(57)【要約】【課題】特異体質薬物毒性の予測方法の提供。【解決手段】被験薬物の存在下に、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の遺伝子多型を導入した自然免疫応答性動物細胞を培養し、ＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量の変化を測定することを特徴とする、被験薬物による特異体質毒性の発現予測方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験薬物の存在下に、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の遺伝子多型を導入した自然免疫応答性動物細胞を培養し、ＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量の変化を測定することを特徴とする、被験薬物による特異体質毒性の発現予測方法。
【請求項２】
ＨＬＡの遺伝子多型が、毒性発現性遺伝子多型である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
自然免疫応答性動物細胞が、表皮細胞（ケラチノサイト）、樹状細胞及び肝細胞から選ばれる動物細胞である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
炎症性サイトカインが、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）から選ばれる１種又は２種以上である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量が、ＨＬＡの遺伝子多型を導入していない自然免疫応答性動物細胞を用いた場合と対比して上昇している場合に、被験薬物による特異体質毒性発現の可能性があると予測するものである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の遺伝子多型を導入した自然免疫応答性動物細胞を用いた特異体質薬物毒性の発現予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物毒性は、中毒性と特異体質性に大別される。中毒性の薬物毒性は、薬物自体の性質に起因して用量依存的に発現するため、前臨床段階での毒性評価が可能である一方、特異体質薬物毒性は、発症率が低く、既知の薬理学的作用とは無関係で用量依存的ではないとされ、前臨床段階での発見は困難である。
【０００３】
近年、薬物による特異体質毒性とＨＬＡ遺伝子多型の関連性に注目が集まっており、例えば、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１多型と抗ウイルス薬アバカビルの服用による薬剤性過敏症や肝障害の発症、ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０２多型と抗てんかん薬カルバマゼピン服用によるスティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）／中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）の発症に相関が認められている（非特許文献１、２）。特異体質薬物毒性とＨＬＡ遺伝子多型との関連性は、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）などから多数示唆されているが、そのどれもが事後報告であって、臨床において実際に生じた毒性被害に基づき関連ＨＬＡ遺伝子多型が特定されたものである。特異体質毒性に関連するＨＬＡ遺伝子多型が特定された薬物については、例えば、患者が当該ＨＬＡ遺伝子多型を保因するか否かを判定し、特異体質薬物毒性発現のリスクを評価することも考えられている（非特許文献３）。しかしながら、これは、臨床で毒性被害が生じた後に初めて可能となる後ろ向きな方法であり、ＧＷＡＳなどの情報に基づいているため、十分な症例が得られないと検出力をもたない、正確性に欠けるといった問題点がある。
【０００４】
毒性被害が生じる前に薬物の危険性を予測しようという試みも行われており、ＨＬＡの関与する薬物毒性の主要因とされる「ＨＬＡ分子と薬物分子との結合」をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでシミュレーションすることによりリスクを評価する方法が報告されている（非特許文献４）。この評価法により、前臨床段階で特異体質薬物毒性を予測できる可能性がある一方、シミュレーション条件の設定によって結果が左右されやすい、シミュレーション上でのＨＬＡ分子と薬物の結合が実際にヒトにおいて免疫応答を惹起するか不明であるなど、予測精度の点で問題が残されている。
【０００５】
したがって、特異体質薬物毒性の発現を未然に防ぐため、毒性被害が生じる前に薬物による特異体質毒性の危険性を予測する新たな方法の構築が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Pavlos R, Mallal S, Ostrov D, Buus S, Metushi I, Peters B, Phillips E, T Cell-Mediated Hypersensitivity Reactions to Drugs, Annu. Rev. Med., 2015, 66: 439-454.
【非特許文献２】Filippo EK, Ripamonti D, Rizzi M, Abacavir-induced liver toxicity in an HIV-infected patient, AIDS, 2014, 28: 613-617.
【非特許文献３】Niihara H, Kohno K, Taketani T, Kaneko S, Ito T, Sugamori T, Takahashi N, Miyaoka T, Okazaki S, Yasuda H, Furuya M, Nagahama M, Morita E, Simple and rapid detection of HLA-A*31:01 for prediction of carbamazepine-induced hypersensitivity using loop-mediated isothermal amplification method, J Dermatol Sci. 2014; 74(1): 88-92.
