(57)【要約】      （修正有）【課題】生体内の狙った場所でＣＯを放出することができ、毒性も低い化合物の提供。【解決手段】式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。2018145105.tif 000010（Ｒａ１〜Ｒａ３及びＲｂ１〜Ｒｂ３は各々独立に、Ｃ１〜６のアルコキシ基又はヒドロキシル基で置換／非置換のＣ１〜６のアルキル基）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2018145105.tif 000009
（式中、Ｒａ１、Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒｂ１、Ｒｂ２、及びＲｂ３は、同一又は異なって、炭素数１〜６のアルコキシ基、又は、ヒドロキシル基で置換されていてもよい炭素数１〜６のアルキル基、を示す。）
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物又はその塩とフェリチンとの複合体。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物又はその塩、及び／又は請求項２に記載の複合体、並びに水を含む、組成物。
【請求項４】
一酸化炭素放出用である、請求項２に記載の複合体、又は請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物、請求項２に記載の複合体、及び請求項３又は４に記載の組成物からなる群より選択される少なくとも１種、並びに
生体に皮膚透過光を照射する手段を備えた装置
を含んでなる、生体内一酸化炭素放出制御システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一酸化炭素放出分子、当該分子を用いた一酸化炭素放出制御方法、当該分子を含む複合体又は組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
一酸化炭素（ＣＯ）は、哺乳類に対して中毒症状を引き起こす毒性ガスとして認知されているが、細胞内で酵素反応によって産生する少量のものは、細胞内情報伝達物質として機能し、細胞の恒常性維持に欠かせない分子であることが近年明かになりつつある。加えて、この知見を応用する新たな医療（ＣＯ医療）も研究されており、現在非臨床段階にある。ＣＯ医療の主な対象は、敗血症、多臓器不全、虚血性再灌流障害など、今の医療では対応の難しい重篤な炎症の抑制および臓器移植時の拒絶反応の抑制であり、モデル動物を用いた研究では２５０ｐｐｍ程度のＣＯガスに対象を暴露することで症状が緩和するとの報告もある。
【０００３】
細胞あるいは生体へのＣＯ投与法として、ガス状ＣＯの直接導入（ＣＯガス雰囲気下への暴露あるいは肺からの吸入）の他、ＣＯ内包型化合物を対象へ導入し、生体内部でＣＯを放出させる方法が検討されている。現在のところ、細胞を対象とする基礎研究、及び非臨床研究段階研究とも、ガス状ＣＯの直接導入がＣＯ投与法として主流である。しかしこの手法は、臨床においてＣＯガスボンベの取り扱いやガス導入のための肺への挿管など、施術者、被施術者への負担が大きいことが予想されるため、医療技術として本格的な普及の足かせになりかねない。このため、ＣＯ内包型化合物の開発が求められており、非臨床研究への利用例も一部報告されているが（例えば非特許文献１）、化合物の安定性やＣＯ放出のタイミング制御、生体毒性の問題が完全には解決されていない。例えば、非特許文献１には光照射によりＣＯを放出する化合物が記載されているが、当該化合物は水には溶け難く、また、当該化合物からＣＯを放出させるためには比較的短波長（４００〜４４０ｎｍ）の光を照射しなければならず、このような光は生体透過性が低い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｎａｋａｅ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄａｌｔｏｎ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，  ２０１６．  ４５（４１）：  ｐ．１６１５３−１６１５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
