(57)【要約】【課題】安価にセロビオースが得られ、高効率な糖化酵素の製造方法及び装置を提供する。【解決手段】本発明は、リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造方法であって、低β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）糖化酵素を用いて、セルロースを含む原料を加水分解し、セロビオースを生産させるセロビオース生産工程と、前記セロビオース生産工程で得られた前記セロビオース及びグルコースの混合溶液と、微生物とを混合して培養し、前記微生物に糖化酵素を生産させる糖化酵素生産工程と、を備える。本発明は、リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造装置であって、低ＢＧＬ糖化酵素と、セルロースを含む原料とを含むセロビオース生産槽と、前記セロビオース生産槽で得られたセロビオース及びグルコースの混合溶液と、微生物とを含む糖化酵素生産槽と、を備える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造方法であって、
低β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースを加水分解させてセロビオースを生産させるセロビオース生産工程と、
前記セロビオース生産工程で得られた前記セロビオースを含む糖化液と、糖化酵素生産菌とを混合して培養し、前記糖化酵素生産菌に糖化酵素を生産させる糖化酵素生産工程と、
を備えることを特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記低ＢＧＬ糖化酵素が、ＢＧＬの活性が低い糖化酵素を生産する菌由来のものである請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ＢＧＬの活性が低い糖化酵素を生産する菌がトルコデルマ・レッセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＰＣ−３−７株である請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
さらに、前記セロビオース生産工程の前に、糖化酵素又は糖化酵素生産菌と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、前記糖化酵素又は前記糖化酵素生産菌由来の糖化酵素に含まれるＢＧＬを前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるリグニンに吸着させることで、低ＢＧＬ糖化酵素を生産させる低ＢＧＬ糖化酵素生産工程を備える請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
リグノセルロース系バイオマスから糖化液を製造するための方法であって、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法を用いて、糖化酵素を製造した後、前記糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、糖化する糖化工程を備えることを特徴とする製造方法。
【請求項６】
リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造するための方法であって、
請求項５に記載の製造方法を用いて、糖化液を製造した後、前記糖化液と微生物とを混合し、発酵する発酵工程を備えることを特徴とする製造方法。
【請求項７】
リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造装置であって、
低ＢＧＬ糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含むセロビオース生産槽と、
前記セロビオース生産槽で得られたセロビオースを含む糖化液と糖化酵素生産菌とを含む糖化酵素生産槽と、
を備えることを特徴とする製造装置。
【請求項８】
さらに、前記セロビオース生産槽の前に、糖化酵素又は糖化酵素生産菌と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含む低ＢＧＬ糖化酵素生産槽を備える請求項７に記載の製造装置。
【請求項９】
リグノセルロース系バイオマスから糖化液を製造するための装置であって、
請求項７又は８に記載の製造装置と、
前記製造装置で得られた糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含む糖化装置と、
を備えることを特徴とする製造装置。
【請求項１０】
リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造するための装置であって、
請求項９に記載の製造装置と、
前記製造装置で得られた糖化液と微生物とを含む発酵槽と、
を備えることを特徴とする製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造方法及び製造装置、リグノセルロース系バイオマスから糖化液を製造するための方法及び装置、並びにリグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造するための方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化対策や、廃棄物の有効活用の観点から、植物資源を原料とするバイオマスの利用が注目されている。一般に、バイオマスからエタノール等の化合物を製造するための原料としては、サトウキビ等の糖質やトウモロコシ等のデンプン質が多く用いられている。しかしながら、これらの原料はもともと食料又は飼料として用いられており、長期的に工業用利用資源として活用することは、食料又は飼料用途との競合を引き起こし、原料価格の高騰を招く危険性がある。
【０００３】
従って、非食用バイオマスをエネルギー資源として活用する技術開発が進められている。非食用バイオマスとしては、地球上に最も多く存在するセルロースがあげられるが、その大部分は芳香族ポリマーのリグニンやヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロースとして存在する。
【０００４】
リグノセルロースを利用したエネルギー生産において、糖化酵素の費用はかなりの割合を占めている。そのため、糖化酵素のオンサイト生産により、糖化酵素の費用を低減することが試みられている。糖化酵素をオンサイト生産する方法として、例えば、糖化酵素生産菌を培養し、糖化酵素を得る方法等が挙げられる。糖化酵素生産菌を用いた糖化酵素の生産を高効率で行うためには、通常、高価な誘導物質であるセロビオースを必要とする。
セロビオースを必要としない糖化酵素生産菌もごくわずかに存在するが、希少であり、さらに生産される糖化酵素の比活性が低い。また、セロビオースを必要としない糖化酵素生産菌を遺伝子組換え等で新たに作り出すことも考えられるが、技術的に難しいため、現実的ではない。
【０００５】
セロビオースを製造する方法としては、例えば、グルコースに耐熱性β−グルコシダーゼを添加し、加熱することで縮合反応により、セロビオース等の二糖類を製造する方法（例えば、特許文献１参照。）等が挙げられる。
【０００６】
また、その他のセロビオースを製造する方法としては、例えば、セルラーゼ構成酵素（例えば、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）、及びβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）等）におけるセルロースへの吸着力の差を利用して、セルロースの吸着がほとんどないＢＧＬを除去した後、酵素反応を行わせてセロビオースを得る方法（例えば、特許文献２参照。）等が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−２２７０３２号公報
【特許文献２】特開昭６３−２２６２９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１に記載の方法では、縮合反応を行わせるために、高濃度のグルコースが必要となり、コスト高になるという問題がある。
また、特許文献２に記載の方法では、原料として単体のセルロースが必要となり、コスト高になるという問題がある。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、安価にセロビオースが得られ、高効率な糖化酵素の製造方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造方法であって、低β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースを加水分解させてセロビオースを生産させるセロビオース生産工程と、前記セロビオース生産工程で得られた前記セロビオースを含む糖化液と、糖化酵素生産菌とを混合して培養し、前記糖化酵素生産菌に糖化酵素を生産させる糖化酵素生産工程と、を備えることを特徴とする製造方法。
［２］前記低ＢＧＬ糖化酵素が、ＢＧＬの活性が低い糖化酵素を生産する菌由来のものである［１］に記載の製造方法。
［３］前記ＢＧＬの活性が低い糖化酵素を生産する菌がトルコデルマ・レッセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＰＣ−３−７株である［２］に記載の製造方法。
［４］さらに、前記セロビオース生産工程の前に、糖化酵素又は糖化酵素生産菌と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、前記糖化酵素又は前記糖化酵素生産菌由来の糖化酵素に含まれるＢＧＬを前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるリグニンに吸着させることで、低ＢＧＬ糖化酵素を生産させる低ＢＧＬ糖化酵素生産工程を備える［１］に記載の製造方法。
［５］リグノセルロース系バイオマスから糖化液を製造するための方法であって、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の製造方法を用いて、糖化酵素を製造した後、前記糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、糖化する糖化工程を備えることを特徴とする製造方法。
［６］リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造するための方法であって、［５］に記載の製造方法を用いて、糖化液を製造した後、前記糖化液と微生物とを混合し、発酵する発酵工程を備えることを特徴とする製造方法。
【００１１】
［７］リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造装置であって、低ＢＧＬ糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含むセロビオース生産槽と、前記セロビオース生産槽で得られたセロビオースを含む糖化液と糖化酵素生産菌とを含む糖化酵素生産槽と、を備えることを特徴とする製造装置。
［８］さらに、前記セロビオース生産槽の前に、糖化酵素又は糖化酵素生産菌と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含む低ＢＧＬ糖化酵素生産槽を備える［７］に記載の製造装置。
［９］リグノセルロース系バイオマスから糖化液を製造するための装置であって、［７］又は［８］に記載の製造装置と、前記製造装置で得られた糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含む糖化装置と、を備えることを特徴とする製造装置。
［１０］リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造するための装置であって、［９］に記載の製造装置と、前記製造装置で得られた糖化液と微生物とを含む発酵槽と、を備えることを特徴とする製造装置。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、安価にセロビオースが得られ、高効率な糖化酵素の製造方法及び装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の糖化酵素の製造装置の一実施形態を模式的に示す概略構成図である。
