(57)【要約】【課題】糖尿病性腎症を鋭敏に診断できる診断マーカーを提供する。【解決手段】被検者の尿中のpyruvate kinase muscle type 2 (PKM2)又はその断片であることを特徴とする。PKM2又はその断片が1.0 ng/40μL以上の場合に糖尿病性腎症を発症していると診断する。高糖下で培養した糸球体上皮細胞は、解糖系依存型のエネルギー産生機構にシフトすること、即ちmetabolic remodeling(MR)が惹起されることを見出した。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
pyruvate kinase muscle type 2 (PKM2)又はその断片であることを特徴とする、糖尿病性腎症の診断マーカー。
【請求項２】
前記断片は下記配列からなることを特徴とする請求項１に記載の糖尿病性腎症の診断マーカー。
IRKASD VHEVRKVLGE KGKNIKIISK IENHEGVRRF DEILEASDGI MVARGDLGIE IPAEKVFLAQ KMMIGRCNRA GKPVICATQM LESMIKKPRP TRAEGSDVAN AVLDGADCIM LSGETAKGDY PLEAVRMQHL IAREAEAAIY HLQLFEELRR LAPITSDPTE ATAVGAVEAS FKCCSGAIIV LTKSGRSAHQ VARYRPRAPI IAVTRNPQTA RQAHLYRGIF PVLCKDPVQE AWAEDVDLRV NFAMNVGKAR GFFKKGDVVI VLTGWRPGSG FTNTMRVVPV P
【請求項３】
被検者の尿中のpyruvate kinase muscle type 2 (PKM2)又はその断片であることを特徴とする、請求項１又は２記載の糖尿病性腎症の診断マーカー。
【請求項４】
被検者の尿中のpyruvate kinase muscle type 2 (PKM2)又はその断片が1.0 ng/40μL以上の場合に糖尿病性腎症を発症していると診断することを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の糖尿病性腎症の診断マーカー。
【請求項５】
pyruvate kinase muscle type 2 (PKM2)又はその断片及び転写因子MEF2Cからなる糖尿病性腎症の診断マーカーであって、
pyruvate kinase muscle type 2 (PKM2)又はその断片の発現上昇及び転写因子MEF2Cの発現低下の場合に糖尿病性腎症であると診断することを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の糖尿病性腎症の診断マーカー。
【請求項６】
pyruvate kinase muscle type 2 (PKM2)又はその断片及び転写因子MYF5からなる糖尿病性腎症の診断マーカーであって、
pyruvate kinase muscle type 2 (PKM2)の発現上昇及び転写因子MYF5の発現低下の場合に糖尿病性腎症であると診断することを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の糖尿病性腎症の診断マーカー。
【請求項７】
糖尿病性腎症を診断するための診断キットであって、被検者から得られた試料におけるpyruvate kinase muscle type 2 (PKM2)又はその断片を検出又は定量する手段を含む診断キット。
【請求項８】
前記試料は、被検者の尿であることを特徴とする請求項７に記載の診断キット。
【請求項９】
被検者の尿中のpyruvate kinase muscle type 2 (PKM2)又はその断片が1.0 ng/40μL以上の場合に糖尿病性腎症を発症していると診断することを特徴とする請求項７記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病性腎症を診断するための診断マーカー及び診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性腎臓病(CKD)は、腎臓の構造的又は機能的異常が３ヵ月以上持続する病態と定義されている。CKDが進行し末期腎不全に至ると透析や移植が必要になることは知られているが、それだけではなく病期の進行とともに心血管疾患を発症する危険が高くなる。CKDの代表が糖尿病性腎症であることは、国内における透析導入原疾患のトップを占めていることからも明らかである。
【０００３】
高血糖によって輸入細動脈が拡張し糸球体内静水圧が上昇して糸球体が障害され、その結果生じる高血圧や尿蛋白排泄、あるいは高血糖に伴う腎組織RA系の亢進、種々の代謝異常の修飾が加わり、腎障害の進行が加速するというのが糖尿病性腎症のメカニズムである。
【０００４】
糖尿病性腎症から腎不全への進行を防ぐためには、早期診断による早期治療介入、あるいは重症化することが予測される症例への強化療法が必須である。
【０００５】
