(57)【要約】【課題】糖尿病性腎症患者の進行リスクを診断するための方法を提供することを課題とする。【解決手段】30 mg/gCr以上の尿アルブミン/Cr比を示す糖尿病性腎症患者の尿中アポリポプロテインE(ApoE)濃度を測定し、尿中ApoE濃度の値が所定の閾値以上の場合に、前記患者は糖尿病性腎症が進行するリスクが高いと判定することにより、上記の課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
30 mg/gCr以上の尿アルブミン/Cr比を示す糖尿病性腎症患者の尿中アポリポプロテインE(ApoE)濃度を測定する工程と、
尿中ApoE濃度の値が所定の閾値以上の場合に、前記患者は糖尿病性腎症が進行するリスクが高いと判定する工程と
を含む、糖尿病性腎症の進行リスクの診断を補助する方法。
【請求項２】
前記糖尿病性腎症患者が、糖尿病性腎症２期、糖尿病性腎症３期または糖尿病性腎症４期である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記判定工程において、前記尿中ApoE濃度の値が前記所定の閾値未満の場合に、前記患者は糖尿病性腎症が進行するリスクが低いと判定する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記糖尿病性腎症患者が糖尿病性腎症２期である場合、前記リスクは、糖尿病性腎症２期から３期または４期へ進行するリスクであり、
前記糖尿病性腎症患者が糖尿病性腎症３期である場合、前記リスクは、糖尿病性腎症３期から４期へ進行するリスクであり、
前記糖尿病性腎症患者が糖尿病性腎症４期である場合、前記リスクは、糖尿病性腎症４期から５期へ進行するリスクである、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、
前記メモリには、下記のステップ：
30 mg/gCr以上の尿アルブミン/Cr比を示す糖尿病性腎症患者の尿中アポリポプロテインE(ApoE)濃度を測定するステップと、
尿中ApoE濃度の値が所定の閾値以上の場合に、前記患者は糖尿病性腎症が進行するリスクが高いと判定するステップと
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、
糖尿病性腎症の進行リスクの診断を補助するデータの取得に適する装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病性腎症の進行リスクの診断を補助する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病性腎症は、糖尿病の合併症の一つであり、段階を経て進行する腎臓病である。糖尿病性腎症の病期は、腎症前期(第１期)から透析療法期(第５期)までの５つに分類されている。腎症前期(第１期)及び早期腎症期(第２期)の段階では、患者に自覚症状はほとんどない。しかし、糖尿病性腎症が進行するとやがて腎不全になり、透析治療が必要になる。透析治療は患者にとって大きな負担である。近年、透析治療を必要とする患者数は増加しており、それに伴う医療費の増加が問題となっている。
【０００３】
糖尿病性腎症では、初期の段階で適切な治療を開始できれば、腎機能を回復することができる。しかし、より進んだ段階では、治療によって病気の進行を遅らせることはできても、腎機能を維持し回復させることは難しい。したがって、糖尿病性腎症が進行するリスクのある患者を、腎機能の回復が望める初期の段階で発見して積極的に治療を行うことは、患者の将来の負担を軽減する。また、医療費の削減にも大きく貢献する。
【０００４】
現在、糖尿病性腎症の診断に有用なバイオマーカーの探索が行われている。例えば、非特許文献１には、糖尿病II型患者において、マクロファージのアポリポプロテインE(ApoE)の分泌量が低下することが開示されている。また、非特許文献２には、ApoEのepsilon4 alleleの遺伝子多型が糖尿病性腎症と糖尿病性腎症のリスクと関連することが示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yamato K.ら, Evaluation of apolipoprotein E secretion by macrophages in type 2 diabetic patients: role of HDL and apolipoprotein A-I, Diabetes Res Clin Pract., 2005 Aug;69(2):124-8. Epub 2004 Dec 28
【非特許文献２】Ilhan N.ら, ApoE gene polymorphism on development of diabetic nephropathy, Cell Biochem Funct. 2007 Sep-Oct;25(5):527-32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１及び２のいずれにも、尿中ApoE濃度と糖尿病性腎症との関連性については何ら記載も示唆もされていない。一方、上述のとおり、進行リスクの高い患者を早期に発見して治療を開始することが重要である。よって、そのようなリスクの診断を可能にする手段の開発が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、30 mg/gCr以上の尿アルブミン/Cr比を示す糖尿病性腎症患者の尿中アポリポプロテインE(ApoE)濃度を測定する工程と、尿中ApoE濃度の値が所定の閾値以上の場合に、前記患者は糖尿病性腎症が進行するリスクが高いと判定する工程とを含む、糖尿病性腎症の進行リスクの診断を補助する方法を提供する。
【０００８】
