(57)【要約】      （修正有）【課題】標識効率に優れた糖鎖を調製する方法を提供する。【解決手段】本発明の糖鎖を調製する方法は、糖鎖を含有する糖鎖含有サンプルに標識試薬を加えることにより、糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程を有する、糖鎖を調製する方法であって、標識工程において、標識試薬と糖鎖との反応環境中に水を含む、糖鎖を調製する方法。標識工程において、反応環境中の水の量をＸ（μＬ）、糖鎖の量をＹ（μｇ）としたとき、Ｘ／Ｙが、１．２以上である、糖鎖を調製する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖を含有する糖鎖含有サンプルに標識試薬を加えることにより、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程を有する、糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程において、前記標識試薬と前記糖鎖との反応環境中に水を含む、糖鎖を調製する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程において、前記反応環境中の水の量をＸ（μＬ）と、前記糖鎖の量をＹ（μｇ）としたとき、Ｘ／Ｙが、１．２以上である、糖鎖を調製する方法。
【請求項３】
請求項１に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程において、前記糖鎖の量が０μｇ超え１μｇ未満の場合、前記反応環境中の水の量は０μＬ超え１．０μＬ以下である、糖鎖を調製する方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程において、前記標識試薬と前記糖鎖との反応が容器内で行われる、糖鎖を調製する方法。
【請求項５】
請求項４に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記容器が、チューブ形状を有する、糖鎖を調製する方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程の前に、前記糖鎖含有サンプルに含まれる溶媒の少なくとも一部を除去する工程をさらに有する、糖鎖を調整する方法。
【請求項７】
請求項６に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程において、前記反応環境中に水を添加する工程を実施する、糖鎖を調整する方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程の前に、固相に固定された状態の試料に糖鎖遊離酵素を作用させることにより、前記糖鎖を含有する糖鎖含有サンプルを得る遊離工程をさらに有する、糖鎖を調製する方法。
【請求項９】
請求項８に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記糖鎖遊離酵素が、ペプチドＮ−グリカナーゼまたはエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを含む、糖鎖を調製する方法。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記固相が、カラムまたはカートリッジ構造を有する、糖鎖を調製する方法。
【請求項１１】
請求項８から１０のいずれか１項に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記遊離工程の後に、固液分離によって前記糖鎖を含む分離液を得る分離工程をさらに有する、糖鎖を調製する方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか１項に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記標識試薬が、紫外線吸収特性または蛍光特性を有するアミノ基を有する化合物、還元剤及び有機溶媒を含む、糖鎖を調製する方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記アミノ基を有する化合物が、２−アミノベンズアミドを含む、糖鎖を調製する方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記還元剤が、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム、メチルアミンボラン、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、ピコリンボラン、およびピリジンボランからなる群から選択される一種以上を含む、糖鎖を調製する方法。
【請求項１５】
請求項１２から１４のいずれか１項に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記有機溶媒が、非プロトン性極性有機溶媒、プロトン性極性有機溶媒および非プロトン性非極性溶媒有機溶媒からなる群から選択される一種以上を含む、糖鎖を調製する方法。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか１項に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記糖鎖が、糖タンパク質由来である、糖鎖を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖を調製する方法に関し、糖鎖の標識技術について様々な開発がなされてきた。この種の技術としては、特許文献１に記載のものが知られている。同文献には、２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅや２−Ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ等の一般的な標識試薬を使用して、完全に乾固した状態のビーズに捕捉されている糖鎖を標識することが記載されている（特許文献１の段落００５６〜００６１）。
【０００３】
同文献には、標識試薬として、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２−ＡＢ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ０．３５Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ＤＭＳＯ混合溶媒が使用されると記載されている（特許文献１の段落００５９）。同様に、非特許文献１には、２−ＡＢを用いた標識試薬の組成について記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００９／１３３６９６号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．Ｃ  Ｂｉｇｇｅ，  Ｔ．Ｐ  Ｐａｔｅｌ，  Ｊ．Ａ  Ｂｒｕｃｅ，  Ｐ．Ｎ  Ｇｏｕｌｄｉｎｇ，  Ｓ．Ｍ  Ｃｈａｒｌｅｓ，  Ｒ．Ｂ  Ｐａｒｅｋｈ．「Ｎｏｎｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｇｌｙｃａｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  ２−Ａｍｉｎｏ  Ｂｅｎｚａｍｉｄｅ  ａｎｄ  Ａｎｔｈｒａｎｉｌｉｃ  Ａｃｉｄ」Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０  ２３０（２）：２２９−２３８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
糖鎖標識の技術分野において、上記文献１等のように、水分が完全に蒸発した乾燥環境下で糖鎖の標識を実施することが、通常のプロトコルとして知られている。そして、２−ＡＢ等の標識試薬の混合溶媒として水を添加しないものが一般的に用いられている。
【０００７】
しかしながら、本発明者が検討した結果、上記文献１に記載の糖鎖標識方法においては、標識効率の点で、さらなる改善の余地を有することが判明した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は検討したところ、糖鎖と標識試薬の反応環境を適切に制御することにより、標識効率を改善できることを見出した。
このような知見に基づきさらに鋭意研究したところ、通常知られている糖鎖標識プロトコルとは異なり、糖鎖と標識試薬との反応環境中に水を含ませることにより、糖鎖の標識効率が文献１の標識効率と比べてさらに改善できることを見出し、本発明を完成するに至った。
詳細なメカニズムは定かでないが、水の高い極性により、２−ＡＢ等の標識試薬の混合溶媒中における分散性が高まり、糖鎖の標識効率が向上するものと考えられる。
【０００９】
本発明によれば、
糖鎖を含有する糖鎖含有サンプルに標識試薬を加えることにより、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程を有する、糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程において、前記標識試薬と前記糖鎖との反応環境中に水を含む、糖鎖を調製する方法が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、標識効率に優れた糖鎖を調製する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１〜３、比較例１で得られたＨＰＬＣスペクトルを示す図である。
【図２】実施例４，５、比較例２で得られたＨＰＬＣスペクトルを示す図である。
【図３】実施例６，７、比較例３で得られたＨＰＬＣスペクトルを示す図である。
【図４】実施例８，９、比較例４で得られたＨＰＬＣスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００１３】
本実施形態の糖鎖を調製する方法の概要を説明する。
【００１４】
本実施形態の糖鎖を調製する方法は、糖鎖を含有する糖鎖含有サンプルに標識試薬を加えることにより、糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程を有するものであり、当該標識工程において、標識試薬と糖鎖との反応環境中に水を含むものである。
【００１５】
本実施形態の糖鎖を調製する方法によれば、糖鎖と標識試薬との反応環境中に水を含ませることにより、糖鎖の標識効率が文献１の標識効率と比べてさらに向上させることが可能である。詳細なメカニズムは定かでないが、水の高極性により、２−ＡＢ等の標識試薬の混合溶媒中における分散性が高まり、糖鎖の標識効率が向上するものと考えられる。
したがって、本実施形態の糖鎖を調製する方法は、糖鎖の標識効率に優れた糖鎖標識プロトコルを実現することが可能である。
【００１６】
以下、本実施形態の糖鎖を調製する方法の各工程について詳述する。
