(57)【要約】【課題】本発明は、高い分散性および可逆性を有する吸着材を提供することを目的とする。【解決手段】水中でイオン化し得る官能基を複数有する、下限臨界溶解温度を示さない高分子材料と、標的物質と相互作用可能な吸着部位と、担体とを備えることを特徴とする吸着材。【選択図】図１
2018030069.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中でイオン化し得る官能基を複数有する、下限臨界溶解温度を示さない高分子材料と、
標的物質と相互作用可能な吸着部位と、
担体と
を備えることを特徴とする吸着材。
【請求項２】
外部環境の変化によって高分子材料のイオン化率が変化することを特徴とする、請求項１に記載の吸着材。
【請求項３】
外部環境の変化が、吸着材が接触している溶液の温度、塩濃度、誘電率またはｐＨの変化であることを特徴とする、請求項２に記載の吸着材。
【請求項４】
水中でイオン化し得る官能基が、ｐＫａが−３．７以上１７．７以下である官能基を含むか、またはその共役酸もしくは共役塩基のｐＫａが−３．７以上１７．７以下である官能基を含むことを特徴とする、請求項１に記載の吸着材。
【請求項５】
水中でイオン化し得る官能基が、アミノ基、イミノ基、含窒素芳香族基、グアニジル基、フェノール性水酸基、カルボキシル基、ボロン酸基およびホスホリル基から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、請求項４に記載の吸着材。
【請求項６】
高分子材料が、ポリリジン、アミノ基を複数有するデンドリマー、イミノ基を複数有するデンドリマー、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、またはそれらを部分構造として含む高分子材料であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の吸着材。
【請求項７】
標的物質が、タンパク、生体分子、細胞、ウイルスまたはナノ粒子であることを特徴とする、請求項１に記載の吸着材。
【請求項８】
標的物質が抗体であることを特徴とする、請求項７に記載の吸着材。
【請求項９】
吸着部位が、プロテインＡ部分構造または模倣分子、プロテインＧ部分構造または模倣分子、プロテインＬ部分構造または模倣分子、糖鎖結合分子、チオフィリックリガンドおよび抗原または抗原部分構造から選ばれる少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１に記載の吸着材。
【請求項１０】
担体またはその表面が、多糖類、架橋された多糖類、ポリスチレン、シリカまたは金属酸化物を有することを特徴とする、請求項１に記載の吸着材。
【請求項１１】
担体またはその表面が、多糖類または架橋された多糖類を有することを特徴とする、請求項１０に記載の吸着材。
【請求項１２】
高分子材料と吸着部位が結合していることを特徴とする、請求項１に記載の吸着材。
【請求項１３】
高分子材料と吸着部位が結合しておらず、異なる位置で担体に固定化されていることを特徴とする、請求項１に記載の吸着材。
【請求項１４】
請求項１に記載の吸着材に標的物質を含む溶液を接触させる工程と、
その後請求項３に記載の外部環境の変化を印加する工程と
を含む標的物質の精製方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の吸着材が充填されたカラムを用いる、請求項１４に記載の精製方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の吸着材を懸濁液の状態で用いる、請求項１４に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、吸着材およびそれを用いた精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパクのような生体分子を標的物質としたアフィニティ精製は、アフィニティ吸着材への標的物質の吸着、非吸着成分の洗浄、溶離液による標的物質の吸着材からの脱離の工程からなる。このとき、溶離液としては、しばしば強酸や強塩基のような過酷なｐＨの溶液を用いる。これは、アフィニティリガンドや標的物質のイオン化状態を変え、電荷反発によりアフィニティリガンドと標的物質の間の相互作用を弱める必要があるためである。しかし、強酸や強塩基のような過酷なｐＨ環境では、しばしば生体分子は不安定であり、精製された標的物質が劣化するリスクがある。このようなリスクを回避するため、温和なｐＨ環境にてｐＨを変化させることなく標的物質を精製可能な温度応答性アフィニティ吸着材が開発されている。
【０００３】
このような温度応答性アフィニティ吸着材としては、リガンドとして、遺伝子組換えによって熱安定性を低下させたタンパクを用いる手法（特許文献１、２）や、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）に代表される下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を示すポリマーを用いて、温度変化に伴う水に対する溶解性の変化により起こる相転移等の現象を利用する手法（特許文献３、４）が報告されている。
【０００４】
しかし、前者は、遺伝子組換えタンパクが高価であることや耐久性が高くないことから実用的な吸着材とはなりにくい。
