(57)【要約】【課題】細胞などの被培養物を複数のウェルに対して均一的に分散して配置することが可能な培養容器を提供する。【解決手段】本発明の培養容器は、複数のウェル及び隔壁部を備えている。隔壁部は、中央が高さ方向に凹んだ形状を有しウェルどうしを区画する。【選択図】図３Ａ
2018085978.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のウェルと、
中央が高さ方向に凹んだ形状を有し前記ウェルどうしを区画する隔壁部と、
を備える培養容器。
【請求項２】
前記隔壁部は、円弧状に凹んでいる、
請求項１に記載の培養容器。
【請求項３】
前記隔壁部の先端部分は、とがった形状で構成されている、
請求項１又は２に記載の培養容器。
【請求項４】
前記隔壁部は、格子状またはハニカム状に配列されている、
請求項１から３までのいずれか１項に記載の培養容器。
【請求項５】
前記隔壁部は、交点部分の高さが最も高い、
請求項４に記載の培養容器。
【請求項６】
前記隔壁部における円弧状に凹んでいる部位の深さｈとウェルの深さｄの関係であるｈ／ｄが０．１以上０．６以下である、
請求項２から５までのいずれか１項に記載の培養容器。
【請求項７】
前記隔壁部における凹みの深さｈが１０μｍ以上６００μｍ以下である、
請求項１から６までのいずれか１項に記載の培養容器。
【請求項８】
前記複数のウェル及び前記隔壁部を構成している材料は、ガラスである、
請求項１から７までのいずれか１項に記載の培養容器。
【請求項９】
前記複数のウェル及び前記隔壁部は、所定の基材上に設けられており、
前記基材が取り付けられた容器本体をさらに備える、
請求項１から８までのいずれか１項に記載の培養容器。
【請求項１０】
前記複数のウェル及び前記隔壁部のそれぞれの表面には、細胞の接着を抑制するための表面処理が施されている、
請求項１から９までのいずれか１項に記載の培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞などの被培養物を培養するための培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えばヒトや動物由来の細胞を培養容器などで人工的に培養しつつ三次元的に凝集させるスフェロイド培養が知られている。スフェロイド培養は、生体内で細胞どうしが相互に作用する三次元的細胞構造に近い状態を構築できるため、単層培養などに比べて、より特異的な機能を引き出すことが可能となる。
【０００３】
ここで、細胞の培養容器としては、細胞の収容部となる各ウェルの最下面に、細胞低接着性の表面を有する窪みを設けた培養容器などが提案されている（特許文献１参照）。また、複数のウェルと隣り合うウェル間に介在された土手部とを備え、このウェルと土手部とを連続的な曲面で構成した培養容器なども知られている（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−５０１９４号公報
【特許文献２】国際公開第２０１２／０３６０１１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、このような培養容器では、均一な大きさのスフェロイド（細胞凝集塊）を得るためにも、培養の対象となる複数の細胞を、培養容器内の各ウェルに対して均一に分散して配置することが重要であり、この点において改善が求められている。
【０００６】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、細胞などの被培養物を複数のウェルに対して均一的に分散して配置することが可能な培養容器の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の培養容器は、複数のウェル及び隔壁部を備えている。隔壁部は、高さ方向に中央が凹んだ形状を有しウェルどうしを区画する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、細胞などの被培養物を、各ウェルに対して均一的に分散して配置することが可能な培養容器を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る培養容器を概略的に示す平面図。
