(57)【要約】【課題】本発明は、ＤＮＡマーカーを使用することによって、大粒の種子をつけるイネ科植物を、実際に栽培を行うことなく実験室内で判別する方法、および新規な大粒遺伝子に基づいた大粒形質を有するイネ科植物を開発することを目的とする。【解決手段】イネの第２染色体の短腕末端からの距離５．７〜１０．３Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカーを検出することによって、Ｇｇ遺伝子の存在を判別することを特徴とする、大粒イネの選抜方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネ科植物の第２染色体の短腕末端からの距離５．７〜１０．３Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカーを検出することによって、Ｇｇ遺伝子の存在を判別することを特徴とする、大粒イネの選抜方法。
【請求項２】
ＤＮＡマーカーが第２染色体の短腕末端からの距離７．６〜９．６Ｍｂの領域にある、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＤＮＡマーカーがＲＦＬＰマーカー、ＡＦＬＰマーカー、ＳＳＲマーカー、ＳＴＳマーカー、ＳＮＰマーカー、およびＲＡＰＤマーカーからなる群から選択される、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡマーカーがＲＭ１２６７５、Ｊ５２１、ＲＭ３３９０、Ｊ５２５、Ｊ５３６、ＲＭ６３７５、ＲＭ１３５８、およびＪ５４３からなる群から選択される１つ以上である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
大粒イネの作成方法であって、
（ａ）大粒の種子をつけるイネと、大粒の形質を有しないイネとを交雑させて、雑種種子を作成すること、
（ｂ）該雑種種子を栽培して雑種イネ植物を作成すること、
（ｃ）請求項１〜４のいずれか１項記載の方法により、該雑種植物から、大粒イネを選抜すること
を含む方法。
【請求項６】
イネの第２染色体の短腕末端からの距離７．７〜９．１Ｍｂの領域に座乗する、大粒遺伝子Ｇｇ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の大粒遺伝子Ｇｇ、および該遺伝子の存在を判別するためのＤＮＡマーカーを用いることを特徴とする大粒イネの選抜方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イネは、コメを主食とする我が国においては極めて重要である。なかでも、コシヒカリは、我が国のコメの生産の約４割を占めており、日本を代表するイネの品種である。しかしながら、アメリカ等他国においても良食味で安価なコシヒカリが生産されている。コメの自由貿易化により、安価で良食味の外国産コシヒカリが輸入されれば、我が国におけるコメの自給体制が崩壊する恐れがある。このような危機的状況を打開するため、外国産コシヒカリよりも低コスト、超多収で、低価格のスーパーコシヒカリを育成する必要がある。
【０００３】
これまで、イネの多収性に関わる大粒化に関する遺伝子として、インディカ米の長粒化に関するＧＬ５（第５染色体、特許文献１）、ｔｇｗ６（第６染色体、特許文献２）、およびｓｈ４（第４染色体、特許文献３）が報告されているだけであった。
【０００４】
一方、ジャポニカ米の品種「いのちの壱」は、玄米千粒重がコシヒカリの約１．５倍という大粒変異体である。コシヒカリの玄米千粒重は約２２ｇであり、いのちの壱の玄米千粒重は約３２ｇである。また、コシヒカリの粒面積は２０〜２２ｍｍ２程度であり、いのちの壱の粒面積は２５〜３２ｍｍ２程度である。現在、いのちの壱は、岐阜県の一部に生産が限られるばかりか、育種にも利用されていない埋もれた遺伝資源である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第５５９４８１８号
【特許文献２】特許第５２８８６０８号
【特許文献３】特許第５６１０４４０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、大粒変異体「いのちの壱」の大粒に関する遺伝子が解明されれば、コシヒカリをはじめとする日本品種の多収化育種における利用が期待されると考えた。そこで、本発明は、いのちの壱の大粒に関する遺伝子を明らかにし、コシヒカリの大粒化および超多収コシヒカリの開発に利用することを目指した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記のような状況下、本発明者は、まず、コシヒカリおよび日本晴と、いのちの壱とを交雑し、いのちの壱に由来する大粒の性質を持つ雑種をコシヒカリおよび日本晴へ戻し交雑を行い、遺伝分析を行った。その結果、大粒型：ヘテロ型：小粒型が１遺伝子遺伝の理論比１：２：１に分離したことから、大粒化に関する１個の対立遺伝子座を見出し、「Ｇｇ（Giant grain）」と命名した。さらに、ＤＮＡマーカーによるマッピングを行い、Ｇｇがイネの第２染色体の短腕末端から５．７〜１０．３Ｍｂの領域に座乗していることを明らかにした。さらに、Ｇｇ遺伝子と連鎖するＤＮＡマーカーを同定した。かくして、本発明が完成した。なお、本明細書中において、本発明で見出した大粒に関する対立遺伝子座Ｇｇを「Ｇｇ遺伝子」または「大粒遺伝子Ｇｇ」とも称する。
