(57)【要約】【課題】農産物等から農薬やカビ毒等の危害因子を、簡便且つ迅速に、しかも高い抽出効率で抽出する。【解決手段】供試植物を９０℃以上、ｐＨ６以下の条件で加熱処理した後、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼからなる群より選択される一又は二以上の酵素で処理し、植物中の危害因子を効率的に抽出し分析用の試料を得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）及び（２）を含む、植物中の危害因子分析用の試料を調製する方法：
（１）供試植物を９０℃以上、ｐＨ６以下の条件で加熱処理する工程、
（２）工程（１）の後、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼからなる群より選択される一又は二以上の酵素で処理する工程。
【請求項２】
工程（１）の温度条件が９０℃〜１２１℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（１）のｐＨ条件がｐＨ３〜ｐＨ６である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（１）の前及び／又は後に、供試植物を破砕ないし粉砕する工程を行う、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（１）と工程（２）の間に、ｐＨ調整の工程を行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（２）の後に、固形分の除去、濃縮、有機溶媒による抽出、溶媒分配、塩析分配、pH調整による夾雑成分の沈殿・除去、分子分画、夾雑成分の除去又は目的成分の吸着・溶離、及び生化学的親和力を利用した目的成分の選択的捕捉からなる群より選択される一又は二以上の精製工程を行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
危害因子が農薬、微生物由来の毒素、重金属又は有害環境汚染物質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
供試植物が農作物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
農作物が野菜、穀類、種実類、コーヒー豆、茶葉、タバコ、薬用植物、香辛料又はこれらを含む加工食材若しくは食品である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法で調製した試料に含まれる目的成分を検出することを特徴とする、危害因子の分析方法。
【請求項１１】
調製した試料に含まれる目的成分を精製ないし分離することなく蛍光法、分光光学的方法又は発光法によって直接検出する、請求項１０に記載の分析方法。
【請求項１２】
液体クロマトグラフ、ガスクロマトグラフ及びイオンクロマトグラフからなる群より選ばれる一種以上の分離法と、質量分析法、蛍光法、分光光学的方法及び発光法からなる群より選ばれるいずれかの検出法との組み合わせによって目的成分の検出が行われる、請求項１０に記載の分析方法。
【請求項１３】
試料中の目的成分を吸着剤等に吸着させ、吸着した状態の目的成分を蛍光法、分光光学的方法又は発光法によって直接検出する、［１０］に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は農作物等に含まれる危害因子（農薬、カビ毒、重金属、各種有害環境汚染物質等）を分析するための試料の調製方法及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
農産物中の農薬等の分析には、厚生労働省通知の試験法（ＧＣ／ＭＳによる農薬等の一斉試験法（農産物）、ＬＣ／ＭＳによる農薬等の一斉試験法（農産物））が用いられる。当該試験法は機器分析前の前処理工程が極めて煩雑であり、かつ所要時間も長い。また、正確な分析結果を得るためには熟練した技術者が必要となる。
【０００３】
ところで、農産物中の農薬等の分析は、流通と同時進行という迅速性が求められる特殊な分析である。そのため、上記の試験法に代わるものとして、残留農薬分析ではＱｕＥＣｈＥＲＳ法（以下、「迅速抽出法」とも呼ぶ）で簡易抽出した後、固相抽出剤を利用した自動精製装置による迅速分析の試みもなされている。しかし、粒剤として播種時や定植時に土壌に散布される薬剤は農産物の組織もしくは組織内部に吸収されるため、迅速抽出法では、それらの抽出効率が低いという不安が残る。また、真菌の菌糸が農産物の組織内に侵入して産生されるカビ毒についても迅速抽出法で真値が得られるかは定かではない。
【０００４】
尚、特許文献１には、植物に含まれる有害物質を分析するための分析用試料の調製方法が開示されている。当該調製方法では、酵素を複合的に作用させることにより、汎用性及び簡便性の向上を図っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１６−５７３０１
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】N. Kasai et al., J. Agric. Food Chem., 2004, 52, 5709-5716.
