(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞毒性の低い牛精子等の牛生殖細胞の凍結保存液及び凍結保存方法の提供。【解決手段】式(I)で示される構成単位及び式(II)で示される構成単位を含み、式(II)で示される構成単位の割合が50〜99モル％である両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）0.3〜0.9w/w％と、グリセリン2〜4w/w％とを含む、ウシ精子の凍結保存液。更にダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ）、イーグルのＭＥＭ培地（ＭＥＭ）、その他の細胞用培養液、又は、その他の生理溶液に、前記不凍ポリアミノ酸及びグリセリンが添加されるとともに、ｐＨが７．０〜８．０に調整され、牛精液に由来する液体を５〜２０ｗ／ｗ％になる様に添加する凍結保存液。2018048115.tif 0000252018048115.tif 000026【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ精子を懸濁させて凍結するためのウシ精子の凍結保存液であって、
下記式(I)で示される構成単位及び下記式(II)で示される構成単位を含み、且つ下記式(II)で示される構成単位の割合が50〜99モル％である両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）0.3〜0.9w/w％と、グリセリン2〜4w/w％とを含む、ウシ精子の凍結保存液。
2018048115.tif 000018
2018048115.tif 000019
【請求項２】
ダルベッコ改変培地(DMEM)、イーグルのMEM培地(MEM)、その他の細胞用培養液、または、その他の生理的溶液に、不凍ポリアミノ酸及びグリセリンが添加されるとともにpHが7.0〜8.0の範囲内になるように調整され、さらに、ウシ精液に由来する液体が5〜20w/w％となるように添加された水溶液である、請求項１記載のウシ精子の凍結保存液。
【請求項３】
下記式(I)で示される構成単位及び下記式(II)で示される構成単位を含み、且つ下記式(II)で示される構成単位の割合が50〜99モル％である両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）と、グリセリンとを添加した生理的溶液により、ウシの精液を5〜20倍に希釈することで、0.3〜0.9w/w％の両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）と、2〜4w/w％のグリセリンと、ウシの精液に由来する部分とを含有する凍結保存液中にウシ精子を懸濁させるようにする希釈工程と、
ウシ精子を懸濁させた凍結保存液を、管状の容器中にて凍結に供する工程と、
この後、-60℃以下の温度に保持することで保存を行う工程とを含む、ウシ精子の凍結保存方法。
2018048115.tif 000020
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【請求項４】
前記希釈工程は、
ウシの精液を、生理的溶液により2.5〜10倍に希釈し、2〜8℃で保持する１次希釈工程と、
2〜8℃で保持しつつ、１次希釈工程により得られた懸濁液に、両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）とグリセリンとを添加した生理的溶液を点滴により添加することで、さらに希釈することにより、ウシの精液が5〜20倍に希釈されるようにする２次希釈工程とを含む、請求項３記載のウシ精子の凍結保存方法。
【請求項５】
径が5mm以下である凍結保存用ストローを用い、−140℃以下にまで冷却することを特徴とする請求項３または４に記載のウシ精子の凍結保存方法。
【請求項６】
凍結融解6時間後にて、運動精子率を30%以上とし、高速直進運動率を10%以上とすることができる請求項３〜５のいずれかに記載のウシ精子の凍結保存方法。
【請求項７】
