(57)【要約】【課題】ＣＤＰを用いて一段階で合成された新規な特性を有するセルロースの三次元構造体を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、式（Ｉ）：2018145216.tif 000011（式中、ｎは、３〜８である）で示される化合物を構成成分とするセルロース三次元構造体であることを特徴とする。【選択図】図１
2018145216.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2018145216.tif 000009
（式中、ｎは、３〜８である）
で示される化合物を構成成分とするセルロース三次元構造体。
【請求項２】
式（Ｉ）で示される化合物が、Ｄ−グルコースをプライマーとして用いて酵素合成した化合物と比較して狭い分子量分布を持ち、式（Ｉ）で示される化合物の平均重合度が７〜８である、請求項１に記載のセルロース三次元構造体。
【請求項３】
スポンジ状であることを特徴とする請求項１または２に記載のセルロース三次元構造体。
【請求項４】
ナノリボン状のナノセルロースが物理架橋したスポンジ状であることを特徴とする請求項３に記載のセルロース三次元構造体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項のセルロース三次元構造体を含む足場材。
【請求項６】
α−Ｄ−グルコース一リン酸と、プライマーとしてのＤ−（＋）−セロビオースとをセロデキストリンホスホリラーゼと反応させる反応させる工程を含む、式（Ｉ）：
【化２】
2018145216.tif 000010
（式中、ｎは、３〜８である）
で示される化合物を構成成分とするセルロース三次元構造体の製造方法。
【請求項７】
前記反応が６０℃で３日間実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記セロデキストリンホスホリラーゼの反応液中での濃度が０．１Ｕ／ｍＬ以上である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記セロデキストリンホスホリラーゼの反応液中での濃度が０．２Ｕ／ｍＬ以上である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
前記セロデキストリンホスホリラーゼの反応液中での濃度が０．４Ｕ／ｍＬ以上である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１１】
式（Ｉ）で示される化合物が、Ｄ−グルコースをプライマーとして用いて酵素合成した化合物と比較して狭い分子量分布を持ち、式（Ｉ）で示される化合物の平均重合度が７〜８である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
セルロース三次元構造体がスポンジ状であることを特徴とする請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
セルロース三次元構造体がナノリボン状のナノセルロースが物理架橋したスポンジ状であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項６〜１３のいずれか１項に記載の方法により製造される、セルロース三次元構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば人工的に合成したセルロース三次元構造体並びにその製造方法及び利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは、地球上で最も豊富に存在する有機高分子である。セルロースは、その資源性に加え、高いサステイナビリティをもつことから、注目されているマテリアル素材である。機械的処理や化学的処理によって天然物から得られるセルロースは、繊維状の形態であることが知られており、その構造や物性に応じた利用が展開されている。また、天然資源を酸処理することによって得られるセルロースナノ結晶（ＣＮＣ）は、新たなセルロース素材としての利用が期待されている。ＣＮＣは、セルロース鎖が平行に配列したＩ型結晶構造を有し、高いアスペクト比や優れた機械的強度、熱的安定性等から複合材料のフィラーとして注目されている。
【０００３】
一方、結晶性のセルロースが人工的にも合成できることが知られている（人工合成で得られるセルロースは一般にオリゴマーであることから、このようなセルロースはセロデキストリンと呼ばれる。ここでは、区別せずにすべてセルロースと呼ぶ）。プライマー（出発物質）として働くＤ−（＋）−グルコースに対して、α−Ｄ−グルコース一リン酸（αＧ１Ｐ）がモノマーとして逐次的に重合される合成方法が知られており、加リン酸分解酵素であるＣＤＰの逆反応を利用した酵素合成により、長さ数μｍ、幅数百ｎｍ、厚さ４．５ｎｍのナノシート構造を有するセルロース結晶（セルロースナノシート；ＣＮＳ）が得られる（非特許文献１）。また、ＣＤＰの逆反応を利用した酵素合成による合成方法において、プライマーとしてＤ−（＋）−グルコースの代わりにＤ−（＋）−セロビオースを用いる方法も知られ（非特許文献２）、以下に示すような反応によりセルロースが酵素合成される。
【０００４】
【化１】
2018145216.tif 000003
（図中、ｎはセロビオースの重合度を示す。）
【０００５】
上記反応に示すように、加リン酸分解酵素であるＣＤＰの逆反応を利用した酵素合成により、長さ１μｍ、幅０．１μｍ、厚さ約１０ｎｍのプレート状の形態を有するセルロース結晶が得られる（非特許文献２）。当該合成においては、プライマーとして働くＤ−（＋）−セロビオースに対して、α−Ｄ−グルコース一リン酸（αＧ１Ｐ）がモノマーとして逐次的に重合される。また、当該セルロース結晶は、天然由来のＩ型結晶とは異なり、より安定な逆平行鎖のＩＩ型結晶構造を有する。また、当該セルロース結晶は７９．８５℃においてジメチルスルホキシドに溶解し、室温で０．２ＭＮａＯＨ水溶液に溶解する性質を有する。
【０００６】
さらに、本発明者の一部は、上記ＣＤＰを利用したセルロースの酵素合成において、プライマーとしてＣ２−５−直鎖状アルキル基又はＣ２−５を主鎖とする分岐状アルキル基を有するグルコース誘導体を用いることで、スポンジ状の構造等の溶媒を含む三次元網目構造を有するセルロースナノ構造体を作製できること（特許文献１）、また水溶性高分子存在下で同様にセルロースを合成すると、その二次元結晶がさらに成長し、ナノリボン状のネットワーク構造を形成することを見出した（特許文献２）。本発明者の一部は、上記ＣＤＰを利用したセルロースの酵素合成において、プライマーとして繰り返し単位を有する親水性置換基を有するグルコース誘導体を用いることでもナノリボン状のネットワーク構造を形成することをさらに見出した（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１５／０７１０４７
【特許文献２】国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０５７２５３
【特許文献３】特願２０１６−１１８２２７
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍ．Ｈｉｒａｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００９年，Ｖｏｌ．３４４，ｐｐ．２４６８−２４７３
【非特許文献２】Ｅ．Ｓａｍａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１９９５年，Ｖｏｌ．２７１，ｐｐ．２１７−２２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のＣＤＰを用いたセルロースの合成において、多様な高分子を添加することで新規な特性を有するセルロースの三次元構造体の有用性が示されている。本発明では、このような有用な三次元構造体について、他の高分子を添加することなく、一段階で酵素合成することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
プライマーに対してα−グルコース−１−リン酸（αＧ１Ｐ）を脱リン酸化しながら結合させるＣＤＰを用いたセルロースの合成において、プライマーとしてセロビオースを用い、反応系における酵素濃度を調節することによって、新規な特性を有する三次元構造体を合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、次式（Ｉ）：
【化２】
2018145216.tif 000004
（式中、ｎは、３〜８である）
で示される化合物を構成成分とするセルロース三次元構造体を包含する。
【００１２】
本発明はさらに、α−Ｄ−グルコース一リン酸と、プライマーとしてのＤ−（＋）−セロビオースとをＣＤＰと反応させる反応させる工程を含む、次式（Ｉ）：
【化３】
2018145216.tif 000005
（式中、ｎは、３〜８である）
で示される化合物を構成成分とするセルロース三次元構造体の製造方法を包含する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、足場材などの医療分野、およびフィルムなどの環境・エネルギー分野において有用なセルロースのみからなる三次元構造体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】異なるＣＤＰ濃度における生成物の反転倒立試験によるスポンジ化挙動の評価を示す。０．０５、０．１、０．２、０．４の数字はそれぞれＣＤＰの濃度（Ｕ／ｍＬ）を示し、それぞれの数字の下にはそれらのＣＤＰ濃度において調製した生成物の反転倒立試験の結果を示す。
【図２】異なるＣＤＰ濃度における生成物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。０．１Ｕ／ｍＬ、０．２Ｕ／ｍＬ、０．４Ｕ／ｍＬのＣＤＰ濃度を用いて調製した生成物の構成成分を１Ｈ  ＮＭＲ測定した結果をそれぞれ示す。図中、ｎはセロビオースの重合度を示す。
【図３】異なるＣＤＰ濃度における生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。０．１Ｕ／ｍＬ、０．２Ｕ／ｍＬ、０．４Ｕ／ｍＬのＣＤＰ濃度を用いて調製した生成物の構成成分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定した結果をそれぞれ示す。
