(57)【要約】【課題】腱または靭帯の傷害を処置するための血小板由来成長因子組成物および方法の提供。【解決手段】本発明は、腱および靭帯の傷害を治療し、かつ／または損傷した腱および靭帯を修復するための組成物および方法を提供する。本発明は、生体適合性マトリックスおよび血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む組成物を提供する。本発明の一態様では、生体適合性マトリックスおよび血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む組成物であって、生体適合性マトリックスは孔を有し、この生体適合性マトリックスは、少なくとも約８０％の多孔度を有し、ＰＤＧＦの少なくとも約５０％が約２４時間以内に放出される組成物が提供される。【選択図】図１
2018030895.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腱または靭帯の傷害を治療するための組成物および方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００８年９月９日に出願された米国仮出願第６１／１９１，６４１号、２００９年１月１２日に出願された米国仮出願第６１／１４４，０８８号および２００９年１月１２日に出願された米国仮出願第６１／１４４，１２６号（これらの全体は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、腱または靭帯の傷害、例えば、断裂、切断、引裂、または横切した腱もしくは靭帯、または骨からの腱もしくは靭帯の剥離などを治療するための組成物および方法、特に、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）と組み合わせて生体適合性マトリックスを含む組成物を投与することによって、腱または靭帯の傷害を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
腱および靭帯は、筋肉と骨または骨と骨をつなぐ強靭な線維であるが、腱および靭帯は、様々な理由で断裂、切断し、または骨から剥離する場合がある。そのような腱または靭帯の傷害は、患部腱／靭帯への直接の外傷、年齢の進行に起因する腱／靭帯の脆弱化、偏心した負荷、繰り返しの運動、酷使および／または応力もしくは活動の増大に起因して、またはこれらの結果として一般に起こり得る。そのような急性傷害は、かなり劇的であり、通常、個体が患部関節を動かすことができないままにする。
【０００４】
腱断裂、腱切断、または骨からの剥離の最も一般的な範囲は、（１）膝頭（膝蓋骨）の直上で一緒になって膝蓋腱（ｐａｔｅｌｌａｒ  ｔｅｎｄｏｎ）を形成する四頭筋（４つの筋、すなわち、外側広筋、内側広筋、中間広筋、および大腿直筋の群）；（２）踵の直上の足の後部（後方）部分に位置するアキレス腱である。アキレス腱は、ふくらはぎの筋肉（腓腹筋）と足の踵（踵骨）の接続機構として機能を果たす；（３）肩内に位置し、４つの筋肉（棘上筋（断裂する最も一般的な腱）、棘下筋、小円筋、および肩甲下筋）からなる回旋腱板；（４）肘の屈筋として機能する、腕の二頭筋。二頭筋断裂は、近位（近方）および遠位（遠方）の型に分類される；ならびに（５）短指屈筋および長指屈筋などの手の屈筋腱（ｆｌｅｘｏｒ  ｔｅｎｄｏｎ）。靭帯断裂、靭帯切断、または骨からの剥離の最も一般的な範囲は、前十字靭帯（ＡＣＬ）、後十字靭帯（ＰＣＬ）、および内側側副靭帯（ＭＣＬ）である。ほとんどすべての腱および靭帯の傷害について、患部関節または肢のかなりの疼痛（急性または慢性）、動きの低下、および脱力感がある場合がある。腱／靭帯の断裂または剥離について、腱もしくは靭帯をその骨に固定し、または患部腱／靭帯の断裂または切断した端部を再接続するために、手術が最も一般的な治療過程である。他の腱／靭帯傷害について、一般的な治療には、安静、氷冷、ＮＳＡＩＤ、コルチコステロイド注射、加熱、および超音波が含まれる。しかし、これらの傷害に対する数十年の研究および臨床的配慮の増大にもかかわらず、その臨床転帰は予測不可能なままである。
【０００５】
四頭筋に関しては、膝蓋腱の断裂は比較的稀であるが、障害を引き起こす傷害であり、これは、年齢が４０歳未満の患者において最も一般にみられる。これは、競技運動活動中に、屈曲した膝が四頭筋群の激しい収縮に逆らうとき起こりやすい。断裂は通常、膝蓋腱への繰り返しの微小外傷から生じる変性腱障害の最終的な段階を表す。
【０００６】
アキレス腱に関しては、運動選手および非運動選手がともに、すべての年齢において傷害を発生させるリスクがあり、ほとんどの傷害は、３０歳と５０歳の間の男性において起こる（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。アキレス腱炎およびアキレス腱症は、仕事により、足首および足に応力がかかる個体、ならびに「週末戦士」、すなわち調整が不十分で、週末のみ、または稀に運動競技に参加する者にも一般的である。
【０００７】
回旋腱板傷害の場合では、外科的な器具使用および技法の進歩にもかかわらず、現在の技法は、永続的な修復をもたらすに及ばず、いくつかの研究は、９４％もの高い失敗率を挙げている。腱修復の失敗は、損傷した腱の治癒が不十分であり、傷害された腱の骨への再結合が不十分であることに起因する場合がある。
【０００８】
靭帯の骨へのしっかりした結合も、多くの靭帯再建手順にとって必須である。前十字靭帯再建などの靭帯置換手順の成功には、骨と腱の生物学的結合を作り出すために、腱グラフトの骨トンネルへの固定、および腱への骨の漸進的な内殖を必要とする。組織学的および生体力学的な研究は、一般に、骨の内殖、腱−骨結合、石灰化、および腱と骨の間のより大きなコラーゲン−線維連続性を実現するのに、腱グラフトを骨に移植した後、６〜１２週間を必要とすることを示す。非特許文献４を参照。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｏｙｄｅｎ，  Ｅ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ、（１９９５年）３１７巻：１５０〜１５８頁
【非特許文献２】Ｈａｔｔｒｕｐ，  Ｓ．およびＪｏｈｎｓｏｎ，  Ｋ、Ｆｏｏｔ  ａｎｄ  Ａｎｋｌｅ、（１９８５年）６巻：３４〜３８頁
【非特許文献３】Ｊｏｚｓａ，  Ｌ．、Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ、（１９８９年）６０巻：４６９〜４７１頁
【非特許文献４】Ｒｏｄｅｏ  Ｓ．Ａ．ら、Ｔｅｎｄｏｎ−Ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ａ  Ｂｏｎｅ  Ｔｕｎｎｅｌ、（１９９３年）７５巻（１２号）：１７９５〜１８０３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、様々な腱／靭帯傷害の治療、および外科的修復または他の非外科的な治療に関連する治癒応答を改善するための腱／靭帯と骨の結合のための新規組成物および新規方法を提供する必要がある。
【００１１】
限定することなく、特許、特許出願、および科学的参考文献を含めた、本明細書に引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要旨
本発明は、腱または靭帯の傷害を治療するための組成物および方法を提供する。
【００１３】
本発明の一態様では、生体適合性マトリックスおよび血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む組成物であって、生体適合性マトリックスは孔を有し、この生体適合性マトリックスは、少なくとも約８０％の多孔度を有し、ＰＤＧＦの少なくとも約５０％が約２４時間以内に放出される組成物が提供される。
【００１４】
別の態様では、本発明は、個体における、骨を伴わない腱傷害または靭帯傷害を治療するための方法であって、生体適合性マトリックスおよび血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む有効量の組成物を個体の傷害患部に投与するステップを含み、生体適合性マトリックスは孔を有し、この生体適合性マトリックスは、少なくとも約８０％の多孔度を有し、ＰＤＧＦの少なくとも約５０％が約２４時間以内に放出される方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、腱または靭帯の傷害を機械的に安定化させるステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、腱または靭帯の傷害を安定化させるステップは、腱または靭帯の傷害を縫合するステップを含み、縫合された腱または靭帯は、傷害された腱または靭帯の端部が実質的に再接近されるように配置される。いくつかの実施形態では、投与するステップは、シリンジを使用して、有効量の組成物を前記個体の傷害患部に投与するステップを含む。
【００１５】
別の態様では、本発明は、個体において腱を骨に結合または再結合させるための方法であって、腱と骨の界面で、生体適合性マトリックスおよび血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む有効量の組成物を個体に投与するステップを含み、生体適合性マトリックスは孔を有し、この生体適合性マトリックスは、少なくとも約８０％の多孔度を有し、ＰＤＧＦの少なくとも約５０％が約２４時間以内に放出される方法を提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、個体において靭帯を骨に結合または再結合させるための方法であって、靭帯と骨の界面で、生体適合性マトリックスおよび血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む有効量の組成物を個体に投与するステップを含み、生体適合性マトリックスは孔を有し、この生体適合性マトリックスは、少なくとも約８０％の多孔度を有し、ＰＤＧＦの少なくとも約５０％が約２４時間以内に放出される方法を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、個体における、骨を伴わない腱または靭帯の傷害を治療するためのキットであって、生体適合性マトリックスを含む第１の容器、および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）溶液を含む第２の容器を備え、生体適合性マトリックスは孔を有し、この生体適合性マトリックスは、少なくとも約８０％の多孔度を有し、ＰＤＧＦの少なくとも約５０％が約２４時間以内に放出されるキットを提供する。
【００１８】
さらに別の態様では、本発明は、個体において腱または靭帯を骨に結合させるためのキットであって、生体適合性マトリックスを含む第１の容器、および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）溶液を含む第２の容器を備え、生体適合性マトリックスは孔を有し、この生体適合性マトリックスは、少なくとも約８０％の多孔度を有し、ＰＤＧＦの少なくとも約５０％が約２４時間以内に放出されるキットを提供する。
【００１９】
本明細書に記載される任意の組成物は、本明細書に記載される任意の方法およびキットにおいて使用することができる。以下に記載される様々な実施形態は、当業者に明らかであるように、本発明の任意の態様とともに使用することができる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９２％、または約９２％〜約９５％の多孔度を有する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、孔は、約８００μｍ（ｕｍ）２〜約３，０００μｍ２、約１３，０００μｍ２〜約５０，０００μｍ２、約２５００μｍ２〜約２０，０００μｍ２、約４５００μｍ２〜約２０，０００μｍ２、約５０００μｍ２〜約１９，０００μｍ２、約６０００μｍ２〜約１８，０００μｍ２、約６０００μｍ２〜約１５，０００μｍ２、または約５０００μｍ２〜約１６０００μｍ２の範囲の平均面積を有する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、孔は、約１００μｍ〜約２００μｍ、約４００μｍ〜約８００μｍ、約２００μｍ〜約５００μｍ、約２００μｍ〜約６００μｍ、約３００μｍ〜約６００μｍ、または約３００μｍ〜約５００μｍの範囲の平均周囲長を有する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、孔は、約１μｍ〜約１ｍｍの範囲の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、孔は、少なくとも約５μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約２０μｍ、少なくとも約３０μｍ、少なくとも約４０μｍ、または少なくとも約５０μｍ、約５μｍ〜約５００μｍ、約１０μｍ〜約５００μｍ、約５０μｍ〜約５００μｍ、約１００μｍ〜約５００μｍ、または約１００μｍ〜約３００μｍの平均直径を有する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、孔は、相互接続された孔を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、約５０％〜約９５％、約６０％〜約９５％、約７０％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約５０％〜約８５％、約６０％〜約８５％、約７０％〜約８５％、または約５０％〜約８０％が、約２４時間以内に放出される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、約５０％〜約９５％、約６０％〜約９５％、約７０％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約５０％〜約８５％、約６０％〜約８５％、約７０％〜約８５％、または約５０％〜約８０％が、約１時間、約６時間、約８時間、約１２時間、または約４８時間以内に放出される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦの放出は、インビボで測定される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦの放出は、インビトロで測定される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、周囲の領域中に放出される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、傷害された腱または靭帯上に放出される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、骨−腱または骨−靭帯結合箇所付近の骨の表面上に放出される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、周囲媒質中に放出される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、インビボ投与して約１カ月、約３カ月、約６カ月、または約９カ月以内に再吸収される。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、インビボ投与して約３０日、約２５日、約２１日、約１８日、約１５日、約１０〜１４日、または約１０日以内に再吸収される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスはコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、コラーゲンはＩ型コラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、コラーゲンは架橋されている。
【００２８】
いくつかの実施形態では、コラーゲンは可溶性である。いくつかの実施形態では、コラーゲンは不溶性である。いくつかの実施形態では、コラーゲンは、可溶性コラーゲンモノマー成分、および不溶性コラーゲンポリマー成分を含む。いくつかの実施形態では、可溶性コラーゲンモノマーと不溶性コラーゲンポリマーの比は、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、または約１：１である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスはグリコサミノグリカンをさらに含む。いくつかの実施形態では、グリコサミノグリカンはコンドロイチン硫酸である。いくつかの実施形態では、グリコサミノグリカンはコンドロイチン硫酸ではない。
【００３０】
様々な実施形態では、組成物は、ゲル、粒子、粉末、ペースト、シート、パッド、パッチ、またはスポンジである。いくつかの実施形態では、組成物は流動性である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスはＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）である。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスはＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（登録商標）である。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスはＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（登録商標）ではない。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスはＰＤＧＦを酸化しない。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦを含む溶液として存在し、溶液中のＰＤＧＦの濃度は、約０．１〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．４ｍｇ／ｍｌ、または約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ溶液は、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、または約１０．０ｍｇ／ｍｌである。
【００３３】
例えば、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤ、およびこれらの混合物および誘導体を含めて、本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦホモ二量体であり、他の実施形態では、ＰＤＧＦはヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ−ＢＢを含む。他の実施形態では、ＰＤＧＦは、組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）などの組換えヒト（ｒｈ）ＰＤＧＦを含む。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ断片である。いくつかの実施形態では、ｒｈＰＤＧＦ−Ｂは以下の断片、すなわち、全Ｂ鎖のアミノ酸配列１〜３１、１〜３２、３３〜１０８、３３〜１０９、および／または１〜１０８を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、細胞は、組成物に曝された後、約３週間、約２週間、約１週間、約７日、約６日、約５、約４、約３、約２、または約１日以内に本発明の組成物に浸潤する。いくつかの実施形態では、細胞は腱細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は骨芽細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は靭帯細胞である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、腱の骨への結合、または靭帯の骨への結合において有用であり、任意の腱または靭帯の結合に適用することができる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、骨への腱／靭帯の結合部位で、腱および／または骨ならびに靭帯および／または骨を強化することによって、骨への腱結合または骨への靭帯結合を増強する。他の型の損傷した、または傷害された腱および／または靭帯、例えば、断裂、離層、および／または任意の他の歪みもしくは変形を示す腱／靭帯なども、本発明の方法によって治療することができる。１つの型の傷害を治療することができ、または２つ以上の型の傷害を同時に治療することができる。いくつかの実施形態では、治療により、腱を治療する。いくつかの実施形態では、治療により、靭帯を治療する。いくつかの実施形態では、腱および／または靭帯組織の特定の治療のために、腱グラフトが使用される。他の実施形態では、腱および／または靭帯組織の特定の治療のために、靭帯グラフトが使用される。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、腱の骨への結合または再結合、および骨を伴わない任意の腱傷害の両方において有用である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、腱の骨への結合または再結合の増強、および骨を伴わない任意の腱傷害の両方において有用である。他の実施形態では、本発明の組成物および方法は、靭帯の骨への結合または再結合、および骨を伴わない任意の靭帯傷害の両方において有用である。他の実施形態では、本発明の組成物および方法は、靭帯の骨への結合または再結合の増強、および骨を伴わない任意の靭帯傷害の両方において有用である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法によって治療することができる腱として、それだけに限らないが、肩甲下筋、棘上筋、棘下筋、小円筋、大腿直筋、後脛骨筋、大腿四頭筋、上腕二頭筋の腱、ならびにアキレス腱、膝蓋腱、外転筋腱（ａｂｄｕｃｔｏｒ  ｔｅｎｄｏｎ）および内転筋腱（ａｄｄｕｃｔｏｒ  ｔｅｎｄｏｎ）、または腰の他の腱、一般的な伸筋腱、一般的な屈筋腱、浅指屈筋腱、指伸筋、ならびに小指伸筋腱、または腕および手の他の腱が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法によって治療することができる腱は、膝蓋腱、前脛骨筋腱（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｔｉｂｉａｌｉｓ  ｔｅｎｄｏｎ）、アキレス腱、膝窩腱、半腱様筋腱（ｓｅｍｉｔｅｎｄｉｎｏｓｕｓ  ｔｅｎｄｏｎ）、薄筋腱（ｇｒａｃｉｌｉｓ  ｔｅｎｄｏｎ）、外転筋腱、および内転筋腱からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法によって治療することができる腱は、棘上筋腱（ｓｕｐｒａｓｐｉｎａｔｕｓ  ｔｅｎｄｏｎ）、棘下筋腱（ｉｎｆｒａｓｐｉｎａｔｕｓ  ｔｅｎｄｏｎ）、肩甲下筋腱（ｓｕｂｓｃａｐｕｌａｒｉｓ  ｔｅｎｄｏｎ）、小円筋腱（ｔｅｒｅ  ｍｉｎｏｒ
ｔｅｎｄｏｎ）（回旋腱板複合体（ｒｏｔａｔｏｒ  ｃｕｆｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ））、屈筋腱、大腿直筋腱（ｒｅｃｔｕｓ  ｆｅｍｏｒｉｓ  ｔｅｎｄｏｎ）、後脛骨筋腱（ｔｉｂｉａｌｉｓ  ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｔｅｎｄｏｎ）、および大腿四頭筋腱（ｑｕａｄｒｉｃｅｐｓ  ｆｅｍｏｒｉｓ  ｔｅｎｄｏｎ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法によって治療することができる腱は、膝蓋腱、前脛骨筋腱、アキレス腱、膝窩腱、半腱様筋腱、薄筋腱、外転筋腱、内転筋腱、棘上筋腱、棘下筋腱、肩甲下筋腱、小円筋腱（回旋腱板複合体）、屈筋腱、大腿直筋腱、後脛骨筋腱、および大腿四頭筋腱からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法によって治療することができる腱は、棘上筋腱、棘下筋腱、肩甲下筋腱、小円筋腱（回旋腱板複合体）、屈筋腱、大腿直筋腱、後脛骨筋腱、および大腿四頭筋腱からなる群より選択されない。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法によって治療することができる靭帯は、前十字靭帯（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、外側側副靭帯（ｌａｔｅｒａｌ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、後十字靭帯（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、内側側副靭帯（ｍｅｄｉａｌ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、頭側十字靭帯（ｃｒａｎｉａｌ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、尾方十字靭帯（ｃａｕｄａｌ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、輪状甲状靭帯（ｃｒｉｃｏｔｈｙｒｏｉｄ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、歯周靭帯、毛様体小帯、前仙腸靭帯、後仙腸靭帯、仙結節靭帯、仙棘靭帯、恥骨弓靭帯、上恥骨靭帯、提靭帯、掌側橈骨手根靭帯、背側橈骨手根靭帯、内側側副靭帯（ｕｌｎａｒ
ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、および外側側副靭帯（ｒａｄｉａｌ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）からなる群より選択される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法によって治療することができる骨には、それだけに限らないが、例えば、脛骨、大腿骨、および上腕骨が含まれる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、骨を伴わない腱または靭帯の損傷は、腱または靭帯の断裂、切断（ｓｅｖｅｒａｎｃｅ）、引裂（ｔｅａｒｉｎｇ）、離層、歪み、または変形である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、腱の骨への結合は、回旋腱板傷害の治療のためである。いくつかの実施形態では、腱の骨への結合または靭帯の骨への結合は、前十字靭帯再建のためである。
【００４３】
いくつかの実施形態では、個体において腱または靭帯の傷害を治療するための方法であって、生体適合性マトリックスおよび血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む有効量の組成物を前記個体に投与するステップを含み、ＰＤＧＦは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度であり、生体適合性マトリックスは、約４５００μｍ２〜約２００００μｍ２の範囲の孔面積サイズおよび約２００μｍ〜約５００μｍの範囲の孔周囲長サイズを有する孔を含む多孔質構造を形成する方法が提供される。
【００４４】
いくつかの実施形態では、個体において腱または靭帯の傷害を治療するための方法であって、生体適合性マトリックスおよび血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む有効量の組成物を前記個体の傷害患部に投与するステップを含み、ＰＤＧＦは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度であり、組成物は流動性である方法が提供される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、個体において腱を骨にまたは靭帯を骨に結合するための方法であって、腱と骨または靭帯と骨の界面で、生体適合性マトリックスおよび血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む有効量の組成物を前記個体に投与するステップを含み、生体適合性マトリックスは、約８５％超の多孔度を有する孔を含む多孔質構造を形成する方法が提供される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、前十字靭帯再建のために、個体において腱を骨に結合するための方法であって、腱と骨の界面で、生体適合性マトリックスおよび血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む有効量の組成物を前記個体に投与するステップを含み、生体適合性マトリックスは、約８５％超の多孔度を有する孔を含む多孔質構造を形成する方法が提供される。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態では、この方法は、関節鏡下の技法、内視鏡下の技法、腹腔鏡下の技法、または任意の他の適当な最小限に侵襲性の技法を使用して実施することができる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
個体における、骨を伴わない腱傷害または靭帯傷害を治療するための方法であって、前記方法は、生体適合性マトリックスおよび血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む有効量の組成物を前記個体の傷害の患部に投与するステップを含み、前記生体適合性マトリックスは孔を有し、前記生体適合性マトリックスは、少なくとも約８０％の多孔度を有し、前記ＰＤＧＦの少なくとも約５０％が約２４時間以内に放出される、方法。
（項目２）
前記生体適合性マトリックスが、少なくとも約８５％の多孔度を有する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記生体適合性マトリックスが、少なくとも約９０％の多孔度を有する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記生体適合性マトリックスが、少なくとも約９２％の多孔度を有する、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記生体適合性マトリックスが、少なくとも約９５％の多孔度を有する、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記孔が、約２５００ｕｍ２〜約２０，０００ｕｍ２の範囲の平均面積を有する、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記孔が、約２００ｕｍ〜約６００ｕｍの範囲の平均周囲長を有する、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記孔が、約１μｍ〜約１ｍｍの範囲の直径を有する、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記孔が、少なくとも約５μｍの直径を有する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記孔が相互接続された孔である、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記ＰＤＧＦの少なくとも約６０％が、約２４時間以内に放出される、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記ＰＤＧＦの少なくとも約７０％が、約２４時間以内に放出される、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記ＰＤＧＦの少なくとも約８０％が、約２４時間以内に放出される、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記生体適合性マトリックスが、インビボ投与の約２１日以内に再吸収される、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記生体適合性マトリックスが、インビボ投与の約１８日以内に再吸収される、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記生体適合性マトリックスが、インビボ投与の約１５日以内に再吸収される、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記生体適合性マトリックスがコラーゲンを含む、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記コラーゲンが可溶性である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記コラーゲンが架橋されている、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記生体適合性マトリックスがグリコサミノグリカンをさらに含む、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
