(57)【要約】【課題】新規の特異性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作するための足場としてのモデルＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の使用を提供すること。【解決手段】特異的なペプチド−主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）産物に対する新規の結合性を有するＴＣＲを、１）Ｔ細胞受容体タンパク質をコードする配列の変異誘発を行って、変異体の変化に富んだ集団（ライブラリー）を作製するステップと、２）ＴＣＲ変異体のライブラリーを、指向性進化のプロセスおよび「ディスプレイ」方法体系（例えば、酵母、ファージ、哺乳動物細胞）およびペプチド−ＭＨＣリガンドを使用し、特異的なペプチド−ＭＨＣを用いて選択するステップとによって単離することができる。このプロセスを繰り返して、選択するペプチド−ＭＨＣリガンドに対する親和性が改善されたＴＣＲバリアントを同定することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）足場およびＴＣＲライブラリー、ならびに改変型ＴＣＲおよび単鎖ＴＣＲを生成する方法、ならびに治療方法、診断方法、および画像化方法へのＴＣＲの対応する使用に関する。
【０００２】
関連出願の引用
本願は、２０１２年７月２７日に提出した米国仮特許出願第６１／６７６，３７３号の米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での利益を主張する。この仮出願は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００３】
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発に関する記載
本開示は、国立保健研究機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）に認定された認可番号Ｒ０１  ＧＭ５５７６７およびＴ３２  ＧＭ０７０４２１の下で米国政府支援によりなされた。米国政府は本開示において一定の権利を有する。
【０００４】
配列表に関する記述
本出願に付随する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、これによって参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称はＩＭＭＵ＿００２＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは６５ＫＢであり、２０１３年７月２６日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００５】
背景
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および抗体は、種々のクラスの抗原（リガンド）を認識するように進化してきた分子である（（Murphy（２０１２年）、xix、８６８頁））。ＴＣＲは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）または任意の有核細胞（例えば、赤血球以外の体内の全てのヒト細胞）の表面上の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の産物に関して存在する抗原性ペプチドの認識に関与する抗原特異的分子である。対照的に、抗体は、一般には、可溶性抗原または細胞表面抗原を認識し、ＭＨＣによる抗原の提示を必要としない。この系により、Ｔ細胞に、それらのＴＣＲを介して、細胞内でプロセシングされて短いペプチドになり、細胞内ＭＨＣ分子に結合し、表面にペプチド−ＭＨＣ複合体（ｐｅｐＭＨＣ）として送達される、細胞によって発現される細胞内抗原（ウイルスタンパク質を含む）のアレイ全体を認識する潜在的な能力が付与される。この系により、仮想的にあらゆる外来タンパク質（例えば、変異したがん抗原またはウイルスタンパク質）または異常に発現されたタンパク質がＴ細胞の標的として機能することが可能になる（（DavisおよびBjorkman（１９８８年）Nature、３３４巻、３９５〜４０２頁；Davisら（１９９８年）Annu  Rev  Immunol、１６巻、５２３〜５４４頁；Murphy（２０１２年）、xix、８６８頁）に概説されている）。
【０００６】
ＴＣＲとｐｅｐＭＨＣの相互作用により、Ｔ細胞が、結合の親和性（または解離速度）に応じて種々の活性化の状態に駆動され得る。ＴＣＲ認識プロセスにより、Ｔ細胞が、正常な健康な細胞と、例えば、ウイルスによって形質転換された細胞または悪性腫瘍を、ＴＣＲの多様なレパートリーをもたらすことによって識別することが可能になり、１つまたは複数のＴＣＲの示すＭＨＣ分子に結合した外来ペプチドに対する結合親和性がＴ細胞活性の刺激に関する閾値を超える確率が高い（ManningおよびKranz（１９９９年）Immunology  Today、２０巻、４１７〜４２２頁）。
【０００７】
現在まで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することによって同定された、ヒトＴ細胞クローンまたはマウスＴ細胞クローンのいずれかから単離された野生型ＴＣＲは結合親和性が比較的低いことが示されている（ＫＤ＝１〜３００μＭ）（Davisら（１９９８年）Annu  Rev  Immunol、１６巻、５２３〜５４４頁）。これに対する説明の一部は、胸腺において発生するＴ細胞は自己ｐｅｐＭＨＣリガンドに対する負の選択を受け（免疫寛容誘導）、したがって、親和性が高すぎるＴ細胞が消去されることであると思われる（Starrら（２００３年）Annu  Rev  Immunol、２１巻、１３９〜７６頁）。これらの比較的低い親和性を補償するために、Ｔ細胞は、細胞表面分子ＣＤ４およびＣＤ８がＭＨＣ分子（それぞれクラスＩＩおよびクラスＩ）に結合し、シグナル伝達活性の媒介においてＴＣＲと協同する補助受容体系を進化させてきた。このプロセスではＣＤ８が特に有効であり、これにより、親和性が非常に低い（例えば、ＫＤ＝３００μＭ）ＴＣＲが強力な抗原特異的活性を媒介することが可能になる。
【０００８】
特異的なｐｅｐＭＨＣに対する親和性がより高いＴＣＲを作製するために、指向性進化が使用されてきた。使用されている３つの異なるディスプレイ方法は、酵母ディスプレイ（Hollerら（２００３年）Nat  Immunol、４巻、５５〜６２頁；Hollerら（２０００年）Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A、９７巻、５３８７〜９２頁）、ファージディスプレイ（Liら（２００５年）Nat  Biotechnol、２３巻、３４９〜５４頁）、およびＴ細胞ディスプレイ（Chervinら（２００８年）J  Immunol  Methods、３３９巻、１７５〜８４頁）である。３つの手法の全てにおいて、プロセスは、野生型ＴＣＲの正常な低親和性を示すＴＣＲを、ＴＣＲの変異体のコグネイトｐｅｐＭＨＣ（Ｔ細胞が特異的であった元の抗原）に対する親和性が増大するように操作すること、または改変することを伴う。したがって、ＣＤＲのうちの１つまたは複数に変異誘発したライブラリーを生成するための鋳型として野生型ＴＣＲを使用し、親和性がより高い変異体を、コグネイトペプチド−ＭＨＣ抗原との結合によって選択した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】DavisおよびBjorkman（１９８８年）Nature、３３４巻、３９５〜４０２頁
【非特許文献２】Davisら（１９９８年）Annu  Rev  Immunol、１６巻、５２３〜５４４頁
【非特許文献３】Ｍｕｒｐｈｙ  Ｋ．  （２０１２）  Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．、xix、８６８頁
【非特許文献４】ManningおよびKranz（１９９９年）Immunology  Today、２０巻、４１７〜４２２頁
【非特許文献５】Starrら（２００３年）Annu  Rev  Immunol、２１巻、１３９〜７６頁
【非特許文献６】Hollerら（２００３年）Nat  Immunol、４巻、５５〜６２頁
【非特許文献７】Hollerら（２０００年）Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A、９７巻、５３８７〜９２頁
【非特許文献８】Liら（２００５年）Nat  Biotechnol、２３巻、３４９〜５４頁
【非特許文献９】Chervinら（２００８年）J  Immunol  Methods、３３９巻、１７５〜８４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これらのＴＣＲを操作する（engineering）手法のそれぞれに伴う主要な問題は、これらの手法では、ペプチド抗原（コグネイト抗原）または構造的に類似したそのバリアントに特異的な、親和性がより高いＴＣＲ変異体を生じさせるために、特異的なペプチド抗原に対する反応性を有するＴ細胞クローンから単離された種々のＴＣＲが必要になることである。種々のがん由来の３００種を超える定義済みのペプチド抗原、およびウイルス由来の多くの抗原が存在するので、構造的に全く異なる抗原（非コグネイト抗原と称される）に対するＴＣＲをｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける操作を使用して作製するためのプラットフォームとして同じＴＣＲを使用できれば好都合である。本発明はこれらの必要性などに対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、例えば、単に例として、新規の結合特異性を有する製品を作製するために有用なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）足場に関する。より詳細には、本発明は、酵母、ファージ、または哺乳動物細胞の表面にディスプレイされたＴ細胞受容体タンパク質のライブラリー；元のＴＣＲによって認識されない非コグネイト抗原との結合についてライブラリーから選択されるＴＣＲタンパク質；およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける治療、診断、または画像化への適用のための、選択されたＴＣＲタンパク質の使用に関する。
【００１２】
本発明の１つの態様は、野生型Ｔ細胞受容体に由来するＶαおよびＶβを含む改変型Ｔ細胞受容体またはその抗原結合性断片であって、Ｖα、Ｖβ、またはその両方が、野生型Ｔ細胞受容体と比較して１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）に変異を含み、改変型Ｔ細胞受容体が、野生型Ｔ細胞受容体が結合しない非コグネイトペプチド−ＭＨＣに結合する、改変型Ｔ細胞受容体またはその抗原結合性断片に関する。
【００１３】
一実施形態では、野生型Ｔ細胞受容体は、配列番号１に記載のＶαアミノ酸配列および配列番号２に記載のＶβアミノ酸配列を含む。関連する実施形態では、改変型Ｔ細胞受容体は、配列番号１に記載のＶαアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む改変型Ｖαおよび配列番号２に記載のＶβアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む改変型Ｖβを含み、改変型Ｔ細胞受容体は、野生型Ｔ細胞受容体が結合するコグネイトペプチド−ＭＨＣに結合しない。別の実施形態では、改変型Ｔ細胞受容体は、ＣＤＲ１α３１、ＣＤＲ３α９８、ＣＤＲ３β９９、ＣＤＲ３α９７、ＣＤＲ３β１０２、ＣＤＲ３α９９、ＣＤＲ３β１００、ＣＤＲ３β１０１、ＣＤＲ１α３２、ＣＤＲ１β３０、ＣＤＲ３β９８のうちの１つまたは複数にアミノ酸置換を含む。さらに別の実施形態では、改変型Ｔ細胞受容体は、ＣＤＲ２α５１位に野生型アミノ酸を含む。一実施形態では、改変型Ｔ細胞受容体は、ＣＤＲ１α３１位に野生型アミノ酸をさらに含む。関連する実施形態では、改変型Ｔ細胞受容体は、ＣＤ１α２８位およびＣＤ１α５２位に野生型アミノ酸をさらに含む。
【００１４】
一実施形態では、野生型Ｔ細胞受容体は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む単鎖Ｔ細胞受容体Ａ６−Ｘ１５である。別の実施形態では、非コグネイトペプチド−ＭＨＣは、Ｍａｒｔ１：ＨＬＡ．Ａ２、ＳＬ９  ＨＩＶ：ＨＬＡ．Ａ２、ＷＴ−１：ＨＬＡ．Ａ２、またはＳＵＲＶ：ＨＬＡ．Ａ２を含む。関連する実施形態では、改変型Ｔ細胞受容体は、１）配列番号３３、４１、または４２のうちの１つに記載のアミノ酸配列のＶα領域に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む改変型Ｖα領域および２）配列番号３３、４１、または４２のうちの１つに記載のアミノ酸配列のＶβ領域に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む改変型Ｖβ領域を含む。ある特定の実施形態では、配列番号３３、４１、または４２のうちの１つに記載のアミノ酸配列。
【００１５】
別の実施形態では、改変型Ｔ細胞受容体は、変異体Ｔ細胞受容体の酵母ディスプレイライブラリーのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける選択によって作製される。一実施形態では、野生型Ｔ細胞受容体はヒト野生型Ｔ細胞受容体である。別の実施形態では、改変型Ｔ細胞受容体は単鎖Ｔ細胞受容体である。さらに別の実施形態では、野生型Ｔ細胞受容体はＨＬＡ−Ａ２に結合する。一実施形態では、改変型Ｔ細胞受容体をコードするポリペプチドが提供される。関連する実施形態では、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００１６】
本発明の別の態様は、野生型Ｔ細胞受容体に由来するＶαおよびＶβを含む改変型Ｔ細胞受容体またはその抗原結合性断片であって、Ｖαが配列番号３４のアミノ酸残基１４０〜２５６を含み、Ｖβが配列番号３４のアミノ酸残基１〜１２２を含む、改変型Ｔ細胞受容体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００１７】
本発明の別の態様は、野生型Ｔ細胞受容体に由来するＶαおよびＶβを含む改変型Ｔ細胞受容体またはその抗原結合性断片であって、Ｖαが配列番号４３のアミノ酸残基１４０〜２５５を含み、Ｖβが配列番号４３のアミノ酸残基１〜１２２を含む、改変型Ｔ細胞受容体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００１８】
本発明の１つの態様は、所望の特異性を有するＴ細胞受容体またはその抗原結合性断片を操作するための方法であって、ａ）野生型Ｔ細胞受容体またはその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチドを単離するステップと、ｂ）変異体Ｔ細胞受容体またはその抗原結合性断片のライブラリーを作製するステップであり、変異体Ｔ細胞受容体またはその抗原結合性断片が、野生型Ｔ細胞受容体と比較して１つまたは複数の相補性決定領域に変異を含むステップと、ｃ）変異体Ｔ細胞受容体を表面ディスプレイ系で発現させるステップと、ｄ）非コグネイトペプチド−ＭＨＣに結合する変異体Ｔ細胞受容体を選択するステップとを含む、方法を提供する。
【００１９】
一実施形態では、野生型Ｔ細胞受容体は、配列番号１に記載のＶαアミノ酸配列および配列番号２に記載のＶβアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、野生型Ｔ細胞受容体は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む単鎖Ｔ細胞受容体Ａ６−Ｘ１５である。一実施形態では、表面ディスプレイ系は、酵母ディスプレイ系である。別の実施形態では、非コグネイトペプチド−ＭＨＣは、Ｍａｒｔ１：ＨＬＡ．Ａ２、ＳＬ９  ＨＩＶ：ＨＬＡ．Ａ２、ＷＴ−１：ＨＬＡ．Ａ２、またはＳＵＲＶ：ＨＬＡ．Ａ２である。一実施形態では、方法は、親和性成熟のステップをさらに含む。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
野生型Ｔ細胞受容体に由来するＶαおよびＶβを含む改変型Ｔ細胞受容体またはその抗原結合性断片であって、前記Ｖα、前記Ｖβ、またはその両方が前記野生型Ｔ細胞受容体と比較して１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）に変異を含み、前記改変型Ｔ細胞受容体が、前記野生型Ｔ細胞受容体が結合しない非コグネイトペプチド−ＭＨＣに結合する、改変型Ｔ細胞受容体またはその抗原結合性断片。
（項目２）
前記野生型Ｔ細胞受容体が、配列番号１に記載のＶαアミノ酸配列および配列番号２に記載のＶβアミノ酸配列を含む、項目１に記載の改変型Ｔ細胞受容体。
（項目３）
配列番号１に記載のＶαアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む改変型Ｖαおよび配列番号２に記載のＶβアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む改変型Ｖβを含み、前記野生型Ｔ細胞受容体が結合するコグネイトペプチド−ＭＨＣに結合しない、項目２に記載の改変型Ｔ細胞受容体。
（項目４）
前記改変型Ｔ細胞受容体が、ＣＤＲ１α  ３１、ＣＤＲ３α  ９８、ＣＤＲ３β  ９９、ＣＤＲ３α  ９７、ＣＤＲ３β  １０２、ＣＤＲ３α  ９９、ＣＤＲ３β  １００、ＣＤＲ３β  １０１、ＣＤＲ１α  ３２、ＣＤＲ１β  ３０、ＣＤＲ３β  ９８のうちの１つまたは複数にアミノ酸置換を含む、項目２に記載の改変型Ｔ細胞受容体。
（項目５）
前記改変型Ｔ細胞受容体が、ＣＤＲ２α  ５１位に野生型アミノ酸を含む、項目２に記載の改変型Ｔ細胞受容体。
（項目６）
前記改変型Ｔ細胞受容体が、ＣＤＲ１α  ３１位に野生型アミノ酸をさらに含む、項目５に記載の改変型Ｔ細胞受容体。
（項目７）
前記改変型Ｔ細胞受容体が、ＣＤ１α  ２８位およびＣＤ１α  ５２位に野生型アミノ酸をさらに含む、項目６に記載の改変型Ｔ細胞受容体。
（項目８）
前記野生型Ｔ細胞受容体が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む単鎖Ｔ細胞受容体Ａ６−Ｘ１５である、項目１に記載の改変型Ｔ細胞受容体。
（項目９）
前記非コグネイトペプチド−ＭＨＣが、Ｍａｒｔ１：ＨＬＡ．Ａ２、ＳＬ９  ＨＩＶ：ＨＬＡ．Ａ２、ＷＴ−１：ＨＬＡ．Ａ２、またはＳＵＲＶ：ＨＬＡ．Ａ２を含む、項目１に記載の改変型Ｔ細胞受容体。
（項目１０）
１）配列番号３３、４１、または４２のうちの１つに記載のアミノ酸配列のＶα領域に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む改変型Ｖα領域、および２）配列番号３３、４１、または４２のうちの１つに記載のアミノ酸配列のＶβ領域に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む改変型Ｖβ領域を含む、項目９に記載の改変型Ｔ細胞受容体。
（項目１１）
配列番号３３、４１、または４２のうちの１つに記載のアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の改変型Ｔ細胞受容体。
（項目１２）
前記改変型Ｔ細胞受容体が、変異体Ｔ細胞受容体の酵母ディスプレイライブラリーのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける選択によって作製される、項目１に記載の改変型Ｔ細胞受容体。
（項目１３）
前記野生型Ｔ細胞受容体がヒト野生型Ｔ細胞受容体である、項目１に記載の改変型Ｔ細胞受容体。
（項目１４）
前記改変型Ｔ細胞受容体が単鎖Ｔ細胞受容体である、項目１に記載の改変型Ｔ細胞受容体。
（項目１５）
前記野生型Ｔ細胞受容体がＨＬＡ−Ａ２に結合する、項目１に記載の改変型Ｔ細胞受容体。
（項目１６）
項目１に記載の改変型Ｔ細胞受容体をコードするポリペプチド。
（項目１７）
項目１６に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（項目１８）
野生型Ｔ細胞受容体に由来するＶαおよびＶβを含む改変型Ｔ細胞受容体またはその抗原結合性断片であって、前記Ｖαが配列番号３４のアミノ酸残基１４０〜２５６を含み、前記Ｖβが配列番号３４のアミノ酸残基１〜１２２を含む、改変型Ｔ細胞受容体またはその抗原結合性断片。
（項目１９）
野生型Ｔ細胞受容体に由来するＶαおよびＶβを含む改変型Ｔ細胞受容体またはその抗原結合性断片であって、前記Ｖαが配列番号４３のアミノ酸残基１４０〜２５５を含み、前記Ｖβが配列番号４３のアミノ酸残基１〜１２２を含む、改変型Ｔ細胞受容体またはその抗原結合性断片。
（項目２０）
所望の特異性を有するＴ細胞受容体またはその抗原結合性断片を操作するための方法であって、
ａ）野生型Ｔ細胞受容体またはその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチドを単離するステップと、
ｂ）変異体Ｔ細胞受容体またはその抗原結合性断片のライブラリーを作製するステップであって、前記変異体Ｔ細胞受容体またはその抗原結合性断片のライブラリーは前記野生型Ｔ細胞受容体と比較して１つまたは複数の相補性決定領域に変異を含む、ステップと、
ｃ）前記変異体Ｔ細胞受容体を表面ディスプレイ系で発現させるステップと、
ｄ）非コグネイトペプチド−ＭＨＣに結合する変異体Ｔ細胞受容体を選択するステップと
を含む方法。
（項目２１）
前記野生型Ｔ細胞受容体が、配列番号１に記載のＶαアミノ酸配列および配列番号２に記載のＶβアミノ酸配列を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記野生型Ｔ細胞受容体が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む単鎖Ｔ細胞受容体Ａ６−Ｘ１５である、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記表面ディスプレイ系が酵母ディスプレイ系である、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記非コグネイトペプチド−ＭＨＣがＭａｒｔ１：ＨＬＡ．Ａ２、ＳＬ９  ＨＩＶ：ＨＬＡ．Ａ２、ＷＴ−１：ＨＬＡ．Ａ２、またはＳＵＲＶ：ＨＬＡ．Ａ２である、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
親和性成熟のステップをさらに含む、項目２０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、非コグネイト抗原に特異的な、親和性がより高いＴＣＲを操作するための単一の足場を合理的に設計するための方法を示す図である。
【００２１】
【図２Ａ】図２Ａは、Ａ６  ＴＣＲ：ｐｅｐＭＨＣ複合体（Ａ６；ＰＤＢ：１ＡＯ７）の構造的な図を示す三次元図である。α鎖およびβ鎖の可変（Ｖ）領域および定常（Ｃ）領域が示されている。示されている構造は、Ａ６  ＴＣＲのＣα領域を含まない。ＨＬＡ−Ａ２（α１、α２、α３、およびβ２ｍ）が灰色で示されており、Ｔａｘペプチド（ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ；配列番号５）が黒色で示されている。
【００２２】
【図２Ｂ】図２Ｂは、ペプチド−ＭＨＣ（Ｔａｘ−ＨＬＡ．Ａ２）の上のＣＤＲフットプリントを示す三次元図である。
【００２３】
【図３】図３は、Ａ６  ｗｔおよび５つの予測された構造の対応するペプチドの３．０Åの範囲内に最も多く存在する残基５つのフットプリントのオーバーレイである。
【００２４】
【図４Ａ】図４Ａは、Ｖα２を含有するＴＣＲの結晶構造を示し、またＴＣＲのＣＤＲ１αループおよびＣＤＲ２αループ内の予測された重要なＭＨＣ接触位置（（Borbulevychら（２０１１年）J  Immunol、１８７巻、２４５３〜６３頁）から改変された）を示す図である。
【００２５】
【図４Ｂ】図４Ｂは、高親和性Ａ６  ＴＣＲ  Ｘ１５、および、それぞれが４つの残基のうちの１つにアラニン置換を有する４つのバリアントの、さまざまな濃度のＴａｘ（ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ、配列番号５）：ＨＬＡ−Ａ２二量体（ＤｉｍｅｒＸ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）との結合について示すグラフである。
【００２６】
【図５】図５は、Ａ６  Ｖβ領域のアミノ酸配列（配列番号２）およびＡ６  Ｖα領域のアミノ酸配列（配列番号１）を示す図であり、灰色の影が付けられた位置は、安定化されたバリアントＡ６−Ｘ１５（配列番号３）において縮重ライブラリー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｌｉｂｒａｒｙ）が構築された場所を示す。各ＶドメインのＣＤＲが標識されており、酵母ディスプレイベクター内の２つのＶ領域をつなぐリンカーの配列も示されている。
【００２７】
【図６】図６は、酵母ディスプレイを使用した単鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴＣＲ）の概略図である。
【００２８】
【図７】図７は、ヒトＡ６  Ｘ１５  ｓｃＴＣＲの縮重ライブラリーであるＲＤ１ライブラリーから選択された１０個のクローンのアミノ酸配列アラインメントを示す。
【００２９】
【図８】図８は、コグネイト抗原（Ｔａｘ：ＨＬＡ．Ａ２）を用いて選別した後のＲＤ１ライブラリーのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。灰色は、二次抗体のみを用いて染色された酵母細胞を示す。
【００３０】
【図９】図９は、非コグネイト抗原（Ｍａｒｔ１：ＨＬＡ．Ａ２）を用いて選別した後のＲＤ１ライブラリーのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。灰色は、二次抗体のみを用いて染色された酵母細胞を示す。
【００３１】
【図１０Ａ】図１０Ａは、コグネイトリガンド、Ｔａｘ（ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ；配列番号５）：ＨＬＡ−Ａ２二量体を用いた４回目の選別の後に単離された６つのクローンの配列アラインメントを示す図である。
【００３２】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、６つのＲＤ１足場バリアントの、縮重位置でのＤＮＡ配列アラインメントを示す表である。各コドンの下はそのコドンによりコードされるアミノ酸であり、ＮＮＳライブラリー内の可能性のあるコドンの組合せの数が一緒に示されている。
【００３３】
【図１１Ａ】図１１Ａは、抗ＨＡ抗体を用いたＮ末端タグについての陽性染色を示し、したがってＡＧＡ２融合の表面発現を示すヒストグラムである。細胞を、抗ＨＡ抗体およびヤギ抗マウスＩｇＧ  ａｌｅｘａ６４７二次抗体を用いて染色し（黒い線のヒストグラム）、または対照として二次抗体のみを用いて染色した（灰色のヒストグラム）。ＨＡ染色された細胞（黒い線）についての陰性ピークが全ての酵母ディスプレイ実験で観察され、これは、プラスミドを失った酵母に起因し、誘導された酵母試料のそれぞれについての内部標準としての機能を果たす。
【００３４】
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、このクローンはＣ末端ｃ−ｍｙｃタグを欠いたので、ｃ−ｍｙｃを用いた陰性染色を示すヒストグラムである。細胞を、ニワトリ抗ｃ−ｍｙｃ抗体およびヤギ抗ニワトリＩｇＹ  ａｌｅｘａ６４７二次抗体を用いて染色し、または対照として二次抗体のみを用いて染色した（灰色）。
【００３５】
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、さまざまな濃度の選択性コグネイト抗原Ｔａｘ：ＨＬＡ．Ａ２二量体を示されている濃度で用いたＡ６−Ｘ１５クローンの染色を示すヒストグラムである。
【００３６】
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、さまざまな濃度の非選択性非コグネイト抗原Ｍａｒｔ１：ＨＬＡ．Ａ２を用いたＡ６−Ｘ１５クローンの染色を示すヒストグラムである。
【００３７】
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、さまざまな濃度のペプチド：ＨＬＡ．Ａ２二量体、Ｔａｘペプチド：ＨＬＡ．Ａ２二量体またはＭａｒｔ１ペプチド：ＨＬＡ．Ａ２二量体を４〜５００ｎＭで用いた染色からの平均蛍光強度（ＭＦＩ）のプロットである。
【００３８】
【図１２Ａ】図１２Ａは、非コグネイトリガンドＭａｒｔ１（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号７）：ＨＬＡ−Ａ２二量体を用いた５回目の選別の後に単離された５つのクローンの配列アラインメントを示す図である。
