(57)【要約】      （修正有）【課題】ヘンドラ及び／又はニパウイルスに対する免疫原性組成物及びその使用方法の提供。【解決手段】ヘンドラ及び／又はニパウイルスＧ糖タンパク質と免疫刺激複合体（ＩＳＣ）と少なくとも１種の賦形剤とを、ヘンドラ及び／又はニパウイルスに感受性のある対象への投与後に該ヘンドラ及び／又はニパウイルスに対する免疫防御を誘発するのに有効な量で含むワクチンであって、（ａ）ヘンドラ及び／又はニパウイルスＧ糖タンパク質は１用量当たり５〜１００μｇの量で存在し、（ｂ）ＩＳＣはサポニン及びステロイドを含む、ワクチン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘンドラ及び／又はニパウイルスＧ糖タンパク質と免疫刺激複合体（ＩＳＣ）と少なくとも１種の賦形剤とを、ヘンドラ及び／又はニパウイルスに感受性のある対象への投与後に該ヘンドラ及び／又はニパウイルスに対する免疫防御を誘発するのに有効な量で含むワクチンであって、
（ａ）ヘンドラ及び／又はニパウイルスＧ糖タンパク質は１用量当たり５〜１００μｇの量で存在し、
（ｂ）ＩＳＣはサポニン及びステロイドを含む、
ワクチン。
【請求項２】
サポニンはＱｕｉｌ  Ａである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
ＩＳＣはリン脂質をさらに含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質は、天然のヘンドラＧ糖タンパク質（配列番号２）の７３〜６０４位のアミノ酸からなる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質は、配列番号１６の６４〜１６６２位のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列によってコードされている、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質は二量体形態で存在している、請求項１に記載のワクチン。
【請求項７】
可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質二量体の各サブユニットは少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結されている、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質は四量体形態で存在している、請求項１に記載のワクチン。
【請求項９】
可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質の量は約５０〜約１００μｇであり、前記対象はウマである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１０】
サポニンは、キラヤ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）から単離されたものである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１１】
サポニンは、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、ＱＨ−Ｃ、又はＱＳ２１である、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
リン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジン酸（ホスファチデート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）、ホスホリルコリン（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（Ｃｅｒ−ＰＥ）、及びセラミドホスホリルグリセロールからなる群から選択される、請求項３に記載のワクチン。
【請求項１３】
サポニンはＱｕｉｌ  Ａであり、リン脂質はＤＰＰＣであり、ステロイドはコレステロールである、請求項３に記載のワクチン。
【請求項１４】
組成物におけるＱｕｉｌ  Ａ：ＤＰＰＣ：コレステロールの重量比は５：１：１である、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記対象は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、又はネコである、請求項１〜８及び１０〜１４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記対象における前記ヘンドラ及び／又はニパウイルスに対する中和抗体応答を生成することができる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１７】
中和抗体応答は前記対象におけるヘンドラ及び／又はニパウイルスの複製を減少させる、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
中和抗体応答は前記対象におけるヘンドラ及び／又はニパウイルスの排出を減少させる、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１９】
前記対象は、ヘンドラ及び／又はニパウイルスに曝露された対象である、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項２０】
前記対象は、ヘンドラ及び／又はニパウイルス感染に罹患している対象である、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】
筋肉内投与された場合に中和抗体応答を生成することができる、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項２２】
複数回投与で投与された場合に中和抗体応答を生成することができる、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項２３】
第２回目の投与が第１回目の投与から少なくとも約２１〜約２８日後に行われる、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２４】
各用量は約５０又は約１００μｇの可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質を含む、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２５】
前記対象はウマであり、各用量は約５０又は約１００μｇの可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質を含み、ＩＳＣはＱｕｉｌ  Ａ、ＤＰＰＣ、及びコレステロールを含む、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２６】
前記ウイルスはヘンドラウイルスである、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２７】
前記ウイルスはニパウイルスである、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載のワクチンをワクチン接種された対象から単離された生物学的試料と、ヘンドラ及び／又はニパウイルスに曝露された対象から単離された生物学的試料と、を識別する方法であって、生物学的試料において、融合タンパク質（Ｆ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、リンタンパク質（Ｐ）、巨大タンパク質（Ｌ）、及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）からなる群から選択されるＨｅＶ及び／又はＮｉＶウイルスタンパク質の少なくとも１つに対する抗体の存在を検出するステップを含む方法。
【請求項２９】
前記対象は、ヒト、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、又はネコである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ウイルスはヘンドラウイルスである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ウイルスはニパウイルスである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
ヘンドラウイルス感染に対してウマにワクチン接種するための方法であって、請求項９に記載のワクチンを前記ウマに２回投与することを含む方法。
【請求項３３】
第２回目の投与が第１回目の投与から少なくとも約２１〜約２８日後に行われる、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
[0001]本発明は、ヘンドラ（Ｈｅｎｄｒａ）ウイルス（ＨｅＶ）及び／又はニパ（Ｎｉｐａｈ）ウイルス（ＮｉＶ）由来のＧ糖タンパク質を含む免疫原性組成物及びワクチン組成物、並びにこれらの組成物に係る使用方法に関する。
【背景の説明】
【０００２】
[0002]ＮｉＶが繰り返し発生して多数の死者が出ていることが近年問題になっている（例えば、Ｂｕｔｌｅｒ、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ、４２９、７を参照）。また、ＨｅＶもヒト及び動物に死をもたらすことが知られているが、ＨｅＶはＮｉＶと遺伝学的及び免疫学的に密接に関連している。現在のところ、ニパウイルス又はヘンドラウイルスによって引き起こされる感染又は疾患を予防するためのワクチン又は治療薬は存在しない。ニパウイルス及びヘンドラウイルスは、いずれも、米国国立アレルギー・感染症研究所により生物テロ防御が憂慮されるカテゴリーＣに分類される病原体である。さらに、これらのウイルスは、人獣共通感染症のバイオセーフティレベル−４の病原体（ＢＳＬ−４）であり、安全にワクチン生産及び／又は診断を行うことは、非常に費用がかかり、また困難である。このように、ニパウイルス又はヘンドラウイルスに対して、ワクチンのハイスループット生産及び／又は診断を可能にするワクチン及び診断が必要とされている。
【０００３】
[0003]ＨｅＶ、ＮｉＶ等のパラミクソウイルスは、ウイルス粒子のエンベロープに２つの主要な膜結合型糖タンパク質を有する。一方の糖タンパク質は、ビリオンが宿主細胞上の受容体に結合するために必要であり、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼタンパク質（ＨＮ）又はヘマグルチニンタンパク質（Ｈ）のいずれかとして構成されている。他方の糖タンパク質は、赤血球凝集活性もノイラミニダーゼ活性も有しない糖タンパク質（Ｇ）である。これらの結合糖タンパク質はＩＩ型膜タンパク質であり、分子のアミノ（Ｎ）末端が細胞質の方に向かい、タンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端が細胞外にある。他の主要な糖タンパク質は融合（Ｆ）糖タンパク質であり、この（Ｆ）糖タンパク質は三量体クラスＩ型膜融合性エンベロープ糖タンパク質であり、２つのヘプタッド反復（ＨＲ）領域と疎水性融合ペプチドとを有している。ＨｅＶ及びＮｉＶは、受容体に結合後、それらの結合Ｇ糖タンパク質とＦ糖タンパク質との協奏的な作用により、ｐＨ非依存的な膜融合プロセスを介して受け手の宿主細胞に感染する。ＨｅＶ及びＮｉＶの結合Ｇ糖タンパク質の主要な機能は宿主細胞表面の適切な受容体に作用することであり、よく特徴づけられているパラミクソウイルスの大半はシアル酸分子に作用する。ＨｅＶ及びＮｉＶのＧ糖タンパク質は、宿主細胞の受容体タンパク質エフリンＢ２及び／又はエフリンＢ３を利用するものであるが、このＧ糖タンパク質に対するウイルス結合を遮断する抗体が開発されてきた（国際公開第２００６／１３７９３１号パンフレット、Ｂｉｓｈｏｐ（２００８）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、８２：１１３９８−１１４０９）。さらに、ＨｅＶ及びＮｉＶ感染に対する免疫防御応答を生成する手段としてＧ糖タンパク質を使用するワクチンも開発されてきた（国際公開第２００９／１１７０３５号パンフレット）。
【０００４】
[0004]ワクチン調製物においてＱｕｉｌ  Ａを使用する際の投与部位での反応性は、動物及びヒトのいずれの場合においても大きな問題である。Ｑｕｉｌ  Ａの毒性を避けるための１つの方法は免疫刺激複合体の使用である（Ｒａｊｐｕｔ（２００７）、Ｊ．Ｚｈｅｊｉａｎｇ  Ｕｎｉｖ．Ｓｃｉ．Ｂ、８：１５３−１６１）。その理由は主として、免疫刺激複合体に組み込まれると、Ｑｕｉｌ  Ａの活性が減弱することにある。Ｑｕｉｌ  Ａの活性が減弱するのは、Ｑｕｉｌ  Ａが複合体中のコレステロールと会合することによって、細胞膜からコレステロールを抜き出すＱｕｉｌ  Ａの能力、ひいてはＱｕｉｌ  Ａの細胞溶解効果が低減するためである。さらに、より少量のＱｕｉｌ  Ａが同様のレベルのアジュバント効果を生じさせることが求められている。Ｑｕｉｌ  Ａサポニンの免疫調節特性と、Ｑｕｉｌ  Ａサポニンが免疫刺激複合体に組み込まれたときにＱｕｉｌ  Ａサポニンから誘導される付加的な効果については、国際公開第２０００／０４１７２０号パンフレットに記載されている。
【０００５】
[0005]単一のワクチンにおけるＨｅＶ及び／又はＮｉＶのＧ糖タンパク質と免疫刺激複合体との組み合わせは、これらの成分が組み合わせて投与されると、アジュバントの副作用が低減しつつ免疫反応が増強する可能性があることから、有効なＨｅＶ及びＮｉＶワクチンの開発における進歩を表すものである。
【発明の概要】
【０００６】
[0006]本発明は、ヘンドラ及び／又はニパウイルスＧタンパク質と免疫刺激複合体（ＩＳＣ）と少なくとも１種の賦形剤とを、対象への投与後にヘンドラ及び／又はニパウイルスに対する中和抗体の産生を誘発するのに有効な量で含む免疫原性組成物を包含する。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物はサポニン、リン脂質及びステロイドを含む。
【０００７】
[0007]いくつかの実施形態において、可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質は、天然のヘンドラＧ糖タンパク質（配列番号２）の７３〜６０４位のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質は、配列番号１６の６４〜１６６２位のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列によってコードされている。いくつかの実施形態において、可溶性ヘンドラウイルスＧタンパク質は二量体形態で存在し、可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質二量体の各サブユニットは少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結されている。いくつかの実施形態において、可溶性ヘンドラウイルスＧタンパク質は四量体形態で存在している。いくつかの実施形態において、四量体は、非共有結合及び／又は少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結されている二量体の二量体として存在している。可溶性ヘンドラウイルスＧタンパク質の濃度は免疫原性組成物中、約５〜１００μｇ／ｍｌであり得る。
【０００８】
[0008]いくつかの実施形態において、サポニンは、キラヤ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）から単離され、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、ＱＨ−Ｃ、又はＱＳ２１から選択され得る。いくつかの実施形態において、リン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジン酸（ホスファチデート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）、ホスホリルコリン（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（Ｃｅｒ−ＰＥ）、及びセラミドホスホリルグリセロールからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、サポニンはＱｕｉｌ  Ａであり、リン脂質はＤＰＰＣであり、ステロイドはコレステロールであり、組成物中のＱｕｉｌ  Ａ：ＤＰＰＣ：コレステロールの重量比は５：１：１である。
【０００９】
