(57)【要約】      （修正有）【課題】ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、補因子ＮＡＤ（Ｈ）に対する増大した特異性を有するデヒドロゲナーゼ変異体を提供すること。【解決手段】大腸菌由来３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼの特定位置を置換した変異体であって、元のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有し；３−ＨＰＤＨ活性を有する、変異体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位に対応する１つまたは複数（数個）の位置に置換を含む３−ＨＰＤＨ変異体であって、
配列番号２、４、もしくは６に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有し；３−ＨＰＤＨ活性を有する、変異体。
【請求項２】
配列番号２の９位に対応する位置に置換を含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
配列番号２の９位に対応する位置にＧｌｙを含む、請求項１または２に記載の変異体。
【請求項４】
配列番号２の３１位に対応する位置に置換を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項５】
配列番号２の３１位に対応する位置にＡｓｐまたはＧｌｕを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項６】
配列番号２の３２位に対応する位置に置換を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項７】
配列番号２の３２位に対応する位置にＬｅｕを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項８】
配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、８０、もしくは８１を含むか、またはこれらから構成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項９】
前記変異体が、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、ＮＡＤ（Ｈ）に対する増大した特異性（例えば、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、ＮＡＤ（Ｈ）に対する２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、もしくは１０００倍を超える特異性）を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項１０】
３−ＨＰＤＨ活性を有するポリペプチドであって、配列番号２、４、もしくは６に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、かつ、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、ＮＡＤ（Ｈ）に対する増大した特異性を有する、ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の変異体またはポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
活性３−ＨＰ経路と、３−ＨＰＤＨ活性を有する３−ＨＰＤＨ変異体をコードする異種ポリヌクレオチドとを含む宿主細胞であって、
前記変異体が、配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位に対応する１つまたは複数（数個）の位置に置換を含み；かつ
前記変異体が、配列番号２、４、もしくは６に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、宿主細胞。
【請求項１３】
前記変異体が、配列番号２の９位に対応する位置に置換を含む、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記変異体が、配列番号２の９位に対応する位置にＧｌｙを含む、請求項１２または１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記変異体が、配列番号２の３１位に対応する位置に置換を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記変異体が、配列番号２の３１位に対応する位置にＡｓｐまたはＧｌｕを含む、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記変異体が、配列番号２の３２位に対応する位置に置換を含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記変異体が、配列番号２の３２位に対応する位置にＬｅｕを含む、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
前記変異体が、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、８０、もしくは８１を含むか、またはこれらから構成される、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記変異体が、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、ＮＡＤ（Ｈ）に対する増大した特異性（例えば、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、ＮＡＤ（Ｈ）に対する２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、もしくは１０００倍を超える特異性）を有する、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記細胞が、酵母細胞（例えば、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）酵母細胞）である、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記細胞が、以下：
ＰＥＰカルボキシラーゼ活性またはピルビン酸カルボキシラーゼ活性；
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性；
アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性；および
βアラニン／αケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）活性
を含む、請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記細胞が、以下：
ＰＥＰカルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド；
ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド；
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド；
アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、および
ＢＡＡＴをコードする異種ポリヌクレオチド
から選択される１つまたは複数の異種ポリヌクレオチドを含む、請求項１２〜２２のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
以下：
ａ．３−ＨＰの製造を実施可能にする条件下で、請求項１２〜２３のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養するステップ；および
ｂ．前記３−ＨＰを回収するステップ
を含む、３−ＨＰを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表を含んでおり、これは本明細書において参照により援用される。
【０００２】
背景
３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）は、発酵によって製造することができる上位１２の高ポテンシャルビルディングブロック化学物質の１つとして米国エネルギー省によって同定された炭素数３のカルボン酸である。乳酸（２−ヒドロキシプロピオン）酸の異性体である３−ＨＰの別名として、エチレン乳酸および３−ヒドロキシプロピオン酸塩が挙げられる。３−ＨＰは、グルコース、複数の官能基からの１００％理論収率を有する魅力的な再生可能プラットフォーム化学物質であり、これによって、様々な化学反応に参加することが可能になり、しかも毒性が低い。３−ＨＰは、１，３−プロパンジオール、マロン酸、アクリルアミド、およびアクリル酸などの数種の汎用化学製品を形成する基質として用いることができる。アクリル酸は、アクリル酸エステルおよび高吸収性ポリマーを製造するのに用いられる大量生産型化学製品（＞７０億ｌｂ／年）であり、プロピレンの接触酸化から容易に得られる。３−ＨＰの発酵生産は、これらの商業的に重要な化学製品の供給原料として石油化学に対する持続可能な代替物を提供することになり、これによって、エネルギー消費、海外の石油供給に対する依存、ならびに温室効果ガス生成が低減する。
【発明の概要】
【０００３】
３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ（３−ＨＰＤＨ）は、マロン酸セミアルデヒドを３−ＨＰに変換する酵素である（図１）。特定の３−ＨＰＤＨ酵素は、補因子ＮＡＤＰ（Ｈ）（ＥＣ１．１．１．２９８）を使用する。しかし、何らかの操作された代謝経路を用いて、３−ＨＰＤＨ酵素が、ＮＡＤＰ（Ｈ）ではなく補因子ＮＡＤ（Ｈ）を用いるようにすることが望ましい場合もある（例えば、レドックスバランスを改善するために）。従って、当分野では、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、補因子ＮＡＤ（Ｈ）に対する増大した特異性を有するデヒドロゲナーゼ変異体を開発する必要がある。本明細書に、この要求を満たすデヒドロゲナーゼ変異体を記載する。
【０００４】
概要
本明細書には、配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位に対応する１つまたは複数（例えば、２つ、数個）の位置に置換を含む３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ変異体が記載され、これらの変異体は、３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する。いくつかの態様では、変異体は、配列番号２の１０位に対応する位置に欠失を含む。いくつかの態様では、変異体は、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、補因子ＮＡＤ（Ｈ）に対する増大した特異性を有する。
【０００５】
また、これらの変異体をコードする単離されたポリヌクレオチド；ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞；ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を用いて、ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）を製造する方法；ならびに変異体を製造する方法も記載される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】３−ＨＰを生成する経路を示す。
【図２】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃ、及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＭＲ２２６ｃ（それぞれ、配列番号２、４、及び６）の在来のデヒドロゲナーゼ配列のアラインメントを示す。補因子結合に関与する残基には下線を引く。触媒関与する残基は太字で示す。
【図３】在来の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）デヒドロゲナーゼ（配列番号２）と比較した、変異体デヒドロゲナーゼｍｕｔ１〜ｍｕｔ２５（それぞれ、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、および３３）のＮ末端領域；在来のイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）デヒドロゲナーゼ（配列番号４）と比較した、変異体デヒドロゲナーゼｍｕｔ２６及びｍｕｔ２７（それぞれ、配列番号８０及び８１）の部分配列アラインメントを示す。
【図４】ｐＴｒｃ９９Ａのプラスミドマップを示す。
【図５】ｐＭｃＴｓ１０８のプラスミドマップを示す。
【図６】ｐＭｃＴｓ１１６のプラスミドマップを示す。
【図７】ｐ１０４５１６８のプラスミドマップを示す。
【図８】ｐＭｃＴｓ７７のプラスミドマップを示す。
【図９】ｐ１１ＡＡＴ５ＷＰのプラスミドマップを示す。
【図１０】ｐＭｃＴｓ７８のプラスミドマップを示す。
【図１１】ｐＭｃＴｓ１１５のプラスミドマップを示す。
【図１２】ｐ１１ＡＡ２ＧＪＰのプラスミドマップを示す。
【図１３】ｐＭｃＴｓ１０２のプラスミドマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
定義
３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ：「３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ」（３−ＨＰＤＨ）という用語は、ＮＡＤ（Ｈ）またはＮＡＤＰ（Ｈ）補因子の存在下で、マロン酸セミアルデヒドと３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ（３−ＨＰ）の相互変換を触媒する酵素を意味する。３−ＨＰデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、それらが、ＮＡＤ（Ｈ）補因子を用いる場合には、ＥＣ１．１．１．５９として分類され、それらが、ＮＡＤＰ（Ｈ）補因子を用いる場合には、ＥＣ１．１．１．２９８として分類される。ＥＣ１．１．１．２９８として分類される酵素はまた、マロン酸セミアルデヒドレダクターゼとも呼ばれる。当業者であれば、３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼが、２つ以上の基質について特異性を持ちうることは認識されよう。例えば、配列番号２の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼは、セリンと２−アミノマロン酸セミアルデヒド（すなわち「セリンデヒドロゲナーゼ」）の相互変換、および３−ＨＰとマロン酸セミアルデヒド（すなわち、３−ＨＰＤＨ）の相互変換の両方を触媒しうる。
【０００８】
３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ活性は、実施例に記載するマロン酸セミアルデヒドレダクターゼアッセイに従って決定することができる。一態様では、本発明の変異体は、配列番号２、４、もしくは６の３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼの少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％を有する。
【０００９】
活性３−ＨＰ経路：本明細書で用いる「活性３−ＨＰ経路」を有する宿主細胞は、発酵性糖から３−ＨＰへの代謝経路における各反応を触媒するのに必要な活性酵素を産生し、従って、少なくとも１つの発酵性糖の存在下、発酵条件下で培養すると、３−ＨＰを測定可能な収量で産生することができる。活性３−ＨＰ経路を有する宿主細胞は、１つまたは複数の３−ＨＰ経路遺伝子を含む。本明細書で用いる「３−ＨＰ経路遺伝子」とは、活性３−ＨＰ経路に関与する酵素をコードする遺伝子を指す。活性３−ＨＰ経路および活性３−ＨＰ経路に関与する対応酵素の一例を図１に示す。
【００１０】
活性３−ＨＰ経路での各反応を触媒するのに必要な活性酵素は、内在性遺伝子発現の活性、異種遺伝子発現の活性、または内在性および異種遺伝子発現の活性の組合せから起こりうる。
【００１１】
対立遺伝子変異体：「対立遺伝子変異体」という用語は、同一の染色体座を占有する遺伝子の２つ以上の代替的な形態のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は、突然変異を介して自然に生じ、また、個体群中の多型性によりもたらされ得る。遺伝子突然変異は、サイレント（コードされるポリペプチドにおける変化無し）であることが可能であり、または、改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがコードされ得る。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされたポリペプチドである。
【００１２】
コード配列：「コード配列」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を特定するポリヌクレオチド配列を意味する。コード配列の境界は、一般に、オープンリーディングフレームによって決定されるが、これは、通常、ＡＴＧ開始コドン、またはＧＴＧおよびＴＴＧなどの別の開始コドンで開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡなどの終止コドンで終了する。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ポリヌクレオチド、および／または組換えポリヌクレオチドの配列のいずれであってもよい。
【００１３】
制御配列：「制御配列」という用語は、ポリペプチド発現に必要な核酸配列を意味する。制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して在来もしくは外来のものであっても、互いに在来もしくは外来のものであってもよい。このような制御配列としては、限定するものではないが、リーダ配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネータ配列が挙げられる。制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域と制御配列の連結を容易にする特定の制限部位を導入する目的で、リンカーを備えていてもよい。
【００１４】
発現：「発現」という用語は、限定するものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌物を含むポリペプチドの生成に関与するいずれかのステップを含む。発現は（例えば、発現の増大を検出する目的で）例えば、ｍＲＮＡおよび／または翻訳ポリペプチドのレベルを測定するなどの当分野では公知の技術によって、測定することができる。
【００１５】
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、また、制御配列に作動可能にリンクされている直鎖または環状ＤＮＡ分子を意味し、ここで、制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現をもたらす。少なくとも、発現ベクターは、プロモータ配列、ならびに転写および翻訳終止シグナル配列を含む。
【００１６】
発酵培地：「発酵培地」という用語は、１つまたは複数（例えば、２つ、数個）の糖、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、セロビオース、キシロース、キシルロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、および／または可溶性オリゴ糖などを含む培地を指し、ここで、培地は、部分的に、活性３−ＨＰ経路を有する宿主細胞によって、３−ＨＰに変換（発酵）することができる。場合によっては、発酵培地は、テンサイ、デンプン、またはセルロースなどの天然の供給源から得られ、また、酵素加水分解（糖化）によって供給源を前処理して得られたものでもよい。
【００１７】
断片：「断片」という用語は、当該ポリペプチド配列のアミノおよび／またはカルボキシル末端から１つまたは複数（例えば、２つ、数個）のアミノ酸が欠失しているポリペプチドを意味する。一態様では、断片は、３−ＨＰＤＨ活性を有する。別の態様では、断片中のアミノ酸残基の数は、例えば、本明細書に記載するいずれかの３−ＨＰＤＨの少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、例えば、配列番号２、４、もしくは６のアミノ残基の数の少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、もしくは９５％である。
【００１８】
異種ポリヌクレオチド：「異種ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では、宿主細胞に対して在来ではないポリヌクレオチド；１つまたは複数（例えば、２つ、数個）の構造的修飾が、コード領域に実施された在来のポリヌクレオチド；組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリヌクレオチドにリンクされた、異なる（外来）プロモータ）によるＤＮＡの操作の結果、発現が量的に変化した在来のポリヌクレオチド；または宿主細胞への１つまたは複数のポリヌクレオチドの追加コピーの導入により、発現が量的に変化した在来のポリヌクレオチドとして定義される。
【００１９】
宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、３−ＨＰＤＨをコードするポリヌクレオチド）を含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入等に対する感受性を有するあらゆる細胞型を意味する。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異による親細胞と同じではない親細胞のあらゆる子孫を包含する。
【００２０】
増大した特異性：「ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、ＮＡＤ（Ｈ）に対する増大した特異性」という用語は、当該ポリペプチドが、その他は同じ条件下で、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、ＮＡＤ（Ｈ）の存在下でより大きな３−ＨＰＤＨ活性を有することを意味する。いくつかの態様では、当該変異体は、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、ＮＡＤ（Ｈ）に対し２倍超、例えば、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、もしくは１０００倍を超える特異性を有する。
【００２１】
単離された：「単離された」という用語は、自然界においては生じない形態または環境にある物質を意味する。単離された物質の非限定的な例としては、（１）いずれかの非天然物質、（２）限定するものではないが、自然界において関連している天然構成成分の１種または複数種もしくは全てから少なくとも部分的に取り出されたいずれかの酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチドもしくは補因子を含むいずれかの物質；（３）自然界において見出される物質に対して人為的に修飾されたいずれかの物質；または、（４）自然界で関連する他の成分に対して物質量の増加により修飾されたいずれかの物質（例えば、物質をコードする遺伝子の複数のコピー；物質をコードする遺伝子と自然界で関連するプロモータより強力なプロモータの使用）が挙げられる。単離された物質は、発酵ブロスサンプル中に存在してもよい。
【００２２】
突然変異体：「突然変異体」という用語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００２３】
核酸構築物：「核酸構築物」という用語は、１つまたは複数（例えば、２つ、数個）の制御配列を含むポリヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよく、これは、天然の遺伝子から単離されるか、もしくは、そうでなければ自然に存在しないであろう様式で核酸のセグメントを含有するよう修飾されても、合成物であってもよい。
【００２４】
作動可能にリンクされた：「作動可能にリンクされた」という用語は、制御配列がコード配列の発現を指令するように、ポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に制御配列を配置する構造を意味する。
【００２５】
親または親３−ＨＰＤＨ：「親」または「親３−ＨＰＤＨ」という用語は、本発明の酵素変異体を生成するような改変が実施される３−ＨＰＤＨを意味する。親は、天然に存在する（野生型）ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片であってもよい。
【００２６】
配列同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性は、「配列同一性」というパラメータによって表される。
【００２７】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。
【００２８】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（前述のＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（前述のＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。
【００２９】
緊縮条件：緊縮条件は、本明細書において、２つのＤＮＡ配列を比較する際に、ハイブリダイゼーションを実施するために用いる。
【００３０】
「極めて低度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、２５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、４５℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００３１】
「低度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、２５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、５０℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００３２】
「中度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、３５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、５５℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００３３】
「中−高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、３５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、６０℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００３４】
「高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、５０％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、６５℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００３５】
「極めて高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、５０％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、７０℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００３６】
サブ配列：「サブ配列」という用語は、当該ヌクレオチド配列の５’および／または３’末端から欠失された１つまたは複数（例えば、２つ、数個）のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを意味する。一態様では、サブ配列は、３−ＨＰＤＨ活性を有する断片をコードする。別の態様において、サブ配列中のヌクレオチド残基の数は、例えば、本明細書に記載する３−ＨＰＤＨをコードするいずれかの配列中のヌクレオチド残基の数の少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、例えば、配列番号１、３、もしくは５のヌクレオチド残基の数の少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、もしくは９５％である。
【００３７】
変異体：「変異体」という用語は、１つまたは複数（例えば、２つ、数個）の位置で、親３−ＨＰＤＨに対する改変、すなわち置換、挿入、および／または欠失を含む３−ＨＰＤＨを意味する。置換とは、ある位置のアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換えを意味し；欠失とは、ある位置のアミノ酸の除去を意味し；また、挿入とは、ある位置のアミノ酸に隣接し、かつすぐ後に位置する１アミノ酸を付加することを意味する。
【００３８】
野生型：「野生型」３−ＨＰＤＨまたは「在来の」３−ＨＰＤＨという用語は、天然に存在する細菌、酵母、または糸状真菌などの天然に存在する微生物によって発現される３−ＨＰＤＨを意味する。
【００３９】
変異体の命名規則
本明細書に記載する目的のために、配列番号２を用いて、他の３−ＨＰＤＨ酵素中のアミノ酸番号付けを決定する。別の３−ＨＰＤＨのアミノ酸配列を配列番号２とアラインメントし、このアラインメントに基づき、配列番号２に開示されるポリペプチド中のいずれかのアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号を、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて決定する。用いるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。
【００４０】
別の３−ＨＰＤＨ中の対応するアミノ酸残基の同定は、いくつかのコンピュータプログラムを用いた複数のポリペプチド配列のアラインメントによって決定することができ、このようなプログラムとして、限定するものではないが、以下：ＭＵＳＣＬＥ（Ｌｏｇ予想による多重配列比較；バージョン３．５以降；Ｅｄｇａｒ，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２：１７９２−１７９７）、ＭＡＦＦＴ（バージョン６．８５７以降；ＫａｔｏｈおよびＫｕｍａ，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０：３０５９−３０６６；Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３：５１１−５１８；ＫａｔｏｈおよびＴｏｈ，２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３：３７２−３７４；Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５３７：３９−６４；ＫａｔｏｈおよびＴｏｈ，２０１０，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６：１８９９−１９００）、ならびにＣｌｕｓｔａｌＷを用いたＥＭＢＯＳＳ  ＥＭＭＡ（１．８３以降；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：４６７３−４６８０）があり、それぞれのデフォルトパラメータを用いる。
【００４１】
他の酵素配列が配列番号２から分岐して、伝統的な配列ベースの比較でそれらの関係性を検出できない場合（ＬｉｎｄａｈｌおよびＥｌｏｆｓｓｏｎ，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６１３−６１５）、別のペアワイズ配列比較アルゴリズムを用いることができる。データベースをサーチするのにポリペプチドファミリーの確率表示（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を使用するサーチプログラム（プロファイル）を用いて、配列ベースのサーチにおいて、より高い感度を達成することができる。例えば、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは、反復データベースサーチ法によってプロファイルを作成し、遠隔相同体を検出することができる（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。ポリペプチドのファミリーもしくはスーパーファミリーが、タンパク質構造データベース中に１つまたは複数の代表を有していれば、さらに高い感度の取得も可能である。ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（Ｊｏｎｅｓ，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：７９７−８１５；ＭｃＧｕｆｆｉｎおよびＪｏｎｅｓ，２００３，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １９：８７４−８８１）などのプログラムは、問合せ配列の構造フォールドを推定するニューラルネットワークに対する入力として、様々なソース（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、二次構造推定、構造アラインメントプロファイル、および溶媒和ポテンシャル）からの情報を使用する。同様に、Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３：９０３−９１９の方法を用いて、ＳＣＯＰデータベースに存在するスーパーファミリーモデルと、未知構造の配列をアラインメントすることができる。また、これらのアラインメントは、ポリペプチドの相同性モデルを作成するのに用いることもでき、こうしたモデルは、専用に開発された様々なツールを用いて、精度について評価することができる。
【００４２】
