(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞取り込み及び／又はエンドソーム脱出を効果的に行うことができる、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドを全身に送達する為の方法の提供。【解決手段】１）オリゴヌクレオチド；２）同一でもあるいは異なっていてもよい、１個又は複数個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド；任意に、３）同一でもあるいは異なっていてもよい１個又は複数個のリンカー；及び任意に、４）１個または複数個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質及び／又はマスキング剤を含むモジュール組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド；
２）下記式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の、同一でもあるいは異なっていてもよ
い１個または複数個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド：
【化１】
2018048186.tif 000034
（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＲ１Ｒ２−または−ＮＲ１−であり、Ｒ１およびＲ２
は各々独立に水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；ｎは１、２、３ま
たは４であり；かつ
【化２】
2018048186.tif 000035
による結合は結合点を示す）；
任意に、３）同一でもあるいは異なっていてもよい１個または複数個のリンカー；およ
び
任意に、４）１個または複数個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質お
よび／またはマスキング剤
を含む、モジュール組成物。
【請求項２】
請求項１に記載のモジュール組成物であって、
１）一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド；
２）同一でもあるいは異なっていてもよい、式（ＩＩ）の１〜８個のｔｅｔｒａＧａｌ
ＮＡｃリガンド（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−または−ＮＨ−であり；ｎは１
、２、３または４である）；
３）同一でもあるいは異なっていてもよい１〜１６個のリンカー；および
任意に、４）１〜８個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／ま
たはマスキング剤
を含む、モジュール組成物。
【請求項３】
モジュール組成物であって、
１）一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡ；
２）同一でもあるいは異なっていてもよい、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の１
〜８個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＲ１Ｒ２−
または−ＮＲ１−であり、Ｒ１およびＲ２は各々独立に水素およびＣ１〜Ｃ６アルキから
なる群から選択され；ｎは１、２、３または４である）；
３）同一でもあるいは異なっていてもよい１〜１６個のリンカー；および
任意に、４）１〜８個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／ま
たはマスキング剤
を含む、モジュール組成物。
【請求項４】
請求項３に記載のモジュール組成物であって、前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは
リボース環の異なる２’位、ならびに／または、前記ｓｉＲＮＡの異なる３’位末端およ
び／もしくは５’位末端で前記ｓｉＲＮＡに結合しており；かつ前記ｔｅｔｒａＧａｌＮ
Ａｃリガンドは任意にリンカーを介して前記ｓｉＲＮＡに結合している、モジュール組成
物。
【請求項５】
請求項３に記載のモジュール組成物であって、式（ＩＩ）のＸは−Ｏ−、−Ｓ−または
−ＣＨ２−であり；ｎは１、２または３である、モジュール組成物。
【請求項６】
請求項３に記載のモジュール組成物であって、前記組成物は同一でもあるいは異なって
いてもよい１〜４個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含む、モジュール組成物。
【請求項７】
請求項３に記載のモジュール組成物であって、
前記ｓｉＲＮＡは二本鎖であり；かつ
前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは前記ｓｉＲＮＡのリボース環の異なる２’位で
前記ｓｉＲＮＡのガイド鎖またはパッセンジャー鎖に結合している、モジュール組成物。
【請求項８】
請求項３に記載のモジュール組成物であって、
前記ｓｉＲＮＡは二本鎖であり；かつ
前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは異なる３’位末端および／または５’位末端で
前記ｓｉＲＮＡのガイド鎖またはパッセンジャー鎖に結合している、モジュール組成物。
【請求項９】
請求項３に記載のモジュール組成物であって、
前記ｓｉＲＮＡは二本鎖であり；かつ
前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドはリボース環の異なる２’位、ならびに／または
、異なる３’位末端および／もしくは５’位末端で前記ｓｉＲＮＡのガイド鎖およびパッ
センジャー鎖の両方に結合している、モジュール組成物。
【請求項１０】
請求項３に記載のモジュール組成物であって、同一でもあるいは異なっていてもよい、
式（ＩＩ）の２〜８個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含み；前記ｔｅｔｒａＧａｌ
ＮＡｃリガンドは前記ｓｉＲＮＡの同じ鎖に結合している、モジュール組成物。
【請求項１１】
請求項３に記載のモジュール組成物であって、前記組成物は、同一でもあるいは異なっ
ていてもよい、式（ＩＩ）の２〜８個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含み；前記ｔ
ｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは前記ｓｉＲＮＡの異なる鎖に結合している、モジュール
組成物。
【請求項１２】
請求項３に記載のモジュール組成物であって、前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは
リンカーを介して前記ｓｉＲＮＡの同じ鎖または異なる鎖に結合している、モジュール組
成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載のモジュール組成物であって、各リンカーは独立に表１から選択され
る、モジュール組成物。
【請求項１４】
請求項１２に記載のモジュール組成物であって、各リンカーは独立に表２から選択され
る、モジュール組成物。
【請求項１５】
請求項３に記載のモジュール組成物であって、
前記ｓｉＲＮＡは二本鎖であり；かつ
前記任意選択の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマス
キング剤はリンカーを介して前記ｓｉＲＮＡの同じ鎖または異なる鎖に結合している
モジュール組成物。
【請求項１６】
１）二本鎖ｓｉＲＮＡ；
２）下記式（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の１〜８個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガ
ンド：
【化３】
2018048186.tif 000036
３）同一でもあるいは異なっていてもよい、表１から独立に選択される１〜１６個のリ
ンカー；および
任意に、４）１〜８個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／ま
たはマスキング剤
を含む、モジュール組成物。
【請求項１７】
１６に記載のモジュール組成物であって、
１）二本鎖ｓｉＲＮＡ；
２）式（Ｖ）の１〜３個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド；
３）同一でもあるいは異なっていてもよい、表１から独立に選択される１〜６個のリン
カー；および
任意に、４）１〜３個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／ま
たはマスキング剤
を含み、
前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位、ならびに／また
は、前記ｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および／もしくは５’位末端で前記ｓｉＲＮＡに
結合しており；かつ
前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、任意にリンカーを介して前記ｓｉＲＮＡに結
合している
モジュール組成物。
【請求項１８】
２〜３個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含む請求項１７に記載のモジュール組成
物であって、前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドはリンカーを介して前記ｓｉＲＮＡの
同じ鎖または異なる鎖に結合している、モジュール組成物。
【請求項１９】
請求項１７に記載のモジュール組成物であって、
１）二本鎖ｓｉＲＮＡ；
２）式（Ｖ）の１〜２個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド；
３）同一でもあるいは異なっていてもよい、表２から独立に選択される１〜４個のリン
カー；および
任意に、４）１〜２個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／ま
たはマスキング剤
を含み、
前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位、ならびに／また
は、前記ｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および／もしくは５’位末端で前記ｓｉＲＮＡに
結合しており；かつ
前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカーを介して前記ｓｉＲＮＡに結合して
いる
モジュール組成物。
【請求項２０】
２個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含む請求項１９に記載のモジュール組成物で
あって、前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドはリンカーを介して前記ｓｉＲＮＡの同じ
鎖または異なる鎖に結合している、モジュール組成物。
【請求項２１】
１個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含む請求項１９に記載のモジュール組成物で
あって、前記ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドはリンカーを介して前記ｓｉＲＮＡに結合
している、モジュール組成物。
【請求項２２】
請求項１に記載のモジュール組成物および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物
。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
治療を目的としたオリゴヌクレオチドの全身送達に着目した科学的取り組みが進行して
いる。オリゴヌクレオチド送達に注目した３つのアプローチとして、１）脂質ナノ粒子（
ＬＮＰ）への封入、２）ポリマーコンジュゲーションおよび３）単一の化学的コンジュゲ
ーションが挙げられる。単一の化学的コンジュゲーションは典型的には、標的化リガンド
または脂質または可溶化基またはエンドソーム溶解ペプチドもしくは細胞膜透過ペプチド
、および／または、オリゴヌクレオチドに結合したこれらの２つまたは４つすべての組み
合わせを利用する。リンカーは、コンジュゲートのほか、他の官能基に存在してもよい。
単一の化学的コンジュゲートは公知であり、オリゴヌクレオチドの結合は、オリゴヌクレ
オチドの５’末端もしくは３’末端、両末端あるいは内部で起こる。国際公開第２００５
／０４１８５９号パンフレット、国際公開第２００８／０３６８２５号パンフレットおよ
び国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレットを参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
かなりの量の文献的証拠から、オリゴヌクレオチド送達の主な障害が細胞取り込みおよ
びエンドソーム脱出であることという仮説が裏付けられている。送達効率、細胞取り込み
および／またはエンドソーム脱出を効果的に行うことができる新たな単一の化学的コンジ
ュゲートが依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本明細書に開示されたｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含む単一の化学的コンジュゲ
ートは、送達効率、細胞取り込みおよび／またはエンドソーム脱出の促進という驚くべき
特性を有する。
【０００４】
一実施形態では、本明細書に開示されたモジュール組成物は、１）一本鎖または二本鎖
オリゴヌクレオチド；２）同一でもあるいは異なっていてもよい、下記式（Ｉ）の１個ま
たは複数個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド：
【化１】
2018048186.tif 000002
（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＲ１Ｒ２−または−ＮＲ１−であり、Ｒ１およびＲ２
は各々独立に水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；ｎは１、２、３ま
たは４であり；かつ
【化２】
2018048186.tif 000003
による結合は結合点を示す）；任意に、３）同一でもあるいは異なっていてもよい１個ま
たは複数個のリンカー；および任意に、４）１個または複数個の標的化リガンド、可溶化
剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含む。一実施形態では、Ｒ１お
よびＲ２は各々独立に水素、メチルおよびエチルからなる群から選択される。別の実施形
態では、Ｒ１およびＲ２は各々水素である。
【０００５】
一実施形態では、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは下記式（ＩＩ）を有し、式中、Ｘ
、Ｒ１、Ｒ２およびｎは、上記で定義した通りである。別の実施形態では、ｔｅｔｒａＧ
ａｌＮＡｃリガンドは下記式（ＩＩＩ）を有し、式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２およびｎは、上記
で定義した通りである。
【化３】
2018048186.tif 000004
【０００６】
別の実施形態では、モジュール組成物は、１）一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド
；２）同一でもあるいは異なっていてもよい、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の１
〜８個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−また
は−ＮＨ−であり；ｎは１、２、３または４である）；３）同一でもあるいは異なってい
てもよい１〜２４個のリンカー；および任意に、４）１〜８個の標的化リガンド、可溶化
剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含む。
【０００７】
別の実施形態では、モジュール組成物は、１）一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）同
一でもあるいは異なっていてもよい、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の１〜８個の
ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−または−ＮＨ
−であり；ｎは１、２、３または４である）；３）同一でもあるいは異なっていてもよい
１〜１６個のリンカー；および任意に、４）１〜８個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物
動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含む。
【０００８】
上記の実施形態の１つのサブセットでは、リンカーは、リボース環の異なる２’位、な
らびに／または、オリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および／も
しくは５’位末端でオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡに結合している。
【０００９】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、任
意にリンカーを介してオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡに結合している。
【００１０】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リ
ボース環の異なる２’位、ならびに／または、オリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡの
異なる３’位末端および／または５’位末端でオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡに
結合しており；ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、任意にリンカーを介してオリゴヌク
レオチドまたはｓｉＲＮＡに結合している。
【００１１】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の
Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＣＨ２−であり；ｎは１、２または３である。
【００１２】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の
Ｘは−Ｏ−または−ＣＨ２−であり、ｎは１または２である。
【００１３】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の
Ｘは−Ｏ−であり、ｎは１または２である。
【００１４】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の
Ｘは−ＣＨ２−であり、ｎは１または２である。
【００１５】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、組成物は、同一でもあるいは異なってい
てもよい１〜６個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド、またはより具体的には１〜４個の
ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含む。
【００１６】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは
二本鎖であり；かつｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉ
ＲＮＡのガイド鎖またはパッセンジャー鎖にリボース環の異なる２’位で結合している。
【００１７】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは
二本鎖であり；かつｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉ
ＲＮＡのガイド鎖またはパッセンジャー鎖に異なる３’位末端および／または５’位末端
で結合している。
【００１８】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは
二本鎖であり；かつ２個以上のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、オリゴヌクレオチド
またはｓｉＲＮＡのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の両方にリボース環の異なる２’位
、ならびに／または、異なる３’位末端および／もしくは５’位末端で結合している。
【００１９】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、リンカーは各々独立に表１から選択され
る。
【００２０】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、リンカーは各々独立に表２から選択され
る。
【００２１】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは
二本鎖であり；かつ任意選択の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および
／またはマスキング剤は、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡの同じ鎖または異なる鎖
に結合している。
【００２２】
一実施形態では、モジュール組成物は、１）二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）下記式（ＩＶ）、
（Ｖ）または（ＶＩ）の１〜８個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド：
【化４】
2018048186.tif 000005
３）同一でもあるいは異なっていてもよい、表１から独立に選択される１〜１６個のリン
カー；および、任意に、４）１〜８個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂
質および／またはマスキング剤を含む。
【００２３】
別の実施形態では、モジュール組成物は、１）二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）式（ＩＶ）、（
Ｖ）または（ＶＩ）の１〜４個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド；３）同一でもあるい
は異なっていてもよい、表１から独立に選択される１〜８個のリンカー；および、任意に
、４）１〜４個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマス
キング剤を含み；ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位、なら
びに／または、ｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および／もしくは５’位末端でｓｉＲＮＡ
に結合しており；かつｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、任意にリンカーを介してｓｉ
ＲＮＡに結合している。
【００２４】
上記の実施形態の１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカ
ーを介してｓｉＲＮＡの同じ鎖に結合している。
【００２５】
一実施形態では、モジュール組成物は、１）二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）式（Ｖ）の１〜４
個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド；３）同一でもあるいは異なっていてもよい、表２
から独立に選択される１〜８個のリンカー；および、任意に、４）１〜４個の標的化リガ
ンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含み；ｔｅｔｒａ
ＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位、ならびに／または、ｓｉＲＮＡの
異なる３’位末端および／もしくは５’位末端でｓｉＲＮＡに結合しており；かつｔｅｔ
ｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカーを介してｓｉＲＮＡに結合している。
【００２６】
上記の実施形態の１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカ
ーを介してｓｉＲＮＡの同じ鎖に結合している。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書に開示されるのは、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド；および同一でも
あるいは異なっていてもよい、下記式（Ｉ）の１個または複数個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡ
ｃリガンド：
【化５】
2018048186.tif 000006
（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＲ１Ｒ２−または−ＮＲ１−であり、Ｒ１およびＲ２
は各々独立に水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；ｎは１、２、３ま
たは４であり；かつ
【化６】
2018048186.tif 000007
による結合は結合点を示す）を含む単一の化学的コンジュゲートである。他の官能基、た
とえば標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤が
任意に存在する。一実施形態では、Ｒ１およびＲ２は各々独立に水素、メチルおよびエチ
ルからなる群から選択される。別の実施形態では、Ｒ１およびＲ２は各々水素である。
【００２８】
一実施形態では、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは下記式（ＩＩ）を有し、式中、Ｘ
、Ｒ１、Ｒ２およびｎは、上記で定義した通りである。別の実施形態では、ｔｅｔｒａＧ
ａｌＮＡｃリガンドは下記式（ＩＩＩ）を有し、式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２およびｎは、上記
で定義した通りである。
【化７】
2018048186.tif 000008
【００２９】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。別の
実施形態では、ｓｉＲＮＡは一本鎖ｓｉＲＮＡである。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは
二本鎖ｓｉＲＮＡである。
【００３０】
本明細書に開示されたｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃを使用すると、モジュール組成物を特定
の細胞に誘導することによりオリゴヌレオチドまたはｓｉＲＮＡが効果的に送達され得る
。たとえば、標的化リガンドは、標的細胞の表面上の分子と特異的または非特異的に結合
し、リガンド−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの取り込みを促進することができる。
【００３１】
リンカーは、各ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃとオリゴヌクレオチドとの間に存在してもよい
。リンカーは、リボース環の異なる２’位、ならびに／または、オリゴヌクレオチドの３
’位末端および／もしくは５’位末端でオリゴヌクレオチドに結合している。
【００３２】
一実施形態では、モジュール組成物は、１）一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド；
２）同一でもあるいは異なっていてもよい、式（Ｉ）の１個または複数個のｔｅｔｒａＧ
ａｌＮＡｃリガンド（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−または−ＮＨ−であり；ｎ
は１、２、３または４であり；かつ
【化８】
2018048186.tif 000009
による結合は結合点を示す）；任意に、３）同一でもあるいは異なっていてもよい１個ま
たは複数個のリンカー；および任意に、４）１個または複数個の標的化リガンド、可溶化
剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含む。
【００３３】
別の実施形態では、モジュール組成物は、１）一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド
；２）同一でもあるいは異なっていてもよい、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の１
〜８個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−また
は−ＮＨ−であり；ｎは１、２、３または４である）；３）同一でもあるいは異なってい
てもよい１〜１６個のリンカー；および任意に、４）１〜８個の標的化リガンド、可溶化
剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含む。
【００３４】
別の実施形態では、モジュール組成物は、１）一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）同
一でもあるいは異なっていてもよい、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の１〜８個の
ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−または−ＮＨ
−であり；ｎは１、２、３または４である）；３）同一でもあるいは異なっていてもよい
１〜１６個のリンカー；および任意に、４）１〜８個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物
動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含む。
【００３５】
上記の実施形態の１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボー
ス環の異なる２’位、ならびに／または、オリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡの異な
る３’位末端および／または５’位末端でオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡに結合
している。
【００３６】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、任
意にリンカーを介してオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡに結合している。一実施形態
では、リンカーが存在する。
【００３７】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リ
ボース環の異なる２’位、ならびに／または、オリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡの
異なる３’位末端および／または５’位末端でオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡに
結合しており；ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカーを介してオリゴヌクレオチ
ドまたはｓｉＲＮＡに結合している。
【００３８】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リ
ンカーを介してオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡに結合しており、リンカーは、リボ
ース環の異なる２’位でオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡに結合している。
【００３９】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リ
ンカーを介してオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡに結合しており、リンカーは、オリ
ゴヌクレオチドの異なる３’位末端および／または５’位末端でオリゴヌクレオチドまた
はｓｉＲＮＡに結合している。
【００４０】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＣＨ２−で
ある。別の実施形態では、Ｘは−Ｏ−または−ＣＨ２−である。別の実施形態では、ｎは
１、２または３である。別の実施形態では、Ｘは−Ｏ−であり、ｎは１または２である。
別の実施形態では、Ｘは−ＣＨ２−であり、ｎは１または２である。別の実施形態では、
Ｘは−Ｏ−であり、ｎは１である。なお別の実施形態では、Ｘは−ＣＨ２−であり、ｎは
１である。
【００４１】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは
一本鎖である。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは二本鎖である
。
【００４２】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、組成物は１〜６個のｔｅｔｒａＧａｌＮ
Ａｃリガンドを含む。別の実施形態では、組成物は１〜４個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリ
ガンドを含む。別の実施形態では、組成物は１〜２個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド
を含む。なお別の実施形態では、組成物は１個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドを含む
。
【００４３】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは
二本鎖であり、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位でガイド
鎖に結合している。
【００４４】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは
二本鎖であり、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、異なる３’位末端および／または５
’位末端でガイド鎖に結合している。
【００４５】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは
二本鎖であり、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位でパッセ
ンジャー鎖に結合している。
【００４６】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは
二本鎖であり、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、異なる３’位末端および／または５
’位末端でパッセンジャー鎖に結合している。
【００４７】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは
二本鎖であり、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位、ならび
に／または、異なる３’位末端および／もしくは５’位末端でガイド鎖およびパッセンジ
ャー鎖の両方に結合している。
【００４８】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは
二本鎖であり、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは同じ鎖に結合している。
【００４９】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは
二本鎖であり、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは異なる鎖に結合している。
【００５０】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは
二本鎖であり、任意選択の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／ま
たはマスキング剤は、同じ鎖または異なる鎖に結合している。
【００５１】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは
二本鎖であり、任意選択の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／ま
たはマスキング剤は、リンカーを介して同じ鎖または異なる鎖に結合している。一実施形
態では、リンカーは各々独立に選択される表１である。別の実施形態では、リンカーは各
々独立に選択される表２である。
【００５２】
一実施形態では、モジュール組成物は、１）一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）同一
でもあるいは異なっていてもよい、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の１〜８個のｔ
ｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド（式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−または−ＮＨ−
であり；ｎは１、２、３または４である）；３）同一でもあるいは異なっていてもよい１
〜１６個のリンカー；および任意に、４）１〜８個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動
態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含み；ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは
、リボース環の異なる２’位、ならびに／または、ｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および
／もしくは５’位末端でｓｉＲＮＡに結合しており；かつｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガン
ドは、任意にリンカーを介してｓｉＲＮＡに結合している。一実施形態では、リンカーが
存在する。別の実施形態では、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＣＨ２−であり、ｎは１、２
または３である。別の実施形態では、Ｘは−Ｏ−または−ＣＨ２−であり、ｎは１または
２である。
【００５３】
別の実施形態では、モジュール組成物は、１）二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）同一でもあるい
は異なっていてもよい、式（Ｉ）の１〜６個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド（式中、
Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＣＨ２−であり；ｎは１、２または３である）；３）同一で
もあるいは異なっていてもよい１〜１８個のリンカー；および任意に、４）１〜６個の標
的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含み；ｔ
ｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位、ならびに／または、ｓｉ
ＲＮＡの異なる３’位末端および／もしくは５’位末端でｓｉＲＮＡに結合しており；か
つｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、任意にリンカーを介してｓｉＲＮＡに結合してい
る。一実施形態では、リンカーが存在する。別の実施形態では、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−また
は−ＣＨ２−であり、ｎは１または２である。別の実施形態では、リンカーは表１から独
立に選択される。別の実施形態では、リンカーは表２から独立に選択される。
【００５４】
別の実施形態では、モジュール組成物は、１）二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）同一でもあるい
は異なっていてもよい、式（Ｉ）の１〜４個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド（式中、
Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＣＨ２−であり；かつ、ｎは１または２である）；３）同一
でもあるいは異なっていてもよい１〜８個のリンカー；および任意に、４）１〜４個の標
的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含み；ｔ
ｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位、ならびに／または、ｓｉ
ＲＮＡの異なる３’位末端および／もしくは５’位末端でｓｉＲＮＡに結合しており；か
つｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカーを介してｓｉＲＮＡに結合している。一
実施形態では、Ｘは−Ｏ−または−ＣＨ２−であり、ｎは１または２である。別の実施形
態では、リンカーは表１から独立に選択される。別の実施形態では、リンカーは表２から
独立に選択される。
【００５５】
別の実施形態では、モジュール組成物は、１）二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）下記式（ＩＶ）
、（Ｖ）または（ＶＩ）の１〜４個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド：
【化９】
2018048186.tif 000010
３）同一でもあるいは異なっていてもよい、表１から独立に選択される１〜８個のリンカ
ー；および任意に、４）１〜４個の標的化リガンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質お
よび／またはマスキング剤を含み；ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異
なる２’位、ならびに／または、ｓｉＲＮＡの異なる３’位末端および／もしくは５’位
末端でｓｉＲＮＡに結合しており；かつｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカーを
介してｓｉＲＮＡに結合している。
【００５６】
別の実施形態では、モジュール組成物は、１）二本鎖ｓｉＲＮＡ；２）式（Ｖ）の１〜
４個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド；３）同一でもあるいは異なっていてもよい、表
２から独立に選択される１〜８個のリンカー；および任意に、４）１〜４個の標的化リガ
ンド、可溶化剤、薬物動態改善剤、脂質および／またはマスキング剤を含み；ｔｅｔｒａ
ＧａｌＮＡｃリガンドは、リボース環の異なる２’位、ならびに／または、ｓｉＲＮＡの
異なる３’位末端および／もしくは５’位末端でｓｉＲＮＡに結合しており；かつｔｅｔ
ｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカーを介してｓｉＲＮＡに結合している。
【００５７】
上記の実施形態の１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リンカ
ーを介してｓｉＲＮＡに結合しており；かつｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは同じ鎖に
結合している。
【００５８】
上記の実施形態のもう１つのサブセットでは、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは、リ
ンカーを介してｓｉＲＮＡに結合しており；かつｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドは異な
る鎖に結合している。
【００５９】
カートゥーン（ｃａｒｔｏｏｎ）により本発明を説明するには、本発明は、オリゴヌク
レオチド（［Ｏ１］［Ｏ２］［Ｏ３］．．．．．．［Ｏｎ］）と、１個または複数個のリ
ンカー（Ｌ）と、１個または複数個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド（Ｇ）と、１つま
たは複数の任意選択の脂質（Ｘ）、標的化リガンド（Ｘ）および／または可溶化基（Ｘ）
とを含むモジュール組成物を特徴とする。
【００６０】
一実施形態では、モジュール組成物は下記式を有し得る。
Ｇ−Ｌ−［Ｏ１］［Ｏ２］［Ｏ３］．．．．．．［Ｏｎ］
【００６１】
別の実施形態では、モジュール組成物は下記式を有し得る。
Ｇ−Ｌ−［Ｏ１］［Ｏ２］［Ｏ３］．．．．．．［Ｏｎ］−Ｘ
【００６２】
末端コンジュゲーションを有する二本鎖オリゴヌクレオチドを含むモジュール組成物の
非限定的な例として、下記がある。
【化１０】
2018048186.tif 000011
【化１１】
2018048186.tif 000012
【００６３】
内部コンジュゲーションを有する二本鎖オリゴヌクレオチドを含むモジュール組成物の
非限定的な例には、下記がある。
【化１２】
2018048186.tif 000013
【００６４】
これらの例は、説明としてのみ使用する。当業者であれば、所望の要素をパッセンジャ
ー鎖およびガイド鎖に配置するのに種々の並べ替えが存在することを理解するであろう。
【００６５】
オリゴヌクレオチドには、何個のリンカーが、したがって何個のｔｅｔｒａＧａｌＮＡ
ｃリガンドが結合していてもよい。好ましいリンカー数の範囲は１〜１６である。より好
ましいリンカー数の範囲は１〜８、あるいはより詳細には１〜４である。好ましいｔｅｔ
ｒａＧａｌＮＡｃリガンド数の範囲は、１〜８である。より好ましいペプチド数の範囲は
１〜８、あるいはより具体的には１〜４である。
【００６６】
２本の鎖は、それぞれｎヌクレオチドおよびｎ’ヌクレオチドを含む。ｎおよびｎ’の
数は、同一でもあるいは異なっていてもよい。その数は８〜５０の範囲の整数である。好
ましくは、その数は１２〜２８の範囲の整数である。一層好ましくは、その数は１９〜２
１の範囲の整数である。
【００６７】
一例を挙げると、リンカー（Ｌ−Ｇおよび／またはＬ−Ｘ）を含むヌクレオチド［Ｏｎ
］または［Ｏｎ’］は各々、以下のカートゥーン（ｃａｒｔｏｏｎ）に示した一般的な構
造を有する。
【化１３】
2018048186.tif 000014
【００６８】
各ヌクレオチドでは、１）Ｅ＝酸素（Ｏ）または硫黄（Ｓ）；２）修飾されていてもあ
るいは修飾されていなくもよい塩基＝Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ；３）Ｄはリボース環とリンカ
ーＬとの間の接合点であり、Ｄ＝酸素（Ｏ）、硫黄（Ｓ、Ｓ（Ｏ）またはＳ（Ｏ）２）、
窒素（Ｎ−Ｒ、式中、Ｒ＝Ｈ、アルキル、Ｌ−ＰもしくはＬ−Ｘ）、炭素（ＣＨ−Ｒ、式
中、Ｒ＝Ｈ、アルキル、Ｌ−ＰもしくはＬ−Ｘ））、またはリン（Ｐ（Ｏ）ＲまたはＰ（
