(57)【要約】      （修正有）【課題】蒸発乾燥法を用いた、長期保存可能なＡＭＶ逆転写酵素を含む核酸増幅試薬の提供。【解決手段】ＡＭＶ逆転写酵素とトレハロースとシクロデキストリンを含む溶液を蒸発乾燥して得られる、核酸増幅試薬。更に、ＲＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸及びリボヌクレオチド三リン酸、標的核酸を増幅させるためのオリゴヌクレオチドのいずれか一つ以上を含む、核酸増幅試薬。シクロデキストリンがγ−シクロデキスリン又はそれの誘導体でありシクロデキストリン誘導体がＣ１〜４のヒドロキシアルキル基を有する、γシクロデスリンである、核酸増幅試薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともＡＭＶ逆転写酵素とトレハロースとシクロデキストリンを含む溶液を蒸発乾燥して得られる、核酸増幅試薬。
【請求項２】
さらに以下の（１）から（３）のいずれか一つ以上を含む、請求項１に記載の核酸増幅試薬。
（１）ＲＮＡポリメラーゼ
（２）デオキシリボヌクレオチド三リン酸およびリボヌクレオチド三リン酸
（３）標的核酸を増幅させるためのオリゴヌクレオチド
【請求項３】
シクロデキストリンがγ‐シクロデキストリンまたはその誘導体である、請求項１または２に記載の核酸増幅試薬。
【請求項４】
シクロデキストリン誘導体が炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基を有するγ‐シクロデキストリンである、請求項３に記載の核酸増幅試薬。
【請求項５】
炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基を有するγ−シクロデキストリンが、２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンである、請求項４に記載の核酸増幅試薬。
【請求項６】
核酸増幅がＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法のいずれかである、請求項１から５のいずれか１項に記載の核酸増幅試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、保存安定性が増した核酸増幅試薬に関する。特に本発明は、保存安定性が増したＡＭＶ逆転写酵素を含む核酸増幅試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中に含まれる標的核酸を核酸増幅反応により増幅するための試薬（核酸増幅試薬）に求められる性能の一つとして、長期保管による増幅性能の差異がないことがあげられる。しかしながら核酸増幅試薬に含まれる核酸合成酵素は、室温や冷蔵条件下で酵素活性が著しく低下することが知られている。そのため、核酸増幅試薬の製造、輸送、および貯蔵においては、核酸合成酵素の活性をいかに保持するかが重要な課題となっている。
【０００３】
そのため試薬は冷凍輸送したり、凍結乾燥や風乾などを行って保存安定性を増した試薬形態が必要とされている。特にＡＭＶ逆転写酵素においてはトレハロースを含む溶液を蒸発乾燥させて得られた試薬が保存安定性に優れていることが既に知られている（特許文献１）。
しかし、輸送や使用期限、保管温度などの観点からさらに保存安定性が増した試薬が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１５−９２８７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、保存安定性が増したＡＭＶ逆転写酵素を含む溶液を蒸発乾燥させた試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）少なくともＡＭＶ逆転写酵素とトレハロースとシクロデキストリンを含む溶液を蒸発乾燥して得られる、核酸増幅試薬。
（２）さらに以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれか一つ以上を含む、（１）に記載の核酸増幅試薬。
（ｉ）ＲＮＡポリメラーゼ
（ｉｉ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸およびリボヌクレオチド三リン酸
（ｉｉｉ）標的核酸を増幅させるためのオリゴヌクレオチド
（３）シクロデキストリンがγ‐シクロデキストリンまたはその誘導体である、（１）または（２）に記載の核酸増幅試薬。
（４）シクロデキストリン誘導体が炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基を有するγ‐シクロデキストリンである、（３）に記載の核酸増幅試薬。
（５）炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基を有するγ−シクロデキストリンが、２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンである、（４）に記載の核酸増幅試薬。
（６）核酸増幅がＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法のいずれかである、（１）から（５）のいずれかに記載の核酸増幅試薬。
【０００８】
