(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、希釈倍率や濃度の異なる複数の測定試料のクロマトグラムに対して、ピーク検出感度を自動で決定する方法を提供するものである。【解決手段】  異なる希釈倍率の試料をクロマトグラフィで測定することによる検量線作成方法であって、特定のピークが検出可能なクロマトグラムが得られる試料の希釈倍率を標準希釈倍率、前記標準希釈倍率の試料を測定する際のピーク検出感度を標準ピーク検出感度とし、前記標準希釈倍率の試料以外の試料を測定する際に、前記標準ピーク検出感度を前記試料の希釈倍率に対する前記標準希釈倍率の比で乗算した値を、ピーク検出感度として用いることを特徴とする前記方法。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる希釈倍率の試料をクロマトグラフィで測定することによる検量線作成方法であって、
特定のピークが検出可能なクロマトグラムが得られる試料の希釈倍率を標準希釈倍率、
前記標準希釈倍率の試料を測定する際のピーク検出感度を標準ピーク検出感度とし、
前記標準希釈倍率の試料以外の試料を測定する際に、前記標準ピーク検出感度を前記試料の希釈倍率に対する前記標準希釈倍率の比で乗算した値を、ピーク検出感度として用いることを特徴とする前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、希釈倍率の異なる複数の測定試料のクロマトグラムに対して、測定試料ごとにピーク検出感度を自動で決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィは複数成分を含む試料をカラムで分離定量する方法である。一般的には、各成分ピークの溶出時間から定性を行い、検出器の出力度合により定量を行う。定量分析を行う際、希釈倍率の異なる複数の標準試料を用いて目的ピークの検量線を作成する必要があり、正確にピークを検出し、そのピークの面積または高さを算出することが重要となる。
【０００３】
ピークの検出は、時間当たりの検出器の出力の変化量、つまり、クロマトグラムの微分値の変化を基に行うのが一般的である。前記変化量が事前に定めたピーク検出感度を閾値としてピークスタート点およびピークエンド点を決定し、ピーク高さ、面積等を算出する。
【０００４】
ピーク検出感度は、濃度の異なる測定試料の全ピークが検出できるように、デフォルトの閾値として指定されたピーク検出感度から各クロマトグラムに最適なピーク検出感度へ手入力により変更し、クロマトグラム毎にピーク検出結果を確認し、正常にピーク検出ができなかった場合は再度、ピーク検出感度を手入力により変更する必要がある。
【０００５】
図１、２に希釈倍率の異なる標準試料を単一のピーク検出感度を用いてピーク検出を試みた結果を示す。ピーク検出感度をピークスタートで２．０００μＳ／ｍｉｎ、ピークエンドで−２．０００μＳ／ｍｉｎとしたところ、図１ａに示すクロマトグラムの一次微分値は図１ｂとなり、ピークスタート点とピークエンド点が一点ずつ検出され、正しくピーク検出ができていることがわかる。一方、図２ａに示すクロマトグラムの一次微分値は図２ｂとなり、ピークスタート点とピークエンド点いずれも検出されず、ピークが検出されていないことがわかる。
【０００６】
目的のピークが自動で検出されないクロマトグラムに対しては、ピーク検出感度を操作者がクロマトグラム毎に手作業により指定する方法がとられている。しかし、操作者に依存したピーク検出手法は、操作者の主観的判断や作業習熟度により解析結果が変化するため、クロマトグラフィの定量性を損ない、計測手法としての信頼性を失う。また、希釈倍率が異なる複数の標準試料のクロマトグラムに含まれるすべての目的ピークを単一の検出感度にて自動検出しようとした場合、もっとも微分値が小さいピーク以下になるようにピーク検出感度を指定しなければならない。