(57)【要約】      （修正有）【課題】治療能を持つ抗体に関係する組成物および方法の提供。【解決手段】ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連性配列Ａ（ＭＩＣＡ）に免疫特異的に結合するペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドが、５以下の保存的アミノ酸置換を有する、特定の抗体のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）３と、５以下の保存的アミノ酸置換を有する、特定の抗体のＶＬのＣＤＲ３と、を含む、組成物。前記ペプチドは、相補性領域に関係する相補性決定領域を含む。【選択図】図５６
2018048139.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連性配列Ａ（ＭＩＣＡ）に免疫特異的に結合するペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドが、５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）３と、５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＬのＣＤＲ３と、を含む、組成物。
【請求項２】
前記ペプチドが、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）３と、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＬのＣＤＲ３と、を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ペプチドが、５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、若しくは９のＶＨのＣＤＲ２、または５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、若しくは９のＶＬのＣＤＲ２、またはこれらの両方を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ペプチドが、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、若しくは９のＶＨの相補性決定領域ＣＤＲ２、または表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＬのＣＤＲ２、またはこれらの両方を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ペプチドが、５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、若しくは９のＶＨのＣＤＲ１、または５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＬのＣＤＲ１、またはこれらの両方を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ペプチドが、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、若しくは９のＶＨの相補性決定領域ＣＤＲ１、または表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、若しくは９のＶＬのＣＤＲ１、またはこれらの両方を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ペプチドが、配列番号２、１４９、１６８、１８６、または２０４と同一性を有するＶＨ鎖、および配列番号１１、１５１、１７０、１８９、または２０６と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、
前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号２、１４９、１６８、１８６、または２０４内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、
並びに前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号１１、１５１、１７０、１８９、または２０６内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ペプチドが、配列番号２、１４９、１６８、１８６、または２０４を含むＶＨ鎖と、配列番号１１、１５１、１７０、１８９、または２０６を含むＶＬ鎖と、を含む抗体または抗体断片である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
抗癌剤をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
医薬組成物として処方された、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
アンジオポエチンに免疫特異的に結合するペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドが、５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、５、または１０のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）３と、５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、または５のＶＬのＣＤＲ３と、を含む、組成物。
【請求項１２】
前記ペプチドが、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、５、または１０のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）３と、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、５、または１０のＶＬのＣＤＲ３と、を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ペプチドが、５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、若しくは１０のＶＨのＣＤＲ２、または５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、若しくは１０のＶＬのＣＤＲ２、またはこれらの両方を含む、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ペプチドが、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、５若しくは１０のＶＨの相補性決定領域ＣＤＲ２、または表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、５若しくは１０のＶＬのＣＤＲ２、またはこれらの両方を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ペプチドが、５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、５、若しくは１０のＶＨのＣＤＲ１、または５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、５、若しくは１０のＶＬのＣＤＲ１、またはこれらの両方を含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ペプチドが、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、５若しくは１０のＶＨの相補性決定領域ＣＤＲ１、または表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、５若しくは１０のＶＬのＣＤＲ１、またはこれらの両方を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ペプチドが、配列番号２０と同一性を有するＶＨ鎖、および配列番号２９と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、
前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ２のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号２０内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ２のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、
並びに前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ２のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号２９内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ２のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ペプチドが、配列番号２０を含むＶＨ鎖と、配列番号２９を含むＶＬ鎖と、を含む抗体または抗体断片である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ペプチドが、配列番号３８と同一性を有するＶＨ鎖、および配列番号４７と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、
前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ３のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号３８内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ３のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、
並びに前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ３のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号４７内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ３のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ペプチドが、配列番号３８を含むＶＨ鎖と、配列番号４７を含むＶＬ鎖と、を含む抗体または抗体断片である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ペプチドが、配列番号５６と同一性を有するＶＨ鎖、および配列番号６５と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、
前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ４のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号５６内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ４のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、
並びに前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ４のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号６５内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ４のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ペプチドが、配列番号５６を含むＶＨ鎖と、配列番号６５を含むＶＬ鎖と、を含む抗体または抗体断片である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ペプチドが、配列番号７４と同一性を有するＶＨ鎖、および配列番号８３と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、
前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ５のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号７４内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ５のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、
並びに前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ５のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号８３内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ５のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ペプチドが、配列番号７４を含むＶＨ鎖と、配列番号８３を含むＶＬ鎖と、を含む抗体または抗体断片である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ペプチドが、アンジオポエチン−２に免疫特異的に結合する、請求項１１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
抗癌剤をさらに含む、請求項１１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
医薬組成物として処方された、請求項１１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
対象において癌を処置する方法であって、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項２９】
前記ペプチドが、配列番号２２２と同一性を有するＶＨ鎖、および配列番号２２４と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、
前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１０のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号７４内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１０のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、
並びに前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１０のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号２２４内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１０のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ペプチドが、配列番号２２２を含むＶＨ鎖と、配列番号２２４を含むＶＬ鎖と、を含む抗体または抗体断片である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３１】
ヒドロキサム酸、ボリノスタット、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＬＡＱ８２４、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ＩＴＦ２３５７  ｉｔａｌｆａｒｍａｃｏ  ＳｐＡ、環状テトラペプチド、デペプシペプチド（ロミデプシン、ＦＫ２２８）、ベンズアミド；エンチノスタット（ＳＮＤＸ−２７５／ＭＳ−２７５）、ＭＧＣＤ０１０３、短鎖脂肪酸、バルプロ酸、フェニル酪酸、ＡＮ−９、ピバネックス（pivanex）、ＣＨＲ−３９９６、およびＣＨＲ−２８４５からなる群から選択されるヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）をさらに含む、請求項１〜８および１１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
ボルテゾミブ、ＮＰＩ−００５２、カーフィルゾミブ（ＰＲ−１７１）、ＣＥＰ  １８７７０、およびＭＬＮ９７０８からなる群から選択されるプロテアソーム阻害剤をさらに含む、請求項１〜８および１１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
対象由来の自己抗原に対する免疫細胞を得る方法であって、
前記自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象を特定すること；
前記自己抗原の多量体を提供すること；
前記自己抗原の多量体を、該自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象由来のサンプルと接触させること；および
前記自己抗原の多量体と結合する免疫細胞を得ること、を含む、方法。
【請求項３４】
自己抗原に対する癌患者から免疫細胞を得る方法であって、
前記自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象を特定すること；
前記自己抗原の多量体を提供すること；
前記自己抗原の多量体を、該自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象由来のサンプルと接触させること；および
前記自己抗原の多量体と結合する免疫細胞を得ること、を含む、方法。
【請求項３５】
前記自己抗原の多量体が、前記自己抗原の四量体である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記自己抗原の多量体が、検出可能な部位を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象が哺乳類である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象がヒトである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記サンプルがヒト対象由来のものである場合のものである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記自己抗原が状態または疾患に関連する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
前記自己抗原が癌に関連する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
前記状態または疾患が、黒色腫、肺癌、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、および結腸癌、リンパ腫、または白血病からなる群から選択される癌である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記自己抗原がＭＨＣクラスＩ型鎖関連性プロテインＡ（ＭＩＣＡ）である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項４４】
前記自己抗原がアンジオポエチンである、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項４５】
前記免疫細胞が記憶Ｂ細胞である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項４６】
前記自己抗原が癌特異的自己抗原である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項４７】
前記対象が癌患者である、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願番号第６１／５４１，９２１号（２０１１年９月３０日出願）の利益を主張するものであり、この出願のすべては、参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
（政府の支援）
本発明は、米国国立衛生研究所助成金番号第ＰＯ１  ＡＩ０４５７５７号の下、政府により支援を受けた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
（配列リスト）
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを通じＡＳＣＩＩ形式で提出した、参照により本明細書にすべてが取り込まれる、配列リストを包含する。前記ＡＳＣＩＩ形式の複製ファイルは、文書名５３２９３ＷＯ１．ｔｘｔ（文書サイズ９０，４１１バイト）として２０１２年９月２７日に作成した。
【０００４】
（発明の分野）
本発明は、ヒトを対象とする治療用組成物（例えば、ペプチド）に関する。
【背景技術】
【０００５】
ヒトは、状態または疾患に曝露されることにより、治療能を持つ抗体源を産生する。当該技術分野においては、このような抗体を得る際に一般的な手法が知られている。しかしながら、治療能を持つ抗体を特異的に得るための方法は、一般に、低頻度、緩慢な増殖速度、および抗体を産生するＢ細胞の抗体分泌濃度の低さにより制限を受ける。例えば、特定の特異性を有する記憶Ｂ細胞が占める割合は、典型的には、末梢血の単核細胞１００万個につき、または血液約１ｍＬにつき、わずか１個のみである（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１：２９８〜３０４（２００９）：Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２３７：１１７〜１３９（２０１０））。治療能を持つ抗体の頻度は、癌患者においてはさらに低くなるものと考えられ、細胞を高感度および高効率に単離することのできる新規アプローチを開発する必要がある。
【０００６】
従来の方法は、概して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養による記憶Ｂ細胞の抗体分泌細胞への分化、および／または免疫したモデル動物（例えば、マウス）の使用に依存するものである（Ｃｒｏｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：４９６９〜４９７３（２００３）：Ｆｅｃｔｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２８：ｅ３５３〜ｅ３６５（２００９）：Ｂｕｉｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２８：１７９〜１８６（２００９）：Ｃｏｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，５：ｅ８８０５（２０１０））。例えば、最大で一週間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養後、培養上清中に含まれる抗体を測定し、酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイにより抗体分泌細胞の頻度を調べることができる。このような方法には制限があることが報告されている（Ｈｅｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８３：３１７７７〜３１８７（２００９）：Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５８：５６〜６５（２０１０））。例えば、記憶Ｂ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養すると、記憶Ｂ細胞の表現型は変化し、異なる機能特性を有する形質細胞と似た表現型を有するようになる（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７：２２０５〜２２１３（２００７）：Ｈｕｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０９：１６１１〜１６１９（２００７）：Ｊｏｕｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１４：５１７３〜５１８１（２００９））。蛍光抗原に基づく方法にまつわる制限も報告されている（Ｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２１１：２９５〜３０２（２００６）：Ｏｄｅｎｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０５：１６１４〜１６２１（２００５）；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：８２２〜８２９（２００３）：Ｓｃｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４５８：６３６〜６４０（２００９）：Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２９：８５６〜８６１（２０１０））。
【０００７】
治療能を持つ抗体を特異的に得るまたは標的とする改良法が必要とされている。
【０００８】
ＭＩＣＡは、ほとんどのヒトＮＫ細胞、γδ  Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現しているＣ型レクチン様ＩＩ型膜貫通受容体ＮＫＧ２Ｄのリガンドである。ＮＫＧ２Ｄは、リガンドの結合により、アダプタータンパク質のＤＡＰ１０を介してシグナル伝達を行い、パーフォリン依存性の細胞溶解を惹起し、同時刺激をもたらす。ヒトにおいては、ＮＫＧ２Ｄリガンドには、ＭＨＣクラスＩ型鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、これと密接に関連するＭＩＣＢ、ＵＬ−１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）１〜４およびＲＡＥ−１Ｇが包含される。通常、正常組織ではＮＫＧ２Ｄリガンドは観察されないものの、ＤＮＡ損傷などの各種細胞ストレスにより発現が上方制御され、黒色腫などの様々な固形悪性腫瘍および血液系腫瘍において高頻度に検出されるようになる。ＮＫＧ２Ｄ欠損型マウスおよび抗ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体により処理した野生型マウスでは、腫瘍易罹患性が著しく上昇することから、リガンドの発現が陽性の形質転換細胞によるＮＫＧ２Ｄの活性化は、腫瘍抑制に外因的に寄与する。しかしながら、患者においては、腫瘍細胞から脱離したＮＫＧ２Ｄリガンドが、表面ＮＫＧ２Ｄの内部移行と、細胞傷害性リンパ球の機能を損なわせるトリガーとなり、免疫逃避が成立する恐れがある。可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドは、Ｆａｓリガンド、ＩＬ−１０、およびＴＧＦ−βを介し、抗腫瘍細胞傷害性に拮抗し得る、ＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−制御性Ｔ細胞の増殖も刺激し得る。ＭＩＣＡは、腫瘍細胞から脱離した、すなわち、細胞表面から周囲の媒質に放出されたＮＫＧ２Ｄリガンドであり、癌患者由来の血清は、典型的には可溶型（ｓＭＩＣＡ）を高濃度で含有している。ＭＩＣＡの脱離は、部分的にタンパク質ジスルフィド異性化酵素ＥＲｐ５との相互作用を通じてなされ、すなわち、ＥＲｐ５がＭＩＣＡの重要なシステインとジスルフィド結合を形成し、結果としてα３ドメインをアンフォールディングさせ、ＡＤＡＭ−１０／１７およびＭＭＰ１４によるタンパク質分解を受けやすくさせることを通じてなされる。
