(57)【要約】      （修正有）【課題】幅広いカルボキシペプチダーゼに適用可能な、新規なカルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブを提供すること。【解決手段】式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。2018145126.tif 000018（ＮＨ−Ｌ１及びＮＨ−Ｌ２は夫々独立にアミノ酸残基、ペプチド又はＣ１〜６のアミノアルキル基、但し、ＮＨ−Ｌ１及びＮＨ−Ｌ２の少なくとも一つはアミノ酸残基であり、好ましくは、同一のアミノ酸残基であり、特に好ましくはフェニルアラシン残基、ロイシン残基又はリジン残基である）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）：
2018145126.tif 000016
（式中、
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示し：
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３の分枝鎖を有してもよい炭素数１〜７のアルキル基、エチル基、フェニルメチル基、４−ヒドロキシフェニルメチル基、１−ハイドロキシエチル基、又は−（ＣＨ2）ｎ−Ｚ基を表し、ｎは１〜４の数を表し、Ｚはヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、メチルチオ基、グアニジノ基、カルバモイル基、又は窒素原子を１〜３個有してもよい５員環若しくは６員環又は５員環と６員環から構成される縮合複素環を示し；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｐ（＝Ｏ）Ｒｃ又はＳｅから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒｃは、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基であり；
Ｙは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ又はＮＲから選択され、
ここで、ＮＲは、置換されていてもよいアミノ基又は置換されていてもよいアミド基を表し；
式（Ｉ）のＮＨ−Ｌ１およびＮＨ−Ｌ２は、それぞれ独立に、アミノ酸残基、ペプチド、又は炭素数１〜６のアミノアルキル基を表し、ただし、ＮＨ−Ｌ１及びＮＨ−Ｌ２の少なくとも１つはアミノ酸残基である；
ｍは、１〜３の整数を表す；
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
ＹはＮＨである、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
ＮＨ−Ｌ１及びＮＨ−Ｌ２は、同一又は異なるアミノ酸残基である、請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
ＮＨ−Ｌ１及びＮＨ−Ｌ２は、同一のアミノ酸残基である、請求項３に記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
ＮＨ−Ｌ１及びＮＨ−Ｌ２の両方が、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、又はリジン残基である、請求項４に記載の化合物又はその塩。
【請求項６】
Ｘは酸素原子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含むカルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブ。
【請求項８】
細胞内のカルボキシペプチダーゼを検出する方法であって、（ａ）請求項７に記載の蛍光プローブを細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該蛍光プローブが細胞内で発する蛍光を測定することを含む方法。
【請求項９】
以下の一般式（ＩＩＩ）：
2018145126.tif 000017
（式中、
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示し：
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３の分枝鎖を有してもよい炭素数１〜７のアルキル基、エチル基、フェニルメチル基、４−ヒドロキシフェニルメチル基、１−ハイドロキシエチル基、又は−（ＣＨ2）ｎ−Ｚ基を表し、ｎは１〜４の数を表し、Ｚはヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、メチルチオ基、グアニジノ基、カルバモイル基、又は窒素原子を１〜３個有してもよい５員環若しくは６員環又は５員環と６員環から構成される縮合複素環を示し； 
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｐ（＝Ｏ）Ｒｃ又はＳｅから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒｃは、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基であり；
Ｙは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ又はＮＲから選択され、
ここで、ＮＲは、置換されていてもよいアミノ基又は置換されていてもよいアミド基を表し；
ｍは、１〜３の整数を表す；
で表される化合物又はその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なカルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
カルボキシペプチダーゼは、ペプチド鎖のＣ末端から１つもしくは複数のアミノ酸を認識し切断する酵素群の総称である。これまで、生体内の様々な生命現象や疾患との関連が多数報告されており、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ（ＡＣＥ）の阻害剤が高血圧治療薬として広く使用されていること、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）が前立腺がん、Ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ａが膵疾患のバイオマーカーとなっていることなどから、生物学研究のみならず創薬および診断の観点からも非常に重要な酵素群である。