本実施形態の糖鎖を調製する方法の一例としては、糖鎖を含有する糖鎖含有サンプルに標識試薬を加えることにより、糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程を有することができる。
【００１７】
（糖タンパク質）
本実施形態において、糖鎖は、糖タンパク質由来の糖鎖とすることできる。
上記糖タンパク質は、少なくとも糖鎖を複合成分として含むタンパク質であればよい。糖タンパク質の糖鎖部分は、Ｎ−結合型であってもよく、Ｏ−結合型であってもよい。また、糖鎖部分は、天然の構造を有していてもよいし、人工的に改変されていてもよい。また、糖鎖部分は、中性糖鎖であってもよいし、酸性糖鎖であってもよい。また、糖タンパク質における糖鎖結合部位は、天然物と同じ部位であってもよいし、天然物では糖鎖が結合していない部位であってもよい。
【００１８】
糖タンパク質のタンパク質部分は、変性前の状態において、糖鎖部分をその内部に取り込むようにフォールディングしていてもよい。このようなタンパク質部分の分子量は、例えば１ｋＤａ以上であってもよく、１０ｋＤａ以上であってもよい。タンパク質部分の分子量範囲内の上限は特に限定されず、例えば１０００ｋＤａであってもよい。
【００１９】
具体的な糖タンパク質としては、例えば、抗体、ホルモン、酵素及びこれらを含む複合体からなる群より選ばれる生理活性物質が挙げられる。ここで、複合体としては、抗原と抗体との複合体、ホルモンと受容体との複合体、酵素と基質との複合体等が挙げられる。これらの糖タンパク質は、細胞培養工学的に調製される生理活性物質として利用することができる。
【００２０】
また、糖タンパク質が抗体を含むことができる。この抗体としては、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等の免疫グロブリン；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）等の低分子抗体；Ｆｃ領域と他の機能性タンパク質又はペプチドとの融合により構成されるＦｃ融合タンパク質又はペプチド等のＦｃ含有分子；放射性同位元素配位性キレート、ポリエチレングリコール等の化学修飾基を付加した化学的修飾抗体等が挙げられる。また、抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。
【００２１】
また、抗体は、抗体医薬品候補又は抗体医薬品であってもよい。抗体医薬品候補は、抗体医薬品の開発途上にある物質であり、抗体医薬品としての活性及び安全性等の評価に供される物質である。
【００２２】
また、本実施形態の糖鎖を調製する方法の一例としては、標識工程の前に、固相に固定された状態の試料に糖鎖遊離酵素を作用させることにより、糖鎖を含有する糖鎖含有サンプルを得る遊離工程と、を有することができる。これにより、糖鎖の切出しを迅速に行うことができる。
【００２３】
（試料）
本実施形態において、固相に固定された試料は、上記糖タンパク質を含むことができる。
上記固相に固定された試料は、例えば、糖タンパク質を含む試料を固相に接触させて捕捉することにより得ることができる。固相に接触させるべき糖タンパク質を含む試料は、糖鎖調製を迅速に行う観点から、糖タンパク質の精製（糖タンパク質をその夾雑物から分離すること）が行われていないものであってもよい。例えば、血液（例えば、血清、血漿）、リンパ液、腹腔浸出液、組織間液、脳脊髄液、腹水等の体液；Ｂ細胞、ハイブリドーマ、ＣＨＯ細胞等の抗体産生細胞の培養上清；抗体産生細胞を移植した動物の腹水等が挙げられる。試料は、培養上清等の細胞培養工学的な糖タンパク質の調製物のように、タンパク質部分が均一であり、かつ糖鎖部分が非均一である、糖タンパク質のバリエーションの混合物であってもよい。
【００２４】
固相に固定されたタンパク質を含む試料は、上記の他に、糖タンパク質の固相合成によって得られる生成物であってもよい。
【００２５】
固相に接触させるべき糖タンパク質を含む試料における糖タンパク質の濃度は特に限定されず、例えば、０．１μｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬであってもよい。上記下限値以上であることは、検出の点で好ましく、上記上限値以下であることは、定量性の点で好ましい。
【００２６】
固相に接触させるべき糖タンパク質は、容器１つあたり０．００１μｇ〜１００ｍｇであってもよく、０．００１μｇ〜５ｍｇであってもよい。糖タンパク質の量が上記下限値以上であることは検出の点で好ましい。本実施形態の方法は工程数が少なく試料のロスが非常に少ないため、糖タンパク質が小スケール（特に０．００１〜５００μｇ）である場合に特に有用である。糖タンパク質の量が上記上限値以下であることは、定量性の点で好ましい。
【００２７】
固相に固定された糖タンパク質を含む試料は、固相に固定された糖タンパク質が液体成分中に分散された状態で用意されてもよいし、液体成分が分離された状態で用意されてもよい。
【００２８】
また、固相に固定された糖タンパク質を含む試料は、上記の糖タンパク質を含む試料を固相に接触させ糖タンパク質の捕捉が完了した時点、又は固相合成が完了した時点で、夾雑物を含み得る。夾雑物としては、固相に固定すべき糖タンパク質を含む試料に含まれていた成分、糖タンパク質の固相合成に用いた試薬等が挙げられ、より具体的には、塩、低分子化合物、タンパク質（当該固相への結合性を有さないタンパク質）その他の生体分子が挙げられる。
【００２９】
したがって、固相に固定された糖タンパク質を含む試料は、糖タンパク質の捕捉が完了した後、又は固相合成が完了した後に、洗浄処理が行われたものであってよい。これによって、糖タンパク質を固相に固定したまま、共雑物を除去することができる。洗浄は、固相に洗浄液を通液させることによって行うことができる。通液の方法としては、自然落下、吸引、加圧、遠心等の方法が挙げられる。
【００３０】
洗浄液としては、糖タンパク質のタンパク質部分と固相表面のリンカーとの結合を切断しない液性及び組成のものが当業者によって適宜選択される。具体的には、緩衝液その他の水溶液又は水であってもよい。水溶液を用いる場合、ｐＨが５〜１０であるものが好ましい。水溶液のｐＨがこの範囲内であれば、後の工程で用いる糖鎖遊離酵素の活性を保ちやすい。また、糖タンパク質が非共有結合によって固相に固定されている場合には、糖タンパク質の遊離を防止しやすい。緩衝液を用いる場合、緩衝剤としては、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；トリスヒドロキシメチルアンモニウム等のトリス緩衝剤；リン酸塩等が挙げられる。
【００３１】
（固相）
本実施形態において、上記試料中の糖タンパク質が固相に固定され得る固定の態様としては、特異的結合による非共有結合（水素結合及びイオン結合）、並びに共有結合が含まれ、例えば泳動ゲルにアプライ又はブロッティングメンブレンに転写されることより単に保持されるに過ぎない態様は含まれない。非共有結合による固定である場合、結合速度定数ｋａ（単位Ｍ−１ｓ−１）が、例えば１０３以上、例えば１０４以上、例えば１０３〜１０５、例えば１０４〜１０５の親和性を有することが好ましい。
【００３２】
糖タンパク質を固定している固相は、糖タンパク質のタンパク質部分と非共有結合的又は共有結合的に連結しているリンカーを表面に有する担体であれば特に限定されない。
【００３３】
担体がその表面に有するリンカーとしては、例えば、糖タンパク質のタンパク質部分を捕捉可能なリガンドが挙げられる。リガンドとしては、糖タンパク質のタンパク質部分に親和性のある分子（以下、単に糖タンパク質に親和性のある分子という場合がある。）、イオン交換基又は疎水性基が表面に化学的に修飾された担体が挙げられる。
【００３４】
糖タンパク質に親和性のある分子は特に限定されず、捕捉すべき糖タンパク質に応じて当業者が容易に決定することができる。例えば、ペプチド性又はタンパク質性リガンド、アプタマー（糖タンパク質に特異的に結合可能な合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ又はペプチド）、化学合成性リガンド（チアゾール誘導体等）が挙げられる。
【００３５】
例えば、糖タンパク質が抗体である場合、糖タンパク質に親和性のある分子は、抗体又は抗体の定常領域であるＦｃ含有分子に特異的に結合するものであってもよい。より具体的には、ペプチド性又はタンパク質性リガンドとして、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＨ、プロテインＤ、プロテインＡｒｐ等の微生物由来リガンド；それらのリガンドの組換え発現により得られる機能的改変体（類縁物質）；抗体のＦｃレセプター等の組換えタンパク質等が挙げられる。これにより、糖鎖解析の重要性が特に高い抗体について、スループット性の高い糖鎖試料調製及び解析が可能となる。
【００３６】
イオン交換基は、イオン交換機能により糖タンパク質を捕捉可能であり、かつ、カウンターイオンによってイオン強度依存的に糖タンパク質を脱離可能である官能基であれば特に限定されない。好ましくは、カルボキシル基（より具体的には、カルボキシメチル基等）、スルホン酸基（より具体的には、スルホエチル基、スルホプロピル基等）等の陽イオン交換基が挙げられ、四級アミノ基等の陰イオン交換基であってもよい。
【００３７】
疎水性基としては、例えば、炭素数２〜８のアルキル基又はアリール基が挙げられる。より具体的には、ブチル基、フェニル基、オクチル基等が挙げられ、これらの基は１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３８】
担体がその表面に有するリンカーとしては、上記の他、糖タンパク質のタンパク質部分の構成要素であるＣ末端アミノ酸残基のＣ末端と共有結合した連結基であってもよい。このような連結基としては、ペプチド固相合成で用いられる固相表面修飾試薬であるアミノ基含有化合物から誘導される連結基が挙げられる。
【００３９】
担体は、水に不溶な基材であって、上記のリンカーを固定化できるものであれば特に限定されず、有機担体、無機担体及びそれらの複合担体が挙げられる。有機担体としては、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン等の合成高分子；架橋セファロース、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アミロース、架橋アガロース、架橋デキストラン等の多糖類からなる担体が挙げられる。これらは１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。無機担体としては、ガラスビーズ、シリカゲル、モノリスシリカ等が挙げられる。
【００４０】
有機担体が水を含みやすい性質であるのに対して、無機担体は水を含みにくい。本実施形態の方法では、固相上で種々の反応を行うため、水を含みにくい無機担体を用いることが好ましい。これにより、酵素及び／又は試薬の効果を希釈させないため好ましい。酵素及び／又は試薬の効果の希釈防止は、分析における不要なシグナルの検出の防止に寄与する。したがって、担体は無機担体であることが好ましい。また、担体が無機担体であると、例えば、糖鎖遊離酵素により担体の一部が遊離することがなく、糖由来の樹脂を使用した場合に初めから樹脂に残存する糖の溶出が起こることがない。このため、遊離された糖鎖の分析において、不要なシグナルの出現を抑制しやすい。
