(57)【要約】【課題】新たなＡＢＣＡ１２遺伝子発現促進及び／又はＡＢＣＡ１２産生促進用組成物を提供することを課題とする。【解決手段】サクシノイルアテロコラーゲンを含有するＡＢＣＡ１２遺伝子発現促進及び／又はＡＢＣＡ１２産生促進用組成物。【選択図】図３
2018145146.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サクシノイルアテロコラーゲンを含有するＡＢＣＡ１２遺伝子発現促進及び／又はＡＢＣＡ１２産生促進用組成物。
【請求項２】
請求項１に記載のＡＢＣＡ１２遺伝子発現促進及び／又はＡＢＣＡ１２産生促進用組成物を含むＡＢＣＡ１２遺伝子発現促進及び／又はＡＢＣＡ１２産生促進用皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＡＢＣＡ１２産生促進用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ａ  １２（以下「ＡＢＣＡ１２」は、皮膚に主に存在するトランスポーター蛋白質である。ＡＢＣＡ１２の作用は、道化師様魚鱗癬の患者の治療過程から発見された。道化師様魚鱗癬は、生まれた時から、全身の皮膚が非常に厚い板状の角層に覆われ、硬い皮膚に引っ張られ、まぶたや唇がめくれあがる等の症状を呈することが知られる難病である。この道化師様魚鱗癬がＡＢＣＡ１２という蛋白質の遺伝子の異常により発症することが近年明らかになってきた。皮膚の表面の細胞のなかで、ＡＢＣＡ１２は、皮膚表面を作っている細胞のなかにある層板顆粒と呼ばれる顆粒に存在する。この層板顆粒は、皮膚表面の細胞に特有な顆粒で、皮膚セラミド等を輸送し、分泌する機能を有している。この層板顆粒によって分泌される脂質や酵素は、皮膚表面のバリアの形成と、そしてさらには、角化して死んだ細胞が、その役割を終えたあと、スムースにはがれ落ちて行くのに必要であると考えられている。道化師様魚鱗癬の病因蛋白質であるＡＢＣＡ１２は、皮膚表面の細胞の層板顆粒の膜に存在し、層板顆粒の内へ脂質を運び、貯め込む働きをしていると考えられている。ＡＢＣＡ１２によって運ばれる脂質は、層板顆粒の中に蓄積され、最終的に、皮膚表面の細胞が角化して死ぬ際に、それら脂質を細胞外に放出し、この放出された脂質が、皮膚の表面の脂質層になると考えられている。
【０００３】
ＡＢＣＡ１２遺伝子は、特許文献１に開示されている。そしてこの遺伝子を含むＡＢＣＡスーパーファミリー遺伝子の発現産物によって各種の脂質代謝に係る疾患の治療用剤が提供されることが記載されている。
近年、このＡＢＣＡ１２遺伝子の利用についていくつかの提案がなされている。特許文献２にはＡＢＣＡ１２遺伝子がノックアウトされた、皮膚バリア機能障害モデルマウスを用いて、皮膚バリア障害を治療又は改善することのできる物質を個体レベルでスクリーニングする技術が開示されている。
特許文献３には、実験動物に被験薬物を投与し、実験動物のＡＢＣＡ１２タンパク質又はＡＢＣＡ１２ｍＲＮＡの減少を指標として、被験物質の大腸がん予防効果を判定する手法が記載されている。
特許文献４には、三次元皮膚モデルに、被験物質を添加後、ＡＢＣＡ１２発現レベルを指標として、表皮バリア機能調整剤のスクリーニングを行うことが記載されている。
特許文献５には、Ｃａ２＋非依存性ホスホリパーゼＡ２／ＰＮＰＬＡ（Ｐａｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅまたはＰａｔａｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）ファミリーに属するＰＮＰＬＡ１遺伝子が欠損した非ヒト動物に、被験物質を投与して、ＡＢＣＡ１２遺伝子の変動を観察し、皮膚バリア機能の促進物質をスクリーニングする方法が記載されている。
また特許文献６には、ＡＢＣＡ１２を含む複数の蛋白質が薬物トランスポーターとして利用可能であることが記載されている。
以上のとおりＡＢＣＡ１２は、生体内の細胞間や細胞内の脂質代謝を制御する重要な因子として理解されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００４−５２７２３７号公報
【特許文献２】特開２００９−２２５６９７号公報
【特許文献３】特開２００９−４５０４１号公報
【特許文献４】特開２０１２−１８３０６１号公報
【特許文献５】特開２０１５−２３０２２２号公報
【特許文献６】特開２００７−２８９７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、これらの先行技術に基づき、各種の物質をスクリーニングしたところ、サクシノイルアテロコラーゲンが極めて高いＡＢＣＡ１２タンパク質遺伝子の発現を促進することを見いだした。またサクシノイルコラーゲンは、紫外線照射によって低下した皮膚細胞のＡＢＣＡ１２遺伝子発現を回復、又は低下を予防することを確認した。
すなわち、本発明はサクシノイルアテロコラーゲンを有効成分とするＡＢＣＡ１２遺伝子の発現を促進し、ＡＢＣＡ１２産生促進のための組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、次の構成からなる。
（１）サクシノイルアテロコラーゲンを含有するＡＢＣＡ１２遺伝子発現促進及び／又はＡＢＣＡ１２産生促進用組成物。
