(57)【要約】      （修正有）【課題】共役酵素反応に関わる複数の異種酵素をメソポーラスシリカに安定に固定化することで、バイオプロセスにおける共役的な酵素反応の効率を増大させ、かつ、酵素の繰り返し使用を可能にする方法、及び当該共役酵素反応を利用したキット、センサー等を提供する。【解決手段】共役酵素反応に関わる複数の異種酵素のうち少なくとも酵素Ａ及び酵素Ｂがそれぞれメソポーラスシリカに固定化されている複合体であって、前記酵素Ａ及び酵素Ｂのうち少なくとも一方の酵素にはＳｉ-ｔａｇ、又はそのＮ末側断片、Ｃ末側断片、及びＮ末-Ｃ末側結合断片から選択されたいずれか１種のＳｉ-ｔａｇ断片が化学的に結合されており、かつ当該Ｓｉ-ｔａｇ又はその断片の側でメソポーラスシリカと結合している、酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。【選択図】図２
2018033451.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共役酵素反応に関わる複数の異種酵素のうち少なくとも酵素Ａ及び酵素Ｂがそれぞれメソポーラスシリカに固定化されている複合体であって、
前記酵素Ａ及び酵素Ｂのうち少なくとも一方の酵素にはＳｉ-ｔａｇ、又はそのＮ末側断片、Ｃ末側断片、及びＮ末-Ｃ末側結合断片から選択されたいずれか１種のＳｉ-ｔａｇ断片が化学的に結合されており、かつ当該Ｓｉ-ｔａｇ又はその断片の側でメソポーラスシリカと結合している、酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
【請求項２】
共役酵素反応が、補酵素再生系を利用する酸化還元反応であり、酵素Ａ及び酵素Ｂが、還元酵素及び脱水素酵素である、請求項１に記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
【請求項３】
補酵素再生系がＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを利用する系であって、
還元酵素がアゾ還元酵素（ＡｚｏＲ）、カルボニル還元酵素（ＣＲ）、イミン還元酵素（ＩＲ）、エノン還元酵素（ＥＲ）、アルドース還元酵素（ＡＲ）、キシロース還元酵素（ＸＲ）、ＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）から選択されたいずれか１つの酵素であり、
脱水素酵素がグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）、グルコース-６-リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、フルクトース脱水素酵素（ＦＤＨ）、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）、ギ酸脱水素酵素（ＦＤＨ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）、グリセロールリン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）、キシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ）から選択されたいずれか１つの酵素である、請求項２に記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
【請求項４】
還元酵素及び脱水素酵素の組み合せがアゾ還元酵素（ＡｚｏＲ）及びグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）であって、
ＡｚｏＲの各サブユニットにはＳｉ-ｔａｇが結合し、ＧＤＨの各サブユニットにはＳｉ-ｔａｇのＣ末側断片が結合しており、かつ当該Ｓｉ-ｔａｇ又はその断片の側でメソポーラスシリカと結合している、請求項３に記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
【請求項５】
還元酵素及び脱水素酵素の組み合せがカルボニル還元酵素（ＣＲ）及びグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）又はソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）であって、
ＣＲ、ＧＤＨ又はＳＤＨの各サブユニットにはＳｉ-ｔａｇのＣ末側断片又はＮ末側断片が結合しており、かつ当該Ｓｉ-ｔａｇの断片の側でメソポーラスシリカと結合している、請求項３に記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
【請求項６】
共役酵素反応がＡＴＰ再生系を利用する反応であり、酵素Ａ及び酵素Ｂの組み合わせが、ＡＴＰ要求性酵素及びキナーゼであって、
ＡＴＰ要求性酵素が、リガーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、キナーゼ、ルシフェラーゼから選択されたいずれか１つの酵素であり、
キナーゼが、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、酢酸キナーゼ（ＡＫ）、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）から選択されたいずれか１つの酵素である、請求項１に記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
【請求項７】
共役酵素反応がカスケード反応であり、酵素Ａ及び酵素Ｂの組み合わせが、以下の（ａ）〜（ｉ）から選択されたいずれか一組の組合せである、請求項１に記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体；
（ａ）ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）と乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、
（ｂ）アルドース還元酵素（ＡＲ）とソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）、
（ｃ）グリセロールキナーゼ（ＧＫ）とグリセロールリン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）、
（ｄ）ピルビン酸脱炭酸酵素とアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）、
（ｅ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）とリンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）、
（ｆ）キシロース還元酵素（ＸＲ）とキシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ）、
（ｇ）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）とピルビン酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼから選択されたいずれか１つの酸化酵素、
（ｈ）グルタミナーゼとグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、
（ｉ）グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）とγ-アミノブチルアルデヒド脱水素酵素（ＡＢＡＬＤＨ）、及び
（ｊ）グルコースオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グルタミン酸オキシダーゼから選択されたいずれか１つの酸化酵素とペルオキシダーゼ及びカタラーゼから選択されたいずれか１つのヒドロペルオキシダーゼ。
【請求項８】
Ｓｉ-ｔａｇが、配列番号１に示されるアミノ酸配列又はその１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質であり、
Ｓｉ-ｔａｇのＮ末側断片が、配列番号２に示されるアミノ酸配列又はその１〜６個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質であり、
Ｓｉ-ｔａｇのＣ末側断片が、配列番号３に示されるアミノ酸配列又はその１〜７個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質であり、
Ｓｉ-ｔａｇのＮ末-Ｃ末側結合断片が、配列番号４に示されるアミノ酸配列又はその１〜１３個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質である、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
【請求項９】
酵素Ａ及び酵素Ｂのうち少なくとも一方の酵素が複数のサブユニットからなる酵素であり、各サブユニットの全てにＳｉ-ｔａｇ又はそのＮ末側断片、Ｃ末側断片、及びＮ末-Ｃ末側結合断片から選択されたいずれか１種のＳｉ-ｔａｇ断片が化学的に結合されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
【請求項１０】
メソポーラスシリカが、中心細孔直径２〜５０ｎｍのメソポーラスシリカである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
【請求項１１】
メソポーラスシリカが、「ＦＳＭ」「ＳＢＡ」、「ＭＣＭ」及び「Ｃ-ｍｅｓｏ」から選択されたいずれか１種のメソポーラスシリカである、請求項１０に記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
【請求項１２】
共役酵素反応に関わる複数の異種酵素のうち酵素Ａ及び酵素Ｂのそれぞれがメソポーラスシリカに固定化された酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体を製造する方法であって、下記（１）〜（３）の工程を含む方法；
（１）酵素Ａ及び酵素Ｂそれぞれに、Ｓｉ-ｔａｇ、又はそのＮ末側断片、Ｃ末側断片、及びＮ末-Ｃ末側結合断片から選択されたいずれか１種のＳｉ-ｔａｇ断片を、化学的に結合する工程、
（２）（１）で得られた酵素Ａ−Ｓｉ-ｔａｇ又はその断片の融合体、及び酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ又はその断片の融合体のそれぞれを、０．５〜１．０Ｍの塩濃度でかつ０．５〜１．０％の濃度の界面活性剤を含有し、ｐＨ８〜１０に調整した緩衝液中でＳｉ-ｔａｇ又はその断片の側でメソポーラスシリカに固定化する工程、
（３）固定化終了後、０．５〜１．０Ｍの塩濃度でかつ０．５〜１．０％の濃度の界面活性剤を含有し、ｐＨ８〜１０に調整した緩衝液で複数回洗浄し、酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体を得る工程。
【請求項１３】
共役酵素反応に関わる複数の異種酵素のうち酵素Ａ及び酵素Ｂのそれぞれがメソポーラスシリカに固定化された酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体を用いた共役酵素反応方法であって、下記（１）〜（３）の工程を含む方法；
（１）酵素Ａ及び酵素Ｂのうちの少なくとも一方の酵素に、Ｓｉ-ｔａｇ、又はそのＮ末側断片、Ｃ末側断片、及びＮ末-Ｃ末側結合断片から選択されたいずれか１種のＳｉ-ｔａｇ断片を、化学的に結合する工程、
（２）（１）で得られた酵素Ａ−Ｓｉ-ｔａｇもしくはその断片の融合体、及び／又は酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇもしくはその断片の融合体をＳｉ-ｔａｇ又はその断片の側でメソポーラスシリカに固定化する工程、
（３）（２）で得られた酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体を、酵素Ａ及び／又は酵素Ｂの基質を含む緩衝液内に添加して懸濁させ、酵素Ａ及び酵素Ｂが関わる共役的な酵素反応を行う工程。
【請求項１４】
共役酵素反応方法が、反応基質から有用物質を製造する方法である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
共役酵素反応方法が、環境中に存在する反応基質となる環境汚染物質を分解する方法である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
共役酵素反応方法が、被検試料中に存在するか又は存在する可能性のある反応基質を検出又は定量する方法である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体を含むことを特徴とする、酵素Ａ及び酵素Ｂが関わる共役酵素反応用キット、センサー又は装置。
【請求項１８】
共役酵素反応用キット、センサー又は装置が、反応基質から有用物質を製造するためのものであることを特徴とする、請求項１７に記載のキット、センサー又は装置。
【請求項１９】
カルボニル還元酵素（ＣＲ）と脱水素酵素との共役酵素反応を利用した光学活性アルコールを製造するためのキット又はバイオリアクターである、請求項１８に記載のキット、センサー又は装置。
【請求項２０】
共役酵素反応用キット、センサー又は装置が、被検試料中に存在する可能性のある反応基質又は共役酵素反応後の産物を検出又は定量するためのものであることを特徴とする、請求項１７に記載のキット、センサー又は装置。
【請求項２１】
グルコースオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ又はグルタミン酸オキシダーゼとペルオキシダーゼとの共役酵素反応を利用した被検試料中のグルコース、ピルビン酸、乳酸、コレステロール、又はグルタミン酸を検出又は定量するための測定キットである、請求項２０に記載のキット、センサー又は装置。
【請求項２２】
グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、フルクトース脱水素酵素（ＦＤＨ）、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）、ギ酸脱水素酵素（ＦＤＨ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）、グリセロールリン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）又はキシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ）とＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）との補酵素再生系の共役酵素反応を利用した、被検試料中のグルコース、グルコース−６−リン酸、フルクトース、アルコール、ギ酸、乳酸、ソルビトール、グリセロールリン酸、リンゴ酸又はキシリトールを検出又は定量するための測定キットである、請求項２０に記載のキット、センサー又は装置。
【請求項２３】
ソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）とＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）との補酵素再生系の共役酵素反応を利用した、被検試料中のソルビトールを検出又は定量するための測定キットである、請求項２２に記載のキット、センサー又は装置。
【請求項２４】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）とリンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）とのカスケード反応を利用して、被検試料中の二酸化炭素濃度を測定するための測定キットである、請求項２０に記載のキット、センサー又は装置。
【請求項２５】
共役酵素反応用キット又は装置が、環境中に存在する反応基質となる環境汚染物質を分解するためのものであることを特徴とする、請求項１７に記載のキット、センサー又は装置。
【請求項２６】
アゾ還元酵素（ＡｚｏＲ）とグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）とのＮＡＤ又はＮＡＤＨ補酵素再生系を利用した、環境中の難分解性化学染料分解のための装置である、請求項２５に記載のキット、センサー又は装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シリカ結合タンパク質（Ｓｉ-ｔａｇ）を介したタンパク質固定化方法を利用する複数の異種酵素による共役酵素反応（同時にもしくは順次に共役して行われる酵素反応）の促進技術に関する。更に詳しくは、２種類以上の異種酵素とメソポーラスシリカ（シリカ系ナノ空孔材料）とを複合体化する際に、少なくとも１種の酵素をＳｉ-ｔａｇ又はその断片に融合することによる、酵素反応効率が高く、安定性の高い複合体の形成方法、及び当該複合体を用いた高効率かつ持続的な共役酵素反応技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体触媒である酵素を利用した低環境負荷型の物質変換プロセスとして、生成物と酵素の分離、酵素の再利用等に向けた様々な固定化支持体の研究・開発が国内外で精力的に進められている。また、固定化酵素を利用した反応系は、医薬品等の機能性化学品の高効率生産の他、バイオセンサーやバイオ燃料電池等への利用法が提案されている（非特許文献１）。
【０００３】
従来の固定化酵素に関する基礎研究では主に１種類の酵素が使用されてきたが、近年、２種類以上の酵素を用いた複雑な反応経路、すなわち、生体模倣反応を利用した反応システムの構築が、バイオ技術分野における触媒反応等の化学反応プロセスへの応用に期待されている（非特許文献２、３、４）。
しかし、複数の酵素を同時に利用する場合、酵素間の凝集体形成により酵素が失活し、反応が阻害されることが多い。
【０００４】
そこで、真の生体模倣反応を実現するための技術的ブレーク・スルーとして、本発明者らは、シリカ系ナノ空孔材料（メソポーラスシリカ）の規則性細孔の内部に酵素やタンパク質を格納することで複数の異種酵素・タンパク質の高次構造を安定に保持した状態で高密度に配列化することによって、多段階反応の効率化を図る手法を開発している（特許文献１、非特許文献５、６）。しかし、反応率の向上は大きな課題であり、繰り返し耐久性（再利用性）の改善は未だ達成できていない。
本発明者らは、最近本手法を、巨大なサブユニット構造を有するグルコースオキシダーゼ（二量体、分子量：約１９０ｋＤａ）とカタラーゼ（四量体、分子量：約２４０ｋＤａ）とのグルコースの酸化反応に適用したところ、カタラーゼによる中間副反応物（過酸化水素）の分解効率が高まったことが見いだされ、共役酵素反応における異種酵素の集積効果は確認できた（非特許文献７）。しかし、グルコースオキシダーゼによる最終目的物であるグルコノラクトンの生産収率は、未固定の遊離酵素と比較すると極めて低いものであった。このように、特に巨大なサブユニット構造又は多量体構造をとる２種以上の異種の酵素又はタンパク質の場合、メソポーラスシリカの細孔内部に高密度に安定的に配列化して複数の協調的な共役酵素反応を同時に起こさせることは実用的なレベルに達するまでには至っていない。
【０００５】
一方、異種酵素利用における共役酵素反応の一つに補酵素（酵素駆動のエネルギー源）の再生系が挙げられ、例えば、カルボニル還元酵素とグルコース脱水素酵素の組み合わせによる光学活性アルコール合成の高効率化の可能性が示唆されている（非特許文献８）。
この補酵素再生系は、医農薬中間体などの高付加価値化学品の高生産プロセスへの応用が検討されているが、酵素の安定性や再利用性、また、補酵素の再生率に課題が残されており、実用化に至っていない。
【０００６】
したがって、複数の異種酵素を用いた共役酵素反応において、異種酵素間の凝集を防止して、固定化支持体に固定化した状態の酵素の活性低下を極力抑制し、高効率で安定的に共役酵素反応を行わせることができること、さらには反応中であっても固定化支持体からの酵素の脱離を抑制し、繰り返し利用できるような、異種酵素の集積反応場の開発・提供が強く要請されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第５１６４０３９号公報
【特許文献２】特許第５１８６６８９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Carlsson, N., et al., Adv. Colloid Interface Sci. 205, 339-360（2014）
【非特許文献２】戸田敬志ら、多孔質シリカ粒子上への酵素集積化とバイオプロセスへの応用、第６４回日本生物工学会大会講演要旨集（２０１２年１０月２４日）
【非特許文献３】Fu, J., et al., J. Am. Chem. Soc. 134, 5516-5519（2012）
【非特許文献４】Ngo, T. A., et al., J. Am. Chem. Soc. 138, 3012-3021（2016）
【非特許文献５】Matsuura, S., et al., Bioconjugate Chem. 19, 10-14（2008）
【非特許文献６】Matsuura, S., et al., Chem. Commun. 46, 2941-2943（2010）
【非特許文献７】松浦俊一ら、メソポーラス材料を足場とした異種酵素の集積反応場の構築、第６６回日本生物工学会大会講演要旨集（２０１４年９月９日）
【非特許文献８】Zhou, X., et al., Process Biochem. 50, 1807-1813（2015）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、本発明者らが以前に開発したメソポーラスシリカ（シリカ系ナノ空孔材料）へ複数の異種酵素・タンパク質を複合化させる手法（特許文献１、非特許文献５、６、７）を改良して、メソポーラスシリカの細孔内へ共役酵素反応に関わる複数の異種酵素（酵素Ａ及び酵素Ｂとも称する。なお、「酵素Ａ」及び「酵素Ｂ」には特別な意味はなく、両者が異種酵素であることと共に、本発明の対象の共役酵素反応に関与する２種以上の異種酵素のうちの主要な酵素であることを示す用語として用いている。例えば還元酵素および脱水素酵素。）を安定に配置・集積化し、酵素機能を連動して発現させ共役酵素反応を起こさせることによって、高度な生体模倣反応による新しい反応場・化学反応システムを提供するものである。
具体的には、複数の異種酵素である酵素Ａ及び酵素Ｂ（例えばアゾ還元酵素とグルコース脱水素酵素）と、メソポーラスシリカとの複合体を用いた共役酵素反応において、共役酵素反応環境を整えることで、共役酵素反応中に双方の酵素と相互作用する各種反応基質（例えばメチルレッドおよびグルコース）および補酵素（例えば還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及び酸化型ＮＡＤ（Ｐ）＋）に影響を与えることなく、異種酵素の非特異的相互作用による凝集体形成等に起因する酵素の活性低下を極力抑制し、かつ高い反応効率を達成できる共役酵素反応システムを提供することにある。あわせて、当該共役酵素反応システムに用いるための改良された異種酵素−メソポーラスシリカ複合体の製造方法も提供する。
また、さらに、酵素周辺における反応基質濃度の至適化を極限まで高めた共役酵素反応技術を提供すること、そして高効率かつ持続的な酵素反応場を実現し、かつより効率的に酵素の繰り返し再利用を行わせるための技術を提供することも本発明の目的とする。
【００１０】
また、還元酵素を用いるものではないが、脱炭酸酵素と脱水素酵素を組み合わせた共役酵素反応系として、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素によるカスケード反応は、将来的には、微生物のアルコール発酵を模倣したカスケード反応によるアルコール製造への利用が期待できる。さらに、酵素反応プロセスによる有用物質生産に用いるものではないが、カルボキシル化反応を触媒する酵素であるカルボキシラーゼと脱水素酵素を組み合わせた共役酵素反応系は、血液成分中の二酸化炭素濃度を高感度に測定する反応として有用である。
しかし、前記の脱炭酸酵素及びカルボキシラーゼは、生体内における機能評価については広範に研究が行われているものの、酸化還元酵素と比較すると、産業利用に向けた研究開発例は極めて少ない。
そのため、高効率の物質生産や成分測定キット、バイオセンサー等としての利用に向けた、脱炭酸酵素及びカルボキシラーゼの実行可能性の評価は重要であると考えられる。
そこで、異種酵素を用いるものではないが、反応基質の脱炭酸反応とカルボキシル化反応の双方の触媒能を有し、単独酵素でありながら脱炭酸酵素及びカルボキシラーゼ両者のモデル酵素として、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）に着目し、メソポーラスシリカの規則性細孔を利用したＧＡＤの反応性及び再利用性の向上技術の開発に取り組んだ。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、以前開発した異種タンパク質とメソポーラスシリカとの複合体の製造方法（特許文献１、非特許文献５、６、７）の手法を共役酵素反応に関わる複数の異種酵素に適用し、メソポーラスシリカの細孔内部に近接した状態に固定化し、異種酵素同士の共役酵素反応を効率的に起こさせることを想起した。
しかし、一般に有用な共役酵素反応に関わる異種酵素は、巨大なサブユニット構造又は多量体構造をとっているため、それぞれのサイズが大きく、異種酵素を細孔内に近接した状態に固定化することには困難が予想された。実際に共役的なカスケード反応によりグルコノラクトンを合成する多量体のグルコースオキシダーゼとカタラーゼを順次細孔へ固定化させた非特許文献７では、両酵素の集積化には成功し中間副反応物（過酸化水素）の分解効率は向上できたものの、最終目的物（グルコノラクトン）の生産収率は遊離酵素の場合よりも低い結果となっていた。
【００１２】
そこで、本発明者らは、巨大なサブユニット構造をとる異種酵素であってもメソポーラスシリカの細孔内部に立体構造を安定に保持した状態で固定化するための固定化手段を種々検討する中で、本発明者らが以前に開発したシリカ結合タンパク質（Ｓｉ-ｔａｇ）を介したタンパク質の固定化方法（特許文献２、非特許文献２）を活用することを思いついた。
具体的には、本発明者らが以前に開発したシリカ結合タンパク質（Ｓｉ-ｔａｇ）を介したタンパク質の固定化方法（特許文献２、非特許文献２）を、典型的な補酵素再生系を利用する共役酵素反応である難分解性化学染料（アゾ染料：メチルレッド）の分解反応に適用することを試みた。アゾ染料の分解には、物質変換反応を触媒するアゾ還元酵素（ＡｚｏＲ）と本酵素を持続的に駆動させるための補酵素（酵素のエネルギー源）の再生を担うグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）との組み合わせによる異種酵素の集積反応場を構築し、高効率かつ持続的な分解反応を起こさせることが必要となる。すなわち、メソポーラスシリカの細孔内部に二量体のＡｚｏＲと四量体のＧＤＨとを立体構造を保持したまま近接した状態で安定的に固定化することで、ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−メソポーラスシリカ複合体を形成させなくてはならない。
当該物質変換反応のみならず、本発明が対象とする共役酵素反応に関与する異種酵素は、サブユニット構造などで多量体化したバルキーな酵素が多いので、前記四量体のＧＤＨがメソポーラスシリカ細孔内のＡｚｏＲと近接した位置に高次構造を保持したまま安定かつ高密度に固定化できるか否かを検討することは、他の共役酵素反応に関与する異種酵素の安定な固定化の優れたモデルとなると考えられる。
【００１３】
本発明者らは、以前にピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）及び乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をＳｉ-ｔａｇを介して多孔質シリカ粒子（多孔状球状シリカゲル充填剤）上に固定化し、２段階の酵素反応を連続して起こさせることに成功している（非特許文献２）。その際、Ｓｉ-ｔａｇ融合ＬＤＨについては、未固定の状態と比較したところ、固定化に伴う活性低下がみられず、連続反応での反応効率も、別々に固定化した粒子を混合した場合と比較すると高い反応効率を示した。これは、両酵素同士が空間的に集積化・近接化できたことで、生成物／基質の受け渡しがスムーズに起こったものと考えられるので、本発明のメソポーラスシリカ細孔内においても、両酵素が固定化できれば、同様に共役する酵素反応の効率化が期待できる。
しかしながら、非特許文献２で用いた多孔状球状シリカゲル充填剤は、同図１（Nucleosil 500-5（平均細孔径：５０ｎｍ））に示されるように細孔径が制御されておらず、細孔径の分布がブロードであるのに対して、本発明者らの開発したメソポーラスシリカは中心細孔直径が典型的には１０ｎｍ以下という微細な細孔が規則的に形成されたシリカ粒子である。Ｓｉ-ｔａｇはおよそ３０ｋＤａの分子量を有する上に、サブユニット構造を有する多量体の酵素（ＡｚｏＲ：二量体、又はＧＤＨ：四量体）の場合、各サブユニットにＳｉ-ｔａｇを融合した多量体酵素−Ｓｉ-ｔａｇ複合体は本来の酵素の分子サイズより遙かに大きくなる。このような背景から、複数のＳｉ-ｔａｇ複合体化した共役酵素反応を担う異種酵素同士が、メソポーラスシリカの微細な規則性細孔の内部で、相互作用を行えるように高次構造を安定に保持した状態での高密度の格納には、かなりの困難性を伴うことが予想された。
【００１４】
本発明者らが最初にモデル的な共役酵素反応として選択した、ＡｚｏＲ酵素とＧＤＨ酵素との補酵素再生系反応においては、とりわけ四量体のＧＤＨの場合が、各サブユニットのそれぞれにＳｉ-ｔａｇが付加されると、極めてバルキーな三次、四次構造となるため、その高次構造を保ったままでの細孔内への固定化自体が難しいと考えた。
そこで、本発明者らは、両酵素のＳｉ-ｔａｇ融合体を用いるのではなく、ＡｚｏＲのみをＳｉ-ｔａｇに融合させたＳｉ-ｔａｇ融合ＡｚｏＲを、未融合のＧＤＨと共にメソポーラスシリカに固定化処理を行いＡｚｏＲ−ＧＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体を形成させてメチルレッドの分解反応に供してみた。その結果、両酵素を遊離状態で反応させた場合と比較しても、脱色率（分解効率）が飛躍的に高いという驚くべき結果が得られた。これは、異種酵素のうちの一方のＡｚｏＲだけでもＳｉ-ｔａｇを介してメソポーラスシリカ細孔内に結合できたことで、ＡｚｏＲとＧＤＨとの凝集失活が抑制されたことによるものと考えられる。しかし、当該酵素複合体の再利用性は確保できなかったことから、Ｓｉ-ｔａｇ未融合のＧＤＨがメソポーラスシリカの細孔表面から脱離してしまったことが考えられた。
【００１５】
四量体で酵素サイズが大きいＧＤＨの場合は、全長Ｓｉ-ｔａｇではなく、シリカ結合性ドメインを含むＮ末側又はＣ末側断片との融合を検討することにした。従来、Ｎ末側及びＣ末側ドメインがＳｉ-ｔａｇのシリカ結合性ドメインであり、両ドメインに対応するＮ末側又はＣ末側断片であってもシリカ表面への結合性を有していることは知られていたが、全長Ｓｉ-ｔａｇと比較した場合に融合させたタンパク質の結合性がきわめて低いという結果も得られていた（特許文献２）。したがって、大きな期待はできなかったものの、全長Ｓｉ-ｔａｇよりも格段にサイズが小さいという利点を生かせる可能性に賭けて、Ｓｉ-ｔａｇのＣ末側断片を融合させた場合を念のため試してみることにした。
具体的には、Ｓｉ-ｔａｇ融合ＡｚｏＲと共に、Ｓｉ-ｔａｇのＣ末端側（２０３〜２７３位）断片を融合したＧＤＨをメソポーラスシリカに固定化して、Ｓｉ-ｔａｇ融合ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１融合ＧＤＨ−メソポーラスシリカ複合体を形成させた（なお、単に、ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体と表記することもある。）。
そして、当該複合体を用いてメチルレッドの分解反応を行ったところ、驚くべきことに、Ｓｉ-ｔａｇ融合ＡｚｏＲと未融合のＧＤＨを用いた前記の結果よりもさらに高い分解効率が達成できたばかりか、繰り返し使用しても酵素活性の低下が抑えられ、再利用性の向上にも成功した。このことは、当該酵素複合体の場合は、Ｓｉ-ｔａｇ融合ＡｚｏＲと同様Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１融合ＧＤＨについても、メソポーラスシリカの細孔表面からの脱離がほとんど起こらないと解される。
【００１６】
