(57)【要約】【課題】天然の免疫グロブリン形式を有する容易に単離される二重特異性抗体を提供すること。【解決手段】単離が容易である二重特異性抗体の形式が提供され、その形式は、ＣＨ３ドメイン内を識別的に改変されている免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、ここで、その識別的改変は、そのＣＨ３改変に関して免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でなく、それらの改変の少なくとも１つは、プロテインＡなどの親和性試薬に対する二重特異性抗体の親和性に違いをもたらし、その二重特異性抗体は、プロテインＡに対するその親和性に基づいて、破壊された細胞、培地、または抗体の混合物から単離可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、重鎖のヘテロ二量体を有する、抗原結合タンパク質または抗体、すなわち、親和性試薬に対する免疫グロブリン重鎖の親和性と改変免疫グロブリン重鎖または変異免疫グロブリン重鎖の親和性との違いに基づいて抗原結合タンパク質の単離を可能にする、少なくとも１つのアミノ酸が異なる２つの免疫グロブリン重鎖を有する、抗原結合タンパク質または抗体に関する。本発明はまた、プロテインＡに対するＩｇＧ領域の結合性の違いによる迅速な単離を可能にする、プロテインＡに対して異なる親和性を有するＩｇＧ  ＣＨ２およびＣＨ３領域を有する抗原結合タンパク質（二重特異性抗体を含む）にも関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
抗体は、標的抗原に対する独特の結合特異性ならびに抗原とは無関係な機序を介して免疫系と相互作用する能力を保有する多機能性分子である。癌に対して現在使用されている多くの生物学的治療薬は、標的にされている癌細胞上で代表的に過剰発現されている抗原に対するモノクローナル抗体である。そのような抗体は、腫瘍細胞に結合すると、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の引き金を引くことがある。残念なことに、癌性細胞は、これらの正常な免疫応答を抑制する機序を発達させることが多い。
【０００３】
近年、２以上の抗原結合特異性を有する抗体様の治療薬、例えば、二重特異性抗体を開発する試みが進行中である。癌治療の場合、多重特異的形式によって、例えば、その分子が腫瘍細胞抗原を標的にするという１つの特異性、通常免疫系が利用できない反応の引き金を引くというその他の特異性を使用することが可能になり得る。二重特異性抗体は、２成分のヘテロ二量体レセプター系（この２成分のヘテロ二量体レセプター系は、それらの天然のリガンドが、そのレセプター系に結合して、その両方の成分と１つになるとき、そのリガンドによって正常に活性化される）に対する代用リガンドとしての使用法も見出し得る。
【０００４】
複数の結合特異性を有する分子によって与えられる治療の機会に応える数多くの形式が当該分野で開発されている。理想的には、そのような分子は、作製しやすくかつ精製しやすく、好ましいインビボ特性、例えば、意図される目的にとって適切な薬物動態、最小の免疫原性、および望まれる場合、従来の抗体のエフェクター機能を有する、よく機能するタンパク質であるべきである。
【０００５】
二重特異性抗体を生成する（単一細胞内で２つの異なる抗体を発現させる）最も単刀直入な方法は、複数の種を生じることである。なぜなら、それぞれの重鎖が、ホモ二量体とヘテロ二量体の両方を形成するが、ヘテロ二量体だけが望まれるからである。また、軽鎖および重鎖は、不適切に対形成することがある。種々の方法でこれらの問題に対処するように試みられた形式のいくつかの例を以下に記載する。
【０００６】
二重特異性Ｔ細胞Ｅｎｇａｇｅｒ（ＢｉＴＥ）分子（例えば、Ｗｏｌｆ，Ｅ．ら（２００５）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  １０：１２３７−１２４４（非特許文献１））を参照のこと）に対して使用される１つの形式は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）モジュールに基づく。ｓｃＦｖは、通常適切に折り畳まれ得る可撓性リンカーを介して融合された抗体の軽鎖および重鎖の可変領域からなり、それらの領域は、同族抗原に結合することができる。ＢｉＴＥでは、特異性の異なる２つのｓｃＦｖが一本鎖にタンデムにつながれている（図１Ａを参照のこと）。この配置は、２コピーの同じ重鎖可変領域を有する分子の生成を妨げる。さらに、それぞれの軽鎖および重鎖の正しい対形成を確実にするようにリンカー配置が設計される。
【０００７】
ＢｉＴＥ形式は、いくつかの欠点を有する。第１に、ｓｃＦｖ分子は、凝集する傾向があるとよく知られている。また、ｓｃＦｖリンカーの免疫原性は、通説では低いが、ＢｉＴＥに対する抗体が産生される可能性を除外することはできない。また、ＢｉＴＥ形式ではＦｃ部が存在しないので、その血清半減期は非常に短くなり、高頻度の反復投与またはポンプによる持続注入の面倒な問題が伴う。最後に、Ｆｃが存在しないことにより、Ｆｃ媒介性のエフェクター機能が存在しないことも当然伴う（そのエフェクター機能が存在しないことは、いくつかの状況では有益であり得るが）。
【０００８】
第２の形式（図１Ｂ）は、マウスとラットのモノクローナル抗体のハイブリッドであり、従来のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィの変法に依存するものである（例えば、Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ，Ｈ．ら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：２１９−２２５（非特許文献２））を参照のこと）。この形式では、マウスＩｇＧ２ａ抗体およびラットＩｇＧ２ｂ抗体を、同じ細胞内で同時に産生させる（例えば、２つのハイブリドーマのクアドローマ融合物として、または操作されたＣＨＯ細胞内で）。各抗体の軽鎖は、それらの同族の種の重鎖と優先的に会合するので、３つの異なる種の抗体：２つの親抗体、およびＦｃ部によって会合している、その２つの抗体の各々の１つの重鎖／軽鎖対を含むその２つの抗体のヘテロ二量体だけが組み立てられ得る。所望のヘテロ二量体は、そのプロテインＡへの結合特性が親抗体の結合特性と異なる（すなわち、ラットＩｇＧ２ｂは、プロテインＡに結合せず、一方、マウスＩｇＧ２ａは、プロテインＡに結合する）ので、この混合物から容易に精製され得る。それゆえ、マウス−ラットヘテロ二量体は、プロテインＡに結合するが、マウスＩｇＧ２ａホモ二量体よりも高いｐＨで溶出することから、これにより、二重特異性ヘテロ二量体を選択的に精製することが可能になる。ＢｉＴＥ形式と同様に、このハイブリッド形式は、２つの一価抗原結合部位を有する。
【０００９】
マウス／ラットハイブリッドの欠点は、それが非ヒトであるので、有害な副作用（例えば、「ＨＡＭＡ」または「ＨＡＲＡ」反応）を有し得、そして／またはその治療薬を中和し得る免疫応答を患者に誘発する可能性があるという点である。
【００１０】
「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」と呼ばれる第３の形式（図１Ｃ）は、二重特異性抗体の作製にとって有用である可能性があると従来技術において考察されている（米国特許第７，１８３，０７６号（特許文献１））。このストラテジーでは、一方が「ノブ」を突出させ、他方が相補的な「ホール」となるように、２つの抗体のＦｃ部を操作する。それらの重鎖は、同じ細胞において産生されると、操作された「ノブ」と操作された「ホール」との会合によって、ホモ二量体ではなくヘテロ二量体を優先的に形成すると言われている。異なる特異性を有するが同一の軽鎖を採用する抗体を選択することによって、正しい軽鎖−重鎖の対形成の問題が対処される。
【００１１】
この形式の欠点は、「ノブ・イントゥ・ホール」ストラテジーが、かなりの量の望ましくないホモ二量体を産生し得るがゆえに、さらなる精製工程が必要となるという点である。この難点は、汚染している種の特性の多くが所望の種とほぼ同一であるという事実によって深刻になっている。「ノブ」および「ホール」を生成する変異によって外来配列が導入されるので、操作された形状は、潜在的に免疫原性でもあり得る。
【００１２】
依然として、二重特異性抗体の形式、特に、上で述べた欠点の一部または全部を最小にする、治療に役立つ用途のための二重特異性抗体の形式が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第７，１８３，０７６号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｗｏｌｆ，Ｅ．ら（２００５）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  １０：１２３７−１２４４
【非特許文献２】Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ，Ｈ．ら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：２１９−２２５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
概要
本発明は、二重特異性抗原結合タンパク質において少なくとも１つのアミノ酸が異なる２つの免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメイン配列を使用することに少なくとも部分的に基づく。少なくとも１つのアミノ酸が異なることにより、ＣＨ３ドメイン配列が親和性物質に結合する能力に違いがもたらされるので、そのタンパク質を単離する能力が改善される。
【００１６】
１つの局面において、第１および第２のポリペプチドを含む抗原結合タンパク質が提供され、その第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１の抗原に選択的に結合する第１の抗原結合領域、それに続く、ＩｇＧ１（配列番号１）、ＩｇＧ２（配列番号３）ＩｇＧ４（配列番号５）およびそれらの組み合わせから選択されるヒトＩｇＧの第１のＣＨ３領域を含む定常領域を含み；そして第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、第２の抗原に選択的に結合する第２の抗原結合領域、それに続くＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびそれらの組み合わせから選択されるヒトＩｇＧの第２のＣＨ３領域を含む定常領域を含み、ここで、その第２のＣＨ３領域は、プロテインＡへの第２のＣＨ３ドメインの結合を減少させるかまたは排除する改変を含む。
【００１７】
１つの実施形態において、第２のＣＨ３領域は、９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエキソンナンバリングにおいて；ＥＵナンバリングでは４３５Ｒ）を含む。別の実施形態において、第２のＣＨ３領域は、９６Ｆ改変（ＩＭＧＴ；ＥＵでは４３６Ｆ）をさらに含む。特定の実施形態において、第２のＣＨ３領域は、配列番号２、配列番号４および配列番号６から選択される。
【００１８】
１つの実施形態において、第２のＣＨ３領域は、改変されたヒトＩｇＧ１（配列番号２）に由来し、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７ＭおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵではＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７ＭおよびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される改変をさらに含む。
【００１９】
１つの実施形態において、第２のＣＨ３領域は、改変されたヒトＩｇＧ２（配列番号４）に由来し、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２ＮおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵではＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２ＮおよびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される改変をさらに含む。
【００２０】
１つの実施形態において、第２のＣＨ３領域は、改変されたヒトＩｇＧ４（配列番号６）に由来し、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９ＱおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵではＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９ＱおよびＶ４２２Ｉ）からなる群から選択される改変をさらに含む。
【００２１】
１つの実施形態において、ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３およびヒトＩｇＧ４のうちの２つ以上の配列を含むキメラドメインである。
【００２２】
１つの実施形態において、ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４に由来し、本抗原結合タンパク質は、ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメインをさらに含み、ここで、そのＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメインは、独立して、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１もしくはＣＨ２ドメイン、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１もしくはＣＨ２ドメイン、またはキメラヒト／ヒトＩｇＧ１／ＩｇＧ２もしくはキメラヒト／ヒトＩｇＧ１／ＩｇＧ３もしくはキメラヒト／ヒトＩｇＧ２／ＩｇＧ３ドメインもしくはキメラヒト／ヒトＩｇＧ１／ＩｇＧ４もしくはキメラＩｇＧ３／ＩｇＧ４もしくはキメラＩｇＧ２／ＩｇＧ４ドメインからなる群から選択される。特定の実施形態において、そのキメラＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３、ＩｇＧ２／ＩｇＧ３、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ３／ＩｇＧ４およびＩｇＧ２／ＩｇＧ４ドメインは、ヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でない。
【００２３】
１つの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、免疫グロブリン軽鎖をさらに含む。１つの実施形態において、その免疫グロブリン軽鎖は、ヒトラムダ軽鎖およびヒトカッパー軽鎖から選択される。
【００２４】
１つの実施形態において、第１および第２の抗原結合領域の各々は、少なくとも１つのＣＤＲを含み、別の実施形態では、少なくとも２つのＣＤＲを含み、別の実施形態では、各々は、３つのＣＤＲを含む。特定の実施形態において、そのＣＤＲは、免疫グロブリン重鎖に由来する。別の特定の実施形態において、その重鎖は、ヒト重鎖である。
【００２５】
１つの実施形態において、第１の抗原結合領域は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、第２の抗原結合領域は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む。
【００２６】
１つの実施形態において、第１および第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、独立して、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、類人猿およびヒトのドメインから選択される。
【００２７】
１つの実施形態において、第１および第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、独立して、ヒトＣＤＲ、マウスＣＤＲ、ラットＣＤＲ、ウサギＣＤＲ、サルＣＤＲ、類人猿ＣＤＲおよびヒト化ＣＤＲを含む。１つの実施形態において、そのＣＤＲは、ヒトのＣＤＲであり、体細胞変異している。
【００２８】
１つの実施形態において、第１および第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。１つの実施形態において、そのヒトＦＲは、体細胞変異したヒトＦＲである。
【００２９】
