(57)【要約】【課題】自己複製ＲＮＡを使用する、免疫化に対してのさらなるアプローチを提供すること。【解決手段】本発明は、ＲＮＡ成分およびポリペプチド成分を含む免疫原性組成物に関する。以下でより詳細に記載される通り、このＲＮＡ成分は自己複製ＲＮＡである。このポリペプチド成分は、インフルエンザウイルス抗原由来のエピトープ（第１のエピトープ）と、インフルエンザウイルス抗原由来のエピトープ（第２のエピトープ）をまた含むポリペプチドをコードするＲＮＡ成分とを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２０１３年１月１０日に出願された米国仮出願第６１／７５１，０７７号に対して利益を主張し、これの全体の内容が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
政府補助の記述
本発明は、国防高等研究計画局（ＤＡＲＰＡ）によって与えられた契約番号第ＨＲ００１１−１２−３−０００１号の下で、部分的に政府補助とともになされた。政府は本発明に対して特定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、インフルエンザウイルスに対する免疫化のための、ＲＮＡおよびタンパク質の混合物の、ウイルスによらない送達の分野におけるものである。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
核酸を基礎とするワクチンは、免疫化に対する魅力的なアプローチである。例えば、国際公開第２０１２／００６３６９号は、この目的のための自己複製ＲＮＡ分子の使用を開示しており、そして国際公開第２０１３／００６８４２号は、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドをコードする自己複製ＲＮＡとともに共送達されるアプローチを記載している。この２つのポリペプチドは同じ病原体に由来するが、同じポリペプチドである必要はない。したがって、国際公開第２０１３／００６８４２号は、それらはエピトープを共有してもよいか、または異なるエピトープを有してもよいが、同じ病原体に由来しなければならない、と開示している。これは、二つの異なる形態におけるエピトープ（ＲＮＡにコードされた形態における、病原体由来の第１のエピトープ；およびポリペプチドの形態における、同じ病原体由来の第２のエピトープ）を送達する組成物を提供しており、これは、このＲＮＡ単独またはこのポリペプチド単独を用いた免疫化と比較したとき、この病原体に対する免疫反応を増強し得る。
【０００５】
自己複製ＲＮＡを使用する、免疫化に対してのさらなるアプローチを提供することが本発明の目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１２／００６３６９号
【特許文献２】国際公開第２０１３／００６８４２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の開示
概して、本発明は、ＲＮＡ成分およびポリペプチド成分を含む免疫原性組成物に関する。以下でより詳細に記載される通り、このＲＮＡ成分は自己複製ＲＮＡである。このポリペプチド成分は、インフルエンザウイルス抗原由来のエピトープ（第１のエピトープ）と、インフルエンザウイルス抗原由来のエピトープ（第２のエピトープ）をまた含むポリペプチドをコードするＲＮＡ成分とを含む。国際公開第２０１３／００６８４２号において記載される通り、これらの２つの異なる様式においてエピトープを送達する免疫原性組成物は、このＲＮＡ単独またはこのポリペプチド単独を用いた免疫化と比較したとき、病原体（インフルエンザウイルス）に対する免疫反応を増強し得る。
【０００８】
したがって、本発明は、（ａ）インフルエンザウイルス抗原由来のエピトープを含むポリペプチドと、（ｂ）インフルエンザウイルス抗原由来のエピトープを含むポリペプチドをコードする自己複製ＲＮＡとを含む免疫原性組成物を提供する。
【０００９】
本発明は、（ａ）インフルエンザウイルス抗原由来のエピトープを含むポリペプチドを含む第１のキット成分と、（ｂ）インフルエンザウイルス抗原由来のエピトープを含むポリペプチドをコードする自己複製ＲＮＡとを含む免疫原性組成物を含む第２のキット成分とを含むキットもまた提供する。
【００１０】
本発明は、上述した通りの、ＲＮＡ分子およびポリペプチド分子の共送達（併用投与）によって、インフルエンザウイルス疾患および／または感染症を処置および／または予防するための方法、インフルエンザウイルスに対する免疫反応を誘導するための方法、ならびに被験者にワクチン接種するための方法もまた提供する。
【００１１】
本発明は、上述した通りの、ＲＮＡ分子およびポリペプチド分子の順次投与（プライム−ブースト）によって、インフルエンザウイルス疾患および／または感染症を処置および／または予防するための方法、インフルエンザウイルスに対する免疫反応を誘導するための方法、ならびに被験者にワクチン接種するための方法もまた提供する。
【００１２】
本発明の第１の実施形態において、第１のエピトープおよび第２のエピトープは両方ともインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）に由来する。
【００１３】
第２の実施形態において、第１のエピトープおよび第２のエピトープは両方ともインフルエンザＡウイルスに由来する。理想的には、それらは両方とも、同じＨＡサブタイプを有するインフルエンザＡウイルス株に由来し、例えば、両方ともＨ５サブタイプのインフルエンザＡウイルスに由来する。この実施形態の特定の局面において、第１のエピトープおよび第２のエピトープは両方とも、同じＨＡサブタイプ由来のヘマグルチニンのエピトープである。しかし、第１のエピトープおよび第２のエピトープは、異なるＨＡサブタイプ、例えば、Ｈ１株由来のものおよびＨ５株由来のもの、を有するインフルエンザＡウイルス株に由来することもまた可能である。
【００１４】
第３の実施形態において、第１のエピトープおよび第２のエピトープは両方ともインフルエンザＢウイルスに由来する。この実施形態の特定の局面において、第１のエピトープおよび第２のエピトープは両方ともインフルエンザＢウイルス由来のヘマグルチニンのエピトープである。
【００１５】
第４の実施形態において、第１のエピトープおよび第２のエピトープは両方とも、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様系統中のインフルエンザＢウイルス株に由来する。この実施形態の特定の局面において、第１のエピトープおよび第２のエピトープは両方とも、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様系統中のインフルエンザＢウイルス株由来のヘマグルチニンのエピトープに由来する。
【００１６】
第５の実施形態において、第１のエピトープおよび第２のエピトープは両方とも、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様系統中のインフルエンザＢウイルス株に由来する。この実施形態の特定の局面において、第１のエピトープおよび第２のエピトープは両方とも、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様系統中のインフルエンザＢウイルス株由来のヘマグルチニンのエピトープに由来する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
免疫原性組成物であって：（ｉ）インフルエンザウイルス抗原に由来する第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子と；（ｉｉ）インフルエンザウイルス抗原に由来する第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原と；
を含み、ここにおいて：
(a)該第１のエピトープおよび該第２のエピトープが、両方ともインフルエンザのヘマグルチニンに由来し；
(b)該第１のエピトープおよび該第２のエピトープが、両方ともインフルエンザＡウイルスに由来し；そして／または
(c)該第１のエピトープおよび該第２のエピトープが、両方ともインフルエンザＢウイルスに由来する、
免疫原性組成物。
（項目２）
前記第１のエピトープおよび前記第２のエピトープが、両方ともインフルエンザＡウイルスのヘマグルチニンに由来する、項目１に記載の免疫原性組成物。
（項目３）
前記第１のエピトープおよび前記第２のエピトープが、両方とも同じサブタイプのインフルエンザＡウイルスのヘマグルチニンに由来し、例えば、両方ともＨ５ヘマグルチニンに由来する、項目２に記載の免疫原性組成物。
（項目４）
前記第１のエピトープおよび前記第２のエピトープが、異なるサブタイプのインフルエンザＡウイルスのヘマグルチニンに由来する、項目２に記載の免疫原性組成物。
（項目５）
前記第１のエピトープおよび前記第２のエピトープが、両方とも同じインフルエンザＡウイルスのヘマグルチニンに由来する、項目３に記載の免疫原性組成物。
（項目６）
前記第１のエピトープおよび前記第２のエピトープが、両方ともインフルエンザＢウイルスのヘマグルチニンに由来する、項目１に記載の免疫原性組成物。
（項目７）
前記第１のエピトープおよび前記第２のエピトープが、両方とも同じ系統のインフルエンザＢウイルスのヘマグルチニンに由来する、項目６に記載の免疫原性組成物。
（項目８）
前記第１のエピトープおよび前記第２のエピトープが、両方とも同じインフルエンザＢウイルスのヘマグルチニンに由来する、項目７に記載の免疫原性組成物。
（項目９）
前記第１のエピトープおよび前記第２のエピトープが同一である、いずれかの前記項目に記載の免疫原性組成物。
（項目１０）
前記第１のポリペプチド抗原および前記第２のポリペプチド抗原が、少なくとも２つのＢ細胞エピトープを共有する、いずれかの前記項目に記載の免疫原性組成物。
（項目１１）
（ａ）前記第１のポリペプチド抗原および前記第２のポリペプチド抗原が、共通のアミノ酸配列であって、複数のエピトープを含み、そして８０個のアミノ酸もしくはそれより長いアミノ酸、例えば、１２０個のアミノ酸もしくはそれより長いアミノ酸、である、アミノ酸配列を共有し、そして／または（ｂ）該第１のポリペプチド抗原および該第２のポリペプチド抗原が、互いに少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、いずれかの前記項目に記載の免疫原性組成物。
（項目１２）
前記自己複製ＲＮＡが、アルファウイルス由来ＲＮＡレプリコンである、いずれかの前記項目に記載の免疫原性組成物。
（項目１３）
前記自己複製ＲＮＡ分子が、１つもしくはそれより多くの修飾されたヌクレオチドを含む、いずれかの前記項目に記載の免疫原性組成物。
（項目１４）
（ｉ）リポソーム、（ｉｉ）毒性がなくそして生分解性のポリマー微粒子、または（ｉｉｉ）カチオン性サブミクロン水中油型エマルジョンを含む、いずれかの前記項目に記載の免疫原性組成物。
（項目１５）
前記第２のポリペプチド抗原が、不活化されたインフルエンザウイルスワクチン、例えば、全ビリオンワクチン、スプリットビリオンワクチンまたは精製された表面抗原ワクチン、である、いずれかの前記項目に記載の免疫原性組成物。
（項目１６）
前記不活化されたインフルエンザウイルスワクチンが、アジュバント化されている、例えば、水中油型エマルジョンアジュバントでアジュバント化されている、項目１５に記載の免疫原性組成物。
（項目１７）
前記第２のポリペプチド抗原が、組み換えヘマグルチニンである、項目１〜項目１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
（項目１８）
インフルエンザ疾患および／またはインフルエンザ感染症を処置または予防するための方法であって、それを必要としている被験者に、治療的に有効量の項目１〜項目１７のいずれか１項に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
（項目１９）
被験者において免疫反応を誘導するための方法であって、それを必要としている被験者に、治療的に有効量の項目１〜項目１７のいずれか１項に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
（項目２０）
インフルエンザウイルス抗原に由来する第２のエピトープを含むポリペプチド抗原とともに使用するための、インフルエンザウイルス抗原に由来する第１のエピトープを含むポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子であって；ここにおいて（ａ）該第１のエピトープおよび該第２のエピトープが、両方ともインフルエンザのヘマグルチニンに由来し；（ｂ）該第１のエピトープおよび該第２のエピトープが、両方ともインフルエンザＡウイルスに由来し；そして／または（ｃ）該第１のエピトープおよび該第２のエピトープが、両方ともインフルエンザＢウイルスに由来する、自己複製ＲＮＡ分子。
（項目２１）
インフルエンザウイルス抗原に由来する第１のエピトープを含むポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子とともに使用するための、インフルエンザウイルス抗原に由来する第２のエピトープを含むポリペプチド抗原であって；ここにおいて（ａ）該第１のエピトープおよび該第２のエピトープが、両方ともインフルエンザのヘマグルチニンに由来し；（ｂ）該第１のエピトープおよび該第２のエピトープが、両方ともインフルエンザＡウイルスに由来し；そして／または（ｃ）該第１のエピトープおよび該第２のエピトープが、両方ともインフルエンザＢウイルスに由来する、ポリペプチド抗原。
（項目２２）
前記ポリペプチド抗原が、不活化されたインフルエンザウイルス抗原である、項目２０における使用のための自己複製ＲＮＡ分子、または項目２１における使用のためのポリペプチド抗原。
（項目２３）
（ａ）インフルエンザウイルス抗原に由来するエピトープを含むポリペプチドを含む第１のキット成分と、（ｂ）インフルエンザウイルス抗原に由来するエピトープを含むポリペプチドをコードする自己複製ＲＮＡを含む第２のキット成分と、を含むキット。
（項目２４）
前記第１のキット成分および前記第２のキット成分が、混合されて項目１〜項目１７のいずれか１項において定義される通りの組成物を提供することができる、項目２３に記載のキット。
（項目２５）
前記第１のキット成分が、必要に応じてアジュバント化されている不活化されたインフルエンザウイルスワクチン（例えば、全ビリオンワクチン、スプリットビリオンワクチンまたは精製された表面抗原ワクチン）である、項目２３または項目２４に記載のキット。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
インフルエンザウイルス抗原
インフルエンザウイルスには、３つの型（Ａ、ＢおよびＣ）がある。インフルエンザＡウイルスは、ヒト、動物および鳥類に感染する最も一般的なインフルエンザウイルスである。インフルエンザＢウイルス感染は殆どがヒトにおいて発生する。インフルエンザＣウイルスの感染は、ヒトまたは動物においていずれの重篤な症状も引き起こさない。
【００１８】
インフルエンザウイルス株は季節ごとに変化し得る。近年のパンデミック間期において、近年の季節毎の３価ワクチンは、２種類のインフルエンザＡ株（１種類のＨ１Ｎ１株および１種類のＨ３Ｎ２株）ならびに１種類のインフルエンザＢ株を含む。パンデミックインフルエンザ株の特徴は以下のものである：（ａ）近年流行しているヒト株におけるヘマグルチニンと比較して新しいヘマグルチニン、すなわち、１０年以上にわたってヒト集団中で顕性でなかったもの（例えばＨ２）、または以前にヒト集団中で全く見られなかったもの（例えば、一般的に、鳥類集団中にのみ見出されるＨ９）、を含み、そのため、ワクチン接種者および一般のヒト集団は、それらの株のヘマグルチニンに対して免疫学的にナイーブである；（ｂ）ヒト集団内で水平に伝染し得る；そして（ｃ）ヒトに対して病原性である。一般的に、パンデミック株はＨ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７またはＨ９サブタイプのインフルエンザＡウイルス株、例えば、Ｈ５Ｎ１株、Ｈ５Ｎ３株、Ｈ９Ｎ２株、Ｈ２Ｎ２株、Ｈ６Ｎ１株、Ｈ７Ｎ１株、Ｈ７Ｎ７株およびＨ７Ｎ９株である。Ｈ５サブタイプの中において、あるウイルスは異なる複数の分岐群に分類され得る。
【００１９】
近年、インフルエンザＡウイルスは、１７種類のＨＡサブタイプ：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６およびＨ１７を提示する。それはまた、９種類のＮＡ（ノイラミニダーゼ）サブタイプ：Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８およびＮ９を提示する。
