(57)【要約】【課題】生体試料の精製工程を経ることなく、一方の末端に蛍光物質を、他方の末端にクエンチャー物質が修飾されたオリゴヌクレオチドからなる標識プローブの検出ができる方法を提供する。【解決手段】（ａ）５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼ及び（ｂ）Ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）を用いて、標的核酸にハイブリダイズする標識プローブを切断して標識断片を遊離させ、その遊離してきた標識断片を検出し、あるいは測定することにより、生体試料から核酸を精製することなく、標的核酸の存在を検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＣ率またはＡＴ率が３０％以下であるか、または、７０％以上である標的核酸を検出する方法であって、
（ａ）５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼ、及び、
（ｂ）Ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）
を用いることにより、標的核酸にハイブリダイズする標識プローブを切断して標識断片を遊離させ、その遊離された標識断片を検出しあるいは測定することにより、標的核酸の存在を検出する方法。
【請求項２】
標識プローブの５’末端に蛍光物質を、３‘末端にクエンチャー物質が修飾されたオリゴヌクレオチドである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼが、
（ａ）５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたファミリーＡに由来するＤＮＡポリメラーゼ、又は、
（ｂ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
のいずれかから選択され、かつ、
プロセッシビティーが５０塩基以上であるＤＮＡポリメラーゼである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼが、
（ａ）５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたファミリーＡに由来するＤＮＡポリメラーゼ、又は、
（ｂ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
のいずれかから選択され、かつ、
鎖置換能をもつＤＮＡポリメラーゼである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ＦＥＮヌクレアーゼが６０度以上で１０分加熱しても活性が５０％以上維持されるＦＥＮヌクレアーゼである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
さらに未精製の生体試料を反応液に含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
生体試料が、血液、糞便、唾液、尿よりなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
以下の（ａ）及び（ｂ）を反応液中に含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の標的核酸の存在を検出する方法を行うための試薬。
（ａ）５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）Ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）
【請求項９】
請求項８に記載の試薬を含む標的核酸の存在を検出する方法を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅、特にＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）において、標的核酸配列の検出または測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ法とは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。この方法により、数コピーといった極微量サンプルから標的核酸を何十万倍に増幅することができるため、遺伝子研究には欠かせない技術となっている。
【０００３】
中でも、リアルタイムＰＣＲは反応後に電気泳動することなく、簡便に核酸の微量検出や定量を行えることができるため、研究用途のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。ＰＣＲを用いた増幅は鋳型となる核酸のコピー数が多いと短時間で一定の強度に達し、少ないと長い時間を要する。そのため、蛍光を用いて増幅の経時変化を測定できるリアルタイムＰＣＲでは、一定強度まで達する増幅回数を濃度既知の核酸と濃度未知の核酸で比較することで、鋳型核酸の定量が可能となる。
【０００４】
リアルタイムＰＣＲの蛍光の検出方法には、二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光色素を使用するインターカレーター法と、遺伝子産物に特異的に結合する蛍光プローブを使用するハイブリダイゼーション法がある。前者の一例としてＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎと呼ばれる蛍光色素が広く使用されている。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎは、二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光色素はあらゆる配列に対して利用することができるため汎用性が高いが、プライマーの二量化などの非特異的な増幅産物にも結合し、不正確な測定値を得る可能性もある。逆に、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ及びＦＲＥＴプローブに代表されるハイブリダイゼーション法は、遺伝子産物によって、それぞれ特異的な配列をもつ蛍光プローブを作成する必要があるが、任意の配列を特異的に定量できる利点がある。