【０００８】
すなわち、本発明は、
［１］イネ科植物の第２染色体の短腕末端からの距離５．７〜１０．３Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカーを検出することによって、Ｇｇ遺伝子の存在を判別することを特徴とする、大粒イネの選抜方法；
［２］ＤＮＡマーカーが第２染色体の短腕末端からの距離７．６〜９．６Ｍｂの領域にある、［１］記載の方法；
［３］ＤＮＡマーカーがＲＦＬＰマーカー、ＡＦＬＰマーカー、ＳＳＲマーカー、ＳＴＳマーカー、ＳＮＰマーカー、およびＲＡＰＤマーカーからなる群から選択される、［１］または［２］記載の方法；
［４］ＤＮＡマーカーがＲＭ１２６７５、Ｊ５２１、ＲＭ３３９０、Ｊ５２５、Ｊ５３６、ＲＭ６３７５、ＲＭ１３５８、およびＪ５４３からなる群から選択される１つ以上である、［１］記載の方法；および
［５］大粒イネの作成方法であって、
（ａ）大粒の種子をつけるイネと、大粒の形質を有しないイネとを交雑させて、雑種種子を作成すること、
（ｂ）該雑種種子を栽培して雑種イネ植物を作成すること、
（ｃ）［１］〜［４］のいずれか１項記載の方法により、該雑種植物から、大粒イネを選抜することを含む方法、および
［６］イネの第２染色体の短腕末端からの距離７．７〜９．１Ｍｂの領域に座乗する、大粒遺伝子Ｇｇ
を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、イネの第２染色体上にあるＧｇ遺伝子と連鎖しているＤＮＡマーカーが同定される。該ＤＮＡマーカーを使用してＧｇ遺伝子の存在を判別することにより、大粒の子実をつけるイネ科植物を容易に選抜することができる。本発明によって、実際に試験個体を栽培し、評価する必要が大幅に減少し、種子や幼苗の時期においても標的遺伝子と連鎖するＤＮＡマーカーを使用するため、高い確率で標的遺伝子Ｇｇを有する固体を選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、大粒遺伝子Ｇｇと、第２染色体短腕上にあるＳＳＲマーカーおよびＳＮＰマーカーとの連鎖状況、および実施例３の戻し交雑によるゲノム置換率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において、イネとは、好ましくは栽培イネ、さらに好ましくはアジアイネ、特に好ましくは、ジャポニカ種のイネである。
【００１２】
本発明において、大粒イネとは、大粒の種子をつけるイネである。すなわち、大粒イネからは、大粒の穀粒が収穫される。
【００１３】
本発明において、大粒とは、種子のサイズ（粒長、粒幅、粒面積等）が増大していることをいい、例えば、イネの標準的な種子のサイズより大きいこと、またはその植物の少なくとも片方の親植物の種子のサイズより大きいこと、またはＧｇ遺伝子を有しない植物の種子のサイズより大きいことが包含される。例えば、限定するものではないが、イネの標準的な種子のサイズ、その植物の少なくとも片方の親植物の種子のサイズ、またはＧｇ遺伝子を有しない植物の種子のサイズと比較して、５％以上、１０％以上、１５％以上、１７％以上、１８％以上、２０％以上、または２５％以上種子のサイズが増大していることをいう。あるいは、例えば、限定するものではないが、標準的なサイズの米と比べて、玄米千粒重が１０％以上、２０％以上、または３０％以上増大しているものをいう。例えば、標準的なコシヒカリの粒面積は約２０〜２２ｍｍ２なので、大粒とは、例えば、限定するものではないが、粒面積が２３ｍｍ２以上、２４ｍｍ２以上、または２５ｍｍ２以上の穀粒である。なお、粒面積は、籾の粒長と粒幅の積である。粒長および粒幅は、それぞれ、楕円形の粒平面の長径および短径である。
【００１４】
Ｇｇ遺伝子は、本発明において見出された大粒化に関する遺伝子である。具体的には、コシヒカリと、大粒イネ品種であるいのちの壱を交雑し、交雑Ｆ２から任意に選択したＦ３５０系統を供試し、Ｆ３後代検定により遺伝子型を決定した。その結果、Ｆ２で大粒型であった個体の後代は、大粒型で固定した系統と、ヘテロ型の系統に分離し、Ｆ２で小粒型であった個体の後代は小粒型に固定し、大粒型系統：ヘテロ型系統：小粒型系統＝１０：３２：８に分離した。この分離比は、不完全優性一遺伝子の理論比１：２：１に適合した（χ２＝４．０８、０．１０＜Ｐ＜０．２５）ため、この大粒の形質が１個の遺伝子によって支配されていることがわかった。この遺伝子をＧｇと命名した。さらに、交雑Ｆ２のコシヒカリへの戻し交雑、および日本晴といのちの壱との交雑および戻し交雑からも、同様の結果を確認した。
【００１５】
さらに、遺伝子連鎖を利用して、Ｇｇ遺伝子を第２染色体上にマッピングした。具体的には、日本晴といのちの壱の交雑Ｆ２およびコシヒカリといのちの壱の交雑Ｆ２という遺伝的背景の異なる２つの分離集団で分離したｇｇホモ型個体を用いて、イネの１２本の染色体を網羅するＳＳＲマーカーおよびＳＮＰマーカーによるマッピングを行い、Ｇｇ遺伝子が第２染色体の短腕末端からの距離５．７〜１０．３Ｍｂの領域に座乗していることを見出した。さらに、イネの第２染色体上のＳＳＲマーカーおよびＳＮＰマーカーを用いる連鎖解析により、Ｇｇ遺伝子が第２染色体の短腕末端からの距離７．７〜９．１Ｍｂの領域に座乗していることを見出した。