【図２】図１の培養容器の構造を概略的に示す垂直断面図。
【図３Ａ】図１の培養容器が備える培養基材の構造を拡大して示す斜視図。
【図３Ｂ】図３Ａに示す培養基材のＡ−Ａ断面図。
【図３Ｃ】図３Ａに示す培養基材のＢ−Ｂ断面図。
【図４Ａ】隔壁部をハニカム状に配列した培養基材の構造を拡大して示す斜視図。
【図４Ｂ】図４Ａに示す培養基材のＣ−Ｃ断面図。
【図５Ａ】図３Ａの培養基材の母材となるガラス基板を示す断面図。
【図５Ｂ】図５Ａのガラス基板に種穴を形成した状態を示す断面図。
【図５Ｃ】図５Ｂの種穴を設けたガラス基板にエッチングを施してウェルを形成した状態を示す断面図。
【図６】図３Ａの培養基材の製造方法を示すフローチャート。
【図７】本発明の第２の実施形態に係る培養容器を概略的に示す平面図。
【図８】図７の培養容器の構造を概略的に示す垂直断面図。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づき説明する。
＜第１の実施の形態＞
図１、図２に示すように、本実施形態の培養容器１０は、被培養物である細胞を培養しつつ、培養の過程で細胞を三次元的に凝集させたスフェロイド（細胞凝集塊）を得るための有底円筒状の細胞培養容器である。この培養容器１０内には、細胞及び培養液（培地）が収容される。なお、培養容器１０の形状は、有底円筒状に限らず、例えばプレート型やフラスコ型の形状を採用することも可能である。
【００１１】
図１〜図３Ａに示すように、培養容器１０は、円板状の底部１２、周壁部１１及び例えばリング状の脚部１２ｂを含む樹脂製の容器本体（ディッシュ）１６と、複数のウェル（ｗｅｌｌ）２１が形成された培養面１５ａを有するガラス製の培養基材１５と、を備えている。培養基材１５は、所定数のウェルを有する基材単体（単一の基材）として構成されていてもよいし、所定数のウェルを有する前記の基材単体を複数個まとめてユニット化したものを適用することも可能である。また、このような培養基材１５は、矩形状に形成されている。一方、容器本体１６の底部１２には、培養基材１５よりもわずかに小さいサイズの矩形状の貫通穴１２ａが穿孔されている。
【００１２】
培養基材１５は、その培養面１５ａが、貫通穴１２ａに臨む（貫通穴１２ａから露出する）ようにして、当該培養基材１５における培養面１５ａ側の周縁部１５ｂが、底部１２の下面における貫通穴１２ａの外縁部分に取り付けられている（接合されている）。培養基材１５の周縁部１５ｂは、ウェル２１の形成されていない平坦部として構成されており、接合対象となる容器本体１６の底部１２との密着性が高められている。
【００１３】
周壁部１１は、底部１２の周縁部分から立ち上がった形状（周縁部分を起立させた状態）で構成されている。なお、容器本体１６が備える底部１２、周壁部１１及び脚部１２ｂは、一体部品によって構成されていてもよいし、それぞれが個別の部品で構成されていてもよい。また、培養容器１０は、容器本体１６の上端の開口部を覆うための蓋体などを備えることも可能である。また、図２に示すように、培養基材１５よりも底部側に突出するリング状の脚部１２ｂを位置合わせに利用することによって、複数の培養容器１０を重ねた状態で保管することなどが可能となる。
【００１４】
ここで、培養基材１５の構造について詳述する。図３Ａ〜図３Ｃに示すように、培養基材１５の培養面１５ａ上における複数のウェル２１は、細胞を収容して培養し、スフェロイドを得るための隔室（窪み部）である。また、培養面１５ａ上には、隣り合うウェル２１どうしを区画する隔壁部２２が設けられている。この隔壁部２２は、中央（中央部分）が高さ方向に凹んだ形状を有する。
【００１５】
詳述すると、隔壁部２２は、図３Ｂに示すように、当該隔壁部２２の厚さ方向から観て（隔壁部２２の稜線に沿って切断したＡ−Ａ断面を観ると）円弧状に凹んでいる。また、図３Ｂ、図３Ｃに示すように、隔壁部２２の先端部分は、とがった形状で（突起状に）構成されている。さらに、このような隔壁部２２は、図３Ａに示すように、格子状に配列されている。ここで、ウェル２１内で培養される細胞を顕微鏡で観察する際に、図３Ａに示す格子状に配列された隔壁部２２の稜線を、顕微鏡の走査方向のＸ軸、Ｙ軸の基準出しなどに利用することも可能である。また、ウェル２１及び隔壁部２２を含む培養基材１５の材料をガラス製としたことで、光透過性が良好となり、顕微鏡による視認性を高めることができる。
