(57)【要約】【課題】真皮と表皮の両面からの皮膚機能の改善と抗老化に有効な皮膚外用剤を提供すること。【解決手段】クラゲムチンを有効成分として含有する、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、ならびにこれらの剤を含む皮膚外用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラゲムチンを有効成分として含有する、コラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
クラゲムチンを有効成分として含有する、ヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の剤を含む、皮膚外用組成物。
【請求項４】
化粧品又は医薬部外品の形態である、請求項３に記載の皮膚外用組成物。
【請求項５】
医薬品の形態である、請求項３に記載の皮膚外用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クラゲムチンを有効成分として含有するコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、ならびにこれらの剤を含む皮膚外用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は大きく分けて外側から表皮、真皮、皮下組織の３層構造をとっている。最外層に存在する表皮は、主に表皮角化細胞（ケラチノサイト）により構成され、表皮角化細胞は、表皮の最下層である基底層で分裂し、成熟するにしたがって上方の角質層へ移行し、角化してやがて剥がれ落ちる。このような表皮細胞が生まれて角質層から剥がれるまでの過程を「ターンオーバー」といい、一定の周期で繰り返される。ターンオーバーの周期は、年齢、環境、個人によって異なり、ターンオーバーの乱れは、肌荒れ、創傷治癒の遅れ、乾燥をもたらす。よって、表皮角化細胞を賦活化し、表皮角化細胞の増加や遊走を促進することによって、表皮性のシワ（小じわ）の改善及び／又は予防、表皮角質層の保湿やバリア機能の向上、創傷治癒の促進が期待できる。
【０００３】
一方、真皮は表皮の下部に存在する構造であり、基底膜によって表皮と隔てられている。真皮は、皮膚の弾力、ハリ、潤いといった肌の美しさや若々しさに深く関わり、線維組織と基質から構成される「細胞外マトリックス」と呼ばれる網目構造をとっている。線維組織は、主にコラーゲンからなり、その中でもＩ型コラーゲンが全体の８０％を占める。一方、基質の主な成分には、フィブロネクチンなどの糖タンパク質、ヒアルロン酸やデルタマン硫酸などのムコ多糖が結合したプロテオグリカンなどが含まれる。コラーゲンは、真皮全体に網目状の構造をつくり、肌に弾力やハリを与え、ヒアルロン酸は肌の潤いを保つ役割を担う。このような肌に弾力やハリ、潤いを与えるコラーゲンやヒアルロン酸を生成するのが、真皮に存在する「線維芽細胞」である。ところが、加齢や紫外線曝露により線維芽細胞の数や機能が低下すると、線維芽細胞によるコラーゲン及びヒアルロン酸の産生量が減少し、その結果、皮膚の弾力やハリ、潤いが失われ、「シワ」や「たるみ」といった皮膚の老化が現れる。従って、皮膚の弾力やハリ、潤いを保ち、皮膚の老化を抑制する上で、コラーゲン、ヒアルロン酸、及びそれらを生成する真皮線維芽細胞が重要な因子となる。コラーゲンの産生促進によってコラーゲンの量を維持することは、皮膚のシワやたるみの改善及び／又は予防に有効であるほか、創傷治癒にも有効である。一方、ヒアルロン酸は、細胞の接着及び保護、皮膚組織の形成、組織水分の保持及び柔軟性の維持など、多くの機能を有している。よって、ヒアルロン酸の産生促進は、保湿性の向上に加え、皮膚のシワやたるみの改善及び／及び予防にも有効である。
【０００４】
従って、コラーゲンとヒアルロン酸の両方の産生促進効果があり、表皮角化細胞と真皮線維芽細胞の両方の賦活化効果のある物質があれば、表皮と真皮の両面からの皮膚の抗老化と皮膚機能の改善に有効であるが、これまで、そのような皮膚に対する多面的な効果を有する物質については報告がない。
【０００５】
一方、ムチンは、動物の上皮性細胞や粘膜、唾液腺等で生産される粘液の主成分である糖タンパク質である。糖質化学での動物性ムチンの定義は、ペプチド鎖のセリンあるいはトレオニン残基に酸素分子を介して糖鎖が接続（Ｏ−グリコシド結合）している高分子を指す。物性としては、糖鎖とペプチドが両親媒性を示して界面活性剤として働き、生体への親和性や抗菌性を示し、平滑性のよい自己組織化膜を形成する。ガン細胞は未熟なムチン型糖鎖を産生することが知られているので、一部のムチン抗体は腫瘍マーカーとしても使用されている。また、ドライアイや胃潰瘍などは、粘液のムチンバランスが壊れることで引き起こされるといわれている。これまでムチンは単独で又は他の成分ともに、肌荒れ防止や保湿などを目的として皮膚に適用することが行われており、例えば、ウシやブタなどの哺乳動物の胃又は顎下腺から得られるムチンを含有する皮膚洗浄料（特許文献１）、当該ムチンとアミノ酸を含む皮膚化粧料（特許文献２）、ウシやブタなどの哺乳動物の唾液腺ムチンを含有する皮膚外用剤（特許文献３、非特許文献１）、ウシ鼻軟骨ムチンをグラブリジンとともに含有する化粧料（特許文献４）などが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平５−２７１０５０号