[0009]また、本発明は、対象においてヘンドラ及び／又はニパウイルスに対する中和抗体応答を生成する方法であって、対象に、本明細書に記載の免疫原性組成物を、中和抗体応答を生成するのに有効な量及び期間で投与するステップを含む方法を包含する。いくつかの実施形態において、中和抗体応答は対象におけるヘンドラ及び／又はニパウイルスの複製を減少させ、また、対象におけるヘンドラ及び／又はニパウイルスの排出も減少させる場合もある。いくつかの実施形態において、対象はヘンドラ及び／又はニパウイルスに曝露された対象であり、他の実施形態において、対象はヘンドラ及び／又はニパウイルス感染に罹患している対象である。いくつかの実施形態において、本発明は、対象においてヘンドラウイルスに対する中和抗体応答を生成する方法であって、対象に、本明細書に記載の免疫原性組成物を、中和抗体応答を生成するのに有効な量及び期間で投与するステップを含む方法を包含する。いくつかの実施形態において、本発明は、対象においてニパウイルスに対する中和抗体応答を生成する方法であって、対象に、本明細書に記載の免疫原性組成物を、中和抗体応答を生成するのに有効な量及び期間で投与するステップを含む方法を包含する。
【００１０】
[0010]いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は筋肉内投与される。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は複数回投与で投与され、第２回目の投与は第１回目の投与から少なくとも約２１〜約２８日後に行われる。いくつかの実施形態において、各用量は約５０又は約１００μｇの可溶性ヘンドラウイルスＧタンパク質を含む。
【００１１】
[0011]本発明は、さらに、本明細書に記載の免疫原性組成物をワクチン接種された対象と、ヘンドラ及び／又はニパウイルスに曝露された対象と、を識別する方法であって、対象から単離した生物学的試料において、融合タンパク質（Ｆ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、リンタンパク質（Ｐ）、巨大タンパク質（Ｌ）、及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）からなる群から選択されるＨｅＶ及び／又はＮｉＶウイルスタンパク質の少なくとも１つに対する抗体の存在を検出するステップを含む方法を包含する。
【００１２】
[0012]本発明の免疫原性組成物及び方法は、ヒト、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、イヌ、ネコ等の対象に投与することができる。
【００１３】
[0013]また、本発明は、ヒト対象においてヘンドラ及び／又はニパウイルスに対する中和抗体応答を生成する方法であって、対象に、可溶性Ｇ糖タンパク質を含む免疫原性組成物を、中和抗体応答を生成するのに有効な量及び期間で投与するステップを含む方法を包含する。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物はアジュバントをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１（Ｆｉｇｕｒｅ  １）は、２５０μｇの免疫刺激複合体でアジュバントされた５０又は１００μｇ／用量の組換えヘンドラウイルス可溶性糖タンパク質（ｓＧ）を投与し、次いで０日目に生ヘンドラウイルスに曝露させたウマの経時的な直腸温を示す。
【図２】図２（Ｆｉｇｕｒｅ  ２）は、２５０μｇの免疫刺激複合体でアジュバントされた５０又は１００μｇ／用量の組換えヘンドラウイルス可溶性糖タンパク質（ｓＧ）を投与し、次いで０日目に生ヘンドラウイルスに曝露させたウマの経時的な心拍数を示す。
【図３】図３（Ｆｉｇｕｒｅ  ３）は免疫刺激複合体の調製の概略図である。
【図４】図４（Ｆｉｇｕｒｅ  ４）はｓＧＨｅＶワクチン接種及びＮｉＶチャレンジスケジュールの概略図である。ｓＧＨｅＶワクチン接種、ＮｉＶチャレンジ、及び安楽死を行った日は矢印で示されている。血液及びスワブ検体は、チャレンジ後−４２、−７、０、３、５、７、１０、１４、２１及び２８日目に採取した（＊で示されている）。灰色の文字はチャレンジのタイムライン（上の列）、黒色の文字はワクチン接種のタイムライン（下の列）を示す。各ワクチン用量グループ及び１つのコントロール対象におけるアフリカミドリザル（ＡＧＭ）の番号が示されている。
【図５】図５（Ｆｉｇｕｒｅ  ５）はＮｉＶ感染対象の生存曲線を示す。コントロール対象（ｎ＝２）及びｓＧＨｅＶワクチン接種対象（ｎ＝９）から得たデータを用いてカプラン−マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）生存曲線を作成した。コントロールには、さらにもう１つの過去のコントロール対象のデータが含まれる。ワクチン接種対象には、１０μｇ、５０μｇ又は１００μｇのｓＧＨｅＶが２回皮下投与された。疾患末期までの平均時間はコントロール対象で１１日であったが、ワクチン接種対象はすべて試験の最後の安楽死まで生存した。
【図６】図６（Ｆｉｇｕｒｅ  ６）はワクチン接種対象におけるＮｉＶ−及びＨｅＶ−特異的免疫グロブリン（Ｉｇ）を示す。血清及び鼻腔スワブをワクチン接種対象から回収し、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭの応答を、ｓＧＨｅＶ及びｓＧＮｉＶ多重マイクロスフェアアッセイを用いて評価した。同じワクチン用量グループ（ｎ＝３）の対象に由来する血清又はスワブを個別に分析し、マイクロスフェア蛍光強度中央値（Ｍ．Ｆ．Ｉ．）の平均を計算した（計算した値をＹ軸に示す）。エラーバーは標準誤差を表す。血清ｓＧ特異的Ｉｇは黒色で示し（ｓＧＨｅＶ（白抜き三角）、ｓＧＮｉＶ（塗りつぶし三角））、粘膜ｓＧ特異的ＩｇＡは灰色の記号で示す（ｓＧＨｅＶ（白抜き三角）、ｓＧＮｉＶ（塗りつぶし三角））。
【発明の説明】
【００１５】
ワクチン及び免疫原性組成物：
[0020]本発明のワクチン及び免疫原性組成物は、組成物を投与された対象において、いくつかの液性及び細胞性免疫のうちの少なくとも１つを誘導するか、あるいは、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶ株の少なくとも１つに対する少なくとも１つの免疫応答を増強するのに有効である。そのため、本発明のワクチン及び免疫原性組成物の投与は、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶの少なくとも１種の株によるＨｅＶ及び／又はＮｉＶ感染に対するワクチン接種用途及び／又は予防に好適である。本発明の組成物は、必要とする対象に、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶ由来の可溶性Ｇ糖タンパク質を含むＧ糖タンパク質と、アジュバントとして作用する免疫刺激複合体（ＩＳＣ）と、を送達する。いくつかの実施形態において、Ｇ糖タンパク質の量としては、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００又は２５０μｇ／ｍｌが挙げられる。また、ＩＳＣの含有量としては、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５又は３００μｇ／ｍｌが挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｇ糖タンパク質の量は、５、５０又は１００μｇ／ｍｌであり、ＩＳＣの量は２５０μｇ／ｍｌである。
【００１６】
Ａ．  ＨｅＶ及びＮｉＶ  Ｇタンパク質：
[0021]いくつかの実施形態において、ワクチン及び免疫原性組成物は、本明細書に記載の少なくとも１種のＨｅＶ及び／又はＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質を含む。本明細書において、タンパク質という語は、ポリペプチド又はその断片を包含するものとして広く使用される。例えば、ＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質は可溶性形態であり得、Ｗａｎｇ（２０００）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７４、９９７２−９９７９（Ｙｕ（１９９８）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２５１、２２７−２３３も参照）におけるＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質のアミノ酸配列の７３〜６０４位のアミノ酸を含み得る。また、例えば、ＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質は可溶性形態であり得、Ｈａｒｃｏｕｒｔ（２０００）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２７１：３３４−３４９、２０００（Ｃｈｕａ（２０００）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８８、１４３２−１も参照）におけるＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質のアミノ酸配列の７１〜６０２位のアミノ酸を含み得る。
【００１７】
[0022]概して、ＨｅＶ及びＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質の可溶性形態は、ＨｅＶ又はＮｉＶのＧ糖タンパク質の外部ドメイン（例えば、細胞外）のすべて又は一部を含み、概して、Ｇ糖タンパク質の膜貫通ドメインのすべて又は一部とＧ糖タンパク質の細胞質テールのすべて又は一部とを削除することによって生成される。一例として、可溶性Ｇ糖タンパク質は、ＨｅＶ又はＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質の完全な外部ドメインを含み得る。また、例えば、可溶性Ｇ糖タンパク質は、ＨｅＶ又はＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質の外部ドメインの全部又は一部と膜貫通ドメインの一部を含み得る。
【００１８】
[0023]本発明の可溶性ＨｅＶ又はＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質は、概して、対応する天然のウイルス糖タンパク質の少なくとも１つの特徴、例えば、ウイルス宿主細胞受容体に対する相互作用又は結合能力、オリゴマー形態となり得る能力、又は天然Ｇ糖タンパク質認識可能抗体（例えばウイルス中和抗体を含む。）を誘発する能力を保持している。さらなる特徴としては、例えば、宿主細胞の感染を遮断又は予防する能力が挙げられる。従来の手法を利用して、可溶性ＨｅＶ又はＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質の特徴の少なくとも１つを評価することができる。
【００１９】
[0024]例えば、可溶性ＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｗａｎｇ（２０００）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７４、９９７２−９９７９におけるＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の約７３〜６０４位のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。また、例えば、可溶性ＨｅＶ  Ｇタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｗａｎｇ（２０００）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７４、９９７２−９９７９におけるＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質のポリヌクレオチド配列の９１２９〜１０７２７位のヌクレオチドを含み得る。さらに、ＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質アミノ酸配列（配列番号２）の約７３〜６０４位のアミノ酸をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列も利用することができる。いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、配列番号１６の６４〜１６６２位のヌクレオチドを含む又はそれからなる。さらなる実施形態において、コドン最適化配列は、Ｉｇκリーダー配列をコードするヌクレオチドを含む配列番号１６を含む又はそれからなる。
【００２０】
[0025]例えば、ＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質は可溶性形態であり得、Ｈａｒｃｏｕｒｔ（２０００）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２７１：３３４−３４９におけるＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質アミノ酸配列の７１〜６０２位のアミノ酸を含み得る。可溶性ＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質の構築に使用し得る配列の例は、例えば、Ｈａｒｃｏｕｒｔ（２０００）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２７１、３３４−３４９に見出し得る。概して、任意のニパウイルス単離物又は株に由来するＧ糖タンパク質配列を利用して、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドを誘導することができる。
【００２１】
[0026]例えば、可溶性ＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｈａｒｃｏｕｒｔ（２０００）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２７１：３３４−３４９におけるＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質アミノ酸配列の約７１〜６０２位のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。また、例えば、可溶性ＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｈａｒｃｏｕｒｔ（２０００）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２７１：３３４−３４９におけるＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質ポリヌクレオチド配列（配列番号４）の２３４〜２０４２位を含み得る。さらに、ＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質アミノ酸配列の約７１〜６０２位のアミノ酸をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列も利用し得る。
【００２２】
[0027]これらのＧ糖タンパク質の機能的等価体を、本発明の免疫原性及びワクチン組成物で使用することができる。例えば、機能的に等価なポリペプチドは次の特徴の少なくとも１つを有する。ウイルス宿主細胞受容体に対する相互作用又は結合能力、二量体又は四量体の形態となり得る能力、又は天然Ｇ糖タンパク質認識可能抗体（例えば、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶウイルス中和抗体を含む。）を誘発する能力、及び／又は宿主細胞の感染を遮断若しくは予防する能力。
【００２３】
[0028]いくつかの実施形態において、Ｇ糖タンパク質は二量体及び／又は四量体形態であり得る。そのような二量体は、Ｇ糖タンパク質のシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合の形成に応じて変化する。そのようなジスルフィド結合は、ＨｅＶ又はＮｉＶの表面に発現された天然のＧ糖タンパク質に形成されている（例えば、システインの位置が変動せずに維持されている）ジスルフィド結合に対応するものであってもよく、あるいは、抗原性を増強させる異なるＧ糖タンパク質二量体及び／又は四量体が形成されるようにＧ糖タンパク質の存在及び位置が（例えば、アミノ酸配列におけるシステインの位置が変化することによって）変化したものであってもよい。さらに、Ｇ糖タンパク質が構造依存性の（すなわち、三次（三次元）構造から生じる）多数のエピトープを提示していること、そして多数のそのような天然のエピトープを保持しておくことが中和抗体応答を付与するために非常に好ましいことを考慮すると、二量体及び四量体形態でないものも本発明に包含される。
【００２４】
[0029]本発明のＨｅＶ免疫原性及びワクチン組成物は、配列番号２の７３〜６０４位のアミノ酸残基を含む種々の長さのタンパク質を含有し得る。本発明の一実施形態において、本発明のエンベロープタンパク質は、配列番号２のＨｅＶ糖タンパク質（７３〜６０４位のアミノ酸を含む。）と少なくとも約８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一である。したがって、本発明のＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質は、天然のＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質の免疫原性断片を、立体構造的エピトープを生成するのに十分なアミノ酸数で含む。免疫原性断片の非限定的な例としては、アミノ酸の長さが少なくとも５３０、５３１、５３２、５３３、５３４又は５３５又はさらに上回る残基であり得るアミノ酸配列が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質は、配列番号２又はＩｇκリーダー配列をさらに含む合成配列（配列番号１５）を含む又はそれからなる。
