４】
また、上記説明した例では、固相上で１段ずつヌクレオチドを伸長させているが、必ずしも１段ずつヌクレオチドを伸長させる必要はない。例えば、１巡目でアデニンヌクレオチド誘導体を用い、２巡目でチアミンヌクレオチド誘導体を用いる場合、１巡目と２巡目で一部重複する位置を露光し、１巡目と２巡目の露光が重複する位置に「Ａ−Ｔ」の配列を形成してもよい。
【００５５】
本実施形態の製造方法によれば、従来の方法よりも、少ない露光量で核酸アレイの製造を行うことができる。また、ＰＡＧ液は、入手が容易で安価なものを使用できるため、核酸合成にかかる費用を削減することができる。さらに、フローセルを利用すれば、工程（ａ）〜（ｄ）を全て同一のフローセル内で行うことができるため、効率的に核酸合成プロセスを進めることができる。また、パターン露光を制御することにより、アレイの微細化も可能である。
そのため、本実施形態の製造方法によれば、アレイの微細化が可能で、かつスループットの高い核酸アレイの製造方法が提供される。
【００５６】
≪核酸アレイ製造装置≫
１実施形態において、本発明は、上記実施形態の核酸アレイ製造方法を実現するための核酸アレイの製造装置を提供する。本実施形態の核酸アレイの製造装置は、酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された固相を設置するための固相設置部と、前記固相設置部に、露光により酸を発生する光酸発生剤（ＰＡＧ）を含有する液体（ＰＡＧ液）を供給するためのＰＡＧ液供給部と、前記固相設置部に供給されたＰＡＧ液の所望の位置を露光するための光源と、前記固相設置部から、ＰＡＧ液を排出するためのＰＡＧ液排出部と、前記固相設置部に、酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体を含有する液体（ヌクレオチド誘導体液）を供給するためのヌクレオチド誘導体液供給部と、前記固相設置部から、前記ヌクレオチド誘導体液を排出するためのヌクレオチド誘導体液排出部と、を含む。
以下に、本実施形態の核酸アレイ製造装置の構成の一例について説明する。
【００５７】
図３は、本実施形態の核酸アレイ製造装置の構成の一例を示したものである。図３に示す核酸アレイ製造装置１００は、フローセル１０と、ＰＡＧ液用タンク５０と、洗浄液用タンク６０と、ヌクレオチド誘導体液用タンク７０と、送液ポンプ８０と、廃液タンク９０と、流路２１〜２９と、光源４０と、を備える。
【００５８】
フローセル１０は、固相１を設置するための開口部１１を備えている。開口部１１では、固相１の端部が保持されて、固相１が固定されるようになっている。また、開口部１１は、流路２８を備え、設置された固相１の少なくとも一方の表面が、流路２８内に存在する液体と接触するようになっている。さらに、開口部１１は、流路２８の固相１側とは逆側、あるいは同じ側に、フォトマスク３０を設置できるようになっている。
フローセル１０は、流路内の液体の粘度のや添加剤の性質に応じて、適宜冷却・加熱・恒温保持できるようになっている。
核酸アレイ製造装置１００において、固相設置部は、開口部１１により構成される。
【００５９】
開口部１１内で、固相１と接触する流路２８は、その一方が、流路２７を介して送液ポンプ８０に接続している。送液ポンプ８０は、さらに、流路２１〜２６を介して、ＰＡＧ液用タンク５０、洗浄液用タンク６０、及びヌクレオチド誘導体液用タンク７０にそれぞれ接続している。送液ポンプ８０が、各タンクに接続する流路は、流路切換弁等により、切換えられるようになっている。
また、流路２８の他方は、流路２９を介して、廃液タンク９０に接続している。
