(57)【要約】【課題】細胞に損傷を与えることなく細胞を捕捉し、細胞懸濁液の細胞捕捉チップの孔における通過速度を向上させる。【解決手段】主面として第１面１１および第２面１２と、第１面１１から第２面１２に向けて貫通する、単一細胞を捕捉可能な貫通孔１３と、を有する基板１１からなり、貫通孔１３は、その内部において、第１面１１の開口径および第２面１２の開口径よりも径の小さいくびれ部を有し、かつ、くびれ部を境界とする第２面側内壁が、前記第１面側から前記第２面側に液体の通過を促進させる親水化処理面である細胞捕捉チップ１０。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
主面として第１面および第２面と、前記第１面から前記第２面に向けて貫通する、単一細胞を捕捉可能な貫通孔と、を有する基板からなり、
前記貫通孔は、その内部において、前記第１面の開口径および前記第２面の開口径よりも径の小さいくびれ部を有し、かつ、前記くびれ部を境界とする第２面側内壁が、前記第１面側から前記第２面側に液体の通過を促進させる親水化処理面であることを特徴とする細胞捕捉チップ。
【請求項２】
主面として第１面および第２面と、前記第１面から前記第２面に向けて貫通する、単一細胞を捕捉可能な貫通孔と、を有する基板からなり、
前記貫通孔は、その内部において、前記第１面の開口径および前記第２面の開口径よりも径の小さいくびれ部を有し、かつ、前記くびれ部を境界とする第２面側内壁が、純水の滴下直後の動的接触角が３０度以下となる親水化処理面であることを特徴とする細胞捕捉チップ。
【請求項３】
前記くびれ部を境界とする第２面側内壁の親水性が、前記第１面側内壁の親水性より高いまたは同等である請求項１または２に記載の細胞捕捉チップ。
【請求項４】
前記第２面側内壁が、純水の滴下直後の動的接触角が１５度以下となる親水処理面である請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップ。
【請求項５】
前記第２面が純水の滴下直後の動的接触角が３０度以下となる親水化処理面である請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップ。
【請求項６】
前記親水化処理面がプラズマ処理面である請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップ。
【請求項７】
前記親水化処理面がシリカコート膜を有してなる請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップ。
【請求項８】
前記基板の板厚が、５０〜５００μｍである請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップ。
【請求項９】
前記貫通孔が、前記第１面から前記くびれ部に向かっておよび前記第２面から前記くびれ部に向かって、それぞれ所定の傾斜角度を有して径が小さくなっており、該傾斜角度が２０〜６０度である請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップ。
【請求項１０】
前記くびれ部の径が１〜３０μｍである請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップ。
【請求項１１】
前記貫通孔が、格子状配置または千鳥配置として、整列して形成されている請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップ。
【請求項１２】
前記基板が、ガラス基板である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップ。
【請求項１３】
主面として第１面および第２面と、前記第１面から前記第２面に向けて貫通し、その内部において、前記第１面の開口径および前記第２面の開口径よりも径の小さいくびれ部を有する単一細胞を捕捉可能な貫通孔と、を有する基板に対し、
前記貫通孔の前記くびれ部を境界とする第２面側内壁に、前記第１面側から前記第２面側に液体の通過を促進させる親水化処理を施すことを特徴とする細胞捕捉チップの製造方法。
【請求項１４】
主面として第１面および第２面と、前記第１面から前記第２面に向けて貫通し、その内部において、前記第１面の開口径および前記第２面の開口径よりも径の小さいくびれ部を有する単一細胞を捕捉可能な貫通孔と、を有する基板に対し、
前記貫通孔の前記くびれ部を境界とする第２面側内壁に、純水の滴下直後の動的接触角が３０度以下となる親水化処理を施すことを特徴とする細胞捕捉チップの製造方法。
【請求項１５】
前記親水化処理が、プラズマ照射である請求項１３または１４に記載の細胞捕捉チップの製造方法。
【請求項１６】
前記親水化処理が、シリカコートである請求項１３または１４に記載の細胞捕捉チップの製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップの前記第１面に、細胞懸濁液を滴下して、前記貫通孔に単一細胞を捕捉させることを特徴とする細胞捕捉方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞懸濁液から単一細胞を捕捉可能で、細胞の性状や機能などの解析に好適な細胞捕捉チップ、その製造方法および細胞捕捉方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、下記特許文献１〜４に開示されているように、基板に多数の孔を２次元配列して、各孔に細胞を捕捉することで、孔の座標により細胞を特定してその性状や機能の分析を行うことが知られている。
【０００３】
