(57)【要約】【課題】遺伝子の機能阻害により醸造特性が望ましく改変された醸造酵母を提供すること。【解決手段】醸造酵母において、RPD3遺伝子又はHDA1遺伝子の機能を阻害することを含む、酢酸イソアミル高生産性、酢酸生産性低生産性かつイソアミルアルコール高生産性の醸造酵母の作出方法を提供した。RPD3遺伝子又はHDA1遺伝子の機能が阻害された醸造酵母は、アルコール飲料の芳香物質である酢酸イソアミルの生産性が高まり、一方で酢酸イソアミルと同じく酢酸エステルでありながらオフフレーバーとみなされる酢酸エチルの生産性は大幅には増大せず、さらに、酸臭の原因物質である酢酸の生産性が低下する、酢酸イソアミル生合成の基質であるイソアミルアルコールの生産性が高まる等の好ましい醸造特性を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
醸造酵母において、RPD3遺伝子又はHDA1遺伝子の機能を阻害することを含む、酢酸イソアミル高生産性、酢酸生産性低生産性かつイソアミルアルコール高生産性の醸造酵母の作出方法。
【請求項２】
前記醸造酵母は清酒酵母である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
RPD3遺伝子又はHDA1遺伝子の機能が阻害されている、酢酸イソアミル高生産性、酢酸生産性低生産性かつイソアミルアルコール高生産性の醸造酵母。
【請求項４】
清酒酵母である、請求項３記載の醸造酵母。
【請求項５】
請求項３記載の醸造酵母を用いてアルコール発酵を行なうことを含む、酢酸イソアミル含量が高く、酢酸含量が低く、かつイソアミルアルコール含量が高いアルコール飲料の製造方法。
【請求項６】
請求項４記載の醸造酵母を用いてアルコール発酵を行なうことを含む、酢酸イソアミル含量が高く、酢酸含量が低く、かつイソアミルアルコール含量が高い清酒の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酢酸イソアミル高生産性、酢酸生産性低生産性かつイソアミルアルコール高生産性の醸造酵母の作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酢酸エステルの一種酢酸イソアミルは、アルコール飲料において重要な芳香物質であり、清酒においては吟醸香の主要成分のひとつとして重視されている。これまでにも、酢酸イソアミル高生産清酒酵母育種法として、ロイシンアナログである5’-5’-5’-トリフルオロロイシンの耐性変異株・プレステロイドホルモンであるプレグノロンの耐性変異株からの選抜法（特許文献１）、UV処理したきょうかい1601号・きょうかい1801号から得られるホモ接合型FAS2遺伝子を有するセルレニン感受性変異株からの選抜法（特許文献２）等が知られていた。一方、清酒酵母から特定遺伝子の機能欠損株を得ることによる、酢酸イソアミル高生産株育種法の前例はほとんどなく、酢酸イソアミル分解性エステラーゼ遺伝子IAH1を遺伝子工学的手法を用いて破壊する方法（特許文献３）等ごくわずかである。
【０００３】
ヒストン脱アセチル化酵素は、DNA-ヒストン間の結合を強めることでヌクレオソームを安定化させ、多くの遺伝子の転写を抑制的に制御することが知られている（非特許文献１）。ヒストン脱アセチル化酵素を介した転写制御が醸造酵母の醸造特性にどのように関わっているかについての報告はほとんど存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2002-191355号公報
【特許文献２】特開2014-018107号公報