【図２】本発明の糖化酵素の製造装置の他の実施形態を模式的に示す概略構成図である。
【図３】本発明の糖化液の製造装置の一実施形態を模式的に示す概略構成図である。
【図４】本発明のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置の一実施形態を模式的に示す概略構成図である。
【図５】実施例１におけるトルコデルマ・レッセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＰＣ−３−７株由来の糖化酵素を用いて前処理済みリグノセルロース系バイオマスを基質とした糖化反応での培養時間とグルコース及びセロビオースの生産量との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、「リグノセルロース系バイオマス」としては、主に、セルロース、ヘミセルロース、及びリグニンを含有するものであり、例えば針葉樹、広葉樹、建築廃材、林地残材、剪定廃材、稲藁、籾殻、麦藁、木材チップ、木材繊維、化学パルプ、古紙、合板等の農林産物資源、サトウキビバガス、サトウキビ茎葉、コーンストーバー等の農林産物廃棄物、農林産物加工品及び大型藻類、微細藻類等の植物組織等が挙げられ、これらに限定されない。これらのリグノセルロース系バイオマスは単独であってもよく、混合物であってもよい。
【００１５】
本明細書において、「ヘミセルロース」には、キシロースなどの５つの炭素を構成単位とする五炭糖とよばれるものやマンノース、アラビノース、ガラクツロン酸などの６つの炭素を構成単位とする六炭糖とよばれるもの、さらにグルコマンナンやグルクロノキシランなどのような複合多糖等が含まれる。よって、ヘミセルロースは加水分解を受けると、炭素５つからなる五炭糖の単糖やその単糖が複数個連結された五炭糖のオリゴ糖、炭素６つからなる六炭糖の単糖やその単糖が複数個連結された六炭糖のオリゴ糖、五炭糖の単糖と六炭糖の単糖が複数個連結されたオリゴ糖を生ずる。
「セルロース」には、６つの炭素を構成単位とする六炭糖が含まれる。よって、セルロースは加水分解を受けると、炭素６つからなる六炭糖の単糖やその単糖が複数個連結された六炭糖のオリゴ糖を生ずる。
一般に、ヘミセルロース又はセルロースから生ずる単糖又はオリゴ糖の構成比率や生成量は、前処理方法や原料として用いた農林産物資源、農林産物廃棄物、農林産物加工品及び大型藻類、微細藻類等の植物組織等の種類によって異なる。
【００１６】
本明細書において、「前処理済みリグノセルロース系バイオマス」とは、糖化反応を効率的に行うために事前処理を行ったリグノセルロース系バイオマスを意味する。前処理方法としては、例えば、蒸気のみでの蒸煮法、イオン液体を用いる方法、ミルを用いる粉砕法などが挙げられる。また、前処理において、必要に応じて、適宜酸又はアルカリを混合させてもよい。酸としては、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸等の中から選ばれ、これらを単独で又は組み合わせて用いてもよい。中でも工業利用には安価で手に入りやすい硫酸が特に好ましい。アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアの中から選ばれ、これらを単独で又は組み合わせて用いてもよい。
【００１７】
本明細書において、「リグノセルロース系バイオマス由来化合物」とは、リグノセルロース系バイオマスを分解して得られた単糖及びオリゴ糖を、微生物が摂取することにより生成された化合物を意味する。例えば、エタノール、ブタノール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、グリセロール等のアルコール、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸、乳酸等の有機酸、イノシン、グアノシン等のヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸等のヌクレオチド、カダベリン等のジアミン化合物等が挙げられる。微生物から生成された化合物が乳酸等のモノマーである場合は、重合によりポリマーに変換することもある。
【００１８】
以下、図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、各図において、説明に関連しない部分は図示を省略する場合がある。
【００１９】
＜＜糖化酵素の製造方法＞＞
一実施形態において、本発明は、リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造方法であって、低β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースを加水分解させてセロビオースを生産させるセロビオース生産工程と、前記セロビオース生産工程で得られた前記セロビオースを含む糖化液と、糖化酵素生産菌とを混合して培養し、前記糖化酵素生産菌に糖化酵素を生産させる糖化酵素生産工程と、を備える製造方法を提供する。
【００２０】
本実施形態の製造方法によれば、安価にセロビオースが得られ、高効率で糖化酵素を製造することができる。
【００２１】
［セロビオース生産工程］
本実施形態の製造方法において、まず、低β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）糖化酵素と、前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースを加水分解させてセロビオースを生産させる。
【００２２】
セロビオース生産工程における温度としては、例えば４０℃以上７０℃以下であればよい。また、セロビオース生産工程における時間としては、例えば２時間以上１２０時間以下であればよい。また、セロビオース生産工程におけるｐＨとしては、例えばｐＨ４以上７以下であればよい。また、セロビオース生産工程において、適当なｐＨ及びセロビオースの生産に適した前処理済みリグノセルロース系バイオマスの固形分濃度となるように、適宜工業用水及びｐＨ調整剤（酸、又はアルカリ）等を用いて調整すればよい。
【００２３】
本明細書において、「糖化酵素」とは、リグノセルロース系バイオマスを単糖又はオリゴ糖単位に分解する酵素を意味し、リグノセルロース系バイオマスを単糖又はオリゴ糖にまで分解するものであればよく、主に、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの各活性を持つものであればよい。
セルラーゼは、セルロースをグルコース等の単糖又はオリゴ糖に分解するものであればよく、エンドグルカナーゼ（ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ；ＥＧ）、セロビオハイドロラーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ；ＣＢＨ）、及びβ−グルコシダーゼ（β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ；ＢＧＬ）の各活性の少なくとも１つの活性を有するものを挙げることができ、これらの各活性を有する酵素混合物であることが、酵素活性の観点から好ましい。
同じくヘミセルラーゼは、ヘミセルロースをキシロース等の単糖又はオリゴ糖に分解するものであればよく、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、及びアラビノフラノシダーゼの各活性の少なくとも１つの活性を有するものを挙げることができ、これらの各活性を有する酵素混合物であることが、酵素活性の観点から好ましい。
これらセルラーゼ及びヘミセルラーゼ等の糖化酵素の由来は限定されることはなく、例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎｕｓ）属、イルペックス（Ｉｒｐｅｘ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属等の糸状菌、担子菌、細菌類等の糖化酵素生産菌由来のセルラーゼ及びヘミセルラーゼ等の糖化酵素を用いることができる。
【００２４】
本明細書において、「低β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）糖化酵素」とは、β−グルコシダーゼの活性が従来の糖化酵素に含まれるＢＧＬよりも低く、当該糖化酵素を用いた糖化反応において、グルコースが全く生産されない、又はグルコースが少量生産されるが、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、及びセロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）の活性が高いため、充分量のセロビオースが生産されるものを意味する。
上記のとおり、セルラーゼは、ＥＧ、ＣＢＨ、及びＢＧＬから構成される酵素混合物である。ＥＧは、セルロースの非結晶領域を分子内部から切断する酵素であり、ＣＢＨは、セルロースの還元末端と非還元末端のいずれかから分解し、グルコースが２分子結合した二糖であるセロビオースを遊離させる酵素であり、ＢＧＬは、糖のβ−グリコシド結合の加水分解反応を触媒する酵素であって、セロビオースを分解し、単糖であるグルコースを遊離させる酵素である。よって、糖化酵素に含まれるＢＧＬの活性が低いことにより、前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースを基質とした、糖化酵素中のセルラーゼによる糖化反応において、ＢＧＬによりセロビオースが単糖であるグルコースに分解されることなく、セロビオースを高効率で生産することができる。
低ＢＧＬ糖化酵素に含まれるＦＰＵあたりのＢＧＬの活性（Ｕ／ＦＰＵ）は、従来の糖化酵素に含まれるＦＰＵあたりのＢＧＬの活性（Ｕ／ＦＰＵ）に対し、例えば、１／３０倍以下であればよい。
低ＢＧＬ糖化酵素に含まれるＢＧＬの活性が、従来の糖化酵素に含まれるＢＧＬの活性に対し、上記値の範囲であることにより、ＢＧＬによりセロビオースがグルコースに分解されることなく、セロビオースを高効率で生産することができる。
また、低ＢＧＬ糖化酵素はセルラーゼの活性のみを持つものであってもよく、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの各活性を持つものであってもよい。中でも、本実施形態における低ＢＧＬ糖化酵素は、セロビオースの生産に必要とされる糖化酵素はセルラーゼであるため、セルラーゼの活性のみを持つものであることが好ましい。
【００２５】
セロビオース生産工程において生産されたセロビオースを含む糖化液を、続く糖化酵素生産工程において用いればよい。また、セロビオース生産工程の後に残った前処理済みリグノセルロース系バイオマス由来の固形分を多く含む残渣を、後述の＜＜糖化液の製造方法＞＞の［糖化工程］において、前処理済みリグノセルロース系バイオマス及び糖化酵素に混合させて用いてもよい。これにより、セロビオース生産工程における廃棄物が生じず、環境負荷を低減することができる。
【００２６】
［低ＢＧＬ糖化酵素生産工程］
（第一実施形態）
本実施形態の製造方法は、低ＢＧＬ糖化酵素を得るために、さらに、前記セロビオース生産工程の前に、低ＢＧＬ糖化酵素生産工程を備えていてもよい。
前記低ＢＧＬ糖化酵素生産工程としては、例えば、ＢＧＬの活性が低い糖化酵素を生産する菌（以下、「低ＢＧＬ糖化酵素生産菌」と称する場合がある。）を培養して、低ＢＧＬ糖化酵素を得る方法等が挙げられる。
【００２７】
本実施形態の低ＢＧＬ糖化酵素生産工程における培養温度としては、例えば、２０℃以上３５℃以下であればよい。また、本実施形態の低ＢＧＬ糖化酵素生産工程における培養時間としては、例えば４日以上１０日以下であればよい。
また、本実施形態の低ＢＧＬ糖化酵素生産工程における培養方法としては、例えば、振とう培養、撹拌培養、撹拌振とう培養、静置培養、連続培養等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２８】