【０００５】
診断用途では、非特異的な増幅産物の検出がないこと、蛍光色素を変えてマルチプレックスで解析できることが重要となっており、ハイブリダイゼーション法での検出が一般的になっている。設計が容易という点から、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが最も広く用いられており、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた様々な診断薬も開発されてきている。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとは標的核酸特異なオリゴヌクレオチドの５‘末端に蛍光色素、３’末端にクエンチャーを標識したプローブであり、ＰＣＲ酵素の５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性で加水分解されることで、蛍光シグナルが発せられ、それを検出することで核酸の微量検出や定量を行うことができる。
【０００６】
ＰＣＲに用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼには、ファミリーＡに属するものとファミリーＢに属するものが存在する。ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼとしてはサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラ−ゼ）やサーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）などが知られている。また、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとしてはパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ）やサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ）、サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ）などが知られている。
【０００７】
最近では、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが増幅ターゲットの配列に依存しない点、ＰＣＲ阻害に強い点で評価されてきており、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを診断用途で使用する流れが出てきている。しかしながら、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼは、それ自身のもつ５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を用い、ＴａｑＭａｎプローブの検出が可能であるが、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないため、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの検出には使用できないといった問題があった。
【０００８】
また、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼはターゲットの配列に依存しやすく、ＧＣリッチやＡＴリッチなターゲットを増幅しにくい。ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼでも、エキソヌクレアーゼ活性を除去したものではこのような増幅が可能になることが報告されている（特許文献２）が、上記と同様、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブでの検出ができなくなるという問題があった。
【０００９】
従来から報告されている手法として、標識プローブの５‘末端にミスマッチを挿入することで、ＦＥＮヌクレアーゼの切断を促し標的核酸の存在を検出する方法が知られている（特許文献３）。しかしながら、この手法ではプローブ配列にミスマッチの配列を挿入する必要があり、非特異的な検出を引き起こす可能性があった。
【００１０】
また、ＦＥＮとファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを融合させたタンパク質で、５‘領域が標的核酸と相補的である標識プローブを検出する方法も知られている（特許文献４）。しかし、この手法では、融合タンパク質の安定性が悪くなる場合があり、ＤＮＡポリメラーゼの反応効率やＦＥＮによる切断効率が融合タンパク質にすることで落ちることが示唆されている。
【００１１】
一方、診断用途では、糸状菌やマラリアなどＧＣやＡＴに偏る配列を持つ微生物から検出が必要であり、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの検出ができ、かつ、増幅ターゲットの配列に依存しないＰＣＲの反応系が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特表平６−５０００２１号公報
【特許文献２】米国特許第５４３６１４９号公報
【特許文献３】特許第４９６０５６０号公報
【特許文献４】国際公開２０１５／０８５２３０パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