将来的なＣＯ医療の普及には、ＣＯ内包・放出化合物（ＣＯ  ｒｅｌｅａｓｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，  ＣＯＲＭ）の開発がカギとなる。特に、生体内において狙った場所でＣＯを放出することができ、且つ生体毒性も低い化合物の開発が求められている。本発明は、このような特性を備えた化合物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、特定の構造を有する鉄カルボニル錯体が、黄赤色光の照射によりＣＯを放出することを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００７】
本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
式（Ｉ）：
【０００８】
【化１】
2018145105.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｒａ１、Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒｂ１、Ｒｂ２、及びＲｂ３は、同一又は異なって、炭素数１〜６のアルコキシ基、又は、ヒドロキシル基で置換されていてもよい炭素数１〜６のアルキル基、を示す。）
で表される化合物又はその塩。
項２．
項１に記載の化合物又はその塩とフェリチンとの複合体。
項３．
項１に記載の化合物又はその塩、及び／又は項２に記載の複合体、並びに水を含む、組成物。
項４．
一酸化炭素放出用である、項２に記載の複合体、又は項３に記載の組成物。
項５．
項１に記載の化合物、項２に記載の複合体、及び項３又は４に記載の組成物からなる群より選択される少なくとも１種、並びに
生体に皮膚透過光を照射する手段を備えた装置
を含んでなる、生体内一酸化炭素放出制御システム。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る化合物又はその塩は、可視光領域の光、特に生体透過性を有する波長の光によりＣＯを放出することができるため、光を照射することで狙ったタイミング及び狙った場所でＣＯを放出させることができる。また、生体タンパク質であるフェリチンは、光照射により当該化合物が分解して生じる有毒な２価のＦｅを無害な３価のＦｅへ変換する能力を有するため、当該化合物とフェリチンとからなる複合体は、この点でも有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１ａ】各化合物の可視光領域の光の吸光度を示す。
【図１ｂ】各化合物の可視光領域の光の吸光度の変化（明所下５分間又は暗所下２０分間）を示す。赤色が検討開始時の吸光度を、青色が検討開始５分後（明所下）又は２０分後（暗所下）の吸光度を示す。
【図１ｃ】非特許文献１に開示される化合物の光の吸光度の変化（明所下５分間）を示す。赤色が検討開始時の吸光度を、青色が検討開始５分後（明所下）の吸光を示す。
【図２】鉄カルボニル錯体（図中[Fe-CO]+で示される）からのCO発生について、当該錯体に共存させた酸化型ミオグロビン（Mb, 活性中心のヘム鉄は、Fe3+）からCO付加体（MbCO, 540nmにおける吸光係数=15.4M-1cm-1）が生成する過程を測定することによって確認することができる原理を示す。図中の吸収スペクトルは実際の検討結果を示しており、酸化型ミオグロビン（青線）が、光照射直後に酸素付加体（黒線）に変化し、その後ミオグロビンCO付加体（MbCO、赤線）が生成することが分かり、これにより、光照射によりＣＯが放出されたことが確認できた。
【図３】鉄カルボニル錯体又はその塩とフェリチンとの複合体に、光を照射してＣＯを放出させ、その後生じた鉄イオン及び有機化合物がフェリチンの内部空間に補足され続けることの概要を示す。当該機構により、CO放出後の錯体の無毒化のみならずCO放出後に生じる鉄イオンを補足し生体の鉄源として再利用できると考えられる。
【図４ａ】鉄カルボニル錯体(3-1)に関し、(3-1)及びフェリチンの複合体（[(3-1)・フェリチン]）、並びにフェリチンを、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した結果を示す。