【非特許文献２】N. Kasai et al., J. Agric. Food Chem., 2003, 51, 6217-6222.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上の背景の下で本発明は、農産物等から農薬やカビ毒等の危害因子を、簡便且つ迅速に、しかも高い抽出効率で抽出する手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決すべく検討を進める中で、植物細胞間のペクチンを主成分とする中葉（ミドルラメラ）を加熱処理により破壊し、さらに酵素処理により細胞壁を分解して可溶化する技術（非特許文献１、２）に着目し、それを応用・発展させた新規な抽出方法を開発した。当該抽出方法の有効性を調べた結果、簡便且つ短時間の操作にもかかわらず、高い抽出効率が得られ、特に、植物組織内に浸潤した危害因子（例えば、農薬やカビ毒）の抽出に有効であることが確認された。また、各種作物に直接散布され収穫後に残留する農薬や植物に蓄積された有害環境汚染物質などを含む各種危害因子の抽出に広く適用可能であることが示唆され、汎用性にも優れることが明らかとなった。尚、本発明は酵素処理前に加熱処理を行う点において、上掲の特許文献１が開示する調製方法とは明確かつ決定的に相違する。
以下の発明は主として上記の成果に基づく。
［１］以下の工程（１）及び（２）を含む、植物中の危害因子分析用の試料を調製する方法：
（１）供試植物を９０℃以上、ｐＨ６以下の条件で加熱処理する工程、
（２）工程（１）の後、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼからなる群より選択される一又は二以上の酵素で処理する工程。
［２］工程（１）の温度条件が９０℃〜１２１℃である、［１］に記載の方法。
［３］工程（１）のｐＨ条件がｐＨ３〜ｐＨ６である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］工程（１）の前及び／又は後に、供試植物を破砕ないし粉砕する工程を行う、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］工程（１）と工程（２）の間に、ｐＨ調整の工程を行う、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］工程（２）の後に、固形分の除去、濃縮、有機溶媒による抽出、溶媒分配、塩析分配、ｐＨ調整による夾雑成分の沈殿・除去、分子分画、夾雑成分の除去又は目的成分の吸着・溶離、及び生化学的親和力を利用した目的成分の選択的捕捉からなる群より選択される一又は二以上の精製工程を行う、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］危害因子が農薬、微生物由来の毒素、重金属又は有害環境汚染物質である、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］供試植物が農作物である、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］農作物が野菜、穀類、種実類、コーヒー豆、茶葉、タバコ、薬用植物、香辛料又はこれらを含む加工食材若しくは食品である、［８］に記載の方法。
［１０］［１］〜［９］のいずれか一項に記載の方法で調製した試料に含まれる目的成分を検出することを特徴とする、危害因子の分析方法。
［１１］調製した試料に含まれる目的成分を精製ないし分離することなく蛍光法、分光光学的方法又は発光法によって直接検出する、［１０］に記載の分析方法。
［１２］液体クロマトグラフ、ガスクロマトグラフ及びイオンクロマトグラフからなる群より選ばれる一種以上の分離法と、質量分析法、蛍光法、分光光学的方法及び発光法からなる群より選ばれるいずれかの検出法との組み合わせによって目的成分の検出が行われる、［１０］に記載の分析方法。
［１３］試料中の目的成分を吸着剤等に吸着させ、吸着した状態の目的成分を蛍光法、分光光学的方法又は発光法によって直接検出する、［１０］に記載の分析方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】新規方法による加熱・酵素処理前後の小松菜。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．危害因子分析用の試料の調製方法
