(57)【要約】      （修正有）【課題】グルカン及び／又はフカンを含む組成物を使って直接食事介入することによる胃腸の健康、免疫及び発育成績の改善に関し、特に、母親の食事のグルカン及び／又はフカン補充を介した関連する健康上の利益の出生児への移行に関する方法の提供。【解決手段】母動物又は人間の母親の子孫における、若齢期死亡率の低減、生涯を通じた発育成績の増加、あるいは、感染性疾患、炎症性疾患、胃腸性疾患又は免疫介在性疾患の予防、治療又は改善に使用するための組成物であって、少なくとも１種のグルカン及び少なくとも１種のフカンを含み、前記子孫を個々に直接治療することを必要とせず、体重１ｋｇ当たり３〜５０ミリグラムのグルカン及び／又は２〜４０ミリグラムのフカンが前記母動物又は人間の母親に投与する組成物。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
母動物または人間の母親の子孫における、若齢期死亡率の低減、生涯を通じた発育成績の増加、あるいは、感染性疾患、炎症性疾患、胃腸性疾患または免疫介在性疾患の予防、治療または改善、に使用するための組成物であって、少なくとも１種のグルカンおよび少なくとも１種のフカンを含み、前記子孫を個々に直接治療することを必要とせず、体重１ｋｇ当たり３〜５０ミリグラムのグルカンおよび／または２〜４０ミリグラムのフカンが前記母動物または人間の母親に投与されるような量で前記組成物が前記母動物に投与される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ラミナリンおよび／またはアルファフカンを使った直接的食事介入による胃腸の健康、免疫および働きの改善、ならびに母親の食事に対するラミナリンおよび／またはアルファフカン補充を介した関連する健康上の利益の出生児への移行に関する。
【０００２】
特に、本発明は、母親の食事へのラミナリンおよび／またはアルファフカンの補充により授乳期および離乳期出生児の栄養学的、免疫学的および微生物学的状態を改善することを目的とする。別の態様では、本発明は、ラミナリンおよび／またはアルファフカン含有調理品または飼料を利用して、ブタ、家禽、ヒツジ、ウマ、ウサギ、魚、ネコ、イヌ、ヒトおよび他の単胃の対象における免疫状態および免疫応答を改善することに関する。他の態様は、このような化合物を使用して、母親の食事のラミナリンおよび／またはアルファフカンによる補充後に、有益な化合物の子宮内、または初乳および授乳中の母乳経由での母親からの移行を介して、離乳家畜の体重増および飼料要求率増加で示される家畜の発育成績を上げることに関する。
【０００３】
別の態様では、本発明は、微生物集団を全体的に減らすこと、または選択的に有益な細菌を助長することにより新生児の腸の無菌条件を操作し、胃腸系内の病原体の成長を抑制することに関する。別の態様は、炭水化物基質からの発酵を増やし、タンパク質基質からの発酵を減少させることによる、腸内の直鎖揮発性脂肪酸の産生増加および分岐鎖揮発性脂肪酸の産生減少に関する。さらに別の態様は、腸管中の選択的刺激性ビフィズス菌による、共役リノール酸やオメガ３脂肪酸を含む長鎖多価不飽和脂肪酸の合成に関する。
【０００４】
別の態様では、本発明は、ムチンおよび／またはトレフォイルファクター（ＴＦＦ）の生体内産生の上方制御、およびそれによる侵襲、感染または傷害に対する胃腸粘膜の保護と安定性の強化に関する。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
小児科医および獣医師は、身体、認知および神経の成長を達成するためには、妊娠中に最適栄養摂取を行うことが重要であることをよく知っている。いくつかの試験により、栄養素および他の化合物の欠乏または毒性に関連した胎児の成長の効果、およびその後の生物季節学的特徴が証明された。これにより、重大な段階および分娩後の健全な成長速度の間の最適成長を得るために、出生前および周産期の食事介入の重要性が強調された。
【０００６】
確認コピー
これらの問題に対処するため、スワンレポート（１９６９）の出版により、抗生物質耐性に関連した、特に公衆衛生に対する脅威をもたらすリスクのために、動物の飼料における抗生物質使用法に関しより厳密な管理が推進された。これが２００６年１月の動物の飼料の成長促進抗生物質に関するＥＵ禁止に結びついた。これらの成長促進剤の禁止により、集約型農業生産者向け市場に空白を生じ、また、天然の安全な代替物の調達の機会がもたらされた。ブタ、家禽、ウマ、ヒツジ、ウサギ、魚、ヒトおよび他の単胃型の対象の妊娠授乳用食事へのラミナリンおよび／またはアルファフカンの含有により、出産時および出産直後の重要な免疫学的および微生物学的状態に大きな効果が得られ、従って、その後の健康、成長および成長速度に関し大きな効果が得られると思われる。
【０００７】
ラミナリンと呼ばれる藻類ベータグルカンは、（１→６）結合分岐部を有する場合もある、ベータ（１→３）−Ｄグルコシルサブユニットから成る。ラミナリアディギタータ由来のラミナリンは、２つの同族列の分子、すなわち、少数の２２〜２８グリコシル残基を含むＧシリーズ、およびより多くのマンニトール残基に結合した２０〜３０グリコシル残基から成るＭシリーズ、として存在する。ラミナリアの多くの種（ラミナリアヒペルボレアを含む）由来のラミナリンは相対的に不溶性であり、主にベータ（１→３）鎖から成る。一方、ラミナリアディギタータ由来のラミナリンは可溶で、分岐部に結合したベータ（１→６）から成り、量的には少ないが有意水準量は存在する（Ｒｅａｄ  ｅｔ  ａｌ、１９９６）。
【０００８】
酵母ベータグルカンは、少量のベータ（１→６）鎖を有するベータ（１→３）結合により結合された長い直鎖の１３００〜１５００グルコース残基のある状態で発見されている。ラミナリンより遙かに短い鎖長（平均＝２４残基）を有する（種によってはベータ（１→６）分岐部を含む場合もある）。ラミナリアディギタータは、ベータ（１→６）分岐を有し、このためこれ由来のグルカンが水溶性になっている。他のラミナリア種、例えば、ラミナリアヒペルボレア、はこの分岐を持たず、直鎖凝集体を形成し、このため、これ由来のグルカンが不溶性になっている。
【０００９】
基本的に硫酸化アルファ−Ｌ−フコース残基から構成される天然の多糖類は、フコイダン（またはアルファフカン）として知られている。これらは、褐藻類、一部の棘皮動物中に存在し、ワカメ、例えば、アスコフィラムノドサム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ）およびラミナリア種、中で２番目に多い多糖である。強力な抗凝固、抗腫瘍、および抗ウイルス試薬であるため、アルファフカンは、多様な生物活性に関して広範に研究されてきた。
【００１０】
本発明は、アルファフカン、特に、海産植物、例えば、ナマコの体壁中に存在するフカン；特に、海洋性藻類の細胞壁中およびウニ卵子の卵ゼリーコート中に存在するアルファフカンの使用を包含する。理想的には、本発明は、大型藻類中に存在するフコイダン（アルファフカン）を使用する。
【００１１】
発明の目的
母親による移行機構を介して、重要な成長段階での有益な化合物の早期送達を確実にすることにより、家畜、例えば、ブタ、家禽、ウマならびにウサギ、魚、ネコ、イヌ、およびヒトの新生児の生物学的、免疫学的および発育成績に関連する特質を制御する新規方法を提供することが本発明の１つの目的である。別の目的は、出生前の子宮内交換または出生後の初乳または母乳を介した移行による送達のための母親の食事の中のラミナリンおよび／またはアルファフカン含有調理品による食事介入を提供することである。別の目的は、家畜、例えば、ブタ、家禽、ウマ、ならびにウサギ、ネコ、イヌ、魚およびヒトの生物学的、免疫学的および発育成績関連特性を制御するためのラミナリンおよび／またはアルファフカン含有調理品用の投与計画を提供することである。
【００１２】
プロリンおよび抗炎症性のサイトカイン、白血球集団の発現、ならびに免疫グロブリン、ムチンおよびトレフォイルファクターの発現を変えることにより、その組成物が免疫応答に有益な影響を与えるようにすることが、さらなる本発明の目的である。
【００１３】
本発明のさらなる目的には、優先的に炭水化物を発酵基質として代謝するものに有利なように微生物学的プロファイルを変えることにより、揮発性直鎖脂肪酸の産生を増加させ、分岐鎖脂肪酸（例えば、吉草酸、イソ吉草酸およびイソ酪酸）の産生を減らすことが含まれる。
【発明の概要】
【００１４】
本発明の第１の態様では、母動物への投与により母動物の子孫の胃腸の健康または機能の改善と維持に使用するための、少なくとも１つのグルカン、少なくとも１つのフカン、または少なくとも１つのグルカンと少なくともひとつのフカンを含む組成物が提供される。
【００１５】
本発明の第２の態様では、母動物の子孫の胃腸の健康または機能の改善と維持の方法を提供し、この方法は、少なくとも１つのグルカン、少なくとも１つのフカン、または少なくとも１つのグルカンと少なくともひとつのフカンを含む組成物を母動物に投与することを含む。
【００１６】
組成物は、少なくとも１つのグルカンを含んでもよい。組成物が２つ以上のグルカンを含む場合は、各グルカンは、同じであっても異なっていてもよい。任意選択、または追加として、組成物は、少なくとも１つのフカンを含んでもよい。組成物が２つ以上のフカンを含む場合は、各フカンは、同じであっても、異なっていてもよい。任意選択で、組成物は、少なくとも１つのグルカン、少なくとも１つのフカン、またはそれらの混合物または組み合わせを含んでもよい。
【００１７】