【００３９】
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、５つのＲＤ１足場バリアントの、縮重位置におけるＤＮＡ配列アラインメントを示す表である。各コドンの下は、そのコドンによりコードされるアミノ酸であり、ＮＮＳライブラリー内の可能性のあるコドンの組合せの数が一緒に示されている。
【００４０】
【図１３Ａ】図１３Ａは、抗ＨＡ抗体を用いたＮ末端タグについてのクローンの陽性染色を示し、したがって、ＡＧＡ２融合物の表面発現を示すヒストグラムである。細胞を、抗ＨＡ抗体およびヤギ抗マウスＩｇＧ  ａｌｅｘａ６４７二次抗体を用いて染色し（黒い線のヒストグラム）、または対照として二次抗体のみを用いて染色した（灰色のヒストグラム）。
【００４１】
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、このクローンはＣ末端ｃ−ｍｙｃタグを含有したのでｃ−ｍｙｃを用いた陽性染色を示すヒストグラムである。細胞を、ニワトリ抗ｃ−ｍｙｃ抗体およびヤギ抗ニワトリＩｇＹ  Ａｌｅｘａ６４７二次抗体を用いて染色し、または対照として二次抗体のみを用いて染色した（灰色）。
【００４２】
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、さまざまな濃度の選択性非コグネイト抗原Ｍａｒｔ１：ＨＬＡ．Ａ２二量体を示されている濃度で用いたＡ６−Ｓ５−４クローンの染色を示すヒストグラムである。
【００４３】
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、さまざまな濃度の非選択性コグネイト抗原Ｔａｘ：ＨＬＡ．Ａ２を用いたＡ６−Ｓ５−４クローンの染色を示すヒストグラムである。
【００４４】
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、さまざまな濃度のペプチド：ＨＬＡ．Ａ２二量体、Ｍａｒｔ１ペプチド：ＨＬＡ．Ａ２二量体またはＴａｘペプチド：ＨＬＡ．Ａ２二量体を４〜５００ｎＭで用いた染色からの平均蛍光強度（ＭＦＩ）のプロットである。
【００４５】
【図１４】図１４は、足場Ａ６単鎖ＴＣＲ野生型Ａ６のＶα領域およびＶβ領域ならびにＲＤ１ライブラリーから単離された２つの高親和性バリアントのアミノ酸配列を、ライブラリー内の５つの縮重位置を含めて示す図である。Ｔａｘ（クローンＳ４−３；単鎖安定化ＴＣＲ  Ａ６−Ｘ１５と同一である；配列番号３）、およびＭａｒｔ１（クローンＳ５−４；配列番号３３）を用いた選択から２つのクローンが単離された。Ｘは任意のアミノ酸を示す。アスタリスクは、野生型Ａ６構造にリンカーが存在しない場合を示すために使用される。
【００４６】
【図１５Ａ】図１５Ａは、非コグネイト選択性抗原ＭＡＲＴ１（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号７）／ＨＬＡ．Ａ２を用いて選別した後のＲＤ１−ＭＡＲＴ１−Ｓ５−４  ＣＤＲ３ライブラリーのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。
【００４７】
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＣＤＲ３親和性成熟ライブラリーのための鋳型として使用したＲＤ１−ＭＡＲＴ１−Ｓ５−４クローンの、２００ｎＭ、１μＭ、および５μＭのＭＡＲＴ１（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号７）／ＨＬＡ．Ａ２  ＵＶ交換単量体、その後、ＰＥとコンジュゲートしたストレプトアビジンを用いた染色を示すヒストグラムである。
【００４８】
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ＲＤ１−ＭＡＲＴ１−Ｓ５−４  ＣＤＲ３ライブラリーの２回目の選別後に単離されたＲＤ１−ＭＡＲＴ１ＨＩＧＨクローンの、２００ｎＭ、１μＭ、および５μＭ  ＭＡＲＴ１（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号７）／ＨＬＡ．Ａ２  ＵＶ交換単量体、その後、ＰＥとコンジュゲートしたストレプトアビジンを用いた染色を示すヒストグラムである。
【００４９】
【図１６Ａ】図１６Ａは、１０ｎＭのＭＡＲＴ１／ＨＬＡ−Ａ２二量体（ＤｉｍｅｒＸ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）および陽性対照としてＡＰＣとコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体を用いて染色したＲＤ１−ＭＡＲＴ１ＨＩＧＨクローンを示すヒストグラムである。灰色は、二次抗体のみを用いて染色された酵母細胞を示す。
【００５０】
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、５００ｎＭのヌルＴａｘ／ＨＬＡ−Ａ２二量体（ＤｉｍｅｒＸ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）およびＡＰＣとコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体を用いて染色したＲＤ１−ＭＡＲＴ１ＨＩＧＨクローンを示すヒストグラムである。
【００５１】
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、５００ｎＭのヌルＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ２二量体（ＤｉｍｅｒＸ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）およびＡＰＣとコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体を用いて染色したＲＤ１−ＭＡＲＴ１ＨＩＧＨクローンを示すヒストグラムである。
【００５２】
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、５００ｎＭのヌルサバイビン／ＨＬＡ−Ａ２二量体（ＤｉｍｅｒＸ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）およびＡＰＣとコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体を用いて染色したＲＤ１−ＭＡＲＴ１ＨＩＧＨクローンを示すヒストグラムである。
【００５３】
【図１７】図１７Ａ〜Ｄは、まずペプチドなし（図１７Ａ）、Ｔａｘ（図１７Ｂ）、ＷＴＩ（図１７Ｃ）、またはＭＡＲＴ１（図１７Ｄ）と一緒にインキュベートし、その後、ビオチン標識したＲＤ１−ＭＡＲＴ１ＨＩＧＨＴＣＲと一緒にインキュベートしたヒトＴ２（ＨＬＡ−Ａ２＋）細胞のフローサイトメトリー分析を示す一連のヒストグラムである。図１７Ｅは、ＲＤ１−ＭＡＲＴ１ＨＩＧＨＴＣＲが少なくとも２８ｎＭの親和性（ＫＤ値）を有することを示す、力価測定を示す線グラフである。
【００５４】
【図１８】図１８は、ＲＤ１ライブラリーから単離され、親和性成熟された足場Ａ６単鎖ＴＣＲ（野生型）および高親和性バリアントのアミノ酸配列を、ライブラリー内の５つの縮重位置を含めて示す図である。Ｔａｘ（クローンＲＤ１−Ｔａｘ−Ｓ４−３；単鎖安定化ＴＣＲ  Ａ６−Ｘ１５と同一である）およびＭＡＲＴ１（クローンＲＤ１−ＭＡＲＴ１−Ｓ５−４）を用いた選択から２つのクローンが単離された。ＲＤ１−ＭＡＲＴ１−Ｓ５−４  ＣＤＲ３親和性成熟ライブラリーから選択された高親和性クローンが示されている（ＲＤ１−ＭＡＲＴ１ＨＩＧＨ）。Ｘは任意のアミノ酸を示す。アスタリスクは野生型Ａ６構造にリンカーが存在しない場合を示す。
【００５５】
【図１９Ａ】図１９Ａは、ＭＡＲＴ１（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号７）／ＨＬＡ．Ａ２結晶構造（ＰＤＢ：１ＪＦ１）（Slizら（２００１年）J  Immunol、１６７巻、３２７６〜８４頁）およびＷＴ１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号９）／ＨＬＡ．Ａ２結晶構造（ＰＤＢ：３ＨＰＪ）（Borbulevychら（２０１０年）Mol  Immunol、４７巻、２５１９〜２４頁）のオーバーレイの極めて近傍にあるＡ６：Ｔａｘ（ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ；配列番号５）／ＨＬＡ．Ａ２結晶構造（ＰＤＢ：１ＡＯ７）の三次元図である。太字で標識された位置（ＴＣＲαのＤ２７、Ｇ２９、およびＳ９９；ＴＣＲβのＬ９９およびＷ１００）は、ＮＮＫ核酸組成に基づいて縮重とされた。ＴＣＲα  Ｑ３１は、野生型残基グルタミンまたはトレオニンのいずれかを選択することができるバイナリー位置である。ＣＤＲ３βの１００〜１０３位は、４つの隣接する残基をＡ６野生型（ＡＧＧＲ、配列番号４４）またはＡ６−Ｘ１５（ＭＳＡＱ、配列番号４５）から選択することができるバイナリーである。
【００５６】
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、選択性コグネイト抗原Ｔａｘ／ＨＬＡ．Ａ２を用いて選別した後のＲＤ２ライブラリーのフローサイトメトリーヒストグラムである。灰色は、二次抗体のみを用いて染色された酵母細胞を示す。
【００５７】
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、非コグネイト抗原ＭＡＲＴ１／ＨＬＡ．Ａ２を用いて選別した後のＲＤ２ライブラリーのフローサイトメトリーヒストグラムである。
【００５８】
【図２０】図２０は、選択前に多様性を示すヒトＡ６  ｓｃＴＣＲの第２世代縮重ライブラリー（ＲＤ２）から単離された５つのクローンの配列アラインメントを示す図である。
【００５９】
【図２１Ａ】図２１Ａは、２μＭのＭＡＲＴ１／ＨＬＡ．Ａ２  ＵＶ交換単量体、ＰＥとコンジュゲートしたストレプトアビジンを用いて染色した、ＲＤ２ライブラリーの３回目の選別の後に選択されたＲＤ２−ＭＡＲＴ１−Ｓ３−３クローンを示すヒストグラムである。
【００６０】
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、２μＭのＭＡＲＴ１／ＨＬＡ．Ａ２  ＵＶ交換単量体、ＰＥとコンジュゲートしたストレプトアビジンを用いて染色した、ＲＤ２ライブラリーの３回目の選別の後に選択されたＲＤ２−ＭＡＲＴ１−Ｓ３−４クローンを示すヒストグラムである。
【００６１】
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、２μＭのヌルＴａｘ／ＨＬＡ．Ａ２  ＵＶ交換単量体、ＰＥとコンジュゲートしたストレプトアビジンを用いて染色した、ＲＤ２ライブラリーの３回目の選別の後に選択されたＲＤ２−ＭＡＲＴ１−Ｓ３−３クローンを示すヒストグラムである。
【００６２】
【図２１Ｄ】図２１Ｄは、２μＭのヌルＴａｘ／ＨＬＡ．Ａ２  ＵＶ交換単量体、ＰＥとコンジュゲートしたストレプトアビジンを用いて染色した、ＲＤ２ライブラリーの３回目の選別の後に選択されたＲＤ２−ＭＡＲＴ１−Ｓ３−４クローンを示すヒストグラムである。
【００６３】
【図２１Ｅ】図２１Ｅは、ＭＡＲＴ１を用いたＲＤ２ライブラリーの選択から単離された足場Ａ６単鎖ＴＣＲおよび高親和性バリアントの配列を示す図である。Ａ６  ＴＣＲの野生型Ａ６のＶα領域およびＶβ領域の配列（Garbocziら（１９９６年）Nature、３８４巻、１３４〜１４１頁）、高親和性単鎖バリアントＡ６−Ｘ１５のＶα領域およびＶβ領域の配列（Aggenら（２０１１年）Protein  Engineering,  Design,  &  Selection、２４巻、３６１〜７２頁）、ならびにＭＡＲＴ１を用いた選択から単離された２つのクローン（クローンＲＤ２−ＭＡＲＴ１−Ｓ３−３およびクローンＲＤ２−ＭＡＲＴ１−Ｓ３−４）のＶα領域およびＶβ領域の配列が示されている。
【００６４】
【図２２】図２２は、代替の足場、ヒトＴＣＲ  Ｔ１−Ｓ１８．４５のアミノ酸配列を示す図である。
【００６５】
【図２３Ａ】図２３Ａは、ＭＡＲＴ−１ペプチド（１μＭ）またはヌルペプチド、ＳＬ９（１μＭ）を前負荷した抗原提示細胞株Ｔ２（ＨＬＡ−Ａ２＋）上のビオチン化Ｔ１−Ｓ１８．４５ｓｃＴｖの力価測定を示すヒストグラムである。細胞を、３．９ｎＭ、７．８ｎＭ、１５．２ｎＭ、３１．１ｎＭ、６２．５ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、および５μＭのビオチン化Ｔ１−Ｓ１８．４５ｓｃＴｖを示されている通り用いて、その後にＳＡ：ＰＥを用いて染色した。示されているデータは４連の実験を表す。
【００６６】
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、ｓｃＴｖ−ビオチン濃度に対してプロットした図２３Ａのヒストグラムの平均蛍光単位（ＭＦＵ）値を示す線グラフである。
【００６７】
【図２４Ａ】図２４は、足場ライブラリーから単離された高親和性の単鎖ＴＣＲの例示的な治療への適用を示す図である。図２４Ａは、可溶性の治療用製品として使用するためのＴＣＲ形式の５つの例を示す：１）Ｖα−Ｖβ方向またはＶβ−Ｖα方向のいずれかの単鎖ＴＣＲ（変異した高親和性Ｖドメインがアスタリスクで示されている）；２）抗体の定常領域ドメインとインフレームで融合した単鎖ＴＣＲ；３）軽鎖または重鎖のいずれかの定常領域とのインフレームの免疫グロブリン融合物；４）薬物と直接カップリングした単鎖ＴＣＲ（または２および３に示されている免疫グロブリン融合物）；および５）単鎖Ｆｖとインフレームで連結した単鎖ＴＣＲ（ＶＬ−リンカー−ＶＨ）。
【００６８】
【図２４Ｂ】図２４は、足場ライブラリーから単離された高親和性の単鎖ＴＣＲの例示的な治療への適用を示す図である。図２４Ｂは、養子Ｔ細胞療法において１）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）内の単鎖受容体および２）全長のαおよびβＴＣＲとしてＴ細胞によって発現させるために哺乳動物細胞ベクターに挿入したＴＣＲ足場を使用して酵母ディスプレイによって高親和性結合について単離された可変ドメイン（Ｖ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
配列の簡単な説明
配列番号１は、Ａ６  ＴＣＲのＶα領域のアミノ酸配列である。
【００７０】
配列番号２は、Ａ６  ＴＣＲのＶβ領域のアミノ酸配列である。
【００７１】
配列番号３は、一本鎖ＴＣＲ  Ａ６−Ｘ１５ならびに同一のクローンＲＤ１−Ｔａｘ−Ｓ４−３およびＲＤ１−Ｔａｘ−Ｓ４−５のアミノ酸配列である。
【００７２】
配列番号４は、ＲＤ１ライブラリーのアミノ酸配列である。
【００７３】
配列番号５は、Ｔａｘ抗原のアミノ酸配列である。
【００７４】
配列番号６は、Ｍａｒｔ１−９マー抗原のアミノ酸配列である。
【００７５】
配列番号７は、Ｍａｒｔ１−１０マー抗原のアミノ酸配列である。
【００７６】
配列番号８は、ＳＬ９  ＨＩＶ抗原のアミノ酸配列である。
【００７７】
配列番号９は、ＷＴ−１抗原のアミノ酸配列である。
【００７８】
配列番号１０は、サバイビン抗原のアミノ酸配列である。
【００７９】
配列番号１１は、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原のアミノ酸配列である。
【００８０】
配列番号１２は、ＰＰＩ抗原のアミノ酸配列である。  
【００８１】
配列番号１３は、ＭＤＭ２抗原アミノ酸配列である。
【００８２】
配列番号１４は、ＨＢＥ１８３抗原のアミノ酸配列である。
【００８３】
配列番号１５は、ｇｐ１００抗原のアミノ酸配列である。
【００８４】
配列番号１６は、ＭＵＣ１抗原のアミノ酸配列である。
【００８５】
配列番号１７は、ＭＡＧＥ  Ａ３抗原のアミノ酸配列である。
【００８６】
配列番号１８は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗原のアミノ酸配列である。
【００８７】
配列番号１９は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原のアミノ酸配列である。
【００８８】
配列番号２０は、ＣＥＡ抗原のアミノ酸配列である。
【００８９】
配列番号２１は、ＲＤ１ライブラリーのリンカーのアミノ酸配列である。
【００９０】
配列番号２２〜３１は、ＲＤ１ライブラリーのクローン番号１〜１０のアミノ酸配列である。
【００９１】
配列番号３２は、クローンＲＤ１−Ｔａｘ−Ｓ４−１、ならびに同一のクローンＲＤ１−Ｔａｘ−Ｓ４−２、ＲＤ１−Ｔａｘ−Ｓ４−４およびＲＤ１−Ｔａｘ−Ｓ４−６のアミノ酸配列である。
【００９２】
配列番号３３は、クローンＲＤ１−Ｍａｒｔ１−Ｓ５−１、ならびに同一のクローンＲＤ１−Ｍａｒｔ１−Ｓ５−２、ＲＤ１−Ｍａｒｔ１−Ｓ５−３、ＲＤ１−Ｍａｒｔ１−Ｓ５−４、ＲＤ１−Ｍａｒｔ１−Ｓ５−５およびＲＤ１−Ｍａｒｔ１−Ｓ５−６のアミノ酸配列である。
【００９３】
配列番号３４は、クローンＲＤ１−Ｍａｒｔ１ＨＩＧＨのアミノ酸配列である。
【００９４】
配列番号３５は、ＲＤ２ライブラリーのアミノ酸配列である。
【００９５】
配列番号３６〜４０は、ＲＤ２ライブラリーのクローン番号１〜５のアミノ酸配列である。
【００９６】
配列番号４１は、クローンＲＤ２−Ｍａｒｔ１−Ｓ３−３のアミノ酸配列である。
【００９７】
配列番号４２は、クローンＲＤ２−Ｍａｒｔ１−Ｓ３−４のアミノ酸配列である。
【００９８】
配列番号４３は、クローンＴ１−Ｓ１８．４５のアミノ酸配列である。
【００９９】
配列番号４４は、Ａ６野生型ＴＣＲのＣＤＲ３βにおける１００位〜１０３位のアミノ酸配列である。
【０１００】
配列番号４５は、Ａ６−Ｘ１５のＣＤＲ３βにおける１００位〜１０３位のアミノ酸配列である。
【０１０１】
配列番号４６は、Ｋｅｓｓｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（（２０００）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ９７，  １４５７８−１４５８３）によって改変されたＴＣＲのコグネイト抗原のアミノ酸配列である。
【０１０２】
配列番号４７は、Ｋｅｓｓｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（（２０００）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ９７，  １４５７８−１４５８３）によって改変されたＴＣＲの構造的に類似したペプチドのアミノ酸配列である。
【０１０３】
配列番号４８は、酵母およびＥ．  ｃｏｌｉの両方について最適化されたＲＤ１遺伝子の５’領域のポリヌクレオチド配列である。
【０１０４】
配列番号４９は、酵母およびＥ．  ｃｏｌｉの両方について最適化されたＲＤ１遺伝子の３’領域のポリヌクレオチド配列である。
【０１０５】
配列番号５０は、ｐＣＴ３０２突出部を付加するために用いられたフォワードプライマーのポリヌクレオチド配列である。
【０１０６】
配列番号５１は、ｐＣＴ３０２突出部を付加するために用いられたリバースプライマーのポリヌクレオチド配列である。
【０１０７】
配列番号５２は、ＣＤＲ３β１ライブラリー（スプライス４Ｌ）を作製するために用いられたフォワードプライマーのポリヌクレオチド配列である。
【０１０８】
配列番号５３は、ＣＤＲ３β１ライブラリー（スプライス４Ｌ）を作製するために用いられたリバースプライマーのポリヌクレオチド配列である。
【０１０９】
配列番号５４は、ＣＤＲ３β１ライブラリー（Ｔ７）を作製するために用いられたフォワードプライマーのポリヌクレオチド配列である。
【０１１０】
配列番号５５は、ＣＤＲ３β１ライブラリー（Ｔ７）を作製するために用いられたリバースプライマーのポリヌクレオチド配列である。
【０１１１】
配列番号５６は、ＣＤＲ３β２ライブラリーを作製するために用いられたフォワードプライマーのポリヌクレオチド配列である。
【０１１２】
配列番号５７は、ＣＤＲ３β２ライブラリーを作製するために用いられたリバースプライマーのポリヌクレオチド配列である。
【０１１３】
配列番号５８は、ＣＤＲ３αライブラリーを作製するために用いられたフォワードプライマーのポリヌクレオチド配列である。
【０１１４】
配列番号５９は、ＣＤＲ３αライブラリーを作製するために用いられたリバースプライマーのポリヌクレオチド配列である。
【０１１５】
配列番号６０は、ＲＤ２ライブラリー配列に付加されたＮ末端ＤＮＡ隣接配列のポリヌクレオチド配列である。
【０１１６】
配列番号６１は、ＲＤ２ライブラリー配列に付加されたＣ末端ＤＮＡ隣接配列のポリヌクレオチド配列である。
【０１１７】
詳細な説明
以下の説明は、本開示の理解を容易にすることを意図しているが、限定的なものではない。
【０１１８】
一般に、本明細書において使用されている用語および句は、当業者に公知の標準のテキスト、雑誌参考文献および状況を参照することによって見いだすことができる、それらの当技術分野で認められている意味を有する。以下の定義は、本開示に関するそれらの特定の使用を明白にするために提供される。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「連結した」とは、２つの基の間の結びつきを指し、これは共有結合性の結びつきであっても非共有結合性の結びつきであってもよい。基は、種々の長さのペプチド鎖、非アミノ酸化学基または当技術分野で公知の他の手段を使用して連結することができる。リンカー領域は、タンパク質またはペプチドの二官能性ドメインまたは構造的ドメインと作動可能に連結したアミノ酸配列であってよい。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「化学療法剤」という用語は、がん細胞、がん細胞の集団、腫瘍、または他の悪性組織の成長、増殖、または拡散を軽減または予防することができる任意の物質を指す。この用語は、任意の抗腫瘍剤または抗がん剤も包含するものとする。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、薬学的有効量または治療有効量などの状況を包含するものとする。例えば、ある特定の実施形態では、有効量は、有益な状態、有益な転帰、スクリーニングアッセイにおける機能活性、または臨床的状態の改善を実現することができるものである。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「がん細胞」という用語は、当技術分野において広範に理解されている定義を包含するものとする。一実施形態では、この用語は、ヒトまたは動物におけるがんの臨床的状態に寄与する可能性がある、調節が異常な細胞を指す。一実施形態では、この用語は、培養細胞株またはヒトもしくは動物の体の中にある細胞もしくはそれに由来する細胞を指し得る。がん細胞は、当技術分野で理解されている多種多様な分化した細胞型、組織型、または臓器型のものであってよい。がん細胞の特定の例としては、乳がん、結腸がん、皮膚がん、卵巣がん、白血病、肺がん、肝がん、睾丸がん、食道がん、および他の種類のがんが挙げられる。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「コグネイト抗原」という用語は、元のＴＣＲが結合し、それに対する特異性を有することが示された抗原を指す。同様に、「非コグネイト抗原」という用語は、ＴＣＲが結合せず、それに対する特異性も有さない抗原を指す。より詳細には、「コグネイト」ペプチドとは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によりコードされるタンパク質との複合体の一部である場合に元のＴＣＲが結合した抗原性ペプチドを指す。「非コグネイト」ペプチドとは、ＭＨＣによりコードされるタンパク質との複合体の一部である場合に元のＴＣＲが結合しなかったペプチドを指す。
【０１２４】
「野生型」および「ｗｔ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、天然に存在するまたは改変されていないＴＣＲ、例えば、コグネイト抗原に対する特異性を有する元のまたは親Ｔ細胞クローンから単離された可変領域のアミノ酸配列またはそれをコードするポリヌクレオチドを有するＴＣＲに関して使用される。
【０１２５】
アミノ酸配列を示す図面および表では、野生型は「ｗｔ」と称される。上の配列の下に示されている配列では、ダッシュは、そのアミノ酸がアラインメントのｗｔ配列または上の配列に存在するものと同じであることを示す。文字は、その位置で上の配列からの置換がなされていることを示す。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「改変型」、「バリアント」、「変異」、「変異した」および「由来の」Ｔ細胞受容体という用語は、１つまたは複数の変異を有する元のＴ細胞クローンから単離された可変領域のＴＣＲ配列を指す。改変型ＴＣＲの例としては、親和性がより高いＴＣＲおよび非コグネイト抗原に対する結合特異性を有するＴＣＲが挙げられる。
【０１２７】
コード配列とは、タンパク質のアミノ酸配列をコードする、またはｔＲＮＡまたはｒＲＮＡなどの機能性ＲＮＡをコードする遺伝子またはｃＤＮＡの一部である。
【０１２８】
相補物または相補配列とは、別のヌクレオチドの配列とワトソン・クリックの塩基対合規則に従って水素結合した２重鎖を形成するヌクレオチドの配列を意味する。
【０１２９】
下流とは、ＤＮＡまたはＲＮＡの相対的な位置を指し、鎖の３’末端に向かう領域である。
【０１３０】
発現とは、遺伝子が構造的ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写されること、およびその後にｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されることを指す。
【０１３１】
２つの核酸配列は、それらの配列が別々の生物体に由来する場合、そのような生物体が異なる種のものであるか否かにかかわらず、それらの配列が天然に同じ生物体内で同じ配置で一緒に存在しない限りは、互いに異種性である。
【０１３２】
相同性とは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の同一性の程度を指す。
【０１３３】
具体的に例示されているＴＣＲ配列と機能的に等しいアミノ酸配列とは、単一もしくは多数のアミノ酸置換によって、アミノ酸の付加および／もしくは欠失によって修飾されたアミノ酸配列である、または、１つもしくは複数のアミノ酸が化学修飾されているが、それにもかかわらず、本開示の細胞に結合したＴＣＲタンパク質もしくは可溶性のＴＣＲタンパク質の結合特異性および親和性の高い結合活性を保持する場合である。機能的に等しいヌクレオチド配列とは、具体的に例示されている細胞に結合したＴＣＲタンパク質または可溶性のＴＣＲタンパク質と実質的に同じ生物活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。本開示に関して、可溶性ＴＣＲタンパク質は、ネイティブな細胞に結合したＴＣＲの部分を欠き、溶液中で安定である（すなわち、一般に、本明細書に記載の通りおよびタンパク質溶液に対する標準の条件下で取り扱った場合に溶液中で凝集しない）。
【０１３４】
「単離された」という用語は、人間の手により天然の状態から変更された組成物、化合物、物質、または分子を指す。例えば、天然に存在する組成物または物質は、その元の環境から変化したもしくは取り出された、またはその両方である場合に、単離されている。例えば、この用語が本明細書において使用される場合、生きている動物の中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、その天然の状態で共存する材料から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。
【０１３５】
核酸構築物とは、天然に存在する遺伝子から単離された、または、そうでなければ天然には存在しない様式で組み合わせられ、並べられた核酸のセグメントを含有するように改変された核酸分子である。
【０１３６】
核酸分子とは、３’−５’−リン酸ジエステル結合によって連結したデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかを含有する一本鎖または二本鎖の直鎖状ポリヌクレオチドを意味する。
【０１３７】
２つのＤＮＡ配列は、連結の性質が、配列が互いと関連したそれらの正常な機能を果たす能力に干渉しない場合、作動可能に連結している。例えば、プロモーター領域は、コード配列と、プロモーターがそのコード配列の転写を果たすことができる場合、作動可能に連結しているということになる。
【０１３８】
ポリペプチドとは、ペプチド結合によって連結したアミノ酸の直鎖状ポリマーである。
【０１３９】
「プロモーター」という用語は、一般に長さが８０〜１２０塩基対であり、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、正しい転写が開始され得る遺伝子の開始部位の上流に位置するシス作用性ＤＮＡ配列を指す。転写のオン／オフ調節をもたらし、かつ／または下流のコード配列の発現を増強する（増加させる）関連する追加的な転写調節配列が存在してよい。
