(57)【要約】【課題】薬学的有効量の、可溶性Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ｓＦｌｔ−１）タンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む医薬組成物を、ヒト対象へと網膜下投与することにより、ヒト対象において、ＡＭＤなどの眼の血管新生を防止または処置するための組成物および方法を提供すること。【解決手段】ヒト対象における眼の血管新生の処置または予防における使用のための、ＶＥＧＦ阻害剤をコードする配列を含む核酸であって、前記使用が、それを必要とするヒト対象における１または複数の網膜下部位へと、前記ヒト対象に有効量の医薬組成物を直接投与するステップを含み、前記医薬組成物が前記核酸を含む、核酸が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介するＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１３年５月１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、４３０１６−７０２．２０１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、８４，７７９バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００２】
加齢黄斑変性（ＡＭＤ：ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、５０歳を超える人々における視覚の不可逆的な損傷の主要な原因のうちの１つである。ＡＭＤは、臨床的に「萎縮型」および「滲出型」という２つの種類へと分けられる。ＡＭＤの滲出形態は、急速に発症する可能性があり、失明を結果としてもたらすことが多い。疾患の病理学的変化は、重度の視覚機能障害を引き起こしうる。ＡＭＤの症状は、黄斑帯域内の網膜色素上皮（ＲＰＥ：ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）細胞の機能不全および脈絡膜血管新生（ＣＮＶ：ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を含みうるがこれらに限定されない。重度の症例では、流体漏出、ＲＰＥまたは神経上皮の剥離、および破裂した血管からの出血も生じうる。その中に血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ：ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）および他のサイトカイン、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）などを含みうるがこれらに限定されない、多くの細胞因子が、ＣＮＶ発生の調節において重要な役割を果たすことが見出されている。
【０００３】
現在承認されている、滲出型ＡＭＤのための１つの処置は、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）である。Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）とは、抗血管形成剤であり、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の全てのアイソフォームを標的とする。臨床研究は、偽処置を施された患者のうちの約６０％と比較して、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）投与された患者のうちの約９５％における視覚の改善または安定を示している。Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）は、視覚を改善することが最初に承認された薬剤であるが、最適な視覚への有益性のためには、４週間ごとの硝子体内投与を要求する。Ｅｙｌｅａ（登録商標）とは、滲出型ＡＭＤを処置することが承認されている、別のＶＥＧＦ阻害剤である。Ｅｙｌｅａ（登録商標）もまた、最適な視覚への有益性のためには、４〜８週間ごとに高頻度の硝子体内注射を要求する。硝子体内投与経路は、投与の反復と共にそれらの累積的な危険性が増大する、感染性眼内炎および網膜剥離などの重篤な合併症に対する危険性を増大させる可能性がある。眼内圧の増大、外傷性白内障、および網膜裂傷もまた報告されている。最後に、処置が眼科医により送達される場合、処置頻度は、患者、医師、および医療システム一般に対する負担を決定し、可能な程度までこれを低減すべきである。当技術分野では、ＡＭＤに続発するＣＮＶのために現在利用可能な治療の限界から、要求される高頻度の処置および処置手順の侵襲性に取り組む代替的な手法に対する必要が創出された。ＶＥＧＦの上昇を伴う血管新生はまた、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ：ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍａｃｕｌａｒ  ｅｄｅｍａ）、および網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ：ｒｅｔｉｎａｌ  ｖｅｉｎ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）など、他の眼病態ももたらしうる。これらの疾患は、網膜血管新生および視覚喪失をもたらす。Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）などのＶＥＧＦ阻害剤は、ＤＭＥおよびＲＶＯにおける有効性を裏付けているが、有益性を維持するためには、滲出型ＡＭＤの場合と同様に、高頻度の硝子体内投与を要求する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、ヒト対象のＡＭＤの滲出形態において見出されるＣＮＶなどのＣＮＶを処置するための組成物および方法を提供する。
【０００５】
一態様において、本開示は、薬学的有効量の、ＶＥＧＦ阻害剤を含む医薬組成物を、ＡＭＤの処置を必要とするヒト対象へと網膜下投与するステップを含む、ヒト対象におけるＡＭＤを処置するための組成物および方法を提供する。一態様において、医薬組成物は、組換えウイルスを含む。別の態様では、ＶＥＧＦ阻害剤は、可溶性Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ｓＦＬＴ−１：ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｆｍｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ
ｋｉｎａｓｅ−１）タンパク質をコードする核酸を含む。
【０００６】
一態様において、本開示は、薬学的有効量の、可溶性Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ｓＦＬＴ−１）タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、ＡＭＤの処置を必要とするヒト対象へと網膜下投与するステップを含む、ＡＭＤを有するヒト対象におけるＣＮＶを防止するための組成物および方法を提供する。
【０００７】
一部の態様では、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびＨＩＶベースのウイルスから選択される。一部の態様では、ＡＡＶカプシドまたは逆位末端配列（ＩＴＲ：ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔｓ）は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、およびこれらのハイブリッドからなる群から選択される。
【０００８】
一部の態様では、組換えウイルスは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ：ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ：Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＭＭＴプロモーター、ＥＦ−１アルファプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、およびオプシンプロモーターから選択されるプロモーターを含む。
【０００９】
一部の態様では、組換えウイルスは、エンハンサーを含む。
【００１０】
一部の態様では、組換えウイルスは、イントロンまたはキメライントロンを含む。
【００１１】
一部の態様では、組換えウイルスは、ＳＶ４０ポリＡ配列を含む。
【００１２】
一部の態様では、組換えウイルスは、ヒトｓＦｌｔ−１タンパク質またはその機能的断片を含む。
【００１３】
一部の態様では、組換えウイルスを、アンピシリン耐性マーカーまたは非アンピシリン耐性マーカーを含むプラスミドから生成する。
【００１４】
一部の態様では、組換えウイルスは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどの細菌性調節配列を含む。
【００１５】
一部の態様では、組換えウイルスは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどの細菌性調節配列を欠く。
【００１６】
一部の態様では、組換えウイルスは、眼細胞内のｓＦｌｔ−１タンパク質またはその機能的断片の選択的発現を指示することが可能な調節性核酸断片を含む。
【００１７】
一部の態様では、医薬組成物は、約１×１０６〜約１×１０１５の組換えウイルスベクターゲノム、約１×１０７〜約１×１０１４の組換えウイルスベクターゲノム、約１×１０８〜約１×１０１３の組換えウイルスベクターゲノム、約１×１０９〜約３×１０１２の組換えウイルスベクターゲノム、または約１×１０１０〜約３×１０１２の組換えウイルスベクターゲノムを含む。
【００１８】
一部の態様では、医薬組成物を、網膜下注射を介して投与する。
【００１９】
一部の態様では、方法は、薬学的有効量のＶＥＧＦ阻害剤をヒト対象に投与するステップをさらに含む。一部の態様では、ＶＥＧＦ阻害剤は、ＶＥＧＦに対する抗体またはその機能的断片を含む。一部の態様では、ＶＥＧＦ阻害剤は、ラニビズマブを含む。一部の態様では、医薬組成物を、ＶＥＧＦ阻害剤を投与した、少なくとも５、６、７、または８日後に投与する。一部の態様では、医薬組成物を、ＶＥＧＦ阻害剤の投与後３０、６０、または９０日以内に投与する。
【００２０】
一部の態様では、組換えウイルスを含む医薬組成物を投与する前に、ＶＥＧＦ阻害剤を１回投与し、投与後にも１〜２回投与する。一部の態様では、医薬組成物を投与する前に、ＶＥＧＦ阻害剤を、少なくとも２回にわたり投与し、投与後にも１〜２回投与する。一部の態様では、ＶＥＧＦ阻害剤を、６〜７週間にわたり投与する。
【００２１】
一部の態様では、ＶＥＧＦ阻害剤は、ベバシズマブまたはラニビズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体である。他の態様では、ＶＥＧＦ阻害剤は、アフリベルセプトまたはｓＦＬＴ０１など、可溶性受容体、融合タンパク質、またはこれらの断片である。
【００２２】
一部の態様では、ＡＭＤは、滲出型ＡＭＤである。
【００２３】
一部の態様では、ＡＭＤは、萎縮型ＡＭＤである。
【００２４】
一部の態様では、ヒト対象は、滲出型ＡＭＤの危険性がある。
【００２５】
一部の態様では、ヒト対象は、早期滲出型ＡＭＤの症状を提示する。
【００２６】
一部の態様では、ＡＭＤを処置するための異なるＶＥＧＦ阻害剤による少なくとも３、５、１０、１５、または２０回の処置が、前記ヒト対象へとあらかじめ投与されている。
【００２７】
一部の態様では、ラニビズマブによる前記処置後において、最高矯正視力（ＢＣＶＡ：ｂｅｓｔ  ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ｖｉｓｕａｌ  ａｃｕｉｔｙ）は、改善しなかった。
【００２８】
一部の態様では、ラニビズマブによる前記処置後において、ＥＴＤＲＳ（糖尿病網膜症早期治療研究（Ｅａｒｌｙ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ  Ｓｔｕｄｙ））文字により測定される最高矯正視力（ＢＣＶＡ）の改善は、１行を超える。
【００２９】
一部の態様では、ヒト対象は、早期萎縮型ＡＭＤの症状を提示する。
【００３０】
一部の態様では、処置を、少なくとも半年ごとに１回の頻度で投与する。
【００３１】
一部の態様では、投与ステップを、２０、４０、５０、５５、または６５歳以上である前記ヒト対象において実行する。
【００３２】
一部の態様では、投与は、中心窩の外側の部位への投与である。
【００３３】
一部の態様では、投与は、中心網膜の網膜下腔の１または複数の細胞への投与である。
【００３４】
一部の態様では、投与は、黄斑の外側の１または複数の細胞への投与である。
【００３５】
一部の態様では、投与は、黄斑の内側の１または複数の細胞への投与である。
【００３６】
一部の態様では、投与は、網膜色素上皮細胞への投与である。
【００３７】
一部の態様では、投与が、中心網膜の機能または中心網膜の構造に有害な影響を及ぼさない。
【００３８】
一部の態様では、投与は、ヒト対象におけるＶＥＧＦ阻害剤の全身レベルを増大させない。
【００３９】
一部の態様では、投与は、ヒト対象におけるｓＦｌｔ−１の全身レベルを増大させない。
【００４０】
一部の態様では、投与ステップを、両方の眼において同時にまたは逐次的に実行する。
【００４１】
一部の態様では、投与ステップを、一方の眼において実行する。
【００４２】
一部の態様では、対の眼がＡＭＤの症状を提示する場合、投与ステップを一方の眼においても実行する。
【００４３】
一部の態様では、投与ステップを、ペニシリンに対して耐性のヒト対象において実行する。
【００４４】
一部の態様では、投与ステップを、ペニシリンに対して感受性のヒト対象において実行する。
【００４５】
一部の態様では、投与ステップを、ペニシリンに対してアレルギー性のヒト対象において実行する。
【００４６】
一部の態様では、投与ステップを、ペニシリンに対してアレルギー性でないヒト対象において実行する。
【００４７】
一部の態様では、投与ステップは、投与ステップ後において生体顕微鏡法（ＢＥ）および間接検眼鏡法（ＩＯＥ）により観察される、硝子体の炎症を引き起こさない。
【００４８】
一部の態様では、投与ステップは、細胞傷害性Ｔ細胞応答を引き起こさない。
【００４９】
一部の態様では、投与ステップは、ベースラインの範囲を１０％未満超える細胞傷害性Ｔ細胞の増大を尺度とする、細胞傷害性Ｔ細胞応答を引き起こさない。
【００５０】
一部の態様では、Ｔ細胞は、投与ステップ後において、活性化したエフェクターの表現型を提示しない。
【００５１】
一部の態様では、投与ステップ後において、ＥＴＤＲＳ（糖尿病網膜症早期治療研究）文字により測定される最高矯正視力（ＢＣＶＡ）は、１、２、３、４、または５行以上改善する。
【００５２】
一部の態様では、血管新生の低減は、投与ステップ後において、フルオレセイン血管造影（ＦＡ：ｆｌｕｏｒｓｃｅｉｎ  ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ）を使用して観察される。
【００５３】
一部の態様では、ラニビズマブの投与頻度は、１年間当たり１２回未満まで低減される。一部の態様では、アフリベルセプトの投与頻度は、１年間当たり６回未満まで低減される。
【００５４】
一部の態様では、ラニビズマブもしくはアフリベルセプトまたは他のＶＥＧＦ阻害剤を、頻度を低減させて投与するか、またはもはや投与しない。
【００５５】
一部の態様では、ウイルスは、ヒトｓＦＬＴ−１遺伝子配列に対する配列相同性が≧９０％であるｓＦＬＴ−１遺伝子またはその機能的断片を含む。
【００５６】
一部の態様では、投与されるウイルスは、ｓＦＬＴ−１遺伝子、遺伝子変異体、または遺伝子断片を含む。
【００５７】
一部の態様では、医薬組成物を投与した７、１４、２１、または３０日後において、ヒト対象の涙液、血液、唾液、または尿試料中にベクターが検出されない。
【００５８】
一部の態様では、ウイルスベクターの存在を、ｑＰＣＲまたはＥＬＩＳＡにより検出する。
【００５９】
一部の態様では、ヒト対象の硝子体中のｓＦｌｔ−１タンパク質レベルは、医薬組成物を投与した７、１４、２１、または３０日後において、約５００〜５，０００ｐｇ／ｍｌ、約６００〜４，０００ｐｇ／ｍｌ、約８００〜３，０００ｐｇ／ｍｌ、約９００〜２，０００ｐｇ／ｍｌ、または約１，０００〜１，８００ｐｇ／ｍｌである。一部の態様では、医薬組成物を投与した７、１４、３１、３０、６０、９０、１８０、２７０、および３６５日後において、ヒト対象の硝子体中の、ｓＦｌｔ−１タンパク質濃度ともまた称しうるｓＦｌｔ−１タンパク質レベルは上昇する。
【００６０】
一部の態様では、ヒト対象は、少なくとも２カ月間にわたる連続的な眼検査により評価される通り、臨床的に重大な網膜毒性を示さない。
【００６１】
一部の態様では、少なくとも２カ月間にわたり、ヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体における炎症の徴候は存在しない。
【００６２】
一部の態様では、ヒト対象は、組換えウイルスを投与した、少なくとも１２０日後において、ＶＥＧＦ阻害剤による救済処置を必要としない。一部の態様では、ヒト対象は、組換えウイルスの前記投与の少なくとも１８０日後または少なくとも２１０日後において、ＶＥＧＦ阻害剤による救済処置を必要としない。一部の態様では、ヒト対象は、組換えウイルスの投与後少なくとも２７０日間にわたり、ＶＥＧＦ阻害剤による救済処置を必要としない。一部の態様では、ヒト対象は、組換えウイルスの投与後少なくとも３６５日間にわたり、ＶＥＧＦ阻害剤による救済処置を必要としない。
【００６３】
一部の態様では、組換えウイルスの前記投与の少なくとも１８０日後または少なくとも２１０日後の前記ヒト対象において、視力の喪失、ＩＯＰの上昇、網膜剥離、または任意の眼内もしくは全身免疫応答の証拠が見られない。一部の態様では、組換えウイルスを投与した、少なくとも３６５日後の前記ヒト対象において、視力の喪失、ＩＯＰの上昇、網膜剥離、または任意の眼内もしくは全身免疫応答の証拠が見られない。
【００６４】
別の態様では、本開示は、約１×１０６〜約１×１０１５個の組換えウイルスを含む医薬組成物であって、組換えウイルスの各々が、可溶性Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ｓＦｌｔ−１）タンパク質をコードする核酸を含む医薬組成物を提供する。
【００６５】
一部の態様では、本開示は、ヒト対象における眼の血管新生を処置または予防するための方法であって、薬学的有効量の、ｓＦＬＴ−１をコードする核酸を含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象の１または複数の網膜下部位へと投与するステップを含む方法を提供する。
【００６６】
一部の態様では、本開示は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、滲出型ＡＭＤ、萎縮型ＡＭＤ、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される１または複数の状態を有するか、または有することが疑われるヒト対象を提供する。場合によって、ヒト対象は、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、分枝性網膜静脈閉塞症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血症、虚血性網膜症、および糖尿病性網膜浮腫からなる群から選択される、１または複数の状態を有するか、または有することが疑われる。
【００６７】
一部の態様では、本開示は、組換えウイルスを含む医薬組成物であって、ウイルスが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびＨＩＶベースのウイルスからなる群から選択される医薬組成物を提供する。
【００６８】
一部の態様では、本開示は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＭＴプロモーター、ＥＦ−１アルファプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、およびオプシンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動的に連結した、ｓＦＬＴ−１をコードする核酸を提供する。
【００６９】
一部の態様では、本開示は、ｓＦＬＴ−１が少なくとも１つの二量体化ドメインをコードする、ｓＦＬＴ−１核酸を提供する。場合によって、ｓＦＬＴ−１核酸は、原核生物調節配列を含有しない。場合によって、ｓＦＬＴ−１核酸は、原核生物調節配列を含有する。
【００７０】
一部の態様では、本開示は、ウイルスまたはプラスミドを含む医薬組成物を提供する。
【００７１】
一部の態様では、本開示は、ヒト対象への、ＶＥＧＦ阻害剤による１回または複数回の処置の投与を提供する。場合によって、ＶＥＧＦ阻害剤を、医薬組成物の投与から３０、９０、または１８０日以内に投与する。場合によって、本開示の医薬組成物とＶＥＧＦ阻害剤とを、少なくとも２４時間隔てて投与する。
【００７２】
一部の態様では、本開示は、少なくとも５５歳のヒト対象に投与される医薬組成物を提供する。
【００７３】
一部の態様では、本開示は、中心窩の外側への、医薬組成物の投与を提供する。
【００７４】
一部の態様では、本開示は、医薬組成物の投与後において、ＥＴＤＲＳ（糖尿病網膜症早期治療研究）文字により測定される、ヒト対象の最高矯正視力（ＢＣＶＡ）が、少なくとも１、２、３、４、または５行改善することを提供する。
【００７５】
一部の態様では、本開示は、医薬組成物の投与後において、ＥＴＤＲＳ（糖尿病網膜症早期治療研究）により測定される、最高矯正視力（ＢＣＶＡ）の低下が、１５文字より少ないことを提供する。
【００７６】
一部の態様では、本開示は、医薬組成物を一方の眼に投与する条件、医薬組成物を２つの眼に逐次的に投与する条件、および医薬組成物を２つの眼に同時に投与する条件からなる群から選択される条件下における医薬組成物の投与を提供する。
【００７７】
一部の態様では、本開示は、フルオレセイン血管造影（ＦＡ）により観察される血管新生の低減が、医薬組成物の投与に後続することを提供する。
【００７８】
一部の態様では、本開示は、注射の少なくとも１週間後のヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体における炎症の徴候は存在しないことを提供する。
【００７９】
一部の態様では、本開示は、医薬組成物を投与した１週間後または３、６、９、もしくは１２カ月後のヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体における炎症の徴候が存在しないことを提供する。
【００８０】
一部の態様では、本開示は、ヒト対象が、医薬組成物の投与後少なくとも３０、６０、９０、１２０、１８０、２７０、または３６５日間にわたり、救済処置を必要としないことを提供する。
【００８１】
一部の態様では、本開示は、ヒト対象が、医薬組成物を投与した後で、視力の喪失、ＩＯＰの上昇、網膜剥離、眼内または全身免疫応答を経ないことを提供する。
【００８２】
一部の態様では、本開示は、投与ステップ後において、抗ＡＡＶ細胞傷害性Ｔ細胞応答の増大が測定されないことを提供する。
【００８３】
一部の態様では、本開示は、ウイルスが、医薬組成物を投与した３、７、１４、２１、または３０日後のヒト対象の血液、唾液、または尿試料中に検出されないことを提供する。
【００８４】
一部の態様では、本開示は、ヒト対象に医薬組成物を投与した７、１４、２１、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２７０、または３６５日後において、ヒト対象の硝子体中のｓＦＬＴ−１タンパク質レベルが約５００〜５，０００ｐｇ／ｍｌであることを提供する。
【００８５】
一部の態様では、本開示は、ヒト対象に、医薬組成物の投与の前に、ＶＥＧＦ阻害剤による１回または複数回の処置を施すことを提供する。
【００８６】
一部の態様では、本開示は、ＶＥＧＦ阻害剤による処置に対して耐性であるものとしてのヒト対象を提供する。
【００８７】
一部の態様では、本開示は、医薬組成物を投与する前に、ＶＥＧＦ阻害剤をあらかじめ施されていないヒト対象を提供する。
【００８８】
一部の態様では、本開示は、ヒト対象における、１年間に３回未満の頻度の医薬組成物の投与を提供する。
【００８９】
一部の態様では、本開示は、医薬組成物の投与により、ヒト対象における、さらなるＶＥＧＦ阻害剤による処置の投与頻度が低減されることを提供する。
【００９０】
一部の態様では、本開示は、医薬組成物の投与の７、１４、２１、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２７０、または３６５日後において測定する場合に、ヒト対象の硝子体中のｓＦＬＴ−１タンパク質の濃度が上昇することを提供する。
【００９１】
一部の態様では、本開示は、医薬組成物の投与の前に、またはその１日以内もしくは１週間以内に硝子体ゲルが除去されているヒト対象を提供する。
【００９２】
一部の態様では、本開示は、２０ゲージより小さい硝子体切除システムを使用して投与される医薬組成物を提供する。
【００９３】
一部の態様では、本開示は、縫合を必要としない硝子体切除システムを使用して投与される医薬組成物を提供する。
【００９４】
一部の態様では、本開示は、３９ゲージより小さいカニューレチップを使用して投与される医薬組成物を提供する。
【００９５】
一部の態様では、本開示は、硝子体腔内のガス／液体交換を後続させる医薬組成物を提供する。
【００９６】
一部の態様では、本開示は、前記薬理作用剤による処置後１２カ月以内における対象の網膜中心厚が、５０ミクロン、１００ミクロン、または２５０ミクロンを超えて増大しないことを提供する。
【００９７】
一部の態様では、本開示は、ヒト対象の罹患眼において、地図状萎縮が、処置されていないヒト対象の罹患眼と比較して進行しないことを提供する。
【００９８】
一部の態様では、本開示は、ｓＦＬＴ−１導入遺伝子配列に作動的に連結した、少なくとも１つのプロモーター配列を含む核酸を含む組換えウイルスまたはプラスミドを含む医薬組成物を提供する。場合によって、本開示の医薬組成物は、３００塩基対を超える配列により隔てられたプロモーター配列とｓＦＬＴ−１導入遺伝子配列とを含む。場合によって、本開示の医薬組成物は、ＵＴＲ配列により隔てられたプロモーター配列とｓＦＬＴ−１導入遺伝子配列とを含む。場合によって、ＵＴＲ配列は、少なくとも１０塩基対を含む。場合によって、医薬組成物は、各々が少なくとも５０塩基対を含む、少なくとも３つのリンカー配列を含む。
【００９９】
一部の態様では、本開示は、ｓＦｌｔ−１核酸が、少なくとも１つの二量体化ドメインをコードする医薬組成物を提供する。
【０１００】
一部の態様では、本開示は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号３４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、および配列番号４７からなる群から選択されるプロモーター配列；配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、および配列番号１０８からなる群から選択される、ＶＥＧＦ阻害剤をコードする配列；配列番号４８、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、および配列番号１１９からなるイントロン配列；配列番号９１、配列番号２、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、および配列番号１０１からなる群から選択されるＵＴＲ配列；ならびに配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、および配列番号５５からなる群から選択される終結配列を含む医薬組成物を提供する。
【０１０１】
一部の態様では、本開示は、１×１０６〜１×１０１５のベクターゲノムを有する組換えウイルスを含む単位用量の医薬組成物であって、組換えウイルスが、プロモーターに作動的に連結したｓＦＬＴ−１をコードする核酸を含む単位用量の医薬組成物を提供する。場合によって、単位用量の医薬組成物は、１×１０１０〜３×１０１２のベクターゲノムを含む。
【０１０２】
一部の態様では、本開示は、細胞内で組換えウイルスを生成する方法であって、ｓＦＬＴ−１導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも１つのプロモーター配列、ＩＴＲ配列、およびＵＴＲ配列を含む核酸を細胞に導入するステップと、組換えウイルスを精製するステップとを含む方法を提供する。場合によって、ＵＴＲ配列は、ヒトＵＴＲ配列である。場合によって、核酸配列は、ベータ−ラクタム抗生剤耐性配列を含有しない。場合によって、ＨＥＫ２９３細胞に、１×１０６の感染多重度（ＭＯＩ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で形質導入した７２時間後において測定した場合、組換えウイルスは、ｓＦＬＴ−１タンパク質を、１００〜１０，０００ｐｇ／ｍＬの範囲で産生する。場合によって、組換えウイルスは、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ：ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）の増殖を阻害する。
【０１０３】
一部の態様では、本開示は、組換えウイルスベクターを生成するための細胞であって、ｓＦＬＴ−１導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも１つのプロモーターポリヌクレオチド配列、ＩＴＲポリヌクレオチド配列、およびＵＴＲポリヌクレオチド配列を含む細胞を提供する。
【０１０４】
一部の態様では、本開示は、ヒトにおける眼の血管新生の処置または予防における使用のための、ｓＦＬＴ−１をコードする配列を含む核酸であって、前記使用が、それを必要とするヒト対象における１または複数の網膜下部位へと、前記ヒト対象に有効量の医薬組成物を直接投与するステップを含み、前記医薬組成物が、前記核酸を含む核酸を提供する。
【０１０５】
一部の態様では、本開示は、前記ｓＦＬＴ−１が、ＶＥＧＦ阻害剤であり、眼の血管新生の可能性の前記処置または低減が、ＶＥＧＦ阻害の結果として生じる使用のための核酸を提供する。
【０１０６】
一部の態様では、本開示は、医薬組成物が、ヒト対象の硝子体中のｓＦＬＴ−１タンパク質のレベルを、前記医薬組成物の、前記ヒト対象への投与の少なくとも７２時間後に、前記投与前における前記ヒトの硝子体中のｓＦＬＴ−１タンパク質のレベルと比較して上昇させることが可能な使用のための核酸を提供する。
【０１０７】
一部の態様では、本開示は、前記ｓＦＬＴ−１を含む核酸が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびＨＩＶベースのウイルスからなる群から選択される組換えウイルスを含む使用のための核酸を提供する。
【０１０８】
一部の態様では、本開示は、ｓＦＬＴ−１をコードする核酸が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＭＴプロモーター、ＥＦ−１アルファプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、およびオプシンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動的に連結している、使用のための核酸を提供する。
【０１０９】
一部の態様では、本開示は、核酸がウイルスによりパッケージングされるか、またはプラスミドＤＮＡである使用のための核酸を提供する。
【０１１０】
一部の態様では、本開示は、使用のための核酸を提供する。前記使用が、処置または低減を必要とするヒト対象への、１または複数のさらなるＶＥＧＦ阻害剤の投与をさらに含み、必要に応じて、前記さらなるＶＥＧＦ阻害剤は、ラニビズマブまたはベバシズマブである。
【０１１１】
一部の態様では、本開示は、前記医薬組成物を、少なくとも５０、５５、または６５歳のヒト対象に投与するステップを含む使用のための核酸を提供する。
【０１１２】
一部の態様では、本開示は、前記医薬組成物を中心窩の外側に投与するステップを含む使用のための核酸を提供する。
【０１１３】
一部の態様では、本開示は、有効量の医薬組成物の投与後において、ＥＴＤＲＳ（糖尿病網膜症早期治療研究）文字により測定される、処置を必要とするヒト対象の最高矯正視力（ＢＣＶＡ）が、少なくとも１、２、３、４、または５行改善する使用のための核酸を提供する。
【０１１４】
一部の態様では、本開示は、処置を必要とするヒト対象において、医薬組成物の投与を、３、６、９、１２、１８、または２４カ月ごとに少なくとも１回の頻度で実施する使用のための核酸を提供する。
【０１１５】
一部の態様では、本開示は、医薬組成物の投与を、ヒト対象において、１年間に３回未満の頻度で実施するか、またはヒト対象における、さらなるＶＥＧＦ阻害剤による処置の投与頻度を低減する頻度で実施する使用のための核酸を提供する。
【０１１６】
一部の態様では、本開示は、約１×１０６〜１×１０１５または１×１０１０〜３×１０１２のベクターゲノムを含む単位用量の医薬組成物を提供する。一部の態様では、組換えウイルスは、プロモーターに作動的に連結した、ｓＦＬＴ−１をコードする核酸またはその機能的断片を含む。
【０１１７】
一部の態様では、本開示は、ヒト対象における眼の血管新生を処置または予防するための方法であって、薬学的有効量の、ＶＥＧＦ阻害剤をコードする核酸を含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象の１または複数の網膜下部位へと投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、ＶＥＧＦ阻害剤は、抗ＶＥＧＦ抗体またはその機能的断片である。一部の態様では、ＶＥＧＦ阻害剤は、可溶性受容体、融合タンパク質、またはこれらの機能的断片である。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ヒト対象における眼の血管新生の処置または予防における使用のための、ＶＥＧＦ阻害剤をコードする配列を含む核酸であって、前記使用が、それを必要とするヒト対象における１または複数の網膜下部位へと、前記ヒト対象に有効量の医薬組成物を直接投与するステップを含み、前記医薬組成物が、前記核酸を含む核酸。
（項目２）
前記ＶＥＧＦ阻害剤が、抗ＶＥＧＦ抗体またはその機能的断片である、項目１に記載の使用のための核酸。
（項目３）
前記ＶＥＧＦ阻害剤が、可溶性受容体、融合タンパク質、またはこれらの断片である、項目１に記載の使用のための核酸。
（項目４）
ヒト対象における眼の血管新生の処置または予防における使用のための、ｓＦＬＴ−１をコードする配列を含む核酸であって、前記使用が、それを必要とするヒト対象における１または複数の網膜下部位へと、前記ヒト対象に有効量の医薬組成物を直接投与するステップを含み、前記医薬組成物が、前記核酸を含む核酸。
（項目５）
前記ｓＦＬＴ−１が、ＶＥＧＦ阻害剤であり、眼の血管新生の可能性の前記処置または低減が、ＶＥＧＦ阻害の結果として生じる、項目４に記載の使用のための核酸。
（項目６）
前記医薬組成物が、ヒト対象の硝子体中のｓＦＬＴ−１タンパク質のレベルを、前記ヒト対象への前記医薬組成物の投与後の少なくとも７２時間後に、前記投与前における前記ヒトの硝子体中のｓＦＬＴ−１タンパク質のレベルと比較して上昇させることが可能である、項目４に記載の使用のための核酸。
（項目７）
前記ｓＦＬＴ−１を含む前記核酸が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびＨＩＶベースのウイルスからなる群から選択される組換えウイルスを含む、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
（項目８）
前記組換えウイルスが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、およびこれらのハイブリッドからなる群から選択されるＡＡＶである、項目７に記載の使用のための核酸。
（項目９）
前記ｓＦＬＴ−１をコードする前記核酸が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＭＴプロモーター、ＥＦ−１アルファプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、およびオプシンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動的に連結している、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
（項目１０）
プラスミドであるか、またはウイルスベクターにより送達される、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
（項目１１）
前記使用が、処置または低減を必要とする前記ヒト対象への、１または複数のさらなるＶＥＧＦ阻害剤の投与をさらに含み、必要に応じて、前記さらなるＶＥＧＦ阻害剤が、ラニビズマブ、ベバシズマブ、またはアフリベルセプトである、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
（項目１２）
前記使用が、前記医薬組成物を、少なくとも５５歳のヒト対象へと投与するステップを含む、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
（項目１３）
前記使用が、前記医薬組成物を中心窩の外側に投与するステップを含む、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
（項目１４）
ＥＴＤＲＳ（糖尿病網膜症早期治療研究）文字により測定したときの、処置を必要とする前記ヒト対象の最高矯正視力（ＢＣＶＡ）が、有効量の前記医薬組成物の前記投与後において、少なくとも１、２、３、４、または５行改善する、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
（項目１５）
前記医薬組成物の前記投与により、他の抗ＶＥＧＦ療法の投与頻度が低減される、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
（項目１６）
他の抗ＶＥＧＦ療法の前記投与が、３カ月当たり１回未満、または６カ月当たり１回未満、または１年当たり１回未満である、項目１５に記載の核酸。
（項目１７）
前記医薬組成物の前記投与が、前記ヒトにおいて、１年間に３回未満の頻度で実施される、前記項目のいずれかに記載の使用のための核酸。
（項目１８）
組換えウイルスを含む単位用量の医薬組成物であって、前記単位が少なくとも１×１０１０〜３×１０１２のベクターゲノムを含み、前記組換えウイルスが、プロモーターに作動的に連結した前記ｓＦＬＴ−１をコードする核酸を含み、前記単位用量が、ヒト対象の硝子体中のｓＦＬＴ−１タンパク質のレベルを、前記ヒト対象への投与後の少なくとも７日後に上昇させることが可能である、単位用量の医薬組成物。
（項目１９）
組換えウイルスまたはプラスミドを含む医薬組成物であって、各組換えウイルスまたはプラスミドが核酸を含み、前記核酸が、プロモーター配列に作動的に連結したｓＦＬＴ−１導入遺伝子配列を含み、前記医薬組成物が、ヒト対象の硝子体中のｓＦＬＴ−１タンパク質のレベルを、前記ヒト対象への投与後の少なくとも７日後に上昇させることが可能である、医薬組成物。
（項目２０）
前記プロモーター配列と、前記ｓＦＬＴ−１導入遺伝子配列とが、３００塩基対を超える配列により隔てられている、項目１９に記載の医薬組成物。
（項目２１）
前記プロモーター配列と、前記ｓＦＬＴ−１導入遺伝子配列とが、ＵＴＲ配列により隔てられている、項目１９に記載の医薬組成物。
（項目２２）
以下の順序：
ａ．配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２からなる群から選択されるプロモーター配列；
ｂ．配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７配列番号１０８または配列番号１２２からなる群から選択される、ＶＥＧＦ阻害剤をコードする配列；
ｃ．配列番号４８、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９または配列番号１２０からなるイントロン配列；
ｄ．配列番号９１、配列番号２、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、および配列番号１０１からなる群から選択されるＵＴＲ配列；および
ｅ．配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、および配列番号５５からなる群から選択される終結配列
で核酸エレメントを含む医薬組成物。
（項目２３）
以下の順序：
ａ．配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９からなる群から選択されるＩＴＲ配列；
ｂ．配列番号６０、配列番号６３、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７６、配列番号７７、および配列番号８４からなる群から選択されるリンカー配列；
ｃ．配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７からなる群から選択されるプロモーター配列；
ｄ．配列番号６０、配列番号６４、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号８７からなる群から選択されるリンカー配列；
ｅ．配列番号４８、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９および配列番号１２０からなるイントロン配列；
ｆ．配列番号６０、配列番号６４、配列番号６５、配列番号７５、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８２、および配列番号８９からなる群から選択されるリンカー配列；
ｇ．配列番号９１、配列番号２、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、および配列番号１０１からなる群から選択されるＵＴＲ配列；ならびに
ｈ．配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０８および配列番号１２２からなる群から選択される、ＶＥＧＦ阻害剤をコードする配列；
ｉ．配列番号９１、配列番号２、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、および配列番号１０１からなる群から選択されるＵＴＲ配列；
ｊ．配列番号６０、配列番号６２、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６からなる群から選択されるリンカー配列；
ｋ．配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、および配列番号５５からなる群から選択される終結配列；
ｌ．配列番号６０、配列番号６１、配列番号８０、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０からなる群から選択されるリンカー配列；ならびに
ｍ．配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、および配列番号５９からなる群から選択されるＩＴＲ配列
で核酸エレメントを含む医薬組成物。
（項目２４）
細胞内で組換えウイルスを生成する方法であって、
ａ．ｓＦＬＴ−１導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも１つのプロモーター配列、ＩＴＲ配列、およびＵＴＲ配列を含む核酸を細胞に導入するステップと、
ｂ．前記組換えウイルスを精製するステップと
を含む方法。
（項目２５）
組換えウイルスベクターを生成するための細胞であって、ｓＦＬＴ−１導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも１つのプロモーターポリヌクレオチド配列、ＩＴＲポリヌクレオチド配列、およびＵＴＲポリヌクレオチド配列を含む細胞。
（項目２６）
ヒト対象における眼の血管新生を処置または予防するための方法であって、薬学的有効量の、ＶＥＧＦ阻害剤をコードする核酸を含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象の１または複数の網膜下部位へと投与するステップを含む方法。
