(57)【要約】【課題】内在性ペプチドの構造解析を効率良く且つ高精度で行う。【解決手段】目的の内在性ペプチドを含むMALDI用サンプルを調製し質量分析を実施したあと（S1-S3)、オンターゲット消化により内在性ペプチドを断片化して再度質量分析する（S4-S6)。酵素消化後に得られたマススペクトルに基づいて内在性ペプチドの産生元であるプロタンパク質を帰属する（S7）。その帰属によって求まったプロタンパク質の配列全長と酵素の切断特性を参照して、マススペクトル上の各ピークに対応する断片ペプチドを同定し、プロタンパク質の両末端に近い位置のペプチドをプリカーサイオンとして選択する（S9）。このプリカーサイオンに対するMS/MS分析の結果から部分配列を推定し(S11-S13)、その推定結果、内在性ペプチドのm/z値情報、プロタンパク質の配列に基づいて、内在性ペプチドの構造を推定する（S16）。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＳ／ＭＳ分析が可能である質量分析装置を用い、試料に含まれる目的の内在性ペプチドの構造を推定する内在性ペプチド解析方法であって、
a)目的の内在性ペプチドを含む試料に対し質量分析を実施してマススペクトルを取得する第１の質量分析実行ステップと、
b)前記試料中の目的の内在性ペプチドを消化酵素により分解して、複数種類の断片ペプチドを含む断片ペプチド混合試料を調製する断片化試料調製ステップと、
c)前記断片ペプチド混合試料に対し質量分析を実施してマススペクトルを取得する第２の質量分析実行ステップと、
d)前記第２の質量分析実行ステップにより得られた前記断片ペプチド混合試料に対するマススペクトルに基づいて、目的の内在性ペプチドの産生元であるプロタンパク質を推定するプロタンパク質推定ステップと、
e)前記第２の質量分析実行ステップにより得られた前記断片ペプチド混合試料に対するマススペクトルにおいて検出されたイオンピークに基づき、前記プロタンパク質推定ステップで推定されたプロタンパク質のアミノ酸配列情報を利用して前記断片ペプチド混合試料に含まれる複数種類の断片ペプチドのアミノ酸配列を推定し、その推定により得られた断片ペプチドのアミノ酸配列の中で目的の内在性ペプチドのＮ末端及びＣ末端に近いものとして推定されたアミノ酸配列に対応するイオンピークをＮ末端側、Ｃ末端側それぞれ一つ以上、ＭＳ／ＭＳ分析のプリカーサイオンとして選択するプリカーサイオン選択ステップと、
f)前記断片ペプチド混合試料に対し前記プリカーサイオン選択ステップで選択されたプリカーサイオンについてＭＳ／ＭＳ分析を実施してＭＳ／ＭＳマススペクトルを取得するＭＳ／ＭＳ分析実行ステップと、
g)前記ＭＳ／ＭＳ分析実行ステップにより得られたＭＳ／ＭＳスペクトルに基づいて、目的の内在性ペプチドの部分的なアミノ酸配列を有する断片ペプチドを同定する部分配列同定ステップと、
h)前記第１の質量分析実行ステップにより得られたマススペクトルにおいて検出されるイオンピークの質量電荷比、前記プロタンパク質推定ステップで推定されたプロタンパク質のアミノ酸配列、及び、前記部分配列同定ステップで得られた断片ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、目的の内在性ペプチドの構造を推定するペプチド構造推定ステップと、
を有することを特徴とする質量分析を用いた内在性ペプチド解析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の質量分析を用いた内在性ペプチド解析方法であって、
前記断片ペプチド混合試料に対し、前記第２の質量分析実行ステップにより得られたマススペクトルに基づいて所定の規則に従って選択されたプリカーサイオンについてＭＳ／ＭＳ分析を実施してＭＳ／ＭＳマススペクトルを取得する事前ＭＳ／ＭＳ分析実行ステップをさらに有し、
前記プロタンパク質推定ステップでは、前記断片ペプチド混合試料に対するマススペクトルに基づいてプロタンパク質が推定できない場合に、前記事前ＭＳ／ＭＳ分析実行ステップにより得られたＭＳ／ＭＳスペクトルに基づいてプロタンパク質を推定することを特徴とする質量分析を用いた内在性ペプチド解析方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の質量分析を用いた内在性ペプチド解析方法であって、
前記質量分析装置はマトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法によるイオン源を有し、
前記断片化試料調製ステップでは、ＭＡＬＤＩ用プレート上で目的の内在性ペプチドを含む試料に液体マトリクス合成試薬を加えたうえで分解酵素を加えて酵素消化を行うことにより、断片ペプチド混合試料を含むＭＡＬＤＩ用サンプルを調製することを特徴とする質量分析を用いた内在性ペプチド解析方法。
【請求項４】
請求項３に記載の質量分析を用いた内在性ペプチド解析方法であって、
ＭＡＬＤＩ用プレート上に滴下された試料に所定のマトリクスを加えてサンプルを調製し、該サンプルに対し前記第１の質量分析実行ステップにおいて質量分析を実行し、そのあと、前記ＭＡＬＤＩ用プレート上のサンプルに液体マトリクス合成試薬及び分解酵素を加えて前記断片化試料調製ステップを実施することを特徴とする質量分析を用いた内在性ペプチド解析方法。
【請求項５】
請求項４に記載の質量分析を用いた内在性ペプチド解析方法であって、
生体由来の試料を液体クロマトグラフにより分離・精製したうえで前記ＭＡＬＤＩ用プレート上に滴下してサンプルを調製することを特徴とする質量分析を用いた内在性ペプチド解析方法。
【請求項６】
請求項４に記載の質量分析を用いた内在性ペプチド解析方法であって、
前記質量分析装置として、マトリクス支援レーザ脱離イオン化タンデム飛行時間型質量分析装置を用いることを特徴とする質量分析を用いた内在性ペプチド解析方法。
【請求項７】
試料に含まれる目的の内在性ペプチドの構造を推定する内在性ペプチド解析装置であって、
a)ＭＳ／ＭＳ分析が可能である質量分析部と、
b)目的の内在性ペプチドを含む試料に対し質量分析を実行するように前記質量分析部を制御してマススペクトルを取得するとともに、前記試料中の目的の内在性ペプチドを消化酵素により分解することで調製された複数種類の断片ペプチドを含む断片ペプチド混合試料に対し質量分析を実行するように前記質量分析部を制御してマススペクトルを取得する質量分析実行制御部と、
c)前記質量分析実行制御部の制御の下で得られた前記断片ペプチド混合試料に対するマススペクトルに基づいて、目的の内在性ペプチドの産生元であるプロタンパク質を推定するプロタンパク質推定部と、
d)前記質量分析実行制御部の制御の下で得られた前記断片ペプチド混合試料に対するマススペクトルにおいて検出されたイオンピークに基づき、前記プロタンパク質推定部で推定されたプロタンパク質のアミノ酸配列情報を利用して前記断片ペプチド混合試料に含まれる複数種類の断片ペプチドのアミノ酸配列を推定し、その推定により得られた断片ペプチドのアミノ酸配列の中で目的の内在性ペプチドのＮ末端及びＣ末端に近いものとして推定されたアミノ酸配列に対応するイオンピークをＮ末端側、Ｃ末端側それぞれ一つ以上、ＭＳ／ＭＳ分析のプリカーサイオンとして選択するプリカーサイオン選択部と、