本発明の第１の局面は植物中の危害因子分析用の試料を調製する方法に関する。本発明の方法で調製した試料は、そのままの状態で、又は分析方法に応じた更なる処理を経た後、危害因子の分析に用いられることになる。危害因子とは、人間又は人間以外の動物（例えば家畜、家禽、家蚕、ペット（コンパニオンアニマル））の健康を害する物質であり、例えば農薬（イミドクロプリド、アセタミプリド、ジノテフラン、クロチアニジン、チアクロプリド、チアメトキサム等のネオニコチノイド系農薬の他、有機リン系農薬、カーバメート系農薬、合成ピレスロイド系農薬、ネライストキシン系農薬、マクロライド系農薬、フェニルピラゾール系農薬など）、微生物由来の毒素（例えばオクラトキシンＡ、アフラトキシン類、トリコテセン類、パツリン、ゼアラレノン、フモニシン類、ステリグマトシスチン、シトリニン、ルテオスカイリン等のカビ毒）、重金属（カドミウム、ヒ素、亜鉛、マンガン、鉛等）、各種有害環境汚染物質（ノニルフェノール、ビスフェノールＡ、フタル酸エステル類等）が該当する。
【００１１】
本発明の調製方法は以下の二つの工程を含むことによって特徴付けられる。
（１）供試植物を９０℃以上、ｐＨ６以下の条件で加熱処理する工程
（２）工程（１）の後、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼからなる群より選択される一又は二以上の酵素で処理する工程
【００１２】
工程（１）では特定の条件で供試植物を加熱処理する。理論に拘泥する訳ではないが、この加熱処理によって植物組織中の中葉部（ミドルラメラ）および二次細胞壁が分解、可溶化され又は分解、可溶化されやすくなり、続く工程（２）を行う際に酵素が作用し易い状態が形成される。
【００１３】
供試植物には各種植物が用いられる。供試植物は好ましくは食用、薬用、飼料用、又は餌用の農作物又はその加工品である。ここでの農作物に該当する植物を例示すると、葉茎菜類（ハクサイ、キャベツ、ホウレンソウ、レタス、ブロッコリー、ネギ、タマネギ等）、果菜類（キュウリ、ナス、トマト、ピーマン、スイートコーン等）、根菜類（ダイコン、にんじん、れんこん等）、イモ類（ジャガイモ、サツマイモ、サトイモ、タロイモ、ヤムイモ、タロイモ等）、菌茸類（シイタケ、シメジ、ブナシメジ、マツタケ、エノキタケ、エリンギ、マイタケ、キクラゲ、ナメコ、ヒラタケ、マッシュルーム、ポルチーニ等）等の野菜、穀類（米、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ハトムギ、エンバク、キビ、アワ等、イネ科作物の種子、ダイズ、アズキ、リョクトウ、インゲンマメ、ラッカセイ、エンドウ、ソラマメ、レンズマメ、ヒヨコマメ等、マメ科作物の種子）、種実類（クリ、アーモンド、クルミ、ヘーゼルナッツ、ペカンナッツ、カシューナッツ、ピスタチオ等）、コーヒー豆、茶葉（緑茶、紅茶、白茶、黄茶、黒茶、花茶等）、タバコ、薬用植物（ウコン、オウレン、クコ、サフラン、チョウジ、ドクダミ、リンドウ、ローズマリー等）、香辛料（シナモン、ショウガ、コショウ、トウガラシ、フェンネル、ワサビ等）である。収穫した植物を各種加工（例えば、乾燥、塩漬、発酵）したものや、加工食品中に含まれる状態の植物を供試植物にすることもできる。言い換えれば、上記の植物を含む加工食材、加工食品等を供試植物として用いることもできる。
【００１４】
工程（１）の加熱処理では温度条件として９０℃以上、ｐＨ条件としてｐＨ６以下が採用される。本発明では、このように適度な加熱条件を採用することにより、目的成分である危害因子への影響（典型的には分解）を抑制しつつ、危害因子の植物からの効率的な抽出を図る。
【００１５】
温度条件は、好ましくは９０℃〜１２５℃、更に好ましくは９０℃〜１２１℃、より一層好ましくは１００℃〜１２１℃である。ｐＨ条件は、好ましくはｐＨ７以下、更に好ましくはｐＨ３〜ｐＨ６である。ここでのｐＨ条件を、工程（２）で使用する酵素が作用し易いｐＨに対応させれば、工程（２）の前にｐＨ調整を行わなくとも効率的な酵素反応を行うことができる。
【００１６】
工程（１）の加熱処理の時間は、期待される効果、即ち、工程（２）における酵素が作用し易い状態の形成、が発揮される限りにおいて特に限定されない。例えば、加熱処理の時間を１分〜１時間に設定することができる。好ましくは、１０分〜３０分の加熱処理とする。
【００１７】
工程（１）を加圧条件下（例えば、１．２気圧〜２気圧の条件下）で行っても良い。加圧条件下での加熱処理は、植物中の二次細胞壁のより効率的かつ効果的な分解に有利である。
