(57)【要約】【課題】非侵襲的で、かつ尿細胞診を凌ぐ高精度の尿路上皮癌の診断方法を提供する。【解決手段】下記N結合型糖鎖のうち少なくとも１種を含む尿路上皮癌識別マーカー：m/z 1362、m/z 1525、m/z 1566、m/z 1591、m/z 1607、m/z 1648、m/z 1687、m/z 1709、m/z 1769、m/z 1794、m/z 1849、m/z 1871、m/z 1915、m/z 2011、m/z 2033、m/z 2058、m/z 2074、m/z 2118、m/z 2220、m/z 2337、m/z 2423、m/z 2525、m/z 2728、m/z 2744、m/z 3109、m/z 3341および被験者より採取された検体中における、前記尿路上皮癌識別マーカーの量を指標として用いた、尿路上皮癌の検査方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記N結合型糖鎖のうち少なくとも１種を含む尿路上皮癌識別マーカー。
2018179962.tif 000025
（式中、○はガラクトース（Gal）、◇はN-アセチルノイラミン酸（NeuAc）、●はマンノース（Man）、■はN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、△はデオキシヘキソース（dHex）をそれぞれ表す；左括弧はN末分岐型末端のいずれかの糖鎖に結合することを示す）
【請求項２】
尿路上皮癌が上部尿路上皮癌（腎盂・尿管癌）であり、N結合型糖鎖が
2018179962.tif 000026
（式中、○、◇、●、■、△は前記と同じ；左括弧はN末分岐型末端のいずれかの糖鎖に結合することを示す）のうちの少なくとも１種である、請求項１に記載の尿路上皮癌識別マーカー。
【請求項３】
被験者より採取された検体中における、請求項１または２に記載の尿路上皮癌識別マーカーの量を指標として用いた、尿路上皮癌の検査方法。
【請求項４】
以下の工程（１）および（２）を含み、被験者より採取された検体中の前記尿路上皮癌識別マーカーの量と、健常者より採取された検体中の前記尿路上皮癌識別マーカーの量との差または比が評価されることを特徴とする、請求項３に記載の尿路上皮癌の検査方法：
（１）被験者より採取された検体中の前記尿路上皮癌識別マーカーの量を測定する工程、および
（２）前記工程で測定された前記尿路上皮癌識別マーカーの量と、健常者より採取された検体中の前記尿路上皮癌識別マーカーの量とを比較し、両者の差または比を評価する工程。
【請求項５】
前記尿路上皮癌識別マーカーが抗体もしくはレクチンを用いて検出される、請求項３または４に記載の検査方法。
【請求項６】
前記被検者より採取された試料から、血尿を検査する工程をさらに含む、請求項３〜５のいずれかに記載の検査方法。
【請求項７】
以下の（１）〜（４）の工程を順次備えたことを特徴とする尿路上皮癌の判定方法：
（１）被検者より採取された血液中の糖タンパクからＮ結合型糖鎖を遊離させる工程；
（２）遊離させた糖鎖を精製する工程；
（３）精製した糖鎖の質量分析を行う工程；
（４）MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が、1362、1525、1566、1591、1607、1648、1687、1709、1769、1794、1849、1871、1915、2011、2033、2058、2074、2118、2220、2337、2423、2525、2728、2744、3109および3341のいずれかである糖鎖、または上記糖鎖に相当する糖鎖のうち、少なくとも１つの糖鎖の検出強度を測定する工程であって、前記検出強度が健常人と比較して増加または減少していることは前記被験者が尿路上皮癌患者であることを示す工程。
【請求項８】
尿路上皮癌が上部尿路上皮癌（腎盂・尿管癌）であり、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が、1362、1525、1566、1648、1709、1769、1794、1914、2011、2033、2074、2118、2423および2525のいずれかである、請求項７に記載の判定方法。
【請求項９】
前記被検者より採取された試料から、血尿を検査する工程をさらに含む、請求項７または８に記載の判定方法。
【請求項１０】
尿路上皮癌の発症をモニターするための、下記N結合型糖鎖のバイオマーカーとしての使用。
2018179962.tif 000027
（式中、○、◇、●、■、△は前記と同じ；左括弧はN末分岐型末端のいずれかの糖鎖に結合することを示す）
【請求項１１】
尿路上皮癌が上部尿路上皮癌（腎盂・尿管癌）であり、N結合型糖鎖が、
2018179962.tif 000028
（式中、○、◇、●、■、△は前記と同じ；左括弧はN末分岐型末端のいずれかの糖鎖に結合することを示す）のうちの少なくとも１種である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
被験者から得られた血液試料のN結合型糖鎖を測定する手段を含む、尿路上皮癌発症モニター用キット。
【請求項１３】
被験者からの血液試料を受領する手段と、血液試料に含まれるN結合型糖鎖を測定する手段と、測定したN結合型糖鎖を基準値と比較する手段と、基準値との比較から前記被験者が尿路上皮癌を発症しているかを判定する手段を含む、請求項１２記載の尿路上皮癌発症モニター用キット。
【請求項１４】
被験者から採取した血液試料中の下記N結合型糖鎖をスクリーニングすることを含む、尿路上皮癌の診断方法。
2018179962.tif 000029
（式中、○、◇、●、■、△は前記と同じ；左括弧はN末分岐型末端のいずれかの糖鎖に結合することを示す）
【請求項１５】
尿路上皮癌が上部尿路上皮癌（腎盂・尿管癌）であり、下記N結合型糖鎖をスクリーニングする、請求項１４に記載の診断方法。
2018179962.tif 000030
（式中、○、◇、●、■、△は前記と同じ；左括弧はN末分岐型末端のいずれかの糖鎖に結合することを示す）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のN結合型糖鎖（以下、「N-グリカン」ともいう）を尿路上皮癌診断用マーカーとして利用した尿路上皮癌の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
尿路上皮癌は膀胱癌と上部尿路上皮癌（腎盂・尿管癌）とを含み、尿路上皮組織が癌化することによって惹き起こされる。
【０００３】
膀胱癌は男性に多く、年齢は７０歳代が最も多いといわれており、また喫煙者に多いことが知られている。膀胱癌は、表在性膀胱癌と浸潤性膀胱癌の２つのタイプに分類される。
【０００４】
腎臓は腎実質（腎実質はさらに皮質と髄質に分けられる）という尿をつくる部分と、腎実質によりつくられた尿が集まる腎盂からできている。尿管は腎臓と膀胱をつないでいる長い管で、左右に１本ずつある。腎実質でつくられた尿は腎盂に集まり、排泄のため尿管を通って膀胱へと送られる。腎盂と尿管は上部尿路と呼ばれ、ここにできる癌が腎盂・尿管癌である。腎盂から尿管、膀胱、尿道の一部へとつながる尿路の内側は尿路上皮（移行上皮）と呼ばれる粘膜でできている。この細胞から発生する癌を尿路上皮癌といい、腎盂・尿管癌のほとんどを占める。腎盂・尿管癌は比較的稀な疾患で、頻度は膀胱癌の約1/20にすぎない。
【０００５】
膀胱癌の診断には膀胱鏡検査がgold standardである。しかしながら、従来の膀胱鏡検査における白日光下の観察では、小径の腫瘍や上皮内癌などの平坦型腫瘍、さらには隆起病変に付随する平坦病変の広がりの同定が困難である。そのため、膀胱鏡での明らかな所見がなくても特に尿細胞診陽性症例など上皮内癌の存在が疑われる症例では、ランダム生検が推奨されている。最近では蛍光膀胱鏡を用いた光力学診断（photodynamic diagnosis: PDD）や狭帯域光観察（Narrow-band imaging: NBI）といった方法が開発されており、膀胱鏡診断精度の向上が期待されている。光力学診断（PDD）は、腫瘍細胞に選択的に取り込まれる５−アミノレブリン酸（5-aminolevulinic acid: 5-ALA）やヘキシルアミノレブリン酸（Hexylaminolevulinic acid: HAL）という蛍光前駆物質を投与した後に、蛍光膀胱鏡を用いて膀胱内を観察し、赤色に蛍光発色する病変を検出するものである。狭帯域光観察（NBI）は、短波長のみに制限した特殊な光で、血管による微細模様や色調により、癌粘膜と正常粘膜の違いを強調表示し病変を検出するものである。
【０００６】
膀胱癌の検診スクリーニングにおける有効性が十分に検討されたマーカーは、尿潜血試験紙法のみである。尿細胞診検査は、尿中に排泄される尿路上皮剥離細胞の異型度を病理学的に診断する方法である。その感度は40〜60%、特異度は90〜100%と報告されている。
【０００７】
膀胱癌関連の新規分子マーカーとして、我が国では、Nuclear Matrix Protein 22（NMP22）、Bladder Tumor Antigen test（BTA test）などが保険適用となっている。近年、欧州では、これらに加えて、ゲノム不安定性の一種であるマイクロサテライト不安定性を検出するMicrosatellite analysisの有用性が報告されている。
【０００８】
一方、腎盂・尿管癌の診断には、腹部超音波、静脈性尿路造影、逆行性腎盂造影、腎盂尿管鏡、CT、MRI、尿細胞診などが用いられている。逆行性腎盂造影は、逆行性に尿道、膀胱を経て尿管内に細いカテーテルを挿入し、直接造影剤を注入して病変を描出する方法である。尿細胞診は、尿中に剥離してきた細胞を色素で染めて癌細胞の有無を調べる方法である。
【０００９】
近年、各種癌の診断用の腫瘍マーカーとして糖鎖が利用されてきている（非特許文献１〜５、特許文献１〜５）。
【００１０】
糖鎖を分析するためには、糖鎖のみをより分け、かつ必要な量を確保することが不可欠であるが、糖鎖の場合は分子を直接増幅させる方法はない。そのため、糖鎖の構造解析や定量化を行うには、血液、尿、組織や細胞などの生体試料から、分析に必要な量以上の糖鎖を直接精製しなければならなかった。近年開発されたグライコブロッティング法は、糖鎖のみを特異的に回収することができ、糖鎖の網羅的解析を可能とするものである。すなわち、アミノオキシ基やヒドラジド基を表面にもつ担体（ビーズ）がアルデヒド基を速やかに吸着する性質があること、また多くの生体分子のうち、分子内にアルデヒド基を持つのはほぼ遊離の糖鎖だけであることから、生体試料中のアルデヒド化合物群を選択的に捕捉することで糖鎖のみが特異的に回収するものである。非特許文献１〜５および特許文献１〜５に開示された技術は、グライコブロッティング法に基づくものである。
【００１１】
非特許文献１には、簡便で回収可能な血液あるいは尿を用いて、膀胱癌特定的な変化を確認するマーカーを提供することを課題として、5種類のN結合型糖鎖が非膀胱癌の血清（n=13）と比較して膀胱癌の血清（n=10）で有意に増加していることが開示されている。また、尿中糖鎖解析により、膀胱癌（n=8）では17種類のN結合型糖鎖が非膀胱癌（n=11）と比較して増加していたことが開示されている。加えて、この結果をもとにさらに大規模な解析を行えば膀胱癌において有用な血清糖鎖マーカーが確立できるかも知れないことが示唆されている。
【００１２】
その他、グライコブロッティング法に基づいた研究が、腎細胞癌（非特許文献２）、前立腺癌（非特許文献３）、膵臓癌（非特許文献４）および肝細胞癌（非特許文献５）で報告されている。
【００１３】
特許文献１には、腎細胞癌の有無を血清中のN結合型糖鎖の解析により判定する方法が開示されている。具体的には、患者の血清を用いてN結合型糖鎖の網羅的解析を行い、検出された糖鎖の発現量を指標とすることにより腎細胞癌の有無または悪性度を評価することができることが開示されている。また、糖鎖が、RC1、RC5、RC15、RC19、RC22、RC23、RC25、RC32、RC33、RC47および4分岐構造若しくは3分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖からなる群から選択されることが開示されている。
【００１４】
特許文献２には、膀胱癌を含む種々の癌やグリコシル化の変化を伴う任意の疾患について、糖鎖プロファイリングから癌マーカーとなり得る糖鎖、とりわけN結合型グリカンを探索することが開示されており、癌の具体例として、例えば、前立腺癌、膵癌、乳癌、膀胱癌、腎癌、結腸癌、卵巣癌、肝細胞癌、胃癌および肺癌が挙げられている。
【００１５】
特許文献３には、特定の構造を有するトリシアリル糖鎖からなる肝細胞癌マーカー、および該マーカーの量を指標として用いた肝細胞癌の検査法が開示されている。
【００１６】
特許文献４には、消化器癌の罹患の有無を識別するために用いられ、血液中に含まれる特定の構造を有するＮ結合型糖鎖であることを特徴とする消化器癌診断用マーカー、および該マーカーを用いた消化器癌を早期かつ簡便に検査し得る消化器癌の検査方法が開示されている。
【００１７】
特許文献５には、N結合型糖鎖を利用した膵臓癌の診断方法が開示されいる。
【００１８】
上記のように、各種癌の診断用の腫瘍マーカーとして糖鎖が利用されてきているが、尿路上皮癌の診断用の腫瘍マーカーとして糖鎖は知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】再表２０１１／０３７０４５号公報
【特許文献２】特表２００８−５３９４１３号公報
【特許文献３】特許４７５２０３２号公報
【特許文献４】特開２０１３−０８３４９０号公報
