(57)【要約】      （修正有）【課題】試料中の少なくとも1つの分析物の濃度を定量的に測定する方法を提供する。【解決手段】この方法は、（i）試料の一部を第1の分析物の分析配合物および分析物の分析参照配合物に加えて、第1の分析物試料および分析物参照試料を生成し、試料中の少なくとも1つの分析物の濃度を決定するステップ、および／または（ii）試料の一部を第2の分析物の分析配合物に加え、試料中の少なくとも1つの分析物の濃度を決定するステップを含む。また、配合物、パーツキット、システムおよび方法に関連するコンピュータに実装された方法を含む。【選択図】図３
2018185335.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の少なくとも1つの分析物の濃度を定量的に測定する方法であって、
i）（a）前記試料の一部を、第1の分析物錯化試薬を含む第1の分析物の分析配合物に加えて、第1の分析物試料を生成するステップと、
（b）前記試料の一部を、前記第1の分析物の分析配合物と同じであるが、前記分析物を変性させるかまたは前記分析物と前記第1の分析物錯化試薬との間での錯体の形成を遮断
する試薬をさらに含む点が異なる、分析物の分析参照配合物に加えて、分析物参照試料を生成するステップと、
（c）前記第1の分析物試料および分析物参照試料の吸光度スペクトルを測定することにより、前記試料中の少なくとも1つの分析物の濃度を決定し、前記第1の分析物試料と前記分析物参照試料との吸光度スペクトル間の差を計算して、第1の事前に設定された分析物
濃度の較正曲線に対して得られた前記差スペクトルを比較するステップ、
および／または
ii）（a）前記試料の一部を、第2の分析物錯化試薬を含む第2の分析物の分析配合物に
加えて、第2の分析物試料を生成するステップと、
（b）一定の期間にわたり前記第2の分析物試料中の分析物の吸光度スペクトル測定することにより、前記試料中の少なくとも1つの分析物の濃度を決定し、前記期間にわたり前
記第2の分析物試料の吸光度変化の速度を計算し、分析物濃度の第2の事前に設定された分析物濃度の較正曲線に対して得られた前記速度を比較するステップと、を含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも1つの分析物はアルブミンであり、前記方法が、
前記試料の一部を、
A）アルブミン試料を生成するためのアルブミン錯化試薬を含むアルブミン分析試料配
合物、および
B）アルブミン参照試料を生成するための、前記アルブミン分析配合物と同じであるが
、アニオン性界面活性剤をさらに含む点が異なるアルブミン分析参照配合物
のそれぞれに加えるステップと、
前記アルブミン試料および前記アルブミン参照試料の吸光度スペクトルを測定することにより、前記試料中のアルブミンの濃度を決定し、前記アルブミン試料と前記アルブミン参照試料との吸光度スペクトル間の差を計算し、事前に設定されたアルブミン濃度の較正曲線に対し、得られた前記差スペクトルを比較するステップとを含む、請求項1に記載の方
法。
【請求項３】
前記少なくとも1つの分析物がクレアチニンであり、前記方法が、前記試料の一部をク
レアチニン錯化試薬を含むクレアチニン分析試料配合物に加え、クレアチニン試料を生成するステップ、および一定の期間にわたり前記クレアチニン試料の吸光度スペクトルの変化を測定することにより、前記試料中のクレアチニンの濃度を決定し、前記期間にわたる前記クレアチニン試料の吸光度変化の速度を計算し、事前に設定されたクレアチニン濃度の較正曲線に対して、前記得られた速度を比較するステップを含む、請求項1に記載の方
法。
【請求項４】
前記少なくとも1つの分析物がアルブミンおよびクレアチニンであり、前記方法が、
a）請求項1（ii）または請求項3の方法に従って前記試料中のクレアチニンの濃度を決
定するステップと、
b）請求項1（i）または請求項2の方法に従って前記試料中のアルブミンの濃度を決定するステップと、を含み、
前記試料のアルブミン／クレアチニン比を決定するステップをさらに含む、請求項1に記
載の方法。
【請求項５】
1種または複数種の前記配合物が凍結乾燥される、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
全ての前記配合物が凍結乾燥されるおよび／または前記試料が尿試料である、請求項5
に記載の方法。
【請求項７】
前記アルブミンの濃度を決定するステップが、前記アルブミン試料およびアルブミン参照試料の625nmでの吸光度スペクトルの測定を必要とする、請求項2および4〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記アルブミンの濃度を決定するステップが、約5分の時間での吸光度スペクトルの測
定を必要とする、請求項2および4〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記クレアチニンの濃度を決定するステップが、前記クレアチニン試料の525nmでの吸
光度変化の速度を決定することを必要とする、請求項3および4〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記検知時間枠が約1分から約10分までである、請求項1（ii）、3〜6および9のいずれ
か1項に記載の方法。
【請求項１１】
動力学的測定が、前記第2の分析配合物または前記クレアチニン分析配合物への前記試
料の添加から30秒で始まり、10分で終わる、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記動力学的測定が、前記第2の分析配合物または前記クレアチニン分析配合物への前
記試料の添加から1分で始まり、5〜10分の時間で終わる、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、前記クレアチニン濃度および前記アルブミン濃度を同時に決定することを含む、請求項4〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アルブミン分析配合物が、
アルブミンと反応してアルブミン錯体を生成する約0.1〜約1.5g/Lの濃度の化合物と、
約10〜約50g/Lの濃度の強塩基と、
約50〜約250g/Lの濃度の緩衝液と、
約1〜約20g/Lの濃度の第1の非イオン性界面活性剤と、
約0.1〜約3g/Lの濃度の防腐剤と、
を含む水溶液である、請求項2および4〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アルブミン分析参照配合物が、請求項14に記載のアルブミン分析試料配合物と同じであるが、アニオン性界面活性剤をさらに含む、請求項2および4〜13のいずれか1項に記
載の方法。
【請求項１６】
前記アニオン性界面活性剤が、前記配合物の約0.1〜5重量％の量で存在する、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
アルブミンと反応してアルブミン錯体を生成する前記化合物が、ブロモクレゾールグリーンである、請求項14〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記アルブミン分析試料配合物および前記アルブミン分析参照配合物が凍結乾燥される、請求項14〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記アルブミン分析試料配合物および前記アルブミン分析参照配合物が、第2の非イオ
ン性界面活性剤を約10〜約200g/Lの濃度でさらに含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記事前に設定されたアルブミン濃度の較正曲線が、尿試料中のアルブミン濃度の定量的測定に使用するためのコンピュータ実装較正曲線生成方法により得られ、前記方法が、
複数のアルブミン不含尿試料のアルブミン不含試料吸光度およびアルブミン不含参照吸光度を表す第1の吸光度データを得るステップであって、前記アルブミン不含試料吸光度
が、アルブミン錯化試薬の存在下で、アルブミン不含尿試料のそれぞれの第1の部分に対
する吸光度を含み、前記アルブミン不含参照吸光度が、前記アルブミン錯化試薬の存在下で、および追加的に、アルブミン変性試薬またはアルブミンと前記アルブミン錯化試薬との間での錯体の形成を遮断する試薬の存在下で、前記アルブミン不含尿試料のそれぞれの第2の部分に対する吸光度を含むステップと、
前記アルブミン不含試料吸光度と前記アルブミン不含参照吸光度との間の関数関係を計算により当てはめて、調節パラメータを得るステップと、
既知のアルブミン濃度を有する複数の尿試料に対し試料吸光度および参照吸光度を表す第2の吸光度データを得るステップであって、前記試料吸光度が、前記アルブミン錯化試
薬の存在下で、前記尿試料のそれぞれの第1の部分に対する吸光度を含み、前記参照吸光
度が、前記アルブミン錯化試薬の存在下で、および追加的に前記アルブミン変性試薬またはアルブミンと前記アルブミン錯化試薬との間での錯体の形成を遮断する試薬の存在下で、前記尿試料のそれぞれの第2の部分に対する吸光度を含むステップと、
前記調節パラメータを使って前記参照吸光度を調節し、それにより、調節された参照吸光度を得るステップと、
前記試料吸光度、前記調節された参照吸光度および前記既知の濃度の間の関数関係を計算により当てはめて前記較正曲線のパラメータを得るステップと、
を含む、請求項1（i）、2、4〜8および13〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
前記アルブミン不含試料吸光度と前記アルブミン不含参照吸光度の間の関数関係が数式１
【数１】
2018185335.tif 000023
であり、式中、AOSは前記アルブミン不含試料吸光度、AORは前記アルブミン不含参照吸光度であり、aとbは前記調節パラメータである、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記調節された参照吸光度が数式２
【数２】
2018185335.tif 000024
に従って計算され、
式中、A*Rは前記参照吸光度である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料吸光度、前記調節された参照吸光度および前記既知の濃度の間の関数関係が数式３
【数３】
2018185335.tif 000025
であり、式中A*Sは前記試料吸光度、C*Albは前記既知の濃度であり、a、bおよびAが前記
較正曲線のパラメータである、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記クレアチニン試料分析配合物が、
クレアチニンと反応してクレアチニン錯体を生成する化合物と、
約40〜約80g/Lの濃度の強塩基と、
約50〜約250g/Lの濃度の緩衝液と、
約0.1〜約20g/Lの濃度の少なくとも1種の界面活性剤と、
を含む水溶液である、請求項3〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
クレアチニンと反応してクレアチニン錯体を生成する前記化合物が、ジニトロ安息香酸またはピクリン酸である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
クレアチニンと反応してクレアチニン錯体を生成する前記化合物が、ジニトロ安息香酸である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
クレアチニンと反応してクレアチニン錯体を生成する前記化合物の濃度が、約1〜約5g/Lである、請求項24または請求項25に記載の方法。
