(57)【要約】【課題】カンジダ菌及びミュータンス菌によるバイオフィルムの形成を抑制する効果に優れたバイオフィルム形成抑制剤を提供する。【解決手段】オリジン又はバシロリシンを有効成分とすることを特徴とするバイオフィルム形成抑制剤。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリジン又はバシロリシンを有効成分とすることを特徴とするバイオフィルム形成抑制剤。
【請求項２】
請求項１に記載のバイオフィルム形成抑制剤を含有することを特徴とするバイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物又は食品。
【請求項３】
オリジン又はバシロリシンを用いることを特徴とするバイオフィルム形成を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物によるバイオフィルムの形成を抑制するために用いるバイオフィルム形成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムとは、細菌やカビ等の微生物が固体や液体の表面に付着することによって形成される微生物集合体であり、様々な環境に存在する。このバイオフィルムと呼ばれる微生物集合体は、日常生活の分野、食品産業の分野及び医療の分野等、各分野において深く関与して多くの問題を引き起こしている。例えば、日常生活の分野においては、台所、浴室、トイレ等の排水口に存在するヌメリもバイオフィルムであり、悪臭の要因となることが指摘されている。食品産業の分野においては、各種配管や各種製造設備等に微生物が付着してバイオフィルムを形成し、微生物汚染の要因になることが指摘されている。医療の分野に関しては、カテーテル内部やコンタクトレンズ、義歯等にバイオフィルムが形成され、感染症を引き起こす要因となることが指摘されている。
【０００３】
特に、義歯の汚れは義歯性口内炎だけでなく口角炎等を引き起こすことも指摘され、更に、バイオフィルムの形成（デンチャープラークの堆積）が助長され、ますます口腔内環境が悪化することも指摘されている。バイオフィルムの形成に関わる微生物としては、カンジダ菌の他、う蝕（虫歯）の原性菌であるストレプトコッカス・ミュータンス菌（以下、「ミュータンス菌」という。）等が知られている。
【０００４】
バイオフィルムの形成を抑制する方法としては、グリセリン脂肪酸エステル等の乳化剤を用いる方法の他、蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）を用いる方法が知られている。後者の方法としては、例えば、バイオフィルム堆積物を抑制または除去するに有効な用量で、本質的にプロテアーゼから成る酵素組成物をこの系に添加することを特徴とする、水系と接触する表面上のバイオフィルム堆積物を抑制または除去する方法（特許文献１）、（Ａ）プロテアーゼ、（Ｂ）２０℃、ｐＨ１０におけるｐＫＣａが５以上のキレート剤、及び水を含有し、２０℃のｐＨが９以上であるバイオフィルム除去剤組成物（特許文献２）、口腔で許容可能なキャリヤー中に、アルカリ性プロテアーゼと、セルラーゼ、α−グルカナーゼおよびその組合せから選択される第２の酵素と、の組合せの効果的量を含有するオーラル・ケア組成物（特許文献３）等が知られている。
【０００５】
しかし、プロテアーゼを用いる上記方法は、カンジダ菌及びミュータンス菌の両方によるバイオフィルムの形成抑制効果において必ずしも満足できるものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平０６−２６２１６５号公報
【特許文献２】特開２０１４−００５４１７号公報
【特許文献３】特表２０１５−５０４８８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、カンジダ菌及びミュータンス菌によるバイオフィルムの形成を抑制する効果に優れたバイオフィルム形成抑制剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決する為に鋭意研究を重ねた結果、多種多様なプロテアーゼのうち特定のものが上記課題を解決することを見出した。本発明者は、これらの知見に基づき更に研究を重ね、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は下記の構成を包含する。
［１］オリジン又はバシロリシンを有効成分とすることを特徴とするバイオフィルム形成抑制剤。