【０００３】
その重要性ゆえ、これまで数々のカルボキシペプチダーゼの酵素活性を検出する手法が開発されてきた。その中には、感度に優れる蛍光法を用いた手法もいくつか報告されているが、それらのほとんどは酵素反応生成物の誘導体化もしくは抽出といった煩雑な操作を有している。例えば、蛍光法によりカルボキシぺプチダーゼの酵素活性を検出する手法としては、Ｄｎｓ−Ａｌａ−Ａｒｇを用いたカルボキシぺプチダーゼＭの活性検出法（非特許文献１）や、ペプチド性基質を用いた酵素反応とそれに引き続く誘導体化を利用したＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅの活性検出法(非特許文献２)などが挙げられる。
【０００４】
また、基質が酵素によって代謝されることで蛍光が上昇するタイプの蛍光性基質もわずかながら報告されており、例えば、基質が酵素に代謝されることで蛍光上昇を観測可能な方法としては、カルボキシぺプチダーゼＡ活性検出の例（非特許文献３）やＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ活性検出の例（非特許文献４）をはじめとするＦＲＥＴを原理とした蛍光性基質を用いたものが報告されている。しかしながら、これらの分子設計においては、酵素認識部位を蛍光団もしくは消光団といった蛍光制御部位として用いているために、活性を検出可能な酵素群が著しく限られる、といった問題点を有する。
また、上述した全ての例において蛍光検出のためには紫外光励起が必要であることも細胞毒性の観点から問題であると言える。
【０００５】
本発明者等の研究グループでは、微小ながんを可視化するために、タンパク質のアミノ末端の加水分解を行うアミノペプチダーゼ蛍光プローブを開発してきた。上記のように、カルボキシ末端の加水分解酵素であるカルボキシペプチダーゼも重要な生体機能に関ることが知られているが、これまで、カルボキシペプチダーゼ活性を生細胞やｉｎ  ｖｉｖｏで検出可能な蛍光プローブは開発されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Journal of Biological Chemistry, 1990, 25, 15083
【非特許文献２】Journal of neurochemistry, 1972, 10, 2443
【非特許文献３】Analytical biochemistry, 1972, 1, 56
【非特許文献４】European Journal of Biochemistry, 1978, 87, 265
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、幅広いカルボキシペプチダーゼに適用可能な、新規なカルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、鋭意検討を行った結果、ローダミン骨格に最適な分子内スピロ環化特性を見せる求核性置換基を導入することにより、カルボキシペプチダーゼ全般に適用可能な蛍光プローブ設計法の確立に成功し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、
［１］以下の一般式（Ｉ）：
2018145126.tif 000002
（式中、
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示し：
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３の分枝鎖を有してもよい炭素数１〜７のアルキル基、エチル基、フェニルメチル基、４−ヒドロキシフェニルメチル基、１−ハイドロキシエチル基、又は−（ＣＨ2）ｎ−Ｚ基を表し、ｎは１〜４の数を表し、Ｚはヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、メチルチオ基、グアニジノ基、カルバモイル基、又は窒素原子を１〜３個有してもよい５員環若しくは６員環又は５員環と６員環から構成される縮合複素環を示し；
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｐ（＝Ｏ）Ｒｃ又はＳｅから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒｃは、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基であり；
Ｙは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ又はＮＲから選択され、
ここで、ＮＲは、置換されていてもよいアミノ基又は置換されていてもよいアミド基を表し；
式（Ｉ）のＮＨ−Ｌ１およびＮＨ−Ｌ２は、それぞれ独立に、アミノ酸残基、ペプチド、又は炭素数１〜６のアミノアルキル基を表し、ただし、ＮＨ−Ｌ１及びＮＨ−Ｌ２の少なくとも１つはアミノ酸残基である；
ｍは、１〜３の整数を表す；
で表される化合物又はその塩。
［２］ＹはＮＨである、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］ＮＨ−Ｌ１及びＮＨ−Ｌ２は、同一又は異なるアミノ酸残基である、［１］又は［２］に記載の化合物又はその塩。
［４］ＮＨ−Ｌ１及びＮＨ−Ｌ２は、同一のアミノ酸残基である、［３］に記載の化合物又はその塩。
［５］ＮＨ−Ｌ１及びＮＨ−Ｌ２の両方が、フェニルアラニン残基、ロイシン残基又はリジン残基である、［４］に記載の化合物又はその塩。
［６］Ｘは酸素原子である、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［７］［１］〜［６］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含むカルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブ。
［８］細胞内のカルボキシペプチダーゼを検出する方法であって、（ａ）［７］に記載の蛍光プローブを細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該蛍光プローブが細胞内で発する蛍光を測定することを含む方法。
［９］以下の一般式（ＩＩＩ）：
2018145126.tif 000003
（式中、
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示し：