１つの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合領域は、抗体可変領域を含むファージライブラリーを目的の抗原に対する反応性についてスクリーニングすることによって得られる。別の実施形態において、第１および／または第２の抗原結合領域は、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、サルまたは類人猿）を目的の抗原で免疫し、目的の抗原に特異的な可変領域をコードする抗体可変領域の核酸配列を同定することによって得られる。特定の実施形態において、その非ヒト動物は、１つ以上のヒト免疫グロブリン可変領域の遺伝子を含む。別の特定の実施形態において、１つ以上のヒト免疫グロブリン可変領域の遺伝子は、染色体外に、内在性の免疫グロブリン遺伝子座における置換として、または非ヒト動物のゲノムにランダムにインテグレートされたトランスジーンとして、非ヒト動物に存在する。１つの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合領域は、ハイブリドーマまたはクアドローマから得られ、別の実施形態では、免疫された非ヒト動物の免疫細胞を、細胞選別を用いてスクリーニングすることによって得られる。
【００３０】
１つの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、二重特異性抗体である。１つの実施形態において、その二重特異性抗体は、二重特異性の完全ヒト抗体であり、各エピトープに対して独立してマイクロモル濃度、ナノモル濃度またはピコモル濃度の範囲の親和性を有する。
【００３１】
１つの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、ヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でない。特定の実施形態において、本抗原結合タンパク質は、非天然のヒトＴ細胞エピトープを有しない。１つの実施形態において、ＣＨ３領域の改変は、ヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でない。特定の実施形態において、ＣＨ３領域の改変は、非天然のヒトＴ細胞エピトープをもたらさない。
【００３２】
１つの実施形態において、本抗原結合タンパク質は、重鎖を含み、ここで、その重鎖は、ヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でない。１つの実施形態において、その重鎖は、非天然のＴ細胞エピトープを含まないアミノ酸配列を有する。１つの実施形態において、その重鎖は、タンパク質分解によってヒトにおいて免疫原性である約９アミノ酸のアミノ酸配列が形成され得ないアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、上記ヒトは、本抗原結合タンパク質で処置されたヒトである。１つの実施形態において、その重鎖は、タンパク質分解によってヒトにおいて免疫原性である約１３〜約１７アミノ酸のアミノ酸配列が形成され得ないアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、上記ヒトは、本抗原結合タンパク質で処置されているヒトである。
【００３３】
１つの局面において、本明細書中に記載されるようなＣＨ２改変および／またはＣＨ３改変を含む二重特異性結合タンパク質が提供され、ここで、その二重特異性結合タンパク質は、Ｂ細胞上の抗原を特異的に認識する第１の結合部分、およびＴ細胞上の抗原を特異的に認識する第２の結合部分を含む。
【００３４】
１つの実施形態において、結合タンパク質は、二重特異性抗体である。特定の実施形態において、その二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧ１重鎖およびヒトＩｇＧ１ΔＡｄｐ重鎖を含む。１つの実施形態において、第１の結合部分は、ＣＤ２０を特異的に認識するヒト重鎖可変ドメインである。１つの実施形態において、第２の結合部分は、ＣＤ３を特異的に認識するヒト重鎖可変ドメインである。１つの実施形態において、上記二重特異性抗体は、Ｒａｊｉ死滅アッセイにおいて約２．８〜３．２×１０−１２Ｍまたは約２．８〜３．０×１０−１２ＭのＥＣ５０を示し、バイスタンダー細胞死滅アッセイにおいて約１〜１０％または１〜５％を越えないバイスタンダー死滅を示し、ここで、そのバイスタンダー細胞は、ＣＤ２０エピトープを含まない。特定の実施形態において、バイスタンダー細胞は、２９３細胞である。別の特定の実施形態において、上記アッセイにおけるバイスタンダー細胞死滅は、約１０−８Ｍ〜約１０−１４Ｍという二重特異性抗体の濃度にわたって測定される。
【００３５】
１つの局面において、二重特異性抗体を作製するための方法が提供され、その方法は：第１のエピトープを認識する第１の可変ドメインを含む第１の免疫グロブリン重鎖をコードする核酸配列を得る工程（ここで、その第１の免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４のアイソタイプ定常ドメインまたはそのキメラアイソタイプ定常ドメインを含む）；第２のエピトープを認識する第２の可変ドメインを含む第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列を得る工程（ここで、その第２の免疫グロブリン重鎖は、プロテインＡへの結合を無くすかまたは減少させる改変をそのＣＨ３ドメインに含む、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４のアイソタイプ定常ドメインまたはそのキメラアイソタイプ定常ドメインを含む）；第１および第２の免疫グロブリン重鎖と対形成する免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の核酸配列を得る工程；その第１、第２および第３の核酸配列を哺乳動物細胞に導入する工程；その細胞に免疫グロブリンを発現させる工程、およびプロテインＡを用いてその免疫グロブリンを単離する工程を包含する。
【００３６】
１つの実施形態において、上記細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａおよびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。
【００３７】
１つの局面において、抗原に結合する第１の特異性およびレセプターを活性化させる第２の特異性を備える二重特異性抗原結合タンパク質が提供され、ここで、その二重特異性抗原結合タンパク質は、プロテインＡに結合する決定基を含む第１のＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド、およびそのプロテインＡに結合する決定基を欠く第２のＩｇＧ１、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを含む。
【００３８】
１つの実施形態において、上記レセプターを活性化する第２の特異性のおかげで、上記レセプターはモル濃度、ミリモル濃度、マイクロモル濃度、ナノモル濃度またはピコモル濃度の範囲であるＫＤで結合する。
【００３９】
１つの実施形態において、上記第２の特異性のおかげで、Ｇタンパク質共役レセプター、チロシンキナーゼレセプター、インテグリンレセプターおよびｔｏｌｌ様レセプターから選択されるレセプターに結合する。
【００４０】
１つの実施形態において、上記第２の特異性によって、上記レセプターと接触し、そのレセプターまたはそれと物理的に会合するサブユニットもしくはタンパク質が、セリン、トレオニンまたはチロシンのリン酸化を起こすか；ヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＡＤＰまたはｃＧＭＰ）の環化（ｃｙｃｌｉｃｉｚａｔｉｏｎ）を引き起こすか；ホスファチジルイノシトールまたはその誘導体（例えば、ＩＰ３またはＰＩＰ３）の産生を引き起こすか；脂質セカンドメッセンジャー（例えば、ジアシルグリセロール（ｄｉａｃｙｌｃｌｙｃｅｒｏｌ）、セラミド、リゾホスファチジン酸、エイコサノイド）の産生を引き起こすか；脱リン酸化（例えば、ホスファターゼ活性）を引き起こすか；脂質のリン酸化を引き起こしてセカンドメッセンジャーを形成するか；セカンドメッセンジャーの加水分解を引き起こすか；タンパク質分解を引き起こすか；レドックスシグナル伝達を引き起こすか；細胞小器官（例えば、核）へのタンパク質のトランスロケーションを引き起こすか；レセプターが（それ自体と）凝集して、ホモ多量体を形成するかまたは（他のレセプターと）ヘテロ多量体を形成するか；あるいは膜貫通型チャネルの開口または閉鎖を引き起こす。
【００４１】
１つの局面において、二重特異性抗体を作製するための方法が提供され、その方法は：クアドローマから目的の二重特異性抗体を単離する工程を包含し、ここで、その目的の二重特異性抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のアイソタイプである第１の重鎖、プロテインＡへの結合を無くすかまたは減少させる改変をそのＣＨ３ドメインに含む定常ドメインを有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のアイソタイプである第２の重鎖を含み、ここで、その目的の二重特異性抗体は、プロテインＡを用いて単離される。
【００４２】
１つの局面において、二重特異性抗体を作製するための方法が提供され、その方法は、破壊された細胞または抗体の混合物から、識別的に改変された（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＣＨ３ドメインを有する二重特異性抗体を単離する工程を包含し、ここで、その識別的に改変されたＣＨ３ドメインは、ヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でなく、その改変は、プロテインＡに対するモノマーの親和性が互いに異なるヘテロ二量体の重鎖を有する二重特異性抗体をもたらし、その二重特異性抗体は、プロテインＡを用いて、破壊された細胞または上記混合物から単離される。
【００４３】
１つの実施形態において、本二重特異性抗体は、プロテインＡ親和性支持体を用いて単離され、ここで、その二重特異性抗体は、約３．９〜約４．４、約４．０〜約４．３、約４．１〜約４．２のｐＨ、またはｐＨ約４．２で溶出する。１つの実施形態において、本二重特異性抗体は、約４、４．１、４．２、４．３、４．４または４．５のｐＨで溶出する。
【００４４】
１つの実施形態において、本二重特異性抗体は、プロテインＡ親和性支持体およびｐＨ勾配またはｐＨ段階（ｐＨ  ｓｔｅｐ）を用いて単離され、ここで、そのｐＨ勾配またはｐＨ段階は、イオン調節物質（ｉｏｎｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）を含む。特定の実施形態において、イオン調節物質は、約０．５〜約１．０モル濃度の濃度で存在する。特定の実施形態において、イオン調節物質は、塩である。１つの実施形態において、イオン調節物質は、酢酸のベリリウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩およびカリウム塩；重炭酸ナトリウムおよび重炭酸カリウム；炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムおよび炭酸セシウム；塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化セシウムおよび塩化マグネシウム；フッ化ナトリウムおよびフッ化カリウム；硝酸ナトリウム、硝酸カリウムおよび硝酸カルシウム；リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム；ならびに硫酸カルシウムおよび硫酸マグネシウムからなる群から選択される。特定の実施形態において、イオン調節物質は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属のハロゲン化物塩である。特定の実施形態において、イオン調節物質は、塩化ナトリウムである。
【００４５】
１つの局面において、Ｆｃを含む結合タンパク質（ここで、そのＦｃは、ヘテロ二量体のＦｃを形成するように、本明細書中に記載されるように改変された第１のＣＨ３ドメインおよび改変されていない第２のＣＨ３を含む）、ここで、その識別的改変は、識別的改変を有しない対応する結合タンパク質よりも０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．３または１．４高いｐＨ単位で、プロテインＡ親和性材料から溶出する結合タンパク質をもたらす。
【００４６】
１つの実施形態において、識別的に改変された結合タンパク質は、約４．２のｐＨで溶出するのに対し、改変されていない結合タンパク質は、約３のｐＨで溶出する。１つの実施形態において、識別的に改変された結合タンパク質は、約４．５のｐＨで溶出するのに対し、改変されていない結合タンパク質は、約３．５のｐＨで溶出する。１つの実施形態において、識別的に改変された結合タンパク質は、約４のｐＨで溶出するのに対し、改変されていない結合タンパク質は、約２．８〜３．５、２．８〜３．２または２．８〜３のｐＨで溶出する。１つの実施形態において、識別的に改変された結合タンパク質は、約４．２のｐＨで溶出するのに対し、改変されていない結合タンパク質は、約２．８のｐＨで溶出する。１つの実施形態において、識別的に改変された結合タンパク質は、約４．４のｐＨで溶出するのに対し、改変されていない結合タンパク質は、約３．６のｐＨで溶出する。これらの実施形態において、「改変されていない」とは、両方のＣＨ３ドメインにおいて、４３５（ＥＵナンバリング）に改変を有しないこと、または４３５および４３６（ＥＵナンバリング）に改変を有しないことを指す。
【００４７】
本明細書中に記載される任意の実施形態および局面は、別段示されないかまたは文脈から明らかでない限り、互いと同時に使用され得る。次の記載を検討することにより、他の実施形態が当業者に明らかになるだろう。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ａ．Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１のエピトープに選択的に結合する第１のエピトープ結合領域、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第１のＣＨ３領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む、第１のポリペプチド；ならびに
ｂ．Ｎ末端からＣ末端に向かって、第２のエピトープに選択的に結合する第２のエピトープ結合領域、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第２のＣＨ３領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む、第２のポリペプチド；
を含むヘテロ二量体の二重特異性抗原結合タンパク質であって、ここで、前記第２のＣＨ３領域は、プロテインＡへの該第２のＣＨ３ドメインの結合を減少させるかまたは排除する改変を含む、ヘテロ二量体の二重特異性抗原結合タンパク質。
（項目２）
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、ヒトＩｇＧ重鎖である、項目１に記載の二重特異性タンパク質。
（項目３）
免疫グロブリン軽鎖をさらに含む、項目１に記載の二重特異性タンパク質。
（項目４）
前記免疫グロブリン軽鎖が、ヒト免疫グロブリン軽鎖である、項目３に記載の二重特異性タンパク質。
（項目５）
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが各々、ヒトＩｇＧ１重鎖である、項目１に記載の二重特異性タンパク質。
（項目６）
前記改変が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）９５Ｒならびに（ｂ）９５Ｒおよび９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）４３５Ｒならびに（ｂ’）４３５Ｒおよび４３６Ｆからなる群から選択される、項目１に記載の二重特異性タンパク質。
（項目７）
ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける１６Ｅ、１８Ｍ、４４Ｓ、５２Ｎ、５７Ｍおよび８２Ｉ、またはＥＵナンバリングシステムにおける３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍおよび４２２Ｉからなる群から選択される１から５つの改変をさらに含む、項目６に記載の二重特異性タンパク質。
（項目８）
前記二重特異性抗体のＣＨ３ドメインが、ヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でない、項目６に記載の二重特異性タンパク質。
