(57)【要約】【課題】核酸増幅反応原理を利用した検査などの遺伝子検査において、陰性結果を迅速かつ積極的に示すことができる、核酸検出方法、試薬およびキット等を提供することを目的とする。【解決手段】等温増幅法において用いることができる、陰性検出用の鋳型核酸（「ネガティブコントロール（ＮＣ）用鋳型核酸」）、およびＮＣ用鋳型に対して相補的にハイブリダイズするプライマーもしくはプローブ（「ネガティブコントロール（ＮＣ）用プライマー」もしくは「ネガティブコントロール（ＮＣ）用プローブ」）を設計した。これらを用いることで、陰性結果を迅速かつ積極的に示すことができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
等温増幅法において、プライマーとの結合について標的核酸配列と競合する、鋳型核酸であって、
ここで、前記プライマーは、標的核酸配列の３’側に位置する配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ）を３’末端に含み、かつ標的核酸配列において配列（Ａ）よりも５’側に位置する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を、配列（Ａｃ）の５’側に含み、
前記鋳型核酸は、５’側から３’側に、配列（Ｂ’’）、配列（Ｎ）、および配列（Ａ’）を含み、
配列（Ｂ’’）は、配列（Ｂ’）がハイブリダイズする配列（Ｂ’’ｃ）の相補配列であり、
配列（Ｎ）は、標的核酸配列またはその部分配列とは異なる配列であり、かつ
配列（Ａ’）は、配列（Ａｃ）がハイブリダイズする配列である、
鋳型核酸。
【請求項２】
配列（Ｂ’’）と配列（Ｎ）の間に、一以上の塩基が付加されている、請求項１に記載の鋳型核酸。
【請求項３】
配列（Ａ’）の５’側または３’側に、一以上の塩基が付加されている、請求項１または２に記載の鋳型核酸。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の鋳型核酸中の配列（Ｎ）の相補配列（Ｎｃ）にハイブリダイズする配列（Ｎ’）を含む、プライマーまたはプローブであって、標的核酸配列もしくはその相補配列、または前記鋳型核酸へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーおよびプローブと競合しない、プライマーまたはプローブ。
【請求項５】
標識されている、請求項４に記載のプライマーまたはプローブ。
【請求項６】
標識が蛍光物質による標識である、請求項５に記載のプライマーまたはプローブ。
【請求項７】
蛍光物質がＥｘｃｉｔｏｎ色素である、請求項６に記載のプライマーまたはプローブ。
【請求項８】
等温増幅法によって標的核酸を検出する方法であって、該方法は陰性結果を検出する工程を含み、
ここで、陰性結果を検出する工程は、
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の鋳型核酸を反応混合物に添加する段階、および
（ｂ）請求項４〜７のいずれか一項に記載のプライマーまたはプローブを反応混合物に添加する段階
を含む、方法。
【請求項９】
等温増幅法によって標的核酸を検出するための試薬であって、該試薬は陰性結果を検出する手段を含み、
ここで、陰性結果を検出する手段は、
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の鋳型核酸、または
（ｂ）請求項４〜７のいずれか一項に記載のプライマーまたはプローブ
の少なくとも一方である、試薬。
【請求項１０】
等温増幅法によって標的核酸を検出するためのキットであって、該キットは陰性結果を検出する手段を含み、
ここで、陰性結果を検出する手段は、
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の鋳型核酸、または
（ｂ）請求項４〜７のいずれか一項に記載のプライマーまたはプローブ
の少なくとも一方である、キット。
【請求項１１】
等温増幅法によって陰性結果を検出する方法であって、
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の鋳型核酸を反応混合物に添加する工程、および
（ｂ）請求項４〜７のいずれか一項に記載のプライマーまたはプローブを反応混合物に添加する工程
を含む、方法。
【請求項１２】
等温増幅法によって陰性結果を検出するための試薬であって、
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の鋳型核酸、または
（ｂ）請求項４〜７のいずれか一項に記載のプライマーまたはプローブ
の少なくとも一方を含む、試薬。
【請求項１３】
等温増幅法によって陰性結果を検出するためのキットであって、
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の鋳型核酸、または
（ｂ）請求項４〜７のいずれか一項に記載のプライマーまたはプローブ
の少なくとも一方を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、等温増幅法によって標的核酸を検出する方法、試薬およびキット、ならびにそれらに用いられる鋳型核酸、プライマーおよびプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、極微量の試料から生物種を特定できる有用な手段として、医療・美容・食品・環境衛生等、幅広い分野において遺伝子検査が利用されつつある。なかでも、遺伝子検査の医療分野への応用として、感染症領域において、これまでの培養法と比較して優位性のある検査が提供されている。具体的には、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）を原理として採用している。
【０００３】
ＰＣＲを採用することによって、検査対象となる生物種に特異的な遺伝子の核酸領域のＤＮＡを短時間にコピーする（すなわち、増幅する）ことができる。そのため、時間を要する培養法より、短時間に対象となる遺伝子を特定することができる。したがって、これまでＰＣＲにおいて重要な材料となるＰＣＲプライマーが、様々な生物種を特定するために、多く開発されている。
【０００４】
一方、ＰＣＲ法は培養法に比べて短時間で結果を得ることができるが、結果が出るまでに数〜十数時間を要する。そのため、その場で結果を提供することが必要な臨床現場では不適であった。そこで、迅速な検査を目的として、等温で核酸を増幅できる、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（特許文献１、２）やＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法（特許文献３、４）に代表される等温増幅法が開発されている。等温増幅法は、ＰＣＲに必要となる温度制御を必要としない。また、連続的な分子内増幅反応を行わせることができる、特徴的なプライマーを数種類利用することにより、ＰＣＲを利用する検査よりも時間が短縮された検査を提供することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３３１３３５８号明細書
【特許文献２】特許第４７２６３８１号明細書
【特許文献３】特許第３８９７８０５号明細書
【特許文献４】特許第４３７０３８５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＰＣＲならびに等温増幅可能なＬＡＭＰ法およびＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法のような原理（以降、「核酸増幅反応原理」という）による検査においては、一般的に、所定の時間を待たなければ測定対象の試料が陰性と判定できない。陰性と判定するために必要な時間は、陽性と判定する場合よりも長時間を要する。
