(57)【要約】【課題】親水性溶媒中で蛍光強度が疎水性溶媒中の蛍光強度と比べて低下する蛍光粒子に対して、親水性溶媒に分散させても高い蛍光強度を維持でき、かつその高い蛍光強度を長期間維持できる、蛍光粒子を提供する。【解決手段】ストークスシフトの大きい蛍光色素をシリカ粒子内部に含有するストークスシフトの大きい蛍光粒子であって、前記蛍光粒子内部に疎水性溶媒を含む、蛍光粒子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストークスシフトの大きい蛍光色素をシリカ粒子内部に含有するストークスシフトの大きい蛍光粒子であって、前記蛍光粒子内部に疎水性溶媒を含む、蛍光粒子。
【請求項２】
紫外線を吸収して可視光領域側の蛍光を発する、請求項１に記載の蛍光色素。
【請求項３】
前記蛍光色素の発色団が含窒素複素芳香族化合物である有機色素の残基であり、かつ、前記蛍光粒子中の蛍光色素の発光要素として機能する、請求項１又は２に記載の蛍光粒子。
【請求項４】
前記蛍光色素の発色団が、下記一般式（１）又は（２）で表される化合物の残基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光粒子。
2018145315.tif 000011
（前記環Ａは、芳香族環又は複素芳香族環を示す。Ｘはイミノ基（ＮＲＡ）、アルケニル基（炭素原子数２〜１２のアルケニル基が好ましく、炭素原子数２〜６のアルケニル基がより好ましい）、アリール基（炭素原子数６〜２２が好ましく、炭素原子数６〜１４がより好ましく、炭素原子数６〜１０がさらに好ましい）、アラルキル基（炭素原子数７〜２３が好ましく、炭素原子数７〜１５がより好ましく、炭素原子数７〜１１がさらに好ましい）、酸素原子、硫黄原子、セレン原子、又はＢＲＡを示し、ＲＡは水素原子又は置換基を示す。ＲＮ及びＲＣはそれぞれ独立に、水素原子又は置換基を示す。）
【請求項５】
前記疎水性溶媒の水の溶解度が０．２５ｇ／Ｌ以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光粒子。
【請求項６】
前記疎水性溶媒の水の溶解度が０．０１ｇ／Ｌ以下である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光粒子。
【請求項７】
ストークスシフトの大きい蛍光色素をシリカ粒子内部に含有し、粒子内部に疎水性溶媒を含む、ストークスシフトの大きい蛍光粒子、及び
生体分子検出用のイムノクロマトグラフィー用試験片、
からなる、生体分子検出用試験キット。
【請求項８】
ストークスシフトの大きい蛍光色素をシリカ粒子内部に含有し、粒子内部に疎水性溶媒を含む、ストークスシフトの大きい蛍光粒子を含浸させた、生体分子検出用のイムノクロマトグラフィー用試験片。
【請求項９】
紫外線を吸収して可視光領域側の蛍光を発する、請求項７又は８に記載の生体分子検出用試験キット又は生体分子検出用のイムノクロマトグラフィー用試験片。
【請求項１０】
前記蛍光色素の発色団が含窒素複素芳香族化合物である有機色素の残基であり、かつ、前記蛍光粒子中の蛍光色素の発光要素として機能する、請求項７〜９のいずれか１項に記載の生体分子検出用試験キット又は生体分子検出用のイムノクロマトグラフィー用試験片。
【請求項１１】
前記蛍光色素の発色団が、下記一般式（１）又は（２）で表される化合物の残基である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の生体分子検出用試験キット又は生体分子検出用のイムノクロマトグラフィー用試験片。
2018145315.tif 000012
（前記環Ａは、芳香族環又は複素芳香族環を示す。Ｘはイミノ基（ＮＲＡ）、アルケニル基（炭素原子数２〜１２のアルケニル基が好ましく、炭素原子数２〜６のアルケニル基がより好ましい）、アリール基（炭素原子数６〜２２が好ましく、炭素原子数６〜１４がより好ましく、炭素原子数６〜１０がさらに好ましい）、アラルキル基（炭素原子数７〜２３が好ましく、炭素原子数７〜１５がより好ましく、炭素原子数７〜１１がさらに好ましい）、酸素原子、硫黄原子、セレン原子、又はＢＲＡを示し、ＲＡは水素原子又は置換基を示す。ＲＮ及びＲＣはそれぞれ独立に、水素原子又は置換基を示す。）
【請求項１２】
前記疎水性溶媒の水の溶解度が０．２５ｇ／Ｌ以下である、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の生体分子検出用試験キット又は生体分子検出用のイムノクロマトグラフィー用試験片。
【請求項１３】
前記疎水性溶媒の水の溶解度が０．０１ｇ／Ｌ以下である、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の生体分子検出用試験キット又は生体分子検出用のイムノクロマトグラフィー用試験片。
【請求項１４】
ストークスシフトの大きい蛍光色素をシリカ粒子内部に含有し、粒子内部に疎水性溶媒を含む、ストークスシフトの大きい蛍光粒子を用いる、生体分子の検出方法。
【請求項１５】
前記蛍光色素の発色団が含窒素複素芳香族化合物である有機色素の残基であり、かつ、前記蛍光粒子中の蛍光色素の発光要素として機能する、請求項１４に記載の生体分子の検出方法。
【請求項１６】
前記蛍光色素の発色団が、下記一般式（１）又は（２）で表される化合物の残基である、請求項１４又は１５に記載の生体分子の検出方法。
2018145315.tif 000013
（前記環Ａは、芳香族環又は複素芳香族環を示す。Ｘはイミノ基（ＮＲＡ）、アルケニル基（炭素原子数２〜１２のアルケニル基が好ましく、炭素原子数２〜６のアルケニル基がより好ましい）、アリール基（炭素原子数６〜２２が好ましく、炭素原子数６〜１４がより好ましく、炭素原子数６〜１０がさらに好ましい）、アラルキル基（炭素原子数７〜２３が好ましく、炭素原子数７〜１５がより好ましく、炭素原子数７〜１１がさらに好ましい）、酸素原子、硫黄原子、セレン原子、又はＢＲＡを示し、ＲＡは水素原子又は置換基を示す。ＲＮ及びＲＣはそれぞれ独立に、水素原子又は置換基を示す。）
【請求項１７】
前記疎水性溶媒の水の溶解度が０．２５ｇ／Ｌ以下である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
【請求項１８】
前記疎水性溶媒の水の溶解度が０．０１ｇ／Ｌ以下である、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
【請求項１９】
ストークスシフトの大きい蛍光色素をシリカ粒子内部に含有するストークスシフトの大きい蛍光粒子を作製し、
疎水性溶媒で溶媒置換し、前記蛍光粒子内部に疎水性溶媒を含有させる、
ストークスシフトの大きい蛍光粒子の作製方法。
【請求項２０】
前記蛍光色素の発色団が含窒素複素芳香族化合物である有機色素の残基であり、かつ、前記蛍光粒子中の蛍光色素の発光要素として機能する、請求項１９に記載の蛍光粒子の作製方法。
【請求項２１】
前記蛍光色素の発色団が、下記一般式（１）又は（２）で表される化合物の残基である、請求項１９又は２０に記載の蛍光粒子の作製方法。
2018145315.tif 000014
（前記環Ａは、芳香族環又は複素芳香族環を示す。Ｘはイミノ基（ＮＲＡ）、アルケニル基（炭素原子数２〜１２のアルケニル基が好ましく、炭素原子数２〜６のアルケニル基がより好ましい）、アリール基（炭素原子数６〜２２が好ましく、炭素原子数６〜１４がより好ましく、炭素原子数６〜１０がさらに好ましい）、アラルキル基（炭素原子数７〜２３が好ましく、炭素原子数７〜１５がより好ましく、炭素原子数７〜１１がさらに好ましい）、酸素原子、硫黄原子、セレン原子、又はＢＲＡを示し、ＲＡは水素原子又は置換基を示す。ＲＮ及びＲＣはそれぞれ独立に、水素原子又は置換基を示す。）
【請求項２２】
前記疎水性溶媒の水の溶解度が０．２５ｇ／Ｌ以下である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の蛍光粒子の作製方法。
【請求項２３】
前記疎水性溶媒の水の溶解度が０．０１ｇ／Ｌ以下である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の蛍光粒子の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストークスシフトの大きい蛍光色素、生体分子検出用試験キット若しくは生体分子検出用のイムノクロマトグラフィー用試験片、生体分子の検出方法、並びにストークスシフトの大きい蛍光粒子の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イムノアッセイやフローサイトメトリーなど、バイオテクノロジーの医療診断、臨床検査、生化学分析などへの応用は益々進んでいる。