特許文献１において、Ｓｉ基板に細胞を捕捉する碗状凹部とその底部に連続する吸引孔から成る多数の貫通孔を２次元配列した細胞捕捉チップが知られている。この細胞捕捉チップでは、吸引孔からの吸引により細胞が碗状凹部に捕捉される。また、特許文献２によると、特許文献１に開示された構造と同様に、碗状凹部とその底部に連続する径のより小さな貫通孔とを有した構造において、碗状凹部の内壁面の一部は疎水処理が、貫通孔の内壁面には親水処理が施されている。貫通孔に液体が入り込む毛細管現象を利用して細胞を碗状凹部に捕捉するものである。
【０００４】
また、特許文献３においては、基板をＰＥＴ樹脂として、２次元配列させる孔を、細胞を取り入れる側の開口の径が液体を流出させる側の開口の径よりも小さい、反すり鉢状とし、細胞懸濁液を孔に導入する流路内面を非イオン性活性剤で処理することが行われている。これにより孔の吐出口から吸引することによる細胞の破壊の防止と、導入流路に細胞が付着することが防止されている。
【０００５】
さらに、特許文献４においては、細胞を捕捉する孔を２次元配列させたマイクロアレイチップにおいて、基板をポリスチレンなどの疎水性材料で構成した場合には、基板の表面を酸素プラズマ処理などの親水化処理を施すことが望ましく、基板をガラスなどの親水材料で構成した場合には、基板表面を親水化処理することが必要ではないとしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−２２２１３２号公報
【特許文献２】特許第５０８１８５４号公報
【特許文献３】特許第５２７８９１３号公報
【特許文献４】特許第５７７７０４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記特許文献１、３に開示のマイクロアレイチップは、孔の吐出口から吸引することで、細胞を孔に捕捉するチップであるので、細胞に損傷を与えるという問題があった。また、特許文献２によると細胞を捕捉する径の大きな碗状凹部とその底部に連続する径のより小さな貫通孔とを設けることが必要であり、さらには、碗状凹部には疎水処理、貫通孔には親水処理を必要とするために、加工が複雑になるという問題がある。また、特許文献４に開示のマイクロアレイチップは、樹脂製基板の表面にプラズマを照射して、接触角が所定範囲に制御された親水性を持たせることで、基板表面に細胞懸濁液を滴下して孔に細胞を捕捉するようにしている。しかしながら、基板表面における細胞懸濁液の流動性は向上しても、孔内部での親水性については示唆がなく、細胞懸濁液における分散媒の通過速度が未だ高くないという問題がある。
【０００８】
そこで、本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、細胞に損傷を与えることなく細胞を捕捉し、細胞捕捉チップの孔において細胞懸濁液における分散媒の通過速度を向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の細胞捕捉チップは、主面として第１面および第２面と、前記第１面から前記第２面に向けて貫通する、単一細胞を捕捉可能な貫通孔と、を有する基板からなり、前記貫通孔は、その内部において、前記第１面の開口径および第２面の開口径よりも径の小さいくびれ部を有し、かつ、前記くびれ部を境界とする第２面側内壁が、前記第１面側から前記第２面側に液体の通過を促進させる親水化処理面であることを特徴とする。
【００１０】
本発明の他の細胞捕捉チップは、主面として第１面および第２面と、前記第１面から前記第２面に向けて貫通する、単一細胞を捕捉可能な貫通孔と、を有する基板からなり、前記貫通孔は、その内部において、前記第１面の開口径および第２面の開口径よりも径の小さいくびれ部を有し、かつ、前記くびれ部を境界とする第２面側内壁が、純水の滴下直後の動的接触角が３０度以下となる親水化処理面であることを特徴とする。
【００１１】
本発明の細胞捕捉チップの製造方法は、主面として第１面および第２面と、前記第１面から前記第２面に向けて貫通し、その内部において、前記第１面の開口径および前記第２面の開口径よりも径の小さいくびれ部を有する単一細胞を捕捉可能な貫通孔と、を有する基板に対し、前記貫通孔の前記くびれ部を境界とする第２面側内壁に、前記第１面側から前記第２面側に液体の通過を促進させる親水化処理を施すことを特徴とする。
【００１２】
本発明の他の細胞捕捉チップの製造方法は、主面として第１面および第２面と、前記第１面から前記第２面に向けて貫通し、その内部において、前記第１面の開口径および前記第２面の開口径よりも径の小さいくびれ部を有する単一細胞を捕捉可能な貫通孔と、を有する基板に対し、前記貫通孔の前記くびれ部を境界とする第２面側内壁に、純水の滴下直後の動的接触角が３０度以下となる親水化処理を施すことを特徴とする。
【００１３】
本発明の細胞捕捉方法は、上記本発明の細胞捕捉チップの前記第１面に、細胞懸濁液を滴下して、前記貫通孔に単一細胞を捕捉させることを特徴とする。
【００１４】
なお、本明細書において「親水化処理面」とは、上記基板において親水化処理を施された面を言い、処理前よりも処理後において親水性が高められたものを指す。このような親水化処理面は、例えば、貫通孔において、上記基板の第１面側から第２面側への液体の通過を促進させるために設けられる。また、この親水化処理面の親水性は、動的接触角測定によって評価される。なお、本明細書における動的接触角測定は、細胞捕捉チップの基板とは、貫通孔のあいていない点のみ異なる単なる平板状の基板表面に、純水を滴下した直後の動的接触角を測定して行われる。
【００１５】