この場合、クロマトグラムに含まれるノイズや夾雑物による不要ピークを検出してしまうといった問題がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、検量線作成時に希釈倍率の異なる複数の試料を測定する際に、試料ごとにピーク検出感度を自動で調整し、適切なピーク検出が可能となる方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、クロマトグラムのピークの一次微分値が、測定試料の希釈倍率によって変化することに着目し、目的ピークが正しく検出されている基準クロマトグラムのピーク検出感度を、測定試料の希釈倍率を用いて補正することで、操作者の判断を不要としたピーク検出感度の自動決定方法を見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、
異なる希釈倍率の試料をクロマトグラフィで測定することによる検量線作成方法であって、
特定のピークが検出可能なクロマトグラムが得られる試料の希釈倍率を標準希釈倍率、
前記標準希釈倍率の試料を測定する際のピーク検出感度を標準ピーク検出感度とし、
前記標準希釈倍率の試料以外の試料を測定する際に、前記標準ピーク検出感度を前記試料の希釈倍率に対する前記標準希釈倍率の比で乗算した値を、ピーク検出感度として用いることを特徴とする。
【００１０】
以下に、本発明の検量線作成方法を詳細に説明する。
【００１１】
本発明の検量線作成方法も、一般的な作成方法と同じく、既知試料を異なる希釈倍率で希釈した試料を複数用意し、同一条件でクロマトグラフィ測定を行い、各ピークごとに縦軸を濃度、横軸をピーク面積としてプロットしていく。用意する試料の数は最低２つ必要だが、検量線の精度にも影響するため、好ましくは２以上である。また、希釈倍率は既知試料に含まれる成分の含有量にもよるが、１〜１０００倍の範囲から選択すれば問題ない。
【００１２】
まず、特定のピークが検出可能なクロマトグラムが得られる試料の希釈倍率を標準希釈倍率として定める。ここで言う「特定のピーク」とは任意のもので問題ないが、検量線作成を目的とするピークのうち試料中に少量しか含まれていない（クロマトグラム上小さなピークしか得られない）成分とすることが好ましい。標準希釈倍率とする試料は、特定のピークが検出可能であれば特に制限はないが、検量線作成用に準備した試料の中で最も希釈倍率の低い試料を選択することが好ましい。
【００１３】
本発明では、標準希釈倍率の試料を測定する際に設定されているピーク検出感度が標準ピーク検出感度となる。デフォルト値などであらかじめ指定された値がノイズや夾雑物による不要ピークを検出してしまうような値で設定されている場合は、ピーク検出感度を下げて標準希釈倍率の試料を測定する方が好ましく、また、デフォルト値などであらかじめ指定された値が目的とするピークを正しく検出できないような値で設定されている場合は、ピーク検出感度を上げて標準希釈倍率の試料を測定する方が好ましい。ただし、実際に標準希釈倍率の試料を測定する際に使用したピーク検出感度を標準ピーク検出感度とすれば問題ない。
【００１４】
標準希釈倍率と標準ピーク検出感度が決定したら、次に標準希釈倍率の試料以外の試料を測定していく。この際に、標準ピーク検出感度を、測定する試料の希釈倍率に対する標準希釈倍率の比で乗算した値をピーク検出感度として用いる。例えば、標準希釈倍率が１０倍、標準ピーク検出感度がピークスタートで２．０００μＳ／ｍｉｎ、ピークエンドで−２．０００μＳ／ｍｉｎの場合、測定する試料の希釈倍率が２０倍であれば、測定する試料の希釈倍率（２０倍）に対する標準希釈倍率（１０倍）の比は０．５（１０倍／２０倍）となるため、標準ピーク検出感度を０．５で乗算し、ピークスタートで１．０００μＳ／ｍｉｎ、ピークエンドで−１．０００μＳ／ｍｉｎというピーク検出感度を用いればよい。
【００１５】
本発明の方法は、測定者自身が自動的に算出されるピーク検出感度を手入力で変更することで実施してもよく、装置がプログラムでピーク検出感度を自動的に変更しても問題ない。
【発明の効果】
【００１６】
本発明では、クロマトグラムを取得した後、適切なピーク検出感度により、定量計算まで適切かつ自動に行うことが可能になり、操作者の負担低減および定量計算の信頼性を高めることが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】一般的な希釈倍率が低い測定試料に対するピーク検出結果を示した図である。