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３の分枝鎖を有してもよい炭素数１〜７のアルキル基、エチル基、フェニルメチル基、４−ヒドロキシフェニルメチル基、１−ハイドロキシエチル基、又は−（ＣＨ2）ｎ−Ｚ基を表し、ｎは１〜４の数を表し、Ｚはヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、メチルチオ基、グアニジノ基、カルバモイル基、又は窒素原子を１〜３個有してもよい５員環若しくは６員環又は５員環と６員環から構成される縮合複素環を示し； 
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｐ（＝Ｏ）Ｒｃ又はＳｅから選択され、
ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒｃは、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基であり；
Ｙは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ又はＮＲから選択され、
ここで、ＮＲは、置換されていてもよいアミノ基又は置換されていてもよいアミド基を表し；
ｍは、１〜３の整数を表す；
で表される化合物又はその塩。
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、幅広いカルボキシペプチダーゼに適用可能なカルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】酵素添加の前後でのプローブの蛍光スペクトルを示す。（ａ）は、ＡＭＲＢＣ−ＰｈｅとカルボキシペプチダーゼＡについての測定結果であり、（ｂ）は、ＡＭＲＢＣ−ＬｙｓとカルボキシペプチダーゼＢについての測定結果である。
【図２】酵素との反応後のプローブのＵＰＬＣ分析の結果を示す。（ａ）は、ＡＭＲＢＣ−ＰｈｅとカルボキシペプチダーゼＡについての測定結果であり、（ｂ）は、ＡＭＲＢＣ−ＬｙｓとカルボキシペプチダーゼＢについての測定結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１〜６個、好ましくは炭素数１〜４個、更に好ましくは炭素数１〜３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。
【００１３】
本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
【００１４】
本発明の１つの実施態様は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
2018145126.tif 000004
【００１５】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示す。
Ｒ１は、同一であっても異なっていてもよい。
【００１６】
Ｒ１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、アミノ基、アミド基、アルキルアミド基からなる群から選ばれることが好ましい。
これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲ１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。更に、Ｒ１が示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４−カルボキシブトキシ基又は４−アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。
【００１７】
本発明の好ましい側面においては、Ｒ１は何れも水素原子である。
【００１８】
一般式（Ｉ）において、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。
Ｒ２又はＲ３がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ２又はＲ３が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ２及びＲ３がともに水素原子である場合、又はＲ２及びＲ３がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
【００１９】
一般式（Ｉ）において、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示すが、Ｒ４及びＲ５について説明したものと同様である。Ｒ４及びＲ５が共に水素原子であるか、共に塩素原子であるか、又は共にフッ素原子であることが好ましい。
【００２０】
Ｘは、酸素原子、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｐ（＝Ｏ）Ｒｃ又はＳｅから選択される。
本発明の好ましい態様においては、Ｘは、酸素原子である。
【００２１】
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいアリール基である。Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒａ及びＲｂがともにメチル基であることがより好ましい。Ｒａ及びＲｂが示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲａ及びＲｂが示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒａ及びＲｂがアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
【００２２】
Ｒｃは、炭素数１〜６個のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基である。フェニル基の置換基としては、メチル基、ヒドロキシ基、メトキシ基などが挙げられる。
合成上の導入のし易さの点から、Ｒｃは、好ましくはメチル基又はフェニル基である。また、Ｒｃがメチル基である方が水溶性は高いため、より好ましい。
【００２３】
