(57)【要約】【課題】細胞の培養に用いられる培養液（培地）が「血清を包含しない培養液」であるのか或いは「血清を包含する培養液」であるのかを、簡易に且つ確実に判定することが出来る判定システム及び判定方法の提供。【解決手段】血清を包含するか否かを判定するべき培養液を収容する収容装置（１）と、インターフェロンγ供給装置（２）と、混合装置（３）と、培養液に培養するべき細胞を供給する細胞供給装置（４）と、細胞が供給された培養液を恒環境下で静置して収容する培養容器（５）と、培養細胞の蛍光強度を分析する分析装置（６）と、分析結果を解析する判断装置（７）備え、判断装置（７）はヒトの２型抗原提示分子が発現したか否かを判定する機能と、発現していない場合には培養液に血清が包含されないと判定する機能と、発現した場合には培養液に血清が包含されると判定する機能を有している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清を包含するか否かを判定するべき培養液を収容する収容装置と、
収容装置に収容された培養液にインターフェロンγを供給するインターフェロンγ供給装置と、
収容装置内の培養液とインターフェロンγを均一に混合する混合装置と、
培養液に培養するべき細胞を供給する細胞供給装置と、
培養するべき細胞が供給された培養液を収容する収容装置を恒環境下で静置して収容する培養容器と、
培養された細胞における蛍光強度を分析する分析装置と、
分析装置の結果を解析する判断装置を備え、
判断装置はヒトの２型抗原提示分子が発現したか否かを判定する機能と、ヒトの２型抗原提示分子が発現していない場合には培養液には血清が包含されていないと判定する機能と、ヒトの２型抗原提示分子が発現した場合には培養液には血清が包含されていると判定する機能を有していることを特徴とする判定システム。
【請求項２】
培養容器において細胞を培養する時間は１２時間以上である請求項１の判定システム。
【請求項３】
血清を包含するか否かを判定するべき培養液を収容装置に収容する工程と、
インターフェロンγ供給装置により収容装置に収容された培養液にインターフェロンγを供給する工程と、
混合装置により収容装置内の培養液とインターフェロンγを均一に混合する工程と、
細胞供給装置により培養液に培養するべき細胞を供給する工程と、
培養容器内で、培養するべき細胞が供給された培養液を収容する収容装置を恒環境下で静置して細胞を培養する工程と、
培養された細胞にヒトの２型抗原提示分子が発現したか否かを判定する工程と、
ヒトの２型抗原提示分子が発現していない場合には培養液には血清が包含されていないと判定する工程と、
ヒトの２型抗原提示分子が発現した場合には培養液には血清が包含されていると判定する工程を有していることを特徴とする判定方法。
【請求項４】
細胞を培養する工程で細胞を培養する時間は１２時間以上である請求項３の判定方法。
【請求項５】
血清が包含されていない培養液を用いて培養され、インターフェロンγを添加してもヒトの２型抗原提示分子が発現しないことを特徴とする細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞（例えば脂肪由来）の培養に用いられる培養液（或いは培地）に関する。より詳細には、本発明は培養液に血清が包含されているか否かを判定する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種疾病に幹細胞を投与する治療が効果的であることが、近年、広く知られている。その際に、幹細胞を安全且つ効率的に培養することが必要である。そして幹細胞投与以外の分野においても、細胞を安全且つ効率的に培養する必要性が存在する。
細胞（例えば脂肪由来の間葉系幹細胞）を培養するに際しては、培養液中に培養するべき細胞を投入して、所定の環境（例えば３７℃、５％ＣＯ２の環境）で保存することにより行われるのが一般的である。
【０００３】
ここで、上述した培養液が血清を含んでいると（所謂「血清培地」であると）、培養液中で培養されるべき細胞に異種抗原が取り込まれてしまい、投与した際に免疫反応を起こしてしまう恐れがある。
また、血清中に混入した病原体による感染症の恐れも存在する。さらに、血清はロットにより成分が異なることが知られており、血清を用いて培養を行う際には培養工程が不均質であることが問題となる。
それに加えて、血清を含む培養液で培養される細胞の特性が当該培養液中に混在する血清に依存するため、培養された細胞の特性の幅が広くなってしまうという問題も存在する。
【０００４】
上述した不都合を解消するためには、血清を包含しない培養液（所謂「無血清培地」）を用いることが好ましい。
しかし、現状で市販されている培養液の中には、血清含有量が比較的少ないものを「低血清培地」等と表記して販売しているケースも存在している。そのため、医療機関や研究機関の様に細胞を培養するために細胞培養液を購入する者（ユーザー）にとって、安全性、安定性が高い培養液（血清を包含しない培養液）であるか、安全性、安定性が低い培養液（血清を包含する培養液）であるかを判定することが困難な場合が多い。
特に（幹細胞投与等の）医療分野で細胞を培養する場合には、培養液の安全性、安定性が高い「血清を包含しない培養液」を使用したいという要請が非常に強い。それにもかかわらず、血清包含しない培養液であるか否かを簡易に且つ確実に判定する技術は、現状では提案されていない。
【０００５】
その他の従来技術として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてサンプル中の核酸の量を検出する技術が提案されている（例えば特許文献１参照）。