【００２５】
[0030]本発明のＮｉＶ免疫原性組成物及びワクチン組成物は、配列番号４の７１〜６０２位のアミノ酸残基を含む種々の長さのタンパク質を含有し得る。本発明の一実施形態において、本発明のエンベロープタンパク質は、配列番号４のＮｉＶ糖タンパク質（７１〜６０２位のアミノ酸を含む。）と少なくとも約８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一である。したがって、本発明のＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質は、天然のＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質の免疫原性断片を、立体構造的エピトープを生成するのに十分なアミノ酸数で含む。免疫原性断片の非限定的な例としては、アミノ酸の長さが少なくとも５２８、５２９、５３０、５３１、５３２又は５３３又はさらに上回る残基であり得るアミノ酸配列が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質は、配列番号４又はリーダー配列をさらに含む合成配列を含む又はそれからなる。
【００２６】
[0031]本明細書に記載の免疫原性断片は、抗原の少なくとも１つのエピトープを含有し、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶ抗原性を示し、適切な構築物で提供されたとき（例えば、他のＨｅＶ及び／又はＮｉＶ抗原と融合されたとき、又は担体上で提示されたとき）、天然の抗原に対する免疫反応を惹起し得るものである。本発明の一実施形態において、免疫原性断片は、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶ抗原由来の少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含有し、例えば、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶ抗原由来の少なくとも５０、７５又は１００個の連続するアミノ酸を含有する。
【００２７】
[0032]ＨｅＶ及びＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質の実施形態としては、さらに、例えば、天然のＨｅＶ又はＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質と少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドが挙げられ、ポリペプチド配列は、天然のＨｅＶ又はＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質アミノ酸配列と同一であってもよく、あるいは、天然のＨｅＶ若しくはＮｉＶ  Ｇタンパク質アミノ酸配列と比較して一定数までのアミノ酸改変を有する配列であってもよく、改変は、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換（保存的及び非保存的置換を含む。）又は挿入からなる群から選択され、改変は、基準となるポリペプチド配列のアミノ末端若しくはカルボキシ末端に存在しても、これらの両端の間のいずれかの位置に存在してもよく、基準となる配列のアミノ酸の間で別個に散在してもよく、又は天然のＨｅＶ若しくはＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質アミノ酸配列内の少なくとも１つの連続するまとまりとして存在してもよい。
【００２８】
[0033]アミノ酸配列レベルの配列同一性又は相同性は、配列の類似性検索のために開発されたＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）解析により、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘプログラムで採用されるアルゴリズムを用いて決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５、３３８９−３４０２及びＫａｒｌｉｎ（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、２２６４−２２６８）。ＢＬＡＳＴプログラムで用いるアプローチでは、まず、検索配列とデータベース配列との間で、ギャップ有り（非連続的）又はギャップ無し（連続的）で類似のセグメントを検討し、次いで、特定されたすべての一致について統計学的有意性を評価し、最後に、予め選択された有意性の閾値を満たす一致のみを集約する。配列データベース類似性検索の基本的事項に関する論考については、Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６、１１９−１２９を参照されたい。ヒストグラム、表示、アラインメント、期待値（つまり、データベース配列に対する一致を出力するための統計学的有意性の閾値）、カットオフ、行列、及びフィルター（低複雑性）に対する検索パラメータはデフォルト設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘで使用されるデフォルトスコア行列は、アミノ酸８５残基を超える長さの検索配列に推奨されるＢＬＯＳＵＭ６２行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、１０９１５−１０９１９）である。
【００２９】
[0034]本発明のワクチン及び免疫原性組成物は、本発明の免疫化方法をさらに増強させ得る異なる株に由来する追加的なＨｅＶ及び／又はＮｉＶ  Ｇタンパク質をさらに含んでもよい。
【００３０】
Ｂ．  免疫刺激複合体：
[0035]概して、本発明は、可溶性形態のＨｅＶ及び／又はＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質エンベロープタンパク質を免疫刺激複合体（ＩＳＣ）と組み合わせて含む免疫原性組成物（ワクチン組成物を含む）、並びにこれらの組成物を用いて対象におけるＨｅＶ及び／又はＮｉＶ感染を予防及び治療するための方法を提供するものである。本発明において、ワクチン及び／又は免疫原性組成物はアジュバントとして作用する免疫刺激複合体を含む。本明細書において、「アジュバント」とは、それ自体は何ら特別な抗原的効果を有しないが、免疫系を刺激して抗原に対する反応を増強させ得る物質を指す。
【００３１】
[0036]ＩＳＣはいくつかの特徴を有することから、一定の用途において理想的なアジュバントとなる。
【００３２】
[0037]抗原節約：
例えば、Ｗｅｅ（２００８）、Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１、４８９−４９６に記載されているように、抗原の入手可能性が制限されている又は抗原が高額である状況において、ＩＳＣにより１０〜１００倍の抗原節約が可能となることが示されている。この特徴は、組み合わせによる効果の増強又は他のアジュバントと比較してより適切な作用機構に基づいている可能性が高い。
【００３３】
[0038]交差提示：
例えば、Ｓｃｈｎｕｒｒ（２００９）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８２、１２５３−１２５９で記載されているように、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原提示は、通常、２つの経路の１つに従う。外来抗原は、通常、ＡＰＣによって貪食された後、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子によってＡＰＣの表面でプロセシングされ、再び発現する。その後、リンパ球で見られるようになり、正しい共刺激因子／シグナルが存在する場合には適切に応答する。自己及び癌抗原並びにウイルス抗原は、ＡＰＣの細胞質に存在しているため、通常、クラスＩ分子においてプロセシングされ、発現する。癌及びウイルス抗原に対する免疫を有効にするためにはクラスＩ経路を利用する必要がある。このクラスＩ経路の利用は、ウイルス感染又は細胞ホメオスタシス（内部抗原の細胞代謝回転）において自然に起こる。ワクチンとして導入される抗原（ウイルス抗原又は自己抗原）は、細胞の外側から細胞の抗原プロセシング機構へ入り、クラスＩＩ経路からクラスＩ経路へ入る方法を見出すことが必要となる。これは、樹状細胞（ＤＣ、スペシャリストＡＰＣ）で自然に起こり得、あるいは、抗原とアジュバントであるＩＳＣとを混合してワクチン接種することによって達成され得る。外来性の抗原が、抗原を提示するクラスＩ経路に自身の経路を見出していくプロセスは、交差提示と称される。ＩＳＣが抗原の交差提示を達成するメカニズムは完全には明らかとなっていないが、ＩＳＣ成分による膜摂動に依拠している可能性がある。
【００３４】
[0039]液性及び細胞性応答：
例えば、Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙ（２００９）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、８７、３７１−３７６）に記載されているように、ＩＳＣの作用機構は獲得免疫系の液性及び細胞性応答の両方に関与する。いくつかの種では、この特徴は、このアジュバントを用いたワクチン接種により刺激されるサイトカインのプロファイルと並行する。１型免疫応答は、インターロイキン−２及びＩＦＮ−γの出現と細胞内毒素（細菌、原生動物及びウイルス）に対する防御によって特徴づけられ、２型免疫応答は、インターロイキン−４の出現並びに抗毒素及び抗病原体関連免疫に対する中和抗体の生成によって特徴づけられる。ＩＳＣは、これらの２つの経路の間でバランスのとれたサイトカインプロファイルをもたらし、より広範な免疫応答を可能にする。さらにいくつかの研究により、ワクチンを鼻腔内送達した場合にＩＳＣの効果が高くなり得ることが示されている。これにより粘膜表面の増感が可能になり、その結果、病原菌侵入部位での重要な免疫（本ケースでは特に重要な免疫）（粘膜免疫）がもたらされる（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ（２００１）、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９、４０７２−４０８０も参照されたい。）
【００３５】
[0040]滅菌濾過性及び一貫性のある製造基準：
ＩＳＣ粒子径は通常、直径４０ｎｍであり、後に製剤化される調製物の滅菌に使用するフィルターに通過させることが可能になる。さらに、Ｑｕｉｌ  Ａで見出されるようなトリテルペノイドサポニンがコレステロール及びリン脂質と関わろうとする本来的傾向がＩＳＣの作製方法の開発のために利用されてきた。ＩＳＣ粒子を形成しないＱｕｉｌ  Ａ種は最終生成物から透析により除去される。構成成分の比率を調整することによって、不均一な連続体のＱｕｉｌ  Ａサポニンから均一な生成物が生じる。偏差によっては構造が４０ｎｍ粒子を特徴としない構造（例えば、へリックス、シート）になるため、上記比率は重要である。ＩＳＣコロイドの自由流動性並びに透過電子顕微鏡法、ＨＰＬＣ及び他の技術での測定可能性により、このアジュバントは放出アッセイ及び他の精度のある測定法で展開させ易い。
【００３６】
[0041]すなわち、いくつかの実施形態において、免疫刺激複合体と最適量のＧ糖タンパク質との製剤はサポニン、リン脂質、及びステロイド分子を含む。いくつかの実施形態において、サポニン、リン脂質、ステロイド分子のモル比は５：１：１の比率である。免疫刺激複合体は、例えば、５〜１０重量％のサポニンと、１〜５重量％のステロイド分子及びリン脂質と、Ｇ糖タンパク質を含む残部と、を含有し得る。Ｇ糖タンパク質は、免疫刺激複合体に直接的に結合して、又はタンパク質が免疫刺激複合体に組み込まれた後の担体タンパク質（例えば、キメラ又は融合タンパク質）に化学的に結合して、免疫刺激複合体に組み込まれ得る。免疫刺激複合体への言及は、その誘導体、化学的等価体及び類似体に対する言及を含むものとして理解されるべきである。いくつかの実施形態において、ＩＳＣは、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質とは別に混合され、その後、Ｇ糖タンパク質とＩＳＣとが混合される。いくつかの実施形態において、Ｇ糖タンパク質はサポニン、リン脂質、及びステロイド分子と直接混合される。
【００３７】
[0042]いくつかの実施形態において、本発明で使用するサポニンはＱｕｉｌ  Ａ及び／又はその誘導体である。Ｑｕｉｌ  Ａは、南アメリカの樹木であるキラヤ・サポナリア・モリナから単離されたサポニン調製物であり、最初にＤａｌｓｇａａｒｄ（１９７４）、Ｓａｐｏｎｉｎ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ、Ａｒｃｈｉｖ．ｆｕｒ  ｄｉｅ  ｇｅｓａｍｔｅ  Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇ、４４巻、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、２４３−２５４頁において、アジュバント活性を有することが記載された。ＨＰＬＣで単離されたＱｕｉｌ  Ａの精製断片、例えばＱＳ７及びＱＳ２１（ＱＡ７及びＱＡ２１としても知られる）は、アジュバント活性を維持しているが、Ｑｕｉｌ  Ａに関連する毒性（欧州特許第０３６２２７８号明細書）はない。ＱＳ２１は、キラヤ・サポナリア・モリナの樹皮に由来する天然のサポニンであり、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、Ｔｈ１細胞及び支配的ＩｇＧ２ａ抗体応答を誘導し、本発明での使用に適したサポニンである。ＩＳＣでの使用に適した他のサポニンとしては、例えば、Ｑｕｉｌ  ＡのＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ及びＱＨ−Ｃ分離物、並びにキラヤ・サポナリア以外の種から誘導されるサポニン（例えば、オタネニンジン属（Ｐａｎａｘ）（チョウセンニンジン）、レンゲソウ属（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ）、イノコズチ属（Ａｃｈｙｒａｎｔｈｅｓ）、ダイズ、アカシア属（Ａｃａｃｉａ）、及びツルニンジン属（Ｃｏｄｏｎｏｐｓｉｓ）由来のサポニン）が挙げられる。いくつかの実施形態において、サポニンはキラヤ・サポナリア以外の種から単離される。
【００３８】
[0043]本発明の免疫原性及びワクチン組成物で使用するリン脂質としては、例えば、ジアシルグリセリド構造及びリンスフィンゴ脂質を有する分子が挙げられる。ジアシルグリセリド構造を有するリン脂質としては、例えば、ホスファチジン酸（ホスファチデート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、又はホスファチジルセリン（ＰＳ）が挙げられる。ジアシルグリセリド構造を有するリン脂質の別の例としては、例えばホスホイノシチドが挙げられる。ホスホイノシチドとしては、例えば、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、又はホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）が挙げられる。リンスフィンゴ脂質としては、例えば、セラミドホスホリルコリン、（スフィンゴミエリン）（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン）（Ｃｅｒ−ＰＥ）、又はセラミドホスホリルグリセロールが挙げられる。
【００３９】
[0044]本発明の免疫原性組成物及びワクチン組成物で使用されるステロイド分子としては、その構造の一部としてステロイドを組み込んだ分子が挙げられる。ステロイド分子としては、例えば、コレステロール、プレグネノロン、１７−α−ヒドロキシプレグネノロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオール、プロゲステロン、１７−α−ヒドロキシプロゲステロン、アンドロステンジオン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、デオキシコルチコステロン、１１−デオキシコルチコステロン、コルチゾル、コルチコステロン、アルドステロン、エストロン、エストラジオール、エストリオールが挙げられる。
【００４０】