【００１８】
工程（１）に続く工程（２）では加熱処理後の供試植物を特定の酵素、即ち、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ又はペクチナーゼで処理する。これらの酵素の中の二つ又は三つを併用してもよい。複数の酵素を併用すると、抽出効率の向上を望める。また、同一種類の酵素を二つ以上併用（例えば、由来の異なるセルラーゼを二つ併用）することにしてもよい。この場合においても、別の種類の酵素を併用することもできる。さらに、これら酵素による植物組織の分解を補助するために、植物細胞壁や細胞膜を構成するタンパク質、ペプチドグリカン、脂質などに作用するプロテアーゼ、ぺプチダーゼ、各種グリコシダーゼ、リパーゼなどの酵素を併用することもできる。また、中葉を構成するペクチンはカルシウムなどの二価のカチオンがその構造維持に寄与していることから、酵素を作用させる際に二価のカチオンとキレート錯体を生成するＥＤＴＡやクエン酸を添加することにより抽出効率を高めることも可能である。
【００１９】
セルラーゼとは、セルロース中などに認められるβ−１，４グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素である。セルラーゼは、非結晶構造のセルロースにランダムに作用するエンドグルカナーゼ、結晶構造のセルロースに作用して非還元末端からセロビオース単位で切断するエキソグルカナーゼ、セロビオースをグルコースに分解するβ-グルコシダーゼに大別される。セルラーゼの由来を例示すると、Aspergillus niger、Aspergillus foetidus、Trichoderma viride、Trichoderma koningi、Trichoderma reesei、Irpex lacteus、Myrothecium vercaria Alternaria alternata、Chaetomium thermophile、Chaetomium globosus、Fusarium solani、Neurospora crassa、Cellulomonas fimi、Cellulomonas uda、Erwinia chrysanthemi、Pseudomonas fluorescence、Streptmyces flavogriseusである。
【００２０】
ヘミセルラーゼとは、ヘミセルロース（植物組織からアルカリ抽出される多糖類）を加水分解する酵素である。キシラナーゼ、ガラクタナーゼはヘミセルラーゼの一種である。ヘミセルラーゼの由来を例示すると、Aspergillus niger、Trichoderma reesei、Cephalosporium sacchari、Agaricus bisporusである。
【００２１】
ペクチナーゼとは、植物の細胞壁に含まれているペクチン質（Ｄ−ガラクチュロン酸のα−１，４結合からなる多糖類）を分解する酵素である。ペクチナーゼは、ペクチン酸を加水分解するポリガラクチュロナーゼ、ペクチンを脱離反応で分解するペクチンリアーゼ、ペクチンのメチルエステル結合を分解するペクチンエステラーゼに大別される。ペクチナーゼの由来を例示すると、Aspergillus pulverulentus、Aspergillus niger、Aspergillus awamori、Rhizopus arrhizus、Fusarium moniliforme、Sclerotinia libertiana、Coniothyrium diplodiellaである。
【００２２】
酵素の使用量はセルラーゼであれば、例えば、供試植物１００ｇあたり重量比で０．０１％〜１％程度、同様にヘミセルラーゼ、ペクチナーゼの場合も、例えば、供試植物１００ｇあたり重量比で０．０１％〜１％程度にすることができる。もちろん、これは使用する酵素の由来、性質、純度、比活性、使用条件（ｐＨ、温度等）等に依存するので、あらかじめ予備試験によって最適使用量を決定するとよい。
【００２３】
セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼのいくつかは市販されている。本発明を実施するにあたって、市販の酵素又は酵素剤を使用することができる。
【００２４】
工程（２）の反応条件としては、使用する酵素が良好に作用する条件を採用すればよい。温度条件としては、例えば３０℃〜６０℃、ｐＨ条件としては、例えばｐＨ３〜ｐＨ６である。反応時間（処理時間）は例えば３０分〜３時間であるが、これより長時間、たとえば一晩（１６時間）の条件を採用しても問題ない。
