(57)【要約】【課題】腹膜透析における腹膜劣化を簡便にモニターできる指標物質の検出方法を提供することを目的とする。【解決手段】採取された腹膜透析の透析排液等の検体中から指標物質を検出する指標物質の検出方法であって、前記指標物質は、前記検体を採取した生物において少なくとも腹膜劣化時に検出され、もしくは腹膜劣化の進行に伴って濃度の増大が確認されるファイブリン-1である指標物質の検出方法である。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
採取された検体中から指標物質を検出する指標物質の検出方法であって、前記指標物質は、前記検体を採取した生物において腹膜劣化を反映して検出されるファイブリン−１であることを特徴とする指標物質の検出方法。
【請求項２】
前記指標物質は、前記検体を採取した生物において 少なくとも腹膜の溶質透過性に伴って濃度の増大が確認されるファイブリン−１である請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記検体は腹膜透析の透析排液もしくは腹腔洗浄液あるいは腹水等の腹腔排液中である請求項１または２に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、適切かつ安全な腹膜透析を施行することが可能となる腹膜劣化の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工透析は、腎機能が低下もしくは喪失した患者に対し、本来腎臓が果たしている血液浄化作用を腎臓に代わって行う血液浄化療法であり、生体内から水を除去することによって体液の組成を一定に保つとともに体液中の尿素等の老廃物を除去することを主な目的としている。現在の人工透析には、主に血液透析療法と腹膜透析（Peritoneal Dialysis：以下ＰＤということがある）療法がある。
腹膜透析は腹膜で囲まれた腹腔内に浸透圧の高い透析溶液を貯留することによって生体内の余分な水と老廃物を取り除くことを基本とする。即ち腹腔内に貯留した透析溶液と体液の間に生じる浸透圧格差により、腹膜組織の毛細血管から腹腔内の透析溶液に水が移動することによって透析される。しかし長期間腹膜透析を継続すると腹膜劣化が生じる。腹膜劣化は、腹膜の線維化や硬化、炎症、血管新生、血管傷害を伴うことが多い。その原因は明らかではないが、細菌性腹膜炎や非生理的な腹膜透析液の長期にわたる暴露が指摘されている。
腹膜透析液には、浸透圧調節物質として高濃度のブドウ糖や乳酸、また製造滅菌過程などで生じるブドウ糖分解産物（以下GDPsという）が含まれており、これらの毒性が報告されている。さらに腹膜透析液の非生理的なpHや高い浸透圧により、腹膜傷害が生じると考えられている。腹膜劣化を防止するため、わが国ではpHが中性のブドウ糖透析液が主流であるが、欧米では未だに酸性のブドウ糖透析液が多く使用されており、また昨今普及したイコデキストリン透析液の中にはpHが酸性のものがある。イコデキストリン透析液は、腹膜透過性が亢進している患者の限外濾過不全に対する効果が期待されている。さらにイコデキストリン透析液は、生体内に存在しないトウモロコシデンプン由来のイコデキストリンを浸透圧調節物質として使用しており、高濃度のブドウ糖を含有していないため、浸透圧やブドウ糖、GDPsによる腹膜劣化を低減できる可能性がある。しかしイコデキストリンは異物であるため、炎症や被嚢性腹膜硬化症（以下EPSという）発症との関連性も疑われており（Habib AM, Preston E, Davenport A. Risk factors for developing encapsulating peritoneal sclerosis in the icodextrin era of peritoneal dialysis prescription. Nephrol Dial Transplant. 25(5):1633-8, 2010.）、腹膜劣化への影響は定かではない。
【０００３】