【０１４０】
組換え核酸分子、例えば組換えＤＮＡ分子とは、２つ以上の非相同ＤＮＡ分子（例えば、少なくとも１つのクローニング部位にクローニングされた外来ＤＮＡの１つまたは複数の挿入断片を含有する組換えプラスミド）をライゲーションすることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成される新規の核酸配列である。
【０１４１】
「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、遺伝子型が異なる別の細胞から精製された組換えＤＮＡを外部から適用し、それにより対象の細胞のゲノム内へのその取り込みおよび組み込みをもたらすことによる細胞のゲノムの指向性修飾を指す。細菌では、組換えＤＮＡは、一般には、細菌の染色体内には組み込まれないが、その代わりに、プラスミドとして自律的に複製される。「形質転換された（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」および「トランスフェクトされた（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【０１４２】
上流とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ内の任意の部位の５’側を意味する。
【０１４３】
ベクターとは、宿主細胞内で自律的に複製することができ、また外来ＤＮＡを受容することができる核酸分子である。ベクターは、それ自体の複製開始点、外来ＤＮＡを挿入するために使用することができる制限エンドヌクレアーゼの１つまたは複数の独特の認識部位、および、通常、抗生物質耐性をコードする遺伝子などの選択マーカー、および、多くの場合、挿入ＤＮＡを発現させるための認識配列（例えば、プロモーター）を有する。一般的なベクターとしてはプラスミドベクターおよびファージベクターが挙げられる。
【０１４４】
高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とは、標的リガンドに対して野生型ＴＣＲよりも強力な結合性を有する操作されたＴＣＲである。高親和性のいくつかの例としては、標的リガンドに対する平衡結合定数が約１０−６Ｍから１０−１２Ｍの間ならびにその中の個々の値および範囲の全てであることが挙げられる。この範囲は、野生型親和性であると報告されている１０−４〜１０−６Ｍと指向性進化によって単離されたもの（約１０−１２Ｍ）の間の親和性を包含する。
【０１４５】
サイトカインとは、他の細胞に影響を及ぼす、細胞により産生されるタンパク質、ペプチドまたは糖タンパク質である。
【０１４６】
哺乳動物はヒトおよび非ヒト哺乳動物のどちらも含む。
【０１４７】
遺伝暗号の縮重に起因して、多数の機能的に等しいヌクレオチド配列が同じアミノ酸配列をコードすることが当業者には理解されよう。
【０１４８】
Ｔ細胞受容体
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞の表面上で対をなしてヘテロ二量体受容体を形成する２つの鎖（αβまたはγδ）で構成される。αβＴＣＲは、体内の大部分のＴ細胞で発現され、ＭＨＣ拘束抗原の認識に関与することが公知である。αβＴＣＲの分子遺伝学的性質、構造、および生化学的性質は、現在徹底的に研究されている。α鎖およびβ鎖はそれぞれ、２つのドメイン：タンパク質を細胞膜につなぎ留め、また、ＣＤ３シグナル伝達装置の不変サブユニットと会合する定常ドメイン（Ｃ）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される、６つのループを通じて抗原認識を付与する可変ドメイン（Ｖ）で構成される。Ｖドメインのそれぞれが３つのＣＤＲを有する。これらのＣＤＲは抗原性ペプチドと主要組織適合性遺伝子複合体によりコードされるタンパク質が結合した複合体（ｐｅｐＭＨＣ）と相互作用する（DavisおよびBjorkman（１９８８年）Nature、３３４巻、３９５〜４０２頁；Davisら（１９９８年）Annu  Rev  Immunol、１６巻、５２３〜５４４頁；Murphy（２０１２年）、xix、８６８頁）。
【０１４９】
ＴＣＲの分子遺伝学的性質により、組み合わさってＶドメインのコード領域を形成する多数の遺伝子間の遺伝子組換えのプロセスが明らかになった。このプロセスは、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子が再編成されて、Ｂ細胞由来の抗体によって示される極めて大きな多様性が生じる抗体発生と類似している（Tonegawa（１９８８年）In  Vitro  Cell  Dev  Biol、２４巻、２５３〜６５頁）。Ｔ細胞の場合では、α鎖Ｖドメインは、１つのＶ領域（ヒトでは約７５の中で）が１つの連結（Ｊ）遺伝子セグメント（ヒトでは約６１の中で）に再編成されることによって形成される（図５．８、Janeway、第８版）。β鎖Ｖドメインは、１つのＶ領域（ヒトでは約５２の中で）が１つの多様性（Ｄ）遺伝子（ヒトでは２の中で）、１つの連結（Ｊ）遺伝子セグメント（ヒトでは１３の中で）に再編成されることによって形成される（図５．８、（Murphy（２０１２年）、xix、８６８頁））。ＶαＪα遺伝子再編成およびＪβＤβＪβ遺伝子再編成の連結部は、各鎖のＣＤＲ３ループをコードし、αβＴＣＲの極めて大きな多様性に寄与し、理論的な限界は１０１５を超える異なるＴＣＲであり（DavisおよびBjorkman（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ、３３４巻、３９５〜４０２頁）、ヒトにおいて実現可能な多様性は全部で約１０１１のＴ細胞のみであるので、これを十分に超える（Mason（１９９８年）Immunol  Today、１９巻、３９５〜４０４頁）。各鎖の可能性のあるＣＤＲ１およびＣＤＲ２の多様性は、これらのループはＶ遺伝子内にコードされ、またＴＣＲはｉｎ  ｖｉｖｏで体細胞変異を受けないので、Ｖ遺伝子の数で表される。ＣＤＲ３ループと比較してＣＤＲ１ループおよびＣＤＲ２ループの多様性は相対的に限定されているが、ペプチド抗原および／またはＭＨＣ産物に基づいて特定のＶ領域に選択された例がいくつも示されている。
【０１５０】
ＭＨＣクラスＩ産物は、長さが８〜１０アミノ酸のペプチドと結合し、体内の全ての有核細胞上で発現される（（RockおよびGoldberg（１９９９年）Annu  Rev  Immunol、１７巻、７３９〜７９頁）によって概説されている）。抗体−抗原相互作用の全ての結合エネルギーは外来抗原に焦点が合っているが、ＴＣＲ−ペプチド：ＭＨＣの結合エネルギーのかなりの割合は自己ＭＨＣ分子を対象とする（ManningおよびKranz（１９９９年）Immunology  Today、２０巻、４１７〜４２２頁）。実際、ごく最近の試験により、ＣＤＲ１ループおよび／またはＣＤＲ２ループの特定の残基が、ＭＨＣへリックス上の特定の残基と相互作用し、それにより、ＭＨＣ拘束のプロセスに関与するＭＨＣに対する基本的な親和性がもたらされるように進化してきたことが示唆された（Garciaら（２００９年）Nat  Immunol、１０巻、１４３〜７頁；Marrackら（２００８年）Annu  Rev  Immunol、２６巻、１７１〜２０３頁）。
【０１５１】
ペプチド−ＭＨＣ抗原（クラスＩ）に対する親和性が正常範囲を超えるＴＣＲ（いわゆる親和性がより高いＴＣＲ）を、１）ＣＤ４ヘルパーＴ細胞（ＣＤ８補助受容体を欠く）の活性を駆動するため、または２）「エフェクター」分子（例えば、二重特異性タンパク質を形成するための抗体Ｆｃ領域、毒性薬物、または抗ＣＤ３抗体などの抗体ｓｃＦｖ）を付着させることによって、細胞を直接標的とするために使用することができる可溶性ＴＣＲを開発するために使用することが興味深いものになっている（（AshfieldおよびJakobsen（２００６年）IDrugs、９巻、５５４〜９頁；FooteおよびEisen（２０００年）Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A、９７巻、１０６７９〜８１頁；Hollerら（２０００年）Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A、９７巻、５３８７〜９２頁；Molloyら（２００５年）Curr  Opin  Pharmacol、５巻、４３８〜４３頁；RichmanおよびKranz（２００７年）Biomol  Eng、２４巻、３６１〜７３頁）。この手法により、一部のがん患者が直面する、そのがん患者のＴ細胞が潜在的な腫瘍抗原に対する十分な特異性および結合親和性を有するＴＣＲを発現しない（ある程度は胸腺および末梢における寛容のプロセスに起因する）という問題も克服され得る。例えば、３００種を超える、ＭＨＣによる拘束を受け、Ｔ細胞により定義される腫瘍抗原が同定されている（cancerimmunity.org/peptide/）（BoonおよびOld（１９９７年）Curr  Opin  Immunol、９巻、６８１〜３頁；Cheeverら（２００９年）Clin  Cancer  Res、１５巻、５３２３〜３７頁）。これらの腫瘍抗原として、変異したペプチド、分化抗原、および過剰発現された抗原が挙げられ、これらは全て、療法の標的として機能し得る。現在までに記載されているがん抗原の大多数は、ＭＨＣ分子に関しては細胞表面にある場合にのみ標的とすることができる細胞内のタンパク質に由来するものであったので、ＴＣＲは、このクラスの抗原を認識するように進化しているので、治療の理想的な候補薬になる。
【０１５２】
同様に、ＴＣＲにより、感染細胞において天然にプロセシングされ、細胞表面上でＭＨＣ分子によってディスプレイされるウイルスタンパク質に由来するペプチドを検出することができる。過去２５年にわたり、ＨＩＶおよびＨＴＬＶのウイルスゲノムに由来するペプチドを含めた多くのウイルス性抗原標的が同定されている（例えば、Addoら（２００７年）PLoS  ONE、２巻、ｅ３２１頁；Tsomidesら（１９９４年）J  Exp  Med、１８０巻、１２８３〜９３頁；Utzら（１９９６年）J  Virol、７０巻、８４３〜５１頁）。しかし、これらの疾患を有する患者は、感染細胞に結合し、それを破壊するために最適なＴＣＲを欠く可能性がある。最後に、ＴＣＲは、自己免疫性標的の受容体アンタゴニストとして、または高度に特異的なプロセスにおいて局所的な免疫細胞応答を免疫抑制し、それにより、全身の免疫抑制を回避するための送達剤として使用することが可能である（（Molloyら（２００５年）Curr  Opin  Pharmacol、５巻、４３８〜４３頁；Stoneら（２０１２年）Protein  Engineering））。
【０１５３】
改変型Ｔ細胞受容体
指向性進化を使用して、特異的なｐｅｐＭＨＣに対する親和性がより高いＴＣＲを作製した。使用されている３つの異なるディスプレイ方法は、酵母ディスプレイ（Hollerら（２００３年）Nat  Immunol、４巻、５５〜６２頁；Hollerら（２０００年）Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A、９７巻、５３８７〜９２頁）、ファージディスプレイ（Liら（２００５年）Nat  Biotechnol、２３巻、３４９〜５４頁）、およびＴ細胞ディスプレイ（Chervinら（２００８年）J  Immunol  Methods、３３９巻、１７５〜８４頁）である。３つの手法の全てにおいて、プロセスは、野生型ＴＣＲの正常な低親和性を示すＴＣＲを、ＴＣＲの変異体のコグネイトｐｅｐＭＨＣ（すなわち、Ｔ細胞が特異的であった元の抗原）に対する親和性が増大するように操作することを伴う。したがって、ＣＤＲのうちの１つまたは複数に変異誘発したライブラリーを生成するための鋳型として野生型ＴＣＲを使用し、その後、親和性がより高い変異体を、コグネイトペプチド−ＭＨＣ抗原との結合によって選択した。
【０１５４】
酵母ディスプレイにより、対象のタンパク質を表面上でＡｇａ２融合物として発現させることが可能になる（BoderおよびWittrup（１９９７年）Nat.  Biotech.、１５巻、５５３〜５５７頁；BoderおよびWittrup（２０００年）Methods  Enzymol、３２８巻、４３０〜４４頁）。この系は、親和性がより高いＴＣＲ、単鎖抗体、フィブロネクチン、および他のタンパク質の操作において首尾よく使用されてきた。酵母ディスプレイ系では、ＴＣＲは、Ｖβ−リンカー−Ｖα形態またはＶα−リンカー−Ｖβ形態の安定化された単鎖タンパク質として（Aggenら（２０１１年）Protein  Engineering,  Design,  &  Selection、２４巻、３６１〜７２頁；Hollerら（２０００年）Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A、９７巻、５３８７〜９２頁；Kiekeら（１９９９年）Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A、９６巻、５６５１〜６頁；Richmanら（２００９年）Mol  Immunol、４６巻、９０２〜１６頁；Weberら（２００５年）Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A、１０２巻、１９０３３〜８頁）、または、二本鎖ヘテロ二量体として（Aggenら（２０１１年）Protein  Engineering,  Design,  &  Selection、２４巻、３６１〜７２頁；Richmanら（２００９年）Mol  Immunol、４６巻、９０２〜１６頁）としてディスプレイされている。この系を使用して２つのマウスＴＣＲがより高い親和性について操作されている：２Ｃ（ＭＨＣクラスＩ拘束）および３．Ｌ２（ＭＨＣクラスＩＩ拘束）（Hollerら（２０００年）Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A、９７巻、５３８７〜９２頁；Weberら（２００５年）Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A、１０２巻、１９０３３〜８頁）。Ｖα２と称されるヒトＶα領域の例外的な安定性を利用することによってヒトＴＣＲ単鎖ＶαＶβ断片（ｓｃＴｖまたはｓｃＴＣＲと称される）も最近開発された（Aggenら（２０１１年）Protein  Engineering,  Design,  &  Selection、２４巻、３６１〜７２頁）。この場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて操作された、単鎖形式の高親和性Ｔ細胞受容体を使用して、ヒト安定化ｓｃＴｖ断片（Ｖβ−リンカー−Ｖα）を単離し、これは、酵母の表面上でも、およびＥ．ｃｏｌｉに由来する可溶性の形態でも安定なタンパク質として発現させることができた。ＴＣＲは、２つの安定化されたヒトｓｃＴｖ断片、ヒトＴ細胞リンパ増殖性ウイルスＴａｘタンパク質（ペプチド：Ｔａｘ１１−１９、配列番号５）に由来するペプチドに対して特異的であるＡ６  ｓｃＴｖ、およびヒト免疫不全ウイルスＧａｇタンパク質（ペプチド：ＳＬ９７７−８５、配列番号８）に由来するペプチドに対して特異的である８６８  ｓｃＴｖを含んだ。これらのＴＣＲはどちらもＶα２遺伝子（ＩＭＧＴ：ＴＲＡＶ１２ファミリー）を使用するが、ＴＣＲを単離した元のＴ細胞クローンに由来するＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、およびＣＤＲ３β残基を有した。したがって、これらのｓｃＴＣＲの親和性がより高い変異体は、それぞれ、それらの元の（親）ＴＣＲから、それらのコグネイトペプチド−ＭＨＣ抗原に対して生じた。
【０１５５】
第２の系であるファージディスプレイでは、対象のタンパク質をウイルスのコートタンパク質のＮ末端と融合する（ScottおよびSmith（１９９０年）Science、２４９巻、３８６〜９０頁）。この方法を使用して、Ａ６、８６８、および１Ｇ４（ＭＨＣクラスＩ拘束）と称されるものを含めた種々のＴＣＲが、より高い親和性について操作されている（Liら（２００５年）Nat  Biotechnol、２３巻、３４９〜５４頁；Samiら（２００７年）Protein  Eng  Des  Sel、２０巻、３９７〜４０３頁；Varela−Rohenaら（２００８年）Nat  Med、１４巻、１３９０〜５頁）。これらのＴＣＲのファージディスプレイは、α鎖とβ鎖の対合を促進するために２つのＣドメイン間に非ネイティブなジスルフィド結合を導入することにより可能であった。したがって、この系では、それらのコグネイトペプチド−ＭＨＣに対する操作のために元のＴ細胞クローンに由来する全長の（ＶαＣα／ＶβＣβ）ヘテロ二量体タンパク質を使用する。
【０１５６】
ＴＣＲの操作に関して報告されている第３の系は、哺乳動物細胞ディスプレイ（Chervinら（２００８年）J  Immunol  Methods、３３９巻、１７５〜８４頁；Kesselsら（２０００年）Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A、９７巻、１４５７８〜８３頁）である。この系では、レトロウイルスベクターを使用してＴＣＲのα鎖およびβ鎖をＴＣＲ陰性Ｔ細胞ハイブリドーマに導入する。１つの試験では（Kesselsら（２０００年）Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A、９７巻、１４５７８〜８３頁）、選択された変異ＴＣＲは、コグネイトペプチドと構造的に非常に類似したペプチドと結合することが示された（ＡＳＮＥＮＭＤＡＭ、配列番号４６、対してＡＳＮＥＮＭＥＴＭ、配列番号４７）。他の試験では、変異ＴＣＲの親和性は、コグネイトｐｅｐＭＨＣに対して増大していることが示された（Chervinら（２００８年）J  Immunol  Methods、３３９巻、１７５〜８４頁）。多くの試験において、そのような親和性がより高いＴＣＲが、コグネイトペプチドの構造的に類似したバリアントに対してもより高い親和性を示すことが示されている（例えば、（Hollerら（２００３年）Nat  Immunol、４巻、５５〜６２頁））。哺乳動物細胞ディスプレイ系では、導入されたＴＣＲは、表面上でそのネイティブなコンフォメーション、ＣＤ３サブユニットとの複合体で発現され、それにより、完全に機能的なＴ細胞（シグナル伝達コンピテント）が可能になった。したがって、この方法を使用して、ネイティブな宿主において全長のヘテロ二量体ＴＣＲが操作された。
【０１５７】
ＴＣＲ足場
本発明は、単一の、例えば、ヒトＴＣＲの、所望の抗原（例えば、コグネイト抗原または非コグネイト抗原）に対する親和性がより高いＴＣＲを操作するための「プラットフォーム」としての使用を提供する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＴＣＲ足場に基づくＴＣＲの操作方法は、例えば、単一のＴＣＲの部位特異的な変異ライブラリーを作製し、その後、非コグネイト抗原との結合について選択することを含んでよい。操作は、元の、単一の、または親ＴＣＲを構造解析することによりガイドされる。ある特定の実施形態では、操作されたＴＣＲは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける標的化送達のために可溶性の形態で、または、養子移入による方法または処理においてＴ細胞において組換えにより発現させて使用することができる。
【０１５８】
一般に、特異的な抗原に対するＴＣＲ変異体を操作するために使用することができるＴＣＲ足場が提供される。ＴＣＲは、例えば、これだけに限定されないが、がん、ウイルス性疾患および自己免疫疾患の治療を含めた多くの目的のために有用である。特定の実施形態では、単鎖ＶαＶβＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）足場を調製し、エフェクター分子をＴＣＲが結合する場所（例えば、腫瘍）に送達するために、サイトカイン、毒素、放射性同位元素、化学療法剤、または薬物（抗体−薬物コンジュゲートと同様の）などのペイロードと一緒に使用することができる。ＴＣＲは、例えば、がん細胞またはウイルス感染細胞に対する応答を媒介するための、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の養子移入などの細胞療法においても使用することができる。本明細書において提供されるｓｃＴＣＲ足場は、例えば、悪性細胞またはウイルス感染細胞を、例えば、新生物またはウイルスに関連する細胞表面抗原を、例えば、ＴＣＲのアミン反応性またはスルフヒドリル反応性のアミノ酸の側鎖を通じた、放射性同位元素または蛍光部分などの検出可能な基との共有結合によって同定することによって診断するためにも使用することができる。
【０１５９】
一実施形態では、本明細書に記載のｓｃＴＣＲ足場は、酵母、ファージ、または哺乳動物細胞の表面上にディスプレイ可能であり、非コグネイト抗原に対する親和性がより高いＴＣＲを操作するために使用することができる。一実施形態では、本明細書に記載のｓｃＴＣＲ足場は、原核細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなど、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）などの細胞株を含めた哺乳動物細胞、または、例えば、植物種（例えば、キャノーラ、ダイズ、トウモロコシ、ジャガイモ、オオムギ、ライムギ、コムギ）、または当技術分野で公知の他のタンパク質の発現供給源において発現させ、多量産生させることができる。ＴＣＲ足場は、特定の抗原に対して作製し、例えば、単に例として、細胞の表面上の特異的なペプチド／ＭＨＣを検出するために使用することができる。一実施形態では、開示されているｓｃＴＣＲ遺伝子を、ＤＮＡ構築物内にコードされる適切なペプチド配列を使用することにより、シグナル伝達ドメインの遺伝子と連結し、標的とされた細胞を排除することができるＴ細胞に導入することができる。これらの構築物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と称されており、現在、ｓｃＴＣＲを含有するＣＡＲの使用を含め、実地で広く使用されている。
【０１６０】
別の実施形態では、本開示は、単鎖ＶαＶβＴ細胞受容体（ｓｃ  ＶαＶβ  ＴＣＲ）足場のアミノ酸配列および形態を提供する。提供されるｓｃ  ＶαＶβ  ＴＣＲ足場では、可変性アルファ鎖および可変性ベータ鎖が、抗体単鎖Ｆｖ連結を用いたものなどの当技術分野で公知のものを含めた任意の適切なペプチドリンカーを使用して接続されている（Birdら（１９８８年）Science、２４２巻、４２３〜４２６頁；Holligerら（１９９３年）Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A、９０巻、６４４４〜８頁；Hoogenboom（２００５年）Nat  Biotechnol、２３巻、１１０５〜１６頁；Turnerら（１９９７年）J  Immunol  Methods、２０５巻、４３〜５４頁）。一実施形態では、構造：Ｖα−Ｌ−ＶβまたはＶβ−Ｌ−Ｖα（式中、ＬはＶβとＶαを連結するリンカーペプチドであり、ＶβはＴＣＲ可変β領域であり、ＶαはＴＣＲ可変α領域である）を有する可溶性ヒト単鎖ＴＣＲが提供される。一実施形態では、モデルＶαＶβ  ＴＣＲはＡ６と称され、Ｖβは、グループ１３のＴＣＲ可変β領域であり、Ｖα２は、グループ２のＴＣＲ可変α領域である（Utz,  U.ら、１９９６年）。一実施形態では、モデルＶαＶβ  ＴＣＲは、Ａ６  Ｘ１５として公知のＡ６の安定化された単鎖バリアントである（Aggen,  D.A.ら、２０１１年）。一実施形態では、リンカーペプチドは、６個以上のリシン（lysine）残基を含有する。一実施形態では、リンカーペプチドは、５から３０の間のアミノ酸を含有する。一実施形態では、リンカーペプチドは、ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＧＫＳ（配列番号２１）のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、提供されるｓｃＶαＶβＴＣＲ足場は定常領域を含有しない。ｓｃ  ＶαＶβ  ＴＣＲ足場という用語法が本明細書で使用される場合、この用語法は当技術分野において理解され、使用されているので、ｓｃＶβＶαＴＣＲ足場も含まれることが理解される。したがって、Ｖα鎖およびＶβ鎖は、互いとリンカーを介して任意の立体配置で接続することができる。
【０１６１】
本開示のある態様では、本開示のｓｃＶαＶβＴＣＲ足場は、リガンドと、約１０−６Ｍから１０−１２Ｍの間の平衡結合定数ＫＤで特異的に結合する。本開示のこの態様の一実施形態では、リガンドは、ペプチド／ＭＨＣリガンドである。一実施形態では、本開示のｓｃ  ＶαＶβ  ＴＣＲはリガンドに対する親和性が、正常な野生型ＴＣＲの親和性と比較して増強されている。
【０１６２】
ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子、およびＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の集合に結合するＴＣＲを、ヒト集団の大部分にわたる疾患を治療するために使用することができる。例えば、集団における多くのＨＬＡ対立遺伝子の頻度が決定されており、これらの対立遺伝子と関連して多くのがんペプチド抗原が記載されている（Marsh、Parham、およびBarber、The  HLA  Facts  Book、copyright  2000  by  Academic  Press、ISBN  0-12-545025-7）。
【０１６３】
例として、白人の集団の中での平均頻度（および範囲）は、ＨＬＡ−Ａ１、１４％；ＨＬＡ−Ａ２、２５％；ＨＬＡ−Ａ３、１２％；ＨＬＡ−Ａ１１、７％；ＨＬＡ−Ａ２４、１０％；ＨＬＡ−Ｂ７、９％；ＨＬＡ−Ｂ４４、１１％；ＨＬＡ−Ｃｗ４、１２％；ＨＬＡ−Ｃｗ７、２３％である。これらの集団内で見いだされる範囲は、ＨＬＡ−Ａ１（５〜２８％）；ＨＬＡ−Ａ２（７〜４０％）；ＨＬＡ−Ａ３（３〜２０％）；ＨＬＡ−Ａ１１（２〜２５％）；ＨＬＡ−Ａ２４（５〜１８％）；ＨＬＡ−Ｂ７（１−１６％）；ＨＬＡ−Ｂ４４（５〜２２％）；ＨＬＡ−Ｃｗ４（６〜１９％）；ＨＬＡ−Ｃｗ７（１３〜３９％）である。
【０１６４】
ＴＣＲ足場手法は、他のヒトＨＬＡ対立遺伝子に種々のやり方で拡張することができる。例えば、本明細書に記載のＴＣＲ足場の、構造に基づく設計を使用して、他の対立遺伝子に対する糸口を作製するために、ＭＨＣへリックスと接触するＣＤＲループ内の変異したライブラリーに焦点を当てることが可能である。例えば、ＨＬＡ−Ａ２と複合体を形成したＡ６  ＴＣＲの構造から、ＣＤＲ２アルファライブラリーにより、ＨＬＡ−Ａ２のアルファ２へリックスの領域内に結合するバリアントが生じることがわかる。ＴＣＲ  Ａ６の残基Ｙ５１はＨＬＡ−Ａ２アルファ２へリックスのＥ１５４位、Ｑ１５５位、およびＡ１５８位の近くにある。ＨＬＡ−Ａ１対立遺伝子は、１５８位のみで異なり、アラニンではなくバリンである。したがって、Ａ６  ＴＣＲはＨＬＡ−Ａ１対立遺伝子に対して基本的な親和性を有する可能性があり、これは、５１位を包含するＣＤＲ２変異体のライブラリーを作製し、その後、ＨＬＡ−Ａ１対立遺伝子との親和性がより高い結合について選択することによって改善することができる。
【０１６５】
別の例では、異なる対立遺伝子に特異的なＴＣＲ（すなわち、そのＭＨＣ対立遺伝子の産物に結合したペプチド）に由来する足場を使用する。本発明では、Ａ６  ＴＣＲ足場について示されているＣＤＲライブラリーを作製することが可能であり、これは、その対立遺伝子の代替の非コグネイトペプチド−ＭＨＣ複合体と反応する。例えば、ＭＡＧＥ−Ａ３由来のがん抗原ペプチドはＨＬＡ−Ａ１に結合し、これを、ＴＲライブラリーの選択のために使用することができる。
【０１６６】
生物活性基
生物活性基を含む本明細書に記載のｓｃ  ＶαＶβ  ＴＣＲ足場も提供される。本明細書で使用される場合、「生物活性基」とは、生物系において測定可能なまたは検出可能な影響を引き起こす基である。一実施形態では、生物活性基は、抗腫瘍剤、例えば、これだけに限定されないが、血管新生阻害剤、酵素阻害剤、微小管阻害剤、ＤＮＡインターカレーターまたは架橋剤、ＤＮＡ合成阻害剤など；例えば、これだけに限定されないが、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γまたはＬＴ−αなどのサイトカイン（Schramaら（２００６年）Nat  Rev  Drug  Discov、５巻、１４７〜５９頁；Wongら（２０１１年）Protein  Eng  Des  Sel、２４巻、３７３〜８３頁）；抗炎症性基、例えば、これだけに限定されないが、ＴＧＦ−β、ＩＬ−３７、ＩＬ−１０など（Noldら（２０１０年）Nat  Immunol、１１巻、１０１４〜２２頁；Stoneら（２０１２年）Protein  Engineering）、放射性同位元素、例えば、これだけに限定されないが、９０Ｙまたは１３１Ｉなど（ReichertおよびValge−Archer（２００７年）Nat  Rev  Drug  Discov、６巻、３４９〜５６頁）；毒素、例えば、これだけに限定されないが、シュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒素、またはリシン（ricin）のＡ鎖など（Pastanら（２００６年）Nat  Rev  Cancer、６巻、５５９〜６５頁；Schramaら（２００６年）Nat  Rev  Drug  Discov、５巻、１４７〜５９頁）；薬物、または抗体、例えば、単鎖Ｆｖなどから選択される。
