(57)【要約】      （修正有）【課題】バルク培養物の発現および製造に好適なプロセス、新規のポリヌクレオチド、及び前記プロセスで製造されたポリペプチドの提供。【解決手段】５’シグナル配列部分と３’毒素部分とを含んでなるポリヌクレオチドであって、５’シグナル配列部分はグラム陰性菌宿主細胞において発現された場合に、異種性タンパク質の細菌ペリプラズムへの輸送を配向させることのできるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、更に、５’シグナル配列部分はジフテリア菌由来ではなく、且つ３’毒素部分は、特定のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する細菌毒素ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’シグナル配列部分と３’毒素部分とを含んでなるポリヌクレオチドであって、
（ａ）５’シグナル配列部分は、グラム陰性菌宿主細胞において発現された場合に異種性タンパク質の細菌ペリプラズムへの輸送を配向させることのできるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、かつ、該５’シグナル配列部分はジフテリア菌由来ではなく、かつ
（ｂ）３’毒素部分は、配列番号３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する細菌毒素ポリペプチドをコードする、
ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記３’毒素部分は、配列番号３２をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記３’毒素部分は、配列番号３１を含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記５’シグナル配列部分は、
ａ．配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６のうちの任意の１つ、
ｂ．１、２、もしくは３の点突然変異、挿入、もしくは欠失を含む配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６のバリアントであって、前記細菌宿主細胞のペリプラズムへの前記細菌毒素ポリペプチドの輸送を配向させることができるバリアント、または
ｃ．配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６の少なくとも１０のアミノ酸の断片であって、前記細菌宿主細胞のペリプラズムへの前記細菌毒素ポリペプチドの輸送を配向させることができる断片、
をコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記５’シグナル配列部分は、
ａ．配列番号２４、
ｂ．１、２、もしくは３の点突然変異、挿入、もしくは欠失を含む、配列番号２４のバリアントであって、前記細菌宿主細胞のペリプラズムへの前記細菌毒素ポリペプチドの輸送を配向させることができるバリアント、または
ｃ．配列番号２４の少なくとも１０のアミノ酸の断片であって、前記細菌宿主細胞のペリプラズムへの前記細菌毒素ポリペプチドの輸送を配向させることができる断片、
をコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記３’毒素部分は、配列番号３２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記３’毒素部分は、配列番号３１を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記５’シグナル配列部分は、前記３’毒素部分の直ちに５’である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
誘導性プロモーターに連結された請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項１０】
前記誘導性プロモーターは、十分な量のイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって活性化される、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞は、グラム陰性菌である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞は、大腸菌細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
ａ）請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の細菌宿主細胞の培養物を増殖する工程と、
ｂ）細菌トキソイドがペリプラズムに発現するよう、前記ポリペプチドの発現を誘導する工程と
を含んでなる、細菌毒素を作製するための方法。
【請求項１５】
Ａ．グラム陰性宿主細胞の培養物を増殖すること、および
Ｂ．タンパク質がペリプラズムに発現するよう、ポリペプチドの発現を誘導すること
による、組換えポリペプチドのペリプラズム発現のための方法であって、この中で、以下の工程のうちの１つ以上は発現中に作用する：
ｉ．工程ａ）のｐＨは、工程ｂ）のｐＨよりも低く、
ｉｉ．工程ａ）の温度は、工程ｂ）の温度よりも高く、または
ｉｉｉ．工程ａ）の基質供給速度は、工程ｂ）の基質供給速度よりも高い。
【請求項１６】
工程ｉ、工程ｉｉ、工程ｉｉｉ、工程ｉかつ工程ｉｉ、工程かつ工程ｉｉｉ、工程ｉｉかつ工程ｉｉｉ、または工程ｉ、工程ｉｉ、かつ工程ｉｉｉは作用する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが発現する、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程ａ）のｐＨおよび工程ｂ）のｐＨは同じである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
工程ａ）のｐＨは、工程ｂ）のｐＨよりも低い、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
工程ａ）において、ｐＨは６．０〜７．０のまたは６．５〜７．０の範囲である、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
工程ｂ）において、ｐＨは、６．５〜１０．０、７．０〜８．０、６．５〜９．０、または７．０〜８．５の範囲である、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
工程ｂ）の間、ｐＨは維持される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｐＨは、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、およびヒスチジン緩衝液からなる群に由来する緩衝液を用いて維持される、請求項２１または２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記緩衝液は、１０〜２００ｍＭ、５０〜１００ｍＭ、１０〜５０ｍＭ、１００〜２００ｍＭ、または５０〜１５０ｍＭの濃度である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記緩衝液は、８０〜１００ｍＭのリン酸緩衝液である、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法は、発酵槽において実施される、請求項１４〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
工程ｂ）のｐＨの上昇は、塩基、例えば水酸化ナトリウムまたはアンモニウムの添加によって達成される、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｐＨは、工程ｂ）の間、水酸化ナトリウムまたはアンモニウムの添加によって、６．５〜１０．０、７．０〜８．０、６．５〜９．０、または７．０〜８．５の間に維持される、請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
工程ａ）における第一の基質供給速度と、工程ｂ）における第二の基質供給速度とを含んでなり、かつ、該第二の基質供給速度は、該第一の基質供給速度よりも低い、請求項１４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記第二の基質供給速度は、前記第一の基質供給速度の５％〜９０％、２０％〜８０％、または２０％〜３０％の間に維持される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細菌毒素は、ジフテリア毒素またはその点突然変異したバリアントである、請求項１４〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記細菌毒素は、ＣＲＭ１９７である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細菌毒素は破傷風毒素である、請求項１４〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
工程ａ）の温度は、工程ｂ）の温度よりも高い、請求項１４〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
工程ａ）は、２０〜４０℃の温度で実施される、請求項１４〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
工程ｂ）は、２０〜２８℃、２１〜２７℃、２１〜２４℃、または２２〜２３℃の温度で実施される、請求項１４〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
発現は、十分な量のＩＰＴＧの添加によって、工程ｂ）において誘導される、請求項１４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ＩＰＴＧは、０．１〜１０ｍＭの間の終濃度になるよう添加される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記宿主細胞は、誘導時に０〜２．５の間の、または０．４〜１．５の間の光学密度（ＯＤ６５０）を有する、請求項１４〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記発酵槽は、１０〜２０００リットルの培養物を含む、請求項２６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記発酵槽は、１００〜２００Ｌの間のまたは約１５０Ｌの培養物を含む、請求項２６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
溶存酸素レベルは、５％超である、請求項２６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記溶存酸素は、１５〜２５％である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
シグナルペプチドは、前記細菌宿主細胞内の前記細菌毒素から除去されて、成熟した細菌毒素を得る、請求項１４〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞ペーストを前記培養物から収穫するさらなる工程ｃ）を含んでなる、請求項１４〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記細菌毒素を例えば、成熟した細菌毒素として精製するさらなる工程を含んでなる、請求項１４〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ｉ）請求項１４〜４１のいずれか一項に記載の方法を用いて細菌毒素を作製する工程と、ｉｉ）工程ａ）の前記細菌毒素を抗原に抱合させる工程とを含んでなる、抱合体を作製するための方法。
【請求項４８】
前記抗原は、細菌糖質である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記細菌糖質は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ、インフルエンザ菌、ナイセリア・メニンジティディス、またはＳ．アウレウスに由来する莢膜糖質である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
Ａ．請求項１４〜４９に記載の方法を用いて細菌毒素または抱合体を作製する工程と、  Ｂ．該細菌毒素またはその抱合体を医薬として許容し得る賦形剤と混合する工程と、
を含んでなる、ワクチンを製造するための方法。
【請求項５１】
前記細菌毒素は、工程ｂ）においてさらなる抗原と混合される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記細菌毒素は、工程ｂ）においてアジュバントと混合される、請求項５０または５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌毒素の発現の分野、特にジフテリア毒素（ＣＲＭ１９７など、ジフテリア毒素の突然変異体形態を含む）に関するものであり、このような毒素のバルク培養物の発現および製造に好適なプロセスを含む。本発明は、本発明のプロセスの間に使用または製造されることのできる新規のポリヌクレオチドおよびポリペプチドも提供する。
【背景技術】
【０００２】
ジフテリア毒素は、細菌ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheria）によって産生される外毒素タンパク質である。シグナル配列（毒素シグナル配列）を含む一本鎖ポリペプチドとして産生され、該シグナル配列は、該タンパク質の分泌の際に該細菌によって除去される。
【０００３】
ジフテリア毒素は、残基１９０、１９２、または１９３における開裂の結果としてジスルフィド結合によって連結された２つのサブユニット断片Ａおよび断片Ｂを形成するよう、容易にスプライスされる（Moskaug et al Biol. Chem. 264: 15709-15713, 1989）。断片Ａは、触媒活性のある部分であり、タンパク質合成因子ＥＦ−２を特異的に標的にして、それによりＥＦ−２を不活性化して細胞におけるタンパク質合成をシャットダウンするＮＡＤ依存性ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼである。
【０００４】
ジフテリア毒素などの細菌毒素に対する免疫は、感染の経過の間に自然に、または毒素の脱毒素化形態（トキソイド）の注射によって人工的に獲得され得る（Germanier, Bacterial Vaccines, Academic Press, Orlando, Fl., 1984）。トキソイドは、天然毒素の化学的修飾によって伝統的に作製され（Lingood et al Brit.J. Exp. Path. 44; 177, 1963）、該化学的修飾は、ワクチン接種された動物を、該天然毒素によるその後の負荷に対して保護する抗原性を保有しながら、該天然毒素を非毒性にする。あるいは、低下した毒性を有するいくつかの突然変異したジフテリア毒素が説明されている（US4709017、US4950740）。
【０００５】
ＣＲＭ１９７は、ジフテリア毒素の非毒性形態であるが、ジフテリア毒素とは免疫学的に識別することができない。ＣＲＭ１９７は、毒素産生性のコリネファージ（ｃａｒｙｎｅｐｈａｇｅ）ｂのニトロソグアニジン突然変異誘発によってβ１９７毒素により作製される非毒素産生性位相によって感染したジフテリア菌によって産生される（Uchida et al Nature New Biology (1971) 233; 8-11）。ＣＲＭ１９７タンパク質は、ジフテリア毒素と同じ分子量を有するが、構造遺伝子における単一の塩基変化によって、ジフテリア毒素とは異なる。このことは、断片ＡがＮＡＤを結合することができなくする位置５２におけるグリシンからグルタミンへのアミノ酸の変化をもたらす（Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem. 46; 69-94, Rappuoli  Applied and Environmental Microbiology Sept 1983 p560-564）。