[0045]いくつかの実施形態において、免疫刺激複合体は、通常、例えば、直径が３０〜４０ｎＭの小カゴ様構造である。いくつかの実施形態において、免疫刺激複合体の製剤は、Ｑｕｉｌ  Ａ、コレステロール、ホスファチジルコリン及びＧ糖タンパク質のモル比が５：１：１の比率である。免疫刺激複合体は、例えば、５〜１０重量％のＱｕｉｌ  Ａと、１〜５％のコレステロール及びリン脂質と、Ｇ糖タンパク質を含む残部と、を含有し得る。Ｇ糖タンパク質は、免疫刺激複合体に直接的に結合して、又は免疫刺激複合体に組み込まれた担体タンパク質（例えば、キメラ又は融合タンパク質）と共役して、免疫刺激複合体に組み込まれ得る。免疫刺激複合体への言及は、その誘導体、化学的等価体及び類似体に対する言及を含むものとして理解されるべきである。例えば、免疫刺激複合体の誘導体への言及は、Ｑｕｉｌ  Ａ、コレステロール、ホスファチジルコリン又はタンパク質のうちの少なくとも１つが、例えば、欠失している、置換されている、又はＱｕｉｌ  Ａ、コレステロール、ホスファチジルコリン若しくはタンパク質に加えて他の成分が複合体に付加されている免疫刺激複合体への言及を含む。免疫刺激複合体の機能的等価体は、その４つの構成成分のうちの少なくとも１つが機能的等価体と交換されている免疫刺激複合体であり得る。本発明のいくつかの実施形態において、免疫刺激複合体のＧ糖タンパク質部分は欠失している。この種の免疫刺激複合体は、本明細書においてタンパク質非含有免疫刺激複合体と称される。
【００４１】
[0046]いくつかの実施形態において、本発明は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨｅＶ及び／又はＮｉＶの複数の株に対する交差反応性中和抗血清の産生を誘導し得る単離されたＨｅＶ又はＮｉＶ  Ｇタンパク質と、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＤＰＰＣ及びコレステロールを含むアジュバントと、を含む免疫原性組成物であって、例えば、５、５０又は１００μｇの可溶性ＨｅＶ又はＮｉＶ  Ｇタンパク質と、適当な量のＱｕｉｌ  Ａ、ＤＰＰＣ及びコレステロールと、を含む組成物である。免疫刺激複合体及びその調製方法のさらなる例示的実施形態は、欧州特許第０２４２３８０号明細書、欧州特許第０１８０５６４号明細書、及び国際公開第２０００／０４１７２０号パンフレット（例えば、Ｃｏｘ  ＆  Ｃｏｕｌｔｅｒ（１９９２）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ４、Ｙｏｎｇ（ｅｄ．）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｄａｌｓｇａｒｄ（１９７４）、Ｇｅｓａｍｔｅ  Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈ、４４、２４３−２５４を言及している第３〜９頁を参照のこと）；オーストラリア特許第５５８２５８号明細書、同第５８９９１５明細書、同第５９０９０４明細書及び同第６３２０６７号明細書に記載されている。また米国特許第６，５０６，３８６号明細書及びその参照文献に記載されているように、免疫刺激複合体が形成されるときにタンパク質抗原が包含される免疫複合体が使用できること（欧州特許第０１０９９４２号明細書参照）、又は予め形成された免疫刺激複合体を別個の追加部分である抗原と混合してワクチンが形成されること（欧州特許第０４３６６２０号明細書を参照）は周知である。一般に認識されているように、タンパク質抗原は免疫刺激複合体にも共有結合し得る（欧州特許第０１８０５６４号明細書を再度参照のこと）。また、当技術分野でよく認識されているように、免疫刺激複合体は粘膜接種により投与することができ（Ｍｏｗａｔ（１９９１）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、７２、３１７−３２２を参照のこと）、本発明の免疫刺激複合体は、膜標的タンパク質の包含により粘膜接種をさらに向上させ得る（国際公開第９７／３０７２８号パンフレット）。
【００４２】
[0047]いくつかの実施形態において、本発明は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨｅＶ及び／又はＮｉＶの複数の株に対する交差反応性中和抗血清の産生を誘導し得る単離されたＨｅＶ又はＮｉＶ  Ｇタンパク質と、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＤＰＰＣ及びコレステロールを含むアジュバントと、を含む免疫原性組成物を包含し、例えば、組成物は、５、５０又は１００μｇの可溶性ＨｅＶ又はＮｉＶ  Ｇタンパク質と、適当な量のＱｕｉｌ  Ａ、ＤＰＰＣ及びコレステロールと、を含有する。免疫刺激複合体のさらなる例示的実施形態は国際公開第２０００／０４１７２０号パンフレットに記載されている。
【００４３】
[0048]本発明の別の実施形態において、ワクチン及び免疫原性組成物は医薬組成物の一部であってもよい。本発明の医薬組成物は、活性化合物を作用部位に送達させるために薬学的に使用し得る調製物への加工を容易にする賦形剤及び助剤を含む、適切な薬学的に許容可能な担体を含み得る。
【００４４】
Ｃ．  賦形剤：
[0049]本発明の免疫原性及びワクチン組成物は、さらに、薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は安定化剤（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００５）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ）を凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で含み得る。許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤は、特定の投与量及び濃度でレシピエントに非毒性のものである。例えば、緩衝剤（例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸）；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、及びメチオニン）；保存剤（例えば、［（ｏ−カルボキシフェニル）チオ］エチル水銀ナトリウム塩（チメロサール）、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、アルキルパラベン（例えば、メチル又はプロピルパラベン）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾール）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン）；単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、又はデキストラン）；キレート剤（例えばＥＤＴＡ）；糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトール）；塩形成対イオン（例えばナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又は非イオン界面活性剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＴＷＥＥＮ、又はＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）が挙げられる。
【００４５】
[0050]本発明の組成物は、投与量を送達させるために適切な体積の任意の適切な薬学的ビヒクル又は担体に懸濁される用量であり得る。概して、最終体積（担体、アジュバント等を含む。）は通常少なくとも１．０ｍｌである。上限は投与量の実用性によって定まり、概して約０．５ｍｌ以下〜約２．０ｍｌである。
【００４６】
使用方法：
[0051]本発明は、ヘンドラ及び／又はニパウイルス感染を予防及び／又は治療する方法であって、本発明の免疫原性及びワクチン組成物を任意の哺乳類対象に投与するステップを含む方法を包含する。ＨｅＶ及び／又はＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質と本明細書に記載のアジュバントとをワクチン接種することにより誘発される活性な免疫により、細胞性又は液性免疫応答をプライム又はブーストすることができる。有効量のＨｅＶ及び／又はＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質又はその抗原性断片をアジュバントと混合して調製し、ワクチンを調製することができる。
【００４７】
[0052]本発明は、ヒト対象におけるヘンドラ及び／又はニパウイルス感染を予防及び／又は治療する方法であって、可溶性ＨｅＶ及び／又はＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質を含む免疫原性及び／又はワクチン組成物又はその組み合わせを、単独で又はヒトでの使用に適した少なくとも１つのアジュバントと組み合わせて投与するステップを含む方法を包含する。ヒトでの使用に適したアジュバントは、単独で用いても組み合わせで用いてもよい。ヒトでの使用に適したアジュバントとしては、例えばアルミニウム塩が挙げられる。アルミニウム塩としては、例えば、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル（アルハイドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）（商標））、リン酸アルミニウム、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム）、又は混合アルミニウム塩が挙げられる。ヒトでの使用に適したさらなるアジュバントとしては、例えば、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、及びＡＳ０４（水酸化アルミニウムとモノホスホリル脂質Ａとの組み合わせ）、及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドが挙げられる。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを特定の配列構成（ＣｐＧモチーフ）に含有する合成オリゴヌクレオチドである。これらのＣｐＧモチーフは、細菌ＤＮＡにおいて、哺乳類ＤＮＡと比較して２０倍高い頻度で存在する。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドはＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）によって認識され、強力な免疫刺激作用をもたらす。
【００４８】
[0053]ＨｅＶ及び／又はＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質と本明細書に記載の少なくとも１種のアジュバントとを含むワクチン及び免疫原性組成物の投与は予防用又は治療用のいずれでもあり得る。本発明の一態様において、組成物は予防用として有用である。予防用として提供される場合、ワクチン組成物は、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶ感染の何らかの検出又は徴候がある前に提供される。有効量の化合物の予防的投与は、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶ感染を防止すること又は後のＨｅＶ及び／又はＮｉＶ感染を減弱することに資する。
【００４９】
[0054]治療用として提供される場合、ワクチンが、実際の感染の徴候の検出に応じた有効量で提供される。組成物は、その組成物の投与がレシピエントに忍容し得るものである場合、「薬理学的に許容可能」といえる。そのような組成物は、投与される量が生理学的に有意義である場合、「治療的又は予防的に有効な量」で投与されるといえる。本発明のワクチン又は免疫原性組成物は、その存在により、レシピエント患者に検出可能な生理学的変化、例えば、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶの少なくとも１種の株に対する広範な反応性を有する液性又は細胞性免疫の強化がもたらされる場合、生理学的に有意義である。提供される防御は完全である必要はなく（つまり、ＨｅＶ又はＮｉＶ感染が完全に防止又は根絶される必要はなく）、コントロール集団と比較して有意な改善があればよい。防御は、疾患の徴候の重症性又は発症の急速性を緩和することに限定される場合がある。
【００５０】
[0055]本発明のワクチン又は免疫原性組成物は、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶの複数の株に対して耐性を付与し得る。本明細書において、ワクチンは、対象に投与されたときに、感染の症候若しくは状態を全体的若しくは部分的に減弱する（すなわち抑制する）又は個体を感染に対して全体的若しくは部分的に免疫化することに至る場合、感染を防御又は減弱するといえる。
【００５１】
[0056]本発明のワクチン又は免疫原性組成物の少なくとも１つは、本明細書に記載の薬学的組成物を使用して、意図した目的を達成する任意の手段により投与することができる。例えば、そのような組成物の投与は、様々な非経口経路、例えば、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経皮、又はバッカル経路によるものであり得る。本発明の一実施形態において、組成物は皮下投与される。非経口投与はボーラス注射によるものであってもよく、又は長時間の段階的還流によるものであってもよい。
【００５２】
[0057]能動的な特異的細胞免疫療法による細胞性免疫応答によって軽減され得る疾患又は状態の予防、抑制又は治療のための典型的なレジメンは、上記ワクチン組成物の有効量を投与することを含む。投与は、単回処置として行われるか、あるいは最長１週間〜約２４カ月の期間にわたって増強又は追加免疫用量の反復投与で行われる。例えば、第１回目の投与（０日目）から少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４日後に第２回目の投与が行われる。免疫原性又はワクチン組成物の用量は、０日目の初回用量に対して少なくてもよく、同じであってもよく、又は多くてもよい。
【００５３】
[0058]本発明によれば、ワクチン又は免疫原性組成物の「有効量」は、所望の生物学的効果（本件ではＨｅＶ及び／又はＮｉＶの少なくとも１種の株に対する細胞性又は液性免疫応答の少なくとも１つ）を達成するのに有効な量である。有効投与量は、対象の年齢、性別、健康及び体重、（もしあれば）併用する処置の種類、処置の頻度、所望の薬学的効果の性質に依存することが理解される。下記で提供される有効用量の範囲は、本発明を制限することを意図するものではなく、本発明の組成物を投与するために好適であり得る用量の範囲の例を表すものである。しかしながら、投与量は、当業者が過度の実験を行うことなく理解・決定し得るように個々の対象に応じて調整することができる。
【００５４】
[0059]本発明のワクチン及び免疫原性組成物のレシピエントは、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶに対する細胞性又は液性免疫応答を介して特別な免疫を獲得し得る任意の対象であり得、ここで、細胞性応答はＭＨＣクラスｉ又はクラスｉｉタンパク質によって媒介されるものである。哺乳類のうち、レシピエントは霊長目の哺乳類（例えば、ヒト、チンパンジー、類人猿、及びサル）であり得る。本発明の一実施形態において、本発明のワクチン又は免疫原性組成物を用いてヒトを処置する方法が提供される。対象は、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶに感染していてもよく、また、試験研究においてＨｅＶ又はＮｉＶ感染のモデルとなり得る。いくつかの実施形態において、対象は飼いならされた哺乳類であり、例えば、ウマ、雌ウシ、雄ウシ、スイギュウ、ヒツジ、ブタ（Ｍｉｎｇｙｉ（２０１０）、Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．、４１、３３）、ヤギ、イヌ（Ｂｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙ  Ａｌｅｒｔ−Ｈｅｎｄｒａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｕｐｄａｔｅ、２７  Ｊｕｌｙ  ２０１１、Ｐｒｅｓｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｂｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙ  Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ）又はネコを含む。いくつかの実施形態において、対象はニワトリを含む家禽類である。
【００５５】
[0060]本発明のワクチンは、ヘンドラウイルス感染に対する防御に使用される用量でニパウイルス感染に対する交差防御も示し、それ故、ニパウイルスに対しても有効なワクチン接種を提供する。
【００５６】
[0061]有効な免疫応答への言及は、有効な予防又は治療効果を直接的又は間接的にもたらす免疫反応に言及するものとして理解されるべきである。免疫原が、本明細書に記載のＨｅＶ又はＮｉＶ  Ｇ糖タンパク質を含む場合、そのような応答としては、ウイルス複製及び／又はウイルス排出の減少又は遮断、及び／又は動物の疾患徴候の減少が挙げられる。有効性は機能に関わる尺度であって、循環抗体の存在だけでは、該循環抗体がウイルス複製及び排出を遮断できることを必ずしも示さないことから、有効性は抗ＨｅＶ及び／又は抗ＮｉＶ抗体力価に言及するだけでは規定されないことが理解されるべきである。