また送液ポンプ８０は流路２８を介さず、図示しない流路を介して廃液タンク９０に送液することもでき、必要に応じて接続タンク切り替え時の薬液汚染を回避するために各タンクからの液体で送液ポンプ８０内をパージする機構を備えていてもよい。
【００６０】
ＰＡＧ液用タンク５０、洗浄液用タンク６０、及びヌクレオチド誘導体液用タンク７０は、それぞれ、「≪核酸アレイ製造方法≫」において説明したＰＡＧ液、洗浄液、及びヌクレオチド誘導体液を収容している。
また、廃液タンク９０は、流路２８から、流路２９を介して排出される、又は送液ポンプ８０から図示しない流路を介して排出される、液体を収容するためのタンクである。流路２８に液体が充たされた状態で、送液ポンプ８０をさらに稼働すると、流路２８に存在していた液体が押し出され、流路２９を介して、廃液タンク９０に排出される。
【００６１】
光源４０は、フォトマスク３０の流路２８側とは逆側に、設置されている。光源４０は、ＰＡＧ液に含有されるＰＡＧが、酸を発生する波長の光を発生する。ＰＢＧがＰＡＧと異なる波長で塩基を発生する場合、光源４０は、ＰＢＧが塩基を発生する波長の光を照射できる光源を含んでいてもよい。また、ＴＢＧを含む場合には、光源４０は、ＴＢＧが塩基を発生する温度に加熱可能な赤外線などの熱線を放射できるようにしてもよい。光源４０は、使用するＰＡＧ（及びＰＢＧ）に応じて選択することができ、例えば、高圧水銀灯、半導体レーザー、エキシマレーザー、キセノンランプ等が使用される。
【００６２】
核酸アレイ製造装置１００において、ＰＡＧ液供給部は、ＰＡＧ液用タンク５０、送液ポンプ８０、及び流路２１，２４，２７，２８により構成される。送液ポンプ８０が接続する流路を、流路２１，２４に切換えて、送液ポンプ８０を稼働すると、ＰＡＧ液用タンク５０から、流路２１，２４，２７を介して、固相１上の流路２８に、ＰＡＧ液が供給される。
【００６３】
核酸アレイ製造装置１００において、ＰＡＧ液排出部は、洗浄液用タンク６０、送液ポンプ８０、廃液タンク９０、及び流路２２，２５，２７，２８，２９により構成される。流路２８内にＰＡＧ液が充たされた状態で、送液ポンプ８０の流路を、流路２２，２５に切換えて、送液ポンプ８０を稼働すると、洗浄液用タンク６０から、流路２２，２５，２７を介して、流路２８に洗浄液が供給される。これにより、流路２８内に存在していたＰＡＧ液が流路２９に押し出され、廃液タンク９０に排出される。
【００６４】
核酸アレイ製造装置１００において、光源は、光源４０により構成される。光源４０が、発生した光は、フォトマスク３０を介して、流路２８内のＰＡＧ液に照射される。そのため、フォトマスク３０の形状を変えることにより、流路２８内のＰＡＧ液の所望の位置を露光することができる。
【００６５】
核酸アレイ製造装置１００において、ヌクレオチド誘導体液供給部は、ヌクレオチド誘導体液用タンク７０、送液ポンプ８０、及び流路２３，２６，２７，２８により構成される。ヌクレオチド誘導体液用タンク７０内は、各塩基のヌクレオチド誘導体液用の区画に分割されており、各区画に各塩基のヌクレオチド誘導体液が収容されている。例えば、ヌクレオチド誘導体液用タンク７０は、４区画に分割されており、各区画には、アデニン、チミン、シトシン、グアニンの４種類のヌクレオチド誘導体が、それぞれ収容されている。流路２３は、流路切換弁等により流路を切換えて、これらの区画に接続する流路のいずれか１つに接続できるようになっている。
送液ポンプ８０が接続する流路を、流路２３，２６に切換えて、送液ポンプ８０を稼働すると、ヌクレオチド誘導体液用タンク７０内で流路２３が接続する区画から、ヌクレオチド誘導体液が、流路２３，２６，２７を介して、流路２８に供給される。
【００６６】