【０００６】
ジフテリアトキソイド、および低下した毒性を有する突然変異体形態であるＣＲＭ１９７は、ジフテリア菌に対する免疫を提供する多くのワクチンにおける成分である。百日咳菌、破傷風菌、ジフテリア菌、ならびに任意にＢ型肝炎ウイルスおよび／またはｂ型インフルエンザ菌を予防することができるいくつかの組み合わせワクチンは、公知である（例えば、WO 93/24148およびWO 97/00697、WO 02/055105参照）。
【０００７】
また、ジフテリア毒素、およびＣＲＭ１９７を含む突然変異体形態は、糖質のための安全かつ有効なＴ細胞依存性担体として、ワクチンにおいて使用される。ＣＲＭ１９７は現に、ｂ型インフルエンザ菌オリゴ糖ＣＲＭ１９７抱合ワクチン（HibTitre（登録商標）； Lederle Praxis Biologicals, Rochester, N.Y.）において用いられている。
【０００８】
ジフテリアトキソイド（ＤＴ）を調製する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ＤＴは、ジフテリア菌の培養物からの毒素の精製後の化学的解毒によって製造され得、または該毒素の組換え体もしくは遺伝子的に解毒した類似体の精製によって製造され得る（例えば、ＣＲＭ１９７、またはUS 4,709,017、US 5,843,711、US 5,601,827、およびUS 5,917,017において説明されるような他の突然変異体）。
【０００９】
ワクチンにおける使用のためのＣＲＭ１９７などのジフテリア毒素の有意な量の製造は、低いタンパク質発生量により妨げられてきた。この問題は、大腸菌においてＣＲＭ１９７を発現させることによって既に対処されており（Bishai et al J Bacteriol. 169:5140-5151）、Ｂｉｓｈａｉらは、（毒素シグナル配列を含む）ジフテリア毒素を含む組換え融合タンパク質の発現を説明しており、このことは、分解されたタンパク質の製造をもたらした。
【００１０】
毒素シグナル配列を含むジフテリア断片のクローン化および大腸菌におけるこれらの配列の発現は、ある困難を包含する。発現したタンパク質は、細胞周辺腔へと分泌され、この分泌は、宿主細胞の低下した生存率（O’Keefe et al Proc. Natl. Acad. Sci. 86:343-346）、および組換えタンパク質の亢進したタンパク質分解（Bishai et al J Bacteriol. 169: 5140-5151）と関係している。これらの理由について、発現がもはやペリプラズムではないような毒素シグナル配列の除去が示唆され、このことは、ジフテリアトキソイドの発現を亢進し得る（Bishai et al）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】US4709017
【特許文献２】US4950740
【特許文献３】WO 93/24148
【特許文献４】WO 97/00697
【特許文献５】WO 02/055105
【特許文献６】US 5,843,711
【特許文献７】US 5,601,827
【特許文献８】US 5,917,017
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Moskaug et al Biol. Chem. 264: 15709-15713, 1989
【非特許文献２】Germanier, Bacterial Vaccines, Academic Press, Orlando, Fl., 1984
【非特許文献３】Lingood et al Brit.J. Exp. Path. 44; 177, 1963
【非特許文献４】Uchida et al Nature New Biology (1971) 233; 8-11
【非特許文献５】Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem. 46; 69-94
【非特許文献６】Rappuoli  Applied and Environmental Microbiology Sept 1983 p560-564
【非特許文献７】Bishai et al J Bacteriol. 169:5140-5151
【非特許文献８】O’Keefe et al Proc. Natl. Acad. Sci. 86:343-346
【発明の概要】
【００１３】
したがって、本出願は、ａ）特定のシグナル配列が細菌毒素の配列と連関する発現ベクターを含む細菌宿主細胞の培養物を増殖させる工程と、ｂ）細菌毒素が細胞質周辺に発現するよう細菌毒素と連関した特定のシグナル配列を含むポリペプチドの発現を誘導する工程とを含んでなる、ペリプラズムでの発現によって細菌毒素を作製するための改良されたプロセスを提供する。本出願は、本発明のプロセスにおいて用いられるポリヌクレオチドも提供する。
【００１４】
ペリプラズムにおける細菌毒素の製造は、細胞質での製造を上回る１つ以上の利点を有し得る。
【００１５】
（１）該タンパク質は、シグナルペプチドの開裂後のその成熟形態で製造され、および／または；
（２）大腸菌のペリプラズムは、ジスルフィド結合の形成を可能にする酸化環境であり、このことは可溶性で正確に折りたたまれたタンパク質を製造するのを助け得、および／または；
（３）大腸菌のペリプラズムは、細胞質よりも少ないプロテアーゼを含み、このことは、発現したタンパク質のタンパク質分解性開裂を回避するのを助け得、および／または；  （４）ペリプラズムは、より少ないタンパク質も含み、このことは、より純粋な組換えタンパク質が得られるのを可能にする。
【００１６】
本発明の第一の態様において、
（ａ）５’シグナル配列部分は、異種性タンパク質の細菌ペリプラズムへの輸送を配向させることのできるアミノ酸配列を有する異種性ポリペプチドをコードし、かつ
（ｂ）３’毒素部分は、配列番号３２あるいは少なくとも１５のアミノ酸および／または少なくとも１つのＢもしくはＴ細胞エピトープをコードするその断片と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、
該５’シグナル配列部分と該３’毒素部分とを含んでなる、ポリヌクレオチドが提供される。
【００１７】
本発明の第二の態様において、
（ａ）５’シグナル配列部分は、異種性タンパク質の細菌ペリプラズムへの輸送を配向させることのできるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、かつ、該５’シグナル配列部分はジフテリア菌由来ではなく、かつ
（ｂ）３’毒素部分は、配列番号３２あるいは少なくとも１５のアミノ酸および／または少なくとも１つのＢもしくはＴ細胞エピトープをコードするその断片と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、
該５’シグナル配列部分と該３’毒素部分とを含んでなるポリヌクレオチドが提供される。
【００１８】
本発明の第三の態様において、５’シグナル部分配列は、
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６、
（ｂ）発現したタンパク質をペリプラズムに配向することのできる、１、２、もしくは３の点突然変異、挿入、もしくは欠失によって相応の配列から変動する配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６のバリアント、または
（ｃ）発現したタンパク質をペリプラズムに配向することのできる配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６の少なくとも１０のアミノ酸の断片
のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドをコードし、かつ３’毒素部分は、細菌毒素またはその断片もしくはバリアントをコードする、該５’シグナル配列部分と３’毒素部分とを含んでなるポリヌクレオチドが提供される。
【００１９】
本発明の第四の態様において、誘導性プロモーターに連結された本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクターが提供される。
【００２０】
本発明の第五の態様において、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含んでなる宿主細胞が提供される。
【００２１】
本発明の第六の態様において、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが提供される。
【００２２】
本発明の第七の態様において、ａ）本発明の細菌宿主細胞の培養物を増殖する工程と、ｂ）細菌トキソイドがペリプラズムに発現するよう、前記ポリペプチドの発現を誘導する工程と
を含んでなる、細菌毒素を作製するためのプロセスが提供される。
【００２３】
本発明の第八の態様において、ａ）本発明のプロセスを用いて細菌毒素を作製する工程と、ｂ）工程ａ）の該細菌毒素を抗原に抱合させる工程とを含んでなる、抱合体を作製するためのプロセスが提供される。
【００２４】
本発明の第九の態様において、ａ）本発明のプロセスを用いて細菌毒素または抱合体を作製する工程と、ｂ）該細菌毒素またはその抱合体を医薬として許容し得る賦形剤と混合する工程とを含んでなる、ワクチンを製造するためのプロセスが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＣＲＭ１９７−シグナル配列コンストラクトを製造するためのクローン化プロセスの概略。ＣＲＭ１９７のＮ末端に融合したシグナル配列をコードするＤＮＡの切片が、ＮｄｅｌおよびＳａｃＩ消化によってプラスミドＡから切り出される。配列番号３１のＣＲＭ１９７のＣ末端配列が、ＡａｔＩＩおよびＸｈｏＩ消化によってプラスミドＢから切り出される。これら２つの配列を、ＮｄｅＩ、ＳａｃＩ、ＡａｔＩＩおよびＸｈｏＩによるｐＥＴ２６ｂベクターの消化ならびにＤＮＡリガーゼを用いた連結によって、ｐＥＴ２６ｂベクターへとスプライスする。結果として生じるベクター（ｐＲＩＴ１６６６８）を用いて、シグナル配列とｐＲＩＴ１６６６８ベクターを含むプラスミドを、ＡｇｅＩおよびＮｄｅＩにより消化し、これらをＤＮＡリガーゼを用いて互いにスプライスすることによって、他のシグナル配列−ＣＲＭ１９７コンストラクトを製造した。
【図２】Ｎ末端シグナル配列を有さないＣＲＭ１９７配列を含むコンストラクト（ｐＲＩＴ１６６６９）を製造するためのクローン化プロセスの概略。これを、ＮｄｅＩおよびＡａｔＩＩ消化に続く連結を用いて、ＣＲＭ１９７をコードするＰＣＲ断片をｐＲＩＴ１６６６８に挿入することによって実施した。
【図３】ＦｌｇＩシグナル配列を含むコンストラクトを製造するためのクローン化プロセスの概略。これを、ＮｄｅＩおよびＡａｔＩＩ消化に続く連結を用いて、ＣＲＭ１９７およびＦｌｇＩシグナル配列をコードするＰＣＲ断片（配列番号２３）をｐＲＩＴ１６６６９へと挿入することによって実施した。このことは、プラスミドｐＲＩＴ１６６８１を製造した。
【図４】３つの異なる株における３０℃でのＩＰＴＧによる処理３時間後のＤｓｂＡ−ＣＲＭ１９７の誘導を示すゲル。Ｎｏｖｅｘ  ＴＧの１０〜２０％ゲルを用いた。パネルＡのゲルは、抗ＤＴＰａおよび抗マウスＮＢＴ−ＢＣＩＰを用いて染色したウェスタンブロットである。パネルＢのゲルは、クーマシーブルーを用いて染色されている。レーン１は分子量マーカーを含み、レーン２は誘導されなかったＢＬＲ（ＤＥ３）株を含み、レーン３は誘導されたＢＬＲ（ＤＥ３）株を含み、レーン４は誘導されなかったＢ８３４（ＤＥ３）株を含み、レーン５は誘導されたＢ３８４（ＤＥ３）株を含み、レーン６は、誘導されたＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を含む。
【図５】細菌細胞におけるおよび培地におけるＣＲＭ−１９７の発現を示すゲル。パネルＢのゲルは、抗ＤＴＰａおよび抗マウスＮＢＴ−ＢＣＩＰを用いて染色したウェスタンブロットを示す。パネルＡは、クーマシーブルーを用いて染色されている。各レーンの内容物を下記の表において説明する：
【表１】
2018085994.tif 000002
【図６】３つの異なる株における３０℃で３時間のＤｓｂＡ−ＣＲＭ１９７の誘導を示すゲル。Ｎｏｖｅｘ  ＴＧの１０〜２０％ゲルを用いた。パネルＡは、抗ＤＴＰａおよび抗マウスＮＢＴ−ＢＣＩＰを用いて染色したウェスタンブロットである。パネルＢは、クーマシーブルーを用いて染色されている。レーン１は分子量マーカーを含み、レーン２は誘導されなかったＢＬＲ（ＤＥ３）株を含み、レーン３は誘導されたＢＬＲ（ＤＥ３）株を含み、レーン４は誘導されたＢＬＲ（ＤＥ３）株由来の可溶性画分を含み、レーン５は誘導されたＢＬＲ（ＤＥ３）株由来の不溶性画分を含み、レーン６は誘導されなかったＢ８３４（ＤＥ３）を含み、レーン７はＢ８３４（ＤＥ３）により誘導された可溶性画分を含み、レーン７はＢ８３４（ＤＥ３）により誘導された不溶性画分を含む。
【図７】誘導相における１００ｍＭの濃度までの１Ｍリン酸カリウム緩衝液の添加を有するまたは有さない最適化されたＦｌｇＩコンストラクトの発現を比較するゲル。Ｎｏｖｅｘ  ＴＧの１０〜２０％ゲルを用いた。レーン１は分子量マーカーを含み、レーン２は誘導（３０℃での誘導）から０分での細胞抽出物を含み、レーン３は誘導（３０℃での誘導）から２時間での細胞抽出物を含み、レーン４は誘導（３０℃での誘導）から４時間での細胞抽出物を含み、レーン５は３０℃での一晩の誘導後の細胞抽出物を含み、レーン６は３０℃での誘導４時間後の培地を含み、レーン７は３０℃で一晩の誘導後の培地を含み、レーン８は誘導（２３℃での誘導）から２時間での細胞抽出物を含み、レーン９は誘導（２３℃での誘導）から４時間での細胞抽出物を含み、レーン１０は一晩の誘導後の細胞抽出物を含み、レーン１１は、誘導（２３℃での誘導）から４時間での培地を含み、レーン１２は一晩の誘導（２３℃での誘導）後の培地を含む。
【図８】２０リットル規模の流加回分発酵の間にモニターされたプロセスパラメータを用いた発酵特性の描写。線１は添加された基質の量（グラム）を示し、線２はｐＨを示し、線３は撹拌速度（ｒｐｍ）を示し、線４はｐＯ２（％）を示し、線５は温度（℃）を示し、線６は添加した塩基の量（グラム）を示す。
【図９−１】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列リスト。
【図９−２】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列リスト。
【図９−３】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列リスト。
【図９−４】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列リスト。
【図９−５】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列リスト。
【図９−６】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列リスト。
【図９−７】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列リスト。
【図１０】ｐＨ６．８において実施された増殖についての誘導中の供給速度およびｐＨの関数としてのペリプラズム画分および細胞会合画分におけるＣＲＭ１９７の製造の描写。左のパネルは、ペリプラズムＣＲＭ１９７の製造を示す。右のパネルは、細胞と会合したＣＲＭ１９７製造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
