(57)【要約】【課題】短時間でセロトニン神経細胞を製造する手段を提供すること【解決手段】多能性幹細胞において、ASCL1とLMX1B及び/又はFEVとを発現させることを含む、セロトニン神経細胞を製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞において、ASCL1とLMX1B及び/又はFEVとを発現させることを含む、セロトニン神経細胞を製造する方法。 
【請求項２】
多能性幹細胞において、ASCL1とLMX1Bとを発現させることを含む、請求項１に記載の方法。 
【請求項３】
更に、多能性幹細胞において、FEVを発現させることを含む、請求項２に記載の方法。 
【請求項４】
多能性幹細胞においてFEVを発現させない、請求項２に記載の方法。 
【請求項５】
多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 
【請求項６】
ASCL1とLMX1B及び/又はFEVをコードする遺伝子を含む、セロトニン神経細胞製造用発現ベクター。 
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターを含む、セロトニン神経細胞製造用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
神経細胞の製造に関する技術が開示される。
【背景技術】
【０００２】
セロトニン神経系は、うつ病や統合失調症などの精神疾患に係わる重要な神経系の一つである。セロトニン神経伝達を調節する化合物が、抗うつ薬や統合失調症の治療薬として有効であることから、これらの疾患の背景に、セロトニン神経系の機能異常が存在することが示唆されている。従って、ヒトのセロトニン神経を用いた解析は、うつ病や統合失調症のメカニズムの解明といった基礎医学的知見、及び、それらの疾患の治療及び予防に有効な物質の探索という実用的な見地から重要である。しかし、ヒトセロトニン神経へのアクセスは困難であり、疾患特異的なヒトｉＰＳ細胞をもちいて患者由来のヒトセロトニン神経細胞を得る試みがなされているが、十分量のセロトニン神経の取得には約6週間といった長期間を要する（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Lu et al., Nature Biotechnology, 34, 89-94, 2016
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の現状の下、より短時間でセロトニン神経細胞を製造する手段を提供することが１つの課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、低分子化合物によるセロトニン神経への分化誘導ではなく、セロトニン神経の発生に関与する転写因子の特定の組み合わせを発現させることにより、より短期間でセロトニン神経細胞が得られることが判明した。斯かる知見に基づき、更なる研究を重ね、下記に代表される発明を完成するに至った。
【０００６】
項１．
多能性幹細胞において、ASCL1とLMX1B及び/又はFEVとを発現させることを含む、セロトニン神経細胞を製造する方法。
項２．
多能性幹細胞において、ASCL1とLMX1Bとを発現させることを含む、項１に記載の方法。
項３．
更に、多能性幹細胞において、FEVを発現させることを含む、項２に記載の方法。
項４．
多能性幹細胞においてFEVを発現させない、項２に記載の方法。
項５．
多能性幹細胞がiPS細胞である、項１〜４のいずれかに記載の方法。
項６．
ASCL1とLMX1B及び/又はFEVをコードする遺伝子を含む、セロトニン神経細胞製造用発現ベクター。
項７．
項６に記載の発現ベクターを含む、セロトニン神経細胞製造用キット。
【発明の効果】
【０００７】
短期間でセロトニン神経細胞を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１−１】レンチウイルスベクターLVV505:pFUW-M2rtTAの塩基配列を示す。大文字は、M2rtTAをコードする領域である。
【図１−２】レンチウイルスベクターLVV543:pFUW-TetO-hASCL1の塩基配列を示す。大文字は、hASCL1をコードする領域である。
【図１−３】レンチウイルスベクターLVV544:pFUW-TetO-hFEVの塩基配列を示す。大文字は、hFEVをコードする領域である。
【図１−４】レンチウイルスベクターLVV545:pFUW-TetO-hFOXA2の塩基配列を示す。大文字は、hFOXA2をコードする領域である。
【図１−５】レンチウイルスベクターLVV546:pFUW-TetO-hGATA2の塩基配列を示す。大文字は、hGATA2をコードする領域である。
【図１−６】レンチウイルスベクターLVV547:pFUW-TetO-hLMX1Bの塩基配列を示す。大文字は、hLMX1Bをコードする領域である。
【図１−７】レンチウイルスベクターLVV548:pFUW-TetO-hNKX2-2の塩基配列を示す。大文字は、hNKX2-2をコードする領域である