しかし、係る従来技術（特許文献１）は培養液が血清を包含するか否かを判定することを目的とはしていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００６／１０２５６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上述した従来技術の問題点に鑑みて提案されたものであり、細胞の培養に用いられる培養液（培地）が「血清を包含しない培養液」であるのか或いは「血清を包含する培養液」であるのかを、簡易に且つ確実に判定することが出来る判定システム及び判定方法の提供を目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の判定システム（１００）は、
血清を包含するか否かを判定するべき培養液を収容する収容装置（１：容器）と、
収容装置（１）に収容された培養液にインターフェロンγを供給するインターフェロンγ供給装置（２：インターフェロンγ滴下ユニット）と、
収容装置（１）内の培養液とインターフェロンγを均一に混合する混合装置（３）と、
培養液（混合装置でインターフェロンγと混合された培養液）に培養するべき細胞を供給する細胞供給装置（４：細胞供給ユニット或いはピペット等）と、
培養するべき細胞が供給された培養液を収容する収容装置（１）を恒環境下（例えば、３７℃、５％ＣＯ２環境下）で静置して収容する培養容器（５：恒環境ユニット）と、
培養された細胞における蛍光強度を分析する分析装置（６：例えば、フローサイトメーター或いはイメージングサイトメーター）と、
分析装置の結果を解析する判断装置（７：判断ユニット：例えばＰＣ等の演算機能を備えた情報処理装置）を備え、
判断装置（７）はヒトの２型抗原提示分子（例えばＨＬＡ−ＤＲ）が発現したか否かを判定する機能と、ヒトの２型抗原提示分子が発現していない場合には培養液には血清が包含されていないと判定する機能と、ヒトの２型抗原提示分子が発現した場合には培養液には血清が包含されていると判定する機能を有していることを特徴としている。
【０００９】
本発明の判定システム（１００）において、前記培養容器（５）と前記分析装置（6）との間に、培養された細胞の一部を、蛍光標識されたヒト２型抗原提示分子を認識する抗体（例えば抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体）で処理し、且つ、培養された細胞の一部をどの様な分子も認識しないネガティブコントロール抗体（陰性コントロール抗体）で処理する機能を有する抗体処理ユニット（１１）を配置することが好ましい。
【００１０】
また本発明の判定方法は、
血清を包含するか否かを判定するべき培養液を収容装置（１：容器）に収容する工程と、
インターフェロンγ供給装置（２：インターフェロンγ滴下ユニット）により収容装置（１）に収容された培養液にインターフェロンγを供給する工程と、
混合装置（３）により収容装置（１）内の培養液とインターフェロンγを均一に混合する工程と、
細胞供給装置（４：細胞供給ユニット：ピペット等）により培養液（混合装置でインターフェロンγと混合された培養液）に培養するべき細胞を供給する工程と、
培養容器（５：恒環境ユニット）内で、培養するべき細胞が供給された培養液を収容する収容装置（１）を恒環境下（例えば、３７℃、５％ＣＯ２環境下）で静置して細胞を培養する工程と、
培養された細胞にヒトの２型抗原提示分子（例えばＨＬＡ−ＤＲ）が発現したか否かを判定する工程と、
ヒトの２型抗原提示分子が発現していない場合には培養液には血清が包含されていないと判定する工程と、
ヒトの２型抗原提示分子が発現した場合には培養液には血清が包含されていると判定する工程を有していることを特徴としている。
【００１１】
本発明の判定システム（１００）及び判定方法において、インターフェロンγを添加した後、細胞を培養する時間（培養容器５において細胞を培養する時間）は１２時間以上であり（細胞を培養する工程で細胞を培養する時間は１２時間以上であり）、特に４８時間以上培養することが好ましい。
そして本発明の判定システム（１００）及び判定方法において、インターフェロンγの濃度は１００ユニット／ｍｌ以上であり、特に４００ユニット／ｍｌ以上であるのが好ましい。
【００１２】
また本発明の判定方法において、培養された細胞にヒトの２型抗原提示分子（例えばＨＬＡ−ＤＲ）が発現したか否かを判定する工程では、前記培養する工程で培養された細胞の一部を、蛍光標識されたヒト２型抗原提示分子を認識する抗体（例えば抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体）で処理し、且つ、一部をどの様な分子も認識しないネガティブコントロール抗体（陰性コントロール抗体）で処理する工程（抗体処理工程）を有することが好ましい。
また本発明の細胞は、血清が包含されていない培養液を用いて培養され、インターフェロンγを添加してもヒトの２型抗原提示分子（例えばＨＬＡ−ＤＲ）が発現しないことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１３】
上述の構成を具備する本発明によれば、インターフェロンγを添加し、例えば脂肪由来の間葉系幹細胞を培養した後に、当該幹細胞（例えば脂肪由来の間葉系幹細胞）においてヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ−ＤＲが発現したか否かを測定することで、培養液中に血清が含まれているかどうかを判定することができる。
換言すれば、本発明において、培養液に血清が包含されている場合に、当該培養液にインターフェロンγを添加して、細胞（例えば脂肪由来の間葉系幹細胞）を培養すると、当該細胞において２型抗原提示分子の一種であるＨＬＡ−ＤＲが発現するので、当該細胞を培養した結果、２型抗原提示分子（例えばＨＬＡ−ＤＲ）が発現すれば培養液中に血清が包含されていると判定され、２型抗原提示分子（例えばＨＬＡ−ＤＲ）が発現しなければ培養液中に血清が包含されていないと判定される。
そのため本発明によれば、細胞を培養するための培養液が成分として血清を包含するか否かを、容易且つ確実に判定することが可能である。
【００１４】
