(57)【要約】【課題】がん細胞の浸潤能を定量的に解析することが可能なキット及びそれを用いた測定方法の提供を目的とする。【解決手段】がん細胞の浸潤能を測定するためのキットであって、内部が観察できる容器と、前記容器内を複数の室に仕切るための仕切部を有し、前記仕切部は少なくとも部分的に複数の細孔を有する細孔仕切部であることを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん細胞の浸潤能を測定するためのキットであって、
内部が観察できる容器と、前記容器内を複数の室に仕切るための仕切部を有し、前記仕切部は少なくとも部分的に複数の細孔を有する細孔仕切部であることを特徴とするがん細胞浸潤能測定キット。
【請求項２】
前記容器は外容器とその内側に配設する内容器とを有し、
前記内容器の少なくとも側壁に前記細孔仕切部を有することを特徴とする請求項１記載のがん細胞浸潤能測定キット。
【請求項３】
前記容器は外容器とその内側に配設する内容器とを有し、
前記内容器は筒状であり、外容器の内側に配設した状態で、上部側のトップゲル保持部と下部側のボトムゲル保持部とを有し、
前記トップゲル保持部とボトムゲル保持部との間に前記細孔仕切部を有することを特徴とする請求項１記載のがん細胞浸潤能測定キット。
【請求項４】
請求項１又は２記載のがん細胞浸潤能測定キットを用いたがん細胞の浸潤能の測定方法であって、
ゲルに包埋したがん細胞を一の室又は内容器にて培養し、他の室又は外容器に浸潤したがん細胞を計測することを特徴とするがん細胞浸潤能測定方法。
【請求項５】
請求項３記載のがん細胞浸潤能測定キットを用いたがん細胞の浸潤能の測定方法であって、
がん細胞を包埋したボトムゲルを前記ボトムゲル保持部に保持し、
前記トップゲル保持部に保持させたトップゲルに浸潤したがん細胞を計測することを特徴とするがん細胞浸潤能測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん細胞の浸潤，転移能を測定する方法及びそれに適した測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
がん細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に浸潤し、血管内を移動した後に血管外に侵出し、転移する。
従って、がん細胞の浸潤を阻止することが手術後の遠隔転移による再発を防ぐのに重要とされている。
そのためには、がん細胞の浸潤能を精度高く、定量解析できることが望まれる。
従来は、図１１に示すようにＢｏｙｄｅｎ  ＣｈａｍｂｅｒとＭａｔｒｉｇｅｌ（マトリゲル）を用いたものであり、チャンバーにて細胞懸濁液等をインキュベーションし、メンブランを通過し、底面に接着した遊走細胞を染色定量、あるいは剥離し、溶解定量する方法が主流である。
また、マトリゲルはラミニンを主成分とし、非常に柔らかい再構成マトリックスである。
特許文献１には、接着分子で被覆されたマトリックスにがん細胞を接着させる方法を開示している。
しかし、がん細胞は細胞外マトリックス中を３次元的に浸潤するものであり、上記のような接着遊走する細胞の測定では不充分である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００４−５２２９３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、がん細胞の浸潤能を定量的に解析することが可能なキット及びそれを用いた測定方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、がん細胞の浸潤能を測定するためのキットであって、内部が観察できる容器と、前記容器内を複数の室に仕切るための仕切部を有し、前記仕切部は少なくとも部分的に複数の細孔を有する細孔仕切部であることを特徴とする。
この場合に容器を細孔仕切部で仕切る替わりに、前記容器は外容器とその内側に配設する内容器とを有し、前記内容器の少なくとも側壁に前記細孔仕切部を有するようにしてもよい。
このようにすると、ゲルに包埋したがん細胞を１の室又は内容器にて培養し、他の室又は外容器に浸潤したがん細胞を計測することで、がん細胞の浸潤能を測定することができる。
【０００６】
本発明において、前記容器は外容器とその内側に配設する内容器とを有し、前記内容器は筒状であり、外容器の内側に配設した状態で、上部側のトップゲル保持部と下部側のボトムゲル保持部とを有し、前記トップゲル保持部とボトムゲル保持部との間に前記細孔仕切部を有するようにしてもよい。
