(57)【要約】【課題】拡散反射分光分析により試料を分析する分光分析方法において、濃度と吸光度との間の対応関係の線形性を改善する。【解決手段】本発明に係る分光分析方法は、試料が有する反射光の異方性に影響されないパラメータを、前記試料の表面から反射された光の強度によって算出し、そのパラメータを用いて前記試料の平均吸収率を求める。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光を用いて試料を分析する分光分析方法であって、
前記試料の表面から反射した表面反射光を受光して前記表面反射光の強度を測定するステップ、
前記表面反射光の強度を用いて、前記試料が有する光の吸収係数によって表されかつ前記試料が有する反射光の異方性に影響されないパラメータを計算するステップ、
前記パラメータを用いて、前記試料の光吸収率を全受光角にわたって平均した平均吸収率を計算するステップ、
を有することを特徴とする分光分析方法。
【請求項２】
前記分光分析方法はさらに、
前記試料から反射された光の強度を測定する測定器の偏光子の偏光状態を出射光の偏光状態と揃えた上で、前記測定器を用いて前記試料から反射された光の第１強度を測定するステップ、
前記偏光子の偏光状態を回転させた上で、前記測定器を用いて前記試料から反射された光の第２強度を測定するステップ、
を有し、
前記表面反射光の強度を測定するステップにおいては、前記第１強度と前記第２強度との間の差分を用いて、前記表面反射光の強度を測定する
ことを特徴とする請求項１記載の分光分析方法。
【請求項３】
前記第２強度を測定するステップにおいては、前記偏光子の偏光状態を９０度回転させる
ことを特徴とする請求項２記載の分光分析方法。
【請求項４】
前記分光分析方法はさらに、
前記試料を第１濃度で含む液体に対して光を照射することにより前記表面反射光の第１反射率を測定するステップ、
前記第１反射率を測定するときと同じ受光角度および偏光状態において、前記試料を第２濃度で含む液体に対して光を照射することにより、前記表面反射光の第２反射率を測定するステップ、
前記第１反射率と前記第２反射率の比を用いて、前記試料の反射光の異方性を表す散乱パラメータを算出するステップ、
を有することを特徴とする請求項１記載の分光分析方法。
【請求項５】
前記平均吸収率を計算するステップにおいては、
前記散乱パラメータを用いて定義された、前記試料の反射光の異方性を表す関数を、全受光角にわたって積分し、
前記積分の結果と前記第２反射率とを用いて、前記平均吸収率を計算する
ことを特徴とする請求項４記載の分光分析方法。
【請求項６】
前記分光分析方法はさらに、
前記試料の反射光の異方性を表す散乱パラメータを指定するステップ、
前記試料を含む液体に対して光を照射することにより前記表面反射光の反射率を測定するステップ、
を有し、
前記平均吸収率を計算するステップにおいては、
前記散乱パラメータを用いて定義された、前記試料の反射光の異方性を表す関数を、全受光角にわたって積分し、
前記積分の結果と前記反射率とを用いて、前記平均吸収率を計算する
ことを特徴とする請求項１記載の分光分析方法。
【請求項７】
前記関数は、Ｈｅｎｙｅｙ  Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ関数、レイリー散乱における光反射の異方性を表す関数、またはレイリー散乱における光反射の異方性と偏光解消度を表す関数、のいずれかである
ことを特徴とする請求項６記載の分光分析方法。
【請求項８】
前記分光分析方法はさらに、
参照試料の表面から反射した第１表面反射光の反射率を所定範囲の光周波数にわたって測定するステップ、
前記参照試料の内部において拡散反射した拡散反射光と、前記第１表面反射光とを含む第１全反射光の反射率を、前記所定範囲の光周波数にわたって測定するステップ、
前記第１全反射光の反射率が極値をとる第１光周波数を特定するステップ、
前記試料の内部において拡散反射した拡散反射光と、前記試料の表面から反射した第２表面反射光とを含む第２全反射光の反射率を、前記所定範囲の光周波数にわたって測定するステップ、
前記第１全反射光の反射率が前記第２全反射光の反射率の極値と同じであるときの第２光周波数を特定するステップ、
前記第２光周波数において測定した前記第１表面反射光の光反射率を、前記第１光周波数における前記第２表面反射光の光反射率として特定するステップ、
を有することを特徴とする請求項１記載の分光分析方法。
【請求項９】
前記分光分析方法はさらに、
前記参照試料から反射された光の強度を測定する測定器の偏光子の偏光状態を出射光の偏光状態と揃えた上で、前記測定器を用いて前記参照試料から反射された光の第３強度を測定するステップ、
前記偏光子の偏光状態を回転させた上で、前記測定器を用いて前記参照試料から反射された光の第４強度を測定するステップ、
前記偏光子の偏光状態を出射光の偏光状態と揃えた上で、前記測定器を用いて前記試料から反射された光の第５強度を測定するステップ、