この動的接触角の測定は、基板の側面にＣＣＤカメラ等の撮像装置を設置し、基板の主面上に滴下された純水の状態を経時的に観察して行う。上記発明における動的接触角は、滴下直後（滴下後０秒）の撮影画像における接触角をいう。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の細胞捕捉チップ、細胞捕捉チップの製造方法および細胞捕捉方法によれば、吸引などの外力を用いることなく貫通孔に細胞懸濁液における分散媒を通過させると共に、目的とする細胞をトラップできるため、細胞に損傷を与えることなく該貫通孔に細胞を捕捉できる。さらに、本発明の細胞捕捉チップは、貫通孔における細胞懸濁液の通過速度を向上させたものであるため、細胞の捕捉操作を効率的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】本発明の一実施例に係る細胞捕捉チップの構成を示した平面図。
【図１Ｂ】図１Ａに示した細胞捕捉チップのＡ−Ａ断面図。
【図１Ｃ】図１Ａに示した貫通孔１３を説明するための拡大図。
【図２】孔あき基板のミクロな接触角について説明する図。
【図３】ミクロな接触角αとマクロな接触角βとの関係を示したグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明について図面を参照しながら詳細に説明する。なお、本発明は下記の実施形態に限定されるものではない。
【００１９】
＜細胞捕捉チップ＞
本発明の一実施形態である細胞捕捉チップ１０は、図１Ａおよび図１Ｂに示したように孔あき基板からなり、この孔あき基板は、主面として、第１面１１と第２面１２とを有し、さらに、この第１面１１から第２面１２に向けて貫通する、単一細胞を捕捉可能な貫通孔１３、を有する板状体である。なお、図１Ａは、本発明の一実施形態である細胞捕捉チップ１０の平面図を、図１Ｂは、図１Ａに示した細胞捕捉チップ１０のＡ−Ａ断面図を示している。また、図１Ｃは、図１Ａおよび図１Ｂに示した貫通孔１３を説明するための拡大図である。
【００２０】
この細胞捕捉チップ１０は、細胞を捕捉するために用いられ、一方の主面（第１面１１）に細胞懸濁液を滴下した際、細胞懸濁液における分散媒は貫通孔１３を通過し、他方の主面（第２面１２）から排出され、細胞懸濁液中に含まれる細胞を貫通孔１３に捕捉する。すなわち、この細胞捕捉チップ１０はフィルターとして用いられる。なお、本明細書において「分散媒」とは、上記のように細胞懸濁液において、細胞を分散させている液体成分をいう。
【００２１】
このような用途に適するように、細胞捕捉チップ１０を構成する孔あき基板は平板状であり、その厚さは５０μｍ〜５００μｍが好ましく、７５μｍ〜４００μｍがより好ましく、１００μｍ〜３００μｍが特に好ましい。孔あき基板の厚さが５０μｍ以上であればハンドリング性が良好で、５００μｍ以下であれば圧力損失を不必要に大きくすることなく細胞懸濁液を通過させることができ、また、孔加工する際にも加工量が減少するため好ましい。
【００２２】
この細胞捕捉チップ１０は、細胞懸濁液が上記貫通孔１３を通過でき、その際、貫通孔１３に単一細胞を捕捉できるものであれば、その材質は特に限定されずに使用できる。ここで用いることができる材質としては、例えば、ガラス、樹脂、セラミックス、金属等が挙げられ、なかでも細胞を観察する観点からは、透明であり、自家蛍光が少ないガラスが好ましい。
【００２３】
第１面１１、第２面１２は共に、上記したように、細胞捕捉チップ１０の主面であり、本明細書では、第１面１１は、細胞懸濁液が滴下、供給される面であり、第２面１２は、貫通孔１３を通過した細胞懸濁液における分散媒が排出される面とする。
【００２４】
貫通孔１３は、上記第１面１１から上記第２面１２に向かって貫通しており、この貫通孔１３は、その内部に、第１面１１における開口径および第２面１２における開口径よりも径の小さいくびれ部を有している。このように、開口径は大きくしながら、径の小さい部分を基板内部に形成することで、単一細胞を貫通孔の形成部分に誘導すると共に、該貫通孔による捕捉を可能としている。
【００２５】
ここで、図１Ｃには、細胞捕捉チップ１０に設けられた貫通孔１３の拡大図を示した。図１Ｃの（ａ）は貫通孔１３における内壁とくびれ部の位置を説明するための図であり、図１Ｃの（ｂ）は貫通孔１３の径と内壁の傾斜角度θを説明するための図であり、図１Ｃの（ｃ）は、貫通孔１３において、細胞懸濁液滴下後の第２面側内壁１３ｂにおける分散媒の状態を説明する図である。
【００２６】
図１Ｃの（ａ）に示したように、貫通孔１３は、第１面側内壁１３ａと、第２面側内壁１３ｂと、くびれ部１３ｃと、から構成される。第１面側内壁１３ａと第２面側内壁１３ｂとは、くびれ部１３ｃを境界として分けられる。
【００２７】
この貫通孔１３は、第１面１１からくびれ部１３ｃに向かって徐々に径が狭くなる逆円錐形状の孔と、くびれ部１３ｃから第２面１２に向かって徐々に径が広くなる円錐形状の孔が連通して形成されている。
【００２８】
図１Ｃ（ａ）〜図１Ｃ（ｃ）では、このくびれ部１３ｃは基板の細胞捕捉チップ１０の厚さ方向における中心位置に設けられ、第１面側内壁１３ａと第２面側内壁１３ｂとがくびれ部１３ｃを挟んで対称となる形状に形成されている。
【００２９】
ただし、このくびれ部１３ｃは、上記中心位置に限定されず、基板の板厚方向において、第１面１１側に近くても、第２面１２側に近くても、いずれでもよい。例えば、図１Ｃ（ｂ）に示したように、第１面１１から第２面１２までの板厚をＬとしたとき、くびれ部の位置は、０．２Ｌ〜０．８Ｌの範囲が好ましく、０．３Ｌ〜０．７Ｌの範囲がより好ましく、０．４Ｌ〜０．６Ｌの範囲がさらに好ましい。
【００３０】
このくびれ部の径ｒｃは、細胞懸濁液の種類、捕捉対象とする細胞の種類、大きさ、変形能力等により、単一の細胞が捕捉できるように適宜設定できる。このくびれ部の径ｒｃとしては、例えば、１〜３０μｍの範囲が好ましく、５〜２０μｍがより好ましい。
【００３１】