e)前記断片ペプチド混合試料に対し前記プリカーサイオン選択部で選択されたプリカーサイオンについてＭＳ／ＭＳ分析を実施するように前記質量分析部を制御してＭＳ／ＭＳマススペクトルを取得するＭＳ／ＭＳ分析実行制御部と、
f)前記ＭＳ／ＭＳ分析実行制御部の制御の下で得られたＭＳ／ＭＳスペクトルに基づいて、目的の内在性ペプチドの部分的なアミノ酸配列を有する断片ペプチドを同定する部分配列同定部と、
g)前記試料に対するマススペクトルにおいて検出されるイオンピークの質量電荷比、前記プロタンパク質推定部で推定されたプロタンパク質のアミノ酸配列、及び、前記部分配列同定部で得られた断片ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、目的の内在性ペプチドの構造を推定するペプチド構造推定部と、
を備えることを特徴とする内在性ペプチド解析装置。
【請求項８】
請求項７に記載の内在性ペプチド解析装置であって、
前記ＭＳ／ＭＳ分析実行制御部は、前記プリカーサイオン選択部で選択されたプリカーサイオンについてのＭＳ／ＭＳ分析を実施するよりも前に、前記断片ペプチド混合試料に対して得られたマススペクトルに基づいて所定の規則に従って選択されたプリカーサイオンについてＭＳ／ＭＳ分析を実施するように前記質量分析部を制御することで、事前ＭＳ／ＭＳマススペクトルを取得し、
前記プロタンパク質推定部は、前記断片ペプチド混合試料に対するマススペクトルに基づいてプロタンパク質が推定できない場合に、前記事前ＭＳ／ＭＳスペクトルに基づいてプロタンパク質を推定することを特徴とする内在性ペプチド解析装置。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の内在性ペプチド解析装置であって、
前記質量分析部はマトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法によるイオン源を有したものであり、
生体由来の試料を液体クロマトグラフにより分離・精製したうえでＭＡＬＤＩ用プレート上に滴下するＭＡＬＤＩ用試料スポッタをさらに備えることを特徴とする内在性ペプチド解析装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の内在性ペプチド解析装置であって、
前記ＭＡＬＤＩ用プレート上の目的の内在性ペプチドを含む試料に液体マトリクス合成試薬を加えたうえで分解酵素を加えて該プレート上で酵素消化を行うオンターゲット試料消化部をさらに備えることを特徴とする内在性ペプチド解析装置。
【請求項１１】
請求項７に記載の内在性ペプチド解析装置であって、
前記質量分析部は、マトリクス支援レーザ脱離イオン化タンデム飛行時間型質量分析装置であることを特徴とする内在性ペプチド解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内で産生される内在性ペプチドの構造を、質量分析を利用して解析する内在性ペプチド解析方法、及びそのための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、生体内においてタンパク質が分解されて産生されたペプチドは、内在性ペプチドと呼ばれる。内在性ペプチドの中で生理機能を有するペプチドは、生理活性ペプチドと呼ばれる。また、生理ペプチドの前駆体タンパク質は未成熟なタンパク質であることから、プロタンパク質とも呼ばれる。
【０００３】
なお、通常、内在性ペプチドは生理活性を有するもののみならず、不要となったタンパク質が分解されて再利用される過程で生成された代謝産物にすぎないものも含み、その場合、生成元のタンパク質をプロタンパク質（又は前駆体タンパク質）と呼ばないのが普通であるが、本明細書では便宜上、そうした代謝産物も含めてペプチドの生成元であるタンパク質を全てプロタンパク質ということとする。また、一般にペプチドとは１０００〜５０００Da程度の分子量を有するものを指すが、本明細書では、プロタンパク質が生体内で分解されて産生されたプロタンパク質の部分断片をその大きさに拘わらず内在性ペプチドと呼び、人為的な酵素消化処理によって得られた消化断片である断片ペプチドと区別することとする。
【０００４】
内在性ペプチドは、プロタンパク質のペプチド結合が加水分解により切断されて生成されるものであるが、切断部位に対する特異性の有無を含む様々なタンパク質分解酵素が分解に関与するため分解様式が多様であることが一つの要因となり、構造が未知であるものが多い。また、一種類のプロタンパク質から共通の部分配列を持つ複数種類のペプチドが産生されることがしばしばあり、また、大きさも不揃いであって、分子量が４０００を超えるような大きなものも少なくない。
【０００５】
近年、タンパク質やペプチドの構造解析には、高いスループットでＭＳ／ＭＳ分析が可能であるマトリクス支援レーザ脱離イオン化タンデム飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ）が広く利用されている。但し、こうした装置で用いられている衝突誘起解離（ＣＩＤ）などのイオン解離手法では、分子量が４０００を超えるような大きな１価のイオンを効率良く開裂させることが難しい。そのため、上述したように分子量の大きな内在性ペプチドの構造解析をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳを用いて行う場合、一般的なタンパク質の同定と同様に、分析の前処理として酵素消化が用いられるのが一般的である。
【０００６】
即ち、まず内在性ペプチドを含む試料に対し酵素消化を行うことによって内在性ペプチドを断片化し、得られた断片ペプチドの混合物に対してＭＳ／ＭＳ分析を行う。そして、その分析結果を解析することによって、内在性ペプチドの元となったプロタンパク質の帰属（つまりは同定）を試みる。プロタンパク質を帰属する際には、プロテオーム解析で広く使用されているタンパク質同定法であるタンパク質配列データベース検索法（例えば米国マトリクスサイエンス社が提供しているMascotに含まれるＭＳ／ＭＳイオンサーチなど）やデノボシーケンシング法などが用いられることが多い（特許文献１など参照）。
【０００７】
