(57)【要約】【課題】赤外分光分析で使用するための微生物試験標準とこれを利用する好適な方法を提供する。【解決手段】少なくとも2つの、閉じたときに液密となる再封止可能な容器のそれぞれが、ある微生物の所定量の乾燥バイオマスを収容する。異なる容器内の微生物は、少なくとも1つの特性が相違しており、この特性は特に、種、亜種、菌株、血清型、病原型、毒素型、及び変種からなる群から選択され、この相違は、所定の微生物間スペクトル距離A, Bに表われる。本開示は更に、この微生物試験標準を使用する方法を含む。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも2つの、閉じたときに液密となる再封止可能な容器を有し、該容器のそれぞれが、ある微生物の所定量の乾燥バイオマスを含み、該異なる容器中の該微生物は、少なくとも1つの特性において相違しており、該相違はそれ自体、所定の微生物間スペクトル距離に表われる、赤外分光分析に使用するための微生物試験標準。
【請求項２】
前記少なくとも1つの特性が、種、亜種、菌株、血清型、病原型、毒素型、及び変種からなる群から選択される、請求項1に記載の微生物試験標準。
【請求項３】
前記乾燥バイオマスが滅菌されている、請求項1に記載の微生物試験標準。
【請求項４】
前記乾燥バイオマスが減圧乾燥されたペレットからなる、請求項1に記載の微生物試験標準。
【請求項５】
前記微生物が、1つの細菌種の異なる菌株に属する、請求項1に記載の微生物試験標準。
【請求項６】
前記容器がねじ式キャップを有する、請求項1に記載の微生物試験標準。 
【請求項７】
請求項1に記載の微生物試験標準を使用する方法であって、
サンプルスポット配列を有する、赤外分光分析用のサンプル支持プレートを提供することと、
溶媒を加えることによって、前記容器内の前記バイオマスを再懸濁させることと、 
該各容器から、所定量の該懸濁液を取り出し、これを所定数のサンプルスポットに配置することと、 
該サンプルスポット上の該懸濁液を乾燥させることと、 
該サンプルスポットの赤外スペクトルを取得することと、
異なる該サンプルスポットの該赤外スペクトルにおけるスペクトルシグネチャ間の微生物間スペクトル距離を計算することと、
該スペクトル距離が所定範囲の外かどうかを判定することと、を含む、方法。
【請求項８】
前記スペクトル距離が、所定の波数範囲内にある前記微生物スペクトルシグネチャから計算され、所定の距離に対応する、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記所定の波数範囲が、約1,300〜800 cm-1である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記異なるサンプルスポットの前記赤外スペクトルの前記スペクトルシグネチャ間の前記微生物内スペクトル距離が計算され、これによりスペクトル再現性を調べる、請求項7に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物内スペクトル距離の前記所定範囲が、最大距離Aまで延長され、該最大距離Aは、前記取得の前記再現性のための測定値であり、また更に、前記微生物間スペクトル距離の前記所定範囲に対して、最小距離Bから延長され、該最小距離Bは、該取得のスペクトル特異性のための測定値である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記再懸濁のための前記溶媒が、蒸留水及び／又は脱イオン水を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１３】
前記再懸濁が、前記容器の振盪、又は混合ピペット操作によって促進される、請求項7に記載の方法。
【請求項１４】
スペクトル距離が前記所定範囲外にあるときに、(警告の) タグが前記IRスペクトルに添付される、請求項7に記載の方法。
【請求項１５】
前記微生物懸濁液の複数の複製物が、前記サンプル支持プレート上に適用される、請求項7に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤外分光分析、特にフーリエ変換赤外分光分析 (FTIR) において、好ましくは透過法で、微生物を識別、同定、及び／又は特性付けるための測定における補助及びプロセス制御として、使用するための微生物 (特に細菌) 試験標準に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