前記偏光子の偏光状態を回転させた上で、前記測定器を用いて前記試料から反射された光の第６強度を測定するステップ、
を有し、
前記第１全反射光の反射率を測定するステップにおいては、前記第３強度と前記第４強度の和を用いて前記第１全反射光の強度を測定し、
前記第２全反射光の反射率を測定するステップにおいては、前記第５強度と前記第６強度の和を用いて前記第２全反射光の強度を測定する
ことを特徴とする請求項８記載の分光分析方法。
【請求項１０】
前記分光分析方法はさらに、前記平均吸収率を用いて、前記試料の吸光度を計算するステップを有する
ことを特徴とする請求項１記載の分光分析方法。
【請求項１１】
前記分光分析方法はさらに、
前記試料の吸光度と前記試料の濃度との間の対応関係を記述したデータを取得するステップ、
前記試料の吸光度を用いて前記データを参照することにより、前記試料の濃度を特定するステップ、
を有することを特徴とする請求項１０記載の分光分析方法。
【請求項１２】
光を用いて試料を分析する分光分析装置であって、
前記試料の表面から反射した表面反射光の強度を測定する測定器、
前記試料の光吸収率を計算する演算部、
を備え、
前記演算部は、前記表面反射光の強度を用いて、前記試料が有する光の吸収係数によって表されかつ前記試料が有する反射光の異方性に影響されないパラメータを計算し、
前記演算部は、前記パラメータを用いて、前記試料の光吸収率を全受光角にわたって平均した平均吸収率を計算する
ことを特徴とする分光分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光を用いて試料を分析する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
分光分析法は、物質が光を吸収または放射する際の光のスペクトルを測定することにより、気体／液体／固体の中に存在する化学物質の濃度を定量する、粒子が分散した溶液の濁度を測定する、などの用途で広く用いられている。分光分析法のなかでも、吸収分光分析法はその定量性の高さから最も一般的に用いられている。
【０００３】
吸収分光分析法においては、照射された光のうち、物質が吸収した光のスペクトルを測定することにより、物質中の特定の分子の濃度を定量する。しかし、例えば物質の濁度が高い場合は、透過する光の量が少ないので、吸収分光分析法を用いることは難しい。こうした場合には、拡散反射分光分析が吸収分光分析に代わって用いられることがある。拡散反射分光分析法においては、光を物質に照射し、照射した光が物質の内部で反射・屈折を繰り返して再度内部から放出された反射光を検出する。拡散反射分光分析は、例えば、土壌中の化学物質、錠剤内部の化学物質、細胞懸濁液中の化学物質、牛乳中の色素成分などの定量解析に用いられている。
【０００４】
吸収分光分析においては、分光分析セルのなかに測定対象物質を入れて分析するのが一般的である。分光分析セルが用意できない場合（例えば、化学プラント中の化学物質をその場で計測する場合）は、プラント内に挿入可能なプローブ内に光源と受光部を内蔵しておき、その光学系を用いて測定を実施する。
【０００５】
このような光学系を用いて吸収分光分析を実施する場合、分光分析セルの長さや、プローブ内での光源と受光部の距離により、光路長が規定されている。したがって、ベール・ランベール則により、分析対象内に含まれる物質濃度を定量することができる。
【０００６】
拡散反射分光分析においては、分析対象に対して照射された光が物質内で反射・屈折を繰り返しながら物質外の検出器に到達する。検出器に到達するまでの間に、物質内部で光が吸収される。この吸収された光の量から物質内部の情報を得る。物質内部で光が反射・屈折を繰り返して吸収されるまでの光路長は、物質の様々なパラメータに影響される。例えば、物質による光吸収が大きいと、物質により吸収される前に反射・屈折を繰り返す回数が少なくなる。これに対して、物質による光吸収が小さい場合、吸収が起きる前に比較的多数回の反射・屈折が起きる。すなわち、物質の吸収が大きいと光路長が短くなり、吸収が小さいと光路長が長くなる、という傾向がある。これにより、拡散反射光に対する吸収の大きさと、実際に物質が固有に持つ吸収の大きさとが対応しなくなる。したがって、吸光度と物質濃度との間の線形関係が崩れ、ベール・ランベール則に基づく濃度定量が困難となる。
【０００７】
分光分析においては、多変量解析などの数学的技法を用いて、多種類の物質が含まれた系における濃度を定量する場合がある。多変量解析の技法としては、部分的最小二乗法（ＰＬＳ；Ｐａｒｔｉａｌ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｑｕａｒｅｓ）などが広く知られており、様々な系の濃度定量に用いられている。ＰＬＳをはじめとする多変量解析の技法においては、説明変数（分光分析の場合は得られる分光スペクトルから求められる吸光度）と目的変数（例えば特定の物質の濃度）の間に線形関係が成立することが前提となっている場合がある。したがって、拡散反射分光分析においては、ＰＬＳなどの多変量解析手法を用いた濃度定量が困難な場合がある。
