(57)【要約】      （修正有）【課題】高選択的に細胞内脂肪滴を染色することができ、且つ、耐光性の優れた化合物の提供。【解決手段】式（1-1）で表される縮環チオフェン化合物又はその溶媒和物。2018145422.tif 000029［Ar1及びAr2は置換/非置換（複素）芳香環；R1-1及びR2-1はＨ、置換/非置換アルキル基、置換/非置換シクロアルキル基、置換/非置換（ヘテロ）アリール基（ただし、R1-1及びR2-1がＨである場合を除く。）；Y1及びY2は片方が−SO2−で表される基であり、他方がＳ、−SO2−で表される基又は−CR32−で表される基（R3はＨ、置換/非置換アルキル基、置換/非置換シクロアルキル基、置換/非置換（ヘテロ）アリール基を示す。）］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（1-1）：
【化１】
2018145422.tif 000027
［式中、Ar1及びAr2は同一又は異なって、置換若しくは非置換（複素）芳香環を示す。R1-1及びR2-1は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。ただし、R1-1及びR2-1がいずれも水素原子である場合を除く。R1-1及びR2-1は結合して隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。R1-1及び／又はR2-1はAr2と結合して隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。Y1及びY2は片方が−SO2−で表される基であり、他方が硫黄原子、−SO2−で表される基又は−CR32−で表される基（R3は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。）である。］
で表される縮環チオフェン化合物又はその溶媒和物。
【請求項２】
前記Y1及びY2は片方が−SO2−で表される基であり、他方が硫黄原子である、請求項１に記載の縮環チオフェン化合物又はその溶媒和物。
【請求項３】
前記Ar1及びAr2が置換若しくは非置換芳香環である、請求項１又は２に記載の縮環チオフェン化合物又はその溶媒和物。
【請求項４】
前記R1-1及びR2-1が置換若しくは非置換アリール基である、請求項１〜３のいずれかに記載のチオフェン化合物又はその溶媒和物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の縮環チオフェン化合物又はその溶媒和物を含有する油滴染色剤。
【請求項６】
一般式（1）：
【化２】
2018145422.tif 000028
［式中、Ar1及びAr2は同一又は異なって、置換若しくは非置換（複素）芳香環を示す。R1及びR2は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。R1及びR2は結合して隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。R1及び／又はR2はAr2と結合して隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。Y1及びY2は片方が−SO2−で表される基であり、他方が硫黄原子、−SO2−で表される基又は−CR32−で表される基（R3は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。）である。］
で表される縮環チオフェン化合物又はその溶媒和物を含有する油滴染色剤。
【請求項７】
前記縮環チオフェン化合物又はその溶媒和物が非極性溶媒中に溶解している、請求項５又は６に記載の油滴染色剤。
【請求項８】
脂肪染色剤である、請求項５〜７のいずれかに記載の油滴染色剤。
【請求項９】
細胞内脂肪球染色剤である、請求項５〜８のいずれかに記載の油滴染色剤。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれかに記載の油滴染色剤を用いる、脂肪のバイオイメージング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、縮環チオフェン化合物及びそれを用いた油滴染色剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内脂肪滴（脂肪球）はあらゆる細胞に普遍的に存在するオルガネラの一種であり、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、コレステロールエステル等の中性脂肪がリン脂質一重層で覆われた構造を有している。最近の研究では、脂肪滴の表面には多くのタンパク質が存在することが判明し、脂肪滴が脂質エステルの加水分解によるエネルギー供給をはじめとして、小胞輸送、シグナリング等の様々な生命現象に関わっていることを示唆する報告がなされている。また、脂肪滴の挙動が肥満、循環器疾患、糖尿病、脂肪肝等の様々な病気に関わっていることも知られている。これらの知見から、脂肪滴の挙動の解明は、脂質代謝等の生命現象を理解するために必要であるとともに、病気の早期発見、予防等に有用であるため重要な研究課題である。しかしながら、脂肪滴の挙動に関して判明していることは少なく、脂肪滴表面に存在する様々なタンパク質の挙動や脂肪滴の形成及び分解過程等を直接観測することはできていない。細胞内の脂肪滴動態を時空間的に高精度で解析することができれば、脂肪滴についての研究が飛躍的に発展すると考えられる。これを実現するためには、脂肪滴を非侵襲且つ長時間、リアルタイムで観察し続ける必要があり、それを実現するための手段が現在求められている。
【０００３】
この脂肪滴の観測には、通常、細胞内脂肪滴を染色する手法が採用されている。このような細胞内脂肪球染色剤としては、BODIPY 493/503が市販されている。
【０００４】
【化１】
2018145422.tif 000002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発生初期段階において、細胞内脂肪滴は極微小であると考えられるため、細胞内脂肪滴をリアルタイムに観測するためには高い空間分解能が求められる。このためには、STED顕微鏡等の超解像顕微鏡技術を採用することが考えられている。超解像顕微鏡を用いることで、極微小な脂肪滴の形成過程を捉えることも期待されるが、そのためには脂肪滴表面のタンパク質ではなく、脂肪滴そのものを可視化するための蛍光プローブが必須である。しかしながら、超解像顕微鏡では強力なレーザー光の照射を必要とするため、耐光性に極めて優れた蛍光色素でなければ蛍光色素が激しく褪色してしまい、連続的に長時間画像を取得することが困難である。そのため、脂肪滴を長時間、超解像顕微鏡を用いて観察するためには、高選択的な脂肪滴染色能に加えて、光照射下でも褪色が抑えられる超耐光性を兼ね備えた蛍光プローブが必要となる。
【０００６】
市販のBODIPY 493/503は、中性脂肪に対する親和性の高さから脂肪滴に集まりやすいものの、細胞壁や細胞膜も同様に強く蛍光するために脂肪滴を選択的に染色することはできない。また、耐光性にも乏しいため、長時間の観察や強力なレーザー光を使用する観察には不向きである。
【０００７】
一方、ベンゾチオフェンオキシドとジフェニルアミノ基を連結させたBTOは、極性溶媒中ではほとんど蛍光しないために脂肪滴を高選択的に染色することが可能である。しかしながら、光安定性についてはいまだ改善の余地がある。
【０００８】
【化２】
2018145422.tif 000003
【０００９】
このように、従来から知られている蛍光色素は、時間の経過とともに蛍光強度が低下するため、脂肪滴のイメージングを繰り返し行うと著しい蛍光褪色が起こるために、脂肪滴の形成過程や分解過程を長時間観察し続けることはできない。また、脂質代謝機構を蛍光イメージングで解析しようとした場合、脂肪滴の分解（代謝）により蛍光強度が落ちているのか、蛍光色素自体の蛍光が褪色しているのか判別することができない。しかも、脂肪滴の生成過程及び分解（代謝）過程をリアルタイムで可視化するためには、非常に小さい組織を観察するために超解像顕微鏡等の強いレーザーを照射する顕微鏡で観察する必要があるが、上記のように耐光性の十分ではない蛍光色素を用いた場合にはこの強いレーザーの照射により蛍光色素の褪色が早く、脂肪滴の生成過程及び分解過程をリアルタイムで可視化することは現状不可能である。
【００１０】
本発明は、このような課題を解決するためになされたものであり、高選択的に脂肪滴を染色することができ、且つ、耐光性の優れた化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、特定の構造を有する縮環チオフェン化合物又はその溶媒和物は、高選択的に脂肪滴を染色することができ、且つ、耐光性に優れていることを見出した。本発明者らは、このような知見に基づき、さらに研究を重ね本発明を完成した。即ち、本発明は、以下の構成を包含する。
【００１２】
項１．一般式（1-1）：
【００１３】
【化３】
2018145422.tif 000004
【００１４】
［式中、Ar1及びAr2は同一又は異なって、置換若しくは非置換（複素）芳香環を示す。R1-1及びR2-1は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。ただし、R1-1及びR2-1がいずれも水素原子である場合を除く。R1-1及びR2-1は結合して隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。R1-1及び／又はR2-1はAr2と結合して隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。Y1及びY2は片方が−SO2−で表される基であり、他方が硫黄原子、−SO2−で表される基又は−CR32−で表される基（R3は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。）である。］