以下に本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明中において蒸発乾燥とは、被乾燥物の溶液（  つまりＡＭＶ逆転写酵素とトレハロースとシクロデキストリンを含む溶液）を減圧下におき、当該被乾燥物がガラス状態または高い粘度を示す液体になるまで水分を蒸発させることをいい、大気圧下で水分を蒸発させる風乾や、被乾燥物の溶液を凍結させてから減圧下で乾燥させる凍結乾燥とは異なる方法である。蒸発乾燥の条件に特に限定はなく、一例として、１０ｋＰａから５８０ｋＰａの減圧条件下、２０℃から４０℃で３時間から２４時間乾燥させた後、４０℃から６０℃で１時間から５時間乾燥させる方法があげられる。なお蒸発乾燥条件の好ましい一例として、１０ｋＰａから２０ｋＰａの減圧条件下、２０℃から３０℃で１１時間から２４時間乾燥させた後、４０℃から５５℃で１時間から４時間乾燥させる方法があげられる。また蒸発乾燥を行なう際、被乾燥物周辺の環境湿度を低値に維持すると、効率的に被乾燥物溶液中の水分を蒸発できる点で好ましいが、特に環境湿度に関する限定はない。なお蒸発乾燥後は、吸湿を防ぐため、本発明の核酸増幅試薬を収容した容器を直ちにアルミシールなどにより密封すると好ましい。
【００１０】
本発明の核酸増幅試薬は、ＡＭＶ逆転写酵素とトレハロース、シクロデキストリンを少なくとも含んでいればよく、その他の酵素、基質、色素、賦形剤を含んでいてもよい。酵素としてはＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素などの逆転写酵素や、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントなどのポリメラーゼや、ＲＮａｓｅＨなどの核酸分解酵素などが例示できる。なお本発明の核酸増幅試薬がＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といったＲＮＡを増幅する反応を用いている場合、本発明の核酸増幅試薬にＲＮＡポリメラーゼが含まれているとより好ましい。基質は酵素が必要とするものであればいずれのものでも良いが、具体的にはデオキシリボヌクレオチド三リン酸、リボヌクレオチド三リン酸、およびこれらの誘導体が例示できる。色素としては試薬に色を付ける指示薬、例えばブロモチモールブルー、フェノールレッドなどが例示でき、さらに核酸増幅を示すためにインターカレーター式蛍光色素やポリスチレンや金コロイドなどの着色粒子も例示できる。中でも、インターカレーター式蛍光色素により標識され、かつ標的核酸またはその相補鎖にハイブリダイズすることで、前記インターカレーター式色素部分がインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計オリゴヌクレオチドプローブは、増幅と検出を同時に実施できるため特に好ましい。賦形剤としては通常用いられる糖類、水溶性高分子、タンパク質などが例示できる。
【００１１】
本発明において標的核酸を増幅させるためのオリゴヌクレオチドは、増幅する標的核酸の相補鎖と特異的にハイブリダイズ可能な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、逆転写酵素やポリメラーゼにより標的核酸の増幅が可能なオリゴヌクレオチドのことをいう。
【００１２】
本発明においてトレハロースの濃度については特に限定はないが、６０ｍＭから６００ｍＭまでの範囲内が好ましい。
本発明においてシクロデキストリンの濃度については特に限定はないが、１％（ｗ／ｗ）から２０％（ｗ／ｗ）が好ましく、さらに５％（ｗ／ｗ）から１０％（ｗ／ｗ）がより好ましく、さらに７．５％（ｗ／ｗ）から８．５％（ｗ／ｗ）がより好ましい濃度として例示できる。
【００１３】
本発明においてシクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、およびこれらの誘導体から選択されるいずれでもよいが、γ−シクロデキストリン、またはその誘導体が好ましい。γ−シクロデキストリンの誘導体は特に限定はされないが、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基を有するγ−シクロデキストリンが例示できる。さらに炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基を有するγ−シクロデキストリンとしては、特に限定はされないが、例えば
１−ヒドロキシメチル基  
１−ヒドロキシエチル基  
２−ヒドロキシエチル基  
１−ヒドロキシプロピル基  
２−ヒドロキシプロピル基  
３−ヒドロキシプロピル基  
２−ヒドロキシ−１−メチル−エチル基  
１−ヒドロキシブチル基  
２−ヒドロキシブチル基  
３−ヒドロキシブチル基  
４−ヒドロキシブチル基  
１−ヒドロキシ−２−メチル−プロピル基  
２−ヒドロキシ−１−メチル−プロピル基  
３−ヒドロキシ−１−メチル−プロピル基  
１−ヒドロキシ−２−メチル−エチル基  
２−ヒドロキシ−１，２−ジメチル−エチル基
１，２−ジヒドロキシ−エチル基  
１，２−ジヒドロキシ−プロピル基  
２，３−ジヒドロキシ−プロピル基  
１，２−ジヒドロキシ−ブチル基  
２，３−ジヒドロキシ−ブチル基  
３，４−ジヒドロキシ−ブチル基  
１，２，３−トリヒドロキシ−ブチル基  
２，３−ジヒドロキシ−１−メチル−プロピル基
等を有するγ−シクロデキストリンがあげられる。中でも１−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基が好ましく、とりわけ２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、少なくともＡＭＶ逆転写酵素とトレハロースとシクロデキストリンを含む溶液を蒸発乾燥して得られる、核酸増幅試薬に係る発明である。本発明により、核酸増幅試薬、特にＡＭＶ逆転写酵素を含む核酸増幅試薬の保存安定性が増すことができる。
【実施例】
【００１５】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００１６】