【０００７】
ここで、内容器に設けたボトムゲル保持部は浸潤能を測定する検体となるがん細胞をゲルに包埋し、保持する部分をいい、トップゲル保持部はボトムゲルのがん細胞が重力に逆らい上方に浸潤してくる細胞を捕獲するためのゲルを保持する部分をいう。
細胞外マトリックスの主な構成要素は、コラーゲンであることから本発明に用いるゲルはコラーゲンゲルが好ましい。
【０００８】
本発明において細孔仕切部は、がん細胞がその細孔を介して移動が円滑に行われるものであるものをいい、複数の細孔を設けたものであれば特に制限はない。
例えば、ナイロン製等のメッシュ材でよく、メッシュのサイズは１０〜１００μｍ程度がよく、好ましくは２５〜７０μｍの範囲である。
メッシュサイズが１００μｍを超えると両側又は上下のゲルの分離がしにくくなるからである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明におけるキットを用いたがん細胞の浸潤能の測定方法は、細孔仕切部を介してがん細胞が一方のゲルから他方のゲルに３次元的に移動するのを観察、撮影することができる。
また、請求項３記載のキットを用いるとボトムゲルに包埋されたがん細胞が重力に逆らってトップゲル側に浸潤した細胞を計測するので、測定のバックグランドが低く抑えられる効果がある。
例えばゲルとしてコラーゲンゲルを用いると、その硬い特性を活かして左右又は上下のゲルの分離が容易であり、分離したゲル内の浸潤細胞数の測定に必ずしも細胞染色を必要としない。
また、細孔仕切部を介して浸潤したゲルに捕獲された細胞を回収してコラゲナーゼ処理することで細胞を単離して培養したり、この浸潤細胞数を細胞活性計測キットで測定することも可能である。
これにより、がん細胞の浸潤能の定量的解析が可能になり、がん治療薬のスクリーニングや浸潤機構の解明に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】トップゲル保持部とボトムゲル保持部を有するキットの構成例を示し、がん細胞，ＨＴ１０８０の浸潤能を測定した例を示す。
【図２】図１の条件にてゲル包埋培養した結果を示す。
【図３】上下のコラーゲンゲルの分離を示す。
【図４】浸潤細胞数の解析例を示す。
【図５】顕微鏡（Microscopic）と細胞活性計測キット（ＣＣＫ−８）との測定比較を示す。
【図６】ＭＭＰｉの影響及びトップゲルとボトムゲルとの比較を示す。
【図７】がん細胞ＨＳＣ３を用いた測定例を示す。
【図８】ＭＭＰ−２（ＩＶ型コラゲナーゼ）及びＴＧＦ-β１（トランスフォーミング増殖因子）の影響調査結果を示す。
【図９】iCT(Invading Cell Trap)AssayとiTIC(Inverted-Trapping an Invading Cell)Assayとの比較結果を示す。
【図１０】２種類の細胞を使用した例を示す。
【図１１】従来のBoyden ChamberとMatrigelによる解析と測定の問題点を示す。
【図１２】容器の内側を細孔仕切部からなる上下方向の仕切壁で２の室に分けたキットの例を示す。
【図１３】図１２のキットを用いたがん細胞の浸潤の観察例を示す。
【図１４】図１２のキットの使用例（２）を示す。
【図１５】ウエルプレートの内側に側壁に細孔仕切部を有するチャンバーを配置した例を示す。
【図１６】側面メッシュ型チャンバーを用いて細胞移動を撮影した例を示す。
【図１７】コラーゲン濃度の細胞移動への影響を調査するために設定した試験条件を示す。
【図１８】図１７に示した条件での細胞浸潤の観察結果を示す。
【図１９】スライドガラスの上に側面メッシュ型のチャンバーを形成したキットの例を示す。
【図２０】３つの室に仕切ったチャンバースライド型の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
がん細胞浸潤能測定キットの第１の構成例を図１に示す。
外容器１１とその内側に配設する内容器１２を有する。
内容器１２は筒状であり、例えば円筒状である。
内容器１２のボトム側に所定の高さの周囲壁（スカート部）１２ｃを有するようにして、上下を水平方向の細孔仕切部１３にて仕切ってある。
本実施例では、メッシュサイズ４０μｍのナイロン網を用いた。
周囲壁の高さは１〜５ｍｍ程度である。
これにより、内容器１２の細孔仕切部１３の下側にボトムゲルを保持できるボトムゲル保持部１２ａと上側にトップゲルを保持できるトップゲル保持部１２ｂとを形成できる。