既知構造のタンパク質の場合、構造アラインメントを検索し、作成するためのいくつかのツールおよび手段が入手可能である。例えば、タンパク質のＳＣＯＰスーパーファミリーが構造的にアラインメントされており、こうしたアラインメントは、閲覧およびダウンロードが可能である。様々なアルゴリズムを用いて、２つ以上のタンパク質構造をアラインメントすることが可能であり、そのようなアルゴリズムとして、ディスタンスアラインメントマトリックス（ＨｏｌｍおよびＳａｎｄｅｒ，１９９８、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３３：８８−９６）またはコンビナトリアルエクステンション（ＳｈｉｎｄｙａｌｏｖおよびＢｏｕｒｎｅ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：７３９−７４７）があり、さらに、これらのアルゴリズムの実装を用いて、考えられる構造相同体を発見するために、目的の構造を含む構造データベースを問い合わせることもできる（例えば、ＨｏｌｍおよびＰａｒｋ，２０００，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １６：５６６−５６７）。
【００４３】
本発明に記載の変異体を説明するに際し、以下に記載する命名法を、参照しやすいように変える。公認のＩＵＰＡＣ１文字または３文字アミノ酸略号を用いる。
【００４４】
置換。アミノ酸置換については、以下の命名法を用いる：本来のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。従って、２２６位のトレオニンのアラニンによる置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」または「Ｔ２２６Ａ」と称する。同じ位置での二者択一の置換は、スラッシュによって分ける。例えば、２２６位のトレオニンのアラニンまたはバリンによる置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ／Ｖａｌ」または「Ｔ２２６Ａ／Ｖ」と称し、Ｔ２２６ＡまたはＴ２２６Ｖ置換を表す。多重突然変異は、プラス記号（「＋」）によって分け、例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ／Ｔｙｒ」または「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ／Ｙ」は、２０５位および４１１位での、グリシン（Ｇ）のアルギニン（Ｒ）での置換、ならびにフェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）によるセリン（Ｓ）の置換をそれぞれ示している。
【００４５】
欠失。アミノ酸欠失については、以下の命名法を用いる：本来のアミノ酸、位置、*。従って、１９５位のグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５*」または「Ｇ１９５*」と称する。多重欠失は、例えば、「Ｇｌｙ１９５*＋Ｓｅｒ４１１*」または「Ｇ１９５*＋Ｓ４１１*」のように、プラス記号（「＋」）によって分ける。
【００４６】
挿入。アミノ酸欠失については、以下の命名法を用いる：本来のアミノ酸、位置、本来のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。従って、１９５位のグリシンの後のリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」または「Ｇ１９５ＧＫ」と称する。複数のアミノ酸の挿入は、［本来のアミノ酸、位置、本来のアミノ酸、挿入されたアミノ酸＃１、挿入されたアミノ酸＃２；等］と称する。例えば、１９５位のグリシンの後のリシンおよびアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」または「Ｇ１９５ＧＫＡ」と称する。
【００４７】
このような場合、挿入されたアミノ酸残基は、挿入されたアミノ酸残基の前のアミノ酸残基の位置番号に小文字を加えることによって番号付けする。前述の例の場合、配列は、以下のようになる：
【００４８】
【表１】
2018033457.tif 000002
【００４９】
本明細書において、値またはパラメータの前の「約」は、その値またはパラメータ自体に関する態様（ａｓｐｅｃｔ）を含む。例えば、「約Ｘ」という表現は、態様「Ｘ」を含む。測定された値と組み合わせて用いられる場合、「約」は、少なくとも、特定の値を測定する方法に伴う不確実性を包含する範囲を含み、表示された値に２つの標準偏差を足した、または引いた範囲を含みうる。
【００５０】
本明細書において、また添付の請求の範囲において、単数形「１つの（ａ）」、「または」および「その」は、文中に明らかに別に記載のない限り、複数の指示対象を含む。本明細書に記載する態様は、態様から「構成される」および／または態様から「実質的に構成される」を含むことを理解されたい。
【００５１】
別途記載されているか、文脈から明らかに示されるのでない限り、本明細書で用いる技術および科学用語は全て、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００５２】
詳細な説明
本明細書には、特に、３−ＨＰＤＨ活性を有するポリペプチドが記載される。いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位に対応する１つまたは複数（例えば、２つ、数個）の位置に置換を含む変異体である。いくつかの態様では、変異体は、配列番号２の１０位に対応する位置に欠失をさらに含む。いくつかの態様では、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、ＮＡＤ（Ｈ）に対する増大した特異性を有するポリペプチド。
【００５３】
３−ＨＰＤＨ活性を有するポリペプチド
一態様では、３−ＨＰＤＨ活性を有するポリペプチドであって、ポリペプチドは：
ａ）配列番号２、４、もしくは６に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ）低度の緊縮条件、例えば、中度の緊縮条件、中度−高度の緊縮条件、高度の緊縮条件、または極めて高度の緊縮条件下で、配列番号１、３、もしくは５の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；または
ｃ）配列番号１、３、もしくは５に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであり；
ここで、ポリペプチドは、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、ＮＡＤ（Ｈ）に対する増大した特異性（例えば、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、もしくは１０００倍超のＮＡＤ（Ｈ）に対する特異性）を有する。
【００５４】
一態様では、ポリペプチドａ）は、配列番号２に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有し；ｂ）は、少なくとも低度の緊縮条件、例えば、中度の緊縮条件、中度−高度の緊縮条件、高度の緊縮条件、または極めて高度の緊縮条件下で、配列番号１の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ；および／またはｃ）は、配列番号１に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００５５】
配列番号２に関する上記の態様のいくつかにおいて、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも１つが、配列番号２とは異なる。一実施形態では、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも２つが、配列番号２と異なる。別の実施形態では、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも３つが、配列番号２と異なる。別の実施形態では、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも４つが、配列番号２と異なる。別の実施形態では、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも５つが、配列番号２と異なる。別の実施形態では、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも６つが、配列番号２と異なる。別の実施形態では、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の全てが、配列番号２と異なる。
【００５６】
別の態様において、ポリペプチドａ）は、配列番号４に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有し；ｂ）は、少なくとも低度の緊縮条件、例えば、中度の緊縮条件、中度−高度の緊縮条件、高度の緊縮条件、または極めて高度の緊縮条件下で、配列番号３の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ；および／またはｃ）は、配列番号３に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００５７】
配列番号４に関する上記の態様のいくつかにおいて、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも１つが、配列番号４とは異なる。一実施形態では、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも２つが、配列番号４と異なる。別の実施形態では、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも３つが、配列番号４と異なる。別の実施形態では、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも４つが、配列番号４と異なる。別の実施形態では、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも５つが、配列番号４と異なる。別の実施形態では、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも６つが、配列番号４と異なる。別の実施形態では、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の全てが、配列番号４と異なる。
【００５８】
別の態様において、ポリペプチドａ）は、配列番号６に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有し；ｂ）は、少なくとも低度の緊縮条件、例えば、中度の緊縮条件、中度−高度の緊縮条件、高度の緊縮条件、または極めて高度の緊縮条件下で、配列番号５の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ；および／または、配列番号５に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００５９】
配列番号６に関する上記の態様のいくつかにおいて、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも１つが、配列番号６とは異なる。一実施形態では、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも２つが、配列番号６と異なる。別の実施形態では、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも３つが、配列番号６と異なる。別の実施形態では、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも４つが、配列番号６と異なる。別の実施形態では、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも５つが、配列番号６と異なる。別の実施形態では、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも６つが、配列番号６と異なる。別の実施形態では、配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の全てが、配列番号６と異なる。
【００６０】
一態様において、ポリペプチドは、配列番号２の９位に対応する位置に、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌを含みうる。いくつかの実施形態では、９位に対応するアミノ酸は、Ｇｌｙである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１０位に対応する位置に欠失を含む。
【００６１】
別の態様では、ポリペプチドは、配列番号２の３１位に対応する位置に、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌを含みうる。いくつかの実施形態では、３１位に対応するアミノ酸は、ＡｓｐまたはＧｌｕである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１０位に対応する位置に欠失を含む。
【００６２】
別の態様では、ポリペプチドは、配列番号２の３２位に対応する位置に、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌを含みうる。いくつかの実施形態では、３２位に対応するアミノ酸は、Ｌｅｕである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１０位に対応する位置に欠失を含む。
【００６３】
別の態様では、ポリペプチドは、配列番号２の３３位に対応する位置に、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌを含みうる。いくつかの実施形態では、３３位に対応するアミノ酸は、ＳｅｒまたはＡｓｎである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１０位に対応する位置に欠失を含む。
【００６４】
別の態様では、ポリペプチドは、配列番号２の３４位に対応する位置に、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌを含みうる。いくつかの実施形態では、３４位に対応するアミノ酸は、ＡｌａまたはＰｒｏである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１０位に対応する位置に欠失を含む。
【００６５】
別の態様では、ポリペプチドは、配列番号２の３５位に対応する位置に、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌを含みうる。いくつかの実施形態では、３５位に対応するアミノ酸は、ＡｌａまたはＡｓｐである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１０位に対応する位置に欠失を含む。
【００６６】
別の態様では、ポリペプチドは、配列番号２の３６位に対応する位置に、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌを含みうる。いくつかの実施形態では、３６位に対応するアミノ酸は、Ａｌａである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１０位に対応する位置に欠失を含む。
【００６７】
ポリペプチドの一態様において、９に対応する位置はＧｌｙで、３１はＡｓｐまたはＧｌｕであり；９はＧｌｙで、３２はＬｅｕ；９はＧｌｙで、３３はＳｅｒまたはＡｓｎであり；９はＧｌｙで、３４はＡｌａまたはＰｒｏであり；９はＧｌｙで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；９はＧｌｙで、３６はＡｌａであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕで、３２はＬｅｕであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕで、３３はＳｅｒまたはＡｓｎであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕで、３４はＡｌａまたはＰｒｏであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕで、３６はＡｌａであり；３２はＬｅｕで、３３はＳｅｒまたはＡｓｎであり；３２はＬｅｕで、３４はＡｌａまたはＰｒｏであり；３２はＬｅｕで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；３２はＬｅｕで、３６はＡｌａであり；３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３４はＡｌａまたはＰｒｏであり；３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３６はＡｌａであり；３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３６はＡｌａであり；あるいは、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１０位に対応する位置に欠失を含む。
【００６８】
ポリペプチドの別の態様において、９に対応する位置はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕで、３２はＬｅｕであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕで、３３はＳｅｒまたはＡｓｎであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕで、３４はＡｌａまたはＰｒｏであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３２はＬｅｕで、３３はＳｅｒまたはＡｓｎであり；９はＧｌｙ、３２はＬｅｕ、３４はＡｌａまたはＰｒｏであり；９はＧｌｙ、３２はＬｅｕ、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；９はＧｌｙ、３２はＬｅｕで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３４はＡｌａまたはＰｒｏであり；９はＧｌｙ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；９はＧｌｙ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；９はＧｌｙ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、  ３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕで、３３はＳｅｒまたはＡｓｎであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕで、３４はＡｌａまたはＰｒｏであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕで、３６はＡｌａであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３４はＡｌａまたはＰｒｏであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３６はＡｌａであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３６はＡｌａであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、  ３６はＡｌａであり；３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３４はＡｌａまたはＰｒｏであり；３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３６はＡｌａであり；３２はＬｅｕ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；３２はＬｅｕ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３６はＡｌａであり；３２はＬｅｕ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３６はＡｌａであり；３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；あるいは、３４はＡｌａまたはＰｒｏ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１０位に対応する位置に欠失を含む。
【００６９】
ポリペプチドの別の態様において、９に対応する位置はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕで、３３はＳｅｒまたはＡｓｎであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕで、３４はＡｌａまたはＰｒｏであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３４はＡｌａまたはＰｒｏであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３４はＡｌａまたはＰｒｏであり；９はＧｌｙ、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；９はＧｌｙ、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３２はＬｅｕ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；９はＧｌｙ、３２はＬｅｕ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３２はＬｅｕ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａ；９はＧｌｙ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；９はＧｌｙ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３４はＡｌａまたはＰｒｏ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３４はＡｌａまたはＰｒｏであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３６はＡｌａであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３６はＡｌａであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３６はＡｌａであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３４はＡｌａまたはＰｒｏ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａ；３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３６はＡｌａであり；３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；３２はＬｅｕ、３４はＡｌａまたはＰｒｏ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；あるいは、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１０位に対応する位置に欠失を含む。
【００７０】
ポリペプチドの別の態様において、９に対応する位置はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕで、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３４はＡｌａまたはＰｒｏであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕで、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕで、３３はＳｅｒまたはＡｓｎで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３４はＡｌａまたはＰｒｏ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；９はＧｌｙ、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３２はＬｅｕ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３６はＡｌａであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕ、３４はＡｌａまたはＰｒｏ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；あるいは、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１０位に対応する位置に欠失を含む。
【００７１】
ポリペプチドの別の態様において、９に対応する位置はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕで、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３５はＡｌａまたはＡｓｐであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕで、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕで、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕで、３２はＬｅｕ、３４はＡｌａまたはＰｒｏ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕで、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；９はＧｌｙ、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａであり；あるいは、３１はＡｓｐまたはＧｌｕ、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１０位に対応する位置に欠失を含む。
【００７２】
ポリペプチドの別の態様において、９に対応する位置は、配列番号２のＧｌｙ、３１はＡｓｐまたはＧｌｕで、３２はＬｅｕ、３３はＳｅｒまたはＡｓｎ、３４はＡｌａまたはＰｒｏ、３５はＡｌａまたはＡｓｐで、３６はＡｌａである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１０位に対応する位置に欠失を含む。
【００７３】
これらの態様のいずれにおいても、ポリペプチドは、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、ＮＡＤ（Ｈ）に対する増大した特異性を有しうる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、２倍超、例えば５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、または１０００倍超のＮＡＤ（Ｈ）に対する特異性を有する。
【００７４】
変異体
いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位のいずれかに対応する１つまたは複数（例えば、２つ、数個）の位置に置換を含む、親３−ＨＰＤＨの３−ＨＰＤＨ変異体として表され、この変異体は、３−ＨＰＤＨ活性を有する。例えば、変異体は、置換Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ、Ｅ３５Ｄ／Ａ、およびＫ／Ｒ３６Ａの１つまたは複数（例えば、２つ、数個）を含んでいてよい。いくつかの態様では、変異体は、さらに、１０位に対応する位置に欠失を含む。いくつかの態様では、変異体は単離されている。
【００７５】
一実施形態において、変異体は、親３−ＨＰＤＨに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の、しかし、１００％未満の配列同一性を有する。
【００７６】
一実施形態において、変異体は、配列番号２に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００７７】
別の実施形態において、変異体は、配列番号４に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００７８】
別の実施形態において、変異体は、配列番号６に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００７９】
一態様において、本明細書に記載する変異体における改変（置換、欠失、および／または挿入）の数は、１〜２０、例えば、１〜１０および１〜５、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０の改変である。
【００８０】
一態様において、変異体は、配列番号２の９位に対応する位置に置換を含むか、その置換から構成される。例えば、９位に対応するアミノ酸を、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌで置換してよい。一態様では、９位に対応するアミノ酸は、Ｇｌｙである。別の態様では、変異体は、置換Ｔ／Ｓ９Ｇ、例えば、配列番号２を含む親の置換Ｔ９Ｇまたは配列番号４もしくは６を含む親の置換Ｓ９Ｇを含むか、これから構成される。
【００８１】
一態様において、変異体は、配列番号２の３１位に対応する位置に置換を含むか、その置換から構成される。例えば、３１位に対応するアミノ酸を、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌで置換してよい。一態様では、３１位に対応するアミノ酸は、ＡｓｐまたはＧｌｕである。別の態様では、変異体は、置換Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、例えば、配列番号２を含む親の置換Ｇ３１Ｄ／Ｅまたは配列番号４もしくは６を含む親の置換Ａ３１Ｄ／Ｅを含むか、これから構成される。
【００８２】
一態様において、変異体は、配列番号２の３２位に対応する位置に置換を含むか、その置換から構成される。例えば、３２位に対応するアミノ酸を、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌで置換してよい。一態様では、３２位に対応するアミノ酸は、Ｌｅｕである。別の態様では、変異体は、置換Ｒ３２Ｌ、例えば、配列番号２、４もしくは６を含む親の置換Ｒ３２Ｌを含むか、これから構成される。
【００８３】
一態様において、変異体は、配列番号２の３３位に対応する位置に置換を含むか、その置換から構成される。例えば、３３位に対応するアミノ酸を、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌで置換してよい。一態様では、３３位に対応するアミノ酸は、ＳｅｒまたはＡｓｎである。別の態様では、変異体は、置換Ｒ３３Ｓ／Ｎ、例えば、配列番号２、４もしくは６を含む親の置換Ｒ３３Ｓ／Ｎを含むか、これから構成される。
【００８４】
一態様において、変異体は、配列番号２の３４位に対応する位置に置換を含むか、その置換から構成される。例えば、３４位に対応するアミノ酸を、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌで置換してよい。一態様では、３４位に対応するアミノ酸は、ＡｌａまたはＰｒｏである。別の態様では、変異体は、置換Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ、例えば、配列番号２を含む親の置換Ｑ３４Ａ／Ｐ、配列番号２を含む親の置換ＫＱ３４Ａ／Ｐ、または配列番号６を含む親の置換Ｌ３４Ａ／Ｐを含むか、これから構成される。
【００８５】
一態様において、変異体は、配列番号２の３５位に対応する位置に置換を含むか、その置換から構成される。例えば、３５位に対応するアミノ酸を、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌで置換してよい。一態様では、３５位に対応するアミノ酸は、ＡｌａまたはＡｓｐである。別の態様では、変異体は、置換Ｅ３５Ｄ／Ａ、例えば、配列番号２、４もしくは６を含む親の置換Ｅ３５Ｄ／Ａを含むか、これから構成される。
【００８６】
一態様において、変異体は、配列番号２の３６位に対応する位置に置換を含むか、その置換から構成される。例えば、３６位に対応するアミノ酸を、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌで置換してよい。一態様では、３６位に対応するアミノ酸は、Ａｌａである。別の態様では、変異体は、置換Ｋ／Ｒ３６Ａ、例えば、配列番号２を含む親の置換Ｒ３６Ａまたは配列番号４もしくは６を含む親の置換Ｋ３６Ａを含むか、これから構成される。
【００８７】
別の態様において、変異体は、配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位に対応するいずれか２つの位置の置換を含むか、またはこれらの置換から構成される。例えば、変異体は、上に記載したものなどの、９位および３１位；９位および３２位；９位および３３位；９位および３４位；９位および３５位；９位および３６位；３１位および３２位；３１位および３３位；３１位および３４位；３１位および３５位；３１位および３６位；３２位および３３位；３２位および３４位；３２位および３５位；３２位および３６位；３３位および３４位；３３位および３５位；３３位および３６位；３４位および３５位；３４位および３６位；または３５位および３６位に対応する２つの置換を含むか、またはこれらの置換から構成されてもよい。一態様では、変異体は、以下の置換：Ｔ／Ｓ９ＧおよびＧ／Ａ３１Ｄ／Ｅ；Ｔ／Ｓ９ＧおよびＲ３２Ｌ；Ｔ／Ｓ９ＧおよびＲ３３Ｓ／Ｎ；Ｔ／Ｓ９ＧおよびＬ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ；Ｔ／Ｓ９ＧおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｔ／Ｓ９ＧおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／ＥおよびＲ３２Ｌ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／ＥおよびＲ３３Ｓ／Ｎ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／ＥおよびＬ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／ＥおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／ＥおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｒ３２ＬおよびＲ３３Ｓ／Ｎ；Ｒ３２ＬおよびＬ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ；Ｒ３２ＬおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｒ３２ＬおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＬ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ；Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＫ／Ｒ３６Ａ；またはＥ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａを含むか、またはこれらから構成される。これらの態様のいずれかにおいて、変異体は、さらに、配列番号２の１０位に対応する位置に欠失を含んでもよい。