Ｏ）（ＯＲ）、式中、Ｒ＝アルキル、Ｌ−ＧもしくはＬ−Ｘ）である。好ましくは、Ｄ＝
酸素（Ｏ）である。
【００６９】
２個のヌクレオチド［Ｏｎ−１］および［Ｏｎ］または［Ｏｎ’−１］および［Ｏｎ’
］は、ホスホジエステル結合またはチオ−ホスホジエステル結合により連結されている。
【００７０】
オリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドである場合、「Ｇ−Ｌ」と脂質、標的
化リガンドおよび／または可溶化基とは、同じ鎖上に位置してもあるいは異なる鎖上に位
置してもよい。
【００７１】
いくつかの実施形態では、「Ｇ−Ｌ」と脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基
とは同じ鎖上にある。
【００７２】
いくつかの実施形態では、「Ｇ−Ｌ」と脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基
とはパッセンジャー鎖上にある。
【００７３】
いくつかの実施形態では、「Ｇ−Ｌ」と脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基
とはガイド鎖上にある。
【００７４】
いくつかの実施形態では、「Ｇ−Ｌ」と脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基
とは異なる鎖上に位置する。
【００７５】
いくつかの実施形態では、「Ｇ−Ｌ」はパッセンジャー鎖上にあるのに対し、脂質、標
的化リガンドおよび／または可溶化基はガイド鎖上にある。
【００７６】
いくつかの実施形態では、「Ｇ−Ｌ」と脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基
とは異なる鎖上にあるが、二本鎖オリゴヌクレオチドの同じ末端上にある。
【００７７】
いくつかの実施形態では、「Ｇ−Ｌ」と脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基
とは異なる鎖上にあり、かつ二本鎖オリゴヌクレオチドの逆末端上にある。
【００７８】
いくつかの実施形態では、上記の実施形態に示した脂質、標的化リガンドおよび／また
は可溶化基の代わりに同一または異なる性質の別の「Ｇ−Ｌ」を使用してもよい。
【００７９】
いくつかの実施形態では、「Ｇ−Ｌ」はパッセンジャー鎖あるいはガイド鎖の複数の末
端に位置していてもよく、脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基はパッセンジャ
ー鎖およびガイド鎖の残りの末端に位置していてもよい。いくつかの実施形態では、１個
の「Ｇ−Ｌ」と２個以上の脂質、標的化リガンドおよび／または可溶化基とがオリゴヌク
レオチドに存在する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、２個以上の「Ｇ−Ｌ」と２個以上の脂質、標的化リガンドお
よび／または可溶化基とがオリゴヌクレオチドに存在する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドであり、か
つ複数の「Ｇ−Ｌ」成分ならびに／または脂質、標的化リガンドおよび／もしくは可溶化
基が存在する場合、そうした複数の「Ｇ−Ｌ」成分ならびに／または脂質、標的化リガン
ドおよび／もしくは可溶化基はすべて二本鎖オリゴヌクレオチドの一方の鎖に存在しても
、あるいは両方の鎖に存在してもよい。
【００８２】
複数の「Ｇ−Ｌ」成分ならびに／または脂質、標的化リガンドおよび／もしくは可溶化
基が存在する場合、それらはすべて同一でも、あるいは異なっていてもよい。
【００８３】
いくつかの実施形態では、「Ｇ−Ｌ」は内部ヌクレオチド上のみ（すなわちオリゴヌク
レオチドの３’末端および５’末端を除く）にある。
【００８４】
別の態様では、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを細胞に送達する方法
を含む。本方法は、（ａ）本明細書に開示されたモジュール組成物を用意または取得する
こと；（ｂ）細胞をモジュール組成物と接触させること；および（ｃ）モジュール組成物
を細胞内に移行させることを含む。
【００８５】
本方法は、たとえばオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡを必要とすると判定された被
検体を処置するため、インビトロ、エキソビボまたはインビボで行うことができる。前記
オリゴヌクレオチドを必要とする被検体は、遺伝子（単数または複数）、たとえば、障害
に関連する遺伝子の発現をダウンレギュレートするまたはサイレンシングさせることを必
要とする被検体、たとえば、ヒトである。
【００８６】
一態様では、本発明は、１個または複数個の遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。
本方法は、１つまたは複数の細胞を本発明の有効量のオリゴヌクレオチドと接触させるこ
とを含み、有効量は、１個または複数個の遺伝子の発現を抑制する量である。この方法は
、インビトロ、エキソビボまたはインビボで行うことができる。
【００８７】
本発明の方法および組成物、たとえば、本明細書に記載のモジュール組成物は、当該技
術分野において公知のどのようなオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡと共に使用しても
よい。さらに、本発明の方法および組成物は、当該技術分野において公知のどのような疾
患または障害の処置、どのような被検体、たとえば任意の動物、任意の哺乳動物、たとえ
ば任意のヒトの処置に使用してもよい。さらに当業者であれば、本発明の方法および組成
物は、遺伝子（単数または複数）のダウンレギュレーションまたはサイレンシングから恩
恵を受けると考えられる任意の疾患の処置に使用することができることも認識するであろ
う。
【００８８】
本発明の方法および組成物、たとえば、本明細書に記載のモジュール組成物は、本明細
書に記載のどのような用量および／もしくは製剤、あるいは当該技術分野において公知の
どのような用量または製剤で使用してもよい。当業者であればさらに、本明細書に記載の
投与経路に加えて他の投与経路を使用して本発明のモジュール組成物を投与してもよいこ
とも理解するであろう。
【００８９】
オリゴヌクレオチド
「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、二本鎖または一本鎖での非修飾
または修飾ＲＮＡまたはＤＮＡである。修飾ＲＮＡの例には、非修飾ＲＮＡよりヌクレア
ーゼ分解に対して抵抗性が高いものがある。さらなる例として、２’糖修飾、塩基修飾、
一本鎖オーバーハング、たとえば３’一本鎖オーバーハングの修飾、または、特に一本鎖
の場合、１つまたは複数のリン酸基または１つまたは複数のリン酸基のアナログを含む５
’修飾を有するものが挙げられる。オリゴヌクレオチドの例およびより詳細な説明は、本
明細書に援用する国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレットで確認することがで
きる。
【００９０】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドはアンチセンス、ｍｉＲＮＡ、ペプチド核酸（Ｐ
ＮＡ）、ポリ−モルホリノ（ＰＭＯ）またはｓｉＲＮＡである。好ましいオリゴヌクレオ
チドはｓｉＲＮＡである。別の好ましいオリゴヌレオチドはｓｉＲＮＡのパッセンジャー
鎖である。別の好ましいオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡのガイド鎖である。
【００９１】
ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスによりｍＲＮＡの配列特異
的サイレンシングを誘導する。このプロセスは、哺乳動物および他の脊椎動物を含む多種
多様な生物で起こる。ｓｉＲＮＡを調製および投与するための方法、ならびに遺伝子機能
を特異的に不活性化するためのその使用は、公知である。ｓｉＲＮＡは、修飾および非修
飾ｓｉＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡの例およびより詳細な説明は、本明細書に援用する国際
公開第２００９／１２６９３３号パンフレットで確認することができる。
【００９２】
ｓｉＲＮＡを被検体に投与するのに使用することができる例示的送達経路は、多く知ら
れている。さらに、ｓｉＲＮＡは、当該技術分野において公知の任意の例示的な方法によ
り製剤化することもできる。ｓｉＲＮＡの製剤および投与の例およびより詳細な説明は、
本明細書に援用する国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレットで確認することが
できる。
【００９３】
「低分子干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「低分
子干渉核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」ま
たは「化学修飾低分子干渉核酸分子」という表現は、ＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）または
遺伝子サイレンシングを介して配列特異的に遺伝子発現またはウイルス複製を阻害または
ダウンレギュレートすることができる任意の核酸分子をいう。これらの用語は、個々の核
酸分子、複数のそうした核酸分子またはそうした核酸分子のプールの両方をいうことがで
きる。ｓｉＮＡは、アンチセンス鎖が標的核酸分子のヌクレオチド配列またはその一部と
相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖が標的核酸配列に相当するヌクレオチド配列
またはその一部を含む、自己相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分
子であってもよい。ｓｉＮＡは、アンチセンス領域が別の標的核酸分子のヌクレオチド配
列またはその一部と相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列または
その一部に相当するヌクレオチド配列を含む、自己相補的なセンス領域およびアンチセン
ス領域を有する二本鎖、非対称二本鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を有する
ポリヌクレオチドであってもよい。ｓｉＮＡは、２つ以上のループ構造と自己相補的なセ
ンス領域およびアンチセンス領域を含むステムとを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドで
あってもよく、この場合、アンチセンス領域は標的核酸分子ヌクレオチド配列またはその
一部と相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部に相
当するヌクレオチド配列を含み、かつ環状ポリヌクレオチドはインビボあるいはインビト
ロでプロセシングを受けてＲＮＡｉを媒介する能力がある活性なｓｉＮＡ分子になること
ができる。ｓｉＮＡは、標的核酸分子のヌクレオチド配列またはその一部と相補的なヌク
レオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドをさらに含んでもよく（たとえば、こうし
たｓｉＮＡ分子には、標的核酸配列またはその一部に相当するヌクレオチド配列がｓｉＮ
Ａ分子内に存在する必要がない）、一本鎖ポリヌクレオチドは、末端リン酸基、たとえば
５’−リン酸（たとえば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ，１１
０，５６３−５７４  ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ  Ｃｅｌｌ，１０，５３７−５６８を参照）、または５’，３’−二リン酸をさら
に含んでもよい。
【００９４】
リンカー
モジュール組成物のｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃとオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡと
の間の共有結合は、リンカーを介してもよい。このリンカーは、用途に応じて切断型でも
あるいは非切断型でもよい。ある種の実施形態では、切断型リンカーは、エンドソームか
ら細胞質への輸送後にオリゴヌクレオチドを放出するのに使用してもよい。目的のコンジ
ュゲーションまたはカップリング相互作用の性質、または所望の生物学的作用により、ど
のリンカー基を選ぶかが決定される。リンカー基は、より複雑な構造を得るため組み合わ
せても、あるいは分岐させてもよい。好適なリンカーとして、本明細書に援用する国際公
開第２００９／１２６９３３号パンフレットに記載されているようなものが挙げられる。
【００９５】
一実施形態では、本発明のリンカーを表１に示す。
【００９６】
【表１】
2018048186.tif 000015
【００９７】
別の実施形態では、好ましいリンカーを表２に示す。
【００９８】
【表２】
2018048186.tif 000016
【００９９】
市販のリンカーは、前記リンカーの組み合わせを含め、ＰｉｅｒｃｅまたはＱｕａｎｔ
ａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎなど様々な供給業者から入手することができる。さらに、リン酸
結合を介して結合された市販のリンカーを、リンカーとして独立に使用しても、あるいは
前記リンカーと組み合わせて使用してもよい。リンカーはさらに、１〜８個のｔｅｔｒａ
ＧａｌＮＡｃリガンドを適合させたより複雑な分岐構造を得るため組み合わせてもよく、
そうした一例を下記に図示する。
【化１４】
2018048186.tif 000017
【０１００】
標的化リガンド
本発明のモジュール組成物は標的化リガンドを含んでもよい。いくつかの実施形態では
、この標的化リガンドは、モジュール組成物を特定の細胞に誘導することができる。たと
えば、標的化リガンドは、標的細胞の表面上の分子と特異的または非特異的に結合するこ
とができる。標的化部分は、標的細胞に対して特異的親和性を有する分子であってもよい
。標的化部分は、標的細胞の表面に見られるタンパク質に対する抗体、あるいは標的細胞
の表面に見られる分子に対するリガンドまたはリガンドの受容体結合部を含んでもよい。
標的化リガンドの例およびより詳細な説明は、本明細書に援用する国際公開第２００９／
１２６９３３号パンフレットで確認することができる。
【０１０１】
標的化リガンドは、抗体、受容体のリガンド結合部、受容体に対するリガンド、アプタ
マー、Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）、多価Ｎ−
アシチル−Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、コレステロール、脂肪酸、リポタンパク
質、フォレート、サイロトロピン、メラノトロピン、界面活性剤プロテインＡ、ムチン、
炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−ア
セチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フルクトース、グリコシル化ポリアミノ酸
、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタマート、ポリアスパルテート、血漿
タンパク質結合を増強する親油性部分、ステロイド、胆汁酸、ビタミンＢ１２、ビオチン
、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体、イブプロフェン、ナプロキセン、アスピリン
、フォレートならびにこれらのアナログおよび誘導体からなる群から選択される。
【０１０２】
好ましい標的化リガンドは、Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース（Ｇ
ａｌＮＡｃ）、ＧａｌＮＡｃ２およびＧａｌＮＡｃ３、コレステロール、フォレート、な
らびにこれらのアナログおよび誘導体からなる群から選択される。
【０１０３】
脂質
親油性部分、たとえばコレステロールまたは脂肪酸は、核酸などの高度の親水性分子に