また、本実施形態の低ＢＧＬ糖化酵素生産工程に用いられる培地としては、低ＢＧＬ糖化酵素生産菌の生存増殖に必要な成分（糖源、窒素源）等を含む培地であればよく、低ＢＧＬ糖化酵素生産菌の種類により適宜選択することができる。
前記糖源としては、特別な限定はないが、新たな原料を必要としないことから、前処理済みリグノセルロース系バイオマスを用いることが好ましい。
また、前記窒素源としては、例えば、ポリペプトン、硫酸アンモニウム、肉汁、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）、大豆かす等が挙げられ、これらに限定されない。また、例えば、アンモニアを用いてリグノセルロース系バイオマスを前処理し、前処理済みリグノセルロース系バイオマスを得た場合には、当該アンモニアが窒素源となりうる。
その他、培地には目的とする低ＢＧＬ糖化酵素を生産する上で必要とされる成分を添加することができる。
【００２９】
前記低ＢＧＬ糖化酵素生産菌としては、上述の［セロビオース生産工程］において糖化酵素生産菌として例示されたものと同様のもののうち、ＢＧＬ遺伝子が破壊、又はＢＧＬ遺伝子の発現が低減されており、低ＢＧＬ糖化酵素を生産可能なものであればよい。中でも、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する糸状菌であることが好ましい。
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する糸状菌としては、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｕｓｔｒｏｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃａｎｄｉｄｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ  ｖａｒ．ａｅｑｕａｔｏｒｉａｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ  ｖａｒ．Ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃａｔｏｐｔｒｏｎ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｒｅｍｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｅｒａｍｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｅｒｉｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｈｌｏｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｈｒｏｍｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｒａｓｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｒｅｍｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｄｉｎｇｌｅｙｅａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｄｏｒｏｔｈｅａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｅｆｆｕｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｅｒｉｎａｃｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｅｓｔｏｎｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｆｅｒｔｉｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｇｈａｎｅｎｓｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｍａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈｅｌｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｉｎｔｒｉｃａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｐｏｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｐｉｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｍｉｎｕｔｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｏｂｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｏｖａｌｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｈｙｌｌｏｓｔａｈｙｄｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｉｌｕｌｉｆｅｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｌｅｕｒｏｔｉｃｏｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｌｅｕｒｏｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｏｇｅｒｓｏｎｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｏｓｓｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｉｎｕｏｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．ＭＡ  ３６４２、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．ＰＰＲＩ  ３５５９、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｉｒａｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｔｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅ���ｍａ  ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｔｒｏｍａｔｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｕｒｒｏｔｕｎｄｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｔｈａｉｌａｎｄｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｔｈｅｌｅｐｈｏｒｕｃｏｌｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｔｈｅｏｂｒｏｍｉｃｏｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｅｌｕｔｉｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｅｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ等が挙げられ、これに限定されない。
中でも、セルラーゼの分泌生産能の観点から、トリコデルマ・レッセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・アトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、又はトリコデルマ・ロンジブラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）が好ましく、トリコデルマ・レッセイがより好ましい。
トリコデルマ・レッセイとして、ＢＧＬ遺伝子が破壊された株としては、例えば、トルコデルマ・レッセイＰＣ−３−７株等が挙げられ、これに限定されない。
【００３０】
低ＢＧＬ糖化酵素生産菌を培養した培養上清には低ＢＧＬ糖化酵素が含まれるため、前記培養上清をそのまま使用してもよく、又は、前記培養上清を、例えば、遠心分離、フィルターろ過等により低ＢＧＬ糖化酵素を分離及び精製して使用してもよい。
【００３１】
（第二実施形態）
また、前記低ＢＧＬ糖化酵素生産工程において、他の実施形態としては、例えば、糖化酵素又は糖化酵素生産菌と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、前記糖化酵素又は前記糖化酵素生産菌由来の糖化酵素に含まれるＢＧＬを前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるリグニンに吸着させることで、低ＢＧＬ糖化酵素を生産させる方法等が挙げられる。
一般的に、糖化反応において、リグニンに糖化酵素が非特異的に吸着する現象がしばしば起きる。また、セルラーゼのうち、ＥＧ及びＣＢＨは、セルロース結合モジュール（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ；ＣＢＭ）を有し、基質であるセルロースに特異的に吸着する。一方、ＢＧＬはＣＢＭを有しないため、リグニンへの非特異的吸着のみである。よって、前記糖化酵素に含まれるＢＧＬを固体であるリグニンへ非特異的吸着させることにより沈殿させ、セルロースに特異的に吸着した状態のＥＧ及びＣＢＨ等のＢＧＬ以外の糖化酵素は培養上清中に可溶化しているため、前記培養上清を回収することで、低ＢＧＬ糖化酵素を生産することができる。
また、ＢＧＬはリグニンに吸着した状態であっても、活性部位が残っており、液中のセロビオースに対して糖化能力が維持されている。よって、本実施形態の低ＢＧＬ糖化酵素生産工程の後に残ったＢＧＬが吸着した状態のリグニンを含む残渣を、後述の＜＜糖化液の製造方法＞＞の［糖化工程］において、前処理済みリグノセルロース系バイオマス及び糖化酵素に混合させて用いてもよい。これにより、低ＢＧＬ糖化酵素生産工程における廃棄物が生じず、環境負荷を低減することができる。
【００３２】
本実施形態の低ＢＧＬ糖化酵素生産工程における温度、時間、及びｐＨは、上述の［セロビオース生産工程］において例示されたものと同様である。
【００３３】
本実施形態における糖化酵素としては、セルラーゼの活性のみを持つものであってもよく、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの各活性を持つものであってもよい。中でも、本実施形態における糖化酵素は、続くセロビオース生産工程において必要とされる糖化酵素はセルラーゼであるため、セルラーゼの活性のみを持つものであることが好ましい。
【００３４】
また、本実施形態における糖化酵素生産菌としては、上述の［セロビオース生産工程］において糖化酵素生産菌として例示されたものと同様のものが挙げられる。また、前記糖化酵素生産菌において、生産される糖化酵素は、セルラーゼの活性のみを持つものであってもよく、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの各活性を持つものであってもよい。中でも、続くセロビオース生産工程において必要とされる糖化酵素はセルラーゼであるため、本実施形態における糖化酵素生産菌としては、セルラーゼ生産菌であることが好ましい。
【００３５】
（その他の実施形態）
また、前記低ＢＧＬ糖化酵素生産工程において、さらに他の実施形態としては、例えば、糖化酵素又は糖化酵素生産菌由来の糖化酵素とＢＧＬ阻害剤とを混合し、前記糖化酵素又は前記糖化酵素生産菌由来の糖化酵素に含まれるＢＧＬの活性を低減させることで、低ＢＧＬ糖化酵素を生産させる方法等が挙げられる。
