(57)【要約】【課題】  密閉系で細胞培養を行うことができ、培養した細胞シートや組織状物等を簡便に取り出し可能な細胞培養容器、細胞培養方法、及び細胞培養容器の使用方法の提供を可能とする。【解決手段】  枠体と、枠体の表裏に接着された上面及び下面により内部空間が形成され、上面及び下面の少なくとも一方がガス透過性フィルムからなり、内部空間内に接着性細胞を培養するための基材を備え、枠体に少なくとも１つのアクセスポートを備えた細胞培養容器。これに培地を封入し、アクセスポートを介して基材に接着性細胞を播種して、接着性細胞を培養する。また、基材と共に接着性細胞を生体に移植するために、接着性細胞の付着した基材を回収する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
枠体と、前記枠体の表裏に接着された上面及び下面により内部空間が形成され、前記上面及び下面の少なくとも一方がガス透過性フィルムからなり、前記内部空間内に接着性細胞を培養するための基材を備え、前記枠体に少なくとも１つのアクセスポートを備えたことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項２】
前記上面及び下面の少なくとも一方が、引き剥がし可能に前記枠体に接着され、易引き剥がし部を備えたことを特徴とする請求項１記載の細胞培養容器。
【請求項３】
前記枠体に、細胞注入用ポートと培地移送用ポートをそれぞれ少なくとも１つずつ備えたことを特徴とする請求項１又は２記載の細胞培養容器。
【請求項４】
前記下面がガス透過性フィルムからなり、前記下面を介してガス透過可能に前記枠体の底部に脚部材を備えたことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項５】
前記基材が、生体膜、スポンジ、又はゲルであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項６】
前記基材を保持するための保持部材を備え、前記保持部材が、トランスウェル、シャーレ、又はディッシュであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項７】
前記ガス透過フィルムが透明であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の細胞培養容器に培地を封入し、前記アクセスポートを介して前記基材に接着性細胞を播種して、前記接着性細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の細胞培養容器を用いて接着性細胞を培養し、前記基材と共に前記接着性細胞を生体に移植するために、前記接着性細胞の付着した前記基材を回収することを特徴とする細胞培養容器の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の培養技術に関し、特に接着細胞を培養するための細胞培養容器、細胞培養方法、及び細胞培養容器の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療などの分野において、細胞シートや組織等を製造する場合、細胞を接着させるための基材（足場）を用いて細胞培養を行い、シート状物や組織状物が作成される。このような場合、一般にシャーレなどの大きな開口を有する開放系の容器を用いて基材の出し入れや培養作業が行われるが、一般に開放系での操作となるため、通常の環境下では雑菌の混入などの問題が生じるおそれがある。このため、細胞シートや組織等を製造するための細胞培養は、セルプロセッシングセンター（ＣＰＣ）などの施設において非常に厳しい管理下で行う必要があり、高いコストが生じるものとなっていた。
【０００３】
そこで、雑菌の混入などの問題を解消するために、閉鎖系の細胞培養容器を用いて細胞シートなどを製造する手法が提案されている。
例えば、特許文献１の図４には、フレームとガス透過性膜とこれに対向する面により閉鎖系の培養チャンバーが形成された細胞培養容器が記載されている。また、特許文献２の図１，２には、開口を有する容器本体と、この開口を封止するガス透過性フィルムとによって、閉鎖系の空間が形成された細胞培養容器が記載されている。
これらの細胞培養容器によれば、閉鎖系空間において、ガス透過性膜やフィルム上に細胞を付着させて培養でき、細胞シートなどをガス透過性膜やフィルムから引き剥がして回収することが可能となっている。
【０００４】
【特許文献１】特許第４８９７７５２号公報
【特許文献２】特開２００８−０２２７１５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、これら従来の細胞培養容器は、細胞シートなどをガス透過性膜やフィルムから引き剥がして回収するものであるため、医療現場での作業には適さないという問題があった。