実施例１  標準ＲＮＡ調製
マイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１）に基づき人工的に２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を作製し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、後述の実施例で使用する標準ＲＮＡを調製した。なお調製した各標準ＲＮＡの定量は、２６０ｎｍにおける吸光度を基に実施した。
【００１７】
実施例２  インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
下記（Ａ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと記載する）を特開２０００−３１６５８７号公報で開示の方法に基づき作製した。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２１９３番目から２２０８番目までの塩基配列）のオリゴヌクレオチドの５’末端から４番目のグアニンと５番目のシトシンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識したもの。
【００１８】
実施例３  核酸増幅試薬の作成
表１に示す、第一のプライマー、第二のプライマーおよびＩＮＡＦプローブの組み合わせを用いて、以下に示す方法で核酸増幅試薬を作成した。なお表１に記載のＩＮＡＦプローブは実施例２で作製したプローブである。
（１）以下の組成からなる溶液（２０μＬ）を市販の０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製品）に分注しシクロデキストリン（−）試薬とした。
【００１９】
増幅試薬の組成：濃度はＲＮＡ試料および開始液の添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３５）
１５０ｍＭ  トレハロース
各０．４８ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２  ．１ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．２ｍＭ  ＩＴＰ
０．２μＭ  第一のプライマー（配列番号２）
０．２μＭ  第二のプライマー（配列番号３）
１００ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製したもの）
０．０２５ｍｇ／ｍＬ  牛血清アルブミン
１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
（２）（１）に示した溶液にさらに以下の試薬を加えた組成からなる溶液（２０μＬ）を市販の０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブに分注しシクロデキストリン（＋）試薬とした。
８．２％（ｗ／ｖ）２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン
【００２０】
（３）シクロデキストリン（−）試薬およびシクロデキストリン（＋）試薬を、それぞれアルミラックにセットし、棚式凍結乾燥機（ＡｄＶａｎｔａｇｅＰｌｕｓＥＬ−８５、Ｖｉｒｔｉｓ社製）に入れて蒸発乾燥を行なった。蒸発乾燥は、減圧度が１２ｋＰａから１４ｋＰａになるように制御のもと、棚温度２５℃で１２時間、続いて棚温度５０℃で２時間、行なった。
（４）蒸発乾燥後、ＰＣＲ用チューブを取り出して、蒸発乾燥体が吸湿しないよう、直ちにアルミシールにて密封した。
【００２１】
実施例４  核酸増幅試薬の安定性評価
実施例３で作成したシクロデキストリン（−）試薬およびシクロデキストリン（＋）試薬の蒸発乾燥体の安定性を以下に示す方法で評価した。
（１）実施例１で調製した標準試料を終濃度１０００コピー／テストになるように、それぞれ以下の組成からなる抽出液で希釈し、これらを検出試料として用いた。
【００２２】
抽出液の組成：  濃度は３０μＬ中の最終濃度
２１．０ｍＭ  塩化マグネシウム
１０５．０ｍＭ  塩化カリウム
１０．０７％  ＤＭＳＯ
（２）実施例３で作成したシクロデキストリン（−）試薬およびシクロデキストリン（＋）試薬の蒸発乾燥体を内抱するＰＣＲ用チューブを温度４０℃、相対湿度（ＲＨ）５％以下の条件で表２に示す期間貯蔵した。
（３）一定期間貯蔵後のＰＣＲ用チューブに、（１）で調製した検体試料３０μＬを、添加、混合した。
（４）引き続きＰＣＲ用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度を経時的に２０分間測定した。
【００２３】
検体試料を加え撹拌を終えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．５を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表２に示す。表２の「Ｎ．Ｄ．」は反応開始後２０分後の蛍光強度比が１．５以下（陰性判定）であったことを意味する。
【００２４】
その結果、４０℃で保存した場合、シクロデキストリン（−）試薬は検出時間に遅れが生じ劣化が認められたが、シクロデキストリン（＋）試薬は９６時間後でも劣化は認められず、シクロデキストリン（−）試薬と比較して保存安定性が増していることが示された。
【００２５】
【表１】
2018201414.tif 000002
【００２６】
【表２】
2018201414.tif 000003
【配列表】
2018201414000001.app