(57)【要約】【課題】ネルボン酸生産能に優れたモルティエレラ属に属する菌株、及びこの菌株を用いた油脂の製造方法を提供すること。【解決手段】本発明のモルティエレラ属に属する菌株は、下記に示す培地：    グルコース１０％（ｗ／ｖ）    酵母エキス０．４％（ｗ／ｖ）    ポテトペプトン０．５％（ｗ／ｖ）    硫酸マグネシウム・七水和物０．００１３５％（ｗ／ｖ）    塩化カルシウム０．００４７５％（ｗ／ｖ）に菌株０．４ｍｇ／ｍｌを接種し、２８℃、２１５ｒｐｍの条件で７日間培養したときに、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を培地１Ｌあたり４００ｍｇ以上生産可能な菌株である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記に示す培地：
グルコース１０％（ｗ／ｖ）
酵母エキス０．４％（ｗ／ｖ）
ポテトペプトン０．５％（ｗ／ｖ）
硫酸マグネシウム・七水和物０．００１３５％（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム０．００４７５％（ｗ／ｖ）
に菌株０．４ｍｇ／ｍｌを接種し、２８℃、２１５ｒｐｍの条件で７日間培養したときに、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を培地１Ｌあたり４００ｍｇ以上生産可能なモルティエレラ属に属する菌株。
【請求項２】
油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を培地１Ｌあたり７５０ｍｇ以上生産可能な請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
下記に示す培地：
グルコース１２％（ｗ／ｖ）
酵母エキス０．８％（ｗ／ｖ）
ポテトペプトン０．５％（ｗ／ｖ）
硫酸マグネシウム・七水和物０．００１３５％（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム０．００４７５％（ｗ／ｖ）
（ただし、培養開始から１０日経過時に６０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液が培地１Ｌあたり７０ｍｌ添加される。）
に菌株０．４ｍｇ／ｍｌを接種し、２８℃、２１５ｒｐｍの条件で１４日間培養したときに、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を、培地１Ｌあたり１０００ｍｇ以上生産可能なモルティエレラ属に属する菌株。
【請求項４】
下記に示す培地：
グルコース１２％（ｗ／ｖ）
酵母エキス０．８％（ｗ／ｖ）
ポテトペプトン０．５％（ｗ／ｖ）
硫酸マグネシウム・七水和物０．００１３５％（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム０．００４７５％（ｗ／ｖ）
（ただし、培養開始から１０日経過時に６０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液が培地１Ｌあたり７０ｍｌ添加される。）
に菌株０．４ｍｇ／ｍｌを接種し、２８℃、１８０ｒｐｍの条件で１４日間培養したときに、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を、１Ｌあたり１０００ｍｇ以上生産可能なモルティエレラ属に属する菌株。
【請求項５】
脂肪酸伸長活性が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５０８として寄託されたモルティエレラ・カピタタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｃａｐｉｔａｔａ）ＲＤ０００９６９株に対して、７００％以上である、請求項１から４のいずれかに記載の菌株。
【請求項６】
油脂の構成脂肪酸のΔ９位の不飽和化活性が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５０８として寄託されたモルティエレラ・カピタタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｃａｐｉｔａｔａ）ＲＤ０００９６９株に対して、２００％以上である、請求項１から５のいずれかに記載の菌株。
【請求項７】
セルレニン耐性を有する菌株である、請求項１から６のいずれかに記載の菌株。
【請求項８】
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２９９、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２３００、又はＮＩＴＥ  Ｐ−０２３０１として寄託されたモルティエレラ・カピタタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｃａｐｉｔａｔａ）の菌株である、請求項１から７のいずれかに記載の菌株。
【請求項９】
ネルボン酸を構成脂肪酸として有する油脂の製造方法であって、
請求項１から８のいずれかに記載の菌株を培養する工程と、
培養後の菌体から、油脂を回収する工程と、を有する製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モルティエレラ属に属する菌株、及び油脂の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ネルボン酸は、脊髄動物の髄鞘を構成する脂肪酸の３０〜４５％を占めており、髄鞘にネルボン酸の濃度が不足すると脱髄疾患という神経系の疾患が誘引される。このため、脱髄疾患の治療には、ネルボン酸やその誘導体の投与が有効であることが知られている。また、ネルボン酸は、栄養価が高い。そのため、飲食品や医薬分野等で、ネルボン酸を使用することが好まれている。更に、セラミドの構成脂肪酸であることから、香粧品原料への応用も期待されている。
【０００３】
特許文献１には、モルティエレラ属に属する菌によりネルボン酸を構成脂肪酸中に有する油脂を製造する方法が開示されている。特に、ネルボン酸の生産量の多い菌株として、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５０８（ＮＩＴＥで分譲を受けることができる保管番号ＲＤ０００９６９）の菌株が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−１６８４１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５０８の菌株は、産業化の観点で十分なネルボン酸を生産するものとはいえず、より一層ネルボン酸生産能が高い菌株が求められている。
【０００６】
本発明は以上の実情に鑑みてなされたものであり、ネルボン酸生産能に優れたモルティエレラ属に属する菌株、及びこの菌株を用いた油脂の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、所定の方法により、高いネルボン酸生産能に有するモルティエレラ属に属する菌株を得られることを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供することを目的とする。
【０００８】
（１）  下記に示す培地：