（項目２７）
前記ＶＥＧＦ阻害剤が、ＶＥＧＦに対する抗ＶＥＧＦ抗体またはその機能的断片である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記ＶＥＧＦ阻害剤が、可溶性受容体、融合タンパク質、またはこれらの機能的断片である、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
ヒト対象における眼の血管新生を処置または予防するための方法であって、薬学的有効量の、ｓＦＬＴ−１をコードする核酸を含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象の１または複数の網膜下部位へと投与するステップを含む方法。
（項目３０）
前記ヒト対象が、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、滲出型ＡＭＤ、萎縮型ＡＭＤ、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される、１または複数の状態を有するか、または有することが疑われる、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記ヒト対象が、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、分枝性網膜静脈閉塞症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血症、虚血性網膜症、および糖尿病性網膜浮腫からなる群から選択される、１または複数の状態を有するか、または有することが疑われる、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記医薬組成物が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびＨＩＶベースのウイルスからなる群から選択される組換えウイルスを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
前記ｓＦＬＴ−１をコードする前記核酸が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＭＴプロモーター、ＥＦ−１アルファプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、およびオプシンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動的に連結している、項目２９に記載の方法。
（項目３４）
前記ｓＦＬＴ−１核酸が、少なくとも１つの二量体化ドメインをコードする、項目２９に記載の方法。
（項目３５）
前記核酸が、原核生物調節配列を含有しない、項目２９に記載の方法。
（項目３６）
前記核酸が、原核生物調節配列を含有する、項目２９に記載の方法。
（項目３７）
前記核酸が、プラスミドであるか、またはウイルスにより送達される、項目２９に記載の方法。
（項目３８）
前記ヒト対象への、ＶＥＧＦ阻害剤による１回または複数回の処置の投与をさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目３９）
前記ＶＥＧＦ阻害剤を、前記医薬組成物の投与から３０日以内、９０日以内、または１８０日以内に投与する、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記医薬組成物と前記ＶＥＧＦ阻害剤とを、少なくとも２４時間隔てて投与する、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
前記医薬組成物を、少なくとも５５歳のヒト対象へと投与する、項目２９に記載の方法。
（項目４２）
前記投与を中心窩の外側で実施する、項目２９に記載の方法。
（項目４３）
ＥＴＤＲＳ（糖尿病網膜症早期治療研究）文字により測定したときの前記ヒト対象の最高矯正視力（ＢＣＶＡ）が、前記医薬組成物の前記投与後において少なくとも１、２、３、４、または５行改善する、項目２９に記載の方法。
（項目４４）
ＥＴＤＲＳ（糖尿病網膜症早期治療研究）により測定したときの最高矯正視力（ＢＣＶＡ）が、前記医薬組成物の前記投与後において１５文字より少なく低下する、項目２９に記載の方法。
（項目４５）
前記医薬組成物の投与を、前記医薬組成物を一方の眼に投与する条件、前記医薬組成物を２つの眼に逐次的に投与する条件、および前記医薬組成物を２つの眼に同時に投与する条件からなる群から選択される条件下で実施する、項目２９に記載の方法。
（項目４６）
フルオレセイン血管造影（ＦＡ）により観察したときの血管新生の低減が、前記医薬組成物の前記投与に後続する、項目２９に記載の方法。
（項目４７）
注射の少なくとも１週間後の前記ヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体における炎症の徴候がいずれも存在しない、項目２９に記載の方法。
（項目４８）
前記ヒト対象が、前記医薬組成物の前記投与後少なくとも３０、６０、９０、１２０、１８０、２７０、または３６５日間にわたり救済処置を必要としない、項目２９に記載の方法。
（項目４９）
前記投与ステップ後において、抗ＡＡＶ細胞傷害性Ｔ細胞応答の増大が測定されない、項目３２に記載の方法。
（項目５０）
ウイルスが、前記医薬組成物を投与した３、７、１４、２１、または３０日後において、前記ヒト対象の血液、唾液、または尿のいずれの試料中にも検出されない、項目３２に記載の方法。
（項目５１）
前記ヒト対象に前記医薬組成物を投与した７、１４、２１、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２７０、または３６５日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記ｓＦＬＴ−１タンパク質レベルが、約５００〜５，０００ｐｇ／ｍｌである、項目２９に記載の方法。
（項目５２）
前記ヒト対象が、前記医薬組成物の前記投与の前に、ＶＥＧＦ阻害剤による１回または複数回の処置を施されている、項目２９に記載の方法。
（項目５３）
前記ヒト対象が、前記医薬組成物の前記投与の前に、ＶＥＧＦ阻害剤による処置をあらかじめ施されていない、項目２９に記載の方法。
（項目５４）
前記医薬組成物の前記投与が、前記ヒト対象において、１年間に３回未満の頻度で実施される、項目２９に記載の方法。
（項目５５）
前記医薬組成物の前記投与により、前記ヒト対象における、さらなるＶＥＧＦ阻害剤による処置の投与頻度が低減される、項目２９に記載の方法。
（項目５６）
前記医薬組成物の前記投与の７、１４、２１、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２７０、または３６５日後において測定する場合に、前記ヒト対象の前記硝子体中のｓＦＬＴ−１タンパク質の濃度が上昇する、項目２９に記載の方法。
（項目５７）
前記薬剤の前記投与の前に、または前記投与の１週間以内に前記ヒト対象の硝子体ゲルが除去されている、項目２９に記載の方法。
（項目５８）
前記薬理作用剤を、２０ゲージより小さい硝子体切除システムを使用して投与する、項目２９に記載の方法。
（項目５９）
前記薬理作用剤を、３９ゲージより小さいカニューレチップを使用して投与する、項目２９に記載の方法。
（項目６０）
前記薬理作用剤による処置後１２カ月以内における、前記対象の網膜中心厚が、５０ミクロン、１００ミクロン、または２５０ミクロンを超えて増大しない、項目２９に記載の方法。
（項目６１）
前記ヒト対象の罹患眼において、地図状萎縮が進行しない、項目２９に記載の方法。
（項目６２）
前記ヒト対象が、ペニシリンに対する感受性またはアレルギーを有する、項目２９に記載の方法。
（項目６３）
前記ヒト対象のＶＥＧＦ阻害剤の全身レベルが増大しない、項目２９に記載の方法。
（項目６４）
ｓＦＬＴ−１導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも１つのプロモーター配列を含む核酸を含む組換えウイルスまたはプラスミドを含み、前記プロモーター配列と、前記ｓＦＬＴ−１導入遺伝子配列とが、３００塩基対を超える配列により隔てられている、医薬組成物。
（項目６５）
ｓＦＬＴ−１導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも１つのプロモーター配列を含む核酸を含む組換えウイルスまたはプラスミドを含み、前記プロモーター配列と、前記ｓＦＬＴ−１導入遺伝子配列とが、ＵＴＲ配列により隔てられている、医薬組成物。
（項目６６）
前記ＵＴＲ配列が、少なくとも１０塩基対を含む、項目６５に記載の医薬組成物。
（項目６７）
前記核酸が、各々が少なくとも５０塩基対を含む、少なくとも３つのリンカー配列を含む、項目６６に記載の医薬組成物。
（項目６８）
１×１０１０〜３×１０１２のベクターゲノムの組換えウイルスを含む単位用量の医薬組成物であって、前記組換えウイルスが、プロモーターに作動的に連結したｓＦＬＴ−１をコードする核酸を含む、単位用量の医薬組成物。
（項目６９）
細胞内で組換えウイルスを生成する方法であって、
ａ．ｓＦＬＴ−１導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも１つのプロモーター配列、ＩＴＲ配列、およびＵＴＲ配列を含む核酸を細胞に導入するステップと、
ｂ．前記組換えウイルスを精製するステップと
を含む方法。
（項目７０）
前記核酸配列が、ベータ−ラクタム抗生剤耐性配列を含有しない、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
ＨＥＫ２９３細胞に、１×１０４〜１×１０６の感染多重度で形質導入した７２時間後において測定した場合、前記組換えウイルスが、ｓＦＬＴ−１タンパク質を、１００〜１０，０００ｐｇ／ｍＬの範囲で産生する、項目６９に記載の方法。
（項目７２）
前記組換えウイルスが、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖を阻害する、項目６９に記載の方法。
（項目７３）
組換えウイルスベクターを生成するための細胞であって、ｓＦＬＴ−１導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも１つのプロモーターポリヌクレオチド配列、ＩＴＲポリヌクレオチド配列、およびＵＴＲポリヌクレオチド配列を含む細胞。
（項目７４）
前記医薬組成物を投与した１週間後または３、６、９、もしくは１２カ月後の前記ヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体のいずれにおける炎症の徴候も存在しない、項目２９に記載の方法。
（項目７５）
前記ヒト対象が、前記医薬組成物を投与した後で、視力の喪失、ＩＯＰの上昇、網膜剥離、眼内または全身免疫応答のいずれも経験しない、項目２９に記載の方法。
（項目７６）
前記ヒト対象が、ＶＥＧＦ阻害剤による処置に対して耐性である、項目２９に記載の方法。
（項目７７）
前記薬理作用剤を、縫合を必要としない硝子体切除システムを使用して投与する、項目２９に記載の方法。
（項目７８）
前記薬理作用剤の前記投与の後に、硝子体腔内のガス／液体交換を行う、項目２９に記載の方法。
（項目７９）
ヒト対象における眼の血管新生を処置または低減するための方法であって、
薬学的有効量の、ＶＥＧＦ阻害剤をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象に網膜下投与するステップ
を含む方法。
（項目８０）
ヒト対象における眼の血管新生を処置または低減するための方法であって、
薬学的有効量の、可溶性Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ｓＦＬＴ−１）タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象に網膜下投与するステップ
を含む方法。
（項目８１）
ヒト対象における眼の血管新生を防止するための方法であって、薬学的有効量の、可溶性Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ｓＦＬＴ−１）タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、ヒト対象に網膜下投与するステップ
を含む方法。
（項目８２）
ＡＭＤを伴うヒト対象における脈絡膜血管新生を処置または低減するための方法であって、
薬学的有効量の、可溶性Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ｓＦＬＴ−１）タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、ＡＭＤの処置を必要とするヒト対象に網膜下投与するステップ
を含む方法。
（項目８３）
萎縮型ＡＭＤを伴うヒト対象における脈絡膜血管新生を防止するための方法であって、薬学的有効量の、可溶性Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ｓＦＬＴ−１）タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、ヒト対象に網膜下投与するステップ
を含む方法。
（項目８４）
前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびＨＩＶベースのウイルスから選択される、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目８５）
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、およびこれらのハイブリッドからなる群から選択される、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目８６）
前記組換えウイルスを、カナマイシン耐性マーカーを含むプラスミドから生成する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目８７）
前記組換えウイルスを、アンピシリン耐性マーカーを含むプラスミドから生成する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目８８）
前記組換えウイルスを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むプラスミドから生成する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目８９）
前記組換えウイルスを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含まないプラスミドから生成する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目９０）
前記組換えウイルスが、アンピシリン耐性マーカーを含む、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目９１）
前記組換えウイルスが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含む、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目９２）
前記組換えウイルスが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含まない、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目９３）
前記組換えウイルスが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＭＴプロモーター、ＥＦ−１アルファプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、およびオプシンプロモーターから選択されるプロモーターを含む、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目９４）
前記組換えウイルスが、エンハンサーを含む、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目９５）
前記組換えウイルスが、キメライントロンを含む、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目９６）
前記組換えウイルスが、ＳＶ４０ポリＡ配列を含む、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目９７）
前記組換えウイルスが、ヒトｓＦＬＴ−１タンパク質またはその機能的断片を含む、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目９８）
前記組換えウイルスが、眼細胞内の前記ｓＦＬＴ−１タンパク質の選択的発現を指示することが可能な調節性核酸断片を含む、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目９９）
前記医薬組成物が、約１×１０６〜約１×１０１５個の組換えウイルスを含む、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１００）
前記医薬組成物が、約１×１０７〜約１×１０１４個の組換えウイルスを含む、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１０１）
前記医薬組成物が、約１×１０８〜約１×１０１３個の組換えウイルスを含む、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１０２）
前記医薬組成物が、約１×１０９〜約１×１０１２個の組換えウイルスを含む、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１０３）
前記医薬組成物が、約１×１０１０〜約１×１０１２個の組換えウイルスを含む、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１０４）
前記医薬組成物を、網膜下注射を介して投与する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１０５）
前記ヒト対象へと、薬学的有効量のＶＥＧＦ阻害剤を投与するステップをさらに含む、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１０６）
前記ＶＥＧＦ阻害剤が、ＶＥＧＦに対する抗体またはその機能的断片を含む、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
前記ＶＥＧＦ阻害剤が、ラニビズマブを含む、項目１０５に記載の方法。
（項目１０８）
前記医薬組成物を、前記ＶＥＧＦ阻害剤の投与の９０日以内に投与する、項目１０５に記載の方法。
（項目１０９）
前記医薬組成物を、前記ＶＥＧＦ阻害剤を投与した、少なくとも５、６、７、または８日後に投与する、項目１０５に記載の方法。
（項目１１０）
前記ＶＥＧＦ阻害剤を、前記医薬組成物を投与する前に少なくとも１回投与する、項目１０５に記載の方法。
（項目１１１）
前記ＶＥＧＦ阻害剤を、前記医薬組成物の投与後に少なくとも１回投与する、項目１０５に記載の方法。
（項目１１２）
前記ＶＥＧＦ阻害剤を、前記ＶＥＧＦ阻害剤の投与の９０日以内に少なくとも２回投与する、項目１０５に記載の方法。
（項目１１３）
前記ＶＥＧＦ阻害剤を、６〜７週間の期間にわたり投与する、項目１０５に記載の方法。
（項目１１４）
前記ＡＭＤが、滲出型ＡＭＤである、項目８２に記載の方法。
（項目１１５）
前記ヒト対象が、加齢黄斑変性を発症する危険性がある、項目８１に記載の方法。
（項目１１６）
前記ヒト対象が、早期加齢黄斑変性の症状を提示する、項目８１に記載の方法。
（項目１１７）
前記ヒト対象が、ＡＭＤを処置するための異なるＶＥＧＦ阻害剤であらかじめ処置されている、項目８０または８２に記載の方法。
（項目１１８）
前記ヒト対象の前記処置された眼が、ＡＭＤを処置するための異なるＶＥＧＦ阻害剤であらかじめ処置されていない、項目８１または８３に記載の方法。
（項目１１９）
ＡＭＤを処置するためのＶＥＧＦ阻害剤による少なくとも５回の処置が、前記ヒト対象へとあらかじめ投与されている、項目８０または８２に記載の方法。
（項目１２０）
ＡＭＤを処置するためのＶＥＧＦ阻害剤による少なくとも１０回の処置が、前記ヒト対象へとあらかじめ投与されている、項目８０または８２に記載の方法。
（項目１２１）
ＡＭＤを処置するためのＶＥＧＦ阻害剤による少なくとも１５回の処置が、前記ヒト対象へとあらかじめ投与されている、項目８０または８２に記載の方法。
（項目１２２）
ＡＭＤを処置するためのＶＥＧＦ阻害剤による少なくとも２０回の処置が、前記ヒト対象へとあらかじめ投与されている、項目８０または８２に記載の方法。
（項目１２３）
ＥＴＤＲＳ（糖尿病網膜症早期治療研究）文字により測定したときの最高矯正視力（ＢＣＶＡ）が、前記医薬組成物による前記処置後において１５文字より少なく低下した、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１２４）
ＥＴＤＲＳ（糖尿病網膜症早期治療研究）文字により測定したときの最高矯正視力（ＢＣＶＡ）が、ラニビズマブによる前記処置後において２行未満改善された、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１２５）
前記ヒト対象が、萎縮型加齢黄斑変性を発症する危険性がある、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１２６）
前記ヒト対象が、早期萎縮型加齢黄斑変性の症状を提示する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１２７）
前記処置を、１２カ月当たり１回未満の頻度で投与する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１２８）
前記処置を、６カ月当たり１回未満の頻度で投与する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１２９）
前記処置を、１８カ月当たり１回未満の頻度で投与する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１３０）
前記投与ステップを、２０歳以上の前記ヒト対象において実行する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１３１）
前記投与ステップを、４０歳以上の前記ヒト対象において実行する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１３２）
前記投与ステップを、５０歳以上の前記ヒト対象において実行する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１３３）
前記投与ステップを、６５歳以上の前記ヒト対象において実行する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１３４）
前記投与が、中心窩を含まない部位への投与である、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１３５）
前記投与が、中心窩に隣接する中心網膜における投与である、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１３６）
投与が、中心網膜の網膜下腔の１または複数の細胞への投与である、項目８０に記載の方法。
（項目１３７）
投与が、黄斑の外側の網膜下腔の１または複数の細胞への投与である、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１３８）
前記投与が、黄斑の内側の網膜下腔の１または複数の細胞への投与である、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１３９）
前記投与が、網膜色素上皮細胞への投与である、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１４０）
前記投与が、中心網膜の機能または中心網膜の構造に有害な影響を及ぼさない、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１４１）
前記投与ステップを、両眼において同時に実行する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１４２）
前記投与ステップを、両眼において逐次的に実行する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１４３）
前記投与ステップを、一方の眼において実行する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１４４）
対の眼がＡＭＤの症状を提示する場合、投与ステップを一方の眼において実行する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１４５）
前記投与ステップを、ペニシリンに対して耐性の前記ヒト対象において実行する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１４６）
前記投与ステップを、ペニシリンに対して感受性の前記ヒト対象において実行する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１４７）
前記投与ステップを、ペニシリンに対してアレルギー性の前記ヒト対象において実行する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１４８）
前記投与ステップを、ペニシリンに対してアレルギー性でない前記ヒト対象において実行する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１４９）
前記医薬組成物を投与した３、７、１４、２１、または３０日後において、ベクターが、前記ヒト対象の血液、唾液、または尿のいずれの試料中でも検出されない、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１５０）
前記ウイルスベクターの存在を、ｑＰＣＲまたはＥＬＩＳＡにより検出する、項目１４９に記載の方法。
（項目１５１）
前記医薬組成物を投与した７、１４、２１または３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２７０、３６５日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記ｓＦＬＴ−１タンパク質レベルが、約５００〜５，０００ｐｇ／ｍｌである、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１５２）
前記医薬組成物を投与した７、１４、２１または３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２７０、ま３６５日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記ｓＦＬＴ−１タンパク質レベルが、約６００〜４，０００ｐｇ／ｍｌである、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１５３）
前記医薬組成物を投与した７、１４、２１または３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２７０、３６５日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記ｓＦＬＴ−１タンパク質レベルが、約８００〜３，０００ｐｇ／ｍｌである、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１５４）
前記医薬組成物を投与した７、１４、２１または３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２７０、３６５日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記ｓＦＬＴ−１タンパク質レベルが、約９００〜２，０００ｐｇ／ｍｌである、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１５５）
前記医薬組成物を投与した７、１４、２１または３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２７０、３６５日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記ｓＦＬＴ−１タンパク質レベルが、約１，０００〜１，８００ｐｇ／ｍｌである、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１５６）
前記医薬組成物を投与した７、１４、２１または３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２７０、３６５日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記ｓＦＬＴ−１タンパク質レベルが、約４，００〜１，０００ｐｇ／ｍｌである、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１５７）
前記ヒト対象が、少なくとも２カ月間の期間にわたる連続的な眼検査により評価したときに、臨床的に重大な網膜毒性を示さない、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１５８）
少なくとも２カ月間の期間にわたり、前記ヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体のいずれにおける炎症の徴候も存在しない、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１５９）
前記ヒト対象が、前記投与後少なくとも１２０日間にわたり救済処置を必要としない、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１６０）
前記投与後少なくとも１２０日間にわたり、前記ヒト対象において、視力の喪失、ＩＯＰの上昇、網膜剥離、または任意の眼内もしくは全身免疫応答のいずれの証拠も見られない、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１６１）
前記投与ステップ後において、生体顕微鏡法（ＢＥ）および間接検眼鏡法（ＩＯＥ）により、硝子体の炎症が観察されない、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１６２）
細胞傷害性Ｔ細胞応答が、前記投与ステップに後続しない、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１６３）
正常範囲の１０％以内の細胞傷害性Ｔ細胞応答が、前記投与ステップに後続しない、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１６４）
ＥＴＤＲＳ（糖尿病網膜症早期治療研究）文字により測定したときの最高矯正視力（ＢＣＶＡ）が前記投与ステップ後に改善する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１６５）
ＢＣＶＡが、１行以上改善する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１６６）
ＢＣＶＡが、少なくとも２行以上改善する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１６７）
ＢＣＶＡが、少なくとも３行以上改善する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１６８）
ＢＣＶＡが、少なくとも４行以上改善する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１６９）
ＢＣＶＡが、少なくとも５行以上改善する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１７０）
フルオレセイン血管造影（ＦＡ）により観察したときの血管新生の低減が、前記投与ステップに後続する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１７１）
他の抗ＶＥＧＦ療法の投与頻度が低減される、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１７２）
他の抗ＶＥＧＦ療法の投与頻度が月１回未満である、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１７３）
他の抗ＶＥＧＦ療法の投与頻度が３カ月未満である、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１７４）
他の抗ＶＥＧＦ療法の投与頻度が６カ月未満である、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１７５）
他の抗ＶＥＧＦ療法の投与頻度が１年未満である、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１７６）
約１×１０６〜１×１０１５個の組換えウイルスを含む単位用量の医薬組成物であって、前記各組換えウイルスが、可溶性Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ｓＦＬＴ−１）タンパク質をコードする核酸を含む、単位用量の医薬組成物。
（項目１７７）
約１×１０１０〜約３×１０１２個の組換えウイルスを含む、項目１７６に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１７８）
約１×１０７〜約１×１０１４個の組換えウイルスを含む、項目１７６に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１７９）
約１×１０８〜約１×１０１３個の組換えウイルスを含む、項目１７６に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１８０）
約１×１０９〜約１×１０１２個の組換えウイルスを含む、項目１７６に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１８１）
約１×１０１０〜約１×１０１２個の組換えウイルスを含む、項目１７６に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１８２）
前記ｓＦＬＴ−１タンパク質が、ヒトｓＦＬＴ−１タンパク質またはその機能的断片を含む、項目１７６に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１８３）
前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびＨＩＶベースのウイルスから選択される、項目１７６に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１８４）
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、およびこれらのハイブリッドからなる群から選択される、項目１７６に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１８５）
前記組換えウイルスが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＭＴプロモーター、ＥＦ−１アルファプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、およびオプシンプロモーターから選択されるプロモーターを含む、項目１７６に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１８６）
前記組換えウイルスが、エンハンサーを含む、項目１７６に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１８７）
前記組換えウイルスが、イントロンを含む、項目１７６に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１８８）
前記組換えウイルスが、ＳＶ４０ポリＡを含む、項目１７６に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１８９）
前記組換えウイルスが、眼細胞内の前記ｓＦＬＴ−１タンパク質の選択的発現を指示することが可能な調節性核酸断片を含む、項目１７６に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１９０）
前記組換えウイルスが、界面活性剤と共に製剤化される、項目１７６に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１９１）
前記組換えウイルスが、プロデューサークローン法を使用して製造される、項目１６８に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１９２）
前記組換えウイルスが、組換えバキュロウイルスを使用して製造される、項目１６８に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１９３）
前記組換えウイルスが、Ａｄ−ＡＡＶを使用して製造される、項目１７６に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１９４）
前記組換えウイルスが、ＨＥＫ２９３細胞を使用して製造される、項目１７６に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１９５）
前記組換えウイルスが、昆虫細胞を使用して製造される、項目１７６に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１９６）
前記組換えウイルスが、ヘルペスヘルパーウイルスを使用して製造される、項目１７６に記載の単位用量の医薬組成物。
（項目１９７）
ヒト対象における眼の血管新生または黄斑浮腫を処置、低減、または防止する方法であって、薬学的有効量の、抗血管形成性因子の発現を指示する組換えＡＡＶ遺伝子送達ベクターを含む医薬組成物を、前記ベクターの投与がヒト対象における血管新生または黄斑浮腫を阻害するように網膜下投与するステップを含む方法。
（項目１９８）
前記投与ステップを、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎のいずれによる感染歴もない前記ヒト対象において実行する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
（項目１９９）
前記医薬組成物の投与の７、１４、２１または３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２７０、または３６５日後において測定したときに、前記ヒト対象の硝子体中の前記ｓＦＬＴ−１タンパク質レベルが上昇する、項目７９、８０、８１、８２、または８３に記載の方法。
【０１１８】
参照による組込み
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
本開示の新規の特色は、付属の特許請求の範囲において詳密に示される。本開示の特色および利点のよりよい理解は、本開示の原理が利用される例示的な態様を示す、以下の詳細な記載、および添付される図面を参照することにより得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、例示的なプラスミドの概略表示を描示する。
【図２】図２は、ｒＡＡＶ．ｓｆｌｔ−１を形質導入した細胞に由来するｓＦＬＴ−１の発現、分泌、および生物学的活性を描示する。（ａ）Ａｄ．ｓＦｌｔ−１を形質導入した２９３細胞（レーン１）、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を形質導入したＤ４０７細胞（レーン２）、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を形質導入した２９３細胞（レーン３）、およびＡＡＶ．ｇｆｐを形質導入したＤ４０７細胞（レーン４）に由来する馴化培地についてのウェスタンブロット解析である。（ｂ）ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を形質導入した細胞に由来する馴化培地による、ＶＥＧＦに誘導されるＨＵＶＥＣ増殖の阻害である。ＨＵＶＥＣは、飢餓培地（カラム１）中、組換えＶＥＧＦを含有する培地中（カラム２）、ＶＥＧＦを含有する培地およびｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を形質導入した２９３細胞に由来する４０μＬの馴化培地中（カラム３）、ＶＥＧＦを含有する培地およびｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を形質導入した２９３細胞に由来する８０μＬの馴化培地中（カラム４）、ならびにＶＥＧＦを含有する培地およびｒＡＡＶ．ｇｆｐを形質導入した２９３細胞に由来する８０μＬの馴化培地中（カラム５）で培養した。（ＶＥＧＦに加えたｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１と、ＶＥＧＦだけとの差異について、＊Ｐ＜０．０２、＊＊Ｐ＜０．００５）
【図３Ａ】図３Ａは、左眼にｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１（サル８５１４、サル８５３０、サル８５２３、サル８５２４、およびサル９９９）、ｒＡＡＶ．ｇｆｐ（サル８２９７およびサル８５３２）を注射されたサル、両方の眼に組換えｓＦｌｔ−１タンパク質（サル８２９４）を注射されたサル、および対照の注射されなかったサル（対照）の硝子体中のヒトｓＦｌｔ−１（ｈｓＦｌｔ−１：ｈｕｍａｎ  ｓＦｌｔ−１）発現を示すグラフを描示する。対照およびサル８２９４およびサル９９９は、注射の３カ月後に安楽死させ、サル８５２４は、注射の９カ月後に安楽死させ、サル８２９７、サル８５３２、サル８５１４、サル８５３０、およびサル８５２３は、注射の１２カ月後に安楽死させた。＊は、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を注射された眼において有意に高い（Ｐ＜０．０５）ｓＦＬＴ−１タンパク質レベルを表示する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、注射後の異なる時点のｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を注射された（９９９、８５２４、８５２３、８５３０、および８５１４）サル、ｒＡＡＶ．ｇｆｐを注射された（８２９７および８５３２）サル、組換えｓＦｌｔ−１タンパク質を注射された（８２９４）サル、および注射されなかった（対照）サルにおけるｈｓＦＬＴ−１レベルを示すグラフを描示する。
【図４】図４：マウスの眼における免疫細胞サブセット集団である。グラフは、注射後の異なる時点における免疫細胞サブセット集団を示す。
【図５】図５：マウスの脾臓における免疫細胞サブセット集団である。グラフは、注射後の異なる時点における免疫細胞サブセット集団を示す。
【図６】図６は、注射後の異なる時点の異なるマウスにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞内のＫｉ６７応答を比較する概略図を描示する。
【図７Ａ】図７Ａ〜図７Ｄは、多様な例示的な複製起点配列を描示する。
【図７Ｂ】図７Ａ〜図７Ｄは、多様な例示的な複製起点配列を描示する。
【図７Ｃ】図７Ａ〜図７Ｄは、多様な例示的な複製起点配列を描示する。
【図７Ｄ】図７Ａ〜図７Ｄは、多様な例示的な複製起点配列を描示する。
【図８Ａ】図８Ａ〜図８Ｆは、多様な例示的なプロモーターの配列を描示する。
【図８Ｂ】図８Ａ〜図８Ｆは、多様な例示的なプロモーターの配列を描示する。
【図８Ｃ】図８Ａ〜図８Ｆは、多様な例示的なプロモーターの配列を描示する。
【図８Ｄ】図８Ａ〜図８Ｆは、多様な例示的なプロモーターの配列を描示する。
【図８Ｅ】図８Ａ〜図８Ｆは、多様な例示的なプロモーターの配列を描示する。
【図８Ｆ】図８Ａ〜図８Ｆは、多様な例示的なプロモーターの配列を描示する。
【図９Ａ】図９Ａ〜図９Ｃは、多様な例示的なイントロン、ポリＡ配列、およびＩＴＲ領域の配列を描示する。
【図９Ｂ】図９Ａ〜図９Ｃは、多様な例示的なイントロン、ポリＡ配列、およびＩＴＲ領域の配列を描示する。
【図９Ｃ】図９Ａ〜図９Ｃは、多様な例示的なイントロン、ポリＡ配列、およびＩＴＲ領域の配列を描示する。