また、本発明は、プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、前記メモリには、下記のステップ：30 mg/gCr以上の尿アルブミン/Cr比を示す糖尿病性腎症患者の尿中アポリポプロテインE(ApoE)濃度を測定するステップと、尿中ApoE濃度の値が所定の閾値以上の場合に、前記患者は糖尿病性腎症が進行するリスクが高いと判定するステップとを前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、糖尿病性腎症の進行リスクの診断を補助するデータの取得に適する装置を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、糖尿病性腎症の進行リスクの診断を補助することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】本実施形態に係る試薬キットの外観の一例を示す図である。
【図１Ｂ】本実施形態に係る試薬キットの外観の一例を示す図である。
【図１Ｃ】本実施形態に係る試薬キットの外観の一例を示す図である。
【図１Ｄ】本実施形態に係る試薬キットの外観の一例を示す図である。
【図１Ｅ】本実施形態に係る試薬キットの外観の一例を示す図である。
【図１Ｆ】本実施形態に係る試薬キットの外観の一例を示す図である。
【図２】進行リスク診断補助装置の一例を示した概略図である。
【図３】図２の進行リスク診断補助装置の機能構成を示すブロック図である。
【図４】図２に示された進行リスク診断補助装置のハードウェア構成を示すブロック図である。
【図５】図２に示された進行リスク診断補助装置を用いた、糖尿病性腎症の進行リスク診断を補助するデータを取得するための判定のフローチャートの一例である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本実施形態の糖尿病性腎症の進行リスクの診断を補助する方法(以下、「診断補助方法」ともいう)では、30 mg/gCr以上の尿アルブミン/Cr (クレアチニン)比を示す糖尿病性腎症患者(以下、「被検者」ともいう)を対象とする。糖尿病性腎症患者は、好ましくは糖尿病性腎症第2期（早期腎症期)、糖尿病性腎症第3期（顕性腎症期)又は糖尿病性腎症第4期（腎不全期)の糖尿病性腎症患者である。これらは、それぞれ腎症の病期の一つである。より具体的には、糖尿病性腎症第２期（早期腎症期）とは、KDIGO (Kidney Disease: Improving Global Outcoms) 2012 Clinical Practice Guideline for the Evaluation and Management of Chronic Kidney Diseaseに記載の慢性腎臓病(CKD)の重症度分類におけるアルブミン尿区分がA2であり、且つGFR区分がG1、G2、G3a又はG3bである病期をいう。糖尿病性腎症第３期（顕性腎症期）とは、慢性腎臓病(CKD)の重症度分類におけるアルブミン尿区分がA3であり、且つGFR区分がG1、G2、G3a又はG3bである病期をいう。糖尿病性腎症第４期（腎不全期）とは、慢性腎臓病(CKD)の重症度分類におけるアルブミン尿区分がA1、A2又はA3であり、且つGFR区分がG4である病期をいう。糖尿病性腎症の診断法は特に限定されず、公知の方法で診断すればよい。尿アルブミン及びクレアチニンの測定法と推算GFRの算出法は、当該技術において公知である。
【００１２】
本実施形態では、試料として、被検者から採取した尿を用いる。被験者から採取される尿は、被験者の体調、食事及び服薬の有無などによって特に限定されない。また、尿の採取時期も特に限定されず、早朝尿、随時尿及び蓄尿のいずれを用いてもよい。本実施形態の方法では、尿の量は100〜500μL程度あれば十分である。
【００１３】
必要に応じて、ApoE濃度の測定に適するように、被検者から採取した尿に前処理を行ってもよい。そのような前処理としては、希釈、pHの調整などが挙げられる。例えば、尿と所定のpHの緩衝液とを混合することにより、尿の希釈とpHの調整を行うことができる。緩衝液は、ApoE濃度の測定に適するpH範囲にて緩衝作用を有するかぎり、特に限定されない。例えば、Tris、MES、PIPES、TES、HEPESなどのグッドの緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などが挙げられる。尿に無晶性塩類が存在する場合は、これを除去するためにEDTA塩などのキレート剤を尿に添加してもよい。以下、被検者から採取した尿及び前処理した尿を「尿試料」ともいう。
【００１４】
尿中でApoEは、マクロファージなどの貪食細胞に取り込まれたリポ蛋白由来またはマクロファージ自身が産生している場合がある。本実施形態では、尿の前処理として、ApoEを取り込んだ貪食細胞からApoEを尿中に遊離させてもよい。細胞からApoEを遊離させる方法は特に限定されず、例えば、界面活性剤による可溶化、超音波破砕、凍結融解などが挙げられる。界面活性剤による細胞の可溶化は、例えば、被検者から採取した尿と、界面活性剤を含む緩衝液とを混合することにより行うことができる。界面活性剤を含む緩衝液の添加量は適宜設定できるが、例えば、尿量の１倍以上50倍以下の量、好ましくは尿量の１倍以上10倍以下の量を添加してもよい。界面活性剤の種類は、ApoEの測定を妨げないかぎり特に限定されない。例えば、Triton X-100、Tween 20、オクチルグルコシドなどが挙げられる。尿試料中の界面活性剤の終濃度は、界面活性剤の種類に応じて適宜設定できる。例えば、Triton X-100を用いる場合、尿試料中の終濃度は0.001％(v/v)以上10％(v/v)以下、好ましくは0.01％(v/v)以上１％(v/v)以下である。
【００１５】