例えば、イムノクロマトグラフィーは、被検物質を捕捉した標識試薬粒子が発色することによって、発色の有無を判定する免疫測定法である。イムノクロマトグラフィーではまず、被検物質が標識試薬粒子に捕捉される。被検物質を捕捉した標識試薬粒子が、メンブレンで構成される支持体中を、毛細管現象により移動する。さらに、支持体にライン状に固定化された捕捉物質と、被検物質とが接触し、捕捉物質が固定化されたライン上で被検物質が捕捉され次第に濃縮される。その結果、捕捉物質が固定化されたラインが標識試薬粒子により強く発色する。これによって、被検物質の有無を精度良く判定することができる。
フローサイトメトリーにおいては、検出器に微細なノズルを設け、ここを通過する各標識試薬粒子の属性を蛍光発光により検出する。
【０００３】
ところで、上記のような臨床検査等に適用できる標識に用いられる色素として、各種色素が提案されている（特許文献１〜４参照）。
このうちストークスシフトの大きい蛍光色素は通常、３００〜４００ｎｍの波長の励起光を受け、より長波長の蛍光を発光する。励起光の波長と蛍光波長との差は大きいもので１００ｎｍ以上におよぶ。励起光の波長と蛍光波長との差が小さい場合、励起波長と重なり合う波長領域のみを透過させ、蛍光を取り出すための高価な光フィルタを発光検出装置に設ける必要がある。しかし、ストークスシフトの大きい蛍光色素を用いた場合、このような光学フィルタを設ける必要がない。また、ストークスシフトの大きい蛍光色素に照射する、励起光となる紫外線は目に見えないため、目視検査において障害になりにくい。
このように、発光検出装置のフィルタが不要な生体分子の検出方法は、検出キットのコンパクト化や低コスト化の観点から、ストークスシフトの大きい蛍光色素の使用が好ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１６−１４０９６号公報
【特許文献２】特開２０１３−２００３１６号公報
【特許文献３】国際公開第２００７／０１３６０１号
【特許文献４】国際公開第２０１１／００２７０４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一般的に生化学反応は、基本的に水溶液中で進行する。そのため前述の標識粒子は、水溶媒中で高輝度の粒子が好ましい。
その一方、ストークスシフトの大きい蛍光色素のうち、特定構造の色素において、有機溶媒中では高輝度であるが、親水性溶媒中では輝度が低下する粒子が存在する。この場合、有機溶媒を用いて生体分子を検出すると、抗体や酵素の活性が低下し、反応が進行しにくくなってしまう。
【０００６】
そこで本発明は、親水性溶媒中での蛍光強度が疎水性溶媒中での蛍光強度と比べて低下する蛍光粒子に対して、親水性溶媒に分散させても高い蛍光強度を維持でき、かつその高い蛍光強度を長期間維持できる、紫外励起蛍光粒子の提供を課題とする。
また本発明は、前記粒子の作製方法の提供を課題とする。
さらに本発明は、高感度及び高精度での生体分子の検出を実現できる、生体分子検出用試験キット若しくは生体分子検出用のイムノクロマトグラフィー用試験片、並びに生体分子の検出方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、常法により作製した蛍光色素含有標識試薬シリカ粒子に対して、疎水性溶媒を用いた溶媒置換を行うことで、親水性溶媒に分散させても高い蛍光強度を維持でき、かつその高い蛍光強度を長期間維持できる、ストークスシフトの大きい蛍光粒子が得られることを見出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
【０００８】
本発明の上記課題は、下記の手段により解決された。
（１）ストークスシフトの大きい蛍光色素をシリカ粒子内部に含有するストークスシフトの大きい蛍光粒子であって、前記蛍光粒子内部に疎水性溶媒を含む、蛍光粒子。
（２）紫外線を吸収して可視光領域側の蛍光を発する、前記（１）項に記載の蛍光色素。
（３）前記蛍光色素の発色団が含窒素複素芳香族化合物である有機色素の残基であり、かつ、前記蛍光粒子中の蛍光色素の発光要素として機能する、前記（１）又は（２）項に記載の蛍光粒子。
（４）前記蛍光色素の発色団が、下記一般式（１）又は（２）で表される化合物の残基である、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の蛍光粒子。
【０００９】
【化１】
2018145315.tif 000002
【００１０】
（前記環Ａは、芳香族環又は複素芳香族環を示す。Ｘはイミノ基（ＮＲＡ）、アルケニル基（炭素原子数２〜１２のアルケニル基が好ましく、炭素原子数２〜６のアルケニル基がより好ましい）、アリール基（炭素原子数６〜２２が好ましく、炭素原子数６〜１４がより好ましく、炭素原子数６〜１０がさらに好ましい）、アラルキル基（炭素原子数７〜２３が好ましく、炭素原子数７〜１５がより好ましく、炭素原子数７〜１１がさらに好ましい）、酸素原子、硫黄原子、セレン原子、又はＢＲＡを示し、ＲＡは水素原子又は置換基を示す。ＲＮ及びＲＣはそれぞれ独立に、水素原子又は置換基を示す。）
【００１１】
（５）前記疎水性溶媒の水の溶解度が０．２５ｇ／Ｌ以下である、前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の蛍光粒子。
（６）前記疎水性溶媒の水の溶解度が０．０１ｇ／Ｌ以下である、前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の蛍光粒子。
【００１２】
（７）ストークスシフトの大きい蛍光色素をシリカ粒子内部に含有し、粒子内部に疎水性溶媒を含む、ストークスシフトの大きい蛍光粒子、及び
生体分子検出用のイムノクロマトグラフィー用試験片、
からなる、生体分子検出用試験キット。
（８）ストークスシフトの大きい蛍光色素をシリカ粒子内部に含有し、粒子内部に疎水性溶媒を含む、ストークスシフトの大きい蛍光粒子を含浸させた、生体分子検出用のイムノクロマトグラフィー用試験片。
（９）紫外線を吸収して可視光領域側の蛍光を発する、前記（７）又は（８）項に記載の生体分子検出用試験キット又は生体分子検出用のイムノクロマトグラフィー用試験片。
（１０）前記蛍光色素の発色団が含窒素複素芳香族化合物である有機色素の残基であり、かつ、前記蛍光粒子中の蛍光色素の発光要素として機能する、前記（７）〜（９）のいずれか１項に記載の生体分子検出用試験キット又は生体分子検出用のイムノクロマトグラフィー用試験片。
（１１）前記蛍光色素の発色団が、前記一般式（１）又は（２）で表される化合物の残基である、前記（７）〜（１０）のいずれか１項に記載の生体分子検出用試験キット又は生体分子検出用のイムノクロマトグラフィー用試験片。
（１２）前記疎水性溶媒の水の溶解度が０．２５ｇ／Ｌ以下である、前記（７）〜（１１）のいずれか１項に記載の生体分子検出用試験キット又は生体分子検出用のイムノクロマトグラフィー用試験片。
（１３）前記疎水性溶媒の水の溶解度が０．０１ｇ／Ｌ以下である、前記（７）〜（１２）のいずれか１項に記載の生体分子検出用試験キット又は生体分子検出用のイムノクロマトグラフィー用試験片。
【００１３】
（１４）ストークスシフトの大きい蛍光色素をシリカ粒子内部に含有し、粒子内部に疎水性溶媒を含む、ストークスシフトの大きい蛍光粒子を用いる、生体分子の検出方法。
（１５）前記蛍光色素の発色団が含窒素複素芳香族化合物である有機色素の残基であり、かつ、前記蛍光粒子中の蛍光色素の発光要素として機能する、前記（１４）項に記載の生体分子の検出方法。
（１６）前記蛍光色素の発色団が、前記一般式（１）又は（２）で表される化合物の残基である、前記（１４）又は（１５）項に記載の生体分子の検出方法。
（１７）前記疎水性溶媒の水の溶解度が０．２５ｇ／Ｌ以下である、前記（１４）〜（１６）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１８）前記疎水性溶媒の水の溶解度が０．０１ｇ／Ｌ以下である、前記（１４）〜（１７）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
【００１４】
（１９）ストークスシフトの大きい蛍光色素をシリカ粒子内部に含有するストークスシフトの大きい蛍光粒子を作製し、
疎水性溶媒で溶媒置換し、前記蛍光粒子内部に疎水性溶媒を含有させる、
ストークスシフトの大きい蛍光粒子の作製方法。
（２０）前記蛍光色素の発色団が含窒素複素芳香族化合物である有機色素の残基であり、かつ、前記蛍光粒子中の蛍光色素の発光要素として機能する、前記（１９）項に記載の蛍光粒子の作製方法。
（２１）前記蛍光色素の発色団が、前記一般式（１）又は（２）で表される化合物の残基である、前記（１９）又は（２０）項に記載の蛍光粒子の作製方法。
（２２）前記疎水性溶媒の水の溶解度が０．２５ｇ／Ｌ以下である、前記（１９）〜（２１）のいずれか１項に記載の蛍光粒子の作製方法。
（２３）前記疎水性溶媒の水の溶解度が０．０１ｇ／Ｌ以下である、前記（１９）〜（２２）のいずれか１項に記載の蛍光粒子の作製方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のストークスシフトの大きい蛍光粒子は、親水性溶媒に分散させても高い蛍光強度を維持でき、かつその高い蛍光強度を長期間維持できる。
また本発明の粒子の作製方法は、前記粒子の作製に好適である。