【非特許文献４】Luo H, Du T, Zhou P, Yang L, Mei H, Ng H, Zhang W, Shu M, Tong W, Shi L, Mendrick DL, Hong H, Molecular Docking to Identify Associations Between Drugs and Class I Human Leukocyte Antigens for Predicting Idiosyncratic Drug Reactions, Comb Chem High Throughput Screen, 2015; 18(3): 296-304.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、薬物による特異体質毒性の発現を予測できる新たな方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者は、抗ウイルス薬アバカビルと結合し、アバカビルによる特異体質毒性発現と関連することが知られているヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子多型ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１、及びアバカビルと結合せず、アバカビルによる特異体質毒性発現と関連しないことが知られているＨＬＡ遺伝子多型ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３に注目し、当該ＨＬＡ遺伝子多型を導入したマウスより表皮細胞（ケラチノサイト）を単離し、アバカビルを曝露したところ、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１導入マウス由来のケラチノサイト特異的に、細胞表面ＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量が上昇したことを見出した。また、予想外に、この発現量上昇は、ケラチノサイトといった自然免疫応答性動物細胞ではみられるものの、非自然免疫応答性動物細胞ではみられないことも見出した。
【０００９】
本発明者は、かかる知見に基づき、さらに検討した結果、ＨＬＡ遺伝子多型を導入した自然免疫応答性動物細胞に被験薬物を曝露した際のＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量の変化を指標とすれば、導入したＨＬＡ遺伝子多型と被験薬物との相互作用により生じる特異体質毒性を予め予測でき、予期しない特異体質薬物毒性の発現を防ぐのに有用であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔６〕を提供するものである。
【００１１】
〔１〕被験薬物の存在下に、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の遺伝子多型を導入した自然免疫応答性動物細胞を培養し、ＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量の変化を測定することを特徴とする、被験薬物による特異体質毒性の発現予測方法。
〔２〕ＨＬＡの遺伝子多型が、毒性発現性遺伝子多型である、〔１〕記載の方法。
〔３〕自然免疫応答性動物細胞が、皮膚細胞（ケラチノサイト）、樹状細胞及び肝細胞から選ばれる動物細胞である、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕炎症性サイトカインが、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）から選ばれる１種又は２種以上である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕ＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量が、ＨＬＡの遺伝子多型を導入していない自然免疫応答性動物細胞を用いた場合と対比して上昇している場合に、被験薬物による特異体質毒性発現の可能性があると予測するものである、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕被験薬物による特異体質毒性の発現予測に用いるためのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の遺伝子多型を導入した自然免疫応答性動物細胞。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、自然免疫応答性動物細胞に導入したＨＬＡ遺伝子多型と被験薬物との相互作用による炎症反応、すなわちＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量の変化を捉え、ＨＬＡ遺伝子多型と被験薬物の相互作用により起こる特異体質毒性を毒性被害が生じる前に予め予測し、予期しない特異体質薬物毒性の発現を防ぐことができる。また、医薬品候補化合物を被験薬物として、様々なＨＬＡ遺伝子多型を導入した自然免疫応答性動物細胞群を用いれば、前臨床段階での医薬品候補化合物の安全性スクリーニングも可能となる。さらに、特定のＨＬＡ遺伝子多型と結合しやすいが炎症反応を惹起することはない被験薬物を判別できるため、特異体質毒性の偽陽性評価の可能性を大幅に下げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＨＬＡ遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトにおける導入ＨＬＡの発現を示す図である。
【図２】ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトに対するアバカビル曝露に伴う炎症性サイトカインの発現量増加を示す図である
【図３】ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトに対するアバカビル曝露に伴うＨＬＡ関連因子の発現量の増加を示す図である。Ａは、内因性ＭＨＣ発現量とβ２−マイクログロブリン（β２ｍ）の発現量の増加を、Ｂは、導入ＨＬＡ発現量の増加を示す。
【図４】ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトに対するアバカビル曝露に伴う細胞毒性の有無を示す図である。
【図５】ケラチノサイトに対するアバカビル曝露に伴う免疫応答のＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１特異性を示す図である。Ａは、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトに対するジドブジン曝露に伴う導入ＨＬＡ発現量の変化を、Ｂは、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトに対するアバカビル曝露に伴う導入ＨＬＡ発現量の変化を示す。
【図６】ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来の肝細胞に対するアバカビル曝露に伴う免疫応答を示す図である。Ａは、炎症性サイトカイン発現量と導入ＨＬＡ発現量の増加を、Ｂは、導入ＨＬＡ発現量の増加を示す。
【図７】ＨＬＡ遺伝子導入肝細胞に対するアバカビル曝露に伴う免疫応答のＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１特異性を示す図である。