ウシ胚を懸濁させて凍結するためのウシ胚の凍結保存液であって、
下記式(I)で示される構成単位及び下記式(II)で示される構成単位を含み、且つ下記式(II)で示される構成単位の割合が50〜99モル％である両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）5〜10w/w％と、エチレングリコール4〜6w/w％と、プロパンダイオール4〜8w/w％と、ウシ胎子血清15〜25w/w％とを含む、ウシ胚の凍結保存液。
2018048115.tif 000022
【請求項８】
請求項７の凍結保存液により、冷却速度100℃／分以下の緩慢凍結法で冷却及び凍結を行う、ウシ胚の凍結保存方法。
【請求項９】
ウシ体細胞を懸濁させて凍結するためのウシ体細胞の凍結保存液であって、
下記式(I)で示される構成単位及び下記式(II)で示される構成単位を含み、且つ下記式(II)で示される構成単位の割合が50〜99モル％である両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）5〜25w/w％と、ウシ胎子血清70〜80w/w％と4〜6w/w％のジメチルスルホキシドとを含む、ウシ体細胞の凍結保存液。
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【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばウシ生殖細胞の凍結保存に有用な凍結保存用組成物及び凍結保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物の細胞又は組織を長期に保存するために、0℃以下の温度での凍結保存法が日常的に用いられている。しかしながら、動物の細胞又は組織は水を含有し、凍結すると、凍結中に水分子同士が、溶質や混入物の媒質を排除しながら結晶化して水分子のみから成る氷結晶を形成するため、含水物中で溶質や混入物の媒質が不均一に拡散し、凍結濃縮が発生することが知られている。
【０００３】
このような凍結濃縮を防止するため、様々な低分子化合物を添加する方法が行われている。例えば、細胞の凍結保存を行う場合に、凍結保存中に起こる細胞内の結晶化による細胞へのダメージを最小限に抑えるために、凍結保護剤として、低分子のジメチルスルホキシドやグリセロール等を添加する方法が行われている。
【０００４】
特に、ウシの子畜生産性向上を図るためには、ウシ生殖細胞にとって有用な凍結保存方法の開発が重要である。
【０００５】
例えば、ウシ精子の凍結に用いられる凍結保護剤としてはグリセリンが知られている。また、ウシ卵子及び胚の凍結に用いられる凍結保護剤としては、グリセリン、エチレングリコール、プロパンダイオールが知られている。さらに、ウシ体細胞の凍結に用いられる凍結保護剤としては、ジメチルスルホキシドが知られている。
【０００６】
しかしながら、これら従来の凍結保護剤は、いずれも細胞毒性が強いといった問題があった。
【０００７】
ところで、PCT/JP2009/002941（日本特許第5726525号）は、アミノ基とカルボシル基を側鎖に持つ両性高分子電解質を含有する凍結保存液を開示する。しかしながら、当該凍結保存液が、生殖細胞や体細胞等のウシ細胞の凍結保存に使用できることは知られていなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のように、ウシの子畜生産性向上を図るためには、ウシ生殖細胞にとって有用な新規凍結保存剤及び凍結保存方法の開発が重要である。しかしながら、従来のウシ細胞の凍結に使用される凍結保護剤は、いずれも細胞毒性が強いといった問題があった。
【０００９】
そこで、本発明は、これらの実情に鑑み、ウシ生殖細胞を含むウシ細胞の凍結に有用な凍結保存用組成物及び凍結保存方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ε-ポリ-L-リジン(PLL)のアミノ基を無水コハク酸と反応させてカルボキシル基を適当量導入した両性高分子電解質(不凍ポリアミノ酸)が、単独で、又は従来の凍結保護剤と併用することで、ウシ生殖細胞又は体細胞の凍結保存に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