【００８８】
別の態様において、変異体は、配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位に対応するいずれか３つの位置の置換を含むか、またはこれらの置換から構成される。例えば、変異体は、上に記載したものなどの、９位、３１位および３２位；９位、３１位および３３位；９位、３１位および３４位；９位、３１位および３５位；９位、３１位および３６位；９位、３２位および３３位；９位、３２位および３４位；９位、３２位および３５位；９位、３２位および３６位；９位、３３位および３４位；９位、３３位および３５位；９位、３３位および３６位；９位、３４位および３５位；９位、３４位および３６位；９位、３５位および３６位；３１位、３２位および３３位；３１位、３２位および３４位；３１位、３２位および３５位；３１位、３２位および３６位；３１位、３３位および３４位；３１位、３３位および３５位；３１位、３３位および３６位；３１位、３４位および３５位；３１位、３４位および３６位；３１位、３５位および３６位；３２位、３３位および３４位；３２位、３３位および３５位；３２位、３３位および３６位；３２位、３４位および３５位；３２位、３４位および３６位；３２位、３５位および３６位；３３位、３４位および３５位；３３位、３４位および３６位；３３位、３５位および３６位；あるいは、３４位、３５位および３６位に対応する３つの置換を含むか、またはこれらの置換から構成されてもよい。一態様では、変異体は、以下の置換：Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／ＥおよびＲ３２Ｌ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／ＥおよびＲ３３Ｓ／Ｎ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／ＥおよびＬ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／ＥおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／ＥおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３２ＬおよびＲ３３Ｓ／Ｎ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３２ＬおよびＬ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３２ＬおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３２ＬおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＬ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２ＬおよびＲ３３Ｓ／Ｎ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２ＬおよびＬ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２ＬおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２ＬおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＬ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＬ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ；Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／Ｎおよび  Ｋ／Ｒ３６Ａ；Ｒ３２Ｌ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｒ３２Ｌ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＫ／Ｒ３６Ａ；���３２Ｌ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；あるいは、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａを含むか、またはこれらから構成される。これらの態様のいずれかにおいて、変異体は、さらに、配列番号２の１０位に対応する位置に欠失を含んでもよい。
【００８９】
別の態様において、変異体は、配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位に対応するいずれか４つの位置の置換を含むか、またはこれらの置換から構成される。例えば、変異体は、上に記載したものなどの、９位、３１位、３２位および３３位；９位、３１位、３２位および３４位；９位、３１位、３２位および３５位；９位、３１位、３２位および３６位；９位、３１位、３３位および３４位；９位、３１位、３３位および３５位；９位、３１位、３３位および３６位；９位、３１位、３４位および３５位；９位、３１位、３４位および３６位；９位、３１位、３５位および３６位；９位、３２位、３３位および３４位；９位、３２位、３３位および３５位；９位、３２位、３３位および３６位；９位、３２位、３４位および３５位；９位、３２位、３４位および３６位；９位、３２位、３５位および３６位；９位、３３位、３４位および３５位；９位、３３位、３４位および３６位；９位、３３位、３５位および３６位；９位、３４位、３５位および３６位；３１位、３２位、３３位および３４位；３１位、３２位、３３位および３５位；３１位、３２位、３３位および３６位；３１位、３２位、３４位および３５位；３１位、３２位、３４位および３６位；３１位、３２位、３５位および３６位；３１位、３３位、３４位および３５位；３１位、３３位、３４位および３６位；３１位、３３位、３５位および３６位；３１位、３４位、３５位および３６位；３２位、３３位、３４位および３５位；３２位、３３位、３４位および３６位；３２位、３３位、３５位および３６位；３２位、３４位、３５位および３６位；あるいは、３３位、３４位、３５位および３６位に対応する４つの置換を含むか、またはこれらの置換から構成されてもよい。一態様では、変異体は、以下の置換：Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２ＬおよびＲ３３Ｓ／Ｎ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２ＬおよびＬ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２ＬおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２ＬおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＬ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＬ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３２Ｌ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３２Ｌ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３２Ｌ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＬ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｒ３２Ｌ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；あるいは、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａを含むか、またはこれらから構成される。これらの態様のいずれかにおいて、変異体は、さらに、配列番号２の１０位に対応する位置に欠失を含んでもよい。
【００９０】
別の態様において、変異体は、配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位に対応するいずれか５つの位置の置換を含むか、またはこれらの置換から構成される。例えば、変異体は、上に記載したものなどの、９位、３１位、３２位、３３位および３４位；９位、３１位、３２位、３３位および３５位；９位、３１位、３２位、３３位および３６位；９位、３１位、３２位、３４位および３５位；９位、３１位、３２位、３４位および３６位；９位、３１位、３２位、３５位および３６位；９位、３１位、３３位、３４位および３５位；９位、３１位、３３位、３４位および３６位；９位、３１位、３３位、３５位および３６位；９位、３１位、３４位、３５位および３６位；９位、３２位、３３位、３４位および３５位；９位、３２位、３３位、３４位および３６位；９位、３２位、３３位、３５位および３６位；９位、３２位、３４位、３５位および３６位；９位、３３位、３４位、３５位および３６位；３１位、３２位、３３位、３４位および３５位；３１位、３２位、３３位、３４位および３６位；３１位、３２位、３３位、３５位および３６位；３１位、３２位、３４位、３５位および３６位；３１位、３３位、３４位、３５位および３６位；あるいは、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位に対応する５つの置換を含むか、またはこれらの置換から構成されてもよい。一態様では、変異体は、以下の置換：Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＬ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／ＮおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３２Ｌ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；あるいは、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａを含むか、またはこれらから構成される。これらの態様のいずれかにおいて、変異体は、さらに、配列番号２の１０位に対応する位置に欠失を含んでもよい。
【００９１】
別の態様において、変異体は、配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位に対応するいずれか６つの位置の置換を含むか、またはこれらの置換から構成される。例えば、変異体は、上に記載したものなどの、９位、３１位、３２位、３３位、３４位および３５位；９位、３１位、３２位、３３位、３４位および３６位；９位、３１位、３２位、３３位、３５位および３６位；９位、３１位、３２位、３４位、３５位および３６位；９位、３１位、３３位、３４位、３５位および３６位；９位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位；あるいは、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位に対応する６つの置換を含むか、またはこれらの置換から構成されてもよい。一態様では、変異体は、以下の置換：Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＥ３５Ｄ／Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／ＰおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａ；あるいは、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａを含むか、またはこれらから構成される。これらの態様のいずれかにおいて、変異体は、さらに、配列番号２の１０位に対応する位置に欠失を含んでもよい。
【００９２】
別の態様において、変異体は、前述したものなど、配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位に対応する７つ全ての位置の置換を含むか、またはこれらの置換から構成される。一態様では、変異体は、置換：Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ、Ｅ３５Ｄ／ＡおよびＫ／Ｒ３６Ａを含むか、またはこれらから構成される。これらの態様のいずれかにおいて、変異体は、さらに、配列番号２の１０位に対応する位置に欠失を含んでもよい。
【００９３】
アミノ酸変異は、副次的な性質のものであってもよく、すなわち、タンパク質の折り畳みおよび／もしくは活性に顕著に影響しない保存的アミノ酸置換もしくは挿入；典型的には１〜３０アミノ酸の小さな欠失；アミノ−端子メチオニン残基などの小さなアミノ−もしくはカルボキシル−末端伸長；２０〜２５個以下の残基の小さなリンカーペプチド；または、ポリヒスチジン配列、抗原性エピトープもしくは結合性ドメインなどの変異もしくは他の機能を変化させることによって精製を促進させる小さな伸長であってもよい。
【００９４】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、および、小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびメチオニン）の群の範囲内である。特異活性を一般に改変しないアミノ酸置換は技術分野において公知であり、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。頻繁に生じる置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００９５】
あるいは、本明細書に記載するように、特定のアミノ酸変更は、ポリペプチドの物理化学的性質が改変されるような性質のものである。例えば、配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位のいずれかに対応する位置へのアミノ酸変更（ならびに１０位での任意選択的な欠失）は、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較してＮＡＤ（Ｈ）に対する特異性を増大するなど、補因子特異性を改変するものであってよい。
【００９６】
ポリペプチドにおける必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）などの技術分野において公知である手法に従って同定することが可能である。後者の技術においては、単一のアラニン突然変異が分子中のすべての残基に導入され、得られたミュータント分子が、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定するために３−ＨＰＤＨ活性についてテストされる。また、Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８を参照のこと。酵素の活性部位または他の生物学的相互作用は、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異が併用される、核磁気共嗚、結晶構造解析、電子回折または光親和性標識などの技術によって判定される、構造の物理的分析によって判定されることも可能である。例えば、ｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照のこと。必須アミノ酸のアイデンティティーは、関連ポリペプチドとのアラインメントから推測することもできる。
【００９７】
例えば、配列番号２の必須アミノ酸は、Ｙａｍａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４９（６）：７０１−７１２（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｗｐｄｂ．ｏｒｇ；ＰＤＢコード：３ＡＳＵおよび３ＡＳＶを参照）に記載される結晶学データの分析によって同定することができ、ここでは、１０６位、１３４位、１４７位、および１５１位の触媒四残基などの活性部位構造が同定されている。そこには、部位指定突然変異誘発研究に基づき、酵素活性に重要な別のアミノ酸残基も同定されている。同様に、配列番号６の必須アミノ酸も、入手可能な結晶学データの分析によって同定することができる（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｗｐｄｂ．ｏｒｇ；ＰＤＢコード：３ＲＫＵを参照）。配列番号４に対応する必須アミノ酸のアイデンティティーは、図２に示すように、配列番号２および配列番号６とのアラインメントから推測することができる。
【００９８】
いくつかの態様において、変異体は、少なくとも１８５アミノ酸、例えば、少なくとも２００、２１０、２２０、２３０、または２４０アミノ酸から構成される。
【００９９】
いくつかの実施形態において、変異体は、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、ＮＡＤ（Ｈ）に対し増大した特異性を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、ＮＡＤ（Ｈ）に対し、２倍超、例えば、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、または１０００倍を超える特異性を有する。
【０１００】
いくつかの実施形態において、変異体は、親と比較して、１つまたは複数の改善された特性、例えば、改善された触媒効率、改善された触媒速度、改善された化学安定性、改善された酸化安定性、改善されたｐＨ活性、改善されたｐＨ安定性、改善された比活性、貯蔵条件下での改善された安定性、改善された基質結合性、改善された基質切断性、改善された基質特異性、改善された基質安定性、改善された表面特性、改善された熱活性、および／または改善された熱安定性を有する。
【０１０１】
親３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ
親３−ＨＰＤＨは、（ａ）配列番号２、４、もしくは６に対して、少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチド；（ｂ）低度の緊縮条件、配列番号１、３、もしくは５の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；または（ｃ）配列番号１、３、もしくは５に対して、少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであってよい。
【０１０２】
一態様において、親３−ＨＰＤＨは、配列番号２に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する。一態様では、親のアミノ酸配列は、配列番号２と、１０アミノ酸以下、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸だけ異なる。別の態様では、親は、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、またはこの配列から構成される。別の態様では、親は、配列番号２の対立遺伝子変異体である。別の態様では、親は、配列番号２の断片である。
【０１０３】
別の態様において、親３−ＨＰＤＨは、配列番号４に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する。一態様では、親のアミノ酸配列は、配列番号４と、１０アミノ酸以下、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸だけ異なる。別の態様では、親は、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはこの配列から構成される。別の態様では、親は、配列番号４の対立遺伝子変異体である。別の態様では、親は、配列番号４の断片である。
【０１０４】
別の態様において、親３−ＨＰＤＨは、配列番号６に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一態様では、親のアミノ酸配列は、配列番号６と、１０アミノ酸以下、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸だけ異なる。別の態様では、親は、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、またはこの配列から構成される。別の態様では、親は、配列番号６の対立遺伝子変異体である。別の態様では、親は、配列番号６の断片である。
【０１０５】
別の態様において、親は、少なくとも低度の緊縮条件、例えば、中度の緊縮条件、中度−高度の緊縮条件、高度の緊縮条件、または極めて高度の緊縮条件下で、配列番号１の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。別の態様では、親は、少なくとも低度の緊縮条件、例えば、中度の緊縮条件、中度−高度の緊縮条件、高度の緊縮条件、または極めて高度の緊縮条件下で、配列番号３の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。別の態様では、親は、少なくとも低度の緊縮条件、例えば、中度の緊縮条件、中度−高度の緊縮条件、高度の緊縮条件、または極めて高度の緊縮条件下で、配列番号５の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１０６】
配列番号１、３、５のポリヌクレオチド、またはそのサブ配列、ならびに配列番号２、４、６のポリペプチド、またはその断片を用いて、当分野では公知の方法に従い、様々な属もしくは種の系統由来の親をコードするＤＮＡを同定し、クローン化するための核酸プローブを設計することもできる。特に、このようなプローブは、標準的サザンブロティング法の後、目的の細胞のゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために用いることができ、これにより、そこで対応する遺伝子を同定および単離することができる。このようなプローブは、完全配列よりはかなり短くてよいが、少なくとも１５、例えば、少なくとも２５、少なくとも３５、または少なくとも７０ヌクレオチドの長さでなければならない。好ましくは、核酸プローブは、少なくとも１００ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、または少なくとも９００ヌクレオチドの長さである。ＤＮＡおよびＲＮＡプローブのいずれを用いてもよい。プローブは、典型的に、対応遺伝子を検出するために標識されている（例えば、32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチン、またはアビジンで）。
【０１０７】
このような他の系統から作製されたゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリは、前述のプローブとハイブリダイズして、親をコードするＤＮＡについてスクリーニングしてもよい。このような他の系統からのゲノムもしくは他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または他の分離技術によって分離してもよい。ライブラリからのＤＮＡまたは分離されたＤＮＡをニトロセルロースもしくは他の好適なキャリア材料上に移し、固定化してもよい。配列番号１、３、５、もしくはそのサブ配列とハイブリダイズするクローンまたはＤＮＡを同定するために、キャリア材料をサザンブロットに用いる。
【０１０８】
一態様では、核酸プローブは、配列番号１、３、または５を有するポリヌクレオチドである。別の態様では、核酸プローブは、配列番号２、４、６のポリペプチド、またはその断片をコードするポリヌクレオチドである。
【０１０９】
別の実施形態において、親は、配列番号１に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。別の実施形態では、親は、配列番号３に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。別の実施形態では、親は、配列番号５に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１１０】
ポリペプチドは、一のポリペプチドの一領域が、他のポリペプチドの一領域のＮ−末端またはＣ−末端で融合したハイブリッドポリペプチドであり得る。
【０１１１】
親は、他のポリペプチドが本発明のポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端で融合した融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドであり得る。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドに融合させることにより生成される。融合ポリペプチドを生成する技術は、技術分野において公知であると共に、フレーム中に収まり、融合ポリペプチドの発現が同一のプロモータおよびターミネータによる制御下にあるよう、ポリペプチドをコードするコード配列を連結するステップを含む。融合ポリペプチドはまた、翻訳後に融合ポリペプチドが形成されるインテインテクノロジーを用いて構築されてもよい（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：２５７５−２５８３；Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）。
【０１１２】
融合ポリペプチドは、２つのポリペプチドの間に切断部位をさらに含んでいることが可能である。融合タンパク質が分泌される際に、この部位が切断されて２つのポリペプチドが遊離される。切断部位の例としては、これらに限定されないが、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８−５７６；Ｓｖｅｔｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５−２５１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ−Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８−３４９３；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：４９８−５０３；および、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：３７８−３８１；Ｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５０５−５１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：９８２−９８７；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：２４０−２４８；および、Ｓｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｌｄ  ４：３５−４８に開示されている部位が挙げられる。
【０１１３】
親は、いずれの属の微生物からでも得ることができる。本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、本明細書において用いられるところ、所与のソースに関連して、ポリヌクレオチドによってコードされた親がソースによって、または、ソースからのポリヌクレオチドが挿入された系統によって生成されることを意味することとする。一態様では、親は、細胞外に分泌される。
【０１１４】
親は、細菌性３−ＨＰＤＨであってもよい。例えば、親は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）もしくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）３−ＨＰＤＨなどのグラム陽性細菌性ポリペプチド、または、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）もしくはウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）３−ＨＰＤＨなどのグラム陰性細菌性ポリペプチドであってよい。
【０１１５】
一態様において、親は、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）３−ＨＰＤＨである。
【０１１６】
別の態様において、親は、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）またはストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）３−ＨＰＤＨである。
【０１１７】
別の態様において、親は、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）またはストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）３−ＨＰＤＨである。
【０１１８】
親は、真菌性３−ＨＰＤＨであってもよい。例えば、親は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）若しくはイサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属３−ＨＰＤＨなどの酵母３−ＨＰＤＨ；または、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ボトリオスペリア属（Ｂｏｔｒｙｏｓｐａｅｒｉａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、ケトミジウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、クラビセプス属（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コクリオボルス属（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、コプリノプシス属（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ）、コプトテルメス属（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ）、コリナスクス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クリホネクトリア属（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ジプロディア属（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、エクシディア属（Ｅｘｉｄｉａ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ギベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ホロマスチゴトイデス属（Ｈｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、イルペクス属（Ｉｒｐｅｘ）、レンチヌラ属（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）、レプトスパエリア属（Ｌｅｐｔｏｓｐａｅｒｉａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、メラノカルプス属（Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ）、メリピルス属（Ｍｅｒｉｐｉｌｕｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ポイトラシア属（Ｐｏｉｔｒａｓｉａ）、シュードプレクタニア属（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｃｔａｎｉａ）、シュードトリコニムファ属（Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、シゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、シタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、トリコファエア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ）、ベルチシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ボルバリエラ属（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ）もしくはキシラリア属（Ｘｙｌａｒｉａ）３−ＨＰＤＨなどの糸状真菌性３−ＨＰＤＨであってもよい。
【０１１９】
別の態様において、親は、サッカロマイセス・カルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）またはサッカロマイセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）３−ＨＰＤＨである。
【０１２０】