核酸アレイ製造装置１００において、ヌクレオチド誘導体液排出部は、洗浄液用タンク６０、送液ポンプ８０、廃液タンク９０、及び流路２２，２５，２７，２８，２９により構成され、ＰＡＧ液排出部と同じ構成を共有している。流路２８内にヌクレオチド誘導体液が充たされた状態で、送液ポンプ８０の流路を、流路２２，２５に切換えて、送液ポンプ８０を稼働すると、洗浄液用タンク６０から、流路２２，２５，２７を介して、流路２８に洗浄液が供給される。これにより、流路２８内に存在していたヌクレオチド誘導体液が流路２９に押し出され、廃液タンク９０に排出される。
【００６７】
上記のような構成を備える核酸アレイ製造装置１００の動作の一例について説明する。
まず、固相１がフローセル１０の開口部１１内に設置される。固相１の流路２８側の表面は、有機シラン化合物結合後に酸分解性保護基を有する分子を有機シラン化合物に結合させる方法等により、酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化されている。
【００６８】
固相１を開口部１１内に設置した後、送液ポンプ８０に接続する流路をＰＡＧ液用タンク５０に接続する流路２１，２４に切換えて、送液ポンプ８０を稼働する。これにより、ＰＡＧ液用タンク５０から、流路２１，２４，２７を介して、固相１上の流路２８に、ＰＡＧ液が供給される。流路２８が、ＰＡＧ液で充たされた時点で、送液ポンプ８０を停止することにより、流路２８内にＰＡＧ液が滞留する。送液ポンプ８０を停止した後、流路２８内のＰＡＧ液の移動が落ち着くまで、一定時間、静置する。
【００６９】
一定時間の静置後、光源４０から、フォトマスク３０を介して、流路２８に照射する。これにより、フォトマスク３０の形状に応じて、流路２８内のＰＡＧ液の所望の位置を露光することができる。ＰＡＧ液の露光部分では、ＰＡＧが酸を発生し、この酸により、固相１上の酸分解性保護基が脱保護されて、官能基が露出する。
【００７０】
その後、送液ポンプ８０に接続する流路を洗浄液用タンク６０に接続する流路２２，２５に切換えて、送液ポンプ８０を稼働する。これにより、洗浄液用タンク６０から、流路２２，２５を介して、固相１上の流路２８に、洗浄液が供給される。そのため、流路２８内に滞留していたＰＡＧ液は、流路２９に押し出され、廃液タンク９０に排出される。流路２８内のＰＡＧ液を、洗浄液で置換した後、送液ポンプ８０を停止する。
【００７１】
次に、送液ポンプ８０に接続する流路をヌクレオチド誘導体液用タンク７０に接続する流路２３，２６に切換えて、送液ポンプ８０を稼働する。これにより、流路２３が接続するヌクレオチド誘導体液用タンク７０の区画から、ヌクレオチド誘導体液（例えば、アデニンヌクレオチド誘導体液）が、流路２３，２６，２７を介して、流路２８に供給される。流路２８が、ヌクレオチド誘導体液で充たされた時点で、送液ポンプ８０を停止することにより、流路２８内にヌクレオチド誘導体液が滞留する。送液ポンプ８０を停止した後、流路２８内のヌクレオチド誘導体液に含有されるヌクレオチド誘導体を、固相１上の脱保護された官能基に反応させるために、一定時間、静置する。これにより、ヌクレオチド誘導体が、固相１上の脱保護された官能基に結合する。
【００７２】
一定時間の静置後、送液ポンプ８０に接続する流路を洗浄液用タンク６０に接続する流路２２，２５に切換えて、送液ポンプ８０を稼働する。これにより、洗浄液用タンク６０から、流路２２，２５を介して、固相１上の流路２８に、洗浄液が供給される。そのため、流路２８内に滞留していたヌクレオチド誘導体液は、流路２９に押し出され、廃液タンク９０に排出される。流路２８内のヌクレオチド誘導体液を、洗浄液で置換した後、送液ポンプ８０を停止する。
