(57)【要約】      （修正有）【課題】胎盤関連組織由来の細胞培養物中の間葉性幹細胞（MSCs）を識別する方法、胎盤関連組織由来の細胞培養物中のMSCs集団の純度を増大する方法、及び、胎盤関連組織由来の細胞培養物中のMSCsの純度を評価する方法の提供。【解決手段】MSCs上に発現されたマーカーCD146を用いて、繊維芽細胞からMSCsを単離することを含み、その際、MSCs及び、繊維芽細胞が胎盤関連組織由来の細胞培養物からのものである、繊維芽細胞から間葉性幹細胞（MSCs）を識別する方法。好ましくは、胎盤関連組織が、羊膜、絨毛用ディスク、絨毛膜及び臍帯から選択される、より好ましくは臍帯である、方法。単離工程が抗体ベース又はヌクレオチドベース又はヌクレオチドベースで、好ましくは、抗体ベースの磁気細胞分離或いはフローサイトメトリー又はヌクレオチドベースのフローサイトメトリーで行う、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維芽細胞から間葉性幹細胞（MSCs）を識別する方法であって、
繊維芽細胞から間葉性幹細胞（MSCs）を識別するように、間葉性幹細胞（MSCs）上に発現されたマーカーCD146を用いて繊維芽細胞から間葉性幹細胞（MSCs）を単離することを含み、その際、間葉性幹細胞（MSCs）および繊維芽細胞は胎盤関連組織由来の細胞培養物からのものである、方法。
【請求項２】
胎盤関連組織が、羊膜、絨毛膜ディスク、絨毛膜および臍帯よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
胎盤関連組織が臍帯である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
単離工程が、抗体ベースの方法またはヌクレオチドベースの方法により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
下記の予備的工程をさらに含む、請求項１に記載の方法：
間葉性幹細胞（MSCs）および繊維芽細胞を胎盤関連組織から回収し、ついで
間葉性幹細胞（MSCs）および繊維芽細胞を培地中で培養して細胞培養物を調製する。
【請求項６】
抗体ベースの単離方法が、抗体ベースの磁気細胞分離または抗体ベースのフローサイトメトリーである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ヌクレオチドベースの単離方法が、ヌクレオチドベースのフローサイトメトリーである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
細胞培養物中の間葉性幹細胞（MSCs）集団の純度を増大する方法であって、
間葉性幹細胞（MSCs）上に発現されたマーカーCD146を用いて間葉性幹細胞（MSCs）を単離および回収し、その際、間葉性幹細胞（MSCs）は胎盤関連組織由来の細胞培養物からのものであり、ついで
間葉性幹細胞（MSCs）を培養する
ことを含む方法。
【請求項９】
胎盤関連組織が、羊膜、絨毛膜ディスク、絨毛膜および臍帯よりなる群から選ばれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
単離工程が、抗体ベースの方法またはヌクレオチドベースの方法により行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
胎盤関連組織由来の細胞が間葉性幹細胞（MSCs）のための培地中で培養される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
抗体ベースの単離方法が、抗体ベースの磁気細胞分離または抗体ベースのフローサイトメトリーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ヌクレオチドベースの単離方法が、ヌクレオチドベースのフローサイトメトリーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
胎盤関連組織由来の細胞培養物中の間葉性幹細胞（MSCs）の純度を評価する方法であって、培養物中のCD146を発現する細胞のパーセントを決定することを含む方法。
【請求項１５】
CD146を発現する細胞のパーセントをフローサイトメトリーにより決定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
間葉性幹細胞（MSCs）の純度がCD146を発現する細胞のパーセントと正の相関を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