例えば、培養対象の細胞が角膜細胞である場合、角膜上皮（又は内皮）細胞を羊膜上で培養し、得られた細胞を羊膜ごと移植することが望ましい。しかしながら、従来の細胞培養容器では、ガス透過性膜やフィルム上に細胞を付着させて培養し、フィルムなどから細胞を剥離するためにトリプシン等の溶液で処理するといった後処理工程が必要になるという煩雑な作業が必要であった。
このため、手術室などの医療現場で用いるのに適するものではなく、また培養細胞によっては後処理工程において細胞が損傷するおそれがあった。
【０００６】
そこで、本発明者らは鋭意研究し、培地交換等の作業を閉鎖系を維持して無菌的に行うことができ、かつ培養した細胞シートや組織状物等を密閉空間から簡便に取り出し可能な細胞培養容器を案出した。このような細胞培養容器を用いれば、セルプロセッシングセンターなどの大がかりな施設を使用せずとも細胞シートや組織状物等を低コストで培養することが可能となる。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、密閉系で細胞培養を行うことができ、培養した細胞シートや組織状物等を簡便に取り出し可能な細胞培養容器、細胞培養方法、及び細胞培養容器の使用方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明の細胞培養容器は、枠体と、前記枠体の表裏に接着された上面及び下面により内部空間が形成され、前記上面及び下面の少なくとも一方がガス透過性フィルムからなり、前記内部空間内に接着性細胞を培養するための基材を備え、前記枠体に少なくとも１つのアクセスポートを備えた構成としてある。
また、本発明の細胞培養方法は、このような細胞培養容器に培地を封入し、アクセスポートを介して前記基材に接着性細胞を播種して、前記接着性細胞を培養する方法としてある。
さらに、本発明の細胞培養容器の使用方法は、このような細胞培養容器を用いて接着性細胞を培養し、前記基材と共に前記接着性細胞を生体に移植するために、前記接着性細胞の付着した前記基材を回収する方法としてある。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、密閉系で細胞培養を行うことができ、培養した細胞シートや組織状物等を簡便に取り出し可能な細胞培養容器、細胞培養方法、及び細胞培養容器の使用方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の第一実施形態に係る細胞培養容器を示す斜視図である。
【図２】本発明の第一実施形態に係る細胞培養容器を示す平面図及び正面図である。
【図３】本発明の第一実施形態に係る細胞培養容器から基材を備えた保持部材を取り出した状態を示す図である。
【図４】本発明の第二実施形態に係る細胞培養容器を示す斜視図である。
【図５】本発明の第三実施形態に係る細胞培養容器を示す斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の細胞培養容器、細胞培養方法、及び細胞培養容器の使用方法の実施形態について、図面を用いて詳細に説明する。
【００１２】
＜第一実施形態＞
［細胞培養容器］
まず、本実施形態の細胞培養容器について、図１〜３を参照して説明する。図１は、本実施形態の細胞培養容器を示す斜視図であり、図２は、本実施形態の細胞培養容器を示す平面図及び正面図である。また、図３は、本実施形態の細胞培養容器から基材を備えた保持部材を取り出した状態を示す図である。
【００１３】
図１，２に示すように、本実施形態の細胞培養容器１０は、枠体１１と、この枠体１１の表裏に接着された上面１４及び下面１５を有し、これらによって内部空間が形成されている。
枠体１１は、固い側壁からなる枠である。この枠体１１の材料としては、特に限定されないが、後述するガス透過フィルムを接着させる観点から、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン系樹脂を好適に用いることができる。
枠体１１の形状は、内部空間を形成可能な形態であれば特に限定されないが、例えば図１〜３に示すような略直方体形状にすることができる。また、円柱形状や多角柱形状等にしても良い。
【００１４】
上面１４及び下面１５の少なくとも一方は、ガス透過性フィルムで構成される。ガス透過性フィルムは、細胞の培養に必要なガス透過性を有し、具体的には、5000ml／m2・day・atm（37℃−80％RH）以上の酸素透過率を有することが好ましい。また、このガス透過フィルムは、高い細胞増殖効率を実現するために、低細胞毒性、低溶出性、及び放射線滅菌適性を有することが好ましい。さらに、培養細胞を細胞培養容器１０の外側から観察可能にするために、ガス透過フィルムとして透明なものを用いることが好ましい。
また、上面１４及び下面１５の両方をガス透過性フィルムで構成すれば、ガス透過性をより向上できると共に、上下面からの観察が可能となるだけでなく、顕微鏡による詳細な観察も可能となるため好ましい。
【００１５】