貫通孔１３の第１面の開口径ｒ１および第２面の開口径ｒ２は、くびれ部の径ｒｃよりも大きい径である。これら開口径ｒ１およびｒ２は、それぞれ独立に、５０〜２００μｍが好ましく、６０〜１５０μｍがより好ましく、７０〜１００μｍがさらに好ましい。また、くびれ部の径ｒｃの径に対して、４〜２０倍が好ましく、６〜１６倍がより好ましく、８〜１２倍がさらに好ましい。
【００３２】
このように、くびれ部の径ｒｃに対して、第１面の開口径ｒ１を大きくすることで、捕捉したい細胞を貫通孔１３ｃに導入しやすくすると共に、圧力損失を増大させないようにできる。また、くびれ部の径ｒｃに対して、第２面の開口径ｒ２を大きくすることで、同様に圧力損失を増大させないようにすると共に、細胞懸濁液における分散媒を排出しやすくできる。
【００３３】
また、貫通孔１３が図１Ａ〜図１Ｃに示した、２つの円錐状の頂点を重ねて結合したような砂時計型の形状である場合、第１面側内壁１３ａおよび第２面側内壁１３ｂのそれぞれの傾斜面について、細胞懸濁液における分散媒を自律的に第１面から第２面へ移動させ、排出を促進できる理由について、以下説明する。
【００３４】
まず、図１Ｃ（ｂ）に示すように、径ｒｃのくびれ部１３ｃから径ｒ２の第２面開口に向かう第２面側内壁１３ｂにおいて、その壁面の貫通孔１３の軸に対する傾斜角度を傾斜角θと定義する。別の表現をすれば、図１Ｃ（ｂ）は貫通孔１３の中心軸に沿って切断した断面図を表すが、傾斜角θは、その断面図における第２面側内壁１３ｂの切断線と貫通孔１３の軸とのなす角度と言うこともできる。
【００３５】
図１Ｃに示した第２面側内壁１３ｂのような、下方に末広がりのテーパー孔形状（円錐の逆形状）において、くびれ部１３ｃから第２面１２の開口に向かって分散媒が移動する際の原理について、図１Ｃ（ｃ）を参照しながら以下説明する。この分散媒の移動に際して、分散媒は、その表面エネルギーγにより、第２面側内壁１３ｂではミクロな接触角α１をもって、メニスカス凹面（第２面１２に向かって凹面を有する）を形成する。ここでミクロな接触角α１は、第２面側内壁１３ｂにおけるミクロな接触角を表す。このミクロな接触角α１も含めミクロな接触角αについては後述する。このメニスカス凹面の曲率半径をＲとすれば、毛管力は２γｃｏｓ（α１）／Ｒとなり、主に分散媒の表面エネルギーにより決定されることがわかる。また、表面エネルギーは分散媒の物性値で決まるが、この毛管力はミクロな接触角α１によっても大きく影響されることがわかる。
【００３６】
ここで、第２面１２から分散媒の排出を促進するためには、毛管力とメニスカス凹面の曲率半径Ｒがそれぞれ所定の範囲であることが必要とされる。メニスカス凹面の曲率半径Ｒが顕著に小さいと、開口の中心位置での液面の凹面の凹み変位量が大きくなり、第２面１２での分散媒の排出促進が難しくなる。一方で、メニスカス凹面の曲率半径Ｒが大きすぎると毛管力が不足して、やはり分散媒の排出の促進が難しくなってしまう。
【００３７】
そこで、上記傾斜角θを考慮すれば、ミクロな接触角α１とは、傾斜面に対して接触角α１が構成されるので、傾斜角θが大きいほど凹面の曲率半径Ｒが大きくなる。すなわち、ミクロな接触角α１が表面の特性で決まっていると、傾斜角θに接触角α１を加えた形で、メニスカス凹面が形成される。例えば、親水化処理されたガラスのミクロな接触角α１を１５度とすれば、傾斜角θをもたない直管では、メニスカス凹面が顕著であり、開口の中心位置での液面の凹面の凹み変位量が大きい（つまり、液面の曲率半径Ｒが小さい）。
【００３８】
一方で、傾斜角θをもうけると、実質（α１＋θ）の角度のメニスカス凹面を形成できるので、開口中心での凹み変位を小さくできる。そのため、毛管力で駆動された分散媒を第２面の面位置になるべく近くすることができ、第２面からの分散媒の排出を促進することができる。
【００３９】
しかし、傾斜角θをあまり大きくしてしまうと開口部面積が大きくなることで孔密度が低くなってしまいフィルター用途には不適となる。これらのことを鑑みて、第２面側内壁１３ｂは２０〜６０度の傾斜角θを有するように形成されることが好ましい。この傾斜角θは３０〜５５度がより好ましく、３５〜５０度がさらに好ましい。
また、この第１面側内壁１３ａと第２面側内壁１３ｂの傾斜面の角度は、それぞれ独立に設けてもよい。
【００４０】
そして、本実施形態においては、貫通孔１３の第２面側内壁１３ｂが親水化処理面であることを特徴とする。
ここで、本明細書において「親水化処理面」とは、上記基板において親水化処理を施された面を言い、処理前よりも処理後において親水性が高められたものを指す。このような親水化処理面は、本発明の１実施形態によれば、貫通孔１３において、上記基板の第１面１１側から第２面１２側への液体の通過を促進させるために設けられる。また、この親水化処理面の親水性は、動的接触角測定によって評価される。なお、本明細書における動的接触角測定は、細胞捕捉チップの基板とは、貫通孔のあいていない点のみ異なる単なる平板状の基板表面に、純水を滴下した直後の動的接触角を測定して行われる。本発明の一実施形態においては、この測定における動的接触角が３０度以下となる親水化処理面を有することが特徴である。
【００４１】
なお、貫通孔があいている基板でミクロな接触角αを測定しようとすると、貫通孔の形状や貫通孔ピッチの影響を受け、マクロな接触角βとなってしまう。そのため、本明細書においては、貫通孔のあいていない基板で同様の表面処理をした場合の動的接触角測定の測定結果により親水化処理面の性状を定義する。すなわち、ミクロな接触角αは、その評価対象の表面と同等の表面状態を有する、単なる平板状の基板表面で測定した動的接触角と同視できるものである。
このように第２面側内壁１３ｂが親水性を有することで、細胞懸濁液における分散媒の通過を促進させることができ、通過速度を向上できる。