【０００７】
一般的に、核酸増幅反応原理は、測定時間に対する核酸増幅量を蛍光量で検出する。検査対象とする核酸が存在する場合は、一定時間経過後に蛍光量が検出され、増幅曲線が得られる。一方、検査対象とする核酸が存在しない場合は、一定時間経過後も蛍光量が検出されないので、増幅曲線が得られない。
【０００８】
したがって、核酸増幅反応原理を利用した検査では、蛍光量が確認されれば、陽性と直ちに判定できるが、陰性の場合は、所定の時間待たなければ陰性と判断できない。そこで、本発明は、遺伝子検査において陰性結果を迅速かつ積極的に示すことができる、核酸検出方法、試薬およびキット等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究を重ね、ＬＡＭＰ法およびＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法等の等温増幅法において用いることができる、陰性検出用の鋳型核酸（以下、「ネガティブコントロール（ＮＣ）用鋳型」とする）、およびＮＣ用鋳型に対して相補的にハイブリダイズするプライマーもしくはプローブ（以下、「ネガティブコントロール（ＮＣ）用プライマー」もしくは「ネガティブコントロール（ＮＣ）用プローブ」とする）を設計し、それによって、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する：
［１］等温増幅法において、プライマーとの結合について標的核酸配列と競合する、鋳型核酸であって、
ここで、前記プライマーは、標的核酸配列の３’側に位置する配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ）を３’末端に含み、かつ標的核酸配列において配列（Ａ）よりも５’側に位置する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を、配列（Ａｃ）の５’側に含み、
前記鋳型核酸は、５’側から３’側に、配列（Ｂ’’）、配列（Ｎ）、および配列（Ａ’）を含み、
配列（Ｂ’’）は、配列（Ｂ’）がハイブリダイズする配列（Ｂ’’ｃ）の相補配列であり、
配列（Ｎ）は、標的核酸配列またはその部分配列とは異なる配列であり、かつ
配列（Ａ’）は、配列（Ａｃ）がハイブリダイズする配列である、
鋳型核酸；
［２］配列（Ｂ’’）と配列（Ｎ）の間に、一以上の塩基が付加されている、［１］に記載の鋳型核酸；
［３］配列（Ａ’）の５’側または３’側に、一以上の塩基が付加されている、［１］または［２］に記載の鋳型核酸；
［４］［１］〜［３］のいずれか一つに記載の鋳型核酸中の配列（Ｎ）の相補配列（Ｎｃ）にハイブリダイズする配列（Ｎ’）を含む、プライマーまたはプローブであって、標的核酸配列もしくはその相補配列、または前記鋳型核酸へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーおよびプローブと競合しない、プライマーまたはプローブ；
［５］標識されている、［４］に記載のプライマーまたはプローブ；
［６］標識が蛍光物質による標識である、［５］に記載のプライマーまたはプローブ；
［７］蛍光物質が、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）、フルオレセイン（ＦＡＭ）（商標）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）（商標）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）（商標）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）（商標）、ＪＯＥ（商標）、ＶＩＣ（登録商標）、ＮＥＤ（商標）、ＰＥＴ（登録商標）、Ａｌｅｘａ（登録商標）蛍光色素、テキサスレッド（登録商標）、ローダミンレッドＸ（ＲＯＸ）（商標）、およびＥｘｃｉｔｏｎ色素からなる群から選択される、［６］に記載のプライマーまたはプローブ；
［８］蛍光物質がＥｘｃｉｔｏｎ色素である、［７］に記載のプライマーまたはプローブ；
［９］等温増幅法によって標的核酸を検出する方法であって、該方法は陰性結果を検出する工程を含み、
ここで、陰性結果を検出する工程は、
（ａ）［１］〜［３］のいずれか一つに記載の鋳型核酸を反応混合物に添加する段階、および
（ｂ）［４］〜［８］のいずれか一つに記載のプライマーまたはプローブを反応混合物に添加する段階
を含む、方法；
［１０］等温増幅法がＬＡＭＰ法またはＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法である、［９］に記載の方法；
［１１］等温増幅法によって標的核酸を検出するための試薬であって、該試薬は陰性結果を検出する手段を含み、
ここで、陰性結果を検出する手段は、
（ａ）［１］〜［３］のいずれか一つに記載の鋳型核酸、または
（ｂ）［４］〜［８］のいずれか一つに記載のプライマーまたはプローブ
の少なくとも一方である、試薬；
［１２］等温増幅法がＬＡＭＰ法またはＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法である、［１１］に記載の試薬；
［１３］等温増幅法によって標的核酸を検出するためのキットであって、該キットは陰性結果を検出する手段を含み、
ここで、陰性結果を検出する手段は、
（ａ）［１］〜［３］のいずれか一つに記載の鋳型核酸、または
（ｂ）［４］〜［８］のいずれか一つに記載のプライマーまたはプローブ
の少なくとも一方である、キット；
［１４］等温増幅法がＬＡＭＰ法またはＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法である、請求項１４に記載のキット；
［１５］等温増幅法によって陰性結果を検出する方法であって、
（ａ）［１］〜［３］のいずれか一つに記載の鋳型核酸を反応混合物に添加する工程、および
（ｂ）［４］〜［８］のいずれか一つに記載のプライマーまたはプローブを反応混合物に添加する工程
を含む、方法；
［１６］等温増幅法によって陰性結果を検出するための試薬であって、
（ａ）［１］〜［３］のいずれか一つに記載の鋳型核酸、または
（ｂ）［４］〜［８］のいずれか一つに記載のプライマーまたはプローブ
の少なくとも一方を含む、試薬；および
［１７］等温増幅法によって陰性結果を検出するためのキットであって、
（ａ）［１］〜［３］のいずれか一つに記載の鋳型核酸、または
（ｂ）［４］〜［８］のいずれか一つに記載のプライマーまたはプローブ
の少なくとも一方を含む、キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＬＡＭＰ法およびＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法等の等温増幅法において、陰性結果を迅速かつ積極的に示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は一般的な等温増幅法の一部分を示す概略図である。具体的には、等温増幅法における第一のプライマー（例えば、ＦＩＰまたはＴＰ）と標的核酸配列との結合、ならびにそれに続く核酸伸長反応を示す。
【図２】図２は等温増幅法におけるプライマー（例えば、ＦＩＰまたはＴＰ）と本発明のＮＣ用鋳型との結合、ならびにそれに続く核酸伸長反応を示す概略図である。
【図３】図３は、ＮＣ用鋳型として、６×１０１０コピー／２５μＬのＡＬＤＨ２＿ＮＣ＿５ｗＴＢ３＿ｆｕｌｌＡｎを用いた場合の核酸増幅曲線を示す。ＡＬＤＨ２鋳型が添加されなかった場合、ＡＬＤＨ２鋳型の濃度が６×１０２コピー／２５μＬの場合、６×１０３コピー／２５μＬの場合、および６×１０４コピー／２５μＬの場合の結果がそれぞれ示される。