【００２０】
近年、インフルエンザＢウイルスは異なるＨＡサブタイプを提示しないが、インフルエンザＢウイルス株は２つの異なる系統に分類される。これらの系統は１９８０年代後期に出現した。そして、これらの系統は、抗原的および／または遺伝的に互いに区別され得るＨＡを有する（Ｒｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：２７３７−４２）。近年のインフルエンザＢウイルス株は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様であるか、またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様であるかのいずれかである。これら２つの系統中の株は、通常は抗原的に区別されるが、アミノ酸配列における相違もまた、それらを区別するために記載されており、例えば、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様の株は多くの場合（常にではないが）、「Ｌｅｅ４０」ＨＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ配列ＧＩ：３２５１７６）に関しての番号でアミノ酸残基１６４に欠失を有するＨＡタンパク質を有する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、第１のエピトープおよび第２のエピトープは両方ともインフルエンザウイルスのヘマグルチニンに由来する。例えば：（ａ）第１のエピトープはインフルエンザＡウイルスのヘマグルチニンに由来してもよく、そして第２のエピトープはインフルエンザＢウイルスのヘマグルチニンに由来してもよかった；（ｂ）第１のエピトープはインフルエンザＡウイルスのヘマグルチニンに由来してもよく、そして第２のエピトープはインフルエンザＡウイルスのヘマグルチニンに由来してもよかった；または（ｃ）第１のエピトープはインフルエンザＢウイルスのヘマグルチニンに由来してもよく、そして第２のエピトープインフルエンザＢウイルスのヘマグルチニンに由来してもよかった。理想的には、これら２つのエピトープは両方とも、同じインフルエンザウイルス型に由来し、例えば、両方ともＡに由来するか、または両方ともＢに由来する。
【００２２】
第１のエピトープおよび第２のエピトープが両方ともインフルエンザＡウイルスに由来する実施形態において、理想的には、それらは、両方ともヘマグルチニンのエピトープであり、そして同じＨＡサブタイプを有するインフルエンザＡウイルス株に由来する。例えば、両方のエピトープは、Ｈ１ヘマグルチニン、Ｈ２ヘマグルチニン、Ｈ３ヘマグルチニン、Ｈ４ヘマグルチニン、Ｈ５ヘマグルチニン、Ｈ６ヘマグルチニン、Ｈ７ヘマグルチニン、Ｈ８ヘマグルチニン、Ｈ９ヘマグルチニン、Ｈ１０ヘマグルチニン、Ｈ１１ヘマグルチニン、Ｈ１２ヘマグルチニン、Ｈ１３ヘマグルチニン、Ｈ１４ヘマグルチニン、Ｈ１５ヘマグルチニン、Ｈ１６ヘマグルチニンまたはＨ１７ヘマグルチニンに由来することが可能であった。特定の実施形態において、両方のエピトープはＨ１ヘマグルチニン、Ｈ３ヘマグルチニンまたはＨ５ヘマグルチニンに由来する。しかし、上述の通り、第１のエピトープおよび第２のエピトープが両方ともインフルエンザＡウイルスのヘマグルチニンのエピトープであるが、異なるＨＡサブタイプを有するインフルエンザＡウイルス株に由来することもまた可能である（この場合において、これら２つのエピトープが、それでも、同じ抗ＨＡ抗体によって認識され得ることは依然として可能であり、例えば、これら２つのＨＡサブタイプが交差反応性のエピトープを共有する場合である）。
【００２３】
第１のエピトープおよび第２のエピトープが両方ともインフルエンザＢウイルスに由来する実施形態において、理想的には、それらは、両方ともヘマグルチニンのエピトープであり、そして同じ系統中のインフルエンザＢウイルス株に由来する。例えば、両方のエピトープはＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様系統中の株に由来してもよかったし、または両方のエピトープはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様系統中の株に由来してもよかった。
【００２４】
全ての実施形態において、通常、第１のエピトープおよび第２のエピトープは同じインフルエンザウイルス株に由来する。特定の実施形態において、第１のエピトープおよび第２のエピトープは同じエピトープでる。しかし、いくつかの実施形態において、第１のエピトープおよび第２のエピトープは異なるインフルエンザウイルス株に由来し、これらは、例えば、同じＨＡサブタイプを有するインフルエンザＡウイルス株（例えば、２ｘＨ１株または２ｘＨ３株）であってもよいし、または異なるＨＡサブタイプを有するインフルエンザＡウイルス株（例えば、Ｈ１株およびＨ５株）であってもよい。
【００２５】
自己複製ＲＮＡ
本発明の免疫原性組成物は、インフルエンザウイルス抗原由来のエピトープ（第２のエピトープ）を含むポリペプチドをコードするＲＮＡ成分を含む。被験者への投与の後、このＲＮＡは細胞の内部で翻訳されてインサイチュでインフルエンザウイルスのポリペプチドを提供する。
【００２６】
ＲＮＡは＋鎖であるべきであり、そしてそうすることで、いずれの介在する複製の工程、例えば逆転写、も必要とせずに細胞によって翻訳され得る。有利な点として、これは、免疫細胞によって発現されるＴＬＲ７受容体にもまた結合することができ、それによってアジュバント効果を開始することができる。好ましい＋鎖ＲＮＡは自己複製ＲＮＡ分子である。自己複製ＲＮＡ分子（レプリコン）は、脊椎動物細胞に送達されたとき、いずれのタンパク質もない場合でさえ、それ自体からの（それ自体から生成するアンチセンスコピーを経由して）転写によって複数の娘ＲＮＡの産生をもたらし得る。したがって、典型的には、自己複製ＲＮＡ分子は、細胞への送達の後に直接翻訳され得る＋鎖の分子であり、そしてこの翻訳は、送達されたＲＮＡからアンチセンス転写物およびセンス転写物の両方をその後産生するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを提供する。したがって、この送達されたＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの産生をもたらす。これらの娘ＲＮＡおよび同じ鎖上のサブゲノム転写物は、コードされるポリペプチドのインサイチュの発現を提供するためにそれら自体翻訳されてもよいし、またはこのポリペプチドのインサイチュの発現を提供するために翻訳される送達されたＲＮＡと同じセンスを有するさらなる転写物を提供するために転写されてもよい。この一連の転写の全体としての結果は、導入レプリコンＲＮＡの数における膨大な増幅であり、そしてそれによって、コードされるポリペプチドはその細胞の主要なポリペプチド産物となる。
【００２７】
自己複製を達成するのに適した１つの系は、アルファウイルスを基礎とするＲＮＡレプリコンを使用することである。これらの＋鎖レプリコンは、レプリカーゼ（またはレプリカーゼ−トランスクリプターゼ）を産生するための細胞への送達の後に翻訳される。このレプリカーゼは、＋鎖送達ＲＮＡのゲノム−鎖コピーを生成する複製複合体を提供するために自己切断するポリタンパク質として翻訳される。これらの−鎖転写物は、それら自体転写されることができて、＋鎖親ＲＮＡのさらなるコピーを与え、そしてまた、このポリペプチドをコードするサブゲノム転写物も与える。したがって、このサブゲノム転写物の翻訳は、感染細胞によるこのポリペプチドのインサイチュの発現をもたらす。適切なアルファウイルスレプリコンには、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用し得る。変異型または野生型ウイルスの配列が使用され得、例えば、ＶＥＥＶの弱毒化ＴＣ８３変異型が、レプリコン中で使用されている（国際公開第２００５／１１３７８２号）。
【００２８】
したがって、好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、（ｉ）この自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写し得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび（ｉｉ）目的のポリペプチドをコードする。このポリメラーゼは、例えば、１つもしくはそれ以上のアルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４を含むアルファウイルスレプリカーゼであり得る。
【００２９】
天然アルファウイルスゲノムは、非構造レプリカーゼポリタンパク質に加えて構造ビリオンタンパク質をコードするのに対して、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好ましい。したがって、好ましい自己複製ＲＮＡは、細胞中でそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの産生をもたらし得るが、ＲＮＡ含有ビリオンの産生はもたらさない。これらのビリオンを産生することができないということは、野生型アルファウイルスと異なり、この自己複製ＲＮＡ分子は感染性形態においてそれ自体を永続させることができないことを意味する。野生型ウイルスにおいて永続化のために必要なアルファウイルス構造タンパク質は本発明の自己複製ＲＮＡに存在せず、そしてそれらの場所は、目的のポリペプチドをコードする遺伝子（単数または複数）によって使用されており、そのため、サブゲノム転写物は、構造アルファウイルスビリオンタンパク質ではなくこのポリペプチドをコードする。
【００３０】
したがって、本発明に有用な自己複製ＲＮＡ分子は、２つのオープンリーディングフレームを有し得る。第１の（５’）オープンリーディングフレームはレプリカーゼをコードし；第２の（３’）オープンリーディングフレームはポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、このＲＮＡは、例えば、さらなるポリペプチド（以下を参照のこと）をコードするためにか、またはアクセサリーポリペプチドをコードするために追加の（例えば下流に）オープンリーディングフレームを有し得る。
【００３１】
自己複製ＲＮＡ分子は、コードされるレプリカーゼと適合する５’配列を有し得る。
【００３２】
自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス以外のウイルス、特に、プラス鎖ＲＮＡウイルス、そして特に、ピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、カリシウイルスまたはコロナウイルスに由来してもよいし、またはそれに基づいてもよい。しかし、アルファウイルスが好ましく、そして適切な野生型アルファウイルス配列は周知であり、そして配列保管機関、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、から入手可能である。適切なアルファウイルスの代表的な例としてアウラ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６８）、ベバルウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６００、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４０）、カバス（Ｃａｂａｓｓｏｕ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２２）、チクングニヤウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６４、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４１）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４２）、フォートモーガン（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４３）、キジラガチ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２７）、マヤロ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６６）、マヤロウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２７７）、ミッデルブルグ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７０）、ムカンボウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４４）、ヌドゥム（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７１）、ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４５）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、セムリキ森林（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、シンドビスウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６８、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４８）、トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２５）、トリニティ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−４６９）、ユナ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７４）、ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）、西部ウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６２２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５２）、ワタロア（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２６）およびＹ−６２−３３（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７５）が挙げられる。複数の異なるアルファウイルス由来の成分を含むキメラのアルファウイルスレプリコンもまた有用であり得る。
【００３３】
自己複製ＲＮＡ分子は様々な長さを有し得るが、それらは典型的には５０００〜２５０００ヌクレオチド長であり、例えば、８０００〜１５０００ヌクレオチドまたは９０００〜１２０００ヌクレオチドである。したがってこのＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの送達において見られるＲＮＡより長い。
【００３４】
本発明に有用なＲＮＡ分子は、５’キャップ（例えば７メチルグアノシン）を有し得る。このキャップはこのＲＮＡのインビボでの翻訳を増強し得る。
【００３５】
本発明に有用なＲＮＡ分子の５’ヌクレオチドは５’トリホスフェート基を有し得る。キャッピングされたＲＮＡ中で、これは５’−から−５’への架橋によって７メチルグアノシンに結合され得る。５’トリホスフェートは、ＲＩＧ−Ｉ結合を増強することができ、そしてしたがってアジュバント効果を促進し得る。
【００３６】
ＲＮＡ分子は、３’ポリＡテールを有し得る。それは、それの３’末端付近にポリＡポリメラーゼ認識配列（例えばＡＡＵＡＡＡ）をもまた含み得る。
【００３７】
本発明に有用なＲＮＡ分子は典型的には一本鎖である。一般的に、一本鎖ＲＮＡは、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＲＮＡヘリカーゼおよび／またはＰＫＲとの結合によってアジュバント効果を開始させることができる。二本鎖の形態で送達されたＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）はＴＬＲ３と結合することができ、そしてこの受容体は、一本鎖ＲＮＡの複製の間か、または一本鎖ＲＮＡの二次構造内かのいずれかにおいて形成されるｄｓＲＮＡによってもまた作動させられ得る。