一方、Ｓｉ-ｔａｇを介したタンパク質の一般的な固定化方法（特許文献２）では、塩と界面活性剤の添加によりシリカに対するタンパク質の結合能が向上できることが知られているが、本発明のような酵素反応系においては、高塩濃度条件下では、しばしば酵素活性が低下する場合が一般的であるため、上述の異種酵素の固定化および洗浄時には塩や界面活性剤を添加することを控えて行った。
【００１７】
次いで、本発明者らは各酵素のメソポーラスシリカへの固定化条件を変えることで固定化率の向上効果と酵素反応効率の向上効果の両方が得られる可能性を検討することとした。まず積極的に塩（塩化ナトリウム）と界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）を含んだ緩衝液を用いて、Ｓｉ-ｔａｇ融合ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１融合ＧＤＨ−メソポーラスシリカ複合体を確実に形成させた後に、当該複合体を含む系から塩及び界面活性剤をほぼ完全に除去した。その後、系にグルコースとメチルレッドを加えてメチルレッド分解反応を行ったところ、驚くべきことに、酵素の反応速度が飛躍的に向上し、さらに、再利用性も一段と高まる、という実験結果を得ることができた。
【００１８】
あわせて、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）についても、Ｓｉ-ｔａｇのＮ末端側（１〜６０位）断片を融合し本発明のメソポーラスシリカの規則性細孔に固定化した、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０融合ＧＡＤ−メソポーラスシリカ複合体を利用することで、反応性の大幅な向上と共に再利用性の飛躍的な向上を達成できた。
以上の知見を得たことで、本発明を完成することができた。
さらに、異種酵素の組み合わせとして、カルボニル還元酵素（ＲＣＲ）及びソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）の組み合わせ、並びにＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）及びソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）の組み合わせに適用した場合においても、Ｓｉ-ｔａｇ又はその断片を介したメソポーラスシリカ複合体を用いて共役酵素反応を起こさせたところ、同様の反応性増強及び再利用性向上効果を確認できた。
【００１９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕  共役酵素反応に関わる複数の異種酵素のうち少なくとも酵素Ａ及び酵素Ｂがそれぞれメソポーラスシリカに固定化されている複合体であって、
前記酵素Ａ及び酵素Ｂのうち少なくとも一方の酵素にはＳｉ-ｔａｇ、又はそのＮ末側断片、Ｃ末側断片、及びＮ末-Ｃ末側結合断片から選択されたいずれか１種のＳｉ-ｔａｇ断片が化学的に結合されており、かつ当該Ｓｉ-ｔａｇ又はその断片の側でメソポーラスシリカと結合している、酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
〔２〕  共役酵素反応が、補酵素再生系を利用する酸化還元反応であり、酵素Ａ及び酵素Ｂが、還元酵素及び脱水素酵素である、前記〔１〕に記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
〔３〕  補酵素再生系がＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを利用する系であって、
還元酵素がアゾ還元酵素（ＡｚｏＲ）、カルボニル還元酵素（ＣＲ）、イミン還元酵素（ＩＲ）、エノン還元酵素（ＥＲ）、アルドース還元酵素（ＡＲ）、キシロース還元酵素（ＸＲ）、ＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）から選択されたいずれか１つの酵素であり、
脱水素酵素がグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）、グルコース-６-リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、フルクトース脱水素酵素（ＦＤＨ）、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）、ギ酸脱水素酵素（ＦＤＨ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）、グリセロールリン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）、キシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ）から選択されたいずれか１つの酵素である、前記〔２〕に記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
〔４〕  還元酵素及び脱水素酵素の組み合せがアゾ還元酵素（ＡｚｏＲ）及びグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）であって、
ＡｚｏＲの各サブユニットにはＳｉ-ｔａｇが結合し、ＧＤＨの各サブユニットにはＳｉ-ｔａｇのＣ末側断片が結合しており、かつ当該Ｓｉ-ｔａｇ又はその断片の側でメソポーラスシリカと結合している、前記〔３〕に記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
〔５〕  還元酵素及び脱水素酵素の組み合せがカルボニル還元酵素（ＣＲ）及びグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）又はソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）であって、
ＣＲ、ＧＤＨ又はＳＤＨの各サブユニットにはＳｉ-ｔａｇのＣ末側断片又はＮ末側断片が結合しており、かつ当該Ｓｉ-ｔａｇの断片の側でメソポーラスシリカと結合している、前記〔３〕に記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
〔６〕  共役酵素反応がＡＴＰ再生系を利用する反応であり、酵素Ａ及び酵素Ｂの組み合わせが、ＡＴＰ要求性酵素及びキナーゼであって、
ＡＴＰ要求性酵素が、リガーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、キナーゼ、ルシフェラーゼから選択されたいずれか１つの酵素であり、
キナーゼが、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、酢酸キナーゼ（ＡＫ）、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）から選択されたいずれか１つの酵素である、前記〔１〕に記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
〔７〕  共役酵素反応がカスケード反応であり、酵素Ａ及び酵素Ｂの組み合わせが、以下の（ａ）〜（ｉ）から選択されたいずれか一組の組合せである、前記〔１〕に記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体；
（ａ）ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）と乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、
（ｂ）アルドース還元酵素（ＡＲ）とソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）、
（ｃ）グリセロールキナーゼ（ＧＫ）とグリセロールリン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）、
（ｄ）ピルビン酸脱炭酸酵素とアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）、
（ｅ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）とリンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）、
（ｆ）キシロース還元酵素（ＸＲ）とキシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ）、
（ｇ）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）とピルビン酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼから選択されたいずれか１つの酸化酵素、
（ｈ）グルタミナーゼとグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、
（ｉ）グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）とγ-アミノブチルアルデヒド脱水素酵素（ＡＢＡＬＤＨ）、及び
（ｊ）グルコースオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グルタミン酸オキシダーゼから選択されたいずれか１つの酸化酵素とペルオキシダーゼ及びカタラーゼから選択されたいずれか１つのヒドロペルオキシダーゼ。
〔８〕  Ｓｉ-ｔａｇが、配列番号１に示されるアミノ酸配列又はその１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質であり、
Ｓｉ-ｔａｇのＮ末側断片が、配列番号２に示されるアミノ酸配列又はその１〜６個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質であり、
Ｓｉ-ｔａｇのＣ末側断片が、配列番号３に示されるアミノ酸配列又はその１〜７個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質であり、
Ｓｉ-ｔａｇのＮ末-Ｃ末側結合断片が、配列番号４に示されるアミノ酸配列又はその１〜１３個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質である、
前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
〔９〕  酵素Ａ及び酵素Ｂのうち少なくとも一方の酵素が複数のサブユニットからなる酵素であり、各サブユニットの全てにＳｉ-ｔａｇ又はそのＮ末側断片、Ｃ末側断片、及びＮ末-Ｃ末側結合断片から選択されたいずれか１種のＳｉ-ｔａｇ断片が化学的に結合されている、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
〔１０〕  メソポーラスシリカが、中心細孔直径２〜５０ｎｍのメソポーラスシリカである、前記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
〔１１〕  メソポーラスシリカが、「ＦＳＭ」「ＳＢＡ」、「ＭＣＭ」及び「Ｃ-ｍｅｓｏ」から選択されたいずれか１種のメソポーラスシリカである、前記〔１０〕に記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体。
〔１２〕  共役酵素反応に関わる複数の異種酵素のうち酵素Ａ及び酵素Ｂのそれぞれがメソポーラスシリカに固定化された酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体を製造する方法であって、下記（１）〜（３）の工程を含む方法；
（１）酵素Ａ及び酵素Ｂそれぞれに、Ｓｉ-ｔａｇ、又はそのＮ末側断片、Ｃ末側断片、及びＮ末-Ｃ末側結合断片から選択されたいずれか１種のＳｉ-ｔａｇ断片を、化学的に結合する工程、
（２）（１）で得られた酵素Ａ−Ｓｉ-ｔａｇ又はその断片の融合体、及び酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ又はその断片の融合体のそれぞれを、０．５〜１．０Ｍの塩濃度でかつ０．５〜１．０％の濃度の界面活性剤を含有し、ｐＨ８〜１０に調整した緩衝液中でＳｉ-ｔａｇ又はその断片の側でメソポーラスシリカに固定化する工程、
（３）固定化終了後、０．５〜１．０Ｍの塩濃度でかつ０．５〜１．０％の濃度の界面活性剤を含有し、ｐＨ８〜１０に調整した緩衝液で複数回洗浄し、酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体を得る工程。
〔１３〕  共役酵素反応に関わる複数の異種酵素のうち酵素Ａ及び酵素Ｂのそれぞれがメソポーラスシリカに固定化された酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体を用いた共役酵素反応方法であって、下記（１）〜（３）の工程を含む方法；
（１）酵素Ａ及び酵素Ｂのうちの少なくとも一方の酵素に、Ｓｉ-ｔａｇ、又はそのＮ末側断片、Ｃ末側断片、及びＮ末-Ｃ末側結合断片から選択されたいずれか１種のＳｉ-ｔａｇ断片を、化学的に結合する工程、
（２）（１）で得られた酵素Ａ−Ｓｉ-ｔａｇもしくはその断片の融合体、及び／又は酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇもしくはその断片の融合体をＳｉ-ｔａｇ又はその断片の側でメソポーラスシリカに固定化する工程、
（３）（２）で得られた酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体を、酵素Ａ及び／又は酵素Ｂの基質を含む緩衝液内に添加して懸濁させ、酵素Ａ及び酵素Ｂが関わる共役的な酵素反応を行う工程。
〔１４〕  共役酵素反応方法が、反応基質から有用物質を製造する方法である、前記〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕  共役酵素反応方法が、環境中に存在する反応基質となる環境汚染物質を分解する方法である、前記〔１３〕に記載の方法。
〔１６〕  共役酵素反応方法が、被検試料中に存在するか又は存在する可能性のある反応基質を検出又は定量する方法である、前記〔１３〕に記載の方法。
〔１７〕  前記〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体を含むことを特徴とする、酵素Ａ及び酵素Ｂが関わる共役酵素反応用キット、センサー又は装置。
〔１８〕  共役酵素反応用キット、センサー又は装置が、反応基質から有用物質を製造するためのものであることを特徴とする、前記〔１７〕に記載のキット、センサー又は装置。
〔１９〕  カルボニル還元酵素（ＣＲ）と脱水素酵素との共役酵素反応を利用した光学活性アルコールを製造するためのキット又はバイオリアクターである、前記〔１８〕に記載のキット、センサー又は装置。
〔２０〕  共役酵素反応用キット、センサー又は装置が、被検試料中に存在する可能性のある反応基質又は共役酵素反応後の産物を検出又は定量するためのものであることを特徴とする、前記〔１７〕に記載のキット、センサー又は装置。
〔２１〕  グルコースオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ又はグルタミン酸オキシダーゼとペルオキシダーゼとの共役酵素反応を利用した被検試料中のグルコース、ピルビン酸、乳酸、コレステロール、又はグルタミン酸を検出又は定量するための測定キットである、前記〔２０〕に記載のキット、センサー又は装置。
〔２２〕  グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、フルクトース脱水素酵素（ＦＤＨ）、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）、ギ酸脱水素酵素（ＦＤＨ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）、グリセロールリン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）又はキシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ）とＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）との補酵素再生系の共役酵素反応を利用した、被検試料中のグルコース、グルコース−６−リン酸、フルクトース、アルコール、ギ酸、乳酸、ソルビトール、グリセロールリン酸、リンゴ酸又はキシリトールを検出又は定量するための測定キットである、前記〔２０〕に記載のキット、センサー又は装置。
〔２３〕  ソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）とＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）との補酵素再生系の共役酵素反応を利用した、被検試料中のソルビトールを検出又は定量するための測定キットである、前記〔２２〕に記載のキット、センサー又は装置。
〔２４〕  ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）とリンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）とのカスケード反応を利用して、被検試料中の二酸化炭素濃度を測定するための測定キットである、前記〔２０〕に記載のキット、センサー又は装置。
〔２５〕  共役酵素反応用キット又は装置が、環境中に存在する反応基質となる環境汚染物質を分解するためのものであることを特徴とする、前記〔１７〕に記載のキット、センサー又は装置。
〔２６〕  アゾ還元酵素（ＡｚｏＲ）とグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）とのＮＡＤ又はＮＡＤＨ補酵素再生系を利用した、環境中の難分解性化学染料分解のための装置である、前記〔２５〕に記載のキット、センサー又は装置。
【発明の効果】
【００２０】
本発明では、補酵素再生系などのエネルギー供給系を利用した複数の異種酵素が関わる協調的な共役酵素反応において、各異種酵素が多量体を形成する分子量の大きな酵素同士であっても、少なくとも１種の酵素をＳｉ-ｔａｇ（又はそのＮ末もしくはＣ末側断片）を介してメソポーラスシリカに固定化することにより、メソポーラスシリカの細孔内に安定して近接した状態に固定化できる技術を提供できた。そのことにより、複数の異種酵素が関わる酵素反応全体を極めて効率的に行うことができる。さらに、２種以上の酵素のいずれもＳｉ-ｔａｇ（又はそのＮ末もしくはＣ末側断片）を介して固定化することで、得られたＳｉ-ｔａｇ融合異種酵素とメソポーラスシリカとの複合体は安定性がさらに高まり繰り返し使用できるため、極めて経済的で実用性の高い技術が提供できた。
【００２１】
本発明により、アゾ染料のような難分解性化学染料を高い反応効率で持続的に分解可能な共役酵素反応場を提供できた。すなわち、持続的使用可能な難分解性化学染料分解用キットなど、各種の共役酵素反応に関わる異種酵素をメソポーラスシリカに固定化した高い反応効率で持続的使用可能なキット製品が提供できる。さらに異種酵素の組み合わせを最適化することにより、光学活性アルコールなど機能性化学品等の有用物質の高効率生産に向けたバイオリアクターへの活用も期待される。メソポーラスシリカに固定化されることで、酵素の安定化と共に凝集失活の抑制効果が達成されるため、従来のバイオリアクターやキット製品と比較して極めて少ない酵素量での反応と定量が可能になるメリットが大きく、さらに再利用も可能であるため、より経済的である。
また、共役酵素反応に関わる異種酵素を利用したソルビトール検出用など各種バイオセンサーやバイオ燃料電池への適用も可能であり、反応効率の増大及び再利用性の向上が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】典型的なメソポーラスシリカ（ＳＢＡ型、ＳＢＡ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ型、ＦＳＭ型）の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）の像である。（ａ）〜（ｃ）ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：７．１ｎｍ）のＳＥＭ像、（ａ）観察倍率：２５万倍（ｂ）観察倍率：１５万倍（ｃ）観察倍率：６千倍、（ｄ）ＳＢＡ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ型メソポーラスシリカのＳＥＭ像（観察倍率：５千倍）、（ｅ）ＦＳＭ型メソポーラスシリカのＳＥＭ像（観察倍率：１千倍）。
【図２】メソポーラスシリカ（シリカ系ナノ空孔材料）の規則性細孔（シリカ細孔）に固定化したアゾ還元酵素（ＡｚｏＲ）及びグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）を備えたＡｚｏＲ−ＧＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体のうちＡｚｏＲと難分解性化学染料（アゾ染料：メチルレッド）が相互作用し、更に、ＧＤＨによる補酵素（ＮＡＤＨ）の再生系を組み込み酸化型ＮＡＤ＋から還元型ＮＡＤＨに再生することができるようになった結果、アゾ染料が高効率かつ持続的に分解される様子を模式的に示す説明図である。
【図３】ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体による補酵素再生系を利用したアゾ染料（メチルレッド）の還元分解における反応系および評価系を示す説明図である。図中、（ａ）は、異種酵素（ＡｚｏＲ及びＧＤＨ）による反応系の概略を示す図であり、また、（ｂ）は、ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−メソポーラスシリカ複合体の調製方法、メチルレッドの分解反応、固定化酵素サンプル回収及び再使用の開始までの手順を模式的に示す説明図である。
【図４】メチルレッド及びグルコースを反応基質とした、遊離の未固定の異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ融合ＡｚｏＲとＳｉ-ｔａｇ未融合ＧＤＨ）及びこれら異種酵素とシリカ粒子との複合体を用いたメチルレッドの分解反応（３０℃、６０分間）を経時的に測定し、脱色率を評価した結果である。
【図５】単一酵素（Ｓｉ-ｔａｇ融合ＡｚｏＲ）、または、異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ融合ＡｚｏＲとＳｉ-ｔａｇ未融合ＧＤＨ）における遊離の未固定酵素、また、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．０ｎｍ）、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．１ｎｍ）、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）に対して固定化した酵素による反応６０分後のメチルレッドの脱色率（反応１回目）、固定化酵素を繰り返し再利用した場合のメチルレッドの脱色率（反応２回目）、また、反応終了後にシリカ粒子からの酵素の脱離を評価した結果をまとめた表である。
【図６】大腸菌タンパク発現系により作製した３種類のＳｉ-ｔａｇ融合ＧＤＨ、また、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＧＤＨの特性を評価した結果である。
【図７】非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）に対する３種類のＳｉ-ｔａｇ融合ＧＤＨ、また、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＧＤＨの吸着能を評価した結果である。
【図８】異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ融合ＡｚｏＲとＳｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１融合ＧＤＨ）における遊離の未固定酵素、または、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．０ｎｍ）、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．１ｎｍ）、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）に対して固定化した酵素による反応６０分後のメチルレッドの脱色率（反応１回目）、また、固定化酵素を繰り返し再利用した場合のメチルレッドの脱色率（反応２回目）を評価した結果をまとめた表である。
【図９】単一酵素、または、異種酵素における遊離の未固定酵素、また、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．０ｎｍ）、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．１ｎｍ）、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）に対して固定化した酵素による反応６０分後のメチルレッドの脱色率について、図５（ａ）及び８の実験結果をまとめたグラフである。また、図中、（ａ）は、反応１回目のメチルレッドの脱色率、また、（ｂ）は、固定化酵素を繰り返し再利用した反応２回目のメチルレッドの脱色率、である。
【図１０】異種酵素における遊離の未固定酵素（Ｓｉ-ｔａｇ融合ＡｚｏＲとＳｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１融合ＧＤＨ）、また、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．０ｎｍ）、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．１ｎｍ）、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）に対して塩（０．５Ｍ  塩化ナトリウム）及び界面活性剤（０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を含んだ緩衝液を利用して固定化した酵素による反応６０分後のメチルレッドの脱色率について、図９に対して実験結果を追加したグラフである。また、図中、（ａ）は、反応１回目のメチルレッドの脱色率、また、（ｂ）は、固定化酵素を繰り返し再利用した反応２回目のメチルレッドの脱色率、である。
【図１１】シリカ粒子に対する異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ融合ＡｚｏＲとＳｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１融合ＧＤＨ）の固定化及び洗浄操作時に、塩（０．５Ｍ  塩化ナトリウム）及び界面活性剤（０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を含んだ緩衝液を利用した場合の反応６０分後のメチルレッドの脱色率について、図１０（反応１、２回目）に対してさらに反応３〜５回目の固定化酵素の繰り返し再利用の実験結果を追加し、繰り返し耐久性（再利用性）を評価した結果である。
【図１２】図１１の反応１〜３回目の実験結果について、異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ融合ＡｚｏＲとＳｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１融合ＧＤＨ）と各種シリカ粒子との複合体を用いたメチルレッドの分解反応（３０℃、６０分間）における脱色率の経時変化を示した結果である。また、図中、（ａ）は、反応１回目、（ｂ）は、反応２回目、（ｃ）は、反応３回目、また、（ｄ）は、反応３回目のメチルレッドの分解反応における各種固定化酵素の比活性の結果をまとめた表、である。
【図１３】グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤβ）−メソポーラスシリカ複合体によるグルタミン酸の脱炭酸における反応系および評価系を示す説明図である。図中、（ａ）は、ＰＬＰ依存型酵素（ＧＡＤβ）による反応系の概略を示す図であり、また、（ｂ）は、ＧＡＤβ−メソポーラスシリカ複合体の調製方法、グルタミン酸の脱炭酸反応、固定化酵素サンプル回収及び再使用の開始までの手順を模式的に示す説明図である。
【図１４】大腸菌タンパク発現系により作製した３種類のＳｉ-ｔａｇ融合ＧＡＤβ、また、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＧＡＤβのタンパク濃度及び変性タンパク状態での電気泳動像を評価した結果である。
【図１５】３種類のＳｉ-ｔａｇ融合ＧＡＤβ、また、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＧＡＤβを用いたグルタミン酸の脱炭酸反応（３７℃、６０分間）を経時的に測定し、反応基質（グルタミン酸）及び生成物（ＧＡＢＡ）のモル濃度を評価した結果である。
【図１６】非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）に対する３種類のＳｉ-ｔａｇ融合ＧＡＤβ、また、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＧＡＤβの吸着能を評価した結果である。
【図１７】ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．０ｎｍ）、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．１ｎｍ）、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）、Ｃ２２-ｍｅｓｏ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：６．１ｎｍ）に対して固定化したＳｉ-ｔａｇ未融合ＧＡＤβ、または、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０融合ＧＡＤβによる反応３０分後の生成物（ＧＡＢＡ）のモル濃度を指標として、固定化酵素の繰り返し耐久性（再利用性）を評価した結果である。
【図１８】メソポーラスシリカの規則性細孔に固定化したＲ体選択的カルボニル還元酵素（ＲＣＲ）及びソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）を備えたＲＣＲ−ＳＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体のうちＲＣＲとプロキラルカルボニル化合物（２-ＨＡＰ）が相互作用し、更に、ＳＤＨによる補酵素（ＮＡＤＨ）の再生系を組み込み酸化型ＮＡＤ＋から還元型ＮＡＤＨに再生することができるようになった結果、光学活性アルコール（（Ｒ）-１-フェニル-１，２-エタンジオール：（Ｒ）-ＰＥＤ）が高効率かつ持続的に合成される様子を模式的に示す説明図である。
【図１９】ＲＣＲ−ＳＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体による補酵素再生系を利用したプロキラルカルボニル化合物（２-ＨＡＰ）の不斉還元による光学活性アルコール（（Ｒ）-ＰＥＤ）の合成における反応系および評価系を示す説明図である。図中、（ａ）は、異種酵素（ＲＣＲ及びＳＤＨ）による反応系の概略を示す図であり、また、（ｂ）は、ＲＣＲ−ＳＤＨ−メソポーラスシリカ複合体の調製方法、（Ｒ）-ＰＥＤの合成反応、ＨＰＬＣ分析、固定化酵素サンプル回収及び再使用の開始までの手順を模式的に示す説明図である。
【図２０】大腸菌タンパク発現系により作製した２種類のＳｉ-ｔａｇ融合ＲＣＲ、また、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＲＣＲの特性を評価した結果である。
【図２１】大腸菌タンパク発現系により作製した２種類のＳｉ-ｔａｇ融合ＳＤＨ、また、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＳＤＨの特性を評価した結果である。