【００７３】
その後、送液ポンプ８０に接続する流路をＰＡＧ液用タンク５０に接続する流路２１，２４に切換えて、上記工程を繰り返す。これにより、固相１上の所望の位置に、所望の配列の核酸を合成して、核酸アレイを製造することができる。
【００７４】
なお、上記の核酸アレイ製造装置１００では、露光のためにフォトマスク３０を用いたが、フォトマスク３０を用いずに、直描露光により、流路２８内のＰＡＧ液の所望の位置を露光するようにしてもよい。
また、上記の核酸アレイ製造装置１００では、プロキシミティ露光により露光を行っているが、レンズ光学系やミラー光学系を用いてプロジェクション露光を行ってもよい。
【００７５】
また、核酸アレイ製造装置１００では、流路２８からのヌクレオチド誘導体液の排出を、洗浄液用タンク６０から供給される洗浄液による置換により行う構成としているが、ヌクレオチド誘導体液排出用の洗浄液を収容するタンクを別途設け、ヌクレオチド誘導体液専用の洗浄液を用いるようにしてもよい。また、ヌクレオチド誘導体液用タンク７０内に、ヌクレオチド誘導体液用洗浄液を収容する区画を設けるようにしてもよい。
【００７６】
また、核酸合成をホスホロアミダイト法により行う場合には、キャッピング反応に必要な反応液を収容するタンク、酸化反応に必要な反応液を収容するタンク、これらのタンクに接続する流路等を備えるようにしてもよい。
【００７７】
さらに、各部を制御する制御部、露光パターンを記憶する露光パターン記憶部、核酸アレイの配列情報を記憶するアレイ配列記憶部等を備えるようにしてもよい。
さらに、各流路内を任意の液体で置換できるパージ機能を備えてもよい。
さらに各流路内の圧力を任意に調整できる調整弁を備えてもよい。
【００７８】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８０】
≪実施例１≫
［基板上でのリンカー層の形成、及び酸分解性保護基の導入］
ビーカーに、シランカップリング剤（Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド、Ｇｅｌｅｓｔ社製）を１５０ｍｇ秤量し、９０℃に加温した１５０ｍＬのイオン交換水を加えた。９０℃で５分間撹拌した後、１．５ｍＬの酢酸を添加し、さらに３０分間加熱撹拌してシラン溶液を作成した。
次に、基板となる１５０ｎｍ熱酸化膜付３インチシリコンウエハーを大気圧酸素プラズマ装置（ＹＡＰ５１０；ヤマト科学社製）で４００Ｗ×３回処理し活性化させた後、反応容器に入れ、上記シラン溶液を加えて設定温度９０℃で２０分間加熱を行った。
加熱後、容器から基板を取り出し、イソプロパノール（ＩＰＡ）に浸漬して、２８ｋＨｚ超音波洗浄を５分間行った後、窒素フローで乾燥した。その後、１２０℃で３分間加熱を行うことにより、シランを基板に定着させてリンカー層の形成を行った。
なお、必要に応じて、プラズマ処理前の基板片面にマスキングテープ（Ｎ３８０，日東電工社製）を貼り付け、ＩＰＡ洗浄する前にマスキングテープを剥離することで片面のみにリンカー層を形成した。
【００８１】
次に、酸素濃度０．０％、湿度３．３％以下の窒素雰囲気に制御したグローブボックス内にて、以下の作業を行った。
ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）−ｄＴホスホロアミダイト（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）１ｇに、テトラゾールのアセトニトリル溶液（４５０ｍＭ，  Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）を２０ｍＬ、乾燥アセトニトリル（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１０ｍＬ加えた。このようにしてＤＭＴ−ｄＴホスホロアミダイト  ４５ｍＭ溶液を３０ｍＬ調製した。
