(57)【要約】      （修正有）【課題】線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に伴う疾患の抗体に基づく治療および診断方法の提供。【解決手段】抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ならびに／あるいは可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）の少なくとも１つが、抗ＦＡＰ抗体を産生したヒトメモリーＢ細胞から得られるｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡによってコードされ、好ましくは、捕捉された、または直接に被覆されたヒトＦＡＰに０．１μＭ以下のＥＣ５０で結合することができる、ヒトＢ細胞由来の抗線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）モノクローナル抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ならびに／あるいは可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）の少なくとも１つが、抗ＦＡＰ抗体を産生したヒトメモリーＢ細胞から得られるｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡによってコードされ、好ましくは、捕捉された、または直接に被覆されたヒトＦＡＰに０．１μＭ以下のＥＣ５０で結合することができる、ヒトＢ細胞由来の抗線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）モノクローナル抗体。
【請求項２】
１５アミノ酸長のペプチドに含まれるＦＡＰエピトープと結合することができ、前記エピトープは下記のアミノ酸配列を含む、または下記のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体：
ＮＩ−２０６−１８Ｈ２（５０１−ＩＱＬＰＫＥＥＩＫＫＬ−５１１）（配列番号６０）；
ＮＩ−２０６．８２Ｃ２（５２１−ＫＭＩＬＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰ−５３５（配列番号３０）；５２５−ＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰＬＬＩＱ−５３９（配列番号３１）；５２５−ＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰ−５３５（配列番号３２）；および／または１１３−ＹＬＥＳＤＹＳＫＬＷＲ−１２３（配列番号６１））；
ＮＩ−２０６．５９Ｂ４（５３−ＳＹＫＴＦＦＰ−５９（配列番号３３））；
ＮＩ−２０６．２２Ｆ７（３８１−ＫＤＴＶＥＮＡＩＱＩＴ−３９１（配列番号３４））；
ＮＩ−２０６．２７Ｅ８（１６９−ＮＩＹＬＫＱＲ−１７５（配列番号３５））；
ＮＩ−２０６．１２Ｇ４（４８１−ＴＤＱＥＩＫＩＬＥＥＮＫＥＬＥ−４９５（配列番号３６））；または
ＮＩ−２０６．１７Ａ６（７７−ＶＬＹＮＩＥＴＧＱＳＹ−８７（配列番号３７））。
【請求項３】
その可変領域または結合ドメインにおいて、
（ａ）図１Ｇ〜図１Ｋおよび図１Ａ〜図１Ｆのいずれか１つに示されるVH鎖アミノ酸配列および／またはVL鎖アミノ酸配列の少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｂ）図１Ｇ〜図１Ｋおよび図１Ａ〜図１Ｆに示されるようなVH鎖アミノ酸配列および／またはVL鎖アミノ酸配列のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；あるいは
（ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含むVH鎖および／またはVL鎖
を含み、
好ましくは、前記アミノ酸配列における変化の数が５０％未満である、請求項１または２に記載の抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体。
【請求項４】
膜貫通ＦＡＰに結合することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体。
【請求項５】
ＦＡＰに対する結合アビディティーが、中性ｐＨまたは生理学的ｐＨよりも酸性ｐＨのもとで大きく、好ましくは、前記酸性ｐＨが６．４または６．８であり、前記生理学的ｐＨが７．４である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体。
【請求項６】
その可変領域または結合ドメインにおいて、
（ａ）図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｄ、図１Ｇ、図１Ｉのいずれか１つに示されるＶＨ鎖アミノ酸配列および／またはＶＬ鎖アミノ酸配列の少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｂ）図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｄ、図１Ｇ、図１Ｉに示されるようなＶＨ鎖アミノ酸配列および／またはＶＬ鎖アミノ酸配列のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；あるいは
（ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含むＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖
を含み、
好ましくは、１５アミノ酸長のペプチドに含まれるＦＡＰエピトープと結合することができ、ただし、そのようなエピトープは、配列番号３０〜配列番号３３、配列番号３５、配列番号６０および配列番号６１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、またはそのようなアミノ酸配列からなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体。
【請求項７】
ヒト定常領域を含み、かつ／または、免疫グロブリンのＦｃ領域もしくは前記Ｆｃ領域と同等な領域を含み、好ましくは前記Ｆｃ領域がＩｇＧのＦｃ領域であり、好ましくは全長のＩｇＧクラスの抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
糖鎖工学操作されたＦｃ領域を含み、かつ、糖鎖工学操作されていない抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増大している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
ＦＡＰならびに少なくとも１つのさらなるエピトープおよび／または標的に結合し、好ましくは二重特異性または多価であり、
二重特異性抗体、三機能性抗体、テトラボディー、二価単鎖フラグメント（ＳｃＦｖ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲイジャー（ＢｉＫＥ）、二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）またはＤｕｏＢｏｄｙであり、好ましくは、ＦＡＰに加えて、細胞死受容体５（ＤＲ５）および／またはＣＤ３に結合する二重特異性抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
その抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）であり、かつ、第１の受容体が、請求項１〜９のいずれか一項に記載される抗ＦＡＰ抗体に由来する可変領域または結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項１１】
請求項１０に記載のＣＡＲであって、該ＣＡＲ、または該ＣＡＲを発現する細胞が、中性ｐＨまたは生理学的ｐＨよりも酸性ｐＨのもとで大きい、ＦＡＰまたはＦＡＰをその細胞表面に発現する細胞に結合するアビディティーを示し、好ましくは、前記酸性ｐＨは６．４または６．８であり、前記生理学的ｐＨは７．４である、ＣＡＲ。
【請求項１２】
前記第１の受容体または第２の受容体が、少なくとも１つのさらなる抗原結合ドメインを含み、好ましくは、前記さらなる抗原結合ドメインがＣＤ３受容体または細胞死受容体について特異的であり、好ましくは、前記細胞死受容体が細胞死受容体５（ＤＲ５）である、請求項１０または１１に記載のＣＡＲ。
【請求項１３】
細胞外ドメイン（受容体）、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメインまたは細胞質ドメイン）を含み、好ましくは、前記細胞内シグナル伝達ドメインは４−１ＢＢ共刺激ドメインおよび／またはＣＤ２８共刺激ドメインおよび／またはＣＤ３ζ（ゼータ）エンドドメインを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか一項に記載されるＣＡＲを発現するように遺伝子改変される宿主細胞であって、必要な場合には請求項１〜１０のいずれか一項に記載される抗体を発現し、分泌し、
好ましくは、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹細胞または多能性幹細胞であり、
好ましくはＴ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）であり、
好ましくは、中性ｐＨまたは生理学的ｐＨよりも酸性ｐＨのもとで大きい、ＦＡＰまたはＦＡＰをその細胞表面に発現する細胞に結合するアビディティーを示す（ただし、好ましくは、前記酸性ｐＨは６．４または６．８であり、前記生理学的ｐＨは７．４である）宿主細胞。
【請求項１５】
ＦＡＰに伴う疾患の診断または処置において有用である医薬用または診断用の組成物であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載される抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載されるＣＡＲ、あるいは請求項１４に記載される細胞を含む、医薬用または診断用の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に伴う疾患の抗体に基づく治療および診断に関連する。具体的には、本発明は、ＦＡＰによって誘発される疾患および状態の処置において、とりわけ、ＦＡＰ誘発腫瘍に伴う疾患のＴ細胞媒介処置において有用である、ヒトＦＡＰおよびそのエピトープに特異的に結合する新規な分子（特に、ヒト由来組換え抗体、ならびに、そのフラグメント、生物工学誘導体および合成誘導体、ヒトＦＡＰに対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ならびにそれらに同等なＦＡＰ結合薬剤）に関連する。さらに、本発明は、健常な組織での中性ｐＨ環境におけるより低いアビディティーと比較して、腫瘍において見出される酸性ｐＨ環境における膜貫通ＦＡＰに対する増大したアビディティーを示すＦＡＰ結合性分子に関連する。特定の局面において、選択的かつ強力なＦＡＰ阻害剤が提供される。加えて、本発明は、ＦＡＰに伴う疾患を特定するための診断ツールとしてともに有益である前記抗体および薬剤を含む医薬組成物および診断組成物に関連し、また、ＦＡＰに伴う疾患（例えば、様々なガン、炎症性疾患および心臓血管疾患ならびに血液凝固障害など）を処置するための本発明の抗体の新規なエピトープを含む抗原による受動的ワクチン接種戦略、ならびに、能動的ワクチン接種にも関連する。
【０００２】
さらに、本発明は、例えば、腫瘍組織における高まったＦＡＰ活性（具体的にはプロテアーゼ活性）によって誘発される疾患または状態を診断する方法であって、前記疾患または状態が、本発明によれば、前記疾患または状態に罹患する対象の体液（具体的には血液）における増大したレベルのＦＡＰおよびＦＡＰの特定のエピトープによってそれぞれ反映される方法に関連する。この発見はまた、治療薬剤によるＦＡＰ誘発疾患の処置をモニターする、または、候補薬剤、好ましくは抗ＦＡＰ抗体の治療有用性を明らかにする新規な方法で、ＦＡＰのレベルを、前記薬剤を対象に投与した後の対象の体液（好ましくは血液）に由来するサンプルにおいて明らかにすることを含み、コントロールと比較される前記対象の前記サンプルにおけるＦＡＰの非存在または低下したレベルにより、前記処置における進展および前記薬剤の治療有用性がそれぞれ示される方法であって、ＦＡＰのレベルがＦＡＰの特定のエピトープを検出することによって明らかにされることを特徴とする方法を開発することにつながった。
【背景技術】
【０００３】
ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ；Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＡＡＣ５１６６８；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００４４６０．３）は、セプラーゼとしてもまた知られており、１７０ｋＤａの内在性膜セリンペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．Ｂ２８）である。ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ、これはＣＤ２６としてもまた知られている；Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号Ｐ２７４８７）（近縁関係にある細胞表面酵素）および他のペプチダーゼと一緒に、ＦＡＰはジペプチジルペプチダーゼＩＶファミリーに属する（非特許文献１）。ＦＡＰは、酵素の触媒作用ドメインが位置する大きいＣ末端側の細胞外ドメインを有する２つのＮ−グリコシル化サブユニットを含有するホモ二量体である（非特許文献２）。ＦＡＰはそのグリコシル化形態において、ポストプロリルジペプチジルペプチダーゼ活性およびゼラチナーゼ活性の両方を有する（非特許文献３）。したがって、ＦＡＰは、ゼラチンおよびＩ型コラーゲンを切断する、ジペプチジルペプチダーゼ活性、ならびに、エンドペプチダーゼ活性をともに有するセリンプロテアーゼである。
【０００４】
ヒトＦＡＰは、最初は、（特許文献１に記載される）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｆ１９（ＡＴＣＣ番号ＨＢ８２６９）を使用して、培養された線維芽細胞において特定された。このタンパク質の様々なホモログが、マウスを含めて、いくつかの種において見出された（非特許文献４、非特許文献５；Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＡＡＨ１９１９０；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０３２０１２．１）。ヒトＦＡＰと、マウスＦＡＰとは、８９％の配列同一性が両者の間にはあり、類似する機能的相同性を有する。ＦＡＰは特異な組織分布を有する：その発現が、肺ガン、結腸直腸ガン、膀胱ガン、卵巣ガンおよび乳ガンを含めて、すべての原発性上皮腫瘍および転移性上皮腫瘍の９０％超の反応性間質線維芽細胞において非常にアップレギュレーションされ、一方、正常な成体組織には一般に存在しないことが見出された（非特許文献６、非特許文献７）。その後の報告により、ＦＡＰが間質線維芽細胞において発現されるだけではなく、上皮起源のいくつかのタイプの悪性細胞においてもまた発現されること、そして、ＦＡＰの発現が悪性表現型と直接に相関することが示された（非特許文献８）。
【０００５】
多くの一般的なガンにおけるその発現および正常な組織におけるその限定された発現のために、ＦＡＰは、様々なガン腫の画像化、診断および治療のための有望な抗原性標的であると見なされている。したがって、多数のモノクローナル抗体が、検出可能な標識または細胞傷害性薬剤をＦＡＰ発現のガン腫細胞に対して標的化することをほとんど常に目的として、研究、診断および治療の様々な目的のためにＦＡＰに対して惹起されている。例えば、シブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）／ＢＩＢＨＩ、すなわち、阻害性ではないが、ヒトＦＡＰに特異的に結合する（特許文献２に記載される）Ｆ１９抗体のヒト化型、および、Ｆ１９エピトープ特異性を有するＦＡＰ抗原に対するさらなるヒト化抗体またはヒト様抗体（非特許文献９、非特許文献１０および特許文献３に記載される）が、ファージディスプレー技術およびヒトＶレパートリーを使用して開発された。この場合、Ｆ１９のＶＬ領域およびＶＨ領域が、Ｆ１９エピトープ特異性を維持するために元の１５アミノ酸長のＨＣＤＲ３配列を保持しながら、類似のヒトＶ領域によって置き換えられたか、あるいは、Ｆ１９抗体が、元のマウス抗体と同じエピトープまたは近縁エピトープを認識するｓｃＦｖを選択するために指針として使用されている。ＯＳ４抗体が、Ｆ１９抗体の別のヒト化（ＣＤＲグラフト化）型であり（非特許文献１１）、一方、ｓｃＦｖ３３およびｓｃＦｖ３６は、Ｆ１９とは異なる結合特異性を有し、ヒトおよびマウスのＦＡＰタンパク質について交差反応性である（非特許文献１２）。他のマウス抗ＦＡＰ抗体、ならびに、それらのキメラ型およびヒト化型が開発された（特許文献４、非特許文献１３）。加えて、ヒト様の抗ＦＡＰ抗体、すなわち、ファージディスプレー技術を使用するＦａｂフラグメントが記載された（特許文献５）。この場合、選択が、ヒトＦＡＰまたはマウスＦＡＰの細胞外ドメインに対して行われた。
【０００６】
腫瘍間質におけるプロテアーゼは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のタンパク質分解を介して、様々なプロセス（例えば、血管形成および／または腫瘍細胞遊走など）を促進させる。そのうえ、腫瘍間質は、重要な役割を腫瘍の栄養供給および酸素供給において、ならびに、腫瘍の侵入および転移において果たしている。これらの本質的な機能により、ＦＡＰは、診断標的だけではなく、潜在的な治療標的にもなっている。抗ＦＡＰ抗体を使用する生体内腫瘍間質標的化の概念の実現可能性のための証拠が、１３１−ヨウ素で標識されたＦ１９抗体によるフェーズ１臨床研究で得られ、この臨床研究では、腫瘍における当該抗体の特異的な集積および転移物の特異的な検出が明らかにされた（非特許文献１４）。同様に、シブロツズマブによるフェーズ１研究では、１３１Ｉ標識された抗体の特異的な腫瘍蓄積が明らかにされた（非特許文献１５）。しかしながら、転移性結腸直腸ガンの患者における非コンジュゲート化シブロツズマブの初期フェーズＩＩ治験が、腫瘍進行を阻害することにおける当該抗体の効力が不十分であるために中断された（非特許文献１６）。加えて、２６名のシブロツズマブ処置患者のうちの８名がヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）を発達させ、薬物動態学における変化および低下した腫瘍取り込みが２６名の患者のうちの４名で認められた（非特許文献１４）。また、より近年に開発された抗ＦＡＰ抗体は、抗腫瘍効果を非コンジュゲート化形態においてインビボで示すことができなかった（特許文献４）。
【０００７】
より近年には、再びファージディスプレー技術を使用して、ＦＡＰに対する３回のパンニングの後の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）から、非機能的なｓｖＦｖコントロールと比較して、蛍光性基質Ａｌａ−Ｐｒｏ−７−アミド−４−トリフルオロメチルクマリンのＦＡＰ切断の３５％を弱めることができ、１．５桁大きい親和性を示した阻害性ｓｃＦｖ抗体（Ｅ３と名づけられる）がもたらされた（非特許文献１７）。しかしながら、推定ＥＣ５０値が極めて低く、すなわち、約２×１０−７ＭのｋＤを有し、ＦＡＰ酵素活性のほんのおよそ３５％の阻害が１７．８５μＭ（１００μｇ）のＥ３において認められただけであり、酵母親和性成熟化の後でさえ、最も良好な変異体は単に、Ｅ３よりも４倍および３倍大きい親和性（４倍）およびＦＡＰ酵素活性に対する高まった阻害効果をそれぞれ示しただけであった。したがって、かなり低い親和性および阻害効果の両方を考慮すると、このｓｃＦｖ自体の治療有用性は期待されないかもしれない。それどころか、著者らは、このｓｃＦｖそのものまたはその派生ＩｇＧはそれにもかかわらず、ＦＡＰ陽性の腫瘍間質のインビボ標的化を調べるための有用な臨床試薬であるかもしれないと結論した。ＦＡＰ標的化に関する報告を考慮すると、今までのところ、大きい親和性と、ＦＡＰのプロテアーゼ活性に対する顕著な阻害効果とを有する抗ＦＡＰ抗体を開発することは実現可能でないかのように思える。
【０００８】
別のＦＡＰ標的化薬物が、Ｐｏｉｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって開発されるタラボスタット（Ｔａｌａｂｏｓｔａｔ）である。タラボスタット（これはＰＴ−１００またはＶａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏとしてもまた知られている）、すなわち、プロリルボロン酸は、元々はＤＰＰＩＶ阻害剤として開発されたものであり、ＦＡＰ、ＤＰＰ８、ＤＰＰ９およびＰＯＰ／ＰＲＥＰもまた阻害することが示されている。転移性ガンの実験的処置の検討から、タラボスタットがまた、ＦＡＰ、および、結果としてガン成長を阻害するために有用であり得るという可能性が生じた（非特許文献１８、非特許文献１９）。タラボスタットはまた、阻害活性を水性媒体（ｐＨ７．８）では環化のために急速に失う（非特許文献２０）。この制限にもかかわらず、Ｖａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏ処置が、ガン患者を処置するために数日間にわたって使用されたとき、Ｍｅｔ−ａ２ＡＰ／Ａｓｎ−ａ２ＡＰ比がヒトにおいて有意に増大し、このことから、この薬物療法により、ＦＡＰ活性がある程度阻害されることが示唆された（非特許文献２１）。
【０００９】
転移性結腸直腸ガンの患者において、タラボスタットが、１日に２回での２００ｍｇでＰＯ投与された。１，２００μｇが、元気な患者におけるタラボスタットの最大耐量であるという報告（非特許文献２２）にもかかわらず、治験は、Ｖａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏが、１日に２回で服用される４００μｇ（８００μｇの１日総量）で経口により与えられる患者により開始された。しかしながら、３名の患者を登録した後、おそらくはＶａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏに関連づけられると考えられるが、３番目の患者が腎不全で死亡し、最初の２名の患者が穏やかな毒性（浮腫、発熱）を示したとき、１日に２回での２００μｇ（４００μｇの１日総量）のプロトコルが修正された。Ｉ度を超える非血液学的毒性を何ら示さなかった場合、４週間の処置の後で、１日に２回での３００μｇ（６００μｇの１日総量）への１回の患者内用量増加が許された。したがって、用量を制限する毒性のために、４００μｇ〜６００μｇの間の１日用量が評価された。
【００１０】
４００μｇ〜６００μｇの１日総量のこの服用療法では、タラボスタットはおよそ９５％の血漿ジペプチジルペプチダーゼ活性（ほとんどの場合、ＦＡＰおよびＤＰＰＩＶの組合せ）を阻害し、しかし、ほんのおよそ１８％のポストプロリン特異的エンドペプチダーゼ（ほとんどの場合にはＦＡＰ特異的な）活性を阻害しただけであり、このことは、ＦＡＰが効果的に阻害されなかったことを示唆した。より高い濃度のエクスビボで加えられたタラボスタット（１０μＭ）はＦＡＰ特異的活性の７５％のさらなる阻害をもたらし、このことから、血漿ＦＡＰ活性のほんの一部がこれらの患者において阻害されたことが明らかにされた。これらのデータはまた、腫瘍におけるＦＡＰ活性がわずかに阻害されたことを示唆する。したがって、タラボスタット研究の臨床結果はＦＡＰ阻害そのものに起因するのではなく、むしろ、臨床効果は大部分が、標的以外への結合と、ＤＰＰＩＶ、ＤＰＰ８およびＤＰＰ９の阻害とに起因したことが明白である（非特許文献１９）。
【００１１】
Ｖａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏはまた、ジペプチジルペプチダーゼ（例えば、ＤＰＰＩＶ、ＤＰＰ８、ＤＰＰ９など）およびプロリルオピゴペプチダーゼ（ｐｒｏｌｙｌｏｐｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）（ＰＯＰ）を阻害し、サイトカイン活性およびケモカイン活性をアップレギュレーションした（非特許文献１９）。これらの患者において報告される用量制限毒性は主に、重度の副作用を動物治験においてもたらす細胞質のＤＰＰ８およびＤＰＰ９の阻害のためであると考えられるサイトカイン作用と一致していた。ラットにおいて、ＤＰＰ８／９の阻害は、脱毛症、血小板減少症、網状赤血球減少症、肥大膵臓、多臓器組織学的変化および死亡をもたらした。イヌにおいて、ＤＰＰ８／９の阻害は胃腸毒性をもたらした（非特許文献２３）。しかしながら、ＤＰＰＩＶの阻害は、動物およびヒトにおいて安全であることが示されている（非特許文献２４）。
【００１２】
Ｖａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏ処置のための臨床エンドポイントは、上皮ガンの患者を処置することにおいて満たされなかったが、この単剤研究は、ＦＡＰ阻害の薬力学的影響を調べることを可能にし、したがって、インビボにおけるＦＡＰ酵素活性に対するＶａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏの影響に関する有益な情報を提供することを可能にした（非特許文献１９）。ＦＡＰ酵素活性が、ＤＰＰ−ＩＶのようなエキソペプチダーゼによって切断され得ないエンドペプチダーゼ基質を使用してＶａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏ処置の前および期間中の患者血漿サンプルで分析された。ＦＡＰ選択的な酵素活性が、処置前のレベルと比較して処置の期間中には低下し、このことは、Ｖａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏがＦＡＰの酵素活性をインビボで阻害し得ることを示していた。しかしながら、ＦＡＰの阻害は、推定されたＦＡＰ酵素活性のほんのおよそ２０％が阻止されたので、利用された用量では部分的にすぎなかった。エクスビボでのより高い濃度のＶａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏ（１０μＭ）は、推定されたＦＡＰ活性の６０％のさらなる阻害をもたらした。しかしながら、これらの濃度は、より大きい用量でのこの薬剤により認められる臨床毒性を考えた場合、患者において達成することが困難である。したがって、Ｖａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏによる堅固かつ強力なＤＰＰエキソペプチダーゼ阻害は認められが、ＦＡＰエンドペプチダーゼ酵素活性のほんの部分的な阻害が達成されただけであった。ＦＡＰのこの部分的な阻害が、Ｖａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏ処置により認められる最小限の臨床活性を説明する別の寄与因子であるかもしれない。他のジペプチジルペプチダーゼ酵素（例えば、細胞質ゾルのＤＰＰ８およびＤＰＰ９）の阻害によって媒介されるサイトカイン毒性をＦＡＰ阻害から切り離す新しい化合物が、ＦＡＰを腫瘍間質において最大限に阻害するために好都合であるかもしれない。そのような治療剤は、改善された臨床効力を、より小さい毒性を伴ってもたらすかもしれない。これは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が、タラボスタットの臨床計画を、転移性の非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）の患者における化学療法との併用でのタラボスタットの２件のフェーズ３研究の中間解析の結果として臨床試験差し止めにしたからであった（非特許文献２５）。
【００１３】
ＦＡＰを小分子阻害剤ＰＴ−６３０により阻害すること、および、遺伝子ノックアウトにより、ＮＳＣＬＣおよびＭＣＲＣにおける腫瘍成長が、間質生成（ｓｔｒｏｍａｇｅｎｅｓｉｓ）、血管新生およびＥＣＭ再構成に対する影響を介して間接的に無効にされ得るという概念実証が、マウスモデルにおいて示されている（非特許文献２６）。しかしながら、ＰＴ−６３０はまた、ＤＰＰＰＩＶ、ＤＰＰ８およびＤＰＰ９を阻害し、一方で、環化に起因する不良なインビボ安定性を同時に示す。
【００１４】
小分子のＦＡＰ阻害剤「阻害剤６」がＭｅｔ−α２ＡＰからＡｓｎ−α２ＡＰへのＦＡＰによるタンパク質分解的転換を用量応答様式で低下させ、生じる増大したＭｅｔ−α２ＡＰ／Ａｓｎ−α２ＡＰ比が、ヒト血漿から作製されるフィブリンについての短縮された溶解時間に対応するという概念実証もまた示されている。ＦＡＰ阻害（Ｍｅｔ−α２ＡＰ転換の停止）が、増大した溶解をもたらすことが明らかにされた。しかしながら、「阻害剤６」は、ＰＯＰ／ＰＲＥＰに対して選択的ではなかった。この阻害剤のこの制限にもかかわらず、刊行物では、インビボでの正常なタンパク質代謝回転の存在下においてＦＡＰ阻害剤に持続してさらされることにより、究極的には、すべてのα２ＡＰがＭｅｔ−α２ＡＰに変わり、このＭｅｔ−α２ＡＰは、最大レベルで維持されるならば、誘導体のＡｓｎ−α２ＡＰよりもはるかに遅くフィブリンに架橋されるであろうと結論された。機能的に損なわれたα２ＡＰについてヘテロ接合性である人では生来的にまさに生じるように、増大したフィブリン溶解の類似する長期状態を、出血の有意な危険性を伴うことなく模倣し、したがって、潜在的な治療的利益を、慢性進行性血管内フィブリン沈着についての危険性が大きい人に与えることが可能であるかもしれないことが結論された（非特許文献２７）。
【００１５】
いわゆる化合物６０は、有望な生化学的特徴がＦＡＰ選択性および薬物動態学に関連して前臨床試験において明らかにされている新規な小分子ＦＡＰ阻害剤である（非特許文献２８）。しかしながら、重要なことに、構造的に類似する分子の「化合物４」（図Ａ２）は、５ｍｇ／ｋｇ（ｉｖ）で注入されたとき、ラットが６時間で死亡し、したがって、安全性がヒトでは懸念事項であるかもしれない。化合物６０に関する別の懸念事項が、ＰＲＥＰに対するＩＣ５０値（１．８μＭ）およびＤＰＰ９に対するＩＣ５０値（１２．５μＭ）である。これらの比較的小さいＩＣ５０値は、化合物６についてのＣｍａｘが、（ＤＰＰ９阻害が毒性であると見なされる）これらのホモログの阻害を防止するためにはサブμＭ範囲にあることを必要とするであろうことを示し、また、十分な薬物が、依然としてサブμＭ範囲にある薬物療法のためのＣｍａｘとともに、ＦＡＰを阻止するために全身に送達され得るかもまた、今後検討されなければならない（非特許文献２８）。
【００１６】
抗体の次に、ＦＡＰに伴う疾患を処置するための、特にガンを処置するためのさらなる免疫療法取り組みには、ＦＡＰ抗原に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）により形質導入された改変Ｔ細胞の養子移入が含まれる。
【００１７】
ＣＡＲは典型的には、意図された標的領域について特異的である抗体に由来する単鎖可変フラグメントから構成される細胞外の抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、Ｔ細胞特異的な細胞内のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζドメインなど）とを含有し、加えて、４−１ＢＢ共刺激ドメインまたはＣＤ２８共刺激ドメインを含有する場合がある遺伝子操作された融合タンパク質である。構造、作用機構、応用などに関する詳細が、様々な文献において、例えば、下記の文献においてまとめられている：非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３３。
【００１８】
抗ＦＡＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に関する概念実証が、例えば、非特許文献３４、非特許文献３５、非特許文献３６、非特許文献３７に、ならびに、特許文献６に記載されている。非特許文献３４によって使用される、ヒトＦＡＰおよびマウスＦＡＰを標的とするＦＡＰ−５モノクローナル抗体の結合ドメインを含む抗ＦＡＰ  ＣＡＲマウスＴ細胞は、ほんの限定された抗腫瘍効力を示すだけであった。非特許文献３５において、モノクローナル抗体Ｆ１９の結合ドメインを含むＣＡＲが様々なマウスモデルにおいて分析されている。しかしながら、このＦ１９抗体はマウスＦＡＰと交差反応しないので、抗腫瘍効力は評価されていない。さらには、非特許文献３６は、抗ヒト／抗マウスＦＡＰモノクローナル抗体の結合ドメインを含む抗ＦＡＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を免疫不全マウスモデルにおいて使用して、抗腫瘍効力を示すことができた。同様に、非特許文献３７は、腫瘍を促進させる間質細胞を標的とする、マウスＦＡＰについて特異的であるＣＡＲ構築物を、対応するＣＡＲ  Ｔ細胞を使用して開発した。特許文献６において、非特許文献３５と同様に、マウス抗ＦＡＰ抗体または言及されたＦ１９抗体のどちらかの結合ドメインを含むＣＡＲが構築され、分析されている。
【００１９】
上記を考慮すると、今までのところ、ヒト臨床試験で今までに評価されたＦＡＰ標的化薬物療法は、いくつかの難点に、例えば、非選択的であること、および、短い生物学的半減期を有すること（例えば、タラボスタットなど）に悩まされており、または、ＦＡＰと特異的に結合することができるにもかかわらず、治療効果を有しておらず、また、ヒトにおいて免疫原性である（例えば、シブロツズマブおよび他のＦ１９系の抗ＦＡＰ抗体など）。加えて、臨床研究におけるＰＴ−１００およびシブロツズマブの両方の以前の評価では、ある特定の成績評価基準が、ＦＡＰ標的化薬物療法が所望の治療効果を有するためには必要であることが示唆される。抗ＦＡＰ  ＣＡＲの場合、それらは主に、マウスＦＡＰを標的とする抗体に基づいて、または、上述の難点に悩まされるマウスモノクローナルＦ１９抗体に基づいて開発されてきた。
【００２０】
したがって、ヒトにおいて許容可能であり、ＦＡＰに伴う疾患を処置するために効果的であるＦＡＰ結合分子、ＦＡＰ選択的阻害剤、ならびに、ＦＡＰに対するＣＡＲが求められており、同様にまた、ＦＡＰによって引き起こされる疾患およびＦＡＰに伴う疾患のための信頼できる診断アッセイで、そのような疾患に罹患する患者がＦＡＰ標的化治療に適するか否かを示す診断アッセイが求められている。
【００２１】
上記の技術的課題が、請求項において特徴づけられ、また、下記においてさらに記載され、また、実施例および図面において例示される実施形態によって解決される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】国際公開ＷＯ９３／０５８０４
【特許文献２】国際特許出願公開ＷＯ９９／５７１５１
【特許文献３】国際特許出願公開ＷＯ０１／６８７０８
【特許文献４】国際特許出願公開ＷＯ２００７／０７７１７３
【特許文献５】国際特許出願公開ＷＯ２０１２／０２０００６
【特許文献６】国際公開ＷＯ２０１４０５５４４２（Ａ２）
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Ｙｕ他、ＦＥＢＳ  Ｊ．２７７（２０１０）、１１２６〜１１４４
【非特許文献２】Ｓｃａｎｌａｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１９９４）、５６５７〜５６６１
【非特許文献３】Ｓｕｎ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２４（２００２）、２７４〜２８１
【非特許文献４】Ｎｉｅｄｅｒｍｅｙｅｒ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７１、３８３〜３８９（１９９７）
【非特許文献５】Ｎｉｅｄｅｒｍｅｙｅｒ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４、６５０〜６５４（１９９８）
【非特許文献６】Ｒｅｔｔｉｇ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１９８８）、３１１０〜３１１４
【非特許文献７】Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７（１９９０）、７２３５〜７２３９
【非特許文献８】Ｊｉｎ他、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２３（２００３）、３１９５〜３１９８
【非特許文献９】Ｍｅｒｓｍａｎｎ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９２（２００１）、２４０〜１０２４８
【非特許文献１０】Ｓｃｈｍｉｄｔ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８（２００１）、１７３０〜１７３８
【非特許文献１１】Ｗｕｅｓｔ他、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．９２（２００１）、１５９〜１６８
【非特許文献１２】Ｂｒａｃｋｓ他、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７（２００１）、４６１〜４６９
【非特許文献１３】Ｏｓｔｅｒｍａｎｎ他、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１４（２００８）、４５８４〜４５９２
【非特許文献１４】Ｗｅｌｔ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２（１９９４）、１１９３〜１２０３
【非特許文献１５】Ｓｃｏｔｔ他、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９、１６３９〜１６４７（２００３）
【非特許文献１６】Ｈｏｆｈｅｉｎｚ他、Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ  ２６（２００３）、４４〜４８
【非特許文献１７】Ｚｈａｎｇ他、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２７（２０１３）、５８１〜５８９
【非特許文献１８】Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ．１６（２００７）、１４５９〜１４６５
【非特許文献１９】Ｎａｒｒａ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６（２００７）、１６９１〜１６９９
【非特許文献２０】Ｋｅｌｌｙ他、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １１５（１９９３）、１２６３７〜１２６３８
【非特許文献２１】Ｌｅｅ他、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、９（２０１１）、９８７〜９９６
【非特許文献２２】ＵｐｒｉｃｈａｒｄおよびＪｏｎｅｓ、ＡＳＨ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ、１０４（２００４）、４２１５
【非特許文献２３】Ｌａｎｋａｓ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４（２００５）、２９８８〜２９９
【非特許文献２４】Ｎａｕｃｋ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ．２０１４、印刷前でのオンライン発表（２０１４年４月１７日）、ｄｏｉ：１０．２３３７／ｄｃ１３−２７６
【非特許文献２５】Ｎａｒｒａ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６（２００７）、１６９１〜１６９９
【非特許文献２６】Ｓａｎｔｏｓ他、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１９（２００９）、３６１３〜３６２５
【非特許文献２７】Ｌｅｅ他、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ９（２０１１）、１２６８〜１２６９
【非特許文献２８】Ｊａｎｓｅｎ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５７（２０１４）、３０５３〜３０７４
【非特許文献２９】ＭａｕｓおよびＪｕｎｅ、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２２（２０１６）、１８７５〜１８８４
【非特許文献３０】Ｚｈａｎｇ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１（２０１５）、４３〜４９
【非特許文献３１】Ｄａｉ他、ＪＮＣＩ  Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１０８（２０１６）
【非特許文献３２】Ｒｏｄｇｅｒｓ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１３（２０１６）、Ｅ４５９〜６８
【非特許文献３３】Ｂｒｏｗｅｒ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  Ｍａｇａｚｉｎｅ（登録商標）、２０１５年４月号
【非特許文献３４】Ｔｒａｎ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２１０（２０１３）、１１２５〜１１３５
【非特許文献３５】Ｓｃｈｕｂｅｒｔｈ他（Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１１（２０１３）、１８７
【非特許文献３６】Ｋａｋａｒｌａ他（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１（２０１３）、１６１１〜１６２０
【非特許文献３７】Ｗａｎｇ他（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２（２０１４）、１５４〜１６６
【発明の概要】
【００２４】
本発明は、ヒト医薬品および／または獣医学医薬品として有用である、特に、ＦＡＰ関連障害（例えば、限定されないが、増殖性障害など）の処置および／または防止のために有用である線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）抗体、対応するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびそれらに同等なＦＡＰ結合薬剤を提供する。より具体的には、ヒトＦＡＰおよび／またはそのフラグメントを認識する治療的に有用なヒト由来の組換え抗体、ならびに、そのフラグメントおよび誘導体が提供される。
【００２５】
したがって、本発明は、下記の項［１］などのいずれか一項に記載される実施形態に関連し、ただし、そのような実施形態は本発明の詳細な説明においてさらに開示されており、かつ／または、ＦＡＰ特異的薬物（例えば、背景の節で引用される文書を含む本明細書中で参照される文書に記載される、または、他の場合には当業者に知られている抗ＦＡＰ抗体、およびヒトＦＡＰに対するＣＡＲなど）について記載される適用および実施形態により補われることがある：
［１］ヒトメモリーＢ細胞由来の抗線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）モノクローナル抗体。
【００２６】
添付された実施例において例示されるように、本発明に従って行われた実験では、ＦＡＰ特異的モノクローナル抗体をヒトメモリーＢ細胞から単離することに成功した。今まで、ＦＡＰに対する自己抗体の存在は報告されていなかったので、このことは驚くべきことである。加えて、ガン腫に罹患する患者の血清におけるＦＡＰのレベルおよび意味に関して意見の分かれる様々な報告は、第１に、既存の抗ＦＡＰ自己抗体およびメモリーＢ細胞の可能性が最初に調べられていなかったことの理由であるかもしれない。
【００２７】
ヒト起源であるために、すなわち、メモリーＢ細胞に由来し、したがって、「ヒト様」抗体（例えば、ファージディスプレーまたはＸｅｎｏ−Ｍｏｕｓｅによって作製されるヒト様抗体など）に反して、ヒト身体内で自己寛容について選択され、親和性成熟しているために、本発明のヒトモノクローナル抗ＦＡＰ抗体およびその誘導体がヒトにおいて非免疫原性であり、かつ、インビボでの治療および／または診断使用において有用であることを予想することは、無理のないことである。したがって、本発明は、ＦＡＰを特異的に認識することができるヒト由来の組換え抗体ならびにその生物工学誘導体および合成誘導体、そして同等なＦＡＰ結合性分子に関する。別途示されないならば、「ＦＡＰを特異的に認識する抗体」、「ＦＡＰに対して／ついて特異的な抗体」および「抗ＦＡＰ抗体」によって、特異的に、全般的に、また集団的にＦＡＰに結合し、しかし、ＦＡＰホモログ（例えば、ＤＰＰＩＶ、ＤＰＰ８、ＤＰＰ９およびＰＯＰ／ＰＲＥＰ）には実質的に結合しない抗体が意味される；実施例６および図７を参照のこと。
【００２８】
［２］抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ならびに／あるいは可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）の少なくとも１つが、抗ＦＡＰ抗体を産生したヒトメモリーＢ細胞から得られるｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡによって得られコードされる、［１］に記載の抗体。
【００２９】
この技術分野では知られているように、所与の抗体の結合特異性および結合親和性を保持するために、同族抗体は、ただ１つの元のＣＤＲ領域を除いて、特に、国際特許出願公開ＷＯ０１／６８７０８およびＭｅｒｓｍａｎｎ（上掲）に記載されるようなＣＤＲＨ３を除いて、元のヒト抗体の６つすべてのＣＤＲ領域を含有することは必要でない。さらには、元のヒトモノクローナル抗体のＣＤＲの１つまたは複数を保持することによって、本発明の抗ＦＡＰ抗体、および、そのようなＣＤＲを含有する同等なＦＡＰ結合性分子は好都合には、マウスモノクローナル抗体から操作されるどのような抗ＦＡＰ抗体よりも小さい異種抗原性能力を有する。同じことが、「ヒト様」抗体（例えば、ファージディスプレーまたはＸｅｎｏ−Ｍｏｕｓｅによって作製されるヒト様抗体など）について当てはまる。これは、述べられたように、ｓｃＦｖ、Ｆａｂフラグメントおよび抗体はそれぞれ、依然として人為的であり、ヒト身体にとって外来であり、そのため、それらは依然として免疫原性であり、抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を誘導することが知られているからである。抗ＦＡＰ抗体Ｆ１９と同等な抗体（上掲）を、ＣＤＲＨ３を保持する誘導された選択方法によって調製するためのプロセスが、国際特許出願公開ＷＯ０１／６８７０８に記載されており、このプロセスは、実施例において例示される本発明のヒト由来のモノクローナルな抗ＦＡＰ抗体に対して適合化される場合がある。
【００３０】
［３］捕捉された、または直接に被覆されたヒトＦＡＰおよび／またはそのフラグメント（３７８−ＨＹＩＫＤＴＶＥＮＡＩＱＩＴＳ−３９２（配列番号２７）、６２２−ＧＷＳＹＧＧＹＶＳＳＬＡＬＡＳ−６３６（配列番号２８）および７２１−ＱＶＤＦＱＡＭＷＹＳＤＱＮＨＧＬ−７３６（配列番号２９））に０．１μＭ以下のＥＣ５０により結合することができる、［１］または［２］に記載の抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体。
【００３１】
実施例１において例示され、また、図２に示されるように、本発明の抗体は、ヒトＦＡＰに対する結合親和性、 すなわち、非線形回帰によってナノモル濃度およびサブナノモル濃度の範囲で求められるようなＥＣ５０値を示す。したがって、好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ抗体は、捕捉されたＦＡＰ（ｓＦＡＰ）に対する、１０ｎＭ下のＥＣ５０による親和性によりヒトＦＡＰと結合し、より好ましくは、捕捉されたＦＡＰ（ｓＦＡＰ）に対する、１ｎＭ以下のＥＣ５０による親和性によりヒトＦＡＰと結合し、最も好ましくは、捕捉されたＦＡＰ（ｓＦＡＰ）に対する、０．１ｎＭ以下のＥＣ５０による親和性によりヒトＦＡＰと結合する。加えて、または代替において、本発明の抗ＦＡＰ抗体は、直接に被覆されたＦＡＰ（ＦＡＰ）に対する、１０ｎＭ以下のＥＣ５０による親和性により、より好ましくは１ｎＭ以下のＥＣ５０による親和性により、最も好ましくは０．１ｎＭ以下のＥＣ５０による親和性によりヒトＦＡＰと結合する。なおさらなる実施形態において、本発明の抗ＦＡＰ抗体はさらに、または代替において、図２（Ｋ）の説明文で示される様々なＦＡＰフラグメントの直接に被覆された混合物（ｃＦＡＰ）に、１０ｎＭ以下のＥＣ５０により結合し、より好ましくは５ｎＭ以下のＥＣ５０により結合する。候補の抗ＦＡＰ抗体の結合特異性およびＥＣ５０値が、様々な方法によって、例えば、この技術分野では広く知られている直接的ＥＬＩＳＡ、好ましくは実施例において例示されるような直接的ＥＬＩＳＡなどによって求められる場合がある。加えて、または代替において、実施例および図において例示される主題抗体のいずれか１つが、ＦＡＰ結合競合アッセイにおいて参照抗体として使用される場合がある；例えば、国際特許出願公開ＷＯ０１／６８７０８、同ＷＯ２０１１／０４０９７２および同ＷＯ２０１２／０２０００６、ならびに、さらに下記の説明を参照のこと。
【００３２】
大きい親和性および特異性のほかに、主題の抗ＦＡＰ抗体は好ましくは、ヒトガン腫組織、ヒトの乳ガン組織、結腸直腸ガン組織、（マウスの）骨髄腫組織および腫瘍間質、ならびに、冠状動脈血栓および／またはアテローム斑を標的とするその能力によって特徴づけられる；実施例８〜実施例１２および実施例１８、ならびに、対応する図９〜図１４および図２４を参照のこと。
【００３３】
したがって、ＦＡＰに対するその大きい親和性、そして、ＦＡＰ陽性のガン腫細胞およびガン腫組織、冠状動脈血栓およびアテローム斑と結合するその特異性のために、本発明の抗ＦＡＰ抗体およびそれに同等なＦＡＰ結合薬剤は、抗ＦＡＰ抗体（例えば、Ｆ１９およびシブロツズマブなど）についてこれまでに記載された治療状況および診断状況のために特に適しており、例えば、ＦＡＰ発現腫瘍を有する患者における診断使用および治療使用のための強力な放射免疫コンジュゲート、インビボ画像化剤または抗体−薬物コンジュゲートとして特に適する；例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ他、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５（２０１２）、６２０８〜６０１８に記載されるメラノーマ異種移植ヌードマウスモデルにおける、ヒトＦＡＰおよびマウスＦＡＰに結合し、かつ、β放射する放射性核種の（１７７）Ｌｕにより標識される完全ヒトＩｇＧ１抗体に操作された抗体ファージライブラリー由来のヒト様Ｆａｂフラグメント（ＥＳＣ１１およびＥＳＣ１４）の生体分布および治療効果を参照のこと。
【００３４】
［４］１５アミノ酸長のペプチドに含まれるＦＡＰエピトープと結合することができ、前記エピトープは下記のアミノ酸配列を含む、または下記のアミノ酸配列からなる、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体：
ＮＩ−２０６−１８Ｈ２（５０１−ＩＱＬＰＫＥＥＩＫＫＬ−５１１）（配列番号６０）
ＮＩ−２０６．８２Ｃ２（５２１−ＫＭＩＬＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰ−５３５（配列番号３０）；５２５−ＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰＬＬＩＱ−５３９（配列番号３１）；５２５−ＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰ−５３５（配列番号３２）；および／または１１３−ＹＬＥＳＤＹＳＫＬＷＲ−１２３（配列番号６１））；
ＮＩ−２０６．５９Ｂ４（５３−ＳＹＫＴＦＦＰ−５９（配列番号３３））；
ＮＩ−２０６．２２Ｆ７（３８１−ＫＤＴＶＥＮＡＩＱＩＴ−３９１（配列番号３４））；
ＮＩ−２０６．２７Ｅ８（１６９−ＮＩＹＬＫＱＲ−１７５（配列番号３５））；
ＮＩ−２０６．１２Ｇ４（４８１−ＴＤＱＥＩＫＩＬＥＥＮＫＥＬＥ−４９５（配列番号３６））；または
ＮＩ−２０６．１７Ａ６（７７−ＶＬＹＮＩＥＴＧＱＳＹ−８７（配列番号３７））。
【００３５】
実施例３に記載されるように、結合アッセイが、本発明の抗体の結合エピトープを決定するために行われている。例えば、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２について、これは、アミノ酸配列５０１−ＩＱＬＰＫＥＥＩＫＫＬ−５１１（配列番号６０）に対応するペプチドを認識することが示されている；図４Ｃを参照のこと。さらには、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２の最小エピトープ領域が、合成され、ニトロセルロースメンブランにスポットされた、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２のエピトープを包含するＦＡＰのアミノ酸５２１〜アミノ酸５３９からなるペプチドフラグメントのＮ末端およびＣ末端からの段階的短縮化ペプチド（この場合、スポット２１が全長ペプチドに対応し、スポット２２〜スポット３３がＣ末端からの段階的な１アミノ酸短縮化形態に対応し、スポット３４〜スポット４５がＮ末端からの段階的な１アミノ酸短縮化形態に対応する）によって特定された、このニトロセルロースメンブランから、抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２が、ＦＡＰにおける配列５２８−ＦＤＲＳＫ−５３２（配列番号３９）に対応するスポット２１〜スポット２８およびスポット３４〜スポット４１を認識することが明らかにされた；図２６を参照のこと。さらに、述べられたＦＡＰフラグメント５２１−ＫＭＩＬＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰＬＬＩＱ−５３９（配列番号３８）におけるアミノ酸を１つずつ、アラニンに逐次的に変異させたことに起因して、ＦＡＰのＤ−５２９およびＫ−５３２のアミノ酸が、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２結合のために必須であることが特定された；図２７を参照のこと。したがって、ある抗ＦＡＰ抗体が抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２に由来するか否か、また、抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２と同等であるか否かがそれぞれ、所与の候補抗体が、実施例３において抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２について記載されるのと実質的に同じ結合特徴（すなわち、ＦＡＰのアミノ酸５２８−ＦＤＲＳＫ−５３２のコアエピトープ、ならびに／あるいは、結合のためのＦＡＰの重要なアミノ酸（Ｄ−５２９およびＫ−５３２）の一方または両方）を示すかどうかを明らかにすることによって特定されるかもしれない。これらの特徴の評価を好ましくは、本出願の実施例に従って行うことができる。同様に、本明細書中に開示される他の抗体のいずれかに由来する抗ＦＡＰ抗体、および、本明細書中に開示される他の抗体のいずれかと同等な抗ＦＡＰ抗体、例えば、抗体ＮＩ−２０６．１８Ｈ２が、所与の候補抗体が実質的に同じ結合特徴を示し、かつ、例えば、配列番号６０のアミノ酸配列を有する同族エピトープと結合することについてこの例示的抗体と競合するかどうかを明らかにすることによって特定される場合がある。
【００３６】
［５］ＦＡＰのプロテアーゼ活性を阻害することができ、好ましくは、プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）基質であるＮ−カルボベンゾキシ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−７−アミド−４−メチルクマリン（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ）または直接的クエンチドゼラチン（ＤＱ−ゼラチン）の組換えヒトＦＡＰ（ｒｈｕＦＡＰ）媒介切断を０．１μＭ以下のＩＣ５０により阻害することができる、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体。
【００３７】
上記で述べられたように、両方を示す、すなわち、（ｉ）抗ＦＡＰ抗体に関して原理的には実現可能であるようなＦＡＰについての大きい親和性および選択性と、（ｉｉ）低分子量の擬似ペプチド基質および擬似ペプチド阻害剤（例えば、タラボスタットなど）について示されるようなＦＡＰの酵素活性に対する強力な阻害作用とを示すＦＡＰ標的化薬剤は、今までのところ提供されていない。実施例４〜実施例７および実施例１８に記載され、ならびに、図５〜図８および図２４に例示されるように、本発明は初めて、そのような薬剤、すなわち、抗ＦＡＰ抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２を提供する。そのうえ、本発明の抗ＦＡＰ抗体は、ＩｇＧタイプの抗体として提供されるときには特に、例えば、タラボスタットおよび類似する化合物よりも相当長い半減期を有することが予想され得る。これは、ヒトＩｇＧには、約２５日の半減期が典型的には伴うからである。他方で、健康な組織が照射されること、および大きいバックグラウンドをそれぞれ引き起こし得るので、長い血清半減期が、放射免疫療法または画像化などの用途のために所望されない場合、主題抗体の抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメントなど）ならびに生物工学誘導体および合成誘導体が、これらは一価であり、かつ腎クリアランスによって迅速に排出され得るので、魅力的な代替物として使用されることがある。具体的には、実施例１９に記載され、また、図２５に示されるように、非放射性で、しかし、蛍光標識された抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２は、腫瘍マウスモデルの腫瘍間質に選択的に蓄積し、また、抗体濃度が抗体注入後６時間から４８時間で動物においてピークに達し、抗体注入後６日後にはほぼゼロにまで低下することにより、動物の身体からの効率的な除去が明らかにされた。したがって、例示的抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２について明らかにされるような結合特性および生物学的性質を有する抗ＦＡＰ抗体が提供されると、様々な技術が、その生物工学誘導体および合成誘導体を調製するために、例えば、生物学的利用能および半減期の強化または低下のどちらかが、意図された使用に依存してもたらされるその生物工学誘導体および合成誘導体を調製するために当業者の思い通りになる；総説については、例えば、Ｃｈａｍｅｓ他、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １５７（２００９）、２２０〜２３３、および、Ｖｕｇｍｅｙｓｔｅｒ他、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３（２０１２）、７３〜９２を参照のこと。抗ＦＡＰ抗体のＮＩ−２０６．１８Ｈ２およびＮＩ．２０６−６Ｄ３はまた、捕捉された、または直接に被覆されたＦＡＰに特異的に結合し、他のヒト抗原には結合しないので、抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２の特徴がそのような抗体にもあると考えられるかもしれない。
【００３８】
［６］ヒト血漿の血餅形成時間を延長することができる、または、ヒト血漿の血餅堅さを低下させることができる、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体。
【００３９】
実施例１３に記載され、また、図１５に例示されるように、本発明は初めて、ヒト血漿凝固時間を延長することができ、凝固速度、血餅弾性および血餅堅さを低下させることができる抗ＦＡＰ抗体を提供する。したがって、この実施形態において、抗ＦＡＰ抗体およびそれに同等なＦＡＰ結合薬剤は抗凝固剤として有用であり、したがって、対応する障害の処置およびインビトロ使用のために好適である。したがって、本発明は概して、ＦＡＰに対する特異的な結合によって血液凝固を阻害することができ／血液凝固時間を延長することができ、凝固速度、血餅弾性および／または血餅堅さを低下させることができるモノクローナル抗体に関連する。さらに、実施例１４に記載され、また、図１６に例示されるように、ＦＡＰのヒト血漿からの免疫沈殿は、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２免疫沈殿前の血漿と比較して、得られた血漿におけるＦＡＰ基質のアルファ２抗プラスミン（α２ＡＰ−ＡＭＣ）の切断速度の有意な低下をもたらす。これらのデータにより、ＦＡＰの阻害が、血栓溶解活性を高めるための治療的取り組みを表しているかもしれないことが立証される。
【００４０】
［７］［１］〜［６］のいずれか一項に記載の抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体であって、その可変領域または結合ドメインにおいて、
（ａ）図１Ｇ〜図１Ｋおよび図１Ａ〜図１Ｆのいずれか１つに示されるＶＨ鎖アミノ酸配列および／またはＶＬ鎖アミノ酸配列の少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｂ）図１Ｇ〜図１Ｋおよび図１Ａ〜図１Ｆに示されるようなＶＨ鎖アミノ酸配列および／またはＶＬ鎖アミノ酸配列のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；あるいは
（ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含むＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖を含み、
好ましくは、前記アミノ酸配列における変化の数が５０％未満である、抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体。
【００４１】
固形腫瘍のｐＨは、増大した発酵性代謝のために酸性である。このことは、不良な灌流と一緒になって、生理学的状態（７．２〜７．４）のもとでの正常な組織と比較して、悪性腫瘍における酸性の細胞外ｐＨ（ｐＨ６．５〜６．９）をもたらす；例えば、 Ｇｉｌｌｉｅｓ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７（１９９４）、（１  Ｐｔ  １）、Ｃ１９５〜２０３；Ｓｔｕｂｂｓ他、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ  ６（２０００）、１５〜１９を参照のこと。酸性ｐＨは局所的な侵襲性成長および転移を促進させることが仮定されている。酸が侵入を媒介するという仮説では、Ｈ（＋）が近位の腫瘍微小環境から、局所的侵入を許す組織再構成が酸によって引き起こされる隣接する正常な組織に拡散することが提案される；例えば、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ他、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ５（２００３）、１３５〜１４５を参照のこと。そのような再構成はエピトープを変化させ、したがって、抗体アビディティーに影響を及ぼしさえするかもしれず、このことが、非コンジュゲート化形態における抗ＦＡＰ抗体の抗腫瘍効果の不首尾についての１つの理由であるかもしれない；国際公開ＷＯ２００７／０７７１７３（上掲）を参照のこと。対照的に、実施例１８において明らかにされ、また、図２４に例示されるように、本発明の抗ＦＡＰ抗体により、特に抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、抗体ＮＩ．２０６−５９Ｂ４、抗体ＮＩ２０６．２７Ｅ８、抗体ＮＩ２０６．１８Ｈ２および抗体ＮＩ２０６．６Ｄ３により、驚くべきことに、健康な組織の中性ｐＨにおけるより低いアビディティーと比較して、腫瘍において見出される酸性ｐＨにおける膜貫通ＦＡＰに対する増大したアビディティーが明らかにされた。ｐＨ依存的アビディティーは、ＦＡＰが健康な組織でもまた発現しているので重要であり、健康な組織への抗体結合は様々な副作用を生じさせているかもしれない。したがって、本発明の抗体は腫瘍微小環境においてＦＡＰに優先的に結合するために、より大きい治療効果が、他の組織における膜貫通ＦＡＰへの結合に伴う副作用を伴うことなく達成され得る。これらのデータにより、酸性の腫瘍微小環境の内部における（膜貫通）ＦＡＰを標的とすることができる本発明の抗ＦＡＰ抗体は悪性疾患のための効果的な治療であるに違いないことがさらに裏づけられる。