【００２５】
工程（１）のｐＨ条件と工程（２）のｐＨ条件が相違する場合には、工程（２）の前にｐＨ調整を行えばよい。ｐＨ調整は、常法に従い、酸又はアルカリの添加によって行えばよい。尚、工程（１）のｐＨ条件と工程（２）のｐＨ条件を同一又は近似したものにすれば、ｐＨ調整の工程が不要となり、より簡便かつ短時間で実施可能な方法となる。
【００２６】
尚、最適な反応条件は供試植物の種類や使用する酵素の種類によって変動し得るが、本願の開示事項を参考にしつつ予備実験を通して決定すればよい。
【００２７】
危害因子の抽出効率を高めるため、工程（１）の前又は後（即ち、工程（１）と工程（２）の間）、或いはこの両方で、供試植物を破砕ないし粉砕する工程を行うことにしてもよい。破砕ないし粉砕の手段は特に限定されない。例えば、ミキサーや乳鉢などを用いた公知の方法を採用すればよい。冷凍及び融解（必要に応じて繰り返しても良い）、或いは冷凍状態にした後に衝撃を加える、といった方法を用いることも可能である。
【００２８】
工程（２）を経た供試植物（即ち、酵素処理物）を分析法に応じた更なる処理に供することができる。例えば、液体クロマトグラフ・質量分析法やガスクロマトグラフ・質量分析法に適した試料を得るため、有機溶媒による抽出を行う。この抽出には、例えば、アセトニトリル、メチルアルコール、エチルアルコール等の有機溶媒を用いることができる。具体的な操作として、例えば、酵素処理物から固形分（不要物）を遠心処理などによって除去した後、有機溶媒と塩（塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、さらに複数の塩類併用等）を利用した抽出、塩析分配を行う。塩析勾配の際、吸着材（シリカゲル、オクタデシルシリカ、アミン型吸着剤等）を併用し、不純物を除去することにしてもよい。有機溶媒による抽出後、必要に応じて、分析方法に応じた精製（例えば、ろ過、カラム処理、濃縮）を行っても良い。その他、溶媒分配、ｐＨ調整による夾雑成分の沈殿・除去、分子分画（例えば分子篩膜を利用する）、夾雑成分の除去又は目的成分の吸着・溶離（例えば各種吸着剤を利用する）、生化学的親和力を利用した目的成分の選択的捕捉（例えば抗体や血清アルブミンなどを利用する）等を行っても良い。尚、調製した試料に含まれる目的成分を精製あるいは分離することなく各種方法（例えば蛍光法、分光光学的方法又は発光法）によって分析することにしてもよい。
【００２９】
２．危害因子の分析方法
本発明の別の局面は危害因子の分析方法を提供する。本発明の分析方法では、上記の調製方法で得られた試料に含まれる目的成分（特定の危害因子）を検出する。目的成分は一つ又は二つ以上である。即ち、特定の一つの危害因子を検出することにしても、或いは特定の二つ以上の危害因子を検出することにしてもよい。検出は定性的又は定量的のいずれであってもよい。様々な分析手段を用いることができる。分析手段の例として、液体クロマトグラフ、ガスクロマトグラフ及びイオンクロマトグラフからなる群より選ばれる一種以上の分離法と、質量分析法、蛍光法、分光光学的方法及び発光法からなる群より選ばれるいずれかの検出法との組み合わせを挙げることができる。これらの分析手段を実施するための装置、器具、試薬等は市販されており、容易に実施可能である。分析条件や分析方法は過去の報告や成書、或いは装置等に付属の説明書等を参考にすればよい。尚、試料中の目的成分を吸着剤等に吸着させ、吸着した状態の目的成分を蛍光法、分光光学的方法又は発光法によって直接検出することにしてもよい。
【実施例】
【００３０】
＜実施例１＞  玄麦に含まれるオクラトキシンＡの抽出測定
オクラトキシンＡに汚染された玄麦（厚生労働省通知法に準じた方法による測定値：３７．９ｎｇ／ｇ）１ｇを粉砕し、５０ｍＬのコニカルチューブに入れ、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）３．９５ｍＬを加えた後、１２１℃、１０分の加熱処理を行った。これにガラスビーズを添加しボルテックスミキサーで試料組織を分散した。冷却後、ｐＨを６に調整し、セルラーゼ（合同酒精株式会社製ＧＯＤＯ−ＴＣＦ）０．０５ｍＬを加えて６０℃で３時間反応させた。本処理後、アセトニトリル５ｍＬを添加混合し、さらに食塩３ｇを加え十分に攪拌後、遠心分離した。上清のアセトニトリル層を回収して液体クロマトグラフィー・蛍光法で分析した（カラム；ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８、移動相；４％酢酸：アセトニトリル＝５０：５０、流速；１ｍＬ／ｍｉｎ、蛍光測定；励起波長３３０ｎｍ、測定波長４７０ｎｍ）。尚、オクラトキシンＡはｐＨ３．５、１２１℃の処理では安定であることは確認している。