【図２】一般的な希釈倍率が高い測定試料に対するピーク検出結果を示した図である。
【図３】実施例１で使用したシステム構成を示した図である。
【図４】一般的なピーク検出結果を用いて作成した検量線を示した図である。
【図５】本発明での希釈倍率が高い測定試料に対するピーク検出結果を示した図である。
【図６】本発明のピーク検出結果を用いて作成した検量線を示した図である。
【実施例】
【００１８】
本発明の効果を、イオンクロマトグラフィ装置を用いて検証を行ったが、これらは本発明の一実施形態であり、本発明を限定するものではない。
【００１９】
本実施例において、図３に示すイオンクロマトグラフィシステムを使用した。
【００２０】
システムは、溶媒脱気装置（２）、送液ポンプ（３）、試料注入バルブ（４）、カラムオーブン（６）、サプレッサ（７）、電気伝導度検出計（８）、データ処理装置（１０）にて構成される。
【００２１】
分析カラム（５）としては、東ソー（株）製  ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＩＣ−Ａｎｉｏｎ ＨＳを使用した。
【００２２】
測定試料には標準陰イオン試料（フッ化物イオン１ｍｇ／Ｌ、塩化物イオン１ｍｇ／Ｌ、亜硝酸イオン５ｍｇ／Ｌ、臭化物イオン５ｍｇ／Ｌ、硝酸イオン５ｍｇ／Ｌ、燐酸イオン１０ｍｇ／Ｌ、硫酸イオン５ｍｇ／Ｌ）を２０倍希釈（相対濃度１．０００）、４０倍希釈（相対濃度０．５００）、８０倍希釈（相対濃度０．２５０）、１６０倍希釈（相対濃度０．１２５０）、３２０倍希釈（相対濃度０．０６３）、６４０倍希釈（相対濃度０．０３１）したものを使用した。
【００２３】
その他の条件は下記の通りである。
【００２４】
注入量：３０μＬ、カラムオーブン温度：４０℃、溶離液流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液：３．８ｍＭ炭酸水素ナトリウム＋３．０ｍＭ炭酸ナトリウム、サプレッサゲル：ＴＳＫｇｅｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ＩＣ−Ａ
（実施例１）
本発明の方法を、前記測定試料と前記イオンクロマトグラフィシステムを使用して、検証した。なお、検量線の作成対象は  塩化物イオン（基準溶出時間  １．８〜２．０５分）とした。
【００２５】
まず、従来法に従い、単一の検出感度であるピークスタート検出感度を２．０００μＳ／ｍｉｎ、ピークエンド検出感度を−２．０００μＳ／ｍｉｎに設定して試料の測定を行った。その結果、６４０倍希釈した試料（相対濃度０．０３１）では、ピークが検出できず検量線としてプロットできなかった（図４参照）。
【００２６】
次に、本発明の方法で検量線作成を行った。２０倍希釈した試料を標準希釈倍率とし、ピークスタート検出感度を２．０００μＳ／ｍｉｎ、ピークエンド検出感度を−２．０００μＳ／ｍｉｎ標準ピーク検出感度とした。表１に希釈倍率ごとのピーク検出感度を示す。
【００２７】
【表１】
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６４０倍希釈した試料の測定の際は、標準ピーク検出感度を希釈倍率６４０倍に対する標準希釈倍率２０倍の比０．０３１で乗算し、ピークスタート検出感度を０．０６３μＳ／ｍｉｎ、ピークエンド検出感度を−０．０６３μＳ／ｍｉｎに設定して、測定を行った。その結果、希釈倍率６４０倍の試料でもピークを検出することができ（図５参照）、全ての測定試料の点をプロットした検量線が作成できた（図６参照）。
【符号の説明】
【００２８】
１．溶離液
２．脱気装置
３．送液ポンプ
４．試料注入バルブ
５．分析カラム
６．カラム恒温槽
７．サプレッサ
８．電気伝導度検出計
９．廃液
１０．システム制御およびデータ処理装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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