(57)【要約】      （修正有）【課題】抗原特異的T細胞反応を向上させるための免疫原エンハンサーとしての融合タンパク質の提供。【解決手段】(a)抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメイン;(b)タンパク質トランスダクションドメイン;及び(c)病原体の抗原を含み、上記APC-結合ドメイン又は上記CD91受容体-結合ドメインは、融合タンパク質のN末端に位置し、上記病原体の抗原は、上記タンパク質トランスダクションドメインのC末端に位置し、上記タンパク質トランスダクションドメインが、(i)T細胞感作シグナル伝達ペプチド、リンカー及びトランスロケーションペプチドを含む融合タンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質であって、上記融合タンパク質は、
(a)  上記融合タンパク質のN末端に位置する、抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメイン；
(b)  上記APC-結合ドメイン又は上記CD91受容体-結合ドメインのC末端に位置するタンパク質トランスダクションドメインであって、
(i)  T細胞感作シグナル伝達ペプチド、リンカー及びトランスロケーションペプチドを含む融合ポリペプチドであって、
(1)  上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、上記融合ポリペプチドのN末端に位置し、
(2)  上記リンカーは、配列番号:15を含み、且つ、上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドとトランスロケーションペプチドとを結合し、
(3)  上記トランスロケーションペプチドは、長さ34-112のアミノ酸残基を有し、配列番号:3、20又は4と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、融合ポリペプチドと、
(ii)  T細胞感作シグナル伝達ペプチドと、
(iii)  配列番号:3、20又は4と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、長さ34-112のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチドからなる群より選択される上記タンパク質トランスダクションドメイン；及び、
(c)  上記タンパク質トランスダクションドメインのC末端に位置する、病原体の抗原；を含み、
上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、長さ28-53のアミノ酸残基を有し、配列番号:31と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含み、Xaa8はI又はLであり、Xaa10はV、F又はAであり、Xaa11はM又はLであり、Xaa17はL又はIであり、
上記APC-結合ドメイン又は上記CD91受容体-結合ドメインは、上記タンパク質トランスダクションドメインが上記トランスロケーションペプチド(biii)である場合、シュードモナスエキソトキシンA(PE)結合ドメインIのアミノ酸配列を有さない、融合タンパク質。
【請求項２】
前記APC-結合ドメイン又は前記CD91受容体-結合ドメインは、配列番号: 5、9、6、7及び8からなる群より選択される配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記融合タンパク質のC末端に位置する小胞体リテンション配列を更に含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記小胞体リテンション配列は、Lys-Asp-Glu-Leu(配列番号: 14)のアミノ酸配列を含む、請求項3に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記抗原が10個又は10個超のエピトープを含む場合、前記融合タンパク質は、そのC末端に前記小胞体リテンション配列を含まない、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質トランスダクションドメインは、前記融合ポリペプチド(bi)である、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記タンパク質トランスダクションドメインは、前記T細胞-感作シグナル伝達ペプチド(bii)である、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記タンパク質トランスダクションドメインと前記抗原との間に追加のリンカーを更に含み、前記追加のリンカーは、配列番号:15を含む、請求項7に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記タンパク質トランスダクションドメインは、前記トランスロケーションペプチド(biii)である、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記APC-結合ドメイン又は前記CD91受容体-結合ドメインと前記トランスロケーションペプチドと間に追加のリンカーを更に含み、前記追加のリンカーは、配列番号:15を含む、請求項9に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記タンパク質トランスダクションドメインは、配列番号:30の配列を有する、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
(a)  請求項1に記載の治療的有効量の融合タンパク質と、
(b)  アジュバントを含む、ワクチン組成物。
【請求項１３】
前記APC-結合ドメイン又は前記CD91受容体-結合ドメインは、配列番号: 5、9、6、7及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、配列番号:1又は2と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、配列番号:1及び2からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項14に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記トランスロケーションペプチドは、配列番号:3、20及び4からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
病原体抗原特異的T細胞反応の向上を誘導するために使用する、請求項1から16のいずれかに記載の融合タンパク質又はワクチン組成物。
【請求項１８】
疾患細胞の細胞膜上のクラスI MHC分子を介して抗原を提示する疾患細胞を殺すために使用する、請求項1から17のいずれかに記載の融合タンパク質又はワクチン組成物。
【請求項１９】
前記疾患細胞は、がん細胞である、請求項18に記載の使用のための、融合タンパク質又はワクチン組成物。
【請求項２０】
病原体によって引き起こされる感染を予防する、治療する、及び/又は、感染によって引き起こされるを症状を最小限にするために使用する、請求項1から19のいずれかに記載の融合タンパク質又はワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、融合タンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、T細胞性免疫応答を向上させる融合タンパク質に関する。
【０００２】
発明の背景
分子生物学は、サブユニットワクチンの生産を可能にした。免疫原は、親タンパク質又は複合体の断片又はサブユニットである。T細胞感作反応を誘発することができ、病原菌の多くの株由来の配列を組み込むのに十分な柔軟性がある安定ワクチンの開発が望まれている。
【０００３】
発明の開示
一つの態様では、本発明は、融合タンパク質であって、上記融合タンパク質は、
(a)  上記融合タンパク質のN末端に位置する、抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメイン；
(b)  上記APC-結合ドメイン又は上記CD91受容体-結合ドメインのC末端に位置するタンパク質トランスダクションドメインであって、
(i)  T細胞感作シグナル伝達ペプチド、リンカー及びトランスロケーションペプチドを含む融合ポリペプチドであって、
(1)  上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、上記融合ポリペプチドのN末端に位置し、
(2)  上記リンカーは、配列番号:15を含み、且つ、上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドとトランスロケーションペプチドとを結合し、
(3)  上記トランスロケーションペプチドは、長さ34-112のアミノ酸残基を有し、配列番号:3、20又は4と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、融合ポリペプチドと、
(ii)  T細胞感作シグナル伝達ペプチドと、
(iii)  配列番号:3、20又は4と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、長さ34-112のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチドからなる群より選択される上記タンパク質トランスダクションドメイン；及び、
(c)  上記タンパク質トランスダクションドメインのC末端に位置する、病原体の抗原；を含み、
上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、長さ28-53のアミノ酸残基を有し、配列番号:31と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含み、Xaa8はI又はLであり、Xaa10はV、F又はAであり、Xaa11はM又はLであり、Xaa17はL又はIであり、
上記APC-結合ドメイン又は上記CD91受容体-結合ドメインは、上記タンパク質トランスダクションドメインが上記トランスロケーションペプチド(biii)である場合、シュードモナスエキソトキシンA(PE)結合ドメインIのアミノ酸配列を有さない、融合タンパク質に関する。
【０００４】