（項目９）
前記二重特異性抗体のＣＨ３ドメインが、ヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でない、項目７に記載の二重特異性タンパク質。
（項目１０）
二重特異性抗体を作製するための方法であって、前記方法は：
ａ．第１のエピトープを認識する第１の可変ドメインを含む第１の免疫グロブリン重鎖をコードする核酸配列を得る工程であって、ここで、該第１の免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のアイソタイプ定常ドメインを含む、工程；
ｂ．第２のエピトープを認識する第２の可変ドメインを含む第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列を得る工程であって、ここで、該第２の免疫グロブリン重鎖は、プロテインＡへの結合を無くすかまたは減少させる改変をそのＣＨ３ドメインに含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のアイソタイプ定常ドメインを含む、工程；
ｃ．該第１の免疫グロブリン重鎖および該第２の免疫グロブリン重鎖と対形成する免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の核酸配列を得る工程；
ｄ．該第１の核酸配列、該第２の核酸配列および該第３の核酸配列を哺乳動物細胞に導入する工程；
ｅ．該細胞が二重特異性抗体を発現するのを可能にする工程；ならびに
ｆ．該二重特異性抗体がプロテインＡに結合する能力に基づいて該二重特異性抗体を単離する工程
を包含する、方法。
（項目１１）
前記改変が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）９５Ｒならびに（ｂ）９５Ｒおよび９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）４３５Ｒならびに（ｂ’）４３５Ｒおよび４３６Ｆからなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける１６Ｅ、１８Ｍ、４４Ｓ、５２Ｎ、５７Ｍおよび８２Ｉ、またはＥＵナンバリングシステムにおける３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍおよび４２２Ｉからなる群から選択される１から５つの改変をさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記二重特異性抗体の前記ＣＨ３ドメインが、ヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でない、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記二重特異性抗体の前記ＣＨ３ドメインが、ヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でない、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記二重特異性抗体が、プロテインＡを備える固体支持体で単離される、項目１０に記載の方法。
（項目１６）
前記固体支持体が、プロテインＡアフィニティーカラムを含み、前記二重特異性抗体が、ｐＨ勾配を使用して単離される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ｐＨ勾配が、ｐＨ３とｐＨ５との間の１またはそれより多いｐＨ段階を含む段階勾配である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
二重特異性抗体を単離するための方法であって、
破壊された細胞または抗体の混合物から、識別的に改変されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＣＨ３ドメインを有する二重特異性抗体を単離する工程を包含し、ここで、該識別的に改変されたＣＨ３ドメインは、ヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でなく、該改変は、プロテインＡに対するモノマーの親和性が互いに異なるヘテロ二量体の重鎖定常領域を有する二重特異性抗体をもたらし、該二重特異性抗体は、プロテインＡに対するその親和性に基づいて、該破壊された細胞または該混合物から単離される、方法。
（項目１９）
前記ヘテロ二量体の重鎖定常領域の一方のモノマーが、ヒトＩｇＧ１であり、該ヘテロ二量体の重鎖定常領域の他方のモノマーが、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおける（ａ）Ｈ９５Ｒならびに（ｂ）Ｈ９５ＲおよびＹ９６Ｆ、またはＥＵナンバリングシステムにおける（ａ’）Ｈ４３５Ｒならびに（ｂ’）Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆからなる群から選択される改変を含む改変されたヒトＩｇＧ１である、項目１８に記載の方法。（項目２０）
前記改変されたヒトＩｇＧ１が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムにおけるＤ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７ＭおよびＶ８２Ｉ、またはＥＵナンバリングシステムにおけるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７ＭおよびＶ４２２Ｉからなる群から選択される改変をさらに含む、項目１９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、３つの二重特異性抗体形式：（Ａ）二重特異性Ｔ細胞Ｅｎｇａｇｅｒ（ＢｉＴＥ）；（Ｂ）マウス−ラットハイブリッド；および（Ｃ）通常の軽鎖を有するノブ・イントゥ・ホールを図示している。
【図２】図２は、ＦｃΔＡｄｐ改変を図示している：（Ａ）ヒトＩｇＧ１（配列番号１）およびＩｇＧ３（配列番号７）のＦｃ領域のアラインメント（ＦｃΔＡｄｐ改変を四角で示している）；（Ｂ）ＦｃΔＡｄｐ二重特異性抗体の模式的表示。
【図２Ｂ】図２は、ＦｃΔＡｄｐ改変を図示している：（Ａ）ヒトＩｇＧ１（配列番号１）およびＩｇＧ３（配列番号７）のＦｃ領域のアラインメント（ＦｃΔＡｄｐ改変を四角で示している）；（Ｂ）ＦｃΔＡｄｐ二重特異性抗体の模式的表示。
【図３】図３は、ΔＡｄｐジペプチド改変有りおよび無しのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のヒトＣＨ３ドメイン（ＩＭＧＴエキソンナンバリングおよびＥＵナンバリングを使用）、ならびにＩｇＧ３のアラインメントを図示している。
【図４】図４は、段階勾配を利用した溶出プロファイルを示している、二重特異性抗体を単離するためのプロテインＡカラムのトレースを示している。
【図５】図５は、図４に示されるクロマトグラフ分離から溶出されたカラム画分のＩＬ４−ＲａおよびＩＬ−６Ｒａ  ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合プロファイルを示している。画分中の抗体を、固定化された抗Ｆｃ抗体で捕捉し、次いで、捕捉された抗体への結合について、可溶性ＩＬ−４ＲａまたはＩＬ−６Ｒａをアッセイした。
【図６】図６は、ＦｃΔＡｄｐ二重特異性抗体（ＩＬ−６ＲΔ／ＩＬ−４Ｒ）、ＦｃΔＡｄｐホモ二量体（ＩＬ−６ＲΔ／ＩＬ−６ＲΔ）、野生型ＣＨ３配列を有するＩｇＧ１抗体（ＩＬ−４Ｒ／ＩＬ−４Ｒ）およびコントロール単一特異的抗体の薬物動態学的プロファイルを示している。
【図７】図７は、Ｒａｊｉ細胞死滅アッセイにおけるＣＤ２０×ＣＤ３ΔＡｄｐ二重特異性抗体の有効性を図示している。
【図８】図８は、ＣＤ２０×ＣＤ３ΔＡｄｐ二重特異性抗体を用いたバイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）細胞（２９３）死滅アッセイを図示している。
【図９】図９は、種々のｍＦｃヘテロ二量体を使用した発現実験についての結果を示している。パネルＡ：ホモ二量体のｍＩｇＧ２ａおよびホモ二量体のＩｇＧ２ａＰＴＴＴＫからのヘテロ二量体のｍＩｇＧ２ａ／ｍＩｇＧ２ａＰＴＴＴＫのｐＨ分離のウエスタンブロット；パネルＢ：ホモ二量体のｍＩｇＧ２ａおよびホモ二量体のＩｇＧ２ａＴＴＴＫからのヘテロ二量体のｍＩｇＧ２ａ／ｍＩｇＧ２ａＴＴＴＫのｐＨ分離のウエスタンブロット；ＩＰ＝投入物；ＦＴ＝フロースルー；Ｗ２＝２回目の洗浄物（１×ＰＢＳ  ｐＨ７．２）；Ｅ１＝１回目の溶出物（２０ｍＭクエン酸Ｎａ、１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ５．５）；Ｅ２＝２回目の溶出物（２０ｍＭクエン酸Ｎａ、１Ｍ  ＮａＣｌ；５７％ｐＨ５．５＋４３％ｐＨ２．６）；Ｅ３＝３回目の溶出物（２０ｍＭクエン酸Ｎａ、１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ２．６）。
【図１０】図１０は、４：１というＩＦＮＡＲ１構築物：ＩＦＮＡＲ２構築物の比を用いたときの、アイソタイプの混合物（例えば、ｍＩｇＧ２ａおよびｍＩｇＧ１）のヘテロ二量体の形態に対する変異体ＩｇＧ２ａのヘテロ二量体の優先的な形態を図示している。レーン１：ＩＦＮＡＲ１−ＩｇＧ２ａ：ＩＦＮＡＲ２−ＩｇＧ１；レーン２：ＩＮＦＡＲ１−ＩｇＧ２ａ：ＩＦＮＡＲ２−ＩｇＧ２ａＴＴＴ；レーン３：ＩＦＮＡＲ１−ＩｇＧ２ａ：ＩＦＮＡＲ２−ＩｇＧ２ａＴＴＴＫ；レーン４：ＩＦＮＡＲ１−ＩｇＧ２ａ：ＩＦＮＡＲ２−ＩｇＧ２ａＰＴＴＴＫ；レーン５：ＩＦＮＡＲ１−ＩｇＧ２ａ：ＩＦＮＡＲ２−ＩｇＧ２ａＲＦ。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
詳細な説明
特定の方法および記載される実験条件は変動し得るので、本発明は、そのような方法および条件に限定されない。本発明の範囲は、請求項によって定義されるので、本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態だけを記載する目的であって、限定する意図はないことも理解される。
【００５０】
別段定義されない限り、本明細書中で使用される専門用語および科学用語のすべては、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、ここでは特定の方法および材料が記載される。言及されるすべての刊行物が、本明細書に参照によって援用される。
【００５１】
用語「抗体」は、本明細書中で使用されるとき、ジスルフィド結合によって相互に接続された４つのポリペプチド鎖、すなわち２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中でＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中でＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域とともに点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。ＶＨおよびＶＬの各々は、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と省略され得る；軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と省略され得る）。用語「高親和性」抗体とは、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）または溶液親和性（ｓｏｌｕｔｉｏｎ−ａｆｆｉｎｉｔｙ）ＥＬＩＳＡによって測定されたとき、その標的に対して少なくとも１０−９Ｍ、少なくとも１０−１０Ｍ；少なくとも１０−１１Ｍ；または少なくとも１０−１２Ｍの結合親和性を有する抗体のことを指す。
【００５２】
句「抗原結合タンパク質」は、少なくとも１つのＣＤＲを有し、かつ抗原を選択的に認識することができる、すなわち、少なくともマイクロモル濃度の範囲のＫＤで抗原に結合することができるタンパク質を含む。治療用の抗原結合タンパク質（例えば、治療用抗体）は、ナノモル濃度またはピコモル濃度の範囲のＫＤを必要とすることが多い。「抗原結合タンパク質」はまた、本明細書中に記載されるような第１および第２のＣＨ３ドメイン、ならびに第１のタンパク質認識ドメインまたはリガンド認識ドメイン、および第２のタンパク質認識ドメインまたはリガンド認識ドメインを含むタンパク質を含み、ここで、その第１のタンパク質認識ドメインまたはリガンド認識ドメインおよび第２のタンパク質認識ドメインまたはリガンド認識ドメインの各々は、独立して、同じタンパク質もしくはリガンドを認識するか、または一緒に同じタンパク質もしくはリガンドを認識するか、あるいは各々独立して、異なるタンパク質またはリガンドを認識する。そのようなタンパク質の１つの例は、融合タンパク質（ヘテロ−またはホモ−）二量体を含むイムノアドヘシンであり、ここで、その二量体のポリペプチドは、レセプター構成要素またはリガンド構成要素を含む融合ポリペプチドであり、そのリガンド構成要素は、レセプターに結合するアミノ酸配列を含む。
【００５３】
句「二重特異性抗体」は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することができる抗体を含む。二重特異性抗体は、一般に、２つの異なる重鎖を含み、各重鎖は、異なるエピトープ（２つの異なる分子（例えば、抗原）上のエピトープまたは同じ分子（例えば、同じ抗原）上のエピトープ）に特異的に結合する。二重特異性抗体が、２つの異なるエピトープ（第１のエピトープおよび第２のエピトープ）に選択的に結合することができる場合、第１のエピトープに対する第１の重鎖の親和性は、一般に、第２のエピトープに対する第１の重鎖の親和性よりも少なくとも１桁から２桁または３桁または４桁低く、逆もまた同じである。二重特異性抗体によって認識されるエピトープは、同じ標的上または異なる標的上（例えば、同じまたは異なるタンパク質上）に存在し得る。二重特異性抗体は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製され得る。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列が、種々の重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合され得、そのような配列が、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞において発現され得る。代表的な二重特異性抗体は、２つの重鎖（各々が、３つの重鎖ＣＤＲ、それに続いて（Ｎ末端からＣ末端に向かって）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する）、および抗原結合特異性を与えないが各重鎖と会合し得る免疫グロブリン軽鎖、または各重鎖と会合し得、かつ重鎖抗原結合領域によって結合される１つ以上のエピトープに結合し得る免疫グロブリン軽鎖、または各重鎖と会合し得、かつ一方または両方のエピトープへの一方または両方の重鎖の（ｏｒ）結合を可能にする免疫グロブリン軽鎖を有する。
【００５４】
用語「細胞」は、組換え核酸配列を発現するのに適した任意の細胞を含む。細胞には、原核生物および真核生物の細胞（単細胞または多細胞）、細菌細胞（例えば、大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．などの系統）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞または細胞融合物（例えば、ハイブリドーマまたはクアドローマ）が含まれる。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウス細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、真核生物細胞であり、以下の細胞：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ−６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ミエローマ細胞、腫瘍細胞、および上述の細胞に由来する細胞株から選択される。いくつかの実施形態において、細胞は、１つ以上のウイルス遺伝子を含む（例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞））。
【００５５】