任意選択として、組成物は、周産期に、出生前に、および／または出生後に母動物に投与してもよい。「出生前」は、全体妊娠期間の初期（受精）から５０％までの期間を意味する。子孫の胃腸の健康または機能の出生前の改善もしくは維持は、出生前の投与の間に生じる可能性がある。「周産期」は、全体妊娠期間の５０％から出産の時間までの期間を意味する。子孫の胃腸の健康または機能の周産期の改善または維持は、周産期の投与の間に起こる可能性がある。「出生後」は、出産以降の期間を意味し、離乳期（子孫による母親の初乳または母乳の摂食終了後の期間）まで及ぶことが意図されている。子孫の胃腸の健康または機能の出生後の改善または維持は、出生後の投与の間に起こる可能性がある。
【００１８】
「子孫」は、母動物の出生児を意味し、出生前の期間に子宮内で成長している出生児、および出生後の期間に体外で成長している出生児を含むことが意図されている。
【００１９】
「グルカン」は、少なくとも２つの糖類モノマーを含み、任意選択としてＤ−グルコースモノマーを含んでもよい多糖分子を意味し、各モノマーは隣接するモノマーとグリコシド結合により結合している。多糖分子は、直鎖であっても分岐であってもよく、すなわち、多糖分子は直鎖多糖であっても分岐鎖多糖であってもよい。任意選択で、グルカンは、分岐鎖グルカンでもよい。グルカンは、アルファグルカンであっても、ベータグルカンであってもよい。任意選択で、グルカンは、ベータグルカンでもよい。「ベータグルカン」は、少なくとも１つのベータグリコシド結合を含むグルカンを意味する。グリコシド結合は、第１のモノマーの炭素原子が、任意選択で一重結合により、隣接するモノマーの炭素原子と結合を形成するグリコシド結合を意味することが意図されている。ベータグリコシド結合は、第１のモノマーの炭素原子に結合した官能基、任意選択でヒドロキシル基、がモノマーの面より上（赤道面上）に伸びているグリコシド結合を意味することが意図されている。任意選択で、第１のモノマーのＣ１炭素原子が隣接モノマーのＣ６炭素原子と、任意選択で一重結合により、結合を形成する。さらなる任意選択で、グルカンは、ベータ（１→６）グリコシド結合、任意選択で、酸素含有ベータ（１→６）グリコシド結合、を含む。任意選択で、少なくとも１つのグルカンは、ベータ（１→３、１→６）グルカンである。またさらなる任意選択で、グルカンは、ラミナリンである。
【００２０】
「フカン」は、多糖、少なくとも２つのフコース糖類モノマーを含む多糖、任意選択で硫酸化多糖、を意味し、各モノマーは、グリコシド結合により隣接モノマーと結合している。多糖分子は、直鎖であっても、分岐であってもよい。任意選択で、フカンは分岐フカンである。フカンは、アルファフカンであっても、ベータフカンであってもよい。任意選択で、フカンはアルファフカンである。「アルファフカン」は、少なくとも１つのアルファグリコシド結合を含むフカンを意味する。グリコシド結合は、第１のモノマーの炭素原子が、任意選択で一重結合により、隣接するモノマーの炭素原子と結合を形成するグリコシド結合を意味することが意図されている。アルファグリコシド結合は、第１のモノマーの炭素原子に結合した官能基、任意選択でヒドロキシル基、がモノマーの面より下（軸方向）に伸びているグリコシド結合を意味することが意図されている。任意選択で、第１のモノマーのＣ１炭素原子が隣接するモノマーのＣ３またはＣ４炭素原子と結合、任意選択で一重結合、を形成する。
【００２１】
任意選択で、フカンはフコイダンである。
【００２２】
任意選択で、グルカンおよび／またはフカンは、褐藻類、任意選択で、ワカメから単離される。任意選択で、褐藻類は大型褐藻類である。任意選択で、大型褐藻類、任意選択で、ワカメ、は褐藻類から選択され、任意選択で、褐藻類コンブ目および褐藻類ヒバマタ目から選択される。さらなる任意選択で、褐藻類、任意選択で、ワカメ、はコンブ科、ヒバマタ科、およびカジメ科から選択される。任意選択で、大型褐藻類、任意選択で、ワカメ、はアスコフィルム種、任意選択で、アスコフィラムノドサムおよびラミナリア種、任意選択で、ラミナリアディギタータ、ラミナリアヒペルボレア、カラフトコンブ、マコンブまたはホンダワラ種から選択される。
【００２３】
あるいは、グルカンおよび／またはフカンは、紅藻類（ｒｅｄ  ａｌｇａ）、任意選択で、紅藻（ｒｅｄ  ｓｅａｗｅｅｄ）から単離される。任意選択で、紅藻類は大型藻類である。任意選択で、大型紅藻類、任意選択で、紅藻、は真正紅藻綱から選択され、任意選択で、真正紅藻綱スギノリ目から選択され、任意選択で、スギノリ科から選択される。
【００２４】
任意選択で、組成物を母動物に毎日投与する。
【００２５】
任意選択で、１ｋｇの体重当たり約３〜５０ミリグラムのグルカンの投与に相当する組成物の量を、任意選択で毎日、母動物に投与する。さらなる任意選択で、１ｋｇの体重当たり約２〜４０ミリグラムのフカンの投与に相当する組成物の量を、任意選択で毎日、母動物に投与する。任意選択で、１ｋｇの体重当たり約３〜５０ミリグラムのグルカンの投与に相当する組成物の量を、任意選択で毎日、動物に投与する。さらなる任意選択で、１ｋｇの体重当たり約２〜４０ミリグラムのフカンの投与に相当する組成物の量を、任意選択で毎日、動物に投与する。任意選択で、動物は単胃の動物である。さらなる任意選択では、動物は、ブタ、家禽、ウマ、ヒツジ、ウサギ、魚、ネコ、イヌ、およびヒトである。
【００２６】
「胃腸の健康または機能の改善と維持」は、生理的な機能または胃腸管の組織像改善および／または胃腸管の微生物学的集団の改善を意味する。さらに、宿主の免疫学的状態を改善することにより分子レベルで胃腸の改善または維持が可能である。胃腸の健康または機能の改善または維持は、不十分な胃腸の健康または機能に関連した障害、例えば、クローン病、過敏性腸症候群、および他の同類の慢性状態を防ぐこと、または予防的に治療することが意図されている。不十分な胃腸の健康に関係した他の障害は、重篤さは少なく、下痢症を生ずることが多い食品媒介病原菌およびある種の細菌やウイルス、悪い糞便の質、低出産体重または体重増加、または不十分な胃腸の健康による他の症状、を含みうる。
【００２７】
任意選択で、胃腸の健康または機能は、母動物の初乳または母乳中の免疫グロブリンの濃度、任意選択で、免疫グロブリンＧの濃度、を増やすことにより改善または維持される。
【００２８】
任意選択で、胃腸の健康または機能は、母動物の初乳または母乳中の粗タンパク質濃度を増やすことにより改善または維持される。
【００２９】
任意選択で、胃腸の健康または機能は、子孫の細菌性、任意選択で病原菌性、感染を減らすことにより改善または維持される。さらなる任意選択で、細菌性、任意選択で病原菌性、感染は腸内細菌感染であり、任意選択でサルモネラおよび大腸菌から選択される。
【００３０】
任意選択で、胃腸の健康または機能は、サイトカインの発現を増やすことにより改善または維持される。サイトカインは、任意選択で、腫瘍壊死因子アルファ、インターロイキン−１アルファ、インターロイキン−６、およびトレフォイルファクター３から選択される。
【００３１】
任意選択で、胃腸の健康または機能は、揮発性分岐鎖脂肪酸の濃度を減らすことにより改善または維持される。分岐鎖脂肪酸は、任意選択で、イソ酪酸、吉草酸、およびイソ吉草酸から選択される。
【００３２】
任意選択で、胃腸の健康または機能は、貪食細胞、任意選択で白血球、好中球、好酸球、単球、またはリンパ球、さらなる任意選択で、白血球、好酸球またはリンパ球、の濃度または活性を変えることにより改善または維持される。さらなる任意選択で、白血球の濃度または活性を上げ、および／またはリンパ球の濃度または活性を下げ、および／または好酸球の濃度または活性を減らす。
【００３３】
本発明のさらなる態様では、１キログラムの体重あたり約３〜５０ミリグラムのグルカンの投与に相当する組成物の量を、任意選択で毎日、動物に投与すること；または１キログラムの体重あたり約２〜４０ミリグラムのフカンの投与に相当する組成物の量を、任意選択で毎日、動物に投与することにより、動物の胃腸の健康または機能を改善または維持するための、少なくとも１つのグルカン、少なくとも１つのフカン、または少なくとも１つのグルカンと少なくとも１つのフカンを含む組成物が提供される。
【００３４】
またさらなる本発明の態様では、動物の胃腸の健康または機能の改善または維持する方法を提供し、この方法は、少なくとも１つのグルカン、少なくとも１つのフカン、または少なくとも１つのグルカンと少なくとも１つのフカンを含む組成物を、１キログラムの体重あたり約３〜５０ミリグラムのグルカンの投与に相当する量で、任意選択で毎日、動物に投与すること；または１キログラムの体重あたり約２〜４０ミリグラムのフカンの投与に相当する該組成物の量を、任意選択で毎日、動物に投与することを含む。
【００３５】
任意選択で、組成物がさらに糖、任意選択で、二糖を含み、任意選択でラクトース、ショ糖、ラクツロース、およびマルトースから選択される。さらなる任意選択で、組成物は、さらに糖、任意選択で、二糖を含み、任意選択でラクトース、ショ糖、ラクツロース、およびマルトースから選択される。
【００３６】
任意選択で、胃腸の健康または機能が細菌感染、任意選択で、大腸菌感染を減らすことにより改善または維持される。任意選択で、胃腸の健康または機能が改善または維持され、下痢症が防がれ、または予防的に治療される。
【００３７】
任意選択で、胃腸の健康または機能は、任意選択で抗原の存在下、サイトカインの発現を増加させることにより改善または維持される。さらなる任意選択で、抗原は、細菌性抗原、任意選択で、細菌性リポ多糖類である。任意選択で、サイトカインはインターロイキン−６およびインターロイキン−８から選択される。
【００３８】
任意選択で、胃腸の健康または機能は、ムチン、任意選択で、ムチン−２および／またはムチン−４、の発現を増加させることにより改善または維持される。
【００３９】