【０１６７】
本開示のこの態様の一実施形態では、生物活性基は、薬物と称される場合もある（例えば、「抗体薬物コンジュゲート」という用語において）細胞傷害性分子である。本明細書で使用される場合、「細胞傷害性」とは、細胞に対する毒性を意味する。細胞傷害性分子の例としては、これだけに限定されないが、ドキソルビシン、メトトレキセート、マイトマイシン、５−フルオロウラシル、デュオカルマイシン、オーリスタチン、マイタンシン、カリチアマイシンおよび上記の分子の類似体が挙げられる（Jarvis（２０１２年）Chemical  and  Engineering  News、９０巻、１２〜１８頁；Litvak−GreenfeldおよびBenhar（２０１２年）Adv  Drug  Deliv  Rev；RicartおよびTolcher（２００７年）Nat  Clin  Pract  Oncol、４巻、２４５〜５５頁）。細胞傷害性分子により完全な細胞死が引き起こされる必要はなく、測定可能なまたは検出可能な成長の阻害または細胞活性の低下が必要である。
【０１６８】
一実施形態では、本明細書に記載のＴＣＲはプロドラッグを薬物に変換することができる酵素と連結している。これは、例えば、ＴＣＲの標的とされる場所（例えば、腫瘍の部位）で薬物の活性型が創出されることを可能にするので有用である。
【０１６９】
一実施形態では、生物活性基は、単鎖ＴＣＲにリンカーを介して結合しており、これは、例えばＴＣＲの遊離のアミン基またはスルフヒドリル基となどの標準の化学反応によって実現することができる。
【０１７０】
別の実施形態では、ＴＣＲを単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）に付着させて、二重特異性作用剤を作製する。腫瘍抗原に対するｓｃＦｖを１つと、Ｔ細胞のＣＤ３分子に対するｓｃＦｖを１つ含有する二重特異性抗体が現在診療所において首尾よく使用されている（Bargouら（２００８年）Science、３２１巻、９７４〜７頁）。さらに、ＴＣＲとＣＤ３に対するｓｃＦｖとを含有する二重特異性作用剤も報告されている（Liddyら（２０１２年）Nat
Med、１８巻、９８０〜７頁）。
【０１７１】
検出可能な基を含む、本明細書に記載の単鎖ＶαＶβＴＣＲも提供される。一実施形態では、検出可能な基は、分光学的方法または酵素に基づく方法によって検出することができるものである。一実施形態では、検出可能な基は、蛍光基、例えば、これだけに限定されないが、フルオレセイン、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）など；放射標識基、例えば、これだけに限定されないが、１２５Ｉ、３２Ｐ、９９ｍＴｃなど；吸収性基、または検出可能な生成物を生じる性質を有する酵素、例えば、これだけに限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはアルカリホスファターゼなどである。
【０１７２】
当技術分野で公知の通り、生物活性基、検出可能な基または他のＴＣＲに付着させる基は、柔軟なペプチドリンカーを使用して、または化学的なコンジュゲーションによって付着させることができ、また、共有結合によってまたは非共有結合によってＴＣＲに付着させてよい。
【０１７３】
抗原特異性
本発明では、特異的な抗原を認識する（または標的とする）ｓｃＶαＶβＴＣＲ足場も提供される。一実施形態では、ＴＣＲは、ウイルスまたはその断片の認識に対して特異的である。一実施形態では、ＴＣＲは、がん特異的エピトープの認識に対して特異的である。一実施形態では、ＴＣＲは、自己免疫性関連エピトープの認識に対して特異的である。他の標的としては、The  HLA  Factsbook（Marshら（２０００年））に列挙されているもの、および当技術分野で公知の他のものが挙げられる。特異的な標的抗原としては、腫瘍関連抗原（van  der  Bruggen  Pら、Peptide  database:  T  cell-defined  tumor  antigens.  Cancer  Immun  ２０１３年  cancerimmunity.org/peptide/；（Cheeverら（２００９年）Clin  Cancer  Res、１５巻、５３２３〜３７頁）、ウイルス性抗原（（Addoら（２００７年）PLoS  ONE、２巻、ｅ３２１頁；Anikeevaら（２００９年）Clin  Immunol、１３０巻、９８〜１０９頁））、および自己免疫性関連エピトープ（（Bulekら（２０１２年）Nat  Immunol、１３巻、２８３〜９頁；Harkiolakiら（２００９年）Immunity、３０巻、３４８〜５７頁；Skoweraら（２００８年）J  Clin  Invest、１１８巻、３３９０〜４０２頁）が挙げられる。一実施形態では、標的抗原は、以下の表１に列挙されているＭＡＲＴ−１（Kawakami  Yら、J  Exp  Med  １９９４年；１８０巻：３４７〜３５２頁；Romeroら、２００２年、Immunol.  Rev.  １８８巻、８１〜９６頁）、ＷＴ−１（Gesslerら、Nature  ３４３巻（６２６０号）、７７４〜７７８頁（１９９０年））、ＳＵＲＶ（Schmidt  SMら、Blood  ２００３年；１０２巻：５７１〜６頁；Schmitz  Mら、Cancer  Res  ２０００年；６０巻：４８４５〜９頁）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（Barfoed  AMら、Scand  J  Immunol  ２０００年；５１巻：１２８〜３３頁）、ＰＰＩ（Bulek  ２０１２年、Nature  Immunology）、ＭＤＭ２（Asaiら、２００２年、Cancer  Immunity）、ＭＤＭ４、ＨＢＥ１８３、ｇｐ１００（Bakker  ABら、Int  J  Cancer  １９９５年；６２巻：９７〜１０２頁；Kawakami  Yら、J  Immunol  １９９５年；１５４巻：３９６１〜３９６８頁）、ＭＵＣ１（Brossart  Pら、Blood  １９９９年；９３巻：４３０９〜１７頁）、ＭＡＧＥ  Ａ３（van  der  Bruggen  Pら、Eur  J  Immunol  １９９４年；２４巻：３０３８〜４３頁）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（Fisk  Bら、J  Exp  Med  １９９５年；１８１巻：２１０９〜２１１７頁）、ＥＧＶＦｖＩＩＩ（Sampson  Semin  Immunol  ２００８年；２０巻：２６７〜７５頁）、ＣＥＡ（Tsang  KYら、J  Natl  Cancer  Inst  １９９５年；８７巻：９８２〜９９０頁）、およびＳＬ９／ＨＩＶ  ｇａｇ（Altfeldら、２００１年、J.  Virol.  ７５巻：１３０１頁）のうちの１つである。表１の順位スコアはCheeverら（２００９年）Clin  Cancer  Res、１５巻、５３２３〜３７頁からのものである。ＭＡＲＴ−１／ＨＬＡ−Ａ２と称される特異的な非コグネイト抗原（ペプチドＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、配列番号７、ＨＬＡ分子Ａ２に結合した）を認識するＡ６足場に由来するｓｃＶαＶβＴＣＲ変異体も提供される。
【表１】
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【０１７４】
本発明では、哺乳動物における疾患または障害を治療または予防する方法であって、治療的に有効な分子と連結した改変型ＴＣＲを有効量で哺乳動物に投与することを含む方法において使用するためのヒトＴＣＲも提供される。特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。別の実施形態では、哺乳動物は、伴侶動物（例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、げっ歯類、ウマ）または家畜動物（例えば、雌ウシ、ウマ、ブタ）である。
【０１７５】
本明細書で使用される場合、「病態」とは、生物体の異常な機能または状態である。一実施形態では、病態は、がん、ウイルス性疾患、細菌性疾患または自己免疫疾患からなる群から選択される。本明細書に記載の単離された単鎖ＴＣＲ、および単鎖ＴＣＲをＥ．ｃｏｌｉにおいて産生させるための方法も提供される。本明細書に記載のｓｃＴＣＲおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供される。Ｔ細胞の表面上で活性なＴＣＲをもたらすシグナル伝達ドメインと連結した本明細書に記載のｓｃ  ＶαＶβ  ＴＣＲも提供される。一実施形態では、このｓｃＴＣＲを、哺乳動物における病態を治療する方法であって、ＴＣＲをベクターにクローニングするステップと、ベクターを患者のＴ細胞に導入するステップと、Ｔ細胞を患者に養子移入するステップとを含む方法において使用することができる。
【０１７６】
改変型ＴＣＲポリペプチドおよびポリヌクレオチド
本開示は、単鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴＣＲ）をコードする少なくとも１つのＤＮＡセグメントを含むＤＮＡベクターを意図している。
【０１７７】
当業者は、標準の変異誘発技法と本明細書に記載のアッセイの併用により、変更されたＴＣＲ配列を得、それらを特定の結合親和性および／または特異性について試験することができる。当技術分野で公知の有用な変異誘発技法としては、これだけに限定することなく、新規の遺伝子合成、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、領域特異的変異誘発、リンカースキャニング変異誘発、およびＰＣＲによる部位特異的変異誘発が挙げられる（例えば、Sambrookら（１９８９年）およびAusubelら（１９９９年）を参照されたい）。
【０１７８】
バリアントＴＣＲコード配列を得ることにおいて、ＴＣＲ由来のタンパク質を、生物活性を失うことも低下させることもなく、特定のアミノ酸の置換、付加、欠失、および翻訳後修飾によって修飾することができることが当業者には理解されよう。特に、保存されたアミノ酸置換、すなわち、あるアミノ酸から、サイズ、電荷、極性およびコンフォメーションが類似した別のアミノ酸への置換によりタンパク質機能は有意に変更されない可能性が高いことが周知である。タンパク質を構成する標準のアミノ酸２０種は、以下の保存されたアミノ酸の４つの群に大まかにカテゴリー化することができる：アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリンを含む非極性（疎水性）群；アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニンおよびチロシンを含む極性（非荷電、中性）群；アルギニン、ヒスチジンおよびリシン（lysine）を含有する正に荷電した（塩基性）群；およびアスパラギン酸およびグルタミン酸を含有する負に荷電した（酸性）群。タンパク質内のあるアミノ酸から同じ群の別のアミノ酸への置換にはタンパク質の生物活性に対する有害作用はない可能性が高い。
【０１７９】
一実施形態では、本開示のｓｃＴＣＲは、安定化されたタンパク質が生じる、可変ドメインの任意の１つまたは複数の領域内の追加的な変異を含有してよい。一実施形態では、１つまたは複数の追加的な変異は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＨＶ４、ＣＤＲ３、ＦＲ２、およびＦＲ３のうちの１つまたは複数におけるものである。変異誘発のために使用される領域は指向性進化によって決定することができ、そこで、結晶構造または分子モデルを使用して対象のリガンド（例えば抗原）と相互作用するＴＣＲの領域を作製する。他の例では、ｓｃＴＣＲとリガンドの間の所望の相互作用を操作するために、アミノ酸を付加するまたは欠失させることによって可変領域を作り直すことができる。
【０１８０】
本発明のポリペプチドは、改変型ＴＣＲおよびその抗原結合性断片（例えば、ｓｃＴＣＲ）、ならびにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」および「糖タンパク質」という用語は、互換的に使用され、いかなる特定の長さにも限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。この用語により、ミリスチル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化およびシグナル配列の付加または欠失などの修飾は排除されない。「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸の鎖を意味し、各鎖は、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸を含み、前記ポリペプチドまたはタンパク質は、ネイティブなタンパク質、すなわち、天然に存在する細胞、特に非組換え細胞、または遺伝子操作された細胞もしくは組換え細胞によって産生されるタンパク質の配列を有する、非共有結合し、かつ／またはペプチド結合によって共有結合した複数の鎖を含んでよく、また、ネイティブなタンパク質、またはネイティブな配列の１つまたは複数のアミノ酸からの欠失、それへの付加、および／またはそれの置換を有する分子のアミノ酸配列を有する分子を含む。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本開示の改変型ＴＣＲもしくはその抗原結合性断片、または改変型ＴＣＲもしくはその抗原結合性断片の１つもしくは複数のアミノ酸からの欠失、それへの付加、および／またはそれの置換を有する配列を特に包含する。したがって、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、１つのアミノ酸の鎖を含んでもよく（「単量体」と称される）、複数のアミノ酸の鎖を含んでもよい（「多量体」と称される）。
【０１８１】
本明細書で言及される「単離されたタンパク質」という用語は、対象タンパク質が、（１）一般に天然に一緒に見いだされる少なくともいくつかの他のタンパク質を含まないこと、（２）同じ供給源に由来する他のタンパク質、例えば、同じ種に由来する他のタンパク質を基本的に含まないこと、（３）異なる種由来の細胞によって発現されること、（４）天然では結びついているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の材料の少なくとも約５０パーセントから分離されていること、（５）「単離されたタンパク質」が天然では結びついているタンパク質の部分と結びついていないこと（共有結合性もしくは非共有結合性の相互作用によって）、（６）天然では結びついていないポリペプチドと作動可能に結びついていること（共有結合性もしくは非共有結合性の相互作用によって）、または（７）天然には存在しないことを意味する。そのような単離されたタンパク質は、合成起源であってよいゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せによりコードされていてよい。ある特定の実施形態では、単離されたタンパク質は、その使用（治療、診断、予防、研究または他の点で）に干渉すると思われるその天然の環境において見いだされるタンパク質またはポリペプチドまたは他の混入物を実質的に含まない。
【０１８２】
特定の実施形態では、対象の改変型ＴＣＲは、ａ）本明細書に記載の改変型ＴＣＲのアルファ鎖可変領域と少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲアルファ鎖可変領域；およびｂ）本明細書に記載の改変型ＴＣＲの軽鎖可変領域と少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するベータ鎖可変領域を含んでよい。
【０１８３】
特定の実施形態では、改変型ＴＣＲは、ａ）ｉ．本明細書に記載の選択されたＴＣＲのアルファ鎖ＣＤＲ１領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ１領域；ｉｉ．選択されたＴＣＲのアルファ鎖ＣＤＲ２領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ２領域；およびｉｉｉ．選択されたＴＣＲのアルファ鎖ＣＤＲ３領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ３領域を含むＴＣＲアルファ鎖可変領域；ならびにｂ）ｉ．選択されたＴＣＲのベータ鎖ＣＤＲ１領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ１領域；ｉｉ．選択されたＴＣＲのベータ鎖ＣＤＲ２領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ２領域；およびｉｉｉ．選択されたＴＣＲのベータ鎖ＣＤＲ３領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ３領域を含むベータ鎖可変領域を含んでよく、ここで、ＴＣＲは選択された非コグネイト抗原に特異的に結合する。さらなる実施形態では、改変型ＴＣＲまたはその抗原結合性断片はバリアント改変型ＴＣＲであり、バリアントは、Ｖアルファ領域およびＶベータ領域のＣＤＲ領域内の８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、またはそれ以上に至るアミノ酸置換以外は選択された改変型ＴＣＲと同一であるアルファ鎖およびベータ鎖を含む。この点について、選択されたバリアント改変型ＴＣＲのＣＤＲ領域内に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、またはある特定の実施形態では９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個またはそれ以上のアミノ酸置換があってよい。置換は、Ｖアルファ領域および／またはＶベータ領域のＣＤＲ全体におけるものであってよい（例えば、Muller、１９９８年、Structure  ６巻：１１５３〜１１６７頁を参照されたい）。
【０１８４】
一実施形態では、改変型ＴＣＲまたはその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチドが提供される。他の関連する実施形態では、ポリヌクレオチドは、改変型ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドのバリアントであってよい。ポリヌクレオチドバリアントは、本明細書に記載の改変型ＴＣＲをコードするポリヌクレオチド配列と実質的に同一であってよい。例えば、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の方法（例えば、下記の通り標準のパラメータを使用したＢＬＡＳＴ分析）を使用して、本明細書に記載の抗体をコードする配列などの参照ポリヌクレオチド配列と比較して少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは  少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれ以上の配列同一性を含むポリヌクレオチドであってよい。これらの値は、２つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために、コドンの縮重、アミノ酸の類似性、読み枠の位置などを考慮に入れることによって適切に調整することができることが当業者には理解されよう。
【０１８５】
一般には、ポリヌクレオチドバリアントは、１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有し、これは、バリアントポリヌクレオチドによりコードされる抗体の結合親和性が、本明細書に具体的に記載されているポリヌクレオチド配列によりコードされる抗体と比較して実質的に減弱しないようなものであることが好ましい。
【０１８６】
ポリヌクレオチド配列を比較した際、２つの配列は、下記の通り、対応が最大になるようにアラインメントした場合に２つの配列内のヌクレオチドの配列が同じであれば、「同一」であると言える。２つの配列間の比較は、一般には、比較ウィンドウにわたって配列を比較して、局所的な配列の領域の類似性を同定し、比較することによって実施される。「比較ウィンドウ」とは、本明細書で使用される場合、２つの配列を最適にアラインメントした後に、配列を同じ数の連続した位置の参照配列と比較することができる少なくとも約２０、通常３０〜約７５、４０〜約５０の連続した位置のセグメントを指す。
【０１８７】
比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）内のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用し、初期状態のパラメータを用いて行うことができる。このプログラムにより、以下の参考文献に記載されているいくつかのアラインメントスキームが具体化される：Dayhoff,  M.O.（１９７８年）A  model  of  evolutionary  change  in  proteins  -  Matrices  for  detecting  distant  relationships.  In  Dayhoff,  M.O.（編）Atlas  of  Protein  Sequence  and  Structure、National  Biomedical  Research  Foundation、Washington  DC  ５巻、補遺３、３４５〜３５８頁；Hein  J.、Unified  Approach  to  Alignment  and  Phylogenes、６２６〜６４５頁（１９９０年）；Methods  in  Enzymology  １８３巻、Academic  Press,  Inc.、San  Diego、CA；Higgins,  D.G.およびSharp,  P.M.、CABIOS  ５巻:１５１〜１５３頁（１９８９年）；Myers,  E.W.およびMuller  W.、CABIOS  ４巻:１１〜１７頁（１９８８年）；Robinson,  E.D.、Comb.  Theor  １１巻：１０５頁（１９７１年）；Santou,  N.  Nes,  M.、Mol.  Biol.  Evol.  ４巻:４０６〜４２５頁（１９８７年）；Sneath,  P.H.A.およびSokal,  R.R.、Numerical  Taxonomy  -  the  Principles  and  Practice  of  Numerical  Taxonomy、Freeman  Press、San  Francisco、CA（１９７３年）；Wilbur,  W.J.およびLipman,  D.J.、Proc.  Natl.  Acad.、Sci.  USA  ８０巻:７２６〜７３０頁（１９８３年）。
【０１８８】
あるいは、比較のための配列の最適なアラインメントは、SmithおよびWaterman,  Add.  APL.  Math  ２巻：４８２頁（１９８１年）の局所同一性アルゴリズムによって、NeedlemanおよびWunsch、J.  Mol.  Biol.  ４８巻：４４３頁（１９７０年）の同一性アラインメントアルゴリズムによって、PearsonおよびLipman、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Wisconsin  Genetics  Software  Package、Genetics  Computer  Group  (GCG)、５７５  Science  Dr.、Madison、WIでのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行うことができる。
【０１８９】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの好ましい一例は、それぞれAltschulら、Nucl.  Acids  Res.  ２５巻:３３８９〜３４０２頁（
１９７７年）、およびAltschulら、J.  Mol.  Biol.  ２１５巻:４０３〜４１０頁（１９９０年）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、例えば、２つ以上のポリヌクレオチドの間のパーセント配列同一性を決定するために、本明細書に記載のパラメータを用いて使用することができる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公的に入手可能である。例示的な一例では、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（マッチする残基の対に対するリワードスコア（ｒｅｗａｒｄ  ｓｃｏｒｅ）；ａｌｗａｙｓ＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア（ｐｅｎａｌｔｙ  ｓｃｏｒｅ）；ａｌｗａｙｓ＜０）を使用して累積スコアを算出することができる。累積的なアラインメントスコアがその最大の実現値から数量Ｘ低下した時；１つまたは複数のネガティブスコアリング（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｃｏｒｉｎｇ）残基アラインメントの蓄積に起因して累積スコアがゼロ以下になった時；または、いずれかの配列の末端に到達した時に、各方向へのワードヒット（ｗｏｒｄ  ｈｉｔ）の伸長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸにより、アラインメントの感度およびスピードが決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）では、初期値としてワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）（Ｗ）１１、および期待値（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）（Ｅ）１０、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（HenikoffおよびHenikoff、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８９巻：１０９１５頁（１９８９年）を参照されたい）アラインメント、（Ｂ）５０、期待値（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を使用する。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、「配列同一性の百分率」は、２つの最適にアラインメントされた配列を少なくとも２０の位置の比較ウィンドウにわたって比較することによって決定し、ここで、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列を最適にアラインメントするために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセント以下、通常５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでよい。百分率は、両方の配列内で同一の核酸塩基が現れる位置の数を決定してマッチする位置の数を得、マッチする位置の数を参照配列（すなわち、ウィンドウサイズ）内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって算出される。
【０１９１】
遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に記載の抗体をコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが当業者には理解されよう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、例えば同じ非コグネイト抗原に結合する改変型ＴＣＲをコードするネイティブなまたは元のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド配列に対して最小の配列同一性を有する。それにもかかわらず、コドンの使用の差異に起因して変動するポリヌクレオチドが本開示により明白に意図されている。ある特定の実施形態では、哺乳動物による発現に対してコドン最適化された配列が特に意図されている。
【０１９２】