【特許文献５】特許５２１２８９３号公報
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】泌尿器外科Vol.27, No.12, pp.1977 (2014.12.15)
【非特許文献２】Hatakeyama S et al., Serum N-glycan profiling predicts prognosis in patients undergoing hemodialysis. The Scientific World Journal. 2013; 2013:268407
【非特許文献３】Ishibashi Y et al., Serum tri- and tetra-antennary N-glycan is a potential predictive biomarker for castration-resistant prostate cancer. The Prostate. 2014; 74:1521-9
【非特許文献４】Nouso K et al., Clinical utility of high-throughput glycome analysis in patients with pancreatic cancer. Journal of gastroenterology. 2013; 48:1171-9
【非特許文献５】Miyahara K et al., Serum glycan as a prognostic marker in patients with advanced hepatocellular carcinoma treated with sorafenib. Hepatology (Baltimore, Md). 2014; 59:355-6
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
膀胱癌の診断には膀胱鏡検査が必須であるが、疼痛や感染症など被験者に侵襲の大きい検査である。非侵襲的検査として尿細胞診が用いられるが、感度が低いため有用性は限られる。
【００２２】
また、腎盂・尿管癌の診断も逆行性腎盂造影や尿管鏡検査など高度な侵襲を伴う割には診断精度が低い。尿路上皮癌の非侵襲的検査として尿細胞診が用いられるが、感度が低いため有用性は限られる。
【００２３】
このように、尿路上皮癌の診断には非侵襲的検査として尿細胞診が用いられるが、感度が低いため膀胱鏡検査を含む侵襲的な検査が必要であり、診断精度や患者の身体負担という問題が解決されていなかった。一方、早期発見に有用な血中腫瘍マーカーは、尿路上皮癌では知られておらず、糖鎖性バイオマーカーも検索されていない。
【００２４】
それゆえ、非侵襲的で、かつ尿細胞診を凌ぐ高精度の尿路上皮癌の診断方法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、尿路上皮癌症例において血清N-glycanの網羅的質量解析を行うことにより、尿路上皮癌に特異的な腫瘍マーカーを見出した。とりわけ、26の尿路上皮癌関連N-グリカンの組み合わせ（N-グリカン・スコア）が高感度かつ高特異度にて尿路上皮癌を予測できること、また、尿細胞診分類とは関係なく予測でき、それゆえ、細胞診陰性の被験者に対しても高い予測価値を有することを見出し、本発明を完成するに至った。本発明の腫瘍マーカーを用いることにより、尿路上皮癌を高精度で判定することができる。
【００２６】
本発明は、以下を含む。
［１］下記N結合型糖鎖のうち少なくとも１種を含む尿路上皮癌識別マーカー。
2018179962.tif 000002
（式中、○はガラクトース（Gal）、◇はN-アセチルノイラミン酸（NeuAc）、●はマンノース（Man）、■はN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、△はデオキシヘキソース（dHex）をそれぞれ表す；左括弧はN末分岐型末端のいずれかの糖鎖に結合することを示す）
［２］尿路上皮癌が上部尿路上皮癌（腎盂・尿管癌）であり、N結合型糖鎖が、
2018179962.tif 000003
（式中、○、◇、●、■、△は前記と同じ；左括弧はN末分岐型末端のいずれかの糖鎖に結合することを示す）のうちの少なくとも１種である、［１］に記載の尿路上皮癌識別マーカー。
［３］被験者より採取された検体中における、［１］または［２］に記載の尿路上皮癌識別マーカーの量を指標として用いた、尿路上皮癌の検査方法。
［４］以下の工程（１）および（２）を含み、被験者より採取された検体中の前記尿路上皮癌識別マーカーの量と、健常者より採取された検体中の前記尿路上皮癌識別マーカーの量との差または比が評価されることを特徴とする、［３］に記載の尿路上皮癌の検査方法：
（１）被験者より採取された検体中の前記尿路上皮癌識別マーカーの量を測定する工程、および
（２）前記工程で測定された前記尿路上皮癌識別マーカーの量と、健常者より採取された検体中の前記尿路上皮癌識別マーカーの量とを比較し、両者の差または比を評価する工程。
［５］前記尿路上皮癌識別マーカーが抗体もしくはレクチンを用いて検出される、［３］または［４］に記載の検査方法。
［６］前記被検者より採取された試料から、血尿を検査する工程をさらに含む、［３］〜［５］のいずれかに記載の検査方法。
［７］以下の（１）〜（４）の工程を順次備えたことを特徴とする尿路上皮癌の判定方法：
（１）被検者より採取された血液中の糖タンパクからN結合型糖鎖を遊離させる工程；
（２）遊離させた糖鎖を精製する工程；
（３）精製した糖鎖の質量分析を行う工程；
（４）MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が、1362、1525、1566、1591、1607、1648、1687、1709、1769、1794、1849、1871、1915、2011、2033、2058、2074、2118、2220、2337、2423、2525、2728、2744、3109および3341のいずれかである糖鎖、または上記糖鎖に相当する糖鎖のうち、少なくとも１つの糖鎖の検出強度を測定する工程であって、前記検出強度が健常人と比較して増加または減少していることは前記被験者が尿路上皮癌患者であることを示す工程。
［８］尿路上皮癌が上部尿路上皮癌（腎盂・尿管癌）であり、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が、1362、1525、1566、1648、1709、1769、2011、2033、2074、2118、2423および2525のいずれかである、［７］に記載の判定方法。
［９］前記被検者より採取された試料から、血尿を検査する工程をさらに含む、［７］または［８］に記載の判定方法。
［１０］尿路上皮癌の発症をモニターするための、下記N結合型糖鎖のバイオマーカーとしての使用。
2018179962.tif 000004
（式中、○、◇、●、■、△は前記と同じ；左括弧はN末分岐型末端のいずれかの糖鎖に結合することを示す）
［１１］尿路上皮癌が上部尿路上皮癌（腎盂・尿管癌）であり、N結合型糖鎖が、
2018179962.tif 000005
（式中、○、◇、●、■、△は前記と同じ；左括弧はN末分岐型末端のいずれかの糖鎖に結合することを示す）のうちの少なくとも１種である、［１０］に記載の使用。
［１２］被験者から得られた血液試料のN結合型糖鎖を測定する手段を含む、尿路上皮癌発症モニター用キット。
［１３］被験者からの血液試料を受領する手段と、血液試料に含まれるN結合型糖鎖を測定する手段と、測定したN結合型糖鎖を基準値と比較する手段と、基準値との比較から前記被験者が尿路上皮癌を発症しているかを判定する手段を含む、［１２］記載の尿路上皮癌発症モニター用キット。
［１４］被験者から採取した血液試料中の下記N結合型糖鎖をスクリーニングすることを含む、尿路上皮癌の診断方法。
2018179962.tif 000006
（式中、○、◇、●、■、△は前記と同じ；左括弧はN末分岐型末端のいずれかの糖鎖に結合することを示す）
［１５］尿路上皮癌が上部尿路上皮癌（腎盂・尿管癌）であり、下記N結合型糖鎖をスクリーニングする、［１４］に記載の診断方法。
2018179962.tif 000007
（式中、○、◇、●、■、△は前記と同じ；左括弧はN末分岐型末端のいずれかの糖鎖に結合することを示す）
【発明の効果】
【００２７】
本発明のN結合型糖鎖は尿路上皮癌に特異的な識別マーカーであり、血清中の特定のN結合型糖鎖を解析することにより、被験者に大きな負担をかけることなく、尿路上皮癌を高感度かつ高特異度で判定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、曲線下面積（AUC）が7.0以上であることにより選択された尿路上皮癌関連N-グリカンを示す。合計6つのN-グリカン（尿路上皮癌患者で上昇する糖鎖m/z 1687, 1871, 2011, 2337および低下する糖鎖m/z1566, 1769）がバイオマーカーとして選択された。
【図２Ａ】図２Ａは、N-グリカン濃度の健常ボランティアと尿路上皮癌患者との比較を示す図である。エラーバーは95%の信頼区間を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、N-グリカン濃度の健常ボランティアと尿路上皮癌患者との比較を示す図である。エラーバーは95%の信頼区間を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、N-グリカン濃度の健常ボランティアと尿路上皮癌患者との比較を示す図である。エラーバーは95%の信頼区間を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、N-グリカン濃度の健常ボランティアと尿路上皮癌患者との比較を示す図である。エラーバーは95%の信頼区間を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、N-グリカン濃度の健常ボランティアと尿路上皮癌患者との比較を示す図である。エラーバーは95%の信頼区間を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、N-グリカン濃度の健常ボランティアと尿路上皮癌患者との比較を示す図である。エラーバーは95%の信頼区間を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、N-グリカン・スコアの健常ボランティアと尿路上皮癌患者との比較を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、N-グリカン・スコアの膀胱癌と上部尿路上皮癌との比較を示す図である。有意の差異は認められなかった。
【図３Ｃ】図３Ｃは、N-グリカン・スコアのlocalized (Ta-1N0M0)およびadvanced (T2 or higher)の尿路上皮癌患者の比較を示す図である。有意の差異は認められなかった。
【図３Ｄ】図３Ｄは、N-グリカン・スコアの尿細胞診分類の比較を示す図である。N-グリカン・スコアと尿細胞診分類との間に相関は認められなかった。
【図４】図４は、N-グリカン・スコアを縦軸に、被験者を横軸として点数の低い順に並べて健常ボランティアと尿路上皮癌患者の分布をSwimmersプロットで表した図である。
【図５】図５は、N-グリカン・スコアの診断精度をROC解析により評価した結果を示す図である。
【図６】図６は、N-グリカン・スコアに加えて血尿検査をした場合の診断精度をROC解析により評価した結果を示す図である。
【図７】図７は、曲線下面積（AUC）が7.0以上であることにより選択された尿路上皮癌関連N-グリカンと、これに血尿検査を加えた場合のROC曲線を示す。
【図８】図８は、N-グリカン・スコアに加えて血尿検査結果を加えたスコアを縦軸に、被験者を横軸として点数の低い順に並べて健常ボランティアと尿路上皮癌患者の分布をSwimmersプロットで表した図である。
【図９】図９は、血清イムノグロブリンのグライコブロッティングによる網羅的解析により同定された血清イムノグロブリン由来N-グリカンを示す図である。
【図１０】図１０は、上部尿路上皮癌患者を健常ボランティアと比較したN-グリカンの変動を示す図である。
【図１１】図１１は、カットオフ値を-0.615とした場合における上部尿路上皮癌患者および健常ボランティアのN-グリカン・スコアを示す図である。上部尿路上皮癌患者では、N-グリカン・スコアはカットオフ値よりも低く、健常ボランティアでは、N-グリカン・スコアはカットオフ値よりも高いことが示されている。
【図１２】図１２は、上部尿路上皮癌患者および健常ボランティアにおけるN-グリカン・スコアの分布を示す図である。
【図１３】図１３は、得られたN-グリカン・スコアに基づく、上部尿路上皮癌の予測性を示す図である。
【図１４】図１４は、IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgG（合計）およびIg（合計）のそれぞれについて、上部尿路上皮癌患者を健常ボランティアと比較したN-グリカンの変動を示す図である。
【図１５】図１５は、上部尿路上皮癌に関連するレクチン結合イムノグロブリンについて、上部尿路上皮癌患者を健常ボランティアと比較したN-グリカンの変動を示す図である。
【図１６】図１６は、カットオフ値を-1.275とした場合における上部尿路上皮癌患者および健常ボランティアのレクチンアレイ・スコアを示す図である。上部尿路上皮癌患者では、レクチンアレイ・スコアはカットオフ値よりも低く、健常ボランティアでは、レクチンアレイ・スコアはカットオフ値よりも高いことが示されている。