本発明の一実施形態において、上記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインは、配列番号:5、9、6、7及び8からなる群より選択される配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。あるいは、上記APC-結合ドメインは、受容体関連タンパク質-1(RAP1)ドメインIII、アルファ-2-マクログロブリン受容体関連タンパク質(A2M)、HIV-Tat及びヒートショックタンパク質(HSP)及びシュードモナスエキソトキシンA(PE)結合ドメインIからなる群より選択される。
【０００５】
本発明の別の実施形態において、上記融合タンパク質は、シュードモナスエキソトキシンA(PE)結合ドメインIのアミノ酸配列を含まない。
【０００６】
本発明の別の実施形態において、上記融合タンパク質は、更に、融合タンパク質のC末端に位置する小胞体リテンション配列を有する。
【０００７】
本発明の別の実施形態において、上記小胞体リテンション配列は、Lys-Asp-Glu-Leu(配列番号:14)のアミノ酸配列を含む。上記ERリテンション配列は、配列番号:14、16-19からなる群より選択される配列を含んでいてもよい。あるいは、ERリテンション配列は、配列番号:16-19からなる群より選択される配列からなっていてもよい。
【０００８】
本発明の別の実施形態において、上記抗原が10又は10超のエピトープを含む場合、上記融合タンパク質はそのC末端において小胞体リテンション配列を含まない。
【０００９】
本発明の別の実施形態において、上記タンパク質トランスダクションドメインは、上記融合ポリペプチド(bi)である。
【００１０】
本発明の別の実施形態において、上記タンパク質トランスダクションドメインは、上記T細胞感作シグナル伝達ペプチド(bii)である。
【００１１】
本発明の別の実施形態において、上記融合タンパク質は、上記タンパク質トランスダクションドメインと上記抗原との間の追加のリンカーを更に含み、上記追加のリンカーは、配列番号: 15を含む。
【００１２】
本発明の別の実施形態において、上記タンパク質トランスダクションドメインは、上記トランスロケーションペプチド(biii)である。
【００１３】
本発明の別の実施形態において、上記融合タンパク質は、上記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインと上記トランスロケーションペプチドとの間の追加のリンカーを更に含み、上記追加のリンカーは、配列番号: 15を含む。
【００１４】
本発明の別の実施形態において、上記タンパク質トランスダクションドメインは、配列番号: 30の配列を含む。
【００１５】
本発明の別の実施形態において、上記APC-結合ドメインは、配列番号: 5、9、6、7及び8からなる群より選択される配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
本発明の別の実施形態において、APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインは、配列番号:5、9、6、7及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００１７】
本発明の別の実施形態において、上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、配列番号:1又は2と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
本発明の別の実施形態において、上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、配列番号:1及び2からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
本発明の別の実施形態において、上記トランスロケーションペプチドは、配列番号:3、20及び4からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２０】
本発明の別の実施形態において、トランスロケーションペプチドは、長さが34-61のアミノ酸残基を有する。
【００２１】
本発明の別の実施形態において、上記融合タンパク質のタンパク質トランスダクションドメインは、(i)T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、配列番号:1又は2のアミノ酸配列を含み、(ii)トランスロケーションペプチドは、配列番号:3と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、T細胞上のCD28受容体のK1(X)2E3(X)4(X)5Y6P7P8P9Y10(配列番号:32)のアミノ酸配列を認識して結合する抗体を誘導する特性を示し、(X)2はI又はLであり、(X)4はV、F又はAであり、(X)5はM又はLである。
【００２３】
別の態様においては、本発明は、融合タンパク質であって、上記融合タンパク質は、
(a)  上記融合タンパク質のN末端に位置するCD91受容体-結合ドメイン又は抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン；
(b)  上記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインのC末端に位置するタンパク質トランスダクションドメインであって、
(i)  T細胞感作シグナル伝達ペプチド、リンカー及びトランスロケーションペプチドを含む融合ポリペプチドであって、
(1)  T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、上記融合ポリペプチドのN末端に位置し、
(2)  上記リンカーは、配列番号:15を含み、且つ、上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドとトランスロケーションペプチドとを結合し、
(3)  上記トランスロケーションペプチドは、長さ34-112のアミノ酸残基を有し、配列番号:3、20又は4と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、融合ポリペプチドと、
(ii)  T細胞感作シグナル伝達ペプチドと、
(iii)  配列番号:3、20又は4と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、長さ34-112のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチドからなる群より選択されるタンパク質トランスダクションドメイン；及び、
(C)  上記タンパク質トランスダクションドメインのC末端に位置する病原体の抗原；、からなり、
上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、長さ28-53のアミノ酸残基を有し、配列番号:31と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、Xaa8はI又はLであり、Xaa10はV、F又はAであり、Xaa11はM又はLであり、Xaa17はL又はIであり、
上記タンパク質トランスダクションドメインがトランスロケーションペプチド(biii)である場合、上記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインは、シュードモナスエキソトキシンA(PE)ドメインIのアミノ酸配列を有さない。
【００２４】
上記抗原提示細胞(APC)は、樹状細胞、マクロファージ、B細胞及び単核細胞からなる群より選択してもよい。
【００２５】
本発明の一実施形態において、APCの細胞膜は、CD91受容体を含む。
【００２６】
別の態様においては、本発明は、(a)治療的有効量の上記融合タンパク質と、(b)アジュバントを含む、ワクチン組成物に関する。
【００２７】
上記アジュバントは、抗原デリバリー薬剤又は免疫強化剤である。本発明の一実施形態において、ワクチン組成物は、抗原デリバリー薬剤を含み、免疫強化剤を含まない。
【００２８】
更に別の態様においては、本発明は、治療的有効量の上記融合タンパク質を含むワクチン組成物を、それを必要とする対象に投与することによって、病原体抗原特異的T細胞反応の向上を誘導するステップを含む、病原体抗原特異的T細胞反応の向上を誘導する方法に関する。
【００２９】
更に別の態様においては、本発明は、治療的有効量の前記融合タンパク質を含むワクチン組成物を、それを必要とする対象に投与することによって、疾患細胞の細胞膜上のクラスI MHC分子を介して抗原を提示する疾患細胞を殺すステップを有する、疾患細胞の細胞膜上のクラスI MHC分子を介した抗原を提示する疾患細胞を殺す方法に関する。
【００３０】
本発明の一実施形態において、上記疾患細胞は、がん細胞である。
【００３１】
更に別の態様においては、本発明は、治療的有効量の請求項1の融合タンパク質を含むワクチン組成物を、それを必要とする対象に投与することによって、病原体によって引き起こされる感染を予防する、治療する、又は、感染によって引き起こされる症状を最小限にするステップを有する、病原体によって引き起こされる感染を予防する、治療する、又は、感染によって引き起こされる症状を最小限にする方法に関する。本発明は、病原体抗原特異的T細胞反応の向上を誘導するため、又は、疾患細胞の細胞膜上のクラスI MHC分子を介して抗原を提示する疾患細胞を殺すため、又は、病原体によって引き起こされる感染を予防する、治療する、若しくは、感染によって引き起こされる症状を最小限にするために使用する、上記融合タンパク質又はワクチン組成物にも関する。
【００３２】
病原体は、ヒトパピローマウイルス(HPV)、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス(PRRSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV-１)、インフルエンザウイルス、デング(Dangue)ウイルス、肝炎Cウイルス(HCV)、肝炎Bウイルス(HBV)及びブタサーコウイルス2(PCV2)からなる群より選択される少なくとも1つであってもよい。
【００３３】
本発明の一実施形態において、上記融合タンパク質は、抗原特異的細胞障害性T細胞反応を向上させるために、その必要がある対象に使用するためのものである。融合タンパク質は、抗原特異的CD4+ T細胞反応を向上させるために、又は、抗原特異的抗体価反応の向上を誘導するための免疫原エンハンサーとして使用するために、その必要がある対象に使用してもよい。
【００３４】
これらの態様及び他の態様は、以下の図面に関連する好適な実施形態に関する以下の記述から明らかになるだろう。但し、その中の変更形態及び修正形態は、開示する新規の概念の精神と範囲から逸脱することなく作用し得るものである。