【００１６】
なお、格子状に配列された隔壁部２２の稜線と矩形状の培養基材１５本体のいずれかの辺部とは平行な位置関係を有する。また、図３Ａ〜図３Ｃに示すように、格子状に配列されている隔壁部２２は、交点部分２２ａの高さが最も高くなるように構成され、一方、交点部分２２ａどうしの間の中央部分の高さが最も低くなるように構成されている。
【００１７】
本実施形態の培養容器１０では、培養の対象となる複数の細胞（細胞懸濁液）を当該培養容器１０内に投入した後、培養容器１０本体を揺動させることで、中央の凹んだ隔壁部２２を介して複数のウェル２１間を細胞が比較的容易に移動することになる。これにより、複数の細胞を、培養容器１０内の各ウェル２１に対して均一的に分散して配置することができる。この結果、各ウェル２１内では、均一な大きさのスフェロイド（細胞凝集塊）を得ることが可能となる。なお、図３Ａ〜図３Ｃでは、隔壁部２２が格子状に配列されている例を示しているが、図４Ａ及び図４Ｂに示すように、隔壁部２２をハニカム状に配列させてもよい。
【００１８】
ここで、隔壁部２２における円弧状に凹んでいる部位の深さｈとウェル２１の深さｄの関係であるｈ／ｄが０．１以上、０．６以下であれば好ましく、ｈ／ｄが０．２以上、０．５以下であればより好ましく、ｈ／ｄが０．３以上、０．４以下であればさらに好ましい。
ｈ／ｄが０．１以上であればウェル２１間での細胞の移動がスムースに行われ、０．６以下であれば、スフェロイド培養時にウェル２１間でのスフェロイド細胞の移動が容易に起こりにくく、スフェロイド細胞が安定するためである。
また、図３Ｃ、図４Ｂに示すように、隔壁部２２における凹みの深さｈが１０μｍ以上６００μｍ以下であれば好ましく、ｈが２０μｍ以上５００μｍ以下であればより好ましく、ｈが３０μｍ以上３００μｍ以下であればさらに好ましい。深さｈは単細胞のサイズによって適宜選択されるが、深さｈが１０μｍ以上であれば単細胞が乗り越えやすくなり、深さｈが６００μｍ以下であればスフェロイド培養時にウェル２１間でのスフェロイド細胞の移動が容易に起こりにくく、スフェロイド細胞が安定するためである。
上記した円弧状に凹んでいる部位の深さｈは、複数形成されるウェルが略等間隔に形成されている場合には、個々のウェルで略同一の深さである。一方、等間隔でないときには、個々のウェルで深さｈが異なる場合がある。このときは隔壁部全てでｈ／ｄが０．１以上、０．６以下を満たすことが好ましい。
【００１９】
また、上述したように、隔壁部２２の先端部分は、図３Ｃ、図４Ｂに示すように、とがった形状で（突起状に）構成されている。つまり、隣り合うウェル２１どうしの境界部分には平坦な面がないため、ウェル２１の境界部分に細胞が留まることなどが抑制され（播種された細胞がウェル２１内に確実に落ち込み）、これにより、細胞がスフェロイドにならないことを抑制することが可能となる。ここで、細胞がスフェロイドにならないという意味は、単層培養や単細胞浮遊培養、球状とならない積層培養、細胞が培養面に接着された状態の培養、スフェロイドに取り込まれずに単細胞の状態で死んでしまうものなどを含む。
【００２０】
また、ウェル２１は、培養面１５ａの単位面積あたり、１０個／ｃｍ2〜２００００個／ｃｍ2、形成することが好ましい。より好ましくは、１５個／ｃｍ2〜１００００個／ｃｍ2、さらに好ましくは、２０個／ｃｍ2〜５０００個／ｃｍ2である。なお、本実施形態において、数値範囲を示す「〜」は、その前後に記載された数値を下限値及び上限値として含む意味で使用している。
【００２１】