【００１６】
さらに、半矮性遺伝子ｄ６０を有するコシヒカリｄ６０系統（以下、「ｄ６０コシヒカリ」という）といのちの壱を交雑し、遺伝分析を行い、Ｇｇ遺伝子がＤ６０遺伝子に連鎖していることを見出した。半矮性遺伝子ｄ６０は、イネ科植物の第２染色体の短腕末端から１０．３Ｍｂ地点に座乗する、イネ科植物を短桿化させる遺伝子である。
【００１７】
したがって、本発明は、イネの第２染色体の短腕末端からの距離５．７〜１０．３Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカーを検出することによって、Ｇｇ遺伝子の存在を判別することを特徴とする、大粒イネの選抜方法（以下、「本発明の大粒イネの選抜方法」ともいう）を提供する。
【００１８】
「ＤＮＡマーカー」とは、遺伝分析のための目印（マーカー）として利用することができる、個体または系統によって塩基配列に違いが見られるＤＮＡ多型を意味し、例えば、ＲＦＬＰ（制限酵素ＤＮＡ断片長多型）、ＡＦＬＰ（増幅断片長多型）、ＳＳＲ（単純反復配列）、ＳＴＳ（配列タグ部位）、ＳＮＰ（一塩基多型）、ＲＡＰＤ（ランダム増幅断片多型）などの種類がある。本発明の大粒型イネ科植物の選抜方法においては、ＤＮＡマーカーがＲＦＬＰマーカー、ＡＦＬＰマーカー、ＳＳＲマーカー、ＳＴＳマーカー、ＳＮＰマーカー、およびＲＡＰＤマーカーからなる群から選択される１以上のマーカーを使用してもよい。ＤＮＡマーカーは、例えば、公開データベースから検索することができる。例えば、ＳＮＰマーカーのデータベースとしては、Ｑ−ＴＡＲＯ（ＱＴＬ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｒｉｃｅ Ｏｎｌｉｎｅ）データベース（http://qtaro.abr.affrc.go.jp/）等がある。
【００１９】
本発明において使用される「イネの第２染色体の短腕末端からの距離５．７〜１０．３Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカー」は、例えば、以下のような方法によって見出すことができる。Ｇｇ遺伝子を有する系統とＧｇ遺伝子を持たない系統との交雑Ｆ２を展開し、ｇｇホモ型Ｆ２個体から得たゲノムＤＮＡに対し、特異的なパターンを示すイネの第２染色体上の短腕末端からの距離５．７〜１０．３Ｍｂの領域に存在するＤＮＡマーカーを見出す。さらに、該特異的なパターンを示したＤＮＡマーカーについて、組換え価を求め、低い組換え価、例えば組換え価３０％以内でＧｇ遺伝子と連鎖しているものＤＮＡマーカーとして用いてもよい。またさらに、該特異的なパターンを示したＤＮＡマーカーについて、戻し交雑によりゲノム置換率を求め、低い置換率、例えば５０％以下の置換率のものをＤＮＡマーカーとして用いてもよい。上記のＧｇ遺伝子を有する系統としては、例えば、いのちの壱、いのちの壱の交雑植物、またはいのちの壱を祖先にもつ植物を用いることができる。上記のＧｇ遺伝子を持たない系統としては、限定するものではないが、例えば、コシヒカリ、日本晴等を用いることができる。
【００２０】
本発明において使用されるＤＮＡマーカーは、イネの第２染色体の短腕末端からの距離が約５．７〜１０．３Ｍｂ、好ましくは約７．６〜９．６Ｍｂ、より好ましくは約７．７〜９．１Ｍｂ、さらに好ましくは約７．７〜９．１Ｍｂの領域にあるマーカーである。
【００２１】
本発明において、好ましくは、Ｇｇ遺伝子と組換え価が３０％以内、より好ましくは２０％以内、特に好ましくは１８％以内で連鎖する遺伝子または染色体部位がＤＮＡマーカーとして用いられる。また、本発明において、好ましくは、Ｇｇ遺伝子を持たない系統へのゲノム置換率が５０％以下の遺伝子または染色体部位がＤＮＡマーカーとして用いられる。
【００２２】
本発明において用いられるＤＮＡマーカーの例としては、限定するものではないが、ＲＭ１２６７５（フォワードプライマー：配列番号１、リバースプライマー：配列番号２）、ＲＭ３３９０（フォワードプライマー：配列番号３、リバースプライマー：配列番号４）、ＲＭ６３７５（フォワードプライマー：配列番号５、リバースプライマー：配列番号６）、ＲＭ１３５８（フォワードプライマー：配列番号７、リバースプライマー：配列番号８）、Ｊ５１３、Ｊ５２１、Ｊ５２５、Ｊ５３６およびＪ５４３が挙げられる。Ｊ５１３、Ｊ５２１、Ｊ５２５、Ｊ５３６およびＪ５４３は各々、イネの第２染色体の短腕末端から５．８Ｍｂ、７．６Ｍｂ、８．１Ｍｂ、９．１Ｍｂおよび１０．２２Ｍｂの距離にあるＳＮＰである。本発明においては、好ましくは、Ｊ５２１、ＲＭ３３９０、Ｊ５２５、Ｊ５３６、およびＲＭ６３７５からなる群から選択される１つ以上のＤＮＡマーカーが用いられる。より好ましくは、Ｊ５２１、ＲＭ３３９０、およびＪ５２５からなる群から選択される１つ以上のＤＮＡマーカーが用いられる。さらに好ましくは、Ｊ５２１またはＲＭ３３９０が用いられ、特に好ましくはＲＭ３３９０が用いられる。
【００２３】