【０００９】
血管新生は、既存の血管から新しい細血管が形成される過程であり、腫瘍の増殖および転移において重要な役割を担うことが明らかになっている。腫瘍は、必要とされる多量の酸素および栄養素を得るために、すなわち、それらを単に拡散させた場合と比較して上回る量の酸素および栄養素を得るために、血管新生を促す。結果として、腫瘍は既存の血管を取り込み、再構築、および拡大させ、必要とされる代謝を得る。腫瘍の増殖は新しい血管の形成に依存して生じることから、血管新生は抗癌治療に魅力的な標的とされている。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーメンバーおよびアンジオポエチンといった多くのサイトカインは、血管新生の制御において機能するものと考えられてきた。アンジオポエチンは、血管内皮において選択的に発現されるチロシンキナーゼファミリーＴｉｅのリガンドとして発見された。アンジオポエチン−１（「Ａｎｇ−１」）〜アンジオポエチン−４（「Ａｎｇ−４」）までの４種のアンジオポエチンが知られている。これまでの研究により、アンジオポエチン群（例えば、Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２）が腫瘍血管新生に関与し得ることが示唆されている。この情報を元に、アンジオポエチンは、癌の免疫療法に有望な標的として同定された。
【００１０】
現在、癌の免疫療法の標的（例えば、ＭＩＣＡおよびアンジオポエチン）を特異的に認識および結合する新規薬剤を同定することが求められている。このような薬剤は、腫瘍の進行と関連付けられる病態に関する診断用スクリーニングおよび治療介入に有用である。
【発明の概要】
【００１１】
本開示は、治療能を持つ抗体に関係する組成物および方法を提供する。
【００１２】
一部の実施形態では、本開示は、ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、またはそれらのエピトープに免疫特異的に結合するペプチドを含む組成物を提供する。一部の態様では、組成物のペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有する相補性決定領域（ＣＤＲ）３と、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ３と、を含む。一部の態様では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）３と、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＬのＣＤＲ３と、を含む。一部の態様では、ペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ２、あるいは表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ２、あるいはこれらの両方をさらに含む。一部の態様では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＨの相補性決定領域ＣＤＲ２、あるいは表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＬのＣＤＲ２、あるいはこれらの両方を含む。一部の態様では、ペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、あるいは表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、あるいはこれらの両方をさらに含む。一部の態様では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＨの相補性決定領域ＣＤＲ１、あるいは表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、または９のＶＬのＣＤＲ１、あるいはこれらの両方を含む。
【００１３】
一部の態様では、ペプチドは、配列番号２と同一性を有するＶＨ鎖、および配列番号１１と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号２内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号１１内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号２を含むＶＨ鎖および配列番号１１を含むＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。一部の態様では、ペプチドに加え、組成物には、さらに１つ以上の（例えば、１  ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または２０未満）抗癌剤を含有させる。一部の態様では、組成物は医薬組成物（例えば、対象に投与するためのもの）として処方される。
【００１４】
一部の態様では、ペプチドは、配列番号１４９と同一性を有するＶＨ鎖、および配列番号１５１と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ６のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号１４９内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ６のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ６のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号１５１内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ６のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号１４９を含むＶＨ鎖および配列番号１５１を含むＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。一部の態様では、ペプチドに加え、組成物には、さらに１つ以上の（例えば、１  ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または２０未満）抗癌剤を含有させる。一部の態様では、組成物は医薬組成物（例えば、対象に投与するためのもの）として処方される。
【００１５】
一部の態様では、ペプチドは、配列番号１６８と同一性を有するＶＨ鎖、および配列番号１７０と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ７のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号１６８内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ７のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ７のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号１７０内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ７のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号１６８を含むＶＨ鎖および配列番号１７０を含むＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。一部の態様では、ペプチドに加え、組成物には、さらに１つ以上の（例えば、１  ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または２０未満）抗癌療法を含有させる。一部の態様では、組成物は医薬組成物（例えば、対象に投与するためのもの）として処方される。
【００１６】
一部の態様では、ペプチドは、配列番号１８６と同一性を有するＶＨ鎖、および配列番号１８８と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ８のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号１８６内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ８のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ８のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号１８８内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ８のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号１８６を含むＶＨ鎖および配列番号１８８を含むＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。一部の態様では、ペプチドに加え、組成物には、さらに１つ以上の（例えば、１  ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または２０未満）抗癌療法を含有させる。一部の態様では、組成物は医薬組成物（例えば、対象に投与するためのもの）として処方される。
【００１７】
一部の態様では、ペプチドは、配列番号２０４と同一性を有するＶＨ鎖、および配列番号２０６と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ９のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号２０４内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ９のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ９のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号２０６内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ９のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号２０４を含むＶＨ鎖および配列番号２０６を含むＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。一部の態様では、ペプチドに加え、組成物には、さらに１つ以上の（例えば、１  ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または２０未満）抗癌剤を含有させる。一部の態様では、組成物は医薬組成物（例えば、対象に投与するためのもの）として処方される。
【００１８】
一部の実施形態では、本開示は、アンジオポエチンまたはそれらのエピトープに結合する１つ以上のペプチドを含有する組成物を提供する。一部の態様では、組成物のペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、５、または１０のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有する相補性決定領域（ＣＤＲ）３、並びに表１に示す、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域内に保存的アミノ酸置換を５つ以下で有する抗体ＩＤ２、３、４、５、または１０のＶＬのＣＤＲ３を含む。一部の態様では、ペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、若しくは５、若しくは１０のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）３と、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、若しくは５、若しくは１０のＶＬのＣＤＲ３と、を含有させることができる。一部の態様では、ペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、若しくは５、若しくは１０のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ２、または表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、若しくは５、若しくは１０のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ２、またはこれらの両方をさらに含有させることができる。一部の態様では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、若しくは５、若しくは１０のＶＨの相補性決定領域ＣＤＲ２、または表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、若しくは５、若しくは１０のＶＬのＣＤＲ２、またはこれらの両方を含む。一部の態様では、ペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、若しくは５、若しくは１０のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、または表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、若しくは５のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、またはこれらの両方をさらに含有させることができる。一部の態様では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、若しくは５、若しくは１０のＶＨの相補性決定領域ＣＤＲ１、または表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、若しくは５、若しくは１０のＶＬのＣＤＲ１、またはこれらの両方を含む。
【００１９】
一部の態様では、ペプチドは、配列番号２０と同一性を有するＶＨ鎖、および配列番号２９と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ２のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号２０内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ２のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ２のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号２９内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ２のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号２０を含むＶＨ鎖および配列番号２９を含むＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。
【００２０】
一部の態様では、ペプチドは、配列番号３８と同一性を有するＶＨ鎖、および配列番号４７と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ３のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号３８内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ３のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ３のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号４７内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ３のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号３８を含むＶＨ鎖および配列番号４７を含むＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。
【００２１】
一部の態様では、ペプチドは、配列番号５６と同一性を有するＶＨ鎖、および配列番号６５と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ４のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号５６内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ４のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ４のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号６５内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ４のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号５６を含むＶＨ鎖および配列番号６５を含むＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。
【００２２】
一部の態様では、ペプチドは、配列番号７４と同一性を有するＶＨ鎖、および配列番号８３と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ５のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号７４内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ５のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ５のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号８３内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ５のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号７４を含むＶＨ鎖および配列番号８３を含むＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。一部の態様では、ペプチドは、少なくともアンジオポエチン−２に免疫特異的に結合する。一部の態様では、組成物にはさらに、１つ以上の抗癌剤を含有させる。一部の態様では、組成物は、医薬組成物として処方される。
【００２３】
一部の態様では、ペプチドは、配列番号２２２と同一性を有するＶＨ鎖、および配列番号２２４と同一性を有するＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片であり、前記ＶＨ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１０のＶＨの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号２２２内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１０のＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、並びに前記ＶＬ鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１０のＶＬの、保存的アミノ酸置換を５つ以下で有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、かつ配列番号２２４内のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、表１に示す抗体ＩＤ１０のＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ペプチドは、配列番号２２２を含むＶＨ鎖および配列番号２２４を含むＶＬ鎖を含む、抗体または抗体断片を含む。一部の態様では、ペプチドは、少なくともアンジオポエチン−２に免疫特異的に結合する。一部の態様では、組成物にはさらに、１つ以上の抗癌剤を含有させる。一部の態様では、組成物は、医薬組成物として処方される。
【００２４】
一部の実施形態では、本開示は、対象において癌を処置する方法を包含する。一部の態様では、方法は、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを包含する。
【００２５】
本開示は、免疫療法後に癌患者からヒト抗体を単離する方法も提供する。
【００２６】
一部の実施形態では、本開示は、対象由来の自己抗原に対する免疫細胞を得る方法を包含し、方法は、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象を特定すること、自己抗原の多量体を提供すること、自己抗原の多量体を、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象由来のサンプルと接触させること、および自己抗原の多量体と結合する免疫細胞を得ること、を包含する。
【００２７】
一部の実施形態では、本開示は、自己抗原に対する癌患者由来の免疫細胞を得る方法を包含し、方法は、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象を特定すること；自己抗原の多量体を提供すること；自己抗原の多量体を、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象由来のサンプルと接触させること；および自己抗原の多量体と結合する免疫細胞を得ること、を包含する。
【００２８】
本明細書において定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。本発明に使用する方法および材料は本明細書に記載されるものの、当該技術分野において既知である、その他の好適な方法および材料も使用できる。材料、方法、および例は、例示目的のためのみのものであり、制限を意図するものではない。すべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース登録物、並びに本明細書において言及されるその他の参照は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。相反する場合には、定義などの、本発明における記載を参照する。
【００２９】
本発明のその他の特徴および利点は、以降の発明を実施するための形態および図面、並びに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】抗体ＩＤ１（抗ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）抗体）の重鎖可変領域（ＶＨ）の核酸配列（配列番号１）。
【図２】抗体ＩＤ１（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号２）。
【図３】抗体ＩＤ１（抗ＭＩＣＡ抗体）の軽鎖可変領域（ＶＬ）の核酸配列（配列番号１０）。
【図４】抗体ＩＤ１（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号１１）。
【図５】抗体ＩＤ２（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＨ鎖の核酸配列（配列番号１９）。
【図６】抗体ＩＤ２（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号２０）。
【図７】抗体ＩＤ２（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＬ鎖の核酸配列（配列番号２８）。
【図８】抗体ＩＤ２（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号２９）。
【図９】抗体ＩＤ３（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＨ鎖の核酸配列（配列番号３７）。
【図１０】抗体ＩＤ３（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号３８）。
【図１１】抗体ＩＤ３（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＬ鎖の核酸配列（配列番号４６）。
【図１２】抗体ＩＤ３（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号４７）。
【図１３】抗体ＩＤ４（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＨ鎖の核酸配列（配列番号５５）。
【図１４】抗体ＩＤ４（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号５６）。
【図１５】抗体ＩＤ４（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＬ鎖の核酸配列（配列番号６４）。
【図１６】抗体ＩＤ４（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号６５）。
【図１７】抗体ＩＤ５（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＨ鎖の核酸配列（配列番号７３）。
【図１８】抗体ＩＤ５（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号７４）。
【図１９】抗体ＩＤ５（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＬ鎖の核酸配列（配列番号８２）。
【図２０】抗体ＩＤ５（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号８３）。
【図２１Ａ】Ｂ細胞から抗体を製造する際の方法例を示す図。部位特異的にビオチン化させ、蛍光標識したストレプトアビジンと四量体を形成させるため、ＢｉｒＡ（ビオチンリガーゼ）タグを付して、抗原を発現させる。
【図２１Ｂ】Ｂ細胞から抗体を製造する際の方法例を示す図。四量体および一連のモノクローナル抗体によりＢ細胞を染色する。クラススイッチした四量体＋の記憶Ｂ細胞を単一細胞でソーティングして、ＰＣＲ用ストリップチューブに回収する。
【図２１Ｃ】Ｂ細胞から抗体を製造する際の方法例を示す図。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡの増幅を行う。
【図２１Ｄ】Ｂ細胞から抗体を製造する際の方法例を示す図。ＰＣＲ産物の配列決定は、３００〜４００ｂｐのＰＣＲ産物を用い実施する。
【図２１Ｅ】Ｂ細胞から抗体を製造する際の方法例を示す図。別個のベクターにクローニングされた、完全長のＩｇＧ１重鎖配列およびκ／λ軽鎖配列を構築するために、オーバーラップＰＣＲを行う。完全なヒト型組換え抗体を発現させるにあたり、ベクターはＣＨＯ−Ｓ細胞に一過性遺伝子導入する。
