(57)【要約】      （修正有）【課題】シグナル伝達因子Ｅｒｋ１／２を活性化する細胞増殖促進剤の提供。【解決手段】Ｇ３ドメインを欠損した分子構造を有するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカン。前記プロテオグリカンは、糖鎖部分Ｃｓを介して細胞増殖シグナル伝達因子Ｅｒｋ１／２を活性化し、ヒト皮膚繊維芽細胞の細胞増殖を有効に促進する。前記プロテオグリカンは、皮膚の荒れ、シワ、弾性低下、関節機能低下等を防止するのに有用な細胞増殖促進剤であり、スキンケア剤、サプリメント、飲食品及び化粧料として利用可能である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇ３ドメインを欠損した分子構造を有するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを有効成分として配合して、細胞増殖シグナル伝達因子Erk1/2を活性化することを特徴とする細胞増殖促進剤。
【請求項２】
Ｇ３ドメインを欠損した分子構造を有するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを有効成分として配合して、細胞増殖シグナル伝達因子Erk1/2を活性化することを特徴とする細胞増殖促進用スキンケア剤。
【請求項３】
Ｇ３ドメインを欠損した分子構造を有するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを有効成分として配合して、細胞増殖シグナル伝達因子Erk1/2を活性化することを特徴とする細胞増殖促進用サプリメント。
【請求項４】
Ｇ３ドメインを欠損した分子構造を有するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを有効成分として配合して、細胞増殖シグナル伝達因子Erk1/2を活性化することを特徴とする細胞増殖促進用飲食品。
【請求項５】
Ｇ３ドメインを欠損した分子構造を有するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを有効成分として配合して、細胞増殖シグナル伝達因子Erk1/2を活性化することを特徴とする細胞増殖促進用化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテオグリカンの分子構造と薬理メカニズムの解明に係り、特にプロテオグリカンの分子構造と薬理メカニズムの解明に依拠した皮膚の荒れ、シワ、弾性低下、関節機能低下等を防止するのに有用な特異なプロテオグリカンを有効成分とする細胞増殖促進剤、細胞増殖促進用サプリメント、細胞増殖促進用飲食品及び細胞増殖促進用化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオグリカンは複合糖質の一つであり、細胞表面や細胞外マトリックスに存在し、様々な機能を担っている。最近の研究から、プロテオグリカンは細胞に働きかけ様々な細胞増殖因子や形態形成因子と相互作用し、細胞機能を調節するといった役割が明らかにされつつある。特に、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンには線維芽細胞に対して増殖を促進する効果のあることが報告されている（特許文献１参照。）。しかし、そのプロテオグリカンのヒト皮膚繊維芽細胞に対する薬理的な効果が説明可能な詳細な作用メカニズムは未だ不明であり、どのような分子構造のプロテオグリカンがヒト皮膚繊維芽細胞に対して効率的な薬理効果を示すかは明らかではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−２４７８０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記事情を鑑み、本発明は、ヒト皮膚繊維芽細胞における細胞増殖促進およびコラーゲン産生に関与するシグナル伝達因子を発見し、それらのシグナル伝達因子の活性化を促進するような特有な分子構造を決定し、この特有な分子構造を有するプロテオグリカンを有効成分として配合した細胞増殖促進剤、細胞増殖促進用サプリメント、細胞増殖促進用飲食品及び細胞増殖促進用化粧料（以下において「細胞増殖促進剤等」と略記する。）を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明の第１の態様は、Ｇ３ドメインを欠損した分子構造を有するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを有効成分として配合して、細胞増殖シグナル伝達因子Erk1/2を活性化する細胞増殖促進剤であることを要旨とする。後述するように、本発明者らは、Erk1/2の活性化を介してヒト皮膚繊維芽細胞の細胞増殖を促進するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンは、Ｇ１ドメインを持ち、Ｇ３ドメインを持たないという特有な分子構造をしているという知見を初めて得た。更に、本発明者らの知見によれば、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンは、以下に説明する図１に示した糖鎖部分Ｃｓを介してErk1/2の活性化を惹起するので、第１の態様に係る細胞増殖促進剤は、ヒト皮膚繊維芽細胞の細胞増殖を有効に促進できる。
