(57)【要約】【課題】網膜神経節細胞死抑制活性を有する組成物、及びその組成物の網膜神経節細胞死抑制剤や緑内障の予防剤としての用途を提供すること。【解決手段】ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）又はＰＱＱの塩を経口投与することにより、視神経障害による網膜神経節細胞死を抑制する。上記ＰＱＱの塩としては、医薬的に許容される塩であれば特に限定されず、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、トリエタノールアミン塩、トリメチルアミン塩等の有機アミン塩、リジン塩、アルギニン塩等の塩基性アミノ酸塩などを挙げることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）又はＰＱＱの塩を含有する、網膜神経節細胞死抑制活性を有する経口用組成物。
【請求項２】
網膜神経節細胞死が視神経障害により引き起こされることを特徴とする請求項１記載の経口用組成物。
【請求項３】
緑内障患者に投与するための、請求項１又は２記載の経口用組成物を含むことを特徴とする網膜神経節細胞死抑制剤。
【請求項４】
非緑内障患者に投与するための、請求項１又は２記載の経口用組成物を含むことを特徴とする網膜神経節細胞死予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）又はＰＱＱの塩を含有する、網膜神経節細胞死抑制活性を有する経口用組成物や、緑内障患者に投与するための網膜神経節細胞死抑制剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本では、世界一速く高齢者人口の割合が増加しているため、様々な眼病の罹患率が上昇している。とりわけ１９９０年以降緑内障が激増し、現在、厚生労働省の調査で失明原因の第一位となっている。緑内障は、緑内障性視神経症とも定義され、視神経が障害されることにより視野の障害をきたす疾患であって、眼圧の上昇、網膜神経節細胞喪失等が症状として観察されるが、現時点では点眼薬による眼圧下降が治療の第一選択となっている。例えば、眼圧降下剤としての８−アザプロスタグランジン類似体（例えば、特許文献１参照）や、アデノシンＡ２ａ受容体作動作用を有する緑内障を治療あるいは予防するための医薬組成物（例えば、特許文献２参照）についての報告もある。したがって、眼圧の上昇に対しては、種々の点眼薬の進歩によりかなり良好な眼圧コントロールが得られることができるようになってきているが、眼圧下降効果だけでは網膜神経節細胞喪失に伴う緑内障の進行を十分に止められないといわれている。また、日本では、正常眼圧でも緑内障が進行する患者が多いことが知られている。また、血流促進が正常眼圧緑内障（ＮＴＧ）向けに有効と考えられており、カシスアントシアニンが有効であるとの報告がある（特許文献３等参照）。特に日本では正常眼圧緑内障が多いので眼圧低下に依存しない、網膜神経節細胞の保護や賦活化治療が求められている。
【０００３】
一方、ＰＱＱは、メタノール資化性菌の代謝産物より単離同定された物質であり、真核生物のカビ、酵母、さらには、哺乳動物にも存在することが確認されている。かかるＰＱＱの生物活性については従来多くの検討がなされていて、これまでに、ＰＱＱ又はその誘導体が細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギ−作用、抗酸化作用、ミトコンドリア賦活作用、紫外線吸収作用、皮膚老化の防止作用、活性酸素除去作用、光老化防止作用（この作用は、ＰＱＱの誘導体について確認されている）、抗アレルギー作用、逆転写酵素阻害作用、メラニン合成抑制作用、グリオキサラ−ゼＩ阻害作用などを有することが確認されている（例えば特許文献４及び５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−１２２２５０号公報
【特許文献２】特開２０１２−０４６５１３号公報
【特許文献３】特開２００７−０５５９０３号公報
【特許文献４】特開２０１６−０２０３７９号公報
【特許文献５】特開２０１６−１０６１０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、網膜神経節細胞死抑制活性を有する組成物、及びその組成物の網膜神経節細胞死抑制剤や緑内障の予防剤としての用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、緑内障を治療するための成分について探索を続け、様々な成分を調製してきたが、満足できる効果をあげる成分を見つけることができていなかった。そんな中、緑内障に対する効果があることは報告されていなかったＰＱＱを、ラットに経口投与したところ、ＰＱＱは視神経障害による網膜神経節細胞死に対して抑制効果を示すことを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下に示す事項により特定されるとおりのものである。