腹膜透析はわが国で開始されてから20年ほど経つが、透析患者のほとんどが血液透析であり、全透析患者の５%にも満たない。腹膜透析は血液透析と異なり自宅で透析が行えるので、通院の頻度が少なくなるといったQOL（クオリティーオブライフ）に優れているだけでなく、循環系への影響や生体内部環境の変動が少ないといった利点を持っている。腹膜透析がこのような利点を持つのにもかかわらず広く普及しない理由として、腹膜劣化により除水不足になると腹膜透析を中止せざるを得なくなる場合が多いことが挙げられる。また、除水能を保つためにより高浸透圧の腹膜透析液を用いることもあるが、この場合腹膜への障害は大きくなる。腹膜劣化がさらに進展するとEPSを発症する危険がある。EPSは重篤な合併症で、臨床的には食欲不振、悪心、嘔気、嘔吐、低栄養による痩せ、腹痛、下痢、便秘、腸管蠕動音低下など腸閉塞症状を示す。
剖検時所見では、小腸は癒着して塊状になり、膠原性線維に富む肥厚した腹膜で包まれる。EPSの頻度は1.4〜7.3％と必ずしも高くはないが、２年後の生存率は約50％しかなく、致死率が非常に高い。EPS患者の直接の死因は被包により圧迫、癒着した腸管が循環障害、壊死をおこし、これが原因となって敗血症になるためと考えられる。
【０００４】
治療法としてはEPS発症初期ではステロイド剤の投与や被包した腹膜を剥離する外科的治療が有効であることもあるが、病状が進行した場合の効果的な治療法は無いため早期診断による予防が重要である。現在、EPSの診断法としてはイレウス症状等の臨床所見のほか、腹部の触診（塊状物の触知）がなされているが、客観的な基準ではない。さらにEPSが進行した場合でも上述のような典型的症状を起こさない場合も多く、診断が遅れることが多い。一部ではＸ線やＣＴ検査、超音波検査などの画像解析による診断もなされているが、病状がある程度進行しないと診断できないといった欠点があり、あくまで補助診断の域を出ていない。
このように現在、EPSの発症初期の確実な検査方法はない。病状が進行すると確実な治療法が無い為、EPSに至った患者の半数以上が死に至る。しかしこれら合併症を早期に診断できれば、初期療法としてステロイド剤等で治療することができる。腹膜透析を安全に施行し広く普及させるためには、腹膜劣化をモニターし、EPSの発症を防止することが重要である。
【０００５】
腹膜劣化は、腹膜の機能低下と形態変化を伴うが、前者は限外濾過量や腹膜透過性で評価し、後者は腹腔鏡、腹膜生検、排液の中皮細胞診などの検査がおこなわれている（2009年度版  日本透析医学会「腹膜透析ガイドライン」．透析会誌42（4）：285-318、2009）。
腹膜平衡試験（以下PETという）は、Ｔｗａｒｄｗｓｋｉらにより提案された試験法で、腹膜透過性を調べることで、腹膜機能を評価する（Twardowski ZJ, Nolph KD, Khanna R, Prowant BF, Ryan LP, Moore HL, et al. Peritoneal equilibration test. PeritDial Bull 7:138-47, 1987）。ブドウ糖濃度が2.27％の透析液またはこれと同等の浸透圧透析液2.0Ｌを4時間腹腔に貯留し、注液2時間目および4時間目における透析排液中のクレアチニン濃度（Ｄ）と血液中クレアチニン濃度（Ｐ）の比（D/Pcre）から腹膜における小分子物質の除去効率を調べる。同時に透析排液中のブドウ糖濃度（Ｄ）とその初期濃度（Ｄ０)の比（D/D0 グルコース値）から除水効率を算出する。
これら検査の結果をもとに腹膜透過性の高い方から順に「High」、「High Average」、「Low Average」、「Low」の4段階のカテゴリーに分類して評価する。2009年に日本透析医学会から腹膜透析ガイドラインが発表された。これによると、腹膜透析が問題なく実施されている場合には腹膜機能の検査を6か月〜1年に1回を目安に定期的に行うことが望ましいとされている。腹膜機能は、もともとの有効腹膜面積にも影響するので、腹膜の劣化のみを反映しているわけではない。このため経時的な相対変化を調べる必要がある。
腹膜機能検査を定期的に実施することが困難な場合には、腹膜透析導入初期、腹膜炎治療後からの復帰時、治療方法の変更や処方の大幅な変更を行う際に腹膜機能検査の実施を考慮する。腹膜機能をPETで評価した場合、D/Pcre（透析排液中と血液中のクレアチン濃度比）が経時的に上昇し、「High」カテゴリーが12カ月以上持続する例では、高度の腹膜劣化が進行していると判断して腹膜透析中止の検討を要する（2009年度版  日本透析医学会「腹膜透析ガイドライン」透析会誌42（4）：285-318、2009）。