上述した様に、本発明によれば培養液に血清が含まれているか否かを容易且つ確実に判定することが出来るので、培養液を本発明により判定することによって、当該培養液で培養された細胞（例えば脂肪由来の間葉系幹細胞）が、血清存在下で培養された細胞であるか否かを識別することが出来る。
幹細胞投与治療において、血清存在下で培養された細胞は感染症等に汚染される危険性が高いので、その様な幹細胞が投与された患者は感染症等に罹患する可能性が高くなり、危険である。本発明により血清存在下で培養された細胞であるか否かを識別することにより、感染症発症等の危険性が少ない幹細胞を患者に投与することが出来て、幹細胞投与における安全性をさらに向上することが出来る。
【００１５】
さらに、上述した培養液が血清を含んでいないため（所謂「無血清培地」であるため）、培養液中で培養されるべき細胞に異種抗原が取り込まれてしまうことがなく、患者に投与した場合には免疫反応を起こしてしまう恐れがない。
さらに、血清を含まない培養液で細胞を培養するので、血清を包含する培養液の場合とは異なり、培養された細胞の特性は血清に依存することが無く、細胞の特性の幅が広くなってしまうことが防止される。
【００１６】
これに加えて、本発明によれば、培養液にヒト血清及び／又は動物（例えば牛）の血清を混合したか否かを判定することが出来るので、ウシ血清を用いた培養液を識別する従来技術（Ｎｅｕ５Ｇｃを測定する技術）とは異なり、ヒト血清を使用して培養された細胞であるか否かをも判定することが出来る。
さらに本発明により、血清が包含される培養液でインターフェロンγを添加して幹細胞（例えば脂肪由来の間葉系幹細胞）を培養すると、当該培養された細胞において２型抗原提示分子が発現することが明らかになった。
また本発明の細胞は、血清が包含されていない培養液で培養されているため、異種抗原が取り込まれてしまうことはなく、投与した際に免疫反応を起こしてしまう恐れがない。また、血清中に混入した病原体による感染症も存在しない。さらに、培養工程が均質であり、培養された細胞の特性の幅が広くなってしまうこともない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の実施形態のブロック図である。
【図２】本発明の実施形態における判定の手順を示すフローチャートである。
【図３】血清を含まない培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示す特性図であり、（Ａ）はインターフェロンγを添加していない培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示し、（Ｂ）はインターフェロンγを添加した培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示す。
【図４】血清を混入した培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示す特性図であり、（Ａ）はインターフェロンγを添加していない培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示し、（Ｂ）はインターフェロンγを添加した培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示す。
【図５】血清を含まない培養液にウシ胎児血清を添加して培養した細胞と、ヒト血清を添加して培養した細胞の蛍光強度特性を示す特性図であり、（Ａ）はウシ胎児血清を添加したがインターフェロンγを添加していない培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示し、（Ｂ）はウシ胎児血清及びインターフェロンγを添加した培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示し、（Ｃ）はヒト血清を添加したがインターフェロンγを添加していない培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示し、（Ｄ）はヒト血清及びインターフェロンγを添加した培養液で培養された細胞の蛍光強度特性を示す。
【図６】血清を混入した培養液にインターフェロンγを添加した培養液で１２時間培養した細胞の蛍光強度特性を示す特性図である。
【図７】図６と同様に血清を混入した培養液にインターフェロンγを添加した培養液で１２時間培養した細胞の蛍光強度特性を示す特性図であって、インターフェロンγの添加量が図６よりも多い場合の特性図である。
【図８】血清を混入した培養液にインターフェロンγを添加した培養液で４８時間培養した細胞の蛍光強度特性を示す特性図である。
【図９】図８と同様に血清を混入した培養液にインターフェロンγを添加した培養液で４８時間培養した細胞の蛍光強度特性を示す特性図であって、インターフェロンγの添加量が図８よりも多い場合の特性図である。
【図１０】ＰＣＲ法を用いて血清を混入した培養液で培養された細胞にヒトの２型抗原提示分子ＨＬＡ−ＤＲが発現したか否かを測定した実験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、添付図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。
最初に図１、図２を参照して、本発明の実施形態に係る判定システム及び判定方法について説明する。
図１において、全体を符号１００で示す判定システム１００において、細胞の移動（或いは判定工程の順序）が矢印で表示されている。図１で示す判定システム１００は、収容装置１（容器）、インターフェロンγ供給装置２（インターフェロンγ滴下ユニット）、混合装置３（手動によるピペッティングを含む）、細胞供給装置４（細胞供給ユニット：ピペット等）、培養容器５（恒環境ユニット）、分析装置６（蛍光強度分析ユニット）、判断装置７（判断ユニット：例えばＰＣ等の演算機能を備えた情報処理装置）を備える。