さらに本発明の生体分子検出用試験キット若しくは生体分子検出用のイムノクロマトグラフィー用試験片、並びに生体分子の検出方法は、前述のストークスシフトの大きい蛍光粒子を用いるため、高感度及び高精度での生体分子の検出を実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の生体分子検出用試験キットに好ましく用いることができる生体分子検出用試験片を模式的に示す図あり、図１（ａ）が平面図であり、図１（ｂ）が展開断面図である。
【図２】本発明の生体分子検出用試験キットに好ましく用いることができる別の生体分子検出用試験片を模式的に示す図あり、図２（ａ）が平面図であり、図２（ｂ）が展開断面図である。
【図３】本発明の生体分子検出用試験片の好ましい実施形態を模式的に示す図あり、図３（ａ）が平面図であり、図３（ｂ）が展開断面図である。
【図４】本発明の生体分子の検出方法の一実施形態に係るフローサイトメーターを模式的に示す装置構成図である。
【図５】実施例で作製した標識シリカナノ粒子の蛍光強度の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書において「物質」とは、化合物又は化学合成された分子の他、生体分子（タンパク質、ペプチド、核酸等）を包含する。これらは人工起源のものであっても、天然起源のものであってもよい。
また、本明細書において「結合」又は「連結」とは、複数のものが分離した状態から連続して一体となることを全般的に指し、共有結合やイオン結合、水素結合といった化学的な結合のほか、化学吸着や物理吸着、そのほか嵌合、螺合、咬合した物理的な連結状態等も含む意味である。ここで、「結合」又は「連結」とは、直接複数のものが結合しても、別のものを介して間接的に結合してもよい意味である。
さらに、本明細書において「検出」とは、定性的な検出や定量的な検出のみならず、その他の各種の測定や同定、分析、評価等を含む概念である。
【００１８】
イムノアッセイやフローサイトメトリーなどに用いられる標識試薬シリカ粒子に内包する蛍光色素は、励起光を照射すると色素骨格内で電子が移動し、基底状態から励起一重項状態（エネルギーの最大レベル）に達し、その後電子エネルギーは基底状態まで低下する。電子エネルギーが低下する際には、エネルギーの一部が蛍光として放出される。
前記標識試薬シリカ粒子は、後述の実施例でも示すように、水や親水性溶媒に分散せた場合、蛍光強度が低下する。これは、標識試薬粒子内部に存在する蛍光色素近傍に水分子が存在すると、誘起効果により、色素骨格内での電子移動が起こりにくくなると推測される。そのため、電子エネルギーが励起一重項状態まで到達せず、結果として蛍光強度が低下する。
【００１９】
このような問題に対して、本発明者らは、標識試薬粒子内の蛍光色素の近傍に水分子が存在しなければ、誘起効果による蛍光強度の低下は防げると考えた。そして、常法により作製した蛍光色素含有標識試薬シリカ粒子に対して、疎水性溶媒を用いた溶媒置換を行い、蛍光色素近傍の水分子を除去して疎水性溶媒を配置させ、蛍光色素と水分子との接触を防ぐことで、蛍光強度の低下を抑制できることを見出した。
【００２０】
［標識試薬粒子］
本発明の標識試薬粒子（以下、本明細書において、「ストークスシフトの大きい蛍光粒子」又は単に「蛍光粒子」ともいう）は、シリカ粒子と、その内部に含有されるストークスシフトの大きい蛍光色素（以下、本明細書において、単に「蛍光色素」ともいう）からなる。本発明で用いる蛍光色素は、紫外光を吸収して可視光領域側の蛍光を発光する、ストークスシフトの大きい蛍光色素が好ましい。
本発明で好ましく用いることができるストークスシフトの大きい蛍光色素は、蛍光波長と励起光の波長との差が、好ましくは３０ｎｍ以上、より好ましくは５０ｎｍ以上、より好ましくは８０ｎｍ以上、より好ましくは１００ｎｍ以上、さらに好ましくは１１０ｎｍ以上である。上限は特にないが、３００ｎｍ以下であることが実際的である。さらに、励起波長領域と発光波長とが互いに重なり合わないことが好ましい。このような色素を用いた場合、励起光のノイズをカットし燐光を検出する高価なフィルタを発光検出装置に設けなくても、生体分子の検出が可能となる。
本発明で用いる色素は、主に励起光波長が紫外線領域であり、蛍光波長は可視光領域側にあることが好ましい。本発明において「紫外線」とは、波長４７５ｎｍ未満の光（電磁波）をいい、４５０ｎｍ以下であることが好ましく、４２０ｎｍ以下であることがより好ましい。下限値は３００ｎｍ以上であることが好ましい。また「可視光領域側」とは照射される紫外線より相対的に長波長側であればよく、典型的には４００ｎｍ超の光をいい、４５０ｎｍ以上であることが好ましい。上限は７５０ｎｍ以下であることが好ましく、７００ｎｍ以下であることがより好ましい。具体的には、励起波長が２３０ｎｍ〜４７５ｎｍの範囲にあり、発光ピークが４５０〜６００ｎｍの間にあることが好ましい。
【００２１】
本発明で用いる蛍光色素の発色団は、含窒素複素芳香族化合物の残基であり、かつ、蛍光粒子中の蛍光色素の発光要素として機能することが好ましい。含窒素複素芳香族化合物は、五員環の芳香族化合物又は六員環の芳香族化合物が好ましく、五員環の芳香族化合物がより好ましい。このような化合物としては、電子移動が起こりやすい化合物が好ましく、具体例としては、アゾール化合物、ベンゾオキサジアゾール化合物、ベンゾチアジアゾール化合物、ベンゾチアジアゾール2,1,3-ベンゾオキサジアゾール-3-カルボキシアルデヒド化合物が挙げられる。
本発明において、含窒素複素芳香族化合物としてアゾール化合物が好ましく、ジアゾール化合物がより好ましい。
【００２２】
本発明で用いる蛍光色素は、その発色団が下記一般式（１）又は（２）で表される化合物の残基であることが好ましい。
【００２３】
【化２】
2018145315.tif 000003
【００２４】
一般式（１）及び（２）において、前記環Ａは、芳香族環又は複素芳香族環を示す。
環Ａが芳香族環の場合、環Ａは炭素原子数６〜２４の芳香族環が好ましく、炭素原子数６〜１４の芳香族環がより好ましく、炭素原子数６〜１０の芳香族環がさらに好ましい。芳香族環の具体例としては、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環が挙げられる。
環Ａが複素芳香族環の場合、環Ａは炭素原子数３〜１２の複素芳香族環が好ましく、炭素原子数３〜８の複素芳香族環がより好ましく、炭素原子数３〜６の複素芳香族環がさらに好ましい。また、複素芳香族環の構成原子は、炭素原子、窒素原子及び硫黄原子から選択することが好ましい。複素芳香族環の具体的としては、ピリジン環、ピラジン環、ピリミジン環、ピリダジン環、ピロール環、ピラゾール環、イミダゾール環が挙げられる。このうち、ピリジン環が好ましい。
【００２５】
一般式（１）において、Ｘはイミノ基（ＮＲＡ）、アルケニル基（炭素原子数２〜１２のアルケニル基が好ましく、炭素原子数２〜６のアルケニル基がより好ましい）、アリール基（炭素原子数６〜２２が好ましく、炭素原子数６〜１４がより好ましく、炭素原子数６〜１０がさらに好ましい）、アラルキル基（炭素原子数７〜２３が好ましく、炭素原子数７〜１５がより好ましく、炭素原子数７〜１１がさらに好ましい）、酸素原子、硫黄原子、セレン原子、又はＢＲＡを示す。
ＲＡは水素原子又は置換基を示す。置換基の具体例としては、ハロゲン原子、アルキル基（炭素原子数１〜１２のアルキル基が好ましく、炭素原子数１〜６のアルキル基がより好ましく、炭素原子数１〜３のアルキル基がさらに好ましい）、アルケニル基（炭素原子数２〜１２のアルケニル基が好ましく、炭素原子数２〜６のアルケニル基がより好ましい）、アルキニル基（炭素原子数２〜１２のアルキニル基が好ましく、炭素原子数２〜６のアルキニル基がより好ましい）、アルコキシ基（炭素原子数１〜１２のアルコキシ基が好ましく、炭素原子数１〜６のアルコキシ基がより好ましく、炭素原子数１〜３のアルコキシ基がさらに好ましい）、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホン酸基、芳香族炭化水素基（炭素原子数６〜２２の芳香族炭化水素基が好ましく、炭素原子数６〜１４の芳香族炭化水素基がより好ましく、炭素原子数６〜１０の芳香族炭化水素基がさらに好ましい）、複素環基（炭素原子数１〜１２の複素環基が好ましく、炭素原子数２〜５の複素環基がより好ましく、環構成原子は、炭素原子、窒素原子及び硫黄原子から選択することが好ましい）が挙げられる。ＲＡは、水素原子、アルキル基（炭素原子数１〜１２のアルキル基が好ましく、炭素原子数１〜６のアルキル基がより好ましく、炭素原子数１〜３のアルキル基がさらに好ましい）がより好ましい。
【００２６】