（１）ＰＱＱ又はＰＱＱの塩を含有する、網膜神経節細胞死抑制活性を有する経口用組成物。
（２）網膜神経節細胞死が視神経障害により引き起こされることを特徴とする上記（１）記載の経口用組成物。
（３）緑内障患者に投与するための、上記（１）又は（２）記載の経口用組成物を含むことを特徴とする網膜神経節細胞死抑制剤。
（４）非緑内障患者に投与するための、上記（１）又は（２）記載の経口用組成物を含むことを特徴とする網膜神経節細胞死予防剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、緑内障を治療、改善及び／又は予防をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＰＱＱを投与したラットと水を投与したラットにおける網膜神経節細胞層におけるｍｍ２当たりの生細胞の数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の網膜神経節細胞死抑制活性を有する経口用組成物としては、ＰＱＱ又はその塩を含有する経口用組成物であれば特に制限されないが、ＰＱＱ又はその塩を有効成分とする経口用の網膜神経節細胞死抑制剤や網膜神経節細胞死予防剤の形態を好適に例示することができる。上記ＰＱＱは、以下の式１に示される、４，５−ジオキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｆ］キノリン−２，７，９−トリカルボン酸とも呼ばれる補酵素の一種である。
【００１１】
【化１】
2018035076.tif 000002
【００１２】
上記ＰＱＱは、微生物を用いた発酵法（例えば、特開平１−２１８５９７等参照）により、培養液中に生成蓄積させることが可能であり、上記培養物から、すでに公知にされている通常の精製手段、例えば、沈澱法、イオン交換樹脂や活性炭等によるクロマトグラフィー法などの分離精製法を用いることにより精製、採取することができる。とりわけＰＱＱ高生産能を有するハイフォミクロビウム属変異菌株を培養し、培養発酵液中にＰＱＱを生成蓄積させ、これを回収する製造法（例えば、特開２０１６−１０６６３３号参照）により、大量生産する方法も有効である。また、有機化学的合成法（例えば、JACS、第103巻、第5599〜5600頁（1981））等公知の化学合成法等を用いて調製することもできる。さらに市販品を用いることもできる。
【００１３】
上記ＰＱＱの塩としては、医薬的に許容される塩であれば特に限定されず、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、トリエタノールアミン塩、トリメチルアミン塩等の有機アミン塩、リジン塩、アルギニン塩等の塩基性アミノ酸塩などを挙げることができる。
【００１４】
本発明の経口用組成物の作用効果としては、視神経障害による網膜神経節細胞の細胞死（アポトーシス）の抑制能、網膜神経節細胞層における生細胞数維持能、又はこれらの作用に付随する緑内障予防能、緑内障改善能又は緑内障治療能、弱視など視神経細胞の異常に起因する難治療性疾患の治療能を挙げることができる。本発明の網膜神経節細胞死抑制剤や網膜神経節細胞死予防剤としては、上記本発明の経口用組成物の作用効果を奏するものであれば特に制限されず、本発明の経口用組成物を網膜神経節細胞死抑制剤や網膜神経節細胞死予防剤として使用する場合の剤型としては、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、懸濁液等に製剤化された剤型を挙げることができ、特に、嚥下することが困難な高齢者等に対しては、口中において速やかな崩壊性を示す崩壊性錠剤や、シロップ剤、懸濁液等の液剤が好ましい。また、本発明の経口用組成物は医薬用途の他、液剤、カプセル剤等のサプリメントの形態とすることもできる。
【００１５】
上記網膜神経節細胞死抑制剤や網膜神経節細胞死予防剤の製剤化にあたっては、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤等の各種調剤用配合成分を添加することができる。
【００１６】
また、本発明の経口用組成物を投与する対象（者）としては、原発性開放隅角緑内障、正常眼圧緑内障、混合型緑内障、続発緑内障等の視神経障害を生じる緑内障の患者や、弱視、難治療性視神経症、緑内障に罹患していない対象（非緑内障患者）であっても、かかる緑内障を予防する必要のある／予防を希望する者を挙げることができる。
【００１７】