下記式(I)で示される構成単位及び下記式(II)で示される構成単位を含み、且つ下記式(II)で示される構成単位の割合が50〜99モル％である両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）とグリセリンとを含む、ウシ精子などウシ生殖細胞の凍結保存用組成物、及び、これを用いる凍結保存方法。
【００１２】
＜化学式I＞
2018048115.tif 000002
【００１３】
＜化学式II＞
2018048115.tif 000003
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ウシ生殖細胞に有用な凍結保存用組成物を提供することができ、ウシの子畜生産性を向上させることができる。また、本発明によれば、ウシ体細胞にとって毒性の低い凍結保存用組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】凍結胚の専用ストローへの封入様式を示す図である。
【図２】凍結保存したウシ体細胞(ウシ皮膚由来線維芽細胞)の凍結融解後に播種した接着細胞数(凍結保護剤除去後播種)を示すグラフである。
【図３】凍結保存したウシ体細胞(ウシ卵丘細胞)の凍結融解後に播種した接着細胞数(凍結保護剤除去後播種)を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に係るウシ細胞の凍結保存用組成物は、数平均分子量1,000〜20,000のε-ポリ-L-リジンのアミノ基の50〜99モル％について、無水コハク酸を反応させてカルボキシル化することでブロックしたもの(以下、「不凍ポリアミノ酸」と称する)を含むものである。
【００１７】
具体的には、本発明における不凍ポリアミノ酸は、下記式(I)で示される構成単位及び下記式(II)で示される構成単位を含み(又はから成り)、且つ下記式(II)で示される構成単位の割合が50〜99モル％である両性高分子電解質である。
【００１８】
＜化学式I＞
2018048115.tif 000004
【００１９】
＜化学式II＞
2018048115.tif 000005
【００２０】
本発明に係るウシ細胞の凍結保存用組成物によれば、凍結融解後のウシ生殖細胞又は体細胞の生存率及び増殖を有意に向上させることができる。また、本発明に係るウシ細胞の凍結保存用組成物によれば、凍結融解後のウシ精子又は胚の発生能を損なうことなく、人工授精や胚移植による受胎率を有意に向上させることができる。
【００２１】
本発明において、ε-ポリ-L-リジンとしては、微生物又は酵素により生産される数平均分子量が1,000〜20,000、特には1,000〜10,000のε-ポリ-L-リジンを挙げることができる。ε-ポリ-L-リジンは、ストレプトマイセス属(Streptomyces)に属する放線菌により生産されて専ら食品添加物として用いられており、重合度15〜35のものの他、重合度が20以下のものの生産も試みられている(例えば、特開2003-171463号公報及び特開2005-318815号公報)。数平均分子量又は数平均重合度の測定は、SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)法により、例えば、アトー(株)製の電気泳動装置及びデンシトグラフ(AE-6920V型)を用いて容易に測定することができる。このとき、標準タンパク質マーカーを用いる。なお、ε-ポリ-L-リジンは、加熱処理による高分子量化により分子量30,000以上として用いることもできる。しかしながら、粘度の上昇を防ぐ等の観点から上記の分子量範囲が好ましい。
【００２２】
下記に示す反応により、ε-ポリ-L-リジンのアミノ基は、部分的に無水コハク酸によってカルボキシル化されて、ブロックされる。
【００２３】
＜化学式III＞
2018048115.tif 000006
【００２４】