【図１７】図１７は、上部尿路上皮癌患者および健常ボランティアにおけるレクチンアレイ・スコアの分布を示す図である。
【図１８】図１８は、得られたレクチンアレイ・スコアに基づく、上部尿路上皮癌の予測性を示す図である。
【図１９】図１９は、血清のグライコブロッティングによる網羅的解析により同定された血清由来N-グリカンを示す図である。
【図２０】図２０は、尿路上皮癌患者を健常ボランティアと比較したN-グリカンの変動を示す図である。
【図２１】図２１は、カットオフ値を0とした場合における尿路上皮癌患者および健常ボランティアのN-グリカン・スコアを示す図である。尿路上皮癌患者では、N-グリカン・スコアはカットオフ値よりも低く、健常ボランティアでは、N-グリカン・スコアはカットオフ値よりも高いことが示されている。
【図２２】図２２は、尿路上皮癌患者および健常ボランティアにおけるN-グリカン・スコアの分布を示す図である。
【図２３】図２３は、得られたN-グリカン・スコアに基づく、尿路上皮癌の予測性を示す図である。
【図２４】図２４は、レクチンアレイの概略を示す図である。
【図２５Ａ】図２５は、免疫グロブリン（Ig）画分の５つの尿路上皮癌関連N-グリカンレベルを示す図である。(a)〜(e)は尿路上皮癌群（UC）、健常ボランティア群（HV）および前立腺癌群（PC）におけるIg画分のcomplex biantennary-type N-グリカン (m/z 1607, 1769および2074)レベルおよびフコシル化bisecting GlcNAc-type N-グリカン (m/z 2118および2423)レベルを示す。示した結果は、３つの独立した実験の代表値である。非正規分布モデルのためのMann-WhitneyのU検定を用いて群間の差異を統計的に比較した。(f)は、本発明における候補N-グリカンの合成経路を示す。
【図２５Ｂ】図２５は、免疫グロブリン（Ig）画分の５つの尿路上皮癌関連N-グリカンレベルを示す図である。(a)〜(e)は尿路上皮癌群（UC）、健常ボランティア群（HV）および前立腺癌群（PC）におけるIg画分のcomplex biantennary-type N-グリカン (m/z 1607, 1769および2074)レベルおよびフコシル化bisecting GlcNAc-type N-グリカン (m/z 2118および2423)レベルを示す。示した結果は、３つの独立した実験の代表値である。非正規分布モデルのためのMann-WhitneyのU検定を用いて群間の差異を統計的に比較した。(f)は、本発明における候補N-グリカンの合成経路を示す。
【図２６】図２６は、グライコブロッティング法の一般的なプロトコールおよびグライコブロッティング法に基づくhigh-throughput臨床グリカン分析を示す図である。(a)グライコブロッティングのために10μlの血清Ig画分試料をSweetBlotTM (System Instruments, Hachioji, Japan)に加えた。(b)代表的な全血清および精製したIg画分試料についてのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）のCoomassie brilliant blue (CBB)染色バンド。レーン１〜４：全血清、レーン５〜８：UIg画分。(c)Igタンパク質からのN-グリカンの酵素的な開裂後、消化混合物中に放出された全N-グリカンを直接BlotGlyco Hビーズ(Sumitomo Bakelite, Co., Tokyo)と混合してN-グリカンを捕捉した。(d)洗浄によって他の分子からビーズを分離した後、シアル酸をメチルエステル化した。(e)ついで、これらプロセシングしたN-グリカンをベンジルオキシアミン(BOA)で標識し、BlotGlyco Hビーズから放出した。(f)Ig画分からのBOA標識N-グリカンの質量スペクトルを、Ultraflex III instrument (Bruker Daltonics, Germany)を用いて得た。合計32種のN-グリカンがIg画分中で同定された。同定されたN-グリカンの構造を単糖符号で示す：○はガラクトース(Gal)、●はマンノース(Man)、■はN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、▲はフコース(Fuc)および◆はシアル酸。
【図２７Ａ】図２７は、尿路上皮癌（UC）（膀胱癌（UCB）および上部尿路上皮癌（UTUC））患者、健常ボランティア（HV）および前立腺癌（PC）患者での血清免疫グロブリン（Ig）レベルを示す図である。(a)尿路上皮癌（UC）群、健常ボランティア（HV）群および前立腺癌（PC）群での血清全Ig(IgG1-4, IgMおよびIgAの合計)レベル。(b)尿路上皮癌（UC）群、健常ボランティア（HV）群および前立腺癌（PC）群での血清全IgG(IgG1-4)レベル。(c)尿路上皮癌（UC）群、健常ボランティア（HV）群および前立腺癌（PC）群での血清IgMレベル。(d)尿路上皮癌（UC）群、健常ボランティア（HV）群および前立腺癌（PC）群での血清IgAレベル。(e)尿路上皮癌（UC）群、健常ボランティア（HV）群および前立腺癌（PC）群での血清IgG1レベル。(f)尿路上皮癌（UC）群、健常ボランティア（HV）群および前立腺癌（PC）群での血清IgG2レベル。(g)尿路上皮癌（UC）群、健常ボランティア（HV）群および前立腺癌（PC）群での血清IgG3レベル。(h)尿路上皮癌（UC）群、健常ボランティア（HV）群および前立腺癌（PC）群での血清IgG4レベル。示した結果は、３つの独立した実験の代表値である。非正規分布モデルのためのMann-WhitneyのU検定を用いて群間の差異を統計的に比較した。
【図２７Ｂ】図２７は、尿路上皮癌（UC）（膀胱癌（UCB）および上部尿路上皮癌（UTUC））患者、健常ボランティア（HV）および前立腺癌（PC）患者での血清免疫グロブリン（Ig）レベルを示す図である。(a)尿路上皮癌（UC）群、健常ボランティア（HV）群および前立腺癌（PC）群での血清全Ig(IgG1-4, IgMおよびIgAの合計)レベル。(b)尿路上皮癌（UC）群、健常ボランティア（HV）群および前立腺癌（PC）群での血清全IgG(IgG1-4)レベル。(c)尿路上皮癌（UC）群、健常ボランティア（HV）群および前立腺癌（PC）群での血清IgMレベル。(d)尿路上皮癌（UC）群、健常ボランティア（HV）群および前立腺癌（PC）群での血清IgAレベル。(e)尿路上皮癌（UC）群、健常ボランティア（HV）群および前立腺癌（PC）群での血清IgG1レベル。(f)尿路上皮癌（UC）群、健常ボランティア（HV）群および前立腺癌（PC）群での血清IgG2レベル。(g)尿路上皮癌（UC）群、健常ボランティア（HV）群および前立腺癌（PC）群での血清IgG3レベル。(h)尿路上皮癌（UC）群、健常ボランティア（HV）群および前立腺癌（PC）群での血清IgG4レベル。示した結果は、３つの独立した実験の代表値である。非正規分布モデルのためのMann-WhitneyのU検定を用いて群間の差異を統計的に比較した。
【図２８】図２８は、診断N-グリカン・スコアの臨床的有意を示す図である。診断N-グリカン・スコア（dNGScore）は、健常ボランティア（HV）群および前立腺癌（PC）群よりも尿路上皮癌（UC）（膀胱癌（UCB）および上部尿路上皮癌（UTUC））群で有意に高かった。
【図２９】図２９は、診断N-グリカン・スコアの臨床的有意を示す図であり、健常ボランティア（HV）、前立腺癌（PC）、上部尿路上皮癌（UTUC）および膀胱癌（BC）におけるN-グリカン・スコアの分布を示す（dNGScoreのWaterfallプロット）。
【図３０】図３０は、診断N-グリカン・スコアの臨床的有意を示す図である。尿路上皮癌（UC）（膀胱癌（UCB）および上部尿路上皮癌（UTUC））の検出のためのdNGScoreのROC曲線分析、血尿および尿細胞診の結果を示す。
【図３１】図３１は、診断N-グリカン・スコアの臨床的有意を示す図であり、dNGScoreレベルと血尿との関連を示す。カットオフ値を−0.0955とした場合の血尿における陰性の予測値(Negative)および陽性の予測値（Positive）のN-グリカン・スコアを示す。
【図３２】図３２は、診断N-グリカン・スコアの臨床的有意を示す図であり、dNGScoreレベルと尿細胞診との関連を示す。カットオフ値を−0.0955とした場合の尿細胞診におけるクラスＩ〜ＶのN-グリカン・スコアを示す。
【図３３】図３３は、診断N-グリカン・スコアの臨床的有意を示す図であり、dNGScoreレベルと腫瘍侵襲性との関連を示す。カットオフ値を−0.0955とした場合のNMIBC、MIBC、非筋層浸潤上部尿路上皮癌（UTUC）および筋層浸潤上部尿路上皮癌（UTUC）のN-グリカン・スコアを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、特定の構造を有するN結合型糖鎖を含む尿路上皮癌識別マーカー、被験者より採取された検体中における、前記尿路上皮癌識別マーカーの量を指標として用いた、尿路上皮癌の検査方法、および被験者から得られた血液試料のN結合型糖鎖を測定する手段を含む、尿路上皮癌発症モニター用キットを提供する。
【００３０】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
【００３１】
これまで、尿路上皮癌において特異的な血清腫瘍マーカーは同定されておらず、糖鎖性バイオマーカーも検索されていなかった。本発明者らは、尿路上皮癌症例において、グライコブロッティング法を用いて血清N結合型糖鎖（N-グリカン）の網羅的質量解析を行った。すなわち、本発明者らは、N結合型糖鎖（N-グリカン）、特に、尿路上皮癌患者の血清に含まれるN結合型糖鎖（N-グリカン）に着目し、尿路上皮癌診断用マーカー、および尿路上皮癌の検査方法の開発を試みた。
【００３２】
具体的には、同意が得られた尿路上皮癌患者289例を被検者とし、各被検者より血液を採取し、血清中のN結合型糖鎖に関して質量解析を行った。その結果、被検者（尿路上皮癌患者）の血清において、健常者（348例）と比較して、有意に存在量が変化しているN結合型糖鎖を同定することに成功し、本発明を完成するに至った
【００３３】
ここで、本発明の解析に用いたグライコブロッティング（Glycoblotting）法は、多くの生体分子が存在する中、その分子内にアルデヒド基（＝ヘミアセタール基）を持つ唯一の分子である糖鎖を選択的に捕捉することで、糖鎖のみを特異的に回収できるという原理に基づくものである。
【化１】
2018179962.tif 000008
具体的には、アミノオキシ基やヒドラジド基などのアルデヒド基に速やかに求核付加する官能基を高密度で表面に持つビーズを作製し、酵素処理によって予め根元のタンパク質から切断した糖鎖を含む試料溶液と反応させ、糖鎖のみを担体に共有結合させることで夾雑物を完全に洗浄して糖鎖のみを精製する。捕捉した糖鎖はビーズから選択的条件で切り離し、質量分析に供する。
【００３４】
本発明において、「糖鎖」とは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、N−アセチルグルコサミン、N−アセチルガラクトサミン、シアル酸等の単糖およびこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に複数結合した分子の総称である。
【００３５】
本発明において、「N結合型糖鎖」とは、糖タンパク質の糖鎖のうち、タンパク質のアスパラギン残基が持つ側鎖のアミド基の窒素原子に結合している糖鎖であり、N-グリカン、N型糖鎖、アスパラギン結合型糖鎖とも称される。本発明において、血液中の糖タンパクからN結合型糖鎖を遊離させる方法としては、例えば、N-グリコシダーゼF（グリコペプチダーゼ、PN Gase、グリカナーゼ、グリコアミダーゼなどとも称される）やグリコペプチダーゼA等を用いた酵素法や、ヒドラジン分解法を具体的に例示することができるが、なかでも、N−グリコシダーゼFによる酵素法を好例として挙げることができる。その際、トリプシン等のプロテアーゼを併用することもできる。また、本発明において、遊離させた糖鎖を精製する方法としては、試料中の混合物から糖鎖を選択的に捕捉し精製する方法であれば特に制限されないが、MALDI-TOF-MS型分析機での高感度測定用に最適化された糖鎖補足ビーズであるBlotGlyco（登録商標）for MALDI（住友ベークライト株式会社製）を用いた方法を好例として具体的に挙げることができる。
【００３６】
本発明において、「MALDI-TOF-MS」とは、Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time-of-Flight（Mass Spectrometer）の略語であり、MALDI法を利用して飛行時間を基に質量を測定する方法である。具体的には、MALDI法は、試料をプレート上にスポットした後、マトリクス溶液（2,5-Dihydroxybenzoic acid）を添加、乾固し、結晶状態にし、パルスレーザー照射により大きなエネルギーをマトリクス上に与え、（M+H）＋、（M+Na）＋などの試料由来イオンとマトリクス由来イオンとを脱離させる方法で、MALDI-TOF-MSは、MALDI法を利用して飛行時間を元に質量を測定するものである。イオンが一定の加速電圧Vで加速される場合、イオンの質量をm、イオンの速度をv、イオンの電荷数をz、電気素量をe、イオンの飛行時間をtとしたとき、イオンのm/zは、m/z=2eVt2/L2で表すことができる。
【００３７】