【図８】ＨＬＡ遺伝子導入非免疫細胞ＨｅＬａ細胞に対するアバカビル曝露に伴う導入ＨＬＡ発現量の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明におけるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とは、ヒト第６染色体短腕上に存在する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の産物である。ＨＬＡはクラスＩ抗原とクラスＩＩ抗原の２群に大別され、クラスＩ抗原としてはＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ及びＧが、クラスＩＩ抗原としてはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ及びＤＰが知られている。ＨＬＡには数多くの遺伝子多型が存在するが、本発明で用いられるＨＬＡの遺伝子多型は特に限定されず、好ましくは薬物による特異体質毒性との関連性が知られている毒性発現性の遺伝子多型が挙げられる（例えば、非特許文献１）。より具体的には、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊１３：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０５、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０２：０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６：０２などが挙げられる。各多型の遺伝子配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）の遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋより入手できる。
【００１５】
本発明の自然免疫応答性動物細胞は、自然免疫応答を示す動物細胞であれば特に限定されず、例えば表皮細胞（ケラチノサイト）、樹状細胞及び肝細胞が挙げられる。このうち、細胞の取り扱いやすさの観点から、ケラチノサイト及び肝細胞が好ましい。細胞の由来となる動物としては、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、サルなどが挙げられ、なかでもヒト又はマウスが好ましい。
【００１６】
本発明の自然免疫応答性動物細胞には、ＨＬＡの遺伝子多型が導入されている（以下、ＨＬＡ導入細胞とも称す）。ここで、導入されるＨＬＡの遺伝子多型は、導入される動物細胞内で機能し得るように改変してもよく、例えば、導入される動物のＭＨＣクラスＩ遺伝子とのキメラ型遺伝子とすることもできる。また、ＨＬＡタンパク質と、ＭＨＣクラスＩ分子の共役タンパク質であるβ２−マイクログロブリン（β２ｍ）とが等量発現されるように改変してもよい。さらに、ＨＬＡ発現量の測定の利便性を上げるため、ＨＬＡ遺伝子末端にＦＬＡＧタグなどのタンパク質タグを導入してもよい。
上記ＨＬＡ遺伝子多型は発現ベクターにクローニングすることができる。発現ベクターのプロモーターや選択マーカーは、導入細胞の種類等に応じて適宜選択すればよい。
かくして得られたＨＬＡ遺伝子多型を含む発現ベクターは、公知の手段を用いて、ヒトを含む哺乳動物細胞又は非ヒト哺乳動物個体に導入することができる。非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、サルなどが挙げられ、なかでもマウスが好ましい。
ＨＬＡ遺伝子多型を含む発現ベクターを動物細胞又は動物個体に導入する方法としては、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ウイルスベクターを利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、導入細胞種、発現効率、発現期間などを考慮して適宜選択すればよい。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。導入したＨＬＡ遺伝子多型の発現は、一過性発現であってもよく安定発現であってもよい。
【００１７】
本発明におけるＨＬＡ導入細胞は、例えば、ＨＬＡ遺伝子多型を動物細胞に導入し確立したトランスジェニック動物から自然免疫応答性動物細胞を単離する方法によって得ることができる。具体的には、ＨＬＡ遺伝子多型をクローニングした発現ベクターを非ヒト哺乳動物の前核期受精卵にマイクロインジェクション法により導入し、当該受精卵を当該動物の雌に着床させ、うまれた子の中から目的遺伝子を発現している個体を選別し、当該個体から自然免疫応答性細胞を単離する方法が挙げられる。
あるいは、本発明におけるＨＬＡ導入細胞は、ＨＬＡ遺伝子多型をクローニングしたウイルスベクター（例えばアデノウイルスベクター）を用いて、当該遺伝子多型を自然免疫応答性動物細胞に直接導入する方法によっても得ることができる。
【００１８】
自然免疫応答性細胞にＨＬＡ遺伝子多型が導入されたか否かは、フローサイトメトリー、免疫染色法、ウェスタンブロッティング法、リアルタイムＰＣＲなどの手法により導入ＨＬＡの発現を検出することで確認できる。
フローサイトメトリーを用いる場合には、例えば、ＨＬＡ導入細胞を培養、回収し、標識抗ＨＬＡ抗体とインキュベーションした後、フローサイトメーターを用いて細胞の蛍光強度を測定する。蛍光強度が非ＨＬＡ導入細胞の蛍光強度と比較して高くシフトしていれば、表面ＨＬＡが発現しており、ＨＬＡ遺伝子多型が導入されたと判断できる。細胞の培養、回収、抗体との反応、フローサイトメトリーの条件は、用いる細胞、抗体等に応じて適宜設定すればよい。抗ＨＬＡ抗体の標識としては、蛍光標識又はビオチン標識が好ましい。蛍光標識としてはＰＥ、ＦＩＴＣ、ＡＰＣ、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５などが例示されるが、これらに限定されるものではない。ビオチン標識の場合は、さらに蛍光標識アビジンを用いる。
ウェスタンブロッティング法を用いる場合には、例えば、ＨＬＡ導入細胞を培養、回収し、細胞を可溶化し、得られたタンパク質を電気泳動の後メンブレンに転写し、抗ＨＬＡ抗体あるいはＨＬＡにタンパク質タグを導入していた場合は当該タグに対する一次抗体を反応させ、次いで対応する標識二次抗体を反応させ、標識に応じて化学発光法又は発色法により検出を行うことで、導入ＨＬＡの発現を確認することができる。細胞の培養、回収、細胞可溶化、電気泳動、転写、抗原抗体反応、検出の条件は、用いる細胞、抗体等に応じて適宜設定すればよい。
リアルタイムＰＣＲを用いる場合には、例えば、後述の炎症性サイトカインのｍＲＮＡの発現量測定の場合と同様にして、ＨＬＡ遺伝子多型のｍＲＮＡの発現を確認することができる。
【００１９】
導入ＨＬＡの発現量は、フローサイトメトリー、免疫組織染色法、ウェスタンブロット、リアルタイムＰＣＲなどの手法により測定した蛍光強度、発光強度又は発色強度をもとに算出することができ、例えば、被験薬物存在下で培養したＨＬＡ導入細胞における蛍光強度等を、被験薬物非存在下で培養したＨＬＡ導入細胞における蛍光強度等で除して、相対発現量として表すことができる。
【００２０】
本発明において、炎症性サイトカインは、細菌やウイルス感染、腫瘍、組織損傷などに伴う炎症反応に深く関わるサイトカインであればいずれでもよい。例えば、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）などが挙げられ、好ましくはＩＬ−１β、ＩＬ−６又はＩＦＮ−γであり、さらに好ましくはＩＬ−１β又はＩＦＮ−γである。これら炎症性サイトカインは、１種又は２種以上を組み合わせて指標とすることができる。
【００２１】
炎症性サイトカインの発現量は、測定対象の炎症性サイトカインに応じて適宜公知の方法により測定すればよく、例えば、リアルタイムＰＣＲ、フローサイトメトリー、ＤＮＡマイクロアレイなどの手法により測定することができる。このうち、迅速性と定量性の観点から、リアルタイムＰＣＲを利用して炎症性サイトカインのｍＲＮＡの発現量を測定するのが好ましい。リアルタイムＰＣＲとしては、当技術分野で通常用いられる方法、例えばインターカレーター法、ＴａｑＭａｎプローブ法及びサイクリングプローブ法等が挙げられるが、簡便性の点からインターカレーター法を用いるのが特に好ましい。