【請求項２８】
前記クレアチニン分析試料配合物の少なくとも1種の界面活性剤が、約0.1〜約10g/Lの
濃度のアニオン性界面活性剤および約0.1〜約10g/Lの濃度のカチオン性界面活性剤をさらに含み、任意選択で、カチオン性界面活性剤：アニオン性界面活性剤の比が1:5である、
請求項24〜27のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
前記クレアチニン分析試料配合物が凍結乾燥され、任意選択で前記クレアチニン分析試料配合物が前記配合物の約1〜約40重量％の量の増量剤をさらに含む、請求項24〜28のい
ずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
前記クレアチニン分析試料配合物中の緩衝液：強塩基のモル濃度比が、0.5:1〜2.5:1、例えば、1:1〜1.5:5、例えば、1.25:1である、請求項24〜29のいずれか1項に記載の方法
。
【請求項３１】
試料の前記クレアチニン濃度の分析に使用するための配合物であって、
約40〜約80g/Lの濃度の強塩基と、
約50〜約250g/Lの濃度の緩衝液と、
約0.1〜約20g/Lの濃度の少なくとも1種の界面活性剤と、
水と、
を含む配合物。
【請求項３２】
クレアチニンと反応してクレアチニン錯体を生成する化合物をさらに含む、請求項31に記載の配合物。
【請求項３３】
クレアチニンと反応してクレアチニン錯体を生成する前記化合物が、ジニトロ安息香酸またはピクリン酸である、請求項32に記載の配合物。
【請求項３４】
クレアチニンと反応してクレアチニン錯体を生成する前記化合物が、ジニトロ安息香酸である、請求項33に記載の配合物。
【請求項３５】
クレアチニンと反応してクレアチニン錯体を生成する前記化合物の濃度が、約1〜約5g/Lである、請求項32〜34のいずれか1項に記載の配合物。
【請求項３６】
前記少なくとも1種の界面活性剤が、約0.1〜約10g/Lの濃度のアニオン性界面活性剤お
よび約0.1〜約10g/Lの濃度のカチオン性界面活性剤を含み、任意選択で、カチオン性界面活性剤：アニオン性界面活性剤の比が1:5である、請求項31〜35のいずれか1項に記載の配合物。
【請求項３７】
（a）前記少なくとも1種の界面活性剤がカチオン性界面活性剤を含む場合には、それは、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、臭化セトリモニウム、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム、および臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムからなる群の1種または複数種
から選択され、および／または
（b）前記少なくとも1種の界面活性剤がアニオン性界面活性剤を含む場合には、それは、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリスチレンスルホネート、直鎖アルキルベンゼンスルホネート、2級アルコールスルホネート、アルコールオレフィンスルホネート、およびアルコ
ールスルフェートからなる群の1種または複数種から選択され、および／または
（c）前記緩衝液が、K2HPO4、Na2HPO4、およびホウ酸塩からなる群の1種または複数種
から選択され、および／または
（d）前記強塩基が、NaOHおよび／またはKOHである、
請求項31〜36のいずれか1項に記載の配合物。
【請求項３８】
前記配合物が凍結乾燥される、請求項31〜37のいずれか1項に記載の配合物。
【請求項３９】
前記配合物が、前記配合物の約1〜約40重量％の量の増量剤を含み、任意選択で、前記
増量剤が糖マンニトール、ラクトースおよびトレハロースからなる群の1種または複数種
から選択される、請求項38に記載の配合物。
【請求項４０】
前記配合物中の前記緩衝液：強塩基の濃度比が、0.5:1〜2.5:1、例えば、1:1〜1.5:5、例えば、1.25:1である、請求項31〜39のいずれか1項に記載の配合物。
【請求項４１】
試料のアルブミン濃度の分析に使用するための配合物であって、
アルブミンと反応してアルブミン錯体を生成する約0.1〜約1.5g/Lの濃度の化合物と、
約10〜約50g/Lの濃度の強塩基と、
約50〜約250g/Lの濃度の緩衝液と、
約1〜約20g/Lの濃度の第1の非イオン性界面活性剤と、
約0.1〜約3g/Lの濃度の防腐剤と、
水と、
を含む配合物。
【請求項４２】
前記配合物が、アニオン性界面活性剤をさらに含む、請求項39に記載の配合物。
【請求項４３】
前記アニオン性界面活性剤が、前記配合物の約0.1〜5重量％で存在する、請求項42に記載の配合物。
【請求項４４】
前記アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリスチレンスルホネート、直鎖アルキルベンゼンスルホネート、2級アルコールスルホネート、アルコールオレフィ
ンスルホネート、およびアルコールスルフェートからなる群の1種または複数種から選択
される、請求項42または請求項43に記載の配合物。
【請求項４５】
アルブミンと反応してアルブミン錯体を生成する前記化合物が、ブロモクレゾールグリーンである、請求項41〜44のいずれか1項に記載の配合物。
【請求項４６】
（a）前記緩衝液が、N−（1−アセトアミド）−2−アミノエタンスルホン酸、酢酸ナトリウム、N−（2−アセトアミド）イミノ二酢酸、2−アミノ−2−メチル−1−プロパノー
ル、2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール、N−（1,1−ジメチル−2−ヒドロキシエチル）−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、N,N−ビス（2−ヒドロキシエチル）−2−アミノエタンスルホン酸、炭酸水素ナトリウム、N,N−ビス（2−ヒドロキ
シエチル）グリシン、ビス（2−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）
メタン、1,3−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン、3−シクロヘキシルアミノ）−1−プロパンスルホン酸、3−（シクロヘキシルアミノ）−2−ヒドロキ
シ−1−プロパンスルホン酸、2−（N−シクロヘキシルアミン）エタンスルホン酸、クエ
ン三酸ナトリウム、N,N−ビス（2−ヒドロキシエチル）−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、4−（2−ヒドロキシエチル）ピペラジン−1−エタンスルホン酸、4−（2−ヒドロキシエチル）ピペラジン−1−プロパンスルホン酸、4−（2−ヒドロキシエチル）ピペラジン−1（2−ヒドロキシ）プロパンスルホン酸、2−モルホリノエタンスルホン
酸、3−モルホリノプロパンスルホン酸、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホ
ン酸、ピペラジン−1,4−ビス（2−エタンスルホン酸）、ピペラジン−1,4−ビス（2−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、N−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−3−アミノプロパンスルホン酸、N−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−3−アミノ−2−ヒド
ロキシプロパンスルホン酸、N−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−2−アミノエタンスルホン酸、N−［トリス−（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン、およびコハク酸からなる群の1種または複数種から選択され
、および／または
（b）前記第1の非イオン性界面活性剤が、ブリージ、ポリ（プロピレングリコール）、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル、トリトンX-100、ツイーン、Zonyl（商標）FSNフッ素系界面活性剤、ALKANOL（商標）6112界面活性剤、ポリエチレングリコールからなる群の1種または複数種から選択され、任意選択で、前記第1の非イオン性界面活性剤はブリージであり、および／または
（c）前記防腐剤が、糖、ソルビン酸、安息香酸、プロピオン酸カルシウム、亜硝酸ナ
トリウム、アジ化ナトリウム、サルファイト、EDTA二ナトリウムおよび抗酸化剤からなる群の1種または複数種から選択され、および／または
（d）前記強塩基が、NaOHおよび／またはKOHである、
請求項41〜44のいずれか1項に記載の配合物。
【請求項４７】
前記配合物が凍結乾燥される、請求項41〜46のいずれか1項に記載の配合物。
【請求項４８】
前記配合物が、前記配合物の約10〜約200g/Lの量の第2の非イオン性界面活性剤をさら
に含む、請求項47に記載の配合物。
【請求項４９】
前記第2の非イオン性界面活性剤が、ブリージ、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ
エチレングリコールヘキサデシルエーテル、トリトンX-100、ツイーン、Zonyl（商標）FSNフッ素系界面活性剤、ALKANOL（商標）6112界面活性剤、ポリエチレングリコールからなる群の1種または複数種から選択され、但し、前記第1と第2の非イオン性界面活性剤が相
互に異なり、任意選択で、前記第2の非イオン性界面活性剤がポリエチレングリコールで
ある、請求項48に記載の配合物。
【請求項５０】
請求項38〜40のいずれか1項に記載の試料のクレアチニン濃度の分析に使用するための
前記凍結乾燥配合物、または請求項46〜49のいずれか1項に記載の試料のアルブミン濃度
の分析に使用するための前記凍結乾燥配合物の調製方法であって、
（a）前記所定の化学成分を一緒に混合し、得られた混合物を濾過し、前記混合物を容
器中に計量分配し、前記容器を凍結乾燥装置中に入れるステップと、
（b）前記試料を約-20℃〜約-80℃の温度で約0.5時間〜5時間の範囲の一定時間凍結す
るステップと、
（c）前記試料を約-10℃〜約-30℃の温度で約1時間〜5時間の範囲の一定時間アニーリ
ングするステップと、
（d）前記試料を約-20℃〜約-80℃の温度で約0.5時間〜5時間の範囲の一定時間再凍結
するステップと、
（e）約-10℃〜約-30℃の温度で約5時間〜50時間の範囲の一定時間、第1の乾燥サイク
ルを行うステップと、
（f）約0℃〜約60℃の温度で約1時間〜20時間の範囲の一定時間、第2の乾燥サイクルを行うステップと、
を含む方法。
【請求項５１】
前記容器が、エッペンドルフチューブ、96ウエルプレート、市販キュベットまたは密着イメージセンサモジュールを含む装置での使用に適合させたキュベットからなる群から選択される、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
前記方法が、前記凍結乾燥配合物を保持する前記容器を、光、酸素および湿気から離して貯蔵することをさらに含む、請求項50または請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
（a）請求項33〜40のいずれか1項に記載の配合によるクレアチニン分析配合物、および／または
（b）請求項41および45〜49のいずれか1項に記載の配合によるアルブミン分析配合物、および