先行技術について、特殊な側面を参照しながら下記に説明する。しかしながらこれは、制限として見なされるべきではない。先行技術に対する、周知の有用な更なる開発と改変も使用することができ、これは本概論の比較的狭い範囲を超えるものであり、これは下記の開示を読むことで当業者には容易に明らかとなろう。
【０００３】
微生物同定のためのIRスペクトル (特に透過法で取得されるもの) は、典型的に、所定の波長範囲、特に中赤外領域 (約4,000〜400 cm-1) にわたる数多くの吸光信号又は吸収バンドを含む。検査されるサンプルとして、微生物はこれらのスペクトルにおいて明確かつ識別可能なスペクトルシグネチャを提供する。これらのシグネチャは、例えば細胞質成分、膜及び細胞壁成分などのすべての細胞成分 (すなわち、特に多糖、DNA/RNA、タンパク質) による寄与の重なりを表わし、よって、ゲノム (DNA/RNA) 又は遺伝子フィンガープリントの形質発現を示す。このフィンガープリントの特性は、微生物の識別、同定及び特性付けのために赤外分光分析を使用する際の基盤を形成する。これらの測定方法の詳細は、非特許文献１の概論を参照されたい。
【０００４】
最近では、測定の再現性と比較性に影響を及ぼし得るような、赤外分光光度計の機器設定及び特性の、所定の操作時間にわたる予測不能かつ望ましくない変動・変化は、自動化試験と再校正ルーチンを利用して、ある程度の信頼性をもって検出・補償することが可能になっている。
【０００５】
しかしながら、外部的測定条件は操作時間の中で変化する可能性があり、時には、連続する取得の間に変化する可能性がある。多くの赤外分光光度計は、個々の取得の間に、圧力、温度、湿度などの周辺条件を一定かつ安定にするような、条件調整されたサンプル支持チャンバは備えていない。特に湿度の変化は、例えば水和シェル又は結晶水の形成により、調製済みサンプルのスペクトル特性に影響し得ると考えられ、これによって、類似のサンプルや同一重複サンプルの比較に悪影響を及ぼし得る。これらの変動は、冬期 (低温の空気、低い絶対湿度) と夏期 (暖かい空気、高い絶対湿度) の間の変化において特に顕著となり得る。よって、このような考えられる外部的影響をより良く考慮に入れ、かつ短時間でIR測定を評価できるような、より良い赤外分光分析プロセスモニタリングのニーズが存在する。
【０００６】
IR測定のためのプロセス制御の簡単な形態はすでに知られている。例えば、特許文献１では、同定すべき4つのバッチの微生物を3回測定して、スペクトル再現性をモニターし、この複製物の互いに対する同一性を評価する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第WO 99/16895 A1号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Encyclopedia of Analytical Chemistry (R.A. Meyers (Ed.), pp. 102-131, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2000) のDieter Naumann執筆 “Infrared Spectroscopy in Microbiology”
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
赤外分光法を用いて微生物の識別、同定又は特性付けを行う際の必須のタスクは、菌株を識別し、それぞれに伴う形質関係を評価することである。パワフルなクラスター分析アルゴリズムを利用してスペクトル間距離を測定し、これを可視化することで、その関係がユーザーに識別可能になるようにするために、微生物バイオマスの固有の吸収スペクトルが取得及び比較される。
【００１０】
この際に、次のような課題がある。1つには、特に同じ微生物種の2つの異なる菌株を識別するためには、高いスペクトル特異性が必要である。しかしながら同時に、異なるサンプリング点に由来するものであっても、同一の菌株は、分析において同じクラスターに確実に含まれなければならない。すなわち、信頼性の高い測定再現性を達成するために、これらは互いに対して、及びそのサンプル支持プレートに適用される複製物の中で、細菌内スペクトル距離が最小限でなければならない。 
【００１１】