一般式（Ｉ）の化合物は、キサンテン骨格とこれに結合しているベンゼン環の間にＹを含むスピロ環を形成していることを１つの特徴としている。カルボキシペプチダーゼ活性検出蛍光プロ―ブに要求される特性の一つとして、酵素反応前後で蛍光が増大することが挙げられるが、酵素反応前後において、蛍光団側からみると、カルボキシペプチダーゼはアミド→カルボキシレートの構造変化を引き起こすが、この構造変化では電子吸引性の変化が小さく、ダイナミックな蛍光増大を得ることは困難であると予想された。そこで、ローダミン骨格に分子内スピロ環を導入することで、アミド→カルボキシレートの電子吸引性の変化をスピロ環化平衡の変化に変換することにより、ローダミン骨格が閉環体（無蛍光）→開環体（蛍光性）の構造変化を起こし、酵素反応前後で蛍光を増大させることが可能である。
【００２４】
一般式（Ｉ）において、Ｙは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ又はＮＲから選択される。ここで、ＮＲは、置換されていてもよいアミノ基又は置換されていてもよいアミド基を表す。
本発明の１つの好ましい態様においては、ＹはＮＨである。理論に拘束されることを意図するものではないが、ＹがＮＨであると、後述する一般式（Ｉ）の化合物の開環体においてアミノ基は求核性がより強い分子内求核種として機能することから、生理的条件（ｐＨが７．５付近）における閉環体の割合が優位に高くなり、プローブとして有効に使用することができる。
【００２５】
一般式（Ｉ）において、ｍは１〜３の整数を表す。好ましくは、ｍは１である。
【００２６】
一般式（Ｉ）において、−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ６）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−Ｌ１及び−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ７）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−Ｌ２の部分は、酵素（カルボキシペプチダーゼ）により基質として認識される部分を表す。ここで、ＮＨ−Ｌ１及びＮＨ−Ｌ２の少なくとも１つはアミノ酸残基である。
本発明においては、ローダミン骨格の３位と６位のアミノ基の部分にヒプリルアミノ酸に類似した構造を有する上記の部位を導入することで、カルボキシペプチダーゼに基質として認識させる機能を持たせたものである。
【００２７】
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素原子、炭素原子数１〜３の分枝鎖を有してもよい炭素原子数１〜７のアルキル基、エチル基、フェニルメチル基、４−ヒドロキシフェニルメチル基、１−ハイドロキシエチル基、又は−（ＣＨ2）ｎ−Ｚ基を表し、ｎは１〜４の数を表し、Ｚはヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、メチルチオ基、グアニジノ基、カルバモイル基、又は窒素原子を１〜３個有してもよい５員環若しくは６員環又は５員環と６員環から構成される縮合複素環を示す。
本発明の１つの好ましい態様においては、Ｒ６及びＲ７は何れも水素原子である。
【００２８】
一般式（Ｉ）において、式（Ｉ）のＮＨ−Ｌ１及びＮＨ−Ｌ２は、それぞれ独立に、アミノ酸残基、ペプチド、又は炭素数１〜６のアミノアルキル基を表す。ただし、ＮＨ−Ｌ１及びＮＨ−Ｌ２の少なくとも１つはアミノ酸残基である。
アミノ酸残基としては、任意のアミノ酸残基から選択することができるが、好ましくは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基又はリジン残基である。
【００２９】
本発明の好ましい態様においては、ＮＨ−Ｌ１及びＮＨ−Ｌ２は、同一又は異なるアミノ酸残基である。
また、本発明のより好ましい態様においては、ＮＨ−Ｌ１及びＮＨ−Ｌ２は、同一のアミノ酸残基である。
【００３０】
本発明のもう１つの実施態様は、以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩である。
2018145126.tif 000005
【００３１】
一般式（ＩＩ）における、Ｒ１〜Ｒ７、Ｘ、Ｙ、ＮＨ−Ｌ１、ＮＨ−Ｌ２及びｍは、一般式（Ｉ）で説明したのと同様である。
【００３２】
一般式（ＩＩ）の化合物は、一般式（Ｉ）の化合物の開環体に相当する。一般式（Ｉ）と（ＩＩ）の化合物は、平衡状態をとり、特に水溶液中においてはｐＨに依存してこれらの割合が変化する。
【００３３】
一般式（ＩＩ）の化合物の好ましい非限定的な例は以下の通りである。
2018145126.tif 000006
2018145126.tif 000007
【００３４】
本発明のもう１つの実施態様は、以下の一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩である。
2018145126.tif 000008
【００３５】
一般式（ＩＩ）における、Ｒ１〜Ｒ７、Ｘ、Ｙ及びｍは、一般式（Ｉ）で説明したのと同様である。
【００３６】
一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩は、一般式（Ｉ）の化合物とカルボキシペプチダーゼとの反応生成物に相当する。
【００３７】
本発明の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質も本発明の範囲内である。
【００３８】
本発明の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。
【００３９】
本発明の一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物を製造することができる。
【００４０】
本発明のもう１つの実施態様は、一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含むカルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブである。
【００４１】
本発明のカルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブは、幅広いカルボキシペプチダーゼの検出に適用することが可能である。例えば、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＭ等に適用することができる。
【００４２】
本発明のもう１つの実施態様は、細胞内のカルボキシペプチダーゼを検出する方法であって、（ａ）本発明の蛍光プローブを細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該蛍光プローブが細胞内で発する蛍光を測定すること含む方法である。