【特許文献２】特開平５−３３９１４０号公報
【特許文献３】特公平６−４５５２４号公報
【特許文献４】特許第３０９１０４０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】山下登喜雄ら、J.Soc.Cosmet.Chem.Japan. Vol.27, No.4, 1994
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、真皮と表皮の両面からの皮膚機能の改善と抗老化に有効な皮膚外用剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、クラゲムチンが真皮線維芽細胞によるコラーゲン及びヒアルロン酸の産生促進作用、真皮線維芽細胞及び表皮角化細胞の増加作用、ならびに表皮角化細胞の遊走作用を有することを見出した。また、クラゲムチンを添加した正常ヒト表皮角化細胞の遺伝子発現解析によれば、創傷治癒に関連する遺伝子群について増減が認められ、創傷治癒に関連する遺伝子群では、創傷治癒を活性化する遺伝子数が創傷治癒を抑制する遺伝子数よりも有意に多く、クラゲムチンは創傷治癒効果を期待できるという知見を得た。本発明はかかる知見により完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）クラゲムチンを有効成分として含有する、コラーゲン産生促進剤。
（２）クラゲムチンを有効成分として含有する、ヒアルロン酸産生促進剤。
（３）クラゲムチンを有効成分として含有する、皮膚細胞の賦活化剤。
（４）皮膚細胞が、真皮線維芽細胞及び／又は表皮角化細胞である、（３）に記載の皮膚細胞の賦活化剤。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の剤を含む、皮膚外用組成物。
（６）化粧品又は医薬部外品の形態である、（５）に記載の皮膚外用組成物。
（７）医薬品の形態である、（５）に記載の皮膚外用組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、皮膚のシワやたるみを改善及び／又は予防し、ハリや潤いを与えることができる外用皮膚組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒト正常線維芽細胞を用いたコラーゲン産生試験の結果を示す。
【図２】ヒト正常線維芽細胞を用いたヒアルロン酸産生試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明について詳細に述べる。
【００１４】
本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、皮膚細胞の賦活化剤（以下、本発明の剤という）はクラゲ由来ムチン（以下、「クラゲムチン」という）を有効成分として含有する。
【００１５】
本発明に用いるクラゲムチンとは、ＷＯ２００７／０２０８８９に記載の下記式（Ｉ）：
Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ  （Ｉ）
（式中、ＸａａはＶａｌ又はＩｌｅである。）
で示されるアミノ酸配列からなる繰り返し単位を３回以上含む繰り返し構造を有するムチン型糖タンパク質をいう。上記単位の繰り返し回数は、３〜２０００回、好ましくは３〜７００回である。当該ムチン型糖タンパク質の分子量は１０〜１００ｋＤａ程度にピークを持つ広い分布をしているが、本発明においてはいずれの分子量のものを用いてもよい。上記の繰り返し単位は、直接結合してもよいし、又はリンカーを介して結合してもよい。リンカーは、限定されるものではないが、例えばシステインを用いたＳ−Ｓ結合などが挙げられる。
【００１６】
また、上記式（Ｉ）の繰り返し単位を含む繰り返し構造を有する当該ムチン型糖タンパク質において、糖鎖が結合しているＴｈｒ残基としては、前記繰り返し構造中の全Ｔｈｒ残基の５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上である。また、当該ムチン型糖タンパク質において、糖鎖を構成する単糖は、一般的なムチン型糖タンパク質において見出されている単糖であれば特に限定されるものではなく、例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、シアル酸、アラビノース、フコースなどが挙げられる。特に、Ｎ−アセチルガラクトサミン及び／又はガラクトースから構成される糖鎖であることが好ましい。具体的には、上記の繰り返し単位におけるトレオニン残基（Ｔｈｒ）に、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びガラクトースが結合してＴｈｒ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌの構造をとるか、Ｎ−アセチルガラクトサミンのみが結合してＴｈｒ−ＧａｌＮＡｃの構造をとることが好ましい。
【００１７】