【図９Ｄ】図９Ｄ〜図９Ｆは、多様な例示的なリンカー配列の配列を描示する。
【図９Ｅ】図９Ｄ〜図９Ｆは、多様な例示的なリンカー配列の配列を描示する。
【図９Ｆ】図９Ｄ〜図９Ｆは、多様な例示的なリンカー配列の配列を描示する。
【図９Ｇ】図９Ｇ〜図９Ｈは、多様な例示的なＵＴＲ配列の配列を描示する。
【図９Ｈ】図９Ｇ〜図９Ｈは、多様な例示的なＵＴＲ配列の配列を描示する。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜図１０Ｃは、多様な例示的な抗ＶＥＧＦタンパク質をコードする配列を描示する。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜図１０Ｃは、多様な例示的な抗ＶＥＧＦタンパク質をコードする配列を描示する。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜図１０Ｃは、多様な例示的な抗ＶＥＧＦタンパク質をコードする配列を描示する。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ｓＦＬＴ−１のアミノ酸配列を描示する。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ｓＦＬＴ−１の機能的断片である、ｓＦＬＴ−１のドメイン２のアミノ酸配列を描示する。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ｓＦＬＴ−１のドメイン２をコードする核酸配列を描示する。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜図１２Ｂは、多様な例示的な抗生剤耐性遺伝子の配列を描示する。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜図１２Ｂは、多様な例示的な抗生剤耐性遺伝子の配列を描示する。
【図１３】図１３は、１つの例示的な組成物（ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１）のＰＫであって、６〜８週間後において、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１が最適な抗ＶＥＧＦ発現に到達するＰＫを描示する。ＲＢＺとは、ラニビズマブなどの抗ＶＥＧＦによる標準的なケアである。「ＲＢＺ救済」は、救済処置を意味する。
【図１４】図１４は、患者の眼科評価を描示する。炎症は、生体顕微鏡法（ＢＥ）および間接検眼鏡法（ＩＯＥ）により査定した。Ｕｎｒｅｍ：顕徴なし。
【図１５Ａ】図１５Ａおよび図１５Ｂは、視力結果を描示する。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび図１５Ｂは、視力結果を描示する。
【図１６】図１６は、既に２４回にわたるＬｕｃｅｎｔｉｓ注射を施された患者の網膜厚の測定を描示する。
【図１７】図１７は、生体内分布：ｓＦＬＴ−１配列についてのｑＰＣＲ（検出されたコピー数）を描示する。
【図１８】図１８は、生体内分布：ＥＬＩＳＡ、１ｍＬ当たりのカプシド数単位のＡＡＶ力価により測定されるＡＡＶカプシドを描示する。
【図１９】図１９は、ＥＬＩＳＡにより測定されるｓＦＬＴ−１の生体内分布を描示する。ヒトｓＦＬＴ−１濃度（ｐｇ／ｍＬ）が示される。
【図２０Ａ】図２０Ａおよび図２０Ｂは、低用量のｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４）または高用量のｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１（Ｒ５、Ｒ６、およびＲ８）を投与された患者のＯＣＴ評価を描示する。
【図２０Ｂ】図２０Ａおよび図２０Ｂは、低用量のｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４）または高用量のｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１（Ｒ５、Ｒ６、およびＲ８）を投与された患者のＯＣＴ評価を描示する。
【図２１Ａ】図２１Ａおよび図２１Ｂは、処置の１８０日後における、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１で処置されたヒト対象の視力結果を、処置されていない対照の患者の視力結果と対比して描示する。
【図２１Ｂ】図２１Ａおよび図２１Ｂは、処置の１８０日後における、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１で処置されたヒト対象の視力結果を、処置されていない対照の患者の視力結果と対比して描示する。
【図２２Ａ】図２２Ａおよび図２２Ｂは、処置の１年後における、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１で処置されたヒト対象の視力結果を、処置されていない対照の患者の視力結果と対比して描示する。
【図２２Ｂ】図２２Ａおよび図２２Ｂは、処置の１年後における、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１で処置されたヒト対象の視力結果を、処置されていない対照の患者の視力結果と対比して描示する。
【図２３】図２３は、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１についての臨床研究における、Ｌｕｃｅｎｔｉｓの救済注射（ＶＥＧＦ阻害剤の再投与）を施されたヒト対象についての表を週ごとに描示する。
【図２４】図２４は、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１についての臨床研究における、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１で処置されたヒト対象についての視力およびＳＤ−ＯＣＴ画像を週ごとに描示する。
【図２５Ａ】図２５Ａおよび図２５Ｂは、ＥＬＩＳＡにより検出される、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞内のヒトｓＦｌｔ−１タンパク質の産生についてのデータを描示する。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１は、ＨＥＫ２９３細胞内のプラスミドによるトランスフェクションを使用して産生させた。第２の構築物であるｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１は、Ｓｆ９昆虫細胞内の組換えバキュロウイルスを使用して産生させた。ｓＦｌｔ−１タンパク質濃度は、多様なＭＯＩで、７２時間後におけるＥＬＩＳＡにより測定した。
【図２５Ｂ】図２５Ａおよび図２５Ｂは、ＥＬＩＳＡにより検出される、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞内のヒトｓＦｌｔ−１タンパク質の産生についてのデータを描示する。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１は、ＨＥＫ２９３細胞内のプラスミドによるトランスフェクションを使用して産生させた。第２の構築物であるｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１は、Ｓｆ９昆虫細胞内の組換えバキュロウイルスを使用して産生させた。ｓＦｌｔ−１タンパク質濃度は、多様なＭＯＩで、７２時間後におけるＥＬＩＳＡにより測定した。
【発明を実施するための形態】
【０１２１】
本開示は、可溶性Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ｓＦｌｔ−１）タンパク質をコードする核酸を含む、薬学的有効量のベクターを含む医薬組成物を、ヒト対象へと網膜下投与することにより、ヒト対象における、ＡＭＤなどの眼の血管新生の防止または処置のための組成物および方法を提供する。
【０１２２】
以下では、例示のための実施例の適用を参照しながら、本開示のいくつかの態様について記載する。本開示の十分な理解をもたらすために、多数の具体的な詳細、関連性、および方法を示すことを理解されたい。しかし、当業者は、本開示を、具体的な詳細のうちの１または複数を伴わずに実施することもでき、他の方法により実施することもできることをたやすく認識するであろう。一部の行為は、異なる順序で、かつ／または他の行為または事象と共時的に生じる可能性があるので、本開示は、行為または事象の例示される順序づけにより限定されない。さらに、全ての例示される行為または事象が、本開示に従い、方法を実装するように要求されるわけでもない。
【０１２３】
本開示の用語法は、特定の場合について記載することだけを目的とするものであり、本開示の方法および組成物を限定することを意図するものではない。
【０１２４】
別段に指し示されない限り、本明細書で記載される、本開示の組成物および方法は、当業者の技術の範囲内にある、分子生物学（組換え技法を含む）、細胞生物学、生化学、免疫化学、および眼科法の従来の技法および記載を援用しうる。このような従来の技法は、網膜、または対象における視覚を観察および解析するための方法、組換えウイルスのクローニングおよび繁殖、医薬組成物の製剤化、ならびに生化学的精製および免疫化学を含む。適切な技法の具体的な例示は、本明細書の実施例を参照することにより与えられる。しかし、当然ながら、同等な従来の手順もまた、使用することができる。このような従来の技法および記載は、それらの全てが、全ての目的で、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Greenら編、「Genome  Analysis:  A  Laboratory  Manual  Series」（Ｉ〜ＩＶ巻）（１９９９年）;  Weinerら編、「Genetic  Variation:  A  Laboratory  Manual」（２００７年）;  Dieffenbach、Dveksler編、「PCR  Primer:  A  Laboratory  Manual」（２００３年）;  BowtellおよびSambrook、「DNA  Microarrays:  A  Molecular  Cloning  Manual」（２００３年）;  Mount、「Bioinformatics:  Sequence  and  Genome  Analysis」（２００４年）;  SambrookおよびRussell、「Condensed  Protocols  from  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual」（２００６年）；ならびにSambrookおよびRussell、「Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual」（２００２年）（全て、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Pressによる）;  Stryer,  L.、「Biochemistry」（４版）、W.H.  Freeman、N.Y.（１９９５年）;  Gait、「Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach」、IRL  Press、London（１９８４年）;  NelsonおよびCox、「Lehninger,  Principles  of  Biochemistry」、３版、W.H.  Freeman  Pub.、New  York（２０００年）；およびBergら、「Biochemistry」、５版、W.H.  Freeman  Pub.、New  York（２００２年）などの標準的な実験室マニュアルにおいて見出す
ことができる。本組成物、本研究ツール、および本方法について記載する前に、本開示は、記載される具体的な方法、組成物、目標、および使用は、当然ながら、変化しうるので、これらに限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語法は、特定の態様だけについて記載することを目的とするものであり、付属の特許請求の範囲だけにより限定される本開示の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【０１２５】
本明細書で使用される単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、文脈によりそうでないことが別段に指し示されない限りにおいて、複数形もまた含むことを意図する。さらに「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｓ）」、「〜を伴う」という用語、またはこれらの変化形が、詳細な記載および／または特許請求の範囲において使用される程度において、このような用語は「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様の様式で包含的であることを意図する。
【０１２６】
本明細書では、範囲を「約」１つの特定の値から、かつ／または「約」別の特定の値までとして表す場合がある。このような範囲を表すとき、別の場合は、１つの特定の値から、かつ／または他の特定の値までを含む。同様に、前置される「約」を使用することにより値を概数として表すときも、特定の値は、別の場合をなすことが理解されるであろう。範囲の各々の端点は、他の端点との関連で、かつ、他の端点とは独立に有意であることもさらに理解されるであろう。本明細書で使用される「約」という用語は、特定の用法の文脈内では、言明された数値に１５％を加えるかまたは言明された数値から１５％を減じた範囲を指す。例えば、約１０ならば、８．５〜１１．５の範囲を含むであろう。「約」という用語はまた、値の測定における典型的な誤差または不正確も表す。
【０１２７】
Ｉ．ＡＭＤ
ＡＭＤとは、５０歳を超える患者における失明の主要な原因であり、黄斑における光受容体、網膜の外側、および網膜色素上皮の進行性の変性を特徴とする。ＡＭＤの末期「滲出」形態（新生血管形態または滲出性形態）は、それほど一般的ではないが、患者における、急速で、かつ、実質的であることが多い、中心視覚の喪失を高頻度で引き起こしうる。ＡＭＤの滲出形態では、脈絡膜血管新生が形成され、網膜色素上皮下および網膜色素上皮内で成長しうる血管のネットワークへと発達する。これは、血漿の漏出および／または網膜下腔への出血を伴うので、これが黄斑内で生じれば、重度で突発的な中心視覚の喪失が見られる場合もあろう。
【０１２８】
別段に指定されない限り「ＡＭＤ」という用語は、萎縮型ＡＭＤの場合もあり、滲出型ＡＭＤの場合もある。本開示は、ＡＭＤ、滲出型ＡＭＤ、および／または萎縮型ＡＭＤの処置または防止を想定する。
【０１２９】
当技術分野では既に公知の通り、ＡＭＤは、単一の原因を有さないことが示されている。この高度に複雑な疾患は、年齢、遺伝的素因、および環境、またはこれらの組合せを含むがこれらに限定されない、様々な寄与から生じうる。例えば、ヒトでは、確立された疫学的危険性因子は、喫煙、食餌、女性、白色人種、およびＡＭＤの家族歴を含みうるがこれらに限定されない。ＡＭＤは、５０歳より若齢の個体ではまれであるため、唯一の不可避的な危険性因子は、ＡＭＤの発症機序において正常な老化に随伴する多数の細胞変化を関与させる年齢である。
【０１３０】
ＡＭＤの病因的複雑性は、有効な療法、予防戦略、およびそれを研究するための好適な動物モデルの相対的貧弱さに反映されている。疾患の複雑性および不完全な特徴付けに起因して、ＡＭＤの動物におけるモデル化は不完全である。これは、動物の網膜と霊長動物の網膜とにおける解剖学的差異に部分的に起因するほか、疾患が発症するのに長期にわたる時間が必要とされることにも起因する。ヒトによる分子的遺伝的研究および動物研究からの証拠は、正常な光受容体−ＲＰＥ生理学の一因となる多数の機構のホメオスタシスの変化が、疾患を誘発しうるという考えを裏付ける。少なくとも分子レベルでは、疾患を動物モデルにおいて探索することができ、場合によっては、その遺伝子欠損がヒトにおけるＡＭＤの主要な原因ではない患者においてもなお探索することができる。
【０１３１】
かつての遺伝的研究ならびに綿密な病理学的解析は、多様なＡＭＤ動物モデルには、ＡＭＤについての単純な遺伝パターンは一般的でなく、１つの病理も一般的でないことを明らかにしている。当技術分野では、非ヒト霊長動物モデルが、ヒトにおけるＣＮＶを、マウスモデルまたはラットモデルより良好に近似することが公知であるが、非ヒト霊長動物の網膜の解剖学、組織学における根本的な差異は、異なる種特異的病態をもたらし、遺伝学における根本的な差異もなお、異なる種特異的病態をもたらしている。
【０１３２】
さらに、そして、本明細書で記載される通り、レーザー光凝固を使用して、動物モデルにおける１つのＡＭＤ様症状であるＣＮＶを誘導することができる。場合によって、レーザー処置は、ブルッフ膜を破断させ、脈絡膜に由来する線維血管性の増殖性応答を惹起する。この応答は、後期ＡＭＤにおける脈絡膜血管新生をモデル化するための基盤であり、アカゲザルおよびカニクイザルにおいて開発された。
【０１３３】
アルゴンレーザーを使用して、スポットを微小に保ち、ブルッフ膜を破断させるのに十分な出力で誘導する。これは、眼底鏡では、光凝固の時点においてバブルとして目視可能である。光凝固は、脈絡膜血管の血栓形成に続き、４８時間後における再内皮化、および１週間後までの網膜下腔への新たな血管の成長を誘導する。新たに形成された血管は透過可能性が大きいため、新生血管の発生は、蛍光眼底血管造影法でモニタリングして、血管漏出を評価することができる。
【０１３４】
新生血管の自然退縮（フルオレセイン漏出の減少により指し示される）は、約３〜７週間後に始まり、次いで、漏出がその部位にもはや現れなくなるまで、徐々に進行する（約２〜１３カ月にわたり）。
【０１３５】
血管化が低度な瘢痕化と比較した新たな血管成長の程度は、全てのモデルにおいて可変的な場合があり、種、網膜内の損傷の位置、およびレーザービームの強度の影響を受ける。種間の処置の差異に固有の可変性は、１つの動物モデルがヒトにおけるＡＭＤを十分に捉えることはないという考えをさらに裏付ける。
【０１３６】
ＡＭＤのための療法は、タンパク質のＶＥＧＦに結合するアプタマー、抗体、および可溶性受容体デコイの利用可能性と共に過去数年間で変化してきた。ＶＥＧＦタンパク質またはＶＥＧＦリガンドは、ＶＥＧＦ受容体を含む細胞内受容体への結合を介して、新たな血管の形成（すなわち、血管形成）を刺激することが示されている。当技術分野で公知の通り、抗ＶＥＧＦ剤は、滲出型ＡＭＤにおいて生じる血管新生および血管形成をある程度防止しうる。Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）またはＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）またはＥｙｌｅａ（登録商標）（抗ＶＥＧＦ剤）の眼内注射は高価であり、大半の症例において、Ｅｙｌｅａ（登録商標）の場合は、４〜６週間ごとまたは８週間ごとに処置を反復しなければならない。例えば、Ｌｕｃｅｎｔｉｓは、毎月注射１回当たり約１９５０ドルの費用がかかるＶＥＧＦ抗体断片である。Ａｖａｓｔｉｎ（ＶＥＧＦ抗体）は、未承認で使用されており、Ｅｙｌｅａ（ＶＥＧＦトラップ）は、注射１回当たり約１８５０ドルの費用がかかり、２カ月ごとに投与する。これらの医薬の全ては、薬物動態プロファイルの低下という一般的問題を共有し、したがって、眼注射の反復を要求する。
【０１３７】
当技術分野では、実践的で、経済的に実現可能で、長期持続的な処置戦略が必要とされている。本開示は、これらの必要のうちのいくつかに取り組む新規の治療剤を提供する。
【０１３８】
本開示は、任意の適切なベクター（例えば、組換えウイルス系）により、ＡＭＤまたは類縁の新生血管性網膜疾患を有するか、またはこれを有することが疑われるヒト対象の網膜へと送達される、ｓＦＬＴ−１などの抗ＶＥＧＦ分子を提供する。場合によって、ｓＦＬＴ−１は、ＶＥＧＦの強力で直接的な結合性タンパク質でありうる。場合によって、ｓＦＬＴ−１はまた、ＶＥＧＦ活性を遮断または阻害することも可能である。
【０１３９】
例えば、当技術分野で公知のｓＦＬＴ−１（本明細書でさらに記載される）は、ＶＥＧＦタンパク質の二量体に、Ｋｄ＝１０ｐＭで結合することが観察されている。
【０１４０】
本発明はまた、ｒＡＡＶに媒介された眼への遺伝子送達に関する組成物および方法も提供する。ＡＡＶベースの系については、イヌの眼（＞８歳）における長期にわたる遺伝子発現が観察されている。網膜内のｓＦＬＴ−１  ｍＲＮＡ発現は、少なくとも１８カ月間にわたり維持されている。レーバー先天性黒内障についての３つのヒト試験が行われ、これらにより、ＬＣＡなどの網膜変性疾患の文脈におけるＡＡＶベースの送達系の安全性が裏付けられた。
【０１４１】
ＩＩ．ＶＥＧＦおよびＦｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ｓＦＬＴ−１）タンパク質
Ａ．ＶＥＧＦ
血管内皮成長因子（本明細書では「ＶＥＧＦ」または「ＶＥＧＦリガンド」と称する）とは、生理学的血管形成において鍵となる役割を果たす強力な内皮細胞特異的マイトジェンである。場合によって、ＶＥＧＦ活性は、ＶＥＧＦリガンドの、細胞内の１または複数のＶＥＧＦ受容体への結合から生じる。ＶＥＧＦリガンドの、ＶＥＧＦ受容体への結合は、下流における多数の細胞効果および生化学的効果であって、組織内の血管形成を含むがこれらに限定されない細胞効果および生化学的効果を及ぼしうる。ＶＥＧＦは、がん、虚血症、および炎症と関連する障害を含む、事実上あらゆる種類の血管形成性障害または新生血管性障害に関与している。加えて、ＶＥＧＦは、虚血性網膜症、眼内血管新生、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、滲出型ＡＭＤ、萎縮型ＡＭＤ、網膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血症、糖尿病性網膜浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症を含むがこれらに限定されない眼疾患にも関与している。さらに、本明細書で記載される、本開示の組成物および方法を含む抗ＶＥＧＦ処置は、本明細書で記載されるこれらの疾患のうちの１または複数の処置において使用することができる。
【０１４２】
近年のデータは、ＶＥＧＦが、ＡＭＤの滲出形態の発症機序における主要な血管形成性成長因子であることを示唆する。
【０１４３】
４６ｋＤａのホモ二量体の糖ペプチドであるＶＥＧＦは、色素上皮細胞、周皮細胞、血管内皮細胞、神経膠細胞、および神経節細胞を含むがこれらに限定されない、複数の異なる眼細胞型が発現させる。場合によって、ＶＥＧＦは、網膜の発生時に、特殊な空間的パターンおよび時間的パターンで発現する。場合によって、ＶＥＧＦのヒトアイソフォームは、単量体１つ当たり２０６、１８９、１８３、１６５、１４８、１４５、および１２１アミノ酸のタンパク質を含みうるが、主要なヒトＶＥＧＦアイソフォームは、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、およびＶＥＧＦ２０６を含むがこれらに限定されない。これらのタンパク質は、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの代替的なスプライシングにより産生され、ヘパリンおよび特異的なＶＥＧＦ受容体またはＶＥＧＦ共受容体（ニューロピリン）に結合するそれらの能力が異なる。ＶＥＧＦ遺伝子のエクソン１〜５によりコードされるドメインは、公知のＶＥＧＦ受容体であるＫＤＲ／ＦＬＫ−１およびＦＬＴ−１の認識に要求される情報を含有する。このドメインは、全てのＶＥＧＦアイソフォームに存在する。ＶＥＧＦは、高アフィニティーの受容体チロシンキナーゼであるこれらの受容体を介して作用し、内皮細胞増殖、遊走、および血管透過性の増大をもたらす。
【０１４４】
ＶＥＧＦは、血管形成の複雑な過程に関与する複数の因子のうちの１つであり、血管内皮細胞に対して極めて高い特異性を有する。ＶＥＧＦは、胚形成、骨格成長、および生殖機能などの過程における生理学的血管形成の調節因子であるが、また、がん、胎盤障害、および他の状態などの疾患と関連する病理学的血管形成にも関与している。ＶＥＧＦの潜在的な生物学的効果は、特異的なｆｍｓ様膜貫通受容体であるＦＬＴ−１およびＦＬＫ−１／ＫＤＲにより媒介されうる。場合によって、これらの自然発生のＶＥＧＦの結合パートナーは、ＶＥＧＦの、ＶＥＧＦ受容体への結合に影響を及ぼし、これにより、ＶＥＧＦ受容体および後続の下流における経路の活性化をモジュレートすることが可能である。
【０１４５】
がんとの関連では、ＶＥＧＦに対するヒト化モノクローナル抗体（ｒｈｕＭａｂ  ＶＥＧＦ）を含む複数のＶＥＧＦ阻害剤、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体、ＶＥＧＦＲ−２によるシグナル伝達を阻害する低分子、および可溶性ＶＥＧＦ受容体は、ある程度の治療特性を示している。
【０１４６】
糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、または加齢黄斑変性など、眼内血管新生性疾患との関連では、いくつかのＶＥＧＦアンタゴニストは、高頻度の投与に対する必要にもかかわらず、治療効果を示している。
【０１４７】
Ｂ．抗ＶＥＧＦ
本開示の組換えウイルスは、米国特許第５，７１２，３８０号、同第５，８６１，４８４号、および同第７，０７１，１５９号において開示されている、ＶＥＧＦ結合性タンパク質またはそれらの機能的断片、ならびに米国特許第７，６３５，４７４号において開示されている、ＶＥＧＦ結合性融合タンパク質を含むがこれらに限定されない、抗ＶＥＧＦタンパク質をコードする配列を含む。抗ＶＥＧＦタンパク質はまた、本明細書で記載されるｓＦＬＴ−１タンパク質も含みうる。
【０１４８】
本開示の組換えウイルスまたはプラスミドは、米国特許第５，８６１，４８４号において記載されている、自然発生のタンパク質であるｓＦｌｔ−１、および配列番号１０９により記載されている配列を含む、抗ＶＥＧＦタンパク質をコードする配列を含みうる。本開示の組換えウイルスまたはプラスミドはまた、ｓＦｌｔ−１のドメイン２の配列または配列番号１２１に示される配列のほか、米国特許第７，６３５，４７４号において開示されている、ＶＥＧＦ結合性融合タンパク質などの類縁の構築物を含む、その機能的断片も含むがこれらに限定されない。抗ＶＥＧＦタンパク質はまた、本明細書で記載されるｓＦＬＴ−１タンパク質も含みうる。これらの配列は、遺伝子コード、当業者により理解されている標準的な技法を使用して、このような配列をコードするＤＮＡから発現させることができる。当業者により察知されうる通り、遺伝子コードの縮重性のために、抗ＶＥＧＦタンパク質配列は、いくつかの異なるＤＮＡ配列からたやすく発現させることができる。
【０１４９】
本明細書では「ｓＦｌｔ−１タンパク質」とは、ｓＦｌｔ−１タンパク質またはｓＦｌｔ−１ポリペプチドが、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦ受容体に結合するように、自然発生のヒトｓＦＬＴ−１配列に対する少なくとも９０％以上の相同性を伴うポリペプチド配列、またはその機能的断片を指す。相同性とは、２つの配列の間のアライメントの残基の保存％を指す。自然発生のヒトｓＦＬＴ−１タンパク質は、機能的断片、挿入、欠失、置換、偽断片、偽遺伝子、スプライス変異体、または人工最適化配列を含む配列を含むがこれらに限定されない、ｓＦＬＴ−１の任意の適切な変異体を含みうる。場合によって「ｓＦＬＴ−１タンパク質」は、自然発生のヒトｓＦＬＴ−１タンパク質配列に対して、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、または１００％相同でありうる。場合によって「ｓＦＬＴ−１タンパク質」は、自然発生のヒトｓＦＬＴ−１タンパク質配列に対して、最大で約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、または１００％空間的に相同でありうる。場合によって「ｓＦＬＴ−１タンパク質」は、自然発生のヒトｓＦＬＴ−１タンパク質のコンフォメーションに対して、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、または１００％相同でありうる。場合によって「ｓＦＬＴ−１タンパク質」は、自然発生のヒトｓＦＬＴ−１タンパク質のコンフォメーションに対して、最大で約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、または１００％空間的に相同でありうる。
【０１５０】
さらに、ＶＥＧＦ受容体ＦＬＴ−１の可溶性切断形態であるｓＦＬＴ−１は、ＶＥＧＦの唯一の公知の内因性の特異的阻害剤である。天然では、ｓＦＬＴ−１は、代替的なｍＲＮＡスプライシングにより生成し、膜近位免疫グロブリン様ドメイン、膜貫通領域、および細胞内チロシンキナーゼドメインを欠く。構造的に、ＦＬＴ−１タンパク質およびｓＦＬＴ−１タンパク質はいずれも、複数の機能的ドメインを含みうる。いくつかの変異体では、ＦＬＴタンパク質およびｓＦＬＴタンパク質は一般に、６つの連結ドメイン；タンパク質の二量体化に関与する３つのドメイン；およびＶＥＧＦなどのリガンドの結合に関与する３つのドメインを共有する。
【０１５１】
ｓＦＬＴ−１は、ＦＬＴ−１の可溶性切断形態であり、内因的に発現する。本明細書で記載される「可溶性」ＦＬＴ−１またはｓＦＬＴ−１とは、細胞膜に限局されないＦＬＴ−１を指す。非結合のｓＦＬＴ−１は、細胞外腔内または溶液中に遊離して拡散しうる。
【０１５２】
ｓＦＬＴ−１は、ＶＥＧＦの唯一の公知の内因性の特異的阻害剤である。この相互作用は、特異的であり、１００倍過剰の非標識ＶＥＧＦと競合しうる。場合によって、ｓＦＬＴ−１の血管新生抑制活性は、２つの機構：ｉ）それが高アフィニティーで結合するＶＥＧＦの隔離、およびｉｉ）ＶＥＧＦ受容体であるＦＬＴｔ−１およびＦＬＫ−１／ＫＤＲの膜貫通アイソフォームとの、不活性のヘテロ二量体の形成によるＶＥＧＦの阻害から生じうる。当技術分野で公知の通り、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイは、ｓＦＬＴ−１がＶＥＧＦに高アフィニティーで結合し、また、ヒト臍帯血管内皮細胞の、ＶＥＧＦに駆動される増殖も阻害することを指し示している。がんについての動物モデルでは、ｓＦＬＴ−１は、腫瘍の成長を阻害する。場合によって、細胞外腔内の過剰なＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ受容体に結合し、その後これを活性化することを阻止されうるので、ｓＦＬＴ−１は、化学量論未満の様式またはドミナントネガティブの様式で機能しうる。ｓＦＬＴ−１のこれらの特性は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、KendallおよびThomas、１９９３年、Proc  Natl  Acad  Sci.、９０巻：１０７０５〜１０７０９頁において
記載されている。当技術分野で公知の通り、ｓＦＬＴ−１の機能的断片は、全長タンパク質の代わりに使用することができる。より具体的には、ＶＥＧＦ結合性ドメイン（ドメイン２）、または代替的に、ｓＦＬＴ−１のドメイン２に加えて、ｓＦＬＴ１、ＫＤＲ、または別のファミリーメンバーに由来するドメイン３を使用して、ＶＥＧＦに結合させ、これを不活化することができる。このような機能的断片は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Wiesmannら、１９９７年、Cell、９１巻：６９５〜７０４頁において記載されている。「ｓＦＬＴ−１」および「ｓＦＬＴ−１の機能的断片」という用語は、同義であり、本明細書では互換的に使用される。
【０１５３】
ＩＩＩ．ベクターおよび組換えウイルス
本開示の組成物および方法は、抗ＶＥＧＦ（例えば、ｓＦＬＴ−１タンパク質）をコードする核酸の、それを必要とするヒト対象または患者における細胞への送達を提供する。場合によって、核酸の送達は、遺伝子治療と称する場合がある。
【０１５４】
本開示の組成物および方法は、抗ＶＥＧＦ核酸（例えば、ｓＦＬＴ−１）を送達するための任意の適切な方法を提供する。場合によって、核酸の送達は、任意の適切な「ベクター」（場合によって、「遺伝子送達」または「遺伝子移入ビヒクル」ともまた称する）を使用して実施することもできる。ベクター、送達ビヒクル、遺伝子送達ビヒクル、または遺伝子移入ビヒクルは、標的細胞へと送達されるポリヌクレオチドを含む任意の適切な高分子または分子の複合体を指す場合がある。場合によって、標的細胞は、核酸または遺伝子が送達される任意の細胞でありうる。送達されるポリヌクレオチドは、ｓＦＬＴ−１遺伝子など、遺伝子治療における対象のコード配列を含みうる。
【０１５５】
例えば、適切なベクターは、ポリヌクレオチドの標的細胞への送達を媒介することが可能な、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、およびレトロウイルスなどのウイルスベクター、リポソーム、他の脂質含有複合体、および他の高分子複合体を含みうるがこれらに限定されない。
【０１５６】
場合によって、ベクターは、有機分子の場合もあり、無機分子の場合もある。場合によって、ベクターは、低分子（すなわち、＜５ｋＤ）の場合もあり、高分子（すなわち＞５ｋＤ）の場合もある。例えば、ベクターは、不活性の分子、金属粒子などの生物学的不活性分子を含みうるがこれらに限定されない。場合によって、ベクターは、金粒子でありうる。
【０１５７】
場合によって、ベクターは、生物学的活性分子を含みうる。例えば、ベクターは、デンドリマーなどの重合化させた高分子を含みうる。
【０１５８】
場合によって、ベクターは、１または複数の核酸を組み込む組換えウイルスベクターを含みうる。本明細書で記載される核酸とは、ポリヌクレオチドを指す場合がある。核酸とポリヌクレオチドとは、互換的に使用することができる。場合によって、核酸は、ＤＮＡを含む場合もあり、ＲＮＡを含む場合もある。場合によって、核酸は、ｓＦＬＴ−１を発現させるためのＤＮＡを含む場合もあり、ｓＦＬＴ−１を発現させるためのＲＮＡを含む場合もある。場合によって、ＲＮＡ核酸は、対象の遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ−１）の転写物、イントロン、非翻訳領域、終結配列などを含みうるがこれらに限定されない。他の場合には、ＤＮＡ核酸は、ハイブリッドプロモーター遺伝子配列、強い構成的プロモーター配列、対象の遺伝子（例えば、ｓＦＬＴ−１）、非翻訳領域、終結配列などの配列を含みうるがこれらに限定されない。場合によって、ＤＮＡとＲＮＡとの組合せも、使用することができる。
【０１５９】
本明細書の本開示で記載される「発現構築物」という用語は、遺伝子産物をコードする核酸またはポリヌクレオチドを含有する任意の種類の遺伝子構築物であって、配列をコードする核酸の一部または全部の転写が可能な遺伝子構築物を含むことを意味する。転写物は、タンパク質へと翻訳されうる。場合によって、転写物は、部分的に翻訳される場合もあり、翻訳されない場合もある。ある特定の態様では、発現は、遺伝子の転写およびｍＲＮＡの遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の態様では、発現は、対象の遺伝子をコードする核酸の転写だけを含む。
【０１６０】
一態様において、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）などの組換えウイルスを、ｓＦＬＴ−１の発現を媒介するベクターとして提供する。
【０１６１】
場合によって、本開示のウイルスベクターは、ｐｆｕ（プラーク形成単位：ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）として測定することができる。場合によって、本開示の組成物および方法の組換えウイルスまたはウイルスベクターのｐｆｕは、約１０８〜約５×１０１０ｐｆｕでありうる。場合によって、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、および５×１０１０ｐｆｕである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、最大で約１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、および５×１０１０ｐｆｕである。
【０１６２】
場合によって、本開示のウイルスベクターは、ベクターゲノムとして測定することができる。場合によって、本開示の組換えウイルスは、１×１０１０〜３×１０１２のベクターゲノムである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、１×１０９〜３×１０１３のベクターゲノムである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、１×１０８〜３×１０１４のベクターゲノムである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８のベクターゲノムである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、１×１０８〜３×１０１４のベクターゲノムである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、最大で約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８のベクターゲノムである。
【０１６３】
場合によって、本開示のウイルスベクターは、感染多重度（ＭＯＩ）を使用して測定することができる。場合によって、ＭＯＩとは、ベクターまたはウイルスゲノムの、核酸を送達しうる細胞に対する比または倍数を指す場合がある。場合によって、ＭＯＩは、１×１０６でありうる。場合によって、ＭＯＩは、１×１０５〜１×１０７でありうる。場合によって、ＭＯＩは、１×１０４〜１×１０８でありうる。場合によって、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８のＭＯＩである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、１×１０８〜３×１０１４のＭＯＩである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、最大で約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８のＭＯＩである。
【０１６４】
一部の態様では、核酸は、ウイルスを使用せずに（すなわち、非ウイルスベクターにより）送達することができ、核酸量として測定することができる。一般に、任意の適切な核酸量を、本開示の組成物および方法と共に使用することができる。場合によって、核酸は、少なくとも約１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、または５ｇでありうる。場合によって、核酸は、最大で約１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、または５ｇでありうる。
【０１６５】
一部の態様では、自己相補性ベクター（ｓｃ）を使用することができる。参照により本明細書に組み込まれる、Wu、Hum  Gene  Ther.、２００７年、１８巻（２号）：１７１〜８２頁により提供される通り、自己相補性ＡＡＶベクターを使用することにより、ウイルス性第２鎖ＤＮＡの合成に対する要求を迂回することができ、導入遺伝子タンパク質の発現速度の増大をもたらすことができる。
【０１６６】
一部の態様では、複数のＡＡＶベクターを生成して、最適な血清型、プロモーター、および導入遺伝子の選択を可能とすることができる。
【０１６７】
場合によって、ベクターは、標的化ベクター、とりわけ、がん細胞または腫瘍細胞または眼細胞などの特異的な細胞に選択的に結合する標的化ベクターでありうる。本開示における使用のためのウイルスベクターは、標的細胞に対して低毒性を呈示し、治療的有用量の抗ＶＥＧＦタンパク質の産生を細胞特異的な様式で誘導するウイルスベクターを含みうる。
【０１６８】
本開示の組成物および方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびＨＩＶベースのウイルスのうちの少なくとも１つの使用を含むがこれらに限定されない、任意の適切なウイルス性核酸送達系を提供する。好ましくは、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された強い真核細胞プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。
【０１６９】
一般に、任意の適切なウイルスベクターは、本開示の組成物および方法を伴う使用に最適化されるように操作することができる。例えば、アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するウイルスベクターを使用することができる。ヒトウイルスベクターおよび非ヒトウイルスベクターのいずれも使用することができ、組換えウイルスベクターは、ヒトにおいて複製欠損でありうるように変化させることができる。ベクターがアデノウイルスである場合、ベクターは、抗ＶＥＧＦタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを有するポリヌクレオチドを含むことが可能であり、ヒトにおいて複製欠損である。
【０１７０】
２つのウイルスベクター系の有利な特性を組み合わせるために、ハイブリッドウイルスベクターを使用して、ｓＦＬＴ−１タンパク質をコードする核酸を標的細胞または標的組織へと送達することができる。当業者には、ハイブリッドベクターを構築するための標準的な技法が周知である。このような技法は、例えば、Sambrookら、「Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual」、Cold  Spring  Harbor、N.Y.または組換えＤＮＡ技術について論じる任意の数の実験室マニュアルにおいて見出すことができる。ＡＡＶ  ＩＴＲとアデノウイルスＩＴＲとの組合せを含有するアデノウイルスカプシド内の二本鎖ＡＡＶゲノムを使用して、細胞に形質導入することができる。別の変化形では、ＡＡＶベクターを、「ガットレス」アデノウイルスベクター、「ヘルパー依存型」アデノウイルスベクター、または「高容量」アデノウイルスベクターに入れることができる。アデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドベクターは、Lieberら、J.  Virol.、７３巻：９３１４〜９３２４頁、１９９９年において論じられている。レトロウイルス／アデノウイルスハイブリッドベクターは、Zhengら、Nature  Biotechnol.、１８巻：１７６〜１８６頁、２０００年において論じられている。
【０１７１】
アデノウイルス内に含有されるレトロウイルスゲノムは、標的細胞ゲノム内に組み込み、安定的な遺伝子発現を実行することができる。
【０１７２】
複製欠損組換えアデノウイルスベクターは、公知の技法に従い産生することができる。Quantinら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８９巻：２５８１〜２５８４頁（１９９
２年）;  Stratford−Perricadetら、J.  Clin.  Invest.、９０巻：６２６〜６３０頁（１９９２年）；およびRosenfeldら、Cell、６８巻：１４３〜１５５頁（１９９２年）を
参照されたい。
【０１７３】
加えて好ましいベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質、および化学コンジュゲートを含みうるがこれらに限定されない。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスおよびＨＩＶベースのウイルスを含む。場合によって、ＨＩＶベースのウイルスベクターであって、ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子がＨＩＶゲノムに由来し、ｅｎｖ遺伝子が別のウイルスに由来する、少なくとも２つのベクターを含むウイルスベクターを使用することができる。ＤＮＡウイルスベクターを使用することができる。これらのベクターは、オルソポックスベクターまたはアビポックスベクターなどのポックスベクター、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターなどのヘルペスウイルスベクター［参照により本明細書に組み込まれる、Geller,  A.I.ら、J.  Neurochem、６４巻：４８７頁（１９９５年）;  Lim,  F.ら、「DNA  Cloning：  Mammalian  Systems」、D.  Glover編（Oxford  Univ.  Press、Oxford  England）（１９９５年）;  Geller,  A.I.ら、Proc  Natl.  Acad.  Sci.  ：  U.S.A.：９０巻、７６０３頁（１９９３年）;  Geller,  A.I.ら、Proc  Natl.  Acad.  Sci  USA、８７巻：１１４９頁（１９９０年）］、アデノウイルスベクター［参照により本明細書に組み込まれる、LeGal  LaSalleら、Science、２５９巻：９８８頁（１９９３年）;  Davidsonら、Nat.  Genet.、３巻：２１９頁（１９９３年）;  Yangら、J.  Virol.、６９巻：２００４頁（１９９５年）］、およびアデノ随伴ウイルスベクター［参照により本明細書に組み込まれる、Kaplitt,  M.G.ら、Nat.  Genet.、８巻：１４８頁（１９９４年）］を含む。