（２）（１）に記載のＡＢＣＡ１２遺伝子発現促進及び／又はＡＢＣＡ１２産生促進用組成物を含むＡＢＣＡ１２遺伝子発現促進及び／又はＡＢＣＡ１２産生促進用皮膚外用剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、あらたなＡＢＣＡ１２遺伝子発現促進及び／又はＡＢＣＡ１２産生促進用組成物が提供される。
また皮膚細胞にあっては、ＡＢＣＡ１２蛋白質の産生が促進されることにより皮膚表層への脂質供給が促進される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】紫外線が、皮膚細胞のＡＢＣＡ１２遺伝子発現を低下させることを試験した結果を示すグラフである。
【図２】防腐剤であるメチルパラベンが、皮膚細胞のＡＢＣＡ１２遺伝子発現を低下させることを試験した結果を示すグラフである。
【図３】各種化粧品原料のＡＢＣＡ１２遺伝子発現促進を試験した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
サクシノイルアテロコラーゲンを含有するＡＢＣＡ１２遺伝子発現促進及び／又はＡＢＣＡ１２産生促進用組成物に係る発明である。ＡＢＣＡ１２蛋白質の産生が促進されると、皮膚の健康維持に必須の皮脂成分が増加して、皮膚の健康が維持される。
本発明に用いるコラーゲンは三重螺旋構造を維持したサクシニル化アテロコラーゲンである。
コラーゲンは動物の皮膚、例えば、牛皮、豚皮、魚皮から抽出することができる。特に魚皮が好ましい。抽出方法としては例えば、まず、魚皮から不純タンパク質、血液、色素、脂質等をナイフ等の刃物を用いて除去するか、あるいは水流により除き、次いで塩溶液、塩基性溶液で洗浄し、さらに有機溶剤で洗浄して不純物を取り除く。得られた魚皮をｐＨ３に調整した酸溶液に分散し、酸性プロテアーゼによるプロテアーゼ処理をすることによりアテロコラーゲンが得られる（特開２０１４−１１８３８１号参照）。より具体的には、０．０１〜２ｍｏｌ／Ｌの希酢酸溶液、０．００１〜２ｍｏｌ／Ｌの希乳酸溶液、０．００１〜２ｍｏｌ／Ｌの希クエン酸溶液、０．００１〜０．２ｍｏｌ／Ｌの希塩酸溶液、０．００１〜０．５ｍｏｌ／Ｌの希リン酸溶液等の酸溶液に不純物を取り除いた魚皮を加え、さらに、酸性プロテアーゼを加え、３〜５℃の低温で１２〜４８時間攪拌することにより、三重螺旋構造を維持したアテロコラーゲンを抽出することができる。不溶解物は濾過法、遠心分離法により除去することが望ましい。酸性プロテアーゼはコラーゲン溶液を、塩基を用いてｐＨ１０〜１２に調整し、３〜５℃の低温で１２〜４８時間攪拌することにより失活させることができる。
【００１０】
アテロコラーゲンのサクシニル化は得られたアテロコラーゲン溶液に無水コハク酸を加え、ｐＨを９〜１２に維持するようにアルカリを添加しながら、３〜５℃の低温で反応させる。このようにしてサクシニル化されたアテロコラーゲンをサクシノイルアテロコラーゲンという。
サクシノイルアテロコラーゲンは塩析法、有機溶媒沈殿法、等電点沈殿法等の定法により精製することができる。
三重螺旋構造を維持したサクシノイルアテロコラーゲンは１５℃における比旋光度が約−４２０〜−３１０°であり、加温攪拌して完全に三重螺旋構造をほぐしたサクシノイルアテロコラーゲンの１５℃における比旋光度は約−１００°である。
【００１１】
本発明のＡＢＣＡ１２遺伝子発現促進及び／又はＡＢＣＡ１２蛋白質産生促進用組成物を皮膚の外用剤とすることができる。この場合の形状としては、液状、固形状、粉末状、ペースト状等いずれの形状でも良く、使用目的にあわせて最適な外用剤としての形状を任意に選択することができる。
【００１２】
本発明の組成物を含む外用剤には、抽出物の含有量として、ＡＢＣＡ１２遺伝子発現促進及び／又はＡＢＣＡ１２産生促進用組成物は、ＡＢＣＡ１２蛋白質産生促進作用を有することが確認できる範囲であれば特に制限はない。製剤として、一般的には製剤重量当たり０．０１〜２００ｍｇ／ｇとなるように配合する。
これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。医薬あるいは化粧料用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、アルブミン、水、生理食塩水、油脂等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤等の慣用の添加剤を適宜添加することができる。
【実施例】
【００１３】
以下に、試験例、実施例を示して本発明を具体的に説明する。
１．試験例１（ヒト表皮角化細胞株を用いた紫外線照射によるＡＢＣＡ１２遺伝子発現影響試験）
１）細胞培養
ヒト成人男性皮膚から樹立された不死化角化細胞（ケラチノサイト）株であるＨａＣａＴ細胞（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ  Ｋｒｅｂｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ社より購入）を３５ｍｍディッシュに１．６×１０５ｃｅｌｌｓの細胞密度に播種し、２日間前培養した。
細胞は３７℃、５％二酸化炭素、９５％空気雰囲気下にて培養を行った。培地は不活性化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０％、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１％を添加した培地ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。