【００３６】
本実施形態の低ＢＧＬ糖化酵素生産工程における温度、時間、及びｐＨは、上述の［セロビオース生産工程］において例示されたものと同様である。
【００３７】
ＢＧＬ阻害剤としては、例えば、ＢＧＬに結合し活性を低減させることで阻害するもの等が挙げられる。ＢＧＬに結合し活性を低減させることで阻害するものとしては、例えば、δ−グルコノラクトン、グルコン酸、カスタノスペルミン、コンズリトールＢ、コンズリトールＢエポキシド等が挙げられ、これらに限定されない。
【００３８】
［糖化酵素生産工程］
続いて、前記セロビオース生産工程で得られた前記セロビオースを含む糖化液と、糖化酵素生産菌とを混合して培養し、前記糖化酵素生産菌に糖化酵素を生産させる。
【００３９】
糖化酵素生産工程における温度及び時間は、上述の［低ＢＧＬ糖化酵素生産工程］の（第一実施形態）において例示されたものと同様である。また、糖化酵素生産工程において、前記セロビオース生産工程で得られた前記セロビオースを含む糖化液の他に、目的とする糖化酵素を生産する上で必要とされる成分（糖源、窒素源）等を添加することができる。前記糖源としては、糖を含むものであればよく、特別な限定はない。前記窒素源としては、上述の［低ＢＧＬ糖化酵素生産工程］の（第一実施形態）において例示されたものと同様のものが挙げられる。
さらに、各種キシラン成分を添加することで、糖化酵素生産菌においてキシラナーゼを増産させることも可能である。
【００４０】
糖化酵素生産菌としては、上述の［セロビオース生産工程］において糖化酵素生産菌として例示されたものと同様のものが挙げられる。また、前記糖化酵素生産菌において、生産される糖化酵素は、上述の［セロビオース生産工程］における定義の通り、主に、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの各活性を持つものであればよい。
【００４１】
糖化酵素生産工程において生産された糖化酵素を含む培養上清は、例えば、前記培養上清から糖化酵素を分離及び精製することで糖化酵素製剤として販売してもよく、又は前記培養上清をそのまま、後述のリグノセルロース系バイオマスから糖化液を製造するために使用してもよい。
また、糖化酵素生産工程の後に残った前処理済みリグノセルロース系バイオマス由来の固形分を多く含む残渣を、後述の＜＜糖化液の製造方法＞＞の［糖化工程］において、前処理済みリグノセルロース系バイオマス及び糖化酵素に混合させて用いてもよい。これにより、糖化酵素生産工程における廃棄物が生じず、環境負荷を低減することができる。
【００４２】
＜＜糖化酵素の製造装置＞＞
（第一実施形態）
図１は、本発明の糖化酵素の製造装置の一実施形態を模式的に示す概略構成図である。
なお、以下の説明で用いる図は、本発明の特徴を分かり易くするために、便宜上、要部となる部分を拡大して示している場合があり、各構成要素の寸法比率等が実際と同じであるとは限らない。
本実施形態の糖化酵素の製造装置１０は、低ＢＧＬ糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含むセロビオース生産槽１１と、前記セルビオース生産槽で得られたセロビオースを含む糖化液と糖化酵素生産菌とを含む糖化酵素生産槽１２と、が配管１３を介して配設されている。
【００４３】
セロビオース生産槽１１は、低ＢＧＬ糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含み、セロビオースを生産するための槽であり、特別な限定はない。セロビオース生産槽１１は撹拌翼等の撹拌機構を有することが好ましい。セロビオース生産槽１１の外側には、上述の［セロビオース生産工程］において例示された温度範囲となるように、例えば、温水循環式のジャケットなど温度調整装置（図示せず）を備えていてもよい。
【００４４】
糖化酵素生産槽１２は、前記セルビオース生産槽１１で得られたセロビオースを含む糖化液と糖化酵素生産菌とを含み、糖化酵素を生産するための槽であり、特別な限定はない。糖化酵素生産槽１２は撹拌翼等の撹拌機構を有することが好ましい。糖化酵素生産槽１２の外側には、上述の［糖化酵素生産工程］において例示された温度範囲となるように、例えば、温水循環式のジャケットなど温度調整装置（図示せず）を備えていてもよい。
【００４５】
配管１３は、セロビオース生産槽１１から得られたセロビオースを含む糖化液を糖化酵素生産槽１２に送液するための配管であって、特別な限定はない。配管１３の途中には、糖化酵素生産槽１２へ送液する糖化液の流量を調整するためのポンプ（図示せず）、及び糖化液に含まれる固形分を分離するための固液分離装置（図示せず）等が配設されていてもよい。
【００４６】
前記固液分離装置としては、固液の分離強度を調節できる装置であればよく、例えば、加わる圧力を調節することで分離強度を調節することができる装置や、篩目やフィルターの網目の大きさを変更することで分離強度を調節することができる装置、固液分離装置の運転条件は変更せずに固液分離後の固形分の一部を排出することで分離強度を下げることができる装置等が挙げられる。前記固液分離装置として具体的には、例えば、フィルタープレス、スクリュープレスや、１００〜２３６０μｍの網目である振動篩等が挙げられる。
また、配管１３をセロビオース生産槽１１の上部に配設した場合、セロビオース生産槽１１の撹拌を停止して一定時間静置し、固形分が沈殿し、セロビオース生産槽１１内で固液が分離された後に、糖化酵素生産槽１２への送液を開始することにより、固形分の流出を防ぐことができる。
【００４７】
図１に示す本実施形態の糖化酵素の製造装置を用いて、糖化酵素を製造する方法を以下に説明する。
まず、セロビオース生産槽１１に低ＢＧＬ糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを添加して混合し、前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースを加水分解させてセロビオースを含む糖化液を生産させる。次いで、配管１３を介して、固液分離装置等を利用して固形分を分離し、セロビオースを含む糖化液のみを糖化酵素生産槽１２へ送液する。次いで、糖化酵素生産槽１２に糖化酵素生産菌を添加し、培養をすることで、セロビオースを誘導物質として、糖化酵素生産菌に糖化酵素を生産させる。生産された糖化酵素を含む培養上清は、例えば、培養上清から糖化酵素を分離及び精製することで糖化酵素製剤として販売してもよく、又は培養上清をそのまま、後述のリグノセルロース系バイオマスから糖化液を製造するために使用してもよい。
【００４８】
（第二実施形態）
図２は、本発明の糖化酵素の製造装置の他の実施形態を模式的に示す概略構成図である。
本実施形態の糖化酵素の製造装置２０は、前記セロビオース生産槽１１の前に、糖化酵素又は糖化酵素生産菌と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含む低ＢＧＬ糖化酵素生産槽１４が配管１５を介して配設されている点で、図１の示す糖化酵素の製造装置１０と相違し、その他の構成は糖化酵素の製造装置１０と同じである。
なお、以下の図２〜４において、図１に示す構成要素と同一のものについては同じ符号を用いている。
【００４９】
低ＢＧＬ糖化酵素生産槽１４は、糖化酵素又は糖化酵素生産菌と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含み、低ＢＧＬ糖化酵素を生産するための槽であって、特別な限定はない。低ＢＧＬ糖化酵素生産槽１４は撹拌翼等の撹拌機構を有することが好ましい。低ＢＧＬ糖化酵素生産槽１４の外側には、上述の［低ＢＧＬ糖化酵素生産工程］において例示された温度範囲となるように、例えば、温水循環式のジャケットなど温度調整装置（図示せず）を備えていてもよい。
【００５０】
配管１５は、低ＢＧＬ糖化酵素生産槽１４から得られた低ＢＧＬ糖化酵素をセロビオース生産槽１１に送液するための配管であって、特別な限定はない。配管１３の途中には、セロビオース生産槽１１へ送液する糖化液の流量を調整するためのポンプ（図示せず）、及び前処理済みリグノセルロース系バイオマス由来の固形分を分離するための固液分離装置（図示せず）等が配設されていてもよい。前記固液分離装置としては、上述の（第一実施形態）において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、配管１５を低ＢＧＬ糖化酵素生産槽１４の上部に配設した場合、低ＢＧＬ糖化酵素生産槽１４の撹拌を停止して一定時間静置し、固形分が沈殿し、低ＢＧＬ糖化酵素生産槽１４内で固液が分離された後に、セロビオース生産槽１１への送液を開始することにより、固形分の流出を防ぐことができる。
【００５１】
図２に示す本実施形態の糖化酵素の製造装置を用いて、糖化酵素を製造する方法を以下に説明する。
まず、低ＢＧＬ糖化酵素生産槽１４に糖化酵素又は糖化酵素生産菌と前処理済みリグノセルロース系バイオマスと添加して混合し、糖化酵素又は糖化酵素生産菌由来の糖化酵素に含まれるＢＧＬを、前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるリグニンに吸着させることで、低ＢＧＬ糖化酵素を生産させる。次いで、配管１５を介して、固液分離装置等を利用して固形分を分離し、低ＢＧＬ糖化酵素を含む溶液のみをセロビオース生産槽１１へ送液する。
糖化酵素の製造装置２０は、低ＢＧＬ糖化酵素を含む溶液が低ＢＧＬ糖化酵素生産槽１４から送液される以外は、図１に示す糖化酵素の製造装置１０と同様の方法により、リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造することができる。
【００５２】
本発明の糖化酵素の製造装置は、図１及び図２に示すものに限定されず、本発明の効果を損なわない範囲内において、図１及び図２に示すものの一部の構成が変更又は削除されたものや、これまでに説明したものにさらに他の構成が追加されたものであってもよい。
例えば、図１及び図２に示す糖化酵素の製造装置においては、セロビオース生産槽１１の前に、リグノセルロース系バイオマスを前処理するための前処理装置が配管を介して配設されていてもよい。
【００５３】
前記前処理装置としては、特に限定はないが、例えば、耐酸性又は耐アルカリ性を有する加熱圧力容器、耐酸性又は耐アルカリ性を有する容器をオートクレーブのような加熱圧力装置に入れて処理する形態等が挙げられる。
【００５４】
＜＜糖化液の製造方法＞＞
一実施形態として、本発明は、リグノセルロース系バイオマスから糖化液を製造するための方法であって、上述の糖化酵素の製造方法を用いて、糖化酵素を製造した後、前記糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、糖化する糖化工程を備える製造方法を提供する。
【００５５】
本実施形態の糖化液の製造方法によれば、オンサイト生産により得られた糖化酵素を用いて、高効率かつ安価に糖化液を製造することができる。
本実施形態の糖化液の製造方法の各工程について、以下に詳細に説明する。
【００５６】
［糖化工程］
糖化工程は、前処理済みリグノセルロース系バイオマスを基質として、上述の糖化酵素の製造方法により得られた糖化酵素を用いて、糖化反応を行う工程である。
糖化温度は、４５℃以上７０℃以下が好ましく、４５℃以上５５℃以下より好ましく、５０℃が特に好ましい。また、糖化時間は１２時間以上１２０時間以下が好ましく、２４時間以上９６時間以下がより好ましく、２４時間以上７２時間以下がさらに好ましい。
【００５７】
また、糖化工程において、上述の＜＜糖化酵素の製造方法＞＞の［セロビオース生産工程］の後に残った前処理済みリグノセルロース系バイオマス由来の固形分を多く含む残渣を、前処理済みリグノセルロース系バイオマス及び糖化酵素に混合させて用いてもよい。前記残渣には、未糖化のセルロース及びヘミセルロース、並びに低ＢＧＬ糖化酵素が含まれるため、糖化工程において、未糖化のセルロース及びヘミセルロース、並びに低ＢＧＬ糖化酵素を糖化反応に利用することができる。また、これにより、前記［セロビオース生産工程］における廃棄物が生じず、環境負荷を低減することができる。
【００５８】