【図４】異なるＣＤＰ濃度における生成物のＡＴＲ／ＦＴＩＲスペクトルを示す。０．１Ｕ／ｍＬ、０．２Ｕ／ｍＬ、０．４Ｕ／ｍＬのＣＤＰ濃度を用いて調製した生成物の構成成分をＡＴＲ／ＦＴＩＲ測定した結果をそれぞれ示す。
【図５】異なるＣＤＰ濃度における生成物のＷＡＸＤチャートを示す。０．１Ｕ／ｍＬ、０．２Ｕ／ｍＬ、０．４Ｕ／ｍＬのＣＤＰ濃度を用いて調製した生成物の構成成分をＷＡＸＤ測定した結果をそれぞれ示す。
【図６】異なるＣＤＰ濃度における生成物のＳＥＭ像を示す。０．１、０．２、０．４の数字はそれぞれＣＤＰの濃度（Ｕ／ｍＬ）を示し、０．１Ｕ／ｍＬ、０．２Ｕ／ｍＬ、０．４Ｕ／ｍＬのＣＤＰ濃度を用いて調製した生成物を溶媒置換して凍結活断したサンプルをＳＥＭ観察した結果をそれぞれ示す。スケールバーは５００ｎｍ、２μｍを示す。
【図７】０．２Ｕ／ｍＬのＣＤＰ濃度を用いて調製した生成物を構成するナノリボンのＡＦＭ像を示す。０．２Ｕ／ｍＬのＣＤＰ濃度を用いて調製した生成物を機械的に破壊してスピンキャストしたサンプルをＡＦＭ観察した結果を示す。スケールバーは１μｍを示す。
【図８】本発明によるセルロース構造体の圧縮試験の結果を示す。０．２Ｕ／ｍＬのＣＤＰ濃度を用いて調製したセルロース構造体（左）とその圧縮後のセルロース構造体（右）を示す。
【図９】０．２Ｕ／ｍＬのＣＤＰ濃度を用いて調製した国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０５７２５３に記載のセルロース構造体（上）と０．２Ｕ／ｍＬのＣＤＰ濃度を用いて調製した本発明によるセルロース構造体（下）のセルラーゼ処理による経時的な変化をそれぞれ示す。０、０．５、１、２の数字はそれぞれセルラーゼの処理時間（時間）を示し、それぞれの数字の下にはそれぞれの時間処理されたセルロース構造体を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．本発明に係るセルロース三次元構造体
本発明に係るセルロース三次元構造体は、次式（Ｉ）：
【化４】
2018145216.tif 000006
（式中、ｎは、３〜８である）
で示される化合物を構成成分として含有するものである。
【００１６】
上述の式（Ｉ）で表される化合物の平均重合度は７〜８となっており、Ｄ−グルコースをプライマーとして酵素合成した場合のセルロースオリゴマーの平均重合度（Ａｖｅｒａｇｅ  ＤＰ  〜１０）（Ｔ．Ｓｅｒｉｚａｗａら，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２０１６年，４８，５３９−５４４）と比較してやや低い。
【００１７】
上述の式（Ｉ）で表される化合物は、Ｄ−グルコースをプライマーとして酵素合成した場合と比較して狭い分子量分布をもつ。
【００１８】
式（Ｉ）の化合物の重合度は、例えば５以上、好ましくは６以上（すなわち、式（Ｉ）の化合物において、ｎが３以上、好ましくは４以上）であり、且つ１０以下、好ましくは９以下（すなわち、式（Ｉ）の化合物において、ｎが８以下、好ましくは７以下）である。
【００１９】
天然由来のセルロース鎖が平行に配列したＩ型セルロース構造とは異なり本発明に係るセルロース三次元構造体は、熱力学的に安定であるセルロースＩＩ型結晶形を形成する。
【００２０】
また、本発明に係るセルロース三次元構造体は、スポンジ状セルロース構造体である。このスポンジ状セルロース構造体は、長さが最大で数μｍにも渡ってよく発達したリボン状の構造体（ナノリボン）から構成される。このナノリボンは枝分かれ構造を持たず、ナノリボン状のナノセルロースが物理架橋することでセルロース構造体を形成している。
【００２１】
さらに、本発明に係るセルロース三次元構造体は、プライマーとしてセロビオースを用い、酵素濃度を調節することで、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０５７２５３に記載するように天然セルロース、ＰＥＧ等を合成中に添加しなくても三次元網目構造を形成できる。
【００２２】
また、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１５／０７１０４７に記載するように、プライマーとして用いるためのアルキル基又はＣ２−５を主鎖とする分岐状アルキル基を有するグルコース誘導体を調製することなく、プライマーとしてセロビオースを用い、酵素濃度を調節することで本発明に係るセルロース三次元構造体を形成できる。
【００２３】
また、特願２０１６−１１８２２７に記載するように、プライマーとして用いるための繰り返し単位を有する親水性置換基を有するグルコース誘導体を調製することなく、プライマーとしてセロビオースを用い、酵素濃度を調節することで本発明に係るセルロース三次元構造体を形成できる。
【００２４】
また、プライマーとしてセロビオースを用い、酵素濃度を調節することで形成する本発明に係るセルロース三次元構造体は、プライマーとしてセロビオースを用いるが異なる酵素濃度条件下で形成されるＥ．Ｓａｍａｉｎら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１９９５年，２７１，２１７−２２６に記載されるようなプレート状の形態とは異なり、ナノリボン状のナノセルロースが物理架橋したスポンジ状の三次元セルロース構造体である。
【００２５】
また、プライマーとしてセロビオースを用い、酵素濃度を調節することで形成する本発明に係るセルロース三次元構造体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０５７２５３に記載するデキストランをセルロース合成中に添加して作製する三次元構造体と比較して高い生分解能を有する。
【００２６】
２．  本発明に係るセルロース構造体の製造方法。
上述の本発明に係るセルロース構造体は、以下に示される反応に準じて製造することができる。
【００２７】
【化５】
2018145216.tif 000007
これはＣＤＰの逆反応を利用した酵素合成によるものであり、プライマーとしてのセロビオースと、基質としてのαＧ１ＰをＣＤＰと反応させることによって、本発明に係るセルロース構造体を製造することができる。プライマーとしてのセロビオースに対してαＧ１Ｐがモノマーとして逐次的に重合される。
【００２８】
この反応に用いるＣＤＰの濃度は、０．１Ｕ／ｍｌ以上であってよく、０．２Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは０．４Ｕ／ｍｌであってよい。
【００２９】
αＧ１Ｐ及びＤ−（＋）−セロビオースは、市販品として入手できるものであってよい。
【００３０】
一方、ＣＤＰは、例えばＭ．Ｋｒｉｓｈｎａｒｅｄｄｙら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００２年，４９，１−８に記載の方法に準じて調製することができる。具体的には、Ｍ．Ｋｒｉｓｈｎａｒｅｄｄｙら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００２年，４９，１−８によれば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ＹＭ４株由来のＣＤＰを調製することができる。
【００３１】
ＣＤＰの酵素量は、例えば、酵素活性をもとに決定することができる。この場合、例えば、αＧ１ＰとＤ−（＋）−セロビオースおよびＣＤＰをインキュベーションし、ＣＤＰにより生成されるリン酸を定量し、１分間あたり１μｍｏｌのリン酸を遊離する酵素量を１Ｕとすることができる。
【００３２】
例えば、１０〜１０００ｍＭ（好ましくは１００〜３００ｍＭ）のαＧ１Ｐ、１０〜２００ｍＭ（好ましくは５０〜６０ｍＭ）のＤ−（＋）−セロビオース、及び０．１Ｕ／ｍＬ以上（または０．２Ｕ／ｍＬ以上、好ましくは０．４Ｕ／ｍＬ以上）のＣＤＰを、１００〜１０００ｍＭ（好ましくは２５０〜７５０ｍＭ）の２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０（好ましくはｐＨ７．５））中で混合し、１０〜８０℃（好ましくは、２０〜６０℃）で３０分間〜３０日間（好ましくは、１時間〜１４日間）インキュベートし、反応させることで、本発明に係るセルロース三次元構造体を製造することができる。
【００３３】
３．本発明に係るセルロース三次元構造体の用途
３−１．医療分野
３−１−１．細胞培養足場材
本発明に係るセルロース三次元構造体は、その表面に動物細胞を生育させる足場材として使用することができる。
【００３４】
生育させる細胞としては、動物由来であれば良く、例えば哺乳類、爬虫類、両生類、又は昆虫由来の細胞が挙げられる。また、心臓、肝臓、脾臓、表皮等の臓器や組織から分離した初代培養細胞でも、継代培養した株化細胞、腫瘍細胞でも良い。さらに、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）等の体性幹細胞、人工多能性幹細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞等の細胞株（Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ）等でも良い。
【００３５】
細胞培養に用いる培地としては、平衡塩類溶液にアミノ酸やビタミン等の低分子化合物を加えた基礎培地が挙げられる。さらに、血清或いは血清・組織抽出物、加水分解物、成長因子、ホルモン、搬送体タンパク質、脂質、ポリアミン酸、微量元素、ビタミン、増粘剤、界面活性剤、細胞接着因子等を添加した培地を使用することもできる。
【００３６】
当該セルロース三次元構造体を、薄膜状に成形して、薄膜の表面で細胞を培養できる。栄養成分を薄膜底面からも供給することで培養効率を高めることができる。
【００３７】
当該セルロース三次元構造体上に単層状に生育した細胞は、細胞剥離剤にて剥離し回収することができる。細胞剥離剤には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の２価カチオン除去のためのキレート剤、細胞・基質間、細胞・細胞間接着タンパク質のためのトリプシン等のプロテアーゼを用いることもできるし、セルラーゼにより当該セルロース三次元構造体の一部又は全部を分解し、可溶化することで細胞を剥離することもできる。プロテアーゼを用いない後者の方法では、細胞・細胞間の接着は剥離することなく、また細胞への影響も無いことから、活性の高い懸濁細胞又は細胞シートを得ることができる。
【００３８】
得られた細胞シートは、同様に得られた細胞シートと積層するか、或いは細胞シートの表面を細胞間接着タンパク質等でコートし、さらに細胞を培養することで、三次元的に厚みを持った細胞塊を得ることができる。