【０００６】
また我が国のEPS例の70％は腹膜透析脱落後に発症していることから、腹膜劣化が疑われる長期腹膜透析施行例においては腹膜透析脱落後も腹膜透析カテーテルを一定期間留置し、排液の性状や腹膜機能の推移を観察することが、EPS発症リスクを判断する上で意義がある。腹膜透析離脱後数カ月以内にEPSを発症する患者も多いため、この間は腹膜機能の推移を頻繁にモニターすることが求められるが、PETを頻回に行うことは現実的には難しい。
腹膜機能の評価法としてPETの他に、総括物質移動・膜面積係数（MTAC）（山下明泰：よくわかる腹膜透析の基礎、pp85-112、東京医学社、東京、1998）やPETを改良したminiPET、double miniPET等の報告もあるが臨床では普及していない。日本透析医学会のガイドラインでは腹膜機能の評価法として世界的に最も広く利用さているPETまたはその簡便法（fastPET）が推奨されている（2009年度版  日本透析医学会「腹膜透析ガイドライン」．透析会誌42（4）：285-318、2009）。
しかしPETやfastPETは比較的簡便な検査法ではあるが、手間と時間がかかるうえ、採血による侵襲が伴う。このためすべての施設で、定期的に検査することは難しく、本邦での施行率は67％にすぎない（(社)日本透析医学会  統計調査委員会. 図説わが国の慢性透析療法の現況2005 年12 月31 日）。またイコデキストリン使用患者では、PETの検査結果がブドウ糖透析液のみを使用している場合に比べて透過性が亢進側にシフトすることがあり、検査結果の解釈に注意を要する（Moriishi M, Kawanishi H, Tsuchiya S. Impact on peritoneal membrane of use of icodextrin-based dialysis solution in PD patients. Adv Perit Dial 2006,22,24-8.）。
【０００７】
特許文献１には、体液検体中からファイブロネクチンの濃度を測定することにより、腹膜肥厚を検知する方法が記載されている（要約）。ファイブロネクチンはコラーゲンに作用する物質であり腹膜肥厚の発症・進行を的確に把握できると記載されている。
腹膜透析療法では腹膜劣化を無侵襲で簡便に知ることが求められているが、多くのバイオマーカーにはそれぞれの特徴があり単一のマーカーでは腹膜劣化を正確に判定することは困難である。有用な特徴を持つ複数の指標物質が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−６６３０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明は腹膜透析において腹膜劣化を簡便にモニターでき、あるいはEPSの発症、進行を防止するための早期治療を可能とする早期診断に使用される指標物質の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は腹膜透析の重篤な合併症であるEPSの発症、進行を防ぐため、簡易に腹膜劣化をモニターできる方法の開発を鋭意重ねた。この結果、臨床で腹膜劣化を簡便にかつ客観的にモニターできる指標物質の発見に至った。即ち、指標物質として腹腔排液中のファイブリン−１を検出することにより、腹膜劣化を把握することが出来る。具体的には下記の（１）〜（３）の本発明によって達成される。
【００１１】
（１）採取された検体中の指標物質の検出方法であって、前記指標物質は、前記検体を採取した生物において少なくとも腹膜劣化の進行に伴って濃度の増大が確認されるファイブリン−１である指標物質の検出方法。
（２）前記指標物質は、前記検体を採取した生物において 少なくとも腹膜の溶質透過性に伴って濃度の増大が確認されるファイブリン−１である上記（１）に記載の検出方法。