インターカレーター法では、二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発するインターカレーターをＰＣＲ反応系に加える。インターカレーターとしては、好ましくはＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉが用いられる。
リアルタイムＰＣＲは、サーマルサイクラーと分光光度計を一体化したリアルタイムＰＣＲ専用装置、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−Ｎａｎｏ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行うことができる。変性、アニーリング、伸長の各ステップの温度及び時間、サイクル数等のＰＣＲ条件、ＤＮＡポリメラーゼの種類及び濃度、プライマーの配列及び濃度、バッファーの種類、ｄＮＴＰ濃度、塩化マグネシウム濃度等のＰＣＲ反応液の組成は、測定対象に応じて適宜選択及び設定すればよい。
【００２２】
炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現量は、例えば、リアルタイムＰＣＲを用いた以下の方法により測定できる。被験薬物存在下で培養したＨＬＡ導入細胞から抽出したトータルＲＮＡ用いて逆転写によりｃＤＮＡを調製し、得られたｃＤＮＡを鋳型として測定対象の炎症性サイトカインに特異的なプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、増幅産物量をモニターする。また、被験薬物非存在下で培養したＨＬＡ導入細胞についても同様にリアルタイムＰＣＲを行う。各ｍＲＮＡ発現量をハウスキーピング遺伝子（例えば、β−アクチン）のｍＲＮＡ発現量で補正する。その後、被験薬物存在下での炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現量を、被験薬物非存在下での炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現量で除して、相対発現量を算出する。ｍＲＮＡの発現量は、あらかじめ濃度の分かっているｍＲＮＡ又はＤＮＡを段階希釈してリアルタイムＰＣＲを行い作成した検量線を利用して、絶対発現量として算出することもできる。
【００２３】
本発明におけるＨＬＡ導入細胞を培養するための培地は、細胞種に応じて適宜選択すればよい。ＨＬＡ導入細胞がケラチノサイトの場合、例えば、市販のＣｎＴ−ＰＲ培地、ＥｐｉＬｉｆｅ培地などを使用することができる。ＨＬＡ導入細胞が肝細胞の場合、例えば、市販のＷｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）などを使用することができる。培地には、必要に応じて、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の血清、グルタミン、抗生物質、抗真菌剤、細胞増殖促進因子（ホルモン、成長因子等）など、通常細胞培養に用いられる添加物を加えてもよい。培地のｐＨは、７．０〜７．７が好ましく、７．２〜７．４がさらに好ましい。
ＨＬＡ導入細胞は、プレート、フラスコ等の培養容器に播種して培養すればよい。当該培養容器は、コラーゲンコートされた培養容器が好ましい。播種する細胞数は、細胞種、培養容器の大きさに応じて適宜決定すればよいが、６ウェルプレートを用いる場合、０．１×１０６〜３×１０６個／ウェル程度、１２ウェルプレートを用いる場合、１×１０５〜６×１０５個／ウェル程度を例示できる。
ＨＬＡ導入細胞の培養温度は特に限定されないが、３５〜４０℃が好ましく、３６−３７℃がさらに好ましい。培養時間は、１０時間〜４日間が好ましく、１２時間〜３日間がさらに好ましい。被験物質添加後の培養時間は、１〜２４時間が好ましく、３〜１８時間がさらに好ましく、１２時間が特に好ましい。培養方法は特に限定されないが、静置培養が好ましい。ＣＯ２濃度は４〜１０％が好ましく、５−７％がさらに好ましい。
【００２４】
本発明における被験薬物は、特異体質薬物毒性発現の危険性を予測したい薬物であればよく、特に限定されない。被験薬物は、ＨＬＡ導入細胞の培地に直接加えるか、予め水又はＤＭＳＯなどの有機溶媒で溶解してから培地に加えればよく、被験薬物の試験濃度は、薬物の種類に応じて適宜設定すればよい。
【００２５】
本発明の特異体質毒性の発現予測方法は、ＨＬＡ導入細胞、ＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量を測定するためのプロトコール、ＨＬＡ及び炎症性サイトカインの測定試薬、測定試薬の使用方法等を含むキットを用いて実施してもよい。
【００２６】
被験薬物による特異体質毒性の発現を予測するには、被験薬物存在下において、ＨＬＡ導入細胞を培養し、ＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量の変化を測定すればよい。被験薬物存在下において、ＨＬＡ導入細胞のＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量が、当該ＨＬＡ遺伝子多型を導入していない非ＨＬＡ導入細胞のＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量に比して上昇していれば、その被験薬物と当該特定ＨＬＡ遺伝子多型による特異体質毒性の発現の可能性があると判定でき、発現量に変化がない又は発現量が低下していれば、その被験薬物と当該特定ＨＬＡ遺伝子多型による特異体質毒性の発現の可能性はないと判定できる。あるいは、被験薬物存在下において、ＨＬＡ導入細胞のＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量が、被験薬物非存在下のＨＬＡ導入細胞のＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量に比して上昇していれば、その被験薬物と当該特定ＨＬＡ遺伝子多型による特異体質毒性の発現の可能性があると判定でき、発現量に変化がない又は発現量が低下していれば、その被験薬物と当該特定ＨＬＡ遺伝子多型によるによる特異体質毒性の発現の可能性はないと判定できる。
【００２７】
本発明の方法によれば、自然免疫応答性動物細胞に導入したＨＬＡ遺伝子多型と被験薬物との相互作用による炎症反応、すなわちＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量の変化を捉え、ＨＬＡ遺伝子多型と被験薬物の相互作用により起こる特異体質毒性を毒性被害が生じる前に予め予測し、予期しない特異体質薬物毒性の発現を防ぐことができる。
本発明の方法によれば、特定のＨＬＡ遺伝子多型には結合しやすいが炎症反応を惹起することはない被験薬物を判別できるため、特異体質毒性の偽陽性評価の可能性を大幅に下げることができる。
臨床段階では、被験薬物と特定のＨＬＡ遺伝子多型との関連性が知られていない場合、本発明の方法により、被験薬物と特定のＨＬＡ遺伝子多型による特異体質毒性の発現の可能性があると判定されれば、当該ＨＬＡ遺伝子多型を保因するヒトに対する当該被験薬物の投与を回避することで毒性被害の発生を防ぐことができる。
前臨床段階では、本発明の方法により、医薬品候補化合物と種々のＨＬＡ遺伝子多型による特異体質毒性の発現の可能性を予測できるため、安全性スクリーニングが可能となる。被験薬物と特定のＨＬＡ遺伝子多型による特異体質毒性の発現の可能性があると判定されれば、被験薬物の修飾、対象患者の選別等の医薬品開発方針の変更が可能となり、ひいては毒性被害の発生を防ぐことができる。
