(57)【要約】      （修正有）【課題】ブラディゾイトを含む宿主細胞内のトキソプラズマ原虫に対して作用する一方で宿主細胞への毒性が低く、且つタキゾイドをブラディゾイトに誘導しない薬剤を提供する。【解決手段】式（Ｉ）で表される化合物、その異性体、薬学的に許容されるそれらの塩又はこれらの混合物を有効成分とする抗トキソプラズマ剤。2018035071.tif 000006（式中、Ｒ１はＨ又はＯＨを、Ｒ２はＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＯＨ又はＣＯＯＣＨ３を、Ｒ３はＣＨ３又はＣＨ２ＯＨを、及びＲ４はＨ又はＳＯ３Ｎａをそれぞれ表し、破線を含む結合は単結合又は二重結合を表す。）【選択図】図１
2018035071.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される化合物、その異性体、薬学的に許容されるそれらの塩又はこれらの混合物を有効成分とする抗トキソプラズマ剤。
【化１】
2018035071.tif 000005
（式中、Ｒ１はＨ又はＯＨを、Ｒ２はＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＯＨ又はＣＯＯＣＨ３を、Ｒ３はＣＨ３又はＣＨ２ＯＨを、及びＲ４はＨ又はＳＯ３Ｎａをそれぞれ表し、破線を含む結合は単結合又は二重結合を表す）
【請求項２】
式（Ｉ）で表される化合物が、タンシノンＩＩＡ、ヒドロキシタンシノンＩＩ、３−ヒドロキシタンシノン、ジヒドロキシタンシノン、タンシノンＩＩＡスルホン酸ナトリウム、クリプトタンシノン、１β−ヒドロキシクリプトタンシノン、１７−ヒドロキシクリプトタンシノン、３−ヒドロキシシプトタンシノン、タンシノンＩＩＢ、３−ヒドロキシタンシノンＩＩＢ、タンシノンＩＩＢスルホン酸ナトリウム、タンシノン酸、タンシノン酸メチル、及びジヒドロノルタンシノン酸メチルよりなる群から選択される化合物である、請求項１に記載の抗トキソプラズマ剤。
【請求項３】
トキソプラズマ原虫タキゾイトの増殖抑制剤である、請求項１又は２に記載の抗トキソプラズマ剤。
【請求項４】
トキソプラズマ原虫ブラディゾイトの駆除剤である、請求項１又は２に記載の抗トキソプラズマ剤。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の抗トキソプラズマ剤を含む、トキソプラズマ症の治療及び／又は予防のための医薬。
【請求項６】
急性感染期の、又は潜伏感染していたトキソプラズマ原虫の再活性化により再発したトキソプラズマ症の治療のための、請求項５に記載の医薬。
【請求項７】
トキソプラズマ原虫の再活性化によるトキソプラズマ症の再発を予防するための、請求項５に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンシノンを有効成分とする抗トキソプラズマ剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
トキソプラズマ症は、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）に感染した家畜の肉を加熱調理などが不十分な状態で食べる、又は終宿主であるネコの糞便に含まれるオーシストを経口摂取するなどにより引き起こされる人獣共通性の原虫感染症である。現在、全世界人口の約３割ほどが感染状態にあると推定されている。
【０００３】
トキソプラズマの終宿主はネコ科動物であるが、ヒト、家畜を含む全ての恒温動物は中間宿主となる。トキソプラズマに感染した中間宿主は、免疫系が健全であるときは症状を示さない、又は軽度な急性感染症状を示すに留まるが、感染したトキソプラズマ原虫は組織シストと呼ばれる安定な壁に覆われた構造の中で緩やかに増殖し、宿主免疫系による排除を回避しつつ宿主に感染し続ける。この時期の原虫はブラディゾイト（緩増虫体）と呼ばれる。一方、ＨＩＶ感染、臓器移植後その他の宿主免疫系の機能が低下した状態になるとトキソプラズマ原虫は再活性化し、視力障害、トキソプラズマ脳炎又は肺炎などを引き起こす。また、胎児が妊娠中の母体を通じて感染する先天性トキソプラズマ症は、流産、胎児の水頭症、失明、頭蓋内石灰化、神経系の発達障害などを引き起こす。