従来の糖尿病性腎症の診断では、糖尿病の既往に加え、尿所見の変化（タンパク尿・微量アルブミン尿の出現）やeGFR（糸球体濾過量：腎機能を表す指標で血清クレアチニン濃度と年齢・性別を基に算出される）の低下等に基づいて判断を行っていた（非特許文献１）。しかし、この従来技術では、糖尿病性腎症を他の腎疾患と確実に区別できない場合がある。
【０００６】
非特許文献２には、尿中のL-type fatty acid binding protein(L-FABP)を診断マーカーとする糖尿病性腎症の診断が記載されている。２型糖尿病患者ではステージの進行とともに尿中L-FABPが有意に高値になり、更に、微量アルブミン尿も呈していない正常アルブミン尿であっても非糖尿病のコントロール群に比して尿中L-FABPが有意に高値を示す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】エビデンスに基づくCKD診療ガイドライン2009、p87〜p104、８章 糖尿病性腎症
【非特許文献２】Kamijo Ikemori A,et al. Diabetes Care 34: 691-696,2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、非特許文献２の診断マーカーでは、精度良く診断するためには尿中アルブミン量も合わせて観測する必要がある。
【０００９】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、糖尿病性腎症を鋭敏に診断できる診断マーカーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明にかかる糖尿病性腎症の診断マーカーは、pyruvate kinase muscle type 2 (PKM2)又はその断片であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、糖尿病性腎症から腎不全への進行を精度良く観測できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】糸球体上皮細胞におけるPKM2の発現を示す写真図であり、図１左側は正常腎の写真図であり、図１右側は糖尿病性腎症の写真図である。
【図２】ELISAキットを使用して尿中のPKM2濃度を測定した図である。
【図３】糖尿病性腎症患者の尿中のPKM2及びその断片の検出を示す電気泳動(SDS-PAGE)分析の写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１４】
糸球体は腎機能に最も重要な微小器官であり、糸球体上皮細胞(podocyte)は糸球体機能の中枢を担う。本発明者は、高糖下に置かれた糸球体上皮細胞におきるエネルギー代謝異常について網羅的プロテオーム解析を行った結果、高糖下で培養した糸球体上皮細胞は解糖系依存型のエネルギー産生機構にシフトすること(即ち、metabolic remodeling(MR)が惹起されること)を見出した。
【００１５】
本発明者は、高糖下培養の糸球体上皮細胞と正常糖濃度培養の糸球体上皮細胞との間で２倍以上の発現変化のあった解糖系酵素あるいは酸化的リン酸化経路の複合体蛋白に着目し、糸球体内で糸球体上皮細胞特異的に発現しているものの探索を行ったところ、pyruvate kinaseを最終候補とした。pyruvate kinaseは、ADPとホスホエノールピルビン酸からピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素である。
【００１６】
本発明者は、ヒトの糖尿病性腎症の腎生検症例を用いて検討した結果、糖尿病性腎症患者では、PKM2又はその断片の糸球体上皮細胞における発現が正常に比較して有意に増加していることを新知見として取得し、かかる事実に基づいて本発明を完成させた。即ち、本発明にかかる糖尿病性腎症の診断マーカーは、PKM2又はその断片である。  MRは高血糖にさらされた糸球体上皮において機能変化として早期に起きる変化であり、その変化はエネルギー産生の非効率化を招き、続いて細胞の病理学的変化に繋がっていくと考えられる。即ち、MRは糖尿病性腎症の組織障害がまさに生じる直前の状態である可能性が高い。そのため本発明はMRの検出に着目した既存のマーカーよりも早期発見が可能な診断マーカーである。
【００１７】
PKM2は、下記配列番号１からなる配列で示される。
MSKPHSEAGT AFIQTQQLHA AMADTFLEHM CRLDIDSPPI TARNTGIICT IGPASRSVET LKEMIKSGMN VARLNFSHGT HEYHAETIKN VRTATESFAS DPILYRPVAV ALDTKGPEIR TGLIKGSGTA EVELKKGATL KITLDNAYME KCDENILWLD YKNICKVVEV GSKIYVDDGL ISLQVKQKGA DFLVTEVENG GSLGSKKGVN LPGAAVDLPA VSEKDIQDLK FGVEQDVDMV FASFIRKASD VHEVRKVLGE KGKNIKIISK IENHEGVRRF DEILEASDGI MVARGDLGIE IPAEKVFLAQ KMMIGRCNRA GKPVICATQM LESMIKKPRP TRAEGSDVAN AVLDGADCIM LSGETAKGDY PLEAVRMQHL IAREAEAAIY HLQLFEELRR LAPITSDPTE ATAVGAVEAS FKCCSGAIIV LTKSGRSAHQ VARYRPRAPI IAVTRNPQTA RQAHLYRGIF PVLCKDPVQE AWAEDVDLRV NFAMNVGKAR GFFKKGDVVI VLTGWRPGSG FTNTMRVVPV P
