(57)【要約】【課題】  ヒト由来のヒト組織カリクレインを使って多血小板血漿のゲル化を行い、創傷治癒や骨再生の再生治療法において安全性を高める。【解決手段】  多血小板血漿のゲル化方法は、多血小板血漿にヒト組織カリクレインを添加し、その後プラスチック製容器内に収容してゲル化させる。またヒト組織カリクレインが、唾液に由来する唾液腺由来の腺性カリクレインであり、それを無菌化したものである。唾液を無菌化は、０．４５μｍ以下のボア径を有するフィルターでろ過すればよい。ＰＲＰに添加する唾液腺由来の腺性カリクレインを液量比は、０．０３以上である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多血小板血漿とヒト由来のヒト組織カリクレインとをプラスチック製容器内に収容して混ぜることで、多血小板血漿をゲル化させる、多血小板血漿のゲル化方法。
【請求項２】
前記ヒト組織カリクレインが、無菌化した唾液に由来する唾液腺由来の腺性カリクレインである請求項１に記載のゲル化方法。
【請求項３】
前記唾液を無菌化は、０．４５μｍ以下のボア径を有するフィルターでろ過することを含む請求項２に記載のゲル化方法。
【請求項４】
前記多血小板血漿に添加する無菌化された前記唾液の液量比が、０．０３以上である請求項２又は請求項３に記載のゲル化方法。
【請求項５】
前記多血小板血漿に骨補填材を添加した後に前記腺性カリクレインを添加する又は、前記多血小板血漿に前記腺性カリクレインを添加した後に前記骨補填材を添加する請求項１〜３のいずれかに記載のゲル化方法。
【請求項６】
前記骨補填材が、β−リン酸三カルシウムを含む請求項４記載のゲル化方法。
【請求項７】
多血小板血漿を入れるプラスチック製容器と、０．４５μｍ以下のボア径を有するフィルターとを備え、請求項２〜５のいずれかに記載のゲル化方法に使用するキット。
【請求項８】
さらに前記プラスチック製容器に入れられる骨補填材を備える請求項７に記載されたキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本実施形態は、多血小板血漿をゲル化させる方法、その方法に用いられる多血小板血漿をゲル化させる際に使われるキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、歯科領域や整形外科領域等において、自己の血液成分を用いて創傷治癒や骨再生を早めるという治療法として、多血小板血漿（Platelet Rich Plasma：以下、「ＰＲＰ」と言う）を用いる再生治療が広まってきている。
【０００３】
ＰＲＰは、全血よりも血小板濃度の高い血漿であり、創傷治癒を促進するために使用されている。また、骨折等の外傷や骨腫瘍の摘出等によって生じる骨欠損部への補填材として、ヒドロキシアパタイトやβ−リン酸三カルシウム（以下、「β−ＴＣＰ」と言う）を主成分としたブロック状または顆粒状の骨補填材が広く使用されているが、ＰＲＰは、このような骨補填材と混合されることによって骨補填材との複合体としても使用されている。
【０００４】
上述したＰＲＰは、通常、採取した血液を遠心分離することによって得られ、所望の形状にゲル化させて使用することが多い。ＰＲＰをゲル化させる際には、通常、ゲル化材が使用される。特許文献１には、ＰＲＰおよびβ−ＴＣＰの混合物をゲル化させる際に使用するゲル化材として、トロンビンおよび抗凝固剤を使用したため塩化カルシウムが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００２／０４００７１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、トロンビンは、ウシまたはヒト由来のものが一般的であり、また塩化カルシウムなどを使用することは安全性の疑義が生じる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、ヒト由来のヒト組織カリクレインを使ってＰＲＰのゲル化を行うことができることを見出した。
【０００８】
本実施形態のＰＲＰのゲル化法は、ＰＲＰとヒト組織カリクレインとをプラスチック製容器内で混ぜて、ＰＲＰをゲル化させる。
またヒト組織カリクレインは唾液腺由来の腺性カリクレインであり、それを無菌化したものである。唾液を無菌化する方法は、０．４５μｍ以下のボア径を有するフィルターでろ過することを含む。
【０００９】
ＰＲＰに添加する唾液腺由来の腺性カリクレインの液量比は、０．０３以上である。
ＰＲＰに骨補填材を添加した後に腺性カリクレインを添加する。また骨補填材はヒドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウムを含む。
【００１０】