前記グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記組成物が、ゲル、粒子、粉末、シート、パッド、ペースト、パッチ、またはスポンジである、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記組成物が流動性である、項目１から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記生体適合性マトリックスがＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）である、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記ＰＤＧＦが、ＰＤＧＦを含む溶液として存在し、前記溶液中のＰＤＧＦの濃度が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．０ｍｇ／ｍｌである、項目１から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記溶液中のＰＤＧＦの濃度が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．４ｍｇ／ｍｌである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記溶液中のＰＤＧＦの濃度が、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌである、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
細胞が、前記組成物に曝された後約４日以内に前記組成物に浸潤する、項目１から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記腱傷害を機械的に安定化させるステップをさらに含む、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記腱または靭帯の傷害を安定化させるステップが、前記腱または靭帯の傷害を縫合するステップを含み、それによって縫合された前記腱または靭帯は、傷害された前記腱または傷害された前記靭帯の端部が実質的に再接近されるように配置される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記投与するステップが、前記個体の前記傷害の患部に前記有効量の前記組成物を、シリンジを使用して投与するステップを含む、項目１から３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記腱が、膝蓋腱、前脛骨筋腱、アキレス腱、膝窩腱、半腱様筋腱、薄筋腱、外転筋腱、内転筋腱、棘上筋腱、棘下筋腱、肩甲下筋腱、小円筋腱、屈筋腱、大腿直筋腱、後脛骨筋腱、および大腿四頭筋腱からなる群より選択される、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記靭帯が、前十字靭帯（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、外側側副靭帯（ｌａｔｅｒａｌ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、後十字靭帯（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、内側側副靭帯（ｍｅｄｉａｌ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、頭側十字靭帯（ｃｒａｎｉａｌ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、尾方十字靭帯（ｃａｕｄａｌ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、輪状甲状靭帯、歯周靭帯、毛様体小帯、前仙腸靭帯、後仙腸靭帯、仙結節靭帯、仙棘靭帯、恥骨弓靭帯、上恥骨靭帯、提靭帯、掌側橈骨手根靭帯、背側橈骨手根靭帯、内側側副靭帯（ｕｌｎａｒ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、および外側側副靭帯（ｒａｄｉａｌ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）からなる群より選択される、項目１から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記腱または靭帯の傷害が、腱もしくは靭帯の断裂、切断、引裂、離層、歪み、または変形である、項目１から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
個体において腱を骨にまたは靭帯を骨に結合させるための方法であって、前記腱と前記骨の界面または前記靭帯と前記骨の界面で、生体適合性マトリックスおよび血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む有効量の組成物を前記個体に投与するステップを含み、前記生体適合性マトリックスは孔を有し、前記生体適合性マトリックスは、少なくとも約８０％の多孔度を有し、前記ＰＤＧＦの少なくとも約５０％が約２４時間以内に放出される、方法。
（項目３６）
前記生体適合性マトリックスが、少なくとも約８５％の多孔度を有する、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記生体適合性マトリックスが、少なくとも約９０％の多孔度を有する、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記生体適合性マトリックスが、少なくとも約９２％の多孔度を有する、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
前記生体適合性マトリックスが、少なくとも約９５％の多孔度を有する、項目３５に記載の方法。
（項目４０）
前記孔が、約２５００ｕｍ２〜約２０，０００ｕｍ２の範囲の平均面積を有する、項目３５から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記孔が、約２００ｕｍ〜約６００ｕｍの範囲の平均周囲長を有する、項目３５から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記孔が、約１μｍ〜約１ｍｍの範囲の直径を有する、項目３５から４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記孔が、少なくとも約５μｍの直径を有する、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記孔が相互接続された孔である、項目３５から４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記ＰＤＧＦの少なくとも約６０％が、約２４時間以内に放出される、項目３５から４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記ＰＤＧＦの少なくとも約７０％が、約２４時間以内に放出される、項目３５から４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記ＰＤＧＦの少なくとも約８０％が、約２４時間以内に放出される、項目３５から４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記生体適合性マトリックスが、インビボ投与の約２１日以内に再吸収される、項目３５から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記生体適合性マトリックスが、インビボ投与の約１８日以内に再吸収される、項目３５から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記生体適合性マトリックスが、インビボ投与の約１５日以内に再吸収される、項目３５から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記生体適合性マトリックスがコラーゲンを含む、項目３５から５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記コラーゲンが可溶性である、項目３５から５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記コラーゲンが架橋されている、項目３５から５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記生体適合性マトリックスがグリコサミノグリカンをさらに含む、項目３５から５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸である、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記組成物が、ゲル、粒子、粉末、シート、パッド、ペースト、パッチ、またはスポンジである、項目３５から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記生体適合性マトリックスがＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）である、項目３５から５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記ＰＤＧＦが、ＰＤＧＦを含む溶液として存在し、前記溶液中のＰＤＧＦの濃度が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．０ｍｇ／ｍｌである、項目３５から５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記溶液中のＰＤＧＦの濃度が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．４ｍｇ／ｍｌである、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記溶液中のＰＤＧＦの濃度が、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌである、項目５８に記載の方法。
（項目６１）
細胞が、前記組成物に曝された後約４日以内に前記組成物に浸潤する、項目３５から６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記腱が、膝蓋腱、前脛骨筋腱、アキレス腱、膝窩腱、半腱様筋腱、薄筋腱、外転筋腱、内転筋腱、棘上筋腱、棘下筋腱、肩甲下筋腱、小円筋腱、屈筋腱、大腿直筋腱、後脛骨筋腱、および大腿四頭筋腱からなる群より選択される、項目３５から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記靭帯が、前十字靭帯（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、外側側副靭帯（ｌａｔｅｒａｌ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、後十字靭帯（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、内側側副靭帯（ｍｅｄｉａｌ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、頭側十字靭帯（ｃｒａｎｉａｌ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、尾方十字靭帯（ｃａｕｄａｌ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、輪状甲状靭帯、歯周靭帯、毛様体小帯、前仙腸靭帯、後仙腸靭帯、仙結節靭帯、仙棘靭帯、恥骨弓靭帯、上恥骨靭帯、提靭帯、掌側橈骨手根靭帯、背側橈骨手根靭帯、内側側副靭帯（ｕｌｎａｒ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、および外側側副靭帯（ｒａｄｉａｌ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）からなる群より選択される、項目３５から６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記結合が、回旋腱板傷害治療のためである、項目３５から６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記結合が、前十字靭帯再建のためである、項目３５から６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
個体における、骨を伴わない腱または靭帯の傷害を治療するためのキットであって、生体適合性マトリックスを含む第１の容器、および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）溶液を含む第２の容器を投与するステップを含み、前記生体適合性マトリックスは孔を有し、前記生体適合性マトリックスは、少なくとも約８０％の多孔度を有し、前記ＰＤＧＦの少なくとも約５０％が約２４時間以内に放出される、キット。
（項目６７）
個体において腱または靭帯を骨に結合させるためのキットであって、生体適合性マトリックスを含む第１の容器、および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）溶液を含む第２の容器を投与するステップを含み、前記生体適合性マトリックスは孔を有し、前記生体適合性マトリックスは、少なくとも約８０％の多孔度を有し、前記ＰＤＧＦの少なくとも約５０％が約２４時間以内に放出される、キット。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、２４時間にわたって様々なコラーゲンマトリックスから放出される累積ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを表す図である。
【図２】図２は、２４時間にわたって様々なコラーゲンマトリックスから放出されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの百分率を表す図である。
【図３】図３は、様々なコラーゲンマトリックスから放出された後のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの生物作用能を表す図である。
【図４】図４は、例示的な、縫合で安定化された横切されたアキレス腱を表す図である。
【図５】図５は、本発明の実施形態による、安定化された傷害されたアキレス腱への組成物の例示的な投与を表す図である。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｂは、Ａ）２つの血腫に冒された試料を含む、およびＢ）２つの血腫に冒された試料を除く、アキレス腱修復治療の周期的プレコンディショニング（コンディショニング伸長（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）およびピークトゥピーク伸長（ｐｅａｋ−ｔｏ−ｐｅａｋ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ））を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｂは、Ａ）２つの血腫に冒された試料を含む、およびＢ）２つの血腫に冒された試料を除く、アキレス腱修復治療の周期的プレコンディショニング（コンディショニング伸長（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）およびピークトゥピーク伸長（ｐｅａｋ−ｔｏ−ｐｅａｋ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ））を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｂは、アキレス腱修復治療の破損までのランプ（ｒａｍｐ  ｔｏ  ｆａｉｌｕｒｅ）試験結果（コンストラクト破損時の極限の力およびコンストラクト全体の剛性（ｇｌｏｂａｌ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ））を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｂは、アキレス腱修復治療の破損までのランプ（ｒａｍｐ  ｔｏ  ｆａｉｌｕｒｅ）試験結果（コンストラクト破損時の極限の力およびコンストラクト全体の剛性（ｇｌｏｂａｌ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ））を示す図である。
【図８】図８は、２つの血腫に冒された試料を含めた、または除いた（それぞれ、左パネルおよび右パネル）、アキレス腱修復治療の修復組織の剛性を示す図である。
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、移植して３週間後の移植されたコラーゲンＡ（パネルａ）、Ｂ（パネルｂ）、Ｃ（パネルｃ）、およびＤ（パネルｄ）の組織切片を表す図である。記号：Ｂ＝骨；Ｃ＝コラーゲン；矢印は、分解されていないコラーゲンを示す。スケールバー＝２００μｍ。
【図１０】図１０は、長指伸筋腱の剥離、コラーゲンスポンジを用いた長指伸筋腱のラッピング、脛骨トンネルを通すスレッディング、内側皮質への結合を表す図である。図は、Ｒｏｄｅｏ  Ｓ．Ａ．ら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．  ２７巻：４７６〜４８８頁（１９９９年）から採用されている。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、脛骨骨幹端を通るトンネルの形成を含む外科手術の側面図を表す図である。図は、Ｒｏｄｅｏ  Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．  Ａｍ．、７５巻（１２号）：１７９５〜１８０３頁（１９９３年）から採用されている。
【図１２】図１２は、組織試料の配向を表す図である。各ブロックは、骨トンネルを通して長手方向に等しく分割され、断面および全長の、長手方向のセクションを切断するのに使用される。
【図１３】図１３は、試料のマイクロトモグラフィー（マイクロＣＴ）を表す図である。図は、Ｒｏｄｅｏ  Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．  Ａｍ．、７５巻（１２号）：１７９５〜１８０３頁（１９９３年）から採用されている。
【図１４】図１４は、Ｂｅｎｃｈ  Ｔｏｐ関節鏡検査モデルを表す図である。
【図１５】図１５は、３０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で培地中にｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを添加した、ヒツジ腱細胞を播種したＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（商標）マトリックス５％（パネルａ）、６％（パネルｂ）、７％（パネルｃ）、およびＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）（パネルｄ）のＳＥＭ画像を示す図である。
【図１６】図１６は、回旋腱板傷害治療の動的プレコンディショニング結果を示す図である。図１６Ａ：０．１５ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群および０．３０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群は、縫合のみの群および縫合＋コラーゲンマトリックス群より有意に大きなコンディショニング伸長を起こした。図１６Ｂ：いずれの群との間にもピークトゥピーク伸長において著しい差はまったくなかった。
【図１７】図１７は、回旋腱板傷害治療の破損までのランプ結果を示す図である。図１７Ａ：０．１５ｍｇ／ｍｌおよび０．３０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを用いた修復増強は、縫合のみの群と比べて、それぞれ破損までの荷重（ｌｏａｄ  ｔｏ  ｆａｉｌｕｒｅ）において６３．７％および６３．３％の増大をもたらした。図１７Ｂ：０．１５ｍｇ／ｍｌおよび０．３０ｍｇ／ｍｌのより低いｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ用量は、より高い１．０ｍｇ／ｍｌのＰＤＧＦ用量より性能が優れており、破損時点の負荷においてそれぞれ１２０％および１１９．３％の増大として顕在化した。
【図１８】図１８は、１）縫合＋コラーゲンマトリックス＋０．１５ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、または２）縫合＋コラーゲンマトリックス＋０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの治療によって分類された病理組織学的スコアのグラフによる表示の図である。平均が示されており、エラーバーは標準偏差を表す。
【図１９】図１９は、１）縫合のみ；２）縫合＋コラーゲンマトリックス酢酸バッファー、または３）縫合＋コラーゲンマトリックス＋１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの治療によって分類された病理組織学的スコアのグラフによる表示の図である。平均が示されており、エラーバーは標準偏差を表す。
【図２０】図２０は、線維軟骨界面（矢印）での腱コラーゲン（囲み）の骨との嵌合の領域を示す図である。Ａ：縫合＋コラーゲンマトリックス、２０倍。Ｂ：縫合＋コラーゲンマトリックス＋０．３ｍｇ／ｍｌ（または１５０μｇ）のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、２０倍。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む生体適合性マトリックスは、骨を伴わない腱または靭帯の傷害の治療において、ならびに腱−骨および靭帯−骨組織修復のために使用することができるという知見に部分的に基づく。
【００５０】
本発明は、別段の指定のない限り、当業者に周知である分子生物学（組換え技法を含む）、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の従来技法を使用する。本発明はまた、別段の指定のない限り、当業者に周知である手術および他の医学的方法の従来の技法および装置を使用する。別段の定義のない限り、本明細書で使用される技術的用語および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００５１】
本明細書を解釈する目的のために、以下の定義を適用し、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数も含み、逆の場合も同様である。以下に示される任意の定義が参照により本明細書に組み込まれている任意の文献と矛盾する場合には、以下に示される定義が支配するものとする。
【００５２】
本明細書で使用する場合、別段の指定のない限り、用語「治療」、または「治療すること」は、個体が治療されている病態を軽減し、病態の進行を減速し、治癒を早め、治療応答を改善し、病態を修復し、かつ／あるいはそれだけに限らないが、傷害された腱または靭帯に伴う疼痛の軽減、患部関節の運動範囲の増大、ならびに修復部位での腱もしくは靭帯の腱への、または靭帯もしくは腱／靭帯の骨への強度および結合の増大を含む、１つまたは複数の望ましい臨床効果または治療効果をもたらす、生体適合性マトリックスおよび血小板由来成長因子を含む有効量の組成物を個体に投与することを指す。
【００５３】
「有効量」は、必要な投与量および期間で、所望の治療結果または臨床結果を実現するのに少なくとも有効な量を指す。有効量は、１つまたは複数の投与で提供することができる。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「骨を伴わない腱傷害または靭帯傷害」の治療は、傷害された骨を伴わない傷害された、もしくは損傷した腱もしくは靭帯、または骨からの腱／靭帯の剥離の治療を指す。そのような腱または靭帯の傷害の例には、それだけに限らないが、腱／靭帯の切断、腱／靭帯の断裂、引裂を示す腱／靭帯、離層、または任意の他の歪みもしくは変形が含まれる。治療されている個体は、腱または靭帯の傷害に加えて骨への傷害、または腱−骨／靭帯−骨の剥離を有する場合があるが、「骨を伴わない腱傷害または靭帯傷害」の治療は、腱および／または靭帯組織の特定の治療を指す。いくつかの実施形態では、個体は、骨を伴わない腱障害または靭帯傷害、ならびに骨を伴う傷害、例えば、腱−骨または靭帯−骨の結合を治療することができることが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、骨を伴わない腱傷害または靭帯傷害のみが治療される。
【００５５】
「個体」は、ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）および農用動物（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）、ならびに動物園動物、競技用動物、またはペット動物、例えば、チンパンジー、および他の類人猿、ならびにサル種、イヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、アレチネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコなどを含めた哺乳動物指す。個体はヒトであることが好ましい。この用語は、特定の年齢または性別を表さない。
【００５６】
「生体吸収性」は、生体適合性マトリックスがインビボで再吸収または再構築される能力を指す。再吸収プロセスは、体液、酵素、または細胞の作用による元の物質の分解および排除を伴う。再吸収された物質は、新組織の形成において宿主によって使用される場合があり、またはこれは、別の方法で宿主によって再利用される場合があり、またはこれは排泄される場合がある。
【００５７】
コラーゲンマトリックスは、本明細書で参照する場合、例えば、ゲル、ペースト、粒子、粉末、シート、パッチ、パッド、ペースト、またはスポンジの形態での物質を含む。商業的に得られるコラーゲンマトリックスは、ウシの真皮および／またはウシの腱のコラーゲン抽出物から通常製造される。いくつかの実施形態では、ウシの腱の源は、ウシの深指屈筋（アキレス）腱である。いくつかの実施形態では、マトリックスはコラーゲンスラリーから作製され、この場合、スラリー中のコラーゲンの濃度は、マトリックスの各型について異なる。例えば、１つの型のコラーゲンマトリックスは、４．５％のコラーゲン濃度を有するスラリーから作製され、このコラーゲンマトリックスは、「コラーゲン（４．５％）」または「コラーゲンマトリックス（４．５％）」と本明細書で呼ばれ；第２の型のコラーゲンマトリックスは、５％のコラーゲン濃度を有するスラリーから作製され、このコラーゲンマトリックスは、「コラーゲン（５％）」または「コラーゲンマトリックス（５％）」と本明細書で呼ばれ；第３の型のコラーゲンマトリックスは、６％のコラーゲン濃度を有するスラリーから作製され、このコラーゲンマトリックスは、「コラーゲン（６％）」または「コラーゲンマトリックス（６％）」と本明細書で呼ばれ；第４の型のコラーゲンマトリックスは、７％のコラーゲン濃度を有するスラリーから作製され、このコラーゲンマトリックスは、「コラーゲン（７％）」または「コラーゲンマトリックス（７％）」と本明細書で呼ばれる。任意のコラーゲンマトリックスについて、開始スラリー中で使用されるコラーゲンの百分率は、最終的なコラーゲンマトリックス中のコラーゲンの百分率を必ずしも反映しない。
【００５８】
本明細書で使用する場合、用語、「結合すること」または「結合」は、本明細書で使用する場合、腱の骨への、もしくは骨中への、または靭帯の骨へのもしくは骨中への再結合をすること、または再結合を含むことが意図され、グラフト（例えば、腱または靭帯グラフト）を骨に、もしくは骨中に結合することも含む。例えば、非限定例を使用して、前十字靭帯再建を実施する場合、傷害された靭帯を骨から取り出すことができ、腱または靭帯グラフトなどのグラフトを、元の靭帯の代わりに骨に、または骨中に結合することができる。
【００５９】
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段の指定のない限り、複数の参照を含む。
【００６０】
本明細書で「約」のついた値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ記述する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、に「Ｘ」の記述を含む。
【００６１】
本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」、および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）ことが理解される。
【００６２】
本発明の組成物および方法
個体において、骨を伴わない腱または靭帯の傷害を治療するための組成物および方法が本明細書で記載されている。一般に、治療方法は、腱または靭帯の傷害を有する個体に、生体適合性マトリックスおよびＰＤＧＦを含む組成物を投与するステップを含む。具体的には、治療方法は、腱または靭帯の傷害の部位に、コラーゲンマトリックスおよびＰＤＧＦを含む組成物を投与するステップを含む。
【００６３】
個体において、腱または靭帯を骨に／骨中に結合または再結合させるための組成物および方法も本明細書に記載されている。一般に、結合方法は、腱／靭帯と骨の界面で、生体適合性コラーゲンマトリックスおよびＰＤＧＦを含む組成物を投与するステップを含む。
【００６４】
生体適合性マトリックス
生体適合性マトリックスは、本発明のいくつかの実施形態によれば、足場マトリックスを含む。足場マトリックスは、本発明のいくつかの実施形態によれば、腱／靭帯および／または骨組織を含めた、新組織成長が起こるためのフレームワークまたは足場を提供する。
【００６５】
生体適合性マトリックスは、いくつかの実施形態では、コラーゲンマトリックスを含む。用語「コラーゲンマトリックス」は、例えば、コラーゲンゲル、ペースト、粉末、粒子、パッチ、パッド、シート、またはスポンジを指すことができる。いくつかの実施形態では、コラーゲンマトリックスは、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型コラーゲンを含めた任意の型のコラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、コラーゲンは、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンの混合物などのコラーゲンの混合物を含む。他の実施形態では、コラーゲンは生理的条件下で可溶性である。いくつかの実施形態では、コラーゲンは生理的条件下で不溶性である。いくつかの実施形態では、コラーゲンは可溶性成分および不溶性成分を含む。いくつかの実施形態では、コラーゲンマトリックスは、可溶性Ｉ型ウシコラーゲンなどの線維性コラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、コラーゲンマトリックスは、ウシ真皮組織に由来する線維性および酸可溶性コラーゲンを含む。骨または筋骨格組織中に存在する他の型のコラーゲンも使用することができる。組換え、合成、および天然に存在する形態のコラーゲンを本発明において使用することができる。コラーゲンは、架橋されていても、架橋されていなくてもよい。
【００６６】
コラーゲンマトリックスにおいて使用するのに適した線維性コラーゲンは、湿潤引張強度を含めた、縫合に耐え、引裂を伴うことなく縫合を保持するのに十分な機械的特性を実証することができる。線維性コラーゲンマトリックスは、例えば、約０．７５ポンド〜約５ポンドの範囲の湿潤引裂強度を有することができる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスはグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、コラーゲンおよびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、例えば、架橋されたコラーゲンおよびＧＡＧを含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＧはコンドロイチン硫酸である。いくつかの実施形態では、ＧＡＧはコンドロイチン硫酸ではない。他のＧＡＧとして、それだけに限らないが、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン、およびこれらの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、コラーゲンとＧＡＧの重量／重量比は約９０：１０である。いくつかの実施形態では、コラーゲンとＧＡＧの重量／重量比は約９２：８である。いくつかの実施形態では、コラーゲンとＧＡＧの重量／重量比は約９５：５である。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、コンドロイチン硫酸を有する架橋コラーゲンを含む。他の実施形態では、生体適合性マトリックスはＧＡＧを有する架橋コラーゲンを含み、ＧＡＧはコンドロイチン硫酸ではない。
【００６８】