【０１７４】
本開示に従い使用しうる、他のウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベースのベクターを含む。１または複数の前初期遺伝子（ＩＥ）を欠失させたＨＳＶベクターは一般に、非細胞傷害性であり、標的細胞内の潜伏性と類似の状態で存続し、効率的な標的細胞への形質導入をもたらすために有利である。組換えＨＳＶベクターは、約３０ｋｂの異種核酸を組み込むことができる。
【０１７５】
本開示ではまた、Ｃ型レトロウイルスなどのレトロウイルスおよびレンチウイルスも使用することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、HuおよびPathak、Pharmacol.  Rev.、５２巻：４９３５１１頁、２０００年；およびFongら、Crit.  Rev.  Ther.  Drug  Carrier  Syst.、１７巻：１〜６０頁、２０００年により提供される通り、レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づきうる。ＭＬＶベースのベクターは、ウイルス遺伝子の代わりに最大で８ｋｂの異種（治療的）ＤＮＡを含有しうる。異種ＤＮＡは、組織特異的プロモーターおよび抗ＶＥＧＦタンパク質核酸を含みうる。新生物細胞への送達法では、異種ＤＮＡはまた、組織特異的な受容体へのリガンドもコードする。
【０１７６】
参照により本明細書に組み込まれる、VignaおよびNaldini、J.  Gene  Med.、５巻：３０８〜３１６頁、２０００年；ならびにMiyoshiら、J.  Virol.、７２巻：８１５０〜８
１５７頁、１９９８年により提供される通り、ヒト免疫不全（ＨＩＶ）ベースのベクターを含む複製欠損レンチウイルスベースのベクターを含むがこれらに限定されない、さらなるレトロウイルスベクターも使用することができる。レンチウイルスベクターは、活性分裂細胞および非分裂細胞のいずれにも感染することが可能な点で有利でありうる。それらははまた、ヒト上皮細胞に形質導入するときにも高度に効率的でありうる。
【０１７７】
本開示における使用のためのレンチウイルスベクターは、ヒトレンチウイルスおよび非ヒト（ＳＩＶを含む）レンチウイルスに由来しうる。レンチウイルスベクターの例は、ベクターの繁殖に要求される核酸配列のほか、抗ＶＥＧＦタンパク質遺伝子に作動可能に連結された組織特異的プロモーターも含む。核酸配列は、ウイルスＬＴＲ、プライマー結合性部位、ポリプリントラクト、ａｔｔ部位、およびカプシド形成部位を含みうる。
【０１７８】
レンチウイルスベクターは、任意の適切なレンチウイルスカプシドへとパッケージングすることができる。１つの粒子タンパク質の、異なるウイルスに由来する別の粒子タンパク質による置換を、「シュードタイピング」と称する。ベクターカプシドは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ：ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）または水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）を含む、他のウイルスに由来するウイルスエンベロープタンパク質を含有しうる。ＶＳＶ  Ｇタンパク質を使用することにより、高ベクター力価がもたらされ、ベクターウイルス粒子の安定性の増大が結果としてもたらされる。
【０１７９】
本開示ではまた、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）およびシンドビスウイルス（ＳＩＮ）から作製されたアルファウイルスベースのベクターなど、アルファウイルスベースのベクターも使用することができる。アルファウイルスの使用は、参照により本明細書に組み込まれる、Lundstrom,  K.、Intervirology、４３巻：２４７〜２５７頁、２０００年；およびPerriら、Journal  of  Virology、７４巻：９８０２〜９８０７頁、２０００年において記載されている。
【０１８０】
組換えの複製欠損アルファウイルスベクターは、高レベルの異種（治療的）遺伝子発現が可能であり、広範な標的細胞範囲に感染しうるため、有利でありうる。アルファウイルスのレプリコンは、それらのビリオン表面上に、コグネイトの結合パートナーを発現させる標的細胞への選択的結合を可能とする機能的な異種リガンドまたは結合性ドメインを提示させることにより、特異的な細胞型へと標的化することができる。アルファウイルスのレプリコンは、潜伏性を確立することが可能であり、したがって、長期にわたる標的細胞内の異種核酸の発現を確立することが可能である。レプリコンははまた、標的細胞内の一過性の異種核酸の発現も呈示しうる。
【０１８１】
ポックスウイルスベクターは、遺伝子を、細胞の細胞質へと導入しうる。アビポックスウイルスベクターは、遺伝子または核酸の短期間の発現だけを結果としてもたらしうる。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ：ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）ベクターは、本開示の組成物および方法と共に使用することができる。一部の態様では、アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスより短期間の発現（例えば、約１カ月間未満）を結果としてもたらす場合もあるがはるかに長期にわたる発現も呈示しうる。選択される特定のベクターは、標的細胞および処置される状態に依存しうる。
【０１８２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）とは、小型の非エンベロープ一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶは、非病原性ヒトパルボウイルスであり、複製のためのヘルパーウイルスであって、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびＣＭＶを含むヘルパーウイルスに依存しうる。野生型（ｗｔ）ＡＡＶへの曝露は、いかなるヒト病態とも関連しないか、またはいかなるヒト病態を引き起こすことも公知ではなく、一般的な集団内に一般的であり、通常は生後最初の１０年間にアデノウイルス感染と関連して生じる。
【０１８３】
本明細書で記載される「ＡＡＶ」とは、アデノ随伴ウイルスを指し、「ｒＡＡＶ」とは、組換えアデノ随伴ウイルスを指す。
【０１８４】
場合によって、野生型のＡＡＶは、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする。ｒｅｐ遺伝子は、ウイルスの複製に要求され、ｃａｐ遺伝子は、カプシドタンパク質の合成に要求される。代替的な翻訳開始部位とスプライシング部位とを組み合わせることにより、小型ゲノムは、４つのｒｅｐ遺伝子産物および３つのｃａｐ遺伝子産物を発現させることが可能でありうる。逆位末端配列（ゲノムを挟む１４５ｂｐのＩＴＲ）内のｒｅｐ遺伝子産物およびｒｅｐ遺伝子配列は、この過程において極めて重要でありうる。現在のところ、ＡＡＶの１１の血清型が単離されている。ＡＡＶ２は、本開示の組成物および方法と共に使用することができる。本開示の組成物および方法は、任意の適切なＡＡＶ血清型の使用を提供する。一部の態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、およびこれらのハイブリッドからなる群から選択される。
【０１８５】
一部の態様では、本開示は、切断型可溶性ＶＥＧＦ受容体１（ｓＦＬＴ−１）のヒト形態をさらに含む核酸を含む組換えウイルスであって、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１と名付けられた組換えウイルスを提供する。ベクターは、血清型２の組換え複製欠損アデノ随伴ウイルス性（ｒＡＡＶ）ベクターである。別の態様では、ベクターは、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１と名付けられた、血清型２の組換え複製欠損アデノ随伴ウイルス性（ｒＡＡＶ）ベクターである。
【０１８６】
ＡＡＶ２は、特徴付けが最もよくなされている。ｒＡＡＶ２は、多くの動物種の眼における長期にわたる導入遺伝子発現を媒介することが可能なことが示されている。ラットでは、ｒＡＡＶに媒介されたレポーター遺伝子（緑色蛍光タンパク質）は、注射の１８カ月後においてもなお存在した。サルでは、同じレポート遺伝子が、注射の１７カ月後において存在した。同様に、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を注射されたサルの眼の硝子体中でも、高ｓＦＬＴ−１タンパク質レベルが、注射の１５カ月後において存在した。
【０１８７】
ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１は、動物モデルにおいて、眼内血管新生性障害について調べられている。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１は、角膜血管新生および網膜血管新生の動物モデルにおいて、血管新生の進行を遅らせると考えられた。興味深いことに、ｒＡＡＶを媒介するｓＦｌｔ−１は、脈絡膜血管新生のサルモデル（加齢黄斑変性またはＡＭＤの滲出形態についてのモデル）において、血管新生のある程度の阻害を指し示した。本研究では、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１構築物の存在は、サルの眼において低レベルのｓＦＬＴ−１の発現を示し、サルの健全性または網膜機能には影響を及ぼさなかった。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１への全身曝露と関連するいかなる安全性問題を示唆する証拠も見られない。これらの研究におけるｒＡＡＶベクターの全体的な肯定的所見および毒性の欠如のほか、脈絡膜血管新生／ＡＭＤの哺乳動物モデルにおけるｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１による所見は、ベクターが、眼へと投与されると、好適な安全性プロファイルを示すことを裏付ける広範なデータをもたらしている。
【０１８８】
サルモデルにおいて、ＡＭＤのある種の症状を改善するｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の能力にもかかわらず、網膜内のｓＦＬＴ−１タンパク質レベルは予測外に低い。当技術分野では、構成的に活性の哺乳動物プロモーターにより駆動されるｓＦＬＴ−１の発現レベルは、多数の細胞型において高レベルのタンパク質の発現をもたらすことが示されている。理論に束縛されることなく述べると、この予測されるより低い発現レベルについては、複数の可能性が存在しうる。大型のマルチドメインタンパク質としてのｓＦＬＴ−１は、早期のタンパク質分解に対して感受性である可能性もあり、発現の反応速度が低い可能性もあり、分取が最適でない可能性もある。後者に関しては、分泌されたタンパク質としてのｓＦＬＴ−１は、細胞内で組換えにより発現すると、分泌経路に入る。ＲＰＥ細胞を含む網膜細胞では、ｓＦＬＴ−１は、タンパク質のＥＲによる分取またはゴルジ体による分取に応じて、尖端側に分泌される場合もあり、基底側方に分泌される場合もある。場合によって、最適でない分取は、分子を望ましくない基底側方膜へと分泌させ、したがって、ＶＥＧＦによるシグナル伝達およびＲＰＥ細胞層の尖端表面上の新生血管性血管形成を阻害するのに利用可能なｓＦＬＴ−１分子の濃度を低下させる場合がある。
【０１８９】
加えて、当技術分野では、この予測外に低いｓＦＬＴ−１のレベルが、ヒトにおける実際のＡＭＤ疾患の処置に対する薬物の有効性にいかなる影響を及ぼしうるのかについても知られていなかった。サルモデルにおいて高レベルとなることがまれでありながらもＡＭＤの症状を改善する有望な徴候が示されたが、ＡＭＤ疾患についてのサロゲートを供するのはＡＭＤについてのサルによる動物モデルだけである。本明細書で記載されるＡＭＤの症状は、網膜内で人為的に誘導される（レーザーを介する）。このモデルは、多様な解析に適するが、サルモデルにおける症状の処置における実際の薬物の有効性をヒトにおける疾患の処置へと外挿することは難しい。予測外なことに、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１によりもたらされる低タンパク質レベルは、ヒトにおける実験を伴わずにこれを評価することの困難をさらに増大させる。
【０１９０】
加えて、英国および米国では、ｒＡＡＶ２骨格を使用して、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ：Ｌｅｂｅｒｓ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ａｍａｕｒｏｓｉｓ）についての３つの臨床試験も行われている。ＬＣＡとは、出生時または生後最初の数カ月間に現れるまれな遺伝性眼疾患であり、眼球振とう、瞳孔反射が遅いかまたは見られないこと、および重度の視覚喪失または失明を特徴とする。現在のところ、ｒＡＡＶ２構築物の、これらの２つの試験の６例の参加者の網膜下腔への注射後における安全性問題は報告されていない。臨床試験に関与するいずれのチームも、それらの所見により、ＬＣＡ患者におけるさらなる遺伝子治療研究が支持されることを結論付けた。
【０１９１】
サルにおいて、ｓＦＬＴ−１の実質的または持続的な高レベルをもたらすことの見かけ上の技術的困難を踏まえると、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を導入した後における網膜内の、ｓＦｌｔ−１の低タンパク質レベルに伏在する技術的問題のうちの１または複数に取り組むために、多様な最適化戦略をとることができる。場合によって、本開示の組成物および方法により提供される最適化戦略を含む最適化戦略は、ｓＦｌｔ−１タンパク質配列もしくはｓＦｌｔ−１タンパク質ドメインを最適化すること、制御エレメントを導入して、網膜細胞内の発現後における適正な分取を指示すること、またはｓＦｌｔ−１タンパク質のレベルを上昇させて、これらの可能な因子のうちのいずれかを補償することを含みうる。場合によって、本開示の組成物および方法は、後者へと方向付けられた特異的な戦略であって、ヒト網膜におけるタンパク質レベルを、かつてサル研究において観察されたｓＦｌｔ−１レベルを上回って上昇させることへと方向付けられた特異的な核酸配列の組込みを伴う戦略を提供する。本明細書で記載される、多様な配列、リンカー、ＵＴＲ、イントロン、ｓＦＬＴ−１変異体、またはこれらの組合せを使用して、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１へと曝露した後における、網膜内のｓＦｌｔ−１タンパク質のタンパク質レベルを上昇させることができる。
【０１９２】
ベクターは、遺伝子送達および／もしくは遺伝子発現をさらにモジュレートするか、または標的とされる細胞に他の形で有益な特性をもたらす成分または機能性を含みうる。このような他の成分は、例えば、細胞への結合または標的化に影響を及ぼす成分（細胞型特異的結合または組織特異的結合を媒介する成分を含む）；細胞によるベクター核酸の取込みに影響を及ぼす成分；取込み後における細胞内のポリヌクレオチドの局在化に影響を及ぼす成分（核局在化を媒介する薬剤など）；およびポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす成分を含む。このような成分はまた、ベクターにより送達される核酸を取り込み、発現させる細胞を検出または選択するのに使用しうる、検出用マーカーおよび／または選択用マーカーなどのマーカーも含みうるであろう。このような成分は、ベクター（結合および取込みを媒介する成分または機能性を有する、ある種のウイルスベクターの使用など）の天然の特色としてもたらすこともでき、ベクターを、このような機能性をもたらすように修飾することもできる。
【０１９３】
選択用マーカーは、陽性の場合もあり、陰性の場合もあり、二機能性の場合もありう
る。陽性の選択用マーカーが、マーカーを保有する細胞の選択を可能とするのに対し、陰性の選択用マーカーは、マーカーを保有する細胞を、選択的に除外することを可能とする。二機能性（すなわち、陽性／陰性）マーカー（例えば、１９９２年５月２９日に公開されたLupton,  S.、ＷＯ９２／０８７９６；および１９９４年１２月８日に公開されたLupton,  S.、ＷＯ９４／２８１４３を参照されたい）を含む、様々なこのようなマーカー遺伝子について記載されている。陰性の選択用マーカーの例は、耐性遺伝子の、アンピシリンまたはカナマイシンなどの抗生剤への組入れを含みうる。このようなマーカー遺伝子は、遺伝子治療の文脈において有利でありうる、さらなる制御尺度をもたらしうる。当技術分野では、多種多様なこのようなベクターが公知であり、一般に利用可能である。
【０１９４】
場合によって、抗生剤耐性マーカーをコードする核酸は、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、または配列番号１１４などの配列を含みうるがこれらに限定されない。
【０１９５】
本開示の方法に適合的なウイルスベクターの多くでは、１または複数のプロモーターを、ベクター内に組み入れて、ベクターが複数の異種遺伝子を発現させることを可能とすることができる。さらに、ベクターは、抗ＶＥＧＦタンパク質の標的細胞からの発現を容易とするシグナルペプチドまたは他の部分をコードする配列も含みうる。
【０１９６】
遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターによる転写制御下に置くことができる。本明細書で提供される「プロモーター」とは、遺伝子の転写を開始するのに要求される適切なＤＮＡ配列を指す。「転写制御下の」という語句は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる開始および遺伝子の発現を制御する核酸との関連で適正な位置および配向性にあることを意味する。場合によって、プロモーターは、「強い」プロモーターまたは構成的に活性のプロモーターを含みうる。例えば、ＣＭＶプロモーターは、当技術分野で公知の、構成的に活性のプロモーターとして使用することができる。場合によって、ＣＭＶプロモーターは、発現を促進するためのさらなる調節エレメントを含みうる。場合によって、ＣＭＶプロモーターは、前初期ＣＭＶプロモーターを含みうる。
【０１９７】
場合によって、プロモーターは、「弱い」プロモーターまたは強いプロモーターより低レベルのｓＦＬＴ−１タンパク質をもたらす配列を指す場合もある。場合によって、プロモーターは、ｓＦＬＴ−１の選択的発現を駆動するように使用することもできる。場合によって、本明細書で記載される他の配列と組み合わせて使用されるプロモーターまたは他の調節エレメントを使用して、眼細胞内または眼組織内のｓＦＬＴ−１の選択的発現を駆動することもできる。
【０１９８】
加えて、本明細書ではまた、「プロモーター」１０４を、任意のさらなる適切な転写制御モジュールであって、ＲＮＡポリメラーゼの開始部位の近傍に存在しうる転写制御モジュールを指すのに互換的に使用することもできる。本開示の組成物および方法では、導入遺伝子１０６を発現させるために、任意の適切なプロモーターおよび転写制御モジュールを使用することができる。さらなる転写制御モジュールは、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ：ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）およびＳＶ４０初期転写単位などのエレメントを含みうるがこれらに限定されない。一般に、プロモーターは、各々が約７〜２０ｂｐのＤＮＡ、または２０〜５０００ｂｐのＤＮＡからなる不連続な機能的モジュールからなることが可能であり、転写活性化因子タンパク質または転写抑制因子タンパク質に対する１または複数の認識部位を含有しうる。本開示の組成物および方法は、任意の適切な調節配列、またはこれらの組合せを提供する。場合によって、これらの転写制御モジュール配列は、エンハンサー配列またはリプレッサー配列と称するかまたは同定することができる。
【０１９９】
各プロモーター内の少なくとも１つのモジュールは、ＲＮＡ合成の開始部位の位置を定めるように機能する。１つの例は、ＴＡＴＡボックスである。他の例は、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなど、ＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーターを含むことが可能であり、開始部位自体を占める不連続なエレメントは、開始位置を固定する一助となる。
【０２００】
さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にもまた機能的エレメントを含有しうるが、一般には、プロモーターエレメントは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置する。プロモーターエレメントの間の間隔はしばしば、エレメントを互いに対して反転させるかまたは移動させた場合にプロモーター機能が保存されるように、柔軟でありうる。ｔｋプロモーターでは、例えば、活性が減衰し始める前に、プロモーターエレメントの間の間隔を、５０ｂｐの隔たりへと増大させることができる。プロモーターに応じて、転写活性化させるのに共作動的または独立に機能するように、個別のエレメントの位置を定めることができる。
【０２０１】
本開示の組成物および方法は、標的とされる細胞内の対象の核酸配列の発現を制御するための任意の適切な配列を提供する。したがって、ヒト細胞を標的とする場合、核酸のコード領域の配列を、ヒト細胞内で発現することが可能なプロモーターに隣接し、その制御下にあるように操作することができる。一般に、このようなプロモーターは、ヒトプロモーターを含む場合もあり、ウイルスプロモーターを含む場合もあろう。
【０２０２】
本開示の多様な態様では、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター（ｉｅ−ＣＭＶ）、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、β−アクチン、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを使用して、対象のコード配列（例えば、ｓＦＬＴ−１）の高レベルの発現を得ることができる。発現レベルが所与の目的に十分であるという条件で、対象のコード配列の発現を達成することが当技術分野で周知な、他のウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターの使用もまた想定される。一部の態様では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列などの原核生物調節配列を、ベクター内に存在させることができる。他の態様では、ベクターは、このような調節配列を含まない。公知の特性を伴うプロモーターを援用することにより、トランスフェクションまたは形質転換後における、対象のタンパク質の発現のレベルおよびパターンを、最適化することができる。
【０２０３】
特異的な生理学的シグナルまたは合成についてのシグナルに応答して調節されるプロモーターの選択は、遺伝子産物の誘導性発現を可能としうる。例えば、マルチシストロニックベクターを利用するときに、１または複数の導入遺伝子の発現が、その中でベクターが産生される細胞に対して毒性である場合、導入遺伝子のうちの１または複数の発現を阻止または低減することが所望でありうる。産生細胞系に対して毒性でありうる導入遺伝子の例は、アポトーシス促進性遺伝子およびサイトカイン遺伝子である。導入遺伝子産物が毒性でありうる場合に、ウイルスベクターを産生させるための、複数の誘導的プロモーター系が利用可能である。本開示の組成物および方法は、プロモーター配列、調節配列、および導入遺伝子の任意の適切な組合せを提供する。場合によって、配列の組合せは、細胞に対する毒性を結果としてもたらさない可能性がある。場合によって、配列の組合せは、細胞に対する高い毒性を結果としてもたらす可能性もある。場合によって、配列の組合せは、細胞内で中等レベルの毒性を結果としてもたらす可能性もある。
【０２０４】
エクジソン系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ）は、導入遺伝子を発現させるための１つのこのような系である。この系は、哺乳動物細胞内の対象の遺伝子の発現の調節を可能とするようにデザインされている。エクジソン系は、導入遺伝子の基礎レベルの発現であるが、２００倍を超える誘導性を伴う発現を可能とする、緊密に調節された発現機構からなる。エクジソン系は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属のヘテロ二量体のエクジソン受容体に基づき、エクジソンまたはムリステロンＡなどの類似体が、受容体に結合すると、受容体がプロモーターを活性化させて、下流における導入遺伝子の発現をオンにし、高レベルのｍＲＮＡ転写物が得られる。この系では、ヘテロ二量体の受容体のうちの単量体のいずれもが、１つのベクターから構成的に発現するのに対し、対象の遺伝子の発現を駆動するエクジソン応答性プロモーターは、別のプラスミド上にある。この種類の系の、対象の遺伝子移入ベクターへの操作は、本開示の組成物および方法において使用することができる。次いで、対象の遺伝子と受容体の単量体とを含有するプラスミドを、産生細胞系へと共トランスフェクションすれば、潜在的に毒性の導入遺伝子を発現させずに、遺伝子移入ベクターの産生が可能となるであろう。適切な時点で、エクジソンまたはムリステロンＡにより、導入遺伝子の発現を活性化しうるであろう。
【０２０５】
一部の状況では、遺伝子治療ベクター内の導入遺伝子の発現を調節することが所望でありうる。例えば、所望の発現レベルに応じて、活性の強度を変化させる、異なるウイルスプロモーターを利用することができる。哺乳動物細胞内の、ＣＭＶ前初期遺伝子プロモーターを使用して、強い転写の活性化をもたらすことができる。低レベルの導入遺伝子の発現が所望される場合にはまた、それほど強力ではないＣＭＶプロモーターの修飾形も使用されている。造血細胞内の導入遺伝子の発現が所望される場合は、ＭＬＶまたはＭＭＴＶに由来するＬＴＲ（長末端反復：ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）などのレトロウイルスプロモーターを使用することが多い。所望の効果に応じて使用されうる他のウイルスプロモーターは、ＳＶ４０、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＨＩＶ−１  ＬＴＲおよびＨＩＶ−２  ＬＴＲ、Ｅ１Ａ領域、Ｅ２Ａ領域、またはＭＬＰ領域に由来するアデノウイルスプロモーターなどのアデノウイルスプロモーター、ＡＡＶ  ＬＴＲ、カリフラワーモザイクウイルス、ＨＳＶ−ＴＫ、およびニワトリ肉腫ウイルスを含む。
【０２０６】
一部の態様では、標的とされない組織に対する潜在的な毒性または望ましくない作用を低減するように、組織特異的プロモーターを使用して、特異的な組織内または細胞内で転写させる。例えば、ＰＳＡ、プロバシン、前立腺酸性ホスファターゼ、または前立腺特異的腺性カリクレイン（ｈＫ２）などのプロモーターを使用して、前立腺内の遺伝子発現を標的化することができる。
【０２０７】
場合によって、プロモーターまたは調節配列エレメントを使用して、眼細胞内または眼組織内の選択的発現を指示することができる。例えば、網膜色素上皮細胞などの特異的な眼細胞型内で見出されるプロモーター、配列エレメント、または調節配列は、適切な発現構築物（例えば、ＲＰＥ６５プロモーターまたはＶＭＤ２プロモーター）において使用することができる。
【０２０８】
適切なプロモーターの選択は、たやすく達成することができる。場合によって、高発現または強いプロモーターを使用することができる。適切なプロモーターの例は、７６３塩基対のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）（Davisら、Hum  Gene  Ther、４巻：１５１頁（１９９３年））およびＭＭＴプロモーターもまた、使用することができる。ある種のタンパク質は、それらの天然のプロモーターを使用して発現させることができる。エンハンサーなど、発現を増強しうる他のエレメント、またはｔａｔ遺伝子およびｔａｒエレメントなど、高レベルの発現を結果としてもたらしうる系もまた、組み入れることができる。次いで、このカセットを、ベクター、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２、または、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点を含む、他の公知のプラスミドベクターなどのプラスミドベクターへと挿入することができる。Sambrookら、「Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual」、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  press（１９８９年）を参照されたい。プロモーターは、前
出において論じられている。プラスミドベクターはまた、マーカーポリペプチドが、処置される生物の代謝に有害な影響を及ぼさないという条件で、アンピシリン耐性についてのβ−ラクタマーゼ遺伝子などの選択用マーカーも含みうる。カセットはまた、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ９５／２２６１８において開示されている系など、合成による送達系内で、核酸結合性部分へと結合させることもできる。一般に、プロモーター配列および／または任意の関連する調節配列は、少なくとも約１５０ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、４０００ｂｐ、５０００ｂｐ、または１００００ｂｐを含みうる。プロモーター配列および任意の関連する調節配列は、最大で約１５０ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、４０００ｂｐ、５０００ｂｐ、または１００００ｂｐを含みうる。
【０２０９】
一部の態様では、組換えウイルスまたはプラスミドは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、およびＭＭＴプロモーター、ＥＦ−１アルファプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、およびオプシンプロモーターから選択されるプロモーターを含む。一般に、本開示により提供されるプロモーター配列およびプロモーター／エンハンサー配列は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号３４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、および配列番号４７から選択される任意の配列を含みうるがこれらに限定されない。
【０２１０】
一部の態様では、抗生剤マーカーを、組換えウイルスを産生させるための過程において使用する。組換えウイルスを生成するときに、抗生剤耐性マーカーを使用して、陽性のトランスジェニック細胞を同定することができる。一部の態様では、抗生剤マーカーは、図８Ａおよび図８Ｂに示される配列を含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される配列など、抗生剤耐性遺伝子をコードする配列を含む。例えば、耐性を付与するマーカーは、カナマイシン、ゲンタマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、またはハイグロマイシンを含みうるがこれらに限定されない。一部の態様では、抗生剤耐性遺伝子は、カナマイシンなど、非ベータ−ラクタム抗生剤耐性遺伝子である。
【０２１１】
一部の態様では、組換えウイルスおよび／または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、本明細書で提供される複製起点配列などの複製起点配列をコードする配列を含む。複製起点配列は一般に、プラスミドを繁殖させるのに有用な配列を提供する。一般に、本開示により提供される複製起点配列は、図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄに提供される配列から選択される任意の配列を含みうるがこれらに限定されない。
【０２１２】
一部の態様では、起点配列または複製起点配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７などの配列を含みうるがこれらに限定されない。
【０２１３】
一部の態様では、組換えウイルスおよび／または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、本明細書で提供されるエンハンサーなどのエンハンサーを含む。
【０２１４】
一部の態様では、組換えウイルスおよび／または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、本明細書で提供され、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７６３５４７４号において開示されている、キメライントロンまたはイントロンなどのキメライントロンまたはイントロン１０５を含む。本明細書では、イントロンまたはキメライントロンを互換的に使用することができる。場合によって、イントロンは、転写される可能性はあるが翻訳されない任意の配列を指す場合がある。場合によって、イントロンは、転写される可能性はあるが細胞内の成熟ＲＮＡ転写物からは除去される任意の配列を指す場合がある。場合によって、イントロンは、少なくとも約１ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、４０００ｂｐ、または５０００ｂｐを含みうる。場合によって、イントロンは、少なくとも約１ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、４０００ｂｐ、または５０００ｂｐを含みうる。場合によって、イントロンは、約３００ｂｐでありうる。場合によって、イントロンは、約２００〜４００ｂｐでありうる。場合によって、キメライントロンは、約１００〜５００ｂｐでありうる。場合によって、イントロンは、約５０〜２００ｂｐでありうる。場合によって、イントロンは、無傷の自然発生のイントロンまたはキメライントロンでありうる。
【０２１５】
一部の態様では、イントロンは、配列番号４８、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、または配列番号１２０などの配列を含みうるがこれらに限定されない。
【０２１６】
一部の態様では、組換えウイルスおよび／または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、本明細書で提供されるポリＡ（ポリアデニル化）配列（例えば、ＳＶ４０ポリＡ配列）などのポリＡ（ポリアデニル化）配列１０７を含む。一般に、導入遺伝子（すなわち、ｓＦＬＴ−１）の所望の発現のための、任意の適切なポリＡ配列を使用することができる。例えば、場合によって、本開示は、ＳＶ４０ポリＡ配列またはＳＶ４０ポリＡ配列の一部を含む配列を提供する。場合によっては、ヒトゲノム配列において見出される、ヒトｓＦＬＴ−１遺伝子の下流に見出される天然のポリＡ配列（３’ＵＴＲ）を使用することができる。他の場合には、ｓＦＬＴ−１以外の遺伝子の下流に見出されるポリＡ配列を使用することができる。他の場合には、本開示は、１または複数のポリＡ配列またはポリＡ配列エレメントの組合せを含むポリＡ配列を提供する。場合によっては、ポリＡ配列を使用しない。場合によって、１または複数のポリＡ配列は、非翻訳領域（ＵＴＲ：ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）、３’ＵＴＲ、または終結配列と称する場合がある。
【０２１７】
本開示のある特定の態様では、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）または口蹄病ウイルス（ＦＭＤＶ：ｆｏｏｔ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）エレメントを使用して、多重遺伝子またはポリシストロニックのメッセージを創出することができる。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化キャップ依存型翻訳のリボソーム走査モデルを迂回し、内部部位で翻訳を始めることが可能である。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオウイルスおよび脳心筋炎ウイルス）に由来するＩＲＥＳエレメントのほか、哺乳動物メッセージに由来するＩＲＥＳも記載されている。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームへと連結することができる。各々がＩＲＥＳにより隔てられた複数のオープンリーディングフレームは、併せて転写して、ポリシストロニックのメッセージを創出することが可能である。ＩＲＥＳエレメントにより、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームにアクセス可能となりうる。単一のメッセージを転写するように、単一のプロモーター／エンハンサーを使用して、複数の遺伝子を効率的に発現させることができる。遺伝子治療の送達ベクターにおいて２つのタンパク質を共発現させるための代替的な系は、ＦＭＤＶ  ２Ａ系である。ＦＭＤＶ  ２Ａ系は、２つの遺伝子をピコルナウイルスの口蹄病ウイルスに由来する２Ａ配列をコードするヌクレオチドへ配列と連結しうる、レトロウイルスによるプラスミドベクターを援用する。転写および翻訳は、バイシストロニックのｍＲＮＡおよび２つの独立のタンパク質産物をもたらす。
【０２１８】
任意の異種オープンリーディングフレームを、ＩＲＥＳエレメントへと連結することができる。これは、独立の遺伝子によりコードされる分泌タンパク質であるマルチサブユニットタンパク質である、細胞内タンパク質または膜結合タンパク質および選択用マーカーの遺伝子を含みうる。この様式で、複数のタンパク質の発現を、単一の構築物および単一の選択用マーカーにより、細胞へと同時に操作することができる。
【０２１９】
ポリＡ配列は、１〜１０ｂｐ、１０〜２０ｂｐ、２０〜５０ｂｐ、５０〜１００ｂｐ、１００〜５００ｂｐ、５００ｂｐ〜１Ｋｂ、１Ｋｂ〜２Ｋｂ、２Ｋｂ〜３Ｋｂ、３Ｋｂ〜４Ｋｂ、４Ｋｂ〜５Ｋｂ、５Ｋｂ〜６Ｋｂ、６Ｋｂ〜７Ｋｂ、７Ｋｂ〜８Ｋｂ、８Ｋｂ〜９Ｋｂ、および９Ｋｂ〜１０Ｋｂの長さを含みうる。ポリＡ配列は、少なくとも１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１Ｋｂ、２Ｋｂ、３Ｋｂ、４Ｋｂ、５Ｋｂ、６Ｋｂ、７Ｋｂ、８Ｋｂ、９Ｋｂ、および１０Ｋｂの長さを含みうる。ポリＡ配列は、最大で１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１Ｋｂ、２Ｋｂ、３Ｋｂ、４Ｋｂ、５Ｋｂ、６Ｋｂ、７Ｋｂ、８Ｋｂ、９Ｋｂ、および１０Ｋｂの長さを含みうる。
【０２２０】
場合によって、ポリＡ配列または終結配列は、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、および配列番号５５などの配列を含みうるがこれらに限定されない。
【０２２１】
一般に、本開示により提供されるポリＡ配列は、図９Ａおよび図９Ｂに提供されるポリＡ領域１〜１０から選択される任意の配列を含みうるがこれらに限定されない。
【０２２２】
場合によって、ポリＡ配列は、細胞内の導入遺伝子のｍＲＮＡの半減期、導入遺伝子のｍＲＮＡの安定性、または転写の調節を含むがこれらに限定されない、タンパク質の発現に影響を及ぼす多様なパラメータについて最適化することができる。例えば、ポリＡ配列を変化させて、導入遺伝子のｍＲＮＡ転写物を増大させ、この結果としてタンパク質の発現を増大させることができる。場合によって、ポリＡ配列を変化させて、導入遺伝子のｍＲＮＡ転写物の半減期を短縮し、この結果としてタンパク質の発現を減少させることができる。
【０２２３】
一部の態様では、組換えウイルスおよび／または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、ヒトｓＦＬＴ−１タンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む。場合によって、組換えウイルスおよび／または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、別の抗ＶＥＧＦタンパク質またはＶＥＧＦ阻害剤をコードする核酸を含む。
【０２２４】
場合によって、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、または配列番号１２２などの配列を含みうるがこれらに限定されない。
【０２２５】
場合によって、ＶＥＧＦ阻害剤の核酸は、配列番号１０９、または配列番号１２１などのポリペプチド配列を含みうるがこれらに限定されないポリペプチド配列をコードしうる。
【０２２６】
一部の態様では、組換えウイルスおよび／または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、眼細胞内のｓＦＬＴ−１タンパク質の選択的発現を指示することが可能な調節性核酸断片を含む。場合によって、眼細胞は、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）を含みうる。
【０２２７】
一部の態様では、組換えウイルスおよび／または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、１または複数の非翻訳領域（ＵＴＲ）またはＵＴＲ配列を含みうる。一般に、導入遺伝子（すなわち、ｓＦＬＴ−１）の所望の最適な発現のために、任意の適切なＵＴＲ配列を使用することができる。例えば、場合によって、ＵＴＲ領域またはＵＴＲ配列は、天然の配列を含みうる。場合によって、ＵＴＲ配列は、ヒトゲノム配列またはその一部において見出されるヒトｓＦＬＴ−１遺伝子の上流（５’ＵＴＲ）または下流（３’ＵＴＲ）に見出される配列でありうる。他の場合には、ＵＴＲ配列は、ｓＦＬＴ−１以外の遺伝子の上流または下流に見出される非天然の配列などの非天然の配列を含む場合もあり、本明細書でさらに記載される１または複数のＵＴＲ配列エレメントの組合せをさらに含む配列含む場合もある。場合によって、５’ＵＴＲ配列だけを使用する。場合によって、３’ＵＴＲ配列だけを使用する。場合によって、ＵＴＲ配列は使用しない。
【０２２８】
ＵＴＲ配列は、１〜１０ｂｐ、１０〜２０ｂｐ、２０〜５０ｂｐ、５０〜１００ｂｐ、１００〜５００ｂｐ、５００ｂｐ〜１Ｋｂ、１Ｋｂ〜２Ｋｂ、２Ｋｂ〜３Ｋｂ、３Ｋｂ〜４Ｋｂ、４Ｋｂ〜５Ｋｂ、５Ｋｂ〜６Ｋｂ、６Ｋｂ〜７Ｋｂ、７Ｋｂ〜８Ｋｂ、８Ｋｂ〜９Ｋｂ、および９Ｋｂ〜１０Ｋｂの長さを含みうる。ＵＴＲ配列は、少なくとも１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１Ｋｂ、２Ｋｂ、３Ｋｂ、４Ｋｂ、５Ｋｂ、６Ｋｂ、７Ｋｂ、８Ｋｂ、９Ｋｂ、および１０Ｋｂの長さを含みうる。ＵＴＲ配列は、最大で１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１Ｋｂ、２Ｋｂ、３Ｋｂ、４Ｋｂ、５Ｋｂ、６Ｋｂ、７Ｋｂ、８Ｋｂ、９Ｋｂ、および１０Ｋｂの長さを含みうる。
【０２２９】
一般に、本開示により提供されるＵＴＲ配列は、配列番号９１、配列番号２、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、および配列番号１０１を含むがこれらに限定されない任意の配列を含みうるがこれらに限定されない。
【０２３０】