本実施形態のＰＲＰのゲル化方法に用いられるキットは、多血小板血漿を入れるプラスチック製容器と、０．４５μｍ以下のボア径を有するフィルターとを備える。さらに骨補填材を備えてもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本実施形態によれば、被験者から採取した唾液腺由来腺性カリクレインでＰＲＰをゲル化させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例に係る多血小板血漿のゲル化方法の工程を示すフローチャートである。
【図２】（ａ）試験管内で赤血球層、バフィーコート及びＰＲＰに血液が分離した写真である。  （ｂ）フィルターを取り付けたシリンジ内コットンロールが入れられた写真である。  （ｃ）プラスチックシャーレに骨補填材及びＰＲＰが入れられた状態で、無菌化した唾液を入れようとしている状態の写真である。
【図３】（ａ）ＰＲＰがゲル化する時間を示したグラフである。  （ｂ）無菌化した唾液の一滴を示した写真である。
【図４】（ａ）は、唾液腺由来の腺性カリクレインを入れてゲル化したＰＲＰを入れないで液体のままのＰＲＰを示した試験管の写真である。  （ｂ）は、プラスチック試験管１６でゲル化したＰＲＰ（図中（＋）で表示）とプラスチック試験管１６で液体のままのＰＲＰ（図中（−）で表示）とを示した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者は、ヒト自己由来の物質でＰＲＰをゲル化できないか鋭意研究を重ねた結果、ヒト自己由来の組織カリクレインを使ってＰＲＰを短時間でゲル化させることができることを見出した。カリクレインは血漿カリクレインと組織カリクレインに分かれる。
血漿カリクレインが血液凝固に関わることは知られるが、組織カリクレインの関与は明らかでない。組織カリクレインは、唾液腺性カリクレイン又は尿腺性カリクレイン等が存在する。本実施例では口腔組織の再生医療に応用することを前提に、唾液腺性カリクレインを使用した。注射筒の先端に取り付けた濾過滅菌フィルターを使って唾液を無菌化することができる。その無菌化唾液は唾液腺性カリクレインを含む。
【００１４】
抗凝固剤なしで採血した静脈血をプラスチック管内で遠心分離して得たＰＲＰに、ヒト由来の組織カリクレインを加えると、ゲル化が始まる。同種の組織カリクレインであってもＰＲＰのゲル化は起きるが、感染症発症の危惧から被験者からのＰＲＰと同一被験者、すなわち自己の組織カリクレインとマッチングさせ使用することが好ましい。
【００１５】
ヒト由来の組織カリクレインをＰＲＰに添加する場合、組織カリクレインの量に応じて、ゲル化の時間が変動する。なお、ヒト由来の組織カリクレインによるＰＲＰのゲル化は、内因系血液凝固系反応の利用と考えられるため、ゲル化にかかる時間は摂氏３７度で１０分プラスマイナス２分である。
【実施例】
【００１６】
以下、本実施例に係る多血小板血漿のゲル化法について、図１を参照して説明する。図１に示すように、ステップＳ１１において、本実施例のゲル化法では、まず被験者の血液採取を行う。採取した血液には、クエン酸ナトリウム等の抗凝固剤を添加しない。
【００１７】
次にステップＳ１３において、採取した静脈血をプラスチック管内で遠心分離しＰＲＰを調製する。具体的には、抗凝固剤なしで採取した血液をプラスチック製の試験管に１０ｍｌの静脈血を入れる。その試験管１６を不図示の遠心分離器で上層１１、インターフェイス層１２、および下層１３の３層に分離させる。分離した状態が図２（ａ）の写真に示される。分離した下層１３が赤血球層であり、分離したインターフェイス層１２がバフィーコートであり、分離した上層がＰＲＰである。遠心分離の条件は４００ｇ、１０分である。この条件下で分離作製されたＰＲＰに含まれる血小板並びに白血球数などの血液学的性状は、発明者らによって明らかにされている。そして、不図示のカテラン針（１８Ｇ）を付けた注射筒でＰＲＰを採取する。
【００１８】
図１のステップＳ１５において、被験者の口底に置いたコットンロール（ロールメン）に唾液を吸収させ、全唾液を採取する。
【００１９】
ステップＳ１７において、採取した全唾液を、フィルターで濾過して無菌化する。具体的には、全唾液を含んだコットンロールを注射筒のシリンダ内に入れて押す、次いで注射筒の筒頭にフィルターを取り付ける。コットンロールから押し出された全唾液はフィルターでろ過されることで無菌化される。図２（ｂ）は、フィルター４０が注射筒の筒頭に取り付けられ、シリンダ３１の中に全唾液を含んだコットンロール２０が入っている状態である。
【００２０】
フィルター４０は、注射筒に使用するためφ１０〜１６ｍｍの直径を有する１層フィルターであり、ポア径はφ０．２２μｍ〜φ０．４５μｍである。フィルター４０は、全唾液に含まれる生菌をゼロにする。
【００２１】
５人の被験者の唾液を、ボア径φ０．４５μｍＡのフィルター４０で無菌化した場合の生菌数検査を行った。検査結果は以下の通りである。
生菌数測定方法：混液培養法
使用培地：トリプトソイ寒天培地（ＢＢＬ）
培養条件：摂氏３７度（二日間）＋室温（５日間）
【表１】
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このように、ボア径がφ０．４５μｍのフィルター４０を使用すれば、生菌数がゼロになる。