上述したように従来のタンパク質・ペプチド同定法を用いることによって、酵素消化により断片化された断片ペプチドからプロタンパク質を同定することが可能である。しかしながら、断片ペプチドからプロタンパク質を同定できたとしても、内在性ペプチドがそのプロタンパク質のいずれの部位において切断されて生成されたのかを推定することは困難である。その理由としては、プロタンパク質の切断点である内在性ペプチド末端を含む断片ペプチドが必ずしも同定されるとは限らないこと、また、末端を含む断片ペプチドが同定された場合であっても、内在性ペプチドのペプチド構造は酵素消化の際に断片化されてしまっており、その酵素消化による切断とプロタンパク質から内在性ペプチドが産生された際の切断との区別がつかない場合があること、そして、そもそも、酵素消化処理は通常、試料精製前に１回のみ実施されることが多く、１種類のプロタンパク質由来の内在性ペプチド末端を含む断片ペプチドが何種類も同定された場合に、どの末端同士が元の内在性ペプチドの末端を構成していたのか推定することが難しいこと、などが挙げられる。また現状では、内在性ペプチドの切断部位に関する情報を完備したタンパク質のアミノ酸配列データベースは存在せず、タンパク質分解酵素とプロタンパク質との相互作用に関する情報も不足しているために、十分な精度で内在性ペプチドの切断部位を推定することも困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１５−２３０２６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように内在性ペプチドには生理機能上重要な機能を有するものもあるため、ペプチドを新たに同定し、その構造を解析することは医療分野、製薬分野などにおいて重要である。また、生理機能を持たないペプチドであっても、特定の疾病の罹患等によって構造や産生量が特異的に変化するものはバイオマーカーとして有用であり、その構造や産生量が変化していないかどうかを捉えることは疾病の診断や治療のうえで重要である。しかしながら、質量分析を利用した内在性ペプチドの構造解析や網羅的な解析の手法は現在まで確立されていない。
【００１０】
本発明はこうした課題に鑑みて成されたものであり、その主たる目的は、内在性ペプチドの構造解析を効率良く且つ精度良く行うことができる質量分析を用いた内在性ペプチド解析方法及び装置を提供することである。
【００１１】
また、本発明の他の目的は、分析に際しての試料の損失をできるだけ抑えることで、少ない量の試料であっても内在性ペプチドの構造等の解析を精度良く行うことができる、質量分析を用いた内在性ペプチド解析方法及び装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために成された本発明に係る内在性ペプチド解析方法は、ＭＳ／ＭＳ分析が可能である質量分析装置を用い、試料に含まれる目的の内在性ペプチドの構造を推定する内在性ペプチド解析方法であって、
a)目的の内在性ペプチドを含む試料に対し質量分析を実施してマススペクトルを取得する第１の質量分析実行ステップと、
b)前記試料中の目的の内在性ペプチドを消化酵素により分解して、複数種類の断片ペプチドを含む断片ペプチド混合試料を調製する断片化試料調製ステップと、
c)前記断片ペプチド混合試料に対し質量分析を実施してマススペクトルを取得する第２の質量分析実行ステップと、
d)前記第２の質量分析実行ステップにより得られた前記断片ペプチド混合試料に対するマススペクトルに基づいて、目的の内在性ペプチドの産生元であるプロタンパク質を推定するプロタンパク質推定ステップと、
e)前記第２の質量分析実行ステップにより得られた前記断片ペプチド混合試料に対するマススペクトルにおいて検出されたイオンピークに基づき、前記プロタンパク質推定ステップで推定されたプロタンパク質のアミノ酸配列情報を利用して前記断片ペプチド混合試料に含まれる複数種類の断片ペプチドのアミノ酸配列を推定し、その推定により得られた断片ペプチドのアミノ酸配列の中で目的の内在性ペプチドのＮ末端及びＣ末端に近いものとして推定されたアミノ酸配列に対応するイオンピークをＮ末端側、Ｃ末端側それぞれ一つ以上、ＭＳ／ＭＳ分析のプリカーサイオンとして選択するプリカーサイオン選択ステップと、
f)前記断片ペプチド混合試料に対し前記プリカーサイオン選択ステップで選択されたプリカーサイオンについてＭＳ／ＭＳ分析を実施してＭＳ／ＭＳマススペクトルを取得するＭＳ／ＭＳ分析実行ステップと、
g)前記ＭＳ／ＭＳ分析実行ステップにより得られたＭＳ／ＭＳスペクトルに基づいて、目的の内在性ペプチドの部分的なアミノ酸配列を有する断片ペプチドを同定する部分配列同定ステップと、
h)前記第１の質量分析実行ステップにより得られたマススペクトルにおいて検出されるイオンピークの質量電荷比、前記プロタンパク質推定ステップで推定されたプロタンパク質のアミノ酸配列、及び、前記部分配列同定ステップで得られた断片ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、目的の内在性ペプチドの構造を推定するペプチド構造推定ステップと、
を有することを特徴としている。
【００１３】
また上記課題を解決するために成された本発明に係る内在性ペプチド解析装置は、試料に含まれる目的の内在性ペプチドの構造を推定する内在性ペプチド解析装置であって、
a)ＭＳ／ＭＳ分析が可能である質量分析部と、
b)目的の内在性ペプチドを含む試料に対し質量分析を実行するように前記質量分析部を制御してマススペクトルを取得するとともに、前記試料中の目的の内在性ペプチドを消化酵素により分解することで調製された複数種類の断片ペプチドを含む断片ペプチド混合試料に対し質量分析を実行するように前記質量分析部を制御してマススペクトルを取得する質量分析実行制御部と、
c)前記質量分析実行制御部の制御の下で得られた前記断片ペプチド混合試料に対するマススペクトルに基づいて、目的の内在性ペプチドの産生元であるプロタンパク質を推定するプロタンパク質推定部と、
d)前記質量分析実行制御部の制御の下で得られた前記断片ペプチド混合試料に対するマススペクトルにおいて検出されたイオンピークに基づき、前記プロタンパク質推定部で推定されたプロタンパク質のアミノ酸配列情報を利用して前記断片ペプチド混合試料に含まれる複数種類の断片ペプチドのアミノ酸配列を推定し、その推定により得られた断片ペプチドのアミノ酸配列の中で目的の内在性ペプチドのＮ末端及びＣ末端に近いものとして推定されたアミノ酸配列に対応するイオンピークをＮ末端側、Ｃ末端側それぞれ一つ以上、ＭＳ／ＭＳ分析のプリカーサイオンとして選択するプリカーサイオン選択部と、
e)前記断片ペプチド混合試料に対し前記プリカーサイオン選択部で選択されたプリカーサイオンについてＭＳ／ＭＳ分析を実施するように前記質量分析部を制御してＭＳ／ＭＳマススペクトルを取得するＭＳ／ＭＳ分析実行制御部と、
f)前記ＭＳ／ＭＳ分析実行制御部の制御の下で得られたＭＳ／ＭＳスペクトルに基づいて、目的の内在性ペプチドの部分的なアミノ酸配列を有する断片ペプチドを同定する部分配列同定部と、
g)前記試料に対するマススペクトルにおいて検出されるイオンピークの質量電荷比、前記プロタンパク質推定部で推定されたプロタンパク質のアミノ酸配列、及び、前記部分配列同定部で得られた断片ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、目的の内在性ペプチドの構造を推定するペプチド構造推定部と、
を備えることを特徴としている。
【００１４】