【００３８】
本発明に有用なＲＮＡ分子は、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって従来的に調製され得る。ＩＶＴには、細菌内でプラスミドの形態において生成され、そして増幅された（ｃＤＮＡ）テンプレートを使用してもよいし、または（例えば、遺伝子合成および／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）構築方法によって）合成的に生成された（ｃＤＮＡ）テンプレートを使用してもよい。例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、バクテリオファージＴ７、Ｔ３またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）は、ＤＮＡテンプレートからＲＮＡを転写するために使用され得る。適切なキャッピング反応およびポリＡ付加反応は必要に応じて使用され得る（けれども、通常、レプリコンのポリＡはＤＮＡテンプレート内にコードされる）。これらのＲＮＡポリメラーゼは、転写された５’ヌクレオチド（単数または複数）に対する厳密な必要条件を有し得、そしていくつかの実施形態において、ＩＶＴによって転写されたＲＮＡが、それ自体にコードされるレプリカーゼの基質として効率的に機能し得ることを確実にするために、これらの必要条件は、このコードされるレプリカーゼの必要条件と適合しなければならない。
【００３９】
国際公開第２０１１／００５７９９号において議論されている通り、自己複製ＲＮＡは、修飾された核酸塩基を有する１つもしくはそれより多くのヌクレオチドを（任意の５’キャップ構造に加えて）含み得る。例えば、自己複製ＲＮＡは、１つもしくはそれより多くの修飾されたピリミジン核酸塩基、例えば、プソイドウリジンおよび／または５メチルシトシン残基、を含み得る。しかし、いくつかの実施形態において、このＲＮＡは修飾された核酸塩基を含まず、そして修飾されたヌクレオチドを含まなくてもよい、すなわち、このＲＮＡ内の全てのヌクレオチドは標準的なＡ、Ｃ、ＧおよびＵリボヌクレオチドである（７’メチルグアノシンを含み得る任意の５’キャップ構造を除外して）。別の実施形態において、このＲＮＡは、７’メチルグアノシンを含む５’キャップを含んでもよく、そして最初の１個、２個または３個の５’リボヌクレオチドはそのリボースの２’位でメチル化されていてもよい。
【００４０】
本発明に使用されるＲＮＡは、理想的には、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合のみを含むが、いくつかの実施形態において、これはホスホロアミデート、ホスホロチオエートおよび／またはメチルホスホネート結合を含み得る。
【００４１】
ＲＮＡは、上記でより詳細に記載される通り、インフルエンザウイルス抗原由来のエピトープを含むポリペプチドをコードする。理想的には、このＲＮＡはインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの断片を含むポリペプチドをコードする。これは、膜集合抗原または分泌抗原よりむしろ可溶性細胞質抗原をコードし得る（けれども、細胞は、免疫プロセッシングの一環として細胞の表面上にこの細胞質抗原を提示し得る）。このポリペプチドのインサイチュでの発現は抗インフルエンザ免疫反応を誘発する。例えば、それは、インフルエンザビリオンを認識する抗体、例えば、ビリオン表面ヘマグルチニンに結合する抗体、の生産をもたらし得る。理想的には、この誘発された抗体は中和抗体または防御抗体である。インサイチュで発現させられたポリペプチドによって誘発された抗体は、ポリペプチドと、そしてまた、本発明の免疫原性組成物の中で送達されたポリペプチドとの両方に理想的には免疫特異的に結合し得る。
【００４２】
ポリペプチド成分
本発明の免疫原性組成物はポリペプチド成分を含み、そしてこのポリペプチドはインフルエンザウイルス抗原由来のエピトープ（第１のエピトープ）を含む。
【００４３】
ポリペプチド成分は単一のポリペプチドであってもよいが、複数鎖のポリペプチド構造（例えば、ポリペプチド複合体、例えば、２つもしくはそれより多くのタンパク質によって形成される複合体）、多量体タンパク質（例えば、３量体ヘマグルチニン）または大きなポリペプチド構造、例えばＶＬＰ（ウイルス様粒子）、であってもよい。同様に、自己複製ＲＮＡは、１つより多くのインフルエンザウイルスポリペプチドをコードしてもよく、例えば、それは、互いに結合して複合体を形成し得る２つもしくはそれより多くの異なるポリペプチドをコードしてもよいし、または１種類より多くのインフルエンザウイルス株に由来する（例えば、少なくとも１種類のインフルエンザＡウイルスおよび少なくとも１種類のインフルエンザＢウイルスに由来する）ポリペプチド（例えばＨＡ）を発現してもよい。実施上の利便性のために、理想的には、自己複製ＲＮＡは５つもしくはそれより少ないポリペプチドを発現する。
【００４４】
理想的には、組成物中のポリペプチド（第１のポリペプチド）および自己複製ＲＮＡによってコードされたポリペプチド（第２のポリペプチド）は少なくとも１つのエピトープを共有する。それらは多くのエピトープを共有してもよく、特に、この２つのポリペプチドが長く（例えば、８０ａａより長く）、そしてそれぞれが複数のエピトープを含むとき、そうである。
【００４５】
特定の実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個または少なくとも５個のＢ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープを共有する。特定の実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、少なくとも１つの免疫優性エピトープを共有する。特定の実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、同じ免疫優性エピトープ（単数または複数）または同じ一級（ｐｒｉｍａｒｙ）免疫優性エピトープを共有する。
【００４６】
通常、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、共通のアミノ酸配列を共有し、例えば、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが同一である場合、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドの断片である場合、第２のポリペプチドが第１のポリペプチドの断片である場合、第１のポリペプチドが、核となるインフルエンザ配列の、第１の融合相手との融合物である場合、および第２のポリペプチドが、核となるインフルエンザ配列の、第２の融合相手との融合物である場合などがある。理想的には、この共通のアミノ酸配列は複数のエピトープを含み、そしてこれは４０個のアミノ酸またはそれより長くてもよく、例えば、≧６０ａａ、≧８０ａａ、≧１００ａａ、≧１２０ａａ、≧１４０ａａ、≧１６０ａａ、≧１８０ａａ、≧２００ａａ、≧２２０ａａ、≧２４０ａａ、≧２６０ａａ、≧２８０ａａ、≧３００ａａ、≧３２０ａａ、≧３４０ａａ、≧３６０ａａ、≧３８０ａａ、≧４００ａａまたはそれより多い。この共通のアミノ酸配列は、完全なＨＡ１ヘマグルチニンサブユニットまたはそれの免疫原性断片を含み得る。
【００４７】
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、互いに少なくともｘ％のアミノ酸配列同一性を有し、ここでｘの値は８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８または９９である。一方のポリペプチドが他方より短い場合、配列同一性は、より短いポリペプチドの長さにわたって計算されるべきである。２つのアミノ酸配列間の百分率配列同一性への言及は、アラインメントさせられたとき、その百分率のアミノ酸が、この２つの配列中で同じであることを意味する。このアラインメントおよび百分率相同性もしくは配列同一性は、当技術分野において公知のソフトウェアプログラムを使用して決定され得る。好ましいアラインメントは、１２のギャップ開始ペナルティおよび２のギャップ伸張ペナルティ、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスを用いたアフィンギャップ探索を使用してＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性探索アルゴリズムによって決定される。
【００４８】
インフルエンザ由来アミノ酸配列に加えて、ポリペプチドは付加的な配列、例えば、発現、産生、精製または検出を容易にする配列（例えば、ポリＨｉｓ配列、タグなど）、を含み得る。
【００４９】
ポリペプチドは通常、単離または精製されている。したがって、これは、妥当な場合、通常、それらが天然で共に見出される分子と会合していない。
【００５０】
通常、ポリペプチドは、組換え宿主系における発現によって調製される。適切な組換え宿主細胞として、例えば、昆虫細胞（例えば、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、哺乳類細胞（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコおよびげっ歯類（例えばハムスター）、鳥類細胞（例えば、ニワトリ、アヒルおよびガチョウ）、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種）、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、テトラヒメナの細胞（例えばＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）またはこれらの組合せが挙げられる。多くの適切な昆虫細胞および哺乳類細胞が当技術分野において周知である。適切な昆虫細胞として、例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｎ５細胞、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｓ２細胞および高度５細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉのＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４親細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するクローン分離株）が挙げられる。適切な哺乳動物細胞として、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞、典型的には剪断されたアデノウイルス５型ＤＮＡによって形質転換されている）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、２９３−Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＥＲＣ．６細胞（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７１）、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７５）、胎児アカゲザル肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＬ−１６０）、メイディン−ダービーウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞、メイディン−ダービーイヌ腎臓（「ＭＤＣＫ」）細胞（例えば、ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４；またはＭＤＣＫ  ３３０１６、ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（例えばＢＨＫ２１−Ｆ）、ＨＫＣＣ細胞などが挙げられる。適切な鳥類細胞として、例えば、ニワトリ胚性幹細胞（例えばＥＢｘ（登録商標）細胞）、ニワトリ胚性線維芽細胞、ニワトリ胚性生殖細胞、アヒル細胞（例えば、ＡＧＥ１．ＣＲおよびＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ細胞株、これらは、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７：４９７５−４９８２（２００９）および国際公開第２００５／０４２７２８号において記載されている）、ＥＢ６６細胞などが挙げられる。
【００５１】
適切な昆虫細胞発現系、例えばバキュロウイルス系、は当業者に公知であり、そして例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）において記載されている。バキュロウイルス／挿入細胞発現系のための材料および方法はキットの形態で市販されている。同様に、細菌発現系および哺乳類細胞発現系もまた当技術分野において公知である。
【００５２】
ポリペプチドをコードする組換えコンストラクトは、従来の方法を使用して適切なベクター内に調製され得る。昆虫細胞または哺乳類細胞における組換えタンパク質の発現のための多数の適切なベクターは、当技術分野において周知であり、そして慣用されるものである。適切なベクターは、多数の成分（１つもしくはそれより多くの以下のものを含むが、これらに限定されない）を含み得る：複製の起点；選択マーカー遺伝子；１つもしくはそれより多くの発現制御エレメント、例えば、転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）および／または１つもしくはそれより多くの翻訳シグナル；ならびに選択された宿主細胞における分泌経路を標的とするためのシグナル配列またはリーダー配列（例えば、哺乳類起源のもの、または異種の哺乳類もしくは哺乳類以外の種に由来するもの）。例えば、昆虫細胞における発現のために、適切なバキュロウイルス発現ベクター、例えばｐＦａｓｔＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、が組換えバキュロウイルス粒子を生産するために使用される。このバキュロウイルス粒子は増幅され、そして昆虫細胞に感染させて組換えタンパク質を発現させるために使用される。哺乳類細胞における発現のために、所望の哺乳類宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）においてこのコンストラクトの発現を駆動するベクターが使用される。
【００５３】
ポリペプチドは、任意の適切な方法を使用して精製され得る。例えば、イムノアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するための方法が当技術分野において公知である。沈殿および様々な種類のクロマトグラフィー（例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、キレート化クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィー）を含む、所望のタンパク質を精製するための適切な方法が、当技術分野において周知である。適切な精製スキームは、２種類もしくはそれより多くのこれらの適切な方法もしくは他の適した方法を使用して創出され得る。所望の場合、このポリペプチドは、精製を容易にする「タグ」、例えば、エピトープタグまたはＨｉｓタグ、を含み得る。このようなタグ付けされたポリペプチドは、例えば、馴化培地から、キレート化クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーにより簡便に精製され得る。
【００５４】
本発明に使用されるポリペプチド抗原は、Ｆｌｕｂｌｏｋ（登録商標）製品の中に見られるような組み換えポリペプチドであり得る。この製品は、化学的に規定された脂質、ビタミン、アミノ酸および無機塩から構成される無血清培地中で培養された、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞に由来する連続昆虫細胞株において発現させられた精製ＨＡポリペプチドを含む。このポリペプチドは、バキュロウイルスベクター（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス）によってこの細胞株中で発現させられ、そしてその後、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）を用いてこの細胞から抽出され、そしてカラムクロマトグラフィーによって精製される。Ｆｌｕｂｌｏｋ（登録商標）製品の一回量は、インフルエンザ株毎に４５μｇのＨＡを含み、すなわち、３価の用量毎に１３５μｇを含む。これは、塩化ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウムおよびポリソルベート２０もまた含む。