【００３５】
添付の図面は、本発明の1又は複数の実施形態を例示して、明細書と共に本発明の原理を説明するのに役立つ。可能限り、同じ参照番号を図面の全体にわたって使用して、実施形態における同一又は類似の構成要素を指す。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図1は、ベクター図である。
【図２】図2は、融合タンパク質のSDS-PAGE分析結果を示している写真である。
【図３】図3は、ベクター図である。
【図４】図4は、本発明の一実施形態を示す略図である。
【図５Ａ】図5Aは、免疫化のスケジュールを示す。
【図５Ｂ】図5Bは、融合タンパク質のSDS-PAGE分析結果を示している写真である。
【図５Ｃ−Ｄ】図5C-Dは、それぞれ、様々な融合タンパク質又はプラセボによってワクチン接種を受けた動物群における、腫瘍サイズ曲線と腫瘍がないマウスのパーセンテージを示しているグラフである。
【図６】図6は、融合タンパク質の調製のための流れ図(左パネル)と、融合タンパク質のSDS-PAGE分析結果を示している写真(右パネル)を示している。
【図７】図7は、T細胞感作融合タンパク質の作用のメカニズムを示す模式図である。
【図８】図8は、様々な種由来のCD28の配列アライメントを示す。
【図９】図9Aは、免疫化のスケジュールを示す。図9B-Cは、それぞれ、様々な融合タンパク質又はプラセボによってワクチン接種を受けた動物群における腫瘍サイズ曲線及び生存率を示す。
【図１０】図10は、病原体由来のDNA挿入物を含むプラスミドを作成するために使用するRAP1含有ベクターを示す模式図である。
【図１１】図11は、様々な病原体の抗原を含む融合タンパク質の構造を示す模式図である。
【図１２】図12A-Fは、様々な融合タンパク質のSDS-PAGE分析結果を示している写真である。
【図１３】図13A-Bは、動物を免疫化するために使用する動物群、ワクチン及び用量、並びに、免疫化スケジュールを示す。
【図１４】図14A-Dは、E716、E718、HCVコア若しくはHBx抗原を含む融合タンパク質又はプラセボによってワクチン接種を受けた図13Aの動物群由来のCD3+/CD4+脾細胞及びCD3+/CD8+脾細胞のex vivo抗原特異的免疫反応分析結果を示している表である。
【図１５Ａ−Ｂ】図15A-Bは、PCV2(15A-B)を含む融合タンパク質又はプラセボによってワクチン接種を受けた図13Aの動物群由来のCD3+/CD8+脾細胞及びCD3+/CD4+脾細胞のex vivo抗原特異的免疫反応分析におけるIFNγ+細胞計数を示す。
【図１５Ｃ−Ｊ】図15C-Jは、PRRSV抗原(15C-J)を含む融合タンパク質又はプラセボによってワクチン接種を受けた図13Aの動物群由来のCD3+/CD8+脾細胞及びCD3+/CD4+脾細胞のex vivo抗原特異的免疫反応分析におけるIFNγ+細胞計数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
本発明は、以下の実施例に特に記載されている。多数の変更形態及びバリエーションが当業者にとって明らかであるため、実施例は、説明のためであることを意図している。以下、本発明の様々な実施形態の詳細について説明する。図面に関して、同じ番号は、図全体にわたって、同じ構成要素を示す。本願明細書及び添付の請求項全体に渡る記述において使用している通り、「a」、「an」及び「the」の意味は、文脈において別途明確に示していない限り、複数を含むまた、本願明細書及び添付の請求項全体に渡る記述において使用している通り、「in」の意味は、文脈において別途明確に示していない限り、「in」及び「on」を含む。さらに、表題又は副題は、読者の便宜のために明細書において使用されているが、本発明の範囲に対する影響を及ぼすものではない。加えて、この明細書において使用するある種の用語は、下でより詳しくは規定している。
【００３８】
定義
この明細書において使用する用語は、一般的に、本発明の背景内の技術分野、及び、各用語が使用されている特定の文脈における通常の意味を有する。本発明を説明するために用いるある種の用語は、本発明の記述に関して実践者に追加のガイダンスを提供するために、以下、又は、別途明細書中にて説明する。便宜上、ある種の用語は、例えば、イタリック及び/又は引用符を使用して、強調されているだろう。強調表示の使用は、用語の範囲及び意味に対する影響を与えない。用語の範囲及び意味は、それが強調されていようといまいと、同じ文脈において同じである。同じことを複数の方法で述べることができることはいうまでもない。その結果、代替の言葉及び同義語を、本願明細書において述べられる任意の1又は複数の用語のために用いることができるが、本願明細書において詳しく述べている又は議論されているか否かによって与えられる任意の特別な用語ではない。ある種の用語には同義語が提供される。1又は複数の同義語の記載は、他の同義語の使用を排除しない。この明細書における例示(本願明細書に記載の任意の用語の例示を含む)の使用は、解説のためだけにあり、本発明又は任意の例示用語の範囲及び意味を限定するものではない。同様に、本発明は、この明細書が提供する様々な実施形態に限定されない。
【００３９】
別途規定されない限り、本願明細書において用いられる全ての技術的及び科学的な用語は、一般的に、本発明が関係する当業者が理解するのと同じ意味を有する。不一致の場合は、定義を含む本書が支配的である。
【００４０】
本明細書で用いられるように、「約」、「凡そ」又は「だいたい」は、所定の値又は範囲の20パーセント以内、好ましくは10パーセント以内、より好ましくは5パーセント以内を一般的に意味する。はっきりと明言されていない場合、本願明細書が与える数量は、用語「約」、「凡そ」又は「だいたい」を推定することができることをだいたい意味する。
【００４１】
「抗原提示細胞(APC)又は補助細胞」という用語は、それらの表面上の主要組織適合性複合体(MHC)と複合体を形成した外来抗原を提示する細胞を指す。T細胞は、それらのT細胞受容体(TCR)を使用しているこれらの複合体を認識することができる。これらの細胞は、抗原を処理して、それらをT細胞に提示する。主要なタイプの成熟抗原提示細胞は、樹状細胞(DC)、マクロファージ、単核細胞及びある種のB細胞である。
【００４２】
「抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン」という用語は、抗原提示細胞(APC)に結合することができるドメインをいう。APC-結合ドメインは、配列番号: 5、6、7、8及び9からなる群より選択される配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。APC-結合ドメインは、APC上の受容体を認識して結合するリガンドである。
【００４３】
分化抗原群91(CD91)は、細胞膜の受容体を形成し、受容体依存性エンドサイトーシスに関連するタンパク質である。
【００４４】
「タンパク質トランスダクションドメイン」という用語は、T細胞を感作することによって抗原特異的T細胞反応を向上させる機能及び/又は抗原提示のクラスI主要組織適合複合体(MHC-I)経路(即ち、細胞障害性T細胞経路)に抗原を案内又は導く(即ち、標的にする)機能を有するポリペプチド又は融合ポリペプチドを指す。
【００４５】
「T細胞を感作する」という用語は、CD8+及びCD4+ T細胞を感作して、結果として、抗原投与に対するCD8+(CTL)及びCD4+ T細胞反応が向上することを一般的に意味する。抗原特異的細胞性免疫反応は、抗原に対する応答として抗原特異的に誘導されたγ-インターフェロンの生産を定量化することによって測定される。例えば、感作シグナルがない(即ち、タンパク質トランスダクションドメインなし)と、単独抗原は、細胞性免疫反応を弱く誘導する又はまったく誘導しない可能性、即ち、CD8+及びCD4+ T細胞由来の抗原特異的γ-インターフェロンを弱く誘導する又は全く誘導しない可能性がある一方で、感作シグナル(タンパク質トランスダクションドメイン)の存在下において、抗原は、細胞性免疫反応の向上を誘導することができる。従って、感作シグナル(タンパク質トランスダクションドメイン)の機能は、宿主においてCD4+及びCD8+ T細胞を感作することである。その後、宿主に抗原が投与されると、抗原は、CD4+及びCD8+ T細胞感作が先であるため抗原特異的細胞性免疫反応の向上を誘導することができる。
【００４６】
タンパク質トランスダクションドメインは、
(i)  T細胞感作シグナル伝達ペプチド、リンカー及びトランスロケーションペプチドを含む融合ポリペプチドであって、
(1)  上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、融合ポリペプチドのN末端に位置し、
(2)  上記リンカーは、配列番号: 15を含み、且つ、上記T細胞感作シグナル伝達ペプチド及びトランスロケーションペプチドを結合し、
(3)  上記トランスロケーションペプチドは、長さ34-112のアミノ酸残基を有し、配列番号:3、20又は4と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、融合ポリペプチド;
(ii)  T細胞感作シグナル伝達ペプチド;
(iii)  配列番号:3、20又は4と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、長さ34-112のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチド;からなる群より選択されるペプチド及び/又はポリペプチドであってもよい。
【００４７】
タンパク質トランスダクションドメインは、「融合ポリペプチド」であってもよく、上記融合ポリペプチドは、T細胞感作シグナル伝達ペプチド、リンカー及びトランスロケーションペプチドを含む。例えば、融合ポリペプチドは、ポリペプチド「CD28convPEt」であってもよい。
【００４８】
「CD28conv」という用語は、「T細胞感作シグナル伝達ペプチド」であるCD28保存領域を指す。これは、CD28アゴニスト抗体を誘導するエピトープである。
【００４９】
「PEt」という用語は、長さ34-112のアミノ酸残基を有するトランスロケーションペプチドを指す。
【００５０】
