(57)【要約】【課題】癌幹細胞阻害剤を提供する。【解決手段】Ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｏ３（ＦＯＸＯ３）／Ｌｉｖｅｒ  ｋｉｎａｓｅ  Ｂ１（ＬＫＢ１）／ＰＰＡＲγ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  １β（ＰＧＣ−１β）／Ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  α１（ＰＤＨＡ１）／Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒｉｎｇ−ＣＨ−ｔｙｐｅ  ｆｉｎｇｅｒ  ８（ＭＡＲＣＨ８）経路の阻害剤を有効成分として含有する、癌幹細胞阻害剤。【選択図】図２５
2018048092.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｏ３（ＦＯＸＯ３）／Ｌｉｖｅｒ  ｋｉｎａｓｅ  Ｂ１（ＬＫＢ１）／ＰＰＡＲγ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  １β（ＰＧＣ−１β）／Ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  α１（ＰＤＨＡ１）／Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒｉｎｇ−ＣＨ−ｔｙｐｅ  ｆｉｎｇｅｒ  ８（ＭＡＲＣＨ８）経路の阻害剤を有効成分として含有する、癌幹細胞阻害剤。
【請求項２】
ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤が、ＦＯＸＯ３阻害剤、ＬＫＢ１阻害剤、ＰＧＣ−１β阻害剤又はＰＤＨＡ１阻害剤である、請求項１に記載の癌幹細胞阻害剤。
【請求項３】
ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤が、環状グアノシン一リン酸産生誘導剤である、請求項１又は２に記載の癌幹細胞阻害剤。
【請求項４】
ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤が、６７ｋＤａラミニンレセプター（６７ＬＲ）アゴニストである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の癌幹細胞阻害剤。
【請求項５】
前記６７ＬＲアゴニストが下記式（１）で表される化合物である、請求項４に記載の癌幹細胞阻害剤。
【化１】
2018048092.tif 000006
【請求項６】
前記癌幹細胞が、膵臓癌幹細胞又は肺癌幹細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の癌幹細胞阻害剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の癌幹細胞阻害剤と、ホスホジエステラーゼ阻害剤とを備える、癌幹細胞阻害用キット。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の癌幹細胞阻害剤と薬学的に許容される担体とを含有する、癌幹細胞阻害用医薬組成物。
【請求項９】
ホスホジエステラーゼ阻害剤を更に含有する、請求項８に記載の癌幹細胞阻害用医薬組成物。
【請求項１０】
ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路を阻害する６７ＬＲアゴニスト抗体の産生を誘導する、癌幹細胞阻害用ペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエピガロカテキンガレートに対する結合能を有するペプチドである、請求項１０に記載の癌幹細胞阻害用ペプチド。
【請求項１２】
被験物質の存在下で、細胞中のＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β、ＰＤＨＡ１又はＭＡＲＣＨ８の発現量を測定する工程と、
ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β若しくはＰＤＨＡ１の発現量が前記被検物質の非存在下における発現量と比較して低下していた場合、又はＭＡＲＣＨ８の発現量が前記被検物質の非存在下における発現量と比較して上昇していた場合に、前記被検物質は癌幹細胞阻害剤であると判断する工程と、を備える、
癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
被験物質の存在下で、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β、ＰＤＨＡ１又はＭＡＲＣＨ８の活性を測定する工程と、
ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β若しくはＰＤＨＡ１の活性が前記被検物質の非存在下における発現量と比較して低下していた場合、又はＭＡＲＣＨ８の活性が前記被検物質の非存在下における活性と比較して上昇していた場合に、前記被検物質は癌幹細胞阻害剤であると判断する工程と、を備える、
癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項１４】
ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤を有効成分として含有する、癌転移抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌幹細胞阻害剤及びその使用に関する。より具体的には、癌幹細胞阻害剤、癌幹細胞阻害用医薬組成物及び癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は現代社会における主要な死亡原因の１つである。癌の治療法の開発のために多くの取り組みがなされているが、外科的切除が可能な初期の癌を除き、依然として治癒が困難な場合が多い。
【０００３】
手術不能な癌の多くは、化学療法又は放射線療法で治療される。しかしながら、腫瘍細胞を完全に排除することは極めて難しく、多くの場合、治療抵抗性細胞が出現し、再発してしまう。
【０００４】
癌の再発や転移の原因として近年提唱されているのが、癌幹細胞仮説である（例えば、非特許文献１を参照）。癌幹細胞仮説では、腫瘍組織中にも、正常組織と同様な幹細胞が存在し、それらは自己を複製する能力を持つとともに、少数存在するだけで元の腫瘍組織と同様の腫瘍を形成する能力を有すると考えられている。そして、癌幹細胞は抗癌剤や放射線への抵抗性を有するため、治療の際に残存しやすく、再発や転移の原因となっていると考えられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Viale A., et al., Oncogene ablation-resistant pancreatic cancer cells depend on mitochondrial function, Nature, 514 (7524), 628-632, 2014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような背景のもと、癌幹細胞を標的とした、再発や転移のリスクが少ない癌治療法の確立が求められている。そこで、本発明は、癌幹細胞阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の態様を含む。
［１］Ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｏ３（ＦＯＸＯ３）／Ｌｉｖｅｒ  ｋｉｎａｓｅ  Ｂ１（ＬＫＢ１）／ＰＰＡＲγ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  １β（ＰＧＣ−１β）／Ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  α１（ＰＤＨＡ１）／Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒｉｎｇ−ＣＨ−ｔｙｐｅ  ｆｉｎｇｅｒ  ８（ＭＡＲＣＨ８）経路の阻害剤を有効成分として含有する、癌幹細胞阻害剤。
［２］ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤が、ＦＯＸＯ３阻害剤、ＬＫＢ１阻害剤、ＰＧＣ−１β阻害剤又はＰＤＨＡ１阻害剤である、［１］に記載の癌幹細胞阻害剤。
［３］ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤が、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）産生誘導剤である、［１］又は［２］に記載の癌幹細胞阻害剤。
［４］ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤が、６７ｋＤａラミニンレセプター（６７ＬＲ）アゴニストである、［１］〜［３］のいずれかに記載の癌幹細胞阻害剤。
［５］前記６７ＬＲアゴニストが下記式（１）で表される化合物である、［４］に記載の癌幹細胞阻害剤。
【化１】
2018048092.tif 000003
［６］前記癌幹細胞が、膵臓癌幹細胞又は肺癌幹細胞である、［１］〜［５］のいずれかに記載の癌幹細胞阻害剤。
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載の癌幹細胞阻害剤と、ホスホジエステラーゼ阻害剤とを備える、癌幹細胞阻害用キット。
［８］［１］〜［６］のいずれかに記載の癌幹細胞阻害剤と薬学的に許容される担体とを含有する、癌幹細胞阻害用医薬組成物。
［９］ホスホジエステラーゼ阻害剤を更に含有する、［８］に記載の癌幹細胞阻害用医薬組成物。
［１０］ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路を阻害する６７ＬＲアゴニスト抗体の産生を誘導する、癌幹細胞阻害用ペプチド。
［１１］前記ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエピガロカテキンガレートに対する結合能を有するペプチドである、［１０］に記載の癌幹細胞阻害用ペプチド。
［１２］被験物質の存在下で、細胞中のＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β、ＰＤＨＡ１又はＭＡＲＣＨ８の発現量を測定する工程と、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β若しくはＰＤＨＡ１の発現量が前記被検物質の非存在下における発現量と比較して低下していた場合、又はＭＡＲＣＨ８の発現量が前記被検物質の非存在下における発現量と比較して上昇していた場合に、前記被検物質は癌幹細胞阻害剤であると判断する工程と、を備える、癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法。
［１３］被験物質の存在下で、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β、ＰＤＨＡ１又はＭＡＲＣＨ８の活性を測定する工程と、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β若しくはＰＤＨＡ１の活性が前記被検物質の非存在下における発現量と比較して低下していた場合、又はＭＡＲＣＨ８の活性が前記被検物質の非存在下における活性と比較して上昇していた場合に、前記被検物質は癌幹細胞阻害剤であると判断する工程と、を備える、癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法。
［１４］ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤を有効成分として含有する、癌転移抑制剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、癌幹細胞阻害剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】（ａ）〜（ｃ）は、実験例１におけるスフェロイド形成能の測定結果を示すグラフである。
【図２】（ａ）は、実験例２における腫瘍体積の変化の測定結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例２において肝臓に転移した腫瘍の数を測定した結果を示すグラフである。（ｃ）は、実験例２におけるＢａｙ４１−２２７２投与群及び対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）のヌードマウスの肝臓の代表的な写真である。
【図３】（ａ）〜（ｃ）は、実験例４におけるコロニーアッセイの結果を示すグラフである。（ｄ）〜（ｆ）は実験例４におけるスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。
【図４】（ａ）は、実験例５におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。（ｂ）〜（ｆ）は、（ａ）の結果を数値化したグラフである。
【図５】（ａ）は、実験例６における腫瘍体積の測定結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例６において肝臓に転移した腫瘍の数を測定した結果を示すグラフである。（ｃ）は、実験例６の癌治療モデルの検討において、肝臓に転移した腫瘍の数を測定した結果を示すグラフである。
【図６】（ａ）は、実験例７におけるアクセッションＩＤ  ＧＳＥ２８７３５の解析結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例７におけるアクセッションＩＤ  ＧＳＥ２１５０１の解析結果を示すグラフである。
【図７】（ａ）〜（ｃ）は、実験例８における蛍光免疫染色の結果を示す写真である。
【図８】（ａ）及び（ｂ）は、実験例９における蛍光免疫染色の結果を示す写真である。
【図９】（ａ）〜（ｄ）は、実験例１０におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図１０】（ａ）は、実験例１１におけるコロニーアッセイの結果を示すグラフである。（ｂ）〜（ｄ）は、実験例１１におけるスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。
【図１１】（ａ）〜（ｄ）は、実験例１２におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図１２】（ａ）〜（ｃ）は、実験例１３におけるコロニーアッセイの結果を示すグラフである。（ｄ）〜（ｆ）は、実験例１３におけるスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。
【図１３】（ａ）は、実験例１４におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。（ｂ）は、実験例１４におけるミトコンドリア膜電位の測定結果を示すグラフである。