（３）前記検体は腹膜透析の透析排液もしくは腹腔洗浄液あるいは腹水等の腹腔排液である上記（１）または（２）に記載の検出方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は腹膜劣化を無侵襲でかつ簡便に知ることが出来る。本発明により、腹膜劣化やEPS等の早期発見・予測が可能となり、これらの発症予防や進行を食い止めることが可能になると期待される。以上により、健全な腹膜透析が可能になると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】腹膜透析患者の腹膜平衡試験で得られた腹腔排液中のファイブリン−１（Fibulin-1）濃度（ng/ml）（縦軸）と腹膜平衡試験（PET）による透析排液中のクレアチニン濃度（Ｄ）と血液中クレアチニン濃度（Ｐ）の比（D/Pcre）の関係を示した図である。横軸の数字が低い方が腹膜機能に優れている。
【図２】腹膜透析患者の腹膜平衡試験で得られた腹腔排液中のファイブリン−１（Fibulin-1）濃度（ng/ml）（縦軸）と腹膜平衡試験（PET）による透析排液中のブドウ糖濃度（Ｄ）とその初期濃度（Ｄ０)の比（D/D0グルコース値）の関係を示した図である。横軸の数字が高い方が除水効率に優れている。
【図３】腹膜透析患者の腹膜平衡試験で得られた腹腔排液中のファイブリン−１（Fibulin-1）濃度（ng/ml）（縦軸）と腹膜透析期間（月）の関係を示した図である。腹膜透析期間に関わらず腹腔排液中のファイブリン−１（Fibulin-1）濃度（ng/ml）が変わらないことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本発明の好適実施例に基づいて詳細に説明する。
本発明は透析患者から検体を採取し、次いで該検体中から所定の指標物質を検出することを特徴とする。
本発明における指標物質は、検体を採取した患者の腹膜劣化に関連して検出され、或いは量、濃度の変化が確認される物質のことである。また本発明における腹膜劣化とは、組織学的には腹膜肥厚等の形態変化が生じ、また機能的には腹膜での小分子物質の移動（透析排液中のクレアチニン濃度（Ｄ）と血液中クレアチニン濃度（Ｐ）の比（D/Pcre）が高くなる）やグルコース吸収率が亢進する（透析排液中のブドウ糖濃度（Ｄ）とその初期濃度（Ｄ０)の比（D/D0 グルコース値）が高くなる）ことである。
本発明者は様々な腹膜の状態の生体から採取した検体に対して調査、研究を重ねた結果、腹膜劣化に伴って、検体中から特異的に検出される物質、或いは検体中の量または濃度が変化する物質が存在することを発見した。従って、検体中からこのような物質、すなわち指標物質を検出することにより、腹膜劣化を簡便にかつ客観的にモニターすることに成功した。
本発明者は腹膜劣化の簡易モニター方法の開発を目的として、有効な指標物質の探索を行った。まず本研究に対してテルモ株式会社の施設内審査委員会の承認を得た後、腹膜透析患者からインフォームドコンセントを得た後に、腹膜劣化に伴って腹腔排液中の濃度が増加する指標物質を探索した。
【００１５】
指標物質として探索する可能性の考えられる例としてはたんぱく質やペプチドなどがあげられる。特に指標物質は細胞外マトリクスの構成物質、もしくは細胞外マトリクスの産生、形成、破壊、再構築に関与している因子が望ましい。細胞外マトリクスの構成物質の例としてはコラーゲンやファイブロネクチン、ファイブリン、ビトロネクチン、ラミニン、テネイシン、エラスチン、トロンボスポンジン、ナイドジェン、プロテオグリカン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸等があげられる。また、細胞外マトリクスの産生、形成、破壊、再構築に関与している因子の例としてプロリン水酸化酵素、プロリジルオキシダーゼ、プロコラーゲンC-プロテアーゼ、プロコラーゲンN-プロテアーゼ、プロコラーゲンC-プロテアーゼエンハンサープロテイン、HSP47等の分子シャぺロン、マトリクス分解酵素、セリンプロテイナーゼ、各種のプロテアーゼ阻害物質（プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター等）などが考えられる。
【００１６】