【図４ｂ】鉄カルボニル錯体(3-1)に関し、(3-1)及びフェリチンの複合体（[(3-1)・フェリチン]）、(3-1)、並びにフェリチンの吸光度を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の各実施形態について、さらに詳細に説明する。
【００１３】
本発明は、式（Ｉ）：
【００１４】
【化２】
2018145105.tif 000003
【００１５】
で表される化合物又はその塩を包含する。以下当該化合物を化合物（Ｉ）ともいう。
【００１６】
式（Ｉ）中、Ｒａ１、Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒｂ１、Ｒｂ２、及びＲｂ３は、同一又は異なって、炭素数１〜６のアルコキシ基、又は、ヒドロキシル基で置換されていてもよい炭素数１〜６のアルキル基、を示す。制限はされないが、炭素数１〜６のアルコキシ基が好ましい。また、Ｒａ１、Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒｂ１、Ｒｂ２、及びＲｂ３のうち、１、２、３、４、５、又は６の基が炭素数１〜６のアルコキシ基であることが好ましく、Ｒａ１、Ｒａ２、及びＲａ３のうち０、１、２、又は３の基が炭素数１〜６のアルコキシ基であってよく、また、Ｒｂ１、Ｒｂ２、及びＲｂ３のうち、０、１、２、又は３の基が炭素数１〜６のアルコキシ基であってよい。
【００１７】
また、好ましくは、Ｒａ１、Ｒａ２、及びＲａ３は、同一又は異なって、炭素数１〜６のアルコキシ基、又は、ヒドロキシル基で置換されていてもよい炭素数１〜６のアルキル基、を示し、Ｒｂ１、Ｒｂ２、及びＲｂ３は、同一又は異なって、炭素数１〜６のアルコキシ基、又は、ヒドロキシル基で置換されていてもよい炭素数１〜６のアルキル基、を示す。
【００１８】
炭素数１〜６（１、２、３、４、５、又は６）のアルコキシ基としては、炭素数１〜４のアルコキシ基が好ましく、炭素数１〜３のアルコキシ基がより好ましく、炭素数１又は２のアルコキシ基がさらに好ましい。また、当該アルコキシ基は、直鎖状又は分岐鎖状であってよく、直鎖状が好ましい。具体的には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ペントキシ、ヘキトシ等が例示でき、中でもメトキシ、エトキシが好ましい。
【００１９】
また、ヒドロキシル基で置換されていてもよい炭素数１〜６のアルキル基における、炭素数１〜６（１、２、３、４、５、又は６）のアルキル基としては、炭素数１〜４のアルキル基が好ましく、炭素数１〜３のアルキル基がより好ましく、炭素数１又は２のアルキル基がさらに好ましい。また、当該アルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状であってよく、直鎖状が好ましい。具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル等が例示でき、中でもメチル、エチルが好ましい。
【００２０】
ヒドロキシル基で当該アルキル基が置換されている場合には、アルキル基の末端炭素原子に結合した水素原子がヒドロキシル基で置換されていることが好ましい。また、ヒドロキシル基の数は１、２、又は３程度が好ましく、１がより好ましい。ヒドロキシル基で置換された炭素数１〜６のアルキル基としては、−ＣＨ２ＯＨ（メチロール）、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（エチロール）、−ＣＨ（ＣＨ）ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＣＨ）ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ）ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ等が好ましく例示でき、中でもメチロール、エチロールが好ましい。
【００２１】
Ｒａ１、Ｒａ２、及びＲａ３は、同一又は異なってよく、同一であることが好ましい。また、Ｒｂ１、Ｒｂ２、及びＲｂ３は、同一又は異なってよく、同一であることが好ましい。なお、Ｒａ１、Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒｂ１、Ｒｂ２、及びＲｂ３が同一であることが、特に好ましい。
【００２２】