で表される縮環チオフェン化合物又はその溶媒和物。
【００１５】
項２．前記Y1及びY2は片方が−SO2−で表される基であり、他方が硫黄原子である、項１に記載の縮環チオフェン化合物又はその溶媒和物。
【００１６】
項３．前記Ar1及びAr2が置換若しくは非置換芳香環である、項１又は２に記載の縮環チオフェン化合物又はその溶媒和物。
【００１７】
項４．前記R1-1及びR2-1が置換若しくは非置換アリール基である、項１〜３のいずれかに記載のチオフェン化合物又はその溶媒和物。
【００１８】
項５．項１〜４のいずれかに記載の縮環チオフェン化合物又はその溶媒和物を含有する油滴染色剤。
【００１９】
項６．一般式（1）：
【００２０】
【化４】
2018145422.tif 000005
【００２１】
［式中、Ar1及びAr2は同一又は異なって、置換若しくは非置換（複素）芳香環を示す。R1及びR2は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。R1及びR2は結合して隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。R1及び／又はR2はAr2と結合して隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。Y1及びY2は片方が−SO2−で表される基であり、他方が硫黄原子、−SO2−で表される基又は−CR32−で表される基（R3は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。）である。］
で表される縮環チオフェン化合物又はその溶媒和物を含有する油滴染色剤。
【００２２】
項７．前記縮環チオフェン化合物又はその溶媒和物が非極性溶媒中に溶解している、項５又は６に記載の油滴染色剤。
【００２３】
項８．脂肪染色剤である、項５〜７のいずれかに記載の油滴染色剤。
【００２４】
項９．細胞内脂肪球染色剤である、項５〜８のいずれかに記載の油滴染色剤。
【００２５】
項１０．項５〜９のいずれかに記載の油滴染色剤を用いる、脂肪のバイオイメージング方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、特定の縮環チオフェン化合物又はその溶媒和物は、小さいサイズであっても油滴（特に細胞内の脂肪球）を高感度に染色することが可能であり、また、他の組織の蛍光染色も抑制することができる。
【００２７】
また、この特定の縮環チオフェン化合物又はその溶媒和物は、光照射によってはその蛍光強度はほとんど褪色せず、長時間の観察や強力なレーザー光を使用する観察にも有効である。
【００２８】
なお、この特定の縮環チオフェン化合物又はその溶媒和物は、可視光レーザー光源を使用して油滴（特に脂肪球）の染色を行うことが可能であるため、生体へのダメージを大幅に軽減することができ、生体内で使用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施例1のDEBSO1及び実施例2のDEBSO2の紫外可視吸収スペクトル及び蛍光スペクトルである。a) 各溶媒中のDEBSO1の紫外可視吸収スペクトル。b) 各溶媒中のDEBSO1の蛍光スペクトル。c) 各溶媒中のDEBSO2の紫外可視吸収スペクトル。d) 各溶媒中のDEBSO2の蛍光スペクトル。
【図２】トルエン中における実施例1のDEBSO1、実施例2のDEBSO2、比較例1のBTO、比較例2のBODIPY 493/503の光安定性の結果である。
【図３】3T3-L1から分化誘導した脂肪細胞に対してそれぞれ1 μMのDEBSO1、DEBSO2及びBTOで12時間染色を行った結果を示す。a) 1μM DEBSO1で脂肪細胞を染色した際のイメージング画像。b) aの白線に沿った蛍光強度断面図。c) 1μM DEBSO2で脂肪細胞を染色した際のイメージング画像。d) c の白線に沿った蛍光強度断面図。e) 1μM BTOで脂肪細胞を染色した際のイメージング画像。f) e の白線に沿った蛍光強度断面図。励起波長はいずれも405nmである。
【図４】3T3-L1から分化誘導した脂肪細胞に対してそれぞれ100nMのDEBSO1、DEBSO2及びBTOで12時間染色を行った結果を示す。a) 100nM DEBSO1で脂肪細胞を染色した際のイメージング画像。b) aの白線に沿った蛍光強度断面図。c) 100nM DEBSO2で脂肪細胞を染色した際のイメージング画像。d) c の白線に沿った蛍光強度断面図。e) 100nM BTOで脂肪細胞を染色した際のイメージング画像。f) e の白線に沿った蛍光強度断面図。励起波長はいずれも405nmである。
【図５】3T3-L1から分化誘導した脂肪細胞に対してそれぞれ1 μMのDEBSO1、DEBSO2及びBTOで12時間染色を行った結果を示す。a) 1μM DEBSO1で脂肪細胞を染色した際のイメージング画像。b) aの白線に沿った蛍光強度断面図。c) 1μM DEBSO2で脂肪細胞を染色した際のイメージング画像。d) c の白線に沿った蛍光強度断面図。e) 1μM BTOで脂肪細胞を染色した際のイメージング画像。f) e の白線に沿った蛍光強度断面図。励起波長はいずれも473nmである。
【図６】3T3-L1から分化誘導した脂肪細胞に対してそれぞれ1 μMのDEBSO1、DEBSO2及びBTOで12時間染色を行った後に共焦点レーザーを照射し続けた際のイメージング画像を示す。励起波長はいずれも473nmである。
【図７】3T3-L1から分化誘導した脂肪細胞に対してそれぞれ1 μMのDEBSO1、DEBSO2及びBTOで12時間染色を行った後に共焦点レーザーを照射し続けた際の蛍光強度の変化を示すグラフである。励起波長はいずれも473nmである。
【図８】脂肪分解の模式図である。
【図９】12時間1μM DEBSO1で染色した脂肪細胞を、10μMフォルスコリン、0.1mM IBMX、2%BSA、及び1μM DEBSO1の培地による刺激を与えた際の脂肪滴の収縮の様子である。
【図１０】図９の上側の青丸で囲った領域（下側の青丸）と、図９の下側の赤丸で囲った領域（上側の赤丸）における面積当たりの輝度の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本明細書において、「（複素）芳香環」は、芳香環又は複素芳香環を意味する。また、本明細書において、「（ヘテロ）アリール基」は、アリール基又はヘテロアリール基を意味する。さらに、本明細書において、「含有」は、「含む（comprise）」、「実質的にのみからなる（consist essentially of）」、及び「のみからなる（consist of）」のいずれも包含する概念である。
【００３１】
本明細書において、ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００３２】
本明細書において、ハロゲン化アルキル基としては、トリフルオロメチル基、ペンタフルオロエチル基等が挙げられる。
【００３３】
１．縮環チオフェン化合物
本発明の縮環チオフェン化合物は、一般式（1）：
【００３４】
【化５】
2018145422.tif 000006
【００３５】
［式中、Ar1及びAr2は同一又は異なって、置換若しくは非置換（複素）芳香環を示す。R1及びR2は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。R1及びR2は結合して隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。R1及び／又はR2はAr2と結合して隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。Y1及びY2は片方が−SO2−で表される基であり、他方が硫黄原子、−SO2−で表される基又は−CR32−で表される基（R3は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。）である。］
で表される化合物である。
【００３６】
このうち、一般式（1-1）：
【００３７】
【化６】
2018145422.tif 000007
【００３８】
［式中、Ar1、Ar2、Y1及びY2は前記に同じである。R1-1及びR2-1は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。ただし、R1-1及びR2-1がいずれも水素原子である場合を除く。R1-1及びR2-1は結合して隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。R1-1及び／又はR2-1はAr2と結合して隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。］
で表される縮環チオフェン化合物は文献未記載の新規化合物である。
【００３９】
一般式（1）及び（1-1）において、Ar1及びAr2で示される（複素）芳香環としては、芳香環及び複素芳香環のいずれも採用できる。
【００４０】
Ar1及びAr2で示される芳香環としては、例えば、単環芳香族炭化水素環としてベンゼン環が挙げられ、多環芳香族炭化水素環としてナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環、フルオレン環、ピレン環、トリフェニレン環等が挙げられる。