ＲＮ及びＲＣはそれぞれ独立に、水素原子又は置換基を示す。置換基の具体例としては、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、及び臭素原子が好ましい）、アルキル基（炭素原子数１〜１２のアルキル基が好ましく、炭素原子数１〜６のアルキル基がより好ましく、炭素原子数１〜３のアルキル基がさらに好ましい）、アルケニル基（炭素原子数２〜１２のアルケニル基が好ましく、炭素原子数２〜６のアルケニル基がより好ましい）、アルキニル基（炭素原子数２〜１２のアルキニル基が好ましく、炭素原子数２〜６のアルキニル基がより好ましい）、アルコキシ基（炭素原子数１〜１２のアルコキシ基が好ましく、炭素原子数１〜６のアルコキシ基がより好ましく、炭素原子数１〜３のアルコキシ基がさらに好ましい）、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホン酸基、芳香族炭化水素基（炭素原子数６〜２２の芳香族炭化水素基が好ましく、炭素原子数６〜１４の芳香族炭化水素基がより好ましく、炭素原子数６〜１０の芳香族炭化水素基がさらに好ましい）、複素環基（炭素原子数１〜１２の複素環基が好ましく、炭素原子数２〜５の複素環基がより好ましく、環構成原子は、炭素原子、窒素原子及び硫黄原子から選択することが好ましい）が挙げられる。ＲＮ及びＲＣは、水素原子、アルキル基（炭素原子数１〜１２のアルキル基が好ましく、炭素原子数１〜６のアルキル基がより好ましく、炭素原子数１〜３のアルキル基がさらに好ましい）がより好ましい。
【００２７】
前記一般式（１）で表される化合物は、下記一般式（１−１）〜（１−３）のいずれか１つで表される化合物が好ましい。
また、前記一般式（２）で表される化合物は、下記一般式（２−１）〜（２−３）のいずれか１つで表される化合物が好ましい。
【００２８】
【化３】
2018145315.tif 000004
【００２９】
【化４】
2018145315.tif 000005
【００３０】
一般式（１−１）〜（１−３）及び一般式（２−１）〜（２−３）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ独立に、水素原子又は置換基を示す。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、及び臭素原子が好ましい）、アルキル基（炭素原子数１〜１２のアルキル基が好ましく、炭素原子数１〜６のアルキル基がより好ましく、炭素原子数１〜３のアルキル基がさらに好ましい）、アルケニル基（炭素原子数２〜１２のアルケニル基が好ましく、炭素原子数２〜６のアルケニル基がより好ましい）、アルキニル基（炭素原子数２〜１２のアルキニル基が好ましく、炭素原子数２〜６のアルキニル基がより好ましい）、アルコキシ基（炭素原子数１〜１２のアルコキシ基が好ましく、炭素原子数１〜６のアルコキシ基がより好ましく、炭素原子数１〜３のアルコキシ基がさらに好ましい）、ヒドロキシル基、シアノ基、スルホン酸基、芳香族炭化水素基（炭素原子数６〜２２の芳香族炭化水素基が好ましく、炭素原子数６〜１４の芳香族炭化水素基がより好ましく、炭素原子数６〜１０の芳香族炭化水素基がさらに好ましい）、又は複素環基（炭素原子数１〜１２の複素環基が好ましく、炭素原子数２〜５の複素環基がより好ましく、環構成原子は、炭素原子、窒素原子及び硫黄原子から選択することが好ましい）が好ましい。
【００３１】
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に、芳香族基（炭素原子数６〜２２の芳香族基が好ましく、炭素原子数６〜１４の芳香族基がより好ましい）又は複素芳香族基（炭素原子数１〜１２の複素芳香族基が好ましく、炭素原子数２〜５の複素芳香族基がより好ましい）が好ましい。芳香族基としてはフェニル基、ナフチル基が挙げられる。複素芳香族基としては、チオフェン若しくはその誘導体、フラン若しくはその誘導体、ピロール若しくはその誘導体、イミダゾール若しくはその誘導体、オキサゾール若しくはその誘導体、チアゾール若しくはその誘導体、ピラゾール若しくはその誘導体、並びにピリジン若しくはその誘導体の残基が挙げられる。
Ｒ２及びＲ３はさらに置換基を有してもよく、例えばアルキル基（炭素原子数１〜１２のアルキル基が好ましく、炭素原子数１〜６のアルキル基がより好ましく、炭素原子数１〜３のアルキル基がさらに好ましい）、アルコキシ基（炭素原子数１〜１２のアルコキシ基が好ましく、炭素原子数１〜６のアルコキシ基がより好ましく、炭素原子数１〜３のアルコキシ基がさらに好ましい）、アルケニル基（炭素原子数２〜１２のアルケニル基が好ましく、炭素原子数２〜５のアルケニル基がより好ましい）、アシル基（炭素原子数１〜１２のアシル基が好ましく、炭素原子数２〜６のアシル基がより好ましく、炭素原子数２〜３のアシル基がさらに好ましい）が挙げられる。
【００３２】
Ｒ１又はＲ４は結合部を構成していてもよい。結合部は、蛍光色素がシリカ粒子に導入される際に、発色団とシランカップリング剤との連結部として機能する。このような観点から、結合部はアルコキシシリル基（炭素原子数１〜１２が好ましく、１〜６がより好ましく、１〜３がさらに好ましい）を有することが好ましい。結合部を誘導するための仮結合部としては、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、カルバモイル基、カルボキシル基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基、活性エステル化したカルボニル基、マレイミド基、及びコハク酸イミド基が挙げられる。
【００３３】
前記結合部は、−（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＨＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＮＲ−、−ＣＯＯ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＨＮ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ａｒ−、−ＣＯ−Ａｒ−ＮＲ−、又はこれらの組合せからなる連結基を有していてもよい。ここで、Ｒはアルキル基（炭素原子数１〜６のアルキル基が好ましい）を示し、ｎは１〜１０の整数である。また、Ａｒはアリーレン基（炭素原子数６〜１０のアリーレン基が好ましい）である。
結合部中の連結基には、以下の一般式（Ｉ）で表されるものを用いることができる。
−［（ＣＨＲａ）ｐ−Ｘ］ｒ−（ＣＨＲｂ）ｑ−［（ＣＨＲａ）ｐ−Ｘ］ｒ−  （Ｉ）
一般式（Ｉ）中、Ｘは単結合、−ＮＨＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＨＮ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ａｒ−（Ａｒはアリーレン基を示す）、−ＣＯ−Ａｒ−ＮＲ−、又はこれらの組合せを示す。ここでＲはアルキル基（炭素原子数１〜６のアルキル基が好ましい）を示す。
Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立に、水素原子、芳香環を含んでもよいアルキル基若しくはアルケニル基等の脂肪族炭化水素基、又は芳香族炭化水素基である。必要によりスルホン酸基、ヒドロキシル基、４級アミン基及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか１種の荷電基により置換された基を示す。
ｐ、ｑ、ｒはそれぞれ独立に、０〜２０の整数を示す。ただし、ｒ＋ｑ≧１である。
【００３４】
一般式（１−３）及び（２−３）において、ＲＭは脂肪族炭化水素基（炭素原子数１〜１２の脂肪族炭化水素基が好ましく、炭素原子数２〜５の脂肪族炭化水素基がより好ましい）又は芳香族炭化水素基（炭素原子数６〜２２の芳香族炭化水素基が好ましく、炭素原子数６〜１４の芳香族炭化水素基がより好ましい）を示す。このうちＲＭは、アルキル基（炭素原子数１〜１２のアルキル基が好ましく、炭素原子数１〜６のアルキル基がより好ましく、炭素原子数１〜３のアルキル基がさらに好ましい）、アリール基（炭素原子数６〜２２のアリール基が好ましく、炭素原子数６〜１４のアリール基がより好ましく、炭素原子数６〜１０のアリール基がさらに好ましい）、又はアラルキル基（炭素原子数７〜２３のアラルキル基が好ましく、炭素原子数７〜１５のアラルキル基がより好ましく、炭素原子数７〜１１のアラルキル基がさらに好ましい）が好ましい。
また、Ａｎ−は対アニオンを示し、ハロゲン化物イオン、ＣＦ３ＳＯ３−、ＢＦ４−、又はＰＦ６−が好ましい。
【００３５】
一般式（１−１）〜（１−３）及び一般式（２−１）〜（２−３）において、Ｘ、ＲＮ及びＲＣは、一般式（１）及び（２）におけるＸ、ＲＮ及びＲＣと同義であり、好ましい範囲も同様である。
【００３６】
一般式（１）又は（２）で表される化合物の具体例を下記に示す。しかし、本発明がこれらにより限定して解釈されるものではない。
【００３７】
【化５】
2018145315.tif 000006
【００３８】
前記蛍光色素として、市販の色素を用いてもよい。例えばＩＳＴ社製フルオリドイエロー、フルオリドレッドなどが利用可能である。