用語「ポリヌクレオチド（複数可）」は一般的に、一本鎖および二本鎖領域／形態を含む修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。
【００２７】
用語ポリペプチドは、少なくとも１０のアミノ酸を含んでなる任意のペプチドを指す。
【００２８】
用語「ペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。該用語は、コード配列および／または非コード配列も含み得る追加的な領域とともに、該ペプチドまたはポリペプチドをコードする単一の連続した領域または不連続な領域を含むポリヌクレオチド（例えば、組み込まれたファージ、組み込まれた挿入配列、組み込まれたベクター配列、組み込まれたトランスポゾン配列によって中断された、またはＲＮＡ編集もしくはゲノムＤＮＡ再編成による、ポリヌクレオチド）も包含する。
【００２９】
ポリヌクレオチド「５’シグナル配列部分のバリアント」は、相応の野生型シグナル配列と比較して、１、２、３、４、または５のアミノ酸置換、アミノ酸付加、またはアミノ酸欠失突然変異を含むシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列である。
【００３０】
「アミノ酸欠失」は、タンパク質のアミノ酸配列からの１つのアミノ酸の除去である。
【００３１】
「アミノ酸付加」は、タンパク質のアミノ酸配列からの１つのアミノ酸の付加である。
【００３２】
「アミノ酸置換」は、タンパク質の配列におけるあるアミノ酸の別のアミノ酸との置換である。
【００３３】
ポリヌクレオチド「３’毒素部分のバリアント」は、毒素ポリペプチドと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列である。同一性についての定義は、下記に与えられる。
【００３４】
一般に、「バリアント」は任意に、保存的アミノ酸置換によって基準体から変動し、それにより１つの残基が類似の特徴を有する別のものによって置換されるポリペプチドである。典型的には、このような置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの間に、ＳｅｒおよびＴｈｒの間に、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの間に、ＡｓｎおよびＧｌｎの間に、ならびに塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの間に、または芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒにある。
【００３５】
「５’シグナル配列部分の断片」は、シグナルペプチドの少なくとも１０、１５、または２０のアミノ酸をコードする配列である。
【００３６】
「３’毒素部分の断片」は、任意に免疫原性活性を有する毒素ポリペプチドの少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、または２００のアミノ酸の連続した部分をコードする配列である。「免疫原性活性」を有するまたは「免疫原性」であるペプチドは、個々の毒素を認識する免疫応答を惹起させることができる（必要であれば、担体との共役時に）。好ましい断片は、Ｂ細胞またはＴ細胞エピトープをコードする該ポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチド断片を含んでなる組換えポリヌクレオチドである。任意に、これらの毒素の断片は、免疫原性である断片である。
【００３７】
当該技術分野で公知の「同一性」は、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列を比較することによって決定され得る場合と同様に、該配列間の関連性である。当該技術分野において、「同一性」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列のストリング間のマッチによって決定され得る場合と同様に、このような配列間の配列近縁性の程度も意味する。「同一性」は、（Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.編, Oxford University Press, New York, 1988、Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編, Academic Press, New York, 1993、Computer Analysis of Sequence Data, 第I部, Griffin, A.M.およびGriffin, H.G.編, Humana Press, New Jersey, 1994、Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987、ならびにSequence Analysis Primer, Gribskov, M.およびDevereux, J.編, M Stockton Press, New York, 1991、ならびにCarillo, H.およびLipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988）に説明されたものを含むがこれらに限定されない公知の方法によって容易に算出されることができる。同一性を決定する方法は、試験された配列間の最大のマッチを与えるよう設計される。その上、同一性を決定する方法は、公共的に入手可能なコンピュータプログラムにおいて成文化される。２つの配列間の同一性を決定するコンピュータプログラム方法には、GCGプログラムパッケージにおけるＧＡＰプログラム（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984))、BLASTP、BLASTN(Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990))、およびFASTA(Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988)）が挙げられるが、これらに限定されない。プログラムのBLASTファミリーは、NCBIおよび他の源から公共的に入手可能である（BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894、Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)）。また、周知のSmith Watermanアルゴリズムを用いて、同一性を決定してもよい。
【００３８】
ポリペプチド配列比較のパラメータには、以下が含まれる：
アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)
比較マトリックス：Henikoff由来のBLOSSUM62およびHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)
ギャップペナルティ：８
ギャップ長ペナルティ：２
これらのパラメータを用いた有用なプログラムは、Genetics Computer Group, Madison  ＷＩ由来の「ギャップ」プログラムとして公共的に入手可能である。上記のパラメータは、（末端ギャップについてペナルティがないことに加えて）ペプチド比較のためのデフォルトパラメータである。
【００３９】
ポリヌクレオチド比較についてのパラメータには、以下が含まれる：
アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)
比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０
ギャップペナルティ：５０
ギャップ長ペナルティ：３
Genetics Computer Group, Madison WI製の「ギャップ」プログラムとして入手可能。これらは、核酸比較のためのデフォルトパラメータである。
【００４０】
用語「シグナルペプチド」または「シグナルポリペプチド」は、発現したタンパク質をペリプラズムに配向することのできるペプチドを指す。
【００４１】
用語「細菌毒素」は、毒素及びトキソイドの両方を包含する。
【００４２】
用語「トキソイド」は、例えば、点突然変異、欠失、または挿入の導入によって部分的にまたは完全に失活した毒素を説明する。
【００４３】
本明細書における用語「を含んでなる(comprising)」、「を含んでなる(comprise)」、および「を含んでなる(comprises)」は、本発明者らによって、いずれの場合においても用語「からなっている(consisting)」、「からなる(consist of)」、および「からなる(consists of)」とそれぞれ任意に置き換え可能であるよう意図される。
【００４４】
用語「異種性タンパク質」は、タンパク質が発現する細胞種類に対して天然ではない該タンパク質を指す。同様に、用語「異種性ポリペプチド」は、ポリペプチドが発現する細胞種類に対して天然ではない該ポリペプチドを指す。
【００４５】
用語「ジフテリア菌由来ではないポリペプチド」は、天然の（組換えではない）ジフテリア菌において見出されるポリペプチドに対して配列において異なるポリペプチドを指す。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチド
本発明の一態様は、ペリプラズムに発現する毒素をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００４７】
一般に、タンパク質におけるシグナル配列の存在は、ペリプラズムへの該タンパク質の輸送（原核生物宿主）またはタンパク質の分泌（真核生物宿主）を容易にする。原核生物宿主において、シグナル配列は、新生タンパク質を、内膜を横切って細胞周辺腔へと配向させた後、シグナル配列は切断される。シグナル配列は、グラム陰性細菌におけるポリペプチドの翻訳中に、それが関心対象のポリペプチドに結合すると、発現したタンパク質をペリプラズムへ配向させることができ、シグナル配列の不在下におけるよりも多くの該ポリペプチドが、グラム陰性細菌のペリプラズムにおいて見出される。一実施態様において、関心対象のポリペプチドの少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、または１００％は、大腸菌などのグラム陰性細菌において発現する場合、ペリプラズムへと配向される。
【００４８】
シグナル配列がペリプラズム発現を管理することができるかどうかを試験するアッセイは、リポータータンパク質を用いて実施されることができる。例えば、ペリプラズムシグナル配列は、緑色蛍光タンパク質についての遺伝子のスプライスされた上流であり得、このタンパク質は、本発明の宿主細胞において発現することができる。顕微鏡を用いて、細胞質及びペリプラズムにおける緑色蛍光タンパク質の比較レベルを判断することができる。
【００４９】
輸送がかなりの量のポリペプチド鎖の合成の前に生じる場合、タンパク質またはペプチドは、同時翻訳的に輸送される。配列番号２、４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、または２６は、発現したタンパク質を、同時翻訳輸送を通じてペリプラズムに配向することのできるペプチドをコードするのに対し、配列番号６および８は、発現したタンパク質を、翻訳後輸送を通じてペリプラズムに配向することのできるペプチドをコードする。
【００５０】
一実施態様において、５’シグナル配列部分と３’毒素部分とを含んでなる（例えば、細菌細胞における毒素の発現のための）ポリヌクレオチドが提供され、この中で、
（ａ）５’シグナル配列部分は、異種性（毒素）タンパク質の細菌ペリプラズムへの輸送を配向することのできるアミノ酸配列を有する異種性（シグナル）ポリペプチドをコードし、かつ
（ｂ）３’毒素部分は、配列番号３２あるいは少なくとも１５の（連続した）アミノ酸および／または少なくとも１つのＢもしくはＴ細胞エピトープをコードする（免疫原性であり得る）その断片と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
【００５１】
さらなる実施態様において、５’シグナル配列部分と３’毒素部分とを含んでなる（細菌細胞におけるポリペプチドの発現のための）ポリヌクレオチドが提供され、この中で、  （ａ）５’シグナル配列部分は、異種性タンパク質の細菌ペリプラズムへの輸送を配向することのできるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、かつこの中で、５’シグナル配列部分は、ジフテリア菌由来ではなく、かつ
（ｂ）３’毒素部分は、配列番号３２あるいは少なくとも１５のアミノ酸および／または少なくとも１つのＢもしくはＴ細胞エピトープをコードするその断片と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
【００５２】
一実施態様において、５’シグナル配列は、ジフテリア菌由来の毒素シグナル配列ではない。
【００５３】
ＢおよびＴ細胞エピトープを同定することは当業者の能力内である。Ｂ細胞エピトープは、例えば、PSIPREDプログラム(David Jones, Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, UK製）を用いて、２次元構造推定によって同定され得る（図４）。抗原指数は、Jameson and Wolf (CABIOS 4:181-186 [1988]）によって説明された方法を基に算出される。このプログラムにおいて用いられるパラメータは、抗原指数および抗原性ペプチドについての最小長である。最小５の連続したアミノ酸についての０．９の抗原指数を、該プログラムにおける閾値として用いた。Ｔ細胞エピトープは、例えば、Sturniolo at al. (Nature Biotech. 17: 555-561 [1999])によって説明されるｔエピトープ(tepitope)法によって同定され得る。
【００５４】
明確性のために、句「異種性タンパク質の細菌ペリプラズムへの輸送を配向することのできるアミノ酸配列を有する」は、「細菌質への異種性タンパク質の輸送を配向することのできるアミノ酸配列を有する」と同じであることを意味する。
【００５５】
さらなる実施態様において、このポリヌクレオチドは、異種性タンパク質の細菌ペリプラズムへの同時翻訳輸送を配向することのできるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
【００５６】
任意に、３’毒素部分は配列番号３２をコードする。任意に、３’毒素部分はＤＴをコードする。任意に、３’毒素部分は、配列番号３１を含んでなる。
【００５７】