図１において、符号ＣＦは培養液、符号ＳＣは培養するべき細胞（例えば脂肪由来の間葉系幹細胞）、符号ＣＣは培養した細胞（例えば脂肪由来の間葉系幹細胞）を表す。
【００１９】
判定システム１００において、収容装置１（容器）は、培養液供給ユニット８から供給される培養液ＣＦ（血清を包含するか否かを判定するべき培養液）を収容する。細胞が培養されるまでの工程（図２のステップＳ２で所定時間が経過するまで）では、判定対象である培養液ＣＦは収容装置１（容器）内に収容された状態となる。
インターフェロンγ供給装置２（インターフェロンγ滴下ユニット）は、収容装置１に収容された培養液ＣＦ（判定対象の培養液）に対してインターフェロンγを供給する機能を有している。
図示の実施形態では、培養液ＣＦにインターフェロンγを添加し、脂肪由来の間葉系幹細胞を培養した後に、当該幹細胞においてヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ−ＤＲが発現したか否かを測定することにより、培養液中に血清が含まれているかどうかを判定することができる。
【００２０】
混合装置３は、収容装置１内の培養液ＣＦと培養液ＣＦに供給されたインターフェロンγを均一に混合する機能を有する。混合装置３は従来公知の装置であり、収容装置１を載置する載置部３Ａと、載置部３Ａに水平方向の往復運動を付与する運動部３Ｂを有しており、混合に際して収容装置１を往復運動せしめ、以て、収容装置１内の培養液ＣＦとインターフェロンγを均一に混合する機能を有している。
なお本明細書において、「混合装置」なる文言は、上述した様な電動装置のみならず、オペレータの手動によるピペッティングを包含する趣旨で用いられている。
細胞供給装置４（細胞供給ユニット）は、混合装置３でインターフェロンγと混合された培養液ＣＦ（判定対象の培養液）に培養するべき細胞ＳＣを供給する。実施形態では、培養するべき細胞ＳＣとして、脂肪由来の間葉系幹細胞を使用している。細胞供給装置４についても、自動装置のみならず、オペレータがピペット等を使用する場合を包含する趣旨である。
【００２１】
培養容器５（恒環境ユニット）は、培養するべき細胞ＳＣが供給された培養液ＣＦ（判定対象）を収容している収容装置１が収容され、静置された際に、細胞の培養に適切な環境を提供、維持する機能を有している。図示の実施形態では、培養容器５内では温度３７℃、５％ＣＯ２の培養環境が維持されている。
培養容器５では、インターフェロンγが混合し、培養するべき細胞ＳＣが供給された培養液ＣＦ（判定対象の培養液）が収容され、温度３７℃、５％ＣＯ２の培養環境下に静置されて、細胞ＳＣが培養される。
【００２２】
培養容器５と分析装置６（蛍光強度分析ユニット）の間には、抗体処理ユニット１１が配置されており、培養容器５で培養された細胞は、抗体処理ユニット１１に供給される。抗体処理ユニット１１では、培養容器５から供給された細胞の一部を、蛍光標識された抗ヒト２型抗原提示分子を認識する抗体（例えば抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体）で処理し、当該細胞の一部をどの様な分子も認識しないネガティブコントロール抗体（陰性コントロール抗体）で処理する機能を有している。
後述するように、血清を含む培養液で培養された細胞を、例えば抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体で処理し、且つ、ネガティブコントロール抗体で処理し、その様な処理がされた細胞を分析装置６、例えばフローサイトメーター或いはイメージングサイトメーターで分析すると、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体で処理された細胞は、図４（Ｂ）の特性Ｂ２で示す様な蛍光強度特性を示し、ネガティブコントロール抗体で処理された細胞は、図４（Ｂ）の特性Ｂ１で示す様な蛍光強度特性を示す。
換言すれば、抗体処理ユニット１１を設けることにより、図３以降で説明する蛍光強度特性を用いて培養液に血清が包含されているか否かを判定するに際して、判定の対象となる細胞における蛍光強度特性が、ＨＬＡ−ＤＲの発現が誘導されなかった場合の特性と同時に表示される。
【００２３】
分析装置６（蛍光強度分析ユニット）は、細胞における蛍光強度を計測し、分析する機能を有する従来公知の装置（例えばフローサイトメーター、イメージングサイトメーター）であり、培養容器５で培養された細胞である細胞ＣＣが分析装置６で分析される。分析装置６による分析の結果、細胞ＣＣの蛍光強度特性を把握することが出来る。
判断装置７（判断ユニット）は、分析装置６の分析結果を解析し、細胞ＣＣの蛍光強度特性を決定し、培養された細胞ＣＣにヒトの２型抗原提示分子（例えばＨＬＡ−ＤＲ）が発現したか否か、すなわち培養液中に血清が包含されているか否かを判定する機能を有している。なお、フローサイトメーターは図１における分析装置６に相当するが、イメージングサイトメーターは図１における分析装置６と判断装置７とを組み合わせに相当する。
【００２４】
判断装置７はＰＣ等の演算機能を備えた情報処理装置であって、分析装置６の分析結果を解析し、培養された細胞ＣＣの蛍光強度特性を決定する機能と、当該蛍光強度特性からヒトの２型抗原提示分子（例えばＨＬＡ−ＤＲ）が発現したか否かを判定する機能と、培養された細胞ＣＣにヒトの２型抗原提示分子が発現していない場合には培養液ＣＦには血清が包含されていないと判定する機能と、培養された細胞ＣＣにヒトの２型抗原提示分子が発現した場合には培養液ＣＦには血清が包含されていると判定する機能を有している。
また、判断装置７は、本体部７Ａと表示部７Ｂを有し、表示部７Ｂに決定された蛍光強度特性その他の分析結果、判断結果を表示する機能を有している。図示はされていないが、情報処理装置に代えてオペレータにより「培養液ＣＦには血清が包含されているか否か」を判定することが可能であり、本明細書における「判断装置」という文言はその様な場合を包含する趣旨で用いられている。