クローニング、ＤＮＡの単離、増幅および精製のための標準の方法、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどが関与する酵素反応のための標準の技法、ならびに種々の分離技法は、公知のものであり、当業者に一般に使用される。いくつもの標準の技法は、Sambrookら（１９８９年）Molecular  Cloning、第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、Plainview、New  York；Maniatisら（１９８２年）Molecular  Cloning、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、Plainview、New  York；Wu（編）（１９９３年）Meth.  Enzymol.  ２１８巻、Ｉ号；Wu（編）（１９７９年）Meth  Enzymol.  ６８巻；Wuら（編）（１９８３年）Meth.  Enzymol.  １００巻および１０１巻；GrossmanおよびMoldave（編）Meth.  Enzymol.  ６５巻；Miller（編）（１９７２年）Experiments  in  Molecular  Genetics、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、Cold  Spring  Harbor、New  York；OldおよびPrimrose（１９８１年）Principles  of  Gene  Manipulation、University  of  California  Press、Berkeley；SchleifおよびWensink（１９８２年）Practical  Methods  in  Molecular  Biology；Glover（編）（１９８５年）DNA  Cloning  I巻およびII巻、IRL  Press、Oxford、UK；HamesおよびHiggins（編）（１９８５年）Nucleic  Acid  Hybridization、IRL  Press、Oxford、UK；およびSetlowおよびHollaender（１９７９年）Genetic  Engineering:  Principles  and  Methods、１〜４巻、Plenum  Press、New  Yorkに記載されている。略語および命名法が使用されている場合、それは、当該分野における標準であり、本明細書において引用されているものなどの専門誌において一般に使用されるものであるとみなされる。
【０１９３】
ヌクレオチド配列間の相同性は、ＤＮＡのハイブリダイゼーション分析によって決定することができ、二本鎖ＤＮＡハイブリッドの安定性は、生じる塩基対合の程度に左右される。高温および／または低塩含量の条件により、ハイブリッドの安定性が低下し、これを変動させて、相同性が選択された程度に満たない配列のアニーリングを防止することができる。例えば、Ｇ−Ｃ含量が約５５％の配列について、４０〜５０℃、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム緩衝液）および０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）のハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件により、約６０〜７０％の相同性が示され、５０〜６５℃、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件により、約８２〜９７％の相同性が示され、５２℃、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件により、約９９〜１００％の相同性が示される。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を比較するため（および相同性の程度を測定するため）に広範囲のコンピュータプログラムも利用可能であり、市販のソフトウェアおよび無料のソフトウェアの両方の供給源を提供する一覧がAusubelら（１９９９
年）に見いだされる。容易に入手可能な配列比較および多数の配列アラインメントアルゴリズムは、それぞれ、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Altschulら、１９９７年）およびＣｌｕｓｔａｌＷプログラムである。ＢＬＡＳＴは、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいてインターネット上で利用可能であり、ＣｌｕｓｔａｌＷのバージョンはｗｗｗ２．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋにおいて利用可能である。
【０１９４】
微生物の工業用株（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、昆虫（ショウジョウバエ）、哺乳動物（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞株、ＣＨＯ）、または植物種（例えば、キャノーラ、ダイズ、トウモロコシ、ジャガイモ、オオムギ、ライムギ、コムギ）を、ＴＣＲタンパク質を組換えにより産生するための宿主細胞として使用することができる。ある特定の実施形態では、高親和性ＴＣＲタンパク質または可溶性タンパク質を異種発現させる第１のステップで、ＴＣＲまたは可溶性ＴＣＲコード配列、ならびにプロモーター、エンハンサーおよびターミネーターなどの制御配列を含む発現構築物を組み立てる。シグナル配列および選択マーカーなどの他の配列も含めることができる。ＴＣＲの細胞外発現を実現するために、発現構築物に分泌シグナル配列を含めることができる。複数の実施形態では、細胞質内発現が望まれる場合、発現構築物にシグナル配列を含めない。複数の実施形態では、プロモーターおよびシグナル配列は宿主細胞において機能的であり、ＴＣＲまたは可溶性ＴＣＲタンパク質の発現および分泌をもたらす。効率的な転写を確実にするために転写ターミネーターを含めることができる。タンパク質の発現または精製を増強する補助的な配列も発現構築物に含めることができる。
【０１９５】
種々のプロモーター（転写開始調節領域）を本開示に従って使用することができる。適切なプロモーターの選択は、提唱された発現宿主に左右され得る。選択された宿主において機能的である限りは異種供給源由来のプロモーターを使用することができる。
【０１９６】
プロモーターの選択は、ペプチドまたはタンパク質産生の所望の効率およびレベルにも左右される。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタンパク質の発現のレベルを劇的に上昇させるために、多くの場合、ｔａｃなどの誘導性プロモーターが使用される。タンパク質の過剰発現は宿主細胞に有害であり得る。したがって、宿主細胞の成長は制限され得る。誘導性プロモーター系を使用することにより、宿主細胞を、遺伝子発現を誘導する前に許容される密度まで培養することが可能になり、それにより、より高い産物収率が容易になる。
【０１９７】
種々のシグナル配列を本開示に従って使用することができる。ＴＣＲコード配列と相同なシグナル配列を使用することができる。あるいは、発現宿主における効率的な分泌およびプロセシングのために選択または設計されたシグナル配列も使用することができる。例えば、適切なシグナル配列／宿主細胞対としては、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて分泌させるためのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓａｃＢシグナル配列、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにより分泌させるためのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α接合因子またはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酸性ホスファターゼｐｈｏＩシグナル配列が挙げられる。シグナル配列は、シグナルペプチダーゼ切断部位をコードする配列によってタンパク質をコードする配列に直接つなぐこともでき、通常１０コドン未満からなる短いヌクレオチド架橋によってつなぐこともでき、架橋により下流のＴＣＲ配列の正しい読み枠が確実になる。
【０１９８】
転写および翻訳を増強するためのエレメントが真核生物のタンパク質の発現系について同定されている。例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーター１０００ｂｐを異種プロモーターのいずれかの側面上に位置づけることにより、植物細胞における転写レベルが１０〜４００倍に上昇し得る。発現構築物は、適切な翻訳開始配列も含むべきである。適切な翻訳開始のためにＫｏｚａｋコンセンサス配列を含むように発現構築物を改変することにより、翻訳のレベルが１０倍上昇し得る。
【０１９９】
多くの場合、選択マーカーが使用され、これは、発現構築物の一部であってもよく、発現構築物とは分離されていてもよく（例えば、発現ベクターに担持させる）、したがって、マーカーは、対象の遺伝子とは異なる部位に組み込まれ得る。例としては、抗生物質に対する耐性を付与するマーカー（例えば、ｂｌａにより、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞にアンピシリンに対する耐性が付与され、ｎｐｔＩＩにより、多種多様な原核細胞および真核細胞にカナマイシン耐性が付与される）、または宿主が最少培地で成長することを可能にするマーカー（例えば、ＨＩＳ４により、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＨｉｓ−Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅがヒスチジンの不在下で成長することが可能になる）が挙げられる。マーカーの独立した発現を可能にするために、選択マーカーはそれ自体の転写および翻訳の開始および終結の調節領域を有する。抗生物質耐性をマーカーとして使用する場合、選択のための抗生物質の濃度は、抗生物質に応じて変動し、一般に、培地１ｍＬ当たり抗生物質１０〜６００μｇにわたる。
【０２００】
発現構築物は、公知の組換えＤＮＡ技法（Sambrookら、１９８９年；Ausubelら、１９９９年）を使用することにより組み立てる。制限酵素消化およびライゲーションは２つのＤＮＡの断片をつなぐために使用される基本的なステップである。ライゲーションの前にＤＮＡ断片の末端を修飾することが必要な場合があり、これは、突出部を埋めること、ヌクレアーゼ（例えば、ＥｘｏＩＩＩ）を用いて断片（複数可）の末端部分を欠失させること、部位特異的変異誘発によって、または新しい塩基対をＰＣＲによって付加することによって実現することができる。ポリリンカーおよびアダプターを使用して、選択された断片をつなぐことを容易にすることができる。発現構築物は、一般には、制限、ライゲーション、およびＥ．ｃｏｌｉの形質転換の繰り返しを使用して段階的に組み立てられる。発現構築物を構築するために適した多数のクローニングベクターが当技術分野で公知であり（λＺＡＰおよびｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＳＫ−１、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ；ｐＥＴ、Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ−Ausubelら
、１９９９年に引用されている）、特定の選択は本開示には重大ではない。クローニングベクターの選択は、発現構築物を宿主細胞に導入するために選択される遺伝子移入系の影響を受ける。各段階の最後に、生じた構築物を、制限、ＤＮＡ配列、ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ分析によって分析することができる。
【０２０１】
発現構築物は、直鎖状または環状のいずれかのクローニングベクター構築物として宿主に導入してそれを形質転換することもでき、クローニングベクターから取り出し、そのまま使用することも送達ベクターに導入することもできる。送達ベクターにより、選択された宿主細胞型への発現構築物の導入および維持が容易になる。発現構築物は、いくつもの公知の遺伝子移入系（例えば、ナチュラルコンピテンス、化学的媒介形質転換（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、プロトプラスト形質転換、電気穿孔、微粒子銃形質転換、トランスフェクション、またはコンジュゲーション）（Ausubelら、１９９９；Sambrookら、１９８９）のいずれかによって宿主細胞に導
入される。選択される遺伝子移入系は使用される宿主細胞およびベクター系に左右される。
【０２０２】
例えば、発現構築物は、プロトプラスト形質転換または電気穿孔によってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞に導入することができる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの電気穿孔は容易に実現され、スフェロプラスト形質転換と同等の形質転換効率が得られる。
【０２０３】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、好ましくは、リガンド結合性部位以外の部位でＴＣＲタンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体を当技術分野で公知の方法によって作出することができ、また、多くが市販されている。例えば、HarlowおよびLane（１９８８年）Antibodies:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratories；Goding（１９８６年）Monoclonal  Antibodies：Principles  and  Practice、第２版、Academic  Press、New  York；およびAusubelら（１９９９年）Current  Protocols  in  Molecular  Biology、John  Wiley  &  Sons,  Inc.、New  Yorkを参照されたい。
【０２０４】
特定の標的リガンドに特異的である、細胞に結合した形態または可溶性の形態のＴＣＲは、例えば、生体試料（例えば、細胞、組織試料、生検材料、体液など）をスクリーニングするため、または試験試料中の標的リガンドの存在を検出するための診断用プローブとして有用である。頻繁に、ＴＣＲは、共有結合または非共有結合のいずれかにより、検出可能なシグナルをもたらす物質とつなぐことによって標識される。適切な標識としては、これだけに限定されないが、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光剤、化学発光剤、磁気粒子などが挙げられる。さらに、ＴＣＲは、第２の結合性分子に対するリガンドとカップリングすることができ、例えば、ＴＣＲをビオチン化することができる。次いで、標的細胞または分子と結合したＴＣＲの検出を、検出可能なストレプトアビジン（蛍光性、放射性、化学発光性、または他の検出可能な分子を付着させた、または発色団基質が存在する酵素が利用可能なストレプトアビジン）を結合させることによって実施することができる。そのようなｓｃＴＣＲに共有結合させる標識および／または毒性化合物の使用が記載されている米国特許としては、これだけに限定されないが、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９２７，１９３号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；同第４，３３１，６４７号；同第４，３４８，３７６号；同第４，３６１，５４４号；同第４，４６８，４５７号；同第４，４４４，７４４号；同第４，６４０，５６１号；同第４，３６６，２４１号；米国再発行特許同第ＲＥ３５，５００号；米国特許第５，２９９，２５３；同第５，１０１，８２７号；同第５，０５９，４１３号が挙げられる。
【０２０５】
標識されたＴＣＲは、使用される標識に適したモニタリングデバイスまたは方法を使用して検出することができる。標識が蛍光部分である場合には蛍光顕微鏡または蛍光活性化細胞選別を使用することができ、標識が放射性核種である場合には、例えば、ガンマ線計測、オートラジオグラフィーまたは液体シンチレーション測定を、当該方法が分析される試料および使用される放射性核種に適するという条件で使用することができる。さらに、本明細書に記載のＭＨＣの構成成分の不在下で標的リガンドの結合部位の一部ではないＴＣＲの部分を認識する検出可能な分子または粒子が存在する場合、二次的な検出用分子または粒子を使用することができる。当技術分野では、ｉｎ  ｓｉｔｕ画像診断のために有用な化合物が公知である。例えば、米国特許第５，１０１，８２７号；同第５，０５９，４１３号を参照されたい。療法および／またはｉｎ  ｖｉｖｏ画像化のために有用な放射性核種としては、１１１インジウム、９７ルビジウム、１２５ヨウ素、１３１ヨウ素、１２３ヨウ素、６７ガリウム、９９テクネチウムが挙げられる。毒素としては、ＴＣＲ−毒素複合体が細胞と結合したら、毒性部分はその細胞毒性効果を発揮することができるように内部移行するという条件で、とりわけ、ジフテリア毒素、リシン（ricin）およびトウゴマ毒素が挙げられる。免疫毒素技術は当技術分野で周知であり、適切な毒性分子としては、限定することなく、化学療法薬、例えばビンデシンなど、葉酸代謝拮抗薬、例えばメトトレキセート、シスプラチン、マイトマイシン、アントラサイクリン系薬剤（anthrocycline）、例えばダウノマイシン、ダウノルビシンまたはアドリアマイシンなど、およびリボソーム不活化タンパク質（例えば、ジフテリア毒素、ポークウィード抗ウイルスタンパク質、アブリン、リシン（ricin）、シュードモナス外毒素Ａまたはそれらの組換え誘導体などの細胞傷害性タンパク質が挙げられる。一般に、例えば、OlsnesおよびPihl（１９８２年）Pharmac.  Ther.  ２５巻:３５５〜３８１頁およびMonoclonal  Antibodies  for  Cancer  Detection  and  Therapy、BaldwinおよびByers編、１５９〜１７９頁、Academic  Press、１９８５年を参照されたい。
【０２０６】
ペプチド：主要組織適合性遺伝子複合体との結合を含めた、ＴＣＲ分子の一般的な構造およびそれを作出し、使用する方法が開示されている。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４２７４；ＰＣＴ／ＵＳ９８／２０２６３；ＷＯ９９／６０１２０を参照されたい。
【０２０７】
医薬組成物および治療剤
特定の標的リガンドに特異的なｓｃＴＣＲは、特定の抗原に関連する疾患に罹患していると思われるヒトを含めた動物および哺乳動物の治療において有用である。
【０２０８】
治療用製品は、本明細書に示されている材料を使用して作出することができる。治療用製品の有効量は、対象において測定可能な効果が生じる最小の用量である。治療用製品は、当業者によって容易に調製される。一実施形態では、本開示のｓｃＴＣＲを直接患者に投与する。一実施形態では、本開示のｓｃＴＣＲを、当技術分野で公知の通りＰＥＧまたは免疫グロブリン定常領域と連結させる。この実施形態では、血清クリアランスが延長される。一実施形態では、薬物をがん細胞などの標的細胞に送達するために、ｓｃＴＣＲを化学療法剤または薬物と連結する。一実施形態では、ｓｃＴＣＲをサイトカインなどの生物学的エフェクター分子と連結する（TayalおよびKalra（２００８年）Eur  J  Pharmacol、５７９巻、１〜１２頁）。一実施形態では、ｓｃＴＣＲをＩＬ−２、ＩＬ−１２、またはＴＮＦαなどの抗腫瘍活性を有するサイトカインと連結する（Wongら（２０１１年）Protein  Eng  Des  Sel、２４巻、３７３〜８３頁）。一実施形態では、ｓｃＴＣＲをＩＬ−１０またはＩＬ−１３などの免疫阻害性サイトカインと連結する（Stoneら（２０１２年）Protein  Engineering）。一実施形態では、ｓｃＴＣＲを別の抗原結合性分子と連結して、二重特異性作用剤を形成する（Millerら（２０１０年）Protein  Eng  Des  Sel、２３巻、５４９〜５７頁；ThakurおよびLum（２０１０年）Curr  Opin  Mol  Ther、１２巻、３４０〜９頁）。一実施形態では、二重特異性分子は、Ｔ細胞および疾患細胞とクロスリンクするために、抗ＣＤ３などの単鎖Ｆｖと連結したｓｃＴＣＲで構成される（（Bargouら（２００８年）Science、３２１巻、９７４〜７頁；Liddyら（２０１２年）Nat  Med、１８巻、９８０〜７頁）。一実施形態では、ｓｃＴＣＲをＣＤ３などのＴＣＲシグナル伝達ドメインと連結して、キメラ抗原受容体を形成する（（Porterら（２０１１年）N  Engl  J  Med、３６５巻、７２５〜３３頁；Sadelainら（２００９年）Curr  Opin  Immunol、２１巻、２１５〜２３頁；Stroncekら（２０１２年）J  Transl  Med、１０、４８）。これらの方法および他の投与方法、例えば静脈内投与などが当技術分野で公知である。有用な投与量は、当業者が決定することができる。
【０２０９】
ｓｃＴＣＲ組成物は、当技術分野で公知の手段のいずれかによって製剤化することができる。ｓｃＴＣＲ組成物は、一般には、特に静脈内投与、腹腔内投与または滑液投与用の注射剤として（経路は特定の疾患によって決定される）、または鼻腔内投与または経口投与用の製剤として、溶液または懸濁剤のいずれかとして調製することができる。溶液に入れる、または懸濁液に入れるために適した固形、注射または他の投与前の液体も調製することができる。調製物は、例えば、乳化されていてもよく、リポソームに封入されたタンパク質（複数可）／ペプチド（複数可）であってもよい。
【０２１０】
活性成分は、多くの場合、薬学的に許容され、活性成分と適合する賦形剤または担体などの任意選択の医薬添加剤と混合される。適切な賦形剤としては、これだけに限定されないが、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組合せが挙げられる。注射可能なエアロゾルまたは経鼻製剤中のｓｃＴＣＲの濃度は通常０．０５〜５ｍｇ／ｍｌの範囲である。特定の有効な投与量の選択については公知であり、当業者により、過度な実験を伴わずに実施される。同様の投与量を他の粘膜表面に投与することができる。
【０２１１】
さらに、所望であれば、ｓｃＴＣＲを含んでよいワクチンは、微量の医薬添加剤、例えば、湿潤剤または乳化剤などの補助物質、ｐＨ緩衝剤、および／またはワクチンの効果を増強するアジュバントなどを含有してよい。有効であり得るアジュバントの例としては、これだけに限定されないが、水酸化アルミニウム；Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）；Ｎ−アセチル−ｎｏｒ−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと称される）；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称される）；および細菌から抽出された３つの構成成分を含有するＲＩＢＩ：２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０乳剤中モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁の骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）が挙げられる。当技術分野で公知のそのような追加的な製剤および投与形式も使用することができる。
【０２１２】
ＴＣＲ可変領域と同様の（９０％超の同一性）一次構造を有し、標的リガンドに対する高親和性を維持する本開示のｓｃＴＣＲおよび／または結合性断片は、中性の形態または塩の形態としてワクチンに製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、これだけに限定されないが、無機酸と形成される酸付加塩（ペプチドの遊離のアミノ基と形成される）、例えば、塩酸またはリン酸；および有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、またはマレイン酸が挙げられる。遊離のカルボキシル基と形成される塩は、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄、および有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノ−エタノール、ヒスチジン、およびプロカインにも由来し得る。
【０２１３】
治療的に使用するためのｓｃＴＣＲは、投薬形態（ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）と適合する様式、および予防的かつ／または治療的に有効な量および様式で、当技術分野で公知のことに従って投与される。投与される数量は、一般に、用量当たりタンパク質約１００〜２０，０００μｇの範囲、より一般的には、用量当たりタンパク質約１０００〜１０，０００μｇの範囲である。同様の組成物を、例えば、標的リガンドが結合している細胞を検出するために、画像化において使用するための標識されたｓｃＴＣＲを使用して同様に投与することができる。投与するために必要な活性成分の正確な量は、医師または獣医師の判断次第であってよく、各個体に独特であってよいが、そのような決定は、そのような実践者の技術の範囲内に入る。
【０２１４】
ワクチンまたは他の免疫原性組成物は、単回投薬；例えば、２週間〜８週間空けた２回投薬スケジュール；または複数回投薬スケジュールでもたらすことができる。複数回投薬スケジュールは、ワクチン接種の一次過程が、１回〜１０回以上の別々の投薬を含んでよく、その後、他の投薬を、免疫応答を維持し、かつ／または補強するために必要なその後の時間間隔で、例えば、１カ月〜４カ月の時点で２回目の投薬を行い、必要であれば、その後の投薬（複数可）を数か月後に行うスケジュールである。本開示のレトロウイルス様粒子を用いて免疫したヒト（または他の動物）はコグネイトレトロウイルスによる感染から保護される。
【０２１５】
自己免疫疾患とは、免疫系により、宿主に通常存在する抗原に対する免疫応答が生じる疾患である。自己免疫疾患としては、関節リウマチ、アジュバント関節炎、重症筋無力症、脳脊髄炎、多発性硬化症、甲状腺炎、炎症性腸疾患または全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、非肥満性糖尿病、グレーブス病、橋本病、変形性関節症、皮膚炎、肝炎、尋常性天疱瘡、小児脂肪便症、シェーグレン症候群、アジソン病、原発性粘液水腫、グッドパスチャー症候群、類結核型ハンセン病、強直性脊椎炎、ライター病、ぶどう膜炎、アミロイドーシス、尋常性乾癬、特発性ヘモクロマトーシスおよび乾癬（psorasis）が挙げられる。
【０２１６】
別段の指定のない限り、本開示を実施するために、記載または例示されているあらゆる製剤または構成成分の組合せを使用することができる。当業者は同じ物質を違うように称する場合があることが公知であるので、物質の特定の名称は例示的であるものとする。本明細書において、化合物が、例えば、式または化学名においてその化合物の特定の異性体または鏡像異性体が指定されずに記載されている場合、その説明は、個々にまたは任意の組合せで記載されている化合物の異性体および鏡像異性体のそれぞれを含むものとする。当業者は、具体的に例示されているもの以外の方法、標的リガンド、生物活性基、出発材料、および合成方法を、過度な実験に頼ることなく本開示の実施において使用することができることを理解されたい。任意のそのような方法、標的リガンド、生物活性基、出発材料、および合成方法の当技術分野で公知の機能的等価物は全て本開示に含まれるものとする。本明細書において範囲、例えば、温度範囲、時間範囲、または組成範囲が示された場合はいつでも、示された範囲内の中間の範囲および部分範囲の全て、ならびに個々の値の全てが本開示に含まれるものとする。
【０２１７】
正確な製剤、投与経路および投与量は、個々の医師が患者の状態を考慮して選択することができる（例えば、Finglら、The  Pharmacological  Basis  of  Therapeutics、１９７５年、１章１頁を参照されたい）。
【０２１８】
主治医には、どのように、いつ、毒性、または臓器機能障害に起因して投与を終結させる、中断する、または調整するかが分かることに留意するべきである。逆に、主治医には、臨床応答が十分でない場合に治療をより高レベルに調整することについて（毒性を妨げながら）も分かる。対象の障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度および投与経路によって変動する。状態の重症度は、例えば、一部において、標準の予後評価方法によって評価することができる。さらに、用量、およびおそらく投薬頻度も、個々の患者の年齢、体重、および応答に応じて変動する。上記のものと同等のプログラムを動物用医薬においても使用することができる。
【０２１９】