任意に、５’シグナル配列部分は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６の任意の１つ、または配列番号２、４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６の任意の１つ、または配列番号２、４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号２、４、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号２、１０、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号２、１２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号２、１４、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号４、１０、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号４、１２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号４、１６、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号４、１８、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号４、２０、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号４、２２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１０、１２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１０、１４、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１０、１６、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１０、１８、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１０、２２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１２、１４、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１２、１６、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１２、１８、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１２、２０、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１２、２２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１４、１６、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１４、１８、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１４、２０、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１４、２２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１６、１８、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１６、２０、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１６、２２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１８、２０、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１８、２２、もしくは２４の任意の１つをコードする。
【００５８】
さらなる実施態様において、５’シグナル配列部分は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６の任意の１つ、または配列番号２、４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６の任意の１つ、または配列番号２、４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、もしくは２４、もしくは配列番号２４の任意の１つ、または配列番号２、４、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号２、１０、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号２、１２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号２、１４、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号４、１０もしくは２４の任意の１つ、または配列番号４、１２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号４、１６、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号４、１８もしくは２４の任意の１つ、または配列番号４、２０もしくは２４の任意の１つ、または配列番号４、２２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１０、１２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１０、１４、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１０、１６、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１０、１８、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１０、２２もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１２、１４、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１２、１６、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１２、１８、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１２、２０、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１２、２２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１４、１６、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１４、１８、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１４、２０もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１４、２２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１６、１８、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１６、２０もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１６、２２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１８、２０もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１８、２２、もしくは２４の任意の１つの１、２、または３の点突然変異、挿入、の任意の１つ、または欠失（を含むバリアント）をコードする。
【００５９】
さらなる実施態様において、５’シグナル配列部分は、タンパク質の細菌ペリプラズムへの輸送を配向することのできる配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６の任意の１つ、または配列番号２、４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６、の任意の１つ、または配列番号２、４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、もしくは２４、もしくは配列番号２４の任意の１つ、または配列番号２、４、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号２、１０、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号２、１２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号２、１４、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号４、１０もしくは２４の任意の１つ、または配列番号４、１２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号４、１６、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号４、１８もしくは２４の任意の１つ、または配列番号４、２０もしくは２４の任意の１つ、または配列番号４、２２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１０、１２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１０、１４、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１０、１６、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１０、１８、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１０、２２もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１２、１４、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１２、１６、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１２、１８、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１２、２０、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１２、２２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１４、１６、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１４、１８、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１４、２０もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１４、２２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１６、１８、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１６、２０もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１６、２２、もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１８、２０もしくは２４の任意の１つ、または配列番号１８、２２、もしくは２４の任意の１つの少なくとも１０、１２、１５、１８、または２０のアミノ酸からなる断片をコードする。
【００６０】
本発明のさらなる態様において、５’シグナル配列と３’毒素部分とを含んでなるポリヌクレオチドが提供され、この中で、５’シグナル部分配列は、以下のアミノ酸配列
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６、または配列番号２、４、１０１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６、または配列番号ＮＯ２、４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、もしくは２４、もしくは配列番号２４、または配列番号２、４、もしくは２４、または配列番号２、１０、もしくは２４、または配列番号２、１２、もしくは２４、または配列番号２、１４、もしくは２４、または配列番号４、１０もしくは２４、または配列番号４、１２、もしくは２４、または配列番号４、１６、もしくは２４、または配列番号４、１８もしくは２４、または配列番号４、２０もしくは２４、または配列番号４、２２、もしくは２４、または配列番号１０、１２、もしくは２４、または配列番号１０、１４、もしくは２４、または配列番号１０、１６、もしくは２４、または配列番号１０、１８、もしくは２４、または配列番号１０、２２もしくは２４、または配列番号１２、１４、もしくは２４、または配列番号１２、１６、もしくは２４、または配列番号１２、１８、もしくは２４、または配列番号１２、２０、もしくは２４、または配列番号１２、２２、もしくは２４、または配列番号１４、１６、もしくは２４、または配列番号１４、１８、もしくは２４、または配列番号１４、２０もしくは２４、または配列番号１４、２２、もしくは２４、または配列番号１６、１８、もしくは２４、または配列番号１６、２０もしくは２４、または配列番号１６、２２、もしくは２４、または配列番号１８、２０もしくは２４、または配列番号１８、２２、もしくは２４の任意の１つ、
（ｂ）発現したタンパク質をペリプラズムに配向することのできる１、２、または３の点突然変異、アミノ酸挿入、またはアミノ酸欠失によって相応の配列から変動する配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６、または配列番号２、４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６、または配列番号ＮＯ２、４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、もしくは２４、または配列番号２４、もしくは配列番号２、４、もしくは２４、または配列番号２、１０、もしくは２４、または配列番号２、１２、もしくは２４、または配列番号２、１４、もしくは２４、または配列番号４、１０もしくは２４、または配列番号４、１２、もしくは２４、または配列番号４、１６、もしくは２４、または配列番号４、１８もしくは２４、または配列番号４、２０もしくは２４、または配列番号４、２２、もしくは２４、または配列番号１０、１２、もしくは２４、または配列番号１０、１４、もしくは２４、または配列番号１０、１６、もしくは２４、または配列番号１０、１８、もしくは２４、または配列番号１０、２２もしくは２４、または配列番号１２、１４、もしくは２４、または配列番号１２、１６、もしくは２４、または配列番号１２、１８、もしくは２４、または配列番号１２、２０、もしくは２４、または配列番号１２、２２、もしくは２４、または配列番号１４、１６、もしくは２４、または配列番号１４、１８、もしくは２４、または配列番号１４、２０もしくは２４、または配列番号１４、２２、もしくは２４、または配列番号１６、１８、もしくは２４、または配列番号１６、２０もしくは２４、または配列番号１６、２２、もしくは２４、または配列番号１８、２０もしくは２４、配列番号１８、２２、もしくは２４の任意の１つ（のバリアント）、あるいは
（ｃ）発現したタンパク質をペリプラズムに配向することのできる配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６、または配列番号２、４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６、または配列番号２、４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、もしくは２４、または配列番号２４、もしくは配列番号２、４、もしくは２４、または配列番号２、１０、もしくは２４、または配列番号２、１２、もしくは２４、または配列番号２、１４、もしくは２４、または配列番号４、１０、もしくは２４、または配列番号４、１２、もしくは２４、または配列番号４、１６、もしくは２４、または配列番号４、１８もしくは２４、または配列番号４、２０、もしくは２４、または配列番号４、２２、もしくは２４、または配列番号１０、１２、もしくは２４、または配列番号１０、１４、もしくは２４、または配列番号１０、１６、もしくは２４、または配列番号１０、１８、もしくは２４、または配列番号１０、２２もしくは２４、または配列番号１２、１４、もしくは２４、または配列番号１２、１６、もしくは２４、または配列番号１２、１８、もしくは２４、または配列番号１２、２０、もしくは２４、または配列番号１２、２２、もしくは２４、または配列番号１４、１６、もしくは２４、または配列番号１４、１８、もしくは２４、または配列番号１４、２０、もしくは２４、または配列番号１４、２２、もしくは２４、または配列番号１６、１８、もしくは２４、または配列番号１６、２０もしくは２４、または配列番号１６、２２、もしくは２４、または配列番号１８、２０、もしくは２４、または配列番号１８、２２、もしくは２４の任意の１つの少なくとも１０のアミノ酸からなる断片