現状では、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに代表される、一方の末端に蛍光物質を、他方の末端にクエンチャー物質が修飾されたオリゴヌクレオチドからなる標識プローブを用いて検出することのできるファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼは、増幅ターゲットの配列に依存しやすく、ＧＣリッチやＡＴリッチなターゲットを増幅しにくかった。増幅ターゲットの配列に依存することなく、一方の末端に蛍光物質を、他方の末端にクエンチャー物質が修飾されたオリゴヌクレオチドからなる標識プローブの検出ができる方法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究を行った結果、ＰＣＲの阻害物質に強いファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼやエキソヌクレアーゼを欠損させたファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼにＦＥＮヌクレアーゼを添加することで、ＧＣリッチやＡＴリッチなターゲットを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブで検出することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
代表的な本発明は、以下の通りである。
項１．ＧＣ率またはＡＴ率が３０％以下であるか、または、７０％以上である標的核酸を検出する方法であって、
（ａ）５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼ、及び、
（ｂ）Ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）
を用いることにより、標的核酸にハイブリダイズする標識プローブを切断して標識断片を遊離させ、その遊離された標識断片を検出しあるいは測定することにより、標的核酸の存在を検出する方法。
項２．標識プローブの５’末端に蛍光物質を、３‘末端にクエンチャー物質が修飾されたオリゴヌクレオチドである項１に記載の方法。
項３．前記５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼが、
（ａ）５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたファミリーＡに由来するＤＮＡポリメラーゼ、又は、
（ｂ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
のいずれかから選択され、かつ、
プロセッシビティーが５０塩基以上であるＤＮＡポリメラーゼである項１又は２に記載の方法。
項４．前記５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼが、
（ａ）５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたファミリーＡに由来するＤＮＡポリメラーゼ、又は、
（ｂ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
のいずれかから選択され、かつ、
鎖置換能をもつＤＮＡポリメラーゼである項１〜３のいずれかに記載の方法。
項５．前記ＦＥＮヌクレアーゼが６０度以上で１０分加熱しても活性が５０％以上維持されるＦＥＮヌクレアーゼである、項１〜４のいずれかに記載の方法。
項６．さらに未精製の生体試料を反応液に含むことを特徴とする項１〜６のいずれかに記載の方法。
項７．生体試料が、血液、糞便、唾液、尿よりなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする項６に記載の方法。
項８．以下の（ａ）及び（ｂ）を反応液中に含むことを特徴とする、項１〜７のいずれかに記載の標的核酸の存在を検出する方法を行うための試薬。
（ａ）５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）Ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）
項９．項８に記載の試薬を含む標的核酸の存在を検出する方法を行うためのキット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、増幅ターゲットの配列に依存せず、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブで検出可能なＰＣＲ反応液を提供することができる。特には、診断用途において非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】５‘末端にミスマッチのあるプローブとないプローブでの検出の比較
【図２】ＦＥＮ−ＫＯＤ融合タンパクの評価
【図３】検出感度の比較
【図４】ＧＣリッチなターゲットの増幅比較
【図５】血液からの増幅検出
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
【００１９】
本発明における標的核酸の存在を検出する方法は、
（ａ）５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼ、及び、
（ｂ）Ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）
を用いて、標的核酸にハイブリダイズする標識プローブを切断して標識断片を遊離させ、その遊離してきた標識断片を検出し、あるいは測定し、標的核酸の存在を検出する方法である。
【００２０】
本発明における標的核酸のＧＣ率とは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、その他修飾塩基から構成される標的核酸配列の中のＧとＣの割合を示す。ＧとＣの割合が全体の３０％以下であるか、あるいは７０％以上であればよく、配列は特に限定されない。
【００２１】