［２］上記［１］に記載のバイオフィルム形成抑制剤を含有することを特徴とするバイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物又は食品。
［３］オリジン又はバシロリシンを用いることを特徴とするバイオフィルム形成を抑制する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、カンジダ菌及びミュータンス菌のいずれに対してもバイオフィルムの形成を抑制する効果に優れている。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、オリジン又はバシロリシンを有効成分とする。
【００１１】
本発明に用いられるオリジンは、セリンプロテアーゼの一種である。より具体的には、オリジンは、国際純正・応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）及び国際生化学・分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）が定めるＥＣ番号３．４．２１．６３の「ｏｒｙｚｉｎ」に分類される。また、オリジンは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属等に属する微生物由来のものを用いることができる。
【００１２】
また、本発明に用いられるバシロリシンは、メタロプロテアーゼ（金属プロテアーゼ）の一種である。より具体的には、バシロリシンは、ＥＣ番号３．４．２４．２８の「ｂａｃｉｌｌｏｌｙｓｉｎ」に分類される。また、バシロリシンは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属等に属する微生物由来のものを用いることができる。
【００１３】
オリジン及びバシロリシンは、酵素製剤として市販されているものを用いることができる。例えば、オリジンとしては、プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ（商品名；天野エンザイム社製；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ由来）、スミチームＦＰ−Ｇ（商品名；新日本化学工業社製；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来）、スミチームＭＰ（商品名；新日本化学工業社製；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ由来）、スミチームＬＰ５０Ｄ（商品名；新日本化学工業社製；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来）等が挙げられる。また、バシロリシンとしては、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（商品名；天野エンザイム社製；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来）、オリエンターゼ９０Ｎ（商品名；エイチビィアイ社製；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来）等が挙げられる。
【００１４】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、有害微生物、特にカンジダ菌及びミュータンス菌に由来するバイオフィルムの形成抑制に有効である。対象となるカンジダ菌は特に制限はなく、カンジダ属に属する真菌全般を指し、具体的には例えば、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラシロシス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ等が挙げられる。
【００１５】
バイオフィルム形成抑制剤を含有するバイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物も本発明の形態の１つである。
【００１６】
バイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物としては、本発明のバイオフィルム形成抑制剤を含有する、例えば、練歯磨、液状歯磨、泡状歯磨等の歯磨剤、入歯安定剤、歯肉マッサージクリーム、局所塗布剤、洗口剤、マウスウォッシュ、口中清涼剤、タブレット、口腔用ウエットティッシュ、口腔湿潤用ジェル剤等が挙げられる。これらはデンチャープラークの堆積等を防止することができる。