【図１−８】レンチウイルスベクターLVV549:pFUW-TetO-hNKX2-8の塩基配列を示す。大文字は、hNKX2-8をコードする領域である。
【図２−１】試験No.1の結果を示す。左は5HT（セロトニン）の発現を検出した画像である。中央は、Tuj1（神経細胞マーカー）を検出した画像である。右は5HT及びTuj1と細胞核の検出結果を融合した画像である。
【図２−２】試験No.2の結果を示す。左は5HT（セロトニン）の発現を検出した画像である。中央は、Tuj1（神経細胞マーカー）を検出した画像である。右は5HT及びTuj1と細胞核の検出結果を融合した画像である。
【図２−３】試験No.3の結果を示す。左は5HT（セロトニン）の発現を検出した画像である。中央は、Tuj1（神経細胞マーカー）を検出した画像である。右は5HT及びTuj1と細胞核の検出結果を融合した画像である。
【図２−４】試験No.4の結果を示す。左は5HT（セロトニン）の発現を検出した画像である。中央は、Tuj1（神経細胞マーカー）を検出した画像である。右は5HT及びTuj1と細胞核の検出結果を融合した画像である。
【図２−５】試験No.5の結果を示す。左は5HT（セロトニン）の発現を検出した画像である。中央は、Tuj1（神経細胞マーカー）を検出した画像である。右は5HT及びTuj1と細胞核の検出結果を融合した画像である。
【図２−６】試験No.6の結果を示す。左は5HT（セロトニン）の発現を検出した画像である。中央は、Tuj1（神経細胞マーカー）を検出した画像である。右は5HT及びTuj1と細胞核の検出結果を融合した画像である。
【図２−７】試験No.7の結果を示す。左は5HT（セロトニン）の発現を検出した画像である。中央は、Tuj1（神経細胞マーカー）を検出した画像である。右は5HT及びTuj1と細胞核の検出結果を融合した画像である。
【図２−８】試験No.8の結果を示す。左は5HT（セロトニン）の発現を検出した画像である。中央は、Tuj1（神経細胞マーカー）を検出した画像である。右は5HT及びTuj1と細胞核の検出結果を融合した画像である。
【図２−９】試験No.9の結果を示す。左は5HT（セロトニン）の発現を検出した画像である。中央は、Tuj1（神経細胞マーカー）を検出した画像である。右は5HT及びTuj1と細胞核の検出結果を融合した画像である。
【図２−１０】試験No.10の結果を示す。左は5HT（セロトニン）の発現を検出した画像である。中央は、Tuj1（神経細胞マーカー）を検出した画像である。右は5HT及びTuj1と細胞核の検出結果を融合した画像である。
【図２−１１】試験No.11の結果を示す。左は5HT（セロトニン）の発現を検出した画像である。中央は、Tuj1（神経細胞マーカー）を検出した画像である。右は5HT及びTuj1と細胞核の検出結果を融合した画像である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
セロトニン神経細胞の製造方法は、多能性幹細胞において、ASCL1とLMX1B及び/又はFEVとを発現させることを含むことが好ましい。ここで、「発現させる」とは、転写因子をコードする核酸を多能性幹細胞に導入し、その産物である転写因子を細胞内で生産させることを意味する。核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれでもよい。一実施形態において核酸はＤＮＡであることが好ましく、他の実施形態において核酸はＲＮＡであることが好ましい。
【００１０】
多能性幹細胞の種類はセロトニン神経細胞に誘導可能である限り特に制限されない。多能性幹細胞には、例えば、誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、及び体性幹細胞、受精卵内部細胞塊細胞、及び初期胚細胞等が包含される。これらの多能性幹細胞は、１種のみを用いてもよく、又は必要に応じて２種以上を混合して用いてもよい。ｉＰＳ細胞には、Nature, 2007, July 19; Vol.448, pp.313-317；Cell, 2006, August 25; Vol.126(4), pp.663-676に記載されている細胞、又はこれに類する細胞が包含される。一実施形態において、多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞であることが好ましい。
【００１１】
多能性幹細胞の種類（由来）は特に制限されない。例えば、多能性幹細胞は、ヒト、サル、ゴリラ、マウス、ラット、ブタ、又はイヌ等の多能性幹細胞であり得る。一実施形態において、多能性幹細胞は、ヒトの多能性幹細胞であることが好ましく、他の実施形態において多能性幹細胞はマウス又はサルの多能性幹細胞であることが好ましい。一実施形態において、多能性幹細胞は、フィーダーフリー培養において自発的に分化するコロニーがなくなるまで継代した多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）であることが好ましい。