本発明における５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼとは、５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼであれば特に限定されるものではない。好ましくは、特許文献２のように、ファミリーＡに属するポリメラーゼに欠損や変異を挿入しエキソヌクレアーゼ活性を除去したものや、元々５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有さない、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。
【００２２】
５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を除去したファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼとは、５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性の完全な欠如を含み、例えば、親酵素と比較して０．０３％、０．０５％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、または最大でも３０％以下の５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する改変されたＤＮＡポリメラーゼを指す。５‘−３’エキソヌクレアーゼの活性を解析するための方法は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．６５，ｐ１６８−１７５（１９７０年）に記載されている方法に基づく。
【００２３】
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばサーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ）、パイロコッカス・フリオサスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）、サーモコッカス・ゴルゴナリウスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（ＴＧＯ）、サーモコッカス・リトラリスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｌｉ、Ｖｅｎｔ）、パイロコッカス・エスピーＧＢ−Ｄに由来するＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・エスピーＪＤＦ−３に由来するＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・エスピー９°Ｎ−７に由来するＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・エスピーＫＳ−１に由来するＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・セラーに由来するＤＮＡポリメラーゼ、又はサーモコッカス・シクリに由来するＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられるが、特に限定されない。
【００２４】
また本発明のＤＮＡポリメラーゼは５‘−３’エキソヌクレアーゼの活性を持たないものであればよく、さらに欠損や変異を導入したもの、ＳＳＢ（一本鎖ＤＮＡ結合ドメイン）を融合させたものであってもよい。変異の種類は特に限定されないが、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼであれば、例えば特許第５８０９０５９号公報や特許第０４１９３９９７号公報に記載の変異などが挙げられる。ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼであれば、特開２０１４−０７９２３６号公報、特開２０１４−０７９２３５号公報、特開２０１４−０７９２３３号公報、特許第３８９１３３０号公報などに記載の変異が挙げられる。
【００２５】
さらに好ましくは、プロセッシビティーが５０塩基以上であるＤＮＡポリメラーゼを用いることが望ましく、好ましくは、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼでは、プロセッシビティー５０〜８５塩基を示すＫｌｅｎＴａｑ、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼでは、プロセッシビティー３００塩基以上を示すＫＯＤ、Ｐｈｕｓｉｏｎなどが挙げられる。ここで、プロセッシビティーとはポリメラーゼがＤＮＡと結合してから解離するまでに合成する塩基数を示し、プロセッシビティー２０塩基を示すＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼなどと比較するとプロセッシビティーが高いポリメラーゼの方が、ＰＣＲの阻害や配列のＧＣ率やＡＴ率に影響することなく、優れた増幅能力を示す。本発明において、プロセッシビティーの測定方法は、Ａｐｐｌ. Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９７ Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．１１，ｐ４５０４−４５１０に記載されている方法に基づく。
【００２６】
さらに好ましくは微弱ながらも鎖置換活性をもつＤＮＡポリメラーゼが望ましく、好ましくはファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼではＫｌｅｎＴａｑ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼではＫＯＤ、Ｐｈｕｓｉｏｎ、Ｖｅｎｔなどが挙げられる。本発明において、鎖置換活性とは、鋳型となる二本鎖ＤＮＡの水素結合を自ら解離しつつ、新しいＤＮＡ鎖を合成する機能をいう。
【００２７】