結合すると、血漿タンパク質結合を実質的に増強し、結果として循環半減期を長くするこ
とができる。さらに、親油基は細胞取り込みを促進することもできる。たとえば、脂質は
、特定の血漿タンパク質、たとえばリポタンパク質に結合でき、その結果、対応するリポ
タンパク質受容体（たとえば、ＬＤＬ受容体またはスカベンジャー受容体ＳＲ−Ｂ１）を
発現する特定の組織の取り込みを促進することが示されている。親油性コンジュゲートは
、標的送達アプローチと見なすこともでき、その細胞内輸送は、エンドソーム溶解剤との
組み合わせによりさらに強力に促進され得る。
【０１０４】
血漿タンパク質結合を増強する例示的な親油性部分には、ステロール、コレステロール
、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン
脂質、スフィンゴ脂質、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、
１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデ
シルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシ
ル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレ
オイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、フェノキサジン、アスピリン、ナプロキセン、
イブプロフェン、ビタミンＥおよびビオチン等があるが、これに限定されるものではない
。脂質の例およびより詳細な説明は、本明細書に援用する国際公開第２００９／１２６９
３３号パンフレットで確認することができる。
【０１０５】
好ましい脂質はコレステロールである。
【０１０６】
可溶化剤
モジュール組成物は、水溶解度の向上、循環半減期の延長および／または細胞取り込み
の促進を行うことができる１個または複数個の他の部分／リガンドを含んでもよい。こう
したものとして、天然に存在する物質、たとえばタンパク質（たとえば、ヒト血清アルブ
ミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）ま
たはグロブリン）；または炭水化物（たとえば、デキストラン、プルラン、キチン、キト
サン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）を挙げることができる。これ
らの部分はまた、組換え分子または合成分子、たとえば合成ポリマーまたは合成ポリアミ
ノ酸であってもよい。例として、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリ
Ｌ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ
−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−
ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ、たとえば、ＰＥＧ−０．５Ｋ、ＰＥＧ−２Ｋ、ＰＥＧ−５Ｋ、ＰＥＧ−１０
Ｋ、ＰＥＧ−１２Ｋ、ＰＥＧ−１５Ｋ、ＰＥＧ−２０Ｋ、ＰＥＧ−４０Ｋ）、メチル−Ｐ
ＥＧ（ｍＰＥＧ）、［ｍＰＥＧ］２、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、
ポリ（２エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホス
ファジンが挙げられる。可溶化剤の例およびより詳細な説明は、本明細書に援用する国際
公開第２００９／１２６９３３号パンフレットで確認することができる。
【０１０７】
好ましい可溶化基はＰＥＧ０．５Ｋ〜３０Ｋである。
【０１０８】
処置の方法
一態様では、本発明は、本発明のモジュール組成物の投与から恩恵を受け得る疾患のリ
スクがあるまたはそれに罹患した被検体を処置する方法を特徴とする。本方法は、本発明
のモジュール組成物の投与を必要とする被検体に本発明のモジュール組成物を投与するこ
とにより、被検体を処置することを含む。投与されるオリゴヌクレオチドは、処置対象の
疾患によって異なる。具体的な適応症の処置方法に関するさらなる詳細については、国際
公開第２００９／１２６９３３号パンフレットを参照されたい。
【０１０９】
処方
オリゴヌクレオチド化合物のコンジュゲートを調製するための方法は、多く存在する。
その技術は、当業者によく知られているはずである。そうした反応に関する有用な参考文
献として、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ
．Ｔ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６がある。
他の参考文献としては、国際公開第２００５／０４１８５９号パンフレット；国際公開第
２００８／０３６８２５号パンフレットおよび国際公開第２００９／１２６９３３号パン
フレットがある。
【実施例】
【０１１０】
本発明について以下の例により詳細に説明するが、以下の例をさらに限定するものと解
釈してはならない。本出願に引用されるすべての参考文献、係属中の特許出願および公開
された特許の内容は、本明細書に明示的に援用する。本明細書に記載されるｓｉＲＮＡは
、広範に発現する遺伝子ＳＳＢ（シェーグレン症候群抗原Ｂ；ＮＭ＿００９２７８．４）
を標的とするように設計した。
【０１１１】
少なくとも１個の酸素原子、少なくとも１個のリン原子および／または少なくとも１個
の窒素原子を含むいくつかの実施形態では、リンカー基は、連結結合点（ＬＡＰ）でオリ
ゴヌクレオチド鎖またはｓｉＲＮＡ鎖（単数または複数）と連結することができ、任意の
炭素含有基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、リン原子は、オリゴヌクレオチド
鎖の接合点としての役割を果たすことができるリンカー基上の末端リン酸基またはホスホ
ロチオエート基の一部を形成する。ある種の実施形態では、窒素原子は、目的のリンカー
、エンドソーム溶解単位、細胞膜透過ペプチド、可溶化基、脂質、標的化基または別の目
的のリンカー接合点としての役割を果たすことができるリンカー基上の末端エーテル基、
エステル基、アミノ基またはアミド（ＮＨＣ（Ｏ）−）基の一部を形成する。これらの末
端リンカー基には、Ｃ６ヘキシル部分、Ｃ５第二級ヒドロキシ部分、Ｃ３チオール部分ま
たはＣ６チオール部分があるが、これに限定されるものではない。下記に記載するＲＮＡ
配列の一例として、Ｃ６ヘキシル：［（ＣＨ２）６ＮＨ２］がある。
【０１１２】
ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドおよびｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡコンジュ
ゲートの調製について、下記の実施例および合成スキームに記載する。下記に記載された
化合物および／またはコンジュゲートに使用した具体的なｓｉＲＮＡ配列を表３に示す。
【０１１３】
【表３】
2018048186.tif 000018
【０１１４】
インビトロおよびインビボ活性データ
後述した方法を使用したインビボおよびインビトロデータを表４に示す。
【０１１５】
【表４】
2018048186.tif 000019
【０１１６】
下記のｓｉＲＮＡの記載は説明を目的としたものであることに留意されたい。具体的な
配列情報は表３で確認することができる。
【０１１７】
実施例１〜２
ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド化合物９および１０の合成
以下のスキーム１を用いてＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ化合物９および１０を調製した。
【０１１８】
スキーム１
【化１５】
2018048186.tif 000020
（２Ｓ）−２，６−ビス［ビス（プロプ−２−イン−１−イル）アミノ］ヘキサン酸（化
合物１）の合成
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した２０００ｍＬ  ３口丸底フラスコに、（２Ｓ
）−２，６−ジアミノヘキサン酸（５０ｇ、３４２．０３ｍｍｏｌ、１．００当量）をア
セトニトリル（１０００ｍＬ）に溶かした溶液を入れ、５０℃に加熱した。これに水酸化
カリウム（２２．６ｇ、０．４０２５ｍｏｌ、１．００当量、８５％）を加えた。得られ
た溶液を３０分間撹拌した。次いで３−ブロモプロプ−１−イン（２９．５ｍＬ、１．０
０当量）を加えた。得られた溶液を５０℃で１時間撹拌した。追加の水酸化カリウム（２
２．６ｇ、０．４０２５ｍｏｌ、１．００当量）をこの溶液に加え、５０℃で３０分間撹
拌した。これに３−ブロモプロプ−１−イン（２９．５ｍＬ、１．００当量）を加えた。
得られた溶液を１時間撹拌した。これに水酸化カリウム（２２．６ｇ、０．４０２５ｍｏ
ｌ、１．００当量）を再度加えた。得られた溶液を５０℃で３０分間撹拌し、続いてさら
に３−ブロモプロプ−１−イン（２９．５ｍＬ、１．００当量）を加えた。得られた溶液
を１時間撹拌した。これに水酸化カリウム（２２．６ｇ、０．４０２５ｍｏｌ、１．００
当量）を加えた。得られた溶液を３０分間撹拌した。これに３−ブロモプロプ−１−イン
（２９．５ｍＬ、１．００当量）を加えた。得られた溶液を３時間撹拌した。反応混合物
を水／氷浴で２５℃まで冷却した。固体を濾去した。濾液をＨＣｌ（６Ｍ）でｐＨ４に調
整した。固体を濾去した。濾液を真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムに供し、ジ
クロロメタン／メタノール（１００：１〜２５：１）で溶出した。この結果、（２Ｓ）−
２，６−ビス［ビス（プロプ−２−イン−１−イル）アミノ］ヘキサン酸（化合物１）を
淡黄色の油として得た。
ＭＳ（ＥＳ，ｍ／ｚ）：２９７．２，［Ｍ−Ｈ］− １ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００Ｍ
Ｈｚ，ｐｐｍ）：３．６２（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，４Ｈ），３．５２−３．４９（ｍ，１
Ｈ），３．５０（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，４Ｈ），２．６２（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）
，２．３０（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ），２．２７（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ），１
．８８−１．７９（ｍ，２Ｈ），１．６０−１．５３（ｍ，２Ｈ），１．５２−１．４３
（ｍ，２Ｈ）。
【０１１９】
２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル４−メチルベンゼンスルホネート（化合物３）の
合成
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した２０００ｍＬ  ３口丸底フラスコに、２−（
２−ヒドロキシエトキシ）エタン−１−オール（化合物２、４２．４ｇ、３９９．５５ｍ
ｍｏｌ、１．００当量）をジクロロメタン（１０００ｍＬ）に溶かした溶液およびトリエ
チルアミン（２７．９ｇ、２７５．７２ｍｍｏｌ、０．２５当量）を入れた。上記にｐ−
トルエンスルホニルクロリド（１９．１ｇ、１００．１８ｍｍｏｌ、０．５０当量）を加
えた。２５℃で１時間撹拌後、得られた混合物を１×５００ｍＬのカリウムヒドロスルフ
ァート水溶液（１Ｍ）および１×５００ｍＬの炭酸水素ナトリウム水溶液（５％）でそれ
ぞれで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣をシ
リカゲルカラムに供し、ジクロロメタン／メタノール（１００：１）で溶出した。この結
果、２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル４−メチルベンゼンスルホネート（化合物３
）を無色油として得た。
【０１２０】
２−（２−アジドエトキシ）エタン−１−オール（化合物４）の合成
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した５００ｍＬ  丸底フラスコに、２−（２−［
［（４−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル４−メチルベンゼンスルホネート（化合
物３、５０ｇ、１９２．０８ｍｍｏｌ、１．００当量）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
（２５０ｍＬ）に溶かした溶液を入れた。これに続いてアジ化ナトリウム（１８．７９ｇ
、２８９．０３ｍｍｏｌ、１．５０当量）を２５℃で加えた。得られた溶液を油浴にて１
００℃で５時間撹拌した。反応混合物を冷却し、濾過した。濾液を真空下で濃縮した。残
液を１０００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、１×５００ｍＬの水で洗浄した。有機層を
無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムに供し、ジ
クロロメタン／メタノール（８０：１）で溶出した。この結果、２−（２−アジドエトキ
シ）エタン−１−オール（化合物４）を無色油として得た。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ，ｐｐｍ）：３．４２−３．４５（ｔ，Ｊ＝４．
８Ｈｚ，２Ｈ），３．６３−３．６５（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．７１−３．７
４（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．７１−３．７９（ｍ，２Ｈ）。
【０１２１】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アセトアミド−６−（アセトキシメチル）テトラヒド
ロ−２Ｈ−ピラン−２，４，５−トリイルトリアセテート（化合物６）の合成
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した２０００ｍＬ  ３口丸底フラスコに、（３Ｒ
，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アミノ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピ
ラン−２，４，５−トリオールヒドロクロリド（化合物５、１２０ｇ、５５６．５０ｍｍ
ｏｌ、１．００当量）をピリジン（１２００ｍＬ）に溶かした溶液を入れた。これに続い
て酢酸無水物（３４１．６ｇ、３．３５ｍｏｌ、６．００当量）を０℃で撹拌しながら滴
下して加えた。得られた溶液を一晩２５℃で撹拌した。次いで８０００ｍＬの水／氷を加
えて反応をクエンチした。この固体を濾過により集めた。この結果、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ
，６Ｒ）−３−アセトアミド−６−（アセトキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−
２，４，５−トリイルトリアセテート（化合物６）を白色固体として得た。
【０１２２】
（３ａＲ，５Ｒ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）−５−（アセトキシメチル）−２−メチル−５，
６，７，７ａ−テトラヒドロ−３ａＨ−ピラノ［３，２−ｄ］オキサゾール−６，７−ジ
イルジアセテート（化合物７）の合成
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した２０００ｍＬ  丸底フラスコに、（３Ｒ，４
Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アセトアミド−６−（アセトキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−