ガス透過性フィルムの材料としては、ポリエチレン系樹脂を用いることが好ましい。ポリエチレン系樹脂としては、例えばポリエチレン、エチレンとα−オレフィンの共重合体、エチレンと酢酸ビニルの共重合体、エチレンとアクリル酸やメタクリル酸共重合体と金属イオンを用いたアイオノマー等を挙げることができる。また、ポリオレフィン、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーン樹脂等を用いることもできる。
【００１６】
また、図１に示すように、本実施形態の細胞培養容器１０において、ガス透過性フィルムを枠体１１から引き剥がす際に、取っ手として用いられる易引き剥がし部を備えることが好ましい。易引き剥がし部は、上面１４及び下面１５のいずれか一方又は両方に形成することができる。図１では、上面１４に易引き剥がし部１４１が備えられている。
易引き剥がし部が形成された上面１４及び／又は下面１５は、容易に引き剥がせるように、比較的弱い接着力となるように枠体１１に接着される。
【００１７】
また、本実施形態の細胞培養容器１０は、内部空間内に接着性細胞を培養するための基材１２を備えている。
培養対象の細胞は、接着性細胞であれば特に限定されないが、例えば皮膚細胞、角膜上皮細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、表皮細胞、間葉系幹細胞、軟骨細胞等を好適に用いることができる。
【００１８】
基材１２は、接着性細胞の培養の際に、細胞が付着して増殖するための足場として用いられる。基材１２は、培養する細胞に応じて適宜なものを選択することができるが、例えば羊膜およびコラーゲン等を好適に用いることができる。基材１２として羊膜を用いることで、移植の際に拒絶反応を起こりにくくすることができる。
【００１９】
保持部材１３は、基材１２を細胞培養容器１０において安定的に支持する部材である。
保持部材１３として、図１にはトランスウェルが示されている。トランスウェルは、ガス透過膜により底面が形成され、この底面上に基材１２が配置される。また、トランスウェルは、孔１３１を備え、この孔１３１を介して細胞培養容器１０内において培地が移動できる。このため、孔１３１がない場合に比較して、細胞培養容器１０内において保持部材１３を安定して配置させることが可能になっている。
また、図１において、トランスウェルは下部が略円柱形状で、上部が略円錐台形状をなしており、培養細胞を円形状に形成することが可能になっている。
保持部材１３は、基材１２を保持可能なものであれば良く、トランスウェルの他、ディッシュなどその他のものを用いることも可能である。
【００２０】
本実施形態の細胞培養容器１０は、枠体１１に少なくとも１つのアクセスポートを備えている。その個数は特に限定されず、２つ以上備えても良い。
図１では、３つのアクセスポートが備えられ、１つは細胞注入用アクセスポート１１１として、残りの２つは培地移送用アクセスポート１１２として設けられている。
細胞注入用アクセスポート１１１は、ゴムやシリコーンなどの弾性体からなり、この細胞注入用アクセスポート１１１を介してシリンジなどを用いて細胞培養容器１０内に細胞を含む細胞懸濁液を注入することができる。
【００２１】
また、２つの培地移送用アクセスポート１１２には、それぞれチューブ１６が接続されており、このチューブ１６を介して、一方を細胞の追加用、他方を細胞の回収用として使用し、細胞培養容器１０内における培地交換を迅速に行えるようになっている。
さらに、本実施形態の細胞培養容器１０において、サンプル用ポートやその他のポートを設けても良く、各種ポートをそれぞれ複数ずつ設けても良い。
なお、本実施形態の細胞培養容器１０においてアクセスポートを１つのみ備えた場合、１つのアクセスポートにより、細胞注入、培地移送、サンプリングなど細胞培養容器１０の内容物に関する移動の全てが行われる。
【００２２】
このような本実施形態の細胞培養容器１０によれば、密閉系で接着性細胞を培養することができ、培養した細胞を簡単かつ安全に回収することが可能である。
【００２３】
［細胞培養方法、及び細胞培養容器の使用方法］
本実施形態の細胞培養方法、及び細胞培養容器の使用方法では、前述した細胞培養容器１０に培地を封入し、アクセスポートを介して基材１２に接着性細胞を播種して、接着性細胞の培養が行われる。具体的には、例えば以下のような環境で使用することが可能である。
【００２４】
まず、無菌環境下の手術室において、本実施形態の細胞培養容器１０を滅菌袋から取り出し、一方のチューブ１６の端部を培地供給容器に接続し、もう一方のチューブ１６の端部を廃液容器に接続する。これにより、細胞培養容器１０の内部空間は、閉鎖系に保たれる。以下、このような細胞培養容器１０と培地供給容器と廃液容器との全体を細胞培養システムと称する場合がある。
【００２５】
次に、患者を手術して角膜上皮細胞を採取し、これを培地に加えて攪拌することにより細胞懸濁液を作成する。次いで、この細胞懸濁液をシリンジを用いて細胞注入用アクセスポート１１１から基材１２上に注入する。さらに、培地供給容器からチューブ１６及び培地移送用アクセスポート１１２を介して、細胞培養容器１０内に培地を供給する。これによって、細胞培養容器１０内において細胞の培養が開始する。
【００２６】