【００５５】
組換え宿主系において発現させられたポリペプチドを使用することに代わる有用なものとして、インフルエンザビリオン由来のヘマグルチニンを含む従来のインフルエンザワクチンを使用することがある。したがって、本発明は、自己複製ＲＮＡを従来のインフルエンザワクチンと併せて使用することができ、それによって後者を改善する。ビリオン由来インフルエンザワクチンは、生ウイルスに基づくか、または不活化ウイルスに基づくかのいずれかであり、そして不活化ワクチンは、全ビリオン、「スプリット」ビリオンに基づいてもよいし、または精製された表面抗原に基づいてもよい。ビリオン由来ＨＡは、ウイロゾームの形態においてもまた提供され得る。本発明は、全てのこれらの種類のインフルエンザワクチンとともに使用され得る。ビリオン由来インフルエンザワクチン組成物は、アジュバント化されていなくてもよいし、または、例えば、水中油型エマルジョン、例えば、スクアレン含有エマルジョンＭＦ５９およびＡＳ０３、を用いてアジュバント化されていてもよい。
【００５６】
不活化ウイルスが使用される場合、ポリペプチド含有組成物は、全ビリオン、スプリットビリオンまたは精製された表面抗原（ヘマグルチニンを含み、そして、通常、ノイラミニダーゼもまた含む）を含み得る。ウイルスを不活化するための化学的手段として、有効量の１種類もしくはそれより多くの以下の薬剤を用いた処理が挙げられる：界面活性剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミンまたはそれらの組み合わせ。ウイルス不活化の非化学的方法は当技術分野において公知であり、例えば、ＵＶ光またはガンマ線照射のようなものがある。
【００５７】
スプリットビリオンは、精製されたビリオンを界面活性剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコレート、リン酸トリ−Ｎ−ブチル、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ９など）で処理することによって取得されてサブビリオン調製物を生産し、これは「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」スプリットプロセスを含む。インフルエンザウイルスをスプリットする方法は、例えば、当技術分野において周知であり、例えば、国際出願第０２／２８４２２号、国際出願第０２／０６７９８３号、国際出願第０２／０７４３３６号、国際出願第０１／２１１５１号、国際出願第０２／０９７０７２号、国際出願第２００５／１１３７５６号などを参照のこと。このウイルスのスプリットは、崩壊濃度のスプリット剤を用いて全ウイルス（感染性であろうと非感染性であろうと）を典型的には崩壊させるかまたは断片化させることによって遂行される。この崩壊は、ウイルスタンパク質の完全または部分的な可溶化をもたらし、このウイルスの統合性を変化させる。好ましいスプリット剤は非イオン性界面活性剤またはイオン性（例えばカチオン性）界面活性剤（例えばカチオン性）であり、例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、ＮＰ９、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、リン酸トリ−Ｎ−ブチル、セタブロン、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミンおよびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−もしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１）、ポリオキシエチレンソルビタンエーテル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。１つの有用なスプリット手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続効果を使用し、そしてスプリットは最初のビリオン精製の間（例えば、ショ糖密度勾配溶液中）に起こり得る。したがって、スプリットのプロセスは、ビリオン含有材料の浄化（ビリオン以外の材料を除去するため）と、収集されたビリオンの濃縮（例えば、吸着方法、例えばＣａＨＰＯ４吸着、を使用して）と、ビリオン以外の材料からの全ビリオンの分離と、密度勾配遠心工程（例えば、スプリット剤、例えばデオキシコール酸ナトリウム、を含むショ糖勾配を使用する）における、スプリット剤を使用したビリオンのスプリットと、その後の、望まない材料を除去するための濾過（例えば限外濾過）とを含み得る。別の有用なスプリットビリオンの調製は、デオキシコール酸ナトリウムでビリオンをスプリットさせ、そしてその後、不活化を確実にするためにデオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドを使用し、その後限外濾過および除菌濾過することによってなされる。スプリットインフルエンザワクチンの例には、ＢＥＧＲＩＶＡＣ（登録商標）��品、ＦＬＵＡＲＩＸ（登録商標）製品、ＦＬＵＺＯＮＥ（登録商標）製品およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（登録商標）製品がある。
【００５８】
精製されたインフルエンザウイルス表面抗原ワクチンは表面抗原ＨＡを含み、そして典型的にはＮＡをもまた含む。精製された形態でこれらのタンパク質を調製するためのプロセスは当技術分野において周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮ（登録商標）製品、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（登録商標）製品およびＩＮＦＬＵＶＡＣ（登録商標）製品は、インフルエンザサブユニットワクチンである。
【００５９】
別の形態の不活化抗原にはウイロソーム（核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子；Ｈｕｃｋｒｉｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３７３：７４−９１）がある。ウイロソームは、界面活性剤を用いたウイルスの可溶化、その後の、ヌクレオキャプシドの除去、およびウイルス糖タンパク質を含む膜の再構成によって調製され得る。ウイロソームを調製するための代替的な方法は、リポソームの膜中にウイルスタンパク質を与えるために、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に添加することを含む。
【００６０】
ＨＡは、近年の不活化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、そしてワクチン用量は、ＨＡレベル（典型的にはＳＲＩＤによって計測される）を参照することによって規格化される。既存のワクチンは、典型的には、株毎に約１５μｇのＨＡを含むが、より低用量が使用され得る（例えば、子供に対して、またはパンデミックの状況下で、あるいはアジュバントを使用するとき）。分割量、例えば、１／２（すなわち、株毎に７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８、が使用され、同様に、より高用量（例えば、３ｘまたは９ｘ用量；Ｔｒｅａｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １７３：１４６７−７０，Ｋｅｉｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：５０７−１０）も使用される。したがって、ワクチンは、インフルエンザ株毎に０．１μｇおよび１５０μｇの間のＨＡ、特に、０．１μｇと５０μｇの間、例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇ、のＨＡを含み得る。特定の用量として、例えば、株毎に、約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約３．７５、約１．９、約１．５などが挙げられる。
【００６１】
本発明は、生ワクチンとともにもまた使用され得る。通常、このようなワクチンは、ビリオン含有液からビリオンを精製することによって調製される。例えば、この液は遠心分離によって浄化され、そして緩衝剤（例えば、ショ糖、リン酸カリウムおよびグルタミン酸一ナトリウムを含む）を用いて安定化され得る。様々な形態のインフルエンザウイルスワクチンが近年利用可能である（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（ｅｄｓ．  Ｐｌｏｔｋｉｎｓ  ＆  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ）．４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００４，ＩＳＢＮ：０−７２１６−９６８８−０の第１７章および第１８章を参照のこと）。生ウイルスワクチンとしてＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＦＬＵＭＩＳＴ（登録商標）製品が挙げられる。このウイルスは典型的には弱毒化されており、そしてこれは温度感受性であってもよく、そして／または低温適応性であってもよい。生ワクチンについて、投与量は、ＨＡ含有量よりむしろ５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）または蛍光フォーカス単位（ＦＦＵ）によって計測され、そして株毎に１０６および１０８の間の（特に、１０６．５〜１０７．５の間の）ＴＣＩＤ５０またはＦＦＵが典型的である。
【００６２】
本発明に使用されるインフルエンザ株は、野生型のウイルスにおいて見出されるような天然のＨＡ、または改変されたＨＡを有し得る。例えば、ウイルスを鳥類において高度に病原性にさせる決定基（例えば、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位周辺の超塩基性領域）を除去するためにＨＡを改変することは公知である。逆遺伝学の使用はこのような改変を容易にする。
【００６３】
全ての実施形態において、従来のウイルス由来ポリペプチドを使用するものであろうと組み換えポリペプチドを使用するものであろうと、本発明に使用される組成物は、単一株のインフルエンザウイルスに由来するＨＡポリペプチド（１価）または複数株に由来するＨＡポリペプチド（多価）を含み得る。したがって、組成物は、１種類もしくはそれより多くの（例えば、１種類、２種類、３種類、４種類もしくはそれより多くの）インフルエンザウイルス株、例えば、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルス、に由来するＨＡを含み得る。ワクチンが１種類より多くの株に由来するＨＡを含む場合、異なる株に由来するＨＡは、典型的には、別々に調製され、そしてその後混合される。３価ワクチンが典型的であり、２種類のインフルエンザＡウイルス株（例えば、Ｈ１株およびＨ３株、例えば、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）に由来するＨＡおよび１種類のインフルエンザＢウイルス株に由来するＨＡを含む（すなわち、典型的な３価季節性インフルエンザワクチンにおいて見られる株の組み合わせ）。４価ワクチンもまた有用であり（国際出願第２００８／０６８６３１号）、２種類のインフルエンザＡウイルス株に由来するＨＡおよび２種類のインフルエンザＢウイルス株に由来するＨＡ、あるいは３種類のインフルエンザＡウイルス株に由来するＨＡおよび１種類のインフルエンザＢウイルス株に由来するＨＡを含む。２種類のインフルエンザＡ株（例えば、Ｈ１株およびＨ３株、例えば、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）に由来するＨＡならびに２種類のインフルエンザＢ株（例えば、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株の１種類の株およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株の１種類の株）に由来するＨＡを有する４価ワクチンは特に有用である。
【００６４】
送達系
ＲＮＡは、裸のＲＮＡとして（例えば、単なるＲＮＡの水溶液として）送達され得るが、細胞内への移入を増強し、そしてまた、後の細胞内効果も増強するために、特定の実施形態において、ＲＮＡ分子は、送達系、例えば、粒子状送達系またはエマルジョン送達系、と組み合わせて投与される。したがって、ポリポプチド成分およびＲＮＡ成分に加え、本発明の組成物は、追加の成分（例えば、脂質、ポリマーまたは標的細胞内へのＲＮＡの移入を容易にし得る他の成分）を含み得る。多くの送達系は、当業者に周知である。
【００６５】
ＲＮＡは、受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞内に導入され得る（例えば、米国特許第６，０９０，６１９号、Ｗｕ  ＆  Ｗｕ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４６２１およびＣｕｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：８８５０）。米国特許第６，０８３，７４１号は、それ自体インテグリン受容体結合部分（例えば、ＡＧＤ配列を有する環状ペプチド）にカップリングされているポリカチオン部分（例えば、３〜１００個のリジン残基を有するポリＬ−リジン）に核酸を結合させることによって、哺乳類細胞内に外因性の核酸を導入することを開示している。
【００６６】
ＲＮＡ分子は、両親媒性物質によって細胞内に送達され得る（例えば、米国特許第６，０７１，８９０号）。典型的には、核酸分子は、カチオン性両親媒性物質とともに複合体を形成し得る。この複合体と接触させた哺乳類細胞は、容易にそれを取り込むことができる。
【００６７】
３つの特に有用な送達系は、（ｉ）リポソーム、（ｉｉ）毒性がなく、そして生分解性のポリマー微粒子、（ｉｉｉ）カチオン性サブミクロン水中油型エマルジョンである。
【００６８】
リポソーム
様々な両親媒性脂質が、水性環境において二重層を形成してリポソームとしてＲＮＡ含有水性コアを被包し得る。これらの脂質は、アニオン性、カチオン性または両性イオン性の親水性頭部基を有し得る。アニオン性リン脂質からのリポソームの形成は、１９６０年代にさかのぼり、そしてカチオン性リポソーム形成脂質は、１９９０年代から研究されてきた。いくつかのリン脂質はアニオン性であるのに対して、別のものは両性イオン性であり、そして別のものはカチオン性である。適切なクラスのリン脂質としてホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジル−グリセロールが挙げられるが、これらに限定されず、そしていくつかの有用なリン脂質は表１にリストされる。有用なカチオン性脂質としてジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ  ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。両性イオン性脂質としてアシル両性イオン性脂質およびエーテル両性イオン性脂質が挙げられるが、これらに限定されない。その他の有用な脂質は国際公開第２０１２／０３１０４６において開示されている。これらの脂質は飽和であってもよいし、または不飽和であってもよい。リポソームを調製するための少なくとも１種類の不飽和脂質の使用が好ましい。不飽和脂質が２つの尾部を有する場合、両方の尾部は不飽和であってもよいし、またはこれは１つの飽和尾部および１つの不飽和尾部を有してもよい。
【００６９】
好ましいリポソームは、５．０〜７．６（例えば、５．７〜５．９）の範囲内のｐＫａを有する脂質、特に、３級アミンを有する脂質、を含む（国際出願第２０１２／００６３７８号を参照のこと）。
【００７０】