【実施例】
【００２８】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２９】
実施例１  ＨＬＡ遺伝子発現ベクターの構築
ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子を有する不死化Ｂ細胞（ＥＣＡＣＣ、Ｎｏ.８８０５２００７）から、ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法によってＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１全長を増幅し、ｐＤＯＮＲ２２１ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。また、その中の２０７〜２９８アミノ酸に相当する部分はマウスＭＨＣ  Ｈ２−Ｋの２０４〜２９５アミノ酸に置換し、キメラ型ＨＬＡ遺伝子とした。次に、キメラ型ＨＬＡ遺伝子のＣ末に３×ＦＬＡＧタグ（DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK）（配列番号１）を部位特異的変異導入法によって挿入した。
ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子と２塩基多型（４１２番目：Ｇ→Ａ、４１９番目：Ｃ→Ａ）のＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３遺伝子は、キメラ型ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子を導入したｐＤＯＮＲ２２１ベクターより、部位特異的変異導入法によって構築した。
β２−マイクログロブリン（β２ｍ）遺伝子も同様に不死化Ｂ細胞よりＰＣＲ法によって増幅し、キメラ型ＨＬＡ遺伝子を導入したｐＤＯＮＲ２２１ベクターにクローニングした。
次に、キメラ型ＨＬＡ遺伝子とβ２ｍとの間に２Ａペプチド配列（ggc agt gga gag ggc aga gga agt ctg cta aca tgc ggt gac gtc gag gag aat cct ggc cca）（配列番号２）を挿入し、キメラ型ＨＬＡタンパク質とβ２ｍタンパク質を一細胞内に等量発現できるように設計した。
２Ａペプチド配列を介して挟んだキメラ型ＨＬＡ遺伝子とβ２ｍ遺伝子は、ｐＣＡＧＧＳベクター（大阪大学の宮崎純一先生より譲渡）とｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴアデノウイルスベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にそれぞれサブクローニングし、発現ベクターとした。
【００３０】
実施例２  ＨＬＡ遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトの単離及び培養
（１）ＨＬＡ遺伝子導入マウスの作出及び維持
実施例１で構築したキメラ型ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１及び５７：０３遺伝子のｐＣＡＧＧＳ発現ベクターをユニーテック株式会社に渡し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統の遺伝子導入マウスを作出し、ＨＬＡ遺伝子導入マウスとした。
マウスの維持及び繁殖は、千葉大学薬学部内の実験動物飼育室において行い、千葉大学動物実験委員会の承認の下、実施した。
【００３１】
（２）マウス初代培養ケラチノサイトの単離及び培養
ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス（Ｔｇ）、そのリッターメイト（同腹子）、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３遺伝子導入マウス（Ｔｇ）またはそのリッターメイトの新生児（それぞれ１〜３日齢）の皮膚を剥離した後、ＣｎＴ−ＰＲ培地（ＣＥＬＬｎＴＥＣ）で調製した５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼ（合同酒精株式会社）溶液中で、４℃において１６〜１８時間インキュベーションを行った。
次に、１ｍＬのＣｎＴ−ＰＲ培地で皮膚切片を洗い、ピンセットを用いて真皮から表皮を剥離した後、１０ｃｍシャーレ上に滴下した１ｍＬのアキュターゼ溶液（ナカライテスク株式会社）上に乗せ、室温で３０分間インキュベーションを行った。アキュターゼ溶液上で表皮を揺らし、ケラチノサイトを分離させ、２ｍＬのＣｎＴ−ＰＲ培地で２回洗い、１５ｍＬの遠心チューブに回収した。２００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した後に４ｍＬのＣｎＴ−ＰＲ培地で細胞ペレットを懸濁し、細胞数を測定した。
ＣｎＴ−ＰＲ培地を用いて細胞密度が２．８×１０５個／ｍＬとなるように懸濁し、１２ウェルプレートに１ｍＬずつ播種した（７．５×１０４個／ｃｍ２）。１２ウェルプレートには予めコラーゲン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）をコートした。２４時間後に培養液を除去し、５００μＬのＰＢＳで洗い、新しいＣｎＴ−ＰＲ培地を１ｍＬ加えた。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３日間培養を行い、培養液を除去した後に、５００μＬのＰＢＳで洗い、以下の試験に供した。
【００３２】
実施例３  ＨＬＡ遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトにおけるＨＬＡの発現の評価
実施例２で得たＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス（Ｔｇ）とそのリッターメイト、またはＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３遺伝子導入マウス（Ｔｇ）とそのリッターメイト由来のケラチノサイトに、ＰＥ  Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（６／３２）（ソニー株式会社）を用いて染色を行い、フローサイトメトリーによって、表面ＨＬＡ発現を確認した（図１）。具体的には、ケラチノサイトに３００μＬのアキュターゼを加えて３７℃で１０〜２０分間インキュベーションを行った。培養プレートを氷上に移して細胞を１．５ｍＬのサンプルチューブに回収し、さらに各ウェルに５００μＬのＰＢＳを加えて細胞を十分に回収した。４℃において３００×ｇで５分間遠心した後に上清を除去し、５００μＬのＰＢＳで懸濁して再度遠心した。上清を除去した後にＰＢＳで調製したＰＥ  Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｗ６／３２）溶液５０μＬで細胞ペレットを懸濁し、４℃において２０分間インキュベーションを行った。インキュベーション後に６０μＬのＰＢＳを加えて、フローサイトメーター（セルアナライザーＥＣ８００、ソニー株式会社）を用いて、蛍光強度から細胞表面ＨＬＡ発現量を測定した。解析には、付属のソフトウェアを用いた。
その結果、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１および５７：０３どちらについても、ＨＬＡ遺伝子の導入されたケラチノサイトでは、その細胞の表面にＨＬＡが発現していることが確認された。
【００３３】
実施例４  ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトに対するアバカビル曝露に伴う炎症性サイトカインの発現量増加