また、前記蛍光色素は、常法従い合成することができる。例えば、下記スキーム１に従い合成することができる。ここでは、反応性基に活性エステル化したカルボニル基を用い、反応性基と結合するスペーサー部の官能基に−ＣＯＯ−を用いた例を示している。活性エステル化したカルボニル基には、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルやマレイミドエステルを用いることができる。Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドを用い、縮合剤としてＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド）を用いることによりＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル体を経由してアミド結合により有機ＥＬ色素と標的分子が結合する。
【００３９】
【化６】
2018145315.tif 000007
【００４０】
前記スキーム１において、Ｄｙｅは蛍光色素の発色団である。Ｒ’はアルコキシシリル基又はアルコキシシリルアルキル基を示す。
【００４１】
本発明の標識試薬粒子は、シリカ粒子とストークスシフトの大きい蛍光色素とで構成される。標識試薬粒子の調製方法に特に制限はなく、任意のいかなる調製方法によってストークスシフトの大きい蛍光色素含有シリカナノ粒子を得ることができる。例えば、Journal  of  Colloid  and  Interface  Science，159，p．150-157（1993）に記載のゾル−ゲル法や、国際公開第２００７／０７４７２２号パンフレットに記載されたコロイドシリカ粒子の調製方法を参照することができる。
【００４２】
ストークスシフトの大きい蛍光色素含有シリカナノ粒子の調製例について、具体的に説明する。しかし本発明はこれに制限されるものではない。
ストークスシフトの大きい蛍光色素を含有するシリカ粒子は、ストークスシフトの大きい蛍光色素とシランカップリング剤とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合若しくは吸着させて得られた生成物に１種又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。これによりオルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなるシリカ粒子が得られる。１例としては、N-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する又は付加したストークスシフトの大きい蛍光色素と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。
【００４３】
前記シランカップリング剤としてアミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、シラン化合物としてテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）を用いた場合を下記に例示する。
【００４４】
【化７】
2018145315.tif 000008
【００４５】
前記置換基を有するシランカップリング剤（紫外励起色素の仮結合部を結合部に変換する化合物）の具体例として、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシラン、N-2（アミノエチル）3-アミノプロピルメチルジメトキシシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。
【００４６】
縮重合させる前記シラン化合物としては特に制限はないが、ＴＥＯＳ、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、ＡＰＳ、3-チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3-イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシランを挙げることができる。中でも、前記シリカ粒子内部のシロキサン成分を形成する観点からはＴＥＯＳが好ましく、前記シリカ粒子内部のオルガノシロキサン成分を形成する観点からはＭＰＳ又はＡＰＳが好ましい。
【００４７】
上述のように調製すると、球状、又は球状に近いシリカ粒子を調製することができる。ここで、「球状に近いシリカ粒子」とは、具体的には長軸と短軸の比が２以下の形状である。
【００４８】
シリカナノ粒子の平均粒径に特に制限はないが、１ｎｍ以上が好ましく、２０ｎｍ以上がより好ましく、３０ｎｍ以上がさらに好ましく、６０ｎｍ以上がさらに好ましく、１００ｎｍ以上がさらに好ましい。また、１０００ｎｍ未満が好ましく、７００ｎｍ以下がより好ましく、５００ｎｍ以下がさらに好ましく、４００ｎｍ以下がさらに好ましい。粒径が小さすぎると、検出感度が低下し、粒径が大きすぎると、試験片に用いられる多孔質支持体（メンブレン）の目詰まりの原因となる。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した１００個の標識試薬シリカ粒子の合計の投影面積からシリカナノ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択したシリカナノ粒子の個数（１００個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
なお、前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子のみからなる粒子の平均粒径である。
所望の平均粒径のシリカナノ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清又は沈殿のみを回収することで可能である。
シリカナノ粒子は粒状物質として単分散であることが好ましい。シリカナノ粒子の粒度分布の変動係数、いわゆるＣＶ値に特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
【００４９】
本明細書において、前記「動的光散乱法による粒度」とは、動的光散乱法により測定され、前記の平均粒径とは異なり、一次粒子だけでなく、一次粒子が凝集してなる二次粒子をも含めた概念であり、前記複合粒子の分散安定性を評価する指標となる。
動的光散乱法による粒度の測定装置としては、ゼータサイザーナノ（商品名；マルバーン社製）が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
【００５０】
イムノクロマトアッセイ用の標識試薬粒子の表面には、抗原などの生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が導入されている。標識試薬粒子の表面に導入する捕捉物質は、生体分子に対する特異的な結合性を有するものであれば特に制限はない。
標識試薬粒子の表面に捕捉物質を導入する方法としては特に制限はなく、常法に従って導入することができる。例えば、静電的引力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等によって標識試薬粒子の表面に捕捉物質を導入してもよい。あるいは、架橋剤や縮合剤の化学結合によって、標識試薬粒子の表面に捕捉物質を導入してもよい。また、標識試薬粒子の表面に導入する捕捉物質を導入したときに標識試薬粒子同士が凝集する場合は、予め交互吸着法によって標識試薬粒子の表面に表面処理を施しておいてもよい。
【００５１】
本発明において、常法に従い作製した標識試薬粒子の分散液に対して、疎水性溶媒を用いた溶媒置換を行う。疎水性溶媒を用いた溶媒置換を行うことで、標識試薬粒子の内部に疎水性溶媒を含有させることができる。
以下、疎水性溶媒を用いた溶媒置換方法について、具体的に説明する。しかし本発明は、これに制限するものではない。
【００５２】
まず、常法に従い作製した標識試薬粒子の分散液の溶媒の除去を行う。シリカ粒子の合成は、加水分解をきっかけに反応が開始する、ゾル・ゲル法により従うのが一般的である。本発明において、分散液の溶媒の除去し、常法に従い作製したシリカ粒子の分散液に含まれる水を除去することが好ましい。
分散液の溶媒の除去は、遠心分離など、常法に従い行うことができる。遠心分離の条件は適宜設定でき、遠心分離時間は5〜30分、回転数は8,000rpm〜14,500rpmが好ましい。
【００５３】
次に、溶媒を除去した標識試薬粒子と疎水性溶媒とを混合し、超音波法、撹拌法などにより標識試薬粒子を疎水性溶媒に再分散させる。疎水性溶媒を粒子内部に含浸させるために、一旦粒子を疎水性溶媒中で分散させた後、一定時間以上（好ましくは5分〜24時間）の攪拌（好ましくは100〜2,500rpm）又は静置することが好ましい。
【００５４】