【００４２】
［８］膜貫通ＦＡＰに結合することができる、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体。
【００４３】
［９］ＦＡＰに対する結合アビディティーが中性ｐＨまたは生理学的ｐＨよりも酸性ｐＨのもとで大きく、すなわち、酸性ｐＨのもとでのＦＡＰに対する優先的な結合を示し、好ましくは、前記酸性ｐＨが６．４または６．８であり、前記生理学的ｐＨが７．４である、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体；酸性環境における膜貫通ＦＡＰに対する本発明の抗体の優先的な結合が検証され得る実施例１８および図２４もまた参照のこと。
【００４４】
対照的に、実施例１８において明らかにされ、また、図２４Ｄに例示されるように、本発明はまた、ＦＡＰに対する低下したアビディティーを中性ｐＨまたは生理学的ｐＨと比較して酸性ｐＨにおいて示すヒト抗ＦＡＰ抗体および組換えヒト由来抗ＦＡＰ抗体、具体的には抗体ＮＩ−２０６．１２Ｇ４を提供する。この特徴は、腫瘍の処置ではなく、むしろ、炎症性疾患または心臓血管疾患（ただし、ＦＡＰおよびＦＡＰ発現細胞が中性ｐＨの環境に存在するかもしれない）に伴うＦＡＰの腫瘍標的化が意図されるときには好都合であるかもしれない。
【００４５】
［１０］ＦＡＰに対する結合アビディティーが中性ｐＨまたは生理学的ｐＨよりも酸性ｐＨのもとで小さく、好ましくは、前記酸性ｐＨが６．４または６．８であり、前記生理学的ｐＨが７．４である、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体；中性環境における膜貫通ＦＡＰに対する本発明の抗体の優先的な結合が検証され得る実施例１８および図２４Ｄもまた参照のこと。
【００４６】
前述の通り、好ましくは本発明の抗ＦＡＰ抗体は組換え抗体であり、この場合、可変重鎖および／または可変軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、好ましくは２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、または、より好ましくは３つすべての相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに／あるいは、実質的には可変領域全体が、抗ＦＡＰ抗体を産生したヒトメモリーＢ細胞から得られるｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡによってコードされる。好ましい実施形態において、本発明の抗ＦＡＰ抗体は、添付された実施例および図において例示される主題抗体について明らかにされるような結合特性および生物学的性質の１つまたは複数を、好ましくは、例示的抗体のＮＩ−２０６．８２Ｃ２またはＮＩ−２０６．１８Ｈ２について明らかにされるような結合特性および生物学的性質の１つまたは複数をどのような組合せでも示す。上述のＣＤＲならびにＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖のアミノ酸配列の代わりに、これらのアミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を使用することができる。しかしながら、アミノ酸配列の変化は、本発明の抗体が、以前に言及された結合特徴および生物学的活性ならびに実施例において例示される結合特徴および生物学的活性のいずれか１つを実質的に保持する範囲でのみ行うことができる。抗体が前述の活性のいずれか１つを有する限り、それぞれの活性がアミノ酸配列の変化によって増減する場合がある。変化させられるアミノ酸の数は、上述のＣＤＲのアミノ酸配列あるいはＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖のアミノ酸配列の全アミノ酸に関してそれぞれ、好ましくは５０％以下であり、より好ましくは４０％以下であり、さらにより好ましくは３０％以下であり、一層より好ましくは２０％以下であり、最も好ましくは１０％以下である。親抗体の生物工学的または合成的な誘導体および変異体を調製するための様々な手段および方法が、この技術分野では広く知られている；本明細書中に引用される文献を参照のこと、例えば、置換変異体、挿入変異体および欠失変異体；グリコシル化変異体；Ｆｃ領域変異体；システイン操作抗体変異体；ならびに、実施例において例示される主題抗体に対して等しく適用され得る抗体誘導体について、国際特許出願公開ＷＯ２０１２／０２０００６を参照のこと。本発明の特に好ましい実施形態において、抗ＦＡＰ抗体またはそのＦＡＰ結合フラグメントは、図１Ｇ〜図１Ｋおよび図１Ａ〜図１Ｆに示されるような可変領域ＶＨおよび／または可変領域ＶＬによって特徴づけられる抗体の免疫学的結合特徴を明らかにする。
【００４７】
［１１］［１］〜［９］のいずれか一項に記載の抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体であって、その可変領域または結合ドメインにおいて、
（ａ）図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｄ、図１Ｇ、図１Ｉのいずれか１つに示されるＶＨ鎖アミノ酸配列および／またはＶＬ鎖アミノ酸配列の少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｂ）図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｄ、図１Ｇ、図１Ｉに示されるようなＶＨ鎖アミノ酸配列および／またはＶＬ鎖アミノ酸配列のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；あるいは
（ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含むＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖を含み、
好ましくは、１５アミノ酸長のペプチドに含まれるＦＡＰエピトープと結合することができ、前記エピトープは、配列番号３０〜配列番号３３、配列番号３５、配列番号６０および配列番号６１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、またはそのようなアミノ酸配列からなる、抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体。
【００４８】
［１２］［１］〜［８］および［１０］のいずれか一項に記載の抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体であって、その可変領域または結合ドメインにおいて、
（ａ）図１Ｅのいずれか１つに示されるＶＨ鎖アミノ酸配列および／またはＶＬ鎖アミノ酸配列の少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｂ）図１Ｅに示されるようなＶＨ鎖アミノ酸配列および／またはＶＬ鎖アミノ酸配列のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；あるいは
（ｄ）（ｂ）の前記アミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含むＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖を含み、
好ましくは、１５アミノ酸長のペプチドに含まれるＦＡＰエピトープと結合することができ、前記エピトープは、配列番号３６のアミノ酸配列を含む、またはそのようなアミノ酸配列からなる、抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体。
【００４９】
添付された実施例において明らかにされ、また、図に例示されるように、独特の結合特性および生物学的性質によって特徴づけられる１つの抗ＦＡＰ抗体（ＮＩ−２０６．８２Ｃ２）が提供される。したがって、この実施形態において、本発明の抗体は好ましくは、
（ｉ）ＦＡＰのプロテアーゼ活性を阻害することができること、
（ｉｉ）ヒト血漿の血餅形成時間を延長することができる、または、ヒト血漿の血餅堅さを低下させることができること、ならびに／あるいは
（ｉｉｉ）１５アミノ酸長のペプチドに含まれるＦＡＰエピトープと結合することができること（ただし、そのようなエピトープはアミノ酸配列５２５−ＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰ−５３５（配列番号３２）を含む、またはアミノ酸配列５２５−ＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰ−５３５（配列番号３２）からなる）
によって特徴づけられる。
【００５０】
別の言い方をすれば、本発明は概して、上記の機能的特徴（ｉ）〜機能的特徴（ｉｉｉ）のいずれか１つによって特徴づけられるＦＡＰ阻害性抗体およびそれに同等なＦＡＰ結合薬剤に関連する。上記の機能的特徴（ｉ）〜機能的特徴（ｉｉｉ）のいずれか１つに加えて、またはそれに代えて、本発明の抗体は好ましくは、上記で記載されるような酸性環境における膜貫通ＦＡＰに対する優先的な結合によって特徴づけられる。例えば、抗体ＮＩ−２０６．１８Ｈ２は、１５アミノ酸長のペプチドに含まれるＦＡＰエピトープに特異的に結合し（ただし、そのようなエピトープはアミノ酸配列５０１−ＩＱＬＰＫＥＥＩＫＫＬ−５１１（配列番号６０）を含み、またはアミノ酸配列５０１−ＩＱＬＰＫＥＥＩＫＫＬ−５１１（配列番号６０）からなり）、かつ、膜貫通ＦＡＰに酸性環境において優先的に結合することによってさらに特徴づけられる。
【００５１】
［１３］ＦＡＰのプロテアーゼ活性を阻害すること、ならびに／あるいは、ヒト血漿の血餅形成時間を延長すること、またはヒト血漿の血餅堅さを低下させることが可能である薬剤であって、配列番号３２または配列番号６０のアミノ酸配列を含む、またはそのようなアミノ酸配列からなるＦＡＰのエピトープと結合するために、［１０］に記載される抗体と競合することができることを特徴とする薬剤（好ましくは、前記薬剤は抗ＦＡＰ抗体である）。
【００５２】
実施例から明らかであるように、抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２のエピトープ（配列番号３２）は独特であり、全く予想外である。これは、このエピトープが、Ｓｅｒ６２４、Ａｓｐ７０２およびＨｉｓ７３４の残基から構成されるＦＡＰの触媒作用トライアドの外側に位置するにもかかわらず、この抗体が結合したとき、ＦＡＰ活性が阻害されるからである；例えば、  Ｌｉｕ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３（２０１２）、１２３〜１２９を参照のこと。実施例において明らかにされるように、このエピトープが、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して定量されるとき、このエピトープはまた、いくつかのヒト疾患を診断するために有用である。したがって、この新規なＦＡＰエピトープに関して、本発明は概して、（ａ）１５アミノ酸長のペプチドに含まれるＦＡＰエピトープと結合すること（ただし、そのようなエピトープはアミノ酸配列５２５−ＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰ−５３５（配列番号３２）を含む、またはアミノ酸配列５２５−ＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰ−５３５（配列番号３２）からなる）、そして、（ｂ）ＦＡＰのプロテアーゼ活性を阻害すること、ならびに／あるいは、ヒト血漿の血餅形成時間を延長すること、またはヒト血漿の血餅堅さを低下させることが可能であるどのような薬剤にも関連する。上記で既に説明されたように、そのような薬剤は、抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２の生物工学誘導体または合成誘導体の抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２誘導選択によって、あるいは、ヒトＦＡＰ、または前記エピトープを含むその対応するフラグメントもしくはペプチドを標的として用いるスクリーニング／競合アッセイにおいて得られる場合がある。例示的な競合アッセイが、例えば、国際特許出願公開ＷＯ０１／６８７０８、同ＷＯ２０１１／０４０９７２および同ＷＯ２０１２／０２０００６において、ならびに、さらには下記の説明において記載される。したがって、この薬剤の性質は抗体に限定されるのではなく、他のタイプの化合物も同様に包含する。例えば、抗体以外のタンパク質ディスプレイおよびペプチドディスプレイが調べられ、これらは、抗体のＣＤＲと類似するループ構造を有し、しかし、より小さい構造的要求、および／または、ＣＤＲグラフト化の可能性を有する；例えば、Ｎｉｃａｉｓｅ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３（２００４）、１８８２〜１８９１、および、Ｈｏｓｓｅ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５（２００６）、１４〜２７を参照のこと。さらに、抗体により可能となった小分子薬剤発見が、例えば、Ｌａｗｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １１（２０１２）、５１９〜５２５に記載される。抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２を参照として続いて単離されたものであるが、抗体ＮＩ．２０６−１８Ｈ２のエピトープは、抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２のエピトープと極めて近いものであり、したがって、このエピトープもまた、ＦＡＰ触媒作用トライアドの外側に位置しており、抗体ＮＩ．２０６−１８Ｈ２およびその生物工学誘導体または合成誘導体が抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２と実質的に同じ性質を示すことを予想することは、無理のないことである。実際、実施例１８におい���例示され、また、図２４に例示されるように、抗ＦＡＰ抗体ＮＩ−２０６．１８Ｈ２は、そのエピトープが未だ特徴づけられていない抗体のＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８およびＮＩ−２０６．６Ｄ３と同様に、ヒトＦＡＰのｐＨ依存的結合を抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２と実質的に同じ様式で示す。したがって、本発明によれば、抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２について記載される、および開示されるすべての実施形態は単独または組合せのどちらであれ、抗体ＮＩ−２０６．１８Ｈ２、抗体ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、抗体ＮＩ−２０６．２７Ｅ８および抗体ＮＩ−２０６．６Ｄ３に等しく当てはまり、本出願の主題である。
【００５３】
［１４］ヒト定常領域を含み、かつ／または、免疫グロブリンのＦｃ領域もしくは前記Ｆｃ領域と同等な領域を含み、好ましくは前記Ｆｃ領域がＩｇＧのＦｃ領域である、［１］〜［１３］のいずれか一項に記載の抗体。
【００５４】
［１５］全長のＩｇＧクラスの抗体である、［１］〜［１４］のいずれか一項に記載の抗体。
【００５５】
［１６］糖鎖工学操作されたＦｃ領域を含み、かつ、糖鎖工学操作されていない抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増大している、［１］〜［１５］のいずれか一項に記載の抗体。
【００５６】
抗ＦＡＰ抗体を糖鎖工学操作するための様々な手段および方法が当業者には知られている；例えば、国際特許出願公開ＷＯ２０１２／０２０００６、具体的には、（糖鎖工学操作された）抗体の調製については実施例１を、そして、糖鎖工学操作された抗ＦＡＰ  ＩｇＧ１抗体によって媒介される抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）については実施例１４を参照のこと。
【００５７】
［１７］ヒト−齧歯類のキメラ抗体、または、齧歯類化された抗体、例えば、マウス抗体またはマウス化抗体、ラット抗体またはラット化抗体などであり、齧歯類型が診断方法および動物における研究のために特に有用である、［１］〜［１６］のいずれか一項に記載の抗体。
【００５８】
［１８］単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントからなる群から選択される、［１］〜［１７］のいずれか一項に記載の抗体。
【００５９】
［１９］ＦＡＰならびに少なくとも１つのさらなるエピトープおよび／または標的に結合し、好ましくは二重特異性または多価である、［１］〜［１８］のいずれか一項に記載の抗体；例えば、前記抗体は、二重特異性抗体、三機能性抗体、テトラボディー、二価単鎖フラグメント（ＳｃＦｖ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲイジャー（ＢｉＫＥ）、二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）またはＤｕｏＢｏｄｙである；好ましくは、前記抗体は、ＦＡＰに加えて、細胞死受容体５（ＤＲ５）および／またはＣＤ３に結合する二重特異性抗体である。
【００６０】
間質におけるＦＡＰと、腫瘍細胞上のＤＲ５とを二重特異性抗体により標的化することにより、これらの標的が異なる細胞に位置しているにもかかわらず、アポトーシスが誘導されることが報告されている（国際特許出願公開ＷＯ２０１４／１６１８４５）。そのような二重特異性抗体では、細胞死受容体５（ＤＲ５）を標的とする抗原結合部位が、ＦＡＰを標的とする第２の抗原結合部位と組み合わされる。それによって、細胞死受容体が架橋され、標的となった腫瘍細胞のアポトーシスが誘導される。従来の細胞死受容体標的化抗体を上回るこれらの二重特異性の細胞死受容体アゴニスト抗体の利点が、ＦＡＰが発現される部位においてだけでアポトーシスを誘導する特異性、ならびに、ＤＲ５のハイパークラスター化が誘導されることに起因するこれらの二重特異性抗体のより大きい効力である。ＤＲ５について特異的な抗原結合部位のための可変重鎖アミノ酸配列および可変軽鎖アミノ酸配列を含むＤＲ５−ＦＡＰ細胞死受容体アゴニスト性二重特異性抗体を調製し、１つの細胞株のアポトーシスを、第２の細胞株による架橋を介して媒介するその能力を検証するための様々な手段および方法が、当業者には知られている；例えば、国際特許出願公開ＷＯ２０１４／１６１８４５、具体的には実施例１および続く実施例を参照のこと。さらなる実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、ＦＡＰと、ＣＤ３受容体としてもまた知られており、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するＣＤ３抗原とを標的とする。ＣＤ３受容体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖および２つのＣＤ３ε鎖を含み、ただし、これらの鎖は、Ｔ細胞受容体、および、活性化シグナルをＴリンパ球において生じさせるζ鎖と会合する。そのような種類の二重特異性抗体を調製するための様々な手段および方法がこの技術分野では知られており、例えば、Ｈｏｒｎｉｇ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（２０１２）、４１８〜４２９に記載される。
【００６１】
本発明の三機能性抗体は、ＦＡＰ抗原に、また、ＣＤ３および／またはＤＲ５に優先的に結合し、加えて、その無傷のＦｃ部分はアクセサリー細胞上のＦｃ受容体に結合する。したがって、三機能性抗体は好ましくは、Ｔ細胞を（上記で記載されるように）ＣＤ３を介して単球／マクロファージのようなＦｃ受容体発現細胞に、ナチュラルキラー細胞または樹状細胞を腫瘍細胞に連結し、これにより、その溶解を引き起こすことができる。三機能性抗体の構築および機構の根底にある原理が、Ｅｉｓｓｌｅｒ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７２（２０１２）、３９５８〜６６に例示的に示される。ガン標的化のためのジアボディー、トリアボディーおよびテトラボディーもまた、Ｈｕｄｓｏｎ他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３）、１２９〜１３４、および、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２４８（２００１）、４７〜６６に記載される。
【００６２】
別の実施形態において、本発明の抗ＦＡＰ抗体のｓｃＦｖは、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のＣＤ３εサブユニットに結合するｓｃＦＶに融合することができる。この融合タンパク質は、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）と近年では呼ばれる可溶性の注入可能な産物として役立つ。ＦＡＰについて特異的である二重特異性のＴ細胞活性化結合性分子が国際特許出願公開ＷＯ２０１３／０２６８３７に記載されており、それに記載される実施形態が本発明の抗ＦＡＰ抗体に対して適合化される場合がある。最も進化したＣＤ３二重特異性タンパク質が、ブリナツモマブ、すなわち、難治性のＢ前駆体急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の処置のためのＦＤＡ承認を受けたＣＤ３／ＣＤ１９ＢｉＴＥ（登録商標）である；例えば、欧州特許出願公開ＥＰ１０７７１１０２（Ａ１）を参照のこと。
【００６３】
さらに、本発明の抗体は、二重特異性抗体に基づくが、さらなる安定化のためのＣ末端架橋を特徴とするＤＡＲＴ（二重親和性再標的化）分子であることが可能である。設計原理および作用機構が、例えば、Ｍｏｏｒｅ他、Ｂｌｏｏｄ  １１７（２００１）、４５４２〜５４５１に記載される。
【００６４】
［２０］［１］〜［１９］のいずれか一項による抗体の一部を形成する抗体ＶＨ鎖および／または抗体ＶＬ鎖を少なくともコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド（好ましくはｃＤＮＡ）。
【００６５】
本発明はまた、本発明の抗体の免疫グロブリン鎖の可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドに関連する。好ましくは、前記可変領域は、図１Ｇ〜図１Ｋおよび図１Ａ〜図１Ｆのいずれか１つに示されるような可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。本発明の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドはｃＤＮＡであり、好ましくは、ＦＡＰとの反応性を有する抗体を産生するヒトメモリーＢ細胞から得られるｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡである。
【００６６】
［２１］［２０］に記載されるポリヌクレオチド（１つまたは複数）を、必要な場合には発現制御配列に機能的に連結した状態で含む１つまたは複数のベクター。
【００６７】
［２２］［２０］に記載されるポリヌクレオチド（１つまたは複数）、または、［２１］に記載されるベクター（１つまたは複数）を含む宿主細胞であって、前記ポリヌクレオチドが当該宿主細胞にとって異種である、宿主細胞。
【００６８】
［２３］抗ＦＡＰ抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体を調製するための方法であって、
（ａ）［２２］に記載される細胞を培養すること、および
（ｂ）前記抗体を培養物から単離すること
を含む、方法。
【００６９】
［２４］［２０］に記載されるポリヌクレオチド（１つまたは複数）によってコードされるか、または、［２３］に記載される方法によって得ることができる抗体。
【００７０】
［２５］［１］〜［１９］または［２４］のいずれか一項に記載の抗体であって、
（ｉ）検出可能な標識（好ましくは、酵素、放射性同位体、蛍光団および重金属からなる群から選択される検出可能な標識）を含み、
（ｉｉ）薬物（好ましくは細胞傷害性薬剤）に結合させられ、
（ｉｉｉ）活性な生物学的薬剤、好ましくは、サイトカイン、ケモカインおよびシグナル伝達経路媒介因子からなる群から選択される活性な生物学的薬剤を含み、かつ／または
（ｉｖ）放射性同位体を診断使用または治療使用のために含む、
抗体。
【００７１】
適切な標識および薬物（具体的には細胞傷害性薬剤）が当業者には知られており、例えば、本明細書中に引用される、ＦＡＰを標的とする免疫療法および診断に関する特許文献および非特許文献に記載される；下記の説明もまた参照のこと。
【００７２】
［２６］［４］〜［１２］のいずれか一項に記載される抗体によって特異的に認識されるＦＡＰのエピトープを有するペプチド（好ましくは、１０アミノ酸長または１１アミノ酸長〜２０アミノ酸長の、好ましくは１５アミノ酸長または１６アミノ酸長のペプチド）であって、［４］において定義されるようなアミノ酸配列、好ましくは、配列番号６０のアミノ酸配列、または、１つもしくは複数のアミノ酸が置換され、欠失され、かつ／もしくは付加されるその改変された配列を含む、あるいは、そのようなアミノ酸配列または改変された配列からなる、ペプチド。
【００７３】
そのようなペプチドは抗原として使用することができ、すなわち、免疫応答を対象において誘発し、本発明の抗体の産生をインビボにおいて刺激するための免疫原であり、したがって、免疫応答を対象において誘発し、本発明の抗体の産生をインビボにおいて刺激するために有用である。したがって、本発明のペプチドはワクチンとして特に有用である。ペプチドに基づくガンワクチンの総説については、例えば、Ｋａｓｔ他、Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２００２）、１６、９７０〜９７１、および、Ｂｕｏｎａｇｕｒｏ他、Ｃｌｉｎ．Ｖａｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（２０１１）、２３〜３４を参照のこと。他方で、そのような抗原は、対応する抗体を、例えば、研究目的のために惹起させるための実験動物の免疫化のために使用される場合がある。
【００７４】
［２７］［１］〜［１９］、［２４］または［２５］のいずれか一項に記載される抗体、［１３］に記載される薬剤、［２０］に記載されるポリヌクレオチド（１つまたは複数）、［２１］に記載されるベクター（１つまたは複数）、［２２］に記載される細胞、あるいは、［２６］に記載されるペプチドを含む組成物であって、好ましくは、
（ｉ）医薬組成物であり、かつ、薬学的に許容され得る担体をさらに含み、好ましくは、ワクチンであり、かつ／または、ＦＡＰに伴う疾患を防止もしくは処置するために有用であるさらなる薬剤を含む、あるいは
（ｉｉ）診断組成物であり、好ましくは、免疫または核酸に基づく診断方法において従来から使用される試薬をさらに含む診断組成物である、
組成物。
【００７５】
さらには、本発明は、ＦＡＰ関連疾患の防止、診断または処置のための免疫治療方法および免疫診断方法であって、本発明の抗ＦＡＰ抗体、薬剤、ペプチドまたは組成物の効果的な量がその必要性のある患者に投与される方法に関連する。
【００７６】
［２８］ＦＡＰに伴う疾患、好ましくは、ガン、例えば、乳ガン、結腸直腸ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、膵臓ガン、腎臓ガン、肺ガン、上皮ガン、メラノーマ、線維肉腫、骨肉腫および結合組織肉腫、腎細胞ガン、巨細胞ガン、扁平上皮ガン、腺ガン、多発性骨髄腫など；組織再構成および／または慢性炎症によって特徴づけられる疾患、例えば、線維性疾患、創傷治癒障害、ケロイド形成障害、変形性関節症、関節リウマチ、軟骨分解障害、アテローム硬化性疾患およびクローン病など；心臓血管障害、例えば、アテローム性動脈硬化、発作または急性冠動脈症候群（例えば、心筋梗塞、心臓発作、脳静脈血栓症、深部静脈血栓症または肺塞栓症、脆弱性アテローム斑またはアテローム血栓症など）など；内分泌学的機能不全を伴う障害、例えば、グルコース代謝の障害など；ならびに血液凝固障害からなる群から選択されるＦＡＰに伴う疾患の予防的処置または治療的処置において使用されるための［１］〜［１９］、［２４］または［２５］のいずれか一項に記載の抗ＦＡＰ抗体、［１３］に記載の薬剤、［２０］に記載のポリヌクレオチド（１つまたは複数）、［２１］に記載のベクター（１つまたは複数）、［２２］に記載の細胞、［２６］に記載のペプチド、あるいは、［２７］に記載の組成物。
【００７７】
実施例１６および実施例１７において明らかにされ、また、図２１、図２２および図２３に例示されるように、本発明の抗ＦＡＰ抗体は、動脈閉塞時間および血栓症をマウス血栓症モデルにおいて延長することができ、かつ、同所性腫瘍成長を同系の結腸直腸ガンマウスモデルにおいて取り消すことができる。したがって、本発明に従って行われる実験、および、他方で、文献において、例えば、背景の節で引用される文書において広範囲に記録される（病態）生理学におけるＦＡＰの知られている役割に基づいて、本発明の抗ＦＡＰ抗体、エピトープおよび薬剤の可能性のある適用を下記のＦＡＰ関連の障害および疾患において想定することは妥当であり、かつ、確かである：（ａ）増殖によって特徴づけられるＦＡＰ関連の障害および疾患（これには、ガンが含まれるが、これに限定されない）；（ｂ）組織再構成および／または慢性炎症によって特徴づけられるＦＡＰ関連の障害および疾患（これには、線維性疾患、慢性肝疾患、創傷治癒、ケロイド形成、変形性関節症、関節リウマチ、および、軟骨分解を伴う関連障害が含まれるが、これらに限定されない）；（ｃ）内分泌学的障害によって特徴づけられるＦＡＰ関連の障害および疾患（これには、グルコース代謝の障害が含まれるが、これらに限定されない）；（ｄ）心臓血管障害によって特徴づけられるＦＡＰ関連の障害および疾患（これには、血栓症、アテローム性動脈硬化、卒中、心筋梗塞、心臓発作、脆弱性アテローム斑またはアテローム血栓症が含まれるが、これらに限定されない）；ならびに（ｅ）血液凝固障害を伴う疾患によって特徴づけられるＦＡＰ関連の障害および疾患；可能な治療的および診断的な適用については、本明細書中に示される文書もまた参照のこと。
【００７８】
［２９］［２８］において定義されるようなＦＡＰ関連障害の処置において使用されるための医薬組成物を調製する方法であって、
（ａ）［２２］に記載される細胞を培養すること；
（ｂ）前記抗体、その生物工学誘導体もしくは合成誘導体または免疫グロブリン鎖を前記培養物から医薬品グレードにまで精製すること；および
（ｃ）前記抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体を薬学的に許容され得る担体と混合すること
を含む、方法。
【００７９】
さらなる治療方法および診断方法、ならびに、本発明の抗ＦＡＰ抗体、薬剤、ペプチドおよび組成物のために用いられることがある対応する組成物の配合が、ＦＡＰ関連疾患の処置および診断に関する本明細書中に引用される文献から、例えば、国際特許出願公開ＷＯ２０１２／０２０００６から当業者には明らかであろう。例えば、心臓血管疾患における新規な治療的および診断的な標的として使用されるためのＦＡＰが国際特許出願公開ＷＯ２０１２／０２５６３３に開示される。
【００８０】
加えて、阻害性の抗ＦＡＰ抗体およびそれに同等なＦＡＰ結合薬剤に関して、治療的および診断的な有用性が切断酵素（ＡＰＣＥ）について想定され、記載され得る。ＡＰＣＥは、ＦＡＰの可溶性のアイソタイプまたは誘導体であると報告されており、後者はＩＩ型内在性膜タンパク質であり、これは、その最初の６個のＮ末端残基を線維芽細胞の細胞質に有し、この後に２０残基の膜貫通ドメインが続き、次いで、７３４残基の細胞外のＣ末端の触媒作用ドメインが続くことが予測される。ＦＡＰのように、ＡＰＣＥもまた、エンドペプチダーゼ活性およびジペプチジルペプチダーゼ活性の両方を示すプロリル特異的な酵素である。ＦＡＰおよびＡＰＣＥは、ＡＰＣＥがＦＡＰの最初の２３個のアミノ末端残基を欠くことを除いて、アミノ酸配列において本質的に同一であり、しかし、それ以外では、これら２つの分子は、本質的に同一の物理化学的性質を有することもまた報告されている；例えば、Ｌｅｅ他、Ｂｌｏｏｄ  １０７（２００６）、１３９７〜１４０４、国際特許出願公開ＷＯ２００４／０７２２４０および米国特許出願公開第２０１１／０１４４０３７号（Ａ１）（具体的には、ＦＡＰ／ＡＰＣＥの阻害剤の有用性については段落［０００９］および段落［００９５］以降）を参照のこと。
【００８１】
実施例１９において明らかにされ、また、図２５に示されるように、抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２は、生物学的に不活性なアイソタイプ一致のコントロール抗体と比較して時間とともに腫瘍間質に選択的に蓄積する、ガンの信頼できるインビボ画像化剤である。述べられたように、抗ＦＡＰ抗体ＮＩ−２０６．１８Ｈ２、ならびに、抗体ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、抗体ＮＩ−２０６．２７Ｅ８および抗体ＮＩ−２０６．６Ｄ３は、ヒトＦＡＰのｐＨ依存的結合を抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２と実質的に同じ様式で示すので、それらが、腫瘍に対する同じ生物学活性をインビボで示すことを予想することは、無理のないことである。
【００８２】
［３０］ヒトまたは動物の身体におけるＦＡＰ発現細胞またはその組織のインビボ検出またはインビボ画像化、あるいは、ヒトまたは動物の身体におけるＦＡＰ発現細胞またはその組織に治療剤および／または診断剤を標的化することにおいて使用されるための、［１］〜［１２］、［１４］〜［１９］、［２４］または［２５］のいずれか一項に記載される抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むＦＡＰ結合性分子であって、好ましくは前記インビボ画像化が、シンチグラフィー、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射型断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光学的画像法または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む、ＦＡＰ結合性分子。
【００８３】
［３１］対象が、［２８］で定義されるようなＦＡＰに伴う疾患に罹患しているかどうか、または、対象が、ＦＡＰ特異的な治療剤による処置に適するかどうかを診断するインビトロ方法であって、前記対象の体液（好ましくは血液）に由来するサンプルにおいてＦＡＰの存在を明らかにすることを含み、健康な対象からのコントロールサンプルと比較したＦＡＰレベルの上昇が、前記疾患、および、前記薬剤による前記処置のための可能性があることの指標となり、前記ＦＡＰレベルが、配列番号３０〜配列番号３２または配列番号６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、またはそのようなアミノ酸配列からなるＦＡＰのエピトープを検出することによって求められることを特徴とする、インビトロ方法。
【００８４】
実施例１５において明らかにされ、また、図１７〜図２０に例示されるように、ＦＡＰを体液において、具体的には血液においてアッセイするための新規なアッセイが、本発明の主題抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２の新規なエピトープに基づいて開発されている。前記の国際特許出願公開ＷＯ２０１２／０２５６３３において、その血液試験は、不明のＦＡＰエピトープが測定されたという点で異なっており、これに対して、この新しいアッセイでは、ＦＡＰエピトープの「５２５−ＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰ−５３５」（配列番号３２）が特異的に測定される。国際公開ＷＯ２０１２／０２５６３３では、ＦＡＰに対するウサギポリクローナル抗体（Ａｂ２８２４６；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）が捕捉抗体として使用されており、Ｆ１９が検出抗体として使用されている。これらの抗体の両方についての結合エピトープは不明である。本発明の新規なアッセイについては、Ｆ１９抗体が捕捉抗体として使用されてもよく、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２または同等な抗ＦＡＰ抗体が、ＦＡＰエピトープ（配列番号３２）のレベルを特異的に定量するために検出抗体として使用されてもよい。ＦＡＰエピトープ（配列番号３２）を診断学のために定量することにより、予想外で、かつ、臨床的に有益な情報がもたらされる。この情報は予想外であり、これは、様々な他のＦＡＰエピトープを測定する今日までに公表された他のＦＡＰ血液試験では実際に、循環ＦＡＰレベルが、健康なコントロール患者に対して、ガン患者ではより低いことが報告されるからである；例えば、Ｊａｖｉｄｒｏｏｚｉ他、Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ３２（２０１２）、３０９〜３２０、Ｔｉｌｌｍａｎｎｓ他、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  １６８（２０１３）、３９２６〜３９３１、および、Ｋｅａｎｅ他、ＦＥＢＳ  Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏ  ４（２０１４）、４３〜５４を参照のこと。しかしながら、全く予想外ではあるが、本発明の新規なアッセイでは、ＦＡＰ特異的エピトープ（配列番号３２）のレベルがガンおよび心臓血管疾患の患者では増大していることが示される（図１８〜図２０）。理論によってとらわれることを意図しないが、この予想外の結果は、ＦＡＰの様々な形態がヒト血液に存在し（例えば、複合体化型、短縮化型、単量体、二量体など）、これらは生物学的役割が異なり、診断標的および治療標的としての価値が異なるという可能性によって説明される。先行技術において記載されるＦＡＰアッセイは、ある特定のエピトープを指定していないようであり、また、適切なエピトープを定量していないようであり、そのため、ＦＡＰ関連疾患（例えば、ガンなど）を予測するための信頼できる方法がこれまで確立されていないが、高レベルの配列番号３２のエピトープを有する患者は、臨床事象（例えば、ガン、心臓発作、卒中または凝固障害など）の増大した危険性があることが予想され、また、上昇したエピトープレベルを有するこれらの同じ患者はまた、ＦＡＰ標的化薬物療法（好ましくは、配列番号３２のエピトープに結合する抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、その生物工学変異体もしくは合成変異体、またはそれらに同等なＦＡＰ結合薬剤）を受けることから最大の利益を受けることが予想されるので、提供される情報は臨床的に有益である。実施例１４に記載され、また、図１７に例示されるように、ＳＢ９オリゴペプチダーゼのホモログであるｒｈＤＤＰ４、ｒｈＤＰＰ８、ｒｈＤＰＰ９およびｒｈＰＯＰ／ＰＲＥＰはシグナル（すなわち、ＯＤの増大）を与えなかったので、本発明のＦＡＰ検出アッセイは、ｒｈＦＡＰに対して特異的である。さらに、図１８〜図２０に例示されるように、本発明のＦＡＰ検出アッセイは、転移性結腸直腸ガン（ＭＣＲＣ）、冠動脈疾患（ＣＡＤ）およびＳＴ上昇型心筋梗塞（ＳＴＥＭＩ）、頸動脈プラークを患者において検出するために特に好適である。抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２および抗体ＮＩ−２０６．１８Ｈ２の類似する結合特性、ならびにそれらのエピトープの近い位置を考慮すると、この実施形態、ならびに、下記の実施形態が、抗体ＮＩ−２０６．１８Ｈ２のＦＡＰエピトープである「５０１−ＩＱＬＰＫＥＥＩＫＫＬ−５１１」（配列番号６０）を用いて等しく行われる場合がある。
【００８５】
［３２］［２８］で定義されるようなＦＡＰに伴う疾患に罹患する、または、そのような疾患を発症する危険性がある患者の処置において使用するための治療剤であって、患者の血液のサンプルのＦＡＰレベルがコントロールと比較して上昇しており、前記ＦＡＰレベルが、配列番号３０〜配列番号３２または配列番号６０のいずれか１つのアミノ酸配列からなる、またはそのようなアミノ酸配列を含むＦＡＰのエピトープを検出することによって明らかにされることを特徴とし、好ましくは、前記患者は、［３１］に記載される方法に従って診断されている、治療剤。
【００８６】
［３３］ＦＡＰの前記レベルが、前記サンプルを抗ＦＡＰ抗体に供し、ＦＡＰと前記抗体との間で形成される複合体の存在を、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡによって検出することによって求められる、［３１］に記載の方法、または、［３２］に従って使用されるための薬剤。
【００８７】
実施例１４に記載されるように、サンドイッチ型免疫アッセイ形式（＝サンドイッチ免疫アッセイまたはサンドイッチＥＬＩＳＡ）が特に好ましい。様々なサンドイッチ免疫アッセイ形式が当業者にはよく知られており、ＦＡＰの検出についてもまた記載されている；例えば、国際特許出願公開ＷＯ２００９／０７４２７５、同ＷＯ２０１０／１２７７８２および同ＷＯ２０１２／０２５６３３を参照のこと。この関連において、配列番号３０〜配列番号３２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、またはそのようなアミノ酸配列からなるＦＡＰのエピトープを検出することが好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ抗体（例えば、抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２）あるいはその生物工学誘導体または合成誘導体を検出抗体として、かつ、抗ＦＡＰ抗体Ｆ１９またはその誘導体を捕捉抗体として用いて行われる。しかしながら、このアッセイは逆の様式で行われる場合がある。抗体Ｆ１９またはその誘導体の代わりに、さらなる抗ＦＡＰ抗体が使用される場合があり、例えば、ラットのモノクローナルな抗ＦＡＰ／セプラーゼ抗体（クローンＤ８、クローンＤ２８およびクローンＤ４３）が使用される場合がある；Ｐｉｎｅｉｒｏ−Ｓａｎｃｈｅｚ他、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１２（１９９７）、７５９５〜７６０１、および、国際特許出願公開ＷＯ２００９／０７４２７５を参照のこと。
【００８８】
［３４］血液凝固障害の処置において使用するための抗ＦＡＰ抗体、または、血液の凝固をインビトロにおいて遅らせるための抗ＦＡＰ抗体の使用。
【００８９】
実施例１３および実施例１４において明らかにされ、また、図１５および図１６に例示されるように、抗ＦＡＰ抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２は凝固カスケードを妨げ、かつ、血液凝固時間を延長させ、したがって、抗凝固剤および血栓形成促進性（ｐｒｏ−ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ）薬剤の定義をそれぞれ満たす。したがって、抗ＦＡＰ抗体のＮＩ−２０６．８２Ｃ２およびＮＩ−２０６．１８Ｈ２ならびにそれらの生物工学誘導体および合成誘導体、ならびに、それらに同等なＦＡＰ結合薬剤の可能な治療的使用には、概して血栓性障害、心房細動（速い不規則な心拍）、機械的心臓弁に伴う障害、心内膜炎（心臓の内部の感染症）、僧帽弁狭窄（心臓における弁の１つが完全に開かない）、血液凝固様式に影響を及ぼすある種の血液障害（遺伝性血栓性素因、抗リン脂質症候群）、股関節または膝関節を置換するための手術に伴う障害の処置、改善および防止が含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明の抗ＦＡＰ抗体およびそれに同等な薬剤は、医療設備において、例えば、試験チューブ、輸血バッグおよび腎透析設備などにおいて使用される場合がある。抗ＦＡＰ抗体またはそれに同等なＦＡＰ結合薬剤の抗凝固活性を、候補の抗ＦＡＰ抗体を血液（好ましくはヒト血液）に由来するサンプルとの血餅形成アッセイに供することによって求めることができ、この場合、アイソタイプ一致のコントロール抗体に供されるサンプルと比較して、延長された血漿凝固時間、低下した凝固速度、低下した血餅弾性、および／または、低下した血餅堅さが、抗ＦＡＰ抗体および薬剤の抗凝固活性についてそれぞれ示しており、好ましくは、この場合、血餅形成が、トロンボエラストグラフィーによって、例えば、回転式トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ（商標））などによって求められる；実施例１３もまた参照のこと。加えて、または代替において、抗ＦＡＰ抗体または薬剤は、実施例１４に記載されるように、ＦＡＰ基質のアルファ２抗プラスミン（α２Ａ−ＡＭＣ）の切断速度をヒト血漿において低下させる能力について試験される場合がある。
【００９０】
［３５］前記抗体が、［１］〜［１９］、［２４］または［２５］のいずれか一項に記載される抗体である、［３３］に従って使用するための方法もしくは薬剤、［３４］に従って使用されるための抗ＦＡＰ抗体、または、［３４］に記載の使用。
【００９１】
［３６］［３１］、［３３］または［３５］のいずれか一項に記載される方法において、あるいは、［３４］または［３５］に記載される使用において有用なキットであって、［１］〜［１９］、［２４］または［２５］のいずれか一項に記載される少なくとも１つの抗体、［１３］に記載される薬剤、［２０］に記載されるポリヌクレオチド（１つまたは複数）、［２１］に記載されるベクター（１つまたは複数）、［２２］に記載される細胞、［２６］に記載されるペプチド、または、［２７］に記載される組成物を、必要な場合には使用のための試薬および／または説明書と一緒に含むキット。
【００９２】
［３７］（ｉ）［３１］、［３２］または［３５］のいずれか一項に記載される方法を行うための手段、好ましくは、［３６］に記載されるキットの構成成分のいずれか１つ、および、（ｉｉ）ＦＡＰ標的化薬物、好ましくは、［３１］、［３３］または［３５］に従って使用されるための治療剤を、必要な場合には使用のための説明書と一緒に含む医薬包装物または製造品。
【００９３】
実際には、ＦＡＰ標的化薬物による薬物療法は、具体的には、抗ＦＡＰ抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２ならびにその生物工学誘導体および合成誘導体、ならびに、それらに同等なＦＡＰ結合薬剤による薬物療法はほとんどの場合、エピトープ「５２５−ＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰ−５３５」、または、抗体ＮＩ−２０６．１８Ｈ２のＦＡＰエピトープ「５０１−ＩＱＬＰＫＥＥＩＫＫＬ−５１１」（配列番号６０）を定量する、［２９］、上記および実施例に記載される方法およびアッセイと組み合わされるであろうことが予想され得る；上記もまた参照のこと。好ましくは、アッセイが、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２由来の抗体または薬剤を検出抗体として使用し、かつ、薬物が注入されると、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２が患者体内において結合するであろう非結合型エピトープ（または「薬物標的」）の量を特異的に測定するサンドイッチＥＬＩＳＡに基づく血液試験として行われる。  したがって、本発明のアッセイは、好ましくは血液試験の形態であり、どの患者を処置するか（すなわち、高レベルの薬物標的を有する患者）、および、薬物療法をどのように与えるかを（すなわち、具体的には「５２５−ＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰ−５３５」エピトープまたは「５０１−ＩＱＬＰＫＥＥＩＫＫＬ−５１１」エピトープの各患者の個体レベルに従って）特定するであろう。したがって、好都合には、ＦＡＰ標的化薬物は、具体的には、抗ＦＡＰ抗体のＮＩ−２０６．８２Ｃ２およびＮＩ−２０６．１８Ｈ２（それぞれ）、ならびにその生物工学誘導体および合成誘導体、ならびに、それらに同等なＦＡＰ結合薬剤は、例えば、当該アッセイを行うために必要かつ十分である成分および／またはそうするための説明書を組み合わせる臨床包装物として、本発明の新規なＦＡＰ検出アッセイと一緒に使用されるために設計される。加えて、本発明のＦＡＰ検出アッセイを代表的な対象および患者の統計学的に有意な集団におけるＦＡＰの血清中レベルの評価においてそれぞれ使用して、概して医学的状況に備える、例えば、ＦＡＰ結合薬剤を投薬することに備える本発明の参照レベルが確立されるであろうことを予想することは、無理のないことである。
【００９４】
［３８］本明細書中に記載されるような発明、とりわけ、添付された実施例を参照する本明細書中に記載されるような発明、ならびに、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２、ＮＩ−２０６．２０Ａ８、ＮＩ−２０６．６Ｄ３、ＮＩ−２０６．１４Ｃ５、ＮＩ−２０６．３４Ｃ１１、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２２Ｆ７、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４およびＮＩ−２０６．１７Ａ６から選択されるどのような抗体とも実質的に同じ結合活性および生物学的活性を示す抗体。抗ＦＡＰ抗体はまた、下記において詳しく記載されるような抗体の標識化を含めて、診断方法の取り扱いを容易にするために変化させることができる。
【００９５】
［３９］その抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）であり、かつ、第１の受容体が、［１］〜［１９］のいずれか一項に記載される抗ＦＡＰ抗体に由来する可変領域または結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、好ましくは、前記ＣＡＲ、または前記ＣＡＲを発現する細胞は、中性ｐＨまたは生理学的ｐＨよりも酸性ｐＨのもとで大きい、ＦＡＰまたはＦＡＰをその細胞表面に発現する細胞に結合するアビディティーを示し、ただし、好ましくは、前記酸性ｐＨは６．４または６．８であり、前記生理学的ｐＨは７．４である。
【００９６】
さらなる局面において、本発明は、本発明の抗ＦＡＰ抗体に基づく、かつ、ガンの処置において間質細胞を標的とするために特に有用である、ＦＡＰについて特異的であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関連する。ＦＡＰを標的とするＣＡＲは、本明細書中ではＦＡＰ  ＣＡＲとして示される。本発明のＦＡＰ  ＣＡＲは、抗体コンジュゲートが、限定された腫瘍浸透を有する可能性があり、また、多くの場合には免疫応答を宿主において誘導する可能性があり、そして、ワクチン接種により、ＦＡＰに対する長続きする内因性の免疫がもたらされ得るという点で、先行技術のガン処置を上回るある特定の利点をいくつか有する。本ＣＡＲは、とりわけＴ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）との組合せでは、これらの制限を回避するために設計される。概して、ＣＡＲは、所望の抗原についての抗体型特異性を、特異的な抗抗原性細胞免疫活性を示すキメラなタンパク質を生じさせるためにＴ細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせる分子である。本発明のＣＡＲは抗ＦＡＰ抗体またはそのＦＡＰ結合フラグメントを含む。具体的には、ＣＡＲは、上記で言及される抗ＦＡＰ抗体のいずれか１つに由来する可変領域または結合ドメインを含む第１の受容体を含む。本発明の好ましい実施形態において、ＦＡＰについて特異的である抗原結合ドメインは本発明の抗体のいずれか１つに由来し、この場合、前記抗体はＦＡＰのｐＨ依存的結合を示し、すなわち、酸性における、したがって、腫瘍環境における増大したアビディティーを示す。最も好ましくは、本発明のＦＡＰ  ＣＡＲでは、抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２または抗体ＮＩ−２０６．１８Ｈ２が使用される；実施例２０を参照のこと。したがって、本発明は概して、ＦＡＰ  ＣＡＲで、とりわけ抗ＦＡＰ抗体がヒト起源であるために、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、かつ／または、好ましくは、前記ＣＡＲ、もしくは前記ＣＡＲを発現する細胞が、中性ｐＨまたは生理学的ｐＨと比較して、酸性ｐＨのもとではより大きい、ＦＡＰまたはＦＡＰをその細胞表面に発現する細胞に結合するアビディティーを示す（好ましくは、前記酸性ｐＨは６．４または６．８であり、前記生理学的ｐＨは７．４である）、ＦＡＰ  ＣＡＲに関連する。
【００９７】
［４０］前記第１の受容体または第２の受容体が、少なくとも１つのさらなる抗原結合ドメインを含み、好ましくは、前記さらなる抗原結合ドメインがＣＤ３受容体または細胞死受容体について特異的であり、好ましくは、前記細胞死受容体が細胞死受容体５（ＤＲ５）である、［３９］に記載のＣＡＲ。
【００９８】
［４１］細胞外ドメイン（受容体）、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメインまたは細胞質ドメイン）を含み、好ましくは、前記細胞内シグナル伝達ドメインが４−１ＢＢ共刺激ドメインおよび／またはＣＤ２８共刺激ドメインおよび／またはＣＤ３ζ（ゼータ）エンドドメインを含む、［３９］または［４０］に記載のＣＡＲ。
【００９９】
１つの実施形態において、本発明のＣＡＲは、抗原認識ドメインを有する細胞外ドメイン、すなわち、ＦＡＰについて特異的である第１の受容体と、膜貫通ドメインと、細胞質ドメイン、すなわち、ＣＤ３ζ（ゼータ）エンドドメインについて特異的である第２の受容体とを含む。１つの実施形態において、ＣＡＲにおけるドメインの１つと生来的に会合する膜貫通ドメインが使用される。別の実施形態において、膜貫通ドメインは、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに対するそのようなドメインの結合を避けて、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために選択することができ、またはアミノ酸置換によって改変することができる。好ましくは、膜貫通ドメインはＣＤ８ヒンジドメインを含む。
【０１００】
細胞質ドメインに関して、本発明のＣＡＲは、ＣＤ２８および／または４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを単独で含む、あるいは、本発明のＣＡＲとの関連で有用であるどのような他の所望される細胞質ドメインであっても組み合わされるように設計することができる。１つの実施形態において、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインをさらに含むように設計することができる。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３−ゼータ、４−１ＢＢおよびＣＤ２８のシグナル伝達モジュールならびにそれらの組合せを含むことができ、しかし、これらに限定されない。
【０１０１】
１つの実施形態において、ＣＡＲにおける共刺激性のシグナル伝達領域は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、および、どのような組合せであれ、これらの組合せからなる群から選択される共刺激性分子の細胞内ドメインを含む。
［４２］［３９］〜［４１］のいずれか一項に記載されるＣＡＲと、必要な場合には［１］〜［１９］のいずれか一項に記載される抗体とをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド（好ましくは、１つまたは複数のｃＤＮＡ）。
【０１０２】
本発明はまた、本発明のＣＡＲと、さらには少なくとも本発明の抗体の免疫グロブリン鎖の可変領域とをコードするポリヌクレオチドに関連する。好ましくは、前記可変領域は、図１Ｇ〜図１Ｋおよび図１Ａ〜図１Ｆのいずれか１つに示されるような可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。本発明の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。
【０１０３】
［４３］［４２］に記載されるポリヌクレオチド（１つまたは複数）を、必要な場合には発現制御配列に機能的に連結された状態で含む１つまたは複数のベクター。
【０１０４】
［４４］［３９］〜［４１］のいずれか一項に記載されるＣＡＲを発現するように遺伝子改変される宿主細胞であって、［４２］に記載されるポリヌクレオチド（１つまたは複数）または［４３］に記載されるベクター（１つまたは複数）を含み、かつ、［１］〜［１９］のいずれか一項に記載される抗体を必要に応じて発現し、分泌する宿主細胞。
【０１０５】
［４５］Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹細胞または多能性幹細胞である、［４４］に記載の細胞、好ましくは、前記細胞はＴ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）であり、好ましくは、前記細胞は、中性ｐＨまたは生理学的ｐＨと比較して、酸性ｐＨのもとではより大きい、ＦＡＰまたはＦＡＰをその表面に発現する細胞に結合するアビディティーを示す（ただし、好ましくは、前記酸性ｐＨは６．４または６．８であり、前記生理学的ｐＨは７．４である）。
【０１０６】
本発明は概して、本発明のＦＡＰ  ＣＡＲを発現するように、かつ、必要に応じて、さらには本発明の抗体を、好ましくは本発明のＮＩ−２０６．１８Ｈ２抗体もしくはＮＩ−２０６．８２Ｃ２抗体またはさらなるＦＡＰ  ＣＡＲを発現し、分泌するように改変される宿主細胞に関連する。抗体またはＦＡＰ  ＣＡＲのさらなる発現が、例えば、腫瘍標的化および／または腫瘍選択性を高めるために行われる。
【０１０７】
１つの実施形態において、本発明の宿主細胞はＴ細胞であり、例えば、初代Ｔ細胞、自己Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞または調節性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹細胞あるいは多能性幹細胞などである。好ましくは、前記Ｔ細胞は、ヒトドナーから単離される単離された初代ヒトＴ細胞である。さらには、Ｔ細胞は、内因性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現を機能的に損なうように、または低下させるように改変することができる。具体的には、単離されている改変された初代ヒトＴ細胞（これは、ヒトから単離される初代ヒトＴ細胞に由来する）が、（ｉ）内因性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現を低下させるように改変され、さらに、（ｉｉ）シグナル伝達ドメインに結合させられるリガンド結合ドメインを含むキメラ受容体を含む少なくとも１つの機能的な内因性の非ＴＣＲを発現するように改変され、この場合、前記改変された初代ヒトＴ細胞はヒト治療における使用に好適であり、さらに、前記改変されている単離された初代ヒトＴ細胞は、（ｉｉ）の場合のように改変されるだけである同じヒトドナーから単離される初代ヒトＴ細胞によって誘発されるＧＶＨＤ応答と比較した場合、組織不適合性ヒトレシピエントにおいて、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）応答を誘発せず、または、低下した移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）応答を誘発する；例えば、国際特許出願公開ＷＯ２０１１／０５９８３６を参照のこと。
【０１０８】
ＣＡＲを発現するＴ細胞は、本明細書中ではＣＡＲ  Ｔ細胞またはＣＡＲ改変Ｔ細胞称される。１つの実施形態において、本発明は、ガンを有する患者を処置する際に使用されるための、ＦＡＰ  ＣＡＲを発現する遺伝子改変されたＴ細胞に関連する。本発明は、本発明の抗ＦＡＰ抗体の抗ＦＡＰ抗原結合ドメインが、ＦＡＰ発現腫瘍細胞の特異的な認識および腫瘍減少を可能にするＣＡＲにおける使用に特に適しているという知見に基づいており、この場合、Ｔ細胞は、ＦＡＰ結合ドメインがヒトＦＡＰと結合したとき、抗腫瘍免疫性、例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞が標的エピトープに結合したとき、ガン細胞の損傷を引き起こすサイトカインの放出を示し、その環境がＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍効果の１つの機構である。したがって、本発明は、養子治療のためＣＡＲ  Ｔ細胞およびその使用方法を提供する。実施例２２において、被覆された組換えＦＡＰに対する、ＦＡＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の特異的な結合、および、エフェクターサイトカインの放出がどのように明らかにされ得るかが例示される。
【０１０９】
［４６］ＣＡＲ発現Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）を作製するための方法であって、
（ａ）［４４］または［４５］に記載される細胞を培養すること；および
（ｂ）前記ＣＡＲ  Ｔ細胞を単離すること
を含む、方法。
【０１１０】
１つの実施形態において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、本発明のＦＡＰ  ＣＡＲを含むレンチウイルスベクターを細胞に導入することによって作製することができる。したがって、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は生体内で複製することができ、これにより、持続した腫瘍抑制を引き起こすことが可能である長期間の持続がもたらされる。別の実施形態において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、本発明のＦＡＰ  ＣＡＲをコードするＲＮＡを細胞にトランスフェクションし、これにより、ＣＡＲの一過性発現を遺伝子改変されたＣＡＲ  Ｔ細胞において引き起こすことによって作製することができる。ＣＡＲ  Ｔ細胞のための詳述される例示的な製造方法が、実施例２１に示される。
【０１１１】
［４７］［４６］に記載される方法によって得ることができるＣＡＲ  Ｔ細胞。
【０１１２】
さらには、本発明は、ＦＡＰ関連疾患（とりわけ、腫瘍疾患）の防止または処置のための免疫治療方法であって、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞の効果的な量がその必要性のある患者に投与される方法に関連する。具体的には、前記ＣＡＲ、前記ポリヌクレオチド、前記ベクターまたは前記細胞を、好ましくはＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＦＡＰ抗原を発現する腫瘍の処置において使用することができ、好ましくは、前記処置は、腫瘍退行を、化学療法の有無にかかわらず、ＦＡＰ陽性悪性細胞および／またはＦＡＰ陽性間質細胞の消失によって引き起こし、かつ／あるいは、化学療法取り込みを増大させ、かつ／あるいは、Ｔ細胞浸潤をＦＡＰ陽性間質細胞の消失によって増大させる。
【０１１３】
［４８］ＦＡＰに伴う疾患、好ましくは、ガン、例えば、乳ガン、結腸直腸ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、膵臓ガン、腎臓ガン、肺ガン、上皮ガン、メラノーマ、線維肉腫、骨肉腫および結合組織肉腫、腎細胞ガン、巨細胞ガン、扁平上皮ガン、腺ガン、多発性骨髄腫など；組織再構成および／または慢性炎症によって特徴づけられる疾患、例えば、線維性疾患、創傷治癒障害、ケロイド形成障害、変形性関節症、関節リウマチ、軟骨分解障害およびクローン病などからなる群から選択されるＦＡＰに伴う疾患の予防的処置または治療的処置において使用されるための［３９］〜［４１］のいずれか一項に記載のＣＡＲ、［４２］に記載のポリヌクレオチド（１つまたは複数）、［４３］に記載のベクター（１つまたは複数）、［４４］または［４５］に記載の細胞、あるいは、［４７］に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【０１１４】