本発明に係る内在性ペプチド解析方法で使用される質量分析装置、又は、本発明に係る内在性ペプチド解析装置における質量分析部としては、ＭＳ／ＭＳ分析が可能である種々の方式の質量分析装置を利用することができる。例えば、タンデム飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ）、四重極飛行時間型質量分析装置（ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ）、イオントラップ飛行時間型質量分析装置（ＩＴ−ＴＯＦ  ＭＳ）、イオントラップ型質量分析装置（ＩＴ  ＭＳ）、リニアイオントラップ型質量分析装置（ＬＩＴ  ＭＳ）などが利用可能である。また、１台の質量分析装置で全ての分析（質量分析、ＭＳ／ＭＳ分析）を実施するとは限らず、例えば通常の質量分析はＭＳ／ＭＳ分析ができないタイプの質量分析装置、例えば飛行時間型質量分析装置（ＴＯＦ  ＭＳ）で行い、ＭＳ／ＭＳ分析をＭＳ／ＭＳ分析が可能である上記のような各種の質量分析装置を用いて実施しても構わない。
【００１５】
本発明に係る内在性ペプチド解析装置により実施される本発明に係る内在性ペプチド解析方法では、解析対象である内在性ペプチドが含まれる試料をトリプシン等の消化酵素で分解する前の試料に対するマススペクトルと、消化酵素で分解したあとの断片ペプチド混合試料に対するマススペクトルと、を取得したあと、プロタンパク質推定ステップにおいて、その断片ペプチド混合試料に対するマススペクトルに基づき、目的の内在性ペプチドの産生元であるプロタンパク質を推定する。プロタンパク質の推定には、例えば周知のペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）法などを用いることができる。
【００１６】
但し、断片ペプチド混合試料に対するマススペクトルに基づいてプロタンパク質が必ずしも推定できるとは限らない。
そこで、本発明に係る内在性ペプチド解析方法では、
前記断片ペプチド混合試料に対し、前記第２の質量分析実行ステップにより得られたマススペクトルに基づいて所定の規則に従って選択されたプリカーサイオンについてＭＳ／ＭＳ分析を実施してＭＳ／ＭＳマススペクトルを取得する事前ＭＳ／ＭＳ分析実行ステップをさらに有し、
前記プロタンパク質推定ステップでは、前記断片ペプチド混合試料に対するマススペクトルに基づいてプロタンパク質が推定できない場合に、前記事前ＭＳ／ＭＳ分析実行ステップにより得られたＭＳ／ＭＳスペクトルに基づいてプロタンパク質を推定するようにするとよい。
【００１７】
断片ペプチド混合試料に対するマススペクトルに基づいてプロタンパク質が推定できない理由として、例えば内在性ペプチドの精製が十分でなく少数種類の内在性ペプチド由来の断片ペプチドが混合しているために十分な信頼度で以てプロタンパク質を推定できない、或いは、酵素消化によって分解されたあとの断片ペプチドの分子量が大きいために十分な感度で検出できないなどの理由により、検出された断片ペプチドの種類が少なくプロタンパク質を推定するのに必要な情報が不足している、といったことが考えられる。ＭＳ／ＭＳ分析の過程でのイオン選択及び解離操作によって断片ペプチドに固有の部分構造情報が得られ、それによって、プロタンパク質に固有の部分構造に関する情報量も増える。その結果、ＭＳ／ＭＳスペクトルではマススペクトルに比べて情報量が増加し、プロタンパク質を推定できる可能性が高まる。
【００１８】
なお、事前ＭＳ／ＭＳ分析実行ステップにおいてＭＳ／ＭＳ分析の対象となるプリカーサイオンは、通常、マススペクトル上で観測されるイオンピークの信号強度や質量電荷比等に基づく一般的なプリカーサイオン選択手法により決められるものであり、そのあとのプリカーサイオン選択ステップで行われるようにアミノ酸配列などが考慮されたものではない。
【００１９】
プロタンパク質が推定されたあと、プリカーサイオン選択ステップでは、そのプロタンパク質のアミノ酸配列情報を参照して、断片ペプチド混合試料に対するマススペクトルにおいて検出されたイオンピーク、つまりは内在性ペプチドに由来する様々な断片ペプチドに対応するイオンピークの質量情報に基づいて、それらの断片ペプチドのアミノ酸配列を推定する。その際に、酵素消化に利用された酵素に特有の切断部位特性も利用するとよい。ここでは一般的に、或る程度の種類の断片ペプチドのアミノ酸配列が推定されるが、その中で、プロタンパク質のＮ末端及びＣ末端にできるだけ近いアミノ酸配列を見いだし、Ｎ末端側、Ｃ末端側それぞれ一つ以上のアミノ酸配列に対応する断片ペプチドをプリカーサイオンとして選択する。プロタンパク質のＮ末端及びＣ末端に近いアミノ酸配列を探索する理由は、そうしたアミノ酸配列はそのプロタンパク質から生成される目的の内在性ペプチドの末端の部分配列を含んでいる可能性が高く、目的の内在性ペプチドの両末端の部分配列が決まれば、それらに挟まれるアミノ酸配列の推定は比較的容易であるからである。
【００２０】
そうして選択された複数のプリカーサイオンについてそれぞれＭＳ／ＭＳ分析を実施してＭＳ／ＭＳスペクトルが得られたならば、部分配列同定ステップでは、そのＭＳ／ＭＳスペクトルに基づいて、目的の内在性ペプチド由来の断片ペプチドを同定する。上記理由により、同定される断片ペプチドは目的の内在性ペプチドの末端の部分構造を含んでいる可能性が高い。ペプチド構造推定ステップでは、酵素消化していない試料に対するマススペクトルにおいて検出されるイオンピークの質量電荷比、つまりは目的の内在性ペプチドの質量情報と、推定されたプロタンパク質のアミノ酸配列と、上記複数の断片ペプチドのアミノ酸配列とに基づいて、目的の内在性ペプチドの構造を推定する。
【００２１】
一般に、目的の内在性ペプチドの構造を推定する際に、その内在性ペプチド由来の断片ペプチドをより多く同定できるほど、その内在性ペプチドの構造の候補をより少なく絞り込むことができる。断片ペプチドを多く同定するには、できるだけ多くの種類のプリカーサイオンについてＭＳ／ＭＳ分析を行うことが望ましいが、そうすると分析に要する時間が長くなるし、多くの場合（特に生体由来の試料の場合）、試料の量が限られているためＭＳ／ＭＳ分析の実行回数には制約がある。これに対し、本発明に係る内在性ペプチド解析方法では、上述したように、内在性ペプチドの構造推定にできるだけ有用な断片ペプチドが生成されるようにＭＳ／ＭＳ分析のプリカーサイオンが選択される。そのため、ＭＳ／ＭＳ分析の実行回数が少なくても内在性ペプチドの構造候補を良好に絞り込むことが可能となり、内在性ペプチドの構造推定を精度良く行うことができる。
【００２２】
また本発明に係る内在性ペプチド解析方法において、好ましくは、
前記質量分析装置はマトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法によるイオン源を有し、
前記断片化試料調製ステップでは、ＭＡＬＤＩ用プレート上で目的の内在性ペプチドを含む試料に液体マトリクス合成試薬を加えたうえで分解酵素を加えて酵素消化を行うことにより、断片ペプチド混合試料を含むＭＡＬＤＩ用サンプルを調製するとよい。即ち、ここでは、液体マトリクスを用いた、オンターゲット消化（又はオンプレート消化）と呼ばれる手法により、内在性ペプチドを酵素消化するとよい。
【００２３】
また本発明に係る内在性ペプチド解析装置では、こうした酵素消化を行うためにオンターゲット試料消化部をさらに備える構成とするとよい。
オンターゲット消化では、質量分析を実施するサンプルを調製するＭＡＬＤＩ用プレート上で試料に対する酵素消化を行うので、酵素処理の作業に要する手間や時間を節約することができる。また、酵素処理の過程で用いた容器への試料の吸着等のロスもなくなるので、微量な試料を無駄なく利用することができる。