請求項32〜49のいずれか1項に記載の配合によるアルブミン参照配合物
を含む、パーツキット。
【請求項５４】
それぞれの凍結乾燥配合物が個別に、エッペンドルフチューブ、キュベット、密着イメージセンサモジュールを含む装置での使用に適合させたキュベットまたは96ウエルプレート中の別のウエルに含まれている、請求項53に記載のパーツキット。
【請求項５５】
前記配合物が、光、酸素および湿気から離して貯蔵される、請求項53または54に記載のパーツキット。
【請求項５６】
尿試料中のアルブミン濃度の定量的測定に使用するためのコンピュータ実装較正曲線生成方法であって、
複数のアルブミン不含尿試料に対しアルブミン不含試料吸光度およびアルブミン不含参照吸光度を表す第1の吸光度データを得るステップであって、前記アルブミン不含試料吸
光度が、アルブミン錯化試薬の存在下で、前記アルブミン不含尿試料のそれぞれの第1の
部分に対する吸光度を含み、前記アルブミン不含参照吸光度が、前記アルブミン錯化試薬の存在下で、および追加的に、アルブミン変性試薬またはアルブミンと前記アルブミン錯化試薬との間での錯体の形成を遮断する試薬の存在下で、前記アルブミン不含尿試料のそれぞれの第2の部分に対する吸光度を含むステップと、
前記アルブミン不含試料吸光度と前記アルブミン不含参照吸光度との間の関数関係を計算により当てはめて、調節パラメータを得るステップと、
既知のアルブミン濃度を有する複数の尿試料に対し試料吸光度および参照吸光度を表す第2の吸光度データを得るステップであって、前記試料吸光度が、前記アルブミン錯化試
薬の存在下で、前記尿試料のそれぞれの第1の部分に対する吸光度を含み、前記参照吸光
度が、前記アルブミン錯化試薬の存在下で、および追加的に前記アルブミン変性試薬またはアルブミンと前記アルブミン錯化試薬との間での錯体の形成を遮断する試薬の存在下で、前記尿試料のそれぞれの第2の部分に対する吸光度を含むステップと、
前記調節パラメータを使って前記参照吸光度を調節し、それにより、調節された参照吸光度を得るステップと、
前記試料吸光度、前記調節された参照吸光度および前記既知の濃度の間の関数関係を計算により当てはめて前記較正曲線のパラメータを得るステップと、
を含む方法。
【請求項５７】
前記アルブミン不含試料吸光度と前記アルブミン不含参照吸光度との間の関数関係が数式１であり、式中、AOSは前記アルブミン不含試料吸光度、AORは前記アルブミン不含参照吸光度であり、aとbは前記調節パラメータである、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
前記調節された参照吸光度が数式２に従って計算され、式中、A*Rは前記参照吸光度で
ある、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
前記試料吸光度、前記調節された参照吸光度および前記既知の濃度の間の関数関係が数式３であり、式中、A*Sは前記試料吸光度、C*Albは前記既知の濃度であり、したがってa
、bおよびAは前記較正曲線のパラメータである、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
尿試料中のアルブミン濃度の定量的測定に使用するための較正曲線生成システムであって、
複数のアルブミン不含尿試料のアルブミン不含試料吸光度およびアルブミン不含参照吸光度を表す第1の吸光度データを保存する記憶装置であって、前記アルブミン不含試料吸
光度が、アルブミン錯化試薬の存在下で、前記アルブミン不含尿試料のそれぞれの第1の
部分に対する吸光度を含み、前記アルブミン不含参照吸光度が、前記アルブミン錯化試薬の存在下で、および追加的に、アルブミン変性試薬またはアルブミンと前記アルブミン錯化試薬との間での錯体の形成を遮断する試薬の存在下で、前記アルブミン不含尿試料のそれぞれの第2の部分に対する吸光度を含み、
既知のアルブミン濃度を有する複数の尿試料に対し試料吸光度および参照吸光度を表す第2の吸光度データをさらに保存し、前記試料吸光度が、前記アルブミン錯化試薬の存在
下で、前記尿試料のそれぞれの第1の部分に対する吸光度を含み、前記参照吸光度が、前
記アルブミン錯化試薬の存在下で、および追加的に前記アルブミン変性試薬またはアルブミンと前記アルブミン錯化試薬との間での錯体の形成を遮断する試薬の存在下で、前記尿試料のそれぞれの第2の部分に対する吸光度を含む記憶装置と、
前記アルブミン不含試料吸光度と前記アルブミン不含参照吸光度との間の関数関係を計算により当てはめて、調節パラメータを得るように構成された第1の当てはめコンポーネ
ントと、
前記調節パラメータを使って前記参照吸光度を調節し、それにより、調節された参照吸光度を得るように構成された吸光度調節コンポーネントと、
前記試料吸光度、前記調節された参照吸光度および前記既知の濃度の間の関数関係を計算により当てはめて、較正曲線のパラメータを得るように構成された第2の当てはめコン
ポーネントと、
を含むシステム。
【請求項６１】
前記アルブミン不含試料吸光度と前記アルブミン不含参照吸光度の間の関数関係が、数式１であり、式中、AOSは前記アルブミン不含試料吸光度、AORは前記アルブミン不含参照吸光度であり、aとbは前記調節パラメータである、請求項60に記載のシステム。
【請求項６２】
前記吸光度調節コンポーネントが数式２に従って前記調節された参照吸光度を計算するように構成され、式中、A*Rは前記参照吸光度である、請求項61に記載のシステム。
【請求項６３】
前記試料吸光度、前記調節された参照吸光度および前記既知の濃度の間の関数関係が数
式３であり、式中、A*Sは前記試料吸光度、C*Albは前記既知の濃度であり、a、bおよびA
が前記較正曲線のパラメータである、請求項62に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿検査装置および尿検査用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
尿検査は、腎臓および尿路の解剖学的構造および機能についての情報源である。尿検査により糖尿病などの全身性疾患の状態への洞察が得られる。尿検査のための試験片、または尿試験紙の使用は、単純なプロトコルであり、非常に費用対効果が大きいという理由から、健康診断の目的で広く受け入れられている。
【０００３】
尿試験紙による尿検査は便利であるが、看護師などの人間の目により行われる場合、色変化の識別力が原因で偽陽性および偽陰性の結果が生じる場合がある。
【０００４】
慢性腎疾患（CKD）は初期段階で微量アルブミン測定により診断することができる。微
量アルブミンの定量的測定のための「至適基準」は24時間の尿収集から構成されるが、患者にとって、これは極めて時間がかかり、面倒なことである。その代わりに、随時尿検査が微量アルブミン検査として最もよく使用されており、これには、尿試料中の尿濃度の変動を補償するために、クレアチニンを使った尿アルブミン/クレアチニン比（ACR）の測定が必要である。
【０００５】
ACRはまた、腎不全のリスクに対する予後因子として使用するために測定する有用なパ
ラメータでもある。処置中のACR値のモニタリングも有用であり、患者の生活の質（QOL）を改善するためには、ポイント・オブ・ケア装置が必要である。
【０００６】
現在では、市場で入手可能な尿検査用のポイント・オブ・ケア装置の大部分は、半定量的であり、試験片および試験片読取器を使用している。家庭用または臨床用途用の定量的ポイント・オブ・ケア装置が望まれる。
【０００７】
例えば、定量的尿検査結果は、病院および臨床検査室で自動尿分析計を使って得ることができる。尿分析計は通常、卓上装置または完全自動化血清／尿分析計などのより大きな設備の一部である。したがって、これらの定量的尿検査ユニットの利便性は集中化されており、田舎の地域に住んでいる人の適切な診断試験の利用が制限されてきた。
【０００８】
尿試料は、大きなpH変動があり、測定結果はまた、周囲（すなわち試験場所）の温度によっても影響を受ける。現在の定量的分析法は尿により引き起こされる干渉を除くために試料希釈が必要である。さらに、尿検査用の比色分析の液体試薬は冷蔵庫中に保持する必要があり、これは家庭または臨床用途に適さない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４１１１６５７号明細書
【特許文献２】米国特許第３７０５０１３号明細書
【特許文献３】欧州特許出願公開第１３６２９２５号明細書
【特許文献４】国際公開第１９９８／０１０４２９号
【特許文献５】米国特許第５５５８８３４号明細書
【特許文献６】中国特許出願公開第１０１２２１１８３号
【特許文献７】中国特許出願公開第１０３２７８６４８号
【特許文献８】国際公開第１９８４／００３９４８号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】BACON et al., “Kinetic Study of the Jaffe Reaction for Quantifying Creatinine in Serum: 2, Evaluation of Buffered Reagent and Comparison of Different Data-Processing Options”, Clinical Chemistry, 1989, Vol.35, No.3, Page 360-363
【非特許文献２】SCHIFREEN et al., “Diethylamine Prevents Precipitation in the Alkaline Buffer Reagent for the Kinetic Jaffe Determination of Serum Creatinine”, Clinical Chemistry, 1981, Vol.27, No.1, page 196-197
【非特許文献３】NOZAKI Y et al., “The Interaction of a Cationic Detergent with Bovine Serum Albumin and Other Proteins”, The Journal of Biological Chemistry, 1974, Vol.249, No.14, Page 4452-4459
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記で指摘したように、現在の定量システムにおけるpHの影響または干渉を最小限にするために、尿試料は、強酸または強アルカリに加えて、大量の緩衝液で希釈される。試験室の温度の影響を最小限にするために、分析に使用される装置に冷却システムが導入されるが、この冷却システムは装置を嵩高いものにする。得られた装置のサイズは輸送を困難にし、臨床検査室設定以外の用途で使用できなくする。
【００１２】
さらに、尿検査で使われる試薬は、反応の間にまたは試薬への試料の添加で泡形成が起こる場合がある。これは、光散乱による正確さの低下に繋がる可能性がある。
【００１３】
現在の定量装置では、データを正規化するために、一連のpHおよび／または温度条件下での内部参照表が通常用意されているが、参照表の作成は面倒であり、干渉のタイプに応じて、正規化することができる範囲に制限がある。このことから、結果は全ての患者に対して正確なものとはいえない。
【００１４】
上記から分かるように、これらの問題は、少なくとも部分的には、現在利用可能な試験に使われる試薬が理由で生じている。
【００１５】