本発明で用いる疎水性溶媒としては特に制限はなく、水との混和性が低いものが好ましい。具体例としては、N,N-ジメチルホルムアミド（以下単に、「ＤＭＦ」ともいう。水の溶解度：１．０４ｇ／Ｌ以下）、ジメチルスルホキシド（以下単に、「ＤＭＳＯ」ともいう。水の溶解度：０．２５ｇ／Ｌ）、メチルエチルケトン（水の溶解度：０．２２ｇ／Ｌ）、オクタノール（水の溶解度：０．０００５４ｇ／Ｌ）、トルエン（水の溶解度：０．０００６７ｇ／Ｌ）、四塩化炭素（水の溶解度：０．００１ｇ／Ｌ）、ヘキサン（水の溶解度：０．０１ｇ／Ｌ以下）、ベンゼン（水の溶解度：０．０１ｇ／Ｌ以下）、ニトロメタン（水の溶解度：０．０１ｇ／Ｌ以下）、ペンタン（水の溶解度：０．０１ｇ／Ｌ以下）、イソブチルアルコール（水の溶解度：０．０９ｇ／Ｌ）などが挙げられる。
このうち、本発明で用いる疎水性溶媒の水の溶解度は、０．２５ｇ／Ｌ以下が好ましく、０．０１ｇ／Ｌ以下がより好ましい。用いる疎水性溶媒が、水に対する混和性が低い場合、粒子外部に存在する水分子が粒子内部に入り込めず、高い蛍光強度を長期間維持できる。
なお、本発明における水の溶解度の測定方法は、ＥＰＡ８３０．７８４０に従い２０℃においてカラム溶出法、フラスコ振盪法により行った。
【００５５】
本発明の標識試薬粒子は、イムノクロマトグラフィー用試験片やフローサイトメトリー、その他の各種のイムノアッセイやバイオチップに適用することができる。
【００５６】
［生体分子検出用試験キット］
本発明は、生体分子検出用のイムノクロマトグラフィー用試験片（以下、「試験片」、又は「テストストリップ」ともいう）と、前記標識試薬粒子とを有する生体分子検出用試験キット（以下、単に「試験キット」ともいう）を提供する。
以下、本発明で好ましく用いることができる試験キットについて説明する。
【００５７】
本発明の試験キットに含まれる試験片の形状に特に制限はないが、平面状の試験片であることが好ましく、ラテラルフロー用の試験片であることがより好ましい。
また、試験片の構造に特に制限はないが、試料添加用部材（サンプルパッド）と、検出対象物質を捕捉する試験領域を有するメンブレンと、吸収パッドとが、この順でそれぞれ相互に毛細管現象が生じるように直列に連結している構造であることが好ましい。そして、各構成部材は粘着剤付きバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。
以下、上記形状及び構造を有する試験片について、図１及び２を参照しながら説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
【００５８】
（サンプルパッド）
サンプルパッド２は生体分子、標識試薬粒子、これらの複合体を含む試料を滴下する構成部材である。サンプルパッド２の材料や寸法等は特に限定されず、この種の製品に適用される一般的なものを利用することができる。
【００５９】
（メンブレン）
メンブレン３は、サンプルパッド２から毛細管現象により移動してきた生体分子を捕捉するための構成部材である。
図１に示すように、メンブレン３には、少なくとも１つの試験領域１０が設けられている。そして、生体分子に対する特異的な結合性を有し生体分子と複合体を形成しうる捕捉物質が、試験領域１０に導入されている。サンプルパッド２から移動してきた標識試薬粒子がメンブレン３を移行することで、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が試験領域１０へ固定化される。
この試験領域１０で捕捉物質−生体分子−標識試薬粒子からなる複合体が形成され、標識試薬粒子が濃縮される。そして、標識試薬粒子が有する標識量の程度により生体分子を定性的又は定量的に検出することができる。
【００６０】
図２に示すように、メンブレン３には、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子を固定化するための試験領域２０を設け、試験領域２０の下流に、標的物質とする生体分子を捕捉していないため試験領域２０に固定化されなかった標識試薬粒子を固定化する参照領域２１をさらに設けてもよい。このような参照領域２１を設けることにより、サンプルパッド２に滴下した試料が毛細管現象によりメンブレン３に移動し、さらに試験領域２０を超えて移動しているかを確認することができる。参照領域２１は設けなくてもよい。
【００６１】
前記試験領域及び参照領域の形状としては、局所的に捕捉物質が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられる。本発明において試験領域及び参照領域はそれぞれライン状であることが好ましく、幅０．５〜１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。
【００６２】
前記捕捉物質は、抗原抗体反応などの特異的な結合により生体分子を捕捉し、前記試験領域で捕捉物質−生体分子−標識試薬粒子からなる複合体を形成しうるものであれば特に制限はない。
前記参照領域に用いる、標識試薬粒子を捕捉する捕捉物質としては、標識試薬粒子に対して結合性を有するものから適宜選択することができる。具体的には、抗体、抗原、核酸、受容体、リガンド、糖鎖、アプタマーなどから適宜選択することができる。
【００６３】
前記試験領域における捕捉物質の導入量に特に制限なく、適宜設定することができる。例えば、試験領域の形状がライン状の場合、単位長さ（ｃｍ）当たりの捕捉物質の固定化量は０．００１μｇ以上が好ましく、０．０１μｇ以上がより好ましく、１０μｇ以下が好ましく、２μｇ以下がより好ましい。
捕捉物質の固定化方法としては、捕捉物質の溶液をメンブレン３の所定の領域に塗布、滴下又は噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。また、非特異的吸着による測定への影響を防止するため、捕捉物質の固定化後にメンブレン３全体をいわゆるブロッキング処理を施してもよい。
【００６４】
（吸収パッド）
吸収パッド４は、毛細管現象でメンブレン３を移動してきた溶液を吸収し、一定の流れを生じさせるための構成部材である。
【００６５】
これら各構成部材の材料としては特に制限は無く、この種の試験片に通常用いられる部材が使用できる。例えば、サンプルパッド２としてはGlass  Fiber  Conjugate  Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のガラスファイバーのパッドを好ましく用いることができる。メンブレン３としてはHi-Flow  Plus180メンブレン（商品名、MILLIPORE社製）等のニトロセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。吸収パッド４としてはCellulose  Fiber  Sample  Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。
前記粘着剤付きバッキングシート６としては、AR9020（商品名、Adhesives  Research社製）等が挙げられる。
【００６６】
試験片の作製法としては、サンプルパッド２、メンブレン３、吸収パッド４の並び順に、各部材間で毛管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端と隣接する部材と１〜５ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくはバッキングシート６上に）貼付することで、テストストリップ１を作製することができる。
【００６７】
［生体分子検出用試験片］
本発明は、前記標識試薬粒子を含浸する、生体分子検出用のイムノクロマトグラフィー用試験片も提供する。
前記イムノクロマトグラフィー用試験片の形状に特に制限はないが、平面状の試験片であることが好ましく、ラテラルフロー用の試験片であることがより好ましい。
また、試験片の構造に特に制限はないが、サンプルパッドと、標識試薬粒子を含浸して得られた部材（以下、「コンジュゲートパッド」ともいう）と、検出対象物質を捕捉する試験領域を有するメンブレンと、吸収パッドとが、この順でそれぞれ相互に毛細管現象が生じるように直列に連結している構造であることが好ましい。そして、各構成部材は粘着剤付きバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。
以下、上記形状及び構造を有する試験片について、図３を参照しながら説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
【００６８】
（サンプルパッド）
サンプルパッド２は、生体分子を滴下する構成部材である。サンプルパッド２の材料や寸法等は特に限定されず、この種の製品に適用される一般的なものを利用することができる。
【００６９】
（コンジュゲートパッド）
コンジュゲートパッド５は、標識試薬粒子を含浸して得られた構成部材である。そして、サンプルパッド２から毛細管現象により移動した生体分子を含む液と標識試薬粒子とを混合する部分である。
コンジュゲートパッド５に含浸させる標識試薬粒子の量に特に制限はなく、適宜設定することができる。
【００７０】
（メンブレン）