なお、通常培養には、１００ｍｍディッシュに細胞を播種し８０〜９０％コンフルエント時に０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）にて剥離し継代を行った細胞を用いた。
【００１４】
２）紫外線刺激
前記培養後、外部刺激として紫外線（ＵＶＢ  １０ｍＪ／ｃｍ２）照射後、２４時間培養した。細胞はＤ−ＰＢＳにて洗浄の後ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて細胞を溶解し回収した。
【００１５】
３）ＲＮＡ抽出
回収した細胞溶液は抽出まで−８０℃にて保存した。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出はＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔのプロトコルに順じて行った。
【００１６】
４）ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡの合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ）を用い、プロトコルに順じて行った。
５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ：ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（２５０ｎｇ）：ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を１：１：３の割合で混合し、サーマルサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて逆転写（３７℃  １５分）、逆転写酵素の熱失活（８５℃  ５秒）を行い合成した。合成したｃＤＮＡは−２０℃にて保存した。
【００１７】
５）ＡＢＣＡ１２遺伝子発現促進作用の測定
ＡＢＣＡ１２遺伝子の増幅発現を指標としてＡＢＣＡ１２活性を測定した。
ＰＣＲ反応はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行った。
プライマーはＰｒｉｍｅｒ−ＢＬＡＳＴを用いて設計し、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓより購入した。
PCR Forward Primer: CCTGGGATGGTTTTCACTGAG
PCR Reverse Primer: TTTCCAGAATTAGGAGCTGTGC
増幅反応はＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を用い、プロトコルに順じて行った。すなわち、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（２Ｘ）にＰＣＲ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（０．４μＭ）、ＰＣＲ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（０．４μＭ）、およびｃＤＮＡを混合しＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を加え調製した。ＰＣＲ反応は初期変性９５℃、ＰＣＲ反応（９５℃  ５秒、６０℃  ３０秒、４０サイクル）、融解曲線分析（９５℃  ５秒、６０℃  １分）を行い後冷却（５０℃  ３０秒）した。増幅効率は、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）を用いて算出した。なお試験結果は、ｃｏｎｔｒｏｌに対する分散性をＦ検定にて確認後、等分散性と仮定できる場合にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定、仮定できない場合にはＷｅｌｃｈのｔ検定を用いて行った。有意水準はｐ＜０．０５とした。
【００１８】
６）結果
図１に紫外線によるＡＢＣＡ１２遺伝子発現への影響試験結果を示した。
この試験結果から、紫外線によって皮膚角層のＡＢＣＡ１２遺伝子発現が抑制されることが明らかとなった。すなわち、皮膚は日常的に紫外線に曝露しており、当然皮膚細胞においてＡＢＣＡ１２遺伝子発現は低下するものと予想された。
【００１９】
２．試験例２（ヒト表皮角化細胞株を用いたメチルパラベン刺激によるＡＢＣＡ１２遺伝子発現への影響試験）
１）細胞培養
試験例１と同様にヒト成人男性皮膚から樹立された不死化角化細胞（ケラチノサイト）株であるＨａＣａＴ細胞（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ  Ｋｒｅｂｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ社より購入）を３５ｍｍディッシュに１．６×１０５ｃｅｌｌｓの細胞密度に播種し、２日間前培養した。
細胞は３７℃、５％二酸化炭素、９５％空気雰囲気下にて培養を行った。培地は不活性化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０％、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１％を添加した培地ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。
