(57)【要約】【課題】ＤＮＡシーケンサー用ＤＮＡライブラリーの種類（サイズ、ＧＣ含量）による影響を受けることなく、正確に定量することができる核酸増幅用組成物を提供する。【解決手段】ＧＣ含量が７０％以上またはサイズが６００ｂｐ以上のＤＮＡシーケンサー用ＤＮＡライブラリーサンプルを定量するための組成であって、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、特にサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属又はパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属由来のＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＣ含量が７０％以上のＤＮＡシーケンサー用ＤＮＡライブラリーサンプルを定量するための組成であって、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用組成物。
【請求項２】
サイズが６００ｂｐ以上のＤＮＡシーケンサー用ＤＮＡライブラリーサンプルを定量するための組成であって、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用組成物。
【請求項３】
前記ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼがサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属又はパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属由来である請求項１または２に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項４】
前記ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼがサーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来である請求項３に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項５】
前記サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属由来のＤＮＡポリメラーゼが３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損していることを特徴とする請求項３または４に記載の核酸増幅用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅の分野に関する。さらに詳しくは、大規模シーケンスである次世代ＤＮＡシーケンサー用ライブラリー定量のための核酸増幅用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡシーケンス解析は遺伝子情報を解析するうえで、重要な基本手段である。近年、ＤＮＡシーケンス解析の中でも、従来のキャピラリーシーケンサーと比較して、短時間で膨大なＤＮＡ情報を得ることができる次世代シーケンサーが台頭し、注目を集めている。例えば、ＤＮＡ断片をテンプレートとし、１塩基ずつ再合成する時の蛍光強度を検出し、塩基配列を決定する方法が挙げられる。次世代シーケンシングは、数千から数百万ものＤＮＡ分子を同時に配列決定可能な技術である。次世代シーケンシングでは、複数個体を同時に配列決定できるなど高度かつ高速な処理が可能であることから、個の医療、遺伝性疾患、および臨床診断学といった分野に変革をもたらしている。
【０００３】
このように、次世代シーケンサーの大きなメリットは、短時間で膨大なＤＮＡ情報が得られることであり、遺伝学、分子生物学から臨床医学と幅広い分野に応用されている。
次世代シーケンサーでは膨大なデータが得られるが、予め濃度が判明しているＤＮＡライブラリーサンプルのロード量が正確でないと、得られるデータの量および質の低下を招くため、ライブラリーサンプル濃度の定量を正確に求めることが重要となる。
【０００４】
ライブラリー濃度の定量方法として、分光光度測定（Ｎａｎｏｄｒｏｐなど）や蛍光測定（Ｑｕｂｉｔ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎなど）がある。しかし、これらの測定法ではイルミナ社次世代ＤＮＡシーケンサーの場合、フローセル上に結合するＰ５、Ｐ７タグが付加されていないＤＮＡも測定するため、有効なライブラリーの濃度を正確に求めることができないという問題がある（非特許文献１）。
【０００５】
一方、リアルタイムＰＣＲによる定量では、ＤＮＡライブラリーに付加されたタグ配列にアニーリングするように設計されたプライマーを使用するため、フローセル上に結合する有効なライブラリーの濃度を正確に定量でき、安定したデータを得ることができる。
【０００６】
しかし、リアルタイムＰＣＲ試薬によく使われているＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼではライブラリーの増幅サイズが長い場合もしくはＧＣ含量の高い場合には増幅が困難となり、正確な定量ができない場合が多かった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  第６巻、第１−１０頁（２０１６年４月６日発行）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、ＤＮＡライブラリーの種類（サイズ、ＧＣ含量）の如何に依らず、正確にターゲットを定量することができる核酸増幅用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意検討した結果、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、従来では困難であった長い鎖長のＤＮＡライブラリーやＧＣ含量が高いＤＮＡライブラリーを正確に定量できることを見出し、本発明に到達した。
【００１０】
項１．ＧＣ含量が７０％以上のＤＮＡシーケンサー用ＤＮＡライブラリーサンプルを定量するための組成であって、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用組成物。