なお、分析結果である蛍光強度特性からヒトの２型抗原提示分子（例えばＨＬＡ−ＤＲ）が発現したか否かを判定する手法に関しては、図３〜図９を参照して後述する。
【００２５】
次に、図示の実施形態において、培養液が血清を包含するか否かの判定手順（工程）を、主として図２のフローチャートを参照して説明する。
ステップＳ１では、血清を包含するか否かを判定するべき培養液を培養液供給ユニット８から収容装置１に供給し、収容装置１に収容された培養液にインターフェロンγ供給装置２によりインターフェロンγを供給する。
そして、インターフェロンγを供給した培養液を収容した収容装置１を混合装置３の載置部３Ａに載置し、収容装置１に往復運動を付与して培養液とインターフェロンγを均一に混合する。なお、上述した様に、ステップＳ１における混合は手動によるピペッティングであっても良い。
【００２６】
またステップＳ１では、インターフェロンγと混合された培養液に対し、細胞供給装置４により、培養するべき細胞である脂肪由来の間葉系幹細胞を供給する。
さらに、ステップＳ１では培養するべき細胞が供給された培養液（判定対象の培養液）を収容した収容装置１を、培養容器５内に収容する。そして、培養容器５内に収容装置１を収容、静置した状態で、培養容器５を恒環境下（例えば３７℃、５％ＣＯ２環境下）で維持して、細胞の培養を開始する。
【００２７】
ステップＳ２では、上記培養開始からの経過時間を計測し、所定時間を経過したか否かを判断する。所定時間を経過した場合（ステップＳ２が「Ｙｅｓ」）、ステップＳ３に進む。一方、所定時間を経過していない場合（ステップＳ２が「Ｎｏ」）、ステップＳ２に戻り、ステップＳ２における「Ｎｏ」のループを繰り返す。
次のステップＳ３では、所定時間経過して培養された細胞（脂肪由来の間葉系幹細胞）にヒトの２型抗原提示分子（ＨＬＡ−ＤＲ）が発現したか否かを判定する。ステップＳ３における「判定」は、分析装置６の蛍光強度分析の結果に基づき、判断装置７で行う。
【００２８】
ステップＳ３におけるヒトの２型抗原提示分子（ＨＬＡ−ＤＲ）が発現したか否かを判定するに際しては、先ず、ステップＳ２で培養された細胞の一部を、蛍光標識されたヒト２型抗原提示分子を認識する抗体（例えば抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体）で処理し、一部をどの様な分子も認識しないネガティブコントロール抗体（陰性コントロール抗体）で処理する。図１をも参照して述べると、培養容器５で培養された細胞を抗体処理ユニット１１に供給し、抗体処理ユニット１１において、培養容器５から供給された細胞の一部を、蛍光標識された抗ヒト２型抗原提示分子を認識する抗体（例えば抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体）で処理し、当該細胞の残りをどの様な分子も認識しないネガティブコントロール抗体（陰性コントロール抗体）で処理する。
そして抗体処理ユニット１１で処理された細胞が血清を含む培養液で培養された細胞であれば、当該処理がされた細胞をフローサイトメトリー或いはイメージングサイトメトリーにより分析する。
その結果、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体で処理された細胞は、図４（Ｂ）の特性Ｂ２で示す様な蛍光強度特性を示し（ステップＳ３が「Ｙｅｓ」）、ネガティブコントロール抗体で処理された細胞は、図４（Ｂ）の特性Ｂ１で示す様な蛍光強度特性を示す（ステップＳ３が「Ｎｏ」）。
【００２９】
ステップＳ３において、培養された細胞にヒトの２型抗原提示分子（ＨＬＡ−ＤＲ）が発現したと判定された場合（ステップＳ３が「Ｙｅｓ」）は、ステップＳ４に進む。
一方、培養された細胞にヒトの２型抗原提示分子（ＨＬＡ−ＤＲ）が発現していないと判定された場合（ステップＳ３が「Ｎｏ」）には、ステップＳ５に進む。
【００３０】
ステップＳ４では、「培養された細胞にヒトの２型抗原提示分子（ＨＬＡ−ＤＲ）が発現した」との判定結果（ステップＳ３が「Ｙｅｓ」）に基づいて、培養液（判定対象の培養液）には血清が包含されていると判定する。
一方、ステップＳ５では、ステップＳ３における「培養された細胞にヒトの２型抗原提示分子（ＨＬＡ−ＤＲ）が発現していない」との判定結果（ステップＳ３が「Ｎｏ」）に基づき、培養液（判定対象の培養液）には血清が包含されていないと判定する。
【００３１】
図示の実施形態で、培養液（判定対象の培養液）にインターフェロンγを添加した後、培養容器５において細胞を培養する時間（ステップＳ２における所定時間）は、図６から図９を参照して後述する様に、１２時間以上であり（細胞を培養する工程で細胞を培養する時間は１２時間以上であり）、特に４８時間以上培養することが好ましい。
そしてインターフェロンγの濃度は、図６から図９を参照して後述する様に、１００ユニット／ｍｌ以上であり、特に４００ユニット／ｍｌ程度であるのが好ましい。
【００３２】
図示の実施形態において、出願人が販売している培養液であって、血清を包含していない培養液（商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」）を用いて、脂肪由来の間葉系幹細胞を温度３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養し、当該培養した幹細胞（脂肪由来の間葉系幹細胞）について、蛍光標識された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色を行った後、フローサイトメトリーで蛍光強度を計測すると、図３（Ａ）で示す様な特性を示す。図３〜図９において、横軸は蛍光強度を示し、縦軸は該当する細胞の個数に関するパラメータを示している。
図３（Ａ）ではインターフェロンγは添加されておらず、ＨＬＡ−ＤＲは発現していない。
【００３３】