よって、測定された参照バイオマスの同定と特性が既知であるときに、IR分光測定の再現性及びスペクトル特異性を備え、かつ、後続の評価ステップが決定及び評価可能であるような、微生物試験標準とこれを利用する好適な方法に対するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第1の態様では、本発明は、赤外分光分析で利用される微生物試験標準に関するものであり、これは少なくとも2つの、閉じたときに液密となる再封止可能な容器を有し、このそれぞれが、ある微生物の所定量の乾燥バイオマスを収容する。異なる容器内の微生物は、少なくとも1つの特性が相違しており、この特性は特に、種、亜種、菌株、血清型、病原型、毒素型、及び変種からなる群から選択することができ、この相違は、所定の微生物間スペクトル距離に表われる。
【００１３】
この試験標準は好ましくは下記の方法で使用される。未知の微生物の実際のサンプルと共に、互いに対するあらかじめ測定された微生物間スペクトル距離を有している (少なくとも) 2つの参照微生物が、同じサンプル支持プレート上に、空間的に分離されるように、二重複製又はそれより多い数の複製で適用される。参照用バイオマスをIR分光分析により測定してから、同定対象となる「本物の」サンプルを測定する。 
【００１４】
この試験に合格し、サンプル支持プレートの測定が全体として有効であることを示すために、2つの参照用微生物の間の微生物間スペクトル距離は、最小スペクトル距離Bよりも大きくなければならず、これによって、スペクトル特異性が十分であることが証明される。複製物に適用される場合、4つの微生物間スペクトル距離を計算することができ、このそれぞれが、試験を合格するための条件を満たさなければならない。
【００１５】
微生物当たり、3つ以上の複製物が適用される場合 (例えば5〜10個)、100%の条件充足を必要とするのではなく、特定の分位 (例えば2〜10パーセント、好ましくは5パーセント) の微生物間スペクトル距離が、試験に不合格とならずに制限条件から逸脱していても許容される。例えば、5×5のサンプルスポットは、2つの参照用バイオマスの複製間に、25の微生物間スペクトル距離をもたらす。小さな数の逸脱 (例えばこれらの距離のうち1つがBよりも小さい場合) は、測定全体を無効とすることなしに許容することができる。 
【００１６】
当然、微生物内最大スペクトル距離Aについても、対応して多数の適用複製物があれば、この方法の変形に同様の考慮事項が適用される。スペクトル再現性の最小限度を示すために、互いに対して、及びそれら自体の内部の、複製物の微生物内スペクトル距離、又は少なくともその大多数 (90%超) は、この特定の最大距離Aよりも小さくなる。
【００１７】
不合格測定について、IR測定に (警告の) タグを付ける代わりに、熟練した当業者は、IRスペクトルを詳細に見て試験基準を (部分的に) 満たしていないことを利用して、結論を導き、この結論によって、可能であれば変更し最適化した条件下でこの測定を再試行することができる。例えば、サンプル支持チャンバ内の湿度を最適化することで、より良い結果がもたらされる可能性がある。吸収バンドの信号対ノイズ比が低すぎる場合、同じサンプルスポットで複数の取得を追加することにより、評価のためのデータベースを改善することができる。最後に、更にサンプル支持プレート上の微生物サンプル調製を調べて、これらがほぼ均一な層厚さで適用されているかどうかを確認することができる。均一な層厚さが確認されない場合は、この点に関して特に注意を払って調製をやり直すことができる。この最適化の試みは、微生物試験標準に照らして監視及びチェックすることができる。
【００１８】
種及び亜種の明らかな分類階層レベルとは別に、微生物間スペクトル距離は、異なった詳しい特徴を有する微生物からもたらされ得る。用語「菌株」は、例えば、属、種、亜種、及び変種を含む命名鎖に追加される国際的に標準化されている菌株名を有する、1個の生物体から成長した、微生物菌株の保存機関 (しばしば国立機関) に保管されている群を意味する。1つの菌株の個々の生物体は遺伝的に同一である。しかしながら、異なる菌株は遺伝子構造がわずかに異なり、そのため、異なるスペクトル特性と距離を伴う、可能な菌株組み合わせの種類は多数となる。これは、IR分光分析における微生物試験標準として利用するのに好適であり得る。
【００１９】
他のスペクトル特異性は、例えば、血清型で表現することができる。血清型 (血清型変種の短縮形) という用語は、血清学的試験によって区別できる細菌の亜種内にある変種を説明するために使用される。これらは、細胞表面上の抗原に関して異なり、特定の抗体を用いて、従来の微生物学的な方法で同定される。血清型の命名階層は、属 > 種 > 亜種 (subsp.) > 血清型となり、例えば、二名法学名Salmonella enterica 亜種enterica 血清型Typhiは、Salmonella Typhiと略される。