【００５７】
[0062]また、例えば、本発明の可溶性Ｇタンパク質ポリペプチドがヘンドラ又はニパによる感染又は感染の疑いのある対象の免疫応答を増大させるために投与される場合、及び／又は本発明の抗体が受動免疫療法の一形態として投与される場合、組成物は、例えば、他の治療剤（例えば抗ウイルス剤）をさらに含むことができる。
【００５８】
[0063]後述の実施例４では、ワクチン接種を受けるウマで使用するために好適な一定の組成物の情報を提供する。ヘンドラウイルスに感染する可能性があり、それゆえ、ヘンドラ及びニパウイルスの両方の感染から動物及びヒトを防御するワクチン接種を忍容する他の動物に関しては概して以下の情報を適用することができ、また、そのような情報は当業者によって容易に適合させ得る。概して、伴侶動物（イヌ及びネコ）は、およそ２５マイクログラムのヘンドラ抗原を忍容し、２５〜１５０マイクログラムのＩＳＣアジュバントと、５：１：１の比率のサポニン、リン脂質及びステロールとを併用する組成物が有利であり得、この組成物は好ましいＩＳＣ組成物の１つであるが、本明細書に開示する任意の構成成分が使用される。伴侶動物に対しては、最終用量が約１ｍｌであることが好ましい。コポリマー系のアジュバントであるポリゲン（Ｐｏｌｙｇｅｎ）（商標）（ＭＶＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）も使用することができ、その量は約５〜１５％（ｖ／ｖ）であることが好ましい。
【００５９】
[0064]概して、大型の農業動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ）に対しては、抗原及びアジュバントの投与量（及び最終投与体積）は、本明細書でウマに対して提供された以外の量が適用可能であり、すなわち５０〜１００マイクログラムの抗原と、典型的には、約２５０マイクログラムのＩＳＣを使用することができ、最終体積は、例えば、１〜３ｍｌである。ブタに関していえば、代替的及び有効なアジュバント製剤としては、（ほぼ同じ量の抗原を含むものに関して）最終用量１〜３ｍｌにＩＳＣとイオン性ポリ多糖との混合物、特に１００ｍｇのＤＥＡＥデキストランと８００マイクログラムのＩＳＣとの混合物（さらに５：１：１のＱｕｉｌ  Ａ：ホスファチジルコリン：コレステロール（国際公開第２０００／４１７２０号パンフレットを参照））が挙げられる。
【００６０】
ワクチン接種動物の識別：
[0065]本発明は、健康なワクチン接種動物と、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶに曝露された又は感染している動物と、を識別する方法を包含する。ウイルス感染の間に、ＨｅＶ及びＮｉＶは、Ｇ糖タンパク質（Ｇ）以外のさらなるタンパク質、例えば、融合タンパク質（Ｆ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、リンタンパク質（Ｐ）、巨大タンパク質（Ｌ）及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）を発現する。これらのさらなるタンパク質は、これらのタンパク質に結合する抗体又はＴ細胞免疫の形態で動物において免疫反応を誘発する可能性がある。これらの他のタンパク質に対する抗体反応のレベルは、通常、酵素結合免疫アッセイ（ＥＩＡ）等のアッセイ法により測定し得る。本発明の免疫原性及びワクチン製剤は、いくつかの実施形態において、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶ抗原としてＧ糖タンパク質のみを含有し、したがって、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶのＧ糖タンパク質のみに対する抗体により免疫反応を誘発する。本明細書に記載の免疫原性組成物をワクチン接種された動物がその後ＨｅＶ又はＮｉＶに感染した場合、Ｇ糖タンパク質に対する追加免疫応答が起こるが、Ｇ糖タンパク質以外のいくつかのＨｅＶ及びＮｉＶタンパク質に対する抗体の存在にも変化が示されるであろう。したがって、融合タンパク質（Ｆ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、リンタンパク質（Ｐ）、巨大タンパク質（Ｌ）及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）のいずれかに対する抗体の存在は、ＥＩＡにより血清試料中のこれらのタンパク質に特異的な抗体の存在又は不在を決定して測定することができる。これらの他のタンパク質（すなわち、Ｇ糖タンパク質以外のタンパク質）のいずれかに対する抗体が検出される場合、該動物はＨｅＶ及び／又はＮｉＶに曝露された動物である。あるいは、これらの他のタンパク質に対する抗体が検出されず、Ｇタンパク質に結合する抗体のみが検出される場合には、該動物はワクチン接種を受けたにすぎない動物である。
【００６１】
[0066]本発明のＥＩＡは、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶに感染した動物と、本明細書に記載の免疫原性組成物を接種した健康な動物と、を検出及び識別することにおいて、特異性が高く、選択性も高い。本発明は、均一及び不均一な環境のいずれにおいても、ＥＬＩＳＡを含む多種類の分析手法を利用することができる。分析手法は、血液、血清、乳、他の抗体含有体液等の試料に対して行い得る。
【００６２】
[0067]いくつかの実施形態において、ＥＩＡで使用する抗体は、Ｇ糖タンパク質を用いたワクチン接種で誘導された抗体と唯一競合し、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶに感染した動物において誘導された抗体とは競合しない。これにより、ＨｅＶ及びＮｉＶ感染の血清学的診断が可能になるだけでなく、１回の分析でワクチン接種と感染とを識別することが可能になる。ＥＩＡ手法は、標準的な血液血清試料又は抗体を含む任意の体液若しくは分泌物に対して実施し得る。ＥＩＡ手法では、Ｇ糖タンパク質と、任意の他のＨｅＶ及び／又はＮｉＶウイルスタンパク質（例えば、融合タンパク質（Ｆ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、リンタンパク質（Ｐ）、巨大タンパク質（Ｌ）及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）が挙げられ、そのようなタンパク質は、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶに曝露されていないワクチン接種健康動物には存在しない）とに対するモノクローナル及び／又はポリクローナル抗体のいずれかを利用し得る。ＥＩＡは、任意の数の商業的に利用可能な、固定若しくは携帯式の手動型、半自動化型、ロボット工学的自動化型のＥＬＩＳＡ機器で、コンピュータ支援データ分析軽減ソフトウェア及びハードウェアを用いて又は用いずに、実施し得る。いくつかの実施形態において、健康なワクチン接種動物と、ＨｅＶ及び／又はＮｉＶに曝露された又は感染した動物と、を識別する方法を、家畜化された哺乳動物（例えば、ウマ、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ又はネコ）から単離した生物学的試料に対して行い得る。いくつかの実施形態において、対象はニワトリを含む家禽類である。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
【実施例】
【００６３】
[0068]以下の実施例はもっぱら説明のためのものであり、また、本発明のすべての実施形態を説明するものではなく、それ故、本発明の範囲を限定するものと見られるべきではない。
【００６４】
実施例１（ベクター構築物）：
[0069]ベクターは、膜貫通／細胞質テール欠失ＨｅＶ  Ｇ又はＮｉＶ  Ｇを発現するように構築した。完全長ＨｅＶ又はＮｉＶ  Ｇタンパク質のクローンｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅して、膜貫通ドメイン／細胞質テール欠失ＨｅＶ又はＮｉＶ  Ｇタンパク質をコードする約２６００のヌクレオチド断片を生成させた。
【００６５】
[0070]下記オリゴヌクレオチドプライマーをＨｅＶ  Ｇの増幅のために合成した。
ｓＨＧＳ：  ５’−ＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＡＴＴＡＣＡＣＣＡＧＡＡＣＧＡＣＴＧＡＴＡＡＴ−３’（配列番号５）
ｓＨＧＡＳ：  ５’−ＧＴＴＴＡＡＡＣＧＴＣＧＡＣＣＡＡＴＣＡＡＣＴＣＴＣＴＧＡＡＣＡＴＴＧＧＧＣＡＧＧＴＡＴＣ−３’（配列番号６）
【００６６】
[0071]下記オリゴヌクレオチドプライマーをＮｉＶ  Ｇの増幅のために合成した。
ｓＮＧＳ：  ５’−ＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＡＡＴＴＡＣＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＣＡＧＡＣＡＡ−３’（配列番号７）
ｓＮＧＡＳ：  ５’−ＣＴＣＧＡＧＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＴＡＣＡＴＴＧＣＴＣＴＧＧＴＡＴＣ−３’（配列番号８）
【００６７】
すべてのＰＣＲ反応は、Ａｃｃｕｐｏｌ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＧＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ  Ｃｏｒｐ）を用い、次のように設定して行った。初回９４℃×５分、次いで、９４℃×１分、５６℃×２分、７２℃×４分を２５サイクル。これらのプライマーにより、Ｓａｌ１部位に隣接されたｓＨｅＶ  Ｇ  ＯＲＦ及びＸｈｏ１部位に隣接されたｓＮｉＶ  Ｇ  ＯＲＦのためのＰＣＲ産物を生成した。ＰＣＲ産物をゲル精製した（Ｑｉａｇｅｎ）。ゲル精製後、ｓＨｅＶ  Ｇ及びｓＮｉＶ  Ｇを、ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。
【００６８】
[0072]ＰＳｅｃｔａｇ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を購入し、Ｓ−ペプチドタグ又はｍｙｃ−エピトープタグを含むように改変した。Ｓ−ペプチド並びに消化Ｋｐｎ１及びＥｃｏＲ１オーバーハングのための配列をコードする、オーバーラップしたオリゴヌクレオチドを合成した。
ＳＰＥＰＳ：  ５’−ＣＡＡＧＧＡＧＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＡＧＴＴＣＧＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＣＡＴＧＧＡＴＴＣＴ−３’（配列番号９）
ＳＰＥＰＡＳ：  ５’ＡＡＴＴＡＧＡＡＴＣＣＡＴＧＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＣＧＡＡＣＴＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＴＣＴＣＣＴＴＧＧＴＡＣ−３’（配列番号１０）
【００６９】
[0073]ｍｙｃ−エピトープタグ並びに消化Ｋｐｎ１及びＥｃｏＲ１オーバーハングのための配列をコードする、オーバーラップしたオリゴヌクレオチドを合成した。
ＭＴＳ：  ５’−ＣＧＡＡＣＡＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧ−３’（配列番号１１）
ＭＴＡＳ：  ５’−ＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＧＴＡＣ−３’（配列番号１２）
【００７０】
[0074]６４ｐｍｏｌのＳＰＥＰＳと６４ｐｍｏｌのＳＰＥＰＡＳとを混合し、６５℃へ５分間加熱し、次いでゆっくりと５０℃へ冷却した。６４ｐｍｏｌのＭＴＳと６４ｐｍｏｌのＭＴＡＳとを混合し、６５℃へ５分間加熱し、次いでゆっくりと５０℃へ冷却した。２つの混合物を希釈し、Ｋｐｎ１−ＥｃｏＲ１消化ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂへクローニングし、Ｓ−ペプチド修飾ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ又はｍｙｃ−エピトープ修飾ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂを生成した。すべての構築物は、最初に制限酵素により消化してスクリーニングを行い、さらに配列決定によって確認した。
【００７１】
[0075]ＴＯＰＯｓＧ構築物をＳａｌ１ゲル精製（Ｑｉａｇｅｎ）で消化し、Ｓ−ペプチド修飾ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ又はｍｙｃ−エピトープ修飾ｐＳｅｃＴａｇ２ＢのＸｈｏ１部位にインフレームでサブクローニングした。すべての構築物は、最初に制限酵素により消化してスクリーニングを行い、さらに配列決定によって確認した。
【００７２】
[0076]ＩｇκリーダーＳ−ペプチド−ｓＨｅＶＧ（ｓＧＳ−ｔａｇ）及びＩｇκリーダー−ｍｙｃタグ−ｓＨｅＶＧ（ｓＧｍｙｃ−ｔａｇ）構築物を、次いでワクシニアシャトルベクターｐＭＣＯ２にサブクローニングした。オリゴヌクレオチドＳＥＱＳ：  ５’−ＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡ−３’（配列番号１３）を合成し、オリゴヌクレオチドｓＨＧＡＳと併用して、ＰＣＲによってｓＧｓ−ｔａｇ及びｓＧｍｙｃ−ｔａｇを増幅した。すべてのＰＣＲ反応は、Ａｃｃｕｐｏｌ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＧＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）を用い、次の条件で行った。初回９４℃×５分、次いで、９４℃×１分、５６℃×２分、７２℃×４分を２５サイクル。これらのプライマーにより、Ｓａｌ１部位が隣接するＰＣＲ産物を生成した。ＰＣＲ産物をゲル精製した（Ｑｉａｇｅｎ）。ゲル精製後、ｓＧｓ−ｔａｇ及びｓＧｍｙｃ−ｔａｇをＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。ｓＧＳ−ｔａｇ及びｓＧｍｙｃ−ｔａｇをＳａｌ１で消化し、ｐＭＣＯ２のＳａｌ１部位にサブクローニングした。すべての構築物は、最初に制限酵素により消化してスクリーニングを行い、さらに配列決定によって確認した。続いて、真核細胞株での産生を容易にするために、コドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号１６）を生成した。
【００７３】
実施例２（ワクシニアを使用した可溶性Ｇタンパク質のタンパク質産生）：
[0077]タンパク質産生のために、コドン最適化配列を含有する遺伝子構築物を使用して、組換えｐｏｘウイルスベクターを生成した（ワクシニアウイルス、ＷＲ株）。次いで、ｔｋ選択及びＧＵＳ染色を利用した標準的な技術を用いて組換えｐｏｘウイルスを得た。簡単に言うと、ＣＶ−１細胞に、カルシウムリン酸トランスフェクションキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ｐＭＣＯ２  ｓＨｅＶ  Ｇ融合体又はｐＭＣＯ２  ｓＮｉＶ  Ｇ融合体のいずれかを遺伝子導入した。次いで、これらの単層にワクシニアウイルスのＷｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）野生株を多重感染度（ＭＯＩ）０．０５ＰＦＵ／細胞で感染させた。２日後、細胞ペレットを未精製の組換えウイルスのストックとして回収した。ＴＫ細胞に、２５μｇ／ｍｌの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の存在下、未精製の組換え体ストックを感染させた。２時間後、ウイルスを、１％低融点（ＬＭＰ）アガロース（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２５μｇ／ｍｌのＢｒｄＵを含有するＥＭＥＭ−１０オーバーレイを用いて置き換えた。インキュベーションの２日後、１％のＬＭＰアガロース、２５μｇ／ｍｌのＢｒｄＵ、及び０．２ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ＧＬＵＣ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含有するＥＭＥＭ−１０オーバーレイを追加的に加えた。２４〜４８時間後、青色のプラークを確認し、これを採集し、二重選択プラーク精製にさらに２回かけた。次いで、組換えワクシニアウイルスｖＫＢ１６（ｓＨｅＶ  Ｇ融合体）及びｖＫＢ２２（ｓＮｉＶ  Ｇ融合体）の増幅を行い、標準的方法で精製した。簡単に言うと、組換えワクシニアウイルスを、プラーク精製、細胞培養増殖、超遠心分離でのショ糖クッションペレット化、及びプラークアッセイによる滴定によって精製する。ｓＨｅＶ  Ｇの発現を細胞溶解物及び培養上清で確認した。
【００７４】