上記で言及されるように、固形腫瘍のｐＨは、増大した発酵性代謝のために酸性であり、そして、本発明の抗体では、特に抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、抗体ＮＩ２０６．１８Ｈ２、抗体ＮＩ．２０６−５９Ｂ４、抗体ＮＩ２０６．２７Ｅ８および抗体ＮＩ２０６．６Ｄ３では、驚くべきことに、腫瘍において見出される酸性ｐＨ環境における膜貫通ＦＡＰに対する増大したアビディティーが、健康な組織の中性ｐＨにおけるより低いアビディティーと比較して明らかにされたので、それらの抗体のいずれかに由来する可変領域または結合ドメインを含むＣＡＲもまた、酸性ｐＨにおけるＦＡＰに対するこの増大したアビディティーを示すことを予想することは、妥当なことである。ＦＡＰ  ＣＡＲのヒトＦＡＰ発現細胞に対する結合、ならびに、正常なｐＨ条件および低いｐＨ条件のもとでのサイトカインの放出を明らかにすることを可能にする実験が、実施例２３〜実施例２５に例示的に記載される。
【０１１５】
［４９］下記の（ｉ）において使用されるための、［３９］〜［４１］のいずれか一項に記載のＣＡＲ、［４２］に記載のポリヌクレオチド（１つまたは複数）、［４３］に記載のベクター（１つまたは複数）、［４４］または［４５］に記載の細胞、あるいは、［４７］に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞：
（ｉ）ＦＡＰ抗原を発現する腫瘍の処置、好ましくは、前記処置は、
（ａ）腫瘍退行を、化学療法の有無にかかわらず、ＦＡＰ陽性悪性細胞および／またはＦＡＰ陽性間質細胞の消失によって引き起こし、かつ／あるいは、
（ｂ）化学療法取り込みを増大させ、および／または、Ｔ細胞浸潤をＦＡＰ陽性間質細胞の消失によって増大させる。
【０１１６】
本発明のさらなる実施形態が下記の説明および実施例から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】例示的なヒト抗体のＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２２Ｆ７、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４、ＮＩ−２０６．１７Ａ６、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２、ＮＩ−２０６．２０Ａ８、ＮＩ−２０６．６Ｄ３、ＮＩ−２０６．１４Ｃ５およびＮＩ−２０６．３４Ｃ１１の可変領域のアミノ酸配列。フレームワーク領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が示され、ＣＤＲには下線が引かれる。Ｋａｂａｔ番号表記スキームが使用された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照のこと）。
【図２】ＥＬＩＳＡによって評価される組換えヒト由来抗体のＦＡＰに対する特異的結合およびＥＣ５０決定。（Ａ）プレートを示された濃度の組換えヒト由来抗体とインキュベーションした。例示的抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２は、被覆された抗Ｈｉｓ抗体によりそのｈｉｓタグを介して捕捉されたｒＦＡＰ（●）に対して大きい親和性で結合する。抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２はＢＳＡ（▲）には結合しない。データは、４５０ｎｍにおけるＯＤ値として表される。（Ｂ）プレートを示された濃度の組換えヒト由来抗体とインキュベーションした。例示的抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２は、ＥＬＩＳＡプレートに直接に被覆されたｒＦＡＰ（●）に対して良好な親和性で結合する。抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２はＢＳＡ（▲）には結合しない。データは、４５０ｎｍにおけるＯＤ値として表される。（Ｃ）プレートを示された濃度の組換えヒト由来抗体とインキュベーションした。例示的抗体ＮＩ−２０６．５９Ｂ４は、被覆された抗Ｈｉｓ抗体によりそのｈｉｓタグを介して捕捉されたｒＦＡＰ（●）に対して大きい親和性で結合する。抗体ＮＩ−２０６．５９Ｂ４はＢＳＡ（▲）には結合しない。データは、４５０ｎｍにおけるＯＤ値として表される。（Ｄ）プレートを示された濃度の組換えヒト由来抗体とインキュベーションした。例示的抗体ＮＩ−２０６．５９Ｂ４は、ＥＬＩＳＡプレートに直接に被覆されたｒＦＡＰ（●）に対して良好な親和性で結合する。抗体ＮＩ−２０６．５９Ｂ４はＢＳＡ（▲）には結合しない。データは、４５０ｎｍにおけるＯＤ値として表される。（Ｅ）プレートを示された濃度の組換えヒト由来抗体とインキュベーションした。例示的抗体ＮＩ−２０６．１８Ｈ２は、被覆された抗Ｈｉｓ抗体によりそのｈｉｓタグを介して捕捉されたｒＦＡＰ（●）に対して良好な親和性で結合する。抗体ＮＩ−２０６．１８Ｈ２は、ＢＳＡとの抗Ｈｉｓ抗体（▲）には結合しない。データは、４５０ｎｍにおけるＯＤ値として表される。（Ｆ）プレートを示された濃度の組換えヒト由来抗体とインキュベーションした。例示的抗体ＮＩ−２０６．１８Ｈ２は、ＥＬＩＳＡプレートに直接に被覆されたｒＦＡＰ（●）に対して良好な親和性で結合する。抗体ＮＩ−２０６．１８Ｈ２はＢＳＡ（▲）には結合しない。データは、４５０ｎｍにおけるＯＤ値として表される。（Ｇ）プレートを示された濃度の組換えヒト由来抗体とインキュベーションした。例示的抗体ＮＩ−２０６．２０Ａ８は、被覆された抗Ｈｉｓ抗体によりそのｈｉｓタグを介して捕捉されたｒＦＡＰ（●）に対して良好な親和性で結合する。抗体ＮＩ−２０６．２０Ａ８は、ＢＳＡとの抗Ｈｉｓ抗体（▲）には結合しない。データは、４５０ｎｍにおけるＯＤ値として表される。（Ｈ）プレートを示された濃度の組換えヒト由来抗体とインキュベーションした。例示的抗体ＮＩ−２０６．２０Ａ８は、ＥＬＩＳＡプレートに直接に被覆されたｒＦＡＰ（●）に対して良好な親和性で結合する。抗体ＮＩ−２０６．２０Ａ８はＢＳＡ（▲）には結合しない。データは、４５０ｎｍにおけるＯＤ値として表される。（Ｉ）プレートを示された濃度の組換えヒト由来抗体とインキュベーションした。例示的抗体ＮＩ−２０６．６Ｄ３は、被覆された抗Ｈｉｓ抗体によりそのｈｉｓタグを介して捕捉されたｒＦＡＰ（●）に対して良好な親和性で結合する。抗体ＮＩ−２０６．６Ｄ３は、ＢＳＡとの抗Ｈｉｓ抗体（▲）には結合しない。データは、４５０ｎｍにおけるＯＤ値として表される。（Ｊ）プレートを示された濃度の組換えヒト由来抗体とインキュベーションした。例示的抗体ＮＩ−２０６．６Ｄ３は、ＥＬＩＳＡプレートに直接に被覆されたｒＦＡＰ（●）に対して良好な親和性で結合する。抗体ＮＩ−２０６．６Ｄ３はＢＳＡ（▲）には結合しない。データは、４５０ｎｍにおけるＯＤ値として表される。（Ｋ）ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２２Ｆ７、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４、ＮＩ−２０６．１７Ａ６、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２、ＮＩ−２０６．２０Ａ８およびＮＩ−２０６．６Ｄ３の各抗体についてのＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアを使用して非線形回帰によって推定した。ｓＦＡＰについてのデータは、ＦＡＰが、被覆された抗Ｈｉｓ抗体によりそのｈｉｓタグを介して捕捉されたＥＬＩＳＡプレートを用いて行われる測定に対応する。ＦＡＰについてのデータは、ＦＡＰが直接に被覆されたＥＬＩＳＡプレートを用いて行われる測定に対応する。ｃＦＡＰについての値は、ＦＡＰ特異的ペプチド（３７８−ＨＹＩＫＤＴＶＥＮＡＩＱＩＴＳ−３９２、６２２−ＧＷＳＹＧＧＹＶＳＳＬＡＬＡＳ−６３６および７２１−ＱＶＤＦＱＡＭＷＹＳＤＱＮＨＧＬ−７３６）の混合物が直接に被覆されたＥＬＩＳＡプレートを用いて行われる測定に対応する。Ｎ／Ａは、該当しないことを表し、抗体は結合を示さず、したがって、ＥＣ５０を求めることができなかった。抗体ＮＩ−２０６．１２Ｇ４のｓＦＡＰに対する結合は調べられなかった。
【図３】ＰｒｏｔｅＯｎ（商標）分析でのＮＩ−２０６．８２Ｃ２の速度論的分析。抗体を、１６μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌから出発する５つの濃度の連続希釈物としてそれぞれ注入し、結合容量が異なる３つの反応表面について１回だけの注入で分析した。それらのうちの１つが示される。
【図４】ペプスキャン（ｐｅｐｓｃａｎ）分析によって評価されるヒト由来組換え抗体のＦＡＰ結合エピトープ。（Ａ）組換えＮＩ−２０６．８２Ｃ２ヒト由来抗体（１μｇ／ｍｌ）のペプスキャン画像。ＮＩ−２０６．８２Ｃ２の結合が、アミノ酸５２５〜５３５を覆うペプチド１３１およびペプチド１３２（Ｇ列、１１番目および１２番目のスポット）において生じ（ペプチド１３１：５２１−ＫＭＩＬＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰ−５３５、ペプチド１３２：５２５−ＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰＬＬＩＱ−５３９、コンセンサスな結合配列：ＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰ）、かつ、アミノ酸１１３〜１２３を覆うペプチド２８およびペプチド２９（Ｂ列、８番目および９番目のスポット）において生じた（ペプチド２８：１０９−ＲＱＦＶＹＬＥＳＤＹＳＫＬＷＲ−１２３、ペプチド２９：１１３−ＹＬＥＳＤＹＳＫＬＷＲＹＳＹＴ−１２７、コンセンサスな結合配列：ＹＬＥＳＤＹＳＫＬＷＲ）。（Ｂ）二次のＨＲＰコンジュゲート化ロバ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγのみ（１：２０，０００；二次抗体のみ）のペプスキャン画像を特異性コントロールとして使用した。（Ｃ）組換えＮＩ−２０６．１８Ｈ２ヒト由来抗体（１０μｇ／ｍｌ）のペプスキャン画像。ＮＩ−２０６．１８Ｈ２の結合が、アミノ酸５０１〜５１１を覆うペプチド１２５およびペプチド１２６（Ｇ列、５番目および６番目のスポット）において生じた（ペプチド１２５：４９７−ＡＬＫＮＩＱＬＰＫＥＥＩＫＫＬ−５１１、ペプチド１２６：５０１−ＩＱＬＰＫＥＥＩＫＫＬＥＶＤＥ−５１５、コンセンサスな結合配列：ＩＱＬＰＫＥＥＩＫＫＬ）。（Ｄ）二次のＨＲＰコンジュゲート化ロバ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγのみ（１：２０，０００；二次抗体のみ）のペプスキャン画像を特異性コントロールとして使用した。（Ｅ）ＦＡＰタンパク質配列の示されたアミノ酸の中における種々のヒト由来ＦＡＰ特異的抗体の特定された結合エピトープ。
【図５】組換えヒトモノクローナル抗体を用いたＦＡＰ酵素活性の阻害。組換えヒトＦＡＰのゼラチナーゼ活性の、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２（Ａ）、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４（Ｂ）、ＮＩ−２０６．２２Ｆ７（Ｃ）、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８（Ｄ）、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４（Ｅ）、ＮＩ−２０６．１７Ａ６（Ｆ）による阻害。 ヒト抗体の阻害特徴をまとめる表（Ｇ）。
【図６】ｒｈｕＦＡＰにより媒介されるＰＥＰ（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ）切断のＮＩ−２０６．８２Ｃ２阻害の機構。下記の異なるＰＥＰ蛍光発生基質（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ）濃度における、０ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭのＮＩ−２０６．８２Ｃ２による活性な組換えヒトＦＡＰによるＰＥＰ切断（４５０ｎＭでの放射として測定される）：１００μＭ（Ａ）、８０μＭ（Ｂ）、７０μＭ（Ｃ）、６０μＭ（Ｄ）、５０μＭ（Ｅ）、４０μＭ（Ｆ）、３０μＭ（Ｇ）および２０μＭ（Ｈ）。速度対［基質］プロット（Ｉ）およびラインウィーバー・バークプロット（Ｊ）が示される。これらから、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２はＦＡＰ媒介ＰＥＰ切断の非競合的阻害剤の特徴的性質を有することが示唆される。
【図７】ヒト由来組換え抗体がＦＡＰと選択的に結合する。（Ａ）２０ｎＭ、４ｎＭおよび０．８ｎＭの濃度で検出抗体として使用されるＮＩ−２０６．８２Ｃ２は、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、ＣＤ２６および一連のさらなる無関係なヒト抗原（Ａ〜Ｎ）と比較して、被覆された抗Ｈｉｓ抗体によりそのｈｉｓタグを介して捕捉された組換えヒトＦＡＰ（ｓＦＡＰ）に対して有意により大きい比色分析シグナル（ＯＤ４５０ｎＭ）をもたらす。（Ｂ）２０ｎＭ、４ｎＭおよび０．８ｎＭの濃度で検出抗体として使用されるＮＩ−２０６．１８Ｈ２は、一連のさらなる無関係なヒト抗原（Ａ〜Ｎ）と比較して、被覆された抗Ｈｉｓ抗体によりそのｈｉｓタグを介して捕捉された組換えヒトＦＡＰ（ｓＦＡＰ）、または、ＥＬＩＳＡプレートに直接に被覆された組換えヒトＦＡＰ（ＦＡＰ）に対して有意により大きい比色分析シグナル（ＯＤ４５０ｎＭ）をもたらす。（Ｃ）２０ｎＭ、４ｎＭおよび０．８ｎＭの濃度で検出抗体として使用されるＮＩ−２０６．２０Ａ８は、一連のさらなる無関係なヒト抗原（Ａ〜Ｎ）と比較して、被覆された抗Ｈｉｓ抗体によりそのｈｉｓタグを介して捕捉された組換えヒトＦＡＰ（ｓＦＡＰ）、または、ＥＬＩＳＡプレートに直接に被覆された組換えヒトＦＡＰ（ＦＡＰ）に対して有意により大きい比色分析シグナル（ＯＤ４５０ｎＭ）をもたらす。（Ｄ）２０ｎＭ、４ｎＭおよび０．８ｎＭの濃度で検出抗体として使用されるＮＩ−２０６．６Ｄ３は、一連のさらなる無関係なヒト抗原（Ａ〜Ｎ）と比較して、被覆された抗Ｈｉｓ抗体によりそのｈｉｓタグを介して捕捉された組換えヒトＦＡＰ（ｓＦＡＰ）、または、ＥＬＩＳＡプレートに直接に被覆された組換えヒトＦＡＰ（ＦＡＰ）に対して有意により大きい比色分析シグナル（ＯＤ４５０ｎＭ）をもたらす。（Ｅ）サンドイッチＥＬＩＳＡを使用する親和性（ＥＣ５０）アッセイにより、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２は組換えヒトＦＡＰ（ｒｈＦＡＰ）に選択的に結合し、しかし、ＦＡＰ  ＳＢ９オリゴペプチダーゼホモログ（ｒｈＤＰＰＩＶ、ｒｈＰＯＰ／ＰＲＥＰ、ｒｈＤＰＰ８およびｒｈＤＰＰ９）には選択的に結合しないことが明らかにされる。（Ｆ）阻害アッセイにより、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２はｒｈＦＡＰを選択的に阻害し、しかし、ＦＡＰホモログを選択的に阻害しないことが明らかにされる。
【図８】ＮＩ−２０６．８２Ｃ２は、活性な組換えヒトＦＡＰおよび活性な組換えマウスＦＡＰの酵素活性を阻害する。ＮＩ−２０６．８２Ｃ２により、活性な組換えヒトＦＡＰ（Ａ）および活性な組換えマウスＦＡＰ（Ｂ）を阻害することについてのより大きい効力が、以前に試験されたＦＡＰ標的化薬剤Ｖａｌ−ｂｏｒｏ−ＰｒｏおよびＦ１９（すなわち、シブロツズマブが、実質的に同じ結合親和性を有するそのヒト化型であるマウスＦ１９モノクローナル抗体；背景の節（上掲）における記載を参照のこと）と比較して明らかにされる。
【図９】ヒトガン腫組織切片に対するＮＩ−２０６．８２Ｃ２結合。ＮＩ−２０６．８２Ｃ２は、共焦点免疫蛍光によってヒトの浸潤性腺管ガン（Ａ）および浸潤性小葉ガン（Ｂ）の切片に特異的に結合する。３Ａ１はヒトアイソタイプコントロール抗体であり、ＤＡＰＩにより、細胞の核が対比染色される。
【図１０】ヒト浸潤性腺管ガン組織のＮＩ−２０６．８２Ｃ２染色。 陽性染色（ＤＡＢ、褐色）がＮＩ−２０６．８２Ｃ２による組織切片染色において認められ（Ｄ、Ｅ、Ｆ）、しかし、４３Ａ１１ヒトアイソタイプコントロール抗体により染色される組織では認められない（Ａ、Ｂ、Ｃ）。核がヘマトキシリンブルーにより青く対比染色される。ＮＩ−２０６．８２Ｃ２により、悪性腫瘍（＋）の周界（黒矢印Ｆ）における細胞外染色が、周囲の結合組織（＊によって示される）における細胞外染色が認められないことと比較して示される（図Ｆ）。陽性染色がまた、（白矢印により示される）周囲組織における細胞の細胞質においても認められる（Ｆ）。
【図１１】ヒト非浸潤性乳管ガン組織のＮＩ−２０６．８２Ｃ２染色。陽性染色（ＤＡＢ、褐色）がＮＩ−２０６．８２Ｃ２による組織切片染色において認められ（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）、しかし、アイソタイプコントロール抗体４３Ａ１１による隣接組織切片の染色では認められない（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）。核酸がヘマトキシリンにより青く対比染色される。ＮＩ−２０６．８２Ｃ２により、悪性の「再構成」ＤＣＩＳ腫瘍（＋）に対する上昇した結合が、大きい非悪性の「被包性」ＤＣＩＳ腫瘍（＊によって示される）におけるより弱い染色と比較して示される。大きい腫瘍（＋）の被包形成をＡおよびＢにおいて認めることができる。染色が４３Ａ１１アイソタイプコントロール抗体からは認められない（Ｅ）。ＮＩ−２０６．８２Ｃ２染色が、（黒矢印により示される）より小さい悪性腫瘍の外側周界で最も高い（Ｆ）。（ＧおよびＨにおいてτによって示される）腫瘍組織を取り囲む結合組織は、（白矢印により示される）細胞の細胞質を除いて陰性である（Ｈ）。
【図１２】ＮＩ−２０６．８２Ｃ２はマウスＣＴ−２６結腸直腸ガン組織切片に結合する。ＮＩ−２０６．８２Ｃ２染色（赤色）が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）トランスフェクションされたＣＴ−２６の同系肝臓転移物（緑色）の周界付近に見出される。 細胞の核がシアン色で示される（ＤＡＰＩ）。
【図１３】ＮＩ−２０６．８２Ｃ２は、同系ＭＯＰＣ３１５．ＢＭマウスモデルにおいて多発性骨髄腫細胞および腫瘍間質に結合する。（Ａ）対麻痺を発症したときのＭＯＰＣ３１５．ＢＭ攻撃マウスの大腿骨のＨ＆Ｅ染色。広範囲の形質細胞増殖が骨髄全体に認められる。腫瘍細胞注入後１５日における、ＭＯＰＣ３１５．ＢＭのＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｂ）およびコントロールのＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃ）におけるＮＩ−２０６．８２Ｃ２および抗ＣＤ１３８（形質細胞マーカー）による免疫蛍光染色。矢印は、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２がＣＤ１３８陽性の多発性骨髄腫形質細胞と共局在化することを示す。
【図１４】ＮＩ−２０６．８２Ｃ２は、心筋梗塞を引き起こす閉塞性ヒト冠状動脈血栓と、大動脈アテローム斑とに結合する。心筋梗塞に罹患する患者から回収される閉塞性冠状動脈血栓（Ａ）と、ヒト大動脈アテローム斑（Ｂ）とが、シアニン３により標識されたＮＩ−２０６．８２Ｃ２により染色され、共焦点免疫蛍光によって可視化される。３Ａ１は、特異性コントロールとしての、既知の結合エピトープを有しないヒトアイソタイプ一致抗体である。
【図１５】ＮＩ−２０６．８２Ｃ２はヒト血漿凝固時間を延長させ、凝固速度を低下させ、血餅弾性を低下させ、かつ、血餅堅さを低下させる。ＲＯＴＥＭ（商標）分析では、血餅形成時間の用量依存的延長が、不活性なアイソタイプ一致コントロール抗体４３Ａ１１による処置ではなく、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２による処置によって示される（Ａ）。ＮＩ−２０６．８２Ｃ２はまた、生理的食塩水ビヒクル（０．０ｎＭ）またはアイソタイプ一致コントロール抗体（４３Ａ１１）と比較して、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２の増大する濃度に比例して、最大凝固角を低下させ（Ｂ）、最大血餅弾性を低下させ（Ｃ）、かつ、血餅堅さを低下させる（Ｄ）。
【図１６】ヒト血漿からのＦＡＰの免疫沈殿。ＮＩ−２０６．８２Ｃ２を使用してヒト血漿に対して行われる免疫沈殿は、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２免疫沈殿前の血漿と比較して、得られた血漿におけるＦＡＰ基質のアルファ２抗プラスミン（α２ＡＰ−ＡＭＣ）の切断速度を有意に低下させる。比較によって、ヒトアイソタイプコントロール抗体の４３Ａ１１および３Ａ１による免疫沈殿はα２ＡＰ−ＡＭＣ切断速度における低下をもたらさなかった。
【図１７】ＮＩ−２０６．８２Ｃ２抗原をヒトサンプルにおいて測定するためのサンドイッチＥＬＩＳＡの特徴づけ。（Ａ）標準曲線を、組換えヒトＦＡＰをコントロールとして使用して成し遂げた。（Ｂ）増大する血清希釈度でのサンプルの直線性を求めた。（Ｃ）ＥＬＩＳＡは、ｒｈＦＡＰに対して特異的であり、しかし、他のＳＢ９オリゴペプチダーゼホモログのｒｈＤＤＰ４、ｒｈＤＰＰ８、ｒｈＤＤｐ９およびｒｈＰＯＰ／ＰＲＥＰについては特異的でないことが示された。
【図１８】ＮＩ−２０６．８２Ｃ２抗原が、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定される場合、健康なコントロール患者と比較して、転移性結腸直腸ガン（ＭＣＲＣ）の患者の血清において有意に増大した。
【図１９】ＮＩ−２０６．８２Ｃ２抗原が、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定される場合、健康なコントロール患者と比較して、冠動脈疾患（ＣＡＤ）およびＳＴ上昇型心筋梗塞（ＳＴＥＭＩ）の患者の血清において有意に増大した。
【図２０】ＮＩ−２０６．８２Ｃ２抗原が、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定される場合、健康なコントロール患者と比較して、頸動脈プラークを有する患者の血漿において有意に増大した。
【図２１】（Ａ）ドップラー血流計（ｉ）、頸動脈（ｉｉ）、および、レーザー誘発頸動脈傷害部位（ｉｉｉ）を示す光化学的頸動脈傷害モデルの顕微鏡写真（バー＝１ｍｍ）。 （Ｂ）ＮＩ−２０６．８２Ｃ２処置マウス（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の閉塞時間が、ビヒクルコントロールにより処置される動物と比較して有意に延長された。統計学、対応のないスチューデントＴ検定（＊；ｐ＜０．０５、ｎ＝４）。
【図２２】ＮＩ−２０６．８２Ｃ２による処置は、同所性の同系ＭＣ３８結腸直腸腫瘍を保有するマウスにおいて磁気共鳴画像法によって評価される場合、リン酸塩緩衝化生理的食塩水ビヒクルコントロールによる処置と比較して、累積腫瘍直径（Ａ）および転移物の数（Ｂ）を低下させた（＊＝ｐ＜０．０５）。
【図２３】抗ＦＡＰ抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２は血栓症をマウスにおいて阻害する。 抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２は、４３Ａ１１（生物学的に不活性なアイソタイプ一致コントロール抗体）と比較して、光化学的傷害誘発動脈閉塞時間を生体マウスにおいて延長させる（Ａ、ログランク・ハザード比＝０．０４、９５％信頼区間＝０．０１〜０．１６、ｐ＜０．０００１）。ＮＩ−２０６．８２Ｃ２は、閉塞までのメジアン時間における用量依存的増大をマウスにおいて示す（Ｂ、ｎ＝群あたり１０匹〜１１匹のマウス）。
【図２４】Ｃｙ５標識された抗ＦＡＰ  ＲＴＭ（商標）由来抗体はともに、ＦＡＰ＋のＨＥＫ２９３細胞に対するｐＨ依存的な結合挙動をｐＨ調節ＰＢＳにおいて有する。  ＲＴＭ（商標）由来のヒトモノクローナルな抗ＦＡＰ抗体は、ｐＨ依存的様式でＦＡＰ＋細胞に結合する：（Ａ）ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、（Ｂ）ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、（Ｃ）ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、（Ｄ）ＮＩ−２０６．１２Ｇ４、（Ｅ）ＮＩ−２０６．１８Ｈ２、（Ｆ）ＮＩ−２０６．６Ｄ３。ΔＭＦＩ＝（ＭＦＩ−抗ＦＡＰ  ＲＴＭ（商標）由来抗体）−（ＭＦＩ−４３Ａ１１；アイソタイプ一致の生物学的に不活性なコントロール）。
【図２５】ＮＩ−２０６．８２Ｃ２標的の関与。ＮＩ−２０６．２８２Ｃ２が、生物学的に不活性なアイソタイプ一致のコントロール抗体４３Ａ１１（Ｂ）と比較して時間とともに腫瘍間質（Ａ）において選択的に蓄積する。
【図２６】抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２の最小エピトープ領域。抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２のエピトープを覆うＦＡＰペプチドを、ＦＡＰのアミノ酸５２８−ＦＤＲＳＫ−５３２（配列番号３８）を覆うＮＩ−２０６．８２Ｃ２の最小エピトープ領域を決定するために、Ｎ末端およびＣ末端から１アミノ酸だけ順次、短縮化した；上記もまた参照のこと。
【図２７】ＮＩ−２０６．８２Ｃ２結合のために不可欠なアミノ酸。ＦＡＰペプチドフラグメント５２１−ＫＭＩＬＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰＬＬＩＱ−５３９（配列番号３９）からのアミノ酸を１つずつ、不可欠なアミノ酸を決定するために、すなわち、変異させたときにＮＩ−２０６．８２Ｃ２結合の喪失を引き起こすアミノ酸を決定するために、逐次的にアラニンに変異させた。この戦略により、ＦＡＰのＤ−５２９およびＫ−５３２のアミノ酸がＮＩ−２０６．８２Ｃ２結合のために不可欠であることが明らかにされた；上記もまた参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【０１１８】
本発明は概して、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対するヒト自己抗体およびその組換え誘導体に関連する。より具体的には、本発明は、そのＣＤＲの少なくとも１つが、ヒトメモリーＢ細胞によって産生されるＦＡＰ特異的抗体に由来することを特徴とするモノクローナルな抗ＦＡＰ抗体に関連する。本発明の抗ＦＡＰ抗体は、ＦＡＰ関連疾患、すなわち、冒された細胞および組織がＦＡＰの（上昇した）発現によって特徴づけられる疾患の免疫療法ならびにインビボ検出およびインビボ標識化において特に有用である。ヒト由来であるために、本発明の得られた組換え抗体が、治療剤として有効かつ安全であること、そして、ＦＡＰを、インビトロで、ならびに、インビボでの両方で、細胞表面および組織内において、偽陽性を与えることなく検出するための診断試薬として非常に特異的であることを無理なく予想することができる。
【０１１９】
さらに、本発明は、健常組織の中性ｐＨにおけるより低いアビディティーと比較して、腫瘍において見出される酸性ｐＨにおける膜貫通ＦＡＰに対する増大したアビディティーを示すＦＡＰ結合性分子（具体的には抗ＦＡＰ抗体）に関連する。ｐＨ依存的アビディティーは、ＦＡＰが健康な組織でもまた発現しているので重要であり、健康な組織に対する抗体結合は様々な副作用を生じ得る。したがって、本発明の抗体は腫瘍微小環境においてＦＡＰに優先的に結合するために、より大きい治療効果が、他の組織における膜貫通ＦＡＰへの結合に伴う副作用を伴うことなく達成され得る。
【０１２０】
さらなる局面において、本発明は、ＦＡＰに選択的に結合し、その酵素活性を選択的に阻害する抗ＦＡＰ抗体およびそれに同等な薬剤であって、加えて、抗凝固活性によって特徴づけられ、したがって、抗血栓溶解剤として有用である抗ＦＡＰ抗体およびそれに同等な薬剤に関連する。さらに、本発明のヒト由来の抗ＦＡＰ抗体によって認識されるＦＡＰの独特かつ新規なエピトープに基づいて、ＦＡＰを体液において、具体的には血液および血漿においてそれぞれ測定するための新規なインビトロアッセイが提供され、この場合、増大したレベルのＦＡＰが信頼性よく、ＦＡＰ関連疾患（例えば、ガンおよびアテローム性動脈硬化など）の存在と相関する。
【０１２１】
加えて、本発明は、主題となる抗ＦＡＰ抗体またはそれに同等なＦＡＰ結合薬剤を含む診断組成物および医薬組成物で、具体的には、腫瘍および心臓血管疾患（例えば、血栓症など）の診断および処置において使用されるための診断組成物および医薬組成物に関連する。
【０１２２】
特定の局面において、本発明は、ヒトＦＡＰを標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、１つの受容体が、本発明の抗ＦＡＰ抗体に由来する可変領域または結合ドメインを含み、かつ、好ましくは、さらなる受容体が、当該ＣＡＲが任意の特異性を免疫エフェクター細胞に与えることを可能にするＣＤ３ζ抗原について優先的に特異的である、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関連する。したがって、本発明のＣＡＲは、治療目的のために、好ましくは、ＦＡＰ誘発腫瘍またはＦＡＰ随伴腫瘍のＴ細胞媒介処置のために有用である。
【０１２３】
図に例示されるような添付された実施例の結果から導かれる本発明の実施形態が請求項および上記の項［１］〜項［４８］において要約され、下記の説明により補われる。さらに、何らかの疑念を避けるために、背景の節で参照される先行技術の技術内容は本発明の開示の一部を形成しており、本明細書中で主張されるどのような実施形態のためにであっても依拠される場合がある。しかしながら、このことは、これらの文書が、本発明に関しての関連のある先行技術を表していることを認めるものではない。
【０１２４】
Ｉ．定義
別途言及されない限り、本明細書中で使用されるような用語には、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年、２０００年改訂及び２００３年再版、ＩＳＢＮ  ０  １９  ８５０６７３  ２）において提供されるような定義が与えられる。
【０１２５】
用語「ａ」又は「ａｎ」を伴う実体はそのような実体の１つ又は複数を示すことに留意しなければならない；例えば、「ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ」（抗体）は１つ又は複数の抗体を表すことが理解される。そのようなものとして、用語「ａ」（又は「ａｎ」）、  「ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ」（１つ又は複数）及び  「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ」（少なくとも１つ）は、本明細書中では交換可能に使用され得る。
【０１２６】
「活性化」は、本明細書中で使用される場合、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に刺激されているＴ細胞の状態を示す。活性化にはまた、誘導されたサイトカイン産生、および検出可能なエフェクター機能が伴い得る。用語「活性化（された）Ｔ細胞」は、中でも、細胞分裂を続けているＴ細胞を示す。
【０１２７】
本明細書中で使用される場合、ＦＡＰと「特異的に結合する」、「選択的に結合する」、または「優先的に結合する」抗体またはそれに同等な薬剤に対する言及は、他の無関係なタンパク質と結合しない抗体を示す。一例において、本明細書中に開示される抗ＦＡＰ抗体またはそれに同等なＦＡＰ結合薬剤はヒト組換えＦＡＰまたはそのエピトープと結合することができ、かつ、他のタンパク質についてはバックグラウンドの約２倍を超える結合を示さない。ヒトＦＡＰのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列についての情報およびデータバンクアクセション番号が背景の節（上掲）において示される。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ＦＡＰホモログ（例えば、ｒｈＤＰＰＩＶ、ｒｈＰＯＰ／ＰＲＥＰ、ｒｈＤＰＰ８およびｒｈＤＰＰ９など）または他の無関係なヒト抗原を実質的に認識しない；特に実施例に従って評価されるときには実施例６および図７Ａ〜図７Ｅを参照のこと。加えて、１つの好ましい実施形態において、抗ＦＡＰ抗体またはそれに同等なＦＡＰ結合薬剤はマウスＦＡＰと同様に結合することができる；実施例７、実施例１０および実施例１１、ならびに、図８、図１２および図１３を参照のこと。マウスＦＡＰのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列についての情報およびデータバンクアクセション番号が背景の節（上掲）において示される。
【０１２８】
さらに、本明細書中で使用される場合、ＦＡＰを「特異的に阻害する」、「選択的に阻害する」、または「優先的に阻害する」「ＦＡＰ阻害（性の）」抗体またはそれに同等な薬剤に対する言及は、ＦＡＰに選択的に結合し、その酵素活性を選択的に阻害するが、ＦＡＰホモログ（例えば、ｒｈＤＰＰＩＶ、ｒｈＰＯＰ／ＰＲＥＰ、ｒｈＤＰＰ８およびｒｈＤＰＰ９など）の酵素活性を実質的に阻害しない抗体または薬剤を示す；特に実施例に従って評価されるときには、実施例６および図７Ｆ、ならびに、実施例７および図８を参照のこと。好ましい実施形態において、本発明の抗ＦＡＰ抗体およびＦＡＰ結合薬剤により、活性な組換えヒトＦＡＰを阻害するためのより大きい効力が、以前に試験されたＦＡＰ標的化薬剤（Ｖａｌ−ｂｏｒｏ−Ｐｒｏおよび／またはＦ１９）と比較して明らかにされる；特に実施例に従って評価されるときには実施例７および図８を参照のこと。加えて、１つの好ましい実施形態において、抗ＦＡＰ抗体またはそれに同等なＦＡＰ結合薬剤は、活性な組換えマウスＦＡＰを同様に阻害することができる；実施例７および図８を参照のこと。
【０１２９】
用語「ｐＨ」は、ラテン語用語「ｐｏｎｄｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｉｉ」を示し、グラム原子／リットルでの水素イオン濃度の逆数の対数を表す記号であり、溶液の酸性度またはアルカリ性度を０〜１４のスケールで表すために使用され、このスケールでは、７未満が酸性であることを表し、７が中性であることを表し、７超がアルカリ性であることを表す。純水はｐＨが約７である。ヒトの正常な器官、組織、または細胞の微小環境の典型的な生理学的ｐＨは７．２〜７．４（平均７．４）であり、一方、腫瘍組織は、より酸性の細胞外ｐＨ（ｐＨｅ）（ｐＨ＝６．５〜６．９）を有することが示されている；例えば、Ｅｓｔｒｅｌｌａ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３（２０１３）、１５２４〜１５３５、および、上記で参照される参考文献を参照のこと。実施例１８において明らかにされ、また、図２４に例示されるように、本発明の１つの好ましい実施形態において、本明細書中に開示される抗ＦＡＰ抗体またはそれに同等なＦＡＰ結合薬剤は、中性ｐＨにおける、または、より具体的には７．４の生理学的ｐＨにおけるＦＡＰに対するその結合と比較して、酸性ｐＨにおいて優先的に、好ましくはｐＨ６．４またはｐＨ６．８において優先的に膜貫通ＦＡＰに結合する。抗ＦＡＰ抗体が酸性ｐＨにおいて膜貫通ＦＡＰに優先的に結合することを、実施例１８に記載される実験設定に従って検証することができる。対照的に、実施例１８において明らかにされ、また、図２４Ｄに例示されるように、本発明はまた、ＦＡＰに対する低下したアビディティーを中性ｐＨまたは生理学的ｐＨと比較して酸性ｐＨにおいて示すヒト抗ＦＡＰ抗体および組換えヒト由来抗ＦＡＰ抗体、具体的には抗体ＮＩ−２０６．１２Ｇ４を提供する。この特徴は、腫瘍の処置ではなく、むしろ、炎症性疾患または心臓血管疾患（ただし、ＦＡＰおよびＦＡＰ発現細胞が中性ｐＨの環境に存在するかもしれない）に伴うＦＡＰの腫瘍標的化が意図されるときには好都合であるかもしれない。
【０１３０】
加えて、本明細書中で使用される場合、抗凝固剤に対する言及は、最大凝固角の低下、最大血餅弾性の低下および血餅堅さの低下が好ましくは伴って、ヒト血漿の血餅形成時間を用量依存的様式で延長することができる抗ＦＡＰ抗体またはそれに同等なＦＡＰ結合薬剤を示す；特に実施例に従って評価されるときには実施例１３および図１５を参照のこと。
【０１３１】
これに関連して、本明細書中で使用される場合、血栓溶解剤または血栓溶解治療に対する言及は、α２−抗プラスミン（プラスミン媒介の血栓溶解を阻害する凝固因子）のＦＡＰ媒介活性化を阻害することができる抗ＦＡＰ抗体またはそれに同等なＦＡＰ結合薬剤およびその使用をそれぞれ示す；特に実施例に従って評価されるときには実施例１４および図１６を参照のこと。
【０１３２】
本発明のＦＡＰ抗体の配列はヒト対象から得られているので、本発明のＦＡＰ抗体はまた、そのような抗体が、実際には最初はヒト対象によって発現されたものであり、合成構築物、例えば、ヒト免疫グロブリンを発現するファージライブラリー（このようなファージライブラリーはこれまで、ヒト様抗体を提供しようと試みるための１つの一般的な方法を表していた）によって生じる合成構築物ではないことを強調するために、「ヒト自己抗体」または「ヒト由来抗体」と呼ばれることがある。他方で、本発明のヒト由来抗体は、プロテインＡカラムまたは親和性カラムによって精製される場合があるヒト血清抗体そのものから区別するために、合成（的）、組換え（型）および／または生物工学（的）であると示される場合がある。
【０１３３】
ペプチド
用語「ペプチド」は、その意味の範囲内において、（時には本明細書中では交換可能に使用されることがある）用語「ポリペプチド」及び用語「タンパク質」を包含することが理解される。同様に、タンパク質及びポリペプチドのフラグメントもまた包含され、タンパク質及びポリペプチドのフラグメントは本明細書中では「ペプチド」と称される場合がある。それにもかかわらず、用語「ペプチド」は好ましくは、少なくとも５個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味し、好ましくは少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味し、より好ましくは少なくとも１５個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味し、さらにより好ましくは少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味し、特に好ましくは少なくとも２５個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味する。加えて、本発明によるペプチドは典型的には、最大でも１００個の連続するアミノ酸、好ましくは８０個未満の連続するアミノ酸、より好ましくは５０個未満の連続するアミノ酸、更に好ましくは、ＦＡＰポリペプチドの最大でも１５個の連続するアミノ酸を有する。
【０１３４】
ポリペプチド
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、１つだけの「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直鎖状に連結されるモノマー（アミノ酸）から構成される分子を示す。用語「ポリペプチド」は、２個以上のアミノ酸の任意の鎖（１つ又は複数）を示し、生成物の特定の長さを示さない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は、２個以上のアミノ酸の鎖（１つ又は複数）を示すために使用される任意の他の用語が、「ポリペプチド」の定義の範囲に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、又は、これらの用語のどれとも交換可能に使用される場合がある。
【０１３５】
用語「ポリペプチド」はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、及び、知られている保護基／ブロック基、タンパク質分解的切断による誘導体化、又は、天然に存在しないアミノ酸による修飾を含めて、当該ポリペプチドの発現後修飾の産物を示すことが意図される。ポリペプチドは天然の生物学的供給源に由来してもよく、又は、組換え技術によって産生されてもよいが、指定された核酸配列から必ずしも翻訳されない。ポリペプチドは、化学合成による様式を含めて、どのような様式において作製されてもよい。
【０１３６】
本発明のポリペプチドは、約３個以上のアミノ酸のサイズ、５個以上のアミノ酸のサイズ、１０個以上のアミノ酸のサイズ、２０個以上のアミノ酸のサイズ、２５個以上のアミノ酸のサイズ、５０個以上のアミノ酸のサイズ、７５個以上のアミノ酸のサイズ、１００個以上のアミノ酸のサイズ、２００個以上のアミノ酸のサイズ、５００個以上のアミノ酸のサイズ、１，０００個以上のアミノ酸、又は、２，０００個以上のアミノ酸のサイズである場合がある。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有する場合があるが、ポリペプチドはそのような構造を必ずしも有さない。規定された三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれたとして示される。規定された三次元構造を有するのではなく、むしろ、非常に多数の異なる立体配座を取ることができるポリペプチドは、折り畳まれていないとして示される。本明細書中で使用される場合、糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基（例えば、セリン残基又はアスパラギン残基）の酸素含有側鎖又は窒素含有側鎖を介して当該タンパク質に結合する少なくとも１つの炭水化物成分に連結されるタンパク質を示す。
【０１３７】
「単離された」ポリペプチドあるいはそのフラグメント、変異体又は誘導体によって、その天然の環境に存在していないポリペプチドが意図される。特定の精製レベルは何ら要求されない。例えば、単離されたポリペプチドはそのネイティブ環境又は天然の環境から取り出され得る。宿主細胞において発現される組換え産生されたポリペプチド及びタンパク質は、任意の好適な技術によって分離されているか、分画されているか、あるいは、部分的又は実質的に精製されているネイティブポリペプチド又は組換えポリペプチドのように、本発明の様々な目的のために単離されていると見なされる。
【０１３８】
「組換え（の）ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質」は、組換えＤＮＡ技術によって産生される、すなわち、所望されるペプチドを含む融合タンパク質をコードする外因性の組換えＤＮＡ発現構築物によって形質転換される細胞（微生物細胞又は哺乳動物細胞）から産生される、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を示す。ほとんどの細菌培養物において発現されるタンパク質又はペプチドは典型的にはグリカンを含まないであろう。酵母において発現されるタンパク質又はペプチドは、哺乳動物細胞において発現されるものとは異なるグリコシル化パターンを有する場合がある。
【０１３９】
本発明のポリペプチドとして、前記ポリペプチドのフラグメント、誘導体、アナログ又は変異体、及びそれらの任意の組合せも含まれる。用語「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」及び「アナログ」には、天然ペプチドのアミノ酸配列に十分に類似するアミノ酸配列を有するペプチド及びポリペプチドが含まれる。用語「十分に類似する」は、第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列が共通の構造的ドメイン及び／又は共通の機能的活性を有するように、第２のアミノ酸配列に対する十分な数又は最小数の同一アミノ酸残基又は等価なアミノ酸残基を含有する第１のアミノ酸配列を意味する。例えば、共通の構造的ドメインを含むアミノ酸配列で、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は少なくとも約１００％が同一であるアミノ酸配列は、十分に類似するとして本明細書中では定義される。好ましくは、変異体は、本発明の好ましいペプチドのアミノ酸配列に、特に、ＦＡＰ変異体、誘導体又はアナログのアミノ酸配列に十分に類似しているであろう。そのような変異体は一般に、本発明のペプチドの機能的活性を保持する。変異体には、１つ又は複数のアミノ酸欠失、アミノ酸付加及び／又はアミノ酸置換によって生来型ペプチド及びｗｔ型ペプチドとはアミノ酸配列においてそれぞれ異なるペプチドが含まれる。これらは、天然に存在する変異体、ならびに、人為的に設計された変異体である場合がある。
【０１４０】
さらに、用語「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」及び「アナログ」は、本発明の抗体又は抗体ポリペプチドに言及するときには、対応する生来型の結合性分子、抗体又はポリペプチドの抗原結合特性の少なくとも一部を保持するどのようなポリペプチドも含まれる。本発明のポリペプチドのフラグメントには、本明細書中の他のところで議論される具体的な抗体フラグメントに加えて、タンパク質分解的フラグメント、ならびに、欠失フラグメントが含まれる。本発明の抗体及び抗体ポリペプチドの変異体には、上記で記載されるようなフラグメント、及び、アミノ酸の置換、欠失又は挿入に起因する変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。変異体は天然に存在している場合があり、又は、天然に存在していない場合がある。天然に存在していない変異体は、この技術分野において知られている変異誘発技術を使用して作製される場合がある。変異体ポリペプチドは、保存的又は非保存的なアミノ酸置換、アミノ酸欠失又はアミノ酸付加を含む場合がある。ＦＡＰ特異的な結合性分子の誘導体、例えば、本発明の抗体、抗体ポリペプチド、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）の誘導体は、生来型ポリペプチドに対して見出されないさらなる特徴を示すように変化させられているポリペプチドである。例には、融合タンパク質が挙げられる。変異体ポリペプチドは、本明細書中では「ポリペプチドアナログ」として示される場合もある。本明細書中で使用される場合、結合性分子もしくはそのフラグメント、抗体、抗体ポリペプチド又はＣＡＲの「誘導体」は、官能側鎖基の反応によって化学的に誘導体化される１つ又は複数の残基を有する当該ポリペプチドを示す。また、「誘導体」として、２０個の標準的アミノ酸の１つ又は複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するそのようなペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシｐｒｏリンがｐｒｏリンの代わりに使用されてもよい；５−ヒドロキシリシンがリシンの代わりに使用されてもよい；３−メチルヒスチジンがヒスチジンの代わりに使用されてもよい；ホモセリンがセリンの代わりに使用されてもよい；また、オルニチンがリシンの代わりに使用されてもよい。
【０１４１】
分子の類似性及び／又は同一性の決定：
２つのペプチドの間における「類似性」が、一方のペプチドのアミノ酸配列を第２のペプチドの配列に対して比較することによって求められる。一方のペプチドのアミノ酸が同一であるか、又は、保存的なアミノ酸置換であるならば、一方のペプチドのアミノ酸は第２のペプチドの対応するアミノ酸と類似している。保存的な置換には、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．編、Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７８））に記載される置換、及び、Ａｒｇｏｓ、ＥＭＢＯ  Ｊ．８（１９８９）、７７９〜７８５に記載される置換が含まれる。例えば、下記の群の１つに属するアミノ酸は、保存的な変化又は置換を表す：−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；及び、−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
【０１４２】
２つのポリヌクレオチドの間における「類似性」が、一方のポリヌクレオチドの核酸配列を所与のポリヌクレオチドの配列に対して比較することによって求められる。一方の核酸が同一であるならば、又は、核酸がコード配列の一部である場合、当該核酸を含むそれぞれのトリプレットが、同じアミノ酸又は保存的なアミノ酸置換をコードするならば、一方のポリヌクレオチドの核酸は第２のポリヌクレオチドの対応する核酸と類似している。
【０１４３】
２つの配列の間におけるパーセント同一性又はパーセント類似性の決定が好ましくは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５８７７）の数学的アルゴリズムを使用して達成される。そのようなアルゴリズムが、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において利用可能なＡｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０）のＢＬＡＳＴｎプログラム及びＢＬＡＳＴｐプログラムに組み込まれる。
【０１４４】
パーセント同一性又はパーセント類似性の決定が、ＮＣＢＩのウエブページで推奨されるような、また、特定の長さ及び組成の配列に関しての「ＢＬＡＳＴ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ」に記載されるような、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索についてはＢＬＡＳＴｎプログラムの標準的なパラメーター、ＢＬＡＳＴタンパク質検索についてはＢＬＡＳＴｐプログラムの標準的なパラメーターを用いて行われる。ＢＬＡＳＴポリヌクレオチド検索が、ＢＬＡＳＴｎプログラムを用いて行われる。
【０１４５】
一般的なパラメーターについては、「Ｍａｘ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ボックスが１００に設定される場合があり、「Ｓｈｏｒｔ  ｑｕｅｒｉｅｓ」ボックスにチェックが入れられる場合があり、「Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」ボックスが１０００に設定される場合があり、「Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ」ボックスが７に設定される場合があり、これらはＮＣＢＩのウエブページにおいて短い配列（２０塩基未満）について推奨される通りである。より長い配列については、「Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」ボックスが１０に設定される場合があり、「Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ」ボックスが１１に設定される場合がある。スコア化パラメーターについては、「Ｍａｔｃｈ／ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｓｃｏｒｅｓ」が、１、−２に設定される場合があり、「Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ」ボックスが直線に設定される場合がある。フィルター及びマスキングパラメーターについては、「Ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ」ボックスにチェックが入れられない場合があり、「Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ」ボックスにチェックが入れられない場合があり、「Ｍａｓｋ  ｆｏｒ  ｌｏｏｋｕｐ  ｔａｂｌｅ  ｏｎｌｙ」ボックスにチェックが入れられる場合があり、「ＤＵＳＴ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｓｅｔｔｉｎｇｓ」にチェックが入れられる場合があり、「Ｍａｓｋ  ｌｏｗｅｒ  ｃａｓｅ  ｌｅｔｔｅｒｓ」ボックスにチェックが入れられない場合がある。一般に、「Ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｈｏｒｔ  ｎｅａｒｌｙ  ｅｘａｃｔ  ｍａｔｃｈｅｓ」がこの点に関して使用される場合があり、これにより、上記で示された設定のほとんどが提供される。この点に関してのさらなる情報は、ＮＣＢＩのウエブページで公開される「ＢＬＡＳＴ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ」に見出される場合がある。
【０１４６】
ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴｐプログラムを用いて行われる。一般的なパラメーターについては、「Ｍａｘ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ボックスが１００に設定される場合があり、「Ｓｈｏｒｔ  ｑｕｅｒｉｅｓ」ボックスにチェックが入れられる場合があり、「Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」ボックスが１０に設定される場合があり、「Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ」ボックスが「３」に設定される場合がある。スコア化パラメーターについては、「Ｍａｔｒｉｘ」ボックスが「ＢＬＯＳＵＭ６２」に設定される場合があり、「Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ」ボックスが「Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１」に設定される場合があり、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ”ボックスが“Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ”に設定される場合がある。フィルター及びマスキングパラメーターについては、“Ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ」ボックスにチェックが入れられない場合があり、「Ｍａｓｋ  ｆｏｒ  ｌｏｏｋｕｐ  ｔａｂｌｅ  ｏｎｌｙ」ボックスにチェックが入れられない場合があり、「Ｍａｓｋ  ｌｏｗｅｒ  ｃａｓｅ  ｌｅｔｔｅｒｓ」ボックスにチェックが入れられない場合がある。
【０１４７】
両方のプログラムの改変、例えば、検索された配列の長さに関しての改変は、ＮＣＢＩのウエブページにおいてＨＴＭＬ版及びＰＤＦ版で公開される「ＢＬＡＳＴ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ」における推奨に従って行われる。
【０１４８】
ポリヌクレオチド：
用語「ポリヌクレオチド」は、１つだけの核酸ならびに複数の核酸を包含することが意図され、単離された核酸分子又は核酸構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を示す。ポリヌクレオチドは、従来型のホスホジエステル結合又は非従来型の結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見出されるアミド結合など）を含む場合がある。用語「核酸」は、ポリヌクレオチドに存在するいずれかの１つ又は複数の核酸セグメント（例えば、ＤＮＡフラグメント又はＲＮＡフラグメント）を示す。「単離された」核酸又はポリヌクレオチドによって、そのネイティブ環境から取り出されている核酸分子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が意図される。例えば、ベクターに含有される、抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の様々な目的のために単離されていると見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種の宿主細胞において維持される組換えポリヌクレオチド、又は、溶液における（部分的又は実質的に）精製されたポリペプチドが含まれる。単離されたＲＮＡ分子には、本発明のポリヌクレオチドのインビボＲＮＡ転写物又はインビトロＲＮＡ転写物が含まれる。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸にはさらに、合成的に作製されるそのような分子が含まれる。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、調節エレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位又は転写ターミネーターなどである場合があり、あるいは、調節エレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位又は転写ターミネーターなどを包含する場合がある。
【０１４９】
本明細書中で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないにもかかわらず、コード領域の一部であると見なされる場合があるが、近接配列はどれも、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどはコード領域の一部ではない。本発明の２つ以上のコード領域を、１つのポリヌクレオチド構築物において、例えば、１つのベクターに存在させることができ、又は、別個のポリヌクレオチド構築物において、例えば、別個の（異なる）ベクターに存在させることができる。さらには、ベクターはどれも、１つだけのコード領域を含有する場合があり、又は、２つ以上のコード領域を含む場合があり、例えば、１つのベクターが免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードする場合がある。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、結合性分子、抗体、あるいは、そのフラグメント、変異体、ＣＡＲ又は誘導体をコードする核酸に融合されて、又は融合されずに、異種のコード領域をコードする場合がある。異種のコード領域には、限定されないが、特殊化されたエレメント又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種の機能的ドメインなどが含まれる。
【０１５０】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは通常、１つ又は複数のコード領域と操作可能に連係させられるプロモーターならびに／あるいは他の転写制御エレメント又は翻訳制御エレメントを含む場合がある。操作可能連係は、遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）のためのコード領域が、当該遺伝子産物の発現を当該調節配列の影響下又は制御下に置くような様式で１つ又は複数の調節配列と連係させられるときにおいてである。２つのＤＮＡフラグメント（例えば、ポリペプチドコード領域及びそれと連係させられるプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘導により、所望される遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が生じるならば、また、これら２つのＤＮＡフラグメントの間における連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現調節配列の能力を妨げないか、又は、転写されるＤＮＡテンプレートの能力を妨げないならば、「操作可能に連係させられる」又は「操作可能に連結される」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写を達成することができたならば、ポリペプチドをコードする核酸と操作可能に連係させられているであろう。プロモーターは、ＤＮＡの実質的な転写を所定の細胞においてのみ導く細胞特異的なプロモーターである場合がある。プロモーターのほかに、他の転写制御エレメントを、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルを、細胞特異的な転写を導くためにポリヌクレオチドと操作可能に連係させることができる。好適なプロモーター及び他の転写制御領域が本明細書中に開示される。
【０１５１】
様々な転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、サイトメガロウイルス由来のプロモーターセグメント及びエンハンサーセグメント（前初期プロモーター、イントロンＡとの併用で）、シミアンウイルス４０由来のプロモーターセグメント及びエンハンサーセグメント（初期プロモーター）、ならびに、レトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーターセグメント及びエンハンサーセグメントなど（これらに限定されない）が含まれる。他の転写制御領域には、脊椎動物の遺伝子（例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ−グロビンなど）に由来する転写制御領域ならびに遺伝子発現を真核生物細胞において制御することができる他の配列が含まれる。さらなる好適な転写制御領域には、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、ならびに、リンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロン又はインターロイキンによって誘導可能であるプロモーター）が含まれる。
【０１５２】
同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン及び翻訳終結コドン、ならびに、ピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位、すなわち、ＩＲＥＳ、これはまたＣＩＴＥ配列とも称する）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５３】
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。
【０１５４】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードし、これにより、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を導くさらなるコード領域と連係させられる場合がある。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を横断する成長途中のタンパク質鎖の移行が開始されると、成熟型タンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは一般に、当該ポリペプチドのＮ末端に融合されるシグナルペプチドで、当該ポリペプチドの分泌型形態又は「成熟型」形態をもたらすために、完全なポリペプチド又は「全長」のポリペプチドから切断されるシグナルペプチドを有することを承知している。特定の実施形態において、生来型のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン軽鎖のシグナルペプチドが使用されるか、又は、操作可能に連係させられるポリペプチドの分泌を導く能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。代替では、異種の哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体が使用されてもよい。例えば、野生型のリーダー配列がヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列により置き換えられる場合がある。
【０１５５】
「結合性分子」又は「ＦＡＰ結合剤」は、本発明に関連して使用される場合、主として抗体、ＣＡＲｓ、それらのフラグメントに関し、しかし、ＦＡＰに結合する他の非抗体分子を示す場合もあり、これらには、ホルモン、受容体、リガンド、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、シャペロン（例えば、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）など）、ならびに、細胞・細胞接着分子（例えば、カドヘリンスーパーファミリー、インテグリンスーパーファミリー、Ｃ型レクチンスーパーファミリー及び免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーなど）が含まれるが、これらに限定されない。したがって、明瞭性だけのために、また、本発明の範囲を限定することなく、下記の実施形態のほとんどが、治療剤及び診断剤を開発するための好ましい結合性分子を代表する抗体及び抗体様分子、特にＣＡＲｓに関して議論される。