【０００４】
現在用いられている抗トキソプラズマ薬は、ピリメサミン、葉酸代謝経路を標的とするサルファ剤とピリメサミンとの合剤、タンパク質合成系を標的とするスピラマイシンなどである。しかし、上記抗トキソプラズマ薬は、増殖期の原虫（タキゾイト）を排除し得るが、ブラディゾイトに対する効果は限定的であることに加え、薬物の投与がタキゾイトをブラディゾイトに誘導してしまうという問題を有する。
【０００５】
このため、ブラディゾイトを含む宿主細胞内のトキソプラズマ原虫に対して作用する一方で宿主細胞への毒性が低く、かつタキゾイドをブラディゾイトに誘導しない、新しい薬剤が必要とされている。
【０００６】
タンシノン（ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅｓ）は、生薬の一種である丹参に含まれるフラン骨格を有する有機化合物の総称であり、クリプトタンシノン（ｃｒｙｐｔｏｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ）、タンシノンＩＩＡ（ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ  ＩＩＡ）、タンシノンＩ（ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ  Ｉ）その他多数のフラン化合物が含まれる。タンノシンの多くは、がん細胞に対する増殖抑制作用、血管新生阻害作用などの生理活性を有することが知られている（例えば、非特許文献１など）。また、タンシノンが抗トリパノソ−マ活性及び抗マラリア活性を有することも報告されている（非特許文献２）。しかし、これまでのところ、トキソプラズマ原虫に対する薬理作用に関する報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｑｉｎｇ，Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２４，７７３−７８０．
【非特許文献２】Ｓｌｕｓａｒｃｚｙｋ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．，２０１１，７７，１５９４−１５９６．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ブラディゾイトを含む宿主細胞内のトキソプラズマ原虫に対して作用する一方で宿主細胞への毒性が低く、かつタキゾイドをブラディゾイトに誘導しない薬剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、タンシノンの幾つかが上記課題を解決し得ることを見出し、下記の各発明を完成させた。
【００１０】
（１）式（Ｉ）で表される化合物、その異性体、薬学的に許容されるそれらの塩又はこれらの混合物を有効成分とする抗トキソプラズマ剤。
【化１】
2018035071.tif 000003
（式中、Ｒ１はＨ又はＯＨを、Ｒ２はＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＯＨ又はＣＯＯＣＨ３を、Ｒ３はＣＨ３又はＣＨ２ＯＨを、及びＲ４はＨ又はＳＯ３Ｎａをそれぞれ表し、破線を含む結合は単結合又は二重結合を表す）
（２）式（Ｉ）で表される化合物が、タンシノンＩＩＡ、ヒドロキシタンシノンＩＩ、３−ヒドロキシタンシノン、ジヒドロキシタンシノン、タンシノンＩＩＡスルホン酸ナトリウム、クリプトタンシノン、１β−ヒドロキシクリプトタンシノン、１７−ヒドロキシクリプトタンシノン、３−ヒドロキシシプトタンシノン、タンシノンＩＩＢ、３−ヒドロキシタンシノンＩＩＢ、タンシノンＩＩＢスルホン酸ナトリウム、タンシノン酸、タンシノン酸メチル、及びジヒドロノルタンシノン酸メチルよりなる群から選択される化合物である、（１）に記載の抗トキソプラズマ剤。
（３）トキソプラズマ原虫タキゾイトの増殖抑制剤である、（１）又は（２）に記載の抗トキソプラズマ剤。