【００２０】
病原型 (語源はギリシャ語のpathos (病気)) は、同じ特性を備えた細菌の菌株又は菌株群であり、その病原性により、同じ種又は亜種の他の菌株から識別可能なものである。病原型は二名法による種名に第3または第4の追加部分を用いて表示される。例えば、柑橘類潰瘍病を引き起こす細菌Xanthomonas axonopodis は、異なる宿主特異性を備えた様々な病原型を有し、X. axonopodis pv. citri はその1つである。短縮形の「pv.」は「pathovar (病原型)」を意味する。
【００２１】
ヒト病原体の毒性株にも病原型があるが、この場合、名前の前に追加した部分により表示される。例えば、ほぼ完全に無害な腸内細菌Escherichia coliは、きわめて危険な病原型のenterohemorrhagic E. coli (EHEC)、enteropathogenic E. coli (EPEC)、enterotoxigenic E. coli (ETEC)、enteroinvasive E. coli (EIEC)、enteroaggregative E. coli (EAEC)、及びdiffusely adherent E. coli (DAEC) を有する。病原型は、異なる血清型を含み得る。EHECの場合、多くの既知の血清型があり、同定されたすべてのEHEC血清型の約60パーセントが０157、Ｏ103およびＯ26である。血清型Ｏ157/H7が特に危険である。慣例的に検査室で使用する微生物試験標準としては、ヒトに対して無害な微生物が明らかに好ましいことが、理解されよう。 
【００２２】
広い意味で、微生物は、その他の医学関連の特性が異なる変種に分けることができる。特に、抗生物質に対する耐性 (特にベータラクタム系抗生物質およびグリコペプチド系抗生物質) があるが、毒素形成 (「毒素型」) または抗生物質に対する同一あるいは同様のバクテリオファージ (「ファージ型」) に対する感受性もある。一般に、「次亜種」という用語は、1つの種または亜種の微生物群に、共通の生物学的特性がある場合に使用される。抗生物質耐性変種の一例はMRSA：Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (メシチリン耐性黄色ブトウ球菌) である。 
【００２３】
乾燥バイオマスは、測定を不適格にし得る微生物汚染を防ぐために、滅菌することができる。具体的には、減圧乾燥されたペレットの形態であり得る。この形態の調製物は、IR測定を迅速に実施する場合、検査機関でサンプル支持プレート上に複製物を作製する際の、試験標準懸濁液の迅速な処理に特に好適である。
【００２４】
好ましい一実施形態において、微生物は、1つの細菌種の異なる菌株に属する。種Escherichia coli を例として使用すると、異なる容器内の乾燥バイオマスは、特に好ましい一実施形態において、菌株DH5α (DSM 6897) 及びML3 (DSM 1058) を含み得る。2つの菌株は、画定された微生物間スペクトル距離を測定することを可能にし、これにより、菌株複製物間の再現性と、異なる菌株の個々の測定間のスペクトル特異性とを、監視及び評価することができる。その菌株が微生物サンプル中に定常的に存在し、よって十分な実践的妥当性がある場合、これは特に有用であり、E. coli 菌株がこれに相当する。微生物間スペクトル距離は、主成分分析の2つの主成分間の距離として示され得る。更に好ましい実施形態において、このスペクトル距離はユークリッド幾何学的であり、n次元スペクトルベクトルの差に対応し得る。分解能、又は選択された波数範囲に応じて、この次元数は2桁範囲から数百又はそれ以上であり得、例えば20 < n < 2,000、特に400 < n < 600、例えばn = 500であり得る。
【００２５】
容器は、確実な開放と再封止のために、ねじ式キャップを有し得る。微生物の懸濁液を処理するために溶媒を容器に加えた後であっても、この懸濁液は、得られるスペクトルの情報的価値に悪影響なく、更なる利用のために、長期間 (例えば最長10週間) 保存することができる。
【００２６】