【０００８】
下記非特許文献１は、こうした拡散反射分光分析の課題を解決する方法が開示されている。同文献においては、拡散反射光成分のうち、偏光が保存された成分の強度と、全反射光の強度とを測定結果に基づき取得し、これらをもとに代表層理論（ＲＬＴ；Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ  Ｌａｙｅｒ  Ｔｈｅｏｒｙ）と呼ばれる理論を用いて、物質の濃度を解析する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｍｉｃａ  Ａｃｔａ, ８５３, ｐｐ.４８６‐４９４（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らが鋭意検討した結果、非特許文献１が記載している手法は、特に測定対象の濃度が高い測定領域において、濃度と吸光度との間の線形性が低下する場合があることが見出された。このことは、物質が反射光について異方性を有しており、その異方性によって測定結果が影響を受けることによると考えられる。
【００１１】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、拡散反射分光分析により試料を分析する分光分析方法において、濃度と吸光度との間の対応関係の線形性を改善することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る分光分析方法は、試料が有する反射光の異方性に影響されないパラメータを、前記試料の表面から反射された光の強度によって算出し、そのパラメータを用いて前記試料の平均吸収率を求める。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、拡散反射分光分析において、低濃度から高濃度までの広いダイナミックレンジにおいて線形性の良い測定結果を得ることができる。これにより、物質の濃度定量などの精度を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施形態１に係る分光分析装置１００の構成を示す図である。
【図２】色素ローダミンＢを牛乳に溶解したものを測定対象物質１５として吸光度Ａｓｕｒｆを測定した結果を示すグラフである。
【図３】単一散乱の様子を示す模式図である。
【図４】色素ローダミンＢの濃度が１００μｇ／ｍＬと０μｇ／ｍＬであるときそれぞれについて表面反射光の反射率を測定した結果を示すグラフである。
【図５】吸光度Ａｓｕｒｆを示すグラフである。
【図６】実施形態１において代表層の吸光度Ａｓｕｒｆを求める手順をまとめたフローチャートである。
【図７】分光分析装置１００を用いて散乱パラメータｇを推定する場合の構成例を示す図である。
【図８】標準試料の反射率と測定対象物質１５の反射率を複数の光波長においてそれぞれ測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜実施の形態１：装置構成＞
図１は、本発明の実施形態１に係る分光分析装置１００の構成を示す図である。光源１１から出射された光は、光ファイバー１２を介してコリメートレンズ１３を通過する。コリメートレンズ１３によってコリメートされた光は、偏光子１４によって一部の偏光成分のみが取り出され、測定対象物質１５に対して照射される。分光分析を行なう場合、光源１１には白色光源、例えばハロゲンランプを用いることが考えられる。
【００１６】
測定対象物質１５に対して照射された光は、測定対象物質１５の内部において反射・屈折を繰り返すことにより拡散する。一部の光は、測定対象物質１５によって吸収されることなく、測定対象物質１５の外部に放射される。この外部に放射された光は、偏光子１６とコリメートレンズ１７を通じて、光ファイバー１８に入射する。光ファイバー１８は、受光部１９に接続されている。受光部１９は、例えば分光器を用いて、各波長における光強度を測定する。演算部２０は、受光部１９が測定した光強度を用いて、測定対象物質１５の濃度などのパラメータを演算する。
【００１７】
出射光と反射光との間には、角度Φ２１を設ける。測定対象物質１５から反射された光が鏡面反射光を含まないようにするため、角度Φ２１は、例えば４５°などに設定することが望ましい。
【００１８】
＜実施の形態１：代表層理論を用いた測定＞
以下では本発明の目的を明確にするため、従来の拡散反射分光分析における測定手順とその課題について、まず説明する。その後に、本発明に係る分光分析方法について説明する。
【００１９】
まず、偏光子１４の偏光方向と偏光子１６の偏光方向を揃えた状態（平行にした状態）で、反射光の強度を測定する。演算部２０は、受光部１９が測定した光強度Ｉ｜｜を記憶しておく。
【００２０】
次に偏光子１４（または偏光子１６）を回転させる。回転角は任意に設定することができるが、例えば先の測定時における出射光と直交する偏光状態を有する光を照射するために、偏光方向を９０°回転させることが考えられる。偏光子１４を回転させた後、同様に反射光の強度を測定する。演算部２０は、受光部１９が測定した光強度Ｉ⊥を記憶しておく。