句「相補性決定領域」または用語「ＣＤＲ」は、通常（すなわち、野生型動物において）免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞レセプター）の軽鎖または重鎖の可変領域内の２つのフレームワーク領域の間に見られる、生物の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。ＣＤＲは、例えば、生殖細胞系列の配列または再配列された配列もしくは再配列されていない配列によって、例えば、ナイーブＢ細胞もしくは成熟Ｂ細胞またはナイーブＴ細胞もしくは成熟Ｔ細胞によって、コードされ得る。いくつかの状況において（例えば、ＣＤＲ３の場合）、ＣＤＲは、連続していない（例えば、再配列されていない核酸配列では連続していない）が、例えば、それらの配列のスプライシングまたは接続（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するＶ−Ｄ−Ｊ組換え）の結果としてＢ細胞の核酸配列では連続している、２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系列の配列）によってコードされ得る。
【００５６】
句「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」は、任意の生物由来の免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含み、別段明記されない限り、重鎖可変ドメインを含む。重鎖可変ドメインは、別段明記されない限り、３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのＦＲ領域を含む。重鎖のフラグメントとしては、ＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。代表的な重鎖は、可変ドメインの後、（Ｎ末端からＣ末端に向かって）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能的なフラグメントには、抗原を特異的に認識することができ（例えば、マイクロモル濃度、ナノモル濃度またはピコモル濃度の範囲のＫＤで抗原を認識することができ）、発現して細胞から分泌されることができ、かつ、少なくとも１つのＣＤＲを含む、フラグメントが含まれる。
【００５７】
句「Ｆｃ含有タンパク質」は、抗体、二重特異性抗体、イムノアドヘシン、ならびに免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも機能的な一部を含む他の結合タンパク質を含む。「機能的な一部」とは、Ｆｃレセプター（例えば、ＦｃγＲ；またはＦｃＲｎ、すなわち、新生児Ｆｃレセプター）に結合し得、そして／または補体の活性化に関与し得る、ＣＨ２およびＣＨ３領域のことを指す。そのＣＨ２およびＣＨ３領域が、いずれのＦｃレセプターにも結合できなくし、また、補体を活性化できなくする、欠失、置換および／もしくは挿入または他の改変を含む場合、そのＣＨ２およびＣＨ３領域は、機能的でない。
【００５８】
Ｆｃ含有タンパク質は、改変が結合タンパク質の１つ以上のエフェクター機能に影響する場合（例えば、ＦｃγＲ結合性、ＦｃＲｎ結合性ひいては半減期、および／またはＣＤＣ活性に影響する改変）を含む改変を免疫グロブリンドメインに含み得る。そのような改変としては、免疫グロブリン定常領域のＥＵナンバリングに準拠した以下の改変およびそれらの組み合わせ：２３８、２３９、２４８、２４９、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１５、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３４２、３４４、３５６、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３７３、３７５、３７６、３７８、３８０、３８２、３８３、３８４、３８６、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４２８、４３０、４３３、４３４、４３５、４３７、４３８および４３９が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
例えば、限定するわけではないが、結合タンパク質は、Ｆｃ含有タンパク質であり、長い血清半減期（列挙される改変を有しない同じＦｃ含有タンパク質と比べて）を示し、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）；２５０位および４２８位（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）に改変を有するか；または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｌ／Ｒ／ＳＩ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）に改変を有するか；または２５０位および／もしくは４２８位に改変を有するか；または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）および４３４位に改変を有する。別の例では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）改変；２５２、２５４および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ）改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌ改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；３０７および／または３０８改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含み得る。
【００６０】
句「イオン調節物質」は、タンパク質間の非特異的な（すなわち、非親和性の）イオン性相互作用の影響を減少させるかまたはその影響を乱す部分を含む。「イオン調節物質」としては、例えば、塩、酢酸、重炭酸、炭酸、ハロゲン（例えば、塩化物またはフッ化物）、硝酸、リン酸または硫酸とＩ族およびＩＩ族金属とのイオン性の組み合わせ物が挙げられる。「イオン調節物質」の非限定的な例示的リストとしては、酢酸のベリリウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩およびカリウム塩；重炭酸ナトリウムおよび重炭酸カリウム；炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムおよび炭酸セシウム；塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化セシウムおよび塩化マグネシウム；フッ化ナトリウムおよびフッ化カリウム；硝酸ナトリウム、硝酸カリウムおよび硝酸カルシウム；リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム；ならびに硫酸カルシウムおよび硫酸マグネシウムが挙げられる。「イオン調節物質」は、ｐＨ勾配もしくはｐＨ段階に加えられたとき、または「イオン調節物質」でのプロテインＡ支持体の平衡化のとき、イオン性の相互作用に影響する部分を含み、ｐＨ段階またはｐＨ勾配を適用することにより、ホモ二量体のＩｇＧの溶出とヘテロ二量体のＩｇＧの溶出との間（例えば、野生型ヒトＩｇＧの溶出と、本明細書中に記載されるようなそのＣＨ３ドメインの１つ以上の改変を有すること以外は同じＩｇＧの溶出との間）のｐＨ単位の間隔が広がる。「イオン調節物質」の適当な濃度は、最大のｐＨの間隔が所与のｐＨ段階またはｐＨ勾配に達するまで「イオン調節物質」の濃度を上げながら、同じカラム、ｐＨ段階またはｐＨ勾配を使用して、その濃度によって決定され得る。
【００６１】
句「軽鎖」は、任意の生物由来の免疫グロブリン軽鎖定常領域配列を含み、別段明記されない限り、ヒトカッパー軽鎖およびヒトラムダ軽鎖を含む。軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは、別段明記されない限り、代表的には、３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。一般に、全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含むＶＬドメイン、および軽鎖定常ドメインを含む。本発明と共に使用され得る軽鎖は、例えば、本抗原結合タンパク質によって選択的に結合される第１または第２の抗原に選択的に結合しない軽鎖を含む。適当な軽鎖には、既存の抗体ライブラリー（ウェットライブラリーまたはインシリコ）において最もよく使用される軽鎖についてスクリーニングすることによって特定され得る軽鎖が含まれ、ここで、その軽鎖は、本抗原結合タンパク質の抗原結合ドメインの親和性および／または選択性を実質的に干渉しない。適当な軽鎖には、本抗原結合タンパク質の抗原結合領域によって結合される一方または両方のエピトープに結合し得る軽鎖が含まれる。
【００６２】
句「マイクロモル濃度範囲」は、１〜９９９マイクロモル濃度を意味することを意図している；句「ナノモル濃度範囲」は、１〜９９９ナノモル濃度を意味することを意図している；句「ピコモル濃度範囲」は、１〜９９９ピコモル濃度を意味することを意図している。
【００６３】
句「体細胞変異した」は、クラススイッチを起こしたＢ細胞由来の核酸配列に対する言及を含み、ここで、クラススイッチしたＢ細胞における免疫グロブリン可変領域（例えば、重鎖可変ドメインまたは重鎖ＣＤＲ配列もしくは重鎖ＦＲ配列を含む領域）の核酸配列は、クラススイッチ前のＢ細胞における核酸配列と同一ではない（例えば、クラススイッチを起こしていないＢ細胞とクラススイッチを起こしたＢ細胞との間でＣＤＲ核酸配列またはフレームワーク核酸配列が異なる）。「体細胞変異した」は、親和性成熟していないＢ細胞における対応する配列（すなわち、生殖細胞系列の細胞のゲノムにおける配列）と同一でない親和性成熟したＢ細胞由来の核酸配列に対する言及を含む。句「体細胞変異した」は、Ｂ細胞を目的の抗原に曝露した後のＢ細胞由来の核酸配列に対する言及も含み、ここで、その核酸配列は、そのＢ細胞をその目的の抗原に曝露する前の対応する核酸配列と異なる。句「体細胞変異した」とは、抗原チャレンジに応答したヒト免疫グロブリン可変領域の核酸配列を有する動物、例えばマウスにおいて産生され、そのような動物において本質的に有効な選択プロセスから生じる、抗体由来の配列のことを指す。
【００６４】
句「可変ドメイン」は、（別段示されない限り）以下のアミノ酸領域を順にＮ末端からＣ末端に向かって含む免疫グロブリン軽鎖または重鎖（所望のとおり改変されたもの）のアミノ酸配列を含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。「可変ドメイン」は、二重のベータシート構造を有する基準のドメイン（ＶＨまたはＶＬ）に折り畳むことができるアミノ酸配列を含み、ここで、そのベータシートは、第１のベータシートの残基と第２のベータシートの残基との間のジスルフィド結合によって接続されている。
【００６５】
改変されたＩｇＧ  ＣＨ３領域を有する二重特異性抗体
本発明者らは、通常の軽鎖ストラテジーを、ヒト抗体の構成要素とともに使用され得る選択的なプロテインＡ精製スキームの実行と組み合わせる新規形式を開発した。
【００６６】
ヒトＩｇＧ３は、プロテインＡに結合しないので、マウス−ラットハイブリッドに対して使用される精製ストラテジーと類似の精製ストラテジーにおいて他の３つのヒトＩｇＧサブクラスのうちのいずれかと一緒に使用することができるという可能性があることは、以前から有名だった（Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ，Ｈ．ら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：２１９−２２５））。しかしながら、４つすべてのヒトＩｇＧサブクラスの配列が、高度に相同であるにもかかわらず、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のＦｃ部が、どれだけ容易にＩｇＧ３とヘテロ二量体を形成するかは知られていない；ある特定の状況下では（例えば、クアドローマからの単離では）、ホモ二量体の優先的な形成だけこそが所望のヘテロ二量体の総収量に対して悪影響を及ぼし得る。ＩｇＧ３のヒンジ領域と他のサブクラスのヒンジ領域との差異を補うために追加の改変が必要となることもある。エフェクター機能に対する潜在的な影響があるので、いくつかの状況では、完全なＩｇＧ３  Ｆｃの存在を必要としないことが好ましい場合もある。
【００６７】
それゆえ、本発明者らは、プロテインＡ結合の偶然にも単純な決定基を活用する「最小」形式を考案した。ＩｇＧ３がプロテインＡに結合できないことは単一のアミノ酸残基Ａｒｇ４３５（ＥＵナンバリング；ＩＭＧＴではＡｒｇ９５）（他のＩｇＧサブクラスでは、対応する位置はヒスチジン残基で占められている）によって判定されることが報告されている（Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ，Ｌ．ら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈ．２０１：２５−３４））。それゆえ、ＩｇＧ３の代わりに、Ｈｉｓ４３５がＡｒｇに変異したＩｇＧ１配列を使用することが可能である。よって、ＩｇＧ１における単一の点変異が、新しい精製スキームに適用できる異なる結合親和性をもたらすのに十分であるはずである。この改変は、プロテインＡに結合することができないことを表すＩｇＧ１ΔＡと呼ばれる（そして同様に、ＩｇＧ２ΔＡおよびＩｇＧ４ΔＡ、またはより一般的にはＦｃΔＡ）。
【００６８】
しかしながら、明記される点変異が、その変異によって新規ペプチド配列を導入することから、それは、潜在的に免疫原性であり得る。この点変異は、理論上、ＭＨＣクラスＩＩ分子上にのせられて、Ｔ細胞に提示され、その結果として、免疫応答を誘発し得る。この不測の困難を回避するために、ジペプチド変異Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ（ＥＵナンバリング；ＩＭＧＴではＨ９５Ｒ／Ｙ９６Ｆ）が使用され得る。その結果生じるこの変更の近傍における配列は、ＩｇＧ３の配列と同一となり（図２Ａを参照のこと）、ゆえに、Ｔ細胞への提示に利用可能な非天然の短いペプチドが存在しないだろうことから、免疫学的に「隠されている」と予想され得る。この二重変異体がなおもプロテインＡに結合しないことが報告されている（Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ，Ｌ．ら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈ．２０１：２５−３４）。最後に、そのジペプチド変異は、Ｆｃ二量体の界面を形成するいずれの残基も含まないので、ヘテロ二量体の形成が干渉される可能性は低い。このジペプチド変異は、「ＩｇＧ１ΔＡｄｐ」（そして同様にＩｇＧ２ΔＡｄｐ、ＩｇＧ４ΔＡｄｐおよびＦｃΔＡｄｐ）と命名される。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４におけるジペプチド改変の配置は、ＩＭＧＴエキソンナンバリングおよびＥＵナンバリングを示しつつ、野生型ヒトＩｇＧ  ＣＨ３ドメイン配列、ならびにｈＩｇＧ３と共に示されている、図３のＩｇＧ１ΔＡｄｐ、ＩｇＧ２ΔＡｄｐおよびＩｇＧ４ΔＡｄｐと表されている配列に示されている。
【００６９】
ＦｃΔＡｄｐ改変は、Ｆｃ二量体の界面を形成すると考えられているいずれの残基も含まないので、そのＦｃΔＡｄｐ改変がヘテロ二量体の形成を干渉する可能性は低い。ＦｃΔＡｄｐは、そのように最小であるので、同様に、他の操作されたＦｃ形態に組み込まれる可能性もあり得る。ＩｇＧ２ΔＡｄｐおよびＩｇＧ４ΔＡｄｐは、後者の各々に関連するエフェクター機能（またはその欠損）が望まれる状況において有益であり得る。
【００７０】
要約すれば、上に記載された二重特異性抗体形式は、同じ軽鎖を使用する特異性の異なる２つの抗体を含み、ここで、それらのうちの１つのＦｃ領域は、ＦｃΔＡｄｐ形式に改変されている（図２Ｂを参照のこと）。その配置は、天然のヒト抗体の配置であり、ゆえに、凝集する傾向が低いこと、インビボ安定性、最小の免疫原性、抗体の体内分布特性に類似した体内分布特性、良好な薬物動態、および必要に応じてエフェクター機能をはじめとした、その好ましい特性を共有するはずである。そのような二重特異性抗体を単離するための、実行することが比較的迅速かつ単純な方法が提供される。
【００７１】
改変されたマウスＩｇＧ  ＣＨ領域を有する二重特異性結合タンパク質
本発明者らは、ＣＨ３ドメインにおける１つ以上のアミノ酸に関してヘテロ二量体である免疫グロブリン重鎖（またはその機能的なＣＨ２およびＣＨ３含有フラグメント）を含む結合タンパク質を容易に単離するための方法を考案した。マウスＩｇＧ  ＣＨドメインの改変を慎重に選択し、特定の分離技術を適用することにより、それらの改変を含まないホモ二量体およびヘテロ二量体から２つの識別的に改変されたマウスＣＨ領域を含む結合タンパク質を容易に単離することができるようになる。