本発明においては、MALDI-TOF-MS型分析機以外の分析機を使用することもでき、イオン源として、例えば、電子イオン化法、化学イオン化法、電界離脱法、高速原子衝突法、エレクトロスプレーイオン化法、大気圧化学イオン化法等を用いることができ、また、分析法としては、例えば、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などの方法を用いることができる。さらに、上記分析法と、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）とを組み合わせて用いることもできる。
【００３８】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が1362である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、1362m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)2 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００３９】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が1525である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、1525m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)3 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００４０】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が1566である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、1566m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)5(HexNAc)3と推定される。
【００４１】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が1591である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、1591m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(HexNAc)2(dHex)1 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００４２】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が1607である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、1607m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)1(HexNAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００４３】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が1648である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、1648m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(HexNAc)3 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００４４】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が1687である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、1687m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)4 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００４５】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が1709である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、1709m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)1(HexNAc)1(NeuAc)1 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００４６】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が1769である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、1769m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)2(HexNAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００４７】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が1794である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、1794m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(HexNAc)3(dHex)1 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００４８】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が1849である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、1849m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)5 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される
【００４９】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が1871である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、1871m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)2(HexNAc)1(NeuAc)1 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００５０】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が1915である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、1915m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)2(HexNAc)2(dHex)1 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００５１】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が2011である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、2011m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)6 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００５２】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が2033である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、2033m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)3(HexNac)1(NeuAc)1 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００５３】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が2058である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、2058m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)1(HexNAc)2(dHex)1(NeuAc)1 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００５４】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が2074である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、2074m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)2(HexNAc)2(NeuAc)1+ (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００５５】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が2118である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、2118m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)2(HexNAc)3(dHex)1 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００５６】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が2220である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、2219.8m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)2(HexNAc)2(dHex)1(NeuAc)1 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００５７】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が2337である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、2337m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)3(HexNAc)4 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００５８】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が2423である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、2423m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)2(HexNAc)3(dHex)1(NeuAc)1 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００５９】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が2525である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、2525m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)2(HexNAc)2(dHex)1(NeuAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００６０】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が2728である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、2728m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)2(HexNAc)3(dHex)1(NeuAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００６１】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が2744である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、2744m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)3(HexNAc)3(NeuAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００６２】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が3109である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、3109m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)4(HexNAc)4(NeuAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００６３】