【００２１】
次に、光源１１から入射された入射光の強度を測定する。入射光の強度も、偏光子１４を回転させる前後それぞれについて測定する。演算部２０は、受光部１９が取得した入射光強度Ｉ０｜｜（回転前）、Ｉ０⊥（回転後）を、記憶しておく。
【００２２】
測定対象物質１５の内部において多数回散乱した光は、もはや入射光の偏光方向を保持していないので、Ｉ｜｜＝Ｉ⊥となる。これに対して表面から反射した光は、入射光の偏光方向が維持されている。表面近傍において拡散反射した光も同様に、入射光の偏光方向が維持されていると考えられる。以下では、表面から反射された光と表面近傍から拡散反射された光をまとめて、表面反射光と呼ぶ。表面反射光については、Ｉ⊥＝０となる。演算部２０はこのことを利用して、下記式１にしたがって、測定対象物質１５の表面反射光の強度ΔＩを算出する。
【００２３】
ΔＩ＝Ｉ｜｜−Ｉ⊥  （１）
【００２４】
演算部２０は、下記式２にしたがって、測定対象物質１５の内部から拡散反射された光と表面から反射された光を含む全反射光の強度Ｉｔｏｔを求める。
【００２５】
Ｉｔｏｔ＝Ｉ｜｜＋Ｉ⊥  （２）
【００２６】
反射率は、入射光の強度と反射光の強度の比である。演算部２０は、表面反射光の反射率ｒ、全反射光の反射率Ｒｔｏｔを、それぞれ下記式３と式４にしたがって算出する。
【００２７】
ｒ＝ΔＩ／Ｉ０  （３）
Ｒｔｏｔ＝Ｉｔｏｔ／Ｉ０  （４）
【００２８】
代表層理論（ＲＬＴ；Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ  Ｌａｙｅｒ  Ｔｈｅｏｒｙ）においては、測定対象物質１５に光源１１から照射された光の透過光強度が無視できるという条件の下、下記式５が表す関係があることが示されている。ａＲＥＰは代表層における光吸収率、ｒＲＥＰは代表層理論における表面反射光の反射率である。
【００２９】
（１−Ｒｔｏｔ２）／Ｒｔｏｔ＝（ａＲＥＰ／ｒＲＥＰ）（２−ｒＲＥＰ−２ａＲＥＰ）（５）
【００３０】
従来の方式では、式５において、ｒＲＥＰとｒが近似的に等しいと仮定することで、代表層理論における光吸収率ａＲＥＰを算出する。代表層理論における光吸収率ａＲＥＰは、多重散乱の影響を受けない程度の厚さを持つ代表層における光吸収率である。したがって、下記式６から代表層の吸光度Ａｓｕｒｆを算出することができる。吸光度Ａｓｕｒｆは、多重散乱の影響をうけていないので、ベール・ランベール則にしたがう。したがって吸光度Ａｓｕｒｆにより、物質の濃度を推定することができる。
【００３１】
Ａｓｕｒｆ＝−ｌｏｇ（１−ａＲＥＰ）  （６）
【００３２】
図２は、色素ローダミンＢを牛乳に溶解したものを測定対象物質１５として吸光度Ａｓｕｒｆを測定した結果を示すグラフである。ここでは色素ローダミンＢの濃度を１．６μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬまで変化させてＡｓｕｒｆを測定した。比較のため、全反射率から計測した吸光度Ａｒｅｆを併記している。比較しやすくするため、Ａｓｕｒｆの縦軸は２０倍している。図２の黒四角がＡｒｅｆを示し、白四角がＡｓｕｒｆを示す。
【００３３】
ＡｓｕｒｆとＡｒｅｆは、検出している深さが異なる。Ａｓｕｒｆは代表層の吸光度を算出したものであるのに対し、Ａｒｅｆは光が到達した全深さの吸光度を算出したものである。Ａｒｅｆは光路長による違いの補正をしていない吸光度である。
【００３４】
図２によれば、Ａｒｅｆは色素ローダミンＢの濃度が高濃度になるにしたがって顕著に傾きが減少していることが分かる。これに対しＡｓｕｒｆは高濃度領域においても濃度と吸光度との間の対応関係の直線性が改善していることが分かる。しかしながら、依然として高濃度領域で傾きが減少する傾向が認められる。本発明者らは、この要因を以下のように考察した。
【００３５】
代表層理論において用いられている反射率ｒＲＥＰは、測定対象物質１５の表面反射光の反射率の平均値である。しかし、反射光を測定する実際の光学系は、ある特定の受光角においてのみ、反射光を測定するのが通常である。図１に示す光学系も同様である。測定対象物質１５の内部において多数回拡散反射した光は、異方性の大部分を喪失していると考えられるので、特定の受光角において測定した反射光を測定したとしても、測定対象物質１５が有する反射光の異方性の影響をあまり受けないと考えられる。即ち、Ｒｔｏｔに対する受光角の影響は小さいと考えられる。他方で代表層理論においては、表面反射光を用いて濃度を推定する。上記の方法では、異方性が充分に残っている表面反射光の反射率ｒをｒＲＥＰと等しいと仮定することになる。しかし実際には、代表層理論におけるｒＲＥＰは、各受光角における表面反射光の反射率の平均である。したがってｒの異方性の影響を考慮せずに濃度を推定するので、図２のような線形性が低下する現象が生じると推測した。
【００３６】
そこで、以下の方法でｒＲＥＰを算出することを考えた。まず、ｒとｒＲＥＰの関係について考察した。