いくつかの実施形態では、コラーゲンマトリックスは、それだけに限らないが、ＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ、ＮＪ）；ＩＮＴＥＧＲＡ流動性創傷マトリックス（Ｉｎｔｅｇｒａ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ、ＮＪ）；Ｃｅｌｌｅｒａｔｅ  ＲＸ、ＨｙＣｕｒｅ加水分解コラーゲンおよび加水分解コラーゲン／Ａｇ創傷ゲル（Ｈｙｍｅｄ  Ｇｒｏｕｐ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）；ならびにＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（商標）およびＰ１０７６流動性コラーゲン（Ｋｅｎｓｅｙ  Ｎａｓｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）を含めた市販供給源から得られる。いくつかの実施形態では、コラーゲンマトリックスはＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（商標）ではない。いくつかの実施形態では、コラーゲンマトリックスはＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）ではない。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本発明の生体適合性マトリックスは流動性である。流動性生体適合性マトリックスは、いくつかの実施形態では、シリンジおよび針またはカニューレによって所望の部位に適用することができる。いくつかの実施形態では、流動性生体適合性マトリックスは、所望の部位に経皮的に適用することができる。他の実施形態では、流動性生体適合性マトリックスは、外科的に露出した部位に適用することができる。いくつかの実施形態では、流動性生体適合性マトリックスは、骨トンネル中に挿入するための腱または靭帯グラフトに適用することができる。いくつかの実施形態では、キットなどにおいて、生体適合性マトリックスは、脱水された粉末または粒子として提供され、これらは投与のために調製すると流動性にすることができる。例えば、脱水形態の生体適合性マトリックスは、適当な量の水和バッファーを添加または混合することによって投与のために調製することができる。水和バッファーは、生体適合性マトリックスの一部として投与される適当な量のＰＤＧＦを含むことができる。添加されるバッファーの適当量は、例えば、ＰＤＧＦの所望の濃度、コラーゲンの所望の濃度、ＧＡＧの所望の濃度、所望の流動性特性、またはこれらの任意の適当な組合せによって求められる。
【００７０】
「流動性」は、カニューレまたは同様の通路を通じて物質を投与するのに必要な力をかけると物質が流れる、物質の物理的特性を指し、それでも物質は、治療される個体における部位に投与された後、実質的に不動のままであり、それによって部位に対して継続した治療をもたらす。流動性物質を投与するための例示的なデバイスはシリンジであり、このシリンジにおいて、プランジャーは、投与される流動性物質を動かす、必要とされる力を提供することができる。適当な例示的なデバイスは、流動性物質のより正確な送達および塗布を可能にする針または他の適当なカニューレをさらに含むことができる。投与用デバイスの内径、組成、構造、長さ、および任意の他の適当な特性を選択し、使用することができる。当業者は、適当な送達デバイスの特定のパラメータの選択は、組成物の流動性特性に基づくことを理解する。例えば、比較的流動性の低い組成物は、比較的に広いカニューレ内径および／またはより短いカニューレを有するデバイスによって送達するのにより適することができる。いくつかの実施形態では、流動性組成物は、２１Ｇ、２５Ｇ、または２７Ｇの針によって送達される。いくつかの実施形態では、シリンジおよび／または針による送達により、経皮注射による流動性組成物の送達が可能になる。いくつかの実施形態では、流動性組成物は、非カニューレデバイス、例えば、組成物が所望の位置に送達されることを可能にする、スクープ、スパーテル、ブラシ、または他の同様のデバイスなどによって送達することができる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、ＰＤＧＦを酸化しない。
【００７２】
生体適合性マトリックスは、いくつかの実施形態によれば、移植に適した形状（例えば、球体、シリンダー、またはブロック）で提供することができる。他の実施形態では、生体適合性マトリックスは鋳造可能または押出し可能である。そのような実施形態では、生体適合性マトリックスは、ペーストまたはパテの形態とすることができる。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、ブロック、球体、もしくはシリンダー、または任意の所望の形状、例えば、鋳型もしくは適用部位によって画定される形状を含めた所定の形状で提供することができる。鋳造可能な生体適合性マトリックスは、骨トンネル中への腱または靭帯グラフトの挿入などの骨の中または骨への腱または靭帯の結合部位を含めた、腱、靭帯、および／または骨の中およびこれらの付近への本発明の組成物の効率的な配置を促進することができる。いくつかの実施形態では、鋳造可能な生体適合性マトリックスは、スパーテルまたは等価なデバイスを用いて骨および／または腱および／または靭帯に適用することができる。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、腱または靭帯グラフトなどの、腱または靭帯の周囲にラップすることによって腱または靭帯に適用することができる。
【００７３】
本発明のコラーゲンマトリックスは、ウシの真皮、ウシの腱（例えば、深指屈筋（アキレス）腱）に由来する精製コラーゲン抽出物、または他の適当なコラーゲン源から作製することができる。いくつかの実施形態では、コラーゲンマトリックスは主にＩ型コラーゲンである。いくつかの実施形態では、コラーゲンマトリックスは、以下の濃度のコラーゲン（ｗ／ｖ）、すなわち約４．５％、約５％、約６％、または約７％のいずれか１つを有するコラーゲンスラリーから作製される。いくつかの実施形態では、コラーゲンは可溶性である。可溶性コラーゲンは、その移植後まもなく溶解することができ、それによって生体適合性マトリックス中にマクロ多孔性を導入する。マクロ多孔性は、アクセスを増強することによって細胞（例えば、骨芽細胞、腱細胞）の移植材への伝導率、したがって、移植部位での細胞のリモデリング活性を増大させることができる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、コラーゲンは、可溶性コラーゲンモノマー成分および不溶性コラーゲンポリマー成分を含む。いくつかの実施形態（ｅｍｂｏｄｉｅｓ）では、可溶性コラーゲンモノマーと不溶性コラーゲンポリマーの比は、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、または約１：１である。
【００７５】
いくつかの好適な実施形態では、生体適合性マトリックスは、孔を含む多孔質構造を形成する。いくつかの実施形態では、孔は、約８００μｍ２〜約３，０００μｍ２、約１３，０００μｍ２〜約５０，０００μｍ２、約２５００μｍ２〜約２０，０００μｍ２、約３５００μｍ２〜約２０，０００μｍ２、４５００μｍ２〜約２０，０００μｍ２、約５０００μｍ２〜約１９，０００μｍ２、約６０００μｍ２〜約１８，０００μｍ２、約６０００μｍ２〜約１５，０００μｍ２、または約５０００μｍ２〜約１６０００μｍ２の範囲の平均面積を有する。いくつかの実施形態では、孔は、約１００μｍ〜約２００μｍ、約４００μｍ〜約８００μｍ。約２００μｍ〜約５００μｍ、約２００μｍ〜約６００μｍ、約３００μｍ〜約６００μｍ、または約３００μｍ〜約５００μｍの範囲の平均周囲長を有する。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、約４５００μｍ２〜約２００００μｍ２の範囲の平均孔面積サイズ、および約２００μｍ〜約６００μｍの範囲の平均孔周囲長サイズを有する。いくつかの実施形態では、コラーゲンマトリックスは、約４５００μｍ２〜約２００００μｍ２の範囲の平均孔面積サイズ、および約２００μｍ〜約５００μｍの範囲の平均孔周囲長サイズを有する孔を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、多方向の、かつ／または相互接続された孔を有する多孔質構造を含む。多孔質構造は、いくつかの実施形態によれば、約１μｍ〜約１ｍｍの範囲、例えば、少なくとも約５μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約２０μｍ、少なくとも約３０μｍ、少なくとも約４０μｍ、または少なくとも約５０μｍの直径を有する孔を含むことができる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、約１００μｍ〜約１ｍｍの範囲の直径を有するマクロ孔を含む。別の実施形態では、生体適合性マトリックスは、約１０μｍ〜約１００μｍの範囲の直径を有するメソ孔を含む。さらなる実施形態では、生体適合性マトリックスは、約１０μｍ未満の直径を有するマイクロ孔を含む。本発明の実施形態は、マクロ孔、メソ孔、およびマイクロ孔、またはこれらの任意の組合せを含む生体適合性マトリックスを企図する。
【００７８】
他の実施形態では、生体適合性マトリックスは、相互接続されていない孔を有する多孔質構造を含む。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、相互接続された孔および相互接続されていない孔の混合物を有する多孔質構造を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは多孔質であり、生体適合性マトリックスの質量の約１倍〜約１５倍の質量の範囲の量で水を吸収することができる。いくつかの実施形態では、コラーゲンマトリックスは多孔質であり、コラーゲンマトリックスの質量の約１倍〜約１５倍の範囲の量で水を吸収することができる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスの多孔質構造により、増加した量でＰＤＧＦがマトリックスから放出されることが可能になる。いくつかの実施形態では、多孔質構造のコラーゲンマトリックス（５％）は、インビボまたはインビトロで測定した場合、特定の時間内にコラーゲンマトリックス（６％）またはコラーゲンマトリックス（７％）より高い百分率のＰＤＧＦを放出する。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスの多孔質構造により、ＰＤＧＦが、インビボまたはインビトロで投与して約２４時間以内にマトリックスから放出されることが可能になる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、約５０％〜約９５％、約６０％〜約９５％、約７０％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約５０％〜約８５％、約６０％〜約８５％、約７０％〜約８５％、または約５０％〜約８０％が、約２４時間以内にマトリックスから放出される。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスの多孔質構造により、インビボまたはインビトロで投与して約１時間、約６時間、約８時間、約１２時間、または約４８時間以内にマトリックスからＰＤＧＦが放出されることが可能になる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、約５０％〜約９５％、約６０％〜約９５％、約７０％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約５０％〜約８５％、約６０％〜約８５％、約７０％〜約８５％、または約５０％〜約８０％が、約１時間、約６時間、約８時間、約１２時間、または約４８時間以内にマトリックスから放出される。いくつかの実施形態では、コラーゲンマトリックスはＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）である。いくつかの実施形態では、コラーゲンマトリックスは、ＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）と類似した多孔質ウシコラーゲンスポンジである。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、ＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）を含み、これにより、コラーゲンマトリックス（５％）、コラーゲンマトリックス（６％）、またはコラーゲンマトリックス（７％）と比較してより高い百分率のＰＤＧＦが放出されることが可能になる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、周囲領域中に放出される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは傷害された腱または靭帯上に放出される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、骨−腱または骨−靭帯結合箇所付近の骨の表面上に放出される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、周囲媒質中に放出される。
【００８２】
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスの多孔質構造により、マトリックスの孔中への細胞の浸潤が可能になる。いくつかの実施形態では、細胞は、組成物に曝された後、約３週間、約２週間、約１週間、約７日、約６日、約５日、約４、約３、約２、または約１日以内に組成物に浸潤する。いくつかの実施形態では、細胞は腱細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は骨芽細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は靭帯細胞である。好適な実施形態では、生体適合性マトリックスは、マトリックスの孔中への細胞の浸潤を可能にする多孔質構造を有するＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）を含む。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、コラーゲンマトリックス（５％）、コラーゲンマトリックス（６％）、またはコラーゲンマトリックス（７％）と比較した場合、より多数の細胞がマトリックスの孔中に浸潤することを可能にする多孔質構造を有するＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）を含む。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、コラーゲンマトリックス（６％）、またはコラーゲンマトリックス（７％）と比較した場合、より多数の細胞がマトリックスの孔中に浸潤することを可能にする多孔質構造を有するコラーゲンマトリックス（５％）を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、少なくとも約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の多孔度を有する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは生体吸収性である。生体適合性マトリックスは、いくつかの実施形態では、インビボで投与して１年以内に再吸収され得る。他の実施形態では、生体適合性マトリックスは、インビボで投与して１、３、６、または９カ月以内に再吸収され得る。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、インビボで投与して約３０日、約２５日、約２１日、約１８日、約１５日、約１０〜１４日、または約１０日以内に再吸収される。生体再吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｉｌｉｔｙ）は、（１）マトリックス物質の性質（すなわち、その化学物質構成、物理的構造、およびサイズ）；（２）マトリックスが配置される体内での位置；（３）使用されるマトリックス物質の量；（４）患者の代謝状態（糖尿病／非糖尿病、骨粗鬆症、喫煙者、老齢、ステロイド使用など）；（５）治療される傷害の程度および／または型；および（６）他の骨同化、異化、および抗異化因子などのマトリックスに加えた、他の物質の使用に依存する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、少なくとも１つのリン酸カルシウムを含む。他の実施形態では、生体適合性マトリックスは、複数のリン酸カルシウムを含む。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックス物質として使用するのに適したリン酸カルシウムは、０．５〜２．０の範囲のカルシウムとリン原子の比を有する。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、同種移植片を含む。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、骨を伴わない腱または靭帯の傷害を治療するのに使用するためのものであり、マトリックスは、リン酸カルシウムまたは同種移植片を含まない。
【００８６】
骨足場材料として使用するのに適したリン酸カルシウムとして、それだけに限らないが、非晶質リン酸カルシウム、リン酸一カルシウム一水和物（ＭＣＰＭ）、リン酸一カルシウム無水物（ＭＣＰＡ）、リン酸二カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）、リン酸二カルシウム無水物（ＤＣＰＡ）、リン酸八カルシウム（ＯＣＰ）、α−リン酸三カルシウム、β−ＴＣＰ、ヒドロキシアパタイト（ＯＨＡｐ）、結晶性の低いヒドロキシアパタイト、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）、十リン酸七カルシウム（ｈｅｐｔａｃａｌｃｉｕｍ  ｄｅｃａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、メタリン酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム脱水和物、炭酸リン酸カルシウム、およびピロリン酸カルシウムが挙げられる。
【００８７】
足場材料および生体適合性結合剤
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、足場マトリックスおよび生体適合性結合剤を含む。生体適合性結合剤は、合わされた物質同士間の粘着を促進するように作用できる物質を含むことができる。生体適合性結合剤は、例えば、生体適合性マトリックスの形成において、骨足場材料の粒子同士間の接着を促進することができる。ある特定の実施形態では、材料が、合わされた物質同士間の粘着を促進するように作用し、腱、靭帯、および骨成長を含めた新規組織成長が起こるためのフレームワークを提供する場合、同じ物質が、足場材料と結合剤の両方として機能することができる。ＷＯ２００８／００５４２７および米国第１１／７７２，６４６号（米国公開第２００８／００２７４４７０号）を参照。
【００８８】
生体適合性結合剤は、いくつかの実施形態では、例えば、コラーゲン、エラスチン、多糖、核酸、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（アンヒドリド）、ポリウレタン、ポリ（オルトエステル）、ポリ（アンヒドリド−ｃｏ−イミド）、ポリ（オルトカーボネート）、ポリ（α−ヒドロキシアルカノエート）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（リン酸エステル）、ポリ乳酸、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ（ｅ−カプロラクトン）、ポリ（ｄ−バレロラクトン）、ポリ（γ−ブチロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアクリル酸、ポリカルボン酸、ポリ（アリルアミンヒドロクロリド）、ポリ（塩化ジアリルジメチルアンモニウム）、ポリ（エチレンイミン）、ポリプロピレンフマレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、炭素線維、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）−ｃｏ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）ポリアミド、ならびに／またはこれらのコポリマーおよび／もしくは混合物を含むことができる。
【００８９】
生体適合性結合剤は、他の実施形態では、アルギン酸、アラビアガム、グアーガム、キサンタン（ｘａｎｔｈａｍ）ガム、ゼラチン、キチン、キトサン、キトサンアセテート、キトサンラクテート、コンドロイチン硫酸、Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサン、デキストラン（例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、またはデキストラン硫酸ナトリウム）、フィブリン接着剤、レシチン、ホスファチジルコリン誘導体、グリセロール、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、セルロース（例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはヒドロキシエチルセルロース）、グルコサミン、プロテオグリカン、デンプン（例えば、ヒドロキシエチルデンプンまたは可溶性デンプン）、乳酸、プルロン酸、グリセロリン酸ナトリウム、グリコーゲン、ケラチン、絹、ならびに／またはこれらの誘導体および／もしくは混合物を含むことができる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、生体適合性結合剤は水溶性である。水溶性結合剤は、生体適合性マトリックスから、その移植後まもなく溶解することができ、それによって生体適合性マトリックス中にマクロ多孔性を導入する。マクロ多孔性は、アクセスを増強することによって移植材の骨伝導性、したがって、移植部位での細胞（例えば、破骨細胞および骨芽細胞、腱細胞）のリモデリング活性を増大させることができる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、生体適合性結合剤は、生体適合性マトリックス中に、マトリックスの約５重量パーセント〜約５０重量パーセントの範囲の量で存在することができる。他の実施形態では、生体適合性結合剤は、生体適合性マトリックスの約１０重量パーセント〜約４０重量パーセントの範囲の量で存在することができる。別の実施形態では、生体適合性結合剤は、生体適合性マトリックスの約１５重量パーセント〜約３５重量パーセントの範囲の量で存在することができる。さらなる実施形態では、生体適合性結合剤は、生体適合性マトリックスの約２０重量パーセントの量で存在することができる。
【００９２】
血小板由来成長因子
本発明は、個体における腱または靭帯の傷害を治療するための組成物および方法を提供する。一般に、治療方法は、腱または靭帯の傷害を有する個体に、生体適合性マトリックスおよびＰＧＧＦを含む組成物を投与するステップを含む。具体的には、治療方法は、腱または靭帯の傷害の部位に、コラーゲンマトリックスおよびＰＤＧＦを含む組成物を投与するステップを含む。
【００９３】
生体適合性マトリックスは、本発明の実施形態によれば、足場マトリックスおよびＰＤＧＦを含む。ＰＤＧＦは、傷害部位で血小板から放出される成長因子である。ＰＤＧＦは、ＶＥＧＦと相乗作用を示すことによって血管新生を促進し、腱細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、および血管平滑筋細胞を含めた間葉系細胞の走化性および増殖を刺激する。
【００９４】
本発明によって提供される組成物および方法は、生体適合性マトリックス、およびＰＤＧＦの溶液を含み、溶液は、生体適合性マトリックス中に分散されている。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、または約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、０．３ｍｇ／ｍｌの濃度で溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶液中に存在する。他の実施形態では、ＰＤＧＦは、以下の濃度のうちのいずれか１つの濃度で溶液中に存在する：約０．０５ｍｇ／ｍｌ；約０．１ｍｇ／ｍｌ；約０．１５ｍｇ／ｍｌ；約０．２ｍｇ／ｍｌ；約０．２５ｍｇ／ｍｌ；約０．３ｍｇ／ｍｌ；約０．３５ｍｇ／ｍｌ；約０．４ｍｇ／ｍｌ；約０．４５ｍｇ／ｍｌ；約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ；約０．７５ｍｇ／ｍｌ；約０．８ｍｇ／ｍｌ；約０．８５ｍｇ／ｍｌ；約０．９ｍｇ／ｍｌ；約０．９５ｍｇ／ｍｌ；約１．０ｍｇ／ｍｌ；約１．５ｍｇ／ｍｌ；または約２．０ｍｇ／ｍｌ。これらの濃度は、単に特定の実施形態の例であり、ＰＤＧＦの濃度は、上述した濃度範囲のいずれかの範囲内とすることができることが理解されるべきである。
【００９５】
様々な量のＰＤＧＦを、本発明の組成物中に使用することができる。使用することができるＰＤＧＦの量には、それだけに限らないが、以下の範囲の量が含まれる：約１μｇ〜約５０ｍｇ、約１０μｇ〜約２５ｍｇ、約１００μｇ〜約１０ｍｇ、および約２５０μｇ〜約５ｍｇ。
【００９６】
本発明の実施形態におけるＰＤＧＦ（または他の成長因子）の濃度は、米国特許第６，２２１，６２５号；同第５，７４７，２７３号；および同第５，２９０，７０８号において記載された酵素結合イムノアッセイ、またはＰＤＧＦ濃度を求めるための当技術分野で公知の任意の他のアッセイを使用することによって求めることができる。本明細書に提供される場合、ＰＤＧＦのモル濃度は、ＰＤＧＦ二量体（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＭＷ約２５ｋＤａ）の分子量に基づいて決定される。
【００９７】
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤ、ならびにこれらの混合物および誘導体を含めたＰＤＧＦホモ二量体およびヘテロ二量体を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ−ＢＢを含む。他の実施形態では、ＰＤＧＦは、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢなどの組換えヒトＰＤＧＦを含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは天然源から得ることができる。他の実施形態では、ＰＤＧＦは、組換えＤＮＡ技法によって作製することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦまたはその断片は、固相ペプチド合成などの当業者に公知のペプチド合成技法を使用して作製することができる。
【００９９】
天然源から得られる場合、ＰＤＧＦは、生体液から得ることができる。生体液は、いくつかの実施形態によれば、血液を含めた生体に関連する任意の処理流体または未処理流体を含むことができる。生体液は、血小板濃縮物、アフェレーシス血小板（ａｐｈｅｒｅｓｅｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ）、多血小板血漿、血漿、血清、新鮮な凍結血漿、およびバフィーコートを含めた血液成分も含むことができる。生体液は、血漿から分離され、生理的流体中に再懸濁された血小板を含むことができる。
【０１００】
組換えＤＮＡ技法によって作製される場合、単一モノマー（例えば、ＰＤＧＦ  Ｂ鎖またはＡ鎖）をコードするＤＮＡ配列を、発現のために培養された原核生物細胞または真核細胞中に挿入することによって、引き続いてホモ二量体（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＡ）を作製することができる。組換え技法によって作製されるホモ二量体ＰＤＧＦは、いくつかの実施形態において使用することができる。他の実施形態では、ＰＤＧＦヘテロ二量体は、ヘテロ二量体の両モノマー単位をコードするＤＮＡ配列を、培養された原核生物細胞または真核細胞中に挿入し、翻訳されたモノマー単位をヘテロ二量体（例えば、ＰＤＧＦ−ＡＢ）を作製するために細胞によって処理させることによって生成することができる。市販の組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢを、様々な供給源から得ることができる。
【０１０１】
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ断片を含む。一実施形態では、ｒｈＰＤＧＦ−Ｂは、以下の断片を含む：全Ｂ鎖のアミノ酸配列１−３１、１−３２、３３−１０８、３３−１０９、および／または１−１０８。ＰＤＧＦのＢ鎖の完全なアミノ酸配列（ａａ１−１０９）は、米国特許第５，５１６，８９６号の図１５に提供されている。本発明のｒｈＰＤＧＦ組成物は、無傷のｒｈＰＤＧＦ−Ｂ（ａａ  １−１０９）とその断片の組合せを含むことができることが理解されるべきである。米国特許第５，５１６，８９６号に開示されているものなどのＰＤＧＦの他の断片も使用することができる。いくつかの実施形態によれば、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、少なくとも６５％の無傷のｒｈＰＤＧＦ−Ｂ（ａａ  １−１０９）を含む。他の実施形態によれば、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の無傷のｒｈＰＤＧＦ−Ｂ（ａａ  １−１０９）を含む。
【０１０２】
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、高度に精製された形態とすることができる。本明細書で使用する場合、精製ＰＤＧＦは、本発明の溶液中に組み込まれる前に、約９５重量％超のＰＤＧＦを有する組成物を含む。溶液は、任意の医薬として許容可能なバッファーまたは希釈剤を使用して調製することができる。他の実施形態では、ＰＤＧＦは、実質的に精製されていてもよい。本明細書で使用する場合、実質的に精製されたＰＤＧＦは、本発明の溶液中に組み込まれる前に、約５重量％〜約９５重量％のＰＤＧＦを有する組成物を含む。一実施形態では、実質的に精製されたＰＤＧＦは、本発明の溶液中に組み込まれる前に、約６５重量％〜約９５重量％のＰＤＧＦを有する組成物を含む。他の実施形態では、実質的に精製されたＰＤＧＦは、本発明の溶液中に組み込まれる前に、約７０重量％〜約９５重量％、約７５重量％〜約９５重量％、約８０重量％〜約９５重量％、約８５重量％〜約９５重量％、または約９０重量％〜約９５重量％のＰＤＧＦを有する組成物を含む。精製ＰＤＧＦおよび実質的に精製されたＰＤＧＦは、足場マトリックス中に組み込むことができる。
【０１０３】
さらなる実施形態では、ＰＤＧＦは部分的に精製されていてもよい。本明細書で使用する場合、部分的に精製されたＰＤＧＦは、ＰＤＧＦを作製するのに採取および分離を必要とする多血小板血漿、新鮮な凍結血漿、または任意の他の血液産物の状況においてＰＤＧＦを有する組成物を含む。本発明の実施形態は、ホモ二量体およびヘテロ二量体を含めた、本明細書に提供される任意のＰＤＧＦアイソフォームを、精製または部分的に精製することができることを企図する。ＰＤＧＦ混合物を含む本発明の組成物は、部分的に精製された割合でＰＤＧＦアイソフォームまたはＰＤＧＦ断片を含むことができる。部分的に精製されたＰＤＧＦおよび精製ＰＤＧＦは、いくつかの実施形態では、米国第１１／１５９，５３３号（米国公開第２００６００８４６０２号）に記載されたように調製することができる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦを含む溶液は、１つまたは複数のバッファー中にＰＤＧＦを可溶化することによって形成される。本発明のＰＤＧＦ溶液において使用するのに適したバッファーは、それだけに限らないが、炭酸塩、リン酸塩（例えば、リン酸緩衝食塩水）、ヒスチジン、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、酸性バッファー、例えば、酢酸およびＨＣｌなど、ならびに有機バッファー、例えば、リシン、トリスバッファー（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、および３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）などを含むことができる。バッファーは、ＰＤＧＦとの生体適合性、および望ましくないタンパク質修飾を妨害するバッファーの能力に基づいて選択することができる。バッファーは、宿主組織との適合性に基づいてさらに選択することができる。一実施形態では、酢酸ナトリウムバッファーが使用される。バッファーは、様々なモル濃度、例えば、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、または約１５ｍＭ〜約２５ｍＭ、またはこれらの範囲内の任意のモル濃度で使用することができる。いくつかの実施形態では、酢酸バッファーは、約２０ｍＭのモル濃度で使用される。
【０１０５】
別の実施形態では、ＰＤＧＦを含む溶液は、水に凍結乾燥ＰＤＧＦを可溶化することによって形成することができ、可溶化の前に、ＰＤＧＦは、適切なバッファーから凍結乾燥される。
【０１０６】