実施例３（２９３Ｆ細胞を使用した可溶性Ｇタンパク質のタンパク質産生）：
[0078]コドン最適化配列を含有する遺伝子構築物を使用して、２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、ＨｅＶ可溶性Ｇ糖タンパク質を発現する安定な細胞株を作製した。ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、形質転換及びＨｅＶ可溶性Ｇ糖タンパク質の発現を行ってもよい。形質転換された細胞を、１６２ｃｍ２組織培養フラスコに、３５ｍｌのＤＭＥＭ−１０と共に、播種する。細胞を接着させ、３７℃、５〜８％ＣＯ２下で数日間増殖させた。細胞がコンフルエントになったとき、１５０μｇ／ｍｌのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂを含むＤＭＥＭ−１０を入れた複数のフラスコ（フラスコ当たり３０ｍｌ）に分割した。細胞が７０〜８０％コンフルエントになったとき、３０ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、次いで、２０ｍｌの２９３  ＳＦＭ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、細胞を３７℃、５〜８％ＣＯ２下で一晩インキュベートした。翌日、細胞を、２００ｍｌのＳＦＭ  ＩＩ培地を入れた三角フラスコに移した。細胞を３７℃、５〜８％ＣＯ２下、１２５ｒｐｍで５〜６日間、細胞が死滅し始めるまで増殖させた。その際、上清を回収する。
【００７５】
[0079]各三角フラスコの培地を３５００ｒｐｍで３０分間遠心する。次いで、上清を２５０ｍｌの遠心ボトルに移し、１００００ｒｐｍで１時間回転させた。得られた上清を回収し、製造業者の推奨に従って、プロテアーゼ阻害剤をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と共に加え、最終濃度を０．１％にする。次いで、上清の可溶性Ｇタンパク質を０．２μｍの低タンパク質結合濾過膜で濾過する。
【００７６】
[0080]ＨｅＶｓＧを、Ｓ−タンパク質アガロースアフィニティーカラムを用いて精製する。総体積が２０ｍｌのＳ−タンパク質アガロース（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、ＸＫ２６カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填する。カラムを、総体積の１０倍の結合／洗浄緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で洗浄する。調製されたＨｅＶ  ｓＧ上清をカラムにかけ、流速３ｍｌ／分を維持する。カラムを総体積の１０倍（２００ｍｌ）の結合／洗浄緩衝液Ｉで洗浄し、続けて、総体積の６倍（１２０ｍｌ）の洗浄緩衝液１×洗浄緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌ、及び２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄する。
【００７７】
[0081]次いで、ポンプを止め、洗浄緩衝液を排出させ、ビーズの表面に達したら、３０ｍｌの溶出緩衝液（０．２Ｍクエン酸、ｐＨ２）を添加する。流出分の最初の１０ｍｌ（未だ洗浄緩衝液であるはずである）を回収し、次いで、溶出緩衝液を、ビーズを用いて１０分間インキュベートする。次いで、１５ｍｌの溶離液を、２５ｍｌの中和緩衝液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８）を含む５０ｍｌの滅菌円錐遠心管に回収する。ｐＨを中性に調節し、溶離及びインキュベーションを３回繰り返す。中和した溶離液をすべて組み合わせ、約４ｍｌに濃縮する。回収したＨｅＶ  ｓＧ（４ｍｌ）を、０．２μｍの低タンパク質結合濾過膜（０．２μｍのＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅを備えるＡｃｒｏｄｉｓｃ  １３ｍｍ  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｆｉｌｔｅｒ）に通して精製する。
【００７８】
[0082]ゲル濾過を利用してＨｅＶ  ｓＧをさらに精製することができる。品質管理分析と、純度及びオリゴマー状態の確認後、一定分量のＨｅＶ  ｓＧを四量体＋二量体、二量体、及び単量体の画分で溜め、−８０℃で保存する。
【００７９】
実施例４（ワクチン製剤の調製）：
[0083]ＩＳＣの調製の概略を図３に示し、以下でさらに説明する。
【００８０】
[0084]ステップ１：
９０ｇ／Ｌのデカノイル−ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ１０洗剤）溶液を、注射用水（ＷＦＩ）で調製する。溶液を加熱して、Ｍｅｇａ１０を確実にすべて溶解させた後、すぐにステップ２で使用するか、又は滅菌濾過する。
【００８１】
[0085]ステップ２：
２５ｇ／Ｌのコレステロール及び２５ｇ／Ｌのジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を含む溶液を、これらの成分をＭｅｇａ１０洗剤の保存溶液に溶解することによって調製する。溶液を加熱して、すべての成分を確実に溶解させた後、すぐにステップ３で使用するか、又は滅菌濾過する。
【００８２】
[0086]ステップ３：
等張緩衝生理食塩水（１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．２±１）（ＢＩＳ）をＷＦＩで調製し、すぐに使用しない場合には滅菌濾過する。
【００８３】
[0087]ステップ４：
Ｑｕｉｌ  ＡをＢＩＳ中で最終濃度１００ｇ／Ｌに調製し、すぐに使用しない場合には滅菌濾過する。
【００８４】
[0088]ステップ５：
ＩＳＣを、撹拌された温度調節容器（２２〜３７℃）に、予熱したＢＩＳ、コレステロール／ＤＰＰＣのＭｅｇａ１０溶液（１６０ｍｌ／Ｌ）、及びＱｕｉｌ  Ａ溶液（２００ｍｌ／Ｌ）を順次追加することによって製剤化する。反応物にＢＩＳを加えることによって目的の体積とする。
【００８５】
[0089]ステップ６：
製剤全体を、必要とされる温度（目標温度：２７℃；許容可能な操作温度範囲：２２〜３７℃）に平衡化し、次いで撹拌しながら１５分間インキュベートして、ＩＳＣ製剤の反応性を高める。ＩＳＣ溶液をステップ７でさらに処理するか、又は中間貯蔵のために滅菌濾過する。
【００８６】
[0090]ステップ７：
複合体化していない成分を除去するために、ＩＳＣ反応混合物を、温度制御（目標温度：２７℃；許容可能な操作温度範囲：２１〜３７℃）下で透析（膜：ハイドロザルト（Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ）３０ｋＤａ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ  Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ））により洗浄して、ＢＩＳに対し少なくとも２０回の体積交換を行う。
【００８７】
[0091]ステップ８：
透析されたＩＳＣを、透析に使用した膜と同じ膜を使用する限外濾過によっておよそ２倍に濃縮する。濾過系をＢＩＳで濯いでＩＳＣを元の体積に戻す。
【００８８】
[0092]ステップ９：
ＩＳＣを、０．２２μｍの酢酸セルロースフィルターに通す滅菌濾過を行って滅菌保存容器に移す。
【００８９】
[0093]ステップ１０：
ＩＳＣアジュバントを、ワクチン製剤で使用するために放出するまで２〜８℃で保存する。
【００９０】
[0094]免疫刺激組成物（２５０μｇ／ｍｌ）を、次いで、適切な量の可溶性ＨｅＶ  Ｇ糖タンパク質（例えば、５、５０、１００μｇ／ｍｌ）と組み合わせ、ＢＩＳで体積を調製する。
【００９１】
実施例５（ウマでの第１臨床実験）：
[0095]試験ワクチン１：
２５０μｇの免疫刺激複合体でアジュバントされた１００μｇ／用量の組換えヘンドラウイルス可溶性糖タンパク質（ｓＧ）。体積を生理食塩水で１ｍｌ／用量に調整。
【００９２】
[0096]試験ワクチン２：
２５０μｇの免疫刺激複合体でアジュバントされた５０μｇ／用量の組換えヘンドラウイルス可溶性糖タンパク質（ｓＧ）。体積を生理食塩水で１ｍｌ／用量に調整。
【００９３】
[0097]試験ワクチン３：
２５０μｇの免疫刺激複合体でアジュバントされた５μｇ／用量の組換えヘンドラウイルス可溶性糖タンパク質（ｓＧ）。体積を生理食塩水で１ｍｌ／用量に調整。
【００９４】
[0098]ウマ由来の血清学的及びチャレンジ防御データを２ロットのウマから回収し、高レベルの抗原を含有するワクチン（５０μｇ／用量及び１００μｇ／用量）を得た。
【００９５】
[0099]血清学的検査：
２頭のウマを各々、２１日間の間隔を空けて２回のワクチン投与（１００μｇのｓＧとＩＳＣを併用）により免疫化した。プライミング後及びチャレンジ前の血清学的検査により、ＨｅＶに対するワクチン誘導の血清転換が確認された（表１）。チャレンジ前のウイルス中和抗体レベルは、致死量の近縁のニパウイルスに曝露されたネコで防御効果があることが見出された抗体レベルに匹敵するものであった。アジュバントのみを適用されたウマ（ネガティブコントロール）では、ウイルスチャレンジ前にＨｅＶに対する抗体は生じなかった。
【００９６】
【表１】
2018030862.tif 000002
【００９７】
[00100]各ウマに、追加免疫を受けさせた後２７日間、ＢＳＬ４封じ込め施設で生ＨｅＶに曝露させた。ウイルスを鼻腔内投与（１×１０６ＴＣＩＤ５０）及び経口投与（１×１０６ＴＣＩＤ５０）した。チャレンジの際及びその後の観察期間にわたって、コントロールウマの識別は作業に参加するスタッフには知らされなかった。
【００９８】
[00101]Ｖ１についての臨床所見：
このウマは、ＨｅＶの曝露後の観察期間を通じて臨床的に良好な状態を維持していた。但し、チャレンジ後８日目に、頸静脈カテーテルの入口で局所的な感染が示された。これは、何ら疾患を構成することを示すものではなかった。ウイルスチャレンジ後９日目に、ウマを選択的に安楽死させた。総体的な死後の検査での異常は、１０ｃｍの腸間膜脂肪腫（偶発的所見）と、バルビツール酸系薬剤に起因する左肺心葉の腹面の先端におけるリンパ管の軽度の拡張に限定されていた。組織の初回スクリーニングにおいて、このウマに、病変又はＨｅＶ抗原の痕跡となるものは見当たらなかった。
【００９９】
[00102]Ｖ２についての臨床所見：
このウマは、３日目に一時的な軽度の鼻汁があった後、良好な状態を維持していたが、６日目に頸静脈カテーテル部位の局所的な炎症反応を伴って体温が上昇した。カテーテルを除去したが、病変は拡大し続け、ウマはかなりの興奮状態になったため、翌日（７日目）に、その雌ウマを長時間作用型ペニシリンで処置した。８日目に、体温も気質も通常に戻り、そしてその雌ウマを選択的に安楽死させた。総体的な死後の検査での異常は、バルビツール酸系薬剤に起因する右肺心葉の腹面先端におけるリンパ管の軽度の拡張に限定された。組織の初回スクリーニングにおいて、このウマに病変又はＨｅＶ抗原の痕跡となるものは見当たらなかった。詳細な検査は現在、完了しつつある。
【０１００】
[00103]Ｖ３についての臨床所見：
このウマは、４日目に、一時的な軽度の鼻汁があった後、良好な状態を維持していたが、６日目に局所的な徴候を有しない体温の上昇が現れた。この雌ウマは心拍数も高くなり、また皮膚にわずかなテンティングがあり、これは軽度の脱水症状及び縫上げたような（ｔｕｃｋｅｄ−ｕｐ）外観に通じるものであった。これらの一群の徴候は、本発明者らの実験条件下での急性ＨｅＶ感染に典型的な徴候であった。雌ウマの体温及び心拍数は、その後も１２時間にわたって増加し続け（図１及び２）、雌ウマは軽い抑鬱となり、７日目に人道的基準に基づいて雌ウマを安楽死させた。死後の検査で、肺の心葉におけるリンパ管の中等度の拡大と、胸膜肥厚及び浮腫が付随する８〜１０ｃｍ腹部の関与があった。
【０１０１】
[00104]組織学的検査において、血管壁のフィブリノイド壊死を伴う肺血管炎、小葉間隔壁の浮腫、及び巣状壊死性肺胞隔炎があった。肺、髄膜、脳柔組織、三叉神経節、顎下、気管支、鼠径部及び腎リンパ節、脾臓、肝臓、心臓、軟口蓋、副腎、腎糸球体、小腸及び大腸、卵巣、咽頭及び鼻甲介、並びに脾臓の胚中心、及び時に心筋細胞の血管の内皮及び中膜にＨｅＶ抗原の過剰な抗原の沈着があった。脊髄、喉嚢、膀胱、及び脳の嗅葉は陰性であった。組織学的及び免疫組織学的に最急性ＨｅＶ感染と一致するものであった。
【０１０２】
[00105]臨床試料の分子解析：
臨床観察期間を通じて、免疫化したウマＶ１及びＶ２から回収した生物学的試料のいずれからもＨｅＶの排出の痕跡は見当たらなかった。具体的には、曝露後のすべての日において、鼻奥の鼻腔スワブ又は血液のいずれからもゲノムは回収されなかった。
【０１０３】
[00106]対照的に、免疫化していないウマＶ３では、チャレンジ後３日目に鼻腔スワブでウイルスゲノムが検出された。連日の試料採取におけるＣｔ値の低減は上部気道におけるウイルス複製を示唆しており、ＨｅＶに曝露された後の無処置のウマ（Ｒｅｄｌａｎｄｓ  ２００８）について本発明者らの実験室で得られた初期の実験結果と一致していた。発熱直前の血液及びその後のすべての分泌物においてウイルスゲノムが見られたことは、他の臨床徴候（例えば抑鬱）についての最初の認識と合致し、先の所見とも一致している。
【０１０４】
【表２】
2018030862.tif 000003
【０１０５】
[00107]死後の試料：
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ（ＨｅＶ  Ｎ遺伝子）により、Ｖ３（コントロール）において、チャレンジウイルスの複製物が複数の組織に伝播して感染していることが確認された（表３）。最高レベルの複製は、先に報告されているように、肺、脾臓、腎臓、心筋、並びに上部及び下部気道に関わるリンパ組織に現れるようであった。免疫化したウマ（Ｖ１及びＶ２）の組織では、ウイルス複製の痕跡は見られなかった。
【０１０６】
【表３】
2018030862.tif 000004
【０１０７】
[00108]チャレンジ後の血清学的検査：
免疫化したウマＶ１及びＶ２では、ＨｅＶチャレンジ後、力価の上昇が見られなかった（表４）。このことは、これらの動物でチャレンジウイルスの顕著な複製がなかったことと一致する。チャレンジ後７日目の安楽死の時点で、コントロールウマＶ３に抗体は検出されなかった。これは、検出可能な抗体の生成に十分な時間がウイルス曝露と動物の死との間に存在しなかったと考えられ、ＲｅｄｌａｎｄｓのウマのＨｅＶについて本発明者らの実験室で得られた先の所見と一致する。
【０１０８】
【表４】
2018030862.tif 000005
【０１０９】
[00109]プライム−ブーストレジメンで、１００μｇのｓＧ＋ＩＳＣアジュバントのワクチン接種を行った２頭のウマ（Ｖ１及びＶ２）は、ＨｅＶ曝露の前に、ＨｅＶに対して血清転換した。ＩＳＣのみを適用したウマ（Ｖ３）は、チャレンジウイルスに対して血清陰性のままであった。
【０１１０】
[00110]致死量のＨｅＶのチャレンジ後、免疫化したウマは観察期間を通じて臨床的に良好な状態を維持し、ウマでのすべての実験的に誘導されたＨｅＶ発症までの時間を上回っていた。免疫の血清学的根拠を有しないウマ（Ｖ３）は、急性ＨｅＶと一致する臨床徴候を発症した後、安楽死させた。免疫化したウマでは、チャレンジ後に抗体力価の上昇が見られず、これらの動物においてチャレンジウイルスの複製が検出されなかったことと一致していた。
【０１１１】
[00111]免疫化したウマでは、毎日の臨床試料すべてでＰＣＲ試験陰性の結果が得られたことに反映されるように、ウイルス排出の痕跡は見られなかった。免疫化していないコントロールにおいて、ウイルスゲノムが、ウイルス曝露後３日目に鼻腔スワブから、発熱直前に血液から、及び発熱時にはすべての臨床試料から確認された。この排出パターンは、この施設での従前の試験でＨｅＶに曝露した無処置のウマで見られたものと一致する。
【０１１２】
[00112]免疫化したウマの死後の検査において、安楽死後、急性感染期間と推定される期間で回収したいずれの組織からも、ＨｅＶウイルス複製の痕跡となるものは見当たらなかった。対照的に、コントロールのウマでは、組織全体にＨｅＶゲノム及び抗原が急性ＨｅＶ感染と一致するパターンで分布しており、ＨｅＶ感染に典型的な脈管障害も同定された。
【０１１３】
実施例６（ウマでの第２臨床試験）：
[00113]３頭のウマを、それぞれ、２１日間の間隔を空けて２回のワクチン投与（５０μｇのｓＧとＩＳＣを併用）により免疫化した。プライミング後及びチャレンジ前の血清学的検査により、ＨｅＶに対するワクチン誘導血清転換が確認された（表５）。チャレンジ前のウイルス中和抗体レベルは、致死量の近縁ニパウイルスに曝露されたネコで防御効果があると見出されたレベルに匹敵するものであり、また、本明細書に記載の第１臨床試験でＨｅＶに曝露されたウマでのレベルに匹敵するものであった。アジュバントのみを適用されたウマでは、免疫化したウマのウイルスチャレンジ前に、ＨｅＶに対する抗体は生じなかった（データは示していない）。
【０１１４】
【表５】
2018030862.tif 000006
【０１１５】
[00114]免疫化した各ウマに、追加免疫を受けさせた後２７日間、ＢＳＬ４封じ込め施設で生ＨｅＶに曝露させた。ウイルスを鼻腔内投与（１×１０６ＴＣＩＤ５０）及び経口投与（１×１０６ＴＣＩＤ５０）した。４匹のモルモットを、これらのうち少なくとも１匹はＨｅＶ疾患で死ぬと推定して、この試験での病原性コントロールとして用いた。モルモットに腹腔内経路で５００００ＴＣＩＤ５０ＨｅＶを曝露させた。