間葉性幹細胞（MSCs）の純度が下記式によって計算される、請求項１４に記載の方法：
Y = SX + I（式中、Yは間葉性幹細胞（MSCs）の純度（%）、XはCD146を発現する細胞のパーセント、Sは1.129〜1.283の範囲の値、およびIは-28.676〜-17.964の範囲の値）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胎盤関連組織由来の細胞培養物中の間葉性幹細胞（MSCs）を識別する方法に関する。本発明はまた、胎盤関連組織由来の細胞培養物中の間葉性幹細胞（MSCs）集団の純度を増大する方法に関する。さらに、本発明はまた、胎盤関連組織由来の細胞培養物中の間葉性幹細胞（MSCs）の純度を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉性幹または間質細胞（MSCs）は、胚性中胚葉起源の多能性細胞であり、繊維芽細胞様の形態をしている。これら細胞は、刺激および培養条件に依存して、他の細胞型の中でも脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経系細胞および筋細胞に分化することができる。hMSCsの可塑性および組織修復および再生におけるその役割は広範に研究されているが、最近最も興味が持たれているのは、hMSCsの免疫学的栄養特性（immunological trophic property）である[1-2]。ヒト間葉性幹細胞は様々な組織から単離されている。最も頻繁に用いられているMSCsの採取源は骨髄（BM）である。しかしながら、その単離手順は極めて侵襲的である。侵襲的な単離手順を回避するため、ヒトの臍帯および胎盤などの組織が良い候補と考えられている。なぜなら、これらは通常、分娩後に廃棄されるものだからである。臍帯または胎盤からのhMSCsの単離は、これまでの研究によって有効であることが確認されている[3]。
【０００３】
MSCsは、間葉性組織に含まれる間質細胞のより複雑な細胞組成の下集団である。間葉性幹細胞の不均一な性質および既知の特異的なバイオマーカーの不在のため、間葉性幹細胞の表現型および特性を決定することは挑戦的な課題である[4-6]。MSCsの機能、とりわけ原形質膜に対する機能を担う分子成分は大部分未知である。加えて、特異的な細胞表面マーカーの欠如は、その細胞培養に他の細胞型、とりわけ、繊維芽細胞などの成熟間質細胞との潜在的な汚染リスクをもたらす（繊維芽細胞は逆に間葉性組織に豊富に存在する）[4-6]。胎盤由来組織からのMSCsの単離プロセスにおいて、インビトロ培養の間に非MSCs（繊維芽細胞、胎盤由来上皮細胞および胎盤由来網状細胞を含む）がMSCsとしばしば共存する。特に、繊維芽細胞は主たる汚染源である。
【０００４】
繊維芽細胞は、特に結合組織に豊富に存在する成熟間葉性細胞と考えられている。それゆえ、これら細胞は多くの細胞培養系に存在する最もしばしば汚染する細胞表現型である。培養液から繊維芽細胞をうまく除去する方法を適用することが困難のみならず、同じ培養液に存在する繊維芽細胞からMSCsを識別することは特に複雑である。繊維芽細胞とMSCsとは極めてよく似た形態的外観を有する：ともによく増殖し、多くの同一の表面マーカーを共有する[7-8]。国際細胞治療学会（the International Society of Cellular Therapy (ISCT)）により、MSCは現在では、CD73, CD90, CD105を発現するが造血マーカーCD14, CD34 and CD45は陰性である、可塑性で接着性の、多能性繊維芽細胞様細胞と定義されている。しかしながら、これら特性およびマーカーは繊維芽細胞も共有している。ISCTによって示唆された現在の定義は、繊維芽細胞一般からMSCを識別することはできない。現在までのところ、繊維芽細胞からMSCsを識別する最良の方法は、これら２種の細胞の機能的特性の分析に基づくものである；MSCsは多能的幹細胞性（multipotent stemness）および免疫調節能（immunomodulation capacity）を保持しているが、繊維芽細胞はこれら機能的特性のいずれもより限定されていると思われる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