【図２１Ｆ】Ｂ細胞から抗体を製造する際の方法例を示す図。抗原結合について抗体を試験し、有望な治療特性について評価する。
【図２２Ａ】記憶Ｂ細胞の同定に関し、抗原の単量体および四量体を比較するグラフ。モノビオチン化ＴＴＣＦまたはＣＤ８０抗原を、Ａｌｅｘａ−４８８フルオロフォアにより直接標識した；四量体は未標識のストレプトアビジンを用い生成した。各ドナー由来の濃縮Ｂ細胞を３画分に分け、総抗原濃度を０．１２５μｇ／ｍＬに揃え、対照ＣＤ８０四量体、ＴＴＣＦモノマーまたはＴＴＣＦ四量体により染色した。ＦＡＣＳプロットはＣＤ１９＋  ＣＤ２７＋  ＩｇＭ−クラススイッチした記憶Ｂ細胞を示し、ゲート付近の数は、親ゲート（parental gate）の割合を表す。
【図２２Ｂ】記憶Ｂ細胞の同定に関し、抗原の単量体および四量体を比較するグラフ。３つの異なるドナーで検出された四量体＋記憶Ｂ細胞の頻度。個数は、四量体＋細胞／１×１０６個ＣＤ１９＋記憶Ｂ細胞として算出した。
【図２３Ａ】形質芽球および記憶Ｂ細胞から産生された抗体が、ＴＴＣＦに対し高親和性に結合したことを示す線グラフ。組換え抗体の親和性を求めるため、飽和結合試験を実施した。ＴＴＣＦ抗原は、キレート剤とインキュベートすることで６１５ｎｍにて強力な蛍光シグナルを発するユーロピウムで標識した。抗体を９６ウェルプレートに固定化し、ＴＴＣＦユーロピウム（１００ｎＭ〜４ｐＭ）とともに３７℃で２時間インキュベートした。６１５ｎｍにて蛍光カウントを記録し、非線形回帰分析によりＫＤを算出した。ＣＨＯ−Ｓ細胞で産生された対照抗体（クローン８．１８．Ｃ５）もすべての実験に包含させた。組換え抗体ＴＴＣＦ  １および２は、ＴＴＣＦ四量体＋形質芽球（ドナー１）により産生された。
【図２３Ｂ】形質芽球および記憶Ｂ細胞から産生された抗体が、ＴＴＣＦに対し高親和性に結合したことを示す線グラフ。組換え抗体の親和性を求めるため、飽和結合試験を実施した。ＴＴＣＦ抗原は、キレート剤とインキュベートすることで６１５ｎｍにて強力な蛍光シグナルを発するユーロピウムで標識した。抗体を９６ウェルプレートに固定化し、ＴＴＣＦユーロピウム（１００ｎＭ〜４ｐＭ）とともに３７℃で２時間インキュベートした。６１５ｎｍにて蛍光カウントを記録し、非線形回帰分析によりＫＤを算出した。ＣＨＯ−Ｓ細胞で産生された対照抗体（クローン８．１８．Ｃ５）もすべての実験に包含させた。ＴＴＣＦ抗体３、４、および５は、３つの異なるドナーのＴＴＣＦ四量体＋記憶Ｂ細胞に由来する。
【図２４】ＭＩＣＡコーティングしたルミネックスビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す棒グラフ。
【図２５Ａ−Ｅ】ＭＩＣＡコーティングビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す線グラフ。
【図２５Ｆ−Ｊ】ＭＩＣＡコーティングビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す線グラフ。
【図２５Ｋ−Ｏ】ＭＩＣＡコーティングビーズに対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合を示す線グラフ。
【図２６Ａ−Ｃ】ヒトアンジオポエチン２に特異的な４つの抗体、並びに３種類のヒトアンジオポエチン（アンジオポエチン−１、２、および４）およびアンジオポエチン様タンパク質３（ang-like-3）に対する対照抗体の結合を示す棒グラフ。ＥＬＩＳＡプレートに組換え型アンジオポエチンを固定化し、ヒト組換え抗体の結合をユーロピウム標識ストレプトアビジンにより検出した。
【図２６Ｄ】ヒトアンジオポエチン２に特異的な４つの抗体、並びに３種類のヒトアンジオポエチン（アンジオポエチン−１、２、および４）およびアンジオポエチン様タンパク質３（ang-like-3）に対する対照抗体の結合を示す棒グラフ。ＥＬＩＳＡプレートに組換え型アンジオポエチンを固定化し、ヒト組換え抗体の結合をユーロピウム標識ストレプトアビジンにより検出した。
【図２７Ａ】グラフ、並びに肺癌患者由来のアンジオポエチン特異的な抗体を単離したゲルを示す。肺癌患者（Ｌ１９）の血清（１：１０００希釈）のアンジオポエチン−２に対する反応性を、ＥＬＩＳＡにより評価。
【図２７Ｂ】グラフ、並びに肺癌患者由来のアンジオポエチン特異的な抗体を単離したゲルを示す。ＦＡＣＳプロットは、ＣＤ１９を有する、ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋  ＩｇＭ−Ｂ細胞をＸ軸に、蛍光タグを付したアンジオポエチン−２をＹ軸にゲーティングしたＰＢＭＣサンプル（タイムポイント−１０／９８）を示す。
【図２７Ｃ】グラフ、並びに肺癌患者由来のアンジオポエチン特異的な抗体を単離したゲルを示す。患者Ｌ１９から単離したアンジオポエチン−２反応性記憶Ｂ細胞１０種の重鎖、軽鎖、およびヒンジ領域のＰＣＲ産物。５００ｂｐのマーカーを左端に示す。
【図２８】抗体ＩＤ６（抗ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）抗体）の重鎖可変領域（ＶＨ）の核酸配列（配列番号１４８）。
【図２９】抗体６（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号１４９）。
【図３０】抗体ＩＤ６（抗ＭＩＣＡ抗体）の軽鎖可変領域（ＶＬ）の核酸配列（配列番号１５０）。
【図３１】抗体ＩＤ６（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号１５１）。
【図３２】抗体ＩＤ７（抗ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）抗体）の重鎖可変領域（ＶＨ）の核酸配列（配列番号１６７）。
【図３３】抗体ＩＤ７（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号１６８）。
【図３４】抗体ＩＤ７（抗ＭＩＣＡ抗体）の軽鎖可変領域（ＶＬ）の核酸配列（配列番号１６９）。
【図３５】抗体ＩＤ７（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号１７０）。
【図３６】抗体ＩＤ８（抗ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）抗体）の重鎖可変領域（ＶＨ）の核酸配列（配列番号１８５）。
【図３７】抗体ＩＤ８（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号１８６）。
【図３８】抗体ＩＤ８（抗ＭＩＣＡ抗体）の軽鎖可変領域（ＶＬ）の核酸配列（配列番号１８７）。
【図３９】抗体ＩＤ８（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号１８８）。
【図４０】抗体ＩＤ９（抗ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）抗体）の重鎖可変領域（ＶＨ）の核酸配列（配列番号２０３）。
【図４１】抗体ＩＤ９（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号２０４）。
【図４２】抗体ＩＤ９（抗ＭＩＣＡ抗体）の軽鎖可変領域（ＶＬ）の核酸配列（配列番号２０５）。
【図４３】抗体ＩＤ９（抗ＭＩＣＡ抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号２０６）。
【図４４】抗体ＩＤ１０（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＨ鎖の核酸配列（配列番号２２１）。
【図４５】抗体ＩＤ１０（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＨ鎖のアミノ酸配列（配列番号２２２）。
【図４６】抗体ＩＤ１０（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＬ鎖の核酸配列（配列番号２２３）。
【図４７】抗体ＩＤ１０（抗アンジオポエチン−２抗体）のＶＬ鎖のアミノ酸配列（配列番号２２４）。
【図４８Ａ−Ｇ】組換え型抗ＭＩＣＡ抗体によるＭＩＣＡ対立遺伝子産物に特異的な結合の評価を示す線グラフ。
【図４９】抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２  Ａｂ２による、自己腫瘍細胞の標識を示す線グラフ。
【図５０】一連のＦＡＣＳプロットは、血清ＭＩＣＡによるＮＫＧ２Ｄの調節を示す。ヒトＮＫ細胞を患者ＣＭ２４００２由来の対照血清により１：１０希釈し、４８時間インキュベートした。記載の抗体を、インキュベートの開始時に１０μｇ／ｍＬ濃度で加えた。フローサイトメトリーにより、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄの発現を評価した。
【図５１】一連のＦＡＣＳプロットは、組換えＭＩＣＡによるＮＫＧ２Ｄの調節を示す。ヒトＮＫ細胞を、２ｎｇ／ｍＬ濃度のＭＩＣＡとともに４８時間インキュベートした。記載の抗体を、インキュベートの開始時に１０μｇ／ｍＬ濃度で加えた。４８時間後、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ発現をフローサイトメトリーにより評価した。
【図５２】抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２  Ａｂ２による細胞介在性細胞傷害の増大を示す線グラフ。１０μｇ／ｍＬの記載の抗体の存在下で、組換え型ＭＩＣＡ（２ｎｇ／ｍＬ）とともに、ヒトＮＫ細胞を４８時間インキュベートした。記載の比率で４時間インキュベートした後で、ＮＫ細胞（エフェクター細胞）がＫ５６２標的細胞を殺傷する能力を、ＬＤＨの放出を測定することにより評価した。
【図５３】抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９による細胞介在性細胞傷害を示す棒グラフ。１０μｇ／ｍＬの記載の抗体の存在下で、組換え型ＭＩＣＡ（２ｎｇ／ｍＬ）とともに、ヒトＮＫ細胞を４８時間インキュベートした。４時間インキュベートした後で、ＮＫ細胞（エフェクター細胞）がＫ５６２標的細胞を殺傷する能力を、ＬＤＨの放出を測定することにより評価した。エフェクター細胞および標的細胞を４時間インキュベートする際、ＮＫＧ２Ｄブロッキング抗体またはＦｃブロッキング抗体を加え、細胞介在性細胞傷害に対するＦｃ受容体およびＮＫＧ２Ｄの関与を評価した。
【図５４】組換え型抗ＭＩＣＡ抗体によるＭＩＣＡ  α３ドメインの結合を示す一連の線グラフ。組換え型ＭＩＣＡ  α３ドメインをビオチン化し、ストレプトアビジンコーティングしたビーズ表面で捕捉した。記載の抗体１０μｇ／ｍＬを、それぞれ組換えタンパク質によりコーティングしたビーズとともに１時間インキュベートした。続いてビーズを洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体とともにインキュベートした。フローサイトメトリーによりＦＩＴＣ蛍光を定量化した。
【図５５】抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９による腫瘍細胞の標識を示す線グラフ。フローサイトメトリーにより蛍光を測定した。
【図５６】抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９の、ＭＩＣＡ対立遺伝子産物特異性をＬｕｍｉｎｅｘアッセイにより定量し、示す棒グラフ。
【図５７】抗アンジオポエチン２特異抗体の抗Ａｎｇ６  Ａｂ２抗体、並びに３種のヒトアンジオポエチン、すなわちアンジオポエチン−１、２および４（Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、およびＡｎｇ−４）、およびａｎｇ−ｌｉｋｅ−３に対する対照抗体の結合性を示す棒グラフ。ＥＬＩＳＡプレートに組換え型アンジオポエチンを固定化し、ヒト組換え抗体の結合をユーロピウム標識ストレプトアビジンにより検出した。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本開示は、対象とする抗原の四量体を用いＢ細胞を標識することで、疾患に罹患したヒト対象から、疾患において重要な治療標的を直接対象にする抗体を得ることができるという観察に一部基づく。上記背景技術の項で記載した通り、従来法には、少なくとも、ヒト対象において適切なＢ細胞を同定するのは非効率的であり、および／すなわち捕捉した任意のＢ細胞の表現型が変化し、ひいては有用性が低減されてしまうという制限がある。対照的に、本明細書に記載の方法は、疾患に関連する抗原を特異的に対象とする希少な記憶Ｂ細胞を捕捉することが可能である。以下に記載する通り、この方法は疾患に関連する抗原の四量体化を要するものであり、以下の実施例に記載する通りの工程により、適切な記憶Ｂ細胞の同定が強化される。詳細には、本明細書に記載の方法により、抗原に対する対象の初回曝露後、より長期間にわたって、適切な記憶Ｂ細胞をより効率的に捕捉できるようになる。本明細書に記載の方法は、本明細書で開示される方法を使用し捕捉した記憶Ｂ細胞から得られた遺伝子材料を使用して生成した抗体（およびこのような抗体の配列から生成されたペプチド）も包含する。
【００３２】
本明細書には、ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連性配列Ａ（ＭＩＣＡ）に対するヒト抗体、並びにアンジオポエチン−２を標的としたヒト抗体が記載される。いずれの種類のヒト抗体も、四量体抗原の使用を伴う方法により、細胞性癌ワクチン（ＧＭ−ＣＳＦを形質導入した自己腫瘍細胞）を接種した患者から同定された。
【００３３】
一部の例では、本開示は、選別されたヒト対象、および対象から得られる治療用組成物から、治療能を持つ抗体を特異的に得るまたは標的とする方法を提供する。これらの方法には、ヒト対象において免疫細胞を得るまたは標的とすること（ここで、免疫細胞には、限定するものではないが例えば、Ｂ細胞および／または記憶Ｂ細胞が含まれる）、得られたまたは標的とした免疫細胞から遺伝子材料（例えば、ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）を単離または精製すること、単離または精製された遺伝子材料を使用して治療用組成物、例えば、本明細書に開示される治療用組成物を製造すること、を包含させることができる。この方法についての詳細は、以下「方法」の項に提供する。
【００３４】
一部の例では、本開示は、状態または疾患を有するまたは有していた、および状態または疾患に対する正の免疫応答を示した対象において存在する抗体に関係する、治療用組成物（例えば、抗体、抗体断片、抗体誘導体、および／または抗体複合体などの治療用ペプチドを含む）を提供する。
【００３５】
治療用組成物
一部の例では、本明細書に記載の治療用組成物は、疾患または状態に関連する結合パートナー（例えば、免疫原（複数可）、抗原（複数可）、および／またはエピトープ（複数可））と相互作用（例えば、結合、特異的結合、および／または免疫特異的結合）することができ、治療用組成物および結合パートナー間の相互作用により、状態または疾患に対し正の免疫応答が生じる（例えば、対象において疾患または症状の程度が軽減する）。
【００３６】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ１、２、３、４、または５、６、７、８、９、または１０の重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、および／または６）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む（例えば、含む、これから本質的になる、またはこれからなる）ペプチドを含有し得る。
【００３７】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、および／または６）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み（例えば、含み、これから本質的になり、またはこれからなり）、かつこれらのエピトープを含むＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連性配列Ａ（ＭＩＣＡ（例えば、ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．１３０８３８））（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ））および／またはアンジオポエチン−２（例えば、ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．５８３８７０）と相互作用（例えば、結合、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する、ペプチドを含有し得る。
【００３８】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、および／または９のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する。一部の例では、ペプチドは少なくとも２つのＣＤＲを含んでよく、少なくとも２つのＣＤＲは、表１に示される異なる抗体のＣＤＲである。換言すれば、抗体ＩＤ１、６、７、８、および９に関し表１に示す、ＣＤＲ（並びにＦＲおよび／またはＡＡ配列）は互換可能であり、かつペプチドがＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に対し結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）するのであれば、組み合わせてペプチドを生成することができる。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、および／または９のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８、および／または９のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１、６、７、８、および／または９のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ＩＤ１、６、７、８、および／または９のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ１、６、７、８、および／または９のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１、６、７、８、および／または９のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４のうち少なくとも１つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号２、１４９、１６８、１８６、若しくは２０４のうちの１つ、および／または配列番号１１、１５１、１７０、１８８、若しくは２０６のうちの１つを含む。各例において、ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）し得る。一部の例では、ペプチドおよびＭＩＣＡ間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭの間であってよく、例えば、約１０ｎＭであってよい。
【００３９】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ６のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ６のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ６のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ６のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ＩＤ６のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ６のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ６のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４のうち少なくとも１つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号１４９および／または配列番号１５１を含む。各例において、ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）し得る。一部の例では、ペプチドおよびＭＩＣＡ間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭの間であってよく、例えば、約１０ｎＭであってよい。
【００４０】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ７のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ７のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ７のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ７のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ＩＤ７のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ７のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ７のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４のうち少なくとも１つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号１６８および／または配列番号１７０を含む。各例において、ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）し得る。一部の例では、ペプチドおよびＭＩＣＡ間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭの間であってよく、例えば、約１０ｎＭであってよい。
【００４１】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ８のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ８のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ８のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ８のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ＩＤ８のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ８のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ８のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４のうち少なくとも１つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号１８６および／または配列番号１８８を含む。各例において、ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）し得る。一部の例では、ペプチドおよびＭＩＣＡ間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭの間であってよく、例えば、約１０ｎＭであってよい。
【００４２】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ９のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ９のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ９のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ９のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ＩＤ９のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ９のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ９のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４のうち少なくとも１つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号２０４および／または配列番号２０６を含む。各例において、ペプチドは、ＭＩＣＡ（例えば、ヒトＭＩＣＡ（例えば、可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）））に結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）し得る。一部の例では、ペプチドおよびＭＩＣＡ間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭの間であってよく、例えば、約１０ｎＭであってよい。
【００４３】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、５、および／または１０のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはアンジオポエチン−２（例えば、ヒトアンジオポエチン−２）に結合（例えば、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する。一部の例では、ペプチドは少なくとも２つのＣＤＲを含んでよく、少なくとも２つのＣＤＲは、表１に示される異なる抗体のＣＤＲである。換言すれば、抗体ＩＤ２、３、４、５、および１０に関し表１に示す、ＣＤＲ（並びにＦＲおよび／またはＡＡ配列）は互換可能であり、かつペプチドがアンジオポエチン−２（例えば、ヒトアンジオポエチン−２）に対し結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）するのであれば、組み合わせてペプチドを生成することができる。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、５、および／または１０のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、５、および／または１０のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ２、３、４、５、および／または１０のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ＩＤ２、３、４、５、および／または１０のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ２、３、４、５、および／または１０のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ２、３、４、５、および／または１０のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４のうち少なくとも１つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号２０、３８、５６、７４、若しくは２２２のうちの１つ、および／または配列番号２９、４７、６５、８３、若しくは２２４のうちの１つを含む。一部の例では、ペプチドは、配列番号２０、３８、５６、７４、または２２２のうちの１つ、および／または配列番号２９、４７、６５、８３、または２２４のうちの１つを含む。各例において、ペプチドは、アンジオポエチン−２（例えば、ヒトアンジオポエチン−２（例えば、ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．５８３８７０））に結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）し得る。