【００４１】
Ar1及びAr2で示される芳香環は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、ハロゲン原子、後述のアルキル基、後述のシクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、1〜6個が好ましく、1〜3個がより好ましい。
【００４２】
Ar1及びAr2で示される複素芳香環としては、例えば、単環複素芳香環としてピロリジン環、ピロール環、テトラヒドロチオフェン環、チオフェン環、オキソラン環、フラン環、イミダゾール環、ピラゾール環、チアゾール環、オキサゾール環、ピペリジン環、ピリジン環、ピラジン環等が挙げられ、多環複素芳香環としてインドール環、イソインドール環、ベンゾイミダゾール環、キノリン環、イソキノリン環、キノキサリン環等が挙げられる。
【００４３】
Ar1及びAr2で示される複素芳香環は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、ハロゲン原子、後述のアルキル基、後述のシクロアルキル基、ハロゲン化アルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、1〜6個が好ましく、1〜3個がより好ましい。
【００４４】
なかでも、Ar1及びAr2としては、吸収極大波長及び蛍光極大波長をより大きくし、耐光性をより向上させ、細胞毒性がより低くし、油滴（脂肪滴等）をより明確に染色できる観点から、置換若しくは非置換芳香環が好ましく、置換若しくは非置換単環芳香族炭化水素環がより好ましい。一方、Ar1を置換若しくは非置換多環芳香族炭化水素環とした場合、Ar1に脂溶性官能基を導入した場合には、特に油滴（脂肪滴等）への局在能を高めることが可能である。
【００４５】
一般式（1）において、R1及びR2で示されるアルキル基としては、直鎖アルキル基及び分岐鎖アルキル基のいずれも採用でき、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基等のC1-10アルキル基（特にC1-6アルキル基）が挙げられる。一般式（1-1）におけるR1-1及びR2-1で示されるアルキル基も同様とすることができる。
【００４６】
R1及びR2で示されるアルキル基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、ハロゲン原子、後述のシクロアルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、1〜6個が好ましく、1〜3個がより好ましい。一般式（1-1）におけるR1-1及びR2-1で示されるアルキル基が有し得る置換基も同様とすることができる。
【００４７】
一般式（1）において、R1及びR2で示されるシクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等のC3-10シクロアルキル基（特にC4-8シクロアルキル基）が挙げられる。一般式（1-1）におけるR1-1及びR2-1で示されるシクロアルキル基も同様とすることができる。
【００４８】
R1及びR2で示されるシクロアルキル基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、ハロゲン原子、上記アルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、1〜6個が好ましく、1〜3個がより好ましい。一般式（1-1）におけるR1-1及びR2-1で示されるシクロアルキル基が有し得る置換基も同様とすることができる。
【００４９】
一般式（1）において、R1及びR2で示されるアリール基としては、例えば、単環アリール基、縮環アリール基及び多環アリール基のいずれも採用でき、例えば、単環アリール基としてフェニル基が挙げられ、縮環アリール基としてナフチル基、アントラセニル基、フェナントレニル基、フルオレニル基、ピレニル基、トリフェニレニル基等が挙げられ、多環アリール基としてビフェニル基、ターフェニル基等のC6-18アリール基（特にC6-14アリール基）が挙げられる。一般式（1-1）におけるR1-1及びR2-1で示されるアリール基も同様とすることができる。
【００５０】
R1及びR2で示されるアリール基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、ハロゲン原子、上記アルキル基、上記アリール基、後述のヘテロアリール基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、1〜6個が好ましく、1〜3個がより好ましい。一般式（1-1）におけるR1-1及びR2-1で示されるアリール基が有し得る置換基も同様とすることができる。
【００５１】
一般式（1）において、R1及びR2で示されるヘテロアリール基としては、単環ヘテロアリール基及び縮環ヘテロアリール基のいずれも採用でき、例えば、単環ヘテロアリール基としてピロリジル基、ピロリル基、テトラヒドロチエニル基、チエニル基、オキソラニル基、フラニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、ピペリジル基、ピリジル基、ピラジル基等が挙げられ、縮環ヘテロアリール基としてインドリル基、イソインドリル基、ベンゾイミダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、キノキサリル基等が挙げられる。一般式（1-1）におけるR1-1及びR2-1で示されるヘテロアリール基も同様とすることができる。
【００５２】
R1及びR2で示されるヘテロアリール基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、上記ハロゲン原子、上記アルキル基、上記アリール基、上記ヘテロアリール基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、1〜6個が好ましく、1〜3個がより好ましい。一般式（1-1）におけるR1-1及びR2-1で示されるヘテロアリール基が有し得る置換基も同様とすることができる。
【００５３】
なかでも、R1及びR2としては、置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基が好ましく、置換若しくは非置換アリール基がより好ましく、非置換アリール基がさらに好ましい。一般式（1-1）におけるR1-1及びR2-1で示されるヘテロアリール基も同様とすることができる。なお、一般式（1-1）におけるR1-1及びR2-1はいずれも水素原子となることはない。
【００５４】
なお、R1及びR2は結合して隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。つまり、−NR1R2で表される基が、
【００５５】
【化７】
2018145422.tif 000008
【００５６】
等で表される基であってもよい。一般式（1-1）におけるR1-1及びR2-1も同様に、窒素原子とともに上記したような環を形成してもよい。
【００５７】
また、R1及び／又はR2はAr2と結合して隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。つまり、Ar2−NR1R2で表される構造が、
【００５８】
【化８】
2018145422.tif 000009
【００５９】
等であってもよい。一般式（1-1）におけるR1-1及び／又はR2-1も同様に、Ar2と結合して窒素原子とともに上記したような環を形成してもよい。
【００６０】
なお、上記一般式（1）で表される化合物において、Ar2において、−NR1R2で表される基が結合する置換位置は特に制限されない。上記一般式（1-1）で表される化合物において、Ar2において、−NR1-1R2-1で表される基が結合する置換位置も特に制限されない。例えば、Ar2がベンゼン環である場合には、一般式（1’）：
【００６１】
【化９】
2018145422.tif 000010
【００６２】
［式中、Ar1、Y1及びY2は前記に同じである。R1及びR2は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。R1及びR2は結合して隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。R1及び／又はR2は近接するベンゼン環と結合して隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。］
で表される化合物や、一般式（1-1’）：
【００６３】
【化１０】
2018145422.tif 000011
【００６４】
［式中、Ar1、Y1及びY2は前記に同じである。R1-1及びR2-1は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。ただし、R1-1及びR2-1がいずれも水素原子である場合を除く。R1-1及びR2-1は結合して隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。R1-1及び／又はR2-1は近接するベンゼン環と結合して隣接する窒素原子とともに環を形成してもよい。］
で表される化合物が形成されやすい。
【００６５】
一般式（1）及び（1-1）において、Y1及びY2は片方が−SO2−で表される基であり、他方が硫黄原子、−SO2−で表される基又は−CR32−で表される基である。Y1及びY2の双方が−SO2−で表される基である場合は、脂溶性を向上させるため、Ar1を置換若しくは非置換多環芳香族炭化水素環とするか、Ar1に脂溶性官能基を導入することが好ましい。