日本透析医学会のガイドラインでは、腹膜劣化のマーカーとして排液中のマトリックスメタロプロテイナーゼ−２（以下、MMP-2という）、癌抗原１２５（CA125)、ヒアルロン酸、IL-6、VEGF、凝固線溶因子などが紹介されている。我々の検討では排液MMP-2レベルは、CA125、ヒアルロン酸、IL-6よりもPETの結果と高い相関を示した。
【００１７】
ファイブリン（Fiburin）は、血液凝固系に関連する血液凝固タンパク質のフィブリン、フィブリノーゲン（フィブリンの前駆体）とは異なる物質である。ファイブリン-1は細胞外マトリックスの一つでファイブリンファミリーに属する。本ファミリーには、現在7種類のファイブリンが存在することが知られている。ファイブリンファミリータンパク質は細胞外マトリックスのコラーゲン等を保持して肺や動脈や皮膚等の組織の弾性を担うタンパク質である。その内、ファイブリン-1遺伝子欠損マウスは小血管・毛細血管が脆弱となって胎生致死となるが弾性繊維の異常はない。
弾性繊維は架橋されて不溶化しているため、生化学的研究の材料として扱いにくく不明な点が多い。
【００１８】
本発明者による腹膜透析患者から得られた腹腔排液中の物質を解析した結果、ファイブリン−１が腹膜劣化をモニターするのに優れた指標物質であることが明らかになった。ファイブリン−１は発生や組織傷害時に産生されるマトリックスで、がんの伸展にも関わっていると考えられる。
本発明は上述のように該指標物質の検出および量もしくは濃度の変化を調べることで、腹膜劣化をモニターすることが可能である。
マトリックスメタロプロテイナーゼ（以下、MMPという）とは全く異なった物質で異なった機序を有する物質であるファイブリン−１がPETの結果と強く相関するバイオマーカーであることは当業者が予想できなかった驚くべき効果である。
【００１９】
本発明の指標物質を調べる検体は、患者の腹腔から得た排液が適切である。患者の腹腔排液を検体として用いた場合は、腹膜透析患者の場合には排液は透析の度に回収されるので、サンプリングの手間が省けるだけでなく、患者に対して非侵襲かつ自宅でも容易にサンプリングすることができる。さらに指標物質がファイブリン−１の場合、腹腔排液を検体として用いれば検査に必要な量は100μL以下と極めて微量ですむ。このため腹腔排液を検体として用いることが好ましいが、病院等でサンプリングする場合は血液や血清、血漿等の方が便利なこともある。また、糞尿も回収する手間が掛かるものの患者に対して非侵襲的に入手でき有望である。故に、腹膜劣化を反映した指標物質を測定することが可能であれば検体は特には限定されない。さらに検体中の指標物質を測定する方法としては、エンザイムイムノアッセイ（以下EIAという）法やウエスタンブロティング法、イムノクロマトグラフ法といった免疫学的手法や活性測定による定量法など、指標物質の変化が測定できれば特に測定法は限定するものではない。指標物質を特異的に検出できればアプタマー等でも構わない。好ましくはEIA法やイムノクロマトグラフ法が失敗も少なく簡単な操作で安定した結果が得られるため適している。EIA法の場合、検体中の指標物質と予めラベルしておいた標準物質を競争的に一次抗体と反応させるコンペティティブEIA法、もしくは２つの抗指標物質抗体を用いるサンドイッチEIA法等が好適例としてあげられるが、該指標物質の濃度が定量的に測定できれば他の方法でも構わない。
本発明は腹膜劣化を簡便にモニターすることが可能であるばかりでなく、低侵襲でかつ検体量が微量ですむといった特色を持つ画期的な診断方法である。
以下の実施例により本診断法の一例を具体的に説明するが、本発明はそれらの例により限定されるものではない。
【実施例】
【００２０】
末期慢性腎不全患者で腹膜透析を行っている患者に対して検討した。本研究は、テルモ株式会社の施設内審査委員会の承認を得た後、腹膜透析患者からインフォームドコンセントを得た後に、腹膜劣化に伴って腹腔排液中の濃度が増加する指標物質を探索した。
患者背景を表１に示した。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
＜実施例１＞
（腹膜機能の評価）
腹膜透析患者に対して腹膜機能を解析するために腹膜平衡試験を行った。腹膜機能は腹膜におけるクレアチニンの移動、即ちD/Pcre値、もしくは、グルコースの吸収率、即ち、D/D0グルコース値にて評価した。