【００７２】
２４７にプロリン、２５２、２５４および２５６にトレオニン、ならびに２５８にリジンを含むマウスＩｇＧ１は、プロテインＡと弱くしか結合しない。しかしながら、マウスＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂは、それらの位置に異なる残基を含み（ＩｇＧ２ｂの２５６位および２５８位を除いて）、マウスＩｇＧ２ａおよび２ｂは、プロテインＡに十分に結合する。重鎖がヘテロ二量体である抗体を作製するための方法において２つのマウスＩｇＧのＣＨ領域を識別的に改変することにより、そのような抗体に識別的なプロテインＡ結合特性が付与され得る。このように、ＩｇＧ１のホモ二量体（プロテインＡには、たとえ結合するとしてもかなり弱くしか結合しない）であるか、またはマウスＩｇＧ２ａのホモ二量体であるか、マウスＩｇＧ２ｂのホモ二量体であるか、またはＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ｂのヘテロ二量体であるかに関係なく、任意のマウスＩｇＧホモ二量体から、改変されたヘテロ二量体を容易に（ｒｅａｄｙ）分離することができる識別的なプロテインＡ単離スキームが考案される。例えば、２つの異なる重鎖可変ドメインを有するが、同じアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ２ａの二重特異性抗体は、その重鎖配列を使用する適当な発現系において発現され得、ここで、ＩｇＧ２ａ  ＣＨ領域のうちのただ１つが、プロテインＡ結合決定基を減少させるかまたは排除するように改変される。このように、ＩｇＧ２ａ  ＣＨ領域のうちの１つだけが、プロテインＡに対する実質的な親和性を示し、改変されていないＩｇＧ２ａと改変されたＩｇＧ２ａとの二量体から形成される任意の抗体は、改変されたヘテロ二量体から容易に単離され得る。
【００７３】
様々な実施形態において、Ｆｃ二量体の単一のＣＨ領域が、改変されたＣＨ領域を含むのに対し、Ｆｃ二量体の他方のＣＨは、それらを欠いている、抗体。そのマウスＩｇＧ  ＣＨ領域は：２５２Ｔ、２５４Ｔおよび２５６Ｔ；２５２Ｔ、２５４Ｔ、２５６Ｔおよび２５８Ｋ；２４７Ｐ、２５２Ｔ、２５４Ｔ、２５６Ｔおよび２５８Ｋ；４３５Ｒおよび４３６Ｆ；２５２Ｔ、２５４Ｔ、２５６Ｔ、４３５Ｒおよび４３６Ｆ；２５２Ｔ、２５４Ｔ、２５６Ｔ、２５８Ｋ、４３５Ｒおよび４３６Ｆ；２４ｔＰ、２５２Ｔ、２５４Ｔ、２５６Ｔ、２５８Ｋ、４３５Ｒおよび４３６Ｆ；ならびに４３５Ｒからなる群から選択される特定の位置（ＥＵナンバリング）に特定のアミノ酸を含むように改変される。特定の実施形態において、Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ；Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ、Ｉ２５８Ｋ；Ｉ２４７Ｐ、Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ、Ｉ２５８Ｋ；Ｈ４３５Ｒ、Ｈ４３６Ｆ；Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ、Ｈ４３５Ｒ、Ｈ４３６Ｆ；Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ、Ｉ２５８Ｋ、Ｈ４３５Ｒ、Ｈ４３６Ｆ；Ｉ２４７Ｐ、Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ、Ｉ２５８Ｋ、Ｈ４３５Ｒ、Ｈ４３６Ｆ；およびＨ４３５Ｒからなる群から選択される特定の基の改変が行われる。
【００７４】
ヘテロ二量体のマウスＩｇＧに基づく結合タンパク質は、種々の用途のために使用され得る。例えば、それらは、マウス定常ドメインを有する二重特異性抗体を単離する方法を可能にし、ここで、その改変は、１つ以上のマウスＦｃレセプターへのその抗体の結合を干渉しないか、または実質的に干渉せず、その抗体は、例えば、ＡＤＣＣまたはＣＤＣに関与し得、また、同じまたは異なる標的上の２つ以上のエピトープに結合し得る。
【００７５】
１つの局面において、第１のマウスＩｇＧ  ＣＨ領域および第２のマウスＩｇＧ  ＣＨ領域を含む結合タンパク質を単離するための方法、ここで、その第１のＩｇＧ  ＣＨ領域は、第１のマウスＩｇＧ  ＣＨ領域のプロテインＡ結合親和性を減少させるかまたは排除するが第２のマウスＩｇＧ  ＣＨ領域のプロテインＡ結合親和性を減少させないかまたは排除しないように改変され（第２のＩｇＧ  ＣＨ領域は改変されない）、その結合タンパク質は、第１のエピトープに結合する第１の結合部分および第２のエピトープに結合する第２の結合部分を含む。
【００７６】
１つの実施形態において、改変は、Ｆｃレセプターへの結合タンパク質の結合親和性を変更しないかまたは実質的に変更しない。１つの実施形態において、本結合タンパク質は、本結合タンパク質のＦｃレセプターへの親和性を増加させるかまたは減少させる改変を含む。
【００７７】
１つの実施形態において、改変は、その改変を有しない対応する結合タンパク質と比べて、天然のマウスＦｃγＲレセプターおよび／または天然のマウスＦｃＲｎを含むマウスにおける結合タンパク質の血清半減期を変更しないかまたは実質的に変更しない。
【００７８】
１つの実施形態において、改変は、その改変を有しない対応する結合タンパク質と比べて、天然の高親和性および低親和性のマウスＦｃγＲレセプターならびに／またはＦｃＲｎレセプターの置き換えを含むマウスにおける本結合タンパク質の血清半減期を変更しないかまたは実質的に変更しない。
【００７９】
１つの実施形態において、第１および第２のエピトープは、異なるものであり、異なる細胞上または異なるタンパク質上に存在する。１つの実施形態において、第１のエピトープおよび第２のエピトープは、異なるものであり、同じ細胞上または同じタンパク質上に存在する。
【００８０】
１つの実施形態において、Ｆｃレセプターは、高親和性Ｆｃレセプター、低親和性ＦｃレセプターおよびＦｃＲｎから選択される。特定の実施形態において、Ｆｃレセプターは、マウスＦｃＲｎ、マウスＦｃγＲ、マウスＦｃγＲＩＩＢ、マウスＦｃγＲＩＩＩ、マウスＦｃγＲＩＶおよびそれらの組み合わせのうちの１つ以上から選択される。特定の実施形態において、Ｆｃレセプターは、ヒトＦｃＲｎ、ヒトＦｃγＲ、ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ヒトＦｃγＲＩＩＣ、ヒトＦｃγＲＩＩＩＢ、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、ヒトＦｃγＲＩＩＡおよびそれらの組み合わせのうちの１つ以上から（ｆｏｒｍ）選択される。
【００８１】
免疫原性
本発明の多くの実施形態の利点の１つは、プロテインＡに対する結合性の違いに基づいて容易に単離可能であり、かつヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でない、二重特異性抗体をもたらす改変を使用することができることである。この特性のおかげで、そのような実施形態は、ヒトへの治療に使用するための二重特異性抗体を作製する際、および例えば、免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でないイムノアドヘシンを作製する際（ヒト結合部分、すなわち、ヒトレセプター構成要素および／またはヒトリガンドを使用するとき）に、特に有用になる。この特性は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３のＨ９５Ｒ／Ｙ９６Ｆ（ＩＭＧＴナンバリング）改変を伴うＣＨ３ドメイン、ならびに異なるＩｇＧアイソタイプの野生型配列を反映して改変された位置をもたらすさらなる改変を含むＣＨ３ドメインを有する二重特異性抗体に関連する。よって、特定のＩｇＧアイソタイプに関連する改変は、天然には見られないが、改変された配列は、異なるＩｇＧアイソタイプの野生型配列と局所的に同一であり、その改変は、免疫原性であるかまたは実質的に免疫原性であると予想されない。配列が、任意の天然の配列と局所的に同一でなかったとしても、その改変は、免疫原性でない可能性もあり；そのような改変は、等しく有用であり得る。ゆえに、最小の点変異Ｈ９５Ｒ（ＩＭＧＴナンバリング）は、免疫原性でない場合、本発明の適当な実施形態であり得る。
【００８２】
よって、重鎖定常ドメインに関してヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でないが、親和性試薬（例えば、プロテインＡ）に対する重鎖定常ドメインの親和性に違いをもたらす改変を含む重鎖定常ドメインの１つ以上の識別的改変を有する、二重特異性抗体が提供される。その改変は、本明細書中に開示される改変を含む。特定の実施形態において、ＣＨ３ドメインに関してヒトにおいて免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でないが、重鎖が識別的に改変された二重特異性抗体は、以下の改変のうちの１つを含む（または、別の実施形態では、以下の改変のうちの１つから本質的になる）ＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４である：Ｈ９５ＲまたはＨ９５ＲおよびＹ９６Ｆ（ＩＭＧＴナンバリング）。
【００８３】
本二重特異性抗体は、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のアイソフォームに対する許容度が任意の著しい程度にまで壊されていないヒトに対して免疫原性でないかまたは実質的に免疫原性でないと予想される。
【００８４】
具体的には、ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｒｏｏｖｅ）は、Ｔ細胞レセプターの可変ループによって認識される主要な決定基を含む９ｍｅｒを収容するものであり、ペプチドの長さが９ｍｅｒに届かない任意の天然の配列である場合、免疫応答が誘発される可能性は低いとみられるので、ＦｃΔＡｄｐ改変は、免疫学的に「隠されている」と予想される。しかしながら、９ｍｅｒより長いペプチド（通常、約１３〜１７ｍｅｒ）は、ＭＨＣクラスＩＩによって結合され、突出したセグメントが潜在的に結合に影響し得る可能性がある。ゆえに、より長い非天然の配列を排除する追加の改変（ＦｃΔＡｄｐ改変に対して追加の改変）が、免疫原性に対する可能性をさらに低下させ得る。１つの特定の例は、最小の非天然のペプチドの長さを、ＩｇＧ１ΔＡｄｐでは１４残基から３９残基に伸ばし、および同じように定義されるＩｇＧ２ΔＡｄｐでは１４残基から４３残基に伸ばす、Ｖ４２２Ｉ（ＥＵ；ＩＭＧＴナンバリングではＶ８２Ｉ）の改変である。別の例は、ＩｇＧ４ΔＡｄｐにおいて１０残基から１４残基に上記長さを伸ばすＬ４４５Ｐ（ＥＵ；ＩＭＧＴナンバリングではＬ１０５Ｐ）の改変である。
【００８５】
薬物動態
プロテインＡに対する結合部位は、免疫グロブリンに長い血清半減期を与えるのに関与すると考えられている新生児ＦｃレセプターＦｃＲＮに対する結合部位と重複する。ゆえに、ヒトＩｇＧ３が、他のＩｇＧサブクラス（約２１日）よりも短い血清半減期を有する（約７日）ことを考えると、プロテインＡ結合部位の近傍の改変は、ここで提案される形式がＩｇＧ１、２および４よりも短い血清半減期を有し得る可能性を高める。Ｈｉｓ４３５に影響するいくつかのＦｃ変異体は、ＦｃＲＮに結合しないことおよびマウスにおいてより短い半減期を有することが示されている。しかしながら、薬物動態学的解析から、ＩｇＧ１ΔＡ／ＩｇＧ１ヘテロ二量体の血清半減期が、ＩｇＧ１ホモ二量体の血清半減期と大きく異ならないことが示されている（実施例２を参照のこと）。よって、ＩｇＧ１ΔＡｄｐ変異は、ＩｇＧ１の長い半減期をなおも保ちつつ、プロテインＡ結合性をなくすという利点を有する。
【００８６】
したがって、１つの実施形態において、本明細書中に記載されるようなＣＨ３ドメインの改変を含む二重特異性抗原結合タンパク質が提供され、ここで、その抗原結合タンパク質は、ＣＨ３ドメインに改変を有しない同じ二重特異性抗原結合タンパク質と等価な薬物動態学的プロファイルを示す。１つの実施形態において、ＩｇＧ１ΔＡ／ＩｇＧ１ヘテロ二量体のＦｃを含む二重特異性抗体が提供され、ここで、その二重特異性抗体は、その他の点は同一であるがＩｇＧ３  ＣＨ３ドメインを含むかまたはその他の点は同一であるが少なくとも１つのＩｇＧ３重鎖を含む二重特異性抗体よりも、約１．５倍、約２倍、約２．５倍または約３倍長い血清半減期を有する。１つの実施形態において、ＩｇＧ１ΔＡ／ＩｇＧ１ヘテロ二量体のＦｃを含む二重特異性抗体が提供され、ここで、その二重特異性抗体は、ＩｇＧ１ΔＡ改変を有しない二重特異性抗体（すなわち、ＩｇＧ１ホモ二量体二重特異性抗体）とほぼ同じ血清半減期を示す。
【００８７】
免疫グロブリン重鎖
所望の特徴（例えば、所望の特異性、所望の親和性、所望の機能性、例えば、遮断、非遮断、阻害、活性化など）を備えた二重特異性抗体を作製するために使用することができる免疫グロブリン重鎖可変領域は、当該分野で公知の任意の方法を用いて作製され得る。次いで、所望の重鎖は、本明細書中に記載される所望の重鎖定常領域を有する構築物内に可変領域を含む核酸配列をクローニングすることによって構築され得る。
【００８８】
１つの実施形態において、第１の重鎖は、第１の抗原で免疫された第１の動物の成熟Ｂ細胞のゲノムに由来する核酸によってコードされる可変領域を含み、その第１の重鎖は、第１の抗原を特異的に認識する。特定の実施形態において、第２の重鎖は、第２の抗原で免疫された第２の動物の成熟Ｂ細胞のゲノムに由来する核酸によってコードされる可変領域を含み、その第２の重鎖は、第２の抗原を特異的に認識する。
【００８９】
１つの実施形態において、第１の動物および／または第２の動物は、再配列されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含む遺伝子改変動物である。１つの実施形態において、第１の動物および／または第２の動物は、再配列されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を含む遺伝子改変動物である。１つの実施形態において、第１の動物および／または第２の動物は、再配列されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含む遺伝子改変マウスである。
【００９０】
免疫グロブリン重鎖可変領域配列は、当該分野で公知の他の任意の方法、例えば、ファージディスプレイによって得ることができ、それによって得られた配列を使用することにより、任意の適当な重鎖、例えば、本明細書中に記載されるようにＣＨ３ドメインが改変された重鎖をコードする核酸に連結され、発現構築物内に置かれ、そして例えば、適当な軽鎖の存在下において、重鎖を作製することができる細胞に運ばれる、核酸構築物が作製され得る。
【００９１】
免疫グロブリン軽鎖
２つの異なるエピトープ（または２つの異なる抗原）を認識する２つの重鎖を含む二重特異性抗体は、同じ軽鎖（すなわち、同一の可変ドメインおよび定常ドメインを有する軽鎖）と対形成し得る場合、より容易に単離される。重鎖可変ドメインの選択性および／またはその標的抗原との親和性を干渉せずにまたは実質的に干渉せずに、特異性が異なる２つの重鎖と対形成し得る軽鎖を作製するための種々の方法が当該分野で公知である。
【００９２】
あるアプローチにおいて、軽鎖は、すべての軽鎖可変ドメインに対する使用統計を調査し、ヒト抗体において最も頻繁に使用される軽鎖を特定し、その軽鎖を特異性が異なる２つの重鎖と対形成させることによって選択され得る。
【００９３】
別のアプローチでは、軽鎖は、ファージディスプレイライブラリー（例えば、ヒト軽鎖可変領域配列を含むファージディスプレイライブラリー、例えば、ヒトＳｃＦｖライブラリー）内の軽鎖配列を観察し、そのライブラリーから最もよく使用される軽鎖可変領域を選択することによって選択され得る。
【００９４】
別のアプローチでは、軽鎖は、プローブとして両方の重鎖の重鎖可変配列を用いて軽鎖可変配列のファージディスプレイライブラリーをアッセイすることによって選択され得る。両方の重鎖可変配列と会合する軽鎖は、それらの重鎖に対する軽鎖として選択され、両方のエピトープに対する結合および／または活性化を可能にする。
【００９５】
別のアプローチでは、軽鎖は、公知の軽鎖と所望の重鎖とを組み合わせ、得られた二重特異性抗体を、結合特異性、親和性および／または活性化能力についてアッセイすることによって選択され得る。
【００９６】
軽鎖を選択するための任意のアプローチにおいて困難に直面する（例えば、軽鎖が、一方もしくは両方の重鎖とその抗原との結合を干渉するか、または軽鎖が、一方もしくは両方の重鎖と十分に会合しない）程度まで、その軽鎖は、重鎖の同族の軽鎖と整列することができ、両方の重鎖の同族の軽鎖と共通の配列特徴とよりマッチするように軽鎖において改変が行われる。免疫原性の変更を最小にする必要がある場合、免疫原性の可能性を評価する（すなわち、インシリコならびにウェットアッセイ）ための当該分野で公知のパラメータおよび方法に基づいて、タンパク分解性プロセシングがＴ細胞エピトープを生成する可能性が低くなるように、改変は、好ましくは公知のヒト軽鎖配列に存在する配列をもたらす。