上記のようにリンカー層を形成した基板を乾燥アセトニトリルに浸漬し、窒素フローで乾燥した。乾燥後、反応容器に入れ、上記ＤＭＴ−ｄＴホスホロアミダイト溶液を加えて２分間揺動した。基板を容器から取り出し、搬送用の別容器に乾燥アセトニトリルを基板と共に入れ、グローブボックスから取り出した。
基板をアセトニトリル１００ｍＬが入った洗浄用容器に浸漬し、２８ｋＨｚ超音波洗浄を５分間行った。別の容器にアセトニトリル１００ｍＬを用意し、同様の洗浄をさらに２回、全３回行った。窒素フローで乾燥後、基板をグローブボックス内で保管した。
【００８２】
［ＰＡＧ液の調製］
ガラス容器内のメタノール（和光純薬工業社製）に対し、ＰＡＧ（ＣＰＩ−２１０Ｓ、サンアプロ社製）を１．０質量％となるように添加した。２８ｋＨｚ超音波を５分間照射して、ＰＡＧをメタノールに完溶させ、ＰＡＧ液を作成した。
【００８３】
［基板上へのＰＡＧ液の供給］
上記のように調製した基板（固相１）を、図４に示すようにフローセル１０内に設置し、流路２８を挟んでフォトマスク３０を設置し固定した。前記基板（固相１）はリンカー層を形成した面を流路２８に接するように固定し、フォトマスク３０はクロムパタン側を流路に接するよう固定した。図５に示すように、開口部１１の入口に送液ポンプ８０(Ｓｙｒｙｓ製マイクロ流路用シリンジポンプ)を接続し、送液ポンプ８０にはＰＡＧ液用タンク５０と洗浄液用タンク６０を接続した。流路出口は廃液タンク９０へ接続した。
フローセル内の流速分布・パージ条件は、ＰＩＶ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｉｍａｇｅ  Ｖｅｌｏｃｉｍｅｔｒｙ：粒子画像流速測定法）解析を行って最適化した。
上記のように基板及びフォトマスクを設置したフローセル内に、ＰＡＧ液を送液・充填した後、送液を停止した。
【００８４】
［パターニング及びＰＡＧ液の除去］
ＰＡＧ溶液の送液停止後、６０秒間静置し、３６５ｎｍのＵＶ光を、フォトマスクを介して、セル内のＰＡＧ溶液に、５００ｍＪ／ｃｍ２照射した。
露光後、洗浄液としてメタノール１００ｍＬをセル内に送液することで、セル内のＰＡＧ溶液を置換・パージした。さらに、窒素をパージした後、基板を取り出した。
【００８５】
［パターニングの評価］
飛行時間二次イオン質量分析計（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：  ＴｏＦ−ＳＩＭＳ）を用いて基板上の有機化学構造の質量を分析・解析し、質量分布によるマッピング評価を行った。分析に際しては、基板をアセトンに浸漬して洗浄を行った。
酸による脱保護部分のＭＳスペクトルを図６に示した。分子イオンピークに相当するｍ／ｚ＝４８７（図７）が検出されており、脱保護構造の帰属が可能であった。また、１００μｍ角のフォトマスクに応じたパターン状に、脱保護されていることが確認できた。
【００８６】
≪実施例２≫
［ＰＡＧ液の調製］
ＰＡＧ液の調製を、メタノールに替えてイソプロパノールを用いて、実施例１と同様に行った。
【００８７】
［パターニング試験方法］
実施例１と同様にパターニング試験を行った。
【００８８】
［パターニングの評価］
実施例１と同様に、ＴｏＦ−ＳＩＭＳを用いて基板上の有機化学構造の質量を分析・解析し、質量分布によるマッピング評価を行った。分析に際しては、基板をアセトンに浸漬し洗浄を行った。