本発明の網膜神経節細胞死抑制剤や網膜神経節細胞死予防剤の投与態様としては、投与される対象の健康状態、症状の軽重、年齢、体重、医師の判断等に応じて適宜設定することができるが、細胞死抑制効果を得るためにはある程度長期間の投与が必要であり、また、高濃度単回投与ではなく同じ量を数回に分けて投与することが必要であるという観点から、ヒトへの経口投与の場合は、ＰＱＱ換算で、１〜１００ｍｇ／ｄａｙ、好ましくは３〜６０ｍｇ／ｄａｙ、より好ましくは５〜５０ｍｇ／ｄａｙ、さらに好ましくは１５〜３０ｍｇ／ｄａｙの投与量を、１日１回、２回、３回、４回又は５回に分けて投与する態様を例示することができる。具体的には、１５〜３０ｍｇを含有するサプリメントを１日１〜３回投与する態様を好適に挙げることができる。治療のための投与期間としては、例えば、１週間、２週間、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、１年３ヶ月、１年６ヶ月、１年９ヶ月、２年又は２年以上を挙げることができ、予防のための投与期間としては、例えば、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、１年３ヶ月、１年６ヶ月、１年９ヶ月、２年又は２年以上を挙げることができる。
【００１８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
［視神経切断モデルを用いた検討］
（ラット飲水量の測定）
９匹のラット（ＳＤ系雄性ラット、日本チャールズリバー社製、４〜５週齢、平均体重約１００ｇ）について、入荷後１週間の通常飼育による馴化を経て試験を開始した。事前にラット１匹の１日当たりの飲水量を数日間測定し、実験期間の平均と想定される体重２５０ｇでの１日の飲水量は３０ｍＬ／匹程度であることを確認した。飲水投与を２ヶ月間行うので、ラットの成長に伴う飲水量の変化を考え、２週間毎に体重測定と飲水量測定を行った。
【００２０】
（ＰＱＱ溶液の調製）
ＰＱＱ（ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩；三菱瓦斯化学社製）０．２ｇを１００ｍＬの生理食塩水に溶解後、苛性ソーダでｐＨ６．０に調整し、ミリポア濾過を行うことでＰＱＱ含有溶液を調製した。ＰＱＱは２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で動物に経口投与するため以下に示したように事前に１日当たりの飲水量を測定し、１６７ｍｇ／Ｌ（２０ｍｇ／３０ｍＬ）に調整した。調整したＰＱＱ溶液は４℃に保存した。
【００２１】
（ＰＱＱ溶液投与）
上記ＰＱＱ溶液は給水瓶で自由摂取させ、２週間毎に体重測定と飲水量測定を行った。コントロールラットには水道水を与えた。ＰＱＱ溶液は１週間に２回交換するようにした。ＰＱＱ溶液投与は２ヶ月間行った。
【００２２】
（視神経切断モデルラットの作製）
２ヶ月間のＰＱＱ溶液投与後、セボフルランで軽く吸入麻酔後に、ネンブタール４０ｍｇ／ｋｇを筋注投与した。前記ラットを保定台に固定し、眼球上方結膜を一部切開した。両手で２本の４５度曲がりマイクロ摂子で組織を避け、視神経を露出した（疼痛カテゴリーＣ）。マイクロ剪刀で視神経のみを切断し、１％フルオロ金（ＦＧ）を染み込ませた２ｍｍ３の止血用ゼラチンスポンジ（スポンゼル、アステラス製薬社製）を視神経断端に留置することにより、網膜神経節細胞のＦＧ標識を行った。結膜を整復し、抗菌剤眼軟膏を点入した。以上のとおり片眼のみ視神経断端処置を行い、僚眼は無処置とした。術後はＰＱＱ溶液投与を継続した。
【００２３】
（網膜神経節細胞数計測による評価）
視神経断端処置後１０日目にラットをセボフルラン麻酔下で頚椎脱臼した上、眼球を摘出して、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）にて網膜を固定し、フラットマウント標本を作製後、網膜神経節細胞を計数、定量した。一網膜あたり、９０度ずつ移動して４ヶ所、当該４ヶ所について同心円状に中心部から周辺部にかけて３ヶ所ずつ、合計１２ヶ所の領域で、蛍光顕微鏡でＦＧラベルされた網膜神経節細胞の写真を撮影した。各写真の中で、５００ピクセル四方の範囲で平均的な細胞体の分布を示す部分の細胞数を計数し、網膜神経節細胞の細胞密度を算出した。保温処置により覚醒を確認し、ゲージに戻した。
【００２４】
（結果）
図１より明らかなとおり、コントロール群（５匹）と比較すると、ＰＱＱ溶液投与群（４匹）のいずれも網膜神経節細胞層における生細胞の数が有意に多かった。したがって、視神経断端処置前の２ヶ月間のＰＱＱ溶液投与により、ＰＱＱは視神経障害による網膜神経節細胞死に対して顕著に抑制効果を示すことが確認された（図１参照）。
【００２５】
（まとめ）
以前の実験で、今回の実験と同量のＰＱＱ溶液をゾンデでの単回投与で１週間与えた場合は有意な結果は得られなかったことから、次の２点が考えられた。
１）細胞死抑制効果を得るためにはある程度長期間の投与が必要である。
２）高濃度単回投与ではなく、同じ量を数回に分けて接種することが必要である
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明は、緑内障などの網膜神経節細胞の損傷に起因する願疾患を予防、改善、治療することができる点で、医療分野において有用である。
【図１】
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