化合物（Ｉ）は、式（Ｉ）中のＦｅが２価である場合及び３価である場合を包含する。当該Ｆｅが２価のときの化合物（Ｉ）は、光を照射してもＣＯを放出しないため、当該Ｆｅが２価の化合物（Ｉ）は、酸化剤を用いるなどして、当該Ｆｅが３価の化合物（Ｉ）としてから用いることが好ましい。ここで用いる酸化剤としては、化合物（Ｉ）の２価のＦｅを３価のＦｅに変える（酸化する）ことができれば特に制限はされず、公知の酸化剤を用いることができる。例えば、フェリシアン酸鉄（ＩＩＩ）カリウム、ヘキサフルオロリン酸トリス（４−トルイル）アンモニウム等を挙げることができる。また、化合物（Ｉ）溶液を単に空気（酸素）と撹拌混合することで化合物（Ｉ）の２価のＦｅを３価のＦｅに変える（酸化する）こともできる。
【００２３】
当該Ｆｅが３価である場合、化合物（Ｉ）は正電荷を有している。この状態では、塩の状態で存在していることが好ましい。化合物（Ｉ）の塩としては、特に制限はされないが、ＰＦ６塩（ヘキサフルオロリン酸塩）が好ましい。また、他にも、ＢＦ４塩（テトラフルオロリン酸塩）、ＣｌＯ４塩（過塩素酸塩）等であってもよい。また、制限はされないが、薬学的に許容される塩であると好ましい。
【００２４】
化合物（Ｉ）は、非特許文献１（Ｎａｋａｅ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄａｌｔｏｎ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，  ２０１６．  ４５（４１）：  ｐ．１６１５３−１６１５６）に記載の方法に準じて調製することができる。詳細には、6-アミノ-2-ブロモピリジン及びジベンゾチオフェン-4-ホウ酸を溶媒に混合して加熱還流することで4-(2-ピリジル)ジベンゾチオフェン（DBT）を調製し、これに鉄ペンタカルボニルを反応させ、[{Fe(μ-BPT-κ3N,C,S)(CO)2}Fe(CO)3]を調製し、さらにこれにＰ（Ｒａ１）（Ｒａ２）（Ｒａ３）やＰ（Ｒｂ１）（Ｒｂ２）（Ｒｂ３）を反応させることにより調製することができる。より詳細には、例えば実施例に記載の方法又はこれに準じた方法により調整することができる。
【００２５】
本発明は、化合物（Ｉ）又はその塩とフェリチンとの複合体も包含する。フェリチンは、４本のα−ヘリックスバンドルを束ねた構造をしたサブユニットが自己集合する（通常は２４個自己集合する）ことで形成されるかご状タンパク質であり、鉄イオンを保持することが知られている。サブユニットの内部にはフェロオキシダーゼセンターと呼ばれる２価のＦｅを触媒的に３価のＦｅへ酸化する部分が存在する。
【００２６】
本発明におけるフェリチンとしては、哺乳動物が有するフェリチンを好ましく用いることができ、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル、ヒツジ、ヤギ等のフェリチンを用いることができる。また、アフリカツメガエルのフェリチンを用いることも出来る。次に、各生物のフェリチンタンパク質のアミノ酸配列のアクセッションＮｏ．を列記する。ヒトフェリチン（ＡＡＡ３５８３２）、ウマフェリチン（肝臓）（１１０４３４７Ａ）、アフリカツメガエル（ＡＡＢ２０３１６）、アナウサギ（ＮＰ＿００１０９５１５８）。
【００２７】
また、公知の遺伝子工学的手法により発現させ精製したフェリチンを用いてもよい。またさらに、本発明のフェリチンには、自然界に存在する（野生型）フェリチンタンパク質のアミノ酸配列において、１又は複数個（例えば、１〜２０個、好ましく１〜１０個、より好ましくは１、２、３、４、５、６、７、又は８個）のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を有するフェリチンサブユニットが自己集合したタンパク質であって鉄イオンの取り込み及び保持機能を有するタンパク質も包含される。例えば、L134P変異体（アミノ酸配列１３４番目のＬがＰに置換された変異を有する変異体）サブユニットからなるフェリチンが好ましい例として挙げられる。
【００２８】
当該複合体は、例えば、化合物（Ｉ）又はその塩と、フェリチンとを緩衝液中で混合することで調製することができる。限定的な解釈を望むものではないが、当該複合体中では、化合物（Ｉ）又はその塩は、フェリチンの内部に取り込まれていると考えられる。このため、光照射により化合物（Ｉ）又はその塩が分解して生じる有害な２価のＦｅをフェロキシダーゼ反応により速やかに無害な３価のＦｅへ変換することができ、有利である。