【特許文献３】特開平09-234077号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kurdistani and Grunstein, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2003, 4(4):276-84.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、遺伝子の機能阻害により醸造特性が望ましく改変された醸造酵母を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した通り、ヒストン脱アセチル化酵素を介した転写制御が醸造酵母の醸造特性にどのように関わっているかについての報告はほとんど存在しない。本願発明者らは、醸造酵母においてもヒストン脱アセチル化酵素を介した転写制御は重要と予想し、清酒酵母きょうかい701号（K701）を親株として主要なヒストン脱アセチル化酵素であるRPD3、HDA1を遺伝子工学的手法を用いて破壊し、その醸造特性を清酒小仕込み試験により確認したところ、各破壊株の製成酒において、芳香物質である酢酸イソアミル濃度の大幅な増加、酸臭の原因物質である酢酸の大幅な低下、さらには酢酸イソアミル生合成の基質であるイソアミルアルコールの増加等を確認し、本願発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、醸造酵母において、RPD3遺伝子又はHDA1遺伝子の機能を阻害することを含む、酢酸イソアミル高生産性、酢酸生産性低生産性かつイソアミルアルコール高生産性の醸造酵母の作出方法を提供する。また、本発明は、RPD3遺伝子又はHDA1遺伝子の機能が阻害されている、酢酸イソアミル高生産性、酢酸生産性低生産性かつイソアミルアルコール高生産性の醸造酵母を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の醸造酵母を用いてアルコール発酵を行なうことを含む、酢酸イソアミル含量が高く、酢酸含量が低く、かつイソアミルアルコール含量が高い清酒等アルコール飲料の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、アルコール飲料の芳香物質である酢酸イソアミルの生産性が高まり、一方で酢酸イソアミルと同じく酢酸エステルでありながらオフフレーバーとみなされる酢酸エチルは大幅には増大せず、さらに、酸臭の原因物質である酢酸の生産性が低下する、酢酸イソアミル生合成の基質であるイソアミルアルコールの生産性が高まる等の好ましい醸造特性を示す醸造酵母が提供される。セルフクローニング法によりRPD3遺伝子又はHDA1遺伝子の機能を阻害すれば、遺伝子導入のためだけに必要な外来DNA配列を変異遺伝子の導入後に除去できるため、アルコール飲料の商業的生産により適した醸造酵母を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明で対象とする醸造酵母には、清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母、焼酎酵母等各種の醸造酵母が包含される。特に限定されないが、醸造酵母としては清酒酵母が好ましい。
【００１１】
本発明では、醸造酵母のRPD3遺伝子又はHDA1遺伝子の機能を阻害する。RPD3遺伝子及びHDA1遺伝子はいずれもヒストン脱アセチル化酵素をコードしている公知の遺伝子であり、Sake Yeast Genome Database（http://nribf1.nrib.go.jp/SYGD/）やSaccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）、NCBIのデータベース等にも配列情報が登録されている。配列表の配列番号１、３には、Sake Yeast Genome Databaseに登録されている清酒酵母きょうかい7号のRPD3遺伝子及びHDA1遺伝子のゲノム配列をそれぞれ示す。なお、本発明において、「Xnt」という表記は「第X番塩基」の意味である。配列番号２は、配列番号１に示したRPD3遺伝子にコードされるRPD3タンパク質のアミノ酸配列であり、配列番号４は、配列番号３に示したHDA1遺伝子にコードされるHDA1タンパク質のアミノ酸配列である。