ＰＤＧＦを含む溶液は、本発明の実施形態によれば、約３．０〜約８．０の範囲のｐＨを有することができる。一実施形態では、ＰＤＧＦを含む溶液は、約５．０〜約８．０、より好ましくは約５．５〜約７．０、最も好ましくは約５．５〜約６．５の範囲、またはこれらの範囲内の任意の値のｐＨを有する。ＰＤＧＦを含む溶液のｐＨは、いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦまたは任意の他の所望の生物学的活性剤の安定性および効力の延長と両立し得る。ＰＤＧＦは、酸性環境において一般により安定である。したがって、いくつか実施形態によれば、本発明は、ＰＤＧＦ溶液の酸性貯蔵製剤（ｓｔｏｒａｇｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を含む。いくつかの実施形態によれば、ＰＤＧＦ溶液は、好ましくは約３．０〜約７．０、より好ましくは約４．０〜約６．５のｐＨを有する。しかし、ＰＤＧＦの生物活性は、中性のｐＨ範囲を有する溶液中で最適化される場合がある。したがって、他の実施形態では、本発明は、ＰＤＧＦ溶液の中性ｐＨ製剤を含む。本実施形態によれば、ＰＤＧＦ溶液は、好ましくは約５．０〜約８．０、より好ましくは約５．５〜約７．０、最も好ましくは約５．５〜約６．５のｐＨを有する。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ含有溶液のｐＨを変更することによって、ＰＤＧＦのマトリックス基質への結合動態を最適化することができる。必要に応じて、物質のｐＨが隣接する物質と平衡化するにつれて、結合したＰＤＧＦは不安定となり得る。ＰＤＧＦを含む溶液のｐＨは、いくつかの実施形態では、本明細書に列挙されるバッファーによって制御することができる。様々なタンパク質は、これらが安定である異なるｐＨ範囲を示す。タンパク質の安定性は、タンパク質上の等電点および電荷によって主に反映される。ｐＨ範囲は、タンパク質の立体配座構造、ならびにタンパク質の、タンパク質分解、加水分解、酸化、およびタンパク質の構造および／または生物活性に対する修飾をもたらし得る他のプロセスに対する感受性に影響し得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦを含む溶液は、他の生物学的活性剤などの追加の成分をさらに含むことができる。他の実施形態では、ＰＤＧＦを含む溶液は、細胞培地、アルブミンなどの他の安定化タンパク質、抗菌剤、プロテアーゼ阻害剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、アプロチニン、Ｅ−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）など）、ならびに／または他の成長因子、例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＥ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）など、またはＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣおよび／もしくはＰＤＧＦ−ＤＤの組成物を含めた他のＰＤＧＦをさらに含むことができる。
【０１０９】
生物学的活性剤をさらに含む組成物
本発明の組成物および方法は、いくつかの実施形態によれば、ＰＤＧＦに加えて、１つまたは複数の生物学的活性剤をさらに含むことができる。ＰＤＧＦに加えて本発明の組成物中に組み込むことができる生物学的活性剤は、有機分子、無機物質、タンパク質、ペプチド、核酸（例えば、遺伝子、遺伝子断片、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、遺伝子制御配列、核転写因子、およびアンチセンス分子）、核タンパク質、多糖（例えば、ヘパリン）、糖タンパク質、およびリポタンパク質を含むことができる。例えば、抗癌剤、抗生物質、鎮痛薬、抗炎症剤、免疫抑制剤、酵素阻害剤、抗ヒスタミン剤、ホルモン、筋弛緩剤、プロスタグランジン、栄養因子、骨誘導タンパク質、成長因子、およびワクチンを含めた、本発明の組成物中に組み込むことができる生物学的活性化合物の非限定例は、米国第１１／１５９，５３３号（米国公開第２００６００８４６０２号）に開示されている。本発明の組成物中に組み込むことができる生物学的活性化合物には、いくつかの実施形態では、骨誘導因子、例えば、インスリン様成長因子、線維芽細胞成長因子、または他のＰＤＧＦが含まれる。他の実施形態によれば、本発明の組成物中に組み込むことができる生物学的活性化因子として、好ましくは、骨誘導因子および骨刺激因子（ｏｓｔｅｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）、例えば、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ模倣剤、カルシトニン、カルシトニン模倣剤、スタチン、スタチン誘導体、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、成長分化因子、および／または副甲状腺ホルモンなどが挙げられる。本発明の組成物中に組み込むための追加の因子として、いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤、ならびにビスホスホネートを含めた、骨吸収を減少させる骨粗鬆症治療剤、ならびにＮＦ−ｋＢ（ＲＡＮＫ）配位子に対する抗体が挙げられる。
【０１１０】
追加の生物学的活性剤を送達するための標準プロトコールおよびレジメンは、当技術分野で公知である。追加の生物学的活性剤は、損傷した腱および／または腱結合部位に適切な投与量の薬剤を送達することを可能にする量で、本発明の組成物中に導入することができる。ほとんどの場合、投与量は、専門家に公知であり、対象とする特定の薬剤に適用可能な指針を使用して求められる。本発明の組成物に含められる追加の生物学的活性剤の量は、状態の型および程度、特定の患者の全体的な健康状態、生物学的活性剤の処方、放出動態、ならびに生体適合性マトリックスの生体再吸収性などの変数に依存し得る。標準的な臨床試験を使用することによって、任意の特定の追加の生物学的活性剤についての用量および投薬頻度を最適化することができる。
【０１１１】
いくつかの実施形態による、腱または靭帯を骨に、または骨中に結合するための組成物は、例えば、自己骨髄、自己血小板抽出物、同種移植片、合成骨マトリックス物質、異種移植片、およびこれらの誘導体を含めた１つまたは複数の骨移植物質をさらに含む。
【０１１２】
治療される腱、靭帯、および骨
本発明の方法によって治療することができる腱には、任意の腱が含まれる。腱の非限定例として、膝蓋腱、前脛骨筋腱、アキレス腱、膝窩腱、半腱様筋腱、薄筋腱、外転筋腱、内転筋腱、棘上筋腱、棘下筋腱、肩甲下筋腱、小円筋腱（回旋腱板複合体）、屈筋腱、大腿直筋腱、後脛骨筋腱、および大腿四頭筋腱が挙げられる。いくつかの実施形態では、腱は、膝蓋腱、前脛骨筋腱、アキレス腱、膝窩腱、半腱様筋腱、薄筋腱、外転筋腱、および内転筋腱からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、腱は、棘上筋腱、棘下筋腱、肩甲下筋腱、小円筋腱（回旋腱板複合体）、屈筋腱、大腿直筋腱、後脛骨筋腱、および大腿四頭筋腱からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、腱は、棘上筋腱、棘下筋腱、肩甲下筋腱、小円筋腱（回旋腱板複合体）、屈筋腱、大腿直筋腱、後脛骨筋腱、および大腿四頭筋腱からなる群より選択されない。
【０１１３】
本発明の方法によって治療することができる靭帯には、任意の靭帯が含まれる。靭帯の非限定例として、前十字靭帯（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、外側側副靭帯（ｌａｔｅｒａｌ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、後十字靭帯（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、内側側副靭帯（ｍｅｄｉａｌ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、頭側十字靭帯（ｃｒａｎｉａｌ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、尾方十字靭帯（ｃａｕｄａｌ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、輪状甲状靭帯、歯周靭帯、毛様体小帯、前仙腸靭帯、後仙腸靭帯、仙結節靭帯、仙棘靭帯、恥骨弓靭帯、上恥骨靭帯、提靭帯（例えば、陰茎または乳房）、掌側橈骨手根靭帯、背側橈骨手根靭帯、内側側副靭帯（ｕｌｎａｒ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、または外側側副靭帯（ｒａｄｉａｌ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）が挙げられる。
【０１１４】
本発明の組成物および方法によって治療することができる骨には、腱または靭帯の結合部位である任意の骨が含まれ、それだけに限らないが、脛骨、大腿骨、および上腕骨が含まれる。
【０１１５】
骨を伴わない腱または靭帯の傷害を治療するための方法
本発明は、腱または靭帯の傷害を治療するための組成物および方法を提供する。この治療方法は、骨を伴わない傷害された腱または靭帯、例えば、腱／靭帯の切断、腱／靭帯の断裂、引裂を示す腱／靭帯、離層、または任意の他の歪みもしくは変形などの治療を含むことができる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、腱または靭帯の傷害を治療するための方法は、傷害された腱または靭帯に本発明の組成物を投与するステップを対象とする。いくつかの実施形態では、傷害された腱または靭帯は、治療のために物理的に安定化することができる。例えば、傷害された腱または靭帯は、改良Ｍａｓｏｎ  Ａｌｌｅｎ縫合デザイン、または任意の他の適当な縫合によって縫合することができる。腱または靭帯の損傷端部は、端部の直接の外科的修復または再接続を可能にしない場合があるので、そのような安定化方法は、いくつかの実施形態では好適となり得る。結果として、安定化縫合は、１つまたは複数の傷害された端部に対して遠位に位置される場合がある。
【０１１７】
安定化縫合の結果として、傷害された腱または靭帯は、腱または靭帯の傷害された端部が、実質的に再接近されるように配置される。いくつかの実施形態では、再接近された端部間に適切なサイズのギャップを残し、それによってギャップ体積中に流動性組成物の導入を可能にし、それによってこのギャップを架橋し、または満たすことができる。いくつかの実施形態では、投与された組成物は、ギャップ内で実質的に不動とすることができる。いくつかの実施形態では、この実質的な不動性は、組成物を含む再接近された端部を囲繞または結合するためのラップまたは他の適当なデバイスによって、傷害およびその中の組成物を囲むことによって補助または提供することができる。
【０１１８】
本発明の組成物は流動性であってもよい。このようにして、流動性組成物は、傷害された腱または靭帯部位により正確に送達することができる。シリンジ、または他の適当なデバイスを使用することによって、本発明の組成物を投与することができる。シリンジは、組成物のより正確な送達を可能にする針または他の適当なカニューレをさらに含むことができる。シリンジおよび／またはカニューレの構成、例えば、その内径、サイズ、長さなどは、送達される組成物の所望の体積、または組成物の流動性特性に応じて構成することができる。本発明の組成物の別の有利な特徴は、組成物は、送達されると、その送達部位で実質的に不動のままとすることができることである。いくつかの実施形態では、流動性組成物は、２１Ｇ、２５Ｇ、または２７Ｇの針を通して送達される。いくつかの実施形態では、シリンジおよび／または針による送達により、経皮注射による流動性組成物の送達が可能になる。いくつかの実施形態では、流動性組成物は、非カニューレデバイス、例えば、組成物が所望の位置に送達されることを可能にする、スクープ、スパーテル、ブラシ、または他の同様のデバイスなどによって送達することができる。
【０１１９】
本発明の一実施形態における組成物のさらに別の有利な機能は、その流動性特性により、通常アクセスすることが困難となり得る傷害の領域に組成物がアクセスし、この領域を満たすことが可能になるということである。例えば、断裂した腱または靭帯は、傷害された端部で著しくぼろぼろになり、それによって直接の外科的修復を困難にする場合がある。さらに、そのような損傷端部は、多くの小さい、比較的アクセスしにくい領域、例えば、裂け目および他の組織内領域などを含有する場合がある。本発明の流動性組成物は、そのような領域中に流れ、したがってそのような領域を実質的に満たすように投与することができ、傷害のより有効な修復および血管再生を可能にし、および促進する。
【０１２０】
本発明のいくつかの実施形態では、この方法は、関節鏡下の技法、内視鏡下の技法、腹腔鏡下の技法、または任意の他の適当な最小限に侵襲性の技法を使用して実施することができる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、個体における、骨を伴わない腱または靭帯の傷害を治療するための方法は、生体適合性マトリックスおよびＰＤＧＦを含む有効量の組成物を個体の傷害患部に投与するステップを含み、生体適合性マトリックスは孔を有し、この生体適合性マトリックスは、少なくとも約８０％の多孔度を有し、ＰＤＧＦの少なくとも５０％が約２４時間以内に放出される。いくつかの実施形態では、個体における、骨を伴わない腱または靭帯の傷害を治療するための方法は、生体適合性マトリックスおよびＰＤＧＦを含む有効量の組成物を個体に投与するステップを含み、生体適合性マトリックスは孔を有し、この生体適合性マトリックスは、少なくとも約８０％の多孔度を有し、ＰＤＧＦの少なくとも５０％が約２４時間以内に放出され、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦを含む溶液として存在し、この溶液中のＰＤＧＦの濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．０ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、溶液中のＰＤＧＦの濃度は約１．０ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、架橋コラーゲンおよびグリコサミノグリカンマトリックスを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも約６０％が約２４時間以内に放出される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも約７０％が約２４時間以内に放出される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも約８０％が約２４時間以内に放出される。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは少なくとも約８５％の多孔度を有する。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは少なくとも約９０％の多孔度を有する。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは少なくとも約９２％の多孔度を有する。いくつかの実施形態では、組成物は流動性である。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、Ｉｎｔｅｇｒａ流動性創傷マトリックスである。いくつかの実施形態では、治療は腱のものである。いくつかの実施形態では、治療は靭帯のものである。
【０１２２】
本発明は、アキレス腱傷害を治療する方法も提供する。一実施形態では、アキレス腱傷害を治療するための方法は、生体適合性マトリックスおよびＰＤＧＦを提供するステップを含み、生体適合性マトリックスは流動性である。
【０１２３】
本発明は、それだけに限らないが、肩甲下筋、棘上筋、棘下筋、小円筋、大腿直筋、後脛骨筋、大腿四頭筋、上腕二頭筋の腱、ならびにアキレス腱、膝蓋腱、外転筋腱および内転筋腱、または腰の他の腱、一般的な伸筋腱、一般的な屈筋腱、浅指屈筋腱、指伸筋腱および小指伸筋腱、または腕および手の他の腱を含めた、任意の他の適当な腱傷害を治療するための組成物および方法も提供する。
【０１２４】
本発明は、それだけに限らないが、前十字靭帯（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、外側側副靭帯（ｌａｔｅｒａｌ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、後十字靭帯（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、内側側副靭帯（ｍｅｄｉａｌ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、頭側十字靭帯（ｃｒａｎｉａｌ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、尾方十字靭帯（ｃａｕｄａｌ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、輪状甲状靭帯、歯周靭帯、毛様体小帯、前仙腸靭帯、後仙腸靭帯、仙結節靭帯、仙棘靭帯、恥骨弓靭帯、上恥骨靭帯、提靭帯（例えば、陰茎または乳房）、掌側橈骨手根靭帯、背側橈骨手根靭帯、内側側副靭帯（ｕｌｎａｒ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）、または外側側副靭帯（ｒａｄｉａｌ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）を含めた、任意の他の適当な靭帯傷害を治療するための組成物および方法も提供する。
【０１２５】
腱と骨または靭帯と骨を結合するための方法
本発明は、骨中に／骨に腱または靭帯を結合または再結合するため、および腱または靭帯の骨への結合を強化するための方法を提供する。結合方法は、腱と骨および靭帯と骨の界面での腱または靭帯の骨との一体化または整復を含むことができる。いくつかの実施形態では、骨に、または骨中に腱または靭帯を結合するための方法は、生体適合性マトリックス中に配置されたＰＤＧＦ溶液を含む組成物を提供するステップと、腱／靭帯と骨の界面にこの組成物を適用するステップとを含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、結合方法は、生体適合性マトリックス中に配置されたＰＤＧＦ溶液を含む組成物を提供するステップと、剥離した腱の周囲をラップするステップと、骨に穴をあけられたトンネル中に組成物および腱を挿入するステップと、縫合で腱を骨に結合するステップとを含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、結合方法は、生体適合性マトリックス中に配置されたＰＤＧＦ溶液を含む組成物を提供するステップと、剥離した靭帯の周囲をラップするステップと、骨に穴をあけられたトンネル中に組成物および靭帯を挿入するステップと、縫合で靭帯を骨に結合するステップとを含む
いくつかの実施形態では、結合方法は、生体適合性マトリックスを含む組成物を提供するステップと、剥離した腱の周囲をラップするステップと、骨中に組成物および腱を挿入するステップと、骨に穴をあけられたトンネル中にＰＤＧＦ溶液を注入するステップと、縫合で腱を骨に結合するステップとを含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、結合方法は、生体適合性マトリックスを含む組成物を提供するステップと、剥離した靭帯の周囲をラップするステップと、骨中に組成物および靭帯を挿入するステップと、骨に穴をあけられたトンネル中にＰＤＧＦ溶液を注入するステップと、縫合で靭帯を骨に結合するステップとを含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ溶液は、コラーゲンマトリックスでラップされた腱のインプラント部位に隣接するトンネル中に注入することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ溶液は、骨トンネルの内側中に注入することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ溶液は、骨トンネルの外側中に注入することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ溶液は、骨トンネル周囲の１箇所に注入することができる。他の実施形態では、ＰＤＧＦ溶液は、骨トンネル周囲の複数箇所に注入することができる。例えば、注入は、トンネル開口部の１／４、１／２、３／４の円周、および全円周で行うことができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ溶液の濃度は約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．０ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ溶液の濃度は約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ溶液の濃度は約０．１５ｍｇ／ｍｌである。他の実施形態では、ＰＤＧＦ溶液の濃度は約０．３ｍｇ／ｍｌである。
【０１３１】
本発明は、前十字靭帯再建のために、個体において腱を骨中に結合するための方法であって、腱と骨の界面で、生体適合性マトリックスおよびＰＤＧＦを含む有効量の組成物を前記個体に投与するステップを含む方法も提供される。いくつかの実施形態では、前十字靭帯再建のための方法は、生体適合性マトリックス中に配置されたＰＤＧＦ溶液を含む組成物を提供するステップと、外側上で大腿挿入部から剥離した長指屈筋腱（ｌｏｎｇ  ｆｌｅｘｏｒ  ｔｅｎｄｏｎ）周囲にラップするステップと、脛骨骨幹端（ｔｉｂｉａ  ｍｅｔａｐｈｙｓｉｃ）を通じて斜めに穴をあけたトンネル中に組成物および腱を挿入するステップと、縫合で長指屈筋腱を脛骨の内側皮質に結合させるステップとを含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、前十字靭帯再建のための方法は、生体適合性マトリックスを含む組成物を提供するステップと、外側上で大腿挿入部から剥離した長指屈筋腱周囲にラップするステップと、脛骨骨幹端を通じて斜めに穴をあけたトンネル中に組成物および腱を挿入するステップと、骨トンネル中にＰＤＧＦ溶液を注入するステップと、縫合で長指屈筋腱を脛骨の内側皮質に結合させるステップとを含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本発明は、回旋腱板傷害において腱を骨に結合または再結合させるための方法も提供する。回旋腱板傷害、ならびにオープン修復法、ミニオープン修復法、および全関節鏡下修復法を用いた回旋腱板傷害治療は、ＷＯ２００８／００５４２７、ならびに米国第１１／７７２，６４６号（米国公開２００８／００２７４７０号）に開示されている。これらの参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。いくつかの実施形態では、回旋腱板傷害を治療するための方法は、生体適合性マトリックス中に配置されたＰＤＧＦ溶液を含む組成物を提供するステップと、上腕骨頭上の腱再結合の少なくとも１つの部位に組成物を適用するステップとを含む。いくつかの実施形態では、腱再結合の少なくとも１つの部位に組成物を適用するステップは、上腕骨頭上の再結合部位の輪郭に組成物を成形するステップを含むことができる。組成物は、例えば、剥離した腱を受けるための上腕骨頭の表面上に形成されたチャネル中に成形することができる。組成物は、腱の骨中への挿入部位の近傍に適用することによって、結合をさらに強化するができる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、回旋腱板引裂を治療するための方法は、上腕骨頭における骨アンカーなどの少なくとも１つのアンカー手段を配置するステップであって、骨アンカーは、ＰＤＧＦ組成物をさらに含むステップと、少なくとも１つの剥離した腱を骨アンカーに結合させるステップとをさらに含む。本発明の実施形態では、腱は、縫合によって骨アンカーに固定することができる。
【０１３５】
本発明のいくつかの実施形態では、この方法は、関節鏡下の技法、内視鏡下の技法、腹腔鏡下の技法、または任意の他の適当な最小限に侵襲性の技法を使用して実施することができる。
【０１３６】
組成物中に使用するのに適したＰＤＧＦ溶液および生体適合性マトリックスは、本発明の方法の実施形態によれば、先に提供したものと一致する。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、個体において、腱または靭帯を骨に、または骨中に結合するための方法は、生体適合性マトリックスおよびＰＤＧＦを含む有効量の組成物を個体の患部に投与するステップを含み、生体適合性マトリックスは孔を有し、この生体適合性マトリックスは、少なくとも約８０％の多孔度を有し、ＰＤＧＦの少なくとも５０％が約２４時間以内に放出される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦを含む溶液として存在し、溶液中のＰＤＧＦの濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．０ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、溶液中のＰＤＧＦの濃度は、約０．１〜約０．４ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、溶液中のＰＤＧＦの濃度は、約０．１５ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、溶液中のＰＤＧＦの濃度は、約０．３ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、架橋コラーゲンマトリックスを含む。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、架橋コラーゲンおよびグリコサミノグリカンマトリックスを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも約６０％が約２４時間以内に放出される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも約７０％が約２４時間以内に放出される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦの少なくとも約８０％が約２４時間以内に放出される。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、少なくとも約８５％の多孔度を有する。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、少なくとも約９０％の多孔度を有する。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、少なくとも約９２％の多孔度を有する。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスはＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）である。いくつかの実施形態では、治療は、腱を骨に結合させるものである。いくつかの実施形態では、治療は、靭帯を骨に結合させるものである。
【０１３８】
縫合
本明細書における本発明の方法で使用され、または本明細書におけるキットに含められる縫合糸は、ＰＤＧＦを含むことができる。ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦを含む溶液によって縫合糸中に浸漬し、または縫合糸上にコーティングすることができる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、約５．０〜約２０．０ｍｇ／ｍｌ、例えば、約７．５〜約１５ｍｇ／ｍｌ、例えば、約１０ｍｇ／ｍｌの任意の濃度で溶液中に存在する。
【０１３９】
本明細書における本発明の方法で使用され、または本明細書におけるキットに含められる縫合糸は、インビボで再吸収性であっても、非再吸収性であってもよい。再吸収プロセスは、体液、酵素、または細胞の作用による元の物質の分解および排除を伴う。再吸収された縫合糸は、新組織の形成において宿主によって使用される場合があり、またはこれは、別の方法で宿主によって再利用される場合があり、またはこれは排泄される場合がある。縫合糸は、合成線維もしくは天然線維、またはこれらの組合せで作製することができる。
【０１４０】
本発明のキット
別の態様では、本発明は、ＰＤＧＦ溶液を含む第１の容器、および生体適合性マトリックスを含む第２の容器を含むキットを提供する。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、個体において骨を伴わない腱または靭帯の傷害を治療するためのキットであって、生体適合性マトリックスを含む第１の容器およびＰＤＧＦ溶液を含む第２の容器を投与するステップを含み、生体適合性マトリックスは孔を有し、この生体適合性マトリックスは、少なくとも約８０％の多孔度を有し、ＰＤＧＦの少なくとも約５０％が約２４時間以内に放出されるキットが提供される。
【０１４２】
他の実施形態では、個体において腱または靭帯を骨に結合させるためのキットであって、生体適合性マトリックスを含む第１の容器および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）溶液を含む第２の容器を投与するステップを含み、生体適合性マトリックスは孔を有し、この生体適合性マトリックスは、少なくとも約８０％の多孔度を有し、ＰＤＧＦの少なくとも約５０％が約２４時間以内に放出されるキットが提供される。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは脱水されている。いくつかの実施形態では、溶液は、所定の濃度のＰＤＧＦを含む。ＰＤＧＦの濃度は、いくつかの実施形態では、治療される腱または靭帯の傷害の性質によって予め決定することができる。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、治療される腱または靭帯の傷害の性質によって所定の量を含む。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、治療される腱／靭帯および骨の性質によって所定の量を含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、架橋コラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、可溶性コラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、架橋コラーゲンおよびグリコサミノグリカンを含む。いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、架橋コラーゲンおよびコンドロイチン硫酸を含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＤＧＦ溶液を含む第１の容器、生体適合性マトリックスを含む第２の容器、およびシリンジを含むキットを提供する。シリンジは、いくつかの実施形態では、腱または靭帯を骨に結合する部位などの手術部位で適用するために、生体適合性マトリックス中のＰＤＧＦ溶液の分散を促進することができる。キットは、使用のための指示書も含有することができる。
【０１４６】
以下の実施例は、例示的な目的のみで提供されており、いずれの様式においても本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【実施例】
【０１４７】
（実施例１）
様々なコラーゲンマトリックスの構造上の特徴づけ
４つのコラーゲンマトリックスを試験して、微細構造および多孔度の差を求めた。コラーゲンマトリックスは、Ｋｅｎｓｅｙ  Ｎａｓｈ  Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎから得た。マトリックスは、主にＩ型コラーゲンの源であるウシ真皮からの精製コラーゲン抽出物から作製した。マトリックスは、４．５％、５％、６％、および７％（ｗ／ｖ）の様々な濃度のコラーゲンを含むコラーゲンスラリーから作製する。乾燥コラーゲンマトリックス（４．５％、５％、６％、および７％）に液体窒素を流した後、打ち抜いて５ｍｍのディスクにした。ディスクを、３つの異なる配向（頂部が上、底部が上、側部が上）でスタブ上に取り付け、金−パラジウムでコーティングし、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）によって調べた。
【０１４８】
ＳＥＭ画像により、コラーゲンマトリックス（４．５％）およびコラーゲンマトリックス（５％）の表面上に開放孔が存在することが明らかになった。ＳＥＭ画像により、コラーゲンマトリックス（６％）およびコラーゲンマトリックス（７％）の表面上の、より小さい孔を有する高密度薄層が明らかになった。コラーゲンマトリックスのそれぞれは、断面の長手方向スライスのＳＥＭ画像に基づくと、多孔質であるように思われたが、コラーゲンマトリックス（５％）は、ＳＥＭによって評価した場合、最大の全体的多孔度を有するように思われた。コラーゲンマトリックス中の孔は、均一に分布していないように思われ、一部の範囲では孔はまったく存在しない。
【０１４９】
ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してＳＥＭ画像を分析して、孔面積サイズおよび周囲長サイズの両方を求めた。ＩｍａｇｅＪは、国立衛生研究所（ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊのワールドワイドウェブ）のＷａｙｎｅ  Ｒａｓｂａｎｄによって創作された画像解析プログラムである。画像解析のためのプログラムを使用するために、適切なパラメータを選択および設定する必要がある。「分析」メニューから、各ＳＥＭ画像からのスケールをプログラムに入力することによって、「スケール」パラメータを設定した。次に、測定パラメータについて「面積」および「周囲長」を選択した。各画像から１０個の孔をランダムに選択し、測定を行い、面積サイズおよび周囲長サイズについて平均した。各画像についての結果を記録した。表１は、１つの分析からの結果を示す。
【０１５０】
【表１】
2018030895.tif 000003
コラーゲンマトリックス（５％）は、最も多孔質な構造を有すると思われ、ＩｍａｇｅＪソフトウェアによって分析した場合、側部Ａおよび側部Ｂ両方の画像から、孔面積サイズは最大であった。
【０１５１】
（実施例２）
様々なコラーゲンマトリックスの累積ＰＤＧＦ放出分析