本発明において、MALDI-TOF-MS型分析機を用いた質量分析によるピークの質量電荷比（m/z）が3341である糖鎖とは、MALDI-TOF-MS型分析機よる質量分析の結果、3341m/zマススペクトルピークを呈する糖鎖であり、その構造式は、(Hex)3 (HexNAc)3(dHex)2(NeuAc)3 + (Man)3(GlcNAc)2と推定される。
【００６４】
本発明において、下記N結合型糖鎖を尿路上皮癌識別マーカーとして用いることができる。
2018179962.tif 000009
（式中、○はガラクトース（Gal）、◇はN-アセチルノイラミン酸（NeuAc）、●はマンノース（Man）、■はN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、△はデオキシヘキソース（dHex）をそれぞれ表す；左括弧はN末分岐型末端のいずれかの糖鎖に結合することを示す）
【００６５】
また、上記N結合型糖鎖のうち、下記N結合型糖鎖は、特に上部尿路上皮癌（腎盂・尿管癌）の識別マーカーとして用いることができる。
2018179962.tif 000010
（式中、○、◇、●、■、△は前記と同じ；左括弧はN末分岐型末端のいずれかの糖鎖に結合することを示す）
【００６６】
本発明において、前記尿路上皮癌識別マーカーは、抗体またはレクチンを用いて検出することもできる。
【００６７】
本発明において、尿路上皮癌は、腎盂から尿管、膀胱、尿道の一部へとつながる尿路の内側を構成する尿路上皮（移行上皮）と呼ばれる粘膜から発生する癌であり、膀胱癌および上部尿路上皮癌（腎盂・尿管癌）の両者を含む。本発明の尿路上皮癌識別マーカーは、膀胱癌および上部尿路上皮癌（腎盂・尿管癌）のいずれの検査/判定に用いることができるが、上部尿路上皮癌（腎盂・尿管癌）が好ましい。
【００６８】
年齢、性別を合わせた尿路上皮癌患者血清患者212名（膀胱癌177名、腎盂尿管癌35名）（早期癌114例、進行癌98例）と、健常ボランティア212名の血清を用い、グライコブロッティング法によりN-結合型糖鎖の網羅的解析を行った。定量的プロファイルは、血清中のN-結合型糖鎖の捕捉・精製後、質量分析装置（MALDI-TOF MS）により取得した。各糖鎖の発現量は、内部標準として加えた既知量オリゴ糖とのスペクトル上の面積比より算出した糖鎖の絶対定量値、およびMALDI-TOF MSで観察されたピーク強度を用いた。検出された糖鎖のうち、尿路上皮癌患者で上昇する糖鎖m/z 1687, 1871, 2011, 2337と低下する糖鎖m/z1566, 1769の発現量に着目し、受信者動作特性（ROC）曲線からそれぞれの糖鎖で陽性・陰性判定のカットオフ値を算出した。選択された糖鎖は以下のとおりであった。
【００６９】
2018179962.tif 000011
（式中、○、◇、●、■、△は前記と同じ；左括弧はN末分岐型末端のいずれかの糖鎖に結合することを示す）
【００７０】
カットオフ値を基準に陽性糖鎖数をN-グリカン・スコアと定義し算出すると、尿路上皮癌患者でN-グリカン・スコアが有意に高値であった（健常ボランティア：平均値1.406 vs．尿路上皮癌患者：平均値4.425）。
【００７１】
また、N-グリカン・スコアを縦軸に、被験者を横軸とし点数の低い順にならべるとN-グリカン・スコア4点以上で明らかに尿路上皮癌患者が多くなることが示された。N-グリカン・スコアによる尿路上皮癌の診断精度をROC曲線にて検討すると、有意に高い値が得られた（AUC=0.95）。
【００７２】
N-グリカン・スコア3点以上、4点以上、5点以上をカットオフ値とすると、それぞれの尿路上皮癌診断陽性率は82.8%（197/238名）、94.1%(160/170名)、99.1%（115/116名）となり、低侵襲な方法で尿路上皮癌を鑑別できることが示唆された。ちなみに臨床では尿細胞診が低侵襲な診断マーカーとして利用されているが、今回尿路上皮癌患者で同時に採取した尿細胞診の陽性率は39％(83/212名)であった。つまり、N-グリカン・スコアは、尿路上皮癌が存在すると増加する値であり、採血で尿路上皮癌を見出す診断マーカーとして、期待できるものである。
【００７３】
さらに、本発明の方法において検出され用いられるN結合型糖鎖には、4分岐構造もしくは3分岐でバイセクティング構造を有する糖鎖も含まれる。「4分岐構造」とは、糖鎖のコア構造のうちα1→6結合したマンノースから、さらにβ1→6及びβ1→2結合したN-アセチルグルコサミンにより糖鎖が2つに分岐し、且つ、コア構造のうちα1→3結合したマンノースからは、β1→4およびβ1→2結合したＮ-アセチルグルコサミンにより糖鎖が2つに分岐した構造を意味する。また、「3分岐でバイセクティング構造」とは、上記4つの分岐鎖のうちの1つの分岐鎖が欠落し、且つ、糖鎖の主鎖の末端にβ1→4結合したGlcNAc（即ちバイセクティングGlcNAc）が存在する構造を有する糖鎖を意味する。
【００７４】
本発明では、上記N-グリカン・スコアに加えて血尿検査を行うことで、尿路上皮癌の判定精度をさらに高めることができる。血尿は、尿路上皮癌の最大の症状であり、主訴が血尿である割合は尿路上皮癌患者の13〜28％にのぼっている。
【００７５】
本発明はまた、被験者から得られた血液試料のN結合型糖鎖を測定する手段を含む、尿路上皮癌発症モニター用キットをも提供する。具体的には、本発明の尿路上皮癌発症モニター用キットは、被験者からの血液試料を受領する手段と、血液試料に含まれるN結合型糖鎖を測定する手段と、測定したN結合型糖鎖を基準値と比較する手段と、基準値との比較から前記被験者が尿路上皮癌を発症しているかを判定する手段を含む。
【００７６】
本発明はさらに、被験者から採取した血液試料中のN結合型糖鎖をスクリーニングすることを含む、尿路上皮癌の診断方法をも提供する。ここで、スクリーニングするN結合型糖鎖は、下記N結合型糖鎖のうち少なくとも１種である。
2018179962.tif 000012
（式中、○、◇、●、■、△は前記と同じ；左括弧はN末分岐型末端のいずれかの糖鎖に結合することを示す）
【００７７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００７８】
2007年3月から2015年9月の間に、尿路上皮癌患者1264人を弘前大学病院およびつがる総合病院で処置した。このうち、処置前の患者278人（膀胱癌230人、腎盂尿管癌48人）から血清試料を採取し、−80°Cで貯蔵した。腫瘍のステージは、2009 Tumor-Node-Metastasis classificationに従って決定した。コントロール試料は、秋田大学病院および弘前大学病院の健常ボランティアから得た。血清バンクは合計で358人のボランティアからなり、これも−80°Cで貯蔵した。遡及的な本研究の性質のため、患者のバックグラウンド、とりわけ年齢および性別はグループ間で様々であった。患者のバックグラウンドを調整し、患者と健常ボランティアとの間での血清N-グリカン比較の有効性を保証するため、傾向スコアマッチング戦略（propensity score matching strategy）を用いた。傾向スコアはロジスティック解析により計算し、解析に用いたデータは年齢および性別を含んでいた。最後に、尿路上皮癌患者212人（尿路上皮癌患者群）と健常ボランティア212人（健常ボランティア群）とのペアが本研究に参加した。N-グリカン濃度（μM）を比較し、健常ボランティア群と尿路上皮癌患者群とで尿路上皮癌の存在を検出し、N-グリカンの候補を曲線下面積（area-under-the-curve; AUC）により選択し、最適のカットオフ値を受信者動作特性（receiver operating characteristic; ROC）曲線により決定した。候補N-グリカンは、濃度がカットオフ値よりも高いかまたは低いときに陽性のものとして定義した。陽性の決定に基づき、候補N-グリカンの陽性数を加えることにより、N-グリカン・スコアを得た。N-グリカン・スコアの診断精度は、ROC解析により評価した。
【００７９】
グライコブロッティング法および質量分析
SweetBlotTM（System Instruments, Hachijo, Japan）を用い、文献記載の方法に従って血清N-グリカン分析を行った（Nishimura S et al. High-throughput protein glycomics: combined use of chemoselective glycoblotting and MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. Angewandte Chemie (International ed in English). 2004;44:91-6）。簡単に説明すると、40pmolの内部標準ジシアロ-ガラクトシル化二分岐N-グリカン（アミド化シアル酸（A2アミドグリカン）を有する）を含有する血清試料（10μL）を、それぞれ還元しDTTおよびヨードアセトアミド（和光純薬）を用いてアルキル化した。ついで、得られた混合物をトリプシン処理し、加熱不活化した。室温に冷却後、ペプチドN-グリカナーゼF (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA) を混合物に加えて血清の全N-グリカンを遊離させた。37°Cで360分間インキュベートした後、得られた20μLの混合物は2.5μLの血清と等価であった。前処理した各試料のアリコートを500μLのBlotGlyco Hビーズ (Sumitomo Bakelite, Co., Tokyo, Japan)と混合し、MultiScreen SolvinertRフィルタープレート (MerkMillipore, Billerica, MA, USA)上で安定なヒドラゾン結合によりグリカンを捕捉した。ついで、ビーズ上の未反応ヒドラジド官能基のアセチルキャッピング、およびサリチル酸カルボキシル基（捕捉したグリカンの末端に存在する）のメチルエステル化を順次行った。各ステップの前に段階洗浄を行った。捕捉したN-グリカンをトランスイミノ化によりベンジルオキシアミン(BOA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)で標識した。BOA標識したグリカンを、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight; MALDI-TOF）質量分析(Ultraflex 3 TOF/TOF mass spectrometer, Bruker Daltonics, Bremen, Germany)を用いて検出した。グリカンの組成および構造をGlycoMod Tool (http://br.expasy.org/tools/glcomod)を用いて推定した。Sweetblotの定量的再現性試験を行った。
【００８０】
統計分析
SPSS v. 22.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA)およびGraphPad Prism v. 5.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)を用い、臨床データの統計分析を行った。フィッシャー直接確率法（Fisher’s exact test）を用い、カテゴリー変数をパーセントで報告し、比較した。定量データを四分位数1および3(Q1, Q3)の中央値として表した。正規分布のデータにはスチューデントのt検定を、非正規分布を示すデータにはMann-WhitneyのU検定を用い、群間の差異を統計的に比較した。3群間の差異をANOVA (Kruskal-Wallis)検定を用いて統計的に比較した。尿路上皮癌検出のためのN-グリカン強度の最適のカットオフ値は、受信者動作特性（ROC）曲線により、つぎの式を用いて計算した：(1−感度)2 ＋ (1−特異度)2。ロジスティック回帰モデルを用いた多変量解析により、尿路上皮癌診断に影響を及ぼす独立因子を同定した。潜在的交絡因子について同時に調整後、95%信頼区間(95%CI)のオッズ比(OR)を計算した。
【００８１】
結果
データから尿路上皮癌患者212人とコントロールとしての健常ボランティア212人とをペアマッチングした。被験者のバックグラウンドは、下記表１に示すとおりであった。
【表１】
2018179962.tif 000013
【００８２】
年齢、性別および合併症に関して、健常ボランティア群と尿路上皮癌群との間に有意の差異はなかった。尿路上皮癌群の患者の殆ど(n=177, 83%)は膀胱癌(BC)を罹患しており、患者の半数(n=114, 54%)は非筋層浸潤疾患を罹患していた。
【００８３】