グルコース１０％（ｗ／ｖ）
酵母エキス０．４％（ｗ／ｖ）
ポテトペプトン０．５％（ｗ／ｖ）
硫酸マグネシウム・七水和物０．００１３５％（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム０．００４７５％（ｗ／ｖ）
に菌株０．４ｍｇ／ｍｌを接種し、２８℃、２１５ｒｐｍの条件で７日間培養したときに、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を培地１Ｌあたり４００ｍｇ以上生産可能なモルティエレラ属に属する菌株。
【０００９】
（２）  油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を培地１Ｌあたり７５０ｍｇ以上生産可能な（１）に記載の菌株。
【００１０】
（３）  下記に示す培地：
グルコース１２％（ｗ／ｖ）
酵母エキス０．８％（ｗ／ｖ）
ポテトペプトン０．５％（ｗ／ｖ）
硫酸マグネシウム・七水和物０．００１３５％（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム０．００４７５％（ｗ／ｖ）
（ただし、培養開始から１０日経過時に６０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液が培地１Ｌあたり７０ｍｌ添加される。）
に菌株０．４ｍｇ／ｍｌを接種し、２８℃、２１５ｒｐｍの条件で１４日間培養したときに、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を、培地１Ｌあたり１０００ｍｇ以上生産可能なモルティエレラ属に属する菌株。
【００１１】
（４）  下記に示す培地：
グルコース１２％（ｗ／ｖ）
酵母エキス０．８％（ｗ／ｖ）
ポテトペプトン０．５％（ｗ／ｖ）
硫酸マグネシウム・七水和物０．００１３５％（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム０．００４７５％（ｗ／ｖ）
（ただし、培養開始から１０日経過時に６０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液が培地１Ｌあたり７０ｍｌ添加される。）
に菌株０．４ｍｇ／ｍｌを接種し、２８℃、１８０ｒｐｍの条件で１４日間培養したときに、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を、１Ｌあたり１０００ｍｇ以上生産可能なモルティエレラ属に属する菌株。
【００１２】
（５）  脂肪酸伸長活性が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５０８として寄託されたモルティエレラ・カピタタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｃａｐｉｔａｔａ）ＲＤ０００９６９株に対して、７００％以上である、（１）から（４）のいずれかに記載の菌株。
【００１３】
（６）  油脂の構成脂肪酸のΔ９位の不飽和化活性が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５０８として寄託されたモルティエレラ・カピタタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｃａｐｉｔａｔａ）ＲＤ０００９６９株に対して、２００％以上である、（１）から（５）のいずれかに記載の菌株。
【００１４】
（７）  セルレニン耐性を有する菌株である、（１）から（６）のいずれかに記載の菌株。
【００１５】
（８）  独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２９９、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２３００、又はＮＩＴＥ  Ｐ−０２３０１として寄託されたモルティエレラ・カピタタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｃａｐｉｔａｔａ）の菌株である、（１）から（７）のいずれかに記載の菌株。
【００１６】
（９）  ネルボン酸を構成脂肪酸として有する油脂の製造方法であって、
（１）から（８）のいずれかに記載の菌株を培養する工程と、
培養後の菌体から、油脂を回収する工程と、を有する製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ネルボン酸生産能の高いモルティエレラ属に属する菌株を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】モルティエレラ・カピタタの油脂を構成する脂肪酸の伸長・不飽和化のフローである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明は特にこれに限定されない。
【００２０】
＜モルティエレラ属に属する菌株＞
本発明のモルティエレラ属に属する菌株は、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を多量に生産する。特許文献１に記載された菌株は、菌体内に油脂を生産する能力は十分でなかったが、本発明のモルティエレラ属に属する菌株は、菌体内に多くの油脂を生産することができる。本発明の菌株が生産可能な油脂とは、菌体内に生産する油脂を指す。以下、本発明の菌株について説明する。
【００２１】
本発明のモルティエレラ属に属する菌株は、下記に示す培地：
グルコース１０％（ｗ／ｖ）
酵母エキス０．４％（ｗ／ｖ）
ポテトペプトン０．５％（ｗ／ｖ）
硫酸マグネシウム・七水和物０．００１３５％（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム０．００４７５％（ｗ／ｖ）
に菌株０．４ｍｇ／ｍｌを接種し、２８℃、２１５ｒｐｍの条件で７日間培養したとき（以下、この培養条件を本明細書において「培養条件（ａ）」ということがある。）に、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を培地１Ｌあたり４００ｍｇ以上生産可能な菌株である。
【００２２】
培養条件（ａ）における培地は、グルコース１０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．４％（ｗ／ｖ）、ポテトペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・七水和物０．００１３５％（ｗ／ｖ）、塩化カルシウム０．００４７５％（ｗ／ｖ）を水に溶解させた液体培地（以下、本明細書において「培地（Ａ）」ということがある。）である。なお、本明細書において、「％（ｗ／ｖ）」は、培地１００ｍＬ中に含まれる成分（培地（Ａ）においては、グルコース、酵母エキス、ポテトペプトン、硫酸マグネシウム・七水和物、塩化カルシウム）の質量（ｇ）を意味する。
【００２３】
培養条件（ａ）において、培地（Ａ）に接種する菌株の量（ｍｇ／ｍｌ）は、乾燥菌体重量に換算した数値であり、培地（Ａ）の体積（ｍｌ）に対する重量である。培地（Ａ）に接種する菌株は、公知の方法により得ることができ、例えば、以下のような手順で前培養あるいはさらに前々培養をし、菌株を準備することができる。
【００２４】