【００１２】
RPD3遺伝子又はHDA1遺伝子の機能が阻害された醸造酵母は、清酒の香気成分である酢酸イソアミルの生産性が向上し、酢酸イソアミル高生産性となる。一方で、酸臭の原因物質である酢酸の生産性は低下する。また、酢酸イソアミル生合成の基質であるイソアミルアルコールの生産性も向上し、イソアミルアルコール高生産性となる。
【００１３】
本発明において、「高生産性」、「低生産性」という語は、上記遺伝子の機能を阻害していない酵母親株との比較で生産性が高いか低いかを意味している。「生産性が向上する」という語も同様に、酵母親株との比較で生産性が向上したかを意味しており、上記遺伝子の機能が阻害されていない酵母親株と比べてその物質の生産性が上昇することをいう。
【００１４】
また、アルコール飲料について、ある成分の含量が「高い」「低い」という語は、上記遺伝子の機能が阻害されていない醸造酵母親株を用いて醸造したアルコール飲料と比べてその成分の含量が高いか低いかを意味している。
【００１５】
本発明において、「遺伝子の機能を阻害する」とは、ゲノム上の当該遺伝子領域の少なくとも一部を改変すること等により、本来コードしているmRNA又はタンパク質の生成又は蓄積を低下又は欠失させることをいい、遺伝子の機能の低下から機能の完全な欠損まで包含される。特定の遺伝子の機能を阻害するための遺伝子改変方法はこの分野で広く知られており、当業者であれば適宜選択して実行できる。
【００１６】
本発明におけるRPD3遺伝子又はHDA1遺伝子の機能の阻害は、該遺伝子の破壊による機能欠損が好ましい。
【００１７】
酵母の遺伝子破壊方法は公知であり、例えば、相同組換えを利用した手法により目的遺伝子を破壊することができる（特開2009-142161号公報、Amberg D.C., Botstein D., Beasley E.M., Yeast, 11, 1275-1280, 1995等を参照）。具体的には、例えば、目的遺伝子の上流及び下流のゲノム領域を酵母ゲノムからPCRにより増幅して上流側相同領域（第１の相同領域）及び下流側相同領域（第２の相同領域）を調製し、正常な目的遺伝子を含まない配列の両末端に２つの相同領域をそれぞれ連結して遺伝子破壊用DNA断片（遺伝子破壊カセット）を調製し、これを酵母細胞に導入すればよい。酵母が有する内在の酵素の働きで、相同な領域間で相同組換えが生じ、ゲノム中の目的遺伝子領域が遺伝子破壊用DNA断片と置き換わるので、ゲノムから目的遺伝子を欠失させることができる。
【００１８】
相同領域としては、通常、酵母ゲノム中の対応する領域と同一の塩基配列からなる断片が用いられるが、対応領域と一部が異なる配列であっても、酵母細胞内で相同組換えが生じる程度の配列同一性を有していれば、相同領域として使用することができる。すなわち、相同領域には、配列表にも示した各遺伝子の野生型ゲノム配列（配列番号１、３）中の対応する部分と同一の塩基配列からなるものの他、該塩基配列において相同組換えが起きる程度に少数（好ましくは１個又は数個）の塩基が置換し、欠失し、挿入され又は付加された塩基配列からなる断片も包含される。相同領域と各野生型配列中の対応領域との同一性は９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上であり、最も好ましくは１００％である。本発明において、ある領域と「相同な領域」とは、その領域と上記の通りの同一性を有する塩基配列からなる領域をいう。
【００１９】
相同領域のサイズは特に限定されず、一般に鎖長が長い方が相同組換えの効率が高まるが、出芽酵母では相同組換え活性が強いため、数十bp（例えば30〜50bp）程度の相同領域を設ければ十分である（下記実施例、及び特開2009-142161号公報等を参照）。もっとも、より長い相同領域、例えば300bp程度以上の領域を用いても差し支えない。サイズの上限は特に限定されないが、DNA合成の便宜から通常は10000bp以下、好ましくは2500bp以下である。
【００２０】