【図２２】ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（ＦＳＭ８．０）、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（ＳＢＡ８．１）、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）に対して固定化した単一酵素（Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０融合ＲＣＲ）、または、異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０融合ＲＣＲとＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０融合ＳＤＨ）による反応３０分後の生成物（（Ｒ）-ＰＥＤ）の生成効率（２-ＨＡＰから（Ｒ）-ＰＥＤへの転化率）を指標として、固定化酵素の活性を評価した結果である。図中、（ａ）は、単一酵素、または、異種酵素における遊離の未固定酵素、また、ＦＳＭ８．０、ＳＢＡ８．１、ＫＥ-Ｓ１００に対して固定化した酵素による反応３０分後の（Ｒ）-ＰＥＤへの転化率（反応１回目）、固定化直後の上清に含まれるＲＣＲの活性（転化率）、また、固定化直後の上清に含まれるＳＤＨの活性（Ｕ／Ｌ）を評価した結果をまとめた表である。また、（ｂ）は、反応３０分後の（Ｒ）-ＰＥＤへの転化率を指標として、固定化酵素の繰り返し耐久性（再利用性）を評価した結果である。
【図２３】ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（ＦＳＭ８．０）、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（ＳＢＡ８．１）、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）に対して固定化した単一酵素（Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＲＣＲ）、または、異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＲＣＲとＳｉ-ｔａｇ未融合ＳＤＨ）による反応３０分後の生成物（（Ｒ）-ＰＥＤ）の生成効率を指標として、固定化酵素の活性を評価した結果である。図中、（ａ）は、単一酵素、または、異種酵素における遊離の未固定酵素、また、ＦＳＭ８．０、ＳＢＡ８．１、ＫＥ-Ｓ１００に対して固定化した酵素による反応３０分後の（Ｒ）-ＰＥＤへの転化率（反応１回目）、固定化直後の上清に含まれるＲＣＲの活性（転化率）、また、固定化直後の上清に含まれるＳＤＨの活性（Ｕ／Ｌ）を評価した結果をまとめた表である。また、（ｂ）は、反応３０分後の（Ｒ）-ＰＥＤへの転化率を指標として、固定化酵素の繰り返し耐久性（再利用性）を評価した結果である。
【図２４】ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（ＦＳＭ２．６）、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（ＳＢＡ５．４および１０．６）に対して固定化したＳｉ-ｔａｇ融合異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０融合ＲＣＲとＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０融合ＳＤＨ）、または、ＦＳＭ２．６およびＳＢＡ５．４に対して固定化したＳｉ-ｔａｇ未融合異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＲＣＲとＳｉ-ｔａｇ未融合ＳＤＨ）による反応３０分後の生成物（（Ｒ）-ＰＥＤ）の生成効率（２-ＨＡＰから（Ｒ）-ＰＥＤへの転化率）を指標として、固定化酵素の活性を評価した結果である。図中、（ａ）（ｂ）は、Ｓｉ-ｔａｇ融合異種酵素、または、Ｓｉ-ｔａｇ未融合異種酵素における、各種シリカ粒子に対して固定化した酵素による反応３０分後の（Ｒ）-ＰＥＤへの転化率（反応１回目）、固定化直後の上清に含まれるＲＣＲの活性（転化率）、また、固定化直後の上清に含まれるＳＤＨの活性（Ｕ／Ｌ）を評価した結果をまとめた表である。また、（ｃ）は、反応３０分後の（Ｒ）-ＰＥＤへの転化率を指標として、固定化酵素の繰り返し耐久性（再利用性）を評価した結果である。
【図２５】図２２〜２４の繰り返し耐久性（反応１〜１０回）の評価結果について、異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ融合、または、Ｓｉ-ｔａｇ未融合）と各種シリカ粒子との複合体を用いた（Ｒ）-ＰＥＤの合成反応の結果をまとめたグラフ、である。
【図２６】Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０融合ＳＤＨ（あるいは、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＳＤＨ）−メソポーラスシリカ複合体による補酵素再生系を利用した標的物質（ソルビトール）量又は標的酵素（ＳＤＨ）活性の高感度測定における反応系を示す説明図および評価結果である。図中、（ａ）は、異種酵素（ＤＴＤ及びＳＤＨ）による反応系の概略を示す図である。また、（ｂ）は、異種酵素における遊離の未固定酵素、および、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（ＦＳＭ２．６および８．０）、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（ＳＢＡ５．４および８．１）に予め固定化・洗浄したＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０融合ＳＤＨ、または、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＳＤＨに対して、ＤＴＤを含んだ反応基質を添加した場合の反応２０分後の生成物（ホルマザン）の呈色を示した写真であり、また、（ｃ）は、（ｂ）の反応後サンプルにおけるホルマザンの吸光度を指標として、固定化酵素の反応性（反応１回目および２回目）を評価した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
１．本発明のメソポーラスシリカについて
（１−１）本発明の「メソポーラスシリカ（シリカ系ナノ空孔材料）」の種類
本発明で酵素の固定化用担体として用いる「メソポーラスシリカ（シリカ系ナノ空孔材料）」は、二酸化ケイ素（シリカ）を材質とする、均一な細孔を持つ多孔質材料であって、細孔の中心細孔直径が２〜５０ｎｍ（メソ孔：ＩＵＰＡＣ）であり、一般的には、全細孔容積が０．１〜３．０ｍＬ／ｇで、比表面積が２００〜１５００ｍ２／ｇである。メソポーラスシリカ内の細孔を規則的に形成させるための一般的合成方法には、（ａ）液晶の鋳型法と（ｂ）シート変形法の２種類あり、（ａ）では、界面活性剤をシリカ又はケイ酸ソーダと混和して縮合による自己組織化させ、焼成により界面活性剤を除去するのに対して、（ｂ）では界面活性剤を層状のカネマイト（ＮａＨＳｉ２Ｏ３・３Ｈ２Ｏ）に添加してイオン交換によりシート変形を起こさせてハニカム構造を形成させ界面活性剤を焼成除去する方法がある。（ａ）の方法で得られる典型的なものとして、「ＭＣＭ（ＭＣＭ−４１など）」、「ＳＢＡ-１５（中心細孔直径：４〜３０ｎｍ）」などがあり、（ｂ）の方法で得られる典型的なものとして、「ＦＳＭ-１６およびＦＳＭ-２２など（中心細孔直径：２〜１２ｎｍ）」などがある。両法で得られる「メソポーラスシリカ」は、いずれも通常ハニカム構造の「ヘキサゴナル」型結晶構造を有している。（ａ）の方法で得られる「ＭＣＭ」及び「ＳＢＡ」などでは、「キュービック」型の結晶構造を採ることもある（ＭＣＭ−４８、ＳＢＡ-１６など）。
「ＦＳＭ」又は「ＳＢＡ」などは、その合成過程で界面活性剤と共に膨張剤を混和して細孔径を拡大させることができるので、これら添加剤の配合量を調整することにより、所望の細孔径のメソポーラスシリカ、例えば「ＦＳＭ（中心細孔直径：５〜１２ｎｍ）」、「ＳＢＡ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１０〜３０ｎｍ）」を得ることができる。
また、「Ｃ１６-ｍｅｓｏ（中心細孔直径：２〜３ｎｍ）」又は「Ｃ２２-ｍｅｓｏ（中心細孔直径：３〜１２ｎｍ）」などの「Ｃ-ｍｅｓｏ」は、シリカ源が異なる点を除いては前記「ＦＳＭ」と同様の方法で製造できる。
本発明において用いられる「メソポーラスシリカ」は、上記いずれかの手法で合成された規則的な細孔構造を有する「メソポーラスシリカ」であり、好ましくは、「ＦＳＭ」「ＳＢＡ」、「ＭＣＭ」又は「Ｃ-ｍｅｓｏ」であり、より好ましくは「ＦＳＭ」、「ＳＢＡ」又は「Ｃ-ｍｅｓｏ」であり、特に「ＦＳＭ」又は「ＳＢＡ」のうちでも細孔径を拡大させた「ＦＳＭ（中心細孔直径：５〜１２ｎｍ）」、「ＳＢＡ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（中心細孔直径：１０〜３０ｎｍ）」や「Ｃ１６-ｍｅｓｏ（中心細孔直径：２〜３ｎｍ）」又は「Ｃ２２-ｍｅｓｏ（中心細孔直径：３〜１２ｎｍ）」が好ましい。
【００２４】
（１−２）本発明の「メソポーラスシリカ（シリカ系ナノ空孔材料）」の製造方法
本発明の「メソポーラスシリカ」は特許文献１又は非特許文献５，６等の記載の製造方法により製造することができる。
本発明の実施例では、典型的な規則的な細孔構造を有する「メソポーラスシリカ」のうち、上記（ｂ）のタイプの典型的な「ＦＳＭ」及び上記（ａ）のタイプの典型的な「ＳＢＡ」を用いたが、これらに限定されるものではない。「ＦＳＭ」は、稲垣らの方法（S. Inagaki et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., pp.680-682 (1993)）、及び、卜部らの方法（Y. Urabe et al., ChemBioChem, vol.8, pp.668-674 (2007)）を参考にして、、「ＳＢＡ」は、Ｚｈａｏらの方法（D. Zhao et al., Science, vol.279, pp.548-552 (1998)）の記載をそれぞれ参考にして合成した。「ＳＢＡ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ」は、Ｗａｎｇらの方法（N. Wang et al., Microporous Mesoporous Mater., vol.91, pp.156-160 (2006)）の記載に従って合成できる。
具体的には、「ＦＳＭ」は、カチオン性界面活性剤を鋳型として用い、層状ケイ酸塩であるカネマイトをシリカ源とした、弱アルカリ性溶液でのシリカの脱水重縮合反応を行い、焼成により界面活性剤を除去する方法により得、「ＳＢＡ」は、非イオン性界面活性剤を鋳型として用い、オルトケイ酸テトラエチルをシリカ源とした、酸性溶液でのシリカの脱水重縮合反応を行い、焼成により界面活性剤を除去する方法により得られる。
「Ｃ１６-ｍｅｓｏ」又は「Ｃ２２-ｍｅｓｏ」の場合は、前記ＦＳＭのシリカ原料を高アルミニウム含有層状ケイ酸塩（Ａｌ-Ｋ-ＬＤＳ）とすれば、池田らの方法（T. Ikeda et al., Microporous Mesoporous Mater., vol.191, pp.38-47 (2014)）に記載の手法に従って製造できる。
また、本発明の実施の態様（製造例１）の手法では、微粒子の状態の「メソポーラスシリカ（シリカ系ナノ空孔材料）」が得られるため、「メソポーラスシリカ粒子」又は「シリカ微粒子粉末」ということもある。
しかし、本発明のメソポーラスシリカは、用途に合わせて膜状、中空糸状又はペレット状など既知の成型法により適宜の形状に成形して用いても、微粒子状のメソポーラスシリカ粒子と同様の効果を発揮できる。メソポーラスシリカの膜状成型法としては片岡らの方法（S. Kataoka et al., Appl. Catal. A-Gen., vol.342, pp.107-112 (2008)）など、中空糸状成型法としてはRownaghiらの方法（A. A. Rownaghi et al., ChemSusChem, vol.8, pp.3439-3450 (2015)）など、また、ペレット状成型法としてはMaheshwariらの方法（H. Maheshwari et al., J. Mater. Sci., vol.51, pp.4470-4480 (2016) (2016)）などが適用できる。
【００２５】
（１−３）メソポーラスシリカの細孔径について
本発明で用いるメソポーラスシリカの一般的な細孔径は、中心細孔直径で２〜５０ｎｍ（メソ孔）であり、膨張剤の量や加熱温度を調整することで、細孔径を変更できる。そのうち、好ましい細孔径の数値範囲はそれぞれで異なっており、例えば、ＦＳＭの場合、中心細孔直径は２〜１２ｎｍ、好ましくは２〜１０ｎｍの範囲である。ＳＢＡの場合は、中心細孔直径は４〜２２ｎｍ、好ましくは４〜１２ｎｍ、より好ましくは５〜１１ｎｍの範囲である。ＳＢＡ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅの場合は、中心細孔直径は１０〜３０ｎｍ、好ましくは１２〜２８ｎｍ、より好ましくは１５〜２５ｎｍの範囲である。また、Ｃ-ｍｅｓｏの場合は、中心細孔直径は２〜１２ｎｍ、好ましくは２〜１０ｎｍの範囲である。
【００２６】
２．本発明のシリカ結合タンパク質（Ｓｉ-ｔａｇ）について
（２−１）「シリカ結合タンパク質（Ｓｉ-ｔａｇ）」とは
本発明で、「シリカ結合タンパク質（Ｓｉ-ｔａｇ）」というとき、非特許文献２又は特許文献２に記載の大腸菌又はシュードモナス属など細菌が産生するシリカ（ＳｉＯ２）表面に強力に結合するタンパク質を指す。Ｓｉ-ｔａｇは、０．１Ｍ以上の高塩濃度条件下（例えば１Ｍ  塩化ナトリウム中）、さらには高濃度界面活性剤（例えば、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）の存在下では特異的にシリカ（ＳｉＯ２）表面に結合するため、そのような高塩濃度条件、さらには高濃度界面活性剤存在条件を用いることで、細菌の細胞破砕液を精製することなくシリカ表面に結合させることができる。
【００２７】
（２−２）Ｓｉ-ｔａｇの種類
典型的なＳｉ-ｔａｇとしては、大腸菌由来のｒｐｌＢ遺伝子によりコードされる、全長２７３アミノ酸のシリカ結合タンパク質（配列番号１、ACCESSION:NP_417776）である。各種細菌が産生するシリカ結合タンパク質のうち、ｒｐｌＢ遺伝子によりコードされるシリカ結合タンパク質は、生物種間でのアミノ酸配列の同一性が約８８％以上と非常に良く保存され、シリカ表面への結合特異性も極めて類似性が高い（特許文献２）。
以下、本明細書中では大腸菌Ｋ１２由来の配列番号１に示されるＳｉ-ｔａｇについて主として説明するが、本発明のＳｉ-ｔａｇはこれに限られない。例えば、Pseudomonas putida ＫＴ２４４０由来（ACCESSION:NP_742623）、Pseudomonas aeruginosa ＰＡＯ１由来（ACCESSION:NP_252950）などのｒｐｌＢ遺伝子によりコードされるシリカ結合タンパク質も本発明のＳｉ-ｔａｇに含まれる。他に、Salmonella_enterica_ＳＴＭ３４３７由来、Haemophilus_influenzae_ＨＩ０７８０由来、及びShewanella_oneidensis_ＳＯ_０２３４由来のｒｐｌＢ遺伝子によりコードされるシリカ結合タンパク質も同様である。
また、これら各Ｓｉ-ｔａｇの全アミノ酸配列との同一性が、９０％、好ましくは９５％の範囲内での変異、具体的にはアミノ酸配列中の１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列であって、シリカ結合性が保持されたタンパク質は、本発明のＳｉ-ｔａｇとして用いることができる。
【００２８】
（２−３）Ｓｉ-ｔａｇのＮ末端及び／又はＣ末端断片
Ｓｉ-ｔａｇは主として４つのドメイン構造に別れており、そのうちのシリカ結合ドメインは、Ｎ末端側のドメイン（配列番号１の１〜６０位）及びＣ末端側のドメイン（配列番号１の２０３〜２７３位）の２箇所に局在しており、これらＮ末端側及び／又はＣ末端側ドメインに対応するＳｉ-ｔａｇ部分ペプチドはシリカ結合性を有している（特許文献２）。
本発明では、Ｓｉ-ｔａｇのＮ末端側のドメインに相当するＳｉ-ｔａｇ部分ペプチドをＳｉ-ｔａｇＮ末端側断片といい、具体的には、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる断片（「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０」）または当該アミノ酸配列との同一性が、９０％、好ましくは９５％の範囲内で変異したアミノ酸配列、すなわち当該アミノ酸配列中の１〜６個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列であって、シリカ結合性が保持された断片を指す。
また、Ｓｉ-ｔａｇのＣ末端側のドメインに相当するＳｉ-ｔａｇ部分ペプチドをＳｉ-ｔａｇＣ末端側断片といい、具体的には、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる断片（「Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１」）または当該アミノ酸配列との同一性が、９０％、好ましくは９５％の範囲内で変異したアミノ酸配列、すなわち当該アミノ酸配列中の１〜７個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列であって、シリカ結合性が保持された断片を指す。
さらに、Ｓｉ-ｔａｇのＮ末端側及びＣ末端側ドメインに対応するＳｉ-ｔａｇ部分ペプチドをＳｉ-ｔａｇＮ末及びＣ末側結合断片といい、具体的には配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる断片（「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＣＴ７１」）または当該アミノ酸配列との同一性が、９０％、好ましくは９５％の範囲内で変異したアミノ酸配列、すなわち当該アミノ酸配列中の１〜１３個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列であって、シリカ結合性が保持された断片を指す。
【００２９】
従来、所望のタンパク質との融合体をシリカ表面に結合させる場合、全長のＳｉ-ｔａｇと比較してＮ末及びＣ末側結合断片でもシリカ表面への結合性は１／２以下であり、Ｎ末端側断片及びＣ末端側断片のいずれも単独で用いると結合性が１／２０以下に減弱されるため、Ｎ末又はＣ末端側断片単独ではシリカ表面への結合性は不十分であると考えられていた（特許文献２）。
しかし、本発明のメソポーラスシリカの細孔内へ固定化する場合には、Ｓｉ-ｔａｇＮ末又はＣ末端側の断片単独で各酵素に融合した場合であっても、Ｓｉ-ｔａｇ全長の場合と同等又はむしろそれ以上に固定化効率が高まる。
したがって、本発明で各酵素と融合させるＳｉ-ｔａｇは、全長でなくてもそのＣ末及び／又はＮ末側の部分タンパク質、すなわち、前記のＳｉ-ｔａｇのＮ末端及び／又はＣ末端断片を用いることができるので、あわせて本発明の「Ｓｉ-ｔａｇ及びその断片」、又は単に「Ｓｉ-ｔａｇ」と称することもある。
【００３０】
（２−４）Ｓｉ-ｔａｇの製造方法
本発明のＳｉ-ｔａｇ及びその断片は、既知のｒｐｌＢ遺伝子の配列情報をもとに遺伝子組み換え技術により製造することができる。本発明の実施例では、それぞれ配列番号１〜３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いて大腸菌タンパク発現系により製造している。
なお、本発明の全長Ｓｉ-ｔａｇについては、特許文献２などに記載の方法により大腸菌Ｋ１２株などの細菌を破砕した細胞破砕液から回収することもできる。
【００３１】
３．本発明が対象とする異種酵素（酵素Ａと酵素Ｂ）の組合せ
本発明の共役酵素反応に関わる複数の酵素のうち、少なくとも２種類の異種酵素（酵素Ａと酵素Ｂ）は、少なくともいずれか１つの酵素がＳｉ-ｔａｇ又はその断片を介してメソポーラスシリカの細孔内に互いに近接して固定化されており、かつ両酵素の酵素反応が補酵素再生系などにより供給されたエネルギーを利用して協調的かつ持続的に効率の良い共役酵素反応を行う。
【００３２】
そのような典型的な異種酵素の組み合わせとしては、補酵素再生系を利用する還元酵素及び脱水素酵素が挙げられる。例えば、補酵素ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを利用した還元酵素（アゾ還元酵素（ＡｚｏＲ）、カルボニル還元酵素（ＣＲ）、イミン還元酵素（ＩＲ）、エノン還元酵素（ＥＲ）、アルドース還元酵素（ＡＲ）、キシロース還元酵素（ＸＲ）、ＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）等）及び脱水素酵素（グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）、グルコース-６-リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、フルクトース脱水素酵素（ＦＤＨ）、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）、ギ酸脱水素酵素（ＦＤＨ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）、グリセロールリン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）、キシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ）等）による物質変換反応が挙げられる。また、前記のＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）及び脱水素酵素（グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）、グルコース-６-リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）等）の利用による、脱水素酵素の反応基質の高感度定量を目的とした測定キット、バイオセンサーおよびバイオ燃料電池のアノード電極への電子供給、等が挙げられる。
【００３３】
その他、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）及び乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、アルドース還元酵素（ＡＲ）及びソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）及びグリセロールリン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）、ピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）、又、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）及びリンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）等によるカスケード反応、キシロース還元酵素（ＸＲ）及びキシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ）を組み合わせた補酵素再生系によるカスケード反応、また、補酵素ＡＴＰを利用したＡＴＰ要求性酵素（リガーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、キナーゼ、ルシフェラーゼ等）による物質変換反応において、キナーゼ（クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、酢酸キナーゼ（ＡＫ）、ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）等）によるＡＴＰ再生系を利用する方法等が挙げられる。
【００３４】
なお、本発明が適用可能な異種酵素による共役酵素反応系は、典型的には補酵素再生系と呼ばれる系であるがそれには限られない。２種以上の酵素のそれぞれ関わる反応系が同時にもしくは順次に共役して行われる酵素反応（共役酵素反応）であればよく、グルコースオキシダーゼとカタラーゼによるカスケード反応（非特許文献７）の他、乳酸又はピルビン酸を反応基質として用いる乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ピルビン酸オキシダーゼ（あるいは、乳酸オキシダーゼ）、ペルオキシダーゼの３酵素のカスケード反応による乳酸又はピルビン酸の定量方法や、グルタミンを反応基質として用いるグルタミナーゼ、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、γ-アミノブチルアルデヒド脱水素酵素（ＡＢＡＬＤＨ）の３酵素のカスケード反応により、茶豆特有の香り成分（２-アセチル-１-プロリン）の原料となる「４-アミノブタナール」の生成反応なども含まれる。２種以上の酵素のうち少なくとも片方が多量体構造を有するなどサイズの大きな酵素を含む場合には、特に本発明を適用することで大きなメリットが得られる。
【００３５】
４．酵素Ａ又は酵素ＢとＳｉ-ｔａｇ又はその断片との複合体及びその製造方法
（４−１）酵素Ａ又は酵素Ｂと融合させるＳｉ-ｔａｇ又はその断片
本発明で用いる共役酵素反応に関わる酵素Ａ又は酵素Ｂは、通常多量体化した状態で働き、しかももともとの分子量が大きい場合が多い。そのため、各サブユニットの全てにＳｉ-ｔａｇを融合させて複合体化する場合、Ｓｉ-ｔａｇを全長で用いると、サイズが大きすぎてメソポーラスシリカの細孔内に入り込むことができず、他の酵素に近接した状態で高密度に存在できない。
全長のＳｉ-ｔａｇの方がシリカ表面への結合性自体は高いものの、酵素の分子量が大きい場合、又はサブユニット数が多い場合は、全長のＳｉ-ｔａｇを用いるよりも、Ｃ末側断片（例えば「Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１」）、Ｎ末側断片（例えば「Ｓｉ-ｔａｇ-Ｎ６０」）又はＮ末及びＣ末側結合断片（例えば「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＣＴ７１」）を用いる方が本発明のメソポーラスシリカにおける細孔内での確実な固定化が可能となる。
例えば、本発明の実施態様で用いた二量体のアゾ還元酵素（ＡｚｏＲ）は全長のＳｉ-ｔａｇと融合させているが、四量体のグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）の場合は、Ｃ末側断片の「Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１」と、そしてカルボニル還元酵素（ＲＣＲ）やソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）の場合は、Ｎ末側断片の「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０」と融合させた。このようなＳｉ-ｔａｇ又はその断片を介してメソポーラスシリカに固定化させることで、メソポーラスシリカ細孔内で両酵素が近接して配置されることとなり、両酵素反応が活発化して、アゾ染料の脱色率や光学活性アルコールの合成効率が飛躍的に改善すると共に、両酵素が細孔内で確実に固定化されたことで洗浄によってもはずれることなく複数回の使用にも耐えられるようになった。
また、本発明の異種酵素のＳｉ-ｔａｇ又はその断片を介したメソポーラスシリカ複合体においては、異種酵素のすべてがそれぞれＳｉ-ｔａｇ又はその断片を介した状態でメソポーラスシリカ複合体を形成していなくてもよく、共役酵素反応にかかわる少なくとも１種の酵素がＳｉ-ｔａｇ又はその断片を介してメソポーラスシリカに固定化されている場合を含み、その場合でも飛躍的な反応性向上効果が期待できる。例えば、ソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）とＤＴＤとの組み合わせによるソルビトール検出系において、ＳＤＨはＳｉ-ｔａｇのＮ末側断片（Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０）と融合させた「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０−ＳＤＨ」とし、ＤＴＤはＳｉ-ｔａｇ未融合の状態で両者をメソポーラスシリカに固定化させたところ、ソルビトール検出における感度が飛躍的に改善した。
【００３６】
（４−２）酵素とＳｉ-ｔａｇ又はその断片との融合方法
対象となる多量体酵素の各サブユニットそれぞれの末端に確実にＳｉ-ｔａｇ又はそのＣ末側断片、Ｎ末側断片もしくはＮ末-Ｃ末側結合断片を融合させるためには、各酵素遺伝子の５’側または３’側に直接、又は３塩基もしくはその倍数の塩基からなるスペーサー配列を介してＳｉ-ｔａｇ又はその断片をコードするＤＮＡを連結し周知の遺伝子組換え技術を用いて融合タンパク質として形質転換大腸菌などの形質転換体から産生させることが好ましい。なお、その際のスペーサー配列の長さは、ベクターへの挿入のしやすさや酵素の高次構造への影響などを考慮して適宜設計できる。具体的には０〜１８０塩基、好ましくは３〜９０塩基であり、本実施例のＡｚｏＲの場合、２４アミノ酸（配列番号８）をコードするスペーサー配列を用いてＳｉ-ｔａｇと融合させており、スペーサー配列（配列番号８）を有するベクターにＡｚｏＲ遺伝子及びＳｉ-ｔａｇ遺伝子を組み込む方法、又はＡｚｏＲ遺伝子を有するベクターにＳｉ-ｔａｇ遺伝子とスペーサー配列が連結したＤＮＡを組み込む方法を用いることができる。
他に、Ｈｉｓ-ｔａｇやＦＬＡＧ-ｔａｇ等のエピトープタグ、及び、エンテロキナーゼ等のプロテアーゼの認識配列を含めたスペーサー配列を適宜用いることができる。なお、配列番号８にもエンテロキナーゼの認識配列（５アミノ酸）が含まれる。
なお、多量体酵素の場合に酵素の各サブユニットに対し、均一にＳｉ-ｔａｇを融合することが難しいものの、市販の酵素など酵素タンパク質に対し、Ｓｉ-ｔａｇタンパク質又はその断片ペプチドを既知のリンカーを介して又は介さずに化学的に結合することもできる。
【００３７】
５．異種酵素とＳｉ-ｔａｇ又はその断片との融合体のメソポーラスシリカ細孔内への固定化
（５−１）異種酵素のＳｉ-ｔａｇ融合体とメソポーラスシリカとの複合体（酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体ともいう。）
本発明は、メソポーラスシリカの細孔内部にＳｉ-ｔａｇ又はその断片を介し、共役酵素反応に関わる少なくとも二種類の異種酵素を備えた異種酵素内包複合体であって、各酵素の少なくともいずれか１種がＳｉ-ｔａｇ又はその断片を介した状態で前記メソポーラスシリカの細孔内に吸着され、分散した状態で細孔内に安定に固定されている。好ましくは、補酵素再生系などを利用した共役酵素反応に関わる少なくとも二種類の酵素がＳｉ-ｔａｇ又はその断片を介した状態で内包され、かつ当該各酵素が補酵素再生系などを介した高効率のエネルギーの受け渡しや電子伝達が可能なように近接した状態にあることを特徴とする。
ここで、各酵素について細孔内で近接した状態にあるとは、異種酵素同士の間に介在する補酵素（酸化型及び還元型）などを高効率に受け渡せる程度に近接していることを指し、具体的には１〜１０ｎｍ程度の距離である。
【００３８】
（５−２）基本的な固定化方法
典型的な固定化方法の実験手順は、図３（ｂ）に示したとおりである。
異種酵素のうち少なくとも一種類の酵素とＳｉ-ｔａｇ（又はそのＣ末もしくはＮ末側断片）との融合体を含んだ酵素溶液を、Ｔｒｉｓ-ＨＣｌなどの緩衝液で中性付近（ｐＨ ７〜８）に調整し、予めマイクロチューブに量り取った微粒子粉末状のメソポーラスシリカ（ＦＳＭ８．０又はＳＢＡ８．１など）と共に、一定温度（４〜４０℃）にて一晩穏やかに混和する。そのことで、酵素−Ｓｉ-ｔａｇ融合体（又はそのＣ末もしくはＮ末側断片）をメソポーラスシリカの細孔内に固定化することができる。その際、異種酵素の全てについてそれぞれＳｉ-ｔａｇ（又はそのＣ末もしくはＮ末側断片）との融合体を形成しておき、各酵素融合体の混合溶液を微粒子粉末状のメソポーラスシリカと混和すれば、全ての酵素のＳｉ-ｔａｇ融合体（又はそのＣ末側、Ｎ末側もしくはＮ末-Ｃ末側結合断片）がメソポーラスシリカの細孔内部で近接した状態に安定して固定化できる。
なお、本発明の対象とする共役酵素反応が、３種類以上の異種酵素が関わるカスケード反応である場合、全ての酵素をＳｉ-ｔａｇ（又はそのＣ末側、Ｎ末側もしくはＮ末-Ｃ末側結合断片）との融合体として同一のメソポーラスシリカに固定化してもよいが、カスケード反応の最初の２工程に関わる酵素のみを同一のメソポーラスシリカに固定化し、続く工程に関与する酵素は遊離状態で系に添加するか、又は別のメソポーラスシリカに固定化することが好ましい。
その後、当該酵素溶液は、酵素反応の至適温度にまで予備加温した反応基質溶液中に添加して反応を開始させるが、その際、異種酵素のうちの一方の酵素しかＳｉ-ｔａｇ（又はそのＣ末側、Ｎ末側もしくはＮ末-Ｃ末側結合断片）との融合体を形成させていない場合は、他の酵素は遊離状態のまま反応基質溶液中に添加すればよい。
【００３９】