【００９７】
抗体および結合タンパク質
上記組成物および方法は、ヒト二重特異性抗体、すなわち、ヒト定常ドメインおよびヒト可変ドメインを含む二重特異性抗体を作製する際に特に有用である。いくつかの実施形態において、ヒト抗体には、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメイン、いくつかの実施形態では、体細胞変異したヒト免疫グロブリン配列（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を含む動物において産生されるヒト免疫グロブリン配列）に由来する重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインを有する抗体が含まれる。いくつかの実施形態において、ヒト可変領域および／またはヒト定常領域は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基、または例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、組換えおよび／もしくはスプライシングの結果としてコードされるアミノ酸残基を含み得る。ヒト抗体は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むと意図されない。それらの抗体は、ヒト化抗体またはキメラ抗体と呼ばれる。ヒト抗体には、例えば、ランダム突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発によってインビトロにおいて導入された変異を含む抗体が含まれるが、その変異は、好ましくは、ヒトにおいて免疫原性でない。
【００９８】
上記方法および組成物は、キメラ抗体、好ましくは、ヒトにおいて免疫原性でないかまたは低免疫原性のキメラ抗体を作製するために使用され得る。キメラ抗体は、重鎖可変領域またはフレームワークもしくはＣＤＲあるいは重鎖定常領域または重鎖定常ドメインのうちの１つが、異なる種（例えば、ヒトおよびマウス、またはヒトおよび霊長類）に由来する抗体である。いくつかの実施形態において、キメラ抗体には、非ヒト起源（例えば、マウス）の重鎖可変領域およびヒト起源の重鎖定常領域を有する抗体が含まれる。いくつかの実施形態において、キメラ抗体には、ヒト起源の重鎖可変領域および非ヒト（例えば、マウス）起源の重鎖定常領域を有する抗体が含まれる。様々な実施形態において、マウス起源の領域は、体細胞超変異を有するかまたは有しない、マウス免疫グロブリン生殖細胞系列の配列と同一であるかまたは実質的に同一である。キメラ抗体には、ヒト免疫グロブリン生殖細胞系列の配列と同一であるかまたは実質的に同一である軽鎖定常領域、および非ヒト（例えば、マウス）重鎖またはキメラヒト／非ヒト重鎖を有する抗体も含まれる。キメラ抗体には、非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリン生殖細胞系列の配列と同一であるかまたは実質的に同一である軽鎖定常ドメイン、およびヒトまたはキメラ非ヒト／ヒト重鎖を有する抗体が含まれる。
【００９９】
いくつかの実施形態において、上記組成物および方法は、親和性成熟抗体を作製するためのものである。いくつかの実施形態において、親和性成熟抗体は、変更を有しない実質的に同一の抗体と比べて、その標的抗原に対してより高い親和性（例えば、ナノモル濃度またはピコモル濃度の範囲のＫＤ）をもたらす１つ以上の変更を１つ以上のＣＤＲに含む。親和性成熟抗体は、当該分野で公知の任意の適当な方法によって、例えば、ＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域のランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発、その後の親和性スクリーニング、ＶＨドメインシャフリングなどによって、作製され得る。
【０１００】
いくつかの実施形態において、抗体は、中和抗体である。中和抗体には、抗原の生物学的活性を中和すること、阻害することまたは妨害することができる抗体が含まれる。中和抗体には、抗原に結合したときに、インビボおよびインビトロにおいて、その抗原の天然の標的に対してその抗原が作用することができる能力を妨害するかまたは減少させる抗体が含まれる。中和抗体の例としては、タンパク質リガンドが生物学的レセプターに結合するのを妨害する、そのレセプターのリガンドに対する抗体、または生物学的レセプターがそのリガンドに結合するのを妨害する、そのレセプターに対する抗体が挙げられ、ここで、その抗体の非存在下でのリガンドの結合によって、そのレセプターは細胞の内部に変化を起こす。抗体が中和抗体であるか否かの判定は、一般的に、抗原の生物学的活性に対する抗体の影響を測定する機能的アッセイの実施を必要とする。
【０１０１】
本発明の方法および組成物は、抗体および他の結合タンパク質に対する種々の用途でも有用である。いくつかの有用な用途の短い説明をここに提供する。
【０１０２】
細胞上の抗原、例えば、ＣＤ２０を標的にし、また、Ｔ細胞上の抗原、例えば、ＣＤ３を標的にする、腫瘍抗原およびＴ細胞抗原に対する結合特異性を備える二重特異性結合タンパク質が作製され得る。このように、その二重特異性抗体は、患者内の目的の細胞を標的にし（例えば、リンパ腫患者におけるＢ細胞、ＣＤ２０結合を介して）、かつその患者のＴ細胞を標的にする。その二重特異性抗体は、様々な実施形態において、ＣＤ３に結合したときにＴ細胞を活性化し、ゆえにＴ細胞活性化を特定の選択された腫瘍細胞に結合するように設計される。
【０１０３】
２つの結合部分を含み、その各々が同じ細胞の表面上の結合パートナーに対するものである（すなわち、各々が異なる標的に対するものである）二重特異性結合タンパク質も作製され得る。この設計は、同じ細胞の表面上に両方の標的を発現する特定の細胞または細胞型を標的にすることに特にふさわしい。標的は、他の細胞上に個別に現れ得るが、これらの結合タンパク質の結合部分は、各結合部分が、比較的低い親和性（例えば、低マイクロモル濃度または高ナノモル濃度、例えば、１００ナノモル濃度を越えるＫＤ、例えば、５００、６００、７００、８００ナノモル濃度）でその標的に結合するように選択される。このように、標的への長期にわたる結合は、２つの標的が同じ細胞上で近接して存在する状況においてのみ好ましい。
【０１０４】
同じ標的に結合する２つの結合部分（各々、同じ標的の異なるエピトープに結合する）を含む二重特異性結合タンパク質が作製され得る。この設計は、特に、結合タンパク質で標的を遮断するのを成功させる確率を最大にするのにふさわしい。複数の細胞外ループ、例えば、膜貫通チャネルまたは細胞表面レセプターの複数の細胞外ループが、同じ二重特異性結合分子によって標的にされ得る。
【０１０５】
クラスター化して免疫シグナル伝達の負の制御因子を活性化することにより免疫抑制をもたらす２つの結合部分を含む二重特異性結合タンパク質が作製され得る。シスでの抑制（Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｉｓ）は、標的が同じ細胞上に存在する場合に達成され得る；トランスでの抑制（ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓ）は、標的が異なる細胞上に存在する場合に達成され得る。シスでの抑制は、例えば、ＦｅｌＤ１に対する免疫応答をダウンレギュレートするために、抗ＩｇＧＲＩＩｂ結合部分および抗ＦｅｌＤ１結合部分を有する二重特異性結合タンパク質を用いて達成され得る（ＩｇＧＲＩＩｂは、ＦｅｌＤ１の存在下でのみクラスター化する）。トランスでの抑制は、例えば、抗ＢＴＬＡ結合部分、および目的の組織特異的抗原に特異的に結合する結合部分を有する二重特異性結合タンパク質を用いて達成され得（阻害性ＢＴＬＡ分子のクラスター化は、選択された標的組織だけで生じる）、これは、自己免疫疾患に対処できる可能性がある。
【０１０６】
多成分性のレセプターを活性化する二重特異性結合タンパク質が作製され得る。この設計では、レセプターの２成分に対する２つの結合部分が、そのレセプターに結合して、そのレセプターを架橋し、そのレセプターからのシグナル伝達を活性化する。これは、例えば、ＩＦＮＡＲ１に結合する結合部分およびＩＦＮＡＲ２に結合する結合部分を有する二重特異性結合タンパク質を用いて行われ得、ここで、結合によって、そのレセプターが架橋される。そのような二重特異性結合タンパク質は、インターフェロン処置に対する代替物を提供し得る。
【０１０７】
半透性障壁、例えば、血液脳関門を越えて結合部分を輸送する二重特異性結合タンパク質が作製され得る。この設計では、一方の結合部分は、特定の選択的な障壁を通過し得る標的に結合する；他方の結合部分は、治療活性を有する分子を標的にし、ここで、その治療活性を有する標的分子は、通常はその障壁を通過することができない。この種の二重特異性結合タンパク質は、治療薬が他の方法では到達しなかった組織にその治療薬を持って行くために有用である。いくつかの例としては、腸または肺に治療薬を輸送するためにｐＩＧＲレセプターを標的にすること、または血液脳関門を越えて治療薬を輸送するためにトランスフェリンレセプターを標的にすることが挙げられる。
【０１０８】
特定の細胞または細胞型に結合部分を輸送する二重特異性結合タンパク質が作製され得る。この設計では、一方の結合部分が、細胞内に容易に内部移行される細胞表面タンパク質（例えば、レセプター）を標的にする。他方の結合部分は、細胞内タンパク質を標的にし、ここで、その細胞内タンパク質の結合は、治療効果をもたらす。
【０１０９】
二重特異性結合タンパク質は、食作用性免疫細胞の表面レセプターおよび感染性病原体（例えば、酵母または細菌）の表面分子に結合することにより、その感染性病原体が食作用性免疫細胞の近くに来て、その病原体のファゴサイトーシスを促進する。そのような設計の例は、ＣＤ６４またはＣＤ８９分子および病原体を標的にする二重特異性抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｙ）であり得る。
【０１１０】
二重特異性結合タンパク質は、１つの結合部分として抗体可変領域および第２の結合部分として非Ｉｇ部分を有する。その抗体可変領域は、標的化を達成するのに対し、非Ｉｇ部分は、Ｆｃに連結されたエフェクターまたはトキシンである。このように、リガンド（例えば、エフェクターまたはトキシン）は、抗体可変領域に結合した標的に送達される。
【０１１１】
二重特異性結合タンパク質は、任意の２つのタンパク質部分が、Ｆｃの状況において互いに近くに置かれ得るように、２つの部分（各々が、Ｉｇ領域（例えば、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むＩｇ配列）に結合している）を有する。この設計の例としては、捕捉、例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体の捕捉分子が挙げられる。
【０１１２】
核酸
モノクローナル抗体をコードする核酸配列は、当該分野で公知の任意の適当な方法によって得ることができる。モノクローナル抗体（およびそれらの核酸配列）を得るための適当な方法の例としては、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７を参照のこと）またはファージ抗体ライブラリー（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８を参照のこと）による方法が挙げられる。
【０１１３】
様々な実施形態において、免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、遺伝子改変動物またはトランスジェニック動物の核酸配列から得られる。いくつかの実施形態において、それらの領域は、ヒト免疫グロブリンのミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）を含む動物から得られる。いくつかの実施形態において、それらの領域は、免疫グロブリン配列をコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上の染色体外核酸を含むマウスから得られる。様々な実施形態において、上記動物は、再配列されていない１つ以上のヒト免疫グロブリン核酸配列を有し得る。いくつかの実施形態において、上記動物は、ヒト軽鎖可変領域核酸配列を含み、いくつかの実施形態において、ヒト重鎖可変配列を含み、いくつかの実施形態において、重鎖可変配列と軽鎖可変配列の両方を含み、そしていくつかの実施形態において、ヒト定常領域配列をさらに含む。特定の実施形態において、上記核酸配列は、内在性のマウス重鎖可変遺伝子セグメントおよび軽鎖可変遺伝子セグメントがヒト重鎖可変遺伝子セグメントおよび軽鎖可変遺伝子セグメントで置き換えられているマウスから得られる。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、上記核酸配列は、そのような動物のナイーブＢ細胞またはナイーブＴ細胞から得られる。他の実施形態において、上記核酸配列は、目的の抗原で免疫された動物のＢ細胞またはＴ細胞から得られる。
【０１１５】
様々な実施形態において、上記核酸配列は、プライマー（例えば、１つ以上のＦＲ、連結配列または定常配列を含む縮重プライマーのセットが挙げられる）でその核酸配列を増幅することによって、細胞から得られる。
【０１１６】
様々な実施形態において、免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、目的の抗原で免疫された動物の核酸から得られる。例えば、非ヒトトランスジェニック動物または非ヒト遺伝子改変動物を、目的の抗原で免疫することにより（例えば、その動物を、その抗原またはその抗原を有する細胞またはその抗原の発現可能な形態をコードする核酸に曝露することにより）、その動物に免疫応答を起こさせ、その動物から免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）を単離し、必要に応じて、それらの細胞を不死化し、そしてそれらの細胞をスクリーニングすることにより、その抗原との反応性を特定し、ならびに／または抗体の状況で置かれたときその抗原を認識することができる免疫グロブリン可変領域をコードする核酸配列を同定し、そして／もしくは単離する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、Ｂ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫された動物のＢ細胞を用いることによりハイブリドーマを作製し、その抗原のエピトープを特異的に認識する抗体を発現するＢ細胞を特定し、そのエピトープを認識する可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸配列を特定し、そして／または単離する。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、上記核酸は、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーなどの類人猿）、サル（例えば、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）またはアカゲザル）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ロバ、ヤギ、ヒツジなどから得られる。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、重鎖は、ヒト細胞から得られる配列を含む。例えば、ヒト胎児細胞が、インビトロで抗原に曝露され、適当な宿主動物（例えば、ＳＣＩＤマウス）に入れられる。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、上記核酸は、ベクターを用いて細胞に導入される。ベクターとしては、例えば、プラスミド、コスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、植物ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームが挙げられる。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、上記核酸は、発現ベクターまたは発現構築物に存在する。いくつかの実施形態において、その発現ベクターまたは発現構築物は、目的の核酸配列が適当な細胞において適当な条件下で発現することができるように、その目的の核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターである。発現ベクターまたは発現構築物は、リーダー配列、エンハンサー、転写または翻訳を増強するプロモーターエレメント、転写停止配列、スプライシング配列、転写増強イントロン、ＩＲＥＳエレメント、マーカー遺伝子、選択配列、リコンビナーゼ認識部位、ホモロジーアーム（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｒｍ）、ウイルス配列、オペレーター（例えば、原核生物のオペレーター）などを含み得る。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、誘導可能な発現を可能にするエレメント、例えば、真核生物のプロモーターに作動可能に連結された原核生物のオペレーターを含む。いくつかの実施形態において、発現は、発現誘導因子を加えたときに誘導される。他の実施形態において、発現は、発現阻害剤を除去したときに誘導される。いくつかの実施形態において、発現は、温度変化によって誘導される。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、１つ以上の重鎖ヌクレオチド配列は、同じベクター上に存在する。いくつかの実施形態において、本明細書中の重鎖核酸配列および軽鎖核酸配列は、同じベクター上に存在する。１つの実施形態において、２つの重鎖核酸配列および１つの軽鎖核酸配列は、同じベクター上に存在する。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、核酸は、ウイルス由来の１つ以上の核酸を含む細胞内で発現される。特定の実施形態において、そのウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ−４０、エプスタイン・バーウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、コロナウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルスおよびワクシニアウイルスから選択される。
【０１２３】
宿主細胞は、目的の核酸を発現するように形質転換され得る細胞である。様々な実施形態において、形質転換は、細胞が外来性核酸（例えば、天然ではその細胞内に見られない核酸、または天然でその細胞内に見られる核酸配列に対応する１つ以上の追加のコピーの核酸）を含むように細胞の核酸含有量を変化させることを含む。細胞の核酸含有量は、当該分野で公知の任意の適当な方法によって、例えば、その核酸を細胞のゲノムにインテグレートすることによって、またはその核酸を染色体外もしくはゲノム外の形態で細胞内に入れることによって、変更され得る。いくつかの実施形態において、細胞の核酸含有量は、その細胞が目的の核酸を一過性に発現するように変更され得るか、または、核酸含有量は、その細胞が目的の核酸を安定的に発現するように変更され得る。いくつかの実施形態において、その細胞の遺伝子含有量の変更は、細胞が分裂するときに受け継がれる。
【０１２４】
二重特異性抗原結合タンパク質の単離
適当な改変のセットが、本明細書中の情報に基づいて選択されたら、当該分野で公知の方法を用いて二重特異性抗原結合タンパク質を単離する試みを行った。公開された方法を単に適用することによって、すべての場合において満足な分離が提供されるわけではなかった。
【０１２５】
Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒらは、プロテインＡに結合する１つの重鎖（マウスＩｇＧ）およびプロテインＡに結合しない１つの重鎖（ラットＩｇＧ）を有するヘテロ二量体の重鎖を有する二重特異性抗体を作製し、そのラット／マウスヘテロ二量体二重特異性抗体を溶出するために中性からｐＨ５．８までのｐＨ段階勾配、次いで、マウス／マウスホモ二量体を溶出するために５．８から３．５までのｐＨ段階を用いて、そのヘテロ二量体をマウス／マウスおよびラット／ラット二量体のクアドローマ混合物から分離することに成功した。（Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒら（１９９５）Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｈｅａｖｙ／ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｐａｉｒｉｎｇ  ｉｎ  ｒａｔ／ｍｏｕｓｅ  ｑｕａｄｒｏｍａｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１）：２１９−２２５を参照のこと）。
【０１２６】
上記のＬｉｎｄｈｏｆｅｒのアプローチは、ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのうちの一方がＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆジペプチド改変を含むという事実を別にすれば同一である２つのＩｇＧ１重鎖を有するＩｇＧ１ヘテロ二量体からＩｇＧ１ホモ二量体を分離することに適用したときは、失敗した。本発明者らは、直線のｐＨ勾配では、そのジペプチド改変されたＩｇＧ１がｐＨ約３．９で溶出されるのに対し、ＩｇＧ１ホモ二量体は、ｐＨ約３．７で溶出されることを見出した。このｐＨの差異では、Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ法を用いて上記ホモ二量体からヘテロ二量体を十分に分離するには不十分であると考えられた。この差異は、予測可能様式では再現性が無かった。
【０１２７】
特定のｐＨ段階またはｐＨ勾配を維持するために必要とされる緩衝液強度によって与えられる比較的実質的なイオン強度を使用するクロマトグラフィの実行において、クロマトグラフィ上の挙動の変動が観察された。しかし、有機修飾剤（ｏｒｇａｎｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（１−プロパノール）を加えることによって、十分な分離は達成されなかった。いくぶん驚いたことに、いくつかのクロマトグラフィの実行については、代わりに、０．５モル濃度〜１．０モル濃度のイオン調節物質（例えば、ＮａＣｌ）を加えることによって、ホモ二量体のＩｇＧ１およびヘテロ二量体のＩｇＧ１の分離が急激かつ予想外に改善された。イオン調節物質の添加によって、溶出に対するｐＨ範囲が広がり（イオン調節物質を用いたときは１．２ｐＨ単位だったが、イオン調節物質を用いないときは０．２ｐＨ単位だった）、ｐＨ段階勾配によって２種の分離に成功することができた。しかしながら、他の実行では、たった約１５０ｍＭのＮａＣｌ濃度を用いただけで、十分な分離が達成された（実施例４を参照のこと）。十分な分離が達成され得るのを確実にするために、１つの実施形態において、約０．５〜約１．０モル濃度のイオン調節物質の存在下で二重特異性抗原結合タンパク質の単離が行われる。
【０１２８】
したがって、１つの実施形態において、本明細書中に記載されるような改変を含む１つの鎖を有するヘテロ二量体のＩｇＧを含む二重特異性抗原結合タンパク質を分離するための方法は、イオン調節物質の存在下においてｐＨ勾配を使用する工程を包含する。１つの実施形態において、そのイオン調節物質は、プロテインＡ支持体からのＩｇＧホモ二量体の溶出と、本明細書中に記載されるような（すなわち、ＣＨ３改変を有する）ＩｇＧヘテロ二量体の溶出との間のｐＨの差を最大にするのに十分な濃度で存在する。特定の実施形態において、イオン調節物質は、約０．５〜約１．０モル濃度の濃度で存在する。別の特定の実施形態において、イオン調節物質は、約０．１５〜約０．５モル濃度の濃度で存在する。
【０１２９】
１つの実施形態において、イオン調節物質は、塩である。１つの実施形態において、イオン調節物質は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属およびハロゲンの塩である。特定の実施形態において、その塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩化物塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２である。特定の実施形態において、塩は、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０のモル濃度で存在する。
【０１３０】
１つの実施形態において、ｐＨ勾配は、ｐＨ約３．９〜ｐＨ約４．５、別の実施形態では、ｐＨ約４．０〜ｐＨ約４．４、別の実施形態では、ｐＨ約４．１〜ｐＨ約４．３である。特定の実施形態において、勾配は、直線勾配である。
【０１３１】
１つの実施形態において、ｐＨ勾配は、段階勾配である。１つの実施形態において、その方法は、ｐＨ約３．９、ｐＨ約４．０、ｐＨ約４．１、ｐＨ約４．２、ｐＨ約４．３またはｐＨ約４．４の段階を、平衡化されたプロテインＡカラム（例えば、ＰＢＳまたは別の適当な緩衝液もしくは液体で平衡化されたカラム）に適用する工程を包含する。特定の実施形態において、その段階は、ｐＨ約４．２である。
【０１３２】
１つの実施形態において、ヘテロ二量体のＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む二重特異性抗体は、非ヘテロ二量体のＩｇＧを実質的に含まない１つ以上の画分にプロテインＡ支持体から溶出する。特定の実施形態において、溶出された二重特異性抗体画分は、非ヘテロ二量体の抗体である全タンパク質の約１重量％未満、０．５重量％未満または０．１重量％未満を構成する。
【実施例】
【０１３３】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物を作製する方法および使用する方法を当業者に対して説明するために提案されるものであって、本発明者らが本発明者らの発明と考える範囲を限定する意図はない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関する精度を保証する努力がなされているが、いくらかの実験誤差および偏差が釈明されるだろう。別段示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧または大気圧付近である。
【０１３４】
実施例１：二重特異性ＩＬ−４Ｒａ／ＩＬ−６Ｒａ抗原結合タンパク質
ヒトＩｇＧ１アイソタイプの２つの公知抗体（１つは、ＩＬ−４Ｒａに対する抗体で、１つは、ＩＬ−６Ｒａに対する抗体）が、４つのアミノ酸だけが異なる軽鎖を有することが見出された。共発現実験から、抗ＩＬ−４Ｒａ抗体の軽鎖が、ＩＬ−６Ｒａ由来の軽鎖で置き換えられ得、ＩＬ−４Ｒａに対する高親和性結合をなおも維持し、ゆえに抗ＩＬ−４Ｒａ重鎖および抗ＩＬ−６Ｒａ重鎖ならびに同じ軽鎖を用いて二重特異性抗体を作製することが可能になることが明らかになった。したがって、ＩＬ−６Ｒａ抗体の重鎖をＦｃΔＡｄｐ型に改変した（すなわち、ＩＭＧＴエキソンナンバリングではＨ９５Ｒ／Ｙ９６ＦのＣＨ３ジペプチド改変）。
【０１３５】
次いで、抗ＩＬ−６Ｒａ軽鎖をＣＨＯ細胞において抗ＩＬ４Ｒａ／Ｆｃおよび抗ＩＬ６Ｒａ／ＦｃΔＡｄｐ重鎖と共発現させ、これらの細胞からのコンディションドメディウムをプロテインＡクロマトグラフィに供した。ホモ二量体とヘテロ二量体との混合物を含む細胞上清をプロテインＡカラムに充填した後、それぞれｐＨ６．０、ｐＨ４．２およびｐＨ３．０で３相となるように２つの緩衝液（Ａ：１００ｍＭクエン酸Ｎａ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ６．０およびＢ：１００ｍＭクエン酸Ｎａ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ３．０；図４を参照のこと）の組み合わせを変化させることによって作製されたｐＨ段階勾配を用いて溶出を行った。図４において、ＩＬ−４Ｒは、抗ＩＬ−４Ｒａを表し、ＩＬ−６ＲΔは、抗ＩＬ−６Ｒａ（ＩｇＧ１ΔＡｄｐ）を表す。示されているカラム画分を、ＩＬ−６ＲａおよびＩＬ−４Ｒａタンパク質への結合についてアッセイした（図５を参照のこと）。段階溶出を行ったところ、ｐＨ４．２で溶出する１つのピークおよびｐＨ３．０における第２のピークが生じた（図４）。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）解析から、予想のとおり、フロースルー材料は、可溶性ＩＬ−６Ｒａに結合することができたが、ＩＬ−４Ｒａには結合できなかったことが示された（図５）。ｐＨ４．２のピークに対応する画分は、ほぼ等量のＩＬ−６ＲａおよびＩＬ−４Ｒａに結合することができ、これは、ヘテロ二量体と矛盾しない。ｐＨ３．０で溶出するピークは、ＩＬ−４Ｒａにだけ結合することができ、ＩＬ−６Ｒａには結合できず、このことから、予想される抗ＩＬ−４Ｒａホモ二量体に対応する。このことから、ヘテロ二量体の二重特異性抗体が、単純なｐＨ段階勾配を伴うプロテインＡクロマトグラフィを使用して効率的に単離され得ることが立証された。
【０１３６】
実施例２：ＦｃΔＡｄｐタンパク質の薬物動態
ＦｃΔＡｄｐ改変が、ヘテロ二量体のＦｃ／ＦｃΔＡｄｐを含む分子の薬物動態に影響したか否かを試験するために、上に記載された抗ＩＬ−４Ｒａ／抗ＩＬ−６Ｒａの精製されたヘテロ二量体種をマウスに注射し、２８日間にわたって血清中のヒト免疫グロブリン濃度を測定した（図６；表１）。そのヘテロ二量体の血清半減期は、約１０日であり、これは、野生型の血清半減期と同様だった。このことから、ＦｃΔＡｄｐ改変は、血清半減期に検出可能な影響を及ぼさないことが立証された。
【０１３７】
【表１】
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実施例３：二重特異性ＣＤ２０／ＣＤ３抗原結合タンパク質
公知の抗ヒトＣＤ２０抗体の重鎖は、公知の（活性化する）抗ヒトＣＤ３抗体の軽鎖と共発現したときも、依然としてＣＤ２０に結合することができることが見出された。次いで、その抗ＣＤ３軽鎖を抗ＣＤ２０／Ｆｃ重鎖、抗ＣＤ３／ＦｃΔＡｄｐ重鎖または両方の重鎖と共発現させた。次いで、得られたホモ二量体およびヘテロ二量体の混合集団をバイオアッセイに使用して、ＣＤ２０を発現している標的細胞を殺滅する能力を測定した（図７）。簡潔には、２×１０７個のヒトＰＢＭＣ細胞を、６×１０７個のＣＤ３×ＣＤ２８ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で７２時間活性化した。次いで、３０単位のＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加え、その細胞をさらに２４時間インキュベートした。次いで、その細胞を０．５×１０６／ｍＬの濃度に分け、さらに３０ＵのＩＬ−２を加えた。次いで、その細胞をさらに４８時間インキュベートし、バイオアッセイに使用した。バイオアッセイの当日、ＣＤ２０を発現している２×１０６個／ｍＬの標的細胞（Ｒａｊｉ）を、８μＭのカルセイン−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３０分間標識した。洗浄した標的細胞を、活性化されたｈＰＢＭＣ細胞に、示されている量の抗体含有上清を含む総体積２００マイクロリットルにおいて標的：エフェクター細胞（１ウェルあたり合計２２０，０００個の細胞）１：１０の比で加えた。細胞を２時間インキュベートし、上清を回収し、蛍光を定量化した。特異的な蛍光と最大蛍光との比を計算することによって、細胞傷害性を測定した。ＣＤ２０抗体単独（抗ＣＤ３軽鎖を用いた）と抗ＣＤ３抗体の両方が、標的細胞の殺滅を誘発できなかった；それら２つの試薬を混合したときでさえ、効果がなかった。しかしながら、３つすべての構成要素を共発現させると、有意な殺滅が観察されたことから、その効果はヘテロ二量体の二重特異性種に起因したことが示唆される。一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の上清中の二重特異性抗体の推定量に基づいて、この効果に対するＥＣ５０が、約１５ｐＭであると推定された。
【０１３８】
実施例４：精製された二重特異性ＣＤ２０／ＣＤ３抗原結合タンパク質を用いた細胞殺滅特異性
実施例３に記載されたようなトランスフェクションからのＣＨＯ細胞上清を、溶出のために段階勾配を利用するプロテインＡアフィニティークロマトグラフィに供した。その段階勾配は、それぞれｐＨ５．２、ｐＨ４．２およびｐＨ２．８で３相となるように２つの緩衝液（Ａ：２０ｍＭクエン酸Ｎａ、１Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ５．２；Ｂ：２０ｍＭクエン酸Ｎａ、１Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ２．７）の組み合わせを変化させることによって作製された。次いで、ｐＨ４．２で溶出するピークからのタンパク質を、実施例３に記載されたような細胞死滅アッセイにおいて使用した。３ｐＭというＥＣ５０で標的細胞の殺滅が観察された（図８）。観察された殺滅の標的特異性を調べる追加の細胞傷害性アッセイを行った。この実験では、ＣＤ２０を発現する標識された標的細胞（Ｒａｊｉ）またはＣＤ２０を有しない標識された標的細胞（２９３）を、活性化されたヒトＰＢＭＣとともにインキュベートした。各標的細胞型をそのアッセイに単独でまたは他のタイプの未標識の標的細胞と組み合わせて加えた。すべての場合において、ＣＤ２０を発現している標的細胞は、３ｐＭというＥＣ５０で特異的に殺滅されたが、ＣＤ２０陰性細胞株は、殺滅されなかった。