任意選択で、胃腸の健康または機能は、サーコウイルスまたはパルボウイルス、任意選択で、ブタサーコウイルスまたはブタパルボウイルスの濃度を減らすことにより改善または維持される。さらなる任意選択で、ブタサーコウイルスは２型ブタサーコウイルスである。
【００４０】
任意選択で、胃腸の健康または機能は、直鎖揮発性脂肪酸の濃度を増やすことにより改善または維持される。
【００４１】
本発明者等は、（Ｉ）腸の組織像、（ＩＩ）腸の微生物学、（ＩＩＩ）プロリン−および抗−炎症性サイトカインの発現、（ＩＩＩ）新生児血清免疫グロブリンレベル、（ＩＶ）ムチン産生、（Ｖ）トレフォイルファクター産生、（ＶＩ）初乳および母乳の栄養学的および免疫学的組成および（ＶＩＩ）性能指数、に与える効果を変えるラミナリンおよび／またはアルファフカン製剤を含む組成物を開発した。さらに、感染と炎症の減少に由来する罹患率と死亡率の減少という利益に関連する腸内細菌集団に対する明らかに有害な作用が認められた。
【００４２】
従って、本発明は、出生前および出生後の母親の食事の補充によって、新生児および離乳児の胃腸の健康および免疫を改善する方法においてベータグルカンおよび／またはアルファフカンを含む組成物の使用を提供する。好ましい実施形態では、ベータグルカンおよびアルファフカンは、海藻および一部の棘皮動物を含む２つ以上のソース由来であってもよい。海藻は、コンブ科、ヒバマタ科、スギノリ科またはカジメ科からなる群由来であってもよい。
【００４３】
本発明はまた、下記の方法において、ベータグルカンおよび／またはアルファフカンを含む組成物の使用を提供する：
−新生児および離乳児の胃腸の細菌性集団を減らすために、母親の栄養学的補助食品または飼料を作成する方法において；
−新生児および離乳児の罹患率および死亡率を減らすために、母親の栄養学的補助食品または飼料を作成する方法において；
−新生児および離乳児の絨毛高を増やす、陰窩深を減らす、または全体絨毛高／陰窩深比率を増やすことにより消化組織像を改善するために、母親の栄養学的補助食品または飼料を作成する方法において；
−平均１日増体量の増加、平均１日飼料摂取量の増加、および増体／飼料比の改善を含む、家畜、例えば、ブタ、家禽、ウマ、ならびにウサギ、魚、ネコ、イヌおよびヒト、等の家畜の子孫の発育成績を改善するために、母親の栄養学的補助食品または飼料を作成する方法において；
−母親の食事を補助して、有益なミクロフローラを助長し、病原性ミクロフローラを減らし、また、新生児および離乳児の能力を改善することにより胃腸の健康を改善する方法において；
−胃腸の上皮の物理的保護を強化する手段として、上皮細胞によるムチンおよびトレフォイルファクターの産生を上方制御する方法において；
【００４４】
さらなる態様では、本発明は、ベータグルカンおよび／またはアルファフカンを含む組成物をヒト、非ヒト動物または家禽に摂食させることにより上記の効果を達成する方法を提供する。
【００４５】
またさらなる態様では、本発明は、下記を提供する：
−直接に食事を、または出生前後の期間の母親の食事を、ベータグルカンおよびアルファフカンを含む組成物で補うことによる、家畜、例えば、ブタ、家禽、ウマ、ヒツジならびにウサギ、魚、ネコ、イヌおよびヒト、の細菌性またはウイルス感染および炎症を防止するための投与計画；
−出生前後の期間の母親の食事を、ベータグルカンおよびアルファフカンを含む組成物で補うことによる、栄養学的質を改善し初乳および母乳の免疫グロブリンレベルを増やすための投与計画；
−出生前後の期間の母親の食事を、ベータグルカンおよびアルファフカンを含む組成物で補って、有益な免疫賦活性化合物を胎盤膜を通って子宮内移行することにより新生児の血清免疫グロブリンレベルを増やすための投与計画；
−出生前後の期間の母親の食事を、ベータグルカンおよびアルファフカンを含む組成物で補うことによる、初乳または母乳の摂取増加により新生児血清免疫グロブリンレベルを増やすための投与計画；
−出生前後の期間の母親の食事を、ベータグルカンおよびアルファフカンを含む組成物で補うことによる、新生児ブタ、家禽、ウマ、ならびにウサギ、魚、ネコ、イヌ、ヒトおよび他の単胃の対象の胃腸中の大腸菌を含む腸内細菌集団を減らすための投与計画；
−出生前後の期間の母親の食事を、ベータグルカンおよびアルファフカンを含む組成物で補うことによる、離乳関連軽減機能性胃腸障害のための投与計画；
−出生前後の期間の母親の食事を、ベータグルカンおよびアルファフカンを含む組成物で補って、出生直後の腸の細菌性コロニー形成の期間に、支配的比率の有益な細菌の選択的助長および病原菌の成長の選択的抑制をすることにより新生児および離乳児の健全な腸微生物学的プロファイルを促進するための投与計画；
【００４６】
ラミナリンの投与計画は、１キログラム体重あたり、３ミリグラム超／日〜最大５０ミリグラム／日のラミナリンの毎日の投与量であってもよい。
【００４７】
アルファフカンの投与計画は、１キログラム体重あたり、２ミリグラム超／日〜最大４０ミリグラム／日の毎日の投与量であってもよい。
【００４８】
ラミナリンとアルファフカンの組み合わせの投与計画は、１キログラム体重あたり、３ミリグラム超／日〜最大５０ミリグラム／日のラミナリンの毎日の投与量を、１キログラム体重あたり、２ミリグラム超／日〜最大５０ミリグラム／日のアルファフカンの毎日の投与量と組み合わせて投与してもよい。
【００４９】
また、本発明は、ベータグルカンおよび／またはアルファフカンを含む組成物の下記の目的の方法に関しての使用を提供する：
−体内での直鎖揮発性脂肪酸産生を増やすための；
−体内での分岐鎖揮発性脂肪酸産生およびそれらの排出を減らすための；
−体内での長鎖多価不飽和脂肪酸産生を増やすための；
−免疫攻撃された家畜、例えば、ブタ、家禽、ウマ、ならびにウサギ、魚、ヒトおよび他の単胃の対象、の免疫状態および応答を改善するための；
−プロリン−および抗−炎症性のサイトカイン、ムチンおよびトレフォイルファクターの発現を増やすことにより免疫状態を改善するための。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
以降で、本発明の実施形態について、非制限的実施例、およびこれに付随する下記の図に対する参照を使用して説明する。
【図１】は、基礎食摂取子ブタのＰＣＶ２特異的抗体力価を示す。
【図２】は、ＬＡＭ＋ＦＵＣを補充した基礎食事摂取子ブタのＰＣＶ２特異的抗体力価を示す。
【図３】は、ＬＡＭ＋ＦＵＣおよびＷＰＩを補充した基礎食事摂取子ブタのＰＣＶ２特異的抗体力価を示す。
【図４】は、異なる食事に慣らし、その後ＰＣＶ２およびＰＰＶの攻撃を受けた子ブタのリンパ球集団割合を示す。
【図５】は、異なる食事を給餌され、その後ＰＣＶ２およびＰＰＶ（Ｄａｙ１４ＰＩ）で攻撃を受けた子ブタの平均好酸球集団パーセンテージを示す。
【図６】は、異なる食事に慣らし、その後ＰＣＶ２およびＰＰＶの攻撃を受けた子ブタの平均末期体重（Ｋｇ）を示す。
【図７】は、異なる食事に慣らし、その後ＰＣＶ２およびＰＰＶの攻撃を受けた子ブタの糞便中で検出された平均ＰＣＶ２ＤＮＡコピー数を示す。
【図８】は、異なる食事に慣らした子ブタのＰＣＶ２ＤＮＡコピー数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
実施例
実施例では、ヒト、動物および家禽を含む全ての単胃生物のモデルとして、ブタの研究対象に対するラミナリンおよび／またはフコイダン補充の効果に関する調査研究の結果が示される。実施例には、ラミナリンおよびフコイダンを組み合わせて（以降、ＳＷＥと呼ぶ）、または各化合物を別々にラミナリン（以降、ＬＡＭと呼び）またはフコイダン（以降、ＦＵＣと呼び）として含む海藻抽出物を使って行った試験が含まれる。
【００５２】
実施例１
材料および方法
動物および処置
４０匹の妊娠ブタを４つの食事療法の内の１つに割り当てた（ｎ＝１０匹雌ブタ／処置）：（Ｔ１）基礎授乳；（Ｔ２）基礎授乳＋１００ｇ／日魚油（Ｆ．Ｏ．）；（Ｔ３）基礎授乳＋１．８ｇ／日ＳＷＥ；および（Ｔ４）基礎授乳＋１００ｇ／日Ｆ．Ｏ．＋１．８ｇ／日ＳＷＥ（妊娠の１０９日目から２６日での離乳まで）。ＳＷＥは、一日量のラミナリン（１ｇ）およびフコイダン（０．８ｇ）を含有。被験動物に対し、食事に実験栄養補助剤を毎日追加した。出生時に体重を記録し、３匹の子ブタを選別して、同腹仔の平均出生時体重の代表値とした。これらは離乳まで毎週秤量した。離乳時に、１２０匹の雄雌混合ブタ（１匹の同腹仔当たり３匹のブタ；平均体重＝８．０５±０．４６Ｋｇ）を選択し、スターター飼料を２１日間与えた。飼料と水は実験中自由に入手できるようにした。ブタは、離乳（ｄａｙ０）の日に別々に秤量し、その後は離乳後、７、１４および２１日目に秤量した。飼料摂取量を毎日記録した。
【００５３】
標本採取
３０ｍｌの初乳および母乳を分娩後、ｄａｙ０および１２に雌ブタから採取した。血液サンプルを、授乳のｄａｙ５および１２に２匹の子ブタ／同腹仔の頸静脈から免疫グロブリン分析用として採取した。Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（ＡＯＡＣ、１９９５）に従って、粗タンパク質を測定した。
【００５４】
免疫グロブリンの定量
免疫グロブリンアッセイを、特異的ブタＥＬＩＳＡ定量キット（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）を使って実施した。雌ブタの初乳および母乳および子ブタ血清を使って、Ｉｌｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（２００５）により記述されているようにして、ブタアッセイを行った。
【００５５】
選択した微生物集団の分析
胃腸内容物標本を無菌的に屠殺後の各ブタの盲腸および結腸から取り出した。ビフィズス菌、大腸菌および乳酸桿菌種集団をＰｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）に従って選択的に単離し、列挙した。