【０００６】
本発明の第２の態様は、Ｇ３ドメインを欠損した分子構造を有するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを有効成分として配合して、細胞増殖シグナル伝達因子Erk1/2を活性化する細胞増殖促進用スキンケア剤であることを要旨とする。Ｇ３ドメインを持たない分子構造のサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンは、糖鎖部分Ｃｓを介してErk1/2の活性化を惹起するので、第２の態様に係る細胞増殖促進用スキンケア剤は、ヒト皮膚繊維芽細胞の細胞増殖を有効に促進できる。
【０００７】
本発明の第３の態様は、Ｇ３ドメインを欠損した分子構造を有するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを有効成分として配合して、細胞増殖シグナル伝達因子Erk1/2を活性化する細胞増殖促進用サプリメントであることを要旨とする。Ｇ３ドメインを持たない分子構造のサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンは、糖鎖部分Ｃｓを介してErk1/2の活性化を惹起するので、第３の態様に係る細胞増殖促進用サプリメントは、ヒト皮膚繊維芽細胞の細胞増殖を有効に促進できる。
【０００８】
本発明の第４の態様は、Ｇ３ドメインを欠損した分子構造を有するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを有効成分として配合して、細胞増殖シグナル伝達因子Erk1/2を活性化する細胞増殖促進用飲食品であることを要旨とする。Ｇ３ドメインを持たない分子構造のサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンは、糖鎖部分Ｃｓを介してErk1/2の活性化を惹起するので、第４の態様に係る細胞増殖促進用飲食品は、ヒト皮膚繊維芽細胞の細胞増殖を有効に促進できる。
【０００９】
本発明の第５の態様は、Ｇ３ドメインを欠損した分子構造を有するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを有効成分として配合して、細胞増殖シグナル伝達因子Erk1/2を活性化する細胞増殖促進用化粧料であることを要旨とする。Ｇ３ドメインを持たない分子構造のサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンは、糖鎖部分Ｃｓを介してErk1/2の活性化を惹起するので、第５の態様に係る細胞増殖促進用化粧料は、ヒト皮膚繊維芽細胞の細胞増殖を有効に促進できる。    
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、G３ドメインを欠損した分子構造を有するプロテオグリカンによりErk1/2のリン酸化が起こり、ヒト皮膚繊維芽細胞の細胞増殖を促進することが明らかになり、そのプロテオグリカンの糖鎖を持った構造が、Erk1/2のリン酸化に必要であるという知見を用い、Ｇ３ドメインを欠損した分子構造を有するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを有効成分として配合した細胞増殖促進剤等を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る細胞増殖促進剤等に好適なG３ドメイン欠損プロテオグリカンの分子構造の概略を説明する模式図である。
【図２】本発明の第１の実施形態に係る細胞増殖促進剤等に好適なG３ドメイン欠損プロテオグリカンのG１ドメイン及びG２ドメインの詳細な構造の概略を説明する模式図である。
【図３】本発明の第１の実施形態に係る細胞増殖促進剤等に好適なＧ３ドメイン欠損プロテオグリカンの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分子量の測定結果を示す図である。
【図４】比較例として、Ｇ３ドメインが存在するプロテオグリカンのＨＰＬＣによる分子量の測定結果を示す図である。
【図５】プロテオグリカンのヒト皮膚繊維芽細胞の生存率に対する効果を示す棒グラフ図である。
【図６】プロテオグリカンのヒト皮膚繊維芽細胞の生存率上昇作用に対する加熱処理による効果を示す棒グラフ図である。