【００３１】
比較のため、迅速抽出法（ＱｕＥＣｈＥＲＳ法）で抽出したものについても分析した。迅速抽出法では、粉砕した玄麦１ｇに水３ｍＬを加えて３０分置き、さらにアセトニトリル６ｍＬを添加混合し、ガラスビーズ２ｇを入れてボルテックスミキサーで撹拌した。これに食塩０．８ｇ、硫酸マグネシウム３．２ｇを添加し、ボルテックスミキサーで撹拌した。これを遠心分離し上層（アセトニトリル層）を回収した。上層に硫酸マグネシウム０．１５ｇ／ｍＬ、アミン型吸着剤（ＰＳＡ）０．１５ｇ／ｍＬ及びオクタデシルシリカ０．０５ｇ／ｍＬを加え撹拌し、その上清を回収し減圧乾固した。これをエタノールに溶解して上記と同じく液体クロマトグラフィー・蛍光法で分析した。新規方法での測定値（玄麦１ｇあたり）は３７．１ｎｇ／ｇ（準通知法測定値の９７．９％）であり、準通知法による測定値とよく一致したが、迅速抽出法（ＱｕＥＣｈＥＲＳ法）では８．１０ｎｇ／ｇ（準通知法測定値の２１．４％）と極めて低い値となり十分な抽出ができていないことが分かった。
【００３２】
＜実施例２＞  小松菜に残留するネオニコチノイド系殺虫剤の抽出測定
市販の小松菜を分析試料としてネオニコチノイド系殺虫剤の抽出・分析を行った。
（１）新規方法による抽出
小松菜を冷凍粉砕し、その１ｇを１５ｍＬのコニカルチューブに入れ、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３）３．９５ｍＬで分散後、１２１℃、１０分の加熱処理を行った。これにガラスビーズを添加しボルテックスミキサーで試料組織を分散した。冷却後、ｐＨを６に調整し、セルラーゼ（合同酒精株式会社製ＧＯＤＯ−ＴＣＦ）０．０５ｍＬを加えて６０℃で３時間反応させた。本処理により小松菜の組織をほぼ完全に分解することができた。図１はこれらの処理前後の小松菜の組織の顕微鏡写真である（顕微鏡：ＯＬＹＭＰＵＳ  ＣＸ３１、撮影装置：株式会社バイオメディカルサイエンス製ＵＳＢ接続式顕微鏡アダプターＢＣ−ＤＫＭＣ０１、撮影倍率２００倍）。処理により細胞が分散し、細胞壁が破壊・分解され、かつ細胞内容物が漏出していることが分かる。本処理後、遠心分離によって上清を回収した。この上清にアセトニトリル５ｍＬを添加混合し、さらに食塩２ｇ、アミン型吸着剤（ＰＳＡ）０．４ｇ及びオクタデシルシリカ０．４ｇを加え十分に攪拌し、上清のアセトニトリル層を回収して分析に供した。
【００３３】
（２）厚生労働省通知法による抽出
「食品に残留する農薬、飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法（平成１７年１月２４日付け食安発第０１２４００１号厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知）に準拠して実施した。小松菜を凍結粉砕し、その４ｇを５０ｍＬコニカルチューブに入れ、アセトニトリル２０ｍＬを加えた後、２分間ホモジナイズした。桐山ロートにろ紙（Ｎｏ．４）を引き、その上にケイソウ土を約１ｃｍ敷き詰めアセトニトリルで湿らせた。その上にホモジナイズした試料溶液を通液し、２００ｍＬナス型フラスコに回収した。さらに、ケイソウ土に残った残渣を再度コニカルチューブに回収し、アセトニトリル２０ｍＬを加え２分間ホモジナイズした。ホモジナイズした試料溶液をケイソウ土に通液させ、上記と同じ２００ｍＬナス型フラスコに回収した後、全液が約２０ｍＬとなるように、エバポレーターで溶液を濃縮した。これに食塩２ｇを加え攪拌し、静置後、水層と分離したアセトニトリル層を５０ｍＬコニカルチューブへ回収した。回収液に硫酸ナトリウム５ｇを加え綿ろ過し、ろ液をナス型フラスコへ回収した。さらに、コニカルチューブをアセトニトリル５ｍＬで２回洗浄し、洗浄液をでナス型フラスコに回収した。回収液をエバポレーターを用いて乾固し、アセトニトリル：トルエン（３：１）２ｍＬに溶解し超音波照射を２０秒行った。この溶液を、アセトニトリル：トルエン（３：１）１０ｍＬでコンディショニングしたＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＩｎｅｒｔＴＭ  Ｓｅｐ  ＧＣ／ＮＨ２（５００ｍｇ／５００ｍｇ）に通液させた。さらにアセトニトリル：トルエン（３：１）  ２０ｍＬを通液し、通液した溶液はすべてナス型フラスコへ回収し、エバポレーターを用いて乾固させた。最終検液が０．５ｇ／ｍＬとなるように水へ溶解し、測定時に適宜希釈して用いた。