第2の態様では、本発明はそのような微生物試験標準の利用に関するものであり、これは次の各工程を含む。(1) サンプルスポット配列 (マトリクスの行列配置で、典型的には48個、96個、又は384個) を有する、赤外分光分析用のサンプル支持プレートを提供することと、(2) 溶媒 (例えば蒸留水及び/又は脱イオン水) を加えることによって、容器内のバイオマスを再懸濁させることと、(3) 各容器から、所定量の懸濁液を抽出し、これを所定数のサンプルスポットに (好ましくは二重複製又は三重複製で) 配置することと、(4) そのサンプルスポット上の懸濁液を、適切ならば加熱及び対流を利用して、乾燥させることと、(5) 好ましくは透過法で、そのサンプルスポットの赤外スペクトルを取得することと、(6) 異なるサンプルスポットの赤外スペクトルにおけるスペクトルシグネチャ間の微生物間スペクトル距離を計算することと、(7) そのスペクトル距離が所定範囲の外かどうかを判定すること。もしスペクトル距離が所定範囲の外である場合は、そのサンプル支持プレート全体のIRスペクトルが、対応する (警告) タグでラベル付けされ得る。
【００２７】
別の実施形態において、所定の波数範囲内 (水の吸収バンドの干渉影響を避けるため、好ましくは約1,300〜800 cm-1) にあるスペクトル距離が、微生物スペクトルシグネチャから計算することができ、これは、所定の距離 (例えば、スペクトルベクトルのユークリッド幾何学的距離) に直接対応し得る。ここで、複数のスペクトルの分析は、階層的クラスター分析 (HCA) を利用して実施することができる。あるいは、この計算は、微生物スペクトルシグネチャの主成分分析によって実施され、その距離は、主成分空間の所定距離に対応する。教師あり機械学習分野により得られる、異なる微生物を識別するための別の手順としては、例えば、ANN (人工ニューラルネットワーク分析)、PLS-DA (部分的最小二乗判別分析)、及びSVM (サポートベクターマシン) がある。しかしながら、これらの場合において、重要なのはスペクトル距離ではなく、期待される分類に試験スペクトルを適正に割り当てることである。
【００２８】
スペクトルの再現性を調べるために、微生物間距離だけでなく、異なるサンプルスポットの赤外スペクトルにおけるスペクトルシグネチャ間の微生物内スペクトル距離 (すなわち、同じ微生物の複製物間の距離) も計算することができる。 
【００２９】
(i) 微生物内スペクトル距離の所定範囲に対して、最大距離Aまで延長することが望ましく (この最大距離Aは、取得の再現性のための測定値である)、更に、(ii) 微生物間スペクトル距離の所定範囲に対して、最小距離Bから延長することが望ましい (この最小距離Bは、取得のスペクトル特異性のための測定値である)。様々な実施形態において、異なる個々のサンプルスポットのIRスペクトル取得間の、少数のスペクトル距離 (例えば2〜10パーセント、特に5パーセント) が (その距離のほぼ大半がその距離条件を充足する場合であっても)、否定的なタグ付けをもたらす知見なしに、更には、このサンプル支持プレートの全ての測定が無効であるという宣言をすることもなしに、その距離条件を充足しない可能性がある。
【００３０】
懸濁した微生物細胞が均一に分布している再懸濁は、容器を振盪することにより促進することができる。特に、ねじ式キャップを備えた容器は、微生物エアロゾルが誤って周囲に漏出するのを確実に防止し、残った懸濁液を後で使用するために数週間保存するのに好適である。必要に応じて、追加的に又は代替的に混合ピペット操作を使用して、容器が開いているときに再懸濁を促進させることができる。
【００３１】
様々な実施形態において、この懸濁液の保存期間は、エタノールを添加することによって延長することができる。そのような処置の後、調製済みの懸濁液は、測定モニタリングとプロセス制御に後で使用するために、数週間、特に最長10週間にわたって保存することができる。
【００３２】
これは、繰り返し生じる未知の吸光信号が高い感度で検出できるため、フーリエ変換を用いて赤外スペクトルを評価するのに特に有用である。
【００３３】
本発明は、下記の図を参照することで、より良く理解することができる。図中の構成要素は必ずしも寸法比通りではなく、主に本発明の原理を示すためのものである (主として概略的である)。図中、同じ参照番号は、別の図における対応する構成要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】微生物試験標準の使用例の最初の部分の模式図表示である。
【図１Ｂ】乾燥サンプルを透過するIRスペクトル測定と、それに対応する吸光スペクトルの例の、模式図を示す。