【００４１】
担体の形状としては特に限定されず、粒子状であってもよく、非粒子状であってもよい。粒子状の担体（ビーズ）の場合、多孔質担体であってもよい。粒子状の担体の場合、平均粒子径は例えば１〜１００μｍであってもよい。平均粒子径が上記下限値以上であることは、通液性の点で好ましく、上記上限値以下であることは、理論断数の低下を防ぐ点で好ましい。
【００４２】
非粒子状の担体としては、モノリスタイプのシリカゲル及び膜体等が挙げられる。モノリスタイプのシリカゲルは、マイクロメートルサイズの三次元網目状細孔（マクロ孔）と、ナノメートルサイズの細孔（メソ孔）とを有する、シリカゲルのバルク体である。マクロ孔の径は例えば１〜１００μｍであってもよく、１〜５０μｍであってもよく、１〜３０μｍであってもよく、１〜２０μｍであってもよい。マクロ孔が上記下限値以上であることは通液性の点で好ましく、上記上限値以下であることは、理論断数の低下を防ぐ点で好ましい。メソ孔の径は例えば１〜１００ｎｍであってもよく、１〜５０ｎｍであってもよい。これによって糖を効率的に捕捉することができる。
【００４３】
担体の使用体積（粒子状担体にあっては、担体自体の体積に、充填時の空隙の体積も含み、非粒子状担体にあっては、担体自体の体積に、メソ孔及びマクロ孔の体積も含む）は、例えば０．００１〜０．１ｃｍ３であってもよく、例えば０．００１〜０．０１ｃｍ３であってもよい。上記下限値以上であることは、理論断数の低下を防ぐ点で好ましく、上記上限値以下であることは、通液性の点で好ましい。また、上記の体積であることにより、溶出後の分離液を、ＨＰＬＣ分析に適した濃度で得ることも容易となる。
【００４４】
本実施形態において、上記固相が、例えば、カラム構造またはカートリッジ構造を有することができる。このような固相は、上記非粒子状の担体で所定のフィルター形状を有するように構成されていており、容器の一部と一体化するように構成されていてもよく、また、個別の部材として着脱自在に容器内に固定されていてもよい。
【００４５】
上記固相は、カラム、マルチウェルプレートの各ウェル、フィルタープレートの各ウェル、マイクロチューブ等の容器の中に充填された状態で使用されてもよい。
【００４６】
本実施形態における上記遊離工程は、容器中で実施されてもよい。すなわち、固相に固定された糖タンパク質を含む試料は、容器内に用意されてもよい。固相に固定された糖タンパク質は、当該容器内で調製されることが効率的で好ましい。
【００４７】
（容器）
上記容器は、液体及び固相の保持並びに固相を保持した状態での液体の分離（通液）が可能な容器であれば特に限定されず、例えば、カラム、マルチウェルプレートの各ウェル、フィルタープレートの各ウェル、マイクロチューブ等が挙げられる。また、この容器は、チューブ形状を有していてもよく、具体的には、一端が開口されており他端が閉口されたチューブ形状を有していてもよい。開放された状態の容器は、一端側の開口がキャップされておらず、その容器の内部空間と外部空間とが連通した状態にある。
【００４８】
（糖鎖遊離酵素）
本実施形態において、上記糖鎖遊離酵素としては、例えば、ペプチドＮ−グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ＰＮＧａｓｅ  Ａ）またはエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅｎｄｏ−Ｈ、Ｅｎｄｏ−Ｆ、Ｅｎｄｏ−Ａ、Ｅｎｄｏ−Ｍ）等が挙げられる。
【００４９】
糖鎖遊離酵素は、水又は緩衝液中に分散された状態で用意されてもよい。緩衝液を用いる場合、緩衝剤としては、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム等が挙げられる。緩衝液は、ｐＨが５〜１０であるものが好ましい。緩衝液のｐＨがこの範囲内であると、糖鎖遊離酵素の活性を保ちやすい。水又は緩衝液は、糖鎖遊離酵素とともに、金属塩等の塩類等のタンパク質の安定化剤等の成分を含有していてもよい。
【００５０】
上記遊離工程は、脱糖鎖促進剤の存在下で行われてもよい。これによって、糖タンパク質から遊離した糖鎖を含む、糖鎖含有サンプルの回収率を向上させることができる。
【００５１】
（脱糖鎖促進剤）
上記脱糖鎖促進剤は、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含有することが好ましい。酸由来型陰イオン性界面活性剤により、糖タンパク質のタンパク質部分が変性して三次構造が変化し、糖鎖遊離酵素が分解標的部位に作用しやすくなる。これによって、糖部分が容易に分解されて遊離する。
【００５２】
酸由来型陰イオン性界面活性剤は、有機酸から誘導される陰イオン性界面活性剤である。例えば、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤、スルホン酸型陰イオン性界面活性剤、硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤、リン酸エステル型陰イオン性界面活性剤等が挙げられる。中でも、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤が好ましい。酸由来型陰イオン性界面活性剤がカルボン酸型陰イオン性界面活性剤であると、糖タンパク質のタンパク質部分を変性させるが、糖鎖遊離酵素を変性させにくい傾向にあると考えられる。
【００５３】
上記カルボン酸型陰イオン性界面活性剤としては、Ｒ１−ＣＯＯＸ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるカルボン酸及びカルボン酸塩、並びに、Ｒ１ＣＯＮ（Ｒ２）−Ｒ３−ＣＯＯＸ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、−Ｎ（Ｒ２）−Ｒ３−ＣＯＯ−はアミノ酸残基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるアミノ酸及びその塩（Ｎ−アシルアミノ酸系界面活性剤）等が挙げられる。中でも、Ｒ１ＣＯＮ（Ｒ２）−Ｒ３−ＣＯＯＸ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、−Ｎ（Ｒ２）−Ｒ３−ＣＯＯ−はアミノ酸残基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるアミノ酸及びその塩（Ｎ−アシルアミノ酸系界面活性剤）が好ましい。
【００５４】
陽イオンＸとしては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属イオン、トリエタノールアミンイオン、アンモニウムイオン等が挙げられる。なお、以下の全ての酸由来型陰イオン性界面活性剤の例示において、「塩」は少なくともナトリウム塩、カリウム塩、トリエタノールアミン塩、アンモニウム塩を例示するものとする。
【００５５】
上記Ｒ１−ＣＯＯＸで示されるカルボン酸塩において、有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基が挙げられる。
【００５６】
高級アルキル基及び高級不飽和炭化水素基の炭素数は６〜１８であってもよい。このような高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基を有するカルボン酸型陰イオン性界面活性剤の具体例としては、オクタン酸塩、デカン酸塩、ラウリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、オレイン酸塩、リノール酸塩等が挙げられる。また、上記の高級アルキル基及び高級不飽和炭化水素基は置換されていてもよく、置換基は炭素数が例えば１〜３０のアルキル基又はアルコキシカルボニル基であってもよい。
【００５７】
オキシアルキレン基が介在した炭化水素基においては、１以上のオキシアルキレン基が主鎖に含まれていてもよい。オキシアルキレン基は、オキシエチレン基、オキシ−ｎ−プロピレン基、オキシイソプロピレン基等が挙げられる。オキシアルキレン基が介在している炭化水素基としては、例えば、Ｒ４−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｒ５−で表される基が挙げられる。
【００５８】
ここで、Ｒ４は、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、又は置換若しくは無置換のアリール基であってもよい。高級アルキル基及び高級不飽和炭化水素基の炭素数は６〜１８であってもよい。アリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。置換アリール基の場合、置換基は直鎖又は分岐のアルキル基であってもよく、当該直鎖又は分岐のアルキル基の炭素数は１〜３０であってもよい。特にフェニル基の場合、当該置換基はスルホニル基に対してパラ位で置換されていてもよい。また、ｎは、１〜１０であってもよい。また、Ｒ５は、シグマ結合、又は、エチレン基、メチレン基、ｎ−プロピレン基等のアルキレン基であってもよい。このようなカルボン酸塩の具体例としては、ラウレスカルボン酸塩（例えば、ラウレス−４−カルボン酸塩、ラウレス−６−カルボン酸塩）トリデセスカルボン酸塩（例えば、トリデセス−４−カルボン酸塩、トリデセス−６−カルボン酸塩）等が挙げられる。
【００５９】
フッ素置換された高級アルキル基においては、１以上の水素原子がフッ素原子で置換されている。フッ素置換された高級アルキル基は、全ての水素原子がフッ素で置換されたペルフルオロアルキル基であってもよい。また炭素数は、６〜１８であってもよい。このようなペルフルオロアルキルカルボン酸及びペルフルオロアルキルカルボン酸塩の具体例としては、ペルフルオロオクタン酸、ペルフルオロノナン酸、ペルフルオロオクタン酸塩、ペルフルオロノナン酸塩等が挙げられる。
【００６０】
上記カルボン酸型陰イオン性界面活性剤−アミノ酸及びその塩において、Ｒ１ＣＯＮ（Ｒ２）−Ｒ３−ＣＯＯＸで示されるアミノ酸又はその塩において、有機基Ｒ１及び陽イオンＸは、上記のカルボン酸又はカルボン酸塩における有機基Ｒ１及び陽イオンＸと同様である。
【００６１】
また、Ｒ２は、水素原子又はアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等）である。Ｒ３は、置換又は無置換のエチレン基、メチレン基、ｎ−プロピレン基等であってもよく、Ｎ末端側の窒素原子と共に環を形成していてもよい。したがって、−Ｎ（Ｒ２）−Ｒ３−ＣＯＯ−で示されるアミノ酸残基は、α−アミノ酸残基、β−アミノ酸残基、γ−アミノ酸残基等であってもよく、天然アミノ酸由来の残基であってもよく、非天然アミノ酸由来の残基であってもよい。例えば、サルコシン残基、グルタミン酸残基、グリシン残基、アスパラギン酸残基、プロリン残基、β−アラニン残基等のアミノ酸由来の残基が挙げられる。