外容器１１は図１（ｄ）に示すように内容器１２に保持した細胞を培養するためのものであり、有底容器であれば形状等に制限は無い。
【００１２】
図１において、内容器１２のボトムゲル保持部１２ａにコラーゲン等のゲル中にがん細胞を包埋し、次に倒立させて外容器の内側に配置し、トップゲル保持部１２ｂに保持させたコラーゲンゲルに重力に逆らって浸潤し、捕獲された浸潤能を有するがん細胞を測定解析する。
これを本明細書では、iTIC(Inverted-Trapping an Invading Cell)Assayと称する。
【００１３】
次に浸潤がん細胞の測定例を説明する。
コラーゲンとしては新田ゼラチン株式会社製の「Cellmatrix」を用いたが、本発明はこれに限定されない。
具体的には、Cellmatrix  Type I-A（Ｉ型コラーゲン）を用い、コラーゲン混合溶液を調整し、これにがん細胞を加えた。
これを図１（ａ）に示すように内容器１２のボトムゲル保持部１２ａに投入し、３７℃，３０ｍｉｎ加温することでゲル化した。
次に図１（ｂ）に示すように、外容器１１内に倒立させ、トップゲル保持部１２ｂに上記と同じコラーゲン混合溶液を投入し、３７℃，３０ｍｉｎ加温しトップ側のコラーゲンをゲル化した。
次に図１（ｄ）に示すように、内容器１２のＩｎｎｅｒ側とＯｕｔｅｒ側にそれぞれ培養液を投入し、所定時間インキュベートした。
【００１４】
図１に示した実施例ではコラーゲンにＨＴ１０８０細胞を包埋し、Ｉｎｎｅｒには１０％の血清（Ｓｅｒｕｍ）を加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を投入し、Ｏｕｔｅｒには０．５％の血清を加えたＤＭＥＭを投入した。
Ｏｕｔｅｒには、コラゲナーゼＭＭＰ−２の活性化因子ＭＴ１−ＭＭＰの阻害剤（ＭＭＰｉ）の有無を比較調査した。
３７℃，４８時間保持後のトップゲル（Ｔｏｐ）とボトムゲル（Ｂｏｔｔｏｍ）との顕微鏡写真を図２に示す。
この結果、ＭＭＰｉを加えない図２ではＤＭＳＯで示したものは、ボトムゲルに包埋されていたがん細胞ＨＴ１０８０の浸潤能を有するものがトップゲル側に移動（遊走）していることが分かる。
【００１５】
図３には、ボトムゲルとトップゲルの分離状況及びＩｎｎｅｒ側のトップゲルに浸潤した細胞の写真を示す。
図３中、Ｃｏｌｌ−ＩＡはＩ型コラーゲンを示し、ＩｎｎｅｒとＯｕｔｅｒに所定の培養液を投入し保持した結果を示す。
コラーゲンゲルが収縮しているのが観察され、トップゲルとボトムゲルとを容易に分離できた。
また、Ｉｎｎｅｒ側のトップゲルを顕微鏡観察すると、がん細胞がカウントでき染色が不要であった。
【００１６】
図４にはコラーゲンゲルをＥＣＭ分解酵素にて分解し、細胞活性計測キット（ＣＣＫ−８）にて細胞数を計測した結果を示す。
トップゲルとボトムゲル中のトータル細胞数［Ｔ＋Ｂ］からトップゲルに浸潤した細胞数の割合［Ｔ／（Ｔ＋Ｂ）］を容易に計測することができる。
【００１７】
図５にはコラーゲンゲル包埋培養日数と血清刺激の影響の調査結果を示す。
このことから、トップゲルへの浸潤細胞の割合は培養時間に依存し、Ｓｅｒｕｍ濃度にも依存していることが分かる。
図６は活性阻害剤ＭＭＰｉの影響を調査したものであり、ＮＴはＭＭＰｉを含まないものを示す。
【００１８】
図７はがん細胞としてＨＳＣ３を用いた実施例を示す。
がん細胞の浸潤能には、ＩＶ型コラゲナーゼ（ＭＭＰ−２）や、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β１）等の各種因子の影響を受け、これらの解析も可能である。
図８はＭＭＰ−２の活性化因子ＭＴ１−ＭＭＰの影響を調査した結果を示す。
このことから本発明に係る測定方法は、がんに対する薬剤スクリーニングにも応用できる。
【００１９】
図９はがん細胞を単にトラップさせたiCT(Invading Cell Trap)Assayと本発明が係るｉＴＩＣ  Ａｓｓａｙとを比較調査した結果を示す。
この結果、本発明に係るｉＴＩＣ  Ａｓｓａｙはボトムゲルからトップゲルに向けて自重に逆らって上方に浸潤する細胞を解析することから、バックグランドを低く抑えることができ、がん細胞の３次元移動を評価できることから信頼性も高い。
【００２０】
図１０は２種類のがん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ｃｅｌｌｓとＨＤＦの浸潤能を同時に測定した結果を示す。