【００６６】
−CR32−で表される基において、R3で示されるアルキル基、シクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基としては、上記したものを採用できる。置換基の種類及び数も同様である。
【００６７】
なかでも、Y1及びY2としては、結晶性を上げ過ぎずに脂肪滴を染色しやすい観点から、片方が−SO2−で表される基であり、他方が硫黄原子であることが好ましい。なお、Y1及びY2として、片方が−SO2−で表される基であり、他方が−CR32−で表される基である場合は、R3を調整して結晶性を極力低く抑えることが好ましい。
【００６８】
上記のような条件を満たす本発明の縮環チオフェン化合物としては、耐光性をより向上させつつ、可視光レーザー光源でより染色しやすく、小さいサイズでも油滴（特に細胞内脂肪滴）をより高感度に検出でき、他の組織の蛍光染色をより抑制できる観点から、一般式（1A）又は（1B）：
【００６９】
【化１１】
2018145422.tif 000012
【００７０】
［式中、Y1a及びY2aは硫黄原子又は−CR32−で表される基を示す。Ar1、Ar2、R1、R2及びR3は前記に同じである。］
で表される化合物や、一般式（1A-1）又は（1B-1）：
【００７１】
【化１２】
2018145422.tif 000013
【００７２】
［式中、Y1a、Y2a、Ar1、Ar2、R1、R2及びR3は前記に同じである。］
が好ましく、一般式（1A1）又は（1B1）：
【００７３】
【化１３】
2018145422.tif 000014
【００７４】
［式中、Ar1、Ar2、R1及びR2は前記に同じである。］
で表される化合物や、一般式（1A1-1）又は（1B1-1）：
【００７５】
【化１４】
2018145422.tif 000015
【００７６】
［式中、Ar1、Ar2、R1及びR2は前記に同じである。］
で表される化合物がより好ましく、一般式（1A1A）又は（1B1A）：
【００７７】
【化１５】
2018145422.tif 000016
【００７８】
［式中、Ar1及びAr2は前記に同じである。R1a及びR2aは同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。］
で表される化合物や、一般式（1A1A-1）又は（1B1A-1）：
【００７９】
【化１６】
2018145422.tif 000017
【００８０】
［式中、Ar1及びAr2は前記に同じである。R1a-1及びR2a-1は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換シクロアルキル基、置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。ただし、R1a-1及びR2a-1がいずれも水素原子である場合を除く。］
がさらに好ましく、
【００８１】
【化１７】
2018145422.tif 000018
【００８２】
等が特に好ましい。
【００８３】
また、本発明の縮環チオフェン化合物は、上記一般式（1）又は（1-1）で表される縮環チオフェン化合物が溶媒和物として存在する場合もあり、いずれも本発明の範囲に包含される。なお、当該溶媒和物としては、上記一般式（1）又は（1-1）で表される縮環チオフェン化合物と溶媒との溶媒和物である限り特に限定されない。溶媒和物を形成する場合の溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、ジエチルエーテル、酢酸エチル、メタノール、エタノール、シクロヘキサン、トルエン、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン等が挙げられる。
【００８４】
２．縮環チオフェン化合物の製造方法
本発明の一般式（1）で表される縮環チオフェン化合物の製造方法は特に制限されない。例えば、Y1及びY2は片方が−SO2−で表される基であり、他方が硫黄原子である場合、以下の反応式1：
【００８５】
【化１８】
2018145422.tif 000019
【００８６】
［式中、Ar1、Ar2、R1及びR2は前記に同じである。Xはハロゲン原子を示す。］
にしたがって合成することができる。なお、一般式（1-1）で表される化合物を合成する場合は、R1をR1-1とし、R2をR2-1とすること以外は同様に合成することができる。
【００８７】
概略としては、化合物（2）に酸化反応を施して化合物（3A）及び（3B）を得た後に単離してバックワルド・ハートウィグカップリング反応を施すか、化合物（2）にバックワルド・ハートウィグカップリング反応を施して化合物（4）を得た後に酸化反応を施すことができる。
【００８８】
なお、上記の合成は、Y1及びY2は片方が−SO2−で表される基であり、他方が硫黄原子である場合についてのみ示しているが、Y1及びY2は片方が−SO2−で表される基であり、他方が−SO2−で表される基又は−CR32−で表される基である場合も同様に、適切な基質に対して酸化反応とバックワルド・ハートウィグカップリング反応とを組合せることにより本発明の縮環チオフェン化合物を得ることができる。
【００８９】
（2-1）酸化反応（化合物（2）→化合物（3A）及び化合物（3B）；化合物（4）→化合物（1B1））
本工程では、例えば、有機溶媒中で、上記反応式1における化合物（2）又は化合物（4）に対して、酸化反応を引き起こすことができる。
【００９０】
酸化反応には酸化剤を使用することができ、例えば、塩化水素（塩酸）、硫酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸（TFA）、無水トリフルオロ酢酸、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体、トリフルオロメタンスルホン酸等の酸；塩素；過酸化水素；過酢酸、過安息香酸、メタクロロ過安息香酸（m-CPBA）等の過酸；tert-ブチルペルオキシド等のペルオキシド；メタ過ヨウ素酸ナトリウム等の過ハロゲン酸塩等が挙げられる。これらは単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。なかでも、本工程では、収率及び合成の容易さの観点から、過酸が好ましく、メタクロロ過安息香酸（m-CPBA）がより好ましい。酸化剤の使用量は、収率及び合成の容易さの観点から、通常、化合物（2）又は化合物（4）1モルに対して、1〜5モルが好ましく、1.5〜3モルがより好ましい。
【００９１】
本工程において使用され得る有機溶媒としては、公知のものを採用することができ、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素；テトラヒドロフラン、ジオキサン等の環状エーテル化合物；ジメチルスルホキシド（DMSO）等が挙げられる。これらの有機溶媒は、単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。本工程では、収率及び合成の容易さの観点から、ハロゲン化炭化水素が好ましく、1,2-ジクロロエタンがより好ましい。
【００９２】
また、反応条件は、反応が十分に進行する程度が好ましく、例えば、反応雰囲気は不活性ガス雰囲気（窒素ガス雰囲気、アルゴンガス雰囲気等）、空気雰囲気等が好ましく、反応温度は-50〜100℃、特に0〜50℃が好ましく、反応時間は5分〜24時間、特に10分〜12時間が好ましい。
【００９３】
この反応により化合物（3A）及び化合物（3B）を得た場合は、必要に応じて常法にしたがって精製処理を施し、さらに、常法にしたがって単離して次の工程に使用することが好ましい。また、化合物（1B1）を得た場合は、必要に応じて常法にしたがって精製処理を施し、本発明の縮環チオフェン化合物として使用することができる。
【００９４】
（2-2）バックワルド・ハートウィグカップリング反応（化合物（2）→化合物（4）；化合物（3A）→化合物（1A1）；化合物（3B）→化合物（1B1））
本工程では、例えば、有機溶媒中で、上記反応式1における化合物（2）、化合物（3A）又は化合物（3B）に対して、バックワルド・ハートウィグカップリング反応を引き起こすことができる。具体的には、例えば有機溶媒中で、パラジウム触媒の存在下、化合物（2）、化合物（3A）又は化合物（3B）と、R1R2NH（R1及びR2は前記に同じである）で表される化合物とを反応させることができる。なお、一般式（1-1）で表される化合物を合成しようとする場合は、R1R2NHで表される化合物の代わりにR1-1R2-1NHで表される化合物を使用する。
【００９５】
R1R2NHで表される化合物の使用量は、収率及び合成の容易さの観点から、通常、化合物（2）、化合物（3A）又は化合物（3B）1モルに対して、1〜10モルが好ましく、2〜5モルがより好ましい。
【００９６】