【図７】初期状態におけるＲＴＫ抗体アレイキットによるプロテオグリカン反応性シグナル伝達因子の検出結果を示す図である。
【図８】５分後のＲＴＫ抗体アレイキットによるプロテオグリカン反応性シグナル伝達因子の検出結果を示す図である。
【図９】１０分後のＲＴＫ抗体アレイキットによるプロテオグリカン反応性シグナル伝達因子の検出結果を示す図である。
【図１０】２０分後のＲＴＫ抗体アレイキットによるプロテオグリカン反応性シグナル伝達因子の検出結果を示す図である。
【図１１】プロテオグリカンのヒト皮膚繊維芽細胞のErk1/2活性化に対する効果を示す図である。
【図１２】図１１に対応するプロテオグリカンのヒト皮膚繊維芽細胞のErk1/2活性化に対する効果を示すグラフである。
【図１３】プロテオグリカンによるヒト皮膚繊維芽細胞の増殖促進作用に対するＭＥＫ１／２阻害剤の抑制効果を示す棒グラフである。
【図１４】Ｇ１およびＧ３抗体によるサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンのドットプロットである。
【図１５】比較例としてG３ドメインが存在する分子構造のプロテオグリカンの概略を説明する模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
次に、図面を参照して、本発明の第１の実施形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号を付している。ただし、図面は模式的なものであり、具体的な厚みや寸法は以下の説明を参酌して判断すべきものである。又、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。
【００１３】
又、以下に示す第１の実施形態は、本発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、本発明の技術的思想は、符号化のビット数、構成部品の材料、形状、構造、配置等を下記のものに特定するものでない。よって、本発明の技術的思想は、特許請求の範囲に記載された請求項が規定する技術的範囲内において、種々の変更を加えることができる。
【００１４】
（分子構造と各ドメインの機能）
プロテオグリカンは、コアタンパクとよばれるタンパク質にコンドロイチン硫酸やデルマタン硫酸等のグリコサミノグリカン（ムコ多糖）が共有結合している化合物の総称で、結合組織や細胞膜などに存在し、それぞれ、独自の分子構造や機能を有している。プロテオグリカンは、哺乳類（ウシ、ブタ等）、鳥類（ニワトリ等）、魚類（サメ、サケ等）、軟体動物（イカ、タコ等）等の動物から抽出され、由来や抽出方法に依存して、種々の分子量や分子構造のものがある。
【００１５】
サケ由来の軟骨基質のプロテオグリカンは、グリコサミノグリカンとしてコンドロイチン硫酸とケラタン硫酸を有している。軟骨基質のプロテオグリカンのコアタンパクの分子量は２００ｋＤａ〜３００ｋＤａで、図１５に示すように、ペプチド配列を書くときはＮ末端（アミノ末端）は左に置き、Ｎ末端からＣ末端（カルボキシ末端）にかけて右方向に配列を書くのが慣例である。なお、分子量は単位のない無次元量として定義されている数量なので，単位をつける必要はないが、本明細書ではバイオ系の標記の慣例に従いＤａの表記で表現する。
【００１６】
軟骨基質のプロテオグリカンは、図１５に示すように、Ｎ端末に２個のＧ１ドメイン、Ｇ２ドメインの球状ドメインを有し、Ｃ端末にＧ３ドメインの球状ドメインがあるモデルが提案されている。
Ｇ１ドメインは、図２に示すように、分子量４０ｋＤａ〜５０ｋＤａのリンクタンパク質（Link Protein：ＬＰ）と共にヒアルロン酸と結合して巨大な会合体を形成しているとされている。従来Ｇ３ドメインは、上皮細胞増殖因子（Epidermal Growth Factor：ＥＧＦ）様サブドメインとされている。Ｇ２メインは  Ｂ，Ｂ′の二つのサブドメインよりなり、アミノ酸配列の９０％  以上が  Ｇ１の  Ｂ−Ｂ′部分と一致するにもかかわらずＧ２ドメインはヒアルロン酸との結合能を持たず、Ｇ２ドメインは現在のところ、機能がよく分かっていない。
【００１７】
Ｇ２ドメインとＧ３ドメインの間には糖鎖結合領域があり、数本〜百本程度のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）という糖鎖が結合している。糖鎖結合領域の糖鎖には、コンドロイチン硫酸鎖Ｃｓとケラタン硫酸鎖、さらにＮ−またはＯ−結合型のオリゴ糖鎖等が含まれる。コンドロイチン硫酸鎖Ｃｓは分子内にカルボキシル基と硫酸基を、ケラタン硫酸は硫酸基を共有しているため、プロテオグリカンは多量の水を保持できる。
【００１８】
また、これらの陰性荷電の反発により、グリコサミノグリカン鎖は伸展したコイル状の形態をとる傾向がある。プロテオグリカンは単独でもそのグリコサミノグリカン鎖の性質により、大きな体積を占有する水和した分子であるが、軟骨基質のプロテオグリカンにおいては、リンクタンパクとともにヒアルロン酸と会合し、巨大な水和ゲルを形成している。この会合体がＩＩ型コラーゲンの骨格間を充填しているため、軟骨は特徴的な弾性体として機能することができる。