実施例２で得たＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス（Ｔｇ）とそのリッターメイト由来のケラチノサイトを、最終濃度が０、１０、１００または５００μＭとなるようにアバカビル（超純水で溶解）（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）を加えたＣｎＴ−ＰＲ−Ｄ培地（ＣＥＬＬｎＴＥＣ）にて３７℃、５％ＣＯ２で１２時間培養した。培養液を除去した後に細胞を５００μＬのＰＢＳで洗い、Ｓｅｐａｓｏｌ−ＲＮＡ  Ｉ  Ｓｕｐｅｒ  Ｇ（ナカライテスク株式会社）を用いてトータルＲＮＡを回収し、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡株式会社）を用いて逆転写を行いｃＤＮＡを得た。作製したｃＤＮＡに対して、Ｔｈｕｎｄｅｒ  Ｂｉｒｄ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（東洋紡株式会社）と表１記載の各プライマーセットを用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−Ｎａｎｏ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）により定量的リアルタイムＰＣＲ反応を行い、炎症性サイトカインであるＩＬ−１βとＩＦＮ−γのｍＲＮＡの定量を行った。各ｍＲＮＡの発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンのｍＲＮＡ発現量で補正した後に、アバカビルを添加していないサンプルのｍＲＮＡ発現量で除した相対値で示しており、データは３試料の平均値±標準偏差で表した（図２）。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
その結果、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトにアバカビルを曝露した際には、濃度依存的に炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現量が上昇することが認められた。
【００３６】
実施例５  ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトに対するアバカビル曝露に伴う内因性ＭＨＣ発現量と導入ＨＬＡ発現量の増加
（１）実施例４と同様に、最終濃度０、１０、１００または５００μＭのアバカビルを曝露したＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトより取得したｃＤＮＡと表２記載の各プライマーセットを用いて、マウス内因性のＭＨＣクラスＩとβ２ｍのｍＲＮＡ発現量の定量を行った。各ｍＲＮＡの発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンのｍＲＮＡ発現量で補正した後に、アバカビルを添加していないサンプルのｍＲＮＡ発現量で除した相対値で示しており、データは３試料の平均値±標準偏差で表した（図３Ａ）。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
その結果、アバカビルを曝露したＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトでは、濃度依存的に内因性ＭＨＣクラスＩ及びβ２ｍのｍＲＮＡ発現量が上昇することが認められた。
【００３９】
（２）実施例４と同様に、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトを、最終濃度０、１０または１００μＭのアバカビルを加えた培地にて３７℃、５％ＣＯ２で１２時間培養した。次いで、実施例３と同様に、ＰＥ  Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｗ６／３２）を用いて染色を行い、フローサイトメトリーによって、表面ＨＬＡ発現量を評価した。表面ＨＬＡの発現量は、アバカビルを添加していないサンプルの表面ＨＬＡ発現量で除した相対値で示しており、データは３試料の平均値±標準偏差で表した（図３Ｂ）。
その結果、アバカビルを曝露したＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトでは、アバカビルの濃度依存的にケラチノサイトの表面ＨＬＡの発現量が上昇することが認められた。
【００４０】
実施例６  ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトに対するアバカビル曝露に伴う細胞毒性の有無の確認
実施例４と同様に、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス（Ｔｇ）またはそのリッターメイト由来のケラチノサイトを、最終濃度０、１０、１００または５００μＭのアバカビルを加えた培地にて３７℃、５％ＣＯ２で１２時間培養した。次いで、アバカビルの細胞毒性を、ＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いて、細胞外に漏出される乳酸脱水素酵素の量によって評価した。データは３試料の平均値±標準偏差で表した（図４）。
その結果、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイト及びそのリッターメイト由来のケラチノサイトのどちらにおいても、アバカビル曝露に伴う細胞毒性は認められなかった。よって、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトにアバカビルを曝露した際に観察される炎症性サイトカインや表面ＨＬＡ発現量の上昇は、細胞毒性による応答ではなく、免疫反応として惹起されたものであることが示唆された。
【００４１】
実施例７  ケラチノサイトに対するアバカビル曝露に伴う免疫応答のＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１特異性の評価
（１）実施例４と同様に、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス（Ｔｇ）由来のケラチノサイトを、アバカビルと同様の核酸アナログであるジドブジン（和光純薬工業株式会社）を超純水で溶解して最終濃度が０、１００または５００μＭとなるように加えた培地中で、３７℃、５％ＣＯ２で１２時間培養した。次いで、実施例３と同様にＰＥ  Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｗ６／３２）を用いて染色を行い、フローサイトメトリーによって、表面ＨＬＡ発現量を評価した。表面ＨＬＡの発現量は、ジドブジンを添加していないサンプルの表面ＨＬＡ発現量で除した相対値で示しており、データは３試料の平均値±標準偏差で表した（図５Ａ）。
その結果、ジドブジンの曝露の場合には、アバカビル曝露の時に認められていた表面ＨＬＡの発現量の上昇は観察されなかった。
【００４２】
（２）実施例４と同様に、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３遺伝子導入マウス（Ｔｇ）由来のケラチノサイトを、最終濃度０、１００または５００μＭのアバカビルを加えた培地にて３７℃、５％ＣＯ２で１２時間培養した。次いで、実施例３と同様にＰＥ  Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｗ６／３２）を用いて染色を行い、フローサイトメトリーによって、表面ＨＬＡ発現を評価した。表面ＨＬＡの発現量は、アバカビルを添加していないサンプルの表面ＨＬＡ発現量で除した相対値で示しており、データは３試料の平均値±標準偏差で表した（図５Ｂ）。