（４）トキソプラズマ原虫ブラディゾイトの駆除剤である、（１）又は（２）に記載の抗トキソプラズマ剤。
（５）（１）から（４）のいずれかに記載の抗トキソプラズマ剤を含む、トキソプラズマ症の治療及び／又は予防のための医薬。
（６）急性感染期の、又は潜伏感染していたトキソプラズマ原虫の再活性化により再発したトキソプラズマ症の治療のための、（５）に記載の医薬。
（７）トキソプラズマ原虫の再活性化によるトキソプラズマ症の再発を予防するための、（５）に記載の医薬。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、トキソプラズマ原虫のタキゾイトの増殖をブラディゾイトへの誘導を回避しながら抑制することができ、また宿主細胞内に潜伏感染したブラディゾイトを殺滅することができる。したがって、本発明の抗トキソプラズマ剤は、視力障害、トキソプラズマ脳炎などのトキソプラズマ症の予防及び／又は治療に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】トキソプラズマ原虫のタキゾイトに対するタンシノンＩＩＡの増殖阻害濃度曲線を示すグラフである。
【図２】宿主細胞への感染前にタンシノンＩＩＡ、デキストラン硫酸（ＤＳ１０）、ピリメサミン（ＰＹＲ）又はＤＭＳＯで処理したトキソプラズマ原虫タキゾイトの増殖を示すグラフである。
【図３】宿主細胞への感染後にタンシノンＩＩＡ、デキストラン硫酸（ＤＳ１０）、ピリメサミン（ＰＹＲ）又はＤＭＳＯで処理したトキソプラズマ原虫タキゾイトの増殖を示すグラフである。
【図４】タンシノンＩＩＡ、ピリメサミン（ＰＹＲ）又はＤＭＳＯ（Ｔａｃｈｙ）で処理したトキソプラズマ原虫の潜伏感染誘導を示すグラフである。
【図５】トキソプラズマ原虫のブラディゾイトに対するタンシノンＩＩＡ（Ｔａｎ０．２〜Ｔａｎ２５）、ピリメサミン（Ｐｙｒ０．０４〜Ｐｙｒ５）又はＤＭＳＯの効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の第一の態様は、下記式（Ｉ）で表される化合物、その異性体、薬学的に許容されるそれらの塩又はこれらの混合物を有効成分とする抗トキソプラズマ剤に関する。
【化２】
2018035071.tif 000004
（式中、Ｒ１はＨ又はＯＨを、Ｒ２はＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＯＨ又はＣＯＯＣＨ３を、Ｒ３はＣＨ３又はＣＨ２ＯＨを、及びＲ４はＨ又はＳＯ３Ｎａをそれぞれ表し、破線を含む結合は単結合又は二重結合を表す）
【００１４】
式（Ｉ）で表される化合物の例としては、以下の化合物を挙げることができる。
・タンシノンＩＩＡ：１，６，６−トリメチル−６，７，８，９−テトラヒドロフェナントロ［１，２−ｂ］フラン−１０，１１−ジオン
・ヒドロキシタンシノンＩＩ：６，７，８，９−テトラヒドロ−９−ヒドロキシ−１，６，６−トリメチルフェナントロ［１，２−ｂ］フラン−１０，１１−ジオン
・３−ヒドロキシタンシノン：６，７，８，９−テトラヒドロ−７β−ヒドロキシ−１，６，６−トリメチルフェナントロ［１，２−ｂ］フラン−１０，１１−ジオン
・ジヒドロキシタンシノン：１−（ヒドロキシメチル）−６，６−ジメチル−７−ヒドロキシ−６，７，８，９−テトラヒドロフェナントロ［１，２−ｂ］フラン−１０，１１−ジオン
・タンシノンＩＩＡスルホン酸ナトリウム：１，６，６−トリメチル−１０，１１−ジオキソ−６，７，８，９，１０，１１−ヘキサヒドロフェナントロ［１，２−ｂ］フラン−２−スルホン酸ナトリウム
・クリプトタンシノン：１，２，６，７，８，９−ヘキサヒドロ−１，６，６−トリメチルフェナントロ［１，２−ｂ］フラン−１０，１１−ジオン
・１β−ヒドロキシクリプトタンシノン：１β−ヒドロキシ−１５β−メチル−１７−オキサ−２０−ノル−１６，１７−シクロカッサ−５（１０），６，８，１３−テトラエン−１１，１２−ジオン
・１７−ヒドロキシクリプトタンシノン：１，２，６，７，８，９−ヘキサヒドロ−１β−（ヒドロキシメチル）−６，６−ジメチルフェナントロ［１，２−ｂ］フラン−１０，１１−ジオン