例えば、配列番号１に示したRPD3遺伝子のゲノム配列中、501nt〜1802ntがコード領域であるから、RPD3遺伝子を破壊するための遺伝子破壊カセットは、このコード領域の大部分（半分以上、好ましくは7割以上、より好ましくは9割以上）が欠失するように構築すればよい。コード領域の全長を欠失させる場合には、例えば、配列番号１の1nt〜500ntの上流領域のうちの数十bp程度以上の部分領域を増幅して上流側相同領域（第１の相同領域）を、1803nt〜2302ntの下流領域のうちの数十bp程度以上の部分領域を増幅して下流側相同領域（第２の相同領域）を調製し、これら２つの相同領域を正常なRPD3遺伝子を含まない配列の両末端にそれぞれ連結して、コード領域全長を欠失させる遺伝子破壊カセットを調製することができる。コード領域の末端数十bp程度の部分領域を相同領域として用いれば、コード領域の8〜9割以上を欠失させることができる。
【００２１】
配列番号３に示したHDA1遺伝子のゲノム配列では、501nt〜2621ntがコード領域であるから、HDA1遺伝子を破壊するための遺伝子破壊カセットは、上記と同様に、このコード領域の大部分が欠失するように構築すればよい。
【００２２】
正常な各遺伝子を含まない配列としてマーカー遺伝子を用いることで、形質転換体（遺伝子破壊株）のスクリーニングが容易になる。マーカー遺伝子としては、導入する酵母株の栄養要求性に適合した栄養要求性相補遺伝子や、各種薬剤耐性遺伝子等を適宜選択して用いることができる。栄養要求性マーカーの場合は、遺伝子破壊の親株として、該当するマーカー遺伝子をもともと欠失している酵母株を用いる必要があるが、酵母遺伝子破壊株を用いて製造された食品に対する消費者の安心を得る観点からは栄養要求性マーカー遺伝子が有利である。一方、薬剤耐性マーカーは、使用する親株の遺伝的背景に制限がなく、より広い範囲の酵母に対し利用することができ有利である。各種のマーカー遺伝子が公知であり、適宜選択して使用することができる。例えば、栄養要求性マーカー遺伝子としては、URA3遺伝子（ウラシル生合成関連遺伝子）等が知られている。これら遺伝子の配列は公知であり、上述のSake Yeast Genome DatabaseやSaccharomyces Genome Database、GenBank等から配列情報を入手できる。薬剤耐性マーカー遺伝子としては、例えば、natMX4（Goldstein, A. L. et. al, Yeast, 15, 1541-1553, 1999）、kanMX4（Wach A., et al., Yeast, 10, 1793-1808, 1994）等を挙げることができる。
【００２３】
２つの相同領域とマーカー遺伝子DNAとの連結は、各断片を別途調製した後、公知のアセンブルPCR法ないしはfusion PCR法と呼ばれる手法により各断片をつなぎ合わせて合成することができる。数十bp程度の短い相同領域を用いる場合には、マーカー遺伝子を増幅するためのプライマーの5'側に相同領域の配列を付加したプライマーセットを用いて、適当な鋳型からマーカー遺伝子を増幅させることにより、[上流側相同領域]−[マーカー遺伝子]−[下流側相同領域]が連結した構造の遺伝子破壊カセットを簡便に調製することができる。
【００２４】
遺伝子破壊カセットの酵母細胞内への導入は、エレクトロポレーション法、酢酸リチウム法等の常法により行えばよい。遺伝子破壊カセットを導入した酵母細胞をマーカーによりスクリーニングした後、適宜、PCR増幅産物サイズの確認、ダイレクトシークエンシング、サザン解析等を行ない、目的通りの位置に遺伝子破壊カセットが挿入され目的遺伝子が破壊されていることを確認すればよい。
【００２５】