リンカーは、「CD28conv」と「PEt」との間に存在する。融合ポリペプチド「CD28convPEt」の方向又は配置は重要であり、「CD28conv」(又は、T細胞感作シグナル伝達ペプチド)は、PEt(又は、トランスロケーションペプチド)の上流に位置しなければならない、即ち、PEtは、T細胞反応の向上を得るために「CD28conv」のC末端に位置しなければならない。「CD28convPEt」は、逆方向融合ペプチドPEtCD28convよりもCD28convに特異的なIgG価をより高く上げることができる(CD28特異的アゴニスト抗体と呼ばれる)。CD28-特異的アゴニスト抗体は、CD4+及びCD8+ T細胞を感作することができる。適切な方向の融合ポリペプチドCD28convPEtは、CD28convとPEtドメインとの間にリンカー(RXRXKR)を含む。リンカーは、抗原提示細胞-(APC)特異的プロテアーゼ(カテプシンL)切断サイトLys-Arg(KR)を含む。従って、融合タンパク質RAP1-CD28convPEt-抗原-K3は、2つの断片(RAP1-CD28conv及びPEt-抗原-K3)に消化され得る。RAP1-CD28conv断片は、リソソームにおいて更に消化され、次に、CD28convのエピトープは、MHC II経路を介してAPC細胞表面に提示される。これは、CD28アゴニスト抗体を生産する体液性免疫反応を誘導する。従って、CD28アゴニスト抗体は、B細胞によって生産される。このCD28アゴニスト抗体は、T細胞表面上のCD28に結合することができ、T細胞(CD4+及びCD8+ T細胞)を予め活性化することができる。
【００５１】
「T細胞-感作シグナル伝達ペプチド」は、長さ28-53のアミノ酸残基を有し、配列番号:31と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有し、Xaa8はI又はLであり、Xaa10はV、F又はAであり、Xaa11はM又はLであり、Xaa17はL又はIである。
【００５２】
T細胞-感作シグナル伝達ペプチドは、臨界領域K1(I/L)2E3(V/F/A)4(M/L)5Y6P7P8P9Y10 (配列番号:32)を有し、(X)2はI又はLであり、(X)4はV、F又はAであり、(X)5はM又はLである。
【００５３】
マウスに特異的なT細胞感作シグナル伝達ペプチド(TDIYFCKIEFMYPPPYLDNEKSNGTIIH;配列番号:31、X8はIであり、X10はFであり、X11はMである)を、以下の実施例で使用した。
【００５４】
図7は、一例として、融合タンパク質RAP1-CD28convPEt-E7-K3を使用した、T細胞-感作融合タンパク質の作用メカニズムを示す模式図である。RAP1-CD28convPEt-E7-K3は、N末端からC末端にかけて、(1)N末端の完全長RAP1のドメインIII、(2)CD28conv、(3)リンカー、(4)シュードモナスエキソトキシンA由来の改変トランスロケーションペプチド、(5)完全長HPVタイプ16 E7タンパク質、及び(6)C末端のERリテンションシグナルである３つのKDELを含む。HPV16 E7タンパク質は、融合タンパク質によって免疫化される対象の細胞内においてエピトープに加工される。RAP1-CD28convPEt-E7-K3は、抗原だけを有する従来のワクチンよりも良好な細胞障害性T細胞(CTL)反応を誘導することができる。RAP1-CD28convPEt-E7-K3タンパク質は、APC(例えば樹状細胞)取り込み効率を上げて、プロテアソーム経路、そしてMHC I複合体を経て提示する、HPV16 E7抗原処理を向上させるように設計した。ワクチンRAP1-CD28convPEt-E7-K3によって誘導されるHPV16 E7タンパク質特異的CTL免疫反応の作用メカニズムは、図7に示しており、(a)ワクチンは、APC(例えば樹状細胞)表面受容体(CD91)に結合して、エンドサイトーシスを介して内在化する(b1)、RAP1-CD28convPEt-E7-K3は、トランスロケーションペプチドPEt前のサイトにおいてカテプシンLプロテアーゼ消化によってタンパク質加水分解を受ける(b2)、又はE.R.にリサイクルして、トランスロケーションペプチドPEt前のサイトにおいてフーリンプロテアーゼによってタンパク質加水分解を受ける(b3)。その間に、RAP1-CD28convは、リソソームプロテアーゼによって消化され、そして、CD28convのエピトープがMHC IIを介して細胞表面に提示され、CD28アゴニスト抗体産生を誘導する。これは、T細胞をプレ活性化させることができる。(c)最も重要なステップは、トランスロケーションペプチド(PEt)によるリソソーム由来の細胞質区画へのPEt-E7-K3の膜貫通トランスロケーションであり、(d)PEt-E7-K3は、プロテアソーム経路を介して消化を受けて、そして、E7のエピトープはMHC I複合体によって提示され、E7特異的細胞性免疫反応を誘導する。
【００５５】
図8は、様々な種由来のCD28保存領域の配列アライメント及びコンセンサス配列を示す。コンセンサス配列中の下線を引いた配列(KIEVMYPPPY;配列番号: 32、X2はIであり、X4はVであり、X5はMである)は、CD28アゴニスト抗体認識及び結合のための臨界領域である。この臨界領域配列は、K1(I/L)2E3(V/F/A)4(M/L)5Y6P7P8P9Y10によって表すことができ、その中の第四アミノ酸残基だけは、種特異的であり、ヒト、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ及びウマにおいてV、マウスにおいてF及びシチメンチョウおいてVでなければならない。臨界領域配列は、K1(X)2E3(X)4(X)5Y6P7P8P9Y10(配列番号:32)として表すことができ、(X)2はI又はLであり、(X)4はV、F又はAであり、(X)5はM又はLである。
【００５６】
PEtは、配列番号:3又は20と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むことができる。例えば、PEtのアミノ酸配列は、PEのa.a.280 - a.a.313(配列番号: 3)、a.a.268 - a.a.313(配列番号: 20)、a.a.253 - a.a.313又はa.a.253 - a.a.364(配列番号: 4)であってもよい。すなわち、PEtのアミノ酸配列は、a.a.280-a.a.313(配列番号: 3)必須断片を含む限り、PEドメインII(a.a.253〜a.a.364;配列番号:4)の任意の領域を含むことができる。
【００５７】
抗原は、病原体によって引き起こされる疾患の原因となる、又は、病原体によって感染している宿主の免疫学的反応を誘導することができる病原性タンパク質、ポリペプチド又はペプチド、又は、具体的には、腫瘍細胞において特異的に発現したポリペプチドである腫瘍関連抗原(TAA)であってもよい。抗原は、ヒトパピローマウイルス(HPV)、PRRSV、HIV-１、インフルエンザウイルス、デングウイルス、肝炎Cウイルス(HCV)、肝炎Bウイルス(HBV)、ブタサーコウイルス2(PCV2)、非小細胞肺がん、乳がん、メラノーマ、リンパ腫、結腸がん、肝細胞がん及び任意のそれらの組み合わせを含むがこれに限定されない病原体又はがん細胞から選択することができる。例えばHPV E7タンパク質(E7)、HCVコアタンパク質(HCVコア)で、ある、HBV Xタンパク質(HBx)を、ワクチン開発のための抗原として選択した。抗原は、1又は複数の病原性タンパク質から選択される2以上の抗原の融合由来の融合抗原であってもよい。例えば、PRRSV ORF6及びORF5断片の融合抗原又はPRRSV及びPCV2病原体由来の抗原タンパク質の融合。
【００５８】
小胞体リテンション配列の機能は、エンドサイトーシス区画からERへの抗原のトランスロケーションを促進することであり、それをルーメンに保持する。これは、配列Lys Asp Glu Leu(KDEL)又はRDELを有する。ER配列は、KKDLRDELKDEL(配列番号: 16)、KKDELRDELKDEL(配列番号: 17)、KKDELRVELKDEL(配列番号: 18)の配列からなる、から本質的になる、又は含むことができる。
【００５９】
39kDaの分子量を有する受容体関連タンパク質(RAP1)は、LDL受容体関連タンパク質に関する分子シャペロン及びERタンパク質である。これは、CD91に対する高結合親和性(Kd〜3nM)を有し、3つの機能が類似するドメインによって構成される。
【００６０】
本発明は、本発明の融合タンパク質によるT細胞性免疫反応の向上及び誘導の発見に関する。一実施例としてRAP1-CD28convPEt-E7-K3を用いたRAP1-CD28convPEt-E7-K3ワクチンの戦略は、標的抗原E7発現HPV16感染細胞を認識することができるT細胞の生産及び活性化を刺激することに主に焦点をおいている。抗原を樹状細胞に送達することによって、抗原特異的CD8+ T細胞及びCD4+ T細胞を生産することができる。１型-ヘルパーCD4+ T細胞は、特に、細胞毒性CD8+ T細胞の免疫反応を効率的に刺激して増やすことが可能である。共に、適応免疫系のこれら2つのアームは、著しい損傷を正常組織に与えることなく、身体における複数の部位でHPV16-感染細胞又はHPV16関連腫瘍細胞を殺す特異性及び力価を有する。
【００６１】
「対象」という用語は、ヒト又は非ヒト動物をいう。
【００６２】
「治療」又は「処置」という用語は、疾患、その症状又はその素因の治癒、緩和、軽減、救済、寛解又は予防の目的で、有効量の融合タンパク質を、それを必要とする対象(上記対象はがん又は感染、又はかかる疾患に対する症状又は素因を有する)に投与することを指す。かかる対象は、任意の適切な診断法からの結果に基づいて健康ケアの専門家によって同定することができる。
【００６３】
「有効量」という用語は、治療対象に治療効果を与える必要がある有効化合物の含量を指す。有効量は、当業者が認識している通り、他の治療薬との共同使用の可能性に応じて変化するだろう。
【００６４】
略称: CD 28(分化抗原群28)。
【実施例】
【００６５】
本発明の範囲を制限する意図なしに、本発明の実施形態による例示的な機器、装置、方法及びそれらの関連結果を以下に示す。表題又は副題は、読者の便宜のために実施例に使用しているが、本発明の範囲を決して制限してはならないことに注意されたい。さらに、ある種の理論が提唱されており、本願明細書に開示している。しかしながら、正しいか間違っているかどうかに関係なく、任意の特定の理論又は作用のスキームに関係なく本発明によって実施される限り、本発明の範囲を決して制限してはならない。
【００６６】
実施例1
発現ベクターの構造
図1は、融合タンパク質RAP1-PE268-313-E7-K3の発現ベクターを示す。これは、RAP1ドメイン3(配列番号:5)、トランスロケーション最小必須ペプチド(PE268-313;配列番号:20)、抗原E7及び小胞体リテンション配列(K3又はKDELシグナル;配列番号:16、17、18、又は19)を含む。トランスロケーション最小必須ペプチド(PE268-313;配列番号:20)は、a.a.268からa.a.313のPE(配列番号:10)ポリペプチド配列領域から得られた。
【００６７】