【００４３】
本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の蛍光プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物又はそれらの塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。本発明の蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
【００４４】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４５】
［合成実施例１］
以下のスキーム１により、本発明の化合物である化合物５（ＡＭＲＢＣ−Ｐｈｅ）及び化合物６（ＡＭＲＢＣ−Ｌｙｓ）を合成した。
【００４６】
スキーム１．ＡＭＲＢＣ−Ｐｈｅ（５）及びＡＭＲＢＣ−Ｌｙｓ（６）の合成
2018145126.tif 000009
(a) 1) MeOH, H2SO4, reflux, 2) LAH, THF, y. 56 % in 2 steps (b) TBS-Cl, Imidazole, DMF, y. 94 % (c) 1) glyoxylic acid, AcOH, EtOH, 2) 2-picoline borane, 3) MeOH, H2SO4, y. 20 % in 3 steps (d) 1) DPPA, DBU, THF, 2) PPh3, THF, H2O, 3) Chloranil, DCM, 4) NaOH, MeOH, H2O, y. 19 % in 4 steps (e) 1) H-Phe-OtBu-HCl, HATU, DIEA, DMF 2) TFA, MeCN, y. 68 % in 2 steps (f) H-Lys(Boc)-OtBu-HCl, HATU, DIEA, DMF 2) TFA, MeCN, y. 73 % in 2 steps
【００４７】
化合物１の合成
Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１１０Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  １１２７ｍｇ（３．１２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をメタノール１８０ｍＬに溶解し、硫酸９ｍＬを加えた後にアルゴン雰囲気下で８０℃で一晩撹拌した。室温まで冷却した後、反応溶媒を減圧除去し、残渣を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和後、濾過した。濾過して得られた個体をメタノールに溶解させ回収し、メタノールを減圧除去した。残渣をテトラヒドロフラン２００ｍＬに溶解させ、氷浴下で撹拌させながら水素化リチウムアルミニウム１５４５ｍｇ（４０．７ｍｍｏｌ，１３ｅｑ）を加えアルゴン雰囲気下、アルミホイルで遮光して一晩室温で撹拌した。反応溶液を氷浴下で撹拌しながらメタノール３０ｍＬを加えた後、反応溶媒を減圧除去した。残渣に飽和ロッシェル塩水溶液２００ｍＬと酢酸エチル１００ｍＬを加えてアルゴン雰囲気下、アルミホイルで遮光して一晩撹拌した。反応溶液から分液操作で酢酸エチル層を抽出した後に酢酸エチルを減圧除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して（ジクロロメタン／メタノール＝９０／１０）目的化合物（５５７ｍｇ、５６％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 4.63 (s, 2H), 5.38 (s, 1H), 6.30 (dd, 2H, J = 2.1, 9.0 Hz), 6.41 (d, 2H, J = 2.1 Hz), 6.64 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 7.04-7.08 (m, 1H), 7.14-7.16 (m, 2H), 7.39-7.42 (m, 1H)
13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 40.2, 63.0, 103.4, 112.2, 115.4, 127.3, 128.7, 128.9, 131.2, 131.9, 145.7, 148.5, 152.8
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 319.14018 ; found, 319.14465 (-4.48 mmu)
【００４８】
化合物２の合成
化合物１  ５５７ｍｇ（１．７５ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、ｔ−ブチルジメチルシリルクロライド４０２ｍｇ（２．６６ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）、イミダゾール２４２ｍｇ（３．５５ｍｍｏｌ、２ｅｑ）をＮ．Ｎ’−ジメチルホルムアミド２５ｍＬに溶解させ、アルゴン雰囲気下、アルミホイルで遮光して４時間撹拌した。水を１００ｍＬ加えた後、酢酸エチルを加え分液操作で酢酸エチル層を抽出した。酢酸エチルを減圧除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して（酢酸エチル／ヘキサン＝２／３）目的化合物（７１３ｍｇ、９４％）を得た。
1H NMR (400 MHz, aceton-d6 ): δ 0.11 (s, 6H), 0.98 (s,9H), 4.72 (s, 4H), 4.79 (s, 2H), 5.44 (s, 1H), 6.35 (dd, 2H, J = 2.9, 10.7 Hz), 6.46 (d, 2H, J = 2.9 Hz), 6.71 (d, 2H, J = 10.7 Hz), 7.22-7.29 (m, 3H), 7.53-7.57 (m, 1H)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ-5.47, 18.3, 25.9, 39.1, 62.9, 102.0, 110.6, 114.1, 126.4, 127.2, 127.4, 130.4, 130.7, 138.5, 143.9, 146.0, 151.3