このような細胞培養容器１０の内部空間は密閉状態が保たれているため、細胞培養システムを手術室から無菌環境でない部屋に持ち運んでも、細胞の培養を無菌的に継続することができる。
そして、角膜上皮細胞が十分に増殖すると、再度細胞培養システムを無菌環境下の手術室に持ち運び、図３に示すように、細胞培養容器１０の易引き剥がし部１４１を摘んで上面１４を引き剥がし、枠体１１から保持部材１３を取り出す。そして、保持部材１３から基材１２を回収して、基材１２ごと患者に移植する。
【００２７】
細胞培養容器１０をこのように用いることで、セルプロセッシングセンターなどの大がかりな施設を使用することなく、閉鎖系を維持したまま接着性細胞を培養でき、接着性細胞の付着した基材１２を効率的に回収して、これを患者に迅速に移植することが可能となる。
このため、本実施形態の細胞培養方法、及び細胞培養容器の使用方法によれば、低コストで接着性細胞を培養でき、再生医療に好適に用いることが可能となっている。
【００２８】
＜第二実施形態＞
［細胞培養容器］
次に、本発明の第二実施形態の細胞培養容器について、図４を参照して説明する。図４は、本実施形態の細胞培養容器を示す斜視図である。
図４に示すように、本実施形態の細胞培養容器１０ａは、下面１５がガス透過性フィルムからなり、かつ下面１５を介してガス透過可能に枠体１１の底部に脚部材１７を備えた点で第一実施形態と相違している。その他の点については、第一実施形態と同様の構成とすることができる。
【００２９】
すなわち、細胞培養容器１０ａには、脚部材１７が枠体１１の四隅に備えられており、これによって、細胞培養容器１０ａを平面上に載置した場合でも、下面１５と該平面との間に空間を設けることができる。このため、本実施形態の細胞培養容器１０ａによれば、この空間と下面１５を介して細胞培養容器１０ａ内にガスを透過させることが可能になっている。
【００３０】
細胞培養容器１０ａに備える脚部材１７の個数や位置、形状等は、細胞培養容器１０ａを安定して載置可能であれば、特に限定されない。
また、細胞培養容器１０ａの材料も特に限定されないが、枠体１１と同様の材料を好適に用いることが可能である。
【００３１】
本実施形態の細胞培養容器１０ａによれば、脚部材１７が設けられることにより、細胞培養容器１０ａ内におけるガス交換効率を向上でき、培養効率を向上させることが可能となっている。
また、本実施形態の細胞培養容器１０ａは、第一実施形態と同様の細胞培養方法、及び細胞培養容器の使用方法に適用することが可能である。
【００３２】
＜第三実施形態＞
［細胞培養容器］
次に、本発明の第三実施形態の細胞培養容器について、図５を参照して説明する。図５は、本実施形態の細胞培養容器を示す斜視図である。
図５に示すように、本実施形態の細胞培養容器１０ｂは、保持部材１３を備えておらず、スポンジからなる基材１２ａを、接着性細胞を培養するための足場として備える点で第一実施形態と相違している。その他の点については、第一実施形態と同様の構成とすることができる。
【００３３】
このスポンジとしては、接着性細胞の足場として使用可能なものであれば特に限定されないが、例えばコラーゲンを含むものを好適に使用することが可能である。
また、本実施形態の細胞培養容器１０ｂ内に基材１２ａとして、スポンジに代えて、コラーゲンを含むゲルやアルギン酸などを用いたハイドロゲル、羊膜などの生体由来膜等を用いることも可能である。
【００３４】
このような本実施形態によれば、細胞培養容器１０ｂ内において、保持部材１３を用いずに、基材１２を直接配置することができる。このため、第一実施形態の細胞培養容器１０に比較して、より面積の大きい細胞シートなどを製造する場合に好適に用いることができる。
さらに、本実施形態の細胞培養容器１０ｂは、第一実施形態と同様の細胞培養方法、及び細胞培養容器の使用方法に適用することが可能である。
【００３５】
本発明は、以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記細胞培養容器を複数室備えたものとし、複数の培養を同時に実行できるようにしたり、第一実施形態と第三実施形態を組み合わせて保持部材内に羊膜に代えてスポンジやゲルなどを配置したり、あるいは第二実施形態と第三実施形態を組み合わせて保持部材を備えずにスポンジやゲルなどを配置した細胞培養容器に脚部材を設けるなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、接着性細胞を簡便かつ低コストで培養する場合に好適に利用することが可能である。
【符号の説明】
【００３７】
１０，１０ａ，１０ｂ  細胞培養容器
１１  枠体
１１１  細胞注入用アクセスポート
１１２  培地移送用アクセスポート
１２，１２ａ  基材
１３  保持部材
１３１  孔
１４  上面フィルム
１４１  易引き剥がし部
１５  下面フィルム
１６  チューブ
１７  脚部材
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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