本発明において、「検出」とは、上記ＤＮＡマーカーを検出するための当該分野で常套の方法を用いて実施すればよく、使用されるＤＮＡマーカーの種類に応じて当業者が適当に選択することができる。例えば、ＰＣＲ法、サザンブロッティング法、ＡＦＬＰ法などが挙げられる。
【００２４】
ＰＣＲを利用するＤＮＡマーカーの検出方法としては、例えば下記のとおりに行うことができる。
〔ＤＮＡ抽出〕
植物体（またはその一部）を液体窒素で凍結粉砕し、ＤＮＡ抽出液を加え、振盪しながらインキュベートする。この溶液から、抽出および重合沈殿によって、高分子ＤＮＡをスプールアウトする。スプールアウトしたＤＮＡを精製し、ＤＮＡ溶液を作製する。
〔ＰＣＲ〕
各イネ科植物体から抽出した上記ゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＤＮＡマーカーに特異的なプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ等を含む反応液を調製する。サーマルサイクラー等を用いて、変性・アニーリング・伸長の一連の反応を繰り返し行う。次いで、得られたＰＣＲ産物を電気泳動する。ＰＣＲの反応条件およびプライマーは、例えばTheor Appl Genet (2000)100:697-712を参考にすることができる（この文献を、参照により本明細書の一部とする）。
【００２５】
ＳＮＰマーカーの場合は、例えば、ＳＮＰアリルごとに特異的にハイブリダイズするプローブを設計し、該プローブの末端をＳＮＰアリルごとに異なる蛍光色素およびクエンチャーで修飾し、該プローブより外側に設計したプライマーを用いてＰＣＲ法により検出することができる。該プライマーの伸長反応によってプローブが分解されて、蛍光色素とクエンチャーが離れることにより発せられる蛍光を測定することにより、アリル特異的な蛍光の増幅曲線を得、検体がどのＳＮＰアリルを持つかを判断することができる。蛍光色素としては、限定するものではないが、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ等が使用される。アリル特異的なプローブ、およびプライマーは、検体のゲノム情報に基づいて、当業者が適宜設計することができる。
【００２６】
本発明の大粒イネの選抜方法は、例えば、新規の大粒イネを作出するための育種方法に利用される。かかる育種方法としては、当該分野で既知の一般的な方法が挙げられ、例えば、Ｇｇ遺伝子を有する品種と他の品種を交雑させることを特徴とする方法が挙げられる。したがって、本発明は、さらに、大粒イネの作成方法であって、
（ａ）大粒の種子をつけるイネと、大粒の形質を有しないイネとを交雑させて、雑種種子を作成すること、
（ｂ）該雑種種子を栽培して雑種イネ植物を作成すること、および
（ｃ）本発明の大粒イネの選抜方法により、該雑種植物から、大粒イネを選抜すること、
を含む方法（以下、「本発明の大粒イネの作成方法」ともいう）を提供する。
【００２７】
本発明の大粒イネの作成方法において、大粒の種子をつけるイネとしては、例えば、いのちの壱、いのちの壱の交雑種、またはいのちの壱を祖先にもつ植物を用いることができる。大粒の形質を有しないイネとしては、例えば、Ｇｇ遺伝子を持たない品種が用いられる。Ｇｇ遺伝子を持たない品種としては、限定するものではないが、例えば、コシヒカリ、日本晴等が挙げられる。
【００２８】
本発明の大粒イネの作成方法の具体例としては、
（ａ’）大粒の種子をつけるイネと、大粒の形質を有しないイネとを交雑させて、Ｆ１を作成すること、
（ｂ’）Ｆ１と前記大粒の形質を有しないイネとを交雑させること、
（ｃ’）本発明の大粒イネの選抜方法により、該雑種植物から、大粒イネを選抜すること、および
（ｄ’）工程（ｃ’）によって選抜された植物と、前記大粒の形質を有しないイネとを交雑させること
を含む方法が挙げられる。上記工程（ｃ’）および（ｄ’）は繰り返してもよい。
【００２９】
本発明の大粒イネの作成方法の別の具体例としては、
（ａ’’）大粒の種子をつけるイネと、大粒の形質を有しないイネとを交雑させて、Ｆ１を作成すること、
（ｂ’’）を同系交配させてＦ２を作成すること、および
（ｃ’’）本発明の大粒イネの選抜方法により、該雑種植物から、大粒イネ植物を選抜すること
を含む方法が挙げられる。上記工程（ｂ’’）および（ｃ’’）は繰り返してもよい。
【００３０】
本発明の大粒イネの作成方法では、大粒遺伝子Ｇｇと連鎖するＤＮＡマーカーを利用するので、所望の植物を高い確率で、かつ、容易に選抜することができる。また、このようなＤＮＡマーカーを用いた育種では、比較的少ない個体数を栽培すればよく、また、種子や幼苗という早い時期においても選抜できるため、効率がよい。
【００３１】
本発明は、さらに、新規の大粒遺伝子Ｇｇを提供する。本発明により、Ｇｇ遺伝子は、イネの第２染色体の短腕末端からの距離が約７．７〜９．１Ｍｂの領域に座乗することがわかった。Ｇｇ遺伝子を用いれば、大粒の種子をつけるイネの選抜、育種を可能とするだけでなく、イネに直接導入して新規な大粒型品種を開発することも可能となる。
【実施例１】
【００３２】
実施例１：大粒遺伝子Ｇｇの検出
（１）コシヒカリの遺伝的背景における大粒遺伝子Ｇｇの遺伝と大粒化効果