また、本発明においては、クラゲムチンとして、クラゲ抽出物を用いてもよい。クラゲとしては、ヒトや動物に対する安全性が確認されているクラゲであることが好ましく、例えば、ミズクラゲ、エチゼンクラゲ、ビゼンクラゲなどが挙げられる。また、抽出に用いるクラゲの部位は特に限定されるものではなく、例えば、表皮、口腕、胃体部、体液など、また凍結保存や常温による保存において生じた液体成分を用いることができる。これらのクラゲの部位を材料としてムチン（ムチン型糖タンパク質）を含む抽出物を得る方法、ならびに得られた抽出物を液体クロマトグラフィーなどのタンパク質の精製に通常用いられる手段によって精製する方法は、ＷＯ２０１４／０３０３２３又はＷＯ２００７／０２０８８９の記載に従えばよい。
【００１８】
本発明において用いるクラゲムチンは、上記のムチン型糖タンパク質を９０％以上含むように高度に精製されたものが好ましいが、コスト低減と効率性の観点から、５０％程度含む粗精製物（粗精製ムチン）であってもよい。かかる粗精製物としては、例えば、上記公報に記載の方法に従って得られる精製処理直前のクラゲ抽出物を用いることができる。
【００１９】
クラゲムチンの本発明の剤への使用に際し、上記のムチン型糖タンパク質及びこれを含むクラゲ抽出物は、あらかじめエンドトキシンを含む病原性成分、抗原性成分、アレルギー源性成分を除去あるいは低減する処理をしておくことが必要である。
【００２０】
上記のクラゲムチンは、優れたコラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、皮膚細胞の賦活化作用を有する。ここで、「皮膚細胞の賦活化」とは、皮膚細胞の増殖促進、遊走促進、及び／又は、生理活動の亢進をいう。本発明において、「皮膚細胞」とは、真皮線維芽細胞及び／又は表皮角化細胞をいう。皮膚細胞は、生体内に存在するものであってもよいし、培養されたもの（生体より取り出されたもの、あるいは、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞から分化誘導して得られたもの等）であってもよい。
【００２１】
本発明の剤は、そのまま用いることも可能であるが、本発明の効果を損なわない範囲で通常皮膚外用組成物に用いられる任意の成分や添加物とともに皮膚外用組成物に配合して提供することが好ましい。本発明の皮膚外用組成物には、化粧品、医薬部外品、医薬品などが含まれる。本発明の皮膚外用組成物は、その種類、剤型、形状等に応じて常法に従って製造することができ、クラゲムチンを含む本発明の剤は、その製造工程のいずれかで配合すればよく、作業性を考えて適宜選択すればよい。
【００２２】
本発明の剤を化粧品又は医薬部外品に配合する場合は、その剤形は、水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、粉末分散系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水−油二層系、又は水−油−粉末三層系等のいずれでもよい。また、当該医薬部外品や化粧品は、本発明の剤とともに、皮膚外用組成物において通常使用されている各種成分、添加剤、基剤等をその種類に応じて選択し、適宜配合し、当分野で公知の手法に従って製造することができる。その形態は、液状、乳液状、クリーム状、ゲル状、ペースト状、スプレー状等のいずれであってもよい。配合成分としては、例えば、水（精製水、温泉水等）、油脂類（オリーブ油、ヤシ油、ホホバ油、ヒマシ油等）、ロウ類（ラノリン、ミツロウ、カルナウバロウ等）、炭化水素類（流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、ワセリン等）、脂肪酸類（ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸等）、高級アルコール類（ミリスチルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等）、エステル類（ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、トリオクタン酸グリセリン等）、有機酸類（クエン酸、乳酸、α-ヒドロキシ酢酸、ピロリドンカルボン酸等）、糖類（マルチトール、ソルビトール、キシロビオース、N-アセチル-D-グルコサミン等）、蛋白質及び蛋白質の加水分解物、アミノ酸類及びその塩、ビタミン類、植物抽出成分、種々の界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、安定化剤、防腐剤、殺菌剤、香料等が挙げられる。また、本発明の効果を損なわない範囲で、他のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、皮膚細胞の賦活化剤を併用することができる。
【００２３】
医薬部外品や化粧品の種類としては、例えば、化粧水、乳液、一般クリーム、日焼け止めクリーム、ハンドクリーム、美容液、パック、マスク、ファンデーション、フェースパウダー、洗顔料、化粧石鹸、ボディシャンプー、ボディローション、浴用剤等が挙げられる。
【００２４】