鎖置換活性の有無はＦＥＮを含む反応系に５’末端がマッチしている標識プローブを添加し、ｑＰＣＲを実施することで判断できる。ＦＥＮヌクレアーゼは、Ｆｌａｐ構造のみを切断するため、鎖置換反応が促進され、Ｆｌａｐ構造をとった場合のみ、プローブが切断される。ｑＰＣＲにいて、標識プローブの分解による蛍光の増加が確認されれば、鎖置換能があると評価する。ＫｌｅｎＴａｑやＫＯＤの鎖置換活性は非常に弱いが、本発明においては、以下の測定系で蛍光の増加が確認され、鎖置換能があるものとみなす。本発明においてＦｌａｐ構造とは、ＤＮＡの三重鎖構造を示し、二本鎖ＤＮＡ上のニックあるいはギャップ部分の５’側または３’側に一本鎖または二本鎖が飛び出したＤＮＡの構造を示す。
【００２８】
より具体的には、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付の１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、またはｒＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｏｙｏｂｏ製）の１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４またはＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、β―アクチンを増幅する４ｐｍｏｌの配列番号１及び２に記載のプライマー、β―アクチン遺伝子と完全にハイブリダイズする５‘にＦＡＭ、３’にＢＨＱ１が修飾された２ｐｍｏｌのプローブ（配列番号３）、ＲＮＡ５ｎｇ相当のｃＤＮＡ、５００ｎｇＫＯＤ  ＦＥＮを含む２０μｌの反応液中に、鎖置換の有無を判定したい酵素を０．４〜２．０Ｕになるよう添加する。９４℃、３０秒の前反応の後、９４℃、１０秒→６０℃、３０秒を４０サイクル繰り返すスケジュールでＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）９６（Ｒｏｃｈｅ製）にてＦＡＭを認識するｑＰＣＲを行う。標識プローブの分解による蛍光の増加が確認されれば、鎖置換能があると評価する。
【００２９】
本発明におけるＦＥＮヌクレアーゼとは、Ｆｌａｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ １のことを示し、Ｆｌａｐ構造を認識して、ヌクレオチドを切断する酵素のことをいう。好ましくは耐熱性のＦＥＮヌクレアーゼであることが望ましく、さらに好ましくは、サーモコッカスやパイロコッカスのＦＥＮヌクレアーゼなどが挙げられるが、特に限定されない。
【００３０】
本発明における耐熱性のＦＥＮヌクレアーゼとは、６０度以上の温度条件下においても安定な耐熱性ＦＥＮヌクレアーゼであり、具体的には、６０度で１０分加温しても活性が５０％以上維持される耐熱性ＦＥＮヌクレアーゼを示す。より好ましくは６０℃で１０分加温しても活性が８０％以上維持される耐熱性ＦＥＮヌクレアーゼであれば、特に限定されない。ＦＥＮヌクレアーゼの活性の測定方法は、特許第３０１８１６３号公報に記載されている方法に基づく。
【００３１】
本発明におけるＦＥＮとＤＮＡポリメラーゼは、融合されることなく、別々に働くことを特徴とする。これによって、ＤＮＡポリメラーゼの反応効率やＦＥＮによる切断効率が融合タンパク質とすることによる低下するという従来の課題を解消することができる。
【００３２】
本発明における標識プローブとは、特許文献１などに記載のオリゴヌクレオチドであり、好ましくは蛍光色素を修飾したオリゴヌクレオチドが挙げられるが、ビオチンの修飾や放射性同位元素の使用など検出に用いられる方法は特に限定されない。蛍光物質としては、５’末端にＦＡＭなどの蛍光物質、３‘末端にＴＡＭＲＡなどのクエンチャー物質を修飾したオリゴヌクレオチドが特に好ましい。この場合に修飾される蛍光物質には、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＨＥＸ、ＲＯＸなど様々あるが特に限定されない。また、クエンチャー物質にもＴＡＭＲＡやＢＨＱなど様々あるが、特に限定されない。本発明における標識プローブは、５‘末端や３’末端にミスマッチが挿入されていてもよい。
【００３３】
本発明では５‘末端が完全に相補的であってもよく、ＤＮＡポリメラーゼの伸長で形成されたＦｌａｐ構造を切断して検出するため、市販のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブについても検出することができる。
【００３４】
また本発明における標的核酸の検出にはＰＣＲの阻害物質が含まれていてもよく、阻害物質としては、例えば生体試料を示すが、ＰＣＲを阻害する物質であれば特に限定されない。生体試料とは、生体から採取された試料であれば特に限定されない。例えば、体毛、爪、口腔粘膜などの動植物組織、血液などの体液、糞便や尿などの排泄物、細胞、細菌、ウイルス等をいう。体液には血液や唾液が含まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
本発明における検出方法は、生体試料内の核酸を精製することなく使用してもよい。ここで、精製とは、生体試料の組織、細胞壁などの夾雑物質と生体試料中のＤＮＡとを分離する方法であり、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、ＤＮＡを分離する方法や、イオン交換樹脂、ガラスフィルターあるいはタンパク質凝集作用を有する試薬によってＤＮＡを分離する方法が挙げられる。
【００３６】
本発明における検出方法は、生体試料をこれらの精製工程を経ることなく、核酸増幅反応液に添加し検出してもよく、本発明において「未精製の生体試料」とは、生体試料そのものも指すが、液体の生体試料を水などの溶媒を用いて希釈したもの、固体の生体試料を水などの溶媒に添加して熱をかけて破砕させたものなども含まれる。一方、臓器や細胞など、増幅対象となる核酸が試料の組織内に存在する場合、前記核酸を抽出するために組織を破壊する行為（例えば、物理的な処理による破壊、界面活性剤などを使用した破壊など）は、本発明における精製に該当しない。また、前記方法で得られた試料、または、生体試料を、緩衝液などにより希釈する行為も、本発明における精製に該当しない。