この際、ε-ポリ-L-リジンのアミノ基について、好ましくは50〜99モル％、特に50〜93モル％、より好ましくは50〜90モル％、さらに好ましくは55〜80モル％、最も好ましくは58〜76モル％をカルボキシル化することでブロックする。
【００２５】
ε-ポリ-L-リジンのアミノ基に対して52〜53モル％の無水コハク酸を反応させることで約50モル％のアミノ基をブロックすることができる。また、100モル％の無水コハク酸を反応させた場合、通常の反応条件で、90〜95モル％のアミノ基をブロックすることができる。ブロック率が上記の範囲を超えても、また、下回っても、凍結保存効果が小さくなる。
【００２６】
本発明に係るウシ細胞の凍結保存用組成物は、生理的水溶液に不凍ポリアミノ酸を溶解したものである。生理的水溶液としては、生理食塩水の他、各種の細胞又は組織用の一般的な培養液を用いることができる。例えば、ダルベッコ改変イーグルMEM培地(DMEM)を好ましいものとして挙げることができる。
【００２７】
本発明の第一実施形態においては、本発明に係るウシ細胞の凍結保存用組成物は、上記に説明した不凍ポリアミノ酸とグリセリンとを含む、ウシ精子の凍結保存用組成物である。本発明に係るウシ精子の凍結保存用組成物は、例えば0.25〜1.0w/w％、好ましくは0.3〜0.9w/w％または0.3〜0.8w/w％の濃度の不凍ポリアミノ酸、及び1.5〜4.5w/w％または1.5〜4.4w/w％好ましくは、2.0〜4.0w/w％の濃度のグリセリンを含む。当該グリセリン含有量は、従来においてウシ精子の凍結保存に使用される量を有意に低減又は半減した量であり、本発明に係るウシ精子の凍結保存用組成物は細胞毒性の低い凍結保護剤である。
【００２８】
第一実施形態による好ましい凍結保存方法によると、不凍ポリアミノ酸及びグリセリンとを添加した生理的溶液により、ウシの精液を5〜20倍に希釈することで、0.3〜0.9w/w％の両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）と、2〜4w/w％のグリセリンと、ウシの精液に由来する部分とを含有する凍結保存液中にウシ精子を懸濁させるようにする希釈工程と、ウシ精子を懸濁させた凍結保存液を、管状の容器中にて凍結に供する工程と、この後、-60℃以下の温度に保持することで保存を行う工程とを含む。
【００２９】
前記希釈工程は、好ましくは、ウシの精液を、生理的溶液により2.5〜10倍に希釈し、2〜8℃で保持する１次希釈工程と、2〜8℃で保持しつつ、１次希釈工程により得られた懸濁液に、両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）とグリセリンとを添加した生理的溶液を点滴により添加することで、さらに希釈することにより、ウシの精液が5〜20倍に希釈されるようにする２次希釈工程とを含む。
【００３０】
また、好ましくは、径が5mm以下である凍結保存用ストローを用い、プログラムフリーザーなどによる冷却速度100℃／分以下の緩慢凍結法で、または、液体窒素浸漬により冷却速度300℃／分以上のガラス化凍結法で、−140℃以下にまで冷却する。また、好ましくは、凍結融解6時間後にて、運動精子率を30%以上とし、高速直進運動率を10%以上とすることができる。
【００３１】
生理的溶液としては、等張性のトリス・クエン酸緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、クエン酸、グルコース、塩化ナトリウム等の水溶液（生理食塩水を含む）、もしくは、これに卵黄、アミノ酸などを適宜添加したもの、M199、CR1aa、ダルベッコ改変培地(DMEM)、イーグルのMEM培地(MEM)などの少なくとも一種を、適宜用いることができる。培地は、例えば1000mg/L〜4500mg/Lのグルコースまたはその他の単糖類、二糖類などを含むことができる。
【００３２】