まず、凍結ストック（菌体を含む寒天培地）を薄く延ばしたポテトデキストロース培地（市販品、寒天入りの固形培地）に移植し、２８℃にて前々培養を行う。前々培養後、花状に広がる菌を直径８ｍｍのストローにて採取し、前培養用の培地（ポテトペプトン：０．５％（ｗ／ｖ）、グルコース：３％（ｗ／ｖ）、酵母エキス：０．１％（ｗ／ｖ））２００ｍｌ（５００ｍｌ容量バッフル付き三角フラスコ）に接種し、１４０ｒｐｍ、２８℃で２日間前培養し、培地（Ａ）に接種する菌体とすることができる。
【００２５】
培養条件（ａ）において、培地（Ａ）は２００ｍｌ用いる。培地（Ａ）において、菌株は乾燥菌体重量で０．４ｍｇ／ｍｌとなるような量に接種し、最終的に２００ｍｌに調整すればよい。また、培養容器としては、５００ｍｌ容量バッフル付き三角フラスコを用いる。培地の振とうは、ロータリーシェイカー（縦型三連式恒温振とう培養機  ＴＡＬ−ＲＳ３１０、トーマス科学器械株式会社製）を用いて、２８℃、２１５ｒｐｍの条件により行う。
【００２６】
本発明の菌株により生産される油脂は、培養条件（ａ）において、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を生産されるものである。培養条件（ａ）において生産される油脂は、構成脂肪酸としてのネルボン酸が、培地１Ｌあたり４００ｍｇ以上の量で有するものであれば、他の構成脂肪酸は特に限定されないが、例えば、他の構成脂肪酸として、エイコセン酸、ヘキサコセン酸等を有するものであってもよい。
【００２７】
本発明の菌株は、培養条件（ａ）において、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を培地１Ｌあたり４００ｍｇ以上生産可能であれば特に限定されないが、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を培地１Ｌあたり５００ｍｇ以上生産可能であることがより好ましく、５５０ｍｇ以上生産可能であることがさらに好ましく、６００ｍｇ以上生産可能であることがより一層好ましく、７００ｍｇ以上生産可能であることがさらに一層好ましく、７５０ｍｇ以上生産可能であることが特に好ましい。他方、本発明の菌株は、培養条件（ａ）において、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を培地１Ｌあたり１０００ｍｇ以下生産可能な菌であってもよい。
【００２８】
本発明の菌株は、培養条件（ａ）において、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸の生産量が、菌体１ｇ（乾燥菌体重量）あたり、２０．０ｍｇ以上であることが好ましく、２５．０ｍｇ以上であることが好ましく、３０．０ｍｇ以上であることが好ましく、３５．０ｍｇ以上であることが特に好ましい。また、本発明の菌株は、培養条件（ａ）において、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸の生産量が、菌体１ｇ（乾燥菌体重量）あたり、１００．０ｍｇ以下（９０．０ｍｇ以下、８０．０ｍｇ以下、７０．０ｍｇ以下、６０．０ｍｇ以下、５０．０ｍｇ以下等）であってもよい。
【００２９】
本発明の菌株は、特に、油脂中の構成脂肪酸中のネルボン酸の割合が多くなるため、その点で有用である。この観点で、培養条件（ａ）において、油脂の構成脂肪酸中のネルボン酸の割合が、油脂の全構成脂肪酸に対して、５．０質量％以上であることが好ましく、５．５質量％以上であることが好ましく、６．０質量％以上であることが好ましく、７．０質量％以上であることが特に好ましい。また、本発明の菌株は、培養条件（ａ）において、油脂の構成脂肪酸中のネルボン酸の割合が、油脂の全構成脂肪酸に対して、２０．０質量％以下（１８．０質量％以下、１６．０質量％以下、１４．０質量％以下、１３．０質量％以下、１２．０質量％以下等）であってもよい。
【００３０】
本発明の菌株は、下記に示す培地：
グルコース１２％（ｗ／ｖ）
酵母エキス０．８％（ｗ／ｖ）
ポテトペプトン０．５％（ｗ／ｖ）
硫酸マグネシウム・七水和物０．００１３５％（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム０．００４７５％（ｗ／ｖ）
（ただし、培養開始から１０日経過時に６０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液が培地１Ｌあたり７０ｍｌ添加される。）
に菌株０．４ｍｇ／ｍｌを接種し、２８℃、２１５ｒｐｍの条件で１４日間培養したとき（以下、この培養条件を本明細書において「培養条件（ｂ）」ということがある。）に、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を、培地１Ｌあたり１０００ｍｇ以上生産可能なモルティエレラ属に属する菌株であってもよい。
【００３１】
培養条件（ｂ）における培地は、グルコース１２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．８％（ｗ／ｖ）、ポテトペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・七水和物０．００１３５％（ｗ／ｖ）、塩化カルシウム０．００４７５％（ｗ／ｖ）を水に溶解させた液体培地（以下、本明細書において「培地（Ｂ）」ということがある。）である。また、培養条件（ｂ）においては、培養開始から１０日経過時に６０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液が培地１Ｌあたり７０ｍｌ添加される。この「培養開始」とは、菌株０．４ｍｇ／ｍｌを培地（Ｂ）に接種した時点を指す。
【００３２】
培養条件（ｂ）において、培地（Ｂ）に接種する菌株の量（ｍｇ／ｍｌ）は、乾燥菌体重量に換算した数値であり、培地（Ｂ）の体積（ｍｌ）に対する重量である。培地（Ｂ）に接種する菌株は、培養条件（ａ）における方法と同様の方法により得ることができる。
【００３３】
培養条件（ｂ）において、培地（Ｂ）は２００ｍｌ用いる。培地（Ｂ）において、菌株は乾燥菌体重量で０．４ｍｇ／ｍｌとなるような量に接種し、最終的に２００ｍｌ調整すればよい。また、培養容器としては、５００ｍｌ容量バッフル付き三角フラスコを用いる。培地の振とうは、ロータリーシェイカー（縦型三連式恒温振とう培養機  ＴＡＬ−ＲＳ３１０、トーマス科学器械株式会社製）を用いて、２８℃、２１５ｒｐｍの条件により行う。
【００３４】
本発明の菌株により生産される油脂は、培養条件（ｂ）において、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を生産されるものであってもよい。培養条件（ｂ）において生産される油脂は、構成脂肪酸としてのネルボン酸が、培地１Ｌあたり１０００ｍｇ以上の量で有するものであれば、他の構成脂肪酸は特に限定されないが、例えば、他の構成脂肪酸として、エイコセン酸、ヘキサコセン酸等を有するものであってもよい。
【００３５】