【００２９】
なお、当該複合体は、本発明の効果を損なわない範囲において、その他の成分を含んでいてもよい。このような成分としては特に制限されないが、例えば他の金属イオン又は金属イオン化合物や、その他のタンパク質等が挙げられる。
【００３０】
本発明は、さらに、化合物（Ｉ）又はその塩、及び／又は化合物（Ｉ）とフェリチンとの複合体、並びに水を含む、組成物をも包含する。このような組成物は、特に体内でのＣＯ放出のために好ましく用いることができる。言い換えれば、当該組成物は、一酸化炭素放出用として好ましく用いることができる。また、本発明の効果を損なわない範囲で、当該組成物には、その他の成分を配合してもよい。例えば、薬学的に許容される担体や添加物等が挙げられる。
【００３１】
当該組成物は、例えば経血管投与（特に静脈投与）や経皮投与、経口投与等により、体内へ投与することができる。投与された化合物（Ｉ）又はその塩、及び／又は化合物（Ｉ）とフェリチンとの複合体に対して、光を照射することで狙ったタイミング及び狙った場所でＣＯを放出させることができる。特に、化合物（Ｉ）は、５８０ｎｍ以上、特に５８０〜５９０ｎｍ程度の比較的長波長の光を照射することでＣＯを放出することができ、当該長波長光は生体透過性を有する又は有する波長に極めて近いため、人体の外部から光を照射した場合であっても、光が皮膚を透過して化合物（Ｉ）に届き、ＣＯを放出させることができ、有利である。
【００３２】
このように、化合物（Ｉ）又はその塩、前記複合体、及び前記組成物は、体内におけるＣＯ放出制御に有用であり、当該性質から、ＣＯを用いた医療への展開が可能である。例えば、体内におけるＣＯには、血管拡張作用、抗炎症作用、抗アポトーシス作用、臓器移植時の臓器不全抑制作用等が知られていることから、血管拡張剤、抗炎症剤、抗アポトーシス剤、臓器移植時の臓器不全抑制剤等としての利用が考えられる。また、医薬組成物として利用することもできる。
【００３３】
本発明はさらに、化合物（Ｉ）又はその塩、前記複合体、及び前記組成物に加えて、生体に皮膚透過光（好ましくは５７０〜６００ｎｍ程度）を照射する手段を備えた装置を含んでなる、生体内一酸化炭素放出制御システムをも包含する。このような装置としては、公知の装置を好ましく用いることが出来る。
【００３４】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、以下で用いた試薬は、全て関東化学株式会社又はシグマアルドリッチから購入した。
【００３６】
鉄カルボニル錯体及びその塩の合成
次に示す(3-1)、(3-2)、(3-3)の鉄カルボニル錯体塩を、以下のようにして合成した。なお、以下各化合物を単に(1)、(3-1)、などといった記載で表すことがある。
【００３７】
(3-1):trans-[Fe(κ3N,C,S)(CO)(P(CH2OH)3)2](PF6)
(3-2):trans-[Fe(κ3N,C,S)(CO)(P(OCH3)3)2](PF6)
(3-3):trans-[Fe(κ3N,C,S)(CO)(P(OCH2CH3)3)2](PF6)
【００３８】
【化３】
2018145105.tif 000004
【００３９】
i) 4-(2-ピリジル)ジベンゾチオフェン（DBT）の合成
炭酸カリウム（425mg, 3.1mmol）の水溶液（10mL）に対し、1,2-ジメトキシエタン(DME) (30mL) と 6-アミノ-2-ブロモピリジン（381mg, 2.2mmol）を加えた。窒素ガスの通気（30分間）により溶液より酸素を除去した後、ジベンゾチオフェン-4-ホウ酸（498mg, 2.2mmol）と パラジウムトリフェニルホスフィン（[Pd(PPh3)4]）（28mg, 0.024mmol）を添加した。反応溶液を窒素雰囲気下、100℃で8時間加熱還流した。反応後の淡黄色の溶液について、DMEを留去した後、ジクロロメタン（15mL）により、3回抽出を行った。抽出操作後のジクロロメタン溶液（淡黄色）をまとめ、溶媒を完全に留去した。得られた固体を冷メタノールで洗浄し、減圧下で乾燥させることにより、白色のDBTの粉末を得た。収率80%。
【００４０】
ii) [{Fe(μ-BPT-κ3N,C,S)(CO)2}Fe(CO)3]（1）の合成