【００４４】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ２のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはアンジオポエチン−２（例えば、ヒトアンジオポエチン−２）に結合（例えば、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ２のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ２のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ２のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ＩＤ２のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ２のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ２のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４のうち少なくとも１つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号２０および／または配列番号２９を含む。各例において、ペプチドは、アンジオポエチン−２（例えば、ヒトアンジオポエチン−２）に結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）し得る。一部の例では、ペプチドおよびアンジオポエチン−２間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭの間であってよく、例えば、約１０ｎＭであってよい。
【００４５】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ３のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはアンジオポエチン−２（例えば、ヒトアンジオポエチン−２）に結合（例えば、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ３のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ３のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ３のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ＩＤ３のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ３のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ３のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４のうち少なくとも１つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号３８および／または配列番号４７を含む。各例において、ペプチドは、アンジオポエチン−２（例えば、ヒトアンジオポエチン−２）に結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）し得る。一部の例では、ペプチドおよびアンジオポエチン−２間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭの間であってよく、例えば、約１０ｎＭであってよい。
【００４６】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ４のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはアンジオポエチン−２（例えば、ヒトアンジオポエチン−２）に結合（例えば、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ４のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ４のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ４のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ＩＤ４のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ４のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ４のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４のうち少なくとも１つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号５６および／または配列番号６５を含む。各例において、ペプチドは、アンジオポエチン−２（例えば、ヒトアンジオポエチン−２）に結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）し得る。場合によっては、ペプチドおよびアンジオポエチン−２間の結合親和性は、Ｘ−Ｙ間のものであり、例えば、Ｘ−Ｙ、Ｘ−Ｙであり得る。一部の例では、ペプチドおよびアンジオポエチン−２間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭの間であってよく、例えば、約１０ｎＭであってよい。
【００４７】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ５のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはアンジオポエチン−２（例えば、ヒトアンジオポエチン−２）に結合（例えば、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ５のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ５のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ５のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ＩＤ５のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ５のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ５のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４のうち少なくとも１つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号７４および／または配列番号８３を含む。各例において、ペプチドは、アンジオポエチン−２（例えば、ヒトアンジオポエチン−２）に結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）し得る。一部の例では、ペプチドおよびアンジオポエチン−２間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭの間であってよく、例えば、約１０ｎＭであってよい。
【００４８】
一部の例では、治療用組成物は、表１に示す抗体ＩＤ１０のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つのＣＤＲを含むペプチドを含有し得るものであり、ペプチドはアンジオポエチン−２（例えば、ヒトアンジオポエチン−２）に結合（例えば、特異的結合、および／または免疫特異的結合）する。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す抗体ＩＤ１０のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ１０のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１０のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２と、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、抗体ＩＤ１０のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。一部の例では、このようなペプチドは、表１に示す、抗体ＩＤ１０のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と、抗体ＩＤ１０のＶＨおよび／またはＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４のうち少なくとも１つと、を含む。一部の例では、このようなペプチドは、配列番号２２２および／または配列番号２２４を含む。各例において、ペプチドは、アンジオポエチン−２（例えば、ヒトアンジオポエチン−２）に結合（例えば、特異的結合および／または免疫特異的結合）し得る。一部の例では、ペプチドおよびアンジオポエチン−２間の結合親和性は、約０．１ｎＭ〜１μＭの間であってよく、例えば、約１０ｎＭであってよい。
【００４９】
一部の例では、アンジオポエチン−２に結合するペプチドは、アンジオポエチン−１（例えば、Ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｈｓ．３６９６７５）および／またはアンジオポエチン−４（例えば、Ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｈｓ．２７８９７３）にも結合し得る。例えば、一部の例では、アンジオポエチン−２に結合するペプチドは、他の抗原（アンジオポエチン−１以外のもの）およびアンジオポエチン−１にも、特異的におよび／または免疫特異的に結合し得る。例えば、一部の例では、アンジオポエチン−２に結合するペプチドは、他の抗原（アンジオポエチン−４以外のもの）およびアンジオポエチン−４にも、特異的におよび／または免疫特異的に結合し得る。
【００５０】
一部の例では、治療用組成物は、配列番号２および／または配列番号１１；配列番号１４９および／または配列番号１５１；配列番号１６８および／または配列番号１７０；配列番号１８６および／または配列番号１８８；配列番号２０４および／または配列番号２０６；配列番号２０および／または配列番号２９；配列番号３８および／または配列番号４７；配列番号５６および／または配列番号６５；配列番号７４および／または配列番号８３；並びに、配列番号２２２および／または配列番号２２４を含むペプチドを含有するものであり得る。
【００５１】
【表１−１】
2018048139.tif 000003
【００５２】
【表１−２】
2018048139.tif 000004
【００５３】
【表１−３】
2018048139.tif 000005
＊  配列は、記載の配列に対し（例えば、少なくとも）８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、および／または１００％配列同一性を有する配列または変異体を含む。
＊＊  配列は、１、２、３、４、５、５未満、または１０未満で保存的なアミノ酸の改変を含有し得る。
＃  配列は、記載の配列、例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４の相当する領域内に対し（例えば、少なくとも）８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、および／または１００％配列同一性を有し、並びに／あるいはＣＤＲ  １、２、および／または３の相当する領域内に１、２、３、４、５、５未満、または１０未満で保存的なアミノ酸の改変を有する、配列または変異体を含む。
＃＃  配列は、記載の配列に対し（例えば、少なくとも）８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％、および／または１００％配列同一性を有する配列または変異体を含み、配列は対応するアミノ酸（ＡＡ）をコードする。
ＡＡ＃は、ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列を示す。
核酸＃＃は、ＶＨまたはＶＬ核酸配列を示す。
【００５４】
ＣＤＲおよびＦＲ領域を上記に示したが、このような領域はカバットの手法に従って定義することもできる（「免疫対象となるタンパク質配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７および１９９１年））。同様に、抗体または抗原結合断片に対するアミノ酸付番も、カバットの手法に従う。
【００５５】
一部の例では、治療用組成物には、例えば、完全長の抗体および／若しくはインタクトな抗体、または抗体断片などといった抗体を含むペプチドが含有され得る。「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介し、糖、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合することのできる、免疫グロブリン分子である。本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）またはそれらの一本鎖、抗体を含む融合タンパク質、および任意のその他の改変を受けた、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の構成成分も包含する。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはこれらのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を包含し、特定のクラスの抗体である必要はない。抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類することができる。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちの幾種類かは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分けることもできる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。各クラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元構造は公知である。代表的な抗体および抗体断片としては、限定するものではないが、モノクローナル抗体（完全長のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合断片から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ラクダ化（camelised）抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、所望の生物活性（例えば、抗原結合部分）を示す抗体断片、ジスルフィド結合させたＦｖｓ（ｄｓＦｖ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体など）、細胞内抗体、並びに上記の任意のエピトープ結合断片が挙げられる。抗体または抗体断片はヒト型またはヒト化抗体であってよい。
【００５６】
抗体断片は、完全長の抗体に所望される親和性および特異性を保持しているものであれば、本方法への使用に好適である。したがって、抗ＭＩＣＡ抗体または抗アンジオポエチン抗体の断片は、それぞれＦｖ部位においてＭＩＣＡまたはアンジオポエチンに対する結合能を保持しており、かつＦＣ部位において樹状細胞上のＦｃ受容体への結合能を保持している。このような断片は、対応する完全長の抗ＭＩＣＡ抗体または抗アンジオポエチン抗体と同様の特性により特徴づけられ、すなわち、断片は、ヒト細胞の表面に発現したヒトＭＩＣＡ抗原若しくはアンジオポエチン抗原、または媒質中の脱離した対応するｓＭＩＣＡ抗原に、それぞれ特異的に結合する。
【００５７】
Ｆｖ断片は完全な抗原認識部位および結合部位を含有している抗体断片である。これらの領域は、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインが緊密に会合した２量体から構成され、これらのドメインは、天然では、例えばｓｃＦｖにて共有結合し得る。このドメインの立体構造中で、各可変ドメインの３箇所のＣＤＲが相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体表面の抗原結合部位を形成する。総じて、抗体には、６つのＣＤＲまたはこれらのサブセットにより、抗原に対する結合特異性が付与される。単一の可変ドメイン（すなわち、Ｆｖのうち、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含む片鎖）であっても、抗原に対する認識能および結合能を有する場合もあるものの、通常は、完全な結合部位と比較して親和性が低くなる。
【００５８】
一本鎖Ｆｖまたは（ｓｃＦｖ）抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般的に、ＦｖポリペプチドはＶＨおよびＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓｃＦｖは抗原を結合するのに望ましい構造を形成することができる。
【００５９】
Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の可変および定常ドメイン、並びに重鎖の可変ドメインおよび第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、断片分子同士が、一般的に、カルボキシ末端近傍においてシステイン残基からなるヒンジ部位により共有結合している、一対のＦａｂフラグメントを含む。抗体断片のその他の化学的カップリング法も当該技術分野において既知である。
【００６０】
二重特異性抗体は、抗原結合部位を２つ有する小型の抗体断片であり、この断片は、同様のポリペプチド鎖（ＶＨおよびＶＬ）中でＶＨがＶＬに連結している。同一鎖上の２つのドメインを対形成させるのには短すぎるリンカーを使用すると、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対形成し、抗原結合部位を２つ生成する。
【００６１】
線状抗体は、一対の抗原結合領域を形成する、タンデムに連結したＦｄ断片対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）と相補的な軽鎖ポリペプチドとをともに含む。線状抗体は、二重特異的または単一特異的なものであり得る。
【００６２】
本開示の抗体および抗体断片には、所望のエフェクター機能または血清半減期を得るためＦｃ領域において改変を加えることができる。一部の例では、Ｆｃ領域は、血清半減期を延長するためにＰＥＧまたはアルブミンと結合させることができ、あるいは所望の効果が得られる何らかのその他の複合体とすることができる。あるいは、副作用または治療による合併症を最小限に抑えるためにエフェクター機能を除去または抑制するのが望ましい場合には、何らかの他のＦｃ領域を使用することもできる。
【００６３】
ヒトおよびヒト化抗体には、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する（すなわちこれらの由来するものと同じアミノ酸配列を有する）抗体が含まれる。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列にはコードされていないアミノ酸残基を、例えば、ＣＤＲ中、特にＣＤＲ３中に含有し得る（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてランダム変異または部位特異的変異により、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて体細胞変異により、変異が導入され得る）。
【００６４】
可変ドメインの「ＣＤＲ」は、超可変領域内のアミノ酸残基であり、カバット（Kabat）、コチア（Chothia）の定義に従って同定される。カバットおよびコチアの両方の蓄積、ＡｂＭ、接触性、および／または立体構造の定義、またはＣＤＲ決定に関わる何らかの手法は、当該技術分野で公知である。抗体ＣＤＲは、もともとはカバットらにより定義された超可変領域として同定することもできる。例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，「免疫対象となるタンパク質配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．を参照されたい。ＣＤＲの位置は、元々コチアおよびその他の著者らにより報告されているループ構造としても同定することができる。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７〜８８３を参照されたい。ＣＤＲを同定するその他の手法としては、「ＡｂＭの定義」が挙げられる。ＡｂＭは、カバットおよびコチアの定義に含まれ、かつＯｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリング用ソフトウェア（現Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））、または抗原の接触性についての観察に基づくＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２〜７４５に記載のＣＤＲの「接触性の定義（contact definition）」を使用して導くことができる。本明細書においてＣＤＲの「立体構造の定義」として参照される、別のアプローチでは、ＣＤＲの配置は、抗原を結合するようエンタルピーを作用させる残基配置として同定することができる。例えば、Ｍａｋａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８３：１１５６〜１１６６を参照されたい。さらに別の、ＣＤＲの境界についての定義は、上記の手法のいずれかに固執するものではないがカバットのＣＤＲと少なくとも一部重なるものの、特定の残基、若しくは残基群、またはさらには完全なＣＤＲが、抗原の結合性に著しく影響を与えないという予測または実験による所見を考慮して、短縮または延長することができる。本明細書で使用するとき、ＣＤＲは、当該技術分野において既知の任意の手法（手法の組み合わせを包含する）により定義されたＣＤＲを指す。本明細書で使用する方法では、これらのアプローチのうちのいずれかに従って規定されたＣＤＲを利用することができる。１つ以上のＣＤＲを含有する任意の所与の実施形態に際し、ＣＤＲは、カバット、コチア、伸長、ＡｂＭ、接触法、および／または立体構造の定義のうちのいずれかに従って規定することができる。
【００６５】
一部の例では、例えば、未改変のペプチドと比較して、ペプチド変異体の抗原結合特性が維持されるかまたは改善されるのであれば、本明細書で開示されるペプチドのアミノ酸配列に改変および変更を加え、ペプチド変異体（例えば、本明細書で開示されるペプチドに対し規定の配列相同性を有するペプチド）を作製してもよい（任意の改変ペプチドの抗原結合特性は、本明細書に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ並びに／あるいは当該技術分野において既知の手法を使用して評価することができる）。
【００６６】
一般的に、ペプチド変異体はアミノ酸レベルで観察されかつ考察される一方で、実際の改変は、典型的には核酸レベルで導入されまたは実施される。例えば、表１に示すペプチドに対し８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、または９９％アミノ酸配列同一性を有する変異体は、配列番号１、１０、１９、２８、３７、４６、５５、６４、７３、および／または８２をコードしている核酸、またはこれらの部分／断片を、当該技術分野において既知の手法（例えば、クローニング法）、および／または本明細書で開示される手法を用い改変することにより作成できる。
【００６７】
アミノ酸配列の改変は、典型的には、置換、挿入、または欠失による改変の３種類のうちの１つ以上に当てはまる。挿入には、アミノおよび／または末端の融合、並びに配列中への単一または複数のアミノ酸残基の挿入が含まれる。通常、挿入は、アミノまたはカルボキシ末端の融合と比較して、より小さな挿入であり、例えば、約１〜４残基ほどである。欠失は、タンパク質配列からの１つ以上のアミノ酸残基の除去により特徴づけられる。典型的には、タンパク質分子内のいずれか一箇所にて約２〜６未満の残基が欠失している。アミノ酸置換は、典型的には単一残基のものであるが、一度に複数の異なる位置に生じる場合もある；挿入は、通常、約１〜１０個のアミノ酸残基である；欠失は、約１〜３０残基の範囲である。欠失または挿入は隣接する対になすことができ、すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入をなすことができる。置換、欠失、挿入、またはこれらの任意の組み合わせを合わせて、最終的なコンストラクトを得ることもできる。変異は、読み枠外の配列に配置すべきではなく、および好ましくは、ｍＲＮＡの二次構造を生成し得る相補性決定領域に作成すべきではない。置換による改変は、少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその部位に挿入されるというものである。一部の例では、置換は、保存的アミノ酸置換であり得る。一部の例では、本明細書に記載のペプチドには、表１に示すペプチドに対する１つ以上の保存的アミノ酸置換を含有させることができる。例えば、変異体は、表１に示すペプチドに対し、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２０〜３０、３０〜４０、または４０〜５０個の保存的アミノ酸置換を含有し得る。あるいは、変異体は、表１に示すペプチドに対する５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下の保存的アミノ酸置換を含有し得る。このような置換は、概して以降の表２に従ってなされ、かつ保存的置換と呼ばれる。タンパク質の改変に対する許容性を予測する方法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１０１（２５）：９２０５〜９２１０（２００４）を参照されたい）。
【００６８】
【表２】
2018048139.tif 000006
【００６９】
一部の例では、置換は非保存的なものである。例えば、表１に示すペプチド中のアミノ酸は、ペプチドの何らかの特性または態様を変更し得るアミノ酸により置換することができる。一部の例では、非保存的アミノ酸置換は、例えば、ペプチドの構造を変化させ、ペプチドの結合特性を変化する（例えば、抗原に対するペプチドの結合親和性を増加または減少させる、並びに／あるいは、抗原に対するペプチドの結合特異性を増加または減少させる）ためになすことができる。