【００１２】
ASCL1とは、中枢神経系の発生における重要な転写因子の一つであり、塩基性ヘリックスループヘリックス転写因子に分類される。ヒトASCL1をコードする塩基配列の一例を配列番号９に示す。ヒトASCL1を発現させるために使用できる塩基配列は、ヒトASCL1をコードする限り特に制限されず、例えば、配列番号９の塩基配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する塩基配列であって、ヒトASCL1をコードするものを使用することができる。ASCL1は、セロトニン神経細胞を誘導可能である限り、野生型ASCL1に限らず変異型ASCL1であってもよい。多能性幹細胞としてヒト以外の動物由来の多能性幹細胞を使用する場合は、細胞の由来にあったASCL1を使用することが好ましい。
【００１３】
LMX1Bとは、組織発生における腹側背側軸の形成に重要な転写因子の一つであり、LIMホメオボックス転写因子に分類される。ヒトLMX1Bをコードする塩基配列の一例を配列番号１０に示す。ヒトLMX1Bを発現させるために使用できる塩基配列は、ヒトASCL1をコードする限り特に制限されず、例えば、配列番号１０の塩基配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する塩基配列であって、ヒトLMX1Bをコードするものを使用することができる。LMX1Bは、セロトニン神経細胞を誘導可能である限り、野生型LMX1Bに限らず変異型LMX1Bであってもよい。多能性幹細胞としてヒト以外の動物由来の多能性幹細胞を使用する場合は、細胞の由来にあったLMX1Bを使用することが好ましい。
【００１４】
FEVとは、ニコチン性アセチルコリン受容体の発現制御およびセロトニン神経発生における重要性が示唆されている転写因子であり、ETS転写因子に分類される。ヒトFEVをコードする塩基配列の一例を配列番号１１に示す。ヒトFEVを発現させるために使用できる塩基配列は、ヒトFEVをコードする限り特に制限されず、例えば、配列番号１１の塩基配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する塩基配列であって、ヒトFEVをコードするものを使用することができる。FEVは、セロトニン神経細胞を誘導可能である限り、野生型FEVに限らず変異型FEVであってもよい。多能性幹細胞としてヒト以外の動物由来の多能性幹細胞を使用する場合は、細胞の由来にあったFEVを使用することが好ましい。
【００１５】
多能性幹細胞において発現させる転写因子はASCL1とLMX1B及び／又はFEVを含むことが好ましい。多能性幹細胞においてASCL1とLMX1B及び／又はFEVを発現させる場合、更に他の転写因子を当該多能性幹細胞において発現させてもよい。そのような他の転写因子としては、FOXA2、NKX2.2、NKX2.8、及びGATA2から成る群より選択される一種以上を挙げることができる。好適な一実施形態において、上記他の転写因子（特に、FOXA2、NKX2.2、及びNKX2.8）は多能性幹細胞において発現させないことが好ましく、FEV、FOXA2、NKX2.2、NKX2.8、及びGATA2を発現させず、ASCL1及びLMX1Bだけを発現させることがより好ましい。ここで「発現させない」とは、所定の転写因子をコードする核酸をそれが発現可能な状態で多能性幹細胞に導入しないことを意味する。
【００１６】
転写因子とは、ＤＮＡに特異的に結合するタンパク質の一群であり、ＤＮＡ上のプロモーターやエンハンサーと呼ばれる転写を制御する領域に結合し、ＤＮＡの遺伝情報をＲＮＡに転写する過程を促進又は抑制する。転写因子はこの機能を単独で、または他のタンパク質と複合体を形成することによって発揮する。
【００１７】
多能性幹細胞における転写因子の発現は、当該技術分野において知られる任意の手法で行うことができる。例えば、上記特定の組み合わせの転写因子をコードする核酸を発現ベクターを用いて多能性幹細胞に導入することにより、それらを発現させることができる。また、転写因子をコードするｍＲＮＡ又はタンパク質の状態の転写因子を直接多能性幹細胞に導入することも可能である。ｍＲＮＡの状態で多能性幹細胞に導入することは、例えば、mMESSAGE mMACHINE (Thermofisher製)を用いてｍＲＮＡを作製し、それをLipofectamine MessengerMAXを用いて細胞内に導入することができる。タンパク質の状態の転写因子の導入は、例えば、細胞内移行性を有するタグ（例えば、tat-ペプチド）を付加することによって可能である。一実施形態において、発現ベクターを用いて転写因子をコードする核酸を導入することが好ましい。
【００１８】