本発明の菌株は、培養条件（ｂ）において、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を培地１Ｌあたり１０００ｍｇ以上生産可能であれば特に限定されないが、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を培地１Ｌあたり１０５０ｍｇ以上生産可能であることがより好ましく、１１００ｍｇ以上生産可能であることがさらに好ましく、１２００ｍｇ以上生産可能であることがより一層好ましく、１３００ｍｇ以上生産可能であることがさらに一層好ましく、１４００ｍｇ以上生産可能であることが特に好ましい。他方、本発明の菌株は、培養条件（ｂ）において、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を培地１Ｌあたり２０００ｍｇ以下（１９００ｍｇ以下、１８００ｍｇ以下、１７００ｍｇ以下、１６００ｍｇ以下等）生産可能な菌であってもよい。
【００３６】
本発明の菌株は、培養条件（ｂ）において、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸の生産量が、菌体１ｇ（乾燥菌体重量）あたり、２５．０ｍｇ以上であることが好ましく、２８．０ｍｇ以上であることが好ましく、３３．０ｍｇ以上であることが特に好ましい。また、本発明の菌株は、培養条件（ｂ）において、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸の生産量が、菌体１ｇ（乾燥菌体重量）あたり、１００．０ｍｇ以下（９０．０ｍｇ以下、８０．０ｍｇ以下、７０．０ｍｇ以下、６０．０ｍｇ以下、５０．０ｍｇ以下等）であってもよい。
【００３７】
本発明の菌株は、特に、油脂中の構成脂肪酸中のネルボン酸の割合が多くなるため、その点で有用である。この観点で、培養条件（ｂ）において、油脂の構成脂肪酸中のネルボン酸の割合が、油脂の全構成脂肪酸に対して、５．５質量％以上であることが好ましく、５．６質量％以上であることが好ましく、５．８質量％以上であることが好ましく、６．０質量％以上であることが特に好ましい。また、本発明の菌株は、培養条件（ｂ）において、油脂の構成脂肪酸中のネルボン酸の割合が、油脂の全構成脂肪酸に対して、１５．０質量％以下（１４．０質量％以下、１３．０質量％以下、１２．０質量％以下、１１．０質量％以下、１０．０質量％以下等）であってもよい。
【００３８】
本発明の菌株は、下記に示す培地：
下記に示す培地：
グルコース１２％（ｗ／ｖ）
酵母エキス０．８％（ｗ／ｖ）
ポテトペプトン０．５％（ｗ／ｖ）
硫酸マグネシウム・七水和物０．００１３５％（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム０．００４７５％（ｗ／ｖ）
（ただし、培養開始から１０日経過時に６０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液が培地１Ｌあたり７０ｍｌ添加される。）
に菌株を０．４ｍｇ／ｍｌを接種し、２８℃、１８０ｒｐｍの条件で１４日間培養したとき（以下、この培養条件を本明細書において「培養条件（ｃ）」ということがある。）に、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を、１Ｌあたり１０００ｍｇ以上生産可能なモルティエレラ属に属する菌株であってもよい。
【００３９】
培養条件（ｃ）における培地は、グルコース１２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．８％（ｗ／ｖ）、ポテトペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・七水和物０．００１３５％（ｗ／ｖ）、塩化カルシウム０．００４７５％（ｗ／ｖ）を水に溶解させた液体培地（以下、本明細書において「培地（Ｃ）」ということがある。）である。また、培養条件（ｃ）においては、培養開始から１０日経過時に６０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液が培地１Ｌあたり７０ｍｌ添加される。この「培養開始」とは、菌株０．４ｍｇ／ｍｌを培地（Ｃ）に接種した時点を指す。
【００４０】
培養条件（ｃ）において、培地（Ｃ）に接種する菌株の量（ｍｇ／ｍｌ）は、乾燥菌体重量に換算した数値であり、培地（Ｃ）の体積（ｍｌ）に対する重量である。培地（Ｃ）に接種する菌株は、培養条件（ａ）における方法と同様の方法により得ることができる。
【００４１】
培養条件（ｃ）において、培地（Ｃ）は２００ｍｌ用いる。培地（Ｃ）において、菌株は乾燥菌体重量で０．４ｍｇ／ｍｌとなるような量に接種し、最終的に２００ｍｌ調整すればよい。また、培養容器としては、５００ｍｌ容量バッフル付き三角フラスコを用いる。培地の振とうは、ロータリーシェイカー（縦型三連式恒温振とう培養機  ＴＡＬ−ＲＳ３１０、トーマス科学器械株式会社製）を用いて、２８℃、１８０ｒｐｍの条件により行う。
【００４２】
本発明の菌株により生産される油脂は、培養条件（ｃ）において、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を生産されるものであってもよい。培養条件（ｃ）において生産される油脂は、構成脂肪酸としてのネルボン酸が、培地１Ｌあたり１０００ｍｇ以上の量で有するものであれば、他の構成脂肪酸は特に限定されないが、例えば、他の構成脂肪酸として、エイコセン酸、ヘキサコセン酸等を有するものであってもよい。
【００４３】
本発明の菌株は、培養条件（ｃ）において、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を培地１Ｌあたり１０００ｍｇ以上生産可能であれば特に限定されないが、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を培地１Ｌあたり１１００ｍｇ以上生産可能であることがより好ましく、１２００ｍｇ以上生産可能であることがさらに好ましく、１３００ｍｇ以上生産可能であることがより一層好ましく、１４００ｍｇ以上生産可能であることがさらに一層好ましく、１５００ｍｇ以上生産可能であることが特に好ましい。他方、本発明の菌株は、培養条件（ｃ）において、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸を培地１Ｌあたり２０００ｍｇ以下（１９００ｍｇ以下、１８００ｍｇ以下、１７００ｍｇ以下等）生産可能な菌であってもよい。
【００４４】
本発明の菌株は、培養条件（ｃ）において、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸の生産量が、菌体１ｇ（乾燥菌体重量）あたり、２０．０ｍｇ以上であることが好ましく、２５．０ｍｇ以上であることが好ましく、３５．０ｍｇ以上であることが好ましく、３９．０ｍｇ以上であることが特に好ましい。また、本発明の菌株は、培養条件（ｃ）において、油脂の構成脂肪酸としてのネルボン酸の生産量が、菌体１ｇ（乾燥菌体重量）あたり、１００．０ｍｇ以下（９０．０ｍｇ以下、８０．０ｍｇ以下、７０．０ｍｇ以下、６０．０ｍｇ以下、５０．０ｍｇ以下等）であってもよい。
【００４５】
本発明の菌株は、特に、油脂中の構成脂肪酸中のネルボン酸の割合が多くなるため、その点で有用である。この観点で、培養条件（ｃ）において、油脂の構成脂肪酸中のネルボン酸の割合が、油脂の全構成脂肪酸に対して、５．０質量％以上であることが好ましく、５．５質量％以上であることが好ましく、６．０質量％以上であることが好ましく、６．６質量％以上であることが特に好ましい。また、本発明の菌株は、培養条件（ｃ）において、油脂の構成脂肪酸中のネルボン酸の割合が、油脂の全構成脂肪酸に対して、１５．０質量％以下（１４．０質量％以下、１３．０質量％以下、１２．０質量％以下、１１．０質量％以下、１０．０質量％以下等）であってもよい。