リポソームは、単一の脂質からかまたは脂質の混合物から形成され得る。混合物は、（ｉ）アニオン性脂質の混合物（ｉｉ）カチオン性脂質の混合物（ｉｉｉ）両性イオン性脂質の混合物（ｉｖ）アニオン性脂質およびカチオン性脂質の混合物（ｖ）アニオン性脂質および両性イオン性脂質の混合物（ｖｉ）両性イオン性脂質およびカチオン性脂質の混合物、または（ｖｉｉ）アニオン性脂質、カチオン性脂質および両性イオン性脂質の混合物を含み得る。同様に、混合物は、飽和脂質および不飽和脂質の両方を含み得る。例えば、混合物は、ＤＳＰＣ（両性イオン性、飽和）、ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性、不飽和）および／またはＤＭＧ（アニオン性、飽和）を含み得る。脂質の混合物が使用される場合、この混合物中の成分脂質のすべてが、両親媒性であることが必要であるとは限らず、例えば、１種類またはそれより多くの両親媒性脂質はコレステロールと混合され得る。
【００７１】
脂質の親水性部分は、ＰＥＧ化され得る（すなわち、ポリエチレングリコールの共有結合によって修飾される）。この修飾は、リポソームの安定性を増大させ、そしてリポソームの非特異的吸着を防ぐことができる。例えば、脂質は、国際出願第２００５／１２１３４８号においておよびＨｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７：２７６−８７において開示されているもののような技術を使用してＰＥＧに結合体化させられ得る。様々な長さのＰＥＧが使用されることができ、例えば、０．５〜８ｋＤａの間、１〜３ｋＤａの間（国際出願第２０１２／０３１０４３号）または３〜１１ｋＤａの間（国際出願第２０１３／０３３５６３号）である。
【００７２】
ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧおよびコレステロールの混合物は、実施例において使用される。これらは、国際出願第２０１２／００６３７６号において開示されている通りに作製され得る。
【００７３】
通常、リポソームは３つの群に分けられる：多重膜ベシクル（ＭＬＶ）；小型単層ベシクル（ＳＵＶ）；および大型単層ベシクル（ＬＵＶ）。ＭＬＶは、それぞれのベシクル内に複数の二重層を有し、いくつかの分離した水性コンパートメントを形成する。ＳＵＶおよびＬＵＶは、水性コアを被包する単一の二重層を有する；ＳＵＶは、典型的には、直径≦５０ｎｍを有し、そしてＬＵＶは直径＞５０ｎｍを有する。理想的には、本発明に有用なリポソームは、５０〜２２０ｎｍの範囲内の直径を有するＬＵＶである。異なる直径を有するＬＵＶの集団を含む組成物について：（ｉ）数の上で少なくとも８０％が、２０〜２２０ｎｍの範囲内の直径を有するべきであり、（ｉｉ）理想的には、この集団の平均直径（Ｚａｖ、強度による）は、４０〜２００ｎｍの範囲内にあり、そして／または（ｉｉｉ）これらの直径は、多分散指数＜０．２を有するべきである。
【００７４】
６０〜１８０ｎｍの範囲内の直径を有するリポソームは特に有用であり得（国際出願第２０１２／０３０９０１号）、例えば、８０〜１６０ｎｍの範囲内の直径を有するものである。異なる直径を有するリポソームの集団を含む組成物について：（ｉ）数の上で少なくとも８０％のリポソームが６０〜１８０ｎｍ、そして特に８０〜１６０ｎｍ、の範囲内の直径を有すべきであり、そして／または（ｉｉ）理想的には、この集団の平均直径（強度による、例えばＺ−平均）は、６０〜１８０ｎｍ、そして特に８０〜１６０ｎｍ、の範囲内である。
【００７５】
リポソームの懸濁液中の平均粒子径およびサイズ分布を決定するための装置は市販されている。これらは、典型的には、動的光散乱および／または単粒子光学検知の技術を使用し、例えば、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＵＳＡ）から市販されているＡｃｃｕｓｉｚｅｒ（登録商標）およびＮｉｃｏｍｐ（登録商標）シリーズの機器、またはＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＵＫ）からのＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）機器、あるいはＨｏｒｉｂａ（Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）からのＰａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ機器がある。動的光散乱法は、リポソームの直径を決定する好ましい方法である。リポソームの集団について、本発明の組成物中における平均リポソーム径を規定するための好ましい方法は、Ｚ−平均、すなわち、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって計測されるリポソームのアンサンブル収集物の強度加重平均流体力学的サイズである。Ｚ−平均は、計測された相関曲線のキュムラント解析に由来し、ここにおいて、単一の粒子サイズ（リポソーム径）が想定され、そして単一指数フィッティングが自己相関関数に適用される。キュムラント解析アルゴリズムは分布を与えないが、強度加重Ｚ−平均に加えて、多分散指数を与える。
【００７６】
適切なリポソームを調製するための技術は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  １：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．（ｅｄ．  Ｗｅｉｓｓｉｇ）．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００９．ＩＳＢＮ  １６０３２７３５９Ｘ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ，ＩＩ  ＆  ＩＩＩ．（ｅｄ．  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ）．Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２００６．およびＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ４  （Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，  ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ＆  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）．（ｅｄｓ．  Ａｒｓｈａｄｙ  ＆  Ｇｕｙｏｔ）．Ｃｉｔｕｓ  Ｂｏｏｋｓ，２００２を参照のこと。１つの有用な方法は、Ｊｅｆｆｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２（３）：３６２−３７２において記載されており、そして（ｉ）脂質のエタノール性溶液、（ｉｉ）核酸の水溶液および（ｉｉｉ）緩衝液の混合、その後の、混合、平衡化、希釈ならびに精製を含む。
【００７７】
特定の実施形態において、ＲＮＡはリポソーム内に被包され、そしてそれによって、このリポソームは、水性のＲＮＡ含有コアの周辺に外層を形成する。この被包は、ＲＮアーゼ消化からＲＮＡを保護することが見出されている。このリポソームは、いくつかの外部ＲＮＡを含み得る（例えば、このリポソームの表面上に）が、少なくとも半分のＲＮＡ（そして理想的にはそのすべて）は被包されている。
【００７８】
有用な組成物は、１：１および２０：１の間のＮ：Ｐ比を有するリポソームおよびＲＮＡを含み得、ここで「Ｎ：Ｐ比」とは、カチオン性脂質中の窒素の、ＲＮＡ中のホスフェートに対するモル比であり（国際出願第２０１３／００６８２５号を参照のこと）、例えば、２：１、４：１、８：１または１０：１のＮ：Ｐ比である。
【００７９】
ポリマー性微粒子  
様々なポリマーが、微粒子を形成してＲＮＡを被包または吸着し得る（例えば、国際出願第２０１２／００６３５９号を参照のこと）。実質的に毒性がないポリマーの使用は、レシピエントが安全にこの粒子を受けることができることを意味し、そして生分解性ポリマーの使用は、この粒子が、送達後に代謝されて長期的な存続を回避することができることを意味する。有用なポリマーは、また滅菌可能でもあって薬学的等級の処方物の調製を補助する。
【００８０】
適切な、毒性のなくそして生分解性のポリマーとしてポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリラクトン（ポリカプロラクトンを含む）、ポリジオキサノン、ポリバレロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリシアノアクリレート、チロシン由来ポリカーボネート、ポリビニルピロリジノンまたはポリエステルアミドおよびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
いくつかの実施形態において、微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、例えば、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）、ラクチドおよびグリコリドのコポリマー、例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）、ならびにＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマー、から形成される。有用なＰＬＧポリマーとして、例えば、２０：８０〜８０：２０の範囲（例えば、２５：７５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、７５：２５）のラクチド／グリコリドモル比を有するものが挙げられる。有用なＰＬＧポリマーとして、例えば、５，０００〜２００，０００Ｄａ（例えば、１０，０００〜１００，０００、２０，０００〜７０，０００、３０，０００〜４０，０００、４０，０００〜５０，０００Ｄａ）の分子量を有するものが挙げられる。
【００８２】
理想的には、微粒子は、０．０２μｍ〜８μｍの範囲内の直径を有する。異なる直径を有する微粒子の集団を含む組成物について、数の上で少なくとも８０％が、０．０３〜７μｍの範囲内の直径を有するべきである。
【００８３】
適切な微粒子を調製するための技術は、当技術分野において周知であり、例えば、Ａｒｓｈａｄｙ  ＆  Ｇｕｙｏｔ，Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．（ｅｄｓ．Ｕｃｈｅｇｂｕ  ＆  Ｓｃｈａｔｚｌｅｉｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００６）、特に第７章、およびＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．（ｅｄｓ．Ｃｏｈｅｎ  ＆  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６．を参照のこと。ＲＮＡの吸着を容易にするために、微粒子はカチオン性の界面活性剤および／または脂質を含み得る（例えば、Ｏ’Ｈａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５：９０３７−９０４３およびＳｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：２４７−２５１．において開示されている通りに）。ポリマー性微粒子を作製する代替的な方法は、成形し、硬化させることによるものである（例えば、国際公開第２００９／１３２２０６号において開示されている通りに）。
【００８４】
本発明の微粒子は、４０〜１００ｍＶの間のゼータ電位を有し得る。
【００８５】
リポソームを超える微粒子の１つの長所は、それらが、安定した保管のために容易に凍結乾燥させられることである。
【００８６】
ＲＮＡは微粒子に吸着されていてもよく、そして吸着は、この微粒子中にカチオン性材料（例えばカチオン性脂質）を含むことによって容易になる。
【００８７】
水中油型カチオン性エマルジョン  
水中油型エマルジョンは、タンパク質を基とするインフルエンザワクチンをアジュバント化することが公知であり、例えば、ＦＬＵＡＤ（登録商標）製品におけるＭＦ５９（登録商標）アジュバント、およびＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（登録商標）製品におけるＡＳ０３アジュバントがある。エマルジョンが１種類もしくはそれより多くのカチオン性分子を含むという条件において、本発明にしたがうＲＮＡ送達は水中油型エマルジョンを利用し得る（国際出願第２０１２／００６３８０号、国際出願第２０１３／００６８３４号および国際出願第２０１３／００６８３７号を参照のこと）。例えば、カチオン性脂質は、負に荷電したＲＮＡが付着することができる正電荷の液滴表面を提供するためにエマルジョン中に含まれ得る。したがって、特定の実施形態において、本発明のＲＮＡ送達は、カチオン性サブミクロン水中油型エマルジョンを使用して達成される。
【００８８】
エマルジョンは、１種類またはそれより多くの油を含む。適切な油（単数または複数）として、例えば、動物（例えば魚類）起源または植物起源に由来するものが挙げられる。理想的には、この油は、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。植物油の起源としてナッツ、種子、および穀類が挙げられる。最も一般的に入手可能なピーナッツ油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油は、ナッツ油の例示である。ホホバ油が使用され得、例えば、これはホホバ豆から取得される。種子油としてベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油などが挙げられる。穀類の群において、コーン油は最も容易に入手可能なものであるが、他の穀物、例えば、コムギ、カラスムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギなど、の油もまた使用され得る。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中で天然に生じないが、ナッツ油および種子油から出発して、適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製され得る。哺乳類の乳由来の脂肪および油は代謝可能であり、そしてそのため、使用され得る。動物供給源から純粋な油を取得するために必要な分離、精製、けん化およびその他の手段についての手順は、当技術分野において周知である。
【００８９】
ほとんどの魚は、容易に回収され得る代謝可能な油を含む。例えば、タラ肝油、サメ肝油および鯨油、例えば鯨ろう、は、本明細書において使用され得るいくつかの魚油の例示である。多くの分枝鎖油は、５−炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、そして一般的にテルペノイドと呼ばれる。好ましいエマルジョンはスクアレン、分枝状の不飽和テルペノイドであるサメ肝油を含み得る。スクアラン（スクアレンに対する飽和アナログ）もまた使用され得る。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、商業的供給源から容易に入手可能であるか、または当技術分野において公知の方法によって取得され得る。
【００９０】
他の有用な油は、トコフェロールであり、特に、スクアレンと組み合わせたものである。エマルジョンの油相がトコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、εまたはζトコフェロールのいずれかが使用され得るが、α−トコフェロールが好ましい。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールは両方とも使用され得る。好ましいα−トコフェロールはＤＬ−α−トコフェロールである。スクアレンおよびトコフェロール（例えば、ＤＬ−α−トコフェロール）を含む油の組み合わせが使用され得る。
【００９１】
エマルジョン中の油は、油の組み合わせ、例えば、スクアレンおよび少なくとも１種類の別の油、を含み得る。
【００９２】
エマルジョンの水性成分は、淡水（例えばｗ．ｆ．ｉ．）であってもよいし、またはさらなる成分、例えば溶質、を含んでもよい。例えば、これは、緩衝液を形成するための塩（例えば、クエン酸塩またはリン酸塩、例えばナトリウム塩）を含み得る。典型的な緩衝剤として、リン酸緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤；またはクエン酸緩衝剤が挙げられる。緩衝化された水相が好ましく、そして緩衝剤は、典型的には、５〜２０ｍＭの範囲内において含まれる。