【図１４】（ａ）〜（ｃ）は、実験例１５におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図１５】（ａ）〜（ｃ）は、実験例１６におけるコロニーアッセイの結果を示すグラフである。（ｄ）〜（ｆ）は、実験例１６におけるスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。
【図１６】実験例１７における免疫沈降及びウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図１７】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１８におけるスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。
【図１８】（ａ）は、実験例１９におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。（ｂ）は、実験例１９における蛍光免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ｃ）〜（ｅ）は、実験例１９におけるスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。
【図１９】（ａ）及び（ｂ）は、実験例２０におけるウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図２０】実験例２１における腫瘍体積の変化を測定した結果を示すグラフである。
【図２１】実験例２１において、肝臓に転移した腫瘍の数を測定した結果を示すグラフである。
【図２２】（ａ）は、実験例２２における各群のヌードマウスの生存率を示すグラフである。（ｂ）は、実験例２２における細胞内ｃＧＭＰの測定結果を示すグラフである。
【図２３】実験例２３におけるスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。
【図２４】実験例２４におけるコロニーアッセイの結果を示す写真である。
【図２５】発明者らが明らかにしたＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［癌幹細胞阻害剤］
１実施形態において、本発明は、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤を有効成分として含有する、癌幹細胞阻害剤を提供する。
【００１１】
実施例において後述するように、発明者らは癌幹細胞の維持機構を明らかにした。図２５は、発明者らが明らかにした癌幹細胞維持経路である、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の模式図である。
【００１２】
図２５に示すように、ＦＯＸＯ３の発現が上昇すると、ＬＫＢ１の発現が上昇する。また、ＬＫＢ１の発現が上昇すると、ＰＧＣ−１βの発現が上昇する。また、ＰＧＣ−１βの発現が上昇すると、ＰＤＨＡ１の発現が上昇する。また、ＰＤＨＡ１の発現が上昇すると、ＭＡＲＣＨ８によるＣＤ４４のユビキチン化が抑制され、ＣＤ４４の高発現が維持される。その結果、細胞の癌幹細胞性が維持される。
【００１３】
ここで、ＦＯＸＯ３は、フォークヘッド型転写因子と呼ばれる転写因子の１種である。ヒトＦＯＸＯ３のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＭ＿００１４５５等であり、マウスＦＯＸＯ３のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＭ＿０１９７４０等である。
【００１４】
また、ＬＫＢ１は、Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １１（ＳＴＫ１１）とも呼ばれるプロテインキナーゼの１種である。ヒトＬＫＢ１のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＭ＿０００４５５等であり、マウスＬＫＢ１のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＭ＿００１３０１８５３、ＮＭ＿００１３０１８５４、ＮＭ＿０１１４９２等である。
【００１５】
また、ＰＧＣ−１βは、核内受容体コファクターの１種である。ヒトＰＧＣ−１βのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＭ＿００１１７２６９８、ＮＭ＿００１１７２６９９、ＮＭ＿１３３２６３等であり、マウスＰＧＣ−１βのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＭ＿１３３２４９等である。
【００１６】
また、ＰＤＨＡ１は、ミトコンドリアのマトリックスに存在する酵素である。ＰＤＨＡ１は、ピルビン酸の酸化的脱炭酸を触媒し、アセチルＣｏＡと二酸化炭素を精製する酵素である。ヒトＰＤＨＡ１のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＭ＿０００２８４、ＮＭ＿００１１７３４５４、ＮＭ＿００１１７３４５５、ＮＭ＿００１１７３４５６等であり、マウスＰＤＨＡ１のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＭ＿００８８１０等である。
【００１７】
また、ＭＡＲＣＨ８は、膜結合型Ｅ３ユビキチンリガーゼの１種である。ヒトＰＧＣ−１βのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＭ＿００１００２２６５、ＮＭ＿００１００２２６６、ＮＭ＿００１２８２８６６等であり、マウスＰＧＣ−１βのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＰ＿００１２８９３１２、ＮＭ＿００１３０２３８３、ＮＰ＿００１２８９３１３、ＮＭ＿００１３０２３８４等である。
【００１８】
実施例において後述するように、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路を阻害することにより、癌幹細胞の機能を阻害することができる。より詳細には、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β、ＰＤＨＡ１のいずれかの活性を阻害すると、ＭＡＲＣＨ８によるＣＤ４４のユビキチン化が促進され、ＣＤ４４の存在量が低下する。この結果、癌幹細胞の機能が阻害される。
【００１９】
本明細書において、癌幹細胞阻害剤とは、癌幹細胞の機能を阻害する物質を意味する。癌幹細胞の機能とは、少数存在するだけで元の腫瘍組織と同様の腫瘍を形成する機能であるということができる。癌幹細胞の機能は、実施例において後述する、スフェロイドアッセイ、コロニーアッセイ、癌の転移能の測定等により測定することができる。すなわち、癌幹細胞の機能とは、スフェロイドを形成する機能、コロニーを形成する機能、癌を転移させる機能等といいかえることができる。また、本明細書において、癌幹細胞の機能のことを癌細胞性という場合がある。また、細胞が癌幹細胞の機能を有することを、細胞が癌幹細胞性を有するという場合がある。
【００２０】
実施例において後述するように、本実施形態の癌幹細胞阻害剤を投与することにより、細胞レベルにおいて、スフェロイド形成能、コロニー形成能等を抑制することができる。また、生体レベルにおいて、腫瘍体積の増加、癌の転移等を抑制することができる。したがって、本実施形態の癌幹細胞阻害剤は、癌転移抑制剤、癌の治療剤等といいかえることができる。
【００２１】
本明細書において、癌幹細胞とは、ＣＤ４４を高発現している癌細胞であるということもできる。ここで、ＣＤ４４を高発現しているとは、対照細胞と比較してよりＣＤ４４の発現量が高いことを意味する。対照細胞としては正常細胞等が挙げられる。あるいは、癌幹細胞とは、スフェロイド形成能有する細胞、コロニー形成能有する細胞、又はインビボにおいて転移して腫瘍を形成する能力を有する細胞であるということもできる。
【００２２】
本実施形態の癌幹細胞阻害剤において、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤は、ＦＯＸＯ３阻害剤であってもよいし、ＬＫＢ１阻害剤であってもよいし、ＰＧＣ−１β阻害剤であってもよいし、ＰＤＨＡ１阻害剤であってもよい。
【００２３】
ここで、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β又はＰＤＨＡ１の阻害剤とは、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β又はＰＤＨＡ１の発現阻害剤であってもよいし、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β又はＰＤＨＡ１の活性を抑制する物質であってもよい。
【００２４】
ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β又はＰＤＨＡ１の発現阻害剤としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、低分子化合物等が挙げられる。また、実施例において後述するように、ｃＧＭＰ産生誘導剤の投与により、ＦＯＸＯ３の発現を抑制することができる。その結果、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路が阻害される。したがって、ｃＧＭＰ産生誘導剤も、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β又はＰＤＨＡ１の発現阻害剤であるということができる。ｃＧＭＰ産生誘導剤としては、例えばＢａｙ４１−２２７２（ＣＡＳ番号：２５６３７６−２４−６）等が挙げられる。
【００２５】
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられる２１〜２３塩基対の低分子２本鎖ＲＮＡである。細胞内に導入されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
【００２６】
ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、９０〜９５℃で約１分程度変性させた後、３０〜７０℃で約１〜８時間アニーリングさせることにより調製することができる。
【００２７】
ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡは、ベクターによって細胞に導入し、Ｕ６プロモーター又はＨ１プロモーターで発現させてもよいし、ｓｈＲＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成し、ｓｉＲＮＡと同様の方法によりセルフアニーリングさせることによって調製してもよい。細胞内に導入されたｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、ｓｉＲＮＡへと切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
【００２８】
ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）は、ゲノム上にコードされ、多段階的な生成過程を経て最終的に約２０塩基の微小ＲＮＡとなる機能性核酸である。ｍｉＲＮＡは、機能性のｎｃＲＮＡ（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ、非コードＲＮＡ：タンパク質に翻訳されないＲＮＡの総称）に分類されており、他の遺伝子の発現を調節するという、生命現象において重要な役割を担っている。特定の塩基配列を有するｍｉＲＮＡを生体に投与することにより、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β又はＰＤＨＡ１の発現を阻害することができる。
【００２９】
リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡである。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、ＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となっている。リボザイムは、グループＩイントロン型、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡ等の４００ヌクレオチド以上の大きさのものであってもよく、ハンマーヘッド型、ヘアピン型等と呼ばれる４０ヌクレオチド程度のものであってもよい。
【００３０】
アンチセンス核酸は、標的配列に相補的な核酸である。アンチセンス核酸は、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が形成された部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制等により、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
【００３１】
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部をペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成してもよい。
【００３２】
実施例において後述するように、発明者らは、癌細胞におけるｃＧＭＰ産生を誘導することにより、癌細胞におけるＦＯＸＯ３の発現が抑制され、癌幹細胞の機能が阻害されることを明らかにした。
【００３３】
したがって、本実施形態の癌幹細胞阻害剤は、癌細胞におけるｃＧＭＰ産生を誘導する物質であってもよい。
【００３４】
また、上述したように、本実施形態の癌幹細胞阻害剤は、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β又はＰＤＨＡ１の活性を抑制する物質であってもよい。
【００３５】
ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β又はＰＤＨＡ１の活性を抑制する物質としては、例えば、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β又はＰＤＨＡ１に対する特異的結合物質が挙げられる。
【００３６】
ここで、特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー、低分子化合物等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β若しくはＰＤＨＡ１タンパク質又はそれらの断片を抗原として免疫することによって作製することができる。あるいは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、市販の抗体であってもよい。
【００３７】
アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標的物質に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標的物質に特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【００３８】