ウシ精子の保存に好ましい生理的溶液の例としては、下記のように調製したトリス・クエン酸緩衝液ベースのものを挙げることができる。すなわち、一具体例において、１７．０３１ｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（和光純薬工業）、９．５１９ｇのクエン酸一水和物（和光純薬工業）、３．０００ｇのグルコース（和光純薬工業）、及び４．６２５ｇの塩化ナトリウム（和光純薬工業）、さらに１００万ＩＵ／４．６ｍｌＳＰＵＦのペニシリンＧカリウム（万有製薬）を３ｍｌ、１０００ｍｇ力価／４．３ｍｌＳＰＵＦのストレプトマイシン（明治製菓）を３ｍｌ加え、蒸留水で１０００ｍｌにメスアップして、１４０．６ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、４５．３ｍＭのクエン酸、１６．７ｍＭのグルコース、７９．１ｍＭの塩化ナトリウムを含む水溶液としたものを用いることができる。
【００３３】
ウシ精子の保存に好ましい生理的溶液の他の例としては、卵黄を添加したトリス・クエン酸緩衝液（卵黄トリス糖液（ＥＴ））を挙げることができる。これは、社団法人家畜改良事業団が「Ｓｏｒｔ９０」の商品名で市販する精液一次希釈液である。
【００３４】
本発明の第二実施形態においては、本発明に係るウシ細胞の凍結保存用組成物は、上記に説明した不凍ポリアミノ酸とエチレングリコールとプロパンダイオールとウシ胎子血清とを含む、ウシ胚の凍結保存用組成物である。凍結保存対象のウシ胚としては、例えば体外受精(IVF)により6〜9日間(好ましくは7〜8日間)発生させたウシ胚等が挙げられる。
【００３５】
本発明に係るウシ胚の凍結保存用組成物は、例えば5〜10w/w％(好ましくは、7w/w％)の濃度の不凍ポリアミノ酸、4〜6w/w％の濃度、例えば5w/w％濃度のエチレングリコール、4〜8w/w％の濃度、例えば6w/w％の濃度のプロパンダイオール(1,3-プロパンジオール；プロピレングリコール)、及び15〜25w/w％の濃度、好ましくは20w/w％濃度のウシ胎子血清を含む。
【００３６】
本発明の第三実施形態においては、本発明に係るウシ細胞の凍結保存用組成物は、上記に説明した不凍ポリアミノ酸とウシ胎子血清とを含む、ウシ体細胞の凍結保存用組成物である。凍結保存対象のウシ体細胞としては、例えば線維芽細胞、卵丘細胞、間葉系細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞等が挙げられる。
【００３７】
本発明に係るウシ体細胞の凍結保存用組成物は、例えば5〜30w/w％(好ましくは、5〜25w/w％)の濃度の不凍ポリアミノ酸、及び65〜85w/w％(好ましくは、70〜80w/w％)の濃度のウシ胎子血清を含む。
【００３８】
さらに、本発明に係るウシ体細胞の凍結保存用組成物は、ジメチルスルホキシドを含んでもよい。本発明に係るウシ体細胞の凍結保存用組成物は、例えば0.1〜10w/w％(好ましくは4〜6w/w％、5w/w％)の濃度のジメチルスルホキシドを含むことができる。
【００３９】
以上に説明した本発明に係るウシ細胞の凍結保存用組成物中に各種ウシ細胞を懸濁し、例えば-20〜-100℃、好ましくは-60〜-90℃または-70〜-90℃、特に好ましくは-80℃前後のフリーザー中で凍結することで、各種ウシ細胞を凍結保存することができる。ウシ精子については、例えば1500万〜3000万個(好ましくは、2000万〜3000万個)のウシ精子を0.25〜0.5mLの凍結保存用組成物に懸濁し、凍結に供する。ウシ胚については、例えば1〜50個(好ましくは、1〜2個)のウシ胚を0.01〜0.25mL(好ましくは、0.02〜0.05mL)の凍結保存用組成物に懸濁し、凍結に供する。ウシ体細胞については、例えば50万〜200万個(好ましくは、50万〜100万個)のウシ体細胞を0.2〜2mL(好ましくは、1mL)の凍結保存用組成物に懸濁し、凍結に供する。
【００４０】
凍結したウシ細胞を使用する場合には、各種ウシ細胞の一般的な融解方法に準じて、凍結したウシ細胞を融解し、使用することができる。なお、不凍ポリアミノ酸は、細胞毒性が低く、ジメチルスルホキシド等と異なり、融解時に除去する必要はない。
【００４１】