を有するシグナルペプチドをコードし、３’毒素部分は、細菌毒素またはその断片もしくはバリアントをコードする。
【００６１】
５’シグナル配列部分と３’毒素部分とを含んでなるポリヌクレオチドがさらに提供され、この中で、５’シグナル部分配列は、
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６、
（ｅ）発現したタンパク質をペリプラズムに配向することのできる、１、２、もしくは３の点突然変異、アミノ酸挿入、もしくはアミノ酸欠失によって、相応の配列から変動する配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６のバリアント、または
（ｆ）発現したタンパク質をペリプラズムに配向することのできる配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６の少なくとも１０のアミノ酸からなる断片
のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドをコードし、かつ３’毒素部分は、細菌毒素またはその断片もしくはバリアントをコードする。
【００６２】
一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドの５’シグナル配列部分は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、または２６のうちの少なくとも１つをコードする。さらなる実施態様において、本発明のポリヌクレオチドの５’シグナル配列部分は、配列番号２、４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、または２６のうちの少なくとも１つをコードする。一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドの５’シグナル配列部分は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６の少なくとも１つ、または配列番号２、４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６、または配列番号２、４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、もしくは２４、または配列番号２４、もしくは配列番号２、４、もしくは２４、または配列番号２、１０、もしくは２４、または配列番号２、１２、もしくは２４、または配列番号２、１４、もしくは２４、または配列番号４、１０、もしくは２４、または配列番号４、１２、もしくは２４、または配列番号４、１６、もしくは２４、または配列番号４、１８、もしくは２４、または配列番号４、２０、もしくは２４、または配列番号４、２２、もしくは２４、または配列番号１０、１２、もしくは２４、または配列番号１０、１４、もしくは２４、または配列番号１０、１６、もしくは２４、または配列番号１０、１８、もしくは２４、または配列番号１０、２２、もしくは２４、または配列番号１２、１４、もしくは２４、または配列番号１２、１６、もしくは２４、または配列番号１２、１８、もしくは２４、または配列番号１２、２０、もしくは２４、または配列番号１２、２２、もしくは２４、または配列番号１４、１６、もしくは２４、または配列番号１４、１８、もしくは２４、または配列番号１４、２０、もしくは２４、または配列番号１４、２２、もしくは２４、または配列番号１６、１８、もしくは２４、または配列番号１６、２０、もしくは２４、または配列番号１６、２２、もしくは２４、または配列番号１８、２０、もしくは２４、または配列番号１８、２２、もしくは２４の任意の１つをコードする。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、または２６によってコードされるヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、または２５の相応のポリヌクレオチド配列と同一であり得る。あるいは、該ヌクレオチド配列は、遺伝暗号の冗長性（縮重）の結果として、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、または２６のポリペプチドもコードする任意の配列であり得る。あるいは、該ポリヌクレオチドは、配列番号３３〜４５をコードする部分を含んでなり得る。
【００６３】
本発明のポリヌクレオチドは、タンパク質をペリプラズムに配向することのできる配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、または２６のバリアントをコードする５’シグナル配列部分も含んでなり得る。
【００６４】
本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、または２６の断片を含んでなる５’シグナル配列部分も提供する。本発明の断片は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、または２６由来の少なくとも１０、１５、または２０のアミノ酸からなる連続した部分からなる。一実施態様において、該断片は、ペリプラズムに輸送される毒素をコードしたポリペプチドの少なくとも５０、６０、７０、９０、９０、または１００％をもたらす。さらなる実施態様において、該断片は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、または２６由来の相応のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドと同じかまたは実質的に同じペリプラズム輸送特性を有する。さらなる実施態様において、該断片は、ポリペプチドのペリプラズムへの同時翻訳輸送を配向することができる。
【００６５】
３’毒素部分は、任意の細菌毒素をコードする。一実施態様において、コードされた細菌毒素は、ジフテリア、破傷風、百日咳、またはニューモリシン毒素である。
【００６６】
一実施態様において、３’毒素部分は、細菌トキソイド、例えばジフテリアトキソイドまたはＣＲＭ１９７をコードする。任意に、３’毒素部分は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列をコードする。さらなる実施態様において、３’毒素部分は、配列番号３１のヌクレオチド配列を含んでなる。一実施態様において、該ポリペプチドは、配列番号３３〜４５をコードする。
【００６７】
あるいは、３’部分は、先に説明された毒素またはトキソイドの８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列相同性を有する少なくとも１０、１５、２５、３５、５０、１００、１５０、のアミノ酸またはバリアントの任意の断片をコードし得る。
【００６８】
任意に、５’シグナル配列部分は、３’毒素部分の直ちに５’である。あるいは、該配列部分は、少なくとも３、６、９、１２、２１、５１、９９、３００、または１０００のさらなるヌクレオチドによって分離される。例えば、これらのヌクレオチドは、少なくとも１０、２０、３０、５０、１００、２００、または５００のアミノ酸からなる１つ以上のさらなるペプチド配列をコードし得る。
【００６９】
本発明の各およびあらゆるポリヌクレオチドに加えて、該ポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドが提供される。これらの相補的なポリヌクレオチドが相補的である各ポリヌクレオチドに対して、該相補的なポリヌクレオチドが完全に相補的であることが好ましい。
【００７０】
また、本発明は、前駆体または融合タンパク質などのより大きなタンパク質をコードする配列内の任意のポリヌクレオチドの発現を熟慮する。分泌配列もしくはリーダー配列、プロ配列、複数のヒスチジン残基など精製を助ける配列、または組換え製造の間の安定性のための追加的な配列を含む、任意のアミノ酸配列を含むことはしばしば有利である。さらに、最終的な分子の免疫原性能力を増大させる外来性ポリペプチドまたは脂質尾部またはポリヌクレオチド配列の付加も考慮される。
【００７１】
一実施態様において、５’シグナル配列部分は、ジフテリア菌の毒素シグナル配列ではない。
【００７２】
本発明のポリペプチド
本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドも提供する。加えて、これらのポリペプチドの断片およびバリアントが提供される。
【００７３】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドをコードするポリペプチドを包含する。
【００７４】
これらのポリペプチドの断片も本発明によって包含される。該断片は、５’シグナル配列部分および３’毒素部分の両方に由来するセグメントを含む。さらなる実施態様において、これらの断片は、少なくとも１０、１５、または２０のアミノ酸のシグナルペプチドを含んでなる。一実施態様において、これらの断片は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、もしくは２６、または配列番号３３〜４５に由来する少なくとも１０、１５、または２０のアミノ酸を含んでなる。
【００７５】
一実施態様において、これらの断片は、大腸菌などのグラム陰性細菌において発現する場合、ペリプラズムに配向される少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である。
【００７６】
本発明は、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド断片を含む融合タンパク質も包含する。
【００７７】
本発明のポリペプチドまたは免疫原性断片は、前駆体または融合タンパク質などのより大きなタンパク質の一部であり得る。複数のヒスチジン残基など精製を助ける配列、または組換え製造の間の安定性のための追加的な配列を含む、追加的なアミノ酸配列を含むことはしばしば有利である。さらに、最終的な分子の免疫原性能力を増大させる外来性ポリペプチドまたは脂質尾部またはポリヌクレオチド配列の付加も考慮される。
【００７８】
ベクターおよび宿主細胞
本発明は、本発明の１つのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（複数）を含んでなるベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの製造にも関する。本発明のＤＮＡコンストラクトに由来するＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を製造するために、無細胞翻訳系を採用することもできる。
【００７９】
本発明の組換えポリペプチドは、発現系を含んでなる遺伝子操作された宿主細胞から、当業者に周知のプロセスによって調製され得る。したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明の１つのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（複数）を含んでなる発現系、このような発現系を用いて遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの製造に関する。本発明のさらなる態様において、本発明は、プロモーターが誘導される場合にポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現するよう、誘導性プロモーターに連結された本発明のポリヌクレオチドに関する。本発明のさらなる態様は、該ベクターを含んでなり、この中で、誘導性プロモーターは、十分量のＩＰＴＧの添加によって活性化される。任意に、該添加は、０．１〜１０ｍＭ、０．１〜５ｍＭ、０．１〜２．５ｍＭ、０．２〜１０ｍＭ、０．２〜５ｍＭ、０．２〜２．５ｍＭ、０．４〜１０ｍＭ、１〜１０ｍＭ、１〜５ｍＭ、２．５〜１０ｍＭ、２．５〜５ｍＭ、５〜１０ｍＭの間の濃度である。
【００８０】
本発明のポリペプチドの組換え製造のために、宿主細胞は、遺伝子操作されて、本発明の発現系もしくはその部分またはポリヌクレオチドを組み込むことができる。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介性トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｖｅｃｔｉｏｎ）、微量注入法、陽イオン脂質仲介性トランスフェクション、電気穿孔法、抱合、形質導入、掻爬物負荷、衝撃導入（ballistic introduction）、および感染など、Davis, et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986)およびSambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)などの多くの標準的な実験室マニュアルにおいて説明された方法によって果たされることができる。
【００８１】
適切な宿主の代表例には、大腸菌、アシネトバクター、アクチノバチルス、ボルデテラ、ブルセラ、カンピロバクター、藍細菌、エンテロバクター、エルウィニア、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ）、ヘリコバクター、ヘモフィルス、クレブシエラ、レジオネラ、モラクセラ、ナイセリア、パスツレラ、プロテウス、シュードモナス、サルモネラ、セラチア、シゲラ、トレポネーマ、ビブリオ、エルシニアの細胞などのグラム陰性細菌細胞が挙げられる。
【００８２】
非常に種々の発現系を用いて、本発明のポリペプチドを製造することができる。一実施態様において、ベクターは、細菌プラスミドに由来する。一般的に、宿主においてポリヌクレオチドを維持、伝播、もしくは発現するのに、および／またはポリペプチドを発現するのに好適な任意の系またはベクターは、この点において発現に用いられ得る。適切なＤＮＡ配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（上述）に示されるものなど、種々の周知のかつ所定の任意の技術によって発現系へと挿入され得る。
【００８３】
発酵
本発明のさらなる態様において、ａ）本発明の細菌宿主細胞の培養物を増殖させる工程と、ｂ）細菌トキソイドがペリプラズムに発現するよう、ポリペプチドの発現を誘導する工程と、を含んでなる、細菌毒素を作製するためのプロセスが提供される。
【００８４】
本発明のさらなる実施態様において、
Ａ．グラム陰性宿主細胞の培養物を増殖させること、および
Ｂ．タンパク質がペリプラズムに発現するよう、ポリペプチドの発現を誘導すること
による組換えポリペプチドのペリプラズム発現のためのプロセスが提供され、この中で、以下の工程の１つ以上が発現時に作用する：
ｉ．工程ａ）のｐＨは、工程ｂ）のｐＨよりも低く、
ｉｉ．工程ａ）の温度は、工程ｂ）の温度よりも高く、または
ｉｉｉ．工程ａ）の基質供給速度は、工程ｂ）の基質供給速度よりも高い。
【００８５】
一実施態様において、工程工程ｉ、工程ｉｉ、工程ｉｉｉ、工程ｉかつ工程ｉｉ、工程ｉかつ工程ｉｉｉ、工程ｉｉかつ工程ｉｉｉ、または工程ｉ、工程ｉｉ、かつ工程ｉｉｉが作用する。さらなる実施態様において、本発明のポリヌクレオチドが発現する。
【００８６】
ポリペプチド発現は、増大した速度でポリペプチドの発現を生じるＩＰＴＧなどの誘導剤が宿主細胞の培養物に添加される場合に誘導される。