【００３７】
本発明においては、必要に応じて、さらに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を用いても良い。前記抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。本反応組成は、ＰＣＲの感度上昇、非特異的増幅の軽減に特に有効である。
【００３８】
核酸増幅法を実行するための試薬
本発明の検出を実行するための試薬は、
（ａ）５‘−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼ、及び、
（ｂ）ＦＥＮヌクレアーゼ
を反応液中に含み、標識プローブを用い、そのプローブを切断することで増幅の有無を判定するものが挙げられる。それ以外の構成は特に限定されない。なお、前記試薬にはキットの形態も含まれる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例により、特に限定されるものではない。
【００４０】
（実施例１）
ＦＥＮヌクレアーゼプラスミドの作製
後述の実施例に用いるために、サーモコッカス・コダカラエンシス  ＫＯＤ１株由来のＦＥＮヌクレアーゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。ＦＥＮヌクレアーゼ遺伝子はＮ末にＨｉｓタグ配列を付与した状態で人工合成により作成され（配列番号４）、ｐＥＴ２３ｂにクローニングされた（ｐＦＥＮ）を用いた。得られたプラスミドはエシェリシア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、酵素調製に用いた。
【００４１】
（実施例２）
ＦＥＮヌクレアーゼの作製
実施例１で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）８０ｍＬを、５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に、予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３０℃でＯＤ６６０が０．５付近になるまで通気培養した。その後、滅菌処理したＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭになるまで添加し、３０℃で引き続き４時間、通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に、細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ニッケルアガロースクロマトグラフィーを行い精製し、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  塩化カリウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、５０％  グリセリン）に置換し、ＦＥＮヌクレアーゼを得た。
【００４２】
（実施例３）
ＦＥＮヌクレアーゼ−ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク  プラスミドの作製
後述の実施例に用いるために、サーモコッカス・コダカラエンシス  ＫＯＤ１株由来のＦＥＮヌクレアーゼ遺伝子とＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの融合タンパクの遺伝子を含有するプラスミドを作製した。具体的には実施例１で用いたＦＥＮヌクレアーゼ遺伝子のＣ末に特許文献４記載のリンカー、及びＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの配列をＩｎ  Ｆｕｓｉｏｎ（ＴａＫａＲａ製）を用いて挿入し、Ｎ末端にＨｉｓタグ配列を付与したＦＥＮ−ＫＯＤ（配列番号５）をクローニングした（ｐＦＥＮ−ＫＯＤ）。得られたプラスミドはエシェリシア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、酵素調製に用いた。
【００４３】
（実施例４）
ＦＥＮヌクレアーゼ-ＫＯＤポリメラーゼ融合タンパクの作製
実施例３で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）８０ｍＬを、５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に、予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３０℃でＯＤ６６０が０．５付近になるまで通気培養した。その後、滅菌処理したＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭになるまで添加し、３０℃で引き続き４時間、通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に、細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ニッケルアガロースクロマトグラフィーを行い精製し、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  塩化カリウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、５０％  グリセリン）に置換し、ＦＥＮヌクレアーゼ−ＫＯＤポリメラーゼ融合タンパクを得た。
【００４４】
（実施例５）
標識プローブによる検出
５‘末端にミスマッチのあるプローブ（配列番号６）とミスマッチのないプローブ（配列番号３）で検出の比較を実施した。
ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付の１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、β―アクチンを増幅する４ｐｍｏｌの配列番号１及び２に記載のプライマー、実施例２で調製した５００ｎｇＫＯＤ  ＦＥＮ、０．４Ｕ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を含む２０μｌの反応液中に、２ｐｍｏｌの５’末端がターゲットとハイブリしない配列を添加したＦＡＭ，ＢＨＱで標識したプローブ（配列番号６）、もしくはターゲットと完全にハイブリするＦＡＭ，ＢＨＱで標識したプローブ（配列番号３）を添加し、それぞれＴｏｔａｌ  ＲＮＡ２５ｎｇ、２．５ｎｇ、２５０ｐｇ、２５ｐｇ、２．５ｐｇ、２５０ｆｇ、２５ｆｇ相当のｃＤＮＡを鋳型に、９４℃、３０秒の前反応の後、９４℃、１０秒→６０℃、３０秒を４０サイクル繰り返すスケジュールで、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）  ９６（Ｒｏｃｈｅ製）にてＦＡＭを認識するｑＰＣＲを行った。
【００４５】
ｑＰＣＲのＣｑ値、および増幅曲線の結果を図１に示す。上段がミスマッチのないプローブを用いたもの、下段がミスマッチのあるプローブを用いたものになる。ＦＥＮヌクレアーゼはＦＬＡＰ構造のみを切断する酵素だが、５’末端にミスマッチがないプローブでも、ミスマッチがあるプローブと同等以上のＣｑ値が得られた。これはＫＯＤの鎖置換反応により、ミスマッチ配列がなくともプローブを浮かせて伸長が進み、ＦＬＡＰ構造を作製したことが示される。このＦＬＡＰ構造をＦＥＮが認識し、プローブの切断が起こったと考えられる。ミスマッチのないプローブの方は２５０ｆｇ、２５ｆｇの検出でＣｑがばらつく結果になったため、検出の効率も低い結果となった。本発明はミスマッチのないプローブを検出でき、反応の効率面でも高い結果が得られた。同様の反応を５‘−３’エキソヌクレアーゼがないことが知られているＰｈｕｓｉｏｎ（ＮＥＢ製）、Ｈｅｍｏ  ＫｌｅｎＴａｑ（ＮＥＢ製）でも実施し、５’末端にミスマッチのないプローブでもミスマッチありのプローブと同程度の検出ができることが示された。
【００４６】
（実施例６）
ＦＥＮ−ＫＯＤ融合タンパク質の評価
ＦＥＮ−ＫＯＤの融合タンパク質において、５‘末端にミスマッチのないプローブ（配列番号３）で遺伝子増幅の検出が可能かを評価した。
ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付の１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、β―アクチンを増幅する４ｐｍｏｌの配列番号１及び２に記載のプライマー、ＲＮＡ２５ｎｇ相当のｃＤＮＡ、実施例４で調製した５０ｎｇＦＥＮ−ＫＯＤ融合タンパク質を含む２０μｌの反応液中に、ターゲットと完全にハイブリする配列番号３のＦＡＭ，ＢＨＱで標識したプローブ、もしくは１／３００００の濃度になるようＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎを添加し、９４℃、３０秒の前反応の後、９４℃、１０秒→６０℃、３０秒を４０サイクル繰り返すスケジュールで、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）９６（Ｒｏｃｈｅ製）にてｑＰＣＲを行った。
【００４７】
ｑＰＣＲの増幅曲線の結果を図２に示す。上段に示すＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎの検出系では蛍光の増加が確認されるが、下段に示すプローブの系では蛍光の増加が確認できなかった。融合タンパクにしたことでＦＥＮやＫＯＤの動きが悪くなり、プローブの検出ができなかったことが考えられる。発現、精製の手間はかかるが、それぞれ反応に適した量を添加できる点において、で融合タンパク質を用いる手法よりも、ＦＥＮとＤＮＡポリメラーゼを別々に入れる本発明の手法の方が容易に反応系を構築できるものと考える。
【００４８】
（実施例７）
検出感度比較
実施例２で得られたＦＥＮヌクレアーゼを用い、Ｔａｑの反応系と検出感度の比較をした。
ＦＥＮの検出系はＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付の１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、β―アクチンを増幅する４ｐｍｏｌの配列番号１及び２に記載のプライマー、実施例２で調製した５００ｎｇＫＯＤ  ＦＥＮヌクレアーゼ、０．４Ｕ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を含む２０μｌの反応液中に、２ｐｍｏｌのＦＡＭ，ＢＨＱで標識したプローブ（配列番号３）を添加し、それぞれＴｏｔａｌ  ＲＮＡ２５ｎｇ、２．５ｎｇ、２５０ｐｇ、２５ｐｇ、２．５ｐｇ、２５０ｆｇ、２５ｆｇ相当のｃＤＮＡを鋳型に、９４℃、３０秒の前反応の後、９４℃、１０秒→６０℃、３０秒を４０サイクル繰り返すスケジュールで、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）９６（Ｒｏｃｈｅ製）にてＦＡＭを認識するｑＰＣＲを行った。
【００４９】
Ｔａｑの検出系では、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘを用い、１×ＭａｓｔｅｒＭｉｘにβ―アクチンを増幅する４ｐｍｏｌの配列番号１及び２に記載のプライマー、２ｐｍｏｌのＦＡＭ，ＢＨＱで標識したプローブ（配列番号３）を含む２０μｌの反応液でＴｏｔａｌ  ＲＮＡ２５ｎｇ、２．５ｎｇ、２５０ｐｇ、２５ｐｇ、２．５ｐｇ、２５０ｆｇ、２５ｆｇ相当のｃＤＮＡを鋳型に、９４℃、３０秒の前反応の後、９４℃、１０秒→６０℃、３０秒を４０サイクル繰り返すスケジュールで、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９６（Ｒｏｃｈｅ製）にてＦＡＭを認識するｑＰＣＲを行った。
【００５０】
ｑＰＣＲのＣｑ値、および増幅曲線の結果を図３に示す。