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 433.23113 ; found, 433.23114 (0.01 mmu)
【００４９】
化合物３の合成
化合物２  ４３２ｍｇ（１．００ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、９Ｍグリオキシル酸水溶液３００μＬ（３．００ｍｍｏｌ、３ｅｑ）をエタノール４．９５ｍＬと酢酸５０μＬの混合溶媒に溶解させ、アルゴン雰囲気下、アルミホイルで遮光して１時間撹拌した。反応溶液へ２−ピコリンボラン６４１ｍｇ（６．００ｍｍｏｌ、６ｅｑ）を加えてさらにアルゴン雰囲気下、アルミホイルで遮光して終夜撹拌した。酢酸エチルおよび飽和クエン酸水溶液を加えた後、分液操作で酢酸エチル層を抽出した。抽出した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させたのち、減圧除去によって溶媒を除いた。残渣をメタノール５０ｍＬおよび硫酸２．５ｍＬに溶解させた後、アルゴン雰囲気下において加熱還流し終夜撹拌した。反応溶液を室温まで冷まして溶媒を減圧除去し、酢酸エチルを加えた後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液によって溶液を中和し、分液操作によって酢酸エチル層を抽出した。抽出した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させたのち、減圧除去によって溶媒を除いた。残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィーで（酢酸エチル／ヘキサン＝２／１→酢酸エチル）一部精製した。目的化合物を含む画分を集めた後に減圧除去によって溶媒を除き、残渣をＧＰＣリサイクルカラムを用いて精製して目的化合物（８８ｍｇ、１９％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3 ): δ 3.76 (s, 6H), 3.86 (s, 4H), 4.56 (s, 2H), 5.33 (s, 1H), 6.19 (dd, 2H, J = 2.6, 8.4 Hz), 6.26 (d, 2H, J = 2.2 Hz), 6.65 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.17-7.20 (m, 3H), 7.34-7.39 (m, 1H)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ39.6, 45.6, 52.2, 62.9, 99.7, 109.1, 114.0, 126.8, 128.1, 129.2, 130.1, 131.2, 138.2, 144.6, 146.8, 151.3, 171.4
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 485.16886 ; found, 485.16633 (-2.52 mmu)
【００５０】
化合物４の合成
化合物３  ８８ｍｇ（０．１９０ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、ジフェニルリン酸アジド１６３μＬ（０．７５８ｍｍｏｌ、４ｅｑ）、ジアザビシクロウンデセン１１４μＬ（０．８１６ｍｍｏｌ、４．３ｅｑ）をテトラヒドロフラン１５ｍＬに溶解した後、アルゴン雰囲気下６５℃で終夜攪拌した。反応液に酢酸エチルおよび飽和塩化アンモニウム水溶液を加えた後、分液操作で酢酸エチル層を抽出した。抽出した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させたのち、減圧除去によって溶媒を除いた。アミノシリカゲルカラムクロマトグラフィーで（酢酸エチル／ヘキサン＝２／１）で一部精製したのち、目的化合物を含む画分を集め減圧除去によって溶媒を除いた。残渣へテトラヒドロフラン１０ｍＬおよび水１ｍＬの混合溶媒を加え、さらにトリフェニルホスフィン１００ｍｇ（０．３８１ｍｍｏｌ、２ｅｑ）を加えてアルゴン雰囲気下で加熱還流し終夜攪拌した。反応溶液を室温まで冷まして溶媒を減圧除去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィーで（ジクロロメタン→ジクロロメタン／メタノール＝９／１）一部精製した後、目的化合物を含む画分を集め減圧除去によって溶媒を除いた。残渣をジクロロメタン５ｍＬへ溶解させ、クロラニル４７ｍｇ（０．１９１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を加えて３０分攪拌した。溶媒を減圧除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで（ジクロロメタン／メタノール＝９５／５）で一部精製した後、目的化合物を含む画分を集め減圧除去によって溶媒を除いた。残渣をメタノール５ｍＬに溶解させ、そこへ０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えて３０分攪拌した。２Ｍ塩酸で中和した後、溶媒を減圧除去し、ＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ  Ａ（Ｈ２Ｏ  ０．１％  ＴＦＡ）  ａｎｄ  ｅｌｕｅｎｔ  Ｂ（ＣＨ３ＣＮ  ８０％、Ｈ２Ｏ  ２０％、０．１％  ＴＦＡ）（Ａ／Ｂ＝８０／２０  ｆｏｒ  ６ｍｉｎ、ｔｈｅｎ  ０／１００  ｉｎ  ３６ｍｉｎ））で精製し目的化合物（２６ｍｇ、２５％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD+NaOD ): δ 3.54 (s, 4H), 4.16 (s, 2H), 6.20 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.23 (t, 3H, J = 2.4 Hz), 6.46 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.74 (d, 1H, J = 7.3 Hz), 7.14 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 7.22 (td, 1H, J = 1.0, 7.3 Hz), 7.29 (d, 1H, J = 7.3 Hz) 