MSCsの同定におけるFriedensteinの先駆的業績以来[48]、一貫してかつ明白にイクスビボ培養拡張したMSCを繊維芽細胞から識別する、培養−誘導法（culture-derivation methodology）、形態学および遺伝子発現署名（gene expression signature）に明確な差異はない[9-12]。現在のところ、繊維芽細胞からMSCsを分離するための許容された基準あるいはたった一つの細胞表面マーカーも存在しない。胎盤から得た場合に繊維芽細胞がMSC培養中の一般的な混入細胞集団であるという事実のため、繊維芽細胞からMSCsを識別するバイオマーカーとしての新規な表面タンパク質が、胎盤由来MSCsの一次培養の均質性を確実にするうえで重要である。
【０００６】
血管内皮細胞の表面マーカーであるCD146（メラノーマ細胞接着分子（melanoma cell adhesion molecule, MCAM）は、細胞−細胞相互作用および血管形成を容易にすることによって機能する。最近の研究は、幾つかのMSCsがCD146を発現すること[13-14, 16]およびCD146の発現レベルが自己再生の能力または脂肪細胞への分化および骨形成の能力と関係していること[13, 15]を明らかにしている。さらに、異なる組織から単離したMSCsは異なるCD146発現レベルを示す：骨髄から単離したMSCsの約40%がCD146を発現し、その発現レベルは継代数が増えるにつれて減少する[13-15]、一方、脂肪細胞から単離したMSCsのわずか10%未満がCD146を発現する[14]。
【０００７】
米国特許第9,470,685号は、MSCs上に発現されたマーカーEphA2を用いた繊維芽細胞からのMSCsの識別方法を開示している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
予期しないことに、間葉性幹細胞（MSCs）が、特異的な表面マーカーであるCD146（メラノーマ細胞接着分子（melanoma cell adhesion molecule, MCAM）の発現レベルに基づいて胎盤関連組織由来の細胞培養物中で識別できることが本発明で見出された。
【０００９】
従って、一つの側面において、本発明は、繊維芽細胞から間葉性幹細胞（MSCs）を識別する方法であって、繊維芽細胞から間葉性幹細胞（MSCs）を識別するように、間葉性幹細胞（MSCs）上に発現されたマーカーCD146を用いて繊維芽細胞から間葉性幹細胞（MSCs）を単離することを含み、その際、間葉性幹細胞（MSCs）および繊維芽細胞は胎盤関連組織由来の細胞培養物からのものである、方法を特徴とする。
【００１０】
本発明のある種の態様において、前記方法は下記の予備的工程をさらに含む：間葉性幹細胞（MSCs）および繊維芽細胞を胎盤関連組織から回収し、ついで間葉性幹細胞（MSCs）および繊維芽細胞を培地中で培養して細胞培養物を調製する。
【００１１】
他の側面において、本発明は、細胞培養物中の間葉性幹細胞（MSCs）集団の純度を増大する方法であって、間葉性幹細胞（MSCs）上に発現されたマーカーCD146を用いて間葉性幹細胞（MSCs）を単離および回収し、その際、間葉性幹細胞（MSCs）は胎盤関連組織由来の細胞培養物からのものであり、ついで間葉性幹細胞（MSCs）を培養することを含む方法を提供する。
【００１２】
本発明によれば、胎盤関連組織は、羊膜、絨毛膜ディスク（chorionic disk）、絨毛膜および臍帯よりなる群から選ばれる。一つの好ましい態様において、胎盤関連組織は臍帯である。
【００１３】
本発明によれば、選別工程は当該技術分野で知られたまたは開発される技術、例えば、抗体ベースまたはヌクレオチドベースの単離方法を用いて行ってよい。
【００１４】
本発明のある態様において、胎盤関連組織由来の細胞はMSCのための培地中で培養される。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、胎盤関連組織由来の細胞培養物中の間葉性幹細胞（MSCs）の純度を評価する方法を提供する。該方法は、培養物中のCD146を発現する細胞のパーセントを決定する工程を含む。
【００１６】
本発明によれば、MSCsの純度はCD146を発現する細胞のパーセントと正の相関を有する。本発明の好ましい態様において、CD146を発現する細胞のパーセントはフローサイトメトリーにより決定される。一つの態様において、MSCsの純度は下記式によって計算される：Y = SX + I（式中、Yは間葉性幹細胞（MSCs）の純度（%）、XはCD146を発現する細胞のパーセント、Sは1.129〜1.283の範囲の値、およびIは-28.676〜-17.964の範囲の値）。
【００１７】
上記の一般的記載および以下の詳細な記載はともに例示的および説明的なものにすぎず、本発明を何ら限定するものでないことが理解されなければならない。
【００１８】