・３−ヒドロキシシプトタンシノン：３−ヒドロキシ−１４，１６−エポキシ−２０−ノルアビエタン−５（１０），６，８，１３−テトラエン−１１，１２−ジオン
・タンシノンＩＩＢ：６，７，８，９−テトラヒドロ−６−ヒドロキシメチル−１，６−ジメチルフェナントロ［１，２−ｂ］フラン−１０，１１−ジオン
・３−ヒドロキシタンシノンＩＩＢ：３，１９−ジヒドロキシ−１４，１６−エポキシ−２０−ノルアビエタン−５（１０），６，８，１３，１５−ペンタエン−１１，１２−ジオン
・タンシノンＩＩＢスルホン酸ナトリウム：１，６−ジメチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−６−（ヒドロキシメチル）−１０，１１−ジオキソフェナントロ［１，２−ｂ］フラン−２−スルホン酸ナトリウム
・タンシノン酸：６，７，８，９，１０，１１−ヘキサヒドロ−１，６−ジメチル−１０，１１−ジオキソフェナントロ［１，２−ｂ］フラン−６−カルボン酸
・タンシノン酸メチル：６，７，８，９，１０，１１−ヘキサヒドロ−１，６−ジメチル−１０，１１−ジオキソフェナントロ［１，２−ｂ］フラン−６β−カルボン酸メチル
・ジヒドロノルタンシノン酸メチル：１１，１２−ジオキソ−１４，１６−エポキシ−２０−ノルアビエタン−５（１０），６，８，１３−テトラエン−１９−酸メチル
【００１５】
本発明において好ましい化合物は、タンシノンＩＩＡ、ヒドロキシタンシノンＩＩ、３−ヒドロキシタンシノン、ジヒドロキシタンシノン、タンシノンＩＩＡスルホン酸ナトリウムであり、特にタンシノンＩＩＡが好ましい。
【００１６】
式（Ｉ）で表される化合物は、シソ科植物の丹参（Ｓａｌｖｉａｅ  ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａｅ）、特に丹参の根から抽出することができるが、有機化学的手法により合成することもできる。
【００１７】
「異性体」は、式（Ｉ）で表される化合物において存在し得るエナンチオマ−、ジアステレオマ−（シス−トランス異性体を含む）、配座異性体、二重結合におけるシス−トランス異性体などを意味する。
【００１８】
式（Ｉ）で表される化合物の薬学的に許容される塩としては、ヒドロキシ基における塩、例えば、ナトリウム及びカリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウム及びマグネシウムなどのアルカリ土類金属塩との塩；アンモニウム塩；並びにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、１−エフェナミン及びＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩などを挙げることができる。
【００１９】
本発明との関連で抗トキソプラズマ剤とは、トキソプラズマ原虫の増殖抑制及び殺滅、宿主細胞への感染阻害、宿主組織からのトキソプラズマ原虫の駆除など、トキソプラズマ原虫の数及び／又はその活動の抑制、低減、停止などのために用いられる剤をいう。本発明の抗トキソプラズマ剤は、特にトキソプラズマ原虫タキゾイトの増殖抑制のために、及びトキソプラズマ原虫ブラディゾイトの駆除のために用いることができる。
【００２０】
式（Ｉ）で表される化合物は、そのまま抗トキソプラズマ剤として利用してもよく、さらに賦形剤、結合剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、固結・付着防止剤、滑沢剤、吸収・吸着担体、溶剤、増量剤、等張化剤、溶解補助剤、乳化剤、懸濁化剤、増粘剤、被覆剤、吸収促進剤、ゲル化・凝固促進剤、光安定化剤、保存剤、防湿剤、乳化・懸濁・分散安定化剤、着色防止剤、脱酸素・酸化防止剤、矯味・矯臭剤、着色剤、起泡剤、消泡剤、無痛化剤、帯電防止剤、緩衝・ｐＨ調節剤などの各種添加物を配合して抗トキソプラズマ剤又はこれを含む医薬若しくは医薬組成物として利用してもよい。
【００２１】
本発明の第二の態様は、第一の態様の抗トキソプラズマ剤を含む、トキソプラズマ症の治療及び／又は予防のための医薬に関する。
【００２２】