【０００５】
また、後者は、価格や耐久性の課題は解決されているものの、ＬＣＳＴ以上の温度ではポリマーの水に対する親和性が大幅に低下するため、吸着材の水中での分散性が極端に低下し取り扱いにくいこと、吸着材を充填したカラム中で、溶液が通過する流路が大きく変化し得、また、クラックや壁面との隙間が発生するリスクがあることや、しばしば温度変化に対してヒステリシスが大きいこと等により、分散性および応答の可逆性に問題があり、実用的な吸着材とはなりにくい（図５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００８／１４３１９９号
【特許文献２】国際公開第２０１４／００３１７６号
【特許文献３】特開平７−１３６５０５号公報
【特許文献４】特表２００３−５２４６８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記の通り、ＬＣＳＴを示すポリマーを用いた従来の吸着材は、遺伝子組換えタンパクを用いた吸着材で問題となる価格および耐久性の面では優れるものの、分散性および応答の可逆性に問題がある。よって、本発明は、高い分散性および可逆性を有する吸着材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するために、本発明の吸着材は、水中でイオン化し得る官能基を複数有する、下限臨界溶解温度を示さない高分子材料と、標的物質と相互作用可能な吸着部位と、担体とを備えることを特徴とし、これらの成分を備えることによって、外部環境の変化によって高分子材料のイオン化率が変化する。本発明の吸着材は、水への溶解性の変化により起こる相転移等の現象を用いず、外部環境の変化による高分子材料のイオン化率の変化を標的物質の吸着・脱着に利用する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の吸着材は、遺伝子組換えタンパクを用いないため、安価に製造可能である。本発明の吸着材は、水中での分散性の温度依存性が小さいため、取り扱いが容易であり、また、ポリマーの溶解性の変化を利用していないため、ヒステリシスが小さい。本発明の標的物質の精製方法は、標的物質の精製中の劣化を抑制可能であり、精製後の中和工程を省略することも可能である。
【００１０】
前記した以外の課題、構成および効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、高分子材料と吸着部位が結合している吸着材の模式図である。
【図２】図２は、高分子材料と吸着部位が結合しておらず、異なる位置で別々に担体に固定化されている吸着材の模式図である。
【図３】図３は、実施例における、４℃から３７℃に昇温した際の吸着材のイオン化率の変化の測定結果を示す図である。
【図４】図４は、実施例における、３７℃から４℃に降温した際の吸着材のイオン化率の変化の測定結果を示す図である。
【図５】図５は、ポリマーの溶解性の変化を利用する従来の吸着材を用いた際の課題の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図面等を用いて、本発明の実施形態について説明する。以下の説明は本発明の内容の具体例を示すものであり、本発明がこれらの説明に限定されるものではなく、本明細書に開示される技術的思想の範囲内において当業者による様々な変更および修正が可能である。また、本発明を説明するための全図において、同一の機能を有するものは、同一の符号を付け、その繰り返しの説明は省略する場合がある。
【００１３】
本発明の吸着材は、水中でイオン化し得る官能基を複数有する高分子材料（以下、単に高分子材料とも記載する）と、標的物質と相互作用可能な吸着部位と、担体とを備える。本発明の吸着材は、これらの成分を備えることによって、外部環境の変化によって高分子材料のイオン化率が変化し、このイオン化率の変化により標的物質を吸着または脱着する。
【００１４】
図１および図２に吸着材の模式図を示す。図１および図２に示すように、吸着材１０または吸着材２０は、高分子主鎖３上に、水中でイオン化し得る官能基２を複数有する高分子材料１と、標的物質５と相互作用可能な吸着部位４と、担体６とを備える。
【００１５】
高分子材料と吸着部位は結合していてもよく、または、これらは結合せずに別々に担体に固定化されていてもよい。
【００１６】
一実施形態において、高分子材料と吸着部位は結合している。図１は、高分子材料と吸着部位が結合している吸着材の模式図を示す。図１に示すように、吸着材１０において、標的物質５を吸着する吸着部位４は、水中でイオン化し得る官能基２を複数有する高分子材料１に結合している。吸着部位４が結合した高分子材料１は担体６に固定化されている。
【００１７】
別の実施形態において、高分子材料と吸着部位は結合しておらず、異なる位置で別々に担体に固定化されている。図２は、高分子材料と吸着部位が結合しておらず、異なる位置で別々に担体に固定化されている吸着材の模式図を示す。図２に示すように、吸着材２０において、標的物質５を吸着する吸着部位４は、水中でイオン化し得る官能基２を複数有する高分子材料１と結合しておらず、高分子材料１および吸着部位４は、異なる位置で別々に担体６に固定化されている。
【００１８】