項２．サイズが６００ｂｐ以上のＤＮＡシーケンサー用ＤＮＡライブラリーサンプルを定量するための組成であって、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用組成物。
項３．前記ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼがサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属又はパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属由来である項１または２に記載の核酸増幅用組成物。
項４．前記ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼがサーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来である項３に記載の核酸増幅用組成物。
項５．前記サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属由来のＤＮＡポリメラーゼが３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損していることを特徴とする項３または４に記載の核酸増幅用組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、ライブラリーの種類（サイズ、ＧＣ含量）の如何に依らず、ターゲットを正確に定量できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例２において、ＤＮＡライブラリーのサイズによる比較を検討した結果を示す図である。
【図２】実施例４において、ＤＮＡライブラリーのＧＣ含量による比較を検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の実施形態の一つは、ＧＣ含量が７０％以上、好ましくは７５％以上のＧＣリッチなターゲットを増幅することが可能である、ＤＮＡシーケンサー用ＤＮＡライブラリーサンプルを定量するための組成であって、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用組成物である。
【００１４】
また、本発明の別な実施態様としては、サイズが６００ｂｐ以上、好ましくは７００ｂｐ以上、より好ましくは８００ｂｐ以上の長鎖のターゲットを増幅することが可能である、ＤＮＡシーケンサー用ＤＮＡライブラリーサンプルを定量するための組成であって、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用組成物である。
【００１５】
本発明において、「ＤＮＡシーケンサー」とは、ＤＮＡの塩基配列を読み取り解析する装置を意味する。特に、膨大なシーケンシング反応を高速処理できる装置を次世代シーケンサーと呼ぶ。
【００１６】
本発明における「ＤＮＡシーケンサー用ＤＮＡライブラリー」とはシーケンサー用に調製された様々なＤＮＡ断片の集まりを意味する。
【００１７】
本発明におけるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである。古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢのＰｏｌ  Ｉ型又はＰｏｌ  ＩＩ型のいずれかに属する。
【００１８】
本発明においては、好ましくはＰｏｌ  Ｉ型に属するＤＮＡポリメラーゼである。ファミリーＢのＰｏｌ  Ｉ型に属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｒｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｒｉｏｓｕｓ、Ｐｒｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＧＢ−Ｄ、Ｐｒｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  Ｗｏｅｓｉｉ、Ｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｉｉ、Ｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｓｓｕ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＪＤＦ−３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｓｕ  ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅ  Ｎｏｒｔｈ−７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９°Ｎ−７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｓｕ  ｓｐ．ＫＳ−１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ、又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｓｕ  ｓｉｃｕｌｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。これらのＤＮＡポリメラーゼは市販されており、Ｐｆｕ（Ｓｔａｒａｇｅｎｅ）、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｐｗｏ（Ｒｏｃｈｅ）などがある。
【００１９】
本発明において、本発明においてファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損しているものが好ましい。ここで、３‘−５’エキソアーゼ活性とは、取り込まれたヌクレオチドをＤＮＡ重合体の３’末端から除去する能力を指す。
【００２０】
「３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損している」ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸の置換、欠失、または付加からなり得る。配列番号１における１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に対応するアミノ酸への改変を示す。より好ましくは、配列番号１における１４１、１４２、１４３、１４７、２１０、３１１番目に対応するアミノ酸のうちの少なくとも一つを改変したものである。より好ましくは、アミノ酸の改変が、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｉ１４２Ｒ、Ｎ２１０Ｄ、またはＹ３１１Ｆから選択されるいずれか一つである、３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＤＮＡポリメラーゼである。
【００２１】
なお、３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた（エキソ（−））ＤＮＡポリメラーゼとは、活性の完全な欠如を含み、例えば、親酵素と比較して０．０３％、０．０５％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、または最大でも５０％以下のエキソヌクレアーゼ活性を有する、改変されたＤＮＡポリメラーゼを指す。本発明においては、３‘−５’エキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼを生成し、解析するために使用される方法は、米国特許第６９４６２７３号公報に開示されている方法によるものとする。
【００２２】
本発明において、ＤＮＡポリメラーゼは、減少した塩基類似体検出活性を有するような改変を施した変異体を用いても良い。ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、減少した塩基類似体検出活性を有する変異体でもよい。塩基類似体とはアデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基を示し、ウラシルやイノシンなどが挙げられる。通常、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、塩基類似体であるウラシルやイノシンを検出すると強く結合し、ＤＮＡポリメラーゼ機能を阻害する。塩基類似体検出活性とは、塩基類似体と強く結合し、ＤＮＡポリメラーゼ機能を阻害する活性を示す。減少した塩基類似体検出活性を有する、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体とは、ウラシルやイノシンへの結合能力が低いことを特徴とする、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体である。このような変異体は、ウラシルの結合に関するアミノ酸配列（ウラシル結合ポケット）の少なくとも１か所に改変を加えることにより作製できる。
【００２３】
具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、第７番目、第３６番目及び第９３番目のアミノ酸残基の少なくとも１つが、他のアミノ酸に置換されている配列を有するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００２４】
具体的には、第７番目のチロシン残基は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン又はシステインに置換されることが好ましい。第３６番目のプロリン残基は、ヒスチジン、リジン又はアルギニンに置換されることが好ましい。第９３番目のバリン残基は、リジン、ヒスヒジン又はアルギニンに置換されることが好ましい。
【００２５】
上述した改変型ＤＮＡポリメラーゼは、例えば国際公開第２０１４／０５１０３１号パンフレットに開示されている方法により得ることができるが、特に限定はされない。
【００２６】
本発明における核酸増幅用組成物のその他の構成は特に限定されないが、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型となる核酸、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマー、１種以上のデオキシヌクレオチド三リン酸又は、デオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体、緩衝剤、及び塩よりなる群のうち少なくとも１つを含有することが好ましい。
【００２７】
本発明の核酸増幅用組成物において使用する１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーとは、増幅されるべき核酸の各核酸鎖に相補的なオリゴヌクレオチドであり、２種またはそれ以上のプライマーを使用することが好ましい。該プライマーは、２本鎖核酸の配列の異なる各鎖と実質的に相補的であって、一方のプライマーから合成された伸長生成物がその相補体から分離された場合に、その伸長生成物が他方のプライマーの伸長生成物の合成のための鋳型として機能することができるように選択される。
【００２８】
１種以上のデオキシヌクレオチド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体は、ＰＣＲ反応において基質として使用される。この基質として、４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰの混合物）溶液などを含んでいてもよい。
【００２９】
本発明の核酸増幅用組成物には、さらに緩衝剤を含むことが好ましい。前記緩衝剤として、例えば、トリス（ＴＲＩＳ）、トリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、ビス−トリシン（ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、及びキャプス（ＣＡＰＳ）などが挙げられるが、特に限定されない。緩衝剤の濃度としては、１０〜２００ｍＭ程度が好ましく、２０〜１００ｍＭ程度がより好ましい。ｐＨとしては、７．０〜９．５程度の範囲が好ましく、７．５〜９．０程度の範囲がより好ましい。また、前記緩衝液中には、１〜５ｍＭの濃度でＭｇ２＋を含むことが好ましく、１．５〜２．５ｍＭの濃度で含むことがより好ましい。更には、ＫＣｌを含んでいてもよい。
【００３０】
さらに、本発明の核酸増幅用組成物中には、アルブミン、グリセロール、ヘパリン、トレハロース、ベタイン等を含んでいてもよい。これらの添加割合は、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で添加すればよい。
【００３１】