【００８７】
一実施態様において、工程ａ）のｐＨは、工程ｂ）のｐＨと同じであり、第二の実施態様において、工程ａ）のｐＨは、工程ｂ）のｐＨよりも低く、すなわち、工程ｂ）のｐＨは、工程ａ）のｐＨよりも高くされる。
【００８８】
当業者は、工程ａ）と工程ｂ）の間の変化をどのように果たすかを認識するであろう。工程ａ）と工程ｂ）の間の条件（例えば、ｐＨ、温度、または基質供給速度）の変化は、工程ａ）または工程ｂ）の間の一般的な平均的条件が報告されているとおりであり、例えば、他の介入がなかった場合、誘導の直前（例えば、５秒間、１５秒間、３０秒間、１分間、１５分間、３０分間、または１時間）に（工程ａ）、または誘導の直後（例えば、５秒間、１５秒間、３０秒間、１分間、１５分間、３０分間、または１時間）に（工程ｂ）評価され得ることを意味する。明確に、本発明者らは、発酵条件を変化させる介入が同じ技術結果を達成するための誘導のわずかに前にまたはわずかに後に生じ得るが、このようなシナリオにおいて再度、工程ａ）または工程ｂ）の間の一般的なまたは平均的な条件が、本明細書に開示されているとおり変化したことも把握する。
【００８９】
さらなる実施態様において、工程ａ）のｐＨは、５．０〜７．０、５．０〜６．０、６．０〜７．０、または６．５〜７．０の範囲である。
【００９０】
一実施態様において、工程ｂ）のｐＨは維持される。一実施態様において、ｐＨは、ｐＨ６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０よりも大きく、または６．５および１０．０、６．５および９．５、６．５および９．０、６．５および８．５、６．５および７．５、６．５および７．０、７．０および１０．０、７．０および９．５、７．０および９．０、７．０および８．５、７．０および８．０、７．０および７．５、７．５および１０．０、７．５および９．５、７．５および９．０、７．５および８．５、７．５および８．０、８．０および１０．０、８．０および９．５、８．０および９．０、８．０および８．５、８．５および１０．０、８．５および９．５、８．０および９．０、８．０および８．５、８．５および１０．０、８．５および９．５、８．５および９．０、９．０および１０．０、９．０および９．５、もしくは９．５および１０．０の間で維持される。さらなる実施態様において、ｐＨは、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、およびヒスチジン緩衝液からなる群由来の緩衝液を用いて維持される。任意に、緩衝液は、１０〜２００ｍＭ、５０〜１００ｍＭ、１００〜２００ｍＭ、１０〜５０ｍＭ、または５０〜１５０ｍＭの濃度である。任意に、緩衝液は、８０〜１２０ｍＭ、８０〜１００ｍＭ、または１００ｍＭのリン酸緩衝液である。
【００９１】
一実施態様において、工程ｂ）のｐＨは、工程ａ）のｐＨよりも少なくとも、実際に、またはおよそ２．０、１．５、１．０、０．５、０．３、０．２、または０．１ｐＨ単位ほど高い。
【００９２】
一実施態様において、本発明のプロセスは、発酵槽において実施される。一実施態様において、ｐＨは、工程ｂ）のｐＨが工程ａ）のｐＨよりも高いように増大する。任意に、このｐＨの増大は、塩基、例えば、水酸化ナトリウムまたはアンモニアの添加によって達成される。
【００９３】
さらなる実施態様において、工程（ｂ）のｐＨは、工程ｂ）の間に塩基、例えば、水酸化ナトリウムまたはアンモニアの添加によって、６．５および１０．０、６．５および９．５、６．５および９．０、６．５および８．５、６．５および７．５、６．５および７．０、７．０および１０．０、７．０および９．５、７．０および９．０、７．０および８．５、７．０および８．０、７．０および７．５、７．５および１０．０、７．５および９．５、７．５および９．０、７．５および８．５、７．５および８．０、８．０および１０．０、８．０および９．５、８．０および９．０、８．０および８．５、８．５および１０．０、８．５および９．５、８．０および９．０、８．０および８．５、８．５および１０．０、８．５および９．５、８．５および９．０、９．０および１０．０、９．０および９．５、または９．５および１０．０の間に維持される。
【００９４】
一実施態様において、本発明のプロセスは、工程ａ）の第一の基質供給速度と、工程ｂ）の第二の基質供給速度とを含んでなり、この中で、第二の基質供給速度は、第一の基質供給速度よりも低い。さらなる実施態様において、第二の基質供給速度は、工程ａ）の間に維持される基質供給速度の５％および９０％、２０％および８０％、または２０％および３０％の間に維持される。
【００９５】
基質供給速度（または基質提供速度）は、流加回分相および誘導相の間の基質添加速度であり（ｍＬ・分−１０）、すなわち、発酵の任意の初期の非流加回分相期間を含まない。
【００９６】
一実施態様において、細菌毒素は、ニューモリシン毒素、ジフテリア毒素、破傷風毒素、もしくは百日咳毒素、またはこれらの点突然変異したバリアントである。一実施態様において、毒素は、ジフテリアトキソイドである。さらなる実施態様において、毒素はＣＲＭ１９７であり、任意にこれは配列番号３２によってコードされる。さらなる実施態様において、細菌毒素は、ニューモリシン、ジフテリア毒素、破傷風毒素、または百日咳毒素の断片または点突然変異したバリアントである。
【００９７】
このプロセスの細菌宿主細胞は、ベクターおよび宿主細胞に関する節において定義された。一実施態様において、細菌宿主細胞は、大腸菌、アシネトバクター、アクチノバチルス、ボルデテラ、ブルセラ、カンピロバクター、藍細菌、エンテロバクター、エルウィニア、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ）、ヘリコバクター、ヘモフィルス、クレブシエラ、レジオネラ、モラクセラ、ナイセリア、パスツレラ、プロテウス、シュードモナス、サルモネラ、セラチア、シゲラ、トレポネーマ、ビブリオ、およびエルシニアからなる群から選択される。
【００９８】
一実施態様において、細菌宿主細胞は、大腸菌の株である。さらなる実施態様において、細菌宿主細胞は、大腸菌のＫ株またはＢ株である。さらなる実施態様において、細菌宿主細胞は、大腸菌のＫ１２またはＢ８３４株である。
【００９９】
一実施態様において、工程ａ）の温度は、工程ｂ）の温度よりも高い。一実施態様において、本発明のプロセスの工程ａ）は、２０〜４０℃の温度で実施される。任意に、本発明のプロセスの工程ｂ）は、２０〜２８℃、２１〜２７℃、２２〜２６℃、２３〜２４℃、２１〜２４℃、または２２〜２３℃の温度で実施される。
【０１００】
さらなる実施態様において、発現は、工程ｂ）において、十分量のＩＰＴＧ（イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）の添加によって誘導される。任意に、これは、０．１および１０ｍＭ、０．１および５ｍＭ、０．１および２．５ｍＭ、０．２および１０ｍＭ、０．２および５ｍＭ、０．２および２．５ｍＭ、０．４および１０ｍＭ、１および１０ｍＭ、１および５ｍＭ、２．５および１０ｍＭ、２．５および５ｍＭ、５および１０ｍＭの間の濃度である。
【０１０１】
一実施態様において、細菌の光学密度ＯＤ６５０は、誘導時に０〜２．５の間、または０．４〜１．５の間である。用語「誘導時に」は、ＩＰＴＧなどの誘導剤が添加されるプロセスにおける時点を指し、このことは、工程ｂ）のまさに開始時に生じる。
【０１０２】
発酵槽は、細菌培養物の産業製造に好適な任意の装置である。しかしながら、この用語は、より小さな規模での細菌の増殖に典型的に用いられる培養フラスコを含まない。任意に、発酵槽は、２０〜５００、５０〜５００、１００〜５００、２５０〜５００、４００〜５００、２０〜４００、５０〜４００、１００〜４００、２５０〜４００、２０〜２５０、１００〜２００、１００〜２５０、２５０〜３００、３００〜５００、１０〜２０００、５００〜２０００、１０００〜２０００、１５００〜２０００、もしくは１０００〜１５００、もしくは約１５０リットルの培養物を含む。
【０１０３】
任意に、発酵槽における培養物は撹拌される。撹拌は任意に、発酵槽中の培養物を撹拌することによるが、任意の他の好適な手段によって、例えば、撹拌、振動混合機、および／または気体発泡によってであってもよい。
【０１０４】
一実施態様において、発酵槽中の溶存酸素レベル（ＤＯ）は、５％、１０％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、または３０％よりも大きい（維持される）。さらなる実施態様において、発酵槽中のＤＯは、５％〜５０％、１０％〜４０％、１５％〜２５％、または１７％〜２２％である。１００％ＤＯは、（培養物の不在下の）培地が、２８℃および０．５バールの圧力で培地を通じて圧縮気体を発泡させた後に酸素で飽和している場合に存在する酸素の量である。
【０１０５】
発酵工程は、多量の気泡製造に供され得る。気泡形成を制御するために、消泡剤は任意に、発酵槽に添加される。任意に、気泡プローブまたは機械的気泡破壊装置が発酵槽の中で用いられ、これは、消泡剤と同様に用いられ得る。
【０１０６】
一実施態様において、細菌毒素を作製するためのプロセスは、成熟細菌毒素を得るための、細菌宿主細胞内の細菌毒素からのシグナルペプチドの除去を包含する。任意に、この除去は、宿主細胞機械によって実施される。一実施態様において、切断は、大腸菌シグナルペプチダーゼによって実施される。任意に、除去されたシグナル配列は、シグナルペプチドペプチダーゼによってさらに切断される。
【０１０７】
一実施態様において、本発明のプロセスは、培養物から細胞ペーストを収穫するさらなる工程ｃ）を含んでなる。
【０１０８】
一実施態様において、遠心分離は、細胞を収穫するために用いられる。任意に、このことは、５，０００〜８，０００ｇ、５，５００〜７，５００ｇ、６，０００〜７，０００ｇにおいて生じる。任意に、このことは、４℃〜１０℃、５℃〜９℃、６℃〜８℃、または７℃〜８℃の間で生じる。
【０１０９】
さらなる実施態様において、本発明のプロセスは、例えば成熟細菌毒素として細菌毒素を精製するさらなる工程を含んでなる。一実施態様において、この工程は、細胞破裂ならびにクロマトグラフィーおよび濾過技術を用いたさらなる精製を包含する。
【０１１０】
一実施態様において、細胞は、浸透圧ショック、機械的、または酵素的方法を用いては破裂させる。任意に、機械的方法は、機械的ホモジナイザー、ボルテックス処理、超音波処理を用いること、フレンチ押圧またはビーズ摩砕を用いることを含んでなる。任意に、酵素法は、リゾチーム、ザイモラーゼ（ｚｙｍｏｌａｓｅ）、またはリソスタフィン消化を用いることを含んでなる。
【０１１１】
一実施態様において、クロマトグラフィー技術は、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、またはイオン交換クロマトグラフィーである。任意に、アフィニティークロマトグラフィーは、親和性タグ精製カラム、抗体精製カラム、レクチン親和性カラム、プロスタグランジン精製カラム、またはストレプトアビジンカラムを用いる。任意に、ＨＰＬＣは、イオン交換カラム、逆相カラム、または分子ふるいカラムを用いる。任意に、イオン交換カラムは、陰イオン交換カラムまたは陽イオン交換カラムである。
【０１１２】
抱合
本発明は、ｉ）本発明のプロセスを用いて細菌毒素を作製する工程と、ｂ）工程ｉｉ）の細菌毒素を抗原に抱合させる工程とを含んでなる、抱合体を作製するためのプロセスも提供する。
【０１１３】
一実施態様において、抗原は、細菌糖質である。例えば、細菌糖質は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ、インフルエンザ菌、ナイセリア・メニンジティディス、Ｂ群のストレプトコッカス、Ａ群のストレプトコッカス、サルモネラＶｉ、エンテロコッカス、およびＳ．アウレウスからなる群から選択される細菌由来の莢膜糖質である。本明細書で定義される場合、「糖質」は、オリゴ糖または多糖のいずれかであり得る。
【０１１４】
本発明の免疫原性組成物に存在する糖質抱合体は、任意の公知のカップリング技術によって調製され得る。抱合法は、シアナートエステルを形成するために、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボラート（ＣＤＡＰ）による糖質の活性化に依存し得る。したがって、活性化された糖質は、直接的にまたはスペーサー（リンカー）基を介して、担体タンパク質上のアミノ基へと共役し得る。例えば、スペーサーは、（例えば、ＧＭＢＳを用いた）マレイミド活性化型担体タンパク質または（例えば、ヨードアセトイミド［例えば、エチルヨードアセトイミドＨＣｌ］またはＮ−スクシンイミジルブロモアセタートまたはＳＩＡＢ、またはＳＩＡ、またはＳＢＡＰを用いた）ハロアセチル化型担体タンパク質との反応後に得られたチオエーテル連結を介して担体に共役し得るチオール化型多糖を与えるためのシスタミンまたはシステアミンであり得る。好ましくは、シアナートエステル（任意にＣＤＡＰ化学物質によって生成）は、ヘキサンジアミンまたはＡＤＨと共役し、アミノ誘導体化糖質は、タンパク質担体上のカルボキシル基を介してカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学物質を用いて担体タンパク質に抱合する。このような抱合体は、ＰＣＴにより公表された出願WO 93/15760 Uniformed Services UniversityならびにWO 95/08348およびWO 96/29094において説明される。
【０１１５】
他の好適な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性化型エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを用いる。多くは、ＷＯ  ９８／４２７２１において説明される。抱合は、糖質の遊離ヒドロキシル基のＣＤＩとの反応（Bethell et al J. Biol. Chem. 1979, 254; 2572-4、Hearn et al J. Chromatogr. 1981. 218; 509-18）に続くタンパク質との反応によって形成され、カルバマート連結を形成し得る、カルボニルリンカーを包含し得る。このことは、第一級ヒドロキシル基へのアノマー末端の還元、ＣＤＩカルバマート中間体を形成するための第一級ヒドロキシル基のＣＤＩとの第一級ヒドロキシル基の第一級ヒドロキシル基反応の任意の保護／脱保護、およびＣＤＩカルバマート中間体のタンパク質上のアミノ基とのカップリングを包含し得る。
【０１１６】
抱合体は、US 4365170(Jennings)およびUS 4673574(Anderson)に説明されるような直接的還元的アミノ化法によっても調製されることができる。他の方法は、EP-0-161-188、EP-208375、およびEP-0-477508に説明される。
【０１１７】
さらなる方法は、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）により誘導体化された、臭化シアノゲン（またはＣＤＡＰ）により活性化された糖質の、タンパク質担体との、カルボジイミド縮合による（Chu C. et al Infect. Immunity, 1983 245 256）、例えばＥＤＡＣを用いたカップリングを包含する。
【０１１８】
一実施態様において、糖質上のヒドロキシル基（好ましくは、活性化型カルボキシル基、例えば糖質上のシアナートエステルを［例えば、ＣＤＡＰを用いて］生成するために活性化されたヒドロキシル基）は、タンパク質上のアミノ基またはカルボン酸基に直接的にまたは（リンカーを通じて）間接的にのいずれかで連結される。リンカーが存在する場合、糖質上のヒドロキシル基は好ましくは、リンカー上のアミノ基に、例えば、ＣＤＡＰ抱合を用いることによって連結される。リンカーにおけるさらなるアミノ基（例えばＡＤＨ）は、タンパク質上のカルボン酸基に、例えば、カルボジイミド化学物質を用いることによって、例えばＥＤＡＣを用いることによって抱合し得る。一実施態様において、肺炎球菌莢膜糖質（複数可）は、リンカーが担体タンパク質に抱合する前に、まずリンカーに抱合する。あるいは、リンカーは、糖質への抱合の前に担体に抱合し得る。