本発明の剤を医薬品に配合する場合は、薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物と混合し、患部に適用するのに適した製剤形態の各種製剤に製剤化することができる。薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、その剤形、用途に応じて賦形剤、増粘剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、保存剤、分散剤、乳化剤、ゲル化剤、色素、香料等を用いることができる。本発明の医薬品に適した形態は外用製剤であり、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、液剤、貼付剤、マイクロニードルなどが挙げられる。軟膏剤は、均質な半固形状の外用製剤をいい、油脂性軟膏、乳剤性軟膏、水溶性軟膏を含む。ゲル剤は、水不溶性成分の抱水化合物を水性液に懸濁した外用製剤をいう。液剤は、液状の外用製剤をいい、ローション剤、懸濁剤、乳剤、リニメント剤等を含む。
【００２５】
本発明の皮膚外用組成物は、その有効成分であるクラゲムチンが、優れたコラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、真皮線維芽細胞及び／又は表皮角化細胞の賦活化作用を有するので、コラーゲン産生促進、ヒアルロン酸産生促進、真皮線維芽細胞及び／又は表皮角化細胞の賦活化によって改善が認められる皮膚の障害や損傷の治療及び／又は予防に有効である。このような皮膚の障害や損傷としては、シワ、たるみ、シミ、くすみ、肌荒れ、皮膚の肥厚、ニキビ痕、瘢痕、ケロイド、皮膚創傷などが挙げられ、薄毛や脱毛などの頭皮や毛髪の損傷も含まれる。すなわち、本発明の皮膚外用組成物は、上記皮膚の障害や損傷を抑制する予防薬として、及び／又は、正常な状態に改善する治療薬として機能する。
【００２６】
本発明の皮膚外用組成物の有効成分は、天然物由来であるため、安全性が高く副作用がないため、前述の皮膚疾患の治療及び／又は予防用医薬として用いる場合、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ等の哺乳動物に対して適用できる。
【００２７】
本発明の剤を皮膚外用組成物に配合する場合、その含有量は上記の皮膚に対する効果を発揮できる量である限り特に限定はされないが、例えばクラゲムチンとして０．０００００１〜１（ｗ／ｖ）％が好ましく、０．００００１〜０．１（ｗ／ｖ）％がさらに好ましく、０．０００１〜０．０１（ｗ／ｖ）％が特に好ましい。上記の量はあくまで例示であって、皮膚外用組成物の種類や形態、一般的な使用量、効能・効果、及びコストなどを考慮して適宜設定・調整すればよい。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２９】
（参考例）クラゲ由来ムチン（粗精製）の調製
後記実施例で用いるクラゲ（ミズクラゲ）由来の抽出物は以下の方法で調製した。
１）  冷蔵状態にあるクラゲ個体を水洗し、ストレーナーで固形物と液体とに分離した。
２）  分離された固形物を、破砕機にて細断した。細断して得られた細断片を試料とした。
３）  ２）にて得られた試料と水とを、抽出撹拌槽に装填し、４℃で撹拌抽出を行った。
４）  ３）における撹拌抽出により得られた水溶液を４℃のまま１００００Ｇで、１０分間遠心分離して液成分を得た。
５）  ４）にて得られた液成分に、イソプロピルアルコール濃度が７０容量％となるように、イソプロピルアルコールを投入するとゲル状の沈殿物が生じた。
６）  ５）において得られたゲル状の沈殿物を含有する液を一晩中４℃に維持しつつ撹拌した後、４℃のまま１００００Ｇで、１０分間遠心分離して固形分を得た。
７）  ６）で得られた固形分質量に対して３倍質量の６０質量％濃度のイソプロピルアルコール水溶液を加えた。
８）  ７）において生成する混合物を４℃で５分間撹拌した後、４℃のまま１００００Ｇで、１０分間遠心分離して固形分を得た。
９）  ８）で得られた固形分につき、再度７）及び８）による洗浄操作を行った。
【００３０】
以上のようにして蛋白質分離工程を終えた。
10）  前記９）で得られた固形分質量に対して３倍質量の２５質量％濃度のイソプロピルアルコール水溶液を加えた。
11）  10）で得られた溶液を４℃で５分間撹拌した後、４℃のまま１００００Ｇで、１０分間遠心分離して固形分を得た。
12）  11)で得られた固形分につき10)及び11)の操作を更に２回行い、固形分と液成分とに分離した。
13)  12)で得られた液成分につき透析処理及び凍結乾燥を行って最終の固形分（ムチン）を得た。
【００３１】
（実施例１）正常ヒト真皮線維芽細胞を用いたI型コラーゲン及びヒアルロン酸産生試験
（１）方法
成人由来正常ヒト真皮線維芽細胞（クラボウ、Cat. No.KF-4009）は、増殖培地（10% FBS、1% Penicillin-Streptomycin添加DMEM培地）を用いてT-75フラスコ内で起眠し、CO2インキュベーター（5% CO2、37℃、湿潤）内で前培養した。培地交換は一日おきに行い、80%コンフルエントに到達した時点で細胞を回収した。
【００３２】