【図４】図４は、ＮＣ用鋳型として、６×１０１０コピー／２５μＬのＭＤＭ２＿ＮＣ＿６ｗＴＢ−３＿ｆｕｌｌＡｎを用いた場合の核酸増幅曲線を示す。ＭＤＭ２鋳型が添加されなかった場合、ＭＤＭ２鋳型の濃度が６×１０２コピー／２５μＬの場合、６×１０３コピー／２５μＬの場合、および６×１０４コピー／２５μＬの場合の結果がそれぞれ示される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１つの態様において、本発明は、等温増幅法において、プライマーとの結合について標的核酸配列と競合する、鋳型核酸を提供する。当該プライマーは、標的核酸配列の３’側に位置する配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ）を３’末端に含み、かつ標的核酸配列において配列（Ａ）よりも５’側に位置する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を、配列（Ａｃ）の５’側に含む。当該鋳型核酸は、５’側から３’側に、配列（Ｂ’’）、配列（Ｎ）、および配列（Ａ’）を含む。配列（Ｂ’’）は、配列（Ｂ’）がハイブリダイズする配列（Ｂ’’ｃ）の相補配列である。配列（Ｎ）は、標的核酸配列またはその部分配列とは異なる配列である。配列（Ａ’）は、配列（Ａｃ）がハイブリダイズする配列である。
【００１４】
上述のプライマーは、等温増幅法において最初に標的核酸配列にハイブリダイズするプライマーである。例えば、このプライマーはＬＡＭＰ法ではＦＩＰに相当する。ＬＡＭＰ法およびＦＩＰの設計方法の詳細については、特許文献１および２、ならびにｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｏｏｐａｍｐ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｌａｍｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを参照のこと。あるいは、上述のプライマーは、ＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法ではターンバックプライマー（ＴＰ）に相当する。ＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法およびＴＰの設計方法の詳細については、特許文献３および４を参照のこと。
【００１５】
配列（Ａｃ）は、配列（Ａ）にハイブリダイズする配列である限り、どのような配列であってもよい。例えば、配列（Ａｃ）は、配列（Ａ）に相補的な配列であってもよく、配列（Ａ）の一部分に相補的な配列であってもよい。あるいは、配列（Ａｃ）は、配列（Ａ）に実質的に相補的な配列であってもよく、配列（Ａ）の一部分に実質的に相補的な配列であってもよい。ＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法では、配列（Ａｃ）はＴＰの「アニーリング領域」に相当する。
【００１６】
配列（Ａｃ）の長さは、特に限定されないが、例えば、５〜５０塩基長、７〜３０塩基長、好ましくは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９塩基長である。
【００１７】
配列（Ｂ’）は、配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列である限り、どのような配列であってもよい。例えば、配列（Ｂ’）は、相補配列（Ｂｃ）に相補的な配列であってもよく、相補配列（Ｂｃ）の一部分に相補的な配列であってもよい。あるいは、配列（Ａｃ）は、相補配列（Ｂｃ）に実質的に相補的な配列であってもよく、相補配列（Ｂｃ）の一部分に実質的に相補的な配列であってもよい。ＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法では、配列（Ｂ’）はＴＰの「ターンバック領域」に相当する。
【００１８】
配列（Ｂ’）の長さは、特に限定されないが、例えば、５〜５０塩基長、７〜３０塩基長、好ましくは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９塩基長である。
【００１９】
配列（Ｂ’’）は、配列（Ｂ’）がハイブリダイズする配列（Ｂ’’ｃ）の相補配列である限り、どのような配列であってもよい。例えば、配列（Ｂ’’）は、配列（Ｂ’）に相補的な配列の相補配列であってもよい。すなわち、配列（Ｂ’’）は配列（Ｂ’）と同一の配列であってもよい。あるいは、配列（Ｂ’’）は、配列（Ｂ’）の一部分に相補的な配列の相補配列であってもよい。すなわち、配列（Ｂ’’）は配列（Ｂ’）の一部分と同一の配列であってもよい。あるいは、配列（Ｂ’’）は、配列（Ｂ’）に実質的に相補的な配列の相補配列であってもよい。すなわち、配列（Ｂ’’）は配列（Ｂ’）と実質的に同一の配列であってもよい。あるいは、配列（Ｂ’’）は、配列（Ｂ’）の一部分に実質的に相補的な配列の相補配列であってもよい。すなわち、配列（Ｂ’’）は配列（Ｂ’）の一部分と実質的に同一の配列であってもよい。
【００２０】
配列（Ｂ’’）の長さは、特に限定されないが、例えば、５〜５０塩基長、７〜３０塩基長、好ましくは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９塩基長である。
【００２１】
配列（Ｎ）は、標的核酸配列またはその部分配列とは異なる配列である限り、どのような配列であってもよい。当業者であれば、標的核酸配列を参照して、公知の配列比較アルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ  ２．０を使用して、二つ以上の配列または部分配列が同一であるか否かを調べることができる。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトを通して公的に入手することができる。
【００２２】
配列（Ｎ）の長さは、特に限定されないが、例えば、２〜１００塩基長、５〜５０塩基長、７〜３０塩基長、好ましくは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９塩基長である。
【００２３】
配列（Ａ’）は、配列（Ａｃ）がハイブリダイズする配列である限り、どのような配列であってもよい。例えば、配列（Ａ’）は、配列（Ａｃ）に相補的な配列であってもよく、配列（Ａｃ）の一部分に相補的な配列であってもよい。あるいは、配列（Ａ’）は、配列（Ａｃ）に実質的に相補的な配列であってもよく、配列（Ａｃ）の一部分に実質的に相補的な配列であってもよい。
【００２４】
配列（Ａ’）の長さは、特に限定されないが、例えば、例えば、５〜５０塩基長、７〜３０塩基長、好ましくは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９塩基長である。
【００２５】
一実施形態では、本発明の鋳型核酸において、配列（Ｂ’’）と配列（Ｎ）の間に、一以上の塩基が付加されている。例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８または９個の塩基が付加されている。
【００２６】
他の実施形態では、本発明の鋳型核酸において、配列（Ａ’）の５’側または３’側に、一以上の塩基が付加されている。例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、または１〜１０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９個）の塩基が、配列（Ａ’）の５’側または３’側に付加されている。
【００２７】
本発明の鋳型核酸の長さは、特に限定されないが、例えば、１０〜４００塩基長、１０〜３５０塩基長、１０〜３００塩基長、１０〜２５０塩基長、１０〜２００塩基長、１０〜１５０塩基長、１０〜１００塩基長、２０〜８０塩基長、３０〜７０塩基長、好ましくは、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、または６９塩基長である。