【０１１９】
一般に、タンパク質担体上の以下の種類の化学基をカップリング／抱合に用いることができる：
Ａ）カルボキシル（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸を介する）。一実施態様において、この基は、糖質上のアミノ基に直接的に、またはリンカー上のアミノ基にカルボジイミド化学物質を用いて、例えばＥＤＡＣを用いて連結される。
【０１２０】
Ｂ）アミノ基（例えば、リシンを介する）。一実施態様において、この基は、糖質上のカルボキシル基に直接的に、またはリンカー上のカルボキシル基にカルボジイミド化学物質を用いて、例えばＥＤＡＣを用いて連結される。別の実施態様において、この基は、糖質上のＣＤＡＰもしくはＣＮＢｒを用いて活性化されたヒドロキシル基に直接的に、またはリンカー上のこのような基に、アルデヒド基を有する糖質もしくはリンカーに、スクシンイミドエステル基を有する糖質もしくはリンカーに連結される。
【０１２１】
Ｃ）スルフヒドリル（例えば、システインを介する）。一実施態様において、この基は、ブロモもしくはクロロによりアセチル化された糖質に、またはマレイミド化学物質を有するリンカーに連結される。一実施態様において、この基は、ビスジアゾベンジジンを用いて活性化／修飾される。
【０１２２】
Ｄ）ヒドロキシル基（例えば、チロシンを介する）。一実施態様において、この基はビスジアゾベンジジンを用いて活性化／修飾される。
【０１２３】
Ｅ）イミダゾリル基（例えば、ヒスチジンを介する）。一実施態様において、この基は、ビスジアゾベンジジンを用いて活性化／修飾される。
【０１２４】
Ｆ）グアニジル基（例えば、アルギニンを介する）。
【０１２５】
Ｇ）インドリル基（例えば、トリプトファンを介する）。
【０１２６】
糖質において、一般に以下の基をカップリングに用いることができる：ＯＨ、ＣＯＯＨ、またはＮＨ２。アルデヒド基は、ペリオダート、酸加水分解、過酸化水素など、当該技術分野で公知の異なる処理後に生じることができる。
【０１２７】
直接的なカップリングアプローチ：
糖質−ＯＨ    ＋  ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ    −−−−−＞  シアナートエステル    ＋  ＮＨ２−保護基      −−−−＞  抱合体
糖質−アルデヒド  ＋  ＮＨ２−保護基  −−−−＞  シッフ塩基  ＋  ＮａＣＮＢＨ３  −−−−＞  抱合体
糖質−ＣＯＯＨ  ＋  ＮＨ２−保護基  ＋  ＥＤＡＣ  −−−−＞  抱合体
糖質−ＮＨ２    ＋  ＣＯＯＨ−保護基  ＋  ＥＤＡＣ  −−−−＞  抱合体
スペーサー（リンカー）を介した間接的なカップリングアプローチ：
糖質−ＯＨ  ＋  ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ  −−−＞  シアナートエステル  ＋  ＮＨ２−−−−ＮＨ２  −−−−＞  糖質−−−−ＮＨ２  ＋  ＣＯＯＨ−保護基    ＋  ＥＤＡＣ    −−−−−＞  抱合体
糖質−ＯＨ  ＋  ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ  −−−−＞  シアナートエステル  ＋  ＮＨ２−−−−−ＳＨ  −−−−−＞  糖質−−−−ＳＨ      ＋  ＳＨ−保護基（露出したシステインを有するかまたは例えばＳＰＤＰによるタンパク質のアミノ基の修飾後に得られる天然タンパク質）  −−−−−＞  糖質−Ｓ−Ｓ−保護基
糖質−ＯＨ  ＋  ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ  −−−＞  シアナートエステル  ＋  ＮＨ２−−−−ＳＨ  −−−−−−−＞  糖質−−−−ＳＨ  ＋  マレイミド−保護基（アミノ基の修飾）  −−−−＞  抱合体
糖質−ＯＨ  ＋  ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ  −−−＞  シアナートエステル  ＋  ＮＨ２−−−−−ＳＨ  −−−＞  糖質−ＳＨ  ＋  ハロアセチル化した保護基  −−−−＞  抱合体
糖質−ＣＯＯＨ  ＋  ＥＤＡＣ  ＋  ＮＨ２−−−−−ＮＨ２  −−−＞  糖質−−−−−−ＮＨ２  ＋  ＥＤＡＣ  ＋    ＣＯＯＨ−保護基  −−−−＞  抱合体
糖質−ＣＯＯＨ  ＋  ＥＤＡＣ＋  ＮＨ２−−−−ＳＨ        −−−−−＞  糖質−−−−ＳＨ    ＋  ＳＨ−保護基（露出したシステインを有するかまたは例えばＳＰＤＰによるタンパク質のアミノ基の修飾後に得られる天然タンパク質）  −−−−−＞  糖質−Ｓ−Ｓ−保護基
糖質−ＣＯＯＨ  ＋  ＥＤＡＣ＋  ＮＨ２−−−−ＳＨ        −−−−−＞  糖質−−−−ＳＨ  ＋  マレイミド−保護基（アミノ基の修飾）  −−−−＞  抱合体
糖質−ＣＯＯＨ  ＋  ＥＤＡＣ  ＋  ＮＨ２−−−−ＳＨ  −−−＞  糖質−ＳＨ  ＋  ハロアセチル化保護基  −−−−＞  抱合体
糖質−アルデヒド  ＋  ＮＨ２−−−−−ＮＨ２  −−−−＞  糖質−−−ＮＨ２  ＋  ＥＤＡＣ  ＋  ＣＯＯＨ−保護基  −−−−＞  抱合体
注記：先のＥＤＡＣの替わりに、任意の好適なカルボジイミドを用いてもよい。
【０１２８】
要約して、糖質とのカップリングのために一般的に用いられ得るタンパク質担体化学基の種類は、アミノ基（例えば、リシン残基上）、ＣＯＯＨ基（例えば、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基上）、およびＳＨ基（アクセス可能な場合）（例えば、システイン残基上）である。
【０１２９】
本発明のワクチンまたは免疫原性組成物
本発明はさらに、
Ａ．本発明のプロセスを用いて細菌毒素または抱合体を作製する工程と、
Ｂ．該細菌毒素またはその抱合体を医薬として許容し得る賦形剤と混合する工程と、
を含んでなる、ワクチンまたは免疫原性組成物を映像するためのプロセスを提供する。
【０１３０】
このプロセスによって製造されるワクチンまたは免疫原性組成物は、さらなる細菌種由来の抗原を追加的に含んでなってもよい。一実施態様において、ワクチンまたは免疫原性組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ、インフルエンザ菌、ナイセリア・メニンジティディス、大腸菌、ヒト下気道感染症原因菌（M. cattarhalis）、破傷風、ジフテリア、百日咳、スタフィロコッカス・エピデルミディス、エンテロコッカス、およびＳ．アウレウスから選択される抗原を含んでなってもよい。
【０１３１】
さらなる工程において、本発明のポリペプチドは、アジュバントと混合されてもよい。細菌毒素または本発明のプロセスを用いて作製される抱合体と混合されるのに好適なアジュバントの選択は、当業者の知識内である。好適なアジュバントには、水酸化アルミニウムゲルもしくはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩またはミョウバンが挙げられるが、カルシウム、マグネシウム、鉄、もしくは亜鉛の塩など、他の金属塩であり得、あるいはアシル化チロシンまたはアシル化糖、陽イオン的にもしくは陰イオン的に誘導体化された糖質、またはポリホスファゼンの不溶性懸濁液であり得る。
【０１３２】
易感染性の哺乳類を保護または治療するために、該ワクチンを全身性経路または粘膜経路を介して投与することによって、本発明の免疫原性組成物を含むワクチン調製物を用いてもよい。これらの投与には、筋肉内、腹腔内、皮内、もしくは皮下経路を介した注射、または口腔／食事性、呼吸器系、泌尿生殖器への粘膜投与を介するものが含まれ得る。肺炎または中耳炎の治療のためのワクチンの鼻内投与は好ましい（肺炎球菌の鼻咽頭輸送がより効果的に予防され、したがってその最初期において感染を減弱させることができるので）。本発明のワクチンは、単回用量として投与され得るが、その成分は、同時にまたは異なる時点で互いに同時投与されてもよい（例えば、肺炎球菌糖質抱合体は、ワクチンの任意の細菌タンパク質成分の投与と別個に、同時に、または１〜２週間後に、互いに関する免疫応答の最適な協調のために、投与され得る）。単一の投与経路に加えて、２つの異なる投与経路を用いてもよい。例えば、糖質または糖質抱合体は、筋肉内（または皮内）投与されてもよく、細菌タンパク質は、鼻内（ＩＮ）（または皮内）投与されてもよい。加えて、本発明のワクチンは、初回抗原刺激量のために筋肉内に、および追加抗原量のために鼻内に（ＩＮ）投与されてもよい。
【０１３３】
ワクチンにおける毒素の含有量は典型的には、１〜１００μｇ、好ましくは５〜５０μｇの範囲、最も典型的には５〜２５μｇの範囲である。初回ワクチン接種後に、対象は、適切に間隔を空けられた１回または数回の追加免疫を受容してもよい。
【０１３４】
ワクチン調製物は一般的に、Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” (Powell M.F.およびNewman M.J.編) (1995) Plenum Press New York）に説明される。リポソーム内の封入は、Fullerton，米国特許第4,235,877号によって説明される。
【実施例】
【０１３５】
実施例１  ＣＲＭ１９７−シグナル配列コンストラクトの設計
ＣＲＭ１９７トキソイドに融合したＮ末端シグナル配列をコードする配列を含むプラスミドを、標準的な分子生物学技術を用いて作製した。１３の異なるシグナル配列を用い（表２）、これらをＧｅｎＥＭＢＬデータベースから選択した。
【表２】
2018085994.tif 000003
【０１３６】
第一のコンストラクトを３つのプラスミドから作製した（図１参照）。Ｇｅｎｅａｒｔによって作製されたプラスミドＡは、ＣＲＭ１９７のＮ末端断片をコードする配列（配列番号３２のアミノ酸１〜２０６）に対して３’にＤｓｂＡシグナル配列（配列番号２５）を含んでいた。このプラスミドを、ＮｄｅｌおよびＳａｃＩ制限酵素に続く連結を用いた両プラスミドの消化によって、ｐＥＴ２６ｂ骨格プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）へとクローン化した。Ｇｅｎｅａｒｔによって作製されたプラスミドＢは、ＣＲＭ１９７のＣ末端断片（配列番号３２のアミノ酸２０６〜５３３）を含んだ。これを、ＡａｔＩＩおよびＸｈｏＩ制限酵素による制限を用いてｐＥＴ２６骨格へとクローン化し、結果として生じるプラスミドをｐＲＩＴ１６６６８と命名した。このコンストラクトは、ＤｓｂＡからシグナラーゼ結合部位までのシグナル配列、続いて、シグナラーゼ結合配列の後ろに見出されるＤｓｂＡ由来の２つのアミノ酸、制限酵素結合部位由来のさらなる２つのアミノ酸、および最後に最初の２つのアミノ酸を欠くＣＲＭ１９７を含む。このことは、これらのコンストラクトが発現する場合に、ペリプラズム発現後に産生されるタンパク質およびシグナラーゼによるシグナル配列の除去が、最初の２つのアミノ酸を欠くがＤｓｂＡおよび制限部位由来の余剰の４つのアミノ酸を有するＣＲＭ１９７を含むことを意味する。
【０１３７】
ｐＲＩＴ１６６６８プラスミドは、ＤｓｂＡシグナル配列に隣接するＮｄｅＩおよびＡｇｅＩ制限部位を含む。
【０１３８】
１２の他のシグナル配列を含むプラスミドを、ＮｄｅＩおよびＡｇｅＩによるプラスミドｐＲＩＴ１６６６８を消化してＤｓｂＡシグナル配列を除去することによって作製した。その他の１２のシグナル配列の各々をコードするハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドは、これら２つの部位間で一度に１つ連結された。
【０１３９】
結果として生じるプラスミドを、Novavlue化学的コンピテント細胞（Novagenカタログ番号70181-3、製造元によって推奨されるように使用）へと形質転換した。精確なインサートの存在を、配列決定によって各プラスミドについて確認した。次に、プラスミドを個々に、化学的コンピテント細胞（Novagenカタログ番号69041-3HMS174 (DE3)）、化学的コンピテント細胞、またはそれに代わるものとしてBLR(DE3)化学的コンピテント細胞（Novagenカタログ番号69053-3、製造元によって推奨されるように使用）へと発現のために形質転換した。
【０１４０】
実施例２  （ペリプラズムシグナル配列を欠失する）細胞質発現のためのＣＲＭ１９７コンストラクトの設計
本実験において、実施例１において作製されたものと同様だが、ペリプラズムシグナル配列を欠失するプラスミドを作製した。この設計プロセスを図２に要約する。まず、ＣＲＭ１９７配列（配列番号３１）をＭＤＳＣＲＭ１（配列番号２７）およびＭＤＳＣＲＭ２（配列番号２８）と命名された２つのプライマーをテンプレートとして用いて、標準的なＰＣＲ技術によって増幅した（使用した温度周期は、（９４℃２分―５５℃２分―７２℃２分３０秒）×２５回―７２℃１０分―終止４℃であった）。
【０１４１】
この断片を、ＣＲＭ１９７シグナル配列インサートの替わりにプラスミドｐＲＩＴ１６６６８へと挿入した。このことを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いたＰＣＲ産物およびｐＲＩＴ１６６６８の消化を通じて、標準的な分子生物学技術を用いて達成した。結果として生じるプラスミドは、成熟ＣＲＭ１９７配列（配列番号３１）を含むが、シグナル配列を含まず、ｐＲＩＴ１６６６９と命名された。
【０１４２】
結果として生じるプラスミドを、Ｎｏｖａｂｌｕｅ化学的コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎカタログ番号７０１８１−３、製造元によって推奨されるように使用）へと形質転換した。正確なインサートの存在を配列決定によって各プラスミドについて確認した。次に、プラスミドをＢ８３４（ＤＥ３）化学的コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎカタログ番号６９０４１−３、製造元によって推奨されるように使用）へと発現のために形質転換した。
【０１４３】
実施例３  最適なシグナル配列−ＣＲＭ１９７コンストラクトの設計
シグナル配列ＦｌｇＩを、改良されたコンストラクトを作製するための使用のために選択した。以下のクローン化プロセスを図３に要約する。
【０１４４】
ＣＲＭ１９７配列のＮ末端部分に融合したＦｌｇＩシグナル配列を含むＤＮＡの一領域を、標準的なＰＣＲ技術を用いて増幅した。ＦｌｇＩ  ｃ−ＣＲＭｏｐｔ３ｅ（配列番号２９）およびＭＤＳＣＲＭ９０６ＮＣ（配列番号３０）と命名された２つのプライマーを用い、テンプレートとしてｐＲＩＴ１６６０９を用い、周期（９４℃２分  （９４℃１分―６０℃１分―７２℃２分３０秒）×３  （９４℃１分―５８℃１分―７２℃２分３０秒）×３  （９４℃１分―５６℃１分―７２℃２分３０秒）×３  （９４℃１分―５４℃１分―７２℃２分３０秒）×２０  ７２℃１０分―終止４℃）を伴った。
【０１４５】
この断片を、ＰＣＲ産物およびプラスミドｐＲＩＴ１６６６９の制限酵素ＮｄｅＩおよびＡａｔＩＩによる消化を通じて、標準的な分子生物学技術を用いて、プラスミドｐＲＩＴ１６６６９へと挿入した。結果として生じるプラスミドは、ＣＲＭ１９７の完全な成熟Ｎ末端（配列番号３１）およびシグナラーゼ結合部位において終止するＦｌｇＩシグナル配列（配列番号２３）を含み、ｐＲＩＴ１６６８１と命名した。
【０１４６】
結果として生じるプラスミドをＮｏｖａｂｌｕｅ化学的コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎカタログ番号７０１８１−３、製造元によって推奨されるように使用）へと形質転換した。正確なインサートの存在を配列決定によって各プラスミドについて確認した。プラスミドを次に、Ｂ８３４（ＤＥ３）化学的コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎカタログ番号６９０４１−３）細胞へと発現のために形質転換した。
【０１４７】
実施例４  ＤｓｂＡシグナル配列−ＣＲＭ１９７コンストラクトの発現