その他の固定化方法としては、酵素と反応基質等を含んだ緩衝液を調製し、メソポーラスシリカと共に一定温度（４〜４０℃）にて数分間から数時間混和することで、酵素とＳｉ-ｔａｇ（又はそのＣ末側、Ｎ末側もしくはＮ末-Ｃ末側結合断片）との融合体をメソポーラスシリカの細孔内に固定化することができる。その際、酵素溶液から補酵素等のその他の反応因子の一部を抜いておくことで反応開始を抑制した状態で酵素の固定化を完了させ、次に、この反応因子を添加することによって反応を開始させる。
【００４０】
（５−３）固定化のための最適化条件
弱アルカリ性のｐＨ範囲（例えば、ｐＨ８〜１０）における高塩濃度条件下（例えば、０．５〜１．０Ｍの塩化ナトリウム含有緩衝液）、又は高塩濃度でかつ高濃度界面活性剤存在下（例えば、０．５〜１．０Ｍの塩化ナトリウム及び０．５〜１．０％Ｔｗｅｅｎ２０含有緩衝液）での固定化を行い、同じ塩濃度又は界面活性剤濃度に調整した洗浄液で複数回洗浄することで、細孔内の夾雑物が確実に除去されて、安定した固定化が行える。
ここで、弱アルカリ性のｐＨ範囲としては、ｐＨ８〜１０が好ましく、そのためには、ｐＨ８〜１０の緩衝能を有する、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＧＬＹ-ＧＬＹ、ＣＨＥＳなどのグッド緩衝液を用いることで酵素溶液及び洗浄液のｐＨ値を調整すれば良いが、特にＴｒｉｓの適用が好ましい。
また、高塩濃度にするための塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどを用いることができ、塩化ナトリウムが特に好ましい。その際の好ましい塩濃度は、０．１〜２．０Ｍ、より好ましくは、０．５〜１．０Ｍである。
界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０（モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、Ｔｗｅｅｎ４０（モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、Ｔｗｅｅｎ６０（モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、Ｔｗｅｅｎ８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００など非イオン性界面活性剤が好ましいが、陽イオン性、陰イオン性、及び、両イオン性界面活性剤も用いることができる。界面活性剤の好ましい濃度は、０．０５〜２．０％、より好ましくは０．５〜１．０％である。
ただし、続いて酵素反応をさせる際には塩類や界面活性剤が系に高濃度で存在していると反応効率が低下するため、メソポーラスシリカ微粒子粉末を緩衝液で十分に洗浄して用いる必要がある。
【００４１】
６．異種酵素の共役的反応の評価方法
本発明の異種酵素が関わる共役酵素反応が補酵素再生系であれば、補酵素の消費率、再生率を反応溶液中の吸光度の変化を観察することで評価できる。また、本発明で製造されるか、分解される物質の変換効率に着目して、評価することもできる。
本発明の実施態様では、典型的な例として、ＡｚｏＲとＧＤＨとの補酵素ＮＡＤＨ系での協調反応を評価するため、アゾ染料（メチルレッド）の分解効率、又はＮＡＤＨの消費率及び再生率を、反応溶液中の吸光度（測定波長：４３０ｎｍ、又は３４０ｎｍ）を経時的に測定することで評価した。
また、本発明においては、（Ｒ）-体の光学活性アルコールに還元することが可能なＮＡＤＨ依存型カルボニル還元酵素（ＲＣＲ）とＧＤＨ又はＳＤＨとを組み合わせ、２-ヒドロキシアセトフェノンを反応基質として、（Ｒ）-１-フェニル-１，２-エタンジオール（（Ｒ）-ＰＥＤ：フルオキセチン（抗鬱薬）のキラルビルディングブロック）を製造することができるが、その際は、３４０ｎｍの吸光度変化を経時的に測定する評価法の他、キラルカラムを搭載した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて（Ｒ）-ＰＥＤの鏡像体過剰率（光学純度）および生産収率を評価できる。なお、本反応系の場合は９９％以上、Ｒ体が得られるため、ＯＤＳカラムを搭載したＨＰＬＣにより、直接（Ｒ）-ＰＥＤの分析が可能である。
【００４２】
７．本発明の異種酵素−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体の用途
（７−１）共役酵素反応用のキット、センサー又は装置
本発明の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体は、酵素Ａ及び酵素Ｂが関与する共役酵素反応の酵素反応用のキット、センサー又は装置を構成する要素として用いることができる。ここで、装置とは、有用物質を合成するためのバッチ式もしくはフロー式の反応装置（バイオリアクター）又は検査、測定用の装置、器具などを含む。
また、本発明のメソポーラスシリカは、一般には微粒子粉末状で使用することが好ましい。しかし、特にバイオリアクターなどの装置、器具の一部として用いる場合は、装置、器具またはその部品の形状、規模に合わせ、１．（１−２）で述べた既知の成型法に従い、膜状、中空糸状又はペレット状などに成形して用いることができる。
これら共役酵素反応キット、センサー又は装置の具体的な用途として、主なものは被検試料中の標的物質の検出もしくは測定、有用物質の生産、及び有害物質、汚染物質の無毒化もしくは除去などがある。以下、それぞれに用いられる酵素Ａ及び酵素Ｂを含む酵素の組合せの典型的な例について述べるが、あくまでも例示であり、本発明はこれら例示された組合せには限定されない。
【００４３】
（７−２）被検試料中に存在する可能性のある標的物質の産物の検出又は定量、又は被検試料中の酵素活性の測定
本発明の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体は、被検試料中に存在する可能性のある標的物質を検出又は定量するために、又は血液など生体由来被検試料中の酵素活性を測定するために用いることができる。そして、その際に被検試料中の標的物質を検出又は定量するための、又は生体由来被検試料中の酵素活性を測定するためのキット、センサー又は装置として用いることができる。
具体的には、例えば各種疾病の診断、血液マーカー値検査など、被験体由来血液などの被検試料中に標的物質が存在するか否か、又はどの程度存在するかを測定し対象疾病への罹患可能性、罹患の有無又は程度を判定、診断するための標的物質検出又は定量用キットとして、本発明のキットを用いることができる。被検試料中に存在する可能性のある標的物質を酵素Ａの反応基質とし、測定対象物質前駆体を酵素Ｂの反応基質として系に存在させれば、共役酵素反応後に産生される酵素Ｂの反応産物量を検出又は定量することで被検試料中の酵素Ａの基質の標的物質量を測定できる。または、酵素Ａの基質を反応系に添加して被検血液など生体試料中の酵素Ａ活性を測定することもできる。その際、発光、蛍光物質またはその前駆体が反応基質となる酵素Ｂを選択して組合せれば、発光、蛍光物質からの発光、蛍光量として、より迅速、簡便かつ正確に測定できる。
これらをキット化する場合は、酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体と共に、酵素希釈用（及び酵素抽出用）緩衝液、酵素Ａ及び／又は酵素Ｂの反応基質、酵素Ａ及び／又は酵素Ｂの標準物質、反応測定用容器（ウエル）などを適宜組み合わせてキットとすることができる。
バイオ電池、又はバイオセンサーの場合はさらに、電極上あるいは電極近傍に酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体を配置すると共に、キノン類及びフェロセン類など低分子の酸化還元物質（電子伝達メディエーター）を一方の基質に代えて組み合わせる必要がある。
【００４４】
そのような異種酵素の組合せを例示すると、これらに限定されるわけではないが、
（ａ）グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼとの共役酵素反応を利用して生成Ｈ２Ｏ２を測定し被検血漿試料中のグルコースを高感度に定量する血糖値測定用キット、
（ｂ）ピルビン酸オキシダーゼとペルオキシダーゼとの共役酵素反応を利用して生成Ｈ２Ｏ２を測定し被検血漿試料中のピルビン酸を高感度に定量するための血中のピルビン酸測定用キット、（なおピルビン酸測定用キットは、清酒の熟成度判定のためのキットとして用いることもできる。）
（ｃ）乳酸オキシダーゼとペルオキシダーゼとの共役酵素反応を利用して生成Ｈ２Ｏ２を測定し被検血漿試料中の乳酸を高感度に定量するための乳酸測定用キット、
（ｄ）コレステロールオキシダーゼとペルオキシダーゼとの共役酵素反応を利用して生成Ｈ２Ｏ２を測定し被検血液試料中のコレステロールを高感度に定量するためのコレステロール測定用キットなどが挙げられる。また、医療用ではないが、
（ｅ）グルタミン酸オキシダーゼとペルオキシダーゼとの共役酵素反応を利用して生成Ｈ２Ｏ２を測定し被検食品試料中のグルタミン酸を検出又は定量するための食品の旨味分析用キットも挙げられる。
【００４５】
また、典型的な蛍光・発色測定キットとしては、各種脱水素酵素とＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）と、ＤＴＤの基質となる発光物質もしくは蛍光物質又はそれらの前駆体を組み合わせた蛍光・発色測定キットが挙げられる。例えば、発色物質のＭＴＴテトラゾリウム塩は、ＮＡＤＨで還元されると紫色（最大波長565 nm）の還元型に変化するので、発色度を測定すると標的物質量又は標的酵素活性が正確に測定できる。
主として疾患との関連で被験者の血液など体液試料に適用する測定キット、検査キットとしてはこれらに限定されるわけではないが、以下の様なキットが例示できる。
（ｆ）グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）とＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）とのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／ＮＡＤ（Ｐ）＋再生系共役酵素反応を利用した、被検血液試料もしくは食品試料中のグルコースを定量するか、又は血中ＧＤＨ活性を測定するための測定キット、検査キット、
（ｇ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）とＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）とのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／ＮＡＤ（Ｐ）＋再生系共役酵素反応を利用した、被検血液試料中のグルコース−６−リン酸を定量するか、又は血中Ｇ６ＰＤＨ活性を測定するための測定キット、検査キット、
（ｈ）アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）とＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）とのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／ＮＡＤ（Ｐ）＋再生系共役酵素反応を利用した、被検血液試料もしくは食品試料中のアルコールを定量するか、又は血中ＡＤＨ活性を測定するための測定キット、検査キット、
（ｉ）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）とＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）とのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／ＮＡＤ（Ｐ）＋再生系共役酵素反応を利用した、被検血液試料もしくは食品試料中の乳酸を定量するか、又は血中ＬＤＨ活性を測定するための測定キット、検査キット、
（ｊ）ソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）とＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）とのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／ＮＡＤ（Ｐ）＋再生系共役酵素反応を利用した、被検血液試料もしくは食品試料中のソルビトールを定量するか、又は血中ＳＤＨ活性を測定するための測定キット、検査キット、
（ｋ）グリセロールリン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）とＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）とのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／ＮＡＤ（Ｐ）＋再生系共役酵素反応を利用した、被検血液試料中のグリセロールリン酸を定量するか、又は血中ＧＰＤＨ活性を測定するための測定キット、検査キット
（ｌ）リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）とＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）とのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／ＮＡＤ（Ｐ）＋再生系共役酵素反応を利用した、被検血液試料もしくは食品試料中のリンゴ酸を定量するか、又は血中ＭＤＨ活性を測定するための測定キット、検査キットなどが挙げられる。
【００４６】
また、下記の（ｍ）及び（ｎ）は、被検試料中のフルクトース、キシリトールの定量にも用いることができるが、むしろ主としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈの電気化学酸化を利用した酵素電池（アノード電極）として期待される。酵素電池としては、（ｆ）〜（ｌ）を用いることもできる。さらに、（ｆ）〜（ｏ）はいずれも脱水素酵素の基質を検出、定量するバイオセンサーとしての用途もある。
（ｍ）フルクトース脱水素酵素（ＦＤＨ）とＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）とのＳｉ-ｔａｇを介したメソポーラスシリカ複合体を含む系にＤＴＤの基質となるキノン類及びフェロセン類などの電子伝達メディエーターを添加して酵素電池のアノード電極とすることができる。同様に、
（ｎ）キシリトール脱水素酵素（ＸＤＨ）とＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）と前記電子伝達メディエーターとを組み合わせれば、酵素電池のアノード電極とすることができる。
また、
（ｏ）ギ酸脱水素酵素（ＦＤＨ）とＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）とのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／ＮＡＤ（Ｐ）＋再生系共役酵素反応を利用した、被検食品試料中のギ酸を定量するか、又は食品中ＦＤＨ活性を測定するための測定キット、検査キットとして用いられる。
【００４７】
その他、ホスホエノールピルビン酸の二酸化炭素によるカルボキシル化反応を触媒するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）とリンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）とのカスケード反応を利用して、環境試料などの被検試料中の二酸化炭素濃度を測定するための測定キットを提供することができる。
【００４８】
（７−３）酵素Ａの反応基質から有用物質を製造するためのキット又はバイオリアクター（装置）
本発明の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体を、有用物質の原料を基質とする酵素Ａの酵素反応に適用すれば、酵素Ｂの酵素反応と共役的に効率よく働かせることができるので、酵素Ａの基質から有用物質を大量生産できる。本発明の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体はそのためのキット又はバイオリアクター（装置）の構成要素として用いることができる。
具体的には、これらに限定されるわけではないが、例えばカルボニル還元酵素（ＣＲ）と脱水素酵素（グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）、ソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）等）の共役酵素反応による光学活性アルコールの高効率合成が可能となる。
典型的には、（Ｒ）-体の光学活性アルコールに還元することが可能なＮＡＤＨ依存型カルボニル還元酵素（ＲＣＲ）とＧＤＨ又はＳＤＨとを組み合わせ、２-ヒドロキシアセトフェノンを反応基質とすることで、（Ｒ）-１-フェニル-１，２-エタンジオールを製造することができる。（Ｒ）-１-フェニル-１，２-エタンジオールは、（Ｒ）-ＰＥＤ：フルオキセチン（抗鬱薬）のキラルビルディングブロックとして有用である。
【００４９】
また、グルタミナーゼとグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）との共役酵素反応を利用し、グルタミンを原料としてγ-アミノ酸（ＧＡＢＡ）を製造するためのキット又はバイオリアクターが提供できる。ＧＡＢＡは、脳内の抑制性神経伝達物質として機能する物質であり、脳内で不足するとＩＤＤＭの発症に繋がり、膵臓では、β細胞でインスリンやソマトスタチンなどの分泌制御に関わっているとされている有用物質であり、化成品原料（ポリアミド４）としての活用も期待されている。
グルタミナーゼ、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）にさらにγ-アミノブチルアルデヒド脱水素酵素（ＡＢＡＬＤＨ）を加えた３種類の酵素のカスケード反応を利用すれば、「４-アミノブタナール」を製造するためのキット又はバイオリアクターが提供できる。
「４-アミノブタナール」は、茶豆特有の香り成分（２-アセチル-１-プロリン）の原料となる。
【００５０】
（７−４）環境中の環境汚染物質や毒性物質を分解するためのキット又はバイオリアクター（装置）
本発明の酵素Ａ−酵素Ｂ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体は、環境中に存在する酵素Ａの反応基質となる環境汚染物質や毒性物質を効率的に分解することができ、そのためのキット又はバイオリアクター（装置）として用いることができる。
例えば、これらに限定されるわけではないが、産業排水中の難分解性化学染料であるアゾ染料（メチルレッドなど）を、アゾ還元酵素（ＡｚｏＲ）とグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）のＳｉ-ｔａｇ融合体とメソポーラスシリカ複合体を緩衝液などと組み合わせてアゾ染料（メチルレッドなど）分解用キットとすることができ、当該メソポーラスシリカ複合体をカラムなどに詰めてアゾ染料分解用バイオリアクターとすることもできる。
【００５１】
８．脱炭酸酵素及びカルボキシラーゼの固定化
（８−１）本発明の対象とする脱炭酸酵素及びカルボキシラーゼ
本発明の脱炭酸酵素及びカルボキシラーゼは、Ｓｉ-ｔａｇ又はその断片を介してメソポーラスシリカの細孔内に安定かつ強固に固定化されており、高効率に物質変換反応を行う。
そのような典型的な脱炭酸酵素及びカルボキシラーゼとしては、反応基質の脱炭酸反応とカルボキシル化反応の双方の触媒能を有するアミノ酸脱炭酸酵素である、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）が挙げられる。その他の脱炭酸酵素として、ピルビン酸脱水素酵素、ヒドロキシアミノ酸脱水素酵素、ピルビン酸脱炭酸酵素、ヒスチジン脱炭酸酵素、オルニチン脱炭酸酵素等、また、カルボキシル化反応を触媒する酵素として、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）等による物質変換反応が挙げられる。例えば、ピルビン酸脱水素酵素を利用したピルビン酸の脱炭酸反応により合成されるアセチルＣｏＡは、コエンザイムＱ１０等のサプリメントの原料として有用である。
また、上述の通り、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）及びリンゴ酸脱水素酵素（ＭＤＨ）等の異種酵素の組み合わせによるカスケード反応は、二酸化炭素濃度の測定に利用できる。さらに、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）は、グルタミナーゼ、又は、γ-アミノブチルアルデヒド脱水素酵素（ＡＢＡＬＤＨ）等と組み合わせた異種酵素によるカスケード反応に適用可能であり、多段階の物質変換反応を実行できる。
【００５２】
（８−２）グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）について
グルタミン酸脱炭酸酵素（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ：ＧＡＤ）は、水系反応においてグルタミン酸を脱炭酸しγ-アミノ酸（ＧＡＢＡ）に変換する酵素であり、生体内では脳及び膵臓のランゲルハンス島細胞に高濃度で存在する。
上述したようにＧＡＢＡには、ＩＤＤＭの発症抑制やインスリンやソマトスタチンなどの分泌制御、化成品原料（ポリアミド４）などの活用が期待されている。一方、ＧＡＤは、非水系反応ではグルタミン酸のカルボキシル化を促し、近年、人工的な血液凝固剤及び骨等としての利用が期待されているγ-カルボキシグルタミン酸を合成する。また、上述の通り、その他の酵素と組み合わせた共役酵素反応による有用物質の生産が可能である。
【００５３】
本実施例では、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）として、Escherichia coli由来のＧＡＤβ（六量体、アミノ酸残基数：４６６、分子量（単量体）：約５０ｋＤ、配列番号７）を用いた。
ＧＡＤへのＳｉ-ｔａｇ又はそのＮ末及び／又はＣ末側断片との融合方法、及びメソポーラスシリカへの固定化方法は上記１．〜６．に記載の方法と同様である。
本実施例では、ＧＡＤβ（配列番号７）のＮ末端側に「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０」を融合させた「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβ」を用いたが、当該Ｎ末側断片には限られない。
【実施例】
【００５４】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した先行技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
【００５５】
（製造例１）メソポーラスシリカ（シリカ系ナノ空孔材料）の製造
（１−１）ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：２．６、４．２、８．０ｎｍ）の合成
中心細孔直径８．０ｎｍを有するＦＳＭ型メソポーラスシリカについては卜部らの方法（Y. Urabe et al., ChemBioChem, vol.8, pp.668-674 (2007)）を参考にして合成した。
具体的には、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライド（１０ｇ、ライオン・アクゾ社製）を、７０℃の水１２５ミリリットルに添加し、溶解後、１，３，５-トリイソプロピルベンゼン（７．５ｇ、アルファエイサー社製）を添加し、７０℃に加熱しながら、ホモミキサーで３０分間撹拌（３０００ｒｐｍ）した。これに、予め、カネマイト（トクヤマシルテック社製）６．６７ｇを溶解した８０℃の水１３１ミリリットルを更に添加し、７０℃に加熱しながら、ホモミキサーで２時間撹拌（３０００ｒｐｍ）した。これに、２規定塩酸を約１時間かけて添加し、ｐＨ８．５の状態で、約３時間撹拌（３０００ｒｐｍ）した。
一方、中心細孔直径２．６、又は４．２ｎｍを有するＦＳＭ型メソポーラスシリカは、稲垣らの方法（S. Inagaki et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., pp.680-682 (1993)）を参考にして、合成した。
具体的には、まずヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド（３．２ｇ、東京化成工業社製）、或いは、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライド（４．２４ｇ、ライオン・アクゾ社製）を、７０℃の水１００ミリリットルに添加し、溶解後、カネマイト（トクヤマシルテック社製）５ｇを更に添加し、ホットスターラーを用いて７０℃に加熱しながら、３時間撹拌した。これに、２規定塩酸を約１時間かけて添加し、ｐＨ８．５の状態で、約３時間撹拌した。
これらを、吸引濾過した後、７０℃の熱水４００ミリリットルに再分散して濾過する工程を３回繰り返してから風乾した。これを、４５℃で３日間乾燥した後、５５０℃で６時間焼成することにより、２．６ｎｍ（ＦＳＭ２．６）、４．２ｎｍ（ＦＳＭ４．２）、又は、８．０ｎｍ（ＦＳＭ８．０）の中心細孔直径を有するメソポーラスシリカを得た。
【００５６】
（１−２）ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：５．４、８．１、１０．６ｎｍ）の合成
前記のＺｈａｏらの方法を参考にして、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ１２３（ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（ＢＡＳＦ社製））（１０ｇ）を、水３００ミリリットルに添加し、３５℃で一晩撹拌し溶解させた後、これに、塩酸２１．８７ｇ及びオルトケイ酸テトラエチル（和光純薬工業社製）２１．３２ｇを更に添加し、ホットスターラーを用いて３５℃に加熱しながら、約２０時間撹拌した。これを、異なる合成温度（ａ：３５℃、ｂ：１００℃、又は、ｃ：１３０℃）で２４時間静置した。
これを、吸引濾過した後、８０℃の熱水４００ミリリットルに再分散して濾過する工程を３回繰り返してから風乾した。これを、４５℃で３日間乾燥した後、時間あたり１０５℃の速度で５５０℃まで昇温させ、更に、これを、５５０℃で１０時間焼成することにより、５．４ｎｍ（ＳＢＡ５．４）、８．１ｎｍ（ＳＢＡ８．１）、又は、１０．６ｎｍ（ＳＢＡ１０．６）の中心細孔直径を有するメソポーラスシリカを得た。なお、図１に、類似のＳＢＡ型メソポーラスシリカ、及び、典型的なＳＢＡ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ型、ＦＳＭ型のメソポーラスシリカの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）の像を示す。
【００５７】
（実施例１）ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体の製造及び酵素反応
本実施例では、各種メソポーラスシリカに対するアゾ還元酵素（ＡｚｏＲ：配列番号５）及びグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ：配列番号６）の固定化と酵素活性の評価を行った。図２に、メソポーラスシリカの規則性細孔（シリカ細孔）に固定化したＡｚｏＲ及びＧＤＨを備えたＡｚｏＲ−ＧＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体のうちＡｚｏＲと難分解性化学染料（アゾ染料：メチルレッド）が相互作用し、更に、ＧＤＨによる補酵素（ＮＡＤＨ）の再生系を組み込み酸化型ＮＡＤ＋から還元型ＮＡＤＨに再生することができるようになった結果、アゾ染料が高効率かつ持続的に分解される様子を模式的に表した説明図を示す。
【００５８】
（１−１）ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体の製造
＜ＡｚｏＲ及びＧＤＨのメソポーラスシリカへの固定化＞
酵素の固定化支持体には、メソポーラスシリカとして、（製造例１）により得られた中心細孔直径の異なる２種類のメソポーラスシリカ：１）ＦＳＭ-２２（中心細孔直径：８．０ｎｍ）及び２）ＳＢＡ-１５（中心細孔直径：８．１ｎｍ）を使用した。また、比較のための非多孔質球状シリカとして、シーホスター ＫＥ-Ｓ１００（日本触媒社製、平均粒子径：０．７６μｍ）を使用した。
また、シリカ結合タンパク質（Ｓｉ-ｔａｇ）として、Escherichia coli由来のｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ２（アミノ酸残基数：２７３、分子量：約３０ｋＤ）（以下、単に「Ｓｉ-ｔａｇ」ともいう。）、及び、上記ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ２のＣ末端側配列（アミノ酸残基数：７１）からなるＳｉ-ｔａｇのＣ末側断片（「Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１」ともいう。）を適用し、「Ｓｉ-ｔａｇ」を融合させたアゾ還元酵素（ＡｚｏＲ）及び「Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１」を融合させたグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）を遺伝子組換え大腸菌を利用したタンパク発現系により作製した。
具体的には、アゾ還元酵素としてEscherichia coli由来のＡｚｏＲ（二量体、アミノ酸残基数：２０１、分子量（単量体）：約２３ｋＤ）を用いた。まず、ＡｚｏＲ遺伝子をｐＥＴ１００／Ｄ-ＴＯＰＯベクターに挿入し、そのＮ末端側にリンカー（配列番号８）を介して上記「Ｓｉ-ｔａｇ」遺伝子を融合させて「Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ」遺伝子を合成した。
グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）としては、Bacillus megaterium由来のＧＤＨ（四量体、アミノ酸残基数：２６１、分子量（単量体）：約２８ｋＤ）のＮ末端側に上記「Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１」を融合させた「Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ」の遺伝子をサーモフィッシャーサイエンティフィック社の人工遺伝子合成サービス「Ｇｅｎｅ Ａｒｔ」により合成した。「Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ」及び「Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ」は、前記合成遺伝子を組換え大腸菌に導入し、大腸菌タンパク発現系を利用して製造した。Ｓｉ-ｔａｇを融合していないBacillus sp.由来のＧＤＨは和光純薬工業社から購入した。
【００５９】
＜ＡｚｏＲ及びＧＤＨのメソポーラスシリカ複合体によるアゾ染料の還元分解反応の実験手順＞
アゾ還元酵素（ＡｚｏＲ）及びグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）による補酵素再生系を利用したアゾ染料（メチルレッド）の還元分解反応の概略は、図３（ａ）に示すとおりである。
ＡｚｏＲ及びＧＤＨをＳｉ-ｔａｇを介して又は介さずにメソポーラスシリカに固定化したメソポーラスシリカとの複合体の製造法、メチルレッドの分解反応、固定化酵素サンプル回収及び再使用の開始までの手順（図３（ｂ））を示す。
【００６０】
＜Ｓｉ-ｔａｇを介した酵素−メソポーラスシリカ複合体の製造方法＞
図３（ｂ）に記載の手順に従い、Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ（３μｇ）を含んだ酵素溶液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５））０．１ｍＬと、予めマイクロチューブに量り取ったシリカ微粒子粉末（ＦＳＭ-２２又はＳＢＡ-１５）０．５ｍｇとを、ローテーターを用いて１７時間以上４℃で穏やかに混合することによって、ＡｚｏＲ−メソポーラスシリカ複合体を得た。以下、「Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−ＦＳＭ」又は「Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−ＳＢＡ」という。