様々なコラーゲンマトリックスからの累積ＰＤＧＦ放出を分析した。コラーゲンマトリックスは、Ｋｅｎｓｅｙ  Ｎａｓｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得た。これは、実施例１で上述したものと同じである。各タイプ、すなわち、５％、６％、および７％のコラーゲンマトリックス（８ｍｍのディスク）を２７  １／２Ｇの針で留め、０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ  ８０μｌで水和し、試料を室温で１０分間インキュベートした。コラーゲンディスクを２ｍｌのマイクロチューブ内に入れ、溶出バッファー（２％のウシ胎児血清を含有するＭＥＭ）２ｍｌを添加してｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを放出させた。各測定に三つ組の試料を使用した。対照試料は、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ  ８０μｌを溶出バッファー２ｍｌに添加して構成した。マイクロチューブを３７℃のインキュベーター内の軌道振盪機上で振盪した。１０分、１時間、８時間、および２４時間で、溶離液を各チューブから取り出し、２〜８℃で貯蔵した。等体積の新鮮な溶出バッファーを各チューブに添加した。各コラーゲンマトリックスの貯蔵した溶離液を、製造者の指示書に従って、ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）キットを使用してｒｈＰＤＧＦ−ＢＢについてアッセイした。
【０１５２】
コラーゲンマトリックス（５％）は、コラーゲンマトリックス（６％）およびコラーゲンマトリックス（７％）と比較して、同様の動態でｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを放出した（図１）。放出動態は、最初の１０分間の初期の急速なｒｈＰＤＧＦ−ＢＢのボーラス放出、その後の残りの２３時間の試験期間にわたるより遅い定常放出を特徴とした。放出動態は同様であったが、コラーゲンマトリックス（５％）から放出されたＰＤＧＦの初期ボーラス量および総量は、コラーゲンマトリックス（６％）またはコラーゲンマトリックス（７％）のいずれよりも大きかった。
【０１５３】
コラーゲンマトリックスからのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの放出率を対照（溶出バッファー単独中のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）と比較した。結果は、上述したように、コラーゲンマトリックス（５％）は、コラーゲンマトリックス（６％）またはコラーゲンマトリックス（７％）より速く、大きいＰＤＧＦの放出を有することを示した（図２）。この試験結果を表２にも示す。
【０１５４】
【表２】
2018030895.tif 000004
（実施例３）
様々なコラーゲンマトリックスからのＰＤＧＦ放出の生物学的力価試験
様々なコラーゲンマトリックスから放出されるＰＤＧＦの生物学的力価を、細胞増殖アッセイで評価した。試料は、実施例２で上述したプロトコールの変法に従って調製した。溶出バッファーを、２％仔ウシ血清含有Ｄ−ＭＥＭに変更した。１時間の時点で採取した各物質についての二つ組の試料を使用した。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの濃度をＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡアッセイによって求め、その結果を参照として使用して、試料を１μｇ／ｍｌの濃度に希釈使用した。０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを参照標準として使用し、すべてのプレートに適用した。１μｇ／ｍｌの開始濃度を使用して、９６ウェルマイクロタイタープレート（ブラックウォールおよびクリアボトム）中に各試料を装填し、次いで同じ横列にわたって１．６６７倍に連続的に希釈した。ブランク対照として使用した、各プレートの最後の縦列を除いて、約１０４個のＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を各ウェルに添加した。４８時間培養した後、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）標識を各プレートに添加した。さらに２４時間培養した後、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイを、製造者の指示書に従って行った。
【０１５５】
ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞増殖アッセイにおいて測定した各マトリックスから放出されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、放出されたＰＤＧの生物活性が、分析した３つのマトリックスについて保存されることを実証した（図３）。
【０１５６】
（実施例４）
コラーゲンマトリックスから放出されるＰＤＧＦの安定性試験
コラーゲンマトリックスから放出されるｒｈＰＤＧＦの安定性を試験した。各タイプ（５％、６％、および７％）のコラーゲンマトリックス（８ｍｍのディスク）を２７  １／２Ｇの針で留め、１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ  ５０μｌで水和した。溶出バッファー（２０ｍＭの酢酸ナトリウム＋０．２５Ｎの塩化ナトリウム）０．４ｍｌで満たしたマイクロチューブ内で、各試料を１時間インキュベートした。次いで放出されたＰＤＧＦをサイズ排除ＨＰＬＣによって分析した。三つ組で測定を行った。コラーゲンマトリックスから放出されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢについて著しい特性シフトはまったく見出されず、コラーゲンマトリックスから放出されるＰＤＧＦの安定性を実証した。
【０１５７】
（実施例５）
様々なコラーゲンマトリックスの腱細胞浸潤試験
様々なコラーゲンマトリックス中に浸潤する腱細胞の能力を評価した。コラーゲンマトリックスは、Ｋｅｎｓｅｙ  Ｎａｓｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得、本明細書に記載したように、５％、６％、および７％（ｗ／ｖ）のコラーゲン濃度を有するコラーゲンスラリーから作製した。コラーゲンシート（１．５〜２．０ｍｍの厚さ）を打ち抜いて直径８ｍｍのディスクにし、インビトロ細胞遊走試験を行った。
【０１５８】
一次ヒツジ腱細胞（４細胞継代未満）をヒツジ屈筋腱から単離した。成長培地（１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２）中で細胞を培養し、試験を開始する１２時間前に、基本培地（２％のＦＢＳを含有するＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２）に切り替えた。
【０１５９】
基本培地中の腱細胞懸濁液５０μｌ（５０，０００細胞）を各コラーゲンディスク試料に添加した。培地出現（ｅｍｅｒｓｉｏｎ）を伴うことなく、３７℃および５％のＣＯ２雰囲気下で１時間インキュベートした後、細胞を播種したディスクを、単独の、またはｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（３０ｎｇ／ｍｌ）を組み合わせた基本培地２ｍｌで予め満たした２４ウェルプレートに移した。１２時間静置培養した後、細胞を播種したディスクを含むプレートを、インキュベーター内の軌道振盪機（６０ｒｐｍ）上に配置した。培地交換は、４８時間毎に行った。６日目に、各コラーゲンマトリックスおよび処置からの四つ組の試料を採取して組織評価した。
【０１６０】
一般に、組織評価は、以下の説明と同様であった。６日間培養した後、細胞培地を各ウェルから取り出し、４％のリン酸緩衝ホルマリン（ＰＢＦ）と置換した。室温（ＲＴ）で約３０分間、ＰＢＦ中で試料を固定した。ＲＴで１時間以上の期間真空下に試料を置くことによって、細胞固定を完了した。振盪機プラットフォームおよび真空チャンバーを使用して、次いで試料を、ＲＴで、漸増する一連のエタノール濃度（７０％−８０％−９５％−１００％）を通して、約５．５時間の期間にわたって脱水し、ＲＴで２時間の期間にわたって１００％のキシレン中で浄化し、２時間以上の期間にわたってパラフィンワックス中で浸潤させた。次いで、各処置群およびマトリックスからの試料を埋め込んだ。埋め込んだ試料を埋め込み鋳型から取り出し、ロータリーミクロトームを用いて「トリム」し、「フェイシングする（ｆａｃｅ）」ことによって、すべての試料の最外側表面を露出し、次いでフリーザー内に一晩置いた。ロータリーミクロトーム、加温水浴、および予めラベルを付けたガラス顕微鏡スライドを使用して、約１００〜１５０ミクロン離して、３〜４のレベルで、４〜６ミクロンで切片（スライド１枚当たり２切片）を採取した。スライドを乾燥器内で、６０℃で一晩乾燥した。最後にスライドを、Ｈｏｅｓｃｈｔ蛍光染色剤を用いて染色し、観察した。
【０１６１】
結果は、腱細胞は、ＰＤＧＦを含むコラーゲンマトリックス（５％）中に浸潤した一方で、腱細胞は、コラーゲンマトリックス（６％）およびコラーゲンマトリックス（７％）中に浸潤するように思われなかったことを示した。コラーゲンマトリックス（６％）およびコラーゲンマトリックス（７％）試料については、腱細胞のほとんどが、ディスクの縁部に蓄積した。したがって、コラーゲンマトリックス（５％）のより大きな多孔度により、より多数の細胞がコラーゲンマトリックス中に浸潤することが可能になったと思われた。
【０１６２】
（実施例６）
コラーゲン／ＰＤＧＦ組成物を用いたアキレス腱傷害の治療
本発明による組成物および方法の効力を評価するために、以下に説明するような例示的試験を使用した。本発明は、コラーゲンマトリックスと混合したｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液を含む組成物およびその使用方法を含む。例えば、コラーゲンマトリックスは、流動性コラーゲンマトリックスであり、架橋ウシ腱コラーゲンおよびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）マトリックスを含む。流動性組成物は、シリンジまたは適当な手段によって傷害部位に容易に供給される。
【０１６３】
この例示的な試験において、ヒツジまたは他の適当な試験対象をヒトアキレス腱修復のモデルとして使用した。ヒツジのアキレス腱のサイズはヒトアキレス腱と類似しているために、ヒツジが特に適当である。さらに、ヒツジは、標準的な整形技法および組成物の配置を可能にするのに十分なサイズのものである。この試験で使用したヒツジは、骨格的に成熟しており（年齢［３．５歳以上］および歯の摩耗によって判断した場合）、正常な歩行運動を伴い、少なくとも１２０ポンドの体重であり、手術時点で順応していた。ヒツジに、標準的な小反芻動物飼料によって給餌し、水を補給した。食物および水は、麻酔などの適切な試験関連のために控えた。
【０１６４】
この試験は、３つの処置群（ｎ＝８／群）を使用し、以下の試験組成物を、急性アキレス腱横切の傷害部位に供給および適用した：（１）バッファー中の流動性コラーゲンマトリックス（２）０．３ｍｇ／ｍＬ（１５０μｇ）のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含むバッファー中の流動性コラーゲンマトリックス、および（３）１．０ｍｇ／ｍＬ（５００μｇ）のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含むバッファー中の流動性コラーゲンマトリックス。他の適当な処置群、例えば、他の適当な濃度のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む組成物を使用する処置群なども使用する。
【０１６５】
例示的な流動性コラーゲンマトリックスは、Ｉｎｔｅｇｒａ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ、ＮＪのＩｎｔｅｇｒａ（商標）流動性創傷マトリックス（ＩＦＷＭ）である。当技術分野で公知の他の適当なマトリックスも使用することができる。
【０１６６】
実験の概要
この試験に登録されたヒツジのアキレス腱を横切し、その後即時に修復を行った。ヒツジを３つの例示的な試験群（ｎ＝８／群）に分け、以下の組成物を使用した：１）再接近させた腱端部（改良Ｍａｓｏｎ  Ａｌｌｅｎ縫合デザインで安定化）に配置した、２０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０＋／−０．５）中の流動性コラーゲンマトリックス（対照）、２）再接近させた腱端部（改良Ｍａｓｏｎ  Ａｌｌｅｎ縫合で安定化）に配置した、０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有する２０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー中の流動性コラーゲンマトリックス、および３）再接近させた腱端部（改良Ｍａｓｏｎ  Ａｌｌｅｎ縫合で安定化）に配置した、１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有する２０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー中の流動性コラーゲンマトリックス。＃１  Ｅｔｈｉｌｏｎナイロン縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｅｎｄｏ−Ｓｕｒｇｅｒｙ，
Ｉｎｃ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）などの縫合材料を使用した。模擬アキレス断裂および再結合の生体力学的性能および組織応答を求めた。生体力学的性能および組織応答試験の両方についての動物の処置の割当および数を、表３に略述する。
【０１６７】
【表３】
2018030895.tif 000005
試験物質を配置した後、標準的な外科的技法を使用して切開部を閉じ、添え木を脚下部に配置することによって、歩行運動の間のナックリングを防止した。手術後の週の間、異常治癒または創傷裂開について手術部位をモニターした。動物を８週間普通に歩行させ、術後２、４、および８週間に超音波評価を実施した。手術して８週間後に、すべての動物を安楽死させ、近位および遠位の筋腱接合部を含めたアキレス腱を収集し、組織学的および生体力学的評価を行った。正常な未処置の腱について組織学的および生体力学的試験を実施することができるように、対照動物（すなわち、流動性コラーゲン創傷マトリックス単独）の対側後肢から正常な未手術の腱およびその筋腱接合部を収集した。最初の手術部位および対側対照からの皮膚も、組織学的評価のために採取する。
【０１６８】
外科的プロトコール
手術日に、全身麻酔を誘導するためにジアゼパム（０．２２ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）からなるＩＶ注射を投与した。カフ付き気管内チューブを配置し、再呼吸系を通じて、１００％の酸素（２Ｌ／分）中のイソフルオラン（１．５％〜３．０％）を用いて全身麻酔を維持した。呼吸を補助するために動物を人工呼吸器上に配置した。胃管を配置することができた。
【０１６９】
動物を左側横臥位とし、右脚から羊毛を除去することによって、手術部位を準備するための適切なアクセスを提供した。ポビドン−ヨウ素（Ｂｅｔａｄｉｎｅ）およびアルコールで交互にスクラブして、無菌手術のために、右足首関節上の皮膚を準備した。次いで、無菌手術のために手術部位をドレープした。脚の外側側面にわたって切開を行い、次いで皮下組織まで深めることによって、踵骨上のその挿入部位で腱を露出した。次いで、腓腹筋腱のより大きい分岐を単離した。踵骨へのアキレス腱挿入部を触診し、滅菌マーカーを用いて挿入部位から２ｃｍ、４ｃｍ、および６ｃｍにマークを付けた。
【０１７０】
手術前に、マトリックスおよび適切なバッファー溶液（２０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．０＋／−０．５）＋／−ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、乾燥コラーゲンおよびバッファー＋／−ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有する、供給された、ラベルを付けた滅菌シリンジを使用して、流動性コラーゲン物質（ＩＦＷＭ）３．０ｃｃに、バッファー＋／−ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ  ６．０ｃｃを添加することによって合わせた（２：１  ｖ／ｖ）。物質は、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有するシリンジから先端キャップを取り除き、これを、供給された、滅菌ルアーロックコネクタと取り替え、次いでこれに乾燥コラーゲンを含有するシリンジを接続することによって合わせた。コラーゲンマトリックスの水和は、コラーゲンシリンジ中にすべてのバッファー＋／−ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを供給し、混合物が均一であると思われ、すべての物質がシリンジ同士間を前後に容易に動くことができるようになるまで、プランジャーを少なくとも１５回押し下げて前後させることにより混合することによって実現した。水和した流動性コラーゲンマトリックスをアリコートして滅菌容器内で体積０．５ｃｃにし、使用するまで４℃で貯蔵した。
【０１７１】
腱を露出した後、安定化縫合糸（＃１  Ｅｔｈｉｌｏｎ）を、改良Ｍａｓｏｎ  Ａｌｌｅｎデザインを使用して配置し、一端が２ｃｍのマーク箇所であり、一端が６ｃｍのマーク箇所であった。Ｍａｓｏｎ  Ａｌｌｅｎ縫合糸は張り詰めたままにすることによって腱の長さを維持したが、腱端部の操作のために一端は縛らないままにした。次いで４ｃｍまたは約４ｃｍのマーク箇所で腱を横切し、その後、腱端部を再接近させ、Ｍａｓｏｎ  Ａｌｌｅｎ縫合糸の自由端を腱の遠位末端で縛った。横切した腱の写真を定規とともに撮り、踵骨挿入部からの距離の記録をとった。例えば、図４に表した例示的な縫合された、横切した腱を参照。縫合糸の小さい末端を遠位末端に残し、剖検後の同定のために近位端に小さい識別縫合糸（３〜０）を配置した。流動性マトリックスを挿入するために腱横切部周囲に空間を残して、上に被さる軟部組織を閉じた。次いで、水和した流動性コラーゲンマトリックス物質を、以下の様式で腱端部に配置した：斜面側を横切した腱端部に向けて、シリンジから２０ゲージの針を通して滅菌アリコート０．５ｃｃを搾り出した。滅菌アリコートの半分（０．２５ｃｃ）を、横切した腱端部のそれぞれの表面に沿って搾り出した。物質が、ギャップ空間内に均等に分布されることを確実にするように注意を払った。図５に表したような、送達されている本発明の例示的な流動性組成物、例示的な縫合された、横切した腱を参照。
【０１７２】
上に被さる皮下組織および皮膚を、標準的な外科手術によって閉じた。ＯｒｔｈｏＧｌａｓｓ製の添え木を脚下部上に形成することによって、歩行運動の間のナックリングを防止した。手術直後に、ヒツジを手術台から移し、嚥下反射が戻るまで観察し、戻った時点でヒツジから抜管した。手術を完了した後、ヒツジを胸骨横臥位で支え、次いで試験の継続時間収容した。ヒツジの添え木および／またはギプス固定を使用することによって、修復した腱のナックリングおよび／または過伸展を低減した。術後の鎮痛を施し、標準的な術後ケア手順に従って動物を管理した。
【０１７３】
臨床的知見
動物を、屠殺するまで１日２回観察した。第１週の間に、異常治癒および創傷裂開について、手術部位を観察し、写真を得た。手術後の試験期間を通して、一般的な姿勢、食欲、手術した肢の使用（例えば、跛行）、および手術部位の外見について動物を観察した。手術部位で感染症が発症した場合、抗生物質を動物に投与し、観察記録に記録した。当技術分野で公知の方法を使用して、手術して２週間後、４週間後、および８週間後に、手術したアキレス腱および対側の未手術のアキレス腱の両方についての超音波画像をすべての処置部位について得た。インデックス手術（ｉｎｄｅｘ  ｓｕｒｇｅｒｙ）の８週間後に、すべての動物を屠殺し、組織を回収した。
【０１７４】
生体力学的試験
実験概要セクションで上に論じた３つの異なる処置群を使用した誘導アキレス腱断裂および再結合の機械的性能を求めた。
【０１７５】
材料および方法
試料は、採取した後、食塩水に浸漬したガーゼでラップし、試験するまで−２０℃で貯蔵した。高強度ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）を使用して２インチのＰＶＤパイプに中足をポッティングした。ポッティング調製および生体力学的試験の間、１５分間隔で食塩水をスプレーして、試料を湿気のある状態に保持した。材料試験システム負荷フレーム（ＭＴＳ  ＭｉｎｉＢｉｏｎｉｘ  ＩＩ、Ｅｄａｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ、ＭＮ）にしっかり取り付けられた特注設計試験備品にポッティングした中足を取り付けた。アキレス腱の天然の断面を保存し、軟部組織の滑りを最小限にするために、特注設計のクライオクランプ（ｃｒｙｏｃｌａｍｐ）を実装し、ポッティングした中足に対して約１３５°の角度でコンストラクトに一軸性のけん引力を印加した。これは、腱の生理的力ベクトルを模倣するために行った。試験は、クライオクランプに付けられた熱電対が−２２℃、すなわち腱とクランプの間の安定したカップリングを保証するのに十分であると以前に報告された温度を記録したとき開始した。試験前に切断された、組織に埋め込まれた縫合糸物質はまったくなかった。したがって、生体力学的結果は、埋め込まれた縫合糸と修復性組織の合わされた機械的寄与を表す。
【０１７６】
４つの逆反射マーカーをポッティングしたコンストラクト、すなわち、１つを修復部位に直接隣接する踵骨上に、２つを腱上に、すなわち、１つをアキレス腱−修復組織界面の近位に、および１つをこの界面の遠位に縫合または接着剤接合した。４番目のものは、クライオクランプ上に接着接合した。３つのカメラ（Ｍｏｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｓａｎｔａ  Ｒｏｓａ、ＣＡ）により、６０Ｈｚでマーカーの空間的移動を記録した。このカメラシステムを使用するマーカー変位測定により、修復性組織内の局所的な組織変位／歪みのリアルタイムモニタリングが可能になった。
【０１７７】
フェーズ１：３０サイクルの動的プレコンディショニング
周期的負荷試験を最初に使用することによって、修復した腱をプレコンディショニングした。力制御プロトコールを使用して、１０ニュートン（Ｎ）の前負荷をコンストラクトに２分間印加した。これにより、すべてのコンストラクトについての初期構成が指定された。次いで、修復したコンストラクトを、定常状態に達するように、６０サイクルにわたって０．２５Ｈｚで１０〜５０Ｎの力制御プロトコールで周期的にプレコンディショニングした。変位対時間曲線の傾きが５０サイクルと６０サイクルの間で収束することを実証した、本発明者らの実験室における以前の実験に基づいて、６０（ｎ＝６０）サイクルを選択した。対象とするパラメータは、最初と６０番目のサイクルの間のピークトゥピーク変位の差として定義されるコンディショニング伸長、および５８番目、５９番目、および６０番目のサイクルの局部的な最小と最大の差の平均として定義されるピークトゥピーク伸長を含んでいた。
【０１７８】
準静的破損負荷
プレコンディショニングした後、１ｍｍ／ｓの速度での変位制御下で、修復したコンストラクトに破損するまで負荷をかけた。対象とする生体力学的パラメータは、極限破損までの荷重、準静的コンストラクト全体の剛性（負荷−変位曲線の傾きとして定義される）、局所的修復組織剛性、破損時点での伸長、および破損時に吸収されたエネルギーを含んでいた。最後に、破損機構を各試料について記録した。試験の前、破損までのランプ手順の間、コンストラクト破損の後に、デジタル画像および／またはビデオを撮った。
【０１７９】
統計分析
一元配置ＡＮＯＶＡ、その後にＴｕｋｅｙのポストホック多重比較検定を使用することによって、ＩＦＷＭ対照および０．３ｍｇ／ｍＬのＰＤＧＦおよび１．０ｍｇ／ｍＬのＰＤＧＦ処置群の間の連続的生体力学的パラメータの有意な差を識別した。有意性をｐ≦０．０５に設定し、すべての分析は、ＳｉｇｍａＳｔａｔ  ３．１（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて実施した。
【０１８０】
結果
３つの処置群の間で、大きな視覚的な差はまったく識別されなかった。ＩＦＷＭ＋０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群における６つのうち２つ（３３％）のコンストラクトは、修復組織の外側側面上に明白な血腫を示した。この血腫の存在は、修復の生体力学的特性に影響し、異常に低い負荷で、血腫の正確な位置で開始する破損によって証明された。データ分析は、これらの血腫のある２つの試料を含めて（ｎ＝６）および含めないで（ｎ＝４）実施した。０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群における血腫のある２つの試料を含めた試験の周期的プレコンディショニング成分からの未処理データを表４に示す。コンディショニング伸長（ｐ＝０．６３６）またはピークトゥピーク伸長（ｐ＝０．８１３）の有意な差は、ＩＦＷＭ、ＩＦＷＭ＋０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、またはＩＦＷＭ＋１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群の間でまったく識別されなかった（図６Ａ）。
【０１８１】
【表４Ａ】
2018030895.tif 000006
同様に、コンディショニング伸長（ｐ＝０．７０９）、またはピークトゥピーク伸長（ｐ＝０．９４７）の有意な差は、ＩＦＷＭ、ＩＦＷＭ＋０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、またはＩＦＷＭ＋１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群の間でまったく識別されなかった。図６Ｂ。分析から除外された血腫のある試料を含む、試験の周期的プレコンディショニング成分からの未処理データを表４Ｂに示す。
【０１８２】
【表４Ｂ】
2018030895.tif 000007
分析に含められた血腫のある２つの試料を含む、生体力学的試験の破損までのランプ成分からの未処理データを、表５Ａに示す。外科的に修復したアキレス腱における、任意の準静的パラメータについての有意な差は、ＩＦＷＭ、ＩＦＷＭ＋０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、またはＩＦＷＭ＋１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群の間でまったく識別されなかった（ｐ＞０．０５、表５、図７Ａ）。有意ではないが、１．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの用量は、ＩＦＷＭ対照および０．３ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群と比べて、破損に対する極限の力において、平均でそれぞれ５７．４％および５５．０％の増加をもたらした。破損時に吸収されたエネルギーの有意な差は、３つの処置群（ｐ＝０．２０９：ＩＦＷＭ、６４２３．３３±１８１１．２６Ｎ＊ｍｍ；０．３ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、７３４６．００±２９８９．９４Ｎ＊ｍｍ；１．０ｍｇ／ｍＬのＰＤＧＦ、１２１７３．３３±２０４９．６２Ｎ＊ｍｍ）の間でまったく識別されなかったが、１．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群における破損時に吸収されたエネルギーは、ＩＦＷＭ対照および０．３ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群より、平均でそれぞれ８９．５％および６５．７％大きかった。
【０１８３】
【表５Ａ】
2018030895.tif 000008
分析から除外された血腫のある２つの試料を含む、生体力学的試験の破損までのランプ成分からの未処理データを表５Ｂに示す。外科的に修復したアキレス腱における、任意の全体的な準静的パラメータについての有意な差は、ＩＦＷＭ、ＩＦＷＭ＋０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、またはＩＦＷＭ＋１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群の間でまったく識別されなかった（ｐ＞０．０５、表５Ｂ、図７Ｂ）。有意ではないが、１．０ｍｇ／ｍｌのＰＤＧＦの用量は、ＩＦＷＭ対照および０．３ｍｇ／ｍｌのＰＤＧＦ群と比べて、破損に対する極限の力において、平均でそれぞれ５７．４％および２２．２％の増加をもたらした。破損時に吸収されたエネルギーの有意な差は、３つの処置群（ｐ＝０．２４７：ＩＦＷＭ、６４２３．３３±１８１１．２６Ｎ＊ｍｍ；０．３ｍｇ／ｍｌのＰＤＧＦ、９８５０．７５±４００６．３６Ｎ＊ｍｍ；１．０ｍｇ／ｍｌのＰＤＧＦ、１２１７３．３３±２０４９．６２Ｎ＊ｍｍ）の間でまったく識別されなかったが、１．０ｍｇ／ｍｌのＰＤＧＦ処置群における破損時に吸収されたエネルギーは、ＩＦＷＭ対照および０．３ｍｇ／ｍｌのＰＤＧＦ処置群より、平均でそれぞれ８９．５％および２３．６％大きかった。
【０１８４】
【表５Ｂ】
2018030895.tif 000009
血腫のある２つの試料を分析に含めて（表６、図８（左））、１．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群（ｎ＝６、３１２．５６±２０．８６Ｎ／ｍｍ）における修復組織の局所的剛性は、０．３ｍｇ／ｍＬの処置群において定量化した局所的剛性（ｎ＝６、１７６．３０±３１．１７Ｎ／ｍｍ）より、平均で７７．３％大きかった。この差は統計的に有意である（ｐ＝０．０１２）。修復組織の局所的剛性の有意な差は、１．０ｍｇ／ｍＬのＰＤＧＦ処置群およびＩＦＷＭ対照（ｎ＝６、２１５．２３±３３．２３Ｎ／ｍｍ、ｐ＝０．０７５）の間でまったく識別されなかった。分析から除外した血腫のある２つの試料を含めて（図８（右））、１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群における修復組織の局所的剛性は、０．３ｍｇ／ｍｌの処置群において定量化した局所的剛性（ｎ＝４、２２３．７２±１１．４６Ｎ／ｍｍ）より、平均で３９．７％大きかった。この差は統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．０９６）。しかし、１．０ｍｇ／ｍｌ群における修復組織の局所的剛性は、ＩＦＷＭ対照の修復組織の局所的剛性（２１５．２３±３３．２３Ｎ／ｍｍ）より有意に大きかった（４５．２％、ｐ＝０．０３９）。
【０１８５】
【表６】
2018030895.tif 000010
試験した１８（ｎ＝８）の処置コンストラクトのうちで、ｎ＝１６（８８．９％）が、調製組織と無傷のアキレスの近位界面で破損した。注目すべきことに、ＩＦＷＭ＋０．３ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群におけるそのようなコンストラクトの２つは、修復組織の外側側面上に血腫を示し、これは、解剖および後続の生体力学的試験の間に肉眼で見えた。両コンストラクトにおいて、破損は、これらの領域で開始した。残りのｎ＝２（１１．１％）の処置コンストラクトは、修復性組織と無傷のアキレスの遠位界面で破損した。ｎ＝６の無傷の対側アキレス腱コンストラクトについての破損様式は多様であった。２つの（ｎ＝２、３３．３％）無傷のコンストラクトは、ＰＭＭＡポッティング材内の中足骨破損を介して破損した。３つの（ｎ＝３、５０％）無傷のコンストラクトは、アキレス腱の中央物質（ｍｉｄ−ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）引裂を介して破損し、１つ（ｎ＝１、１６．７％）は、踵骨裂離を介して破損した。
【０１８６】
結論
インビボで８週間後、ＩＦＷＭ＋１．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで処置した群について観察された生体力学的データは、ＩＦＷＭ対照およびＩＦＷＭ＋０．３ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群と比較して一貫して増加し、より大きい治癒応答を平均で示した。この投薬効果は、０．３ｍｇ／ｍＬおよびＩＦＷＭ単独の処置群と比べて、それぞれ、５５％／２２．２％（ｎ＝６／ｎ＝４）および５７．４％の極限破損までの荷重の増大として顕在化した。修復（すなわち、局所的な）組織剛性は、０．３ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢおよびＩＦＷＭ単独の処置群と比べて、平均でそれぞれ、７７．３％／３９．７％（ｎ＝６／ｎ＝４）および４５．２％増大した。さらに、ＩＦＷＭ＋１．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群についてのこの試験で観察された極限の力は、マトリックス（血小板に富む血漿フィブリンマトリックスと合わせたコラーゲンパッチを使用する２４週間の修復（Ｓａｒｒａｆｉａｎら、Ｔｒａｎｓ  ＯＲＳ、３３巻：３２２頁（２００８年）より３４．９倍高い））、またはタンパク質（ＣＤＭＰ−２で処置された３週間の修復（Ｖｉｒｃｈｅｎｋｏ、Ａｒｃｈ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｔｒａｕｍａ  Ｓｕｒｇ、１２８巻：１００１〜１００６頁（２００８年）より１．９倍高い））を利用した他の試験と比較して増大した。
【０１８７】
組織学的試験
組織の回収およびトリミング
安楽死させた後、手術したアキレス腱を回収し、組織の湾曲を防止するために添え木で支え、組織学的処理のために１０％の中性緩衝ホルマリン中に入れた。手術したアキレスに加えて、２つの未手術の対側アキレス腱を回収して組織を分析した。２４時間固定した後、メスを使用して各アキレス腱を内側と外側の半分に二分した。アキレスの近位端に刻み目を付けることによって、組織学的処理の間を通して配向を保存した。１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群中の１頭の動物は、試験と無関係の理由（肺炎）のために、治癒の４０日（５．８週間）後に安楽死させた。
【０１８８】
組織学的処理