【００２４】
また本発明に係る内在性ペプチド解析方法では、ＭＡＬＤＩ用プレート上に滴下された試料に所定のマトリクスを加えてサンプルを調製し、該サンプルに対し前記第１の質量分析実行ステップにおいて質量分析を実行し、そのあと、前記ＭＡＬＤＩ用プレート上のサンプルに液体マトリクス合成試薬及び分解酵素を加えて前記断片化試料調製ステップを実施することが望ましい。
【００２５】
これによれば、予め試料を酵素処理するものと酵素処理しないものとに分ける必要がなく、試料を酵素処理せずに分析を遂行し、その分析実行後の試料（つまりは残りの試料）を酵素処理して再び分析に供すればよい。それにより、サンプル調製の作業手順が簡単になってその作業に要する手間や時間が節約できるとともに、試料のロスも一層軽減できるため、試料が微量であっても分析に供される試料がＭＳ／ＭＳ分析時等に枯渇してしまうことを回避することができる。
なお、分析のスループットを高めるために、上記第１の質量分析ステップにおいて実施した質量分析により、目的とする質量電荷比値（例えばm/z ４０００）を超えるイオンピークが検出された試料のみに対して、上記断片化試料調製ステップにおける処理を実施してもよい。
【００２６】
また本発明に係る内在性ペプチド解析方法では、生体由来の試料を液体クロマトグラフにより分離・精製したうえで前記ＭＡＬＤＩ用プレート上に滴下してサンプルを調製するとよい。
【００２７】
また本発明に係る内在性ペプチド解析装置では、上記処理を行うために、生体由来の試料を液体クロマトグラフにより分離・精製したうえでＭＡＬＤＩ用プレート上に滴下するＭＡＬＤＩ用試料スポッタをさらに備える構成とするとよい。
【００２８】
これにより、生体由来である元の試料に多数の種類の物質（内在性ペプチド）が含まれる場合であっても、特定の一種類又は少数種類の内在性ペプチドが含まれる試料を分析対象とすることができる。それにより、内在性ペプチドと酵素消化後の断片ペプチドとの対応付けが確実に行え、解析作業が容易になる。
【００２９】
なお、本発明に係る内在性ペプチド解析方法で使用される質量分析装置としては上述したような様々なタイプの質量分析装置を用いることができるが、分子量の大きなペプチド由来のイオンピークを高感度且つ高スループットで以て質量分析（ＭＳ1分析）することができるとともに、高スループットで以てＭＳ／ＭＳ分析が実行可能であることが好ましい。そこで、より好ましくは、マトリクス支援レーザ脱離イオン化タンデム飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ−ＭＳ）を使用するとよい。但し、上述したように、通常の質量分析（ＭＳ1分析）とＭＳ／ＭＳ分析とは必ずしも同じ装置で行う必要はないから、例えば上記ＭＳ／ＭＳ分析実行ステップ及び事前ＭＳ／ＭＳ分析実行ステップはＩＴ−ＴＯＦ  ＭＳを用い、それ以外の第１の質量分析実行ステップ等はより高感度であるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ−ＭＳ又はＴＯＦ  ＭＳなどを用いてもよい。
【発明の効果】
【００３０】
本発明に係る質量分析を用いた内在性ペプチド解析方法及び解析装置によれば、従来は困難であった内在性ペプチドの構造解析を効率良く且つ精度良く行うことができる。また、サンプル調製等の前処理の際の試料のロスを抑えることができるので、生体由来試料のように元々試料の量が少ない場合であっても、該試料を有効に利用しつつ該試料に含まれる内在性ペプチドの構造解析を精度良く行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の一実施例である内在性ペプチド解析方法を実施するための内在性ペプチド解析装置の要部の構成図。
【図２】本実施例の内在性ペプチド解析方法の作業及び処理の手順を示すフローチャート。
【図３】図２中のプロタンパク質の帰属処理ステップの詳細な処理の一態様を示すフローチャート。
【図４】図２中のプロタンパク質の帰属処理ステップの詳細な処理の別の態様を示すフローチャート。
【図５】本実施例の内在性ペプチド解析方法におけるサンプル調製及びオンターゲット試料消化の説明図。
【図６】本実施例の内在性ペプチド解析方法を用いた場合における、断片ペプチドの部分配列の末端からアミノ酸を伸長させたときに所定のペプチド質量に一致する候補の数と質量許容誤差との関係をシミュレーションした結果を示す図であり、（ａ）は未決定配列数が５個である場合、（ｂ）は未決定配列数が４０個である場合。
【図７】本実施例の内在性ペプチド解析方法を用いた場合における、断片ペプチドの部分配列の末端からアミノ酸を伸長させたときに所定のペプチド質量に一致する候補の数と未決定配列数との関係をシミュレーションした結果を示す図。
【図８】ウマミオグロビン由来の断片ペプチドのマススペクトル上でのピーク強度順位、ＰＭＦ法（Mascot：PMF使用）により得られた部分配列ペプチドの質量、Ｎ／Ｃ末端残基番号、及びアミノ酸配列を示す図。
【図９】ウマミオグロビンの配列推定シミュレーションにより得られた配列候補数と同定ペプチド数との関係を示す図。
【図１０】ウマミオグロビン由来の断片ペプチドのマススペクトルの実測例を示す図。
【図１１】図１０に示したマススペクトルに基づくＰＭＦ法による同定結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明に係る内在性ペプチド解析方法及びその方法を実施する解析装置の一実施例について、添付図面を参照して詳細に説明する。
図１は本実施例の内在性ペプチド解析装置の要部の構成図である。
【００３３】
本装置は、尿や血液等の生体から採取した生体試料由来の試料中の成分を分離・精製してＭＡＬＤＩ用プレート上にスポッティングするＭＡＬＤＩ用試料スポッタ７と、ＭＡＬＤＩ用プレート上で試料に対する酵素消化を行うオンターゲット試料消化部８と、与えられたＭＡＬＤＩ用サンプルＳに対してイオン解離操作を伴わない通常の質量分析（以下ＭＳ分析という）又はＭＳ／ＭＳ分析を実行してデータを収集する質量分析部１と、質量分析部１により得られたデータを解析処理するデータ解析部２と、質量分析部１を制御する分析制御部３と、システム全体を統括的に制御する主制御部４と、ユーザにより操作される入力部５と、ユーザに分析結果等を提示する表示部６と、を含む。
【００３４】
質量分析部１は、ＭＳ／ＭＳ分析が可能であるとともに、高スループットで且つ質量分解能や質量精度が高いことが望ましく、ここでは、ＭＡＬＤＩイオン源とタンデム飛行時間型質量分析装置を組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳを用いるものとする。但し、質量分析部１はこれに限るものではなく、ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ、ＩＴ−ＴＯＦ  ＭＳ、ＩＴ  ＭＳ、ＬＩＴ  ＭＳなどの様々な装置が利用可能である。また、上述したようにタイプが相違する複数の装置を併用しても構わない。
【００３５】