別の態様において、親は、アクレモニウム・セルロリチクス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、フザリウム・バクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉ���ｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、イルペクス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、チエラビア・アクロマチカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｃｈｒｏｍａｔｉｃａ）、チエラビア・アルボミセス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｌｂｏｍｙｃｅｓ）、チエラビア・アルボピロサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｌｂｏｐｉｌｏｓａ）、チエラビア・アウストラレインシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｕｓｔｒａｌｅｉｎｓｉｓ）、チエラビア・フィメティ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｆｉｍｅｔｉ）、チエラビア・ミクロスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）、チエラビア・オビスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｏｖｉｓｐｏｒａ）、チエラビア・ペルビアナ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｐｅｒｕｖｉａｎａ）、チエラビア・セトサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｅｔｏｓａ）、チエラビア・スペデドニウム（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｐｅｄｅｄｏｎｉｕｍ）、チエラビア・スブテルモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｕｂｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビア・テルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）３−ＨＰＤＨである。
【０１２１】
一態様において、親３−ＨＰＤＨは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のものであり、例えば、配列番号２の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）３−ＨＰＤＨである。別の態様では、親３−ＨＰＤＨは、イサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属由来のものであり、例えば、配列番号４のイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）３−ＨＰＤＨである。別の態様では、親３−ＨＰＤＨは、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来のものであり、例えば、配列番号６のサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ＨＰＤＨである。
【０１２２】
前述の種について、本発明は、知られている種の名称に関わらず、完全および不完全世代の両方、ならびに、例えば無性世代などの他の分類学上の同等物を含むことが理解されるであろう。当業者は、適切な同等物のアイデンティティーを容易に認識するであろう。
【０１２３】
これらの種の系統は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ：Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）、オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ：Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）、および、農業研究局特許培養物コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、北方リサーチセンター（ＮＲＲＬ：Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）などの多数の微生物保存機関において公共に容易に利用可能である。
【０１２４】
親は、前述のプローブを用いて天然（例えば、汚染物、コンポスト、水など）から単離された微生物、または天然物質（例えば、汚染物、コンポスト、水など）から直接得られるＤＮＡサンプルを含む他のソースから同定し、取得することもできる。微生物およびＤＮＡを自然環境から直接単離する技術は、当分野において周知である。次いで、親をコードするポリヌクレオチドは、他の微生物または混合ＤＮＡサンプルのゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリを同じようにスクリーニングすることにより得られ得る。一旦、親をコードするポリヌクレオチドがプローブで検出されたら、ポリヌクレオチドは、当業者に既知である技術（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと）を利用することにより単離またはクローン化されることが可能である。
【０１２５】
変異体の作製
また、３−ＨＰＤＨ活性を有する変異体を取得する方法も記載され、これは、（ａ）親３−ＨＰＤＨに、配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、および３６位に対応する１つまたは複数（例えば、２つ、数個の）位置で、置換を導入するステップ；ならびに（ｂ）変異体を回収するステップを含む。
【０１２６】
変異体は、部位指定突然変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、ランダム突然変異誘発、シャッフリングなどの当分野では公知のいずれかの突然変異誘発方法を用いて、作製することができる。
【０１２７】
部位指定突然変異誘発は、親をコードするポリヌクレオチドの１つまたは複数の確定部位に１つまたは複数（例えば、数個）の突然変異を導入する技術である。
【０１２８】
部位指定突然変異誘発は、所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドの使用を含むＰＣＲによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで達成することができる。部位指定突然変異誘発は、カセット突然変異誘発によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで達成することができ、これは、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド中の部位で制限酵素による切断の後、ポリヌクレオチド中に突然変異を含むオリゴヌクレオチドを連結することを含む。通常、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドを消化する制限酵素は同じであり、これによって、プラスミドの付着末端と挿入断片が相互に連結することが可能になる。例えば、ＳｃｈｅｒｅｒおよびＤａｖｉｓ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：４９４９−４９５５；ならびにＢａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：７３４９−４９６６を参照されたい。
【０１２９】
部位指定突然変異誘発はまた、当分野では公知の方法によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで達成することもできる。例えば、米国特許出願第２００４／０１７１１５４号明細書；Ｓｔｏｒｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：７７３−７７６；Ｋｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５−２９０；ならびにＣａｌｉｓｓａｎｏおよびＭａｃｉｎｏ，１９９６，Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５−１６を参照されたい。
【０１３０】
本明細書に記載する変異体を作製するのに、いずれの部位指定突然変異誘発を用いてもよい。例えば、用いることができる多数の市販のキットがある。
【０１３１】
合成遺伝子構築は、目的のポリペプチドをコードするように設計されたポリヌクレオチド分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成を含む。遺伝子合成は、多数の方法を用いて実施することができ、例えば、Ｔｉａｎら（２００４，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１０５０−１０５４）によって記載されているマルチプレックスマイクロチップを用いた技術および同様の技術があり、これらの方法では、オリゴヌクレオチドを合成し、光プログラム可能なマイクロ流体チップ上で組み立てる。
【０１３２】
単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を実施し、突然変異誘発、組換え、および／またはシャッフリングの公知の方法を用いて試験した後、関連するスクリーニング方法を実施することができ、このような方法として、以下に開示されたものがある：Ｒｅｉｄｈａａｒ−ＯｌｓｏｎおよびＳａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７；ＢｏｗｉｅおよびＳａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；または国際公開第９５／２２６２５号パンフレット。用いることができる他の方法として、変異性ＰＣＲ、ファージディスプレイ（Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）および領域指定突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５；Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ  ７：１２７）が挙げられる。
【０１３３】
突然変異誘発／シャッフリング方法は、宿主細胞によって発現されたクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検定するために、ハイスループット、自動スクリーニング方法と組み合わせることができる（Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、当分野における標準的方法を用いて、高速で配列決定することができる。これらの方法によって、ポリペプチドにおける個別のアミノ酸残基の重要性を迅速に決定することが可能になる。
【０１３４】
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築、および／または部位指定突然変異誘発、およびランダム突然変異誘発、および／またはシャッフリングの態様を組み合わせることによって達成される。半合成構築は、ＰＣＲ技術と組み合わせて、合成されたポリヌクレオチド断片を用いる方法によって代表される。従って、確定した遺伝子の領域をｄｅ  ｎｏｖｏ合成しても、部位特異的突然変異誘発プライマーを用いて他の領域を増幅してもよく、また、さらに別の領域を変異性ＰＣＲまたは非変異性ＰＣＲ増幅に付してもよい。次に、ポリヌクレオチドサブ配列をシャッフリングすることができる。
【０１３５】
ポリヌクレオチド、核酸構築物、および発現ベクター
一態様では、本明細書に記載するポリペプチドおよび変異体をコードするポリヌクレオチド（例えば、単離されたポリヌクレオチド）、ならびにこれらのポリヌクレオチドを含む核酸構築物および発現ベクターである。
【０１３６】
核酸構築物は、本明細書に記載するポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、これは、制御配列と適合可能な条件下で、好適な宿主細胞においてコード配列の発現を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされている。
【０１３７】
ポリヌクレオチドは、多様な方法で処置されて変異体の発現がもたらされ得る。ベクターへ挿入される前のポリヌクレオチドの処置が、発現ベクターに応じて、望ましいか、または、必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチドを修飾するための技術は技術分野において周知である。
【０１３８】
制御配列は、プロモータ、すなわち、ポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドであってもよい。プロモータは、変異体の発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモータは、ミュータント、切断およびハイブリッドプロモータを含む宿主細胞において転写活性を示すいずれかのポリヌクレオチドであり得、ならびに、宿主細胞に対して相同性または非相同性である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
【０１３９】
細菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写を指令する好適なプロモータの例としては、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（ＡｇａｉｓｓｅおよびＬｅｒｅｃｌｕｓ、１９９４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３：９７−１０７）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｒｃプロモータ（Ｅｇｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）および原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１）、ならびに、ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）から得られるプロモータがある。さらなるプロモータが、「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２４２：７４−９４；および、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９に記載されている。タンデムプロモータの例が、国際公開第９９／４２８３５号パンフレットに開示されている。
【０１４０】
糸状真菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写を指令する好適なプロモータの例としては、以下：アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）アルカリ性タンパク分解酵素、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム・ダリア（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ  Ｄａｒｉａ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム・クイン（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ  Ｑｕｉｎｎ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼ、ならびに、ＮＡ２−ｔｐｉプロモータ（非翻訳リーダが、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダで置換された、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中性α−アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモータ；非限定的例としては、非翻訳リーダがアスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダで置換された、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモータが挙げられる）の遺伝子から得られるプロモータ；ならびに、その突然変異体、切断およびハイブリッドプロモータがある。
【０１４１】
酵母宿主において、有用なプロモータは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコール３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）、およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞についての他の有用なプロモータは、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８により記載されている。
【０１４２】
制御配列はまた、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる転写ターミネータであり得る。ターミネータ配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの３’−末端に作動可能にリンクする。宿主細胞において機能するいずれかのターミネータが用いられ得る。
【０１４３】
細菌宿主細胞の好ましいターミネータは、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリ性プロテアーゼ（ａｐｒＨ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）リボソームＲＮＡ（ｒｒｎＢ）の遺伝子から得られる。
【０１４４】
糸状真菌宿主細胞の好ましいターミネータは、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン−様タンパク分解酵素の遺伝子から得られる。
【０１４５】
酵母宿主細胞の好ましいターミネータは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）チトクロムＣ（ＣＹＣ１）およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グリセルアルデヒド−３−リン酸３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞の他の有用なターミネータが、前述のＲｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２に記載されている。
【０１４６】
制御配列は、プロモータの下流で、かつ遺伝子のコード配列の上流のｍＲＮＡ安定化領域であってもよく、これは、遺伝子の発現を増大させる。
【０１４７】
好適なｍＲＮＡ安定化領域の例は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（国際公開９４／２５６１２号パンフレット）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＰ８２遺伝子（Ｈｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７７：３４６５−３４７１）から得られる。
【０１４８】
制御配列はまた、リーダ、すなわち、ｍＲＮＡの非翻訳領域であってもよく、これは、宿主細胞による翻訳にとって重要である。リーダ配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの５’−末端に作動可能にリンクさせる。宿主細胞において機能性であれば、どんなリーダを用いてもよい。
【０１４９】
糸状真菌宿主細胞の好ましいリーダは、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびアスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
【０１５０】
酵母宿主細胞の好適なリーダは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコール３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【０１５１】
制御配列はまた、変異体コード配列の３’−末端に作動可能にリンクし、転写された場合に、ポリアデノシン残基を転写ｍＲＮＡに付加するシグナルとして宿主細胞により認識される配列であるポリアデニル化配列であってよい。宿主細胞において機能性であれば、どのポリアデニル化配列を用いてもよい。
【０１５２】
糸状真菌宿主細胞の好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、およびフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【０１５３】
イースト菌宿主細胞の有用なポリアデニル化配列が、Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．１５：５９８３−５９９０に記載されている。
【０１５４】
制御配列はまた、変異体のＮ−末端にリンクしたシグナルペプチドをコードし、および、変異体を細胞の分泌経路に送るシグナルペプチドコード領域であり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の５’−末端は、変異体をコードするコード配列のセグメントと共に、翻訳読み枠に元々リンクしたシグナルペプチドコード配列を本質的に含有し得る。または、コード配列の５’−末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドコード配列を含有し得る。コード配列がシグナルペプチドコード配列を元々含有していない場合には、外来性のシグナルペプチドコード配列が必要とされる場合がある。または、外来性のシグナルペプチドコード配列は単に、変異体の分泌を増強するために天然シグナルペプチドコード配列を置き換えてもよい。しかしながら、発現変異体を宿主細胞の分泌経路に送るいずれかのシグナルペプチドコード配列が用いられてもよい。
【０１５５】
細菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＣＩＢ１１８３７マルトジェニックアミラーゼ、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）サブチリシン、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）β−ラクタマーゼ、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼ、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）および古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドが、Ｓｉｍｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５７：１０９−１３７に記載されている。
【０１５６】
糸状真菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼＶ、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼおよびリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。
【０１５７】
イースト菌宿主細胞の有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード配列が、前述のＲｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２により記載されている。
【０１５８】
制御配列はまた、変異体のＮ−末端でプロペプチド位置をコードするプロペプチドコード配列であり得る。得られたポリペプチドは、酵素原またはプロポリペプチド（または、いくつかの場合においてチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に非活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって活性ポリペプチドに転換されることが可能である。プロペプチドコード配列は、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリ性タンパク分解酵素（ａｐｒＥ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性タンパク分解酵素（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼおよびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子の遺伝子から得られ得る。
【０１５９】
シグナルペプチドおよびプロペプチド配列の両方が存在する場合、プロペプチド配列は変異体のＮ−末端に隣接して位置されており、また、シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のＮ−末端に隣接して位置されている。
【０１６０】
宿主細胞の増殖に対した変異体の発現を調節する調節配列を付加することが望ましい場合もあり得る。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応じて、遺伝子の発現をオンオフさせるものである。原核系における調節系としては、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレータ系が挙げられる。イースト菌においては、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が用いられ得る。糸状菌においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモータ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモータおよびアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼプロモータが用いられ得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能とするものである。真核系において、これらの調節配列は、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および、重金属を伴って増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの事例において、変異体をコードするポリヌクレオチドは、調節配列と作動可能にリンクしているであろう。
【０１６１】
組換え発現ベクターは、本明細書に記載するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む。様々なヌクレオチドと制御配列を互いに結合して、組換え発現ベクターを形成することもでき、これは、当該部位で、変異体をコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能にするような、１つまたは複数の好都合な制限部位を含みうる。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。
【０１６２】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。
【０１６３】
ベクターは、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体または人工染色体といった、自己複製ベクター（すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製とは無関係なベクター）であり得る。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含有し得る。または、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノム中に統合され、および、中に統合された染色体と一緒に複製されるものであり得る。しかも、単一のベクターもしくはプラスミド、または、一緒になって、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、または、トランスポゾンが用いられてもよい。
【０１６４】
ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入などされた細胞の選択を容易とする１つまたは複数の選択マーカを含有することが好ましい。選択マーカは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性などをもたらす遺伝子である。
【０１６５】
細菌性選択マーカの例としては、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）もしくは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｄａｌ遺伝子、または、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン、もしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を賦与するマーカである。酵母宿主細胞の好適なマーカとしては、限定するものではないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３が挙げられる。糸状真菌宿主細胞に使用する選択マーカとしては、限定するものではないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの同等物が挙げられる。アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子、ならびに、ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ｂａｒ遺伝子が、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞での使用に好ましい。
【０１６６】
ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、または、ゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製を許容する要素を含有することが好ましい。
【０１６７】
宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、変異体をコードするポリヌクレオチドの配列、または、相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。または、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる統合をもたらす追加のポリヌクレオチドを含有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対および８００〜１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディングまたはコーディングポリヌクレオチドであり得る。他方で、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。
【０１６８】
自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミドまたはベクターの複製を可能とするポリヌクレオチドを意味する。
【０１６９】
細菌性複製起点の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製を許容するプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７およびｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、ならびに、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における複製を許容するｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０およびｐＡＭβ１の複製起点である。
【０１７０】
イースト菌宿主細胞において用いられる複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組み合わせ、および、ＡＲＳ４とＣＥＮ６との組み合わせである。
【０１７１】
糸状真菌細胞において有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１およびＡＮＳ１（Ｇｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ  ９８：６１−６７；Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：９１６３−９１７５；国際公開第００／２４８８３号パンフレット）である。ＡＭＡ１遺伝子の単離およびＡＭＡ１遺伝子を含むプラスミドまたはベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号パンフレットに開示されている方法に従って達成可能である。
【０１７２】
本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、変異体の生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、または、増幅可能な選択マーカ遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカ遺伝子の増幅されたコピー、従って、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。
【０１７３】
上記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと）。
【０１７４】
宿主細胞
本発明はまた、例えば、活性３−ＨＰ経路での使用を目的として、生産を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクした、本明細書の記載のポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、もしくは、既述の自己複製余剰−染色体性ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により親細胞と同等ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。
【０１７５】
いくつかの態様では、宿主細胞は、本明細書に記載するポリペプチドまたは変異体の組換え生産および回収のために選択することができる。他の態様では、宿主細胞は、活性３−ＨＰ経路を含み、細胞による３−ＨＰの組換え生産における３−ＨＰ経路遺伝子として、本明細書に記載のポリペプチドまたは変異体を発現するように選択される（例えば、国際公開第２０１２／０７４８１８号パンフレットに記載されている通り；尚、その内容は、参照として本明細書に組み込む）。こうした細胞は、発酵性糖またはマロニルセミアルデヒド前駆体から３−ＨＰを産生することができる。