本発明の吸着材は、前記の成分を備えることにより、特に、高分子材料が水中でイオン化し得る官能基を複数有することにより、外部環境の変化によって高分子材料のイオン化率が変化する。そして、高分子材料のイオン化率が変化することで、標的物質と相互作用する吸着部位の周辺環境が変化し、その結果、標的物質と吸着部位の相互作用の強さが変化し、標的物質が吸着または脱着する。
【００１９】
より詳細には、高分子材料のイオン化率が変化すると、高分子材料全体の親水性やコンフォメーションが変化すると考えられる。高分子材料は、水中でイオン化し得る官能基を複数有しており、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を示さないため、イオン化率が高い状態でも低い状態でも親水性であるが、イオン化率が高い状態ではより親水性であり、イオン化率が低い状態ではより疎水性である。高分子材料のイオン化率が高い状態では、水中でイオン化し得る官能基はよりイオン化された状態であり、このイオン化された部位どうしの電荷反発により、高分子主鎖は比較的伸長した状態になりやすく、一方、イオン化率が低い状態では、電荷反発が小さいため、高分子主鎖は比較的収縮した状態になりやすい。
【００２０】
高分子材料と吸着部位が結合している吸着材（図１参照）の推定される吸着・脱着メカニズムを以下に説明する。高分子材料のイオン化率がより高い状態では、水中でイオン化し得る官能基はよりイオン化された状態であり、このイオン化された部位どうしの電荷反発により、高分子材料の高分子主鎖は比較的伸長した状態になっている。このとき、吸着部位が疎水性の場合、親水性の高分子材料と疎水性の吸着部位との相互作用は比較的弱いため、標的物質は吸着部位に吸着している（図１の左図）。そして、外部環境の変化によって、高分子材料のイオン化率が低下すると、高分子材料の疎水性が増大するため、吸着部位が疎水性の場合、高分子材料と吸着部位の相互作用が強くなる方向に平衡が移動し、結果として吸着部位と標的物質の吸着が弱くなり、標的物質が吸着部位から脱着する（図１の右図）。高分子材料のイオン化率が低下した状態では、高分子材料の高分子主鎖は、電荷反発が小さいため比較的収縮した状態になっている。
【００２１】
高分子材料と吸着部位が結合しておらず、異なる位置で別々に担体に固定化されている吸着材（図２参照）の推定される吸着・脱着メカニズムを以下に説明する。高分子材料のイオン化率がより高い状態では、イオン化された部位どうしの電荷反発により、高分子材料の高分子主鎖は比較的伸長した状態になっている。このとき、高分子材料が担体表面において占める排除体積がより大きいため、標的物質は吸着部位から脱着している（図２の右図）。そして、外部環境の変化によって、高分子材料のイオン化率が低下すると、高分子材料の周辺の水和水の量が減少し、高分子材料が担体表面において占める排除体積が小さくなり、担体表面に存在する吸着部位への溶質のアクセスがしやすくなる方向に平衡が移動し、結果として吸着部位と標的物質が吸着する（図２の左図）。
【００２２】
本発明の吸着材は、外部環境の変化によって高分子材料のイオン化率が低下しても、高分子材料が疎水性にはならないため、水中での分散性が保たれ、また、高分子材料の溶解性の変化を利用していないため、ヒステリシスが小さい。よって、本発明の吸着材は、温度変化に伴う溶解性の変化を利用する従来の吸着材と比較して分散性および可逆性に優れ、また、吸着材の製造・輸送・充填の際の取り扱いも容易である。
【００２３】
外部環境の変化は、高分子材料のイオン化率を変化させることができるものであれば特に限定されない。ここで、水中でイオン化し得る官能基のイオン化率は、イオン化に関わる自由エネルギー（ΔＧ＝ΔＨ−ＴΔＳ）の温度依存性、すなわちイオン化に際するエントロピー変化（ΔＳ）の度合いに依存するところ、一般にΔＳ≠０であるため、イオン化率は温度によって変化する。すなわち、外部環境の変化は、例えば温度変化である。前記の式より、イオン化率は、通常、昇温に伴いイオン化率が低くなり、降温に伴いイオン化率が高くなる。また、ΔＨは溶媒分子の極性や電離度等からも影響されるため、外部環境の変化としては、温度変化以外にも、例えば、吸着材が接触している溶液の塩濃度、誘電率およびｐＨ等の変化が挙げられる。例えば、塩濃度が変化すると静電遮蔽効果が変化し、溶媒や溶質の種類の変化により誘電率が変化し、また、ｐＨが変化するとイオン化の平衡移動が起こり、これらによってイオン化率が変化する。外部環境の変化は、好ましくは、吸着材が接触している溶液の温度、塩濃度、誘電率およびｐＨの変化であり、温度変化がより好ましい。これらの外部環境の変化を組み合わせてもよい。外部環境の変化により高分子材料のイオン化率が変化して標的物質が吸着または脱着することから、本発明の吸着材は、外部環境の変化に応答性の吸着材であり、例えば、外部環境の変化が温度変化である場合には、吸着材は温度応答性吸着材となり、外部環境の変化が塩濃度、誘電率またはｐＨの変化である場合には、それぞれ、塩濃度応答性、誘電率応答性またはｐＨ応答性吸着材となる。
【００２４】