場合によって、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲの変化形は、所望のレベルのタンパク質の発現について最適化することができる。場合によって、３’ＵＴＲ配列は、細胞内の導入遺伝子のｍＲＮＡの半減期、導入遺伝子のｍＲＮＡの安定性もしくは二次構造、または条件的調節（例えば、翻訳をモジュレートする多様な因子の結合）を含むがこれらに限定されない、タンパク質の発現に影響を及ぼす多様なパラメータについて最適化することができる。例えば、３’ＵＴＲ配列を変化させて、導入遺伝子のｍＲＮＡ転写物の半減期を延長し、この結果としてタンパク質の発現を増大させることができる。場合によって、３’ＵＴＲ配列を変化させて、導入遺伝子のｍＲＮＡ転写物の半減期を短縮し、この結果としてタンパク質の発現を減少させることもできる。
【０２３１】
一般に、３’ＵＴＲ配列は、多様な配列エレメントを含みうる。本開示は、１または複数のポリアデニル化シグナル、リンカー配列、スペーサー配列、ＳＥＣＩＳエレメント、ＡＵに富む配列もしくはＡＲＥ配列またはｍｉＲＮＡ結合性配列もしくはＲＮＡｉ結合性配列、転写ターミネーター配列３’終結配列またはそれらの変異体および／もしくは組合せなどの配列エレメントを含みうるがこれらに限定されない、３’ＵＴＲ配列を提供する。
【０２３２】
場合によって、５’ＵＴＲ配列は、細胞内の導入遺伝子のｍＲＮＡの半減期、導入遺伝子のｍＲＮＡの安定性もしくは二次構造、または転写の調節を含むがこれらに限定されない、タンパク質の発現に影響を及ぼす多様なパラメータについて最適化することができる。例えば、５’ＵＴＲ配列を変化させて、導入遺伝子のｍＲＮＡ転写物の翻訳効率を増大させ、この結果としてタンパク質の発現を増大させることができる。場合によって、５’ＵＴＲ配列を変化させて、導入遺伝子のｍＲＮＡ転写物の翻訳効率を減少させ、この結果としてタンパク質の発現を減少させることができる。
【０２３３】
一般に、５’ＵＴＲ配列は、多様な配列エレメントを含みうる。本開示は、１または複数のリボソーム結合性部位（ＲＢＳ）、リンカー配列、スペーサー配列、調節配列、調節応答エレメント、リボスイッチ、翻訳開始を促進または阻害する配列、ｍＲＮＡ輸送のための調節配列またはそれらの変異体および／もしくは組合せなどの配列エレメントを含みうるがこれらに限定されない、５’ＵＴＲ配列を提供する。
【０２３４】
一部の態様では、組換えウイルスおよび／または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、１または複数のリンカー配列またはスペーサー配列を含みうる。本明細書で記載されるリンカー配列またはスペーサー配列は、互換的に使用することができる。一般に、リンカー配列またはスペーサー配列は、少なくとも２つの配列エレメントの間の非隣接配列を創出するのに使用される任意の適切な配列でありうる。例えば、本開示の一態様では、リンカー配列は、図１Ａに反映される通り、ＩＴＲ−１（１０８）配列、またはＩＴＲ−２（１０３）、および抗生剤耐性遺伝子配列１０６の間に挿入されて見出されうる。別の例では、リンカー配列は、ＩＴＲ配列、プロモーター配列もしくはプロモーター／エンハンサー配列、イントロン配列、導入遺伝子配列、およびポリＡ領域配列を含む、組換えウイルスまたは組換えウイルスをコードするプラスミドの任意の配列エレメントに隣接させて挿入することができる。一般に、任意の適切なリンカー配列またはスペーサー配列を使用して、非隣接配列を創出することができる。例えば、場合によっては、リンカー配列は、ランダムに生成された配列でありうる。場合によって、リンカー配列は、タンパク質の発現に有害な影響を及ぼしうる二次構造または分子内相互作用の形成を防止するように最適化された、非特異的な配列でありうる。場合によって、リンカー配列は、イントロン、調節配列、エンハンサーなどを含むがこれらに限定されない、任意のさらなる機能的配列エレメントを含みうる。リンカー配列内の機能的エレメントを、ウイルスの所望の最適な産生および／または導入遺伝子の発現のために使用することができる。場合によって、リンカー配列は、クローニング部位、先行するクローニング部位の残余部分、または他の重要でない配列であり、任意の２つの配列エレメントの間におけるこのようなリンカーの挿入は必要に応じてである。
【０２３５】
一般に、本開示により提供されるリンカー配列は、図９Ｄ、図９Ｅ、および図９Ｆに提供される配列から選択される任意の配列を含みうるがこれらに限定されない。
【０２３６】
場合によって、リンカー配列の長さは、ウイルスの所望の最適な産生および／または導入遺伝子の発現のために最適化することができる。場合によって、ウイルスゲノム内またはプラスミド内の１または複数の部位に配置される１または複数のリンカー配列の長さは、所望の最適なタンパク質の発現をもたらすように変化させることができる。例えば、リンカー配列は、本明細書で記載されるイントロンと導入遺伝子（すなわち、ｓＦＬＴ−１）との間に見出すことができる。細胞内の導入遺伝子の転写および後続の翻訳に対する効果を変化させるように、リンカー配列の長さを変化させることができる。
【０２３７】
リンカー配列は、１〜１０ｂｐ、１０〜２０ｂｐ、２０〜５０ｂｐ、５０〜１００ｂｐ、１００〜５００ｂｐ、５００ｂｐ〜１Ｋｂ、１Ｋｂ〜２Ｋｂ、２Ｋｂ〜３Ｋｂ、３Ｋｂ〜４Ｋｂ、４Ｋｂ〜５Ｋｂ、５Ｋｂ〜６Ｋｂ、６Ｋｂ〜７Ｋｂ、７Ｋｂ〜８Ｋｂ、８Ｋｂ〜９Ｋｂ、および９Ｋｂ〜１０Ｋｂの長さを含みうる。リンカー配列は、少なくとも１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１Ｋｂ、２Ｋｂ、３Ｋｂ、４Ｋｂ、５Ｋｂ、６Ｋｂ、７Ｋｂ、８Ｋｂ、９Ｋｂ、および１０Ｋｂの長さを含みうる。リンカー配列は、最大で１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１Ｋｂ、２Ｋｂ、３Ｋｂ、４Ｋｂ、５Ｋｂ、６Ｋｂ、７Ｋｂ、８Ｋｂ、９Ｋｂ、および１０Ｋｂの長さを含みうる。
【０２３８】
場合によって、リンカー配列またはスペーサー配列は、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、および配列番号９０を含みうるがこれらに限定されない。
【０２３９】
一部の態様では、組換えウイルスは、組換え遺伝子発現カセットを、ウイルスベクターのビリオンへとパッケージングするために使用される逆位末端配列（ＩＴＲ）を含む。場合によって、ＩＴＲは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する。場合によって、ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２に由来する。場合によって、ＩＴＲは、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、または配列番号５９を含みうるがこれらに限定されない。
【０２４０】
一部の態様では、組換えウイルスおよび／または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、以下：ａ）第１のＩＴＲ配列；ｂ）プロモーター配列；ｃ）イントロン配列；ｄ）第１のＵＴＲ配列；ｅ）ＶＥＧＦ阻害剤をコードする配列；ｆ）第２のＵＴＲ配列；ｇ）ポリＡ配列；およびｈ）第２のＩＴＲ配列の順序で核酸エレメントを含む。組換えウイルスおよび／または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドの一部の態様では、プロモーター配列は、プロモーター／エンハンサー配列を含む。一部の態様では、ＶＥＧＦ阻害剤をコードする配列は、ヒトｓＦＬＴ−１タンパク質またはその機能的断片をコードする配列を含む。他の態様では、組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、複製起点配列１０２をさらに含む。一部の態様では、プラスミドは、本明細書で提供される抗生剤耐性遺伝子の配列をさらに含む。
【０２４１】
一部の態様では、組換えウイルスおよび／または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、以下：ａ）第１のＩＴＲ配列；ｂ）第１のリンカー配列；ｃ）プロモーター配列；ｄ）第２のリンカー配列；ｅ）イントロン配列；ｆ）第３のリンカー配列；ｇ）第１のＵＴＲ配列；ｈ）ＶＥＧＦ阻害剤をコードする配列；  ｉ）第２のＵＴＲ配列；ｊ）第４のリンカー配列；ｋ）ポリＡ配列；ｌ）第５のリンカー配列；およびｍ）第２のＩＴＲ配列の順序で核酸エレメントを含む。組換えウイルスおよび／または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドの一部の態様では、プロモーター配列は、プロモーター／エンハンサー配列を含む。一部の態様では、ＶＥＧＦ阻害剤をコードする配列は、ヒトｓＦＬＴ−１タンパク質またはその機能的断片をコードする配列を含む。他の態様では、組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、複製起点配列をさらに含む。一部の態様では、プラスミドは、本明細書で提供される抗生剤耐性遺伝子の配列をさらに含む。
【０２４２】
ＩＶ．医薬組成物
医薬組成物とは、所望の診断結果または治療効果もしくは予防効果を達成するために、１または複数の有効成分のほか、ヒト患者への投与に適する１または複数の賦形剤、担体、安定化剤、または充填剤を含有する処方物である。保存における安定性および取扱いの簡便性のために、医薬組成物は、患者への投与の前に、生理食塩水または水で再構成しうる、凍結乾燥させた（すなわち、凍結させて乾燥させた）または真空乾燥させた粉末として製剤化することができる。代替的に、医薬組成物は、水溶液として製剤化することもできる。医薬組成物は、タンパク質性の有効成分を含有しうる。残念ながら、タンパク質は、安定化させることが極めて難しいことの結果として、製剤化し、再構成（要求される場合）するとき、および医薬組成物を含有するタンパク質を使用する前に保存するときに、タンパク質の喪失および／またはタンパク質活性の喪失をもたらす場合がある。安定性の問題は、タンパク質の変性、分解、二量体化、および／または重合化のために生じうる。アルブミンおよびゼラチンなどの多様な賦形剤が、医薬組成物中に存在するタンパク質の有効成分を安定化させようと試みて、異なる程度の成功を収めながら使用されている。加えて、アルコールなどの凍結保護剤も、凍結乾燥の凍結状態下におけるタンパク質の変性を低減するために使用されている。
【０２４３】
内用に適する医薬組成物は、滅菌水溶液または滅菌分散液および滅菌注射用溶液または滅菌注射用分散液を即席で調製するための滅菌粉末を含む。静脈内投与では、適切な担体は、生理学的生理食塩水、静菌水、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）を含む。全ての場合に、組成物は、無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流体であるものとする。組成物は、製造条件下および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護しなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒でありうる。適正な流体性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより、分散液の場合には、要求される粒子サイズを維持することにより、かつ、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ（商標））、ドデシル硫酸ナトリウム（ラウリル硫酸ナトリウム）、ラウリルジメチルアミンオキシド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ポリエトキシル化アルコール、ポリオキシエチレンソルビタン、オクトキシノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００（商標））、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミン−Ｎ−オキシド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＨＴＡＢ）、ポリオキシル１０ラウリルエーテル、Ｂｒｉｊ  ７２１（商標）、胆汁塩（デオキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム）、プルロニック酸（Ｆ−６８、Ｆ−１２７）、ポリオキシルヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標））、ノニフェノールエトキシレート（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標））、シクロデキストリン、およびエチルベンゼトニウム塩化物（Ｈｙａｍｉｎｅ（商標））などの界面活性剤を使用することにより維持することができる。微生物の作用の防止は、多様な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいであろう。内用組成物の遅延吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらすことができる。
【０２４４】
滅菌溶液は、活性化合物を、要求に応じて、適切な溶媒中に、要求される量で、上記で列挙した１つの成分または成分の組合せと共に組み込んだ後、濾過滅菌を施すことにより調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒および上記で列挙した成分に由来する、要求される他の成分を含有する滅菌ビヒクルへと組み込むことにより調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製法は、有効成分の粉末に加えた任意のさらなる所望の成分を、そのあらかじめ滅菌濾過された溶液からもたらす真空乾燥および凍結−乾燥である。
【０２４５】
一態様において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出処方物など、化合物を体内からの急速な排出に対して保護する担体と共に調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生体分解性ポリマー、生体適合性ポリマーを使用することができる。当業者には、このような処方物を調製するための方法が明らかであろう。材料はまた、購入することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス性抗原に対するモノクローナル抗体を伴う、感染細胞へと標的化されたリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，５２２，８１１号に記載される、当業者に公知の方法に従い調製することができる。
【０２４６】
経口組成物または非経口組成物を、投与の容易さおよび投与量の均一性のための単位剤形で製剤化することがとりわけ有利である。本明細書で使用される単位剤形とは、処置されるヒト対象の１回分の投与量として適する物理的に個別の単位であって、各単位が、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物であり、要求される医薬担体と会合させた活性化合物を含有する単位を指す。本開示の単位剤形の仕様は、活性化合物の固有の特徴および達成される特定の治療効果、ならびに個体を処置するためのこのような活性化合物の調合に対する、当技術分野に内在する制約により決定され、これらに直接依存する。
【０２４７】
医薬組成物は、投与のための指示書と共に、容器内、パック内、または分注器内に組み入れることができる。
【０２４８】
本開示の医薬組成物は、ヒトを含む動物へと投与されると、生物学的に活性の代謝物またはその残留物をもたらす（直接的にまたは間接的に）ことが可能な、任意の、薬学的に許容される塩、エステル、もしくはこのようなエステルの塩、または他の任意の化合物を包摂する。したがって、例えば、本開示はまた、本開示の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容される塩、このようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、ならびに他の生物学的同等物にも引き寄せられる。
【０２４９】
「プロドラッグ」という用語は、体内またはその細胞内で、内因性酵素もしくは他の化学物質の作用、および／または条件により、活性形態（すなわち、薬物）へと転換される不活性形態で調製される治療剤を指し示す。
【０２５０】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示の化合物の生理学的かつ薬学的に許容される塩：すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望ましくない毒性効果をそれに付与しない塩を指す。
【０２５１】
薬学的に許容される塩基添加塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミンなどの金属またはアミンにより形成する。カチオンとして使用される金属は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどを含む。アミンは、Ｎ−Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、およびプロカインを含む（例えば、Bergeら、「Pharmaceutical  Salts」、J.  Pharma  Sci.、１９７７年、６６巻、１１９頁を参照されたい）。前記酸性化合物の塩基添加塩は、遊離酸形態を十分量の所望の塩基と接触させて、従来の様式で塩を産生することにより調製する。遊離酸形態は、塩形態を酸と接触させ、従来の様式で遊離酸を単離することにより再生することができる。遊離酸形態は、それらのそれぞれの塩形態と、極性溶媒中の可溶性など、ある種の物理的特性において、何らかの形で異なるが、本開示で目的とする塩は、他の点では、それらのそれぞれの遊離酸と同等である。
【０２５２】
本明細書で使用される、「薬学的添加塩」は、本開示の組成物の成分のうちの１つの酸形態の薬学的に許容される塩を含む。これらは、アミンの有機酸塩または無機酸塩を含む。好ましい酸塩は、塩化物塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩、およびリン酸塩である。他の適切な薬学的に許容される塩は、当業者に周知であり、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、またはリン酸など、例えば、無機酸との塩基性塩；有機のカルボン酸、スルホン酸、スルホ酸またはホスホ酸またはＮ置換されたスルファミン酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデリン酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボン酸、ニコチン酸、またはイソニコチン酸との塩基性塩；および自然界におけるタンパク質の合成に関与する２０のアルファアミノ酸、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸などのアミノ酸との塩基性塩；ならびにまた、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸（4-methylbenzenesulfoic  acid）、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−ホスホグリセリン酸もしくは３−ホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラミン酸塩の形成を伴う）との塩基性塩、またはアスコルビン酸など、他の酸有機化合物など、様々な無機酸および有機酸の塩基性塩を含む。化合物の薬学的に許容される塩はまた、薬学的に許容されるカチオンにより調製することもできる。適切な、薬学的に許容されるカチオンは、当業者に周知であり、アルカリカチオン、アルカリ土類カチオン、アンモニウムカチオン、および四級アンモニウムカチオンを含む。炭酸塩または炭酸水素塩もまた可能である。オリゴヌクレオチドのためには、薬学的に許容される塩の好ましい例は、以下を含むがこれらに限定されない。（Ｉ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムなどのカチオン、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミドにより形成される塩；（ＩＩ）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などにより形成される酸添加塩；（ＩＩＩ）例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの有機酸により形成される塩；ならびに（ＩＶ）塩素、臭素、およびヨウ素などの元素アニオンから形成される塩。
【０２５３】
本開示の医薬組成物は、溶液、エマルジョン、およびリポソーム含有処方物を含むがこれらに限定されない。これらの組成物は、あらかじめ形成された液体、自己乳化固体、および自己乳化半固体を含むがこれらに限定されない、様々な成分から生成することができる。
【０２５４】
本開示のある種の組成物はまた、担体化合物も処方物中に組み込む。本明細書で使用される「担体化合物」または「担体」は、不活性（すなわち、それ自体では生物学的活性を保有しない）であるが、例えば、生物学的に活性の核酸を分解するかまたは循環からのその除去を促進することにより、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティーを低減するｉｎ  ｖｉｖｏ過程により、核酸としては認識される核酸またはその類似体を指す場合もある。一般に、後者の物質を過剰とする、核酸と担体化合物との共投与は、おそらくは、共通の受容体についての、担体化合物と核酸との間の競合に起因して、肝臓、腎臓または他のさらなる循環の貯留部分内に回収される核酸の量の実質的な低減を結果としてもたらしうる。例えば、肝臓組織内のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの部分的な回収は、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸、または４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’ジスルホン酸と共に共投与されると低減される場合がある（Miyaoら、Antisense  Res.  Dev.、１９９５年、５巻、１１５〜１２１頁;  Takakuraら、Antisense  &  Nucl.  Acid  Drug  Dev.、１９９６年、６巻、１７７〜１８３頁）。
【０２５５】
ベクターまたは組換えウイルス（ビリオン）は、哺乳動物患者、特に、ヒトへと投与するための医薬組成物へと組み込むことができる。ベクターまたはビリオンは、非毒性で不活性の、薬学的に許容される水性担体中、好ましくは３〜８の範囲、より好ましくは６〜８の範囲のｐＨで製剤化することができる。このような滅菌組成物は、再構成したときに許容可能なｐＨを示す水性の緩衝液中に溶解した治療用分子をコードする核酸を含有するベクターまたはビリオンを含むであろう。
【０２５６】
一部の態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、薬学的に許容される担体および／または賦形剤、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸およびアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝液、保存剤、ならびに他のタンパク質と混合した治療有効量のベクターまたはビリオンを含む。例示的なアミノ酸、ポリマー、および糖などは、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアリン酸化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、スクロース、果糖、デキストロース、マルトース、ブドウ糖、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、ラクトース、トレハロース、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン、クエン酸、酢酸、リンゲル液およびハンクス液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リシン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ならびにグリコールである。好ましくは、この処方物は、４℃で少なくとも６カ月間にわたり安定である。
【０２５７】
一部の態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水、およびGoodら（１９６６年）、Biochemistry、５巻：４６７頁により記載されている緩衝液など、当業者に公知の他の緩衝液などの緩衝液を含む。アデノウイルスベクター送達系内に含有される抗ＶＥＧＦを含む医薬組成物を溶解した緩衝液のｐＨは、６．５〜７．７５、７〜７．５、または７．２〜７．４の範囲内でありうる。処方物のｐＨは、約３．０〜約１２．０の範囲でありうる。免疫原性組成物のｐＨは、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ｐＨ単位でありうる。免疫原性組成物のｐＨは、最大で約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ｐＨ単位でありうる。
【０２５８】
一部の態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、カルボキシメチルナトリウムセルロース、ソルビトール、またはデキストランなど、懸濁液の粘度を増大させる物質を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０パーセントなど、約１〜１０パーセントの量で含む。
【０２５９】
本開示のある特定の態様は、１または複数の組換えウイルスおよび１または複数の他の化学療法剤を含有する医薬組成物を提供する。
【０２６０】
このような化学療法剤の例は、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、窒素マスタード、クロランブシル、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＩＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチン、およびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）などの抗がん薬を含むがこれらに限定されない。一般に、「The  Merck  Manual  of  Diagnosis  and  Therapy」、１５版、Berkowら編、１９８７年、Rahway,  N.J.、１２０６〜１２２８頁）を参照
されたい。
【０２６１】
非ステロイド性抗炎症薬およびコルチコステロイドを含むがこれらに限定されない抗炎症薬、ならびにを含むがこれらに限定されない抗ウイルス薬、リビビリン、ビダラビン、アシクロビル、およびガンシクロビルもまた、本開示の組成物中に組み合わせることができる（「The  Merck  Manual  of  Diagnosis  and  Therapy」、１５版、Berkowら編、１９８７年、Rahway,  N.J.、それぞれ、２４９９〜２５０６頁および４６〜４９頁）。他の非アンチセンス化学療法剤もまた、本開示の範囲内にある。２つ以上の組み合わせた化合物を、併せて使用することもでき、逐次的に使用することもできる。
【０２６２】
別の関連する態様では、本開示の組成物は、１または複数の組換えウイルス、特に、配列の異なるｓＦＬＴ−１を含有しうる。２つ以上の組み合わせたウイルスを、併せて使用することもでき、逐次的に使用することもできる。
【０２６３】
別の態様では、本開示は、約１×１０６〜約１×１０１５のウイルスゲノムを含む単位用量の医薬組成物であって、ウイルスがｓＦＬＴ−１をコードする核酸を含む単位用量の医薬組成物を提供する。
【０２６４】
場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量は、ｐｆｕ（プラーク形成単位）として測定することができる。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量のｐｆｕは、約１×１０８〜約５×１０１０ｐｆｕでありうる。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量のｐｆｕは、少なくとも約１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、および５×１０１０ｐｆｕである。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量のｐｆｕは、最大で約１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、および５×１０１０ｐｆｕである。
【０２６５】
場合によって、本開示のウイルスベクターは、ベクターゲノムとして測定することができる。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量は、１×１０１０〜３×１０１２のベクターゲノムである。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量は、１×１０９〜３×１０１３のベクターゲノムである。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量は、１×１０１０〜１×１０１１のベクターゲノムである。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量は、１×１０８〜３×１０１４のベクターゲノムである。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量は、少なくとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８のベクターゲノムである。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量は、１×１０８〜３×１０１４のベクターゲノムである。場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量は、最大で約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８のベクターゲノムである。
【０２６６】
場合によって、本開示の医薬組成物の単位用量は、感染多重度（ＭＯＩ）を使用して測定することができる。場合によって、ＭＯＩとは、ベクターまたはウイルスゲノムの、核酸を送達しうる細胞に対する比または倍数を指す場合がある。場合によって、ＭＯＩは、１×１０６でありうる。場合によって、ＭＯＩは、１×１０５〜１×１０７でありうる。場合によって、ＭＯＩは、１×１０４〜１×１０８でありうる。場合によって、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８のＭＯＩである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、１×１０８〜３×１０１４のＭＯＩである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、最大で約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８のＭＯＩである。
【０２６７】
一部の態様では、核酸は、ウイルスを使用せずに（すなわち、非ウイルスベクターにより）送達することができ、核酸量として測定することができる。一般に、任意の適切な核酸量を、本開示の組成物および方法と共に使用することができる。場合によって、核酸の量は、少なくとも約１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、または５ｇでありうる。場合によって、核酸は、最大で約１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、または５ｇでありうる。
【０２６８】
一部の態様では、医薬組成物は、約１×１０６〜約１×１０１５個の組換えウイルス、約１×１０７〜約１×１０１４個の組換えウイルス、約１×１０８〜約１×１０１３個の組換えウイルス、約１×１０９〜約３×１０１２個の組換えウイルス、または約１×１０１０〜約３×１０１２個の組換えウイルスを含む。
【０２６９】
キット
本開示に有用な組成物および試薬は、キット内にパッケージングして、本開示の適用を容易とすることができる。一部の態様では、本方法は、本開示の組換え核酸を含むキットを提供する。一部の態様では、本方法は、本開示の組換えウイルスを含むキットを提供する。指示書は、キットの添付文書上に印字された指示書、１または複数の容器上に印字された指示書のほか、コンピュータで読取り可能な保存媒体など、電子的保存媒体上で提供される、電子的に保存された指示書を含むがこれらに限定されない、任意の所望の形態でありうるであろう。また、必要に応じて、使用者が情報を組み込み、対照用量を計算することを可能とする、コンピュータで読取り可能な保存媒体上のソフトウェアパッケージも組み入れられる。
【０２７０】
別の態様では、本開示は、本明細書で提供される医薬組成物を含むキットを提供する。さらに別の態様では、本開示は、例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＲＶＯ、血管形成関連疾患、がん、自己免疫疾患、感染性疾患生物などの疾患の処置におけるキットを提供する。
【０２７１】
一態様において、キットは、（ａ）本明細書で提供される組換えウイルスおよび（ｂ）治療有効量の組換えウイルスを細胞または個体に投与するための指示書を含む。一部の態様では、キットは、組換えウイルスを投与するための、薬学的に許容される塩または溶液を含みうる。必要に応じて、キットは、表示または別個の添付文書の形態における適切な操作パラメータのための指示書もさらに含みうる。例えば、キットは、医師または実験室の技師に、ある用量の組換えウイルスを調製するための情報をもたらす標準的な指示書を有しうる。
【０２７２】
必要に応じて、キットは、患者試料を、組換えウイルスの被験量が、例えば、腫瘍の退縮と符合する治療量であるのかどうかを決定するための基準となる対照の情報と比較しうるように、基準の情報または対照の情報をさらに含みうる。必要に応じて、キットは、シリンジ、フィルターニードル、延長チューブ、カニューレ、および網膜下注射器など、投与のためのデバイスもさらに含みうるであろう。
【０２７３】
組換えウイルスは、任意の適切な手段により生成することができる。本開示の方法および組成物は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、動物細胞、または真菌細胞を含みうる、トランスジェニック細胞の使用を含む、多様な手段による組換えウイルスの生成を提供する。
【０２７４】
例えば、一部の態様では、組換えウイルスは、組換えバキュロウイルスを介する昆虫細胞のトランスフェクションにより生成することができる。場合によって、組換えバキュロウイルスは、バキュロウイルスが、ＡＡＶウイルスまたはｒＡＡＶ２ウイルスなど、他のウイルスを生成するのに必要な配列を含有しうる、中間体として生成することができる。場合によって、本開示の処置の組成物および方法に使用される組換えウイルスの生成では、１または複数のバキュロウイルスを使用することもできる。場合によって、Ｓｆ９細胞系、Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞系、またはＳｆ２１細胞系などの昆虫細胞も使用することができる。ある場合には、細胞系は、一過性の方法（すなわち、安定的に組み込まれるわけではない導入遺伝子による感染）を使用して生成することができる。他の場合には、細胞系は、安定的な細胞系（すなわち、宿主細胞ゲノムへと安定的に組み込まれた導入遺伝子による感染）の生成により生成することができる。他の態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、接着性ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３：ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ２９３）細胞を使用して製造する。代替的な態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、懸濁液に適応させたＨＥＫ２９３細胞を使用して製造する。別の態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、バキュロウイルス発現系（ＢＶＥＳ）を昆虫細胞内で使用して製造する。一部の態様では、ベクターは、ヘルペスヘルパーウイルスを使用して産生する。一部の態様では、ベクターは、プロデューサークローン法を使用して産生する。一部の態様では、ベクターは、Ａｄ−ＡＡＶを使用して産生する。
【０２７５】
一般に、任意の適切な方法は、本明細書で記載される医薬組成物における使用のための、組換えウイルスの生化学的精製において使用することができる。組換えウイルスは、細胞から直接採取することもでき、宿主細胞を取り巻く培養培地から採取することもできる。ウイルスは、ゲル濾過、濾過、クロマトグラフィー、アフィニティー精製、勾配超遠心分離、またはサイズ除外法など、多様な生化学的手段を使用して精製することができる。組換えウイルスは、医薬組成物へと製剤化する前に、任意の適切な手段を使用して、内容物（すなわち、識別）、純度、または効力（すなわち、活性）について調べることができる。方法は、イムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、またはＰＣＲ、ＨＵＶＥＣアッセイなどを含みうるがこれらに限定されない。
【０２７６】
Ｖ．処置法
別の態様では、本開示は、病理学的血管形成関連疾患を処置するための方法であって、薬学的有効量の、本明細書で提供される医薬組成物を、このような処置を必要とするヒト対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、疾患は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、滲出型ＡＭＤ、萎縮型ＡＭＤ、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、分枝性網膜静脈閉塞症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血症、虚血性網膜症、および糖尿病性網膜浮腫からなる眼の血管新生性疾患の群から選択される。
【０２７７】
場合によって、萎縮型ＡＭＤも処置することができる。場合によって、萎縮型ＡＭＤは、網膜の下方における網膜色素上皮層の萎縮、およびその後の眼の中心部における光受容体の喪失を特徴とする中心地図状萎縮と称する場合がある。本開示の組成物および方法は、ＡＭＤの任意の形態および全ての形態の処置を提供する。
【０２７８】
別の態様では、本開示は、本明細書で記載されるＡＭＤまたは眼の血管新生性疾患の予防的処置ための方法であって、薬学的有効量の、本明細書で提供される医薬組成物を、このような処置を必要とするヒト対象に投与するステップを含む方法を提供する。本開示を使用して、ＡＭＤを発症するか、またはＡＭＤの初期症状を提示する危険性がある患者を処置することができる。これは、同時的または逐次的な眼の処置を含みうる。同時的な処置とは、処置を各眼へと同時に投与するか、または両方の眼を、処置する医師または他の医療ケア提供者への、同じ来院時に処置することを意味する場合がある。患者は、ＡＭＤの症状を提示する眼の健康な対の眼においてもＡＭＤを発症する危険性が高いか、またはＡＭＤの発症に対する遺伝的素因を有する患者においてもＡＭＤを発症する危険性が高いことが記録されている。本開示は、対の眼におけるＡＭＤの防止における予防的処置として使用することができる。
【０２７９】
対の眼における眼の血管新生性疾患の進行に対する危険性の増大に伏在する機構は知られていないが、当技術分野では、この危険性の上昇について詳述する複数の研究がなされている。例えば、１１０例の対の眼についての、１つのこのような大規模研究では、９８例の眼で、進行期〜末期のＡＭＤ、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）が発症し、１５例の眼で、中心窩地図状萎縮（ＧＡ）が発症することが観察された（Ophthalmologica.、２０１１年、２２６巻（３号）：１１０〜８頁、doi:  10.1159/000329473;  Curr  Opin  Ophthalmol.、１９９８年６月、９巻（３号）：３８〜４６頁）。眼以外の特徴（年齢、性別、高
血圧症または喫煙の履歴）によっても、ベースラインにおける被験眼の眼特性（病変の組成、病変のサイズ、または視力）によっても、このコホート内の進行期〜末期のＡＭＤは予測されなかった。しかし、統計学的解析は、ドルーゼンのサイズ、限局性の色素過剰、および非中心窩地図状萎縮を含む第１の眼のＡＭＤ症状が、対の眼におけるＡＭＤの発症の危険性の評価において有意な独立の関連性を有したことを指し示している。近年の研究は、眼の特徴のうち、遺伝因子およびある種の環境因子が、対の眼においてＡＭＤを発症する危険性の増大に役割を果たしうることを指し示している（JAMA  Ophthalmol.、２０１３年４月１日、１３１巻（４号）：４４８〜５５頁、doi:  10.1001/jamaophthalmol.2013.2578）。処置されていない対の眼におけるＡＭＤの発症（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）の危険性の十分に特徴付けられた増大を踏まえると、当技術分野では、発症（ｏｎｓｅｔ）およびこの疾患に起因するその後の視覚喪失を防止するための方法が必要とされる。
【０２８０】
本明細書で使用される「対象」または「個体」または「患者」という用語は、疾患もしくは障害を有するか、または疾患もしくは障害などを有することが疑われる個体を指す。本開示では、対象、個体、または患者を互換的に使用することができ、哺乳動物および非哺乳動物を包摂しうる。哺乳動物の例は、哺乳動物のクラス：ヒト、チンパンジー、ならびに他の類人猿種およびサル種などの非ヒト霊長動物；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの農場動物；ウサギ、イヌ、およびネコなどの愛玩動物；ラット、マウス、およびモルモットなどの齧歯動物を含む実験動物などのうちの任意のメンバーを含むがこれらに限定されない。非哺乳動物の例は、鳥類、魚類などを含むがこれらに限定されない。本明細書で提供される方法および組成物の一部の態様では、哺乳動物は、ヒトである。
【０２８１】
「対象」または「個体」という用語はまた、障害または疾患を患う、２０歳以上のヒトも含む。予測外のことに、本開示は、ある範囲の患者年齢において使用することができる。これは、６５歳を超える患者においてより高頻度で現れるＡＭＤ疾患と一般に関連しない若齢の患者を含む。本開示のヒト対象またはヒト患者は、少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００歳を含みうる。本開示のヒト対象またはヒト患者は、最大で約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００歳を含みうる。
【０２８２】
一部の態様では「対象」または「個体」という用語は、その効果に対する耐性または感受性など、ペニシリンに対する応答を変化させる患者、または薬物に対するアレルギー反応の症状を示すかもしくは欠く患者を含む。
【０２８３】
Ａ．送達法
一部の態様では、医薬組成物を、任意の方向付け法を使用して、網膜下部位へと投与する。場合によって、送達法は、参照によりその全体において組み込まれる、米国特許第２０１０００８１７０号において記載されている送達法など、注射による送達法でありうる。場合によって、網膜下部位への直接的な投与は、シリンジを介する液体医薬組成物の注射を含む。別の例では、直接的な投与は、カニューレまたはベクターまたは組換えウイルスを送達するための他の適切な器具を介する注射を伴いうる。他の例では、直接的な投与は、ｓＦＬＴ−１などの導入遺伝子を送達するための適切なベクターをさらに含むインプラントを含みうる。場合によって、インプラントは、網膜内または網膜近傍に直接植え込むことができる。
【０２８４】