【０１５６】
抗体：
用語「抗体」及び用語「免疫グロブリン」は本明細書中では交換可能に使用される。抗体又は免疫グロブリンは、重鎖の可変ドメインを少なくとも含み、かつ、通常の場合には重鎖及び軽鎖の可変ドメインを少なくとも含む結合性分子である。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は比較的よく理解されている（例えば、Ｈａｒｌｏｗ他、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）を参照のこと）。
【０１５７】
より詳しく下記で議論されるように、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に識別することができる様々な幅広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として、それらの中のいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）を伴って分類されることを理解するであろう。抗体の「クラス」を、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ又はＩｇＥとしてそれぞれ決定するのが、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などが十分に特徴づけられており、また、機能的な特殊化を与えることが知られている。これらのクラス及びアイソタイプのそれぞれの改変された型が、本開示を考慮して当業者には容易に認識可能であり、従って、本発明の範囲内である。すべての免疫グロブリンクラスが明らかに本発明の範囲内であり、下記の議論は一般に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関する。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量がおよそ２３，０００ダルトンである２つの同一の軽鎖ポリペプチドと、分子量が５３，０００〜７０，０００である２つの同一の重鎖ポリペプチドとを含む。これら４つの鎖は典型的には、軽鎖が、「Ｙ」字型の口部から始まり、可変領域の終わりまで続く腕木として重鎖を支える「Ｙ」字型の立体配置でジスルフィド結合によって結合される。
【０１５８】
軽鎖はカッパ又はラムダ（κ、λ）のどちらかとして分類される。それぞれの重鎖クラスがカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖のどちらかと結合し得る。一般には、免疫グロブリンが、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、又は、遺伝子操作された宿主細胞のどれかによって生じるとき、軽鎖及び重鎖は互いに共有結合により結合し、２つの重鎖の「テール」部分が共有結合性のジスルフィド連結又は非共有結合性の連結によって互いに結合する。重鎖において、アミノ酸配列が、Ｙ字型の立体配置の二叉末端におけるＮ末端から、それぞれの鎖の底部におけるＣ末端にまで延びる。
【０１５９】
軽鎖及び重鎖はともに、構造的及び機能的に相同的である領域に分けられる。用語「定常」及び「可変」が機能的に使用される。これに関連して、軽鎖部分及び重鎖部分の両方の可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）により、抗原認識及び特異性が決定されることが理解されるであろう。逆に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）により、様々な重要な生物学的性質、例えば、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合及び補体結合などが与えられる。慣例によって、定常領域ドメインの番号づけは、これらのドメインが抗体の抗原結合部位又はアミノ末端からより遠位になるにつれて大きくなる。Ｎ末端部分が可変領域であり、Ｃ末端部分が定常領域である；ＣＨ３ドメイン及びＣＬドメインが実際に、重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端をそれぞれ含む。
【０１６０】
上記で示されるように、可変領域により、抗体は抗原上のエピトープを選択的に認識し、かつ、このエピトープと特異的に結合することができる。すなわち、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメイン、又は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、三次元の抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この四元抗体構造が、Ｙ字型のそれぞれのアームの端部に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位がＶＨ鎖及びＶＬ鎖のそれぞれにおける３つのＣＤＲによって規定される。ＦＡＰに特異的に結合するための十分な構造を含有する抗体又は免疫グロブリンフラグメントはどれも、本明細書中では交換可能に、「結合フラグメント」又は「免疫特異性フラグメント」として示される。
【０１６１】
天然に存在する抗体において、抗体は、抗体がその三次元立体配置を水性環境において取るような抗原結合ドメインを形成するために特異的に配置されるアミノ酸の短い不連続な配列である６つの超可変領域（これらは時には、それぞれの抗原結合ドメインに存在する「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる）を含む。「ＣＤＲ」には、分子間の変動性をそれほど示さない４つの比較的保存された「フレームワーク」領域又は「ＦＲ」が近接する。これらのフレームワーク領域は主としてβ−シートの立体配座を取り、ＣＤＲにより、このβ−シート構造をつなぐ、また、時にはこのβ−シート構造の一部を形成するループが形成される。したがって、フレームワーク領域は、ＣＤＲを鎖間の非共有結合性の相互作用によって正しい配向で配置することを提供する足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインにより、免疫反応性抗原におけるエピトープに対して相補的な表面が規定される。この相補的な表面は、抗体がその同種エピトープに非共有結合的に結合することを促進させる。ＣＤＲ及びフレームワーク領域を構成するアミノ酸が、それらは正確に規定されているので、当業者によっていずれかの所与の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域についてそれぞれ容易に特定され得る；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｋａｂａｔ，Ｅ．他編、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９８３）、及び、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）、９０１〜９１７を参照のこと。
【０１６２】
この技術分野において使用される、及び／又は受け入れられる用語の２つ以上の定義が存在する場合には、本明細書中で使用されるような当該用語の定義は、反するようなことが明示的に言及される場合を除き、すべてのそのような意味を包含することが意図される。具体的な一例が、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域の中に見出される不連続な抗原結合部位を記述するための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。この特定の領域が、Ｋａｂａｔ他、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって、また、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）、９０１〜９１７によって記載されており（これらは参照によって本明細書中に組み込まれる）、この場合、それらの定義は、互いに比較されたときにはアミノ酸残基の重複又はサブセットを包含する。それにもかかわらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを示すためのどちらかの定義の適用は、本明細書中で定義され、かつ使用されるようなこの用語の範囲内であることが意図される。上記で引用された参考文献のそれぞれによって定義されるようなＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基が、比較として下記において表Ｉに示される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及びサイズに依存して変わる。当業者は、どの残基が、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられる抗体のヒトＩｇＧサブタイプの特定の超可変領域又はＣＤＲを含むかを常法により決定することができる。
【表１】
2018035137.tif 000002
１表ＩにおけるすべてのＣＤＲ定義の番号表記は、Ｋａｂａｔ他によって示される番号表記慣例に従う（下記を参照のこと）。
【０１６３】
Ｋａｂａｔ他はまた、どのような抗体に対しても適用可能である可変ドメイン配列のための番号表記システムを定義した。当業者は、「Ｋａｂａｔ番号表記」のこのシステムを、配列そのものを超える実験的データに何ら頼ることなく、どのような可変ドメイン配列に対してでも一義的に割り当てることができる。本明細書中で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号表記」は、Ｋａｂａｔ他、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって示される番号表記システムを示す。別途指定される場合を除き、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体における具体的なアミノ酸残基位置の番号表記に対する言及は、Ｋａｂａｔ番号表記システムに従っており、しかしながら、Ｋａｂａｔ番号表記システムは理論的であり、本発明のどの抗体にも等しく適用されない場合がある。例えば、最初のＣＤＲの位置に依存して、その後のＣＤＲはどちらかの方向でずれる場合がある。
【０１６４】
本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、免疫特異性フラグメント、変異体又は誘導体には、ポリクローナル性、モノクローナル性、多特異性、ヒト型、ヒト化型、霊長類化型、マウス化型又はキメラ型の抗体、単鎖抗体、エピトープ結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２）、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬドメイン又はＶＨドメインのどちらかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作製されるフラグメント、ならびに、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書中に開示される抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が含まれるが、これらに限定されない。ｓｃＦＶ分子がこの技術分野では知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載される。本発明の免疫グロブリン分子又は抗体分子は、免疫グロブリン分子のどのようなタイプのものも（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、どのようなクラスのものも（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はどのようなサブクラスのものも可能である。
【０１６５】
１つの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、免疫特異的なフラグメント、変異体もしくは誘導体にはさらに、二重特異性抗体、三機能性抗体、テトラボディー、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲイジャー（ＢｉＫＥ）、二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）およびＤｕｏＢｏｄｙが含まれるが、それらに限定されない；これらはすべてが、この技術分野ではよく知られており、記載されている（上記で引用される文書を参照のこと）。したがって、この実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、免疫特異的なフラグメント、変異体もしくは誘導体は、ＦＡＰに結合するだけではなく、少なくとも１つのさらなるエピトープ／標的にも結合する。好ましい実施形態において、ＦＡＰに加えて、本発明の抗体は細胞死受容体５（ＤＲ５）またはＣＤ３に結合する。
【０１６６】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、五価構造を有するＩｇＭ又はその誘導体ではない。特に、本発明の具体的な適用において、とりわけ治療的使用において、ＩｇＭはＩｇＧ及び他の二価抗体又は対応する結合性分子よりも有用でない。これは、ＩｇＭは、その五価構造のために、また、親和性成熟化の欠如のために、非特異的な交差反応性及び非常に低い親和性を示すことが多いからである。
【０１６７】
特に好ましい実施形態において、本発明の抗体はポリクローナル抗体でない。すなわち、本発明の抗体は、血漿の免疫グロブリンサンプルから得られる混合物ではなく、むしろ、１つの特定の抗体種から実質的になる。
【０１６８】
単鎖抗体を含めて、抗体フラグメントは、可変領域（１つ又は複数）を単独で、あるいは、下記の全体又は一部分との組合せで含む場合がある：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン。また、本発明には、可変領域（１つ又は複数）と、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインとのどのような組合せをも含むＦＡＰ結合フラグメントが含まれる。本発明の抗体又はその免疫特異性フラグメントは、鳥類及び哺乳動物を含めて、どのような動物起源に由来してもよい。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ又はニワトリの抗体である。別の実施形態において、可変領域が起源において（例えば、サメからの）コンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）である場合がある。
【０１６９】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、ヒトから単離されるヒトモノクローナル抗体である。場合により、ヒト抗体のフレームワーク領域がデータベースにおける該当するヒト生殖系列可変領域配列に従ってアライメントされ、それらと一致させられる；例えば、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）によって提供されるＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を参照のこと。例えば、真の生殖系列配列から潜在的に逸脱すると見なされるアミノ酸は、クローニング過程の期間中に組み込まれるＰＣＲプライマー配列に起因し得ると思われる。人為的に作製されたヒト様抗体、例えば、ファージディスプレーされた抗体ライブラリー又は異種マウスに由来する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦＶ）などと比較した場合、本発明のヒトモノクローナル抗体は、（ｉ）代理動物の免疫応答ではなく、ヒトの免疫応答を使用して得られること、すなわち、抗体が、ヒト体内におけるその関連する立体配座における天然のＦＡＰに対する応答で作製されていること、（ｉｉ）個体を保護しているか、あるいは、ＦＡＰの存在について少なくとも有意であること、そして、（ｉｉｉ）抗体がヒト起源であるので、自己抗原に対する交差反応性の危険性が最小限に抑えられることによって特徴づけられる。したがって、本発明によれば、用語「ヒトモノクローナル抗体」、「ヒトモノクローナル自己抗体」及び「ヒト抗体」などは、ヒト起源である、すなわち、ヒト細胞（例えば、Ｂ細胞又はそのハイブリドーマなど）から単離されているか、あるいは、ｃＤＮＡがヒト細胞（例えば、ヒトメモリーＢ細胞）のｍＲＮＡから直接クローン化されているＦＡＰ結合性分子を示すために使用される。ヒト抗体は、アミノ酸置換が、例えば、結合特性を改善するために、当該抗体においてたとえ行われるにしても、依然として「ヒト」である。
【０１７０】
１つの実施形態において、本発明のヒト由来抗体は、天然の存在する抗体と比較して異種の領域を含み、例えば、フレームワーク領域におけるアミノ酸置換、可変領域に外因的に融合される定常領域、及び、Ｃ末端又はＮ末端における異なるアミノ酸などを含む。
【０１７１】
ヒト免疫グロブリンライブラリーに由来する抗体、あるいは、１つ又は複数のヒト免疫グロブリンについて遺伝子組換えであり、かつ、内因性免疫グロブリンを発現しない動物に由来する抗体（下記において、また、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ他）に記載されるような抗体）は、本発明の真のヒト抗体から区別するためにヒト様抗体として示される。
【０１７２】
例えば、ヒト様抗体の重鎖及び軽鎖の対形成、例えば、ファージディスプレーから典型的には単離される合成抗体及び半合成抗体などは、その対形成が元々のヒトＢ細胞において生じていたような元の対形成を必ずしも反映していない。したがって、先行技術において一般に使用されるような組換え発現ライブラリーから得られるＦａｂフラグメント及びｓｃＦｖフラグメントは、免疫原性及び安定性に対するすべての可能な関連した影響に関して人為的であると見なされる。
【０１７３】
対照的には、本発明は、その治療的有用性及びヒトにおけるその寛容性によって特徴づけられる、選択されたヒト対象から得られる単離された親和性成熟している抗体を提供する。
【０１７４】
本明細書中で使用される場合、用語「齧歯類化（された）抗体」又は「齧歯類化（された）免疫グロブリン」は、本発明のヒト抗体に由来する１つ又は複数のＣＤＲと、齧歯類抗体配列に基づくアミノ酸の置換及び／又は欠失及び／又は挿入を含有するヒトフレームワーク領域とを含む抗体を示す。齧歯類を示すとき、好ましくは、マウス及びラットに起源を有する配列が使用され、この場合、そのような配列を含む抗体は、「マウス化された」又は「ラット化された」としてそれぞれ示される。ＣＤＲを提供するヒト免疫グロブリンは「親」又は「アクセプター」と呼ばれ、フレームワークの変化を提供する齧歯類抗体は「ドナー」と呼ばれる。定常領域は存在している必要はないが、定常領域が存在するならば、定常領域は通常、齧歯類抗体の定常領域と実質的に同一であり、すなわち、少なくとも約８５％〜９０％が同一であり、好ましくは約９５％以上が同一である。したがって、いくつかの実施形態において、全長のマウス化されたヒト重鎖免疫グロブリン又は軽鎖免疫グロブリンは、マウスの定常領域、ヒトのＣＤＲ、及び、いくつかの「マウス化する」アミノ酸置換を有する実質的にはヒトのフレームワークを含有する。典型的には、「マウス化抗体」は、マウス化された可変軽鎖及び／又はマウス化された可変重鎖を含む抗体である。例えば、マウス化抗体は、例えば、キメラ抗体の可変領域全体が非マウス性であるので、典型的なキメラ抗体を包含しないであろう。「マウス化」のプロセスによって「マウス化」されている改変された抗体は、ＣＤＲを提供する親抗体と同じ抗原に結合し、かつ、通常の場合、マウスにおける免疫原性が、親抗体と比較してより低い。「マウス化」抗体に関しての上記説明は、他の「齧歯類化」抗体について、例えば、ラットの配列がマウスの代わりに使用される「ラット化抗体」などについて同様に当てはまる。
【０１７５】
本明細書中で使用される場合、用語「重鎖部分」には、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中央及び／又は下部のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインあるいはそれらの変異体又はフラグメントのうちの少なくとも１つを含む。例えば、本発明において使用されるための結合性ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、及び、ＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、及び、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；又は、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む場合がある。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明において使用されるための結合性ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部分（例えば、ＣＨ２ドメインのすべて又は一部）を欠く場合がある。上記で示されるように、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）は、天然に存在する免疫グロブリン分子からアミノ酸配列において異なるように改変され得ることが、当業者によって理解されるであろう。
【０１７６】
本明細書中に開示されるある特定の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体において、マルチマーの１つのポリペプチド鎖の重鎖部分が、当該マルチマーの第２のポリペプチド鎖における重鎖部分と同一である。代替では、本発明の重鎖部分を含有するモノマーは同一でない。例えば、それぞれのモノマーが、異なる標的結合部位を含む場合があり、これにより、例えば、二重特異性抗体又はディアボディを形成する。
【０１７７】
別の実施形態において、本明細書中に開示される抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、ただ１つのポリペプチド鎖から構成され（例えば、ｓｃＦｖ）、潜在的なインビボ治療適用及び診断適用のために細胞内で発現させられることになる（細胞内抗体）。
【０１７８】
本明細書中に開示される診断方法及び処置方法において使用されるための結合性ポリペプチドの重鎖部分が、異なる免疫グロブリン分子に由来してもよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部分が、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域とを含む場合がある。別の例において、重鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、かつ、一部がＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例において、重鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、かつ、一部がＩｇＧ４分子に由来するキメラなヒンジを含むことができる。
【０１７９】
本明細書中で使用される場合、用語「軽鎖部分」には、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。好ましくは、軽鎖部分はＶＬドメイン又はＣＬドメインの少なくとも一方を含む。
【０１８０】
抗体のためのペプチドエピトープ又はポリペプチドエピトープの最小サイズは約４個〜５個のアミノ酸であると考えられる。ペプチドエピトープ又はポリペプチドエピトープは好ましくは、少なくとも７個のアミノ酸を含有し、より好ましくは少なくとも９個のアミノ酸を含有し、最も好ましくは少なくとも約１５個〜約３０個の間のアミノ酸を含有する。ＣＤＲは抗原性のペプチド又はポリペプチドをその三次形態で認識することができるので、エピトープを含むアミノ酸は連続している必要はなく、場合により、同じペプチド鎖に存在していないことさえある。本発明において、本発明の抗体によって認識されるペプチドエピトープ又はポリペプチドエピトープは、ＦＡＰの少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、又は、約１５個〜約３０個の間の連続するアミノ酸又は非連続なアミノ酸の配列を含有する。
【０１８１】
上記で示されたように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び三次元立体配置が広く知られている。本明細書中で使用される場合、用語「ＶＨドメイン」には、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインが含まれ、用語「ＣＨ１ドメイン」には、免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ末端側の）定常領域ドメインが含まれる。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接しており、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端側である。
【０１８２】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＨ２ドメイン」には、従来の番号表記スキームを使用して、例えば、抗体のおよそ残基２４４から残基３６０にまで広がる重鎖分子の一部分が含まれる（残基２４４〜残基３６０、Ｋａｂａｔ番号表記システム；残基２３１〜残基３４０、ＥＵ番号表記システム；Ｋａｂａｔ  ＥＡ他（前掲書中）を参照のこと）。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密に対形成しないという点で独特である。むしろ、２つのＮ−連結している分岐した炭水化物鎖が、無傷の生来型ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に置かれる。ＣＨ３ドメインがＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ末端にまで広がり、およそ１０８残基を含むこともまた広く記録されている。
【０１８３】
本明細書中で使用される場合、用語「ヒンジ領域」には、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインにつなぐ重鎖分子の一部分が含まれる。このヒンジ領域はおよそ２５残基を含み、かつ、柔軟であり、したがって、２つのＮ末端の抗原結合領域が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は３つの異なったドメイン（上部、中央及び下部のヒンジドメイン）に細分化することができる（Ｒｏｕｘ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（１９９８）、４０８３〜４０９０を参照のこと）。
【０１８４】
本明細書中で使用される場合、用語「ジスルフィド結合」には、２つのイオウ原子の間に形成される共有結合性の結合が含まれる。アミノ酸のシステインは、ジスルフィド結合を形成することができるか、又は、第２のチオール基と架橋することができるチオール基を含む。ほとんどの天然に存在するＩｇＧ分子において、ＣＨ１領域及びＣＬ領域がジスルフィド結合によって連結され、２つの重鎖が、Ｋａｂａｔ番号表記システムを使用して２３９位及び２４２位（２２６位又は２２９位、ＥＵ番号表記システム）に対応する位置での２つのスルフィド結合によって連結される。
【０１８５】
本明細書中で使用される場合、用語「連結される」、「融合される」又は「融合」は交換可能に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲート化又は組換え手段を含むどのような手段によってでも、２つ以上の要素又は成分を一緒につなぐことを示す。「インフレーム融合」は、２つ以上のポリヌクレオチド・オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、これらの元々のＯＲＦの正しい翻訳読み枠を維持する様式で、連続したより長いＯＲＦを形成するためにつなぐことを示す。したがって、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含有する単一タンパク質である（そのようなセグメントは通常、自然界ではそのようにつながれない）。したがって、読み枠が、融合されたセグメントの全体にわたって連続にされるにもかかわらず、これらのセグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的又は空間的に隔てられる場合がある。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドが、インフレーム融合される場合があり、しかし、「融合された」ＣＤＲが、連続したポリペプチドの一部として共翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域又はさらなるＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって隔てられる場合がある。
【０１８６】
用語「発現」は、本明細書中で使用される場合、遺伝子が生化学物質（例えば、ＲＮＡ又はポリペプチド）をもたらすプロセスを示す。このプロセスには、限定されないが、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現及び安定的発現の両方を含めて、細胞内における遺伝子の機能的な存在のどのような顕在化も含まれる。このプロセスには、限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小さいヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小さい干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は何らかの他のＲＮＡ産物への遺伝子の転写、及び、ポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳が含まれる。最終的な所望される産物が生化学物質であるならば、発現には、そのような生化学物質及び何らかの前駆体を生じさせることが含まれる。遺伝子の発現により、「遺伝子産物」がもたらされる。本明細書中で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ、又は、転写物から翻訳されるポリペプチドのどちらもが可能である。本明細書中に記載される遺伝子産物にはさらに、転写後修飾（例えば、ポリアデニル化）を伴う核酸、又は、翻訳後修飾（例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、及び、タンパク質分解的切断など）を伴うポリペプチドが含まれる。
【０１８７】
本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」は、対象または患者から得られるどのような生物学的材料をも示す。１つの局面において、サンプルは、血液、腹腔液、ＣＳＦ、唾液または尿を含むことができる。別の局面において、サンプルは、全血、血漿、血清、血液サンプルから富化されるＢ細胞、および、培養された細胞（例えば、対象からのＢ細胞）を含むことができる。サンプルにはまた、神経組織を含む生検サンプルまたは組織サンプルが含まれ得る。さらに他の局面において、サンプルは、細胞全体および／または細胞の溶解物を含むことができる。血液サンプルを、この技術分野において知られている様々な方法によって採取することができる。１つの局面において、ペレットを、２００μｌの緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ．７．５）、０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ＩＸ  Ｓｉｇｍａプロテアーゼ阻害剤、ならびに、ＩＸ  Ｓｉｇｍａホスファターゼ阻害剤１および２）において４℃でボルテックス撹拌することによって再懸濁することができる。懸濁物は、断続的なボルテックス撹拌を行いながら２０分間、氷上に保つことができる。１５，０００×ｇにおける５分間の約４℃での遠心分離を行った後、上清の小分け物を約−７０℃で貯蔵することができる。
【０１８８】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）：
本明細書中で使用される場合、用語「キメラ抗原受容体」および用語「ＣＡＲ」はそれぞれ、組換えポリペプチド構築物、たとえば、細胞外の抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、下記で定義されるような刺激性分子に由来する機能的なシグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメインとを含む融合タンパク質を示す。したがって、ＣＡＲは概して、抗原結合ドメイン／領域を、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変領域の単鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）を、膜を貫通する細胞内シグナル伝達ドメインに融合することによって作製される；例えば、ＣＡＲ構造の概略図については、 Ｄａｉ他（Ｄａｉ他、ＪＮＣＩ  Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．１０８（２０１６）、１〜１５：ｄｊｖ４３９）の図１を参照のこと）。１つの実施形態において、刺激性分子は、Ｔ細胞受容体複合体と会合するゼータ鎖である。１つの実施形態において、細胞質シグナル伝達ドメインはさらに、下記で定義されるような少なくとも１つの共刺激性分子に由来する１つまたは複数の機能的なシグナル伝達ドメインを含む。１つの局面において、共刺激性分子が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、および、どのような組合せであれ、これらの組合せからなる群から選ばれる。別途示される場合を除き、国際特許出願公開ＷＯ２０１４／０５５４４２において定義されるようなＣＡＲの基本的構造および構成成分の定義が適用される。
１つの実施形態において、ＣＡＲは、必要に応じたリーダー配列をＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）において含む。１つの局面において、ＣＡＲはさらに、リーダー配列を細胞外の抗原認識ドメインのＮ末端において含み、この場合、リーダー配列は必要に応じて、細胞プロセシングの期間中、および、ＣＡＲが細胞膜に局在化する期間中に抗原結合ドメインから切断される。
【０１８９】
本明細書中で使用される場合、「シグナル伝達ドメイン」は、二次メッセンジャーを生じさせることによって、または、そのようなメッセンジャーに応答することによりエフェクターとして機能することによって、細胞活性を、規定されたシグナル伝達経路を介して調節するために、情報を細胞内に伝達することにより作用するタンパク質の機能的部分である。
【０１９０】
ＣＡＲ  Ｔ細胞との関連で使用される場合、用語「刺激」によって、刺激性分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）がその同族リガンドと結合し、それにより、シグナル伝達事象（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達など、これらに限定されない）を媒介することによって誘導される一次応答が意味される。刺激は、ある特定の分子の変化した発現（例えば、ＴＧＦ−βのダウンレギュレーションなど）、および／または、細胞骨格構造の再編成などを媒介することができる。
【０１９１】
「刺激性分子」は、ＣＡＲ  Ｔ細胞との関連で使用される場合、ＴＣＲ複合体の一次活性化をＴ細胞シグナル伝達経路の刺激性方向で調節する一次の細胞質シグナル伝達配列を提供するＴ細胞によって発現される分子を意味する。１つの実施形態において、一次シグナルが、例えば、ペプチドが負荷されるＭＨＣ分子とＴＣＲ／ＣＤ３複合体が結合することによって開始され、これにより、増殖、活性化および分化など（これらに限定されない）を含むＴ細胞応答の媒介が引き起こされる。刺激性様式で作用する一次の細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフ、すなわち、ＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含有する場合がある。本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有の一次の細胞質シグナル伝達配列の例には、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（これはまた、「ＩＣＯＳ」として知られている）およびＣＤ６６ｄに由来するそのような細胞質シグナル伝達配列が含まれる。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＡＲを含めて、本発明のいずれか１つまたは複数のＣＡＲ（ｓ）における細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ３−ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む。
【０１９２】
本明細書中で使用される場合、「ゼータ」あるいは代替では「ゼータ鎖」、「ＣＤ３−ゼータ」または「ＴＣＲ−ゼータ」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＢＡＧ３６６６４．１として提供されるタンパク質、または、非ヒト種（例えば、マウス、齧歯類、サルおよび類人猿など）に由来する同等な残基として定義され、「ゼータ刺激ドメイン」あるいは代替では「ＣＤ３−ゼータ刺激ドメイン」または「ＴＣＲ−ゼータ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞活性化のために必要な初期シグナルを機能的に伝えるために十分であるゼータ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基として定義される。１つの局面において、ゼータの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２〜１６４、または、その機能的なオルソログである、非ヒト種（例えば、マウス、齧歯類、サルおよび類人猿など）に由来する同等な残基を含む。
【０１９３】
「共刺激性分子」は、共刺激性リガンドと特異的に結合し、それにより、Ｔ細胞による共刺激応答（例えば、増殖など、これらに限定されない）を媒介するＴ細胞上の同族の結合パートナーを示す。共刺激性分子は、効率的な免疫応答のために要求される、抗原受容体またはそのリガンドとは異なる細胞表面分子である。共刺激性分子には、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体、ならびに、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）が含まれるが、それらに限定されない。
【０１９４】
本明細書中で使用される場合、「４−１ＢＢ」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＡ６２４７８．２として提供されるアミノ酸配列、または、非ヒト種（例えば、マウス、齧歯類、サルおよび類人猿など）に由来する同等な残基を有する、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーとして定義され、「４−１ＢＢ共刺激性ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４〜２５５、または、非ヒト種（例えば、マウス、齧歯類、サルおよび類人猿など）に由来する同等な残基として定義される。
【０１９５】
本明細書中で使用される場合、用語「連結される」、「融合される」又は「融合」は交換可能に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲート化又は組換え手段を含むどのような手段によってでも、２つ以上の要素又は成分を一緒につなぐことを示す。「インフレーム融合」は、２つ以上のポリヌクレオチド・オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、これらの元々のＯＲＦの正しい翻訳読み枠を維持する様式で、連続したより長いＯＲＦを形成するためにつなぐことを示す。したがって、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含有する単一タンパク質である（そのようなセグメントは通常、自然界ではそのようにつながれない）。したがって、読み枠が、融合されたセグメントの全体にわたって連続にされるにもかかわらず、これらのセグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的又は空間的に隔てられる場合がある。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドが、インフレーム融合される場合があり、しかし、「融合された」ＣＤＲが、連続したポリペプチドの一部として共翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域又はさらなるＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって隔てられる場合がある。
【０１９６】
用語「発現」は、本明細書中で使用される場合、遺伝子が生化学物質（例えば、ＲＮＡ又はポリペプチド）をもたらすプロセスを示す。このプロセスには、限定されないが、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現及び安定的発現の両方を含めて、細胞内における遺伝子の機能的な存在のどのような顕在化も含まれる。このプロセスには、限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小さいヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小さい干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は何らかの他のＲＮＡ産物への遺伝子の転写、及び、ポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳が含まれる。最終的な所望される産物が生化学物質であるならば、発現には、そのような生化学物質及び何らかの前駆体を生じさせることが含まれる。遺伝子の発現により、「遺伝子産物」がもたらされる。本明細書中で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ、又は、転写物から翻訳されるポリペプチドのどちらもが可能である。本明細書中に記載される遺伝子産物にはさらに、転写後修飾（例えば、ポリアデニル化）を伴う核酸、又は、翻訳後修飾（例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、及び、タンパク質分解的切断など）を伴うポリペプチドが含まれる。
【０１９７】
抗体及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）の結合特性
「特異的に結合する」又は「特異的に認識する」によって、これらは本明細書中では交換可能に使用されており、結合性分子、例えば、抗体又はＣＡＲが、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、及び、この結合は、抗原結合ドメインとエピトープとの間における何らかの相補性を伴うことが一般に意味される。この定義によれば、抗体は、抗体がランダムな無関係なエピトープに結合するであろうよりも容易にその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合するとき、そのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、ある特定の抗体又はＣＡＲがある特定のエピトープに結合する相対的な親和性を限定するために本明細書中では使用される。例えば、抗体「Ａ」は、所与のエピトープについて、抗体又はＣＡＲ「Ｂ」よりも大きい親和性を有すると見なされる場合があり、或いは、抗体又はＣＡＲ「Ａ」は、関連したエピトープ「Ｄ」について有するよりも大きい特異性によりエピトープ「Ｃ」に結合すると言われる場合がある。
【０１９８】
存在する場合、抗原との抗体又はＣＡＲの用語「免疫学的結合特性」又は他の結合特性はその文法的形態のすべてで、抗体又はＣＡＲの特異性、親和性、交差反応性及び他の結合特性を示す。
【０１９９】
「優先的に結合する」によって、結合性分子、例えば、抗体又はＣＡＲが、関連したエピトープ、類似したエピトープ、相同的なエピトープ又は類似的なエピトープに結合するであろうよりも容易にエピトープに特異的に結合することが意味される。したがって、所与のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、そのような抗体又はＣＡＲが関連のエピトープと交差反応することがあるとしても、関連のエピトープよりもそのエピトープに結合する可能性が大きいであろう。
【０２００】
非限定的な例として、結合性分子、例えば、抗体又はＣＡＲは、それが第２のエピトープについての結合性分子のＫＤよりも小さい解離定数（ＫＤ）により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。別の非限定的な例において、結合性分子は、それが第２のエピトープについての結合性分子のＫＤよりも少なくとも１桁小さい親和性により第１のエピトープと結合するならば、この第１の抗原と優先的に結合すると見なされる場合がある。別の非限定的な例において、抗体又はＣＡＲは、それが第２のエピトープについての抗原結合性分子のＫＤよりも少なくとも２桁小さい親和性により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。
【０２０１】
別の非限定的な例として、結合性分子、例えば、抗体又はＣＡＲは、それが第２のエピトープについての結合性分子のｋ（ｏｆｆ）よりも小さいオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。別の非限定的な例において、結合性分子は、それが第２のエピトープについての結合性分子のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも１桁小さい親和性により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。別の非限定的な例において、抗体又はＣＡＲは、それが第２のエピトープについての結合性分子のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも２桁小さい親和性により第１のエピトープと結合するならば、この第１のエピトープと優先的に結合すると見なされる場合がある。
【０２０２】
結合性分子、例えば、本明細書中に開示される抗体あるいは抗原結合フラグメント、変異体、ＣＡＲ又は誘導体は、５×１０−２ｓｅｃ−１以下、１０−２ｓｅｃ−１以下、５×１０−３ｓｅｃ−１以下又は１０−３ｓｅｃ−１以下であるオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））によりＦＡＰあるいはそのフラグメント、変異体又は特異的な立体配座と結合すると言われる場合がある。より好ましくは、本発明の抗体又はＣＡＲは、５×１０−４ｓｅｃ−１以下、１０−４ｓｅｃ−１以下、５×１０−５ｓｅｃ−１以下又は１０−５ｓｅｃ−１以下、５×１０−６ｓｅｃ−１以下、１０−６ｓｅｃ−１以下、５×１０−７ｓｅｃ−１以下又は１０−７ｓｅｃ−１以下であるオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））によりＦＡＰあるいはそのフラグメント、変異体又は特異的な立体配座と結合すると言われる場合がある。
【０２０３】
結合性分子、例えば、本明細書中に開示される抗体あるいは抗原結合フラグメント、変異体、ＣＡＲ又は誘導体は、１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、５×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上又は５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１以上であるオン速度（ｋ（ｏｎ））によりＦＡＰあるいはそのフラグメント、変異体又は特異的な立体配座と結合すると言われる場合がある。より好ましくは、本発明の抗体又はＣＡＲは、１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１以上、１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１以上又は５ｘ１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１以上又は１０７Ｍ−１ｓｅｃ−１以上であるオン速度（ｋ（ｏｎ））によりＦＡＰあるいはそのフラグメント、変異体又は特異的な立体配座と結合すると言われる場合がある。
【０２０４】
結合性分子、例えば、抗体又はＣＡＲは、所与のエピトープに対する参照抗体の結合をある程度阻止する程度にそのエピトープに優先的に結合するならば、そのエピトープに対する参照抗体又はＣＡＲの結合を競合的に阻害すると言われる。競合的阻害が、この技術分野において知られているいずれかの方法によって、例えば、競合的ＥＬＩＳＡアッセイによって求められてもよい。抗体又はＣＡＲは、所与のエピトープに対する参照抗体又はＣＡＲの結合を、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％又は少なくとも５０％競合的に阻害すると言われる場合がある。
【０２０５】
本明細書中で使用される場合、用語「親和性」は、結合性分子（例えば、免疫グロブリン分子又はＣＡＲ）のＣＤＲとの個々のエピトープの結合の強さの尺度を示す（例えば、Ｈａｒｌｏｗ他、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９８８）、２７頁〜２８頁を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「アビディティー」は、免疫グロブリンの集合と抗原との複合体の全般的な安定性、すなわち、抗原との免疫グロブリン混合物の機能的結合強度を示す（例えば、Ｈａｒｌｏｗ、２９頁〜３４頁を参照のこと）。アビディティーは、特異的なエピトープとの集団内の個々の免疫グロブリン分子の親和性に、及びまた、免疫グロブリン及び抗原の結合価の両方に関連づけられる。例えば、二価のモノクローナル抗体と、高度に反復するエピトープ構造を有する抗原（例えば、ポリマーなど）との間における相互作用が、高いアビディティーの１つであろう。抗原についての抗体の親和性又はアビディティーを、いずれかの好適な方法（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ他、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）を参照のこと）及び本明細書中に記載される方法を使用して実験的に求めることができる。抗原についての抗体又はＣＡＲの親和性を測定するための一般的な技術には、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及び表面プラズモン共鳴が含まれる。特定の抗体／ＣＡＲ−抗原相互作用の測定された親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）のもとで測定されるならば異なる可能性がある。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメーター（例えば、ＫＤ、ＩＣ５０）の測定は好ましくは、抗体／ＣＡＲ及び抗原の標準化された溶液ならびに標準化された緩衝液を用いて行われる。
【０２０６】
結合性分子、例えば、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体、ＣＡＲ又は誘導体はまた、それらの交差反応性に関して記載又は指定される場合がある。本明細書中で使用される場合、用語「交差反応性」は、抗体（これは１つの抗原について特異的である）が第２の抗原と反応する能力、すなわち、２つの異なる抗原性物質の間における関連度の度合いを示す。したがって、抗体は、その形成を誘導したエピトープとは異なるエピトープに結合するならば、交差反応性である。交差反応性エピトープは一般に、誘導用エピトープと同じ相補的な構造的特徴の多くを含有しており、また、場合により、実際には元のエピトープよりも良好にはまる場合がある。
【０２０７】
例えば、ある種の抗体又はＣＡＲは、関連しているが、同一でないエピトープと結合するという点で、例えば、参照エピトープに対して（この技術分野で知られている方法及び本明細書中に記載される方法を使用して計算されるように）少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％及び少なくとも５０％の同一性を有するエピトープと結合するという点で、ある程度の交差反応性を有する。抗体又はＣＡＲは、参照エピトープに対して（この技術分野で知られている方法及び本明細書中に記載される方法を使用して計算されるように）９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満及び５０％未満の同一性を有するエピトープと結合しないならば、交差反応性をほとんど有していないか、又は全く有していないと言われる場合がある。抗体又はＣＡＲは、ある特定のエピトープのどのような他のアナログ、オルソログ又はホモログとも結合しないならば、そのエピトープについて「非常に特異的」であると見なされる場合がある。
【０２０８】
結合性分子、例えば、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体、ＣＡＲ又は誘導体はまた、ＦＡＰ及び／又はそのフラグメントに対するそれらの結合親和性に関して記載又は指定される場合がある。好ましい結合親和性には、解離定数つまりＫｄが５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満又は１０−１５Ｍ未満である結合親和性が含まれる。
【０２０９】
疾患：
別途言及される場合を除き、用語「障害」および用語「疾患」は本明細書中では交換可能に使用され、どのような生理学的変化であれ、対象、動物、単離された器官、組織または細胞／細胞培養物における望まれない生理学的変化を含む。ＦＡＰ関連の疾患および障害は、下記の疾患を含むが、それらに限定されない：
【０２１０】
・増殖性疾患、これには、転移性乳ガン、結腸直腸ガン、腎臓ガン、慢性リンパ性白血病、膵臓腺ガン、ガン腫、浸潤性小葉ガン、非小細胞肺ガン、骨髄腫および腫瘍間質が含まれる。
・組織再構成および／または慢性炎症を伴う疾患（これには、線維性疾患、創傷治癒、ケロイド形成、変形性関節症、関節リウマチ、および、軟骨分解を伴う関連障害、アテローム硬化性疾患およびクローン病が含まれるが、これらに限定されない）。
・内分泌学的障害を伴う疾患（これには、グルコース代謝の障害が含まれるが、これらに限定されない）、および、血液凝固障害を伴う疾患。
・心臓血管疾患、これには、心臓障害、ならびに、循環系の血管の障害、例えば、血管における脂質の異常に高い濃度によって引き起こされる循環系の血管の障害、アテローム性動脈硬化、アテローム斑、アテローム血栓症、心筋梗塞、心臓発作、慢性肝臓疾患、脳静脈血栓症、深部静脈血栓症および肺塞栓症が含まれる。
【０２１１】
用語「ガン」および用語「腫瘍」は本明細書中では交換可能に使用されることがあり、異常な細胞の迅速かつ制御されない成長によって特徴づけられる疾患として定義される。ガン細胞は、局所的に、または血流およびリンパ系を介して身体の他の部分に拡大することができる。様々なガンの例には、乳ガン、前立腺ガン、卵巣ガン、子宮頸ガン、皮膚ガン、膵臓ガン、結腸直腸ガン、腎臓ガン、肝臓ガン、脳ガン、リンパ腫、白血病および肺ガンなどが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、ガン細胞および腫瘍細胞は、それらの細胞表面におけるＦＡＰの異常な発現によって特徴づけられる。
【０２１２】
処置：
本明細書中で使用される場合、用語「処置する」又は「処置」は治療的処置及び予防的又は防止的な対策の両方を示し、この場合、その目的が、望まれない生理学的変化又は障害（例えば、糖尿病の発症など）を防止すること又は抑制すること（緩和すること）である。有益な臨床結果又は所望される臨床結果には、検出可能であるか、又は検出不能であるかにかかわりなく、症状の緩和、疾患の程度の減弱、疾患の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延又は緩速化、疾患状態の改善又は緩和、及び、寛解（部分的又は全体的を問わず）が含まれるが、これに限定されない。「処置」はまた、処置を受けない場合の予想された生存と比較して、生存を延ばすことを意味することができる。処置を必要としている人々には、状態又は障害を既に有する人々ならびに状態又は障害を有する傾向がある人々、あるいは、状態又は障害の発現が防止されなければならない人々が含まれる。
【０２１３】
別途言及される場合を除き、用語「薬物」、「医薬」又は「医薬品」は本明細書中では交換可能に使用され、下記のすべてを包含するものとするが、それに限定されない：（Ａ）体内使用又は体外使用のための物品、医薬及び調製物、ならびに、ヒト又は他の動物のどちらかの疾患の診断、治療、緩和、処置又は防止のために使用されることが意図されるあらゆる物質又は物質の混合物；ならびに、（Ｂ）ヒト又は他の動物の身体の構造又はどのような機能に対してでも影響を及ぼすことが意図される（食物以外）の物品、医薬及び調製物；ならびに（Ｃ）条項（Ａ）及び条項（Ｂ）において指定されるあらゆる物品の成分としての使用のために意図される物品。用語「薬物」、「医薬」又は「医薬品」は、１つ又は複数の「薬剤」、「化合物」、「物質」又は「（化学的）組成物」をフィラー、崩壊剤、滑剤、流動促進剤、バインダーとして、また、何らかの他の関連では、他の医薬的に不活性な賦形剤もまた、フィラー、崩壊剤、滑剤、流動促進剤、バインダーとして含有するか、あるいは、「薬物」、「医薬」又は「医薬品」の容易な輸送、崩壊、解離、溶解及び生物学的利用性を、ヒト又は他の動物の体内の意図された標的場所（例えば、皮膚、胃内又は腸内）において保証する、ヒト又は他の動物のどちらかでの使用のために意図される調製物の完全な処方を包含するものとする。用語「薬剤」、「化合物」又は「物質」は本明細書中では交換可能に使用され、より具体的な関連では、すべての薬理学的に活性な薬剤、すなわち、本発明の方法によって所望の生物学的又は薬理学的な効果を誘発するか、あるいは、そのような可能な薬理学的効果を誘発することができることについて研究又は試験される薬剤を包含するものとするが、これらに限定されない。
【０２１４】
用語「抗腫瘍効果」は、本明細書中で使用される場合、様々な手段によって現れ得る生物学的影響を示し、これらには、腫瘍体積における減少、腫瘍細胞の数における減少、転移物の数における減少、平均余命における増大、腫瘍細胞増殖における低下、腫瘍細胞生存における低下、または、ガン性状態に伴う様々な生理学的症状の改善が含まれるが、これらに限定されない。「抗腫瘍効果」はまた、最初の場所における腫瘍の発生を防止することにおける本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、抗体およびＣＡＲの能力によって現れ得る。
【０２１５】
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」によって、診断、予後、防止又は治療が望まれるあらゆる対象、特に哺乳動物対象、例えば、ヒト患者が意味される。
【０２１６】
医薬用キャリア：
医薬的に許容されるキャリア及び投与経路を、当業者に知られている対応する文献から選ぶことができる。本発明の医薬組成物は、この技術分野において広く知られている方法に従って配合することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＩＳＢＮ０−６８３−３０６４７２）；Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２版（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、米国、２００３）；Ｂａｎｇａ、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第２版（Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ（２００６）、ＩＳＢＮ：０−８４９３−１６３０−８）を参照のこと）。好適な医薬用キャリアの例がこの技術分野では広く知られており、これらには、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水エマルションなど）、様々なタイプの湿潤化剤、無菌溶液などが含まれる。そのようなキャリアを含む組成物を、広く知られている従来の方法によって配合することができる。これらの医薬組成物は好適な用量で対象に投与することができる。好適な組成物の投与を種々の方式によって行うことができる。例には、医薬的に許容されるキャリアを含有する組成物を、経口方法、鼻腔内方法、直腸方法、局所的方法、腹腔内方法、静脈内方法、筋肉内方法、皮下方法、真皮下方法、経皮的方法、クモ膜下腔内方法及び頭蓋内方法を介して投与することが含まれる。エアロゾル配合物、例えば、鼻腔噴霧配合物などには、保存剤及び等張剤を伴う活性な薬剤の精製された水性溶液又は他の溶液が含まれる。そのような配合物は好ましくは、鼻腔粘膜と適合し得るｐＨ及び等張性状態に調節される。経口投与用の医薬組成物、例えば、単一ドメイン抗体分子（例えば、「ナノボディー（商標）」）などもまた、本発明において想定される。そのような経口配合物は、錠剤、カプセル、粉末、液体又は半固体の形態である場合がある。錠剤は、固体のキャリア、例えば、ゼラチン又はアジュバントなどを含む場合がある。直腸投与又は膣投与のための配合物が、好適なキャリアを伴う坐薬として提示される場合がある（Ｏ’Ｈａｇａｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２（９）（２００３）、７２７〜７３５もまた参照のこと）。様々なタイプの投与のために好適である配合物に関するさらなる指針を、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、第１７版（１９８５）及び対応する更新版）において見出すことができる。薬物送達のための方法の簡単な総説については、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９（１９９０）、１５２７〜１５３３を参照のこと。
【０２１７】
ＩＩ．本発明の抗体
本発明は一般には、ヒト由来抗ＦＡＰ抗体及び抗原結合フラグメント、並びに生物工学的誘導体に関連し、この場合、これらは好ましくは、実施例において例示される抗体について概略されるような免疫学的結合特性及び／又は生物学的性質を明らかにする。本発明によれば、ＦＡＰについて特異的であるヒトモノクローナル抗体が、健康なヒト対象のプールからクローン化された。しかしながら、本発明の別の態様では、ヒト抗ＦＡＰモノクローナル抗体はＦＡＰに伴う、ＦＡＰ関連疾患及び／又は障害の症状を示す患者からもクローン化され得る。
【０２１８】
本発明に従って行われた実験の過程において、培養ヒトメモリーＢ細胞の馴化培地に存在する抗体が、ＦＡＰに対する、また、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、１０以上の他のタンパク質に対するそれらの結合能について評価された。このスクリーニングにおいてＦＡＰタンパク質に結合することができ、しかし、他のタンパク質のどれにも結合することができないＢ細胞上清のみが、抗体クラス及び軽鎖サブクラスの決定を含めて、さらなる分析のために選択された。選択されたＢ細胞はその後、抗体クローニングのために処理された。