【００５６】
揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）分析
Ｐｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）の手続きに従ったガスクロマトグラフィーによる方法により、盲腸および結腸からの胃腸内容物標本をＶＦＡ分析用に回収した。
【００５７】
組織学的分析
十二指腸、空腸および回腸の切片を、１０％リン酸塩緩衝ホルマリン中で無菌的に取りはずし、摘出および固定した。各腸セグメントの５μｍ厚さの断面をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。絨毛高および陰窩深をイメージアナライザー（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ；Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）付き光顕微鏡を使って測定した。
【００５８】
フローサイトメトリーによる血球細胞の食作用評価
非オプソニン化、ＦＩＴＣ標識大腸菌の摂食を測定する、ＰＨＡＧＯＴＥＳＴ（登録商標）キット（Ｏｒｐｅｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を全血球細胞の貪食活性測定に使用した。標本をＤａｋｏＣｙａｎ−ＡＤＰフローサイトメーター（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使って解析した。
【００５９】
回腸および結腸遺伝子発現−ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
組織標本を回腸および結腸から採取し、氷冷ＰＢＳで洗浄後直ちにＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を含むチューブに入れた。全ＲＮＡをＧｅｎｅ  Ｅｌｕｔｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使って抽出し、ＮａｎｏＤｒｏｐＮＤ１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．ＭＡ、ＵＳＡ）を使って定量した。２６０および２８０ｎｍでの吸光度比を測定し純度を評価した。全体ＲＮＡを、Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）とオリゴｄＴプライマーを使って逆転写（ＲＴ）した。
【００６０】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
定量的リアルタイム（ｑＰＣＲ）アッセイを、７９００ＨＴ  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）上で、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使ってｃＤＮＡ標本で実施した。ＲＴ−ＰＣＲ（ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＭＵＣ２、ＴＦＦ３、ＧＡＰＤＨ、Ｂ２Ｍ、ＡＣＴＳ、ＰＰＩＡおよびＹＷＨＡＺ）に使った全プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ソフトウェアを使って設計した。増幅を、１０μｌのＳＹＢＲ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、１μｌの順方向および逆方向プライマー、８μｌのＤＰＥＣ処理水および１μｌのテンプレートｃＤＮＡ中で実施した。ＰＣＲ産物の解離分析を行い、得られたＰＣＲ産物の特異性を確認した。
【００６１】
結果
初乳および母乳組成物
初乳ＩｇＧレベルは、ＳＷＥを補充した雌ブタで有意に高かった（ｐ＜０．０１）。補充により雌ブタの母乳中のタンパク質濃度が１２日目に増加した（ｐ＜０．０５）。
【表１】
2018048141.tif 000003
【００６２】
哺乳子豚の免疫グロブリン
ＳＷＥ補充雌ブタから授乳した小ブタは、授乳の５日目（ｐ＜０．０１）と１２日目（ｐ＜０．０５）に有意に高い血清中ＩｇＧ濃度を示し、授乳５日目に高い血清ＩｇＡ濃度を示した（ｐ＞０．０５）。
【表２】
2018048141.tif 000004
【００６３】
哺乳子豚の発育成績
ＳＷＥ補充雌ブタから授乳した小ブタは、授乳の第１週目の間、有意に低い平均１日増体量を示した（ｐ＜０．０５）。出生と離乳の間の１日増体量に有意差はなかった。同腹仔サイズ、同腹仔体重、子ブタ出産体重および離乳時体重は、雌ブタの食事療法の影響を受けなかった。
【表３】
2018048141.tif 000005
【００６４】
離乳後の子ブタの発育成績
ＳＷＥ補充雌ブタから授乳した小ブタは、離乳後７〜１４日目（ｐ＜０．０５）、離乳後０〜２１日目（ｐ＝０．０６３）に有意に高いＡＤＧを示し、また離乳後７〜１４日目に有意に高い食事摂取量を示した（ｐ＜０．０５）。
【表４】
2018048141.tif 000006
【００６５】
微生物学
結腸では、母親のＳＷＥ補充により、ビフィズス菌集団の有意な減少が生じた（ｐ＜０．０１）。さらに、ＳＷＥ補充により、対象と比べて結腸中の大腸菌および乳酸桿菌集団を減少させる傾向が認められた（ｐ＝０．０９）。
【表５】
2018048141.tif 000007
【００６６】
サイトカイン遺伝子発現
離乳後ブタの回腸では、母親へのＳＷＥ補充がプロリン炎症性サイトカインＴＮＦ−α発現の有意な増加を誘導した（ｐ＜０．０１）。また、結腸でのＴＦＦ３遺伝子発現の有意な増加も認められた（ｐ＜０．０５）。
【表６】
2018048141.tif 000008
【００６７】
揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）分析およびｐＨ測定
【表７】
2018048141.tif 000009
【００６８】
組織像
回腸では、ＳＷＥ補充が絨毛高および絨毛高の陰窩深に対する比率に与える有意な効果があった（ｐ＜０．０５）。また、十二指腸での結果も、陰窩深に対するＳＷＥ補充と同様の有益な効果を示した（ｐ＞０．１０）。
【表８】
2018048141.tif 000010
【００６９】
食作用能力
ＳＷＥ補充は、授乳子ブタの全好酸球数に対し抑制効果を発揮した（ｐ＜０．０１）。ＳＷＥ補充食事は、ＳＷＥ非補充食事に比較して、高い割合の大腸菌貪食白血球（ｐ＜０．０５）および低い割合の大腸菌貪食リンパ球（ｐ＜０．０１）を生成した。
【表９】
2018048141.tif 000011
【００７０】
実施例２  実験１
材料および方法
実験計画および食事
実験１を下記の５つの食事療法を含む完全な無作為化方式として計画した：（Ｔ１）０ｇ／Ｋｇ  ＳＷＥ（対照）、（Ｔ２）０．７ｇ／Ｋｇ  ＳＷＥ、（Ｔ３）１．４ｇ／Ｋｇ  ＳＷＥ抽出物、（Ｔ４）２．８ｇ／Ｋｇ  ＳＷＥ抽出物および（Ｔ５）５．６ｇ／Ｋｇ  ＳＷＥ抽出物。ＳＷＥは、ＬＡＭ＋ＦＵＣを含む。全食事を同じ濃度の正味エネルギーおよび合計リシンを有するように処方した。アミノ酸要求をリシンに対して合わせた（Ｃｌｏｓｅ、１９９４）。灰分消化率の測定を行うために、１５０ｐｐｍの速度で粉砕するときに酸化クロムを全食事に添加した。
【００７１】
動物および管理
５１±３．４Ｋｇの初期生体重を有する３０匹の仕上げ成熟雄ブタを実験に使用した。ブタを生体重に基づいて区分けし、無作為に５つの食事療法の１つに割り付けた。ブタを１４日間の食事適応期間を与え、その後、秤量し別々の代謝クレートに移した。動物に５日間の順化を行わせ、５日間の採取期間で見かけ消化率を促進し、さらに窒素バランス調査を行った。１日摂取許容量（ＤＥ摂取量＝３．４４ｘ（生体重）０．５４（Ｃｌｏｓｅ、１９９４））を２回の食事に分けた。水を食事と一緒に１：１の比率で与えた。食事の間に、新しい水を自由に与えた。代謝クレートを環境制御室で割り付け、２２℃（±１．５℃）の定温で維持した。
【００７２】
全消化管見かけ消化率係数（ＣＴＴＡＤ）および窒素バランス調査
採取中、クレート下部の漏斗経由で尿を２０ｍｌの硫酸（２５％Ｈ２ＳＯ４）を含むプラスチック容器に採取した。窒素の揮発を避けるため、漏斗に毎日４回、弱塩酸（２％Ｈ２ＳＯ４）溶液を吹き付けた。尿容量を毎日記録し、５０ｍｌの標本を採取し、研究室分析用に冷凍した。総糞便重量を毎日記録し、１００℃でオーブン乾燥した。新しく排泄された糞便の標本を毎日集め、窒素分析とｐＨ測定用として冷凍した。採取期間の最後で、糞便標本をプールし、副標本を研究室分析用に保管した。飼料標本を毎日集め化学分析用に保管した。全３０匹のブタを屠殺までそのそれぞれの食事療法のまま保持した。
【００７３】
実施例２  実験２
材料および方法
実験計画および食事
この実験を下記４つの食事療法を含む２ｘ２要因配置として計画した：（Ｔ１）対照食事、（Ｔ２）対照＋３００ｐｐｍ  ＬＡＭ、（Ｔ３）対照＋２３８ｐｐｍ  ＦＵＣ、（Ｔ４）対照＋３００ｐｐｍ  ＬＡＭ＋２３８ｐｐｍ  ＦＵＣ。全食事を正味エネルギー（９．８ＭＪ／Ｋｇ）と全リシン（１０ｇ／Ｋｇ）で規格化した。アミノ酸要求をリシンに対して合わせた（Ｃｌｏｓｅ、１９９４）。
【表１０】
2018048141.tif 000012
【００７４】
動物および管理
５５Ｋｇの初期生体重を有する２８匹の仕上げ成熟雄ブタを使用した。ブタを生体重に基づいて区分けし、無作為に４つの食事療法の１つに割り付けた。ブタに２８日間の食事適応期間を与え、その後秤量し、屠殺した。
【００７５】