パラジウム触媒としては、有機化合物等の合成用触媒として公知のパラジウム触媒が挙げられる。本発明においては、バックワルド・ハートウィグカップリング反応に使用されるパラジウム触媒を用いることができる。具体的には、酢酸パラジウム（Pd(OAc)2）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（Pd(PPh3)4）、トリフルオロ酢酸パラジウム、塩化パラジウム、臭化パラジウム、ヨウ化パラジウム、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（0）（Pd2(dba)3）、ビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（0）、ジクロロ（１，５−シクロオクタジエン）パラジウム（II）、2,5-ノルボルナジエンパラジウムジクロリド等が挙げられる。これらのパラジウム触媒は、溶媒和物を使用することもできる。また、これらのパラジウム触媒は、単独で使用することもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。本工程では、合成の容易さ、収率等の観点から、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（0）（Pd2(dba)3）（又はその溶媒和物）が好ましい。パラジウム触媒の使用量は、合成の容易さ、収率等の観点から、通常、化合物（2）、化合物（3A）又は化合物（3B）1モルに対して、0.001〜0.1モルが好ましく、0.005〜0.05モルがより好ましい。
【００９７】
本工程では、必要に応じて配位子化合物を使用することもできる。使用できる配位子化合物としては、特に制限されず、例えば、トリフェニルホスフィン、トリメトキシホスフィン、トリエチルホスフィン、トリイソプロピルホスフィン、トリ(t-ブチル)ホスフィン、トリ(n-ブチル)ホスフィン、トリイソプロポキシホスフィン、トリシクロペンチルホスフィン、トリシクロヘキシルホスフィン、トリメシチルホスフィン、トリフェノキシホスフィン、ジ(t-ブチル)メチルホスフィン、メチルジフェニルホスフィン、ジメチルフェニルホスフィン、トリエチルアミン、ピリジン、2,2’-ビピリジル、4,4’-(t-ブチル)ビピリジル、1,1’-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン、1,1’-ビス(t-ブチル)フェロセン、ジフェニルホスフィノメタン、1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)エタン、1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン、1,5-ビス(ジフェニルホスフィノ)ペンタン、1,2-ビス(ジペンタフルオロフェニルホスフィノ)エタン、1,2-ビス(ジシクロヘキシルホスフィノ)エタン、1,3-(ジシクロヘキシルホスフィノ)プロパン、1,2-ビス(ジ-t-ブチルホスフィノ)エタン、1,3-ビス(ジ-t-ブチルホスフィノ)プロパン、1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)ベンゼン、1,5-シクロオクタジエン、2-(ジシクロヘキシルホスフィノ-2’,6’-ジメトキシ-1,1’-ビフェニル（S-Phos）、2-(ジシクロヘキシルホスフィノ-2’,4’,6’-トリ-イソプロピル-1,1’-ビフェニル（X-Phos）、ビス(2-ジフェニルホスフィノフェニル)エーテル（DPEPhos）、テトラメチルホスホニウムクロリド、テトラエチルホスホニウムブロミド、テトラフェニルホスホニウムブロミド、トリ-tert-ブチルホスホニウムテトラフルオロボレート（tert-Bu3PHBF4）等が挙げられる。これらの配位子化合物は、溶媒和物を使用することもできる。これらは単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。なかでも、本工程では、収率及び合成の容易さの観点から、トリ-tert-ブチルホスホニウムテトラフルオロボレート（tert-Bu3PHBF4）が好ましい。配位子化合物の使用量は、合成の容易さ、収率等の観点から、パラジウム触媒1モルに対して、1.5〜10モルが好ましく、2〜5モルがより好ましい。
【００９８】
本工程では、必要に応じて、塩基を使用することもできる。塩基としては、塩化アンモニウム、フッ化カリウム、フッ化セシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムtert-ブトキシド、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸カルシウム等が挙げられ、本工程では、収率及び合成の容易さの観点から、ナトリウムメトキシド、ナトリウムtert-ブトキシド等が好ましく、ナトリウムtert-ブトキシドがより好ましい。塩基を使用する場合の使用量は、合成の容易さ、収率等の観点から、化合物（2）、化合物（3A）又は化合物（3B）1モルに対して、1.5〜10モルが好ましく、2〜5モルがより好ましい。  本工程において使用され得る有機溶媒としては、公知のものを採用することができ、例えば、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン（THF）、1,4-ジオキサン、ジメトキシエタン（DME）、ジグライム、シクロペンチルメチルエーテル（CPME）、tert-ブチルメチルエーテル（TBME）等のエーテル；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素；ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素等の脂肪族ハロゲン化炭化水素；N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、N-メチルピロリドン等のアミド等が挙げられる。これらの有機溶媒は、単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。本工程では、収率及び合成の容易さの観点から、芳香族炭化水素が好ましく、キシレン（特にo-キシレン）がより好ましい。
【００９９】
また、反応条件は、反応が十分に進行する程度が好ましく、例えば、反応雰囲気は不活性ガス雰囲気（窒素ガス雰囲気、アルゴンガス雰囲気等）等が好ましく、反応温度は50〜250℃、特に100〜200℃が好ましく、反応時間は5分〜48時間、特に10分〜36時間が好ましい。
【０１００】
この反応により化合物（4）を得た場合は、必要に応じて常法にしたがって精製処理を施して次の工程に使用することが好ましい。また、化合物（1A1）又は化合物（1B1）を得た場合は、必要に応じて常法にしたがって精製処理を施し、本発明の縮環チオフェン化合物として使用することができる。
【０１０１】
３．油滴染色剤
本発明の縮環チオフェン化合物は、上記説明した特定の構造を有しているため、吸収極大波長が可視光領域（例えば380〜500nm程度）であり、蛍光極大波長も可視光領域（例えば420〜650nm程度）である。特に、本発明の縮環チオフェン化合物は、吸収極大波長が小さいため、生細胞内で使用した際のダメージを極端に小さくすることができる。また、本発明の縮環チオフェン化合物は、蛍光極大波長がレーザー顕微鏡が通常備わっているHeNeレーザーの励起波長633nmと近いことから、蛍光色素としての励起効率が極めて高い。このため、本発明の縮環チオフェン化合物は、生細胞内で蛍光色素として使用するのに非常に適している。
【０１０２】
しかも、本発明の縮環チオフェン化合物は、細胞内の脂肪球（脂肪滴）を強く蛍光させ、脂肪球（脂肪滴）以外の組織の蛍光を抑制することができる。本発明の縮環チオフェン化合物は、脂肪球（脂肪滴）以外の組織の蛍光を抑制することにより、脂肪球（脂肪滴）の蛍光強度を他の組織の蛍光強度よりも著しく大きく（S/N比でBTOの2倍以上）することができる。このため、本発明の縮環チオフェン化合物は、小さいサイズでも油滴（特に細胞内脂肪滴）を高感度に検出でき、さらに、他の組織の蛍光染色を抑制できる。
【０１０３】
しかも、従来の油滴染色剤に使用される蛍光色素は、光照射時間の経過とともに蛍光強度が著しく低下していたが、本発明の縮環チオフェン化合物は、光照射時間が経過しても蛍光強度がほとんど低下しない。このため、脂肪の生成過程及び分解過程の脂肪球（脂肪滴）であっても高感度に検出することができ、強力なレーザー光を用いる高分解能顕微鏡を使用した場合にも蛍光強度は低下しないと考えられ、脂肪の生成過程及び分解過程をリアルタイムで可視化することができるため、脂肪細胞の生成及び分解の挙動を明らかにするうえで有用である。
【０１０４】
以上から、本発明の縮環チオフェン化合物又はその溶媒和物は、油滴染色剤（特に脂肪染色剤、さらに細胞内脂肪球染色剤（細胞内脂肪滴染色剤））として非常に有用である。この本発明の油滴染色剤を使用することで、脂肪（特に細胞内脂肪球）のみをより高感度にバイオイメージングしつつ、上記のように光照射時間が経過しても蛍光強度がほとんど低下しないため長時間のバイオイメージングや強力なレーザー光を用いる超解像顕微鏡を用いたバイオイメージングにも耐え得る。
【０１０５】
また、本発明の縮環チオフェン化合物は、上記製造方法において示されているように、わずか2工程のみで合成することが可能である。このため、より簡便に油滴染色剤を得ることができる。
【０１０６】
このような本発明の油滴染色剤（特に細胞内脂肪球染色剤）は、本発明の縮環チオフェン化合物又はその溶媒和物を含有している。その使用形態は特に制限はなく、例えば、有機溶媒中に溶解させて溶液とすることが好ましい。この際、小さいサイズの脂肪球でもより高感度に検出（染色）し、脂肪球以外の組織の蛍光をより抑制する観点から、本発明の縮環チオフェン化合物の含有量は、1×10-10〜1×10-4mol/Lが好ましく、1×10-8〜1×10-5mol/Lがより好ましい。特に、含有量を1×10-10〜5×10-5mol/L等のように小さくしても高感度に油滴（特に細胞内脂肪球）を検出することが可能である。このように、本発明では、縮環チオフェン化合物の含有量を低く抑えることもできることから、生細胞へのダメージをより抑制することができる。