【００２８】
本明細書で用いる場合、「実質的に相補的な配列」とは、ある配列と１００％の相補性を有するものではないが、その配列にハイブリダイズできる程度に相補的である配列を意味する。「実質的に相補的な配列」は、ハイブリダイズする配列に対して、例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の相補性を有する。配列の相補性は、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）などを用いて測定することができる。あるいは、単純に配列を比較して配列の相補性を計算することもできる。
【００２９】
本明細書で用いる場合、「実質的に同一の配列」とは、ある配列と１００％の配列同一性を有するものではないが、例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有する配列を指す。配列同一性は、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）などを用いて測定することができる。あるいは単純に配列を比較して、配列の同一性を計算することもできる。
【００３０】
本明細書で用いる場合、「等温増幅法」とは、等温で核酸を増幅する方法を意味する。等温増幅法の例としては、ＬＡＭＰ法（栄研化学株式会社）、ＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法（株式会社ダナフォーム）、およびＩＣＡＮ（商標）法（タカラバイオ株式会社）が挙げられる。
【００３１】
本明細書で用いる場合、「標的核酸配列」とは、増幅しようとする核酸またはその配列を意味する。「標的核酸配列」はまた、その配列に相補的な配列または相補的な配列を含む核酸も意味する。本明細書において、「標的核酸配列」は「標的配列」または「標的核酸」ともいう。標的核酸配列は、例えば、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列である。標的核酸配列は、天然に存在する配列であってもよく、プラスミドなどの人工的な配列であってもよい。増幅酵素としては、当技術分野において公知の核酸増幅酵素が用いられる。例えばＡａｃ  ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。標的核酸配列がＲＮＡ配列である場合、増幅反応溶液中に逆転写酵素を添加してもよい。逆転写酵素としては、当技術分野において公知の逆転写酵素が用いられる。例えばＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）由来の逆転写酵素（ＡＭＶ  ＲＴ）が用いられる。
【００３２】
標的核酸配列は、例えば、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、ＲＳウイルス、デングウイルス、エボラウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、マールブルグウイルス、ラッサウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、肝炎ウイルス、コクサッキーウイルス、パルボウイルスなどのウイルス；大腸菌、放線菌、枯草菌、黄色ブドウ球菌、肺炎レンサ球菌、ボツリヌス菌、腸炎ビブリオ、サルモネラ、カンピロバクター、リステリア、ウェルシュ菌、セレウス菌、エルシニア菌、ペスト菌、コレラ菌、赤痢菌、ジフテリア菌、チフス菌、パラチフス菌、百日咳菌、結核菌、溶血性レンサ球菌、マイコプラズマ、リケッチア、スピロヘータ、レジオネラ、クリプトスポリジウム、ジアルジアなどの細菌；ジストマ、有鉤嚢虫、無鉤条虫、粘液胞子虫、住肉胞子虫、アニサキスなどの寄生虫；赤痢アメーバ、リーシュマニア、マラリア、トリパノソーマ、トキソプラズマ、ランブリア、トリコモナス、バランチジウム、コクシジウム、クリプトスポリジウム、バベシア・マイクロティなどの原虫；酵母、白癬菌、カンジダ、クリプトコッカス、アスペルギルス、マラセチア、スポロトリックスなどの真菌；ラン藻類；古細菌；藻類；植物；およびヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、鳥類、は虫類、両生類、魚類などの動物に由来する配列である。
【００３３】
他の態様において、本発明は、上述した本発明の鋳型核酸中の配列（Ｎ）の相補配列（Ｎｃ）にハイブリダイズする配列（Ｎ’）を含む、プライマーまたはプローブであって、標的核酸配列もしくはその相補配列、または前記鋳型核酸へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーおよびプローブと競合しない、プライマーまたはプローブを提供する。このプライマーまたはプローブは、ＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法におけるブーストプライマー（ＢＰ）に相当する。本明細書において、本発明のプライマーまたはプローブは「ネガティブコントロール（ＮＣ）用プライマー」もしくは「ネガティブコントロール（ＮＣ）用プローブ」とも称される。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「他のプライマーおよびプローブと競合しない」とは、あるプライマーまたはプローブが標的核酸配列にハイブリダイズすることによって、他のプライマーおよびプローブによる相補鎖合成起点の提供が妨げられないことを意味する。
【００３５】
本明細書で用いる場合、「ハイブリダイズする」とは、ある核酸またはその一部分が、ストリンジェントな条件下で別の核酸またはその一部分に相補的に結合して二本鎖を形成することを意味する。当業者であれば、二本鎖を形成する核酸の融解温度（Ｔｍ）およびハイブリダイゼーションに用いる溶液の塩濃度などに基づいて、ストリンジェントな条件を決定することができる。例えば、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｓｃｈ，  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８９）等を参照のこと。プライマーまたはプローブと標的核酸との二本鎖を形成する場合には、例えば、使用するプライマーの融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行うと、プライマーまたはプローブを標的核酸に特異的にハイブリダイズさせることができる。プライマーおよびプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）などの市販のプライマー構築ソフトを用いて設計することができる。ある標的核酸にハイブリダイズするプライマーまたはプローブは、その標的核酸またはその一部分に相補的な配列を含む。
【００３６】
本発明のプライマーまたはプローブの長さは、特に限定されないが、例えば、２〜１００塩基長、５〜５０塩基長、７〜３０塩基長、好ましくは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９塩基長である。
【００３７】
一実施形態では、本発明のプライマーまたはプローブは標識されている。例えば、プライマーまたはプローブは蛍光物質により標識されている。蛍光物質の例としては、例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）、フルオレセイン（ＦＡＭ）（商標）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）（商標）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）（商標）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）（商標）、ＪＯＥ（商標）、ＶＩＣ（登録商標）、ＮＥＤ（商標）、ＰＥＴ（登録商標）、Ａｌｅｘａ（登録商標）蛍光色素、テキサスレッド（登録商標）、ローダミンレッドＸ（ＲＯＸ）（商標）、およびＥｘｃｉｔｏｎ色素が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、蛍光物質はＥｘｃｉｔｏｎ色素である。