【００３７】
図３は、単一散乱の様子を示す模式図である。測定対象物質１５の表面からの散乱が１回散乱であると仮定する。この場合、偏光が保存されている成分における反射率については、単一散乱が主要な成分として寄与している表面反射光であると考えられる。入射光強度Ｉ０と表面反射光の強度ΔＩは、下記式７によって表される。ｓは入射光が１回散乱される確率、ｐは散乱の異方性（受光角への依存性）を表現するフェーズ関数、σａは媒質２７の光吸収係数、ｄは代表層の厚さである。受光角は４５°である。
【００３８】
ΔＩ＝Ｉ０×ｓ×ｐ（θ＝４５°）×ｅｘｐ(−σａ（ｄ＋ｄ／ｃｏｓ（４５°））   （７）
【００３９】
これをI０で割ったものがｒ４５°となる。
【００４０】
ｒ４５°＝ｓ×ｐ（θ＝４５°）×ｅｘｐ(−σａ（ｄ＋ｄ／ｃｏｓ（４５°））（８)
【００４１】
ｒＲＥＰは各方向からの各受光角での反射率の平均値であり、下記式で表される。
【００４２】
ｒＲＥＰ＝∫ｓ×ｐ（θ）×ｓｉｎθ×ｅｘｐ(−σａ（ｄ＋ｄ／ｃｏｓθ）)ｄθ）／∫ｓｉｎθｄθ  （９）
【００４３】
また、ａＲＥＰは、厚さｄの代表層における吸収率であり、以下の式で表される。
【００４４】
ａＲＥＰ＝ｅｘｐ(−σａｄ)  （１０）
【００４５】
１回散乱の異方性を表すフェーズ関数としては、例えば、下記式で表されるＨｅｎｙｅｙ  Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ関数が知られている。ｇは、散乱の異方性を表す散乱パラメータであり、散乱の異方性に応じて−１から１までの値を持つ。例えばｇ＝０であればフェーズ関数は散乱方向に依存しない等方散乱に対応している。正の値のときは前方散乱、負の値のときは後方散乱が支配的となる。
【００４６】
ｐ（ｇ，θ）＝（１−ｇ２）／（４π（１＋ｇ２−２ｇｃｏｓθ）３／２）  （１１）
【００４７】
以下において、代表層理論を用いて、測定対象物質１５の濃度を推定する際に、反射光の異方性による影響を緩和する手法を提案する。
【００４８】
図４は、色素ローダミンＢの濃度が１００μｇ／ｍＬと０μｇ／ｍＬであるときそれぞれについて表面反射光の反射率を測定した結果を示すグラフである。符号２８は１００μｇ／ｍＬの測定結果を示し、符号２９は、０μｇ／ｍＬの測定結果を示す。色素ローダミンＢが１００μｇ／ｍＬ溶けている場合は、これにより光が吸収されるので、溶けていないときと比較して反射率が顕著に低下していることが分かる。この様に、光を吸収する物質の濃度が高い場合には、表面反射光の反射率に吸収の影響が現れる。
【００４９】
図３に例示するような単一散乱において、色素ローダミンＢの濃度が１００μｇ／ｍＬのときの受光角θにおける反射率ｒ４５°（１００μｇ／ｍＬ）と、０μｇ／ｍＬのときの受光角θにおける反射率ｒ４５°（０μｇ／ｍＬ）の比は、下記式１２によって表すことができる。σａは吸収係数、ｄは代表層の厚さである。色素ローダミンＢの濃度が０μｇ／ｍＬの場合には、σａ＝０である。色素ローダミンＢの濃度が１００μｇ／ｍＬのときσａ＝σａ、１００μｇ／ｍＬと表現する。式１２は、全ての波長において成立するので、差分３０が最も顕著に現れる波長における測定結果を式１２に代入すると好適である。
【００５０】
ｒ４５°（１００μｇ／ｍＬ）／ｒ４５°（０μｇ／ｍＬ）＝ｅｘｐ（−σａ、１００μｇ／ｍＬ（ｄ＋ｄ／ｃｏｓ（４５°）））  （１２）
【００５１】
ｒ４５°（１００μｇ／ｍＬ）とｒ４５°（０μｇ／ｍＬ）は、ともに同じ反射角４５°において測定したものであるので、式１２にしたがってこれらの比を求めることにより、反射光の異方性の影響がキャンセルされ、求めた比は異方性の影響を受けていないと考えられる。
【００５２】
式１２から、σａ、１００μｇ／ｍＬｄを求めることができる。この求められたσａ、１００μｇ／ｍＬｄと式１０を用いることにより、ａＲＥＰ（１００μｇ／ｍＬ）を求めることができる。
【００５３】
求められたａＲＥＰ（１００μｇ／ｍＬ）を、代表層理論の式５に代入することにより、ｒＲＥＰ（１００μｇ／ｍＬ）を求めることができる。
【００５４】
ｒＲＥＰ（１００μｇ／ｍＬ）、ｒ４５°（１００μｇ／ｍＬ）、式８、式９、式１１を用いて、散乱パラメータｇを決定することができる。したがって、Ｈｅｎｙｅｙ  Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ関数ｐ（ｇ，θ）を求めることができる。
【００５５】
求められたｇは媒質２７の濃度に依らず、散乱体の性質だけで決まるものである。したがって、この求められたｇを用いることにより、任意の濃度条件で測定したｒ４５°をｒＲＥＰに変換することができる。以下では具体例として、上記手順のなかで既に測定したｒ４５°（０μｇ／ｍＬ）をｒＲＥＰに変換する手順を説明する。
【００５６】
色素ローダミンＢの濃度が０μｇ／ｍＬであるとき、光は吸収されないと考えられるので、σａ＝０である。これを式８と式９に代入すると下記式１３が得られる。
【００５７】
ｒＲＥＰ／ｒ４５°（０μｇ／ｍＬ）