コシヒカリといのちの壱を交雑し、Ｆ２を得た。Ｆ２の粒径の分布は、粒長６．９〜８．５ｍｍの範囲で両親にまたがる二頂性の分離を示し、いのちの壱と同程度で７．８〜８．５ｍｍの大粒型とコシヒカリと同程度で６．９〜７．７ｍｍの小粒型が、大粒型：小粒型＝１３４：５２に分離し、一遺伝子遺伝の理論比３：１に適合した（χ２＝０．８７２、０．３５＜Ｐ＜０．４）。
【００３３】
さらに、コシヒカリ×いのちの壱の交雑Ｆ２系統から任意に選択したＦ３５０系統を供試し、Ｆ３後代検定を行った結果、系統ごとの粒長の平均値の分布は、Ｆ２の大粒型（粒長７．８〜８．５ｍｍ）の後代は８〜８．３ｍｍで大粒で固定した系統と、系統内で分離を示すヘテロ型の系統が分離し、Ｆ２の小粒型（粒長６．８〜７．７ｍｍ）の後代は７．２〜７．５ｍｍで小粒に固定し、大粒型系統：ヘテロ型系統：小粒型系統＝１０：３２：８に分離し、不完全優性一遺伝子の理論比１：２：１に適合した（χ２＝４．０８、０．１０＜Ｐ＜０．２５）。この大粒遺伝子をＧｇと命名した。
【００３４】
このコシヒカリ×いのちの壱のＦ２の次代Ｆ３で固定したＧｇホモ型大粒個体を一回親とし、コシヒカリを反復親として一回戻し交雑を行い、［コシヒカリ＊１／（コシヒカリ×いのちの壱）Ｆ３  Ｇｇ型］ＢＣ１Ｆ２を展開した。ＢＣ１Ｆ２における粒長と粒幅の分布は、コシヒカリ（２１．１〜２３．０ｍｍ２）より明らかに大きい（粒面積２４．６〜２５．９ｍｍ２）のＧｇホモ大粒型、コシヒカリと同程度で粒面積２０．６〜２４．０ｍｍ２のｇｇホモ型個体が、ＧｇＧｇ大粒ホモ型：［Ｇｇｇｇヘテロ型＋ｇｇｇｇ小粒ホモ型］＝１０：３２に分離し、不完全優性１遺伝子の理論比３：１に適合した（χ２＝０．０３，０．５０＜Ｐ＜０．９０）。また、Ｇｇホモ型大粒個体はコシヒカリに比べて粒面積が１８％増大した。したがって、大粒は１個の遺伝子Ｇｇに支配されていて、コシヒカリの遺伝的背景において粒面積を約１８％増大させる十分な効果があることが分かった。
【００３５】
次に、ＢＣ１Ｆ２で分離したＧｇホモ型大粒個体を、コシヒカリへ２回目の戻し交雑を行った［コシヒカリ＊２／（コシヒカリ×いのちの壱）Ｆ３  Ｇｇ型］ＢＣ２Ｆ２の２系統４０個体を供試した。ＢＣ２Ｆ２における系統ごとの粒面積の分布は、どちらも両親型および中間型からなる三頂性の分離を示した。一方の系統は、コシヒカリより明らかに大きいＧｇホモ型個体［粒面積２３．６〜２５．１ｍｍ２］、コシヒカリより小さいｇｇホモ型個体［粒面積１９．６〜２０．５ｍｍ２］、その中間型ヘテロ型が、［ＧｇＧｇ大粒ホモ型：Ｇｇｇｇヘテロ型：ｇｇｇｇ小粒ホモ型］＝７：２３：６に分離し、不完全優性１遺伝子の理論比１：２：１に適合した（χ２＝２．８３３、０．２＜Ｐ＜０．２５）。もう一方の系統は、コシヒカリより大きいＧｇホモ型個体［粒面積２２．３〜２４．６ｍｍ２］、コシヒカリのサイズ範囲から外れたｇｇホモ型個体［粒面積１８．６〜２１．０ｍｍ２］、その中間のヘテロ型が、［ＧｇＧｇ大粒ホモ型：Ｇｇｇｇヘテロ型：ｇｇｇｇ小粒ホモ型］＝１０：１６：８に分離し、不完全優性１遺伝子の理論比１：２：１に適合した（χ２＝０．３５２、０．８＜Ｐ＜０．８５）。また、この二つの系統を合わせた粒面積の分布は、［ＧｇＧｇ大粒ホモ型：Ｇｇｇｇヘテロ型：ｇｇｇｇ小粒ホモ型］＝１７：３９：１４に分離し、不完全優性１遺伝子の理論比１：２：１に適合した（χ２＝１．１７１、０．５５＜Ｐ＜０．６）。Ｇｇホモ型大粒個体の平均をとると、コシヒカリに比べ粒面積が１７％増大した。以上のように、大粒に関する不完全優勢の１個の遺伝子Ｇｇの存在が明らかとなり、ＧｇはＢＣ１Ｆ２からＢＣ２Ｆ２にかけてコシヒカリより粒面積を約１７〜１８％増大させることが明らかとなった。
【００３６】
上記ＢＣ２Ｆ２で分離したＧｇホモ型大粒個体にさらに３回目の戻し交雑を行った［コシヒカリ＊３／（コシヒカリ×いのちの壱）Ｆ３］ＢＣ３Ｆ２における系統ごとの粒面積の分布は、コシヒカリより明らかに大きい個体が分離した。該系統を統合した結果、［ＧｇＧｇ大粒ホモ型：Ｇｇｇｇヘテロ型：ｇｇｇｇ小粒ホモ型］＝１５：１３：７（χ２＝５．９７、０．０５＜Ｐ＜０．１０）となり、不完全優性１遺伝子の理論比１：２：１に適合し、大粒に関する１個の対立遺伝子Ｇｇが確かに遺伝していることがわかった。また、Ｇｇホモ型粒サイズは、コシヒカリよりも約２７．７％［コシヒカリ平均２２．３２ｍｍ２、ＧｇＧｇ大粒型平均２８．５０ｍｍ２］増大した。
【００３７】
（２）日本晴の遺伝的背景における大粒遺伝子Ｇｇの遺伝と大粒化効果
日本晴といのちの壱を交雑し、Ｆ２を得た。Ｆ２の粒長の分布は、三頂性の分離を示した。粒長がいのちの壱と同程度で７．９〜８．６ｍｍのＧｇホモ型、日本晴よりは大きいが、いのちの壱のサイズ範囲から外れた７．２〜８．３ｍｍのｇｇホモ型、その中間型に分布するヘテロ型が、［ＧｇＧｇ大粒ホモ型：ｇｇｇｇ小粒ホモ型＋Ｇｇｇｇヘテロ型］＝３４１：９８６に分離し、不完全優性１遺伝子の理論比３：１に適合した（χ２＝０．３４，０．５０＜Ｐ＜０．７５）。
【００３８】