酸による脱保護部分のＭＳスペクトルを図８に示した。分子イオンピークに相当するｍ／ｚ＝４８７（図７）が検出されており脱保護構造の帰属が可能であった。また、１００μｍ角のフォトマスクに応じたパターン状に、脱保護されていることが確認できた。
【００８９】
≪実施例３≫
［ＰＡＧ液の調製］
ガラス容器内のメタノール（和光純薬工業社製）に対し、ＰＡＧ（ＣＰＩ−２１０Ｓ、サンアプロ社製）を１．０質量％となるように添加した。さらに、ＰＢＧ（ＸＡＡ−ＴＢＤ、東京化成工業社製）を１．０質量％となるように添加した。２８ｋＨｚ超音波を５分間照射し、ＰＡＧ及びＰＢＧをメタノールに完溶させ、ＰＡＧ液を作成した。
【００９０】
［パターニング試験方法］
３６５ｎｍのＵＶ光を、フォトマスクを介して、セル内のＰＡＧ液に、１０００ｍＪ／ｃｍ２照射した以外は、実施例１と同様にパターニング試験を行った。
【００９１】
［パターニングの評価］
実施例１と同様に、ＴｏＦ−ＳＩＭＳを用いて基板上の有機化学構造の質量を分析・解析し、質量分布によるマッピング評価を行った。分析に際しては、基板をアセトンに浸漬し洗浄を行った。
酸による脱保護部分のＭＳスペクトルを図９に示した。分子イオンピークに相当するｍ／ｚ＝４８７（図７）が検出されており脱保護構造の帰属が可能であった。また、１００μｍ角のフォトマスクに応じたパターン状に、脱保護されていることが確認できた。
【００９２】
以上の結果より、上記いずれの実施例においても、露光部分のみ水酸基を生成させることができたことから、本技術は、ホスホロアミダイト法などの人工核酸合成法などを用いることで、光加工を用いた核酸アレイの作製を可能とするものと言える。
【００９３】
≪参考例≫
上記実施例３においてＰＡＧ液の調製に用いたＰＡＧ及びＰＢＧについて、露光量に対する反応効率を評価した。
前記ＰＡＧ及びＰＢＧを、それぞれ５０μＭのアセトニトリル溶液として調製した。ＰＡＧ及びＰＢＧの各アセトニトリル溶液について、各露光量における吸光度を測定した。０ｍＪ／ｃｍ２での吸光度に対する、吸光度が飽和したときの露光量における吸光度の変化量を１．０として、各露光量におけるＰＡＧ及びＰＢＧの反応効率を算出した。
また、実施例３で調製したＰＡＧ液（ＰＡＧ及びＰＢＧを各１質量％含有）において、各露光量での酸濃度を測定した。
その結果を図１０に示す。ＰＡＧ及びＰＢＧは、共に、５００〜１０００ｍＪ／ｃｍ２でほぼ反応を完了するが、０〜１００ｍＪ／ｃｍ２の範囲においては、ＰＡＧによる酸発生効率が僅かに上回ることが確認された。この範囲では、ＰＡＧ液は僅かに酸性となり、その後中和されることが確認された。
この結果は、ＰＡＧよりも、僅かに反応速度が遅いＰＧＢを、ＰＡＧ液中に混在させることにより、ＰＡＧにより発生した酸を速やかに中和できることを示す。
【符号の説明】
【００９４】
１…固相、２…ＰＡＧ液、３…露光された部分のＰＡＧ液、４…洗浄液、５…ヌクレオチド誘導体、６…ヌクレオチド誘導体液、１０…フローセル、１１…開口部、２１〜２９…流路、３０…フォトマスク、４０…光源、５０…ＰＡＧ液用タンク、６０…洗浄液用タンク、７０…ヌクレオチド誘導体液用タンク、８０…送液ポンプ、９０…廃液タンク、１００…核酸アレイ製造装置
【図１】
2018110554.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2018110554.tif 000008
【図７】
2018110554.tif 000009
【図８】
2018110554.tif 000010
【図９】
2018110554.tif 000011
【図１０】
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