同様の手順を、Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ（３μｇ）及びＧＤＨ（３μｇ）を含んだ酵素溶液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５））０．１ｍＬとの混合液０．２ｍＬと、シリカ微粒子粉末（ＦＳＭ-２２又はＳＢＡ-１５）０．５ｍｇとに適用してＡｚｏＲ−ＧＤＨ−メソポーラスシリカ複合体を得た。以下、「Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−ＦＳＭ」又は「Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−ＳＢＡ」という。
さらに、同様の手順を、Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ（３μｇ）及びＳｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ（３．８μｇ）を含んだ酵素溶液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５））０．１ｍＬとの混合液０．２ｍＬと、メソポーラスシリカ微粒子粉末（ＦＳＭ-２２又はＳＢＡ-１５）０．５ｍｇとに適用してＡｚｏＲ−ＧＤＨ−メソポーラスシリカ複合体を得た。以下、「Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ−ＦＳＭ」又は「Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ−ＳＢＡ」という。
比較のために非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）を用いて、同様の手順によりそれぞれの複合体を得た。以下、「Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−ＫＥ-Ｓ１００」「Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−ＫＥ-Ｓ１００」または「Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ−ＫＥ-Ｓ１００」という。（これらをあわせて「酵素−シリカ微粒子複合体」ということもある。）
【００６１】
＜強塩濃度下の高濃度界面活性剤存在下でのＳｉ-ｔａｇを介した酵素−メソポーラスシリカ複合体の製造方法＞
次いで、図３（ｂ）記載の酵素固定化による複合体の製造方法として、酵素の固定化及び洗浄のいずれも強塩濃度下の高濃度界面活性剤存在下で行った。
具体的には、Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ（３μｇ）と共にＳｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ（３．８μｇ）を含んだ酵素溶液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８）、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）０．２ｍＬと、予めマイクロチューブに量り取ったシリカ微粒子粉末０．５ｍｇとを、ローテーターを用いて１７時間以上４℃で穏やかに混合した後、遠心分離を行い、上清を全て除去することによって、酵素−シリカ微粒子複合体の前駆体を得た。
続いて、洗浄用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８）、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）１ｍＬを添加し、Ｖｏｒｔｅｘ  Ｍｉｘｅｒを用いて約５秒間室温で攪拌し、前記酵素−シリカ微粒子複合体の前駆体を再懸濁した後、遠心分離を行い、上清を全て除去する洗浄操作を行った。再び、前記洗浄用緩衝液１ｍＬを用いて洗浄操作を繰り返し、さらに２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）０．２ｍＬを用いて再懸濁し、最終的に、強塩濃度下の高濃度界面活性剤存在下で固定化した「Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）」並びに「Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ−ＫＥ-Ｓ１００」を得た。
【００６２】
（１−２）メチルレッドの分解活性の評価
（１−１）で得られたＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体などの各種複合体それぞれの酵素活性を、反応基質としてのアゾ染料（メチルレッド）及びグルコースを添加して補酵素再生系を働かせ、メチルレッドの分解率（脱色率）により評価した。
具体的には、図３（ｂ）に示したように、（１−１）で得られた「Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）」などの各種複合体それぞれに対して、以下の酵素反応を起こさせ、それぞれのメチルレッドの脱色率を測定した。
【００６３】
酵素反応は、分光光度計用セル内においてあらかじめマイクロ撹拌子を用いて撹拌（２５０ｒｐｍ）しながら３０℃で１０分間の予備加温を行ったメチルレッド、グルコース、また、補酵素を含んだ反応基質（２．９ｍＬ、あるいは、２．８ｍＬ）に対して、上記ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体の分散液０．１ｍＬ、又は、上記ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体の分散液０．２ｍＬを添加することによって開始した。
その際、最終反応組成が、「２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、０．１ｍＭ  メチルレッド、０．１ｍＭ  ＮＡＤＨ、１μＭ  ＦＭＮ、１０ｍＭ  グルコース、１μｇ／ｍＬ  ＡｚｏＲ、１〜１．３μｇ／ｍＬ  ＧＤＨ、反応液量：３ｍＬ」となるように調整した。
反応条件は、マイクロ撹拌子を用いて撹拌（２５０ｒｐｍ）しながら３０℃で６０分間の加温状態を保持することとした。本反応には、分光光度計（島津製作所社製、ＵＶ−２４５０）を使用し、４３０ｎｍ、または、３４０ｎｍの吸光度変化を観測することによって、メチルレッドの分解率（脱色率）、または、ＮＡＤＨの消費率及び再生率を評価した。
【００６４】
次いで、反応後の固定化酵素サンプルを遠心分離によって回収し、上清を除去した後、新しい反応基質溶液を添加することによって、反応２回目以降の酵素活性測定を行った（再利用性評価）。
さらに、反応評価後の固定化酵素サンプルにＳＤＳ-ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（２０μＬ）を加えた後、９５℃で５分間加温し、遠心分離後の上清をＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）で解析することによって、シリカ微粒子からの酵素の脱離の程度を評価した。
【００６５】
（実施例２）異種酵素の活性評価（Ｓｉ-ｔａｇ融合ＡｚｏＲ及びＳｉ-ｔａｇ未融合ＧＤＨの場合）
（２−１）メソポーラスシリカへの固定化による酵素活性低下の抑制効果
実施例（１−２）の通り、遊離の未固定の異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ及びＧＤＨ）、又はこれら異種酵素と各種シリカ粒子との複合体を用いて、メチルレッド及びグルコースを反応基質としたメチルレッド分解反応（３０℃、６０分間）を行い、脱色率を経時的に測定した（図４）。図４における白丸印は、混和した直後の未固定の異種酵素を用いた場合、黒丸印は、４℃で一晩混和した後の未固定の異種酵素を用いた場合、白菱形印は、ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．０ｎｍ）を用いた場合、黒菱形印は、ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．１ｎｍ）を用いた場合、また、白三角印は、ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）を用いた場合を示す。
また、図中、破線は、未固定の遊離Ｓｉ-ｔａｇ−ＡｚｏＲのみを用いた場合のメチルレッドの脱色率（約３０％）、である。
【００６６】
その結果、いずれの場合も、未固定のＳｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲを単独で用いた場合の脱色率（約３０％）よりも高いメチルレッドの脱色率が認められており、これは、ＧＤＨの補酵素再生活性の発現に伴うメチルレッド分解反応の促進を示している（図４）。
未固定の異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ及びＧＤＨ）を用いた場合、混和直後にメチルレッドの分解反応を行った場合には反応６０分後の脱色率（１００％）であったが、異種酵素を混和して一晩放置後に分解反応に用いた場合には、異種酵素間の凝集体形成が引き起こされ、脱色率の大幅な低下が示された（脱色率：３７％）。
一方、固定化酵素では、酵素の固定化操作時に一晩、混和しているにもかかわらず、凝集体形成は起こさず、ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−ＫＥ-Ｓ１００複合体では、反応活性の増大が示され（脱色率：５１％）、ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体では、さらに著しい反応活性の促進効果が認められた（脱色率：８３％（ＦＳＭ型）、７７％（ＳＢＡ型））。
【００６７】
（２−２）メソポーラスシリカ固定化酵素における補酵素再生系の共役効果
単一酵素（Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ）、又は異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ及びＧＤＨ）を、遊離の状態で反応させた場合、及び各種シリカ粒子に固定化した場合のそれぞれについて、実施例（１−２）の通り６０分間反応させてメチルレッドの脱色率（反応１回目）を測定し、次いで同じ系を繰り返し再利用した場合のメチルレッドの脱色率（反応２回目）を測定し、その反応終了後にシリカ粒子からの酵素の脱離を評価した（図５（ａ））。その際、シリカ粒子としては、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．０ｎｍ）、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．１ｎｍ）、及び非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）を用い、異種酵素を固定化する際には、Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ及びＧＤＨを同時にシリカ粒子に一晩混和させて吸着させた。
【００６８】
その結果、３種類のＳｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−シリカ微粒子複合体において、Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲのみを固定化した場合と比較してより高いメチルレッドの脱色率が認められ、これは、Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−シリカ微粒子複合体が固定化状態にもかかわらず、異種酵素の双方の活性を有していることを示している。特に、２種類のメソポーラスシリカに固定化した異種酵素では、一晩、混和した後の未固定の異種酵素の場合（脱色率：３７％）よりも２倍以上高いメチルレッドの分解活性が示された（脱色率：８３．２％（ＦＳＭ型）、７６．８％（ＳＢＡ型））。
これらの実験結果は、Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−メソポーラスシリカ複合体が酵素の凝集体形成を抑制しながら異種酵素を安定的に固定化できるという、酵素の凝集失活の抑制能を有している結果、酵素活性が著しく向上した可能性を示している。しかし、反応１回目の後に回収した固定化酵素を再び反応に使用した結果、Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲのみを固定化した場合と同等のメチルレッドの脱色率が示され、さらに、反応後のシリカ粒子からの酵素の脱離を調べた結果、特に、ＧＤＨが脱離しやすく、大半のＧＤＨが反応系外に排除されている可能性が示唆された。以上より、Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−メソポーラスシリカ複合体が反応１回目においては極めて高い反応活性を発現するが、回収した固定化酵素の再利用性は低いことが明らかとなった。
【００６９】
（２−３）メソポーラスシリカへの固定化順序の検討
（２−２）の結果で、Ｓｉ-ｔａｇと融合させていないＧＤＨは、メソポーラスシリカの場合であっても反応２回目に繰り返し使用した場合に脱離してしまったことから、本実施例では予めＧＤＨをメソポーラスシリカに固定化させてから、Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲの固定化を行った。
具体的には、ＦＳＭ又はＳＢＡ粒子とＧＤＨを一晩混和し、次いでＳｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲを加えて一晩混和したＳｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−ＧＤＨ−メソポーラスシリカ複合体を用いて、（２−２）と同様の実験を行った。
【００７０】
その結果、２回の繰り返し反応後でもＧＤＨの脱離は認められなかったものの、反応１回目からメチルレッドの分解活性が低く、ＧＤＨの補酵素再生能が効率良く機能しなかったことが示された（図５（ｂ））。このことから、ＧＤＨをＳｉ-ｔａｇと融合していない状態でメソポーラスシリカの細孔内にまず固定化してしまうと、Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲが細孔内でＧＤＨと共役的反応可能な位置にもはや配置できないことが推察された。
【００７１】
（実施例３）Ｓｉ-ｔａｇ融合ＧＤＨの調製および特性評価（比活性、シリカ吸着能）
（３−１）Ｓｉ-ｔａｇ又はその断片とＧＤＨとの融合体の調製
（実施例２）の結果を受けて、ＧＤＨについてもＳｉ-ｔａｇ融合ＧＤＨを用いることを検討した。しかし、ＧＤＨは四量体で分子量も大きいため、各単量体のＮ末端にＳｉ-ｔａｇを融合したＳｉ-ｔａｇ-ＧＤＨはさらにサイズが大きく、特に細孔径の小さいメソポーラスシリカの場合に、その高次構造を保ったままで細孔内へ固定化することが難しいことが予想された。
そこで、本実施例では、Ｓｉ-ｔａｇ（全長）を融合させたＳｉ-ｔａｇ-ＧＤＨと共に、Ｓｉ-ｔａｇのＣ末端側断片及びＮ末端側断片との融合体についても調製し、その特性を調べることとした。
まず、Ｓｉ-ｔａｇのＣ末端側断片としてＳｉ-ｔａｇのＣ末端側配列の７１アミノ酸残基（配列番号３）をＧＤＨに融合したＳｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨを、またＳｉ-ｔａｇのＮ末端側配列の６０アミノ酸残基（配列番号２）が融合したＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＤＨを、大腸菌タンパク発現系により製造した。
詳細には、サーモフィッシャーサイエンティフィック社の人工遺伝子合成サービス「Ｇｅｎｅ Ａｒｔ」を利用して、各配列の合成遺伝子をｐＥＴ３０２／ＮＴ-Ｈｉｓベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に挿入したＳｉ-ｔａｇ-ＧＤＨ-ｐＥＴ３０２／ＮＴ-Ｈｉｓ（７２８８塩基対）、Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ-ｐＥＴ３０２／ＮＴ-Ｈｉｓ（６６８２塩基対）、及びＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＤＨ-ｐＥＴ３０２／ＮＴ-Ｈｉｓ（６６４９塩基対）を作製した。
上記プラスミドＤＮＡにより形質転換した大腸菌（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ ＤＥ３ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）により目的の酵素を発現させ、得られた各Ｓｉ-ｔａｇ融合ＧＤＨを、Ｈｉｓ-ｔａｇ融合タンパク質精製用クロマトグラフィー担体（Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）で精製した。
【００７２】
得られた３種類のＳｉ-ｔａｇ融合ＧＤＨのタンパク濃度を図６の（ａ）に示す。
各種ＧＤＨのタンパク濃度は、Ｓｉ-ｔａｇを融合していないＧＤＨ（Ｎｏｒｍａｌ ＧＤＨ）で最も高くなり、Ｓｉ-ｔａｇ融合ＧＤＨでは付加されたＳｉ-ｔａｇのアミノ酸残基数に反比例したタンパク濃度の増減が示された。なお、図中Ｎｏｒｍａｌ ＧＤＨは、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＧＤＨである。
また、精製後の酵素（各２μｇ）のＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）の解析結果から見て、Ｓｉ-ｔａｇ-ＧＤＨ、Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＤＨのいずれも正しく合成されている（図６（ｃ））。
【００７３】
（３−２）各Ｓｉ-ｔａｇ融合ＧＤＨの比活性の比較
Ｓｉ-ｔａｇ-ＧＤＨ、Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＤＨ及びＮｏｒｍａｌ ＧＤＨのそれぞれを、基質のグルコース（１０ｍＭ）及びβ-ＮＡＤ＋（３ｍＭ）を含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）緩衝液中に添加し、「酵素濃度：３１．６ｎＭ、反応液量：３ｍＬ、反応温度：３０℃、反応時間：６０分間」の条件で反応させた。酵素反応中、分光光度計用セル内においてマイクロ撹拌子を用いて反応溶液を撹拌（２５０ｒｐｍ）しながら経時的に吸光度を測定し、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを生成する酵素量（又はモル数）を１ｕｎｉｔとし、酵素活性（比活性）を評価した。
反応開始後５〜１０分間における３４０ｎｍでの吸光度変化から、それぞれのＮＡＤＨ生成量を測定し、比活性を求めて比較したところ、酵素の比活性は、Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨが最も高かった（図６（ｂ））。
【００７４】
（３−３）シリカ粒子への吸着能の比較
各Ｓｉ-ｔａｇ-ＧＤＨのシリカ表面への結合活性を調べるために、細孔を有さない非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）を用い、各Ｓｉ-ｔａｇ融合体及び未融合ＧＤＨのシリカ粒子への吸着能を評価した（図７）。
具体的には、各種ＧＤＨ（１５μｇ）を含んだ酵素溶液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８）、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）０．５ｍＬと、予めマイクロチューブに量り取った非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）粉末１００ｍｇとを、ローテーターを用いて１時間、室温で穏やかに混合した後、遠心分離（１５，０００〜２０，０００Ｇ、５分間）を行い、上清を回収した。続いて、この上清及び吸着操作前の酵素溶液０．５ｍＬに対して、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）による精製を行った後、ＳＤＳ-ＰＡＧＥに供した。
【００７５】
一方、遠心分離後に沈殿したシリカ粒子に対して、洗浄用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８）、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）１ｍＬを添加し、Ｖｏｒｔｅｘ  Ｍｉｘｅｒを用いて約５秒間室温で攪拌することで前記沈殿シリカ粒子を再懸濁した後、ローテーターを用いて１０分間、室温で穏やかに混合し、続いて、遠心分離（１５，０００〜２０，０００Ｇ、５分間）を行い、上清を全て除去する洗浄操作を行った。再び、前記洗浄用緩衝液１ｍＬを用いて洗浄する工程を２回繰り返し、さらに、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８）１ｍＬを添加し、Ｖｏｒｔｅｘ  Ｍｉｘｅｒを用いて再懸濁した後、遠心分離（１５，０００〜２０，０００Ｇ、５分間）を行い、上清を全て除去した。最終的には、洗浄後の沈殿シリカ粒子にＳＤＳ-ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（０．２ｍＬ）を加えた後、９５℃で５分間加温し、遠心分離後の上清をＳＤＳ-ＰＡＧＥに供した。
図中、レーン１、４、７、１０は、吸着操作前の各種ＧＤＨ、レーン２、５、８、１１は、吸着操作後の上清、また、レーン３、６、９、１２は、ＧＤＨとＫＥ-Ｓ１００との複合体をＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ中で加熱処理（９５℃、５分間）した後の上清、をＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）で解析した結果である。また、図中、（ａ）は、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＧＤＨ（Ｎｏｒｍａｌ ＧＤＨ）の場合、（ｂ）は、Ｓｉ-ｔａｇの全配列が融合したＧＤＨ（Ｓｉ-ｔａｇ-ＧＤＨ）の場合、（ｃ）は、Ｓｉ-ｔａｇのＣ末端側配列の７１アミノ酸残基が融合したＧＤＨ（Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ）の場合、また、（ｄ）は、Ｓｉ-ｔａｇのＮ末端側配列の６０アミノ酸残基が融合したＧＤＨ（Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＤＨ）の場合、である。
【００７６】
その結果、Ｓｉ-ｔａｇを融合していないＧＤＨ（Ｎｏｒｍａｌ ＧＤＨ）では吸着操作後の上清に未吸着の酵素の存在を示唆する３２ｋＤａ付近のバンドが示され（レーン２）、シリカ粒子への酵素の結合は認められなかった（レーン３）のに対して、３種類のＳｉ-ｔａｇ融合ＧＤＨでは吸着操作後の上清に酵素は遊離しておらず（レーン５、８、１１）、当該融合酵素がシリカ粒子に対する高い吸着能を有していることが明瞭に示された（レーン６、９、１２）。
【００７７】
シリカ粒子への吸着能については、Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ及びＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＤＨのいずれも全長Ｓｉ-ｔａｇと遜色なく高い吸着能が確認された。そこで、以下の実験では、前記（３−２）の比活性比較実験で最も高い酵素活性を有し、かつＮｏｒｍａｌ ＧＤＨの約２倍の比活性を有するＳｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ（図６（ｂ））を用いた。
【００７８】
（実施例４）異種酵素の活性評価（Ｓｉ-ｔａｇ融合ＡｚｏＲ及びＳｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１融合ＧＤＨの場合）
本実施例では、（実施例２）で用いた「Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ」と共に、（実施例３）で検討した「Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ」を含む緩衝液を用い、実施例（１−１）の方法に従って、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．０ｎｍ）、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．１ｎｍ）、及び非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）の各微粒子に対して固定化処理を行い、３種類の「Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ−シリカ微粒子複合体」を形成させた。
コントロールとして遊離の未固定「Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ」及び「Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ」を用い、実施例（２−１）と同様のアゾ染料（メチルレッド）脱色実験を行い、反応６０分後のメチルレッドの脱色率（反応１回目）、また、固定化酵素を繰り返し再利用した場合のメチルレッドの脱色率（反応２回目）を評価した（図８）。なお、未固定の遊離酵素による脱色反応は、一晩、混和した後の脱色率を測定した。
【００７９】
その結果、３種類のＳｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ−シリカ微粒子複合体のいずれもが未固定酵素の場合（４１．３％）よりも２倍以上高い分解活性を示した。特にメソポーラスシリカでは、ＦＳＭ型で脱色率：９７．６％、ＳＢＡ型で９８．５％もの分解活性であったばかりか、反応２回目においても反応１回目の８割程度の活性を保持した（ＦＳＭ：７５．９％、ＳＢＡ：７６．８％）。
【００８０】
図５（ａ）及び図８の実験結果を、まとめたグラフを図９の（ａ）（ｂ）に示す。図中、白丸印は、単一酵素（Ｓｉ-ｔａｇ融合ＡｚｏＲ）を用いた場合、黒丸印は、異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ融合ＡｚｏＲとＳｉ-ｔａｇ未融合ＧＤＨ）を用いた場合、また、白菱形印は、異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ融合ＡｚｏＲとＳｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１融合ＧＤＨ）を用いた場合、である。また、図中、（ａ）は、反応１回目のメチルレッドの脱色率、また、（ｂ）は、固定化酵素を繰り返し再利用した反応２回目のメチルレッドの脱色率、である。
【００８１】
図９（ａ）によれば、遊離の未固定の異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ-ＧＤＨ、あるいは、Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ）によるメチルレッドの脱色率は、Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ単独の場合と同等であり、酵素の凝集体形成に起因する酵素活性の低下の可能性が示された。一方、シリカ粒子に固定化した異種酵素では、酵素の凝集失活が抑制され、補酵素再生系が効率良く機能した結果、メチルレッドの脱色率が著しく向上した。特に、双方の酵素にＳｉ-ｔａｇを融合したＳｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨを用い、さらに２種類のメソポーラスシリカ（ＦＳＭ型及びＳＢＡ型）と融合した場合に酵素活性が飛躍的に向上し（図９（ａ））、また、固定化酵素の繰り返し耐久性（再利用性）も改善された（図９（ｂ））。
【００８２】
これらの実験結果より、メソポーラスシリカ複合体を用いる場合、共役的な酵素反応を行う異種酵素のいずれか少なくとも１つをＳｉ-ｔａｇ融合体とすることで、酵素の凝集体形成を抑制しながら固定化異種酵素間の共役的な酵素反応により、酵素活性が高まる効果（図４及び５）が追認できた。さらに、当該異種酵素のそれぞれをＳｉ-ｔａｇ特異的にシリカ表面と結合したことで、メソポーラスシリカの細孔内で両酵素の触媒部位を配向制御でき、反応基質との接触頻度が増大した結果、共役的な酵素反応が効率的に行われ、酵素活性が飛躍的に向上することが確認でき、その共役的な酵素反応活性の向上効果は２回の繰り返し使用にも耐えられることがわかった（図８）。また、Ｓｉ-ｔａｇ融合した酵素では、反応２回目でもシリカ粒子からの脱離を抑制できる（図５、図８）ため、固定化酵素の再利用性が著しく向上する。
【００８３】
また、メソポーラスシリカのシリカ細孔は、メチルレッドの分解反応における異種酵素の凝集体形成の抑制場および酵素活性を安定の保持することで異種酵素機能を最大限に発揮させることのできる酵素の集積組立場として好適であることが判明した。さらに、Ｓｉ-ｔａｇを融合した異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ及びＳｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ）をシリカ細孔に固定化することにより、補酵素再生系を組み込んだ酵素反応における反応活性および再利用性の向上効果が認められた。
【００８４】
（実施例５）異種酵素の活性評価（Ｓｉ-ｔａｇ融合ＡｚｏＲ及びＳｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１融合ＧＤＨの固定化における塩および界面活性剤の影響）
本実施例では、異種酵素にＳｉ-ｔａｇ又はその断片の融合体の調製時と共に、シリカ粒子への固定化及び固定化後の洗浄操作時に、高濃度の塩及び界面活性剤の存在条件で行い、シリカ粒子への特異性を高めた場合について、酵素活性評価を行った。
（５−１）２回の繰り返し実験結果
（実施例４）の「Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ」を、塩（０．５Ｍ  塩化ナトリウム）及び界面活性剤（０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を含んだ緩衝液（ｐＨ８）を用いて酵素溶液を調製し、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．０ｎｍ）、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．１ｎｍ）、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）に対して固定化し、同じ組成の緩衝液で洗浄した。
得られた各融合固定化酵素と、遊離の未固定「Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ」の反応１回目のメチルレッドの脱色率（図１０（ａ））及び固定化酵素を繰り返し再利用した反応２回目のメチルレッドの脱色率（図１０（ｂ））を（実施例４）と同様に行った。
【００８５】
その結果、遊離の未固定の異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ）、また、３種類のＳｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ−シリカ微粒子複合体によるメチルレッドの脱色率は、いずれも１００％を示した。未固定酵素の反応組成は、その他の固定化酵素とは異なり、微量の塩（３３ｍＭ塩化ナトリウム）及び界面活性剤（０．０３％  Ｔｗｅｅｎ２０）が含まれており、厳密には同条件での反応評価といえないが、異種酵素溶液の調製時に、塩（０．５Ｍ  塩化ナトリウム）及び界面活性剤（０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を含んだ緩衝液（ｐＨ８）を使用したことによって酵素の凝集失活が抑制された結果、極めて高い酵素活性が発現した可能性が示された。同様に、シリカ粒子に固定化した異種酵素においても、異種酵素溶液の調製時、また、シリカ粒子への固定化及び固定化後の洗浄操作時に、塩（０．５Ｍ  塩化ナトリウム）及び界面活性剤（０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を含んだ緩衝液（ｐＨ８）を使用したことによって、凝集体を形成せず分散した状態の酵素をシリカ表面と相互作用することができるようになり、さらに、塩および界面活性剤、ｐＨの違いによる効果によって、Ｓｉ-ｔａｇ特異的にシリカ表面と結合できる酵素の相対的な分子数が増大し、また、ＡｚｏＲ及びＧＤＨの触媒部位を配向制御でき、反応基質との接触頻度が増大した結果、酵素活性が飛躍的に向上し（図１０（ａ））、また、固定化酵素の繰り返し耐久性（再利用性）も改善され、反応２回目のメチルレッドの脱色率はいずれのシリカ粒子を用いた場合にも１００％に達した（図１０（ｂ））。