13C NMR (100 MHz, CD3OD+NaOD): δ30.7, 51.2, 67.6, 99.7, 110.6, 116.5, 123.0, 125.8, 128.6, 128.8, 130.0, 142.6, 149.0, 150.5, 153.4, 178.1
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 432.15595 ; found, 432.15567 (-0.27 mmu)
2018145126.tif 000010
【００５１】
化合物５の合成
化合物４  ８．５ｍｇ（０．０１６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、Ｈ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ塩酸塩９．４ｍｇ（０．０３６ｍｍｏｌ、２．３ｅｑ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン１４．２μＬ（０．０８０ｍｍｏｌ、５ｅｑ）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド１ｍＬに溶解させ、そこへＨＡＴＵ  １５．４ｍｇ（０．０４１ｍｍｏｌ、２．６ｅｑ）を加え、３時間攪拌した。反応溶液に酢酸エチルおよび飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、分液操作によって酢酸エチル層を抽出した。抽出した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させたのち、減圧除去によって溶媒を除いた。残渣をアセトニトリル１ｍＬおよびトリフルオロ酢酸２ｍＬに溶解させ、１時間攪拌した。減圧除去によって溶媒を除いた後、ＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ  Ａ（Ｈ２Ｏ  ０．１％  ＴＦＡ）  ａｎｄ  ｅｌｕｅｎｔ  Ｂ（ＣＨ３ＣＮ  ８０％、Ｈ２Ｏ  ２０％、０．１％  ＴＦＡ）（Ａ／Ｂ＝８０／２０  ｆｏｒ  １０ｍｉｎ、ｔｈｅｎ  ０／１００  ｉｎ  ３５ｍｉｎ））で精製し目的化合物（８．９ｍｇ、６８％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD+NaOD) δ: 2.84-2.89 (2H, m), 3.01 (t, 2H, J = 4.1 Hz), 3.04 (t, 2H, J = 4.1 Hz), 3.51 (dd, 2H, J = 17.1, 11.2 Hz), 3.66 (dd, 2H,J = 17.6, 4.9 Hz), 4.22 (s, 2H), 4.43-4.47 (m, 2H), 6.05 (dd, 1H, J = 8.8, 2.4 Hz), 6.13-6.16 (m, 1H), 6.22 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.50 (dd, 2H, J = 8.3, 4.4 Hz), 6.78 (d, 1H, J = 7.3 Hz), 6.86-6.88 (m, 2H), 6.92-6.94 (m, 8H), 7.16 (t, 1H, J = 7.1 Hz), 7.26 (td, 1H, J = 7.3, 1.0 Hz), 7.34 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 13C-NMR (100 MHz, CD3OD+NaOD) δ: 39.4, 51.4, 56.9, 67.5, 99.9, 100.6, 110.1, 110.9, 117.5, 117.7, 123.2, 125.8, 127.3, 128.7, 129.0, 129.2, 130.4, 130.6, 149.0, 149.9, 150.0, 153.1, 153.1, 171.8, 177.9 (diastereomer mixture), HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 726.29277 ; found, 726.29199 (-0.89 mmu)
2018145126.tif 000011
【００５２】
化合物６の合成
化合物４  ４．２ｍｇ（０．００７７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯｔＢｕ塩酸塩６．４ｍｇ（０．０１９ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン６．５μＬ（０．０３７ｍｍｏｌ、４．８ｅｑ）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド１ｍＬに溶解させ、そこへＨＡＴＵ  ７．２ｍｇ（０．０１９ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）を加え、９０分間攪拌した。反応溶液に酢酸エチルおよび飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、分液操作によって酢酸エチル層を抽出した。抽出した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させたのち、減圧除去によって溶媒を除いた。残渣をアセトニトリル１ｍＬおよびトリフルオロ酢酸２ｍＬに溶解させ、２時間攪拌した。減圧除去によって溶媒を除いた後、ＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ  Ａ（Ｈ２Ｏ  ０．１％  ＴＦＡ）  ａｎｄ  ｅｌｕｅｎｔ  Ｂ（ＣＨ３ＣＮ  ８０％、Ｈ２Ｏ  ２０％、０．１％  ＴＦＡ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０  ｆｏｒ  １０ｍｉｎ、ｔｈｅｎ  ０／１００  ｉｎ  ３５ｍｉｎ））で精製し目的化合物（４．８ｍｇ、７３％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD+NaOD) δ: 1.22-1.24 (4H, m), 1.32-1.40 (4H, m), 1.59-1.69 (2H, m), 1.78-1.87 (2H, m), 2.47 (4H, q, J = 7.1 Hz), 3.68 (2H, d, J = 17.6 Hz), 3.82 (2H, d, J = 17.2, Hz), 4.27-4.31 (4H, m), 6.30-6.34 (4H, m), 6.60 (2H, t, J = 8.8 Hz), 6.82 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.23 (1H, t, J = 7.0 Hz), 7.31 (1H, t, J = 7.0 Hz), 7.38 (1H, d, J = 7.3 Hz).