尿中ApoE濃度は、尿試料に含まれるApoEの濃度又は量を反映する値(以下、「ApoEの測定値」ともいう)を取得できる方法によって測定できる。そのような方法としては、ApoEと特異的に結合する捕捉体を用いて、ApoEを捕捉する方法が好ましい。捕捉体により捕捉されたApoEを公知の方法で検出することにより、ApoEの測定値を取得できる。ApoEと特異的に結合する捕捉体としては、例えば、抗体、アプタマーなどが挙げられる。それらの中でも抗体が特に好ましい。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及びそれらの断片(例えば、Fab、F(ab')2など)のいずれであってもよい。ApoEと特異的に結合する抗体(以下、「抗ApoE抗体」ともいう)自体は当該技術において公知であり、一般に入手可能である。
【００１６】
本実施形態では、抗ApoE抗体を用いる免疫学的測定法により、尿中ApoE濃度を測定することが好ましい。免疫学的測定法としては、例えば、酵素結合免疫吸着法(ELISA法)、免疫複合体転移測定方法(特開平1-254868号公報参照)、免疫比濁法、イムノクロマト法、ラテックス凝集法などが挙げられる。ELISAキットなどの市販の測定用キットを用いてもよい。測定工程の一例として、サンドイッチELISA法により尿中ApoE濃度を測定する場合について、以下に説明する。
【００１７】
まず、尿中のApoEと、ApoEを捕捉するための抗体(以下、「捕捉用抗体」ともいう)と、ApoEを検出するための抗体(以下、「検出用抗体」ともいう)とを含む複合体を固相上に形成させる。この複合体は、尿試料と、捕捉用抗体と、検出用抗体とを混合することにより形成できる。そして、複合体を含む溶液を、捕捉用抗体を捕捉できる固相と接触させることにより、上記の複合体を固相上に形成させることができる。あるいは、捕捉用抗体をあらかじめ固定した固相を用いてもよい。すなわち、捕捉用抗体を固定した固相と、尿試料と、検出用抗体とを接触させることにより、上記の複合体を固相上に形成させることができる。ここで、捕捉用抗体及び検出用抗体がいずれもモノクローナル抗体の場合は、互いのエピトープが異なっていることが好ましい。
【００１８】
捕捉用抗体の固相への固定の態様は特に限定されない。例えば、捕捉用抗体と固相とを直接結合させてもよいし、捕捉用抗体と固相とを別の物質を介して間接的に結合させてもよい。直接の結合としては、例えば、物理的吸着などが挙げられる。間接的な結合としては、例えば、ビオチンと、アビジン又はストレプトアビジン(以下、「アビジン類」ともいう)との組み合わせを介した結合が挙げられる。この場合、捕捉用抗体をあらかじめビオチンで修飾し、固相にアビジン類をあらかじめ結合させておくことにより、ビオチンとアビジン類との結合を介して、捕捉用抗体と固相とを間接的に結合させることができる。
【００１９】
固相の素材は特に限定されず、例えば、有機高分子化合物、無機化合物、生体高分子などから選択できる。有機高分子化合物としては、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。無機化合物としては、磁性体(酸化鉄、酸化クロム及びフェライトなど)、シリカ、アルミナ、ガラスなどが挙げられる。生体高分子としては、不溶性アガロース、不溶性デキストラン、ゼラチン、セルロースなどが挙げられる。これらのうちの２種以上を組み合わせて用いてもよい。固相の形状は特に限定されず、例えば、粒子、膜、マイクロプレート、マイクロチューブ、試験管などが挙げられる。
【００２０】
固相上に形成された複合体を、当該技術において公知の方法で検出することにより、尿におけるApoEの測定値を取得できる。例えば、検出用抗体として、標識物質で標識した抗体を用いた場合は、その標識物質により生じるシグナルを検出することにより、ApoEの測定値を取得できる。あるいは、検出用抗体に対する標識二次抗体を用いた場合も、同様にしてApoEの測定値を取得できる。
【００２１】
本実施形態では、複合体の形成工程と複合体の検出工程との間に、複合体を形成していない未反応の遊離成分を除去するB/F(Bound/Free)分離を行ってもよい。未反応の遊離成分とは、複合体を構成しない成分をいう。例えば、ApoEと結合しなかった捕捉用抗体及び検出用抗体などが挙げられる。B/F分離の手段は特に限定されないが、固相が粒子であれば、遠心分離により、複合体を捕捉した固相だけを回収することによりB/F分離ができる。固相がマイクロプレートやマイクロチューブなどの容器であれば、未反応の遊離成分を含む液を除去することによりB/F分離ができる。また、固相が磁性粒子の場合は、磁石で磁性粒子を磁気的に拘束した状態でノズルによって未反応の遊離成分を含む液を吸引除去することによりB/F分離ができる。未反応の遊離成分を除去した後、複合体を捕捉した固相をPBSなどの適切な水性媒体で洗浄してもよい。
【００２２】
本明細書において、「シグナルを検出する」とは、シグナルの有無を定性的に検出すること、シグナル強度を定量すること、及び、シグナルの強度を半定量的に検出することを含む。半定量的な検出とは、シグナルの強度を、「シグナル発生せず」、「弱」、「中」、「強」などのように段階的に示すことをいう。本実施形態では、シグナルの強度を定量的又は半定量的に検出することが好ましい。
【００２３】
標識物質は、検出可能なシグナルが生じるかぎり特に限定されない。例えば、それ自体がシグナルを発生する物質(以下、「シグナル発生物質」ともいう)であってもよいし、他の物質の反応を触媒してシグナルを発生させる物質であってもよい。シグナル発生物質としては、例えば、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。他の物質の反応を触媒して検出可能なシグナルを発生させる物質としては、例えば、酵素などが挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、Alexa Fluor(登録商標)などの蛍光色素、GFPなどの蛍光タンパク質などが挙げられる。放射性同位元素としては、125Ｉ、14Ｃ、32Ｐなどが挙げられる。それらの中でも、標識物質として、酵素が好ましく、アルカリホスファターゼ及びペルオキシダーゼが特に好ましい。
【００２４】