一方、図３（Ａ）の特性を得た実験で使用された培養液と同一の培養液（血清を含まない培養液：商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」：出願人が販売）にインターフェロンγ（Ｐｒｏｓｐｅｃ社販売の商品名「ＩＦＮ−γ」を図示の実施形態では使用）を添加し、当該インターフェロンγを添加した培養液で脂肪由来の間葉系幹細胞を温度３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養し、培養された幹細胞（脂肪由来の間葉系幹細胞）について、蛍光標識された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色を行った後、フローサイトメトリーで蛍光強度を計測した。その結果、図３（Ｂ）で示す様な特性を示した。
図３（Ｂ）で示す様に、血清を含まない培養液にインターフェロンγを添加しても、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ−ＤＲの発現は誘導されない。
【００３４】
間葉系幹細胞の培養に古典的に用いられているαＭＥＭ培養液に１０％（本明細書では全て容積％）のウシ胎児血清を添加した培養液によって培養された脂肪由来の間葉系幹細胞を、蛍光標識された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色を行った後、フローサイトメトリーで蛍光強度を計測した結果を、図４で示す。
図４（Ａ）は、上記培養液にインターフェロンγを添加していない場合の蛍光強度の特性が示されている。図４（Ａ）で示す特性は図３（Ａ）、（Ｂ）で示す特性と同様であり、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ−ＤＲが発現は誘導されない。
【００３５】
一方、図４（Ｂ）には、αＭＥＭ培養液に１０％のウシ胎児血清を添加した培養液（符号「αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ」で示す）にインターフェロンγを添加して、上記幹細胞を培養した場合の蛍光強度の特性が示されている。
図４（Ｂ）で示す特性では、特性曲線Ｂ１はネガティブコントロール抗体で処理した細胞の蛍光特性を示しており、特性曲線Ｂ２は抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体で処理した細胞の蛍光特性を示している。特性曲線Ｂ１、Ｂ２は明瞭に区別することが出来るので、
図４（Ｂ）からＨＬＡ−ＤＲが発現したと判断出来る。
【００３６】
図５は、出願人が販売している培養液であって、血清を包含していない培養液（商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」）を用いて、脂肪由来の間葉系幹細胞を温度３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養し、当該培養した幹細胞（脂肪由来の間葉系幹細胞）について、蛍光標識された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色を行った後、フローサイトメトリーで蛍光強度を計測した実験結果を示している。
図５（Ａ）は血清を含まない培養液（商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」）に１０％のウシ胎児血清を添加したがインターフェロンγを添加していない培養液で培養された細胞について、蛍光標識された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体とネガティブコントロール抗体で染色を行った後、フローサイトメトリーで蛍光強度を計測した実験結果である。図５（Ａ）では、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ−ＤＲが発現は誘導されていない。一方、図５（Ｂ）は、ウシ胎児血清及びインターフェロンγを添加した培養液（血清を含まない培養液：商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」）で培養された細胞について、蛍光標識された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体とネガティブコントロール抗体で染色を行った後、フローサイトメトリーで蛍光強度を計測した実験結果である。図５（Ｂ）から明らかな様に、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ−ＤＲが発現している。
図５（Ａ）及び図５（Ｂ）の実験結果から、この実験で用いられた血清を包含していない培養液（商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」）の成分によりＨＬＡ−ＤＲの発現が抑えられている訳ではなく、この培養液に血清を添加した場合にはＨＬＡ−ＤＲの発現が誘導されることが明らかになった。
【００３７】
図５（Ｃ）は、血清を含まない培養液（商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」）に１０％のヒト血清を添加したがインターフェロンγを添加していない培養液で培養された細胞について、蛍光標識された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体とネガティブコントロール抗体で染色を行った後、フローサイトメトリーで蛍光強度を計測した実験結果である。図５（Ｃ）では、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ−ＤＲが発現は誘導されていない。