上記発明の開示並びに下記の発明の詳細な説明は、添付の図面とともに読めばより良く理解されるであろう。本発明を説明する目的で、図面には現在のところ好ましい態様を示してある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、間葉性幹細胞（MSCs）と繊維芽細胞との混合集団のフローサイトメトリー分析の結果を示す。ドナーからの臍帯由来間葉性幹細胞（MSCs）を繊維芽細胞と異なる比で混合した。得られた結果は、フローサイトメトリーによって検出されたCD146+集団のパーセントが、増大した繊維芽細胞集団に応じて比例して低下することを示した。FB= 繊維芽細胞
【００２０】
【図２】図２は、異なる継代数での臍帯由来間葉性幹細胞（MSCs）のCD146発現についてのフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【００２１】
【図３】図３は、胎盤関連組織由来の細胞培養物中の間葉性幹細胞（MSCs）の純度（%）とCD146を発現する細胞のパーセントとの線形回帰を示す。
【００２２】
【図４Ａ】図４Ａは、CD146high MSCsおよびCD146low MSCsのCD146発現レベルを示す。
【００２３】
【図４Ｂ】図４Ｂは、CD146high MSCsおよびCD146low MSCsからの脂肪生成分化の結果を示す。
【００２４】
【図５】図５は、PBMC増殖アッセイの結果を示す。
【００２５】
【図６】図６は、CD146high MSCsおよびCD146low MSCsのならし培地での肝細胞増殖因子（HGF）のレベルを示す。
【００２６】
【図７】図７は、CD146high MSCsおよびCD146low MSCsでの細胞ROS、ミトコンドリアROSおよびβ−ガラクトシダーゼ（老化マーカー）の相対レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、表面マーカーCD146によるセルソーティングにより、胎盤関連組織由来の細胞培養物中で間葉性幹細胞（MSCs）を識別することができるという予期しない知見に基づく。
【００２８】
一つの態様において、本発明は、繊維芽細胞から間葉性幹細胞（MSCs）を識別する方法を提供する。この方法は、繊維芽細胞から間葉性幹細胞（MSCs）を識別するように、間葉性幹細胞（MSCs）上に発現されたマーカーCD146を用いて繊維芽細胞から間葉性幹細胞（MSCs）を単離することを含み、その際、間葉性幹細胞（MSCs）および繊維芽細胞は胎盤関連組織由来の細胞培養物からのものである。
【００２９】
本発明のある態様において、この方法は、下記の予備的工程をさらに含む：間葉性幹細胞（MSCs）および繊維芽細胞を胎盤関連組織から回収し、ついで間葉性幹細胞（MSCs）および繊維芽細胞を培地中で培養して細胞培養物を調製する。
【００３０】
他の側面において、本発明は、細胞培養物中の間葉性幹細胞（MSCs）集団の純度を増大する方法であって、間葉性幹細胞（MSCs）上に発現されたマーカーCD146を用いて間葉性幹細胞（MSCs）を単離および回収し、その際、間葉性幹細胞（MSCs）は胎盤関連組織由来の細胞培養物からのものであり、ついで間葉性幹細胞（MSCs）を培養することを含む方法を提供する。
【００３１】
さらに他の側面において、本発明は、間葉性幹細胞（MSCs）の集団を単離する方法であって、間葉性幹細胞（MSCs）上に発現されたマーカーCD146を用いて間葉性幹細胞（MSCs）を単離および回収し、その際、間葉性幹細胞（MSCs）は胎盤関連組織由来の細胞培養物からのものであり、間葉性幹細胞（MSCs）の集団は、より高い分化能を有し、より高い抗炎症作用を奏し、より低い程度の老化を有し、および／またはより高い量の増殖因子を分泌する方法を提供する。
【００３２】
本発明によれば、細胞は当該技術分野で知られたプロトコール、例えば、Shenら[21]のプロトコールに従い、胎盤関連組織から新たに由来し、得、または回収する。ある好ましい態様において、胎盤関連組織由来の細胞はついでMSCのための培地中で培養される。MSCのための標準培地は、最小必須培地（様々なバージョンの改変にて）、ウシ胎仔血清（FBS）、L-グルタミンおよび塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を含む[3, 16-20]。
【００３３】
胎盤関連組織は、羊膜、絨毛膜ディスク（chorionic disk）、絨毛膜および臍帯よりなる群から選ばれてよい。一つの好ましい態様において、胎盤関連組織は臍帯である。
【００３４】