このことから、複数の種類のがん細胞も同時に解析することができることが明らかになった。
【００２１】
図１に示すキットを用いたがん細胞の浸潤能の解析では、ボトムゲルに包埋されたがん細胞が重力に逆らってトップゲル側に浸潤する細胞を解析するので、測定のバックグランドが低く抑えられる効果がある。
しかし、細胞移動が垂直方向であるため、やや観察しにくい恐れがある。
そこで、細胞の３次元移動を水平方向にすることで観察が容易であり、使用できるゲルの濃度，粘度，硬度等の範囲が広くなるキットを示したのが、図１２に示したキット２０の例である。
【００２２】
キット２０は、内部が見える容器２１の内側を複数の室２３，２４に仕切った仕切壁にメッシュ２０〜４０μｍの細孔を形成した細孔仕切部２２にした例である。
容器２１の底部は、ガラス製等の透明なものが好ましい。
また、各室２３，２４の上部には、ゲルや培地を注入しやすいように蓋２３ａ，２４ａを設けてもよい。
このキット２０の使用方法例１を図１３に示す。
細孔仕切部（ナイロンメッシュ）が横方向になるように容器を倒立させ、一方の室にゲル液を投入し、ナイロンメッシュ上にゲル化する。
次に反転し、他方の室にがん細胞等の細胞とゲル液を投入し、ナイロンメッシュ上にゲル化する。
次に、ナイロンメッシュが上下になるように容器を元に戻し、培地等を注入して培養することで、細胞移動を観察することができる。
このように、上下方向の細孔仕切部の一方の面に細胞を包埋したゲルを保持させ、他方の面に保持したゲルへの細胞移動を観察できるようにしたことにより、細胞の水平方向の３次元移動の観察が容易になる。
また、ゲルの使用できる範囲が広がる。
【００２３】
図１４に、キット２０の使用方法例２を示す。
一方の室側の細孔仕切部にＡ細胞を包埋したゲルを保持させ、他方の室側の細孔仕切部にＢ細胞を包埋したゲルを保持させることで、がん細胞に対する線維芽細胞，免疫細胞等、細胞間相互の３次元移動を観察することができる。
また、両側のゲル硬度に差を設けたり、ゲルの多層化を図ることで、細胞外微小環境の再構築を図ることも可能になる。
【００２４】
本発明に係るキットの応用例を図１５，１６に示す。
図１５は、例えば２４ウェルプレート等の内側に側面の１部に細孔を有する内容器（チャンバー）を配設した例である。
これにより、チャンバーの内側と外側とで異なるゲルや細胞を注入することができ、またウェル毎に培地や添加成分を変えることもでき、複数の解析を同時に行うことができる。
【００２５】
図１６は、側壁部に４０μｍのナイロンメッシュからなる細孔仕切部を形成したチャンバー（内容器）を外容器の内側に配設して、細胞移動を観察した例を示す。
チャンバー内に細胞を包埋したゲルを形成するとともに外側にゲルを形成し、チャンバー内外に培地を添加して培養した結果５日目〜７日目にかけて、チャンバーの外側に移動した細胞が確認された。
【００２６】
図１７，１８は側面メッシュ型チャンバーを用いて、細胞移動に対するコラーゲン濃度の影響を調査した結果を示す。
図１７は試験条件を示し、図１８はチャンバーを外し、移動細胞を単離後に核染色した上で画像を取得した結果を示す。
図１７に示した試験条件１，２，３に対応させた取得画像を、図１８の１，２，３に示す。
このことから、高濃度から低濃度コラーゲンゲルへの細胞移動の条件の方が、評価に効率的であることが示唆された。
【００２７】
図１９はスライドガラスの上に２ウエルからなる容器部を形成し、その境界板に穴を開けて、この穴に２０μｍのナイロンメッシュを貼付したキットの例を示す。
細胞が、このナイロンメッシュを通過してゲルに浸潤するのが観察できた。
【００２８】
図２０は、室を３つに仕切ったチャンバースライド型の例を示す。
スライドガラスの上に透明な容器部を形成することで、側面及び上面からも細胞移動の評価が可能となる。
また、このように３つ以上の室にメッシュ等の細孔仕切部で仕切ると、それぞれ異なる組成、濃度のゲル内の細胞移動を測定、観察することも可能になる。
【符号の説明】
【００２９】
１０      キット
１１      外容器
１２      内容器
１２ａ    ボトムゲル保持部
１２ｂ    トップゲル保持部
１２ｃ    周囲壁
１３      細孔仕切部
２０      キット
２１      容器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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