より具体的な、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤としては、例えば、６７ｋＤａラミニンレセプター（以下、「６７ＬＲ」という場合がある。）アゴニストが挙げられる。
【００３９】
発明者らは以前に、癌細胞では６７ＬＲの発現が亢進している場合があり、６７ＬＲアゴニストが６７ＬＲに結合すると、Ａｋｔが活性化され、内皮性一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）を活性化され、一酸化窒素（ＮＯ）及びｃＧＭＰの産生が誘導され、タンパク質キナーゼＣδ（ＰＫＣδ）が活性化され、産生スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）が活性化され、その結果、細胞死が誘導されることを明らかにした。
【００４０】
すなわち、６７ＬＲアゴニストは細胞内のｃＧＭＰの産生を誘導し、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路を阻害することができる。
【００４１】
実施例において後述するように、発明者らは、インビトロ又はインビボにおいて、６７ＬＲアゴニストの投与により、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路を阻害できることを明らかにした。
【００４２】
６７ＬＲアゴニストとしては、緑茶に含まれる主要なカテキンの一種であるエピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ、以下、「ＥＧＣＧ」という場合がある。）、ＥＧＣＧ誘導体、ウーロン茶重合ポリフェノール、ウーロン茶重合ポリフェノール誘導体、抗６７ＬＲ抗体（６７ＬＲアゴニスト抗体）等が挙げられる。
【００４３】
ＥＧＣＧ誘導体としては、例えばメチル化ＥＧＣＧが挙げられ、より具体的には下記式（１）で表される化合物等が挙げられる。
【００４４】
【化２】
2018048092.tif 000004
【００４５】
ウーロン茶重合ポリフェノールとは、半発酵というウーロン茶の独特の製造方法において、酵素反応や熱重合反応により形成される、カテキン類が複雑に結合した化合物の総称であり、例えばカテキン類の２量体、カテキン類の３量体等が挙げられる。カテキン類の２量体としては、例えば、ウーロンホモビスフラバンＡ、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ、ウーロンホモビスフラバンＢ、ウーロンホモビスフラバンＣ等のウーロンホモビスフラバン類等が挙げられる。
【００４６】
ところで、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤は、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ等の環状リン酸ジエステルを加水分解する酵素を阻害する物質である。実施例において後述するように、６７ＬＲアゴニストと共にＰＤＥ阻害剤を併用することにより、ｃＧＭＰの分解が抑制され、６７ＬＲアゴニストの効果を相乗的に増強することができる。
【００４７】
ＰＤＥ阻害剤としては、非選択的なＰＤＥ阻害剤及び選択的なＰＤＥ阻害剤が知られている。ＰＤＥ阻害剤は、非選択的なＰＤＥ阻害剤であってもよく、選択的なＰＤＥ阻害剤であってもよい。
【００４８】
非選択的なＰＤＥ阻害剤としては、例えば、カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）及びペントキシフィリン（ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｌｉｎｅ）等が挙げられる。
【００４９】
選択的なＰＤＥ阻害剤としては、例えば、８−メトキシ−３−イソブチル−１−メチルキサンチン等のＰＤＥ１阻害剤、エリスロ−９−（２−ヒドロキシ−３−ノニル）アデニン塩酸塩（ＥＨＮＡ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）等のＰＤＥ２阻害剤、シロスタミド（ｃｉｌｏｓｔａｍｉｄｅ）、ミルリノン（ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ）及びトレキシン（ｔｒｅｑｕｉｓｉｎ）等のＰＤＥ３阻害剤、エタゾラート塩酸塩（ｅｔａｚｏｌａｔｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）及びデンブフィリン（ｄｅｎｂｕｆｙｌｌｉｎｅ）等のＰＤＥ４阻害剤、及び、バルデナフィル（ｖａｒｄｅｎａｆｉｌ）、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）、ザプリナスト（ｚａｐｒｉｎａｓｔ）、タダラフィル（ｔａｄａｌａｆｉｌ）、ジピリダモール（ｄｉｐｙｒｉｄａｍｏｌｅ）、４−｛［３’，４’−（メチレンジオキシ）ベンジル］アミノ｝−６−メトキシキナゾリン、及び１−（３−クロロアニリノ）−４−フェニルフタラジン（ＭＹ−５４４５）等のＰＤＥ５阻害剤が挙げられる。
【００５０】
本実施形態の癌幹細胞阻害剤が機能を阻害することができる癌幹細胞としては、癌幹細胞であれば特に限定されず、膵臓癌幹細胞、肺癌幹細胞等が挙げられる。
【００５１】
本実施形態の癌幹細胞阻害剤を投与することにより、これらの癌幹細胞の機能を阻害することができる。このため、実施例において後述するように、癌を効果的に治療することができ、再発や転移のリスクを低減することができる。
【００５２】
［癌幹細胞阻害用キット］
１実施形態において、本発明は、上述した癌幹細胞阻害剤とＰＤＥ阻害剤とを備える、癌幹細胞阻害用キットを提供する。
【００５３】
本実施形態のキットにおいて、癌幹細胞阻害剤はｃＧＭＰの産生を促進させるものであることが好ましい。上述したように、ＰＤＥ阻害剤は、ｃＧＭＰの分解を抑制することにより、癌幹細胞阻害剤の効果を相乗的に増強することができる。ＰＤＥ阻害剤としては、上述したものと同様のものを使用することができる。
【００５４】
本実施形態のキットにおいて、癌幹細胞阻害剤及びＰＤＥ阻害剤は、単一の容器内に混合して収容されていてもよいし、別々の容器内に収容されていてもよい。
【００５５】
また、癌幹細胞阻害剤及びＰＤＥ阻害剤は、同時に投与されてもよいし、時間差を設けて投与されてもよい。時間差を設けて投与される場合、癌幹細胞阻害剤及びＰＤＥ阻害剤のいずれを先に投与してもよい。
【００５６】
［癌幹細胞阻害用医薬組成物］
１実施形態において、本発明は、上述した癌幹細胞阻害剤と薬学的に許容される担体とを含有する、癌幹細胞阻害用医薬組成物を提供する。
【００５７】
上記の医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の形態で非経口的に投与することができる。皮膚外用剤としては、より具体的には、軟膏剤、貼付剤等の剤型が挙げられる。
【００５８】
薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。
【００５９】
医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。
【００６０】
医薬組成物は、上述した癌幹細胞阻害剤、薬学的に許容される担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【００６１】
医薬組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、例えば、投与単位形態あたり０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分（癌幹細胞阻害剤）を投与すればよい。また、注射剤の場合には、例えば、投与単位形態あたり０．０１〜５０ｍｇの有効成分を投与すればよい。
【００６２】
また、医薬組成物の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、例えば、成人１日あたり０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分を１日１回又は２〜４回程度に分けて投与すればよい。
【００６３】
本実施形態の癌幹細胞阻害用医薬組成物において、癌幹細胞阻害剤は６７ＬＲアゴニストであってもよい。６７ＬＲアゴニストとしては、上述したものと同様のものを使用することができる。
【００６４】
また、本実施形態の癌幹細胞阻害用医薬組成物は、ＰＤＥ阻害剤を更に含有していてもよい。ＰＤＥ阻害剤としては、上述したものと同様のものを使用することができる。
【００６５】
［癌幹細胞阻害用ペプチド］
１実施形態において、本発明は、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路を阻害する６７ＬＲアゴニスト抗体の産生を誘導する、癌幹細胞阻害用ペプチドを提供する。
【００６６】
本実施形態のペプチドを生体に投与することにより、６７ＬＲアゴニスト抗体を誘導することができる。誘導された６７ＬＲ抗体は、癌幹細胞に発現した６７ＬＲに結合し、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路を阻害する。その結果、癌幹細胞の機能が阻害され、癌を効果的に治療することができる。本実施形態のペプチドは、癌の転移抑制用ペプチドであるということもできる。
【００６７】
したがって、本実施形態のペプチドは、癌幹細胞阻害用ペプチドワクチンとして用いることができる。本実施形態のペプチドは、通常のペプチドワクチンと同様に、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアタンパク質と結合させて用いてもよい。
【００６８】
上記のペプチドは、６７ＬＲのアミノ酸配列におけるＥＧＣＧとの結合領域に対応するものである。上記のペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであってもよく、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥＧＣＧに対する結合能を有するペプチドであってもよい。ここで、１又は複数個とは、例えば１〜１０個であってもよく、例えば１〜５個であってもよく、例えば１〜３個であってもよく、例えば１〜２個であってもよい。
【００６９】
より具体的なペプチドとしては、配列番号１〜１６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
【００７０】
発明者らは以前に、上記のペプチドでマウスを免疫することにより、６７ＬＲアゴニスト抗体の産生が誘導されることを確認した（例えば、特開２０１６−１４５２００号を参照）。
【００７１】
［癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、細胞中のＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β、ＰＤＨＡ１又はＭＡＲＣＨ８の発現量を測定する工程と、前記工程において測定された、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β若しくはＰＤＨＡ１の発現量が前記被検物質の非存在下における発現量と比較して低下していた場合、又は、前記工程において測定されたＭＡＲＣＨ８の発現量が前記被検物質の非存在下における発現量と比較して上昇していた場合に、前記被検物質は癌幹細胞阻害剤であると判断する工程と、を備える、癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法を提供する。本実施形態のスクリーニング方法は、癌転移抑制剤のスクリーニング方法であるということもできる。
【００７２】
本実施形態のスクリーニング方法において、細胞としては、例えば癌細胞株を用いることができる。細胞は癌幹細胞であるか、癌幹細胞を含んでいることがより好ましい。ここで、癌幹細胞は上述したものと同様であり、例えばＣＤ４４を高発現している癌細胞であってもよい。あるいは、スフェロイド形成能を有する細胞であってもよい。また、被験物質としては、特に制限されず、例えば化合物ライブラリー等を用いることができる。
【００７３】
本実施形態のスクリーニング方法において、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β、ＰＤＨＡ１又はＭＡＲＣＨ８の発現量は、例えばマイクロアレイ、リアルタイムＰＣＲ等により遺伝子レベルで測定してもよく、ＥＬＩＳＡ、プロテインチップ、ウエスタンブロット等によりタンパク質レベルで測定してもよい。
【００７４】
実施例において後述するように、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β又はＰＤＨＡ１の発現量を低下させる物質は、癌幹細胞の機能を阻害することができる。したがって、より効果的な癌の治療剤となる。また、ＭＡＲＣＨ８の発現量を上昇させる物質は、癌幹細胞の機能を阻害することができる。したがって、より効果的な癌の治療剤となる。
【００７５】
現在、癌幹細胞維持機構としては、Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ経路、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ経路、Ｎｏｔｃｈ経路等が知られている。しかしながら、これらの因子をノックアウトしたマウスはいずれも胎生致死であることが知られている。したがって、これらの因子は正常幹細胞においても重要な機能を有していると考えられる。
【００７６】
これに対し、特にＦＯＸＯ３ノックアウトマウスは、中年期に不妊が認められるものの、生存期間、発癌、体重において野生型マウスとの相違が認められない。このため、ＦＯＸＯ３は比較的安全な創薬ターゲットであるといえる。
【００７７】
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β、ＰＤＨＡ１又はＭＡＲＣＨ８の活性を測定する工程と、前記工程において測定された、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β若しくはＰＤＨＡ１の活性が、前記被検物質の非存在下における活性と比較して低下していた場合、又は、前記工程において測定されたＭＡＲＣＨ８の活性が前記被検物質の非存在下における活性と比較して上昇していた場合に、前記被検物質は癌幹細胞阻害剤であると判断する工程とを備える、癌幹細胞阻害剤のスクリーニング方法を提供する。本実施形態のスクリーニング方法は、癌転移抑制剤のスクリーニング方法であるということもできる。
【００７８】