グライコブロッティングおよび質量分析を用いた血清グライコミクスにより、血清試料中の70種のBOA標識N-グリカンが同定された。定量再現性試験の後、36種のN-グリカンを用いて行った統計分析は良好な定量的再現性を示した。このうち、ROC曲線分析により0.70よりも高いAUCを示した6つのN-グリカン(m/z 1566, 1687, 1769, 1871, 2011, 2337)を選択した（図１）。下記表２は、これら6つのN-グリカンのAUおよび最適カットオフ値並びに選択しなかったN-グリカンのAUを示す。
【００８４】
【表２】
2018179962.tif 000014
注：＊は以前の研究で同定されたものを示す。
【００８５】
高マンノース型(m/z 1687, 2011)、末端シアル化されたハイブリッド型(m/z 1871)および三分岐または四分岐グリカンを有する複合型(m/z 2337)のN-グリカンレベルは、尿路上皮癌患者で有意に増大していたが、一方、ハイブリッド型(m/z 1566)および二分岐グリカンを有する複合型(m/z 1769)のN-グリカンレベルは、尿路上皮癌患者で有意に低減していた（図２A〜図２F）。これら6つのN-グリカンの最適のカットオフ値はROC解析により計算した（表２）。N-グリカンの濃度が各カットオフ値よりも高いか(m/z 1687, 1871, 2011, および2337)または低い(m/z 1566および1769)場合に、N-グリカンは陽性であると認定した。尿路上皮癌に関連するN-グリカンの陽性の数の合計（N-グリカン・スコア）を、健常ボランティア群と尿路上皮癌群とで比較した。中央値のN-グリカン・スコアは、健常ボランティア群に比べて尿路上皮癌群で有意に高かった(それぞれ、5.0 vs. 1.0, P < 0.001)（図３Ａ）。膀胱癌患者と上部尿路上皮癌患者との間（図３Ｂ）、localized (Ta-1N0M0)およびadvanced (T2 or higher)の尿路上皮癌患者の間（図３Ｃ）、または尿細胞診分類間（図３Ｄ）でN-グリカン・スコアに有意の差異は認められなかった。また、N-グリカン・スコアのバープロットは、尿路上皮癌患者が健常ボランティアに比べて高いN-グリカン・スコアを示した（図４）。尿路上皮癌についてのN-グリカン・スコアの的中率は、0.95のAUC値(95%CI: 0.93-0.97, P < 0.001)で有意であった（図５）。最適のカットオフ値は、93%の感度および81%の特異度での2.5として定義した（表３）。
【００８６】
【表３】
2018179962.tif 000015
【００８７】
以下は、全ての試料中で定量的再現性を示した代表的な36種のN-グリカン[m/z 2176のN-グリカンは内部標準ジシアロ-ガラクトシル化二分岐N-グリカン（アミド化シアル酸（A2アミドグリカン）を有する）である；組成および推定構造を略語で示す]の一覧を示す。
ピーク番号 m/z 組成
1      1362.5    (Hex)2 + (Man)3(GlcNAc)2 
2      1524.5    (Hex)3 + (Man)3(GlcNAc)2
3      1565.6    (Hex)5(HexNAc)3
4      1590.6    (HexNAc)2(dHex)1 + (Man)3(GlcNAc)2
5      1606.6    (Hex)1(HexNAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2
6      1647.6    (HexNAc)3 + (Man)3(GlcNAc)2
7      1686.6    (Hex)4 + (Man)3(GlcNAc)2
8      1708.6    (Hex)1(HexNAc)1(NeuAc)1 + (Man)3(GlcNAc)2
9      1752.6    (Hex)1(HexNAc)2(dHex)1 + (Man)3(GlcNAc)2
10      1768.6    (Hex)2(HexNAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2
11      1793.7    (HexNAc)3(dHex)1 + (Man)3(GlcNAc)2
12      1809.7    (Hex)1(HexNAc)3 + (Man)3(GlcNAc)2
13      1848.6    (Hex)5 + (Man)3(GlcNAc)2
14      1854.7    (Hex)1(HexNAc)1(dHex)1(NeuAc)1 + (Man)3(GlcNAc)2
15      1870.7    (Hex)2(HexNAc)1(NeuAc)1 + (Man)3(GlcNAc)2
16      1914.7    (Hex)2(HexNAc)2(dHex)1 + (Man)3(GlcNAc)2
17      1955.7    (Hex)1(HexNAc)3(dHex)1 + (Man)3(GlcNAc)2
18      2010.7    (Hex)6 + (Man)3(GlcNAc)2
19      2032.7    (Hex)3(HexNac)1(NeuAc)1 + (Man)3(GlcNAc)2
20      2057.8    (Hex)1(HexNAc)2(dHex)1(NeuAc)1 + (Man)3(GlcNAc)2
21      2073.8    (Hex)2(HexNAc)2(NeuAc)1+ (Man)3(GlcNAc)2
2175.8    内部標準 (BOA標識A2アミド)
22      2219.8    (Hex)2(HexNAc)2(dHex)1(NeuAc)1 + (Man)3(GlcNAc)2
23      2336.9    (Hex)3(HexNAc)4 + (Man)3(GlcNAc)2
24      2378.9    (Hex)2(HexNAc)2(NeuAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2
25      2524.9    (Hex)2(HexNAc)2(dHex)1(NeuAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2
26      2728.0    (Hex)2(HexNAc)3(dHex)1(NeuAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2
27      2744.0    (Hex)3(HexNAc)3(NeuAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2
28      2890.1    (Hex)3(HexNAc)3(dHex)1(NeuAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2
29      3049.1    (Hex)3(HexNAc)3(NeuAc)3 + (Man)3(GlcNAc)2
30      3109.1    (Hex)4(HexNAc)4(NeuAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2
31      3195.2    (Hex)3(HexNAc)3(dHex)1(NeuAc)3 + (Man)3(GlcNAc)2
32      3341.2    (Hex)3 (HexNAc)3(dHex)2(NeuAc)3 + (Man)3(GlcNAc)2
33      3414.2    (Hex)4(HexNAc)4(NeuAc)3 + (Man)3(GlcNAc)2
34      3560.3    (Hex)4(HexNAc)4(dHex)1(NeuAc)3 + (Man)3(GlcNAc)2
35      3719.3    (Hex)4(HexNAc)4(NeuAc)4 + (Man)3(GlcNAc)2
36      3865.4    (Hex)4(HexNAc)4(dHex)1(NeuAc)4 + (Man)3(GlcNAc)2
上記において、Manはマンノース、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン、Hexはヘキソース、dHexはデオキシヘキソース、HexNAcはＮ−アセチルヘキソサミン、NeuAcはＮ−アセチルノイラミン酸を表す。
【実施例２】
【００８８】
実施例１と同様にして、N-グリカン・スコアの陽性に加えて血尿が陽性のものについて、同様に算定されたカットオフ値より陽性糖鎖数をスコア化（0〜7）し、それぞれのROC曲線を描いた。その結果、N-グリカン・スコアの陽性に加えて血尿が陽性のものにおいてはAUC 0.98（P＜0.001）となった（図６および図７）。
【００８９】
【表４】
2018179962.tif 000016
【００９０】
カットオフ＞2.5とすると、感度93%、特異度81%となった。上記表において、感度は実際に病気に罹っている人のうち陽性と出る割合、特異度は病気に罹っていない人のうち陰性と出る割合である。また、陽性的中率（Positive Predictive Value; PPV；陽性と出た人のうち実際に病気に罹っている人の割合）は83%、陰性的中率（Negative Predictive Value; NPV；陰性と出た人のうち実際に罹っていない人の割合）は92%であった。
【００９１】
この結果をSwimmersプロットで表すと図８のようになる。図８において、横軸に沿って左から右へ、スコア0、尿路上皮癌2.5%；スコア1、尿路上皮癌15%；スコア2、尿路上皮癌32%；スコア3、尿路上皮癌65%；スコア4、尿路上皮癌91%；およびスコア5、尿路上皮癌98%をそれぞれ表す。
【実施例３】
【００９２】
実施例１と同様にして、血清分泌糖タンパク質であるイムノグロブリンのN-グリカンを網羅的に解析し、上部尿路上皮癌に特徴的な糖鎖変化を検索した。血清から精製したイムノグロブリン（IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgMおよびIgAの混合物）のN-グリカンを網羅的に解析した。血清からのイムノグロブリンの精製は、血清100μLをZeba spin plateに添加し、1000g, 2分間遠心分離し、脱塩血清100μLを回収した後、Melon gel spin plate columnに脱塩血清100μLを添加した。5分間室温放置後、1000g, 2分間遠心分離し、カラム素通り画分を血清イムノグロブリン画分(100μL)として回収した。Melon Gelは体液試料中に多量に含まれるアルブミンやトランスフェリン等を吸着し、素通り分画にIgが回収される。酸性条件での溶出や抗Ig抗体固定化カラム由来の糖鎖が混入せず、かつ出発材料の容量を変えずにイムノグロブリンのみを回収可能であるため、Igの糖鎖解析に有用である。血清イムノグロブリン画分のN-グリカンの網羅的解析は、グライコブロッティング法のすべてのプロトコルを自動で行う前処理ロボット“SweetBlot”を用いて行った。被験者のバックグラウンドは、下記表５に示すとおりであった。
【００９３】
【表５】
2018179962.tif 000017
【００９４】
図９に示す30種類の血清Ig由来N-グリカンが同定された。これら血清Ig由来N-グリカンのうち、健常ボランティアに比べて上部尿路上皮癌患者で変動のみられたN-グリカンを調べた。N-グリカンの濃度が各カットオフ値よりも高いか(m/z 1362, 1525, 1566, 1648, 1709, 1769,2011, 2033, 2074, 2118, および2525)または低い(m/z 2423)場合に、N-グリカンは陽性であると認定した。
【００９５】
上部尿路上皮癌の有無を説明変数とし、得られたN-グリカン数値を目的変数として判別分析を行い、得られたF値が2.0以上の上部尿路上皮癌の鑑別に有用な糖鎖を選択した。さらに性別、年齢および選択した各糖鎖値を説明変数として判別分析を行い、各項目に対する特定の予測関数を積算した数値の合計をN-グリカン・スコアとして算出した。予測関数は以下のとおりであった。
N-グリカン・スコア＝(Gen*0.5446)+(Age*0.0050)+(m/z 1362*3.9720)+(m/z 1525*-4.0053)+(m/z 1566*-0.2758)+(m/z 1648*-1.7947)+(m/z 1709*4.5967)+(m/z 1769*1.4764)+(m/z 1794*0.4042)+(m/z 1915*0.4942)+(m/z 2011*-3.7266)+(m/z 2033*-1.2859)+(m/z 2074*-11.2450)+(m/z 2118*-1.6229)+(m/z 2423*1.4247)+(m/z 2525*5.3805)+(-0.6815)
【００９６】
得られたN-グリカン・スコアに基づき、上部尿路上皮癌の予測性を検討した。その結果を図１１〜１３および表６に示す。
【表６】
2018179962.tif 000018
表中、NPVは陰性の予測性、PPVは陽性の予測性をそれぞれ示す。
【００９７】
カットオフ<-0.615 ptで97.8%の上部尿路上皮癌患者が検出可能であった。このように、血清IgのN型糖鎖解析により上部尿路上皮癌に特徴的な糖鎖変化が同定され、N-グリカン・スコアは上部尿路上皮癌の予測に有用である可能性が示唆された。
【実施例４】
【００９８】
実施例１と同様にして、血清分泌糖タンパク質のN-グリカンを網羅的に解析し、レクチンアレイにより、上部尿路上皮癌に関連するN型糖鎖変異を有する血清イムノグロブリンを検索した。被験者のバックグラウンドは、下記表７に示すとおりであった。
【表７】
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【００９９】