【００６２】
Ｒ２が水素原子である場合の当該アミノ酸又はその塩（つまりＮ−アシルアミノ酸系界面活性剤）の具体例としては、Ｎ−ラウロイルアスパラギン酸塩、Ｎ−ラウロイルグルタミン酸、Ｎ−ラウロイルグルタミン酸塩、Ｎ−ミリストイルグルタミン酸塩、Ｎ−ココイルアラニン塩、Ｎ−ココイルグリシン塩、Ｎ−ココイルグルタミン酸塩、Ｎ−パルミトイルグルタミン酸塩、Ｎ−パルミトイルプロリン、Ｎ−パルミトイルプロリン塩、Ｎ−ウンデシレノイルグリシン、Ｎ−ウンデシレノイルグリシン塩、Ｎ−ステアロイルグルタミン塩等が挙げられる。酸由来型陰イオン性界面活性剤がＮ−アシルアミノ酸系界面活性剤であると、糖タンパク質のタンパク質部分をより変性させやすく、糖鎖遊離酵素を変性させにくい傾向がある。
【００６３】
Ｒ２がアルキル基である場合の当該アミノ酸又はその塩（つまりＮ−アシル−Ｎ−アルキルアミノ酸系界面活性剤）の具体例としては、Ｎ−ココイル−Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−ココイル−Ｎ−メチルアラニン塩、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチル−β−アラニン、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチル−β−アラニン塩、Ｎ−ミリストイルサルコシン塩、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチルアラニン塩、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−イソプロピルグリシン塩、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチル−β−アラニン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチル−β−アラニン塩、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−エチル−β−アラニン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−エチル−β−アラニン塩、Ｎ−ラウロイルサルコシン、Ｎ−ラウロイルサルコシン塩、Ｎ−ココイルサルコシン、Ｎ−ココイルサルコシン塩、Ｎ−オレオイル−Ｎ−メチル−β−アラニン、Ｎ−オレオイル−Ｎ−メチル−β−アラニン塩、Ｎ−オレオイルサルコシン、Ｎ−オレオイルサルコシン塩、Ｎ−リノレイル−Ｎ−メチル−β−アラニン、Ｎ−パルミトイル−Ｎ−メチル−β−アラニン、Ｎ−パルミトイルサルコシン塩等が挙げられる。酸由来型陰イオン性界面活性剤がＮ−アシル−Ｎ−アルキルアミノ酸系界面活性剤であると、糖タンパク質のタンパク質部分をさらに変性させやすく、糖鎖遊離酵素を変性させにくい傾向がある。
【００６４】
上記スルホン酸型陰イオン性界面活性剤は、Ｒ１−ＳＯ３Ｘ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるスルホン酸又はスルホン酸塩である。有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基、置換又は無置換のアリール基、二価の連結基（例えば、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨ−等）が介在した高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基等が挙げられる。
【００６５】
有機基Ｒ１のうち、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基、及び陽イオンＸについては、上記のカルボン酸又はカルボン酸塩における有機基Ｒ１及び陽イオンＸと同様である。
【００６６】
具体的には、１−ヘキサンスルホン酸塩、１−オクタンスルホン酸塩、１−デカンスルホン酸塩、１−ドデカンスルホン酸塩；ペルフルオロブタンスルホン酸、ペルフルオロブタンスルホン酸塩、ペルフルオロオクタンスルホン酸、ペルフルオロオクタンスルホン酸塩；テトラデセンスルホン酸塩；アルファスルホ脂肪酸メチルエステル塩（ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＳＯ３Ｘ）ＣＯＯＣＨ３）等（ｎは、１〜３０の整数）が挙げられる。
【００６７】
有機基Ｒ１が置換又は無置換のアリール基である場合、アリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。置換アリール基の場合、置換基は直鎖又は分岐のアルキル基であってもよく、当該直鎖又は分岐のアルキル基の炭素数は１〜３０であってもよい。特にフェニル基の場合、当該置換基はスルホニル基に対してパラ位で置換されていてもよい。このような芳香属系スルホン酸塩としては、トルエンスルホン酸塩、クメンスルホン酸塩、オクチルベンゼンスルホン酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、ナフタレンジスルホン酸塩、ナフタレントリスルホン酸塩、ブチルナフタレンスルホン酸塩等が挙げられる。
【００６８】
有機基Ｒ１が、二価の連結基（例えば、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨ−等）が介在した高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基である場合のスルホン酸型界面活性剤としては、当該高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基でＯ−置換されたイセチオン酸塩、当該高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基でＮ−置換されたタウリン塩等が挙げられる。当該高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基の炭素数は、６〜１８であってもよい。このようなスルホン酸型界面活性剤の具体例としては、ココイルイセチオン酸塩、ココイルタウリン塩、ココイル−Ｎ−メチルタウリン、Ｎ−オレオイル−Ｎ−メチルタウリン塩、Ｎ−ステアロイル−Ｎ−メチルタウリン塩、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチルタウリン塩等が挙げられる。
【００６９】
上記硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤は、Ｒ１−ＯＳＯ３Ｘ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、Ｘは陽イオンを表す。）で表される硫酸エステル塩である。有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基であり、それぞれ、上述のカルボン型界面活性剤におけるＲ１と同じである。陽イオンＸとしては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属イオン、トリエタノールアミンイオン、アンモニウムイオン等が挙げられる。
【００７０】
硫酸エステル塩の具体例としては、ラウリル硫酸塩、ミリスチル硫酸塩、ラウレス硫酸塩（Ｃ１２Ｈ２５（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＯＳＯ３Ｘ、ここで、ｎは１〜３０の整数）、ポリオキシエチレンアルキルフェノールスルホン酸ナトリウム（Ｃ８Ｈ１７Ｃ６Ｈ４Ｏ［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］３ＳＯ３Ｘ）等が挙げられる。
【００７１】
上記リン酸エステル型陰イオン性界面活性剤は、Ｒ１−ＯＳＯ３Ｘ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるリン酸エステル又はリン酸エステル塩である。有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基であり、それぞれ、上述のカルボン型界面活性剤におけるＲ１と同様である。陽イオンＸとしては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属イオン、トリエタノールアミンイオン、アンモニウムイオン等が挙げられる。
【００７２】
リン酸エステル又はリン酸エステル塩の具体例としては、ラウリルリン酸、ラウリルリン酸塩等が挙げられる。
【００７３】
上記脱糖鎖促進剤は、水又は緩衝液中に酸由来型陰イオン性界面活性剤が溶解又は分散された状態で用意されてもよい。緩衝液を用いる場合、緩衝剤としては、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；トリスヒドロキシメチルアンモニウム等のトリス緩衝剤；リン酸塩等が挙げられる。緩衝液は、ｐＨが５〜１０であるものが好ましい。緩衝液のｐＨがこの範囲内であると、糖鎖遊離酵素の活性を保ちやすい。脱糖鎖促進剤において、水又は緩衝液中に含まれる酸由来型陰イオン性界面活性剤以外の成分としては、界面活性剤以外の金属塩等の塩類が挙げられる。
【００７４】
本実施形態における遊離工程では、糖鎖遊離酵素の至適条件（温度及びｐＨ）が満たされた、糖タンパク質と糖鎖遊離酵素とを含む遊離反応液が調製されればよい。
【００７５】
脱糖鎖促進剤を用いる場合は、糖鎖遊離酵素の至適条件（温度及びｐＨ）が満たされた、糖タンパク質と酸由来型陰イオン性界面活性剤と糖鎖遊離酵素とを含む遊離反応液が調製されればよい。したがって、脱糖鎖促進剤を用いる場合には、固定された糖タンパク質を含む試料（以下、単に糖タンパク質を含む試料という場合がある。）、脱糖鎖促進剤、及び糖鎖遊離酵素はどのような操作手順で混合されてもよい。
【００７６】
例えば、糖タンパク質を含む試料と、脱糖鎖促進剤と、糖鎖遊離酵素とを同じタイミングで互いに混合して遊離反応液を調製してもよい。また、先に脱糖鎖促進剤を加え、その後に糖鎖遊離酵素を加えることで遊離反応液を調製してもよい。さらに、固相に固定された糖タンパク質が後述する前処理を経て得られたものである場合で、かつ、脱糖鎖促進剤と前処理に用いられる界面活性剤とが同一物質である場合には、前処理の時に、脱糖鎖促進剤に相当する分量の界面活性剤を、前処理剤に相当する分量の界面活性剤に上乗せして先に加えておき、引き続く遊離工程で（すでに脱糖鎖促進剤が存在している状態であるため）糖鎖遊離酵素のみを加えてもよい。
【００７７】
具体的には、すべての成分を混合させた遊離反応液を調製し、その後、至適温度に設定して、糖タンパク質から糖鎖を遊離させる反応を行うことができる。この場合、反応時間は例えば５秒〜２４時間であってもよい。
【００７８】
脱糖鎖促進剤を用いる場合には、糖タンパク質を含む試料と、酸由来型陰イオン性界面活性剤とを先に混合して糖タンパク質のタンパク質部分を変性させた後に、糖鎖遊離酵素と混合してもよい。この場合、変性時間は例えば５秒〜２４時間であってもよく、糖鎖遊離時間は例えば５秒〜２４時間であってもよい。