本実施形態のスクリーニング方法によれば、ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β又はＰＤＨＡ１の活性を阻害する物質をスクリーニングすることができる。あるいは、本実施形態のスクリーニング方法によれば、ＭＡＲＣＨ８の活性を上昇させる物質をスクリーニングすることができる。ここで、ＦＯＸＯ３の活性としては、例えば標的遺伝子の転写活性等が挙げられる。また、ＬＫＢ１の活性としては、例えば標的基質をリン酸化する活性等が挙げられる。また、ＰＧＣ−１βの活性としては、例えば核内受容体であるＥＲＲ（ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、エストロゲン関連受容体）を活性化する活性等が挙げられる。また、ＰＤＨＡ１の活性としては、例えば基質であるピルビン酸を酸化的脱炭酸する活性等が挙げられる。また、ＭＡＲＣＨ８の活性としては、例えばＣＤ４４のユビキチン化を促進する活性等が挙げられる。
【００７９】
本実施形態のスクリーニング方法は、細胞レベルで行ってもよく、非細胞レベル（試験管レベル）で行ってもよい。
【００８０】
ＦＯＸＯ３、ＬＫＢ１、ＰＧＣ−１β又はＰＤＨＡ１の活性を低下させる物質は、癌幹細胞の機能を阻害することができる。したがって、より効果的な癌の治療剤となる。また、ＭＡＲＣＨ８の活性を上昇させる物質は、癌幹細胞の機能を阻害することができる。したがって、より効果的な癌の治療剤となる。
【００８１】
［癌転移抑制剤］
１実施形態において、本発明は、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤を有効成分として含有する、癌転移抑制剤を提供する。実施例において後述するように、本実施形態の癌転移抑制剤を生体に投与することにより、癌の転移を抑制することができる。
【００８２】
本実施形態の癌転移抑制剤において、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤としては、上述した癌幹細胞阻害剤におけるものと同様である。
【００８３】
本実施形態の癌転移抑制剤は、膵臓癌、肺癌等の転移の抑制に有効である。
【００８４】
本実施形態の癌転移抑制剤は、上述した癌幹細胞阻害剤と同様に、薬学的に許容される担体と混合して医薬組成物として製剤化されていてもよい。また、当該医薬組成物はホスホジエステラーゼ阻害剤を更に含有していてもよい。
【００８５】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、癌幹細胞の阻害方法を提供する。
【００８６】
本実施形態の癌幹細胞の阻害方法は、癌幹細胞の癌幹細胞性の阻害方法、癌幹細胞のスフェロイド形成能を阻害する方法、癌幹細胞の癌幹細胞マーカーの発現を抑制する方法、癌の転移を抑制する方法、癌の治療方法等といいかえることもできる。
【００８７】
本実施形態の方法において、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤としては、上述したものが挙げられる。また、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、既存の抗癌剤と併用して用いてもよい。
【００８８】
１実施形態において、本発明は、癌幹細胞の阻害のためのＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤を提供する。ここで、「癌幹細胞の阻害」は、「癌幹細胞性の阻害」、「癌幹細胞の機能の阻害」、「スフェロイド形成能の阻害」、「癌幹細胞マーカーの発現の抑制」、「癌の転移の抑制」、「癌の治療」等といいかえることもできる。
【００８９】
本実施形態の方法において、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤としては、上述したものが挙げられる。
【００９０】
１実施形態において、本発明は、癌幹細胞阻害剤の製造のためのＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤の使用を提供する。本実施形態の方法において、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路の阻害剤としては、上述したものが挙げられる。
【００９１】
１実施形態において、本発明は、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路を阻害する６７ＬＲアゴニスト抗体の産生を誘導する、癌幹細胞阻害用ペプチドの有効量を、治療又は予防を必要とする患者に投与することを含む、癌幹細胞の阻害方法を提供する。本実施形態の方法において、ペプチドとしては、上述したものを用いることができる。
【００９２】
本実施形態の癌幹細胞の阻害方法は、癌幹細胞の癌幹細胞性の阻害方法、癌幹細胞のスフェロイド形成能を阻害する方法、癌幹細胞の癌幹細胞マーカーの発現を抑制する方法、癌の転移を抑制する方法、癌の治療方法、癌の予防方法等といいかえることもできる。
【００９３】
１実施形態において、本発明は、ＦＯＸＯ３／ＬＫＢ１／ＰＧＣ−１β／ＰＤＨＡ１／ＭＡＲＣＨ８経路を阻害する６７ＬＲアゴニスト抗体の産生の誘導のためのペプチドを提供し、当該ペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエピガロカテキンガレートに対する結合能を有するペプチドである。本実施形態のペプチドの具体例は、上述したものと同様である。
【００９４】
ここで、「６７ＬＲアゴニスト抗体の産生の誘導」は、「癌幹細胞の阻害」、「癌幹細胞性の阻害」、「癌幹細胞の機能の阻害」、「スフェロイド形成能の阻害」、「癌幹細胞マーカーの発現の抑制」、「癌の転移の抑制」、「癌の治療」、「癌の予防」等といいかえることもできる。
【００９５】
１実施形態において、本発明は、癌幹細胞阻害用ペプチドワクチンの製造のためのペプチドの使用を提供し、当該ペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエピガロカテキンガレートに対する結合能を有するペプチドである。本実施形態におけるペプチドの具体例は、上述したものと同様である。
【実施例】
【００９６】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００９７】
［実験例１］
（ｃＧＭＰ産生誘導剤はヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した  １）
ヒト膵臓癌細胞株（Ｐａｎｃ−１、ＢｘＰＣ−３、ＭＩＡ  Ｐａｃａ−２）の培地に、ｃＧＭＰ産生誘導剤である、Ｂａｙ４１−２２７２（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を添加し、スフェロイド形成能を検討した。なお、スフェロイド形成能は癌幹細胞の機能の１つである。
【００９８】
具体的には、Ｐａｎｃ−１、ＢｘＰＣ−３、ＭＩＡ  Ｐａｃａ−２の各細胞株を、Ｂ２７（５０倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を含有する無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１０００個／ｍＬの細胞密度に調製した。続いて、終濃度０、２．５又は５μＭのＢａｙ４１−２２７２を添加して、低接着プレートである、Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ（２４ウェル、Ｃｏｓｔａｒ社）に播種して２１日間培養した。その後、顕微鏡下でスフェロイド数を測定した。
【００９９】
図１（ａ）〜（ｃ）は、スフェロイド形成能を測定した結果を示すグラフである。図１（ａ）はＰａｎｃ−１細胞株の結果を示し、図１（ｂ）はＢｘＰＣ−３細胞株の結果を示し、図１（ｃ）はＭＩＡ  Ｐａｃａ−２細胞株の結果を示す。縦軸はスフェロイド形成能（測定されたスフェロイドの数）を示す。
【０１００】
その結果、いずれの細胞株においても、Ｂａｙ４１−２２７２の濃度が高いほどスフェロイド形成能が有意に低下することが明らかとなった。この結果から、ｃＧＭＰ産生を誘導することにより、膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることが明らかとなった。
【０１０１】
［実験例２］
（ｃＧＭＰ産生誘導剤はヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した  ２）
７週齢のヌードマウス（ｂａｌｂＣｎｕ／Ｃｒｌｊ、雌）にＣｏ６０線源を用いて１．８Ｇｙのγ線を照射し免疫抑制を誘導した。３日後、ＲＰＭＩ１６４０培地で１．０×１０７個／ｍＬの細胞密度に調整したＰａｎｃ−１細胞株を、ヌードマウスに５００μＬ（５×１０６個／匹）ずつ背面皮下注射し、Ｐａｎｃ−１細胞株移植モデルマウスを作製した。
【０１０２】
移植から４日後に腫瘍の生着が確認できたため、生着した腫瘍体積をもとに群分けを行い、Ｂａｙ４１−２２７２の腹腔内投与を開始した。投与量は２日に１回２．５ｍｇ／ｋｇとした。対照群には、Ｂａｙ４１−２２７２の代わりに溶媒のみ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）を投与した。腫瘍体積の測定を７日毎に行った。
【０１０３】
図２（ａ）は、腫瘍体積の変化を測定した結果を示すグラフである。その結果、Ｂａｙ４１−２２７２を投与したヌードマウスでは、対照（Ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較して、腫瘍体積が有意に縮小したことが明らかとなった。
【０１０４】
また、Ｂａｙ４１−２２７２の投与開始から３６日後に各ヌードマウスをと殺し、肝臓に転移した腫瘍の数を測定した。
【０１０５】
図２（ｂ）は、肝臓に転移した腫瘍の数を測定した結果を示すグラフである。その結果、Ｂａｙ４１−２２７２を投与したヌードマウスでは、対照（Ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較して、腫瘍の肝臓への転移が有意に減少したことが明らかとなった。
【０１０６】
図２（ｃ）は、Ｂａｙ４１−２２７２投与群及び対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）のヌードマウスの肝臓の代表的な写真である。各写真の右下に、各肝臓の拡大写真を示す。その結果、対照群のマウスの写真において、矢印の位置には肝臓に転移した腫瘍が認められた。また、肝臓の拡大写真において、丸で囲んだ領域には、肝臓に転移した腫瘍が認められた。これに対し、Ｂａｙ４１−２２７２投与群のヌードマウスの肝臓には、腫瘍は認められなかった。
【０１０７】
この結果から、ｃＧＭＰ産生を誘導することにより、インビボにおいても膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることが明らかとなった。この結果は、ｃＧＭＰ産生を誘導することにより、膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることを更に支持するものである。
【０１０８】
［実験例３］
（ｃＧＭＰ産生誘導により発現量が変化する遺伝子の探索）
実験例１及び２の結果を踏まえ、ｃＧＭＰ産生誘導により発現量が変化する遺伝子をマイクロアレイを用いて解析した。その結果、ｃＧＭＰ産生誘導剤Ｂａｙ４１−２２７２の投与により、細胞中のＦｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｏ３（ＦＯＸＯ３）の発現が抑制されることが示唆された。
【０１０９】
［実験例４］
（ＦＯＸＯ３の発現抑制はヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した  １）
ＲＮＡ干渉によりヒト膵臓癌細胞株におけるＦＯＸＯ３をノックダウンし、癌幹細胞の機能を検討した。
【０１１０】
具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ−１細胞及び膵臓癌患者由来初代膵臓癌細胞を、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調製し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ  ｓｉ−ＦＯＸＯ３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、４８時間培養後細胞を回収した。なお、ｓｉ−ＦＯＸＯ３は、ＦＯＸＯ３に対するｓｉＲＮＡであり、ＦＯＸＯ３−ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＦＯＸＯ３＿９１２７」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＦＯＸＯ３−ｓｉＲＮＡ（ｉｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＦＯＸＯ３＿９１２８」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）の配列の異なる２種類を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ−ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＳＩＣ−００１」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
【０１１１】
《コロニーアッセイ》
回収した細胞を１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地で１０００個／ｍＬの細胞密度で５ｍＬディッシュに播種して２１日培養し、コロニー数を測定した。
【０１１２】
《スフェロイドアッセイ》
回収した細胞を、Ｂ２７（５０倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を含有する無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１０００個／ｍＬの細胞密度に調整し、低接着プレートである、Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ  （２４ウェル、Ｃｏｓｔａｒ社）に播種して２１日間培養した。その後、顕微鏡下でスフェロイド数を測定した。
【０１１３】
《結果》
図３（ａ）〜（ｃ）は、コロニーアッセイの結果を示すグラフである。図３（ａ）〜（ｃ）の縦軸はコロニー形成能（測定されたコロニーの数）を示す。
【０１１４】
また、図３（ｄ）〜（ｆ）はスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。図３（ｄ）〜（ｆ）の縦軸はスフェロイド形成能（測定されたスフェロイドの数）を示す。
【０１１５】
図３（ａ）及び（ｄ）の「Ｐａｎｃ−１」は、Ｐａｎｃ−１細胞株の結果であることを示す。また、図３（ｂ）及び（ｅ）の「Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｎｏ．１」は、膵臓癌患者Ｎｏ．１由来初代膵臓癌細胞の結果であることを示す。また、図３（ｃ）及び（ｆ）の「Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｎｏ．２」は、膵臓癌患者Ｎｏ．２由来初代膵臓癌細胞の結果であることを示す。
【０１１６】