また、本発明に係るウシ細胞の凍結保存用組成物を、ウシ細胞の凍結保存用キットとして提供することもできる。当該キットには、凍結保存用組成物に加えて、例えば凍結保存に使用する容器、キットの取扱説明書等を含むことができる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４３】
〔実施例１〕不凍ポリアミノ酸を用いたウシ精子の凍結保存
１−１．凍結保存溶液の調製
ε-ポリ-L-リジン(チッソ社製、分子量4000)の25％水溶液に、モル％で65％の無水コハク酸(和光純薬工業製)を添加し、ε-ポリ-L-リジン分子中のアミノ基の60モル％についてカルボキシル化することでブロックした不凍ポリアミノ酸を作製した。
【００４４】
次いで、作製した不凍ポリアミノ酸(CPLL)の溶液（約33w/w％の水溶液）及びグリセリン(Gly)をダルベッコ改変培地(DMEM、Gibco(登録商標)11330-032、グルコース量：3151mg/L)に所定の割合（グリセリンV/V%，CPLLw/w%）となるように添加した。この際、pHが7.0〜8.0の範囲内になるように1Nの塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液で中和した。
【００４５】
１−２．ウシ精子の凍結保存方法
種雄牛から採取した精液は、精子の数・運動性等を検査した後、１次希釈液（「１−１．」で用いたダルベッコ改変培地）で５倍程度に希釈した後、低温室(４℃)にて静置し、ゆっくり冷却した。精液の温度が４℃程度まで下がった段階で１次希釈液にて最終希釈量の半量まで点滴にて希釈した。その後、４℃程の温度を維持しつつ、耐凍剤の入った２次希釈液（「１−１．」で得られた「凍結保存溶液」）を点滴にて最終希釈量まで希釈し、凍結保存用ストロー（富士平工業株式会社製品「0.5ml 細133型」、径4mm×133mm）に分注・注入した。その後暫く静置し、プログラムフリーザーを用いた冷却速度100℃／分以下の緩慢凍結法で−150℃前後まで冷却・凍結してから、液体窒素中に保存した（2次希釈液中の耐凍剤の添加量  グリセリン：13v/v％：従来型、グリセリン6.5v/v％＋CPLL1.0w/v％：新規型）。
【００４６】
凍結保存された精子懸濁液の融解は、液体窒素中から凍結保存用ストローを取り出した後、30〜38℃の温湯中に15秒浸漬することで行われた。
【００４７】
１−３．ウシ精子の凍結保存の結果及び考察
凍結保存したウシ精子の凍結融解後の生存性の結果を以下の表１に示す。
【００４８】
【表１】
2018048115.tif 000007
【００４９】
表１に示すように、ウシ精子の凍結保存にCPLLが使用できることが明らかとなった。また、CPLLを添加することにより、従来から使用されているGlyを低減(半減)できた。このことは、新たな組成の細胞毒性の低い凍結液を意味する。
【００５０】
凍結保存したウシ精子の人工授精による受胎成績を以下の表２に示す。
【００５１】
【表２】
2018048115.tif 000008
【００５２】
表２に示すように、CPLLを使用した凍結ウシ精子の人工授精で有効な受胎率が得られた。このことは、凍結融解後の発生能も損なわれていないことを意味する。
【００５３】
１−４．凍結融解6時間後の精子の生存性（運動性）の評価
目的：
凍結融解直後の精子生存性に差異がみられなかったが(表１)、人工授精による受胎率には差異が認められたことから(表２)、その要因を検索した。
【００５４】
方法：
従来法（6.5％グリセリン）または新規法（3.25％グリセリン+0.5％CPLL）により凍結され、融解されたそれぞれの精子を、6時間保温保存した後、精子の運動性を調査した。ウシ精子の運動性評価には、精子運動解析装置（CASA；SMAS 3、ディテクト製）および測定用チャンバー（MicroCell、Vitrolife 製）を使用して、37℃で精子運動パラメータ（運動率 Mot、前進運動率 Prog、直線速度 VSL、曲線速度 VCL、平均速度 VAP、頭部振幅AHL、頭部振動数BCF）を測定した。VAP＞10μm/secを運動精子、VAP＞50μm/sec かつ STR＞0.75を前進運動精子とした。
【００５５】
結果：
結果を以下の表３に示す。
【００５６】