【００４２】
以下、マクロな（見かけの）接触角βとミクロな接触角αの関係性について説明する。
細胞捕捉チップ１０の第１面１１、第２面１２にはそれぞれ開口が設けられているため、数μｌの微量な分散媒を基板上に滴下して計測されるマクロな接触角βは、開口の傾斜角θに大きく依存する。Ｃａｓｓｉｅによって異なる接触角αＣ（１）ならびにαＣ（２）をもつ物質が混在している表面では、それらの占有率ｆ１ならびにｆ２によって、マクロな接触角βＣがｃｏｓ（βＣ）＝ｆ１ｃｏｓ（αＣ（１））＋ｆ２ｃｏｓ（αＣ（２））で表されるとした。
【００４３】
そこで、孔が設けられた基板表面における接触角について以下説明する。
まず、図２のように、例えば、基板に、ピッチ１００μｍで開けられたφ８０μｍの開口をもつ孔が設けられており、基板表面と孔内壁との表面状態（親水性）が同一であって、該基板に分散媒の液滴がφ５００μｍ以上で表面に滴下された場合のマクロな接触角βについて説明する。
【００４４】
なお、マクロな接触角βを説明するにあたって、先にミクロな接触角αについて説明する。図２（ａ）には、開口径と同じ径で垂直に開けられた孔（貫通していない）の場合、図２（ｂ）に図１Ａ〜１Ｃに示したテーパー状の孔（貫通している）の場合、における各部におけるミクロな接触角について示している。
【００４５】
まず、図２（ａ）に示す垂直に開けられた孔の場合について説明する。この図２（ａ）の（１’）平坦部ではミクロな接触角αをもっている。これは孔の形成されていない平板状の基板表面における動的接触角と同視できる。また、図２（ａ）、（ｂ）において、基板表面に円弧状の実線で示したのは、純水の液滴の輪郭を表し、その輪郭の接線（破線）はミクロな接触角αを示すものである。次に（２’）平坦部と孔との境界部分においては、垂直に開けられた孔の場合境界に達した時点で、αに孔の側面の傾斜角度（９０度）が加わり、（９０＋α）度になり、（３’）内壁面に接している状態では、（２’）と同様に（９０＋α）度である。さらに、（４’）反対の内壁面では、メニスカス凹面になるため、開口は液体で満たされ、再び平坦面での接触角を示す。
【００４６】
図２（ｂ）においても同様に考えれば、（１）平坦部ではミクロな接触角αをもっている。（２）テーパー状の孔の境界部では壁面の傾斜角θにより、ここで加えられる角度は（９０−θ）度であり、（９０−θ＋α）度が見かけの接触角となり、（３）内壁面（くびれ部の境界まで）では（２）と同様に（９０−θ＋α）度である。さらに、（４）くびれ部より先では凹面になるため、液体が満たされ再度接触角αとなる。
【００４７】
そのため、分散媒の液滴の液体−基板界面の周辺長、接触線が、どの程度開口の影響を受けるかを見積もれればよい。開口の平均ピッチをｐとして、平坦部の占める長さの比率で、マクロな接触角βが見積もられる。ミクロな接触角α（α１）を１０度として、傾斜角θを３０度、平均ピッチｐを１２０μｍ、開口径ｒの半分で（９０−θ＋α）度になるとすれば、ｃｏｓ（β）＝（１−ｒ／２ｐ）ｃｏｓ（α）＋（ｒ／２ｐ）ｃｏｓ（９０−θ＋α）である。そのため、接触面周囲の外周長に平均ピッチで貫通孔からなる微細構造が形成されていると近似すれば、ｐと孔の占有率のみで考えてよい。
【００４８】
この観点から、図３には基板面のミクロな接触角αを横軸にとったときに、傾斜角θを３０度，４５度，６０度とした場合に、マクロな接触角βがどう生じるかを見積もったグラフを示した。図３から分かる通り、マクロな接触角βは、傾斜角θに強く依存した接触角として計測されることとなる。しかしながら、ミクロな接触角αが低くなければ、計測したマクロな接触角βも小さくならない。そのため、上記仮想的に見積もった条件において、本発明の目的とする分散媒の通過速度を有意に向上させるために好ましいマクロな接触角βは５５度以下である。
【００４９】
このとき、第２面側内壁１３ｂの親水性は、第１面側内壁１３ａの親水性より高いか、または、第１面側内壁１３ａの親水性と同等であることが好ましい。なお、本明細書において、親水性が同等とは、その接触角の差が±１０％の範囲内であることをいう。
【００５０】
さらに、第２面側内壁１３ｂだけでなく、基板の主面である第２面１２も親水化処理面とすることが好ましい。具体的には、第２面が純水の滴下直後の動的接触角が３０度以下となる親水化処理面であることが好ましい。このように、第２面側内壁１３ｂおよび第２面１２が共に良好な親水性を有する場合、さらに、細胞懸濁液の通過を促進し、通過速度を向上できる。第２面１２の親水性は、第２面側内壁１３ｂの親水性と同等または第２面側内壁１３ｂの親水性の方が高いことが好ましい。
【００５１】
また、基板の主面である第１面１１も親水化処理面としてもよい。このとき、第１面１１ａの親水性は、第２面１２の親水性と同等または第２面１２の親水性の方が高いことが好ましい。
【００５２】
このような親水化処理面としては、プラズマ照射により表面が改質されたプラズマ処理面、親水性の良好なシリカ膜等をコーティングしたシリカコート面、等が挙げられる。
【００５３】
そして、このような細胞捕捉チップ１０は、第２面側内壁１３ｂが上記動的接触角を満たす親水化処理面（すなわち、動的接触角が３０度以下）であることが好ましく、この動的接触角としては、２０度以下がより好ましく、１５度以下がさらに好ましい。この動的接触角を３０度以下とすることで、くびれ部１３ｃのような小さな径を有する貫通孔であっても、細胞懸濁液の通過速度を向上させることができる。
【００５４】