シグナルを検出する方法自体は、当該技術において公知である。本実施形態では、上記の標識物質に由来するシグナルの種類に応じた測定方法を適宜選択すればよい。例えば、標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を反応させることによって発生する光、色などのシグナルを、分光光度計などの公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。
【００２５】
酵素の基質は、該酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択できる。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、基質として、CDP-Star(登録商標)(4-クロロ-3-(メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2'-(5'-クロロ)トリシクロ[3. 3. 1. 13, 7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)、CSPD(登録商標)(3-(4-メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2-(5'-クロロ)トリシクロ[3. 3. 1. 13, 7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)などの化学発光基質、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)、5-ブロモ-6-クロロ−インドリルリン酸２ナトリウム、p-ニトロフェニルリン酸などの発色基質が挙げられる。また、酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合、基質としては、ルミノール及びその誘導体などの化学発光基質、2, 2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸アンモニウム)(ABTS)、1, 2-フェニレンジアミン(OPD)、3, 3',5, 5'-テトラメチルベンジジン(TMB)などの発色基質が挙げられる。
【００２６】
標識物質が放射性同位体である場合は、シグナルとしての放射線を、シンチレーションカウンターなどの公知の装置を用いて測定できる。また、標識物質が蛍光物質である場合は、シグナルとしての蛍光を、蛍光マイクロプレートリーダーなどの公知の装置を用いて測定できる。なお、励起波長及び蛍光波長は、用いた蛍光物質の種類に応じて適宜決定できる。
【００２７】
シグナルの検出結果は、ApoEの測定値として用いてもよい。例えば、シグナルの強度を定量的に検出する場合は、シグナル強度値自体又は該強度値から取得される値を、ApoEの測定値として用いることができる。シグナル強度値から取得される値としては、例えば、ApoEのシグナル強度値から陰性対照試料のシグナル強度値又はバックグラウンドの値を差し引いた値が挙げられる。陰性対照試料は適宜選択できるが、例えば、健常者から得た尿などが挙げられる。
【００２８】
本実施形態では、ApoE濃度が既知の複数の標準試料についてApoEの測定値を取得し、ApoE濃度とApoEの測定値との関係を示す検量線を作成してもよい。尿試料から取得したApoEの測定値をこの検量線に当てはめて、尿中ApoE濃度の値を取得することができる。また、尿量による誤差を回避するために、取得した尿中ApoE濃度の値を、被検者の尿中クレアチニン濃度の値によって補正することが好ましい。具体的には、尿中ApoE濃度の値を、クレアチニン１g当たりのApoE濃度(μg/gCr)に換算することが好ましい。これにより、検体間で尿中ApoE濃度の値を比較することができる。
【００２９】
本実施形態では、磁性粒子に固定された捕捉用抗体と、標識物質で標識された検出用抗体とを用いるサンドイッチELISA法により、尿中ApoE濃度を測定してもよい。この場合、測定は、HISCLシリーズ(シスメックス株式会社製)などの市販の全自動免疫測定装置を用いて行ってもよい。
【００３０】
次いで、本実施形態の方法では、尿中ApoE濃度の値に基づいて、被検者の糖尿病性腎症が進行するリスクが高いか否かを判定する。具体的には、尿中ApoE濃度の値が所定の閾値以上である場合は、被検者の糖尿病性腎症が進行するリスクが高いと判定できる。また、尿中ApoE濃度の値が所定の閾値未満である場合は、被検者の糖尿病性腎症が進行するリスクが高くないまたは低いと判定できる。ここで、糖尿病性腎症の「進行」とは、ある患者の糖尿病性腎症が、本実施形態の方法を実施した時点における病期から、より悪い病期に移行することをいう。たとえば、糖尿病性腎症２期から３期または４期への進行、糖尿病性腎症３期から４期への進行および糖尿病性腎症４期から５期への進行である。
【００３１】
本実施形態の方法によって糖尿病性腎症の進行リスクが高いと判定された場合は、被検者は現在よりも厳格な治療と食事制限を受けなければ、所定の期間内に糖尿病性腎症が進行する、と予測してもよい。また、糖尿病性腎症の進行リスクが高くないまたは低いと判定された場合は、現在受けている治療方法を継続することで所定の期間内に糖尿病性腎症が進行することはない、と予測してもよい。所定の期間としては、例えば12ヶ月、好ましくは６ヶ月の期間が挙げられる。このように、本実施形態の方法は、医師などに対して、糖尿病性腎症の進行リスクの診断を補助する情報の提供を可能にする。
【００３２】