高分子材料のイオン化率は、例えば、吸着材を充填したカラムに緩衝液を通液した状態で外部環境を変化させたときに、カラムから溶出される溶液の特性（例えばｐＨ）をモニタリングすることで求めることができる。例えば、外部環境の変化が温度変化であって（すなわち、高分子材料のイオン化率が温度依存性である）、中性状態からプロトンを捕捉することでイオン化するアミノ基のような官能基を水中でイオン化し得る官能基として有する高分子材料において、温度変化によってイオン化率が低下する場合には、カラムの温度を変化させることで高分子材料が捕捉しているプロトンの量が減り、それに伴って緩衝液中のプロトン濃度が上昇する。そのため、カラムから溶出する溶液のｐＨをモニタリングすれば、高分子材料が放出したプロトンの分だけｐＨが低下する領域が見られる。逆に、イオン化率が高くなる場合には、高分子材料が緩衝液からプロトンを奪うため、カラムから溶出する溶液のｐＨは上昇する領域が見られる。このような変化が見られる吸着材では、イオン化率の変化が温度依存性であることがわかる。なお、滴定、表面分析、元素分析等によって吸着材中の高分子材料の分子数が定量されれば、イオン化率の変化幅も定量可能となる。
【００２５】
外部環境の変化による高分子材料のイオン化率の変化は、標的物質と吸着部位の相互作用の強さを変化させて、吸着特性を変化させることができる程度の変化であればよい。これは、例えば、吸着材を充填したカラムを用いる前記のイオン化率の測定方法において、外部環境の変化に対し、カラムから溶出される溶液のｐＨが０．７以上変化する領域が存在すれば十分である。
【００２６】
標的物質は、吸着部位に吸着し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、タンパク、生体分子、細胞、ウイルスおよびナノ粒子等が挙げられる。標的物質は、抗体であってもよい。また、本発明の吸着材の特性を活かす観点からは、過酷なｐＨ条件で不安定なものが好適である。
【００２７】
吸着部位は、吸着部位に吸着する標的物質に応じて選ぶことができる。本発明では、高分子材料のイオン化率の変化を利用して標的物質の吸着・脱着を制御するため、吸着部位は、高分子材料のイオン化率の変化による物性の変化を受けやすいことが好ましく、親水性の高分子材料に対して疎水性の吸着部位が好ましい。また、吸着部位は高分子材料の分子サイズに対して同等以下程度のサイズであることが好ましい。好ましくは、吸着部位は、疎水性であり、かつ高分子材料の分子サイズに対して同等以下程度のサイズのものである。なお、吸着部位は、水中でイオン化し得る官能基を有し得るが、この場合、高分子材料と吸着部位が結合している吸着材において、吸着部位が有する水中でイオン化し得る官能基は、高分子材料が有する水中でイオン化し得る官能基とはならない。すなわち、高分子材料は、吸着部位が有する水中でイオン化し得る官能基とは別に、水中でイオン化し得る官能基を有する。
【００２８】
吸着部位としては、特に限定されずに、例えば、ペプチド、タンパク、スルフィド基含有（複素環式）芳香族化合物、ビタミン類、色素、糖類、糖鎖結合分子、チオフィリックリガンド、ボロン酸、抗原および抗原部分構造、酵素の基質、抗体および抗体部分構造等が挙げられる。吸着部位は、これらの物質に由来する部分を有していればよい。ペプチドおよびタンパクとしては、例えば、ヒスチジンタグ、グルタチオン、レクチンおよびＲＧＤ配列を有するもの等が挙げられる。ペプチドおよびタンパクは、これらの部分構造または模倣分子であってもよい。ペプチドまたはタンパクの部分構造または模倣分子としては、例えば、プロテインＡ部分構造または模倣分子、プロテインＧ部分構造または模倣分子、プロテインＬ部分構造または模倣分子等が挙げられ、これらの模倣分子としては、例えば、プロテインＡ模倣分子ＡｐＡ、プロテインＡ模倣分子２２／８およびプロテインＧ模倣分子Ａ２Ｃ７Ｉ１等が挙げられる。スルフィド基含有（複素環式）芳香族化合物としては、例えば、メルカプトピリジン、メルカプトエチルピリジンおよび（３−チア−５−ピリジルペンチル）ビニルスルホン等が挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビオチンが挙げられる。色素としては、例えば、ローダミン、シバクロンブルーおよびミメティックブルー等が挙げられる。好ましい吸着部位は、プロテインＡ部分構造または模倣分子、プロテインＧ部分構造または模倣分子、プロテインＬ部分構造または模倣分子、糖鎖結合分子、チオフィリックリガンドおよび抗原または抗原部分構造である。
【００２９】
標的物質と吸着部位の好ましい組み合わせとしては、例えば、抗体と、プロテインＡ部分構造もしくは模倣分子、またはスルフィド基含有（複素環式）芳香族化合物との組み合わせや、タンパクと、色素またはビタミン類との組み合わせが挙げられる。
【００３０】
吸着部位への標的物質の吸着は、化学的結合および物理的結合のいずれであってもよく、多点結合であってもよい。例えば、水素結合、疎水性相互作用、π−π相互作用、双極子−双極子相互作用、電荷−双極子相互作用、電荷−電荷相互作用、電荷移動相互作用、ファンデルワールス結合、アンカー効果等の適宜の相互作用や、これらの組み合わせによって可逆的な結合が形成される。
【００３１】