治療されている特定の状態および選択される標的化方法に応じて、そのような作用剤を製剤化し、全身投与または局所投与することができる。製剤化および投与の技法は、AlfonsoおよびGennaro（１９９５年）に見いだすことができる。適切な経路としては、例えば、経口投与、直腸内投与、経皮投与、膣内投与、経粘膜投与、または腸内投与；筋肉内注射、皮下注射、または髄内注射、ならびに、くも膜下腔内注射、静脈内注射、または腹腔内注射を含めた非経口送達を挙げることができる。
【０２２０】
注射用には、本開示の作用剤を水溶液中、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液などの生理的に適合性の緩衝液中に製剤化することができる。経粘膜投与用には、浸透させる関門に適した浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は、一般に、当技術分野で公知である。
【０２２１】
本開示の実施に関して本明細書において開示されている化合物を製剤化するために、薬学的に許容される担体を全身投与するために適した剤形（ｄｏｓａｇｅ）に使用することは本開示の範囲内に入る。担体の適切な選択および適切な製造の実施により、本開示の組成物、特に溶液として製剤化された組成物を、非経口的に、例えば、静脈内注射によって投与することができる。適切な化合物は、当技術分野で周知の薬学的に許容される担体を経口投与のために適した剤形（ｄｏｓａｇｅ）に使用することによって容易に製剤化することができる。そのような担体により、本開示の化合物を、治療される患者が経口摂取するための錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化することが可能になる。
【０２２２】
細胞内に投与されることが意図された作用剤は、当業者に周知の技法を使用して投与することができる。例えば、そのような作用剤をリポソームに封入し、次いで上記の通り投与することができる。リポソームは内部が水性の球状脂質二重層である。リポソーム形成時に水溶液中に存在する分子は全て水性の内部に組み入れられる。リポソームの内容物はどちらも外部の微小環境から保護され、また、リポソームは細胞膜と融合するので、細胞質内に効率的に送達される。さらに、リポソームの疎水性に起因して、小有機分子を細胞内に直接投与することができる。
【０２２３】
本開示において使用するために適した医薬組成物としては、活性成分が意図された目的を実現するために有効な量で含有される組成物が挙げられる。有効量の決定は、特に、本明細書において提供される詳細な開示を踏まえると、十分に当業者の能力の範囲内に入る。
【０２２４】
これらの医薬組成物は、活性成分に加えて、活性化合物を薬学的に使用することができる調製物に加工することを容易にする賦形剤および助剤を含む適切な薬学的に許容される担体を含有してよい。経口投与用に製剤化された調製物は、遅延放出用に、または医薬が小腸または大腸に到達した時にのみ放出されるように製剤化されたものを含め、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、または溶液の形態であってよい。
【０２２５】
本開示の医薬組成物は、それ自体が公知の様式で、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造（ｄｒａｇｅｅ−ｍａｋｉｎｇ）、研和（ｌｅｖｉｔａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル封入、封入または凍結乾燥のプロセスによって製造することができる。
【０２２６】
非経口投与用の医薬製剤としては、水溶性形態の活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁液を適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水を含む注射用懸濁液は、懸濁剤の粘度を増大させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどを含有してよい。場合によって、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、懸濁液は適切な安定剤または化合物の溶解性を増大させる作用剤も含有してよい。
【０２２７】
経口使用するための医薬調製物は、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせること、場合により、生じた混合物を粉砕すること、および、所望であれば適切な助剤を加えた後、顆粒剤の混合物を加工して錠剤または糖衣錠のコアを得ることによって得ることができる。適切な賦形剤は、特に、増量剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含めた糖など；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、イネデンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などである。所望であれば、架橋したポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を加えることができる。
【０２２８】
糖衣錠のコアには適切なコーティングが施される。この目的のために、濃縮糖溶液を使用することができ、これは、場合によって、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有してよい。活性化合物の用量の異なる組合せを識別するためまたは特徴付けるために染料または色素を錠剤または糖衣錠のコーティングに加えることができる。
【０２２９】
経口的に使用することができる医薬調製物としては、ゼラチン製の押し込み型（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル剤、ならびに、ゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤製の密閉軟カプセル剤が挙げられる。押し込み型カプセル剤は、活性成分を、ラクトースなどの増量剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ならびに場合によって安定剤との混和物の状態で含有してよい。軟カプセル剤では、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解していても懸濁していてもよい。さらに、安定剤を加えることができる。
【実施例】
【０２３０】
以下の実施例に本開示の非限定的な例をさらに記載する。
【０２３１】
（実施例１）
モデルＴＣＲの選択
ＴＣＲは全てが同様のＩｇのフォールディングおよびドッキング角度をとり、ｐｅｐＭＨＣのＴＣＲによる認識は完全にＣＤＲループ上の特定の残基によって媒介される（Garciaら（２００９年）Nat  Immunol、１０巻、１４３〜７頁；Marrackら（２００８年）Annu  Rev  Immunol、２６巻、１７１〜２０３頁；Rudolphら（２００６年）Annu  Rev  Immunol、２４巻、４１９〜６６頁））。したがって、本発明に従って、既知構造を有する単一のＴＣＲにより、ＭＨＣ上にディスプレイされた非コグネイトペプチドに対する特異性および高親和性をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて操作するための足場がもたらされる。すなわち、非コグネイトペプチド−ＭＨＣ抗原に対する高親和性を有するように開発することができるＴＣＲをもたらすために、ペプチドと直接接触する可能性が最も高いＣＤＲループ残基内の縮重残基を有する変異体を作製することにより単一のＴＣＲ内の変異体のライブラリーを作製した。
【０２３２】
非コグネイト抗原に対する新規のＴＣＲを単一の足場から発見または作製するために使用される一般的な戦略が図１に示されている。当該プロセスは、既知構造を有する単一のＴＣＲを選択することを伴う。本実施例では、Ａ６と称されるヒトＴＣＲを使用した。Ａ６  ＴＣＲは構造が解明された最初のヒトＴＣＲであり（Garbocziら（１９９６年）Nature、３８４巻、１３４〜１４１頁）、数多くの構造試験および生化学的試験の主題になってきた（例えば、（Armstrongら（２００８年）Biochem  J、４１５巻、１８３〜９６頁；Dingら（１９９９年）Immunity、１１巻、４５〜５６頁；Hawseら（２０１２年）J  Immunol、１８８巻、５８１９〜２３頁）。さらに、Ａ６  ＴＣＲは、そのコグネイト抗原Ｔａｘ：ＨＬＡ．Ａ２に対する親和性がより高い変異体を操作するためのヘテロ二量体型に使用されてきた（Liら（２００５年）Nat  Biotechnol、２３巻、３４９〜５４頁）。また、安定型の単鎖ＴＣＲ（Ｖβ−リンカー−Ｖα）が酵母ディスプレイ系の表面上にディスプレイされてきた（Aggenら（２０１１年）Protein  Engineering,  Design,  &  Selection、２４巻、３６１〜７２頁）。
【０２３３】
当該プロセスの別のステップは、ペプチド特異性に寄与する可能性が最も高いＴＣＲ（例えば、Ａ６）結合部位内の残基を同定することである。このステップは、ペプチドの集合をＨＬＡ．Ａ２分子にモデリングすること、Ａ６  ＴＣＲをドッキングすること、Ａ６  ＴＣＲ残基が各ペプチドの３オングストローム以内に存在する頻度を分析することを伴う。
【０２３４】
上記の通り構造に基づく分析によって同定された位置に変動性を有する変異体のライブラリーをクローニングすることが次のステップである。これらのライブラリーは、酵母ディスプレイなどの種々のディスプレイ系にクローニングすることができる。ファージディスプレイベクターおよびクローニングによりもたらされたライブラリーサイズは１０１１であり、酵母ディスプレイベクターおよび相同組換えステップによりもたらされたライブラリーサイズは１０１０であった（（Benatuilら（２０１０年）Protein  Eng  Des  Sel、２３巻、１５５〜９頁）。
【０２３５】
次に、特異的な非コグネイトｐｅｐ−ＭＨＣリガンドに結合する変異体を選択する。バリアントを選択するために、固定化したリガンドへの親和性に基づく結合（ファージディスプレイ）、または抗原を用いた磁気粒子による選択（酵母ディスプレイ）、または標識したペプチド−ＭＨＣ抗原を用いた蛍光活性化細胞選別（酵母ディスプレイ）を含めた種々の方法が使用されている。これらのステップのそれぞれの例は以下にさらに記載されている。
【０２３６】
（実施例２）
ＴＣＲを操作するための足場としてのＴａｘ：ＨＬＡ．Ａ２と複合体を形成したヒトＴＣＲ  Ａ６の分析  例示のために、既知構造を有する単一のＴＣＲとしてＡ６  ＴＣＲを選択した。Ａ６：Ｔａｘペプチド：ＨＬＡ−Ａ２複合体（ＰＤＢ：１ＡＯ７）の構造（Garbocziら（１９９６年）Nature、３８４巻、１３４〜１４１頁）は１９９６年に公開された。複合体の側面図により、６つのＣＤＲを含有する可変ドメインの末端がＴａｘ：ＨＬＡ．Ａ２分子上にドッキングされており、結合部位の中心的な領域はペプチドＴａｘの上に位置することが示された（図２Ａ）。６つのＣＤＲループ以外はＴＣＲを「取り除いた」、Ｔａｘ：ＨＬＡ．Ａ２複合体を上から見た図。この図は、ＴＣＲがペプチド−ＭＨＣの上に対角項の位置をとることを示し、これは現在全てのＴＣＲ：ペプチド−ＭＨＣ構造について観察されている知見である。この方向に、２つのＣＤＲ３ループがペプチドの上に位置し、一方、ＣＤＲ１ループおよびＣＤＲ２ループ由来の種々の残基は主にＭＨＣ分子のへリックスと相互作用する。この対角項ドッキング方向は、α２  ＭＨＣへリックスおよびペプチドのＮ末端の上に位置するＶα領域、およびα１  ＭＨＣへリックスおよびペプチドのＣ末端の上に位置するＶβ領域が現在まで仮想的に全ての複合体において観察されている。これらの相互作用の保存された特徴により、種々の重要な「ペプチドと相互作用する」残基の変異誘発により新規のＴＣＲの特異性を作製および発見することが可能になる単一のＴＣＲを足場として使用することが可能であり得ることが示唆された（図２Ｂ）。
【０２３７】
最近の試験では、コグネイト抗原Ｔａｘ／ＨＬＡ．Ａ２に対する親和性がより高いＴＣＲを、１）指向性進化（Liら（２００５年）Nat  Biotechnol、２３巻、３４９〜５４頁）、および２）部位特異的な設計についての予測アルゴリズム（Pierceら（２０１０年）Biochemistry、４９巻、７０５０〜９頁）によって操作するために、Ａ６  ＴＣＲが使用されている。本発明に従って、ＨＬＡ産物と結合した非コグネイトペプチドに対するＴＣＲを発見するために、重要な位置に変異を有する縮重ＴＣＲライブラリーの構造に基づく合理的設計をハイスループットなスクリーニングと組み合わせて使用することが可能であることが初めて示されている。
【０２３８】
（実施例３）
ペプチドの結合および特異性に寄与する可能性が最も高いＣＤＲループ残基の分析
潜在的な接触および特異性決定残基を同定するために、種々の手法を使用して、Ａ６のＣＤＲループのどの残基が、ＨＬＡ．Ａ２ペプチド結合性溝の幅広いペプチドに適応し、結合エネルギーをもたらす可能性が最も高いかを決定した。まず、他のＨＬＡ．Ａ２拘束ペプチドのパネルをＡ６結晶構造にモデリングした（図３）。Ａ６：Ｔａｘペプチド：ＨＬＡ．Ａ２結晶構造（ＰＤＢ：１ＡＯ７）を開始点として使用して（Garbocziら（１９９６年）Nature、３８４巻、１３４〜１４１頁）、Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｂａｃｋｒｕｂ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍを使用してＨＬＡ．Ａ２拘束ペプチド（すなわち、Ｔａｘ、Ｍａｒｔ１−９マー、Ｍａｒｔ１−１０マー、ＳＬ９  ＨＩＶ、ＷＴ１、およびサバイビン）を、Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｂａｃｋｒｕｂ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓを使用してＨＬＡ．Ａ２溝にモデリングした（図３）（（Lauckら（２０１０年）Nucleic  Acids  Res、３８巻、Ｗ５６９〜７５頁）；ｋｏｒｔｅｍｍｅｌａｂ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｂａｃｋｒｕｂ／）。水素結合の距離（２．５〜３．５Å）内にあるＡ６  ＴＣＲの残基を決定するために、ペプチドをＡ６：ｔａｘ：ＨＬＡ−Ａ２構造の結合性溝にモデリングした。次いで、各ペプチドについて、どのＣＤＲループの位置が、これらのペプチドとの最低エネルギーコンフォメーションモデルでの接触を可能にする可能性が最も高いかを測定することによって縮重の候補残基を決定した。
【表２】
2018015010.tif 000003
【０２３９】
Ｍａｒｔ１に関しては２つの関連するペプチドが列挙されており、どちらもＨＬＡ−Ａ２とのそれらの結合について試験されている。モデリングのために、１０マーの「０」位にある残基は予測から除いた。
【０２４０】
６つのモデルそれぞれについて、ペプチド残基の３Å以内にあるＣＤＲループ残基を決定した。この分析により、モデルの大多数（４／６または５／６）で６つの残基（表３）が３オングストローム以内にあることが明らかになった。したがって、これらのコドンの位置が、非コグネイトペプチド−ＨＬＡ抗原と結合する新規の変異体を発見するために使用するＡ６  ＴＣＲライブラリーを開発するための焦点としての機能を果たした。
【表３】
2018015010.tif 000004
【０２４１】
表３には、６つの構造内のペプチドの３．０Å以内に見いだされたＡ６  ＴＣＲの残基およびそれが見いだされた構造の百分率が列挙されている。太字の位置を使用して縮重ライブラリーを構築したが、他の位置を別々にまたは組み合わせて使用して、多くの異なるペプチド／ＨＬＡ複合体に対するＴＣＲを開発するための追加的なライブラリーを構築することができる。
【０２４２】
単鎖形態のＴＣＲの配列内にＡ６  ＴＣＲ内の５つの残基の位置が示されている（図５）。さらに、コグネイト抗原Ｔａｘ：ＨＬＡ．Ａ２に対する高親和性結合について以前に操作されたＡ６−Ｘ１５と称される安定化されたＡ６単鎖ＴＣＲの配列（配列番号３）が示されている。この配列は、ｓｃＴＣＲの安定性スクリーニングにおいて以前に単離された５つのフレームワーク変異（Ｓ３３Ａ、Ｅ５９Ｄ、Ｎ６３Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｋ１２１Ｉ、全てＶβドメインにある）および２つのＣＤＲ変異（Ａ５２ＶおよびＱ１０６Ｌ、どちらもＶβドメインにある）も包含する。この変異体は、Ｔａｘ：ＨＬＡ．Ａ２との親和性がより高い結合をもたらした４つのＣＤＲ３β変異（Ａ１００Ｍ、Ｇ１０１Ｓ、Ｇ１０２Ａ、およびＲ１０３Ｑ）（Liら（２００５年）Nat  Biotechnol、２３巻、３４９〜５４頁）も含有した。Ａ６−Ｘ１５は高度に安定なＶα２セグメント（ＩＭＧＴ：ＴＲＡＶ１２−２）も使用するが、安定性を改善するためにＰｈｅ４９Ｓｅｒ  Ｖα変異を含有する。
【０２４３】
（実施例４）
いくつかのＣＤＲ残基の結合寄与の分析
いくつかのＣＤＲ残基がＨＬＡ．Ａ２へリックスおよび／またはＴａｘペプチドとの結合に関与すると予測された（Borbulevychら（２０１１年）J  Immunol、１８７巻、２４５３〜６３頁；Marrackら（２００８年）Annu  Rev  Immunol、２６巻、１７１〜２０３頁）。ＨＬＡ．Ａ２と結合した異なるペプチドに結合するＡ６  ＴＣＲ変異体を操作するプロセスには、ＨＬＡ．Ａ２へリックスとの相互作用に結合エネルギーをもたらすアミノ酸の側鎖を保持することが有効であると思われる。ＴａｘペプチドとのＡ６：ｐｅｐＨＬＡ−Ａ２の結晶構造およびｔａｘペプチドバリアントとのＡ６：ｐｅｐＨＬＡ−Ａ２の結晶構造の両方により、α鎖残基によって優勢に媒介されるｐｅｐＭＨＣ−接触が示された（Dingら（１９９９年）Immunity、１１巻、４５〜５６頁；Garbocziら（１９９６年）Nature、３８４巻、１３４〜１４１頁）。Ｖα２を含有するＴＣＲの最近の試験には、ＨＬＡ．Ａ２へリックスを認識するように進化した、Ｖα２セグメント内の推定上の保存された残基が詳細に記載されている。
【０２４４】
図４は、選択されたＡ６  ＴＣＲの残基の、Ｔａｘ：ＨＬＡ．Ａ２の結合へのそれらの寄与についての分析を示す。ＣＤＲ１またはＣＤＲ２内のこれらの残基がＭＨＣ拘束の維持において重要であることが示唆された試験に従って、４つの残基（Aggenら（２０１１年）Protein  Engineering,  Design,  &  Selection、２４巻、３６１〜７２頁）をアラニンで置換し、結合について試験した。表３は、Ａ６  Ｘ１５アラニン変異体のおおよその親和性および野生型と比較した結合親和性の倍率変化を示す。結果により、ＨＬＡ．Ａ２のαへリックスと接触するＣＤＲ２αの５１位のチロシンが結合に最も重要であることが示された。したがって、この残基を本明細書に記載のライブラリー内に維持した。
【表４】
2018015010.tif 000005
【０２４５】
ＣＤＲ２αの残基Ｙ５１およびＳ５２は、種々のα鎖にわたって保存されており、同じ位置でＨＬＡ．Ａ２と頻繁に結合する（Marrackら（２００８年）Annu  Rev  Immunol、２６巻、１７１〜２０３頁）。Ｖα２を含有するＴＣＲ  Ａ６、ＤＭＦ４、およびＤＭＦ５の結晶構造解析により、ＣＤＲ１αの残基Ｒ２８およびＱ３１がＭＨＣとの接触において重要であるが、接触する正確なＨＬＡ残基は変動することが示された。Ｑ３１は、ＨＬＡ−Ａ２に加えてペプチドとも接触することが示されている（Borbulevychら（２０１１年）J  Immunol、１８７巻、２４５３〜６３頁）。
【０２４６】
これらのＶα２の残基（Ｒ２８、Ｑ３１、Ｙ５１、およびＳ５２）はＨＬＡ．Ａ２分子との接触において重要であるが、各接触の結合エネルギー付与については以前に記載されていない。どの残基が著しい結合エネルギーを付与するか、したがって、ライブラリー内に保持するべきかを決定するために、Ａ６  Ｘ１５構築物の各位置における部位特異的アラニン変異体を作出し、Ｔａｘ（ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ、配列番号５）：ＨＬＡ−Ａ２二量体を用いて染色した（図４Ｂ）。最も著しい結合エネルギーを付与した残基はＣＤＲ２αのＹ５１位であった。この残基はＡ６  ｗｔ構造のＭＨＣへリックスと排他的に接触したので、この残基を野生型としてライブラリー内に保持した。次に高い結合エネルギーを付与した残基はＣＤＲ１αの残基Ｑ３１であったが、この残基もＡ６  ｗｔ構造内のペプチドと接触したので、コグネイトリガンドとのいかなる交差反応性も防止するためにＲＤ１ライブラリー内でランダム化した。調査した他の２つの残基、Ｒ２８およびＳ５２は、Ａ６：ｔａｘ：ＨＬＡ．Ａ２相互作用に実質的な結合エネルギーを付与しなかったが、ＭＨＣへリックスに対するペプチド非依存性反応性が増大することを防ぐために野生型として保持した。
【０２４７】
（実施例５）
酵母ディスプレイおよびライブラリー構築
この実施例では、変異体ＴＣＲのライブラリーの調製が記載されている。単一の足場から新規のＴＣＲを同定するために、ＴＣＲ変異体のライブラリーを非コグネイト抗原に結合する稀な変異体（複数可）についてスクリーニングすることができるディスプレイ系を使用することが必要である。３つのディスプレイ系：酵母ディスプレイ、ファージディスプレイ、およびＴ細胞（哺乳動物細胞）ディスプレイがＴＣＲをより高い親和性について操作するために使用されており、このプロセスのために使用することができる。リボソームディスプレイ、ＲＮＡディスプレイ、ＤＮＡディスプレイ、およびＣＩＳディスプレイなどの代替のディスプレイ法もこのプロセスに適し得る。これらの場合の全てにおいて、コグネイト抗原に対する親和性が低い野生型ＴＣＲを系にクローニングし、コグネイト抗原に対する親和性がより高いＴＣＲを操作するための鋳型として使用した。これらの系はいずれも、単一の足場ＴＣＲ（この場合Ａ６）を、ライブラリーを合理的に設計し、非コグネイト抗原に対するＴＣＲを選択するための鋳型として使用する本明細書に記載の手法に適用することができた。
【０２４８】
本実施例では、酵母ディスプレイをプラットフォームとして使用した。単鎖Ａ６−Ｘ１５  ＴＣＲは酵母の表面上で適正にフォールディングされた形態で安定に発現されるので、これを鋳型として使用した（図６）。図３Ｃおよび図４に示されている上の５つの位置のそれぞれに縮重コドンを含有する遺伝子をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）によって合成し、ＲＤ１ライブラリーと名付けた。完全なまたは部分的なコドンの縮重を有する遺伝子は、現在では商業的な供給源により容易に合成され得る、または、多数の合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲによって作製することもできる。合成遺伝子を、一般的なプラスミド（例えば、ｐＥＴベクター）にクローニングした後に鋳型として使用することもでき、直接ＰＣＲ産物鋳型として使用することもできる。直線化された酵母ディスプレイベクターに対する相同性を有する２つの隣接したオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、相同組換えによって酵母ディスプレイベクター、ｐＣＴ３０２に挿入することができる二本鎖ＰＣＲ産物を作製するためにＰＣＲを実施した。このように、直線化されたｐＣＴ３０２ベクター、Ａ６−Ｘ１５  ＲＤ１ライブラリーＰＣＲ産物、およびコンピテントＥＢＹ１００酵母細胞を組み合わせることによってヒトＡ６−Ｘ１５  ｓｃＴＣＲライブラリーを酵母ディスプレイベクターに導入した。生じたＲＤ１ライブラリーは、電気穿孔後の酵母の限界希釈した一定分量をプレーティングすることによって判断された約６×１０６個の独立したクローンを含有した。複合体内のＴａｘペプチドの近くにある残基のそれぞれにおける多様性から予測された通り、生じたライブラリーでは、ペプチド−ＨＬＡ．Ａ２  ＤｉｍｅｒＸ調製物を使用して決定された通り、コグネイト抗原Ｔａｘ：ＨＬＡ−Ａ２またはＭａｒｔ１：ＨＬＡ−Ａ２複合体のいずれを用いても陽性染色は示されなかった。
【０２４９】
図６では、酵母の表面上でのｓｃＴＣＲの発現を検出するために使用したＮ末端赤血球凝集素（ＨＡ）およびＣ末端ｃ−ｍｙｃタグを有するＶβ−リンカー−Ｖα  ｓｃＴＣＲが示されている（Stoneら（２０１２年）Methods  Enzymol、５０３巻、１８９〜２２２頁）。ｓｃＴＣＲ構築物を、ｓｃＴＣＲが酵母の表面上で発現されることを可能にするＡＧＡ−２酵母接合タンパク質との融合物として発現させ、フローサイトメトリーによって迅速に分析し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってスクリーニングした。
【０２５０】
５つのコドンの位置のそれぞれにおけるＲＤ１ライブラリーの多様性を検証するために、プレーティングしたライブラリーからのコロニー１０個について配列決定した（図７）。５つの位置のそれぞれが広範囲にわたる多様性を示し、これにより、ライブラリーが、ＨＬＡ．Ａ２と結合したペプチドと接触することができると予測された領域内に多様な潜在的結合部位を含有することが示された。
【０２５１】
（実施例６）
細胞選別による酵母−ディスプレイＡ６  ＴＣＲライブラリーの選択
この実施例では、標的リガンドに結合する変異体ＴＣＲの選択について記載されている。Ａ６足場ライブラリーを、非コグネイトペプチド抗原と結合するＴＣＲ変異体を同定するために使用することができるかどうか決定するために、コグネイト抗原Ｔａｘ：ＨＬＡ．Ａ２に加えて、非コグネイト抗原Ｍａｒｔ１−１０マー：ＨＬＡ．Ａ２を用いてライブラリーを選択した。これらの２つのペプチドは、長さのみが異なるが、Ｍａｒｔ１−１０マーの２位（Ｔａｘの１位）のロイシンおよびＭａｒｔ１の１０位（Ｔａｘの９位）のバリンのみをアラインメントした場合、同一である。さらに、バリンは、ＨＬＡ．Ａ２アンカー残基であると考えられ、したがって、ＴＣＲに対して露出する側鎖は２つの場合で明瞭に異なる。
【０２５２】
コグネイト抗原に結合した変異体を含有したライブラリーを検証するために、Ｔａｘ：ＨＬＡ−Ａ２二量体を用いて蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用した（図８）。ＲＤ１ライブラリーを、表５に従って１０〜１００ｎＭのＴａｘ（ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ、配列番号５）：ＨＬＡ−Ａ２二量体（ＤｉｍｅｒＸ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）、ＡＰＣとコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体を用い、合計４回の選別で逐次的に選別した。次いで、各選別後の酵母細胞の一定分量を１００ｎＭのＴａｘ（ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ、配列番号５）：ＨＬＡ−Ａ２二量体（ＤｉｍｅｒＸ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）と一緒にインキュベートし、その後、ＡＰＣとコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体と一緒にインキュベートした。ヌクレオチド配列はアミノ酸配列が同じクローン間で変動するので、これらの残基についての強力な選択圧力が示唆される。
【表５】
2018015010.tif 000006
【０２５３】
示されている通り、ＲＤ１ライブラリーでは検出可能な陽性ピークは示されなかったが、２回目の選別後に、陽性集団が出現し始め、４回目の選別後に、追加的な分析のために細胞をプレーティングした。６つのクローンにより、６つのうち２つがＡ６−Ｘ１５と同一のアミノ酸配列を有し（しかし使用されるヌクレオチド配列／コドンは変動した）、６つのうち４つがＣＤＲ１αの３１位にトレオニン置換を有することが明らかになった。全てのクローンが同様の染色プロファイルを有した。分析した６つのクローンのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は図１０に示されている。
【０２５４】
足場手法により、非コグネイト特異性を有するＴＣＲを作製することができるかどうかを決定するために、Ｍａｒｔ１−１０マー：ＨＬＡ−Ａ２二量体を用いて蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用した（図９）。ＲＤ１ライブラリーを、２０〜５００ｎＭのＭａｒｔ１（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、配列番号７）：ＨＬＡ−Ａ２二量体（ＤｉｍｅｒＸ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）、ＡＰＣとコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体を用い、表５に従って合計５回の選別で逐次的に選別した。３回目の選別の間に、切断型クローンを排除するために、酵母細胞についてニワトリ抗ｃ−ｍｙｃ抗体、ヤギ抗ニワトリＩｇＹ  ａｌｅｘａ６４７二次抗体を用いた染色も行い、２重陽性を単離した。（Ｂ）次いで、各選別後の酵母細胞の一定分量を１００ｎＭのＭａｒｔ１（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、配列番号７）：ＨＬＡ−Ａ２二量体（ＤｉｍｅｒＸ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）と一緒にインキュベートし、その後、ＡＰＣとコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体と一緒にインキュベートした。