目的遺伝子を破壊する他の方法としては、例えばAritomiら, Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(1), 206-214, 2004や特開2003-144164等に記載されるようなセルフクローニング法を利用することができる。該方法は、形質転換体選抜用の薬剤耐性マーカーとマーカー除去株選抜用の生育抑制マーカーとを含むプラスミドベクターを利用して、ゲノム中の正常遺伝子を変異遺伝子に置き換える方法である。該方法によれば、遺伝子導入のためだけに必要な外来ＤＮＡ配列を変異遺伝子の導入後に除去できるため、食品産業で用いられる醸造酵母の育成に好ましい。
【００２６】
用いる上記２種類のマーカーは特に限定されず、例えば、薬剤耐性マーカーとしてはYAP1（セルレニン、シクロヘキシミド耐性）、AUR1-C（オーレオバシジン耐性）等、生育抑制マーカーとしてはGIN11等の公知のマーカーを用いることができる。これら２種類のマーカーを含むプラスミドベクター中に、変異を導入したRPD3遺伝子又はHDA1遺伝子（例えば、コード領域のうちの上流側の部分にストップコドンを導入した変異遺伝子）を挿入し、該変異遺伝子配列中の適当な制限酵素部位で切断してリニア化したものを酵母細胞内に導入すれば、相同組換えにより該リニア化プラスミドがゲノム中の遺伝子座に組み込まれる。その結果、ゲノム中にはプラスミド配列を介して正常な遺伝子と変異遺伝子が縦列して存在するようになる。薬剤耐性マーカーにより、リニア化プラスミドがゲノム中に組み込まれた酵母を容易に選択することができる。
【００２７】
その後、ゲノム中で縦列して存在する正常な遺伝子と変異遺伝子との間で相同組換えが生じると、生育抑制マーカーを含むプラスミド配列が脱落する。そのため、生育抑制マーカーを発現させる条件下で（例えば、生育抑制マーカーがガラクトース誘導性過剰発現プロモーターの制御下にある場合には、ガラクトース培地上で）選択を行なえば、プラスミド配列が残存する酵母は生育抑制マーカーの作用により生育することができず、一方、相同組換えによりプラスミド配列が脱落した酵母は生育することができるので、プラスミド配列が脱落し正常な遺伝子又は変異遺伝子のみがゲノム中に残存する酵母を得ることができる。ゲノム中に残存したRPD3遺伝子又はHDA1遺伝子が所期の変異を有するか否かは、例えば変異を含む領域をPCR増幅してシークエンス解析を行なうことにより容易に調べることができる。
【００２８】
実用される醸造酵母は通常二倍体である。本発明では、二倍体で目的遺伝子の両アレルが破壊されたホモ破壊株を作出することが好ましい。ホモ破壊株を作出する方法としては、下記実施例で行なっているように、二倍体でアレルの一方が破壊された酵母を作製し、次いで、該酵母に対し再度遺伝子破壊処理を行なう方法が挙げられる。上記した遺伝子破壊カセットを用いる方法により目的遺伝子を破壊する場合には、例えば、１回目の遺伝子破壊処理と２回目の遺伝子破壊処理とで異なる薬剤耐性マーカーを用いればよい。
【００２９】
本発明による酢酸イソアミル高生産性、酢酸生産性低生産性かつイソアミルアルコール高生産性の醸造酵母を用いた清酒等のアルコール飲料の製造は、当該醸造酵母を用いてアルコール発酵を行なうということの他は、通常の醸造酵母を用いたアルコール飲料の製造と同様に実施できる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３１】
１．酵母RPD3遺伝子破壊株およびHDA1遺伝子破壊株の作出
表1に挙げるRPD3Δ-F・RPD3Δ-R及びHDA1Δ-F・HDA1Δ-Rのプライマーセットにより、プラスミドpFA6a-kanMX6（ジェネティシン耐性遺伝子kanMXを含む）またはpAG25（ストレプトスライシン耐性遺伝子natMXを含む）をテンプレートとして、以下の様にPCR試薬調製を行った。
【００３２】
DDW・・・32 μl
0.5 ng/μlテンプレートDNA溶液・・・1 μl
10× PCR Buffer for KOD -Plus- Neo・・・5 μl
2 mM dNTPs・・・5 μl
25 mM MgSO4・・・3 μl
10 μM F primer・・・1.5 μl
10 μM R primer・・・1.5 μl