ここで、本実施形態における細胞捕捉チップ１０においては、純水を滴下すると経時的に接触角が変化していくため、ここで測定される接触角は動的接触角である。そして、本明細書においては、動的接触角として、純水を滴下した直後の動的接触角を所望の範囲とすることで、通液速度が良好な細胞捕捉チップが得られる。動的接触角の測定は、基板の側面にＣＣＤカメラ等の撮像装置を設置し、基板上に滴下された純水の状態を経時的に観察して行う。具体的には、撮影された画像において、変化する接触角を画像処理により所望のタイミングでの動的接触角を算出できる。
なお、親水化処理面がプラズマ処理面である場合、経時的に接触角が大きくなる（親水性が低下していく）方に変化していくため、上記動的接触角はプラズマ処理後３分以内に測定して決定する。
【００５５】
また、貫通孔１３は、基板に複数個を設けることが好ましい。複数個の貫通孔１３を設けるにあたっては、これらを整列して設けることが好ましい。このように整列し、貫通孔１３の基板上における位置を特定しておくことで、捕捉された細胞を特定でき、その後の観察、評価等を円滑に行うことができる。貫通孔１３は、基板の表面に２次元的に配列すればよく、例えば、格子状配置としたり、千鳥配置としたり、すればよい。図１Ａは、格子状配置の一例である。
【００５６】
この細胞捕捉チップの形状は、板状であれば特に限定されるものではなく、例えば、その平面視形状が三角形、四角形等の多角形や、真円、楕円等の円形等、様々な形状とできる。
【００５７】
また、この基板は、耐熱性、耐薬品性を有することが好ましい。細胞懸濁液を通液させるにあたって熱処理を行ったり、使用する懸濁液が酸性又はアルカリ性であったり、する場合においても、このような物理的及び化学的耐久性が良好であることで、安定して分離、捕捉操作を行うことができる。
【００５８】
＜細胞捕捉チップの製造方法＞
本発明の細胞捕捉チップは、例えば、平板状の基板に対して、レーザ照射や機械的処理により所望の孔形状を有する貫通孔を形成して孔あき基板とした後、孔あき基板の表面を親水化処理することで製造できる。以下、ガラス製の基板を用いた場合を例に説明する。
【００５９】
〈貫通孔の形成〉
まず、ガラス製の基板、例えば、無アルカリガラスを用意する。そして、このガラス基板に対して、貫通孔を設けたい箇所にレーザ照射、または、レーザ照射後フッ酸エッチングして貫通孔を形成する。貫通孔１３は、本発明においては特徴的な形状となっているため、例えば、次のように形成して所望の孔あき基板を得る。なお、ここで用いることができるガラスは、ソーダガラス、ホウ珪酸ガラス、石英ガラス、化学強化用ガラス等が挙げられる。
【００６０】
貫通孔１３の形成についてはこのガラス製の基板に、次のようにレーザ照射とフッ酸エッチングを用いて行うことができる。レーザには、例えば、Ｙｂ-ＫＧＷレーザ装置から出射されるパルス幅２３０ｆｓ〜１０ｐｓのレーザ（波長１０３０ｎｍ若しくは５１５ｎｍ、１５Ｗ）を用いることができる。レーザ照射は、例えば、レーザ装置から出射されたビーム径約４ｍｍのレーザパルスを、５倍〜２０倍の対物レンズでガラス基板１０に集光させ、１つの貫通孔１３当たりの照射を１パルス（２３０ｆｓ〜１０ｐｓ）とし、それによりガラス内部に改質ラインが板厚方向に形成させる。ガラスをＸＹステージに固定して、ＸＹステージを任意に動かしながら、貫通孔の形成箇所のそれぞれに上記レーザ照射を繰り返し行うことによって二次元配列された板厚方向に伸びる改質ライン群を得ることができる。
【００６１】
その後、改質ライン群が形成されたガラスを１％〜４５％フッ酸によりエッチングする。このエッチングを行うことで、改質ライン群が選択的にエッチングされるとともに、基板表面近傍と基板内部におけるエッチング速度及びエッチング量の差により、二次元配列された砂時計型の貫通孔を有する孔あき基板を作成できる。この時、フッ酸には塩酸や硝酸を添加物として加えてもよい。
【００６２】
なお、レーザ装置は上記以外にも同様のパルス幅、波長、出力を得られるものであればよく、また、対象となる基板の種類や貫通孔の大きさ等を変更した場合には、それに応じてレーザ照射の条件を所望の砂時計型の貫通孔が形成できるように適宜変更すればよく、これに限定されるものではない。さらに、エッチングについてもアルカリエッチング（ＮａＯＨ）等で行ってもよい。
【００６３】
〈親水化処理〉
本実施形態において、親水化処理は、上記得られた孔あき基板の表面において、親水性を高める処理である。ここで、親水化処理としては、公知の処理を特に限定せずに用いることができ、例えば、プラズマ照射、シリカコーティング、等が挙げられる。また、このとき親水化処理は、上記親水化処理面で説明したのと同様に、純水の滴下直後の動的接触角が３０度以下となる処理であることが好ましい。
【００６４】
本実施形態において、プラズマ照射による親水化処理は、ラジカル（酸素ラジカルなど）による表面洗浄による表面からの疎水基の離脱、付着した不純物の除去、表面への親水基の付着、表面改質などの概念を含む処理である。したがって、基板として、ガラス基板を例に説明するが、それ以外の材質からなる基板であっても、親水化表面とできる。
【００６５】
プラズマの照射条件としては、例えば、大気圧、グロー放電、パワー３〜１８Ｗ、電流７ｍＡ、圧力１０Ｐａで１０分間処理を行うことで親水化処理できる。
【００６６】
また、コーティングによる親水化処理は、親水性を有するように孔あき基板の表面を被覆する処理である。ここで用いられる材料としては、基板を被覆できるものであれば特に限定されず、無機系被覆材、有機系被覆材等が挙げられる。無機系被覆材料としては、シリカ、チタニア等が好ましく挙げられるが、シリカがより好ましい。被覆材料がシリカであれば、長期的に親水性を付与できる。シリカコートは、加水分解性基を有するシラン化合物の加水分解物またはケイ酸の加水分解物であるのが好ましく、アルコキシシラン化合物の加水分解物またはケイ酸のアルカリ金属塩からアルカリ金属の一部を除去した脱塩ケイ酸の加水分解物がより好ましい。なお、これらの加水分解物は、未反応のシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）基を有していてもよい。