血清から精製したイムノグロブリンのN-グリカンを網羅的に解析した。レクチンアレイは、特定の糖鎖構造に結合するレクチンが固定化されたチップ上で、上部尿路上皮癌の鑑別に有用な糖鎖をもつイムノグロブリンを検出する方法である（図２４）。血清20μLを100μLのProbing Solution (1mM CaCl2, 1mM MgCl2を含む20mM Tris-HCl buffer, pH7.5)で希釈し、組み換えレクチン固定化レクチンアレイチップ(Rexxam社製)のウェルに100μL添加した。水平振盪させながら、室温で70分間、インキュベートした。アレイチップ上の血清サンプルをアスピレーターで吸引し、完全に除去したのち、洗浄のために100μL のProbing Solutionを静かに添加し、軽くアレイチップを揺すった後、溶液をアスピレーターで吸引し溶液を完全に除去した。洗浄操作は、計3回繰り返した。洗浄後、100μLの1μg/mLのビオチン標識抗ヒトIg light chain抗体(RM129,Abcam社, ab193185)を含むProbing Solutionをアレイチップのウェルに100μL添加した。水平振盪させながら、室温で60分間、インキュベートした。アレイチップ上の抗体溶液をアスピレーターで吸引し、完全に除去したのち、洗浄のために100μLのProbing Solutionを静かに添加し、軽くアレイチップを揺すった後、溶液をアスピレーターで吸引し溶液を完全に除去した。洗浄操作は、計3回繰り返した。100μLの1μg/mLのCy3標識-ストレプトアビジン(GE社, PA43001)を含むProbing Solutionをアレイチップのウェルに100μL添加した。水平振盪させながら、室温で30分間、インキュベートした。アレイチップ上の抗体溶液をアスピレーターで吸引し、完全に除去したのち、洗浄のために100μLのProbing Solutionを静かに添加し、軽くアレイチップを揺すった後、溶液をアスピレーターで吸引し溶液を完全に除去した。洗浄操作は、計3回繰り返した。100μLのProbing Solutionをアレイチップのウェルに100μL添加し、エバネッセント蛍光スキャナ（BIO-REX SCAN200、Rexxam社）を用いて300ｍsecの露光時間で蛍光強度値(Mean Fluoresence intensity, MFI)を測定した。同血清検体における各イムノグロブリンクラス（IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgG (合計)およびIg (合計)）ごとの結果を図１４に示す。レクチンアレイによって得られた蛍光強度値をイムノグロブリン（IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgMおよびIgAの混合物）濃度で補正した値をプロットした箱ひげ図を図１５に示す。得られた蛍光強度値をイムノグロブリン（IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgMおよびIgAの混合物）濃度で補正した値と性別および年齢を説明変数として投入し、上部尿路上皮癌の鑑別に有用なレクチンとして以下のレクチンを選択した：high mannose構造を認識するレクチン(rGRFT, rOrysata, rCalsepa, rBC2L-A,rPALa), Bisect構造を認識するレクチン(rF17AG), Fucoseを認識するレクチン(rAAL, rPA-II L, RS-Fuc), Gal/GalNAc構造を認識するレクチン(rCNL, rPA-I L, rABA, rMOA）。上部尿路上皮癌の有無を説明変数とし、性別、年齢および選択した各レクチン/Ig値を目的変数として判別分析を行い、得られた特定の予測関数を積算した数値の合計をレクチンアレイ・スコアとして算出した。予測関数は以下のとおりであった。
レクチンアレイ・スコア＝(Gen*0.1476)+(Age*2.8688)+ +(rF17AG/Ig*0.0697)+(rGRFT/Ig*0.0697)+ (rOrysata/Ig *0.2151)+ (rCalsepa/Ig *-0.2643)+ (rBC2L-A/Ig *0.1813)+ (rPALa/Ig *0.3208)+ (rAAL/Ig *0.1085)+ (rPA-II L/Ig *-0.1079)+ (RS-Fuc/Ig *-0.0346)+ (rCNL/Ig *-0.0986)+ (rPA-I L/Ig *0.1583) + (rABA/Ig *-0.6347)+(rMOA/Ig *0.4423)+(-0.9912)
【０１００】
得られたレクチンアレイ・スコアに基づき、上部尿路上皮癌の予測性を検討した。その結果を図１５〜１８および表８に示す。
【表８】
2018179962.tif 000020
表中、NPVは陰性の予測性、PPVは陽性の予測性をそれぞれ示す。カットオフ<-1.275 ptで74.6%の上部尿路上皮癌患者が検出可能であった。
【０１０１】
このように、レクチンアレイの結果、high mannose, Bisect, Fucose, Gal/GalNAcに反応するレクチンにおいて有意差が認められ、レクチンアレイ・スコアは上部尿路上皮癌の予測に有用である可能性が示唆された。
【実施例５】
【０１０２】
実施例１と同様にして、血清分泌糖タンパク質のN-グリカンを網羅的に解析し、尿路上皮癌（膀胱がん＋上部尿路上皮癌）に特徴的な糖鎖変化を検索した。被験者のバックグラウンドは、表１と同様であった。
【０１０３】
図１９に示す37種類の血清由来N-グリカンが同定された。これら血清由来N-グリカンのうち、健常ボランティアに比べて尿路上皮癌患者で変動のみられたN-グリカンを調べた。N-グリカンの濃度が各カットオフ値よりも高いか(m/z 1591, 1607, 1648, 1687, 1709, 1794, 2011, 2074, 2744, 3109, 3341)または低い(m/z 1566, 1769)場合に、N-グリカンは陽性であると認定した。
【０１０４】
尿路上皮癌の有無を説明変数とし、得られたN-グリカン数値を目的変数として判別分析を行い、得られたF値が2.0以上の尿路上皮癌の鑑別に有用な糖鎖を選択した。さらに性別、年齢および選択した各糖鎖値を説明変数として判別分析を行い、各項目に対する特定の予測関数を積算した数値の合計をN-グリカン・スコアとして算出した。予測関数は以下のとおりであった。
N-グリカン・スコア＝(Gen*0.1676)+(Age*-0.0075)+(m/z 1565*0.6488)+(m/z 1590*0.3244)+(m/z 1607*-0.0544)+(m/z 1648*-0.3051)+(m/z 1687*-0.7940)+(m/z 1709*-1.0849)+(m/z 1769*0.1752)+(m/z 1794*-0.2878)+(m/z 1849*0.3176)+(m/z 1915*0.4443)+(m/z 2011*-0.2800)+(m/z 2058*0.1916)+(m/z 2074*1.0742)+(m/z 2220*-0.8861)+(m/ 2728*0.2749)+(m/z 2744*-1.2235)+(m/z 3109*0.4362)+(m/z 3341*0.1149)+(2.2792)
【０１０５】
得られたN-グリカン・スコアに基づき、尿路上皮癌の予測性を検討した。その結果を図２１〜２３および表９に示す。
【表９】
2018179962.tif 000021
表中、NPVは陰性の予測性、PPVは陽性の予測性をそれぞれ示す。カットオフ<0 ptで95.28%の尿路上皮癌患者が検出可能であった。
【０１０６】
このように、血清N型糖鎖解析により尿路上皮癌（膀胱がん＋上部尿路上皮癌）に特徴的な糖鎖変化が同定され、N-グリカン・スコアは尿路上皮癌（膀胱がん＋上部尿路上皮癌）の予測に有用である可能性が示唆された。
【実施例６】
【０１０７】
2009年から2016年の間に、尿路上皮癌患者237人からの血清試料および他の癌のコントロールとして本発明者らの血清バンクから前立腺癌患者96人からの血清試料を採取した。また、岩木健康増進プロジェクト（Iwaki Health Promotion Project）の健康維持プログラムの地域住民の健常ボランティア339人からも血清試料を採取した。血清試料はすべて−80℃で貯蔵した。腫瘍のステージは、2017 Tumor-Node-Metastasis classification（第8版）に従って決定した。尿路上皮癌の組織学的分類は、World Health Organization 1973 and 2004 grading systems 18に従って行った。患者のデータを表１０に示す。
【０１０８】
【表１０】
2018179962.tif 000022
注
ａ：ｄＮＧＳ＝診断N-グリカン・スコア
ｂ：ＵＣ＝尿路上皮癌
ｃ：ＵＣＢ＝膀胱癌
ｄ：ＵＴＵＣ＝上部尿路上皮癌
【０１０９】
血清からのＩｇ画分の精製および定量
各血清100μLを、リン酸緩衝食塩水で平衡化したZebaTM Spin Desalting resin Plate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)に添加し、1000×gで2分間遠心分離した。カラム素通り画分を緩衝液交換血清(100μL)として回収した。Ig画分の精製は、MelonTM Gel Spin Purification Kit (Thermo Fisher Scientific)を用い、使用説明書に従って行った。精製緩衝液で平衡化したMelon Gel resinに緩衝液交換血清(100μL)を添加した。5分間インキュベートした後、Melon Gel resinを1000×gで2分間遠心分離し、カラム素通り画分を精製Ig画分 (100μL)として回収した。Ig画分の10μLアリコートをN-グリカン分析に供した。Ig画分の精製を確認するため、Melon Gel resinカラム素通りIg画分をSDS-PAGEに供し、CBBで染色した。精製Ig画分のIg (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgMおよびIgA)レベルを、Bio-plex Pro Human Isotyping 6-plex kit (Bio-Rad Laboratories, CA, USA)用い、使用説明書に従って測定した。
【０１１０】
グライコブロッティング法および質量分析を用いて行ったIgの血清N-グリカン分析
文献記載の方法に従ってN-グリカン分析を行った（Nishimura S et al. High-throughput protein glycomics: combined use of chemoselective glycoblotting and MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. Angewandte Chemie (International ed in English). 2004;44:91-6）。精製Ig画分の10μLアリコートを、SweetBlotTM（System Instruments, Hachijo, Japan）を用い、グライコブロッティング法で分析した。ついで、得られたベンジルオキシアミン（BOA）標識したグリカンを、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間（matrix-assisted laser desorption time-of-flight; MALDI-TOF）質量分析(Ultraflex 3 TOF/TOF mass spectrometer; Bruker Daltonics, Bremen, Germany)を用いて検出した（図２５ａ〜ｆ）。グリカンの組成および構造をGlycoMod Tool (http://br.expasy.org/tools/glcomod)を用いて推定した。ついで、各N-グリカンレベルの定量的再現性試験を評価した。
【０１１１】
統計分析
SPSS v. 22.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA)およびGraphPad Prism v. 6.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)を用い、臨床データの統計分析を行った。フィッシャー直接確率法（Fisher’s exact test）を用い、カテゴリー変数をパーセントで報告し、比較した。年齢データを四分位数25および75(Q1, Q3)の中央値として表した。正規分布のデータにはスチューデントのt検定を、非正規分布を示すデータにはMann-WhitneyのU検定を用い、群間の差異を統計的に比較した。3群間の差異をANOVA (Kruskal-Wallis)検定を用いて統計的に比較した。尿路上皮癌検出のための多変量判別分析は、尿路上皮癌事象を説明変数として、N-グリカンレベルを目的変数としてそれぞれ入力することにより行った。診断N-グリカン・スコアは、候補N-グリカンレベルに各関数値を乗じることによって計算した。N-グリカン・スコアの診断性能は、library ‘rms’ in R (http://www.r-project.org/)を用いて展開した受信者動作特性（receiver operating characteristic; ROC）曲線分析を用いて評価し、曲線下面積（area-under-the-curve; AUC）間の統計的差異は同じプログラムを用いて行った。p<0.05の差異は統計的に有意であるとした。