【００７９】
遊離反応液において、糖タンパク質の濃度は、例えば０．１μｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであってもよく、例えば１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬであってもよい。遊離反応液中の糖タンパク質の濃度が上記下限値以上であることは、検出性の点で好ましく、上記上限値以下であることは、定量性の点で好ましい。
【００８０】
脱糖鎖促進剤を用いる場合、遊離反応液において、酸由来型陰イオン性界面活性剤の濃度は、例えば０．０１〜３０質量％であってもよく、例えば０．２〜１．０質量％であってもよく、例えば０．２〜０．３質量％であってもよく、例えば０．２２〜０．２７質量％であってもよい。あるいは、酸由来型陰イオン性界面活性剤は、糖タンパク質１μｇに対して０．００１μｇ〜１００ｍｇ以下となるように用いてもよい。
【００８１】
酸由来型陰イオン性界面活性剤の使用量を上記の範囲に設定することによって、糖鎖遊離酵素の活性維持の点及び遊離糖鎖の回収量の点で良好となり、かつ、回収量の安定性の点でも良好となる。また、例えば遊離糖鎖の精製を固相担体によって行う場合に、乾燥時間の冗長を防止する点でも好ましい。
【００８２】
遊離反応液において、糖鎖遊離酵素の濃度は、例えば０．００１μＵ／ｍＬ〜１０００ｍＵ／ｍＬであってもよく、例えば０．０１μＵ／ｍＬ〜１００ｍＵ／ｍＬであってもよい。あるいは、糖鎖遊離酵素を糖タンパク質１μｇに対して０．００１μＵ〜１０００ｍＵとなるように用いてもよい。糖鎖遊離酵素の使用量を上記の範囲に設定することによって、効率的な糖鎖遊離が可能となる。
【００８３】
反応ｐＨは、糖鎖遊離酵素の至適ｐＨに合わせればよいが、例えば５〜１０であってもよい。反応温度も、糖鎖遊離酵素の至適温度に合わせればよいが、例えば４〜９０℃であってもよい。
【００８４】
上記遊離工程において、反応時間は、糖タンパク質のスケール等にもよるが、例えば５秒〜２４時間であってもよい。好ましくは、遊離工程の反応系を開放系（例えば、容器を開放した状態）にして溶媒が蒸発するように加熱してもよい。また、閉鎖（キャップ）した状態で容器を加熱した後、開放した状態の容器中の溶媒について、公知方法で乾燥して除去してもよい。加熱温度としては、例えば４０℃以上、例えば４５℃以上であってもよい。これによって、遊離工程の進行中に溶媒が蒸発して反応液の濃度が徐々に上昇するため、本実施形態の方法に供された糖タンパク質のスケールにかかわらず、糖鎖遊離が効率的に進む濃度に供することが容易である。さらに、遊離反応とともに溶媒除去が併せて行われるため、遊離工程と別に溶媒除去工程を行うための時間が短縮され又は不要となり、更に迅速な糖鎖調製が可能となる。加熱温度の範囲内の上限としては、糖鎖遊離酵素の変性を防ぐ観点から、例えば８０℃であってもよい。
以上により、上記遊離工程によって、試料中の糖タンパク質から分離した糖鎖を含有する糖鎖含有サンプルが得られる。
【００８５】
（前処理工程）
本実施形態の糖鎖を調製する方法の一例としては、上記遊離工程の前に、試料に対して、界面活性剤または、塩化グアニジン・グアニジンチオシアネート・グアニジン塩酸塩等のグアニジン塩・尿素などのカオトロピック試薬を含む、前処理剤を接触させる前処理工程をさらに有してもよい。
これにより、タンパク質部分の分解処理を行うことなく、糖タンパク質からの糖鎖の遊離が容易になる。その結果、糖鎖遊離処理に要する時間を大幅に短縮することができる。
【００８６】
前処理工程では、固相に固定された糖タンパク質を含む試料に界面活性剤を含む前処理剤を接触させてもよい。前処理工程は、糖タンパク質を含む試料を固相に接触させ糖タンパク質の捕捉が完了した後、又は、固相合成が完了した後若しくは更に洗浄処理が行われた後であって、糖鎖遊離酵素に接触させられる前に行われてもよい。前処理工程を実施することにより、遊離工程において糖タンパク質に糖鎖遊離酵素が作用しやすくなる。
【００８７】
前処理剤に含まれる界面活性剤は、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、及び非イオン界面活性剤のいずれであってもよい。
【００８８】
陰イオン界面活性剤としては特に限定されず、石鹸等の脂肪酸の塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、高級アルコール硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、α−スルホ脂肪酸エステル、α−オレフィンスルホン酸塩、モノアルキルリン酸エステル塩、アルキルスルホン酸塩等が挙げられるが、後の糖鎖遊離工程で用いられる脱糖鎖促進剤として用いることができる陰イオン性界面活性剤（本明細書では、脱糖鎖促進剤としても用いることができる陰イオン性界面活性剤を、特に酸由来型陰イオン性界面活性剤という。）であることが好ましい。酸由来型陰イオン性界面活性剤を前処理工程で用いる場合、糖鎖遊離工程で用いられる脱糖鎖促進剤として挙げた界面活性剤と同じ界面活性剤であってもよいし、異なる界面活性剤であってもよい。
【００８９】
陽イオン界面活性剤としては特に限定されず、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、アミン塩系等が挙げられる。両性界面活性剤としては特に限定されず、アルキルアミノ脂肪酸塩、アルキルベタイン、アルキルアミンオキシド等が挙げられる。非イオン界面活性剤としては特に限定されず、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグルコシド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー等が挙げられる。
【００９０】
前処理剤は、界面活性剤が、水又は緩衝液中に溶解した状態で用いられてもよい。緩衝液を用いる場合、緩衝剤としては、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；トリスヒドロキシメチルアンモニウム等のトリス緩衝剤；リン酸塩等が挙げられる。緩衝液は、ｐＨが５〜１０であるものが好ましい。緩衝液のｐＨがこの範囲内であると、後の工程で用いる糖鎖遊離酵素の活性を保ちやすい。糖タンパク質を含む試料において、水又は緩衝液中に含まれる糖タンパク質以外の成分としては、金属塩等の塩類等のタンパク質の安定化剤等が挙げられる。
【００９１】
前処理剤中の界面活性剤の濃度は、例えば０．０１〜３０質量％であってもよく、例えば０．２〜１．０質量％であってもよく、例えば０．２〜０．３質量％であってもよく、例えば０．２２〜０．２７質量％であってもよい。当該濃度が上記下限値以上であること、及び上記上限値以下であることによって、後の糖鎖遊離工程において遊離させた糖鎖を、良好な回収率で得ることができる。
【００９２】
前処理剤は、固相に接触させた後は、固相に固定された糖タンパク質から分離され得る。分離は、所定の使用量の全てを容器内に入れた後に一度に行ってもよいし、所定の使用量の一部を何回かに分けて入れ、その都度行ってもよい。前処理剤の分離は、減圧又は遠心分離等によって行うことができる。
【００９３】
前処理工程を終えた固相に固定された糖タンパク質は、迅速調製の観点で、洗浄されることなく遊離工程に供してもよいが、前処理工程の後、遊離工程の前に洗浄操作を行ってもよい。洗浄操作は、各操作の間に適宜実施してもよい。
【００９４】
（標識工程）
本実施形態の糖鎖を調製する方法の一例としては、糖鎖を含有する糖鎖含有サンプルに標識試薬を加えることにより、糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程を有するものであり、当該標識工程において、標識試薬と糖鎖との反応を容器内で行うことができる。また、標識工程は、遊離工程を行った容器と同じ容器を用いて実施してもよい。
このような標識工程では、遊離工程で得られた容器中の糖鎖を含有する糖鎖含有サンプルに、標識化合物を含む標識試薬（標識反応液）を加え、糖鎖の標識体を含む標識生成物を得ることができる。
【００９５】
（標識化合物）
上記標識化合物は、糖鎖に対する反応性基と、糖鎖に付すべき修飾基とを有するものであれば特に限定されない。糖鎖に対する反応性基としては、オキシルアミノ基、ヒドラジド基、アミノ基等が挙げられる。修飾基は、糖鎖の分析手法に応じて当業者が適宜選択することができる。
【００９６】
例えば、標識化合物が、糖鎖への反応性基としてオキシルアミノ基又はヒドラジド基を有する場合、糖鎖に付すべき修飾基としては、例えば、アルギニン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、システイン残基、リジン残基からなる群より選ばれるアミノ酸残基を選択することができる。
【００９７】
標識化合物がアルギニン残基を含む場合、修飾された糖鎖のＭＡＬＤＩＴＯＦ−ＭＳ測定時にイオン化が促進され、検出感度が向上する点で好ましい。標識化合物がトリプトファン残基を含む場合、当該残基は蛍光性かつ疎水性であることから、修飾された糖鎖の逆相ＨＰＬＣ検出時に、分離性が向上及び蛍光検出感度が向上する点で好ましい。標識化合物がフェニルアラニン残基及び／又はチロシン残基を含む場合、修飾された糖鎖のＵＶ吸収による検出に適する点で好ましい。標識化合物がシステイン残基を含む場合、当該残基の−ＳＨ基を標的としてＩＣＡＴ試薬（米国ＡＢＩ社）等のラベル化試薬によるラベル化ができる。標識化合物がリジン残基を含む場合、当該残基のアミノ基を標的としてｉＴＲＡＱ試薬（米国Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＥｘａｃＴａｇ試薬（米国Ｐｅｒｋｉｎ社）等のラベル化試薬によるラベル化ができる。標識化合物がトリプトファン残基を含む場合、当該残基のインドール基を標的としてＮＢＳ試薬（日本国、島津製作所）によるラベル化ができる。
【００９８】
また、例えば、標識化合物が糖鎖への反応性基としてアミノ基を有する場合、標識化合物として、紫外線吸収特性または蛍光特性を有するアミノ基を有する化合物を用いることができる。このアミノ基を有する化合物において、糖鎖に付すべき修飾基としては、芳香族基が挙げられる。アミノ基及び芳香族基を有する標識化合物の使用では、還元アミノ化による修飾が行われる。芳香族基は、紫外可視吸収特性又は蛍光特性を有するため、ＵＶ検出又は蛍光検出での検出感度が向上する点で好ましい。
【００９９】