PKM2の断片は、特に限定されるものではないが、例えば下記配列番号２からなる配列で示される。
IRKASD VHEVRKVLGE KGKNIKIISK IENHEGVRRF DEILEASDGI MVARGDLGIE IPAEKVFLAQ KMMIGRCNRA GKPVICATQM LESMIKKPRP TRAEGSDVAN AVLDGADCIM LSGETAKGDY PLEAVRMQHL IAREAEAAIY HLQLFEELRR LAPITSDPTE ATAVGAVEAS FKCCSGAIIV LTKSGRSAHQ VARYRPRAPI IAVTRNPQTA RQAHLYRGIF PVLCKDPVQE AWAEDVDLRV NFAMNVGKAR GFFKKGDVVI VLTGWRPGSG FTNTMRVVPV P
また、本発明は、PKM2又はその断片の発現の程度を比較することにより、糖尿病性腎症の病期を診断することも可能である。また、本発明は、PKM2又はその断片の発現の程度を比較することにより、糖尿病性腎症への重症化を予測することも可能である。
【００１８】
糖尿病性腎症は臨床的特徴（尿蛋白、クレアチニンクリアランス）に基づき、第I期（腎症前期）、第II期（早期腎症）、第III期前期（顕性腎症前期）、第III期後期（顕性腎症後期）、第IV期（腎不全期）、第V期（透析療法期）に分類される。本発明によれば全ての時期である第I期〜第V期における糖尿病性腎症を診断することができる。
【００１９】
糸球体上皮細胞は尿腔に直接接しており、尿中に漏出したPKM2又はその断片の測定が可能である。被検者の尿中のPKM2又はその断片を測定することにより簡便に糖尿病性腎症の診断が可能となる。なお被検者の試料は尿に限定されず、例えば血液(全血、血清、血漿)、唾液、精液等でも可能である。
【００２０】
本発明にかかる糖尿病性腎症を診断するための診断キットは、被検者から得られた試料におけるPKM2又はその断片を検出又は定量する手段を含む。
【００２１】
PKM2又はその断片の検出又は定量は、特に限定されるものではなく、単にPKM2又はその断片の有無を検出するものであってもよく、またPKM2又はその断片の発現量を相対的又は絶対的に決定するものでもよい。
【００２２】
PKM2又はその断片の発現量の測定は、免疫学的手法によるものが可能であり、例えば、電気泳動法による分離と蛍光、酵素、放射性同位元素等による検出又は定量との組み合わせ（ウェスタンブロット法、蛍光二次元電気泳動法を含む）、免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法を含む）、酵素免疫測定吸着法（ELISA）、ドット・ブロッティング法等により行うことができ、好ましくはELISAである。
【００２３】
本発明では、例えば、(1)尿サンプル中のPKM2又はその断片を測定するステップ、及び、(2)測定結果に基づき、糖尿病性腎症の発症の有無を診断するステップに基づいて、糖尿病性腎症の診断が可能である。
【００２４】
ステップ(1)では被検者由来の尿サンプルを用意し、その中に存在するPKM2又はその断片の含有量（濃度）を測定する。被検者は糖尿病患者又は潜在的糖尿病患者（糖尿病を罹患している可能性のある者）である。なお、上記したように、被検者由来の試料は尿サンプルに限定されず、例えば血液、唾液、精液等でも可能である。
【００２５】
ステップ(2)では、測定結果に基づき、糖尿病性腎症の発症の有無を診断する。診断に用いる基準値やカットオフ値は、使用するサンプルの状態、要求される精度等を考慮して適宜決定することが可能である。例えば、糖尿病性腎症を発症していない者（無症状患者）の尿中のPKM2又はその断片の量（基準値）を予め測定し、そして被検者の尿中のPKM2又はその断片の量が基準値と有意な差を示したとき、糖尿病性腎症を発症していると診断できる。
【００２６】
例えば糖尿病性腎症を発症していない者の尿中のPKM2又はその断片の量を０ ng/40μLとした場合、尿中のPKM2又はその断片の量が0.5 ng/40μL、好ましくは0.8 ng/40μL、より好ましくは1.0 ng/40μL以上の場合に糖尿病性腎症を発症していると診断できる。
【００２７】
診断は定性的なものに限られず半定量的又は定量的に行うことも可能である。例えば、以下に示すように測定値の範囲ごとに糖尿病性腎症を発症している可能性を設定することが可能である。
x＜測定値：糖尿病性腎症を発症している可能性は70％より大きい
y≦測定値＜x：糖尿病性腎症を発症している可能性は30％〜70％
測定値＜y：糖尿病性腎症を発症している可能性は30％未満
このステップ(2)の診断によれば、医師の診断によらずとも機械的に行うことができる。
【００２８】