【００６７】
有機系被覆材としては、ポリエチレングリコールのような親水性高分子化合物や２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー（ＭＰＣポリマー）のような生体膜模倣材料、ポリエチレングリコール変性アルコキシシラン等が挙げられる。このような被覆材を溶剤に溶解させてコーティング用の溶液を用意し、これを孔あき基板の表面に塗布した後、乾燥させて、コート膜を形成すればよい。溶液の塗布は、孔あき基板の表面にディップコーティング、スピンコーティング、等の公知の塗布方法を用いればよい。
【００６８】
本実施形態において、第２面側内壁１３ｂだけでなく、第２面１２も親水化処理が施されていることが好ましい。このとき、第２面側内壁１３ｂの親水性と第２面１２の親水性との協働作用により、細胞懸濁液の貫通孔１３への流入と、分散媒の貫通孔１３からの排出を促進でき、細胞懸濁液における分散媒の通過速度を向上させることができる。
【００６９】
［細胞捕捉方法］
本実施形態の細胞捕捉方法は、上記したような本実施形態の細胞捕捉チップの第１面１１に、細胞懸濁液を滴下して、貫通孔１３に単一細胞を捕捉させるものである。
【００７０】
ここで用いる細胞懸濁液は、単一細胞が分散媒中に分散して含有するものであれば特に限定されずに用いられる。なお、含有する単一細胞としては、血球系細胞、がん細胞等が挙げられ、細胞の直径がφ１０〜２０μｍ程度のものが好ましい。また、分散媒としては、水、生理的食塩水、等が挙げられる。
【００７１】
このような細胞懸濁液を、細胞捕捉チップ１０の第１面１１に滴下、供給することで、細胞懸濁液中の分散媒は貫通孔１３を通過して第２面１２から排出され、その際、目的とする細胞は貫通孔１３のくびれ部に捕捉される。
【００７２】
このとき、本実施形態の細胞捕捉チップ１０においては、細胞懸濁液の滴下後にポンプ等で吸引する等の外力を加えなくても、細胞懸濁液が細胞捕捉チップ１０の貫通孔１３を通過する方向に自律的に駆動する力が働き、簡便な操作で容易に単一細胞を１つの貫通孔１３に捕捉できる。
【実施例】
【００７３】
以下、本発明について実施例を参照しながらより詳細に説明する。
［細胞捕捉チップの製造］
（例１）
旭硝子（株）社製無アルカリガラス（０．２ｍｍ厚）を用意した。このガラス製の基板に、次のようにレーザ照射とフッ酸エッチングを用いて行った。レーザにはＹｂ−ＫＧＷレーザ装置から出射されるパルス幅１０ｐｓのレーザ（波長１０３０ｎｍ）を用いた。レーザ装置から出射されたビーム径約４ｍｍのレーザパルスを、５倍の対物レンズでガラス基板１０の表面に集光させた。１つの貫通孔１３あたりの照射は１パルス（パルスエネルギ１７０μＪ）であり、それによりガラス内部に改質ラインが板厚方向に形成される。ガラスをＸＹステージに固定して、ＸＹステージを任意に動かすことによって二次元配列された改質ライン群を得ることができる。その後、改質ライン群が形成されたガラスを約２．５時間５％フッ酸エッチングすることで、改質ライン群が選択的にエッチングされることで二次元配列された砂時計型の孔を作成した。その後、円状に外径を切断して、φ１３ｍｍとした。このようにして孔あき基板Ａを得た。この貫通孔は、第１面および第２面の開口径がφ８０μｍ、くびれ部の径がφ８μｍであり、図１Ｃに示したように２つの円錐状の頂点部分が重なった砂時計型の形状であり、１００μｍピッチで８９個×８９個（７９２１個）設けた。
なお、この時の傾斜角度θは４０度であった。
【００７４】
孔あき基板Ａに対して、その両面にプラズマ照射により親水化処理を行い、細胞捕捉チップ１を得た。このとき、プラズマ照射は、大気圧、グロー放電、パワー３〜１８Ｗ、電流７ｍＡ、圧力１０Ｐａで１０分間処理を行った。
【００７５】
（例２）
例１で得られた孔あき基板Ａに対し、一方の面にプラズマ照射を行い、他方の面にはプラズマ照射を行わなかった以外は、例１と同一の操作により細胞捕捉チップ２を得た。
【００７６】
（例３）
例１で得られた孔あき基板Ａに対し、プラズマ照射を行わなかった。すなわち、孔あき基板Ａを用意し、そのまま本例の細胞捕捉チップ３とした。
【００７７】
（例４）
例１で得られた孔あき基板Ａに対し、親水性シリカコート液を用いたディップコーティングにより親水性シリカコート処理をして両面にシリカコート膜を形成し、室温にて乾燥させ、厚さ５０ｎｍのシリカコート膜を有する細胞捕捉チップ４を得た。
親水性シリカコート液は、以下のように作成した。
蒸留水２３７．５ｇを撹拌しながら、これにケイ酸ソーダ４号（日本化学工業社製、（ＳｉＯ２：２４．０質量％、Ｎａ２Ｏ：７．０質量％。ＳｉＯ２／Ｎａ２Ｏのモル比：３．５／１）を６２．５ｇ、陽イオン交換樹脂（三菱化学社製、ダイヤイオンＳＫ１ＢＨ）を１８０ｇ加え、１０分以上撹拌した後、吸引ろ過により陽イオン交換樹脂を分離し、酸化ケイ素換算の固形分濃度が５質量％の脱塩ケイ酸の加水分解物を得た。
２−プロパノールの９４ｇを撹拌しながら、これに前述の脱塩ケイ酸の加水分解物を６ｇ加え、酸化ケイ素換算固形分が０．３質量％、親水性シリカコーティング液を調製した。
【００７８】
（例５）