この発現ベクターは、図10に示されるプラスミドRAP1-K3を用いて構成した。プラスミドRAP1-K3(図10)は、RAP-1ドメイン3及びK3の融合遺伝子を含むものであり、以下のようにして生成した。NdeIRAP1-(EcoRI、XhoI)-K3XhoIをエンコードしているDNA断片を、PCR方法によって合成して、カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドpUC18主鎖に結合し、プラスミドRAP1-K3(図10)を得た。発現ベクターRAP1-PE268-313-E7-K3(図1)の作成のために、PE268-313-E7をエンコードしているDNA断片を、プラスミドRAP1-K3(図10)に挿入した。同様の方法を用いて、様々な融合ペプチドをエンコードしているDNA断片を、PCR(図11)によって作成して、それぞれをプラスミドRAP1-K3(図10)に挿入し、様々な融合タンパク質の発現ベクター(図12A-F)を作成した。図3は、融合タンパク質RAP1-CD28convPEt-E7-K3(図3)の発現ベクターを示している。
【００６８】
断片CD28convPEtは、カテプシンL及びフーリンプロテアーゼ切断サイトを含む。図4は、融合タンパク質RAP1-CD28convPEt-E7-K3のアミノ酸配列マップを示し、断片CD28convPEtの重要性を示している。2本の矢は、それぞれ、カテプシンL及びフーリンプロテアーゼ切断サイトを示している。これらの2つの切断サイトは、CD28convとPEt-E7を結合するためのリンカーの役割を果すだけでなく、融合タンパク質の切断がリソソームから細胞質への断片PEt-E7-K3の放出も可能になる。様々な病原体由来の関心のある任意の他の抗原は、E7に代えて、CD28convPEtと融合することができ、そして、融合産物を図10のプラスミドに挿入して、図11に示す融合タンパク質に関する様々な発現ベクターを作成することができる。
【００６９】
PE268-313の配列は、pletftrhrqprgweqleqcgypvqrlvalylaarlswnqvdqvir(配列番号:20)である。CD28convPEtの全配列は、以下の通りである: tdiyfckiefmypppyldneksngtiihrarykrgweqleqcgypvqrlvalylaarlswnqvdqvirgs(配列番号:30)。下線の配列は、カテプシンL及びフーリンプロテアーゼ切断サイトを含むリンカー配列を表す。
【００７０】
実施例2
タンパク質発現
タンパク質発現ベクターを含む大腸菌BL21細胞を、25μg/mlのカナマイシンを含むルーリアベルターニブロス中で37℃で培養した。培養が初期対数期(A600=0.1から0.4)に到達すると、誘導のためにイソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド(IPTG)を0.5〜2mMの終濃度で加えた。IPTG誘導の4時間後、細胞を回収して、超音波処理によって破壊した。過剰発現タンパク質含有封入体を単離して、8Mの尿素/TN緩衝液(8Mの尿素、50mMのトリス、50mMのNaCl、pH 8.0)に可溶化した。
【００７１】
融合タンパク質RAP1-PE268-313-E7-K3のリフォールディングは、4℃で一晩、50X体積のTNZ緩衝液(50mMのトリス、50mMのNaCl及び0.01mMのZnCl2、pH8.0)において透析によって実行した。リフォールディングしたタンパク質を、還元(ジチオトレイトール;+DTT)条件及び非還元(ジチオトレイトールなし;-DTT)条件下でSDS-PAGE分析を行った。この結果から、ほとんどのリフォールディングタンパク質は還元条件下で単量体であることが示されたことから、RAP1融合タンパク質は容易にリフォールディングされ、凝集されなかったことが示された(図2)。
【００７２】
図6Aは、(マウスCD28conv又はヒトCD28convを有する)融合タンパク質RAP1-CD28PEt-E7-K3を発現させて、大腸菌細胞の封入体から抽出することを示す流れ図である。SDS-PAGE分析から、融合タンパク質がよくリフォールディングされていることが示された(図6B)。
【００７３】
図11は、上述の方法と類似の方法を使用して発現された融合タンパク質のリストを示している。(1)RAP1-PE268-313-E7-K3;(2)RAP1-CD28convPEt-E7-K3;(3)RAP1-CD28PEt-E718-K3;(4)RAP1-HCVコア-K3;(5)RAP1-CD28conv-HCVコア-K3;(6)RAP1-CD28convPEt-HCVコア-K3;(7)RAP1-HBx;(8)RAP1-HBx-K3;(9)RAP1-CD28conv-HBx;(10)RAP1-CD28conv-HBx-K3;(11)RAP1-CD28convPEt-HBx;(12)RAP1-CD28convPEt-HBx-K3;(13)RAP1-PCV2ORF2-K3;(14)RAP1-PE268-313-PCV2ORF2-K3;(15)RAP1-CD28convPEt-PCV2ORF2-K3;(16)RAP1-PE268-313-DGD-K3;(17)RAP1-PE268-313-M12-K3;(18)RAP1-PE268-313-PQAB-K3;(19)RAP1-PE268-313-RSAB-K3;(20)RAP1-CD28convPEt-DGD-K3;(21)RAP1-CD28convPEt-M12-K3;(22)RAP1-CD28convPEt-PQAB-K3;(23)RAP1-CD28convPEt-RSAB-K3。これらの融合タンパク質は、上述の方法と同じ方法を使用して、リフォールディングさせた。SDS-PAGE分析の結果から、これらの融合タンパク質は、よくリフォールディングされたことから、ワクチン作成に用いた(図12A-F)。
【００７４】
実施例3
RAP1-PE268-313-E7-K3は、ヒトパピローマウイルス(HPV)タイプ16 E7タンパク質によって誘導される腫瘍の成長を阻害する。
融合タンパク質PE407-E7-K3及びRAP1-PE268-313-E7-K3は、上記の通りに発現させて、SDS-PAGE(図5B)によってタンパク質リフォールディングを検討した。s.c.注射を介して2×103のTC-01細胞(HPVタイプ16 E7遺伝子を含むマウス肺上皮細胞株)をマウスに投与して、HPV-16タイプ上皮性悪性腫瘍を誘導した。TC-01細胞投与の12日後、1週1回を3週間、アジュバントとしてのAS04C(グラクソスミスクライン)と共に、プラセボ(PBS+リン酸アルミニウム)、PE407-E7-K3(200μg/投与)又はRAP1-PE268-313-E7-K3(200μg/投与)をs.c.にてマウスにワクチン接種した(図5A)。AS04Cは、細胞毒性Tリンパ球向上アジュバントであり、MPL(モノホスホリルリピドA、免疫強化剤)及びリン酸アルミニウム(抗原デリバリーのためのタンパク質吸着剤)を含む。「K3」という用語は、アミノ酸配列KDELKDELKDEL(配列番号:19)を表す。各群における腫瘍のサイズ及び腫瘍がない動物の数を記録した(図5C-D)。腫瘍成長は、アジュバントとしてのAS04Cを有するワクチンPE407-E7-K3及びRAP1-PE268-313-E7-K3によって著しく抑制された。しかしながら、RAP1-PE268-313-E7-K3によるワクチン接種を受けたマウス群は、腫瘍がないマウスの割合が高かった。これは、ワクチンRAP1-PE268-313-E7-K3は、腫瘍成長の抑制についてPE407-E7-K3と同じくらい有効又はそれよりも有効であるが、腫瘍がない動物のパーセンテージはより増加することを示している。
【００７５】
実施例4
RAP1-CD28convPEt-E7-K3は、ヒトパピローマウイルス(HPV)タイプ16 E7タンパク質によって誘導された腫瘍の成長を阻害して、生存率を増加させる。
【００７６】
腫瘍サイズ及び生存率について、免疫強化剤の有無での融合タンパク質PE407-E7-K3及びRAP1-CD28convPEt-E7-K3の効果を検討した。マウスは、s.c.注射を経て高用量のTC-01細胞(3x104)を投与した。投与の7日後、1週1回を3週間、免疫強化剤GPI-0100又はタンパク質吸着性リン酸アルミニウムと共に、プラセボ、PE407-E7-K3(100μg/投与)又はRAP1-CD28convPEt-E7-K3(100μg/投与)をs.c.にてワクチン接種した(図9A)。GPI-0100は、Th1/CTL刺激アジュバント(免疫強化剤)である。各群における腫瘍のサイズ及び生残率を記録した(図9B-C)。アジュバントGPI-0100と組み合わせると、PE407-E7-K3及びRAP1-CD28convPEt-E7-K3の両方は、腫瘍成長を抑制した。予想外に、腫瘍成長を阻害するRAP1-CD28convPEt-E7-K3の効果がアジュバントに依存していないということを発見した。アジュバントGPI-0100よりもむしろ吸着性リン酸アルミニウムと組み合わせると、RAP1-CD28convPEt-E7-K3は、免疫強化剤GPI-0100と組み合わせた時と同じ力価にて腫瘍成長を更に著しく抑制することができた(図9B、非中塗り三角形対中塗り逆三角形)。
【００７７】
対照的に、腫瘍成長を抑制するPE407-E7-K3の力価は、アジュバント次第であった。吸着性リン酸アルミニウムと組み合わせると、PE407-E7-K3は、免疫強化剤GPI-0100と組み合わせたときよりも低い力価になった(図9B、中塗り正方形対非中塗り円)。
【００７８】
一方では、免疫強化剤GPI-0100又は吸着性リン酸アルミニウムと組み合わせて、RAP1-CD28convPEt-E7-K3を投与したマウスは、GPI-0100又はリン酸アルミニウム組み合わせて、PE407-E7-K3をワクチン接種した群よりも生存率が良好であった(図9C)。このことから、RAP1-CD28convPEt-E7-K3は、免疫強化剤GPI-0100がなくてもTh1/CTL免疫反応を引き出すことができることが示された。この結果は、融合タンパク質RAP1-CD28convPEt-E7-K3が動物の生存率を増加させるワクチンとしてPE407-E7-K3よりも優れていることも示した。
【００７９】
実施例5
免疫原性アッセイ
様々なワクチンの免疫原性を試験した。簡潔にいえば、マウスを以下の群に分けた。HPV16 E7、HPV 18 E7、HCVコア、HBV HBx、PCV2 ORF2及びPRRSV(図13A)。各群をサブ群に更に分けて、1週1回を3週間間、病原体の1又は複数のある種の抗原を標的にするように設計したワクチン又はプラセボを各サブ群にs.c.を経て投与した(図13B)。PRRSVを標的にしたワクチンを除いて、各ワクチンは、単一の融合タンパク質及び吸着性リン酸アルミニウムから構成した。単一の融合タンパク質は、少なくとも病原体の抗原を含むこととした。抗原は、病原体由来の全長タンパク質又は病原体の抗原の少なくとも一つのエピトープを含む若しくは2以上の抗原の融合ペプチドである非全長タンパク質とした。各抗原は、病原体の種々のタンパク質から選択した。