本発明の方法を実施するに際し、胎盤関連組織由来の細胞培養物をCD146によるセルソーティングに供する。セルソーティングは当該技術分野で知られたまたは開発される技術、例えば、抗体ベースまたはヌクレオチドベースの単離方法により行ってよい。好ましくはセルソーティングは抗体ベースの磁気細胞分離により行う。例えば、MACS法（MACSR Technology, Miltenyi Biotec）。加えて、セルソーティングはフローサイトメトリー法、例えば、抗体ベースまたはヌクレオチドベースのフローサイトメトリーにより行ってよい。
【００３５】
さらに、間葉性幹細胞（MSCs）の純度がCD146を発現する細胞のパーセントと正の相関を有することが予期しないことに本発明において見出された。
【００３６】
従って、本発明はさらなる側面において、胎盤関連組織由来の細胞培養物中の間葉性幹細胞（MSCs）の純度を評価する方法を提供する。該方法は、培養物中のCD146を発現する細胞のパーセントを決定する工程を含む。
【００３７】
本発明の好ましい態様において、CD146を発現する細胞のパーセントはフローサイトメトリーにより決定する。
【００３８】
一つの態様において、間葉性幹細胞（MSCs）の純度は下記式によって計算される：
Y = SX + I（式中、Yは間葉性幹細胞（MSCs）の純度（%）、XはCD146を発現する細胞のパーセント、Sは1.129〜1.283の範囲の値、およびIは-28.676〜-17.964の範囲の値）。
【００３９】
本発明のある態様に従って、本発明の方法によって単離された間葉性幹細胞（MSCs）の集団は、より高い分化能を有する。一つの態様において、間葉性幹細胞（MSCs）の集団はより高い脂肪生成能を有する。
【００４０】
本発明のある態様に従って、本発明の方法によって単離された間葉性幹細胞（MSCs）の集団は、より高い抗炎症作用を奏する。一つの態様において、間葉性幹細胞（MSCs）の集団は、PBMC増殖の阻害においてより高い能力を示す。
【００４１】
本発明のある態様に従って、本発明の方法によって単離された間葉性幹細胞（MSCs）の集団は、より低い程度の老化を有する。ある態様において、間葉性幹細胞（MSCs）の集団は、より低いレベルの細胞ROS、ミトコンドリアROSまたはβ−ガラクトシダーゼを発現する。
【００４２】
本発明のある態様に従って、本発明の方法によって単離された間葉性幹細胞（MSCs）の集団は、より高い量の増殖因子を分泌する。一つの態様において、間葉性幹細胞（MSCs）の集団は、より高い量の肝細胞増殖因子（HGF）を分泌する。
【００４３】
上記の一般的記載および以下の詳細な記載はともに例示的および説明的なものにすぎず、本発明を何ら限定するものでないことが理解されなければならない。
実施例
【００４４】
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、これら実施例は限定ではなく実証の目的のために提供される。
【００４５】
実施例１：間葉性幹細胞（MSCs）と繊維芽細胞との混合集団のフローサイトメトリー分析
CD146が繊維芽細胞から胎盤関連組織由来の間葉性幹細胞（MSCs）を分離するバイオマーカーとして機能しうることを実証するため、臍帯由来の間葉性幹細胞（MSCs）をEppendorf管中で以下の比率（間葉性幹細胞（MSCs）：繊維芽細胞；細胞数にて）で混合した：2x105：0、1.8x105：2x104、1x105：1x105、2x104：1.8x105、または0：2x105。ついで、各Eppendorf管中のCD146+集団をフローサイトメトリーにより分析した。図１を参照すると、得られた結果は、フローサイトメトリーにより、抗CD146抗体（抗ヒトCD146-V450, BD biosciences)により検出されたCD146+集団のパーセントが繊維芽細胞集団の増加との関連で比例して減少したことを示す。
【００４６】
実施例２：CD146発現レベルは継代数が増えても維持される
臍帯由来の間葉性幹細胞（MSCs）を異なる継代数で回収し（継代数：4, 6, 8, 10および12）、CD146の発現レベルをフローサイトメトリーにより分析した。得られた結果は、CD146の発現レベルが継代の間に維持されることを示す（図２）。
【００４７】
実施例３：間葉性幹細胞（MSCs）の純度の評価