13C-NMR (100 MHz, CD3OD+NaOD) δ: 23.8, 23.9, 33.8, 42.5, 42.6, 51.3, 55.9, 67.4, 99.8, 100.0, 110.7, 111.0, 116.8, 117.7, 117.8, 119.7, 123.2, 125.7, 128.8, 128.9, 130.3, 130.4, 142.5, 148.7, 150.0, 153.1, 153.2, 163.0, 163.3, 172.7, 178.7 (diastereomer mixture)
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 688.34587 ; found, 688.34498 (-0.89 mmu)
2018145126.tif 000012
【００５３】
カルボキシぺプチダーゼ活性検出の機能機序
各カルボキシペプチダーゼが基質とするアミノ酸をＡＭＲＢＣ−ＣＯＯＨに縮合させた蛍光プローブ（ＡＭＲＢＣ−ＰｈｅもしくはＡＭＲＢＣ−Ｌｙｓ）から、二段階の酵素反応によってアミノ酸が切り出されることにより、ＡＭＲＢＣ−ＣＯＯＨが生成する。反応前の蛍光プローブは生理的条件下で大部分が無色・無蛍光の閉環体構造で存在する一方、反応生成物のＡＭＲＢＣ−ＣＯＯＨは約５０％の分子が強蛍光性の開環体として存在するため、酵素反応によって蛍光の上昇が観測できる。
下記スキーム２においては嵩高いアミノ酸を基質とするカルボキシペプチダーゼＡに対するプローブとしてＡＭＲＢＣ−Ｐｈｅ、塩基性アミノ酸を基質とするカルボキシペプチダーゼＢに対するプローブとしてＡＭＲＢＣ−Ｌｙｓを示している。
【００５４】
スキーム２：カルボキシペプチダーゼＡ又はＢとのＡＭＲＢＣ誘導体の酵素反応
2018145126.tif 000013
【００５５】
［実施例１］
ＡＭＲＢＣ−ＣＯＯＨ（４）、ＡＭＲＢＣ−Ｐｈｅ（５）、ＡＭＲＢＣ−Ｌｙｓ（６）の吸収・蛍光スペクトル測定
ＡＭＲＢＣ−ＣＯＯＨ、ＡＭＲＢＣ−Ｐｈｅ、ＡＭＲＢＣ−Ｌｙｓの吸収・蛍光スペクトル測定結果を表１に示す。同表の結果から、蛍光プローブであるＡＭＲＢＣ−Ｐｈｅ（５）およびＡＭＲＢＣ−Ｌｙｓ（６）は生理的条件下において大部分が無色・無蛍光性の閉環体、ＡＭＲＢＣ−ＣＯＯＨ（４）は約５０％が強蛍光性の開環体をとることが明らかとなった。尚、吸収スペクトルの測定はＵＶ−１８００（ＳＩＭＡＤＺＵ）、蛍光スペクトルの測定はＦ−７０００（ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて行った。
【００５６】
【表１】
2018145126.tif 000014
（ａ）０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で測定した。
（ｂ）０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で測定した。
（ｃ）０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で測定した。
（ｄ）フルオレセイン（Φｆｌ＝０．８５）を参照として用いて決定した相対量子収率
【００５７】
［実施例２］
酵素アッセイ
ＡＭＲＢＣ−Ｐｈｅ（５）に対してカルボキシペプチダーゼＡ、ＡＭＲＢＣ−Ｌｙｓ（６）に対してカルボキシペプチダーゼＢを適用したところ、酵素反応による蛍光上昇が観測された。尚、酵素反応前後の蛍光スペクトルは以下のように測定した。
【００５８】
（１）５μＭ  ＡＭＲＢＣ−ＰｈｅおよびＡＭＲＢＣ−ＬｙｓのＰＢＳ（−）溶液２６０μＬを用意した。
（２）（１）のうち８０μＬをＰＢＳ（−）で８００μＬに希釈し、酵素反応前の蛍光スペクトルとして測定した。
（３）（１）のうち１８０μＬに８．８μｇの酵素（ＡＭＲＢＣ−Ｐｈｅ溶液にはカルボキシペプチダーゼＡ、ＡＭＲＢＣ−Ｌｙｓ溶液にはカルボキシペプチダーゼＢ）を添加し、３７℃でインキュベートした（ＡＭＲＢＣ−Ｐｈｅは２．５時間、ＡＭＲＢＣ−Ｌｙｓは４時間）。
（４）（３）のインキュベート後の溶液のうち８０μＬをＰＢＳ（−）で８００μＬに希釈し、酵素反応後の蛍光スペクトルとして測定した。
【００５９】
また、ＬＣ−ＭＳでの分析により酵素反応生成物がＡＭＲＢＣ−ＣＯＯＨ（４）であることを確認し、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ  Ｐｌｏｔによる見かけの酵素反応速度定数も算出した。
【００６０】
酵素添加の前後でのプローブの蛍光スペクトルを図１に示す。（ａ）は、ＡＭＲＢＣ−ＰｈｅとカルボキシペプチダーゼＡについての測定結果であり、（ｂ）は、ＡＭＲＢＣ−ＬｙｓとカルボキシペプチダーゼＢについての測定結果である。励起波長は５３０ｎｍである。
図２は、酵素との反応後のプローブのＵＰＬＣ分析の結果を示す。（ａ）は、ＡＭＲＢＣ−ＰｈｅとカルボキシペプチダーゼＡについての測定結果であり、（ｂ）は、ＡＭＲＢＣ−ＬｙｓとカルボキシペプチダーゼＢについての測定結果である。
表２は、各プローブの酵素反応速度定数を示す。
【００６１】
【表２】
2018145126.tif 000015
【００６２】
本発明の蛍光プローブは、ターゲットとするカルボキシペプチダーゼによって認識されるアミノ酸を有し、標的カルボキシペプチダーゼとの反応前は無色・無蛍光であるが、酵素との反応により、可視光領域の吸収と蛍光が回復した。また、本発明の蛍光プローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素系に適用した結果、標的カルボキシペプチダーゼ活性を迅速に蛍光検出できることが示された。
【００６３】
（産業上の利用可能性）
本発明の蛍光プローブは、世界初のカルボキシペプチダーゼ蛍光プローブであり、種々の疾患細胞だけでなく、臨床検体上の興味あるカルボキシペプチダーゼ活性を検出できる可能性がある。このことから、従来法では明らかにできていなかった疾患特異的な酵素活性が明らかにされ、その結果、本ターゲットを活用した可視化手法の確立に加えて、創薬ターゲットとしても極めて有効であることが期待される。
【図１】
2018145126.tif 000019
【図２】
2018145126.tif 000020