【００１７】
また、バイオフィルム形成抑制剤を含有するバイオフィルム形成を抑制する食品も本発明の形態の１つである。
【００１８】
バイオフィルム形成を抑制する食品としては、本発明のバイオフィルム形成抑制剤を含有する、例えば、トローチ剤、チューインガム、フィルム状食品等が挙げられる。これらはデンチャープラークの堆積等を防止することができる。
【００１９】
この他、バイオフィルム形成抑制剤を含有するバイオフィルム形成を抑制する化粧品、医薬部外品、医薬品等も本発明の形態に包含される。
【００２０】
上記したバイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物、食品、化粧品、医薬部外品、医薬品等に含まれるバイオフィルム形成抑制剤の配合量は、有効成分であるオリジン又はバシロリシンとして、好ましくは０．０００１〜１０．０質量％であり、より好ましくは０．０００５〜５．０質量％である。０．０００１質量％未満であるとバイオフィルム形成抑制効果が不十分である場合があり、１０．０質量％を超えると風味に悪影響を与える場合がある。
【００２１】
以下に本発明を実施例で説明するが、これは本発明を単に説明するだけのものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００２２】
＜本発明品及び比較例品＞
［本発明品］
本発明品として、下記に示す本発明品１〜５を用いた。
本発明品１：オリジン（商品名：スミチームＭＰ；新日本化学工業社製）
本発明品２：オリジン（商品名：スミチームＦＰ−Ｇ；新日本化学工業社製）
本発明品３：オリジン（商品名：プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ；天野エンザイム社製）
本発明品４：オリジン（商品名：スミチームＬＰ５０Ｄ；新日本化学工業社製）
本発明品５：バシロリシン（商品名：オリエンターゼ９０Ｎ；エイチビィアイ社製）
［比較例品］
比較例品として、下記に示す比較例品１〜７を用いた。
比較例品１：トリプシン（商品名：ＰＴＮ６．０Ｓ；Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）
比較例品２：サブチリシン（商品名：ナットウキナーゼ；和光純薬工業社製）
比較例品３：パパイン（商品名：スミチームＰ；新日本化学工業社製）
比較例品４：ブロメライン（商品名：スミチームＢＲ；新日本化学工業社製）
比較例品５：ペプシン（商品名：ｐｅｐｓｉｂｏ  １：１０，０００；日本バイオコン社製）
比較例品６：アスペルジロペプシンＩ（商品名：モルシンＦ；キッコーマンバイオケミファ社製）
比較例品７：リゾプスペプシン（商品名：ニューラーゼＦ；天野エンザイム社製）
【００２３】
［カンジダ菌によるバイオフィルムの形成抑制効果の評価］
バイオフィルム形成抑制剤の本発明品１〜５及び比較例品１〜７のそれぞれを用いて、供試菌（カンジダ・アルビカンス  ＮＢＲＣ  １５９４株）に由来するバイオフィルムの形成抑制効果の評価を行った。
（１）供試菌液の調整
１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌したポテトデキストロース寒天培地（ＤＩＦＣＯ社製）を滅菌済みシャーレにて加えて固化し、寒天平板を作製した。凍結保存品の供試菌をこの寒天平板に塗抹して、３０℃にて２日間培養した。２％グルコース含有酵母ニトロゲンベース（ＤＩＦＣＯ社製）を１０倍希釈し、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した培地２０ｍｌをバッフル付き三角フラスコに分注し、上記寒天培地で培養した供試菌を一白金耳取り植菌した。その後、３０℃、１５０ｒｐｍにて２４時間撹拌培養し、前培養液とした。次いで、遠心分離（４７００ｒｐｍ、１０分、２０℃）をおこない集菌した。集菌した菌を生理食塩水２０ｍｌを用いて洗浄し、再び遠心分離（４７００ｒｐｍ、１０分、２０℃）をおこない集菌した。集菌した菌をサブローブドウ糖培地（ペプトン１．０質量％、ブドウ糖４．０質量％を含み、１規定の塩酸を用いてｐＨ５．７に調整した液体培地。以下、「ＳＧ培地」という。）１０ｍｌに加え、再懸濁した。この再懸濁液をＳＧ培地で２０倍希釈したものを供試菌液として用いた。供試菌液中の菌数は、３．２×１０６個／ｍｌであった。