【０１１６】
[00115]Ｖ４についての臨床所見：
このウマは、ＨｅＶへの曝露後の観察期間において臨床的に良好な状態を維持しており、体温及び心拍数も正常な範囲に留まっていた。このウマを、ウイルスチャレンジ後８日目に選択的に安楽死させた。死後の検査において全体的に異常は見られなかった。組織の初回スクリーニングにおいて、病変又はＨｅＶ抗原の痕跡となるものはこのウマでは見当たらなかった。詳細な検査は現在、完了しつつある。
【０１１７】
[00116]Ｖ５についての臨床所見：
このウマは、ＨｅＶへの曝露後の観察期間において臨床的に良好な状態を維持しており、体温及び心拍数も正常な範囲内に留まっていた（図２）。このウマを、ウイルスチャレンジ後７日目に選択的に安楽死させた。死後の検査において全体的に異常は見られなかった。組織の初回スクリーニングにおいて、病変又はＨｅＶ抗原の痕跡となるものはこのウマでは見当たらなかった。詳細な検査は現在、完了しつつある。
【０１１８】
[00117]Ｖ６についての臨床所見：
このウマは、ＨｅＶへの曝露後の観察期間において、臨床的に良好な状態を維持しており、体温及び心拍数も正常な範囲内に留まっていた（図２）。このウマを、ウイルスチャレンジ後９日目に選択的に安楽死させた。死後の検査において全体的に異常は見られなかった。組織の初回スクリーニングにおいて、病変又はＨｅＶ抗原の痕跡となるものはこのウマでは見当たらなかった。詳細な検査は現在、完了しつつある。
【０１１９】
[00118]モルモット：
４匹のモルモットのうち１匹（番号３）は、ＨｅＶチャレンジ後３日目に体重が減少し始めた。体重の減少は、神経学的徴候（頭部後屈、振戦）が現れた５日目まで続き、その後、モルモットを安楽死させた。死後の検査での異常は後腹膜結合組織での浮腫に限定された。
【０１２０】
[00119]組織学的検査では、ＨｅＶ抗原に関連して、肺血管炎、腎周囲血管の脈管炎、卵巣炎、及び非化膿性脳炎があった。組織学的及び免疫組織学的に急性ＨｅＶ感染と一致するものであり、チャレンジウイルスの病原性が確認された。
【０１２１】
[00120]臨床観察期間を通じて、Ｖ４、Ｖ５又はＶ６から回収されたいずれの生物学的試料においてもＨｅＶ排出の痕跡は見当たらなかった。但し、３日目にＶ６由来の直腸スワブにおいて３６．２のＣｔ値（ＨｅＶ  Ｎ遺伝子）がＴａｑＭａｎ  ＰＣＲの２つの複製物のウェルの１つで観察された。但し、第２のウェルでは増幅は示されなかった（表６）。具体的には、曝露後のすべての日において、鼻奥の鼻腔スワブ又は血液のいずれからもゲノムは回収されなかった。
【０１２２】
【表６】
2018030862.tif 000007
【０１２３】
[00121]死後の試料：免疫化したウマＶ４、Ｖ５又はＶ６において、組織にウイルス複製の痕跡は見当たらなかった。１匹のモルモット（番号３）において、チャレンジ後５日目にウイルスゲノムが血液（Ｃｔ３４．２）、脳、肺及び脾臓において検出され、この動物が急性ＨｅＶ感染であることの臨床的、組織的及び免疫組織学的所見が確認された（表７）。
【０１２４】
【表７】
2018030862.tif 000008
【０１２５】
[00122]チャレンジ後の血清学的検査：
免疫化したウマＶ４、Ｖ５及びＶ６では、ＨｅＶチャレンジ後、力価の上昇が見られなかった（表８）。このことは、これらの動物でチャレンジウイルスの顕著な複製がないことと一致する。
【０１２６】
【表８】
2018030862.tif 000009
【０１２７】
[00123]プライム−ブーストレジメンで５０μｇのｓＧ＋ＩＳＣアジュバントでワクチン接種を行った３頭のウマ（Ｖ４、Ｖ５及びＶ６）は、ＨｅＶ曝露の前にＨｅＶに対して血清転換した。ＩＳＣのみを適用された１頭のウマはチャレンジウイルスに対して血清陰性のままであった。
【０１２８】
[00124]ＨｅＶの致死量でのチャレンジ後、免疫化したウマは観察期間を通じて臨床的に良好な状態を維持し、ウマでのすべての実験的に誘導されたＨｅＶ発症までの時間を上回っていた。病原性コントロールとして用いた１匹のモルモットは、急性ＨｅＶと一致する臨床的徴候が発症した後に安楽死させた。免疫化したウマではチャレンジ後に抗体力価の上昇が見られず、これらの動物においてチャレンジウイルスの複製が検出されなかったことと一致していた。
【０１２９】
[00125]３日目のＶ６由来直腸スワブにおける１つの複製物を除いて、すべての日々の臨床試料についてＰＣＲ試験陰性の結果が得られたことから反映されるように、免疫化したウマにおいてウイルス排出の痕跡は見られなかった。この試験を繰り返す。１回の評価で同様の結果が観察されるならば、残留接種源が低レベルであることを表している。１匹の免疫化していないモルモットにおいては、ウイルスの曝露から５日後に、ウイルスゲノムが主要な器官及び血液において検出された。
【０１３０】
[00126]免疫化したウマの死後の検査において、安楽死後、急性感染期間と推定される期間で回収したいずれの組織からも、ＨｅＶウイルス複製の痕跡となるものは見当たらなかった。対照的に、感染が疑われるモルモットでは、組織全体にＨｅＶゲノム及び抗原が急性ＨｅＶ感染と一致するパターンで分布されており、ＨｅＶ感染に典型的な脈管障害も同定された。
【０１３１】
実施例７（ニパウイルスについての霊長類での臨床試験）：
[00127]統計：バイオセーフティレベル４（ＢＳＬ−４）の動物試験、特に非ヒト霊長類の試験の実施では、動物対象の数、得られ得る生物学的試料の体積、分析の独立した再試可能性が著しく制限され、従って、統計学的分析も限定される。結果として、データは、複製アッセイではなく複製試料から計算した平均値又は中央値で表され、エラーバーは複数の複製物にわたる標準偏差を表す。
【０１３２】
[00128]ウイルス：
ＮｉＶ−マレーシア（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ２１２３０２）は、米国疾病管理予防センターの特殊病原菌部門（Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  Ｂｒａｎｃｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）（ジョージア州、アトランタ）から入手した。ＮｉＶを、Ｒｏｃｋｘら、（２０１０）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、８４、９８３１でＨｅＶに対して記載されているように、ベロ細胞で増殖させ、力価を測定した。
【０１３３】
[00129]ワクチン製剤：
３種のｓＧＨｅＶワクチン製剤を用いた（１０μｇ、５０μｇ、又は１００μｇ）。ｓＧＨｅＶの生産及び精製は、従前に、Ｐａｌｌｉｓｔｅｒ  （２０１１）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２９、５６２３に記載されているように行った。各ワクチン製剤には、アルハイドロゲル（商標）（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と、完全なホスホロチオエート骨格を有するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）２００６（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）も含有させた。一定量のＯＤＮ２００６と、異なる量のｓＧＨｅＶ及びアルミニウムイオン（重量比１：２５）を含むワクチン用量を次のように処方した。１００μｇ用量：ｓＧＨｅＶ  １００μｇ，アルミニウムイオン  ２．５ｍｇ，及びＯＤＮ２００６  １５０μｇ；５０μｇ用量：ｓＧＨｅＶ  ５０μｇ，アルミニウムイオン  １．２５ｍｇ，及びＯＤＮ２００６  １５０μｇ；１０μｇ用量：ｓＧＨｅＶ  ５μｇ，アルミニウムイオン  ２５０μｇ，及びＯＤＮ２００６  １５０μｇ。すべての用量において、アルハイドロゲル（商標）とｓＧＨｅＶとを、ＯＤＮ２００６を添加する前に最初に混合した。各ワクチン用量を、ＰＢＳで１ｍｌに調節し、混合物を室温で少なくとも２〜３時間、回転輪上でインキュベートした後で注射した。各対象は同じ１ｍｌ用量でプライミング及びブースティングを受け、すべてのワクチン用量は筋肉内注射により投与された。
【０１３４】
[00130]動物：
体重が４〜６ｋｇの若齢成体アフリカミドリザル（ＡＧＭ）（クロロセブス・アエチオプス（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ））（Ｔｈｒｅｅ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）１０匹を別個に檻に入れた。対象にケタミン（１０〜１５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔をかけ、ｓＧＨｅＶのワクチン接種を−４２日目（プライム）及び−２１日目（ブースト）に行った。３匹の対象は１０μｇ用量を２回（ＡＧＭ１６、ＡＧＭ１７、ＡＧＭ１８）、３匹の対象は５０μｇの用量を２回（ＡＧＭ１３、ＡＧＭ１４、ＡＧＭ１５）、３匹の動物は１００μｇの用量を２回（ＡＧＭ１０、ＡＧＭ１１、ＡＧＭ１２）、１匹の対象（ＡＧＭ９）はアジュバントのみを投与した。０日目に、対象に麻酔をかけ、１×１０５ＴＣＩＤ５０（組織培養感染量中央値）のＮｉＶを含有する４ｍｌのダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を気管内接種した。対象に臨床検査のために麻酔をかけた。臨床検査には、体温、呼吸数、胸部Ｘ線写真、採血、鼻腔、口腔及び直腸粘膜のスワブが含まれ、感染後（ｐ．ｉ．）０、３、５、７、１０、１４、２１及び２８日目に行った。コントロール対象（ＡＧＭ９）は、感染後１０日目に、承認された人道的エンドポイントに従って安楽死させなければならなかった。他のすべての対象は、試験終了まで生存し、感染後２８日目に安楽死させた。剖検に際し、様々な組織を、ウイルス学的及び組織病理学的な目的で回収した。組織試料には、結膜、扁桃、中／鼻咽頭、鼻腔粘膜、気管、右気管支、左気管支、右肺上葉、右肺中葉、右肺下葉、左肺上葉、左肺中葉、左肺下葉、気管支リンパ節（ＬＮ）、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、副腎、膵臓、空腸、横行結腸、脳（前頭葉）、脳（小脳）、脳幹、頸部脊髄、脳下垂体、下顎骨ＬＮ、唾液ＬＮ、鼠径部ＬＮ、腋下ＬＮ、腸間膜ＬＮ、膀胱、精巣又は卵巣、大腿骨骨髄が挙げられる。ワクチン接種はＢＳＬ−２封じ込め条件で行った。接種スケジュール、チャレンジ及び生物学的試料回収日のタイムラインを図４に示す。
【０１３５】
[00131]ワクチン接種及びＮｉＶチャレンジ：
先に、本発明者らは、１０５ＴＣＩＤ５０（組織培養感染量中央値）のＮｉＶでＡＧＭを気管内接種すると、一様に死に至ることを実証した（Ｒｏｃｋｘら、（２０１０）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、８４、９８３１）。急速に進行する臨床的疾患がこれらの研究で示された。臨床的徴候としては、重度抑鬱、急性呼吸窮迫を導く呼吸器疾患、重症の神経疾患、及び機動性の著しい低下が挙げられ、安楽死に対して承認された人道的エンドポイントの基準に至るまでの時間は、７〜１２日であった。ここで、本発明者らは、ｓＧＨｅＶを用いたワクチン接種により、ＡＧＭにおけるＮｉＶ感染及び疾患が予防できるかを判定することを試みた。上記方法で記載されるように、１０、５０又は１００μｇの用量のｓＧＨｅＶを、ミョウバン及びＣｐＧ部分と混合した。各ワクチン製剤を３匹の対象に０日目（プライム）及び再度２１日目（ブースト）に皮下投与し、１匹のコントロール対象（ＡＧＭ９）には、アジュバントのみで上記と同じ日程でプライミング及びブースティングを行った。４２日目に、すべての対象に、１０５ＴＣＩＤ５０のＮｉＶを気管内接種した。コントロール対象（ＡＧＭ９）は、食欲の喪失、重症の持続性行動の変化（抑鬱、活動性の低下、丸まった姿勢）、血小板数の減少、及び末期疾患での呼吸数の段階的増加を示した。続いて、ＡＧＭ９は、急性呼吸窮迫を発症し、感染後１０日目に、承認された人道的エンドポイントに従って安楽死させなければならなかった。対照的に、ワクチン接種対象のいずれも臨床的な疾患を有さず、すべてのワクチン接種対象が試験終了まで生存した。カプラン−マイヤー生存曲線を図５に示す。
【０１３６】
[00132]コントロール対象におけるＮｉＶ媒介性疾患：
コントロール対象の総体的な病理学的変化は、以前、ＮｉＶ感染ＡＧＭで見られたものと一致していた（Ｇｅｉｓｂｅｒｔら、（２０１０）、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５、ｅ１０６９０）。脳の表面に巨脾及び血管の鬱血が現れ、肺の全葉が湿り、重かった。ＮｉＶ  ＲＮＡ及び感染ウイルスはＡＧＭ９血液試料からは回収されず、ウイルス血症の痕跡もなかった。ＡＧＭ９では、ＮｉＶ特異的ＩｇＭ並びに検出可能なＮｉＶ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡのレベルが顕著であった。組織試料のさらなる分析により、従前にＡＧＭで見られた広範なＮｉＶ感染と類似する過度のＮｉＶ組織屈性が明示された（Ｇｅｉｓｂｅｒｔら、（２０１０）、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５、ｅ１０６９０）。ＡＧＭ９は組織の大半にＮｉＶ  ＲＮＡを有しており、多数の組織から感染性ウイルスが回収された。顕著な病変としては、間質性肺炎、亜急性脳炎及び壊死及び白脾髄の出血があった。肺胞空間には、浮腫液、フィブリン、核崩壊及び細胞性破片、及び肺胞マクロファージが充満していた。多病巣性脳炎は、ウイルヒョウ・ロバン腔の拡大、適度な数のリンパ球、及び少ない好中球によって特徴づけられた。少数のこれらの炎症細胞が、隣接する柔組織内に延びていた。複数のニューロンが膨張し、空胞化し（変性）、又は核崩壊（壊死）により細片化していた。白脾髄の小胞の多病巣性胚中心は、出血及びフィブリン、並びに少数の好中球及び細胞性及び核崩壊性破片により失われていた。これらの所見は、脾臓での壊死及び胚中心の喪失と一致していた。過剰量のウイルス抗原が脳幹に存在しており、ＮｉＶが中枢神経系に著しい損傷を引き起こしていることを強調していた。
【０１３７】
[00133]ｓＧＨｅＶワクチン接種対象の防御：
すべての生物学的試料（チャレンジ後に回収した全血液試料及び剖検の際に回収したすべての組織を含む。）がＮｉＶ  ＲＮＡ陰性であり、いずれの試料からも感染性ウイルスは単離されなかった。ワクチン接種対象に由来する組織切片をより詳細に試験した結果、組織構築は正常のようであり、ＮｉＶ抗原はいずれの組織からも免疫組織化学的技術手段で検出されなかった。ワクチンが誘発する防御メカニズムをさらに分析するために、血清及び粘膜ｓＧＮｉＶ−及びｓＧＨｅＶ−特異的ＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡ、並びにＮｉＶ及びＨｅＶ血清中和力価をワクチン接種動物で測定した。図６に示されるように、チャレンジ前の７日間、最低用量のｓＧＨｅＶを投与した対象は、検出可能な抗原特異的血清ＩｇＭと最高レベルのｓＧＨｅＶ特異的血清ＩｇＧを示した。５０μｇのｓＧＨｅＶを投与した対象も、チャレンジ前の７日間に、検出可能レベルの血清ＩｇＭと最高レベルの血清ＩｇＧを示した。高用量の対象は検出可能な血清ＩｇＭを有さず、血清ＩｇＧレベルは、−７日目において他の２つのグループに対して著しく低かった。ＮｉＶチャレンジの日までに、高用量対象の血清ＩｇＧレベルが増加し、すべてのワクチン接種対象が同様のＩｇＧレベルを有していた。血清ＩｇＭレベルは、ＮｉＶチャレンジ後、いずれの対象においても変化しなかった。血清ＩｇＧレベルはＮｉＶチャレンジの日に中用量対象で減少し、ＩｇＧレベルはＮｉＶチャレンジ後すぐに低用量対象で減少した。興味深いことに、ＩｇＧレベルは、これらのグループのいずれにおいても感染後３日目及び５日目までに増加したが、チャレンジ前の７日間に提示されたＩｇＧレベルを超えることはなく、両方のグループの力価が感染後２８日までに顕著に減少した。
【０１３８】
[00134]反対に、血清ＩｇＧレベルは高用量グループで高いままであり、感染後２８日目において最も高くなった。抗原特異的血清ＩｇＡは、ワクチン接種後のすべての対象において検出された。しかしながら、検出レベルは非常に低く、チャレンジ前とチャレンジ後のレベルに有意な差はなかった（図６）。粘膜の抗原特異的ＩｇＡのわずかな増加が、感染後１４日目に低用量対象の鼻腔スワブから検出されたが、その増加レベルは非常にわずかであり、これらの粘膜抗体はチャレンジ後のＮｉＶの広がりを抑制する役割を果たしそうではなかった。血清中和試験（ＳＮＴ）の結果を表９に示す。すべてのワクチン接種対象に対して、ＨｅＶ特異的中和力価は同様に維持されたか、又は感染後２８日まで減少し、ＮｉＶ特異的中和力価は、チャレンジ前の力価が最も低い対象であっても、感染後７日までに顕著な変化を示さなかった。１匹の低用量対象及び１匹の高用量対象は、感染後１４日までにＮｉＶ  ＳＮＴ力価がログ増加し、１匹の中用量対象では、感染後２１日までにＮｉＶ  ＳＮＴ力価がログ増加した。他のすべてのワクチン接種動物において、ＳＮＴ力価の変化は一貫性がないか（力価が増加し、次いで減少する）又は顕著でなかった（力価は３〜４倍になるがログを超えない）。最後に、ＮｉＶ融合（Ｆ）エンベロープ糖タンパク質に対する血清転換がＮｉＶチャレンジ後のワクチン接種対象で測定された。血清抗ＮｉＶ  Ｆ  ＩｇＭの最小レベルが、低用量対象及び中用量対象においてそれぞれ感染後１０日目及び２１日目に検出され、これらの低いＭ．Ｆ．Ｉ．値はＮｉＶチャレンジ後の一次抗体反応が弱いことを示唆する。血清抗ＮｉＶ−Ｆ  ＩｇＭは高用量対象で検出されず、これらの動物では、チャレンジ後のウイルスの循環がほとんど又は全くないことが示唆された。