このような芳香族基を与える標識化合物としては、具体的には、８−ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ，８−ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ，７−ａｍｉｎｏ−１，３−ｎａｐｈｔａｌｅｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，２−ａｍｉｎｏ９（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｏｎｅ，５−ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，ｄａｎｓｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ，２−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ，７−ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ，２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ，２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ，３−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ，７−ａｍｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ，３−（ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）−６−ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅ，２−ａｍｉｎｏ−６−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ，ｅｔｈｙｌ  ｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ，ｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｎｉｔｒｉｌｅ及び７−ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄが挙げられる。
【０１００】
中でも、アミノ基を有する化合物としては、２−アミノベンズアミド（２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ）を含むことができる。２−アミノベンズアミドは、反応スケールが大きい場合であっても夾雑物（例えば、塩、タンパク質その他の生体分子）の影響を比較的受けにくい点で好ましい場合がある。一方、本実施形態の方法は、反応スケールが小さい場合に特に有用である。反応スケールが小さいほど夾雑物の影響を受けにくくなるため、より多種多様の標識試薬（標識反応液）へ適用することができる。なお、標識化合物としての機能が維持される限りにおいて、上述の化合物の誘導体もまた好ましく用いられる。
【０１０１】
標識化合物は、水、緩衝液及び／又は有機溶媒に溶解させて使用され得る。緩衝液としては、前述の遊離工程で用いられるものと同様の緩衝剤の水溶液が挙げられる。
【０１０２】
（標識試薬）
本実施形態の標識試薬は、紫外線吸収特性または蛍光特性を有するアミノ基を有する化合物等の標識化合物、還元剤及び有機溶媒を含むことができる。
【０１０３】
上記有機溶媒は、非プロトン性極性有機溶媒、プロトン性極性有機溶媒および非プロトン性非極性溶媒有機溶媒からなる群から選択される一種以上を含むことができる。
具体的には、有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）等の非プロトン性極性有機溶媒、有機酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸等）及びアルコール（メタノール、エタノール、プロパノール等）等のプロトン性極性有機溶媒、並びにヘキサン等の非プロトン性非極性溶媒有機溶媒が挙げられる。これらの溶媒は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１０４】
標識工程に要する時間の短縮効果をより好ましく得る観点から、有機溶媒として、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸等の有機酸を用いることができる。中でも、操作容易性の観点から、有機酸として酢酸を用いることができる。
【０１０５】
プロトン性極性有機溶媒の沸点が比較的低い場合（例えば沸点が１４０℃未満である場合）、プロトン性溶媒に加えて、当該プロトン性溶媒よりも沸点が高い溶媒を併用してもよい。これによって、標識工程における上記の比較的沸点が低いプロトン性極性有機溶媒の揮発速度を遅延させることができる。その結果、標識工程中に、未反応物の不所望の析出を抑制することができる。このことによって、収量よく標識糖鎖を得ることができる。このような沸点が高い溶媒（以下、高沸点溶媒と記載する。）を併用する態様は、糖鎖のスケールが小さい場合、溶媒の量が少ない場合、及び／又は、反応時間が長くなる場合に選択することができる。
【０１０６】
上述の高沸点溶媒としては、例えば沸点１４０〜２００℃の非プロトン性極性有機溶媒であってもよい。具体的な高沸点溶媒としては、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン等の非プロトン性極性有機溶媒が挙げられる。
【０１０７】
高沸点溶媒として非プロトン性極性有機溶媒を併用する場合、その量は、標識化合物である２−アミノベンズアミドや還元剤の溶解性・反応性を向上させるという観点から、プロトン性極性有機溶媒よりも体積％が低いことが好ましく、プロトン性極性有機溶媒の４体積％以上１００体積％未満であってもよく、４〜７０体積％であってもよい。
【０１０８】
還元アミノ化による修飾においては、糖鎖の還元末端に形成されるアルデヒド基と標識化合物のアミノ基とを反応させ、形成されたシッフ塩基を還元剤により還元することで糖鎖の還元末端に修飾基が導入されることで、効率的な標識が可能となる。
【０１０９】
上記還元剤としては、例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム、メチルアミンボラン、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、ピコリンボランおよびピリジンボランからなる群から選択される一種以上を含むことができる。毒性の低いピコリンボランを用いることにより、安全性の高い標識が可能となる。
【０１１０】
安全性及び反応性の両方の観点から、ピコリンボラン（２−ピコリン−ボラン）を用いることが好ましい。同様の観点から、ピコリンボランを還元剤として用いる場合、標識化合物としては例えば２−アミノベンズアミドを用いることが好ましい。また、還元剤としてピコリンボランを用いた場合は、溶媒としてプロトン性極性有機溶媒を含むことが好ましい。これにより、ピコリンボランを高濃度で溶解することができるため、標識工程に要する時間が短縮される。溶媒として、酢酸等のプロトン性極性有機溶媒とジメチルスルホキシド等の非プロトン性極性有機溶媒との混合溶媒を用いてもよい。
【０１１１】
本実施形態における標識工程では、標識試薬と糖鎖含有サンプル中に含有される糖鎖との反応環境中に水を含むものである。具体的には、上記標識工程は、容器内の反応環境中に水が含まれた状態で、標識試薬と糖鎖とを反応させることができる。これにより、上述の通り、標識効率を高めることができる。
【０１１２】
上記標識工程において、標識試薬と糖鎖との反応環境は、固相中に存在してもよいが、これに限定されず、固相中ではなく容器内の底部表面上の液相中に存在してもよい。この反応環境系は、例えば、標識化合物、還元剤並びに有機溶媒を含む標識試薬、糖鎖を含む糖鎖含有サンプル、及び水などで構成することができる。上記液相は、これらの反応環境系中の溶媒等で構成されていてもよい。
【０１１３】
また、標識工程において、反応環境中の水の量をＸ（μＬ）と、糖鎖の量をＹ（μｇ）としたとき、糖鎖量に対する水分量の比率を表すＸ／Ｙの下限値は、例えば、１．２以上であり、好ましくは１．３以上であり、より好ましくは２以上である。このように糖鎖に対する水分比率を適切に制御することにより、糖鎖の標識を効率的に行うことができる。さらには、反応環境中に高濃度で存在する糖鎖に対する標識についても、安定的に行うことができる。上記Ｘ／Ｙの上限値は、特に限定されないが、例えば、５０以下でもよく、３０以下としてもよい。過剰な水が存在することにより、反応環境系中の標識化合物の濃度が低下することで、標識効率が低下してしまうことを抑制できる。
【０１１４】
また、本実施形態の標識工程において、微量の水が存在する場合でも、糖鎖を標識することができる。すなわち、標識工程において、糖鎖の量が０μｇ超え１μｇ未満の場合、反応環境中の水の量は、例えば、０μＬ超え、１．０μＬ以下であり、好ましくは０．５μＬ以下であり、より好ましくは０．３μＬ以下である。このように、反応環境中に低濃度で存在する糖鎖については、微量の水でも標識効率を向上させることができる。
【０１１５】
本実施形態の標識工程において、反応環境中の水は、標識工程前に糖鎖含有サンプル中の水を含有する溶媒を完全に除去した後で、水を後添加すること、標識工程前に溶媒の一部を除去することにより、水を残存させること、または、標識化合物や還元剤などの標識試薬を添加する際に、この標識試薬に含まれる水などによって、適切に調整することができる。
【０１１６】
すなわち、本実施形態の方法は、標識工程において、反応環境中に水を添加する工程を実施することができる。このとき、水を添加する工程前に、糖鎖含有サンプル中の水含有溶媒を完全に乾燥させて水を除去してもよく、溶媒を半乾燥させて、その少なくとも一部を除去してもよい。具体的には、容器を開放した状態で、加熱、吸引、遠心等の方法によって溶媒を乾燥させることができる。これにより、標識工程の反応環境中に水を含ませることができる。
【０１１７】
また、本実施形態の方法は、標識工程の前に、糖鎖含有サンプルに含まれる、糖鎖含有サンプル中の水含有溶媒の少なくとも一部を除去する工程を有することができる。このとき、標識工程の前に、水含有溶媒を完全に除去せず、標識工程にその一部を残存させることができる。これにより、標識工程の反応環境中に水を含ませることができる。
【０１１８】
また、本実施形態の方法の一例としては、例えば、標識工程において、容器を開放又は密閉した状態で、糖鎖含有サンプルに標識試薬を加えてもよい。このとき、糖鎖含有サンプルや標識試薬を容器外の外部環境に曝してもよい。
【０１１９】
標識工程における反応温度は、例えば４℃〜８０℃であってもよく、例えば２５℃〜７０℃であってもよい。反応温度が上記下限値以上であることは反応時間が短くなる点で好ましく、上記上限値以下であることは高温による糖鎖の部分分解が抑制される点で好ましい。
また、標識工程における反応時間は、例えば５分〜６００分であってもよく、例えば３０分〜３００分であってもよい。反応時間が上記下限値以上であることは定量的な標識の点で好ましく、上記上限値以下であることは糖鎖の部分分解が抑制される点で好ましい。
このような加熱処理は、開放系の状態または閉鎖系の状態のいずれの容器を用いて実施してもよい。
【０１２０】
以上の標識工程によって、糖鎖の標識体を含む標識生成物を得ることができる。
【０１２１】
（分離工程）