標準的なパラフィン組織学技法および装置（Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｃｉｔａｄｅｌ  ２０００  ＰｒｏｃｅｓｓｏｒおよびＳｈａｎｄｏｎ  Ｈｉｓｔｏｃｅｎｔｒｅ  ２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｈａｎｄｏｎ，  Ｉｎｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して、すべての試料（ｎ＝８）をさらに固定、脱水、浄化、浸潤、および包埋した。Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｆｉｎｅｓｓｅロータリーミクロトーム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｈａｎｄｏｎ，  Ｉｎｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）でパラフィンブロックをフェイシングし、約１０ミクロンの切片を切断した。合計４０切片に対して、１試料当たり５枚の切片を切断した。各組織切片をヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｉｍａｇｉｎｇシステム（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）およびＮｉｋｏｎ  Ｅ８００顕微鏡（ＡＧ  Ｈｅｉｎｚｅ、Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ、ＣＡ）を使用して、対象とする領域を含む染色したスライド全体について、高分解能デジタル画像をフィールドバイフィールドで得た。
【０１８９】
定性的病理組織検査
すべての組織切片について、修復性／治癒組織、天然の腱／修復性組織界面、血管新生、炎症、およびコラーゲン密度／線維配向の質を評価した。切片は、処置に対して盲検化して評価した。Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓイメージングシステムを使用して、較正した全体のデジタル画像によって腱の退縮も測定した。
【０１９０】
結果
腱の退縮
すべての手術した試料を、治癒して８週間後にある程度の腱の退縮を示した。平均で、アキレス腱は、投与なしの群について５５．７±１６．１ｍｍ、０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ用量群について３９．８±４．５ｍｍ、および１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ用量群について４４．４±１．５ｍｍ退縮した。
【０１９１】
病理組織検査
８週間の治癒後に、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの用量にかかわらず、すべての試料において流動性コラーゲンは目に見えた。流動性コラーゲンは一般に、修復部位の遠位末端に向かってより多く認められた。少数例において、流動性コラーゲンは、修復部位の中心から修復性組織の背側表面に向けて移動していた。１つの試料において、修復部位の全長にわたって分散した流動性コラーゲンが観察された。軽度の炎症のみが、流動性コラーゲン中およびこの周囲に観察された。炎症は、用量なしの試料と比較して流動性コラーゲン＋ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群（０．３ｍｇ／ｍｌおよび１．０ｍｇ／ｍｌの用量）においてわずかに増大していると判断された。炎症は一般に、多核異物巨細胞および／または単核炎症（リンパ球、単球および血漿細胞）からなっていた。好中球は一般に観察されなかった。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの用量にかかわらず、流動性コラーゲン内に、活性化線維芽細胞による新規コラーゲン産生を伴う線維増殖が観察された。いくつかの線維増殖が流動性コラーゲン内に観察されたが、修復性コラーゲン線維内に不連続があった。天然アキレス腱の近位末端および遠位末端は、修復性組織の新規コラーゲン線維と一般によく一体化されていた。少数例において、遠位の界面は、近位の界面と比較した場合、わずかにより良好な一体化を示した。近位の界面は、軽度の炎症と合わさった、ねじれた天然アキレス腱端部とともに、未成熟コラーゲンを産生する多くの幼若線維芽細胞を含有していた。
【０１９２】
処置またはｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの用量にかかわらず、高密度のコラーゲン線維を伴った、活性化線維芽細胞による比較的高い線維増殖およびコラーゲン産生があった。偏光を使用して観察した場合、主要なコラーゲン線維のアライメントは天然アキレスコラーゲン線維方向と一致していた。線維芽細胞密度は、処置同士間で同様であった。一試料において、線維芽細胞の密度は相対的により低く、コラーゲン線維はより未成熟であり、より密度が低く、より配向性が低かった。コラーゲン線維は一般に、天然のアキレス線維方向と平行に整列していたが、コラーゲンまたは線維芽細胞密度について群間で差はまったく観察されなかった。
【０１９３】
炎症は、すべての処置について、修復部位内に観察され、一般に軽度であった。炎症は、単核の炎症（リンパ球、単球、および血漿細胞）を伴った多核異物巨細胞からなっていた。好中球は、一般に観察されなかった。炎症は、縫合糸物質および流動性コラーゲンの存在に関連しており、まず間違いなく、宿主組織の局在的な損傷によるものであった。豊富な血管新生も、すべての処置について、修復部位内で観察された。炎症の増大は、より豊富な血管新生と関連していた。血管肥大、膨らんだ内皮細胞を伴った反応性血管、および血管壁の肥厚は、すべてのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの用量について観察された。用量なしの試料と比較した場合、０．３ｍｇ／ｍｌおよび１．０ｍｇ／ｍｌの用量で処置した試料において、より肥大性の血管が確認された。これらの血管は通常、背側表面の表層性領域における修復性組織内に位置していた。一試料（手術後４０日）において、豊富な血管新生があったが、これらの血管はより小さく、肥大性血管は観察されなかった。ヘマトマトマタスな（ｈｅｍａｔｏｍａｔｏｍａｔｏｕｓ）空間およびフィブリンとともに見出された出血が、２試料において観察された。
【０１９４】
結論
要約すると、試験した限られた数の試料に基づいて、０．３ｍｇ／ｍｌの用量、１．０ｍｇ／ｍｌの用量、および対照（用量なし）群の間で、アキレス腱修復において定性的な差はまったくなかった。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの存在は、治癒を妨げず、また、組織学的に負の応答を誘発（ｉｌｌｉｃｉｔ）しなかった。０．３ｍｇ／ｍｌの用量および１．０ｍｇ／ｍｌの用量の処置群の間で同様の治癒があった。すべての手術した試料は、ある程度の腱退縮を示した。流動性コラーゲンは、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置または用量にかかわらず、すべての試料において目に見え、一般に修復部位の遠位末端に向けて位置していた。炎症は、一般に軽度であり、単核の炎症（リンパ球、単球、および血漿細胞）を伴った多核異物巨細胞からなっていた（ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ  ｏｆ）。炎症は、用量なしの群と比較した場合、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（０．３ｍｇ／ｍｌおよび１．０ｍｇ／ｍｌの用量）で処置した流動性コラーゲン内でわずかに増大したと判断された。修復性組織において、高密度のコラーゲン線維を伴った、実質的な、進行中の線維増殖があり、これは、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの処置または用量に無関係であった。修復性コラーゲン線維のアライメントは一般に、天然アキレスコラーゲン線維方向と平行であった。コラーゲンおよび線維芽細胞密度は、処置同士間で同様であった。豊富な血管分布は、すべての試料において観察された。用量なしの群と比較した場合、０．３ｍｇ／ｍｌおよび１．０ｍｇ／ｍｌの用量を用いた試料において確認される、より肥大性の血管があることが判断された。少数例では、遠位界面は、近位界面と比較した場合、わずかにより良好な一体化を示し、近位界面では、成熟の低いコラーゲンおよび軽度の炎症と合わさった、ねじれた天然アキレス腱端部が存在した。これは、連続的な腱退縮、および縫合糸の滑りによって生じた同時の局部組織損傷の結果である場合がある。
【０１９５】
（実施例７）
ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢに応答して正常および疾患一次ヒト腱細胞が増殖する
この試験により、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが、腱障害を有する患者に由来する一次腱細胞の増殖および／または走化性を直接活性化したかどうかを判定した。そのような知見は、腱障害におけるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの治療可能性の概念を指示することができる。
【０１９６】
患者および方法
患者
アキレス腱障害を有する５人の患者および後脛骨腱（ＰＴＴ）の腱障害を有する５人の患者を含む、腱障害を有する患者１０人がこの試験に関与した。膝の完全関節置換を受けた追加の５人の患者も関わった。
【０１９７】
腱細胞の一次培養
その他の場合では処分される腱組織は、臨床的適応症のために実施された再建的手術手順の間に、正常な腱および傷害された腱から得た。これらの組織は、アキレス腱またはＰＴＴ腱の腱障害（ｔｅｎｄｉｎｏｐａｔｈｉｃ）部分、ならびに長指屈筋（ＦＤＬ）腱組織、アキレス腱組織、および膝蓋腱組織の健康な（非腱障害）部分を含んでいた。一次腱細胞外植片培養物を、これらの組織から得、継代３〜５で試験した。腱細胞同一性は、特異的プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、腱細胞特異的遺伝子スクレラキス、およびコラーゲンα１（Ｉ）、α２（Ｉ）、およびα１（ＩＩＩ）に関する遺伝子の発現を評価することによって確認した。
【０１９８】
細胞増殖
腱細胞単層をトリプシン処理し、０．５％の透析ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に再懸濁し、一晩付着させ、次いで滴定濃度のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで２４時間インキュベートした。市販のアッセイ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して、細胞中のＤＮＡ合成の間のＢｒｄＵ取り込みに基づいて、細胞増殖速度の変化を評価した。各培養物を、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの各用量について三つ組で試験した。
【０１９９】
細胞遊走
腱細胞単層をトリプシン処理し、０．５％の透析ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に再懸濁し、９６ウェルＣｈｅｍｏＴｘ（登録商標）使い捨て細胞遊走システム（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の上段のチャンバー内に置いた。下段のチャンバーに、滴定濃度のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを入れた。チャンバーを分離している膜を横切って、４８時間腱細胞を遊走させた。次いで、９６ウェルプレートを遠心沈殿し、３回凍結融解することによって、遊走細胞を溶解した。成育可能な遊走細胞の量を、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からの市販キットを使用して、細胞質乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）に基づいて測定した。
【０２００】
統計分析
一元配置ＡＮＯＶＡを使用することによって、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを用いた刺激が、用量依存的な様式で腱細胞増殖に影響するかどうかを判定した。
【０２０１】
結果
対照の肺線維芽細胞培養物または対照の一次Ｔリンパ球培養物ではなく、腱細胞培養物のみがスクレラキシスｍＲＮＡを発現した一方で、リンパ球ではなく、腱細胞および線維芽細胞がコラーゲン遺伝子ｍＲＮＡを発現した。
【０２０２】
すべての場合において、疾患過程に関与した、または関与していない腱組織に由来する腱細胞は、ＢｒｄＵ取り込みを加速することによってｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ刺激に応答した（ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ）。応答は用量依存的であり、１０、５０、および１５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで観察された。すべての細胞培養物がｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ刺激に応答したが、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ刺激後のＢｒｄＵ取り込みの規模において患者間で有意なばらつきがあった。ＢｒｄＵの取り込みは、対照の刺激されていない培養物と比較して、最低２．１±０．２倍から最大１０．７±０．５倍まで増大した。５人の患者に由来する腱細胞は、逆説的に応答し、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢのより高い（５０および１５０ｎｇ／ｍＬ）濃度より低い（１０ｎｇ／ｍＬ）濃度でＢｒｄＵ取り込みがより大きく増大した。そのような逆説的応答は、これらの患者の腱障害組織および正常組織の両方に由来する腱細胞において観察された。４人の患者の健康な腱に由来する腱細胞は、患部組織に由来する腱細胞より、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ刺激に応答して、ＢｒｄＵを２倍多く取り込んだ。１人の患者において、疾患組織に由来する腱細胞が、非病変部の組織に由来する腱細胞より、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ刺激に応答して、ＢｒｄＵを４倍多く取り込んだ。
【０２０３】
すべての場合において、腱細胞は、５０ｎｇ／ｍＬおよび１５０ｎｇ／ｍＬでのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢに対して走化的に応答性であった。走化性実験のために１０ｎｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢに腱細胞を曝さなかったが、これは、パイロット実験において応答が低かったためである。やはり、応答は用量依存的であり、５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢより、１５０ｎｇ／ｍＬに対して走化性が大きかった。しかし、５人の患者に由来する腱細胞は、１５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢより５０ｎｇ／ｍＬに対して大きい走化性で応答し、遊走細胞数の有意な減少を伴った（ｐ＜０．０５、両側スチューデントｔ−検定）。刺激されていない対照と比較して、１．４±０．１〜４．０±０．５倍の増大まで、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢに対する最大の走化性応答において患者間でばらつきがあった。腱障害組織または健康な腱組織に由来する整合（ｍａｔｃｈｉｎｇ）腱細胞培養物内で、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢに対する腱細胞走化性の統計的に有意な差（ｐ＞０．０５）はまったくなかった。
【０２０４】
結論
これらの実験の結果は、健康な組織および腱障害組織に由来する腱細胞は、増殖速度および走化性速度を増大させることによって、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢに応答することを示す。重要なことに、一部の患者に由来する腱細胞は、ＰＤＧＦに対して逆説的な応答を示し、より高い用量は、より低い用量より小さい効果を生じた。同様に重要なことに、疾患の腱に由来する腱細胞は、いくつかの場合では、健康な腱に由来する腱細胞に対して、ＰＤＧＦに差次的に応答性であり、適切な投薬が臨床状況において最も重要となり得ることを示した。
【０２０５】
（実施例８）
腱を骨に再結合する治療において適用するための、組換えヒト血小板由来成長因子−ＢＢ（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）と組み合わせた４つのコラーゲンマトリックスの評価
この試験により、前十字靭帯再建などの腱を骨に結合する治療において適用するための、腱−骨界面でｒｈＰＤＧＦ−ＢＢとともに使用することができる４つのコラーゲンマトリックスの物理的特性、生体適合性（インビトロおよびインビボ）および安定性（生分解）を評価した。
【０２０６】
方法
（ｉ）材料および調製
この試験において、４つのＩ型コラーゲンマトリックス（パッド）を評価した。３つの線維性コラーゲンマトリックス（Ａ、Ｂ、およびＣ）は、様々なコラーゲン密度（Ａ＝４．５％のコラーゲン；Ｂ＝５％のコラーゲン、Ｃ＝６％のコラーゲン；Ｋｅｎｓｅｙ  Ｎａｓｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって提供された、様々な百分率のコラーゲンスラリーから作製されたＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（商標）コラーゲン）のウシ真皮誘導体であり、４番目の線維性マトリックス（Ｄ）は、「高度に多孔質」（９０％の多孔度）として特徴づけられるウシ腱誘導体（ＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）、Ｉｎｔｅｇｒａ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）であった。すべてのコラーゲンシート（１．５〜２．０ｍｍの厚さ）を打ち抜いて直径８ｍｍのディスクにし、物理的特徴づけおよびインビトロ（細胞適合性）評価を行った。インビボ（生体適合性および生分解）評価は、１×１ｃｍ２のパッドを利用して実施した。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ：０．３ｍｇ／ｍｌの組換えヒト血小板由来成長因子（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）も調製した。
【０２０７】
細胞源は、ヒツジ屈筋腱から単離した一次ヒツジ腱細胞（＜４継代）であり、これは、成長培地（１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２）中で培養し、使用する１２時間前に基本培地（２％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２）でダウンレギュレートした。
【０２０８】
（ｉｉ）インビトロ細胞適合性試験
基本培地中の腱細胞懸濁液５０μｌ（５０，０００細胞）を各コラーゲンディスクに添加した。培地出現を伴うことなく、３７℃および５％のＣＯ２雰囲気で１時間インキュベートした後、細胞を播種したディスクを、単独の、またはｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（３０ｎｇ／ｍｌ）を組み合わせた基本培地２ｍｌで予め満たした２４ウェルプレートに移した。１２時間静置培養した後、細胞を播種したディスクを含むプレートを、インキュベーター内の軌道振盪機（６０ｒｐｍ）上に配置した。培地交換は、４８時間毎に行った。２、４、および６日目に、各物質および処置からの三つ組の試料をＡＴＰアッセイのために利用することによって、コラーゲンマトリックス中／上の生細胞数を求めた。４日目に、各物質および処置からの１つの試料を、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）評価のために使用した。６日目に、各物質および処置からの四つ組の試料を利用して組織学的評価を行った。
【０２０９】
（ｉｉｉ）インビボ生体適合性および生分解試験
合計１２匹のニュージーランド白ウサギをこの試験に使用した。前方−内側の切開によって、大腿骨を露出した。骨膜を除去した後、大腿骨の腹側表面の中間点を位置づけ、この中間点に対して約０．５〜０．８ｃｍ近位および遠位の２つの範囲（１ｃｍ×１ｃｍ）を、ラウンドバーおよび骨の過熱を防止するための多量の洗浄を使用して皮質除去した。内側および外側縁部上の皮質除去部位の中間点で２つの穴（０．９ｍｍ）をあけた。最後に、５〜０絹縫合糸を２つの穴に通し、次いでコラーゲンパッド（０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ  １００μｌで予め飽和させた）を縛ることによって、大腿骨の表面にパッドを固定した。手術は両方に行い、その結果、各大腿骨は２つのパッドを受け、各動物は４つの異なるコラーゲンパッドをそれぞれ１つ受けた。大腿骨上のパッドの順序は無作為化した。手術して１、２、および３週間後に、４匹の動物を安楽死させ、パッドおよび周囲組織と一緒に大腿骨を１０％の中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中で固定し、メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）中に埋め込み、Ｇｏｌｄｎｅｒのトリクローム手順で染色した。
【０２１０】
結果
（ｉ）インビトロ細胞適合性試験
ＡＴＰアッセイにより、コラーゲンディスク上／中の細胞増殖は、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの存在下で有意に増大し、培養物中で時間とともに増大し、同じ処置状態下で、異なるマトリックスにわたって有意な差は観察されなかったことが明らかになった。マトリックス単独についてのＳＥＭ画像により、多孔度において定性的な差が明らかになり、マトリックスＤは最大の多孔度を示し、マトリックスＡ、Ｂ、およびＣは、漸減するレベルの多孔度を示した。細胞播種後のマトリックスのそれぞれについてのＳＥＭ結果は、異なる密度の３つの線維性マトリックスの表面上でより多くの細胞が観察され、「高度に多孔質な」マトリックス（Ｄ）の表面上で最少の細胞が観察されたことを示した。細胞を播種したマトリックスのそれぞれの断面からの組織画像は、ＳＥＭ観察結果をさらに支持し、漸増密度のマトリックスについて、パッドの外表面に沿った細胞分布を示し、マトリックスＤは、マトリックス全体にわたって細胞の最大分布を示した。
【０２１１】
（ｉｉ）インビボ生体適合性および生分解試験
組織学的評価により、４つのすべてのコラーゲンパッドは、移植後１週間無傷のままであったことが明らかになった。４つの異なるマトリックスの周囲の組織において、顆粒球および単核細胞の細胞浸潤の増大があった。移植して２週間後に、マトリックスＡ、Ｂ、およびＤについて部分的な分解が観察され、明白な細胞浸潤がマトリックスＤに伴っていた。移植して３週間後に、マトリックスＤは、大部分が分解し、正常な線維芽細胞の中で小さいコラーゲン断片のみが観察された（図９Ｄ）。真皮が起源のコラーゲンマトリックス誘導体（Ａ、Ｂ、およびＣ）を受けた部位は分解を示し、これはコラーゲン密度と反比例した。広範な炎症細胞浸潤がこれらのマトリックスについて観察され、これは、３週間の観察期間にわたってより局在的となった（図９Ａ〜９Ｃ）。
【０２１２】
結果は、コラーゲンマトリックスＤは、最も多孔質であり、均質の微細なコラーゲン線維ネットワークを有し、細胞結合および遊走にとってより多くアクセス可能な表面積を提供することを示した。個々のマトリックスのインビボ評価は、コラーゲンＤは、最短の滞留期間を示し、最も生体適合性である物質であると思われ、移植して３週間後に最小の炎症細胞浸潤を示した一方で、異なる密度のコラーゲンマトリックスは、漸増する炎症細胞浸潤を示し、これは移植して３週間後までに局在化して病巣になったことを示した。
【０２１３】
（実施例９）
腱−骨または靭帯−骨再結合のヤギモデルにおける、腱のトンネル固定を増強するための、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢおよびコラーゲンラップの使用
この試験は、骨幹端を貫く（ｔｒａｎｓｍｅｔａｐｈｙｓｅａｌ）脛骨トンネル中に長指屈筋腱を挿入および固定する前に、ある用量のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ中に浸漬したコラーゲンスポンジをラップすることの組織学的および生体力学的利点を評価する。前十字靭帯（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｕｒｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）を再建するためにグラフトを添える方法は、Ｒｏｄｅｏら、Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．  Ａｍ．、７５巻（１２号）：１７９５〜１８０３頁（１９９３年）に記載された通りであった。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢと組み合わせたコラーゲンパッドを使用することによって、脛骨挿入部位内での腱または靭帯のより急速で完全な一体化を促進する。
【０２１４】
（Ａ）物質および方法
（ｉ）種
ヤギは、ヒトと同様に、その骨は、骨形成および再吸収のバランスのとれた組合せであり、正常な骨構造に導くリモデリングを起こすので、適当なモデルである。ラットまたはマウスなどのより小さい動物の骨は、リモデリングを起こさず、したがって腱が骨と再一体化するにつれて起こる生物学的プロセスを表さない。さらに、ヤギなどのより大きい動物の腱は、ヒトの手術において使用される技法および器具を使用して、より容易に操作および再結合することができる。
【０２１５】
合計２４頭の骨格的に成熟したヤギ（メス、混合された遺伝的背景）をこの試験において使用する。これらの動物を３つ処置群に分割する（表７）。群１に、外側側部上の大腿挿入部からの長指屈筋腱の素早い剥離、その後に脛骨骨幹端を通して斜めにあけられた骨トンネルを通るスレッディングを行う。反対側では、ステンレス鋼縫合糸で脛骨の内側皮質に腱を結合させる（図１０および１１参照）。群１の動物の対側の肢は、群２におけるものを含む。群２に同じ外科手術を行うが、トンネルを通すスレッディングの前に、腱に２５×１５ｍｍのコラーゲンスポンジ（ＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）、Ｉｎｔｅｇｒａ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ、ＮＪ）でラップする。脛骨の内側皮質に添えたら、コラーゲンマトリックスを酢酸ナトリウムバッファー（２０ｍＭ、ｐＨ６．０）１．０ｍＬで水和する。各動物内で、これらの処置を受ける肢を無作為化する（表８）。群１および２について合計１０頭の動物を使用し、各時点（２週間および４週間）についてｎ＝５をもたらす。生涯（各時点および各処置に使用される動物のコホート）における各回は、生体力学的試験について３つの試料、および組織学について２つの試料を生じる。
【０２１６】
群３の動物に群２におけるものと同じ外科手術を行うが、コラーゲンスポンジは、１．０ｍｇ／ｍＬの組換えヒト血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１．０ｍＬで水和する。この群において、両方の肢にＰＤＧＦ−ＢＢで処置を施す。群３は、１０頭の動物からなる；これは、各時点（２週間および４週間）についてｎ＝１０試料（２つの手術した肢／動物）をもたらす。生涯における各回は、生体力学的試験について５つの試料、および組織学について５つの試料を生じる。
【０２１７】
外科的パイロット試験のためにさらに２頭を使用することによって、物質を外科的に移植する実現可能性を確認する（一方に上記群１および２について記載した処置を施し、他方に上記群３について記載した処置を施す）。これらの動物を、手術後２週間観察することによって、正常な歩行運動に戻ること、および合併症がないことを確認する。この期間の後、パイロット試験からの動物を安楽死させ、組織を収集する。手術および術後の評価期間が、事故を伴うことなく行われる場合、試験の残り（２０頭の動物）を計画したように実施する。
【０２１８】
（ｉｉ）試験物品および対照物品
試験物品１は、２０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．０＋／−０．５中の１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢであり、液体形態であり、２℃〜８℃で貯蔵する。試験物品２は、ＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）、Ｉｎｔｅｇｒａ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓからのコラーゲンであり、固体形態であり、室温で貯蔵する。
【０２１９】
ｉｉｉ）用量調製
コラーゲンのｒｈＤＧＦ−ＢＢとの混合
試験物品および対照物品を混合する。無菌配合物を物品に使用する。すべての混合は室温で実施する。製剤化した試験物品および対照物品は、調製して最大１時間後までに使用する。
【０２２０】
コラーゲンパッドを切断して２５×１５ｍｍにし、腱上にラップし、骨トンネル中に通す。２７Ｇの針を用いて、１．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ  １．０ｍＬを、コラーゲンマトリックスの最終的な移植部位に隣接したトンネル中に注入する。トンネルの内側および外側の開口部に、合計で約０．５ｍＬの１．０ｍｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを投与する。トンネルの内側または外側で行われる注入は、トンネル周囲の複数箇所、すなわちトンネル開口部のおおよそ１／４、１／２、３／４、および全円周で注入することによって行われる。
（ｉｖ）試験システム（動物および動物のケア）
３０〜４０ポンドの、Ｑ熱検査して健康が証明された、骨格的に成熟したメスの家畜ヤギ（混血、ｎ＝２４）を使用する。予備実験のために動物はまったく使用しなかった。動物は、ヤギ１頭当たり最低１０平方フィートの空間を有するラン内に置いた。ケージは、ステンレス鋼で構築し、定期的に清掃する。周囲温度を６０〜８０°Ｆの間に維持し、湿度を３０〜７０％の間に維持する。
【０２２１】
ヤギに、バケツでおよび自動給水システム（ＬＩＸ−ＩＴ）によって自由に水を与える。乾草は、連続的に１日１回提供する。ヤギに市販で購入したヤギ用固形飼料を与える。試験動物は、投薬の初日の前に少なくとも１４日間、指定された小屋に順応させる。この順化期間により、動物が、試験室の設定に慣れることが可能になる。すべての動物に、心拍数、呼吸、および糞便浮遊を含めた理学的検査を施す。獣医によって優れた健康状態にあると判断された動物のみを施設に入れ、試験を認める。アイボメック（１ｃｃ／７５ポンド）、ならびにペニシリンＧおよびベンゾカイン（１ｃｃ／１０ポンド）を用いて、動物を予防的に処置する。
【０２２２】
（Ｂ）実験デザイン
（ｉ）一般的な説明および外科的方法
１ｍｌ／１０ｋｇで、ＩＭでヤギカクテル［ケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ）１０ｃｃ＋キシラジン（２０ｍｇ／ｍｌ）１ｃｃ］を使用して、前投薬の３０分以内に麻酔を誘導する。誘導後、頭部ＩＶカテーテルを所定位置に配置する。眼の軟膏を角膜上に穏やかに塗布することによって眼の乾燥を最小限にする。気管内チューブ（５−８  ＥＴＴ）ならびにルーメンチューブを使用してヤギに挿管する。再呼吸回路を使用して１００％の酸素で送達される１．５〜２％のイソフルランを使用することによって麻酔を維持する。必要な場合、一回呼吸量（１５ｍＬ／ｋｇ  ＢＷ）による人工呼吸器上にヤギを置く。麻酔の間全体にわたって、１０ｍｌ／ｋｇ／時間で加温した乳酸リンガー液をヤギに投与する。
【０２２３】
ペニシリンＧおよびベンゾカイン（１ｃｃ／１０ポンド  ＢＷ）を、手術の１時間前、および手術後のＥＯＤ（エンドオブデイ（ｅｎｄ  ｏｆ  ｄａｙ））に、合計３回の投与にわたって投与する。ブプレノルフィン（Ｂｕｐｒｅｎｅｘ）を、手術後、０．００５ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩＭ  ＢＩＤ×４８時間で投与する。
【０２２４】
手術部位を、無菌手術（滅菌食塩液と交互に３−クロルヘキシジン［４％］のスクラブ）に対して準備し、ドレープする。無菌的に、外側傍膝蓋（ｐａｒａｐａｔｅｌｌａｒ）切開によって各膝関節を露出し、長指伸筋腱を外側大腿顆上の挿入部から素早く剥離する（図１０）。前脛骨筋の筋膜を切開し、筋肉を横方向に後退させることによって、近位脛骨骨幹端を露出する。
【０２２５】