本実験において、実施例１において作製したＤｓｂＡシグナル配列コンストラクトで形質転換した細胞を培養し、発現を誘導した。Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、およびＢＬＲ（ＤＥ３）組換え株の前培養物（３ｍＬ）を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）の存在下で１％グルコースを補充したＬＢＴ培地において３７℃で一晩、攪拌の下で増殖した。翌日、培地の光学密度ＯＤ６２０が０．１に到達した後、この前培養物の試料を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを有する２０ｍＬのＬＢＴ培地へと転化した。これらの細胞を撹拌の下で３０℃で増殖しておいた。このプラスミドにおいて、ＣＲＭ１９７発現は、ｌａｃオペレーターの制御下にあり、それゆえ、コードされたＣＲＭ１９７の発現は、イソプロピル−ベータ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加の際に誘導されることができる。光学密度が０．６に到達すると、ＩＰＴＧ（１ｍＭの終濃度になるまで添加）を用いた誘導を実施し、培養物をさらに３０℃で３時間増殖させておいた。
【０１４８】
ＣＲＭ１９７発現のレベルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｎｏｖｅｘトリス−グリシン１０〜２０％）上で全細菌細胞産物を泳動し、クーマシーブリリアントブルーを用いて染色することによって評価した。ウェスタンブロットを、ＮＢＴ−ＢＣＩＰによるマウス抗ＤＴＰａポリクローナル抗体染色を用いて実施した。
【０１４９】
図４は、本実験の結果を示す。クーマシーゲルは、誘導済み培養物と誘導されていない培養物の間の発現特性に差を示さない。ウェスタンブロットは、誘導済み培養物および誘導されていない培養物の両方におけるＣＲＭ１９７の欠失を示す。これらの条件下で発現するペリプラズムＣＲＭ１９７は全くないかまたはほとんどない。
【０１５０】
実施例５  ｐＨおよび温度の最適化ならびにコンストラクトの発現分析
実施例４の工程を反復したが、この場合、１００ｍＭのＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４緩衝液を誘導前に培養物に添加し、それにより培地をｐＨ７．５に緩衝した。発現を１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘導し、培養物を２３℃または３０℃のいずれかで一晩増殖させておいた。上清およびペレットにおいて発現したタンパク質のレベルを、実施例４において説明されるように、クーマシー染色およびウェスタンブロット技術を用いて評価した。
【０１５１】
翻訳後シグナル配列に関して、ＣＲＭ１９７の発現レベルは、ＯｍｐＡシグナル配列について非常に高かったが、該タンパク質は、約２７ｋＤａのタンパク質を形成するために切断される。この切りつめられた形態は、細胞と会合する（ペリプラズム放出画分においてまたは培地においてのいずれでも見出されていない）。ＮｓｐＡシグナル配列に関して、発現は陽性だが、低レベルの成熟ＣＲＭ１９７が得られる。
【０１５２】
同時翻訳配列に関して、発現レベルは、ＦｌｇＩおよびＳｉｐＡシグナル配列によって高いが、産生されたＣＲＭ１９７は完全に成熟型ではない。ＮｉｋＡシグナル配列による発現は、成熟タンパク質の発現をもたらす。包括的な発現レベルは、ＦｌｇＩおよびＳｉｐＡシグナル配列によるよりも低いが、全抽出物においてクーマシー染色によってなおも検出可能である。
【０１５３】
実施例６  ＣＲＭ１９７細胞質発現コンストラクトの発現分析
ＤＥ３細胞を実施例２において製造したプラスミドで形質転換し、培養し、ＣＲＭ１９７の発現を実施例４において説明される通り誘導した。実施例４に説明される通り、ＣＲＭ１９７発現レベルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおおける全細菌細胞の産物を泳動し、クーマシーブルー染色およびウェスタンブロット技術を用いることによって評価した。細菌抽出を標準的なＰＢＳ緩衝液におけるワンショット技術（Ｃｏｎｓｔａｎｔの系）によって実施した。遠心分離後、得られた可溶性画分および不溶性画分をゲルに負荷した。
【０１５４】
本実験の結果を図６に表す。遺伝子は、タンパク質のかなりの部分が不溶性でありかつペレットに留まっているにもかかわらず、これらの株において十分に発現する。さらに、細胞質発現は、ゲルにおいて現れる見かけのより低分子量のタンパク質をもたらす。
【０１５５】
実施例７  最適化されたＦｌｇＩコンストラクトの発現分析
ＢＬＲ（ＤＥ３）大腸菌細胞を実施例３において製造したコンストラクトで形質転換し、培養し、実施例５の最適化されたプロトコールにおいて説明された通り、発現を誘導した。加えて、いくつかの試料細胞を、１００ｍＭのＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４緩衝液の添加なしで増殖した。同様に、発現したタンパク質のレベルを、実施例４に説明される通り、クーマシー染色およびウェスタンブロット技術を用いて評価した。誘導時に、温度を２３℃または３０℃のいずれかで維持し、試料を誘導時、誘導２時間後、誘導４時間後、および一晩の誘導後に採取した。
【０１５６】
本実験の結果を図７に示す。ウェスタンブロットは、２３℃における緩衝液によるＣＲＭ１９７の発現の容易に検出可能なレベルを示す。誘導相の間に緩衝されていない細胞におけるタンパク質発現のレベルは、より低いと観察された。
【０１５７】
実施例８―大腸菌Ｂ２３５５の前培養
前培養物を、大腸菌株Ｂ２３５５の凍結種培養を用いて調製した。この株は、大腸菌由来のＦｌｇＩのシグナルペプチドとＣＲＭ１９７の成熟部分の間の融合タンパク質をコードする配列を含むｐＥＴ２６ｂ誘導体（これは、図３および実施例３において説明されたプラスミドｐＲＩＴ１６６８１である）を用いて形質転換されたＢ８３４（ＤＥ３）株である。シード培養能は、１ｍＬあたりおよそ１×１０１０コロニー形成単位として決定された。
【０１５８】
種培養物を室温に融解し、４００μＬを用いて、４００ｍＬの前培養培地を含む２リットルのエルレンマイヤーフラスコに接種した（Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987)）から応用）。
【０１５９】
次に、接種したフラスコを３７℃（±１℃）および２００ｒｐｍでインキュベートした。６５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ６５０ｎｍ）が２．５０に到達すると（約６時間のインキュベーション）、前培養を停止した。培養を停止するとすぐに、前培養物を用いて発酵槽中の培地に接種した（実施例９）。
【０１６０】
実施例９―２０Ｌ規模の流加回分発酵
方法
２０リットルの発酵槽（Biolafitte）を用いた。９リットルのバッチ相培地を発酵槽へと無菌的に転移させた（Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987)）から応用）。培地のｐＨを塩基の添加により、６．８に再調整した。次に、３ｍＬの希釈していない照射済み消泡剤（ＳＡＧ４７１）も発酵槽に添加した。温度（２８℃）、頭部圧力（０．５バール）、曝気速度（１分間当たり２０リットルの撒き散らした空気）、および初期撹拌速度（３００ｒｐｍ）を設定した後に接種した。これらの条件下の溶存酸素レベルは１００％であった。頭部圧力および曝気速度を、発酵の間定常レベルで維持した。
【０１６１】
接種は、１８ｍＬの前培養物（実施例８に説明される通り調製）の添加によって達成された。
【０１６２】
バッチ相の間（０〜１５時間）、温度を２８℃に維持した。溶存酸素のレベルを２０％に設定した。溶存酸素（ＤＯ）が２０％未満に落ちた場合、撹拌を増大させることによって、ＤＯのレベルを調節した。グルコース枯渇は結果的に、ＤＯの増大および撹拌中の付随する低下を生じた。
【０１６３】
１５時間の発酵後、追加的な基質を以下の供給添加特性に従って添加した：
【表３】
2018085994.tif 000004
2018085994.tif 000005
【０１６４】
流加回分相の間（１５〜４６時間）、ｐＨを塩基の添加によって６．８に維持し、温度を２８℃に調節し、ＤＯレベルを撹拌速度の制御を通じて２０％に維持した。
【０１６５】
４６時間時に、ＩＰＴＧを１ｍＭの終濃度に添加し、細菌を誘導した。加えて、ｐＨは、塩基の添加によって４６時間後に漸増し、温度は２３℃にまで低下した（これらの変化は、高レベルのペリプラズム発現に必要とされる）。ｐＨおよび温度を全誘導相の間（４６〜７２時間）に維持した。ＤＯレベルを、撹拌速度を制御することによって２０％に維持した。
【０１６６】
誘導相の終了時に（７２時間）、細胞ペーストを遠心分離（６，５００×ｇ、４℃１時間）によって回収し、−２０℃で保存した。
【０１６７】
ペリプラズム抽出を、Chen et al. (Biochem. Eng. J. 19:211-215 (2004)）から応用した手順を用いた浸透圧ショックによって実施した。ペリプラズム画分および細胞質画分におけるＣＲＭ１９７含有量をＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【０１６８】
図８は、２０Ｌ規模の流加回分発酵の間にモニターされるプロセスのパラメータによる典型的な発酵特性を示す。
【０１６９】
発酵の終了時に、ペリプラズムＣＲＭ１９７の生産性をＥＬＩＳＡによってアッセイした：
【表４】
2018085994.tif 000006
【０１７０】
本技術は、未曾有の発現レベルおよび分泌効率を示した。
【０１７１】
実施例１０―誘導相の間に用いられるべき最適な供給速度および温度の決定
本実験において、応答−表面方法論（J.ind. Microbiol. Biotechnol. 37:195-204 (2010)）を用いて、組換えタンパク質のペリプラズム産生を最大化するために、３つのパラメータについての最適な値を決定した。研究した３つの発酵パラメータは、増殖相の間のｐＨ、誘導中のｐＨ、および誘導中の供給速度であった。これら３つのパラメータについての値を、Ｄｏｅｈｌｅｒｔの均一なシェル設計（Doehlert (Applied Statistics 19:231-239 (1970))）に従って選択した。表５に示される値を用いて、１５の発酵を実施した。
【０１７２】
株Ｂ２２８４を用いて発酵を実施し、該株は、大腸菌由来のＦｌｇＩのシグナルペプチドとＣＲＭ１９７の成熟部分の間の融合タンパク質をコードする配列を含むｐＥＴ２６ｂ誘導体（これは、図３および実施例３において説明されたプラスミドｐＲＩＴ１６６８１である）で形質転換したＢＬＲ（ＤＥ３）細胞の株である。
【０１７３】
各発酵について、種培養物を室温に融解し、５００μＬを用いて、４００ｍＬの前培養培地を含む２リットルのエルレンマイヤーフラスコに接種した（Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987)）から応用）。
【０１７４】
次に、接種したフラスコを３７℃（±１℃）および２００ｒｐｍでインキュベートした。６５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６５０ｎｍ）が約２．５に到達すると（約６時間のインキュベーション）、前培養を停止した。培養が停止するとすぐに、前培養物を用いて発酵槽中の培地に接種した（Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987)から応用）。
【０１７５】
２０リットルの発酵槽(Biorafitte)を用いた。９リットルのバッチ相培地を発酵槽に無菌的に転移した。培地のｐＨを標的値（表５）に、塩基添加により再調整した。３ｍＬの希釈していない照射済み消泡剤（ＳＡＧ４７１）も発酵槽に添加した。次に、温度（２８℃）、頭部圧力（０．５バール）、曝気速度（１分間当たり２０リットルの撒き散らした空気）、および初期撹拌速度（３００ｒｐｍ）を設定した後に接種した。これらの条件下での溶存酸素（ＤＯ）のレベルは１００％であった。頭部圧力および曝気速度を、発酵の間、定常レベルに維持した。
【０１７６】
接種は、１５〜２０ｍＬの前培養物の添加によって達成された。
【０１７７】
バッチ相の間（０〜１５時間）、温度を２８℃に維持した。溶存酸素のレベルを２０％に設定し、ＤＯが２０％未満に落ちると、撹拌を増大させることによって調節した。
【０１７８】
流加回分相の間（１５〜４６時間）、ｐＨを、塩基の添加によって、表５に示された条件のうちの１つに従って維持した。温度を２８℃に調節した。撹拌速度を定常セットポイント（最大８００ｒｐｍ）に維持し、ＤＯが２０％を上回って増大した場合、濃縮した供給溶液の自動添加によってＤＯレベルを２０％に維持した（Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol. 2:87-95 (1987)）から応用）。
【０１７９】
培養物が約９０のＯＤ６５０ｎｍに到達すると、ｐＨセットポイントを、塩基または酸の添加によって、表５に示される条件のうちの１つに従って修正し、温度を２３まで低下した。一旦これらの条件に達すると、ＩＰＴＧを１ｍＭの終濃度に添加した。ｐＨおよび温度を全誘導相の間（２４時間）に維持した。定常基質供給速度を、表５に示される条件のうちの１つに従って、全誘導相の間に用いた。撹拌速度を制御することによって、ＤＯレベルを２０％に維持した。
【０１８０】
誘導相の終了時に、細胞ペーストを遠心分離（典型的には６，５００×ｇ、４℃１時間）によって回収し、−２０℃で保存した。
【０１８１】
ペリプラズム抽出を、Chen et al. (Biochem. Eng. J. 19:211-215 (2004)から応用した手順を用いる浸透圧ショックによって実施した。
【表５】
2018085994.tif 000007
【表６】
2018085994.tif 000008
【０１８２】
１５の発酵からの結果に基づいて、ＮＥＭＲＯＤ−Ｗソフトウェア（LPRAI, Marseille, France）を用いて、ペリプラズム画分および細胞質画分におけるＣＲＭ１９７の産生をモデル化した。
【０１８３】
図１０に示すように、ペリプラズムＣＲＭ１９７の産生は、誘導時の低い供給速度で最大である（図１０のａ）のに対し、細胞の内側のＣＲＭ１９７の蓄積は、より高い供給速度で最大である（図１０のｂ）。、ペリプラズムのまたは細胞会合型のＣＲＭ１９７の産生に最適な供給速度の差は、ペリプラズムＣＲＭ１９７の産生を選択的に改良する条件を規定させる。誘導時のｐＨの上昇も、ペリプラズムＣＲＭ１９７の効率的な産生に必要とされる（図１０のａ）。
【０１８４】
下記の表７は、ＮＥＭＲＯＤ−Ｗソフトウェアを用いて得られたように、増殖時の最適なｐＨ、誘導時の最適なｐＨ、および最適な供給速度を示す。
【表７】
2018085994.tif 000009
【０１８５】
ｐＨおよび供給速度の条件を最適化することは、ＣＲＭ９７のペリプラズムへの最適な分泌をもたらした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
2018085994.tif 000018
【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年2月1日(2018.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’シグナル配列部分と３’毒素部分とを含んでなるポリヌクレオチドであって、
（ａ）５’シグナル配列部分は、グラム陰性菌宿主細胞において発現された場合に異種性タンパク質の細菌ペリプラズムへの輸送を配向させることのできるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、かつ、該５’シグナル配列部分はジフテリア菌由来ではなく、かつ
（ｂ）３’毒素部分は、配列番号３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する細菌毒素ポリペプチドをコードする、
ポリヌクレオチド。
【外国語明細書】
2018085994000001.pdf