なお、通常培養には、１００ｍｍディッシュに細胞を播種し８０〜９０％コンフルエント時に０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）にて剥離し継代を行った細胞を用いた。
【００２０】
２）メチルパラベン刺激
メチルパラベンは化粧料に防腐剤として多用される化学物質である。前記培養後、外部刺激として、メチルパラベン（０．０１％、０．１％  ｗ／ｖ）添加後４８時間培養を行った。その後、細胞をＤ−ＰＢＳにて洗浄の後ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて細胞を溶解し回収した。
【００２１】
３）ＲＮＡ抽出
回収した細胞溶液は抽出まで−８０℃にて保存した。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出はＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔのプロトコルに順じて行った。
【００２２】
４）ｃＤＮ合成
ｃＤＮＡの合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ）を用い、プロトコルに順じて行った。
５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ：ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（２５０ｎｇ）：ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を１：１：３の割合で混合し、サーマルサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて逆転写（３７℃  １５分）、逆転写酵素の熱失活（８５℃  ５秒）を行い合成した。合成したｃＤＮＡは−２０℃にて保存した。
【００２３】
５）ＡＢＣＡ１２遺伝子発現の測定
試験例１と同様にＡＢＣＡ１２遺伝子の増幅発現を測定した。
ＰＣＲ反応はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行った。
プライマーはＰｒｉｍｅｒ−ＢＬＡＳＴを用いて設計し、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓより購入した。
用いたプライマーの配列は試験例１と同様とした。
増幅反応はＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を用い、プロトコルに順じて行った。すなわち、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（２Ｘ）にＰＣＲ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（０．４μＭ）、ＰＣＲ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（０．４μＭ）、およびｃＤＮＡを混合しＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を加え調製した。ＰＣＲ反応は初期変性９５℃、ＰＣＲ反応（９５℃  ５秒、６０℃  ３０秒、４０サイクル）、融解曲線分析（９５℃  ５秒、６０℃  １分）を行い後冷却（５０℃  ３０秒）した。増幅効率は、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）を用いて算出した。なお試験結果は、ｃｏｎｔｒｏｌに対する分散性をＦ検定にて確認後、等分散性と仮定できる場合にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定、仮定できない場合にはＷｅｌｃｈのｔ検定を用いて行った。有意水準はｐ＜０．０５とした。
【００２４】
６）結果
図２にメチルパラベンによるＡＢＣＡ１２遺伝子発現への影響試験結果を示した。
この試験結果から、メチルパラベンによって容量依存的に皮膚角層のＡＢＣＡ１２遺伝子発現が抑制されることが明らかとなった。
【００２５】
３．試験例３（ＡＢＣＡ１２遺伝子発現促進作用を有する物質の探索試験）
市販されている各種の化粧品原料のＡＢＣＡ１２遺伝子発現促進作用を試験した。
（１）試験試料
次の６種の化粧品原料について試験を行った。
１．オリゼノーブル−Ｖ・３０ＢＧ（テクノーブル）：加水分解コメエキス（コメ）
２．マローモイスチャー（丸善製薬）：ゼニアオイ花エキス（ゼニアオイ）
３．ローヤルゼリー抽出ＢＧ（丸善製薬）：ローヤルゼリーエキス（ローヤルゼリー）
４．マリンセラミドＷＳ０２Ｎ−ＢＧ（山川貿易）: スフィンゴ脂質（セラミド）
５．フレッシュモイストコラーゲンＡＳ（Ｈ）ＥＸ（片倉コープアグリ）：サクシノイルアテロコラーゲン（コラーゲン）  
なお記載は、商品名（販売者）：化粧品表示名称（略称）の順。
【００２６】
（２）試験方法
試験例１と同様の条件で実施した。
１）細胞培養