【０２１９】
簡単に記載すると、このことは、選択されたＢ細胞からのメッセンジャーＲＮＡの抽出、ＲＴ−ＰＣＲによる逆転写、ＰＣＲによる抗体コード領域の増幅、プラスミドベクターへのクローニングおよび配列決定にあった。選択されたヒト抗体がその後、ＨＥＫ−２９３細胞またはＣＨＯ細胞における組換え発現および精製によって産生され、続いて、ヒトＦＡＰタンパク質と結合するそれらの能力について特徴づけられた。様々な試験の組合せにより、例えば、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞における抗体の組換え発現、そして、ヒトＦＡＰタンパク質に対するそれらの結合特異性の引き続いた特徴づけ、および、ＦＡＰホモログに対するのではなく、ＦＡＰに対するそれらの弁別的な結合により、ＦＡＰについて非常に特異的であり、かつ、ＦＡＰタンパク質を弁別的に認識し、これと選択的に結合するヒト抗体が今回初めてクローン化されたことが確認された。場合により、様々なマウスキメラ抗体が、本発明のヒト抗体の可変ドメインに基づいて作製される。実施例９に記載され、また、図１０および図１１に示されるように、このようなマウスキメラ抗体は、ＦＡＰ陽性のヒト乳ガン組織切片が、マウス定常ドメインと、元の抗体のヒト可変ドメインとを有するＮＩ−２０６．８２Ｃ２の組換え操作されたキメラ形態により特異的に染色されたという点で、ヒトＦＡＰに対する、ヒト抗体と等しい結合親和性、特異性および選択性を有する。
【０２２０】
したがって、本発明は概して、組換えのヒト由来抗ＦＡＰモノクローナル抗体ならびにその生物工学誘導体および合成誘導体に関連する。本発明の１つの実施形態において、抗体はヒトおよびマウスのＦＡＰと結合することができる；実施例７および図８を参照のこと。
【０２２１】
１つの実施形態において、本発明は、抗ＦＡＰ抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体に関しており、この場合、前記抗体は、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２２Ｆ７、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４およびＮＩ−２０６．１７Ａ６からなる群から選択される参照抗体と同じＦＡＰのエピトープに特異的に結合する；それぞれのエピトープについて実施例３および図４を参照のこと。実施例３において説明されるように、ＦＡＰの配列全体が、１１アミノ酸の重なりが個々のペプチドの間にある合計で１８８個の線状の１５−ｍｅｒペプチドとして合成された。したがって、実施例において例示される本発明の主題抗体は、Ｎ末端および／またはＣ末端のさらなるアミノ酸のみとの関係で、言及されたエピトープのいずれかを認識する抗体とは異なる。したがって、本発明の好ましい実施形態において、抗ＦＡＰ抗体のＮＩ−２０６．１８Ｈ２、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２２Ｆ７、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４およびＮＩ−２０６．１７Ａ６について特定されるエピトープのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＦＡＰエピトープに対する抗ＦＡＰ抗体の特異的結合が、実施例３および図４に従って、１５アミノ酸の長さおよび１１アミノ酸の重なりを有する連続するペプチドにより明らかにされる。したがって、本発明は概して、図１Ａ〜図１Ｋのいずれか１つに示されるようなＣＤＲならびに／あるいは可変重鎖領域および可変軽鎖領域を有する実施例で例示される抗体と同じエピトープに結合するどのような抗ＦＡＰ抗体および抗体様分子にも関連する。
【０２２２】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、実施例に記載されるような例示的抗体のＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２２Ｆ７、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４、ＮＩ−２０６．１７Ａ６、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２、ＮＩ−２０６．２０Ａ８、ＮＩ−２０６．６Ｄ３、ＮＩ−２０６．１４Ｃ５およびＮＩ−２０６．３４Ｃ１１の結合性質を示す。
【０２２３】
用語「実質的に認識しない」は、抗体、そのフラグメント、あるいは、特定の標的分子、特定の抗原、ならびに／または、前記標的分子および／もしくは抗原の特定の立体配座についての結合性分子を含む一群の分子の結合親和性を記述するために本出願において使用されるときには、前述の群の分子が、別の分子、抗原および／または立体配座と結合することについての前述の群の分子の結合親和性の２分の１未満である、３分の１未満である、４分の１未満である、５分の１未満である、６分の１未満である、７分の１未満である、８分の１未満である、または９分の１未満である結合親和性により、前記の分子、抗原および／または立体配座と結合することを意味する。非常に多くの場合、解離定数（ＫＤ）が、結合親和性の尺度として使用される。ときには、結合親和性の尺度として使用されるのが、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイのような特異的アッセイでのＥＣ５０である。好ましくは、用語「実質的に認識しない」は、本出願において使用されるときには、前述の群の分子が、別の分子、抗原および／または立体配座に対する結合についての前述の群の前記分子の結合親和性の１０分の１未満である、２０分の１未満である、５０分の１未満である、１００分の１未満である、１０００分の１未満である、または１００００分の１未満である結合親和性により、前記の分子、抗原および／または立体配座と結合することを意味する。この関連で、結合親和性が、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２２Ｆ７、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４、ＮＩ−２０６．１７Ａ６、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２、ＮＩ−２０６．２０Ａ８およびＮＩ−２０６．６Ｄ３の各抗体について図２で示されるような範囲である場合があり、すなわち、これらの抗体は、ヒトＦＡＰについて、すなわち、図２に示されるような捕捉されたＦＡＰ（ｓＦＡＰ）、直接に被覆されたＦＡＰ（ＦＡＰ）および／または直接に被覆されたＦＡＰペプチド混合物（ｃＦＡＰ）について、最大半量有効濃度（ＥＣ５０）が約１ｐＭ〜５００ｎＭであり、好ましくはＥＣ５０が約５０ｐＭ〜１００ｎＭであり、最も好ましくはＥＣ５０が約１ｎＭ〜２０ｎＭ、または１ｎＭ未満でさえある。
【０２２４】
いくつかの抗体は広範囲の数々の生体分子（例えば、タンパク質）に結合することができる。当業者は理解するであろうように、特異的（な）の用語は、ＦＡＰタンパク質またはそのフラグメントでない他の生体分子が抗原結合性分子（例えば、本発明の抗体の１つ）に有意に結合しないことを示すために本明細書中では使用される。好ましくは、ＦＡＰ以外の生体分子に対する結合のレベルにより、ＦＡＰに対する親和性の最大でもほんの２０％以下、１０％以下、ほんの５％以下、ほんの２％以下、または、ほんの１％以下（すなわち、５分の１未満、１０分の１未満、２０分の１未満、５０分の１未満または１００分の１未満、あるいは、それよりも小さいどのような程度でも）である結合親和性がそれぞれもたらされる；例えば、図７を参照のこと。本発明はまた、抗体、あるいは、その抗原結合フラグメント、変異体または生物工学誘導体もしくは合成誘導体に関しており、この場合、前記抗体は、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２２Ｆ７、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４、ＮＩ−２０６．１７Ａ６、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２、ＮＩ−２０６．２０Ａ８、ＮＩ−２０６．６Ｄ３、ＮＩ−２０６．１４Ｃ５およびＮＩ−２０６．３４Ｃ１１からなる群から選択される抗体の抗原結合ドメインと同一の抗原結合ドメインを含む。
【０２２５】
本発明ではさらに、その可変領域において、例えば、結合ドメインにおいて、図１Ｇ〜図１Ｋおよび図１Ａ〜図１Ｆに示されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＨ可変領域および／またはＶＬ可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことによって特徴づけられることがあるいくつかの結合性分子、例えば、抗体およびその結合フラグメントが例示される。上記可変領域をコードする対応するヌクレオチド配列が下記の表ＩＩに示される。ＶＨ領域および／またはＶＬ領域の上記アミノ酸配列のＣＤＲの例示的なセットが図１Ｇ〜図１Ｋおよび図１Ａ〜図１Ｆに示される。しかしながら、下記で議論されるように、当業者は、加えて、または代替において、様々なＣＤＲが使用されることがあり、この場合、これらのＣＤＲは、それらのアミノ酸配列が、図１Ｇ〜図１Ｋおよび図１Ａ〜図１Ｆに示されるアミノ酸配列から、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の場合には１つ、２つ、３つ、または、それどころか、それ以上のアミノ酸によって異なるという事実を十分に承知している。したがって、１つの実施形態において、図１Ｇ〜図１Ｋおよび図１Ａ〜図１Ｆに示されるような少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに／あるいは、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むその１つまたは複数のＣＤＲをその可変領域に含む本発明の抗体またはそのＦＡＰ結合フラグメントが提供される。
【０２２６】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、図１Ｇ〜図１Ｋおよび図１Ａ〜図１Ｆに示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域、あるいは、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むそのＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列を含む抗体のいずれか１つである。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトＢ細胞に存在していたような重鎖および軽鎖の同族性の対形成の保存によって特徴づけられる。
【０２２７】
本発明のさらなる実施形態において、抗ＦＡＰ抗体、そのＦＡＰ結合フラグメント、合成変異体または生物工学変異体は、標的に対する適切な結合親和性と、適切な薬物動態学的特性とを有するように最適化することができる。したがって、グリコシル化、酸化、脱アミノ化、ペプチド結合切断、イソアスパラギン酸形成および／または不対システインからなる群から選択される修飾を受けやすいＣＤＲ領域内または可変領域内の少なくとも１つのアミノ酸が、そのような変化を欠く変異アミノ酸によって置換され、あるいは、少なくとも１つの炭水化物成分が化学的または酵素的に除かれ、または抗体に付加される。アミノ酸最適化のための様々な例を、例えば、国際特許出願公開ＷＯ２０１０／１２１１４０および同ＷＯ２０１２／０４９５７０において見出すことができる。抗体の性質を最適化するさらなる修飾が、Ｇａｖｅｌ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ３（１９９０）、４３３〜４４２、および、Ｈｅｌｅｎｉｕｓ他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７３（２００４）、１０１９〜１０４９に記載される。
【０２２８】
代替において、本発明の抗体は、ＦＡＰに対する結合について、図１Ａ〜図１Ｆのいずれか１つに示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域を有する抗体の少なくとも１つと競合する抗体あるいはその抗原結合フラグメント、誘導体または変異体である。
【０２２９】
本発明の抗体は、特に治療適用のためには、ヒトのものである場合がある。代替において、本発明の抗体は、動物における診断方法および研究のために特に有用である齧歯類抗体、齧歯類化抗体または齧歯類−ヒトのキメラ抗体、好ましくは、マウス抗体、マウス化抗体またはマウス−ヒトのキメラ抗体、あるいは、ラット抗体、ラット化抗体またはラット−ヒトのキメラ抗体である。１つの実施形態において、本発明の抗体は齧歯類−ヒトのキメラ抗体または齧歯類化抗体である。
【０２３０】
上記で述べられるように、ヒト免疫応答時におけるその生成のために、本発明のヒトモノクローナル抗体は、特定の病理学的関連性を有するエピトープで、かつ、例えば、マウスモノクローナル抗体の作製のための免疫化プロセス、および、ファージディスプレーライブラリーのインビトロスクリーニングの場合には接近可能でないかもしれないエピトープ、またはそれほど免疫原性でないかもしれないエピトープをそれぞれ認識するであろう。したがって、本発明のヒト抗ＦＡＰ抗体のエピトープは独特であること、そして、本発明のヒトモノクローナル抗体によって認識されるエピトープに結合することができる他の抗体が存在しないことを明記することは賢明である。本発明の抗体が独特であることについてのさらなる指摘は、実施例において示されるように、抗体作製のための通常のプロセス（例えば、免疫化またはインビトロライブラリースクリーニング）などによって得ることができないかもしれない選択的かつ強力なＦＡＰ阻害性の抗ＦＡＰ抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２が初めてもたらされているという事実である。
【０２３１】
したがって、１つの実施形態において、本発明はまた、概して、ＦＡＰに対する特異的な結合について本発明のヒトモノクローナル抗体と競合する抗ＦＡＰ抗体およびＦＡＰ結合性分子にまで及ぶ。本発明はより具体的には、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体に関しており、前記抗体は、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２２Ｆ７、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４およびＮＩ−２０６．１７Ａ６からなる群から選択される参照抗体と同じＦＡＰのエピトープに特異的に結合する。
【０２３２】
抗体間の競合が、試験下にある免疫グロブリンが共通の抗原（ＦＡＰなど）に対する参照抗体の特異的な結合を阻害するアッセイによって求められる。数多くのタイプの競合的結合アッセイが知られている：例えば、固相での直接的又は間接的な放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、固相での直接的又は間接的な酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９（１９８３）、２４２〜２５３を参照のこと）、固相での直接的なビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７（１９８６）、３６１４〜３６１９、及び、Ｃｈｅｕｎｇ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６（１９９０）、５４６〜５５２を参照のこと）、固相での直接的な標識化アッセイ、固相での直接的な標識化サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照のこと）、Ｉ１２５標識を使用する固相での直接的な標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ他、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１９８８）、７〜１５、及び、Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ他、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２（１９９０）、７７〜８２を参照のこと）。典型的には、そのようなアッセイは、精製されたＦＡＰ又はそのエピトープ含有抗原と、標識されていない試験用免疫グロブリン及び標識された参照用免疫グロブリン（すなわち、本発明のヒトモノクローナル抗体）とを使用することを伴う。競合的阻害が、試験用免疫グロブリンの存在下において固体表面又は細胞に結合する標識の量を求めることによって測定される。通常、試験用免疫グロブリンは過剰に存在する。好ましくは、競合的結合アッセイが、添付された実施例においてＥＬＩＳＡアッセイについて記載されるような条件のもとで行われる。競合アッセイによって特定される抗体（競合抗体）には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、及び、立体的障害が生じるために、参照抗体が結合するエピトープに十分に近い隣接エピトープに結合する抗体が含まれる。通常の場合、競合抗体が過剰に存在するときには、競合抗体により、共通の抗原に対する参照抗体の特異的な結合が少なくとも５０％又は７５％阻害されるであろう。したがって、本発明はさらに、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体に関しており、この場合、当該抗体は、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２，  ＮＩ−２０６．５９Ｂ４，  ＮＩ−２０６．２２Ｆ７，  ＮＩ−２０６．２７Ｅ８，  ＮＩ−２０６．１２Ｇ４，  ＮＩ−２０６．１７Ａ６，  ＮＩ−２０６．１８Ｈ２，  ＮＩ−２０６．２０Ａ８，  ＮＩ−２０６．６Ｄ３，  ＮＩ−２０６．１４Ｃ５及びＮＩ−２０６．３４Ｃ１１からなる群から選択される参照抗体がＦＡＰ又はそのフラグメントに結合することを競合的に阻害する。
【０２３３】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）から本質的になる単離されたポリペプチド、又は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）からなる単離されたポリペプチドであって、重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも１つ、又は、重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、そのような単離されたポリペプチドを提供する。代替において、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域及びＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、図１Ｇ−Ｋ及び１Ａ−１Ｆのいずれか１つにそれぞれ示される群に関連づけられるＶＨ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＨ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列及びＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。図１Ｇ−Ｋ及び１Ａ−１Ｆは、Ｋａｂａｔシステムによって定義されるＶＨ−ＣＤＲを示すが、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステムによって定義されるＶＨ−ＣＤＲもまた本発明に含まれ、これらは、図１Ｇ−Ｆ及び１Ａ−１Ｆに示されるデータを使用して当業者によって容易に特定され得る。
【０２３４】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）から本質的になる単離されたポリペプチド、又は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）からなる単離されたポリペプチドであって、ＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域及びＶＨ−ＣＤＲ３領域が、図１Ｇ−Ｋ及び１Ａ−１Ｆのいずれか１つにそれぞれ示されるＶＨ−ＣＤＲ１群、ＶＨ−ＣＤＲ２群及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、そのような単離されたポリペプチドを提供する。
【０２３５】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）から本質的になる単離されたポリペプチド、又は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）からなる単離されたポリペプチドであって、ＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域及びＶＨ−ＣＤＲ３領域が、いずれか１つのＶＨ−ＣＤＲにおける１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸置換を除いて、図１Ｇ−Ｋ及び１Ａ−１Ｆのいずれか１つにそれぞれ示されるＶＨ−ＣＤＲ１群、ＶＨ−ＣＤＲ２群及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、そのような単離されたポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、アミノ酸置換は保存的である。
【０２３６】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）から本質的になる単離されたポリペプチド、又は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる単離されたポリペプチドであって、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも１つ、又は、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、そのような単離されたポリペプチドを提供する。代替において、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域及びＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、図１Ｇ−Ｋ及び１Ａ−１Ｆのいずれか１つにそれぞれ示されるポリペプチドに関連づけられるＶＬ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＬ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列及びＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。図１Ｇ−Ｋ及び１Ａ−１Ｆは、Ｋａｂａｔシステムによって定義されるＶＬ−ＣＤＲを示すが、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステムによって定義されるＶＬ−ＣＤＲもまた本発明に含まれる。別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）から本質的になる単離されたポリペプチド、又は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる単離されたポリペプチドであって、ＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域及びＶＬ−ＣＤＲ３領域が、図１Ｇ−Ｋ、１Ａ−１Ｆにそれぞれ示されるＶＬ−ＣＤＲ１群、ＶＬ−ＣＤＲ２群及びＶＬ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、そのような単離されたポリペプチドを提供する。
【０２３７】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチド、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）から本質的になる単離されたポリペプチド、又は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）からなる単離されたポリペプチドであって、ＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域及びＶＬ−ＣＤＲ３領域が、いずれか１つのＶＬ−ＣＤＲにおける１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸置換を除いて、図１Ｇ−Ｋ及び１Ａ−１Ｆにそれぞれ示されるＶＬ−ＣＤＲ１群、ＶＬ−ＣＤＲ２群及びＶＬ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、単離されたポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、アミノ酸置換は保存的である。
【０２３８】
免疫グロブリン又はそのコードｃＤＮＡがさらに改変される場合がある。したがって、さらなる実施形態において、本発明の方法は、キメラ抗体、マウス化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、二重特異性抗体、融合抗体、標識化抗体、又は、それらのいずれか１つのアナログを製造する工程のいずれか１つを含む。対応する様々な方法が当業者には知られており、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８８）に記載される。前記抗体の誘導体がファージディスプレー技術によって得られるとき、ＢＩＡｃｏｒｅシステムにおいて用いられるような表面プラズモン共鳴を、本明細書中に記載される抗体のいずれか１つのエピトープと同じエピトープに結合するファージ抗体の効率を増大させるために使用することができる（Ｓｃｈｉｅｒ、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７（１９９６）、９７〜１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３（１９９５）、７〜１３）。キメラ抗体の製造が、例えば、国際特許出願公開ＷＯ８９／０９６２２に記載される。ヒト化抗体を製造するための方法が、例えば、欧州特許出願ＥＰ−Ａ１０２３９４００及び国際特許出願公開ＷＯ９０／０７８６１に記載される。本発明に従って利用されるための抗体のさらなる供給源は、いわゆる異種抗体である。異種抗体（例えば、ヒト様抗体）をマウスにおいて製造するための一般的原理が、例えば、国際特許出願公開ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６及びＷＯ９６／３３７３５に記載される。上記で議論されたように、本発明の抗体は、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２を含めて、完全な抗体のほかに様々な形態で、ならびに、単鎖で存在する場合がある（例えば、国際特許出願公開ＷＯ８８／０９３４４を参照のこと）。したがって、１つの実施形態において、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメントからなる群から選択される本発明の抗体が提供される。
【０２３９】
本発明の様々な抗体又はそれらの対応する免疫グロブリン鎖はさらに、この技術分野において知られている従来からの技術を使用して、例えば、この技術分野において知られているアミノ酸欠失、アミノ酸挿入、アミノ酸置換、アミノ酸付加及び／又は組換えならびに／あるいはいずれかの他の改変を単独又は組合せでのどちらかで使用することによって改変することができる。そのような改変を免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の根底にあるＤＮＡ配列に導入するための方法が、当業者には広く知られている；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）、Ｎ．Ｙ．、及び、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）を参照のこと。本発明の抗体の修飾には、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、及び、炭水化物成分又は脂質成分及び補因子などの連結を含む側鎖修飾、骨格修飾、ならびに、Ｎ末端修飾及びＣ末端修飾を含めて、１つ又は複数の構成アミノ酸における化学的及び／又は酵素的な誘導体化が含まれる。同様に、本発明は、記載された抗体又はその何らかのフラグメントを異種分子（例えば、カルボキシル末端での免疫刺激リガンドなど）に融合されてアミノ末端において含むキメラなタンパク質の製造を包含する；対応する技術的詳細については、例えば、国際特許出願公開ＷＯ００／３０６８０を参照のこと。
【０２４０】
加えて、重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）は、より大きい度合いの可変性と、抗原−抗体相互作用における支配的な関与とを有する領域であることがしばしば認められているので、本発明は、上記で記載されるような結合性分子を含有するペプチド、例えば、述べられた抗体のいずれか１つの可変領域のＣＤＲ３領域（特に、重鎖のＣＤＲ３）を含有するペプチドを含むペプチドを包含する。そのようなペプチドが、本発明に従って有用である結合剤を製造するために容易に合成される場合があり、又は、組換え手段によって製造される場合がある。そのような方法は当業者にはよく知られている。ペプチドを、例えば、市販されている自動化されたペプチド合成機を使用して合成することができる。ペプチドはまた、ペプチドを発現するＤＮＡを発現ベクターに組み込むこと、及び、細胞を、ペプチドを産生させるために発現ベクターにより形質転換することによる組換え技術によって製造することができる。
【０２４１】
したがって、本発明は、どのようなＦＡＰ結合性分子にも関連し、例えば、抗ＦＡＰ抗体、ならびに／あるいは、ＦＡＰおよび／またはそのフラグメントと結合することができる抗体に向けられ、かつ、例示的な組換えヒト型のＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２２Ｆ７、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４、ＮＩ−２０６．１７Ａ６、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２、ＮＩ−２０６．２０Ａ８、ＮＩ−２０６．６Ｄ３、ＮＩ−２０６．１４Ｃ５およびＮＩ−２０６．３４Ｃ１１についての述べられた性質を示す抗体またはその結合フラグメントに関連する。そのような抗体および結合性分子は、本明細書中に記載されるようなＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学によってそれらの結合特異性および結合親和性について試験することができる；例えば、実施例を参照のこと。抗体および結合性分子のこれらの特性はウエスタンブロットによって同様に試験することができる。
【０２４２】
免疫グロブリンをＢ細胞又はＢメモリー細胞の培養から直接に得ることの代替として、これらの細胞を、その後の発現及び／又は遺伝子操作のための、再編成された重鎖遺伝子座及び軽鎖遺伝子座の供給源として使用することができる。再編成された抗体遺伝子を、ｃＤＮＡを作製するために、適切なｍＲＮＡから逆転写することができる。所望されるならば、重鎖定常領域を異なるアイソタイプの重鎖定常領域に交換することができ、又は、完全に除くことができる。可変領域を、単鎖のＦｖ領域をコードするために連結することができる。多数のＦｖ領域を、２つ以上の標的に対する結合能を与えるために連結することができ、又は、重鎖及び軽鎖のキメラな組合せを用いることができる。遺伝物質が入手可能であると、所望の標的と結合するそれらの能力をともに保持する上記で記載されるようなアナログの設計は簡単である。抗体可変領域のクローニング及び組換え抗体の作製のための方法が当業者には知られており、例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ他、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ４７（１９９６）、１〜２０；Ｄｏｅｎｅｃｋｅ他、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １１（１９９７）、１７８７〜１７９２に記載される。
【０２４３】
適切な遺伝物質が得られ、かつ、所望されるならば、アナログをコードするために改変されると、コード配列（これは、最低でも重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする配列を含む）を、標準的な組換え宿主細胞にトランスフェクションされ得るベクターにおいて含有される発現系に挿入することができる。様々なそのような宿主細胞が使用してよい；しかしながら、効率的なプロセシングのためには、哺乳動物細胞が好ましい。この目的のために有用である典型的な哺乳動物細胞株には、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はＮＳＯ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４４】
抗体又はアナログの製造はその後、改変された組換え宿主を、宿主細胞の成長及びコード配列の発現のために適切である培養条件のもとで培養することによって着手される。その後、抗体が、抗体を培養物から単離することによって回収される。発現系は好ましくは、シグナルペプチドを含み、その結果、生じた抗体が培地中に分泌されるように設計される。しかしながら、細胞内産生もまた可能である。
【０２４５】
上記によれば、本発明はまた、本発明の抗体又は同等な結合性分子をコードするポリヌクレオチドに関連し、抗体の場合には、好ましくは、上で記載される抗体の免疫グロブリン鎖の可変ドメインを少なくともコードするポリヌクレオチドに関連する。典型的には、ポリヌクレオチドによってコードされる前記可変領域は、前記抗体の可変領域のＶＨ及び／又はＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０２４６】
当業者は、上記の可変ドメインを有する抗体の可変ドメインが、所望される特異性及び生物学的機能の他のポリペプチド又は抗体を構築するために使用され得ることを容易に理解するであろう。したがって、本発明はまた、上で記載された可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲを含み、かつ、添付された実施例において記載される抗体と実質的に同じ又は類似する結合性質を好都合には有するポリペプチド及び抗体を包含する。当業者は、結合親和性が、アミノ酸置換をＣＤＲ内において、又は、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲと部分的に重なる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）、９０１〜９１７）の内部において行うことによって強化され得ることを理解している（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２（１９８８）、３２３〜３２７を参照のこと）。したがって、本発明はまた、述べられたＣＤＲの１つ又は複数が１つ又は複数の、好ましくは２つ以下のアミノ酸置換を含む抗体に関連する。好ましくは、本発明の抗体は、その免疫グロブリン鎖の一方又は両方において、図１Ｇ−Ｋ及び１Ａ−１Ｆのいずれか１つに示されるような可変領域の２つのＣＤＲ又は３つすべてのＣＤＲを含む。
【０２４７】
結合性分子、例えば、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、当業者によって知られているように、１つ又は複数のエフェクター機能を媒介する定常領域を含むことができる。例えば、補体のＣ１成分が抗体の定常領域に結合することにより、補体系が活性化される場合がある。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化及び溶解において重要である。補体の活性化は炎症応答をも刺激し、自己免疫の過敏性に関与することもある。さらに、抗体は、Ｆｃ領域を介して、すなわち、抗体のＦｃ領域におけるＦｃ受容体結合部位が細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合することにより様々な細胞における受容体に結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（イプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）及びＩｇＭ（ミュー受容体）を含めて、異なるクラスの抗体について特異的であるいくつかのＦｃ受容体が存在する。抗体が細胞表面のＦｃ受容体に結合することにより、抗体被覆粒子の貪食及び破壊、免疫複合体の排除、キラー細胞による抗体被覆された標的細胞の溶解（これは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害又はＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症性媒介因子の放出、胎盤移行及び免疫グロブリン産生の制御を含む多数の重要かつ多様な生物学的応答が誘発される。
【０２４８】
したがって、本発明の特定の実施形態には、少なくとも定常領域ドメインの１つ又は複数の一部が欠失されているか、さもなければ変化させられており、その結果、所望される生化学的特性を提供するように、例えば、およそ同じ免疫原性の完全な未変化抗体と比較したとき、低下したエフェクター機能、ダイマーを非共有結合により形成することができること、細胞表面におけるＦＡＰ発現部位に局在化する増大した能力、低下した血清中半減期、あるいは、増大した血清中半減期などを提供するようにされている抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体が含まれる。例えば、本明細書中に記載される診断方法及び処置方法において使用されるためのある種の抗体は、免疫グロブリン重鎖に類似するポリペプチド鎖を含むが、１つ又は複数の重鎖ドメインの少なくとも一部を欠くドメイン欠失抗体である。例えば、ある種の抗体では、改変された抗体の定常領域の１つのドメイン全体が欠失されるであろう。例えば、ＣＨ２ドメインのすべて又は一部が欠失されるであろう。他の実施形態において、本明細書中に記載される診断方法及び処置方法において使用されるためのある種の抗体は、グリコシル化を排除するために変化させられる定常領域（例えば、ＩｇＧ重鎖定常領域）を有しており、これは、本明細書中の他のところでは、非グルコシル化抗体又は「ａｇｌｙ」抗体として示される。そのような「ａｇｌｙ」抗体は、酵素学的に、ならびに、定常領域におけるコンセンサスなグリコシル化部位を操作することによって調製されてもよい。理論によって拘束されることはないが、「ａｇｌｙ」抗体は生体内での安全性及び安定性の改善されたｐｒｏフィルを有する場合があると考えられる。所望されるエフェクター機能を有する非グリコシル化抗体を製造する方法が、例えば、国際特許出願公開ＷＯ２００５／０１８５７２に見出される（その全体が参照によって組み込まれる）。
【０２４９】
本明細書中に記載されるある種の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体において、Ｆｃ部分が、この技術分野において知られている技術を使用して、エフェクター機能を低下させるために変異させられる場合がある。例えば、定常領域ドメインの（点変異又は他の手段による）欠失又は不活性化は、循環する改変された抗体のＦｃ受容体結合を低下させ、それにより、ＦＡＰの局在化を増大させる場合がある。他の場合には、本発明と一致する定常領域改変が補体結合を和らげ、したがって、抱合された細胞毒素の血清半減期及び非特異的会合を低下させることがあるかもしれない。定常領域のさらに他の改変が、増大した抗原特異性又は抗体柔軟性に起因する高まった局在化を可能にするジスルフィド連結又はオリゴ糖成分を改変するために使用される場合がある。そのような改変の得られた生理学的プロファイル、生物学的利用能及び他の生化学的影響、例えば、ＦＡＰの局在化、生体分布及び血清半減期などが、過度な実験を行うことなく、広く知られている免疫学的技術を使用して容易に測定及び定量化され得る。
【０２５０】
本明細書中に記載されるある種の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体において、Ｆｃ部分が、例として、Ｆｃγ受容体、ＬＲＰ又はＴｈｙ１受容体を介する抗体の受容体媒介性エンドサイトーシスを高めることによって、あるいは、「ＳｕｐｅｒＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（これは、抗体が、生細胞を傷つけることなく生細胞内に往復させられることを可能にすると言われる）（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５）、２３７〜２４１）によって抗体の細胞取り込みを増大させるために変異させられる場合があり、又は、代わりのタンパク質配列に交換される場合がある。例えば、抗体結合領域と、細胞表面受容体の同族タンパク質リガンドとの融合タンパク質、あるいは、ＦＡＰならびに細胞表面受容体に結合する特異的な配列を有する二重特異性抗体又は多特異性抗体の作製が、この技術分野において知られている技術を使用して設計される場合がある。
【０２５１】
本明細書中に記載されるある種の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体において、Ｆｃ部分が、その血液脳関門透過を増大させるために変異させられる場合があり、又は、代わりのタンパク質配列に交換される場合があり、あるいは、抗体が化学的に改変される場合がある。
【０２５２】
本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体の改変された形態を、この技術分野において知られている技術を使用して完全な前駆体又は親抗体から作製することができる。例示的な技術が本明細書中により詳しく議論される。本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、この技術分野において知られている技術を使用して作製又は製造することができる。特定の実施形態において、抗体分子又はそのフラグメントが「組換え製造され」、すなわち、組換えＤＮＡ技術を使用して製造される。抗体分子又はそのフラグメントを作製するための例示的な技術が本明細書中の他のところでより詳しく議論される。
【０２５３】
本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体にはまた、例えば、共有結合による結合により、抗体がその同族エピトープに特異的に結合することが妨げられないように、どのようなタイプの分子でも抗体に共有結合により結合させることによって改変される誘導体が含まれる。例えば、しかし、限定としてではなく、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、知られている保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への連結などによって改変されている抗体が含まれる。数多くの化学的修飾のどれもが、知られている技術によって行われる場合があり、これらには、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などが含まれるが、これらに限定されない。加えて、誘導体は１つ又は複数の非古典的アミノ酸を含有する場合がある。
【０２５４】
特に好ましい実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、有害な免疫応答を処置されるべき動物において、例えば、ヒトにおいて誘発しないであろう。特定の実施形態において、結合性分子、例えば、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは患者、例えば、ヒト患者に由来し、続いて、抗体又はその抗原結合フラグメントが由来する同じ種、例えば、ヒトにおいて使用され、これにより、有害な免疫応答の出現を緩和するか、又は最小限に抑える。
【０２５５】
脱免疫化もまた、抗体の免疫原性を低下させるために使用することができる。本明細書中で使用される場合、用語「脱免疫化」は、Ｔ細胞エピトープを改変するための抗体の変化を包含する（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９８／５２９７６及び同ＷＯ００／３４３１７を参照のこと）。例えば、出発抗体からのＶＨ配列及びＶＬ配列が分析され、そして、相補性決定領域（ＣＤＲ）との関連でのエピトープの所在位置、及び、配列内の他の重要な残基を示すそれぞれのＶ領域からのヒトＴ細胞エピトープ「マップ」が分析される。Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープが、最終的な抗体の活性を変化させる危険性が低い代わりのアミノ酸置換を特定するために分析される。アミノ酸置換の組合せを含む様々な代替的なＶＨ配列及びＶＬ配列が設計され、これらの配列が続いて、本明細書中に開示される診断方法及び処置方法における使用のために様々な結合性ポリペプチド（例えば、ＦＡＰ特異的抗体又はその免疫特異性フラグメント）に組み込まれ、その後、これらは機能について試験される。典型的には、１２個〜２４個の間の変化型抗体が作製され、試験される。改変されたＶ領域及びヒトＣ領域を含む完全な重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子がその後、発現ベクターにクローン化され、それに続くプラスミドが、完全な抗体の産生のために細胞株に導入される。その後、抗体が、適切な生化学的アッセイ及び生物学的アッセイにおいて比較され、最適な変異体が特定される。
【０２５６】
モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ技術、組換え技術及びファージディスプレー技術又はそれらの組合せの使用を含むこの技術分野において知られている広範囲の様々な技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体を、この技術分野において知られているハイブリドーマ技術、及び、例えば、Ｈａｒｌｏｗ他、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、５６３〜６８１（１９８１）に教示されるハイブリドーマ技術を含む様々なハイブリドーマ技術を使用して製造することができる（前記参考文献はそれらの全体が参照によって組み込まれる）。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用される場合、ハイブリドーマ技術により製造される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、真核生物クローン、原核生物クローン又はファージクローンのどのようなものも含めて、ただ１つのクローンに由来する抗体を示し、モノクローナル抗体が製造される方法に由来する抗体を示さない。したがって、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術により製造される抗体に限定されない。特定の実施形態において、本発明の抗体は、本明細書中に記載されるように、エプスタイン・バールウイルスによる形質転換により不死化されているヒトＢ細胞に由来する。
【０２５７】
広く知られているハイブリドーマプロセス（Ｋｏｈｌｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５）、４９５）では、哺乳動物から得られる比較的短命の、すなわち、いつかは死滅するリンパ球、例えば、本明細書中に記載されるようなヒト対象に由来するＢ細胞が、不死性の腫瘍細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）と融合され、このようにして、不死性であり、かつ、Ｂ細胞の遺伝子コードされた抗体を産生することができるハイブリッド細胞、すなわち、「ハイブリドーマ」がもたらされる。得られたハイブリッドは、選抜、希釈及び再成長によって単一の遺伝的形質に分離され、それぞれの個々の株が単一抗体の形成のための特定の遺伝子を含む。それらにより、所望の抗原に対して均質であり、そして、それらの純粋な遺伝的起源に関連して、「モノクローナル」と呼ばれる抗体が産生される。
【０２５８】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、融合されていない元の骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する１つ又は複数の物質を好ましくは含有する好適な培養培地において播種され、成長させられる。当業者は、ハイブリドーマの形成、選抜及び成長のための試薬、細胞株及び培地がいくつかの供給源から市販されており、また、標準化されたプロトコルが十分に確立されていることを理解するであろう。一般に、ハイブリドーマ細胞が成長している培養培地が、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性が、インビトロアッセイによって、例えば、本明細書中に記載されるような免疫沈殿、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などによって求められる。所望される特異性、親和性及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、当該クローンは限界希釈手法によってサブクローン化され、標準的な方法によって成長させられる場合がある（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、５９頁〜１０３頁（１９８６）を参照のこと）。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体が、従来からの精製手段によって、例えば、プロテインＡ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなどによって、培養培地、腹水又は血清から分離され得ることがさらに理解されるであろう。
【０２５９】
別の実施形態において、リンパ球を顕微操作によって選択することができ、可変性遺伝子を単離することができる。例えば、末梢血単核細胞を、免疫化された哺乳動物又は生まれつき免疫性の哺乳動物（例えば、ヒト）から単離し、約７日間にわたってインビトロ培養することができる。培養物を、スクリーニング基準を満たす特異的なＩｇＧについてスクリーニングすることができる。陽性のウェルからの細胞を単離することができる。個々のＩｇ産生Ｂ細胞を、ＦＡＣＳによって、又は、Ｉｇ産生Ｂ細胞を補体媒介溶血プラークアッセイで特定することによって単離することができる。Ｉｇ産生Ｂ細胞をチューブの中に顕微操作することができ、ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを使用して増幅することができる。ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を抗体発現ベクターにクローン化し、発現のための細胞（例えば、真核生物細胞又は原核生物細胞）にトランスフェクションすることができる。
【０２６０】
代替では、抗体産生の細胞株が、当業者に広く知られている技術を使用して選択及び培養される場合がある。そのような技術が様々な実験室マニュアル及び一次刊行物に記載されている。これに関連して、下で記載されるような本発明における使用のために好適である技術が、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎ他編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載される（これは、増刊を含めて、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０２６１】
特異的なエピトープを認識する抗体フラグメントが、知られている技術によって作製され得る。例えば、Ｆａｂフラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメントが、組換えによって、あるいは、例えば、パパイン（Ｆａｂフラグメントを製造するために）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを製造するために）などの酵素を使用する免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって製造され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。そのようなフラグメントは、例えば、免疫グロブリンの免疫特異性部分を検出用試薬（例えば、放射性同位体など）に連結することを伴う免疫診断手順における使用のために十分である。
【０２６２】
１つの実施形態において、本発明の抗体は抗体分子の少なくとも１つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つ又は複数の抗体分子からの少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つ又は複数の抗体分子からの少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つ又は複数の抗体分子からの少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つ又は複数の抗体分子からの少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の抗体は１つ又は複数の抗体分子からの少なくとも６つのＣＤＲを含む。主題となるこれらの抗体に含まれ得る少なくとも１つのＣＤＲを含む例示的な抗体分子が本明細書中に記載される。
【０２６３】
本発明の抗体は、抗体を合成するためにこの技術分野において知られているいずれかの方法によって、特に、化学合成によって、又は、好ましくは、本明細書中に記載されるような組換え発現技術によって製造することができる。
【０２６４】
１つの実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、１つ又は複数のドメインが部分的又は完全に欠失される合成された定常領域を含む（「ドメイン欠失抗体」）。特定の実施形態において、適合し得る改変された抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が除かれているドメイン欠失の構築物又は変異体（ΔＣＨ２構築物）を含むであろう。他の実施形態については、短い連結ペプチドが、動きの柔軟性及び自由を可変領域に与えるために欠失ドメインの代わりに使用される場合がある。当業者は、そのような構築物が抗体の異化速度に対するＣＨ２ドメインの調節的特性のために特に好ましいことを理解するであろう。ドメイン欠失された構築物を、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクターを使用して得ることができる（例えば、国際特許出願公開ＷＯ０２／０６０９５５及び同ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２を参照のこと）。このベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失し、かつ、ドメイン欠失されたＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを提供するために操作される。
【０２６５】
特定の実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体はミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）である。ミニボディを、この技術分野において記載される方法を使用して作製することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号又は国際特許出願公開ＷＯ９４／０９８１７を参照のこと）。
【０２６６】
１つの実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、モノマーサブユニット間の会合を可能にする限り、数個のアミノ酸の欠失もしくは置換、又は、１個だけのアミノ酸の欠失もしくは置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域における１個だけのアミノ酸の変異が、Ｆｃ結合を実質的に低下させるために、そして、それにより、ＦＡＰの局在化を増大させるために十分である場合がある。同様に、調節されるべきエフェクター機能（例えば、補体結合）を制御する１つ又は複数の定常領域ドメインのその部分を単に欠失することが望ましい場合がある。定常領域のそのような部分的欠失は抗体の選択された特性（血清半減期）を改善し、一方で、当該定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を損なわないままにし得る。そのうえ、上記において暗に示されるように、開示された抗体の定常領域は、生じた構築物のプロファイルを高める１つ又は複数のアミノ酸の変異又は置換により合成物である場合がある。これに関連して、改変された抗体の立体配置及び免疫原性プロファイルを実質的に維持しながら、保存されている結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によって提供される活性を妨げることが可能である場合がある。さらに他の実施形態は、１つ又は複数のアミノ酸を、望ましい特性（例えば、エフェクター機能など）を高めるために、あるいは、細胞毒素又は炭水化物のより多くの結合を提供するために定常領域に付加することを含む。そのような実施形態では、選択された定常領域ドメインに由来する特異的な配列を挿入すること、又は複製することが望ましい場合がある。
【０２６７】
本発明はまた、本明細書中に記載される抗体分子（例えば、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）を含む抗体、本明細書中に記載される抗体分子（例えば、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）から本質的になる抗体、あるいは、本明細書中に記載される抗体分子（例えば、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）からなる抗体を提供し、そのような抗体又はそのフラグメントはＦＡＰに免疫特異的に結合する。当業者に知られている様々な標準的技術を、抗体をコードするヌクレオチド配列に変異を導入するために使用することができ、そのような技術には、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、変異体（誘導体を含む）は、基準となるＶＨ領域、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２又はＶＬ−ＣＤＲ３に対して５０未満のアミノ酸置換、４０未満のアミノ酸置換、３０未満のアミノ酸置換、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換又は２未満のアミノ酸置換をコードする。「保存的（な）アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似する電荷を伴う側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えられるアミノ酸置換である。類似する電荷を伴う側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーがこの技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐した側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。代替において、変異を、例えば、飽和変異誘発などによってコード配列の全体又は一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた変異体を、活性（例えば、ＦＡＰと結合し、阻害する能力）を保持する変異体を特定するために生物学的活性についてスクリーニングすることができる。
【０２６８】
例えば、変異を抗体分子のフレームワーク領域においてのみに、又は、抗体分子のＣＤＲ領域においてのみに導入することが可能である。導入された変異はサイレント変異又は中立のミスセンス変異である場合があり、例えば、抗体の抗原結合能に対する影響を全く有しないか、又はほとんど有しない場合があり、実際、いくつかのそのような変異はアミノ酸配列を全く変化させない。これらのタイプの変異は、コドン使用を最適化するために、又は、ハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用である場合がある。本発明の抗体をコードするコドン最適化コード領域が本明細書中の他のところで開示される。代替において、非中立的なミスセンス変異により、抗体の抗原結合能が変化する場合がある。ほとんどのサイレント変異及び中立的ミスセンス変異の位置はフレームワーク領域内である可能性が高く、一方、ほとんどの非中立的ミスセンス変異の位置はＣＤＲ内である可能性が高く、だが、このことは絶対的要件でない。当業者であれば、所望される性質、例えば、抗原結合活性における変化がないこと又は結合活性における変化（例えば、抗原結合活性における改善又は抗体特異性における変化）などを有する変異体分子を設計し、試験することができるであろう。変異誘発後、コードされたタンパク質が常法により発現させられる場合があり、そして、コードされたタンパク質の機能的活性及び／又は生物学的活性（例えば、ＦＡＰの少なくとも一つのエピトープと免疫特異的に結合する能力）を、本明細書中に記載される技術を使用して、又は、この技術分野において知られている技術を常法により改変することによって求めることができる。
【０２６９】
ＩＩＩ．本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
述べられたように、ヒト由来の抗ＦＡＰ抗体の次に、さらなる局面において、本発明は概して、本発明の前記ヒト由来の抗ＦＡＰ抗体の可変ドメインまたは結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖフラグメント）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関連する。したがって、本発明のＣＡＲが、同じまたは類似した特徴を示すこと、とりわけ、本発明の抗ＦＡＰ抗体のような結合特徴を示すことは、無理のないことである。本発明のＣＡＲは好ましくは、ガンを処置するために、具体的には、血液学的悪性腫瘍、固形腫瘍、原発性腫瘍または転移腫瘍から選択され得るガンを処置するために使用される。ＦＡＰは主に間質細胞に関連するので、前記ＣＡＲは、腫瘍微小環境における間質細胞集団を優先的に標的とする。したがって、１つの実施形態において、本発明は、腫瘍細胞を直接に標的とするのではなく、間質細胞を標的とするＣＡＲを提供する。これは、腫瘍微小環境に存在する間質細胞が腫瘍原性活性を有することが認められたからである。例えば、腫瘍微小環境における間質細胞は腫瘍の成長および転移を促進させる。したがって、ＦＡＰ発現の間質細胞を標的とすることにより、腫瘍細胞が影響を受け、その結果、腫瘍細胞は成長できなくなり、死滅するように促され、あるいは、他の場合には、患者における腫瘍負荷が減少するように、または排除されるように影響される。
【０２７０】