高分子材料が有する水中でイオン化し得る官能基は、水中でイオン化し得るものであれば特に限定されないが、好ましくは、水のｐＫａである１５．７より２高い１７．７以下かつ水中におけるオキソニウムイオンのｐＫａである−１．７より２低い−３．７以上のｐＫａの官能基であるか、または、水のｐＫａである１５．７より２高い１７．７以下かつ水中におけるオキソニウムイオンのｐＫａである−１．７より２低い−３．７以上のｐＫａの共役酸もしくは共役塩基を生じる官能基である。すなわち、水中でイオン化し得る官能基は、好ましくは、ｐＫａが−３．７以上１７．７以下である官能基を含むか、またはその共役酸もしくは共役塩基のｐＫａが−３．７以上１７．７以下である官能基を含む。水中でイオン化し得る官能基は、該官能基またはその共役酸もしくは共役塩基の少なくとも一部が前記のｐＫａを有していればよい。なお、水中でイオン化し得る官能基が高分子材料中に存在するときの実際のｐＫａは、水中でイオン化し得る官能基が単独で水中に存在する際のｐＫａと異なる場合がある。これは、高分子材料中に水中でイオン化し得る官能基が複数存在することでそれらの間で相互作用が生じることがあるためである。
【００３２】
水中でイオン化し得る官能基またはその共役酸もしくは共役塩基のｐＫａの適正な範囲は、吸着材を使用する際のｐＨによって異なる。ただし、高分子材料中の水中でイオン化し得る官能基の数を増やすことで、前記の相互作用によってｐＫａが変化する官能基が増え、広範なｐＫａ範囲の官能基を高分子材料中に含ませることができるため、本発明の吸着材を使用可能なｐＨ範囲は十分に広い。
【００３３】
水中でイオン化し得る官能基としては、特に限定されずに、例えば、アミノ基（１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基）、イミノ基、各種含窒素芳香族基（ピロール基、イミダゾリル基、ピリジル基、ピリミジル基、オキサゾリル基、チアゾリル基およびトリアゾリル基等）、グアニジル基、フェノール性水酸基、カルボキシル基、ボロン酸基、ホスホリル基、ホスフィニル基、シリケート基およびそれらの誘導体の基等を用いることができ、アミノ基、イミノ基、含窒素芳香族基、グアニジル基、フェノール性水酸基、カルボキシル基、ボロン酸基およびホスホリル基が好ましく、アミノ基およびイミノ基が特に好ましい。水中でイオン化し得る官能基は、１種類のみを用いてもよいし、複数種類を用いてもよい。水中でイオン化し得る官能基として複数種類のものを用いる際には、それらの相互作用によってｐＫａが大きく変化し、適正なｐＫａ範囲から外れる可能性があるため、適宜前記のｐＫａ範囲に設定することが好ましい。
【００３４】
水中でイオン化し得る官能基を複数有する高分子材料は、前記のイオン化し得る官能基を複数有するものであれば特に限定されない。高分子材料は、デンドリマーであってもよい。高分子材料としては、例えば、ポリリジン（α−ポリリジン、ε−ポリリジン）、直鎖ポリエチレンイミン、分岐ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、キトサン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリプロピレンイミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ポリリン酸、ポリリン酸エステル、ポリケイ酸、ポリシロキサンおよびそれらの誘導体、ならびにそれらを部分構造として有する誘導体および共重合体等が挙げられる。高分子材料としては、ポリリジン、アミノ基を複数有するデンドリマー、イミノ基を複数有するデンドリマー、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミンまたはそれらを部分構造として含むものが好ましい。なお、ポリリジンおよびポリアリルアミンは、水中でイオン化し得る官能基としてアミノ基を有し、また、ポリエチレンイミンは、水中でイオン化し得る官能基としてイミノ基を有する。
【００３５】
水中でイオン化し得る官能基を複数有する高分子材料は、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を示さない。よって、本発明の高分子材料は、温度変化に伴って相変化するものではない。また、高分子材料は、好ましくは親水性である。本発明の吸着材は、高分子材料がＬＣＳＴを示さないため、高分子材料の溶解性の変化を利用するものではなく、よって、相変化によって標的物質を吸着または脱着させるものではない。本発明の吸着材は、ＬＣＳＴを示す温度応答性高分子を用いる従来の吸着材と比べて、分散性および応答の可逆性の面で優れる。
【００３６】
担体は、多孔質および非多孔質のいずれの形状であってもよい。担体の形状としては、例えば、板状、ビーズ状、不織布や織物等の繊維状、膜状、モノリス状および中空糸状等が挙げられる。
【００３７】
担体は、例えば、多糖類、合成樹脂、無機化合物およびそれらの複合材料を含む材料を有する。多糖類は、架橋された多糖類であってもよい。担体は、これらの材料を少なくとも担体表面に有していればよい。多糖類または架橋された多糖類としては、例えば、アガロース、架橋アガロース、疎水化アガロースおよびセルロース等が挙げられる。合成樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ポリアルキルメタクリレート、ポリグリシジルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリシロキサンおよびポリフッ化エチレン等が挙げられる。無機化合物としては、シリカ、金属酸化物（例えば、アルミナ、チタニア、ジルコニア、酸化鉄等）、フェライト、ハイドロキシアパタイトおよびシリケート等が挙げられる。担体またはその表面は、多糖類、架橋された多糖類、ポリスチレン、シリカまたは金属酸化物を有することが好ましく、多糖類または架橋された多糖類を有することが特に好ましい。