D/Pcre値は以下のようにして求めた。腹腔内に貯留した腹膜透析液を排液した後、2.27％から2.5％グルコース含有透析溶液を腹腔内に注液し、投与4時間後に腹腔内貯留液を採取した。本検体および血液中のクレアチニン濃度を求め、投与4時間後の腹腔内貯留液のクレアチニン濃度（D）を血液中のクレアチニン濃度（P)で除することによりD/Pcre値を算出した。
【００２３】
D/D0グルコース値は以下のようにして求めた。腹膜透析液を排液した後、2.27％から2.5％グルコース含有透析溶液を腹腔内に注液し、投与直後および投与4時間後に腹腔内貯留液を採取した。各検体中のグルコース濃度を求め、投与4時間後に採取した腹腔内貯留液のグルコース濃度（D）を投与直後の腹腔内貯留液のグルコース濃度（D0)で除することによりD/D0グルコース値を算出した。
【００２４】
（排液中のファイブリン−１の濃度測定）
腹腔排液のファイブリン−１濃度はEIA法により測定した。検体として0.37、1.1、3.3、10、30 ng/mlの濃度のファイブリン−１標準液または100倍希釈した腹腔排液を、予め抗ファイブリン−１抗体でコートした９６穴プレートに100ulずつ注液した。2時間37℃で静値したのち、検体を除去し、100μlのビオチン標識した2次抗体を加えた後、1時間37℃で静置した。反応終了後、反応液を除去し、100μlのホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）で標識したストレプトアビジンを加えた後、30分間37℃で静置した。反応終了後、反応液を除去し、90μlの3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidineを加えて37℃で25分間発色反応させた後、50μlの硫酸を加え、450nmの吸光度を測定した。ファイブリン−１標準液の吸光度をもとに検量線を作成して、腹腔排液中のファイブリン−１の濃度を算出した。
その結果、排液ファイブリン−１レベルはD/Pcre値と高い相関を示した（ｐ＜0.01、ｒ＝0.41）。また排液ファイブリン−１レベルはD/D0グルコース値とも相関した（ｐ＜0.01、ｒ＝-0.34） 。この結果を図1、図２に示した。
一方、腹腔排液中のファイブリン−１濃度は腹膜透析期間とは相関しなかった（ｐ＞0.05、R2＝0. 197）。この結果を図３に示した。
また腹腔排液中のファイブリン−１濃度は腹膜炎の回数とも相関しなかった。この結果を表２に示した。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
表２で、p値は、ある実験中に群間差が偶然生じる可能性を示す尺度。例えば、p値が＜0.01（p=0.01）というのは、この結果を偶然生じることが100回に1回未満であることを意味する。p値が小さくなるほど、それだけ排液中のファイブリン−１レベルはD/Pcre値と高い相関を示し相関関係が高くなる。Ｒ値はピアソンの相関係数（決定係数、寄与率）であり、排液中のファイブリン−１レベルがD/D0値に寄与する強さを示している。
以上の結果から腹腔排液中のファイブリン−１濃度を測定することで腹膜劣化をモニターできることが明らかになった。
【００２７】
＜比較例１＞
（比較としての排液中のヒアルロン酸の濃度測定と臨床パラメータとの関係）
表１に示す腹膜透析患者に対して腹膜機能を解析するために腹膜平衡試験に対して、表２と同様に、ただし腹腔排液のヒアルロン酸濃度を測定して、得られた値を表１に示す腹膜透析患者のヒアルロン酸濃度と比較した。結果を表３に示す。
日本透析医学会のガイドラインで、腹膜劣化のマーカーとしてMMP-2の他に、排液中のヒアルロン酸が挙げられているが、本発明の指標であるファイブリン−１濃度は、日本透析学会の挙げるマーカーであるヒアルロン酸より、高精度であるが侵襲を伴うPETから得られる腹膜機能評価結果との相関が高く、簡易な非侵襲の測定結果で、臨床試験なみの分析精度が期待できる。
【００２８】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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