【００９３】
エマルジョンはカチオン性脂質もまた含む。特定の実施形態において、このエマルジョンの形成および安定化を容易にすることができるように、この脂質は界面活性剤である。一般的に、有用なカチオン性脂質は、生理的条件下で正に荷電した窒素原子、例えば、第三級アミンまたは第四級アミンとして、を含む。この窒素は、両親媒性界面活性剤の親水性頭部基中にあり得る。有用なカチオン性脂質として以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３’−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシル−アンモニウム（ＤＤＡ、例えばブロミド）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチル−アンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の有用なカチオン性脂質は以下である：ベンザルコニウムクロリド（ＢＡＫ）、ベンゼトニウムクロリド、セトラミド（ｃｅｔｒａｍｉｄｅ）（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドならびに、場合によっては、少量のドデシルトリメチルアンモニウム（ｄｅｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）ブロミドおよびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含む）、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−獣脂（ｔａｌｌｏｗ）−１，３−ジアミノプロパン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチル−アンモニウムブロミド、混合アルキルトリメチル−アンモニウムブロミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシル−アンモニウムクロリド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、メチルベンゼトニウムクロリド、デカメトニウムクロリド、メチル混合トリアルキルアンモニウムクロリド、メチルトリオクチルアンモニウムクロリド）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２（２−メチル−４−（１，１，３，３テトラメチルブチル）−フェノキシ］−エトキシ）エチル］−ベンゼンメタンアミニウムクロリド（ＤＥＢＤＡ）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ジアシル−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジアシル−３（ジメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチル−アンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジオレオイル  ３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル、コレステリル（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノエート、Ｎ−アルキル���リジニウム塩（例えば、セチルピリジニウムブロミドおよびセチルピリジニウムクロリド）、Ｎ−アルキルピペリジニウム塩、ジカチオン性ボラ型電解質（Ｃ１２Ｍｅ６；Ｃ１２Ｂｕ６）、ジアルキルグリセチルホスホリルコリン、リソレシチン、Ｌ−αジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミスクシネートコリンエステル、リポポリアミン（以下のものが挙げられるが、これらに限定されない）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノール−アミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、リポポリ−Ｌ（またはＤ）−リジン（ＬＰＬＬ、ＬＰＤＬ）、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンに結合体化されたポリ（Ｌ（またはＤ）−リジン、ペンダントアミノ基を有するジドデシルグルタミン酸エステル（Ｃ１２ＧｌｕＰｈＣｎＮ＋）、ペンダントアミノ基を有するジテトラデシルグルタミン酸エステル（Ｃ１２ＧｌｕＰｈＣｎＮ＋）、コレステロールのカチオン性誘導体（以下のものが挙げられるが、これらに限定されない）、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレンジメチルアミン、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、およびコレステリル−３β−カルボキシアミドエチレンジメチルアミン。他の有用なカチオン性脂質は、ＵＳ−２００８／００８５８７０およびＵＳ−２００８／００５７０８０において記載されている。
【００９４】
特定の実施形態において、カチオン性脂質は、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。
【００９５】
油およびカチオン性脂質に加えて、エマルジョンは、非イオン性界面活性剤および／または両性イオン性界面活性剤を含み得る。そのような界面活性剤として、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特に、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（ＤＯＷＦＡＸ（登録商標）商標下で販売されている、例えば、直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；オクトキシノール、これは、繰り返しのエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動し得、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えばホスファチジルコリン（レシチン）；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されるポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）；ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル；ならびにソルビタンエステル（Ｓｐａｎとして一般的に公知）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウレート、が挙げられるが、これらに限定されない。このエマルジョン中に含むための好ましい界面活性剤には、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００がある。
【００９６】
これらの界面活性剤の混合物は、エマルジョン中に含まれることができ、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物またはＴｗｅｅｎ８０／Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００混合物がある。ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０））およびオクトキシノール（例えば、ｔ−オクチルフェノキシ−ポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００））の組み合わせもまた適している。他の有用な組み合わせは、ラウレス９＋ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。有用な混合物は、１０〜２０の範囲内のＨＬＢ値を有する界面活性剤（例えば、１５．０のＨＬＢを有するポリソルベート８０）および１〜１０の範囲内のＨＬＢ値を有する界面活性剤（例えば、１．８のＨＬＢを有するソルビタントリオレエート）を含み得る。
【００９７】
最終エマルジョン中の油の好ましい量（体積％）は、２〜２０％の間、例えば、５〜１５％、６〜１４％、７〜１３％、８〜１２％、である。約４〜６％または約９〜１１％のスクアレン含有量は特に有用である。
【００９８】
最終エマルジョン中の界面活性剤の好ましい量（重量％）は、０．００１％および８％の間である。例えば：０．２〜４％、特に、０．４〜０．６％の間、０．４５〜０．５５％の間、約０．５％または１．５〜２％の間、１．８〜２．２％の間、１．９〜２．１％の間、約２％または０．８５〜０．９５％もまたは約１％、のポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリソルベート８０）；０．０２〜２％、特に、約０．５％または約１％のソルビタンエステル（例えば、ソルビタントリオレエート）；０．００１〜０．１％、特に、０．００５〜０．０２％、のオクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）；０．１〜８％、特に、０．１〜１０％、そして特に、０．１〜１％または約０．５％、のポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）である。
【００９９】
油および界面活性剤の絶対量ならびにそれらの比は、依然としてエマルジョンを形成したまま、広い範囲内で変動され得る。当業者は、所望のエマルジョンを取得するために成分の相対的な割合を容易に変動させ得るが、４：１および５：１の間の、油および界面活性剤についての重量比が典型的である（過剰な油）。
【０１００】
エマルジョンの免疫賦活活性を確実にするための重要なパラメーターは、特に、大型の動物において、油滴サイズ（直径）である。最も有効なエマルジョンは、サブミクロンの範囲の液滴サイズを有する。適切には、この液滴サイズは、範囲５０〜７５０ｎｍ内である。最も有用には、平均液滴サイズは、２５０ｎｍ未満、例えば、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満である。平均液滴サイズは、有用には、８０〜１８０ｎｍの範囲内である。理想的には、エマルジョンの油滴の少なくとも８０％（数の上で）が、直径で２５０ｎｍ未満であり、そして特に、少なくとも９０％がそうである。エマルジョン中の平均液滴サイズおよびサイズ分布を決定するための装置は、市販されている。これらのこれらは、典型的には、動的光散乱および／または単粒子光学検知の技術を使用し、例えば、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＵＳＡ）から市販されているＡｃｃｕｓｉｚｅｒ（登録商標）およびＮｉｃｏｍｐ（登録商標）シリーズの機器、またはＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＵＫ）からのＺｅｔａｓｉｚｅｒ（登録商標）機器、またはＨｏｒｉｂａ（Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）からのＰａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ機器がある。
【０１０１】
理想的には、液滴サイズの分布（数の上で）は１つの最大値のみを有する、すなわち、平均値（モード）の周辺に分布する液滴の単一の集団があり、２つの最大値を有するのではない。好ましいエマルジョンは、＜０．４、例えば、０．３、０．２またはそれより小さい多分散性を有する。
【０１０２】
サブミクロンの液滴および狭いサイズ分布を有する適切なエマルジョンは、微少溶液操作の使用によって取得され得る。この技術は、高圧および高速度で、幾何学的に固定されたチャネルを通して投入成分のストリームを推進することによって、平均油滴サイズを減少させる。これらのストリームは、チャネル壁、チャンバー壁および互いに接触する。その結果としての剪断力、衝撃力、およびキャビテーション力は、液滴サイズにおける減少を引き起こす。微少溶液操作の繰り返しのステップは、所望の液滴サイズ平均および分布を有するエマルジョンが達成されるまで実行され得る。
【０１０３】
微少溶液操作に代わるものとして、熱的方法が、転相を引き起こすために使用され得る（ＵＳ２００７／００１４８０５において開示される通りに）。これらの方法もまた、厳密な粒度サイズ分布を有するサブミクロンのエマルジョンを提供することができる。
【０１０４】
好ましいエマルジョンは、濾過滅菌され得る、すなわち、それらの液滴は、２２０ｎｍのフィルターを通過することができる。滅菌の提供と同様に、この手順はまた、エマルジョン中のいずれの大きな液滴をも除去する。
【０１０５】
特定の実施形態において、エマルジョン中のカチオン性脂質はＤＯＴＡＰである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含み得る。例えば、このカチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌでＤＯＴＡＰを含み得る。例示的な実施形態において、このカチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含み、例えば、０．８ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌまたは１．６ｍｇ／ｍｌである。
【０１０６】
特定の実施形態において、カチオン性脂質はＤＣコレステロールである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールで、ＤＣコレステロールを含み得る。例えば、このカチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含み得る。例示的な実施形態において、このカチオン性水中油型エマルジョンは、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含み、例えば２．４６ｍｇ／ｍｌである。
【０１０７】
特定の実施形態において、カチオン性脂質はＤＤＡである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含み得る。例えば、このカチオン性水中油型エマルジョンは、ＤＤＡを約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌで含み得る。例示的な実施形態において、このカチオン性水中油型エマルジョンは、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含み、例えば１．４５ｍｇ／ｍｌである。
【０１０８】
患者への投与のための、本発明の特定の好ましい組成物はスクアレン、スパン８５、ポリソルベート８０およびＤＯＴＡＰを含む。例えば：スクアレンは５〜１５ｍｇ／ｍｌで存在し得；スパン８５は０．５〜２ｍｇ／ｍｌで存在し得；ポリソルベート８０は０．５〜２ｍｇ／ｍｌで存在し得；そしてＤＯＴＡＰは０．１〜１０ｍｇ／ｍｌで存在し得る。エマルジョンは、同じ量の（体積の上で）スパン８５およびポリソルベート８０を含み得る。このエマルジョンは界面活性剤より多くのスクアレンを含み得る。このエマルジョンはＤＯＴＡＰより多くのスクアレンを含み得る。
【０１０９】
免疫原性組成物
典型的には、免疫原性組成物は、ＲＮＡおよびポリペプチド（ならびに任意の送達系）に加えて薬学的に受容可能な担体を含む。このような担体の徹底的な議論は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎにおいて得られる。
【０１１０】
本発明の薬学的組成物は、淡水（例えば、ｗ．ｆ．ｉ．）の中、または緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液またはクエン酸緩衝液、の中に活性のある成分（ＲＮＡおよびポリペプチド）を含み得る。典型的には、緩衝剤の塩は、５〜２０ｍＭの範囲内で含まれる。
【０１１１】
本発明の薬学的組成物は、５．０および９．５の間、例えば、６．０および８．０の間、のｐＨを有し得る。
【０１１２】
本発明の組成物は、浸透圧を与えるためにナトリウム塩（例えば塩化ナトリウム）を含み得る。１０±２ｍｇ／ｍｌの濃度のＮａＣｌが典型的であり、例えば約９ｍｇ／ｍｌである。