本明細書中前記で述べられたように、ＣＡＲの基本的構造はこの技術分野ではよく知られている；背景の節で引用される文書、また、例えば、ＧｒｏｓｓおよびＥｓｈｈａｒ、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＣＡＲｓ）  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  Ｏｆｆ−Ｔｕｍｏｒ  Ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｓａｆｅ  ＣＡＲ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ５６（２０１６）、５９〜８３、ならびに、Ｚｈａｎｇ他、Ｎｅｗ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ＣＡＲ−Ｔ  Ｃｅｌｌｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１２（２０１６）、７１８〜７２９もまた参照のこと。  本発明の１つの実施形態において、前記ＣＡＲのＦＡＰ結合ドメイン（細胞外ドメイン）は好ましくは、共刺激性シグナル伝達領域およびゼータ鎖部分を含む細胞内ドメイン（細胞質ドメイン）と融合される。好ましくは、抗原結合ドメインが、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナルドメイン、および、どのような組合せであれ、これらの組合せの群から選択される１つまたは複数の細胞内ドメインと融合される。共刺激性シグナル伝達領域は、共刺激性分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を示す。共刺激性分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答のために要求される、抗原受容体またはそのリガンドとは異なる細胞表面分子である。
【０２７１】
ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、または、ＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間には、スペーサードメインが組み込まれる場合がある。本明細書中で使用される場合、用語「スペーサードメイン」は概して、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖において細胞外ドメインまたは細胞質ドメインのどちらかに連結するために機能するどのようなオリゴペプチドまたはポリペプチドであっても意味する。スペーサードメインは、３００個までのアミノ酸、好ましくは１０個〜１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５個〜５０個のアミノ酸を含む場合がある。好ましくは、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。そのようなＣＡＲの調製、ならびに、本発明によるＣＡＲの構築のために使用することができるスペーサードメイン、ヒンジドメイン、シグナル伝達ドメインおよび膜貫通ドメインのアミノ酸配列の詳細な説明を、例えば、国際特許出願公開ＷＯ２０１４／０５５４４２において見出すことができる。
【０２７２】
概して、本発明のＣＡＲの細胞外ドメイン、すなわち、ＦＡＰ抗原結合ドメインは、ＣＨ１定常ドメインおよびヒンジ領域の存在によって、または、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの存在によって抗ＦＡＰ抗体の軽鎖可変領域と共有結合により同様に結合し得る抗ＦＡＰ抗体の重鎖可変領域を含む場合があり、あるいは、ＣＨ１定常ドメインおよびヒンジ領域の存在によって、または、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの存在によって抗ＦＡＰ抗体の軽鎖可変領域と共有結合により同様に結合し得る抗ＦＡＰ抗体の重鎖可変領域からなる場合がある。したがって、本発明のＣＡＲは、本発明の抗体のいずれか１つのどのようなＦＡＰ結合部分であっても含むように操作することができる。１つの実施形態において、ＦＡＰ結合ドメインおよびそのコード核酸配列はそれぞれ、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６または配列番号５８を含む核酸配列、あるいは前記核酸配列の一部、すなわち、少なくとも、前記核酸によってコードされる抗体の軽鎖または重鎖の１つのＣＤＲをコードする一部分を含む。１つの実施形態において、ＦＡＰ結合ドメインは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７または配列番号５９を含むアミノ酸配列、あるいは前記アミノ酸配列の一部、すなわち、少なくとも、前記抗体の軽鎖または重鎖の少なくとも１つのＣＤＲを構成する一部分を含む。
【０２７３】
膜貫通ドメインに関して、概して、ＣＡＲは、当該ＣＡＲの細胞外ドメインに融合される膜貫通ドメインを含むように設計することができる。１つの実施形態において、ＣＡＲにおけるドメインの１つと生来的に会合する膜貫通ドメインが使用される。いくつかの場合において、膜貫通ドメインは、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに対するそのようなドメインの結合を避けて、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために選択することができ、またはアミノ酸置換によって改変することができる。
【０２７４】
膜貫通ドメインは天然起源または合成起源のどちらでも由来する場合がある。起源が天然である場合、ドメインは、どのような膜結合型タンパク質または膜貫通タンパク質からでも由来する場合がある。本発明において特に有用である膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域に少なくとも由来する場合がある（すなわち、そのような膜貫通領域を少なくとも含む場合がある）。代替において、膜貫通ドメインは合成である場合があり、そのような場合、膜貫通ドメインは主に疎水性の残基（例えば、ロイシンおよびバリンなど）を含むであろう。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの三つ組が、合成された膜貫通ドメインのそれぞれの末端に見出されるであろう。必要に応じて、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー（好ましくは長さにおいて２アミノ酸〜１０アミノ酸の間）が、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間における連結を形成する場合がある。グリシン−セリンの二つ組により、特に好適なリンカーがもたらされる。
【０２７５】
本発明のＣＡＲの細胞質ドメインまたは他の場合には細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが置かれた免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つを活性化することに関わっている。用語「エフェクター機能」は細胞の特殊化された機能を示す。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能が、細胞溶解活性、または、サイトカインの分泌を含むヘルパー活性である場合がある。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊化された機能を行うことを細胞に仕向けるタンパク質の一部分を示す。通常の場合には細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、鎖全体を使用することは必要ない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮化部分が使用されるほどにまで、そのような短縮化部分が、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、無傷の鎖に代わって使用される場合がある。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインの用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するために十分である細胞内シグナル伝達ドメインのどのような短縮化部分であっても含むことが意味される。
【０２７６】
本発明のＣＡＲにおいて使用されるための細胞内シグナル伝達ドメインの好ましい例には、シグナル伝達を抗原受容体関与の後で開始するために協働して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列、ならびに、これらの配列のどのような誘導体または変異体であっても、また、同じ機能的能力を有するどのような合成配列であっても含まれる。ＴＣＲだけを介して生じるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化のためには不十分であること、そして、二次的なシグナルまたは共刺激性のシグナルもまた要求されることが知られている。したがって、Ｔ細胞の活性化は、２つの異なったクラスの細胞質シグナル伝達配列によって、すなわち、抗原依存的な一次活性化を、ＴＣＲを介して開始させる細胞質シグナル伝達配列（一次細胞質シグナル伝達配列）と、二次的なシグナルまたは共刺激性のシグナルを提供するために抗原非依存的様式で作用する細胞質シグナル伝達配列（二次細胞質シグナル伝達配列）とによって媒介されると言うことができる。
【０２７７】
一次細胞質シグナル伝達配列により、ＴＣＲ複合体の一次活性化が刺激性方向または阻害性方向のどちらかで調節される。刺激性様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフ、すなわち、ＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含有する場合がある。
【０２７８】
本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有の一次細胞質シグナル伝達配列の例には、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するそのような細胞質シグナル伝達配列が含まれる。本発明のＣＡＲにおける細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含むことが特に好ましい。
【０２７９】
好ましい実施形態において、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインを単独で、あるいは、本発明のＣＡＲとの関連で有用であるどのような他の所望される細胞質ドメインであっても組み合わされて含むように設計することができる。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分と、共刺激性のシグナル伝達領域とを含むことができる。共刺激性のシグナル伝達領域は、共刺激性分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を示す。共刺激性分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答のために要求される、抗原受容体またはそのリガンドとは異なる細胞表面分子である。そのような分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、および、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが含まれる。したがって、本発明は、主に４−１ＢＢおよびＣＤ２８を共刺激性のシグナル伝達要素として用いて例示される一方、他の共刺激性要素は本発明の範囲内である。
【０２８０】
本発明のＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分における細胞質シグナル伝達配列は、ランダムな順序で、または指定された順序で互いに連結される場合がある。必要に応じて、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー（好ましくは長さにおいて２アミノ酸〜１０アミノ酸の間）により、連結が形成される場合がある。グリシン−セリンの二つ組により、特に好適なリンカーがもたらされる。
【０２８１】
１つの実施形態において、細胞質ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインと、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインとを含むように設計される。さらに別の実施形態において、細胞質ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインと、ＣＤ２８および４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインとを含むように設計される。
【０２８２】
さらに、当業者は、原理的には、先行技術において記載されるＦＡＰ  ＣＡＲの設計が、例えば、マウスのモノクローナルな抗ＦＡＰ抗体（例えば、抗体Ｆ１９など）に由来するＦＡＰ結合ドメインを使用する、Ｔｒａｎ他  （Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２１０（２０１３）、１１２５〜１１３５）、Ｓｃｈｕｂｅｒｔｈ他（Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１１（２０１３）、１８７）、Ｋａｋａｒｌａ他（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１（２０１３）、１６１１〜１６２０）、Ｗａｎｇ他（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２（２０１４）、１５４〜１６６）に、ならびに、国際公開ＷＯ２０１４０５５４４２（Ａ２）に記載されるＦＡＰ  ＣＡＲの設計が、記載されたＦＡＰ結合ドメインを本発明において記載されるヒトモノクローナルな抗ＦＡＰ抗体のＦＡＰ結合ドメインで置き換えることによって本発明のＦＡＰ  ＣＡＲを構築するために使用され得ることを理解するであろう。
【０２８３】
ＩＶ．抗体およびＣＡＲをコードするポリヌクレオチド
本発明はまた、ＣＡＲおよび／または抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体をコードする核酸配列を含むＤＮＡ構築物に関連する；上記を参照のこと。ＣＡＲの場合、ＤＮＡ構築物は、細胞内ドメインをコードする核酸配列に機能的に連結される、本発明のＦＡＰ結合ドメインのいずれか１つをコードする核酸配列を含む。本発明のＣＡＲにおいて使用することができる例示的な細胞内ドメインには、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８および４−１ＢＢなどの細胞内ドメインが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８および４−１ＢＢなどのどのような組合せであっても含むことができる。
【０２８４】
ＣＡＲ又は抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは、どのようなポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチド（これらは非修飾のＲＮＡ又はＤＮＡあるいは修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡである場合がある）からでも構成され得る。例えば、ＣＡＲ又は抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ、一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖のＲＮＡ、ならびに、一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖である場合がある、あるいは、より典型的には、二本鎖である場合があるか、又は、一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物である場合があるＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。加えて、ＣＡＲ又は抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡ、あるいは、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。ＣＡＲ又は抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドはまた、安定性又は他の理由のために改変される１つ又は複数の修飾された塩基あるいはＤＮＡ骨格又はＲＮＡ骨格を含有してもよい。「修飾（改変）（された）」塩基には、例えば、トリチル化塩基及び非通常的塩基（例えば、イノシンなど）が含まれる。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに対して行うことができる；したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的又は代謝的に改変された形態を包含する。
【０２８５】
免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリンの重鎖部分又は軽鎖部分）又はＣＡＲに由来するポリペプチドの非天然型変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドを、１つ又は複数のアミノ酸置換、アミノ酸付加又はアミノ酸欠失が、コードされたタンパク質に導入されるように、１つ又は複数のヌクレオチド置換、ヌクレオチド付加又はヌクレオチド欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列に導入することによって作出することができる。変異は、標準的な技術によって、例えば、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発などによって導入される場合がある。好ましくは、保存的なアミノ酸置換が１つ又は複数の非必須アミノ酸残基において行われる。
【０２８６】
よく知られているように、ＲＮＡが、標準的な技術、例えば、イソチオシアン酸グアニジウム抽出及び沈殿化、その後、遠心分離又はクロマトグラフィーなどによって、元のＢ細胞、ハイブリドーマ細胞又は他の形質転換細胞から単離される場合がある。望ましい場合、ｍＲＮＡが、標準的な技術、例えば、オリゴｄＴセルロースでのクロマトグラフィーなどによって総ＲＮＡから単離される場合がある。好適な技術がこの技術分野では熟知されている。１つの実施形態において、抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡが、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼをよく知られている方法に従って使用して、同時又は別個に作製される場合がある。ＰＣＲが、コンセンサスな定常領域プライマーによって、又は、公開された重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーによって開始される場合がある。上記で議論されるように、ＰＣＲはまた、抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために使用される場合がある。この場合、ライブラリーが、コンセンサスなプライマー又はより大きい相同的プローブ（例えば、ヒト定常領域プローブなど）によってスクリーニングされる場合がある。
【０２８７】
ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡが、この技術分野において知られている技術を使用して細胞から単離され、そして、例えば、組換えＤＮＡ技術に関連する前記の参考文献に詳しく示される標準的なよく知られている技術に従って制限酵素マッピング及び配列決定に供される場合がある。当然のことながら、ＤＮＡは、単離プロセス又はその後の分析の期間中のどの時点であっても、本発明に従う合成物である場合がある
【０２８８】
この関連において、本発明はまた、本発明の抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメイン又は可変領域（好ましくは、本発明のＣＡＲの結合ドメイン（細胞外ドメイン）を構成する）を少なくともコードするポリヌクレオチドに関連する。１つの実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチド、そのような核酸から本質的になる単離されたポリヌクレオチド、又は、そのような核酸からなる単離されたポリヌクレオチドであって、重鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ、又は、重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、そのような単離されたポリヌクレオチドを提供する。代替において、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域又はＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、図１Ｇ−Ｋ及び１Ａ−１Ｆに示されるポリペプチド配列に関連づけられるＶＨ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＨ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列又はＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【０２８９】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）（好ましくは、本発明のＣＡＲの結合ドメイン（細胞外ドメイン）を構成する）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチド、そのような核酸から本質的になる単離されたポリヌクレオチド、又は、そのような核酸からなる単離されたポリヌクレオチドであって、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも１つ、又は、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、そのような単離されたポリヌクレオチドを提供する。代替において、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域又はＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書中に開示される抗体から得られる参照用軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列又はＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。したがって、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、図１Ｇ−Ｋ及び１Ａ−１Ｆのいずれか１つに示されるポリペプチド配列に関連づけられるＶＬ−ＣＤＲ１ポリペプチド配列、ＶＬ−ＣＤＲ２ポリペプチド配列又はＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【０２９０】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）（好ましくは、本発明のＣＡＲの結合ドメイン（細胞外ドメイン）を構成する）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチド、そのような核酸から本質的になる単離されたポリヌクレオチド、又は、そのような核酸からなる単離されたポリヌクレオチドであって、ＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域及びＶＨ−ＣＤＲ３領域が、図１Ｇ−Ｋ及び１Ａ−１Ｆのいずれか１つに示されるＶＨ−ＣＤＲ１群、ＶＨ−ＣＤＲ２群及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一であるポリペプチド配列を有する、そのような単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０２９１】
この技術分野において知られているように、２つのポリペプチド又は２つのポリヌクレオチドの間における「配列同一性」が、一方のポリペプチド又はポリヌクレオチドのアミノ酸配列又は核酸配列を第２のポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列に対して比較することによって求められる。本明細書中で議論されるとき、任意の特定のポリペプチドが別のポリペプチドと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるかどうかを、この技術分野において知られている方法及びコンピュータープログラム／ソフトウエア（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、５３７１１）（これに限定されない）など）を使用して決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴでは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２（１９８１）、４８２〜４８９）の局所的相同性アルゴリズムを、２つの配列の間における相同性の最も良いセグメントを見出すために使用する。ＢＥＳＴＦＩＴ又はいずれかの他の配列アライメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明による参照配列と９５％同一であるかどうかを決定するときには、当然のことながら、同一性の百分率が参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算され、かつ、参照配列におけるアミノ酸の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。
【０２９２】
本発明の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、表ＩＩに示されるような、抗ＦＡＰ抗体及び／又はＦＡＰ種を認識する抗体及び／又はそれらのフラグメントのＶＨ領域又はＶＬ領域（好ましくは、本発明のＣＡＲの結合ドメイン（細胞外ドメイン）を構成する）のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、あるいは、そのような核酸から本質的になるか、あるいは、そのような核酸からなる。これに関連して、当業者は、軽鎖及び／又は重鎖の可変ドメインを少なくともコードするポリヌクレオチドが両方の免疫グロブリン鎖又は一方の免疫グロブリン鎖のみの可変ドメインをコードし得ることを容易に理解するであろう。したがって、１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、表ＩＩに示されるような、抗ＦＡＰ抗体及び／又はそのフラグメントのＶＨ領域及びＶＬ領域のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、あるいは、そのような核酸から本質的になるか、あるいは、そのような核酸からなる。
表ＩＩ：ヒトＦＡＰ又はそのペプチドを認識する抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のヌクレオチド配列
【表２−１】
2018035137.tif 000003
【表２−２】
2018035137.tif 000004
【表２−３】
2018035137.tif 000005
【表２−４】
2018035137.tif 000006
【０２９３】
クローニング戦略に起因して、重鎖および軽鎖のＮ末端およびＣ末端におけるアミノ酸配列は潜在的にはプライマー誘発変化をＦＲ１およびＦＲ４に含有する場合があり、しかしながら、この変化は抗体の生物学的活性には実質的な影響を与えない。コンセンサスなヒト抗体を提供するために、最初のクローンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をデータベースにおける該当するヒト生殖系列可変領域配列とアライメントし、それらと一致させることができる；例えば、上記で記載されるようなＶｂａｓｅ２を参照のこと。ヒト抗体のアミノ酸配列は、Ｎ末端およびＣ末端のアミノ酸が、ＰＣＲプライマーに起因してコンセンサスな生殖系列配列から逸脱している可能性があると見なされ、したがって、プライマー誘発変異補正（ＰＩＭＣ）によって置き換えられているときには太字で示される。
【０２９４】
本発明にはまた、他のところで記載されるように、本発明のポリヌクレオチドのフラグメントが含まれる。加えて、本明細書中に記載されるように、融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂフラグメント及び他の誘導体をコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。ポリヌクレオチドは、この技術分野において知られているいずれかの方法によって作製又は製造される場合がある。例えば、抗体のヌクレオチド配列が知られているならば、当該抗体をコードするポリヌクレオチドが、例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ他、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７（１９９４）、２４２に記載されるように、化学合成されたオリゴヌクレオチドから組み立てられる場合があり、これには、簡単に記載すると、抗体をコードする配列の一部分を含有する重複するオリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及び連結、ならびに、連結されたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を伴う。
【０２９５】
代替において、ＣＡＲ又は抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドが、好適な供給源から得られる核酸から作製される場合がある。特定の抗体又はＣＡＲをコードする核酸を含有するクローンが入手できず、しかし、抗体又はＣＡＲ分子の配列が知られているならば、当該抗体又はＣＡＲをコードする核酸が化学合成される場合があるか、あるいは、好適な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、あるいは、ＦＡＰ特異的抗体又は対応するＣＡＲを発現するいずれかの組織もしくは細胞（例えば、抗体を発現させるために選択されるハイブリドーマ細胞など）から作製されるｃＤＮＡライブラリー、又は、そのようなものから単離される核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’末端及び５’末端にハイブリダイゼーション可能である合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって得られる場合があり、又は、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを特定するために特定の遺伝子配列について特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られる場合がある。ＰＣＲによって生じる増幅された核酸がその後、この技術分野において広く知られているいずれかの方法を使用して、複製可能なクローニングベクターにクローン化される場合がある。したがって、本発明の１つの実施形態では、抗体、免疫グロブリン鎖、又はそれらのフラグメントをコードするｃＤＮＡが抗ＦＡＰ抗体又は対応するＣＡＲの産生のために使用される。
【０２９６】
ＣＡＲ又は抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列が決定されると、そのヌクレオチド配列が、異なるアミノ酸配列を有する抗体及び／又はＣＡＲｓを作製するために、例えば、アミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入をもたらすために、ヌクレオチド配列の操作についてこの技術分野においてよく知られている方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなどを使用して操作される場合がある（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０）、及び、Ａｕｓｕｂｅｌ他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９８）に記載される技術を参照のこと。これらはともに、それらの全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０２９７】
Ｖ．抗体ポリペプチドの発現
単離された遺伝物質が、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体を提供するために操作された後、抗体をコードするポリヌクレオチドは典型的には、所望される量の抗体を産生させるために使用されることがある宿主細胞への導入のために発現ベクターに挿入される。抗体あるいはそのフラグメント、誘導体又はアナログ（例えば、標的分子に結合する抗体の重鎖又は軽鎖）の組換え発現が本明細書中に記載される。本発明の抗体分子又は抗体の重鎖もしくは軽鎖あるいはその一部分（好ましくは重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインを含有するその一部分）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子を産生させるためのベクターが、この技術分野においてよく知られている技術を使用する組換えＤＮＡ技術によって作製される場合がある。したがって、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製するための方法が本明細書中に記載される。当業者によく知られている方法を、抗体コード配列ならびに適切な転写制御シグナル及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ遺伝子組換えが含まれる。したがって、本発明は、本発明の抗体分子あるいはその重鎖又は軽鎖あるいは重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列をｐｒｏモーターに機能的に連結されて含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含む場合があり（例えば、国際特許出願公開ＷＯ８６／０５８０７及びＷＯ８９／０１０３６、ならびに、米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）、また、抗体の可変ドメインが、重鎖全体又は軽鎖全体を発現させるためにそのようなベクターにクローン化される場合がある。
【０２９８】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、所望される遺伝子を宿主細胞に導入し、その遺伝子をその宿主細胞において発現させるためのビヒクルとして本発明に従って使用されるベクターを意味するために本明細書中では使用される。当業者には知られているように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス及びレトロウイルスからなる群から容易に選択される場合がある。一般に、本発明と適合し得るベクターは、選択マーカー、所望される遺伝子のクローニングを容易にするための適切な制限部位、ならびに、真核生物細胞又は原核生物細胞における進入能及び／又は複製能を含む。本発明の目的のために、数多くの発現ベクター系が用いられる場合がある。例えば、１つのクラスのベクターでは、動物ウイルス、例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ又はＭＯＭＬＶ）又はＳＶ４０ウイルスなどに由来するＤＮＡエレメントが利用される。他では、内部リボソーム結合部位を伴う多シストロン系の使用を伴う。加えて、ＤＮＡをその染色体に組み込んでいる細胞が、トランスフェクションされた宿主細胞の選択を可能にする１つ又は複数のマーカーを導入することによって選択される場合がある。マーカーにより、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤抵抗性（例えば、抗生物質）、又は、重金属（例えば、銅など）に対する抵抗性が与えられる場合がある。選択マーカー遺伝子は、発現させられるＤＮＡ配列に直接に連結することができるか、又は、共形質転換によって同じ細胞に導入することができる。さらなるエレメントがまた、ｍＲＮＡの最適な合成のために必要となる場合がある。これらのエレメントには、シグナル配列、スプライス信号ならびに転写プロモーター、エンハンサー及び終結シグナルが含まれる場合がある。
【０２９９】
特に好ましい実施形態において、クローン化された可変領域遺伝子が、上記で議論されるような重鎖定常領域遺伝子及び軽鎖定常領域遺伝子（好ましくはヒトの遺伝子）と一緒に発現ベクターに挿入される。このベクターは、サイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー、マウスのベータグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０の複製起点、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのエクソン１及びエクソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼの遺伝子及びリーダー配列を含有する。このベクターは、可変領域遺伝子及び定常領域遺伝子の取り込み、ＣＨＯ細胞におけるトランスフェクション、それに続く、Ｇ４１８含有培地における選択、及び、メトトレキサート増幅を行ったとき、抗体の非常に高いレベルの発現をもたらすことが見出されている。当然のことながら、発現を真核生物細胞において誘発することができる発現ベクターはどれも、本発明において使用される場合がある。好適なベクターの例には、プラスミドのｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１及びｐＺｅｏＳＶ２（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能である）、ならびに、プラスミドのｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から入手可能である）が含まれるが、これらに限定されない。一般に、非常に多数の形質転換細胞を、好適に高レベルの免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖を発現する形質転換細胞についてスクリーニングすることは、例えば、ロボットシステムによって行うことができる日常的な実験である。ベクター系はまた、米国特許第５，７３６，１３７号及び第５，６５８，５７０号に教示される（これらのそれぞれがその全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。この系は、例えば、３０ｐｇ／細胞／日を超える高い発現レベルを提供する。他の例示的なベクター系が、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示される。
【０３００】
他の好ましい実施形態において、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体が、多シストロン構築物、例えば、米国特許出願公開第２００３−０１５７６４１号Ａ１（その全体が本明細書中に組み込まれる）に開示される多シストロン構築物などを使用して発現させられる場合がある。これらの発現系において、目的とする多数の遺伝子産物（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖など）がただ１つの多シストロン構築物からもたらされる場合がある。これらの系では、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が、比較的高いレベルの抗体を提供するために都合よく使用される。適合し得るＩＲＥＳ配列が米国特許第６，１９３，９８０号（これもまた本明細書中に組み込まれる）に開示される。当業者は、そのような発現系が、本出願において開示される抗体の完全な範囲を効果的に産生するために使用されることがあることを理解するであろう。したがって、１つの実施形態において、本発明は、抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメイン又は可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドを、場合により、前記結合性分子の他の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドとの組合せで含むベクターを提供する。
【０３０１】
より一般的には、抗体のモノマーサブユニットをコードするベクター又はＤＮＡ配列が調製されると、発現ベクターが、適切な宿主細胞に導入される場合がある。宿主細胞へのプラスミドの導入を、当業者にはよく知られている様々な技術によって達成することができる。これらには、例えば、Ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）又はリポフェクタミンを使用するリポトランスフェクションを含むトランスフェクション、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、包まれたＤＮＡを用いた細胞融合、顕微注入、及び、無傷のウイルスによる感染が含まれるが、これらに限定されない。典型的には、宿主へのプラスミド導入が、標準的なリン酸カルシウム共沈殿法により行われる。発現構築物を有する宿主細胞が、軽鎖及び重鎖を産生させるために適切である条件のもとで成長させられ、重鎖及び／又は軽鎖のタンパク質合成についてアッセイされる。例示的なアッセイ技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）又は蛍光活性化細胞分取器分析（ＦＡＣＳ）及び免疫組織化学などが含まれる。
【０３０２】
発現ベクターが従来からの技術によって宿主細胞に移され、トランスフェクションされた細胞がその後、抗体を本明細書中に記載される方法における使用のために産生させるため従来からの技術によって培養される。したがって、本発明には、好ましくは異種プロモーターに機能的に連結される、本発明の抗体又はその重鎖もしくは軽鎖、あるいは、少なくともその免疫グロブリンの結合ドメイン又は可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞が含まれる。加えて、又は、代替において、本発明にはまた、抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメイン又は可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドを、場合により、前記結合性分子の他の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドとの組合せで含む本明細書中上記で定義されるようなベクターを含む宿主細胞が含まれる。二重鎖抗体を発現させるための好ましい実施形態において、重鎖及び軽鎖の両方をコードする単一のベクター又は複数のベクターが、下記で詳述されるように、完全な免疫グロブリン分子の発現のために宿主細胞において共発現させられる場合がある。
【０３０３】
宿主細胞が本発明の２つの発現ベクターにより共トランスフェクションされる場合があり、この場合、第１のベクターが重鎖由来のポリペプチドをコードし、第２のベクターが軽鎖由来のポリペプチドをコードする。これら２つのベクターは、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択マーカーを含有する場合がある。代替では、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードするただ１つのベクターが使用される場合がある。そのような状況では、軽鎖が好都合には、毒性のない重鎖の過剰を避けるために重鎖の前に置かれる（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２（１９８６）、５２；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７（１９８０）、２１９７を参照のこと）。重鎖及び軽鎖のためのコード配列がｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含む場合がある。
【０３０４】
本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを有する細胞を示す。抗体を組換え宿主から単離するためのプロセスの記載において、用語「細胞」及び「細胞培養（物）」が、別途明確に指定される場合を除き、抗体の供給源を示すために交換可能に使用される。別の言い方をすれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠心分離された細胞全体から、又は、培地及び懸濁された細胞の両方を含有する細胞培養物からのどちらをも意味する場合がある。
【０３０５】
様々な宿主−発現ベクター系が、本明細書中に記載される方法において使用されるための抗体分子を発現させるために利用される場合がある。そのような宿主−発現系は、目的とするコード配列が産生され、続いて精製されることがあるビヒクルを表し、しかし、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換又はトランスフェクションされたとき、本発明の抗体分子をその場で発現する細胞もまた表す。これらには、微生物、例えば、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクター又はコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換される細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換される酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）が感染させられる昆虫細胞系；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ；タバコモザイクウイルスＴＭＶ）が感染させられるか、又は、抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）により形質転換される植物細胞系；あるいは、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＢＬＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、完全な組換え抗体分子の発現のためにはとりわけ、細菌細胞（例えば、大腸菌など）、より好ましくは真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ベクター（例えば、ヒトサイトメガロウイルスからの主要前初期遺伝子プロモーターエレメントなど）と併せての哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などが、抗体のための効果的な発現系である（例えば、Ｆｏｅｃｋｉｎｇ他、Ｇｅｎｅ  ４５（１９８６）、１０１；Ｃｏｃｋｅｔｔ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８（１９９０）、２を参照のこと）。
【０３０６】
タンパク質発現のために使用される宿主細胞株は多くの場合、哺乳動物起源である；当業者には、宿主細胞株において発現させられる所望の遺伝子産物のために最もよく適する特定の宿主細胞株を優先的に決定する能力があると思われる。例示的な宿主細胞株には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲ欠損）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸ガン）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０のＴ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）及び２９３（ヒト腎臓）が含まれるが、これらに限定されない。ＣＨＯ細胞及び２９３細胞が特に好ましい。宿主細胞株は典型的には、商用サービスから、すなわち、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能であり、又は、発表された文献から入手可能である。
【０３０７】
加えて、挿入された配列の発現を調節するか、あるいは、遺伝子産物を所望される特定の様式で修飾し、また、プロセシングする宿主細胞系統が選ばれる場合がある。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）が当該タンパク質の機能のために重要である場合がある。種々の宿主細胞が、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後のプロセシング及び修飾のための特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株又は宿主系を、発現される外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを保証するために選ぶことができる。この目的を達成するために、一次転写物の適正なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が使用される場合がある。
【０３０８】
組換えタンパク質の長期間にわたる高収量の産生のためには、安定的発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞株が操作される場合がある。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、むしろ、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）及び選択マーカーによって制御されるＤＮＡにより形質転換することができる。外来ＤＮＡを導入した後、操作された細胞は富化培地において１日間〜２日間にわたって成長させられる場合があり、その後、選択培地に切り換えられる。組換えプラスミドにおける選択マーカーは選択に対する抵抗性を与え、また、細胞がプラスミドをその染色体に安定的に組み込み、成長して、結果としてクローン化され、かつ、細胞株に拡大することができる増殖巣を形成することを可能にする。この方法は、抗体分子を安定的に発現する細胞株を操作するために都合よく使用される場合がある。
【０３０９】
数多くの選択システムが使用される場合があり、これらには、下記のものが含まれるが、それらに限定されない：単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ他、Ｃｅｌｌ  １１（１９７７）、２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８（１９９２）、２０２）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙ他、Ｃｅｌｌ  ２２（１９８０）、８１７）をｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞又はａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ用いることができる。また、代謝拮抗物質抵抗性を下記の遺伝子のための選択の基礎として使用することができる：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する抵抗性を与える（Ｗｉｇｌｅｒ他、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７（１９８０）、３５７；Ｏ’Ｈａｒｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８（１９８１）、１５２７）；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する抵抗性を与える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８（１９８１）、２０７２）；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を与える（Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ他、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２（１９９３）、４８８〜５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３（１９９１）、８７〜９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２（１９９３）、５７３〜５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０（１９９３）、９２６〜９３２；ならびに、Ｍｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２（１９９３）、１９１〜２１７；ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（１９９３）、１５５〜２１５）；及び、ｈｙｇｒｏ、これはヒグロマイシンに対する抵抗性を与える（Ｓａｎｔｅｒｒｅ他、Ｇｅｎｅ  ３０（１９８４）、１４７）。使用することができる、組換えＤＮＡ技術の技術分野において一般に知られている様々な方法が、Ａｕｓｕｂｅｌ他（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）に記載さされ、また、第１２章及び第１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ他（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載される（これらはその全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０３１０】
抗体分子の発現レベルをベクター増幅によって増大させることができる（総説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第３巻（１９８７）を参照のこと）。抗体を発現させるベクター系におけるマーカーが増幅可能であるときには、宿主細胞の培養において存在する阻害剤のレベルにおける増大はマーカー遺伝子のコピー数を増大させるであろう。増幅された領域は抗体遺伝子に付随するので、抗体の産生もまた増大するであろう（Ｃｒｏｕｓｅ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３（１９８３）、２５７を参照のこと）。
【０３１１】
インビトロ産生では、スケールアップにより、多量の所望されるポリペプチドを与えることが可能である。組織培養条件のもとでの哺乳動物細胞培養のための様々な技術がこの技術分野において知られており、これらには、均一懸濁培養、例えば、エアーリフト型リアクター又は連続撹拌槽リアクターにおける培養、あるいは、固定化細胞又は包括化細胞の培養、例えば、中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ又はセラミックカートリッジにおける培養が含まれる。必要及び／又は所望されるならば、ポリペプチドの溶液を、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的な生合成の後で、あるいは、本明細書中に記載されるＨＩＣクロマトグラフィー工程の前又は後で、慣例的なクロマトグラフィー方法、例えば、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースでのクロマトグラフィー、又は、（免疫）アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。
【０３１２】
本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体をコードする遺伝子はまた、哺乳動物以外の細胞、例えば、細菌細胞又は昆虫細胞又は酵母細胞又は植物細胞において発現させることができる。核酸を容易に取り込む細菌には、腸内細菌科のメンバー、例えば、大腸菌又はサルモネラ属の菌株など；バチルス科、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など；肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）；連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）が含まれる。細菌において発現させられるとき、異種ポリペプチドは典型的には封入体の一部となることがさらに理解されるであろう。異種ポリペプチドは単離され、精製され、その後、機能的な分子に組み立てられなければならない。四価形態の抗体が所望される場合、そのサブユニットは四価抗体に自己集合するであろう（例えば、国際特許出願公開ＷＯ０２／０９６９４８を参照のこと）。
【０３１３】
細菌系において、多数の発現ベクターが、抗体分子が発現されるための意図される使用に依存して、都合よく選択される場合がある。例えば、多量のそのようなタンパク質が抗体分子の医薬組成物の作製のために産生させられることになるときには、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を導くベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターには、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．２（１９８３）、１７９１）（この場合、抗体コード配列がｌａｃＺコード領域とインフレームでベクターに個々に連結され、その結果、融合タンパク質が産生されるようにされる場合がある）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３（１９８５）、３１０１〜３１０９；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４（１９８９）、５５０３〜５５０９）などが含まれるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターもまた、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために使用される場合がある。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズのマトリックスへの吸着及び結合、その後の遊離したグルタチオンの存在下での溶出によって溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビン又は第Ｘａ因子のプロテアーゼ切断部位を含み、その結果、クローン化された標的遺伝子産物がＧＳＴ成分から放出され得るように設計される。
【０３１４】
原核生物に加えて、真核生物の微生物もまた使用される場合がある。サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、すなわち、普通のパン酵母が、真核生物の微生物の中で最も一般に使用されるが、多くの他の菌株が一般に利用可能である（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））。サッカロミセス属における発現のために、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ他、Ｎａｔｕｒｅ  ２８２（１９７９）、３９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ他、Ｇｅｎｅ  ７（１９７９）、１４１；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ他、Ｇｅｎｅ  １０（１９８０）、１５７）が一般に使用される。このプラスミドは、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母の変異菌株（例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号又はＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５（１９７７）、１２））のための選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子を既に含有する。その場合、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１損傷の存在により、形質転換をトリプトファンの不在下での成長によって検出するための効果的な環境が提供される。
【０３１５】
昆虫系において、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が典型的には、外来タンパク質を発現させるためのベクターとして使用される。このウイルスはヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞において成長する。抗体コード配列がウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）の中に個々にクローン化され、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれる場合がある。
【０３１６】
本発明の抗体分子が組換え発現させられると、本発明の完全な抗体、それらのダイマー、個々の軽鎖及び重鎖又は他の免疫グロブリン形態を、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特に、プロテインＡの後での特異的抗原についてのアフィニティー、及び、サイズ分画カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈澱）、又は、タンパク質の精製のためのいずれかの他の標準的な技術によることを含めて、この技術分野の標準的な手順に従って精製することができる（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照のこと）。代替では、本発明の抗体の親和性を増大させるための好ましい方法が米国特許出願公開第２００２−０１２３０５７号Ａ１に開示される。したがって、１つの実施形態において、本発明はまた、抗ＦＡＰ抗体又はその生物工学若しくは合成誘導体、或いはそれらの免疫グロブリン鎖を調製するための方法であって、
（ａ）本明細書中上記で定義されるようなポリヌクレオチド又はベクターを含む本明細書中上記で定義されるような宿主細胞を培養すること、及び
（ｂ）前記抗体又はその免疫グロブリン鎖を培養物から単離すること
を含む方法を提供する。
【０３１７】
さらには、本発明は１つの実施形態として、本明細書中上記で定義されるようなポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその免疫グロブリン鎖、あるいは、抗ＦＡＰ抗体を調製するための前記方法によって得ることができる抗体又はその免疫グロブリン鎖に関連する。
【０３１８】
ＶＩ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリヌクレオチドの発現
本発明のＣＡＲおよびＣＡＲ  Ｔ細胞を提供するための単離された遺伝物質の操作に関して、概してポリヌクレオチドを発現させるための様々な手段および方法が、本明細書中前記の抗体に関して既に記載されており、例えば、好適な発現ベクターの選定およびその設計、ならびに、哺乳動物細胞のトランスフェクションのための手段および方法（Ｖ節を参照のこと）を、ＣＡＲの発現に同様に適用することができる。さらに、ＣＡＲの一般的な設計および発現が、先行技術において、例えば、Ｔｒａｎ他  （Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２１０（２０１３）、１１２５〜１１３５）、Ｓｃｈｕｂｅｒｔｈ他（Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１１（２０１３）、１８７）、Ｋａｋａｒｌａ他（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１（２０１３）、１６１１〜１６２０）、Ｗａｎｇ他（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２（２０１４）、１５４〜１６６）、ならびに、国際公開ＷＯ２０１４０５５４４２（Ａ２）に詳しく記載されている。