本発明との関連でトキソプラズマ症とは、トキソプラズマ原虫の感染、又は感染により引き起こされるあらゆる症状若しくは状態をいう。本発明の医薬は、かかる感染又はこれに伴う症状若しくは状態の治癒、寛解、改善、予防のために恒温動物に投与することで使用される。
【００２３】
トキソプラズマ症の急性感染期には、タキゾイトが宿主細胞に侵入し、細胞内で増殖する。トキソプラズマ原虫はその後ブラディゾイトに変化して潜伏感染に移行するが、宿主免疫系の機能低下などにより再活性化され、再びタキゾイトに変化して細胞内での増殖を開始し、これがトキソプラズマ症の再発につながる。
【００２４】
本発明の抗トキソプラズマ剤はタキゾイトに対する増殖抑制効果を有することから、かかる剤を含む医薬は急性感染期の、又は潜伏感染していたトキソプラズマ原虫の再活性化により再発したトキソプラズマ症の治療のために用いることができる。
【００２５】
また、本発明の抗トキソプラズマ剤は組織内でシストを形成して潜伏感染しているブラディゾイトに対する駆除効果も有する。したがって、本発明の医薬は、トキソプラズマ原虫の再活性化によるトキソプラズマ症の再発を予防するために用いることもできる。
【００２６】
本発明の医薬は、トキソプラズマ原虫に感染し得る全ての恒温動物を対象として適用することができる。そのような恒温動物の例としては、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、アヒルなどの鳥類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、サルその他の非ヒト哺乳動物及びヒトを挙げることができる。
【００２７】
本発明の医薬の剤形としては、経口剤（錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤など）、注射剤、坐剤、外用剤（軟膏剤、貼付剤など）、エアゾ−ル剤などを挙げることができる。
【００２８】
錠剤、散剤、顆粒剤などの経口用固形製剤は、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロ−ス、無水第二リン酸カルシウム、部分アルファ化デンプン、コ−ンスタ−チ及びアルギン酸などの賦形剤；単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコ−ル、ポリビニルエ−テル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロ−ス、セラック、メチルセルロ−ス、エチルセルロ−ス、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルメチルセルロ−ス、ヒドロキシプロピルセルロ−ス、水及びエタノ−ルなどの結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸、寒天末、デンプン、架橋ポリビニルピロリドン、架橋カルボキシメチルセルロ−スナトリウム、カルボキシメチルセルロ−スカルシウム及びデンプングリコ−ル酸ナトリウムなどの崩壊剤；ステアリルアルコ−ル、ステアリン酸、カカオバタ−及び水素添加油などの崩壊抑制剤；ケイ酸アルミニウム、リン酸水素カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、無水ケイ酸などの固結防止・付着防止剤；カルナバロウ、軽質無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム、硬化油、硬化植物油誘導体、胡麻油、サラシミツロウ、酸化チタン、乾燥水酸化アルミニウムゲル、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、リン酸水素カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びポリエチレングリコ−ルなどの滑沢剤；第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム、尿素及び酵素などの吸収促進剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、無水ケイ酸、含水二酸化ケイ素、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム及びコロイド状ケイ酸などの吸収・吸着担体といった固形製剤化医薬用添加物を用い、常法に従い調製すればよい。