近接する盲腸と結腸中の灰分の微生物学および見かけ消化率
屠殺後各動物の近接した盲腸および結腸から胃腸内容物を取り出した。マーカーとして酸化クロムを使って盲腸および結腸中の消化率を測定した。ビフィズス菌種、乳酸桿菌種および腸内細菌を、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、（２００５）により記載された方法に従って単離、計数した。
【００７６】
揮発性脂肪酸標本採取および分析
それぞれのブタの盲腸由来の胃腸内容物および近接したおよび遠位の結腸の検体をＶＦＡ分析用に採取した。Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）に従って改良したＰｏｒｔｅｒとＭｕｒｒａｙ（２００１）の方法を使って、胃腸内容物中のＶＦＡ濃度を測定した。
【００７７】
結果
実験１−微生物学的調査
【表１１】
2018048141.tif 000013
【００７８】
実験１−CFAsc：産生的に見かけ灰分消化率を増加する、その胃腸表面の発酵基質の合計リシン（１０．０）分析
【表１２】
2018048141.tif 000014
【００７９】
実験１−揮発性脂肪酸調査
【表１３】
2018048141.tif 000015
【００８０】
実験２−微生物学調査
【表１４】
2018048141.tif 000016
【００８１】
実験２−揮発性脂肪酸調査
【表１５】
2018048141.tif 000017
【００８２】
実施例３
実験計画および食事
この実験は、２５日間を２回連続して行った。２４０匹の子ブタを離乳後２４日目に選別し、４つの食事療法の１つに割り当てた。期間１と２のブタはそれぞれ７．２Ｋｇおよび７．８Ｋｇ（±０．９Ｋｇ）の生体重であった。この実験を２ｘ２要因計画で行った。実験（０〜２５日）の間、子ブタに次の食事を与えた：（Ｔ１）１５０ｇ／Ｋｇラクトース；（Ｔ２）１５０ｇ／Ｋｇラクトース＋ＳＷＥ；（Ｔ３）２５０ｇ／Ｋｇラクトース（Ｔ４）２５０ｇ／Ｋｇラクトース＋ＳＷＥ。ＳＷＥは、２．８ｇ／Ｋｇとし、これはラミナリアディギタータ由来であり、ラミナリン（１１２ｇ／Ｋｇ）、フコイダン（８９ｇ／Ｋｇ）および灰分（７９９ｇ／Ｋｇ）が含まれている。
【００８３】
動物および管理
ブタを４つのグループ（ｎ＝１５匹／処置）に分けて収容し、離乳（０日目）、７、１４および２５日目に秤量した。ブタは自由に摂食させた。新しい糞便検体を１０〜１５日目に採取し、栄養消化率測定およびＶＦＡ分析用とした。新しい糞便を１０日目に採取し大腸菌と乳酸桿菌の計数用とした（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。
【００８４】
微生物学
１ｇの糞便検体をマキシマムリカバリー希釈液（ＭＲＤ；Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、ＵＫ）で系列希釈し、選んだ寒天に蒔いた。乳酸桿菌種をｄｅ  Ｍａｎ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐ寒天（ＭＲＳ、Ｏｘｏｉｄ）に単離した。ＡＰＩ５０ＣＨＬ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ）キットを使って、疑わしい乳酸桿菌ｓｐｐ．を確認した。大腸菌種をＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天（Ｏｘｏｉｄ）に単離した。疑わしいコロニーをＡＰＩ２０Ｅ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ）で確認した。
【００８５】
結果
発育成績
【表１６】
2018048141.tif 000018
【００８６】
全消化管見かけ消化率係数（ＣＴＴＡＤ）
【表１７】
2018048141.tif 000019
【００８７】
微生物学およびＶＦＡ
【表１８】
2018048141.tif 000020
【００８８】
実施例４
実験計画および食事
初期生体重６．４±０．７８５Ｋｇの１９２匹の２４日齢離乳子ブタを４つの食事療法の１つまたは２１日の離乳に割り当てた。食事療法は、（Ｔ１）基礎食事、（Ｔ２）基礎食事＋３００ｐｐｍ  ＬＡＭ、（Ｔ３）基礎食事＋２３６ｐｐｍ  ＦＵＣ、（Ｔ４）基礎食事＋３００ｐｐｍ  ＬＡＭ＋２３６ｐｐｍ  ＦＵＣ、から構成されている。食事を同じ濃度の消化可能エネルギー（ＤＥ）（１６ＭＪ／Ｋｇ）および回腸消化可能リシン（１４ｇ／Ｋｇ）となるよう処方した。総アミノ酸要求をリシンに対して合わせた（Ｃｌｏｓｅ、１９９４）。栄養消化率測定のために酸化クロム（ＩＩＩ）を食事に添加した。ＬＡＭおよびＦＵＣをラミナリアヒペルボレア由来とした。
【００８９】
管理
子ブタをグループ４に収納し毎日２回摂食させた。水は自由に与えた。病気の症状を呈する全てのブタを適切に処置し、記録した。ブタを０（離乳の日）、７、１４および２１日目に秤量した。飼料摂取量を毎週モニターした。新しい糞便検体を１０日目に採取し大腸菌および乳酸桿菌濃度測定に供した。糞便献体を各家畜から１２〜１７日目に採取し化学分析用に保管した。新しい糞便検体を１４日目に取り出し、冷凍して揮発性脂肪酸分析用に保管した。新しい糞便検体を１７日目に採取しｐＨ測定に供した。
【００９０】
糞便スコアリングおよび罹患率
０〜２１日目にブタの下痢症の臨床的兆候を観察した。スコアリングシステムを適用し兆候の存在と重症度を示した。次のスコアリングシステムを使った：１＝固い、２＝やや柔らかい、３＝柔らかい、部分形成、４＝緩い、半液状および５＝水様、粘液様。
【００９１】
微生物学
献体を９．０ｍｌのマキシマムリカバリー希釈液（ＭＲＤ、Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、ＵＫ）を使って系列希釈（１：１０）し、選択した寒天に拡散播種した（０．１ｍｌ分量）。乳酸桿菌をｄｅＭａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、Ｓｈａｒｐ寒天（ＭＲＳ、Ｏｘｏｉｄ）を用い、５％ＣＯ２中３７℃で一晩インキュベーションして単離した。ＡＰＩ５０ＣＨＬ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ）キットを使って疑わしい乳酸桿菌ｓｐｐを確認した。大腸菌種を、３７℃で１８〜２４時間の好気性インキュベーションの後、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天（Ｏｘｏｉｄ）に単離した。疑わしいコロニーをＡＰＩ２０Ｅ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ）を使って確認した。
【００９２】
結果
発育成績
ＬＡＭ補充食を摂食したブタは、ＬＡＭ無補充食を受けたブタに比べ、７〜１４日目の間に（０．３４４  ｖ  ０．２６６、ｐ＜０．０１）、および全実験期間の間に（０．３２４  ｖ  ０．２３２、ｐ＜０．０１）ＡＤＧが増加した。ＬＡＭ補充食摂食ブタは、栄養補助されないＬＡＭ食に比べ、７〜１４日目の間に（０．７６３  ｖｓ．０．５６９、ｐ＜０．００１）および全実験期間の間に（０．７０３  ｖ  ０．６４６、ｐ＜０．０５）増体／飼料比が改善した。１４〜２１日目の間に、ＡＤＧに関しＬＡＭおよびＦＵＣ補充間で有意な相互作用（ｐ＜０．０５）が認められた。ＦＵＣ食を受けたブタは、基礎食事を受けたブタより有意に高いＡＤＧを示したが、ＬＡＭ食事にＦＵＣを追加した場合には、効果は認められなかった。平均１日飼料摂取量にＬＡＭまたはＦＵＣを入れた場合には、効果は認められなかった。
【表１９】
2018048141.tif 000021
【００９３】
糞便ｐＨ、ＤＭ、糞便スコア
ＬＡＭ補充食を摂食したブタは、非栄養補助ＬＡＭ食に比べ糞便ＤＭ含量が増加した（２８．６４  ｖ  ２６．２４；ｐ＜０．０５）。ＬＡＭ補充食を摂食したブタは、７〜１４日目の間に糞便スコアが減少した（２．０５  ｖ  ２．５７；ｐ＜０．０５）。糞便スコアに関し、全実験期間の間（０〜２１日目）ＬＡＭおよびＦＵＣ含有間に有意な相互作用が認められた（Ｐ＜０．０５）。ＬＡＭとＦＵＣの組み合わせを摂食したブタは、ＦＵＣ単独食を受けたブタに比べ、糞便スコアが減少した。しかし、基礎食事に比較して、ＬＡＭ添加の糞便スコアに対する効果は認められなかった。
【表２０】
2018048141.tif 000022
【００９４】
微生物学および揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）
ＬＡＭ食を摂食したブタは、ＬＡＭ非補充食を摂食したブタに比較して糞便大腸菌集団が減少した（７．２２  ｖｓ．７．８４；ｐ＜０．０５）。糞便乳酸桿菌集団に関して、ＬＡＭおよびＦＵＣ間に有意な相互作用（Ｐ＜０．０１）が認められた。ＦＵＣ食を受けたブタは、基礎食事を受けたブタに比べ乳酸桿菌数が増加した（９．２２  ｖ  ８．９３）が、ＬＡＭと一緒に入れた場合には、糞便乳酸桿菌集団に対するＦＵＣの効果は認められなかった。揮発性脂肪酸濃度に対する有意な処置効果は認められなかった。
【表２１】
2018048141.tif 000023
【００９５】