【００３９】
３−１−２．高濃度細胞培養用足場材
本発明に係るセルロース三次元構造体は、その内部に動物細胞を生育させる足場材として使用することができる。当該セルロース三次元構造体を、細胞が入ることができる大きさ程度又はそれ以上の空隙を持つ構造体に成形し、構造体の中で細胞を培養することができる。
【００４０】
生育させる細胞は、上記の第３−１−１節に記載するように、動物由来であればどのような細胞でも良い。また、培養に用いる培地は、上記の第３−１−１節に記載するように、基礎培地、血清添加培地又はその他成分を添加した培地でも良い。
【００４１】
当該セルロース三次元構造体中で細胞を培養することで、浮遊懸濁培養の際に起こる撹拌のせん断応力による細胞の傷害が起こらず、培養液当たりの細胞の高濃度化が可能となる。
【００４２】
また、抗体やタンパク質等のバイオ医薬品の生成能を付与したｒＣＨＯ細胞等を当該セルロース三次元構造体で高濃度に培養すれば、バッチ当たりの抗体やタンパク質等の生産量が増大し、バイオ医薬品の製造コスト低減が可能である。さらに、目的生産物を回収後、新しい培地を添加し、再度培養を行うか、或いは連続的に目的生産物を含む培地を回収し、新しい培地を追加添加することで、バッチ連続式又は連続式に生産物を得ることができる。
【００４３】
さらに、高濃度培養した細胞は、足場材として利用したセルロース三次元構造体をセルラーゼ処理に供することで、プロテアーゼ処理の際に起こるような細胞への傷害を起こさずに細胞を遊離させ、回収することができる。ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の全能性幹細胞を当該手法で大量に培養し、再生医療や創薬産業のために必要な細胞を供給することができる。本発明による三次元構造体は、従来のものと比較してセルラーゼよって分解されやすいためこの用途に適している。
【００４４】
３−１−３．三次元構造体足場材
本発明に係るセルロース三次元構造体は、その内部に動物細胞を生育させる足場材として使用することができる。当該セルロース三次元構造体を、細胞が入ることができる大きさ程度又はそれ以上の空隙を持つ構造体に成形し、構造体の中で細胞を培養することができる。
【００４５】
生育させる細胞は、上記の第３−１−１節に記載するように、動物由来であればどのような細胞でも良い。培養に用いる培地は、上記の第３−１−１節に記載するように、基礎培地、血清添加培地又はその他成分を添加した培地でも良い。
【００４６】
当該セルロース三次元構造体を、細胞培養の前、途中又は後に、目的組織に合わせた形状に成形し、生体組織又は臓器の再生のために用いることができる。細胞培養の前に成形する場合、当該セルロース三次元構造体の重合反応時に目的の形状の型枠で反応させることもできるし、成形後に切断、積層、編み込み等で目的の形状にすることができる。
【００４７】
当該セルロース三次元構造体は、セルラーゼ処理により、細胞へ影響することなく分解可溶化することができる。本発明による三次元構造体は、従来のものと比較してセルラーゼよって分解されやすいためこの用途に適している。臓器への移植する前に、セルラーゼ処理に供し、部分的に、又は全部を分解可溶化しても良いし、セルラーゼ処理に供することなく足場材と共に移植しても良い。
【００４８】
さらに、細胞を生育させた三次元構造体は、組織又は臓器の形状や機能を生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で再現したものとして、癌転移の機構解明、制癌剤の薬効評価等の基礎医学研究用、或いは、近年動物試験が禁止された化粧品の皮膚等の生体組織への影響を検討するための素材として利用することができる。
【００４９】
３−１−４．骨欠損部位への移植材料
本発明に係るセルロース三次元構造体は、動物の骨欠損部位への移植材料、歯周組織の再生誘導材料としても使用することができる。当該セルロース三次元構造体は、容易に望む形に成形加工することができ、高圧蒸気による滅菌も可能である。当該セルロース三次元構造体は、移植する前に細胞を生着させても良いし、そのまま移植しても良い。
【００５０】
３−２．環境・エネルギー分野
下記に説明するように、本発明に係るセルロース三次元構造体は、フィルム（例えば、微多孔性のフィルム（用途例：セパレータ、吸着材、バイオセンサー等）、緻密なフィルム（用途例：バリアフィルム等））として環境・エネルギー分野において使用することができる。
【００５１】
３−２−１．電池セパレータ用途
本発明に係るセルロース三次元構造体は、例えばリチウムイオン電池等の二次電池向けのセパレータとしても用いることができる。セパレータとして用いることにより、従来のポリオレフィン製のセパレータに比べ、高い耐熱性を有するため、例えば、過充電等により、電池が異常発熱した場合に、セパレータが融解し、内部短絡することを防ぐことができ、安全性を向上させることができる。また、親水性置換基の存在により、一般的に電池に用いられる極性溶媒等をより保持しやすく、安定したイオン伝導性、すなわち電池の入出力特性の維持が期待でき、寿命を向上させることが可能である。
【００５２】
３−２−２．吸着材、濃縮（生分解性）
本発明に係るセルロース三次元構造体は、シリカ、アルミナ、ゼオライト、プルシアンブルー等の吸着材微粒子を分散、担持させることにより、アンモニア、アルデヒド等の有毒ガス、放射性廃棄物等の有害物質、海水中の有価金属等を吸着回収することが可能である。
【００５３】
また、当該セルロース三次元構造体は、分解酵素を用いて簡単に分解可能であることから、吸着回収した物質を必要に応じて簡単に濃縮することができるといった特長も有する。
【００５４】
３−２−３．バイオセンサー
本発明に係るセルロース三次元構造体は、酵素や抗体を担持することによってバイオセンサーとして使用することができる。例えば、グルコースオキシダーゼ等の酵素を担持すればグルコースセンサーとして使用することが可能であり、親水性置換基を活用し、例えば、ナトリウムイオン等のイオン伝導特性を観測すれば、血中のナトリウムイオン濃度等を計測するセンサーとして使用することが可能である。
【００５５】
３−２−４．ガスバリアシート（構造体も含む）
本発明に係るセルロース三次元構造体に無機ナノ材料を緻密に担持させることにより、例えば水蒸気等のガスを遮断するガスバリアシートとすることができる。無機ナノ材料としては、シリカ等のナノ粒子、又はモンモリロナイト等のクレイが挙げられる。これら無機ナノ材料と親水性置換基とは親和性が高く、強く相互作用するため、無機ナノ材料を強固に取り込んだ複合材料を形成し、バリア性を向上させることが可能である。
【００５６】
３−２−５．放熱シート
本発明に係るセルロース三次元構造体に高熱伝導率を持つ材料を緻密に担持させることにより、放熱材料として使用することが可能である。高熱伝導率を持つ材料としては、ダイヤモンド、グラフェン、カーボンナノチューブ等の炭素系材料、銀、銅、金、アルミニウム等の金属材料、アルミナ、マグネシア、六方晶窒化ホウ素等の無機材料等が挙げられる。また、親水性置換基により、シート表面を柔らかくすることが可能であり、発熱体との密着性を改善させ、熱界面抵抗を低減することにより、放熱性を改善することが可能である。
【００５７】
３−２−６．蓄熱シート
本発明に係るセルロース三次元構造体に蓄熱性を有する材料を分散、担持させることにより、蓄熱材として使用することが可能である。蓄熱材としては、エリスリトール、酢酸ナトリウム３水塩、硫酸ナトリウム１０水塩、パラフィン、Ｆｅ−Ｃｏ合金等の潜熱蓄熱材、その他、顕熱蓄熱材、化学蓄熱材等が挙げられる。潜熱蓄熱材は物質の相転移を利用するものであり、固液相転移を利用する蓄熱材の場合は、液状となった場合に漏洩が生じないように工夫する必要があり、例えば石油樹脂等のカプセル内に包含させる方法がある。
【００５８】
３−２−７．分離精製の基材（カラムの充填剤、電気泳動）
本発明に係るセルロース三次元構造体は、ナノサイズの空間を有しているため、当該空間を利用して分離精製カラムや電気泳動の充填剤として用いることが可能である。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、例示の目的のみを意図しており、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６０】
〔セルロースオリゴマーからなる三次元構造体の酵素合成〕
１．実験方法
１−１．試薬
ＬＢ−ＢＲＯＴＨ  ＬＥＮＮＯＸ及びＬＢ−ＡＧＡＲ  ＬＥＮＮＯＸはフナコシより購入した。
【００６１】
グリセロール、カナマイシン硫酸塩、イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：ＩＰＴＧ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチルエチレンジアミン（Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ：ＴＥＭＥＤ）、ジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ：ＤＴＴ）、１−ブタノール、αＧ１Ｐ二ナトリウム・ｎ水和物、４０％重水酸化ナトリウム重水溶液、は和光純薬より購入した。
【００６２】
ジクロロメタン、酢酸エチル、シリカゲル６０Ｎ（４０−１００μｍ、球状、中性）は関東化学より購入した。
【００６３】
Ｄ−（＋）−セロビオースはナカライテスクより購入した。セルラーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ由来）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより購入した。
【００６４】
ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）アガロースゲルはＱＩＡＧＥＮより購入した。
【００６５】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）はタカラバイオより購入した。
【００６６】