【００３８】
別の態様において、本発明は、等温増幅法によって標的核酸を検出する方法であって、陰性結果を検出する工程を含む、方法を提供する。陰性結果を検出する工程は、（ａ）上述した本発明の鋳型核酸を反応混合物に添加する段階、および（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブを反応混合物に添加する段階を含む。一実施形態では、等温増幅法はＬＡＭＰ法もしくはＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法、またはそれらの改良方法である。
【００３９】
上述した標的核酸を検出する方法は、特定の理論に縛られることを望むものではないが、標的核酸を検出する系に本発明の鋳型核酸を添加することで、標的核酸と本発明の鋳型核酸の間で、プライマー（例えば、ＦＩＰまたはＴＰ）とのハイブリダイゼーションにおける競合が生じることに基づくと考えられる。以下、ＬＡＭＰ法またはＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法によって標的核酸を検出する場合を例に説明する。
【００４０】
ＬＡＭＰ法およびＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法では、標的核酸に対しては、複数のプライマーが増幅に関与することで連続してループ形成が起こり、それによって迅速な核酸増幅が可能となる。しかしながら、本発明の鋳型核酸に対しては、ＦＩＰまたはＴＰと本発明のプライマーまたはプローブのみが増幅に関与し、ループ形成が起こらない。そのため、本発明の鋳型核酸に対する増幅速度は、標的核酸に対する増幅速度よりも遅いと考えられる。これにより、標的核酸と本発明の鋳型核酸の両方が存在する場合には、ＦＩＰまたはＴＰは標的核酸の増幅に優先的に用いられ、標的核酸が優先的に検出される。対照的に、標的核酸が存在せず本発明の鋳型核酸だけが存在する場合には、本発明の鋳型核酸が検出される。
【００４１】
上記の理論に基づくと、プライマー（例えば、ＦＩＰまたはＴＰ）が本発明の鋳型核酸よりも標的核酸に優先的にハイブリダイズするように、本発明の鋳型核酸を設計することが望ましい。例えば、本発明の鋳型核酸において配列（Ｂ’’）と配列（Ｎ）の間に一以上の塩基、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８または９個の塩基が付加されてもよい。例えば、本発明の鋳型核酸における配列（Ａ’）を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の塩基が置換、欠失、および／または付加された配列（Ａ）としてもよい。例えば、本発明の鋳型核酸における配列（Ｂ’’）を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の塩基が置換、欠失、および／または付加された配列（Ｂ）としてもよい。
【００４２】
あるいは、プライマー（例えば、ＦＩＰまたはＴＰ）が本発明の鋳型核酸よりも標的核酸に優先的にハイブリダイズするように、本発明の鋳型核酸の添加量を調節してもよい。当業者であれば、公知の手法に基づき、本発明の鋳型核酸の添加量を適宜設定することができる。例えば、既知の濃度の標的核酸を用いて、様々な比率で標的核酸と本発明の鋳型核酸を組み合わせ、それらの組み合わせについて等温増幅法を実施することで、本発明の鋳型核酸の適切な添加量を決定することができる。
【００４３】
本発明の標的核酸を検出する方法では、本発明のＮＣ用プライマーまたはプローブは、標的核酸検出用のプライマーの標識物質と同一の物質により標識されてもよい。あるいは、本発明のＮＣ用プライマーまたはプローブは、標的核酸検出用のプライマーの標識物質と異なる物質により標識されてもよい。
【００４４】
本発明のＮＣ用プライマーまたはプローブと標的核酸検出用のプライマーが、同一の物質によって標識される場合、例えば、以下のようにして試料中の標的核酸配列の有無を判定することができる。１つの試料につき、ＮＣ用鋳型を含む反応混合液と、これを含まない反応混合液を調製する。ＮＣ用鋳型を含む反応混合液に、標識したＮＣ用プライマーまたはプローブと標識した標的核酸検出用のプライマーを添加する。ＮＣ用鋳型を含まない反応混合液に標識した標的核酸検出用のプライマーを添加する。これらの反応混合液を等温増幅法に供する。この場合、想定される結果は以下の表のとおりである。
【００４５】
【表１】
2018033377.tif 000003
ＮＣ用鋳型を含む反応混合液およびＮＣ用鋳型を含まない反応混合液の両方でシグナルが得られた場合、試料中に標的核酸配列が存在することを意味する。これに対し、ＮＣ用鋳型を含まない反応混合液でシグナルが得られる前に、ＮＣ用鋳型を含む反応混合液でシグナルが得られた場合、試料中に標的核酸配列が存在しない（あるいは標的核酸配列は存在するが検出限界以下である）ことを意味する。
【００４６】
あるいは、例えば、以下のようにして試料中の標的核酸配列の有無を判定することができる。１つの試料につき、ＮＣ用鋳型を含む反応混合液と、これを含まない反応混合液を調製する。ＮＣ用鋳型を含む反応混合液に、標識したＮＣ用プライマーまたはプローブと未標識の標的核酸検出用のプライマーを添加する。ＮＣ用鋳型を含まない反応混合液に標識した標的核酸検出用のプライマーを添加する。これらの反応混合液を等温増幅法に供する。この場合、想定される結果は以下の表のとおりである。
【００４７】
【表２】
2018033377.tif 000004
ＮＣ用鋳型を含まない反応混合液のみでシグナルが得られた場合、試料中に標的核酸配列が存在することを意味する。これに対し、ＮＣ用鋳型を含まない反応混合液でシグナルが得られる前に、ＮＣ用鋳型を含む反応混合液でシグナルが得られた場合、試料中に標的核酸配列が存在しない（あるいは標的核酸配列は存在するが検出限界以下である）ことを意味する。
【００４８】
本発明のＮＣ用プライマーまたはプローブと標的核酸検出用のプライマーが、別の物質によって標識される場合、例えば、以下のようにして試料中の標的核酸配列の有無を判定することができる。例として、ＮＣ用プライマーまたはプローブを赤色蛍光物質で、標的核酸検出用のプライマーを緑色蛍光物質で標識した場合について説明する。１つの試料につき、ＮＣ用鋳型を含む反応混合液を調製する。この反応混合液に、標識したＮＣ用プライマーまたはプローブ（赤）と標識した標的核酸検出用のプライマー（緑）を、一緒に、または別個に添加する。これらの反応混合液を等温増幅法に供する。この場合、想定される結果は以下の表のとおりである。
【００４９】
【表３】
2018033377.tif 000005
緑色蛍光のシグナルが得られた場合は、試料中に標的核酸配列が存在することを意味する。これに対し、赤色蛍光のシグナルが得られた場合は、試料中に標的核酸配列が存在しない（あるいは標的核酸配列は存在するが検出限界以下である）ことを意味する。
【００５０】
別の態様において、本発明は、等温増幅法によって標的核酸を検出するための試薬であって、陰性結果を検出する手段を含む、試薬を提供する。陰性結果を検出する手段は、（ａ）上述した本発明の鋳型核酸、または（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブの少なくとも一方である。一実施形態では、等温増幅法はＬＡＭＰ法もしくはＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法、またはそれらの改良方法である。