ＬＡＭ補充食を摂食したブタは、非栄養補助食を摂食したブタに比較して、平均１日増体量（ＡＤＧ）および増体／飼料比（ＧＦＲ）が改善された。ＬＡＭに対するこの陽性の応答は、これらのブタの腸中大腸菌集団の減少に起因する可能性がある。ＬＡＭ補充食では、ＬＡＭ非補助食を摂取したブタに比べ、７〜１４日目の間に糞便大腸菌集団の減少を生じ、これは糞便ＤＭの減少および下痢症の減少（より低い糞便スコア）を生じた。食事へのＬＡＭの含有によりブタの腸内に腸内細菌集団の減少が生じた。このように、ラミナリン食摂食ブタに発育成績の改善が認められ、これはＬＡＭの抗菌特性と関連し、この結果、ブタの腸内の健康状態の改善および大腸菌型負荷の減少が生ずると思われる。免疫細胞の特異的受容体へのＬＡＭの結合による粘膜免疫の調節が、細菌のコロニー形成および増殖を防ぎ、その結果、その後の腸壁の損傷を防ぐことによりブタの健康に有益な効果を与える可能性がある。ＦＵＣ補充食中の乳酸桿菌ｓｐｐ．の増殖は、ある割合の補充ＦＵＣが前腸での加水分解を避けて結腸に入り細菌性発酵を起こすことを示唆していると思われる。糖分解種の細菌、例えば、乳酸桿菌ｓｐｐ．、は複合体炭水化物の分解に寄与する。ＦＵＣは水に可溶で、それを急速に発酵性炭水化物源にする。乳酸桿菌種は、Ｌ−フコースを含む多くの単糖類を発酵させると報告されている。細菌の研究で、結腸中の乳酸桿菌ｓｐｐ．の濃度がＦＵＣ含有により増加することが明らかになった。乳酸桿菌集団の増加に拘わらず、ＶＦＡ濃度またはプロファイルに対し食事効果が認められなかった。大腸で作られるＶＦＡ量は、基質の組成と量、および存在するミクロフローラに依存する（ＭａｃＦａｒｌａｎｅ  ａｎｄ  ＭａｃＦａｒｌａｎｅ、２００３）。しかし、糞便ＶＦＡ濃度は、大腸中での発酵強度を示すには、全体としては正しくない可能性がある。
【００９６】
ＦＵＣ＋ＬＡＭの組み合わせ食事は、離乳後の下痢症を減らすには、最も有効であった。これには多くの理由が考えられる。第１に、組み合わせ食摂食からくる免疫応答である可能性がある。第２に、組み合わせ処置に伴う糞便大腸菌数の減少があった。下痢症を呈するブタは大量の溶血性大腸菌を住まわせている。従って、腸中の大腸菌の数の減少により、下痢症の重症度が低下し、最終的には離乳後子ブタ罹患率が減少するのであろう。
【００９７】
全体として、糞便大腸菌集団の減少ならびにＡＤＧおよびＧＦＲの増加により、ＬＡＭが離乳後の腸の健康を改善するための食事手段を提供する可能性があることが示唆される。しかし、ＬＡＭとＦＵＣの組み合わせは、下痢症を減らすのにより有効である。
【００９８】
実施例５
実験計画および動物の食事
初期体重１７．９±２．２Ｋｇの２１匹のブタを３つの食事療法の１つに割り当てた：（Ｔ１）対照；（Ｔ２）基礎食事＋３００ｐｐｍ  ＬＡＭ；（Ｔ３）基礎食事＋６００ｐｐｍ  ＬＡＭ。自由摂取実験を２１日間続けた。食事は、類似の消化可能エネルギー（ＤＥ）（１４．４ＭＪ／Ｋｇ）および回腸消化可能リシン（１２．５ｇ／Ｋｇ）を有するように処方した。
【００９９】
微生物および揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）分析
屠殺後、胃腸を解剖で取り出し胃腸内容物を回腸から取り出した。各胃腸内容物献体をマキシマムリカバリー希釈液（ＭＲＤ、Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、ＵＫ）で系列希釈し、選択寒天に拡散播種した。ビフィズス菌、乳酸桿菌および腸内細菌種をＰｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）により記載された方法に従って単離した。ＶＦＡ濃度測定に使う胃腸内容物献体を盲腸、ならびに回腸および結腸の同じ位置からから採取した。ＶＦＡ分析は、Ｐｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．、（２００５）により記載された方法に従いガス液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）を使って行った。
【０１００】
組織検体採取および組織攻撃手続き
回腸および結腸組織を胃腸内容物検体と同じ位置から摘出した。切除組織を腸間膜に沿って解剖して組織を空にし、無菌の燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｏｘｏｉｄ）で洗浄した。覆っている平滑筋を取り除いて、１ｃｍ３の組織断面を各組織から切り取った。各組織の２つの断面を１ｍｌのダルベッコのＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）中に入れ、１つは１０μｇ／ｍｌの濃度の細菌性リポ多糖類（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下のものに入れた。他の組織標本は対照として使用し、ＬＰＳが無い場合には無菌のＤＭＥＭ中でインキュベートした。攻撃を受けたおよび未処置組織の両方を３７℃で９０分間インキュベートした後、取り出して吸い取り乾燥して秤量した。約１〜２ｇのブタの回腸および結腸組織を切断して小片とし、１５ｍｌのＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）中に入れた。ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）を除去した後、検体をＲＮＡ抽出で使用するまで−８０℃で保存した。
【０１０１】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）用の未処置組織の調製
回腸および結腸組織をＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）溶液中で安定化させ、４℃で一晩貯蔵した。翌日、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）を除去し検体を−８６℃でＲＮＡ抽出まで貯蔵した。
【０１０２】
ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
ＲＮＡ抽出用の組織標本を−８６℃から取りだし、ホモジナイズした。５００μ１の溶菌液／２−ＭＥを各検体に添加し、これらを検体毎に１つの５ｍｍステンレス鋼ビーズを使って機械的に粉砕した。次に組織破砕機（Ｑｉａｇｅｎ）に入れ、ライセートを３分間ホモジナイズした後、ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に移してＲＮＡを抽出した。１μｇの総ＲＮＡ、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマーを用い、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍを使って２０μｌの最終反応容量でｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡ合成の最終ステップで、大腸菌ＲＮａｓｅ  Ｈ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）を用いて処置を行い、残っているＲＮＡ／ｍＲＮＡテンプレートを消化して、次のｑＲＴ−ＰＣＲ反応用の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートを産生した。
【０１０３】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびｑＰＣＲデータの正規化
サイトカイン遺伝子インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１ａ）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、ムチン遺伝子（ＭＵＣ１、２、４、５ＡＣ、１２、１３および２０）および３つのリファレンス遺伝子、β−アクチン（ＡＣＴＢ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）およびペプチジルプロリン異性化酵素Ａ（ＰＰＩＡ）、のための全ブタプライマーを、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使ってデザインし、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍｉｌｔｏｎ  Ｋｅｙｎｅｓ、ＵＫ）で合成した。これらのリファレンス遺伝子がブタ組織での使用に対し前もって検証され、次に９６−ウエルプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）用ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍを使ってｃＤＮＡでｑＰＣＲを行った。全検体をＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使い、ｃＤＮＡをテンプレートおよび選択遺伝子用の特異的プライマーとして使用して二通り調製した。核反応で、５μｌｃＤＮＡ、１．２μｌ（順方向および逆方向プライマーミックス、５μＭ）、１０μｌ  Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を添加し、２０μｌの最終容量にした。２ステップＰＣＲプログラムは次の通り：９５℃、１０分１サイクル、次に９５℃、１５秒、そして６０℃、１分４０サイクル。レファレンス遺伝子用の未加工Ｃｔ値は、式Ｑ＝Ｅ ΔＣｔを使って相対量に変換される；ここでＥはアッセイのＰＣＲ効率、ΔＣｔは各遺伝子に対する最低Ｃｔ値と対象検体のＣｔ値の差の計算値である。次に、内在性対照の相対量をｇｅＮｏｒｍ（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）を使って安定性の観点から解析した。選択した内在性対照（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨおよびＰＰＩＡ）へのｇｅＮｏｒｍ適用により得られた安定性「Ｍ」値は、これら腸検体用内在性対照としての適合性を示した。次に、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨおよびＰＰＩＡのための相対量の幾何学的手段（正規化因子）をｇｅＮｏｒｍを使って計算した。各標的遺伝子の相対量をその検体用正規化因子（ｇｅＮｏｒｍにより得た）で割って最終的な正規化相対発現量を得た。