【００１９】
本発明の第１の実施形態に好適な細胞増殖促進剤等に用いる軟骨基質のプロテオグリカンは、図１５に示した構造とは異なり、図１に示すようなＧ３ドメインが欠損した分子構造のプロテオグリカンである。従来のＧ３ドメインが上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）様サブドメインとされていた技術的常識とは異なる知見である。
【００２０】
図３に、図１のように、Ｇ３ドメインが欠損した分子構造のプロテオグリカン（以下において、しばしば「Ｇ３ドメイン欠損プロテオグリカン」と略記する。）の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分子量の測定結果を示す。図３のＧ３ドメイン欠損プロテオグリカンのＨＰＬＣでは、６．８８３分の位置にピークが検出されたことが分かる。一方、図４に示したＧ３ドメイン有りの分子構造のプロテオグリカンにおけるＨＰＬＣ測定によるピークの位置は、６．０９２分であるので、Ｇ３ドメイン有りの分子構造のプロテオグリカンに比して、Ｇ３ドメイン欠損プロテオグリカンでは低分子側にあることが分かる。
【００２１】
図３及び図４では、高分子になるほど流出時間が短くなることを示しているが、分子量スタンダードと比較した結果、Ｇ３ドメイン無しの分子構造のプロテオグリカンの分子量は約６００ｋＤａ、Ｇ３ドメイン有りの分子構造のプロテオグリカンの分子量は、約１０５０ｋＤａと推定できる。抽出や調整等の製造時のバラツキや測定誤差を考慮すると、本発明の第１の実施形態に係る細胞増殖促進剤等に用いるに好適なＧ３ドメイン無しの分子構造を有する軟骨基質のプロテオグリカンの分子量は、約７８０ｋＤａ〜４２０ｋＤａ程度と判断できる。
以下に説明する実験では、Ｇ３ドメイン有りの分子構造のプロテオグリカンは、グアニジン塩酸を用いて、サケ鼻軟骨のアセトン抽出粉末から抽出したものである。一方、Ｇ３欠損プロテオグリカンは、サケの鼻軟骨から酢酸を用いて抽出したものである。
【００２２】
（増殖促進効果の測定）
サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンは細胞に対して様々な作用を有していると言われてはいるが、図１５に示したプロテオグリカンのＧ１ドメイン、Ｇ２ドメイン及びＧ３ドメインのうち、どのドメインを介して細胞のどの分子に作用しているのか、これまで全く不明であった。このため、Ｇ３ドメインを欠損した分子構造を有するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを本発明の第１の実施形態に係るプロテオグリカンとして、以下のような実験を行った。
【００２３】
（ａ）図５には、実施形態に係るプロテオグリカンのヒト皮膚繊維芽細胞の相対的生存率に対する時間および濃度依存的な影響を示す。実験においては、実施形態に係るプロテオグリカンの濃度を、０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、１６００μｇ／ｍｌと変え、ヒト皮膚繊維芽細胞に添加し、それぞれの濃度の実施形態に係るプロテオグリカンに関し、２４時間後、４８時間後および７２時間後にＭＴＴアッセイにより調べた。
【００２４】
図５に示すように、２４時間後のＭＴＴアッセイの測定においては、０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、１６００μｇ／ｍｌと実施形態に係るプロテオグリカンの濃度が増えるに従い、コントロールサンプルに対する相対的生存率が増大することが分かる。
４８時間後のＭＴＴアッセイの測定においても、０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、１６００μｇ／ｍｌと実施形態に係るプロテオグリカンの濃度が増えるに従い、コントロールサンプルに対する相対的生存率が増大するが、その相対的生存率は２４時間後の測定値よりも高いことが分かる。又、実施形態に係るプロテオグリカンの濃度が８００μｇ／ｍｌ及び１６００μｇ／ｍｌの高濃度のレベルでは相対的生存率の上昇率に飽和の傾向が見られる。
【００２５】
７２時間後のＭＴＴアッセイの測定においても、０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、１６００μｇ／ｍｌと実施形態に係るプロテオグリカンの濃度が増えるに従い、コントロールサンプルに対する相対的生存率が増大するが、実施形態に係るプロテオグリカンの濃度が８００μｇ／ｍｌと１６００μｇ／ｍｌとの比較では、高濃度側の１６００μｇ／ｍｌの実施形態に係るプロテオグリカンの方が、８００μｇ／ｍｌの実施形態に係るプロテオグリカンよりも、相対的生存率が低くなっている。ただし、それぞれの濃度の比較では、その相対的生存率は４８時間後の測定値よりも高いことが分かる。