上記標識工程で得られた標識生成物が固相中に存在する場合、標識工程の後に、固液分離によって、標識された糖鎖を含む分離液を得る分離工程をさらに有することができる。すなわち、固液分離によって、糖鎖の標識体を溶出することにより、固相から、糖鎖の標識体を容易に分離することができる。例えば、標識生成物に溶離液を通液することで、糖鎖の標識体を溶出することができる。この場合に用いる溶離液は、水、水溶液、コロイド溶液等の水系溶液であってよい。溶離液として、固相とタンパク質部分との結合に対する切断能を有する性質を具備するものを選択してもよい（標識糖鎖の分析を例えばクロマトグラフィーによって行う場合等）し、そのような性質を具備しないものを選択してもよい（標識糖鎖の分析を例えば質量分析によって行う場合等）。これによって、糖鎖の標識体を含む分離液が得られる。
【０１２２】
また、上記分離工程は、遊離工程の後、標識工程前に実施してもよい。これにより、固液分離によって、糖鎖を含む糖鎖含有サンプルを容器内の底部に溶出させることができる。
【０１２３】
（精製）
本実施形態の方法は、精製工程を有することができる。糖鎖の分析手法によっては、分離液から不要物を除去することで標識糖鎖を精製してもよい。不要物の除去は、分離液を精製用固相に通液して糖鎖の標識体を捕捉し、捕捉された糖鎖の標識体を再溶出することで行われてよい。なお精製工程は、分離工程後に限らず、前処理工程、遊離工程、分離工程、標識工程等の各工程の間に実施してもよい。
【０１２４】
分離液中には、糖鎖の標識体とともに、標識工程で用いた余剰の標識化合物、及び遊離工程で脱糖鎖促進剤を用いた場合には、酸由来型陰イオン性界面活性剤等の不要物が存在している。溶離液として、固相とタンパク質部分との結合に対する切断能を有するものを選択した場合は、分離液中にタンパク質も混入する。このような場合、上記の精製工程を実施することができる。なお、溶離液として、固相とタンパク質部分との結合に対する切断能を有さないものを選択した場合は、分離液中にタンパク質は実質的に含まれない。
【０１２５】
また、上記の精製の他に、洗浄、遠心等の公知の処理については、前処理工程、遊離工程、分離工程、標識工程等の各工程の間、前後において、適宜実施することができる。
【０１２６】
（分析工程）
本実施形態の方法によって調製された糖鎖の標識体は、質量分析法（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）、クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィーやＨＰＡＥ−ＰＡＤクロマトグラフィー）、電気泳動（例えば、キャピラリ電気泳動）等の公知の方法により、定性的及び／又は定量的に分析することができる。糖鎖の分析においては、各種データベース（例えば、ＧｌｙｃｏＭｏｄ、Ｇｌｙｃｏｓｕｉｔｅ、ＳｉｍＧｌｙｃａｎ（登録商標）等）を利用することができる。
【０１２７】
このような糖タンパク質の糖鎖分析によって、例えば、抗体医薬品の研究開発、製造及び品質保証等の際に行われる抗体医薬品の糖鎖修飾分析；糖鎖バイオマーカーの検索研究等の際に行われる血清等の検体中の糖タンパク質の分析；幹細胞の糖鎖分析；電気泳動ゲルバンド中の糖鎖分析；植物組織の糖鎖分析等を迅速に行うことが可能となる。
【０１２８】
なお、本発明は前述の実施形態に限定されるものではなく、本発明の目的を達成できる範囲での変形、改良等は本発明に含まれるものである。
【実施例１】
【０１２９】
以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例の記載に何ら限定されるものではない。
【０１３０】
［実施例］
糖鎖含有サンプルとして、遠心エバポレーターで乾燥させた０．３μｇのマルトヘプタオース（糖鎖：単一のオリゴ糖）に、標識試薬として、２０μＬの２ＡＢ溶液（４０ｍｇの２−ピコリンボラン、８０ｍｇの２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ、１２０μＬの酢酸、４０μＬのＤｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）を混合した溶液）、および１μＬの純水を加え、５０℃で４０分反応させた。得られた粗２ＡＢ標識糖鎖を含む分離液にアセトニトリルを加えモノリスシリカスピンカラムにアプライし、洗浄した後、５０μＬの純水で溶出し、精製２ＡＢ標識糖鎖を含む分離液を得た。続いて、得られた精製２ＡＢ標識糖鎖を含む分離液１μＬについて、下記表１に示す条件でＨＰＬＣ測定を行った。
【０１３１】
【表１】
2018179559.tif 000002
【０１３２】
表１のＡ液及びＢ液は、それぞれ移動相を構成する液体であり、これらＡ液とＢ液とを混合して移動相の極性を調整した。また、表１において、「Ｂ：ａ％（Ｔ１分）→Ｂ：ｂ％（Ｔ２分）」という記載は、Ｂ溶液の濃度を、（Ｔ２−Ｔ１）分間で、ａ％からｂ％まで変化させたことを意味する。ただし、Ｔ１，Ｔ２，ａ，ｂはそれぞれ実数を表わす。また、表１において％は体積％を表わす。
【０１３３】
得られたＨＰＬＣスペクトルを図１（ａ）に示す。図１（ａ）に示すように、２ＡＢ標識糖鎖のピークが検出されたことが確認された。２ＡＢ標識糖鎖のピーク面積値を表２に示す。
【０１３４】
【表２】
2018179559.tif 000003
【０１３５】
［実施例２］
純水の量を４μＬに変更した以外は、実施例１と同様にした。結果を表２に示す。また、得られたＨＰＬＣスペクトルを図１（ｂ）に示す。
【０１３６】
［実施例３］
純水の量を８μＬに変更した以外は、実施例１と同様にした。結果を表２に示す。また、得られたＨＰＬＣスペクトルを図１（ｃ）に示す。
【０１３７】
［比較例１］
純水を加えなかった以外は、実施例１と同様にした。結果を表２に示す。また、得られたＨＰＬＣスペクトルを図１（ｄ）に示す。
【０１３８】
［実施例４］
マルトヘプタオースの量を１μｇに変更し、純水の量を４μＬに変更した以外は、実施例１と同様にした。結果を表２に示す。また、得られたＨＰＬＣスペクトルを図２（ａ）に示す。
【０１３９】
［実施例５］
純水の量を８μＬに変更した以外は、実施例４と同様にした。結果を表２に示す。また、得られたＨＰＬＣスペクトルを図２（ｂ）に示す。
【０１４０】
［比較例２］
純水を加えなかった以外は、実施例４と同様にした。結果を表２に示す。また、得られたＨＰＬＣスペクトルを図２（ｃ）に示す。
【０１４１】
［実施例６］
マルトヘプタオースの量を３μｇに変更し、純水の量を４μＬに変更した以外は、実施例１と同様にした。結果を表２に示す。また、得られたＨＰＬＣスペクトルを図３（ａ）に示す。
【０１４２】
［実施例７］
純水の量を８μＬに変更した以外は、実施例６と同様にした。結果を表２に示す。また、得られたＨＰＬＣスペクトルを図３（ｂ）に示す。
【０１４３】
［比較例３］
純水を加えなかった以外は、実施例６と同様にした。結果を表２に示す。また、得られたＨＰＬＣスペクトルを図３（ｃ）に示す。
【０１４４】
［実施例８］
マルトヘプタオースを、遠心エバポレーターで乾燥させたグルコースオリゴマー（糖鎖：オリゴマーの長さが異なる複数のオリゴ糖の混合物）に変更した以外は、実施例４と同様にした。結果を表３に示す。また、得られたＨＰＬＣスペクトルを図４（ａ）に示す。
【０１４５】
［実施例９］
純水の量を８μＬに変更した以外は、実施例８と同様にした。結果を表３に示す。また、得られたＨＰＬＣスペクトルを図４（ｂ）に示す。
【０１４６】
［比較例４］
純水を加えなかった以外は、実施例８と同様にした。結果を表３に示す。また、得られたＨＰＬＣスペクトルを図４（ｃ）に示す。
【０１４７】
【表３】
2018179559.tif 000004
【０１４８】
（標識効率の評価）
得られた各実施例のＨＰＬＣスペクトルからピーク面積値Ｓ１、および各比較例のＨＰＬＣスペクトルからピーク面積値Ｓ０を算出した。ＨＰＬＣスペクトル中に複数のピークが存在する場合、それぞれピークにおけるピーク面積の和（合計値）をピーク面積値とした。
また、実施例１〜３は比較例１を基準とし、実施例４〜５は比較例２を基準とし、実施例６〜７は比較例３を基準とし、実施例８〜９は比較例４を基準としたとき（糖鎖量および水量が実施例と同じ条件であり、かつ糖鎖と標識試薬との反応環境に水を含有しない比較例を基準としたとき）、基準となる比較例のピーク面積値Ｓ０に対する、各実施例のピーク面積値Ｓ１の比をピーク面積比（Ｓ１／Ｓ０）とした。
各実施例におけるＨＰＬＣスペクトル中のピーク面積比について、下記の評価基準に照らして評価した。評価結果を表２、３に示す。表２、３中、「−」は、基準となる比較例を示す。基準となる比較例のピーク面積比（Ｓ０／Ｓ０）を１とした。
◎：ピーク面積比が１．５以上である
○：ピーク面積比が１．０以上、１．５未満である
×：ピーク面積比が、１．０未満である
【０１４９】
（標識性の評価）
比較例１の糖鎖量当たりのピーク面積値（比較例１のＳ０／Ｘ）を基準としたとき、各実施例および各比較例について、基準となる比較例１のＳ０／Ｘに対する、糖鎖量Ｘ（μｇ）当たりのＨＰＬＣスペクトル中のピーク面積値（Ｓ０／ＸまたはＳ１／Ｘ）の比（糖鎖量当たりのピーク面積値比）を算出した。
各実施例および各比較例における糖鎖量当たりのピーク面積値比について、下記の評価基準に照らして評価した。評価結果を表２に示す。表２中、「−」は、基準となる比較例１を示す。基準となる比較例１の糖鎖量当たりのピーク面積値（比較例１のＳ０／Ｘ）を１（基準値）とした。
○：糖鎖量当たりのピーク面積値比が、基準値１より大きい
×：糖鎖量当たりのピーク面積値比が、基準値１以下である
【０１５０】
各実施例の標識方法は、各比較例と比べて、標識効率や標識性が向上していることが分かった。
【０１５１】
以上、実施形態および実施例に基づいて本発明を具体的に説明したが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【図１】
2018179559.tif 000005
【図２】
2018179559.tif 000006
【図３】
2018179559.tif 000007
【図４】
2018179559.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成29年7月6日(2017.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖を含有する糖鎖含有サンプルに標識試薬を加えることにより、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程を有する、糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程において、前記標識試薬と前記糖鎖との反応環境中に水を含み、
前記標識工程において、前記反応環境中の水の量をＸ（μＬ）と、前記糖鎖の量をＹ（μｇ）としたとき、Ｘ／Ｙが、１．２以上５０以下である、糖鎖を調製する方法。
【請求項２】