【０１７６】
原核宿主細胞は、グラム陽性またはグラム陰性バクテリアのいずれかであり得る。グラム陽性バクテリアとしては、これらに限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。グラム陰性バクテリアとしては、これらに限定されないが、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられる。
【０１７７】
細菌宿主細胞は、特にこれらに限定されないが、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞を含むいずれかのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であり得る。
【０１７８】
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、およびストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）細胞のいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞を含むいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞であり得る。
【０１７９】
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトマイセス・アウロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、およびストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）細胞を含むいずれかのストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞であり得る。
【０１８０】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５を参照のこと）、コンピテント細胞転換（例えば、Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３−８２９、またはＤｕｂｎａｕ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９−２２１を参照のこと）、電気穿孔法（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ａｎｄ  Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２−７５１を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１−５２７８を参照のこと）行われ得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換により（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０を参照のこと）または電気穿孔法により（例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５を参照のこと）行われ得る。ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換電気穿孔法（例えば、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９−４０５を参照のこと）、接合（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３−３５８５を参照のこと）、または、形質導入により（例えば、Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：６２８９−６２９４を参照のこと）行われ得る。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、電気穿孔法（例えば、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６４：３９１−３９７を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｐｉｎｅｄｏ  ａｎｄ  Ｓｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１−５７を参照のこと）行われ得る。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、天然コンピテンス（例えば、Ｐｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５−１２９７を参照のこと）、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃａｔｔ  ａｎｄ  Ｊｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ  ６８：１８９−２０７を参照のこと）、電気穿孔法（例えば、Ｂｕｃｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００−３８０４を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９−４３６を参照のこと）行われ得る。しかしながら、ＤＮＡを宿主細胞に導入するための技術分野において公知である方法のいずれかを用いることが可能である。
【０１８１】
宿主細胞はまた、哺乳類、昆虫、植物または真菌細胞などの真核生物であり得る。
【０１８２】
宿主細胞は真菌細胞であってもよい。本明細書において用いられる「真菌」は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）および接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）、ならびに、卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）およびすべての栄養胞子形成真菌を含む（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫに定義されているとおり）。
【０１８３】
真菌宿主細胞はイースト菌細胞であり得る。本明細書において用いられるところ、「イースト菌」は、子嚢菌酵母（エンドミセス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子菌イースト菌を含み、イースト菌は、不完全菌類（不完全酵母菌類（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する。イースト菌の分類は将来において変更される可能性があるため、本発明の目的について、イースト菌は、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，，ＰａｓｓｍｏｒｅおよびＤａｖｅｎｐｏｒｔ編，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．９，１９８０）に記載されているとおりに定義されるものとする。
【０１８４】
イースト菌宿主細胞は、クルイベロマイセスラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロマイセス・カルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）またはヤロウイア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞などのカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞であり得る。
【０１８５】
いくつかの態様では、宿主細胞は、イサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、ジゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択される。いくつかの態様では、宿主細胞は、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、カンジダ・ランビカ（Ｃ．ｌａｍｂｉｃａ）、またはサッカロマイセス・ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）宿主細胞から選択される。
【０１８６】
真菌宿主細胞は糸状真菌細胞であり得る。「糸状菌」は、真菌植物門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜門（前述のＨａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５で定義されているとおり）のすべてのフィラメント形を含む。糸状菌は、一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナンおよび他の複雑な多糖類から組成される菌糸体壁によって特徴付けられる。栄養成長は菌糸の伸展によるものであり、および、炭素異化は絶対好気性である。対照的に、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのイースト菌による栄養成長は単細胞葉状体の出芽によるものであり、および、炭素異化は発酵性であり得る。
【０１８７】
糸状真菌宿主細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブエルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロツス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞であり得る。
【０１８８】
例えば、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ  ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベスセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、クリオルス・ヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウム・バクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ���、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジアタ（Ｐｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔａ）、プレウロツス・エリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）細胞であり得る。
【０１８９】
真菌細胞は、それ自体公知の様式でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および、細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換され得る。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞の形質転換に好適な手法は、欧州特許第２３８０２３号明細書、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４、ならびにＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１４１９−１４２２に記載されている。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の形質転換に好適な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ  ７８：１４７−１５６および国際公開第９６／００７８７号パンフレットに記載されている。イースト菌は、Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ  Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，ｐｐ  １８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３；および、Ｈｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２０に記載の手法を用いて形質転換され得る。
【０１９０】
いくつかの態様では、宿主細胞は、本明細書に記載のポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、かつ、発酵性糖（例えば、グルコース）またはピルビン酸塩から３−ＨＰを生成することができる活性３−ＨＰ経路を含む。図１に示す経路などの活性３−ＨＰ経路は、当分野では周知である（例えば、国際公開第２０１２／０７４８１８号パンフレットを参照；尚、その内容は、参照として本明細書に組み込む）。宿主細胞は、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性またはピルビン酸カルボキシラーゼ活性；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性；アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性；およびβ−アラニン／α−ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）活性を有する（例えば、国際公開第０２／４２４１８号パンフレットおよび国際公開第２００８／０２７７４２号パンフレットを参照；尚、その内容は、参照として本明細書に組み込む）。このような酵素活性は、内在性遺伝子発現、代謝経路における酵素をコードする異種ポリヌクレオチドの発現から、または１つまたは複数（例えば、２つ、数個）の異種ポリヌクレオチドの発現を追加した内在性遺伝子発現の組合せから起こりうる。いくつかの態様では、宿主細胞は、ＰＥＰカルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、および／またはＢＡＡＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。
【０１９１】
いくつかの態様では、宿主細胞は、３−ＨＰ耐性宿主細胞である。本明細書で用いる「３−ＨＰ耐性宿主細胞」は、４．０未満のｐＨで、７５ｇ／Ｌ以上の３−ＨＰを含有する培地中で、少なくとも２．５ｇ／Ｌ／時の平均解糖速度を呈示する宿主細胞を指す。このような速度および条件は、３−ＨＰを生成する経済的な方法をもたらす。これらの実施形態のいくつかでは、宿主細胞は、その在来形態で３−ＨＰ耐性を示しうる。別の実施形態では、細胞は、突然変異細胞および／または選択細胞が、同じ種の野生型細胞より高度の３−ＨＰ耐性を有するように、活性３−ＨＰ発酵経路に関する遺伝子改変の導入前、最中、または導入後に、突然変異および／または選択に付してもよい。特定の実施形態では、突然変異および／または選択は、その在来の形態で３−ＨＰ耐性を呈示する細胞について実施してもよい。突然変異および／または選択に付した細胞は、３−ＨＰ生成のための工業用宿主としてのその能力を決定するために、様々なレベルの３−ＨＰの存在下での糖消費およびその他の特徴について試験してもよい。３−ＨＰ耐性以外に、本明細書に記載する宿主細胞は、１つまたは複数の別の有機酸、または他の発酵産物、副産物、もしくは媒質成分に対する耐性のために突然変異および／または選択に付されていてもよい。
【０１９２】
３−ＨＰまたは他の化合物に対する耐性の選択は、当分野では公知の方法を用いて達成することができる。例えば、ケモスタットを用いて、選択を実施してもよい。ケモスタットは、微生物（例えば、酵母）の連続的培養を可能にする装置で、そこでは、比増殖速度および細胞数を独立に制御することができる。連続的培養は、主として、定容量のフローシステムであり、そこに培地を連続的に添加し、そこから溢流を連続的に除去することができる。このようなシステムが平衡状態になれば、細胞数および栄養状態は一定に保たれ、システムは定常状態になる。ケモスタットは、希釈率、ならびに炭素または窒素源などの制限栄養因子の濃度の変更によって、培養物の集団密度および比増殖速度の両方を制御することを可能にする。培養物の成長に従って条件を変更する（中でも、例えば、接種系統の増殖に必要な二次炭素源の濃度を低減する）ことによって、変更した条件でより速く増殖することができる集団の微生物が選択されて、新しい条件下でそれほど機能しない微生物より速く成長するであろう。典型的に、このような選択は、ケモスタット培養物の成長過程にわたって少なくとも１つの培養成分の段階的増加または減少を必要とする。ケモスタットの操作および微生物の指向進化におけるその使用は、当分野では周知である（例えば、Ｎｏｖｉｃｋ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ３６：７０８−７１９（１９５０），Ｈａｒｄｅｒ  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ４３：１−２４（１９７７）を参照のこと。
【０１９３】
いくつかの態様では、上記の宿主細胞は、同じ条件下で培養した場合、本明細書に記載するポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチドを含まない宿主細胞と比較して、増大したレベルの３−ＨＰを分泌する（および／または分泌することができる）。いくつかの実施形態では、上記宿主細胞は、同じ条件下で培養した場合、本明細書に記載するポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチドを含まない宿主細胞と比較して、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、または少なくとも５００％の増加レベルの３−ＨＰを分泌する、および／または分泌することができる。好適な培養条件の例を以下に記載するが、これらは、本明細書の教示内容に基づき、当業者には容易に理解されよう。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、理論値の少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の収率で、３−ＨＰを産生する（および／または産生することができる）。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、毎時約０．１ｇ／Ｌ超、例えば、毎時約０．２ｇ／Ｌ、毎時０．５ｇ／Ｌ、毎時０．６ｇ／Ｌ、毎時０．７ｇ／Ｌ、毎時０．８ｇ／Ｌ、毎時０．９ｇ／Ｌ、毎時１．０ｇ／Ｌ、毎時１．１ｇ／Ｌ、毎時１．２ｇ／Ｌ、毎時１．３ｇ／Ｌ、毎時１．５ｇ／Ｌ、毎時１．７５ｇ／Ｌ、毎時２．０ｇ／Ｌ、毎時２．２５ｇ／Ｌ、毎時２．５ｇ／Ｌ、もしくは毎時３．０ｇ／Ｌを超えるか；または毎時約０．１ｇ／Ｌ〜毎時約２．０ｇ／Ｌ、例えば、毎時約０．３ｇ／Ｌ〜毎時約１．７ｇ／Ｌ、毎時約０．５ｇ／Ｌ〜毎時約１．５ｇ／Ｌ、毎時約０．７ｇ／Ｌ〜毎時約１．３ｇ／Ｌ、毎時約０．８ｇ／Ｌ〜毎時約１．２ｇ／Ｌ、もしくは毎時約０．９ｇ／Ｌ〜毎時約１．１ｇ／Ｌの３−ＨＰの量的生産率を有する。
【０１９４】
宿主細胞は、当分野では公知の方法を用いて、本明細書に記載のポリペプチドおよび変異体の生成に適した栄養培地中で培養することができる。例えば、振盪フラスコ培養、ならびに好適な培地および所望のポリペプチドの発現および／または単離を可能にする条件下で実施される実験用もしくは工業用発酵槽における小規模もしくは大規模発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式、もしくは固相発酵）によって培養してよい。培養は、当分野で公知の方法を用いて、本明細書に記載するように、炭素および窒素源ならびに無機塩を含む好適な栄養培地中で実施する。好適な培地は、供給業者から市販されており、また、公開された組成（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）に従って調製してもよいし、あるいは、市販の材料から調製することも可能である。
【０１９５】
前述したように、本明細書に記載する酵素の酵素活性は、当分野で公知の方法を用いて検出することができる。これらの検出方法は、特定の抗体の使用、酵素産物の形成、または酵素基質の消失を含みうる。例えば、以下の文献を参照されたい：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａＩ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ  （１９９９）；およびＨａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３：７８１４−７８１８（２００７））。
【０１９６】
生成方法
本発明はまた、本明細書に記載のポリペプチドまたは変異体を生成する方法にも関し、これは、（ａ）発現に好適な条件下で、ポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養するステップ；ならびに（ｂ）ポリペプチドまたは変異体を回収するステップを含む。
【０１９７】
宿主細胞は、当分野では公知の方法を用いて、本明細書に記載のポリペプチドまたは変異体の生成に適した栄養培地中で培養する。例えば、細胞は、好適な培地中ならびに変異体の発現および／または単離が許容される条件下で行われる、振盪フラスコ培養により、および、実験用もしくは産業用発酵槽における小規模もしくは大規模発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式または固体状発酵を含む）により培養され得る。培養は、炭素および窒素源および無機塩を含む好適な栄養培地において、技術分野において公知である手法を用いて行われる。好適な媒体は、商業的な供給者から入手可能であるか、または、公開された組成に従って調製され得る（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）。変異体が栄養培地に分泌される場合、変異体は培地から直接回収可能である。変異体が分泌されない場合、細胞ライセートから回収可能である。
【０１９８】
変異体は、変異体に特異的な技術分野において公知である方法を用いて検出され得る。これらの検出方法として、限定するものではないが、特定の抗体の使用、酵素産物の形成、または、酵素基質の消失などが挙げられる。例えば、実施例の項に記載するアッセイなどの酵素アッセイを用いて、酵素活性を決定してもよい。
【０１９９】
ポリペプチドまたは変異体は技術分野において公知である方法を用いて回収され得る。例えば、変異体は、特にこれらに限定されないが、収集、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含む従来の手法により栄養培地から回収され得る。
【０２００】
ポリペプチドまたは変異体は、実質的に純粋な変異体を得るために、特にこれらに限定されないが、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動的手法（例えば、分取等電点電気泳動）、較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または、抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＪａｎｓｏｎおよびＲｙｄｅｎ編，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）を含む技術分野において公知である多様な手法によって精製され得る。
【０２０１】
別の態様では、３−ＨＰの生成について本明細書に記載するように、ポリペプチドまたは変異体を回収するのではなく、ポリペプチドを発現する宿主細胞を代謝経路の一部として用いる。
【０２０２】
３−ＨＰを生成する方法
本明細書に記載の宿主細胞を３−ＨＰの生成に用いることができる。一態様では、発酵性糖（例えば、グルコース）またはピルビン酸塩から３−ＨＰを生成する方法であって、これは、以下：（ａ）３−ＨＰを生成するのに好適な条件下で、本明細書に記載の宿主細胞（例えば、活性３−ＨＰ経路と、本明細書に記載する３−ＨＰＤＨをコードするポリヌクレオチドとを含む宿主細胞）のいずれか１つを培地中で培養するステップ；ならびに（ｂ）３−ＨＰを回収するステップを含む。本方法のいくつかの実施形態では、宿主細胞はさらに、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性またはピルビン酸カルボキシラーゼ活性；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性；アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性；およびβ−アラニン／α−ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）活性を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＰＥＰカルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、および／またはＢＡＡＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。本方法のいくつかの実施形態において、宿主細胞は、前述したように、３−ＨＰ耐性宿主細胞である。
【０２０３】
一態様では、発酵性糖（例えば、グルコース）またはピルビン酸塩から３−ＨＰを生成する方法であって、これは、以下：（ａ）３−ＨＰを生成するのに好適な条件下で、本明細書に記載の宿主細胞（例えば、活性３−ＨＰ経路と、本明細書に記載する配列番号２、４もしくは６の３−ＨＰＤＨ変異体をコードするポリヌクレオチドとを含む宿主細胞）のいずれか１つを培地中で培養するステップ；ならびに（ｂ）３−ＨＰを回収するステップを含む。本発明のいくつかの実施形態では、３−ＨＰＤＨ変異体は、配列番号２、４もしくは６に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞はさらに、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性またはピルビン酸カルボキシラーゼ活性；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性；アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性；およびβ−アラニン／α−ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）活性を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＰＥＰカルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、および／またはＢＡＡＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。本方法のいくつかの実施形態において、宿主細胞は、前述したように、３−ＨＰ耐性宿主細胞である。
【０２０４】
一態様では、発酵性糖（例えば、グルコース）またはピルビン酸塩から３−ＨＰを生成する方法であって、これは、以下：（ａ）３−ＨＰを生成するのに好適な条件下で、本明細書に記載の宿主細胞（例えば、活性３−ＨＰ経路と、配列番号８２に関連する３−ＨＰＤＨをコードするポリヌクレオチドとを含む宿主細胞）のいずれか１つを培地中で培養するステップ；ならびに（ｂ）３−ＨＰを回収するステップを含む。本発明のいくつかの実施形態では、３−ＨＰＤＨは、配列番号８２のシュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）３−ＨＰＤＨに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞はさらに、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性またはピルビン酸カルボキシラーゼ活性；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性；アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性；およびβ−アラニン／α−ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）活性を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＰＥＰカルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、および／またはＢＡＡＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。本方法のいくつかの実施形態において、宿主細胞は、前述したように、３−ＨＰ耐性宿主細胞である。
【０２０５】
３−ＨＰの生成方法は、１つまたは複数（例えば、２つ、数種）の糖、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、セロビオース、キシロース、キシルロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、および／または可溶性オリゴ糖などを含む発酵性培地において実施することができる。いくつかのケースでは、発酵培地は、テンサイ、デンプン、またはセルロースなどの天然の供給源から得られ、また、酵素加水分解（糖化）によって供給源を前処理して得られたものでもよい。
【０２０６】
１つまたは複数（例えば、２つ、数種）の糖からの適切な炭素源に加えて、発酵性培地は、多量栄養素（例えば、窒素源）および微量栄養素（例えば、ビタミン、無機塩、および金属補因子）などの当業者には公知の他の栄養素または刺激因子を含んでもよい。いくつかの態様では、炭素源には、少なくとも１つの窒素原、例えば、酵母エキス、Ｎ2、ペプトン（例：Ｂａｃｔｏ（商標）Ｐｅｐｔｏｎｅ）、またはソイトン（例：Ｂａｃｔｏ（商標）Ｓｏｙｔｏｎｅ）を優先的に添加することができる。ビタミンの非制限的例として、複合ビタミン、ビオチン、パントテン酸塩、ニコチン酸、メソ−イノシトール、チアミン、ピリドキシン、パラ−アミノ安息香酸、葉酸、リボフラビン、ならびにビタミンＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥが挙げられる。無機塩および金属補因子の例として、限定するものではないが、Ｎａ、Ｐ、Ｌ、Ｍｇ、Ｓ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｚｎ、ＭｎおよびＣｕがある。
【０２０７】
３−ＨＰの生成方法に用いる好適な条件は、本明細書の教示内容に照らして、当業者が決定することができる。本方法のいくつかの態様では、宿主細胞を約１２〜約２１６時間、例えば、約２４〜約１４４時間、または約３６時間〜約９６時間培養する。温度は典型的に、約２６℃〜約６０℃、例えば、約３４℃〜約５０℃で、ｐＨは、約３．０〜約８．０、例えば、約３．０〜約７．０、約３．０〜約６．０、約３．０〜約５．０、約３．５〜約４．５、約４．０〜約８．０、約４．０〜約７．０、約４．０〜約６．０、約４．０〜約５．０、約５．０〜約８．０、約５．０〜約７．０、または約５．０〜約６．０である。本方法のいくつかの態様では、宿主細胞の、得られる細胞内ｐＨは、約３．０〜約８．０、例えば、約３．０〜約７．０、約３．０〜約６．０、約３．０〜約５．０、約３．５〜約４．５、約４．０〜約８．０、約４．０〜約７．０、約４．０〜約６．０、約４．０〜約５．０、約５．０〜約８．０、約５．０〜約７．０、または約５．０〜約６．０である。培養は、必要に応じて、嫌気性、微好気性、または好気性条件下で実施してよい。いくつかの態様では、嫌気性条件下で培養を実施する。好適な緩衝剤は、当分野では公知である。
【０２０８】
培養は、必要に応じて、嫌気性、実質的に嫌気性（微好気性）、または好気性条件下で実施してよい。手短には、嫌気性とは、酸素が全くない環境を指し、実質的に嫌気性（微好気性）とは、酸素の濃度が空気より薄い環境を指し、好気性とは、酸素濃度が空気とほぼ同じか、それより濃い環境を指す。実質的に嫌気性の条件は、例えば、培地中の溶存酸素濃度が、１０％未満の飽和を維持するような培養、バッチ式発酵または連続式発酵を含む。実質的に嫌気性の条件はまた、酸素が１％未満の大気で維持された密閉チャンバー内の液体培地中または固体寒天上の成長もしくは休止細胞も包含する。酸素の割合は、例えば、Ｎ2／ＣＯ2混合物または他の好適な非酸素ガスを培地に注入することによって維持することができる。いくつかの実施形態では、嫌気性条件または実質的に嫌気性条件下で培養を実施する。
【０２０９】
本明細書に記載する方法は、いずれの好適な発酵操作方法を使用してもよい。例えば、バッチ式発酵は、密閉系と共に用いることができ、そこで、発酵の開始時に用意した培地および宿主微生物には、試薬、例えば、ｐＨ制御、泡制御剤のための特定の試薬、または工程の維持に必要な他の試薬以外は、一切追加投入物を加えない。本明細書に記載する方法はまた、フェドバッチ式または連続式で用いることもできる。
【０２１０】
本明細書に記載する方法は、複数のバイオリアクター構成、例えば、撹拌タンク、気泡塔、エアリフト反応器および当業者には公知の他の反応器で実施することができる。
【０２１１】
本方法は、必要に応じて、遊離細胞培養または細胞固定化培養で実施することができる。細胞固定化培養のためのいずれの材料支持体を用いてもよく、例えば、アルギン酸塩、繊維層、またはクリソタイル、モンモリロナイトＫＳＦおよびモンモリロナイトＫ−１０などのアーガイル材料がある。
【０２１２】
本方法の一態様において、約１０ｇ／Ｌ超、例えば、約２５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２１０ｇ／Ｌ、２２５ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌ、２７５ｇ／Ｌ、３００ｇ／Ｌ、３２５ｇ／Ｌ、３５０ｇ／Ｌ、４００ｇ／Ｌもしくは５００ｇ／Ｌを超える；または約１０ｇ／Ｌ〜約５００ｇ／Ｌ、例えば、約５０ｇ／Ｌ〜約３５０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ〜約３００ｇ／Ｌ、約１５０ｇ／Ｌ〜約２５０ｇ／Ｌ、約１７５ｇ／Ｌ〜約２２５ｇ／Ｌ、もしくは約１９０ｇ／Ｌ〜約２１０ｇ／Ｌの力価で、３−ＨＰを生成する。本方法の一態様では、炭水化物１グラム当たり約０．０１グラム超、例えば、炭水化物１グラム当たり約０．０２、０．０５、０．７５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０グラムを超える力価で、３−ＨＰを生成する。
【０２１３】
本方法の一態様において、生成される３−ＨＰの量は、同じ条件下で、３−ＨＰＤＨをコードするポリヌクレオチドを含まない宿主細胞を培養するのと比較して、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％大きい。
【０２１４】