オンターゲット試料消化部８は、ＭＡＬＤＩ用のプレート上で試料に分解酵素を添加し、該プレート上で試料中の内在性ペプチドを分解するものである。データ解析部２は、機能ブロックとして、データ格納部２０、マススペクトル作成部２１、プロタンパク質帰属部２２、プリカーサイオン選択部２３、部分配列同定部２４、ペプチド構造推定部２５等を含む。
【００３６】
なお、一般に、主制御部４、データ解析部２、及び分析制御部３の少なくとも一部は、パーソナルコンピュータ又はより高性能なワークステーション等をハードウェア資源とし、該コンピュータに予めインストールされた専用の制御・処理ソフトウェアを該コンピュータ上で動作させることでそれぞれの機能を達成する構成である。
【００３７】
図２は、図１に示した装置を用いて実行される内在性ペプチドの解析処理の手順を示すフローチャートである。図３、図４はそれぞれ、図２中のプロタンパク質の帰属の際の具体的な処理手順の異なる例を示すフローチャートである。図５は、サンプル調製及びオンターゲット試料消化の説明図である。これら図を参照しつつ、試料に含まれる内在性ペプチドを解析する際の作業及び処理について説明する。
【００３８】
まず、解析対象である内在性ペプチドを含むサンプルをＭＡＬＤＩ用サンプルプレート上に調製する（ステップＳ１）。
具体的には例えば、元の試料が尿や血液等の生体から採取した生体試料である場合、ゲル濾過クロマトグラフィなどの方法により、分析したい分子量（例えばm/z ４０００〜２００００）のペプチドを選択的に分取したペプチド混合物試料を取得する。さらに、このペプチド混合物試料をＭＡＬＤＩ用試料スポッタ７においてまず液体クロマトグラフィ（ＬＣ）により分離及び精製し、図５（ａ）に示すように、そのＬＣ溶出液をＭＡＬＤＩ用サンプルプレート１００上の所定の位置（ウェル）に滴下する。そのあと、図５（ｂ）に示すように、その上にＭＡＬＤＩ用のマトリクスとしてα-シアノ-４-ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）の溶液を滴下する。これにより、目的の内在性ペプチドを含むＭＡＬＤＩ用サンプルＳが調製される。
【００３９】
上記のように調製されたサンプルＳをユーザは質量分析部１の所定位置にセットし、解析開始を指示する。この指示を受けた分析制御部３の制御の下で、質量分析部１は目的の内在性ペプチドを含むサンプルＳに対するＭＳ分析を実行する（ステップＳ２）。ＭＳ分析により得られた、酵素消化前のサンプルＳに対するマススペクトルデータはデータ解析部２に送られ、データ格納部２０に保存される（ステップＳ３）。
【００４０】
次いで、上記ＭＳ分析後のサンプルプレート１００上の未消化の試料を、該プレート１００上で分解酵素により消化することで分解する（ステップＳ４）。
即ち、図５（ｄ）に示すように、サンプルプレート１００上の未消化の試料に液体マトリクス合成試薬である３?アミノキノリン（３ＡＱ）溶液を滴下する。これにより、マトリクスは３-アミノキノリンとα-シアノ-４-ヒドロキシケイ皮酸を含むものとなる（図５（ｅ）参照）。これにさらに、図５（ｆ）に示すように、トリプシンなどの所定の分解酵素を滴下することで試料中の内在性ペプチドの結合が切断され、目的の内在性ペプチドに由来する複数種類の断片ペプチドを含むサンプル、つまり酵素消化後の断片ペプチド混合試料が調製される。
【００４１】
上記のオンターゲット消化は、通常、質量分析装置から試料を取り出して手作業で行われるが、ここでは、オンターゲット試料消化部８において上記のような液体マトリクス試薬や分解酵素の添加を自動的に行うようにしている。もちろん、手作業により同様の作業を行っても構わない。
【００４２】
上記のように調製された消化後のサンプル（断片ペプチド混合試料）が質量分析部１の所定位置にセットされると、質量分析部１はこのサンプルに対し再びＭＳ分析を実行する（ステップＳ５）。ＭＳ分析により得られた、消化後のサンプルに対するマススペクトルデータはデータ解析部２に送られ、データ格納部２０に保存される（ステップＳ６）。
【００４３】
次に、プロタンパク質帰属部２２は、ステップＳ６でデータ格納部２０に保存された消化後のサンプルに対するマススペクトルデータに基づいて、目的の内在性ペプチドの産生元であるプロタンパク質の帰属、つまりはプロタンパク質のアミノ酸配列の推定を試みる（ステップＳ７）。
【００４４】
プロタンパク質を帰属する方法としては、図３、図４に示した二つの方法のいずれかを用いることができる。図３に示した方法と図４に示した方法との違いは、前者はＭＳ分析で得られた結果のみを利用するのに対し、後者はＭＳ分析の結果を利用してプロタンパク質の帰属ができない場合にＭＳ／ＭＳ分析を実施し、その結果を利用してプロタンパク質の帰属を試みることである。
【００４５】
即ち、図３に示した方法では、プロタンパク質帰属部２２は、酵素消化のサンプルである断片ペプチド混合試料に対するＭＳ分析により得られたマススペクトルに対し周知のＰＭＦ法（例えばMascot：PMF）を適用してプロタンパク質の帰属を試みる（ステップＳ７１）。様々な断片ペプチド由来のイオンピークがマススペクトルに比較的明瞭に現れている場合、ステップＳ７１の処理でプロタンパク質の帰属が可能なことが多い。但し、仮にプロタンパク質が帰属されなかった場合には、その旨の情報を有して図２に示すフローチャートへ戻るため、ステップＳ８でＮｏと判定され、そのまま処理が終了する。
【００４６】
一方、図４に示した方法では、プロタンパク質帰属部２２はまず、断片ペプチド混合試料に対するＭＳ分析により得られたマススペクトルに対しＰＭ法を用いてプロタンパク質の帰属を試みる（ステップＳ７１）が、プロタンパク質を帰属できなかった場合（ステップＳ７２でＮｏ）に、ペプチド同定に至る可能性の高い１又は１以上の所定個数のイオンピーク、例えばマススペクトルの中でピーク強度の高い順に所定個数のイオンピークをプリカーサイオンとして選択する（ステップＳ７３）。そして、プリカーサイオンが選択できたならば（ステップＳ７４でＹｅｓ）、選択されたプリカーサイオンをターゲットとするＭＳ／ＭＳ分析を実行し、ＭＳ／ＭＳスペクトルを取得する（ステップＳ７５、Ｓ７６）。
【００４７】
そのあと、取得されたＭＳ／ＭＳスペクトルに対し例えばＭＳ／ＭＳイオンサーチ法を用いてプロタンパク質の帰属を試みる（ステップＳ７７）。ＭＳ／ＭＳ分析の際のＣＩＤによって、断片ペプチド固有の部分構造情報が得られ、それにより、プロタンパク質に固有の部分構造に関する情報量も増加する。その結果、ＭＳ／ＭＳスペクトルではマススペクトルよりもさらに多くの断片ペプチドの質量情報が得られる。それによって、ステップＳ７１でプロタンパク質が帰属されなかった場合でも、ステップＳ７７ではプロタンパク質が帰属される可能性が高まる。なお、ステップＳ７３におけるプリカーサイオンの選択方法は上記記載のものに限らない。
【００４８】
上述したようにステップＳ７での処理の実行後、プロタンパク質帰属部２２はプロタンパク質が帰属できたか否かを判定し（ステップＳ８）、帰属できていなければ内在性ペプチドの構造解析が不可能であるため、そのまま処理を終了する。プロタンパク質が帰属できたならば、プリカーサイオン選択部２３は以下の手順でＭＳ／ＭＳ分析すべきプリカーサイオンを選択する（ステップＳ９）。