その結果、ＦＯＸＯ３の発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、癌細胞のコロニー形成能及びスフェロイド形成能が有意に低下することが明らかとなった。この結果から、ＦＯＸＯ３の発現を抑制することにより、膵臓癌幹細胞の機能が抑制される（癌幹細胞性が抑制される）ことが明らかとなった。
【０１１７】
［実験例５］
（ＦＯＸＯ３の発現抑制はヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した  ２）
ＲＮＡ干渉によりヒト膵臓癌細胞株におけるＦＯＸＯ３をノックダウンし、癌幹細胞マーカーの発現を検討した。
【０１１８】
具体的には、まず、膵臓癌患者由来初代膵臓癌細胞を１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調整し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養後、１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ  ｓｉ−ＦＯＸＯ３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、４８時間培養した。なお、ｓｉ−ＦＯＸＯ３は、ＦＯＸＯ３に対するｓｉＲＮＡであり、実験例３におけるＦＯＸＯ３−ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＦＯＸＯ３＿９１２７」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ−ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＳＩＣ−００１」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
【０１１９】
その後、ウエスタンブロットにより癌幹細胞マーカーの発現を評価した。癌幹細胞マーカーとして、ＣＤ４４、β−ｃａｔｅｎｉｎ（ＣＴＮＮＢ）、ＰＯＵ  Ｃｌａｓｓ  ５  Ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １（ＰＯＵ５Ｆ１）、ｃ−Ｍｙｃ（ＭＹＣ）の発現を検出した。なお、ＰＯＵ５Ｆ１はＯＣＴ−４とも呼ばれるものである。また、ローディングコントロールとしてβ−ａｃｔｉｎの発現を検出した。
【０１２０】
図４（ａ）は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。図４（ｂ）〜（ｆ）は、図（ａ）の結果を数値化したグラフである。図４（ｂ）はＦＯＸＯ３の結果を示し、図４（ｃ）はＣＤ４４の結果を示し、図４（ｄ）はβ−ｃａｔｅｎｉｎの結果を示し、図４（ｅ）はＰＯＵ５Ｆ１の結果を示し、図４（ｆ）はｃ−Ｍｙｃの結果を示す。
【０１２１】
また、図４（ｂ）〜（ｆ）中、「Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｎｏ．１」は膵臓癌患者Ｎｏ．１由来の初代膵臓癌細胞の結果であることを示し、「Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｎｏ．２」は膵臓癌患者Ｎｏ．２由来の初代膵臓癌細胞の結果であることを示し、「Ｓ」は対照のスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ−ｓｉＲＮＡ）の結果であることを示し、「（ｉ）」はＦＯＸＯ３−ｓｉＲＮＡ（ｉ）の結果であることを示す。
【０１２２】
その結果、ＦＯＸＯ３の発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、ＦＯＸＯ３だけでなく、ＣＤ４４、β−ｃａｔｅｎｉｎ、ＰＯＵ５Ｆ１、ｃ−Ｍｙｃの各癌幹細胞マーカーの発現も有意に低下することが明らかとなった。
【０１２３】
この結果は、ＦＯＸＯ３の発現を抑制することにより、膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることを更に支持するものである。
【０１２４】
［実験例６］
（ＦＯＸＯ３の発現抑制はヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した  ３）
ＦＯＸＯ３に対するＳｈ−ＲＮＡレンチウイルス（カタログ番号「ＴＲＣＮ００００２３５４８９」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びスクランブルＳｈ−ＲＮＡレンチウイルス（カタログ番号「ＳＨＣ００２」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）をヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ−１細胞に感染させ、ＦＯＸＯ３をノックダウンしたヒト膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ−１細胞を作製した。
【０１２５】
７週齢のヌードマウス（ｂａｌｂＣｎｕ／Ｃｒｌｊ、雌）にＣｏ６０線源を用いて１．８Ｇｙのγ線を照射し免疫抑制を誘導した。続いて、上記の各細胞を５×１０６個／匹ずつヌードマウスの右背部に皮下注射し、Ｐａｎｃ−１細胞株移植モデルマウスを作製した。続いて、３６日後に腫瘍体積をノギスで測定した。腫瘍体積は下記式（Ｆ１）により算出した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝（短径）２×長径×０．５  …（Ｆ１）
また、肝臓への腫瘍の転移を評価した。
【０１２６】
図５（ａ）は、腫瘍体積の測定結果を示すグラフである。図５（ａ）中、「ＦＯＸＯ３−ｓｈ」は、ＦＯＸＯ３に対するＳｈ−ＲＮＡレンチウイルスを感染させたＰａｎｃ−１細胞株の結果であることを示し、「Ｓｃｒ−ｓｈ」は対照のスクランブルＳｈ−ＲＮＡレンチウイルスを感染させたＰａｎｃ−１細胞株の結果であることを示す。
【０１２７】
その結果、ＦＯＸＯ３に対するＳｈ−ＲＮＡレンチウイルスを感染させたＰａｎｃ−１細胞株を移植したヌードマウスでは、対照と比較して、腫瘍体積が有意に縮小したことが明らかとなった。
【０１２８】
また、図５（ｂ）は、肝臓に転移した腫瘍の数を測定した結果を示すグラフである。図５（ｂ）中、「ＦＯＸＯ３−ｓｈ」は、ＦＯＸＯ３に対するＳｈ−ＲＮＡレンチウイルスを感染させたＰａｎｃ−１細胞株の結果であることを示し、「Ｓｃｒ−ｓｈ」は対照のスクランブルＳｈ−ＲＮＡレンチウイルスを感染させたＰａｎｃ−１細胞株の結果であることを示す。
【０１２９】
その結果、ＦＯＸＯ３に対するＳｈ−ＲＮＡレンチウイルスを感染させたＰａｎｃ−１細胞株を移植したヌードマウスでは、対照と比較して、腫瘍の肝臓への転移が有意に減少したことが明らかとなった。
【０１３０】
以上の結果は、ＦＯＸＯ３の発現を抑制することにより、膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることを更に支持するものである。
【０１３１】
《癌治療モデルの評価》
７週齢のヌードマウス（ｂａｌｂＣｎｕ／Ｃｒｌｊ、雌）にＣｏ６０線源を用いて１．８Ｇｙのγ線を照射し免疫抑制を誘導した。３日後、ヒト膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ−１細胞株を５×１０６個／匹ずつヌードマウスの右背部に皮下注射し、Ｐａｎｃ−１細胞株移植モデルマウスを作製した。
【０１３２】
続いて、腫瘍生着後（１４日後）から、４日おきにＦＯＸＯ３に対するＳｈ−ＲＮＡレンチウイルス（カタログ番号「ＴＲＣＮ００００２３５４８９」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）又はスクランブルＳｈ−ＲＮＡレンチウイルス（カタログ番号「ＳＨＣ００２」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を腫瘍内投与した。続いて、レンチウイルスの投与開始から３６日後に各ヌードマウスをと殺し、肝臓への腫瘍の転移を評価した。
【０１３３】
図５（ｃ）は、肝臓に転移した腫瘍の数を測定した結果を示すグラフである。図５（ｃ）中、「ＦＯＸＯ３−ｓｈ」は、ＦＯＸＯ３に対するＳｈ−ＲＮＡレンチウイルスを腫瘍内投与した結果であることを示し、「Ｓｃｒ−ｓｈ」は対照のスクランブルＳｈ−ＲＮＡレンチウイルスを腫瘍内投与した結果であることを示す。
【０１３４】
その結果、ＦＯＸＯ３に対するＳｈ−ＲＮＡレンチウイルスを継続的に腫瘍内投与したヌードマウスでは、対照と比較して、腫瘍の肝臓への転移が有意に減少したことが明らかとなった。この結果は、ＦＯＸＯ３の発現を抑制することにより、インビボにおいて膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることを更に支持するものである。
【０１３５】
［実験例７］
（ＦＯＸＯ３活性が膵臓癌患者の予後に与える影響の検討）
ＦＯＸＯ３活性化と膵臓癌患者の予後の関係を検討した。具体的には、マイクロアレイデータベースであるＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）のデータを用いてＦＯＸＯ３の活性と予後の関係をカプラン・マイヤー法に基づく生存曲線を基に解析した。
【０１３６】
マイクロアレイデータとしては、膵臓癌の中でも最も一般的かつ予後不良である浸潤性膵管癌（ＰＤＡＣ）の患者のマイクロアレイデータである、アクセッションＩＤ  ＧＳＥ２８７３５及びＧＳＥ２１５０１のデータを使用した。
【０１３７】
データの抽出は（Huang S., et al., MED12 Controls the Response to Multiple Cancer Drugs through Regulation of TGF-beta Receptor Signaling, Cell, 151, 937-950, 2012）に基づいて、ａｆｆｙ  ｐａｃｋａｇｅ（Gautier L., et al., affy--analysis of Affymetrix GeneChip data at the probe level, Bioinformatics, 20 (3), 307-315, 2004.）にしたがってＲ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（Gentleman R. C., et al., Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics, Genome Biol., 5 (10), R80, 2004.）を用いて行った。
【０１３８】
ＦＯＸＯ３の活性は、ＦＯＸＯ３によって転写制御される９つの遺伝子の発現に基づいて決定した。ＦＯＸＯ３の活性と予後の関係をカプラン・マイヤー法に基づく生存曲線を基に解析した。図６（ａ）は、アクセッションＩＤ  ＧＳＥ２８７３５の解析結果を示すグラフである。図６（ｂ）は、アクセッションＩＤ  ＧＳＥ２１５０１の解析結果を示すグラフである。
【０１３９】
その結果、ＦＯＸＯ３活性が高い患者において有意に予後不良であることが明らかとなった。このことから、ＦＯＸＯ３はヒトにおいても膵臓癌の進行に寄与することが明らかとなった。
【０１４０】
［実験例８］
（ＣＤ４４陽性膵臓癌幹細胞におけるＦＯＸＯ３の発現の検討）
癌幹細胞マーカーであるＣＤ４４陽性の膵臓癌幹細胞におけるＦＯＸＯ３の発現を蛍光免疫染色により検討した。
【０１４１】
膵臓癌の組織標本としては、ヒト膵臓癌腫瘍アレイ（ＵＳ  ｂｉｏｍａｘ社）を使用した。また、抗体としては、抗ＣＤ４４抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）及び抗ＦＯＸＯ３抗体（ＣＳＴ社）を使用した。
【０１４２】
図７（ａ）は、蛍光免疫染色によりＣＤ４４の発現を検出した結果を示す写真である。また、図７（ｂ）は、図７（ａ）と同一視野においてＦＯＸＯ３の発現を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。また、図７（ｃ）は、図７（ａ）と同一視野においてＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の蛍光により核を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【０１４３】
その結果、ＣＤ４４陽性細胞がＦＯＸＯ３を発現していることが明らかとなった。すなわち、膵臓癌幹細胞においてＦＯＸＯ３が高発現していることが明らかとなった。
【０１４４】
［実験例９］
（ｃＧＭＰ産生誘導剤Ｂａｙ４１−２２７２は、膵臓癌細胞におけるＦＯＸＯ３及びＣＤ４４の発現量を低下させた）
ｃＧＭＰ産生誘導剤が膵臓癌細胞におけるＦＯＸＯ３及びＣＤ４４の発現量に及ぼす影響を検討した。
【０１４５】
具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ−１細胞を、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で２．５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調整し、２ｍＬディッシュ（マツナミ社）に播種した。続いて、２４時間前培養した後、培地をＢａｙ４１−２２７２（５μＭ）を添加した１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、４８時間後（ＦＯＸＯ３）及び７２時間後（ＣＤ４４）に細胞を固定した。
【０１４６】
続いて、固定した細胞を用いて、ＦＯＸＯ３及びＣＤ４４の免疫染色を行った。ＦＯＸＯ３の染色には抗ＦＯＸＯ３抗体（ＣＳＴ社）を用いた。また、ＣＤ４４の染色には、抗ＣＤ４４抗体（ａｂｃａｍ社）を用いた。
【０１４７】
図８（ａ）は、ＦＯＸＯ３の発現を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。また、図８（ｂ）は、ＣＤ４４の発現を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、ｃＧＭＰ産生誘導剤を添加することにより、膵臓癌細胞におけるＦＯＸＯ３及びＣＤ４４の発現量が低下することが明らかとなった。
【０１４８】
［実験例１０］
（膵臓癌細胞におけるＦＯＸＯ３の発現抑制はＬＫＢ１の発現量を低下させた）
ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉により膵臓癌細胞株におけるＦＯＸＯ３をノックダウンし、ＬＫＢ１の発現に与える影響を検討した。
【０１４９】