発現ベクターの種類は特に制限されず、多能性幹細胞の種類等に応じて、例えば、ウイルスベクター、及びプラスミドベクター等から適宜選択することができる。一実施形態において、発現ベクターとしてウイルスベクターを用いることが好ましい。ウイルスベクターとしては、例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びアデノウイルスベクター等を挙げることができる。一実施形態において好ましいウイルスベクターは、レンチウイルスベクター及びレトロウイルスベクターであり、より好ましくはレンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターを用いることにより転写因子を安定的に発現させることができる。アデノ随伴ウイルスベクター、及びアデノウイルスベクター、並びにプラスミドベクターを用いることにより転写因子を一過的に発現させることができる。
【００１９】
発現ベクターの作製は常法に従って行うことができる。例えば、多能性幹細胞において外来遺伝子を発現させるための発現ベクターを作製するためのキット及び試薬が市販されているため、それらを用いて作製することができる。また、例えば、ウイルスベクターは、次の（Ａ）および（Ｂ）の工程を含む製造方法により作製することができる：（Ａ）導入遺伝子の翻訳領域の5'側にプロモーター配列を含む発現コンストラクトを構築する工程；及び（Ｂ）ウイルスへの取り込みシグナル配列を含有したベクターを制限酵素で切断し、それに（Ａ）で作製した発現コンストラクトをライゲーションする工程。発現ベクターは、１種類の転写因子をコードするＤＮＡのみを組み込んでいてもよく、２種又は３種の転写因子をコードするＤＮＡを組み込んでいてもよい。
【００２０】
上記のようにして得られる転写因子の発現ベクター（又はその組み合わせ）は、セロトニン神経細胞製造用キットとすることができる。当該キットには、多能性幹細胞からセロトニン神経細胞を製造する際に使用する任意の試薬、及び／又は取扱に関する説明書を含めることができる。
【００２１】
発現ベクターを用いた多能性幹細胞への転写因子をコードする核酸の導入は常法に従って行うことができる。例えば、ウイルスベクターを用いる場合は、ウイルスベクターで多能性幹細胞を感染させることにより、目的の転写因子を多能性幹細胞内で発現させることができる。プラスミドベクターを用いる場合は、カチオンポリマー、カチオン脂質、又はリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション、或いは、エレクトロポレーション、又はマイクロインジェクションを用いてプラスミドベクターを多能性幹細胞に導入し、転写因子を発現させることができる。
【００２２】
転写因子をコードする核酸を導入した多能性幹細胞は、セロトニン神経細胞への分化に適した条件にて培養することが好ましい。神経細胞への分化に適した条件は、特に制限されず、任意に選択することができる。例えば、[ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）に添加因子として２％Ｂ２７，１％Ｎ２を加えたもの]の組成が神経細胞への分化に用いられる培地の基本組成として広く用いられている。Ｂ２７およびＮ２は神経細胞培養用の培地添加物であり、神経細胞の培養時に血清の代わりに使用される。これ以外の基本組成も各種知られている。そのような基本組成の培地に、神経細胞の分化誘導に有用な物質（細胞培養基材に固定化されたタンパク質以外の物質）を適宜添加して用いてもよい。例えば、神経細胞への分化誘導においてはレチノイン酸がしばしば用いられており、通常１μＭ程度の濃度で培地に添加して使用される。また、後述する実施例で採用するように、培養開始後１〜２日間は、基本培地にDoxycyclineを添加することができ、培養開始後２日〜６日の間は、更にSB-431542及びLDN-193189添加することができる。更に培養開始後７日〜１１日の間は、Doxycycline、SB-431542及びLDN-193189を除いた培地を使用することができる。SB-431542及びLDN193189はALK阻害薬であり、一実施形態において、これらのALK阻害剤のそれぞれと同種のALK阻害剤を用いることもできる。一実施形態において、分化用培地にWntシグナルの活性化剤（例えば、CHIR-99021）及び／又は阻害薬（例えば、IWP-2）を添加することが好ましい。
【００２３】
多能性幹細胞の培養は、通常、細胞の培養に使用されるプレート（例えば、２４ウェルプレート、６ウェルプレート）上で行うことができる。培養液中の多能性幹細胞の量（濃度）は特に制限されないが、例えば、１０２〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、又は１０３〜１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとすることができる。培養温度は、特に制限されず、例えば、約３７℃とすることができる。また、ＣＯ２細胞培養装置などを利用して、５％程度のＣＯ２濃度雰囲気下で培養することが好ましい。
【００２４】
培養期間は、セロトニン神経細胞への分化が誘導される限り特に制限されず、例えば、４日以上、５日以上、６日以上、１週間以上、２週間以上、３週間以上、４週間以上培養することができる。一実施形態において、セロトニン神経細胞を短期間で製造するという観点から、培養期間は、好ましくは、５週間以内、４週間以内、３週間以内、２週間以内、１２日以内、又は１１日以内である。