組換え３−ＨＰは、任意選択で、限定するものではないが、クロマトグラフィ（例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、吸着クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ）、電気泳動法、溶解度差、蒸留、抽出（例えば、液体−液体）、浸透蒸発、抽出濾過、膜濾過、膜分離、逆浸透圧法、限外濾過、または結晶化などの当分野では公知のあらゆる方法を用いて、発酵培地から回収および精製することができる。
【０２１５】
本方法のいくつかの態様において、任意選択で精製する前および／または後の組換え３−ＨＰは実質的に純粋である。３−ＨＰの生成方法に関して、「実質的に純粋」とは、１５％以下の不純物を含む、回収された３−ＨＰの調製物を意味し、ここで、不純物は、３−ＨＰ以外の化合物を意味する。一変形例では、実質的に純粋な３−ＨＰの調製物が提供され、調製物は、２５％以下の不純物、または２０％以下の不純物、または１０％以下の不純物、または５％以下の不純物、または３％以下の不純物、または１％以下の不純物、または０．５％以下の不純物を含む。
【０２１６】
本明細書に記載する生成方法および宿主細胞についての３−ＨＰの生成を試験する好適なアッセイを、当分野で公知の方法を用いて実施することができる。例えば、最終３−ＨＰ（およびその他の有機化合物）は、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィ）、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィ−マススペクトロスコピー）およびＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィ−マススペクトロスコピー）または他の好適な分析方法によって、当分野では公知の常用の手順を用いて、分析することができる。また、発酵ブロス中への３−ＨＰの放出も、培養上澄みを用いて試験することができる。発酵培地中の副産物および残留糖（例えば、グルコース）は、例えば、グルコースおよびアルコールについての屈折率検出器、ならびに有機酸についてのＵＶ検出器（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９０：７７５−７７９（２００５））を用いて、または当分野で公知の他の好適なアッセイおよび検出方法を用いて、ＨＰＬＣにより定量することができる。
【０２１７】
植物
本発明はまた、本明細書に記載のポリペプチドまたは変異体を回収可能な量で発現および産生するように、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む、植物、例えば、トランスジェニック植物、植物部分、または植物細胞にも関する。
【０２１８】
トラスジェニック植物は、双子葉植物（ｄｉｃｏｔ）または単子葉植物（ｍｏｎｏｃｏｔ）であってよい。単子葉植物の例として、牧草（ナガハグサ、イチゴツナギ（Ｐｏａ））、ウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ）、ライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ）などの飼料草、ヌカボ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）などの寒地型牧草などの草、ならびに穀類、例えば、コムギ、オーツムギ、ライムギ、オオムギ、イネ、モロコシおよびトウモロコシ（コーン）が挙げられる。
【０２１９】
双子葉植物の例としては、タバコ、ハウチワマメなどのマメ類、ジャガイモ、テンサイ、エンドウマメ、インゲンマメおよびダイズ、ならびにカリフラワー、ナタネなどのアブラナ科植物（アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、ならびに近縁のモデル生物であるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）がある。
【０２２０】
植物部分の例としては、茎、カルス、葉、根、果実、種子、および塊茎、ならびにこれらの部分を含む個別の組織、例えば、表皮、歯肉、柔組織、導管組織、分裂組織などがある。葉緑体、アポプラスト、ミトコンドリア、液胞、ペロキシソームおよび細胞質などの特定の植物細胞コンパートメントも植物部分であると考えられる。さらに、どの組織由来のものかに関係なく、あらゆる植物細胞が植物部分であると考えられる。同様に、本発明の使用を容易にするために単離された特定の組織および細胞などの植物部分も植物部分であると考えられ、例えば、胚、内胚乳、アリューロンおよび種皮などがある。
【０２２１】
変異体を発現するトランスジェニック植物または植物細胞は、当分野では公知の方法に従い構築することができる。手短には、変異体をコードする１つまたは複数の発現構築物を植物宿主細胞ゲノムまたは葉緑体ゲノムに組み込んだ後、得られた修飾済み植物または植物細胞をトランスジェニック植物または植物細胞に増殖させることによって構築する。
【０２２２】
発現構築物は、好適には、選択した植物または植物部分におけるポリヌクレオチドの発現に必要な好適な調節配列と作動可能にリンクした変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物である。さらに、発現構築物は、発現構築物が組み込まれた植物細胞を同定するのに有用な選択マーカ、および対象植物への構築物の導入に必要なＤＮＡ配列を含んでもよい（後者は、使用するＤＮＡ導入方法に応じて異なる）。
【０２２３】
プロモータおよびターミネータ配列、ならびに任意選択でシグナルまたはトランジット配列などの調節配列の選択は、例えば、いつ、どこで、どのように変異体を発現したいのかに応じて決定する。例えば、変異体をコードする遺伝子の発現は、構成性もしくは誘導性であってもよいし、または発生、段階もしくは組織特異的であってもよく、遺伝子産物を種子もしくは葉などの特定の組織もしくは植物部分にターゲティングしてもよい。調節配列は、例えば、Ｔａｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ８６：５０６に記載されている。
【０２２４】
構成性発現の場合、３５Ｓ−ＣａＭＶ、トウモロコシユビキチン１、またはイネアクチン１プロモータを用いてもよい（Ｆｒａｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２１  ２８５−２９４；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：１１５５−１１６５）。器官特異的プロモータは、以下のものであってよい：例えば、種子、ジャガイモ塊茎、および果実などの貯蔵シンク組織（ｓｔｏｒａｇｅ  ｓｉｎｋ  ｔｉｓｓｕｅ）（Ｅｄｗａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｒｕｚｚｉ，１９９０，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２４：２７５−３０３）、または分裂組織などの代謝シンク組織（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：８６３−８７８）由来のプロモータ、コメ由来のグルテリン、プロラミン、グロブリン、もしくはアルビンプロモータなどの種子特異的プロモータ（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９：８８５−８８９）、レグミンＢ４由来のソラマメ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ）プロモータ、ならびにソラマメ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ）由来の未知の種子タンパク質遺伝子（Ｃｏｎｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５２：７０８−７１１）、油糧種子ボディタンパク質由来のプロモータ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９：９３５−９４１）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来の貯蔵タンパク質ｎａｐＡプロモータ、または、例えば国際公開第９１／１４７７２号パンフレットに記載のように、当分野では公知のその他いずれかの種子特異的プロモータ。さらに、プロモータは、以下のものでもよい：イネもしくはトマト由来のｒｂｃｓプロモータなどの葉特異的プロモータ（Ｋｙｏｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：９９１−１０００）、クロレラウイルスアデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモータ（ＭｉｔｒａおよびＨｉｇｇｉｎｓ，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：８５−９３）、イネ由来のａｌｄＰ遺伝子プロモータ（Ｋａｇａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４８：６６８−６７４）、あるいは、ジャガイモｐｉｎ２プロモータなどの傷害誘導性プロモータ（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：５７３−５８８）。同様に、プロモータは、温度、乾燥、もしくは塩分の変化などの非生物的処理によって誘導してもよいし、またはプロモータを活性化する細胞外から加える物質、例えば、エタノール、エストロゲン、およびエチレンなどの植物ホルモン（アブシシン酸、およびジベレリン酸など）、ならびに重金属により誘導してもよい。
【０２２５】
植物における変異体のより高度の発現を達成するために、プロモータエンハンサーエレメントを用いてもよい。例えば、プロモータエンハンサーエレメントは、イントロンであってもよく、これをプロモータと、変異体をコードするポリヌクレオチドとの間に配置する。例えば、Ｘｕらは、１９９３年（前掲）、発現の増強を目的とする、イネアクチン１の第１イントロンの使用を開示している。
【０２２６】
選択マーカ遺伝子および発現構築物の他のいずれかの部分を当分野で入手可能なものから選択してもよい。
【０２２７】
核酸構築物は、アグロバクテリウム媒介形質転換、ウイルス媒介形質転換、マイクロインジェクション、パーティクルガン、微粒子銃、およびエレクトロポレーションなどの植物当分野では公知の従来の技術（Ｇａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２９３；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：５３５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：２７４）に従って植物ゲノムに組み込む。
【０２２８】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介の遺伝子移入は、トランスジェニック双子葉植物を作製する方法（概要については、ＨｏｏｙｋａｓおよびＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：１５−３８を参照）および単子葉を形質転換する方法であるが、別の形質転換方法をこれらの植物に用いてもよい。トランスジェニック単子葉植物を作製する方法は、胚発生カルスまたは発生中の胚のパーティクルガン（形質転換ＤＮＡをコーティングした微細な金もしくはタングステン粒子）である（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：２７５−２８１；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：１５８−１６２；Ｖａｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：６６７−６７４）。単子葉の形質転換のための別の方法は、Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１：４１５−４２８によって記載されているように、原形質体形質転換に基づくものである。別の形質転換方法としては、米国特許第６，３９５，９６６号明細書および同第７，１５１，２０４号明細書（いずれも、その全文を本明細書に参照として組み込む）に記載されているものがある。
【０２２９】
形質転換の後、発現構築物が組み込まれた形質転換体を選択し、当分野で公知の方法によって全植物に再生させる。多くの場合、形質転換方法は、再生中、または後の作製時のいずれかに、選択遺伝子の選択的排除のために設計されるが、これは、例えば、２つの個別のＴ−ＤＮＡ構築物による共形質転換、または特定のリコンビナーゼによる選択遺伝子の部位特異的切除を用いて行う。
【０２３０】
本発明の構築物を含む特定の植物遺伝子型の直接形質転換以外にも、構築物を含まない第２の植物と、構築物を含む植物を交雑させることにより、トランスジェニック植物を作製することもできる。例えば、変異体をコードする構築物を交雑により特定の植物変種に導入することができ、その際、その所定変種の植物を直接形質転換する必要はない。従って、本発明は、本発明に従って形質転換した細胞から直接再生させた植物だけではなく、このような植物の子孫も含む。本明細書で用いる「子孫」は、本発明に従い調製される親植物のあらゆる世代の子孫を指し得る。こうした子孫は、本発明に従い調製したＤＮＡ構築物を含んでもよい。交雑の結果、出発系とドナー植物系の交差受粉により、植物系へのトランスジーンの導入が行われる。このようなステップの非制限的例が、米国特許第７，１５１，２０４号明細書に記載されている。
【０２３１】
戻し交雑法により、植物を作製することもできる。例えば、植物は、戻し交雑遺伝子型、系列、同系繁殖体、またはハイブリッドと称する植物を含む。
【０２３２】
１つの遺伝子バックグラウンドから別のものへの本発明の１つまたは複数のトラスジーンの遺伝子移入を促進するために、遺伝子マーカを用いてもよい。マーカ利用選択は、従来の育種に対して、表現型の変化によって起こる誤りを回避するのに用いることができるという利点をもたらす。さらに、遺伝子マーカは、特定の交雑の個別の子孫におけるエリート生殖質の相対割合に関するデータを提供しうる。例えば、通常は非農学的に望ましい遺伝子バックグラウンドを有する所望の特徴を備える植物をエリート親と掛け合わせる場合、遺伝子マーカを用いて目的の特徴を有するだけではなく、比較的大きな割合で所望の生殖質を含む子孫を選択することができる。このようにして、特定の遺伝子バックグラウンドに１つまたは複数の特徴を移入するのに必要な世代数が最小化される。
【０２３３】
一態様では、（ａ）生成が実施可能な条件下でポリペプチドまたは変異体をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物細胞を培養するステップ；および（ｂ）ポリペプチドまたは変異体を回収するステップを含む、本明細書に記載のポリペプチドまたは変異体を生成する方法である。
【０２３４】
以下の実施例により、本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【実施例】
【０２３５】
緩衝剤および基質として用いられる化学物質は、少なくとも試薬グレードの市販の製品である。
【０２３６】
系統
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）系統ＭＧ１６５５（ＮＮ０５９２６８）をｙｄｆＧ３−ＨＰＤＨ遺伝子をコードするＤＮＡの供給源として用いた。ｙｄｆＧプラスミドを発現するために、系統ＭＧ１６５５、ＳｏｌｏＰａｃｋ  Ｇｏｌｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＳＵＲＥ細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いた。
【０２３７】
国際公開第２０１２／０７４８１８号パンフレットに記載されているように、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃ  ３−ＨＰＤＨ遺伝子をコードするＤＮＡの供給源として、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）系統ＭＢｉｎ５００を用いた。イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）系統ＭｃＴｓ２５９（国際公開第２０１２／０７４８１８号パンフレット）を用いて、３−ＨＰ生成のために記載の３−ＨＰＤＨを発現させた。
【０２３８】
培地
ＬＢ培地は、１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇの塩化ナトリウム、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【０２３９】
２ＸＹＴプレートは、１６ｇのトリプトン、１０ｇの酵母エキス、５ｇのＮａＣｌ、１５ｇのＢａｃｔｏ  ａｇａｒ（寒天）、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【０２４０】
【表２】
2018033457.tif 000003
【０２４１】
【表３】
2018033457.tif 000004
【０２４２】
実施例１：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ３−ＨＰＤＨ遺伝子の発現ベクターの構築
ｐＴｒｃ９９Ａへの組込みのために、５’末端にＥｃｏＲＩ制限部位および３’末端にＢａｍＨＩ制限部位を生成するように設計した２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ３−ＨＰＤＨコード配列を増幅した（図４；Ａｍａｎｎ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）“Ｔｉｇｈｔｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔａｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｆｕｓｅｄ  ａｎｄ  ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．”Ｇｅｎｅ  ６９（２）：３０１−３１５を参照のこと）。
【０２４３】
２ＸＹＴプレートから大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５の単一コロニーを単離して、２５μｌ１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＣＬＳ溶液）に溶解させ、８０℃で１０分加熱した後、氷上で冷却することにより、ＰＣＲ用の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡを取得した。３マイクロリットルのこの溶液をＰＣＲ反応での鋳型として用いたが、これは、最終容量５０μｌ中に、１Ｘ  Ｐｆｘ増幅緩衝剤、それぞれ５０ピコモルのプライマー０００００１および０００００２、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ、ならびに２．５単位のＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）をさらに含有した。９５℃で２分を１サイクル；ならびに、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で１分をそれぞれ２５サイクルのようにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥ（登録商標）５３３３（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）で、増幅反応を実施した。２５サイクルの後、反応物を７２℃で３分インキュベートした後、さらに処理するまで１０℃で冷却した。
【０２４４】
５マイクロリットルのＰＣＲ反応混合物を、ＴＢＥ緩衝剤中に臭化エチジウムを含む１％ＴＢＥ−アガロースゲル電気泳動に付すことにより、所望の７６５ｂｐ  ＰＣＲ断片を同定した。残る４５μｌのＰＣＲ反応混合物からのＰＣＲ断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて精製した。精製した断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）で消化した後、臭化エチジウムを含む１％ＴＢＥ−アガロースゲル上で分析した。
【０２４５】
プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（前掲）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られた断片を１％ＴＢＥ−アガロースゲル電気泳動により分離した後、ＤＡＲＫ  ＲＥＡＤＥＲ（商標）（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｄｏｌｏｒｅｓ，ＣＯ，ＵＳＡ）で視覚化した。使い捨てのかみそりの刃で所望の４．１ｋｂ断片をゲルから切除し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて精製した。
【０２４６】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧを含有するＤＮＡ断片のｐＴｒｃ９９Ａへのクローン化をＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて実施した。反応混合物は、１０μｌの総量中に、１ＸＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝剤、１μｌＴ４  ＤＮＡリガーゼ、１μｌの前記のｐＴｒｃ９９Ａ  ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片、および５μｌの前記のｙｄｆＧ  ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化ＰＣＲ産物を含有していた。反応混合物を１６℃で一晩インキュベートした後、製造業者の指示に従い、ＳＵＲＥコンピテント細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を形質転換するのに用いた。回収時間後、形質転換混合物からの２つの１００μｌアリコートを、ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリンを添加した１５０ｍｍ２ＸＹＴプレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０２４７】
形質転換の組換えコロニーを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した３ｍｌのＬＢ培地に各々接種した。ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００ワークステーション（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、これらの培養物からプラスミドＤＮＡを作製し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化の後、１％ＴＢＥ−アガロースゲル電気泳動により分析した。１コロニーからのプラスミドＤＮＡをｐＭｅＪｉ９と称し、正しい制限消化パターンを有するものを、正しいｙｄｆＧコード配列の組込みを確認するため、さらに配列分析に付した。
【０２４８】
実施例２：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ３−ＨＰＤＨ遺伝子の構築
所望のｙｄｆＧ変異体をコードし、５’フランキングＥｃｏＲＩ制限部位および３’ＮａｅＩ制限部位を含む合成ＤＮＡ配列を、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）由来のプラスミド構築物に付与した。各プラスミドをＥｃｏＲＩおよびＮａｅＩ制限酵素で消化し、得られた断片を１％ＴＡＥ−アガロースゲル上で分離した後、ＤＡＲＫ  ＲＥＡＤＥＲ（商標）（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で視覚化した。ｙｄｆＧ変異体コード配列を含有する所望のＤＮＡバンドを、使い捨てのかみそりの刃でゲルから切除し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｄｕｅｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。
【０２４９】
プラスミドｐＭｅＪｉ９（前掲）をＥｃｏＲＩおよびＮａｅＩによる消化で線状化した後、５’リン酸塩の除去のためにアルカリホスファターゼ、Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ（ＣＩＰ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と一緒にインキュベートした。得られた混合物をゲル電気泳動に付し、視覚化した後、前述のように精製して、所望の４６５７ｂｐ  ＤＮＡ断片を取得した。
【０２５０】
各ｙｄｆＧ変異体コード配列の線状化ｐＭｅＪｉ９へのクローン化を、１Ｘ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝剤、１μｌＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、２μｌＥｃｏＲＩ／ＮａｅＩ線状化ｐＭｅＪｉ９、および１５μｌの選択ＥｃｏＲＩ／ＮａｅＩ  ｙｄｆＧ変異体コード配列（総量２０μｌ）を室温で２時間インキュベートすることによって実施した。インキュベーション反応物の１０μｌサンプルを用いて、製造業者の指示に従い、ＳｏｌｏＰａｃｋ（登録商標）Ｇｏｌｄのケミカルコンピテント細胞を形質転換した。回収時間後、形質転換混合物からの２つの１００μｌアリコートを、ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリンを添加した１５０ｍｍ２ＸＹＴプレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。推定組換えクローンを選択プレートから選択し、ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００ワークステーションを用いて、各々からプラスミドＤＮＡを作製した。配列決定によりクローンを分析した。正しい配列を有するプラスミドを表１に示す。
【０２５１】
【表４】
2018033457.tif 000005
【０２５２】
以下の表２に示す別の変異体は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いたＰＣＲ反応において、部位指定突然変異誘発および表示のプライマーを用いて構築した。ＰＣＲ反応物は、１Ｘ反応緩衝剤、１２５ｎｇの各プライマー、３０ｎｇのプラスミドＤＮＡ鋳型、１Ｘ  ｄＮＴＰ、１Ｘ  Ｑｕｉｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２．５Ｕ  ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＨＦ  ＤＮＡポリメラーゼを最終的な量５０μｌに含有していた。９５℃で３分を１サイクル；ならびに、９５℃で５０秒、６０℃で５０秒、および６８℃で６分をそれぞれ１８サイクルのようにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）５３３３（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）で、増幅反応を実施した。１８サイクルの後、反応物を６８℃で７分インキュベートした後、さらに処理するまで１０℃で冷却した。各ＰＣＲ反応物に１μｌのＤｐｎｌを添加し、３７℃で１．５時間インキュベートして、鋳型プラスミドＤＮＡを消化した。
【０２５３】
各部位指定ＰＣＲ反応物から、２．５μｌの反応物を用いて、製造業者の指示に従い、ＸＬ１０  Ｇｏｌｄ  Ｓｕｐｅｒケミカルコンピテント細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に形質転換した。回収時間後、形質転換混合物からの２つの１００μｌアリコートを、ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリンを添加した１５０ｍｍ２ＸＹＴプレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０２５４】
形質転換の組換えコロニーを、アンピシリンを添加した（１００μｇ／ｍｌ）３ｍｌのＬＢ培地に各々接種した。ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００ワークステーション（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、これらの培養物からプラスミドＤＮＡを作製して、配列決定分析に付すことにより、ｙｄｆＧコード配列における部位指定突然変異を確認した。
【０２５５】
【表５】
2018033457.tif 000006
【０２５６】
実施例３：ＭＧ１６５５細胞における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ３−ＨＰＤＨ遺伝子変異体の発現
Ｓｈｅｅｎ，Ｊ．（１９８９）．“Ｈｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１．８．４．に記載されている方法に従って、エレクトロコンピテント細胞ＭＧ１６５５を、実施例２から得られたクローニングプラスミド（または対照ｐＭｅＪｉ９もしくはｐＴｒｃ９９Ａ）で形質転換した。回収時間の後、形質転換混合物からの２つの１００μｌアリコートを、ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリンを添加した１５０ｍｍ２ＸＹＴプレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。各形質転換について、ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００ワークステーションを用いて、選択した組換えクローンのプラスミドＤＮＡを作製し、配列決定により分析した。次に、選択したクローンを、１００μｇのアンピシリンを添加した３ｍｌのＬＢ培地の培養物に接種し、振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。１２５ｍｌのバッフル付き振盪フラスコ中で、ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリンを添加した２５ｍｌのＬＢ培地に一晩培養物２５０μｌを添加し、ＯＤ600約０．６のまで増殖させた後、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを添加することにより、プラスミドから発現を誘導した。ＩＰＴＧと１時間インキュベートした後、培養物を遠心分離によって収集し、以下に記載するように、酵素アッセイに付した。培養物からのサンプルも収集し、８〜１６％Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣｒｉｔｅｒｉｏｎステインフリーＴｒｉｓ−ＨＣｌゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付した。
【０２５７】
実施例４：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ３−ＨＰＤＨ遺伝子変異体を発現する細胞の補因子特異性
実施例３からの培養物を遠心分離（４℃、１５，０００×ｇで、１０分）によって回収した後、−８０℃で保存した。細胞を氷上で解凍し、ペレットを、緩衝剤１０ｍＬ当たり１錠のＲｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ）を含むｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ＮａＣｌ、１３７ｍＭ；ＫＣｌ、２．７ｍＭ；Ｎａ2ＨＰＯ4、１０ｍＭ；ＫＨ2ＰＯ4、１．７６ｍＭ）中に再懸濁させた。細胞を３回洗浄した後、２ｍｇ／ｍＬの濃度で、リゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）を添加したＰＢＳおよびプロテアーゼ阻害剤中に再懸濁させた。次いで、細胞を氷上で３０分インキュベートすることにより、細胞質内容物を放出させ、膜残屑を遠心分離（４℃、１５，０００×ｇで、３０分）によって回収した。粗抽出物（ＣＣＥ）を含む上澄みを新しい試験管に移し、次の使用まで氷上に保持した。ＢＳＡを標準として用いるＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質検出キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて、製造業者の推奨事項に従い、ＣＣＥタンパク質を定量した。以下に記載するプロトコルの一方または両方を用いて、表示した変異体をＣＣＥからアッセイした。
【０２５８】
３４０ｎｍでの関連する低減補因子の経時的出現を測定することにより、ＮＡＤＰ＋またはＮＡＤ＋補因子のいずれかを用いて、リバースセリンデヒドロゲナーゼ活性アッセイを実施した。９６ウェルマイクロプレートでアッセイを実施したが、最終容量は３００μＬであった。２７０μＬのアッセイ緩衝剤（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１０  ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、４００ｍＭ  Ｌ−セリンおよび２ｍＭのＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋のいずれか）に３０μＬのＣＣＥ（前掲）を添加することにより、反応を開始した。室温（約２５℃）で１０分にわたり、３４０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダ（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ３４０ＰＣ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で追跡した。１単位は、ｐＨ８．０、２５℃のＬ−セリンの存在下で、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨのいずれかを１分に１μモル生成するのに必要な酵素の量として定義した。
【０２５９】
セリンデヒドロゲナーゼアッセイ（表３を参照）を用いた結果は、親大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ遺伝子産物（ｐＭｅＪｉ９から発現した）、およびｙｄｆＧ遺伝子産物が欠如した対照（ブランク発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ）と比較して、特定のデヒドロゲナーゼ変異体について、ＮＡＤＰ（Ｈ）に対するＮＡＤ（Ｈ）の増大した特異性を示している。