上記のことから、移動式で費用対効果が大きい、より正確な尿検査設備に対する必要性が残されている。さらに、簡略化装置と共に使用するために適合させることができ、結果の正確さを高めるのに役立つ分析試薬に対する必要性が残されている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の態様および実施形態は請求項1〜63に列挙されており、また、以下でさらに詳
しく考察されている。
【００１７】
本発明の第1の態様では、試料中の少なくとも1つの分析物の濃度を定量的に測定する方法が提供され、該方法は、
i）（a）試料の一部を、第1の分析物錯化試薬を含む第1の分析物の分析配合物に加えて、第1の分析物試料を生成するステップと、
（b）試料の一部を、第1の分析物の分析配合物と同じであるが、分析物を変性させるかまたは分析物と第1の分析物錯化試薬との間での錯体の形成を遮断する試薬をさらに含む
点が異なる、分析物の分析参照配合物に加えて、分析物参照試料を生成するステップと、
（c）第1の分析物試料および分析物参照試料の吸光度スペクトルを測定することにより、試料中の少なくとも1つの分析物の濃度を決定し、第1の分析物試料と分析物参照試料の吸光度スペクトルの間の差を計算して、第1の事前に設定された分析物濃度の較正曲線に
対して、得られた差スペクトルを比較するステップ、
および／または
ii）（a）試料の一部を、第2の分析物錯化試薬を含む第2の分析物の分析配合物に加え
て、第2の分析物試料を生成するステップと、
（b）一定の期間にわたり第2の分析物試料中の分析物の吸光度スペクトル測定することにより、試料中の少なくとも1つの分析物の濃度を決定し、前記期間にわたり第2の分析物試料の吸光度変化の速度を計算し、第2の事前に設定された分析物濃度の較正曲線に対し
て、得られた速度を比較するステップと、を含む。
【００１８】
本発明の一実施形態では、少なくとも1つの分析物はアルブミンであり、該方法は、
試料の一部を、
A）アルブミン試料を生成するためのアルブミン錯化試薬を含むアルブミン分析試料配
合物、および
B）アルブミン参照試料を生成するための、アルブミン分析配合物と同じであるが、ア
ニオン性界面活性剤をさらに含む点が異なるアルブミン分析参照配合物
のそれぞれに加えるステップと、
アルブミン試料およびアルブミン参照試料の吸光度スペクトルを測定することにより、試料中のアルブミンの濃度を決定し、アルブミン試料とアルブミン参照試料との吸光度スペクトル間の差を計算し、事前に設定されたアルブミン濃度の較正曲線に対し、得られた差スペクトルを比較するステップと
を含む。
【００１９】
本発明の代替的実施形態では、少なくとも1つの分析物がクレアチニンであり、該方法
は、試料の一部をクレアチニン錯化試薬を含むクレアチニン分析試料配合物に加え、クレアチニン試料を生成するステップ、および一定の期間にわたりクレアチニン試料の吸光度スペクトルの変化を測定することにより、試料中のクレアチニンの濃度を決定し、前記期間にわたるクレアチニン試料の吸光度変化の速度を計算し、事前に設定されたクレアチニン濃度の較正曲線に対して、得られた速度を比較するステップを含む。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態では、少なくとも1つの分析物はアルブミンおよびクレアチ
ニンであり、該方法は、
a）上記の方法に従って試料中のクレアチニンの濃度を決定するステップと、
b）上記の方法に従って試料中のアルブミンの濃度を決定するステップと、を含み、
試料のアルブミン／クレアチニン比を決定するステップをさらに含む。
【００２１】
本発明の特定の実施形態では、1種または複数種の配合物を凍結乾燥することができる
。例えば、全ての配合物が凍結乾燥される。
【００２２】
本発明の特定の実施形態では、試料は尿試料である。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態では、アルブミンの濃度を決定するステップは、
アルブミン試料およびアルブミン参照試料の625nmでの、および／または
所望の分析物配合物への試料の添加から約5分の時間での
吸光度スペクトルの測定を必要とする。
【００２４】
本発明のまたさらなる実施形態では、クレアチニンの濃度を決定するステップは、クレアチニン試料の525nmでの吸光度変化の速度を決定することを必要とする。
【００２５】
またさらなる実施形態では、クレアチニンの濃度を決定するステップは、約10秒から約10分までの期間中に吸光度を測定することを含む、クレアチニン試料の525nmでの吸光度
変化の速度を決定することを必要とする。例えば、このような動力学的測定は第2の分析
配合物またはクレアチニン分析配合物への試料の添加から30秒で始まり、10分で終わる（すなわち、動力学的測定は、第2の分析配合物またはクレアチニン分析配合物への試料添
加から1分で始まり5〜10分の時間に終わる）。
【００２６】
本発明のまたさらなる実施形態では、該方法はクレアチニン濃度およびアルブミン濃度を同時に決定することができる。
【００２７】
本発明のさらなる実施形態では、クレアチニン試料分析配合物は本発明の第2の態様で
定義されたとおりである。
【００２８】
本発明のまたさらなる実施形態では、アルブミン分析配合物は本発明の第3の態様で定
義されたとおりである。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態では、事前に設定されたアルブミン濃度の較正曲線は、尿試料中のアルブミン濃度の定量的測定に使用するためのコンピュータ実装較正曲線生成方法により得られ、方法は本発明の第6の態様で定義される。
【００３０】
本発明の第2の態様では、試料のクレアチニン濃度の分析に使用するための配合物が提
供され、この配合物は、
約40〜約80g/Lの濃度の強塩基と、
約50〜約250g/Lの濃度の緩衝液と、
約0.1〜約20g/Lの濃度の少なくとも1種の界面活性剤と、
水と、
を含む。
【００３１】
本発明の一実施形態では、配合物はクレアチニンと反応してクレアチニン錯体を生成する化合物をさらに含む。例えば、クレアチニンと反応してクレアチニン錯体を生成する化合物は、ピクリン酸または特に、ジニトロ安息香酸である。
【００３２】
特定の実施形態では、クレアチニンと反応してクレアチニン錯体を形成する化合物の濃度は、約1〜約5g/Lである。
【００３３】
本発明のさらなる実施形態では、少なくとも1種の界面活性剤は、約0.1〜約10g/Lの濃
度のアニオン性界面活性剤および約0.1〜約10g/Lの濃度のカチオン性界面活性剤を含む。
【００３４】
特定の実施形態では、カチオン性界面活性剤：アニオン性界面活性剤の比は、1:2〜1:10（例えば、1:3〜1:7、例えば、1:5）である。
【００３５】
本発明の特定の実施形態では、試料のクレアチニン濃度の分析で使用する配合物に関連して、
（a）少なくとも1種の界面活性剤がカチオン性界面活性剤を含む場合には、それは、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、臭化セトリモニウム、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム、および臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムからなる群の1種または複数種から
選択され、および／または
（b）少なくとも1種の界面活性剤がアニオン性界面活性剤を含む場合には、それは、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリスチレンスルホネート、直鎖アルキルベンゼンスルホネート、2級アルコールスルホネート、アルコールオレフィンスルホネート、およびアルコール
スルフェートからなる群の1種または複数種から選択され、および／または
（c）緩衝液はK2HPO4、Na2HPO4、およびホウ酸塩からなる群の1種または複数種から選
択され、および／または
（d）強塩基はNaOHおよび／またはKOHである。
【００３６】
本発明の特定の実施形態では、試料のクレアチニン濃度の分析に使用するための配合物が凍結乾燥される。
【００３７】
本発明のまたさらなる実施形態では、試料のクレアチニン濃度の分析に使用するための配合物は、配合物の約1〜約40重量％の量の増量剤を含み、任意選択で、増量剤は糖マン
ニトール、ラクトースおよびトレハロースからなる群の1種または複数種から選択される
。
【００３８】
本発明のまたさらなる実施形態では、試料のクレアチニン濃度の分析に使用するための配合物において、配合物中の緩衝液：強塩基の濃度比は、0.5:1〜2.5:1、例えば、1:1〜1.5:5、例えば、1.25:1である。
【００３９】
本発明の第3の態様では、試料のアルブミン濃度の分析に使用するための配合物が提供
され、この配合物は、
アルブミンと反応してアルブミン錯体を生成する約0.1〜約1.5g/Lの濃度の化合物と、
約10〜約50g/Lの濃度の強塩基と、
約50〜約250g/Lの濃度の緩衝液と、
約1〜約20g/Lの濃度の第1の非イオン性界面活性剤と、
約0.1〜約3g/Lの濃度の防腐剤と、
水と、
を含む。
【００４０】
本発明の実施形態では、配合物はアニオン性界面活性剤をさらに含む。特定の実施形態では、アニオン性界面活性剤は、配合物の約0.1〜5重量％で存在する。例えば、アニオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリスチレンスルホネート、直鎖アルキルベンゼンスルホネート、2級アルコールスルホネート、アルコールオレフィンスルホネート
、およびアルコールスルフェートからなる群の1種または複数種から選択される。
【００４１】
本発明の特定の実施形態では、アルブミンと反応してアルブミン錯体を生成する化合物はブロモクレゾールグリーンである。
【００４２】
本発明の特定の実施形態では、試料のアルブミン濃度の分析で使用する配合物に関連して、
（a）緩衝液は、N−（1−アセトアミド）−2−アミノエタンスルホン酸、酢酸ナトリウム、N−（2−アセトアミド）イミノ二酢酸、2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール、2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール、N−（1,1−ジメチル−2−ヒドロキシエ
チル）−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、N,N−ビス（2−ヒドロキシエチル）−2−アミノエタンスルホン酸、炭酸水素ナトリウム、N,N−ビス（2−ヒドロキシエ
チル）グリシン、ビス（2−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタ
ン、1,3−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン、3−シクロヘキシルアミノ−1−プロパンスルホン酸、3−（シクロヘキシルアミノ）−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホン酸、2−（N−シクロヘキシルアミン）エタンスルホン酸、クエン酸三ナトリウム、N,N−ビス（2−ヒドロキシエチル）−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、4−（2−ヒドロキシエチル）ピペラジン−1−エタンスルホン酸、4−（2−ヒド
ロキシエチル）ピペラジン−1−プロパンスルホン酸、4−（2−ヒドロキシエチル）ピペ
ラジン−1（2−ヒドロキシ）プロパンスルホン酸、2−モルホリノエタンスルホン酸、3−