【００２５】
多能性幹細胞がセロトニン神経細胞に分化されたか否かは、任意の指標を用いて行うことができる。例えば、後述する実施例で採用したように、抗セロトニン抗体及び神経細胞を特異的に認識する抗体（例えば、抗Tuj1抗体）で培養後の細胞を染色して確認することができる。
【００２６】
本発明の細胞培養基材上で分化誘導した神経細胞は、ピペッティング、セルスクレーパーによる物理的な剥離により、または酵素処理（トリプシン、ディスパーゼ等）により回収して所望の用途に使用することができる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００２８】
１．分化誘導用レンチウイルスベクター作製
分化誘導用レンチウイルスベクターは、Takahashi et al., （Takahashi et al., PLoS One.2014 Apr 16;9(4):e94657.）の方法に準拠して行った。10cm dishに25% confluencyでLenti-X 293T細胞（Clontech）を播種し、37℃、CO25%環境下で終夜培養した。一方、300μLのDMEM (Life technologies)に5.2μgのpNHP、2.1μgのpHEF-VSVG、0.43μgのpCEP4-tat、及び2.6μｇのshuttle vector(pFUW-M2rtTA or pFUW-TetO-GeneX)を加えた。これをボルテックスで懸濁し、7.5μLのpolyethyleneimine溶液（polysciences社製)を加え、再度ボルテックスで懸濁して常温で20分放置した。懸濁液を37℃で予熱した5mLの10%FBS添加DMEMに加え転倒混和した。これを、培地を除去した培養細胞（Lenti-X 293T細胞）に加え、37℃、CO25%環境下で終夜培養した。培養上清を除去し、PBSで2回洗浄し、6 mLのEssential 8 basal medium(Life technologies社製)を加え、37℃、CO2 5%環境下で終夜培養した。培養上清を回収し、0.45μm孔径のフィルターを通し清澄化した。これを500μLづつ分注し、-80度で保存し、セロトニン神経誘導試験において各転写因子を強制発現させるためのウイルスベクターとして使用した。
【００２９】
２．セロトニン神経細胞の誘導
２−１．試薬等
本試験では下記の試薬等を使用した。
・hiPS cells (454E2)：RIKENから提供され、フィーダーフリー培養へ移行後、自発的に分化するコロニーがなくなるまで継代したhiPS cellsを使用した。
・Essential 8  + Supplement（Life technologies）
・Matrigel growth factor reduced (BD Biosciences) 
・Accutase (Stempro)
・Y-27632 (Y: 10mM stock. use 1 μL/1 mL media)
・DMEM/F12 (Life technologies 11330-032, HEPES+, Gln+, sodium bicarbonate+)
・N2 supplement (Wako, アポトランスフェリンタイプ)
・NEAA (MEM, Life technologies)
・B27 supplement (Life technologies)
・PD-0332991 (PD: 10 mM)
・hBDNF (100 μg/mL, 10 μL/tube, -20degC)
・hGDNF (100 μg/mL, 10 μL/tube, -20degC)
・SB-431542 (SB: 10 mM, 100 μL/tube, -20degC)
・LDN-193189 (LDN: 10 mM)
・Doxycycline (Clontech) dissolved in ddH2O (20 mg/mL), フィルターで滅菌
・Lentiviral vectors（いずれも上記１で作製したもの）
LVV505:pFUW-M2rtTA（Addgene#20342）    
LVV543:pFUW-TetO-hASCL1
LVV544:pFUW-TetO-hFEV
LVV545:pFUW-TetO-hFOXA2
LVV546:pFUW-TetO-hGATA2
LVV547:pFUW-TetO-hLMX1B
LVV548:pFUW-TetO-hNKX2-2
LVV549:pFUW-TetO-hNKX2-8
これらのベクターの配列を図１に示す。各配列において大文字は転写因子のコーディング領域を示す。
・分化培地
分化培地A（DMEM/F12+N2+NEAA(1:100)＋B27(1:50)+Y (1:1000)+20 ng/mL hBDNF+20 ng/mL hGDNF+1 μM PD+1 μg/mL Doxycycline）
分化培地B（DMEM/F12+N2+NEAA(1:100)＋B27(1:50)+Y (1:1000)+20 ng/mL hBDNF+20 ng/mL hGDNF+1 μM PD+1 μg/mL Doxycycline+0.1 μM LDN+2.5 μM SB）