また、糖化工程において、上述の＜＜糖化酵素の製造方法＞＞の［低ＢＧＬ糖化酵素生産工程］（第二実施形態）の後に残ったＢＧＬが吸着した状態のリグニンを含む残渣を、前処理済みリグノセルロース系バイオマス及び糖化酵素に混合させて用いてもよい。前記残渣には、ＢＧＬが吸着した状態のリグニンが含まれており、ＢＧＬはリグニンに吸着した状態であっても、活性部位が残っており、液中のセロビオースに対して糖化能力が維持されているため、溶液中に含まれるセロビオースを効率的にグルコースへ分解することができる。また、これにより、前記［低ＢＧＬ糖化酵素生産工程］における廃棄物が生じず、環境負荷を低減することができる。
【００５９】
本実施形態において、糖化工程の前にリグノセルロース系バイオマスを糖化酵素による糖化反応を行いやすくするために前処理を行う前処理工程を備えていてもよい。
【００６０】
［前処理工程］
前処理工程は、続く糖化工程において、糖化反応を効率的に行うためにリグノセルロース系バイオマスを前処理する工程である。
前処理方法としては、例えば、蒸気のみでの蒸煮法、イオン液体を用いる方法、ミルを用いる粉砕法などが挙げられる。また、前処理工程において、必要に応じて、適宜酸又はアルカリを混合させてもよい。前記酸及び前記アルカリとしては、上述の「前処理済みリグノセルロース系バイオマス」の定義の際に例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００６１】
本実施形態の糖化液の製造方法において得られた糖化液は、糖化液から不純物を取り除き精製して、精糖蜜として販売してもよく、又は、前記糖化液をそのまま、後述のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造するために用いてもよい。
【００６２】
＜＜糖化液の製造装置＞＞
図３は、本発明の糖化液の製造装置の一実施形態を模式的に示す概略構成図である。
本実施形態の糖化液の製造装置１００は、糖化酵素の製造装置１０と、前記糖化酵素の製造装置１０で得られた糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含む糖化装置１０１と、が配管１０２を介して配設されている。
【００６３】
糖化装置１０１は、前記糖化酵素の製造装置１０で得られた糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含み、単糖を生成する糖化反応を行うための装置であり、特別な制限はない。例えば、撹拌型、通気撹拌型、気泡塔型、流動層型、充填層型などを挙げられ、これらに限定されない。
糖化装置１０１内の温度を一定に保つために、糖化装置１０１の外側に温水循環式のジャケットなど温度調整装置を備えていてもよい。
【００６４】
配管１０２は、糖化酵素生産槽１２から得られた糖化酵素を糖化装置１０１に送液するための配管であって、特別な限定はない。配管１０２の途中には、糖化装置１０１へ送液する糖化酵素を含む溶液の流量を調整するためのポンプ（図示せず）、及び溶液に含まれる固形分を分離するための固液分離装置（図示せず）等が配設されていてもよい。前記固液分離装置としては、上述の＜＜糖化酵素の製造装置＞＞の（第一実施形態）において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００６５】
図３に示す本実施形態の糖化液の製造装置を用いて、糖化液を製造する方法を以下に説明する。
糖化酵素を製造するまでは、図１に示す糖化酵素の製造装置１０と同様の方法により、糖化酵素を製造することできる。また、前処理装置を用いて、リグノセルロース系バイオマスを物理的又は化学的な処理を施し、形状を微細化する、又はオリゴ糖に分解する等して糖化酵素処理しやすい状態にして前処理済みリグノセルロース系バイオマスを準備しておく。次いで、糖化装置１０１に糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを添加して混合し、糖化反応を行うことでグルコースやキシロース等の単糖又はより小さなオリゴ糖に分解させて、糖化液を生産させる。生産された糖化液は、例えば、固形分を分離及び精製することで精糖蜜として販売してもよく、又は糖化液をそのまま、後述のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造するために使用してもよい。
【００６６】
本発明の糖化液の製造装置は、図３に示すものに限定されず、本発明の効果を損なわない範囲内において、図３に示すものの一部の構成が変更又は削除されたものや、これまでに説明したものにさらに他の構成が追加されたものであってもよい。
例えば、図３に示す糖化液の製造装置においては、糖化装置１０１の前に、リグノセルロース系バイオマスを前処理するための前処理装置が配管を介して配設されていてもよい。前記前処理装置としては、上述の＜＜糖化酵素の製造装置＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、例えば、図３に示す糖化液の製造装置においては、糖化酵素の製造装置１０の代わりに、糖化酵素の製造装置２０を備えていてもよい。さらに、糖化酵素の製造装置２０を備えている場合、例えば、低ＢＧＬ糖化酵素生産槽からＢＧＬが吸着した状態のリグニンを含む残渣を糖化装置１０１に送液するために、低ＢＧＬ糖化酵素生産槽の底面、又は側面の下部から糖化装置１０１にかけて配管を備えていてもよい。
また、例えば、図３に示す糖化液の製造装置において、セロビオース生産槽１１から前処理済みリグノセルロース系バイオマス由来の固形分を多く含む残渣を送液するために、セロビオース生産槽１１の底面、又は側面の下部から糖化装置１０１にかけて配管を備えていてもよい。
【００６７】
＜＜リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法＞＞
一実施形態として、本発明は、リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造するための方法であって、上述の糖化液の製造方法を用いて、糖化液を製造した後、前記糖化液と微生物とを混合し、発酵する発酵工程を備える製造方法を提供する。
【００６８】
本実施形態のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法によれば、オンサイト生産により得られた糖化液を用いて、高効率かつ安価にリグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造することができる。
本実施形態のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法の各工程について、以下に詳細に説明する。
【００６９】
［発酵工程］
まず、前記糖化液の製造方法において得られた糖化液と微生物とを添加し、撹拌しながら発酵を行う。また、前記糖化液の製造方法において得られた糖化液のみを用いてもよく、前記糖化液の製造方法において得られた糖化液及び糖化残渣両方を用いてもよい。中でも、糖化残渣には未糖化のセルロース及びヘミセルロース等の多糖、並びに糖化残渣に吸着した状態の糖化酵素が含まれるため、発酵工程においても糖化工程を同時に行い、微生物による発酵における基質となる単糖及びオリゴ糖を生成することができることから、前記糖化液の製造方法において得られた糖化液及び糖化残渣両方を用いることが好ましい。
発酵温度は、２５℃以上５０℃以下が好ましく、２８℃以上３５℃以下がより好ましく、３２℃が特に好ましい。また、発酵時間は、２４時間以上１２０時間以下が好ましく、２４時間以上９６時間以下がより好ましく、２４時間以上７２時間以下がさらに好ましい。
【００７０】
使用する微生物としては、目的のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を生成できるものであれば、特別な限定はない。具体的には、酵母や細菌等が挙げられ、遺伝子組換え微生物も好ましく用いられる。遺伝子組換え微生物とは、アルコール等の目的のリグノセルロース系バイオマス由来化合物への変換に必要な酵素遺伝子を有していない微生物に、遺伝子工学技術によりこれら遺伝子を導入し、アルコール等の目的のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の生成を可能にしたものである。遺伝子組換え微生物としては、例えば、アルコール発酵性を有する遺伝子組換え大腸菌等が挙げられる。
また、微生物は微生物を含む培養液をそのまま使用してもよく、又は、微生物を含む培養液を遠心分離により濃縮したもの、乾燥状態のもの等を適宜使用してよい。
使用する微生物の量は、微生物の増殖速度、発酵槽の大きさ、及び発酵に用いる糖化液の量等を元に算出すればよい。
【００７１】
本実施形態において、発酵工程の後に得られたリグノセルロース系バイオマス由来化合物の純度を上げるために精製を行う精製工程を備えていてもよい。
【００７２】
［精製工程］
精製工程は、発酵工程において得られた発酵液に含まれるリグノセルロース系バイオマス化合物を精製するための工程である。
精製方法としては、リグノセルロース系バイオマス化合物がアルコール類である場合は、例えば、前記発酵液を蒸留する方法等が挙げられる。また、リグノセルロース系バイオマス化合物がアミノ酸類である場合は、例えば、イオン交換法、活性炭を用いた異物の吸着除去法等が挙げられる。
【００７３】
＜＜リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置＞＞
図４は、本発明のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置の一実施形態を模式的に示す概略構成図である。
本実施形態のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置１Ａは、糖化液の製造装置１００と、前記糖化液の製造装置１００で得られた糖化液と微生物とを含む発酵槽１０３とが、配管１０４を介して配設されている。
【００７４】
発酵槽１０３は、糖化液の製造装置１００で得られた糖化液に、微生物を植菌し、発酵槽するための槽であって、特別な限定はない。前記発酵槽としては、例えば、撹拌型、通気撹拌型、気泡塔型、流動層型、充填層型等を挙げられ、これらに限定されない。
また、発酵槽１０３内の温度を一定に保つために、発酵槽１０３の外側に温水循環式のジャケットなど温度調整装置を備えていてもよい。
【００７５】
配管１０４は、糖化装置１０１から得られた糖化液、又は糖化液及び糖化残渣を発酵槽１０３に送液するための配管であって、特別な限定はない。配管１０４の途中には、発酵槽１０３へ送液する糖化液、又は糖化液及び糖化残渣の流量を調整するためのポンプ（図示せず）、並びに糖化液に含まれる固形分を調整するための固液分離装置（図示せず）等が配設されていてもよい。前記固液分離装置としては、上述の＜＜糖化酵素の製造装置＞＞の（第一実施形態）において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００７６】
図４に示す本実施形態のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置を用いて、リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造する方法を以下に説明する。
糖化液を製造するまでは、図３に示す糖化液の製造装置１００と同様の方法により、糖化液を製造することできる。次いで、発酵槽１０３に糖化液、又は糖化液及び糖化残渣と微生物とを添加し、撹拌しながら発酵を行う。次いで、得られた発酵液に含まれる所望のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を分離又は精製するために、必要に応じて、蒸留塔等の精製装置へ送液される。
【００７７】
本発明のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置は、図４に示すものに限定されず、本発明の効果を損なわない範囲内において、図３に示すものの一部の構成が変更又は削除されたものや、これまでに説明したものにさらに他の構成が追加されたものであってもよい。