＝（∫ｓ×ｐ（θ）×ｓｉｎθｄθ／∫ｓｉｎθｄθ）／ｓ×ｐ（θ＝４５°）
＝（∫ｐ（θ）×ｓｉｎθｄθ／∫ｓｉｎθｄθ）／ｐ（θ＝４５°）  （１３）
【００５８】
ｇの値と式１１を用いて、∫ｐ（θ）×ｓｉｎθｄθ／∫ｓｉｎθｄθを数値的に計算することができる。ｐ（θ＝４５°）は、ｇの値と式１１から求めることができる。ｒ４５°（０μｇ／ｍＬ）は測定済である。これらの値を式１３に代入することにより、ｒＲＥＰを求めることができる。
【００５９】
ｒＲＥＰを式５に代入することにより、ａＲＥＰを求めることができる。ａＲＥＰを式６に代入することにより、代表層の吸光度Ａｓｕｒｆを求めることができる。
【００６０】
以上の説明においては、濃度条件１００μｇ／ｍＬにおける測定結果と濃度条件０μｇ／ｍＬにおける測定結果を用いて、ｇの値を求めるとともにそのｇの値を用いてｒＲＥＰを求める手順を説明したが、その他濃度条件においても同様の手順によりｒＲＥＰを求めることができる。
【００６１】
図５は、上記の手続きにより補正された吸光度Ａｓｕｒｆを示すグラフである。白四角は図２に示す白四角と同じものである。黒丸は補正された吸光度Ａｓｕｒｆを示す。図５に示すように、本実施形態１に係る手法により、高濃度領域においても、濃度と吸光度との間の対応関係の線形性がさらに改善されることが分かる。
【００６２】
図６は、本実施形態１において代表層の吸光度Ａｓｕｒｆを求める手順をまとめたフローチャートである。以下図６の各ステップについて説明する。
【００６３】
（図６：ステップＳ６０１）
オペレータは、分光分析装置１００を用いて、ｒ４５°（１００μｇ／ｍＬ）とｒ４５°（０μｇ／ｍＬ）を計測する。本ステップは、図４に例示する計測結果を得ることに相当する。演算部２０は、その計測結果を保持する。
【００６４】
（図６：ステップＳ６０２〜Ｓ６０４）
演算部２０は、ステップＳ６０１における計測結果と式１２を用いて、σａ、１００μｇ／ｍＬｄを求める（Ｓ６０２）。演算部２０は、σａ、１００μｇ／ｍＬｄと式１０を用いることにより、ａＲＥＰ（１００μｇ／ｍＬ）を求める（Ｓ６０３）。演算部２０は、ａＲＥＰ（１００μｇ／ｍＬ）と式５を用いることにより、ｒＲＥＰ（１００μｇ／ｍＬ）を求める（Ｓ６０４）。
【００６５】
（図６：ステップＳ６０５）
演算部２０は、ｒＲＥＰ（１００μｇ／ｍＬ）、ｒ４５°（１００μｇ／ｍＬ）、式８、式９、式１１を用いて、散乱パラメータｇを求める。
【００６６】
（図６：ステップＳ６０６〜Ｓ６０８）
演算部２０は、ｇとｒ４５°（０μｇ／ｍＬ）を用いて、式１３にしたがってｒＲＥＰを求める（Ｓ６０６）。演算部２０は、ｒＲＥＰと式５を用いてａＲＥＰを求める（Ｓ６０７）。演算部２０は、ａＲＥＰと式６を用いてＡｓｕｒｆを求める（Ｓ６０８）。
【００６７】
（図６：ステップＳ６０１〜Ｓ６０８：補足）
その他濃度条件（仮にｘμｇ／ｍＬと呼ぶ）についてＡｓｕｒｆを求める場合は、その濃度条件（ｘμｇ／ｍＬ）について、（ａ）ｒ４５°（０μｇ／ｍＬ）と同様の測定結果を取得し、（ｂ）式５を用いる前に式３と式４にしたがってＲｔｏｔを求めておく。その他手順は以上と同様である。
【００６８】
＜実施の形態１：まとめ＞
本実施形態１に係る分光分析装置１００は、媒質２７を溶かした試料の反射率と溶かしていない試料の反射率を測定し、これらと代表層理論を合わせることにより、散乱の異方性パラメータｇを算出することができる。これにより、吸光度Ａｓｕｒｆと測定対象物質１５の濃度との間の対応関係の線形性を改善し、より正確に濃度を求めることができる。
【００６９】
＜実施の形態２＞
実施形態１においては、測定対象物質１５の表面反射光の異方性による影響を受けないパラメータを求めることにより、吸光度と濃度との間の対応関係の線形性を改善することを説明した。これに対して、測定対象物質１５の表面反射光の異方性をあらかじめ計測するかまたはこれが既知である場合は、その異方性による影響があらかじめ分かっていることになるので、これを利用して吸光度や濃度を用いることもできる。本発明の実施形態２では、その具体的手法を説明する。
【００７０】
図７は、分光分析装置１００を用いて式１１で表されるＨｅｎｙｅｙ  Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ関数の散乱パラメータｇを推定する場合の構成例を示す図である。分光分析装置１００の構成は実施形態１と同じだが、複数の受光角度（図７においては受光角度１１１と１１２）において測定を実施する。受光角度１１１において測定を実施した後、偏光子１６／コリメートレンズ１７／光ファイバー１８／受光部１９を受光角度１１２に対応する位置に移動させて測定を実施する。
【００７１】
式１１のフェーズ関数は、測定対象物質１５の位置を基準として楕円のような軌道を描く関数であり、ｐ（ｇ，θ）の値が２つ以上分かればｇを特定することができる。したがって２つ以上の受光角度における測定結果と式７を用いてｐ（ｇ，θ）の値を２つ以上取得することにより、ｇと式１１の関数を求めることができる。図７においては２つの受光角度１１１と１１２における測定を例示しているが、３つ以上の受光角度において測定してもよいし、２以上の受光光学系を用いて測定してもよい。ｇの値が既知である測定対象物質１５を測定する場合は、図７のような測定プロセスを省略することができる。