【図１Ｃ】評価の前に実施される、吸光スペクトルの別の処理ステップの模式図を示す。
【図２】2次元主成分空間における2つの細菌菌株の複製についての、スペクトル距離決定の考えられる結果の模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、数多くの様々な実施形態を参照して図示及び説明されているが、添付の請求項で定義される本発明の要旨及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細の様々な変更を行い得ることが、当業者には理解されよう。
【００３６】
微生物IR試験標準のための乾燥バイオマスは、下記の方法で作製することができる。異なる参照用微生物を、2次元培地 (例えばコロンビアヒツジ血液寒天培地) で一晩培養する。培養した細胞を、数百ミリリットルの栄養ブロス (例えばLB-溶原ブロス) に接種してから、数時間 (例えば12〜24時間)、数百rpmで軽く振盪しながら37°Cで再び成長させる。この栄養ブロスを複数の遠心分離容器に分割し、数千gで数分間遠心分離にかけることができる。この上澄みを捨て、残った微生物ペレットを水に再懸濁させて、残留する栄養ブロスを除去する。新たに遠心分離を行い、新たに水で再懸濁させて、必要に応じてプロトン性溶媒 (例えばエタノール) の添加を行い、懸濁液を作製する。その微生物成分は、光学密度を測定することにより (例えばマクファーランド濁度標準液により) 決定できる。懸濁した微生物の濃度が十分である場合、この懸濁液のアリコートをプラスチック容器に移し、その中で乾燥させ (例えば若干温度を上げて減圧下で)、使用準備済みのペレットを形成し、その容器中でこのペレットから液体を除去する。 
【００３７】
図1A〜1Cは、微生物試験標準を用いた、考えられる手順の概要を示す。
【００３８】
2つの参照用微生物のための乾燥バイオマス (2) は、ねじ式キャップ (6) を備えたプラスチック容器 (4) 内に供給され得る。参照サンプルを調製するには、ねじ式キャップ (6) を外し、ある量の溶媒 (例えば蒸留水又は脱イオン水) を加えて、乾燥ペレット (2) を再懸濁させる。容器 (4) を再封止した後、軽い振盪によって、又は追加的に若しくは代替的に、泡を形成しないようにピペット先端に液体を吸い上げては押し出すことを繰り返す (「混合ピペット操作」) (図示なし) ことによって、この手順を支援することができる。 
【００３９】
数分後、固体のバイオマスが「溶解」して見えなくなったら、キャップ (6) を再び開け、一定量の微生物懸濁液 (8) を容器 (4) から取り出し、IR分光分析サンプル支持プレート (10) 上の複数のサンプルスポット (A〜H、1〜12) に適用する。これは二重複製、三重複製、又はより多数の複製で行うことができる。図には、96個のサンプルスポット配列 (A〜Hの8行、1〜12の12列) を備えた2枚のサンプル支持プレート (10) の模式図を示す。一般に、スペクトル距離測定の統計学的手法は、試験標準の複製の数を増やすことによって改善され得るが、これに対応して、サンプル支持プレート上で実際に同定する分析サンプルについて、サンプルスポットの数が少なくなるという代償を払うことになる。明瞭化のために、後者は図示していない。試験標準懸濁液の液滴を、必要に応じて熱照射によって室温よりやや高い温度で、及び／又は空気流を用いて、乾燥させる。
【００４０】
次に、参照標準 (#1、#2) の微生物を、図示のように、IR分光光度計 (12a、12b) (好ましくは透過式) を用いて、実際のサンプルと同じ測定実施で測定する。そのような分光光度計の一例は、Bruker Optik GmbHから販売されるTENSOR II FT-IRである。その測定の結果は、例として図1Bの下側に示すように、吸光スペクトルである。分光分析で通常行われるように、光学密度 (O.D.) が波数の関数としてプロットされる。取得されたスペクトルは、特定の数のデータポイントについて、2回微分を行い、各例について正規化される。次に、微生物細胞の吸収バンド (特に、炭水化物及びタンパク質により生じるもの) が、背景の影響 (例えば水の吸収バンド) に対して最も目立つように、波数範囲を選択し、これによって最良の信号対背景比を得る。これには約1,300〜800 cm-1の範囲が特に好適である (図1C)。
【００４１】