【０１１３】
本発明の組成物は金属イオンキレート剤を含み得る。これらは、ホスホジエステルの加水分解を加速させ得るイオンを除去することによってＲＮＡの安定性を延長させ得る。  したがって、組成物は、１種類もしくはそれより多くのＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ペンテト酸などを含み得る。典型的には、このようなキレート剤は、１０〜５００μＭの間、例えば０．１ｍＭ、で存在する。有益なことに緩衝作用もまた提供しながら、クエン酸塩、例えばクエン酸ナトリウム、はキレート剤としてもまた働く。
【０１１４】
本発明の薬学的組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇおよび４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、例えば、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間または２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、のモル浸透圧濃度を有し得る。
【０１１５】
本発明の薬学的組成物は、１種類もしくはそれより多くの保存料、例えば、チメロサールまたは２−フェノキシエタノール、を含み得る。水銀を含まない組成物が好ましく、そして保存料を含まないワクチンが調製され得る。
【０１１６】
特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物は滅菌されている。
【０１１７】
別の特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物は、発熱原性でなく、例えば、用量毎に＜１のＥＵ（エンドトキシン単位、標準的な尺度）を含み、そしていくつかの実施形態において、用量毎に＜０．１のＥＵを含む。
【０１１８】
特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物はグルテンを含まない。
【０１１９】
本発明の薬学的組成物は、単位用量の形態において調製され得る。いくつかの実施形態において、単位用量は、０．１〜１．０ｍｌの間、例えば約０．５ｍｌ、の体積を有し得る。
【０１２０】
本発明の薬学的組成物は、１種類もしくはそれより多くの小分子免疫増強剤を含み得る。例えば、この組成物は、ＴＬＲ２アゴニスト（例えばＰａｍ３ＣＳＫ４）、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート、例えばＥ６０２０）、ＴＬＲ７アゴニスト（例えばイミキモド）、ＴＬＲ８アゴニスト（例えばレシキモド）および／またはＴＬＲ９アゴニスト（例えばＩＣ３１）を含み得る。理想的には、いずれのこのようなアゴニストも＜２０００Ｄａの分子量を有する。
【０１２１】
組成物は注射剤として調製され得、これは溶液としてか、または懸濁液としてかのいずれかである。この組成物は、肺内投与（例えば、細微なスプレーを使用する吸入器による）のために調製され得る。この組成物は、鼻腔内投与、耳内投与または眼投与（例えば、スプレーまたは液滴として）のために調製され得る。筋肉内投与のための注射剤が典型的である。
【０１２２】
組成物は、免疫学的有効量のＲＮＡおよびポリペプチドならびに、必要に応じて、任意の他の成分、を含む。「免疫学的有効量」によって、固体にその量を投与すること（単一用量においてか、または一連のものの部分としてかのいずれかによって）が、処置または予防に有効であることが意味される。この量は、処置されるべき固体の健康状態および身体状態、年齢、処置されるべき固体の分類群（例えば、ヒト以外の霊長類、霊長類など）、固体の免疫系の抗体を合成する能力、所望の予防の程度、ワクチンの製剤形態、処置する医者による医学的状況の評価、およびその他の関係する因子に依存して変動する。この量は、通例の試験を通して決定され得る比較的広い範囲内に収まることが期待される。概して、本発明の組成物のポリペプチドおよびＲＮＡ含有量は、用量毎のＲＮＡの量の観点から表される。好ましい用量は≦１００μｇのＲＮＡ（例えば、１０〜１００μｇ、例えば、約１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇまたは１００μｇ）を有する。発現物は、はるかにより低いレベル（例えば、≦１μｇ／用量、≦１００ｎｇ／用量、≦１０ｎｇ／用量、≦１ｎｇ／用量）で認められ得るが、０．１μｇの最小用量が好ましい（国際出願第２０１２／００６３６９号を参照のこと）。
【０１２３】
本発明は、本発明の薬学的組成物を含む送達器具（例えば、シリンジ、ネブライザー、スプレイヤー、吸入器、皮膚パッチなど）もまた提供する。この器具は、被験者にこの組成物を投与するために使用され得る。
【０１２４】
処置の方法および医学的使用
本発明の薬学的組成物は、インフルエンザウイルスに対する免疫反応を誘発するためのインビボでの使用のためのものである。
【０１２５】
本発明は、有効量の本発明の薬学的組成物を投与する工程を含み、脊椎動物における免疫反応を生じさせるための方法を提供する。この免疫反応は、好ましくは、防御的であり、そして好ましくは、抗体および／または細胞媒介性免疫を含む。この方法はブースター反応を生じさせ得る。
【０１２６】
本発明は、脊椎動物におけるインフルエンザウイルスに対する免疫反応を生じさせるための方法における使用のための本発明の薬学的組成物もまた提供する。
【０１２７】
本発明は、脊椎動物におけるインフルエンザウイルスに対する免疫反応を生じさせるための薬物の製造における、上記で記載される通りの、ＲＮＡ分子およびポリペプチドの使用もまた提供する。
【０１２８】
これらの使用および方法によって脊椎動物において免疫反応を生じさせることによって、この脊椎動物はインフルエンザウイルス感染および／または疾患に対して保護され得る。この組成物は免疫原性であり、そして特定の実施形態において、より多くのワクチン組成物である。本発明にしたがうワクチンは、予防的か（すなわち、感染を予防するため）または治療的か（すなわち、感染症を処置するため）のいずれかであり得るが、典型的には、予防的である。
【０１２９】
特定の実施形態において、脊椎動物は哺乳類、例えば、ヒトまたは大型の獣医学的哺乳類（例えば、ウマ、ウシ、シカ、ヤギ、ブタ）である。ワクチンが予防的使用のためのものである場合、特定の実施形態において、ヒトは、子供（例えば、歩き始めの子供または幼児）あるいはティーンエイジャーである；ワクチンが治療的使用のためのものである場合、特定の実施形態において、ヒトはティーンエイジャーまたは大人である。子供のために意図されたワクチンは、大人にもまた投与され得る（例えば、安全性、用量、免疫原性などを評価するために）。  
【０１３０】
本発明にしたがって調製されたワクチンは、子供および大人の両方を処置するために使用され得る。したがって、ヒト患者は、１歳未満、５歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳または少なくとも５５歳であり得る。特定の実施形態において、このワクチンを受けるための患者は、年配者（例えば、≧５０歳、≧６０歳および特に≧６５年）、年少者（例えば、≦５歳）、入院患者、医療従事者、軍人（ａｒｍｅｄ  ｓｅｒｖｉｃｅ）および軍関係者、妊娠女性、慢性的に病気の患者または免疫不全の患者である。しかし、このワクチンは、これらの群についてのみ適切であるのではなく、そしてより一般的に集団において使用され得る。
【０１３１】
一般的に、本発明の組成物は、直接的に患者に投与される。直接送達は、非経口的な注射（例えば、皮下にか、腹腔内にか、静脈内にか、筋肉内にか、皮内にか、または組織の間質の空間に）によって成し遂げられ得る。代替的な送達経路として、直腸投与、経口投与（例えば、錠剤、スプレー）、口腔投与、舌下投与、膣内投与、局所投与、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）投与もしくは経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与、鼻腔内投与、眼投与、耳内投与、肺内投与あるいはその他の粘膜投与が挙げられる。皮内投与および筋肉内投与が２つの好ましい経路である。注射は、針（例えば皮下注射針）によってもよいが、針を使わない注射が代替的に使用され得る。典型的な筋肉内投与量は０．５ｍｌである。
【０１３２】
本発明は、全身性免疫および／または粘膜免疫を誘発するために、特に、全身性免疫および／または粘膜免疫の増強を誘発するために、使用され得る。
【０１３３】
治療的処置の有効性を確認する一つの方法は、組成物の投与後に病原体感染をモニタリングすることを含む。予防的処置の有効性を確認する一つの方法は、抗原に対する、全身性の（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ生産のレベルをモニタリングして）および／または粘膜性の（例えば、ＩｇＡ生産のレベルをモニタリングして）、免疫反応をモニタリングすることを含む。典型的には、抗原特異的血清抗体反応は免疫化後に決定される。組成物の免疫原性を評価する別の方法は、標的ポリペプチドに対して患者血清または粘膜分泌物をスクリーニングすることである。タンパク質と患者試料との間の陽性反応は、この患者が、問題のポリペプチドに対する免疫反応を開始したことを示す。組成物の有効性は、目的の感染症の病原体の適切な動物モデルを曝露させることによってインビボにおいてもまた決定され得る。
【０１３４】
投薬は、単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュールによるものであり得る。複数用量は、一次免疫化スケジュールにおいて、そして／またはブースター免疫化スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて、様々な用量は、同一または異なる経路（例えば、非経口的なプライムおよび粘膜的なブースト、粘膜的なプライムおよび非経口的なブースト、など）によって与えられ得る。複数用量は、典型的には、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）離して投与される。一つの実施形態において、複数用量は、生後およそ、６週間後、１０週間後および１４週間後に、（例えば、世界保健機関のＥｘｐａｎｄｅｄ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｎ  Ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ（「ＥＰＩ」）において多くの場合使用される通り、６週、１０週および１４週の週齢で）投与され得る。代替的な実施形態において、２回の一次用量は、約２か月離して（例えば、約７、８もしくは９週間離して）投与され、その後、２回目の一次用量の約６か月後〜１年後（例えば、２回目の一次用量の約６、８、１０または１２か月後）に１回もしくはそれより多くのブースター用量が用いられる。さらなる実施形態において、３回の一次用量は、約２か月離して（例えば、約７、８または９週間離して）投与され、その後、３回目の一次用量の約６か月後〜１年後に（例えば、３回目の一次用量の約６、８、１０または１２か月後に）１回もしくはそれより多くのブースター用量が用いられる。
【０１３５】
キット
本発明は、（ａ）インフルエンザウイルス抗原由来のエピトープを含むポリペプチドを含む第１のキット成分、および（ｂ）インフルエンザウイルス抗原由来のエピトープを含むポリペプチドをコードする自己複製ＲＮＡを含む第２のキット成分、を含むキットもまた提供する。
【０１３６】
一つの局面において、この２つのキット成分は、本発明の免疫原性組成物を与えるために混合され得る。別の局面において、このキットは、インフルエンザウイルスに対する免疫反応を引き起こすために、第２の組成物の前に第１の成分が投与される免疫化投与計画で投与するのに適している。
【０１３７】
第１のキット成分および第２のキット成分は別々に保存される。それらの容器は互いに分離されていてもよいし（例えば、２つのバイアル）、または互いに結合されていてもよい（例えば、デュアルチャンバーシリンジにおける２つのチャンバー）。
【０１３８】
これらキット成分のいずれかまたは両方は、水性の形態であり得る。これらキット成分のいずれかまたは両方は、固体の形態または乾燥形態であり得る（例えば、凍結乾燥されている）。
【０１３９】
このＲＮＡおよびポリペプチドが併用投与されるとき、それらを別々に詰めそして保存することがいっそう望ましくあり得る。これら２つの成分は、例えば、投与の約７２時間前以内、約４８時間前以内、約２４時間前以内、約１２時間前以内、約１０時間前以内、約９時間前以内、約８時間前以内、約７時間前以内、約６時間前以内、約５時間前以内、約４時間前以内、約３時間前以内、約２時間前以内、約１時間前以内、約４５分前以内、約３０分前以内、約１５分前以内、約１０分前以内または約５分前以内に合わせられ得る。例えば、このポリペプチドおよびＲＮＡは、患者のベッドサイドで合わせられ得る。
【０１４０】
これらの成分が順々に投与される場合、それらは、互いに約４時間以内、約３時間以内、約２時間以内、約１時間以内、約４５分以内、約３０分以内、約１５分以内、約１０分以内または約５分以内に投与され得る。プライム組成物、ブースト組成物またはその両方は、必要に応じて、本明細書中に記載される通りの、１種類もしくはそれより多くの送達系、免疫制御剤（例えばアジュバント）を含み得る。
【０１４１】
キットの成分のための適切な容器として、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックを含む様々な材料から形成され得る。容器は、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。
【０１４２】
キットは、薬学的に受容可能な緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液、を含む第３の容器をさらに含み得る。これは、エンドユーザーに有用な他の材料（例えば、薬学的に受容可能な他の処方溶液、例えば、緩衝剤、希釈剤、フィルター、注射針、およびシリンジ、または他の送達器具）もまた含み得る。キットは、アジュバント（例えば、水中油型エマルジョン）を含む第４の容器もさらに包含し得る。
【０１４３】
キットは、免疫を誘導する方法についての、または感染症を処置することについての書面による指示を含む添付文書もまた含みうる。この添付文書は、未承認である添付文書の草稿であってもよいし、または米国食品医薬品局（ＦＤＡ）または他の規制機関により承認された添付文書であってもよい。
【０１４４】
キット成分は、異なる場所で（例えば、異なる商業的実体によって、異なる国においてでさえ）製造され、そしてその後に合わせられてキットを形成してもよい。したがって、本発明は、本明細書中で定義される通りのポリペプチドとともにキットの中へとアセンブリするための本明細書中で定義される通りのＲＮＡ、ならびに本明細書中で定義される通りのＲＮＡとともにキットの中へとアセンブリするための本明細書中で定義される通りのポリペプチドを包含する。
【０１４５】
本発明の１つの局面は、プライム組成物によって誘導された免疫反応がブースト組成物によってブーストされる「プライムおよびブースト」免疫化投与計画に関する。例えば、抗原を用いたプライム（少なくとも１回）の後の（例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドの投与後の）、実質的に異なる形態の抗原（例えば、ポリペプチドの代わりにＲＮＡ、逆もまたしかり）を含むブースト組成物。ブースト組成物の投与は、一般的に、プライム組成物の投与後、数週間後または数か月後である（例えば、プライム組成物が投与された後、約１週間後、約２週間後、約３週間後、約４週間後、約８週間後、約１２週間後、約１６週間後、約２０週間後、約２４週間後、約２８週間後、約３２週間後、約３６週間後、約４０週間後、約４４週間後、約４８週間後、約５２週間後、約１か月後、約２か月後、約３か月後、約４か月後、約５か月後、約６か月後、約７か月後、約８か月後、約９か月後、約１０か月後、約１１か月後、約１２か月後、約１８か月後、約２年後、約３年後、約４年後、約５年後、約６年後、約７年後、約８年後、約９年後または約１０年後）。
【０１４６】
一般
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、排他的にＸからなってもよいし、または追加的な何かを含んでもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１４７】