テフロン製コックの付いた石英製反応容器に上記i)で合成したDBT（101mg, 0.26mmol）、 鉄ペンタカルボニル（Fe(CO)5）（177mg, 0.62mmol）、THF（20mL）を加えた。凍結脱気法（3回）により酸素を除去した後、反応溶液に高圧水銀灯を18時間照射した。その間、6時間ごとに反応溶液の脱気を行った。赤紫色に変化した反応溶液から溶媒を留去し、濃紫色の固体を得た。この固体をシリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒 ジクロロメタン/n-ヘキサン 4:1）により精製した。紫色を呈した溶出画分をまとめ、溶媒を留去して、紫色の[{Fe(μ-o-BPT-κ3N,C,S)(CO)2}Fe(CO)3]（1）を得た。収率60%。
【００４１】
iii) trans-[Fe(BPT-κ3N,C,S)(CO)(PR3)2]（2-1(R = CH2OH), 2-2(OCH3), 2-3(OCH2CH3)）の合成
テフロン製コックの付いたガラス製反応容器にii)で合成した(1)（55mg, 0.10mmol）、PR3（0.42mmol）、トルエン（15mL）を加えた。反応溶液を90℃で2時間加熱した後、得られた赤橙色の溶液から溶媒を留去した。得られた固体をTHF／n-ヘキサン混合溶液から再結晶させることにより、(2-1),(2-2),又は(2-3)を得た。収率70%。
【００４２】
【化４】
2018145105.tif 000005
【００４３】
iv) trans-[Fe(BPT-κ3N,C,S)(CO)(PR3)2](PF6)（3-1(R = CH2OH), 3-2(OCH3), 3-3(OCH2CH3)）の合成
ジクロロメタン（2mL）に(2-1),(2-2),又は(2-3)のいずれか（0.29mmol）とトリス（4-トルイル）アミニウムヘキサフルオロリン酸（131 mg, 0.30 mmol）を加え、暗所、室温にて10分間攪拌混合した後、溶媒を留去した。得られた濃緑色のオイルにジエチルエーテル（2mL）を加え、10分間攪拌し、濃緑色の固体を得た。この固体を濾別し、ジエチルエーテルで洗浄した後、減圧下で乾燥して(3-1),(3-2),又は(3-3)を得た。収率90%。
【００４４】
【化５】
2018145105.tif 000006
【００４５】
(3-1)又は(3-3)を水に溶解させ、吸光度を測定した結果を図１ａに示す。また、可視光領域を含む波長光（３００〜８５０ｎｍ）を照射した時の吸光度、及び暗所下で静置した時の吸光度、を測定した。結果を図１ｂに示す。図１ｃには、非特許文献１（Ｎａｋａｅ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄａｌｔｏｎ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，  ２０１６．  ４５（４１）：  ｐ．１６１５３−１６１５６）に記載の下記構造式で表わされる化合物について同様に光照射して吸光度を検討した際の結果も併せて示す。
【００４６】
【化６】
2018145105.tif 000007
【００４７】
図１ｂに示されるように、本発明に係る化合物は、可視光領域における吸光度が時間と共に変化した。一方、この変化は暗所では観測されなかった。このことから、これらの化合物は可視光領域の光によりＣＯを放出することが分かった。
【００４８】
trans-[Fe(BPT-κ3N,C,S)(CO)(PR3)2](PF6)（3-1(R = CH2OH), 3-2(OCH3), 3-3(OCH2CH3)）からのＣＯ放出の観測
＜紫外可視分光器を用いた定性的観測＞
各化合物（(3-1),(3-2),又は(3-3)）からのCO発生は、各化合物に共存させた酸化型ミオグロビン（Mb, 活性中心のヘム鉄は、Fe3+）からミオグロビンCO付加体（MbCO, 540nmにおける吸光係数=15.4M-1cm-1）が生成する過程を測定することによって確認することができる。当該原理の外用を図２に示す。具体的には、次のようにして測定した。
【００４９】