【０１０７】
本発明の油滴染色剤を、本発明の縮環チオフェン化合物を含有する溶液とする場合、使用し得る有機溶媒としては、油滴（特に脂肪球）をより高感度に蛍光しやすい観点から、非極性溶媒が好ましい。なお、本発明の油滴染色剤は、極性溶媒（ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、酢酸エチル、N-メチルピロリドン、水等）中では蛍光量子収率が著しく低い。このことが、周囲の環境に応答し、細胞内脂肪球のみを高選択的に蛍光させることができることの一因である。
【０１０８】
非極性溶媒としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン等の脂肪族有機溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等の芳香族溶媒；ジクロロメタン、ジクロロエタン等の脂肪族ハロゲン化炭化水素等が挙げられる。
【０１０９】
本発明の油滴染色剤を溶液の形態とする場合、生細胞内で使用しやすく、小さいサイズでも油滴（特に細胞内の脂肪球）をより高感度に検出でき、他の組織の蛍光染色をより抑制できる観点から、pHは5〜11程度が好ましく、6.5〜7.5程度がより好ましい。本発明の油滴染色剤のpHを調整するために、緩衝剤（ヘペス緩衝剤、トリス緩衝剤、トリシン−水酸化ナトリウム緩衝剤、リン酸系緩衝剤、リン酸緩衝生理食塩水等）等を使用することもできる。
【実施例】
【０１１０】
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらのみに限定されるものではない。
【０１１１】
1H NMRスペクトル及び13C NMRスペクトルは、極低温プローブであるSuperCOOLプローブを装備した核磁気共鳴装置ECZ400（JEOL）を用いて測定した。一部の13C NMRスペクトルは極低温プローブであるUltraCOOLプローブを装備した核磁気共鳴装置ECA600II（JEOL）を用いて測定した。化学シフト値はppmで表記し、溶媒には重クロロホルムを用いた。1H NMRスペクトルにおいては、溶媒の残存プロトン由来のシグナルを用い、内部標準としてクロロホルム をδ7.26ppm、又はアセトンをδ2.05ppmに設定した。13C NMRスペクトルにおいては、重溶媒を内部標準として用い、重クロロホルムをδ77.16ppmに設定した。ジフェニルアミンは東京化成工業（株）より購入したものを用いた。トリ-tert-ブチルホスホニウムテトラフルオロボレート（tert-Bu3PHBF4）及び1,2-ジクロロエタンは和光純薬工業（株）より購入したものを用いた。メタクロロ過安息香酸（m-CPBA）はSigma Aldrichより購入したものを用いた。薄層クロマトグラフィー（TLC）は、シリカゲル60F-254（Merck）を0.25mm塗布したガラスプレートを用いて行った。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、充填材としてシリカゲルPSQ-100B（富士シリシア化学（株））を用いて行った。リサイクル分取ゲルペーミエーションクロマトグラフィー（GPC）は、ポリスチレンゲルカラムのYMC-GPC T2000及びYMC-GPC T40000を備えたLC-Forte/R（YMC）を用いた。
【０１１２】
合成例1：N,N-ジフェニルベンゾ[b]ベンゾ[4,5]チエノ[2,3-d]チオフェン-2-アミン（化合物2）
【０１１３】
【化１９】
2018145422.tif 000020
【０１１４】
化合物1にバックワルド・ハートウィグカップリング反応を用いてジフェニルアミノ基を導入し、化合物2を収率66%で得た。具体的には以下のとおり合成を行った。
【０１１５】
N2 ガス雰囲気下で2-ブロモベンゾ[b]ベンゾ[4,5]チエノ[2,3-d]チオフェン（化合物1; 509mg, 1.59mmol）、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(0)クロロホルム錯体（Pd2(dba)3・CHCl3; 17.8mg, 0.0172mmol）、トリ-tert-ブチルホスホニウムテトラフルオロボレート（tert-Bu3PHBF4; 19.0mg, 0.0655mmol)、ジフェニルアミン（Ph2NH; 813mg, 4.80mmol）、ナトリウムtert-ブトキシド（t-BuONa; 509mg, 5.30mmol）を脱気したo-キシレン（5mL）に溶解させた。これを160℃にまで昇温し、9時間撹拌した。冷水を加えた後、酢酸エチルを用いて3回抽出した。ヘキサンを展開溶媒としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行った（Rf= 0.46）。得られた固体をCHCl3で溶解させ、リサイクル分取GPCを用いて精製し、化合物2を白色固体として収率66%（434mg, 1.06mmol）で得た。
1H NMR (400 MHz, acetone-d6) δ 8.07 (d, JHH = 7.6 Hz, 1H), 7.94 (d, JHH = 6.4 Hz, 1H), 7.89 (d, JHH = 8.8 Hz, 1H), 7.65 (d, JHH = 2.4 Hz, 1H), 7.52 (td, JHH = 7.6 Hz, 0.8 Hz, 1H), 7.46 (td, JHH = 7.6 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.31-7.38 (m, 4H), 7.23 (dd, JHH = 8.8 Hz, 2.4 Hz, 1H), 7.08-7.16 (m, 6H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 147.9, 145.8, 143.8, 142.1, 133.4, 131.5, 129.5, 125.0, 124.7, 124.5, 124.1, 123.3, 122.4, 122.1, 121.4, 118.8; HRMS (APCI): Obsd. 407.0782 ([M]+); Calcd. For C26H17NS2: 407.0797。
【０１１６】
合成例2：7-ブロモベンゾ[b]ベンゾ[2,3-d]チオフェン5,5-ジオキシド（化合物3）及び2-ブロモベンゾ[b]ベンゾ[4,5]チエノ[2,3-d]チオフェン5,5-ジオキシド（化合物4）
【０１１７】
【化２０】
2018145422.tif 000021
【０１１８】
化合物1を、mCPBAを用いて酸化したところ、化合物3及び4を、それぞれ収率17%、12%で得られた。具体的には、以下の通り合成を行った。
【０１１９】
2-ブロモ[b]ベンゾ[4,5]チエノ[2,3-d]チオフェン（化合物1; 509 mg, 1.59 mmol）を1,2-ジクロロエタン（150mL）に溶解させた。 そこへ、メタクロロ過安息香酸（m-CPBA; 849 mg, 3.44 mmol）を0℃でゆっくり加えた。室温に戻し、66時間撹拌した。Na2SO3水溶液を加え、CH2Cl2で3回抽出し、無水MgSO4を加えて脱水し、固体を吸引ろ過で取り除いてから、減圧下で溶媒留去した。得られた粗生成物に対して、CH2Cl2/ヘキサン= 3/1の混合溶媒を展開溶媒としてPTLCで分離した（Rf(3)= 0.53, Rf(4)= 0.64）。その結果、化合物3を白色の固体として収率17%（98.1mg, 0.280mmol）、化合物4を白色の固体として収率12%で得た。
化合物3: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.05 (d, JHH = 1.2 Hz, 1H), 7.90 (d, JHH = 6.8 Hz, 1H), 7.79 (d, JHH = 6.0 Hz, 1H), 7.65 (dd, JHH = 7.2 Hz, 1.6 Hz, 1H), 7.60-7.63 (m, 1H), 7.56 (dd, JHH = 5.6 Hz, 0.8 Hz, 1H), 7.51-7.54 (m, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 155.7, 144.1, 142.6, 133.9, 133.7,130.7, 130.5, 129.3, 128.1, 126.5, 123.4, 122.5, 122.2, 120.6; HRMS (APCI): Obsd. 349.9057 ([M]+); Calcd. For C14H7BrO2S2: 349.9065; 
化合物4: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.04 (d, JHH = 6.4 Hz, 1H), 7.89-7.91 (m, 2H), 7.73 (dd, JHH = 1.2 Hz, 6.4 Hz, 1H), 7.55 (td, JHH = 0.8 Hz, 6.4 Hz, 1H), 7.48 (td, JHH = 0.8 Hz, 6.4 Hz, 1H), 7.39 (d, JHH = 6.4 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 144.0, 143.1, 136.7, 130.4, 127.8, 127.4, 127.1, 126.9, 125.9, 125.6, 124.4, 124.0, 123.5, 122.6; HRMS (APCI): Obsd. 350.9127 ([M+H]+); Calcd. For C14H8BrO2S2: 350.9144。