上記の所定の閾値は特に限定されず、適宜設定できる。例えば、糖尿病性腎症患者について尿中ApoE濃度の値を含む腎機能に関するデータを蓄積することにより、所定の閾値を経験的に設定してもよい。あるいは、次のようにして所定の閾値を設定してもよい。まず、複数の糖尿病性腎症患者から尿を採取し、尿中ApoE濃度を測定する。尿の採取から所定の期間の経過後、これらの患者について腎機能に関する検査を行い、糖尿病性腎症の病期を確認する。測定した尿中ApoE濃度のデータを、糖尿病性腎症が進行した患者群のデータと、糖尿病性腎症が進行しなかった患者群のデータとに分類する。そして、糖尿病性腎症が進行した患者群の尿中ApoE濃度と、糖尿病性腎症が進行しなかった患者群の尿中ApoE濃度とを最も精度よく区別可能な値を求め、その値を所定の閾値として設定する。閾値の設定においては、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などを考慮することが好ましい。
【００３３】
本発明の範囲には、上記の糖尿病性腎症の進行リスクの診断補助方法に用いられる試薬キットも含まれる。すなわち、本発明は、ApoEを捕捉するためのApoEと特異的に結合する第１の捕捉体と、ApoEを検出するためのApoEと特異的に結合する第２の捕捉体と、標識物質とを含む、糖尿病性腎症の進行リスクの診断用試薬キット(以下、「試薬キット」ともいう)を提供する。標識物質が酵素である場合、本実施形態の試薬キットは、該酵素に対する基質をさらに含んでいてもよい。
【００３４】
本実施形態において、第１の捕捉体、第２の捕捉体、標識物質及び基質の形態は特に限定されず、固体(例えば、粉末、結晶、凍結乾燥品など)であってもよいし、液体(例えば、溶液、懸濁液、乳濁液など)であってもよい。本実施形態では、第１の捕捉体、第２の捕捉体、標識物質及び基質は、それぞれ別の容器に保存されているか又は個別に包装されていることが好ましい。なお、尿試料、第１の捕捉体、第２の捕捉体、標識物質及び基質についての詳細は、上記の診断補助方法の説明で述べたことと同様である。本実施形態では、第１の捕捉体及び第２の捕捉体はいずれも抗ApoE抗体であることが好ましい。第１の捕捉体及び第２の捕捉体がいずれもモノクローナル抗体の場合は、互いのエピトープが異なっていることが好ましい。
【００３５】
本実施形態では、上記の各種試薬を収容した容器を箱に梱包して、ユーザに提供してもよい。この箱には、試薬キットの添付文書を同梱していてもよい。この添付文書には、たとえば、試薬キットの構成、尿中ApoE濃度の測定プロトコールなどが記載されることが好ましい。図１Ａに、本実施形態の試薬キットの外観の一例を示す。図中、５１０は、試薬キットを示し、５１１は、第１の捕捉体を収容した第１容器を示し、５１２は、第２の捕捉体を収容した第２容器を示し、５１３は、標識物質としての酵素を収容した第３容器を示し、５１４は、酵素の基質を収容した第４容器を示し、５１５は、添付文書を示し、５１６は、梱包箱を示す。
【００３６】
本実施形態の試薬キットは、被検者から採取した尿を前処理するための前処理液をさらに含んでいてもよい。前処理液としては上述の緩衝液が好ましい。前処理液は、ApoEを取り込んだ細胞を可溶化するための界面活性剤を含んでいてもよい。緩衝液及び界面活性剤についての詳細は、上記の診断補助方法の説明で述べたことと同様である。本実施形態では、第１の捕捉体、第２の捕捉体、標識物質、基質及び前処理液は、それぞれ別の容器に保管されているか又は個別に包装されていることが好ましい。図１Ｂに、前処理液をさらに含む試薬キットの外観の一例を示した。なお、固相についての詳細は、上記の診断補助方法の説明で述べたことと同様である。図中、５２０は、試薬キットを示し、５２１は、第１の捕捉体を収容した第１容器を示し、５２２は、第２の捕捉体を収容した第２容器を示し、５２３は、標識物質としての酵素を収容した第３容器を示し、５２４は、酵素の基質を収容した第４容器を示し、５２５は、前処理液を収容した第５容器を示し、５２６は、添付文書を示し、５２７は、梱包箱を示す。
【００３７】
本実施形態の試薬キットは、第１の捕捉体を固定化するための固相をさらに含んでいてもよい。この場合、第１の捕捉体、第２の捕捉体、標識物質、基質及び固相は、それぞれ別の容器に保管されているか又は個別に包装されていることが好ましい。図１Ｃに、固相をさらに含む試薬キットの外観の一例を示した。固相についての詳細は、上記の診断補助方法の説明で述べたことと同様である。図中、５３０は、試薬キットを示し、５３１は、第１の捕捉体を収容した第１容器を示し、５３２は、第２の捕捉体を収容した第２容器を示し、５３３は、標識物質としての酵素を収容した第３容器を示し、５３４は、酵素の基質を収容した第４容器を示し、５３５は、固相(96ウェルマイクロプレート)を示し、５３６は、添付文書を示し、５３７は、梱包箱を示す。図１Ｄに、前処理液をさらに含む試薬キットの外観の一例を示した。図中、５４０は、試薬キットを示し、５４１は、第１の捕捉体を収容した第１容器を示し、５４２は、第２の捕捉体を収容した第２容器を示し、５４３は、標識物質としての酵素を収容した第３容器を示し、５４４は、酵素の基質を収容した第４容器を示し、５４５は、前処理液を収容した第５容器を示し、５４６は、固相(96ウェルマイクロプレート)を示し、５４７は、添付文書を示し、５４８は、梱包箱を示す。
【００３８】
さらなる実施形態では、第１の捕捉体はあらかじめ固相に固定化されていてもよい。さらに、標識物質はあらかじめ第２の捕捉体に結合されていてもよい。この場合、試薬キットは、第１の捕捉体を固定化した固相、標識物質を結合させた第２の捕捉体、及び基質を含む。図１Ｅに、当該試薬キットの外観の一例を示した。図中、５５０は、試薬キットを示し、５５１は、標識物質としての酵素を結合させた第２の捕捉体を収容した第１容器を示し、５５２は、酵素の基質を収容した第２容器を示し、５５３は、第１の捕捉体を固定化した固相(96ウェルマイクロプレート)を示し、５５４は、添付文書を示し、５５５は、梱包箱を示す。図１Ｆに、前処理液をさらに含む試薬キットの外観の一例を示した。図中、５６０は、試薬キットを示し、５６１は、標識物質としての酵素を結合させた第２の捕捉体を収容した第１容器を示し、５６２は、酵素の基質を収容した第２容器を示し、５６３は、前処理液を収容した第３容器を示し、５６４は、第１の捕捉体を固定化した固相(96ウェルマイクロプレート)を示し、５６５は、添付文書を示し、５６６は、梱包箱を示す。