アクリルアミド、Ｎ−Ｎ´−メチレンビスアクリルアミド、ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ：ＳＤＳ）、過硫酸アンモニウム（Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ：ＡＰＳ）、重水、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（２，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｘｏｎｉｃ  ａｃｉｄ：ＤＨＢＡ）、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ  Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  １−７  ＭＡＬＤＩ−ＭＳスタンダード（Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ  Ｐ１４Ｒ  ＭＡＬＤＩ−ＭＳスタンダード（Ｐ１４Ｒ）、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ  ＡＣＴＨ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  １８−３９  ＭＡＬＤＩ−ＭＳスタンダード（ＡＣＴＨ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、アセトニトリルはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより購入した。
【００６７】
カーボンテープ、ドータイトは日新ＥＭより購入した。
【００６８】
その他の試薬は、特に表記しない限りナカライテスクより購入し、特級以上の試薬を使用した。
【００６９】
超純水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ａ−１０，  Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で精製された水を使用した。
【００７０】
純水はＴＡＮＫ  ６０  Ｌｉｔｅ  ＰＥ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で精製された水を使用した。
【００７１】
１−２．ＣＤＰの調製及び酵素活性評価
ＣＤＰは、Ｍ．Ｋｒｉｓｈｎａｒｅｄｄｙら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００２年，４９，１−８に記載の方法と同様の方法により調製した。
【００７２】
１−２−１．試薬の調製
（１）滅菌精製水
５００ｍＬ広口メディウム瓶に超純水５００ｍＬを採取してオートクレーブ（１２１℃、２０分間、ＢＳ−２４５、ＴＯＭＹ）して室温で保存した。
【００７３】
（２）５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液
カナマイシン硫酸塩１．５ｇを滅菌精製水に溶解させ、３０ｍＬにメスアップした。調製した溶液をクリーンベンチ内でポリフッ化ビニリデン（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ：ＰＶＤＦ）製０．２２μｍフィルターで濾過滅菌し、１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して−２０℃で保存した。
【００７４】
（３）１０ｍＭＩＰＴＧストック溶液
ＩＰＴＧ７１．５ｍｇを滅菌精製水に溶解させ、３０ｍＬにメスアップした。調製した溶液をクリーンベンチ内においてＰＶＤＦ製０．２２μｍフィルターで濾過滅菌した。１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して−２０℃で保存した。
【００７５】
（４）ＬＢ−ＡＧＡＲ／カナマイシンプレート
２５０ｍＬ広口メディウム瓶にＬＢ−ＡＧＡＲ  ＬＥＮＮＯＸ２．８ｇを採取し、超純水８０ｍＬを添加して溶解させてオートクレーブした。６０℃以下まで室温で冷却した後、クリーンベンチ内で５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液８０μＬを加えて混合した。滅菌済みシャーレに分注して室温で固化させた後、４℃で保存した。調製後１ヶ月以内に使用した。
【００７６】
（５）５０％グリセロール溶液
２５０ｍＬ広口メディウム瓶にグリセロール５０ｍＬ、超純水５０ｍＬを加えて混合した後、オートクレーブして室温で保存した。
【００７７】
（６）ＬＢ培地
５００ｍＬ広口メディウム瓶にＬＢ−ＢＲＯＴＨ  ＬＥＮＮＯＸ１０ｇを純水５００ｍＬに溶解させ、オートクレーブして室温で保存した。
【００７８】
（７）ＭＯＰＳ−Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）
３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）４．１８ｇを約６００ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、１Ｌにメスアップした。ＰＶＤＦ製０．１０μｍフィルターで濾過滅菌して４℃で保存した。
【００７９】
（８）７０％エタノール（バイオテクノロジーグレード）
エタノール（バイオテクノロジーグレード）１４０ｍＬ及び超純水６０ｍＬを２５０ｍＬ広口メディウム瓶に採取して混合した後、室温で保存した。
【００８０】
（９）洗浄バッファー（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）
ＭＯＰＳ２．０９ｇ、塩化ナトリウム８．７７ｇ、イミダゾール３４０ｍｇを約３５０ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、５００ｍＬにメスアップした。ＰＶＤＦ製０．１０μｍフィルターで濾過滅菌して４℃で保存した。
【００８１】
（１０）溶出バッファー（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）
ＭＯＰＳ２．０９ｇ、塩化ナトリウム８．７７ｇ、イミダゾール８．５１ｇを約３５０ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、５００ｍＬにメスアップした。ＰＶＤＦ製０．１０μｍフィルターで濾過滅菌して４℃で保存した。
【００８２】
（１１）５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムストック溶液
アジ化ナトリウム５００ｍｇをプラスチック製スパチュラにより秤量してＭＯＰＳ−Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）を添加して全量が１０ｍＬとなるよう溶解させて４℃で遮光保存した。
【００８３】
（１２）３０％アクリルアミド／ビス混合溶液
アクリルアミドは劇物であるため、調製には細心の注意を払った。アクリルアミド２９．２ｇ、Ｎ−Ｎ´−メチレンビスアクリルアミド０．８ｇを約７０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。全量が１００ｍＬになるようにメスアップして４℃で遮光保存した。
【００８４】
（１３）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１．５Ｍ、ｐＨ８．８）
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）１８．１７ｇを約８０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。６Ｎ塩酸によりｐＨ８．８に調整後、全量が１００ｍＬになるようにメスアップして４℃で保存した。
【００８５】
（１４）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ６．８）
Ｔｒｉｓ６．０６ｇを約８０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。６Ｎ塩酸によりｐＨ６．８に調整後、全量が１００ｍＬになるようにメスアップして４℃で保存した。
【００８６】
（１５）１０％ＳＤＳ水溶液
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１０ｇを約９０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。全量が１００ｍＬになるようにメスアップして室温で保存した。
【００８７】
（１６）１０％ＡＰＳ水溶液
過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）０．１ｇを約１ｍＬの超純水に溶解させて４℃で保存した。
【００８８】
（１７）飽和１−ブタノール
１−ブタノールと超純水を２：１の割合で混合して室温で保存した。
【００８９】
（１８）５×泳動バッファー（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、９６０ｍＭグリシン、０．５％ＳＤＳ）
Ｔｒｉｓ１５．１ｇ、グリシン７２．１ｇ、ＳＤＳ５．０ｇを全量が１Ｌとなるように超純水に溶解させて４℃で保存した。使用の際は超純水で５倍に希釈した。一度使用した泳動バッファーは回収して再度使用し、使用回数は最大で２回とした。
【００９０】
（１９）５×Ｌｏａｄｉｎｇバッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．０５％ブロモフェノールブルー、１０％ＳＤＳ、５０％グリセロール）
Ｔｒｉｓ２．４２ｇ、ＳＤＳ１０．０ｇ、ブロモフェノールブルー５０ｍｇを５０ｍＬのグリセロールと約４０ｍＬの超純水を添加して溶解させた。６Ｎ塩酸を用いてｐＨ６．８に調整後、１００ｍＬにメスアップした。１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して４℃で保存した。
【００９１】
（２０）１Ｍ  ＤＴＴ溶液
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）約１５０ｍｇを１Ｍとなるように約１ｍＬの超純水を添加して溶解させ、−２０℃で保存した。
【００９２】
（２１）固定液
酢酸５０ｍＬ、エタノール２００ｍＬを混合した後、超純水で５００ｍＬにメスアップして室温で保存した。
【００９３】
（２２）脱色液
酢酸４０ｍＬ、エタノール１２５ｍＬを混合した後、超純水で５００ｍＬにメスアップして室温で保存した。
【００９４】
（２３）染色液
クマシーブリリアントブルーＲ−２５０  ０．２５ｇを脱色液１００ｍＬに加え、撹拌して溶解させて室温で遮光保存した。
【００９５】
１−２−２．大腸菌の培養及びＣＤＰの発現
（１）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰグリセロールストックの調製