【００４６】
本発明の菌株は脂肪酸伸長活性が高いために、ネルボン酸生産能が高いものと考えられる。そのため、脂肪酸伸長活性が高い菌株であることが好ましい。本発明において「脂肪酸伸長活性」とは、具体的には油脂の構成脂肪酸の炭素鎖を伸長する遺伝子の発現量が多いことを意味し、より具体的には、炭素数１６の構成脂肪酸（パルミチン酸）を炭素数１８の構成脂肪酸（ステアリン酸）に伸長する酵素をコードする遺伝子の発現量が多いことを意味する。この観点で、本発明の菌株は独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５０８として寄託されたモルティエレラ・カピタタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｃａｐｉｔａｔａ）ＲＤ０００９６９株の脂肪酸伸長活性より高い脂肪酸伸長活性を有するものであることが好ましく、さらに具体的には、ＲＤ０００９６９株における脂肪酸伸長活性を有する酵素をコードする遺伝子（配列番号１）の発現量（ＲＤ０００９６９株の脂肪酸伸長活性）を１００％としたときに、本発明の菌株における対応する遺伝子（例えば、配列番号１）の発現量（本発明の菌株の脂肪酸伸長活性）が、ＲＤ０００９６９株の脂肪酸伸長活性に対して１００％超の脂肪酸伸長活性を有するものであることが好ましく、３００％以上の脂肪酸伸長活性を有するものであることがより好ましく、５００％以上の脂肪酸伸長活性を有するものであることがさらに好ましく、７００％以上の脂肪酸伸長活性を有するものであることがより一層好ましく、９００％以上の脂肪酸伸長活性を有するものであることがさらに一層好ましく、１２００％以上の脂肪酸伸長活性を有するものであることが特に好ましい。また、本発明の菌株は、ＲＤ０００９６９株の配列番号１の遺伝子の発現量を脂肪酸伸長活性１００％としたときに、ＲＤ０００９６９株の脂肪酸伸長活性に対して１７００％以下（１６００％以下、１５００％以下、１４００％以下等）の脂肪酸伸長活性を有するものであってもよい。
【００４７】
また、本発明の菌株の脂肪酸伸長活性は、上記の配列番号１の発現量についての活性以外に、（１）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ、（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつ、脂肪酸伸長活性を有するＤＮＡ、（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８５％以上（９０％以上、９４％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなり、かつ、脂肪酸伸長活性を有するＤＮＡのいずれかについての発現量に関する活性であることが好ましい。
【００４８】
本発明の菌株は油脂の構成脂肪酸のΔ９位の不飽和化活性も高いために、ネルボン酸生産能が高いものと考えられる。そのため、Δ９位の不飽和化活性が高い菌株であることが好ましい。本発明において「Δ９位の不飽和化活性」とは、具体的には油脂の構成脂肪酸のうち飽和脂肪酸（ステアリン酸）の９位を不飽和化した不飽和脂肪酸（オレイン酸）に変換する遺伝子の発現量が多いことを意味する。この観点で、本発明の菌株は独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５０８として寄託されたモルティエレラ・カピタタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｃａｐｉｔａｔａ）ＲＤ０００９６９株の脂肪酸不飽和化活性より高いΔ９位の不飽和化活性を有するものであることが好ましく、さらに具体的には、ＲＤ０００９６９株におけるΔ９位の不飽和化活性を有する酵素をコードする遺伝子（配列番号３）の発現量（ＲＤ０００９６９株の脂肪酸伸長活性）を１００％としたときに、本発明の菌株における対応する遺伝子（例えば、配列番号３）の発現量（本発明の菌株のΔ９位の不飽和化活性）が、ＲＤ０００９６９株のΔ９位の不飽和化活性に対して１００％超のΔ９位の不飽和化活性を有するものであることが好ましく、１２０％以上のΔ９位の不飽和化活性を有するものであることがより好ましく、１５０％以上のΔ９位の不飽和化活性を有するものであることがさらに好ましく、２００％以上のΔ９位の不飽和化活性を有するものであることがより一層好ましく、３００％以上のΔ９位の不飽和化活性を有するものであることがさらに一層好ましく、３５０％以上のΔ９位の不飽和化活性を有するものであることが特に好ましい。また、本発明の菌株は、ＲＤ０００９６９株の配列番号３の遺伝子の発現量をΔ９位の不飽和化活性１００％としたときに、ＲＤ０００９６９株のΔ９位の不飽和化活性に対して１０００％以下（９００％以下、８００％以下、７００％以下、６００％以下、５００％以下等）の脂肪酸不飽和化活性を有するものであってもよい。
【００４９】
また、本発明の菌株のΔ９位の不飽和化活性は、上記の配列番号３の発現量についての活性以外に、（１）配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ、（２）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつ、Δ９位の不飽和化活性を有するＤＮＡ、（３）配列番号４に記載のアミノ酸配列と８５％以上（９０％以上、９４％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなり、かつ、Δ９位の不飽和化活性を有するＤＮＡのいずれかについての発現量に関する活性であることが好ましい。
【００５０】
本発明において、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中、４０〜７０℃（好ましくは、５０〜６７℃、より好ましくは、６０〜６５℃）で反応を行い、塩濃度１５〜３００ｍＭ（好ましくは、１５〜１５０ｍＭ、より好ましくは１５〜６０ｍＭ、更に好ましくは、３０〜５０ｍＭ）の洗浄液中で洗浄を行う条件が挙げられる。
【００５１】
本発明において、「１もしくは複数」とは、通常、５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、更に好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、１アミノ酸）である。脂肪酸伸長活性を維持する場合、変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
【００５２】
本発明において、アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。
【００５３】
本発明の菌株は、ネルボン酸産生能が高い傾向にあることから、セルレニン耐性を有する菌株であることが好ましい。
【００５４】