【００３９】
本実施形態の試薬キットは、尿中ApoE濃度の値と尿中の他の腎症マーカー濃度の値との比に基づく糖尿病性腎症の進行リスクの診断補助方法に用いられるものである場合には、他の腎症マーカーを捕捉するための他の腎症マーカーと特異的に結合する第３の捕捉体と、他の腎症マーカーを検出するための他の腎症マーカーと特異的に結合する第４の捕捉体とをさらに含んでいてもよい。
本実施形態の試薬キットは、上述の各種試薬の他、固相の洗浄液、酵素反応の停止剤、キャリブレーターなどを適宜含んでいてもよい。
【００４０】
本発明の範囲には、上記の試薬を、糖尿病性腎症の進行リスクの診断用試薬キットの製造のために使用することも含まれる。すなわち、本発明は、糖尿病性腎症の進行リスクの診断用試薬キットの製造のための、ApoEを捕捉するためのApoEと特異的に結合する第１の捕捉体、ApoEを検出するためのApoEと特異的に結合する第２の捕捉体、及び標識物質の使用にも関する。
【００４１】
本発明には、糖尿病性腎症の進行リスクの診断を補助するデータの取得に適する装置が含まれる。また、本発明には、糖尿病性腎症の進行リスクの診断を補助するデータの取得をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム製品も含まれる。なお、該コンピュータプログラム製品が備える媒体は、コンピュータプログラムが非一時的に記録され、且つ、コンピュータが読取可能な媒体であってもよい。
【００４２】
以下に、上記の本実施形態の方法を実施するのに好適な装置の一例を、図面を参照して説明する。しかし、本発明はこの例に示される形態のみに限定されない。図２は、糖尿病性腎症の進行リスクの診断を補助するデータを取得するための、進行リスク診断補助装置の概略図である。図２に示された進行リスク診断補助装置１１は、測定装置２２と、該測定装置２２と接続された判定装置３３とを含んでいる。
【００４３】
本実施形態において、測定装置の種類は特に限定されず、ApoEの測定方法に応じて適宜選択できる。図２に示される例では、測定装置２２は、標識抗体を用いるELISA法により生じるシグナルを検出可能なプレートリーダーである。プレートリーダーは、マーカーの測定に用いた標識物質に基づくシグナルの検出が可能であれば特に限定されず、標識物質の種類に応じて適宜選択できる。以下に説明する例では、シグナルは、化学発光シグナルや蛍光シグナルなどの光学的情報である。
【００４４】
抗原抗体反応を行ったプレートを測定装置２２にセットすると、測定装置２２は、ApoEと特異的に結合した標識抗体に基づく光学的情報を取得し、得られた光学的情報を判定装置３３に送信する。なお、測定装置２２に取得される光学的情報には、尿中ApoE濃度の値などの算出ための濃度既知の検体の情報も含まれている。
【００４５】
判定装置３３は、コンピュータ本体３３ａと、入力部３３ｂと、検体情報や判定結果などを表示する表示部３３ｃとを含む。判定装置３３は、測定装置２２から光学的情報を受信する。そして、判定装置３３のプロセッサは、光学的情報に基づいて、糖尿病性腎症の進行リスクの診断を補助するデータを取得するプログラムを実行する。
【００４６】
図３は、進行リスク診断補助装置１１のコンピュータ本体３３ａのソフトウェアを機能ブロックで示すブロック図である。図３に示されるように、判定装置３３は、受信部３０１と、記憶部３０２と、算出部３０３と、判定部３０４と、出力部３０５とを備える。受信部３０１は、測定装置２２と、ネットワークを介して通信可能に接続されている。
【００４７】
受信部３０１は、測定装置２２から送信された情報を受信する。記憶部３０２は、判定に必要な閾値及び各マーカーの濃度値を算出するための式や処理プログラムなどを記憶する。算出部３０３は、受信部３０１で取得された情報を用い、記憶部３０２に記憶された式にしたがって、尿中ApoE濃度の値又は尿中ApoE濃度の値と尿中の他の腎症マーカーの値との比を算出する。判定部３０４は、算出部３０３によって算出された尿中ApoE濃度の値又は尿中ApoE濃度の値と尿中の他の腎症マーカーの値との比が、記憶部３０２に記憶された閾値以上であるか又はそれ未満であるかを判定する。出力部３０５は、判定部３０４による判定結果を、糖尿病性腎症の進行リスクの診断を補助するデータとして出力する。
【００４８】
図４は、図３に示すコンピュータ本体３３ａのハードウェア構成を示すブロック図である。図４に示されるように、コンピュータ本体３３ａは、ＣＰＵ(Central Processing Unit)３３０と、ＲＯＭ(Read Only Memory)３３１と、ＲＡＭ(Random Access Memory)３３２と、ハードディスク３３３と、入出力インターフェイス３３４と、読出装置３３５と、通信インターフェイス３３６と、画像出力インターフェイス３３７とを備えている。ＣＰＵ３３０、ＲＯＭ３３１、ＲＡＭ３３２、ハードディスク３３３、入出力インターフェイス３３４、読出装置３３５、通信インターフェイス３３６及び画像出力インターフェイス３３７は、バス３３８によってデータ通信可能に接続されている。
【００４９】
ＣＰＵ３３０は、ＲＯＭ３３１に記憶されているコンピュータプログラム及びＲＡＭ３３２にロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。ＣＰＵ３３０がアプリケーションプログラムを実行することにより、図３に示す各機能が実行される。これにより、判定装置３３が、糖尿病性腎症の進行リスクの診断を補助するデータを取得するための装置として機能する。
【００５０】
ＲＯＭ３３１は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３３１には、ＣＰＵ３３０によって実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。
【００５１】