【００８６】
（５−２）繰り返し耐久性（再利用性）試験
図１１に、各種シリカ粒子に対する異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ）の固定化及び洗浄操作時に、塩（０．５ Ｍ 塩化ナトリウム）及び界面活性剤（０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を含んだ緩衝液を利用した場合の反応６０分後のメチルレッドの脱色率について、図１０（反応１、２回目）に対してさらに反応３〜５回目の固定化酵素の繰り返し再利用の実験結果を追加し、繰り返し耐久性（再利用性）を評価した結果を示す。図中、白四角印は、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．０ｎｍ）を用いた場合、黒菱形印は、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．１ｎｍ）を用いた場合、また、白三角印は、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）を用いた場合、である。
【００８７】
その結果、メチルレッドの分解反応における３種類のＳｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ−シリカ微粒子複合体の繰り返し耐久性（再利用性）は、ＳＢＡ型メソポーラスシリカを適用した場合が最も高く、次いで、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）の順に再利用性が低下する傾向が示された。
【００８８】
（５−３）繰り返し使用持の酵素活性の経時変化
また、図１２（ａ）〜（ｄ）に、図１１の反応１〜３回目の実験結果について、異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ）とシリカ粒子との複合体を用いたメチルレッドの分解反応（３０℃、６０分間）における脱色率の経時変化を示した結果を示す。図中、白四角印は、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．０ｎｍ）を用いた場合、黒菱形印は、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．１ｎｍ）を用いた場合、また、白三角印は、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）を用いた場合、である。また、図中、（ａ）は、反応１回目、（ｂ）は、反応２回目、（ｃ）は、反応３回目、また、（ｄ）は、反応３回目のメチルレッドの分解反応における各種固定化酵素の比活性の結果をまとめた表、である。
【００８９】
図１２（ａ）〜（ｃ）より、固定化酵素の再利用回数が増大すると共にメチルレッドの脱色率が１００％に達するまでに要する反応時間が延びており、すなわち、反応速度が徐々に低下する傾向が認められた。３種類のＳｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ−シリカ微粒子複合体の反応速度は、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）の順に高く、図１２（ｄ）より、反応３回目の酵素の比活性は、ＫＥ-Ｓ１００を用いた場合と比較して、ＳＢＡ型メソポーラスシリカで５倍近く、また、ＦＳＭ型メソポーラスシリカで約３倍増大した。この反応３回目の結果も勘案すれば、酵素の繰り返し耐久性に与えるメソポーラスシリカの優位性が認められたといえる。
【００９０】
以上の結果から、異種酵素（Ｓｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ）−メソポーラスシリカ複合体の調製において、異種酵素溶液の調製時、また、メソポーラスシリカへの固定化及び固定化後の洗浄操作時に、塩（０．５Ｍ  塩化ナトリウム）及び界面活性剤（０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を含んだ緩衝液（ｐＨ８）を使用することにより、補酵素再生系を組み込んだ酵素反応における反応活性および繰り返し耐久性（再利用性）の飛躍的な向上効果が認められた。特に、固定化酵素の再利用性に関して、非多孔質球状シリカを用いた場合と比較して、メソポーラスシリカを用いた場合により優れた効果が認められ、メソポーラスシリカ細孔への固定化による異種酵素の安定性向上効果が確認された。
【００９１】
（実施例６）ＧＡＤβ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体の製造及び酵素反応
本実施例では、各種メソポーラスシリカに対するグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤβ）の固定化と酵素活性の評価を行った。
【００９２】
（６−１）ＧＡＤβ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体の製造
＜ＧＡＤβのメソポーラスシリカへの固定化＞
酵素の固定化支持体には、メソポーラスシリカとして、（製造例１）により得られた中心細孔直径の異なる２種類のメソポーラスシリカ：１）ＦＳＭ-２２（中心細孔直径：８．０ｎｍ）及び２）ＳＢＡ-１５（中心細孔直径：８．１ｎｍ）を使用した。また、高アルミニウム含有メソポーラスシリカとして、Ｃ２２-ｍｅｓｏ（中心細孔直径：６．１ｎｍ）、及び、比較のための非多孔質球状シリカとして、シーホスター ＫＥ-Ｓ１００（日本触媒社製、平均粒子径：０．７６μｍ）を使用した。
また、上記ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ２のＮ末端側配列（アミノ酸残基数：６０）からなるＳｉ-ｔａｇのＮ末側断片（「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０」）を融合させたグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤβ）を遺伝子組換え大腸菌を利用したタンパク発現系により作製した。
具体的には、グルタミン酸脱炭酸酵素としてEscherichia coli由来のＧＡＤβ（六量体、アミノ酸残基数：４６６、分子量（単量体）：約５０ｋＤ、配列番号７）のＮ末端側に上記「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０」を融合させた「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβ」の遺伝子をサーモフィッシャーサイエンティフィック社の人工遺伝子合成サービス「Ｇｅｎｅ Ａｒｔ」により合成した。「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβ」は、前記合成遺伝子を組換え大腸菌に導入し、大腸菌タンパク発現系を利用して製造した。
【００９３】
＜ＧＡＤβ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体によるグルタミン酸の脱炭酸反応の実験手順＞
グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤβ）を用いたグルタミン酸の脱炭酸反応によるγ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）生成の概略は、図１３（ａ）に示すとおりである。
ＧＡＤβを固定化したシリカ微粒子（メソポーラスシリカ、あるいは、非多孔質球状シリカ）の製造法、グルタミン酸の脱炭酸反応、固定化酵素サンプル回収及び再使用の開始までの手順（図１３（ｂ））を示す。
＜ＧＡＤβ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体の製造方法＞
図１３（ｂ）に記載の手順に従い、２０ｍＭ  グルタミン酸−１００ｍＭ  塩酸エチルアミン（ｐＨ４）０．９ｍＬ、５０ｍＭ  ＤＴＴ０．０１ｍＬ、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβ（１２８ｐｍｏｌ）０．０５ｍＬの混合液（０．９６ｍＬ）と、予めマイクロチューブに量り取ったシリカ微粒子粉末（ＦＳＭ-２２、ＳＢＡ-１５又はＣ２２-ｍｅｓｏ）０．５ｍｇとを、ローテーターを用いて１０分間３７℃で穏やかに混合することによって、ＧＡＤβ−メソポーラスシリカ複合体を得ることができる。別法として、グルタミン酸-塩酸エチルアミン（ｐＨ４）及びＤＴＴの混合液（０．９１ｍＬ）と、シリカ微粒子粉末（ＦＳＭ-２２、ＳＢＡ-１５又はＣ２２-ｍｅｓｏ）とを混和した後に、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβ（１２８ｐｍｏｌ）を添加し、ローテーターにより穏やかに混合することもできる。本実施例では、別法によりＧＡＤβ−メソポーラスシリカ複合体を得た。以下、「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβ−ＦＳＭ」、「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβ−ＳＢＡ」又は「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβ−Ｃ２２-ｍｅｓｏ」という。
比較のために非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）を用いて、同様の手順によりそれぞれの複合体を得た。以下、「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβ−ＫＥ-Ｓ１００」という。
【００９４】
（６−２）グルタミン酸の脱炭酸によるγ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の生成活性の評価
（６−１）で得られたＧＡＤβ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体などの各種複合体それぞれの酵素活性を、反応基質としてのＬ-グルタミン酸、及び、生成物としてのγ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の反応後のモル濃度により評価した。
具体的には、図１３（ｂ）に示したように、（６−１）で得られた「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）（Ｃ２２-ｍｅｓｏ）」などの各種複合体それぞれに対して、以下の酵素反応を起こさせ、それぞれのグルタミン酸及びＧＡＢＡのモル濃度を測定した。
【００９５】
酵素反応は、定温恒温器内においてあらかじめローテーターを用いて穏やかに混和しながら３７℃で１０分間の予備加温を行った上記Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβ−シリカ微粒子複合体と反応基質との混合液（０．９６ｍＬ）に対して、１２．５ｍＭ  ＰＬＰ０．０４ｍＬを添加することによって開始した。
その際、最終反応組成が、「１８ｍＭ  グルタミン酸−９０ｍＭ  塩酸エチルアミン（ｐＨ  ４）、０．５ｍＭ  ＰＬＰ、５０ｍＭ  ＤＴＴ、１２８ｐｍｏｌ／ｍＬ  ＧＡＤβ、反応液量：１ｍＬ」となるように調整した。
反応条件は、ローテーターを用いて穏やかに混和しながら３７℃で６０分間の加温状態を保持することとした。反応開始後、１、５、１０、１５、３０、６０分間毎に０．１ｍＬずつ反応液を採取し、この回収液を７０℃で１０分間加熱処理し、遠心分離した後の上清に含まれる反応基質（グルタミン酸）及び生成物（ＧＡＢＡ）の定量を行った。本反応には、定温恒温器（ＳＡＮＹＯ社製、ＭＩＲ-１５４）を使用した。また、グルタミン酸及びＧＡＢＡの定量には、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社製、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２ｅ）を使用し、Ｌ-グルタミン酸測定キットＩＩ（ヤマサ社製）、または、ＧＡＢａｓｅ（シグマアルドリッチ社製）を利用した反応系（ＧＡＢａｓｅアッセイ）における、６００ｎｍ、または、３４０ｎｍの吸光度を観測することによって、グルタミン酸、または、ＧＡＢＡのモル濃度を測定し、グルタミン酸の消費及びＧＡＢＡの生成挙動を評価した。
【００９６】
次いで、固定化酵素サンプルの再利用性を評価する場合には、反応３０分後の固定化酵素サンプルを遠心分離によって回収し、新しい反応基質溶液を添加することによって、反応２回目以降の酵素反応を開始した。この際、遠心分離によって回収された上清に対して、上記の定量法により酵素活性測定を行った。
【００９７】
（実施例７）Ｓｉ-ｔａｇ融合ＧＡＤβの調製および特性評価（活性、シリカ吸着能）
（７−１）Ｓｉ-ｔａｇ又はその断片とＧＡＤβとの融合体の調製
ＧＡＤβは六量体で分子量も大きいため、各単量体のＮ末端にＳｉ-ｔａｇを融合したＳｉ-ｔａｇ-ＧＡＤβはさらにサイズが大きく、特に細孔径の小さいメソポーラスシリカの場合に、その高次構造を保ったままで細孔内へ固定化することが難しいことが予想された。
そこで、本実施例では、Ｓｉ-ｔａｇ（全長）を融合させたＳｉ-ｔａｇ-ＧＡＤβと共に、Ｓｉ-ｔａｇのＣ末端側断片及びＮ末端側断片との融合体についても調製し、その特性を調べることとした。
まず、Ｓｉ-ｔａｇのＣ末端側断片としてＳｉ-ｔａｇのＣ末端側配列の７１アミノ酸残基（配列番号３）をＧＡＤβに融合したＳｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＡＤβを、またＳｉ-ｔａｇのＮ末端側配列の６０アミノ酸残基（配列番号２）が融合したＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβを、大腸菌タンパク発現系により製造した。
詳細には、サーモフィッシャーサイエンティフィック社の人工遺伝子合成サービス「Ｇｅｎｅ Ａｒｔ」を利用して、各配列の合成遺伝子をｐＥＴ３０２／ＮＴ-Ｈｉｓベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に挿入したＳｉ-ｔａｇ-ＧＡＤβ-ｐＥＴ３０２／ＮＴ-Ｈｉｓ（７９０３塩基対）、Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＡＤβ-ｐＥＴ３０２／ＮＴ-Ｈｉｓ（７２９７塩基対）、及びＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβ-ｐＥＴ３０２／ＮＴ-Ｈｉｓ（７２６４塩基対）を作製した。
上記プラスミドＤＮＡにより形質転換した大腸菌（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ ＤＥ３ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）により目的の酵素を発現させ、得られた各Ｓｉ-ｔａｇ融合ＧＡＤβを、Ｈｉｓ-ｔａｇ融合タンパク質精製用クロマトグラフィー担体（Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）で精製した。
【００９８】
得られた３種類のＳｉ-ｔａｇ融合ＧＡＤβのタンパク濃度を図１４の（ａ）に示す。
各種ＧＡＤβのタンパク濃度は、Ｓｉ-ｔａｇを融合していないＧＡＤβ（ＮｏｒｍａｌＧＡＤβ）で最も高くなり、Ｓｉ-ｔａｇ融合ＧＡＤβでは付加されたＳｉ-ｔａｇのアミノ酸残基数に反比例したタンパク濃度の増減が示された。なお、図中Ｎｏｒｍａｌ ＧＡＤβは、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＧＡＤβである。
また、精製後の酵素（各２μｇ）のＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）の解析結果から見て、Ｓｉ-ｔａｇ-ＧＡＤβ、Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＡＤβ、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβのいずれも正しく合成されている（図１４（ｂ））。
【００９９】
（７−２）各Ｓｉ-ｔａｇ融合ＧＡＤβの活性の比較
実施例（６−２）の方法に従って、Ｓｉ-ｔａｇ-ＧＡＤβ、Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＡＤβ、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβ及びＮｏｒｍａｌ ＧＡＤβの酵素活性を評価した。実験結果をまとめたグラフを図１５の（ａ）（ｂ）に示す。図中、白菱形印は、Ｎｏｒｍａｌ ＧＡＤβを用いた場合、黒四角印は、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβを用いた場合、白丸印は、Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＡＤβを用いた場合、また、黒三角印は、Ｓｉ-ｔａｇ-ＧＡＤβを用いた場合、である。また、図中、（ａ）は、反応基質（グルタミン酸）のモル濃度、（ｂ）は、生成物（ＧＡＢＡ）のモル濃度、である。
反応開始後１〜６０分間におけるグルタミン酸の消費（図１５（ａ））及びＧＡＢＡの生成（図１５（ｂ））における反応挙動を評価したところ、酵素活性は、Ｎｏｒｍａｌ ＧＡＤβが最も高く、次いで、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβが高かった。
【０１００】
（７−３）シリカ粒子への吸着能の比較
各Ｓｉ-ｔａｇ-ＧＡＤβのシリカ表面への結合活性を調べるために、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）を用い、各Ｓｉ-ｔａｇ融合体及び未融合ＧＡＤβのシリカ粒子への吸着能を評価した（図１６）。
具体的には、各種ＧＡＤβ（１５μｇ）を含んだ酵素溶液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８）、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）０．５ｍＬと、予めマイクロチューブに量り取った非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）粉末１００ｍｇとを、ローテーターを用いて１時間、室温で穏やかに混合した後、遠心分離（１５，０００〜２０，０００Ｇ、５分間）を行い、上清を回収した。続いて、この上清及び吸着操作前の酵素溶液０．５ｍＬに対して、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）による精製を行った後、ＳＤＳ-ＰＡＧＥに供した。
一方、遠心分離後に沈殿したシリカ粒子に対して、洗浄用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８）、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）１ｍＬを添加し、Ｖｏｒｔｅｘ  Ｍｉｘｅｒを用いて約５秒間室温で攪拌することで前記沈殿シリカ粒子を再懸濁した後、ローテーターを用いて１０分間、室温で穏やかに混合し、続いて、遠心分離（１５，０００〜２０，０００Ｇ、５分間）を行い、上清を全て除去する洗浄操作を行った。再び、前記洗浄用緩衝液１ｍＬを用いて洗浄する工程を２回繰り返し、さらに、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８）１ｍＬを添加し、Ｖｏｒｔｅｘ  Ｍｉｘｅｒを用いて再懸濁した後、遠心分離（１５，０００〜２０，０００Ｇ、５分間）を行い、上清を全て除去した。最終的には、洗浄後の沈殿シリカ粒子にＳＤＳ-ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（０．５ｍＬ）を加えた後、９５℃で５分間加温し、遠心分離後の上清をＳＤＳ-ＰＡＧＥに供した。
図中、レーン１、４、７、１０は、吸着操作前の各種ＧＡＤβ、レーン２、５、８、１１は、吸着操作後の上清、また、レーン３、６、９、１２は、ＧＡＤβとＫＥ-Ｓ１００との複合体をＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ中で加熱処理（９５℃、５分間）した後の上清、をＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）で解析した結果である。また、図中、（ａ）は、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＧＡＤβ（ＮｏｒｍａｌＧＡＤβ）の場合、（ｂ）は、Ｓｉ-ｔａｇの全配列が融合したＧＡＤβ（Ｓｉ-ｔａｇ-ＧＡＤβ）の場合、（ｃ）は、Ｓｉ-ｔａｇのＣ末端側配列の７１アミノ酸残基が融合したＧＡＤβ（Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＡＤβ）の場合、また、（ｄ）は、Ｓｉ-ｔａｇのＮ末端側配列の６０アミノ酸残基が融合したＧＡＤβ（Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβ）の場合、である。
【０１０１】
その結果、Ｓｉ-ｔａｇを融合していないＧＡＤβ（ＮｏｒｍａｌＧＡＤβ）では吸着操作後の上清に未吸着の酵素の存在を示唆する５０ｋＤａ付近のバンドが示され（レーン２）、シリカ粒子への酵素の結合は認められなかった（レーン３）のに対して、３種類のＳｉ-ｔａｇ融合ＧＡＤβでは吸着操作後の上清に酵素は遊離しておらず（レーン５、８、１１）、当該融合酵素がシリカ粒子に対する高い吸着能を有していることが明瞭に示された（レーン６、９，１２）。
【０１０２】
シリカ粒子への吸着能については、Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＡＤβ及びＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβのいずれも全長Ｓｉ-ｔａｇと遜色なく高い吸着能が確認された。そこで、以下の実験では、前記（７−２）の活性比較実験でＮｏｒｍａｌ ＧＡＤβに次いで高い酵素活性を有するＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβ（図１５（ａ、ｂ））を用いた。
【０１０３】
（実施例８）Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０融合ＧＡＤβ−メソポーラスシリカ複合体の活性評価  本実施例では、（実施例７）で検討した「Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＧＡＤβ（ＮｏｒｍａｌＧＡＤβ）」及び「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβ」を含む緩衝液を用い、実施例（６−１）の方法に従って、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．０ｎｍ）、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．１ｎｍ）、Ｃ２２-ｍｅｓｏ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：６．１ｎｍ）、及び非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）の各微粒子に対して固定化処理を行い、４種類の「ＮｏｒｍａｌＧＡＤβ−シリカ微粒子複合体」、又は、４種類の「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβ−シリカ微粒子複合体」を形成させた。
【０１０４】
次に、前記の酵素複合体を用い、実施例（６−２）と同様のグルタミン酸の脱炭酸反応を行い、反応３０分後の生成物（ＧＡＢＡ）のモル濃度を指標として、反応１０回分における固定化酵素の繰り返し耐久性（再利用性）を評価した。実験結果をまとめたグラフを図１７の（ａ）（ｂ）に示す。図中、白四角印は、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．０ｎｍ）を用いた場合、黒菱形印は、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．１ｎｍ）を用いた場合、白三角印は、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）を用いた場合、また、黒丸印は、Ｃ２２-ｍｅｓｏ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：６．１ｎｍ）を用いた場合、である。また、図中、（ａ）は、ＮｏｒｍａｌＧＡＤβの場合、（ｂ）は、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβの場合、である。
【０１０５】
その結果、４種類のＮｏｒｍａｌＧＡＤβ−シリカ微粒子複合体のいずれもが繰り返し回数が増大するとともにＧＡＢＡ濃度が低下する傾向が示され、ＫＥ-Ｓ１００では、反応５回目でＧＡＢＡ生成能が認められなくなったが、３種類のメソポーラスシリカに固定化した場合では、反応１０回目においてもＧＡＢＡ生成能の残存が認められた（図１７（ａ））。特にメソポーラスシリカでは、反応１０回目におけるＧＡＢＡの反応収率がＦＳＭ型で２９．４％、ＳＢＡ型で４４．５％、Ｃ２２-ｍｅｓｏ型で１５．１％もの生成活性を保持した。
【０１０６】
一方、ＮｏｒｍａｌＧＡＤβ−シリカ微粒子複合体の結果と同様に、４種類のＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβ−シリカ微粒子複合体のいずれもが繰り返し回数が増大するとともにＧＡＢＡ濃度が低下する傾向が示されたが、ＫＥ-Ｓ１００及び３種類のメソポーラスシリカに固定化した場合のいずれにおいても反応１０回目でのＧＡＢＡ生成能の残存が認められた（図１７（ｂ））。反応１０回目におけるＧＡＢＡの反応収率がＦＳＭ型で５８．１％、ＳＢＡ型で５８．３％、Ｃ２２-ｍｅｓｏ型で３７．４％、また、ＫＥ-Ｓ１００で１６．３％もの生成活性を保持し、いずれのＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＧＡＤβ−シリカ微粒子複合体もＮｏｒｍａｌＧＡＤβ−シリカ微粒子複合体と比較して活性が著しく向上し、固定化酵素の繰り返し耐久性（再利用性）が改善された。
【０１０７】
以上の実験結果より、メソポーラスシリカ複合体を用いる場合、酵素反応を行う酵素をＳｉ-ｔａｇ融合体とすることで、メソポーラスシリカからの脱離を抑制できるようになり、反応１０回の繰り返し使用においても固定化酵素の再利用性の著しい向上効果が認められた。さらに、酵素をＳｉ-ｔａｇ特異的にシリカ表面と結合したことで、メソポーラスシリカの細孔内で両酵素の触媒部位を配向制御でき、反応基質との接触頻度が増大した結果、酵素反応が効率的に行われ、酵素活性が飛躍的に向上することが追認できた。また、非多孔質球状シリカを用いた場合と比較して、メソポーラスシリカに固定化した場合の酵素活性の向上効果は極めて大きかったことより、メソポーラスシリカのシリカ細孔は酵素機能を最大限に発揮させることのできる酵素の集積組立場として好適であることが判明した。
【０１０８】
（実施例９）ＲＣＲ−ＳＤＨ−メソポーラスシリカ複合体の製造及び酵素反応の実験手順
本実施例に記載の酵素複合体の製造法および酵素反応の実験手順に従い、（実施例１２）〜（実施例１４）では、Ｒ体選択的カルボニル還元酵素（ＲＣＲ：配列番号９）及びソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ：配列番号１０）のそれぞれをＳｉ-ｔａｇを介して又は介さずに各種メソポーラスシリカに対して固定化したＲＣＲ−ＳＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体又はＲＣＲ−ＳＤＨ−メソポーラスシリカ複合体を調製し、その酵素活性の評価を行った。（実施例１０）及び（実施例１１）には、その際用いたＳｉ-ｔａｇ断片融合ＲＣＲ及びＳｉ-ｔａｇ断片融合ＳＤＨの製造方法を記載した。
図１８に、メソポーラスシリカの規則性細孔（シリカ細孔）に固定化したＲＣＲ及びＳＤＨを備えたＲＣＲ−ＳＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体のうちＲＣＲとプロキラルカルボニル化合物（２-ヒドロキシアセトフェノン：２-ＨＡＰ）が相互作用し、更に、ＳＤＨによる補酵素（ＮＡＤＨ）の再生系を組み込み酸化型ＮＡＤ＋から還元型ＮＡＤＨに再生することができるようになった結果、光学活性アルコール（（Ｒ）-１-フェニル-１，２-エタンジオール：（Ｒ）-ＰＥＤ）が高効率かつ持続的に合成される様子を模式的に表した説明図を示す。
【０１０９】
（９−１）ＲＣＲ−ＳＤＨ−メソポーラスシリカ複合体製造方法の実験手順
図１９（ｂ）の「実験手順」の前段に、ＲＣＲ及びＳＤＨをＳｉ-ｔａｇを介して又は介さずにメソポーラスシリカに吸着させ、洗浄する工程における手順を示す。
ここで、Ｓｉ-ｔａｇを介してメソポーラスシリカに固定化する場合は、（実施例５）の結果からみて固定化効率が高いことが予想される強塩濃度下の高濃度界面活性剤存在下で固定化及び洗浄を行うが、Ｓｉ-ｔａｇを介さずに固定化する場合は、一般的なＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８）を用いる。
酵素の固定化支持体には、メソポーラスシリカとして、（製造例１）により得られた中心細孔直径の異なる５種類のメソポーラスシリカ：１）ＦＳＭ-１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）、２）ＦＳＭ-２２（中心細孔直径：８．０ｎｍ）及び３）〜５）ＳＢＡ-１５（中心細孔直径：５．４、８．１、１０．６ｎｍ）を使用し、比較のための非多孔質球状シリカとして、シーホスター ＫＥ-Ｓ１００（日本触媒社製、平均粒子径：０．７６μｍ）を使用する。
また、下記（実施例１０）及び（実施例１１）により、本発明でＲＣＲ−ＳＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体製造に用いるＳｉ-ｔａｇとして、Ｓｉ-ｔａｇのＮ末側断片（「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０」）を選択し、「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０」を融合させたＲＣＲ及びＳＤＨを遺伝子組換え大腸菌を利用したタンパク発現系により作製した「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ」及び「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ」を用いて各種メソポーラスシリカへの固定化を行う。
【０１１０】
（９−２）ＲＣＲ及びＳＤＨのメソポーラスシリカ複合体による光学活性アルコールの合成反応の実験手順
Ｒ体選択的カルボニル還元酵素（ＲＣＲ）及びソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）による補酵素再生系を利用したプロキラルカルボニル化合物（２-ＨＡＰ）の不斉還元による光学活性アルコール（（Ｒ）-ＰＥＤ）の合成反応の概略は、図１９（ａ）に示すとおりである。
図１９（ｂ）の「実験手順」の後段に、得られたＲＣＲ及びＳＤＨのメソポーラスシリカ複合体を用いた（Ｒ）-ＰＥＤの合成反応、ＨＰＬＣ分析、固定化酵素サンプル回収及び再使用の開始までの手順を示す。
【０１１１】
（９−３）光学活性アルコールの合成活性の評価手順
（９−１）で得られたＲＣＲ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体などの各種複合体それぞれの酵素活性を、反応基質としてのプロキラルカルボニル化合物（２-ＨＡＰ）及びＤ-ソルビトールを添加して補酵素再生系を働かせ、光学活性アルコール（（Ｒ）-ＰＥＤ）の生成効率（２-ＨＡＰから（Ｒ）-ＰＥＤへの転化率）により評価する。
【０１１２】
（実施例１０）Ｓｉ-ｔａｇ融合ＲＣＲの調製および特性評価（比活性）
（１０−１）Ｓｉ-ｔａｇ断片とＲＣＲとの融合体の調製
（実施例３）及び（実施例６）の結果を受けて、Ｓｉ-ｔａｇ（全長）を融合させたＳｉ-ｔａｇ融合ＲＣＲの酵素活性は低くなることが予想された。