【０３１９】
本発明のＦＡＰ  ＣＡＲをコードする天然核酸または合成核酸の発現が典型的には、ＣＡＲポリペプチドまたはその一部分をコードする核酸をプロモーターに機能的に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。様々なベクターが真核生物における複製および組込みのために好適であり得る。典型的なクローニングベクターは、所望される核酸配列の発現を調節するために有用である転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、転写開始配列および翻訳開始配列、ならびにプロモーターを含有する。用語「発現ベクター」は本明細書中前記で定義されている；Ｖ節を参照のこと。本発明の発現構築物はまた、標準的な遺伝子送達プロトコルを使用する核酸免疫化および遺伝子治療のために使用される場合がある。遺伝子送達のための様々な方法がこの技術分野では知られている；例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号を参照のこと（これらはそれらの全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。別の実施形態において、本発明は遺伝子治療ベクターを提供する。
【０３２０】
本発明の１つの実施形態において、本発明のＣＡＲの配列は、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを使用して真核生物の細胞、組織または生物全体に送達される。好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲの配列はＴ細胞に送達される。したがって、本発明は、Ｔ細胞に安定的に組み込まれ、そのＴ細胞において安定的に発現させられる、ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターに関する。
【０３２１】
レトロウイルス（例えば、レンチウイルスなど）に由来するベクターが、これらは導入遺伝子の長期間かつ安定的な組込みおよび娘細胞におけるその伝播を可能にするので、長期間の遺伝子移入を達成するための特に好適なツールである。レンチウイルスベクターは、非増殖性細胞（例えば、肝細胞など）への形質導入を行うことができるという点で、オンコ−レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルスなど）に由来するベクターを上回る追加された利点を有する。レンチウイルスベクターはまた、免疫原性が低いという追加された利点を有する。
【０３２２】
「レンチウイルス」は、本明細書中で使用される場合、レトロウイルス科の１つの属を示す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができることにおいてレトロウイルスの中で特異である；レンチウイルスは著しい量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに送達することができ、その結果、レンチウイルスは遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶがすべて、レンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、著しいレベルの遺伝子移入をインビボで達成するための手段を提供する。「レンチウイルスベクター」は、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターであり、これには、とりわけ、Ｍｉｌｏｎｅ他、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（２００９）、１４５３〜１４６４において提供されるような自己不活性化レンチウイルスベクターが含まれる。ｐＥＬＰＳベクターの代替として臨床において使用され得るレンチウイルスベクターの他の例には、例えば、ＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達技術（Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａ）およびＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクターシステム（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ）などが含まれるが、これらに限定されない。非臨床タイプのレンチウイルスベクターもまた利用可能であり、当業者には知られているであろう。
【０３２３】
本発明のＦＡＰ  ＣＡＲをコードする天然核酸または合成核酸の発現はまた、所望の細胞タイプに直接に移入することができる、本発明のＣＡＲをコードするＲＮＡ構築物を作製することによって達成することができる。
【０３２４】
本発明の１つの実施形態において、本発明のＣＡＲの配列は、インビトロ転写されたｍＲＮＡを使用して真核生物の細胞、組織または生物全体に送達される。好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲの配列はＴ細胞に送達される。
【０３２５】
したがって、本発明はまた、Ｔ細胞に直接にトランスフェクションすることができ、かつ、そのＴ細胞において一過性に発現させることができる、本発明のＣＡＲをコードするＲＮＡ構築物を開示する。細胞におけるＣＡＲの一過性の一体化しない発現により、細胞におけるＣＡＲの永続的かつ一体化した発現に伴う様々な懸念が軽減される。ｍＲＮＡをトランスフェクションにおける使用のために作製するための１つの方法では、特別に設計されたプライマーを用いたＣＡＲのインビトロ転写（ＩＶＴ）、続いてポリＡ付加を行い、３’末端および５’末端の非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’末端キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現させられる遺伝子、ならびにポリＡテール（典型的には長さにおいて５０塩基〜２０００塩基）を含有する構築物を作製することが伴う。この手段によって作製されるＲＮＡは様々な種類の細胞を効率よくトランスフェクションすることができる；詳しい方法については、例えば、国際特許出願公開ＷＯ２０１４／０５５４４２、および、Ｓｃｈｕｔｓｋｙ他、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．６（２０１５）、２８９１１〜２８９２８を参照のこと。
【０３２６】
ＲＮＡトランスフェクション法の１つの利点は、ＲＮＡトランスフェクションが本質的には一過性であり、かつ、ベクター非存在であるということである。ＲＮＡ導入遺伝子を、何らかのさらなるウイルス配列を必要としない最小限の発現カセットとしてリンパ球に送達し、短時間のインビトロ細胞活性化の後でそのリンパ球において発現させることができる。これらの条件のもとでは、導入遺伝子の宿主細胞ゲノム内への組込みは考えられない。細胞のクローニングは、当該ＲＮＡのトランスフェクションの効率、および、リンパ球集団全体を均一に改変することができるその能力のために必要ない。
【０３２７】
インビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴＲＮＡ）によるＴ細胞の遺伝子改変では、様々な動物モデルにおいて首尾よくともに検証されている２つの異なる戦略が使用される。細胞が、リポフェクションまたはエレクトロポレーションによってインビトロ転写ＲＮＡによりトランスフェクションされる。好ましくは、ＩＶＴＲＮＡを、移入されたＩＶＴ−ＲＮＡの長期発現を達成するための様々な改変を使用して安定化することが望ましい。
【０３２８】
標準化された様式で、インビトロ転写のためのテンプレートとして利用され、かつ、安定化されたＲＮＡ転写物が産生されるような方法で遺伝子改変されているいくつかのＩＶＴベクターが、文献において知られている。現在のところ、この技術分野において使用されるプロトコルは、下記の構造を有するプラスミドベクターに基づいている：ＲＮＡ転写を可能にする５’端でのＲＮＡポリメラーゼプロモーター、それに続く、非翻訳領域（ＵＴＲ）が３’端および／または５’端のどちらかで隣接する目的とする遺伝子、ならびに、５０個〜７０個のＡヌクレオチドを含有する３’端でのポリアデニルカセット。インビトロ転写の前に、環状プラスミドが、（認識配列が切断部位に対応する）ＩＩ型制限酵素によってポリアデニルカセットの下流側で線状化される。したがって、ポリアデニルカセットは転写物における後期ポリ（Ａ）配列に対応する。この手順の結果として、いくつかのヌクレオチドが線状化後において酵素切断部位の一部として残存し、ポリ（Ａ）配列を３’末端において延長し、または遮蔽する。この非生理学的な突出が、そのような構築物から細胞内に産生されるタンパク質の量に影響を及ぼすかどうかは、明らかではない。ＲＮＡは、より多くの従来的なプラスミド取り組みまたはウイルス取り組みを上回る利点をいくつか有する。ＲＮＡ源からの遺伝子発現は転写を必要とせず、タンパク質産物がトランスフェクション後に迅速に産生される。さらに、ＲＮＡは、核ではなく、むしろ、細胞質へのアクセスをただ単に得なければならないので、したがって、典型的なトランスフェクション方法では、トランスフェクションの極めて大きい割合がもたらされる。加えて、プラスミドに基づく取り組みでは、目的とする遺伝子の発現を行わせるプロモーターが検討中の細胞において活性であることが要求される。
【０３２９】
別の局面において、ＲＮＡ構築物はエレクトロポレーションによって細胞に送達することができる；例えば、米国特許出願公開第２００４／００１４６４５号（Ａ１）、同第２００５／００５２６３０号（Ａ１）、同第２００５／００７０８４１号（Ａ１）、同第２００４／００５９２８５号（Ａ１）、同第２００４／００９２９０７号（Ａ１）において教示されるような哺乳動物細胞への核酸構築物のエレクトロポレーションの構築および方法論を参照のこと。どのような細胞タイプであれ、知られている細胞タイプのエレクトロポレーションのために要求される電場強度を含む様々なパラメーターが一般には、関連のある研究文献において、ならびに、この分野における数多くの特許および特許出願において知られている；例えば、米国特許第６，６７８，５５６号、米国特許第７，１７１，２６４号および米国特許第７，１７３，１１６号を参照のこと。エレクトロポレーションの治療適用のための様々な装置が市販されており（例えば、ＭｅｄＰｕｌｓｅｒ（商標）ＤＮＡ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｏｖｉｏ／Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、また、様々な特許において、例えば、米国特許第６，５６７，６９４号、米国特許第６，５１６，２２３号、米国特許第５，９９３，４３４号、米国特許第６，１８１，９６４号、米国特許第６，２４１，７０１号および米国特許第６，２３３，４８２号などにおいて記載される。エレクトロポレーションはまた、例えば、米国特許出願公開第２００７０１２８７０８号（Ａ１）に記載されるようなインビトロでの細胞のトランスフェクションのために使用される場合がある。エレクトロポレーションはまた、核酸をインビトロで細胞に送達するために利用される場合がある。したがって、当業者に知られている多くの利用可能なデバイスおよびエレクトロポレーションシステムのいずれかを利用する、発現構築物を含む核酸の細胞内へのエレクトロポレーション媒介投与により、目的とするＲＮＡを標的細胞に送達するための刺激的な新しい手段がもたらされる。
【０３３０】
１つの実施形態において、本発明は、本発明の抗ＦＡＰ抗体のＦＡＰ結合ドメインを含む上記ＣＡＲのいずれか１つを発現するように操作される細胞（例えば、Ｔ細胞）（これはまた、ＦＡＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞として示される）を提供し、この場合、ＣＡＲ  Ｔ細胞は抗腫瘍特性を示し、かつ、本発明のＣＡＲは、Ｔ細胞において発現したとき、抗原認識をＦＡＰ抗原結合特異性に基づいて変更することができる。１つの実施形態において、本発明のＦＡＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ロバストなインビボでのＴ細胞増殖を経ることができ、かつ、血液および骨髄において長期間にわたって高レベルで持続するＦＡＰ特異的なメモリー細胞を樹立することができる。場合により、患者に注入された本発明のＦＡＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍細胞をガンの患者においてインビボで排除することができる。
【０３３１】
本発明のＴ細胞の増殖および遺伝子改変に先立って、Ｔ細胞の供給源を対象から得なければならない。Ｔ細胞を、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含めて、数多くの供給源から得ることができる。本発明のある特定の実施形態において、この技術分野で利用可能であるいくつかのＴ細胞株が使用される場合がある。そのようなＴ細胞を得て、濃縮するための様々な方法が当業者には知られており、例えば、国際特許出願公開ＷＯ２０１４／０５５４４２に記載される。
【０３３２】
望ましいＣＡＲを発現させるためのＴ細胞の遺伝子改変の前であろうと、またはその後であろうと、Ｔ細胞は、概して下記に記載されるような方法を使用して活性化させ、増殖させることができる：例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号および米国特許出願公開第２００６／０１２１００５号（Ａ１）。
【０３３３】
概して、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体に伴うシグナルを刺激する薬剤と、Ｔ細胞の表面における共刺激性分子を刺激するリガンドとが結合させられている表面との接触によって増殖される。具体的には、Ｔ細胞集団が、本明細書中に記載されるように、例えば、表面に固定化された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは抗ＣＤ２抗体との接触によって、あるいは、カルシウムイオノフォアと併せてのプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によって刺激される場合がある。Ｔ細胞の表面におけるアクセサリー分子を共刺激するために、当該アクセサリー分子と結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切である条件のもとで抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のどちらかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例には、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、フランス）が含まれ、これらは、この技術分野において一般に知られている他の方法（Ｂｅｒｇ他、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３０（１９９８）、３９７５〜３９７７；Ｈａａｎｅｎ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（１９９９）、１３１９〜１３２８；Ｇａｒｌａｎｄ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２２７（１９９９）、５３〜６３）が使用され得るように使用することができる。本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化および増殖に関するさらなる詳細が、国際特許出願公開ＷＯ２０１４／０５５４４２において示される。
【０３３４】
ＶＩＩ．融合タンパク質及びコンジュゲート
特定の実施形態において、抗体ポリペプチドは、通常の場合には抗体に付随しないアミノ酸配列あるいは１つ又は複数の成分を含む。例示的な改変が下記においてより詳細に記載される。例えば、本発明の単鎖Ｆｖ抗体フラグメントは柔軟なリンカー配列を含む場合があり、又は、機能的成分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素又は標識（例えば、蛍光性、放射性、酵素、核磁気性及び重金属など））を付加するために改変される場合がある。本発明のＣＡＲもまた、融合タンパク質としてデザインされ得る。
【０３３５】
本発明の抗体ポリペプチドは融合タンパク質を含む場合があり、融合タンパク質から本質的になる場合があり、又は、融合タンパク質からなる場合がある。融合タンパク質は、例えば、少なくとも１つの標的結合部位を伴う免疫グロブリンのＦＡＰ結合ドメインと、少なくとも１つの異種部分、すなわち、自然界では生来的に連結されない部分とを含むキメラ分子である。これらのアミノ酸配列は、融合ポリペプチドにおいて一緒にされる別個のタンパク質において正常に存在する場合があり、又は、同じタンパク質において正常に存在する場合があるが、融合ポリペプチドにおいては新しい配置で置かれる。融合タンパク質が、例えば、化学合成によって、又は、ペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを作出し、翻訳することによって作出される場合がある。
【０３３６】
用語「異種（の）」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドに適用される場合、当該ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、比較されている実体の残部のものとは異なる実体に由来することを意味する。例えば、本明細書中で使用されるように、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又はアナログに融合されるための“異種ポリペプチド”は、同じ種の非免疫グロブリンポリペプチド、あるいは、異なる種の免疫グロブリンポリペプチド又は非免疫グロブリンポリペプチドに由来する。本明細書中の他のところでより詳細に議論されるように、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体はさらに、Ｎ末端又はＣ末端において異種ポリペプチドに組換え融合される場合があり、あるいは、ポリペプチド又は他の組成物に化学的にコンジュゲート化される場合がある（共有結合によるコンジュゲート化及び非共有結合によるコンジュゲート化を含む）。例えば、抗体が、検出アッセイにおいて標識として有用である分子に、また、エフェクター分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種又は毒素など）に組換え融合されるか、又はコンジュゲート化される場合がある（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９２／０８４９５、ＷＯ９１／１４４３８、ＷＯ８９／１２６２４、米国特許第５，３１４，９９５号及び欧州特許出願ＥＰ０３９６３８７を参照のこと）。それらはまた、本願発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）を形成するように、上記シグナルドメイン及び膜貫通ドメインに融合され得る。
【０３３７】
本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、ペプチド結合又は修飾型ペプチド結合（すなわち、ペプチドアイソスター）によって互いにつながれるアミノ酸から構成されることが可能であり、また、遺伝子によりコードされる２０個のアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有する場合がある。抗体は、天然のプロセス（例えば、翻訳後プロセシングなど）によって、又は、この技術分野ではよく知られている化学的修飾技術によって改変される場合がある。そのような修飾が、基礎的な教本において、また、より詳しいモノグラフにおいて、ならびに、膨大な数の研究文献において十分に記載されている。修飾を、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ末端又はカルボキシル末端を含めて、抗体においてどこにでも、あるいは、炭水化物などの成分に対して行うことができる。同じタイプの修飾が、所与の抗体において、いくつかの部位において同じ程度又は種々の程度で存在する場合があることが理解されるであろう。また、所与の抗体が多くのタイプの修飾を含有する場合がある。抗体は、例えば、ユビキチン化の結果として分岐する場合があり、また、分岐を伴って、又は伴うことなく、環状である場合がある。環状の抗体、分岐した抗体、及び、分岐した環状の抗体が、翻訳後の天然のプロセスから生じる場合があり、又は、合成的方法によって作製される場合がある。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合連結、ヘム成分の共有結合連結、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合連結、脂質又は脂質誘導体の共有結合連結、ホスファチジルイノシトールの共有結合連結、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加（例えば、アルギニル化など）、及び、ユビキチン化が含まれる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第２版（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１頁〜１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２（１９９０）、６２６〜６４６；Ｒａｔｔａｎ他、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３（１９９２）、４８〜６２を参照のこと）。
【０３３８】
本発明はまた、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体と、異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体のＶＨ領域のいずれか１つ又は複数のアミノ酸配列、あるいは、本発明の抗体のＶＬ領域又はそのフラグメントもしくは変異体のいずれか１つ又は複数のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含むか、あるいは、そのようなポリペプチドから本質的になるか、あるいは、そのようなポリペプチドからなる。別の実施形態において、本明細書中に開示される診断方法及び処置方法において使用されるための融合タンパク質は、抗体のＶＨ−ＣＤＲ又はそのフラグメント、変異体もしくは誘導体のいずれか１つ、２つ、３つのアミノ酸配列、あるいは、抗体のＶＬ−ＣＤＲ又はそのフラグメント、変異体もしくは誘導体のいずれか１つ、２つ、３つのアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含むか、あるいは、そのようなポリペプチドから本質的になるか、あるいは、そのようなポリペプチドからなる。１つの実施形態において、融合タンパク質は、本発明の抗体のＶＨ−ＣＤＲ３又はそのフラグメント、誘導体もしくは変異体のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含み、そのような融合タンパク質はＦＡＰに特異的に結合する。別の実施形態において、融合タンパク質は、本発明の抗体の少なくとも１つのＶＨ領域のアミノ酸配列と、本発明の抗体の少なくとも１つのＶＬ領域又はそのフラグメント、誘導体もしくは変異体のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む。好ましくは、融合タンパク質のＶＨ領域及びＶＬ領域は、ＦＡＰと特異的に結合する単一供給源の抗体（あるいはｓｃＦｖフラグメント又はＦａｂフラグメント）に対応する。さらに別の実施形態において、本明細書中に開示される診断方法及び処置方法において使用されるための融合タンパク質は、抗体のＶＨＣＤＲのいずれか１つ、２つ、３つ又はそれ以上のアミノ酸配列と、抗体のＶＬＣＤＲ又はそのフラグメントもしくは変異体のいずれか１つ、２つ、３つまたそれ以上のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む。好ましくは、ＶＨ−ＣＤＲ又はＶＬ−ＣＤＲの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上が、本発明の単一供給源の抗体（あるいはｓｃＦｖフラグメント又はＦａｂフラグメント）に対応する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子もまた本発明によって包含される。
【０３３９】
文献に報告される例示的な融合タンパク質には、下記の融合物が含まれる：Ｔ細胞受容体（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４（１９８７）、２９３６〜２９４０）；ＣＤ４（Ｃａｐｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７（１９８９）、５２５〜５３１；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９（１９８９）、６８〜７０；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ他、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ  ９（１９９０）、３４７〜３５３；及びＢｙｒｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４（１９９０）、６６７〜６７０）；Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）（Ｗａｔｓｏｎ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０（１９９０）、２２２１〜２２２９；及びＷａｔｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９（１９９１）、１６４〜１６７）；ＣＤ４４（Ａｒｕｆｆｏ他、Ｃｅｌｌ  ６１（１９９０）、１３０３〜１３１３）；ＣＤ２８及びＢ７（Ｌｉｎｓｌｅｙ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３（１９９１）、７２１〜７３０）；ＣＴＬＡ−４（Ｌｉｓｌｅｙ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４（１９９１）、５６１〜５６９）；ＣＤ２２（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ他、Ｃｅｌｌ  ６６（１９９１）、１１３３〜１１４４）；ＴＮＦ受容体（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８（１９９１）、１０５３５〜１０５３９；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１９９１）、２８８３〜２８８６；及びＰｅｐｐｅｌ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４（１９９１）、１４８３〜１４８９（１９９１））；ならびにＩｇＥ受容体ａ（Ｒｉｄｇｗａｙ  ａｎｄ  Ｇｏｒｍａｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５（１９９１）、アブストラクト番号：１４４８）。
【０３４０】
本明細書中の他のところで議論されるように、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、ポリペプチドのインビボ半減期を増大させるために、又は、この技術分野において知られている方法を使用する免疫アッセイにおける使用のために異種ポリペプチドに融合される場合がある。例えば、１つの実施形態において、ＰＥＧを、本発明の抗体に、その半減期をインビボにおいて増大させるためにコンジュゲート化することができる（例えば、Ｌｅｏｎｇ他、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１６（２００１）、１０６〜１１９；Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４（２００２）、５３１；又はＷｅｉｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０（２００２）、５１２を参照のこと）。
【０３４１】
そのうえ、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、マーカー配列（例えば、それらの精製又は検出を容易にするためのペプチドなど）に融合することができる。好ましい実施形態において、マーカーのアミノ酸配列は、多くのものが市販されているが、とりわけ、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（ＨＩＳ）であり、例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ．、９１３１１）において提供されるタグなどである。例えば、Ｇｅｎｔｚ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６（１９８９）、８２１〜８２４に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の便利な精製をもたらす。精製のために有用である他のペプチドタグには、「ＨＡ」タグ（これは、インフルエンザの赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する）（Ｗｉｌｓｏｎ他、Ｃｅｌｌ  ３７（１９８４）、７６７）、ＧＳＴ、ｃ−ｍｙｃ及び「ｆｌａｇ」タグが含まれるが、これらに限定されない（例えば、エピトープタグ化技術の総説については、Ｂｉｌｌ  Ｂｒｉｚｚａｒｄ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４４（２００８）、６９３〜６９５を、また本発明において使用可能である最も一般的なエピトープタグを列挙するその６９４頁における表１を参照のこと。これらの主題は、本明細書により明示的に、参照によって組み込まれる）。
【０３４２】
融合タンパク質を、この技術分野においてよく知られている方法を使用して調製することができる（例えば、米国特許第５，１１６，９６４号及び第５，２２５，５３８号を参照のこと）。融合が行われるまさにその部位が、融合タンパク質の分泌又は結合特性を最適化するために経験的に選択される場合がある。融合タンパク質をコードするＤＮＡがその後、本明細書中上で記載されるように行われる発現のために宿主細胞にトランスフェクションされる。
【０３４３】
本発明の抗体は非コンンジュゲート化形態で使用される場合があり、あるいは、例えば、分子の治療的性質を改善するために、標的検出を容易にするために、又は、患者の画像化もしくは治療のために様々な分子の少なくとも１つにコンジュゲート化される場合がある。本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、精製が行われるときには精製前又は精製後のどちらでも標識化又はコンジュゲート化することができる。特に、本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節物質、医薬剤又はＰＥＧにコンジュゲート化される場合がある。
【０３４４】
従来の抗体を含む免疫毒素であるコンジュゲートがこの技術分野において幅広く記載されている。毒素が従来からのカップリング技術によって抗体にカップリングされる場合があり、又は、タンパク質毒素部分を含有する免疫毒素を融合タンパク質として作製することができる。本発明の抗体は、そのような免疫毒素を得るための対応する方法で使用することができる。そのような免疫毒素を例示するものが、Ｂｙｅｒｓ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（１９９１）、５９〜７０、及び、Ｆａｎｇｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １２（１９９１）、５１〜５４によって記載される免疫毒素である。
【０３４５】
当業者は、コンジュゲートがまた、コンジュゲート化されるための選択された薬剤に依存して様々な技術を使用して組み立てられ得ることを理解するであろう。例えば、ビオチンとのコンジュゲートが、例えば、ＦＡＰ結合ポリペプチドをビオチンの活性化エステル（例えば、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなど）と反応することによって調製される。同様に、蛍光性マーカーとのコンジュゲートがカップリング剤（例えば、本明細書中に列挙されるカップリング剤）の存在下で調製される場合があり、又は、イソチオシアン酸塩との反応によって、好ましくはイソチオシアン酸フルオレセインとの反応によって調製される場合がある。本発明の抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体のコンジュゲートが同様な様式で調製される。
【０３４６】
本発明はさらに、診断剤または治療剤にコンジュゲート化される本発明の抗体、その生物工学誘導体および合成誘導体、ならびに、それらに同等なＦＡＰ結合薬剤を包含する。とりわけ治療的使用については、本発明の抗体およびその融合タンパク質、ならびに、本発明による組成物は、治療的使用のための生物学的に活性な薬剤（例えば、サイトカイン、ケモカインまたはシグナル伝達経路媒介因子あるいは放射性同位体など）を含むことができる。例えば、様々なサイトカインは、抗ガン活性を有することが知られているが、治療活性な濃度への用量増加の期間中に示されるそれらの壊滅的な毒性のために、臨床利用にまで至ることができない。これらの問題を避けるために、治療剤を腫瘍部位に蓄積させ、したがって、これにより、全身的な副作用を軽減させるための的確かつ効率的な方法が、腫瘍特異的抗体に対するそれらのコンジュゲート化、例えば、ＦＡＰに対するそれらのコンジュゲート化である。腫瘍関連間質または血管を選択的に標的とする単鎖ヒト抗体にコンジュゲート化される免疫サイトカインに関する総説が、例えば、Ｒｏｎｃａ他、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２１４（２００９）、８００〜８１０において示される。
【０３４７】
抗体を、例えば、ＦＡＰの存在を明らかにして、ＦＡＰに関連付づけられる疾患に罹る危険性を示すために、そのような疾患（すなわち、ＦＡＰの出現を示す、あるいは、ＦＡＰの上昇したレベルに関連づけられる疾患）の発症又は進行をモニターして、又は臨床検査手順の一部として、例えば、所与の処置療法及び／又は防止療法の効力を明らかにするために、診断的に使用することができる。したがって、１つの実施形態において、本発明は、検出可能に標識される抗体に関連する。さらには、１つの実施形態において、本発明は、薬物に結合させられる抗体に関連する。検出を、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体を検出可能な物質にカップリングすることによって容易にすることができる。検出可能な物質又は標識は一般に、酵素、重金属（好ましくは金）、色素（好ましくは蛍光性色素又は発光性色素）又は放射性標識である場合がある。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光性物質、発光性物質、生物発光性物質、放射性物質、様々な陽電子放出断層撮影法を使用する陽電子放出金属、及び、非放射性常磁性金属イオンが含まれる（本発明に従って診断剤として使用されるために抗体にコンジュゲート化することができる金属イオンについては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと）。好適な酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；好適な補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられる；好適な蛍光性物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリンが挙げられる；発光性物質の一例として、ルミノールが挙げられる；生物発光性物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられる；好適な放射性物質の例として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ又は９９Ｔｃが挙げられる。したがって、１つの実施形態において、本発明は、検出可能な標識が、酵素、放射性同位体、蛍光団及び重金属からなる群から選択される検出可能に標識された抗体を提供する。ＦＡＰターゲッティングにおける更なる好適な放射性ラベル及び細胞毒素は当業者に公知である。例えば、国際出願ＷＯ  ２０１１／０４０９７２を参照。
【０３４８】
抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体はまた、化学発光化合物にカップリングすることによって検出可能に標識することができる。化学発光標識された抗体の存在がその後、化学反応の経過の期間中に生じる発光の存在を検出することによって求められる。特に有用な化学発光性の標識用化合物の例が、ルミノール、イソルミノール、テロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルである。抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体が検出可能に標識され得る方法の１つは、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体を酵素に連結し、連結された生成物を酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）において使用することによってである（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．、「Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２（１９７８）、１〜７）；Ｖｏｌｌｅｒ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１（１９７８）、５０７〜５２０；Ｂｕｔｌｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（１９８１）、４８２〜５２３；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編）、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９８０）；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．他（編）、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ、Ｔｏｋｙｏ（１９８１））。酵素は、抗体に結合しているので、例えば、分光光度法的手段、蛍光定量法的手段又は目視的手段によって検出することができる化学的成分を生成するような様式で、適切な基質（好ましくは発色性基質）と反応するであろう。抗体を検出可能に標識するために使用することができる酵素には、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されない。加えて、検出を、酵素のための発色性基質を用いる比色法によって達成することができる。検出はまた、類似して調製された標準物との比較における基質の酵素反応の程度の目視比較によって達成される場合がある。
【０３４９】
検出はまた、様々な他の免疫アッセイのいずれかを使用して達成される場合がある。例えば、抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体を放射能標識することによって、抗体を放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）の使用により検出することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（Ｍａｒｃｈ、１９８６）を参照のこと。これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。放射性同位体を、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター又はオートラジオグラフィー（これらに限定されない）を含む手段によって検出することができる。抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体はまた、蛍光放射金属（例えば、ランタニド系列の１５２Ｅｕなど）を使用して検出可能に標識することができる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート化基を使用して抗体に結合させることができる。
【０３５０】
様々な成分を抗体あるいはその抗原結合フラグメント、変異体又は誘導体にコンジュゲート化するための技術がよく知られている；例えば、Ａｒｎｏｎ他、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄ他（編）、２４３頁〜５６頁、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ他、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、６２３頁〜５３頁（１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａ他（編）、４７５頁〜５０６頁（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎ他（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、３０３頁〜１６頁（１９８５）、及び、Ｔｈｏｒｐｅ他、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２（１９８２）、１１９〜１５８を参照のこと。述べられたように、特定の実施形態において、結合性分子、例えば、結合性ポリペプチド、例えば、抗体又はその免疫特異性フラグメントの安定性又は効力を高める成分をコンジュゲート化することができる。例えば、１つの実施形態において、ＰＥＧを、本発明の結合性分子に、その半減期をインビボにおいて増大させるためにコンジュゲート化することができる。Ｌｅｏｎｇ他、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１６（２００１）、１０６；Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４（２００２）、５３１；又は、Ｗｅｉｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０（２００２）、５１２。
【０３５１】
ＶＩＩＩ．有用な組成物および方法
添付された実施例において明らかにされ、また、図に例示されるように、本発明の抗ＦＡＰ抗体は、ＦＡＰとインビトロにおいて、また、信頼性のあるＦＡＰの非侵襲的かつ組織非存在の検出アッセイのために提供されるそのエピトープと選択的に結合することができる。さらに、本発明の抗ＦＡＰ抗体は、ＦＡＰとインビボにおいて、ヒト血漿において、また、ＦＡＰの存在によって特徴づけられる疾患組織において、例えば、乳ガン組織、ガン腫、多発性骨髄腫組織など、ならびに、アテローム斑および閉塞性冠状動脈血栓において選択的に結合することができる。そのうえ、いくつかの実施形態において、本発明の抗ＦＡＰ抗体は、ＦＡＰセリンプロテアーゼ活性に対する阻害作用を有しており、インビボにおいて生物学的に活性であり、これにより、様々な治療効果（例えば、血液凝固時間および動脈閉塞時間を延長すること）、ならびに、例えば、結腸直腸ガンに対する抗腫瘍効果を発揮する。これらのすべての性質のために、前節において記載される本発明の抗ＦＡＰ抗体およびその同等物は様々な診断適用および治療適用において有用となる。
【０３５２】
したがって、本発明は、本明細書中前記で定義されるような上述のＦＡＰ結合性分子（例えば、本発明の抗体またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体）、あるいは、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、細胞またはペプチドを含む組成物、および、その使用に関連する。１つの実施形態において、本発明の組成物は医薬組成物であり、かつ、医薬的に許容され得る担体をさらに含む。さらには、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図された使用に依存して、さらなる薬剤（例えば、抗腫瘍剤、インターロイキンまたはインターフェロンなど）を含む場合がある。増大したレベルのＦＡＰの出現を示す疾患または障害、あるいは、増大したレベルのＦＡＰに関連づけられる疾患または障害の処置における使用のために、さらなる薬剤が、小さい有機分子、抗ＦＡＰ抗体およびそれらの組合せからなる群から選択される場合がある。したがって、特定の好ましい実施形態において、本発明は、ＦＡＰに伴う疾患または障害の予防的処置および治療的処置、ＦＡＰに伴う疾患もしくは障害の進行またはＦＡＰ標的化処置に対する応答を対象においてモニターすること、あるいは、ＦＡＰに伴う疾患または障害を発症することについての対象の危険性を明らかにすることのための医薬組成物または診断組成物を調製するための、ＦＡＰ結合性分子（例えば、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント）の使用、あるいは、それらのいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有する結合性分子、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、又は細胞の使用に関連する。
【０３５３】
したがって、１つの実施形態において、本発明は、冒された組織および器官におけるＦＡＰの異常な発現によって特徴づけられる疾患または障害（例えば、ガン、血管系における疾患または障害など、上記もまた参照のこと）を処置する方法であって、その必要性のある対象に、本発明の上記のＦＡＰ結合性分子、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞またはペプチドのいずれか１つの治療効果的な量を投与することを含む方法に関連する。
【０３５４】
本発明のこの治療的アプローチの特定の利点の１つが、本発明の組換え抗体は、体細胞成熟、すなわち、抗体の可変領域の体細胞変化による、標的ＦＡＰ分子に対する高親和性結合における選択性および有効性に関しての最適化を既に首尾良く経ているヒトメモリーＢ細胞に由来するという事実にある。
【０３５５】
そのような細胞は生体内において、例えば、ヒト体内において、自己免疫学的反応又はアレルギー反応の意味で、関連した、又は他の生理学的なタンパク質又は細胞構造によって活性化されていないという認識はまた、臨床試験段階を首尾よく生き残るという相当に増大した可能性がこれにより意味されるので、非常に医学的に重要である。いわば、効率、許容性及び耐容性が、少なくとも１名のヒト対象において予防的抗体又は治療的抗体の前臨床開発及び臨床開発の前に既に実証されている。したがって、本発明のヒト由来抗ＦＡＰ抗体は、治療剤としてのその標的構造特異的効率と、副作用のその低下した可能性との両方により、成功のその臨床的可能性を著しく増大させることが予想され得る。
【０３５６】
本発明はまた、上記で記載された成分（例えば、本発明の抗ＦＡＰ抗体、その結合フラグメント、誘導体もしくは変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞および／またはペプチド）の１つまたは複数により満たされる１つまたは複数の容器を含む医薬用および診断用のそれぞれのパックまたはキットを提供する。そのような容器には、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められる形式での通知が伴い得る（ただし、そのような通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売の当局による承認を反映する）。加えて、または代替において、キットは、適切な診断アッセイにおいて使用されるための試薬および／または説明書を含む。本発明の組成物、例えば、キットは、当然のことではあるが、ＦＡＰの存在が伴う疾患または障害の危険性評価、診断、防止および処置のために特に適しており、具体的には、ガン、アテローム性動脈硬化および凝固障害などの疾患および／または障害を含む、ＦＡＰ発現によって一般には特徴づけられる障害を処置するために適用可能である；上記を参照のこと。
【０３５７】
本発明の医薬組成物はこの技術分野においてよく知られている方法に従って配合することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＩＳＢＮ０−６８３−３０６４７２）を参照のこと）。好適な医薬用キャリアの例がこの技術分野ではよく知られており、これらには、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水エマルションなど）、様々なタイプの湿潤化剤、無菌溶液などが含まれる。そのようなキャリアを含む組成物を、よく知られている従来の方法によって配合することができる。これらの医薬組成物は好適な用量で対象に投与することができる。好適な組成物の投与が、種々の方法によって、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、局所的投与又は皮内投与あるいは脊髄送達又は脳送達によって行われる場合がある。エアロゾル配合物、例えば、鼻腔噴霧配合物などには、保存剤及び等張剤を伴う活性な薬剤の精製された水性溶液又は他の溶液が含まれる。そのような配合物は好ましくは、鼻腔粘膜と適合し得るｐＨ及び等張性状態に調節される。直腸投与又は膣投与のための配合物が、好適なキャリアを伴う坐薬として提示される場合がある。
【０３５８】
投薬計画が主治医及び臨床上の要因によって決定されるであろう。医療技術分野ではよく知られているように、どのような患者であれ、患者のための投薬量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与されるべき具体的な化合物、性別、投与時間及び投与経路、全身の健康状態、ならびに、同時に投与されている他の薬物を含めて、多くの要因に依存する。典型的な用量が、例えば、０．００１μｇ〜１０００μｇの範囲（あるいは、この範囲における発現又は発現阻害のための核酸の範囲）であり得る；しかしながら、この例示的な範囲よりも少ない用量又は大きい用量が、とりわけ上述の要因を考慮して想定される。一般に、投薬量は、例えば、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲が可能であり、より通常的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）が可能である。例えば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重、あるいは、１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記範囲において中間的である用量もまた、本発明の範囲内で意図される。対象には、そのような用量を毎日、１日おきに、毎週、又は、経験的分析によって決定されるいずれかの他のスケジュールに従って投与することができる。例示的な処置は、例えば、少なくとも６ヶ月の長期間にわたる多数回の投薬での投与を伴う。さらなる例示的な処置計画は、２週間毎に１回、又は、１ヶ月に１回、又は、３ヶ月毎〜６ヶ月毎に１回での投与を伴う。例示的な投薬スケジュールには、連続した毎日での１〜１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇ、１日おきでの３０ｍｇ／ｋｇ、あるいは、毎週での６０ｍｇ／ｋｇが含まれる。一部の方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、そのような場合、投与されるそれぞれの抗体の投薬量が、示される範囲内である。進行を定期的な評価によってモニターすることができる。非経口投与のための調製物には、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁物及びエマルションが含まれる。非水性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油など）、及び、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）が挙げられる。水性キャリアには、生理的食塩水及び緩衝媒体を含めて、水、アルコール性溶液／水溶液、エマルション又は懸濁物が含まれる。非経口用ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル又は固定油が含まれる。静脈内用ビヒクルには、流体及び栄養補充液及び電解質補充液（例えば、リンゲルブドウ糖に基づくものなど）などが含まれる。保存剤及び他の添加剤もまた存在する場合がある（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤及び不活性ガスなど）。さらには、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図された使用に依存して、さらなる薬剤（例えば、ドーパミン又は精神薬理学的薬物など）を含む場合がある。
【０３５９】
１つの実施形態において、本発明の抗体の組換えＦａｂフラグメント（ｒＦａｂ）及び単鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）を使用することが有益である場合がある。これは、それらがより容易に細胞膜に浸透するかもしれないからである。エフェクター機能を欠く小さいＦａｂ及びｓｃＦｖの操作された抗体様式を使用することの認識された利点には、血液脳関門をより効率的に通過すること、及び、炎症性の副反応を誘発する危険性を最小限に抑えることが含まれる。さらには、ｓｃＦＶ及び単鎖ドメイン抗体は全長抗体の結合特異性を保持することのほかに、それらは単一遺伝子として発現させることができ、また、折り畳み、相互作用、修飾、又は、それらの標的の細胞内局在化の変化についての潜在的可能性が伴うが、細胞内抗体として哺乳動物細胞において細胞内に発現させることができる（総説については、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｓｓｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１２（２００５）、３９４〜４０１を参照のこと）。
【０３６０】
異なる取り組みにおいて、Ｍｕｌｌｅｒ他、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５）、２３７〜２４１は、抗体が、生細胞を傷づけることなく生細胞内に往復させられることを可能にすると言われる技術基盤（いわゆる「ＳｕｐｅｒＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」）を記載する。そのような細胞浸透抗体により、新しい診断範囲及び治療範囲が開拓される。用語「ＴｒａｎｓＭａｂｓ」がこれらの抗体のために案出されている。
【０３６１】
さらなる実施形態において、他のＦＡＰ標的化薬剤の共投与または逐次投与が望ましい場合がある。対象を処置するために使用することができる薬剤の例には、下記の薬剤が含まれるが、それらに限定されない：ＦＡＰ四量体を安定化する薬剤、例えば、タファミジスメグルミン、ジフルシナール（ｄｉｆｌｕｓｉｎａｌ）、ウルソデオキシコール酸を伴うドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎ）など；抗炎症剤、例えば、ジフルシナール、コルチコステロイド類、２−（２，６−ジクロルアニリノ）フェニル酢酸（ジクロフェナク）、イソ−ブチルプロパノイックフェノール酸（ｉｓｏ−ｂｕｔｙｌ−ｐｒｏｐａｎｏｉｃ−ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（イブプロフェン）など；利尿剤、没食子酸エピガロカテキン、メルファラン塩酸塩、デキサメタゾン、ボルテゾミブ、ボルテゾミブ−メルファラン、ボルテゾミブ−デキサメタゾン、メルファラン−デキサメタゾン、ボルテゾミブ−メルファラン−デキサメタゾン；抗うつ剤、抗精神病薬、神経遮断剤、抗認知症薬（例えば、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストのメマンチン）、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（例えば、 ドネペジル，ＨＣｌ、リバスチグミン、ガランタミン）、グルタミン酸アンタゴニストおよび他の向知性剤血圧薬剤（例えば、 ジヒドララジン、メチルドパ）、細胞増殖抑制剤、グルココルチコイド類、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤；抗炎症剤、または、どのような組合せであれ、それらの組合せ。
【０３６２】
臨床臓器移植の後における臓器拒絶を処置または防止するために使用されることがある薬剤の例には、免疫系の弱化を引き起こす一群の薬剤、すなわち、例えば、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリンおよびタクロリムスなど）などを含む免疫抑制剤、増殖の阻害剤、例えば、エベロリムスおよびシロリムス（ラパマイシン）を含むｍＴＯＲ阻害剤など、ならびに、代謝拮抗剤、例えば、アザチオプリン、ミコフェノラート、モフェチル／ＭＭＦおよびミコフェノール酸が含まれるが、それらに限定されず、また、コルチコステロイド類、例えば、コルチゾンおよびコルチゾールなど、ならびに、合成物質、例えば、プレドニソンまたはプレドニソロンなどを使用することができる。加えて、様々な抗体を使用することができる：例えば、抗ＩＬ２受容体モノクローナル抗体（例えば、 バシリキシマブ、ダクリズマブ）、ならびに、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（例えば、 ムロモナブ−ＣＤ３）、および、ポリクローナル組成物、例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）など；ならびにグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体アゴニスト（例えば、Ｎｏｇｕｃｈｉ他、Ａｃｔａ  Ｍｅｄ．Ｏｋａｙａｍａ、６０（２００６）、および、国際特許出願公開ＷＯ２０１２／０８８１５７を参照のこと）。さらに、さらなる薬剤には、臓器移植後の感染症および他の副作用の予防および／または処置のための薬剤が含まれる場合があり、これらには、バルガンシクロビル、サイトメガリエ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｉｅ）−免疫グロブリン、ガンシクロビル、アムホテリシンＢ、ピリメタミン、ラニチジン、ラミプリル、フロセミド、ベンズブロマロンが含まれる。したがって、１つの実施形態において、ＦＡＰアミロイドーシスを処置するために有用であり、かつ／あるいは、例えば、臨床肝臓移植の後における臓器拒絶を処置または防止することにおいて有用であるさらなる薬剤をさらに含む組成物が提供される。
【０３６３】
特定の好ましい実施形態において、本発明は、本明細書中上記で特徴づけられるようなＦＡＰに伴う疾患に罹患する、または、そのような疾患を発症する危険性がある患者の処置において使用するための治療剤（好ましくはＦＡＰ標的化薬剤）であって、患者の血液のサンプルのＦＡＰレベルが、健康な対象からのコントロールサンプルと比較して上昇しており、ＦＡＰレベルが、配列番号３０〜配列番号３２および配列番号６０のいずれか１つのアミノ酸配列からなる、またはそのようなアミノ酸配列を含むＦＡＰのエピトープを検出することによって明らかにされることを特徴とする治療剤に関連する。好ましくは、患者は、下記でさらに記載されるような本発明の方法に従って診断されている。実際には、ＦＡＰ標的化薬剤による薬物療法、具体的には、抗ＦＡＰ抗体のＮＩ−２０６．８２Ｃ２およびＮＩ−２０６．１８Ｈ２ならびにその生物工学誘導体および合成誘導体、また、それらに同等なＦＡＰ結合薬剤による薬物療法がほとんどの場合、エピトープ「５２５−ＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰ−５３５」およびエピトープ「５０１−ＩＱＬＰＫＥＥＩＫＫＬ−５１１」を定量し、それにより、「薬物標的」ＦＡＰの量を特異的に測定し、したがって、薬物療法のための治療効果的な量を服用することを可能にする、実施例において例示される本発明の方法およびアッセイと組み合わされるであろう。
【０３６４】
治療効果的な用量又は量は、症状又は状態を改善するために十分である有効成分のそのような量を示す。そのような化合物の治療効力及び毒性を、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学手順によって、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療効果的な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）によって求めることができる。治療効果と毒性影響との間における用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。
【０３６５】
前記から、本発明は、上記抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むＦＡＰ結合性分子のどのような使用をも包含し、具体的には、上記で述べられるような、ＦＡＰに関連づけられる疾患又は障害の診断及び／又は処置のためのそのような分子のどのような使用をも包含することが明らかである。好ましくは、前記結合性分子は本発明の抗体である。加えて、本発明は、本明細書中前記で記載される述べられた抗体のいずれかの１つの様々な抗イディオタイプ抗体に関連する。これらは、抗原結合部位の近くにおいて抗体の可変領域に位置する特有の抗原性ペプチド配列に結合する抗体又は他の結合性分子であり、例えば、対象から得られるサンプルにおける抗ＦＡＰ抗体を検出するために有用である。１つの実施形態において、本発明は、ＦＡＰに関連づけられる疾患又は障害の予防的処置、治療的処置、ならびに／あるいは、ＦＡＰに関連づけられる疾患又は障害の進行又は処置に対する応答をモニターすることにおいて使用されるための、本明細書中上記において、また下記で定義されるような抗体、又は、前記抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＦＡＰ結合性分子、本明細書中で定義されるようなポリヌクレオチド、ベクター又は細胞、あるいは、それらのいずれか１つを含む医薬組成物又は診断組成物を提供する。
【０３６６】
別の実施形態において、本発明は、本発明の上記で記載されたＦＡＰ結合性分子、抗体、抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクターあるいは細胞のいずれか１つと、場合により、検出のための好適な手段（例えば、免疫又は核酸に基づく診断方法において従来から使用される試薬など）とを含む診断組成物に関連する。本発明の抗体は、例えば、抗体を液相において利用することができるか、又は、固相キャリアに結合させることができる免疫アッセイにおける使用のために適している。本発明の抗体を利用することができる免疫アッセイの例が、直接的様式又は間接的様式でのどちらであれ、競合的免疫アッセイ及び非競合的免疫アッセイである。そのような免疫アッセイの例が、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチアッセイ（イムノメトリックアッセイ）、フローサイトメトリーアッセイ及びウエスタンブロットアッセイである。本発明の抗原及び抗体は多くの異なるキャリアに結合させることができ、また、それらに特異的に結合する細胞を単離するために使用することができる。よく知られているキャリアの例には、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然セルロース及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及びマグネタイトが含まれる。キャリアの性質は本発明の目的のために可溶性又は不溶性のどちらでも可能である。多くの異なる標識及び標識化方法が当業者には知られている。本発明において使用することができる標識のタイプの例には、酵素、放射性同位体、コロイド状金属、蛍光性化合物、化学発光化合物及び生物発光化合物が含まれる（本明細書中上記で議論された実施形態もまた参照のこと）。