【表３】
2018048115.tif 000009
【００５７】
表３に示すように、凍結融解6時間後の精子の生存性(運動性）は、従来法より新規法の方が有意に良好であった。
【００５８】
考察：
凍結融解直後の精子の生存性（運動性）には差異が無いものの、融解して一定時間経過した精子の生存性に差異が認められた。
【００５９】
人工授精で子宮頚管または子宮体部へ注入された精子は、4時間程度かけて受精の場である卵管膨大部に達することから、融解後一定時間経過した精子の生存性の差異は受胎率に影響する可能性が示唆される。
【００６０】
１−５．凍結融解後精子頭部の細胞膜の評価
目的：
凍結融解直後の精子生存性に差異がみられなかったが(表１)、融解6時間後の精子生存性に差異が認められたことから(表３)、その要因を検索した。
【００６１】
方法：
従来法（6.5％グリセリン）または新規法（3.25％グリセリン+0.5％CPLL）により凍結され、融解されたそれぞれの精子をSYBR14とpropidium iodide（PI）で染色を行い、精子頭部細胞膜の障害を調査した。
【００６２】
なお、細胞膜に障害が無い場合はSYBR14で緑色に染まり、障害がある場合はpropidium iodideで赤く染まる。
【００６３】
結果：
結果を以下の表４に示す。
【００６４】
【表４】
2018048115.tif 000010
【００６５】
表４に示すように、凍結融解後の精子頭部細胞膜に障害が無い割合は、従来法より新規法の方が有意に多かった。
【００６６】
考察：
凍結融解6時間後の精子の生存性に差異が認められた要因の一つは、凍結融解による精子細胞膜へのダメージによるものと推測される。
【００６７】
〔実施例２〕不凍ポリアミノ酸を用いたウシ胚の凍結保存
２−１．凍結保存溶液の調製
ε-ポリ-L-リジン(チッソ社製、分子量4000)の25％水溶液に、モル％で65％の無水コハク酸(和光純薬工業製)を添加し、ε-ポリ-L-リジン分子中のアミノ基の60モル％についてカルボキシル化することでブロックした不凍ポリアミノ酸を作製した。
【００６８】
次いで、作製した不凍ポリアミノ酸溶液(CPLL)、エチレングリコール(EG)、プロパンダイオール(PD)及びウシ胎子血清(FCS又はCS)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、ギブコ製)に所定の割合(w/w％)となるように添加した。この際、pHが7.0〜7.5の範囲内になるように1Nの塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液で中和した。
【００６９】
２−２．ウシ胚の凍結保存方法
桑実胚から胚盤胞期胚に成長したウシ胚は、20%ウシ胎子血清を加えたPBSで洗浄した後、CPLLを加えた凍結保存液に浸漬し、ただちに0.25mlの凍結保存用ストロー（IMV製）に凍結液とともに封入された（図１）。封入後、10分〜20分の平衡処理後、プログラムフリーザーにより冷却速度100℃／分以下の緩慢凍結法で-30℃まで冷却した後、液体窒素中に浸漬することで凍結が行われた。凍結後は使用まで液体窒素中で保存された。
【００７０】
凍結保存された凍結胚の融解は、液体窒素中から凍結保存用ストローを取り出し、5秒間空中保持された後、30〜38℃の温湯中に15秒間浸漬することで行われた。
【００７１】
２−３．ウシ胚の凍結保存の結果及び考察
凍結保存したウシ胚の凍結融解後の生存性の結果を以下の表５に示す。
【００７２】
【表５】
2018048115.tif 000011
【００７３】
表５に示すように、ウシ胚の凍結保存(緩慢凍結法)にCPLLが使用できることが明らかとなった。また、従来の凍結保護剤(濃度)にCPLLを添加することで、従来と変わらない生存性を確保できた。このことは、新たな組成の凍結液を意味する。
【００７４】
凍結保存したウシ胚の胚移植成績を以下の表６に示す。
【００７５】
【表６】
2018048115.tif 000012
【００７６】
表６に示すように、CPLLを使用した凍結ウシ胚の胚移植で有効な受胎率が得られた。このことは、凍結融解後の発生能は損なわれていないことを意味する。