脛骨の長軸に対して３０度と４５度の間の角度で、近位脛骨骨幹端内に直径５．６ｍｍのドリル穴を作る（図１１）。すべてのドリル穴あけは、多量の洗浄とともに実施し、脛骨内顆（触診した関節ラインの１ｃｍ下）の近位で開始し、脛骨の外側（触診した関節ラインの２ｃｍ下）上の遠位で終了する。ドリルであけた穴の深さは、薄い金属の深さゲージを用いて測定し、記録する。２５×１５ｍｍのコラーゲンスポンジを、重ねることなく腱の周囲にラップし、４−０Ｖｉｃｒｙｌ縫合糸で固定し、次いでステンレス鋼ワイヤを用いて骨トンネルに通す。骨の反対側では、２つの小さい穴、および４−０ステンレス鋼の結節縫合を使用することによって腱を内側皮質に固定する。コラーゲンをラップした腱を骨に固定した後、２７Ｇのシリンジ針を使用して、ｐＨ６．０の酢酸ナトリウムバッファー１ｍＬを分割量でトンネルの両側に注入することによって、コラーゲンスポンジを水和させる。コラーゲンラップを施していない対照動物の腱は、単に骨トンネルに通し、内側皮質上で固定する。成長因子で処置した腱は、上記のようにコラーゲンスポンジでラップし、骨トンネルに通し、内側皮質上で固定し、次いで１ｍｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢを含有する酢酸ナトリウム（ｐＨ６）バッファー１ｍＬで水和する。
【０２２６】
軟部組織は、吸収性縫合糸（例えば、４−０  Ｖｉｃｒｙｌ）を用いて層状に閉じる。切開部および皮膚を閉じた後、各肢の放射線撮影を実施することによって、トンネルの位置および角度を記録する。理想的には、放射線撮影は、脛骨トンネルの全長を画像化するような向きにする。
【０２２７】
ヤギを胸骨横臥位にし、移動できるようになったとき、これらを檻に戻す。各ヤギを自由に飲食させる。
【０２２８】
骨幹端の骨トンネル中に挿入された長指屈筋腱の一部に、ある用量のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを添加することにより、生体力学的破損までの荷重の２５％の増大、ならびに組織像およびマイクロＣＴによる一体化および石灰化の改善を示すことが予期される。
【０２２９】
外科手術を、獣医の存在下で２頭の動物に対して最初に実施することによって、手術および動物ケアのすべての側面を考察する。１４日後、すべての動物が事故を伴うことなく回復した場合、次いで実験的なプロトコールを実施する。困難が生じる場合には、研究者らは、獣医スタッフと鋭意取り組むことによって、動物に最適なケアを提供し、試験の成功を保証するのに必要なあらゆる問題を解決する。手術の間、動物に麻酔をし、動物に鎮静剤を投与して血液サンプリング手順を行う。
【０２３０】
（ｉｉ）群の割り当ておよび用量レベル
【０２３１】
【表７】
2018030895.tif 000011
【０２３２】
【表８】
2018030895.tif 000012
（Ｃ）生存中の観察および測定
動物を、試験の間全体にわたって少なくとも毎日観察する。事前選択判定基準が完成したら観察の記録を開始し、試験の終了まで継続する。歩行運動の変化を含む、一般的な外見および挙動についての変化について各動物を観察する。手術の前、および屠殺時に体重を測定する。体重は、動物の健康をモニターするのに必要な場合、追加の時点で測定する。
【０２３３】
術後１週目の最後に、２週目で屠殺される動物に、１０ｍｇ／ｋｇのカルセイン（購入先ＴＢＤ）をＩＰ（腹腔内）注射する。同様に、３週目に、４週目で屠殺される動物に、１０ｍｇ／ｋｇのカルセイン（購入先ＴＢＤ）をＩＰ注射する。これらの注射は、組織試料のトンネル中への新規骨形成および成長のスケッチを提供する。
【０２３４】
（Ｄ）臨床病理学的評価
（ｉ）分析のための血清採取
外科手術前に１回、および屠殺前に、すべての動物から血液約５ｍｌを無添加（すなわち、「血餅」）チューブに採取する。血液を遠心分離することによって血清を得、２つのアリコートに分割する。さらなる分析のために、血清を−７０℃以下で貯蔵する。
【０２３５】
（Ｅ）解剖学的病理学
適切な試験エンドポイントですべての動物を屠殺する。死亡したことが分かった、または瀕死状態で屠殺された動物に肉眼的剖検を行うことによって、死亡原因を判定する。
【０２３６】
（ｉ）剖検
ＵＳＤＡ動物保護法および実験動物の管理と使用に関する指針（ＩＬＡＲ刊行物、１９９６年、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ）に従ってヤギを安楽死させる。１ｍｌ／１０ｋｇ  ＩＭで、ヤギカクテル［ケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ）１０ｃｃ＋キシラジン（２０ｍｇ／ｍｌ）１ｃｃ］を使用してヤギに最初に鎮静剤投与する。次いで、１ｃｃ／１０ポンドＢＷ  ＩＶで、Ｅｕｔｈａｓｏｌ（３６０ｍｇ／ｍｌのナトリウムペントバルビタール）を投与する。聴診および反射（まばたき、引っ込めなど）の欠如によって死亡を確認する。
【０２３７】
（ｉｉ）組織の採取および保存
インプラント部位の巨視的観察および写真撮影
安楽死の時点で、移植部位を肉眼で検査し、部位の記述を記録する。デジタル写真撮影を使用して観察結果を記録する。
【０２３８】
（ｉｉｉ）病理学
後膝関節を外し、ストライカーのこぎりを使用することによって、中央骨幹で脛骨を切断する。臨床評価を実施するのに必要である以上に骨の創傷を露出することなく、周囲の筋肉および皮膚を可能な限りトリムする。各試料に、ヤギの番号ならびにこれが右肢であるか左肢であるかの表示を標識する。組織を中性緩衝ホルマリン（１０体積の固定液：１体積の組織）中に入れ、スポンサーに発送する。
【０２３９】
（Ｆ）エンドポイント
（ｉ）組織学および病理組織学
組織の処理を行う。簡単に言えば、組織をメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）に埋設し、切片にし、ヘマトキシリン／エオシン、Ｓａｆｒａｎｉｎ  Ｏ／Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ、Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ／ＭａｃＮｅａｌおよび／またはＶａｎ  Ｇｉｅｓｏｎを使用して染色して光学顕微鏡評価を行う。評価するための切片の面は、脛骨のトンネルに対して断面および長手方向としてである。各移植部位に残っている物質の量、トンネル壁に沿った腱の石灰化の程度および新規骨成長の量を評価するために、格付けシステムを考案する。ヘマトキシリン／エオシンで染色した切片に隣接する未染色の切片に対してカルセイン視覚化を実施する。
【０２４０】
（ｉｉ）生体力学
生体力学的試験のために保持した試料を、使用するまで−２０℃に凍結させる。トンネルの長軸を、引っ張った腱の方向と合わせるために、脛骨／腱複合体を多軸テーブルに固定する。この方向づけにより、摩擦のいずれの影響も最小限になり、周囲の骨との腱の一体化／石灰化を直接試験することが可能になる。破損までの荷重のピーク測定値を、手作業および術後の放射線撮影によって測定したトンネルの長さに対して正規化する。
【０２４１】
（ａ）試験デザイン
この試験により、脛骨トンネル中の模擬指伸筋腱再結合の機械的性能を求める。１２頭のボーアヤギをこの試験に利用する。
【０２４２】
（ｂ）生体力学的試験
試料を食塩水に浸漬したガーゼでラップし、試験するまで−２０℃で貯蔵する。高ポリメチルメタクリレートを使用して２インチのＰＶＣパイプに脛骨の遠位部分をポッティングする。ポッティング調製および生体力学的試験の間、１５分間隔で食塩水をスプレーして、試料を湿気のある状態に保持する。物質試験システム負荷フレーム（ＭＴＳ  ＭｉｎｉＢｉｏｎｉｘ、Ｅｄａｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ、ＭＮ；図１２）に強固に付けられた特注設計試験備品にポッティングした脛骨を取り付ける。腱の天然断面をつかむように設計された特注設計のクライオクランプをこの試験において使用することによって、コンストラクトに一軸性のけん引力を印加する。任意の残っている外側の縫合糸を横切する。
【０２４３】
生体力学的および組織学的読みの分析を、共分散技法の分析によって実施する。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢおよびＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）の効果を、動物の体質量および腱の直径を共変量として調査する。
【０２４４】
読みは、適切な方法によって分析する前に変換することができる。
【０２４５】
フェーズＩ：３０サイクルの動的プレコンディショニング
周期的な負荷試験を最初に使用することによって、腱修復をプレコンディショニングする。１０ニュートン（Ｎ）の前負荷を印加し、コンストラクトの力を約４０％緩和させる。これにより、すべてのコンストラクトについての初期構成が指定される。次いで、修復したコンストラクトを、定常状態に達するように、３０サイクルにわたって０．２５Ｈｚで１０〜３０Ｎの力制御プロトコールで周期的にプレコンディショニングする。本発明者らの実験室における以前の実験は、変位対時間曲線の傾きは、２０サイクルと３０サイクルの間で安定となるように思われることを示すので、３０（ｎ＝３０）サイクルを選択する。
【０２４６】
フェーズ２：準静的破損負荷
プレコンディショニングした後、１ｍｍ／ｓの速度での変位制御下で、修復したコンストラクトに破損するまで負荷をかける。対象とする生体力学的パラメータは、極限破損までの荷重、および準静的剛性（負荷−変位曲線の傾きとして定義される）を含む。最後に、破損機構を各試料について記録する。各試料のデジタル画像を、試験デバイスに装填する際、および破損後に撮って、破損の様式および条件を記録する。
【０２４７】
（ｉｉｉ）マイクロトモグラフィー（ＣＴ）
試料サイズによって決定される最適な分解能で各試料をスキャンする。図１３を参照。円柱状欠陥に対する近似断面でスライスを得る。半自動輪郭法を使用することによって、欠陥の本来の境界の周囲長に限定される関心体積（ＶＯＩ）を選択する。最適化した密度閾値およびノイズフィルターを選択し、すべての試料に均一に適用することによって、軟部組織から骨を分割する。総平均密度、骨の平均密度、およびトンネル内の骨体積／総体積を計算する。
【０２４８】
（実施例１０）
ＢｅｎｃｈＴｏｐモデルによる、ＢＩＯＢＬＡＮＫＥ（商標）およびＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）マトリックスからのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（組換えヒト血小板由来成長因子−ＢＢ）の放出特性の評価
この試験の目的は、室温でＢｅｎｃｈＴｏｐモデルを使用して、様々な密度を有するＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（商標）およびＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）マトリックスからのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ放出を測定することである。
【０２４９】
試験物質
【０２５０】
【表９】
2018030895.tif 000013
試験デザイン
試験デザインを、すべての試料群（ＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（商標）マトリックス、ＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）マトリックス、およびコラーゲンマトリックスを含まない対照群）について５分の初期フラッシング時間を示す表１０に列挙する。
【０２５１】
【表１０】
2018030895.tif 000014
無菌法を使用して、生検パンチを用いて、ＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（商標）およびＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）シートのそれぞれから８ｍｍのディスクを打ち抜く。シリンジ針を使用することによって、２７Ｇ１１／４針で１枚のＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（商標）およびＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）ディスクを穏やかに突き刺し、特別に設計されたチャンバー内に取り付けられた１ｍＬのシリンジヘッドを有する針を接続する。ＰＤＧＦ−ＢＢ（２０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー中１．０ｍｇ／ｍＬ）５０μｌを各ディスクにかける。次いで、ディスクを室温で１０分間インキュベートする。関節鏡カニューレデバイスへのシリコンチューブの一方の端、および２０ｍｌのシリンジへのチューブの他方の端を図１４に示すように接続する。溶出バッファー（ＥＭＥ＋２％のＦＢＳ）２０ｍｌをシリンジ中に満たし、Ｖａｒｉｓｔａｌｔｉｃポンプへのシリコンチューブをアセンブルする。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで飽和したコラーゲンパッドを、関節鏡カニューレデバイスの頂部に装填する。２００ｍｌ／分（予め較正した）の流速を設定する。ポンプの電源を入れ、５分作動させる。対照については、関節鏡カニューレデバイスの頂部からシステムに、１．０ｍｇ／ｍｌでｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ  ５０μｌを添加する。フラッシングして５分後に、ポンプを依然として作動させながら、シリコンチューブを２０ｍｌのシリンジから外すことによって、５０ｍｌの円錐チューブに溶出バッファーを収集する。分析のために試料を２〜４℃で貯蔵する。各試料中で溶出されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの量は、以下のＥＬＩＳＡアッセイ手順において説明するように、Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓからのＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキットを使用して測定する。
【０２５２】
ＥＬＩＳＡアッセイ手順
捕獲試薬は、捕獲試薬原液５６μｌをＤＰＢＳ  １０ｍｌに添加することによってＤＰＢＳ中の作業濃度（０．４μｇ／ｍｌ）に希釈し、次いで希釈捕獲試薬１００μｌを、９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。プレートをプレートシーラーで密封し、振盪機上で、室温で一晩インキュベートする。吸引および分配マニホールドからの気泡を排出し、プレートを洗浄バッファーで３回洗浄する。溶出バッファー２００μｌを各ウェルに添加し、揺り動かしながら室温で２時間（最大４時間）、プレートをブロックする。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄する。
【０２５３】
ストレプトアビジン（ｓｔｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰは、ストレプトアビジン−ＨＲＰ原液５０μｌを、試薬希釈剤バッファー１０ｍｌに添加することによって、試薬希釈剤バッファー中の作業濃度（２００倍希釈）に希釈する。次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ  １００μｌを各ウェルに添加し、アルミホイルで覆い、軌道振盪機上で、室温で２０分間インキュベートする。ストレプトアビジン−ＨＲＰをプレートに添加した直後に、次いで必要な体積のＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢを、ホイルでラップされた１５ｍｌの円錐チューブにアリコートし、ベンチ上に置き、室温まで平衡状態にさせる。各プレートについて別個のチューブを準備する。次いでプレートを洗浄バッファーで３回洗浄する。
【０２５４】
Ｓｕｒｅ  Ｂｌｕｅ  １００μｌを各ウェルに添加し、アルミホイルで覆い、室温で２０分間インキュベートする。１ＮのＨＣＬ  ５０μｌを各ウェルに添加することによって、反応を停止する。反応が停止して３０分以内に、５４０ｎｍで設定した補正値を用いて、４５０ｎｍでの光学密度を読み取る。
【０２５５】
データの計算
４−パラメータグラフを使用してスタンダードをプロットし、各プレートに対する検量線を使用して、各希釈での各試験試料についてのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ濃度を計算する。各時点での２つの希釈からの三つ組の試料のそれぞれについての平均値および標準偏差（ＳＤ）も計算する。
【０２５６】
各試料中に存在する総ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ濃度に各試料の総体積を乗じることによって求める。各時点での各試料中のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積量を、以前の時点にその時点でのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの量を加算することによって計算する。
【０２５７】
４つの時点のそれぞれにおいて放出されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積量についての平均＋／−ＳＤをプロットする。各時点での累積ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ放出量を、同じ時点での対照の平均値で除することによって、各試料中のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ放出率を計算する。各時点での三つ組の試料のそれぞれについてのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ放出率の平均値も計算する。４つの時点のそれぞれにおけるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ放出率についての平均＋／−ＳＤをプロットする。
【０２５８】
統計分析
各時点でのデータの統計的比較を、データ分布に従って適切な方法によって行う。
【０２５９】
（実施例１１）
関節鏡下洗浄のＢｅｎｃｈＴｏｐモデルを使用した、コラーゲンマトリックスと合わせた組換えヒト血小板由来成長因子−ＢＢ（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）の放出、安定性、および生物作用能の特徴づけ
この試験は、高流量関節鏡下環境を再現するため、および腱を骨に結合する手順、例えば、前十字靭帯再建手順または回旋腱板傷害治療手順などにおいて適用するために考慮された４つの異なるコラーゲンマトリックスから溶出されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの放出、安定性、および生物作用能を特徴づけるための新規のＢｅｎｃｈ  Ｔｏｐ関節鏡下モデルを開発するために行った。
【０２６０】
方法
３つが異なるコラーゲン濃度の経皮由来のコラーゲンマトリックス（Ｋｅｎｓｅｙ  Ｎａｓｈ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＡ＝４．５％のコラーゲン；Ｂ＝５％のコラーゲン、Ｃ＝６％のコラーゲン）であり、１つがアキレス腱由来のマトリックス（コラーゲンＤ、Ｉｎｔｅｇｒａ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓからのＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標））である、４つのＩ型コラーゲンマトリックスを評価した。すべてのマトリックスを打ち抜いて８ｍｍのディスクにした。コラーゲンマトリックスからのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）の放出を評価するために、各ディスクを１ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ  ５０μｌ（５０μｇ）で水和し、室温で１０分間インキュベートし、溶出バッファー（２％のＦＢＳを含有するＭＥＭ）２０ｍｌで予め満たしたＢｅｎｃｈ  Ｔｏｐ関節鏡システム中に装填し（図１４参照）、２００ｍｌ／分の流速で５分間流した。同じ量のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを、対照としてこのシステムに添加した。マトリックスを洗浄するのに使用した溶出バッファー試料は、ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析した。逆相およびサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することによって、コラーゲンマトリックスから放出されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの特性を引き出して、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの天然／変性構造の変化／改変を評価した。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、コラーゲンマトリックスから放出されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの生物作用能を試験した。ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（０〜０．２４μｇ／ｍｌ）を含有する放出物（ｒｅｌｅａｓａｔｅ）中で培養し、次いでＢｒｄＵを添加し、細胞を４８時間インキュベートした。
【０２６１】
４つのコラーゲンマトリックスのそれぞれについての対照と比べた平均ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ放出率は、以下の通りであった：コラーゲンＡ、７９％；コラーゲンＢ、６４．６％；コラーゲンＣ、７４．３％；およびコラーゲンＤ、８９．０％。コラーゲンＤは、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの最大の放出を示し、これは、一元配置分散分析のＦｉｓｈｅｒ  ＬＳＤ法を使用して実証されたように、マトリックスＢまたはＣについて観察されたものより有意に大きかった。逆相ＨＰＬＣで実証されたように、マトリックスＤと組み合わせた後に、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢに対する明らかな変化はまったく見出されなかったが、軽度のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの酸化が、コラーゲンマトリックスＡ、Ｂ、およびＣで起こった。しかしこれらの変化は、生物作用能に影響するように思われなかった（ＢｒｄＵによって評価した場合）。
【０２６２】
この試験は、Ｂｅｎｃｈ  Ｔｏｐ関節鏡下モデルが、スポーツ医学関節鏡下修復／再生手順において使用することが提案された組換えタンパク質治療剤の送達のためのマトリックスを評価するのに有効なシステムであることを示す。コラーゲンＡおよびＤは、コラーゲンＢおよびＣより多くのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを放出し、コラーゲンＤは、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢに対していずれの変化ももたらさず、スポーツ医学再生手順において使用するための大きな可能性を示した。さらに、この関節鏡下モデルは、有効性を最大にするのに最適な送達用量を提供するための組換えタンパク質治療デバイスを作ることを可能にする優れたインビトロツールを代表する。
【０２６３】
（実施例１２）
走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）評価による、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢに応答した様々な密度のＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（商標）マトリックスおよびＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）における細胞遊走
この試験により、一次ヒツジ腱細胞を培養することによって、ＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（商標）およびＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）マトリックス中への細胞遊走の程度を評価する。この腱細胞は、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを用いて、または用いずに処理され、引き続いて走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）技法によって評価される。
【０２６４】
物質および方法
ＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（商標）マトリックスおよびＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）中へのヒツジ腱細胞の遊走は、既知量の細胞を含むマトリックスを播種し、次いでこのマトリックスを４日間培養することによって評価した。次いでマトリックスを臨界点乾燥によって処理し、マトリックス中の細胞分布および密度を、走査型電子顕微鏡下で評価した。
【０２６５】
試験物質は、１）５％、６％、または７％のＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（商標）（ロット番号Ｒ４３６−１、Ｒ４３６−２、Ｒ４３６−３）；２）ＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）（ロット番号１０７２５４９）；３）ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（０．３ｍｇ／ｍｌ；ロット番号：ＢＭＴＩ２０４）、および４）足首関節で切断した新鮮なヒツジの脚を含む。試験デザインを表１１に列挙する。
【０２６６】
【表１１】
2018030895.tif 000015
（ｉ）一次ヒツジ腱細胞の単離および培養
石けん、水、および７０％のアルコールを使用して、新鮮なヒツジの脚を、浄化、噴霧、および洗浄した。屈筋腱の表面から約３インチの幅の皮膚を切除した。切開部を７０％のアルコールで噴霧し、外科的ドレープで覆った。腱鞘の上を切開することによって、腱を露出した。次いで、腱を遠位側から切断した。腱をできる限り長く引っ張り、近位側を切断した。次いで腱を、氷冷のＤＰＢＳで満たされた５０ｍｌの円錐チューブに入れた。脚および余分の組織を廃棄した。
【０２６７】
層流フード作業域内で、滅菌した１２０ｍｍの細胞培養皿中で、腱組織を刻んで小さい断片にした。次いで刻んだ組織を、新しい５０ｍｌの円錐チューブに移した。刻んだ腱組織を、ＤＰＢＳで２回、およびＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で１回洗浄した。次いで腱組織を、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中の５００ユニット／ｍｌのプロナーゼプロテアーゼで１時間消化した。プロナーゼプロテアーゼを吸引し、ＤＰＢＳで２回、および無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で１回洗浄した。
【０２６８】
次いで、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ｍｅｉｄｕｍ）中の０．２コラゲナーゼＰと１５０ユニット／ｍｌのＤＮＡｓｅ−ＩＩを用いて１時間、腱細胞を遊離した。消化産物を、７５μｍの細胞ストレーナを通して濾過した。残った組織を５０ｍｌの円錐チューブへのストレーナ内に戻し、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中の０．２％のコラゲナーゼＰと１５０ユニット／ｍｌのＤＮＡｓｅ−ＩＩを用いて１時間、腱細胞を遊離した。細胞を、１２００〜１５００ＲＰＭで、４℃で５分間遠心分離することによってペレット化した。細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２成長培地１０ｍｌ中に再懸濁し、トリパンブルーおよび血球計数器を使用して細胞計数を実施した。５０００〜７５００細胞／ｃｍ２の間の密度で、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２成長培地を含むＴ７５またはＴ１５０フラスコ中に細胞を蒔いた。すべての腱組織が消化されるまで、この段落に記載した全プロセスを１時間毎に繰り返した。成長培地は、２日毎に交換し、ＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（商標）およびＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）マトリックスに細胞を播種する２４時間前に基本培地に交換した。
【０２６９】
（ｉｉ）細胞播種およびｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ添加
滅菌技法を使用して、ＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（商標）およびＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）マトリックスから８ｍｍのディスクを生検パンチを使用して打ち抜いた。各２７Ｇ１／２針上の１枚のＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（商標）またはＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）ディスクを穏やかに突き刺し、開放矩形形状に対して９０度の角度で２回曲げることによって、ディスクが滑り落ちる恐れをなくした。ＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（商標）およびＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）マトリックスディスクが刺さった針を、特別に設計されたチャンバー内の１ｍｌのシリンジヘッドに接続した。腱細胞をトリプシン処理し、２％のＦＢＳおよび１０６細胞／ｍｌの濃度の抗生物質を含有するＤＭＥＭ基本培地１ｍｌ中に懸濁した（４継代未満）。総量６０ｎｇ（培地２ｍｌ中３０ｎｇ／ｍｌ）のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを各ディスクに装填した。ＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（商標）およびＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）マトリックスディスクに、細胞を播種し、培地を浸漬することなく、インキュベーター内のチャンバー内で１時間インキュベートした。２％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地を調製し、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群としての合計８ウェルについて、各２４ウェル超低付着プレートの８ウェルに２ｍｌを添加した。１時間インキュベートした後、細胞を播種したディスクを装填ボックスから取り出した。止血鉗子を使用して、針先端部をプラスチックの根元から折った。細胞を播種したディスクを、針先端部と一緒に、様々な組成物を含有する培地で予め満たしたウェルに移した。ディスク中に付着した針先は、ディスクを培地中で浮遊させ、その結果、ディスクの両側の細胞は、栄養を均等に供給された。各物質について合計４つの処置を行い、各物質および各処置について三つ組の試料を準備した。３７℃および５％のＣＯ２雰囲気で、インキュベーター内で１２時間静置培養した後、プレートを、インキュベーター内の軌道振盪機上に、細胞を播種したコラーゲンマトリックスとともに置いた。初回のフィーディングと同じ組成物を含有する培地を、４８時間毎に交換した。
【０２７０】
（ｉｉｉ）走査電子顕微鏡プロセス
培養して４日後に、２４ウェルプレートからの細胞を播種した各ディスクを、培地の出現を伴ってクライオバイアルに移した。次いでクライオバイアルから培地を取り出し、ＤＰＢＳ中で２回洗浄した。２．５％のグルタルアルデヒド中で２時間試料を固定した。次いで試料をＤＰＢＳ中で５回洗浄し、２％の四酸化オスミウム中で２時間、後固定した（ｐｏｓｔ−ｆｉｘｅｄ）。試料を脱イオン水中に１０分間浸漬し、脱イオン水で５回洗浄することによって過剰の四酸化オスミウムを除去した。試料を上昇系列のエタノール中で脱水し、次いでＰｏｌａｒｏｎ臨界点乾燥機内で乾燥させた。試料に金−パラジウムをコーティングし、Ｈｉｔａｃｈｉ  ＳＥＭを用いて見た。
【０２７１】
結果および結論
腱細胞は、様々な濃度のコラーゲンスラリーを有するすべてのＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（商標）マトリックスの表面上で成長したが、ＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）マトリックスの内部で成長した。ほとんどの腱細胞は、様々な濃度のコラーゲンスラリーを有するすべてのＢＩＯＢＬＡＮＫＥＴ（商標）マトリックス上で成長しながら丸い形状であったが、ＣＯＬＬＡＴＡＰＥ（登録商標）マトリックス上で紡錐体形状であった。図１５を参照。
【０２７２】
（実施例１２）
ヒツジモデルにおける、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢおよびＩ型ウシコラーゲンマトリックスを使用する回旋腱板修復