ＲＡＭ３３２は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ３３２は、ＲＯＭ３３１及びハードディスク３３３に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。ＲＡＭ３３２はまた、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３３０の作業領域として利用される。
【００５２】
ハードディスク３３３は、ＣＰＵ３３０に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム(糖尿病性腎症の進行リスクの診断を補助するデータを取得するためのコンピュータプログラム)などのコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
【００５３】
読出装置３３５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読出装置３３５は、可搬型記録媒体３４０に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。
【００５４】
入出力インターフェイス３３４は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス３３４には、キーボード、マウスなどの入力部３３ｂが接続されている。操作者は、当該入力部３３ｂにより、コンピュータ本体３３ａに各種の指令やデータを入力することが可能である。
【００５５】
通信インターフェイス３３６は、例えば、Ethernet(登録商標)インターフェイスなどである。コンピュータ本体３３ａは、通信インターフェイス３３６により、プリンタなどへの印刷データの送信が可能である。測定装置２２は、通信インターフェイス３３６により、判定装置３３への測定データ(光学的情報)の送信が可能である。
【００５６】
画像出力インターフェイス３３７は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部３３ｃに接続されている。これにより、表示部３３ｃは、ＣＰＵ３３０から与えられた画像データに応じた映像信号を出力することができる。表示部３３ｃは、入力された映像信号にしたがって画像(画面)を表示する。
【００５７】
次に、進行リスク診断補助装置１１による、糖尿病性腎症の進行リスクの診断を補助するデータ取得の処理手順を説明する。図５は、進行リスク診断の補助データ取得のフローチャートの一例である。ここでは、ApoEと特異的に結合した標識抗体に基づく光学的情報から尿中ApoE濃度の値を取得し、得られた値を用いて判定を行なう場合を例として挙げて説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されるものではない。
【００５８】
まず、ステップＳ１−１において、進行リスク診断補助装置１１の受信部３０１は、測定装置２２から光学的情報を受信する。次に、ステップＳ１−２において、算出部３０３は、受信部３０１が受信した光学的情報から、記憶部３０２に記憶された濃度値を算出するための式にしたがって、尿中ApoE濃度の値を算出する。
【００５９】
その後、ステップＳ１−３において、判定部３０４は、ステップＳ１−３で算出された値が、記憶部３０２に記憶された閾値以上であるか、それともそれ未満であるかを判定する。ここで、算出された値が閾値以上であるとき、ルーチンは、ステップＳ１−４に進行し、判定部３０４は、糖尿病性腎症の進行リスクが高いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。また、算出された値が閾値未満であるとき、ルーチンは、ステップＳ１−５に進行し、判定部３０４は、糖尿病性腎症の進行リスクが高くない(または低い)ことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
【００６０】
そして、ステップＳ１−６において、出力部３０５は、判定結果を出力し、表示部３３ｃに表示させる。これにより、進行リスク診断補助装置１１は、糖尿病性腎症の進行リスクの診断を補助するデータを医師などに提供することができる。
【００６１】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６２】
30 mg/gCr以上の尿アルブミン/Cr (クレアチニン)比を示す第２期(早期腎症期)、第３期(顕性腎症期)又は第４期(腎不全期)の糖尿病性腎症患者である被検者から血液及び尿を採取し、６ヶ月後にこれらの被検者を、糖尿病性腎症の病期が進行した群と進行しなかった群とに分けた。各群の被検者の血中及び尿中のApoE濃度を比較した。
【００６３】
(１) 被検者からの試料の採取
30 mg/gCr以上の尿アルブミン/Cr (クレアチニン)比を示す第２期(早期腎症期)、第３期(顕性腎症期)又は第４期(腎不全期)の糖尿病性腎症患者(n=２４)から、試料として血液及び尿を採取した。
【００６４】
(２) バイオマーカーの測定
(2.1) 血清中のクレアチニンの濃度の測定
エルシステム・CRE(シスメックス株式会社)及びCRE標準液(シスメックス株式会社)を用いて、被検者の血液から血清クレアチニン(sCR)の濃度を測定した。具体的な操作は試薬の添付文書に従った。
【００６５】
(2.2) 尿中のApoE、ApoB及びクレアチニンの濃度の測定
上記(１)で得た各被検者の尿と、後述のキットに添付のTriton-X100/PBSとを等量混合した後、検体希釈液で25倍に希釈した。Human Apolipoprotein E ELISA Pro Kit (CELL BIOLABS,Inc.社)及びHuman Apolipoprotein B ELISA Pro Kit (MABTECH AB社)を用いて、希釈した尿から尿中のApoE及びApoBの濃度を測定した。具体的な操作は、血清に代えて希釈した尿を用いたことを除いて、キットの添付文書に従った。エルシステム・CRE(シスメックス株式会社)及びCRE標準液(シスメックス株式会社)を用いて、被検者の尿から尿中クレアチニンの濃度を測定した。具体的な操作は試薬の添付文書に従った。尿量による誤差を補正するため、尿中クレアチニンの濃度を用いて、測定した尿中ApoE及びApoB濃度をクレアチニン１g当たりの濃度(μg/gCr)に換算した。