【００７０】
一部の例では、ペプチドおよび／またはペプチド変異体には、表１に示すペプチドの断片を含有させることができ、あるいは断片であってよい。このような断片には、例えば、断片が、完全長のペプチドの結合特性を少なくとも一部保有するのであれば、例えば、表１に示すＣＤＲ、ＦＲ、および／またはＡＡと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６  ３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０〜１００、１０１〜１５０個少ないアミノ酸を含有させ得る（例えば、完全長のペプチドの結合特性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％）。切断はアミノ末端、カルボキシ末端、および／または本明細書に記載のペプチド内に行うことができる。
【００７１】
一部の例では、ペプチド変異体の相互作用面は、例えば、未改変のペプチドに対するペプチド変異体の結合特性を、変更（例えば、増強または減弱）、保存、または維持するための改変を受けていないペプチドのものと同様（例えば、ほぼ同様）であり得る。ペプチドの相互作用面を同定する手法は当該技術分野において既知である（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ：Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，６：１４７１〜２１０５（２００７）；Ａｎｄｒａｄｅ  ａｎｄ  Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，６４（１１）：１７７７〜１７８１（１９９２）；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，７７（１）：１４〜２５（２００９）；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ：並びにＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１０：１４７１〜２１０５（２００９）。
【００７２】
当業者であれば、２つのポリペプチド（例えば、未改変のペプチドおよびペプチド変異体）の同一性を評価する方法については容易に判断する。例えば、同一性は、同一度が最も高くなるように２つの配列を整列させた後に算出することができる。同一性を算出する別の方法は、公開されているアルゴリズムにより実施することができる。配列比較の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ，２：４８２（１９８１）の局所同一性アルゴリズム（local identity algorithm）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）と同様の検索方法、コンピュータへのこれらのアルゴリズムの実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェア・パッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または観察により実施することができる。
【００７３】
同様の種類の同定は、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８〜５２（１９８９）；Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６〜１０（１９８９）；Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１〜３０６（１９８９）に開示されるアルゴリズムにより、核酸についても得ることができ、これらの文献は、少なくとも、核酸アラインメントに関係する要素を参照することにより、本明細書に組み込まれる。典型的には任意の方法を使用できること、並びに特定の例においてはこれらの各種方法により得られる結果が異なっていることは理解されるが、当業者であれば、これらの方法のうち少なくとも１つにより同一性が認められた場合、配列は記載の同一性を有するものとされ、かつ本明細書で開示される配列であるとみなされることは理解するであろう。
【００７４】
一部の例では、以降の方法の項においてより詳細に記載される通り、本明細書で開示される治療用組成物は、本明細書で開示される方法を使用して得られた免疫細胞（例えば、記憶Ｂ細胞などのＢ細胞）から単離および／または精製された遺伝子材料（例えば、ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）を使用して作製することができる。このような遺伝子材料が得られた場合に、本明細書で開示される治療用組成物をこのような遺伝子材料を使用して作製する方法は当該技術分野において既知であり、および／または以下に要約される。
【００７５】
一部の例では、ペプチドには検出可能な標識を含有させ得る。本明細書で使用するとき、「標識」は、標識を取り付けられるペプチドの検出を可能にする部位に組み込まれた、少なくとも１つのエレメント、同位体、または官能基を指す。標識は直接取り付けることができ（すなわち、結合を介して）、またはリンカー（例えば、環状または非環状、分岐状または非分岐状、置換または非置換アルキレン；環状または非環状、分岐状または非分岐状、置換または非置換アルケニレン；環状または非環状、分岐状または非分岐状、置換または非置換アルキニレン；環状または非環状、分岐状または非分岐状、置換または非置換ヘテロアルキレン；環状または非環状、分岐状または非分岐状、置換または非置換ヘテロアルケニレン；環状または非環状、分岐状または非分岐状、置換または非置換ヘテロアルキニレン；置換または非置換アリーレン；置換または非置換ヘテロアリーレン；あるいは置換または非置換アシレン（acylene）、あるいはこれらのうちの、リンカーを構成させることのできる任意の組み合わせ）により取り付けることができる。標識は、生物活性または検出される本発明のポリペプチドの特性に干渉しない任意の位置にて、ペプチドに取り付けることができる。
【００７６】
標識としては、限定するものではないが、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、６７Ｇａ、９９ｍＴｃ（Ｔｃ−９９ｍ）、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１６９Ｙｂ、および１８６Ｒｅといった放射性同位体または重同位体などであり得る同位体部位を含有する標識；酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）と結合し得る抗体または抗原であり得る免疫性部分または免疫反応性部分を含有する標識；着色、冷光、リン光などの標識、または蛍光部分（例えば、蛍光標識ＦＩＴＣなど）を含有する標識；１つ以上の光親和性部分を有する標識；１つ以上の既知の結合パートナー（ビオチン−ストレプトアビジン、ＦＫ５０６−ＦＫＢＰなど）を有するリガンド部分を有する標識を挙げることができる。
【００７７】
一部の例では、標識には、生物システムにおいて分子間相互作用を直接的に解明するために、１つ以上の光親和性部分を含有させることができる。各種既知の発光分子を使用することができ、殆どの場合、ジアゾ化合物類、アジド類、ジアジリニン類のナイトレン類またはカルベン類への光分解（photoconversion）を利用する（例えば、Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．，Ｐｈｏｔｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８３），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍを参照されたい。この非特許文献は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）。本発明の特定の実施形態では、光親和性の標識としては、限定するものではないが、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸などといった、１つ以上のハロゲン部分により置換されたｏ−、ｍ−、およびｐ−アジゾベンゾイル類が使用される。
【００７８】
標識は撮像剤であってもよく、または撮像剤として利用することもできる。撮像剤の例としては、限定するものではないが、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピューター断層撮影法（ＣＡＴ）、単一光子放射断層撮影法、Ｘ線法、蛍光透視法、および磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）；制吐薬；並びに造影剤に使用されるものが挙げられる。診断薬の例としては、限定するものではないが、蛍光分子、冷光分子、磁気分子；ガドリニウム系キレート剤（例えば、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、ＤＯＴＡ、およびＨＰ−ＤＯ３Ａを併用したガドリニウム系キレート剤）、鉄キレート剤、マグネシウムキレート剤、マンガンキレート剤、銅キレート剤、クロムキレート剤、ＣＡＴおよびＸ線撮像に有用なヨウ素系化合物、並びに放射性核種が挙げられる。好適な放射性核種としては、限定するものではないが、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３０Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｉ、１３５Ｉ、４７Ｓｃ、７２Ａｓ、７２Ｓｅ、９０Ｙ、８８Ｙ、９７Ｒｕ、１００Ｐｄ、１０１ｍＲｈ、１１９Ｓｂ、１２８Ｂａ、１９７Ｈｇ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、１０９Ｐｄ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、６７Ｃｕ、７５Ｂｒ、７７Ｂｒ、９９ｍＴｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５０、３２Ｐ、３３Ｐ、および１８Ｆが挙げられる。
【００７９】
蛍光および冷光分子としては、限定するものではないが、「染料」、「標識」、または「指示薬」として一般に呼ばれる異なる各種有機または無機小分子が挙げられる。例としては、限定するものではないが、フルオレセイン、ローダミン、アクリジン染料、Ａｌｅｘａ、シアニン染料などが挙げられる。蛍光および冷光分子としては、天然に生じる各種タンパク質およびその誘導体、例えば、遺伝子組み換えされた変異体を挙げることができる。例えば、蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ、赤色、青色、黄色、シアン色、およびサファイア色蛍光タンパク質、造礁サンゴ蛍光タンパク質などが挙げられる。冷光タンパク質としては、ルシフェラーゼ、エクオリン、およびこれらの誘導体が挙げられる。当該技術分野においては、数多くの蛍光および冷光染料並びにタンパク質が知られている（例えば、米国特許出願公開第２００４／００６７５０３号；Ｖａｌｅｕｒ，Ｂ．，「分子蛍光：原理および応用（Molecular Fluorescence: Principles and Applications），」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，２００２；並びに「蛍光プローブおよび探索分子、分子プローブハンドブック（Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Molecular Probes）」，第９版，２００２）。
【００８０】
本明細書で使用するとき、用語「精製された」は、他の分子、例えば、ポリペプチド、核酸分子が、その天然の環境成分から識別されかつ分離されおよび／または回収されていることを指す。したがって、一実施形態では、本発明の抗体は精製抗体であり、自然環境の１つ以上の成分から分離されている。
【００８１】
本明細書で使用するとき、用語「エピトープ」は、抗体が結合し得るタンパク質の抗原決定基を指す。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基から構成され、かつ通常、特異的な立体構造特性、並びに特異的な電荷特性を有する。立体構造および非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下において、前者に対する結合は失われるのに対し、後者に対する結合は失われないという点で区別される。
【００８２】
一部の例では、本開示は、本開示のペプチド（例えば、表１に開示される）に相当する（例えば、本開示のペプチドをコードする）ヌクレオチド配列を提供する。これらの配列には、本開示のペプチドに関係するすべての縮重配列を包含し、すなわち、特定のペプチドおよび変異体並びにその誘導体を１つコードする配列を有するすべての核酸を包含する。したがって、具体的な各核酸配列は記載されないものの、各配列およびすべての配列は、実際のところ本開示のポリペプチド配列により本明細書に開示されかつ記載される。
【００８３】
一部の例では、本開示の核酸には、発現ベクターを含む。適切なベクターの例としては、限定するものではないが、プラスミド、人工染色体、例えば、ＢＡＣ、ＹＡＣ、またはＰＡＣ、並びにウイルスベクターが挙げられる。
【００８４】
提供されるベクターには、例えば、複製起点および／またはマーカーを含有させることもできる。マーカー遺伝子は、選択可能な表現型、例えば、抗生物質耐性を細胞に付与し得る。マーカー産物は、ベクターが細胞に入り、かつ入った後に発現しているかを判断するために使用する。哺乳類細胞用の選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、およびブラストサイジンである。このような選択可能なマーカーが哺乳類の宿主細胞に首尾よく移行された場合、形質転換した哺乳類宿主細胞は、選択圧下に置いた場合に生存し得る。他のマーカーの例としては、例えば、大腸菌（E. coli）ｌａｃＺ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびルシフェラーゼが挙げられる。加えて、発現ベクターには、発現したポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を促進するよう設計したタグ配列を含有させることができる。ＧＦＰ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集、またはＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ；Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）配列などのタグ配列は、典型的には、コードされているポリペプチドを有する融合体として発現させることができる。このようなタグは、カルボキシまたはアミノ末端のいずれかを含む、ポリペプチド内のどこにでも挿入することができる。
【００８５】
一部の例では、本開示は、本明細書で開示される核酸（例えば、ベクター）および／またはペプチドを含む細胞を包含する。細胞には、例えば、真核生物および／または原核細胞が包含され得る。一般的に、本明細書において使用され得る細胞は、例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８から市販のものである。同様に、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，「分子生物学標準プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，（１９９８）も参照されたい。本明細書で開示される細胞の生成に有用な形質転換および遺伝子導入方法は、例えば、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，「分子生物学標準プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，（１９９８）に記載されている。
【００８６】
医薬組成物
一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物には、癌の処置に使用される他の化合物、薬剤、および／または剤を含有させることができる。このような化合物、薬剤、および／または剤としては、例えば、化学療法剤、低分子抗癌剤または所定の癌に対する免疫応答を刺激する抗体を挙げることができる。一部の例では、治療用組成物には、例えば、本明細書で開示される１つ以上のペプチド、および１つ以上の抗ＣＴＬＡ−４抗体若しくはペプチド、抗ＰＤ−１抗体若しくはペプチド、および／または抗ＰＤＬ−１抗体若しくはペプチドが挙げられる。例えば、一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物は、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、または１０未満）の化合物と組み合わせることができる。
【００８７】
一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物には、ヒストン脱アセチル化酵素（「ＨＤＡＣ」）阻害剤などの他の化合物を含有させ得る。ＨＤＡＣ阻害剤の例としては、例えば、ヒドロキサム酸、ボリノスタット（Ｚｏｌｉｎｚａ）；スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）（Ｍｅｒｃｋ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＬＡＱ８２４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）（ＣｕｒａＧｅｎ）、ＩＴＦ２３５７  Ｉｔａｌｆａｒｍａｃｏ  ＳｐＡ（Ｃｉｎｉｓｅｌｌｏ）、環状テトラペプチド；デプシペプチド（ロミデプシン、ＦＫ２２８）（Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ベンズアミド；Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ（ＳＮＤＸ−２７５／ＭＳ−２７５）（Ｓｙｎｄａｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＭＧＣＤ０１０３（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、短鎖脂肪酸、バルプロ酸、フェニル酪酸、ＡＮ−９、ｐｉｖａｎｅｘ（Ｔｉｔａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ＣＨＲ−３９９６（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、およびＣＨＲ−２８４５（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。
【００８８】
一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物には、例えば、ボルテゾミブ（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＮＰＩ−００５２（Ｎｅｒｅｕｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、カーフィルゾミブ（ＰＲ−１７１）（Ｏｎｙｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＣＥＰ  １８７７０、およびＭＬＮ９７０８といったプロテアソーム阻害剤などの、その他の化合物を含有させることができる。
【００８９】
一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物には、これまでに、抗ＭＩＣＡモノクローナル抗体の有効性を増強させ得るＭＩＣＡの発現を増大させることが示されている、メルファランなどのアルキル化剤、およびアドリアマイシン（ドキソルビシン）などのトポイソメラーゼ阻害薬を含有させることができる。
【００９０】
一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物は、医薬組成物として、または医薬組成物に使用するために処方することができる。このような組成物は、任意の経路、例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に認可された任意の経路により対象に投与するために処方または調節することができる。方法例は、ＦＤＡのＣＤＥＲデータ標準マニュアル（CDER Data Standards Manual），ｖｅｒ．００４（ｆｄａ．ｇｉｖｅ／ｃｄｅｒ／ｄｓｍ／ＤＲＧ／ｄｒｇ００３０１．ｈｔｍから入手可能）に記載されている。
【００９１】
一部の例では、医薬組成物には、有効な量の１つ以上のペプチドを含有させることができる。本明細書で使用するとき、用語「有効な量」および「処置に有効な」は、所望される効果または生理学的結果を得る際の投与という文脈において、一定時間（急性または慢性投与および定期または継続投与など）にわたって有効である１つ以上のペプチドの量または濃度を指す。
【００９２】
一部の例では、医薬組成物には、１つ以上のペプチド並びに任意の製薬上許容可能な担体、補助剤および／または賦形剤を含有させることができる。一部の例では、医薬組成物には、さらに１つ以上の追加の治療剤を、疾患または病徴の調節を達成するのに有効な量で含有させることができる。
【００９３】
用語「製薬上許容可能な担体または補助剤」は、本発明のペプチドとともに患者に投与することができ、かつ本発明のペプチドの薬理活性を損なわず、かつ治療量の化合物を送達するのに十分な投与量で投与した場合に非毒性である基剤または助剤を指す。
【００９４】
本発明の医薬組成物に使用することのできる製薬上許容可能な基材、補助剤および賦形剤としては、限定するものではないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸塩などの自己乳化薬物送達システム（ＳＥＤＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ若しくは他の同様の高分子系送達マトリックスなどの薬物剤形において使用される界面活性剤、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、緩衝成分、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸と、水と、塩類とまたは電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩との、部分グリセリド混合物、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系材料、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、並びに羊毛脂が挙げられる。本明細書に記載の処方の化合物の送達性を増強させるために、α−、β−、およびγ−シクロデキストリンなどのシクロデキストリンを有利に使用することもできる。
【００９５】
本発明の医薬組成物には、製薬上許容できる任意の一般的な非毒性基材、補助剤、または賦形剤を含有させることができる。場合によっては、処方のｐＨは、製薬上許容可能な酸、塩基、または緩衝剤により調整して、処方された化合物またはその送達形態の安定性を向上させることができる。本明細書で使用するとき、用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病巣内、および頭蓋内注射または輸液による手法を包含する。
【００９６】
医薬組成物は、吸入および／または経鼻投与用の溶液または粉末の形態であり得る。このような組成物は、好適な分散剤または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０など）および懸濁剤を使用して、当該技術分野において既知の手法に従って処方することもできる。無菌注射製剤は、非毒性非経口投与可能な希釈剤または溶媒を用いた無菌注射製剤または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール溶液）であってもよい。利用することのできる投与可能な賦形剤および溶媒としては、マンニトール、水、リンガー液および生理食塩水が挙げられる。加えて、無菌硬化油は、一般的に、溶媒または懸濁媒質として利用される。この目的に関し、合成モノまたはジグリセリドなどの任意の低刺激性硬化油が利用され得る。例えば、オリーブ油またはヒマシ油、特に、これらのポリオキシエチル化化合物などといった、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、製薬上許容できる天然油として、注射剤の調製に有用である。これらの油溶液または懸濁液には、乳濁液およびまたは懸濁液など、製薬上許容可能な剤形の処方に一般的に使用される、長鎖アルコール希釈剤若しくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロース若しくは同様の分散剤を含有させることができる。その他の一般的に使用されるＴｗｅｅｎ若しくはＳｐａｎなどの界面活性剤、および／または他の類似の乳化剤、または製薬上許容可能な固体、液体若しくは他の剤形の製造に一般に使用される生物学的利用能増強剤なども、製剤目的で使用することができる。
【００９７】
医薬組成物は、限定するものではないが、カプセル剤、錠剤、乳濁液および水性懸濁液、分散液および溶液などといった、経口投与可能な任意の投与形態で経口投与することができる。経口用途用の錠剤の場合、一般に使用される基材としては乳糖およびトウモロコシデンプンが挙げられる。典型的には、ステアリン酸マグネシウムなどの粘滑剤も添加される。カプセル形態での経口投与の際に有用な希釈剤としては、乳糖および乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。水性懸濁液および／または乳濁液を経口投与する場合、有効成分は、乳化剤および／または懸濁剤と組み合わせた油相に懸濁または溶解させることもできる。必要に応じて、特定の甘味料および／または香料および／または着色料を添加することもできる。
【００９８】
あるいは、またはこれに加え、医薬組成物は、点鼻剤（エアゾール）または経鼻吸入により投与することができる。このような組成物は、製剤処方の技術分野で公知の手法に従って調製され、かつベンジルアルコールまたは他の好適な保存料、生物学的利用能を増強させる吸収促進剤、フッ化炭素、および／または当該技術分野において既知の他の溶解剤若しくは分散剤を利用して、生理食塩水溶液として調製することができる。
【００９９】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される任意の１つ以上のペプチドまたは医薬組成物（以降「Ｘ」として記載）を、以降の方法において使用するための方法を提供する。
【０１００】
本明細書で開示される１つ以上の疾患または状態（例えば、「Ｙ」として以降の実施例において参照される癌）の処置において薬剤として使用するための物質Ｘ。Ｙの処置用薬剤を製造する際の物質Ｘの使用；およびＹの処置において使用するための物質Ｘ。
【０１０１】
一部の例では、本明細書で開示される治療用組成物は、米国での販売、米国への輸入、および／または米国からの輸出用に製剤することができる。
【０１０２】
方法