【００２４】
（２）バイオフィルム形成方法
バイオフィルム形成抑制剤の本発明品１〜５及び比較例品１〜７を被験試料とし、各被験試料を水で溶解して被験試料液とし、該被験試料液４μＬ、供試菌液１９６μＬを、９６穴マイクロプレート（商品名：ＴＣプレート９６ｗｅｌｌ（Ｃｅｌｌ＋）；ザルスタット社製）の各ウェル（穴）に加えた。なお、被験試料液中の被験試料濃度は、供試菌液と加えた際の濃度、即ち各ウェル中の酵素の濃度がそれぞれ１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍとなるように調製した。その後、被験試料液及び供試菌液を加えた９６穴マイクロプレートを３０℃、２日間の静置培養を行って各ウェル中にバイオフィルムを形成した。
また、コントロール（被験試料無添加）として、被験試料液４μＬと供試菌液１９６μＬをウェルに加えるのに替えて、被験試料を用いずに水４μＬと供試菌液１９６μＬをウェルに加える以外は同様の操作を行って各ウェル中にバイオフィルムを形成した。
【００２５】
（３）形成させたバイオフィルムの定量方法
静置培養終了後、各ウェルの被験試料液及び培養液等の液部を除去し、各ウェルの付着物（菌体、分泌物及び沈着物等）をバイオフィルムとし、各ウェルに０．０１質量％のクリスタルバイオレット水溶液（商品名：Ｂｅｃｔｏｎ；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）５０μＬを添加し、バイオフィルムを染色した。次いで、各ウェルから添加したクリスタルバイオレット液を除き、２００μＬの蒸留水で２回洗浄後、エタノール２００μＬを加えて各ウェルからバイオフィルムを染色していたクリスタルバイオレットを溶出させることにより、マイクロプレートに固着したバイオフィルムを定量した。定量方法としては、マイクロプレートリーダー（型式：ＳＨ−９０００Ｌａｂ；ＣＯＲＯＮＡ ＥＬＥＣＴＲＩＣ社製）を用いて、各ウェルの６００ｎｍにおける吸光度（Ｏ．Ｄ．６００）を測定した。
【００２６】
（４）バイオフィルム形成抑制効果の評価方法
コントロールのウェルに形成したバイオフィルムの６００ｎｍにおける吸光度を基準吸光度とし、その数値の時にバイオフィルム形成率１００％とした。それぞれの被験試料の吸光度と基準吸光度と対比してバイオフィルム形成率を計算し、各被験試料のバイオフィルム形成率を縦軸、各被験試料の濃度を横軸とした対数近似曲線グラフを作成した。
上記対数近似曲線のグラフを用い、各ウェルの吸光度が、基準吸光度の５０％に相当するバイオフィルム形成率、すなわちバイオフィルム形成率５０％となる各被験試料の濃度（以下、「５０％阻害濃度」という。）を算出した。
被験試料のバイオフィルム形成抑制効果の判定は、被験試料の５０％阻害濃度が１００ｐｐｍ以下の場合にバイオフィルム形成の抑制効果があるとし、被験試料の５０％阻害濃度が１００ｐｐｍを超える場合にバイオフィルム形成の抑制効果がないと判定した。得られた結果を表１に示す。
【００２７】
［ミュータンス菌によるバイオフィルムの形成抑制効果の評価］
バイオフィルム形成抑制剤の本発明品１〜５及び比較例品１〜７のそれぞれを用いて、供試菌（ストレプトコッカス・ミュータンス  ＮＢＲＣ  １３９５５株）に由来するバイオフィルムの形成抑制効果の評価を行った。
（１）供試菌液の調製
１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌したブレイン・ハート・インフュージョン（以下、「ＢＨＩ」という。）寒天培地（ＤＩＦＣＯ社製）を滅菌済みシャーレにて加えて固化し、寒天平板を作製した。凍結保存品の供試菌をこの寒天平板に塗抹して、３０℃にて２日間培養した。ＢＨＩ液体培地（ＤＩＦＣＯ社製）３ｍｌを１８ｍｍ試験管に入れて１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌し、上記寒天培地で培養した供試菌を一白金耳取り植菌した。その後、３０℃、１５０ｓｐｍにて７２時間攪拌培養し、供試菌液（原液）とした。供試菌液中の菌数は、３．６×１０６個／ｍｌであった。
これとは別に、３０質量％シュクロース水溶液、およびＢＨＩ液体培地、を１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌しておいた。３０質量％シュクロース水溶液０．２５ｍｌ、供試菌液（原液）０．５０ｍｌ、ＢＨＩ液体培地１４．２５ｍｌを無菌的に混合しておき、供試菌液とした。