分化培地C（DMEM/F12+N2+NEAA(1:100)＋B27(1:50)+Y (1:1000)+20 ng/mL hBDNF+20 ng/mL hGDNF+1 μM PD）
【００３０】
Day -3：細胞を接着させるため、24-well plateを30倍稀釈したMatrigel(BD Biosciences社製)でコートした。6-wellプレートにおいてsubconfluentな状態のhiPSC培養から、培養上清を除去した。2mL/wellのPBSでwell plateを2回洗浄した。細胞を剥離するため、予熱したAccutaseを1mL/wellで加え、37℃で5分間インキュベートした。1mL/wellのPBSを加え、1mLのピペットマンでピペッティングしながら細胞を剥がした。2well分の培養液全量を15mLの遠沈管に移し、一部を細胞濃度測定用に採取した。遠沈管に6mlのPBSを加え、300g、4分、4℃で遠心分離し、Accutaseを除去した。遠心中に細胞数をカウントした。遠心上清を吸引除去し、沈殿をEssential 8 +Sup+ Y 1mLに懸濁した。8x104cells/mLになるようにE8+Sup+Yで薄めた。24-well plateからマトリゲルを吸引除去し、そこに500μL/well (= 4x104 cells/well)で希釈した細胞を播種した。
【００３１】
Day -2：well plateの培養液を500μLのEssential 8 + Sup + Yに交換した。レンチウイルスベクター(LVV505:pFUW-M2rtTA（Addgene社製）を40 μL/wellで添加し、レンチウイルスベクターLVV543〜LVV 550を下記の表１に示す組み合わせで40 μL/well添加し、ピペッティングで懸濁した後、37℃、CO25%環境下で終夜培養した。
【００３２】
【表１】
2018033330.tif 000002
【００３３】
Day -1：培養液を500μLのEssential 8 + Sup + Yに交換し、37℃、CO25%環境下で終夜培養した。
Day 0：培養液を500μLの分化培地Aに交換し、37℃、CO2 5%環境下で２日間培養した。Day 2：培養液を500μLの分化培地Bに交換し、37℃、CO2 5%環境下で２日間培養した。Day 4：培養液を500μLの分化培地Bに交換し、37℃、CO2 5%環境下で２日間培養した。Day 6：培養液を500μLの分化培地Bに交換し、37℃、CO2 5%環境下で終夜培養した。Day 7：培養液を500μLの分化培地Cに交換し、37℃、CO2 5%環境下で２日間培養した。Day 9：培養液を500μLの分化培地Cに交換し、37℃、CO2 5%環境下で２日間培養した。Day 11：培養液を500μLの分化培地Cに交換し、37℃、CO2 5%環境下で終夜培養した。
【００３４】
その後、下記の手順で細胞を固定し、免疫染色した。
（１）培地を吸引除去した。
（２）細胞を500 μL/wellのPBSで２回洗浄した。
（３）4% パラホルムアルデヒド溶液 500μL/wellを加えた。
（４）室温で１０分間静置し、細胞を固定した。
（５）細胞を500 μL/wellのPBSで3回洗浄した。
（６）0.1% Triton X-100溶液を加えた（200μL/well）。
（７）室温で10分間静置することで、膜透過処理を行った。
（８）細胞を500 μL/wellのPBSで3回洗浄した。
（９）1% BSA/PBS溶液を加えた（200μL/well）。
（１０）室温で３０分間静置することで、抗体の非特異的吸着を防ぐためのブロッキングを行った。
（１１）1% BSA/PBS溶液を除去した。
（１２）一次抗体液 (0.4 μL/well 5-HT 抗体 + 0.4 μL/well TUJ1 抗体を加えた（200 μL/well 1% BSA/PBS）。
（１３）4℃で終夜静置した。
（１４）翌日、一次抗体液を除去した
（１５）細胞を500 μL/wellのPBSで3回洗浄した
（１６）二次抗体液を加えた(1μL/well Alexa FluorR 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) antibody + 1μL/well Alexa FluorR 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody + 1μL/well Hoechst 33342 in 200μL/well 1% BSA/PBS)。
（１７）室温で2時間静置した。
（１８）細胞を500 μL/wellのPBSで3回洗浄した。
（１９）200μL/well PBSを加えて蛍光顕微鏡（オリンパス社製BZ-9000）で観察した。結果（図２）は、下記のとおりである。
【００３５】
試験No.1
Tuj1陽性の神経細胞数は少なく、その突起の長さも極めて短く、神経細胞への分化が不十分であることが示唆された。また、5-HT（セロトニン）陽性の神経細胞は観察されなかった。