網膜の中心網膜領域、黄斑領域、および中心窩領域は、哺乳動物〜霊長動物の間で固有である。さらに、霊長動物とヒトとでは、解剖学およびその後のＡＭＤの発症機序において顕著に異なる差異が見られる。中心網膜とは、霊長動物の眼の血管アーケードの間の後極を取り巻く網膜の帯域であって、中心窩、黄斑、および周囲帯域を含む帯域である。黄斑は、網膜の中心の近傍にあり、直径が約１．５ｍｍである。この帯域は、杆体光受容体および錐体光受容体の両方を最高濃度で含有する。黄斑の中心には、最大濃度の錐体光受容体を含有する小窩である中心窩が存在する。網膜の黄斑領域および中心窩領域はまた、下層のＲＰＥ細胞も含有する。網膜のこれらの領域は、微細な細部に対する知覚（視力）および色彩に対する知覚の一因となる。この領域は、ヒト視覚（微細視覚）の最も重要な部分の一因となるので、ベクターの、黄斑および中心窩の網膜下腔への安全かつ有効な標的化が所望される。場合によって、本開示の医薬組成物は、中心網膜に投与する。場合によって、本開示の医薬組成物は、中心窩の外側の中心網膜に投与する。
【０２８５】
略述すると、ベクターを、黄斑および中心窩の網膜下腔へと送達するための一般的な方法は、以下の短い概略により例示することができる。この例は、方法のある種の特色を例示することだけを意図し、限定的であることを意図するものではない。
【０２８６】
一般に、ベクターは、手術用顕微鏡を使用する直接的な観察下において、眼内（網膜下）注射される懸濁液の形態で送達することができる。この手順は、硝子体切除術後において、網膜下腔への１カ所以上の微小な網膜切開部分を通す細型カニューレを使用する、ベクター懸濁液の注射を伴いうる。
【０２８７】
略述すると、注入用カニューレを適所に縫合して、手術中にわたり注入（例えば、生理食塩水を）することにより、正常な球体容量を維持することができる。適切な内径サイズ（例えば、２０〜２７ゲージ）のカニューレを使用して、生理食塩水または他の等張性溶液を、注入用カニューレから注入することにより、除去される硝子体ゲルの容量を置き換える、硝子体切除術を実施する。（１）その皮質（後部ヒアリン膜）の除去は、カニューレによる網膜の穿通を容易とし、（２）その除去および流体（例えば、生理食塩水）による置き換えは、ベクターの眼内注射に応じる空間を創出し、（３）その除去を制御することにより、網膜裂傷および意想外の網膜剥離の可能性を低減するため、硝子体切除術を実施することが有利である。
【０２８８】
一部の態様では、ベクターは、適切な内径サイズ（例えば、２７〜４５ゲージ）のカニューレを利用し、したがって、網膜下腔内にブレブを創出することにより、中心網膜内の網膜下腔へと直接注射する。他の態様では、ベクター懸濁液の網膜下注射に、微小容量（例えば、約０．１〜約０．５ｍｌ）の適切な流体（生理食塩水またはリンゲル液など）の、中心網膜内の網膜下腔への網膜下注射を先行させる。この網膜下腔への初期注射は、網膜下腔内に初期流体ブレブを確立し、初期ブレブの位置に限局的な網膜剥離を引き起こす。この初期流体ブレブは、ベクター懸濁液の、網膜下腔への標的化送達を容易とし（ベクターを送達する前に、注射面を規定することにより）、脈絡膜への可能なベクター投与および硝子体腔へのベクターの注射または還流の可能性を最小化することが可能である。一部の態様では、これらの流体を、初期流体ブレブへと、同じ内径またはさらに微小内径のカニューレにより直接投与することにより、この初期流体ブレブに、１または複数のベクター懸濁液および／または１または複数のさらなる治療剤を含む流体を、さらに注射することができる。
【０２８９】
ベクター懸濁液および／または初期小容量流体の眼内投与は、シリンジへと取り付けた微小内径のカニューレ（例えば、２７〜４５ゲージ）を使用して実施することができる。一部の態様では、このシリンジのプランジャーは、足踏みペダルを踏むことによるなど、機械化されたデバイスにより駆動することができる。微小内径のカニューレを、強膜切開を介して、硝子体腔を越えて、標的とされる網膜の帯域（中心網膜内の）に応じて、網膜内の各対象の所定の部位に送り込む。一態様において、投与は、中心窩の外側の部位へと実施する。直接可視化下で、ベクター懸濁液を、感覚神経網膜下に機械で注射し、セルフシーリング非拡大網膜切開術により限局的な網膜剥離を引き起こす。上記で言及した通り、ベクターは、網膜下腔へと直接注射し、中心網膜内にブレブを創出することもでき、ベクターは、中心網膜内の初期ブレブへと注射し、それを拡大させる（および網膜剥離帯域を拡大させる）こともできる。一部の態様では、ベクター懸濁液の注射に続いて、ブレブへの別の流体の注射を行う。
【０２９０】
理論に束縛されることを望まずに述べると、網膜下注射の速度および位置によって、黄斑、中心窩、および／または下層のＲＰＥ細胞を損傷しうる限局的なせん断力が結果としてもたらされる場合もある。網膜下注射は、せん断力を最小化または回避する速度で実施することができる。一部の態様では、ベクターは、約１５〜１７分間にわたり注射する。一部の態様では、ベクターは、約１７〜２０分間にわたり注射する。一部の態様では、ベクターは、約２０〜２２分間にわたり注射する。一部の態様では、ベクターは、約１分間にわたり、または約１〜３分間もしくは１分間未満にわたり注射する。一部の態様では、ベクターを、約３５〜約６５μｌ／分または６５μｌ／分〜約１５０μｌ／分の速度で注射する。一部の態様では、ベクターを、約３５μｌ／分の速度で注射する。一部の態様では、ベクターを、約４０μｌ／分の速度で注射する。一部の態様では、ベクターを、約４５μｌ／分の速度で注射する。一部の態様では、ベクターを、約５０μｌ／分の速度で注射する。一部の態様では、ベクターを、約５５μｌ／分の速度で注射する。一部の態様では、ベクターを、約６０μｌ／分の速度で注射する。一部の態様では、ベクターを、約６５μｌ／分の速度で注射する。一部の態様では、ベクターを、約１００μｌ／分の速度で注射する。当業者であれば、ブレブの注射の速度および回数は、例えば、中心網膜の細胞にアクセスするのに十分な網膜剥離を創出するのに必要なベクターの容量またはブレブのサイズ、ベクターを送達するのに使用されるカニューレのサイズ、および本開示のカニューレの位置を安全に維持する能力により方向付けうることを認識するであろう。
【０２９１】
１または複数の（例えば、２つ、３つ以上の）ブレブを創出することができる。一般に、本開示の方法およびシステムにより創出される１または複数のブレブの全容量は、眼の流体容量、例えば、典型的なヒト対象における約４ｍｌを超えることができない。各個別のブレブの全容量は、好ましくは約０．１〜０．２ｍｌである。当業者は、本開示の方法およびシステムに従うブレブの創出において、適切な眼内圧を維持して、眼構造への損傷を回避しなければならないことを察知するであろう。各個別のブレブのサイズは、例えば、約５０μｌ〜約１００μｌ、約５０μｌ〜約２００μｌ、約０．１〜約０．２ｍｌ、約０．１〜約０．３ｍｌ、または＞０．３ｍｌでありうる。
【０２９２】
ブレブの元の位置の縁辺部の外側における標的網膜（例えば、中心網膜）の帯域に安全かつ効率的に形質導入するために、場合によっては、ブレブを操作して、ブレブを形質導入のための標的帯域へとリポジショニングすることが所望でありうる。ブレブの操作は、ブレブの容量により創出されるブレブの依存性、ブレブを含有する眼のリポジショニング、１または複数のブレブを含有する１もしくは複数の眼を伴うヒトの頭部のリポジショニング、および／または液体−空気交換により施すことができる。中心網膜は一般に、網膜下注射による剥離に耐性であるので、ブレブの操作は特に、中心網膜に関与性である。
【０２９３】
一部の態様では、網膜下注射後において、注入用カニューレからの流体を、空気、例えば、網膜の表面上へと吹き込ませる空気で一時的に置き換える、液体−空気交換を利用する。空気の容量により、硝子体腔に由来する生理食塩水流体を移動させるとき、ブレブは、硝子体腔へと溢出せずにその場に保たれる。場合によって、眼球を適切にポジショニングすることにより、網膜下ベクターのブレブを、隣接する帯域（例えば、黄斑および／または中心窩）に関与するように操作することができる。場合によって、ブレブの質量は、液体−空気交換を使用せずになお、ブレブを重力に引き寄せさせるのに十分である。ブレブの移動は、ブレブが眼内の所望の位置へと引き寄せられることを可能とするように、ヒト対象の頭部の位置を変えることによってもさらに容易とすることができる。ブレブの所望の立体配置を達成したら、流体を硝子体腔へと戻す。流体とは、適切な流体、例えば、新鮮な生理食塩水である。一般に、網膜下のベクターは、網膜切開術に対する網膜復位術を行わず、眼内タンポナーデを伴わずに、ｉｎ  ｓｉｔｕに放置することができ、網膜は、約４８時間以内に自発的に再付着する。
【０２９４】
眼疾患を処置するためのＡＡＶ−２の網膜下投与は、まれな遺伝性疾患であるレーバー先天性黒内障（「ＬＣＡ」）の処置において裏付けられている。ＬＣＡの病理およびＬＣＡの患者集団は、滲出型ＡＭＤの病理および患者集団と異なり、したがって、遺伝子治療による滲出型ＡＭＤの処置であり、特に、ＡＡＶ−２による滲出型ＡＭＤの処置が、ｒＡＡＶ．ｓＦＬＴによる臨床研究の前に安全かつ有効であろうとは予測されなかった。とりわけ、ＬＣＡは、網膜タンパク質であるＲＰＥ−６５の発現が不十分であることにより引き起こされる変性遺伝性疾患である。ＬＣＡは、乳児および幼齢小児における緩慢な視覚の減退を引き起こし、一般に、２５〜３０歳以前の若齢成年までに全失明をもたらす。これに対し、本明細書で既に記載した滲出型ＡＭＤは、一般に、６５〜７５歳の間に始まる晩年における、網膜内の新たな血管の成長により引き起こされる。新たな血管の存在は、ＡＡＶ粒子、導入遺伝子、または導入遺伝子産物が、ＬＣＡ研究において示されるより大量に眼の外側に輸送されるという憂慮をもたらす。加えて、実施例１２において開示される、ｒＡＡＶ．ｓＦＬＴ−１などのウイルスベクターによる滲出型ＡＭＤの処置が安全かつ有効であるという研究結果以前には、患者が老化するにつれて、外来物質に対する免疫系および免疫応答が変化することは、不確実性をもたらしていた。
【０２９５】
Ｂ．処置の効果
一部の態様では、本開示の医薬組成物の、罹患した眼への単回の注射は、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）処置の有益性を示すだけでなく、また、単回だけの注射も要求する可能性がある。
【０２９６】
本開示の医薬組成物は、既存の血管内の漏出を停止させ、ＡＭＤに続発するＣＮＶを患う患者の網膜下腔内の新たな血管形成を、少なくとも１８カ月間にわたりさらに阻害することが可能であり、一部の態様では、３〜５年間にわたり活性が持続する。漏出および新たな血管形成の阻害は、罹患した患者における失明の発症を防止する。
【０２９７】
一部の態様では、前記ヒト対象の硝子体中のｓＦＬＴ−１タンパク質レベルは、約５００〜５，０００ｐｇ／ｍｌ、約６００〜４，０００ｐｇ／ｍｌ、約８００〜３，０００ｐｇ／ｍｌ、約９００〜２，０００ｐｇ／ｍｌ、または約１，０００〜１，８００ｐｇ／ｍｌ、５００〜７００ｐｇ／ｍｌ、７００〜１，０００ｐｇ／ｍｌ、１，０００〜１２００ｐｇ／ｍｌ、１２００〜１，５００ｐｇ／ｍｌ、１，８００〜２０００ｐｇ／ｍｌである。場合によって、ヒト対象の硝子体中のタンパク質レベルは、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、または２４００ｐｇ／ｍｌである。場合によって、ヒト対象の硝子体中のタンパク質レベルは、最大で約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、または２４００ｐｇ／ｍｌである。
【０２９８】
場合によって、タンパク質「レベル」は、タンパク質の任意の量または任意の相対量を指す場合がある。場合によって、レベルは、濃度（例えば、ｐＭ、ｎＭ、ｕＭなど）、モル濃度（例えば、ｍ）、質量（例えば、ｐｇ、ｕｇ、ｎｇなど）、または任意の適切な測定値として測定することができる。場合によって、無単位の測定値は、レベルを指し示しうる。
【０２９９】
場合によって、タンパク質レベルは、前記医薬組成物を投与した、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２、３、４、５、６、７、１４、２１、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、または３６５日後において測定することができる。場合によって、タンパク質レベルは、前記医薬組成物を投与した、最大で約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２、３、４、５、６、７、１４、２１、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、または３６５日後において測定することができる。場合によって、タンパク質レベルは、前記医薬組成物を投与した、少なくとも７２時間後において測定する。
【０３００】
本開示の医薬組成物の投与は一般に、副作用または有害事象をもたらさない。
【０３０１】
一部の態様では、前記医薬組成物を投与した、７、１４、２１、または３０日後において、ヒト対象の涙液、血液、唾液、または尿試料中にベクターが検出されない。一部の態様では、ウイルスベクターの存在を、当技術分野で公知のｑＰＣＲまたはＥＬＩＳＡにより検出する。
【０３０２】
場合によって、前記医薬組成物を投与した、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２、３、４、５、６、７、１４、２１、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、または３６５日後において、ヒト対象の涙液、血液、唾液、または尿試料中にベクターが検出されない。場合によって、前記医薬組成物を投与した、最大で約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２、３、４、５、６、７、１４、２１、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、または３６５日後において、ヒト対象の涙液、血液、唾液、または尿試料中にベクターが検出されない。場合によって、前記医薬組成物を投与した、少なくとも７２時間後において測定されたヒト対象の涙液、血液、唾液、または尿試料中にベクターが検出されない。
【０３０３】
一部の態様では、ヒト対象は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ月間にわたる連続的な眼検査により評価される通り、臨床的に重大な網膜毒性を示さない。一部の態様では、ヒト対象は、最大で約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ月間にわたる連続的な眼検査により評価される通り、臨床的に重大な網膜毒性を示さない。
【０３０４】
一部の態様では、少なくとも２カ月間にわたり、ヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体における炎症の徴候は存在しない。場合によって、医薬組成物を投与した１週間後または３、６、９、もしくは１２カ月後のヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体における炎症の徴候は存在しない。
【０３０５】
一部の態様では、投与ステップ後において、正常な範囲の約１０％以内の細胞傷害性Ｔ細胞応答を含む炎症性徴候は見られない。一部の態様では、ＥＬＩＳｐｏｔにより測定されるＴ細胞応答の増大は見られない。一部の態様では、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Laiら、２０１１年、Gene  Therapyにおいて記載されている通り、Ｔ細胞は、ＨＬＡ−ＤＲまたはＫｉ６７を発現させず、活性化したエフェクターの表現型を発生させない。一部の態様では、投与ステップ後において、硝子体の炎症が、生体顕微鏡法（ＢＥ）および間接検眼鏡法（ＩＯＥ）により観察されない。一部の態様では、投与ステップ後において、１０日以内に消失する硝子体の軽微な炎症が、生体顕微鏡法（ＢＥ）および間接検眼鏡法（ＩＯＥ）により観察される。一部の態様では、ヒト対象は、投与後少なくとも１２０日間にわたり、救済処置を必要としない。一部の態様では、ヒト対象は、投与後少なくとも３０日間、少なくとも６０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１２０日間、少なくとも１８０日間、少なくとも２７０日間、または少なくとも３６５日間にわたり、救済処置を必要としない。
【０３０６】
本明細書で使用される、救済処置とは、本開示において記載されている医薬組成物の初期投与の後における、ある用量のＶＥＧＦ阻害剤の投与を指す。救済処置は、疾患の進行の徴候および症状を停止または逆転するために、患者の眼内のＶＥＧＦ阻害量をブーストするのに投与する。救済処置を投与する決定は、実施例１２で記載される臨床研究における所定の診断基準に基づく場合もあり、活性の疾患の徴候が患者において存在するという医師の臨床判断に基づく場合もある。
【０３０７】
一部の態様では、投与後少なくとも１２０日間にわたり、前記ヒト対象において、視力の喪失、ＩＯＰの上昇、網膜剥離、または任意の眼内もしくは全身免疫応答の証拠が見られない。一部の態様では、投与後少なくとも３０日間、少なくとも６０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１２０日間、少なくとも１８０日間、少なくとも２７０日間、または少なくとも３６５日間にわたり、前記ヒト対象において、視力の喪失、ＩＯＰの上昇、網膜剥離、または任意の眼内もしくは全身免疫応答の証拠が見られない。一部の態様では、投与後最大で３０日間、少なくとも６０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１２０日間、少なくとも１８０日間、少なくとも２７０日間、または少なくとも３６５日間にわたり、前記ヒト対象において、視力の喪失、ＩＯＰの上昇、網膜剥離、または任意の眼内もしくは全身免疫応答の証拠が見られない。
【０３０８】
一部の態様では、患者の最高矯正視力（ＢＣＶＡ）は、１、２、３、４、５行以上改善する。
【０３０９】
一部の態様では、フルオレセイン血管造影（ＦＡ）により評価される血管新生の低減が投与ステップに後続する。
【０３１０】
場合によって、網膜厚を測定して、処置の効果を検討することができる。場合によって、ヒト対象の網膜中心厚は、本開示の医薬組成物による処置後１２カ月以内において、５０ミクロン、１００ミクロン、または２５０ミクロンを超えて増大しない。場合によって、ヒト対象の網膜中心厚は、本開示の医薬組成物による処置後３カ月、６カ月、９カ月、または１２カ月以内に少なくとも５０ミクロン、１００ミクロン、２００ミクロン、２５０ミクロン、３００ミクロン、４００ミクロン、５００ミクロン、６００ミクロン減少する。ヒト対象の網膜中心厚の減少は、ある時点における網膜中心厚を、本開示の医薬組成物の投与の１、３、７、もしくは１０日後、または１、３、７、もしくは１０日以内に行ったベースラインの測定と比較して測定することができる。
【０３１１】
Ｃ．ＶＥＧＦ阻害剤による組合せ処置
一部の態様では、方法は、薬学的有効量のＶＥＧＦ阻害剤をヒト対象に投与するステップをさらに含む。
【０３１２】
一部の態様では、ＶＥＧＦ阻害剤は、ＶＥＧＦに対する抗体またはその機能的断片を含む。一部の態様では、ＶＥＧＦ阻害剤は、ラニビズマブを含む。他の態様では、ＶＥＧＦ阻害剤は、アフリベルセプトまたはｓＦＬＴ０１など、可溶性受容体、融合タンパク質、またはこれらの断片である。一部の態様では、医薬組成物を、前記ＶＥＧＦ阻害剤を投与した、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、または８日後に投与する。一部の態様では、医薬組成物を、前記ＶＥＧＦ阻害剤を投与した、最大で１、２、３、４、５、６、７、または８日後に投与する。一部の態様では、医薬組成物を、前記ＶＥＧＦ阻害剤の投与後９０日以内に投与する。
【０３１３】
一部の態様では、図１３において概括されるプロトコールなどのプロトコール下で患者を処置する。組換えウイルスが発現させるタンパク質を、適切なレベルで発現させた後（または「発現させたとき」）、患者には基準ベースの再処置を施す：
ａ．疾患が再発する場合は、ラニビズマブによる再処置が許容される
ｂ．対照群には１年当たり５〜８回の再処置が予期される
ｃ．処置群では、再処置の回数を実質的に減少させながら、同等な視覚が期待される。
【０３１４】
患者は、活性ＣＮＶの徴候：
ａ．盲検化された従事者（技師、および眼科医）により査定される客観的基準に基づく徴候
ｂ．再処置基準が、抗ＶＥＧＦ剤による先行試験における「必要に応じた」（ＰＲＮ）処置による実質的な経過に基づく徴候
が存在する場合、再処置に適格である。
【０３１５】
再処置は、
ａ．ヒト対象の前回の来院からの、ＥＴＤＲＳ（糖尿病網膜症早期治療研究）文字の減退が＞１０である（網膜性原因に帰することが可能な）、または機能喪失に対する患者の知覚と共に、前回の来院からの、ＥＴＤＲＳによる文字の減少が＞５であること；
ｂ．ＯＣＴ時において、感覚網膜下、網膜色素上皮（ＲＰＥ）下、または網膜内において、流体の任意の新たな増大または増大の遷延がみられること；
ｃ．ＦＡを介するＣＮＶからの漏出の増大の徴候が見られること
など、活性の疾患の徴候に基づき正当化される。
【０３１６】
一部の態様では、ＶＥＧＦ阻害剤を、前記医薬組成物を投与する前に少なくとも１回投与し、前記投与後において、約３０日間の間隔でさらに１または２回投与して、タンパク質の発現が、適切なレベルまで増大する間に、疾患の進行を防止する。一部の態様では、ＶＥＧＦ阻害剤を、前記医薬組成物を投与する前に、少なくとも２回にわたり投与する。一部の態様では、ＶＥＧＦ阻害剤を、前記医薬組成物の投与後６〜７週間にわたり投与する。
【０３１７】
一部の態様では、ＶＥＧＦ阻害剤の投与頻度は、１年未満まで低減されるか、完全に停止される。
【０３１８】
一部の態様では、ＶＥＧＦ阻害剤による３回以上の処置の後で、本開示を使用する。一部の態様では、ＡＭＤ患者が、他のＶＥＧＦ阻害剤を使用した後でＢＣＶＡの改善を示さないことを観察した後で、本開示を使用する。
【０３１９】
Ｄ．他の組合せ処置
別の好ましい態様では、患者の処置は、他の療法、例えば、化学療法、放射線、手術、抗炎症薬剤、選択されたビタミンなどと共に、本明細書で提供される医薬組成物のうちの１または複数の投与を含む。他の薬剤は、医薬組成物の前に投与することもでき、医薬組成物の後で投与することもでき、医薬組成物と共投与することもできる。
【０３２０】
本開示の態様は、理論的側面を提示せずに実施することができる。なおさらに、本出願人らが、提示される理論により束縛されることを欲しないことを理解した上で、理論的側面も提示する。
【０３２１】
本明細書では、本開示の好ましい態様について示し、記載してきたが、当業者には、このような態様は、例だけを目的として提供されることが明白であろう。当業者は今や、本開示から逸脱することなく、多数の変化形、変更、および置換に想到するであろう。本明細書で記載される本開示の態様に対する多様な代替物を、本開示の実施において援用することができることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本開示の範囲、これらの特許請求の範囲の範囲内にある方法および構造、ならびにそこで対象とされるそれらの同等物を規定することが意図される。
【０３２２】
核酸の有効用量は、発現させる特定のタンパク質、標的とされる特定の疾患、患者および患者の臨床状態、体重、年齢、性別などの関数となろう。
【実施例】
【０３２３】
当業者は、多数かつ多様な改変を施して、本開示の精神から逸脱することなく、本質的に同様の結果をもたらしうることを理解するであろう。論じられる対象物について、本明細書で言及される参考文献の全ては、参照によりそれらの全体において組み込まれる。以下の実施例は、例示的目的だけのために組み入れられるものであり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
【０３２４】
以下の実施例による百分率は、指定されない場合も、全て内容物の重量パーセント（ｗｔ％）であることを説明しなければならない。
【０３２５】
（実施例１）
ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１
組換えウイルスの１つの例は、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１である。ｒＡＡＶ．ｓＦＬＴ−１は、ベクターおよび切断型可溶性ＶＥＧＦ受容体１（ｓＦＬＴ−１）のヒト形態をコードする。ベクターは、血清型２の組換え複製欠損アデノ随伴ウイルス性（ｒＡＡＶ）ベクターである。
【０３２６】
ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１は、「医薬品の製造管理および品質管理の基準」（ｃＧＭＰ）の下で製造した。製造施設では、プロトコール要件に従い、最終生成物を、滅菌で低ウイルス結合性のマイクロ遠心管（個別包装された低残留量で滅菌平型キャップ式のバイアル）へとアリコート分割（すなわち、１×１０１０または１×１０１１のウイルスゲノム２００□ｌ）し、−８０□Ｃで保存して、最終生成物の放出を待機した。各バイアルは、単一の患者における使用（１００□ｌを投与する）に十分なベクターを含有した。
【０３２７】
組換えウイルス、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１とは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターにより駆動される可溶性ＶＥＧＦＲ受容体１（ＶＥＧＦＲ１）またはｓＦＬＴ−１を保有する、組換えアデノ随伴ウイルス２（ｒＡＡＶ２）ベクターである。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１ベクターのおよび骨格として使用される無傷のＡＡＶ２ゲノムは、Lai
ら、Gene  Therapy、２００２年、９巻（１２号）：８０４〜８１３頁において記載され
ている通りに調製した。ｒＡＡＶ２ベクターは、ウイルス性コード配列を欠く、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐが、治療用遺伝子のための発現カセットで置き換えられている。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の活性部分は、ｓＦｌｔ−１である。ｓＦＬＴ−１とは、自然発生の血管内皮成長因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１またはＦｌｔ−１）の可溶性切断形態である。ｓＦＬＴ−１は、ＶＥＧＦの唯一の公知の内因性の特異的阻害剤である。ｓＦＬＴ−１は、代替的なスプライシングにより生成され、膜近位免疫グロブリン様ドメイン、膜貫通領域、および細胞内チロシンキナーゼドメインを欠く。よって、ｓＦＬＴ−１は、３１の固有なアミノ酸残基を後続させる第１の６回細胞外免疫グロブリン様ループだけを含有する。ｓＦＬＴ−１は、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において最初に同定されたが、それ以来、妊婦の胎盤内および全身の循環中で自然発生することが見出されている。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の生成において使用されるｓＦＬＴ−１は、全長膜貫通ＦＬＴ−１の第１の６回細胞外免疫グロブリン様ドメインだけをコードするオープンリーディングフレームであって、代替的にスプライスされる、既に記載されている分泌型可溶性ＦＬＴ−１アイソフォームを表す、固有な３１アミノ酸長のＣ末端伸長を後続させるオープンリーディングフレームを含有する。
【０３２８】
ＩＴＲは、軽微なプロモーター活性を保有することが示されているが、最大レベルの導入遺伝子発現のために、カセットは一般に、プロモーター／エンハンサーの組合せ、短いイントロン配列、治療用遺伝子のｃＤＮＡ、およびポリアデニル化シグナルを含む。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１では、ヒトＣＭＶ主要前初期遺伝子のエンハンサー／プロモーターおよびキメライントロンを、ｓＦＬＴ−１  ｃＤＮＡの上流に配置した。サルウイルス４０ポリアデニル化（ＳＶ４０ポリＡ）シグナルは、ｓＦＬＴ−１  ｃＤＮＡの下流に配置した。
【０３２９】
ｓＦＬＴ−１のＶＥＧＦへのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける結合は、広範に裏付けられている。ＶＥＧＦに駆動される血管形成を阻害するｓＦＬＴ−１の能力は、その潜在的な臨床適用についての無視できない関心を惹きつけてきたが、実施例１２で記載されるｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１についての臨床研究以前には、ヒトにおける有効性または適性の証拠は示されなかった。ｓＦＬＴ−１の血管新生抑制活性は、２つの機構：ｉ）それが高アフィニティーで結合するＶＥＧＦの隔離、ならびにｉｉ）ＶＥＧＦ受容体であるＦｌｔ−１およびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の膜貫通アイソフォームとの、不活性のヘテロ二量体の形成によるＶＥＧＦの阻害から生じうる。
【０３３０】
ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を生成するのに使用されるプラスミドベクターのヌクレオチド配列および概略図
ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１は、当技術分野で公知の通り（Xiaoら、１９９８年、J  Virololgy、７２巻（３号）：２２２４〜２２３２頁）に、ヒト胎児由来腎臓２９３細胞の、ｐＳＳＶ．ＣＩ．ｈｓＦｌｔ−１プラスミドベクターおよびヘルパープラスミドに由来するＤＮＡによる３連のトランスフェクションを介して生成した。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１は、核単離、密度勾配遠心分離、および硫酸ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィーの連続工程を使用して精製した。ｓＦＬＴ−１のプラスミドベクターについての概略表示を、図１に示す。
【０３３１】
処方物
ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１は、２つの濃度：滅菌低ウイルス結合性マイクロ遠心管内に１００ｕＬ当たり１×１０１０のベクターゲノム（低用量）および１００ｕＬ当たり１×１０１１のベクターゲノム（高用量）の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７）中で製剤化した。処方物は、１回融解で網膜下注射による単回使用だけのための保存剤非含有処方物である。
【０３３２】
ｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１
組換えウイルスの第２の例は、ｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１である。ｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１は、Ｓｆ９昆虫細胞内のバキュロウイルス発現系（ＢＥＶＳ）を使用して産生され、切断型可溶性ＶＥＧＦ受容体１（ｓＦＬＴ−１）のヒト形態をコードする、血清型２の組換え複製欠損アデノ随伴ウイルス性（ｒＡＡＶ）ベクターである。ベクターは、Ｓｆ９細胞の２つの組換えバキュロウイルスであるＢａｃ−ｉｎＲｅｐ−ｉｎＣａｐおよびＢａｃ−ｓＦｌｔ−１による感染を使用して産生させた。Ｂａｃ−ｓＦｌｔ−１は、Ｍａｎｉａｔｉｓらにおいて記載されており、以下でもさらに記載されている、標準的な分子生物学法を使用して、Ｆｒａｇ００１ｍ−ＢＨＫａｎおよびプラスミド骨格であるＶ１０９−ｐＦＢ−ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＳＶ４０ｐＡ−Ｋａｎからクローニングされた、８．７ｋｂのプラスミドであるＡＶＡ０１−ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｓＦｌｔによる、エレクトロコンピテントセルの形質転換から生成された、バクミドＤＮＡに由来した。Ｆｒａｇ００１ｍは、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＬＬＣ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）により化学合成され、ＢＨＫａｎ骨格へとクローニングされた、以下の連続核酸エレメント：ＩＴＲ（ＡＡＶ血清型２）、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター、キメライントロン、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ｓＦｌｔ−１コード配列、ＳＶ４０ポリＡ領域、ＩＴＲ（ＡＡＶ血清型２）から形成した。プラスミドであるＶ１０９−ｐＦＢ−ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＳＶ４０ｐＡ−Ｋａｎは、Ｖｉｒｏｖｅｋ，Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）から得た。プラスミドは、カナマイシン抗生剤耐性遺伝子、ＣｏｌＥ１起点、ならびにＣＭＶ−ＩＥプロモーター、イントロン、複数のクローニング配列、およびＡＡＶ血清型２に由来する逆位末端配列（ＩＴＲ）で挟まれたＳＶ４０ポリＡ領域を含有する組換えＡＡＶカセットを含有した。このｒＡＡＶカセットは、ゲンタマイシン耐性遺伝子とＴｎ７Ｌ接合部位とで挟んだ。ＡＶＡ０ｌ−ｐＦＢ−ＣＭＶ−ｓＦｌｔは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターまたは他の原核生物調節配列を含有しなかった。Ｂａｃ−ｉｎＲｅｐ−ｉｎＣａｐとは、ＡＡＶ血清型２に由来するｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子のための発現カセットを含有する組換えバキュロウイルスである。
【０３３３】
バキュロウイルス内のｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１の産生
ｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１は、米国特許出願第１２／２９７，９５８号において記載されており、より具体的には、以下の通りの方法に従い、バキュロウイルス内で産生させた。Ｓｆ９細胞を、２８℃で、１ｍｌ当たり１００単位のペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＳＦ９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地中に１ｍｌ当たり約１０７個の細胞へと成長させ、感染させる前に、約１ｍｌ当たり５×１０６個の細胞へと希釈した。Ｂａｃ−ｉｎＲｅｐ−ｉｎＣａｐおよびＢａｃ−ｓＦｌｔ−１の各々を、ｍ．ｏ．ｉ．を１として、２８℃で３日間にわたり、細胞に感染させるのに使用して、ＡＡＶ型２ベクターを産生した。３日間にわたる感染の後、細胞ペレットを、卓上用遠心分離器内、２，０００ｒｐｍで１５分間にわたる遠心分離により回収した。細胞ペレットは、Urabeら、Hum  Gene  Ther.、１、１３巻（１６号）、１９３５〜４３頁（２００２年）により記載されている通りに、溶解緩衝液中で溶解させ、細胞内核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）を、ベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）で消化させた。細胞溶解物を、Ａｖａｎｔｉ  Ｊ−２５遠心分離器（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆ）内、８，０００ｒｐｍで３０分間にわたる遠心分離により清浄にし、次いで、１ｃｃ当たり１．５５ｇのＣｓＣｌ溶液５ｍｌ、および１ｃｃ当たり１．３２ｇのＣｓＣｌ溶液１０ｍｌを含有するＳＷ２８遠心分離管へとロードした。１５℃、２８，０００ｒｐｍで約１６時間にわたる遠心分離の後、シリンジ注射針を使用して遠心分離管に穿刺することによりｒＡＡＶ含有画分を回収し、第２ラウンドのＣｓＣｌ超遠心分離にかけた。ｒＡＡＶ含有画分を、シリンジ注射針を使用して遠心分離管に穿刺することにより再度回収し、ＰＢＳ緩衝液中で透析して、塩および洗浄剤を除去した。ベクター力価は、製造元（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ）のプロトコールに従う定量的リアルタイムＰＣＲアッセイにより決定した。
【０３３４】
（実施例２）
ＶＥＧＦに誘導される内皮細胞増殖のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける阻害
ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖のＶＥＧＦによる誘導を評価し、ＶＥＧＦに誘導されるＨＵＶＥＣ増殖が、ｒＡＡＶを媒介するｓＦＬＴ−１により阻害されるのかどうかを決定するための研究を実施した。形質導入された細胞内のｓＦＬＴ−１の存在を、馴化培地についてのウェスタンブロット解析によりまず確認した（図２、パネルａ）。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を形質導入した２９３細胞およびｒＡＡＶ．ｇｆｐを形質導入した２９３細胞に由来する馴化培地を、ＶＥＧＦで処置されたＨＵＶＥＣへと、希釈率を増大させながら添加した。また、対照の飢餓培地（ウシ内皮成長因子を伴わない通常のＨＵＶＥＣ成長培地）だけも組み入れた。ヘパリンを、１００μｇ／ｍＬで各ウェルへと添加した。ＶＥＧＦおよび異なる馴化培地で処置されたＨＵＶＥＣＳの、ＶＥＧＦに誘導される相対増殖は、２５μＬの３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrozolium  bromide）（ＭＴＴ、５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を、各ウェルへと、３７℃で４時間にわたり添加することによりアッセイした。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を形質導入した２９３細胞に由来する４０μＬの馴化培地中のｒＡＡＶベクターによりコードされて分泌されるｓＦＬＴ−１は、ＶＥＧＦに誘導されるＨＵＶＥＣＳの増殖を３２％阻害することが確認された。馴化培地の容量を倍加することにより、細胞成長同等物による、飢餓培地中の培養物と同様な基底レベルまでの完全な阻害を結果としてもたらした（図２、パネルｂ）。
【０３３５】
ｒＡＡＶ．ｓＦｔ−１ベクターの効力についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける評価
形質導入されたヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞によるヒトｓＦｌｔ−１タンパク質の発現を、ＥＬＩＳＡを介して定量化することにより、組換えヒトｓＦｌｔ−１遺伝子をコードするＡＡＶベクターの効力を評価するための研究を実施した。ヒト胎児由来腎臓２９３細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）から得、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、ＧＩＢＣＯ）および１倍濃度のペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミンを伴うダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ；Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）中で培養した。全ての培養物は、加湿雰囲気中、３７℃および５％のＣＯ２で維持した。
【０３３６】
ＨＥＫ２９３細胞は、２４ウェル当たり８×１０４個または１．５×１０５個の細胞で播種し、６０〜９０％のコンフルエンシーのとき、２％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地中に１×１０３〜１×１０６の範囲の感染多重度（ＭＯＩ）の組換えＡＡＶベクターを形質導入した。７２時間後、形質導入後の馴化培地を回収した。馴化培地のアリコートを、試薬を使用して、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＶＲ１００Ｂ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｈｕｍａｎ  ｓＶＥＧＦ  Ｒ１／ｓＦｌｔ−１キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）による標準的な指示書に従い、ＥＬＩＳＡのために調製した。ＥＬＩＳＡキットの指示書に従い、Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＥＬＩＳＡ試薬により、試料、基準物質、および対照を調製し、次いで、ｓＶＥＧＦ  Ｒ１／ｓＦｌｔ−１に対する抗体であらかじめコーティングされたＥＬＩＳＡプレートへと移し、水平軌道型マイクロプレートシェーカー上、室温で２時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、抗ｓＶＥＧＦ  Ｒ１コンジュゲート（２時間）、基質溶液（３０分間）および停止溶液を、標準的なＥＬＩＳＡアッセイ手順に従い、各々の間に吸引ステップおよび洗浄ステップを伴いながら、逐次的に各ウェルへと適用した。試料、基準物質、および対照の光学密度（ＯＤ：ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）は、基質反応を停止させて３０分以内に、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにより測定した。ｐｇ／ｍＬ単位のｓＦｌｔ−１の濃度は、ＥＬＩＳＡプレートリーダーによるＯＤ測定値を使用するＳｏｆｔｍａｘＰｒｏソフトウェアを使用して計算した。
【０３３７】
ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１およびｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１についての研究の結果を、図２５Ａおよび図２５Ｂに示す。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１およびｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１を形質導入した７２時間後において、ＨＥＫ２９３細胞が発現させるｓＦｌｔ−１タンパク質の濃度は、１×１０４のＭＯＩで１００〜１，０００ｐｇ／ｍＬの範囲、１×１０５のＭＯＩで１００〜１０，０００ｐｇ／ｍＬの範囲、および１×１０６のＭＯＩで１，０００〜１０，０００ｐｇ／ｍＬの範囲であった。
【０３３８】
（実施例３）
マウスにおけるｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１研究
ヒトＶＥＧＦの、光受容体細胞からのトランスジェニック発現により誘導される、緩慢であるが安定的な網膜血管新生を伴うトランスジェニックマウス（ｔｒＶＥＧＦ０２９）を、網膜血管新生についてのモデルとして使用した。これらのマウスにより、２つの個別の研究を行った。
【０３３９】
第１のマウス研究では、１３匹のトランスジェニックマウスを、一方の眼内のｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１ベクター（１×１０１１個のベクター粒子）の投与および反対側の眼内の対照ベクターの投与の前と後における眼の血管新生の変化について評価した。注射の１、３、および８カ月後において、蛍光眼底血管造影法を使用して、眼を新生血管性変化について評価した。被験眼内に施された処置に対して盲検化された３名の観察者を介して、血管新生の程度、強度、および段階をグレード付けした（０〜４）。「３」の中央値グレード（注射前）から、注射の１カ月後における「１」の中央値グレードへの、新生血管のグレード付けの、統計学的に有意な全体的低減（Ｐ＝０．０１２）が見られた。この低減は、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１による注射の３カ月後（中央値＝１；Ｐ＝０．００１）および８カ月後（中央値＝１；Ｐ＝０．００１）においても維持された。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１ベクターの注射は、対照ベクターで処置された眼では、８％（１３例中１例）と比較して、処置された眼のうちの８５％（１３例中１１例）において、新生血管性血管の長期（少なくとも８カ月間）にわたる退縮を結果としてもたらした。
【０３４０】