【０１３９】
【表９】
2018030862.tif 000010
【０１４０】
実施例８（ヘンドラウイルスについての霊長類での臨床試験）：
[00135]ヘンドラウイルスを用いたワクチン接種及びチャレンジを評価するために、第２の臨床試験をＡＧＭで行った。実施例７と同じ製剤をワクチンとして利用したが、ｓＧＨｅＶと、アジュバントとしてアルハイドロゲル（商標）のみ（ＯＤＮ２００６は含めなかった）と、を投与した別のグループとも比較した。動物に、−２１日目にワクチン接種を行い、０日目にブースティングを行い、２１日目にチャレンジを行った。特に断わらない限り、すべての条件は実施例７と同じとした。実験概要を下記に示す。
【０１４１】
【表１０】
2018030862.tif 000011
【０１４２】
[00136]結果：
両方のグループ（Ａ及びＢ）のすべての動物（ｎ＝４）が、１０５ＴＣＩＤ５０ヘンドラウイルスを気管内に接種後、ヘンドラウイルスチャレンジを生き延びた。コントロール対象は８日目に死亡した。ワクチン接種対象のいずれにおいても臨床的疾患は観察されず、健康で良好な状態が試験の終了時点まで維持された。
【０１４３】
[00137]本発明の他の実施形態及び用途は、本明細書に記載された本発明の説明及び実施形態を考慮すれば当業者には明らかである。本明細書で引用されるすべての参照文献（刊行物、並びに米国及び外国の特許及び特許出願を含む。）は、参照により個別にかつ全体として組み込まれる。明細書及び実施例は例示としてのみ考慮され、本発明の真の範囲及び趣旨は添付の特許請求の範囲に示されるものとする。
【図１】
2018030862.tif 000012
【図２】
2018030862.tif 000013
【図３】
2018030862.tif 000014
【図４】
2018030862.tif 000015
【図５】
2018030862.tif 000016
【図６】
2018030862.tif 000017
【配列表】
2018030862000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月8日(2017.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
[00137]本発明の他の実施形態及び用途は、本明細書に記載された本発明の説明及び実施形態を考慮すれば当業者には明らかである。本明細書で引用されるすべての参照文献（刊行物、並びに米国及び外国の特許及び特許出願を含む。）は、参照により個別にかつ全体として組み込まれる。明細書及び実施例は例示としてのみ考慮され、本発明の真の範囲及び趣旨は添付の特許請求の範囲に示されるものとする。
本発明の実施形態は例えば下記実施形態１〜３３を含む。
実施形態１：
ヘンドラ及び／又はニパウイルスＧ糖タンパク質と免疫刺激複合体（ＩＳＣ）と少なくとも１種の賦形剤とを、ヘンドラ及び／又はニパウイルスに感受性のある対象への投与後に該ヘンドラ及び／又はニパウイルスに対する免疫防御を誘発するのに有効な量で含むワクチンであって、
（ａ）ヘンドラ及び／又はニパウイルスＧ糖タンパク質は１用量当たり５〜１００μｇの量で存在し、
（ｂ）ＩＳＣはサポニン及びステロイドを含む、
ワクチン。
実施形態２：
サポニンはＱｕｉｌ  Ａである、実施形態１に記載のワクチン。
実施形態３：
ＩＳＣはリン脂質をさらに含む、実施形態１に記載のワクチン。
実施形態４：
可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質は、天然のヘンドラＧ糖タンパク質（配列番号２）の７３〜６０４位のアミノ酸からなる、実施形態１に記載のワクチン。
実施形態５：
可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質は、配列番号１６の６４〜１６６２位のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列によってコードされている、実施形態４に記載のワクチン。
実施形態６：
可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質は二量体形態で存在している、実施形態１に記載のワクチン。
実施形態７：
可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質二量体の各サブユニットは少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結されている、実施形態６に記載のワクチン。
実施形態８：
可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質は四量体形態で存在している、実施形態１に記載のワクチン。
実施形態９：
可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質の量は約５０〜約１００μｇであり、前記対象はウマである、実施形態１に記載のワクチン。
実施形態１０：
サポニンは、キラヤ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）から単離されたものである、実施形態１に記載のワクチン。
実施形態１１：
サポニンは、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、ＱＨ−Ｃ、又はＱＳ２１である、実施形態１０に記載のワクチン。
実施形態１２：
リン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジン酸（ホスファチデート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）、ホスホリルコリン（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（Ｃｅｒ−ＰＥ）、及びセラミドホスホリルグリセロールからなる群から選択される、実施形態３に記載のワクチン。
実施形態１３：
サポニンはＱｕｉｌ  Ａであり、リン脂質はＤＰＰＣであり、ステロイドはコレステロールである、実施形態３に記載のワクチン。
実施形態１４：
組成物におけるＱｕｉｌ  Ａ：ＤＰＰＣ：コレステロールの重量比は５：１：１である、実施形態１３に記載のワクチン。
実施形態１５：
前記対象は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、又はネコである、実施形態１〜８及び１０〜１４のいずれかに記載のワクチン。
実施形態１６：
前記対象における前記ヘンドラ及び／又はニパウイルスに対する中和抗体応答を生成することができる、実施形態１〜１５のいずれかに記載のワクチン。
実施形態１７：
中和抗体応答は前記対象におけるヘンドラ及び／又はニパウイルスの複製を減少させる、実施形態１６に記載のワクチン。
実施形態１８：
中和抗体応答は前記対象におけるヘンドラ及び／又はニパウイルスの排出を減少させる、実施形態１６に記載のワクチン。
実施形態１９：
前記対象は、ヘンドラ及び／又はニパウイルスに曝露された対象である、実施形態１６に記載のワクチン。
実施形態２０：
前記対象は、ヘンドラ及び／又はニパウイルス感染に罹患している対象である、実施形態１９に記載のワクチン。
実施形態２１：
筋肉内投与された場合に中和抗体応答を生成することができる、実施形態１６に記載のワクチン。
実施形態２２：
複数回投与で投与された場合に中和抗体応答を生成することができる、実施形態１６に記載のワクチン。
実施形態２３：
第２回目の投与が第１回目の投与から少なくとも約２１〜約２８日後に行われる、実施形態２２に記載のワクチン。
実施形態２４：
各用量は約５０又は約１００μｇの可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質を含む、実施形態２２に記載のワクチン。
実施形態２５：
前記対象はウマであり、各用量は約５０又は約１００μｇの可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質を含み、ＩＳＣはＱｕｉｌ  Ａ、ＤＰＰＣ、及びコレステロールを含む、実施形態１６〜２４のいずれかに記載のワクチン。
実施形態２６：
前記ウイルスはヘンドラウイルスである、実施形態１６〜２５のいずれかに記載のワクチン。
実施形態２７：
前記ウイルスはニパウイルスである、実施形態１６〜２５のいずれかに記載のワクチン。
実施形態２８：
実施形態１〜２７のいずれかに記載のワクチンをワクチン接種された対象から単離された生物学的試料と、ヘンドラ及び／又はニパウイルスに曝露された対象から単離された生物学的試料と、を識別する方法であって、生物学的試料において、融合タンパク質（Ｆ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、リンタンパク質（Ｐ）、巨大タンパク質（Ｌ）、及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）からなる群から選択されるＨｅＶ及び／又はＮｉＶウイルスタンパク質の少なくとも１つに対する抗体の存在を検出するステップを含む方法。
実施形態２９：
前記対象は、ヒト、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、又はネコである、実施形態２８に記載の方法。
実施形態３０：
前記ウイルスはヘンドラウイルスである、実施形態２８に記載の方法。
実施形態３１：
前記ウイルスはニパウイルスである、実施形態２８に記載の方法。
実施形態３２：
ヘンドラウイルス感染に対してウマにワクチン接種するための方法であって、実施形態９に記載のワクチンを前記ウマに２回投与することを含む方法。
実施形態３３：
第２回目の投与が第１回目の投与から少なくとも約２１〜約２８日後に行われる、実施形態３２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘンドラ及び／又はニパウイルスＧ糖タンパク質と免疫刺激複合体（ＩＳＣ）と少なくとも１種の賦形剤とを、ヒト対象への投与後にヘンドラ及び／又はニパウイルスに対する中和抗体の産生を誘発するのに有効な量で含む免疫原性組成物。
【請求項２】
可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質は、天然のヘンドラＧ糖タンパク質（配列番号２）の７３〜６０４位のアミノ酸からなる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質は、配列番号１６の６４〜１６６２位のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列によってコードされている、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質は二量体形態で存在している、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質二量体の各サブユニットは少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結されている、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質は四量体形態で存在している、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質の濃度は約５〜約１００μｇ／ｍｌである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
ＩＳＣはサポニンを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
サポニンは、キラヤ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）から単離されたものである、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
サポニンは、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、ＱＨ−Ｃ、又はＱＳ２１である、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
ＩＳＣはリン脂質及びステロイドを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
リン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジン酸（ホスファチデート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）、ホスホリルコリン（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（Ｃｅｒ−ＰＥ）、及びセラミドホスホリルグリセロールからなる群から選択される、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
ＩＳＣはサポニン、リン脂質及びステロイドを含み、サポニンはＱｕｉｌ  Ａであり、リン脂質はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）であり、ステロイドはコレステロールである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
組成物におけるＱｕｉｌ  Ａ：ＤＰＰＣ：コレステロールの重量比は５：１：１である、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
ヒト対象においてヘンドラ及び／又はニパウイルスに対する中和抗体応答を生成するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
中和抗体応答は前記対象におけるヘンドラ及び／又はニパウイルスの複製を減少させる、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
中和抗体応答は前記対象におけるヘンドラ及び／又はニパウイルスの排出を減少させる、請求項１５又は１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記対象は、ヘンドラ及び／又はニパウイルスに曝露された対象である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記対象は、ヘンドラ及び／又はニパウイルス感染に罹患している対象である、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
免疫原性組成物が筋肉内投与されるように用いられる、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
免疫原性組成物が複数回投与で投与されるように用いられる、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
第２回目の投与が第１回目の投与から少なくとも約２１〜約２８日後に行われる、請求項２１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
各用量は約５０又は約１００μｇの可溶性ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質を含む、請求項２１又は２２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物をワクチン接種されたヒト対象から単離された生物学的試料と、ヘンドラ及び／又はニパウイルスに曝露されたヒト対象から単離された生物学的試料と、を識別する方法であって、生物学的試料において、融合タンパク質（Ｆ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、リンタンパク質（Ｐ）、巨大タンパク質（Ｌ）、及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）からなる群から選択されるＨｅＶ及び／又はＮｉＶウイルスタンパク質の少なくとも１つに対する抗体の存在を検出するステップを含む方法。
【請求項２５】
前記ウイルスはヘンドラウイルスである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ウイルスはニパウイルスである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ヒト対象においてヘンドラ及び／又はニパウイルスに対する中和抗体応答を生成するための免疫原性組成物であって、ヘンドラウイルス可溶性Ｇ糖タンパク質を含む免疫原性組成物。
【請求項２８】
アジュバントをさらに含む、請求項２７に記載の免疫原性組成物。
【外国語明細書】
2018030862000001.pdf