本発明のモルティエレラ属に属する菌株としては、例えば、モルティエレラ・カピタタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｃａｐｉｔａｔａ）、モルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｌｏｎｇａｔａ）、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｘｉｇｕａ）、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）、モルティエレラ・パルビスポラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｐａｒｖｉｓｐｏｒａ）、モルティエレラ・ベルジャコバ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｂｅｌｊａｋｏｖａｅ）、モルティエレラ・グロバルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｇｌｏｂａｌｐｉｎａ）、モルティエレラ・エピガマ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｐｉｇａｍａ  ）、モルティエレラ・クフルマニ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｋｕｈｌｍａｎｉｉ  ）、モルティエレラ・アクロトナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｃｒｏｔｏｎａ）、モルティエレラ・ザイチャ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｚｙｃｈａｅ）、モルティエレラ・ミヌチシマ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）、モルティエレラ・バイニエリ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｂａｉｎｉｅｒｉ）、モルティエレラ・シュマッカリ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｓｃｈｍｕｃｋｅｒｉ）等を挙げることができる。これらのうち、特に、ネルボン酸生産能が高いことからモルティエレラ・カピタタが好ましく、モルティエレラ・カピタタのうち、特に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２９９、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２３００、又はＮＩＴＥ  Ｐ−０２３０１として寄託されたモルティエレラ・カピタタの菌株が好ましい。
【００５５】
本発明におけるネルボン酸の量は、菌体内に生産したネルボン酸の量を意味する。ネルボン酸の量（油脂中の構成脂肪酸としてのネルボン酸の量）は、ガスクロマトグラフ質量分析計により測定する。
【００５６】
本発明における、上述の培養条件（ａ）によりネルボン酸を培地１Ｌあたり４００ｍｇ以上生産可能なモルティエレラ属に属する菌株、培養条件（ｂ）によりネルボン酸を１Ｌあたり１０００ｍｇ以上生産可能なモルティエレラ属に属する菌株、培養条件（ｃ）によりネルボン酸を１Ｌあたり１０００ｍｇ以上生産可能なモルティエレラ属に属する菌株は、以下の方法で製造できる。
【００５７】
モルティエレラ・カピタタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｃａｐｉｔａｔａ）ＲＤ０００９６９株を５ｍｌのポテトデキストロース液体培地に植菌して、例えば、２８℃で２日間振とう培養する。この培養液からフィルター濾過により菌体を回収し、緩衝液を加え、超音波（例えば、周波数２０ｋＨｚ、振幅４０μｍ）を２分間照射して菌糸懸濁液を調製する。懸濁液に１ｍｌのＮＴＧ液を加えて、例えば、２８℃で１５分間静置した後に、遠心分離により菌体を回収し、蒸留水で洗浄後、１ｍｌの蒸留水に懸濁する。この懸濁液をセルレニンを添加したポテトデキストロース培地に塗布してセルレニン耐性菌を分離し、これを本発明の菌株としてもよい。
【００５８】
さらに、上記の分離したセルレニン耐性菌について紫外線照射（２５３ｎｍ）して変異処理を行うことが好ましい。具体的には、上記の分離したセルレニン耐性菌を１５ｍｌのポテトデキストロース液体培地に植菌して、例えば、２８℃で２日間振とう培養する。この培養液からフィルター濾過により菌体を回収し、洗浄後、緩衝液を加え、超音波（例えば、周波数２０ｋＨｚ、振幅４０μｍ）を照射して菌糸懸濁液を調製する。懸濁液をシャーレに移し、紫外線ランプを照射した後に、５０μｌを０．０４％のセルレニンを添加したポテトデキストロース培地に塗布してセルレニン耐性菌を分離する。このように、セルレニン耐性株を選択することにより、ネルボン酸生産能の高い本発明の菌株を得ることができる。
【００５９】
なお、得られた菌株が、上述の菌株であるか否かは、上記の培養条件（ａ）により培養し、ネルボン酸の量を測定することで確認可能である。
【００６０】
＜油脂の製造方法＞
本発明の油脂の製造方法は、ネルボン酸を構成脂肪酸として有する油脂の製造方法であって、上述のモルティエレラ属に属する菌株を培養する工程と、培養後の菌体から、油脂を回収する工程と、を有する。
【００６１】
モルティエレラ属に属する菌株は、上述の本発明の菌株を用いることができる。
【００６２】
モルティエレラ属に属する菌株の培養方法は、特に制限されず、例えば、予め培養して得られた前培養液を、液体培地に接種し培養してよい。あるいは、固形培地に培養しておいた菌株（胞子、菌糸等）を液体培地に接種し培養してもよい。
【００６３】
本発明の培地に用いられる培地は、モルティエレラ属に属する菌株が生育可能な培地であれば特に限定されないが、具体的な炭素源としては、例えば、グルコース、スクロース、フルクトース、キシロース、マンノース、可溶性デンプン、グリセロール、マンニトール等を使用することができる。これらのうち、グルコースが好ましい。また、炭素源の濃度は５〜１５％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、グルコースが５〜１５％（ｗ／ｖ）で含まれることが好ましい。
【００６４】
培地はさらに窒素源を含むことが好ましい。窒素源は、特に制限されないが、例えば、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティプリカー等を使用することができる。中でも、培養液あたりの菌体の濃度を高める効果が大きいため、酵母エキス、ペプトンを用いる事が好ましく、酵母エキスとペプトンの両方を用いる事が好ましい。特に、窒素原の濃度は０．１〜１．０％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、特に、酵母エキス０．１〜１．０％（ｗ／ｖ）、ポテトペプトン０．１〜１．０％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。
【００６５】
これら以外の成分としては、特に、マグネシウム塩（硫酸マグネシウム・七水和物等）、カルシウム塩（塩化カルシウム等）、リン酸塩（リン酸カリウム等）、鉄塩（硫酸鉄等）、銅塩（硫酸銅等）等の無機塩、塩化ナトリウム等の等張化剤を含むことが好ましい。無機塩（特に硫酸マグネシウムと塩化カルシウム）について、硫酸マグネシウムは０．００００１〜０．０１０００％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、塩化カルシウムは０．００００１〜０．０２０００％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。