【００２６】
（ｂ）サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンのヒト皮膚繊維芽細胞の生存率に対する効果が実施形態に係るプロテオグリカンのコアタンパク質を介して作用しているかどうかを調べた。このために、図６に示すように、実施形態に係るプロテオグリカンを３分間及び１０分間加熱処理してタンパク質の立体構造を壊し、このプロテオグリカンをヒト皮膚繊維芽細胞胞に添加してＭＴＴアッセイにより、相対的生存率を調べた。相対的生存率は、培養時間の未処置群をコントロールサンプルとして、吸光度のコントロールサンプルに対する百分率で示される。
【００２７】
図６から分かるように、実施形態に係るプロテオグリカンを３分間加熱処理してタンパク質の立体構造を壊した場合は、加熱処理をしない場合に比して、相対的生存率が僅かに低下している。しかし、実施形態に係るプロテオグリカンを１０分間加熱処理した場合は、加熱処理をしない場合に比して、相対的生存率が向上している。このことから、実施形態に係るプロテオグリカンを加熱処理しても、ヒト皮膚繊維芽細胞に対する増殖促進効果は減少しないと判断できる。したがって、図１に示した糖鎖部分Ｃｓが細胞生存率の増加に重要であることを図６のデータは示している。
【００２８】
（ｃ）実施形態に係るプロテオグリカンによって、ヒト皮膚繊維芽細胞の生存率がどのような作用機序で増加しているかを調べるために、細胞増殖に関連するシグナル伝達因子を抗体アレイにより網羅的に調べた。
細胞外シグナル調節キナーゼ（Extracellular Signal-regulated Kinase：Erk）は上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）や血清刺激、酸化ストレスなどによって活性化される分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（Mitogen-activated Protein Kinase：MAPK）のサブファミリーである。MAPKはセリン/スレオニンキナーゼの一つであり、酸化ストレス、サイトカイン等の刺激を受けて活性化される。Erkはその関わるシグナル伝達経路の違いからErk1/2，Erk5，Erk7，Erk8に分けられる。Erk1/2は分子量が４４ｋＤａのErk1と４２ｋＤａのErk2から成り、アミノ酸配列の一次構造は互いに８５％の相同性を有する。Erk1/2のスレオニン残基・チロシン残基をリン酸化することにより、細胞増殖シグナルを活性化してシグナルが伝達される。
【００２９】
図７は、初期状態におけるヒトレセプターチロシンキナーゼ（Receptor Tyrosine Kinase:ＲＴＫ）抗体アレイキットによるプロテオグリカン反応性シグナル伝達因子の検出結果である。ＲＴＫ抗体アレイキットでは、４９種類のＲＴＫに対する抗体をスポットしたアレイを用いて、チロシンがリン酸化されたＲＴＫを検出できる。
図８は、５分後のＲＴＫ抗体アレイキットによるプロテオグリカン反応性シグナル伝達因子の検出結果を示す図で、実施形態に係るプロテオグリカンを加えた試料（PG＋）において抗体アレイ上のリン酸化Erk1/2に変化が見られるが、実施形態に係るプロテオグリカンを加えない試料（PG−）においては、抗体アレイ上のリン酸化Erk1/2に変化が見られないことがわかる。図８のPGBは、１００℃で５分間加熱処理してタンパク質の立体構造を壊した実施形態に係るプロテオグリカンを意味する。１００℃で５分間加熱処理して、タンパク質の立体構造を壊した場合であっても、プロテオグリカン反応性シグナル伝達因子が検出されたことを示す。
【００３０】
図９は、１０分後のＲＴＫ抗体アレイキットによるプロテオグリカン反応性シグナル伝達因子の検出結果を示す図で、５分後の場合と同様に、実施形態に係るプロテオグリカンを加えた試料（PG＋）において抗体アレイ上のリン酸化Erk1/2に変化が見られるが、実施形態に係るプロテオグリカンを加えない試料（PG−）においては、抗体アレイ上のリン酸化Erk1/2に変化が見られないことがわかる。
【００３１】
図１０は、２０分後のＲＴＫ抗体アレイキットによるプロテオグリカン反応性シグナル伝達因子の検出結果を示す図である。実施形態に係るプロテオグリカンを加えた試料（PG＋）において抗体アレイ上のリン酸化Erk1/2に変化が見られるのは１０分後の場合と同様であるが、実施形態に係るプロテオグリカンを加えない試料（PG−）においては、抗体アレイ上のリン酸化Erk1/2に僅かに変化が見られる。
図７〜図１０に示した結果から、実施形態に係るプロテオグリカンをヒト皮膚繊維芽細胞に作用させることによって、抗体アレイ上のリン酸化Er k1/2のみにおいて変化を検出することが出来たことが分かる。