【００８０】
免疫化スケジュール、ワクチン及び用量を図13A-Bに示している。簡潔にいえば、マウスは、図13Aにリストしたワクチンを用いて、1周間に1回を3週間、ワクチン接種を受けさせた。全てのマウスは、最後の免疫の7日後に屠殺して、脾臓を回収した。脾細胞を単離して、10μg/mlの各病原体の組み換え抗原と共に6ウェルプレートで培養(2x107細胞/2ml/ウェル)し、37℃で16時間、1μg/ml GolgiPlug(BD Pharmingen、サンディエゴ、CA)の存在下で脾細胞を刺激した。
【００８１】
刺激した脾細胞を、FACScan緩衝液にて洗浄して、細胞表面マーカーCD8a、CD4及びCD3を、フィコエリトリン共役モノクローナルラット抗マウスCD8a、AF700共役モノクローナルラット抗マウスCD4及びAF647共役モノクローナルラット抗マウスCD3抗体で染色した。次に、細胞を、製造業者(BD Pharmingen)の指示に従ってCytofix/Cytopermキットによって透過処理して固定した。細胞内IFN-γを、AF488共役ラット抗マウスIFN-γで着色して、免疫反応及びサイトカインレベルを測定した。Kaluza分析ソフトウェア(ベックマンクールター)用いたガリオフローサイトメトリーを使用してフローサイトメトリー分析を実施した。
【００８２】
以下のPRRSVワクチンにおける免疫原性を試験した:PE407-PRRSV-K3、RAP1-PE268-313-PRRSV-K3又はRAP1-CD28convPEt-PRRSV-K3ワクチン。各ワクチンは、4つの異なる融合タンパク質の混合物を含ませ、各融合タンパク質は、DGD、M12、PQAB及びRSABからなる群より選択される種々の抗原を含ませた(図13A)。マウスのワクチン接種及び脾細胞の刺激は、上記方法と類似の方法を使用して実施した。簡潔にいえば、全てのマウスは、最後の免疫の7日後に屠殺して、脾臓を回収した。脾細胞を単離して、10μg/mlの組換え型DGD、M12、PQAB又はRSAB抗原と共に別々に6ウェルプレートで培養(2x107細胞/2ml/ウェル)し、37℃で16時間、1μg/ml GolgiPlug(BD Pharmingen、サンディエゴ、CA)の存在下で脾細胞を刺激した。
【００８３】
「DGD」のアミノ酸配列(配列番号:26)は、以下の通りである:
2018030843.tif 000002
DGDは、PRRSV ORF7 a.a.64 - a.a.123(太字)、リンカー(下線)及びORF7 a. a.64 - a.a.123(太字)の融合抗原を表す。
【００８４】
「M12」という用語は、PRRSV ORF1b a.a.1046 - a.a.1210の抗原を表す。そのアミノ酸配列(配列番号:27)は、以下の通りである:
NNKECTVAQALGNGDKFRATDKRVVDSLRAICADLEGSSSPLPKVAHNLGFYFSPDLTQFAKLPIELAPHWPVVSTQNNEKWPDRLVASLRPLDKYSRACIGAGYMVGPSVFLGTPGVVSYYLTKFVKGEAQVLPETVFSTGRIEVDCREYLDDREREVAASLPH。
【００８５】
「PQAB」のアミノ酸配列(配列番号:28)は、以下の通りである:
GSSLDDFCYDSTAPQKVLLAFSITYASNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFDWA。
PQABは、PRRSVアメリカン株ORF6 a.a.2 - a.a.26及びORF5 a.a.31 - a.a.63(下線)の融合抗原を表す。
【００８６】
RSABのアミノ酸配列は、MGSLDDFCNDSTAAQKLVLAFSITYTPIFVAGGSSSTYQYIYNLTICELNGTDWLSNHFDWA(配列番号: 29)である。「RSAB」という用語は、PRRSVヨーロピアン株ORF6 a.a.2-28及びORF5 a.a.31-64(下線)の融合抗原を表す。
【００８７】
実施例6
融合タンパク質RAP1-CD28convPEt-E7-K3のRAP1ドメイン3の断片を、A2Mミニマム(配列番号:6)、HIV-Tatミニマム(配列番号:7)又はHSPミニマム(配列番号:8)と置き換えて、融合タンパク質A2M-CD28convPEt-E7-K3、Tat-CD28convPEt-E7-K3及びHSP-CD28convPEt-E7-K3ワクチンをそれぞれ生成する。これらのワクチンによって向上した細胞性免疫反応及びTC-1腫瘍抑制活性は、上記方法と類似の方法を使用して検討する。表1は、様々な融合タンパク質の構成成分の配列番号を示している。表2は、動物のT細胞性免疫応答に対する効果に関して試験した融合タンパク質及び抗原の配列を示している。
【００８８】
【表１】
2018030843.tif 000003
2018030843.tif 000004
【００８９】
【表２】
2018030843.tif 000005
【００９０】
免疫原性アッセイにおいて、様々なワクチンによって誘導される抗原特異的細胞性免疫応答は、CD3+/CD4+/IFNγ+の数及び脾細胞のCD3+/CD8+/IFNγ+ T細胞を測定することによって評価した。この結果から、ワクチンRAP1-CD28convPEt-抗原-K3が強いT細胞反応を誘導できることが示された。図14Bは、CD28convPEt-E718-K3によって誘導されるCD3+/CD4+/IFNγ+ T細胞数及びCD3+/CD8+/IFNγ+ T細胞数は、それぞれ、RAP1-K3の約50倍及び9倍超であったことを示している。
【００９１】
ワクチンRAP1-CD28convPEt-抗原-K3は、T細胞性免疫原性を引き出す点でPE407-抗原-K3より優れている。例えば、図14Aは、CD28convPEt-E716-K3によって誘導されるCD3+/CD4+/IFNγ+ T細胞数及びCD3+/CD8+/IFNγ+ T細胞数は、それぞれ、PE407-E716-K3の約5倍及び7倍であった。これは、ワクチンRAP1-CD28convPEt-E7-K3は、PE407-E7-K3よりも細胞性免疫原性が良好であることを示している。
【００９２】
RAP1ドメインIII、トランスロケーションペプチドPEtなしの単独感作シグナルCD28conv、抗原及びERリテンションシグナルを含む融合タンパク質は、選択した抗原が10個又は10個超のエピトープを含む場合、強い抗原特異的T細胞性免疫反応を誘導するには充分である。図14Cは、ワクチンRAP1-CD28conv-HCVコア-K3が、CD3+/CD4+/IFNγ+の数及びCD3+/CD8+/IFNγ+ T細胞の数がそれぞれプラセボ群の20倍及び7.6倍、T細胞反応を誘導することを示している。抗原HCVコアは、11個の周知のMHC Iエピトープを含む。
【００９３】
ERリテンションシグナルは、強い細胞性免疫原性を誘導するのに、本発明の融合タンパク質にとって必須でないことは予想外であった。言い換えると、ERリテンション配列がなくても、本発明の融合タンパク質は、強いT細胞反応を更に誘導することができる。図14Dは、RAP1-CD28convPEt-HBx(ERリテンションシグナルK3なし)によって誘導されるCD3+/CD4+/IFNγ+及びCD3+/CD8+/IFNγ+ T細胞の数は、プラセボ群の7倍及び74倍であったことを示している。
【００９４】
対照的に、米国特許番号7378100B2及び7335361において、ERリテンションシグナルK3は、T細胞反応を誘導するためにPE関連融合タンパク質(PE407-抗原-K3)に不可欠であることを示している。
【００９５】
RAP1ドメインIII、トランスロケーションペプチドPE218-313(感作用シグナルCD28convなし)、抗原及びERリテンションシグナルを含む融合タンパク質がRAP1ドメインIIIを含まないPE関連融合タンパク質よりも優れているということも発見した。図15C-Jは、ワクチンRAP1-PE268-313-PRRSV-K3は、ワクチンPE407-PRRSV-K3よりも大きいCD3+/CD4+/IFNγ+及びCD3+/CD8+/IFNγ+ T細胞計数を誘導したことを示している。
【００９６】
本発明の例示的な実施形態に関する前述の説明は、図示及び説明の目的のためだけに示しており、網羅的であったり開示される厳密な形態に本発明を制限したりすることを意図するものではない。上記説明の観点から多くの修正形態及び変更形態が可能である。実施形態及び実施例は、本発明及びそれらの実用的な応用の原理を説明する目的で選択し記載しており、他の当業者が本発明及び各種実施形態を、予想される特定の用途に適している各種変更形態を伴って利用することができるようにしている。代わり実施形態は、その趣旨及び範囲を逸脱しない範囲内で、関係する当業者にとって明らかになるだろう。従って、本発明の範囲は、ここで記載されている前述の記述及び例示的な実施形態よりは、むしろ添付の特許請求の範囲によって規定される。
【図１】
2018030843.tif 000006
【図２】
2018030843.tif 000007
【図３】
2018030843.tif 000008
【図４】
2018030843.tif 000009
【図５Ａ】
2018030843.tif 000010
【図５Ｂ】
2018030843.tif 000011
【図５Ｃ−Ｄ】
2018030843.tif 000012
【図６】
2018030843.tif 000013
【図７】
2018030843.tif 000014
【図８】
2018030843.tif 000015
【図９】
2018030843.tif 000016
【図１０】
2018030843.tif 000017
【図１１】
2018030843.tif 000018
【図１２】
2018030843.tif 000019
【図１３】
2018030843.tif 000020
【図１４】
2018030843.tif 000021
【図１５Ａ−Ｂ】
2018030843.tif 000022
【図１５Ｃ−Ｊ】
2018030843.tif 000023
【配列表】
2018030843000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年9月11日(2017.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質であって、
(a)  前記融合タンパク質のN末端に位置する、抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインであって、