臍帯由来の間葉性幹細胞（MSCs）をEppendorf管中で以下の比率（間葉性幹細胞（MSCs）：繊維芽細胞；細胞数にて）で混合した：2x105：0、1.8x105：2x104、1x105：1x105、2x104：1.8x105、または0：2x105。ついで、各Eppendorf管中のCD146+集団をフローサイトメトリーにより分析した。つぎに、間葉性幹細胞（MSCs）の純度（%）とCD146を発現する細胞のパーセントとの関係を単純線形回帰により分析した。その結果を図３に示す。回帰式はY = 1.206X - 3.32（式中、Yは間葉性幹細胞（MSCs）の純度（%）、XはCD146を発現する細胞のパーセント）である。得られた結果は、CD146の発現レベルと間葉性幹細胞（MSCs）の純度との間に直線関係があることを示していた。
【００４８】
実施例４：CD146high MSCsはCD146low MSCsよりも高い分化能を示す
フローサイトメトリーを用い、異なる臍帯由来の間葉性幹細胞（MSCs）をCD146の発現について調べた。２群の間葉性幹細胞（MSCs）を得た：CD146high MSCsおよびCD146low MSCs（図４Ａ）。2×105/ウエルのMSCsを12-ウエルプレートに播種し、一夜培養し、ついで脂肪生成添加物（adipogenesis supplement）（InvitroGen）を添加した脂肪細胞分化基礎培地（adipocyte differentiation basal medium）（InvitroGen）で培養した。14日間培養後、２群の間葉性幹細胞（MSCs）をホルマリン固定し、オイルレッドで染色し、顕微鏡下で観察して脂肪細胞の数をカウントした。図４Ｂに示すように、CD146high MSCsはより高い分化能を示した。
【００４９】
実施例５：CD146high MSCsはCD146low MSCsよりも高い抗炎症作用を引き起こす
CD146high MSCsおよびCD146low MSCsを実施例４と同様にして得た。MSCの免疫調節能をPBMC増殖アッセイにより分析した。カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）標識したPBMCをフィトヘマグルチニン（PHA）で刺激し、間葉性幹細胞（MSCs）とともに培養した。増殖したPBMCsのパーセントをFACSにより分析した。蛍光細胞透過性染色（fluorescent cell permeable dye）CFSEの強度の低減を評価することにより、PBMCの増殖速度を決定した。得られた結果は、PBMCの増殖の抑制においてCD146high MSCsがCD146low MSCsよりも有効であったことを示しており（図５）、CD146high MSCsがより高い抗炎症作用を引き起こすことを示唆した。
【００５０】
実施例６：CD146high MSCsはCD146low MSCsよりも高い量の増殖因子を分泌する
CD146high MSCsおよびCD146low MSCsを実施例４と同様にして得た。両群からのならし培地での肝細胞増殖因子（HGF）レベルをELISAにより分析し、MSC合計タンパク質をBCAアッセイにより分析した。HGFレベルは、MSC合計タンパク質の量に対するHGFの量の比として表す。図６に示すように、CD146high MSCsはCD146low MSCsよりも有意に高い量のHGFを分泌した。
【００５１】
実施例７：CD146high MSCsはCD146low MSCsよりも低い程度の老化を有する
CD146high MSCsおよびCD146low MSCsを実施例４と同様にして得た。より高いレベルの細胞ROS、ミトコンドリアROSおよびβ−ガラクトシダーゼは、老化と関連していると考えられる。本実験では、細胞ROSレベルおよびミトコンドリアROSレベルを市販キット（それぞれ、Sigma のDCFDAおよびInvitrogenのMitoSox）を用いて決定した。老化と関連するβ−ガラクトシダーゼのレベルは、C12FDG（Molecular Probes）を用いて決定した。得られた結果は、細胞ROS、ミトコンドリアROSおよびβ−ガラクトシダーゼのレベルがCD146high MSCsではCD146low MSCsよりも低かったことを示し（図７）、CD146high MSCsがCD146low MSCsよりも低い程度の老化を有することを示唆した。
【００５２】
上記に記載した態様をその広い発明概念から逸脱することなく変更を加えることができることは当業者には評価されるであろう。それゆえ、本発明は開示した特定の態様に限られるものではなく、添付の特許請求の範囲によって定められる本発明の趣旨および範囲内での改変をカバーすることを意図するものである。
【００５３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【外国語明細書】
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