【００２２】
図１のステップＳ２１において、プラスチック容器（プラスチックシャーレまたはプラスチック試験管）中にステップＳ１３で採取したＰＲＰ２ｍｌを入れる。そして無菌化した唾液をＰＲＰに加えて混ぜる。そして３７度で孵置する。すると血液凝固カスケード反応により、ゲル化したＰＲＰが得られる。
【００２３】
ＰＲＰと無菌化した唾液とを混合する量に関しは、後述する。
【００２４】
ステップＳ２３において、ゲル化したＰＲＰに骨補填材を添加して複合材を作製する。すなわち、ステップＳ２１でＰＲＰに無菌化した唾液を加える前に、骨補填材５０を添加して複合材を作製する。図２（ｃ）は、プラスチックシャーレ１８に骨補填材５０を入れ、さらにＰＲＰ１１が入れられた状態で、無菌化した唾液を入れようとしている状態の写真である。
【００２５】
骨補填材としてはヒドロキシアパタイト、β−ＴＣＰ等が挙げられ、これらは１種または２種以上を混合して用いてもよい。
【００２６】
骨補填材５０は、平均直径が３ｍｍ以下の顆粒状であるのが好ましいが、使用場所による適応サイズが知られる。
【００２７】
また、本実施例では、プラスチック製容器（プラスチックシャーレまたはプラスチック試験管等）内でゲル化を完了させるので、骨欠損個別の形状に対応する容器の使用により、ＰＲＰを簡単に所望の形状にゲル化させることができる。
【００２８】
プラスチック容器の構成材料としては、例えばポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリスチレン樹脂等、再生医療実施に容認されている器具ならば使用できる。
【００２９】
図３（ａ）は、被験者が３３歳の女性のＰＲＰがゲル化する時間を示したグラフである。グラフの縦軸はゲル化までの時間であり、横軸が唾液量である。図３（ｂ）に示されるように、フィルター４０からの無菌化された唾液２５を１滴ずつ加えた。このため横軸は、０滴、１滴、２滴、３滴及び４滴加えた場合を示している。
【００３０】
図４（ａ）は、プラスチック試験管１６でゲル化したＰＲＰ（図中（＋）で表示）とプラスチック試験管１６で液体のままのＰＲＰ（図中（−）で表示）とを示した写真である。図４（ｂ）は、プラスチックシャーレ１８でゲル化したＰＲＰ（図中（＋）で表示）とプラスチックシャーレ１８で液体状のままのＰＲＰ（図中（−）で表示）とを示した写真である。フィルター４０から出た唾液２５の１滴の液量は０．０６５ｍｌであった。このため、無菌化した唾液量は、０．０６５ｍｌ（１滴）、０．１３０ｍｌ（２滴）、０．１９５ｍｌ（３滴）、及び０．２６０ｍｌ（４滴）となる。
【００３１】
図１のステップＳ２１で説明したように、プラスチック管１８にＰＲＰ２ｍｌを入れ、無菌化した唾液を入れて攪拌する。そして摂氏３７度でＰＲＰがゲル化するまでの時間を測定した。唾液を入れなかった（０滴）ＰＲＰは２０分以上経過してもゲル化することはなかった。唾液を１滴入れた場合は１７分で、２滴入れた場合は１２．４分で、３滴入れた場合は１０．６分で、４滴入れた場合は７．５分でＰＲＰがゲル化した。つまり、添加する唾液量を増加させるとＰＲＰのゲル化時間は短縮した。図４（ａ）又は（ｂ）に示されるように、ゲル化の確認は、プラスチック試験管１６又はプラスチックシャーレ１８内に入ったＰＲＰを傾けて、発明者が目視で行った。
【００３２】
無菌化した唾液とＰＲＰとの液量比は、０．０６５ｍｌ／２ｍｌでもＰＲＰのゲル化が始まるので、液量比で０．０３以上の無菌化した唾液をＰＲＰに加えればよい。一般に、内因系血液凝固時間は１０分プラスマイナス２分であるので、０．２６０ｍｌ（４滴）以上入れても、ゲル化の時間はそれほど短縮されない。すなわち、ＰＲＰの液量１に対して、無菌化された唾液０．１程度以上加えてもゲル化時間がそれほど短縮するわけではないと考えられる。しかし、採取する全唾液中に含まれる腺性組織カリクレイン量は年齢、性、採取時間帯等の生理的影響を受ける可能性があると推測される。
【００３３】
従事者は上述したＰＲＰをゲル化させるゲル化法を用いて、被験者から採取した腺性カリクレインでＲＰＲを容易にゲル化できる。その際に使用されるのは、プラスチック試験管１６又はプラスチックシャーレ１８、及びポア径がφ０．４５μｍ以下のフィルター４０である。これらをキットとして用意しておけば、ＰＲＰをゲル化できる。また再生療法としてゲル化したＰＲＰを使用する際には、骨補填材をさらにキットに用意しておくこともできる。
【符号の説明】
【００３４】
１１  …  上層
１２  …  中間層
１３  …  下層
１６  …  試験管
１８  …  プラスチックシャーレ
３１  …  シリンダ
４０  …  フィルター
５０  …  骨補填材
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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