【００２９】
さらに錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、胃溶性被覆錠、腸溶性被覆錠及び水溶性フィルムコ−ティング錠とすることができる。
【００３０】
カプセル剤は、上記で例示した各種の医薬を、硬質ゼラチンカプセル及び軟質カプセルなどに充填して調製される。
【００３１】
また、溶剤、増量剤、等張化剤、溶解補助剤、乳化剤、懸濁化剤、増粘剤などの上記した各種の液体製剤化用添加物を用い、常法に従い調製して、水性又は油性の懸濁液、溶液、シロップ及びエリキシル剤とすることもできる。
【００３２】
注射剤は、例えば、水、エチルアルコ−ル、マクロゴ−ル、プロピレングリコ−ル、クエン酸、酢酸、リン酸、乳酸、乳酸ナトリウム、硫酸及び水酸化ナトリウムなどの希釈剤；クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及びリン酸ナトリウムなどのｐＨ調整剤及び緩衝剤；ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコ−ル酸及びチオ乳酸などの安定化剤；食塩、ブドウ糖、マンニト−ル又はグリセリンなどの等張化剤；カルボキシメチルセルロ−スナトリウム、プロピレングリコ−ル、安息香酸ナトリウム、安息香酸ベンジル、ウレタン、エタノ−ルアミン、グリセリンなどの溶解補助剤；グルコン酸カルシウム、クロロブタノ−ル、ブドウ糖、ベンジルアルコ−ルなどの無痛化剤；及び局所麻酔剤などの液体製剤化用の医薬品添加物を用い、常法に従い調製すればよい
【００３３】
本発明の医薬の投与方法は特に限定されないが、製剤の形態に応じて適宜決定される。例えば、非経口製剤である場合は、血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与などを挙げることができる。好ましい実施形態の一つにおいて、本発明の抗トキソプラズマ剤は、経口投与、静脈内投与により生体に投与される。
【００３４】
本発明の医薬の投与量は、投与された対象において治療及び／又は予防効果を奏する量、すなわち有効量であればよい。有効量は対象となる動物の種類、症状の程度、ヒトにあっては患者の年齢、性別、疾患の形態その他の条件などに応じて適宜選択されるが、通常成人に対して体重１ｋｇあたり１０μｇ〜２０００μｇ、好ましくは５０μｇ〜１０００μｇ、より好ましくは１００μｇ〜５００μｇであり、これを１日に１回若しくは複数回に分けて、又は間歇的に投与することができる。
【００３５】
本発明の第三の態様は、第二の態様の医薬の有効量を対象に投与することを含む、トキソプラズマ症を治療及び／又は予防する方法に関する。
【００３６】
以下、非限定的な実施例を示して、本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００３７】
＜実験材料＞
（１）化合物
タンシノンＩＩＡは東京化成工業株式会社から、ピリメサミン（ｐｙｒｉｍｅｔｈａｍｉｎｅ）は和光純薬工業株式会社から、それぞれ購入し、ＤＭＳＯに溶解して以下の実験に使用した。
【００３８】
（２）宿主細胞
アフリカミドリザル腎臓由来細胞（Ｖｅｒｏ細胞）は理研バイオソ−スセンタ−から、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ細胞）はＡＴＣＣから、それぞれ入手して使用した。Ｖｅｒｏ細胞は５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、ＨＦＦ細胞は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で維持した。
【００３９】
（３）トキソプラズマ原虫