そこで、本実施例では、Ｓｉ-ｔａｇのＣ末端側断片及びＮ末端側断片との融合体についてのみ調製し、その特性を調べることとした。具体的には、Ｒ体選択的カルボニル還元酵素として、Candida Parapsilosis由来のＲＣＲ（四量体、アミノ酸残基数：３３６、分子量（単量体）：約３７ｋＤ）を適用し、当該酵素のＮ末端側に上記のＳｉ-ｔａｇの断片を融合させた。
まず、Ｓｉ-ｔａｇのＣ末端側断片としてＳｉ-ｔａｇのＣ末端側配列の７１アミノ酸残基（配列番号３）をＲＣＲに融合したＳｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＲＣＲを、またＳｉ-ｔａｇのＮ末端側配列の６０アミノ酸残基（配列番号２）が融合したＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲを、大腸菌タンパク発現系により製造した。
詳細には、サーモフィッシャーサイエンティフィック社の人工遺伝子合成サービス「Ｇｅｎｅ Ａｒｔ」を利用して、各配列の合成遺伝子をｐＥＴ３０２／ＮＴ-Ｈｉｓベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に挿入したＳｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＲＣＲ-ｐＥＴ３０２／ＮＴ-Ｈｉｓ（６９０７塩基対）、及びＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ-ｐＥＴ３０２／ＮＴ-Ｈｉｓ（６８７４塩基対）を作製した。
上記プラスミドＤＮＡにより形質転換した大腸菌（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ ＤＥ３ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）により目的の酵素を発現させ、得られた各Ｓｉ-ｔａｇ融合ＲＣＲを、Ｈｉｓ-ｔａｇ融合タンパク質精製用クロマトグラフィー担体（Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）で精製した。
【０１１３】
得られた２種類のＳｉ-ｔａｇ融合ＲＣＲのタンパク濃度を図２０の（ａ）に示す。
各種ＲＣＲのタンパク濃度は、Ｓｉ-ｔａｇを融合していないＲＣＲ（Ｎｏｒｍａｌ ＲＣＲ）で最も高くなり、Ｓｉ-ｔａｇ融合ＲＣＲでは付加されたＳｉ-ｔａｇのアミノ酸残基数に反比例したタンパク濃度の増減が示された。なお、図中Ｎｏｒｍａｌ ＲＣＲは、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＲＣＲである。
また、精製後の酵素（各２μｇ）のＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）の解析結果から見て、Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＲＣＲ、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲのいずれも正しく合成されている（図２０（ｃ））。
【０１１４】
（１０−２）各Ｓｉ-ｔａｇ融合ＲＣＲの比活性の比較
Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＲＣＲ、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ及びＮｏｒｍａｌＲＣＲのそれぞれを、基質の２-ＨＡＰ（０．５ｍＭ）及びβ-ＮＡＤＨ（０．３ｍＭ）を含む１００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．５）緩衝液中に添加し、「酵素濃度：１．８７μＭ、反応液量：１ｍＬ、反応温度：３５℃、反応時間：３０分間」の条件で反応させた。酵素反応中、分光光度計用セル内においてマイクロ撹拌子を用いて反応溶液を撹拌（２５０ｒｐｍ）しながら経時的に吸光度を測定し、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを酸化する酵素量（又はモル数）を１ｕｎｉｔとし、酵素活性（比活性）を評価した。
反応開始後２〜５分間における３４０ｎｍでの吸光度変化から、それぞれのＮＡＤＨ消費量を測定し、比活性を求めて比較したところ、酵素の比活性は、Ｎｏｒｍａｌ ＲＣＲが最も高く、次いで、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲが高く、Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＲＣＲでは極めて低い活性が示された（図２０（ｂ））。
また、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲを用いた反応では、硫酸亜鉛（５ｍＭ）を加えることによって、ＮｏｒｍａｌＲＣＲと同等の活性が認められた。しかし、硫酸亜鉛の添加により、予期せぬ凝集物の発生が確認された。そこで、以下の実験では、前記の活性比較実験でＮｏｒｍａｌ ＲＣＲに次いで高い酵素活性を有するＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲを用いた。
【０１１５】
（実施例１１）Ｓｉ-ｔａｇ融合ＳＤＨの調製および特性評価（比活性）
（１１−１）Ｓｉ-ｔａｇ断片とＳＤＨとの融合体の調製
（実施例３）及び（実施例６）の結果を受けて、Ｓｉ-ｔａｇ（全長）を融合させたＳｉ-ｔａｇ融合ＳＤＨの酵素活性は低くなることが予想された。
そこで、本実施例では、前記（１０−１）と同様に、Ｓｉ-ｔａｇのＣ末端側断片及びＮ末端側断片との融合体についてのみ調製し、その特性を調べることとした。具体的には、ソルビトール脱水素酵素として、Rhodobacter sphaeroides Si4由来のＳＤＨ（四量体、アミノ酸残基数：２５６、分子量（単量体）：約２９ｋＤ）を適用し、当該酵素のＮ末端側に上記のＳｉ-ｔａｇの断片を融合させた。
まず、Ｓｉ-ｔａｇのＣ末端側断片としてＳｉ-ｔａｇのＣ末端側配列の７１アミノ酸残基（配列番号３）をＳＤＨに融合したＳｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＳＤＨを、またＳｉ-ｔａｇのＮ末端側配列の６０アミノ酸残基（配列番号２）が融合したＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨを、大腸菌タンパク発現系により製造した。
詳細には、サーモフィッシャーサイエンティフィック社の人工遺伝子合成サービス「Ｇｅｎｅ Ａｒｔ」を利用して、各配列の合成遺伝子をｐＥＴ３０２／ＮＴ-Ｈｉｓベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に挿入したＳｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＳＤＨ-ｐＥＴ３０２／ＮＴ-Ｈｉｓ（６６６７塩基対）、及びＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ-ｐＥＴ３０２／ＮＴ-Ｈｉｓ（６６３４塩基対）を作製した。
上記プラスミドＤＮＡにより形質転換した大腸菌（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ ＤＥ３ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）により目的の酵素を発現させ、得られた各Ｓｉ-ｔａｇ融合ＳＤＨを、Ｈｉｓ-ｔａｇ融合タンパク質精製用クロマトグラフィー担体（Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）で精製した。
【０１１６】
得られた２種類のＳｉ-ｔａｇ融合ＳＤＨのタンパク濃度を図２１の（ａ）に示す。
各種ＳＤＨのタンパク濃度は、Ｓｉ-ｔａｇを融合していないＳＤＨ（Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ）とＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨが同等であったが、Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＳＤＨでは低い濃度が示された。なお、図中Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨは、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＳＤＨである。
また、精製後の酵素（各２μｇ）のＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）の解析結果から見て、Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＳＤＨ、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨのいずれも正しく合成されている（図２1（ｃ））。
【０１１７】
（１１−２）各Ｓｉ-ｔａｇ融合ＳＤＨの比活性の比較
Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＳＤＨ、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ及びＮｏｒｍａｌＳＤＨのそれぞれの比活性を、ソルビトール脱水素酵素活性測定キット（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、「酵素濃度：５０ｎＭ、反応液量：０．１ｍＬ、反応温度：３０℃、反応時間：１５分間、反応ｐＨ：８．２」の条件で評価した。本酵素反応には、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社製、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２ｅ）を使用し、経時的に吸光度を測定し、１分間に１μｍｏｌのＤ-ソルビトールをＤ-フルクトースに変換する酵素量（又はモル数）を１ｕｎｉｔとし、酵素活性（比活性）を評価した。
反応開始後３〜１５分間における５６５ｎｍでの吸光度変化から、それぞれのＤ-フルクトース生成量を測定し、比活性を求めて比較したところ、酵素の比活性は、Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨが最も高く、次いで、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨが高く、Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＳＤＨでは極めて低い活性が示された（図２１（ｂ））。
そこで、以下の実験では、Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨに次いで高い酵素活性を有するＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨを用いた。
【０１１８】
（実施例１２）ＲＣＲ−ＳＤＨ−メソポーラスシリカ複合体の製造
（１２−１）Ｓｉ-ｔａｇを介した酵素−メソポーラスシリカ複合体
本実施例では、（実施例１０）で検討した「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ」及び（実施例１１）で検討した「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ」を含む緩衝液を用い、実施例（９−１）の方法に従って、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（ＦＳＭ８．０，中心細孔直径：８．０ｎｍ）、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（ＳＢＡ８．１，中心細孔直径：８．１ｎｍ）、及び非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）の各微粒子に対して固定化処理を行い、３種類の「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−シリカ微粒子複合体」、又は、３種類の「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−シリカ微粒子複合体」を形成させた。
これらのＳｉ-ｔａｇを介した酵素−シリカ微粒子複合体の製造の場合、酵素の固定化及び洗浄の際は、いずれも強塩濃度下の高濃度界面活性剤存在下で行った。
具体的には、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ（２μｍｏｌ）と共にＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ（０．５μｍｏｌ）を含んだ酵素溶液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８）、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）１ｍＬと、予めマイクロチューブに量り取ったメソポーラスシリカ（ＦＳＭ-１６、ＦＳＭ-２２又はＳＢＡ-１５）１０ｍｇとを、ローテーターを用いて１６時間以上４℃で穏やかに混合した後、遠心分離を行い、上清を全て除去することによって、酵素−シリカ微粒子複合体の前駆体を得た。
続いて、洗浄用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８）、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）１ｍＬを添加し、Ｖｏｒｔｅｘ  Ｍｉｘｅｒを用いて約５秒間室温で攪拌し、前記酵素−メソポーラスシリカ複合体の前駆体を再懸濁した後、遠心分離を行い、上清を全て除去する洗浄操作を行った。再び、前記洗浄用緩衝液１ｍＬを用いて洗浄操作を繰り返し、さらに２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８）１ｍＬを用いて再懸濁した後、遠心分離を行い、上清を全て除去し、強塩濃度下の高濃度界面活性剤存在下で固定化した「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）」を得、最終的には「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）」を得た。
比較のために非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）を用いて、同様の手順によりそれぞれの複合体を得た。以下、「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−ＫＥ-Ｓ１００」または「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−ＫＥ-Ｓ１００」という。
【０１１９】
（１２−２）Ｓｉ-ｔａｇを介さない酵素−メソポーラスシリカ複合体
酵素活性、再利用性の比較のため、Ｓｉ-ｔａｇを介さない酵素−メソポーラスシリカ複合体を製造した。その際、酵素溶液中にも、洗浄用緩衝液中にも塩化ナトリウム及びＴｗｅｅｎ２０を添加しない通常のメソポーラスシリカ固定化条件を適用したほかは、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０融合ＲＣＲ又はＳＤＨの場合と同様の手順で行い、最終的に、「Ｎｏｒｍａｌ ＲＣＲ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）」、並びに、「Ｎｏｒｍａｌ ＲＣＲ−Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）」を得た。
さらに、比較のために非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）を用いて、同様の手順によりそれぞれの複合体を得た。以下、「Ｎｏｒｍａｌ ＲＣＲ−ＫＥ-Ｓ１００」または「Ｎｏｒｍａｌ ＲＣＲ−Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ−ＫＥ-Ｓ１００」という。
【０１２０】
（実施例１３）光学活性アルコールの合成活性の評価
（１３−１）光学活性アルコール（（Ｒ）-ＰＥＤ）生成の共役酵素反応
実施例（１２−１）で得られた「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）（ＫＥ-Ｓ１００）」など各種複合体それぞれの酵素活性を、反応基質としてのプロキラルカルボニル化合物（２-ＨＡＰ）及びＤ-ソルビトールを添加して補酵素再生系を働かせ、光学活性アルコール（（Ｒ）-ＰＥＤ）の生成効率（２-ＨＡＰから（Ｒ）-ＰＥＤへの転化率）により評価した（図２２）。
具体的には、「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）（ＫＥ-Ｓ１００）」などの各種複合体それぞれに対して、以下の酵素反応を起こさせ、それぞれの（Ｒ）-ＰＥＤへの転化率を測定した。
コントロールとして「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）（ＫＥ-Ｓ１００）」と共に、遊離の未固定「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ」及び「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ」を用いた。
【０１２１】
酵素反応は、（１２−１）で得られた、マイクロチューブ内の上記酵素−シリカ微粒子複合体に対して、２-ＨＡＰ、Ｄ-ソルビトール、また、補酵素を含んだ反応基質（１ｍＬ）を添加することによって開始した。
その際、最終反応組成が、「２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８）、１ｍＭ  ２-ＨＡＰ、０．１ｍＭ  ＮＡＤＨ、１０ｍＭ  Ｄ-ソルビトール、２μＭ  ＲＣＲ、０．５μＭ  ＳＤＨ、反応液量：１ｍＬ」となるように調整した。
反応条件は、定温恒温器内（ＳＡＮＹＯ社製、ＭＩＲ-１５４）においてローテーターを用いて穏やかに混和しながら３５℃で３０分間の加温状態を保持することとした。
【０１２２】
次いで、遠心分離後の上清を回収し、この回収液を８０℃で１０分間加熱処理し、上清に含まれる生成物（（Ｒ）-ＰＥＤ）の定量を行った。（Ｒ）-ＰＥＤの分析には、ＯＤＳカラムを搭載した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（日立ハイテクサイエンス社製、ＬａＣｈｒｏｍ ＥＬＩＴＥ）を使用した。
その際、分析条件は、「測定波長：２１０ｎｍ、カラムオーブン設定温度：３０℃、流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ、分析時間：１０分間、移動相組成：アセトニトリル／水＝６０／４０（Ｖ／Ｖ）」とした。
【０１２３】
ここで、固定化酵素サンプルの再利用性を評価する場合には、上記の遠心分離後に回収された酵素−シリカ微粒子複合体に対して、洗浄用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８））１ｍＬを添加し、Ｖｏｒｔｅｘ  Ｍｉｘｅｒを用いて約５秒間室温で攪拌し、酵素−シリカ微粒子複合体を再懸濁した後、遠心分離を行い、上清を全て除去する洗浄操作を行った。続いて、新しい反応基質溶液を添加することによって、反応２回目の酵素反応を開始した。固定化酵素の繰り返し耐久性（再利用性）の評価は、上述の実験手順に従い、合計１０回行った。
【０１２４】
光学活性アルコール（（Ｒ）-ＰＥＤ）の合成実験は、反応３０分後の（Ｒ）-ＰＥＤへの転化率（反応１回目）、固定化直後の上清に含まれるＲＣＲの活性（転化率）、また、固定化直後の上清に含まれるＳＤＨの活性（Ｕ／Ｌ）を評価した（図２２（ａ））。なお、未固定の遊離酵素による合成反応は、一晩、混和した後の転化率を測定した。
【０１２５】
（１３−２）光学活性アルコール（（Ｒ）-ＰＥＤ）の生成効率の比較
その結果、３種類のＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−シリカ微粒子複合体のいずれもが未固定酵素の場合（８．４％）と同等の転化率を示した。一方、３種類のＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−シリカ微粒子複合体のいずれもが未固定酵素の場合（６６．７％）の６割程度（転化率：約４０％）の活性を保持した。従って、異種酵素を固定化した場合、未固定酵素と比較して活性が低下するものの、単一酵素（ＲＣＲ）の場合よりも転化率が５倍程度増大していることより、補酵素再生系を組み込んだ共役酵素反応による反応の向上効果が認められた。
また、メソポーラスシリカ（ＦＳＭ８．０及びＳＢＡ８．１）の場合は、固定化後の上清において遊離のＲＣＲとＳＤＨの活性が全く認められず、これは、酵素が全量固定化されたことを示唆している。一方、ＫＥ-Ｓ１００では、若干のＲＣＲ及びＳＤＨ活性が示されたことより、酵素が全量固定化されていないことが判明した。特に、ＳＤＨに関しては、１６．３％分の酵素が遊離していることが明らかとなった。
【０１２６】
（１３−３）再利用性の比較
次に、前記の酵素複合体を用い、反応３０分後の（Ｒ）-ＰＥＤへの転化率を指標として、反応１０回分における固定化酵素の繰り返し耐久性（再利用性）を評価した。実験結果をまとめたグラフを図２２（ｂ）に示す。図中、白四角印は、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．０ｎｍ）を用いた場合、黒菱形印は、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．１ｎｍ）を用いた場合、また、白三角印は、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）を用いた場合、である。また、図中、左図は、ＲＣＲのみを固定化した場合、右図は、ＲＣＲとＳＤＨを固定化した場合、である。
【０１２７】
その結果、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−シリカ微粒子複合体のうち、メソポーラスシリカ（ＦＳＭ８．０及びＳＢＡ８．１）の場合は、反応１〜１０回において反応初期と同等の転化率を保持し、ＫＥ-Ｓ１００では、最終的に３％程度の転化率の低減が示された（図２２（ｂ）左図）。
【０１２８】
一方、３種類のＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−シリカ微粒子複合体のいずれもが繰り返し回数が増大するとともに転化率が低下する傾向が示されたが、いずれにおいても反応１０回目での（Ｒ）-ＰＥＤ生成能の残存が認められた（図２２（ｂ）右図）。反応１０回目における転化率がＳＢＡ型で１３．０％、ＦＳＭ型で１２．６％、また、ＫＥ-Ｓ１００で９．１％の生成活性を保持した。
反応４回目以降の活性は、ＫＥ-Ｓ１００の場合よりもメソポーラスシリカ（ＦＳＭ８．０及びＳＢＡ８．１）の場合により高い活性が示され、全体的には、ＳＢＡ８．１ ＞ ＦＳＭ８．０ ＞ ＫＥ-Ｓ１００の順に固定化酵素の繰り返し耐久性（再利用性）が高い傾向が認められた。
【０１２９】
（１３−４）Ｓｉ-ｔａｇ未融合のＲＣＲ及びＳＤＨを用いた場合の光学活性アルコール合成効率の評価
本実施例では、上記実施例（１２−２）で得られた３種類の「Ｎｏｒｍａｌ ＲＣＲ−Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ−シリカ微粒子複合体」と共に３種類の「Ｎｏｒｍａｌ ＲＣＲ−シリカ微粒子複合体」、さらにコントロールとして遊離の未固定「Ｎｏｒｍａｌ ＲＣＲ」及び「Ｎｏｒｍａｌ ＲＣＲ−Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ」を用い、（１３−２）と同様に、光学活性アルコール（（Ｒ）-ＰＥＤ）の合成実験を行い、反応３０分後の（Ｒ）-ＰＥＤへの転化率（反応１回目）、固定化直後の上清に含まれるＲＣＲの活性（転化率）、また、固定化直後の上清に含まれるＳＤＨの活性（Ｕ／Ｌ）を評価した（図２３（ａ））。なお、未固定の遊離酵素による合成反応は、一晩、混和した後の転化率を測定した。
【０１３０】
その結果、３種類のＮｏｒｍａｌ ＲＣＲ−シリカ微粒子複合体のいずれもが未固定酵素の場合（９．３％）と同等の転化率を示した。一方、３種類のＮｏｒｍａｌ ＲＣＲ−Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ−シリカ微粒子複合体のいずれもが未固定酵素の場合（７７．５％）の１割程度（転化率：平均９．６％）の活性を示した。従って、異種酵素を固定化した場合、未固定酵素と比較して活性が極めて低く、さらに、単一酵素（ＲＣＲ）の場合の転化率と同等であることより、補酵素再生系を組み込んだ共役酵素反応が構築できなかったことが判明した。
また、メソポーラスシリカ（ＦＳＭ８．０及びＳＢＡ８．１）の場合は、固定化後の上清において遊離のＲＣＲとＳＤＨの活性が全く認められず、これは、酵素が全量固定化されたことを示唆している。一方、ＫＥ-Ｓ１００では、相当のＲＣＲ及びＳＤＨ活性が示されたことより、酵素が全量固定化されていないことが判明した。特に、ＳＤＨに関しては、ほぼ１００％分の酵素が遊離していることが明らかとなった。
【０１３１】
（１３−５）Ｓｉ-ｔａｇ未融合のＲＣＲ及びＳＤＨを用いた場合の再利用性の評価
次に、前記の酵素複合体を用い、反応３０分後の（Ｒ）-ＰＥＤへの転化率を指標として、反応１０回分における固定化酵素の繰り返し耐久性（再利用性）を評価した。実験結果をまとめたグラフを図２３（ｂ）に示す。図中、白四角印は、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．０ｎｍ）を用いた場合、黒菱形印は、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．１ｎｍ）を用いた場合、また、白三角印は、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）を用いた場合、である。また、図中、左図は、ＲＣＲのみを固定化した場合、右図は、ＲＣＲとＳＤＨを固定化した場合、である。
【０１３２】
その結果、Ｎｏｒｍａｌ ＲＣＲ−シリカ微粒子複合体のいずれもが、反応１〜１０回の繰り返し使用の間に徐々に転化率が低下する傾向が示された。最終的には、ＦＳＭ８．０の場合に約１％、ＳＢＡ８．１の場合に約２％。また、ＫＥ-Ｓ１００の場合に約４％の転化率の低減が示された（図２３（ｂ）左図）。
【０１３３】
一方、３種類のＮｏｒｍａｌ ＲＣＲ−Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ−シリカ微粒子複合体のいずれもが前述のＮｏｒｍａｌ ＲＣＲ−シリカ微粒子複合体の場合と同様の反応挙動を示し、全体的には、ＦＳＭ８．０ ＞ ＳＢＡ８．１ ＞ ＫＥ-Ｓ１００の順に固定化酵素の繰り返し耐久性（再利用性）が高い傾向が認められた（図２３（ｂ）右図）。
詳細には、メソポーラスシリカ（ＦＳＭ８．０及びＳＢＡ８．１）の場合は、前述のＮｏｒｍａｌ ＲＣＲ−シリカ微粒子複合体の場合と比較すると１％未満の極僅かな転化率の向上が認められたが、ＫＥ-Ｓ１００の場合は転化率に有意な差が見られなかった。図２３（ａ）の固定化後の上清のＳＤＨ活性の結果より、メソポーラスシリカ（ＦＳＭ８．０及びＳＢＡ８．１）にはＳＤＨが全量固定化されているにもかかわらず、大半の酵素が失活した結果、補酵素再生効率が極めて低かったことが推察される。また、ＫＥ-Ｓ１００にはＳＤＨが全く固定化されておらず、補酵素再生能を発揮できなかったことが推察される。
【０１３４】
（１３−６）Ｓｉ-ｔａｇを介した又は介さないＲＣＲ−ＳＤＨ−メソポーラスシリカ複合体の酵素活性及び再利用性の比較
前記（１３−２）〜（１３−５）の実験結果より、単一酵素（ＲＣＲ）に関しては、メソポーラスシリカ（ＦＳＭ８．０及びＳＢＡ８．１）との複合体を用いた場合、Ｓｉ-ｔａｇの有無に関係なく、酵素が全量固定化され、遊離の未固定酵素と同等の酵素活性が発現され、さらに反応１０回の繰り返し使用においても高い活性保持率が認められた。また、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）との複合体では、Ｓｉ-ｔａｇの有無の違いによって酵素の固定化率に差が生じ（固定化率の高さ：Ｓｉ-ｔａｇ有り ＞ Ｓｉ-ｔａｇ無し）、酵素活性および繰り返し耐久性のいずれもがメソポーラスシリカとの複合体と比較して低い値に留まった。
一方、異種酵素（ＲＣＲ及びＳＤＨ）に関しては、メソポーラスシリカ（ＦＳＭ８．０及びＳＢＡ８．１）との複合体を用いた場合、Ｓｉ-ｔａｇの有無に関係なく２種類の酵素が全量固定化されたが、ＳＤＨによる補酵素再生効率に大きな違いが生じた。具体的には、Ｓｉ-ｔａｇを介して異種酵素を固定化した場合には、遊離の未固定酵素より低い活性発現率が示されたものの、補酵素再生の効果により光学活性アルコールの生成効率が向上し、さらに反応１０回の繰り返し使用を達成した。Ｓｉ-ｔａｇを介さずに異種酵素を固定化した場合には、補酵素再生における顕著な効果が認められず、反応１０回の繰り返し使用においても単一酵素（ＲＣＲ）の場合と同等の反応挙動が示された。また、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）との複合体では、Ｓｉ-ｔａｇの有無の違いによって酵素の固定化率に差が生じ（固定化率の高さ：Ｓｉ-ｔａｇ有り ＞ Ｓｉ-ｔａｇ無し）、酵素活性および繰り返し耐久性のいずれもがメソポーラスシリカとの複合体と比較して低い値に留まった。
【０１３５】
以上より、Ｓｉ-ｔａｇを介して異種酵素（ＲＣＲ及びＳＤＨ）をシリカ微粒子に固定化し、シリカ表面で両酵素の触媒部位を配向制御できた結果、補酵素再生系を組み込んだ共役酵素反応が効率的に行われ、光学活性アルコール合成における反応活性および繰り返し耐久性（再利用性）の向上効果が認められた。特に、固定化後のＳＤＨの安定性に関して、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＳＤＨを用いた場合と比較して、Ｓｉ-ｔａｇ融合ＳＤＨを用いた場合により優れたＳＤＨの安定性向上効果が確認された。
また、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）を用いた場合と比較して、メソポーラスシリカ（ＦＳＭ８．０及びＳＢＡ８．１）に固定化した場合の酵素の繰り返し耐久性（再利用性）がより高かったことより、メソポーラスシリカのシリカ細孔は異種酵素の機能を最大限に発揮させることのできる酵素の集積組立場として好適であることが判明した。
【０１３６】
（実施例１４）異種酵素の活性評価（メソポーラスシリカの細孔径の影響）
本実施例では、固定化異種酵素を用いた光学活性アルコールの合成活性に与えるメソポーラスシリカの細孔径の影響について検証した。具体的には、（実施例１２）で検討した「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ」及び「Ｎｏｒｍａｌ ＲＣＲ−Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ」を含む緩衝液を用い、実施例（９−１）の方法に従って、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（ＦＳＭ２．６，中心細孔直径：２．６ｎｍ）、及びＳＢＡ型メソポーラスシリカ（ＳＢＡ５．４および１０．６，中心細孔直径：５．４および１０．６ｎｍ）の各微粒子に対して固定化処理を行い、３種類の「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−ＦＳＭ２．６（ＳＢＡ５．４）（ＳＢＡ１０．６）」、又は、２種類の「Ｎｏｒｍａｌ ＲＣＲ−Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ−ＦＳＭ２．６（ＳＢＡ５．４）」を形成させた。
次に、実施例（９−２）及び（９−３）の方法に従って、光学活性アルコール（（Ｒ）-ＰＥＤ）の合成実験を行い、反応３０分後の（Ｒ）-ＰＥＤへの転化率（反応１回目）、固定化直後の上清に含まれるＲＣＲの活性（転化率）、また、固定化直後の上清に含まれるＳＤＨの活性（Ｕ／Ｌ）を評価した（図２４（ａ）（ｂ））。
【０１３７】
その結果、３種類のＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−ＦＳＭ２．６（ＳＢＡ５．４）（ＳＢＡ１０．６）のいずれもが、実施例（１３−２）での結果と同様に、未固定酵素の場合（６６．７％）の６割程度（転化率：約４０％）の活性を保持した（図２４（ａ））。従って、補酵素再生系を組み込んだ共役酵素反応による反応の向上効果が認められた。