【００３８】
担体表面は、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、エポキシ基、エステル基等の反応性基によって修飾されていてもよい。また、担体表面は、吸着部位および高分子材料以外の化合物によって修飾されていてもよい。例えば、担体表面は、標的物質の非特異的な吸着を防止するブロッキングや、吸着部位または高分子材料の配向性を制御する表面修飾や、担体の分散性または吸着性を改質する修飾等が行われていてもよい。
【００３９】
本発明の吸着材は、高分子材料、または高分子材料および吸着部位を担体に化学結合することで製造できる。
【００４０】
高分子材料と担体の化学結合は、例えば、高分子材料中のイオン化し得る官能基を用いて形成してもよい。この場合、化学結合を形成する担体の表面の官能基と、イオン化し得る官能基との組み合わせとして、例えば、エポキシ基とアミノ基、エステル基（例えば、カルボン酸のＮＨＳエステル）とアミノ基、アミノ基とカルボキシル基との組み合わせ等が挙げられる。化学結合の形成は、担体に高分子材料の溶液を接触させることで行うことができる。縮合反応により化学結合を形成する場合（例えば、アミノ基とカルボキシル基を用いる場合等）、縮合剤（例えば、ＤＭＴ−ＭＭ等）の存在下で反応を行うことが好ましい。
【００４１】
一実施形態において、高分子材料と吸着部位が結合している吸着材では、高分子材料と吸着部位との結合は、高分子材料を担体に固定化する前および後のいずれに形成してもよい。すなわち、高分子材料と吸着部位とを結合させ、その後、吸着部位が結合した高分子材料を担体に固定化してもよく、あるいは、吸着部位を有さない高分子材料を担体に固定化した後に、固体化した高分子材料と吸着部位とを結合させてもよい。
【００４２】
別の一実施形態において、高分子材料と吸着部位とが結合しておらず、異なる位置で別々に担体に固定化されている吸着材は、高分子材料と吸着部位を別々に担体に固定化して製造できる。高分子材料の担体への固定化は、前記と同様にして行うことができる。吸着部位の担体への固定化は、例えば、吸着部位と担体を化学結合により結合させることで行うことができる。高分子材料と担体の固定化の順序には特に制限はないが、吸着部位を先に担体に固定化することが好ましい。
【００４３】
本発明は、前記の吸着材を用いる標的物質の精製方法にも関する。標的物質の精製方法は、前記の吸着材に、標的物質を含む溶液を接触させる工程と、その後、前記の外部環境の変化を印加する工程とを含む。本発明は、標的物質を吸着材に吸着して、該標的物質を精製することもできるし、不要物質を標的物質として吸着材に吸着して、目的物質を精製することもできる。後者の場合、例えば、標的物質を細胞膜上の不要分子として細胞を精製することができ、また、標的物質をウイルスやナノ粒子の表面の不要分子として該ウイルスやナノ粒子を精製することができる。
【００４４】
標的物質を含む溶液を吸着材に接触させる工程では、溶液中の標的物質が吸着材に吸着する。標的物質の吸着材への吸着は、高分子材料のイオン化率を、吸着部位と標的物質が吸着するように適宜設定することで達成できる。例えば、高分子材料と吸着部位が結合している吸着材では、好ましくは、イオン化率をより高くすることで標的物質を吸着部位に吸着させることができる。また、例えば、高分子材料と吸着部位が結合しておらず、異なる位置で別々に担体に固定化されている吸着材では、好ましくは、イオン化率をより低くすることで、標的物質を吸着部位に吸着させることができる。
【００４５】
標的物質を含む溶液の温度は、標的物質が吸着材に吸着するように適宜選択できるが、標的物質が安定な範囲内であることが好ましく、その範囲内において低い方がより好ましい。例えば、高分子材料と吸着部位が結合している吸着材では、溶液の温度は、標的物質が安定な範囲内において低い方が吸着には好ましく、例えば４℃とする。また、例えば、高分子材料と吸着部位が結合しておらず、異なる位置で別々に担体に固定化されている吸着材では、溶液の温度は、標的物質が安定な範囲内において高い方が吸着には好ましく、例えば３７℃とする。
【００４６】
標的物質を含む溶液は、水を溶媒とした緩衝液とすることが好ましい。
【００４７】
標的物質を含む溶液を吸着材に接触させる際のｐＨは、標的物質、吸着部位および高分子材料の各物性に依存して選ぶことができるが、標的物質の吸着に有利なｐＨを選ぶことが望ましい。
【００４８】
外部環境の変化を印加する工程では、高分子材料は水中でイオン化し得る官能基を複数有するため、外部環境の変化を印加することで、高分子材料のイオン化率が変化し、吸着材から標的物質が脱着する。外部環境の変化としては、前記の変化を用いることができ、例えば、吸着材が接触している溶液の温度、塩濃度、誘電率（溶質および溶媒の種類）またはｐＨの変化等が用いられる。
【００４９】
一実施形態において、標的物質の精製方法は、吸着材が充填されたカラムを用いて実施される。従来の溶解度の変化を利用する温度応答性の吸着材では、温度変化によって、疎水性が増大して分散性が低下し、水との親和性が大きく変化し、カラムの流路が変わったり、クラックや壁面との隙間が発生したりするリスクがあるが、本発明の吸着材は、温度変化に伴う溶解性の変化を標的物質の吸着または脱着に利用していないため、そのようなリスクは少ない。
【００５０】