【００２８】
（２）バイオフィルム形成方法
本発明品１〜５及び比較例品１〜７を被験試料とし、各被験試料を水で溶解して被験試料液とし、該被験試料液４μＬ、供試菌液１９６μＬを、９６穴マイクロプレート（商品名：ＴＣプレート９６ｗｅｌｌ（Ｃｅｌｌ＋）；ザルスタット社製）の各ウェル（穴）に加えた。なお、被験試料液中の被験試料濃度は、供試菌液と加えた際の濃度、即ち各ウェル中の酵素の濃度がそれぞれ３．１３ｐｐｍ、６．２５ｐｐｍ、１２．５ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、４００ｐｐｍ、となるように調製した。その後、被験試料液及び供試菌液を加えた９６穴マイクロプレートを３０℃、４日間の静置培養を行って各ウェル中にバイオフィルムを形成した。
また、コントロール（被験試料無添加）として、被験試料液４μＬと供試菌液１９６μＬをウェルに加えるのに替えて、被験試料を用いずに水４μＬと供試菌液１９６μＬをウェルに加える以外は同様の操作を行って各ウェル中にバイオフィルムを形成した。
【００２９】
（３）形成させたバイオフィルムの定量方法
静置培養終了後、各ウェルの被験試料液及び培養液等の液部を除去し、各ウェルの付着物（菌体、分泌物及び沈着物等）をバイオフィルムとし、各ウェルに０．０１質量％のクリスタルバイオレット水溶液（商品名：Ｂｅｃｔｏｎ；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）５０μＬを添加し、バイオフィルムを染色した。次いで、各ウェルから添加したクリスタルバイオレット液を除き、２００μＬの蒸留水で２回洗浄後、エタノール２００μＬを加えて各ウェルからバイオフィルムを染色していたクリスタルバイオレットを溶出させることにより、マイクロプレートに固着したバイオフィルムを定量した。定量方法としては、マイクロプレートリーダー（型式：ＳＨ−９０００Ｌａｂ；ＣＯＲＯＮＡ ＥＬＥＣＴＲＩＣ社製）を用いて、各ウェルの６００ｎｍにおける吸光度（Ｏ．Ｄ．６００）を測定した。
【００３０】
（４）バイオフィルム形成抑制効果の評価方法
コントロールのウェルに形成したバイオフィルムの６００ｎｍにおける吸光度を基準吸光度とし、その数値の時にバイオフィルム形成率１００％とした。それぞれの被験試料の吸光度と基準吸光度と対比してバイオフィルム形成率を計算し、各被験試料のバイオフィルム形成率を縦軸、被験試料の濃度を横軸とした対数近似曲線グラフを作成した。
上記対数近似曲線のグラフを用い、各ウェルの吸光度が、基準吸光度の５０％に相当するバイオフィルム形成率、すなわち５０％阻害濃度を算出した。
被験試料のバイオフィルム形成抑制効果の判定は、被験試料の５０％阻害濃度が４００ｐｐｍ以下の場合にバイオフィルム形成抑制の効果があるとし、被験試料の５０％阻害濃度が４００ｐｐｍを超える場合にバイオフィルム形成抑制の効果がないと判定した。得られた結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
2018030819.tif 000002
【００３２】
表１の結果より、本発明品１〜５は、カンジダ菌によるバイオフィルム形成の５０％阻害濃度が１００ｐｐｍ以下であり、かつ、ミュータンス菌によるバイオフィルム形成の５０％阻害濃度が４００ｐｐｍ以下であり、バイオフィルム形成抑制効果に優れていた。一方、比較例品１〜７は、カンジダ菌によるバイオフィルム形成の５０％阻害濃度が１００ｐｐｍ以下のものも含まれていたが、いずれもミュータンス菌によるバイオフィルム形成の５０％阻害濃度が４００ｐｐｍを超えており、バイオフィルム形成抑制効果に劣っていた。
【００３３】
［製造例１：タブレットの製造］
下記表２の配合により、各成分を均一に混合し水を加えて混練りした後、乾燥させて単発式打錠機にて本発明品１を含有するタブレットを製造した。
【００３４】
【表２】
2018030819.tif 000003
【００３５】
［製造例２：フィルム状食品の製造］
下記表３の配合により、各成分を均一に混合し水を加えて混練りした後プラスチックフィルムに展延し乾燥させ、本発明品２を含有するフィルム状食品を製造した。
【００３６】
【表３】
2018030819.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は、バイオフィルム形成の抑制が求められる食品及び化粧品産業の分野並びに医療の分野等、各分野において利用することができる。