【００３２】
（ｄ）ヒト皮膚繊維芽細胞の生存率が実施形態に係るプロテオグリカンによって、どのような作用機序で増加しているかを調べるために、細胞増殖シグナル伝達因子の１つであるErk1/2の活性化を、図１１及び図１２に示すように、解析した。
図１１の上段は抗体アレイ上のリン酸化によるErk1/2の活性化を示す図であり、左側の実施形態に係るプロテオグリカンを加えない試料（PG−）においては、リン酸化による変化が見られないが、右側の実施形態に係るプロテオグリカンを加えた試料（PG＋）では、１０分後にリン酸化による変化が見られる。
【００３３】
図１２の縦軸は、リン酸化されたErk1/2の強度と、リン酸化されていないErk1/2の強度の比を示し、実施形態に係るプロテオグリカンを加えた試料（PG＋）では、Erk1/2のリン酸化が１０分後をピークに変化していることが分かる。一方、実施形態に係るプロテオグリカンを加えない試料（PG−）においては、１以下の価の範囲で次第に増加している傾向が見られる。
図１１及び図１２から、実施形態に係るプロテオグリカンをヒト皮膚繊維芽細胞に作用させることによって、細胞増殖シグナル因子Erk1/2のリン酸化が１０分後をピークに変化していることが分かる。
【００３４】
（ｅ）実施形態に係るプロテオグリカンによるヒト皮膚繊維芽細胞の増殖促進効果に対してErk1/2の活性化が関与しているかどうかを確認するために、Erk1/2に対するリン酸化酵素ＭＥＫ１／２の阻害剤であるＰＤ９８０５９を用いて実施形態に係るプロテオグリカンによる細胞増殖促進作用が抑制されるかどうかを調べた。
図１３の縦軸は、コントロールサンプルに対する相対的生存率で、横軸は実施形態に係るプロテオグリカンの濃度である。図１３に白抜きの棒で示した阻害剤ＰＤ９８０５９を加えない試料（−）においては、０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌと、実施形態に係るプロテオグリカンの濃度を増大させると、相対的生存率が増大しており、増殖促進作用の阻害の効果は認められない。
【００３５】
一方、図１３のピンドットを散りばめた模様（ドット柄）を付した棒で示した阻害剤ＰＤ９８０５９を加えた試料（＋）は、０μｇ／ｍｌの場合を除いて阻害剤ＰＤ９８０５９を加えない試料（−）の相対的生存率よりも低い値になっており、阻害剤ＰＤ９８０５９による阻害の効果が認められる。又、阻害剤ＰＤ９８０５９を加えた試料（＋）においては、実施形態に係るプロテオグリカンの濃度が２００μｇ／ｍｌを超えると、阻害の効果が顕著になり、４００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌと、実施形態に係るプロテオグリカンの濃度を増大させるに従い、相対的生存率が減少している。
図１３から、リン酸化酵素ＭＥＫ１／２の阻害剤ＰＤ９８０５９は、実施形態に係るプロテオグリカンによるヒト皮膚繊維芽細胞の増殖促進作用を阻害したことが分かる。
【００３６】
（ｆ）  Erk1/2の活性化を介してヒト皮膚繊維芽細胞の増殖を促進するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンの構造を、Ｇ１およびＧ３ドメインに対する抗体を用いてドットプロット法により解析した。
図１４の上段が、Ｇ１抗体によるサケ鼻軟骨由来プロテオグリカン等３つの試料に対するドットプロットであり、左から比較例としてのウシ血清アルブミン (Bovine Serum Albumin：ＢＳＡ)、比較例としてのウシ由来プロテオグリカン、実施形態に係るプロテオグリカンであるサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンである。Ｇ１抗体によって、中央の比較例としてのウシ由来プロテオグリカンと一番右側のサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンが化学発光しているので、ウシ由来プロテオグリカンとサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンはＧ１ドメインを有することがわかる。しかし、比較例としてのウシ由来プロテオグリカンに比して、実施形態に係るプロテオグリカンのＧ１抗体の化学発光は弱い。
【００３７】
図１４の下段が、比較例としてのＢＳＡ、比較例としてのウシ由来プロテオグリカン、実施形態に係るプロテオグリカンであるサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを試料とした場合の、Ｇ３抗体によるドットプロットでありである。Ｇ３抗体によって、中央の比較例としてのウシ由来プロテオグリカンのみが化学発光し、一番右側の実施形態に係るプロテオグリカンであるサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンの場合は化学発光しないことが分かる。よって、本発明の第１の実施形態に係るサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンはＧ３ドメインを欠損していると判断できる。