【００５１】
他の実施形態では、陰性結果を検出する手段は（ａ）上述した本発明の鋳型核酸である。別の実施形態では、陰性結果を検出する手段は（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブである。さらに別の実施形態では、陰性結果を検出する手段は（ａ）上述した本発明の鋳型核酸および（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブの両方である。
【００５２】
別の態様において、本発明は、等温増幅法によって標的核酸を検出するためのキットであって、陰性結果を検出する手段を含む、キットを提供する。陰性結果を検出する手段は、（ａ）上述した本発明の鋳型核酸、または（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブの少なくとも一方である。一実施形態では、等温増幅法はＬＡＭＰ法もしくはＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法、またはそれらの改良方法である。
【００５３】
他の実施形態では、陰性結果を検出する手段は（ａ）上述した本発明の鋳型核酸である。別の実施形態では、陰性結果を検出する手段は（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブである。さらに別の実施形態では、陰性結果を検出する手段は（ａ）上述した本発明の鋳型核酸および（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブの両方である。
【００５４】
本明細書で用いる場合、「標的核酸を検出する」とは、試料中に標的核酸が存在する、あるいは存在しないことを判定することを指す。「標的核酸が存在しない」とは、試料中に標的核酸が全く存在しない場合だけでなく、等温増幅法によって検出可能な量未満で標的核酸が存在する場合も含む。
【００５５】
別の態様において、本発明は、等温増幅法によって陰性結果を検出する方法であって、（ａ）上述した本発明の鋳型核酸を反応混合物に添加する工程、および（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブを反応混合物に添加する工程を含む、方法を提供する。一実施形態では、等温増幅法はＬＡＭＰ法もしくはＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法、またはそれらの改良方法である。
【００５６】
別の態様において、本発明は、等温増幅法によって陰性結果を検出するための試薬であって、（ａ）上述した本発明の鋳型核酸、または（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブの少なくとも一方を含む、試薬を提供する。一実施形態では、等温増幅法はＬＡＭＰ法もしくはＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法、またはそれらの改良方法である。
【００５７】
他の実施形態では、当該試薬は（ａ）上述した本発明の鋳型核酸を含む。別の実施形態では、当該試薬は（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブを含む。さらに別の実施形態では、当該試薬は（ａ）上述した本発明の鋳型核酸および（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブの両方を含む。
【００５８】
別の態様において、本発明は、等温増幅法によって陰性結果を検出するためのキットであって、（ａ）上述した本発明の鋳型核酸、または（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブの少なくとも一方を含む、キットを提供する。一実施形態では、等温増幅法はＬＡＭＰ法もしくはＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法、またはそれらの改良方法である。
【００５９】
他の実施形態では、当該キットは（ａ）上述した本発明の鋳型核酸を含む。別の実施形態では、当該キットは（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブを含む。さらに別の実施形態では、当該キットは（ａ）上述した本発明の鋳型核酸および（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブの両方を含む。
【００６０】
上述した本発明の方法において用いられる試料は、特に限定されないが、例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液、胸腹水、結膜ぬぐい液、鼻汁、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、うがい液、唾液、喀痰、気管支肺胞洗浄液、汗、尿、糞便、組織などが挙げられる。試料は、感染実験などに用いられた細胞やその培養液であってもよい。あるいは、試料は、生体由来の検体や培養細胞などから分離したウイルスを含む溶液などであってもよい。本発明において、かかる試料は、採取した状態のまま用いてもよく、あるいは、分離、抽出、濃縮、精製などの前処理を適宜行ってもよい。
【００６１】
上述した本発明の試薬は、液体または粉末などの試薬が通常とり得る形態で提供される。通常、かかる試薬は適切な容器に入れて提供される。
【００６２】
上述した本発明のキットは、ＬＡＭＰ法およびＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法などの等温増幅法ならびにその改良方法に利用される、酵素試薬および／またはｄＮＴＰなどの核酸試薬などの任意の試薬を含んでもよい。さらに、検出を簡便にするための適当な試薬、例えば、試料希釈液、プライマー希釈液、反応希釈液、バッファー、および／または標識試薬などを含んでもよい。通常、かかる試薬は適切な容器に入れて提供される。さらに、注射器または綿棒などの試料採取器具を含んでもよい。さらに、本発明の方法の実施に必要な説明書などの資材を含んでもよい。
【００６３】
本発明によれば、試料中の標的核酸配列の有無を判定することができる。したがって、例えば、試料中のＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス、細菌、寄生虫、原虫、真菌、ラン藻類、古細菌、藻類、植物細胞、植物組織、動物細胞、動物組織などの有無を判定することができる。
【００６４】
別の態様において、本発明は、等温増幅法において核酸増幅酵素が機能しているかどうかを判定する方法であって、陰性結果を検出する工程を含む、方法を提供する。陰性結果を検出する工程は、（ａ）上述した本発明の鋳型核酸を反応混合物に添加する段階、および（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブを反応混合物に添加する段階を含む。別の態様において、本発明は、等温増幅法において核酸増幅酵素が機能しているかどうかを判定するための試薬であって、陰性結果を検出する手段を含む、試薬を提供する。陰性結果を検出する手段は、（ａ）上述した本発明の鋳型核酸、または（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブの少なくとも一方である。別の態様において、本発明は、等温増幅法において核酸増幅酵素が機能しているかどうかを判定するためのキットであって、陰性結果を検出する手段を含む、キットを提供する。陰性結果を検出する手段は、（ａ）上述した本発明の鋳型核酸、または（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブの少なくとも一方である。これらの方法、試薬またはキットは、標的核酸の存在下で用いてもよく、標的核酸の非存在下で用いてもよい。標的核酸の存在下で標的核酸配列および陰性結果の両方が検出されない場合、等温増幅法における核酸増幅酵素が機能していないと判定される。あるいは、標的核酸の非存在下で陰性結果が検出されない場合、等温増幅法における核酸増幅酵素が機能していないと判定される。「核酸増幅酵素が機能していない」とは、例えば、核酸増幅酵素が反応混合物中に添加されていない場合、核酸増幅酵素の活性が低下している場合、核酸増幅酵素が失活している場合が挙げられる。一実施形態では、等温増幅法はＬＡＭＰ法もしくはＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法、またはそれらの改良方法である。