一部の例では、方法には、状態または疾患を有するまたは有したヒト対象、および状態または疾患に対し正の免疫応答を示すまたは示したヒト対象を選別することが包含され得る。一部の例では、好適な対象には、例えば、状態または疾患を有するまたは有していたものの、疾患またはそれらの病態から回復している対象、現在では疾患の症状が（例えば、同様の状態または疾患を有する他の対象（例えば、大多数の対象）と比較して）軽減している対象、並びに／あるいは、例えば、無症候期（例えば、同様の状態または疾患を有する他の対象（例えば、大多数の対象）と比較して）において、状態または疾患を有するまたは有していたものの、状態または疾患を有しつつ（例えば、同様の状態または疾患を有する他の対象（例えば、大多数の対象）と比較して）より長期間生存している対象、が包含される。一部の例では、状態または疾患に対してワクチンを接種している（例えば、ワクチン接種歴があるおよび／またはワクチンを接種されたことがあるおよびワクチンを再接種されている（例えば、免疫補助剤入りワクチンを接種されている））対象を選別することができる。
【０１０３】
本明細書で使用するとき、用語「対象」は、任意の動物を指す。一部の例では、対象は哺乳類である。本明細書で使用するとき、一部の例では、用語「対象」はヒト（例えば、男性、女性、または子供）を指す。本方法に使用する試料には、血清試料が包含され、例えば、選別された対象から得られた血清試料が包含される。
【０１０４】
一部の例では、対象の選別には、対象から試料を得ること（例えば、候補となる対象）、および対象が選択に適するかを示す指標について試料を試験することを包含させることができる。一部の例では、対象は、状態または疾患を有していたかまたは有しているものとして、例えば、医療従事者により、確認または特定することができる。一部の例では、状態または疾患に対する正の免疫応答の提示は、病歴、家族歴、および／または正の免疫応答に関する指標の検出からなされる。場合によっては、患者の選別には複数名の患者を包含させることができる。例えば、第１施設により候補となる対象から試料を得て、第２施設により試料を試験することができる。一部の例では、対象は、医師（例えば、一般開業医）により選別および／または参照することができる。一部の例では、対象の選別には、選別した対象から試料を得ること、および試料を保管すること、および／または本明細書で開示される方法を使用すること、を包含させることができる。試料は、例えば、細胞または細胞集団を含有し得る。
【０１０５】
一部の例では、免疫細胞を得ることまたは標的とすることには、例えば、標的とする免疫細胞に結合（例えば、特異的に結合）することができる免疫原四量体を得ること、または提供すること；免疫原四量体と試料とを接触させること；免疫原四量体を検出すること；免疫原四量体が標的免疫細胞に結合するか否か判定すること；並びに、標的とする免疫細胞に免疫原四量体が結合する場合には、標的とする免疫細胞を得ること、のうちの１つ以上および／または組み合わせを包含させることができる。
【０１０６】
免疫原四量体には、状態または疾患に関連する、および／または標的とする免疫細胞に結合（例えば、特異的に結合）する免疫原を含有させることができ、例えば、標的免疫細胞は、選択された状態または疾患に関連するものである。状態または疾患に関連する免疫原および標的免疫細胞としては、例えば、特定の状態または疾患を有する対象には存在するが、この状態または疾患を有さない対象には存在しない、免疫原または免疫細胞；並びに／あるいは特定の状態または疾患を有する対象と、この状態または疾患を有さない対象とで程度が異なる（例えば、増加している）免疫原または免疫細胞が挙げられる。一部の例では、免疫原または免疫細胞は癌特異的なものであり得る。免疫原は可溶性であり得る。免疫原四量体には、四量体（例えば、免疫原性抗原（例えば、抗原および／またはエピトープ）の単量体、二量体、および／または三量体を含む）が含有され得る。一部の例では、免疫原四量体は、同様の条件下での、細胞に対する非四量体型の免疫原の結合性と比較して、細胞に対する結合性が増大している。一部の例では、四量体抗原は、検出可能な部分、例えば、ストレプトアビジン部分を含有する。四量体化の方法は、当該技術分野において既知でありかつ本明細書で開示される。
【０１０７】
免疫原四量体を検出すること、および／または免疫原四量体が標的細胞に結合するか否かを判定することは、当該技術分野において既知のおよび／または本明細書で開示される方法を使用して実施することができる。例えば、方法はフローサイトメトリーを包含し得る。フローサイトメトリー（ソーティングおよびゲーティング法を含む）を最適化する方法は、当該技術分野において既知であり、および／または本明細書で開示される。一部の例では、方法には、標的とする免疫細胞に結合する抗原四量体間の結合性、結合親和性、および／または結合特異性の度合いの解析が包含され得る。例えば、免疫原四量体と標的免疫細胞と間に、規定の結合度が測定された場合に（例えば、このような場合に限り）、標的とする免疫細胞を得ることができる。規定の結合度は、特定の度合いであってよく、および／または相対的な度合いであってよい。標的とする免疫細胞を得ることには、標的とする免疫細胞を得ること、提供すること、同定すること、選別すること、精製すること、および／または単離すること、を包含させることができる。このような方法には、例えば、セルソーティング法、細胞濃縮法、および／またはバックグラウンド減少法を含有させることができる。
【０１０８】
一部の例では、自己抗原に対する免疫細胞を得ることは、例えば、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象を特定すること；自己抗原の多量体を得ることまたは提供すること；自己抗原の多量体を、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象由来のサンプルと接触させること；自己抗原の多量体と結合する免疫細胞を得ることのうちの１つ以上および／またはこれらの組み合わせを包含し得る。
【０１０９】
一部の例では、方法には、癌患者由来の自己抗原に対する免疫細胞を得ることを包含させることができ、例えば、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象を特定すること；自己抗原の多量体を提供すること；自己抗原の多量体を、自己抗原に対し正の免疫応答を示す対象由来のサンプルと接触させること；並びに自己抗原の多量体と結合する免疫細胞を得ることのうちの１つ以上および／またはこれらの組み合わせを包含させ得る。
【０１１０】
多量体型の自己抗原には、状態または疾患に関連する、および／または標的とする免疫細胞に結合（例えば、特異的に結合）する自己抗原を含有させることができ、例えば、標的免疫細胞は、選択された状態または疾患に関連するものである。状態または疾患に関連する自己抗原および標的免疫細胞としては、例えば、特定の状態または疾患を有する対象には存在するが、この状態または疾患を有さない対象には存在しない、抗原または免疫細胞；および／あるいは特定の状態または疾患を有する対象と、この状態または疾患を有さない対象とで程度が異なる（例えば、増加している）免疫原または免疫細胞が挙げられる。一部の例では、状態または疾患は癌であり得る。一部の実施形態では、癌は、黒色腫、肺癌、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、並びに結腸癌、リンパ腫または白血病である。一部の例では、自己抗原または免疫細胞は、癌特異的なものであり得る。自己抗原は可溶性であり得る。多量体型の自己抗原には、自己抗原（例えば、抗原および／またはエピトープ）の四量体（例えば、単量体、二量体、および／または三量体型抗原を四量体化させたものなど）が包含され得る。一部の例では、自己抗原の多量体は、検出可能な部位、例えば、ストレプトアビジン部位を含有する。多量体化の方法は、当該技術分野において既知でありかつ本明細書で開示される。
【０１１１】
得られた標的免疫細胞からの遺伝子材料（例えば、ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）の単離または精製方法は、当該技術分野において既知であり、かつ本明細書において例示される。このような遺伝子材料が得られた場合に、本明細書で開示される治療用組成物をこのような遺伝子材料を使用して作製する方法は当該技術分野において既知であり、および／または以下に要約される。上述のように、当該技術分野において既知の手法を用いて遺伝子材料に変更を加え、本明細書で開示されるペプチド変異体を作製することができる。
【０１１２】
標的細胞内に含有されるまたは標的細胞から得られる核酸（例えば、ｃＤＮＡ）からペプチドを作製することは、例えば、解析法、例えば、標的とする免疫細胞（例えば、単一のまたは単離され、同定された標的免疫細胞）由来の重鎖および軽鎖可変ドメインの配列決定をすることを包含し得る。一部の例では、方法には、完全型ヒト抗体、またはそれらの断片（例えば、上記の通りのもの）を生成すること、並びに非ヒト抗体をヒト化することが包含され得る。ＤＮＡは、得られた免疫細胞から、一般的な手法を用い（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを使用することで）容易に単離および／または配列決定することができる。
【０１１３】
単離したＤＮＡは、発現ベクター中に配置し、次に、本来であれば抗体タンパク質を産生しない大腸菌（Escherichia coli）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞に遺伝子導入し、組み換え宿主細胞においてモノクローナル抗体を合成させることができる。抗体をコードしているＤＮＡの、細菌における組換え発現についての総説としては、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６〜２６２（１９９３）およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．，１３０：１５１〜１８８（１９９２）が挙げられる。
【０１１４】
抗体またはそれらの変異体の組換え発現には、一般的に、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有している発現ベクターの構築が必要とされる。したがって、本発明は、抗体分子、抗体重鎖または軽鎖、抗体またはこれらの部分の重鎖または軽鎖可変ドメイン、あるいは重鎖または軽鎖ＣＤＲ、操作可能に連結したプロモーター、をコードしているヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターには、抗体分子の定常部をコードしているヌクレオチド配列（例えば、米国特許第５，９８１，２１６号；同第５，５９１，６３９号；同第５，６５８，７５９号および同第５，１２２，４６４号を参照されたい）を含有させることができ、並びに完全な重鎖、完全な軽鎖、または完全な重鎖および軽鎖の両方を発現させるために、抗体の可変ドメインをこのようなベクターにクローニングすることもできる。
【０１１５】
一般的な手法により、発現ベクターを宿主細胞に移行させたならば、次に、遺伝子導入した細胞を一般的な手法により培養し、抗体を産生させる。したがって、本発明は、操作可能に異種プロモーターに連結された、本発明の抗体若しくはそれらの断片、またはそれらの重鎖若しくは軽鎖、またはそれらの部分、または本発明の単鎖抗体、をコードしているポリヌクレオチドを含有している、宿主細胞を含む。特定の実施形態では、二本鎖抗体の発現にあたり、以降に記載の通りに、完全な免疫グロブリン分子を発現させるための重鎖および軽鎖の両方をコードしているベクターを宿主細胞において同時発現させることもできる。
【０１１６】
組換え抗体の発現の際に宿主として入手可能な哺乳類細胞株は、当該技術分野において公知であり、かつアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能な、限定するものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、ヒト腎臓上皮細胞２９３、および数多くのその他の細胞株などの数多くの不死化細胞株を包含する。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後のプロセシングおよび修飾に関し、特徴的でかつ特異的な機序を有する。適切な細胞株または宿主系を選択することで、発現させた抗体またはそれらの部分の正しい修飾およびプロセシングが保証されることになる。この目的を達成するために、一次転写産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機序を保有している真核生物を宿主細胞として使用することができる。このような哺乳類宿主細胞としては、限定するものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ＮＳ０（なんらかの機能性免疫グロブリン鎖を内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＳＰ２０、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ並びにＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられる。一実施形態では、ヒトリンパ球を不死化させることにより展開されるヒト細胞株を使用して、遺伝子組み換え法によりモノクローナル抗体を産生させることができる。一実施形態では、遺伝子組み換え法によるモノクローナル抗体の産生には、ヒト細胞株ＰＥＲ．Ｃ６．（Ｃｒｕｃｅｌｌ，オランダ）を使用することができる。
【０１１７】
一部の例では、本明細書で開示されるペプチドは合成により生成することができる。本明細書に記載のペプチドの合成に有用な、合成による化学的な変換および保護基による方法論（保護および脱保護）は、当該技術分野において既知であり、このようなものとしては、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，包括的有機分子変換法（Comprehensive Organic Transformations），ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，「有機合成における保護基（Protective Groups in Organic Synthesis）」，第３版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９９）；Ｌ．ＦｉｅｓｅｒおよびＭ．Ｆｉｅｓｅｒ，「有機合成用フィッシャーおよびフィッシャー試薬（Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis）」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）；並びにＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，「有機合成用試薬辞典（Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis）」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）、並びにこれらの改訂版に記載のものなどが挙げられる。
【０１１８】
ペプチドは、当業者により公知の化学合成法により製造することもできる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，「合成ペプチド（Synthetic Peptides）」第３章：ユーザーズガイド（User's Guide），ｅｄ．Ｇｒａｎｔ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，（ニューヨーク市，Ｎ．Ｙ．），１９９２，ｐ．７７を参照されたい。したがって、ペプチドは、自動化したメリーフィールド固相合成法を使用して、例えば、アプライドバイオシステムズのモデル４３０Ａまたは４３１のペプチド合成装置において、側鎖保護されたアミノ酸を使用し、ｔ−Ｂｏｃ若しくはＦｍｏｃ化学法のいずれかにより保護したα−ＮＨ２により合成することができる。
【０１１９】
本明細書に記載のペプチドを製造する際の一つの手法には、ペプチド固相合成法（ＳＰＰＳ）が使用される。リンカー分子を用い酸に不安定な結合を介し、Ｃ末端アミノ酸をポリスチレン樹脂と結合させる。この樹脂は、合成に使用される溶媒に不溶性であることから、過剰な試薬および副産物は比較的簡単かつ迅速に洗い流される。Ｎ末端は、酸には安定であるものの塩基により除去することのできるＦｍｏｃ基により保護される。任意の側鎖官能基は、塩基に安定で酸には不安定な基により保護される。
【０１２０】
天然の化学連結法を使用し、個々の合成ペプチドを結合させることにより、より長鎖のペプチド鎖を合成することができる。別の方法としては、より長鎖の合成ペプチドは、公知の組換えＤＮＡ法により合成することができる。このような手法は、詳細なプロトコルを備える公知の一般的な手法により提供される。本発明のペプチドをコードしている遺伝子を構築するため、アミノ酸配列を逆翻訳して、アミノ酸配列をコードしている核酸配列、好ましくは、遺伝子を発現させる生物に関し最適化されたコドンを有する核酸配列を得る。次に、合成遺伝子を、典型的にはペプチドおよび必要に応じて任意の制御エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することにより作製する。合成遺伝子を適切なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞に形質移入させる。次に、選択された発現系および宿主に合った、好適な条件下でペプチドを発現させる。このペプチドを、一般的な手法により精製し、および特徴づける。
【０１２１】
ペプチドは、ハイスループットでコンビナトリアルな方法、例えば、アドバンスドケムテックから入手可能な、ハイスループットなマルチチャンネルシンセサイザーで合成することができる。
【０１２２】
ペプチド結合は、例えば、ペプチドの生理学的安定性を向上させるために、レトロ・インベルソ（retro-inverso）結合（Ｃ（Ｏ）−ＮＨ）；還元型アミド結合（ＮＨ−ＣＨ２）；チオメイレン結合（Ｓ−ＣＨ２またはＣＨ２−Ｓ）；オキソメチレン結合（Ｏ−ＣＨ２またはＣＨ２−Ｏ）；エチレン結合（ＣＨ２−ＣＨ２）；チオアミド結合（Ｃ（Ｓ）−ＮＨ）；トランス型オレフィン結合（ＣＨ＝ＣＨ）；フッ素置換されたトランス型オレフィン結合（ＣＦ＝ＣＨ）；ケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）−ＣＨＲ）またはＣＨＲ−Ｃ（Ｏ）（式中、ＲはＨまたはＣＨ３である）；およびフッ素−ケトメチレン結合（Ｃ（Ｏ）−ＣＦＲまたはＣＦＲ−Ｃ（Ｏ）（式中、ＲはＨまたはＦまたはＣＨ３である）により置き換えることができる。
【０１２３】
ペプチドは、アセチル化、アミド化、ビオチン化、シンナモイル化、ファルネシル化、フルオレセイン化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、リン酸化（Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒ）、ステアロイル化、スクシニル化およびスルフリル化によりさらに修飾することができる。上記の通り、ペプチドを例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アルキル基（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０線状または分岐状アルキル基）；脂肪酸ラジカル；およびこれらの組み合わせと結合させることができる。
【０１２４】
一部の例では、ペプチドは、免疫グロブリン分子の精製に関し、当該技術分野において既知の任意の方法、例えば、クロマトグラフ（例えば、イオン交換、アフィニティ（特にプロテインＡまたはプロテインＧ特異的抗原に対する親和性をもとにしたもの）、およびサイズ排除クロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の違い、あるいはタンパク質の精製に関する任意のその他の一般的な手法により精製することができる。さらに、本発明の抗体またはそれらの断片は、精製を容易にするため、上記のまたは当該技術分野において既知の異種ポリペプチド配列（本明細書において「タグ」と参照される）と融合させることもできる。
【０１２５】
代表的な、非限定的な方法の概略を図２１に示す。この概略は、順序を指定するものではない。
【０１２６】
使用方法
一部の例では、本開示は、本明細書で開示される組成物を対象に投与することを包含する処置方法を提供する。
【０１２７】
本明細書においては、対象における癌または癌の症状の処置および／または予防方法も提供され、方法は、ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連性配列Ａ（ＭＩＣＡ）に免疫特異的に結合する、治療に有効な量のペプチドを、前記対象に投与することを包含し、前記ペプチドは、５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８または９のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）３と、５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ１、６、７、８または９のＶＬのＣＤＲ３と、を含む。一部の実施例では、癌は、ＭＩＣＡの過剰発現を伴う癌である。一部の実施形態では、癌は、黒色腫、肺癌、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、並びに結腸癌、リンパ腫または白血病である。一部の実施形態では、癌は黒色腫である。一部の実施形態では、癌は、形質細胞の悪性腫瘍であり、例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）または形質細胞の前癌性状態である。一部の実施例では、対象は、それまでに癌を有するものとして診断されているか、または癌になりやすいものとして診断されている。
【０１２８】
一部の例では、本開示は、対象における癌または癌の症状の処置および／または予防方法を提供し、方法は、ＭＨＣクラスＩ型ポリペプチド関連性配列Ａ（ＭＩＣＡ）に特異的に結合する単離抗体を含む治療に有効な量の組成物を、前記対象に投与することを包含し、前記抗体は、配列番号１１、１４９、１６８、１８６、または２０４のＶＨ配列として示される、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４、１５１、１７０、１８９、または２０６の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列と、を含む。
【０１２９】
本明細書においては、対象における癌または癌の症状の処置および／または予防方法も提供され、方法は、アンジオポエチンに免疫特異的に結合する、治療に有効な量のペプチドを、前記対象に投与することを包含し、前記ペプチドは、５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、または５、または１０のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）３と、５以下の保存的アミノ酸置換を有する、表１に示す抗体ＩＤ２、３、４、または５のＶＬのＣＤＲ３と、を含む。一部の実施例では、癌は、ＭＩＣＡの過剰発現を伴う癌である。一部の実施形態では、癌は、黒色腫、肺癌、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、並びに結腸癌、リンパ腫または白血病である。一部の実施形態では、癌は黒色腫である。一部の実施形態では、癌は、形質細胞の悪性腫瘍であり、例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）または形質細胞の前癌性状態である。一部の実施例では、対象は、それまでに癌を有するものとして診断されているか、または癌になりやすいものとして診断されている。
【０１３０】
一部の例では、本開示は、対象における癌または癌の症状の処置および／または予防方法を提供し、方法は、アンジオポエチン（例えば、アンジオポエチン−２）に特異的に結合する単離抗体を含む治療に有効な量の組成物を、前記対象に投与することを包含し、前記抗体は、配列番号２０、３８、５６、７４、または２２２のＶＨ配列として示される、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２９、４７、６５、８３、または２２４の軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列と、を含む。
【０１３１】
当業者により公知の癌の症状としては、限定するものではないが、異常な分子特徴、非対称性、境界、色、および／または直径など分子外見の変化、新規色素沈着を生じた皮膚面積、異常なほくろ、爪下暗色化領域、乳房腫瘤、乳頭変化、乳房嚢胞、乳房痛、死亡、体重減少、脱力感、過剰な倦怠感、食欲低下、食欲不振、慢性咳嗽、息切れの悪化、喀血、血尿、血便、悪心、嘔吐、肝転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、鼓腸、腹腔内液体貯留、膣出血、便秘、腹部膨隆、結腸の穿孔、急性腹膜炎（感染、発熱、疼痛）、疼痛、吐血、大量の発汗、発熱、高血圧、貧血症、下痢、黄疸、目眩、悪寒、筋痙攣、大腸癌転移、肺転移、膀胱転移、肝転移、骨転移、腎転移、および膵転移、嚥下障害、および同様の症状が挙げられる。
【０１３２】
本明細書で開示される方法は、広範な種、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、シカ、エルク、ヤギ、イヌ、ネコ、イタチ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット、およびマウスに適用することができる。
【０１３３】
本明細書で使用するとき、用語「処置」または「処置する」は、対象が罹患している疾患または状態を、一部または完全に軽減、阻害、寛解、および／または軽減することを指す。一部の例では、処置により、患者が罹患している疾患または状態が持続的に消失し得る。
【０１３４】
一般的に、方法は、状態または疾患に関連するリスクを有する、あるいは状態または疾患を有する対象を選別することを包含する。一部の例では、対象の状態または疾患は、本明細書で開示される医薬組成物により処置することができる。例えば、一部の例では、方法には、癌を有する対象を選別することが包含され、例えば、対象の癌は、ＭＩＣＡおよび／またはアンジオポエチン−２のいずれかまたは両方を標的とすることにより処置することができる。
【０１３５】
一部の例では、処置方法には、必要に応じて、患者が罹患している疾患または病状を予防または処置するための、単回投与、複数回投与、および反復投与が包含される。場合によっては、処置方法には、処置前、処置中、および／または処置後に対象において疾患の程度を評価することを包含させることができる。一部の例では、処置は、対象において検出される疾患の度合いが低減するまで継続することができる。
【０１３６】
本明細書で使用するとき、用語「投与する」、「投与すること」、または「投与」は、形態にかかわらず本発明のペプチドを、埋め込むこと、吸収させること、摂取させること、注入すること、または吸入させることを指す。一部の例では、本明細書で開示される１つ以上のペプチドは、対象に局所的に（例えば、経鼻的に）、および／または経口的に投与することができる。例えば、本明細書に記載の方法には、有効な量の化合物または化合物の組成物を投与して、所望のまたは記載の効果を得ることが包含される。任意の特定の患者に対する具体的な投与法および処置レジメンは、使用する具体的な化合物の活性、年齢、体重、通常の健康状態、性別、体重、投与時間、排泄速度、合剤、疾患、状態、または症状の重症度および経過、疾患、状態、または症状に対する患者の性質、並びに処置を行う医師の判断などといった多様な因子に応じ変化し得る。
【０１３７】
投与後に、対象を、疾患の程度を検出、診断、または判定するために評価することができる。一部の例では、処置を、対象において検出される疾患の程度が変化（例えば、低減）するまで継続することができる。
【０１３８】