【００７２】
ｇと式１１のフェーズ関数を特定することができれば、以後の手順は実施形態１と同様である。ただし、Ａｓｕｒｆを求めようとしている濃度条件（ｘμｇ／ｍＬ）について未だｒ４５°（０μｇ／ｍＬ）と同様の測定結果を取得していない場合は、改めてこれを取得する必要がある。
【００７３】
測定対象物質１５の特性によっては、式１１以外のフェーズ関数を用いることが適している場合もある。例えば、波長スケールに対して測定対象物質１５の大きさが十分に小さい場合、Ｒａｙｌｅｉｇｈ散乱と呼ばれる散乱が支配的になる。これに対し、波長スケールに対して測定対象物質１５の大きさが同程度の場合には、Ｍｉｅ散乱と呼ばれる散乱が支配的となる。
【００７４】
Ｒａｙｌｅｉｇｈ散乱の場合におけるフェーズ関数としては、下記式１４を用いることができる。さらには、Ｒａｙｌｅｉｇｈ散乱は偏光を解消する性質があるので、その影響を考慮すると下記式１５を用いることができる。Δは偏光解消度である。
【００７５】
ｐ（θ）＝３（１＋ｃｏｓ２θ）  （１４）
ｐ（θ）＝（３／４）（２／（２＋Δ））（１＋Δ）＋（１−Δ）ｃｏｓ２θ （１５)
【００７６】
測定対象物質１５の大きさが波長スケールよりも十分大きい拡散性散乱の場合には、物質表面の形状に依存した散乱が発生する。この場合は、物質表面の形状に関する情報（例えば表面の屈折率や凹凸、表面粗さ、など）を分光分析装置１００に対して入力し、演算部２０はその情報を用いてフェーズ関数に相当する関数を定めることができる。
【００７７】
フェーズ関数を特定するための各情報（例えば式１１、１４、１５の区別、偏光解消度Δ、測定対象物質１５の形状、など）は、オペレータが適当なインターフェースを介して分光分析装置１００に対して与えることができる。
【００７８】
＜実施の形態２：まとめ＞
本実施形態２に係る分光分析装置１００において、演算部２０は、散乱パラメータｇを測定またはオペレータが与えることによって取得し、その散乱パラメータｇを用いて、全受光角度にわたる平均反射率を求めることができる。これにより、測定対象物質１５が反射光の異方性を有し、かつ特定の受光角度において測定を実施した場合であっても、異方性の影響を除去し、測定対象物質１５の濃度を正確に求めることができる。
【００７９】
＜実施の形態３＞
測定対象物質１５の特性などの測定条件によっては、表面反射光の強度が弱く、測定が困難である場合がある。本発明の実施形態３では、標準試料の表面反射光の反射率を用いて、測定対象物質１５の表面反射光の反射率を推定する手法を説明する。
【００８０】
図８は、標準試料の反射率と測定対象物質１５の反射率を複数の光波長においてそれぞれ測定した結果を示すグラフである。まず標準サンプルに対して、実施形態１と同様に、表面反射光の反射率１１３と全反射光の反射率１１４を算出する。標準サンプルとしては、測定対象物質１５と同じ物質であり、かつ反射率１１３において吸収の影響が認められる高濃度のものを用いることが望ましい。
【００８１】
次に、標準サンプルとは異なる濃度の測定対象物質１５について、実施形態１と同様に全反射光の反射率１１５を算出する。測定対象物質１５については、表面反射光が吸収の影響を受けるか否かは問わない。測定対象物質１５の表面反射光は強度が弱いものと仮定する。この場合の反射率は、図８の点線曲線に示すようになり、精度よく反射率を求めることが困難である。
【００８２】
標準サンプルにおける全反射光の反射率１１４と表面反射光の反射率１１３との間の関係は、測定対象物質１５における全反射光の反射率１１５と点線に示す反射率との間の関係と相似していると推定される。本実施形態３においては、このことを利用して測定対象物質１５の表面反射率を求める。以下具体的な手順を説明する。なお、一般に反射率は光波長に応じて変化するが、以下の手順においてはその変化が僅かであり反射率を求めるに際してその影響を無視できると仮定する。
【００８３】
演算部２０は、反射率１１５の測定結果に基づき、反射率１１５が極値をとるときの光波長λｐｅａｋを特定する。演算部２０は、光波長λｐｅａｋにおける反射率１１５と同じ値（図８におけるＲｒｅｆ）を反射率１１４が有するときの光波長λｒｅｆを特定する。光波長λｒｅｆの候補が複数ある場合は、｜λｐｅａｋ−λｒｅｆ｜が最も小さくなるように光波長λｒｅｆを選ぶことが望ましい。
【００８４】
演算部２０は、光波長λｒｅｆにおける標準サンプルの表面反射光の反射率ｒｒｅｆを、光波長λｒｅｆにおける測定対象物質１５の表面反射光の反射率として特定する。反射率１１４と１１５との間の関係は、反射率１１３と測定対象物質１５の表面反射光の反射率との間の関係と相似していると推測されるからである。
【００８５】