７５ｍｍ×２５ｍｍの旭硝子（株）社製無アルカリガラスの基板（厚さ０．１ｍｍ）を用意した。このガラス製の基板に、次のようにレーザ照射をしてアブレーション加工により孔あけを行った。レーザにはＹｂ−ＫＧＷレーザ装置から出射されるパルス幅６００ｆｓのレーザ（波長５１５ｎｍ）を用いた。レーザ装置から出射されたビーム径約４ｍｍのレーザパルスを、５倍の対物レンズでガラス基板１０の表面に集光させた。１つの貫通孔１３あたりの照射は４００パルス（パルスエネルギ５６μＪ、周波数７．５ｋＨｚ）であり、ＸＹステージを任意に動かすことによって二次元配列された孔を得ることができる。今回は貫通孔を格子状に配列するように形成して、孔あき基板Ｂを得た。この貫通孔は、第１面から第２面に向かってほぼ径が同等のストレート形状であり（詳細には、第１面の開口径がφ１３〜φ１４μｍ、第２面の開口径がφ１０〜φ１１μｍで、板厚内部における孔径の極端な変化はない）、１００μｍピッチで８９個×８９個（７９２１個）設けた。その後、円状に外形を切断して、φ１３ｍｍとした。
【００７９】
孔あき基板Ｂに対して、その両面にプラズマ照射により親水化処理を行い、細胞捕捉チップ５を得た。このとき、プラズマ照射は、例１と同一の、大気圧、グロー放電、パワー３〜１８Ｗ、電流７ｍＡ、圧力１０Ｐａの条件で行った。
【００８０】
（例６）
例５で得られた孔あき基板Ｂに対し、一方の面にプラズマ照射を行い、他方の面にはプラズマ照射を行わなかった以外は、例５と同一の操作により細胞捕捉チップ６を得た。
【００８１】
（例７）
例５で得られた孔あき基板Ｂに対し、プラズマ照射を行わなかった。すなわち、孔あき基板Ｂを用意し、そのまま本例の細胞捕捉チップ７とした。
【００８２】
以上、例１〜例７で得られた細胞捕捉チップについて表１にまとめて示した。ここで、例１，２，４が実施例、例３，５〜７が比較例である。
【表１】
2018033434.tif 000003
【００８３】
＜水浸透試験＞
例１〜７で得られた細胞捕捉チップ１〜７を用いて、水浸透試験を行った。水浸透試験は、２４ｍｍ×６０ｍｍ×０．１２〜０．１７ｍｍの松浪硝子工業（株）社製のスライドガラス上に、細胞捕捉チップ１〜７を載置した状態で、細胞捕捉チップの上面（第１面）に純水３μＬ滴下したときの浸透状態を観察し、浸透の有無を評価した。浸透の有無は、純水を滴下した後６０秒間観察して、滴下した純水が細胞捕捉チップ上面に残っている場合を「浸透せず」と、滴下した純水が貫通孔を通過し、スライドガラス上に広がった場合を「浸透」と評価した。なお、浸透試験は３回行い（試験例５は２回）、そのうち「浸透」と評価された割合を浸透率として算出した。
【００８４】
これらの結果を表２〜４にまとめて示した。表中、親水化処理については、親水化処理をしている面を○、親水化処理をしていない面を×、として示している。
【００８５】
【表２】
2018033434.tif 000004
【００８６】
【表３】
2018033434.tif 000005
【００８７】
【表４】
2018033434.tif 000006
【００８８】
以上より、第２面を親水化処理している場合、第１面やスライドガラス板表面の親水化処理に関わらず浸透が良好に行えていることがわかる。また、例６〜７に示したように、同じ細胞捕捉チップを用いても、親水化処理された面をフィルター上面（第１面）とし、親水化処理されていない面をフィルター下面（第２面）として使用すると、浸透がしづらいことがわかる。
【００８９】
また、試験例１〜２では、純水の滴下後、一瞬で浸透し、試験例３〜４では、純水の滴下後、１秒以内で浸透し、非常に良好な浸透状態であった。また、試験例５では、純水の滴下後５秒程度で浸透し、良好な浸透状態であった。一方、フィルター下面（第２面）が親水化処理されていない試験例６〜９では、なかなか浸透がしづらかった。
【００９０】
また、試験例１０〜１３のストレート型の貫通孔を有する細胞捕捉チップでは、親水化処理の有無に関わらず、浸透しなかった。
【００９１】
＜接触角測定＞
上記例１〜７で使用した親水化処理における接触角について以下の通り試験を行い、評価した。
【００９２】
試験の対象基板として貫通孔のあいていない７５ｍｍ×２５ｍｍ×０．２ｍｍの旭硝子（株）社製無アルカリガラスの基板を用意した。この基板に対して、表面にプラズマ処理、シリカコート処理の親水化処理をした基板、親水化処理を行わなかった基板の３種類を用意した。なお、親水化処理は、上記例と同一条件で行った。
次いで、得られた基板の測定対象面に純水１μＬを滴下したときの接触角を測定した。このとき、接触角の測定は、対象基板の側面からＣＣＤカメラにより撮影し、画像処理によって接触角を算出した。なお、測定に際して、純水の滴下から経時的に接触角が低下する傾向にあり、滴下直後（０ｓ）の接触角（すなわち動的接触角）を表５に示した。この接触角は、３回測定した平均値である。また、プラズマ照射による親水化処理は、親水性が経時的に変化する傾向（親水性が劣化する方向）にあるため、プラズマ照射後、３分以内に測定した。
【００９３】
【表５】
2018033434.tif 000007
【００９４】
以上、説明したように、本発明によると、基板の第１面の捕捉領域に細胞懸濁液を滴下するだけで、貫通孔の第２面の開口（吐出口）から吸引することなく、目的とする細胞を単位細胞毎に貫通孔に捕捉することができる。この結果、細胞に損傷を与えることがない。特に、くびれ部を有する貫通孔において細胞懸濁液を滴下する面とは反対側の第２面側内壁の親水度を向上させることで、細胞懸濁液における分散媒の通過速度が向上されたものと想定される。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の細胞捕捉チップは、細胞毎の性状、機能の分析に用いることができる。
【符号の説明】
【００９６】
１０…細胞捕捉チップ、１１…第１面、１２…第２面、１３…貫通孔、１３ａ…第１面側内壁、１３ｂ…第２面側内壁、１３ｃ…くびれ部
【図１Ａ】
2018033434.tif 000008
【図１Ｂ】
2018033434.tif 000009
【図１Ｃ】
2018033434.tif 000010
【図２】
2018033434.tif 000011
【図３】
2018033434.tif 000012