【０１２０】
実施例1：DEBSO1
【０１２１】
【化２１】
2018145422.tif 000022
【０１２２】
合成例1で得られた化合物2を、mCPBAを用いて酸化することでDEBSO1を収率36%で合成した。なお、この反応では、後述の実施例2で得たDEBSO2は得られず、DEBSO1のみが選択的に得られた。
【０１２３】
合成例1で得たN,N-ジフェニルベンゾ[b]ベンゾ[4,5]チエノ[2,3-d]チオフェン-2-アミン（化合物2; 80.6mg, 0.198mmol）を1,2-ジクロロエタン（2mL）に溶解させた。そこへメタクロロ過安息香酸（m-CPBA; 108mg, 0.437mmol）を0℃でゆっくり加えた。室温に戻し、5時間撹拌した。Na2SO3水溶液を加え、CH2Cl2で3回抽出し、無水MgSO4を加えて脱水し、固体を吸引ろ過で取り除いてから、減圧下で溶媒留去した。得られた粗生成物に対して、CH2Cl2/ヘキサン= 1/1の混合溶媒を展開溶媒としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した（Rf= 0.25）。その結果、DEBSO1を黄色固体として収率36%（31.9mg, 0.0726mmol）で得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.98 (d, JHH = 8.4 Hz, 1H), 7.85 (d, JHH = 8.4 Hz, 1H), 7.47-7.52 (m, 1H), 7.41 (d, JHH = 7.2 Hz, 1H), 7.33-7.38 (m, 6H), 7.15-7.20 (m, 6H), 7.11 (dd, JHH = 8.4 Hz, 2.0 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 151.5, 150.6, 146.2, 144.3, 142.2, 132.1, 130.9, 130.1, 126.8, 126.0, 125.9, 125.3, 124.0, 123.8, 123.0, 122.0, 119.9,114.0; HRMS (APCI): Obsd. 440.0768 ([M+H]+); Calcd. For C26H18NO2S2: 440.0773。
【０１２４】
実施例2：DEBSO2
【０１２５】
【化２２】
2018145422.tif 000023
【０１２６】
合成例2で得られた化合物4に対してバックワルド・ハートウィグカップリング反応でジフェニルアミノ基を導入することでDEBSO2を収率16%で得た。具体的には、以下の通り合成を行った。
【０１２７】
N2 ガス雰囲気下で、合成例2で得た2-ブロモベンゾ[b]ベンゾ[4,5]チエノ[2,3-d]チオフェン5,5-ジオキシド（化合物4; 100mg, 0.285mmol）、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(0)クロロホルム錯体（Pd2(dba)3・CHCl3; 3.2mg, 0.00309mmol）、トリ-tert-ブチルホスホニウムテトラフルオロボレート（tert-Bu3PHBF4; 3.4mg, 0.0117mmol)、ジフェニルアミン（Ph2NH; 142.7mg, 0.843mmol）、ナトリウムtert-ブトキシド（t-BuONa; 89.4mg, 0.930mmol）を脱気したo-キシレン（1mL）に溶解させた。これを160℃にまで昇温し、21時間撹拌した。冷水を加えた後、酢酸エチルを用いて3回抽出し、無水MgSO4を加えて脱水し、固体を吸引ろ過で取り除いてから、減圧下で溶媒留去した。得られた粗生成物に対して、CH2Cl2/ヘキサン= 5/1の混合溶媒を展開溶媒としてPTLCで分離した（Rf= 0.64）。得られた固体をCHCl3で溶解し、リサイクル分取GPCを用いて精製した結果、DEBSO2を黄色固体として収率16%（20.0mg, 0.0455mmol）で得た。
1H NMR (400 MHz, acetone-d6) δ 7.84-7.87 (m, 2H), 7.74-7.75 (m, 2H), 7.64-7.67 (m, 2H), 7.35-7.39 (m, 4H), 7.29 (dd, JHH = 8.8 Hz, 2.0 Hz, 1H), 7.12-7.19 (m, 6H) ; 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 147.3, 144.7, 142.3, 141.2, 133.8, 129.8, 129.7, 128.9, 125.2, 125.1, 124.1, 123.3, 122.7, 122.1, 121.9, 116.7; HRMS (APCI): Obsd. 440.0792 ([M+H]+); Calcd. For C26H18NO2S2: 440.0773。
【０１２８】
比較例1：2-[4-(N,N-ジフェニルアミノ)フェニル]ベンゾ[b]チオフェン-S,S-ジオキシド（BTO）
【０１２９】
【化２３】
2018145422.tif 000024
【０１３０】
既報（Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 4539-4543）にしたがい、2-[4-(N,N-ジフェニルアミノ)フェニル]ベンゾ[b]チオフェン-S,S-ジオキシド（BTO）を得た。得られたBTOを比較例1の油滴染色剤とした。
【０１３１】
比較例2
市販のBODIPY493/503：
【０１３２】
【化２４】
2018145422.tif 000025
【０１３３】
を比較例2の油滴染色剤とした。
【０１３４】
試験例1：光物理特性
実施例1〜2で得られたDEBSO1及びDEBSO2について、シクロヘキサン、ジクロロメタン、DMSO、トルエン、アセトニトリル中での紫外可視吸収スペクトル及び蛍光スペクトルの測定を行った。結果を表１及び図１に示す。表１には、比較のため比較例１のBTOのデータも載せた。
【０１３５】
【表１】
2018145422.tif 000026
【０１３６】
以上の結果、紫外可視吸収スペクトルにおいては実施例1の DEBSO1及び実施例2のDEBSO2ともにどの溶媒においても415nm付近に吸収極大波長を有し、溶媒の極性にはほぼ依存しないことがわかった。この結果は、DEBSO1及びDEBSO2は細胞内のように異なる環境が存在する場合においても、同じ可視光レーザー光を用いて励起できることを示唆している。一方、蛍光スペクトルにおいてはDEBSO1及びDEBSO2ともに溶媒の極性が増すにしたがって、蛍光極大が大きく長波長シフトすることがわかった。また、絶対蛍光量子収率ΦFは、DEBSO1及びDEBSO2それぞれについて、極性が低いシクロヘキサン中ではそれぞれ0.85及び0.82と高い値を示したのに対し、極性が高いDMSO中ではそれぞれ0.18及び0.21と低い値を示し、非極性溶媒中でのみ強い蛍光を発することがわかった。上記のようなDEBSO1及びDEBSO2の光物性は、BTOの光物性を保持していることがわかった。したがって、DEBSO1及びDEBSO2を細胞内に導入した場合、BTOと同様に、極性の低い脂肪滴に取り込まれたものだけが強い蛍光を発することで、高いS/N比が得られることが示唆される。
【０１３７】
実施例1のDEBSO1、実施例2のDEBSO2、比較例1のBTO、比較例2のBODIPY 493/503について、脂肪滴内の環境と極性が近いトルエン中の光安定性を評価した。DEBSO1、DEBSO2、BTO及びBODIPY 493/503の同じ濃度のトルエン溶液に対して、同じ条件下でキセノンランプ（>325nm）を照射し続けた際の30分おきの吸光度の変化を追った。結果を図２に示す。この結果、DEBSO1及びDEBSO2 は、BODIPY 493/503のみならず、高耐光性であるBTOよりもはるかに耐光性に優れており、180分間レーザー光を照射し続けても2%程度しか吸光度が減衰しなかった。この結果から、DEBSO1及びDEBSO2はBTOに架橋構造を導入したことにより超耐光性を獲得したことがわかった。
【０１３８】
上述のDEBSO1及びDEBSO2の光物性及び光安定性の測定結果から、DEBSO1及びDEBSO2はBTOの特性を保持しつつより優れた耐光性をもった化合物といえる。したがって、DEBSO1及びDEBSO2はともに高感度と超耐光性を兼ね備えた超耐光性脂肪滴染色蛍光プローブになりうることが示唆された。
【０１３９】
［細胞実験］
細胞培養
3T3-L1前駆脂肪細胞（RIKEN Cell Bank）を10%FBS（ウシ胎児血清；Biosera社）、1%ペニシリン−ストレプトマイシン−アムホテリシンB懸濁液（和光純薬工業（株））を含むDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地；和光純薬工業（株））を培地として用い、インキュベーター内で37℃、5%CO2、95%空気の条件にして培養した。
【０１４０】
細胞染色（脂肪滴内での色素の感度及び光安定性測定の場合）