具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ−１、ＢｘＰＣ−３、ＭＩＡ  Ｐａｃａ−２を１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調整し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ  ｓｉ−ＦＯＸＯ３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、更に４８時間培養した。ｓｉ−ＦＯＸＯ３としては、実験例４におけるＦＯＸＯ３−ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＦＯＸＯ３＿９１２７」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＦＯＸＯ３−ｓｉＲＮＡ（ｉｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＦＯＸＯ３＿９１２８」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ−ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＳＩＣ−００１」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
【０１５０】
続いて、ウエスタンブロットによりＦＯＸＯ３及びＬｉｖｅｒ  ｋｉｎａｓｅ  Ｂ１（ＬＫＢ１）の発現量を検討した。また、ローディングコントロールとしてβ−ａｃｔｉｎの発現を検出した。なお、ＬＫＢ１はＳｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １１（ＳＴＫ１１）とも呼ばれるものである。
【０１５１】
図９（ａ）〜（ｄ）は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。図９（ａ）及び（ｂ）は、Ｐａｎｃ−１細胞の結果を示し、図９（ｃ）はＢｘＰＣ−３細胞の結果を示し、図９（ｄ）はＭＩＡ  Ｐａｃａ−２細胞の結果を示す。
【０１５２】
その結果、ＦＯＸＯ３の発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、ＬＫＢ１の発現が顕著に低下することが明らかとなった。
【０１５３】
［実験例１１］
（ＬＫＢ１の発現抑制はヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した）
ＲＮＡ干渉によりヒト膵臓癌細胞株におけるＬＫＢ１をノックダウンし、癌幹細胞の機能を検討した。
【０１５４】
《コロニーアッセイ》
ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ−１細胞を、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調製し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ  ｓｉ−ＬＫＢ１（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、４８時間培養後細胞を回収した。なお、ｓｉ−ＬＫＢ１は、ＬＫＢ１に対するｓｉＲＮＡであり、ＬＫＢ１−ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＳＴＫ１１＿２６８７」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＬＫＢ１−ｓｉＲＮＡ（ｉｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＳＴＫ１１＿２６８９」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）の配列の異なる２種類を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ−ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＳＩＣ−００１」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
【０１５５】
回収した細胞を１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地で１０００個／ｍＬの細胞密度で５ｍＬディッシュに播種して２１日培養し、コロニー数を測定した。
【０１５６】
《スフェロイドアッセイ》
ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ−１、ＢｘＰＣ−３、ＭＩＡ  Ｐａｃａ−２細胞を、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調製し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ  ｓｉ−ＬＫＢ１（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、４８時間培養後細胞を回収した。なお、ｓｉ−ＬＫＢ１としては、ＬＫＢ１−ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＳＴＫ１１＿２６８７」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＬＫＢ１−ｓｉＲＮＡ（ｉｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＳＴＫ１１＿２６８９」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）の配列の異なる２種類を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ−ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＳＩＣ−００１」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
【０１５７】
回収した細胞を、Ｂ２７（５０倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を含有する無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１０００個／ｍＬの細胞密度に調整し、低接着プレートである、Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ  （２４ウェル、Ｃｏｓｔａｒ社）に播種して２１日間培養した。その後、顕微鏡下でスフェロイド数を測定した。
【０１５８】
《結果》
図１０（ａ）は、Ｐａｎｃ−１細胞株を用いたコロニーアッセイの結果を示すグラフである。図１０（ａ）の縦軸はコロニー形成能（測定されたコロニーの数）を示す。
【０１５９】
また、図１０（ｂ）〜（ｄ）はスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。図１０（ｂ）〜（ｄ）の縦軸はスフェロイド形成能（測定されたスフェロイドの数）を示す。図１０（ｂ）はＰａｎｃ−１細胞株の結果を示し、図１０（ｃ）はＢｘＰＣ−３細胞株の結果を示し、図１０（ｄ）はＭＩＡ  Ｐａｃａ−２細胞株の結果を示す。
【０１６０】
その結果、ＬＫＢ１の発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、癌細胞のコロニー形成能及びスフェロイド形成能が有意に低下することが明らかとなった。この結果から、ＬＫＢ１の発現を抑制することにより、膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることが明らかとなった。
【０１６１】
［実験例１２］
（膵臓癌細胞におけるＬＫＢ１の発現抑制はＰＧＣ−１βの発現量を低下させた）
ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉により膵臓癌細胞株におけるＬＫＢ１をノックダウンし、ＰＧＣ−１βの発現に与える影響を検討した。
【０１６２】
具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ−１、ＢｘＰＣ−３、ＭＩＡ  Ｐａｃａ−２を１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調整し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ  ｓｉ−ＬＫＢ１（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、更に４８時間培養した。ｓｉ−ＬＫＢ１としては、実験例１１におけるＬＫＢ１−ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＳＴＫ１１＿２６８７」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＬＫＢ１−ｓｉＲＮＡ（ｉｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＳＴＫ１１＿２６８９」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ−ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＳＩＣ−００１」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
【０１６３】
続いて、ウエスタンブロットによりＬＫＢ１及びＰＰＡＲγ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  １β（ＰＧＣ−１β）の発現量を検討した。また、ローディングコントロールとしてβ−ａｃｔｉｎの発現を検出した。
【０１６４】
図１１（ａ）〜（ｄ）は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。図１１（ａ）及び（ｂ）は、Ｐａｎｃ−１細胞の結果を示し、図１１（ｃ）はＢｘＰＣ−３細胞の結果を示し、図１１（ｄ）はＭＩＡ  Ｐａｃａ−２細胞の結果を示す。
【０１６５】
その結果、ＬＫＢ１の発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、ＰＧＣ−１βの発現が顕著に低下することが明らかとなった。
【０１６６】
［実験例１３］
（ＰＧＣ−１βの発現抑制はヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した）
ＲＮＡ干渉によりヒト膵臓癌細胞株におけるＰＧＣ−１βをノックダウンし、癌幹細胞の機能を検討した。
【０１６７】
具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ−１、ＢｘＰＣ−３、ＭＩＡ  Ｐａｃａ−２を、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調製し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ  ｓｉ−ＰＧＣ−１β（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、４８時間培養後細胞を回収した。なお、ｓｉ−ＰＧＣ−１β（カタログ番号「Ｈｓ＿ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ＿２９２３」、Ｓｉｇｍａ社）は、ＰＧＣ−１βに対するｓｉＲＮＡである。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ−ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＳＩＣ−００１」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
【０１６８】
《コロニーアッセイ》
回収した各細胞を１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地で１０００個／ｍＬの細胞密度で５ｍＬディッシュに播種して２１日培養し、コロニー数を測定した。
【０１６９】
《スフェロイドアッセイ》
回収した各細胞を、Ｂ２７（５０倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を含有する無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１０００個／ｍＬの細胞密度に調整し、低接着プレートである、Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ  （２４ウェル、Ｃｏｓｔａｒ社）に播種して２１日間培養した。その後、顕微鏡下でスフェロイド数を測定した。
【０１７０】
《結果》
図１２（ａ）〜（ｃ）は、コロニーアッセイの結果を示すグラフである。図１２（ａ）〜（ｃ）の縦軸はコロニー形成能（測定されたコロニーの数）を示す。
【０１７１】
また、図１２（ｄ）〜（ｆ）はスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。図１２（ｄ）〜（ｆ）の縦軸はスフェロイド形成能（測定されたスフェロイドの数）を示す。
【０１７２】
図１２（ａ）及び（ｄ）はＰａｎｃ−１細胞株の結果を示し、図１２（ｂ）及び（ｅ）はＢｘＰＣ−３細胞株の結果を示し、図１２（ｃ）及び（ｆ）はＭＩＡ  Ｐａｃａ−２細胞株の結果を示す。
【０１７３】
その結果、ＰＧＣ−１βの発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、癌細胞のコロニー形成能及びスフェロイド形成能が有意に低下することが明らかとなった。この結果から、ＰＧＣ−１βの発現を抑制することにより、膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることが明らかとなった。
【０１７４】
［実験例１４］
（膵臓癌細胞におけるＦＯＸＯ３の発現抑制はミトコンドリア機能を阻害した）
ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉により膵臓癌細胞株におけるＦＯＸＯ３をノックダウンし、ＰＧＣ−１βの発現及びミトコンドリア機能に与える影響を検討した。
【０１７５】
具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株であるＢｘＰＣ−３を１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調整し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ  ｓｉ−ＦＯＸＯ３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、更に４８時間培養した。ｓｉ−ＦＯＸＯ３としては、実験例４におけるＦＯＸＯ３−ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＦＯＸＯ３＿９１２７」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ−ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＳＩＣ−００１」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
【０１７６】
続いて、ウエスタンブロットによりＦＯＸＯ３及びＰＧＣ−１βの発現量を検討した。また、ローディングコントロールとしてβ−ａｃｔｉｎの発現を検出した。