【表６】
2018015010.tif 000007
【０２５５】
ＲＤ１ライブラリーおよび最初の３回の選別では検出可能な陽性ピークが示されなかったが、４回目の選別後に陽性集団が出現し始め、５回目の選別後に追加的な分析のために細胞をプレーティングした。５つのクローンにより、これらが全て同一のアミノ酸配列を有することが明らかになり、これにより、これらの残基が高親和性結合の付与において重要であることが示された。ヌクレオチド配列はアミノ酸配列が同じクローン間で変動しないが、このアミノ酸配列を用いると少量の可能性のあるコドンの組合せのみが可能である。
【０２５６】
アミノ酸配列およびヌクレオチド配列が図１２に示されている。ＴａｘペプチドとＭａｒｔ１ペプチドの配列が明瞭に異なることから予測される通り、Ａ６ライブラリーを選別することにより得られた５つのＴＣＲの残基全てが、元の高親和性ＴＣＲとＭａｒｔ１選択物の間で異なる。ｔａｘ：ＨＬＡ．Ａ２を用いたＡ６ライブラリーの選択では、野生型配列は６つの配列のうち２つに出現し（例えば、Ｔａｘ−Ｓ４−３）、３１位にトレオニンを含有するバリアントは６つの配列うち４つに存在した（例えば、Ｔａｘ−Ｓ４−１）。Ｔａｘに特異的なＴＣＲバリアントでは、５つの残基は、Ｌｅｕ９９β、Ａｌａ１０２β、Ｇｌｎ３１αまたはＴｈｒ３１α、Ｔｈｒ９７α、およびＡｓｐ９８αであった。Ｍａｒｔ１に特異的なＴＣＲでは、残基は、Ｔｒｐ９９β、Ｇｌｙ１０２β、Ｔｈｒ３１α、Ｌｙｓ９７α、およびＴｙｒ９８αであった。Ｍａｒｔ１に特異的なＴＣＲとＴａｘに特異的なＴＣＲの１つのバリアント（例えば、Ｔａｘ−Ｓ４−１）のどちらにおいてもＴｈｒ３１α残基が見いだされたが、Ａ６結晶構造により、この位置はペプチドとＭＨＣの両方との接触において重要であることが示される（図４参照）。トレオニンはグルタミンと構造が類似しているので、トレオニンにより、他のペプチドとの交差反応性を生じることなくＭＨＣとの接触を維持することが可能になり得る。
【０２５７】
（実施例７）
選択された高親和性ＴＣＲの結合および特異性の分析
本開示のＴＣＲを、抗原を発現する細胞の特異的標的化に使用するためには、ＴＣＲがペプチド特異性を示すことが重大である。Ｔａｘペプチド（配列番号５）およびＭａｒｔ１ペプチド（配列番号７）との結合のために選択されたＴＣＲが選択性ペプチドとの反応において特異性を示したかどうかを決定するために、それぞれの代表的なクローンについて、Ｔａｘ：ＨＬＡ．Ａ２二量体およびＭａｒｔ１：ＨＬＡ．Ａ２二量体の両方をさまざまな濃度で用いて力価測定を行った。Ｍａｒｔ１：ＨＬＡ−Ａ２二量体との結合のために選択されたクローンＲＤ１−Ｍａｒｔ１−Ｓ５−４を、酵母についてＭａｒｔ１：ＨＬＡ−Ａ２  ＤｉｍｅｒＸおよびｔａｘ：ＨＬＡ−Ａ２  ＤｉｍｅｒＸを４〜５００ｎＭの濃度で用いて力価測定を行うことによる結合分析に供した（図１１および１３）。
【０２５８】
図８に記載されている通りＴａｘ：ＨＬＡ．Ａ２を用いてライブラリーを４回選別した後、個々の酵母クローンを培養し、誘導し、細胞表面レベルおよびペプチド：ＨＬＡ．Ａ２の結合について分析した。４回目の選別後に単離された６つのクローンのうち２つとアミノ酸配列が同一であった（データは示していない）Ｘ１５と称されるＡ６高親和性変異体を分析した。
【０２５９】
図９に記載されている通りＭａｒｔ１：ＨＬＡ．Ａ２を用いてライブラリーを５回選別した後、個々の酵母クローンを培養し、誘導し、細胞表面レベル、およびペプチド：ＨＬＡ．Ａ２の結合について分析した。４回目の選別後に単離された全てのクローンとアミノ酸配列が同一であったＳ５−４と称されるＡ６高親和性変異体（配列番号３３）（データは示していない）を分析した。
【０２６０】
Ｍａｒｔ１に特異的なＴＣＲは、Ｍａｒｔ１複合体にのみ結合し、Ｔａｘ複合体には結合せず、結合の最大半量の濃度は低ナノモルの範囲であった。逆に、Ｔａｘに特異的なＴＣＲは、Ｔａｘ複合体にのみ結合し、Ｍａｒｔ１複合体には結合せず、結合の最大半量の濃度は低ナノモルの範囲であった。最高濃度においてさえも結合しないことにより、高親和性ＴＣＲバリアントが選択性リガンドＴａｘ：ＨＬＡ．Ａ２に対する特異性を維持したことが示された。同様に、最高濃度においてさも結合しないことにより、高親和性ＴＣＲバリアントが選択性リガンドＭａｒｔ１：ＨＬＡ．Ａ２に対する特異性を維持したことが示された。
【０２６１】
（実施例８）
ＭＡＲＴ１選択ＲＤ１足場バリアントＲＤ１−ＭＡＲＴ１−Ｓ５−４  ｓｃＴｖの部位特異的変異誘発による親和性成熟
ＲＤ１−ＭＡＲＴ１−Ｓ５−４から単離されたｓｃＴｖ（配列番号３３）の選択性リガンドＭＡＲＴ１（配列番号７）に対する親和性を増大させるために、変異体をペプチドＭＡＲＴ１／ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇ二量体に対する親和性の増大について選択するためにＲＤ１−ＭＡＲＴ１−Ｓ５−４のＣＤＲ３ループにおける縮重ライブラリーを作出した。ＲＤ１−ＭＡＲＴ１−Ｓ５−４  ＣＤＲ３ライブラリーを、１〜２００ｎＭのＭＡＲＴ１／ＨＬＡ−Ａ２二量体（ＤｉｍｅｒＸ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）、ＡＰＣとコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体を用い、合計２回の選別で逐次的に選別した。ＭＡＲＴ１／ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇ二量体を用いてＦＡＣＳによる選択を２ラウンド行った後、ＭＡＲＴ１／ＨＬＡ．Ａ２に強力に結合した酵母の陽性染色集団が出現し、種々のクローンを単離し、結合について調査した（図１５Ａ）。次いで、各選別後の酵母細胞の一定分量を、５０ｎＭのＭＡＲＴ１／ＨＬＡ−Ａ２二量体（ＤｉｍｅｒＸ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）と一緒にインキュベートし、その後、ＡＰＣとコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体と一緒にインキュベートした。ＭＡＲＴ１／ＨＬＡ．Ａ２単量体を用いて染色した際、１つのクローン、ＲＤ１−ＭＡＲＴ１ＨＩＧＨ（配列番号３４）で鋳型クローンＲＤ１−ＭＡＲＴ１−Ｓ５−４からの有意な結合の増加が示された（図１５Ｂおよび１５Ｃ）。
【０２６２】
（実施例９）
選択されたＲＤ１−ＭＡＲＴ１ＨＩＧＨｓｃＴｖの特異性および配列
単離されたＴＣＲが選択性リガンドＭＡＲＴ１に対してのみ特異的であることを決定するために、非選択性コグネイトペプチドＴａｘ／ＨＬＡ．Ａ２、非選択性非コグネイトペプチドＷＴ１／ＨＬＡ．Ａ２、および非選択性非コグネイトペプチドサバイビン／ＨＬＡ．Ａ２を用いたＲＤ１−ＭＡＲＴ１ＨＩＧＨの染色を実施した。５００ｎＭのペプチド／ＨＬＡ．Ａ２二量体を用いた染色では検出可能なシグナルは示されず、これにより、ｓｃＴｖが選択性抗原ＭＡＲＴ１に対して高度に特異的であることが示唆された（図１６）。
【０２６３】
図１８には、Ａ６  ＴＣＲの野生型Ａ６のＶα領域およびＶβ領域の配列が示されており（Garbocziら（１９９６年）Nature、３８４巻、１３４〜１４１頁）、高親和性単鎖バリアントＡ６−Ｘ１５（Aggenら（２０１１年）Protein  Engineering,  Design,  &  Selection、２４巻、３６１〜７２頁）が示されている。配列決定により、ＲＤ１−ＭＡＲＴ１ＨＩＧＨクローンが、ＣＤＲ３βにＲＤ１−ＭＡＲＴ１−Ｓ５−４鋳型からの変異を３つ（Ｓ１０１Ａ、Ｑ１０３Ｇ、およびＰ１０４Ｖ）含有したことが明らかになった（図１８）。したがって、Ａ６と比較して、ＲＤ１−ＭＡＲＴ１ＨＩＧＨはＴＣＲαの変異Ｑ３１Ｔ、Ｔ９７Ｋ、およびＤ９８Ｙ、ならびにＴＣＲβの変異Ｌ９９Ｗ、Ａ１００Ｍ、Ｇ１０１Ａ、Ｒ１０３Ｇ、Ｐ１０４Ｖを含有した（配列番号３４）。
【０２６４】
ＲＤ１−ＭＡＲＴ１ＨＩＧＨｓｃＴｖがＭＡＲＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に高親和性で特異的に結合したことをさらに示すために、可溶性の形態のＲＤ１−ＭＡＲＴ１ＨＩＧＨｓｃＴｖをＥ．ｃｏｌｉ封入体から発現させ、リフォールディングさせ、Ｃ末端ＢｉｒＡタグを介してビオチン化した（Aggenら（２０１１年）Protein  Engineering,  Design,  &  Selection、２４巻、３６１〜７２頁；Zhangら（２００７年）J  Exp  Med、２０４巻、４９〜５５頁）。ヒト細胞株Ｔ２（ＨＬＡ−Ａ２＋）を、１μＭのＭＡＲＴ１、Ｔａｘ、またはＷＴ１ペプチドと一緒にインキュベートし、洗浄した。ビオチン化ＲＤ１−ＭＡＲＴ１ＨＩＧＨｓｃＴｖについて、ＭＡＲＴ−１ペプチド（１μＭ）、ヌルペプチド、ｔａｘ（１μＭ）を前負荷したＴ２細胞、またはペプチドを伴わないＴ２細胞で力価測定を行った。細胞を洗浄し、ＳＡ−ＰＥと一緒にインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。ＭＡＲＴ１ペプチドを負荷した細胞にのみＲＤ１−ＭＡＲＴ１ＨＩＧＨＴＣＲが結合した。結果により、可溶性ＴＣＲがＭＡＲＴ−１に特異的であること、および低ナノモルの結合親和性を示したことが示された（図１７）。
【０２６５】
（実施例１０）
第２世代Ａ６足場ライブラリー、ＲＤ２の設計および選択
足場手法を、Ａ６  ＴＣＲ鋳型を使用した他のライブラリーと連携させることができることを示すために、Ｒｏｓｅｔｔａモデリング情報を使用してＲＤ１ライブラリーを作製し（図３）、ＭＡＲＴ１／ＨＬＡ．Ａ２（ＰＤＢ：１ＪＦ１）の結晶構造（Slizら（２００１年）J  Immunol、１６７巻、３２７６〜８４頁）およびＷＴ１／ＨＬＡ．Ａ２（ＰＤＢ：３ＨＰＪ）の結晶構造（Borbulevychら（２０１０年）Mol  Immunol、４７巻、２５１９〜２４頁）にオーバーレイしたＡ６：Ｔａｘ／ＨＬＡ．Ａ２結晶構造（ＰＤＢ：１ＡＯ７）（図１９Ａ）を使用して、ＲＤ２と称される第２世代ライブラリーの作製をガイドした。このライブラリーは、ＮＮＫ核酸組成に基づいて５つの縮重位置（ＴＣＲαのＤ２７、Ｇ２９、およびＳ９９；ＴＣＲβのＬ９９およびＷ１００）、ＴＣＲαのＱ３１に野生型残基グルタミンまたはトレオニンのいずれかを選択できる１つのバイナリー位置、およびＣＤＲ３βの１００位〜１０３位に４つの隣接する残基をＡ６野生型（ＡＧＧＲ、配列番号４４）またはＡ６−Ｘ１５（ＭＳＡＱ、配列番号４５）から選択することができるバイナリー配列（図２０）を含んだ。さらに、Ｖα２の１位のグルタミンは省略された。多様な位置のそれぞれにおけるＲＤ２ライブラリーの多様性を検証するために、プレーティングしたライブラリーから５つのクローンについて配列決定した（図２０）。
【０２６６】
５μＭのＴａｘ／ＨＬＡ．Ａ２  ＵＶ交換単量体およびストレプトアビジンＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから入手）と一緒にインキュベートした後、ＲＤ２ライブラリーの２回の逐次的な磁気ビーズ選択を実施した（図１９Ｂ）。２回目の選択後、酵母細胞を、１ｎＭのＴａｘ／ＨＬＡ−Ａ２二量体（ＤｉｍｅｒＸ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）およびＡＰＣとコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体と一緒にインキュベートした。次いで、各選択後の酵母細胞の一定分量を、５０ｎＭのＴａｘ／ＨＬＡ−Ａ２二量体（ＤｉｍｅｒＸ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）、ＡＰＣとコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体と一緒にインキュベートした。
【０２６７】
ＲＤ２ライブラリーの２回の逐次的な磁気ビーズ選択を、５μＭのＭＡＲＴ１／ＨＬＡ−Ａ２  ＵＶ交換単量体およびストレプトアビジンＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから入手）と一緒にインキュベートした後にも実施した（図１９Ｃ）。２回目の選択後、酵母細胞を、１００ｎＭのＭＡＲＴ１／ＨＬＡ−Ａ２二量体（ＤｉｍｅｒＸ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）およびＡＰＣとコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体と一緒にインキュベートした。次いで、各選択後の酵母細胞の一定分量を５０ｎＭのＭＡＲＴ１／ＨＬＡ−Ａ２二量体（ＤｉｍｅｒＸ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）、ＡＰＣとコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体と一緒にインキュベートした。
【０２６８】
ＲＤ２ライブラリーを、２つのペプチド／ＭＨＣリガンド、Ｔａｘ／ＨＬＡ．Ａ２（コグネイト）およびＭＡＲＴ１／ＨＬＡ．Ａ２（非コグネイト）を用いて、２回のＭＡＣＳ磁気ビーズ選択、その後１ラウンドのＦＡＣＳによって選択した。コグネイト抗原であるＴａｘを用いた選択では、Ｔａｘ／ＨＬＡ．Ａ２単量体を用いた１回目の磁気選択後に陽性染色集団の出現が示された（図１９Ｂ）。ＭＡＲＴ１／ＨＬＡ．Ａ２を用いた選択では、３回目のＦＡＣＳ選択後に陽性染色集団の出現が明らかになった（図１９Ｃ）。
【０２６９】
（実施例１１）
ＭＡＲＴ１／ＨＬＡ．Ａ２に結合するＲＤ２バリアントの単離および特徴付け
ＭＡＲＴ１／ＨＬＡ．Ａ２を用いてＲＤ２ライブラリーを３回選択した後、６つのコロニーを単離し、ＭＡＲＴ１／ＨＬＡ．Ａ２についての染色の改善について分析した（データは示していない）。個々の酵母クローンを培養し、誘導し、ペプチド／ＨＬＡ．Ａ２結合について分析した。ＲＤ２−ＭＡＲＴ１−Ｓ３−３（配列番号４１）およびＲＤ２−ＭＡＲＴ１−Ｓ３−４（配列番号４２）と称される２つのクローンでＭＡＲＴ１／ＨＬＡ．Ａ２との結合の増加が示され（図２１Ａおよび２１Ｂ）、これらはコグネイト非選択性Ｔａｘ／ＨＬＡ．Ａ２には結合しなかった（図２１Ｃおよび２１Ｄ）。配列決定分析により、ＲＤ２−ＭＡＲＴ１−Ｓ３−３およびＲＤ２−ＭＡＲＴ１−Ｓ３−４の両方についてＡ６野生型ＣＤＲ３βループ配列ＡＧＧＲ（配列番号４４）の選択が明らかになった。さらに、ＲＤ２−ＭＡＲＴ１−Ｓ３−３およびＲＤ２−ＭＡＲＴ１−Ｓ３−４のどちらにおいてもＴＣＲ−βＭ９９、ＴＣＲ−αＳ２７およびＨ２９、ならびにＴＣＲ−αに２つのＰＣＲに基づく変異（Ｓ３４およびＰ４０）が選択された。ＲＤ２−ＭＡＲＴ１−Ｓ３−３ではＣＤＲ１αバイナリー位置の３１位にトレオニンが選択されたが、ＲＤ２−ＭＡＲＴ１−Ｓ３−４クローンでは野生型Ｑ３１が保持された。さらに、ＲＤ２−ＭＡＲＴ１−Ｓ３−３ではＴＣＲαＲ９９およびＳ１００が選択されたが、ＲＤ２−ＭＡＲＴ１−Ｓ３−４ではＬ９９およびＷ１００が選択された（図２１Ｅ）。
【０２７０】
したがって、ＲＤ２−ＭＡＲＴ１−Ｓ３−３は、ＴＣＲαの変異Ｄ２７Ｓ、Ｇ２９Ｈ、Ｑ３１Ｔ、Ｆ３４Ｓ、Ｓ４０Ｐ、Ｓ９９Ｒ、Ｗ１００Ｓ、およびＴＣＲβの変異Ｌ９９Ｍを含有し（配列番号４１）、ＲＤ２−ＭＡＲＴ１−Ｓ３−４はＴＣＲαの変異Ｄ２７Ｓ、Ｇ２９Ｈ、Ｆ３４Ｓ、Ｓ４０Ｐ、Ｓ９９Ｌ、およびＴＣＲβの変異Ｌ９９Ｍを含有した（配列番号４２）。
【０２７１】
（実施例１２）
代替の足場の使用
野生型ＴＣＲ  Ａ６およびＡ６  Ｘ１５として公知のＡ６の安定化されたバリアントに加えて、他の単鎖ＴＣＲを示すために、Ｔ１−Ｓ１８．４５として公知の別の操作した高親和性ｓｃＴＣＲを酵母ディスプレイ系における単鎖足場用の鋳型ＴＣＲとして使用した。Ｔ１−Ｓ１８．４５ではＶα２およびＶβ１６が使用され、ＭＡＲＴ１／ＨＬＡ−Ａ２抗原に対して単離された（Fleischerら（２００４年）J  Immunol、１７２巻、１６２〜９頁）。野生型単鎖ＴＣＲをＣＤＲ３ライブラリーの鋳型として使用し、上記の通り親和性成熟を実施した。高親和性変異体Ｔ１−Ｓ１８．４５について配列決定し（図２２）、これにより、この変異体がＴＣＲαの変異Ｎ９２Ｓ、Ｄ９９Ｓ、Ｎ１００Ｓ、Ａ１０１Ｄ、およびＲ１０２Ｆを含有することが示された（配列番号４３）。
【０２７２】
Ｔ１−Ｓ１８．４５ｓｃＴｖがＭＡＲＴ１／ＨＬＡ−Ａ２に高親和性で結合したことをさらに示すために、可溶性の形態のＴ１−Ｓ１８．４５ｓｃＴｖをＥ．ｃｏｌｉにおいて産生させ、ビオチン化した（Aggenら（２０１１年）Protein  Engineering,  Design,  &  Selection、２４巻、３６１〜７２頁；Zhangら（２００７年）J  Exp  Med、２０４巻、４９〜５５頁）。ビオチン化Ｔ１−Ｓ１８．４５ｓｃＴｖについて、ＭＡＲＴ−１ペプチド（１μＭ）またはヌルペプチド、ＳＬ９（１μＭ）を前負荷した抗原提示細胞株Ｔ２（ＨＬＡ−Ａ２＋）で力価測定を行った。結果により、可溶性ＴＣＲがＭＡＲＴ−１に特異的であり、低ナノモルの結合親和性を示したことが示された（図２３）。
【０２７３】
（実施例１３）
足場プロセスを使用して操作した治療的用形式のＴＣＲ
現在では親和性がより高いＴＣＲを、対応する抗原を発現する細胞を標的化するために種々の形式で使用することができることが周知である。したがって、足場戦略により作製されたＴＣＲは、可溶性の形態で、または養子Ｔ細胞療法のためのＴＣＲ遺伝子療法においてのいずれかで使用することができる。
【０２７４】
図２４に要約されている通り、ＴＣＲは、特異的なペプチド−ＭＨＣ抗原を発現している標的細胞に対する「ペイロード」を保有する可溶性の治療用製品として使用するために容易に形式化することができる。形式としては、免疫グロブリン融合物、化学療法薬または薬物コンジュゲート、および二重特異性抗体を含めた当技術分野においてすでに実施されているものが挙げられる：１）結合適用のためにまたは示されている他の適用のためのプラットフォームとして可溶性の形態で発現させたＶα−Ｖβ方向またはＶβ−Ｖα方向のいずれかの単鎖ＴＣＲ；変異した、高親和性Ｖドメインがアスタリスクで示されている（＊）；２）Ｅｎｂｒｅｌ製品（Brower（１９９７年）Nat  Biotechnol、１５巻、１２
４０頁）においてＴＮＦ−α受容体の細胞外ドメインを用いて行われている通り、単鎖ＴＣＲを抗体の定常領域ドメインとインフレームで融合して、エフェクター機能およびＦｃ領域の他の性質を有する免疫グロブリン融合物を生成することができる；３）個々のＶαドメインおよびＶβドメインを、軽鎖の定常領域または重鎖の定常領域のいずれかとのインフレーム融合物として従来の抗体のように形づくって免疫グロブリン融合物を生成することができる；４）標的細胞を死滅させるための毒性化合物を有するペプチド−ＭＨＣ標的化ドメインを付与するために、単鎖ＴＣＲ（または２および３に示されている免疫グロブリン融合物）を薬物と直接カップリングすることができる；５）単鎖ＴＣＲを抗体の単鎖Ｆｖ（ＶＬ−リンカー−ＶＨ）とインフレームで単鎖として連結して二重特異性単鎖を生成することができる；現在ｓｃＦｖに基づく二重特異性抗体、またはつい最近、ＴＣＲに基づく二重特異性を用いて行われている通り、ｓｃＦｖは、Ｔ細胞の活性を動員するためにＴＣＲ／ＣＤ３複合体のＣＤ３サブユニットを対象とするものであってよい。
【０２７５】
さらに、図２４Ｂは、ＴＣＲ足場を使用して高親和性結合について酵母ディスプレイによって単離された可変ドメイン（Ｖ）を養子Ｔ細胞療法においてＴ細胞で発現させるために哺乳動物細胞ベクターに挿入することができることを示す。ＴＣＲは、１）現在周知のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の単鎖受容体として使用することができる、または２）従来のＴＣＲ遺伝子療法のために養子Ｔ細胞形式で全長のαＴＣＲおよびβＴＣＲとしてクローニングすることができる。
【０２７６】
抗体、ペプチド：ＨＬＡ−Ａ２、およびフローサイトメトリー
酵母表面での発現を検出するために使用する抗体は、抗ＨＡエピトープタグ（クローンＨＡ．１１；Ｃｏｖａｎｃｅ）、抗Ｃｍｙｃエピトープタグ（クローン９Ｅ１０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびヤギ抗ニワトリＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含んだ。ＨＬＡ−Ａ２に結合するペプチド［Ｔａｘ１１−１９：配列番号５、Ｍａｒｔ１２６−３５Ａ２７Ｌ：配列番号７］は、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ａｔ  Ｐｅｎｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｈｅｒｓｈｅｙ、ＰＡ、ＵＳＡ）において標準のＦ−ｍｏｃ（Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル）化学によって合成された。ＦＡＣＳおよびフローサイトメトリー分析については、組換え可溶性二量体ＨＬＡ−Ａ２：Ｉｇ融合タンパク質（ＢＤＤｉｍｅｒＸ）を使用した。
【０２７７】
Ａ６  ＲＤ１ライブラリーの設計
縮重の候補残基を、ＣＤＲループのどの位置によって種々のペプチドとの接触が可能になる可能性が最も高いかを、Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｂａｃｋｒｕｂ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ（（Lauckら（２０１０年）Nucleic  Acids  Res、３８巻、Ｗ５６９〜７５頁；SmithおよびKortemme（２００８年）J  Mol  Biol、３８０巻、７４２〜５６頁）、ｋｏｒｔｅｍｍｅｌａｂ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｂａｃｋｒｕｂ／）を使用して測定することによって決定した。Ａ６：Ｔａｘペプチド：ＨＬＡ−Ａ２結晶構造（ＰＤＢ：１ＡＯ７）（Garbocziら（１９９６年）Nature、３８４巻、１３４〜１４１頁）をインプットとして使用し、Ｒｏｓｅｔｔａを使用して、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｍｏｄｕｌｅを使用することによって対象の種々のＨＬＡ−Ａ２拘束ペプチド（ＳＬ９、Ｍａｒｔ１、ＷＴ１、サバイビン）をＨＬＡ−Ａ２のペプチド結合性溝にモデリングした。次に、ペプチド残基の３Å以内にあるＣＤＲループ残基を各モデルの最低エネルギーコンフォメーションとして決定し、以前に記載されている通り安定化変異を含有するＡ６  Ｘ１５  ｓｃＴＣＲを鋳型として使用し、５つの最も頻繁に出現する位置を縮重とした（Aggenら（２０１１年）Protein  Engineering,  Design,  &  Selection、２４巻、３６１〜７２頁）。
【０２７８】
Ｔ細胞受容体のそれらのコグネイトペプチド−ＭＨＣに対する親和性を改善するためのコンピュータによる設計方法体系が記載されている（Haidarら（２００９年）Proteins、７４巻、９４８〜６０頁；Hawseら（２０１２年）J  Immunol、１８８巻、５８１９〜２３頁）。ＺＡＦＦＩと称されるこの設計方法では、単一の点変異をモデリングし、結合の改善について分析する。次に、結合を増加させる点変異を組み合わせ、相加効果について分析した。このアルゴリズムは、野生型ＴＣＲよりも９９倍しっかりと結合した、４つの変異を含有するＡ６バリアントの記載に使用された（Haidarら（２００９年）Proteins、７４巻、９４８〜６０頁）。後者の試験では、Ｍａｒｔ−１特異的ＴＣＲ  ＤＭＦ５のより高い親和性バリアントを設計するために同じ方法体系が使用された。高親和性ＤＭＦ５バリアントは、親和性を２５０倍に増大させる２つの変異を含有した（Hawseら（２０１２年）J  Immunol、１８８巻、５８１９〜２３頁）。非コグネイトリガンドに対する新規の親和性を有するＴ細胞受容体を操作するための、コンピュータによる手法の使用についてはまだ記載されていない。本発明は、指向性進化に使用される足場作製をガイドするための、コンピュータによるモデリングの使用を初めて提供する。
【０２７９】
縮重の候補残基を、ＣＤＲループのどの位置によって種々のペプチドとの接触が可能になる可能性が最も高いかをＲｏｓｅｔｔａ  Ｂａｃｋｒｕｂ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ（Lauck、２０１０年、＃７６９１｝；ｋｏｒｔｅｍｍｅｌａｂ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｂａｃｋｒｕｂ／）を使用して測定することによって決定した。Ａ６：Ｔａｘペプチド：ＨＬＡ−Ａ２結晶構造（ＰＤＢ：１ＡＯ７）を使用して、Ｒｏｓｅｔｔａを使用して、対象の種々のＨＬＡ−Ａ２拘束ペプチド（ＳＬ９、Ｍａｒｔ１、ＷＴ１、サバイビン）をモデリングした。次に、各モデルについてペプチド残基の３Å以内にあるＣＤＲループ残基を決定し、５つの最も頻繁に出現する位置を、以前に記載されている通り安定化変異を含有するＡ６  Ｘ１５  ｓｃＴＣＲを鋳型として使用して縮重させた（Aggenら（２０１１年）Protein  Engineering,  Design,  &  Selection、２４巻、３６１〜７２頁）。
【０２８０】
ライブラリーの作製、ディスプレイ、および選択
Ａ６  ＲＤ１ライブラリーを、Ｔｒｐ培地での成長が可能になるガラクトース誘導可能ＡＧＡ２融合物を含有する酵母ディスプレイプラスミドｐＣＴ３０２（Ｖβ−Ｌ−Ｖα）（BoderおよびWittrup（１９９７年）Nat.  Biotech.、１５巻、５５３〜５５７頁；BoderおよびWittrup（２０００年）Methods  Enzymol、３２８巻、４３０〜４４頁）において発現させた。ｓｃＴｖ遺伝子の誘導は、形質転換したＥＢＹ１００酵母細胞を選択培地で定常期まで成長させ、その後ガラクトースを含有する培地に移すことを伴う。
【０２８１】
Ａ６  ＲＤ１ライブラリーを、Ａ６  Ｘ１５を鋳型として使用してＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）によって合成した（Aggenら（２０１１年）Protein  Engineering,  Design,  &  Selection、２４巻、３６１〜７２頁；Liら（２００５年）Nat  Biotechnol、２３巻、３４９〜５４頁）。構築物はリンカー領域GSADDAKKDAAKKDGKS  (配列番号  21)  (Aggen  et  al.  (2011)  Protein  Engineering,  Design,  &  Selection,  24,  361-72;  Kieke  et  al.  (1999)  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A,  96,  5651-6;  Soo  Hoo  et  al.  (1992)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.,  89,  4759-4763;  Weber  et  al.  (2005)  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A,  102,  19033-8)によって付着した可変性断片、およびＮ末端ＨＡおよびＣ末端Ｃｍｙｃエピトープタグからなった。以下の遺伝子を合成し、「Ｘ」によって示される領域は、ＮＮＳコドンによる縮重であった：NAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMAWYRQDPGMGLRLIHYSVGVGITDQGDVPDGYKVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASRPGXMSXQPELYFGPGTRLTVTEDLINGSADDAKKDAAKKDGKSQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSXSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVTXXSWGKLQFGAGTQVVVTPDEQKLISEEDL**  (配列番号4)。遺伝子を、酵母およびＥ．ｃｏｌｉの両方に対して、５’配列ＴＣＴ  ＧＣＴ  ＡＧＣ（配列番号４８）および３’配列ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＴＧＡ（配列番号４９）を用いてコドン最適化した。
【０２８２】