糖鎖を含有する糖鎖含有サンプルに標識試薬を加えることにより、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程を有する、糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程において、前記標識試薬と前記糖鎖との反応環境中に水を含み、
前記標識工程において、前記糖鎖の量が０μｇ超え１μｇ未満の場合、前記反応環境中の水の量は０μＬ超え１．０μＬ以下である、糖鎖を調製する方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程において、前記標識試薬と前記糖鎖との反応が容器内で行われる、糖鎖を調製する方法。
【請求項４】
請求項３に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記容器が、チューブ形状を有する、糖鎖を調製する方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程の前に、前記糖鎖含有サンプルに含まれる溶媒の少なくとも一部を除去する工程をさらに有する、糖鎖を調整する方法。
【請求項６】
請求項５に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程において、前記反応環境中に水を添加する工程を実施する、糖鎖を調整する方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程の前に、固相に固定された状態の試料に糖鎖遊離酵素を作用させることにより、前記糖鎖を含有する糖鎖含有サンプルを得る遊離工程をさらに有する、糖鎖を調製する方法。
【請求項８】
請求項７に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記糖鎖遊離酵素が、ペプチドＮ−グリカナーゼまたはエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを含む、糖鎖を調製する方法。
【請求項９】
請求項７または８に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記固相が、カラムまたはカートリッジ構造を有する、糖鎖を調製する方法。
【請求項１０】
請求項７から９のいずれか１項に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記遊離工程の後に、固液分離によって前記糖鎖を含む分離液を得る分離工程をさらに有する、糖鎖を調製する方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記標識試薬が、紫外線吸収特性または蛍光特性を有するアミノ基を有する化合物、還元剤及び有機溶媒を含む、糖鎖を調製する方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記アミノ基を有する化合物が、２−アミノベンズアミドを含む、糖鎖を調製する方法。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記還元剤が、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム、メチルアミンボラン、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、ピコリンボラン、およびピリジンボランからなる群から選択される一種以上を含む、糖鎖を調製する方法。
【請求項１４】
請求項１１から１３のいずれか１項に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記有機溶媒が、非プロトン性極性有機溶媒、プロトン性極性有機溶媒および非プロトン性非極性溶媒有機溶媒からなる群から選択される一種以上を含む、糖鎖を調製する方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記糖鎖が、糖タンパク質由来である、糖鎖を調製する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明によれば、
糖鎖を含有する糖鎖含有サンプルに標識試薬を加えることにより、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程を有する、糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程において、前記標識試薬と前記糖鎖との反応環境中に水を含み、
前記標識工程において、前記反応環境中の水の量をＸ（μＬ）と、前記糖鎖の量をＹ（μｇ）としたとき、Ｘ／Ｙが、１．２以上５０以下である、糖鎖を調製する方法が提供される。
また、本発明によれば、
糖鎖を含有する糖鎖含有サンプルに標識試薬を加えることにより、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程を有する、糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程において、前記標識試薬と前記糖鎖との反応環境中に水を含み、
前記標識工程において、前記糖鎖の量が０μｇ超え１μｇ未満の場合、前記反応環境中の水の量は０μＬ超え１．０μＬ以下である、糖鎖を調製する方法が提供される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
なお、本発明は前述の実施形態に限定されるものではなく、本発明の目的を達成できる範囲での変形、改良等は本発明に含まれるものである。
以下、参考形態の例を付記する。
１．  糖鎖を含有する糖鎖含有サンプルに標識試薬を加えることにより、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程を有する、糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程において、前記標識試薬と前記糖鎖との反応環境中に水を含む、糖鎖を調製する方法。
２．  １．に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程において、前記反応環境中の水の量をＸ（μＬ）と、前記糖鎖の量をＹ（μｇ）としたとき、Ｘ／Ｙが、１．２以上である、糖鎖を調製する方法。
３．  １．に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程において、前記糖鎖の量が０μｇ超え１μｇ未満の場合、前記反応環境中の水の量は０μＬ超え１．０μＬ以下である、糖鎖を調製する方法。
４．  １．から３．のいずれか１つに記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程において、前記標識試薬と前記糖鎖との反応が容器内で行われる、糖鎖を調製する方法。
５．  ４．に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記容器が、チューブ形状を有する、糖鎖を調製する方法。
６．  １．から５．のいずれか１つに記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程の前に、前記糖鎖含有サンプルに含まれる溶媒の少なくとも一部を除去する工程をさらに有する、糖鎖を調整する方法。
７．  ６．に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程において、前記反応環境中に水を添加する工程を実施する、糖鎖を調整する方法。
８．  １．から７．のいずれか１つに記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記標識工程の前に、固相に固定された状態の試料に糖鎖遊離酵素を作用させることにより、前記糖鎖を含有する糖鎖含有サンプルを得る遊離工程をさらに有する、糖鎖を調製する方法。
９．  ８．に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記糖鎖遊離酵素が、ペプチドＮ−グリカナーゼまたはエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを含む、糖鎖を調製する方法。
１０．  ８．または９．に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記固相が、カラムまたはカートリッジ構造を有する、糖鎖を調製する方法。
１１．  ８．から１０．のいずれか１つに記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記遊離工程の後に、固液分離によって前記糖鎖を含む分離液を得る分離工程をさらに有する、糖鎖を調製する方法。
１２．  １．から１１．のいずれか１つに記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記標識試薬が、紫外線吸収特性または蛍光特性を有するアミノ基を有する化合物、還元剤及び有機溶媒を含む、糖鎖を調製する方法。
１３．  １２．に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記アミノ基を有する化合物が、２−アミノベンズアミドを含む、糖鎖を調製する方法。
１４．  １２．または１３．に記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記還元剤が、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム、メチルアミンボラン、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、ピコリンボラン、およびピリジンボランからなる群から選択される一種以上を含む、糖鎖を調製する方法。
１５．  １２．から１４．のいずれか１つに記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記有機溶媒が、非プロトン性極性有機溶媒、プロトン性極性有機溶媒および非プロトン性非極性溶媒有機溶媒からなる群から選択される一種以上を含む、糖鎖を調製する方法。
１６．  １．から１５．のいずれか１つに記載の糖鎖を調製する方法であって、
前記糖鎖が、糖タンパク質由来である、糖鎖を調製する方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
（標識性の評価）
比較例１の糖鎖量当たりのピーク面積値（比較例１のＳ０／Ｙ）を基準としたとき、各実施例および各比較例について、基準となる比較例１のＳ０／Ｙに対する、糖鎖量Ｙ（μｇ）当たりのＨＰＬＣスペクトル中のピーク面積値（Ｓ０／ＹまたはＳ１／Ｙ）の比（糖鎖量当たりのピーク面積値比）を算出した。
各実施例および各比較例における糖鎖量当たりのピーク面積値比について、下記の評価基準に照らして評価した。評価結果を表２に示す。表２中、「−」は、基準となる比較例１を示す。基準となる比較例１の糖鎖量当たりのピーク面積値（比較例１のＳ０／Ｙ）を１（基準値）とした。
○：糖鎖量当たりのピーク面積値比が、基準値１より大きい
×：糖鎖量当たりのピーク面積値比が、基準値１以下である