【００４９】
まず、ステップＳ７において帰属されたプロタンパク質のアミノ酸配列全長とステップＳ４におけるオンターゲット試料消化で用いられた消化酵素の切断部位特性とを参照して、ステップＳ６で得られたマススペクトル上で検出される各ピークのm/z値に対応する断片ペプチドのアミノ酸配列を推定する。通常、マススペクトル上には多数のピークが現れるから、多数の断片ペプチドのアミノ酸配列が求まる（但し、当然のことながら、その全てが正しいとは限らない）。
【００５０】
次いで、アミノ酸配列が推定されたペプチドに対応するイオンピークのうち、推定されたアミノ酸配列のＮ末端残基がプロタンパク質のアミノ酸配列のＮ末端のより近くに位置するピーク、及び、推定されたアミノ酸配列のＣ末端残基がプロタンパク質のアミノ酸配列のＣ末端のより近くに位置するピークをそれぞれ１個以上選定し、それをプリカーサイオンとして決定する。選定するプリカーサイオンの個数は予め定めておいてもよいし、少なくとも２個以上（各末端毎に１個ずつ）で条件に応じて適宜の個数と決めておいてもよい。
【００５１】
なお、ステップＳ７において図４に示した処理手順でプロタンパク質を帰属した場合には、ステップＳ９でマススペクトルから帰属されたペプチドのＮ末端側残基よりもさらにＮ末端に近い側のＮ末端残基を持つペプチドであると推定されるイオンピークと、帰属されたペプチドのＣ末端側残基よりもさらにＣ末端に近い側のＣ末端残基を持つペプチドであると推定されるイオンピークとの中から、それぞれ最もＮ／Ｃ末端に近いものをプリカーサイオンとして選択するとよい。
【００５２】
ステップＳ９の処理の実行後、プリカーサイオン選択部２３はプリカーサイオンが選択できたか否かを判定し（ステップＳ１０）、選択できていなければ内在性ペプチドの構造解析が不可能であるため、そのまま処理を終了する。プリカーサイオンが選択できた場合、分析制御部３の制御の下で、質量分析部１は選択されたプリカーサイオンをターゲットとするＭＳ／ＭＳ分を実行し（ステップＳ１１）、ＭＳ／ＭＳスペクトルを取得してデータ格納部２０に保存する（ステップＳ１２）。
【００５３】
部分配列同定部２４は、ステップＳ１２で得られたＭＳ／ＭＳスペクトルデータに基づいて、内在性ペプチドに由来する断片ペプチドのアミノ酸配列、つまりは内在性ペプチドのアミノ酸配列の一部である部分配列を推定する（ステップＳ１３）。ここで、部分配列の推定手法は、プロテオーム解析で広く使われているタンパク質データベース検索法（例えば上述したMascotに含まれるＭＳ／ＭＳイオンサーチ法）やデノボシーケンシング法、スペクトルライブラリ検索法などの既知の方法を用いることができる。
【００５４】
ステップＳ９でプリカーサイオンが複数選択された場合には、その全てのプリカーサイオンについてステップＳ１１〜Ｓ１３の処理を繰り返すことで、内在性ペプチドの様々な部分配列の情報を収集する。そして、選択された全てのプリカーサイオンについてのＭＳ／ＭＳ分析結果に基づく部分配列の情報が得られたならばステップＳ１４からＳ１５を経てＳ１６へと進み、ペプチド構造推定部２５は、ステップＳ３で得られたマススペクトルから検出されたイオンピークから求まる目的の内在性ペプチド由来の分子イオンのm/z値情報、ステップＳ７で帰属された帰属されたプロタンパク質のアミノ酸配列情報、及び、ステップＳ１３で求まった断片ペプチドのアミノ酸配列（部分配列）情報、に基づいて、目的の内在性ペプチドのアミノ酸配列を推定する。なお、ステップＳ７においてＭＳ／ＭＳ分析を実行した場合には、プロタンパク質のアミノ酸配列を推定する過程で部分配列が求まるから、その部分配列の情報も加えて目的の内在性ペプチドのアミノ酸配列を推定するとよい。
【００５５】
上述したようにステップＳ９においてプリカーサイオンを選択する際に、プロタンパク質のＣ末端及びＮ末端に近い位置にある断片ペプチド由来のイオンピークを選択するようにしているので、ステップＳ１３においてＭＳ／ＭＳスペクトルに基づいて推定される部分配列には、プロタンパク質のＣ末端及びＮ末端に近い位置にある断片ペプチドの情報が多く含まれる。通常、両末端に近い位置にある断片ペプチドのアミノ酸配列が判明していれば、それに挟まれる配列はプロタンパク質のアミノ酸配列全長から推測が容易である。これによって、本実施例の内在性ペプチドの解析装置では、ペプチド構造推定部２５におけるペプチドの構造推定、つまりはアミノ酸配列の推定の精度を上げることができる。
【００５６】
なお、上述したように、ステップＳ７におけるプロタンパク質の帰属の処理の際には、通常、ＰＭＦ法が利用されるが、ＰＭＦ法を適用した結果として、ステップＳ９におけるマススペクトルに現れるイオンピークに対応するアミノ酸配列と同様の情報が得られる場合がある。その場合には、ステップＳ９におけるアミノ酸配列推定処理を省略し、直接、プリカーサイオンの選定を実行しても構わない。
【実施例】
【００５７】
上記実施例で説明した内在性ペプチド解析方法の有効性を確認するために実施した、シミュレーション実験について以下に説明する。
【００５８】
［内在性ペプチドのアミノ酸配列候補数の見積もり］
ここでは、上述した解析方法を想定し、酵素消化後の或る１個の断片ペプチドのアミノ酸配列（部分配列）がＭＳ／ＭＳ分析の結果に基づくステップＳ１３の処理によって決定されたものとして、その得られたアミノ酸配列の末端からアミノ酸残基をさらに伸長させたときに、元の非消化ペプチド（つまりは内在性ペプチド）の質量に一致するアミノ酸配列の候補の数がどのようになるのかをシミュレーションによって求めた。
【００５９】
具体的なシミュレーション計算は下記の要領である。
（１）周知のデータベースであるUniProtに登録されているヒト・タンパク質から質量が３５kDa以上であるアミノ酸配列を無作為に１００個抽出し、その各タンパク質のアミノ酸配列から無作為に選んだ１０種類の部分配列（質量は５〜２５kDaの範囲）を仮想的な内在性ペプチド（仮想内在性ペプチド）として選定した。
（２）前提として、上記仮想内在性ペプチドのアミノ酸配列のＣ末端側領域の部分配列はステップＳ１３の処理によって決定されたものとした。この部分配列のアミノ酸残基数は、内在性ペプチドのアミノ酸残基数に対して、配列が未決定であるアミノ酸残基数（以下、配列未決定残基数という）が５〜４０個となるように、又は、決定されたアミノ酸配列のうち仮想内在性ペプチドのアミノ酸配列に占める割合（シーケンス・カバレッジ）が５〜８０％となるように選定した。また、このシミュレーションの目的から鑑みて、いかに短いアミノ酸配列であっても、仮想内在性ペプチドの産生元となるプロタンパク質、及び該プロタンパク質のアミノ酸配列上の部分配列の位置は必ず同定されるものとした。
（３）内在性ペプチドのアミノ酸配列の推定にあたっては、決定済みである部分配列のＮ／Ｃ末端側をプロタンパク質のアミノ酸配列全長をもとに伸長し、仮想内在性ペプチドの質量に対し質量許容誤差の範囲で一致するアミノ酸配列候補を求め、そのアミノ酸配列の候補数を集計した。
【００６０】