患者の状態の改善に応じ（例えば、対象における疾患の程度の変化（例えば、低減））、必要に応じて、本発明の化合物、組成物または組み合わせの維持量を投与することができる。続いて、症状の変化に応じ、改善された状態が維持される程度にまで、投与量または投与頻度あるいはこの両方を減少させることもできる。しかしながら、患者は、何らかの疾患の症状の再発に応じて、長期にわたって断続的に処置する必要がある場合もある。
【０１３９】
一部の例では、本開示は、ヒト対象由来の、免疫細胞、例えば、Ｂ細胞および／または記憶Ｂ細胞を検出する方法を提供する。例えば、このような方法を使用して、ヒト対象において、免疫細胞、例えば、Ｂ細胞および／または記憶Ｂ細胞の程度を、例えばイベントを追跡して、モニターすることができる。イベント例としては、限定するものではないが、疾患、感染症の検出；本明細書で開示される治療用組成物の投与、治療薬または処置レジメンの投与、ワクチンの投与、免疫応答の誘導が挙げられる。このような方法は、臨床的におよび／または研究用に使用することができる。
【実施例】
【０１４０】
本発明は、以降の実施例でさらに説明される。これらの実施例は、請求項に記載される本発明の範囲を制限するものではない。
【０１４１】
本明細書に記載される方法は、所定の抗原に対し特異性を有する希少な記憶Ｂ細胞を、限られた量の末梢血から、高感度に、特異的におよび高信頼度で検出可能なものである。本方法は、抗原の排除後数カ月から数年間にわたり記憶Ｂ細胞の可視化および単離を可能にする。
【０１４２】
本明細書で開示される方法の原理の証明は、Ｆｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ，１１８（２）：３４８〜３５７（２０１１））に詳細に報告される通り、破傷風毒素のＣ末断片（ＴＴＣＦ）の四量体を使用してなされている。この参考文献は、参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【０１４３】
ほとんどの個体は破傷風トキソイドによりワクチン接種を受け、ワクチンによりＩｇＧ抗体の持続性力価を誘導されることから、ＴＴＣＦ（すなわち、ＴＴＣＦの、５２ｋＤａ、非毒性のＣ末断片）をモデル抗原として選択した（Ａｍａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５７：１９０３〜１９１５，２００７）。したがって、本明細書で開示される方法において、ＴＴＣＦを使用し、対象の大規模なプールを検証することができた。しかしながら、当業者であれば、一般的な手法を用い、任意の疾患に関連する抗原を包含するよう、本方法を改変することができることは理解するであろう。以降に例示される通り、このような改変は、癌関連抗原であるＭＩＣＡおよびアンジオポエチン−２を抗原とする抗体を獲得することにより示される。
【０１４４】
実施例１：抗原の発現および四量体の形成
以下にさらに詳細に記載される通り、ＴＴＣＦは大腸菌（Eschericia coli）において発現させ、ＢｉｒＡ酵素による部位特異的モノビオチン化のためＢｉｒＡ部位をＮ末端に取り付けた。タンパク質とビオチン化部位の間に可動性リンカーを配置し、抗体の結合に関係する立体障害を回避した。ＴＴＣＦは、アニオン交換クロマトグラフィーにより精製し、ＢｉｒＡによりビオチン化し、ゲル濾過クロマトグラフィーにより、未結合のビオチンおよびＢｉｒＡから分離した。蛍光標識したストレプトアビジンを、モル比１：４でビオチン化ＴＴＣＦ抗原とインキュベートし、ＴＴＣＦ四量体を生成した。これらの四量体を、次に一連のｍＡｂとともに使用して、破傷風トキソイドに特異的な記憶Ｂ細胞を同定した。
【０１４５】
ＴＴＣＦをｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Eschericia coli）において、１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により２８℃で４時間タンパク質発現を誘導した。細胞を洗浄し、溶解し、得られる上清を回収した。ＨＩＳ−選択親和性カラム（Ｓｉｇｍａ）を使用して、ＴＴＣＦを精製した。タンパク質分解によりＨｉｓタグを除去した。同様の方法を用い、マウスＣＤ８０膜近位ドメインを産生した。タンパク質をモノビオチン化した。特定の実験に際し、Ａｌｅｘａ−４８８染料分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、ビオチン化ＴＴＣＦまたはＣＤ８０の一級アミンに連結した。
【０１４６】
ビオチン化抗原を、モル比４：１で特級ＰＥ標識ストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と少なくとも２０分間氷上でインキュベートし、抗原四量体を調製した。使用に先立ち、四量体抗原を遠心分離し、凝集体を除去した。一部の実施例では、四量体は、４：１比のＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ−４８８標識抗原と非蛍光ストレプトアビジンとにより形成させた。
【０１４７】
実施例２：特定方法
Ｆｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１８（２）：３４８〜３５７（２０１１）に記載の通りに方法を実施した。
【０１４８】
細胞は、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ細胞選別機で分取した。細胞は単一細胞として分取した。サンプルからは、最初に、一連の除外マーカー（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、７ＡＡＤ）が陰性のＣＤ１９＋細胞をゲーティングし、次に、ＣＤ２７を高発現しかつＣＤ１９を即時的に（immediate level）発現していると同定された形質芽球をゲーティングし、最後に四量体＋  ＣＤ１９＋細胞をゲーティングした。
【０１４９】
記憶Ｂ細胞は低頻度であることから、注意深く、可能な限りバックグラウンドを減少させる必要があった。Ｂ細胞は、最初はネガティブ選別により濃縮し（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ５６およびグリコホリンＡに対する抗体カクテル）、四量体に非特異的に結合し得る大部分の細胞を除去した。濃縮細胞を均一に分注し、ＴＴＣＦまたは対照四量体により染色した後、ＣＤ１９、ＣＤ２７およびＩｇＭにより標識して、クラススイッチした記憶Ｂ細胞を特異的に選択した。ゲーティング戦略では、ＣＤ１９を発現し、一連の除外マーカー（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、７ＡＡＤ）による標識を欠き、メモリーマーカーＣＤ２７を発現し、かつＩｇＭの発現を欠くことをクラススイッチのエビデンスとしてみなした。対象とする抗原に特異的な記憶Ｂ細胞を可視化するため、四量体の染色をＣＤ２７染色に対しプロットした。ｍＲＮＡ抽出緩衝液３μＬを入れたＰＣＲ用ストリップチューブに、四量体陽性のＢ細胞を直接分取した。
【０１５０】
分取の間チューブは冷温に維持し、分取した細胞は凍結し、−８０℃で保管した。ＣＤ１９＋  ＣＤ２７＋  ＩｇＭ−Ｂ細胞を陽性対照として使用した。
【０１５１】
既存のネステッドＰＣＲプロトコルを使用して、重鎖および軽鎖可変領域を増幅した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，２４４：２１７〜２２５，２０００）。混入を最小限に抑えるのに適切な条件下でｍＲＮＡの増幅を行った。使用したプライマーは次のものを含む：
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧ（配列番号：９１）；
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＧＡＡＧＴＴＡＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＣ（配列番号：９２）；
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＡＧＲＴＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＣ（配列番号：９３）。
【０１５２】
Ｆｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１８（２）：３４８〜３５７（２０１１）に記載の通りにネステッドＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【０１５３】
混入をモニターし、予防するため、陰性対照を包含させた。ＴＴＣＦ四量体により標識した計３５の単一細胞から、３２の重鎖および３０の軽鎖断片を増幅させ、ＰＣＲ産物をゲルから精製し直接配列決定したところ、最終的なＰＣＲ効率は８９％に相当した。配列解析により、ＴＴＣＦ四量体＋細胞では、特定の遺伝子配列が優先されることはなく、異なる多様なＶＨＤ−ＪＨ遺伝子配列が選択されていたことが明らかになった。観察された配列により、クローンにおいて、体細胞突然変異により細胞が多様化していることが支持された。
【０１５４】
抗体産生および精製には、重鎖および軽鎖可変ドメインのＤＮＡを、ウシプロラクチンシグナルペプチド配列並びに完全長のＩｇＧ１またはκ軽鎖定常ドメインを含有している別個のｐｃＤＮＡ３．３発現ベクターにクローニングすることを包含させた。抗体は、３７℃、８％  ＣＯ２下で、１００ｍＬ培養フラスコを用い、８ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＣＨＯ−Ｓ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で発現させた。遺伝子導入の一日前に、細胞は６×１０５個／ｍＬとして分取した。遺伝子導入の当日に、必要があれば細胞は１×１０６個／ｍＬに調整した。ＭＡＸ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２５μｇの重鎖および軽鎖プラスミドＤＮＡを同時導入し、遺伝子導入した細胞を６〜８日間培養した。プロテインＧセファロースビーズを用いてタンパク質を得て、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）を使用して抗体を溶出し、Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心チューブを使用してビーズから分離した。マイクロバイオスピンカラム（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、精製抗体をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に移した。タンパク質濃度は吸光度（２８０ｎｍ）により評価した。
【０１５５】
飽和結合アッセイに関し、非ビオチン化、ＭｏｎｏＱ精製ＴＴＣＦをユーロピウムにより標識し、未結合のユーロピウムを除去した。９６ウェル平底プレートの各ウェルを、２０ｎｇの抗体を含む１００ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．６）により一晩コーティングした。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびウシγグロブリンを添加したアッセイ緩衝液を用い、ブロッキングを行った。アッセイ緩衝液によりＴＴＣＦ−ユーロピウムを希釈し（１００ｎＭ〜４ｐＭ）、３ウェル１組で各ウェルに２００μＬずつ分注した。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、２００μＬの洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０μＭのＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した。各ウェルに１００μＬの増感液を加え、Ｖｉｃｔｏｒ３プレートリーダーを６１５ｎｍで使用して、蛍光をカウントした。
【０１５６】
ソフトウェアＩＭＧＴ／Ｖ−ＱｕｅｓｔおよびＪＩＯＮＳＯＬＶＥＲを使用し、重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を解析した。ＦｌｏｗＪｏ解析ソフトウェアを使用し、フローサイトメトリーデータを評価した。ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を使用し、独立ｔ検定により統計解析を実施した。抗体のＫＤ値を測定するため、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を使用して、非線形回帰分析により飽和結合データを当てはめた。
【０１５７】
実施例３：多量体化により記憶Ｂ細胞の識別が促進される
ＴＴＣＦ四量体および単量体を比較した。Ａｌｅｘａ−４８８によりＴＴＣＦを蛍光標識し、次に単量体形態で使用するか、あるいは未標識のストレプトアビジンを使用して四量体に変換した（上記を参照されたい）。次に、濃縮Ｂ細胞を、同濃度のＴＴＣＦ−Ａｌｅｘａ−４８８四量体または単量体とインキュベートした。対照タンパク質（ＣＤ８０膜近位ドメイン）を同様の方法で標識し、同様に四量体として使用した。
【０１５８】
図２２Ａおよび２２Ｂに示す通り、３つのドナー由来の細胞を使用したところ、ＴＴＣＦ単量体では一部の記憶Ｂ細胞が標識されていたのに対し、四量体では識別頻度は大幅に増大した（１．６〜７．３倍）。３つのＴＴＣＦ特異的記憶Ｂ細胞のドナーのうちの１つは四量体により検出されたが、単量体では検出されなかった。
【０１５９】
これらの結果から、末梢血に存在する記憶Ｂ細胞は非常にわずかであるにもかかわらず、抗原四量体により、ＢＣＲの抗原特異性に基づき、記憶Ｂ細胞を高感度に検出することが可能になることが示される。ＴＴＣＦ特異的にクラススイッチした記憶Ｂ細胞は、適切なＴＴＣＦ抗原四量体により高感度に標識されたのに対し、四量体型の対照により標識されたバックグラウンドは一貫して低かった。
【０１６０】
実施例４：方法／抗体の確認
オーバーラップＰＣＲにより、ＩｇＧ重鎖およびκ鎖の定常部を、単離された可変配列と連結して、完全ヒト型抗体を生成した。ＣＨＯ−Ｓ細胞を使用し、無血清哺乳類発現系により、６〜８日間にわたって抗体を一過性に発現させた。プロテインＧおよびゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、抗体を精製した。
【０１６１】
図２３に示す通り、ＴＴＣＦ特異的形質芽球から単離された抗体は、ＴＴＣＦ抗原に対し、ＫＤ＝２．２ｎＭ（ＴＴＣＦ  Ａｂ  １）および３２３ｐＭ（ＴＴＣＦ  Ａｂ  ２）の高結合親和性を示した（図２３Ｂ）。記憶Ｂ細胞から単離した抗体は、他の抗体に対しても、ＫＤ＝３８２ｐＭ、２２８ｐＭ、および１．４ｎＭの高結合親和性を示した（ＴＴＣＦ  Ａｂｓ  ３、４および５）（図２３Ｂ）。
【０１６２】
これらのデータにより、本明細書で開示される方法の特異性が支持される。さらには、本明細書に記載の方法の特異性は、３の異なるドナーから５種の抗ＴＴＣＦ抗体を構築することによっても実証され、これらのすべての抗体は高親和性でＴＴＣＦと結合した。
【０１６３】
本明細書に示すデータは、宿主由来の抗原が排除されてから長時間が経過した後でも、抗原四量体により、記憶Ｂ細胞を高感度に検出することができることも実証する。
【０１６４】
実施例５：抗ＭＩＣＡ抗体の取得
本明細書に記載の方法を使用して、ＭＩＣＡに対し免疫特異的に結合する抗体を作製した。
【０１６５】
簡潔に述べると、抗原のモノビオチン化を可能にするＣ末端ＢｉｒＡタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号２３８））とともに、ＭＩＣＡ抗原（ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．１３０８３８）を発現させた。Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）で標識したストレプトアビジン（ＳＡ）により、抗原を四量体化した（ＭＩＣＡ：ＳＡのモル比４：１）。ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクター（ＧＶＡＸ）（ＰＮＡＳ  １０３：９１９０、２００６）により遺伝子導入した自己腫瘍細胞をワクチン接種した進行期黒色腫患者から末梢血単核細胞を得て、次に抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂから入手可能））により処理した。末梢血単核細胞を迅速に解凍し、洗浄し、２％のウシ胎児血清を添加したリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）により５×１０６にて再懸濁し、約０．１ｕｇ／ｍＬの四量体により氷上で３０分間染色した。クラススイッチした記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋、かつＩｇＭ−）を識別するため、抗体を加えた。Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、および死細胞を標識する一連の排除抗体をインキュベートして、四量体によるバックグラウンドの染色を軽減させた（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、７−ＡＡＤ）。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩを使用し、ＭＩＣＡ四量体と結合する単一のＢ細胞をＰＣＲ用８連ストリップチューブに分取した。以下に記載の遺伝子特異的なプライマーを使用して、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販のキット（カタログ番号ＭＢＣＬ９０３１０）により、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）のｍＲＮＡを増幅した。
ｍＲＮＡの増幅
ＩｇＧ−Ｔ７：ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧ（配列番号：９４）
κ−Ｔ７：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＧＡＡＧＴＴＡＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＣ（配列番号：９５）
λ−Ｔ７：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＡＧＲＴＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＣ（配列番号：９６）
【０１６６】
第１回目のＰＣＲ
ＶＨＬ−１：ＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧ（Ｃ／Ｇ）ＡＣＣＴＧＧＡ（配列番号：９７）
ＶＨＬ−２：ＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＡＣＴＴＴＧ（Ｃ／Ｔ）ＴＣＣＡＣ（配列番号：９８）
ＶＨＬ−３：ＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣ（配列番号：９９）
ＶＨＬ−４：ＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＡＣＡ（Ｃ／Ｔ）ＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴ（配列番号：１００）
ＶＨＬ−５：ＡＴＧＧＧＧＴＣＡＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＴ（配列番号：１０１）
ＶＨＬ−６：ＡＣＡＡＴＧＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＡＴ（配列番号：１０２）
ＶｋＬ−１：ＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧ（配列番号：１０３）
ＶｋＬ−２：ＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＡＡＴＧＣＴＣＴＧＧ（配列番号：１０４）
ＶｋＬ−３：ＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＴＣＴＧＧＣＴＣ（配列番号：１０５）
ＶｋＬ−４：ＣＡＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＴＴＣＴ（配列番号：１０６）
ＶｌＬ−１：ＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＴＣＣＴ（配列番号：１０７）
ＶｌＬ−２：ＣＴＣＣＴＣＡＣＴＣＡＧＧＧＣＡＣＡ（配列番号：１０８）
ＶｌＬ−３：ＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡ（Ｔ／Ｃ）Ｃ（Ｃ／Ｇ）ＣＴＣＴＣＣ（配列番号：１０９）
ＣｇＩＩ：ＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＧＡＣ（Ｃ／Ｇ）ＧＡＴＧ（配列番号：１１０）
ＣｋＩＩ：ＴＴＴＣＡＡＣＴＧＣＴＣＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＧ（配列番号：１１１）
ＣｌＩＩ：ＡＧＣＴＣＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＧ（Ｃ／Ｔ）ＧＧ（配列番号：１１２）
【０１６７】
第２回目のＰＣＲ
ＶＨ−１：ＣＡＧＧＴ（Ｇ／Ｃ）ＣＡＧＣＴＧＧＴ（Ｇ／Ａ）ＣＡＧＴＣ（配列番号：１１３）
ＶＨ−２：ＣＡＧ（Ａ／Ｇ）ＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号：１１４）
ＶＨ−３：（Ｇ／Ｃ）ＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣ（配列番号：１１５）
ＶＨ−４：ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号：１１６）
ＶＨ−５：ＧＡ（Ｇ／Ａ）ＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣ（配列番号：１１７）
ＶＨ−６：ＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣ（配列番号：１１８）
Ｖｋ−１：ＣＧ（Ａ／Ｃ）ＣＡＴＣＣ（Ａ／Ｇ）Ｇ（Ａ／Ｔ）ＴＧＡＣＣＣＡＧＴ（配列番号：１１９）
Ｖｋ−２：ＣＧＡＴ（Ａ／Ｇ）ＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣ（Ｃ／Ｔ）ＣＡＧ（配列番号：１２０）
Ｖｋ−３：ＣＧＡＡＡＴ（Ｔ／Ａ）ＧＴＧ（Ｔ／Ａ）ＴＧＡＣ（Ｇ／Ａ）ＣＡＧＴＣＴ（配列番号：１２１）
Ｖｋ−４：ＣＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴ（配列番号：１２２）
Ｖｌ−１：ＣＣＡＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣ（配列番号：１２３）
Ｖｌ−２：ＣＣＡＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣ（配列番号：１２４）
Ｖｌ−３：ＣＴＣＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣ（Ｔ／Ａ）ＣＡＧＣ（配列番号：１２５）
ＣｇＩＩＩ：ＧＡＣ（Ｃ／Ｇ）ＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡ（配列番号：１２６）
ＣｋＩＩＩ：ＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣ（配列番号：１２７）
ＣｌＩＩＩ：ＧＧＧＡＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＧ（配列番号：１２８）
【０１６８】
第１のＰＣＲおよび第２のＰＣＲに使用したプライマーおよびＰＣＲのサイクル条件は、Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｏｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ２０００）に記載の方法をもとに最適化した。
【０１６９】
上記のプライマーセットにより十分に網羅されていない可能性のあった重鎖可変領域配列を網羅するよう、代替となる重鎖可変領域の順方向プライマーのセットを開発した。以降の代替的なプライマーを作成した：
第１回目のＰＣＲ
ＶＨＬ１−５８：ＴＣＡＣＴＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＴＧＧＡ（配列番号：１２９）
ＶＨＬ２−５：ＣＣＡＴＧＧＡＣＡ（Ｃ／Ｔ）ＡＣＴＴＴＧ（Ｃ／Ｔ）ＴＣＣＡＣ（配列番号：１３０）
ＶＨＬ３−７：ＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＧＧＣＣ（配列番号：１３１）
ＶＨＬ３−１１：ＡＡＣＡＡＡＧＣＴＡＴＧＡＣＡＴＡＴＡＧＡＴＣ（配列番号：１３２）
ＶＨＬ３−１３．１：ＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴ（配列番号：１３３）
ＶＨＬ３−１３．２：ＡＧＴＴＧＴＴＡＡＡＴＧＴＴＴＡＴＣＧＣＡＧＡ（配列番号：１３４）
ＶＨＬ３−２３：ＡＧＧＴＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＴＡＧＡＡ（配列番号：１３５）
ＶＨＬ４−３９：ＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡ（Ｃ／Ｔ）ＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴ（配列番号：１３６）
ＶＨＬ４−６１：ＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＴＣ（配列番号：１３７）
ＶＨＬ−９：ＣＣＴＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＡＣＣＡＧＣＣＣ（配列番号：１３８）
【０１７０】
第２回目のＰＣＲ
ＶＨ１−３／１８：ＣＡＧＧＴ（Ｃ／Ｔ）ＣＡＧＣＴ（Ｔ／Ｇ）ＧＴＧＣＡＧＴＣ（配列番号：１３９）
ＶＨ１−４５／５８：ＣＡ（Ａ／Ｇ）ＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣ（配列番号：１４０）
ＶＨ２−５：ＣＡＧ（Ａ／Ｇ）ＴＣＡＣＣＴＴＧＡ（Ａ／Ｇ）ＧＧＡＧＴＣＴＧＧＴ（配列番号：１４１）
ＶＨ３−９／２３／４３：ＧＡ（Ａ／Ｇ）ＧＴＧＣＡＧＣＴＧ（Ｔ／Ｇ）ＴＧＧＡＧＴＣ（配列番号：１４２）
ＶＨ３−１６：ＧＡＧＧＴＡＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣ（配列番号：１４３）
ＶＨ３−４７：ＧＡＧＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣ（配列番号：１４４）
Ｖ４−３４：ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＡＧＴＧ（配列番号：１４５）
Ｖ４−３０−２／３９：ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号：１４６）
ＶＨ７−４−１：ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＣ（配列番号：１４７）
【０１７１】