KOD -Plus-Neo（東洋紡）・・・1 μl
Total 50 μl
【００３３】
PCRは、初期変性94℃・2分→5サイクル反応（98℃・10秒→55℃・20秒→68℃・45秒）→30サイクル反応（98℃・10秒→68℃・45秒）→最終伸長68℃・3分とした。反応終了後、1.5%アガロースゲル電気泳動でPCR産物の増幅を確認し、カラム精製して核酸濃度を測定した。これらの精製後PCR産物を、rpd3::kanMXカセット（約1600 bp）・rpd3::natMXカセット（約1400 bp）及びhda1::kanMXカセット（約1600 bp）・hda1::natMXカセット（約1400 bp）とした。これらの破壊カセットは、破壊対象遺伝子のORFの5'側に隣接するゲノム領域45bpを上流側相同領域として、また破壊対象遺伝子のORFの3'末端領域45bpを下流側相同領域として、薬剤耐性遺伝子の上流側及び下流側にそれぞれ連結させた構造を有し、該破壊カセットを酵母細胞に導入することで、相同組換えにより酵母ゲノム中の各遺伝子ORFをkanMX又はnatMXに置き換えて破壊することができる。表１に示したRPD3Δ-F・RPD3Δ-R及びHDA1Δ-F・HDA1Δ-Rのプライマーセットの配列中、小文字の部分が相同領域である。
【００３４】
rpd3::kanMXカセットまたはhda1::kanMXカセットを、YPD培地（1% (w/v)酵母エキス、2% (w/v)ポリペプトン、2% (w/v)グルコース）で培養（30℃・150 rpm）した対数増殖期の清酒酵母K701（平成22年度頒布）にエレクトロポレーション法で導入した。機器はMicroPulser（バイオラッド）を用いて、Saccharomyces cerevisiaeに対するメーカー推奨の方法に準拠して行った（3.0×108個の菌に対し、1.5 μgの破壊カセットを混合）。破壊カセット導入後、回収した菌体を5 mlのYPD培地に懸濁し、30℃・150 rpm・2時間振盪培養した。その後、10・100・1000 μlの培養液を回収し、菌体を400 μg/mlのジェネティシンを含むYPDプレート（2% (w/v)寒天を含むYPD固形培地）に塗布し、30℃・3日間培養した。
【００３５】
培養後、生じたコロニーのうち相対的に大きなものを400 μg/mlのジェネティシンを含むYPDプレートに移植し、30℃・2日間培養した。増殖が見られた菌体を少量掻き取り、Genとるくん（酵母用）High Recovery（タカラバイオ）を用いてゲノムDNAを抽出して30 μlのDDWに溶解した。表1に挙げるkanMX check-F・RPD3Δ-R 及びkanMX check-F・HDA1Δ-Rのプライマーセットにより、各ゲノムDNAをテンプレートとして、以下の様にPCR試薬調製を行った。
【００３６】
DDW・・・5.3 μl
ゲノムDNA溶液・・・2 μl
10×PCR Buffer for Blend Taq・・・1 μl
2 mM dNTPs・・・1 μl
10 μM kanMX check-F primer・・・0.3 μl
10 μM R primer・・・0.3 μl
Blend Taq-plus-（東洋紡）・・・0.1 μl
Total 10 μl
【００３７】
PCRは、初期変性94℃・2分→40サイクル反応（94℃・20秒→68℃・90秒）→最終伸長68℃・3分とした。反応終了後、1.5%アガロースゲル電気泳動を行い、約500 bpの増幅が認められたクローンをK701 (RPD3/rpd3::kanMX)・ K701 (HDA1/hda1::kanMX)とした（ヘテロ破壊株）。
【００３８】
K701 (RPD3/rpd3::kanMX)または K701 (HDA1/hda1::kanMX)の各クローン複数をそれぞれ少量ずつ掻き取り、YPD培地中に懸濁してプールした。これらを30℃・150 rpmで対数増殖期まで培養し、先述の方法によりrpd3::natMXカセット及びhda1::natMXカセットをエレクトロポレーション法で導入した。破壊カセット導入後、回収した菌体を5 mlのYPD培地に懸濁し、30℃・150 rpm・2時間振盪培養した。その後、10・100・1000 μlの培養液を回収し、菌体を300 μg/mlのジェネティシン及び130 μg/mlのストレプトスライシンを含むYPDプレートに塗布し、30℃・3日間培養した。