ピラン−２，４，５−トリイルトリアセテート（化合物６、３０ｇ、７７．０５ｍｍｏｌ
、１．００当量）をジクロロメタン（１５００ｍＬ）に溶かした溶液を入れ、次いで鉄（
ＩＩＩ）クロリド（３０ｇ、１８４．９５ｍｍｏｌ、２．４０当量）を加えた。得られた
混合物を２５℃で２時間撹拌した。次いで１０００ｍＬの水／氷を加えて反応をクエンチ
した。有機層を１×１０００ｍＬの炭酸水素ナトリウム水溶液および１×１０００ｍＬの
水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。この結果、（３ａＲ，
５Ｒ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）−５−（アセトキシメチル）−２−メチル−５，６，７，７
ａ−テトラヒドロ−３ａＨ−ピラノ［３，２−ｄ］オキサゾール−６，７−ジイルジアセ
テート（化合物７）を黄色油として得た。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ，ｐｐｍ）：２．０３（ｓ，９Ｈ），２．１２（
ｓ，３Ｈ），３．９７−４．２７（ｍ，４Ｈ），４．９０−４．９３（ｍ，Ｊ＝３．３Ｈ
ｚ，１Ｈ），５．４５−５．４７（ｔ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ），５．９８−６．００（
ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ）。
【０１２３】
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−５−アセトアミド−２−（アセトキシメチル）−６
−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジイ
ルジアセテート（化合物８）の合成
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した５００ｍＬ  丸底フラスコに、（３ａＲ，５
Ｒ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）−５−（アセトキシメチル）−２−メチル−５，６，７，７ａ
−テトラヒドロ−３ａＨ−ピラノ［３，２−ｄ］オキサゾール−６，７−ジイルジアセテ
ート（化合物７、４０ｇ、１２１．４７ｍｍｏｌ、１．００当量）を１，２−ジクロロエ
タン（２００ｍＬ）に溶かした溶液、２−（２−アジドエトキシ）エタン−１−オール（
化合物４、２３．８９ｇ、１８２．１８ｍｍｏｌ、１．５０当量）を入れた。上記に数個
の４Ａゼオライトを加えた。得られた混合物を２５℃で１時間撹拌した。次いでトリメチ
ルシリルトリフルオロメタンスルホネート（１０．８ｍＬ、０．５０当量）を加えた。２
５℃で一晩撹拌後、反応混合物を５００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、１×５００ｍＬ
の水、１×５００ｍＬの炭酸水素ナトリウム水溶液および１×５００ｍＬの水で洗浄した
。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラム
に供し、ジクロロメタン／メタノール（１００：１）で溶出した。この結果、（２Ｒ，３
Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−５−アセトアミド−２−（アセトキシメチル）−６−［２−（
２−アジドエトキシ）エトキシ］テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジイルジアセテ
ート（化合物８）を無色油として得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：４６１．１，［Ｍ＋Ｈ］＋
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ，ｐｐｍ）５．７８（ｄ，Ｊ＝８．９０Ｈｚ，１
Ｈ），５．３６（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），５．２２（ｄｄ，Ｊ＝１１．２，３．６
Ｈｚ，１Ｈ），４．７７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），４．１９−４．１２（ｍ，２Ｈ
），４．１１−４．０５（ｍ，１Ｈ），３．９８−３．９２（ｍ，２Ｈ），３．８２−３
．７８（ｍ，１Ｈ），３．７１−３．６３（ｍ，４Ｈ），３．４９−３．３８（ｍ，２Ｈ
），２．１６（ｓ，３Ｈ），２．０５（ｓ，３Ｈ），２．０１（ｓ，３Ｈ），１．９７（
ｓ，３Ｈ）。
【０１２４】
（Ｓ）−２，６−ビス（ビス（（１−（２−（２−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ
）−３−アセトアミド−４，５−ジアセトキシ−６−（アセトキシメチル）テトラヒドロ
−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾ
ール−４−イル）メチル）アミノ）ヘキサン酸（化合物９、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃアセ
テート）（Ｅｘ．１）の合成
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した２５０ｍＬ  丸底フラスコに、（２Ｓ）−２
，６−ビス［ビス（プロプ−２−イン−１−イル）アミノ］ヘキサン酸（化合物１、１．
０ｇ、１．０当量）、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−５−アセトアミド−２−（ア
セトキシメチル）−６−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］テトラヒドロ−２Ｈ−
ピラン−３，４−ジイルジアセテート（化合物８、９．２６ｇ、６．０当量）、無水ＴＨ
Ｆ５０ｍＬ、ＣｕＢｒ．ＳＭｅ２（０．１３８ｇ、０．２０当量）、および無水ＤＢＵ（
１．５ｍｌ、３．０当量）をそれぞれ順番に仕込んだ。得られた溶液を室温で１６時間撹
拌し、酢酸（０．７５ｍＬ、４．０当量）でクエンチし、ＭＰ−ＴＭＴ樹脂（Ｐａｒｔ  
Ｎｏ：８０１４７２、Ｂｉｏｔａｇｅ製）（９ｇ）で処理し、室温で１６時間熟成させ、
濾過し、濾液を濃縮して泡状固体とした。次いでこの固体をＣＨ２Ｃｌ２（１４０ｍＬ）
に溶解させ、ＡｃＯＨ／ＮａＣｌ溶液（１４０ｍＬ）で洗浄した。ＡｃＯＨ／ＮａＣｌ溶
液は、１ｍＬ  ＡｃＯＨおよび１００ｍＬ  ２０％ＮａＣｌ溶液で調製した。下層の有機
層を濃縮し、ＳｉＯ２カラム（２２０ｇ）で精製し、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨで溶出した
。この結果、（Ｓ）−２，６−ビス（ビス（（１−（２−（２−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ
，５Ｒ，６Ｒ）−３−アセトアミド−４，５−ジアセトキシ−６−（アセトキシメチル）
テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，
３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）ヘキサン酸（化合物９）を白色固体とし
て得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１３９．５，［Ｍ＋Ｈ］＋
【０１２５】
（Ｓ）−２，６−ビス（ビス（（１−（２−（２−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ
）−３−アセトアミド−４，５−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ
−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾ
ール−４−イル）メチル）アミノ）ヘキサン酸（化合物１０、ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ）
（Ｅｘ．２）の合成
窒素の不活性雰囲気をパージして維持した２５０ｍＬ  丸底フラスコに、（Ｓ）−２，
６−ビス（ビス（（１−（２−（２−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アセ
トアミド−４，５−ジアセトキシ−６−（アセトキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラ
ン−２−イル）オキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イ
ル）メチル）アミノ）ヘキサン酸（化合物９、６．９ｇ、１．０当量）、Ｎａ２ＣＯ３（
６．８３ｇ、２０当量）、水（５６ｍＬ）およびＭｅＯＨ（３２ｍＬ）をそれぞれ順番に
仕込んだ。反応を室温で１６時間熟成させ、濃縮して残渣を得、水（５０ｍＬ）に再溶解
させ、Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ  Ｃ１８  ｇｏｌｄ逆相カラム（４１５ｇ）で精製し、水／
ＭｅＣＮで溶出した。真空下で濃縮後、生成物を最小量の水に溶解させ、凍結乾燥して（
Ｓ）−２，６−ビス（ビス（（１−（２−（２−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）
−３−アセトアミド−４，５−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−
２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾー
ル−４−イル）メチル）アミノ）ヘキサン酸（化合物１０）を白色固体として得た。
ＭＳ（ｍ／ｚ）：１６５７［Ｍ＋Ｎａ］＋
１ＨＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ，ｐｐｍ）：８．０５（ｓ，２Ｈ），７．９１（ｓ，
２Ｈ），４．６２（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，４Ｈ），４．５７（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，４Ｈ
），４．４５−４．４１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，４Ｈ），３．９９−３．８２（ｍ，２８
Ｈ），３．８０−３．６１（ｍ，２８Ｈ），３．１４（ｔ，Ｊ  ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），
２．５２（ｂｒｏａｄ  ｓ，２Ｈ），１．９９（ｓ，６Ｈ），１．９８（ｓ，６Ｈ），１
．７３（ｍ，２Ｈ），１．６０（ｍ，２Ｈ），１．２９（ｍ，２Ｈ）。
【０１２６】
実施例３〜５
ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド化合物１７ａ、１７ｂおよび１７ｃの合成
以下のスキーム２を用いてＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ化合物１７ａ、１７ｂおよび１７ｃ
を調製した。
【０１２７】
スキーム２
【化１６】
2018048186.tif 000021
化合物１３の合成
５−クロロ−１−ペンタノール（３．０ｇ、２４．４７ｍｍｏｌ）化合物１１をＤＭＦ
（２０ｍＬ）に溶かした溶液にアジ化ナトリウム（１．９０９ｇ、２９．４ｍｍｏｌ）化
合物１２を加えた。６０℃で一晩撹拌した後、反応混合物を真空中で濃縮した。残渣をシ
リカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：３）により精製して生成物化合
物１３を透明な液体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ３．６２
（ｍ，２Ｈ），３．２５（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．６３−１．５３（ｍ，４Ｈ
），１．４５−１．４０（ｍ，２Ｈ）。
【０１２８】
化合物１５の合成
化合物１３（０．７９６ｇ、６．１６ｍｍｏｌ）およびＤ−ガラクトサミンペンタアセ
テート（２．００ｇ、５．１４ｍｍｏｌ）化合物１４を２０ｍＬ  ＤＣＭに懸濁し、続い
てトリフルオロメタンスルホン酸（０．１５４ｇ、１．０２７ｍｍｏｌ）を加えた。得ら
れた混合物を一晩還流させた。ＬＣ−ＭＳにより、ＳＭの変換が終了したことを確認し、
反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、炭酸水素ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥
させた。溶媒を除去し、残渣を、３０分かけて１００／０〜９０／１０のＩＳＣＯ  ＤＣ
Ｍ／ＭｅＯＨにより精製して化合物１５を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００Ｍ
Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．９７（６Ｈ，ｓ），２．０２（６Ｈ，ｓ），２．０６（６Ｈ
，ｓ），２．１５（６Ｈ，ｓ），３．２８（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８９Ｈｚ），３．５０（
３Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝９．６３，６．６６Ｈｚ），３．６８（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝５．９８Ｈｚ）
，３．９４−３．９２（７Ｈ，ｍ），４．１６−４．１５（５Ｈ，ｍ），４．７３（２Ｈ
，ｄ，Ｊ＝８．３４Ｈｚ），５．３１（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．１６，３．４８Ｈｚ），
５．４０−５．３８（５Ｈ，ｍ）。Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ：［Ｍ＋Ｈ］＋：Ｃ
１９Ｈ３１Ｎ４Ｏ９，４５９．２；ｏｂｓｅｒｖｅｄ：４５９．４。
【０１２９】
化合物１６の合成。
Ｌｙｓ−アルキン化合物１（１３０ｍｇ、０．４３６ｍｍｏｌ）およびＧａｌＮＡｃア
ジド６（９９９ｍｇ、２．１７８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ、脱気処理）に溶解させた
。反応混合物に臭化銅（Ｉ）−ジメチルスルフィド錯体（１７．９１ｍｇ、０．０８７ｍ
ｍｏｌ）を一度に加え、ＴＨＦ溶液を４０℃で一晩撹拌した。反応の色がＣｕ２＋を示す
青／緑に変化し、反応混合物に、新鮮なアスコルビン酸ナトリウム３７ｍｇを含む０．２
ｍＬの水を加え、一晩反応させた。反応を濃縮し、２０分かけてＲＰ  ＨＰＬＣ  ５〜６
０  ＭｅＣＮ（０．５％ＴＦＡ）／水（０．５％ＴＦＡ）により精製した。集めた画分を
合わせて、凍結乾燥して化合物８を白色固体として得た。Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓ
ｓ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋：Ｃ９４Ｈ１４５Ｎ１８Ｏ３８，１３４．０，ｍ／ｚ＝７１１．３
；ｏｂｓｅｒｖｅｄ：７１１．９。
【０１３０】
化合物１７ａ（Ｅｘ．３）の合成
保護されたＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ化合物８（３００ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ）を含
む０℃のＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１／１  ５ｍＬに、ナトリウムメトキシド（９１ｍｇ、１．
６８８ｍｍｏｌ）を加えた。反応を１時間撹拌し、２ｍＬの水を加えてクエンチした。揮
発性の溶媒を除去し、反応混合物を、水を用いてＰ４バイオゲルにより精製し、集めた画
分を合わせて、凍結乾燥して化合物９を白色固体として得た。Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍ
ａｓｓ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋：Ｃ７０Ｈ１２１Ｎ１８Ｏ２６，１６２９．９，ｍ／ｚ＝５４
３．３；ｏｂｓｅｒｖｅｄ：５４３．８；［Ｍ＋２Ｈ］２＋：Ｃ７０Ｈ１２０Ｎ１８Ｏ２
６，１６２８．９，ｍ／ｚ＝８１４．５；ｏｂｓｅｒｖｅｄ：８１４．９。
【０１３１】
化合物１７ｂおよび１７ｃ（Ｅｘ．４およびＥｘ．５）の合成
下記構造を有する化合物１７ｂおよび１７ｃの合成を、適切なアジド供給源を用いて化
合物１７ａに使用したのと類似の方法で達成した。
【化１７】
2018048186.tif 000022
【０１３２】
実施例６
ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンドのコンジュゲーションのスキーム
下記スキーム３は、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの調製に使用
することができる一般的なスキームを示す。
【０１３３】
スキーム３
【化１８】
2018048186.tif 000023
一般的なスキーム３を用いて、コンジュゲート１０−１、１０−２、１０−３、１０ａ
−１、１７ａ−１、１７ｂ−１、１７ｃ−１を得ることができる。予め形成したｓｉＲＮ
Ａ二本鎖または一本鎖にカップリング手順を行い、続いてアニーリングを行えばよい。あ
るいは、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２０１１，２２，ｐｐ．１７２３−８に概説さ
れたプロトコルを利用してもよい。
【０１３４】
実施例７
ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃアセテート化合物９を介したＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮ
Ａコンジュゲート１０−１の合成
ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃアセテート（化合物９、５８．７ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）
をアセトニトリル（１．５ｍｌ）に溶かした溶液に、ＤＩＰＥＡ（２．２ｍｇ、０．０５
５ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（１０．４４ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物
を室温で３０分間撹拌し、ｓｉＲＮＡ（５１）（０．０１４ｍｍｏｌ）を水（１．５ｍｌ
）およびアセトニトリル（１．５ｍｌ）に溶かした溶液にシリンジポンプにより２０分か
けて移し、３０分間撹拌してから１．５ｍＬまで真空下で濃縮した。次いで炭酸ナトリウ
ム（２１８ｍｇ、２．０５９ｍｍｏｌ）、続いて  ＭｅＯＨ（０．５０ｍｌ）を加えた。
得られた溶液を室温で１６時間撹拌し、濃縮し、透析により精製し、凍結乾燥してｔｅｔ
ｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート１０−１を得た。
【０１３５】
実施例８
３’５’ビスＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート一本鎖１８の合成
ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃ酸化合物１０（４１．２ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳ
Ｏ（２００ｕＬ）に溶かした溶液に、ＨＡＴＵ（９．６ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）およ
びＤＩＰＥＡ（１７．６ｕＬ、０．１２６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１５分間
撹拌し、ジアミノ−ｓｉＲＮＡ（１８．８ｍｇ、２．５２ｕｍｏｌ）を水（４０ｕＬ）お
よびＤＭＳＯ（３６０ｕＬ）に溶かした溶液に移し、３０分間撹拌した。混合物を水（１
．５ｍＬ）で希釈し、１００ｍＭ  ＴＥＡＡを含む０〜３０％ＣＨ３ＣＮ／水のグラジエ
ントによりＸＢｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  Ｐｈｅｎｙｌカラム（５ｕＭ、１９×２５０ｍｍ
）を用いて精製した。画分を透析により濃縮し、凍結乾燥して化合物１８を得た。
【０１３６】
実施例９
３’５’ビスＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ二本鎖コンジュゲート１９−１の合成
下記スキーム４を用いてＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート１９−１
を調製した。
【０１３７】
スキーム４
【化１９】
2018048186.tif 000024
３’５’ビスｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート１８（１３．７ｍｇ
、１．２９ｕｍｏｌ）を水（２００ｕＬ）に溶かした溶液を、ガイドｓｉＲＮＡ（９．３
ｍｇ、１．３５ｕｍｏｌ）を水（１００ｕＬ）に溶解させた溶液に加え、９０Ｃで１分間
加熱した。得られた溶液を冷却し、凍結乾燥して二本鎖１９−１を得た。
【０１３８】
実施例１０
ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド化合物２４の合成
以下のスキーム５を用いてｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃリガンド化合物２４を調製した。
【０１３９】
スキーム５
【化２０】
2018048186.tif 000025
化合物２２の合成
Ｎ−ＢＯＣ−１，３−ジアミノプロパン（化合物２０、１１５ｍｇ、０．６６０ｍｍｏ
ｌ）を１：１  ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＣＮ（１ｍＬ）に溶かした０℃の溶液に、３−マレ
イミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（化合物２１、１８５ｍｇ、
０．６９５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍＬ）およびＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）に溶解
させた溶液を加えた。混合物を１時間撹拌し、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルクロ
マトグラフィー（０〜５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２により精製して生成物化合物２２を得
た。Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ：［Ｍ＋Ｈ］＋：Ｃ１５Ｈ２４Ｎ３Ｏ５，３２６．
２；ｏｂｓｅｒｖｅｄ：３２６．３。
【０１４０】
化合物２３の合成
マレイミド化合物２２（５６ｍｇ、０．１７２ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１ｍｌ）に
溶かした溶液に、４Ｍ  ＨＣｌ（１ｍｌ、４．００ｍｍｏｌ）をジオキサンに溶かした溶
液を加えた。混合物を１時間撹拌し、真空中で濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２で共沸し（
２×）、真空下で乾燥させて生成物化合物２３を得た。Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ
：［Ｍ＋Ｈ］＋：Ｃ１０Ｈ１６Ｎ３Ｏ３，２２６．１；ｏｂｓｅｒｖｅｄ：２２６．３。
【０１４１】
ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃマレイミド化合物２４（Ｅｘ．１０）の合成
ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃ酸化合物１０（１００ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（
５００ｕＬ）に溶かした溶液に、ＨＡＴＵ（３４．９ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）、Ｅｔ
３Ｎ（４２．６ｕＬ、０．３０６ｍｍｏｌ）およびＮ−（３−アミノプロピル）−３−（
２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミドヒド
ロクロリド（１６．０ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１．５時間
撹拌し、ＴＦＡで酸性化し、０．１％ＴＦＡを含む逆相０〜５０％ＣＨ３ＣＮ／水により
精製した。画分を凍結乾燥して化合物２４を得た。Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ：［
Ｍ＋２Ｈ］２＋：Ｃ７６Ｈ１２５Ｎ２１Ｏ３２，１８４３．８，ｍ／ｚ＝９２１．９；ｏ
ｂｓｅｒｖｅｄ：９２２．７。
【０１４２】
実施例１１
化合物２６の合成
下記スキーム６を用いて化合物２６を調製した。
【０１４３】
スキーム６
【化２１】
2018048186.tif 000026
２’−３，１７プロパルギルｓｉＲＮＡ（ＲＮＡ２５、３３ｍｇ、４．４９ｕｍｏｌ）
およびＰＥＧ９  ＳＰＤＰアジド（２６ｍｇ、３６ｕｍｏｌ、市販のＰＥＧ−アジドおよ
びピリジルジスルフィド試薬から調製）を３：１  ＤＭＡ／水（１ｍＬ）に溶かした脱気
した溶液に、臭化銅（Ｉ）−ジメチルスルフィド錯体（１．８ｍｇ、９．０ｕｍｏｌ）を
含む脱気した溶液を加えた。混合物を室温で７２時間撹拌し、水（２ｍＬ）で希釈し、０
．４５ｕＭ  シリンジフィルターを用いて濾過し、透析により濃縮した。濃縮混合物を、
１００ｍＭ  ＴＥＡＡを含む０〜５０％ＣＨ３ＣＮ／水のグラジエントを用いてＸＢｒｉ
ｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  Ｐｈｅｎｙｌカラム（５ｕＭ、１９×２５０ｍｍ）により精製した。
画分を透析により濃縮し、凍結乾燥して化合物２６を得た。
【０１４４】
実施例１２〜１３
化合物２７および２８の合成
下記スキーム７を用いて化合物２７および２８を調製した。
【０１４５】
スキーム７
【化２２】
2018048186.tif 000027
化合物２７（Ｅｘ．１２）の合成
２’−３，１７ｃｌｉｃｋ  ＰＥＧ９  ＳＰＤＰコンジュゲート２６（１３．２ｍｇ、
１．５０μｍｏｌ）を水（１ｍＬ）に溶かした溶液に、ＴＣＥＰヒドロクロリド（９．１
５ｍｇ、３２．２ｕｍｏｌ）を水（０．５ｍＬ）に溶解させた溶液を加えた。混合物を室
温で３０分間撹拌し、次いで１００ｍＭ  ＴＥＡＡを含む５〜４０％ＣＨ３ＣＮ／水のグ
ラジエントを用いてＸＢｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  Ｐｈｅｎｙｌカラム（５ｕＭ、１９×２
５０ｍｍ）により精製した。画分を透析により濃縮し、凍結乾燥して化合物２７を得た。
【０１４６】
化合物２８（Ｅｘ．１３）の合成
２’−３，１７−ｃｌｉｃｋ  ＰＥＧ９ＳＨ２７（３ｍｇ、０．３５μｍｏｌ）をｐＨ
６．０  酢酸塩緩衝液（１００ｕＬ）に溶かした溶液に、ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃマレイ
ミド（５．１ｍｇ、２．７７μｍｏｌ）をｐＨ６．０  酢酸塩緩衝液（１００ｕＬ）に溶
解させた溶液を加えた。混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで１００ｍＭ  ＴＥＡＡを
含む５〜４０％ＣＨ３ＣＮ／水のグラジエントを用いてＸＢｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  Ｐｈ
ｅｎｙｌカラム（５ｕＭ、１９×２５０ｍｍ）により精製した。画分を透析により濃縮し
、凍結乾燥して化合物２８を得た。
【０１４７】
実施例１４
２’−３，１７ビスＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ二本鎖コンジュゲート２９の合
成
コンジュゲート１９に関して詳述した手順を二本鎖２８に用いてコンジュゲート２９を
作製した。
【０１４８】
実施例１５
ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃチオール化合物３１の合成
下記スキーム８を用いて化合物３１を調製した。
【０１４９】
スキーム８
【化２３】
2018048186.tif 000028
ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃ酸化合物１０（５４ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジ
メチルアセトアミド（５００μｌ）に溶かした溶液に、シスタミンジヒドロクロリド３０
（１４．９ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１２．７ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）
、ＨＯＡＴ（１０．２ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（５７．７μｌ、０
．３３０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１８時間撹拌し、次いでＤＴＴ（５０．９
ｍｇ、０．３３０ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（１００μｌ）に溶かした
溶液を加えた。混合物を室温で０．５時間撹拌し、ＴＦＡで酸性化し、０．１％ＴＦＡを
含む逆相０〜３０％ＣＨ３ＣＮ／水により精製した。画分を凍結乾燥して化合物３１を得
た。Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋：Ｃ６８Ｈ１１５Ｎ１９Ｏ２９
Ｓ，１６９５．８，ｍ／ｚ＝８４７．９；ｏｂｓｅｒｖｅｄ：８４８．０。
【０１５０】
実施例１６〜１８
コンジュゲート３５〜３７の合成
下記スキーム９を用いてコンジュゲート３５〜３７を調製した。
【０１５１】
スキーム９
【化２４】
2018048186.tif 000029
化合物３３の合成
２’−ｃｌｉｃｋ１５ＧＳ化合物３２（１３０ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）および（９
Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（２−アジドエチル）カルバメート（２９．１ｍｇ、
０．０９５ｍｍｏｌ）を３：１  ＤＭＡ／水（２ｍＬ）に溶かした脱気した溶液に、臭化
銅（Ｉ）−ジメチルスルフィド錯体（９．７２ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）を脱気ＤＭＳ
Ｏ（０．３２ｍＬ）に溶解させた溶液を加えた。混合物を４５℃で２時間撹拌し、室温ま
で冷却し、ｐＨ８  ＥＤＴＡ（０．５Ｍ、２ｍＬ）を加えて反応をクエンチした。１５分
間撹拌し、１００ｍＭ  ＴＥＡＡを含む０〜４５％ＣＨ３ＣＮ／水のグラジエントを用い
てＸＢｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  Ｐｈｅｎｙｌカラム（５ｕＭ、３０×１５０ｍｍ）で精製
した。画分を透析により濃縮した。水（３ｍＬ）中の合わせた材料に、ピペリジン（９３
６μＬ、１．８９１ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を４℃で１８時間保管し、水（１
０ｍＬ）で希釈し、シリンジフィルターを通して固体を濾別した。ｐＨ８  ＥＤＴＡ（０
．５  Ｍ、２ｍＬ）を加え、透析により濃縮し、凍結乾燥して化合物３３を得た。
【０１５２】
化合物３４の合成
２’−１５ｃｌｉｃｋ  Ｃ２  ＮＨ２  ＧＳ化合物３３（４３．６ｍｇ、６．２６μｍ
ｏｌ）を２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３溶液（２０００μｌ）およびホルムアミド（１０００