【０１３９】
実施例５：識別的に改変されたｈＩｇＧ２  ＦｃのプロテインＡ分離
識別的に改変されたヘテロ二量体のヒトＩｇＧ２  Ｆｃ／ΔＡｄｐＦｃおよび改変されていないヒトホモ二量体のＩｇＧ２  Ｆｃ／Ｆｃを、まず、プロテインＡカラム（ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＦＦ，ＧＥ）に通す結合・洗浄（ｂｉｎｄ−ａｎｄ−ｗａｓｈ）プロセスによって濃縮した。ｈＩｇＧ２  Ｆｃ／ＦｃからｈＩｇＧ２  Ｆｃ／ΔＡｄｐＦｃをさらに分離するために、以下のとおり、ＳＭＡＲＴ（商標）システム（ＧＥ）を使用して段階勾配溶出を行った。この溶媒系は、溶媒Ａ（ＰＢＳ，１×）、溶媒Ｂ（２０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび１Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ５．５）および溶媒Ｃ（２０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび１Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ２．５）からなるものだった。溶出を、最初の２０分間の１００％Ａによるアイソクラティック溶出から開始し、続いて、２０分後に素早く１００％Ｂに切り換えた。次いで、次の１０分間にわたって、３３．５％Ｃおよび６６．５％Ｂに向かって直線勾配を開始した；第１のピーク（Ｆｃ／ΔＡｄｐＦｃ）が完全に溶出するまで、Ｃの濃度を２０分間３３．５％に維持した。続いて、３３．５％Ｃから１００％Ｃへの直線勾配を３０分間行った。流速を２５０マイクロリットル／分に維持し、ＵＶ検出器によって２８０ｎｍでクロマトグラムを検出した。ｈＩｇＧ２  Ｆｃ／ΔＡｄｐＦｃは、ｐＨ４．５で溶出し、一方、ｈＩｇＧ２は、ｐＨ３．５で溶出した。
【０１４０】
実施例６：識別的に改変されたｈＩｇＧ４  ＦｃのプロテインＡ分離
識別的に改変されたヘテロ二量体のヒトＩｇＧ４（Ｆｃ／ΔＡｄｐＦｃ）および改変されていないホモ二量体のＩｇＧ４（Ｆｃ／Ｆｃ）をまず、プロテインＡカラム（ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＦＦ，ＧＥ）に通す結合・洗浄プロセスによって濃縮した。ｈＩｇＧ４  Ｆｃ／ＦｃからｈＩｇＧ４  Ｆｃ／ΔＡｄｐＦｃをさらに分離するために、以下のとおり、ＳＭＡＲＴ（商標）システム（ＧＥ）を使用して段階勾配溶出を行った。この溶媒系は、溶媒Ａ（ＰＢＳ，１×）、溶媒Ｂ（２０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび１Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ５．１）および溶媒Ｃ（２０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび１Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ２．８）からなるものだった。溶出を、最初の２０分間の１００％Ａによるアイソクラティック溶出から開始し、続いて、２０分後に素早く１００％Ｂに切り換えた。次いで、次の１０分間にわたって、５０％Ｃおよび５０％Ｂに向かって直線勾配を開始した；第１のピーク（Ｆｃ／ΔＡｄｐＦｃ）が完全に溶出するまで、Ｃの濃度を２０分間５０％に維持した。続いて、５０％Ｃから１００％Ｃへの直線勾配を３０分間行った。流速を２５０マイクロリットル／分に維持し、ＵＶ検出器によって２８０ｎｍでクロマトグラムを検出した。ｈＩｇＧ４  Ｆｃ／ΔｄｐＦｃは、ｐＨ約４で溶出し、一方、ホモ二量体は、ｐＨ約４からｐＨ２．８までの勾配中に溶出した。
【０１４１】
実施例７；識別的に改変されたｈＩｇＧ１  ＣＤ３×ＣＤ２０のプロテインＡ分離
識別的に改変されたヘテロ二量体の抗ｈＣＤ３×ＣＤ２０  ＩｇＧ１（Ｆｃ／ΔＡｄｐＦｃ）および改変されていないホモ二量体の抗ｈＣＤ２０を、以下のとおり、１ｍＬのｒＰｒｏｔｅｉｎ  ＡＦＦ（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムにおいて分離した。この溶媒系は、緩衝液Ａ１（ＰＢＳ  １×）、緩衝液Ａ２（２０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ５．１）、緩衝液Ｂ（２０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび１Ｍ
ＮａＣｌ  ｐＨ２．８）だった。混合サンプルを結合させ、ＰＢＳおよび緩衝液Ａ２で洗浄した。段階を用いてｐＨ４．２に達したところ、それにより、二重特異性ＣＤ３＊×ＣＤ２０  ＩｇＧ１（Ｆｃ／ΔＡｄｐＦｃ）が溶出し、次いで、ｐＨ４．２からｐＨ２．８までの直線勾配により、ホモ二量体の抗ｈＣＤ２０  ＩｇＧ１が溶出した。
【０１４２】
実施例８：改変されたＣＨ３のＦｃレセプターに対する結合親和性
ΔＡｄｐ改変（Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ，ＥＵナンバリング）を有するヒトＩｇＧ１アイソタイプ二重特異性抗体の種々のヒトＦｃレセプターに対する結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）定常状態平衡結合アッセイにおいて試験した。
【０１４３】
簡潔には、アミンに結合した抗ペンタ−ｈｉｓ  ｍＡｂ（Ｑｉａｇｅｎ）を有するカルボキシメチル化デキストラン（ＣＭ５）チップを使用して、ヒトＦｃレセプターの様々な構築物を捕捉した。以下のｈｉｓタグ化Ｆｃレセプター外部ドメインを、抗ペンタ−ｈｉｓでコーティングされた種々のＣＭ５チップの表面に結合させた：ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ１３１多形）、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＩＢ（各々、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した）；およびＲｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１多形）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１７６多形）およびＲｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１７６多形）（各々、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎにて製造されたもの）。高親和性レセプターＦｃγＲＩ外部ドメインについては３つの濃度（２５ｎＭ、５０ｎＭおよび１００ｎＭ）で、および低親和性ＦｃγＲレセプター外部ドメインについては５マイクロモル濃度〜３９ナノモル濃度で抗体を上記表面の上に通過させ、会合速度定数および解離速度定数（ｋａおよびｋｄ）の値を測定し、それを用いてそれらの抗体に対する平衡解離定数（ＫＤ）を算出した。ｐＨ７．２のＨＢＳ−Ｔ緩衝液を使用して、室温にて結合研究を行った。コントロール抗体（ｈｍＡｂ）、抗ＣＤ２０および抗ＣＤ３Δｄｐ改変ならびにＣＤ２０×ＣＤ３Δｄｐ二重特異性抗体に対するＫＤを測定した。抗ＣＤ３Δｄｐ抗体に対するＫＤ値は、改変されていないｈＩｇＧ１アイソタイプ抗体と比べて、試験されたいずれのＦｃレセプターに対する結合についても有意差を明らかにしなかった（表２）。
【０１４４】
【表２】
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実施例９：ｈＦｃＲｎマウスにおける二重特異性ｈＩｇＧ１ΔＡｄｐの薬物動態
二重特異性抗ｈＣＤ３／ｈＣＤ２０  ＩｇＧ１ΔＡｄｐ抗体およびその抗体に関するコントロール（抗ｈＣＤ３  ＩｇＧおよび抗ｈＣＤ３  ＩｇＧΔＡｄｐホモ二量体）の薬物動態学的クリアランス速度を、野生型（ＷＴ）マウスおよびｈＦｃＲｎ遺伝子によるマウスＦｃＲｎの置き換えについてホモ接合性のマウス（ｈＦｃＲｎマウス）において測定した。野生型マウスおよびｈＦｃＲｎマウスは、Ｃ５７ＢＬ６（７５％）および１２９Ｓｖ（２５％）を含むバックグラウンドの交雑系統由来のものだった。ＩｇＧ１アイソタイプマッチコントロール抗体を投与されるＷＴマウスの１つのコホートの場合（このコホートは３匹のマウスを含んだ）を除いて、コホートは、ＷＴマウスまたはｈＦｃＲｎマウスの各々を４匹含んだ。１ｍｇ／ｋｇのアイソタイプマッチ（ｈＩｇＧ１）コントロール、抗ｈＣＤ３×ＣＤ２０ＩｇＧ１ΔＡｄｐ二重特異性、抗ｈＣＤ３ＩｇＧ１または抗ｈＣＤ３ＩｇＧ１ΔＡｄｐホモ二量体をマウスに投与した。すべての被験物質を皮下に投与した。血液（Ｂｌｅｅｄｓ）を０時間、６時間、１日、２日、３日、４日、７日、１０日、１４日、２１日および３０日の時点で回収した。
【０１４５】
ヒト抗体の血清レベルをサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。簡潔には、ヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、１マイクログラム／ｍＬの濃度で９６ウェルプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。そのプレートをＢＳＡでブロッキングした後、６点段階希釈物中の血清サンプルおよび１２点段階希釈物中のそれぞれの抗体の対照基準を、そのプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄して未結合の抗体を除去した後、捕捉されたヒト抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で結合体化された同じヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出し、製造者の推奨に従って、標準的な比色テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質によって発色させた。４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーにて記録し、そのサンプルプレートにおいて作成された基準検量線を用いて、血清サンプル中のｈＩｇＧの濃度を算出した。
【０１４６】
試験された３０日間にわたる４つのＩｇＧ１抗体の血清半減期に有意差は観察されなかった。特に、ΔＡｄｐ改変を有するＩｇＧ１抗体と野生型ＩｇＧ１抗体との間に有意差は観察されなかった。野生型（ｍＦｃＲｎ）マウスまたはヒト化ＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ）を有するマウスを用いたとき、それらの抗体の間に差は観察されなかった。予想の通り、ｈＦｃＲｎマウスは、野生型マウスよりもわずかに速いクリアランスを示した。結果を表３に示す。
【０１４７】
【表３】
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実施例１０：低塩緩衝液における大量単離
二重特異性ＣＤ３×ＣＤ２０ΔＡｄｐ抗体を、本発明に従って大量培養物から単離した。簡潔には、二重特異性抗ｈＣＤ３×ＣＤ２０ΔＡｄｐ（ＣＤ３重鎖に改変）抗体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞株を１１リットルのバイオリアクターにおいて培養した。二重特異性抗体を産出する細胞は、約８．２５×１０６細胞／ｍＬの密度まで成長し、約２５０〜３５０ｍｇ抗体／Ｌが得られた。対照的に、コントロール抗ｈＣＤ３抗体は、約１００〜１５０ｍｇ／Ｌで得られた。
【０１４８】
１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２で平衡化されたＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）樹脂（ＧＥ）（床の高さ２０ｃｍ，内径１ｃｍ）において抗体を単離し、浄化された細胞培養物を１９ｇ／Ｌで充填し、そのカラムを３カラム体積の１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２で洗浄した後、２カラム体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．２（ＮａＣｌなし）で洗浄した。４０ｍＭ酢酸塩，ｐＨ３．０で抗体を溶出した。
【０１４９】
単一特異的な抗ＣＤ３０抗体は、ｐＨ３．６で溶出し、一方、二重特異性抗ｈＣＤ３×ＣＤ２０ＤＡｄｐは、ｐＨ４．４で溶出した。
【０１５０】
実施例１１：中性付近ｐＨによるマウスヘテロ二量体の選択的プロテインＡ溶出
野生型または変異体（ＴＴＴＫまたはＰＴＴＫ）ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃと融合された、ヒトＩＦＮＡＲ１（ｈＩＦＮＡＲ１）およびヒトＩＦＮＡＲ２（ｈＩＦＮＡＲ２）細胞外ドメインに対する発現構築物でＣＨＯ−Ｋ１細胞を一過性にトランスフェクトした。等量の２つの発現プラスミドで細胞をトランスフェクトすることによって、ｈＩＦＮＡＲ１−ｍＦｃとｈＩＦＮＡＲ２−ｍＦｃとの比を１：１に保った。トランスフェクションの４日後に培養液を回収し、それを、０．２ｍＬのＮＡｂ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｐｌｕｓ（商標）スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｉｅｒｃｅ）を使用するプロテインＡ精製に供した。簡潔には、カラムを１×ＰＢＳ，ｐＨ７．２で平衡化した。１ｍｌのＣＨＯ−Ｋ１培養液を、室温で１０分間、プロテインＡ樹脂とともにインキュベートした。次いで、そのカラムを１×ＰＢＳ，ｐＨ７．２で３回洗浄した。結合したタンパク質を、１Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を用いて溶出した。ｐＨを下げながら０．４ｍＬの溶出緩衝液を使用して、溶出を３回行った。異なる画分中のタンパク質を、ウエスタンブロット解析によって検出した。
【０１５１】
結果から、ｐＨ勾配溶出を用いたとき、野生型ｍＩｇＧ２ａのホモ二量体から野生型およびｓｔａｒ変異体ｍＩｇＧ２ａのヘテロ二量体を分離することが可能であることが示される（図９の両方のゲルにおける画分Ｅ１を参照のこと）。
【０１５２】
実施例１２；アイソタイプヘテロ二量体に対するｍＩｇＧ２ａ変異体の優先的なヘテロ二量体形成
Ｃ末端のマウスＦｃ（ｍＩｇＧ２ａまたはｍＩｇＧ１）を有するヒトＩ型インターフェロンレセプター（ｈＩＦＮＡＲ１およびｈＩＦＮＡＲ２）の細胞外ドメインの哺乳動物発現用のＤＮＡプラスミドを構築した。部位特異的突然変異誘発を用いて、ｍＩｇＧ２ａ配列内に変異を導入した。これらの変異体は、ＴＴＴ＝Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ；ＴＴＴＫ＝Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ、Ｉ２５８Ｋ；ＰＴＴＴＫ＝Ｉ２４７Ｐ、Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ、Ｉ２５８Ｋ；ＲＦ＝Ｈ４３５Ｒ、Ｈ４３６Ｆである。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、上記発現構築物で一過性にトランスフェクトした。ｈＩＦＮＡＲ２−ｍＦｃ（ｍＩｇＧ１または変異体ｍＩｇＧ２ａ）よりも４倍多いｈＩＦＮＡＲ１−ｍＦｃ発現プラスミド（ｈＩＦＮＡＲ１−ｍＩｇＧ２ａ）で細胞をトランスフェクトすることによって、ＩＦＮＡＲ１−ｍＦｃとＩＦＮＡＲ２−ｍＦｃとの比を４：１に保った。トランスフェクションの４日後に培養液を回収し、ｍＦｃタンパク質をウエスタンブロット解析によって検出した。
【０１５３】
結果から、ｍＩｇＧ２ａとｍＩｇＧ１とのヘテロ二量体の形成が、野生型ｍＩｇＧ２ａとｍＩｇＧ２ａ変異体とのヘテロ二量体の形成よりもかなり効率的でないことが示される（図１０のレーン１とレーン２〜５とを比較のこと）。この実験では、４：１の比のＩＦＮＡＲ１構築物：ＩＦＮＡＲ２構築物を使用することにより、過剰な野生型ＩｇＧ２ａ構築物を維持した。
【図１】
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【図２】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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