【００３８】
以上において、図６に示した実施形態に係るプロテオグリカンの加熱処理実験結果から、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンの糖鎖部分Ｃｓがヒト皮膚繊維芽細胞の細胞生存率の増加に重要であることが明らかにされた。そして、図７〜図１２に示したように、シグナル伝達物質の発現解析から細胞増殖シグナル伝達因子Erk1/2の関与が証明された。
また、図１４に示した結果から、Erk1/2の活性化を介してヒト皮膚繊維芽細胞の細胞増殖を促進するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンはＧ１ドメインを持ち、Ｇ３ドメインを持たないという特有な分子構造をしていることが分かった。更に、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンは、図１に示した糖鎖部分Ｃｓを介してErk1/2の活性化を惹起し、ヒト皮膚繊維芽細胞の細胞増殖を促進している可能性が理解できる。
【００３９】
（細胞増殖促進剤等の製造方法）
本発明の第１の実施形態に係る細胞増殖促進剤等は、経口投与あるいは塗布することにより、細胞増殖シグナル伝達因子Erk1/2を活性化して、ヒト皮膚繊維芽細胞に対する細胞増殖促進効果を発揮する。図３及び図４で比較したとおり、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンであっても、調整方法によって、Ｇ３ドメインを持つ分子構造と、Ｇ３ドメインを持たない分子構造のものがある。よって、第１の実施形態に係る細胞増殖促進剤等を製造する際には、ＨＰＬＣ等による分子量の測定や、Ｇ３ドメインに対する抗体を用いたドットプロット法による解析等によって、Ｇ３ドメインを持たない分子構造であることを確認した後、以下のような処理を実施すれば製造できる。
【００４０】
例えば、経口投与用の第１の実施形態に係る細胞増殖促進剤を製造するに際しては、上記のように、Ｇ３ドメインを欠損した分子構造であるサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンであることを確認した後、有効成分である第１の実施形態に係るプロテオグリカンを、常法に従い、錠剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、ドリンク剤等に製剤化して用いることもできる。ただし、Ｇ３ドメインを欠損した分子構造であるサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをそのままの状態で経口投与に用いることもできる。
【００４１】
本発明の第１の実施形態において、Ｇ３ドメインを欠損した分子構造を有するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを有効成分として配合した錠剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口剤は、例えば、澱粉、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等の賦形剤を用いて常法によって製剤化することが可能である。この種の製剤には賦形剤の他に、界面活性剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、香料、流動性促進剤、着色料等を適宜使用してもよい。
【００４２】
実施の形態に係る細胞増殖促進剤に用いる界面活性剤としては、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステル等、滑沢剤としては、ロウ、タルク、蔗糖脂肪酸エステル、水素添加植物油等、流動性促進剤としてはケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウム、等が挙げられる。
また、実施の形態に係る細胞増殖促進剤に用いる結合剤としては、例えば、澱粉、ゼラチン、デキストリン、アラビアガム、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、結晶性セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンが挙げられ、崩壊剤としては、例えば、結晶性セルロース、澱粉、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム等が挙げられる。
【００４３】