潜伏感染型虫体に分化する能力が低く、バクテリア型β−ガラクトシダ−ゼを高発現する組換えトキソプラズマ原虫ＲＨ／２Ｆ株（ＡＴＣＣ５０８３９）、並びに潜伏感染型虫体に分化する能力を有し、原虫で恒常的に発現するＴＵＢＡ１プロモ−タ−の制御下にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を及び潜伏感染期特異的なＢＡＧ１プロモ−タ−の制御下にホタルルシフェラ−ゼ遺伝子をそれぞれ有する組換えトキソプラズマ原虫ＰＬＫ／ＤＬＵＣ１Ｃ９株（特開２０１５−２２３１０５号公報）を、Ｓｕｇｉら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１４，４６４，９−１１）に記載の方法に従って維持し、それぞれのタキゾイトを調製した。
【００４０】
＜実施例１＞トキソプラズマ原虫に対する増殖抑制効果及び宿主細胞への毒性の評価
（１）ＰＬＫ／ＤＬＵＣ１Ｃ９株のタキゾイトをＶｅｒｏ細胞にＭ．Ｏ．Ｉ＝０．５で感染させ、２時間インキュベ−トした後、感染細胞をトリプシン処理して細胞懸濁液を調製した。感染細胞２５００個を含む培地２５μＬを、被験物質であるタンシノンＩＩＡ（２ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液を１２５ｎＬ、終濃度１０μＭ）を添加したハーフエリア９６ウェルプレ−トのウェルに加えて４８時間培養後、Ｒｅｎｉｌｌａ−Ｇｌｏ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてウミシイタケルシフェラ−ゼ活性を測定した。タンシノンＩＩＡに代えて同量のＤＭＳＯのみを加えたものをネガティブコントロ−ル（０％阻害）とし、またタンシノンＩＩＡに代えてピリメサミン（終濃度１０μＭ）を添加したものをポジティブコントロ−ル（１００％阻害）としたとき、タンシノンＩＩＡはウミシイタケルシフェラ−ゼ活性すなわち宿主細胞中のトキソプラズマ原虫の増殖を９０％以上阻害することが確認された。
【００４１】
（２）ＨＦＦ細胞をコンフルエントになるまで培養したハーフエリア９６ウェルプレートのウェルに、５０μＬの培地に懸濁した５００個のＲＨ／２Ｆ株タキゾイトを感染させた。感染細胞に被験物質としてタンシノンＩＩＡ（終濃度２５μＭ又は２．５μＭ）を加えて、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で４８時間培養後、Ｂｅｔａ−Ｇｌｏ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてβ−ガラクトシダ−ゼ活性を測定した。タンシノンＩＩＡに代えて同量のＤＭＳＯのみを加えたものをネガティブコントロ−ル（０％阻害）とし、またタンシノンＩＩＡに代えてピリメサミン（終濃度１０μＭ）を添加したものをポジティブコントロ−ル（１００％阻害）としたとき、β−ガラクトシダ−ゼ活性すなわち宿主細胞中のトキソプラズマ原虫の増殖は、２５μＭのタンシノンＩＩＡによって１１２％、２．５μＭのタンシノンＩＩＡによって５５％阻害されることが確認された。
【００４２】
さらに、タンシノンＩＩＡの添加量を変えて同様の実験を繰り返して行った結果を図１に示す。図１の阻害曲線からＲＨ／２Ｆ株に対するタンシノンＩＩＡのＩＣ５０を求めたところ、２．５μＭであることが確認された。
【００４３】
一方、トキソプラズマ原虫に感染していないＨＦＦ細胞を終濃度２５μＭ又は２．５μＭのタンシノンＩＩＡの存在下で４８時間培養したときの宿主細胞の生存率をＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。宿主細胞生存率は、それぞれ７５％（終濃度２５μＭ）及び９９％（終濃度２．５μＭ）であり、トキソプラズマ原虫へのタンシノンＩＩＡの選択性指標（宿主細胞生存５０％阻害濃度（＞２５μＭ）／原虫増殖５０％阻害濃度）は１０以上であることが確認された。
【００４４】
＜実施例２＞トキソプラズマ原虫に対する宿主細胞侵入及び宿主細胞内増殖抑制効果の評価