【０１７７】
また、各細胞のミトコンドリア膜電位を、フローサイトメーターを用いて測定した。
【０１７８】
図１３（ａ）はウエスタンブロットの結果を示す写真である。また、図１３（ｂ）はミトコンドリア膜電位の測定結果を示すグラフである。
【０１７９】
その結果、ＦＯＸＯ３のノックダウンによってＰＧＣ−１βの発現が抑制され、ミトコンドリアの機能が阻害されることが明らかになった。
【０１８０】
［実験例１５］
（膵臓癌細胞におけるＰＧＣ−１βの発現抑制はＰＤＨＡ１の発現量を低下させた）
ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉により膵臓癌細胞株におけるＰＧＣ−１βをノックダウンし、ＰＤＨＡ１の発現に与える影響を検討した。
【０１８１】
具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株であるＢｘＰＣ−３、ＭＩＡ  Ｐａｃａ−２、Ｐａｎｃ−１を１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調整し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ  ｓｉ−ＰＧＣ−１β（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、更に４８時間培養した。ｓｉ−ＰＧＣ−１βとしては、ＰＧＣ−１β−ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ＿２９２３」、Ｓｉｇｍａ社）及びＰＧＣ−１β−ｓｉＲＮＡ（ｉｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ＿２９２４」、Ｓｉｇｍａ社）の配列の異なる２種類を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ−ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＳＩＣ−００１」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
【０１８２】
続いて、ウエスタンブロットによりＰＧＣ−１β及びＰｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  α１（ＰＤＨＡ１）の発現量を検討した。また、ローディングコントロールとしてβ−ａｃｔｉｎの発現を検出した。
【０１８３】
図１４（ａ）〜（ｃ）は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。図１４（ａ）はＢｘＰＣ−３細胞の結果を示し、図１４（ｂ）はＭＩＡ  Ｐａｃａ−２細胞の結果を示し、図１４（ｃ）はＰａｎｃ−１細胞の結果を示す。
【０１８４】
その結果、ＰＧＣ−１βの発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、ＰＤＨＡ１の発現が顕著に低下することが明らかとなった。
【０１８５】
［実験例１６］
（ＰＤＨＡ１の発現抑制はヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した）
ＲＮＡ干渉によりヒト膵臓癌細胞株におけるＰＤＨＡ１をノックダウンし、癌幹細胞の機能を検討した。
【０１８６】
具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ−１、ＢｘＰＣ−３、ＭＩＡ  Ｐａｃａ−２を、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調製し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ  ｓｉ−ＰＤＨＡ１（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、４８時間培養後細胞を回収した。なお、ｓｉ−ＰＤＨＡ１は、ＰＤＨＡ１に対するｓｉＲＮＡである。ｓｉ−ＰＤＨＡ１としては、ＰＤＨＡ１−ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＰＤＨＡ１＿２４５８」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＰＤＨＡ１−ｓｉＲＮＡ（ｉｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＰＤＨＡ１＿２２４２」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）の配列の異なる２種類を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ−ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＳＩＣ−００１」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
【０１８７】
《コロニーアッセイ》
回収した各細胞を１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地で１０００個／ｍＬの細胞密度で５ｍＬディッシュに播種して２１日培養し、コロニー数を測定した。
【０１８８】
《スフェロイドアッセイ》
回収した各細胞を、Ｂ２７（５０倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を含有する無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１０００個／ｍＬの細胞密度に調整し、低接着プレートである、Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ  （２４ウェル、Ｃｏｓｔａｒ社）に播種して２１日間培養した。その後、顕微鏡下でスフェロイド数を測定した。
【０１８９】
《結果》
図１５（ａ）〜（ｃ）は、コロニーアッセイの結果を示すグラフである。図１５（ａ）〜（ｃ）の縦軸はコロニー形成能（測定されたコロニーの数）を示す。
【０１９０】
また、図１５（ｄ）〜（ｆ）はスフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。図１５（ｄ）〜（ｆ）の縦軸はスフェロイド形成能（測定されたスフェロイドの数）を示す。
【０１９１】
図１５（ａ）及び（ｄ）はＰａｎｃ−１細胞株の結果を示し、図１５（ｂ）及び（ｅ）はＢｘＰＣ−３細胞株の結果を示し、図１５（ｃ）及び（ｆ）はＭＩＡ  Ｐａｃａ−２細胞株の結果を示す。
【０１９２】
その結果、ＰＤＨＡ１の発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、癌細胞のコロニー形成能及びスフェロイド形成能が有意に低下することが明らかとなった。この結果から、ＰＤＨＡ１の発現を抑制することにより、膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることが明らかとなった。
【０１９３】
［実験例１７］
（ＦＯＸＯ３又はＰＤＨＡ１の発現抑制はＭＡＲＣＨ８依存的にＣＤ４４のユビキチン化を促進した）
ＲＮＡ干渉によりヒト膵臓癌細胞株におけるＦＯＸＯ３又はＰＤＨＡ１をノックダウンし、ＣＤ４４のユビキチン化を検討した。
【０１９４】
具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ−１を、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調整して１０ｍＬディッシュに播種し、２４時間前培養した。前培養後、１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に培地交換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ、それぞれ１０ｎＭのｓｉ−ＦＯＸＯ３、ｓｉ−ＰＤＨＡ１又はｓｉ−ＭＡＲＣＨ８（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ、及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、２４時間培養した。
【０１９５】
ｓｉ−ＦＯＸＯ３としては、上述したＦＯＸＯ３−ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＦＯＸＯ３＿９１２７」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。また、ｓｉ−ＰＤＨＡ１としては、上述したＰＤＨＡ１−ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＰＤＨＡ１＿２４５８」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。また、ｓｉ−ＭＡＲＣＨ８としては、ＭＡＲＣＨ８−ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「ｓｃ−９０４３２」、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ−ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＳＩＣ−００１」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
【０１９６】
続いて、２４時間後に、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２  ０．１μＭを添加し、更に２４時間培養した。培養後、各細胞を回収し、抗ＣＤ４４抗体で免疫沈降し、抗ユビキチン抗体（Ｕｂ）、抗ＭＡＲＣＨ８抗体（ＭＡＲＣＨ８）又は抗ＣＤ４４抗体（ＣＤ４４）を用いたウエスタンブロットを行った。
【０１９７】
図１６は免疫沈降及びウエスタンブロットの結果を示す写真である。その結果、対照と比較して、ＦＯＸＯ３又はＰＤＨＡ１をノックダウンした場合には、ＭＡＲＣＨ８とＣＤ４４との相互作用が増加し、ＣＤ４４のユビキチン化が促進されることが明らかとなった。
【０１９８】
また、ＦＯＸＯ３及びＭＡＲＣＨ８をノックダウンした場合、又は、ＰＤＨＡ１及びＭＡＲＣＨ８をノックダウンした場合には、上記の効果は認められなかった。
【０１９９】
以上の結果は、ＦＯＸＯ３又はＰＤＨＡ１のノックダウンにより、ＭＡＲＣＨ８依存的にＣＤ４４のユビキチン化が促進されることが明らかとなった。
【０２００】
［実験例１８］
（ＦＯＸＯ３の発現抑制によるヒト膵臓癌幹細胞の機能阻害は、ＭＡＲＣＨ８の発現抑制によって解消された）
ＲＮＡ干渉によりヒト膵臓癌細胞株におけるＦＯＸＯ３又はＭＡＲＣＨ８をノックダウンし、癌幹細胞の機能を検討した。
【０２０１】
ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ−１を、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調製し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ、１０ｎＭのｓｉ−ＦＯＸＯ３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）又はｓｉ−ＭＡＲＣＨ８（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、４８時間培養後細胞を回収した。なお、ｓｉ−ＦＯＸＯ３としては、上述したＦＯＸＯ３−ｓｉＲＮＡ（ｉ）を使用した。また、ｓｉ−ＭＡＲＣＨ８としては、ＭＡＲＣＨ８−ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「ｓｃ−９０４３２」、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）及びＭＡＲＣＨ８−ｓｉＲＮＡ（ｉｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＭＡＲＣＨ８＿４９５２」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）の配列の異なる２種類を使用した。また、対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ−ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＳＩＣ−００１」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。
【０２０２】
回収した細胞を、Ｂ２７（５０倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を含有する無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１０００個／ｍＬの細胞密度に調整し、低接着プレートである、Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ  （２４ウェル、Ｃｏｓｔａｒ社）に播種して２１日間培養した。その後、顕微鏡下でスフェロイド数を測定した。
【０２０３】
図１７（ａ）及び（ｂ）は、スフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。図１０（ａ）及び（ｂ）の縦軸はスフェロイド形成能（測定されたスフェロイドの数）を示す。
【０２０４】
その結果、対照と比較して、ＦＯＸＯ３の発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、癌細胞のスフェロイド形成能が有意に低下することが明らかとなった。また、ＦＯＸＯ３及びＭＡＲＣＨ８をノックダウンした場合には、ＦＯＸＯ３のノックダウンによるスフェロイド形成能の低下の効果は解消された。
【０２０５】
以上の結果から、ＦＯＸＯ３のノックダウンによる癌幹細胞の機能の抑制が、ＭＡＲＣＨ８依存的であることが明らかとなった。
【０２０６】
［実験例１９］
（ＥＧＣＧとＰＤＥ阻害剤の併用は、ヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した  １）
発明者らは、以前に、緑茶に含まれる主要なカテキンの一種であるエピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ、以下、「ＥＧＣＧ」という場合がある。）が、６７ｋＤａラミニンレセプター（以下、「６７ＬＲ」という場合がある。）に結合すると、Ａｋｔが活性化され、内皮性一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）を活性化され、一酸化窒素（ＮＯ）及びｃＧＭＰの産生が誘導され、タンパク質キナーゼＣδ（ＰＫＣδ）が活性化され、産生スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）が活性化され、その結果、細胞死が誘導されることを明らかにした。すなわち、ＥＧＣＧは、６７ＬＲを介してｅＮＯＳ／ＰＫＣδ／ＡＳＭ経路を活性化し、細胞致死活性を示すことを明らかにした。