【００６５】
別の態様において、本発明は、逆転写酵素が機能しているかどうかを判定する方法であって、（ｉ）ＲＮＡである、上述した本発明の鋳型核酸を逆転写反応に供する段階、および（ｉｉ）陰性結果を検出する工程を含む、方法を提供する。陰性結果を検出する工程は、（ａ）（ｉ）で得られた逆転写産物を反応混合物に添加する段階、および（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブを反応混合物に添加する段階を含む。別の態様において、本発明は、逆転写酵素が機能しているかどうかを判定するための試薬であって、陰性結果を検出する手段を含む、試薬を提供する。陰性結果を検出する手段は、（ａ）ＲＮＡである、上述した本発明の鋳型核酸、または（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブの少なくとも一方である。別の態様において、本発明は、逆転写酵素が機能しているかどうかを判定するためのキットであって、陰性結果を検出する手段を含む、キットを提供する。陰性結果を検出する手段は、（ａ）ＲＮＡである、上述した本発明の鋳型核酸、または（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブの少なくとも一方である。これらの方法、試薬またはキットは、標的核酸（標的ＲＮＡの逆転写産物）の存在下で用いてもよく、標的核酸の非存在下で用いてもよい。標的核酸の存在下で標的核酸配列および陰性結果の両方が検出されない場合、等温増幅法における核酸増幅酵素が機能していないと判定される。あるいは、標的核酸の非存在下で陰性結果が検出されない場合、等温増幅法における核酸増幅酵素が機能していないと判定される。「逆転写酵素が機能していない」とは、例えば、逆転写酵素が反応混合物中に添加されていない場合、逆転写酵素の活性が低下している場合、逆転写酵素が失活している場合が挙げられる。
【００６６】
別の態様において、本発明は、試料の前処理が機能しているかどうかを判定する方法であって、陰性結果を検出する工程を含む、方法を提供する。陰性結果を検出する工程は、（ａ）上述した本発明の鋳型核酸を反応混合物に添加する段階、および（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブを反応混合物に添加する段階を含む。別の態様において、本発明は、試料の前処理が機能しているかどうかを判定するための試薬であって、陰性結果を検出する手段を含む、試薬を提供する。陰性結果を検出する手段は、（ａ）上述した本発明の鋳型核酸、または（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブの少なくとも一方である。別の態様において、試料の前処理が機能しているかどうかを判定するためのキットであって、陰性結果を検出する手段を含む、キットを提供する。陰性結果を検出する手段は、（ａ）上述した本発明の鋳型核酸、または（ｂ）上述した本発明のプライマーまたはプローブの少なくとも一方である。標的核酸配列および陰性結果の両方が検出されない場合は、等温増幅法における核酸増幅酵素が機能していないと判定することができる。標的核酸配列および陰性結果の両方が検出されない場合、試料の前処理が機能していないと判定される。「試料」とは上述したものを指す。「前処理」とは試料から増幅される予定の核酸を分離する処理（例えば、微生物の破砕、またはウイルス／細胞の溶解）を指す。
【００６７】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００６８】
ＮＣ用鋳型およびＮＣ用プライマーの合成
以下の表に示されるＮＣ用鋳型およびＮＣ用プライマーをシグマアルドリッチジャパンにて受託合成した。これらのＮＣ用鋳型およびＮＣ用プライマーは、ヒト由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＬＤＨ２）またはヒト由来のＭＤＭ２遺伝子（ＭＤＭ２）の検出において用いる目的で設計された。
【００６９】
【表４】
2018033377.tif 000006
下線：配列Ｂ’’
囲み線：配列Ｎ
二重下線：配列Ａ’
【００７０】
【表５】
2018033377.tif 000007
下線：配列Ｂ’’
囲み線：配列Ｎ
二重下線：配列Ａ’
【００７１】
【表６】
2018033377.tif 000008
【実施例２】
【００７２】
標的核酸（ＡＬＤＨ２）存在下におけるＮＣ用鋳型の増幅阻害
標的核酸としてＡＬＤＨ２が増幅反応溶液中に存在する場合に、ＡＬＤＨ２用のＮＣ用鋳型に対する増幅が阻害されるかどうかを確認した。このため、ＡＬＤＨ２鋳型あり（＋）／なし（−）の反応溶液を調製し、ＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法により増幅反応を実施した。「ＡＬＤＨ２鋳型」とは、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にヒトＡＬＤＨ２の部分配列（配列番号８）をクローニングして構築したプラスミドである。
［ヒトＡＬＤＨ２の部分配列（配列番号８）］
ＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＧＡＣＴＴＴＧＧＧＧＣＡＡＴＡＣＡＧＧＧＧＧＴＣＣＴＧＧＧＡＧＴＧＴＡＡＣＣＣＡＴＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＡＧＴＧＡＴＴＴＣＴＧＣＡＡＴＣＴＣＧＴＴＴＣＡＡＡＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＴＧＡＴＧＴＧＴＴＴＧＧＡＧＣＣＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＴＴＧＧＴＧＧＣＴＡＣＡＡＧＡＴＧＴＣＧＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＧＣＧＡＧＴＡＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＡＣＴＧＴＧＡＧＴＧＴＧＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＴＧＧＧＧＣＴＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＧＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＡＴＴＧＧＧＧＴＣＴＧＴＴＧＧＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＣＣＴＧＣＣＡＧＡＧＧＴＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＣＧＧＧＧＡＣＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＧＡＴＴＴＡＧ
【００７３】
増幅反応に用いたバッファー（２×反応バッファー）の組成は、以下の表のとおりである。
【表７】
2018033377.tif 000009
【００７４】
ＡＬＤＨ２検出用プライマー（ＴＰ、ＢＰ、およびＦＰ）として、以下の表に示すプライマーを用いた。各プライマーを１００μＭに調製した。プライマーミックスを、プライマーのモル比がＴＰ（８）：ＢＰ（８）：ＦＰ（４）：ＮＣ用プライマー（１）となるように調製した。
【表８】
2018033377.tif 000010
【００７５】
増幅反応の試薬組成を以下の表に示す。反応溶液の全量は２５μＬとした。増幅酵素としてＡａｃ  ＤＮＡポリメラーゼ（２０  Ｕｎｉｔ）を用いた。増幅反応はリアルタイムＰＣＲ装置（ＭＸ３０００、アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて実施した（ｎ＝３）。反応温度は６０℃、反応時間は９０分であった。
【００７６】
ＡＬＤＨ２鋳型（−）の増幅反応試薬組成
【表９】
2018033377.tif 000011
ＮＣ用鋳型の濃度：６×１０１０コピー／２５μＬ
【００７７】
ＡＬＤＨ２鋳型（＋）の増幅反応試薬組成
【表１０】
2018033377.tif 000012
ＮＣ用鋳型の濃度：６×１０１０コピー／２５μＬ
ＡＬＤＨ２鋳型の濃度：６×１０４コピー／２５μＬ、６×１０３コピー／２５μＬ、または６×１０２コピー／２５μＬ
【００７８】
結果
結果を図３に示す。なお、グラフは平均値（ｎ＝３）を示す。ＡＬＤＨ２鋳型が増幅反応系に存在しない場合には、ＮＣ用鋳型に対する増幅挙動が得られた。６×１０２コピー／２５μＬのＡＬＤＨ２鋳型が増幅反応系に存在する場合には、ＮＣ用鋳型に対する増幅が大幅に阻害された。６×１０３コピー／２５μＬおよび６×１０４コピー／２５μＬのＡＬＤＨ２鋳型が増幅反応系に存在する場合には、ＮＣ用鋳型に対する増幅挙動が得られなかった。すなわち、ＡＬＤＨ２鋳型の存在により、ＮＣ用鋳型の増幅が阻害された。なお、６×１０１３コピー／２５μＬのＮＣ用鋳型を用いた場合にも、同様の傾向が見られた。
【実施例３】
【００７９】
標的核酸（ＭＤＭ２）存在下におけるＮＣ用鋳型の増幅阻害
標的核酸としてＭＤＭ２が増幅反応溶液中に存在する場合に、ＭＤＭ２用のＮＣ用鋳型に対する増幅が阻害されるかどうかを確認した。このため、ＭＤＭ２鋳型あり（＋）／なし（−）の反応溶液を調製し、ＳｍａｒｔＡｍｐ（登録商標）法により増幅反応を実施した。「ＭＤＭ２鋳型」とは、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にヒトＭＤＭ２の部分配列（配列番号１２）をクローニングして構築したプラスミドである。
［ヒトＭＤＭ２の部分配列（配列番号１２）］
ＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＡＴＧＧＧＧＣＡＣＧＴＧＧＣＴＴＴＧＣＧＧＡＧＧＴＴＴＴＧＴＴＧＧＡＣＴＧＧＧＧＣＴＡＧＧＣＡＧＴＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＧＧＡＴＴＴＣＧＧＡＣＧＧＣＴＣＴＣＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＴＴＣＧＧＡＧＧＴＣＴＣＣＧＣＧＧＧＡＧＴＴＣＡＧＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＡＣＧＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＴＴＣＧＧＣＧＣＧＧＧＡＧＧＴＣＣＧＧＡＴＧＡＴＣＧＣＡＧＧＴＧＣＣＴＧＴＣＧＧＧＴＣＡＣＴＡＧＴＧＴＧＡＡＣＧＣＴＧＣＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴＴＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＡＣＴＣＡＧＣＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴＧＡＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＧＡＣＡＣＧＴＴＣＣＧＡＡＡＣＴＧＣＡＧＴＡＡＡＡＧＧＡＧＴＴＡＡＧＴＣＣＴＧＡＣＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＴＡＴＴＴＡＡＡＣ
【００８０】
ＭＤＭ２検出用プライマー（ＴＰ、ＦＰ、ＢＰ１、ＢＰ２、およびＯＰ）として、以下の表に示すプライマーを用いた。各プライマーを１００μＭに調製した。プライマーミックスを、プライマーのモル比がＴＰ（８）：ＦＰ（８）：ＢＰ１（４）：ＢＰ２（４）：ＯＰ（１）：ＮＣ用プライマー（１）となるように調製した。
【表１１】
2018033377.tif 000013
【００８１】
増幅反応の試薬組成を以下の表に示す。反応溶液の全量は２５μＬとした。増幅酵素としてＡａｃ  ＤＮＡポリメラーゼ（２０  Ｕｎｉｔ）を用いた。増幅反応はリアルタイムＰＣＲ装置（ＭＸ３０００、アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて実施した（ｎ＝３）。反応温度は６０℃、反応時間は９０分であった。２×反応バッファーの組成は、実施例２のとおりである。
【００８２】
ＭＤＭ２鋳型（−）の増幅反応試薬組成
【表１２】
2018033377.tif 000014
ＮＣ用鋳型の濃度：６×１０１０コピー／２５μＬ
【００８３】
ＭＤＭ２鋳型（＋）の増幅反応試薬組成
【表１３】
2018033377.tif 000015
ＮＣ用鋳型の濃度：６×１０１０コピー／２５μＬ
ＭＤＭ２鋳型の濃度：６×１０４コピー／２５μＬ、６×１０３コピー／２５μＬ、または６×１０２コピー／２５μＬ
【００８４】
結果
結果を図４に示す。なお、グラフは平均値（ｎ＝３）を示す。６×１０１０コピー／２５μＬのＮＣ用鋳型の場合、ＭＤＭ２鋳型が増幅反応系に存在しない場合には、ＮＣ用鋳型に対する増幅挙動が得られた。６×１０２コピー／２５μＬのＭＤＭ２鋳型が増幅反応系に存在する場合には、ＮＣ用鋳型に対する増幅が阻害された。６×１０３コピー／２５μＬおよび６×１０４コピー／２５μＬのＭＤＭ２鋳型が増幅反応系に存在する場合には、ＮＣ用鋳型に対する増幅が大幅に阻害された。すなわち、ＭＤＭ２鋳型の存在により、ＮＣ用鋳型の増幅が阻害された。なお、６×１０１３コピー／２５μＬのＮＣ用鋳型を用いた場合にも、同様の傾向が見られた。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明は、研究、臨床、および診断において、特に試験管内遺伝子検出、生体内遺伝子検出において、利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００８６】
配列番号１：ALDH2_NC_4wTB-3_halfAn
配列番号２：ALDH2_NC_5wTB3_fullAn
配列番号３：ALDH2_NC_6wTB-3_fullAn
配列番号４：MDM2_NC_4wTB-3_halfAn
配列番号５：MDM2_NC_5wTB3_fullAn
配列番号６：MDM2_NC_6wTB-3_fullAn
配列番号７：ＮＣ用プライマー
配列番号９：ＡＬＤＨ２検出用ＴＰ
配列番号１０：ＡＬＤＨ２検出用ＢＰ
配列番号１１：ＡＬＤＨ２検出用ＦＰ
配列番号１３：ＭＤＭ２検出用ＴＰ
配列番号１４：ＭＤＭ２検出用ＦＰ
配列番号１５：ＭＤＭ２検出用ＢＰ１
配列番号１６：ＭＤＭ２検出用ＢＰ２
配列番号１７：ＭＤＭ２検出用ＯＰ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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