この前臨床研究における眼の組織学的検討は、光受容体の撹乱または喪失が、対照ベクターを注射された眼では、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を注射された眼と比較して有意に（Ｐ＜０．０１）より顕著であることを明らかにした。ｓＦＬＴ−１の発現はまた、組織試料についての逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応解析によっても確認し；ｓＦＬＴ−１のｍＲＮＡは、４例の被験眼全てにおいて検出された。対照（ｒＡＡＶ．ｇｆｐ）ベクターを注射された眼と比較したところ、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を注射された眼では、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１ベクター特異的有害作用が認められなかった。
【０３４１】
ｔｒＶＥＧＦ０２トランスジェニックマウスにおいて行った第２の研究では、研究の目的は、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の網膜下注射が、任意の細胞を媒介する免疫応答であって、ｓＦＬＴ−１の長期にわたる発現に対して否定的な影響を及ぼすか、または網膜に対する免疫応答関連損傷を引き起こす可能性がある免疫応答を結果としてもたらすのかどうかを決定することであった。本研究では、５０匹のｔｒＶＥＧＦ０２トランスジェニックマウスの一方の眼に、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の網膜下注射（８×１０９個のウイルス粒子）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を施した。次いで、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１処置群または対照処置群に由来する３０匹のマウスの網膜を、注射の１週間後および１カ月後において、免疫細胞（白血球、マクロファージ、ならびにＢリンパ球およびＴリンパ球）の存在について評価した。後部眼杯についてのフローサイトメトリーによる検討は、注射の１週間後において、ＣＤ４５＋白血球（対照と比較して６．６倍の増大；Ｐ＜０．０５）およびＣＤ１１ｂ＋マクロファージ（対照と比較して５．７倍の増大；Ｐ＜０．０３６）の統計学的に有意な増大が見られることを示した。しかし、この時点で、ＣＤ１９＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ４＋（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）には差異が見られなかった。注射の１カ月後、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１またはＰＢＳ対照で処置されたマウスの眼において、白血球サブセット（すなわち、ＣＤ４５＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ８＋細胞、またはＣＤ４＋細胞）の間の細胞数の差異が見られなかったことから、白血球およびマクロファージの浸潤は一過性であったことが示唆される。これらのマウスに由来する脾臓のリンパ球サブセットについての、１週間後および１カ月後の時点におけるフローサイトメトリーによる査定は、リンパ球の数の有意差を示さなかった。この所見は、網膜内では、一過性の限局的な免疫応答が示されたが、全身性の免疫応答は観察されなかったことを示唆する。
【０３４２】
この第２の研究では、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１またはＰＢＳを注射されたマウスのうちの５匹に由来する眼についての組織学的検討では、被験マウスのうちのいずれにおいても、網膜内の観察可能な免疫応答関連破壊または続発症が明らかになることはなかった。
【０３４３】
網膜血管新生についての、このトランスジェニックマウスモデル（ｔｒＶＥＧＦ０２）における、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の、血管新生のレベルに対する影響を評価するために、また、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１またはＰＢＳを注射されたマウスの網膜も、２名の異なる評価者を介して、処置の２カ月後において独立にグレード付けした。総じて、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を注射された眼では、平均血管新生グレードの有意な低減（注射前：１．４６±０．５８；注射後：０．８１±０．５７；Ｐ＜０．０００１５）が見られたのに対し、ＰＢＳ対照を注射された眼では、平均血管新生グレードの有意な増大が見られた（注射前：１．０８±０．５６；注射後：１．６３±０．９６；Ｐ＜０．０１８）。
【０３４４】
この第２のマウス研究からの所見は、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１による処置は、この網膜血管新生およびＡＭＤについてのマウスモデルにおいて観察される血管新生の進行性の増大を逆転すると考えられたことを明確に指し示す。さらに、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１による網膜下注射の１週間後に観察されたのは、限定された限局性の炎症応答だけであり、１カ月後には消失した。この免疫応答は、網膜内のｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の長期にわたる治療的有効性を損なわないと考えられた。
【０３４５】
この実施例３で記載したトランスジェニックマウスモデルは、本明細書で開示される医薬組成物は、ＶＥＧＦの阻害が関与する他の網膜の血管疾患の処置および／または予防のために使用しうることを裏付ける。これらは、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血症、糖尿病性網膜浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、および網膜静脈分枝閉塞症を含む。臨床研究では、Ｌｕｃｅｎｔｉｓなど、いくつかのＶＥＧＦ阻害剤は、糖尿病性黄斑浮腫および網膜静脈閉塞症を含むある種のこれらの疾患を効果的に処置することが示されている。これらのマウスモデルにおいて裏付けられるｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の有効性は、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１はまた、これらのＶＥＧＦを媒介する疾患を処置するのにも有効であることを指し示す。
【０３４６】
（実施例４）
ラットにおけるｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１研究
ラットｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１研究では、眼の血管新生についての２つのモデル：焼灼誘導型角膜血管新生モデルおよびレーザー光凝固誘導型脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）モデルを使用した。角膜血管新生モデルでは、２２匹のラットの一方の眼の前房に、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１ベクター（８×１０８個のウイルス粒子）を注射し、反対側の眼に対照ベクター（ｒＡＡＶ．ｇｆｐ）を注射した後、角膜を焼灼した。次いで、眼を、焼灼の４日後に、細隙灯撮影を使用して、血管新生について検討した。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１で処置された眼では、対照で処置された眼と比較して、著明により低い割合の角膜血管形成が見出された（それぞれ、２７％および６３％；Ｐ＝０．００９）。眼についての組織学的検討は、焼灼され、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１で処置された眼の大半では、角膜血管が観察されないことを示した。組織学的検討はまた、対照ベクターを注射された眼では、角膜間質層に対する細胞浸潤が、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１で処置された眼と比較してより顕著であることも明らかにした。加えて、対照ベクターで処置された眼では、明白な浮腫および角膜間質の腫脹も見られたのに対し、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１で処置された眼では、有意な組織腫脹の証拠は見られなかった。
【０３４７】
レーザー光凝固誘導型ＣＮＶモデルでは、１０匹のラットの一方の眼に、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１ベクター（８×１０８個のウイルス粒子）を網膜下注射し、反対側の眼に対照ベクター（ｒＡＡＶ．ｇｆｐ）を網膜下注射した。レーザー光凝固を使用して、注射の１カ月後にＣＮＶを誘導した。レーザー光凝固の５週間後、蛍光眼底血管造影法を使用して、眼をＣＮＶについて検討した。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１で処置された眼では、レーザーで処理した帯域のうちで漏出を示したのは、対照ベクターで処置された眼における６０％と比較して４１％だけであった（Ｐ＝０．００２）。レーザー誘導型ＣＮＶの１６週間後、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１で処置された眼が示す血管新生は、対照の眼よりなおも著明により低かった。注射部位に直に隣接する帯域内の眼についての組織学的検討は、網膜色素上皮の正常ならびに外節および外核層の正常を明らかにした。これらの所見は、ｓＦＬＴ−１の発現と関連する明白な毒性が見られないことを示唆した。網膜電図はまた、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１で処置された眼の正常な機能も指し示した。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１ベクターおよび対照ベクターで処置されたレーザー病変の大半は、網膜下細胞膜を発生させた。しかし、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１で処置された眼内の病変における増殖性内皮細胞は一般に少数であったことから、蛍光眼底血管造影法の所見が反映され、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１で処置された眼では、血管形成（すなわち、血管新生）の割合が低減されることが指し示される。
【０３４８】
糖尿病についてのラットモデルにおける、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１およびｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１による研究
糖尿病性網膜症（ＤＲ：ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）および糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）を処置するための、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１およびｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１の安全性および有効性をさらに評価するために、糖尿病についてのラットモデルにおける実験を行う。
【０３４９】
糖尿病患者における視覚喪失は、炎症により媒介され、血液網膜関門の最終的な破断および後続の血管漏出をもたらす結果として、黄斑浮腫をもたらす。ストレプトゾシン（ＳＴＺ：ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）糖尿病ラットモデルは、十分に特徴付けられた血管漏出のパターンであって、ＶＥＧＦが、２週間後には早くも強く上方調節されるパターンを提示する（Miyamoto,  K.ら、Proc  Natl  Acad  Sci  USA、９６巻、１０８３６〜
１０８４１頁（１９９９年））。ＤＲについての動物モデルの処置への現行の接近法により裏付けられているのは、血管漏出についての部分的な解明に過ぎない。
【０３５０】
糖尿病を、ブラウンノルウェーラットにおいて、ストレプトゾシンの腹腔内注射により誘導する（５０ｍｇ／ｋｇ）。糖尿病は、血中グルコース測定値により確認およびモニタリングする。血中グルコース＞３５０ｍｇ／ｄｌであるラットは、糖尿病性であると考える。糖尿病発症の８日後において、Chalberg,  T.W.ら、Invest  Ophthalmol  Vis  Sci
、４６巻、２１４０〜２１４６頁（２００５年）において記載されている、確立された技法を使用して、１×１０１０または５×１０１０ｖｇのｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１またはｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１を含有する、５μＬの網膜下注射によりラットを処置する（１群当たりｎ＝１２例の眼）。ＡＡＶ２．ＧＦＰ（５×１０１０ｖｇ）およびビヒクルは、対照として注射する。非糖尿病性および糖尿病性の非処置群もまた、対照として使用する。
【０３５１】
ｓＦＬＴ−１を発現させるｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１の、血管漏出に対する効果は、６０日後に測定する。網膜血管漏出は、ＦＩＴＣ−アルブミン漏出法により、ＦＩＴＣでコンジュゲートしたアルブミンをトレーサーとして使用する注射後において測定する。ＦＩＴＣ−アルブミン漏出法は、循環から網膜へと漏出するＦＩＴＣ−アルブミンの漏出を直接測定し、網膜の血管透過性を測定するのに一般的に使用される方法である。注射された眼における網膜血管漏出を、非糖尿病性対照、処置されていない糖尿病性眼、およびビヒクルで処置された糖尿病性眼、ならびに野生型のＡＡＶ血清型２および８と比較する。
【０３５２】
結果：ｓＦＬＴ−１を発現させるｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１が、ＳＴＺ−糖尿病性ラットにおける血管漏出を低減するのに対し、ＡＡＶ２．ＧＦＰおよび他の対照の注射は、血管漏出を低減しない。
【０３５３】
（実施例５）
サルにおけるｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１研究
ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の有効性および安全性はまた、ＡＭＤの非ヒト霊長動物（マカクザル）モデルにおいて、レーザー光凝固を使用してＣＮＶを誘導しても調べた。ヒトにおけるＡＭＤの処置の開発における１つの難題は、非ヒト霊長動物が、ＡＭＤを発症しないことである。レーザー光凝固により誘導されるＣＮＶは、いくつかのＡＭＤの症状をシミュレートするが、伏在する生物学的過程は、慢性疾患の進行ではなく、急性損傷の治癒であり、したがって、ＡＭＤまたは他のＣＮＶベースの疾患を伴うヒトにおけるＣＮＶのための任意の特定の処置の効能を予測できない可能性がある。にもかかわらず、ヒトの眼は、非霊長動物の眼より非ヒト霊長動物の眼と解剖学的に類似するため、潜在的な処置または他の介入の毒性およびこれに対する組織学的応答を評価するためには、非ヒト霊長動物が高頻度で研究される。
【０３５４】
非ヒト霊長動物についての第１の研究では、５匹のマカクザルの一方の眼に、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１（４×１０１２個のウイルス粒子）を網膜下注射し、反対側の眼に対照ベクター（ｒＡＡＶ．ｇｆｐ）を網膜下注射した。サルの眼の健康は、網膜下注射後において定期的に評価した。対照ベクターまたはｒＡＡＶｓＦｌｔ−１ベクターの網膜下注射と直接関連する見かけの合併症は見られなかった。注射後の週に、一過性の結膜刺激および硝子体のかすみが感知されたが、２週目までに消失した。サルのうちの１匹の右眼では、網膜下注射は奏効せず、したがって、この動物をさらなる査定にかけなかった。
【０３５５】
４０〜１００ｕＬのｒＡＡＶ懸濁液の網膜下注射により網膜を持ち上げ、色素上皮と光受容体層との間にベクターを収容するブレブを、限局性の様式で創出した。このブレブは、２４〜４８時間以内に自己補正された。注射針穿通点における、網膜色素上皮に対する微小な撹乱を除き、他の網膜の異常は、追跡期間（注射後３〜１７カ月）にわたり観察されなかった。他の異常または有害事象も観察されず、いかなる時点においても、手術と関連する網膜剥離は観察されなかった。
【０３５６】
次いで、ｒＡＡＶｓＦｌｔ−１の長期にわたる治療有効性を評価するため、４匹の注射されたサルを、ベクターによる処置の１６カ月後において、強いレーザー光凝固にかけた。各眼において、レーザーを使用して、８カ所の病変を誘導し、次いで、レーザー処置の２および４週間後に、眼をＣＮＶについてモニタリングした。レーザー光凝固の後、４匹中３匹のサルだけが解析可能であり、したがって、３匹の動物について、有効性データを回収した。ｒＡＡＶｓＦｌｔ−１で処置された３例のサルの眼のうちのいずれも、ＣＮＶ関連病変を発症せず、弱いフルオレセイン染色だけが観察されたことから、漏出／血管新生は最小限であることが指し示される。対照ベクターで処置された、全ての反対側の眼は、ＣＮＶ関連病変を発症した。
【０３５７】
網膜下腔へと注射されたｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の安全性および毒性の評価を目的とする追跡研究では、８匹のサルを使用した。５匹には、それらの左眼にｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を注射し、２匹には、それらの左眼にｒＡＡＶ．ｇｆｐを注射し、１匹には、両方の眼に組換えＦｌｔ−１タンパク質を注射し、１匹は、注射されない対照として保った。サルは、注射前および注射後において、カラー眼底撮影、蛍光眼底血管造影法、および網膜電図写真により調べた。血液は、ｓＦＬＴ−１レベルをアッセイするために日常的に回収し、末梢血リンパ球をフローサイトメトリーのために単離して、免疫細胞サブセット応答について評価した。屠殺時（注射の３、９、および１２カ月後）において、ｉ）抽出されたゲノムＤＮＡに対するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を使用する、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１ベクターについての生体内分布研究；ｉｉ）ＥＬＩＳＡによる、ｈｓＦｌｔ−１タンパク質レベルおよびＡＡＶ２カプシドタンパク質レベルの定量化；ならびにｉｉｉ）眼についての組織学のために組織を回収した。
【０３５８】
カラー眼底撮影、蛍光眼底血管造影法、および網膜電図写真は、注射後における眼に対するいかなる有害作用も検出しなかった。試験した雄または雌のサルのうちのいずれにおける血漿ｓＦＬＴ−１レベルも、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１注射に関連するレベルの上昇を示さなかった。視神経試料を除き、サンプリングされた他の組織（リンパ節、脾臓、肝臓、脳、脳、心臓、脾臓、角膜）のうちのいずれのゲノムＤＮＡにおいても、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１配列は検出されなかった。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された眼のパラフィン包埋切片は、正常な外見を呈した。
【０３５９】
非ヒト霊長動物の解剖学は、マウスなどの小型の哺乳動物の解剖学よりヒト解剖学に類似する一方で、非ヒト霊長動物における研究を興味深いものとするものの、ヒトにおける臨床結果を予測しない限界も存在する。上記で言及した通り、本実施例における研究では、動物が、レーザー損傷がなければ健康な網膜組織を有する、レーザー損傷モデルを使用する。網膜組織は、経時的に疾患の網膜組織内で退化することも、疾患特異的な病原性因子が存在することもなかった。非ヒト霊長動物は、生体内分布、薬物動態、ならびに用量依存性、抗体力価、免疫応答および炎症応答に関して、予測可能でない形でヒトと異なる頻度が高い。さらなる差異は、ＩＬＭ（内境界膜：ｉｎｎｅｒ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）、およびヒトでは本研究において使用される非ヒト霊長動物の約４倍である硝子体腔の容量を含む。網膜と硝子体との間の輸送を限定するように作用する障壁であるヒト内境界膜は、サルのＩＬＭより根本的で有効な障壁である。
【０３６０】
（実施例６）
安全性研究
これらの研究では、ｓＦＬＴ−１タンパク質を検出するための酵素免疫測定アッセイキットを使用して、ｓＦＬＴ−１タンパク質を、動物の硝子体中および血漿中で測定した。ｓＦＬＴ−１タンパク質レベルは、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を注射された動物の硝子体内および眼内で上方調節された。図３Ａは、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を注射されたサルの眼（左眼）およびｒＡＡＶ．ｇｆｐを注射された対照のサルの眼ならびに注射されなかったサルの眼（右眼）の硝子体内のｓＦＬＴ−１タンパク質レベルを示す。ｓＦＬＴ−１タンパク質レベルは、５例のｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を注射された眼のうちの４例において著明に高かった。表５．３．１は、注射されなかったマウスの眼内、およびｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を注射されたマウスの眼内、および注射の１カ月後において除核されたマウスの眼内のｓＦＬＴ−１タンパク質レベルを示す。マウスの眼およびサルの硝子体におけるｓＦＬＴ−１の過剰発現は、それらの全体的な健全性に対していかなる有害作用も及ぼさなかった。サルでは、硝子体中のｓＦＬＴ−１の過剰発現は、それらの網膜機能に対していかなる影響も及ぼさず、眼に対して臨床的または組織学的に明らかな毒性効果も及ぼさなかった。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を注射された眼における有意に高いｓＦＬＴ−１タンパク質レベルは、長期にわたるｒＡＡＶを媒介するｈｓＦＬＴ−１の発現を示唆し、注射の１７カ月後のサルの網膜におけるウイルス性ｍＲＮＡ配列の検出およびｒＡＡＶに媒介されるｇｆｐ発現の存在についての既往のデータを裏付ける。
【表１】
2018015008.tif 000002
【０３６１】
サルにおける血漿ｈｓＦＬＴ−１レベルは、異なるサンプリング時点において、いかなる傾向も示さなかった（図３Ｂ）。これは、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の注射が、血漿ｈｓＦＬＴ−１レベルに対して明白な影響を及ぼさなかったことを示唆する。レベルの変動は、任意のサルの健全性に対していかなる影響も及ぼさなかった。
【０３６２】
【表２】
2018015008.tif 000003
表２：免疫原性研究において使用される動物株、注射経路、持続期間、およびｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の用量の概要
【０３６３】
（実施例７）
マウスについての免疫原性研究
フローサイトメトリーを使用して、注射の１、２、および４週間後におけるマウスの眼内の、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１治療に対する細胞性免疫応答を評価した。浸潤白血球は、ＣＤ４５の発現に基づき同定し、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ４、およびＣＤ８のそれぞれの発現に基づき、単球／顆粒球、Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞として分類した。後部眼杯を、各群内５匹のマウス（ｒＡＡＶ．ｓＦＬＴ−１を注射されたマウス、ＰＢＳを注射された対照マウス、注射されない対照マウス）から回収し、解析のためにプールした。図４Ａに示す通り、この実験の経過にわたり、各群のマウスから回収される細胞の数には差異が見られない。しかし、注射の１および２週間後において、ＣＤ４５＋細胞の数の有意な増大が見られたが、これは、４週間後までに消滅した（図４Ｂ）。ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、およびＣＤ１９＋細胞の数（図４Ｄ〜Ｆ）の差異が見られないので、１週間後において見られた増大のほとんど全ては、ＣＤ１１ｂ＋細胞の増大に帰せられうるであろう（図４Ｃ）。２週間後において、ＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を注射されたマウスの眼に存在するＣＤ１１ｂ＋の数に有意差はもはや見られなかったが、代わりに、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数の有意な増大、ならびにＢ細胞の増大への可能な傾向が見られた。ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の数は、４週間後において急激に減少したが、ＰＢＳを注射されたマウスおよび注射されなかったマウスと比較した著明な増大を維持した。これに対し、この実験の経過において、脾臓内のＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、およびＣＤ１９＋細胞の数の変化は見られなかった（図５Ａ〜Ｅ）。
【０３６４】
網膜に浸潤するＴ細胞の機能を、それらをＰＭＡ／イオノマイシンまたは抗ＣＤ３で刺激し、フローサイトメトリーを介して細胞内ＩＦＮ−ガンマ産生を測定することにより緊密に調べた。図６は、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を注射した後、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の小部分が、注射されない対照と比較して、ＩＦＮ−ガンマを産生するようにプライミングされたことを示す。ＩＦＮ−ガンマ産生細胞の頻度は、３日目におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の見かけの増大にもかかわらず、実験の経過にわたり、著明には変化しなかった（図６Ｂ）。Ｔ細胞を、ｒＡＡＶカプシドタンパク質のクラスＩ  ＭＨＣ制限エピトープで再刺激したところ、低レベルのＩＦＮ−ガンマが測定され、また、いかなる刺激の不在下（データは示さない）でも、ある程度のＩＦＮ−ガンマが検出された。まとめると、これらの結果は、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を注射されたマウスの眼に浸潤するＴ細胞の小部分は、ＩＦＮ−ガンマを産生するように新たに活性化されたが、これは、この実験の経過において、Ｔ細胞サブセットの間で変化しなかったことを指し示す。
【０３６５】
ＡＡＶ−ｓＦＬＴ−１を注射されたマウスの眼への免疫細胞の浸潤に関するこれらの実験について提示されたデータは、細胞浸潤の２つの波を明確に示す。１週間後におけるＣＤ１１ｂ＋細胞による初期波の後、２週間後において、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞による波が見られた。重要なことは、浸潤のいずれの波も、４週間後にはもはや存在しなかったことから、浸潤はそれ自体で消失したと示唆されることである。重要なことは、ｓＦＬＴ−１タンパク質の産生が、この時点で減衰したわけではなく、極めて高レベルで発現し続けたことである。
【０３６６】
ＩＦＮ−ガンマ産生についてのデータは、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの約５％が、新たにプライミングされたものであり、この頻度は、実験の経過にわたり変化しなかったことを指し示した。Ｈｕらは、活性化Ｔ細胞による血液網膜関門の破断について最初に記載し、本明細書で提示したデータは、活性化ＣＤ４＋細胞および活性化ＣＤ８＋細胞の浸潤と符合する。しかし、特異的なペプチドによる再刺激だけが、実験の経過にわたり変化しない低レベルのＩＦＮ−ガンマ産生を明らかにしたので、この集団内における、カプシド特異的なＴ細胞の数の増大の証拠は見られなかった。まとめると、これらの観察は、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の注射により生じた初期の刺激は、免疫細胞浸潤の短命の波を生み出したが、４週間以内にそれ自体で消失し、眼の組織に有害な可能性があり、ｓＦＬＴ−１の発現に影響を及ぼしうる、進行中の免疫応答を誘発しなかったことを示唆する。
【０３６７】
（実施例８）
サルについての免疫原性研究
免疫細胞サブセット集団の変化を同定する抗体のパネルを使用して、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１またはｒＡＡＶ．ｇｆｐの網膜下注射後における免疫応答を解析した。結果を、図４にまとめる。何匹かのサルでは、免疫細胞サブセット集団の極めて小さな変化が観察されたが、それらは、統計学的に有意ではなかった。この結果にもかかわらず、この後、循環細胞についてのより徹底された研究を行った。具体的には、本発明者らは、ベクター（ｒＡＡＶ）または挿入される遺伝子産物（ｓＦＬＴ−１）が、免疫の活性化を引き起こしうる可能性について評価した。Ｂ細胞およびＴ細胞の活性化について探索した（図５および図６）。他のリンパ球集団もまた解析して、治療が、直接的な活性化または活性化に対する応答の指標でありうる観察可能な差異を引き起こすのかどうかを決定した。解析は、古典的なマーカーの組合せ（Pitcher、２００２年、１２９頁）のほか、近年公表された
報告（Miller、２００８年、１２６頁）において記載されている新規の表現型解析を使用して行った。表現型マーカーの小さなサブセット（ＨＬＡ−ＤＲ、Ｋｉ−６７、およびＢｃｌ−２）を使用して、本発明者らは、ｒＡＡＶ−ｓＦＬＴ−１の投与後において、ＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＢ細胞が、活性化の徴候を示すのかどうかについて探索した。Ｍｉｌｌｅｒらにより公表された研究では、活性化Ｔ細胞は、分化マーカーであるＨＬＡ−ＤＲ、および増殖についてのマーカーとして使用される、細胞周期に関連する核抗原であるＫｉ−６７の発現を特徴とする、活性化したエフェクターの表現型を提示する。休眠Ｔ細胞は、Ｋｉ−６７を発現させないのに対し、循環Ｔ細胞または新たに分裂したＴ細胞は、Ｋｉ−６７の発現を上方調節する。Ｋｉ−６７発現のレベルは通常、ホメオスタシス細胞の循環の一部として検出される。
【０３６８】
（実施例９）
ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の生体内分布
ゲノムＤＮＡは、サルを安楽死させた直後に回収された組織（視神経、リンパ節、脳、心臓、肺、脾臓、肝臓、角膜）から抽出した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を、ゲノムＤＮＡについて実施して、網膜下腔に注射したｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１ベクター構築物が、別の部位に存在するのかどうかを決定した。既知量の対照プラスミドであるｐｓｓｖ．Ｃ１．ｓｆｌｔ−１  ＤＮＡにおけるＣｔ値の比較に基づき、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１構築物は、注射された一方の眼の視神経において低遺伝子コピー数で見出されたが、他の組織試料のうちのいずれにおいても見出されなかった。これは、網膜下腔へと注射されたｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１が、主に眼内に滞留していることを示唆する。表４は、注射されなかったサル、またはｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を注射されたサル、およびｒＡＡＶ．ｇｆｐを注射されたサルから抽出されたゲノムＤＮＡによるＣｔ値の概要である。
【表３−１】
2018015008.tif 000004
【表３−２】
2018015008.tif 000005
【表３−３】
2018015008.tif 000006
【０３６９】
（実施例１０）
網膜血管新生のマウスモデルについての有効性研究
光受容体細胞内のＶＥＧＦの上方調節を介して生成されたトランスジェニックマウスを、研究において使用した。一方の眼には、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を注射し、反対側の眼には、ｒＡＡＶ．ｇｆｐを注射した。盲検化された観察者を介して、合意されたスケールに基づき、血管新生の程度、強度、および段階をグレード付けした。結果は、注射の１カ月後において、３（重度）の中央値から、注射の１カ月後における１（軽度）の中央値への、血管新生グレードの、統計学的に有意な全体的低減（Ｐ＝０．０１２）が見られることを示した。この低レベルのフルオレセイン漏出が、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を注射した３カ月後（中央値＝１；Ｐ＝０．００１）および８カ月後（中央値＝１；Ｐ＝０．００１）において維持されたことから、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の、長期にわたる持続的な治療効果が示唆される。
【表４−１】
2018015008.tif 000007
【表４−２】
2018015008.tif 000008
【０３７０】
（実施例１１）
レーザー誘導型脈絡膜血管新生のサルモデルについての有効性研究
５匹のサルの一方の眼にｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を注射し、他方の眼にｒＡＡＶ．ｇｆｐを注射した。サルのうちの１匹の右眼では、網膜下注射は奏効せず、したがって、この動物をさらなる査定にかけなかった。４０〜１００μｌのｒＡＡＶ懸濁液の網膜下注射により網膜を持ち上げ、色素上皮と光受容体層との間にベクターを収容するブレブを、限局性の様式で創出した。このブレブは、２４〜４８時間以内に自己補正された。注射針穿通点における、網膜色素上皮に対する微小な撹乱を除き、他の網膜の異常は、追跡期間（注射後３〜１７カ月）にわたり観察されなかった。他の異常または有害事象も観察されず、いかなる時点においても、手術と関連する網膜剥離は観察されなかった。
【０３７１】
次いで、ｒＡＡＶｓＦｌｔ−１の長期にわたる治療有効性を評価するため、４匹の注射されたサルを、ベクターによる処置の１６カ月後において、強いレーザー光凝固にかけた。各眼において、レーザーを使用して、８カ所の病変を誘導し、次いで、レーザー処置の２および４週間後に、眼を脈絡膜血管新生についてモニタリングした。レーザー光凝固の後、４匹中３匹のサルだけが解析可能であり、したがって、３匹の動物について、有効性データを回収した。ｒＡＡＶｓＦｌｔ−１で処置された３例のサルの眼のうちのいずれも、脈絡膜血管新生関連病変を発症せず、弱いフルオレセイン染色だけが観察されたことから、漏出／血管新生は最小限であることが指し示される。対照ベクターで処置された、全ての反対側の眼は、脈絡膜血管新生関連病変を発症した。３匹の動物についての有効性データを表５に示す。
【表５】
2018015008.tif 000009
サルの網膜機能は、網膜電図写真により評価した。注射された眼および注射されなかった反対側の眼の応答に由来する振幅および陰的時間を計算し、注射前と、注射後の異なる時点とで比較した。結果は、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１、組換えｓＦＬＴ−１タンパク質、またはｒＡＡＶ．ｇｆｐの注射が、サルの網膜機能に対していかなる有害作用も及ぼさないことを示した。
【０３７２】
（実施例１２）
滲出型ＡＭＤの処置における標準的ケアは、組換え抗ＶＥＧＦタンパク質の、４〜８週間ごとの高頻度の眼内注射に関与する。ｒＡＡＶ構築物は、滲出型ＡＭＤを処置するための、強力な（Ｋｄ≒１０ｐＭ）、自然発生の抗ＶＥＧＦタンパク質である、可溶性Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（ｓＦｌｔ−１）のために開発された。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１は、ＵＮＣ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて、ＦＤＡおよびＩＣＨによるガイドラインに従い産生した。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の安全性および有効性についての、８例の患者による対照研究を行った。研究のための適格性基準、組入れ基準、および除外基準は、以下の通りであった。
【０３７３】
適格性基準
研究に適格な年齢：６５歳以上
研究に適格な性別：男女
健常ボランティアの受け入れ：なし
【０３７４】
組入れ基準：
・年齢が６５歳以上であること；
・ＡＭＤに続発する中心窩下ＣＮＶを有し、他方の眼における最高の補正視力が、２０／８０〜２０／４００以上であること；
・被験眼のフルオレセイン血管造影図が、漏出する中心窩下脈絡膜新生血管性病変の証拠を示さなければならないこと；
・抗ＶＥＧＦの硝子体内注射の候補者でなければならないこと；
・病変全体の大きさが、黄斑光凝固研究（Ｍａｃｕｌａｒ  Ｐｈｏｔｏｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ）による円板面積で１２を超えてはならないこと；
・過去に光力学療法またはレーザーによる網膜の処置を施されていないこと；
・インフォームドコンセントを提供することが可能なこと；
・参加者が、登録の時点において、臨床的に許容可能な検査室パラメータおよびＥＣＧを示すこと；ならびに
・追跡来院を含むプロトコール要件を順守することが可能なこと。
【０３７５】
除外基準：
・肝臓酵素＞正常の上限の２倍であること；
・アデノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、もしくはＣ型肝炎ウイルス、またはＨＩＶウイルスを含む任意の種類の活性感染の臨床的証拠があること；
・被験眼／対照眼において、ＡＭＤのための、抗ＶＥＧＦ注射を除く、任意の先行する処置が施されていること；
・網膜色素上皮内に裂傷があること；
・広範な黄斑下瘢痕組織が見られること；
・糖尿病性網膜症または網膜静脈閉塞症など、中心窩下ＣＮＶ、ＡＭＤ以外の著明な網膜疾患を有すること；
・眼の萎縮または白内障など、著明な非網膜疾患を有すること；
・フルオレセインに対するアレルギーが既知であること；
・プレドニゾロン、他の抗炎症性ステロイド剤、または免疫抑制薬を現在使用していること。アスピリンなどの非ステロイド薬が許容されていること；
・治験責任医師の所見で、研究への参加のために参加者を危険にさらしうるか、または研究の結果もしくは研究に参加する参加者の能力に影響を及ぼしうる、他の任意の著明な疾患または障害を有すること；
・過去１２週間以内に、被験生成物を伴う別の研究に参加したことがある参加者であること；および
・ペニシリン感受性があること。
【０３７６】
投与手順：ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を含有する医薬組成物を、網膜下注射に適切な状況下にある被験対象へと、以下の手順：
１．ドレーピングの前に、対象の眼周囲の皮膚および眼瞼縁辺部および睫毛を、５％のポビドンヨウ素で清浄化し；
２．滅菌全身用ドレープをかけた後で、さらに眼用ドレープをかけ；
３．眼瞼鏡を挿入し、睫毛を視野から遠ざけ、視野が眼用ドレープで保護されるように、眼瞼鏡が眼瞼の下にうまく配置されていることを確認し；
４．２３Ｇまたは２５Ｇの硝子体切除術用ポートを３つ挿入し；
５．生理食塩水注入部を第１のポートへと接続し；
６．光ファイバーを第２のポートへと挿入し；
７．３６Ｇ〜４１Ｇの網膜下カニューレを薬物シリンジへと、第３のポート内のマイクロコネクターを介して接続し；
８．顕微鏡制御下で、１００マイクロリットルを網膜下に注射し；
９．注射後、器具およびポートを引き抜き；
１０．クロラムフェニコール軟膏を適用し；
１１．滅菌単回使用容器からの１％のアトロピン滴下剤を、滴下し；
１２．眼用パッドおよび眼用シールドを適用する
に従い投与した。
【０３７７】
ここでは、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１研究の結果についてまとめる。８例の登録対象（平均年齢：７７歳）全ては、活性の中心窩下脈絡膜血管新生を有し、視力が２０／４０〜２０／４００であり、１〜２５回の間のラニビズマブの硝子体内注射をあらかじめ施されていた。患者は、対照群および２つの被験群である３つの群へと無作為に分配した。全ての患者には、研究の１日目および３０日目に、ラニビズマブの硝子体内注射を施した。７日目に、１００ｕｌの容量中に１×１０１０のｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１ベクターゲノムを、網膜下注射を介して、第１の被験群へと投与し、１００ｕｌの容量中に１×１０１１のｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１ベクターゲノムを、網膜下注射を介して、第２の被験群へと投与した。被験群内の患者６例全てにおいて、網膜下流体のブレブは、４時間以内に消失した。２４時間後、硝子体中の空気の大半は吸収され、網膜の注射部位だけが依然として目視可能であった。１例の患者が、手順と関連する軽度の出血を発症したが、これは視覚に影響を及ぼさなかった。予測される通り、硝子体切除術後において、好中球カウントの一過性の増大が見られたが、これは、注射の１４日後までに正常へと戻った。ベクター配列は、注射の１日後において、１例の対象の涙液中で見出されたが、これは、３０日目までにクリアランスされた。これまでに、この単回の発生以外に、ＡＡＶ２は、対象の血液、唾液、または尿試料のうちのいずれにおいても、ｑＰＣＲまたはＥＬＩＳＡにより検出されなかった。自然発生のｓＦＬＴ−１タンパク質のバックグラウンドレベルは、尿中、血清中、および唾液中で大きなベースラインのばらつきを示したが、処置後においては増大しなかった。硝子体中のｓＦＬＴ−１レベルはまた、対象間でも変化した（９７５〜２０８５ｐｇ／ｍｌ）。血液生化学、全血球計算、およびＴ細胞応答は、ベースラインと比較して、いかなる有意な変化も伴わずに維持された。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の網膜下注射は、２カ月間にわたる連続的眼科検査により評価される、臨床的に重大な網膜毒性を示さなかった。表面、前部、または硝子体における炎症性徴候は、対象のうちのいずれにおいても存在しなかった。患者のうちのいずれにおいても、視力の喪失、ＩＯＰの上昇、網膜剥離、または任意の眼内もしくは全身免疫応答の証拠は見られなかった。初期処置および救済処置の両方である、抗ＶＥＧＦ処置の概要を、表６において、各患者についてまとめる。
【表６】
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【０３７８】
被験群内の患者のうちのいずれも、６０日目において救済処置を要求せず、低用量被験群における患者の大半も、９０日目、１２０日目、１５０日目、１８０日目、または２１０日目、または２７０日目、または３６５日目（１年後）において要求した救済処置が０回であったことは注目に値する。対照の患者は、複数回の救済処置を要求した。これらの結果は、予測外であり、遺伝子治療の有望性を、滲出型ＡＭＤを患う老齢患者の大型のコホートへと拡張する。一般に、ＶＥＧＦ阻害剤タンパク質または他の抗ＶＥＧＦ剤の硝子体内注射など、現行の抗ＶＥＧＦ療法で処置された患者は、３０、６０、または９０日間のうちに、さらなる注射を要求するであろう。
【０３７９】
被験対象または患者におけるｓＦＬＴ−１の最高発現レベルには、ｒＡＡＶ．ｓＦＬＴ−１の網膜下投与の６〜８週間後に到達する。このいわゆる「ランプアップ」期間において、少なくとも１、２、または３回にわたる抗ＶＥＧＦ剤の硝子体内注射を、１５〜４５日間隔で注射し、好ましくは約３０日間隔で注射して、疾患の進行を防止する。抗ＶＥＧＦ剤の１回目の硝子体内注射は、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の投与の１〜３０日間の間前に投与し、好ましくはｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の投与の５〜１０日間の間前に投与して、硝子体内注射された抗ＶＥＧＦ剤（ＬｕｃｅｎｔｉｓもしくはＡｖａｓｔｉｎもしくはＥｙｌｅａまたは他のｓＦＬＴ以外の薬剤）の吸収を可能とすることが好ましい。この１回目の硝子体内注射を、ｒＡＡＶ．ｓＦＬＴの網膜下投与前の２４時間未満に投与する場合、この１回目の硝子体内注射は、網膜下注射手順時に、硝子体からウォッシュアウトすることができるが、抗ＶＥＧＦ剤の濃度を治療濃度未満とし、疾患の進行をもたらす場合がある。