ｕＬ）に溶かした溶液に、Ｎ−スクシニミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネ
ート（１７．９ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２９８ｕＬ）に溶解させた溶液
を加えた。混合物を１０℃で１５分間撹拌し、水（１０ｍＬ）およびホルムアミド（１ｍ
Ｌ）で希釈し、透析により濃縮した。２Ｍ  ＴＥＡＡ（２００ｕＬ）を加え、１００ｍＭ
ＴＥＡＡを含む５〜４０％ＣＨ３ＣＮ／水のグラジエントを用いてＸＢｒｉｄｇｅ  Ｐ
ｒｅｐ  Ｐｈｅｎｙｌカラム（５ｕＭ、１９×２５０ｍｍ）で精製した。画分を透析によ
り濃縮し、凍結乾燥して化合物３４を得た。
【０１５３】
２’−１５ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート３５（Ｅｘ．１６）の合
成
２’−１５ｃｌｉｃｋ  Ｃ２  ＮＨ２  ＮＨＳ  ＳＰＤＰ  ＧＳ化合物３４（１３ｍｇ
、１．８２μｍｏｌ）を１：１  ホルムアミド／水（２００μｌ）に溶かした溶液に、ｔ
ｅｔｒａＧａｌＮＡｃ  ＳＨ（４．６２ｍｇ、２．７２μｍｏｌ）をホルムアミド（２０
０ｕＬ）に溶かした溶液を加えた。混合物を室温で３．５時間撹拌し、２Ｍ  ＴＥＡＡ（
５０ｕＬ）を加え、１００ｍＭ  ＴＥＡＡを含む２〜３５％ＣＨ３ＣＮ／水のグラジエン
トを用いてＸＢｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  Ｐｈｅｎｙｌカラム（５ｕＭ、１９×２５０ｍｍ
）で精製した。画分を透析により濃縮し、凍結乾燥した。得られた固体を、２〜３０％（
溶媒Ａ：４０ｍＭ  Ｅｔ３Ｎを含む６０：４０  ＴＦＥ／水、溶媒Ｂ：４０ｍＭ  Ｅｔ３
Ｎ、１Ｍ  グアニジンＨＣｌを含む６０：４０  ＴＦＥ／水）のグラジエントを用いてＰ
ｒｏｔｅｏｍｉｘ  ＳＡＸ−ＮＰ１０カラム（２２．１×５０ｍｍ）で精製した。画分を
透析により濃縮し、凍結乾燥してコンジュゲート３５を得た。
【０１５４】
コンジュゲート３６および３７（Ｅｘ．１７およびＥｘ．１８）の合成
コンジュゲート１９−１に関して詳述した手順を二本鎖コンジュゲート３５および適切
なパッセンジャー鎖に使用して、それぞれコンジュゲート３６および３７を調製した。
【０１５５】
実施例１９〜２６
コンジュゲート３８〜４５（Ｅｘ．１９〜２６）の合成
下記スキーム１０および１１を用いてコンジュゲート３８〜４４を調製した。
【０１５６】
スキーム１０
【化２５】
2018048186.tif 000030
スキーム１１
【化２６】
2018048186.tif 000031
スキーム１１。ｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃをｓｉＲＮＡにコンジュゲートするのに使用し
た表２の様々なリンカーの例。
【０１５７】
ステップ１：パッセンジャー−ＲＮＡおよびリンカー、プロトコルを説明するためプロリ
ンを用いた例
ＦＭＯＣ−ＰＲＯ−ＯＨ（１１．１１ｍｇ、０．０３３μｍｏｌ）を１２０μＬ  ＤＭ
ＳＯに溶かした溶液に、ＤＩＰＥＡ（４３．２μｌ、０．２４７μｍｏｌ）、続いてＨＡ
ＴＵ（１０．９６ｍｇ、０．０２９μｍｏｌ）を加えた。この淡黄色の混合物を室温で３
０分間撹拌した。次いでこの混合物を、オリゴヌクレオチドパッセンジャー鎖ＴＥＡＡ塩
（６０ｍｇ、８．２４μｍｏｌ）を５００μＬの（１０％Ｈ２Ｏ／ＤＭＳＯ）に溶かした
溶液に加え、混合物を引き続き室温で１時間撹拌した。反応混合物は、ＬＣ−ＭＳにより
所望の生成物を示した。反応混合物にジエチルアミン（４３．０μｌ、０．４１２μｍｏ
ｌ）を加え、混合物を１時間撹拌し、ＬＣ−ＭＳにより所望の生成物を確認した。反応混
合物を、カットオフ分子量３ｋＤａの膜を用いた遠心透析により精製した。このプロセス
を、水を用いて３回繰り返した（各回１４ｍＬ）。得られた溶液を濃縮し、凍結し、一晩
凍結乾燥して生成物を白色の綿状固体として得た。ＬＣ／ＭＳから生成物［７３８４．９
］が確認された。
【０１５８】
ステップ２：ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−リンカー−パッセンジャーＲＮＡ
ＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ化合物１０（５３．２ｍｇ、０．０３３μｍｏｌ）を５３２μ
Ｌ  ＤＭＳＯに溶かした溶液に、ＤＩＰＥＡ（４２．６μｌ、０．２４４μｍｏｌ）、続
いてＨＡＴＵ（１２．３６ｍｇ、０．０３３μｍｏｌ）を加えた。この淡黄色の混合物を
室温で３０分間撹拌した。次いで混合物を、リンカー−オリゴヌクレオチドパッセンジャ
ー鎖を５００μＬのＤＭＳＯに溶かした溶液に加え、混合物を引き続き室温で２時間撹拌
した。ＬＣ／ＭＳにより所望の生成物が示された。反応混合物を、カットオフ分子量３ｋ
Ｄａの膜を用いて遠心透析に供した。このプロセスを、水を用いて３回繰り返した（各回
１４ｍＬ）。得られた溶液を、ＸＢＲＩＤＧＥ  ＰＨＥＮＹＬ、３５分間の、２００μＭ
ＴＥＡＡを含む１０〜２７％ＣＨ３ＣＮを用いてＧｉｌｓｏｎ  ＰＬＣ  ２０２０によ
り精製した。回収溶液を、カットオフ分子量３ｋＤａの膜を用いて遠心透析により濃縮し
た。得られた濃縮溶液を１．０Ｎ  ＮａＣｌで処理し、遠心透析した。このプロセスを、
水を用いて５回繰り返した（各回１４ｍＬ）。得られた濃縮溶液（約１．５ｍＬ）を凍結
し、一晩凍結乾燥して生成物を白色の綿状固体として得た。ＬＣ／ＭＳから生成物［９０
０２．５］が確認された。
【０１５９】
ステップ３：二本鎖の形成
１．５ｍＬの水中のＴｅｔｒａＧａｌＮＡｃ−リンカー−ＲＮＡ（１８．５ｍｇ、２．
０５５μｍｏｌ）に、１．５ｍＬの水中のＡｐｏＢガイド鎖（１４．１２ｍｇ、２．０５
５μｍｏｌ）と二本鎖を形成させた。撹拌子を用いて混合物を９０℃で５分間加熱した。
二本鎖を冷却し、撹拌子を除去した。溶液を２日にわたり凍結乾燥して所望の二本鎖コン
ジュゲート３８を白色の綿状固体として得た。ＬＣ／ＭＳから生成物［１６０４８］が確
認された。
【０１６０】
残りのコンジュゲートもすべて、同じ一般的な手順を用いて調製した。
【０１６１】
実施例２７〜２９
化合物／コンジュゲート４６〜４８の合成
下記スキーム１２を用いて化合物および／またはコンジュゲート４６〜４８を調製した
。
【０１６２】
スキーム１２
【化２７】
2018048186.tif 000032
ＲＮＡ化合物４６（Ｅｘ．２７）の合成
ＳＰＤＰ酸（２．２ｍｇ、１０．３μｍｏｌ）をＤＭＳＯ１００μＬに溶解し、Ｎ，Ｎ
−ジイソプロピルエチルアミン（１４．０μｌ、０．０８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１９．
６ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）を連続的に加えた。ＲＮＡ（１５ｍｇ、２．０６μｍｏｌ
）を含む２００μＬのＤＭＳＯ：水（９：１）を加え、得られた反応混合物を１時間撹拌
し、反応を、３ｍＬ  水を加えてクエンチし、５００μＬになるまで透析し、ホルムアミ
ドにより３ｍＬに希釈し、ＳＡＸ（緩衝液Ａ：６０％ＴＦＥ水溶液、２０ｍＭ  ＴＥＡ、
緩衝液Ｂ：６０％ＴＦＥ水溶液、２０ｍＭ  ＴＥＡ、１Ｍ  ＣｓＣｌ、１５分かけての１
００／０〜３５／６５のＡ／Ｂグラジエント）により精製した。集めた画分を合わせて、
水に対して透析し、凍結乾燥して化合物４６を白色固体として得た。Ｃａｌｃｕｌａｔｅ
ｄ  ｍａｓｓ：［Ｍ−Ｈ］−：Ｃ２３４Ｈ３００Ｆ８Ｎ７２Ｏ１５０Ｐ２３Ｓ３，７４８
０．１；ｏｂｓｅｒｖｅｄ：７４８３．０。
【０１６３】
コンジュゲート４７（Ｅｘ．２８）の合成
ＲＮＡ化合物４６（２２ｍｇ、２．９μｍｏｌ）およびｔｅｔｒａＧａｌＮＡｃチオー
ル化合物３１（１０．０ｍｇ、５．９μｍｏｌ）をホルムアミド：ｐＨ＝６．８トリス緩
衝液（３：１）４００μＬに溶解させ、１時間撹拌した。反応混合物をＳＡＸ（緩衝液Ａ
：６０％ＴＦＥ水溶液、２０ｍＭ  ＴＥＡ、緩衝液Ｂ：６０％ＴＦＥ水溶液、２０ｍＭ  
ＴＥＡ、１Ｍ  ＣｓＣｌ、１５分かけての１００／０〜３５／６５のＡ／Ｂグラジエント
）により精製した。集めた画分を合わせて、水に対して透析し、凍結乾燥してコンジュエ
ート４７を白色固体として得た。Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｍａｓｓ：［Ｍ−Ｈ］−：Ｃ２
９７Ｈ４１０Ｆ８Ｎ９０Ｏ１７９Ｐ２３Ｓ３，９０６３．９；ｏｂｓｅｒｖｅｄ：９０６
６．２。
【０１６４】
コンジュゲート４８（Ｅｘ．２９）の合成
コンジュゲート４７（１０．９ｍｇ、１．２０μｍｏｌ）およびガイド鎖（７．８１ｍ
ｇ、１．１４μｍｏｌ）を、ＲＮＡｓｅを含まない水１ｍＬ中で２時間混合した。反応混
合物を凍結乾燥して二本鎖コンジュゲート４８を定量的収率で得た。
【０１６５】
実施例３０〜３２
化合物／コンジュゲート４９〜５１の合成
下記スキーム１３を用いて化合物および／またはコンジュゲート４９〜５１を調製した
。
【０１６６】
スキーム１３
【化２８】
2018048186.tif 000033
ＲＮＡ化合物４９（Ｅｘ．３０）の合成
３３．３ｍｇのｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖を４ｍＬ  バイアルに秤量し、次いで１ｍ
Ｌ  １００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３を加えて溶解させた。０．８６ｕＬのプロピオン酸無水物
を加え、室温で撹拌した。約２時間熟成後、水に対して３回回転透析した。フリットで濾
過し、溶液を凍結乾燥により乾燥させて３０．８ｍｇのＲＮＡ化合物４９を得た。
【０１６７】
コンジュゲート５０（Ｅｘ．３１）の合成
ステップ１。２．８ｍｇ  アジド、２５．７ｍｇ  ｓｉＲＮＡ、２５ｍｌ  Ｎ２でスパ
ージしたＤＭＳＯおよび４ｍｌ  水を４０ｍＬ  バイアルに仕込む。Ｎ２でスパージする
。２．９８ｍＬのＣｕ／リガンド溶液（Ｎ２でスパージ、２０／１００ｕｍｏｌを含む１
０ｍｌ  ＤＭＳＯ）を仕込む。スパージしたＮ２下、室温で撹拌する。
【０１６８】
ステップ２。化合物１０および１ｍｌ  ＤＭＳＯを仕込む。６ｕＬのＤＩＰＥＡを仕込
み、２分間撹拌する。６ｍｇ  ＨＢＴＵを仕込み、２分間撹拌する。ステップ１で得られ
たｓｉＲＮＡ混合物を仕込む。反応が終了しなかったため、前述の試薬の仕込みの半分を
繰り返した。反応混合物を蒸発させ、透析し、ＨＰＬＣ精製した（Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｐ
ｈｅｎｙｌ、ＴＥＡＡ／ＡＣＮグラジエント）。蒸発させ、透析し、凍結乾燥してコンジ
ュゲート５０を得た。
【０１６９】
コンジュゲート５１（Ｅｘ．３２）の合成
ＧＳ（コンジュゲート５０）１０．６５ｍｇを１ｍｌ  水に溶解させ、ＰＳ（コンジュ
ゲート４９）１０．２０ｍｇを１．１７ｍｌ  水に溶解させる。８．７ｍｇのコンジュゲ
ート４９をコンジュゲート５０のすべてに加えて１：１  二本鎖を形成した。９０℃に１
分間加熱し、１５分にわたり室温まで冷却する。溶液を濾過し、凍結乾燥により乾燥させ
てコンジュゲート５１を白色固体として得た。
【０１７０】
ルシフェラーゼコンストラクトによる、リポフェクタミンを用いてトランスフェクトした
化合物のＲＮＡサイレンシング活性
ウミシイタケルシフェラーゼの３’ＵＴＲにｓｉＲＮＡの標的部位を含むルシフェラー
ゼベクターを安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を作製した。この細胞を９
６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ：＃３９０３）に、ＤＭＥＭ  １０％血清培
地中１ウェル当たり７．５ｅ３細胞の密度で播種した。次いで細胞プレートを３７℃／５
％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、製造者のプロトコルに
従いＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ：＃３１９８５）中のトランスフェクション試薬リポ
フェクタミン２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：＃１１６６８−０１９）を用いてコトラ
ンスフェクトした被検化合物でプレートを処理した。処理濃度は１０ｎＭ〜０．０３ｐＭ
の範囲であった。次いで処理プレートを３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートし
た。インキュベーション処理後、細胞を溶解させ、Ｄｕａｌ−ＧｌｏＴＭ  Ｌｕｃｉｆｅ
ｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ：Ｅ２９２０）に従って処理し、ＴＥＣＡＮ  ｓ
ａｆｉｒｅ２プレートリーダーで読み取った。
【０１７１】
ＨｅｐＧ２細胞における、リポフェクタミンを用いてトランスフェクトした化合物のＲＮ
Ａサイレンシング活性
ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ：ＨＢ−８０６５）をコラーゲンコートプレート（ＢｉｏＣ
ｏａｔ：３５６６４９）に、ＤＭＥＭ  １０％血清培地中１ウェル当たり７．５ｅ３細胞
の密度で播種した。次いで細胞プレートを３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベート
した。インキュベーション後、プレートを、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのプロトコルに従いＯ
ｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ：３１９８５）中のトランスフェクション試薬リポフェクタ
ミン２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：１１６６８−０１９）を用いてコトランスフェク
トした被検化合物で処理した。処理濃度は１０ｎＭ〜０．０３ｐＭの範囲であった。次い
で処理プレートを３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーショ
ン処理後、提供されたプロトコルに従い細胞をＰＬＡ緩衝液（ＡＢ：４４４８５４２）で
溶解させた。得られた細胞ライセートを、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｋｉ
ｔ（ＡＢ：４３６８８１３）を用いてｃＤＮＡに逆転写し、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ  ７９００を用いてｑＰＣＲに供した。
【０１７２】
ＲＮＡｉ活性のインビボ評価
ＣＤ１雌マウスに２００ｕｌ量で皮下注射により投与した。動物の行動の変化または生
理学的変化を観察した。動物を投与から７２時間後にＣＯ２窒息により屠殺し、続いて心
臓穿刺により失血させた。肝臓サンプルは中葉の３ｍｍパンチ標本とし、ＲＮＡｌａｔｅ
ｒの入ったチューブに入れて全ＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡノックダウン解析を、標準的
な手順を用いてＴａｑｍａｎ解析により行った。
【０１７３】
選択した化合物／コンジュゲートのインビトロおよびインビボデータの概略は、前に示
した表４に示す。
【０１７４】
当業者であれば、本発明が本目的を実行し、記載した目的および利点のほか、それに内
在する目的および利点を得るように十分に適合されていることを容易に理解するであろう
。現時点で好ましい実施形態の代表例である本明細書に記載の方法および組成物は、例示
的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者であれば
、その変更および他の使用を想到するであろうが、それらは本発明の精神に包含され、特
許請求の範囲の範囲により規定される。
【配列表】
2018048186000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月1日(2017.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2018048186000001.pdf