上段で示すＦＥＮとＫＯＤの組み合わせでは、２５ｆｇＲＮＡ相当のｃＤＮＡからでも増幅が確認され、２５０ｆｇまでしか検出できなかった下段に示すＴａｑの検出系より良好な検出感度が確認できた。ＫＯＤはＴａｑより優れた検出感度、ＰＣＲ効率を持つことが知られている。本発明でＫＯＤの特長を活かし、プローブ検出が可能になった。
【００５１】
（実施例８）
ＧＣリッチなターゲットの増幅
実施例２で得られたＦＥＮヌクレアーゼを用い、Ｔａｑの反応系とＧＣリッチなターゲットの増幅を比較した。
ＦＥＮの検出系はＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付の１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、ＧＣ率７０％を超えるβ―グロビンを増幅する４ｐｍｏｌの配列番号７及び８に記載のプライマー、実施例２で調製した５００ｎｇＫＯＤ  ＦＥＮヌクレアーゼ、０．４Ｕ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を含む２０μｌの反応液中に、２ｐｍｏｌのＦＡＭ，ＢＨＱで標識したプローブ（配列番号９）を添加し、ｇＤＮＡを鋳型に、９４℃、３０秒の前反応の後、９４℃、１０秒→６０℃、３０秒を４０サイクル繰り返すスケジュールでＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９６（Ｒｏｃｈｅ製）にてＦＡＭを認識するｑＰＣＲを行った。
【００５２】
Ｔａｑの検出系では、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘを用い、１×ＭａｓｔｅｒＭｉｘにβ―グロビンを増幅する４ｐｍｏｌの配列番号７及び８に記載のプライマー、２ｐｍｏｌのＦＡＭ，ＢＨＱで標識したプローブ（配列番号９）を含む２０μｌの反応液でｇＤＮＡを鋳型に、９４℃、３０秒の前反応の後、９４℃、１０秒→６０℃、３０秒を４０サイクル繰り返すスケジュールでＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９６（Ｒｏｃｈｅ社）にてＦＡＭを認識するｑＰＣＲを行った。それぞれｇＤＮＡは８．２５ｎｇ、２ｎｇ、０．５２ｎｇ、０．１３ｎｇ、３２ｐｇ、８．１ｐｇの６水準を鋳型とした。
【００５３】
ｑＰＣＲのＣｑ値、および増幅曲線の結果を図４に示す。
下段で示すＴａｑの検出系では、ＧＣ率の高いターゲットがうまく増幅できず、立ち上がりが遅れるのに対し、上段で示すＦＥＮとＫＯＤの組み合わせでは、６水準目の８．１ｐｇまでしっかりと立ち上がりが確認された。プロセッシビティーの高いＫＯＤやＫｌｅｎＴａｑは、通常のＴａｑに比べ、このようなＧＣの偏りがある配列の増幅にも耐性があることが確認される。ＦＥＮと組み合わせることで、ポリメラーゼの高い性能を活かしてプローブアッセイが可能になる。同様にＧＣ率が３０％以下の非翻訳領域の増幅においても、通常のＴａｑに比べ、ＫＯＤやＫｌｅｎＴａｑはＦＥＮと組み合わせることで高い効率で増幅が可能であった。
【００５４】
（実施例９）
血液耐性
実施例２で得られたＦＥＮヌクレアーゼを用い、Ｔａｑの反応系と血液からの増幅を比較した。
ＦＥＮの検出系はＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付の１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、β―グロビンを増幅する４ｐｍｏｌの配列番号１０及び１１に記載のプライマー、実施例２で調製した５００ｎｇＫＯＤ  ＦＥＮヌクレアーゼ、０．４Ｕ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を含む２０μｌの反応液中に、２ｐｍｏｌのＦＡＭ，ＢＨＱで標識したプローブ（配列番号１２）を添加し、血液を鋳型に、９４℃、３０秒の前反応の後、９４℃、１０秒→６０℃、３０秒を４０サイクル繰り返すスケジュールでＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ９６（Ｒｏｃｈｅ製）にてＦＡＭを認識するｑＰＣＲを行った。
Ｔａｑの検出系では、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘを用い、１×ＭａｓｔｅｒＭｉｘにβ―グロビンを増幅する４ｐｍｏｌの配列番号１０及び１１に記載のプライマー、２ｐｍｏｌのＦＡＭ，ＢＨＱで標識したプローブ（配列番号１２）を含む２０μｌの反応液で血液を鋳型に、９４℃、３０秒の前反応の後、９４℃、１０秒→６０℃、３０秒を４０サイクル繰り返すスケジュールで、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）９６（Ｒｏｃｈｅ製）にてＦＡＭを認識するｑＰＣＲを行った。それぞれ血液は反応系に５％、０．２％、０．０５％含まれるように添加した。
【００５５】
ｑＰＣＲの増幅曲線の結果を図５に示す。
血液にはヘモグロビンなどＰＣＲを阻害する物質が多く含まれている。下段で示すＴａｑの系では０．０５％といった非常に薄い血液からしか増幅できないものの、上段で示すＦＥＮとＫＯＤの組み合わせでは５％と非常に濃い血液からでも増幅が可能であった。
同様の反応を５‘−３’エキソヌクレアーゼがないことが知られているＰｈｕｓｉｏｎ（ＮＥＢ製）、Ｈｅｍｏ  ＫｌｅｎＴａｑ（ＮＥＢ製）でも実施し、Ｐｈｕｓｉｏｎでは５％まで。Ｈｅｍｏ  ＫｌｅｎＴａｑでは０．２％まで検出ができることが示された。また、ＧＣ率の高い実施例８に記載のプライマーでも同様の血液濃度から検出が可能であった。
血液を希釈することなくｑＰＣＲの反応系に添加できるため、コンタミや時間の短縮につながる。診断用途でも利用できると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、ＤＮＡ合成に関わるバイオテクノロジー関連産業において有用であり、特に診断用途において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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