この試験の目的は、ヒツジモデルを使用して、回旋腱板を修復するために、棘下筋腱の上腕骨へのより強い再結合を促進することを意図した、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを装填したマトリックスの効力を求めることであった。実験デザインを以下のように提供する：１）縫合のみ（ｎ＝９）；２）縫合＋コラーゲンマトリックス＋バッファー（ｎ＝９）；３）縫合＋コラーゲンマトリックス＋０．１５ｍｇ／ｍｌ（または７５μｇ）のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（ｎ＝９）；４）縫合＋コラーゲンマトリックス＋０．３０ｍｇ／ｍｌ（または１５０μｇ）のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（ｎ＝９）；５）縫合糸＋コラーゲンマトリックス＋１．０ｍｇ／ｍｌ（または５００μｇ）のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（ｎ＝９）；および６）ｉＣＴＬ（ｎ＝９）無傷のコントララテラル対照。縫合のみ、縫合＋コラーゲンマトリックス＋バッファー、および３つの用量群からの９頭の動物を生体力学的試験に利用し、それぞれ３頭を組織診断試験に利用した。ｉＣＴＬ群はより小さく、生体力学的試験について６頭であり、組織診断試験について３頭であった。
【０２７３】
外科手術
骨格的に成熟したヒツジ（３．５歳以上）の棘下筋腱を外科的に露出し、上腕骨頭から素早く剥離した。腱フットプリント（ｔｅｎｄｏｎ  ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）を剥皮し、出血を誘導するために３つの穿孔を骨に作った。試験物品を、腱と骨の間の挿入（ｉｎｔｅｒｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ）移植片として配置した。２本の縫合糸を、Ｍａｓｏｎ−Ａｌｌｅｎ技法を使用して腱に通し、３つの骨トンネルからなる単列修復によって、腱を上腕骨頭に固定した。標準的な手順を使用して手術部位を閉じ、ヒツジを普通に歩き回らせた。手術して１２週間後に動物を屠殺した。
【０２７４】
材料および方法
生体力学的な試験
生体力学的な試験に割り当てた動物からの肩を回収し、上腕骨−棘下筋腱のコンストラクトを無傷にしたまますべての筋系を剥皮した。合計５１個の肩を生体力学的に評価した。浄化後、食塩水に浸漬したガーゼで試料をラップし、生体力学的試験まで−２０℃で貯蔵した。高強度ポリ−メチル−メタクリレート（ＰＭＭＡ）樹脂を使用して、２インチのＰＶＣパイプに上腕骨をポッティングした。試料は、１５分間隔で食塩水を噴霧して、ポッティング調製および生体力学的試験の間、水和した状態を保った。物質試験システム負荷フレーム（ＭＴＳ  ＭｉｎｉＢｉｏｎｉｘ、Ｅｄａｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ、ＭＮ）にしっかり取り付けた特注設計試験備品にポッティングした上腕骨を取り付けた。棘下筋腱の天然断面を保存し、軟部組織の滑りを最小限にするように設計された特注設計のクライオクランプは、ポッティングした上腕骨に対して約１３５°の角度でコンストラクトに一軸性のけん引力を印加するためであった。これは、腱の生理的力ベクトルを模倣するために行った。試験は、クライオクランプに付けられた熱電対が−２２℃、すなわち腱とクランプの間の安定したカップリングを保証するのに十分であると以前に報告された温度を記録したとき開始した。
【０２７５】
３つの逆反射マーカーをポッティングしたコンストラクト、すなわち、１つを修復部位に直接隣接する上腕骨上に、１つを修復界面の近位の腱上に、および３番目をクライオクランプ上に縫合または接着剤接合した。３つのカメラ（Ｍｏｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｓａｎｔａ  Ｒｏｓａ、ＣＡ）により、６０Ｈｚでマーカーの空間的な移動を記録した。このカメラシステムを使用するマーカー変位測定により、回旋腱板修復部位にわたる局所的な組織変形のリアルタイムモニタリングが可能になった。
【０２７６】
フェーズ１：３０サイクルの動的プレコンディショニング
周期的負荷試験を最初に使用することによって、回旋腱板修復をプレコンディショニングした。１０ニュートン（Ｎ）の前負荷を力制御で２分間印加し、その後、修復したコンストラクトを、定常状態に達するように、６０サイクルにわたって０．２５Ｈｚで１０〜５０Ｎの力制御プロトコールで周期的にプレコンディショニングした。変位対時間曲線の傾きが５０サイクルと６０サイクルの間で、繰り返し可能な定常状態の挙動に到達することを実証した、本発明者らの実験室におけるパイロット実験に基づいて、６０（ｎ＝６０）サイクルを選択した。コンディショニング伸長およびピークトゥピーク伸長を、周期的なプレコンディショニング試験の間に求めた。コンディショニング伸長は、１番目のサイクルのピークと６０番目のサイクルのピークの間のｙ変位における距離として定義した。ピークトゥピーク伸長は、５８番目、５９番目、および６０番目のサイクルの局部的な最小から最大の平均として定義した。
【０２７７】
フェーズ２：準静的破損負荷
プレコンディショニングした後、１ｍｍ／ｓの速度での変位制御下で、修復したコンストラクトに破損するまで負荷をかけた。対象とする生体力学的パラメータは、極限破損までの荷重、および準静的剛性（負荷−変位曲線の傾きとして定義される）を含んでいた。最後に、破損機構を各試料について記録した。適切な場合、デジタル画像を撮った。
【０２７８】
統計分析
一元配置ＡＮＯＶＡおよびポストホックＦｉｓｈｅｒ’ｓ  ＬＳＤおよびＴｕｋｅｙ検定を使用することによって、無傷の対照を除外した処置群同士間の連続的生体力学的パラメータの有意な差を識別した。有意性をｐ≦０．０５に設定し、すべての分析は、ＳｉｇｍａＳｔａｔ  ３．１（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて実施した。
【０２７９】
結果
試験の周期的プレコンディショニング成分からの未処理データを表１２に示す。０．１５ｍｇ／ｍｌのＰＤＧＦおよび０．３０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群は、縫合のみ、および縫合＋コラーゲンマトリックス群より有意に大きいコンディショニング伸長を受けた（Ｔｕｋｅｙ’ｓ：ｐ≦０．０２４；Ｆｉｓｈｅｒ  ＬＳＤ：ｐ≦０．００３）。図１６Ａ。任意の群同士間で、ピークトゥピーク伸長の有意な差はまったくなかった（ｐ＝０．１１１、図１６Ｂ）。
【０２８０】
【表１２】
2018030895.tif 000016
生体力学的試験の破損までのランプ成分からの未処理データを表１３に示す。０．１５ｍｇ／ｍｌおよび０．３０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを用いた修復増強は、縫合のみの群と比べてそれぞれ、６３．７％および６３．３％の破損までの荷重の増大をもたらした（Ｔｕｋｅｙ：ｐ＝０．１７６；Ｆｉｓｃｈｅｒ  ＬＳＤ：ｐ＝０．０２９、およびＴｕｋｅｙ：ｐ＝０．１８１；Ｆｉｓｈｅｒ  ＬＳＤ：ｐ＝０．０３０、図１７Ａ）。さらに、破損時の負荷データは、０．１５ｍｇ／ｍｌおよび０．３０ｍｇ／ｍｌのより低いｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ用量は、より高い１．０ｍｇ／ｍｌのＰＤＧＦ用量より性能が優れていることを示し、破損時の負荷においてそれぞれ１２０％および１１９．３％の増大として顕在化した（ｐ＝０．０２３およびｐ＝０．０２３（Ｆｉｓｈｅｒ：ｐ＝０．００３））。コンストラクトの剛性の統計的な差は、群同士間でまったく識別されなかった（ｐ＝０．２５４、図１７Ｂ）。０．１５ｍｇ／ｍｌおよび０．３０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの群におけるコンストラクトは、縫合のみの群と比べて破損時に有意に大きい伸長を示した（それぞれ、ｐ≦０．０１８およびｐ≦０．０２４）。Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ＬＳＤは、０．１５ｍｇ／ｍｌおよび０．３０ｍｇ／ｍｌのＰＤＧＦ群は、縫合＋コラーゲンマトリックスバッファー群より有意に多く伸長したことを示した（それぞれ、ｐ＝０．０１５およびｐ＝０．０１１）。０．１５ｍｇ／ｍｌ、０．３０ｍｇ／ｍｌ、または１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群の間で、破損時の伸長の差はまったく識別されなかった（ｐ≧０．０５４）。
【０２８１】
【表１３】
2018030895.tif 000017
縫合のみ、縫合＋コラーゲンマトリックス＋バッファー、および縫合＋コラーゲンマトリックス＋１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群について、あらゆる試料におけるコンストラクト破損は、上腕骨上の挿入部位での中央物質組織破損として顕在化した。これらの３つの群中の腱のいずれ（ｎ＝２７）においても、上腕骨剥離破損はまったく確認されなかった。対照的に、０．１５ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢおよび０．３０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群における破損モードは混合されており、上腕骨上の挿入部位での中央物質組織破損、またはいくらかの骨の裂離と合わさった中央物質組織破損として顕在化した。具体的には、０．１５ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群における肩の９個のうちの６個（６６．７％）が、ある度の骨の裂離を示した一方で、０．３０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群における肩の９個のうちの５個（５５．６％）が、ある程度の骨の裂離を示した。無傷の、対側のコンストラクトの破損は、中央骨幹の（ｍｉｄｄｉａｐｈｙｓｅａｌ）上腕骨（ｈｕｍｏｒａｌ）破損（ｎ＝５）、または上腕骨上の棘下筋腱挿入部位での骨の裂離（ｎ＝１）として顕在化した。
【０２８２】
結論
０．１５ｍｇ／ｍｌおよび０．３０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦを用いた上腕骨棘下筋腱再結合の増強は、縫合のみ、縫合＋コラーゲンマトリックス＋バッファー、および縫合＋コラーゲンマトリックス＋１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群と比べて、ヒツジモデルにおいて３カ月後に機械的機能を改善した。より低い用量のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの生体力学的完全性の増強は、縫合のみの群と比べて、破損までの荷重の６３％の増大、および１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群と比べて、破損時の負荷の１２０％の増大として顕在化した。ここで報告したデータは、回旋腱板増強に対する用量依存的効果を支持し、より低いｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ用量は、成長因子のより高い１．０ｍｇ／ｍｌの用量と比べてより大きい治癒応答を誘発する。さらに、０．１５ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢおよび０．３０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群における破損モードは、０．１５ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群における肩の９個のうちの６個（６６．７％）がある程度の骨の裂離を示した一方で、０．３０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群における肩の９個のうちの５個（５５．６％）が、ある程度の骨の裂離を示したように、無傷の、未手術の肩において一貫してみられる破損モードと同様であった。この知見は、より低い用量のＰＤＧＦ（例えば、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）は、１２週間の治癒期間の過程にわたって、より大きい上腕骨粗面との腱の（ｔｅｎｄｉｎａｃｉｏｕｓ）一体化を促進し、より低い用量のＰＤＧＦは、回旋腱板修復を増強するのにより適していることを示す。
【０２８３】
（実施例１３）
ヒツジモデルにおける、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢおよびＩ型ウシコラーゲンマトリックスを使用する回旋腱板修復：組織学的結果
この試験は、ヒツジ回旋腱板挿入部の治癒および再生を促進するための、Ｉ型ウシコラーゲンマトリックスと組み合わせた組換えヒト血小板由来成長因子−ＢＢ（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）の有効性を評価するために設計した。回旋腱板傷害の最適な治癒は、結合の本来の部位（腱「フットプリント」）での腱の骨への再挿入を伴う。腱線維の骨への再挿入がない場合、治癒した部位は、本来の結合より「弱い」と考えられ、潜在的に機能を制限し、再傷害のより大きい確率に導く。回旋腱板修復後の相対的に高い割合の破損が報告されており（例えば、Ｂｏｉｌｅａｕ  Ｐ．ら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ、８７巻：１２２９〜１２４０頁（２００５年）；Ｇａｌａｔｚ  Ｌ．  Ｍ．ら、Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ．、８６巻：２１９〜２２４頁（２００４年）；Ｇａｚｉｅｌｌｙ  Ｄ．  Ｆ．、Ｃｌｉｎ．  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｌａｔ  Ｒｅｓ、３０４巻：４３〜５３頁（１９９４年）；Ｇｅｒｂｅｒ  Ｃ．  Ｊ．ら、Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ、８２巻：５０５〜５１５頁（２０００年）；およびＨａｒｒｙｍａｎ  Ｄ．  Ｔ．ら、Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ、７３巻：９８２〜９８９頁（１９９１年）を参照）、これは、様々な異なる要因から生じると仮定されている（例えば、Ｇｏｕｔａｌｉｅｒ  Ｄ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ、３０４巻：７８〜８３頁（１９９４年）；Ｇｅｒｂｅｒ  Ｃ．ら．、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ｂｒ、７６巻：３７１〜３８０頁（１９９４年）；Ｗａｒｎｅｒ  Ｊ．  Ｐ．ら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ、７４巻：３６〜４５頁（１９９２年）を参照）。腱組織の質および腱から骨までの治癒が、回旋腱板修復の失敗の一因となる最も重要な要因の２つとして提案されており、腱から骨までの治癒を増強するための成長因子または細胞の送達が、これらの傷害の治癒を最適化するための方法として示されている（例えば、Ｇａｍｒａｄｔ  Ｓ．  Ｃ．ら、Ｔｅｃｈ  ｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ、２２巻：２６〜３３頁（２００７年）およびＤｏｖａｃｅｖｉｃ  Ｄ．ら、Ｃｌｉｎ．  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｌａｔ  Ｒｅｓ、４６６巻：６２２〜６３３頁（２００８年）を参照）。ＰＤＧＦ−ＢＢは、十分に特徴づけられた創傷治癒タンパク質であり、これは、骨（骨芽細胞）および腱（腱細胞）細胞を含めた間葉系起源の細胞に関して、走化性（細胞遊走）および分裂促進性（細胞増殖）であることが公知である。さらに、ＰＤＧＦ−ＢＢは、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）をアップレギュレートし、再生プロセスの成功にとって本質的である血管新生（血管再生）の増大に導くことが示されている。この試験の目的は、生体力学的および組織学的結果の措置を使用して、腱再結合を増強および改善するための、腱修復部位での、Ｉ型ウシコラーゲンマトリックスと合わせたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの効力を求めることであった。
【０２８４】
試験デザイン
合計１７頭の骨格的に成熟したヒツジを試験の一部として含めた。動物に、外科的な剥離、その後、骨トンネルを通す縫合を使用して、上腕骨のより大きい粗面への右棘下筋腱の即時の再結合を行った。第１のセットの実験では、実験動物（ｎ＝３）の腱−骨界面に、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（酢酸塩）バッファー中、０．１５（ｎ＝３）または０．３（ｎ＝３）ｍｇ／ｍｌの濃度を有するｒｈＰＤＧＦ−ＢＢと合わせたＩ型コラーゲン担体を投与した。すべての動物についての生存時間は、１２週間であった。処置の割り当てを表１４に示す。
【０２８５】
【表１４】
2018030895.tif 000018
第２のセットの実験では、実験動物（ｎ＝３／群）の腱−骨界面に、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（酢酸塩）バッファー中、１．０ｍｇ／ｍＬの濃度を有するｒｈＰＤＧＦ−ＢＢと合わせたＩ型コラーゲン担体（コラーゲンマトリックス）またはコラーゲンマトリックス単独を投与した。表１５。
【０２８６】
【表１５】
2018030895.tif 000019
組織の回収およびトリミング
治癒の１２週間後に動物を人道的に安楽死させ、手術した（右）肩を回収し、組織学的な処理のために１０％の中性緩衝ホルマリン中に入れた。腱用メスおよび上腕骨用ダイヤモンドブレードソー（Ｅｘａｋｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｃｉｔｙ、ＯＫ）を使用して、棘下筋腱およびその上腕骨結合部位を通して頭側の半分と尾側の半分に各肩を二分した。トリミングの間に各試料のデジタル画像を撮った。一方の半分（頭側または尾側の面のいずれか）を、脱灰組織診断のために処理し、他方の半分を、未脱灰組織分析のために処理した。
【０２８７】
脱灰組織学的処理
頭側または尾側の面のいずれかを脱灰組織診断のために処理し、パラフィン中に埋め込んだ。標準的なパラフィン組織学技法および装置（Ｓａｋｕｒａ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＴＥＫ  Ｖ．Ｉ．Ｐ．  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ，  Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、およびＳｈａｎｄｏｎ  Ｈｉｓｔｏｃｅｎｔｒｅ  ２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｈａｎｄｏｎ，  Ｉｎｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して、試料を固定、脱灰、脱水、浄化、浸潤、および包埋した。パラフィンブロックを、Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｆｉｎｅｓｓｅロータリーミクロトーム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｈａｎｄｏｎ，  Ｉｎｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）でフェイシングし、約８ｍｍの切片を切断した。約２５０ミクロンの空間的厚さの増分で、各肩から５つの組織切片を得た。Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｉｍａｇｉｎｇシステム（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ
Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）、Ｎｉｋｏｎ  Ｅ８００顕微鏡（ＡＧ  Ｈｅｉｎｚｅ、Ｌａｋｅ
Ｆｏｒｅｓｔ、ＣＡ）、およびＳｐｏｔデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＭＩ）、メモリー機能を拡張したＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）  ＩＢＭ系コンピューター（Ｄｅｌｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．、Ｒｏｕｎｄ  Ｒｏｃｋ、ＴＸ）を使用して、全体の対象とする染色したスライドおよび領域について、フィールドバイフィールドで高分解能デジタル画像を得た。
【０２８８】
半定量的病理組織学的検査
腱退縮の程度（もしあれば）、修復性／治癒組織の評価、腱骨界面、処置に対する組織の応答、血管新生、炎症、コラーゲン方向づけ／線維のアライメント、ならびに挿入部位でのシャーペー線維の嵌合および存在を評価するための格付けスケールに従って、すべての組織切片を格付けした。切片を、処置に対して盲検化して最初に評価し、互いに比較して総合的な治癒に対して評価し、治癒スコアを与えた。各スコアについての判定基準の説明を表１６に示す。Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓイメージングシステム（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を使用して、較正した全体のデジタル画像によって腱の退縮の程度（もしあれば）も測定した。
【０２８９】
【表１６】
2018030895.tif 000020
結果
（ｉ）
第１のセットの実験（コラーゲンマトリックス＋０．１５ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢまたは０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）では、処置にかかわらず、すべての手術した試料が治癒の１２週間後にある程度の腱退縮を示した。平均で、棘下筋腱は、０．１５ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ用量群について、骨溝から４１．８±３．５ｍｍ（平均±標準偏差）、および０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ用量群について、４５．２±８．９ｍｍ退縮した。
【０２９０】
第１のセットの実験における処置によって平均した病理組織学的スコアを、表１７に示す；これらの結果のグラフによる表示を、図１８に示す。縫合は、治癒の１２週間後に、６試料のうち４つについて骨トンネル内で無傷であることが観察された。これは、腱退縮に導く破損は、骨−縫合界面ではなく縫合−腱界面で起こったことを示す。
【０２９１】
全体的に、処置にかかわらず、上腕骨と天然の腱端部の間の修復性組織は、線維性血管性組織（高度に血管新生した線維性組織）からなり、活性な線維増殖および適度に高密度な分極性コラーゲン線維が存在した。線維芽細胞密度の差は、処置同士間でまったく観察されなかった。すべての試料は、元の腱のアライメントと平行な一次コラーゲン線維のアライメントを示し、あまり組織化されていない線維ポケットを伴った。平均のコラーゲン線維配向および線維密度は、処置同士間で同様であった。
【０２９２】
【表１７】
2018030895.tif 000021
再生中の挿入部位で、骨コラーゲンと直接、または線維軟骨の層を通じて挿入および嵌合している修復性腱組織のコラーゲン性シャーペー線維が、すべての試料について観察された。平均で、嵌合は、完全に剥皮した骨表面の約３０〜４０％にわたって観察され、この観察結果は、すべての処置群にわたって一貫していた。手術した試料において観察されたシャーペー線維は、無傷の対照よりも未成熟であったが、下にある骨のコラーゲンとの、これらの再生線維の挿入および連続性があった。少数例で、元の天然の腱の結合部位の一部が、手術した肩において観察された。
【０２９３】
骨表面の以前の破骨細胞性吸収が、ほとんどの試料中で、元の結合部位の剥皮した領域において観察された。これは、破骨細胞がもはや存在していなかった骨の波打った表面（ハウシップ窩）、または表面が新規骨組織によって覆われていた、波打った好塩基球性反転線（ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｌｉｎｅ）によって認識された。一般に、以前の再吸収の領域は、反応性の網状骨の層で覆われており、骨芽細胞が存在した。反応性の骨は、シャーペー線維挿入部を有することが多かった。再吸収の程度は、多様であった。これは、処置にかかわらず、全骨表面の約１０〜５０％にわたって見出され、一般に、新規網状骨によって覆われていた。反応性網状骨および／または線維軟骨の島が、修復性組織内に時折観察された。
【０２９４】
すべての試料において、軽度の異物炎症が治癒組織内に観察され、主に縫合物質付近に集中していた。少数例で、単核の炎症の小さいポケットが修復性組織内に観察され、おそらく血管新生または局所的に損傷した組織と関連していた。炎症は主に、多核巨細胞を伴う単核であった。好中球は、一般にまったく観察されなかった。処置にかかわらず、豊富な血管新生がすべての試料中の治癒組織において観察された。新規血管生成を示す血管芽細胞増殖もいくつかの試料において観察され、特定の処置と相関していなかった。この増殖は、まず間違いなく、治癒プロセスに関連した進行中の適応変化によるものであった。
【０２９５】
脂肪浸潤は、回旋腱板腱引裂の１つの結果であることが公知であり、腱退縮の程度と相関することが示されている（Ｎａｋａｇａｋｉら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈ  Ｒｅｌ  Ｒｅｓ（２００８年）およびＢｊｏｒｋｅｎｈｅｉｍ  Ｊ．  Ｍ．ら、Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｓｃａｎｄ．６０巻（４号）：４６１〜３頁（１９８９年））。脂肪浸潤は、いくつかの試料中で、筋肉に隣接する末梢組織において観察された。これは、１つの試料（０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ用量）中の修復性組織の中心においてのみ観察された。
【０２９６】
（ｉｉ）
第２のセットの実験（縫合、縫合＋コラーゲンマトリックス＋酢酸バッファー、縫合＋コラーゲンマトリックス＋ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、または無傷の対照）では、棘下筋腱は、縫合のみの群について骨溝から２８．１±２．８ｍｍ、縫合＋コラーゲンマトリックス＋酢酸バッファー群について、３９．０±４．６ｍｍ、および縫合＋コラーゲンマトリックス＋ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群について４０．９±８．３ｍｍ退縮した。
【０２９７】
縫合は、治癒の１２週間後に、すべての試料について骨トンネル内で無傷であった。これは、腱退縮に導く破損は、骨−縫合界面ではなく縫合−腱界面で起こったことを示す。処置内および処置同士間の治癒は多様であった。縫合のみの群についての治癒は、最も多様であり、群の最良の治癒から最悪の治癒までの範囲の試料を伴った。縫合＋コラーゲンマトリックス＋酢酸バッファー試料は、中程度／高度から中程度／低度の治癒までの格付けの範囲であり、縫合＋コラーゲンマトリックス＋ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの試料は、中程度／低度から低度の治癒までの範囲であった。処置自体は、染色した組織スライドのいずれにおいても目に見えなかった。群の最良の治癒から最悪の治癒まで並べた、すべての試料についての治癒スコアを、表１８に示す。
【０２９８】
【表１８】
2018030895.tif 000022
処置によって平均した病理組織学的スコアを表１９および図１９に示す。全体的に、処置にかかわらず、上腕骨と天然の腱端部の間の修復性組織は、線維性血管性組織（高度に血管新生した線維性組織）からなり、活性な線維増殖および分極性コラーゲン線維が存在した。線維芽細胞密度の差は、処置同士間でまったく観察されなかった。いくつかの試料は、一次コラーゲン線維のアライメント（コラーゲンのアライメントは、元の腱のアライメントと平行である）の領域を有し、他の試料は有していなかった；ほとんどの試料は、組織化された、および組織化されていないコラーゲン線維のアライメントの両方の領域を有していた。一般に、コラーゲンのアライメントは、退縮した腱端部付近より、骨の表面付近で良好であった。
【０２９９】
【表１９】
2018030895.tif 000023
一般に、挿入部での腱のコラーゲン性シャーペー線維、および線維軟骨の層を通じた骨コラーゲンとのこれらの線維の嵌合が観察されたが、非常に小さい領域においてであった；嵌合は通常、全骨結合表面の１０％未満にわたって観察された。小さい領域のシャーペー線維挿入は、３つすべての縫合のみ（単独）の試料、縫合＋コラーゲンマトリックス＋酢酸バッファー試料のうちの２つ、およびすべての縫合＋コラーゲンマトリックス＋ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ試料において観察された。少数例で、元の天然の腱の結合部位の一部が、手術した肩において観察された。
【０３００】
骨表面の破骨細胞性吸収が、ほとんどの試料中で、元の結合部位の剥皮した領域において観察された。これは、破骨細胞がもはや存在しないか、または表面が他の組織によって覆われていた、骨の波打った表面（ハウシップ窩）によって認識された。再吸収は、処置にかかわらず、全骨表面の約１０〜２０％にわたって起こった。３つのすべての縫合のみの試料、および１つの縫合＋コラーゲンマトリックス＋酢酸バッファー試料において、反応性網状骨および／または線維軟骨が、修復性組織内および骨の表面で観察された。
【０３０１】
すべての試料において、軽度の異物炎症が、主に縫合物質付近に集中して、治癒組織内に観察された。少数例で、単核の炎症の小さいポケットが修復性組織内に観察され、おそらく局所的に損傷した組織と関連していた。炎症は主に、多核巨細胞を伴う単核であった。一般に、好中球はまったく観察されなかった。豊富な血管新生が、処置にかかわらず、すべての試料中の治癒組織において観察された。新規血管生成を示す血管芽細胞増殖も、処置にかかわらずいくつかの試料において観察され、おそらく、治癒プロセスにおける進行中の適応変化を表した。
【０３０２】
結論
ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを浸漬したコラーゲンマトリックスを用いた上腕骨（ｈｕｍｕｒａｌ）棘下筋腱再結合の増強により、縫合−組織界面での破損は防止されなかった。治癒の１２週間後に、すべての試料において、腱は、上腕骨から退縮し、修復性線維性血管性組織によって置換された。これは、退縮が、手術後の最初の数週間以内に起こったことを示す。
【０３０３】
試料は、様々な程度の新規骨形成、炎症、血管分布、および挿入部位での、腱を骨に挿入するシャーペー線維を示した。腱退縮、炎症細胞、血管新生、またはシャーペー線維の評価において、縫合のみ、縫合＋コラーゲン、および縫合＋コラーゲン＋１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群の中で差はまったく確認されなかった。縫合＋コラーゲンマトリックス＋０．１５ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、および縫合＋コラーゲンマトリックス＋０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群の組織切片は、腱修復の増大、および腱コラーゲンの、線維軟骨界面での骨のコラーゲンとの嵌合を示した。図２０Ａおよび２０Ｂ。
【０３０４】
別段の定義のない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語の意味は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものである。記載した特定の方法、プロトコール、および試薬は変更することができるので、本発明はこれらに限定されないことが理解されるべきである。当業者は、本明細書に記載されたものと同様または等価な任意の方法および物質も、本発明を実践または試験するのに使用することができることも理解するであろう。
【０３０５】
本明細書に設けられた見出しは、全体として本明細書に参照により有され得る、本発明の様々な態様または実施形態の限定ではない。
【図１】
2018030895.tif 000024
【図２】
2018030895.tif 000025
【図３】
2018030895.tif 000026
【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
2018030895.tif 000029
【図６Ｂ】
2018030895.tif 000030
【図７Ａ】
2018030895.tif 000031
【図７Ｂ】
2018030895.tif 000032
【図８】
2018030895.tif 000033
【図９】
2018030895.tif 000034
【図１０】
2018030895.tif 000035
【図１１】
2018030895.tif 000036
【図１２】
2018030895.tif 000037
【図１３】
2018030895.tif 000038
【図１４】
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【図１５】
2018030895.tif 000040
【図１６】
2018030895.tif 000041
【図１７】
2018030895.tif 000042
【図１８】
2018030895.tif 000043
【図１９】
2018030895.tif 000044
【図２０】
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【外国語明細書】
2018030895000001.pdf