【０２６０】
【表６】
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【０２６１】
３４０ｎｍでのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかの経時的消失を測定することにより、フォワードマロン酸セミアルデヒドレダクターゼアッセイを実施した。マロン酸セミアルデヒドは、Ｙａｍａｄａ  ａｎｄ  Ｊａｃｏｂｙ（１９６０）“Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｌｏｎｉｃ  ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ  ｔｏ  ａｃｅｔｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３５（３）：５８９−５９４によって開発されたプロトコルに従って研究室内で合成した。９６ウェルマイクロプレートでアッセイを実施したが、最終容量は２００μＬであった。１７０μＬのアッセイバッファー（２ｍＭマロン酸セミアルデヒド、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、および０．５ｍＭのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれか）に３０μＬのＣＣＥ（前掲）を添加することにより、反応を開始した。室温（約２５℃）で１０分にわたり、３４０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダ（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ３４０ＰＣ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＬＬＣ）で追跡した。１単位は、ｐＨ８．０、２５℃で、マロン酸セミアルデヒドの存在下、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨのいずれかを１分に１μモル酸化するのに必要な酵素の量として定義した。
【０２６２】
マロン酸セミアルデヒドレダクターゼアッセイ（表４を参照）を用いた結果は、親大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ遺伝子産物（ｐＭｅＪｉ９から発現した）、およびｙｄｆＧ遺伝子産物が欠如した対照（ブランク発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ）と比較して、特定の３−ＨＰＤＨについて、ＮＡＤＰ（Ｈ）に対するＮＡＤ（Ｈ）の増大した特異性を示している。
【０２６３】
【表７】
2018033457.tif 000008
【０２６４】
実施例５：イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃ３−ＨＰＤＨ遺伝子の発現ベクターの構築
プラスミドｐＭＢｉｎ１９０（国際公開第２０１２／０７４８１８号パンフレット）は、ＮｈｅＩ／ＰａｃＩ部位がフランキングする配列番号４の３−ＨＰＤＨをコードするイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃヌクレオチド配列を含有する。ｐＭＢｉｎ１９０プラスミドをＮｈｅＩおよびＰａｃＩで消化し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、ゲルから単離および精製した後、８２７ｂｐ断片を、ＸｂａＩおよびＰａｃＩで消化したｐＭｌＢａ１０７（国際公開第２０１２／０７４８１８号パンフレット）の７９４２ｂｐ（これは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて、ゲルから単離および精製した）と連結させた。ｐＭｌＢａ１０７へのイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃポリヌクレオチド含有ＤＮＡ断片のクローン化を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて実施した。反応混合物は、総量１０μｌ中に、１ＸＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝剤、１μｌＴ４  ＤＮＡリガーゼ、１μｌの前記ｐＭｌＢａ１０７ＸｂａＩ／ＰａｃＩ消化ＤＮＡ断片、ならびに５μｌの前記ＹＭＲ２２６ｃＮｈｅＩ／ＰａｃＩ消化産物を含有した。反応混合物を室温で少なくとも１時間インキュベートした後、製造業者の指示に従い、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換するのに用いた。回収時間の後、形質転換混合物からの２つの１００μｌアリコートを、ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリンを添加した１５０ｍｍ２ＸＹＴプレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。形質転換の組換えコロニーを、アンピシリンを添加した（１００μｇ／ｍｌ）３ｍｌのＬＢ培地に各々接種した。ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００ワークステーション（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、これらの培養物からプラスミドＤＮＡを作製して、制限消化物検査に付した。正しい制限消化パターンを有する１つのクローンからのプラスミドＤＮＡをさらに配列分析に付し、ｐＭＢｉｎ２００と名付けた。
【０２６５】
ｐＴｒｃ９９Ａ（前掲）への組込みのために、５’末端にＥｃｏＲＩ制限部位を、また３’末端にＸｍａＩ制限部位を生成するように設計した２つの合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃコード配列を増幅した。
【０２６６】
２０ナノグラムのｐＭＢｉｎ２００プラスミドＤＮＡをＰＣＲ反応物における鋳型として用いたが、これは、総量５０μｌに、１Ｘ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ緩衝剤、各々５０ピコモルのプライマー６１４９６７および６１４９６８、各々０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ、ならびに２単位のＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ，Ｖａｎｔａａ，Ｆｉｎｌａｎｄ）をさらに含有していた。９５℃で３分を１サイクル；ならびに、９５℃で３０秒、５６．５℃で３０秒、および７２℃で１分をそれぞれ３０サイクルのようにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）５３３３（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）で、増幅反応を実施した。３０サイクルの後、反応物を７２℃で５分インキュベートした後、さらなる処理まで１０℃で冷却した。
【０２６７】
ＰＣＲ反応物からの８３１ｂｐ  ＰＣＲ断片を、ＴＢＥ緩衝剤中に臭化エチジウムを含む１％ＴＢＥ−アガロースゲル電気泳動に付し、ＰＣＲ産物をゲルから切除し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて精製した。精製した断片をＥｃｏＲＩおよびＸｍａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、プラスミドｐＴｒｃ９９ＡをＥｃｏＲＩおよびＸｍａＩで消化した後、得られた断片を１％ＴＢＥ−アガロースゲル電気泳動により分離した後、ＤＡＲＫ  ＲＥＡＤＥＲ（商標）（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で視覚化した。使い捨てのかみそりの刃でｐＴｒｃ９９Ａおよび８１９ｂｐ  ＹＭＲ２２６ｃ断片の所望の４．１６ｋｂ断片をゲルから切除し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて精製した。
【０２６８】
イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃコード配列を含有するＤＮＡ断片のｐＴｒｃ９９Ａへのクローン化をＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて実施した。反応混合物は、２０μｌの総量中に、１ＸＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝剤、１μｌＴ４  ＤＮＡリガーゼ、１μｌの前記ｐＴｒｃ９９Ａ  ＥｃｏＲＩ／ＸｍａＩ消化ＤＮＡ断片、および１５μｌの前記ＹＭＲ２２６ｃ  ＥｃｏＲＩ／ＸｍａＩ消化ＰＣＲ産物を含有していた。反応混合物を室温で一晩インキュベートした後、製造業者の指示に従い、Ｓｏｌｏ  Ｐａｃｋ  Ｇｏｌｄスーパーコンピテント細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を形質転換するのに用いた。回収時間後、形質転換混合物からの２つの１００μｌアリコートを、ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリンを添加した１５０ｍｍ２ＸＹＴプレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。形質転換の組換えコロニーを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した３ｍｌのＬＢ培地に各々接種した。
【０２６９】
ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００ワークステーション（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、これらの培養物からプラスミドＤＮＡを作製し、ＥｃｏＲＩ／ＸｍａＩ消化の後、１％ＴＢＥ−アガロースゲル電気泳動により分析した。ｐＭｃＴｓ１０３と名付けた１つのクローンに由来し、かつ正しい制限消化パターンを有するプラスミドＤＮＡをさらに配列分析に付して、正しいＹＭＲ２２６ｃコード配列の組込みを確認した。配列決定から、このＹＭＲ２２６ｃコード配列が、予想したゲノム配列とは１塩基対だけ異なることが判明した。
【０２７０】
ｐＭｃＴｓ１０３における１塩基対の突然変異を訂正するために、プライマー６１５４２８および６１４４２９を用い、前述したＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いたＰＣＲ反応において、鋳型ＤＮＡとしてｐＭｃＴｓ１０３を用い、部位指定突然変異誘発を実施した。
【０２７１】
形質転換の組換えコロニーを、アンピシリンを添加した（１００μｇ／ｍｌ）３ｍｌのＬＢ培地に各々接種した。ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００  ワークステーション（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、これらの培養物からプラスミドＤＮＡを作製して、配列分析に付し、ＹＭＲ２２６ｃコード配列における部位指定突然変異誘発を確認した。配列決定に基づく正しい配列を有するクローンをｐＭｃＴｓ１０７と名付けた。
【０２７２】
実施例６：イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃ３−ＨＰＤＨ遺伝子変異体の構築
実施例４に示す知見に基づき、親イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃ相同体（配列番号４）を用いて、別の３−ＨＰＤＨ遺伝子変異体を構築した。
【０２７３】
配列番号４の４５位および４６位（配列番号２の３１位および３２位に対応する）にそれぞれアスパラギン酸およびロイシンのアミノ酸置換を実施するように設計された、プライマー６１５００６および６１５００７を用い、前述したＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いたＰＣＲ反応において、鋳型ＤＮＡとしてｐＭｃＴｓ１０７（前掲）を用い、部位指定突然変異誘発を実施し、これにより、変異体ｍｕｔ２６（配列番号８０）を得た。
【０２７４】
形質転換の組換えコロニーを配列分析に付して、ＹＭＲ２２６ｃコード配列における部位指定突然変異誘発を確認した。変異体ｍｕｔ２６（配列番号８０）をコードする正しい配列を有するクローンをｐＭｃＴｓ１１０と名付けた。
【０２７５】
配列番号８０の２０位（配列番号２の９位に対応する）にグリシンのアミノ酸置換を導入するように設計された、プライマー６１５００４および６１５００５を用い、前述したＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いたＰＣＲ反応において、ｐＭｃＴｓ１１０で部位指定突然変異誘発を実施し、これにより、変異体ｍｕｔ２７（配列番号８１）を得た。
【０２７６】
形質転換の組換えコロニーを配列分析に付して、ＹＭＲ２２６ｃコード配列における部位指定突然変異誘発を確認し、変異体ｍｕｔ２７（配列番号８１）をコードする正しい配列を有するクローンをｐＭｃＴｓ１１２と名付けた。
【０２７７】
実施例７：イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃ３−ＨＰＤＨ遺伝子変異体を発現する細胞の補因子特異性
実施例６から得られたイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）遺伝子変異体をＭＧ１６５５細胞に発現させ、前述したマロン酸セミアルデヒドレダクターゼアッセイを用いて、３−ＨＰＤＨ補因子特異性を測定した。結果を以下の表５に示す。ｐＭｃＴｓ１１２（配列番号８１）から発現されたｍｕｔ２７イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃ３−ＨＰＤＨ変異体は、ｐＭｃＴｓ１０７（配列番号４）から発現された親イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃ遺伝子産物、およびＹＭＲ２２６ｃ遺伝子産物の欠如した対照（ブランク発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ）と比較して、ＮＡＤＰ（Ｈ）に対しＮＡＤ（Ｈ）に対する増大した特異性を示した。
【０２７８】
【表８】
2018033457.tif 000009
【０２７９】
実施例８：イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ａｄｈ９０９１遺伝子座でのイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃ３−ＨＰＤＨ遺伝子の組込みのための発現ベクターの構築
フランキング５’ＮｈｅＩおよび３’ＰａｃＩ制限部位を付加するように設計されたプライマーを用いて、ｐＭｃＴｓ１０７（前掲）から、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６  ３−ＨＰＤＨコード配列を増幅した。５０ナノグラムのｐＭｃＴｓ１０７プラスミドＤＮＡをＰＣＲ反応物における鋳型として用いたが、これは、最終量５０μｌ中に、１ＸＰｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ緩衝剤、各々５０ピコモルのプライマー６１５４８５および６１５４８６、各々０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ、ならびに２単位のＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）をさらに含有していた。９５℃で３分を１サイクル；ならびに、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で１分をそれぞれ３０サイクルのようにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）５３３３（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）で、増幅反応を実施した。３０サイクルの後、反応物を７２℃で５分インキュベートした後、さらに処理するまで１０℃で冷却した。
【０２８０】
ＰＣＲ反応物からの８３７ｂｐ  ＰＣＲ断片を、ＴＢＥ緩衝剤中に臭化エチジウムを含む１％ＴＢＥ−アガロースゲル電気泳動に付し、ＰＣＲ産物をゲルから切除し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて精製した。精製した断片をＮｈｅＩおよびＰａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、プラスミドｐＭＢｉｎ２０４（国際公開第２０１２／０７４８１８号パンフレット）をＸｂａＩおよびＰａｃＩで消化した後、得られた断片を１％ＴＢＥ−アガロースゲル電気泳動により分離した後、ＤＡＲＫ  ＲＥＡＤＥＲ（商標）（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で視覚化した。ｐＭＢｉｎ２０４の所望の８．４ｋｂ断片および８２７ｂｐ  ＹＭＲ２２６ｃ断片をゲルから切除し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて精製した。
【０２８１】
イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃ３−ＨＰＤＨのコード配列（配列番号４）を含有するＤＮＡ断片のｐＭＢｉｎ２０４へのクローン化をＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて実施した。反応混合物は、総量２０μｌ中に、１ＸＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝剤、１μｌＴ４  ＤＮＡリガーゼ、１μｌの前記ｐＭＢｉｎ２０４ＸｂａＩおよびＰａｃＩ消化ＤＮＡ断片、および５μｌの前記ＹＭＲ２２６ｃ  ＮｈｅＩおよびＰａｃＩ消化ＰＣＲ産物を含有していた。反応混合物を室温で１時間インキュベートした後、製造業者の指示に従い、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換するのに用いた。回収時間後、形質転換混合物からの２つの１００μｌアリコートを、ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリンを添加した１５０ｍｍ２ＸＹＴプレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。形質転換の組換えコロニーを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した３ｍｌのＬＢ培地に各々接種した。
【０２８２】
ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００ワークステーション（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、これらの培養物からプラスミドＤＮＡを作製し、制限消化により分析した。正しい制限消化パターンを有する１クローンからのプラスミドＤＮＡをさらに配列分析に付して正しいＹＭＲ２２６ｃコード配列を確認し、これをｐＭｃＴｓ１０８と名付けた（図５）。
【０２８３】
実施例９：イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ａｄｈ９０９１遺伝子座でのイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃ３−ＨＰＤＨ遺伝子変異体の組込みのための発現ベクターの構築
フランキング５’ＮｈｅＩおよび３’ＰａｃＩ制限部位を付加するように設計されたプライマーを用いて、ｐＭｃＴｓ１１２（前掲）から、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６変異体ｍｕｔ２７のコード配列（配列番号８１）を増幅した。５０ナノグラムのｐＭｃＴｓ１１２プラスミドＤＮＡをＰＣＲ反応物における鋳型として用いたが、これは、最終量５０μｌ中に、１ＸＰｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ緩衝剤、各々５０ピコモルのプライマー６１５４８５および６１５４８６、各々０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ、ならびに２単位のＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）をさらに含有していた。９５℃で３分を１サイクル；ならびに、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で１分をそれぞれ３０サイクルのようにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）５３３３（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）で、増幅反応を実施した。３０サイクルの後、反応物を７２℃で５分インキュベートした後、さらに処理するまで１０℃で冷却した。
【０２８４】
ＰＣＲ反応混合物からの８３７ｂｐ  ＰＣＲ断片を、ＴＢＥ緩衝剤中に臭化エチジウムを含む１％ＴＢＥ−アガロースゲル電気泳動に付した後、ＰＣＲ産物をゲルから切除し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて精製した。精製した断片をＮｈｅＩおよびＰａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、プラスミドｐＭＢｉｎ２０４をＸｂａＩおよびＰａｃＩで消化した後、得られた断片を１％ＴＢＥ−アガロースゲル電気泳動により分離した後、ＤＡＲＫ  ＲＥＡＤＥＲ（商標）（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で視覚化した。ｐＭＢｉｎ２０４の所望の８．４ｋｂ断片および８２７ｂｐ  ＹＭＲ２２６ｃ変異体断片をゲルから切除し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて精製した。
【０２８５】
イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃ３−ＨＰＤＨ変異体ｍｕｔ２７のコード配列を含有するＤＮＡ断片のｐＭＢｉｎ２０４へのクローン化をＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて実施した。反応混合物は、総量２０μｌ中に、１ＸＴ４  ＤＮＡリガーゼ衝剤、１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、１μｌの前記ｐＭＢｉｎ２０４ＸｂａＩおよびＰａｃＩ消化ＤＮＡ断片、および１０μｌの前記ＹＭＲ２２６ｃ変異体ＮｈｅＩおよびＰａｃＩ消化ＰＣＲ産物を含有した。反応混合物を室温で１時間インキュベートした後、製造業者の指示に従い、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換するのに用いた。回収時間後、形質転換混合物からの２つの１００μｌアリコートを、ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリンを添加した１５０ｍｍ２ＸＹＴプレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。形質転換の組換えコロニーを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した３ｍｌのＬＢ培地に各々接種した。
【０２８６】
ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００ワークステーション（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、これらの培養物からプラスミドＤＮＡを作製し、制限消化により分析した。正しい制限消化パターンを有する１クローンからのプラスミドＤＮＡをさらに配列分析に付して正しいＹＭＲ２２６ｃコード配列を確認し、これをｐＭｃＴｓ１１６と名付けた（図６）。
【０２８７】
実施例１０：イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ａｄｈ９０９１遺伝子座での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ３−ＨＰＤＨ遺伝子の組込みのための発現ベクターの構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ３−ＨＰＤＨのコード配列を、５’ＸｂａＩ部位および３’ＰａｃＩ制限部位によってフランキングされるイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＤＮＡについてコドン最適化した後、ＧｅｎｅＡｒｔにより、ｐ１０４５１６８と称するプラスミドに付与した（図７）。プラスミドｐ１０４５１６８およびプラスミドｐＭＢｉｎ２０４（国際公開第２０１２／０７４８１８号パンフレット）をＸｂａＩおよびＰａｃＩで個別に消化した後、得られた断片を１％ＴＢＥ−アガロースゲル電気泳動により分離した後、ＤＡＲＫ  ＲＥＡＤＥＲ（商標）（Ｃｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で視覚化した。ｐＭＢｉｎ２０４の所望の８．４ｋｂ断片および７６１ｂｐ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ断片をゲルから切除し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて精製した。
【０２８８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ３−ＨＰＤＨのコード配列（配列番号２）を含有するＤＮＡ断片のｐＭＢｉｎ２０４へのクローン化をＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて実施した。反応混合物は、総量２０μｌ中に、１ＸＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝剤、１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、１μｌの前記ｐＭＢｉｎ２０４ＸｂａＩおよびＰａｃＩ消化ＤＮＡ断片、および１０μｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ産物を含有していた。反応混合物を室温で１時間インキュベートした後、製造業者の指示に従い、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換するのに用いた。回収時間後、形質転換混合物からの２つの１００μｌアリコートを、ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリンを添加した１５０ｍｍ２ＸＹＴプレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。形質転換の組換えコロニーを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した３ｍｌのＬＢ培地に各々接種した。
【０２８９】
ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００ワークステーション（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、これらの培養物からプラスミドＤＮＡを作製し、制限消化により分析した。正しい制限消化パターンを有する１クローンからのプラスミドＤＮＡをｐＭｃＴｓ７７と名付けた（図８）。
【０２９０】
実施例１１：イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ａｄｈ９０９１遺伝子座での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ３−ＨＰＤＨ遺伝子変異体の組込みのための発現ベクターの構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ３−ＨＰＤＨ変異体ｍｕｔ６（配列番号１２）のコード配列を、５’ＸｂａＩ部位および３’ＰａｃＩ制限部位によってフランキングされるイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＤＮＡについてコドン最適化した後、ＧｅｎｅＡｒｔにより、ｐ１１ＡＡＴ５ＷＰと称するプラスミドに付与した（図９）。５０ナノグラムのｐ１１ＡＡＴ５ＷＰ  ＤＮＡをＰＣＲ反応物における鋳型として用いたが、これは、最終量５０μｌ中に、１Ｘ  Ｅｘｐａｎｄ緩衝剤、各々５０ピコモルのプライマー６１４６９７および６１４６９８、各々０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ、ならびに２．６単位のＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）をさらに含有していた。９５℃で２分を１サイクル；ならびに、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で１分をそれぞれ３０サイクルのようにプログラムしたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ＭＡＳＴＥＲＣＹＣＬＥＲ（登録商標）５３３３（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）で、増幅反応を実施した。３０サイクルの後、反応物を７２℃で５分インキュベートした後、さらに処理するまで１０℃で冷却した。
【０２９１】
７８３ｂｐＰＣＲ断片をＸｂａＩおよびＰａｃＩで消化した後、やはりＸｂａＩおよびＰａｃＩで消化したｐＭＢｉｎ２０４（前掲）の８．４ｋｂ断片にクローン化した。組換えクローンを制限消化および配列決定によりスクリーニングし、正しい配列を有する１クローンをｐＭｃＴｓ７８と名付けた（図１０）。
【０２９２】
プラスミドｐ１０４５１６８（前掲：図７も参照）を、前述のようにプライマー６１５８９２および６１５８９３を用いた部位指定突然変異誘発に付すことにより、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ３−ＨＰＤＨのコード配列（配列番号２）を、置換Ｇ３１ＤおよびＲ３２Ｌを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ３−ＨＰＤＨ変異体ｍｕｔ２５のコード配列（配列番号３３）に変更した。形質転換の組換えコロニーを配列決定し、正しいアミノ酸変更を有する３−ＨＰＤＨをコードするクローンをｐＭｃＴｓ１１１と名付けた。
【０２９３】
プラスミドｐＭｃＴｓ１１１を、前述のようにプライマー６１５８９０および６１５８９１を用いた部位指定突然変異誘発に付すことにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ３−ＨＰＤＨ変異体ｍｕｔ２５のコード配列（配列番号３３）を、追加のＴ９Ｇ置換を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ３−ＨＰＤＨ変異体ｍｕｔ２２のコード配列（配列番号３０）に変更した。形質転換の組換えコロニーを配列決定し、正しいアミノ酸変更を有する３−ＨＰＤＨをコードするクローンをｐＭｃＴｓ１１１と名付けた。形質転換の組換えコロニーを配列決定し、正しいアミノ酸変更を有する３−ＨＰＤＨをコードするクローンをｐＭｃＴｓ１１３と名付けた。
【０２９４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ３−ＨＰＤＨ変異体ｍｕｔ２２のコード配列（配列番号３０）のｐＭＢｉｎ２０４へのクローン化は、ＸｂａＩおよびＰａｃＩでｐＭｃＴｓ１１３を消化し、得られたｐＭｃＴｓ１１３の７６１ｂｐ断片を、前述のように、やはりＸｂａＩおよびＰａｃＩで消化して得られたｐＭＢｉｎ２０４の８．４ｋｂｐ断片に連結することによって実施した。形質転換の組換えコロニーを制限消化および配列決定によってスクリーニングし、正しい配列を有するクローンをｐＭｃＴｓ１１５と名付けた（図１１）。
【０２９５】
実施例１２：イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ａｄｈ９０９１遺伝子座でのシュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ｍｍｓＢ３−ＨＰＤＨの組込みのための発現ベクターの構築
シュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ｍｍｓＢ３−ＨＰＤＨのコード配列（配列番号８２）を、５’ＸｂａＩ部位および３’ＰａｃＩ制限部位によってフランキングされるイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＤＮＡについてコドン最適化した後、ＧｅｎｅＡｒｔにより、ｐ１１ＡＡ２ＧＪＰと称するプラスミドに付与した（図１２）。プラスミドｐ１１ＡＡ２ＧＪＰをＸｂａＩおよびＰａｃＩで消化し、８９８ｂｐ断片を、前述のようにやはりＸｂａＩおよびＰａｃＩで消化したｐＭＢｉｎ２０４の８．４ｋｂ断片にクローン化した。いくつかの組換えコロニーを制限消化および配列決定によってスクリーニングした。正しい配列を有する１つのクローンをｐＭｃＴｓ１０２と名付けた（図１３）。
【０２９６】
実施例１３：活性３−ＨＰ経路を含み、かつイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ａｄｈ９０９１遺伝子座で３−ＨＰＤＨを発現する宿主系統の構築