一方、図５（Ｄ）は、血清を含まない培養液（商品名「ｓｆ−ＤＯＴ」）にヒト血清及びインターフェロンγを添加して培養された細胞について、蛍光標識された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体とネガティブコントロール抗体で染色を行った後、フローサイトメトリーで蛍光強度を計測した実験結果である。図５（Ｄ）から明らかな様に、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ−ＤＲが発現している。
図５（Ｃ）及び図５（Ｄ）の実験結果から、ウシ血清（ウシ胎児血清）と同様に、ヒト血清においても、インターフェロンγの添加により、ＨＬＡ−ＤＲが発現することが明らかになった。このことから、血清の由来に拘らず、インターフェロンγを添加すれば、血清を添加した培養液で培養された細胞は、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ−ＤＲを発現することが示された。
【００３８】
発明者は、インターフェロンγを添加した後の培養時間と、インターフェロンγの濃度について実験を行った。インターフェロンγとしては、Ｐｒｏｓｐｅｃ社販売の商品名「ＩＦＮ−γ」を、実験で使用した。そしてインターフェロンγの濃度のパラメータである「ユニット」も、当該インターフェロンγ（Ｐｒｏｓｐｅｃ社販売の商品名「ＩＦＮ−γ」）における「ユニット」である。
図６では、血清を混入した培養液（αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ、ウシ胎児血清を１０％混合した培養液）にインターフェロンγを添加した培養液で１２時間培養した細胞の蛍光強度特性を示す。
図６において、ネガティブコントロール抗体で処理された場合の蛍光強度特性である特性６−１と、蛍光標識された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色を行った場合の蛍光強度特性６−２を示している。蛍光標識された抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色を行った場合の特性６−１における蛍光強度は、ネガティブコントロール抗体で処理された場合の蛍光強度特性６−１の蛍光強度よりも、僅かではあるが強かった。このことは、図４（Ｂ）のデータと同様に、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ−ＤＲが発現していることを示す特性である。
【００３９】
明示はしないが、発明者の実験では、培養時間が１１時間以下ではＨＬＡ−ＤＲが発現していることを示す特性曲線は明瞭には発現しなかった。そのことから、培養液が血清を包含するか否かを判定する際には、インターフェロンγを添加した後、細胞を１２時間以上培養するべきであることが判明した。
また、図６の実験において、インターフェロンγの濃度は１００ユニット／ｍｌであるが、インターフェロンγの濃度がそれ未満（発明者の実験では９５ユニット／ｍｌ以下）であると、ＨＬＡ−ＤＲが発現していることを示す特性曲線は明瞭に発現しなかった。従って、インターフェロンγの濃度は１００ユニット／ｍｌ以上にするべきことが判明した。
【００４０】
図７も図６と同様に、血清を混入した培養液（αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ、牛胎児血清を混合した培養液）にインターフェロンγを添加した培養液で１２時間培養した細胞の蛍光強度特性を示す。
図７では、添加したインターフェロンγの濃度は４００ユニット／ｍｌである。図６と図７を比較すれば、図７の方がＨＬＡ−ＤＲが発現していることを示す特性は明瞭である。
図７から、インターフェロンγの濃度は４００ユニット／ｍｌ以上であることが好ましいことが判明した。
【００４１】
図８も図６と同様に、血清を混入した培養液（αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ、牛胎児血清を１０％混合した培養液）にインターフェロンγを添加した培養液で培養した細胞の蛍光強度特性を示す。
図８では、培養時間が４８時間であり、添加したインターフェロンγの濃度は１００ユニット／ｍｌである。図６と図８を比較すれば、図８の方がＨＬＡ−ＤＲが発現していることを示す特性は明瞭である。
図６と図８の比較から、培養時間は４８時間以上が好ましいことが判明した。
【００４２】
図９も図８と同様に、血清を混入した培養液（αＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ、牛胎児血清を１０％混合した培養液）にインターフェロンγを添加した培養液で培養した細胞の蛍光強度特性を示す。
図９では、培養時間が４８時間であり、添加したインターフェロンγの濃度は４００ユニット／ｍｌである。図６〜図９を比較すれば、図９においてＨＬＡ−ＤＲの発現が最も明瞭である。
図６〜図９から、培養時間は４８時間以上が好ましく、インターフェロンγの濃度は４００ユニット／ｍｌ以上が好ましいことが判明した。
【００４３】
発明者が行った実験によれば、ＰＣＲにより、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ−ＤＲの発現を示すことが出来た。
発明者が行った実験では、細胞よりＲＮＡを抽出した後、逆転写反応を行ってｃＤＮＡを調整した。逆転写反応は、１μｇのＲＮＡをもとに、ランダムな配列を有する６ｍｅｒまたは９ｍｅｒのデオキシリボヌクレオチド混合物（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ：４６個または４９個の配列が可能）で５´末端がリン酸化されているものをプライマーとして、逆転写酵素（タカラバイオ株式会社販売の商品名「ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ」）を用いて行った。得られたｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行い、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ−ＤＲが発現したか否かを測定した。