回収した細胞を、5×103 cells/0.1mL/ウェルとなるよう増殖培地（10% FBS、1% Penicillin-Streptomycin添加DMEM）で調製し、96ウェルプレートに播種した。CO2インキュベーター内（5% CO2、37℃）で1日間培養後、サンプルとしてクラゲムチン溶液を0.00003、0.0003、0.003 w/v%の濃度で添加した試験培地（1% Penicillin-Streptomycin添加DMEM培地）、コントロールとして無添加の同試験培地、Ｉ型コラーゲン産生の陽性対照として2mM アスコルビン酸添加試験培地、ヒアルロン酸産生の陽性対照として1mM N-Methyl-L-Serine(NS)添加試験培地に置換した。その後、3日間培養し、培養上清を回収して測定まで-80℃保存した。培養上清中のコラーゲン濃度の測定には、ヒトコラーゲンタイプ1 ELISA kit（ACEL, Cat. No. EC1-E105）、ヒアルロン酸濃度の測定には、DueSet Hyaluronan（R & D Systems, Cat. No. DY3614）を用いた。キット付属のプロトコールに従って培養上清中の各濃度をそれぞれスタンダードの吸光度から検量線を作成し測定した。その際、コラーゲンは等倍の上清を45μl、ヒアルロン酸は100倍希釈の上清を100μl使用した。実験はn=5で行った。
【００３３】
（２）結果
Ｉ型コラーゲン産生試験の結果を図１に、ヒアルロン酸産生試験の結果を図２に示す。図１及び図２に示されるように、クラゲムチンを添加することによって、コラーゲン産生量及びヒアルロン酸産生量が増加した。
【００３４】
（実施例２）製品の処方例
参考例で製造したクラゲ由来ムチンを配合した製品の処方例を以下に示す。
【００３５】
＜処方例１＞クリーム
処方                                                配合量（質量％）
クラゲ由来ムチン（１％液）                                  ０．１
ステアリン酸                                                ２．０
ステアリルアルコール                                        ７．０
水添ラノリン                                                ２．０
スクワラン                                                  ５．０
２−オクチルドデシルアルコール                              ６．０
ポリオキシエチレン（２５モル）  セチルアルコールエーテル    ３．０
グリセリンモノステアリン酸エステル                          ２．０
プロピレングリコール                                        ５．０
エチルパラベン                                              ０．３
香料                                                        適量
精製水                                                      残量
【００３６】
＜処方例２＞  ローション
処方                                                配合量（質量％）
クラゲ由来ムチン（１％液）                                  ０．１
グリセリン                                                  ２．０
１，３−ブチレングリコール                                  ８．０
ポリオキシエチレンメチルグルコシド                          １．０
ＰＥＧ／ＰＰＧ−１４／７ジメチルエーテル                    ３．０
エリスリトール                                              １．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油                              ０．５
ジイソステアリン酸ポリグリセリル                            ０．３
クエン酸                                                    ０．０１
クエン酸ナトリウム                                          ０．１
香料                                                        適量
精製水                                                      残量
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は、シワやたるみなどの皮膚の老化を改善及び／又は予防するための、化粧品や医薬品の製造分野において利用できる。
【図１】
2018145106.tif 000002
【図２】
2018145106.tif 000003