【００６６】
(2-3)その他の尿中マーカー
腎臓病のその他の尿中バイオマーカーとして、α1-マイクログロブリン(α1M）、Kidney injury molecule-1(KIM-1)、N-アセチルグルコサミニダーゼ(NAG)、IV型コラーゲン、尿アルブミン(uALB)、尿蛋白(uTP)、尿コレステロール(uCHO)及びＬ型脂肪酸結合蛋白(LFABP)の尿中濃度を測定した。α1M濃度は、LZテスト‘栄研'α-1M(栄研化学株式会社)及び尿中α-1M測定用LZ-α1-M標準‘栄研'(栄研化学株式会社)を添付文書に従って用いて測定した。KIM-1濃度は、KIM-1 (human) Elisa Kit (Enzo life sciences Inc.)を添付文書に従って用いて測定した。NAG濃度は、Lタイプワコー NAG(和光純薬株式会社)及びNAGキャリブレーター(和光純薬株式会社)を添付文書に従って用いて測定した。IV型コラーゲンは、パナウリア(登録商標)uIV・C「プレート」(協和ファーマケミカル株式会社)を添付文書に従って用いて測定した。uALB濃度は、LZテスト‘栄研'U-ALB(栄研化学株式会社)及びLZ-U-ALBキャリブレーター‘栄研'(栄研化学株式会社)を添付文書に従って用いて測定した。uTPは、マイクロTP-AR(和光純薬株式会社)及び蛋白標準液(蛋白100 mg/dL、和光純薬株式会社)を添付文書に従って用いて測定した。uCHO濃度は、特許第4527925号に準じて測定した。LFABP濃度は、ノルディア(登録商標)L-FABP (積水メディカル株式会社)及びL-FABPキャリブレーター(積水メディカル株式会社)を添付文書に従って用いて測定した。尿量による誤差を補正するため、尿中クレアチニンの濃度を用いて、測定した各バイオマーカーの濃度をクレアチニン１g当たりの濃度(μg/gCr)に換算した。
【００６７】
(３) 被検者の分類
上記(１)の試料採取から６ヶ月後にsCR濃度を測定した。得られたsCRの測定値から、下記の式に従って推算糸球体ろ過量(eGFR)を算出した。式中、「Age」は被検者の年齢である。
【００６８】
eGFR (mL/min/1.73 m2) ＝ 194×sCr-1.094×Age-0.287
(被検者が女性の場合は、eGFR = 194×sCr-0.739×Age-0.287)
【００６９】
試料採取時及び６ヶ月後のeGFRの変化率から、下記の式に従って１年間当たりのeGFRの変化率(％)を算出した。得られた変化率の値を糖尿病性腎症の進行指標(％)とした。進行指標が０以上である被検者を、糖尿病性腎症の病期が進行しなかった群(以下、「非進行群」ともいう。(n=11))に分類し、進行指標が０より低い被検者を、糖尿病性腎症の病期が進行した群(以下、「進行群」ともいう。(n=13))に分類した。
【００７０】
進行指標 (％) = [(６ヶ月後のeGFR−試料採取時のeGFR)/(試料採取時のeGFR)]×測定日間インターバル(日)×100/365
【００７１】
(４) 統計学的解析
採尿した日の尿中バイオマーカーの値から、進行指標を予測できるか否かを単回帰分析で評価した。
【００７２】
(５) 結果
解析結果を表１に示す。表１において、危険率P値は、各バイオマーカーの単独濃度の単回帰分析の結果を示し、0.05よりも低い場合に有意差があるといえる。
【００７３】
【表１】
2018048962.tif 000002
【００７４】
表１から明らかなように、尿中ApoE濃度から６ヵ月後のeGFRの変化量を予測でき、糖尿病性腎症の進行リスクを精度よく予測できることが示された。
【符号の説明】
【００７５】
１１      進行リスク診断補助装置
２２      測定装置
３３      判定装置
３３ａ    コンピュータ本体
３３ｂ    入力部
３３ｃ    表示部
３０１    受信部
３０２    記憶部
３０３    算出部
３０４    判定部
３０５    出力部
３３０    ＣＰＵ
３３１    ＲＯＭ
３３２    ＲＡＭ
３３３    ハードディスク
３３４    入出力インターフェイス
３３５    読出装置
３３６    通信インターフェイス
３３７    画像出力インターフェイス
３３８    バス
３４０    記録媒体
５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０    試薬キット
５１１、５２１、５３１、５４１、５５１、５６１    第１容器
５１２、５２２、５３２、５４２、５５２、５６２    第２容器
５１３、５２３、５３３、５４３、５６３    第３容器
５１４、５２４、５３４、５４４    第４容器
５２５、５４５    第５容器
５１５、５２６、５３６、５４７、５５４、５６５    添付文書
５１６、５２７、５３７、５４８、５５５、５６６    梱包箱
５３５、５４６、５５３、５６４    固相
【図１Ａ】
2018048962.tif 000003
【図１Ｂ】
2018048962.tif 000004
【図１Ｃ】
2018048962.tif 000005
【図１Ｄ】
2018048962.tif 000006
【図１Ｅ】
2018048962.tif 000007
【図１Ｆ】
2018048962.tif 000008
【図２】
2018048962.tif 000009
【図３】
2018048962.tif 000010
【図４】
2018048962.tif 000011
【図５】
2018048962.tif 000012