【０３８０】
ランプ期間が完了した後、それらのＡＭＤを処置するか、またはそれらのＡＭＤの進行を防止するのに十分なｓＦＬＴ−１を発現させる患者は、さらなる硝子体内抗ＶＥＧＦ注射を必要としない場合もあるが、それらの注射は、医師のケアの下で依然としてなされることが予期される。患者は、光コヒーレンストモグラフィーによる中心点網膜厚の測定値の増大などの客観的基準に基づく必要ベースで、モニタリングおよび処置される。
【０３８１】
本研究では、対照群および被験群の両方における患者を、活性の脈絡膜血管新生の徴候について約１カ月ごとのベースで査定し、以下の基準：
・対象の前回の来院（網膜性原因に帰することが可能な）からの、ＥＴＤＲＳ（糖尿病網膜症早期治療研究）文字の減退が＞１０であるか、または機能喪失に対する患者の知覚と共に、前回の来院からの、ＥＴＤＲＳによる文字の減少が＞５であること；
・ＯＣＴ時において、感覚網膜下、網膜色素上皮（ＲＰＥ）下、または網膜内において、流体の任意の新たな増大または増大の遷延がみられること；
・ＦＡを介するＣＮＶからの漏出の増大の徴候が見られることのうちのいずれかが満たされた場合は、硝子体内ラニビズマブで再処置した。
【０３８２】
（実施例１３）
光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）
スペクトルドメイン光コヒーレンストモグラフィー（ＳＤ−ＯＣＴ：ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）は、承認されている装置（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ（登録商標）ＳＤ−ＯＣＴ）、ならびに患者の中心点網膜厚および網膜内の流体漏出をモニタリングする標準的な技法を使用して実施した。
【０３８３】
光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ：ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）とは、超音波およびＭＲＩと同様に、非接触型の医用造影技術である。ＯＣＴでは、反射光を使用して、眼の詳細な断面画像および三次元画像をもたらす。ＳＰＥＣＴＲＡＬＩＳ（登録商標）ＳＤ−ＯＣＴは、あるスペクトルにわたる複数波長の反射光を同時に測定するので、スペクトルドメインの名称がある。走査の速度および回数の増大は、高解像度および疾患を観察する可能性の増大へと変換される。滲出型ＡＭＤを伴う患者では、新たな網膜内流体の検出または臨床的に重大な網膜厚の増大を、ＳＤ−ＯＣＴにより検出することができる（Adhiら、Curr  Opin  Ophthalmol.、２０１３年５月、
２４巻（３号）、２１３〜２１頁;  Malamosら、Invest  Ophthalmol  Vis  Sci.、２０
０９年１０月、５０巻（１０号）、４９２６〜３３頁）。ＡＭＤを伴う患者におけるこれらの症状の検出は、ＬｕｃｅｎｔｉｓまたはＥｙｌｅａなどの抗ＶＥＧＦ療法による処置を正当化する疾患の進行を指し示す。
【０３８４】
研究中の各対象の網膜の健康およびＡＭＤ進行の症状は、ＳＤ−ＯＣＴを介してモニタリングした。各回約６ｍｍの長さにわたる、黄斑内の少なくとも６回にわたる放射状の走査を行い、各回の指定された来院時にＯＣＴ画像／走査を回収した。ＳＤ−ＯＣＴ画像は、盲検化された解読者を介して、網膜内流体の存在について査定し、網膜中心厚は、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｈｅｙｅｘ  ＳＤ−ＯＣＴソフトウェアを使用して測定した。各回の来院の８例の患者についての網膜中心厚の結果を、下記の表７に示す。
【表７】
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【０３８５】
表７に示す通り、全ての投薬コホート内の対象の平均網膜中心厚は、プロトコールにより要求される、研究の開始時における抗ＶＥＧＦタンパク質（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）の硝子体内注射を投与した後で減少した。予測される通り、対照群における患者の網膜中心厚は増大し始め、抗ＶＥＧＦタンパク質を投与して３０〜９０日間以内に、ＳＤ−ＯＣＴ画像上で流体を見ることができる。予測外のことに、低用量群および高用量群における対象の網膜中心厚は一般に、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１により良好にコントロールされ、経時的に増大することはない。新たな網膜内流体は、低用量群対象または高用量群対象の網膜内では生じない。これは、例えば、図２４におけるＯＣＴにより示される。１２カ月後において、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１で処置された対象の網膜中心厚は、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１を含む医薬組成物を投与した１２カ月以内に、５０ミクロンを超えて、または１００ミクロンを超えて、または２５０ミクロンを超えて増大することがなかった。ベースラインに照らして比較した場合に、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１で処置されたヒト対象の網膜中心厚は、５０ミクロン、または場合によっては１００ミクロン、または場合によっては２００ミクロン減少した。この減少は、ｓＦｌｔ−１を投与した８週間以内に観察され、３カ月間、６カ月間、９カ月間、および１２カ月間にわたり維持された。この結果は、驚くべきことであり、ヒト対象におけるＡＭＤおよび眼の血管新生の臨床処置では知られていなかった。より一般に、抗ＶＥＧＦタンパク質または他のＶＥＧＦ阻害剤阻害剤のさらなる投与を伴わなければ、３０日間、６０日間、９０日間、または１８０日間にわたる初期抗ＶＥＧＦ処置を伴っても、網膜内流体および網膜中心厚の増大が観察されるであろう。
【０３８６】
蛍光眼底血管造影法（ＦＡ）
標準的な技法を使用して、ＦＡを実施した。被験眼の推移画像を撮影する。被験眼および非被験眼の中期および後期の画像を撮影するが、ＦＡは、各回の指定された来院時に得る。
【０３８７】
生体内分布研究
涙液、血漿、尿、および唾液による試料から単離されたベクターゲノムを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）で増幅することにより、ベクターの播種を探索した。ベクターおよびｓＦＬＴ−１の生体内分布は、血漿中、涙液中、および唾液中のｓＦＬＴ−１およびＡＡＶ２カプシドについてのＥＬＩＳＡにより探索した。
【０３８８】
ＤＮＡの抽出
試料（１００〜３００ｕｌ）を、Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃａｒｄｓ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）または滅菌フォームチップアプリケーターへとピペティングした。製造元のプロトコールに従い、ＤＮＡを、各試料から抽出した。精製されたＤＮＡを、５０ｕｌの溶出緩衝液中に溶解した。存在するＤＮＡの量は、分光光度計により決定した。
【０３８９】
リアルタイムＰＣＲによるｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の検出
ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して、ゲノムＤＮＡ試料（０．５〜１μｇ）を、ＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１のベクターの存在についてスクリーニングした。アッセイは、ＡＡＶ２配列とｓＦＬＴ−１配列との間の断片を増幅する非標識ＰＣＲプライマーの対、ならびにＦＡＭ（商標）色素標識またはＶＩＣ（登録商標）色素標識を伴うＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、ならびに５’端における副溝結合剤部分および３’端における非蛍光消光剤色素からなる。サイクリング条件は、５０℃で２分間にわたって１ホールドおよび９５℃で２０秒間にわたって別のホールド、続いて９５℃で３秒間および６０℃で３０秒間を４５サイクルであった。
【０３９０】
ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１断片について陽性の試料をさらに調べ、存在するｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の遺伝子コピー数を、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により定量化した。ＩＱ５  Ｂｉｏ−ＲａｄリアルタイムＰＣＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を使用して、０．５〜１．０ｕｇの間の抽出されたＤＮＡを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ−ＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）および０．５ｕＭの各プライマーを含有する２０ｕｌの反応ミックス中で増幅した。標的配列を含有するプラスミドＤＮＡでスパイクした同様の試料のセットを、スパイクされた試料と並行して用意した。使用されたプライマー対（フォワード：ＣＡＣＴＡＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＧＴＧＧＡ；リバース：ＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣ）は、Ｐｒｉｍｅｒ３  Ｏｕｔｐｕｔ（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を一助として、ベクターｃＤＮＡに由来する領域を、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ（Ｃｏｒｂｅｔｔ）を使用して、ｓＦＬＴ−１遺伝子へと増幅するようにデザインした。使用したサイクリング条件は、以下の通りであった。５０．０℃で２分間、９５．０℃で２分間、および９５．０℃で２０秒間、６０．０℃で２０秒間および７２．０℃で２０秒間による３ステップサイクル６０回であった。検量線は、同じ標的ベクター配列を有するプラスミドＤＮＡ（ｐＳＳＶ．ｓＦｌｔ−１）の１０倍希釈液による各試行において作成した。各試料を三連で解析した。
【０３９１】
ｓＦｌｔ−１タンパク質濃度のＥＬＩＳＡによる定量化
血漿中、涙液中、および唾液中に存在するｓＦＬＴ−１の濃度は、サンドイッチイムノアッセイ法に基づくＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用して、ＥＬＩＳＡにより定量的に測定した。試料（１００ｕｌ）を、ＶＥＧＦ  Ｒ１／ｓＦＬＴ−１に特異的なモノクローナル抗体でコーティングした９６ウェルプレートへと添加し、２時間にわたりインキュベートさせた。結合していないｓＦＬＴ−１は、緩衝液で洗浄することにより除去した。酵素に連結したＶＥＧＦ  Ｒ１／ｓＦＬＴ−１に特異的なポリクローナル抗体とのインキュベーションの後、過剰量の抗体−酵素コンジュゲートを洗い落とし、次いで、試料を基質溶液と共にインキュベートした。酵素により触媒される色原体の形成を、４５０ｎｍにおける可視光の吸光度を測定することにより定量化した。試料中のｓＦＬＴ−１の濃度（ｐｇ／ｍＬ単位の）は、組換えヒトｓＦＬＴ−１でプロットした検量線を使用して、吸光度値から計算した。
【０３９２】
ＥＬＩＳＡによるＡＡＶ２の検出
ＡＡＶ２  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｌｍｏｎｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を使用して、血漿中、涙液中、尿中、および唾液中のＡＡＶ２カプシドの存在を解析した。このキットは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法に基づき、アセンブルされたＡＡＶ粒子上のコンフォメーションエピトープに特異的なマウスモノクローナル抗体を使用する。このモノクローナル抗体は、マイクロプレートストリップ上にコーティングし、ＡＡＶ粒子を検体から捕捉するのに使用する。捕捉されたＡＡＶ粒子は、２ステップで検出した。まず、ビオチンでコンジュゲートした、ＡＡＶに対するモノクローナル抗体を、免疫複合体へと結合させた。第２のステップでは、ストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートを、ビオチン分子と反応させる。基質溶液を添加する結果として、特異的に結合したウイルス粒子に応じた色彩反応がもたらされる。吸光度は、４５０ｎｍにおける光度法により測定した。提供されたキットの対照は、空のカプシドのＡＡＶ粒子調製物を含有し、粒子力価が未知の試料を定量的に決定することを可能とした。試料（１００ｕｌ）を、プレートへと添加し、アッセイは、製造元のプロトコールに従い実行するものとした。
【０３９３】
ＡＡＶ−２中和抗体の検出
血漿を、ＨＥＫ２９３細胞への、ＡＡＶ２．ｇｆｐの形質導入を遮断する能力についてアッセイした。患者の血漿を、マルチウェルプレート内の正常マウス血清中で系列希釈した。ＡＡＶ２．ｇｆｐを、各ウェルへと添加し、ＨＥＫ２９３細胞へと三連で添加する前に、プレートを、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。中和抗体力価は、ＡＡＶ２−ｇｆｐによる形質導入の５０％の阻害を結果としてもたらす血漿希釈率として表した。最大ｇｆｐ活性は、正常マウス血清中で希釈されたベクターで表し、最大阻害は、正常マウス血清中の培地だけで表した。各対象に由来するベースラインの血漿を、各術後試料と共にアッセイした。４８時間後における被験ウェル内の、２９３Ｔ細胞への、ＡＡＶ２．ｇｆｐの形質導入による緑色細胞をカウントし、ベースラインの血清試料中の緑色細胞の数と比較した。
【０３９４】
抗ＡＡＶ２抗体の検出
ＡＡＶ２カプシドに対する血漿中抗体を検出するために、タンパク質結合増強型ＥＬＩＳＡプレートを、１０９ｖｇ／ｍｌのＡＡＶ２（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）で、４℃で一晩にわたりコーティングした。プレートを、３７℃で２時間にわたりブロッキングし、次いで、系列希釈した抗ＡＡＶ２モノクローナル抗体（Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＭＡ）、または患者の血漿の１：５０希釈液、１：１００希釈液、１：２００希釈液、もしくは１：４００希釈液と共に、４℃で一晩にわたりインキュベートした。プレートを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）でコンジュゲートした抗ヒトＩｇと共に、３７℃で２時間にわたりインキュベートし、次いで、テトラメチルベンジジン（ＴＭＰ）基質および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）と共にインキュベートした。反応は、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）により停止させ、プレートリーダー上４５０ｎｍで読み取った。抗ＡＡＶ２抗体の力価は、並行して決定した市販抗体の検量線に基づき計算した。各値は、三連で決定した。
【０３９５】
地図状萎縮
ヒト被験対象を、それらの処置された眼および処置されていない眼における地図状萎縮の徴候について、標準的な技法に従い検討した。ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１で処置された患者における地図状萎縮の増大は、３カ月、６カ月、９カ月、または１２カ月後には観察されなかった。処置は、処置された眼における地図状萎縮の進行を、最大で１５カ月、１８カ月、２４カ月、３６カ月、５年間および１０年間にわたり停止させうることが仮定される。
【０３９６】
（実施例１４）
被験滲出型ＡＭＤおよび脈絡膜血管新生を処置するための、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の安全性および有効性をさらに調べるために、４０例のさらなる対象を、対照臨床研究に登録した。実施例１２の場合の通り、ｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１は、ＵＮＣ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  Ｈｕｍａｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて、ＦＤＡおよびＩＣＨによるガイドラインに従い産生した。研究のための適格性基準、組入れ基準、および除外基準は、以下の通りであった。
【０３９７】
適格性：
研究に適格な年齢：５５歳以上
研究に適格な性別：男女
健常ボランティアの受け入れ：なし
【０３９８】
組入れ基準：
・年齢が５５歳以上であること；
・ＡＭＤに続発する中心窩下ＣＮＶを有し、被験眼における最高の補正視力が、２０／３０〜２０／４００であり、他方の眼における最高の補正視力が、２０／２００以上であること；
・被験眼のフルオレセイン血管造影図が、漏出する中心窩下脈絡膜新生血管性病変の証拠を示さなければならないこと；または脈絡膜血管新生が、現在抗ＶＥＧＦ療法による能動的な管理下にあること；
・抗ＶＥＧＦの硝子体内注射の候補者でなければならないこと；
・病変全体の大きさが、黄斑光凝固研究による円板面積で１２を超えてはならないこと；
・過去に光力学療法またはレーザーによる網膜の処置を施されていないこと；
・インフォームドコンセントを提供することが可能なこと；
・参加者が、登録の時点において、臨床的に許容可能な検査室パラメータおよびＥＣＧを示すこと；ならびに
・追跡来院を含むプロトコール要件を順守することが可能なこと。
【０３９９】
除外基準：
・肝臓酵素＞正常の上限の２倍であること；
・アデノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、もしくはＣ型肝炎ウイルス、またはＨＩＶウイルスを含む任意の種類の活性感染の臨床的証拠があること；あるいはＢ型肝炎またはＣ型肝炎の履歴が記録されていること；
・被験眼／対照眼において、ＡＭＤのための、抗ＶＥＧＦ注射を除く、任意の先行する処置が施されていること；
・網膜色素上皮内に裂傷があること；
・治験責任医師により決定される、被験眼内に広範な中心窩下瘢痕化、広範な地図状萎縮、または網膜下血液の増粘が見られること；
・被験眼における視覚を損ないうる、糖尿病性網膜症または網膜静脈閉塞症など、中心窩下ＣＮＶ、ＡＭＤ以外の著明な網膜疾患を有すること；
・被験眼における眼の萎縮または著明な白内障などであり、視力に影響を及ぼす中心角膜の瘢痕化、視野欠損を伴う緑内障、または任意の測定可能なブドウ膜炎を含む、著明な非網膜疾患を有すること；
・フルオレセインに対するアレルギーが既知であること；
・プレドニゾロン、他の抗炎症性ステロイド剤、または免疫抑制薬を現在使用していること。吸入用ステロイドおよびアスピリンなどの非ステロイド薬が許容されていること；
・治験責任医師の所見で、研究への参加のために参加者を危険にさらしうるか、または研究の結果もしくは研究に参加する参加者の能力に影響を及ぼしうる、他の任意の著明な疾患または障害を有すること；
・過去１２週間以内に、被験生成物を伴う別の研究に参加したことがある参加者であること；および
・参加者の医療記録により確認される、ペニシリン感受性があること。
【０４００】
初期登録対象は、活性の中心窩下脈絡膜血管新生を有し、被験眼における視力が２０／３０〜２０／４００であり、０〜２５回の間のラニビズマブの硝子体内注射をあらかじめ施されていた。患者は、１４例の対照患者および２６例の被験患者の全てを登録するまで、対照群または被験群へと無作為に分配した。全ての患者には、研究の１日目および３０日目に、ラニビズマブの硝子体内注射を施した。７日目に、１００ｕｌの容量中に１×１０１１のｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１ベクターゲノムを、網膜下注射を介して、被験群へと投与する。
【０４０１】
実施例１２における研究の場合の通り、被験対象または患者におけるｓＦＬＴ−１の最高発現レベルには、ｒＡＡＶ．ｓＦＬＴ−１の網膜下投与の６〜８週間後に到達した。このいわゆる「ランプアップ」期間において、少なくとも１、２、または３回にわたる抗ＶＥＧＦ剤の硝子体内注射を、１５〜４５日間隔で注射し、好ましくは約３０日間隔で注射して、疾患の進行を防止した。抗ＶＥＧＦ剤の１回目の硝子体内注射は、ｒＡＡＶ．ｓＦＬＴ−１の投与の１〜３０日間の間前に投与し、好ましくはｒＡＡＶ．ｓＦＬＴ−１の投与の５〜１０日間の間前に投与して、硝子体内注射された抗ＶＥＧＦ剤（ＬｕｃｅｎｔｉｓもしくはＡｖａｓｔｉｎもしくはＥｙｌｅａまたは他のｓＦＬＴ以外の薬剤）の吸収を可能とすることが好ましい。この１回目の硝子体内注射を、ｒＡＡＶ．ｓＦＬＴの網膜下投与前の２４時間未満に投与する場合、この１回目の硝子体内注射は、網膜下注射手順時に、硝子体からウォッシュアウトすることができるが、抗ＶＥＧＦ剤の濃度を治療濃度未満とし、疾患の進行をもたらす場合がある。
【０４０２】
ランプ期間が完了した後、それらのＡＭＤまたは脈絡膜血管新生の他の症状を処置するか、またはそれらのＡＭＤまたは脈絡膜血管新生の他の症状の進行を防止するのに十分なｓＦＬＴ−１を発現させる患者は、さらなる硝子体内抗ＶＥＧＦ注射を必要としなかったが、それらの注射は、医師のケアの下で依然としてなされることが予期される。
【０４０３】
本実施例で再掲される本研究では、対照群および被験群における患者を、活性の脈絡膜血管新生の徴候について約１カ月ごとのベースで査定し、以下の基準：
・対象の前回の来院（網膜性原因に帰することが可能な）からの、ＥＴＤＲＳ（糖尿病網膜症早期治療研究）文字の減退が＞１０であるか、または機能喪失に対する患者の知覚と共に、前回の来院からの、ＥＴＤＲＳによる文字の減少が＞５であること；
・ＯＣＴ時において、感覚網膜下、網膜色素上皮（ＲＰＥ）下、または網膜内において、流体の任意の新たな増大または増大の遷延がみられること；
・ＦＡを介するＣＮＶからの漏出の増大の徴候が見られることのうちのいずれかが満たされた場合は、硝子体内ラニビズマブで再処置した。
【０４０４】
（実施例１５）
眼の新生血管性の疾患または加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を防止または予防するためのｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の安全性および有効性を調べるために、４０例（１５０）の患者によるさらなる対照臨床研究を行う。ｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１は、Ｌｏｎｚａ  Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘａｓ）において、ＦＤＡおよびＩＣＨによるガイドラインに従い作製する。研究のための適格性基準、組入れ基準、および除外基準は、以下の通りであった。
【０４０５】
適格性：
・研究に適格な年齢：５０歳以上
・研究に適格な性別：男女
・健常ボランティアの受け入れ：あり
【０４０６】
組入れ基準：
・非滲出性ＡＭＤ（ＡＲＥＤＳ基準による、類型２、３、または４；群４には、末期以外のＡＭＤを伴う眼を組み入れる）を伴う患者；「滲出型」または「萎縮型」として分類されるＡＭＤを伴う患者を組み入れること；
・年齢が５０〜９０歳の間であること；
・試験の要件を理解および遵守することが可能であること；
・視力＞０．４であること。
【０４０７】
除外基準：
・現在眼科の臨床試験に登録されていること；
・眼がＡＭＤ以外の黄斑障害または脈絡膜障害を併発し、ＡＭＤの性状不詳の徴候を伴うこと；
・眼が、被験眼において、活性の網膜下血管新生（ＳＲＮＶ）またはレーザー光凝固を要求するＣＮＶ病変を伴う滲出性ＡＭＤの診断を伴うこと；
・対象が、視覚減退を引き起こす著明な水晶体の混濁を伴うこと；
・対象が、弱視を伴うこと；
・対象が、視神経疾患（神経障害、萎縮、乳頭浮腫）、２５ｍｍＨｇを超える眼内圧、３つ以上の緑内障薬、緑内障と符合する０．８以上のＣ／Ｄおよび視野により規定される不安定性緑内障；網膜硝子体手術の履歴、変性近視、活性の後部眼内炎症性疾患、外用の眼用ステロイド薬の慢性使用、血管増殖性網膜症（ＡＭＤ以外の）、裂孔原性網膜剥離、および遺伝性黄斑ジストロフィーを伴うこと；
・対象が、デマンド型のペースメーカーまたはてんかんを伴うこと；
・対象が、コントロール不良の高血圧症（９０以上の拡張期血圧および１５０以上の収縮期血圧として規定される）を伴うこと；
・対象が、脳血管疾患の最近の履歴（前年以内の）を伴うこと；
・一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）または脳血管発作（ＣＶＡ）を呈すること；
・対象が、ＡＩＤＳの履歴を伴うこと；
・対象が、被験眼において、試験への登録前３カ月以内に眼内手術を受けていること；
・患者が、来院検査スケジュールに従うことを望まないこと。
【０４０８】
主要転帰尺度：
ＭＰＯＤおよび多局所網膜電図［時間枠：１年後］［安全性問題としての指定：あり］
【０４０９】
副次的転帰尺度：
末期ＡＭＤの発症の危険性の低減におけるｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１の安全性および有効性［時間枠：１年後］［安全性問題としての指定：あり］
【表９】
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【０４１０】
（実施例１６）
眼の新生血管性の疾患または糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）を処置するためのｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の安全性および有効性を調べるために、４０例の患者によるさらなる対照臨床研究を行う。ｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１は、Ｌｏｎｚａ  Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘａｓ）において、ＦＤＡおよびＩＣＨによるガイドラインに従い産生する。研究のための適格性基準、組入れ基準、および除外基準は、以下の通りであった。
【０４１１】
適格性：
・研究に適格な年齢：１８歳以上
・研究に適格な性別：男女
・健常ボランティアの受け入れ：なし
【０４１２】
一般的な組入れ基準：
・以下の基準を満たす場合、対象は適格である。
・書面によるインフォームドコンセント、ならびに、米国内の施設では、医療保険の携行性と責任に関する法律（Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｓｕｒａｎｃｅ  Ｐｏｒｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ａｃｃｏｕｎｔａｂｉｌｉｔｙ  Ａｃｔ）（ＨＩＰＡＡ）による認証であり
、他の諸国では、国内の法律により適用可能な認証である認証を提供する意思があること；
・糖尿病（１型または２型）を有すること；
・糖尿病（diabetes  mellitus）（ＤＭＥ）に続発する網膜の肥厚であって、光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）上で評価される、中心サブフィールド内の黄斑中心厚が≧２７５μｍであり、中心窩の中心に及ぶ肥厚が見られること；
・４メートルの初期検査距離でＥＴＤＲＳ（糖尿病網膜症早期治療研究）プロトコールを使用する、被験眼における最高矯正視力（ＢＣＶＡ）スコアが、２０／４０〜２０／３２０の近似スネレン等価視力であること；
・視覚の減退が主にＤＭＥの結果であり、他の原因の結果ではないと決定されていること；
・全てのスケジュールされた来院および評価に戻る能力（治験責任医師の所見による）および意思があること。
【０４１３】
除外基準：
・被験眼において、硝子体網膜手術の履歴があること；
・スクリーニングの３カ月以内に、被験眼において、汎網膜光凝固（ＰＲＰ）または黄斑レーザー光凝固を施されていること；
・被験眼において、不活性の消褪したＰＤＲを除く、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）を有すること；
・被験眼において、虹彩血管新生、硝子体出血、牽引性網膜剥離、または黄斑に及ぶ網膜前線維症を有すること；
・被験眼に硝子体黄斑牽引または網膜上膜を有すること；
・被験眼において眼炎症（炎症の痕跡またはそれを上回る炎症を含む）を有すること；
・いずれかの眼に特発性ブドウ膜炎または自己免疫性ブドウ膜炎の履歴があること；
・被験眼において、黄斑の中心に対する構造的損傷であって、黄斑浮腫の消失後において、ＶＡの改善を妨げる可能性が高く、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の萎縮、網膜下線維症、または組織化されて硬化した浸出物プラークを含む構造的損傷が見られること；
・被験眼における眼障害であって、研究結果の解釈を混同させる可能性があり、任意の原因（例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、眼ヒストプラズマ症、または病理学的近視）による、網膜静脈閉塞症、網膜剥離、黄斑円孔、または脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を含む眼障害を有すること；
・０日目をさかのぼる３カ月以内に、被験眼において、白内障手術を施されているか、過去２カ月以内に、イットリウム−アルミニウム−ガーネット（ＹＡＧ）レーザー嚢切開を施されているか、または９０日以内に他の任意の眼内手術を施されていること；
・被験眼において、コントロール不良の緑内障を有するか、またはかつて濾過手術を施されていること；
・コントロール不良の血圧が見られること；
・０日目以前の３カ月以内に脳血管発作または心筋梗塞の履歴があること；
・コントロール不良の糖尿病を有すること；
・透析または腎移植を要求する腎不全を有すること；
・他の疾患、代謝機能不全、身体検査所見、または臨床検査室所見の履歴であって、被験薬の使用を禁忌とするか、研究結果の解釈に影響を及ぼしうるか、または対象を処置による合併症に由来する大きな危険にさらす疾患または状態の合理的な疑いをもたらす履歴があること。
【０４１４】
主要転帰尺度：  
・１２カ月後において、それらの最高矯正視力（ＢＣＶＡ）スコアがベースラインから≧１５文字上がる患者の百分率［時間枠：ベースライン〜１２カ月後］［安全性問題としての指定：なし］
【０４１５】
副次的転帰尺度：  
・１２、２４、および３６カ月後における、最高矯正視力（ＢＣＶＡ）スコアのベースラインからの平均変化
・１２、２４、および３６カ月後において、スネレン等価視力による視力（ＶＡ）が２０／４０以上である患者の百分率
・１２、２４、および３６カ月後における、ＳＤ−ＯＣＴにより測定される中心窩厚の、ベースラインからの平均変化
・併用される抗ＶＥＧＦ処置（例えば、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ、Ａｖａｓｔｉｎ、Ｍａｃｕｇｅｎ、またはＥｙｅｌｅａ）の頻度の低減［安全性問題としての指定：なし］
【表１０】
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【０４１６】
初期登録対象は、ＤＭＥを有し、被験眼における視力が２０／４０〜２０／３２０であり、０〜２５回の間のラニビズマブまたはアフリベルセプトの硝子体内注射をあらかじめ施されているであろう。患者は、１４例の対照患者ならびに１３例の低用量被験患者および１３例の高用量被験患者の全てを登録するまで、対照群または２つの被験群へと無作為に分配する。全ての患者には、研究の１日目および３０日目に、ラニビズマブの硝子体内注射を施した。７日目に、１００ｕｌの容量中に１×１０１０または１×１０１１のｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１ベクターゲノムを、網膜下注射を介して、被験群へと投与する。
【０４１７】
実施例１２における研究の場合の通り、被験対象または患者におけるｓＦＬＴ−１の最高発現レベルには、ｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦＬＴ−１の網膜下投与の６〜８週間後に到達する。このいわゆる「ランプアップ」期間において、少なくとも１、２、または３回にわたる抗ＶＥＧＦ剤の硝子体内注射を、１５〜４５日間隔で注射し、好ましくは約３０日間隔で注射して、疾患の進行を防止する。抗ＶＥＧＦ剤の１回目の硝子体内注射は、ｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦＬＴ−１の投与の１〜３０日間の間前に投与し、好ましくはｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦＬＴ−１の投与の５〜１０日間の間前に投与して、硝子体内注射された抗ＶＥＧＦ剤（ＬｕｃｅｎｔｉｓもしくはＡｖａｓｔｉｎもしくはＥｙｌｅａまたは他のｓＦＬＴ以外の薬剤）の吸収を可能とすることが好ましい。この１回目の硝子体内注射を、ｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦＬＴの網膜下投与前の２４時間未満に投与する場合、この１回目の硝子体内注射は、網膜下注射手順時に、硝子体からウォッシュアウトすることができるが、抗ＶＥＧＦ剤の濃度を治療濃度未満とし、疾患の進行をもたらす場合がある。
【０４１８】
ランプ期間が完了した後、それらのＤＭＥを処置するか、またはそれらのＤＭＥの進行を防止するのに十分なｓＦＬＴ−１を発現させる患者は、さらなる硝子体内抗ＶＥＧＦ注射を必要としない場合もあるが、それらの注射は、医師のケアの下で依然としてなされることが予期される。
【０４１９】
本実施例で再掲される本研究では、対照群および被験群における患者を、活性のＤＭＥまたは新たなＤＭＥおよび血管新生の徴候について約１カ月ごとのベースで査定し、以下の基準：
・対象の前回の来院（網膜性原因に帰することが可能な）からの、ＥＴＤＲＳ（糖尿病網膜症早期治療研究）文字の減退が＞１０であるか、または機能喪失に対する患者の知覚と共に、前回の来院からの、ＥＴＤＲＳによる文字の減少が＞５であること；
・ＯＣＴ時において、感覚網膜下、網膜色素上皮（ＲＰＥ）下、または網膜内において、流体の任意の新たな増大または増大の遷延がみられること；
・ＦＡを介するＣＮＶからの漏出の増大の徴候が見られることのうちのいずれかが満たされた場合は、硝子体内ラニビズマブで再処置する。
【０４２０】
（実施例１７）
眼の新生血管性の疾患または網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ：Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）を処置するためのｒＡＡＶ．ｓＦｌｔ−１の安全性および有効性を調べるために、４０例の患者によるさらなる対照臨床研究を行う。臨床研究は、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ：Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）を伴う患者を含む１つのコホートおよび網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ：Ｂｒａｎｃｈｅｄ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）を伴う患者を含む１つのコホートである、２つのコホートの患者により実施する。実施例１５の場合の通り、ｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１は、Ｌｏｎｚａ  Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘａｓ）において、ＦＤＡおよびＩＣＨによるガイドラインに従い産生する。研究のための適格性基準、組入れ基準、および除外基準は、以下の通りであった。
【０４２１】
組入れ基準：
・９カ月間以内にわたり、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）に続発する、中心部に及ぶ黄斑浮腫、またはＢＲＶＯに続発する、分枝に及ぶ黄斑浮腫であって、光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）上で評価される、平均中心サブフィールド厚が≧２５０μｍである黄斑浮腫が見られること；
・≧１８歳の成人であること；
・ＥＴＤＲＳ（糖尿病網膜症早期治療研究）による、被験眼における最高矯正視力（ＢＣＶＡ）が、２０／４０〜２０／３２０（７３〜２４文字）であること。
【０４２２】
除外基準：
・被験眼において、任意の先行する、抗ＶＥＧＦ剤による処置（ペガプタニブナトリウム、酢酸アネコルタブ、ベバシズマブ、ラニビズマブなど）または既往の全身性抗血管形成薬の投与が施されていること；
・被験眼において、先行する汎網膜レーザー光凝固または黄斑レーザー光凝固が施されていること；
・診断日からのＣＲＶＯの疾患持続期間が＞９カ月間であること；診断日からのＢＲＶＯの疾患持続期間が＞９カ月間であること；
・被験眼において、眼内コルチコステロイドがかつて使用されたか、または１日目の３カ月以内前に、被験眼において、眼周囲コルチコステロイドが使用されていること；
・被験眼または対の眼において、黄斑に及ぶ、虹彩血管新生、硝子体出血、牽引性網膜剥離、または網膜前線維症を有すること。
【０４２３】
主要転帰尺度：
・６カ月後における最高矯正視力（ＢＣＶＡ）スコアのベースラインからの平均変化［時間枠：ベースラインおよび６カ月後］［安全性問題としての指定：なし］
・被験眼における、ＥＴＤＲＳ（糖尿病網膜症早期治療研究）で規定された研究ベースライン範囲による、最高矯正視力（ＢＣＶＡ）文字スコアが、７３〜２４（＝２０／４０〜２０／３２０の視力）であること（高スコアは、より良好な機能を表す；分子＝（視覚を維持した参加者の数×１００）；分母＝解析される参加者の数）
【０４２４】
副次的転帰尺度：
・６カ月後において、ベースラインと比較したＢＣＶＡスコアが≧１５文字上がる患者の百分率
・６カ月後における、中心網膜厚（ＣＲＴ）のベースラインからの平均変化［時間枠：ベースラインおよび６カ月後］［安全性問題としての指定：なし］
・併用される抗ＶＥＧＦ処置（例えば、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ、Ａｖａｓｔｉｎ、Ｍａｃｕｇｅｎ、またはＥｙｅｌｅａ）の頻度の低減［安全性問題としての指定：なし］
【表１１】
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【０４２５】
初期登録対象は、ＣＲＶＯまたはＢＲＶＯを有し、被験眼における視力が２０／４０〜２０／３２０であり、０〜２５回の間のラニビズマブの硝子体内注射をあらかじめ施されているであろう。患者は、１４例の対照患者ならびに１３例の低用量被験患者および１３例の高用量被験患者の全てを登録するまで、対照群または２つの被験群へと無作為に分配する。全ての患者には、研究の１日目および３０日目に、ラニビズマブの硝子体内注射を施した。７日目に、１００ｕｌの容量中に１×１０１０または１×１０１１のｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦｌｔ−１ベクターゲノムを、網膜下注射を介して、被験群へと投与する。
【０４２６】
実施例１４における研究の場合の通り、被験対象または患者におけるｓＦＬＴ−１の最高発現レベルには、ｒＡＡＶ（ｂｖ）．ｓＦＬＴ−１の網膜下投与の６〜８週間後に到達する。実施例１４で記載した通り、ランプ期間が完了した後、それらのＣＲＶＯまたはＢＲＶＯを処置するか、またはそれらのＣＲＶＯまたはＢＲＶＯの進行を防止するのに十分なｓＦＬＴ−１を発現させる患者は、さらなる硝子体内抗ＶＥＧＦ注射を必要としない場合もあるが、それらの注射は、医師のケアの下で依然としてなされることが予期される。
【０４２７】
本実施例で再掲される本研究では、対照群および被験群における患者を、活性の網膜静脈閉塞症または新たな網膜静脈閉塞症および血管新生の徴候について約１カ月ごとのベースで査定し、以下の基準：
・対象の前回の来院（網膜性原因に帰することが可能な）からの、ＥＴＤＲＳ（糖尿病網膜症早期治療研究）文字の減退が＞１０であるか、または機能喪失に対する患者の知覚と共に、前回の来院からの、ＥＴＤＲＳによる文字の減少が＞５であること；
・ＯＣＴ時において、感覚網膜下、網膜色素上皮（ＲＰＥ）下、または網膜内において、流体の任意の新たな増大または増大の遷延がみられること；
・ＦＡを介するＣＮＶからの漏出の増大の徴候が見られることのうちのいずれかが満たされた場合は、硝子体内ラニビズマブで再処置する。
【図１】
2018015008.tif 000015
【図２】
2018015008.tif 000016
【図３Ａ】
2018015008.tif 000017
【図３Ｂ】
2018015008.tif 000018
【図４】
2018015008.tif 000019
【図５】
2018015008.tif 000020
【図６】
2018015008.tif 000021
【図７Ａ】
2018015008.tif 000022
【図７Ｂ】
2018015008.tif 000023
【図７Ｃ】
2018015008.tif 000024
【図７Ｄ】
2018015008.tif 000025
【図８Ａ】
2018015008.tif 000026
【図８Ｂ】
2018015008.tif 000027
【図８Ｃ】
2018015008.tif 000028
【図８Ｄ】
2018015008.tif 000029
【図８Ｅ】
2018015008.tif 000030
【図８Ｆ】
2018015008.tif 000031
【図９Ａ】
2018015008.tif 000032
【図９Ｂ】
2018015008.tif 000033
【図９Ｃ】
2018015008.tif 000034
【図９Ｄ】
2018015008.tif 000035
【図９Ｅ】
2018015008.tif 000036
【図９Ｆ】
2018015008.tif 000037
【図９Ｇ】
2018015008.tif 000038
【図９Ｈ】
2018015008.tif 000039
【図１０Ａ】
2018015008.tif 000040
【図１０Ｂ】
2018015008.tif 000041
【図１０Ｃ】
2018015008.tif 000042
【図１１Ａ】
2018015008.tif 000043
【図１１Ｂ】
2018015008.tif 000044
【図１１Ｃ】
2018015008.tif 000045
【図１２Ａ】
2018015008.tif 000046
【図１２Ｂ】
2018015008.tif 000047
【図１３】
2018015008.tif 000048
【図１４】
2018015008.tif 000049
【図１５Ａ】
2018015008.tif 000050
【図１５Ｂ】
2018015008.tif 000051
【図１６】
2018015008.tif 000052
【図１７】
2018015008.tif 000053
【図１８】
2018015008.tif 000054
【図１９】
2018015008.tif 000055
【図２０Ａ】
2018015008.tif 000056
【図２０Ｂ】
2018015008.tif 000057
【図２１Ａ】
2018015008.tif 000058
【図２１Ｂ】
2018015008.tif 000059
【図２２Ａ】
2018015008.tif 000060
【図２２Ｂ】
2018015008.tif 000061
【図２３】
2018015008.tif 000062
【図２４】
2018015008.tif 000063
【図２５Ａ】
2018015008.tif 000064
【図２５Ｂ】
2018015008.tif 000065
【配列表】
2018015008000001.app
【外国語明細書】
2018015008000001.pdf