前述した組込み構築物ｐＭｃＴｓ７７、ｐＭｃＴｓ７８、ｐＭｃＴｓ１０２、ｐＭｃＴｓ１１５の各々約１０μｇをＡｐａＩおよびＫｐｎＩで個別に消化した後、８９ｍＭ  Ｔｒｉｓベース−８９ｍＭホウ酸−２ｍＭ二ナトリウムＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝剤を用いた１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動によって分離した。各々約１０μｇの組込み構築物ｐＭｃＴｓ１０８およびｐＭｃＴｓ１１６をＡｐａＩおよびＳａｃＩで消化し、ＴＢＥ緩衝剤を用いた１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動によって分離した。ｐＭｃＴｓ７７、ｐＭｃＴｓ７８およびｐＭｃＴｓ１１５については約５３４８ｂｐ；ｐＭｃＴｓ１０２については約５４８５ｂｐの断片；およびｐＭｃＴｓ１０８およびｐＭｃＴｓ１１６については約５４０８ｂｐの断片を切除し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、製造業者の指示に従い抽出した。プラスミドｐＭｃＴｓ７７、ｐＭｃＴｓ７８、ｐＭｃＴｓ１０２、ｐＭｃＴｓ１１５、ｐＭｃＴｓ１１６、ｐＭｃＴｓ１０８からの線状構築物を系統ＭｃＴｓ２５９（活性３−ＨＰ経路を含むが、在来のイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃ３−ＨＰＤＨ遺伝子に欠失を有する：国際公開第２０１２／０７４８１８号パンフレットを参照）に形質転換した。各形質転換からの数個の単一単離物を組込み部位についてスクリーニングすると共に、他の遺伝子座がまだ修飾されていることを確認した。ａｄｈ９０９１での組込みを、プライマー６１４６２７＋６１２９０９および６１２９０８＋６１４６２６と共に、製造業者の指示に従い、Ｐｈｉｒｅ（登録商標）Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲキット（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いて、ＰＣＲにより確認した。プライマー６１２９０８＋６１４６２６を用いたＰＣＲ産物は、ｐＭｃＴｓ７７、ｐＭｃＴｓ７８、ｐＭｃＴｓ１０２、ｐＭｃＴｓ１１５、ｐＭｃＴｓ１１６、およびｐＭｃＴｓ１０８組込み体について約１．９７ｋｂであった。プライマー６１４６２７＋６１２９０９を用いたＰＣＲ産物は、ｐＭｃＴｓ１０２組込み体については約３．４ｋｂであり、ｐＭｃＴｓ７７、ｐＭｃＴｓ７８、ｐＭｃＴｓ１０２、ｐＭｃＴｓ１１５、ｐＭｃＴｓ１１６、ｐＭｃＴｓ１０８組込み体について約３．３ｋｂであった。既存のａｄｈ１２０２遺伝子座およびＹＭＲ２２６ｃ遺伝子座の完全性を、ａｄｈ１２０２遺伝子座についてはプライマーセット：６１１２４５＋６１２７９４、および６１１８１５＋６１２７９５を用いて、またＹＭＲ２２６ｃ遺伝子座についてはプライマーセット：６１３０３４＋６１３２４１を用いて確認した。ＰＣＲについて正しいサイズバンドを有する形質転換体を表６に示すように設計した。
【０２９７】
【表９】
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【０２９８】
実施例１４：活性３−ＨＰ経路を含み、かつイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ａｄｈ９０９１遺伝子座で３−ＨＰＤＨを発現する宿主系統からの３−ＨＰ生成
前述の系統ＭｃＴｓ２６３、ＭｃＴｓ２６５、ＭｃＴｓ２７６、ＳｈＴｈ１００、ＳｈＴｈ１０１、およびＭＢｉｎ５５６を振盪フラスコ内で増殖させ、サンプルを補因子特異性（前述の通り）、ならびに国際公開第２０１２／０７４８１８号パンフレットに記載のように、３−ＨＰ生成について分析した。国際公開第２０１２／０７４８１８号パンフレットに記載の対照系統ＭｅＪｉ４１２（在来のイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃ３−ＨＰＤＨ遺伝子を含む活性３−ＨＰ経路を有する）およびＭｃＴｓ２４４（活性３−ＨＰ経路を含むが、在来のイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃ３−ＨＰＤＨ遺伝子に欠失を有する）も、３−ＨＰＤＨ活性および３−ＨＰ生成について分析した。表７の結果から、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＹＭＲ２２６ｃ遺伝子が欠失すると、検出可能な３−ＨＰ生成が起こらないこと、ならびにＮＡＤ（Ｈ）に対する特異性が増大した３−ＨＰＤＨをコードする遺伝子の１コピーを用いて、３−ＨＰ生成を回復することができることがわかる。
【０２９９】
【表１０】
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【０３００】
本明細書に記載および請求する本発明は、本明細書に開示する特定の態様によって範囲を限定されない。というのは、これらの態様は、本発明のいくつかの態様の例示として意図されるからである。あらゆる均等の態様が本発明の範囲に含まれるものとする。実際、本明細書に示し、説明したものに加えて、本発明の様々な変更形態が、以上の説明から、当業者には明らかになるであろう。こうした変更形態も、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。矛盾が生じた場合、定義を含む本発明の開示内容が優先される。
【０３０１】
いくつかの態様において、本発明は、以下の番号のパラグラフによって記載されうる：
［１］配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位に対応する１つまたは複数（数個）の位置に置換を含む３−ＨＰＤＨ変異体であって、
配列番号２、４もしくは６に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有し；しかも、３−ＨＰＤＨ活性を有する、変異体。
【０３０２】
［２］以下：
ａ．配列番号２、４もしくは６に対して、少なくとも６０％の配列同一性を有し；
ｂ．低度の緊縮条件下で、配列番号１、３、５を有するポリヌクレオチドまたはその完全長相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；ならびに
ｃ；配列番号１、３、もしくは５に対して、少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
から選択される親３−ＨＰＤＨの変異体である、パラグラフ［１］に記載の変異体。
【０３０３】
［３］親３−ＨＰＤＨが、配列番号２、４もしくは６に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する、パラグラフ［２］に記載の変異体。
【０３０４】
［４］親３−ＨＰＤＨが、少なくとも低度の緊縮条件、例えば、中度の緊縮条件、中度−高度の緊縮条件、高度の緊縮条件、または極めて高度の緊縮条件下で、配列番号１、３、もしくは５を有するポリヌクレオチド、またはその完全長相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、パラグラフ［２］または［３］に記載の変異体。
【０３０５】
［５］親３−ＨＰＤＨが、配列番号１、３もしくは５に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる、パラグラフ［２］〜［４］のいずれかに記載の変異体。
【０３０６】
［６］親３−ＨＰＤＨが、配列番号２、４もしくは６を含むか、またはこれから構成される、パラグラフ［２］〜［５］のいずれかに記載の変異体。
【０３０７】
［７］親３−ＨＰＤＨのアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、パラグラフ［２］〜［６］のいずれかに記載の変異体。
【０３０８】
［８］置換の数が、１〜２０、例えば、１〜１０または１〜５、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０の置換である、パラグラフ［１］〜［７］のいずれかに記載の変異体。
【０３０９】
［９］配列番号２の９位に対応する位置に置換を含む、パラグラフ［１］〜［８］のいずれかに記載の変異体。
【０３１０】
［１０］配列番号２の９位に対応する位置にＧｌｙを含む、パラグラフ［１］〜［９］のいずれか１つに記載の変異体。
【０３１１】
［１１］配列番号２の３１位に対応する位置に置換を含む、パラグラフ［１］〜［１０］のいずれかに記載の変異体。
【０３１２】
［１２］配列番号２の３１位に対応する位置にＡｓｐまたはＧｌｕを含む、パラグラフ［１］〜［１１］のいずれか１つに記載の変異体。
【０３１３】
［１３］配列番号２の３２位に対応する位置に置換を含む、パラグラフ［１］〜［１２］のいずれかに記載の変異体。
【０３１４】
［１４］配列番号２の３２位に対応する位置にＬｅｕを含む、パラグラフ［１］〜［１３］のいずれか１つに記載の変異体。
【０３１５】
［１５］配列番号２の３３位に対応する位置に置換を含む、パラグラフ［１］〜［１４］のいずれかに記載の変異体。
【０３１６】
［１６］配列番号２の３３位に対応する位置にＳｅｒまたはＡｓｎを含む、パラグラフ［１］〜［１５］のいずれか１つに記載の変異体。
【０３１７】
［１７］配列番号２の３４位に対応する位置に置換を含む、パラグラフ［１］〜［１６］のいずれかに記載の変異体。
【０３１８】
［１８］配列番号２の３４位に対応する位置にＡｌａまたはＰｒｏを含む、パラグラフ［１］〜［１７］のいずれか１つに記載の変異体。
【０３１９】
［１９］配列番号２の３５位に対応する位置に置換を含む、パラグラフ［１］〜［１８］のいずれかに記載の変異体。
【０３２０】
［２０］配列番号２の３５位に対応する位置にＡｌａまたはＡｓｐを含む、パラグラフ［１］〜［１９］のいずれか１つに記載の変異体。
【０３２１】
［２１］配列番号２の３６位に対応する位置に置換を含む、パラグラフ［１］〜［２０］のいずれかに記載の変異体。
【０３２２】
［２２］配列番号２の３６位に対応する位置にＡｌａを含む、パラグラフ［１］〜［２１］のいずれか１つに記載の変異体。
【０３２３】
［２３］配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位のいずれかに対応する位置に少なくとも２つの置換を含む、パラグラフ［１］〜［２２］のいずれかに記載の変異体。
【０３２４】
［２４］配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位のいずれかに対応する位置に少なくとも３つの置換を含む、パラグラフ［１］〜［２２］のいずれかに記載の変異体。
【０３２５】
［２５］配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位のいずれかに対応する位置に少なくとも４つの置換を含む、パラグラフ［１］〜［２２］のいずれかに記載の変異体。
【０３２６】
［２６］配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位のいずれかに対応する位置に少なくとも５つの置換を含む、パラグラフ［１］〜［２２］のいずれかに記載の変異体。
【０３２７】
［２７］配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位のいずれかに対応する位置に少なくとも６つの置換を含む、パラグラフ［１］〜［２２］のいずれかに記載の変異体。
【０３２８】
［２８］配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位のいずれかに対応する位置に７つの置換を含む、パラグラフ［１］〜［２２］のいずれかに記載の変異体。
【０３２９】
［２９］配列番号２の位置に対応する、Ｔ／Ｓ９Ｇ、Ｇ／Ａ３１Ｄ／Ｅ、Ｒ３２Ｌ、Ｒ３３Ｓ／Ｎ、Ｌ／Ｋ／Ｑ３４Ａ／Ｐ、Ｅ３５Ｄ／Ａ、およびＫ／Ｒ３６Ａから選択される１つまたは複数の置換を含む、パラグラフ［１］〜［２４］のいずれかに記載の変異体。
【０３３０】
［３０］配列番号２の位置１０に対応する位置に欠失をさらに含む、パラグラフ［１］〜［２９］のいずれかに記載の変異体。
【０３３１】
［３１］配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、８０、もしくは８１を含むか、またはこれらから構成される、パラグラフ［１］〜［３０］のいずれか１つに記載の変異体。
【０３３２】
［３２］変異体が、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、ＮＡＤ（Ｈ）に対する増大した特異性（例えば、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、ＮＡＤ（Ｈ）に対する２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、もしくは１０００倍を超える特異性）を有する、パラグラフ［１］〜［３１］のいずれかに記載の変異体。
【０３３３】
［３３］変異体が、単離されている、パラグラフ［１］〜［３２］のいずれか１つに記載の変異体。
【０３３４】
［３４］パラグラフ［１］〜［３２］のいずれかに記載の変異体をコードするポリヌクレオチド（例えば、単離されたポリヌクレオチド）。
【０３３５】
［３５］パラグラフ［３４］に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
【０３３６】
［３６］パラグラフ［３４］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【０３３７】
［３７］パラグラフ［３５］に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【０３３８】
［３８］以下：
ａ．変異体の発現に好適な条件下でパラグラフ［３７］に記載の宿主細胞を培養するステップ；および
ｂ．変異体を回収するステップ
を含む、３−ＨＰＤＨを生成する方法。
【０３３９】
［３９］パラグラフ［３４］に記載のポリヌクレオチドで形質転換したトランスジェニック植物、植物部分または植物細胞。
【０３４０】
［４０］以下：
ａ．変異体の生成を実施可能にする条件下で、変異体をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物細胞を培養するステップ；および
ｂ．変異体を回収するステップ
を含む、パラグラフ［１］〜［３４］のいずれかに記載の変異体を生成する方法。
【０３４１】
［４１］パラグラフ［１］〜［３４］のいずれか１つに記載の３−ＨＰＤＨ変異体を取得する方法であって、親３−ＨＰＤＨに、配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位に対応する１つまたは複数の位置の置換を導入するステップ；ならびに、変異体を回収するステップを含む方法。
【０３４２】
［４２］ポリペプチドが、以下：
ａ．配列番号２、４もしくは６に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ．低度の緊縮条件、例えば、中度の緊縮条件、中度−高度の緊縮条件、高度の緊縮条件、または極めて高度の緊縮条件下で、配列番号１、３、もしくは５を有するポリヌクレオチドまたはその完全長相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；または
ｃ．配列番号１、３もしくは５に対して、少なくとも６０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであり；
ここで、ポリペプチドは、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、ＮＡＤ（Ｈ）に対する増大した特異性（例えば、ＮＡＤＰ（Ｈ）と比較して、ＮＡＤ（Ｈ）に対する２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、もしくは１０００倍を超える特異性）を有する、３−ＨＰＤＨ活性を有するポリペプチド。
【０３４３】
［４３］配列番号２に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する、パラグラフ［４２］に記載のポリペプチド。
【０３４４】
［４４］少なくとも低度の緊縮条件、例えば、中度の緊縮条件、中度−高度の緊縮条件、高度の緊縮条件、または極めて高度の緊縮条件下で、配列番号１を有するポリヌクレオチドまたはその完全長相補体を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、パラグラフ［４２］または［４３］に記載のポリペプチド。
【０３４５】
［４５］配列番号１に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる、パラグラフ［４２］〜［４４］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３４６】
［４６］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも１つが、配列番号２と異なる、パラグラフ［４２］〜［４５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３４７】
［４７］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも２つが、配列番号２と異なる、パラグラフ［４２］〜［４５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３４８】
［４８］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも３つが、配列番号２と異なる、パラグラフ［４２］〜［４５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３４９】
［４９］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも４つが、配列番号２と異なる、パラグラフ［４２］〜［４５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３５０】
［５０］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも５つが、配列番号２と異なる、パラグラフ［４２］〜［４５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３５１】
［５１］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも６つが、配列番号２と異なる、パラグラフ［４２］〜［４５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３５２】
［５２］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の全てが、配列番号２と異なる、パラグラフ［４２］〜［４５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３５３】
［５３］配列番号４に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する、パラグラフ［４２］〜［５２］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３５４】
［５４］少なくとも低度の緊縮条件、例えば、中度の緊縮条件、中度−高度の緊縮条件、高度の緊縮条件、または極めて高度の緊縮条件下で、配列番号３またはその完全長相補体を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、パラグラフ［４２］〜［５３］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３５５】
［５５］配列番号３に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる、パラグラフ［４２］〜［５４］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３５６】
［５６］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも１つが、配列番号４と異なる、パラグラフ［４２］〜［５６］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３５７】
［５７］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも２つが、配列番号４と異なる、パラグラフ［４２］〜［５５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３５８】
［５８］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも３つが、配列番号４と異なる、パラグラフ［４２］〜［５５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３５９】
［５９］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも４つが、配列番号４と異なる、パラグラフ［４２］〜［５５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３６０】
［６０］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも５つが、配列番号４と異なる、パラグラフ［４２］〜［５５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３６１】
［６１］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも６つが、配列番号４と異なる、パラグラフ［４２］〜［５５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３６２】
［６２］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の全てが、配列番号４と異なる、パラグラフ［４２］〜［５５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３６３】
［６３］配列番号６に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する、パラグラフ［４２］〜［６２］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３６４】
［６４］少なくとも低度の緊縮条件、例えば、中度の緊縮条件、中度−高度の緊縮条件、高度の緊縮条件、または極めて高度の緊縮条件下で、配列番号５またはその完全長相補体を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、パラグラフ［４２］〜［６３］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３６５】
［６５］配列番号５に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる、パラグラフ［４２］〜［６４］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３６６】
［６６］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも１つが、配列番号６と異なる、パラグラフ［４２］〜［６５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３６７】
［６７］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも２つが、配列番号６と異なる、パラグラフ［４２］〜［６５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３６８】
［６８］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも３つが、配列番号６と異なる、パラグラフ［４２］〜［６５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３６９】
［６９］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも４つが、配列番号６と異なる、パラグラフ［４２］〜［６５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３７０】
［７０］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも５つが、配列番号６と異なる、パラグラフ［４２］〜［６５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３７１】
［７１］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の少なくとも６つが、配列番号６と異なる、パラグラフ［４２］〜［６５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３７２】
［７２］配列番号２に対応する９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位の全てが、配列番号６と異なる、パラグラフ［４２］〜［６５］のいずれかに記載のポリペプチド。
【０３７３】
［７３］配列番号２の９位に対応する位置にＧｌｙを含む、パラグラフ［４２］〜［７２］のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０３７４】
［７４］配列番号２の３１位に対応する位置にＡｓｐまたはＧｌｕを含む、パラグラフ［４２］〜［７３］のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０３７５】
［７５］配列番号２の３２位に対応する位置にＬｅｕを含む、パラグラフ［４２］〜［７４］のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０３７６】
［７６］配列番号２の３３位に対応する位置にＳｅｒまたはＡｓｎを含む、パラグラフ［４２］〜［７５］のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０３７７】
［７７］配列番号２の３４位に対応する位置にＡｌａまたはＰｒｏを含む、パラグラフ［４２］〜［７６］のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０３７８】
［７８］配列番号２の３５位に対応する位置にＡｌａまたはＡｓｐを含む、パラグラフ［４２］〜［７７］のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０３７９】
［７９］配列番号２の３６位に対応する位置にＡｌａを含む、パラグラフ［４２］〜［７８］のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０３８０】
［８０］配列番号２の１０位に対応する位置の欠失をさらに含む、パラグラフ［４２］〜［７９］のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０３８１】
［８１］配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、８０、もしくは８１を含むか、またはこれらから構成される、パラグラフ［４２］〜［８０］のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０３８２】
［８２］ポリペプチドが、単離されている、パラグラフ［４２］〜［８２］のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０３８３】
［８３］パラグラフ［４２］〜［８２］のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、単離されたポリヌクレオチド）。
【０３８４】
［８４］パラグラフ［８３］に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
【０３８５】
［８５］パラグラフ［８３］のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【０３８６】
［８６］パラグラフ［８３］のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【０３８７】
［８７］以下：
ａ．ポリペプチドの発現に好適な条件下で、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養するステップ；および
ｂ．ポリペプチドを回収するステップ
を含む、パラグラフ［４２］〜［８２］のいずれかに記載のポリペプチドを生成する方法。
【０３８８】
［８８］パラグラフ［８３］のポリヌクレオチドで形質転換したトランスジェニック植物、植物部分または植物細胞。
【０３８９】
［８９］以下：
ａ．ポリペプチドの生成を実施可能にする条件下で、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物細胞を培養するステップ；および
ｂ．変異体を回収するステップ
を含む、パラグラフ［４２］〜［８２］のいずれかに記載のポリペプチドを生成する方法。
【０３９０】
［９０］パラグラフ［４２］〜［８２］のいずれかに記載のポリペプチドを取得する方法であって、親３−ＨＰＤＨに、配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位に対応する１つまたは複数の位置の置換を導入するステップ；ならびに、ポリペプチドを回収するステップを含む方法。
【０３９１】
［９１］細胞が、原核細胞である、パラグラフ［３７］または［８６］に記載の宿主細胞。
【０３９２】
［９２］細胞が、真核細胞である、パラグラフ［３７］または［８６］に記載の宿主細胞。
【０３９３】
［９３］細胞が、酵母細胞である、パラグラフ［９２］に記載の宿主細胞。
【０３９４】
［９４］細胞が、イサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、ジゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択される属に属する、パラグラフ［９３］に記載の宿主細胞。
【０３９５】
［９５］細胞が、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、カンジダ・ランビカ（Ｃ．ｌａｍｂｉｃａ）、またはサッカロマイセス・ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）から選択される、パラグラフ［９４］に記載の宿主細胞。
【０３９６】
［９６］細胞が、活性３−ＨＰ経路を含む、パラグラフ［３７］、［８６］または［９１］〜［９５］のいずれかに記載の宿主細胞。
【０３９７】
［９７］細胞が、以下：
ＰＥＰカルボキシラーゼ活性またはピルビン酸カルボキシラーゼ活性；
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性；
アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性；および
βアラニン／αケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）活性
を含む、パラグラフ［３７］、［８６］または［９１］〜［９６］のいずれかに記載の宿主細胞。
【０３９８】
［９８］細胞が、以下：
ＰＥＰカルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド；
ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド；
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド；
アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、および
ＢＡＡＴをコードする異種ポリヌクレオチド
から選択される１つまたは複数の異種ポリヌクレオチドを含む、パラグラフ［３７］、［８６］または［９１］〜［９７］のいずれかに記載の宿主細胞。
【０３９９】
［９９］以下：
ａ．３−ＨＰの生成を実施可能にする条件下で、パラグラフ［３７］、［８６］または［９１］〜［９８］のいずれかに記載の宿主細胞を培養するステップ；および
ｂ．３−ＨＰを回収するステップ
を含む、３−ＨＰを生成する方法。
【０４００】
［１００］活性３−ＨＰ経路と、配列番号８２に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する３−ＨＰＤＨをコードする異種ポリヌクレオチドとを含む宿主細胞。
【０４０１】
［１０１］細胞が、原核細胞である、パラグラフ［１００］に記載の宿主細胞。
【０４０２】
［１０２］細胞が、真核細胞である、パラグラフ［１００］に記載の宿主細胞。
【０４０３】
［１０３］細胞が、酵母細胞である、パラグラフ［１０２］に記載の宿主細胞。
【０４０４】
［１０４］細胞が、イサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、ジゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択される属に属する、パラグラフ［１０３］に記載の宿主細胞。
【０４０５】
［１０５］細胞が、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、カンジダ・ランビカ（Ｃ．ｌａｍｂｉｃａ）、またはサッカロマイセス・ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）から選択される、パラグラフ［１０４］に記載の宿主細胞。
【０４０６】
［１０６］細胞が、以下：
ＰＥＰカルボキシラーゼ活性またはピルビン酸カルボキシラーゼ活性；
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性；
アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性；および
βアラニン／αケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）活性
を含む、パラグラフ［１００］〜［１０５］のいずれかに記載の宿主細胞。
【０４０７】
［１０７］細胞が、以下：
ＰＥＰカルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド；
ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド；
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド；
アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、および
ＢＡＡＴをコードする異種ポリヌクレオチド
から選択される１つまたは複数の異種ポリヌクレオチドを含む、パラグラフ［１００］〜［１０６］に記載の宿主細胞。
【０４０８】
［１０８］以下：
ａ．３−ＨＰの生成を実施可能にする条件下で、パラグラフ［１００］〜［１０７］のいずれかに記載の宿主細胞を培養するステップ；および
ｂ．３−ＨＰを回収するステップ
を含む、３−ＨＰを生成する方法。
【図１】
2018033457.tif 000012
【図２】
2018033457.tif 000013
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月25日(2017.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の９位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位および３６位に対応する１つまたは複数（数個）の位置に置換を含む３−ＨＰＤＨ変異体であって、
配列番号２、４、もしくは６に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有し；３−ＨＰＤＨ活性を有する、変異体。
【外国語明細書】
2018033457000001.pdf