簡潔に述べると、初回のＰＣＲには、ｍＲＮＡ増幅により生成したｃＤＮＡ  ２ｕＬをテンプレートとして使用し、次のサイクル条件を用いた：前増幅３サイクル（９４℃／４５秒、４５℃／４５秒、７２℃／１０５秒）；増幅３０サイクル（９４℃／４５秒、５０℃／４５秒、７２℃／１０５秒）；最終的な伸長、７２℃／１０分。
【０１７２】
初回のＰＣＲ産物３ｕＬを、第２回目のネステッドＰＣＲのテンプレートとして使用した。３サイクルの前増幅を省略したことを除き、初回のＰＣＲと同様のサイクル条件を使用した。いずれのＰＣＲ工程も、クローン化したＰｆｕポリメラーゼＡＤ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで分離し、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ  ＤＮＡゲル回収キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、大きさにして３００〜４００ヌクレオチドを単離した。第２回目のネステッドＰＣＲ用の順方向および逆方向プライマーを使用して、配列決定を実施した。２段階ネステッドＰＣＲにより、重鎖および軽鎖のＢＣＲ可変ドメインを増幅する（上記を参照のこと）。ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクター（ＧＶＡＸ）により遺伝子導入した自己腫瘍細胞をワクチン接種した進行期黒色腫患者から、末梢血単核細胞を得た（ＰＮＡＳ  １０３：９１９０，２００６）。完全長のＩｇＧ１抗体として、ＣＨＯ−Ｓ発現系において抗体を発現させた。
【０１７３】
２つの独立したビーズ系アッセイにより、ＭＩＣＡに結合する抗ＭＩＣＡ抗体を検証した。初回アッセイには、各種ＭＩＣＡ対立遺伝子産物（Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ、カタログ番号ＬＳＭＩＣＡ００１）に対し、抗ＭＩＣＡ抗体の検出用に設計された市販の溶液系ビーズアッセイキットを使用した。各種濃度のＭＩＣＡ抗体をビーズとともにインキュベートし、次に洗浄し、フィコエリトリンと結合させた抗ヒトＩｇＧ抗体とともにインキュベートした。２次洗浄工程後に、装置Ｌｕｍｉｎｅｘでビーズを解析した。陰性対照は、フィコエリトリンのみ（抗ＭＩＣＡ抗体は含まない）と結合させた抗ヒトＩｇＧ抗体を備えるビーズをインキュベートしたものから構成された。陽性対照は、フィコエリトリンと直接結合させた市販の抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢモノクローナル抗体（クローン６Ｄ４）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号３２０９０６）とビーズとをインキュベートしたものから構成された。第２のアッセイは、ストレプトアビジンと結合させたポリスチレンビーズを使用して、社内で開発した。ビーズはモノビオチン化ＭＩＣＡタンパク質によりコーティングし、各種濃度の抗ＭＩＣＡ抗体、抗ＴＴＣＦ抗体（アイソタイプ陰性対照）、またはフィコエリトリンと直接結合させたＢｉｏＬｅｇｅｎｄ抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体（陽性対照）とともにインキュベートした。抗ＭＩＣＡ抗体または抗ＴＴＣＦ抗体とインキュベートしたビーズを洗浄し、次にＡｌｅｘａ４８８を結合させた抗ヒトＩｇＧ抗体とともにインキュベートした。ビーズに結合するバックグラウンドを測定するため、比較のためＭＩＣＡタンパク質によりコーティングしていないストレプトアビジン結合ビーズを使用して、同様のインキュベートを実施した。抗体に対する結合について、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒフローサイトメーターによりビーズを解析した。
【０１７４】
図２４および２５に示す通り、抗ＭＩＣＡ抗体（ＭＩＣＡ−Ａｂ１２およびＭＩＣＡ−Ａｂ２０）は高親和性でＭＩＣＡと結合する。ＭＩＣＡ−Ａｂ２０は、表１に記載の抗ＭＩＣＡ抗体ＩＤ−１に相当する。
【０１７５】
実施例６：抗ＭＩＣＡ抗体
本明細書に記載の方法を使用して、生物学的特性と臨床的な相関を有するさらなる抗ＭＩＣＡ抗体を開発した。癌の細胞ワクチン（ＧＭ−ＣＳＦ形質導入された癌細胞、ＧＶＡＸとして参照）と、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ−４受容体に対するイピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂから入手可能））による阻害を遮断する抗体との接種を受けた患者において、共通の対立遺伝子産物と反応するＭＩＣＡ特異的抗体を同定した。次に、ＭＩＣＡ四量体を使用して、血清ＭＩＣＡの反応が最も高かった患者の末梢血単核細胞からＢ細胞を単離した。実施例５において概説する通り、単一細胞ＰＣＲにより、これらのＢ細胞から、重鎖および軽鎖配列を決定した。この試行により、北アメリカの人口集団において共通する対立遺伝子産物を認識する抗体を同定した。
【０１７６】
ＣＭ２４００２  Ａｂ２（表１に記載される抗ＭＩＣＡ抗体ＩＤ−６）は、ＧＶＡＸ＋イピリムマブ併用療法に対し臨床的に有意な応答を示し、かつ血漿がＭＩＣＡと強力に反応した、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者から単離された抗体である。ＣＭ２４００２  Ａｂ２軽鎖（図３０および３１）および重鎖（図２８および２９）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列に下線を引き、示す。同様の患者から、強力な結合性を有するさらなる抗体を得て、ＣＭ２４００２  Ａｂ４（表１に記載の抗ＭＩＣＡ抗体ＩＤ−７）と標識した。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列に下線を引き、ＣＭ２４００２  Ａｂ４軽鎖（図３４および３５）および重鎖（図２３および３２）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【０１７７】
ＣＭ３３３２２  Ａｂ１１（表１に記載の抗ＭＩＣＡ抗体ＩＤ−８）およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９（表１に記載の抗ＭＩＣＡ抗体ＩＤ−９）は、ＧＶＡＸ＋イピリムマブ併用療法に対し長期にわたって（＞１５年）応答を示す、転移性黒色腫患者から単離された抗体である。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列に下線を引き、ＣＭ３３３２２  Ａｂ１１軽鎖（（図３８および３９）および重鎖（図３６および３７）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列に下線を引き、ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９軽鎖（図４２および４３）および重鎖（図４０および４１）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。この患者が長期にわたって臨床応答を示したため、これらの抗体を特に対象とする。
【０１７８】
最初に、対象とする抗体を同定、クローニング、および発現させた後、異なるＭＩＣＡ対立遺伝子産物に対するこれらの抗体の特異性を、細胞数測定ビーズアッセイにより評価した。簡潔に述べると、可溶性の組換えＭＩＣＡ対立遺伝子産物００２、００８、００９と、単一のＢｉｒＡビオチン化部位を有するＭＩＣＢとを発現させ、精製し、およびストレプトアビジンビーズで捕捉した。次に、記載の抗ＭＩＣＡ抗体を、組換えＭＩＣＡによりコーティングした異なる濃度のビーズとともに１時間インキュベートし、次に洗浄し、ＦＩＴＣで標識した抗ヒトＩｇＧ二次抗体とともにインキュベートした。２回目の洗浄工程後、フローサイトメトリーにより、ビーズの結合したＦＩＴＣの蛍光の定量を完了した。北アメリカの人口集団における有病率に基づき、ＭＩＣＡ対立遺伝子産物００２、００８、００９並びに関連するＭＩＣＢタンパク質を選択した（図４８）。世界的に見て一般に罹患率が高いことから、ＭＩＣＡ対立遺伝子産物００２、００８、００９並びに関連するＭＩＣＢタンパク質も選択した。重要なことに、ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９は、すべてのＭＩＣＡ対立遺伝子産物並びにＭＩＣＢに強力に結合した。他に２つの抗体が対立遺伝子産物のサブセットに結合した：ＣＭ２４００２  Ａｂ４はＭＩＣＡ＊００９およびＭＩＣＢに強力に結合し、ＣＭ３３３２２  Ａｂ１１はＭＩＣＡ＊００２、ＭＩＣＡ＊００８、およびＭＩＣＢに強力に結合した（図４８Ａ〜Ｆ）。同様の手法により生成したヒト陰性対象抗体（破傷風トキソイドＣ末端断片、すなわちＴＴＣＦ特異的抗体）、並びに抗ＭＩＣＡ陽性対照抗体（ＭＩＣＡを抗原とする、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから市販のマウス抗体）を使用し、特異性を実証した。これらの試験により、ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９を、臨床応用に有望な候補として同定した。
【０１７９】
実施例７：自己腫瘍細胞に対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合
フローサイトメトリーにより、単離した抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２  Ａｂ２の自己腫瘍細胞への結合能を評価した（図４９）。患者ＣＭ２４００２から骨髄を得て、ＣＭ２４００２  Ａｂ２により、腫瘍細胞への結合を試験した。次に、骨髄試料から、ＣＤ３３＋  ＣＤ３４＋細胞として腫瘍細胞を同定した。次に、腫瘍細胞を、１０μｇ／ｍＬの、抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２  Ａｂ２、陽性対照の市販のＭＩＣＡ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、または陰性対照抗体（ＴＴＣＦ特異性）により染色した。図４９に示す通り、ＣＭ２４００２  Ａｂ２はこれらの細胞に強力に結合した。ＣＭ２４００２  Ａｂ２は非腫瘍細胞（ＣＤ１６＋およびＣＤ３＋細胞）に対し結合を示さず、バックグラウンドの結合のみがＣＤ１４＋細胞にみられたことから、抗腫瘍特異性が実証された（データ不掲載）。
【０１８０】
実施例８．抗ＭＩＣＡ抗体によるＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体の阻害
単離された抗ＭＩＣＡ抗体ＣＭ２４００２  Ａｂ２が、同族受容体であるＮＫＧ２Ｄによる可溶性ＭＩＣＡ介在性の下方制御を妨げる能力を評価した。患者由来の血清ＣＭ２４００２を１：１０希釈して使用して、ヒトＮＫ細胞とともに４８時間インキュベートした。これらの培養物に、ＣＭ２４００２  Ａｂ２（濃度１０μｇ／ｍＬ）、市販の陽性対照ＭＩＣＡ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）または陰性対照抗体（ＴＴＣＦ特異的）を加えた。４８時間の時点で、ＮＫＧ２Ｄの発現をフローサイトメトリーにより評価した（図５０）。患者由来の血清ＣＭ２４００２は、ＮＫＧ２Ｄの発現を強力に下方制御した（したがって、この受容体の機能を不能にした）。ＣＭ２４００２  Ａｂ２および陽性対照ＭＩＣＡ抗体は、ＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ｄの細胞表面での発現を部分的に回復した。特異性を実証するために、患者の血清の代わりに組換えＭＩＣＡ  ２ｎｇ／ｍＬとともに細胞をインキュベートして、上記の実験を繰り返した（図５１）。ＣＭ２４００２  Ａｂ２はＮＫＧ２Ｄ発現のＭＩＣＡ介在性の下方制御を完全に妨げたのに対し、陰性対照抗体（ＴＴＣＦ特異的）は効果を有さなかった（図５１）。これらのデータは、ヒトＮＫ細胞上の重要なＮＫＧ２Ｄ受容体の阻害は、ヒトＭＩＣＡ抗体により妨げられることを実証する。
【０１８１】
実施例９：抗ＭＩＣＡ抗体の細胞介在性細胞傷害
ＣＭ２４００２  Ａｂ２が細胞介在性細胞傷害を可能にするか評価するため、１０μｇ／ｍＬのＣＭ２４００２  Ａｂ２、陰性対照抗体（ＴＴＣＦ特異的）、または陽性対照抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の存在下で、ヒトＮＫ細胞（エフェクター細胞）を、組換えＭＩＣＡ（２ｎｇ／ｍＬ）とともに４８時間インキュベートした。４８時間後、細胞を洗浄し、エフェクター：標的比２０：１、１０：１、および５：１で、Ｋ５６２腫瘍細胞とともに４時間インキュベートした。ＮＫ細胞による標的細胞の特異的な溶解は、Ｋ５６２腫瘍細胞からの細胞質タンパク質（ＬＤＨ）の放出により測定した。ＭＩＣＡ抗体の非存在下においては、ＮＫ細胞によるＫ５６２腫瘍細胞の殺傷は観察されなかった。しかしながら、ＣＭ２４００２  Ａｂ２は、ＮＫ細胞介在性のＫ５６２腫瘍細胞の溶解を非常に促進させ、かつすべてのエフェクター：標的比において、マウスＭＩＣＡの陽性対照抗体よりも効果的であった（図５２）。（Ｆｃ受容体によりというよりは）ＮＫＧ２Ｄ経路によりＫ５６２腫瘍細胞の殺傷が実際に介在されることがさらに実証された。さらに２つの実験群（ＮＫＧ２ＤおよびヒトＦｃブロック用の遮断抗体による）を加え、上記の実験を繰り返した。加えて、ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９も試験した。データから、ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９を加えることで、ＮＫ細胞介在性細胞傷害が可能になることが示される。ＮＫＧ２Ｄ遮断抗体を加えた場合にはＫ５６２細胞の殺傷は生じなかったのに対し、Ｆｃ遮断試薬の場合にはわずかに効果が示された（図５３）。これらのデータは、ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９がＮＫＧ２Ｄ経路の抗腫瘍機能を回復させることを示す。
【０１８２】
実施例１０：ＭＩＣＡドメインα３に対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合
ＮＫＧ２Ｄ受容体は、ＭＩＣＡのα１およびα２ドメイン頂部に結合するため、同じ部位に結合する抗体は、ＮＫＧ２Ｄ受容体と競合し、ＮＫ細胞による腫瘍細胞の殺傷を妨げる可能性がある。α３ドメインに結合する抗体は、ＮＫＧ２Ｄ受容体の結合を遮断できないため、特に対象となる。同時に、このような抗体は、タンパク質分解による腫瘍細胞表面からのＭＩＣＡの切断に干渉し得る。ＭＩＣＡ  α３ドメインに対する抗ＭＩＣＡ抗体の性能を、前述の細胞数測定ビーズアッセイにより評価した。ビオチン化組換えタンパク質をストレプトアビジンビーズ上に捕捉した。次に、ビーズを、１０μｇ／ｍＬの抗体ＣＭ２４００２  Ａｂ２、ＣＭ２４００２  Ａｂ４、ＣＭ３３３２２  Ａｂ１１、ＣＭ３３３２２  ＡＢ２９、陰性対照の抗体（ＴＴＣＦ特異的）、または陽性対照の抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）とともにインキュベートし、続いてＦＩＴＣにより標識した抗ヒトＩｇＧ二次抗体とともにインキュベートし、ビーズに結合したＦＩＴＣ蛍光をフローサイトメトリーにより定量した（図５４）。図５４に示す通り、ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９はＭＩＣＡ  α３ドメインに結合するため、治療応用に関し非常に興味を引く。
【０１８３】
実施例１１：腫瘍細胞に対する抗ＭＩＣＡ抗体の結合
広範な癌を標的とした際のＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９の使用可能性を評価した。ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９による標識性について、多発性骨髄腫（ＲＰＭＩ  ８２２６およびＸｇ−１）、卵巣癌（ＯＶＣＡＲ３）、急性骨髄性白血病（Ｕ９３７）、黒色腫（Ｋ０２８）、肺癌（１７９２および８２７）、および乳癌（ＭＣＦ７）細胞をひと通り試験した。１％  ＢＳＡを添加したＰＢＳに、腫瘍細胞を１×１０６個／ｍＬの濃度で再懸濁し、１０μｇ／ｍＬの、ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９、並びに陽性および陰性対照（それぞれマウスＭＩＣＡ抗体およびＴＴＣＦ−特異的抗体）（直接的に結合させたもの）により４℃で１時間染色した。フローサイトメトリーにより標識を評価した（図５５）。試験した細胞株の大部分に関し、ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９は、いずれも、市販の陽性対照により標識した場合と比較してより良好に各腫瘍細胞型に結合した。
【０１８４】
実施例１１：抗ＭＩＣＡ抗体のＭＩＣＡ対立遺伝子産物特異性
市販のＬｕｍｉｎｅｘアッセイを用い、ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９の対立遺伝子産物特異性を評価した。市販の試験キットは、単一のサンプルにおいて結合性を評価することを可能にする、それぞれ固有の蛍光特性を有するＬｕｍｉｎｅｘビーズに直接結合した組換えＭＩＣＡ対立遺伝子産物（ＭＩＣＡ＊００１、＊００２、＊００７、＊０１２、＊０１７、＊０１８、＊０２７、＊００４、＊００９、および＊０１５）を含有する。記載のＭＩＣＡ対立遺伝子産物によりコーティングしたＬｕｍｉｎｅｘビーズを、１０μｇ／ｍＬの、ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ陽性対照、および陰性対照（ＴＴＣＦ）とともに１時間インキュベートし、続いて、ＰＥを結合させた抗ヒトＩｇＧ二次抗体とともにインキュベートした。記載の抗体とともに６０分間インキュベートし、続いてＰＥ結合抗ヒト二次抗体とともにインキュベートした後、装置Ｌｕｍｉｎｅｘ  ２００を用い蛍光を測定した（図５６）。ＣＭ３３３２２  Ａｂ２９が市販のアッセイに存在するすべての対立遺伝子産物に結合し得たことから、この抗体はＭＩＣＡの遺伝子型とは関係なく患者に使用できることが示唆された。
【０１８５】
これらのデータにより、ＣＭ２４００２  Ａｂ２およびＣＭ３３３２２  Ａｂ２９の高生物活性と、これらの抗体の、ＮＫ細胞介在性の腫瘍細胞溶解能とが実証される。これらのデータは、免疫療法に応答性の癌患者が、ＮＫ細胞の抗腫瘍活性を回復したＭＩＣＡ抗体を産生したことを実証する。あわせて、これらの結果により、癌患者において免疫抑制を克服する際に、および腫瘍崩壊を促進する際に、抗ＭＩＣＡ抗体が持ち得る治療能が強調された。
【０１８６】
実施例１２：抗アンジオポエチン−２抗体の入手
本明細書に記載の方法を用い、アンジオポエチン−２に結合する抗体を開発した。簡潔に述べると、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからビオチン化アンジオポエチン−２（ＵｎｉＧｅｎｅ  Ｈｓ．５８３８７０）を購入した。末梢血単核細胞を迅速に解凍し、洗浄し、２％ウシ胎児血清を添加したリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）に５×１０６で再懸濁し、約０．５ｕｇ／ｍＬのアンジオポエチン−２により氷上で３０分間染色した。２％  ＦＣＳ含有ＰＢＳ  ４ｍＬにより、細胞を２回洗浄した。次に、抗体を加え、クラススイッチした記憶Ｂ細胞（ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋、およびＩｇＭ−）、並びにＳＡ−ＰＥを同定し、Ｂ細胞表面に対しビオチン化アンジオポエチンにより標識を行った。四量体によるバックグラウンドの染色を軽減させるため、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、および死細胞を標識する一連の排除抗体を含有させた（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、７−ＡＡＤ）。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩを使用し、アンジオポエチン−２と結合する単一のＢ細胞をＰＣＲ用８連ストリップチューブに分取した。遺伝子特異的なプライマー（上記を参照のこと）を使用して、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販のキット（カタログ番号ＭＢＣＬ９０３１０）により、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）のｍＲＮＡを増幅した。２段階ネステッドＰＣＲにより、重鎖および軽鎖のＢＣＲ可変ドメインを増幅する（上記を参照のこと）。ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクター（ＧＶＡＸ）により遺伝子導入した自己腫瘍細胞をワクチン接種した悪性非小細胞肺癌患者から、末梢血単核細胞を得た（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０：１０１５０，２０１０）。完全長のＩｇＧ１抗体として、ＣＨＯ−Ｓ発現系において抗体を発現させた。
【０１８７】
ＥＬＩＳＡアッセイを用い、アンジオポエチン−２に結合する抗アンジオポエチン−２抗体の評価を行った。簡潔に述べると、４℃下で、９６ウェル平底プレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を、アンジオポエチン−２を４μｇ／ｍＬ含む１００ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）によりコーティングした。ウシ血清アルブミンおよびウシγグロブリン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含有させたアッセイ緩衝液により、室温で３時間プレートをブロッキングした。抗体を２０ｕｇ／ｍＬ〜０．１６ｕｇ／ｍＬでアッセイ緩衝液に希釈し、４℃で１時間インキュベートした。プレートを２００μＬ洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）により３回洗浄した。各ウェルに増感液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を１００μＬ加え、Ｖｉｃｔｏｒ３プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用い６１５ｎｍの波長で蛍光強度を測定した。ヒトアンジオポエチン−１および−４を結合性について試験した所、これらについても同様の反応性が示された。
【０１８８】
相関データを図２７Ａ〜２７Ｃに示す。これらの図では、肺癌患者からのアンジオポエチン特異的抗体の単離についてのグラフおよびゲルが提供される。（Ａ）肺癌患者（Ｌ１９）の血清（１：１０００希釈）のアンジオポエチン−２の反応性をＥＬＩＳＡにより評価。血清の採取日をＸ軸に示す。対照タンパク質のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は陰性対照として包含させた。（Ｂ）ＦＡＣＳプロットは、ＣＤ１９を有する、ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋ＩｇＭ−Ｂ細胞をＸ軸に、蛍光タグを付したアンジオポエチン−２をＹ軸にゲーティングしたＰＢＭＣサンプル（タイムポイント−１０／９８）を示す。このゲートにより、選別のカットオフを行ったおおよその位置を示す。このサンプルから１０種のＢ細胞を選別した。（Ｃ）患者Ｌ１９から単離したアンジオポエチン−２反応性記憶Ｂ細胞１０種からの重鎖、軽鎖、およびヒンジ領域のＰＣＲ産物。第２回目のネステッドＰＣＲ後の重鎖（上図）および軽鎖（下図）ＰＣＲ産物（約３５０ｂｐ）。
【０１８９】
実施例１３：ヒト組換え型アンジオポエチンファミリーメンバーに対する抗アンジオポエチン−２抗体の結合
４μｇ／ｍＬの組換え型アンジオポエチン−１、−２、および−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）により、９６ウェルプレートを一晩コーティングした。続いて、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とウシγ−グロブリンを含有させたアッセイ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により、プレートを室温で３時間インキュベートした。２０μｇ／ｍＬ〜０．１６μｇ／ｍＬで希釈した抗体ＩＤ２、３、４、および５（表１を参照のこと）をプレートに入れ、４℃で１時間、振盪しながらインキュベートした。続いて、プレートを洗浄した後、抗ヒトＩｇＧ−ユーロピウム抗体（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）とともにインキュベートした。プレートリーダーにより、６１５ｎｍでの蛍光強度を得た。陰性対照抗体（クローン８．１８．Ｃ５）を使用して、特異性を評価した。データは２ウェル１組で測定して評価した。
【０１９０】
図２６Ａ〜２６Ｃに示す通り、抗体ＩＤ２、３、４、および５（表１を参照のこと）は、高特異性でアンジオポエチン−１、−２、および−４と結合する。抗体は、構造的に関連するタンパク質Ａｎｇ−ｌｉｋｅ−３には結合しない（図２６Ｄを参照のこと）。
【０１９１】
本明細書に記載の方法を用い、生物学的特性に臨床的に相関を有するよう設計された、その他の抗アンジオポエチン抗体、すなわち抗Ａｎｇ２  Ａｂ６（表１に記載の抗ＭＩＣＡ抗体ＩＤ−１０）を開発した。抗Ａｎｇ２  Ａｂ６のヒト組換え型アンジオポエチンファミリーメンバーへの結合性を上記の通り解析した。簡潔に述べると、４μｇ／ｍＬのアンジオポエチン群、すなわち、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、およびＡｎｇ−ｌｉｋｅ−３を結合させてＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、２０μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、０．８μｇ／ｍＬ、および０．１６μｇ／ｍＬ濃度の抗Ａｎｇ２  Ａｂ６により検出した。ユーロピウム複合抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用し、４５分後にユーロピウム数を測定した。図５７に示す通り、抗Ａｎｇ２  Ａｂ６は、用量依存的な様式ですべてのアンジオポエチンに結合する。
【０１９２】
その他の実施の形態
本発明は、発明を実施するための形態と組み合わせて記載したが、前述の記載は、例示目的のものであり、本発明の範囲を制限するものではないことは理解されるであろう。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義される。以降の特許請求の範囲内に含まれるその他の態様、利点、および改変も存在する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５Ａ−Ｅ】
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【図２５Ｆ−Ｊ】
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【図２５Ｋ−Ｏ】
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【図２６Ａ−Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８Ａ−Ｇ】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【配列表】
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