本発明の吸着材を充填したカラムを用いる精製方法は、その特性を活かす観点から、低いｐＨで分解や凝集体生成が発生する対象に適用することが好ましい。また、溶出された標的物質が中性に近いｐＨ領域の緩衝液に溶解した状態で得られるため、中和工程を必要とせず次の精製プロセスに適用できる。
【００５１】
別の実施形態において、標的物質の精製方法は、吸着材を懸濁液の状態で用いて実施される。従来の溶解度の変化を利用する温度応答性の吸着材では、温度変化によって、疎水性が増大して分散性が低下し、懸濁状態の吸着材が凝集、壁面に付着、界面に局在化等するリスクが高いが、本発明の吸着材は、温度変化に伴う溶解性の変化を標的物質の吸着または脱着に利用していないため、そのようなリスクはほぼない。
【００５２】
以下、実施例を示して本発明について具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００５３】
＜実施例１＞
水中でイオン化し得る官能基を複数有する高分子材料としてポリアミンを用いた。具体的には、標的物質をヒトＩｇＧ抗体とし、該高分子材料としてε−ポリリジン（ＥＰＬ）を用い、吸着部位を（４−ヒドロキシフェニルエチルアミノ）（フェニルアミノ）トリアジン（ＡｐＡ）とした。なお、ＡｐＡは、抗体吸着能を有するプロテインＡ模倣分子である。
【００５４】
【化１】
2018030069.tif 000003
【００５５】
ＥＰＬの水／ＤＭＦ溶液にクロロ（４−ヒドロキシフェニルエチルアミノ）（フェニルアミノ）トリアジン（ＡｐＡ−Ｃｌ）（０．２当量）およびトリエチルアミン（０．０２当量）を加え、８０℃で６時間加熱することで、ＥＰＬにＡｐＡを導入した。得られた反応液に塩酸を加えて酸性とし、水により透析し、生じた沈殿を濾別した後に凍結乾燥することでポリマー１を固体として得た。
【００５６】
得られたポリマー１の０．１重量％溶液を調製し、これを、ＮＨＳエステル基を表面に有する架橋アガロース担体に加え、得られた懸濁液を室温で一晩振盪することで、ポリマー１が担体に固定化された実施例１の吸着材を得た。
【００５７】
＜実施例２＞
標的物質をヒトＩｇＧ抗体とし、高分子材料としてＥＰＬを用い、吸着部位を、（３−チア−５−ピリジルペンチル）ビニルスルホン（ＭＥＰ−ＤＶＳ）由来の（３−チア−５−ピリジルペンチル）スルホニルエチル部分とした。
【００５８】
ジビニルスルホンと２−ピリジルエタンチオール塩酸塩とを塩基存在下で反応させることによって（３−チア−５−ピリジルペンチル）ビニルスルホン（ＭＥＰ−ＤＶＳ）を調製した。ＥＰＬの水／ＴＨＦ溶液にＭＥＰ−ＤＶＳ（０．７当量）のＴＨＦ溶液を加え、室温で１２時間撹拌することで、ＥＰＬにＭＥＰ−ＤＶＳ由来の（３−チア−５−ピリジルペンチル）スルホニルエチル部分を導入した。得られた反応液に塩酸を加えて酸性とし、水により透析し、生じた沈殿を濾別した後に凍結乾燥することでポリマー２を固体として得た。
【００５９】
実施例１と同様にして、ポリマー２が担体に固定化された実施例２の吸着材を得た。        
【００６０】
＜実施例３−６＞
種々の高分子材料と吸着部位の組み合わせを用いて実施例３−６の吸着材を得た。具体的には、表１に示す高分子材料と、吸着部位を形成するための化合物（１〜２０当量）とを混合し、所定の条件にて反応させてポリマー３−６を合成し、得られた各ポリマーを実施例１と同様にして担体に固定化して、実施例３−６の吸着材を得た。
【００６１】
＜実施例７＞
高分子材料としてＥＰＬを用い、吸着部位をＡｐＡとした。実施例１におけるポリマー１の担体への固定化と同様にして、ＡｐＡを、ＮＨＳエステル基を表面に有する架橋アガロース担体に固定化し、その後、ＥＰＬを担体に固定化して、ＡＰＡおよびＥＰＬが別々に担体に固定化された実施例７の吸着材を得た。
【００６２】
＜比較例１＞
架橋アガロース担体に、ＮａＯＨ存在下でジビニルスルホン（ＤＶＳ）を作用させた後に２−ピリジルエタンチオール（ＭＥＰ）塩酸塩を作用させることで、ＭＥＰ−ＤＶＳに由来する（３−チア−５−ピリジルペンチル）スルホニルエチル部分が担体に導入された比較例１の吸着材を得た。
【００６３】
＜比較例２＞
表面にアミノ基を有する架橋アガロース担体に、プロテインＡ模倣分子２２／８の原料であるクロロトリアジン誘導体のＤＭＦ溶液を作用させることで、プロテインＡ模倣分子２２／８が担体に導入された比較例２の吸着材を得た。
【００６４】
＜比較例３＞
架橋アガロース担体にヒトＩｇＧ抗体を固定化して、ヒトＩｇＧ抗体が担体に導入された比較例３の吸着材を得た。
【００６５】
＜比較例４＞
ＮＨＳエステル基を表面に有する架橋アガロース担体にポリアミドアミンデンドリマーの０．１重量％溶液を加え、得られた懸濁液を室温で一晩振盪することで、担体にポリアミドアミンデンドリマーが固定化された比較例４の吸着材を得た。
【００６６】
＜比較例５＞
架橋アガロース担体を比較例５の吸着材とした。
【００６７】
実施例１−７および比較例１−５の吸着材について、高分子材料、吸着部位および好ましい標的物質を表１に示す。ここで、吸着部位については、導入された吸着部位または吸着部位の導入に用いた原料化合物を記載している。
【００６８】
【表１】
2018030069.tif 000004
【００６９】
＜試験例１＞
実施例１−７および比較例１−５の吸着材について、温度変化に伴うイオン化率の変化を測定した。
【００７０】