1cm×1cm 紫外可視分光器用石英セルに20mM カリウムリン酸緩衝液中（pH 7.2）（2mL）、マッコウクジラ由来のメトミオグロビン（10μM）、及び(3-1),(3-2),又は(3-3)（10μM）を暗所にて加えて混合し、反応溶液とした。反応溶液に対して、CO解離に必要な単色光（黄赤色光：590nm）（1mW, ハロゲンランプをモノクロメーターを用いて分光）を5分間照射した。反応溶液に対する脱気操作は行わず、酸素が溶存する条件で行った。光照射中、一定時間毎に吸収スペクトルを測定した（350〜1000nm）。図２中の吸収スペクトルは、(3-3)を用いたときの当該検討の結果を示す。当該吸収スペクトルから、酸化型ミオグロビン（青線）が、光照射直後に酸素付加体（黒線）に変化し、その後ミオグロビンCO付加体（MbCO、赤線）が生成することが分かり、これにより、光照射によりＣＯが放出されたことが確認できた。MbCOの生成は、およそ3分間で終了し、(3-3)の光分解に要した時間とほぼ一致した。また540nmの吸収帯から算出した、生成したMbCOの濃度は、元の(3-3)の濃度の80%に相当し、光反応によるCOの生成が定量的に進行することを示していた。また、同様にして(3-1)及び（3-2）を用いて検討したところ、（3-2）は(3-3)と同様に黄赤色光（590nm）照射でＣＯの放出が確認できた。また、(3-1)は比較的短波長の光（好ましくは420nm）の照射がＣＯ放出のために必要であった。
【００５０】
＜ガスクロマトグラフィーを用いた定量観測＞
1cm×1cm 紫外可視分光器用石英セルに20mM カリウムリン酸緩衝液中（pH 7.2）（2mL）、及び(3-2)又は(3-3)（100μM）を暗所にて加えて混合し、反応溶液とした。反応溶液に対して、CO解離に必要な単色光（黄赤色光：590nm）（1mW, ハロゲンランプをモノクロメーターを用いて分光）を5分間照射した。反応溶液に対する脱気操作は行わず、酸素が溶存する条件で行った。光照射中、一定時間毎に反応溶液20μLを取り出し、ガスクロマトグラフィー（カラム充填剤：モレキュラーシーブ13X、検出器：TCD）にて、生成するCO2を定量した。カラム保持時間の同定、定量のための検量線の作成には、市販のCO2標準ガス（純度99.9%）を用いた。
【００５１】
当該検討の結果、(3-2)及び(3-3）のいずれからも収率80％でCOが光照射により放出されることが確認できた。
【００５２】
ＣＯ生成の量子収率の検討
ライネッケ塩（NH4[Cr(SCN)4(NH3)2]）の光分解反応（量子収率 27.0%、585nm）（Wegner, E.E. and A.W. Adamson, Journal of the American Chemical Society, 1966. 88(3): p. 394-&）を基準に用いた、(3-3)からのCO生成の量子収率は2%であり、紫外光照射による一般的な金属カルボニル錯体からのCO解離と同程度であり、既報の光応答型有機分子CORM（ＣＯ内包・放出化合物）の量子収率（通常0.02%程度）を大きく上回ることがわかった。
【００５３】
光反応によりCOが脱離した後の(3-3)の分解生成物の確認
光照射後の(3-3)の光反応溶液に1,10-フェナンスロリン（phen）を添加したところ、[Fe(phen)3]2+の生成を示す吸収帯（吸収極大510nm,ε510nm＝1.1×104 M-1cm-1）が観測され、鉄（II）イオンの生成が確認された。また、光反応後の錯体の1H-NMRスペクトルでは、N,C,Sピンサー配位子前駆体の生成が観測され、CO解離後、(3-3)からピンサー配位子が還元的脱離することが示された。CO解離後の分解反応は、金属イオンへの配位性を示すニトリルやイソニトリル化合物存在では進行せず、CO脱離後の空き配位座にニトリル、イソニトリルの配位した安定な錯体を生成した。このことから、(3-3)の分解は、CO脱離に伴って生成する5配位型錯体から進行することが推測された。限定的な解釈を望むものではないが、以上の結果から推測される(3-3)の光反応過程を次に示す。
【００５４】
【化７】
2018145105.tif 000008
【００５５】
フェリチンへのtrans-[Fe(BPT-κ3N,C,S)(CO)(PCH2OH3)2](PF6)（3-1）取込み実験
本発明に係る鉄カルボニル錯体又はその塩は、生体元素である鉄イオンを中心金属として有しており、このため、哺乳類の鉄代謝経路を利用することでCO放出後の錯体の無毒化を行える可能性が考えられた。特に、哺乳類の鉄貯蔵タンパク質であるフェリチンと当該作成又はその塩とを組み合わせることで、前記無毒化のみならず、CO放出後に生じる鉄イオンを補足し生体の鉄源として再利用できる可能性も考えられた（図３）。そこで、本発明に係る鉄カルボニル錯体又はその塩とフェリチンとの複合体形成の検討を行った。
【００５６】