その結果、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトにアバカビルを曝露した場合には、表面ＨＬＡの発現量の上昇は観察されなかった。したがって、アバカビル曝露に伴う免疫応答は、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３に特異的であることが示唆された。
【００４３】
実施例８  ＨＬＡ遺伝子導入マウス由来の肝細胞の単離及び培養
８〜１２週齢のキメラ型ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス、または野生型のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ペントバルビタール（１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して麻酔し、開腹した。門脈にシュアシールドを挿入して、クレンメで挟み、ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（０．４ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、６０ｍｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、４８ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、９８ｍｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、２．３８ｇ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、２２８ｍｇ／Ｌ  ＥＧＴＡ、１ｇ／Ｌ  グルコース、１．２９ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ  ７．２）で灌流した。次に、下大静脈を切断して灌流液を流出させた。ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒで１０分間、続いてコラゲナーゼ溶液（ＥＧＴＡ不含のｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  １２０ｍＬ、１００ｍＭ  ＣａＣｌ２  ４．８ｍＬ、コラゲナーゼ（和光純薬工業株式会社）３５ｍｇ、ｐＨ  ７．４）で１０分間灌流した。灌流の完了した肝臓を滅菌済みの１００ｍＬビーカーに移し、そこにコラゲナーゼ溶液を約２０ｍＬ加えた。ピンセットを用いて肝臓に切り込みを入れ、肝臓内部を露出させた。目開き１２５μｍのメッシュで濾過後、目開き７４μｍのメッシュで５０ｍＬの遠心チューブに濾した。
４℃において７００ｒｐｍで３分間の遠心後に上清を除去し、２４ｍＬのＷｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２１．６ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、  ２．４ｍＬの１０倍濃縮ＨＢＳＳ溶液（８０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、４ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．７７２ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．６ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、３．５ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３）で再懸濁した。続いて、４℃において７００ｒｐｍで１５分間の遠心の後、上清を除去し、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ  Ｍｅｄｉｕｍで再懸濁した。目開き７４μｍのメッシュで再度濾過し、４℃において７００ｒｐｍで３分間の遠心を行い、上清を除去した。
約１０ｍＬの播種用培地（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ５００ｍＬ、ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５ｍＭ  デキサメタゾン（和光純薬工業株式会社）１００μＬ、抗生物質−抗真菌剤混合溶液  ５ｍＬ、ＧｌｕｔａＭＡＸTM（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）  ５ｍＬ、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ７．５ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬのインスリン溶液（和光純薬工業株式会社）５００μＬ）で再懸濁した。細胞数を測定した後、６ウェルプレートに１ウェルあたり１．２×１０６個、または１２ウェルプレートに１ウェルあたり４．３７５×１０５個となるように播き、その２４時間後に培養用培地（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ５００ｍＬ、５ｍＭ  デキサメタゾン  １０μＬ、抗生物質−抗真菌剤混合溶液  ２．５ｍＬ、ＧｌｕｔａＭＡＸTM  ５ｍＬ、ＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）  ５００μＬ）に置換した。ウェルプレートには予めコラーゲンをコートした。
【００４４】
実施例９  ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来の肝細胞に対するアバカビル曝露に伴う免疫応答の評価
（１）実施例８で得たＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来の肝細胞を、最終濃度０、１００または５００μＭのアバカビルを加えた培地にて３７℃、５％ＣＯ２で１２時間培養した。その後、実施例４と同様にトータルＲＮＡを回収してｃＤＮＡを作製し、表３の各プライマーセットを用いて、炎症性サイトカインであるＩＦＮ−γと導入したＨＬＡのｍＲＮＡ発現量の定量を行った。各ｍＲＮＡの発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンのｍＲＮＡ発現量で補正した後に、アバカビルを添加していないサンプルのｍＲＮＡ発現量で除した相対値で示しており、データは３試料の平均値±標準偏差で表した（図６Ａ）。
【００４５】
【表３】
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【００４６】
その結果、アバカビルの曝露によってＩＦＮ−γと導入したＨＬＡのｍＲＮＡ発現量がいずれも上昇することが認められた。
【００４７】