ＰＣＲによりＨＬＡ−ＤＲの発現するために、下記を混合した。
酵素（タカラバイオ株式会社販売の商品名「ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ」）の５ユニット／μリットルのものを０．１μリットル（最終濃度：０．０２５ユニット／μリットル）、
調整剤（ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ：反応液の１／１０だけ混合用）を２μリットル、
核酸混合液（タカラバイオ株式会社販売の商品名「ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ」）を１μリットル、
フォワードプライマー（５μＭ）を０．４μリットル（最終濃度：０．１μＭ）、
リバースプライマー（５μＭ）を０．４μリットル（最終濃度：０．１μＭ）、
２５ｎｇのＲＮＡに由来するｃＤＮＡ。
【００４４】
ここで、プライマーの配列は以下の通りである。
図１０において、内部標準として用いられた遺伝子（全てにおいて発現する遺伝子：図１０における符号「ＧＡＰＤＨ」）において、
フォワードプライマーは  ａｇｃｃａｃａｔｃｇｃｔｃａｇａｃａｃ
リバースプライマーは  ｇｃｃｃａａｔａｃｇａｃｃａａａｔｃｃ
である。
一方、遺伝子ＨＬＡ−ＤＲにおいて、
フォワードプライマーは  ｇｇａｃａａａｇｃｃａａｃｃｔｇｇａａａ
リバースプライマーは  ａａａｃａｇａｔｇａｇｇａｃｇｔｔｇｇｇ
である。
一般的なサーマルサイクラーを用いて、
９５℃  １５秒
６０℃  １分
を１サイクルとして、２５サイクル反応を行った。
【００４５】
ＰＣＲ反応液のうち、１０μリットルを染色試薬（株式会社バイオクラフト製の商品名「ＧＲＧｒｅｅｎ  Ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ」）１０μリットルと混合した後、アガロースゲル電気泳動に供した。
アガロースゲル電気泳動の後、分析装置（ＧＥヘルスケア社製の商品名「ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００」）を用いた結果、図１０で示す様なバンドを検出した。
【００４６】
図１０において、符号「ＦＢＳ」は符号「ＦＣＳ」と同様にウシ胎児血清を包含する培養液を示しており、符号「ＦＢＳ＿ＩＦＮγ」はウシ胎児血清を包含する培養液にインターフェロンγを添加したサンプルを示す。そして符号「ＨＳ」はヒト血清を包含する培養液を示し、符号「ＨＳ＿ＩＦＮγ」はヒト血清を包含する培養液にインターフェロンγを添加したサンプルを示す。
図１０において、下行「ＨＬＡ−ＤＲ」において、白いバンドはヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ−ＤＲが発現したことを示している。ウシ胎児血清にインターフェロンγを添加したＦＢＳ＿ＩＦＮγと、ヒト血清にインターフェロンγを添加したＨＳ＿ＩＦＮγには白いバンドが示されている。
図１０で結果を示す実験により、ＰＣＲによっても、血清を含有する培地であれば、インターフェロンγを添加することにより、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ−ＤＲが発現することが確認された。
【００４７】
これに加えて発明者の実験によれば、血清含有量が低い培養液（例えば、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製造の商品名「ＭｅｓｓｅｎＰｒｏ  ＲＳ」においても、インターフェロンγを添加すると、図４（Ｂ）、図５（Ｂ）、図７〜図９と同様に、ヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ−ＤＲが発現することが確認された。
【００４８】
図示の実施形態はあくまでも例示であり、本発明の技術的範囲を限定する趣旨の記述ではないことを付記する。
例えば図示の実施形態では、２型抗原提示分子としてＨＬＡ−ＤＲが発現したか否かにより培養液の血清の有無を判定したが、本発明では、ＨＬＡ−ＤＲ以外のヒトの２型抗原提示分子であるＨＬＡ−ＤＱ或いはＨＬＡ−ＤＰが発現したか否かにより、培養液が血清を包含するか否かを判断する場合を包含する。
また図示の実施形態では、２型抗原提示分子（ＨＬＡ−ＤＲ）が発現したか否かについてはフローサイトメトリーで計測しているが、本発明はフローサイトメトリーに限定されるものではなく、ＰＣＲ法、その他のヒトの２型抗原提示分子の発現の有無を計測することが出来る測定手法を用いる場合を包含する。
さらに、図示の実施形態では脂肪由来の間葉系幹細胞を培養する場合について説明しているが、臍帯由来、骨髄由来、羊膜由来、歯髄由来、胎盤由来の間葉系幹細胞であっても同様であり、本発明は臍帯由来、骨髄由来、羊膜由来、歯髄由来、胎盤由来の間葉系幹細胞の培養で使用される培養液が血清を包含するか否かを判断することが出来る。或いは、幹細胞以外の各種細胞を培養する場合においても、本発明を適用することが出来る。
【符号の説明】
【００４９】
１・・・収容装置（容器）
２・・・インターフェロンγ供給装置（インターフェロンγ滴下ユニット）
３・・・混合装置
３Ａ・・・載置部
３Ｂ・・・運動部
４・・・細胞供給装置（細胞供給ユニット）
５・・・培養容器（恒環境ユニット）
６・・・分析装置（蛍光強度分析ユニット）、
７・・・判断装置（判断ユニット）
７Ａ・・・本体部
７Ｂ・・・表示部
８・・・培養液供給ユニット
１００・・・判定システム
ＣＣ・・・培養した細胞
ＣＦ・・・培養液
ＳＣ・・・培養するべき細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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