＜フェリチンの調製＞
馬脾臓フェリチン（より詳細には、フェリチンL鎖サブユニット）を組換えタンパク質として発現させた。タンパク質発現の宿主には、K-12株由来の大腸菌を用いた。当該組換えタンパク質を発現させた大腸菌を超音波破砕して得た無細胞抽出液（50mM トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（pH 8.0）を使用）から、陰イオン交換カラム（HiLoad 26/10 Q Sepharose HP）、ゲル濾過カラム（HiLoad 26/600 Superdex 75pg）、精密陰イオン交換カラム（MonoQ HR 10/10）を用いて当該組換えタンパク質（フェリチン）を精製した。得られたフェリチンの濃度は、280nmの吸光度（吸光係数ε280nm = 47.6×104cm-1M-1）より算出した。なお、フェリチンは、野生型とL134P変異体の２種を調製した。
【００５７】
＜フェリチンへの(3-1)の取込み実験＞
凍結脱気法（3回）により酸素を除去した20mM カリウムリン酸緩衝液（pH7.2）／DMSO混合溶液（30% v/v）2.5mLに対し、300μLの(3-1) DMSO溶液（3 mg, 16 mM）、10μLのフェリチン（300μM）を窒素雰囲気下で加えた。45℃で二時間攪拌して混合した後、室温、大気下でセルロース膜による透析（MWCO = 6000）を行った。透析の際に生成した沈殿を遠心分離操作（15000回転、5分）により除去した後、20mM カリウムリン酸緩衝液（pH7.2）で平衡化した陽イオン交換カラム（HiperpTM CM FF 16/10）に通過させた。この過程で、反応溶液およびフェリチンタンパク質表面に残留する金属イオン、金属錯体の分離を行った。フェリチンに取り込まれた(3-1)の数は、精製後の溶液に含まれるタンパク質量（ブラッドフォード法により定量）、鉄イオン量（ICP-AES法により定量）の比より算出した。フェリチン内部に取り込まれた(3-1)の個数は、野生型フェリチンの場合1.5-2程度、L134P変異体の場合、27-30程度であった。なお、フェリチンの内径から見積もられる内部空間体積からL134P変異体内の(3-1)の濃度を算出すると170 mMであった。この値は、取込み反応に用いた(3-1)の溶液濃度（1.7 mM、水溶液への飽和溶解度）の100倍に相当しており、L134P変異体がその内部空間に（3-1）を濃縮・蓄積可能なことを確認した。
【００５８】
(3-1)及びフェリチンの複合体、並びにフェリチンを、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した結果を図４ａに示す。また、 (3-1)及びフェリチンの複合体、(3-1)、並びにフェリチンについて吸光度を測定した結果を図４ｂに示す。なお、これらの図中では、(3-1)及びフェリチンの複合体を[(3-1)・フェリチン]と表記する。これらの結果から、(3-1)及びフェリチンが複合体を形成していることが確認できた。
【００５９】
(2-1),(2-2),又は(2-3)の水溶性の検討
(2-1),(2-2),又は(2-3)の20mM カリウムリン酸緩衝液（pH7.2）（20℃）への溶解度を次の操作により調べた。40℃に加温した20mM カリウムリン酸緩衝液（pH7.2）5mLに対し、すべてが溶解すると仮定した場合、5mmol/Lとなる量の錯体(2-1), (2-2), 又は(2-3)を加え、10分間超音波照射をおこなった。超音波処理後の懸濁液は、20℃の恒温槽にて12時間静置した。その後、質量を予め計測した親水性PVDF濾過膜（細孔径1.2・M）にて未溶解の錯体を分離し、濾過膜と共に減圧下で完全に乾燥させた。濾過前後の濾過膜の質量差から、未溶解の錯体量を算出し、その量を溶解実験当初に用いた錯体量から差し引くことで、緩衝液に溶解した錯体量を求め、溶解度を決定した。
結果は、次のとおりであった。
(2-1)：1.7 mmol/L
(2-2)：0.2 mmol/L
(2-3)：0.05 mmol/L
当該結果から、これらの化合物はいずれも水への溶解度が高く、溶解性に優れていることがわかった。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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