例えば、図４に示すリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置においては、発酵槽１０３の後に配管を介して精製装置を備えていてもよい。前記精製装置としては、例えば、蒸留塔、分離ろ過膜、遠心分離機が挙げられ、これらに限定されない。
【実施例】
【００７８】
以下、具体的実施例により、本発明についてより詳細に説明する。ただし、本発明は以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
【００７９】
［実施例１］
（１）基質溶液の調製
１本の１００ｍＬ容量の三角フラスコに、乾燥重量２ｇの前処理済みリグノセルロース系バイオマスを入れて、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加えて、固形分１０％の基質溶液２０ｇを調製した。
【００８０】
（２）トルコデルマ・レッセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＰＣ−３−７株によるセロビオースの生産
次いで、予め培養していたトルコデルマ・レッセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＰＣ−３−７株の低ＢＧＬ糖化酵素を含む培養液を、４ＦＰＵ（Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐａｐｅｒ  Ｕｎｉｔ）／ｇ−ｄｒｙ  ＢＭとなるように、（１）で調製した基質溶液に添加した。なお、「４ＦＰＵ／ｇ−ｄｒｙＢＭ」とは、１ｇの乾燥前処理済みリグノセルロース系バイオマスに対して、フィルターペーパー分解活性量が４となるような酵素量を示している。次いで、撹拌数６０ｒｐｍ、５０℃の条件で、４８時間糖化反応を行った。培養開始から２４時間後及び４８時間後に、少量のサンプルを採取し、高速液体クロマトグラフィー（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製、ＨＰＬＣ還元糖システム）およびＡｓａｈｉｐａｋ  ＭＨ２ｐ−５０  ４Ｅカラム（ｓｈｏｄｅｘ社製）を用いて、セロビオース濃度及びグルコース濃度を計測した。結果を図５に示す。
【００８１】
図５から、培養開始から２４時間後及び４８時間後において、約１６〜１７ｇ／Ｌのセロビオースが得られることが明らかとなった。また、培養開始から２４時間後よりも４８時間後において、グルコース濃度が約１１ｇ／Ｌから約１４ｇ／Ｌまで増加していることから、トルコデルマ・レッセイＰＣ−３−７株の培養液に含まれる少量のＢＧＬによって、セロビオースの一部がグルコースに分解されたが、低ＢＧＬ糖化酵素に含まれるＣＢＨ及びＥＧの割合が多いため、セロビオースの生産量が多く、充分量のセロビオースが得られたと推察された。
【００８２】
以上のことから、低ＢＧＬ糖化酵素を用いることで、前処理済みリグノセルロース系バイオマスからセロビオースが得られることが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明によれば、安価にセロビオースが得られ、高効率な糖化酵素の製造方法及び装置を提供することができる。また、得られた糖化酵素を用いて、リグノセルロース系バイオマスから糖化液、さらに所望のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を得ることができる。
【符号の説明】
【００８４】
１Ａ…リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置、１０、２０…糖化酵素の製造装置、１１…セロビオース生産槽、１２…糖化酵素生産槽、１３，１５，１０２，１０４…配管、１４…低ＢＧＬ糖化酵素製造装置、１００…糖化液の製造装置、１０１…糖化装置、１０３…発酵槽。
【図１】
2018110555.tif 000002
【図２】
2018110555.tif 000003
【図３】
2018110555.tif 000004
【図４】
2018110555.tif 000005
【図５】
2018110555.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成29年4月28日(2017.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造方法であって、
トリコデルマ属に属する糸状菌由来の糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースを加水分解させてセロビオースを生産させるセロビオース生産工程と、
前記セロビオース生産工程で得られた前記セロビオースを含む糖化液と、糖化酵素生産菌とを混合して培養し、前記糖化酵素生産菌に糖化酵素を生産させる糖化酵素生産工程と、
を備え、前記セロビオース生産工程と前記糖化酵素生産工程とはそれぞれ独立した、異なる反応工程であり、
前記トリコデルマ属に属する糸状菌由来の糖化酵素はエンドグルカナーゼ及びセロビオハイドロラーゼの活性を有し、
前記糖化酵素生産菌に生産させる糖化酵素は少なくともセルラーゼの活性を有し、前記セルラーゼはＢＧＬ、エンドグルカナーゼ、及びセロビオハイドロラーゼの活性を有する酵素混合物であることを特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記トリコデルマ属に属する糸状菌がトリコデルマ・レッセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＰＣ−３−７株である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造方法であって、
糖化酵素又は糖化酵素生産菌と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、前記糖化酵素又は前記糖化酵素生産菌由来の糖化酵素に含まれるＢＧＬを前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるリグニンに吸着させて沈殿させ、一方、前記糖化酵素又は前記糖化酵素生産菌由来の糖化酵素に含まれるエンドグルカナーゼ及びセロビオハイドロラーゼを前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースに特異的に吸着させ、前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼが前記セルロースを分解することで、前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼを培養上清中に可溶化させ、前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼを含有する培養上清を回収する回収工程と、
前記培養上清と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースを加水分解させてセロビオースを生産させるセロビオース生産工程と、
前記セロビオース生産工程で得られた前記セロビオースを含む糖化液と、糖化酵素生産菌とを混合して培養し、前記糖化酵素生産菌に糖化酵素を生産させる糖化酵素生産工程と、
を備え、前記回収工程と前記セロビオース生産工程と前記糖化酵素生産工程とはそれぞれ独立した、異なる反応工程であり、
前記糖化酵素生産菌に生産させる糖化酵素は少なくともセルラーゼの活性を有し、前記セルラーゼはＢＧＬ、エンドグルカナーゼ、及びセロビオハイドロラーゼの活性を有する酵素混合物であることを特徴する製造方法。
【請求項４】
リグノセルロース系バイオマスから糖化液を製造するための方法であって、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法を用いて、糖化酵素を製造した後、前記糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、糖化する糖化工程を備えることを特徴とする製造方法。
【請求項５】
リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造するための方法であって、
請求項４に記載の製造方法を用いて、糖化液を製造した後、前記糖化液と微生物とを混合し、発酵する発酵工程を備えることを特徴とする製造方法。
【請求項６】
リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造装置であって、
トリコデルマ属に属する糸状菌由来の糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含むセロビオース生産槽と、
前記セロビオース生産槽で得られたセロビオースを含む糖化液と糖化酵素生産菌とを含む糖化酵素生産槽と、
を備え、前記セロビオース生産槽と前記糖化酵素生産槽とはそれぞれ独立して、異なる反応槽であり、
前記トリコデルマ属に属する糸状菌由来の糖化酵素はエンドグルカナーゼ及びセロビオハイドロラーゼの活性を有し、
前記糖化酵素生産菌に生産させる糖化酵素は少なくともセルラーゼの活性を有し、前記セルラーゼはＢＧＬ、エンドグルカナーゼ、及びセロビオハイドロラーゼの活性を有する酵素混合物であることを特徴とする製造装置。
【請求項７】
リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造装置であって、
糖化酵素又は糖化酵素生産菌と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含み、前記糖化酵素のうちエンドグルカナーゼ及びセロビオハイドロラーゼを含有する培養上清を回収するための回収槽と、
前記回収槽で得られた前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼを含有する培養上清と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含むセロビオース生産槽と、
前記セロビオース生産槽で得られたセロビオースを含む糖化液と糖化酵素生産菌とを含む糖化酵素生産槽と、
前記回収槽で得られた前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼを含有する培養上清を前記セロビオース生産槽に送液するための配管と、を備え、
前記回収槽と前記セロビオース生産槽と前記糖化酵素生産槽とはそれぞれ独立して、異なる反応槽であることを特徴とする製造装置。
【請求項８】
リグノセルロース系バイオマスから糖化液を製造するための装置であって、
請求項６又は７に記載の製造装置と、
前記製造装置で得られた糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含む糖化装置と、
を備えることを特徴とする製造装置。
【請求項９】
リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造するための装置であって、
請求項８に記載の製造装置と、
前記製造装置で得られた糖化液と微生物とを含む発酵槽と、
を備えることを特徴とする製造装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造方法であって、トリコデルマ属に属する糸状菌由来の糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースを加水分解させてセロビオースを生産させるセロビオース生産工程と、前記セロビオース生産工程で得られた前記セロビオースを含む糖化液と、糖化酵素生産菌とを混合して培養し、前記糖化酵素生産菌に糖化酵素を生産させる糖化酵素生産工程と、を備え、前記セロビオース生産工程と前記糖化酵素生産工程とはそれぞれ独立した、異なる反応工程であり、前記トリコデルマ属に属する糸状菌由来の糖化酵素はエンドグルカナーゼ及びセロビオハイドロラーゼの活性を有し、前記糖化酵素生産菌に生産させる糖化酵素は少なくともセルラーゼの活性を有し、前記セルラーゼはＢＧＬ、エンドグルカナーゼ、及びセロビオハイドロラーゼの活性を有する酵素混合物であることを特徴とする製造方法。
［２］前記トリコデルマ属に属する糸状菌がトリコデルマ・レッセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＰＣ−３−７株である［１］に記載の製造方法。