酵母において相同組換えを行うために、ｐＣＴ３０２突出部を、合成されたライブラリーにフォワードプライマー5’-CAGGCTAGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGCAATGCTGGTGTAACACAAACGCCAA-3’(配列番号50)およびリバースプライマー5’-GGAACAAAGTCGATTTTGTTACATCTACACTGTTGTTAACAGATCTCG  AGTCATTATAAATCTTCTTCAGAGATC-3’(配列番号51)を使用して付加した。酵母ライブラリーを、ＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＣＴ３０２一緒に電気穿孔で導入することによってＥＢＹ１００酵母における相同組換えにより作製した（Benatuilら（２０１０年）Protein  Eng  Des  Sel、２３巻、１５５〜９頁；Colbyら（２００４年）Methods  Enzymol、３８８巻、３４８〜５８頁；Starwaltら（２００３年）Protein  Eng、１６巻、１４７〜５６頁；Swersら（２００４年）Nucleic  Acids  Res、３２巻、ｅ３６頁）。生じたライブラリーサイズは６×１０６であった。ライブラリーを、ガラクトースを含有する培地（ＳＧ−ＣＡＡ）において４８時間にわたって誘導し、１ｍＬの１％ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、以下を用いて染色した：抗ＨＡエピトープタグ（１：５０）、抗Ｖα２抗体（１：５０）、およびｔａｘペプチド：ＨＬＡ−Ａ２ＤｉｍｅｒＸまたはＭａｒｔ１ペプチド：ＨＬＡ−Ａ２ＤｉｍｅｒＸ（１００ｎＭ）をヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７二次抗体と一緒に（１：１００）、および抗ｃｍｙｃ（１：５０）をヤギ抗ニワトリＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７二次抗体（１：１００）と一緒に。細胞を洗浄し（１ｍｌ、１％ＰＢＳ／ＢＳＡ）、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）高速選別機を使用して蛍光が最も高い細胞を選択した。ｔａｘ：ＨＬＡ−Ａ２二量体（１０〜２０ｎＭ）およびＭａｒｔ１：ＨＬＡ−Ａ２二量体（２０〜５００ｎＭ）を用いて選択を実施した。
【０２８３】
ＲＤ−ＭＡＲＴ１  ＣＤＲ３酵母ディスプレイライブラリーの作製、ディスプレイ、および選択
ＣＤＲ３ライブラリーを、一度に５つの近接するコドンにわたるオーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲにより、ＲＤ１ライブラリーから選択されたＲＤ１−ＭＡＲＴ１  ｓｃＴＶクローンを鋳型として使用して作製した（ＣＤＲ３βループにライブラリー２つ；ＣＤＲ３αループに１つ）（Hortonら（１９９０年）Biotechniques、
８巻、５２８〜３５頁）。４つのライブラリーのそれぞれについて、以下のプライマー対を利用してＰｒｅ−ＳＯＥ  ＰＣＲ産物を作製した。β1:  5'-  GGC  AGC  CCC  ATA  AAC  ACA  CAG  TAT  -3'  (配列番号52)(スプライス4L)および5'-  CGG  ACG  GGA  AGC  GCA  GAA  ATA  CAC  TGA  GGT  TTG  AGA  AGG  TGC  AGC  GCT  TAA  CAG  ACG  CAG  CGG  -3'(配列番号53)、ならびに5'-  ACC  TCA  GTG  TAT  TTC  TGC  GCT  TCC  CGT  CCG  NNK  NNK  NNK  NNK  NNK  CAG  CCT  GAA  CTG  TAC  TTT  GGT  CCA  GGC  ACT  AGA  C  -3'  (配列番号54)および5'-  TAA  TAC  GAC  TCA  CTA  TAG  GG  -3'(配列番号55)  (T7);  β2:スプライス4Lおよび5'-  CGG  ACG  GGA  AGC  GCA  GAA  ATA  CAC  TGA  GGT  TTG  AGA  AGG  TGC  AGC  GCT  TAA  CAG  ACG  CAG  CGG  -3'  (配列番号56)、ならびに5'-  ACC  TCA  GTG  TAT  TTC  TGC  GCT  TCC  CGT  CCG  GGT  TGG  NNK  NNK  NNK  NNK  NNK  GAA  CTG  TAC  TTT  GGT  CCA  GGC  ACT  AGA  CTG  ACC  G  -3'  (配列番号57)およびT7;  α:スプライス4Lおよび5'-  CGT  AAC  CGC  GCA  CAA  GTA  TGT  GGC  CGA  ATC  GGA  AGG  CTG  GGA  GTC  ACG  AAT  CAG  CAA  ACT  AAC
ATA  CTG  GC  -3'  (配列番号58)、ならびに5'-  TCC  GAT  TCG  GCC  ACA  TAC  TTG  TGC  GCG  GTT  ACG  NNK  NNK  NNK  NNK  NNK  AAA  CTG  CAA  TTT  GGT  GCG  GGC  ACC  CAG  GTT  GTG  G  -3'  (配列番号59)およびT7。ＳＯＥ  ＰＣＲを、それぞれ対応するＰｒｅ−ＳＯＥを伴い、各ライブラリーについてＴ７とスプライス４Ｌの両方と一緒に実施した。
【０２８４】
酵母ライブラリーを、ＥＢＹ１００酵母にＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化した酵母ディスプレイベクターｐＣＴ３０２と一緒に電気穿孔で導入することによって相同組換えにより作製した（Benatuilら（２０１０年）Protein  Eng  Des  Sel、２３巻、１５５〜９頁；Colbyら（２００４年）Methods  Enzymol、３８８巻、３４８〜５８頁；Starwaltら（２００３年）Protein  Eng、１６巻、１４７〜５６頁；Swersら（２００４年）Nucleic  Acids  Res、３２巻、ｅ３６頁）。生じたライブラリーサイズはβ１：２．１×１０７、β２：１．７×１０７、およびα：１．１×１０７であった。ライブラリーを同じ細胞数、相対的な多様性を反映する比率でプールし、ＳＤ−ＣＡＡ培地で増大させた。
【０２８５】
ガラクトースを含有する培地（ＳＧ−ＣＡＡ）で４８時間にわたって混合ライブラリーを誘導し、１ｍＬの１％ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、ＭＡＲＴ１／ＨＬＡ．Ａ２ＤｉｍｅｒＸ、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７二次抗体（１：１００）を用いて染色した。細胞を洗浄し（１ｍｌ、１％ＰＢＳ／ＢＳＡ）、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）高速選別機を使用して蛍光が最も高い細胞を選択した。ＭＡＲＴ１／ＨＬＡ−Ａ２二量体（１〜２００ｎＭ）を用いて選択を実施した。抗ＨＡエピトープタグ（１：５０）、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７二次抗体（１：１００）、および抗ｃｍｙｃ（１：５０）、ヤギ抗ニワトリＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７二次抗体（１：１００）を用いて発現をモニターした。
【０２８６】
Ａ６  ＲＤ２ライブラリーの設計
ＰｙＭＯＬソフトウェア（Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、バージョン１．５．０．４  Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ）を使用して、Ａ６：Ｔａｘ／ＨＬＡ．Ａ２複合体（ＰＤＢ：１ＡＯ７）の結晶構造をＭＡＲＴ１／ＨＬＡ．Ａ２（ＰＤＢ：１ＪＦ１）の結晶構造（Slizら（２００１年）J  Immunol、１６７巻、３２７６〜８４頁）およびＷＴ１／ＨＬＡ．Ａ２（ＰＤＢ：３ＨＰＪ）の結晶構造（Borbulevychら（２０１０年）Mol  Immunol、４７巻、２５１９〜２４頁）にオーバーレイした。目視検査および合理的設計を使用して、オーバーレイした結晶構造においてＭＡＲＴ１／ＨＬＡ．Ａ２およびＷＴ１／ＨＬＡ．Ａ２の極めて近傍にあるＡ６：Ｔａｘ／ＨＬＡ．Ａ２結晶構造内の残基の位置を選択した。５つの位置（ＴＣＲαのＤ２７、Ｇ２９、およびＳ９９；ＴＣＲβのＬ９９およびＷ１００）がＮＮＫ核酸組成に基づいて縮重とされた。Ｖα２の第１位のグルタミンは合成から省略された。ＴＣＲαのＱ３１位は、野生型残基グルタミンまたはトレオニンのいずれかを選択することができるバイナリー位置であり、ＣＤＲ３βの１００〜１０３位は４つの隣接する残基をＡ６野生型（ＡＧＧＲ、配列番号４４）またはＡ６−Ｘ１５（ＭＳＡＱ、配列番号４５）から選択することができるバイナリーであった。
【０２８７】
ＲＤ２酵母ディスプレイライブラリーの作製、ディスプレイ、および選択
Ａ６  ＲＤ２ライブラリーを、Ｔｒｐ培地での成長が可能になるガラクトース誘導可能ＡＧＡ２融合物を含有する酵母ディスプレイプラスミドｐＣＴ３０２（Ｖβ−Ｌ−Ｖα）（BoderおよびWittrup（１９９７年）Nat.  Biotech.、１５巻、５５３〜５５７頁；BoderおよびWittrup（２０００年）Methods  Enzymol、３２８巻、４３０〜４４頁）において発現させた。ｓｃＴｖ遺伝子の誘導は、形質転換したＥＢＹ１００酵母細胞を選択培地で定常期まで成長させ、次いでガラクトースを含有する培地に移すことを伴った。Ａ６  ＲＤ２ライブラリーを、Ａ６−Ｘ１５を鋳型として使用してＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって合成した。構築物は、リンカー領域ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＧＫＳ（配列番号２１）によって付着した可変性断片およびＮ末端ＨＡおよびＣ末端Ｃｍｙｃエピトープタグからなった。以下の遺伝子を合成し、「Ｘ」によって示される位置はＮＮＫコドンによる縮重であり、「１２３４」と標識された位置はＡ６野生型ＣＤＲ３βループＡＧＧＲ（配列番号４４）またはＡ６−Ｘ１５  ＣＤＲ３βループＭＳＡＱ（配列番号４５）が可能なバイナリーであり、「＃」によって示される位置は野生型残基Ｑまたは変異したＴのいずれかが可能なバイナリーであり、「＊」によって示される位置は終止コドンであった：NAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMAWYRQDPGMGLRLIHYSVGVGITDQGDVPDGYKVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASRPGX1234PELYFGPGTRLTVTEDLINGSADDAKKDAAKKDGKSKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSXRXS#SFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVTTDXXGKLQFGAGTQVVVTPDIEQKLISEEDL**  (配列番号35)。遺伝子を酵母に対してコドン最適化し、Ｔ７クローニングプライマーおよびスプライス４Ｌクローニングプライマーとのオーバーラップを含有する以下のフランキングＤＮＡ配列を付加した：N末端DNA配列:5’  −  GGC  AGC  CCC  ATA  AAC  ACA  CAG  TAT  GTT  TTT  AAG  GAC  AAT  AGC  TCG  ACG  ATT  GAA  GGT  AGA  TAC  CCA  TAC  GAC  GTT  CCA  GAC  TAC  GCT  CTG  CAG  GCT  AGT  GGT  GGT  GGT  GGT  TCT  GGT  GGT  GGT  GGT  TCT  GGT  GGT  GGT  GGT  TCT  GCT  AGC  −  3’  (配列番号60)、ならびにC末端DNA配列:5’  −  CTC  GAG  ATC  TGT  TAA  CAA  CAG  TGT  AGA  TGT  AAC  AAA  ATC  GAC  TTT  GTT  CCC  ACT  GTA  CTT  TTA  GCT  CGT  ACA  AAA  TAC  AAT  ATA  CTT  TTC  ATT  TCT  CCG  TAA  ACA  ACA  TGT  TTT  CCC  ATG  TAA  TAT  CCT  TTT  CTA  TTT  TTC  GTT  CCG  TTA  CCA  ACT  TTA  CAC  ATA  CTT  TAT  ATA  GCT  ATT  CAC  TTC  TAT  ACA  CTA  AAA  AAC  TAA  GAC  AAT  TTT  AAT  TTT  GCT  GCC  TGC  CAT  ATT  TCA  ATT  TGT  TAT  AAA  TTC  CTA  TAA  TTT  ATC  CTA  TTA  GTA  GCT  AAA  AAA  AGA  TGA  ATG  TGA  ATC  GAA  TCC  TAA  GAG  AAT  TGA  GCT  CCA  ATT  CGC  CCT  ATA  GTG  AGT  CGT  ATT  A  −  3’(配列番号61)。生じたＰＣＲ産物を、スプライス４ＬプライマーおよびＴ７プライマーを使用してＰＣＲによって増幅し、ＥＢＹ１００酵母に増幅されたＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化した酵母ディスプレイベクターｐＣＴ３０２（Benatuilら（２０１０年）Protein  Eng  Des  Sel、２３巻、１５５〜９頁；Colbyら（２００４年）Methods  Enzymol、３８８巻、３４８〜５８頁；Starwaltら（２００３年）Protein  Eng、１６巻、１４７〜５６頁；Swersら（２００４年）Nucleic  Acids  Res、３２巻、ｅ３６頁）と一緒に電気穿孔で導入することによって相同組換えにより酵母ライブラリーを作製した。生じたライブラリーサイズは２．４×１０８であった。
【０２８８】
ガラクトースを含有する培地（ＳＧ−ＣＡＡ）において４８時間にわたってＲＤ２ライブラリーを誘導し、１ｍＬの１％ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、５μｍのＴａｘ（配列番号５）ペプチド／ＨＬＡ．Ａ２  ＵＶ交換ＨＬＡ．Ａ２単量体またはＭＡＲＴ１（配列番号７）ペプチド／ＨＬＡ．Ａ２  ＵＶ交換ＨＬＡ．Ａ２単量体を用いて染色した（Rodenkoら（２００６年）Nat  Protoc、１巻、１１２０〜３２頁；Toebesら（２００６年）Nat  Med、１２巻、２４６〜５１頁）。ストレプトアビジンＭＡＣＳミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ）を利用し、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ（商標）Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ）でＭＡＣＳ  ＬＳカラムを使用した合計２回の選択で磁気ビーズ選択を実施した。２回の選択後、選択されたライブラリーを、以下を用いて染色した：選択性ペプチド／ＨＬＡ．Ａ２  ＤｉｍｅｒＸ、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７二次抗体（１：１００）。細胞を洗浄し（１ｍｌ、１％ＰＢＳ／ＢＳＡ）、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）高速選別機を使用して蛍光が最も高い細胞を選択した。選択性コグネイト抗原Ｔａｘ、および選択性非コグネイト抗原ＭＡＲＴ１に対して、それぞれ、１ｎＭのペプチド／ＨＬＡ．Ａ２および１００ｎＭのペプチド／ＨＬＡ．Ａ２を用いて選択を実施した。抗ＨＡエピトープタグ（１：５０）、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７二次抗体（１：１００）、および抗ｃｍｙｃ（１：５０）、ヤギ抗ニワトリＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７二次抗体（１：１００）を用いて発現をモニターした。
【０２８９】
高親和性クローンの単離および染色
Ｔａｘ：ＨＬＡ−Ａ２を用いた４回目の選別の後、およびＭａｒｔ１：ＨＬＡ−Ａ２を用いた５回目の選別の後、限界希釈物をプレーティングすることによって単一のコロニーを単離した。コロニーを増大させ、ガラクトースを含有する培地（ＳＧ−ＣＡＡ）において４８時間にわたって誘導し、１ｍＬの１％ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、以下を用いて染色した：抗ＨＡエピトープタグ（１：５０）、抗Ｖα２抗体（１：５０）、およびｔａｘペプチド：ＨＬＡ−Ａ２  ＤｉｍｅｒＸまたはＭａｒｔ１ペプチド：ＨＬＡ−Ａ２  ＤｉｍｅｒＸ（１００ｎＭ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７二次抗体と一緒に（１：１００）、および抗ｃｍｙｃ（１：５０）、ヤギ抗ニワトリＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７二次抗体と一緒に（１：１００）。細胞を洗浄し（１ｍｌ、１％ＰＢＳ／ＢＳＡ）、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターで分析した。
【０２９０】
Ｚｙｍｏｐｒｅｐ（商標）Ｙｅａｓｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＩＩ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してプラスミドを回収し、Ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（商標）ＤＨ５α（商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への熱ショック形質転換によってＥ．ｃｏｌｉに導入し戻した。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を増大させ、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドを単離した。個々のクローンの配列をＳａｎｇｅｒ配列決定によって決定した。
【０２９１】
参照による組み込みおよび変形に関する記載
本明細書において引用された全ての参考文献、例えば、交付された特許または等価物；特許出願公開を含めた特許文書；および非特許文献または他の原資料は、これにより、参考文献のそれぞれが本出願の開示と少なくとも部分的に相反しない限りでは、個別に参照により組み込まれるのと同様にそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる（例えば、部分的に相反する参考文献は、参考文献の部分的に相反する部分以外は参照により組み込まれる）。
【０２９２】
本明細書に記載の特許および刊行物は全て、本開示が関係する当業者のレベルを示す。本明細書において引用されている参考文献は、いくつかの場合には、それらの出願日における当技術分野の状態を示すためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれ、また、本明細書では、必要であれば、先行技術の特定の実施形態を排除する（例えば、拒絶する）ため、または当技術分野の現状の方法または材料を、本開示の方法または材料に具体的に含めずに使用するためにこの情報を使用することができるものとする。例えば、化合物が特許請求されている場合、本明細書に開示されている参考文献（特に参照されている特許文書）に開示されている特定の化合物を含めた先行技術において公知の化合物は、特許請求に含まれるものではないことが理解されるべきである。
【０２９３】
マーカッシュ群または他の群分けが本明細書で使用される場合、群の個々のメンバーの全てならびに群の可能性のある全ての組合せおよび部分組合せが本開示に個別に包含されるものとする。
【０２９４】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が本明細書で使用される場合、これらは、参照されている明記された特徴、整数、ステップ、または構成成分の存在を明示するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、構成成分、またはその群の存在または追加を妨げるものではないものと解釈されるべきである。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」という用語が場合によって文法上類似した用語、例えば；「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ／ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ））」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ／ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ）  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」と交換され、それにより、必ずしも同一の広がりを有さない別の実施形態を説明する本開示の別々の実施形態も包含される。明瞭にするために、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書で使用される場合、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義であり、包括的または無制限なものであり、これにより、追加的な、列挙されていない要素または方法のステップは排除されない。本明細書で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」により、特許請求された要素に明示されていない要素、ステップ、構成成分、または成分はいずれも排除される。本明細書で使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」により、請求項の基本的な特性および新規の特性に実質的に影響を及ぼさない（例えば、活性成分に影響を及ぼさない）材料またはステップは排除されない。本明細書の各例において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、いずれも、他の２つの用語と置き換えることができる。本明細書に例示的に記載されている本開示は、本明細書において具体的には開示されていない１つまたは複数の要素、１つまたは複数の限定のいずれも存在しない状態で実施することができることが適切である。
【０２９５】
本開示は、種々の特定の好ましい実施形態および技法を参照して説明されている。しかし、本開示の主旨および範囲から逸脱せずに多くの変形および修飾がなされ得ることが理解されるべきである。本明細書に具体的に記載されているもの以外の組成物、方法、デバイス、デバイスの要素、材料、任意選択の特徴、手順および技法を、過度な実験に頼ることなく、本明細書に開示されている通り広範に本開示の実施に適用することができることが当業者には理解されよう。本明細書に記載されている組成物、方法、デバイス、デバイスの要素、材料、手順および技法の当技術分野で公知の機能的等価物ならびにその一部は全て、本開示に包含されるものとする。範囲が開示されている場合はいつでも、部分範囲および個々の値のすべてが包含されるものとする。本開示は、例または例証として示されており限定として示されているのではない、図に示されているものまたは本明細書に例示されているいかなるものも含めた、開示されている実施形態によって限定されるものではない。本明細書において提供されるいくつかの参考文献は、本開示の追加的な出発材料、追加的な合成方法、および追加的な分析方法および追加的な使用にかかわる詳細を提供するために参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９６】
本開示は、目的を実行し、言及された結果および利点ならびに本発明に固有の結果および利点を得るために十分に適合することが当業者には容易に理解されよう。現在好ましい実施形態を表す本明細書に記載の組成物および方法および付帯的方法は例示的なものであり、本開示の範囲を限定するものではない。本開示の主旨に包含されるその変化および他の使用が当業者には想起されよう。
【０２９７】
参考文献
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【０２９８】
米国特許
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米国特許第6,699,658号;1998年1月20日出願;2004年3月2日発行;  Board  of  Trustees
University  of  Illinois.  Yeast  cell  surface  display  of  proteins  and  uses  thereof.
米国特許第6,696,251号;2000年11月28日出願;2004年2月24日発行;  Board  of  Trustees  University  of  Illinois.  Yeast  cell  surface  display  of  proteins  and
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米国特許第6,423,538号;2000年11月28日出願;2002年7月23日発行;  Board  of  Trustees  University  of  Illinois.  Yeast  cell  surface  display  of  proteins  and
uses  thereof.
米国特許第6,300,065号;1998年8月26日出願;2001年10月9日発行;  Board  of  Trustees  University  of  Illinois.  Yeast  cell  surface  display  of  proteins  and  uses  thereof.
米国特許第8,143,376号;2005年5月18日出願;2012年3月27日発行;  Immunocore  Limited;  High  affinity  NY-ESO  T  cell  receptor.
米国特許第8,088,379号;2007年9月26日出願;2012年1月3日発行;  Immunocore  Limited;  Modified  T  cell  receptors  and  related  materials  and  methods.
米国特許第8,017,730号;2006年5月19日出願;2011年9月13日発行;  Immunocore  Limited;  T  cell  receptors  which  bind  to  antigen-HLA-A24.
米国特許第7,763,718号;2007年10月29日出願;2010年7月27日発行;  Immunocore  Limited;  Soluble  T  cell  receptors.
米国特許第7,666,604号;2003年7月9日出願;2010年2月23日発行;  Immunocore  Limited;  Modified  soluble  T  cell  receptor.
米国特許第7,608,410号;2008年10月7日出願;2009年10月27日発行;  Immunocore  Limited;  Method  of  improving  T  cell  receptors.
米国特許第7,569,664号;2003年10月3日出願;2009年8月4日発行;  Immunocore  Limited;  Single  chain  recombinant  T  cell  receptors.
米国特許第8,105,830号;2002年11月5日出願;2012年1月31日発行;  Altor  Bioscience  Corporation;  Polyspecific  binding  molecules  and  uses  thereof.
米国特許第6,534,633号;1999年10月21日出願;2003年3月3日;  Altor  Bioscience  Corporation;  Polyspecific  binding  molecules  and  uses  thereof.
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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