【００７７】
凍結保存したウシ胚の凍結融解後に凍結液曝露した際の胚の生存性の結果を以下の表７に示す。
【００７８】
【表７】
2018048115.tif 000013
【００７９】
〔実施例３〕不凍ポリアミノ酸を用いたウシ体細胞の凍結保存
３−１．凍結保存溶液の調製
ε-ポリ-L-リジン(チッソ社製、分子量4000)の25％水溶液に、モル％で65％の無水コハク酸(和光純薬工業製)を添加し、ε-ポリ-L-リジン分子中のアミノ基の60モル％についてカルボキシル化することでブロックした不凍ポリアミノ酸を作製した。
【００８０】
次いで、作製した不凍ポリアミノ酸溶液（CPLL）、ジメチルスルホキシド(DMSO)及びウシ胎子血清(CS)をダルベッコ改変培地(DMEM、シグマアルドリッチ製)に所定の割合(w/w％)となるように添加した。この際、pHが7.0〜7.5の範囲内になるように1Nの塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液で中和した。
【００８１】
３−２．ウシ体細胞の凍結保存方法
組織培養用フラスコ（ディッシュ）でコンフルエントまで培養されたウシ体細胞は、PBS洗浄、トリプシンによる酵素処理等定法によって回収された。回収されたウシ体細胞は、凍結保存用チューブ（1.0ml用、ファルコン製）中の凍結保存液に浸漬され、ただちに-80℃ディープフリーザー内に置かれ、凍結および保存された（長期保存の場合は液体窒素中で保管）。
【００８２】
凍結保存された体細胞の融解は、保管場所より取り出された後、ただちに30〜38℃の温湯中にチューブ内に米粒大の氷晶が残るまで浸漬され、定法により遠心操作により凍結保存液を除去された後、細胞培養用デバイスに播種された。また、本凍結保存液による凍結では、融解後の凍結保存液の除去が不要であった（除去せずに播種することが可能であった）。
【００８３】
３−３．ウシ体細胞の凍結保存の結果及び考察
凍結保存したウシ体細胞(ウシ皮膚由来線維芽細胞)の凍結融解直後の生存性の結果を以下の表８に示す。また、凍結保存したウシ体細胞(ウシ皮膚由来線維芽細胞)の凍結融解後の細胞増殖性の結果を以下の表９に示す。さらに、凍結保存したウシ体細胞(ウシ皮膚由来線維芽細胞)の凍結融解後に播種した接着細胞数(凍結保護剤除去後播種)を図２に示す。
【００８４】
【表８】
2018048115.tif 000014
【００８５】
【表９】
2018048115.tif 000015
【００８６】
凍結保存したウシ体細胞(ウシ卵丘細胞)の凍結融解直後の生存性の結果を以下の表１０に示す。また、凍結保存したウシ体細胞(ウシ卵丘細胞)の凍結融解後の細胞増殖性の結果を以下の表１１に示す。さらに、凍結保存したウシ体細胞(ウシ卵丘細胞)の凍結融解後に播種した接着細胞数(凍結保護剤除去後播種)を図３に示す。
【００８７】
【表１０】
2018048115.tif 000016
【００８８】
【表１１】
2018048115.tif 000017
【００８９】
表８〜１１及び図２〜３に示すように、ウシ体細胞の凍結保存にCPLLが使用できることが明らかとなった。
【００９０】
表８及び９並びに図２に示すように、ウシ皮膚由来線維芽細胞では凍結保護剤としてCPLLはDMSOの代替となり、CPLLのみを凍結保護剤として凍結保存が可能であった。また、凍結融解後の増加能力は、DMSOよりCPLL使用の方が高かった。さらに、CPLLは凍結融解時に除去をする必要は無く、除去せずに細胞を播種できた。
【００９１】
一方、表１０及び１１並びに図３に示すように、卵丘細胞では凍結保護剤としてCPLLはDMSOの代替となり、CPLLのみを凍結保護剤として凍結保存が可能であった。また、凍結融解後の増加能力から、線維芽細胞(CPLL5％)と卵丘細胞(CPLL25％)の至適CPLL濃度が異なった。
【図１】
2018048115.tif 000027
【図２】
2018048115.tif 000028
【図３】
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