［３］リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造方法であって、糖化酵素又は糖化酵素生産菌と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、前記糖化酵素又は前記糖化酵素生産菌由来の糖化酵素に含まれるＢＧＬを前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるリグニンに吸着させて沈殿させ、一方、前記糖化酵素又は前記糖化酵素生産菌由来の糖化酵素に含まれるエンドグルカナーゼ及びセロビオハイドロラーゼを前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースに特異的に吸着させ、前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼが前記セルロースを分解することで、前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼを培養上清中に可溶化させ、前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼを含有する培養上清を回収する回収工程と、前記培養上清と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースを加水分解させてセロビオースを生産させるセロビオース生産工程と、前記セロビオース生産工程で得られた前記セロビオースを含む糖化液と、糖化酵素生産菌とを混合して培養し、前記糖化酵素生産菌に糖化酵素を生産させる糖化酵素生産工程と、を備え、前記回収工程と前記セロビオース生産工程と前記糖化酵素生産工程とはそれぞれ独立した、異なる反応工程であり、前記糖化酵素生産菌に生産させる糖化酵素は少なくともセルラーゼの活性を有し、前記セルラーゼはＢＧＬ、エンドグルカナーゼ、及びセロビオハイドロラーゼの活性を有する酵素混合物であることを特徴する製造方法。
［４］リグノセルロース系バイオマスから糖化液を製造するための方法であって、［１］〜［３］のいずれか一つに記載の製造方法を用いて、糖化酵素を製造した後、前記糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、糖化する糖化工程を備えることを特徴とする製造方法。
［５］リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造するための方法であって、［４］に記載の製造方法を用いて、糖化液を製造した後、前記糖化液と微生物とを混合し、発酵する発酵工程を備えることを特徴とする製造方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
［６］リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造装置であって、トリコデルマ属に属する糸状菌由来の糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含むセロビオース生産槽と、前記セロビオース生産槽で得られたセロビオースを含む糖化液と糖化酵素生産菌とを含む糖化酵素生産槽と、を備え、前記セロビオース生産槽と前記糖化酵素生産槽とはそれぞれ独立して、異なる反応槽であり、前記トリコデルマ属に属する糸状菌由来の糖化酵素はエンドグルカナーゼ及びセロビオハイドロラーゼの活性を有し、前記糖化酵素生産菌に生産させる糖化酵素は少なくともセルラーゼの活性を有し、前記セルラーゼはＢＧＬ、エンドグルカナーゼ、及びセロビオハイドロラーゼの活性を有する酵素混合物であることを特徴とする製造装置。
［７］リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造装置であって、糖化酵素又は糖化酵素生産菌と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含み、前記糖化酵素のうちエンドグルカナーゼ及びセロビオハイドロラーゼを含有する培養上清を回収するための回収槽と、前記回収槽で得られた前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼを含有する培養上清と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含むセロビオース生産槽と、前記セロビオース生産槽で得られたセロビオースを含む糖化液と糖化酵素生産菌とを含む糖化酵素生産槽と、前記回収槽で得られた前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼを含有する培養上清を前記セロビオース生産槽に送液するための配管と、を備え、前記回収槽と前記セロビオース生産槽と前記糖化酵素生産槽とはそれぞれ独立して、異なる反応槽であることを特徴とする製造装置。
［８］リグノセルロース系バイオマスから糖化液を製造するための装置であって、［６］又は［７］に記載の製造装置と、前記製造装置で得られた糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含む糖化装置と、を備えることを特徴とする製造装置。
［９］リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造するための装置であって、［８］に記載の製造装置と、前記製造装置で得られた糖化液と微生物とを含む発酵槽と、を備えることを特徴とする製造装置。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
前記低ＢＧＬ糖化酵素生産菌としては、上述の［セロビオース生産工程］において糖化酵素生産菌として例示されたものと同様のもののうち、ＢＧＬ遺伝子が破壊、又はＢＧＬ遺伝子の発現が低減されており、低ＢＧＬ糖化酵素を生産可能なものであればよい。中でも、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する糸状菌であることが好ましい。
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する糸状菌としては、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｕｓｔｒｏｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃａｎｄｉｄｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ  ｖａｒ．ａｅｑｕａｔｏｒｉａｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ  ｖａｒ．Ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃａｔｏｐｔｒｏｎ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｒｅｍｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｅｒａｍｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｅｒｉｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｈｌｏｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｈｒｏｍｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｒａｓｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｃｒｅｍｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｄｉｎｇｌｅｙｅａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｄｏｒｏｔｈｅａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｅｆｆｕｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｅｒｉｎａｃｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｅｓｔｏｎｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｆｅｒｔｉｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｇｈａｎｅｎｓｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｍａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈｅｌｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｉｎｔｒｉｃａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｐｏｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｐｉｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｍｉｎｕｔｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｏｂｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｏｖａｌｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｈｙｌｌｏｓｔａｈｙｄｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｉｌｕｌｉｆｅｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｌｅｕｒｏｔｉｃｏｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｌｅｕｒｏｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｏｇｅｒｓｏｎｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｏｓｓｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｉｎｕｏｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．ＭＡ  ３６４２、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．ＰＰＲＩ  ３５５９、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｉｒａｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｔｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅ���ｍａ  ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｔｒｏｍａｔｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｕｒｒｏｔｕｎｄｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｔｈａｉｌａｎｄｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｔｈｅｌｅｐｈｏｒｕｃｏｌｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｔｈｅｏｂｒｏｍｉｃｏｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｅｌｕｔｉｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｅｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ等が挙げられ、これに限定されない。