モルホリノプロパンスルホン酸、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、ピペラジン−1,4−ビス（2−エタンスルホン酸）、ピペラジン−1,4−ビス（2−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、N−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−3−アミノプロパンスルホン酸、N−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−3−アミノ−2−ヒドロキシプ
ロパンスルホン酸、N−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−2−アミノエタンスルホン酸、N−［トリス−（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン、およびコハク酸からなる群の1種または複数種から選択され、および
／または
（b）第1の非イオン性界面活性剤は、ブリージ、ポリ（プロピレングリコール）、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル、トリトンX-100、ツイーン、Zonyl（商標）FSNフッ素系界面活性剤、ALKANOL（商標）6112界面活性剤、ポリエチレングリコールからなる群の1種または複数種から選択され、任意選択で、第1の非イオン性界面活性剤はブリージであり、および／または
（c）防腐剤は、糖、ソルビン酸、安息香酸、プロピオン酸カルシウム、亜硝酸ナトリ
ウム、アジ化ナトリウム、サルファイト、EDTA二ナトリウムおよび抗酸化剤からなる群の1種または複数種から選択され、および／または
（d）強塩基はNaOHおよび／またはKOHである。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態では、アルブミン（および参照試料）濃度の分析で使用するための配合物は凍結乾燥することができる。
【００４４】
本発明の特定の実施形態では、配合物は、配合物の約10〜約200g/Lの量の第2の非イオ
ン性界面活性剤をさらに含むことができる。例えば、第2の非イオン性界面活性剤は、ブ
リージ、ポリ（プロピレングリコール）、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル、トリトンX-100、ツイーン、Zonyl（商標）FSNフッ素系界面活性剤、ALKANOL（商標）6112界面活性剤、ポリエチレングリコールからなる群の1種または複数種から選択され、但
し、第1と第2の非イオン性界面活性剤は相互に異なり、任意選択で、第2の非イオン性界
面活性剤はポリエチレングリコールである。
【００４５】
本発明の第4の態様では、本発明の第2の態様に関して記載されたように、試料のクレアチニン濃度の分析に使用するための凍結乾燥配合物、または本発明の第3の態様に記載の
ように、試料のアルブミン濃度の分析に使用するための凍結乾燥配合物の調製方法が提供され、該方法は、
（a）所定の化学成分を一緒に混合し、得られた混合物を濾過し、前記混合物を容器中
に計量分配し、容器を凍結乾燥装置中に入れるステップと、
（b）試料を約-20℃〜約-80℃の温度で約0.5時間〜5時間の範囲の一定時間凍結するス
テップと、
（c）試料を約-10℃〜約-30℃の温度で約1時間〜5時間の範囲の一定時間アニーリング
するステップと、
（d）試料を約-20℃〜約-80℃の温度で約0.5時間〜5時間の範囲の一定時間再凍結する
ステップと、
（e）約-10℃〜約-30℃の温度で約5時間〜50時間の範囲の一定時間、第1の乾燥サイク
ルを行うステップと、
（f）約0℃〜約60℃の温度で約1時間〜20時間の範囲の一定時間、第2の乾燥サイクルを行うステップと、
を含む。
【００４６】
本発明の特定の実施形態では、容器は、エッペンドルフチューブ、96ウエルプレート、市販キュベットまたは密着イメージセンサモジュールを含む装置での使用に適したキュベットからなる群から選択される。
【００４７】
本発明のさらなる実施形態では、該方法は、凍結乾燥配合物を保持する容器を光、酸素および湿気から離して貯蔵することをさらに含むことができる。
【００４８】
本発明の第5の態様では、
（a）本発明の第2の態様の配合によるクレアチニン分析配合物、および／または
（b）本発明の第3の態様の配合によるアルブミン分析配合物およびアルブミン参照配合物
を含むパーツキットが提供される。
【００４９】
本発明の特定の実施形態では、パーツキットにおいて、それぞれの凍結乾燥配合物は個別にエッペンドルフチューブ、キュベット、密着イメージセンサモジュールを含む装置で使用するのに適したキュベットまたは96ウエルプレート中の別のウエルに含まれていてもよい。
【００５０】
特定の実施形態では、配合物は、光、酸素および湿気から離して貯蔵される。
【００５１】
本発明の第6の態様では、尿試料中のアルブミン濃度の定量的測定に使用するためのコ
ンピュータ実装較正曲線作成方法が提供され、該方法は、
複数のアルブミン不含尿試料のアルブミン不含試料吸光度およびアルブミン不含参照吸光度を表す第1の吸光度データを得るステップであって、アルブミン不含試料吸光度が、
アルブミン錯化試薬の存在下で、アルブミン不含尿試料のそれぞれの第1の部分に対する
吸光度を含み、アルブミン不含参照吸光度が、アルブミン錯化試薬の存在下で、および追加的に、アルブミン変性試薬またはアルブミンとアルブミン錯化試薬との間での錯体の形成を遮断する試薬の存在下で、アルブミン不含尿試料のそれぞれの第2の部分に対する吸
光度を含むステップと、
アルブミン不含試料吸光度とアルブミン不含参照吸光度との間の関数関係を計算により当てはめて、調節パラメータを得るステップと、
既知のアルブミン濃度を有する複数の尿試料に対し試料吸光度および参照吸光度を表す第2の吸光度データを得るステップであって、試料吸光度が、アルブミン錯化試薬の存在
下で、尿試料のそれぞれの第1の部分に対する吸光度を含み、参照吸光度が、アルブミン
錯化試薬の存在下で、および追加的にアルブミン変性試薬またはアルブミンとアルブミン錯化試薬との間での錯体の形成を遮断する試薬の存在下で、尿試料のそれぞれの第2の部
分に対する吸光度を含むステップと、
調節パラメータを使って参照吸光度を調節し、それにより、調節された参照吸光度を得るステップと、
試料吸光度、調節された参照吸光度および既知の濃度の間の関数関係を計算により当てはめて較正曲線のパラメータを得るステップと、
を含む。
【００５２】
本発明の一実施形態では、アルブミン不含試料吸光度とアルブミン不含参照吸光度の間の関数関係は、AOS＝a*AOR+bの形であり、式中、AOSはアルブミン不含試料吸光度、AORはアルブミン不含参照吸光度であり、aとbは調節パラメータである。
【００５３】
本発明のさらなる実施形態では、調節された参照吸光度は、a*A*R+bに従って計算され
、式中、A*Rは参照吸光度である。
【００５４】
本発明のまたさらなる実施形態では、試料吸光度、調節された参照吸光度および既知の濃度の間の関数関係は、A*S-(a*A*R+b)=A*C*Albの形であり、式中、A*Sは試料吸光度、C*Albは既知の濃度であり、Aは較正曲線のパラメータである。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図1はアルブミンの反応原理を示す。
【図２】図2はクレアチニンの反応原理を示す。
【図３】図3は、乾燥試薬の調製を示す。
【図４】図4は、キュベットカートリッジおよびキュベットホルダーを示す。
【図５】図5は、試料導入装置を示す。
【図６】図6は、試料導入構造を示す。
【図７】図7は、キュベットホルダーおよび光モジュールを示す。
【図８】図8は、分析方法を示す。
【図９】図9は、BCG乾燥試薬によるpHの影響の補償を示す。
【図１０】図10は、BCG乾燥試薬による温度の影響の補償を示す。
【図１１】図11は、BCG乾燥試薬の較正曲線を示す。
【図１２】図12は、データ処理の前の実際の尿試料を使ったBCG乾燥試薬の較正曲線を示す。
【図１３】図13は、AS対ARのグラフを示す。
【図１４】図14は、データ処理後の後の実際の尿試料を使ったBCG乾燥試薬の較正曲線を示す。
【図１５】図15は、DNBA乾燥試薬の較正曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
液体試薬の、または特に、乾燥試薬を使った、簡単で小型のポイント・オブ・ケア尿検査システムを提供することが望ましい。特に、この試薬は多数の分析的な試料を同時に測定することができるポイント・オブ・ケア分析システムで使用するのに好適である場合がある。
【００５７】
例えば、このようなシステムは、光を放出する発光ダイオード（LED）を有する密着イ
メージセンサ（CIS）モジュールの使用を含むことができ、光の波長は尿検査試薬と標的
分析物の反応生成物の吸収波長にマッチするように予め構成され、光学キュベットはキュベットのCISモジュールから遠い側に反射面を有し、凍結乾燥尿検査試薬が光学キュベッ
ト中に配置され、尿分配構造は試料尿を個々の光学キュベット中に分配するリザーバーを有し、分配された溶液の容量を別々に制御する溶液停止構造を有する。
【００５８】
慢性腎疾患（CKD）は初期段階で微量アルブミンを測定することにより診断することが
できる。このような試験は、尿中微量アルブミンおよびクレアチニン濃度ならびにそれらの対応するアルブミン／クレアチニン比（ACR）を決定することにより行うことができる
。
【００５９】
本明細書で使われる試験は尿試料の分析に使用することができるが、試験はその他の供給源（例えば、唾液、血液など）由来の試料の分析にも好適である。したがって、［尿中微量アルブミン］という用語は、明細書の全体を通して、用語の「アルブミン」により置き換えることができる。
【００６０】
ACRを検出するために、尿中微量アルブミンおよびクレアチニン測定のために2種の試薬がそれぞれ使用される。尿中微量アルブミンの検出のためにブロムクレゾールグリーン（BCG）が使われ、尿中クレアチニンの検出のために3,5-ジニトロ安息香酸（DNBA）が使わ
れる。
【００６１】
尿試料中に存在する微量アルブミンはBCGと反応して着色された錯体を形成する（図1）。625nmの波長で測定した色の強度は、尿試料中の微量アルブミン微量アルブミン濃度に
正比例する。
【００６２】
微量アルブミン分析では、2つのタイプの液体試薬、または特に乾燥試薬がサンプリン
グおよび照合のために調製される。乾燥試薬（サンプリングおよび照合）および尿試料の混合物が比色分析法により同時に測定される。サンプリング試薬は、BCG−アルブミン錯
体により得られる色の強度を測定するために使用される。照合試薬は、pHおよび温度の影響、ならびに尿試料に蛋白変性法を適用することによる干渉を減らすまたは取り除くために使用される。すなわち、微量アルブミン分析は蛋白変性法を利用し、この方法では、照合用の乾燥試薬がアルブミンを変性させる界面活性剤を含み、それにより、変性アルブミンが照合試薬中に存在するBCGと反応しないようにする。
【００６３】
尿試料中に存在するクレアチニンは、アルカリ媒質中のDNBAと反応して赤紫色錯体を形成する（図2）。525nmの波長での錯体形成速度は、尿試料中のクレアチニンの濃度に正比例する。あるいは、DNBAをピクリン酸で置き換えてもよい。
【００６４】
クレアチニン分析はクレアチニン測定のためにサンプリング試薬のみを使用する。クレアチニンサンプリング試薬は、尿pHの干渉を最小限にするために緩衝液添加法を利用し、一方、温度の影響は較正曲線中の温度因子により補償され、尿バックグラウンドの影響は、錯体形成の速度を測定することにより除かれる。現在の装置は従来の配合物の反応パラメータ内で操作するように適合されている。この結果として、尿中の分析物を検出するのに使用される異なる試薬の反応物を分析するために、異なるセンサーを使用することが必要になることがあり（例えば、比色分析）、そのために、より複雑化した自動装置になる場合がある。