【０２０７】
発明者らはまた、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤は、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ等の環状リン酸ジエステルを加水分解する酵素を阻害する物質であることから、ＥＧＣＧと共にＰＤＥ阻害剤を併用することにより、ｃＧＭＰの分解が抑制され、ＥＧＣＧの活性を相乗的に増強することができることを明らかにした。
【０２０８】
そこで、ＥＧＣＧとＰＤＥ阻害剤の併用がヒト膵臓癌幹細胞の機能に与える影響を検討した。
【０２０９】
具体的には、まず、ヒト膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ−１における６７ＬＲの発現量をウエスタンブロットにより検討した。対照として、正常ヒト線維芽細胞を用いた。また、ローディングコントロールとしてβ−ａｃｔｉｎの発現を検出した。
【０２１０】
図１８（ａ）は、ウエスタンブロットの結果を示す写真である。その結果、正常ヒト線維芽細胞と比較して、膵臓癌細胞では６７ＬＲの発現が亢進していることが明らかとなった。
【０２１１】
続いて、膵臓癌組織におけるＰＤＥ３の発現を蛍光免疫染色により検討した。膵臓癌の組織標本としては、ヒト膵臓癌腫瘍アレイ（ＵＳ  ｂｉｏｍａｘ社）を使用した。また、抗体としては、抗ＣＤ４４抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）及び抗ＰＤＥ３抗体（ＣＳＴ社）を使用した。
【０２１２】
図１８（ｂ）は、蛍光免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、膵臓癌組織においてＰＤＥ３が高発現していることが明らかとなった。
【０２１３】
《スフェロイドアッセイ》
ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ−１、ＢｘＰＣ−３、ＭＩＡ  Ｐａｃａ−２を、Ｂ２７（５０倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、Ｃａｔａｌａｓｅ（２００  Ｕ／ｍＬ）を含有する無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１０００個／ｍＬの細胞密度に調整し、ＥＧＣＧ（１０μＭ）及びＰＤＥ３阻害剤であるＴｒｅｑｕｉｎｓｉｎ（２．５μＭ）を添加し、低接着プレートである、Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ  （２４ウェル、Ｃｏｓｔａｒ社）に播種して２１日間培養した。その後、顕微鏡下でスフェロイド数を測定した。
【０２１４】
図１８（ｃ）〜（ｅ）は、スフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。図１８（ｃ）〜（ｅ）の縦軸はスフェロイド形成能（測定されたスフェロイドの数）を示す。図１８（ｃ）はＰａｎｃ−１細胞株の結果であり、図１８（ｄ）はＢｘＰＣ−３細胞株の結果であり、図１８（ｅ）はＭＩＡ  Ｐａｃａ−２細胞株の結果である。
【０２１５】
その結果、ＥＧＣＧ及びＰＤＥ３を併用した場合に、膵臓癌幹細胞の指標であるスフェロイド形成能が有意に阻害されることが明らかとなった。この結果から、ＥＧＣＧとＰＤＥ３阻害剤の併用が、ヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害することが明らかとなった。
【０２１６】
［実験例２０］
（ＥＧＣＧとＰＤＥ阻害剤の併用は、ヒト膵臓癌細胞におけるＦＯＸＯ３及びＣＤ４４の発現を低下させた）
ヒト膵臓癌細胞の培地にＥＧＣＧ及びＰＤＥ阻害剤を添加し、ウエスタンブロットによりＦＯＸＯ３及びＣＤ４４の発現を検討した。
【０２１７】
具体的には、ヒト膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ−１を１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で２．５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調整し、１０ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養を行った後、培地をＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）及びＣａｔａｌａｓｅ（２００  Ｕ／ｍＬ）を含有する１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＥＧＣＧ（１０μＭ）又はＰＤＥ３阻害剤であるＴｒｅｑｕｉｎｓｉｎ（２．５μＭ）を添加した。続いて、ＦＯＸＯ３（４８時間後）及びＣＤ４４（７２時間後）の発現量をウエスタンブロットにより検討した。また、ローディングコントロールとしてβ−ａｃｔｉｎの発現を検出した。
【０２１８】
図１９（ａ）及び（ｂ）はウエスタンブロットの結果を示す写真である。図１９（ａ）及び（ｂ）において、「対照」はＥＧＣＧもＴｒｅｑｕｉｎｓｉｎも添加しなかった群の結果を示し、「ＥＧＣＧ」はＥＧＣＧのみを添加した群の結果を示し、「Ｔｒｅｑｕｉｎｓｉｎ」はＴｒｅｑｕｉｎｓｉｎのみを添加した群の結果を示し、「ＥＧＣＧ＋Ｔｒｅｑｕｉｎｓｉｎ」はＥＧＣＧ及びＴｒｅｑｕｉｎｓｉｎを添加した群の結果を示す。
【０２１９】
また、図１９（ａ）はＦＯＸＯ３の発現を検討した結果を示し、図１９（ｂ）はＣＤ４４の発現を検討した結果を示す。
【０２２０】
その結果、ＥＧＣＧ及びＰＤＥ阻害剤を併用することにより、ヒト膵臓癌細胞におけるＦＯＸＯ３及びＣＤ４４の発現が顕著に低下することが明らかとなった。
【０２２１】
［実験例２１］
（ＥＧＣＧとＰＤＥ阻害剤の併用は、ヒト膵臓癌幹細胞の機能を阻害した  ２）
７週齢のヌードマウス（ｂａｌｂＣｎｕ／Ｃｒｌｊ、雌）にＣｏ６０線源を用いて１．８Ｇｙのγ線を照射し免疫抑制を誘導した。３日後、ＲＰＭＩ１６４０培地で１．０×１０７個／ｍＬの細胞密度に調整したＰａｎｃ−１細胞株を、ヌードマウスに５００μＬ（５×１０６個／匹）ずつ背面皮下注射し、Ｐａｎｃ−１細胞株移植モデルマウスを作製した。
【０２２２】
移植から４日後に腫瘍の生着が確認できたため、生着した腫瘍体積をもとに群分けを行い、ＥＧＣＧ、ＰＤＥ３阻害剤であるＴｒｅｑｕｉｎｓｉｎ、又は抗癌剤であるＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅを投与した。ＥＧＣＧの投与量は２日に１回１０ｍｇ／ｋｇとした。Ｔｒｅｑｕｉｎｓｉｎの投与量は２日に１回５ｍｇ／ｋｇとした。Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅの投与量は６日に１回１００ｍｇ／ｋｇとした。
【０２２３】
続いて、経時的に腫瘍体積をノギスで測定した。腫瘍体積は下記式（Ｆ１）により算出した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝（短径）２×長径×０．５  …（Ｆ１）
【０２２４】
図２０は、腫瘍体積の変化を測定した結果を示すグラフである。その結果、ＥＧＣＧとＰＤＥ阻害剤を併用して投与することにより、腫瘍体積の増加が顕著に阻害されることが明らかとなった。
【０２２５】
また、ＥＧＣＧ、Ｔｒｅｑｕｉｎｓｉｎ、又はＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅの投与開始から３６日後に各ヌードマウスをと殺し、肝臓に転移した腫瘍の数を測定した。
【０２２６】
図２１は、肝臓に転移した腫瘍の数を測定した結果を示すグラフである。その結果、ＥＧＣＧとＰＤＥ阻害剤を併用して投与したヌードマウスでは、腫瘍の肝臓への転移が顕著に減少したことが明らかとなった。
【０２２７】
この結果から、ＥＧＣＧとＰＤＥ阻害剤を併用して投与することにより、インビボにおいても膵臓癌幹細胞の機能が抑制されることが明らかとなった。この結果は、ＥＧＣＧとＰＤＥ阻害剤との併用が、膵臓癌幹細胞の機能を抑制することを更に支持するものである。
【０２２８】
［実験例２２］
（ＥＧＣＧ誘導体は膵臓癌モデルマウスの生存期間を有意に延長した）
７週齢のヌードマウス（ｂａｌｂＣｎｕ／Ｃｒｌｊ、雌）にＣｏ６０線源を用いて１．８Ｇｙのγ線を照射し免疫抑制を誘導した。３日後、ＲＰＭＩ１６４０培地で１．０×１０７個／ｍＬの細胞密度に調整したＢｘＰｃ−３細胞株を、ヌードマウスに５００μＬ（５×１０６個／匹）ずつ腹腔内投与し、ＢｘＰｃ−３細胞株移植モデルマウス（腹膜播種モデル）を作製した。
【０２２９】
続いて、ヌードマウスをランダムに群分けし、ＥＧＣＧ又はＥＧＣＧ誘導体（化合物Ｎｏ．１９）を２日に１回５ｍｇ／ｋｇの投与量で腹腔内投与した。下記式（１）に使用したＥＧＣＧ誘導体（化合物Ｎｏ．１９）の化学式を示す。対照には、等容量の溶媒のみを腹腔内投与した。続いて、ヌードマウスの生存率を検討した。ヌードマウスの死亡をエンドポイントとした。実験結果の統計処理にはＴｕｋｅｙ’ｓ  ｔｅｓｔを用い、危険率５％未満を有意とした。
【０２３０】
【化３】
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【０２３１】
図２２（ａ）は各群のヌードマウスの生存率を示すグラフである。その結果、ＥＧＣＧ誘導体は生存期間の顕著な延長効果を有することが明らかになった。
【０２３２】
また、ヒト膵臓癌細胞株であるＢｘＰｃ−３を１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で２．５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調整し、１０ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養を行った後、培地をＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）及びＣａｔａｌａｓｅ（２００  Ｕ／ｍＬ）を含有する１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＥＧＣＧ（１０μＭ）又はＥＧＣＧ誘導体（化合物Ｎｏ．１９）（２．５μＭ）を添加して、９６ウェルプレートに播種して３時間インキュベートした。対照には、等容量の溶媒のみを添加した。その後、市販のキット（商品名「ｃＧＭＰ  ＥＩＡ  ｋｉｔ」、ケイマンケミカル社製）を用いて細胞内のｃＧＭＰ量を測定した。
【０２３３】
図２２（ｂ）は、細胞内ｃＧＭＰの測定結果を示すグラフである。その結果、ＥＧＣＧ誘導体（化合物Ｎｏ．１９）の添加により、細胞内のｃＧＭＰの産生が有意に上昇することが明らかとなった。
【０２３４】
［実験例２３］
（ｃＧＭＰ産生誘導剤はヒト肺癌幹細胞の機能を阻害した  １）
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９の培地に、ｃＧＭＰ産生誘導剤である、Ｂａｙ４１−２２７２（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を添加し、スフェロイド形成能を検討した。
【０２３５】
具体的には、Ａ５４９細胞株を、Ｂ２７（５０倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を含有する無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で１０００個／ｍＬの細胞密度に調製した。続いて、終濃度０、０．５、１又は２．５μＭのＢａｙ４１−２２７２を添加して、低接着プレートである、Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ（２４ウェル、Ｃｏｓｔａｒ社）に播種して２１日間培養した。その後、顕微鏡下でスフェロイド数を測定した。
【０２３６】
図２３は、スフェロイドアッセイの結果を示すグラフである。縦軸はスフェロイド形成能（測定されたスフェロイドの数）を示す。図中、「＊＊」は危険率５％未満で有意差があることを示し、「＊＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。
【０２３７】
その結果、Ｂａｙ４１−２２７２の濃度が高いほどスフェロイド形成能が有意に低下することが明らかとなった。この結果から、ｃＧＭＰ産生を誘導することにより、肺癌幹細胞の機能が抑制されることが明らかとなった。
【０２３８】
［実験例２４］
（ＦＯＸＯ３の発現抑制はヒト肺癌幹細胞の機能を阻害した  ２）
ＲＮＡ干渉によりヒト肺癌細胞株におけるＦＯＸＯ３をノックダウンし、癌幹細胞の機能を検討した。
【０２３９】
具体的には、まず、ヒト肺癌細胞株であるＡ５４９を、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０４個／ｍＬの細胞密度に調製し、５ｍＬディッシュに播種した。続いて、２４時間前培養した後、１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）１５μＬ及び１０ｎＭ  ｓｉ−ＦＯＸＯ３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）１５μＬ及びＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬを添加し、４８時間培養後細胞を回収した。ｓｉ−ＦＯＸＯ３としては、実験例４におけるＦＯＸＯ３−ｓｉＲＮＡ（ｉ）（カタログ番号「Ｈｓ＿ＦＯＸＯ３＿９１２７」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した。また、比較のためにスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ−ｓｉＲＮＡ）（カタログ番号「Ｍｉｓｓｏｎ＿Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＳＩＣ−００１」、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加した群を用意した。また、対照としてｓｉＲＮＡを添加しなかった群を用意した。
【０２４０】
続いて、回収した各細胞を１％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地で１０００個／ｍＬの細胞密度で５ｍＬディッシュに播種して２１日培養し、コロニー数を測定した。
【０２４１】
図２４は、コロニーアッセイの結果を示す写真である。その結果、ＦＯＸＯ３の発現をｓｉＲＮＡで抑制すると、癌細胞のコロニー形成能が顕著に低下することが明らかとなった。この結果から、ＦＯＸＯ３の発現を抑制することにより、肺癌幹細胞の機能が抑制されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０２４２】
本発明によれば、癌幹細胞阻害剤を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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