中でも、セルラーゼの分泌生産能の観点から、トリコデルマ・レッセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・アトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、又はトリコデルマ・ロンジブラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）が好ましく、トリコデルマ・レッセイがより好ましい。
トリコデルマ・レッセイとして、ＢＧＬ遺伝子が破壊、又はＢＧＬ遺伝子の発現が低減された株としては、例えば、トリコデルマ・レッセイＰＣ−３−７株等が挙げられ、これに限定されない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2018110555.tif 000007
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2018110555.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成29年9月15日(2017.9.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造方法であって、
第１の糖化酵素又は第１の糖化酵素生産菌と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、前記第１の糖化酵素又は前記第１の糖化酵素生産菌由来の第１の糖化酵素に含まれるＢＧＬを前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるリグニンに吸着させて沈殿させ、一方、前記第１の糖化酵素又は前記第１の糖化酵素生産菌由来の第１の糖化酵素に含まれるエンドグルカナーゼ及びセロビオハイドロラーゼを前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースに特異的に吸着させ、前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼが前記セルロースを分解することで、前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼを培養上清中に可溶化させ、前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼを含有する培養上清を回収する回収工程と、
前記培養上清と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースを加水分解させてセロビオースを生産させるセロビオース生産工程と、
前記セロビオース生産工程で得られた前記セロビオースを含む糖化液と、第２の糖化酵素生産菌とを混合して培養し、前記第２の糖化酵素生産菌に第２の糖化酵素を生産させる糖化酵素生産工程と、
を備え、前記回収工程と前記セロビオース生産工程と前記糖化酵素生産工程とはそれぞれ独立した、異なる反応工程であり、
前記第１の糖化酵素生産菌及び前記第２の糖化酵素生産菌はそれぞれ少なくともセルラーゼの活性を持つ前記第１の糖化酵素及び前記第２の糖化酵素を生産する菌であり、
前記第１の糖化酵素生産菌及び前記第２の糖化酵素生産菌は同じ菌種であってもよく、異なる菌種であってもよく、
前記セルラーゼはＢＧＬ、エンドグルカナーゼ、及びセロビオハイドロラーゼの活性を有する酵素混合物であることを特徴する製造方法。
【請求項２】
リグノセルロース系バイオマスから糖化液を製造するための方法であって、
請求項１に記載の製造方法を用いて、前記第２の糖化酵素を製造した後、前記第２の糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、糖化する糖化工程を備えることを特徴とする製造方法。
【請求項３】
リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造するための方法であって、
請求項２に記載の製造方法を用いて、糖化液を製造した後、前記糖化液と微生物とを混合し、発酵する発酵工程を備えることを特徴とする製造方法。
【請求項４】
リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造装置であって、
第１の糖化酵素又は第１の糖化酵素生産菌と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含み、前記第１の糖化酵素又は前記第１の糖化酵素生産菌由来の第１の糖化酵素のうちエンドグルカナーゼ及びセロビオハイドロラーゼを含有する培養上清を回収するための回収槽と、
前記回収槽で得られた前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼを含有する培養上清と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含むセロビオース生産槽と、
前記セロビオース生産槽で得られたセロビオースを含む糖化液と第２の糖化酵素生産菌とを含む糖化酵素生産槽と、
前記回収槽で得られた前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼを含有する培養上清を前記セロビオース生産槽に送液するための配管と、を備え、
前記回収槽と前記セロビオース生産槽と前記糖化酵素生産槽とはそれぞれ独立して、異なる反応槽であり、
前記第１の糖化酵素生産菌及び前記第２の糖化酵素生産菌はそれぞれ少なくともセルラーゼの活性を持つ前記第１の糖化酵素及び前記第２の糖化酵素を生産する菌であり、
前記第１の糖化酵素生産菌及び前記第２の糖化酵素生産菌は同じ菌種であってもよく、異なる菌種であってもよく、
前記セルラーゼはＢＧＬ、エンドグルカナーゼ、及びセロビオハイドロラーゼの活性を有する酵素混合物であることを特徴とする製造装置。
【請求項５】
リグノセルロース系バイオマスから糖化液を製造するための装置であって、
請求項４に記載の製造装置と、
前記製造装置で得られた第２の糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含む糖化装置と、
を備えることを特徴とする製造装置。
【請求項６】
リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造するための装置であって、
請求項５に記載の製造装置と、
前記製造装置で得られた糖化液と微生物とを含む発酵槽と、
を備えることを特徴とする製造装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造方法であって、第１の糖化酵素又は第１の糖化酵素生産菌と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、前記第１の糖化酵素又は前記第１の糖化酵素生産菌由来の第１の糖化酵素に含まれるＢＧＬを前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるリグニンに吸着させて沈殿させ、一方、前記第１の糖化酵素又は前記第１の糖化酵素生産菌由来の第１の糖化酵素に含まれるエンドグルカナーゼ及びセロビオハイドロラーゼを前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースに特異的に吸着させ、前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼが前記セルロースを分解することで、前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼを培養上清中に可溶化させ、前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼを含有する培養上清を回収する回収工程と、前記培養上清と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、前記前処理済みリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースを加水分解させてセロビオースを生産させるセロビオース生産工程と、前記セロビオース生産工程で得られた前記セロビオースを含む糖化液と、第２の糖化酵素生産菌とを混合して培養し、前記第２の糖化酵素生産菌に第２の糖化酵素を生産させる糖化酵素生産工程と、を備え、前記回収工程と前記セロビオース生産工程と前記糖化酵素生産工程とはそれぞれ独立した、異なる反応工程であり、前記第１の糖化酵素生産菌及び前記第２の糖化酵素生産菌はそれぞれ少なくともセルラーゼの活性を持つ前記第１の糖化酵素及び前記第２の糖化酵素を生産する菌であり、前記第１の糖化酵素生産菌及び前記第２の糖化酵素生産菌は同じ菌種であってもよく、異なる菌種であってもよく、前記セルラーゼはＢＧＬ、エンドグルカナーゼ、及びセロビオハイドロラーゼの活性を有する酵素混合物であることを特徴する製造方法。
［２］リグノセルロース系バイオマスから糖化液を製造するための方法であって、［１］に記載の製造方法を用いて、前記第２の糖化酵素を製造した後、前記第２の糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを混合し、糖化する糖化工程を備えることを特徴とする製造方法。
［３］リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造するための方法であって、［２］に記載の製造方法を用いて、糖化液を製造した後、前記糖化液と微生物とを混合し、発酵する発酵工程を備えることを特徴とする製造方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
［４］リグノセルロース系バイオマスを糖化するための糖化酵素の製造装置であって、第１の糖化酵素又は第１の糖化酵素生産菌と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含み、前記第１の糖化酵素又は前記第１の糖化酵素生産菌由来の第１の糖化酵素のうちエンドグルカナーゼ及びセロビオハイドロラーゼを含有する培養上清を回収するための回収槽と、前記回収槽で得られた前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼを含有する培養上清と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含むセロビオース生産槽と、前記セロビオース生産槽で得られたセロビオースを含む糖化液と第２の糖化酵素生産菌とを含む糖化酵素生産槽と、前記回収槽で得られた前記エンドグルカナーゼ及び前記セロビオハイドロラーゼを含有する培養上清を前記セロビオース生産槽に送液するための配管と、を備え、前記回収槽と前記セロビオース生産槽と前記糖化酵素生産槽とはそれぞれ独立して、異なる反応槽であり、前記第１の糖化酵素生産菌及び前記第２の糖化酵素生産菌はそれぞれ少なくともセルラーゼの活性を持つ前記第１の糖化酵素及び前記第２の糖化酵素を生産する菌であり、前記第１の糖化酵素生産菌及び前記第２の糖化酵素生産菌は同じ菌種であってもよく、異なる菌種であってもよく、前記セルラーゼはＢＧＬ、エンドグルカナーゼ、及びセロビオハイドロラーゼの活性を有する酵素混合物であることを特徴とする製造装置。
［５］リグノセルロース系バイオマスから糖化液を製造するための装置であって、［４］に記載の製造装置と、前記製造装置で得られた第２の糖化酵素と前処理済みリグノセルロース系バイオマスとを含む糖化装置と、を備えることを特徴とする製造装置。
［６］リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造するための装置であって、［５］に記載の製造装置と、前記製造装置で得られた糖化液と微生物とを含む発酵槽と、を備えることを特徴とする製造装置。