例えば、本発明の第１の実施形態に係るＧ３ドメインを欠損した分子構造を有するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを有効成分として配合した細胞増殖促進剤の錠剤を製造するには、サケの鼻軟骨から分離精製されたＧ３ドメイン欠損プロテオグリカンの凍結乾燥粉末、でんぷん、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、カルボキシメチルセルロース、タルクの各成分をよく混合してから打錠すればよい。
【００４４】
また、細胞増殖促進剤のカプセル剤を製造するには、サケの鼻軟骨から分離精製されたＧ３ドメイン欠損プロテオグリカンの凍結乾燥粉末、でんぷん、乳糖、ステアリン酸マグネシウムの各成分をよく混合してからカプセルに充填すればよい。
さらには、本発明の第１の実施形態に係るＧ３ドメインを欠損した分子構造を有するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをそのままあるいは製剤化した後、これを細胞増殖促進用サプリメント、細胞増殖促進用栄養剤や細胞増殖促進用飲食品等に配合することも可能である。
【００４５】
なお、Ｇ３ドメインを欠損した分子構造を有するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンは、図６に示すように、熱に対して安定であるので、Ｇ３ドメインを欠損した分子構造を有するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを含む原料を通常行われるような条件で加熱殺菌することも可能である。
上記の固形剤の他、本発明の第１の実施形態に係る細胞増殖促進剤を塗布するに際しては、その使用目的に応じて、通常用いられる公知の成分に配合することによって、液剤、半固形剤等の各種剤形に調製することが可能で、好ましい組成物としてクリーム、ローション、軟膏、ゲル、スプレー剤、貼付剤、粉末等が挙げられる。
【００４６】
例えば、本発明の第１の実施形態に係る細胞増殖促進剤をグリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸、ポリエチレングリコール等の界面活性剤、ラノリン等の動物性油脂、ワセリン等の炭化水素、ミリスチン酸イソプロピル、ステアリルアルコール等の高級脂肪酸低級アルキルエステル、グリセリン等の多価アルコール、無機塩、ロウ、樹脂、水及び、要すればパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等の保存料に混合することによって、細胞増殖促進用化粧料や医薬品を製造することができる。
【００４７】
本発明の第１の実施形態に係る細胞増殖促進用化粧料のクリーム剤を製造するには、サケの鼻軟骨から分離精製されたＧ３ドメイン欠損プロテオグリカンの凍結乾燥粉末、モノステアリン酸グリセリン、ステアリルアルコール、ポリオキシエチレンセチルエーテル、水添ラノリン、スクワラン、オクチルドデカノール、プロピレングリコール、ステアリン酸、香料、精製水、防腐剤、から常法に従って製造すればよい。
【００４８】
本発明の第１の実施形態に係る細胞増殖促進剤の塗布による有効量は、剤形により異なるが、適用する組成物全量を基準として、好ましくは、０．００１〜２重量％となるように、Ｇ３ドメインを欠損した分子構造を有するサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを有効成分として配合すれば、細胞増殖シグナル伝達因子Erk1/2を有効に活性化できる。ただし、入浴剤のように使用時に希釈されるものは、さらに配合量を増やすことができる。
【００４９】
（その他の実施の形態）
上記のように、本発明は第１の実施形態によって記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面は本発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。よって、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を含むことは勿論である。したがって、本発明の技術的範囲は上記の説明から妥当な特許請求の範囲に係る発明特定事項によってのみ定められるものである。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、皮膚の荒れ、シワ、弾性低下、関節機能低下等を防止するのに有用な細胞増殖促進剤を提供する医薬品及び医療分野、細胞増殖促進用サプリメントや細胞増殖促進用飲食品を提供する食品分野、或いは細胞増殖促進用化粧料を提供する化粧品分野等の技術分野に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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