【００６５】
以下でより詳細に記載するように、DNBAとクレアチニンとの間の相互作用動力学を制御することが重要である。DNBAとクレアチニンとの間の反応が使用されている装置に対し速すぎるまたは遅すぎる場合には、装置は正確な分析を提供することができないであろう。さらに、DNBAとクレアチニンとの混合物は気泡を形成する傾向があるので、光散乱に起因して分析が正確でない場合がある。本明細書で開示の配合物は、試料および試薬の分析に関連するこのような問題を克服するように配合されている。
【００６６】
クレアチニン分析用の乾燥試薬
緩衝液添加法がDNBA乾燥試薬に適用され、尿pHの影響が取り除かれる。DNBAは、アルカリ条件下でクレアチニンと反応し、紫色の錯体が生成される。サンプリング試薬はDNBA、強塩基、緩衝液、増量剤、アニオン性界面活性剤およびカチオン性界面活性剤を含む。使用される具体的な化学薬品は、以下のリスト（表1）から選択することができ、それぞれ
の化学薬品の濃度は指定された範囲内であってよい。
【００６７】
【表１】
2018185335.tif 000003
【００６８】
クレアチニン分析用の化学薬品リスト
1）強塩基；NaOH、KOH。
【００６９】
2）緩衝液；K2HPO4、Na2HPO4、ホウ酸塩。
【００７０】
3）増量剤；糖（例えば、マンニトール、ラクトース、トレハロース）。
【００７１】
4）アニオン性界面活性剤；特にアニオン性硫酸化／スルホン化界面活性剤；ドデシル
硫酸ナトリウム（SDS）、ポリスチレンスルホネート（PSS）、直鎖アルキルベンゼンスルホネート（LAS）、2級アルコールスルホネート、アルコールオレフィンスルホネート、アルコールスルフェート。
【００７２】
5）カチオン性界面活性剤；塩化セチルピリジニウム（CPC）、塩化ベンザルコニウム（BAC）、塩化ベンゼトニウム（BZT）、塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、臭化セトリモニウム、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム（DODAB）、臭化ヘキサデシル
トリメチルアンモニウム（CTAB）。
【００７３】
理論に束縛されることを意図するものではないが、強塩基に対する緩衝液の添加はDNBAまたはピクリン酸とクレアチニンとの間の化学反応の動力学的調節をもたらすと思われる。上記から分かるように、緩衝液と水酸化ナトリウムの比率は分析装置に適合するように選択することができる。これにより装置のより正確な読み取りを可能にする。例えば、緩衝液：強塩基の濃度比（モル比）は、0.5:1〜3.2:1、例えば、0.8:1〜2.5:1（例えば、1.5:1〜2.5:1）、例えば、1:1〜1.5:1（例えば、1.25:1）であってよい。例えば、現在の出願の図4〜7に記載の装置で使用する場合、0.5:1より小さい緩衝液：強塩基比は、その生
成速度を正確に測定するには速すぎる錯体形成になる可能性がある。
【００７４】
さらに、理論に束縛されることを意図するものではないが、界面活性剤の添加は、反応混合物中の気泡形成を減らすのに役立ち、それにより、散乱を減らし、正確さを高めると考えられている。特に、アニオン性界面活性剤と組み合わせて溶媒和助剤として使用する場合、第四級アンモニウム部分を含むカチオン性界面活性剤の使用は、気泡形成制御に有用であることが分かっている。これは、第四級アンモニウム界面活性剤が、溶媒和助剤（例えば、アニオン性界面活性剤）がない場合には緩衝液中で十分な量で溶解することができないが、アニオン性界面活性剤は、単独使用時には泡形成に影響を与えないという理由による。したがって、泡形成を制御するために、クレアチニン分析試薬中で、アニオン性およびカチオン性界面活性剤の特定の比率を使用することが有用である。カチオン性界面活性剤：アニオン性界面活性剤の比は、1:2〜1:10、例えば、1:3〜1:7、または、さらに
限定すれば、1:5であってよい。
【００７５】
微量アルブミン分析用の乾燥試薬
蛋白変性法をBCG乾燥試薬用に適用することにより、尿pH、試料温度および尿バックグ
ラウンドなどの尿成分からの干渉が取り除かれる。アルブミンはBCGと反応し色が変化す
るが、変性アルブミンはBCGと反応せず、色は同じまま残る。第1の試薬はサンプリング用であり、第2の試薬は照合用である。両方の試薬は、同じ濃度のBCG、強塩基、緩衝液、非イオン性界面活性剤および防腐剤を含む。しかし、第2の試薬のみがアニオン性界面活性
剤を含み、参照試料中のアルブミンを変性させる。化学薬品は、以下のリスト（表2）か
ら選択することができ、濃度は指定された範囲内であってよい。
【００７６】
【表２】
2018185335.tif 000004
【００７７】
アルブミン分析用の化学薬品リスト
1）強塩基；NaOH、KOH。
【００７８】
2）緩衝液；ACES（N−（1−アセトアミド）−2−アミノエタンスルホン酸）、アセテート（酢酸ナトリウム）、ADA（N−（2−アセトアミド）イミノ二酢酸）、AMP（2−アミノ
−2−メチル−1−プロパノール）、AMPD（2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオー
ル）、AMPSO（N−（1,1−ジメチル−2−ヒドロキシエチル）−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、BES（N,N−ビス（2−ヒドロキシエチル）−2−アミノエタンスルホン酸）、重炭酸塩（炭酸水素ナトリウム）、ビシン（N,N−ビス（2−ヒドロキシエチル）グリシン）、ビストリス（ビス（2−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチ
ル）メタン）、ビストリスプロパン（1,3−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルア
ミノ］プロパン）、CAPS（3−シクロヘキシルアミノ）−1−プロパンスルホン酸）、CAPSO（3−（シクロヘキシルアミノ）−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホン酸）、CHES（2
−（N−シクロヘキシルアミン）−エタンスルホン酸）、シトレート（クエン酸三ナトリ
ウム）、DIPSO（N,N−ビス（2−ヒドロキシエチル）−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパ
ンスルホン酸）、HEPES（4−（2−ヒドロキシエチル）ピペラジン−1−エタンスルホン酸）、HEPPS（4−（2−ヒドロキシエチル）ピペラジン−1−プロパンスルホン酸）、HEPPSO（4−（2−ヒドロキシエチル）ピペラジン−1（2−ヒドロキシ）プロパンスルホン酸）、MES（2−モルホリノエタンスルホン酸）、MOPS（3−モルホリノプロパンスルホン酸）、MOPSO（3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、PIPES（ピペラジン−1,4−ビス（2−エタンスルホン酸））、POPSO（ピペラジン−1,4−ビス（2−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、TAPS（N−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−3−アミノプロパンスルホン酸）、TAPSO（N−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、TES（N−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−2−
アミノエタンスルホン酸）、トリシン（N−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリ
シン）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、コハク酸。
【００７９】
3）非イオン性界面活性剤；ポリ（プロピレングリコール）（PPG）、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル（ブリージ）、トリトンX-100、ツイーン、Zonyl（登録商標）FSNフッ素系界面活性剤、ALKANOL（登録商標）6112界面活性剤、ポリエチレングリコール（PEG）。
【００８０】
4）防腐剤；糖、ソルビン酸、安息香酸、プロピオン酸カルシウム、亜硝酸ナトリウム
、アジ化ナトリウム、サルファイト、EDTA二ナトリウム、抗酸化剤。
【００８１】
5）アニオン性界面活性剤；ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、ポリスチレンスルホネート（PSS）、直鎖アルキルベンゼンスルホネート（LAS）、2級アルコールスルホネート、
アルコールオレフィンスルホネート、アルコールスルフェート。
【００８２】
乾燥試薬の調製方法（図3）
所定の化学成分が混合され、0.45μmセルロースアセテートフィルターディスクを通し
て濾過される。濾過された混合物はピペットまたはディスペンサーにより適切な試料ウエル中に分注される。試料ウエルはエッペンドルフチューブ、96ウエルプレート、市販キュベット、またはその他の任意の等価な試薬ホルダーであってよい。例えば、試料ウエルは図4に示すキュベットカートリッジ（102）であってよい。試料ウエルは凍結乾燥機に挿入され、特定のプロファイル下で凍結乾燥される。この凍結乾燥は凍結、アニーリング、凍結、一次乾燥および二次乾燥処理から構成される。凍結乾燥プロセスは湿気との接触を避けるために湿気不含の条件下で行うことができる。
【００８３】
その他の試薬ホルダーの使用は、一次乾燥持続時間の最適化（例えば、持続時間の延長）を必要とする場合がある。
【００８４】
凍結乾燥プロファイルおよびパラメータの範囲の一例を下表に示す。これらの条件は図4に示すキュベットカートリッジに特に適合させることができる。
【００８５】
【表３】
2018185335.tif 000005
【００８６】
包装
乾燥された試薬は暗所および乾燥条件中で貯蔵し、光、湿気および酸素への暴露を防ぐ必要がある。乾燥された試薬はグローブボックス中（すなわち、不活性雰囲気下で）で吸湿防止バッグ中に梱包し、真空密閉することができる。必要に応じ、乾燥剤または抗酸化剤を包装中に入れることができる。
【００８７】
キュベットカートリッジ、導入装置および分析方法
キュベットカートリッジシステムおよび試料導入装置は、乾燥試薬で使用することができる（例えば、図4〜7に示すように）。カートリッジの幅は、それぞれの分析物の経路長を基準にして計算することができる。複数の分析物に対する分析の場合は、容積は、それぞれのキュベットカートリッジ（102）で同じであってよい。例えば、容積は0.5mL〜5mL
、好ましくは1mLであってよい。例えば、容積が1mLの場合、キュベット幅はアルブミン分析用には5mm、クレアチニン分析用には2mmであってよい。キュベットカートリッジ（102
）は透明な材料、例えば、PMMA（ポリメチルメタクリレート）、PC（ポリカーボネート）、COC（環状オレフィンコポリマー）から作製することができる。迷光を遮断するために
、色は黒であってよい。
【００８８】
液体試薬がディスペンサー（例えば、武蔵ディスペンサー）によりキュベットカートリッジ（102）中に分注され、例えば、上記で使用された乾燥試薬を調製、貯蔵する方法を