ガスバーナーで加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、ＣＤＰの遺伝子を含むプラスミドをもつＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰ）のグリセロールストックからＬＢ−ＡＧＡＲ／カナマイシンプレートに植菌し、３７℃で８〜１２時間培養した。加熱した白金耳を用いてシングルコロニーから、予め乾熱滅菌した試験管に加えた５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液５μＬとＬＢ培地５ｍＬの混合溶液に植菌した。ＯＤ６６０が０．６〜０．８に達するまで振盪培養機（ＢＲ−２３ＦＰ、ＴＡＩＴＥＣ）で３７℃で振盪培養（往復、２００ｒｐｍ）した。その後、培養液８００μＬを１．７ｍＬチューブに採取し、５０％グリセロール溶液１００μＬを添加して混合した。液体窒素で凍結して−８０℃で保存した。
【００９６】
（２）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰマスタープレートの調製
ガスバーナーで加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰのグリセロールストックもしくは作製後１ヶ月以内のマスタープレートからＬＢ−ＡＧＡＲ／カナマイシンプレートに植菌して３７℃で８〜１２時間培養した。マスタープレートから植菌した場合はそのまま４℃で保存した。グリセロールストックから植菌した場合は、さらにＬＢ−ＡＧＡＲ／カナマイシンプレートに植菌して３７℃で８〜１２時間培養して４℃で保存した。
【００９７】
（３）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰ前培養液の調製
乾熱滅菌した試験管にＬＢ培地３ｍＬを採取して５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液３μＬを加えた。加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰマスタープレートのシングルコロニーから植菌した。振盪培養機を用いて３７℃で１０〜１２時間振盪培養（往復、２００ｒｐｍ）した。
【００９８】
（４）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰの培養とＣＤＰの発現
２本の１Ｌバッフル付きフラスコにＬＢ−ＢＲＯＴＨ  ＬＥＮＮＯＸ６ｇをそれぞれ秤量して純水３００ｍＬを加えてオートクレーブして放冷した。５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液３００μＬをそれぞれに添加して混合した後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰ前培養液３００μＬを加えた。振盪培養機を用いて３０℃で振盪培養（回転、６００ｒｐｍ）してＯＤ６６０が０．５５〜０．６０に達したことを確認後、１０ｍＭ  ＩＰＴＧストック溶液３ｍＬをそれぞれ加えて２５℃で２０時間振盪培養（回転、２００ｒｐｍ）してＣＤＰを発現させた。
【００９９】
１−２−３．Ｈｉｓタグ精製及び緩衝液置換
（１）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰの破砕によるＣＤＰの抽出
１−２−２項（４）で調製したＣＤＰを発現させたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰ懸濁液を５０ｍＬチューブ１２本に約５０ｍＬずつ均等に分注し、遠心機（遠心機：ＥＸ−１２６、ＴＯＭＹ、ローター：３８５０−０４Ｐ、ＴＯＭＹ）を用いて遠心（３５００ｒｐｍ、２０分間、４℃）した。上清をデカンテーションにより除去し、沈澱したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰペレットにＭＯＰＳ−Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）を加えてそれぞれ約１５ｍＬにメスアップし、手で激しく振盪して懸濁させた。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰ懸濁液を４本の１００ｍＬ自立式チューブに約４５ｍＬずつ分注し、氷浴しながらプローブ式超音波照射器（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０、ＢＲＡＮＳＯＮ）を用いて超音波照射してＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰを破砕した。超音波照射は、ｐｏｗｅｒ：２００Ｗ（ダイヤル１０）、ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ：３０％の条件で２サイクル（５秒間超音波照射と２５秒間インターバルの４回繰り返しを１サイクル）行った。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰ破砕液にはＣＤＰの他にプロテアーゼ等が含まれていることから、それらによるＣＤＰの分解を防ぐために、以降はＥ．ｃｏｌｉ破砕液は常に氷浴した。４本の１００ｍＬチューブ中のＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰ破砕液をそれぞれ５０ｍＬチューブに移して遠心（３５００ｒｐｍ、＞２０分間、４℃）した。沈澱したＥ．ｃｏｌｉペレットが舞わないよう注意を払いながら、デカンテーションにより上清を５０ｍＬチューブに回収した。
【０１００】
（２）Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティーカラムによるＣＤＰの精製
コンタミネーションを避けるため、以後の精製操作で用いるマイクロピペットのチップ及び１．７ｍＬチューブはオートクレーブ後乾燥して用いた。
予め７０％エタノールで滅菌し、超純水で置換した直径１．８ｃｍ、長さ１０ｃｍのプラスチック製カラムに、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースゲル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）分散液９．８ｍＬを充填した。カラム内を１−２−１項（８）で調製した７０％エタノールで満たして流すことでＮＩ−ＮＴＡアガロースゲルを殺菌・洗浄した。この操作を２回繰り返した。ＭＯＰＳ−Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）３ｍＬをアプライして流し、さらに３ｍＬアプライした。スパチュラで撹拌もしくはマイクロピペットでピペッティングしてＮｉ−ＮＴＡアガロースゲルを再分散させて気泡を取り除いた。その後、ＭＯＰＳ−Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）５ｍＬで４回置換した。
【０１０１】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰ破砕液の上清をカラムにアプライし、カラムより流出した溶液を回収してフロースルー溶液とした。洗浄バッファー３〜５ｍＬをアプライして置換し、さらに３〜５ｍＬアプライした。ピペッティングによりＮｉ−ＮＴＡアガロースゲルを再分散させてゲル層の表面を均一にした後アプライした洗浄バッファーを流した。さらに洗浄バッファー５ｍＬをアプライして置換する操作を繰り返し、合計で３０ｍＬ以上をアプライした。洗浄バッファーをアプライした際に通過した溶液は全て回収し、洗浄液とした。その後、溶出バッファー３〜５ｍＬをアプライし、１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつフラクションに分けて回収し、溶出液とした。この操作を繰り返し、合計で溶出バッファー２５ｍＬをアプライした。それぞれのフラクションの吸光度を微量紫外可視分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定し、２８０ｎｍの吸光度を指標にタンパク質の溶出を確認した。この際、バックグラウンド測定には超純水を用いた。タンパク質の溶出が完了していない場合は、２８０ｎｍの吸収が無くなるまでカラムに溶出バッファーをアプライした。回収した溶出液のうち、吸光度が高いフラクションを回収し、ＣＤＰ溶液とした。
【０１０２】
（３）ＣＤＰ溶液の緩衝液置換
ＣＤＰ溶液の緩衝液置換はＰＤ１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、付属の説明書に従って行った。ＣＤＰ溶液の容量に応じて、必要な数のＰＤ１０カラムを用いた。付属のアダプターを用いてＰＤ１０カラムを５０ｍＬチューブに固定した。７０％エタノール（バイオテクノロジーグレード）で満たし、遠心機（ＭＸ−３０５、ＴＯＭＹ）を用いて遠心（１０００ｇ、２分間、４℃）した。この操作を２回繰り返すことでカラムを殺菌及び洗浄した。５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムストック溶液をＭＯＰＳ−Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）で２５０倍希釈して調製した０．０２％アジ化ナトリウム／２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｎａ緩衝液で満たし、静置して溶液を流す操作を４回繰り返すことでＰＤ１０カラムを緩衝液で置換した。さらに０．０２％アジ化ナトリウム／２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｎａ緩衝液を加え、遠心した。
【０１０３】
ＰＤ１０カラムを新たな５０ｍＬチューブに移し、遠心によるＳｅｐｈａｄｅｘの斜面を崩さないようにＣＤＰ溶液をＰＤ１０カラム１本につき１．７５〜２．５ｍＬアプライした。前述の遠心時と同じ角度で遠心機に固定し、遠心した。溶出した溶液を回収してＣＤＰストック溶液とし、ＣＤＰストック溶液の２８０ｎｍの吸光度をＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃにより測定し、１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して４℃で保存した。なおＣＤＰストック溶液を使用する際は、必要量を適宜クリーンベンチ内で分注した。