上記Ｆ２で分離したＧｇホモ型大粒短稈個体を一回親とし、日本晴を反復親として１回戻し交雑を行った［日本晴／（日本晴×いのちの壱）Ｆ２  Ｇｇホモ型］ＢＣ１Ｆ２の３系統６０個体を展開した。該ＢＣ１Ｆ２における粒面積の分布は、２２．１〜２８．０ｍｍ２の範囲で両親型および中間型からなる三頂性の分離を示した。いのちの壱と同程度で２６．１〜２８．５ｍｍ２のＧｇホモ型、日本晴と同程度で２２．１〜２６．０ｍｍ２のｇｇホモ型、その中間のヘテロ型が、［ＧｇＧｇ大粒ホモ型：ｇｇｇｇ小粒ホモ型＋Ｇｇｇｇヘテロ型］＝６：２３に分離し、不完全優性一遺伝子の理論比３：１（χ２＝０．２８７，０．５５＜Ｐ＜０．６）に適合した。Ｇｇホモ型大粒個体は、日本晴に比べ粒面積が約２７％増大した。また、稈長についての分離も調べたところ、長稈型個体内における粒面積の分布および短稈型個体内における粒面積の分布が共に、不完全優性一遺伝子の理論比１：２：１に適合した。以上のことよりＧｇと短稈遺伝子は独立遺伝していると考えられる。
【００３９】
上記ＢＣ１Ｆ２で分離したＧｇホモ型大粒短稈個体にさらに２回目の戻し交雑を行った［日本晴＊２／（日本晴×いのちの壱）Ｆ２］ＢＣ２Ｆ１を播種し、世代促進をし、種子を得た。以上のようにして、いのちの壱と日本晴の交雑Ｆ２で分離したＧｇホモ型大粒個体を１回親、日本晴を反復親として、日本晴に２回戻し交雑を行ったＢＣ２Ｆ２［日本晴＊２／（日本晴×いのちの壱）Ｆ２  Ｇｇホモ型］３系統のそれぞれ７７個体、８０個体、８０個体の合計２３７個体を圃場に栽植した。栽植した全個体において形質調査（出穂日、稈長、草型、粒長、粒幅）を行い、Ｇｇホモ型大粒短稈個体を選抜し、日本晴への３回目の戻し交雑を行った。また、ＢＣ２Ｆ２で分離したＧｇホモ型大粒短稈個体の葉をサンプリングし、コシヒカリと日本晴間のＳＮＰｓ（一塩基多型）を用いた連鎖解析を行った（実施例３）。
【００４０】
上記［日本晴＊２／（日本晴×いのちの壱）Ｆ２］ＢＣ２Ｆ２の３系統における粒面積の分布は、２１．９〜３１．５ｍｍ２の範囲で、両親型および中間型からなる３頂性の分離を示した。上記３系統について統合した結果、［ＧｇＧｇ大粒ホモ型：Ｇｇｇｇヘテロ型：ｇｇｇｇ小粒ホモ型］＝５１：１０５：７７（χ２＝８．０７、０．０１５＜Ｐ＜０．０２５）となり、不完全優性１遺伝子の理論比１：２：１に適合し、日本晴の遺伝的背景においても大粒に関する１個の対立遺伝子Ｇｇの遺伝が判明した。Ｇｇホモ型個体［平均２９．７３ｍｍ２］の粒面積は、日本晴［平均２３．７４ｍｍ２］よりも２５．２％増大した。
【実施例２】
【００４１】
実施例２：大粒遺伝子Ｇｇのマッピング
（１）Ｇｇ遺伝子と第２染色体上のｄ６０遺伝子との連鎖関係
半矮性遺伝子ｄ６０を有するコシヒカリ（ｄ６０コシヒカリ）といのちの壱を交雑し、Ｆ２を得た。半矮性遺伝子ｄ６０は、イネ科植物の第２染色体の短腕末端から１０．３Ｍｂ付近に座乗することが知られている。ｄ６０コシヒカリ×いのちの壱の交雑Ｆ２における稈長と粒径の分布を調べたところ、長稈型個体（Ｄ６０ホモ型個体、Ｄ６０ｄ６０ヘテロ型個体）内における粒径の分布は、［Ｇｇホモ型：ヘテロ型：ｇｇ小粒型］＝１４：２８：２５となり、Ｇｇホモ型に偏った分離、ｄ６０ホモ型短稈個体内における粒径の分布は、［Ｇｇホモ型：ヘテロ型：ｇｇホモ型］＝１１：５：３となり、ｇｇホモ型に偏った分離となった。このことより、ＧｇとＤ６０（ｇｇとｄ６０）の連鎖が示唆された。
【００４２】
（２）ＤＮＡマーカーによるＧｇのマッピング
いのちの壱×日本晴の交雑Ｆ２、およびいのちの壱×コシヒカリの交雑Ｆ２におけるそれぞれｇｇホモ型小粒個体を用いて、イネの１２本の染色体を網羅するＳＳＲマーカーおよびＳＮＰマーカーによってＧｇ遺伝子のマッピングを行った。その結果、第２染色体の５．７Ｍｂ、７．７Ｍｂ、９．６Ｍｂ地点のＤＮＡマーカーとの強い連鎖が検出された。そこで、さらに、いのちの壱×日本晴の交雑Ｆ２、およびいのちの壱×コシヒカリの交雑Ｆ２で分離したｇｇホモ型小粒個体を用いて、第２染色体上の短腕末端から５．７〜１０．６Ｍｂの領域に存在する１５個のＳＳＲマーカー［ＲＭ１２６７５（５．７Ｍｂ）、ＲＭ３３９０（７．７Ｍｂ）、ＲＭ１４５（７．７３Ｍｂ）、ＲＭ１２８０８（７．７７Ｍｂ）、ＲＭｆ０６９（７．８Ｍｂ）、ＲＭｆ０７０（７．８６Ｍｂ）、ＲＭ６２０３（８．０Ｍｂ）、ＲＭｆ０７１（８．２５Ｍｂ）、ＲＭ３６８０（８．７８Ｍｂ）、ＲＭ５６９９（９．０１Ｍｂ）、ＲＭ７５０１（９．２７Ｍｂ）、ＲＭ６３７５（９．６Ｍｂ）、ＲＭ１２９３９（９．８９Ｍｂ）、ＲＭ１３５８（１０．２Ｍｂ）、ＲＭ１２９８６（１０．５８Ｍｂ）］によってＧｇ遺伝子との連鎖解析を行った。
【００４３】
いのちの壱×日本晴の交雑Ｆ２の３系統１３２８個体を育成し（それぞれ、４７１個体、５２８個体、３２９個体）、分離したｇｇホモ型小粒個体合計１２８個体（それぞれ、５２個体、４９個体、２７個体）の葉からゲノムＤＮＡを抽出した。いのちの壱×コシヒカリの交雑Ｆ２を育成し、分離したｇｇホモ型小粒個体２８個体の葉からゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出は常法にしたがって行った。
【００４４】