各吸着材をそれぞれカラム（内径５ｍｍ、長さ５０ｍｍ）に充填し、４℃の恒温槽内に設置し、ＰＢＳ緩衝液（５ｍＭ）を流量０．５ｍＬ／分にて通液することで４℃にてカラムを安定化させた。その後、この流量（０．５ｍＬ／分）を維持した状態でカラムを３７℃の恒温槽内に設置し、カラムから溶出される溶液のｐＨをモニタリングした。代表例として、実施例１、２および比較例３、５の吸着材についての結果を図３に示す。図３は、実施例１、２および比較例３、５の吸着材について、４℃から３７℃に昇温した際の吸着材のイオン化率の変化の測定結果を示す。
【００７１】
引き続き、カラムが３７℃にて安定化した後に、前記流量（０．５ｍＬ／分）を維持した状態でカラムを４℃の恒温槽内に再度設置し、カラムから溶出される溶液のｐＨをモニタリングした。代表例として、実施例１、２および比較例３、５の吸着材についての結果を図４に示す。図４は、実施例１、２および比較例３、５の吸着材について、３７℃から４℃に降温した際の吸着材のイオン化率の変化の測定結果を示す。
【００７２】
図３および図４より、比較例３の吸着材では、温度変化に伴いカラムから溶出される溶液のｐＨ変化は小さく、比較例５の吸着材では、カラムから溶出される溶液のｐＨ変化は見られなかった。これに対し、実施例１および２の吸着材では、比較例３および５の吸着材と比べて、温度変化に伴いカラムから溶出される溶液のｐＨ変化が大きく、温度変化に伴いイオン化率が大きく変化することが示された。なお、図示していないが、実施例３−７の吸着材も実施例１および２の吸着材と同様に、比較例の吸着材と比べて、温度変化に伴いカラムから溶出される溶液のｐＨ変化が大きく、温度変化に伴いイオン化率が大きく変化していた。よって、水中でイオン化し得る官能基を複数有する高分子材料を用いることで、温度変化に伴い高分子材料のイオン化率が大きく変化することが示された。
【００７３】
＜試験例２＞
実施例１−７の吸着材および比較例１−５の吸着材の温度変化に伴う標的物質に対する吸着特性の変化をカラム中で測定した。
【００７４】
カラムに、４℃または３７℃で、１重量％の所定の標的物質を含むｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液（リン酸５ｍＭまたは３０ｍＭ、塩化ナトリウム３７．５ｍＭ）を１０ｍＬ通液し、カラムから溶出される溶液内の標的物質濃度をモニタリングし、溶液中の濃度減少分から吸着材の吸着容量を算出した。代表例として、実施例１、２、４、６、７および比較例２、３、５の結果を表２に示す。
【００７５】
【表２】
2018030069.tif 000005
【００７６】
表２より、試験例１において、温度変化に伴う高分子材料のイオン化率の大きな変化が見られた実施例１、２、４、６および７の吸着材は、比較例２、３および５の吸着材と比較して脱着率が高く、優れた吸着特性を示し、また、吸着特性の温度依存性が見られた。なお、高分子材料と吸着部位が結合している実施例１、２、４および６の吸着材では、昇温時に標的物質が脱着するのに対し、高分子材料と吸着部位が別々に担体に固定化されている実施例７の吸着材では、降温時に標的物質が脱着することが示された。一方、比較例１−４の吸着材では、試験例１において温度変化に伴う高分子材料のイオン化率の小さな変化が見られたものの、脱着率は低く、また、吸着特性の温度依存性はほぼ見られなかった。なお、実施例３および５の吸着材も同様に、比較例の吸着材に対して優れた吸着特性を示し、また、吸着特性の温度依存性が見られた。
【００７７】
＜試験例３＞
実施例１−７の吸着材および比較例１−５の吸着材の温度変化に伴う標的物質に対する吸着特性の変化を、吸着材を懸濁液の状態で用いるビーズ分散系で測定した。
【００７８】
各吸着材に、４℃または３７℃で、１重量％の所定の標的物質を含むｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液（リン酸５ｍＭまたは３０ｍＭ、塩化ナトリウム３７．５ｍＭ）をビーズ体積の２倍量加え、３時間振盪させた後に、上澄み溶液をＧＰＣで分析して濃度の減少分を定量することで、吸着材の吸着容量を算出した。代表例として、実施例１、２および比較例２、３、５の結果を表３に示す。
【００７９】
【表３】
2018030069.tif 000006
【００８０】
表３より、試験例１において、温度変化に伴う高分子材料のイオン化率の大きな変化が見られた実施例１および２の吸着材は、比較例２、３および５の吸着材と比較して脱着率が高く、優れた吸着特性を示し、また、吸着特性の温度依存性が見られた。一方、比較例１−４の吸着材では、試験例１において温度変化に伴うイオン化率の小さな変化が見られるものの、脱着率は低く、また、吸着特性の温度依存性はほぼ見られなかった。なお、実施例３−７の吸着材も同様に、比較例の吸着材に対して優れた吸着特性を示し、また、吸着特性の温度依存性が見られた。
【符号の説明】
【００８１】
１０  吸着材
２０  吸着材
１  高分子材料
２  水中でイオン化し得る官能基
３  高分子主鎖
４  吸着部位
５  標的物質
６  担体
【図１】
2018030069.tif 000007
【図２】
2018030069.tif 000008
【図３】
2018030069.tif 000009
【図４】
2018030069.tif 000010
【図５】
2018030069.tif 000011