受容体関連タンパク質-1(RAP1)ドメインIII、アルファ-2-マクログロブリン受容体関連タンパク質(A2M)、HIV-Tat、ヒートショックタンパク質又はシュードモナスエキソトキシンA結合ドメインIである、前記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメイン；
(b)  前記APC-結合ドメイン又は前記CD91受容体-結合ドメインのC末端に位置するタンパク質トランスダクションドメインであって、
(1)  長さ28-53のアミノ酸残基からなり、配列番号:31のアミノ酸配列を含み、Xaa8はIであり、Xaa10はV、F又はAであり、Xaa11はM又はLであり、Xaa17はL又はIである、前記融合ポリペプチドのN末端に位置するT細胞感作シグナル伝達ペプチドと、
(2)  長さ34-112のアミノ酸残基からなり、配列番号:3、20又は4と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、トランスロケーションペプチドと、
(3)  配列番号:15を含み、且つ、前記T細胞感作シグナル伝達ペプチドと前記トランスロケーションペプチドとを結合する、リンカー
からなる融合ポリペプチドである、前記タンパク質トランスダクションドメイン；及び、
(c)  前記タンパク質トランスダクションドメインのC末端に位置する、病原体又はがん細胞の抗原；を含み、
前記病原体は、ヒトパピローマウイルス(HPV)、PRRSV、HIV-１、インフルエンザウイルス、デングウイルス、肝炎Cウイルス(HCV)、肝炎Bウイルス(HBV)及びブタサーコウイルス2(PCV2)からなる群より選択される少なくとも1つであり、
前記がん細胞は、非小細胞肺がん、乳がん、メラノーマ、リンパ腫、結腸がん、肝細胞がんからなる群より選択される少なくとも1つである、
融合タンパク質。
【請求項２】
前記病原体は、HPV、PRRSV、HCV、HBV及びPCV2からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記病原体の抗原は、HPV E7タンパク質、PRRSVタンパク質、HCVコアタンパク質、HBV Xタンパク質及びPCV2 ORF2タンパク質からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項2に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記抗原は、配列番号:21、22、23、24、25、26、27、28又は29と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項3に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記抗原は、配列番号:21、22、23、24、25、26、27、28及び29からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項3に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記APC-結合ドメイン又は前記CD91受容体-結合ドメインは、配列番号:5、9、6、7及び8からなる群より選択される配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記APC-結合ドメイン又は前記CD91受容体-結合ドメインは、配列番号:5、9、6、7及び8からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記融合タンパク質のC末端に位置する小胞体リテンション配列を更に含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記トランスロケーションペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記タンパク質トランスダクションドメインは、配列番号30の配列を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
融合タンパク質であって、
(a)  前記融合タンパク質のN末端に位置する、抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインであって、
受容体関連タンパク質-1(RAP1)ドメインIII、アルファ-2-マクログロブリン受容体関連タンパク質(A2M)、HIV-Tat、ヒートショックタンパク質又はシュードモナスエキソトキシンA結合ドメインIである、前記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメイン；
(b)  前記APC-結合ドメイン又は前記CD91受容体-結合ドメインのC末端に位置するタンパク質トランスダクションドメインであって、
(i)  長さ28-53のアミノ酸残基からなり、配列番号:31のアミノ酸配列を含み、Xaa8はIであり、Xaa10はV、F又はAであり、Xaa11はM又はLであり、Xaa17はL又はIである、T細胞感作シグナル伝達ペプチドと、
(ii)  配列番号:3又は20と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、長さ34-46のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチド
からなる群より選択される、前記タンパク質トランスダクションドメイン；及び、
(c)  前記タンパク質トランスダクションドメインのC末端に位置する、病原体の抗原；からなり、
前記APC-結合ドメイン又は前記CD91受容体-結合ドメインは、前記タンパク質トランスダクションドメインが前記トランスロケーションペプチドである場合、シュードモナスエキソトキシンA(PE)結合ドメインIのアミノ酸配列を有さず、
前記病原体は、ヒトパピローマウイルス(HPV)、PRRSV、HIV-１、インフルエンザウイルス、デングウイルス、肝炎Cウイルス(HCV)、肝炎Bウイルス(HBV)及びブタサーコウイルス2(PCV2)からなる群より選択される少なくとも1つであり、
前記がん細胞は、非小細胞肺がん、乳がん、メラノーマ、リンパ腫、結腸がん、肝細胞がんからなる群より選択される少なくとも1つである、
融合タンパク質。
【請求項１３】
融合タンパク質であって、
(a)  前記融合タンパク質のN末端に位置する、抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインであって、
受容体関連タンパク質-1(RAP1)ドメインIII、アルファ-2-マクログロブリン受容体関連タンパク質(A2M)、HIV-Tat、ヒートショックタンパク質又はシュードモナスエキソトキシンA結合ドメインIである、前記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメイン；
(b)  前記APC-結合ドメイン又は前記CD91受容体-結合ドメインのC末端に位置するタンパク質トランスダクションドメインであって、
(i)  長さ28-53のアミノ酸残基からなり、配列番号:31のアミノ酸配列を含み、Xaa8はIであり、Xaa10はV、F又はAであり、Xaa11はM又はLであり、Xaa17はL又はIである、T細胞感作シグナル伝達ペプチドと、
(ii)  配列番号:3又は20と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、長さ34-46のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチド
からなる群より選択される、前記タンパク質トランスダクションドメイン；
(c)  前記タンパク質トランスダクションドメインのC末端に位置する、病原体の抗原；及び、
(d)  前記融合タンパク質のC末端に位置する小胞体リテンション配列；からなり、
前記病原体は、ヒトパピローマウイルス(HPV)、PRRSV、HIV-１、インフルエンザウイルス、デングウイルス、肝炎Cウイルス(HCV)、肝炎Bウイルス(HBV)及びブタサーコウイルス2(PCV2)からなる群より選択される少なくとも1つであり、
前記がん細胞は、非小細胞肺がん、乳がん、メラノーマ、リンパ腫、結腸がん、肝細胞がんからなる群より選択される少なくとも1つである、
融合タンパク質。
【請求項１４】
融合タンパク質であって、
(a)  前記融合タンパク質のN末端に位置する、抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインであって、
受容体関連タンパク質-1(RAP1)ドメインIII、アルファ-2-マクログロブリン受容体関連タンパク質(A2M)、HIV-Tat、ヒートショックタンパク質又はシュードモナスエキソトキシンA結合ドメインIである、前記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメイン；
(b)  前記APC-結合ドメイン又は前記CD91受容体-結合ドメインのC末端に位置するタンパク質トランスダクションドメインであって、
(1)  配列番号:31のアミノ酸配列からなり、Xaa8はI又はLであり、Xaa10はV、F又はAであり、Xaa11はM又はLであり、Xaa17はL又はIである、前記融合ポリペプチドのN末端に位置する、長さ28のアミノ酸残基のT細胞感作シグナル伝達ペプチドと、
(2)  長さ34-112のアミノ酸残基からなり、配列番号:3、20又は4と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、トランスロケーションペプチドと、
(3)  配列番号:15を含み、且つ、前記T細胞感作シグナル伝達ペプチドと前記トランスロケーションペプチドとを結合する、リンカー
からなる融合ポリペプチドである、前記タンパク質トランスダクションドメイン；及び、
(c)  前記タンパク質トランスダクションドメインのC末端に位置する、病原体の抗原；を含み、
前記病原体は、ヒトパピローマウイルス(HPV)、PRRSV、HIV-１、インフルエンザウイルス、デングウイルス、肝炎Cウイルス(HCV)、肝炎Bウイルス(HBV)及びブタサーコウイルス2(PCV2)からなる群より選択される少なくとも1つであり、
前記がん細胞は、非小細胞肺がん、乳がん、メラノーマ、リンパ腫、結腸がん、肝細胞がんからなる群より選択される少なくとも1つである、
融合タンパク質。
【請求項１５】