上述したように、本発明者は、高糖下で培養した糸球体上皮細胞は解糖系依存型のエネルギー産生機構にシフトすること、即ちMRが惹起されることを見出したが、転写因子解析用のqPCRマイクロアレイを使用してそのMRを惹起する転写因子がMEF2C及びMYF5であることを明らかにした。即ち、MEF2C及びMYF5は、健常者と比較して発現が低下している場合に糖尿病性腎症であると診断することができ、また、MEF2C及びMYF5は発現が低下しているほど、その後の腎症進行が早いと判断可能である。
【００２９】
そのため本発明にかかる糖尿病性腎症の診断マーカーは、PKM2又はその断片及び転写因子MEF2Cからなる糖尿病性腎症の診断マーカーであって、PKM2又はその断片の発現上昇及び転写因子MEF2Cの発現低下の場合に糖尿病性腎症であると診断する。
【００３０】
また、本発明にかかる糖尿病性腎症の診断マーカーは、PKM2又はその断片及び転写因子MYF5からなる糖尿病性腎症の診断マーカーであってPKM2又はその断片の発現上昇及び転写因子MYF5の発現低下の場合に糖尿病性腎症であると診断する。
【００３１】
また、本発明にかかる糖尿病性腎症の診断マーカーは、PKM2又はその断片、転写因子MYF5及び転写因子MEF2Cからなる糖尿病性腎症の診断マーカーであってPKM2又はその断片の発現上昇、転写因子MYF5の発現低下、及び、転写因子MEF2Cの発現低下の場合に糖尿病性腎症であると診断する。
【実施例】
【００３２】
(1)網羅的プロテオーム解析
ヒトの培養糸球体上皮細胞（podocyte:Podo）を用い、糖尿病の条件を模した高糖（360mg/dl）下培養Podoと正常血糖相当の培養条件（90mg/dl）のPodoとの間で、網羅的な蛋白発現解析あるいは遺伝子発現解析を行った結果、高糖下で培養されたPodoではミトコンドリア機能が低下し、そのエネルギー代謝機構が酸化的リン酸化から解糖系への依存度を高めるMRが惹起されること、MRによりエネルギー産生が非効率化されることを見出した。
【００３３】
糖尿病性腎症症例の腎生検組織を用い、網羅的プロテオーム解析を行ったところ、発現が顕著に変化（1.5倍以上）していたMRに関与する蛋白が４つ検出された。それらにつき、各々の抗体を用い、正常腎と糖尿病性腎症腎とでの発現を検討したところ、PKM2の発現が糸球体内において上皮細胞特異的であり、かつプロテオームの結果と同様に、糖尿病性腎症で顕著に増加していた。結果を図１に示す。図１左側は正常腎の写真図であり、図１右側は糖尿病性腎症の写真図である。図１左側では糸球体内には陽性細胞は見られないが、図１右側では糸球体上皮細胞特異的にPKM2の発現増強が見られた。
(2)尿中測定
腎生検を施行し、組織診断の確定している被検者５例と健常者１例とを対象とした。腎生検組織診断によれば、被検者５例のうち糖尿病性腎症患者が３例、腎硬化症患者が１例、腎硬化症に糖尿病を合併した症例が１例であった。
【００３４】
早朝新鮮尿40 mLを採取して、市販のPKM2測定ELISAキット(BioVender  RD191345200R)を用い濃度測定を行った。結果を図２に示す。図２に示されるように、糖尿病性腎症においては、PKM2濃度（gCre換算）が増加していることが確認された。なお図２においてDMNは糖尿病性腎症を示し、DMは糖尿病を示す。
(3) MR惹起転写因子
糖尿病性腎症（DMN, N=5）と正常腎（Cont, N=5）の腎生検組織を用い、MEF2C, MYF5, PGC-1αに加え、培養実験にて解糖系酵素中で発現量変化が最大であったPyruvate Kinase, Muscle(PKM)の免疫染色後、糸球体を盲検下で評価した。結果を下記表１に示す。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
高血糖下で培養したPodocyteでは、ミトコンドリア（Mit）酸化的リン酸化系から解糖系に依存する非効率的エネルギー産生へとシフトし、その上流には転写因子MEF2C、MYF5の低下と、それに引き続くPGC-1α低下が関与することが判明した。
(4)尿中で測定されるPKM2の断片
糖尿病性腎症患者の早朝新鮮尿40 mLを採取して、尿中に含まれるPKM2断片の存在をSDSポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)分析により試験した。ポリアクリルアミドゲルは14.0%のアクリルアミド濃度を用いた。泳動したポリアクリルアミドゲルは Coomassieblue G-250で染色した。結果を図３に示す。図３においてPt#19は糖尿病性腎症患者の尿であり、Oriは原尿、ｘ33は濃縮させた尿を示す。矢印で示した58.6Kdは切断されていないPKM2であり、31.5KdはPKM2の断片である。図３に示されているように、糖尿病性腎症患者の尿中には、PKM2のみならずその断片も検出された。このPKM2の断片は、配列番号２で示される配列を有していた。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
糖尿病性腎症の診断に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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