（２）実施例８で得たＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来の肝細胞を、最終濃度０、１００、５００μＭのアバカビルを加えた培地にて３７℃、５％ＣＯ２で１２時間培養した。その後、細胞を可溶化し、その可溶化液をウェスタンブロッティングにかけ、導入したＨＬＡの発現量をＨＬＡのＣ末側に付加したＦＬＡＧタグに対する抗体によって評価した（図６Ｂ）。コントロールには、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量を用いた。具体的には、培養液を除去した後に細胞を５００μＬのＰＢＳで２回洗い、可溶化バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  ＮＰ−４０、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））を３００μＬ加えて可溶化した。氷上で１０分インキュベーションした後に、４℃において１０分間１２，０００×ｇで遠心し、その上清を回収した。その細胞可溶化液のタンパク質濃度をＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した後に、タンパク質量として５μｇ相当を１５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて展開した。電気泳動後、ゲル上のタンパク質をＰＶＤＦメンブレン（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。このメンブレンを５％  ＢＳＡを含む０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０入りＴＢＳ（ＴＴＢＳ）でブロッキングし、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）または抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と４℃で１２時間反応させた。その後、対応する二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と室温で１時間インキュベーションを行い、ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出した。検出器はＬＡＳ４０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。
その結果、アバカビルの濃度依存的に細胞内ＨＬＡ発現量が上昇することが認められた。
【００４８】
実施例１０  ＨＬＡ遺伝子導入マウス肝細胞の調製
（１）ＨＬＡ遺伝子導入アデノウイルスの作製
実施例１で構築したキメラ型ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１及び５７：０３のｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴアデノウイルスベクターは、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて２９３Ａ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に導入し、ＶｉｒａＰｏｗｅｒTM  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、アデノウイルスを含む培養上清を得た。得られたアデノウイルスは、Ｖｉｖａｐｕｒｅ  ＡｄｅｎｏＰＡＣＫTM  ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇoｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、Ａｄｅｎｏ−Ｘ  Ｒａｐｉｄ  Ｔｉｔｅｒ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）に従いＨＥＫ２９３細胞（独立行政法人理化学研究所）を用いてウイルスの力価を決定した。
２９３Ａ細胞及びＨＥＫ２９３細胞はいずれもＤＭＥＭ培地（ナカライテスク株式会社）に１０％のＦＢＳと抗生物質−抗真菌剤混合溶液を加えて培養した。
【００４９】
（２）野生型マウス由来の肝細胞へのアデノウイルス導入
野生型のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の肝細胞を単離し、上記（１）で得たアデノウイルスを用いてＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１またはＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３遺伝子を導入した。アデノウイルス導入時には、力価が２５  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ）となるように培養液中にウイルス溶液を添加し、その２４時間後に培地交換を行って培養液中のウイルスを除いた。
【００５０】
実施例１１  肝細胞に対するアバカビル曝露に伴う免疫応答のＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１特異性の評価
実施例１０で得たＨＬＡ遺伝子導入肝細胞を、最終濃度０または１００μＭのアバカビルを加えた培地にて３７℃、５％ＣＯ２で１２時間培養し、実施例３と同様にＰＥ  Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｗ６／３２）を用いて染色を行い、フローサイトメトリーによって、表面ＨＬＡ発現量を評価した。表面ＨＬＡの発現量は、アバカビルを添加していないサンプルの表面ＨＬＡ発現量で除した相対値で示しており、データは３試料の平均値±標準偏差で表した（図７）。
その結果、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子を導入した肝細胞においては、アバカビルの曝露によって表面ＨＬＡの発現量が増加することが観察された。一方、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３遺伝子を導入した肝細胞においては、表面ＨＬＡの発現量増加は観察されなかった。
【００５１】
参考例１  ＨＬＡを導入した非免疫細胞であるＨｅＬａ細胞を用いたアバカビル応答性の評価
ＨｅＬａ細胞（独立行政法人理化学研究所）は、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地（ナカライテスク株式会社）に１０％のＦＢＳ、抗生物質−抗真菌剤混合溶液を加えた培養液中にて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。３．０×１０３個／ｃｍ２で１２ウェルプレート（１ｍＬ）に播種し、２４時間後に培養液を除去し９００μＬの新しいＭＥＭ培地を加えた。
実施例１で構築したキメラ型ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子のｐＣＡＧＧＳ発現ベクターまたはｐＣＡＧＧＳコントロールベクターを１μｇ、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM  ２０００を２μＬ、それぞれ５０μＬのＭＥＭ培地に加えて室温で５分間インキュベーションし、続いて両者を混合して室温で２０分間インキュベーションを行った。それを、培養中のＨｅＬａ細胞に添加し、その２４時間後に培養液を除去して最終濃度０、１０、１００または５００μＭのアバカビルを含むＭＥＭ培地を加えて３７℃、５％ＣＯ２で１２時間培養した。その後、実施例３と同様にＰＥ  Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｗ６／３２）を用いて染色を行い、フローサイトメトリーによって、表面ＨＬＡ発現量を評価した。表面ＨＬＡの発現量は、アバカビルを添加していないサンプルの表面ＨＬＡ発現量で除した相対値で示しており、データは３試料の平均値±標準偏差で表した（図８）。
その結果、非免疫細胞であるＨｅＬａ細胞においては、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子を導入しても、アバカビルの曝露に伴う表面ＨＬＡの発現量の増加は認められなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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