５０μＬの培地中で、５００個のＲＨ／２Ｆ株タキゾイトを、被験物質であるタンシノンＩＩＡ（終濃度２．５μＭ）、宿主細胞へのトキソプラズマ原虫の侵入を阻害することが知られているデキストラン硫酸（１０ｋＤａ、終濃度１０ｍｇ／ｍＬ）、宿主細胞内の原虫の増殖を阻害することが知られているピリメサミン（終濃度５μＭ）又は同量のＤＭＳＯと混合した。混合物を、ＨＦＦ細胞をコンフルエントになるまで培養したハーフエリア９６ウェルプレートのウェルに加え、室温で１０分間インキュベ−トした。さらに３７℃のＣＯ２インキュベーター内で４８時間培養後、β−ガラクトシダ−ゼ活性を測定することで、宿主細胞感染前の被験物質処理がトキソプラズマ原虫の宿主細胞への侵入及び宿主細胞内増殖に及ぼす影響を評価した。また、ＲＨ／２Ｆ株タキゾイトとＨＦＦ細胞とを混合して２時間インキュベ−トした後、培地交換及び洗浄により未侵入の原虫を除去し、その後に被験物質を加えて同様に試験を行うことで、宿主細胞感染後の被験物質処理の影響を評価した。
【００４５】
宿主細胞感染前にＤＭＳＯで処理したＲＨ／２Ｆ株のβ−ガラクトシダーゼ活性を１００％としたときの各被験物質で処理したＲＨ／２Ｆ株のβ−ガラクトシダーゼ活性を、原虫の増殖率として図２及び図３に表す。タンシノンＩＩＡ及びピリメサミンは、感染前処理、感染後処理のいずれの場合にも原虫の増殖を抑制した。一方、デキストラン硫酸は感染前処理の場合は原虫の増殖を抑制したが、感染後処理の場合は原虫の増殖に影響しなかった。このことから、タンシノンＩＩＡは宿主細胞内の原虫の増殖を阻害することが確認された。
【００４６】
＜実施例３＞潜伏感染誘導能の確認
ＨＦＦ細胞を１２ウェルプレ−トで培養し、各ウェルに２．０×１０４個のＰＬＫ／ＤＬＵＣ１Ｃ９株を接種して２４時間インキュベ−トした後、被験物質としてタンシノンＩＩＡ（終濃度２．５μＭ）、潜伏感染を引き起こすことが知られているピリメサミン（終濃度５μＭ）又は同量のＤＭＳＯを添加して、さらに４８時間インキュベ−トした。２００μＬのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを加えて細胞を溶解した後、ＤＵＡＬ−Ｇｌｏ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、潜伏感染期特異的なＢＡＧ１プロモ−タ−の制御下にあるホタルルシフェラ−ゼ活性及び構成的ＴＵＢＡ１プロモ−タ−の制御下にあるウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定し、ホタルルシフェラーゼ活性／ウミシイタケルシフェラーゼ活性をＢＡＧ１プロモーター活性として算出した。
【００４７】
ピリメサミンで処理したＰＬＫ／ＤＬＵＣ１Ｃ９株のＢＡＧ１プロモーター活性を１００％としたときのＤＭＳＯ又はタンシノンＩＩＡで処理したＰＬＫ／ＤＬＵＣ１Ｃ９株のＢＡＧ１プロモーター活性を図４に表す。タンシノンＩＩＡは、ピリメサミンと比較してブラディゾイトを誘導しない、すなわち潜伏感染を誘導しないことが確認された。
【００４８】
＜実施例４＞ブラディゾイトに対する殺滅効果
実施例３と同様にしてＰＬＫ／ＤＬＵＣ＿１Ｃ９株を感染させたＨＦＦ細胞を一般的に潜伏感染誘導に用いられる条件であるｐＨ８．２及びＣＯ２非存在下で８日間培養し、ブラディゾイトへの分化を誘導した。培養９日目に被験物質としてタンシノンＩＩＡ（終濃度０．２μＭ、１μＭ、５μＭ又は２５μＭ）、ピリメサミン（終濃度０．０４μＭ、０．２μＭ、１μＭ又は５μＭ）、又は同量のＤＭＳＯを添加して、さらに４８時間インキュベ−トした後、細胞を溶解してウミシイタケルシフェラ−ゼの活性を測定した。なお各被験物質の濃度範囲は、タキゾイトに対して同等の効果を示すように設定されており、例えば終濃度５μＭのタンシノンＩＩＡ及び１μＭのピリメサミンはタキゾイトに対しておよそ９０％の増殖阻害を示す。
【００４９】
結果を図５に示す。ピリメサミン処理したＰＬＫ／ＤＬＵＣ１Ｃ９株のルシフェラーゼ活性は大きく変動しなかった一方、タンシノンＩＩＡ処理はルシフェラーゼ活性を濃度依存的に低下させた。このことから、タンシノンＩＩＡはブラディソイトに対して殺滅効果を示すことが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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