使って、凍結乾燥機（VirTis AdVantage Plus Freeze-dryer）により凍結乾燥される。試薬は「液体」型で、すなわち、凍結乾燥をしないで使用することができることは、理解されよう。キュベットカートリッジ（102）はキュベットホルダー（100；図4）中に移され
る。
【００８９】
図4に示されるように、キュベットホルダー（100）は4つのキュベットカートリッジ（102）を保持することができる。例えば、4つのキュベットは光遮断構造（101）により2列
に配列させることができる。2つのキュベットカートリッジ（102）を1つの分析物用に使
用することができ、その他の2つのキュベットカートリッジをその他の分析物用に使用す
ることができる。図7に示されるように、2つの光モジュール（700）をキュベットホルダ
ー（100）の各側に配置させることができる。キュベットホルダー（100）はまた、キュベット（102）と光モジュール（700）との間の距離を維持する役割も果たし、それにより、試料測定中に特定の経路長が維持される。
【００９０】
被験者から収集コップ中に尿が採取され、シリンジで吸い込まれ、試料ウエルカバー（502）中の試料導入ポート（500）を介して試料ウエル（501；図5）中に導入される。尿は試料導入孔（600；図6）を通ってそれぞれのキュベット（102）中に分注される。尿およ
び乾燥試薬は、振盪、磁気攪拌、振動、超音波処理またはその他の任意の等価な方法によりキュベットカートリッジ中で混合される。1種または複数種の光モジュール（700；図7
）を使って光学測定が行われる。図8に示すように、吸光度値が各キュベットに対し測定
され、必要に応じ、試料と参照との間の差が計算される。事前に作成されている較正曲線を利用することにより、分析物濃度を計算することができ、その後、クレアチニンに対するアルブミンの比を計算することができる。
【００９１】
図9〜11は、合成標準物（例えば、合成尿マトリックス）に基づく微量アルブミン分析
用の較正曲線を示す。これらのアルブミン基準は、人工またはプールされた尿および特定の濃度のアルブミンを使って調製される。図9Aおよび10Aはサンプリング試薬を使い、図9Bおよび10Bは照合試薬を使い、図9Cおよび10Cおよび11は較正曲線を示す。この結果は、
基準と接触させた場合の、サンプリング試薬と照合試薬との間の差から生じる。表4は図9の結果の正規化前に得られたpH変化に対する結果を示し、表5は下式（1）を使って正規化した後に得られた結果を示す。表6は図10の正規化前の結果を示し、表7は温度の影響を補償するために正規化したデータを示す。
【００９２】
【表４】
2018185335.tif 000006
【００９３】
【表５】
2018185335.tif 000007
【００９４】
【表６】
2018185335.tif 000008
【００９５】
【表７】
2018185335.tif 000009
【００９６】
【数１】
2018185335.tif 000010
【００９７】
式中、Asはサンプリング試薬を意味し、ARは照合試薬を意味し、CAlbはアルブミンの濃度で、AおよびBは定数である。得られた較正曲線は中間から高レベルのアルブミン（例えば、30〜300mg/L）の被験者に対しては正確であることが分かったが、低レベルのアルブ
ミン（例えば、0〜30mg/L）に対しては、得られた結果が大きく変動する可能性があるこ
とが分かった。これらの結果を図12および表8に示す（すなわち、非スパイク尿試料は約0mg/Lの平均濃度である必要がある）。この不正確さは尿マトリックス副作用が原因であり、これはより低い濃度でより大きな変動を生じると考えられている。
【００９８】
【表８】
2018185335.tif 000011
【００９９】
実際のヒト試料の低アルブミン濃度での分析の正確さを改善するために、後述のような、さらなる処理を行う必要があった。
【０１００】
元の較正曲線：数式２
【０１０１】
【数２】
2018185335.tif 000012
【０１０２】
ブランク試料（正常な尿；0mg/Lアルブミン）に対しては：
【０１０３】
【数３】
2018185335.tif 000013
【０１０４】
スパイクした試料に対しては：
【０１０５】
【数４】
2018185335.tif 000014
【０１０６】
スパイクした試料の結果がブランク試料で正規化されると（すなわち、式（3）マイナ
ス式（2））、式（4）が得られる。
【０１０７】
【数５】
2018185335.tif 000015
【０１０８】
A*R＝AOR、すなわち、照合試薬の吸光度はブランクおよびスパイクした試料と同じであると仮定すると、式（4）は、式（5）として書き直すことができる：
【０１０９】
【数６】
2018185335.tif 000016
【０１１０】
A*SおよびA*Rを測定することは可能であるが、AOSは未知である。しかし、AOSとAORと
の間には強い相関が認められ、これは、図13および式（6）に示されるように、異なる実
際の尿試料における尿マトリックスの影響を阻止する。
【０１１１】
【数７】
2018185335.tif 000017
【０１１２】
式（6）を式（5）に代入することにより、式（7）を使って、アルブミン分析用の新し
い較正曲線を得ることができる（式中、C*Albは0mg/Lとみなされる）。
【０１１３】
【数８】
2018185335.tif 000018
【０１１４】
図14の正規化曲線の較正曲線は、濃度範囲全体にわたり正確で、特にアルブミンの低濃度でより正確である。これは表9に示されている。
【０１１５】
【表９】
2018185335.tif 000019
【０１１６】
上述した較正プロセスは、図16に示すようなIntel IA-32ベースのパーソナルコンピュ
ータシステムなどの標準的なコンピュータシステムにより実行される1種または複数種の
ソフトウェアモジュールとして実装することができる。しかし、別の選択肢として、少なくとも一部の較正処理を、例えば、特定用途向け集積回路（ASIC）および／またはフィールドプログラマブルゲートアレー（FPGA）などの1種または複数種の専用ハードウェアコ
ンポーネントの形態で一部または全体を実装することも可能であることは、当業者には明白であろう。
【０１１７】
図16に示すように、尿試料中のアルブミン濃度の定量的測定に使用するための較正曲線を生成するシステム1600は、上述のように較正プロセスを実行し、このプロセスは、標準的コンピュータシステムに組み込まれた不揮発性（例えば、ハードディスク、半導体ドライブ、またはフラッシュメモリー）記憶装置1602に保存された1種または複数種のソフト
ウェアコンポーネント1630として実装される。システム1600は、ランダムアクセスメモリー（RAM）1604、少なくとも1つのプロセッサ1606、および外部インターフェース1608、1610、1612（これらは全てバス1614により相互に連接される）などの標準的コンピュータコンポーネントを含む。
【０１１８】
外部インターフェースには、ユニバーサル・シリアルバス（USB）インターフェース1608、システム1600をインターネットなどのコミュニケーションネットワークに接続するの
に使用することができるネットワークインターフェースコネクタ（NIC）1610、およびLCDパネルディスプレイ1620などの表示デバイスに接続されるディスプレイアダプター1612が含まれる。上記USBインターフェースの少なくとも1つは、キーボード1616およびマウス1618などのポインティングデバイスに接続される。システム100はまた、多くの標準的ソフ
トウェアコンポーネントを含み、これらには、Linux（登録商標）またはMicrosoft Windowsなどのオペレーティングシステム1628、およびMatlabまたはRなどの統計ソフトウェア
パッケージ1629が含まれる。
【０１１９】
システム1600は、不揮発性記憶装置1602に、吸光度データ1640を保存し、これはアルブミン不含試料および参照吸光度AOSおよびAORを表す第1の吸光度データ、ならびにスパイ
クイン試料および参照吸光度A*SおよびA*Rを表す第2の吸光度データを含む。吸光度デー
タ1640は以前の実験から保存することができ、またはアルブミン不含およびスパイクイン試料で実行された吸光度測定から光モジュール700を使ってリアルタイムで取得し、例え
ば、NIC1610を介してシステム1600に伝達することができる。
【０１２０】
ソフトウェアコンポーネント1630は、例えば、統計ソフトウェアパッケージ1629を使って、計算によりアルブミン不含試料吸光度とアルブミン不含参照吸光度との間の式（6）
に記載されている関数関係に当てはめて、調節パラメータaとbを得るように構成された第1の当てはめコンポーネントを含むことができる。コンポーネント1630の吸光度調節コン
ポーネントは、調節パラメータを使って参照吸光度を調節し、それにより、調節された参照吸光度A’R＝a*A*R+bを得るように構成され得、コンポーネント1630の第2の当てはめコンポーネントは、この場合も統計ソフトウェアパッケージ1629を使って、試料吸光度、調節された参照吸光度および既知の（スパイクイン）濃度の間の式（7）により記載される
関数関係を計算により当てはめて、較正曲線のパラメータa、bおよびAを得るように構成
することができる。したがって、試験下の試料に対するアルブミン濃度CAlbを計算することが所望される場合は、試料に対する測定吸光度が、ASおよびARとすれば、CAlbは、システム1600の較正ソフトウェアコンポーネント1630により得られた較正パラメータa、bおよびAを使って
下記式に従って計算することができる。
【０１２１】
【数９】
2018185335.tif 000020
【０１２２】
図15は、クレアチニン分析用の較正曲線を示す。DNBA／クレアチニン反応の動力学が測定され、反応速度対クレアチニン濃度のプロッティングによりクレアチニン用の較正曲線が生成される。クレアチニン基準は、人工またはプールされた尿および特定の濃度のクレアチニンを使って調製される。
【０１２３】
クレアチニン分析には5分〜10分が必要で、微量アルブミン分析には約5分が必要である。
【０１２４】
クレアチニン分析に対しては、動力学的測定は、試料がクレアチニン分析配合物に添加される時点から開始することができるか、または動力学的測定が開始される前に測定を遅らせる（例えば、5秒間、10秒間、30秒間、1分間、2分間または5分間）ことができることは理解されよう。したがって、測定が行われる実際の検知時間枠は、1分〜10分であって
よい。クレアチニン分析における動力学測定中のデータ取込時間間隔は、0.1秒〜15秒（
例えば、5秒）であってよい。
【０１２５】
サンプリングからACR値を得るまでの合計分析時間は、10分未満であってよく、これは
高速測定である。
【０１２６】
乾燥試薬分析システムの利点
乾燥試薬は尿試料の添加により極めて容易に再構成される。
【０１２７】
この試薬は一段階検知プロトコルを可能にし、使い勝手を大きく改善する。
【０１２８】
上記のように、配合物は、尿検体を使った乾燥試薬の再構成時にキュベット壁表面に接着する気泡の生成を防止し、直接光学測定を可能にする。すなわち、本明細書で開示の配合物は、溶液から気泡を除去する必要がなく（可能であったにしても）、高速光学測定を可能にし、尿中の再構成配合物からの気泡の除去はまた、光散乱を減らすために、吸光度の測定のより高い精度を可能とする。
【０１２９】
乾燥試薬として供給される場合、本明細書で考察の配合物は、液体試薬に比べて貯蔵および輸送が容易である。
【０１３０】
操作上の変動および別の選択肢