3T3-L1前駆脂肪細胞をガラスボトムディッシュにまき、100%コンフルエンスになった日（0日目と定義する）から2日後に、培地を分化培地に変更することで3T3-L1を脂肪細胞へと分化誘導した。分化培地には、通常の培養時の培地に、インスリンを最終濃度10μg/mL、デキサメタゾンを最終濃度2.5μM、3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）を最終濃度0.5mMになるように加えたものを使用した。インスリン、デキサメタゾン及びIBMXはタカラバイオ（株）のAdipoinducer Reagent (for animal cell)に含まれていたものを使用した。4日目に、維持培地へと培地を切り替えた。維持培地には、通常の培養時の培地に、インスリンを最終濃度10μg/mLになるように加えたものを使用した。9日目に維持培地を除去し、DMEMに1μM又は100nMのDEBSO1、DEBSO2又はBTOを混ぜたもの（0.1%DMSOを含む）を染色用の培地として切り替え、12時間37℃、5%CO2、95%空気の条件にして培養した。L-グルコースとフェノールレッドとを含まないDMEM（以下、「DMEM colorless」と表記することもある；gibco）で3回洗浄し、DMEM colorless 2mLで満たした。
【０１４１】
細胞染色（脂肪滴の収縮の様子の観察時）
洗浄前までは前述と同じ条件で行った。2%BSA（アルブミン、牛血清由来；脂肪酸、IgG及びプロテアーゼ不含；和光純薬工業（株））を含むHBSS (+)（フェノールレッド 不含；和光純薬工業（株））で3回洗浄した。10μM フォルスコリン（和光純薬工業（株））、0.1mM IBMX（和光純薬工業（株））、2% BSA、染色時と同じ濃度の色素を含むDMEM colorless（0.1% DMSO）にイメージング直前に切り替えた。
【０１４２】
蛍光イメージング
FV 10i共焦点レーザー走査型顕微鏡（オリンパス（株））を用い、405nmの波長で励起した場合には470〜570nmのスペクトル情報を得た。473nmの波長で励起した場合には490〜590nmのスペクトル情報を得た。
【０１４３】
試験例2：脂肪細胞染色試験
試験例1の結果より、実施例1のDEBSO1及び実施例2のDEBSO2がともに脂肪滴染色における有用性を示したため、実際に脂肪細胞の染色試験を行った。3T3-L1から分化誘導した脂肪細胞に対してそれぞれ1 μMのDEBSO1、DEBSO2及びBTOで12時間染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。結果を図３に示す。この結果、S/N比は、DEBSO1は13倍、DEBSO2は12倍、BTOは12倍であった。
【０１４４】
次に、DEBSO1、DEBSO2及びBTOの脂肪滴染色における感度を比較するため、濃度をそれぞれ100nMにした場合について、同様に脂肪細胞を12時間染色したところ、S/N比は、DEBSO1は12倍、DEBSO2は18倍、BTOは4倍であり、DEBSO1及びDEBSO2はBTOと比較して2倍以上のS/N比で染色することができた。結果を図４に示す。したがって、DEBSO1及びDEBSO2は低濃度で高感度の脂肪滴染色が可能といった点でBTOより優れている。
【０１４５】
図３及び４では励起波長405nmでイメージングを行ったが、励起波長の違いによって感度に差が出る可能性があるため、図３と励起波長以外は同じ条件にして、励起波長を 473nmに変えてイメージング画像を取得した。結果を図５に示す。S/N比は、DEBSO1は11倍、DEBSO2は14倍、BTOは11倍であり、励起波長の違いによるこれらの色素の感度への影響はほとんどないことがわかった。
【０１４６】
図３〜５の結果より、DEBSO1、DEBSO2及びBTOともに濃度が1μMの場合には励起可能な波長範囲であれば励起波長によらず、同程度の感度で脂肪滴を染色可能である一方、濃度が100nMの場合は、BTOは感度が下がってしまうのに対してDEBSO1及びDEBSO2は濃度低下の影響を受けずに染色可能であった。このため、脂肪滴染色の感度に関して、BTOよりもDEBSO1及びDEBSO2の方が優れているといえる。
【０１４７】
また、図２の結果から実施例1のDEBSO1及び実施例2のDEBSO2が脂肪滴内と類似の極性を示すトルエン中で比較例1のBTOと比べて高い光安定性を示したことから、脂肪滴内でも高い耐光性を示すことが期待される。そこで, それぞれの色素で脂肪細胞を染色した後に、共焦点レーザーを連続で照射し続けた場合の脂肪滴における蛍光強度の変化を追跡した。条件は、濃度1μM、λex= 473nmとして測定した。
【０１４８】
結果を図６〜７に示す。BTOで染色した場合には蛍光強度が減衰していったのに対し、DEBSO1及びDEBSO2で染色した場合には50分共焦点レーザーを照射し続けても蛍光強度が照射する前とほぼ変わらなかった。この結果は、DEBSO1及びDEBSO2で染色した脂肪細胞は、473nmの共焦点レーザーを用いてイメージングすることによって、長時間観察し続けることが可能であることが示された。
【０１４９】
最後に、実施例1のDEBSO1を用いてフォルスコリンによる脂肪滴分解過程を追跡する実験を行った。脂肪分解には図８のような多段階のプロセスが存在する。まず、ホルモンが脂肪細胞表面に存在するβアドレナリン作動性受容体に結合することで、アデニル酸シクラーゼが活性化され、細胞内の環状アデノシン一リン酸（cAMP）の濃度が上昇する。プロテインキナーゼ（PKA）は活性状態においてタンパク質をリン酸化する作用を持つが、cAMPはPKAを活性化する作用をもつため、cAMP濃度の上昇とともに活性状態のPKAが増える。この活性状態のPKAにより、脂肪滴表面のペリリピンと細胞質内に存在するホルモン感受性リパーゼ（HSL）がリン酸化される。リン酸化されたペリリピンはHSLが脂肪滴表面に移動するのを促進し、脂肪滴にHSLが結合することで、脂肪滴内のトリアシルグリセロールの脂肪酸とジアシルグリセロールへの分解が開始される。フォルスコリンにはアデニル酸シクラーゼの活性を高めてcAMP濃度を上昇させる作用があるため、脂肪細胞にフォルスコリンを投与することで、脂肪分解が促進されて、脂肪滴が収縮していく。ただし、フォルスコリンの働きはインスリンによって阻害されるという報告もある。上記の細胞染色では、3T3-L1を分化誘導する培地及び分化後の脂肪細胞の維持培地にインスリンを加えていたため、染色及びフォルスコリン投与の前に洗浄を行っても、わずかに残ったインスリンによりフォルスコリンの働きが阻害される恐れがあった。そこで、脂肪滴収縮の様子を追うために、フォルスコリンだけでなくIBMXも加えることにした。IBMXはcAMPを開環させる酵素であるホスホジエステラーゼ（PDE）の阻害剤であるため、IBMXを加えることがcAMP濃度の上昇につながる。また、トリアシルグリセロールの分解によって生じた脂肪酸がトリアシルグリセリドの生成に再利用され、結果的に脂肪滴が収縮しない可能性もある。そこで、疎水性相互作用により脂質をトラップすることができるBSAを細胞培地に加えることで、生じた脂肪酸が細胞外へ吸収され、脂肪滴合成経路に再利用されないようにした。このような考えから、12時間1μM DEBSO1で染色した脂肪細胞を、10μMフォルスコリン、0.1mM IBMX、2%BSA、及び1μM DEBSO1の培地で刺激し、脂肪滴の様子を観察した。結果を図９〜１０に示す。
【０１５０】
図９の青丸で囲った領域（上側の丸で囲った領域）に関しては、図１０で面積あたりの輝度の変化を追うことでも確認したが、時間の経過とともに脂肪滴が収縮していく様子を捉えることができた。一方、図９の赤丸で囲った領域（下側の丸で囲った領域）に関しては、フォルスコリン及びIBMXを加えてから1.5時間後までは青丸で囲った領域（上側の丸で囲った領域）と同じように面積あたりの輝度が減少していったが、その後に面積あたりの輝度が増加した。図９からは。もともと存在していた脂肪滴に関しては時間の経過とともに収縮していったが、4時間後の図を参酌すると観察開始時点では存在しなかった微小な輝点が増えたことがわかる。この輝点は微小な脂肪滴であると考えられる。本発明では脂肪分解で生じた脂肪酸をトラップするためにBSAを加えたが、一部の脂肪細胞においてはBSAが期待通りには機能せずに、脂肪酸が再利用されて新しい脂肪滴が生成したものと考えられる。この新たな脂肪滴の生成が見られたことから、予想外にも、実施例1のDEBSO1が既に成熟した脂肪滴の変化を捉えることに利用できるだけではなく、微小な脂肪滴の生成も捉えることができることがわかった。この結果は、DEBSO1が脂肪滴の形成から成熟を経て分解される過程の追跡に有用であることを示唆している。
【０１５１】
まとめ
上記のように、DEBSO1及びDEBSO2の光物性を測定したところ、紫外可視吸収スペクトルは溶媒の極性に関わらずほぼ変わらなかったが、蛍光スペクトルに関しては高い溶媒依存性が認められ、低極性溶媒中でのみ強く蛍光するといったように、BTO の性質が保持されていることがわかった。さらに、トルエン中におけるキセノンランプ照射下での光安定性を測定したところ、BTOと比べてはるかに高い光安定性を有していることわかった。
【０１５２】
DEBSO1及びDEBSO2を用いて実際に脂肪細胞を染色したところ、脂肪滴を選択的且つ高感度で染色できることがわかった。特に100nMという非常に低濃度でも脂肪滴を十分に染色できることがわかり、非侵襲イメージングを達成することができた。また、共焦点レーザーの照射下における脂肪滴内でのDEBSO1及びDEBSO2の光安定性を調べたところ、473nmのレーザー光を用いた場合に、DEBSO1及びDEBSO2がBTOよりもはるかに安定であることがわかった。また、DEBSO1を用いて、フォルスコリンによる脂肪滴分解の様子を追跡することに成功した。これらの結果から、DEBSO1及びDEBSO2は脂肪滴を選択的且つ高感度で長時間観察するために有用な色素分子であることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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