図３に示すように、メンブレン３には、少なくとも１つの試験領域２０が設けられている。そして、生体分子に対する特異的な結合性を有し生体分子と複合体を形成しうる捕捉物質が、試験領域２０に導入されている。サンプルパッド２から移動してきた標識試薬粒子がメンブレン３を移行することで、標的物質とする生体分子を捕捉した標識試薬粒子が試験領域２０へ固定化される。
この試験領域２０で捕捉物質−生体分子−標識試薬粒子からなる複合体が形成され、標識試薬粒子が濃縮される。そして、標識試薬粒子が有する標識量の程度により生体分子を定性的又は定量的に検出することができる。
さらに図３に示すように、メンブレン３には、試験領域２０の下流に、標的物質とする生体分子を捕捉していないため試験領域２０に固定化されなかった標識試薬粒子を固定化する参照領域２１をさらに設けてもよい。このような参照領域２１を設けることにより、サンプルパッド２に滴下した試料が毛細管現象によりメンブレン３に移動し、さらに試験領域２０を超えて移動しているかを確認することができる。参照領域２１は設けなくてもよい。
【００７１】
前記試験領域及び参照領域の形状としては、局所的に捕捉物質が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられる。本発明において試験領域及び参照領域はそれぞれライン状であることが好ましく、幅０．５〜１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。
【００７２】
前記捕捉物質は、抗原抗体反応などの特異的な結合により抗原を捕捉し、前記試験領域で捕捉物質−生体分子−標識試薬粒子からなる複合体を形成しうるものであれば特に制限はない。
前記参照領域に用いる、標識試薬粒子を捕捉する捕捉物質としては、標識試薬粒子に対して結合性を有するものから適宜選択することができる。具体的には、抗体、抗原、核酸、受容体、リガンド、糖鎖、アプタマーなどから適宜選択することができる。
【００７３】
前記試験領域における捕捉物質の導入量に特に制限なく、適宜設定することができる。例えば、試験領域の形状がライン状の場合、単位長さ（ｃｍ）当たりの捕捉物質の固定化量は０．００１μｇ以上が好ましく、０．０１μｇ以上がより好ましく、１０μｇ以下が好ましく、２μｇ以下がより好ましい。
捕捉物質の固定化方法としては、捕捉物質の溶液をメンブレン３の所定の領域に塗布、滴下又は噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。また、非特異的吸着による測定への影響を防止するため、捕捉物質の固定化後にメンブレン３全体をいわゆるブロッキング処理を施してもよい。
【００７４】
（吸収パッド）
吸収パッド４は、毛細管現象でメンブレン３を移動してきた溶液を吸収し、一定の流れを生じさせるための構成部材である。
【００７５】
これら各構成部材の材料としては特に制限は無く、この種の試験片に通常用いられる部材が使用できる。例えば、サンプルパッド２及びコンジュゲートパッド５としてはGlass  Fiber  Conjugate  Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のガラスファイバーのパッドを好ましく用いることができる。メンブレン３としてはHi-Flow  Plus180メンブレン（商品名、MILLIPORE社製）等のニトロセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。吸収パッド４としてはCellulose  Fiber  Sample  Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。
前記粘着剤付きバッキングシート６としては、AR9020（商品名、Adhesives  Research社製）等が挙げられる。
【００７６】
試験片の作製法としては、サンプルパッド２、コンジュゲートパッド５、メンブレン３、吸収パッド４の並び順に、各部材間で毛管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端と隣接する部材と１〜５ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくはバッキングシート６上に）貼付することで、テストストリップ１を作製することができる。
【００７７】
［生体分子の検出方法］
次に、上記構成の生体分子検出用の試験片と本発明の標識試薬粒子を用いた生体分子の検出方法について、好ましい実施態様に基づいて説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
【００７８】
本発明において、検出対象（標的物質）としての生体分子に特に制限はなく、抗原、抗体、核酸、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、その他生体活性を有する化学物質等が挙げられる。これらのうち、本発明は抗原の検出に好適に用いることができる。
【００７９】
本発明において、生体分子を含有する試料としては特に制限はないが、臨床検体（例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、膵液、胃液、喀痰、鼻や咽等の粘膜から採取したぬぐい液等の体液や便等）、食品検体（例えば、液体飲料、半固形食品、固形食品等）、環境サンプリング検体（例えば、土壌、河川、海水等の自然界のサンプル、工場内の生産ラインやクリーンルームに設置されたエアーサンプラーによるサンプリング検体、ふき取り検体等）等が挙げられる。
また、試料は液体であればそのまま用いることもできる。試料が半固形又は固形物等の場合には、希釈や抽出等の処理を施した後に用いることもできる。
【００８０】
まず本発明の生体分子検出用試験キットを用いた実施態様では、生体分子を含有しうる液体試料と本発明の標識試薬粒子との混合物を、前記試験片１のサンプルパッド２に滴下する。サンプルパッド２に滴下する液体試料の量は、試験片１の構成に合わせて適宜調節することができる。
そして、毛細管現象によりサンプルパッド２からメンブレン３に移動してきた生体分子と標識試薬粒子との複合体が、試験片１の試験領域（テストライン）上に導入された捕捉物質との結合により濃縮される。そして、試験領域に光を照射し、濃縮された標識試薬粒子の標識を検出する。検出した標識の有無又は標識の程度により、生体分子を検出することができる。
【００８１】
本発明の生体分子検出用試験片を用いた実施態様では、本発明の標識試薬粒子を生体分子アッセイに用いる部材に乾燥された状態で含ませておく。そして、抗原抗体反応などの特異的な反応により生体分子を検出する前に、生体分子を含有しうる液体試料と前記標識試薬粒子とを混合させる。例えば、イムノクロマト法により生体分子を検出する場合、前記標識試薬粒子をサンプルパッド２やメンブレン３に含ませておき、生体分子を含有しうる液体試料がこれらの部材を通過する際に、生体分子を含有しうる液体試料と前記標識試薬粒子とを混合してもよい。あるいは、前記標識試薬粒子を含ませたコンジュゲートパッド５をメンブレン３よりも上流に設け、生体分子を含有しうる液体試料がこの部材を通過する際に、生体分子を含有しうる液体試料と前記標識試薬粒子とを混合してもよい。これらの場合、生体分子を含有しうる液体試料が前記部材を通過した後に抗原抗体反応などの特異的な反応が行われる。
そして、毛細管現象によりコンジュゲートパッド５からメンブレン３に移動してきた生体分子と標識試薬粒子との複合体が、試験片１の試験領域（テストライン）上に導入された捕捉物質との結合により濃縮される。そして、試験領域に光を照射し、濃縮された標識試薬粒子の標識を検出する。検出した標識の有無又は標識の程度により、生体分子を検出することができる。
【００８２】
本発明の標識試薬粒子が発する標識は、目視で検出してもよいし、汎用の検出装置を用いて検出してもよい。
検出装置は通常、生体分子検出用の試験片を設置する試験片設置部、設置された試験片に光を照射するための光照射源、前記試験片からの光を集光する集光部、及び集光された光を検出する検出部を有する。そして前記集光部は、検出する生体分子を捕捉した標識試薬粒子が濃縮された前記試験片の部位からの光を集光する。
本発明の標識試薬粒子にストークスシフトの大きい蛍光色素を用いた場合、前記集光部は、標識試薬粒子に照射する励起光と波長領域が重なり合わない波長領域の光を透過させるフィルタを設けず、集光レンズのみからなる構成とすることができる。
【００８３】
前記光照射源としては特に制限はなく、水銀ランプ、ハロゲンランプ、キセノンランプ、レーザダイオード、発光ダイオードなどから適宜選択することができる。
照射する励起光の波長は特に限定されないが、２５０ｎｍ〜３４０ｎｍが好ましい。また、発光の波長は３５０ｎｍ以上が好ましく、４５０ｎｍ以上がより好ましく、５３０ｎｍ以上がさらに好ましい。また、８００ｎｍ以下が好ましく、７５０ｎｍ以下がより好ましく、５８０ｎｍ以下がさらに好ましい。
【００８４】
集光部に用いられる集光レンズに特に制限はなく、両凸レンズ、凹レンズ、平凸レンズ、メニスカス凸レンズ、フレネルレンズ、回折レンズ、シリンドリカル凸レンズなどこの種の集光部に通常用いられるレンズから適宜選択することができる。