緩衝液添加法および／または蛋白変性法を適用する上記した本尿検査システムはまた、クレアチニンまたはアルブミン以外の尿中成分に対しても適用可能である。このような分析物の例には、水、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、塩化物、リン酸、リン、硫黄、臭化物、フッ化物、ヨウ化物、カルシウム、マグネシウム、鉄、鉛、水銀など）、タンパク質（例えば、ハプトグロビン、トランスフェリン、免疫グロブリン、ラクテートデヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase）、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、ア
ルファアミラーゼ、ウロペプシノゲン（uropepsinogen）、リゾチーム、ウロキナーゼな
ど）、糖（例えば、グルコース、フェニルピルビン酸、アラビノース、キシロース、リボース、フコース、ラムノース、ケトペントース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、ラクトース、ショ糖、フコシルグルコース、ラフィノースなど）、アミノ酸（例えば、アラニン、カルノシン、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、チロシン、バリン、ヒドロキシロプロリン（hydroxyloproline）、ガラクトシルヒドロキシリシン（galactosyl hydroxylyzine）、キシロシルセリンなど）、ホルモン（例えば、エピネフィリン、ノルエピネフィリン、ドーパミン、セロトニン、hCG、EPF、エストラジオール、ゴナドトロピン、副腎皮質刺激ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、バソプレシン、チロキシン、カテコールアミン（エピネフィリン、ノルエピネフィリン、ドーパミン）、インスリン、エリスロポエチン、副腎皮質ステロイド（アルドステロン、コルチコステロン、コルチゾン）、テストステロン、プロゲステロン、エストロゲンなど）、ビタミン（例えば、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、4−ピ
リドキシン酸、ニコチン酸、ビタミンB2、ビオプテリン（biopterine）、ビタミンC、な
ど）、薬剤またはその他の生理活性物質（例えば、カフェイン、コカインなど）、代謝廃棄物（例えば、尿素、尿酸、クレアチン、コリン、ピペリジン、ビリルビン、アラントインなど）、ケトン、葉酸などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３１】
尿検査は、5〜8のpH範囲のヒト尿に対し実施することができる。ほとんどの人は、この範囲内の尿pHを有するが、一部の人はこの範囲から外れる場合がある。
【０１３２】
検知温度は、15℃〜40℃であってよい。
【０１３３】
乾燥試薬は防湿バッグ内に梱包し、室温で少なくとも1年間貯蔵することができる。
【０１３４】
乾燥試薬システムは、pH、温度および干渉の影響を減らすために参照試料用の試薬を含む。クレアチニン、アルブミンまたはその他の標的分析では、緩衝効果を有する化学薬品を参照試料用の試薬中に含めることが効果的である。特にアルブミン分析では、参照試料中の界面活性剤によるアルブミンの変性が、参照試料を測定するのに極めて効果的である。
【０１３５】
液体試薬を乾燥試薬に代えて使用してもよい。この場合、表10および11に示すように、クレアチニン測定用の液体試薬は増量剤を必要とせず、また、微量アルブミン測定用の液体試薬は、非イオン性界面活性剤2を必要としない。
【０１３６】
【表１０】
2018185335.tif 000021
【０１３７】
【表１１】
2018185335.tif 000022
【０１３８】
さらに、微量アルブミン／クレアチニン分析は分離することができる。すなわち、微量アルブミン分析は単独で実施することができ、またはクレアチニン分析も同様に単独で実施することができる。
【図１】
2018185335.tif 000026
【図２】
2018185335.tif 000027
【図３】
2018185335.tif 000028
【図４】
2018185335.tif 000029
【図５】
2018185335.tif 000030
【図６】
2018185335.tif 000031
【図７】
2018185335.tif 000032
【図８】
2018185335.tif 000033
【図９】
2018185335.tif 000034
【図１０】
2018185335.tif 000035
【図１１】
2018185335.tif 000036
【図１２】
2018185335.tif 000037
【図１３】
2018185335.tif 000038
【図１４】
2018185335.tif 000039
【図１５】
2018185335.tif 000040
【図１６】
2018185335.tif 000041
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月24日(2018.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
【図１】図1はアルブミンの反応原理を示す。
【図２】図2はクレアチニンの反応原理を示す。
【図３】図3は、乾燥試薬の調製を示す。
【図４】図4は、キュベットカートリッジおよびキュベットホルダーを示す。
【図５】図5は、試料導入装置を示す。
【図６】図6は、試料導入構造を示す。
【図７】図7は、キュベットホルダーおよび光モジュールを示す。
【図８】図8は、分析方法を示す。
【図９】図9は、BCG乾燥試薬によるpHの影響の補償を示す。
【図１０】図10は、BCG乾燥試薬による温度の影響の補償を示す。
【図１１】図11は、BCG乾燥試薬の較正曲線を示す。
【図１２】図12は、データ処理の前の実際の尿試料を使ったBCG乾燥試薬の較正曲線を示す。
【図１３】図13は、AS対ARのグラフを示す。
【図１４】図14は、データ処理後の後の実際の尿試料を使ったBCG乾燥試薬の較正曲線を示す。
【図１５】図15は、DNBA乾燥試薬の較正曲線を示す。
【図１６】図16は、尿試料中のアルブミン濃度の定量的測定に使用するための較正曲線を生成するシステムを示す。
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月27日(2018.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の前記クレアチニン濃度の分析に使用するための配合物であって、
40〜80g/Lの濃度の強塩基と、
50〜250g/Lの濃度の緩衝液と、
0.1〜20g/Lの濃度の少なくとも1種の界面活性剤と、
クレアチニンと反応してクレアチニン錯体を生成する化合物と、
水と、
を含む配合物。
【請求項２】
クレアチニンと反応してクレアチニン錯体を生成する前記化合物が、ジニトロ安息香酸またはピクリン酸である、
請求項１に記載の配合物。
【請求項３】
クレアチニンと反応してクレアチニン錯体を生成する前記化合物が、ジニトロ安息香酸である、
請求項２に記載の配合物。
【請求項４】
クレアチニンと反応してクレアチニン錯体を生成する前記化合物の濃度が、1〜5g/Lである、
請求項１〜３のいずれか1項に記載の配合物。
【請求項５】
前記少なくとも1種の界面活性剤が、0.1〜10g/Lの濃度のアニオン性界面活性剤および0.1〜10g/Lの濃度のカチオン性界面活性剤を含む、
請求項１〜４のいずれか1項に記載の配合物。
【請求項６】
カチオン性界面活性剤：アニオン性界面活性剤の比が1:5である、
請求項５に記載の配合物。
【請求項７】
カチオン性界面活性剤：アニオン製界面活性剤の比が1:2〜1:10であり、
カチオン性界面活性剤が第四級アンモニウム部分を含む、
請求項６に記載の配合物。
【請求項８】
（a）前記少なくとも1種の界面活性剤がカチオン性界面活性剤を含む場合には、それは、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、臭化セトリモニウム、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム、および臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムからなる群の1種または複数種から選択され、および／または
（b）前記少なくとも1種の界面活性剤がアニオン性界面活性剤を含む場合には、それは、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリスチレンスルホネート、直鎖アルキルベンゼンスルホネート、2級アルコールスルホネート、アルコールオレフィンスルホネート、およびアルコールスルフェートからなる群の1種または複数種から選択され、および／または
（c）前記緩衝液が、K2HPO4、Na2HPO4、およびホウ酸塩からなる群の1種または複数種から選択され、および／または
（d）前記強塩基が、NaOHおよび／またはKOHである、
請求項１〜７のいずれか1項に記載の配合物。
【請求項９】
前記配合物が凍結乾燥される、請求項１〜８のいずれか1項に記載の配合物。
【請求項１０】
前記配合物が、前記配合物の1〜40重量％の量の増量剤を含み、前記増量剤が糖マンニトール、ラクトースおよびトレハロースからなる群の1種または複数種から選択される、請求項９に記載の配合物。
【請求項１１】
前記配合物中の前記緩衝液：強塩基の濃度比が、0.5:1〜2.5:1である、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の配合物。
【請求項１２】
前記配合物中の前記緩衝液：強塩基の濃度比が、1:1〜1.5:1である、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の配合物。
【請求項１３】
前記配合物中の前記緩衝液：強塩基の濃度比が、1.25:1である、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の配合物。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれか1項に記載の試料のクレアチニン濃度の分析に使用するための前記凍結乾燥配合物の調製方法であって、
（a）前記所定の化学成分を一緒に混合し、得られた混合物を濾過し、前記混合物を容器中に計量分配し、前記容器を凍結乾燥装置中に入れるステップと、
（b）前記試料を-20℃〜-80℃の温度で0.5時間〜5時間の範囲の一定時間凍結するステップと、
（c）前記試料を-10℃〜-30℃の温度で1時間〜5時間の範囲の一定時間アニーリングするステップと、
（d）前記試料を-20℃〜-80℃の温度で0.5時間〜5時間の範囲の一定時間再凍結するステップと、
（e）-10℃〜-30℃の温度で5時間〜50時間の範囲の一定時間、第1の乾燥サイクルを行うステップと、
（f）0℃〜60℃の温度で1時間〜20時間の範囲の一定時間、第2の乾燥サイクルを行うステップと、
を含む方法。
【請求項１５】
（a）前記容器が、エッペンドルフチューブ、96ウエルプレート、市販キュベットまたは密着イメージセンサモジュールを含む装置での使用に適合させたキュベットからなる群から選択され、
（b）前記方法が、前記凍結乾燥配合物を保持する前記容器を、光、酸素および湿気から離して貯蔵することをさらに含む、
請求項１４に記載の方法。
【外国語明細書】
2018185335000001.pdf