図６、図７がシミュレーション計算の結果であり、図６（ａ）は配列未決定残基数が５個である場合における仮想内在性ペプチドに対するアミノ酸配列の候補数と質量許容誤差との関係、図６（ｂ）は配列未決定残基数が４０個である場合における仮想内在性ペプチドに対するアミノ酸配列の候補数と質量許容誤差との関係である。また、図７は、質量許容誤差を一定としたときの仮想内在性ペプチドに対するアミノ酸配列の候補数と配列未決定残基数との関係を示す図である。
【００６１】
上記の結果、図６（ａ）、（ｂ）に示すように、内在性ペプチドの質量に拘わらず、内在性ペプチドの質量許容誤差が小さいほどアミノ酸配列の候補数は少ないことが分かる。また、図７に示すように、質量許容誤差に加え、配列未決定残基数が少ないほどアミノ酸配列候補数は少なくなることが分かる。例えば、図２中のステップＳ２において質量許容誤差４Daの精度で以てＭＳ分析が行われ、ステップＳ１３において部分配列が同定され、配列未決定残基数が１０であった場合には、内在性ペプチドに対するアミノ酸配列候補数は平均で１．７７個となり、かなり候補数が少ないことが分かる。このことから、本実施例の内在性ペプチド解析方法では、目的の内在性ペプチドに対するアミノ酸候補の数を実用的に使用可能なレベルにまで絞り込むことが可能であると結論付けることができる。
【００６２】
［ＭＳ／ＭＳ分析の実行回数の見積もり］
上述したように、内在性ペプチドに対して推定されるアミノ酸配列の候補数は配列未決定残基数の増加に伴い増大する。そのため、アミノ酸配列候補の数を十分に絞り込むには、配列未決定残基数をできる限り減らすことが望ましい。一般には、ＭＳ／ＭＳ分析の回数を増やすほど部分配列の情報が増え、配列未決定残基数は少なくなる。しかしながら、特に生体試料の場合、試料の量は少なく、質量分析の実行毎に試料は消費されてしまうため、一つの試料に対して実施可能なＭＳ／ＭＳ分析の回数、即ち、同定可能な断片ペプチドの数には自ずと制約がある。したがって、ＭＳ／ＭＳ分析を行う回数をできるだけ抑えながら、可能な限り元のアミノ酸配列の両末端に近い部分配列の同定を行う必要がある。
【００６３】
そこで、内在性ペプチドのアミノ酸配列推定に必要となるＭＳ／ＭＳ分析の具体的な測定要件を調べるために、ウマミオグロビンを仮想的な内在性ペプチドに見立てた構造推定シミュレーションを行った。図９は、同定された断片ペプチドの数と内在性ペプチドのアミノ酸配列候補数との関係のシミュレーション結果を示す図である。この結果から、トリプシンによる酵素処理で得られる多数の断片ペプチド由来のピークの中からピーク強度に従ってプリカーサイオンを選択した場合、選択した全てのイオンからミオグロビン由来の部分配列を正しく同定できたとした場合でも、５個以上の断片ペプチドを同定しないと内在性ペプチドのアミノ酸配列を２、３個程度に絞り込めない可能性が確認された。但し、実測で得られたＭＳ／ＭＳスペクトルの全てから断片ペプチドを同定できるとは限らないことを考慮すると、実際には、１０個程度のプリカーサイオンを選択する必要がある、つまりはＭＳ／ＭＳ分析を１０回程度は実施する必要があるものと推測される。
【００６４】
一般的なプリカーサイオン選択処理では、質量電荷比やピーク強度に基づいて優先順位や閾値を定めることで、より有意と推定されるＭＳ／ＭＳ分析を実行しＭＳ／ＭＳ分析回数を減らすようにしている。しかしながら、基本的な方針は、ペプチド同定数の増加に寄与するピークについては可能な限り多くＭＳ／ＭＳ分析する、というものであり、内在性ペプチドの構造推定精度を高めるという目的においては、無駄なＭＳ／ＭＳ分析を行うことにならざるを得ない。これに対し、上記実施例の内在性ペプチド解析方法では、内在性ペプチドのアミノ酸配列を推定する際にその候補数を最大限に絞り込むという目的を実現するために、元の内在性ペプチドの両末端に近い部分配列を可能な限り少ないＭＳ／ＭＳ回数で同定するためのＭＳ／ＭＳプリカーサイオン選択法を提供している。
【００６５】
［内在性ペプチドの構造推定精度の確認］
上記実施例の方法による構造推定精度を確認するために、ウマミオグロビンを仮想的な内在性ペプチド（ミオグロビンペプチドと呼ぶこととする）として、ペプチド構造推定シミュレーションを実施した。
このシミュレーションでは、ミオグロビンペプチドの酵素消化物に対するＭＳ分析により得られた図１０に示したマススペクトルに対し、ステップＳ７における処理でＰＭＦ法（Mascot：PMF）を適用し、ミオグロビンのプロタンパク質の帰属を試みた。図１１は、そのＰＭＦ法による同定結果を示す図である。図１１に示すように、ウマミオグロビン（MYG EQUBU）が高いスコアで、つまり高い信頼度で同定されている。
【００６６】
上記ＰＭＦ法の結果から、図８に示すように、ピーク強度上位９位までの断片ペプチドのイオンピークについて部分配列の推定結果が得られた。そこで、ステップＳ９に相当する処理において、ピーク強度９位以内のイオンピークから、最もＮ末端側に位置する部分配列と推定されたm/z １８１４．９とm/z １６０５．８５である２個のイオンピーク、及び、最もＣ末端側に位置する部分配列と推定されたm/z １３５９．７５とm/z ２２８２．２１である２個のイオンピークの計４個をプリカーサイオンとして選択した。その選択されたプリカーサイオンに対するＭＳ／ＭＳ分析を行うことで得られたＭＳ／ＭＳスペクトルに対しMascot MISによるタンパク質データベース検索を行ったところ、推定結果が正しいことが確認できた。
【００６７】
上記の処理では、ＮＣ末端についてそれぞれ選択した２個のピークのうち少なくとも１個は同定されるものとして、計４個の断片ペプチドイオンをプリカーサイオンとして選択し、測定可能である断片ペプチドのうちの最もＮ／Ｃ末端側のペプチドを同定した。同様に最もＮ／Ｃ末端側である各２個のペプチドを含む最低限２個のプリカーサイオンを、ピーク強度順位のみで決定する従来的なプリカーサイオン選択法で選択する場合、図８によれば、Ｎ／Ｃ末端側の部分配列の同定には少なくとも５個のプリカーサイオンを選択する必要がある。また、２個のうち少なくとも１個が同定されるものとした場合には、確実にＮ／Ｃ末端側のペプチドを同定するためには少なくとも１０個のプリカーサイオンを選択する必要があると考えられる。つまり、本実施例の内在性ペプチド解析方法では、従来法と同等の精度のペプチド配列推定を行うのに、プリカーサイオンの選択数を５分の２個に削減できたと結論付けることができる。
【００６８】
なお、上記実施例は本発明の一例にすぎず、上記記載の変形例以外でも、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００６９】
１…質量分析部
２…データ解析部
２０…データ格納部
２１…マススペクトル作成部
２２…プロタンパク質帰属部
２３…プリカーサイオン選択部
２４…部分配列同定部
２５…ペプチド構造推定部
３…分析制御部
４…主制御部
５…入力部
６…表示部
７…ＭＡＬＤＩ用試料スポッタ
８…オンターゲット試料消化部
１００…ＭＡＬＤＩ用サンプルプレート
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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