さらに、上記した複数のウェル２１及び隔壁部２２のそれぞれの表面（培養面１５ａ）には、細胞の接着を抑制するための表面処理が施されている。具体的には、細胞接着抑制剤（タンパク質低接着剤）を用いた被膜（コート層）がウェル２１及び隔壁部２２の表面に形成されている。この細胞接着抑制剤としては、例えばリン脂質ポリマー（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンなど）、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、フッ素含有化合物、若しくは、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。ウェル２１及び隔壁部２２を含む培養面１５ａに、このような被膜が形成されていることで、細胞は培養面に接着することがないため、細胞どうしで凝集してスフェロイドを形成され、また、ウェル２１内からのスフェロイドの取り出しも容易になる。
【００２２】
次に、培養容器１０が備える培養基材１５の製造方法を主に図５Ａ〜図５Ｃに示す断面図及び図６に示すフローチャートに基づき説明する。図５Ａ、図６に示すように、まず、培養基材１５の母材となる矩形状のガラス基板（例えば縦７５ｍｍ×横２５ｍｍ［又は６インチ角］×厚さ０．５ｍｍの無アルカリガラス基板）１５ｃを用意する（Ｓ［ステップ］１）。
【００２３】
次に、ガラス基板１５ｃの上下面（一方及び他方の主面）にＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）フィルムを貼り付ける（Ｓ２）。続いて、ＣＯ2レーザを用い、図５Ｂ、図６に示すように、ガラス基板１５ｃの培養面の形成側（上面側）に、ウェルの基になる複数の種穴１５ｄを所定のピッチ（例えば８００μｍピッチ）で穿孔する（Ｓ３）。種穴１５ｄの形成後、ＰＥＴフィルムをガラス基板１５ｃから剥離し（Ｓ４）、例えば７１０℃の温度環境を１時間継続させる条件でアニールを行う（Ｓ５）。
【００２４】
次いで、ガラス基板１５ｃの非培養面側（下面側）に保護フィルムを貼り付けた後（Ｓ６）、フッ酸のかけ流しによるシャワーエッチングを行う（Ｓ７）。これにより、図５Ｃに示すように、培養面１５ａ上に複数のウェル２１及び隔壁部２２が形成される。この場合のエッチングは、等方エッチングであるため、ウェル２１の深さは、種穴１５ｄの深さとなり、ウェル２１の幅方向のサイズは、エッチング時間に依存することになる。なお、シャワーエッチングでは、残渣（アルミニウムとフッ酸との反応による不要な生成物）の発生を抑える。また、このようなシャワーエッチングに代えて、エッチング液にガラス基板１５ｃ全体を浸漬させる一般的なエッチングを適用してもよい。なお、ここで用いることができるガラスは、ソーダ石灰ガラス、ホウ珪酸ガラス、石英ガラス、化学強化用ガラス等が挙げられる。
【００２５】
この後、例えば培養基材の複数個取り用のガラス基板を適用している場合、このガラス基板を基材単位（培養基材１５の単位）に切断し（Ｓ８）、さらに、検査、洗浄を行う（Ｓ９）。次いで、シランカップリング剤を加水分解した細胞非接着用のコーティング材料を培養面１５ａに室温で塗工した後、例えば１２０℃の温度環境を２時間継続させる加熱乾燥によって、細胞非接着コート層を培養面１５ａ上に形成する（Ｓ１０）。
【００２６】
続いて、γ線による滅菌処理では、ガラス製の材料を変色させてしまうため、これを用いずに、細胞非接着コートを形成した上記のガラス製の基材に対して、ＥＯＧ滅菌（６０℃のエチレンオキサイドガスを用いた滅菌）又はオートクレーブ滅菌（１２１℃の飽和水蒸気中での２０分間の滅菌）を施す（Ｓ１１）。このような滅菌処理を経ることで、培養基材１５を得ることができる（Ｓ１２）。
【００２７】
次に、本実施形態に係る培養容器１０を用いたスフェロイドの形成方法について説明する。まず、培養の対象となる複数の細胞（細胞懸濁液）を培養容器１０内に投入した後、培養容器１０本体を揺動させることで、複数の細胞を、中央の凹んだ隔壁部２２を介して、ウェル２１どうしの間で移動させ、これによって、培養容器１０内の各ウェル２１に対して、複数の細胞を均一的に分散して配置する。
【００２８】