抽出した各Ｆ２植物体由来のゲノムＤＮＡ２００ｎｇを鋳型にして、各ＳＳＲマーカーの２００ｎＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、４００μＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１×ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒII（ＴＡＫＡＲＡ）、０．５Ｕ  ＬＡ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）を含む全量２５μｌの反応液を作製した。サーマルサイクラーを用いて、変性９４℃３０秒間、アニーリング５８℃３０秒間、伸長７２℃１分間の一連の反応を３５回行った。また、最初の変性９４℃と最後の合成７２℃を５分間ずつ行った。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで１００Ｖで４５分間電気泳動した。
【００４５】
その結果、ＲＭ１２６７５は日本晴／いのちの壱間で多型を示し、ＲＭ３３９０はコシヒカリ／いのちの壱間で多型を示し、ＲＭ６３７５はコシヒカリ／いのちの壱間で多型を示し、ＲＭ１３５８はコシヒカリ／いのちの壱間で多型を示した。 
【００４６】
上記多型を示したＳＳＲマーカーとＧｇ遺伝子との組換え価を算出したところ、第２染色体短腕末端から５．７Ｍｂ地点のＲＭ１２６７５で４２．５％、７．７Ｍｂ地点のＲＭ３３９０で１７．５％、９．６Ｍｂ地点のＲＭ６３７５で３０．０％、１０．２Ｍｂ地点のＲＭ１３５８で３４．４％となった。したがって、Ｇｇ遺伝子を第２染色体上にマッピングすることができた。また、以上の結果から、Ｇｇ遺伝子は、第２染色体短腕末端から５．７Ｍｂ〜１０．３Ｍｂの領域にあるＤＮＡマーカーと連鎖することがわかった。したがって、第２染色体短腕末端から５．７Ｍｂ〜１０．３Ｍｂの領域にあるＤＮＡマーカーを用いて、Ｇｇ遺伝子の存在を判別することができる。特に、７．７Ｍｂ地点のＲＭ３３９０と強く連鎖しており、ＲＭ３３９０はＧｇ遺伝子のジェノタイピングに最も好ましく使用できることが分かった。
【実施例３】
【００４７】
実施例３：大粒遺伝子Ｇｇと第２染色体上のＳＳＲマーカーおよびＳＮＰマーカーとの連鎖解析
Ｇｇ遺伝子をコシヒカリの遺伝的背景に３回の戻し交雑で移入した［コシヒカリ＊３／（コシヒカリ×いのちの壱）Ｆ３大粒型］ＢＣ３Ｆ２で分離した、粒面積がいのちの壱と同程度の２６．１〜３０．０ｍｍ２のＧｇホモ型個体７個体、およびコシヒカリ×いのちの壱の交雑Ｆ２のｇｇホモ型個体２３個体の葉を供試し、第２染色体上のコシヒカリといのちの壱との間で多型を示すＳＳＲマーカーおよびＳＮＰマーカーによって、ＢＣ３Ｆ２におけるゲノムの置換率を調べ、Ｆ２における組換え価を求めた。
【００４８】
一方、Ｇｇ遺伝子を日本晴の遺伝的背景に２回の戻し交雑で移入した［日本晴＊２／（日本晴×いのちの壱）Ｆ２大粒型］ＢＣ２Ｆ２で分離した、粒面積がいのちの壱と同程度の２８．５〜３１．６ｍｍ２のＧｇホモ型個体２３個体の葉を供試し、第２染色体上の日本晴といのちの壱との間で多型を示すＳＳＲマーカーおよびＳＮＰマーカーによって、ＢＣ２Ｆ２におけるゲノムの置換率を調べた。
【００４９】
使用したＳＳＲマーカーは、日本晴といのちの壱間で多型を示す第２染色体のＲＭ１２６７５（５．７Ｍｂ）、コシヒカリといのちの壱間で多型を示すＲＭ３３９０（７．７Ｍｂ）、ＲＭ６３７５（９．６Ｍｂ）、ＲＭ１３５８（１０．２Ｍｂ）である。
【００５０】
使用したＳＮＰマーカーは、Ｇｇ遺伝子が座乗していると考えられる第２染色体短腕末端からの距離５．７〜１０．３Ｍｂの領域に等間隔に位置し、日本晴といのちの壱間、またはコシヒカリといのちの壱間で多型を示す５か所のＳＮＰ［Ｊ５１３（５．８Ｍｂ）、Ｊ５２１（７．６Ｍｂ）、Ｊ５２５（８．１Ｍｂ）、Ｊ５３６（９．１Ｍｂ）、Ｊ５４３（１０．２２Ｍｂ）］について、１塩基だけが異なるＳＮＰアリルにそれぞれ特異的にハイブリダイズするプローブを設計し、それぞれ異なる蛍光色素ＦＡＭおよびＨＥＸで標識したものである（表１−１）。こうして作製されたＴａｑＭａｎプローブは、それより外側に設計したプライマー（表１−２）の伸長反応によって分解されて、蛍光色素とクエンチャーが離れると発光する。このアリル特異的な蛍光の増幅曲線によってどちらのＳＮＰアリルを持つかを判断した。
【００５１】
【表１−１】
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なお、Ｊ５１３は日本晴れといのちの壱間で多型を示し、Ｊ５２１、Ｊ５２５、Ｊ５３６、およびＪ５４３はコシヒカリといのちの壱間で多型を示した。表１中、一塩基多型を下線で示す。
【００５２】
【表１−２】
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【００５３】
［ＤＮＡ抽出］