【０１０４】
カラム１本につき３０ｍＬのＭＯＰＳ−Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）を加えて静置してカラムを洗浄した。次いで超純水で満たし、遠心する操作を２回繰り返した。同様に５０％エタノール水溶液で２回洗浄した。ＰＤ−１０カラムを５０％エタノール水溶液で満たして４℃で保存した。
【０１０５】
１−２−４．ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によるＣＤＰの精製の確認
（１）１０％アクリルアミドゲルの調製
５０ｍＬチューブに３０％アクリルアミド／ビス混合溶液３．３３ｍＬ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１．５Ｍ、ｐＨ８．８）２．５ｍＬ、超純水４．０１ｍＬを加え、超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。１０％ＳＤＳ水溶液１００μＬ、１０％ＡＰＳ水溶液５０μＬ、ＴＥＭＥＤ１０μＬを加え、泡立たないようピペッティングして混合した。混合した溶液３．５ｍＬを２枚のガラスプレートの間隙（０．７５ｍｍ）に加え、飽和１−ブタノール９００μＬを静かに重層し、室温で１時間静置して重合した。マイクロピペットを用いて飽和１−ブタノールを除去し、次いで超純水で洗浄し、分離ゲルとした。
５０ｍＬチューブに３０％アクリルアミド／ビス混合溶液０．４４ｍＬ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ６．８）０．４４ｍＬ、超純水２．０３ｍＬを加え、超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。１０％ＳＤＳ水溶液３３μＬ、１０％ＡＰＳ水溶液１６．７μＬ、ＴＥＭＥＤ１．６５μＬを加え、泡立たないようピペッティングして混合した。溶液を分離ゲルの上に十分に加え、１０ウェルのコームを空気が入らないように注意しながらセットし、室温で１時間静置して重合した。生成したゲルはガラスプレートごと十分に湿らせたキムワイプで挟み、さらにラップで包み４℃で保存した。ゲルは調製後１ヶ月以内に使用した。
【０１０６】
（２）電気泳動による評価
１．７ｍＬチューブにＰｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）５μＬ、１Ｍ  ＤＴＴ溶液２μＬ、５×Ｌｏａｄｉｎｇバッファー２０μＬ、滅菌精製水１７３μＬを加えて混合し、これをマーカーとし、−２０℃で保存した。ＣＤＰストック溶液及びＣＤＰの精製において回収したフロースルー液、洗浄液それぞれ１μＬを５×Ｌｏａｄｉｎｇバッファー２μＬ、１Ｍ  ＤＴＴ１μＬ、超純水６μＬと混合した。これらと室温で解凍したマーカー１０μＬを１０５℃で熱処理し、卓上小型遠心機（Ｒ５−ＡＱＢＤ０２、Ｒｅｃｅｎｔｔｅｃ）によりスピンダウンした。本項（１）で調製したポリアクリルアミドゲルを電気泳動用容器（ミニプロティアンＴｅｔｒａセル、ＢＩＯ  ＲＡＤ）にセットし、超純水で５倍希釈した５×泳動バッファーを５００ｍＬ注ぎ、コームを外した。１ウェルずつに電気泳動サンプルをロードし、電気泳動装置（ミニプロティアンＴｅｔｒａシステム、ＢＩＯ  ＲＡＤ）を用いて電圧１５０Ｖで約４０分間泳動した。バンドがゲルの下端より約１ｃｍ上に達したところで泳動を止め、ゲルをガラスプレートから取り出して固定液に浸漬させ、遮光してシェイカー（Ｗａｖｅ−ＰＲ、ＴＡＩＴＥＣＨ）で３０分間振盪した。固定液を除去し、染色液を加えてゲルを浸漬させ、遮光して６０分間振盪した。染色液を回収し、脱色液を加えてゲルを浸漬させ、遮光して３０分間振盪した。脱色液を除去して新たに脱色液を加えて振盪する操作を、マーカーに含まれるタンパク質のバンドが明確に見えるまで繰り返した。超純水でゲルを洗浄し、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  ＥＺ  Ｉｍａｇｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）により撮影して付属のソフトウェアで解析した。
【０１０７】
１−２−５．ＣＤＰの酵素活性測定
セロビオースを３００ｍＭとなるように超純水を用いて溶解させ、セロビオースストック溶液とした。ＣＤＰの活性は以下のように測定した。αＧ１Ｐ５０ｍＭとＤ−（＋）−セロビオース５０ｍＭ、及び所定倍率希釈されたＣＤＰを含む３−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）を３７℃でインキュベーションした。ＣＤＰにより生成されるリン酸を定量し、１分間あたり１μｍｏｌのリン酸を遊離する酵素量を１Ｕと定義した際のＵ／ｍＬを求め、酵素活性とした。ＣＤＰの希釈率は、反応時間が１００分の際におけるαＧ１Ｐの転化率が１０％以下になるように決定した。
【０１０８】
１−３．セルロースオリゴマーからなる三次元構造体の酵素合成
１−３−１．ＣＤＰによるセルロースの酵素合成
２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）２３．８ｇを約６０ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、１００ｍＬにメスアップしてＰＶＤＦ製０．２２μｍフィルターで濾過滅菌した。これをＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ７．５）とし、４℃で保存した。
【０１０９】
αＧ１Ｐ二ナトリウムｎ水和物を所定量秤量し、１Ｍとなるよう超純水に溶解させた。
ＨＥＰＥＳ緩衝液、１ＭαＧ１Ｐ水溶液、１−２−５項で調製した所定濃度のセロビオースストック溶液を反応時の濃度がそれぞれ５００ｍＭ、２００ｍＭ、５０ｍＭとなるよう４ｍＬチューブに加え、使用するＣＤＰストック溶液の量を考慮し、超純水でメスアップした。超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。終濃度が０．１Ｕ／ｍＬ、０．２Ｕ／ｍＬ、０．４Ｕ／ｍＬになるようＣＤＰストック溶液を適量加え、気泡が発生しないようピペッティングにより混合した。１．７ｍＬチューブあるいは１ｍＬマイティーバイアルあるいは２４穴プレートに所定量分取し、６０℃で３日間インキュベーションした。
【０１１０】
１−３−２．酵素合成されたセルロースの精製
１−３−１項において調製された生成物を各種分析に用いるために超純水で精製した。走査型電子顕微鏡観察もしくはセルラーゼによる分解に用いる場合は、生成物を超純水に浸漬させ、４℃で１週間精製した。その他の測定に用いる場合は、超純水を加えてピペッティングによる水流により生成物を機械的に破壊して分散させ、遠心（１５０００ｒｐｍ、＞１０分間、４℃）し、上清を除去した。超純水を加えて沈澱物を再分散させ、遠心する操作を５回以上繰り返し、溶液の置換率が９９．９９９％以上となるまで精製した。精製した分散液を１００℃のヒートブロックにより１０分間加熱することで、残存するＣＤＰを失活させた。
【０１１１】
生成物の収量は、精製後の水分散液を絶乾し、乾燥前後の重量変化から算出した。予め１０５℃で２４時間乾燥させ、デシケーター内で放冷したサンプル管を秤量し、精製後の水分散液を加えて１０５℃で２４時間乾燥させ、その後デシケーター内で放冷して秤量した。乾燥前後の重量の差から生成物の濃度を算出した。この操作は同時に３回行い、それらの平均値より生成物の収量を算出した。
【０１１２】
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ）法、全反射型赤外分光（ＡＴＲ／ＦＴＩＲ）法、広角Ｘ線回折（ＷＡＸＤ）法による測定に用いる場合は、精製後の水分散液を１．７ｍＬチューブに分注し、２４時間凍結乾燥した。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）法による測定、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）観察に用いる場合は凍結乾燥することなく、精製後の分散液を超純水により希釈して用いた。
【０１１３】
１−４．生成されたセルロースの特性評価
１−４−１．生成物の反転倒立試験
１ｍＬマイティーバイアルを用いて調製したサンプルを用いて、反転倒立試験によりスポンジ化を評価した。バイアルを上下反転して静置し、生成物が流動しなかった場合にスポンジ状セルロース構造体が形成したと判断した。
【０１１４】
１−４−２．生成物の化学構造及び結晶構造の評価
（１）生成物の収量測定
１−３−２項で示した手法で、絶乾により収量を算出した。
【０１１５】
（２）生成物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル測定
４０％重水酸化ナトリウム重水溶液５０μＬ及び重水４５０μＬを混合して４％重水酸化ナトリウム重水溶液を調製した。凍結乾燥した生成物１５ｍｇ以上を４％重水酸化ナトリウム重水溶液５００μＬに溶解させた。溶液をＮＭＲチューブに移し、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ−３００（Ｂｒｕｋｅｒ、磁場強度：３００ＭＨｚ）により測定した。積算回数は３２回とした。水のケミカルシフトをリファレンス（４．７９ｐｐｍ）として校正した。
【０１１６】
（３）  生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定
質量電荷比の校正に用いる標準サンプルはＢｒａｄｙｋｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  １−７水溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ  Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ１−７、０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５０％アセトニトリル）、Ｐ１４Ｒ水溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ  Ｐ１４Ｒ、０．１％ＴＦＡ）、ＡＣＴＨ  ｆｒａｇｍｅｎｔ１８−３９水溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ  ＡＣＴＨ  ｆｒａｇｍｅｎｔ１８−３９、０．１％ＴＦＡ）それぞれ５μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＤＨＢＡ水溶液５μＬ、１．０％ＴＦＡ水溶液１μＬ、アセトニトリル４μＬを１．７ｍＬチューブ中で混合して調製した。