前記抗原は、配列番号21、22、23、24、25、26、27、28及び29からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項12に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記抗原は、配列番号21、22、23、24、25、26、27、28及び29からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項13に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記抗原は、配列番号21、22、23、24、25、26、27、28及び29からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項14に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
抗原特異的T細胞反応の向上を必要とする対象における前記抗原特異的T細胞反応の向上を誘導する医薬の製造における請求項1、12、13又は14のいずれかに記載の融合タンパク質の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
発明の開示
一つの態様では、本発明は、融合タンパク質であって、上記融合タンパク質は、
(a)  上記融合タンパク質のN末端に位置する、抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメイン；
(b)  上記APC-結合ドメイン又は上記CD91受容体-結合ドメインのC末端に位置するタンパク質トランスダクションドメインであって、
(i)  T細胞感作シグナル伝達ペプチド、リンカー及びトランスロケーションペプチドを含む融合ポリペプチドであって、
(1)  上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、上記融合ポリペプチドのN末端に位置し、
(2)  上記リンカーは、配列番号:15を含み、且つ、上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドとトランスロケーションペプチドとを結合し、
(3)  上記トランスロケーションペプチドは、長さ34-112のアミノ酸残基を有し、配列番号:3、20又は4と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、融合ポリペプチドと、
(ii)  T細胞感作シグナル伝達ペプチドと、
(iii)  配列番号:3又は20と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、長さ34-46のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチドからなる群より選択される上記タンパク質トランスダクションドメイン；及び、
(c)  上記タンパク質トランスダクションドメインのC末端に位置する、病原体の抗原；を含み、
上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、長さ28-53のアミノ酸残基を有し、配列番号:31のアミノ酸配列を含み、Xaa8はI又はLであり、Xaa10はV、F又はAであり、Xaa11はM又はLであり、Xaa17はL又はIであり、
上記APC-結合ドメイン又は上記CD91受容体-結合ドメインは、上記タンパク質トランスダクションドメインが上記トランスロケーションペプチド(biii)である場合、シュードモナスエキソトキシンA(PE)結合ドメインIのアミノ酸配列を有さない、融合タンパク質に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明の別の実施形態において、上記トランスロケーションペプチドは、配列番号:3のアミノ酸配列を含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
別の態様においては、本発明は、融合タンパク質であって、上記融合タンパク質は、
(a)  上記融合タンパク質のN末端に位置するCD91受容体-結合ドメイン又は抗原提示細胞(APC)-結合ドメイン；
(b)  上記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインのC末端に位置するタンパク質トランスダクションドメインであって、
(i)  T細胞感作シグナル伝達ペプチド、リンカー及びトランスロケーションペプチドを含む融合ポリペプチドであって、
(1)  T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、上記融合ポリペプチドのN末端に位置し、
(2)  上記リンカーは、配列番号:15を含み、且つ、上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドとトランスロケーションペプチドとを結合し、
(3)  上記トランスロケーションペプチドは、長さ34-112のアミノ酸残基を有し、配列番号:3、20又は4と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、融合ポリペプチドと、
(ii)  T細胞感作シグナル伝達ペプチドと、
(iii)  配列番号:3又は20と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、長さ34-46のアミノ酸残基のトランスロケーションペプチドからなる群より選択されるタンパク質トランスダクションドメイン；及び、
(C)  上記タンパク質トランスダクションドメインのC末端に位置する病原体の抗原；、からなり、
上記T細胞感作シグナル伝達ペプチドは、長さ28-53のアミノ酸残基を有し、配列番号:31のアミノ酸配列を含み、Xaa8はI又はLであり、Xaa10はV、F又はAであり、Xaa11はM又はLであり、Xaa17はL又はIであり、
上記タンパク質トランスダクションドメインがトランスロケーションペプチド(biii)である場合、上記APC-結合ドメイン又はCD91受容体-結合ドメインは、シュードモナスエキソトキシンA(PE)ドメインIのアミノ酸配列を有さない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
本発明は、病原体抗原特異的T細胞反応の向上を誘導するための、又は、疾患細胞の細胞膜上のクラスI MHC分子を介して抗原を提示する疾患細胞を殺すための、又は、病原体によって引き起こされる感染を予防する、治療する、若しくは、感染によって引き起こされる症状を最小限にするための、上記融合タンパク質又はワクチン組成物にも関する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
【図１】図1は、ベクター図である。
【図２】図2は、融合タンパク質のSDS-PAGE分析結果を示している写真である。
【図３】図3は、ベクター図である。
【図４】図4は、本発明の一実施形態を示す略図である。
【図５Ａ】図5Aは、免疫化のスケジュールを示す。
【図５Ｂ】図5Bは、融合タンパク質のSDS-PAGE分析結果を示している写真である。
【図５Ｃ−Ｄ】図5C-Dは、それぞれ、様々な融合タンパク質又はプラセボによってワクチン接種を受けた動物群における、腫瘍サイズ曲線と腫瘍がないマウスのパーセンテージを示しているグラフである。
【図６】図6A及びBは、それぞれ、融合タンパク質の調製のための流れ図と、融合タンパク質のSDS-PAGE分析結果を示している写真である。
【図７】図7は、T細胞感作融合タンパク質の作用のメカニズムを示す模式図である。
【図８】図8は、様々な種由来のCD28の配列アライメント(ヒト(配列番号: 33)、ラット(配列番号: 34)、マウス(配列番号: 35)、ラビット(配列番号: 36)、ブタ(配列番号: 37)、ウシ(配列番号: 38)、ヒツジ(配列番号: 39)、イヌ(配列番号: 40)、ウマ(配列番号: 41)、シチメンチョウ(配列番号: 42)、及びコンセンサス配列(配列番号: 43))を示す。
【図９】図9Aは、免疫化のスケジュールを示す。図9B-Cは、それぞれ、様々な融合タンパク質又はプラセボによってワクチン接種を受けた動物群における腫瘍サイズ曲線及び生存率を示す。
【図１０】図10は、病原体由来のDNA挿入物を含むプラスミドを作成するために使用するRAP1含有ベクターを示す模式図である。
【図１１】図11は、様々な病原体の抗原を含む融合タンパク質の構造を示す模式図である。
【図１２】図12A-Fは、様々な融合タンパク質のSDS-PAGE分析結果を示している写真である。
【図１３】図13A-Bは、動物を免疫化するために使用する動物群、ワクチン及び用量、並びに、免疫化スケジュールを示す。
【図１４】図14A-Dは、E716、E718、HCVコア若しくはHBx抗原を含む融合タンパク質又はプラセボによってワクチン接種を受けた図13Aの動物群由来のCD3+/CD4+脾細胞及びCD3+/CD8+脾細胞のex vivo抗原特異的免疫反応分析結果を示している表である。
【図１５Ａ−Ｂ】図15A-Bは、PCV2(15A-B)を含む融合タンパク質又はプラセボによってワクチン接種を受けた図13Aの動物群由来のCD3+/CD8+脾細胞及びCD3+/CD4+脾細胞のex vivo抗原特異的免疫反応分析におけるIFNγ+細胞計数を示す。
【図１５Ｃ−Ｊ】図15C-Jは、PRRSV抗原(15C-J)を含む融合タンパク質又はプラセボによってワクチン接種を受けた図13Aの動物群由来のCD3+/CD8+脾細胞及びCD3+/CD4+脾細胞のex vivo抗原特異的免疫反応分析におけるIFNγ+細胞計数を示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
「PEt」又は「PEtコア」という用語は、長さ34のアミノ酸残基を有するPEトランスロケーションドメインコアを指す。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
PEトランスロケーションペプチドは、配列番号:3又は20と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むことができる。例えば、PEトランスロケーションペプチドのアミノ酸配列は、PEのa.a.280 - a.a.313(配列番号: 3)、a.a.268 - a.a.313(配列番号: 20)、a.a.253 - a.a.313又はa.a.253 - a.a.364(配列番号: 4)であってもよい。すなわち、PEトランスロケーションペプチドのアミノ酸配列は、a.a.280-a.a.313(配列番号: 3)必須断片を含む限り、PEドメインII(a.a.253〜a.a.364;配列番号:4)の任意の領域を含むことができる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2018030843000001.app
【外国語明細書】
2018030843000001.pdf