ヒト成人男性皮膚から樹立された不死化角化細胞（ケラチノサイト）株であるＨａＣａＴ細胞（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ  Ｋｒｅｂｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ社より購入）を３５ｍｍディッシュに１．６×１０５ｃｅｌｌｓの細胞密度に播種し、２日間前培養した。
細胞は３７℃、５％二酸化炭素、９５％空気雰囲気下にて培養を行った。培地は不活性化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０％、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１％を添加した培地ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。
なお、通常培養には、１００ｍｍディッシュに細胞を播種し８０〜９０％コンフルエント時に０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）にて剥離し継代を行った細胞を用いた。
【００２７】
２）試験試料の添加
その後、各試験試料を１質量％になるように添加し、２４時間培養した。細胞はＤ−ＰＢＳにて洗浄の後ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて細胞を溶解し回収した。
【００２８】
３）ＲＮＡ抽出
回収した細胞溶液は抽出まで−８０℃にて保存した。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出はＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔのプロトコルに順じて行った。
【００２９】
４）ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡの合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ）を用い、プロトコルに順じて行った。
５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ：ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（２５０ｎｇ）：ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を１：１：３の割合で混合し、サーマルサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて逆転写（３７℃  １５分）、逆転写酵素の熱失活（８５℃  ５秒）を行い合成した。合成したｃＤＮＡは−２０℃にて保存した。
【００３０】
５）ＡＢＣＡ１２遺伝子発現の測定
ＡＢＣＡ１２遺伝子の増幅発現を指標としてＡＢＣＡ１２活性を測定した。
ＰＣＲ反応はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行った。
プライマーはＰｒｉｍｅｒ−ＢＬＡＳＴを用いて設計し、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓより購入した。
用いたプライマーの配列は試験例１と同様とした。
増幅反応はＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を用い、プロトコルに順じて行った。すなわち、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（２Ｘ）にＰＣＲ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（０．４μＭ）、ＰＣＲ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（０．４μＭ）、およびｃＤＮＡを混合しＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を加え調製した。ＰＣＲ反応は初期変性９５℃、ＰＣＲ反応（９５℃  ５秒、６０℃  ３０秒、４０サイクル）、融解曲線分析（９５℃  ５秒、６０℃  １分）を行い後冷却（５０℃  ３０秒）した。増幅効率は、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）を用いて算出した。なお試験結果は、ｃｏｎｔｒｏｌに対する分散性をＦ検定にて確認後、等分散性と仮定できる場合にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定、仮定できない場合にはＷｅｌｃｈのｔ検定を用いて行った。有意水準はｐ＜０．０５とした。
【００３１】
６）結果
図３にＡＢＣＡ１２遺伝子発現を測定した結果を示す。なお測定結果は、試験試料無添加のＨａＣａＴ細胞のＡＢＣＡ１２活性を１とする相対値で示した。また図の表記は試験試料の略称で示した。
試験に用いた試料のなかで、サクシノイルアテロコラーゲン（コラーゲン）のみが有意にＡＢＣＡ１２活性を上昇させた。
したがって、サクシノイルアテロコラーゲンは、皮膚細胞のＡＢＣＡ１２活性を上昇させることができるものと結論付けられた。
【図１】
2018145146.tif 000003
【図２】
2018145146.tif 000004
【図３】
2018145146.tif 000005