【００３９】
培養後、生じたコロニーのうち相対的に大きなものを300 μg/mlのジェネティシン及び130 μg/mlのストレプトスライシンを含むYPDプレートに移植し、30℃・2日間培養した。増殖が見られた菌体を少量掻き取り、先述の方法によりゲノムDNAを抽出した。表1に挙げるnatMX check-F・RPD3Δ-R 及びnatMX check-F・HDA1Δ-Rのプライマーセットにより、各ゲノムDNAをテンプレートとして、Blend Taq-plus-を用いる先述の方法によりPCRを行った。反応終了後、1.5%アガロースゲル電気泳動を行い、約400 bpの増幅が認められるクローンを確認した。それらのクローンより抽出したゲノムDNAを用いて、表1に挙げるRPD3Δ check-F・RPD3Δ check-R及びHDA1Δ check-F・HDA1Δ check-Rのプライマーセットにより、Blend Taq-plus-を用いる先述の方法で再度PCRを行った。反応終了後、1.5%アガロースゲル電気泳動を行い、約1700 bp・1500 bpの2本のバンドが検出されたクローンをK701 (rpd3::kanMX/rpd3::natMX)・ K701 (hda1::kanMX/hda1::natMX)とした（ホモ破壊株; 以下、K701 (rpd3Δ)・ K701 (hda1Δ)と略称）。
【００４０】
【表１】
2018033399.tif 000002
【００４１】
２．酵母RPD3遺伝子破壊株およびHDA1遺伝子破壊株を用いた清酒小仕込み試験
K701及び各5クローンのK701 (rpd3Δ)・ K701 (hda1Δ)を清酒小仕込み試験に供した。仕込み・醸造条件は、α化米（精米歩合70%）72.8 g、乾燥麹（精米歩合70%）19.2 g、汲み水（0.052% 乳酸）174 ml、酵母添加量：〜2×109個、仕込み段数1段、醗酵温度15℃、醗酵期間20日とした。醗酵終了後、製成酒を遠心分離によって得、各種成分分析を行った。各種成分の分析方法は、有機酸以外については国税庁所定分析法（訓令）、有機酸については木崎らの方法（貴醸酒の熟成における成分変化, 日本醸造協会誌, 93:148-152,1998）により行った。
【００４２】
その結果を表２−１〜表２−３に示す（K701はn数3の、K701 (rpd3Δ)・ K701 (hda1Δ)は各5クローン各n数1の平均値）。各破壊株において、製成酒一般成分には大きな変動はなかったが、K701 (rpd3Δ)のアルコール分（発酵力）はやや低下していた。香気成分においては、両破壊株とりわけK701 (rpd3Δ)において、酢酸イソアミル濃度の大幅な増加（対親株2倍以上）が認められた。さらに、酢酸イソアミルと同じく酢酸エステルでありながら、オフフレーバーとみなされる酢酸エチルはいずれの破壊株においても大幅には増大せず、また有機酸組成においては酸臭の原因物質である酢酸も、対親株約1/2になる等の好ましい醸造特性をも示した。加えて、K701 (rpd3Δ)では、フーゼルアルコール組成の変化（高イソアミルアルコール・イソブチルアルコール、低n-プロパノール）及び酢酸以外の有機酸組成の変化（高クエン酸・コハク酸、低リンゴ酸）を示した。K701 (hda1Δ)では、フーゼルアルコールのうちイソアミルアルコールの増大が認められた。
【００４３】
【表２−１】
2018033399.tif 000003
【００４４】
【表２−２】
2018033399.tif 000004
【００４５】
【表２−３】
2018033399.tif 000005
【配列表】
2018033399000001.app