【００８５】
集光部で集光された光束は、検出部で検出する。本発明の検出装置における検出部としては、この種の装置で通常用いられる物から適宜選択することができ、ＰＤ、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、光電子倍増管（ＰＭＴ）、ＣＣＤなどが挙げられる。製造コストの観点からは、ＰＤが好ましく、煩雑な製造工程を要しないＣＡＮ実装型ＰＤであることがより好ましい。
なお、検出部による検出装置の嵩張りを防止する等の観点から、集光レンズと検出部との間に光ファイバを設け、集光レンズからの光を光ファイバの端で受け、検出部に導くこともできる。このような光ファイバとしては、プラスチック光ファイバ、ガラス光ファイバ等が挙げられる。十分な内径を確保する観点からは、プラスチック光ファイバであることが好ましい。
前記検出部は、検出した光を目視で観察する目視開口部であってもよいし、検出した光をカメラなどで観察する画像検出器であってもよい。
【００８６】
［フローサイトメトリー］
フローサイトメトリーは、一例として、図４のような検出部を有する装置を用いて行われる。同図から明らかなように、本装置では、ノズルを１つ１つの粒子が通過し、この部分で粒子の蛍光発光を検出することができる。具体的には、検出部の出口で、複数の波長の光を順次当てて、そこからの蛍光発光を検出することができる。フローサイトメトリーの装置においては、２つの光源ＥＬ−１、ＥＬ−２が設けられたものが例示され、この態様では、４０９ｎｍ、４４０ｎｍの励起光が付与される。検出器は、２つから４つのチャネルを備えたものがあり、５３０ｎｍ、５８５ｎｍ、６６１ｎｍ、６７０ｎｍなどの蛍光の検出がしばしば行われる。
【００８７】
フローサイトメーターは、特に制限はなく、従来用いられているフローサイトメーターをそのまま用いることができる。励起光の照射に先立って、シース液（例えば、ＩｓｏＦｌｏｗシース液（商品名、ベックマン・コールター社製）、ダコ  シースフルード（商品名、ダコジャパン社製等））、及び標的生体分子、標識試薬粒子等が含有されたサンプル液がフローセルに導入されることが好ましい。ここで、前記シース液と前記サンプル液とが混じりあうことがない層流が形成されることが好ましい。前記フローセルから流れていくときに前記サンプル液はシース液流によって囲まれたサンプルコアを形成して流れ、照射域を通過するときにレーザーが照射される態様が挙げられる。
【００８８】
フローサイトメーターは、所定のフロー条件とすることにより、標的生体分子を標識している標識試薬粒子１個だけを、各検出域に存在させることができる。それにより標識試薬粒子１個だけの検出データを取得することができる。前記フローサイトメトリーは、１回の測定操作で複数の標的を同時に測定することができる。いわゆるマルチプレックシング方式である。測定時のフロー速度は特に制限はないが、標的生体分子の定量のためには、１００〜１０００標識試薬粒子数／秒の条件とすることができ、標的細胞の検出ないしは分取のためには、１００〜１０００細胞／秒の条件とすることができる。例えば、フローサイトメーターとしてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商品名；ベクトン・ディッキンソン社製）を用いた場合、シース圧（上記シース液を流す圧力）とサンプル圧（上記サンプル液を流す圧力）の差が１ｋ〜２ｋｐｓｉである条件とすることができる。
【００８９】
各検出域においては、光電子増倍管等任意の１又は２以上の蛍光チャンネル（例えば、ＦＬ１、ＦＬ２、ＦＬ３）を用いて、検出域を通ってレーザーによって照射された蛍光標識試薬粒子からの蛍光発光を集めることができる。また、光電子増倍管等任意の散乱光集光チャンネルを用いて、各シリカ粒子によって屈折される光（前方散乱光または側方散乱光）を集めてもよい。フローサイトメーターは、前記検出域を通った各標的生体分子に由来する蛍光発光や散乱光を、蛍光チャンネル等によって検出したデータを記録・記憶し、分析するデータ集積分析手段（ハードウエアもしくはソフトウエア）を含むのが好ましい。前記データ集積分析手段として、ＦＡＣＳＤｉＶａ、ＥＸＰＯ３２、Ｓｕｍｍｉｔ、ＡｐｐＳａｎ、ＬｙｓｉｓＩＩ、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（いずれも商品名）等市販のものを用いてもよい。
【００９０】
フローサイトメーターとしては、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商品名；ベクトン・ディッキンソン社製）、ＰＥＲＦＬＯＷ  Ａｎａ（商品名；古河電気工業社製）、ＥＰＩＣＳ  ＡＬＴＲＡ（商品名；ベックマン・コールター社製）、ＣｙＡｎ（商品名；ダコジャパン社製）、ＪＳＡＮ（商品名；ベイバイオサイエンス社製）等市販のフローサイトメーターを用いてもよい。標識試薬粒子のフローサイトメトリーに対する利用については、例えば国際公開第２００７／０９７３７７号、特開２００９−２２２７１８号公報を参照することができる。
【実施例】
【００９１】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００９２】
（調製例）各種溶媒で置換した、標識シリカナノ粒子の調製
市販のFluolid色素（ＩＳＴ社製フルオリドイエロー）とＡＰＳ（信越シリコーン社製、LS-3150）とを反応させ、有機蛍光色素を調製した。
４質量％のアンモニア水をエタノールで５倍希釈し、アンモニア水含有溶媒３．５ｍＬを調製した。該アンモニア水含有溶媒に、ＴＥＯＳ（信越シリコーン社製、LS-2430）９０μＬと、１００ｍＭの濃度になるようにジメチルスルフォキシド（ＤＭＦ）に溶解した前記有機蛍光色素１６０μＬとを添加して、４０℃で１６時間攪拌し、標識シリカナノ粒子（平均粒径１００ｎｍ）が形成された溶液を得た。
得られた標識シリカナノ粒子は、励起波長が４１５ｎｍであり、発光波長は５３５ｎｍであった。
【００９３】
前記標識シリカナノ粒子含有溶液を遠心分離（10分、15000rpm）して溶媒を除去した。ここに、下記表１に示す疎水性溶媒１ｍＬを添加し、超音波で粒子を再分散させた。そして分散液を室温で１時間撹拌し（回転数：1,500rpm）、その後、疎水性溶媒に分散した粒子を遠心分離（10分、15,000rpm）して疎水性溶媒を除去した後、水１ｍL添加して超音波で粒子を再分散させ、目的粒子を得た。
【００９４】
【表１】
2018145315.tif 000009
【００９５】
（試験例）蛍光強度の測定
前記調製例で得られた、各種溶媒で置換した標識シリカナノ粒子液、及び各種溶媒を用いた溶媒置換を行わなかった以外は同様に調製した標識シリカナノ粒子を水で２００倍希釈した。得られた希釈液について、蛍光分光光度計FP-6500（日本分光社製）を用いて蛍光強度を測定した。なお、蛍光強度の測定は、粒子の調製直後、粒子の調製から５日後、粒子の調製から６日後に実施した。
その結果を表２に示す。また、オクタノールで溶媒置換した標識シリカナノ粒子、DMSOで溶媒置換した標識シリカナノ粒子、DMFで溶媒置換した標識シリカナノ粒子、及びで溶媒置換を行わなかった標識シリカナノ粒子について、蛍光強度の経時変化を示すグラフを作成した。その結果を図５に示す。
【００９６】
【表２】
2018145315.tif 000010
【００９７】
表２及び図４に示すように、疎水性溶媒で溶媒置換を行うことで、疎水性溶媒による溶媒置換を行わない場合と比較して、標識試薬粒子の蛍光強度が向上した。特に、オクタノール、トルエン、四塩化炭素、又はメチルエチルケトンなど、水の溶解度が０．２５ｇ／Ｌ以下である溶媒で溶媒置換を行った場合、その効果は顕著であった。
また、溶媒置換に用いた溶媒の、水に対する溶解度が低いほど、経過時間に伴う蛍光強度の低下が抑制された。特に、オクタノール、トルエン、四塩化炭素、又はメチルエチルケトンで溶媒置換を行った場合、蛍光強度の低下率（（６日目の蛍光強度）／（０日目の蛍光強度）×１００）が９０％以上維持された。
【００９８】
以上のように、蛍光色素含有標識試薬シリカ粒子に対して、疎水性溶媒を用いた溶媒置換を行うことで、親水性溶媒に分散させても高い蛍光強度を維持でき、かつその高い蛍光強度を長期間維持できる、ストークスシフトの大きい蛍光粒子を作製することができる。
【符号の説明】
【００９９】
１  テストストリップ
２  サンプルパッド
３  メンブレン
４  吸収パッド
６  バッキングシート
１０  試験領域
２０  試験領域
２１  参照領域
【図１】
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【図２】
2018145315.tif 000016
【図３】
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【図４】
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【図５】
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