【００６６】
培地には、基質として、脂肪酸や脂肪酸を含む油脂を使用してもよい。脂肪酸は、特に制限されないが、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、アラキジン酸、エイコセン酸、ベヘン酸、エルカ酸、リグノセリン酸等が挙げられる。中でも、油脂組成物中のネルボン酸の濃度を高める効果が大きいため、エルカ酸が好ましい。油脂は、オリーブ油、パーム油、ナタネ油等が挙げられる。中でも、エルカ酸の含有量が高いためナタネ油が好ましい。
【００６７】
また、従来のモルティエレラ属に属する菌株に用いられる公知の培地を使用してもよく、Ｃｚａｐｅｋ培地、Ｃｚａｐｅｋ−ｄｏｘ培地、ＰＤ（ポテトデキストロース）培地等を使用することができる。
【００６８】
培養温度は、モルティエレラ属に属する菌株の生育しうる温度であればよく、特に制限されないが、例えば５℃以上、１０℃以上、２０℃以上であってよく、５０℃以下、４０℃以下、３０℃以下であってよい。
【００６９】
培地のｐＨは、モルティエレラ属に属する菌株の生育しうるｐＨであればよく、特に制限されないが、例えば、３以上、４以上、５以上であってよく、１２以下、１１以下、１０以下であってよい。
【００７０】
培養の方法は、モルティエレラ属に属する菌株の生育しうる方法であれば、特に制限されないが、例えば、上記の培養条件下で、撹拌培養、振とう培養、静置培養等に行うことができる。振とう培養の場合、振とうの回転数は、モルティエレラ属に属する菌株の生育しうる方法であれば、特に制限されないが、１５０〜２５０ｒｐｍで行うことが好ましい。
【００７１】
モルティエレラ属に属する菌株の培養時間は、所望のネルボン酸の量に応じて決定すればよく、例えば、１０時間〜３０日の範囲内であってよいが、７日以上であることが好ましく、１０日以上であることが好ましい。特に、７日以上培養する場合、グルコース水溶液を培養中に途中添加することが好ましい。また、ネルボン酸の生産量が減少に転じる事から、培養時間は３０日以内が好ましく、２５日以内であることが更に好ましい。
【００７２】
培養後の菌体から、油脂を回収する方法は、従来の公知の方法により行うことができる。例えば、まず、培養液から遠心分離、ろ過等により菌体を分離、回収し、菌体からネルボン酸を構成脂肪酸として有する油脂をノルマルヘキサンで抽出することにより、行ってもよい。
【００７３】
本発明の製造方法は、さらに、油脂からネルボン酸の分離をさせる工程を有してもよい。油脂からネルボン酸の分離は、溶剤分別法や分取ＨＰＬＣ等の公知の方法により行うことができる。
【００７４】
なお、油脂の製造は、特開２０１４−１６８４１８号公報に記載されたとおりに公知の方法を用いてもよい。
【００７５】
本発明の菌株により産生された油脂から、ネルボン酸を分離して、飲食品や医薬品に用いる事ができる。
【実施例】
【００７６】
＜変異株の作製＞
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１５０８として寄託されたモルティエレラ・カピタタＲＤ０００９６９株に対して、ＮＴＧ（Ｎ−メチル‐Ｎ’−ニトロ‐Ｎ−ニトロソグアニジン）による変異処理を行った。
【００７７】
まず、この菌体を５ｍｌのポテトデキストロース液体培地に植菌して２８℃で２日間振とう培養した。この培養液からフィルター濾過により菌体を回収し、５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、１ｍｌの１００ｍＭトリスマレイン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、超音波（周波数２０ｋＨｚ、振幅４０μｍ）を２分間照射して菌糸懸濁液を調製した。懸濁液に１ｍｌのＮＴＧ液（４０μｇ／ｍｌ）を加えて２８℃で１５分間静置した後に、遠心分離により菌体を回収し、蒸留水で洗浄後、１ｍｌの蒸留水に懸濁した。この懸濁液５０μｌを０．０４％のセルレニンを添加したポテトデキストロース培地に塗布してセルレニン耐性菌を２株（Ｍ２０９株、Ｍ３２４株）分離した。Ｍ２０９株を実施例１、Ｍ３２４株を実施例２に係る菌株とした。なお、Ｍ２０９株の受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２９９、Ｍ３２４株の受託番号はＮＩＴＥ  Ｐ−０２３００である。
【００７８】
実施例２に係る菌株に対して、さらに紫外線照射（２５３ｎｍ）して変異処理を行った。セルレニン耐性菌を１５ｍｌのポテトデキストロース液体培地に植菌して２８℃で２日間振とう培養した。この培養液からフィルター濾過により菌体を回収し、５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、１ｍｌの１００ｍＭトリスマレイン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、超音波（周波数２０ｋＨｚ、振幅４０μｍ）を２分間照射して菌糸懸濁液を調製した。懸濁液をシャーレに移し、紫外線ランプを３０ｃｍ離れた場所から２２分照射した後に、５０μｌを０．０４％のセルレニンを添加したポテトデキストロース培地に塗布してセルレニン耐性菌の株（Ｍ４６３株）を分離した。Ｍ４６３株を実施例３に係る菌株とした。なお、Ｍ４６３株の受託番号はＮＩＴＥ  Ｐ−０２３０１である。
【００７９】
＜油脂の製造＞
（前々培養、前培養）
比較例１として、ＲＤ０００９６９株を準備し、比較例２としてＮＢＲＣ１０２９８４株（Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）を準備した。これら比較例１、２の菌体と、実施例１〜３の菌体について、前々培養、前培養を行った。
【００８０】
まず、それぞれの菌株の凍結ストック（菌体を含む寒天培地）を移植し、ポテトデキストロース培地（市販品  寒天入り）に２８℃にて生育状況を見ながら前々培養を行った。前々培養後、花状に広がる菌を直径８ｍｍのストローにて採取し、前培養用の液体培地（ポテトペプトン：０．５％（ｗ／ｖ）、グルコース：３％（ｗ／ｖ）、酵母エキス：０．１％（ｗ／ｖ））２００ｍｌ（５００ｍｌ容量バッフル付きフラスコ）に加え、１４０ｒｐｍ、２８℃で２日間前培養を行った。
【００８１】
（本培養）
前培養後、実施例１〜３、比較例１、２に係る菌体を１０ｍｌ採取（培養液含む）し、１９０ｍｌの培地に菌体１０ｍｌを添加して計２００ｍｌとして、乾燥菌体重量で０．４ｍｇ／ｍｌとなるように接種し、以下の培養条件（ａ）により本培養を行った。
【００８２】
〔培養条件（ａ）〕
培地：グルコース１０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．４％（ｗ／ｖ）、ポテトペプトン
０．５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・七水和物０．００１３５％（ｗ／ｖ）、
塩化カルシウム０．００４７５％（ｗ／ｖ）
容量：２００ｍｌ（５００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコ）
培養温度：２８℃
振とう速度：２１５ｒｐｍ（ロータリーシェイカー（縦型三連式恒温振とう培養機  ＴＡＬ−ＲＳ３１０、トーマス科学器械株式会社製））