ベクトル正規化により、次にスペクトル距離測定に関して評価するための、選択されたスペクトル範囲が準備される。微生物固有の吸光信号からスペクトル距離を決定するためのオプションの1つは、主成分分析である。ここで重要な問題は、異なる容器の微生物を選択することにより、信頼できる、わずかではあるが明確な差を有する別の成分が表わされ得ることである。微生物間スペクトル距離は本質的に下限値により画定されるが、赤外分光光度計の性能限界でスペクトル特異性について評価できるようにするために、この値の設定は高すぎてはならない。また、主成分のデータ雲 (測定の際の測定による一定の分散を呈する) が分散によりランダムに重なり合う危険性に対抗するために、この値は低すぎてもならない。
【００４２】
図2は、例として、2つの細菌菌株のIRスペクトルを基にした主成分分析の結果を示す概略図である。同じ微生物の複製間の微生物内スペクトル距離は、特定のピーク値Aを超えてはならない。もし超えた場合、同定を確認することは不可能になり、測定の品質に疑問を投げ掛けるものとなり得るからである。加えて、使用される異なる微生物の、異なる複製物間の微生物間スペクトル距離は、特定の下限値Bを下回ってはならない。もし下回った場合、その測定のスペクトル特異性は十分ではなかったことになるからである。個々の微生物懸濁液の複製の数が多いほど、そこから得られる評価の統計的信頼性が高くなる。しかしながら、サンプル支持プレート上での実際の微生物測定サンプルに利用できるスペースを考慮に入れる必要がある。
【００４３】
図2に見られるように、線で囲んで示されている、2つの別々のデータ雲が、同じ微生物を再び測定したときに、2次元主成分空間に形成される。これらのデータ雲は、1つの微生物の個別の複製物に関しては互いに近接しているが、他の微生物の複製物からは、それぞれ有意な距離 (この例では0.15任意単位より大きい距離) 離れている。微生物試験標準は、実際の微生物サンプルと同じ測定実施で検査されるため、この計算された主成分の距離により、IR分光光度計のスペクトル特異性についての評価を行うことが可能になる。同時に、同じ微生物の個々の複製物の、互いに対する、及びそれらの中での、微生物内スペクトル距離を用いることによって、IR測定の再現性を評価することができる。同じ微生物の複製物で得られた個々のデータポイントが、許容される最大距離Aを超える場合、これは、測定の再現性に問題があることを示唆していると見なすことができる。これに従って、実際のサンプルの平行測定をタグ付けすることができる。異なる微生物のデータ雲が互いに重なり合うような場合も、そのスペクトル特異性は適切でない可能性がある。このような場合、同定の質が低下し、そのサンプル支持プレートから得られた同定/特性付け結果は、その所与の測定条件において信頼できないものとしてラベル付けをする必要がある可能性がある。
【００４４】
上述の主成分分析の使用は、制限として理解されるべきものではなく、単に例示として見なすべきものである。本開示の原理は、スペクトル距離を決定する別の方法でも実施することができ、例えば、そのままのユークリッド幾何学的距離で、及び／又は階層クラスター分析を利用して、実施することができる。この試験スペクトルはまた、あらかじめ適切にトレーニングされたANN (人工ニューラルネットワーク分析)、PLS-DA (部分的最小二乗判別分析)、又はSVM (サポートベクターマシン) により分類することが可能である。
【００４５】
上述の本発明の原理は、スペクトルで識別可能な2つの微生物を利用して説明されている。ただし当業者には、3つ以上の好適な微生物を使用して、赤外分光分析のための微生物試験標準の提供が可能であることも理解されよう。この点において、基本的な考え方は、望ましいように拡張することができる。
【００４６】
本発明は、様々な具体例の実施形態を参照して上記で説明されている。しかしながら、記述されている実施形態の様々な態様又は詳細は、本発明の範囲から逸脱することなく改変することが可能であることが理解されよう。特に、異なる実施形態に関連して開示されている特性及び方法は、実施可能であると当業者が考える場合、望ましいように組み合わせることが可能である。更に、上記の説明は、本発明の説明のためのものであり、保護の範囲を制限するものではない。本発明の保護の範囲は、存在する可能性がある同等物を考慮に入れて、添付の請求項によってのみ定義されるものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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