この後、培養液（培地）を添加した培養容器１０は、数時間〜数日間、例えば３７℃、飽和水蒸気下、５％炭酸ガス雰囲気に保たれた培養装置内で培養やインキュベートが行われる。ウェル２１内の細胞は、ウェル２１の内面に細胞接着抑制剤を用いた被膜が形成されているため、ウェル２１や隔壁部２２に接着することなく、細胞どうしが接着して、スフェロイド（細胞凝集塊）が形成される。この際、細胞は、ウェル２１の形状及び大きさに対応して、三次元的に凝集する。この後、さらに培養を継続することにより、スフェロイドを構成する細胞は増殖及び分化して、任意の生理活性を示すようになる。
【００２９】
既述したように、本実施形態の培養容器１０によれば、培養の対象となる細胞を、各ウェルに対して均一的に分散して配置することができる。これにより、大きさの均一化されたスフェロイドを得ることが可能となる。
【００３０】
＜第２の実施の形態＞
次に、第２の実施形態を図７及び図８に基づき説明する。なお、図７及び図８において、図１及び図２に示した第１の実施形態中の構成要素と同一の構成要素については、同一の符号を付与し重複する説明を省略する。
【００３１】
図７、図８に示すように、第２の実施形態に係る培養容器３０は、第１の実施形態の培養容器１０が備えていた容器本体１６及び矩形状の培養基材１５に代えて、容器本体３６及び円板状のガラス製の培養基材３５を備えている。培養容器３０の容器本体３６における底部３２には、貫通穴が形成されておらず、図７、図８に示すように、円板状の培養基材３５は、容器本体３６の底部３２の上面に接合されている。また、培養基材３５には、培養基材１５と同様に、図３Ａに示した構造の複数のウェル２１及び隔壁部２２が培養面３５ａに設けられている。
【００３２】
ここで、培養面１５ａ側（培養基材１５の平坦な周縁部１５ｂ）を容器本体１６に接合していた培養容器１０とは異なり、培養容器３０は、培養面３５ａの背面側（非培養面側）が容器本体３６と接合されている。このため、培養基材３５の周縁部３５ｂにもウェル２１が形成されている。このようなスペースの有効的な活用により、効率的に細胞を培養することができる。
【００３３】
なお、培養基材３５の周縁部３５ｂにウェルを形成することに代えて、培養基材３５の周縁部３５ｂを平坦部として構成することも可能である。この平坦な周縁部３５ｂに、個々のウェルを特定するための識別番号など示す数字（番地）やマークを記すようにしてもよい。
【００３４】
第２の実施形態に係る培養容器３０によれば、第１の実施形態の培養容器１０と同様に、培養の対象となる細胞を、各ウェルに対して均一的に分散して配置することが可能であると共に、培養容器本体の構造の簡略化や細胞を培養する際の効率化などを図ることができる。
【００３５】
以上、本発明を実施の形態により具体的に説明したが、本発明はこの実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々変更可能である。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよいし、上記実施形態に開示されている複数の構成要素を適宜組み合わせることも可能である。例えば、ガラス製の培養基材１５、３５に代えて、樹脂製の培養基材を適用してもよい。樹脂製の培養基材の場合、ウェルの種穴を、金型成形やリヒートプレス加工などによって形成することが可能となる。
【符号の説明】
【００３６】
１０，３０…培養容器、１５，３５…培養基材、１５ａ，３５ａ…培養基材の培養面、１５ｂ，３５ｂ…培養基材の周縁部、１５ｃ…ガラス基板、１５ｄ…種穴、１６，３６…容器本体、２１…ウェル、２２…隔壁部、２２ａ…隔壁部の交点部分。
【図１】
2018085978.tif 000003
【図２】
2018085978.tif 000004
【図３Ａ】
2018085978.tif 000005
【図３Ｂ】
2018085978.tif 000006
【図３Ｃ】
2018085978.tif 000007
【図４Ａ】
2018085978.tif 000008
【図４Ｂ】
2018085978.tif 000009
【図５Ａ】
2018085978.tif 000010
【図５Ｂ】
2018085978.tif 000011
【図５Ｃ】
2018085978.tif 000012
【図６】
2018085978.tif 000013
【図７】
2018085978.tif 000014
【図８】
2018085978.tif 000015