培養期間：７日間
【００８３】
実施例２、３、比較例１に係る菌株については、前培養後、菌体を１０ｍｌ採取（培養液含む）し、１９０ｍｌの培地に菌体１０ｍｌを添加して計２００ｍｌとして、乾燥菌体重量で０．４ｍｇ／ｍｌとなるように接種し、以下の培養条件（ｂ）により本培養を行った。
【００８４】
〔培養条件（ｂ）〕
培地：グルコース１２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．８％（ｗ／ｖ）、ポテトペプトン
０．５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・七水和物０．００１３５％（ｗ／ｖ）
塩化カルシウム０．００４７５％（ｗ／ｖ）
（培養開始から１０日経過時に６０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液を培地１Ｌあ
たり７０ｍｌ添加）
容量：２００ｍｌ（５００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコ）
培養温度：２８℃
振とう速度：２１５ｒｐｍ（ロータリーシェイカー（縦型三連式恒温振とう培養機  ＴＡＬ−ＲＳ３１０、トーマス科学器械株式会社製））
培養期間：１４日間
【００８５】
実施例２に係る菌株については、前培養後、菌体を１０ｍｌ採取（培養液含む）し、１９０ｍｌの培地に菌体１０ｍｌを添加して計２００ｍｌとして、乾燥菌体重量で０．４ｍｇ／ｍｌとなるように接種し、以下の培養条件（ｃ）により本培養を行った。
【００８６】
〔培養条件（ｃ）〕
培地：グルコース１２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．８％（ｗ／ｖ）、ポテトペプトン
０．５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・七水和物０．００１３５％（ｗ／ｖ）、
塩化カルシウム０．００４７５％（ｗ／ｖ）
（培養開始から１０日経過時に６０％（ｗ／ｖ）のグルコース水溶液を培地１Ｌ
あたり７０ｍｌ添加）
容量：２００ｍｌ（５００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコ）
培養温度：２８℃
振とう速度：１８０ｒｐｍ（ロータリーシェイカー（縦型三連式恒温振とう培養機  ＴＡＬ−ＲＳ３１０、トーマス科学器械株式会社製））
培養期間：１４日間
【００８７】
＜ネルボン酸量の測定＞
ネルボン酸量の測定を以下の方法により行った。
【００８８】
まず、本培養後、フィルター濾過により菌体を回収し、凍結乾燥した。乾燥菌体３０ｍｇに、２Ｍ塩酸メタノール溶液を３ｍｌ加えて、１００℃で２時間加熱して菌体脂肪酸をメチルエステル化した。反応液を１ｍｌの蒸留水で洗浄後、６ｍｌのノルマルヘキサンで脂肪酸メチルエステルを抽出し、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＴＳＱ８０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でネルボン酸量を測定した。
【００８９】
＜測定結果＞
下記の表１〜３に、培養結果を示す。表１〜３中のネルボン酸生産量は、本培養後の菌体内に含まれるネルボン酸量（油脂中の構成脂肪酸としてのネルボン酸の量）である。また、「脂質中のネルボン酸の割合（％）」は、菌体から回収した油脂中の構成脂肪酸としてのネルボン酸の割合（質量％）を意味する。なお、表１は培養条件（ａ）により本培養を行った結果であり、表２は培養条件（ｂ）により本培養を行った結果であり、表３は培養条件（ｃ）により本培養を行った結果である。
【００９０】
【表１】
2018033433.tif 000003
【００９１】
【表２】
2018033433.tif 000004
【００９２】
【表３】
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【００９３】
表１〜３に示すとおり、実施例１〜３に係る菌株は、比較例１のＲＤ０００９６９株より、ネルボン酸生産量が高くなり、さらに、脂質中のネルボン酸の割合も増加することがわかった。
【００９４】
＜遺伝子発現量の解析＞
実施例１に係る菌株と、比較例１に係る菌株について、ＲＮＡ抽出を行い、発現した遺伝子がコードするアミノ酸配列について、下記の表４に示す公知の脂肪酸合成酵素との相同性検索を行った。
【００９５】
【表４】
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【００９６】
相同性検索の結果、実施例１と比較例１のＴＲ３５９５遺伝子（配列番号１）がコードするアミノ酸配列（配列番号２）が、表４のＭＡＬＣＥ１ｐのアミノ酸配列と８９％の相同性を有した。また、分析の結果、ＭＡＬＣＥ１ｐと同一の系統枝に属するものであり、ＭＡＬＣＥ１ｐと似た膜貫通様式であったことがわかった。また、実施例１と比較例１のＴＲ１３９１９遺伝子（配列番号３）がコードするアミノ酸配列（配列番号４）が、表４のＯｌｅ１ｐのアミノ酸配列と８５％の相同性を有し、Δ９不飽和化酵素ファミリーの系統に属するものであることがわかった。実施例１と比較例１のＴＲ３５９５遺伝子、ＴＲ１３９１９遺伝子について、遺伝子の発現量をＲＮＡ−シーケンシング（イルミナ社  ＨｉＳｅｑ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）により解析した。その発現量の結果を以下の表５に示す。なお、表５に示す発現量の単位は、ＦＰＫＭ（Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  Ｐｅｒ  Ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｐｅｒ  Ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄｓ）である。
【００９７】
【表５】
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【００９８】
上記の相同性検索の結果より、ＴＲ３５９５遺伝子が、脂肪酸伸長活性遺伝子（炭素数１６の構成脂肪酸（パルミチン酸）を炭素数１８の構成脂肪酸（ステアリン酸）に伸長する酵素をコードする遺伝子）であり、ＴＲ１３９１９遺伝子が、Δ９位の不飽和化活性遺伝子（飽和脂肪酸（ステアリン酸）の９位を不飽和化した不飽和脂肪酸（オレイン酸）に変換する遺伝子）であることが示唆された。モルティエレラ・カピタタは、図１に示すような経路で、油脂の構成脂肪酸の伸長、不飽和化が進んでいるものと考えられる。なお、図１中、Ｃ２４：１がネルボン酸である。また、実施例１は、ＴＲ３５９５遺伝子の発現量が比較例１に対して約１３．６倍高く、ＴＲ１３９１９遺伝子の発現量が比較例１に対して約３．９倍高かった。この結果から、実施例１〜３においてネルボン酸量の生産量が高かったのは、図１に示すフローにおける脂肪酸伸長活性遺伝子（ＴＲ３５９５）とΔ９位の不飽和化活性遺伝子（ＴＲ１３９１９）の発現量が、増加することによるものと推測される。
【図１】
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【配列表】
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