本発明における核酸増幅用反応液には、増幅産物の検出、モニタリングのために核酸増幅用反応液中にＤＮＡ検出剤を含んでいてもよい。ＤＮＡ検出剤は、特に限定されない。ＤＮＡ表面のリン酸基に結合する色素や塩基間にインターカレートする色素（インターカレーター）などが挙げられるが、インターカレーターを用いることが好ましい。インターカレーターとは、二本鎖ＤＮＡに挿入（インターカレート）することによって、可逆的な、非共有結合的な様式で核酸と結合し、それによって核酸の存在および量を示す任意の分子を指す。一般に、インターカレーターは、二本鎖ＤＮＡに挿入して蛍光を発する色素である。
【００３２】
多数のインターカレーターが当技術分野においては公知であり、本発明においても、これらを用いることができる。例えば、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、シアニン色素（例えば、ＴＯＴＯ（登録商標）、ＹＯＹＯ（登録商標）、ＢＯＢＯおよびＰＯＰＯ）、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＥＲ、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ（登録商標）  ＤＸ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＬＣＧｅｅｎ（登録商標）、ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯＸ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ、ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ、ヨウ化プロピジウム、Ａｃｒｉｄｉｎｅ  ｏｒａｎｇｅ、７−アミノ−アクチノマイシン  Ｄ、ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）  ＧＲ、ＳＹＴＯ（登録商標）９，  ＳＹＴＯ（登録商標）１０、ＳＹＴＯ（登録商標）１３、ＳＹＴＯ（登録商標）１４、ＳＹＴＯ（登録商標）８２、ＦＵＮ−１などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００３３】
本発明においては、一本鎖結合タンパク質、二本鎖結合タンパク質あるいはミスマッチ結合タンパク質の共存下、核酸増幅反応を行ってもよい。
【００３４】
さらには、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を用いても良い。前記抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。本反応組成は、ＰＣＲの感度上昇、非特異的な増幅の軽減に特に有効である。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例により、特に限定されるものではない。
【００３６】
実施例１：様々なサイズのＤＮＡライブラリー調製
平均断片サイズが４００ｂｐ、６００ｂｐ、８００ｂｐのライブラリー調製を実施した。平均断片サイズ４００ｂｐ、６００ｂｐ、８００ｂｐを得るために、Ｋａｐａ  Ｈｙｐｅｒ  Ｐｌｕｓ  Ｋｉｔ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、キット付属のＫａｐａ  Ｆｒａｇ  Ｅｎｚｙｍｅで、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）１００ｎｇを５分（８００ｂｐ用）、７分（６００ｂｐ用）、１０分（４００ｂｐ用）の異なる処理時間で反応を行った。処理した産物を１％アガロースゲル電気泳動し、使用する断片サイズのＤＮＡをゲルからＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  Ｕｐ−（Ｔｏｙｏｂｏ製）で抽出および精製を行った。精製したＤＮＡ断片のライブラリー調製は、取扱説明書に準じて行った。
【００３７】
調製したライブラリーはＮａｎｏｄｒｏｐ（商標登録）にて定量し、定量値を参考にして希釈し、テンプレートとして５．５ｐｇ/μｌから６段階の１０倍希釈を実施した。
【００３８】
実施例２：ＤＮＡライブラリーのサイズによる比較
調製したライブラリーをテンプレートとして、サイズによる各社のＰＣＲ効率と定量値の違いを比較した。リアルタイムＰＣＲ試薬として、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を除去したＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを使用しているＫＯＤ  ＳＹＢＲ（商標登録）ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（Ｔｏｙｏｂｏ製）を使用した。また、定量値を算出するためのＤＮＡスタンダードとしてＩｌｌｕｍｉｎａ用  ＤＮＡ定量スタンダード（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用した。リアルタイムＰＣＲは、ＫＯＤ  ＳＹＢＲ（商標登録）ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ添付のマスターミックスを用い、１×ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ、１×ＲＯＸ、各４ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２、３）、ライブラリーテンプレートもしくはＩｌｌｕｍｉｎａ用 ＤＮＡ定量スタンダードを含む２０μｌの反応液を調製した。反応は９８℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールで行った。
【００３９】
比較するライブラリー定量試薬として、ＮＥＢＮｅｘｔ（商標登録）Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標登録）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製）を使用した。マスターミックスとして１．５ｍＬのＮＥＢＮｅｘｔ（商標登録）Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに１００μｌのＮＥＢＮｅｘｔ（商標登録）Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを加え、さらに２０μｌのＲＯＸを添加した。この混合したマスターミックスにライブラリーテンプレートまたはＩｌｌｕｍｉｎａ用ＤＮＡ定量スタンダードを加え、２０μｌの反応液を調製した。反応は９５℃、２分の前反応の後、９５℃、１５秒→６３℃、４５秒を３５サイクル繰り返すスケジュールで行った。