【０１１２】
結果
Igの異常なN-グリコシル化に基づく尿路上皮癌の診断N-グリカン・スコアは、古典的な尿細胞診や血尿検査より遙かに優れていることがわかった。全血清（図２６ｂ、レーン１〜４）およびUIg画分（図２６ｂ、レーン５〜８）のSDS-PAGE分析は、Melon Gelクロマトグラフィーにより非Igタンパク質が全血清から有効に除去されたことを示していた。Ig画分のN-グリカン分析（図２６ａ〜ｅ）は、下記のIg上の32種のBOA標識N-グリカンを同定した（図２６ｆ）。
【０１１３】
Thirty-two types of N-glycans that showed good quantitative reproducibility in all Igs fraction samples and could be analyzed statistically
ピーク番号 m/z 組成
1      1362.5    (Hex)2 + (Man)3(GlcNAc)2
2      1524.5    (Hex)3 + (Man)3(GlcNAc)2
3      1565.5    (Hex)5 + (HexNAc)3
4      1590.6    (HexNAc)2(dHex)1 + (Man)3(GlcNAc)2
5      1606.6    (Hex)1(HexNAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2
6      1647.6    (HexNAc)3 + (Man)3(GlcNAc)2
7      1686.6    (Hex)4 + (Man)3(GlcNAc)2
8      1708.6    (Hex)1(HexNAc)1(NeuAc)1 + (Man)3(GlcNAc)2
9      1752.6    (Hex)1(HexNAc)2(dHex)1 + (Man)3(GlcNAc)2
10      1768.6    (Hex)2(HexNAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2
11      1793.7    (HexNAc)3(dHex)1 + (Man)3(GlcNAc)2
12      1809.7    (Hex)1(HexNAc)3 + (Man)3(GlcNAc)2
13      1848.6    (Hex)5 + (Man)3(GlcNAc)2
14      1870.7    (Hex)2(HexNAc)1(NeuAc)1 + (Man)3(GlcNAc)2
15      1914.7    (Hex)2(HexNAc)2(dHex)1 + (Man)3(GlcNAc)2
16      1955.7    (Hex)1(HexNAc)3(dHex)1 + (Man)3(GlcNAc)2
17      2010.7    (Hex)6 + (Man)3(GlcNAc)2
18      2032.7    (Hex)3(HexNac)1(NeuAc)1 + (Man)3(GlcNAc)2
19      2057.8    (Hex)1(HexNAc)2(dHex)1(NeuAc)1+ (Man)3(GlcNAc)2
20      2073.8    (Hex)2(HexNAc)2(NeuAc)1+ (Man)3(GlcNAc)2
21      2117.8    (Hex)2(HexNAc)3(dHex)1 + (Man)3(GlcNAc)2
22      2219.8    (Hex)2(HexNAc)2(dHex)1(NeuAc)1 + (Man)3(GlcNAc)2
23      2336.9    (Hex)3(HexNAc)4 + (Man)3(GlcNAc)2
IS      2348.9    内部標準(BOA-標識A2アミド)
24      2378.9    (Hex)2(HexNAc)2(NeuAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2
25      2422.9    (Hex)2(HexNAc)3(dHex)1(NeuAc)1 + (Man)3(GlcNAc)2
26      2524.9    (Hex)2(HexNAc)2(dHex)1(NeuAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2
27      2727.9    (Hex)2(HexNAc)3(dHex)1(NeuAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2
28      2743.9    (Hex)3(HexNAc)3(NeuAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2
29      2890.1    (Hex)3(HexNAc)3(dHex)1(NeuAc)2 + (Man)3(GlcNAc)2
30      3049.1    (Hex)3(HexNAc)3(NeuAc)3 + (Man)3(GlcNAc)2
31      3195.2    (Hex)3(HexNAc)3(dHex)1(NeuAc)3 + (Man)3(GlcNAc)2
32      3341.2    (Hex)3 (HexNAc)3 (Deoxyhexose)2 (NeuAc)3 + (Man)3(GlcNAc)2
上記において、m/z2348.9は内部標準であり、アミド化シアル酸残基を含むジシアロ−ガラクトシル化２分岐N-グリカン（A2アミドグリカン）である。Manはマンノース、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン、Hexはヘキソース、dHexはデオキシヘキソース、HexNAcはＮ−アセチルヘキソサミン、NeuAcはＮ−アセチルノイラミン酸を表す。
【０１１４】
非尿路上皮癌群（健常ボランティアおよび前立腺癌）および尿路上皮癌群の被験者のバックグラウンドは、下記表１１に示すとおりであった。非尿路上皮癌群と尿路上皮癌群とで、年齢、喫煙歴、BPH（良性前立腺肥大症）の病歴および既往の結石において統計的に有意な差異は認められなかった。
【表１１】
2018179962.tif 000023
注：
ａ：IQR（Interquartile range）＝四分位範囲
ｂ：BPH（benign prostatic hyper plasia）＝良性前立腺肥大症
ｃ：HSPC（hormone sensitive prostate cancer）＝ホルモン感受性前立腺癌
【０１１５】
尿路上皮癌検出のため、尿路上皮癌事象を説明変数として、N-グリカンレベルを目的変数としてそれぞれ入力することにより多変量判別分析を行い、尿路上皮癌の検出のために最も高感度で特異的な組み合わせを形成した5つの候補N-グリカン(complex biantennary type: m/z 1607, m/z 1769, m/z 2074; core fucosylated bisecting GlcNAc type: m/z 2118, m/z 2423)を選択した（図２５ａ〜ｆ、表１２）。
【０１１６】
【表１２】
2018179962.tif 000024
注：
ａ：ODF（one dgree of freedom）＝ 自由度1
ｂ：TDF（two dgree of freedom）＝ 自由度2
【０１１７】
Ig上のアシアロ２分岐型N-グリカン(m/z 1607およびm/z 2074)は、健常ボランティア／前立腺癌群に比べて尿路上皮癌群で有意にダウンレギュレーションされていた。Ig上のアシアロ２分岐型N-グリカン(m/z 1769)だけは、尿路上皮癌群および健常ボランティア群に比べて前立腺癌群で有意にダウンレギュレーションされていた。コアフコシル化（core fucosylated）bisecting GlCNAc N-グリカンを有するモノシアリルbisecting GlcNAc (m/z 2423)は、尿路上皮癌群と健常ボランティア群とで有意の変化はなかったが、前立腺癌群では有意に減少していた。とりわけ、Ig上のコアフコシル化N-グリカンを有するアシアロbisecting GlcNAc (m/z 2118)は、尿路上皮癌群では有意にアップレギュレーションされていたが、健常ボランティア群および前立腺癌群では検出されなかった。しかしながら、尿路上皮癌患者の全Igレベルは、健常ボランティアおよび前立腺癌患者に比べて有意に低かった（図２７ａ〜ｈ）。図２５ｆに示すN-グリカンの合成経路によれば、上記結果は、Ig上のアシアロ２分岐型N-グリカンのダウンレギュレーションおよびコアフコシル化N-グリカンを有するアシアロbisecting GlcNAcの蓄積が、尿路上皮癌と関連したIgの異常なN-グリコシル化として生じることを示唆している。これらIg上の異常なN-グリコシル化プロファイルの候補を尿路上皮癌の検出に適用するため、本発明者らは、下記式によって計算される尿路上皮癌診断N-グリカン・スコア（dNGScore）を確立した：
(m/z 1607の血清レベル×0.1925)＋(m/z 1769の血清レベル×0.4932)＋(m/z 2074の血清レベル×0.4941)＋(m/z 2118の血清レベル×−3.2460)＋(m/z 2423の血清レベル×0.6179)＋(−0.4905)
【０１１８】
dNGScoreは、健常ボランティア（HV）および前立腺癌（PC）を含む非尿路上皮癌群に比べて尿路上皮癌（UC）（膀胱癌（UCB）および上部尿路上皮癌（UTUC））患者で有意に高かった（図２８および図２９）。尿路上皮癌の予測のためのdNGScoreのAUC（尿路上皮癌について0.969、膀胱癌について0.993、上部尿路上皮癌について0.907）は、血尿（0.892）および尿細胞診（0.707）よりも遙かに高かった（図３０、表１０）。尿路上皮癌を予測するためのカットオフdNGScore (−0.0955)では、陰性の予測値(NPV)は96.1%であり、これは尿細胞診のNPV(75.8%)および血尿のNPV(89.5%)よりも遙かに高かった。診断N-グリカン・スコアは血尿および尿細胞診のクラスとは有意には関連していなかったが（図３１および図３２）、膀胱癌の侵襲性とは有意に関連していた（図３３）。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明に従ってグライコブロッティングおよびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間質量分析によって得られた26のN-グリカンのプロファイルは、尿路上皮癌の存在を示すバイオマーカーとして用いることができる。
【図１】
2018179962.tif 000031
【図２Ａ】
2018179962.tif 000032
【図２Ｂ】
2018179962.tif 000033
【図２Ｃ】
2018179962.tif 000034
【図２Ｄ】
2018179962.tif 000035
【図２Ｅ】
2018179962.tif 000036
【図２Ｆ】
2018179962.tif 000037
【図３Ａ】
2018179962.tif 000038
【図３Ｂ】
2018179962.tif 000039
【図３Ｃ】
2018179962.tif 000040
【図３Ｄ】
2018179962.tif 000041
【図４】
2018179962.tif 000042
【図５】
2018179962.tif 000043
【図６】
2018179962.tif 000044
【図７】
2018179962.tif 000045
【図８】
2018179962.tif 000046
【図９】
2018179962.tif 000047
【図１０】
2018179962.tif 000048
【図１１】
2018179962.tif 000049
【図１２】
2018179962.tif 000050
【図１３】
2018179962.tif 000051
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2018179962.tif 000054
【図１７】
2018179962.tif 000055
【図１８】
2018179962.tif 000056
【図１９】
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【図２０】
2018179962.tif 000058
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
2018179962.tif 000061
【図２４】
2018179962.tif 000062
【図２５Ａ】
2018179962.tif 000063
【図２５Ｂ】
2018179962.tif 000064
【図２６】
2018179962.tif 000065
【図２７Ａ】
2018179962.tif 000066
【図２７Ｂ】
2018179962.tif 000067
【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2018179962.tif 000070
【図３１】
2018179962.tif 000071
【図３２】
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【図３３】
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