【０１１７】
生成物の測定サンプルは、０．０５％（ｗ／ｖ）とした生成物の水分散液１μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＤＨＢＡ水溶液１μＬ、トリフルオロ酢酸／アセトニトリル溶液（０．２％（ｖ／ｖ））３μＬをＫＯＨ／メタノール（３．３％（ｗ／ｖ））により洗浄したマイティーバイアル中で混合して調製した。
【０１１８】
標準サンプル及び生成物の測定サンプルそれぞれ１μＬをサンプルプレートにマウントし、風乾させる操作を５回繰り返した。１時間以上真空乾燥し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＡＸＩＭＡ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、島津製作所）で測定した。測定条件はＭｏｄｅ：Ｌｉｎｅｒ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、Ｍａｓｓ  Ｒａｎｇｅ：１．０−３０００．０、Ｍａｘ  Ｌｅａｓｅｒ  Ｒａｐ  Ｒａｔｅ：１０、ｐｏｗｅｒ：１００−１１５、ｐｒｏｆｉｌｅｓ：１００、ｓｈｏｔｓ：２、Ｉｏｎ  Ｇａｔｅ（Ｄａ）：Ｂｌａｎｋ５００、Ｐｕｌｓｅｄ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ａｔ  （Ｄａ）：１０００．０とした。
【０１１９】
測定により得られたＭＳスペクトルは、Ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ：Ｇａｕｓｓｉａｎ，  Ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ  ｆｉｌｔｅｒ  ｗｉｄｔｈ：１９，  Ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｆｉｌｔｅｒ  ｗｉｄｔｈ：１０００の条件で処理した。
【０１２０】
平均重合度は、生成物のナトリウムイオン、またはカリウムイオン付加体のピーク強度が強い方のピーク面積を用いて算出した。
【０１２１】
（４）生成物のＡＴＲ／ＦＴＩＲスペクトル測定
凍結乾燥した生成物を全反射赤外分光光度計（ＦＴ／ＩＲ−４１００ｔｙｐｅＡ、日本分光）のステージのダイヤモンドセルにスパチュラを用いて乗せ、押しこみユニットを下げてサンプルをダイヤモンドセルに押し付けて測定した。測定条件は、測定波長：３５０−７８００ｃｍ−１、分解能：２ｃｍ−１、積算回数：１００とした。
【０１２２】
（５）生成物のＷＡＸＤ測定
凍結乾燥した生成物をシリコン無反射試料板の凹部にマウントし、表面を均して卓上粉末Ｘ線回折計（ＭｉｎｉＦｌｅｘ  ６００、リガク）に設置して測定した。測定条件は、検出器：Ｄ／ｔｅＸ  Ｕｌｔｒａ、Ｘ線出力：４０ｋＶ及び１５ｍＡ、フィルター：Ｋβ、スキャンスピード：２．００００ｄｅｇ／ｍｉｎ、ステップ幅：０．０２００ｄｅｇ、スキャン軸：２θ／θ、スキャン範囲：５．００００−７０．００００ｄｅｇ、入射スリット：１．２５０ｄｅｇとした。
【０１２３】
１−５−３．生成物の顕微鏡観察
（１）生成物のＳＥＭ観察
超純水に浸漬させて精製した生成物の一部を薬さじを用いて採取し、２４穴プレート中で１０％エタノール水溶液２ｍＬに浸漬させ、１５分間静置した。その後、溶液を除去し、２０％エタノール水溶液を加えて１５分間静置した。同様に３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９９．５％エタノール水溶液の順に浸漬させた。次いで溶液を除去し、９９．５％エタノール水溶液を加えて１５分間静置した。溶液を除去し、９９％エタノール／ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（５０％（ｖ／ｖ））溶液に１５分間浸漬させた。溶液を除去して９９％ｔｅｒｔ−ブチルアルコールに１５分間浸漬させ、溶液を除去する操作を２回繰り返した。
【０１２４】
溶媒が９９％ｔｅｒｔ−ブチルアルコールに置換された生成物をパラフィルムで作製したカプセルに移し、９９％ｔｅｒｔ−ブチルアルコールで満たしてカプセルの封をした。ｔｅｒｔ−ブチルアルコールの結晶が成長しないように速やかに液体窒素にカプセルごと沈めて１０分間以上凍結した。液体窒素中でカプセルごと生成物をカミソリにより割断した。液体窒素中から生成物を取り出し、速やかに凍結乾燥した。
【０１２５】
ＳＥＭのステージ（直径２６ｍｍ）上に小さく切ったカーボンテープを貼り、その上に凍結乾燥した生成物を割断面が上になるようにマウントし、側面にドータイトを塗布することでステージに固定した。３時間以上真空乾燥し、デシケーター内で８時間以上乾燥した。オスミウムコータ（Ｎｅｏｃ−Ｐｒｏ、メイワフォーシス）を用いて、ＳＥＭのステージにマウントしたサンプルを１０ｍＡで３０秒間コーティングし、走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ−７５００Ｆ、日本電子）により観察した。観察条件は、加速電圧は５ｋＶ、エミッション電流：１０μＡ、照射電流：Ｎｏ．８、カラムモード：通常、ｒ−フィルタ：ＳＢ［０］、ワーキングディスタンス：８ｍｍ前後とした。
【０１２６】
（２）生成物のＡＦＭ観察
生成物の濃度が０．００１％（ｗ／ｖ）となるよう希釈し、セロハンテープで表面を５回剥がしたマイカ基板に１５μＬマウントして６００ｒｐｍで３０分間スピンコートした。デシケーター内で１２時間以上乾燥し、走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ−９６００、島津製作所）を用いてＡＦＭにより観察した。測定条件はタッピングモード、操作速度：０．５−１Ｈｚ、画素数：５１２×５１２、Ｚレンジ：×１、操作モード：力一定とした。それぞれの試料から１０個の構造体を観察し、観察された構造体ひとつにつき９点の高さを算出し、それら全てを平均して構造体の高さを算出した。
【０１２７】
１−５−４．生成物の圧縮試験
１−３−１項においてＰＴＦＥ製リングを用いて調製した生成物を圧縮試験に用いた。圧縮試験用負荷治具（３４６−５１５３１−０４、島津製作所）を取り付けた万能小型試験機（ＡＧＳ−Ｘ、島津製作所）を用い、圧縮速度を２ｍｍ／ｍｉｎ、温度を室温（２５±１．０℃）とした。
【０１２８】
１−６．生成物の分解試験
超純水に酢酸を溶解させ、５０ｍＭ酢酸水溶液を調製した。また超純水に酢酸ナトリウムに溶解させ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液を調製した。ｐＨを測定しながら、５０ｍＭ酢酸水溶液に５０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液を加え、ｐＨ４．８とすることで、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ４．８）を調製した。
【０１２９】
生成物の分解試験は、２ｍｍ×２ｍｍ程度のゲルを作成し、セルラーゼによって分解することによって実施した。本発明によるセロビオースプライマーから調製した構造体は、１−３−１項で示した手法で、２００ｍＭ  αＧ１Ｐおよび５０ｍＭセロビオースを０．２Ｕ／ｍｌＣＤＰと反応させて調製され、１−３−２項で示した手法により超純水で精製された。比較例として、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０５７２５３によるデキストラン存在下で調製したセルラーゼ構造体を用いた。この調製は、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０５７２５３の記載に従い、２００ｍＭ  αＧ１Ｐおよび５０ｍＭ  Ｇｌｃを０．４Ｕ／ｍｌＣＤＰと１０ｗ／ｖ％デキストランの存在下で反応させた。
【０１３０】
それぞれの構造体を、酢酸−酢酸Ｎａバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ４．８）中において、セルラーゼを３ｍｇ／ｍｌとなるように添加して５０℃でインキュベーションし、０、０．５、１、２時間後の構造体を観察した。
【０１３１】
２．結果及び考察
２−１．セルロースの酵素合成
２−１−１．酵素合成した生成物の反転倒立試験
セロビオースをＣＤＰによる酵素合成系に適応した。モノマーとしてαＧ１Ｐ、プライマーとしてセロビオースを用い、濃度０．０５Ｕ／ｍＬ、０．１Ｕ／ｍＬ、０．２Ｕ／ｍＬ、０．４Ｕ／ｍＬのＣＤＰを混合して６０℃で３日間インキュベーションした結果、いずれのＣＤＰ濃度を用いた場合も反応後の溶液が白濁し、新たに適応したプライマーがＣＤＰにより認識されることでセルロース誘導体が酵素合成されることが示唆された。さらに、０．１Ｕ／ｍＬ以上のＣＤＰ濃度を用いた場合に容器を反転させても溶液が流れ落ちず、スポンジ状セルロース構造体が形成することが明らかになった（図１）。
【０１３２】
２−１−２．酵素合成されたセルロース誘導体の化学構造の評価
（１）１Ｈ  ＮＭＲスペクトル
セルロースは重合度１５以下の低分子量であれば水酸化ナトリウム水溶液に溶解するため、重水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させることで１Ｈ  ＮＭＲ測定できることが知られている（Ａ．Ｉｓｏｇａｉ，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，１９９７年，４，９９−１０７）。セロビオースプライマーを用いて酵素合成した生成物をピペッティングによる水流で機械的に破壊して遠心−再分散により精製した後、凍結乾燥したサンプルを１Ｈ  ＮＭＲ測定することで、生成物の化学構造を解析した。その結果、全てのピークは既報のセルロースオリゴマー（Ｍ．Ｈｉｒａｉｓｈｉら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００９年，３４４，２４６８−２４７３、Ｌ．Ａ．Ｆｌｕｇｇｅら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９９年，１２１，７２２８−７２３８、Ｈ．Ｓｕｇｉｙａｍａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，２０００年，５５６，１７３−１７７、Ｂ．Ｘｉｏｎｇら，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，２０１３年，２０，６１３−６２１、Ｍ．Ｕ．Ｒｏｓｌｕｎｄら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００８年，３４３，１０１−１１２）に帰属でき、セルロースオリゴマーが酵素合成されていることが明らかになった（図２）。次いで１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの積分値より、平均重合度（ＤＰ）を算出した。水に溶解したセルロース分子鎖の還元末端はαアノマーとβアノマーが平衡となっており、それぞれのアノマー位の水素（Ｈ１α、Ｈ１β）は異なるケミカルシフトにピークを示すことが知られている。さらに還元末端以外のグルコースユニットの１位の水素（Ｈ７、Ｈ１３）はこれらと異なるケミカルシフトにピークを示すため、それぞれの積分値を次式に適用してＤＰを算出することができる。