【０１０４】
結果
この調査で、ラミナリアディギタータ由来ＬＡＭは、発育成績、栄養消化率または選択回腸内細菌に影響を与えなかったが、回腸と結腸中の腸内細菌は減少させた。特に関心があるのは、リポ多糖類（ＬＰＳ）によるインビトロ攻撃後の回腸と結腸中のサイトカイン遺伝子発現に対するＬＡＭの影響であった。
【０１０５】
動物発育成績および栄養消化率
ＬＡＭ増加による発育成績（食物摂取量、１日増体量または飼料要求率）または栄養消化率係数（ＤＭ、ＯＭ、灰分、ＮまたはＧＥ）に与える効果は認められなかった。
【０１０６】
微生物学および揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）
ＬＡＭレベルを０〜６００ｐｐｍの範囲で増やしたことよる、回腸中のビフィズス菌、乳酸桿菌または腸内細菌集団に与える効果は認められなかった（ｐ＞０．０５）。ＬＡＭの増加に伴う腸内細菌集団の減少は認められた。ビフィズス菌や乳酸桿菌数に影響しないで、有害腸内細菌株を減らせる可能性があることは、病原菌が死亡率を増加させていることから、非常に意義が大きい。これらの結果から、最適ＬＡＭ含有割合は３００ｐｐｍであることが示される。
【表２２】
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【０１０７】
回腸または結腸中の総ＶＦＡに与えるＬＡＭ食事含有レベル増加の有意な効果は認められなかった。ＶＦＡ産生の主要部位である盲腸中のＬＡＭレベルの増加に伴う総ＶＦＡの有意な増加が認められた（ｐ＜０．０５）。いずれの腸領域から記録された胃腸内容物ｐＨにも有意な変化は認められなかった。
【０１０８】
サイトカイン遺伝子発現
解析したいずれのサイトカインに対しても未処理回腸または結腸組織に与えるＬＡＭの効果は認められなかった。このこれら炎症性マーカーに対する効果の全体的な欠如により、食事中のＬＡＭの存在がどのような負の効果も誘発しなかったことが示唆されている。微生物の攻撃に対するＬＡＭに曝された動物の回腸および結腸組織の応答を模倣するために、これらの組織を、その後、ＬＰＳと共に体外でインキュベートした。回腸では効果が観察されなかったが、ＬＰＳ攻撃組織の結腸中でのＩＬ−６およびＩＬ−８遺伝子発現に対する有意な攻撃効果が観察された。３００ｐｐｍのＬＡＭ含有レベルにより、ＩＬ−６発現の増加がもたらされ（ｐ＜０．０５）、一方、ＩＬ−８遺伝子発現の直線的増加が観察された（ｐ＜０．０５）。これらのデータから、食事ＬＡＭは、微生物の攻撃に対しプロリン炎症反応を高める可能性があることが示唆される。ＩＬ−６が、初期免疫応答における急性炎症で重要な役割を演ずるプロリン炎症性サイトカインであることから、ＬＰＳ攻撃後のＩＬ−６およびＩＬ−８サイトカインの遺伝子上方制御強化の潜在的利益は、宿主にとって意義深いことである。同様に、ケモカインＩＬ−８もまた、炎症に関し重要な役割を演じ、感染の初期部位に対する好中球補充および活性化の役割をする。ＬＡＭ単独への暴露は、胃粘膜中のプロリン炎症性サイトカイン産生を刺激しなかったが、ＬＰＳ誘導プロリン炎症性サイトカイン産生を強化した。
【表２３】
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【表２４】
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【０１０９】
ムチン遺伝子発現
食事因子、例えば、線維、タンパク質および非栄養因子が杯細胞からのムチンの合成と分泌および胃腸内容物中のムチンの回収に直接影響を与えることが知られている（Ｍｏｎｔａｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）。全７ムチン遺伝子転写物がブタ結腸中で検出されたのは確かであるが、回腸中では７つの内の５つが実際に定量可能であったにすぎない。ＬＡＭを３００ｐｐｍ補充したブタの回腸で対照動物に比べＭＵＣ２の増加が認められた（ｐ＝０．０５）。このＭＵＣ２発現の増加は、より高い食事中含有レベル（６００ｐｐｍ）では認められなかった。残りの回腸中検出可能ムチン（ＭＵＣ４、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１３およびＭＵＣ２０）に対してはＬＡＭ補充は効果がなかった。結腸中では、６００ｐｐｍの含有レベルのＬＡＭによる食事補助によりＭＵＣ２（２次；Ｐ＜０．０５）およびＭＵＣ４（２次；Ｐ＜０．０５）発現が有意に増加したが、この部位の残りのムチン遺伝子のいずれの発現に対しても効果が認められなかった。ベータグルカン含有食はまた、マウスモデルの空腸、回腸、盲腸および結腸のムチン産生の質と量に影響を与える（Ｄｅｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００７）。
【表２５】
2018048141.tif 000027
【０１１０】
最適含有レベル
体外ＬＰＳ攻撃で免疫系を「刺激」するには３００ｐｐｍＬＡＭで十分である。
【０１１１】
実施例６
免疫能力は、ＬＡＭおよび／またはＦＵＣを用いた栄養学的介入により調節可能であり、これにより実験的感染出産ブタ中のブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）ウイルス量の減少およびブタの離乳後多臓器発育不良症候群（ＰＭＷＳ）の影響の改善につながる。
【０１１２】
結果
組織中のＰＣＶ２抗原の免疫蛍光検出
ＰＣＶ２特異的モノクローナル抗体を使った免疫蛍光法によって、ＰＣＶ２抗原が検死解剖動物（肝臓、肺、腎臓、脾臓、ＩＬＮ、ＭＬＮ）由来の組織断面中で検出された。
・基礎食事では、６匹の動物中の５匹を安楽死させた。
・基礎食事＋ＬＡＭおよびＦＵＣ処置では、６匹の内１匹の動物を安楽死させた。
・基礎食事＋ＬＡＭ、ＦＵＣ、ＷＰＩでは、実験の間に６匹の内１匹のブタを安楽死させた。この動物由来の組織には、高レベルのＰＣＶ２抗原を含んでいた。残りの５匹は実験の終わり時点で健康に見えた。これらは抗体陽転し体重が増えた。
【０１１３】
ＰＣＶ２特異的抗体力価の測定
図１に、ＩＰＭＡで測定した血清のＰＣＶ２特異的抗体力価を示す。 
【０１１４】
グループ内分析
・基礎食事：６匹の子ブタの内の５匹は弱いＰＣＶ２抗体応答を示し、全て分析組織断面中に疾患を示すＰＣＶ２抗原を有していた。残りの動物（Ｔａｇ１０）は、妥当なＰＣＶ２特異的抗体力価に抗体陽転した。この残りの動物は実験の継続期間中健康を維持した。
・基礎食事＋ＬＡＭおよびＦＵＣ処置：６匹のブタ中１匹は実験の終わりの前に抗体陽転した（Ｔａｇ３０）。この動物は、このグループの全動物の中でより低いＰＣＶ２特異的抗体力価を示し、組織中のＰＣＶ２抗原レベルは、ＰＣＶ２関連疾患を示した。しかし、この動物の抗体力価はグループ１の疾患発症子ブタよりも高かった。
・基礎食事＋ＬＡＭおよびＦＵＣ＋ＷＰＩ：６匹のブタの内１匹が実験の終わりの前に抗体陽転した（Ｔａｇ２６）。残りの全５匹の動物は実験の終わり時点で健康で、抗体陽転し体重が増えた。２匹の動物（Ｔａｇ２２および２５）が組織中に高レベルのＰＣＶ２抗原を有していた。
【０１１５】
グループ間分析
感染後（ＰＩ）、２１および２８日目に、処置２（＋ＬＡＭおよびＦＵＣ；図２参照）ならびに処置４（＋ＬＡＭおよびＦＵＣ＋ＷＰＩ、図３参照）における動物の平均ＰＣＶ２特異的抗体力価は、基礎食事を摂食した動物および基礎＋ＷＰＩを摂食した子ブタよりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。これらの結果から、ブタの食事にＬＡＭとＦＵＣ単独、またはＷＰＩと組み合わせ多補充がＰＣＶ２感染ブタの体液性応答を強化することが示唆される。
【０１１６】
リンパ球数
図４で、感染後（ＰＩ）２８日目までに、基礎食事摂食グループは、３つの補充食よりも有意に低い割合のリンパ球細胞集団を有したことが認められる。いずれの補充剤も相互に有意な差がなかった。図５に示すように、ＰＩ１４日目に、ＬＡＭ＋ＦＵＣを補充した食事を摂取した子ブタは、他のグループよりも有意に大きな好酸球割合を示した（ｐ＜０．０５）。この時間以降、有意差は検出されなかった。
【０１１７】
動物の体重の分析
ブタの体重を毎週記録した。図６から、グループ２（＋ＬＡＭおよびＦＵＣ）、３（＋乳清タンパク単離物）および４（＋ＬＡＭおよびＦＵＣ＋乳清タンパク）の子ブタの実験終了時点での平均体重は基礎食事摂食のものよりも大きいことがわかる。グループ２および４の動物は、基礎食事摂食子ブタよりも有意により重かった。
【０１１８】
動物体温の分析
体温もまた全調査期間にわたりモニターした。ＰＩ１７日目に、グループ３（＋乳清タンパク単離物）およびグループ４（＋ＬＡＭおよびＦＵＣおよび乳清タンパク単離物）の動物は、基礎食事を摂食した子ブタ（３９．８２℃、ｐ＜０．０５）よりも有意に低い平均体温（それぞれ３８．３３および３８．０２℃）であった。ＰＩ２４日後のそれぞれの摂食グループ間での平均体温の有意差は認められなかった。
【０１１９】
ウイルス排出の分析