光が吸収されない場合における標準サンプルの表面反射光の反射率ｒ０は、反射率ｒｒｅｆ、吸収係数σａ、図３のθとｄを用いて、下記式１６により表すことができる。式１６と式９から代表層における光吸収率ａＲＥＰを求め、さらに式６により吸光度Ａｓｕｒｆを求めることができる。
【００８６】
ｒｒｅｆ／ｒ０＝ｅｘｐ（−σａ（ｄ＋ｄ／ｃｏｓθ））  （１６）
【００８７】
吸光度Ａｓｕｒｆは、多重散乱の影響を受けていないので、ベール・ランベール則にしたがうと考えられる。ｒ０の波長に対する依存性が小さいという仮定が成り立てば、以上の手順により測定対象物質１５の濃度を算出することができる。
【００８８】
＜実施の形態４＞
実施形態１〜３においては、全反射光の強度Ｉｔｏｔを式２によって求めることとした。しかし測定対象によっては、光学的性質が深さ方向に応じて変化する場合がある。例えば皮膚は、表面から順に表皮／真皮／皮下脂肪によって構成されており、各層は組成が異なる。こうした測定対象物質１５においては、Ｉｔｏｔを全反射光として全反射率を求めると、測定対象である層以外の特性が全反射率に含まれてしまう場合がある。特に実施形態３においては、光波長によって反射率が変化しない（または変化の影響を無視できる）ことを前提としているので、測定対象以外の層の影響を受けることは望ましくない。
【００８９】
そこでこのような測定対象物質１５については、全反射光として、Ｉｔｏｔの代わりにＩ｜｜を用いることができる。これにより、Ｉｔｏｔよりも深度の浅い部分における全反射率を得ることができる。これを用いて、実施形態３の手法により濃度を求めることができる。測定対象物質１５の特性によっては、全反射光としてＩ⊥を用いてもよいし、偏光角を０°から９０°の任意の値に設定してもよい。
【００９０】
一般的には、Ｉ｜｜が浅い部分における反射率を与え、Ｉ⊥が最も深い部分までの全層を含む全反射率を与えると考えられる。したがって、測定対象物質１５が層毎に異なる特性を有する場合は、全反射光として、Ｉｔｏｔの代わりにＩ｜｜を用いることが望ましいと考えられる。
【００９１】
＜本発明の変形例について＞
本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【００９２】
実施形態１においては、２つの表面反射率ｒ（１００μｇ／ｍＬ）とｒ（０μｇ／ｍＬ）の比を用いて吸光度を計算する。これら表面反射率の値が小さい場合は、例えば実施形態３を併用することができる。
【００９３】
実施形態１において、偏光子１４の各回転状態のとき光源１１をＯＦＦして、バックグラウンドを測定してもよい。演算部２０は、偏光状態が平行であるときのバックグラウンド光強度Ｉｂ｜｜と、偏光状態が垂直であるときのバックグラウンド光強度Ｉｂ⊥を、それぞれ記憶しておき、反射光強度を求める際にこれらを差し引くことができる。
【００９４】
入射光強度Ｉ０を測定する際には、ミラーなどを通じて入射光を受光部１９に直接導くようにすることもできる。それが難しい場合には、拡散反射標準などを用いて入射光強度Ｉ０を測定してもよい。
【００９５】
以上の実施例形態においては、色素ローダミンＢが溶解した牛乳を測定対象物質１５の例として取り上げたが、本発明の方法は、より一般的に、散乱体を含む溶液や粉体における成分の濃度を拡散反射分光により定量する際に適用することができる。
【００９６】
実施形態３において、反射率１１３を測定する際の光強度信号は弱いことが多いので、得られた反射率１１３をスムージングしておくことが望ましい。スムージングの方法としては、移動平均に基づく方法、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法、フーリエ変換に基づく方法、Ｗａｖｅｌｅｔ変換に基づく方法、などが考えられる。また、吸収により影響される部分は、純物質の吸収スペクトルの定数倍になると考えられるので、その定数をあらかじめ求めておいてもよい。
【００９７】
以上の実施形態においては、表面近傍から反射された光も含めて表面反射光と呼ぶこととした。具体的には、測定精度などの諸条件に鑑みて、式１が成立するとみなすことができる範囲の反射光を、表面反射光として取り扱うことができる。
【００９８】
以上の実施形態において、演算部２０は、これらの機能を実装した回路デバイスなどのハードウェアによって構成することもできるし、これらの機能を実装したソフトウェアをＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）などの演算装置が実行することにより構成することもできる。
【符号の説明】
【００９９】
１１：光源
１２：光ファイバー
１３：コリメートレンズ
１４：偏光子
１５：測定対象物質
１６：偏光子
１７：コリメートレンズ
１８：光ファイバー
１９：受光部
２０：演算部
２１：受光角度
２７：媒質
１１１：受光角度
１１２：受光角度
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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