【数１】
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【０１３３】
その結果、プライマーとしてセロビオースを用いた場合、平均重合度はそれぞれ７、８、８と算出され、同条件でＤ−グルコースをプライマーとして酵素合成した場合のセルロースオリゴマーの平均重合度（Ａｖｅｒａｇｅ  ＤＰ  〜１０）（Ｔ．Ｓｅｒｉｚａｗａら，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２０１６年，４８，５３９−５４４）と比較してやや低かった。より高いＣＤＰ濃度で酵素合成した場合、セルロース誘導体の平均重合度がわずかながら増大することが明らかとなった。これは、ナノセルロース前駆体が結晶化するよりも速く、ＣＤＰに認識されてセルロース鎖が伸長したため、セルロース誘導体がより高重合度まで伸長したと推察される。
【０１３４】
（２）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトル
セロビオースプライマーを用いＣＤＰ濃度を０．１Ｕ／ｍＬ、０．２Ｕ／ｍＬ、０．４Ｕ／ｍＬで酵素合成した生成物をピペッティングによる水流で機械的に破壊して遠心−再分散により精製した後、凍結乾燥したサンプルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより測定した。得られたＭＳスペクトルは、いずれもｍ／ｚの間隔がグルコシルユニット（１６２Ｄａ）に対応する複数のピークを示し、さらに検出されたピークは重合度が５〜１０量体のセルロースオリゴマーのナトリウムまたはカリウムイオン付加体にそれぞれ一致した（図３）。したがって、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定からもセルロースオリゴマーが正しく酵素合成されていることが明らかになった。さらに、合成されたセルロースオリゴマーは、Ｄ−グルコースをプライマーとして酵素合成した場合と比較して狭い分子量分布をもつことが明らかになった。ＭＳスペクトルのピークの積分比から平均重合度を算出した結果、プライマーとしてセロビオースを用いＣＤＰ濃度を０．１Ｕ／ｍＬ、０．２Ｕ／ｍＬ、０．４Ｕ／ｍＬとした場合、それぞれ６．８、７．０、７．２と算出され、１Ｈ  ＮＭＲから算出した平均重合度と比較して、１程度低い値を示した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定ではイオン化された分子のみが検出されるため、測定した条件では高重合度のセルロースオリゴマーが十分にイオン化していないことが示唆された。本発明者は酵素合成により調製されるセルロースオリゴマーの平均重合度の算出にはこれまで１Ｈ  ＮＭＲ測定を用いてきたことから、本実施例でも１Ｈ  ＮＭＲ測定により算出した平均重合度を用いることとした。
【０１３５】
（３）αＧ１Ｐの転化率
絶乾により算出した生成物の収量と１Ｈ  ＮＭＲ測定から算出した平均重合度を用いて、モノマーであるαＧ１Ｐの転化率を算出した。プライマーとしてセロビオースを用いＣＤＰ濃度を０．１Ｕ／ｍＬ、０．２Ｕ／ｍＬ、０．４Ｕ／ｍＬとした場合、αＧ１Ｐの転化率はそれぞれ２０、５０、５０％と算出された。ＣＤＰ濃度を０．１Ｕ／ｍＬとした場合、同条件でＤ−グルコースをプライマーとした場合のαＧ１Ｐの転化率（約３５％）よりも低く（Ｔ．Ｓｅｒｉｚａｗａら，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２０１６年，４８，５３９−５４４）、ＣＤＰ濃度を０．２Ｕ／ｍＬ、０．４Ｕ／ｍＬとした場合はＤ−グルコースをプライマーとした場合よりも高かった。したがって、同条件下では、本来のＣＤＰの基質であるセロビオースは、Ｄ−グルコースをプライマーとした場合よりもＣＤＰにより認識されやすいことが示唆された。
【０１３６】
２−１−３．セルロースの結晶構造
（１）ＡＴＲ／ＦＴＩＲスペクトル
セルロースは複数の結晶形を形成し得ることが知られているため、ＡＴＲ／ＦＴＩＲ測定により、生成されたセルロースオリゴマーが形成する結晶構造を解析した。セルロースプライマーを用いて酵素合成した生成物をピペッティングによる水流で機械的に破壊して遠心−再分散により精製した後、凍結乾燥したサンプルをＡＴＲ／ＦＴＩＲ測定した結果、いずれもセルロースのＩＩ型結晶に特徴的なＯＨ伸縮振動に由来する２本の鋭いピーク（Ｑ．Ｗｕら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．，２０１５年，１３３，４３８−４４７）を３４４１ならびに３４９０ｃｍ−１付近に示したことから、酵素合成されたセルロースオリゴマーはセルロースＩＩ型結晶形を形成することが明らかとなった（図４）。これは、Ｄ−グルコースをプライマーとして酵素合成した場合にセルロースオリゴマーが形成する結晶形と同様であった。
【０１３７】
（２）ＷＡＸＤチャート
セロビオースプライマーを用いて酵素合成した生成物をピペッティングによる水流で機械的に破壊して遠心−再分散により精製した後、凍結乾燥したサンプルをＷＡＸＤ測定した結果、２θ＝１２．３、１９．９、２２．１°において鋭い回折ピークを示した（図５）。これらの回折ピークは、それぞれセルロースＩＩ型結晶の１−１０、１１０、０２０面（Ｍ．Ｈｉｒａｉｓｈｉら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００９年，３４４，２４６８−２４７３）に帰属された。ＷＡＸＤ測定からもＤ−グルコースをプライマーとして酵素合成した場合にセルロースオリゴマーが形成する結晶形と同様に、セルロースＩＩ型の結晶形を形成することが支持された。
【０１３８】
２−１−４．セルロースのネットワーク構造
（１）ＳＥＭ像
セロビオースプライマーを用いて酵素合成したセルロース構造体を超純水で１週間精製し、溶媒を超純水から徐々にｔｅｒｔ−ブチルアルコールに置換し、凍結乾燥した生成物をＳＥＭにより観察した。その結果、スポンジ状セルロース構造体は、長さが最大で数μｍにも渡ってよく発達したリボン状の構造体（ナノリボン）から構成されることが明らかとなった（図６）。観察されたナノリボン状のナノセルロースの形態は、異なる酵素濃度条件下で、セロビオースをプライマーとした場合のプレート状の形態（Ｅ．Ｓａｍａｉｎら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１９９５年，２７１，２１７−２２６）とは大きく異なっていた。これは、ナノセルロース前駆体が凝集して沈殿する前にナノリボンへと３次元的に結晶成長し、スポンジ状セルロース構造体の形成に至ったと推察される。ＳＥＭ像からは枝分かれ構造が観察されず、ナノリボン状のナノセルロースが物理架橋することでスポンジ状セルロース構造体を形成していることが示唆された。
【０１３９】
（２）ＡＦＭ像
ＳＥＭによって観察されたスポンジ状セルロース構造体の構成要素であるナノリボンの形態を詳細に解析するために、αＧ１Ｐ、セロビオース、ＣＤＰそれぞれの濃度が２００ｍＭ、５０ｍＭ、０．２Ｕ／ｍＬで酵素合成したセルロース構造体をピペッティングにより機械的に破壊して遠心−再分散により精製した後、スピンキャストしてＡＦＭ観察した。その結果、マイカ基板上でよく分散した短いリボン状の構造体が観察された（図７）。観察されたナノリボンの厚さは４．８±０．９ｎｍと算出された。合成されたセルロース分子鎖の平均重合度を基に算出した分子鎖長よりもわずかながら大きな値であった（例えば、セルロースＩＩ型結晶を形成したセロデカオースの末端構造を除いた分子鎖長は５．２ｎｍと算出される（Ｍ．Ｈｉｒａｉｓｈｉら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００９年，３４４，２４６８−２４７３））。ナノリボンの幅は数百ｎｍであり、２−１−４項（１）のＳＥＭにおける観察結果とよく一致した。
【０１４０】
（３）圧縮試験
図８（左）に示すセルロース構造体を１−５−４項で示した手法により圧縮し、その結果を図８（右）に示す。図８（右）に示すように、圧縮試験後にはセルロースゲルの内部の水が絞り出されることが見られた。このように、本発明のセルロース構造体はスポンジ様の挙動を示すことが明らかになった。
【０１４１】
２−２．セルロースの分解
本発明によるセルロース構造体の生分解能について、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０５７２５３に記載の構造体と比較した。国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０５７２５３に記載の構造体は、デキストラン存在下でグルコースをプライマーとし、αＧ１ＰとＣＤＰとを添加して反応することによって調製された。図９は、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０５７２５３の構造体（図９上）と本発明の構造体（図９下）のセルラーゼ処理開始後の経時変化を示す。図９に見られるように、デキストラン存在下で調製した構造体は、消失するまでに２時間のセルラーゼ処理を必要とする一方で、本発明によるセルロース構造体はセルラーゼ処理開始後３０分間で完全に消失している。本発明によるセルロース構造体は従来技術のものと比較してより高い生分解能を有することが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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