試験No.2
Tuj1陽性の神経細胞が多数観察され、その突起長も長く、試験No.1と比較すると神経細胞への分化が誘導されていることが示唆された。しかし、5-HT陽性の神経細胞は観察されなかった。
試験No.3
Tuj1陽性の神経細胞が観察され、神経細胞への分化が誘導されていることが示唆された。また、5-HT陽性の神経細胞が観察された。
試験No.4
Tuj1陽性の神経細胞が観察され、その突起長も長く、神経細胞への分化が誘導されていることが示唆された。また、5-HT陽性の神経細胞が試験No.3よりも更に多く観察された。
試験No.5
Tuj1陽性の神経細胞が観察され、神経細胞への分化が誘導されていることが示唆された。また、5-HT陽性の神経細胞が観察された。
試験No.6
数は少ないもののTuj1陽性の神経細胞が観察された。5-HT陽性の神経細胞がわずかに観察された。
試験No.7
試験No.5の結果と同等の結果であった。
試験No.8
試験No.5の結果と同等の結果であった。
試験No.9
試験No.5の結果と同等の結果であった。
試験No.10
数は少ないもののTuj1陽性の神経細胞が観察された。一方、5-HT陽性の神経細胞は観察されなかった。
試験No.11
試験No.10の結果と同様の結果であった。
【図１−１−１】
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【図１−１−２】
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【図１−１−３】
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【図１−２−１】
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【図１−２−２】
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【図１−２−３】
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【図１−３−１】
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【図１−３−２】
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【図１−３−３】
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【図１−４−１】
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【図１−４−２】
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【図１−４−３】
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【図１−５−１】
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【図１−５−２】
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【図１−５−３】
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【図１−６−１】
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【図１−６−２】
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【図１−６−３】
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【図１−７−１】
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【図１−７−２】
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【図１−７−３】
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【図１−８−１】
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【図１−８−２】
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【図１−８−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
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【図２−１１】
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【配列表】
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