数値ｘに関して、用語「約」とは、必要に応じたものであり、そして例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１４８】
「実質的に」という言葉は、「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない、であってもよい。必要に応じて、「実質的に」という言葉は、本発明の定義から省略され得る。
【０１４９】
本発明の組成物の活性のある成分は、異なる場所で製造され、そしてその後に合わせられそして製剤化されてもよい。したがって、プロセスの異なる工程は、異なる場所で（例えば、異なる国で）異なる人々によって大きく異なる回数実行されてもよい。したがって、いくつかの実施形態において、インフルエンザウイルス抗原由来のエピトープを含むポリペプチドおよび自己複製ＲＮＡは、別々に（そして異なる実態によってでさえ）調製され、その後合わせられてもよいし、または一緒に使用されてもよい。本発明は、本明細書中で定義される通りのポリペプチドとともにその後使用するための本明細書中で定義される通りのＲＮＡ、ならびにまた本明細書中で定義される通りのＲＮＡとともにその後使用するための本明細書中で定義される通りのポリペプチドを包含する。これら２つの成分は、それらの調製（例えば、異なる商業的実体による、そして／または異なる国における）の後の任意の時点で、合わせられてもよいし、共製剤化されてもよいしまたは一緒に併せて使用されてもよい。したがって、ＲＮＡおよびポリペプチドは同じ場所で作製される必要はない。
【０１５０】
「エピトープ」とは、免疫系によって（例えば、抗体によって、またはＴ細胞受容体によって）認識される抗原の部位である。ポリペプチドエピトープは、直鎖状であってもよいし、または立体構造的であってもよい。Ｔ細胞およびＢ細胞は、異なる方法で抗原を認識する。Ｔ細胞が、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子またはクラスＩ  ＭＨＣ分子に埋め込まれたタンパク質のペプチド断片を細胞の表面において認識するのに対し、Ｂ細胞は、免疫グロブリン様細胞表面受容体によって、プロセシングされていない抗原の表面特徴を認識する。Ｔ細胞の抗原認識機構とＢ細胞の抗原認識機構との差違は、それらのエピトープの異なる性格に反映される。したがって、Ｂ細胞は、抗原または病原体の表面特徴を認識するのに対して、Ｔ細胞エピトープ（約８〜１２アミノ酸の長さのペプチドを含む）は、抗原の三次元構造の文脈で見たとき、「表面」エピトープであると同時に「内部」エピトープでもあり得る。したがって、Ｂ細胞エピトープは、好ましくは、抗原または病原体の表面上に露出されており、そして直鎖状または立体構造的であり得るのに対して、Ｔ細胞エピトープは、典型的には、直鎖状であるが、利用可能であるかまたは抗原の表面にあることが必要とされない。通常、Ｂ細胞エピトープは、少なくとも約５個のアミノ酸を含むが、３〜４個のアミノ酸ほどに小さくてもよい。Ｔ細胞エピトープ、例えばＣＴＬエピトープ、は典型的には、少なくとも約７〜９個のアミノ酸を含み、そしてヘルパーＴ細胞エピトープは典型的には、少なくとも約１２〜２０個のアミノ酸を含む。
【０１５１】
個体が、複数のエピトープを有するポリペプチド抗原で免疫化される場合、多くの場合において、反応するＴリンパ球の大部分は、その抗原に由来する１つまたは少数の直鎖状エピトープに特異的であり、そして／または応答するＢリンパ球の大部分は、その抗原に由来する１つまたは少数の直鎖状エピトープまたは立体構造的なエピトープに特異的である。このようなエピトープは、典型的には「免疫優性エピトープ」と呼ばれる。いくつかの免疫優性エピトープを有する抗原において、単一のエピトープが最も優性となり得、そして典型的には、これは「一級（ｐｒｉｍａｒｙ））」免疫優性エピトープと呼ばれる。残りの免疫優性エピトープは、典型的には、「二級（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）」免疫優性エピトープ（単数または複数）と呼ばれる。
【実施例】
【０１５２】
発明を実施するための形態
実施例１：Ｈ５Ｎ１の研究
Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、インフルエンザＡ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のヘマグルチニンで免疫化した。組成物を０日目および５６日目に投与し、そして血清を０日目、２１日目、５６日目および７２日目に採取した。ヘマグルチニンを、タンパク質としてか、または自己複製アルファウイルスＲＮＡレプリコンの中にコードさせてかのいずれかによって（あるいは両方の組み合わせで）送達した。ＲＮＡはカチオン性ナノエマルジョン（ＣＮＥ）を用いて送達し、そしてタンパク質は、緩衝液中か、または水中油型エマルジョンアジュバント（ＭＦ５９）とともにかのいずれかによって送達した。対照群には、オボアルブミンまたは緩衝液（ＰＢＳ）単独を与えた。マウスは１０グループに分け、グループ毎に１２匹のマウスがいた：
【数１】
2018035195.tif 000002
【０１５３】
表２は、７２日目における血球凝集阻害（ＨＩ）力価（ＧＭＴ）を示す。ＲＮＡおよびタンパク質の混合物（グループ９）は、ＭＦ５９アジュバント化タンパク質（グループ８）と同じ程度に高い力価を示した。同様の効果がマイクロ中和試験において見られ、ここで３つの異なるＨ５Ｎ１株に対する力価もまた、ＭＦ５９アジュバント化タンパク質を使用して取得した力価に匹敵していた。
【表２】
2018035195.tif 000003
【０１５４】
ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＨＡ５３３〜５４１ペプチドに特異的なＭＨＣＩ五量体を使用して１０５日目に計測した。このペプチドはＨ１株とＨ５株との間で保存されている。表３は、五量体陽性細胞の頻度（ＣＤ８＋ＣＤ４４ｈＴ細胞の％）を示し、その結果は、混合ＲＮＡ／タンパク質組成物の使用が、免疫化後長期間にわたって抗原特異的Ｔ細胞を循環中に留まらせたことを示す。
【表３】
2018035195.tif 000004
【０１５５】
表４は、第２投与の１２週間後のＨ５特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答（抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＩＦＮγの％）を示す。グループ９は、最も高い比率の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を示した。  
【表４】
2018035195.tif 000005
【０１５６】
実施例２：Ｈ１Ｎ１／Ｈ５Ｎ１研究
マウスを、異なるＨＡサブタイプを有する２つのインフルエンザＡウイルス株：Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０９（Ｈ１Ｎ１）；およびＡ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／２００５（Ｈ５Ｎ１）、に由来するヘマグルチニンを用いて免疫化した。組成物を０日目および５６日目に投与し、そして血清を０日目、２１日目、４２日目、５５日目および７０日目に採取した。ヘマグルチニンは、タンパク質としてか、または自己複製アルファウイルスＲＮＡレプリコンの中にコードさせてかのいずれかによって（あるいは両方の組み合わせで）送達した。ＲＮＡはカチオン性ナノエマルジョン（ＣＮＥ）を用いて送達し、そしてタンパク質は、緩衝液中か、または水中油型エマルジョンアジュバント（ＭＦ５９）とともにかのいずれかによって送達した。対照群には、緩衝液（ＰＢＳ）単独を与えた。マウスは１０グループに分け、以下の通りにグループ毎に６匹のマウスがいた：
【数２】
2018035195.tif 000006
【０１５７】
表５は、示される実験グループにおける７０日目でのＨＩ力価（ＧＭＴ）を示す。抗Ｈ５の結果は、Ｈ５レプリコンが、タンパク質の形態で送達されたＨ５ヘマグルチニンに対する免疫反応を増強することを裏付ける（グループ３およびグループ５を比較のこと）。さらに、グループ６についての抗Ｈ１の結果は、Ｈ５レプリコンが、抗Ｈ１応答をもまた、ＭＦ５９を用いてアジュバント化したＨ１タンパク質によって達成された増強（グループ９）に到達するレベルまで増強することができる（グループ６およびグループ８を比較のこと）ことを示す。
【表５】
2018035195.tif 000007
【０１５８】
表６は、Ｈ１またはＨ５ヘマグルチニンについて応答する抗原特異的ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の％を示す。Ｈ５についての抗原特異的なＴ細胞応答は、Ｈ５レプリコンが、タンパク質の形態で送達されたＨ５ヘマグルチニンに対する免疫反応を増強することをさらに裏付け、最良の結果はグループ５において見られる。全てのレプリコンのグループ（すなわち、グループ２、グループ５、グループ６およびグループ７）は、タンパク質がＭＦ５９を用いてアジュバント化されている場合でさえ（グループ４）、タンパク質抗原を用いて達成されたＨ５特異的応答（すなわち、グループ３およびグループ４）より高いＨ５特異的応答を示す。同じ効果がＨ１特異的応答で見られた。
【０１５９】
したがって、２つの異なる様式でヘマグルチニンを送達するためのタンパク質およびレプリコンの組み合わせ（すなわちグループ５およびグループ６）は、強いＨＩ力価と一緒に高い比率のインフルエンザ特異的機能性Ｔ細胞を与える。
【表６】
2018035195.tif 000008
【０１６０】
本発明は、単に例示の方法によって記載されているだけであり、そして本発明の範囲および精神の中に留まったまま、改変がなされ得ることが理解される。
表１：有用なリン脂質
ＤＤＰＣ    １，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＥＰＡ    １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＥＰＣ    １，２−エルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＥＰＥ    １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＥＰＧ    １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＬＯＰＣ  １，２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＬＰＡ    １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＬＰＣ    １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＬＰＥ    １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＬＰＧ    １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＬＰＳ    １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＭＧ      １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＭＰＡ    １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＭＰＣ    １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＭＰＥ    １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＭＰＧ    １，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＭＰＳ    １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＯＰＡ    １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＯＰＣ    １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＯＰＥ    １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＯＰＧ    １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＯＰＳ    １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＰＰＡ    １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＰＰＣ    １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＰＰＥ    １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＰＰＧ    １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＰＰＳ    １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＰｙＰＥ  １，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＳＰＡ    １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＳＰＣ    １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＳＰＥ    １，２−ジオステアルピル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＳＰＧ    １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＳＰＳ    １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＥＰＣ      卵ＰＣ
ＨＥＰＣ    水素添加卵ＰＣ
ＨＳＰＣ    高純度水素添加大豆ＰＣ
ＨＳＰＣ    水素添加大豆ＰＣ
ＬＹＳＯＰＣ  ＭＹＲＩＳＴＩＣ  １−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＬＹＳＯＰＣ  ＰＡＬＭＩＴＩＣ  １−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＬＹＳＯＰＣ  ＳＴＥＡＲＩＣ    １−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ミルクスフィンゴミエリンＭＰＰＣ  １−ミリストイル，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ３−ホスファチジルコリン
ＭＳＰＣ    １−ミリストイル，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＭＰＣ    １−パルミトイル，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＯＰＣ    １−パルミトイル，２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＯＰＥ    １−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＰＯＰＧ    １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセリン）．．．］
ＰＳＰＣ    １−パルミトイル，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＭＰＣ    １−ステアロイル，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＯＰＣ    １−ステアロイル，２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＰＰＣ    １−ステアロイル，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン。
【外国語明細書】
2018035195000001.pdf