−８０℃で保存しておいた葉をセラミックビーズ（ＹＴＺビーズ）が入った２ｍｌ粉砕専用チューブ（ＣＫ２８）に入れ、液体窒素に浸漬して１分間凍結した。ビーズ式高速細胞破砕装置（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ２４，ｂｅｒｔｉｎ）で、５０００ｒｐｍで２０秒回転させた後、取り出して再び液体窒素に浸漬凍結し、もう一度５０００ｒｐｍで２０秒間回転させて葉を粉砕した。粉砕した葉に２×ＣＴＡＢを５００μｌ注入し、５５℃の恒温槽で３０分間インキュベートした。クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を５００μｌ注入し、１５分間振とうさせた後、５０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心し、上澄みをオートクレーブで滅菌済みの１．５ｍｌチューブに分取した。これに３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．８）を５０μｌ、およびイソプロパノールを５００μｌ加え、ＤＮＡを凝集させた。これを５０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心して沈殿させ、上澄みを捨てて、７０％エタノールを３００μｌ入れ、５０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心した。遠心後、上澄みを捨て、風乾させ、滅菌ミリＱ水１００μｌでＤＮＡを溶かし、ＤＮＡを抽出した。
【００５４】
［ＰＣＲ］
抽出したＤＮＡサンプルを用いて、第２表および第３表の組成でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプログラムは、ＳＳＲマーカーでは、９５℃２分間で熱変性させた後、熱変性９５℃３０秒、アニーリング５０または５５℃３０秒、伸長反応７２℃３０秒を３５サイクル行った。ＳＮＰマーカーでは、９５℃３０秒で熱変性させた後、熱変性９５℃１５秒、アニーリングそれぞれ４８、５０．５、５３．５℃３０秒を４０サイクル行った。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
【表３】
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【００５７】
［電気泳動］
ＰＣＲ産物（ＳＳＲマーカー）を電気泳動装置ＱＩＡｘｃｅｌで電気泳動した。電気泳動カートリッジはＱＩＡｘｃｅｌ  ＤＮＡ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｎｇ  Ｋｉｔ（２４００）を用いて、５ｋＶで１０分間、電気泳動を行った。
【００５８】
［結果］
戻し交雑ＢＣ２Ｆ２で分離したＧｇホモ型個体を供試し、ゲノムの置換率を調べた結果、短腕末端から５．７Ｍｂ地点のＲＭ１２６７５座では、８２．６％が日本晴ゲノムに置換されていた。短腕末端から５．８Ｍｂ地点のＪ５１３座では、８９．１％が日本晴のゲノムに置換されていた。さらに、戻し交雑ＢＣ３Ｆ２では、短腕末端から７．６Ｍｂ地点のＪ５２１座では、５０．０％がコシヒカリのゲノムに置換され、短腕末端から７．７Ｍｂ地点のＲＭ３３９０では、５７．１％がコシヒカリのゲノムに置換されていた。一方、短腕末端から９．１Ｍｂ地点のＪ５３６では、５０．０％がコシヒカリのゲノムに置換され、短腕末端から９．６Ｍｂ地点のＲＭ６３７５では、７５．０％がコシヒカリのゲノムに置換され、さらに上流の１０．２Ｍｂ地点のＪ５４３では、１００．０％がコシヒカリのゲノムに置換されていた（図１）。
【００５９】
コシヒカリ／いのちの壱間または日本晴／いのちの壱間で多型を示す第２染色体のＳＳＲマーカー及びＳＮＰマーカーとＧｇ遺伝子との連鎖関係を調べた結果、ＢＣ２Ｆ２、ＢＣ３Ｆ２で分離したＧｇホモ型個体を供試した連鎖解析では、短腕末端から８．１Ｍｂ地点のＪ５２５座で連鎖が検出された他は、それより上流の、７．７Ｍｂ地点のＲＭ３３９０座および７．６Ｍｂ地点のＪ５２１座、さらに上流の５．８Ｍｂ地点のＪ５１３座および５．７Ｍｂ地点のＲＭ１２６７５座ではいずれも日本晴型またはコシヒカリ型が多く分離していることより、この領域は戻し交雑によって日本晴ゲノムまたはコシヒカリゲノムに置換されつつあるということが分かった。一方、Ｊ５２５座よりも下流の、９．１Ｍｂ地点のＪ５３６座、さらに下流の１０．２２Ｍｂ地点のＪ５４３座においても、コシヒカリ型が多く分離していることより、この領域はコシヒカリゲノムに置換されつつあるということが分かった。
【００６０】
組換え価の結果は、短腕末端から５．７Ｍｂ地点のＲＭ１２６７５で４２．５％、７．６Ｍｂ地点のＪ５２１で２１．７％、７．７Ｍｂ地点のＲＭ３３９０で１７．５％、９．１Ｍｂ地点のＪ５３６で２８．３％、９．６Ｍｂ地点のＲＭ６３７５で３０．０％、１０．２Ｍｂ地点のＲＭ１３５８で３４．５％であった（図１）。戻し交雑が進んだ個体でのゲノムの置換率の結果と、Ｇｇ遺伝子と７．７Ｍｂ地点のＲＭ３３９０との組換え価１７．５％を勘案すると、Ｇｇ遺伝子は第２染色体の短腕末端から７．７〜９．１Ｍｂの領域に座乗していると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明によれば、新規の大粒遺伝子Ｇｇに密接に連鎖していて選抜効率が高いＤＮＡマーカーを開発し、Ｇｇ遺伝子のマーカー選抜による大粒型イネの開発法を提供する。したがって、本発明は、農業分野、特にイネ科植物の品種改良の分野において利用可能である。
【図１】
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【配列表】
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