【００４０】
得られたＣｔ値からＰＣＲ効率および定量値を求めた結果を、図１に示す。ＮＥＢＮｅｘｔ（商標登録）Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標登録）およびＫａｐａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔは長くなるにつれてＰＣＲ効率が下がるのに対し、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を除去したＫＯＤ  ＤＮＡ  ポリメラーゼを使用しているＫＯＤ  ＳＹＢＲ（商標登録）ｑＰＣＲ  Ｍｉｘは長さによるＰＣＲ効率への影響をほとんど受けなかった。
【００４１】
実施例３：様々なＧＣ含量のライブラリー調製
平均ＧＣ含量が、５０％、７０％、８０％のライブラリー調製を実施した。イルミナ社Ｐ５、Ｐ７タグを付加したプライマー（配列番号４〜２１）を使用し、ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ製）を用いて、ヒトゲノムＤＮＡ５０ｎｇをテンプレートとして増幅を行った。得られたＰＣＲ産物を、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  Ｕｐ−（Ｔｏｙｏｂｏ製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物を組み合わせて、ＧＣ含量が５０％、７０％、８０％となるライブラリーを作製した。
【００４２】
調製したライブラリーはＮａｎｏｄｒｏｐ（商標登録）にて定量し、定量値を参考にして希釈し、テンプレートとして、５．５ｐｇ/μｌから６段階の１０倍希釈を実施した。
【００４３】
実施例４：ＤＮＡライブラリーのＧＣ含量による比較
調製したＤＮＡライブラリーをテンプレートとしてＧＣ含量によるＰＣＲ効率の違いを比較した。リアルタイムＰＣＲ試薬として、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を除去したＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを使用しているＫＯＤ  ＳＹＢＲ（商標登録）ｑＰＣＲ  Ｍｉｘを使用した。また、定量値を算出するためのＤＮＡスタンダードとしてIllumina用ＤＮＡ定量スタンダードを使用した。  リアルタイムＰＣＲは、ＫＯＤ  ＳＹＢＲ（商標登録）ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ添付のマスターミックスを用い、１×ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ、１×ＲＯＸ、各４ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２、３）、ライブラリーテンプレートまたはＩｌｌｕｍｉｎａ用ＤＮＡ定量スタンダードを含む２０μｌの反応液を調製した。反応は９８℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールで行った。
【００４４】
比較するライブラリー定量試薬として、ＮＥＢＮｅｘｔ（商標登録）Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標登録））を使用した。マスターミックスとして１．５ｍＬのＮＥＢＮｅｘｔ（商標登録）Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに、１００μｌのＮＥＢＮｅｘｔ（商標登録）Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを加え、さらに２０μｌのＲＯＸを添加した。この混合したマスターミックスに、ライブラリーテンプレートまたはＩｌｌｕｍｉｎａ用ＤＮＡ定量スタンダードを加え、２０μｌの反応液を調製した。反応は９５℃、２分の前反応の後、９５℃、１５秒→６３℃、４５秒を３５サイクル繰り返すスケジュールで行った。
【００４５】
得られたＣｔ値から、ＰＣＲ効率を求めた結果を図２に示す。ＮＥＢＮｅｘｔ（商標登録）Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標登録）およびＫａｐａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＫｉｔではＧＣ含量が高くなるにつれて正確なＰＣＲ効率を算出することができなかった。一方、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を除去したＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを使用しているＫＯＤ  ＳＹＢＲ（商標登録）ｑＰＣＲ  Ｍｉｘは、ＧＣ含量によるＰＣＲ効率への影響をほとんど受けなかった。
【００４６】
実施例５：次世代―シーケンサーにおけるクラスター密度
上記の定量値を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標登録）製次世代であるシーケンサーＭｉｓｅｑ（商標登録）にてＭｉｓｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｖ２（３００ｃｙｃｌｅｓ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ製）を使用して、ランを実施した。
【００４７】
ランの結果、クラスター密度１０７６ｋ/ｍｍ２が得られ、ＫＯＤ  ＳＹＢＲ（商標登録）ｑＰＣＲ  Ｍｉｘにより正確な定量ができていることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明により、ＤＮＡシーケンサー用ＤＮＡライブラリーの種類（サイズ、ＧＣ含量）に依らず正確に定量することができる。
【図１】
2018085934.tif 000002
【図２】
2018085934.tif 000003
【配列表】
2018085934000001.app