【００３４】
（３）分析
上記（１）及び（２）で得られた小松菜抽出液中のネオニコチノイド系殺虫剤を液体クロマトグラフィー・質量分析法で分析した（カラム；ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８、移動相；アセトニトリル：水＝２５：７５／０．１％ギ酸添加、流速；０．４ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン；４０℃）。結果を表１に示す。新規方法では厚生労働省通知法とほぼ同等の値が得られ、通知法に替わる迅速簡易抽出法となることが確認できた。尚、抽出を含む分析の前処理に要する時間は厚生労働省通知法で約５時間、新規方法では３時間３０分程度であった。新規方法は短時間であると同時に操作が簡便であるため、厚生労働省通知法に比べて多数の分析試料を同時処理できるという優位性もある。
【表１】
2018048987.tif 000002
【００３５】
＜実施例３＞  加熱条件の検討（温度）
実施例１に準じ、オクラトキシンＡ  ３７．９ｎｇ／ｇを含む玄麦について新規方法でオクラトキシンＡを抽出・分析した。この際、最初の加熱処理は、ｐＨは実施例１と同様に３．５に固定し、加熱温度８０℃から１２１℃の四段階について比較した。その他の操作については実施例１と同様とした。結果を表２に示す。新規方法では加熱温度としては９０℃以上、さらには１００℃以上が好ましいことが分かる。
【表２】
2018048987.tif 000003
【００３６】
＜実施例４＞  抽出条件の検討（ｐＨ）
実施例１に準じ、オクラトキシンＡ  ３７．９ｎｇ／ｇを含む玄麦について新規方法でオクラトキシンＡを抽出・分析した。この際、加熱処理及び酵素反応におけるｐＨを変化させ、ｐＨの効果を確認した。加熱温度は１２１℃とした。その他の操作については実施例１と同様とした。結果を表３に示す。表３より、加熱及び酵素反応のｐＨは６以下で測定値に変化がなく、本抽出法はｐＨ６以下で実施可能であることが分かる。共同発明者の笠井による報告（非特許文献１、２）では、加熱処理によってミドルラメラが可溶化、除去され、その結果、細胞が分散されることが示されている。この細胞の分散によって、酵素が細胞に作用しやすくなる。ここで使用しているセルラーゼの分解活性はｐＨ３よりｐＨ５〜６において高くなる。しかし、表３の結果では低いｐＨ、たとえばｐＨ３、でも十分な抽出ができている。ｐＨ３でもｐＨ５あるいはｐＨ６と同等の測定値が得られたことは、高濃度のセルラーゼを使用すれば、セルラーゼの反応の最適ｐＨでなくても十分な効果が得られることを示している。
【表３】
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【００３７】
＜実施例５＞  酵素の相乗効果
実施例１に準じ、新規方法でオクラトキシンＡ  ３７．９ｎｇ／ｇを含む玄麦についてオクラトキシンＡを抽出・分析した。この際、実施例１と同様に酵素としてセルラーゼ単独で処理する方法と、セルラーゼと同時にペクチナーゼ（ノボザイム社製Ｐｅｃｔｉｎｅｘ）で処理する方法を比較した。測定値はそれぞれ３６．９ｎｇ／ｇ、３８．３ｎｇ／ｇであった（それぞれ準通知法測定値の９７．４％、１０１％の値）。セルラーゼ単独、セルラーゼとペクチナーゼの同時処理、について酵素処理時間を比較したところ、セルラーゼとペクチナーゼの同時処理では２時間処理でセルラーゼ単独の３時間処理と同等の値が得られた。この結果は、試料の種類によっては複数の酵素を組み合わせて使用することで抽出効率が向上することを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明によれば、危害因子（農薬、カビ毒、重金属、各種有害環境汚染物質等）の分析用の試料を簡便かつ短時間で調製することができる。また、本発明の調製方法は危害因子の植物からの効率的な抽出を可能にする。従って、植物組織内に浸潤した危害因子を分析する際に特に有用である。
【００３９】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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