また、ＳＢＡ１０．６を用いた場合は、ＦＳＭ８．０及びＳＢＡ８．１での結果（実施例（１３−２））と同様に、固定化後の上清において遊離のＲＣＲとＳＤＨの活性が全く認められず、これは、酵素が全量固定化されたことを示唆している。
ＦＳＭ２．６及びＳＢＡ５．４を用いた場合は、固定化後の上清において相当のＲＣＲ及びＳＤＨ活性が示されたことより、酵素が全量固定化されていないことが判明した。特に、ＳＤＨに関しては、ＦＳＭ２．６の場合に６．５％分、ＳＢＡ５．４の場合に１９％分の酵素が遊離していることが明らかとなった。
【０１３８】
一方、２種類のＮｏｒｍａｌ ＲＣＲ−Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ−ＦＳＭ２．６（ＳＢＡ５．４）のいずれもが、未固定酵素の場合（７７．５％）の１．５割程度（転化率：平均１１．６％）の活性を示した（図２４（ｂ））。従って、ＦＳＭ８．０及びＳＢＡ８．１での結果（実施例（１３−４））と比較すると、０．５割程度の僅かな転化率の向上が認められた。しかし、Ｓｉ-ｔａｇを介して異種酵素を固定化した場合の結果（図２４（ａ））と比較して活性が極めて低く、補酵素再生系を組み込んだ所望の共役酵素反応が構築できなかったことが判明した。
また、ＦＳＭ２．６及びＳＢＡ５．４共に、ＦＳＭ８．０及びＳＢＡ８．１での結果（実施例（１３−４））と同様に、固定化後の上清において遊離のＲＣＲとＳＤＨの活性がほとんど認められず、これは、酵素がほぼ全量固定化されたことを示唆している。
【０１３９】
次に、前記の酵素複合体を用い、反応３０分後の（Ｒ）-ＰＥＤへの転化率を指標として、反応１０回分における固定化酵素の繰り返し耐久性（再利用性）を評価した。実験結果をまとめたグラフを図２４（ｃ）に示す。図中、黒四角印は、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：２．６ｎｍ）を用いた場合、白菱形印は、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：５．４ｎｍ）を用いた場合、また、白菱形印（横線入り）は、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）を用いた場合、である。また、図中、左図は、Ｓｉ-ｔａｇ融合酵素（ＲＣＲ及びＳＤＨ）を固定化した場合、右図は、Ｓｉ-ｔａｇ未融合（Ｎｏｒｍａｌ）酵素（ＲＣＲ及びＳＤＨ）を固定化した場合、である。
【０１４０】
その結果、３種類のＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−ＦＳＭ２．６（ＳＢＡ５．４）（ＳＢＡ１０．６）のいずれもが繰り返し回数が増大するとともに転化率が低下する傾向が示され、反応１０回目における転化率は、ＳＢＡ１０．６で１８．０％、ＳＢＡ５．４で９．７％、また、ＦＳＭ２．６で７．４％であり、メソポーラスシリカの種類および細孔径の違いによって異なる残存活性が示された（図２４（ｃ）左図）。
このうち、特に、ＳＢＡ１０．６を用いた場合の残存活性が格段に高く、反応１０回目において反応１回目の５割程度の活性を保持した。従って、メソポーラスシリカの細孔径を拡大することによって、固定化酵素の繰り返し耐久性（再利用性）が著しく向上した。
【０１４１】
一方、２種類のＮｏｒｍａｌ ＲＣＲ−Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ−ＦＳＭ２．６（ＳＢＡ５．４）のいずれもが、反応１０回の繰り返し使用において、ＦＳＭ８．０及びＳＢＡ８．１での結果（実施例（１３−５））と比較して僅かな転化率の向上を示したが、Ｓｉ-ｔａｇを介して異種酵素を固定化した場合の結果（図２４（ｃ）左図）と比較して活性が極めて低く、補酵素再生系を組み込んだ所望の共役酵素反応が構築できなかったことが判明した（図２４（ｃ）右図）。これは、実施例（１３−２）で使用した２種類のメソポーラスシリカ（ＦＳＭ８．０及びＳＢＡ８．１）を用いた場合の結果と同様に、図２４（ｂ）の固定化後の上清のＳＤＨ活性の結果より、ＦＳＭ２．６及びＳＢＡ５．４にはＳＤＨが全量固定化されているにもかかわらず、大半の酵素が失活した結果、補酵素再生効率が極めて低かったことが原因であることが推察される。
【０１４２】
Ｓｉ-ｔａｇ融合及び未融合の異種酵素（ＲＣＲ及びＳＤＨ）における前述の実験結果（図２２（ｂ）右図、図２３（ｂ）右図、また、図２４（ｃ）左図及び右図）をまとめたグラフを図２５に示す。図中、黒四角印は、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：２．６ｎｍ）を用いた場合、白四角印は、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．０ｎｍ）を用いた場合、白菱形印は、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：５．４ｎｍ）を用いた場合、黒菱形印は、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：８．１ｎｍ）を用いた場合、白菱形印（横線入り）は、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（中心細孔直径：１０．６ｎｍ）を用いた場合、また、白三角印は、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）を用いた場合、である。また、図中、左図は、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−シリカ微粒子複合体の場合、また、右図は、Ｎｏｒｍａｌ ＲＣＲ−Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ−シリカ微粒子複合体の場合、である。
【０１４３】
図２５（左図）によれば、光学活性アルコール（（Ｒ）-ＰＥＤ）の合成反応における６種類のＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＲＣＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−シリカ微粒子複合体の繰り返し耐久性（再利用性）は、メソポーラスシリカの細孔径に比例して高くなり、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）で最も低くなる傾向が示された。具体的には、ＳＢＡ１０．６ ＞ ＳＢＡ８．１ ＞ ＦＳＭ８．０ ＞ ＳＢＡ５．４ ＞ ＦＳＭ２．６ ＞ ＫＥ-Ｓ１００の順に固定化酵素の繰り返し耐久性が高くなった。
上述の通り、細孔径の大きいメソポーラスシリカ（ＳＢＡ１０．６、ＳＢＡ８．１及びＦＳＭ８．０）と比較して、細孔径の小さいメソポーラスシリカ（ＳＢＡ５．４及びＦＳＭ２．６）、また、ＫＥ-Ｓ１００では、異種酵素（ＲＣＲ及びＳＤＨ）の固定化率が低く、これが反応活性および再利用性の低さの要因と考えられる。
一方で、中心細孔直径が８ｎｍ以上のメソポーラスシリカでは、いずれも異種酵素が全量固定化されているにもかかわらず、メソポーラスシリカの種類と細孔径の違いにより反応活性および再利用性の程度が変化した。より具体的には、同程度の細孔径を有する２種類のメソポーラスシリカ（ＳＢＡ８．１及びＦＳＭ８．０）に着目すると、ＳＢＡ８．１の方がより酵素の再利用性が高く、この傾向は、（実施例５）のメチルレッドの分解反応における３種類のＳｉ-ｔａｇ-ＡｚｏＲ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＣＴ７１-ＧＤＨ−シリカ微粒子複合体の繰り返し耐久性（再利用性）の結果（ＳＢＡ８．１ ＞ ＦＳＭ８．０ ＞ ＫＥ-Ｓ１００）(図１１）と類似している。
また、細孔径の異なる２種類のＳＢＡ型メソポーラスシリカ（ＳＢＡ１０．６及びＳＢＡ８．１）に着目すると、ＳＢＡ１０．６の方が飛躍的に酵素の再利用性が高くなるという驚くべき結果が得られた（反応１０回目の残存活性：ＳＢＡ１０．６（５割程度） ＞ ＳＢＡ８．１（３割程度））。
【０１４４】
一方、図２５（右図）によれば、光学活性アルコール（（Ｒ）-ＰＥＤ）の合成反応における５種類のＮｏｒｍａｌ ＲＣＲ−Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ−シリカ微粒子複合体の繰り返し耐久性（再利用性）は、相対的に転化率が低い値に留まったものの、メソポーラスシリカの細孔径に反比例して高くなり、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）で最も低くなる傾向が示された。具体的には、ＦＳＭ２．６ ＞ ＳＢＡ５．４ ＞ ＦＳＭ８．０ ＞ ＳＢＡ８．１ ＞ ＫＥ-Ｓ１００の順に固定化酵素の繰り返し耐久性が高くなった。
上述の通り、ＫＥ-Ｓ１００では、異種酵素（ＲＣＲ及びＳＤＨ）の固定化率が低く、特にＳＤＨに関しては全く固定化されておらず、これが反応活性および再利用性の低さの要因と考えられる。
しかし、目的産物（（Ｒ）-ＰＥＤ）の生成効率については、前記のＳｉ-ｔａｇ融合異種酵素での結果（図２５（左図））と比較すると、細孔径の違いに関係なくいずれも低い。ＫＥ-Ｓ１００以外はメソポーラスシリカに対して両酵素は全量固定化されていると考えられるので、ＳＤＨによる補酵素再生能の発揮が不十分であった可能性がある、すなわち、Ｓｉ-ｔａｇ融合が補酵素再生能の十分な発揮にとっても有効であることが示唆される。
【０１４５】
以上より、Ｓｉ-ｔａｇを介して異種酵素（ＲＣＲ及びＳＤＨ）をシリカ微粒子に固定化する際、メソポーラスシリカの細孔径を拡大することによって、シリカ表面で両酵素の触媒部位を最適に配向制御できた結果、補酵素再生系を組み込んだ共役酵素反応が効率的に行われ、光学活性アルコール合成における反応活性および繰り返し耐久性（再利用性）の飛躍的な向上効果が認められた。特に、固定化後のＳＤＨの安定性に関して、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＳＤＨを用いた場合と比較して、Ｓｉ-ｔａｇ融合ＳＤＨを用いた場合により優れたＳＤＨの安定性向上効果が確認され、さらに、メソポーラスシリカの細孔径の拡大によってＳＤＨによる補酵素再生能が向上した結果、反応１０回の繰り返し使用における高効率の反応活性が維持できることが示唆された。
また、非多孔質球状シリカ（ＫＥ-Ｓ１００）を用いた場合と比較して、メソポーラスシリカ（ＦＳＭ型及びＳＢＡ型）の微粒子粉末は繰り返し使用における溶液中での分散性（ハンドリング性）に優れ、さらに固定化した場合の酵素の繰り返し耐久性（再利用性）がより高かったことも勘案すれば、メソポーラスシリカ及びそのシリカ細孔は異種酵素の機能を最大限に発揮させることのできる酵素の集積組立場として好適であるといえる。
【０１４６】
（実施例１５）ＤＴＤ−ＳＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体の製造及び酵素反応
本実施例では、各種メソポーラスシリカに対するＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）及びソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ：配列番号１０）の固定化と酵素活性の評価を行った。
【０１４７】
（１５−１）ＤＴＤ−ＳＤＨ−Ｓｉ-ｔａｇ−メソポーラスシリカ複合体の製造
＜ＤＴＤ及びＳＤＨのメソポーラスシリカへの固定化＞
酵素の固定化支持体には、メソポーラスシリカとして、（製造例１）により得られた中心細孔直径の異なる４種類のメソポーラスシリカ：１）ＦＳＭ-１６（中心細孔直径：２．６ｎｍ）、２）ＦＳＭ-２２（中心細孔直径：８．０ｎｍ）及び３）４）ＳＢＡ-１５（中心細孔直径：５．４、８．１ｎｍ）を使用した。
また、上記ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ２のＮ末端側配列（アミノ酸残基数：６０）からなるＳｉ-ｔａｇのＮ末側断片（「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０」）を融合させた「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ」を実施例（１１−１）の方法に従って、遺伝子組換え大腸菌を利用したタンパク発現系により製造した。Ｓｉ-ｔａｇを融合していないＤＴＤはソルビトール脱水素酵素活性測定キット（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）の添付品を利用した。
【０１４８】
＜ＤＴＤ及びＳＤＨのメソポーラスシリカ複合体による標的物質（ソルビトール）量の測定の実験手順＞
ＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）及びソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）による補酵素再生系を利用した標的物質（ソルビトール）量又は標的酵素（ＳＤＨ）活性の高感度測定における反応系の概略は、図２６（ａ）に示すとおりである。
本実施例では、共役的な酵素反応を行う異種酵素のうち、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０融合ＳＤＨ（あるいは、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＳＤＨ）のみをメソポーラスシリカに固定化したメソポーラスシリカとの複合体を予め作製しておき、次いで、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＤＴＤを含んだ反応基質を相互作用させることによって、シリカ細孔へのＤＴＤの固定化とＤＴＤ−ＳＤＨによる共役酵素反応を行った。
以下に、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＤＴ-ジアホラーゼ（ＤＴＤ）−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０融合ＳＤＨ（あるいは、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＳＤＨ）−メソポーラスシリカ複合体の製造法、ホルマザンの発色度を指標としたソルビトール検出、固定化酵素サンプル回収及び再使用の開始までの手順を示す。
【０１４９】
＜Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＤＴＤ及びＳｉ-ｔａｇを介したＳＤＨ−メソポーラスシリカ複合体の製造方法＞
Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０融合ＳＤＨの固定化による複合体の製造方法として、酵素の固定化及び洗浄のいずれも強塩濃度下の高濃度界面活性剤存在下で行った。
具体的には、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ（０．１μｍｏｌ）を含んだ酵素溶液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８）、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）０．１ｍＬと、予め９６ウェルの平底マイクロプレートの各ウェルに量り取ったメソポーラスシリカ粉末（ＦＳＭ-１６、ＦＳＭ-２２又はＳＢＡ-１５）１ｍｇとを、シェイキングインキュベーター（ＭｙＢＬ-Ｐ２Ｓ；  アズワン製）を用いて、１０分間、３０℃で穏やかに混合した後、遠心分離を行い、上清を全て除去することによって、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）複合体の前駆体を得た。
続いて、洗浄用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８）、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）０．１ｍＬを添加し、上記シェイキングインキュベーターを用いて約５秒間、３０℃で攪拌し、前記Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）複合体の前駆体を再懸濁した後、遠心分離を行い、上清を全て除去する洗浄操作を行った。再び、前記洗浄用緩衝液０．１ｍＬ、及び、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８）０．１ｍＬを用いて、順次洗浄操作を繰り返し、さらに２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８）０．０２ｍＬを用いて再懸濁し、強塩濃度下の高濃度界面活性剤存在下で固定化した「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）」を得た。
次に、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）の入った各ウェルに、ソルビトール脱水素酵素活性測定キット（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）に添付のソルビトール、β-ＮＡＤ＋、テトラゾリウム塩（ＭＴＴ）、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＤＴＤ（Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ）を含んだ反応基質溶液（ｐＨ  ８．２）０．０８ｍＬを添加し、上記シェイキングインキュベーターを用いて約５秒間、３０℃で攪拌し、最終的に、両酵素が固定化された「Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）複合体」を得た。
【０１５０】
＜Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＤＴＤ及びＳｉ-ｔａｇを介さないＳＤＨ−メソポーラスシリカ複合体の製造方法＞
Ｓｉ-ｔａｇを融合していないＳＤＨ（Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ）に対しては、酵素溶液中にも、洗浄用緩衝液中にも塩化ナトリウム及びＴｗｅｅｎ２０を添加しない通常のメソポーラスシリカ固定化条件を適用したほかは、Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０融合ＳＤＨの場合と同様の手順で行い、「Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）」を得た。
次に、Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）の入った各ウェル内で上記「Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０−ＳＤＨ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）」の場合と同様の手順で、両酵素が固定化された「Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ−Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）複合体」を得た。
【０１５１】
（１５−２）標的物質（ソルビトール）量の測定評価
酵素反応は、（１５−１）で得られた、Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）又は、Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ−ＦＳＭ（ＳＢＡ）と反応基質の混合液（０．１ｍＬ）の入ったマイクロプレートを、上記シェイキングインキュベーターを用いて２０分間攪拌しながら、３０℃の加温状態を保持することによって行った。
続いて、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２ｅ；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製）を用いて、反応後の酵素反応液の５６５ｎｍの吸光度を測定することによって、テトラゾリウム塩（ＭＴＴ）を基質とした生成物（ホルマザン）の発色度を評価した。
【０１５２】
ここで、固定化酵素サンプルの再利用性を評価する場合には、吸光度測定後の遠心分離操作によって上清を除去し、マイクロプレートの各ウェルに回収された酵素−メソポーラスシリカ複合体に対して、洗浄用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８））０．１ｍＬを添加し、上記シェイキングインキュベーターを用いて約５秒間、３０℃で攪拌し、酵素−シリカ微粒子複合体を再懸濁した後、遠心分離を行い、上清を全て除去する洗浄操作を行った。続いて、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ  ８）０．０２ｍＬを用いて、酵素−シリカ微粒子複合体を再懸濁し、次いで、ＤＴＤを含んでいない新しい反応基質溶液０．０８ｍＬを添加することによって、反応２回目の酵素反応を開始した。固定化酵素の再利用性の評価は、上述の実験手順に従い、合計２回行った。
【０１５３】
（実施例１６）異種酵素の活性評価（Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＤＴＤ及びＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０融合ＳＤＨ（Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＳＤＨ）の場合）
本実施例では、「Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＤＴＤ（Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ）」と共に、「Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ」又は、「Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＳＤＨ（Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ）」を含む緩衝液を用い、実施例（１５−１）の方法に従って、２種類の細孔径の異なるＦＳＭ型メソポーラスシリカ（ＦＳＭ２．６，中心細孔直径：２．６ｎｍ，ＦＳＭ８．０，中心細孔直径：８．０ｎｍ）、及び２種類の細孔径の異なるＳＢＡ型メソポーラスシリカ（ＳＢＡ５．４，中心細孔直径：５．４ｎｍ，ＳＢＡ８．１，中心細孔直径：８．１ｎｍ）の各微粒子に対して固定化処理を行い、４種類の「Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−メソポーラスシリカ複合体」及び４種類の「Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ−Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ−メソポーラスシリカ複合体」を形成させた。
コントロールとして遊離の未固定「Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ」及び「Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ−Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ」を用い、実施例（１５−２）の方法に従って、ホルマザンの発色度を指標としたＤ-ソルビトールからＤ-フルクトースへの変換反応の評価を行った。
【０１５４】
図２６（ｂ）に、異種酵素における遊離の未固定酵素、および、ＦＳＭ型メソポーラスシリカ（ＦＳＭ２．６および８．０）、ＳＢＡ型メソポーラスシリカ（ＳＢＡ５．４および８．１）に予め固定化・洗浄したＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０融合ＳＤＨ、または、Ｓｉ-ｔａｇ未融合ＳＤＨに対して、ＤＴＤを含んだ反応基質を添加した場合の反応２０分後の生成物（ホルマザン）の呈色を示した９６ウェルの平底マイクロプレートの写真を示す。
【０１５５】
図２６（ｂ）の写真によれば、４種類のＮｏｒｍａｌ ＤＴＤ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−シリカ微粒子複合体のいずれもが未固定の異種酵素（Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ及びＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ）と同様の、ホルマザン由来の呈色（紫色）を示した。これは、図２６（ａ）で示した、補酵素再生系を組み込んだ共役酵素反応を効率良く起こさせることに成功しており、すなわち、ＳＤＨによるＤ-ソルビトールからＤ-フルクトースへの変換反応の際、酸化型ＮＡＤ＋が還元型ＮＡＤＨへ変換され、さらに、ＤＴＤが駆動エネルギー源としてＮＡＤＨを利用して、テトラゾリウム塩（ＭＴＴ）をホルマザンに変換したことを示唆している。
一方、未固定の異種酵素（Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ及びＮｏｒｍａｌ ＳＤＨ）がホルマザン由来の呈色（紫色）を示したにもかかわらず、４種類のＮｏｒｍａｌ ＤＴＤ−Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ−メソポーラスシリカ複合体のいずれもが反応基質であるＭＴＴ由来の呈色（黄色）を示した。これより、Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ及びＮｏｒｍａｌ ＳＤＨをメソポーラスシリカに固定化した場合には共役酵素反応が起こらないと解される。
【０１５６】
また、図２６（ｃ）に、（ｂ）の反応後サンプルにおけるホルマザンの吸光度を指標として、固定化酵素の反応性（反応１回目および２回目）を評価した結果を示す。
図中、白棒状印は、未固定の異種酵素およびＤＴＤ−ＳＤＨ−メソポーラスシリカ複合体を用いた場合（反応１回目）、また、黒棒状印は、ＤＴＤ−ＳＤＨ−メソポーラスシリカ複合体を用いた場合（反応２回目）、である。また、図中、左図は、Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ−Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ−シリカ微粒子複合体の場合、また、右図は、Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ−Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ−シリカ微粒子複合体の場合、である。
【０１５７】
図２６（ｃ）左図によれば、ＦＳＭ型及びＳＢＡ型メソポーラスシリカ（反応１回目）のいずれも、細孔径が小さい場合（ＦＳＭ２．６及びＳＢＡ５．４）には、未固定の異種酵素（Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ及びＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ）よりも吸光度が低くなったが、細孔径が大きい場合（ＦＳＭ８．０及びＳＢＡ８．１）には、未固定の異種酵素よりも吸光度が高くなり、細孔径の最適化によってホルマザンの生成量の増大、すなわち、反応効率が向上する可能性が示唆された。
また、反応２回目では、更に、平均して２倍程度の吸光度の増大が確認された。吸光度が増大した原因としては、メソポーラスシリカ微粒子に反応１回目で生成されたホルマザンが吸着状態を維持しており、これに反応２回目に新たに生成されたホルマザンの吸光度が足し合わされたことが推察される。反応２回目の反応基質にはＤＴＤが含まれていないことを勘案すれば、前記の吸光度の増大は、Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ及びＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨの双方が固定化状態を保持し、反応１回目と同様の共役酵素反応を起こさせたことを示唆しており、反応２回目の再使用を達成したといえる。
【０１５８】
一方、図２６（ｃ）右図によれば、未固定の異種酵素（Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ及びＮｏｒｍａｌ ＳＤＨ）が図２６（ｃ）左図の未固定の異種酵素（Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ及びＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ）と同等の吸光度を示したにもかかわらず、ＦＳＭ型及びＳＢＡ型メソポーラスシリカ（反応１回目および２回目）では５６５ｎｍにおけるホルマザン由来の吸収が示されなかった。これより、図２６（ｂ）の結果と合わせて勘案しても、Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ及びＮｏｒｍａｌ ＳＤＨをメソポーラスシリカに固定化した場合には共役酵素反応が全く起こらないと解される。
【０１５９】
実施例（１５−１）において、各メソポーラスシリカ微粒子に対して、Ｓｉ-ｔａｇ融合ＳＤＨ（Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ）及びＳｉ-ｔａｇ未融合ＳＤＨ（Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨ）を固定化した直後の上清に含まれるＳＤＨの活性（Ｕ／Ｌ）を評価した結果、いずれのメソポーラスシリカ（ＦＳＭ２．６、ＦＳＭ８．０、ＳＢＡ５．４及びＳＢＡ８．１）にもＳＤＨが全量固定化されている可能性が示唆された。それにもかかわらず、Ｎｏｒｍａｌ ＳＤＨの場合は、大半の酵素が失活した結果、補酵素再生能（ＮＡＤ＋→ ＮＡＤＨ）及びＤ-ソルビトールからＤ-フルクトースへの変換能を発揮できなかったことが推察される。
【０１６０】
これらの実験結果より、ＤＴＤ及びＳＤＨを固定化したメソポーラスシリカ複合体を用いる場合、共役的な酵素反応を行う異種酵素のうち、少なくともＳＤＨをＳｉ-ｔａｇ融合体とすることで、ＳＤＨの活性低下を抑制しながら固定化異種酵素間の共役的な酵素反応を起こさせることが出来るようになり、（実施例１３）及び（実施例１４）での異種酵素（ＲＣＲ及びＳＤＨ）による反応結果におけるＳｉ-ｔａｇ融合ＳＤＨ（Ｓｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ）の優位な効果が追認できた。さらに、異種酵素（Ｎｏｒｍａｌ ＤＴＤ及びＳｉ-ｔａｇ-ＮＴ６０-ＳＤＨ）をメソポーラスシリカに固定化する際、メソポーラスシリカの細孔径を拡大することによって、シリカ表面で両酵素の触媒部位を最適に配向制御できた結果、補酵素再生系を組み込んだ共役酵素反応が効率的に行われ、酵素活性が飛躍的に向上することが確認でき、その共役的な酵素反応活性の向上効果は２回の繰り返し使用にも耐えられることがわかった（図２６（ｃ）左図）。
【図１】
2018033451.tif 000003
【図２】
2018033451.tif 000004
【図３】
2018033451.tif 000005
【図４】
2018033451.tif 000006
【図５】
2018033451.tif 000007
【図６】
2018033451.tif 000008
【図７】
2018033451.tif 000009
【図８】
2018033451.tif 000010
【図９】
2018033451.tif 000011
【図１０】
2018033451.tif 000012
【図１１】
2018033451.tif 000013
【図１２】
2018033451.tif 000014
【図１３】
2018033451.tif 000015
【図１４】
2018033451.tif 000016
【図１５】
2018033451.tif 000017
【図１６】
2018033451.tif 000018
【図１７】
2018033451.tif 000019
【図１８】
2018033451.tif 000020
【図１９】
2018033451.tif 000021
【図２０】
2018033451.tif 000022
【図２１】
2018033451.tif 000023
【図２２】
2018033451.tif 000024
【図２３】
2018033451.tif 000025
【図２４】
2018033451.tif 000026
【図２５】
2018033451.tif 000027
【図２６】
2018033451.tif 000028
【配列表】
2018033451000001.app