全糞便検体の定量ＰＣＲを行い、ウイルス量および排出を評価した。図７に示すように、ＰＩ１０日目までにグループ３（＋乳清タンパク単離物）の動物中で検出された平均ＰＣＶ２  ＤＮＡコピー数は、他の３つの摂食グループよりも有意に少なかった（ｐ＜０．０５）。ＰＩ２０と２４日目に、ＬＡＭおよびＦＵＣ補充食を摂食した子ブタはグループ１と３の子ブタよりも有意に少ないＰＣＶ２  ＤＮＡコピー数であった。ＬＡＭおよびＦＵＣならびに乳清タンパク単離物を摂食した動物は、基礎食事のものに比べ有意に少ないＰＣＶ２  ＤＮＡコピー数であった（ｐ＜０．０５）。ＰＩ２７日目までに、全補充食事は基礎食事のものに比べ有意に少ないＰＣＶ２  ＤＮＡコピー数であった（ｐ＜０．０５）。図８からわかるように、最も少ない平均ＰＣＶ２  ＤＮＡコピー数がＬＡＭ＋ＦＵＣ摂食子ブタの糞便検体中で検出された。これらの結果は、これらの実験条件下、ＬＡＭ＋ＦＵＣ、ＷＰＩ、または両方の組み合わせによるブタ栄養補助食事がＰＣＶ２ウイルス排出の有意な減少につながったことを示している。 
【表２６】
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【０１２０】
サイトカインＰＣＲ結果
ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−４のためのサイトカインｍＲＮＡを、確立された２ステップ逆転写ＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）アッセイを使って定量化した。結果は、これらのサイトカインのプロファイルに関し異なる摂食処置間に有意差がないことを示した。
【０１２１】
組織ホモジネート中のＰＣＶ２  ＤＮＡの定量化
組織ホモジネートプール（１０％ｗ／ｖ）を各動物の肝臓、肺、脾臓、腎臓、腸間膜および鼠径部リンパ節から調製した。ＰＣＶ２  ＤＮＡを確立された定量化ＰＣＲ方法（ｑＰＣＲ）を使って定量化した。最多量のＰＣＶ２  ＤＮＡが基礎食事（グループ１）を摂取した動物で検出された。また、ＷＰＩ（グループ３）を補充した食事を摂食したブタは、ＬＡＭ＋ＦＵＣ（グループ２）またはＬＡＭ＋ＦＵＣとＷＰＩの組み合わせ（グループ４）を補充した基礎食事を摂食したグループより高い量のＰＣＶ２  ＤＮＡであった。これら結果は、免疫蛍光法に基づく動物組織中のＰＣＶ２抗原の検出レベルと比べても遜色がない。他の２つのグループ（すなわち基礎／基礎＋ＷＰＩ）に比べ、ＬＡＭ＋ＦＵＣ単独またはこれにＷＰＩを組み合わせて補充した食事を摂食した動物で最小量のＰＣＶ２抗原が検出された。
【０１２２】
本発明は、実験的に感染した出産ブタのブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）ウイルス量を減少させ、ブタの離乳後多臓器発育不良症候群（ＰＭＷＳ）の影響を改善する。
【０１２３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
2018048141.tif 000031
【図４】
2018048141.tif 000032
【図５】
2018048141.tif 000033
【図６】
2018048141.tif 000034
【図７】
2018048141.tif 000035
【図８】
2018048141.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月5日(2017.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のβ−グルカンと、任意選択で少なくとも１種のフカンと、を含む組成物をヒト以外の母動物に投与することを含む、離乳期以降に各子孫に直接投与することにより達成されるレベル以上のレベルで前記ヒト以外の母動物の子孫の健康、機能、免疫もしくは発育成績を改善するか維持するための、またはヒト以外の母動物の子孫における機能もしくは免疫における障害を治療もしくは予防するための、方法であって、
体重１ｋｇ当たり約３〜５０ミリグラムのβ−グルカンが前記ヒト以外の母動物に投与されるような量で前記組成物が前記ヒト以外の母動物に投与される、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１種のβ−グルカンは、β（１→３、１→６）グルカンまたはラミナリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種のフカンは、α−フカンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種のβ−グルカンは褐藻綱の大型褐藻類から単離され、および／または前記少なくとも１種のフカンは、真正紅藻綱から選択される紅藻類（ｒｅｄ  ａｌｇａ）から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物は、周産期および／または出生前および／または出生後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
体重１ｋｇ当たり約２〜４０ミリグラムのフカンが投与されるような量で前記組成物が前記ヒト以外の母動物に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が毎日投与される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記母動物は、ブタ、家禽、魚、ネコおよびイヌからなる群より選択される単胃の動物である、および／または
前記動物は、ウマおよびウサギからなる群より選択される後腸発酵動物である、
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
プロリン−および抗−炎症性サイトカインの発現、白血球集団、ならびに免疫グロブリン、ムチンおよびトレフォイルファクターの発現を変えることによって免疫応答が有益な影響を受ける、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
免疫学的機能および／もしくは免疫学的プロファイルが、貪食細胞、任意選択で白血球、好中球、好酸球、単球、またはリンパ球、さらに任意選択で、白血球、好酸球またはリンパ球、の濃度または活性を変えることにより改善され、さらに任意選択で、白血球の濃度または活性が増加し、および／またはリンパ球の濃度または活性が減少し、および／または好酸球の濃度または活性が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
白血球の数が減少する、および／または食細胞活性が増加する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
サイトカインが、プロリン−炎症性サイトカインおよび／または抗−炎症性サイトカインから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
子孫における機能または免疫の障害が、クローン病、過敏性腸症候群および大腸炎からなる群より選択される慢性疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
子孫における構造または機能の障害が予防されるか、その症状および合併症が、前記ヒト以外の母動物の初乳または乳の免疫グロブリンの濃度の増加によって減少するか、細菌感染症の減少および／またはウイルス感染症の減少によって減少するか、ムチンの発現の増加によって減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
子孫における構造または機能の障害は、発育不良症候群を引き起こすものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
感染症の減少によって、子孫における構造または機能の障害が防止されるかその症状および合併症が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
直鎖揮発性脂肪酸の産生の増加および／または分岐鎖揮発性脂肪酸の減少によって、子孫における構造または機能の障害が防止されるかその症状および合併症が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１種のフカンは、フコイダンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１種のβ−グルカンおよび／または前記少なくとも１種のフカンは、コンブ科、ヒバマタ科およびカジメ科からなる群より選択される少なくとも１つの科に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１種のβ−グルカンおよび／または前記少なくとも１種のフカンは、アスコフィルム種、ラミナリア種およびホンダワラ種からなる群より選択される少なくとも１つの種に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１種のβ−グルカンが酵母に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
大腸菌感染症、サルモネラ感染症、ブタサーコウイルス感染症およびＰＣＶ−２感染症からなる群より選択される感染症の減少によって、子孫における構造または機能の障害が防止されるかその症状および合併症が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記母動物への前記組成物の投与が、罹患率および死亡率を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物の投与が、離乳時の子孫を改善する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物の投与が、子孫の生涯を通じた発育成績を向上させる、請求項１に記載の方法。