【０３６７】
さらなる実施形態によって、ＦＡＰ結合性分子はまた、特に、本発明の抗体はまた、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、リンパサンプル又はいずれかの他の体液サンプル（例えば、唾液サンプル又は尿サンプルなど）である場合がある体液サンプルを検査された個体から得ること、及び、体液サンプルを、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件のもとで本発明の抗体と接触させることによって、ＦＡＰ関連疾患又は障害を個体において診断するための方法において使用される場合がある。そのような複合体のレベルがその後、この技術分野において知られている方法によって求められ、コントロールサンプルにおいて形成されるレベルよりも有意に大きいレベルにより、疾患が、検査された個体において示される。同じ様式で、本発明の抗体が結合する特異的抗原もまた使用される場合がある。したがって、本発明は、結合性分子、例えば、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを含むインビトロ免疫アッセイに関連する。好ましくは、ＦＡＰ結合性分子は抗ＦＡＰ抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２又はＮＩ−２０６．１８Ｈ２或いはそれらの組換え、生物工学又は合成誘導体である。
【０３６８】
本発明のさらなる実施形態において、ＦＡＰ結合性分子、具体的には本発明の抗体はまた、個体における疾患または障害の診断を、皮膚、唾液腺、毛根、心臓、結腸、神経、皮下脂肪生検物、または、どのような罹患器官からでもその生検物であり得る生検物を検査された個体から得ることによって行うための方法において使用される場合がある。
【０３６９】
この関連において、本発明はまた、この目的のために具体的に設計される手段に関連する。例えば、抗体に基づくアレイが使用される場合があり、アレイには、例えば、ＦＡＰを特異的に認識する本発明の抗体又はその同等な抗原結合性分子が負荷される。マイクロアレイでの免疫アッセイの設計が、Ｋｕｓｎｅｚｏｗ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５（２００６）、１６８１〜１６９６において要約される。したがって、本発明はまた、本発明に従って特定されるＦＡＰ結合性分子が負荷されるマイクロアレイに関連する。
【０３７０】
１つの実施形態において、本発明は、ＦＡＰに関連づけられる疾患又は障害を対象において診断する方法であって、診断される対象から得られるサンプルにおけるＦＡＰの存在を、本発明の少なくとも１つの抗体、ＦＡＰ結合フラグメント、又は、それらのいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＦＡＰ結合性分子を用いて明らかにすることを含み、この場合、ＦＡＰの存在が、ＦＡＰ関連疾患を示すものであり、また、健常コントールのレベルとの比較において、ＦＡＰのレベルの増大が、前記対象のＦＡＰアミロイドーシスの進行について示すものである方法に関連する。
【０３７１】
診断されるべき対象は疾患について無症候性又は病状発現前である場合がある。好ましくは、コントロール対象は、上記で記載されるように、ＦＡＰに伴う疾患を有しており、ただし、この場合、ＦＡＰのレベルと、参照標準との間における類似性により、診断されるべき対象が、ＦＡＰ関連疾患を有すること、或いは、ＦＡＰ関連疾患を発症する危険性があることが示される。代替において、又は加えて、第２のコントロールとして、コントロール対象はＦＡＰ関連疾患を有しておらず、ただし、この場合、生理学的ＦＡＰのレベルと、参照標準との間における違いにより、診断されるべき対象が、ＦＡＰ関連疾患を有すること、或いは、ＦＡＰ関連疾患を発症する危険性があることが示される。好ましくは、診断されるべき対象と、コントロール対象とは、年齢が一致している。分析されるべきサンプルは、ＦＡＰを含有することが疑われる、どのような体液であってもよく、例えば、血液、血漿、血清、尿、腹腔液、唾液又は脳脊髄液（ＣＳＦ）である場合がある。
【０３７２】
ＦＡＰレベルが、例えば、ＦＡＰを、ウエスタンブロット、免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、二次元ゲル電気泳動、質量分析法（ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、表面増強レーザー脱離イオン化−飛行時間（ＳＥＬＤＩーＴＯＦ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、多次元液体クロマトグラフィー（ＬＣ）それに続くタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、及び、レーザーデンシトメトリーから選ばれる１つ又は複数の技術によって分析することを含む、この技術分野で知られている好適な方法のどれによって評価されてもよい。好ましくは、ＦＡＰの前記インビボ画像化は、シンチグラフィー、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射型断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光学的画像法又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む。
【０３７３】
特定の好ましい実施形態において、本発明は、対象が、ＦＡＰに伴う疾患に罹患しているかどうか、または、対象が、ＦＡＰ特異的な治療剤による処置に適するかどうかを診断するインビトロ方法であって、前記対象の体液（好ましくは血液）に由来するサンプルにおいてＦＡＰの存在を明らかにすることを含み、健康な対象からのコントロールサンプルと比較したＦＡＰレベルの上昇が、前記疾患および前記薬剤による前記処置のための可能性があることの指標となり、ただし、前記ＦＡＰレベルが、配列番号３０〜配列番号３２または配列番号６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、またはそのようなアミノ酸配列からなるＦＡＰのエピトープを検出することによって求められることを特徴とする、インビトロ方法に関連する。実施例１５において明らかにされ、また、図１７〜図２０に例示されるように、ＦＡＰを体液において、具体的には血液においてアッセイするための新規なアッセイが、本発明の主題抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２の新規なエピトープに基づいて開発されている。実施例１４に記載されるように、サンドイッチ型免疫アッセイ形式（＝サンドイッチ免疫アッセイまたはサンドイッチＥＬＩＳＡ）が特に好ましい。最も好ましくは、抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２またはその生物工学誘導体もしくは合成誘導体が検出抗体として使用され、抗ＦＡＰ抗体Ｆ１９またはその誘導体が捕捉抗体として使用される。代替において、別の抗ＦＡＰ抗体（例えば、ラットモノクローナル抗ＦＡＰ抗体クローンのＤ８、Ｄ２８およびＤ４３など）が捕捉抗体として使用される場合がある。抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２および抗体ＮＩ−２０６．１８Ｈ２の類似する結合特性、ならびにそれらのエピトープの近い位置を考慮すると、この実施形態、ならびに、下記の実施形態は、抗体ＮＩ−２０６．１８Ｈ２のＦＡＰエピトープである「５０１−ＩＱＬＰＫＥＥＩＫＫＬ−５１１」（配列番号６０）を用いて等しく行われる場合がある。
【０３７４】
上記で示されるように、本発明の抗体、そのフラグメント及び、本発明の抗体及びそのフラグメントと同じ結合特異性の分子は、インビトロだけでなく、インビボにおいても同様に使用される場合があり、ただし、この場合、診断的適用のほかに、治療的適用が同様に実行される場合がある。したがって、１つの実施形態において、本発明はまた、ヒト又は動物の身体におけるＦＡＰのインビボ検出のための組成物、或いは、治療剤及び／又は診断剤をヒト又は動物の身体においてＦＡＰに対して標的化するための組成物を調製するための、本発明の抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むＦＡＰ結合性分子に関連する。潜在的可能性のある治療剤及び／又は診断剤が、本明細書中上記で示されるような、ＦＡＰ関連疾患の処置において有用である治療剤、並びに、潜在的可能性のある標識の非網羅的な列挙から選ばれる場合がある。インビボ画像化に関して、１つの好ましい実施形態において、本発明は、本発明の抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含む前記ＦＡＰ結合性分子を提供し、ただし、この場合、前記インビボ画像化が、シンチグラフィー、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射型断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（ＮＩＲ）光学的画像法又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む。さらなる実施形態において、本発明はまた、本発明の抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含む前記ＦＡＰ結合性分子、又は、上記で指定されるインビボ画像化方法のための組成物を調製するための前記分子を、本明細書中上記で定義されるような、対象におけるＦＡＰに関連づけられる疾患又は障害を診断する、或いはその進行をモニターする方法における使用のために提供する。
【０３７５】
本発明のＣＡＲの抗原結合ドメインは本発明のヒト抗ＦＡＰ抗体に由来するので、前記ＣＡＲが、これらの抗体の結合特徴、具体的には、ヒト血漿における、また、ＦＡＰの存在によって特徴づけられる患部組織（例えば、乳ガン組織、ガン腫、多発性骨髄腫組織、アテローム斑および閉塞性冠状動脈血栓など）におけるインビボでのＦＡＰに対する選択的かつｐＨ依存的な結合、ならびに、ＦＡＰセリンプロテアーゼ活性に対する同じまたは類似する阻害効果、および抗腫瘍効果を実質的に保持することを予想することは、無理のないことである。さらには、本発明の組換え抗体はヒトメモリーＢ細胞に由来するので、ヒト由来成分から全体が構成されるＣＡＲを製造すること、したがって、例えば、マウスモノクローナル抗体から得られるＦＡＰ結合ドメインを使用する先行技術において記載されるものと比較したとしても、免疫原性がより低いＦＡＰ  ＣＡＲおよびＣＡＲ  Ｔ細胞に到達することが可能である。
【０３７６】
したがって、本発明はとりわけ、ヒト身体に対して異物である抗原を実質的に欠いているという意味で好ましくは全体がヒト型であり、かつ、場合により、ＣＡＲ媒介のＴ細胞応答を誘発することができる本発明のＦＡＰ  ＣＡＲを発現するように改変される細胞（例えば、Ｔ細胞）に関連する。本発明は、初代Ｔ細胞の特異性をＦＡＰ抗原に変更するためのＦＡＰ  ＣＡＲの使用を提供する。したがって、本発明はまた、哺乳動物における腫瘍微小環境内の間質細胞の集団に対するＴ細胞媒介の免疫応答を刺激する際に使用されるための方法であって、本発明のＦＡＰ  ＣＡＲを発現するＴ細胞を前記哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。
【０３７７】
１つの実施形態において、本発明のＣＡＲは、Ｔ細胞が、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変され、かつ、ＣＡＲ  Ｔ細胞がその必要性のあるレシピエントに注入されるタイプの細胞治療法において使用されるためのものである。注入された細胞は腫瘍負荷をレシピエントにおいて減少させることができる。抗体治療法とは異なり、ＣＡＲ  Ｔ細胞はインビボで複製することができ、これにより、持続した腫瘍抑制を引き起こすことが可能である長期間の持続がもたらされる。１つの実施形態において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、ロバストなインビボでのＴ細胞増殖を経ることができ、かつ、長期間にわたって持続することができる。別の実施形態において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、どのようなさらなる腫瘍形成または腫瘍成長も阻害するために再活性化され得る特異的なメモリーＴ細胞に進化する。例えば、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、ロバストなインビボでのＴ細胞増殖を経て、血液および骨髄において長期間にわたって高レベルで持続し、かつ、特異的なメモリー細胞を形成することができる。何らかの特定の理論によってとらわれることを望まないが、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、同族抗原を発現する標的細胞と遭遇し、その後、この標的細胞が排除されると、セントラルメモリー様状態にインビボで分化する場合がある。
【０３７８】
何らかの特定の理論によってとらわれることを望まないが、ＣＡＲ改変Ｔ細胞によって誘発される応答は能動的または受動的な免疫応答である場合がある。加えて、ＣＡＲ媒介の免疫応答は、ＣＡＲ改変Ｔ細胞により、ＣＡＲ内の抗原結合ドメインに対して特異的である免疫応答が誘導される養子免疫療法取り組みの一部である場合がある。例えば、ＦＡＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞により、ＦＡＰを発現する細胞に対して特異的である免疫応答が誘発される。本明細書中に開示されるデータは、抗ＦＡＰ結合ドメインを４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインと一緒に含むＣＡＲを具体的に開示するが、本発明は、本明細書中のどこか他のところで記載されるような構築物の構成成分のそれぞれについての変形をいくつでも含むように解釈されなければならない。
【０３７９】
本明細書中のどこか他のところで記載されるように、本発明は、腫瘍微小環境に存在する間質細胞を、ガンを処置するために標的化することにおいて使用されるためのＦＡＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を提供する。そのようなものとして、本発明は、間質細胞が存在するどのようなガンでも処置することにおいて使用されるための本発明のＣＡＲを包含する。処置され得るガンには、血管新生していない、または未だ実質的に血管新生していない腫瘍、ならびに、血管新生した腫瘍が含まれる。ガンは、非固形腫瘍（例えば、血液学的腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫）を含む場合があり、または固形腫瘍を含む場合がある。本発明のＣＡＲにより処置されることになるガンのタイプには、ガン腫、芽細胞腫および肉腫、ならびに、ある種の白血病またはリンパ性悪性腫瘍、良性および悪性の腫瘍、ならびに、様々な悪性腫瘍（例えば、肉腫、ガン腫およびメラノーマなど）が含まれるが、これらに限定されない。成人の腫瘍／ガンおよび小児の腫瘍／ガンもまた含まれる。
【０３８０】
血液学的ガンは血液または骨髄のガンである。血液学的（または血行性）ガンの例には、白血病が含まれ、これには、急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病など）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病および慢性リンパ性白血病など）、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（緩徐進行性形態および高悪性度形態）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病および脊髄形成異常症が含まれる。
【０３８１】
固形腫瘍は、嚢胞または液体領域を通常の場合には有しない異常な組織塊である。固形腫瘍は良性または悪性であることが可能である。種々のタイプの固形腫瘍が、固形腫瘍を形成する細胞のタイプに関して名付けられる（例えば、肉腫、ガン腫およびリンパ腫など）。固形腫瘍（例えば、肉腫およびガン腫など）の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸ガン、リンパ性悪性腫瘍、膵臓ガン、乳ガン、肺ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、肝細胞ガン、扁平上皮ガン、基底細胞ガン、腺ガン、汗腺ガン、甲状腺髄様ガン、甲状腺乳頭ガン、クロム親和性細胞腫、皮脂腺ガン、乳頭状ガン、乳頭状腺ガン、髄様ガン、気管支原性ガン、腎細胞ガン、ヘパトーマ、胆管ガン、絨毛ガン、ウィルムス腫瘍、子宮頸ガン、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱ガン、メラノーマ、ならびに、ＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫（例えば、脳幹神経膠腫および混合性神経膠腫など）、神経膠芽細胞腫（これはまた、多形性神経膠芽細胞腫として知られている）、星状膠細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、シュワン細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫および脳転移物など）が含まれる。
【０３８２】
本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞はまた、哺乳動物におけるエクスビボ免疫化および／またはインビボ治療のためのタイプのワクチンとして使用される場合がある。好ましくは、哺乳動物はヒトである。エクスビボ免疫化に関して、下記のうちの少なくとも１つが、細胞を哺乳動物に投与する前にインビトロで行われる：ｉ）細胞の増殖（拡大）、ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸を細胞に導入すること、および／または、ｉｉｉ）細胞の凍結保存。様々なエクスビボ手順がこの技術分野ではよく知られており、より詳しくは下記で議論される。簡単に記載すると、細胞が哺乳動物（好ましくはヒト）から単離され、本明細書中に開示されるＣＡＲを発現するベクターにより遺伝子改変される（すなわち、インビトロで形質導入され、またはトランスフェクションされる）。ＣＡＲ改変細胞を、治療的利益を与えるために哺乳動物レシピエントに投与することができる。哺乳動物レシピエントはヒトである場合があり、ＣＡＲ改変細胞はレシピエントに関して自己であることが可能である。代替において、細胞は、レシピエントに関して同種、同系または異種であることが可能である。
【０３８３】
造血幹細胞および造血始原体細胞のエクスビボ増殖のための手順が米国特許第５，１９９，９４２号（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されており、本発明の細胞に適用することができる。他の好適な方法がこの技術分野では知られており、したがって、本発明は、上記細胞のエクスビボ増殖のどのような特定の方法にも限定されない。簡単に記載すると、Ｔ細胞のエクスビボでの培養および増殖は、（１）哺乳動物からのＣＤ３４＋の造血幹細胞および造血始原体細胞を末梢血採取物または骨髄外植片から集めること、ならびに、（２）そのような細胞をエクスビボで増殖することを含む。米国特許第５，１９９，９４２号に記載される細胞成長因子に加えて、他の因子、例えば、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３およびｃ−ｋｉｔリガンドなどを、当該細胞の培養および増殖のために使用することができる。細胞に基づくワクチンをエクスビボ免疫化の観点から使用することに加えて、本発明はまた、抗原に対する免疫応答を患者において誘発するためのインビボ免疫化において使用されるための組成物および方法を提供する。
【０３８４】
概して、本明細書中に記載されるように活性化され、増殖された細胞は、免疫低下している個体において生じる疾患の処置および防止において使用される場合がある。具体的には、本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞はガンの処置において使用される。ある特定の実施形態において、本発明の細胞は、ガンを発症させることについて危険性がある患者の処置において使用される。したがって、本発明は、ガンの処置または防止において使用されるための方法であって、その必要性のある対象に本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞の治療効果的な量を投与することを含む方法を提供する。
【０３８５】
１つの実施形態において、ＦＡＰ  ＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞が、単独療法として投与するために使用される。しかしながら、別の実施形態において、ＦＡＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、併用療法で投与するために、例えば、本明細書中のどこか他のところで開示されるような抗腫瘍ワクチンと一緒に投与するために使用される。
【０３８６】
本発明のＦＡＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、単独で、あるいは、希釈剤および／または他の成分（例えば、ＩＬ−２または他のサイトカインなど）もしくは細胞集団との組合せでの医薬組成物として、そのどちらでも投与される場合がある。簡単に記載すると、本発明の医薬組成物は、本明細書中に記載されるような標的細胞集団を、１つまたは複数の医薬的または生理学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤との組合せで含む場合がある。そのような組成物は、緩衝剤（例えば、中性の緩衝生理食塩水およびリン酸塩緩衝生理食塩水など）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなど）、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシンなど）、酸化防止剤、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなど）、補助剤（例えば、水酸化アルミニウム）および保存剤を含む場合がある。本発明の組成物は好ましくは、静脈内投与のために配合される。
【０３８７】
本発明の医薬組成物は、処置（または防止）されるべき疾患に対して適切である様式で投与される場合がある。投与量および投与頻度が、患者の状態ならびに患者の疾患のタイプおよび重篤度のような要因によって決定されるであろう。だが、適切な投薬量が臨床試験によって決定される場合がある。
【０３８８】
「免疫学的に効果的な量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」または「治療量」が示されるとき、投与されるべき本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および患者（対象）の状態における個々の違いを考慮することにより医師によって決定することができる。本明細書中に記載されるＴ細胞を含む医薬組成物は、１０４細胞／ｋｇ体重〜１０９細胞／ｋｇ体重の投薬量（好ましくは１０５細胞／ｋｇ体重〜１０６細胞／ｋｇ体重の投薬量、そのような範囲に含まれるすべての整数値を含む）で投与され得ると概して述べることができる。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投薬量で多数回投与される場合がある。細胞は、免疫療法において一般に知られている注入技術を使用することによって投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ他、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ  ３１９（１９８８）、１６７６を参照のこと）。特定の患者のための最適な投薬量および処置計画を、患者を疾患の徴候についてモニターし、それに従って処置を調節することによって当業者により容易に決定することができる。
活性化Ｔ細胞を対象に投与し、さらにまた、続いて、再び採血し（またはアフェレーシスが行われ）、得られたＴ細胞を本発明に従って活性化し、これらの活性化および増殖されたＴ細胞を患者に再注入することが所望される場合がある。このプロセスを数週間毎に多数回行うことができる。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞を１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血物から活性化することができる。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞が、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃまたは１００ｃｃの採血物から活性化される。理論によってとらわれることはないが、多数回の採血／多数回の再注入のこのプロトコルを使用することは、ある特定のＴ細胞集団を選び出すために役立つ場合がある。
【０３８９】
主題組成物の投与が、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、埋め込みまたは移植によることを含めて、どのような様式であれ、好都合な様式で行われる場合がある。本明細書中に記載される組成物は、皮下投与、皮内投与、腫瘍内投与、結節内投与、髄内投与、筋肉内投与、静脈内（ｉ．ｖ．）注射による投与、または腹腔内投与により患者に投与される場合がある。したがって、本発明のＴ細胞組成物は、皮内注射もしくは皮下注射によって、またはｉ．ｖ．注射によって患者に投与することができる。Ｔ細胞の組成物が、腫瘍内、リンパ節内または感染部位内に直接に注入される場合がある。
【０３９０】
本明細書中に記載される方法、または、Ｔ細胞が治療的レベルにまで増殖されるこの技術分野において知られている他の方法を使用して活性化および増殖される細胞は、様々な薬剤による処置、例えば、抗ウイルス治療、シドホビルおよびインターロイキン−２、ＭＳ患者のためのシタラビン（これはまた、ＡＲＡ−Ｃとして知られている）またはナタリズマブ処置、あるいは乾癬患者のためのエファリズマブ処置、あるいはＰＭＬ患者のための他の処置など（これらに限定されない）を含めて、多くの関連のある処置様式と併せて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後で）患者に投与することができる。さらには、本発明のＴ細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェラートおよびＦＫ５０６など）、抗体、または他の免疫除去（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ）剤（例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体または他の抗体治療法など）、サイトキシン、フルダリビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎｅ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカインおよび照射との併用で使用される場合がある。これらの薬物により、カルシウム依存的ホスファターゼのカルシニューリンが阻害され（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、または、増殖因子により誘導されるシグナル伝達のために重要であるｐ７０Ｓ６キナーゼが阻害される（ラパマイシン）（Ｌｉｕ他、Ｃｅｌｌ  ６６（１９９１）、８０７〜８１５；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ他、Ｉｍｍｕｎ．７３（１９９１）、３１６〜３２１；Ｂｉｅｒｅｒ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．５（１９９３）、７６３〜７７３）。さらには、本発明の細胞組成物は、化学療法剤（例えば、フルダラビンなど）、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミドまたは抗体（例えば、ＯＫＴ３またはＣＡＭＰＡＴＨなど）のいずれかを使用する骨髄移植、Ｔ細胞除去（ａｂｌａｔｉｖｅ）療法と併せて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後で）患者に投与することができる。そのうえ、本発明の細胞組成物は、Ｂ細胞除去療法の後で、例えば、ＣＤ２０と反応する薬剤（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ）などの後で投与することができる。例えば、対象は、高用量の化学療法の後に末梢血幹細胞移植が行われる標準的な処置を受ける場合があり、または、移植後、対象は本発明の増殖された免疫細胞の注入を受ける。増殖された細胞を術前または術後に投与することができる。
【０３９１】
患者に投与されるべき上記処置の投薬量は、処置されている状態の正確な性質および当該処置のレシピエントとともに変化するであろう。ヒトへの投与のための投薬量の見積りを、この技術分野で認められている慣行に従って行うことができる。ＣＡＲ  Ｔ細胞の投薬およびスケジュール策定のための様々な方策が議論されている；例えば、Ｅｒｔｌ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７１（２０１１）、３１７５〜３１８１；Ｊｕｎｇｈａｎｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８（２０１０）、５５を参照のこと。
【０３９２】
ＩＸ．特異的なＦＡＰエピトープを有するペプチド
さらなる局面において、本発明は、本発明のいずれかの抗体（ＮＩ−２０６．１８Ｈ２、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２２Ｆ７、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４およびＮＩ−２０６．１７Ａ６）によって特異的に認識されるＦＡＰのエピトープを有するペプチドに関連する。好ましくは、そのようなペプチドは、上記抗体によって認識される独特の線状エピトープとして配列番号３０〜配列番号３７および配列番号６０に示されるようなアミノ酸配列、または、１つもしくは複数のアミノ酸が置換され、欠失され、かつ／もしくは付加される改変配列を含み、あるいは、そのようなアミノ酸配列またはそのような改変配列からなり、このペプチドは本発明のいずれかの抗体によって認識され、好ましくは、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２２Ｆ７、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４またはＮＩ−２０６．１７Ａ６の抗体によって認識される。
【０３９３】
本発明の１つの実施形態において、そのようなペプチドは、対象におけるＦＡＰ種および／またはそのフラグメントに関連づけられる疾患または障害を診断するために、またはモニターするために使用される場合があり、そのような診断またはモニタリングは、前記対象の生物学的サンプルにおけるペプチドに結合する抗体の存在を明らかにする工程を含み、本発明の上記ペプチドを認識する抗体のレベルを測定すること、および、測定結果を、比較可能な年齢および性別の健康な対象において見出されるレベルに対して比較することによって前記対象におけるそのような疾患の診断のために使用される。
【０３９４】
さらには、本発明のペプチドは、ヒトに由来する治療的に有用な抗体のエピトープを含有するので、そのようなペプチドは当然のことながら、抗原として、すなわち、免疫応答を対象において誘発させ、インビボでの本発明の抗体の産生を刺激するための免疫原として使用することができる。本発明のペプチドは、本明細書中上記で記載されるように、アレイ、キットおよび組成物（例えば、ワクチンなど）においてそれぞれ配合される場合がある。これに関連して、本発明はまた、ＦＡＰ関連疾患を診断すること、またはその進行をモニターすることにおいて有用なキットであって、本発明の少なくとも１つの抗体または前記抗体のいずれか１つの実質的に同じ結合特異性を有するＦＡＰ結合性分子、本明細書中上記でそれぞれ定義されるようなポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞および／またはペプチドを、必要な場合には使用のための試薬および／または説明書と一緒に含むキットに関連する。
【０３９５】
Ｘ．製造品
本発明の別の局面において、上記で記載される障害の処置、防止および／または診断のために有用である材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器、および、前記容器における、または前記容器に付随する標識または添付文書を含む。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが含まれる。容器は、様々な材料から、例えば、ガラスまたはプラスチックなどから形成される場合がある。容器は、それ自体が、状態の処置、防止および／または診断のためのものである組成物、あるいは、状態の処置、防止および／または診断のために効果的である別の組成物と組み合わされる組成物を収容し、また、無菌の出し入れ口を有する場合がある（例えば、容器は、皮下注射針によって突き刺すことができる栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルである場合がある）。組成物における少なくとも１つの活性な薬剤が本発明の抗体である。標識または添付文書により、組成物が、選ばれた状態を処置するために使用されることが示される。そのうえ、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物が含有される第１の容器と、（ｂ）さらなる細胞傷害性薬剤または他の場合には治療剤を含む組成物が含有される第２の容器とを含む場合がある。本発明のこの実施形態における製造品はさらに、組成物が、特定の状態を処置するために使用され得ることを示す添付文書を含む場合がある。代替において、または加えて、製造品はさらに、医薬的に許容され得る緩衝剤（例えば、静菌性注射用水など）を含む第２（または第３）の容器を含む場合がある。
【０３９６】
これらの実施形態および他の実施形態が本発明の説明および実施例によって開示され、包含される。本発明に従って用いられるための材料、方法、使用法および化合物のいずれか１つに関するさらなる文献が、例えば、電子デバイスを使用して、公開されている図書館およびデータベースから検索される場合がある。例えば、公開されているデータベースの「Ｍｅｄｌｉｎｅ」が利用される場合がある（このデータベースは国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）および／または国立衛生研究所の国立医学図書館（ＮＬＭ．ＮＩＨ）によって提供される）。さらなるデータベースおよびウエブアドレスが、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）（これは欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）の一部である）のデータベースなどが当業者には知られており、これらもまた、インターネット検索エンジンを使用して得ることができる。バイオテクノロジーにおける特許情報、ならびに、遡及的検索および現在の認識のために有用な特許情報の関連原典の調査の概略が、Ｂｅｒｋｓ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１２（１９９４）、３５２〜３６４に示される。
【０３９７】
上記開示は本発明を概して記載する。別途言及されない限り、本明細書中で使用されるような用語には、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年、２０００年改訂及び２００３年再版、ＩＳＢＮ  ０  １９  ８５０６７３  ２）において提供されるような定義が与えられる。いくつかの文書が本明細書の本文を通して引用される。完全な書誌的引用が請求項の直前において明細書の最後に見出される場合がある。すべての引用された参考文献（本出願明細書を通して引用されるような文献参照物、発行された特許、公開された特許出願、及び、製造者の仕様書、説明書などを含む）の内容が、本明細書により明示的に、参照によって組み込まれる；しかしながら、どのような文書であれ、引用される文書は実際に本発明に関して先行技術であることを何ら認めるものではない。より完全な理解を、例示のみの目的のために本明細書中に提供され、かつ、本発明の範囲を限定するために意図されない下記の具体的な実施例を参照することによって得ることができる。
【実施例】
【０３９８】
ＦＡＰを標的とするヒト由来抗体を、国際特許出願公開ＷＯ２００８／０８１００８に記載される方法を改変とともに利用して特定した。具体的には、ＦＡＰを標的とするヒト由来抗体を、臨床的に選択されたドナーに由来するヒトメモリーＢ細胞レパートリーの補体のハイスループット分析によって特定した。直接に被覆された標的に対するＦＡＰ抗体スクリーニングのために、９６ウエルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）を、炭酸塩緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４）において５μｇ／ｍｌの濃度に希釈される組換えヒトＦＡＰ（ｒＦＡＰ）、ｃＦＡＰ（下記ペプチドの混合物：３７８−ＨＹＩＫＤＴＶＥＮＡＩＱＩＴＳ−３９２、６２２−ＧＷＳＹＧＧＹＶＳＳＬＡＬＡＳ−６３６および７２１−ＱＶＤＦＱＡＭＷＹＳＤＱＮＨＧＬ−７３６）またはＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）により４℃で一晩被覆した。捕捉ＥＬＩＳＡのために、マイクロプレートを、ＰＢＳにおいて３μｇ／ｍｌの濃度に希釈されるマウス抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により被覆し、その後、プレートをブロッキング処理し、ｒＦＡＰまたはＢＳＡをＰＢＳにおいて２μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、捕捉されるためのプレートに加えた。その後、プレートをＰＢＳ−Ｔ（ｐＨ７．６）で洗浄し、非特異的な結合部位を、ＲＴで１時間、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０によりブロッキング処理した。Ｂ細胞馴化培地をメモリーＢ細胞培養プレートからＥＬＩＳＡプレートに移し、ＲＴで１時間インキュベーションした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化抗ヒト免疫グロブリンポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、英国）を使用して、その後、ＨＲＰ活性を標準的な比色アッセイで測定して求めた。培地に含有される抗体の結合がＢＳＡに対してではなく、ＦＡＰ（直接に被覆された、もしくは捕捉されたｒＦＡＰ、またはｃＦＡＰのどちらか）に対して示されているＢ細胞培養物のみを、抗体クローニングに供した。
【０３９９】
上記で特定された抗ＦＡＰ抗体の可変領域のアミノ酸配列をそれらのｍＲＮＡ配列に基づいて決定した；図１を参照のこと。簡単に記載すると、選択された不死化されていないメモリーＢ細胞培養物の生存Ｂ細胞を集めた。続いて、選択された抗ＦＡＰ抗体を産生する細胞からのｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに変換し、抗体の可変領域をコードする配列をＰＣＲによって増幅し、プラスミドベクターにクローン化し、配列決定した。簡単に記載すると、ヒト免疫グロブリン生殖系列レパートリーのすべての配列ファミリーを表すプライマーの組合せを、リーダーペプチド、ＶセグメントおよびＪセグメントの増幅のために使用した。１回目の増幅を、５’末端におけるリーダーペプチド特異的プライマーと、３’末端における定常領域特異的プライマーとを使用して行った（Ｓｍｉｔｈ他、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．４（２００９）、３７２〜３８４）。重鎖およびカッパ軽鎖のために、２回目の増幅を、５’末端におけるＶセグメント特異的プライマーと、３’末端におけるＪセグメント特異的プライマーとを使用して行った。ラムダ軽鎖のために、２回目の増幅を、５’末端におけるＶセグメント特異的プライマーと、３’末端におけるＣ領域特異的プライマーとを使用して行った（Ｍａｒｋｓ他、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１）、５８１〜５９７；ｄｅ  Ｈａａｒｄ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６（１９９９）、１８２１８〜１８２３０）。
【０４００】
所望の特異性を有する抗体クローンの特定を、完全な抗体を組換え発現させたときにＥＬＩＳＡでの再スクリーニングによって行った。完全なヒトＩｇＧ１抗体の組換え発現が、可変重鎖配列および可変軽鎖配列を、可変領域配列を５’末端において、リーダーペプチドをコードする配列により補い、かつ、３’末端において、適切な定常ドメインをコードする配列により補う発現ベクターに「正しい読み枠で」挿入したときに達成された。その目的を達成するために、プライマーは、抗体発現ベクターへの可変重鎖配列および可変軽鎖配列のクローニングを容易にするために設計される制限部位を含有した。重鎖免疫グロブリンを、免疫グロブリン重鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物を、シグナルペプチドとヒト免疫グロブリンガンマ１またはマウス免疫グロブリンガンマ２ａの定常ドメインとを有する重鎖発現ベクターに読み枠を合わせて挿入することによって発現させた。カッパ軽鎖免疫グロブリンを、カッパ軽鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物を、シグナルペプチドとヒトまたはマウスのカッパ軽鎖免疫グロブリンの定常ドメインとを提供する軽鎖発現ベクターに読み枠を合わせて挿入することによって発現させた。ラムダ軽鎖免疫グロブリンを、ラムダ軽鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物を、シグナルペプチドとヒトまたはマウスのラムダ軽鎖免疫グロブリンの定常ドメインとを提供するラムダ軽鎖発現ベクターに読み枠を合わせて挿入することによって発現させた。
【０４０１】
機能的な組換えモノクローナル抗体を、Ｉｇ重鎖発現ベクターとカッパＩｇ軽鎖発現ベクターまたはラムダＩｇ軽鎖発現ベクターのＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞（あるいは、どのようなレシピエント細胞株であれ、ヒト起源またはマウス起源の他の適切なレシピエント細胞株）へのコトランスフェクションによって得た。組換えヒトモノクローナル抗体を続いて、標準的なプロテインＡカラム精製を使用して馴化培地から精製した。組換えヒトモノクローナル抗体を、一過性トランスフェクション細胞または安定的トランスフェクション細胞のどちらかを使用して無限の量で製造することができる。組換えヒトモノクローナル抗体を産生する細胞株を、Ｉｇ発現ベクターをそのまま使用することによって、または、Ｉｇ可変領域を異なる発現ベクターに再クローニングすることによってそのどちらでも樹立することができる。誘導体、例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２およびｓｃＦｖなどもまた、これらのＩｇ可変領域から作製することができる。
【０４０２】
フレームワーク領域および相補性決定領域をデータベース（例えば、Ａｂｙｓｉｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ／）など）において利用可能な参照抗体配列との比較によって決定し、これらの領域に、Ｋａｂａｔ番号表記スキーム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／）を使用して注釈を付けた。フレームワーク領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を示すことを含む、主題抗体のＮＩ−２０６−１８Ｈ２、ＮＩ−２０６−２０Ａ８、ＮＩ−２０６−６Ｄ３、ＮＩ−２０６−１４Ｃ５、ＮＩ−２０６−３４Ｃ１１、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２２Ｆ７、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４およびＮＩ−２０６．１７Ａ６の可変領域のアミノ酸配列が図１Ｇ〜図１Ｋおよび図１Ａ〜図１Ｆに示される。
【０４０３】
実施例１：ＦＡＰ抗体の結合特異性
ＥＬＩＳＡアッセイを、ＦＡＰに対する本発明の例示的抗体の結合を確認するために、また、それらの５０％最大有効濃度（EＣ５０）を決定することができるようにするために様々な抗体濃度を用いて行った。例示的な組換えヒト抗体のＮＩ−２０６−１８Ｈ２、ＮＩ−２０６−２０Ａ８、ＮＩ−２０６−６Ｄ３、ＮＩ−２０６−１４Ｃ５、ＮＩ−２０６−３４Ｃ１１、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２２Ｆ７、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４およびＮＩ−２０６．１７Ａ６について、９６ウエルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）を直接的ＥＬＩＳＡのために、炭酸塩のＥＬＩＳＡ被覆緩衝液（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４）において５μｇ／ｍｌの濃度に希釈されるＦＡＰ、３つのペプチドの混合物、またはＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）により被覆した。捕捉ＥＬＩＳＡのために、マイクロプレートを、ＰＢＳにおいて３μｇ／ｍｌの濃度に希釈されるマウス抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により被覆し、その後、プレートをブロッキング処理し、ＦＡＰまたはＢＳＡをＰＢＳにおいて２μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、捕捉されるためのプレートに加えた。その後、抗体の結合効率を調べた。例示的なＮＩ−２０６．８２Ｃ２抗体が、捕捉されたＦＡＰには特異的に強く結合し、直接に被覆されたＦＡＰにはそれほど効率的に結合していない。例示的なＮＩ−２０６．５９Ｂ４抗体およびＮＩ−２０６．１８Ｈ２抗体が、捕捉されたＦＡＰに対して、また、直接に被覆されたＦＡＰに対して特異的に強く、かつ類似して結合する。上述の例示的抗体との比較において、ＮＩ−２０６．２０Ａ８抗体は、捕捉されたＦＡＰと、直接に被覆されたＦＡＰとの両方にはそれほど効率的に結合していない。結合がＢＳＡに対しては何ら認められなかった。例示的抗体ＮＩ−２０６．６Ｄ３は、捕捉されたＦＡＰおよび直接に被覆されたＦＡＰに強くかつ類似して結合し、しかし、とりわけ、捕捉されたＦＡＰの場合、高い抗体濃度において、ＢＳＡに対する強い結合が同様に認められた；図２Ａ〜図２Ｊを参照のこと。
【０４０４】
ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、米国）ソフトウエアを使用して非線形回帰によって推定した。組換えヒト由来抗体のＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１７Ａ６、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２およびＮＩ−２０６．２０Ａ８が、捕捉されたＦＡＰ（ｓＦＡＰ）に大きい親和性で結合し、ＥＣ５０がそれぞれ、０．０１４ｎＭ、０．０４４ｎＭ、３．３６ｎＭ、５０．２ｎＭ、０．２７２ｎＭおよび１．３３ｎＭであり、これに対して、抗体ＮＩ−２０６．６Ｄ３は、より低い結合親和性を示し、ＥＣ５０が１１８ｎＭであった。ＮＩ−２０６．２２Ｆ７はｓＦＡＰに対する結合を何ら示さなかった。ＮＩ−２０６．１２Ｇ４のｓＦＡＰに対する結合は調べられなかった。組換えヒト由来抗体のＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４、ＮＩ−２０６．１７Ａ６、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２およびＮＩ−２０６．２０Ａ８が、直接に被覆されたＦＡＰ（ＦＡＰ）に大きい親和性で結合し、ＥＣ５０がそれぞれ、０．６１ｎＭ、０．０９６ｎＭ、０．３３ｎＭ、１．４ｎＭ、１０．５ｎＭ、３．５４ｎＭおよび２．９０ｎＭであり、これに対して、抗体ＮＩ−２０６．６Ｄ３は、より低い結合親和性を示し、ＥＣ５０が８６．５ｎＭであった。ＮＩ−２０６．２２Ｆ７は、直接に被覆されたＦＡＰに対する結合を何ら示さなかった。組換えヒト由来抗体のＮＩ−２０６．２２Ｆ７が、直接に被覆されたＦＡＰペプチド混合物（ｃＦＡＰ）に対して大きい親和性で結合し、ＥＣ５０が０．１２ｎＭであった。ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４、ＮＩ−２０６．１７Ａ６、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２、ＮＩ−２０６．２０Ａ８およびＮＩ−２０６．６Ｄ３は、ｃＦＡＰに対する結合を何ら示さなかった；図２Ｋ参照のこと。
【０４０５】
実施例２：ＮＩ−２０６．８２Ｃ２結合速度の決定
ＮＩ−２０６．８２Ｃ２の速度を検討するために、組換えヒトＦＡＰ（ｒｈｕＦＡＰ、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、１０４６４−Ｈ０７Ｈ）をＧＬＣセンサーチップ（Ｂｉｏｒａｄ  ＃１７６−５０１１）にアミノカップリングした（ただし、１つの流路が、さらなる参照表面を提供するために非修飾のままにされた）。このことを、それぞれの流路で使用される活性化試薬の濃度を変えることによって達成した。３つの活性化溶液を、０．４Ｍ  ＥＤＣ＋０．１Ｍスルホ−ＮＨＳを含有するストック混合物の３倍連続希釈を使用して調製し、３６０秒間注入した。その後、カップリング緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３，４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５．２）における２．５μｇ／ｍｌでのｒｈｕＦＡＰを２５μＬ／分で１０２０秒間カップリングさせた。過剰な反応性エステルを１Ｍエタノールアミン塩酸塩により６００秒間にわたってブロッキング処理した。これにより、７００ＲＵの最終的な固定化レベルに及ぶｒｈｕＦＡＰの均一なストリップがもたらされた。１６μｇ／ｍＬ（１０６．７ｎＭ）から始まるｒｈｕＦＡＰの５倍連続希釈物を６０μＬ／分で４００秒間にわたって注入した。単回注入により、完全な濃度系列が、６つのサンプルからなる一列を補い、かつ、応答データを二重参照するためのインライン・ブランクを提供するために緩衝液を使用して送達された。会合段階および解離段階を４００秒間および３６００秒間それぞれ測定した。固定化ｒｈｕＦＡＰを、それぞれの結合サイクルの後、１００μＬ／分で３０秒間、１．５Ｍグリシン（ｐＨ３）により再生させ、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２を、サイクル対サイクルの再現性を確認するために同じ実験の中で二連の注入で分析した；図３を参照のこと。
【０４０６】
実施例３：ＦＡＰ特異的抗体の結合エピトープの評価
例示的なＮＩ−２０６．８２Ｃ２抗体およびＮＩ−２０６．１８Ｈ２抗体の結合エピトープを決定するために、結合分析を、重複するペプチドを用いてＦＡＰの配列全体をマッピングして行った。抗体の結合能を、ニトロセルロースメンブラン（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）にスポットされるこれらのペプチドに対して、かつ、ＨＲＰコンジュゲート化されたロバ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、英国）を使用し、その後、ＨＲＰ活性の検出を行って調べた（図４Ａおよび図４Ｃ）。簡単に記載すると、エピトープマッピングを、重複するペプチドのスキャンを使用して行った。ＦＡＰの配列全体を、１１アミノ酸の重なりが個々のペプチドの間にある合計で１８８個の線状の１５−ｍｅｒペプチドとして合成した。それらのペプチドをニトロセルロースメンブラン（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）にスポットした。メンブランをメタノール中で５分間活性化し、その後、ＲＴで１０分間、ＴＢＳで洗浄した。非特異的な結合部位を、ＲＴで２時間、Ｒｏｔｉ（登録商標）−Ｂｌｏｃｋ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ＋Ｃｏ．ＫＧ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）によりブロッキング処理した。ヒト抗体（１μｇ／ｍｌ）を、ＲＴで３時間、Ｒｏｔｉ（登録商標）−Ｂｌｏｃｋにおいてインキュベーションした。一次抗体の結合を、ＨＲＰコンジュゲート化ロバ抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して求めた。ブロットを、ＥＣＬおよびＩｍａｇｅＱｕａｎｔ３５０検出（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｏｔｅｌｆｉｎｇｅｎ、スイス）を使用して発色させ、評価した。
【０４０７】
抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２により、ＦＡＰにおける配列５２５−ＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰ−５３５に対応するペプチド１３１およびペプチド１３２（Ｇ列、１１番目および１２番目のスポット）が認識され（図４Ａを参照のこと）、抗体ＮＩ−２０６．１８Ｈ２により、配列５０１−ＩＱＬＰＫＥＥＩＫＫＬ−５１１に対応するペプチド１２５およびペプチド１２６（Ｇ列、５番目および６番目のスポット）が認識される（図４Ｃを参照のこと）。抗体ＮＩ−２０６．５９Ｂ４により、ＦＡＰにおける配列５３−ＳＹＫＴＦＦＰ−５９が認識される。抗体ＮＩ−２０６．２２Ｆ７により、ＦＡＰにおける配列３８１−ＫＤＴＶＥＮＡＩＱＩＴ−３９１が認識される。抗体ＮＩ−２０６．２７Ｅ８により、ＦＡＰにおける配列１６９−ＮＩＹＬＫＱＲ−１７５が認識される。抗体ＮＩ−２０６．１２Ｇ４により、ＦＡＰにおける配列４８１−ＴＤＱＥＩＫＩＬＥＥＮＫＥＬＥ−４９５が認識される。抗体ＮＩ−２０６．１７Ａ６により、ＦＡＰにおける配列７７−ＶＬＹＮＩＥＴＧＱＳＹ−８７が認識される。
【０４０８】
抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２の最小エピトープ領域を決定するために、抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２のエピトープを包含する（Ｎ末端およびＣ末端からの）ペプチドを１アミノ酸ずつ連続して短縮化し（この場合、スポット２１が全長ペプチドに対応し、スポット２２〜スポット３３がＣ末端からの段階的な１アミノ酸短縮化形態に対応し、スポット３４〜スポット４５がＮ末端からの段階的な１アミノ酸短縮化形態に対応する）、合成し、ニトロセルロースメンブラン（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）にスポットした。これらのスポットされたペプチドに対するＮＩ−２０６．８２Ｃ２結合を上記のように可視化した。抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２は、ＦＡＰにおける配列５２８−ＦＤＲＳＫ−５３２（配列番号３９）に対応するスポット２１〜スポット２８およびスポット３４〜スポット４１を認識する；図２６を参照のこと。
【０４０９】
ＮＩ−２０６．８２Ｃ２結合のために不可欠なアミノ酸を決定するために、ＦＡＰの５２１−ＫＭＩＬＰＰＱＦＤＲＳＫＫＹＰＬＬＩＱ−５３９（配列番号３８）からのアミノ酸を１つずつ、不可欠なアミノ酸（すなわち、変異させたときにＮＩ−２０６．８２Ｃ２結合の喪失を引き起こすアミノ酸）を決定するために、逐次的にアラニンに変異させた。単一アラニン変異の線状エピトープを有するこれらの線状ペプチド配列を合成し、ニトロセルロースメンブラン（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）にスポットした。これらのスポットされたペプチドに対するＮＩ−２０６．８２Ｃ２結合を上記の実施例に記載されるように可視化し、それにより、対応するＦＡＰペプチドがアラニン置換を５２９位および５３２位にそれぞれ含有した２つのスポット（スポット１０およびスポット１３）に対する結合の非存在が認められ、したがって、このことから、ＦＡＰのＤ−５２９およびＫ−５３２のアミノ酸がＮＩ−２０６．８２Ｃ２結合のために不可欠であることが明らかにされた；図２７を参照のこと。
【０４１０】
実施例４：組換えヒトモノクローナル抗体がＦＡＰ酵素活性を阻害することができるかどうかの決定
黒色で、平底の標準的な９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを、滅菌されたブロッキング緩衝液（リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）における５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を使用して３７℃で１時間、ブロッキング処理した。ブロッキング緩衝液を除き、４０μＬの新鮮なブロッキング緩衝液、ＰＢＳにおける４０μＬの抗体、ＰＢＳにおける１０μＬの２０ｎＭの活性な組換えヒトＦＡＰ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、１０４６４−Ｈ０７Ｈ）、および、ＰＢＳにおける１０μＬのＤＱ−ゼラチン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｄ−１２０５４）により置き換えた。蛍光強度を、プレートをどの測定の前でも２０秒間穏やかに振とうしながら、４５分の総時間にわたって３分毎に４８５ｎＭの励起および５３０ｎＭの放射で測定した。活性割合を計算するために、定常状態での速度（Δ５３０ｎＭ放射／Δ時間）が、抗体のそれぞれの濃度で認められる速度によって除される。結果が図５に示される。
【０４１１】
実施例５：ｒｈｕＦＡＰ媒介ＰＥＰ（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ）切断の競合阻害、非競合阻害または不競合阻害の決定
黒色で、平底の標準的な９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを、滅菌されたブロッキング緩衝液（リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）における５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を使用して３７℃で１時間、ブロッキング処理した。１０μＬの組換えヒトＦＡＰ溶液（２２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）における０．４ｎＭ組換えヒトＦＡＰ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、１０４６４−Ｈ０７Ｈ））をそれぞれのウエルに加えた。その後、ＰＢＳにおける示された濃度での８０μＬのＮＩ−２０６．８２Ｃ２をウエルに加え、３７℃で１時間インキュベーションした。その後、１０μＬの蛍光発生基質溶液（４０％のメタノールおよび６０％の２５ｎＭ  ＰＢＳ／１０ｎＭ  ＥＤＴＡにおけるＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ）をそれぞれのウエルに加えた。蛍光強度を２時間の総読み取り時間にわたって３分毎に３６０ｎＭの励起および４６０ｎＭの放射で測定した。結果が図６に示される。
【０４１２】
実施例６：抗体（ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２、ＮＩ−２０６．２０Ａ８およびＮＩ−２０６．６Ｄ３）の結合特異性の決定
マウス抗６Ｘヒスチジンタグ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＰＢＳにおける３μｇ／ｍｌの濃度で９６ウエルＥＬＩＳＡプレートに被覆し、その後、プレートをＰＢＳにおける５％ＢＳＡによりブロッキング処理し、Ｎ末端の６Ｘヒスチジンタグを有する酵素活性な組換えヒトＦＡＰを、捕捉されるためのプレートに加えた。その後、ｓＦＡＰに対するＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２、ＮＩ−２０６．２０Ａ８およびＮＩ−２０６．６Ｄ３の（２０ｎＭ、４ｎＭおよび０．８ｎＭでの）結合効率、ならびに、ＦＡＰに対するＮＩ−２０６．１８Ｈ２、ＮＩ−２０６．２０Ａ８およびＮＩ−２０６．６Ｄ３の結合効率も、１時間のインキュベーション、その後、ＰＢＳによる洗浄、および、比色アッセイを使用するＨＲＰ標識化ヤギ抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）による検出によって調べた。他の標的と結合するＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２、ＮＩ−２０６．２０Ａ８およびＮＩ−２０６．６Ｄ３を評価するために、組換えヒトＣＤ２６（ＮＩ−２０６．８２Ｃ２の場合のみ）および１４個の他の無関係な組換えヒトタンパク質（Ａ〜Ｎ）を個々に９６ウエルＥＬＩＳＡプレートに三連で加え、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２の結合効率を評価した（図７Ａ〜図７Ｄ）。
【０４１３】
ＦＡＰに対する配列類似性を有するＳＢ９オリゴペプチダーゼファミリーの他のメンバーに対するＮＩ−２０６．８２Ｃ２の結合効率および阻害能を明らかにするために、間接的ＥＬＩＳＡアッセイおよび阻害アッセイを、活性な酵素標的に対して行った。 このアッセイにおいて評価される活性な組換えヒト酵素には、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ；Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、１０４６４−Ｈ０７Ｈ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ、ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８００４０）、ジペプチジルペプチダーゼ８（ＤＰＰ８、ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８００８０）、ジペプチジルペプチダーゼ９（ＤＰＰ９、ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８００８０）およびプロリルオリゴペプチダーゼ／プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＯＰ／ＰＲＥＰ、ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８０１０５）が含まれる。それぞれの組換えペプチダーゼを精製タグと一緒に発現させ、マウス抗ヒスチジン抗体（ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ）またはマウス抗グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、１１１２１３−ＭＭ０２）タグ抗体のどちらかを使用して９６ウエルＥＬＩＳＡプレートに結合させた。それぞれの酵素が、酵素特異的な蛍光発生基質を使用して、結合することが確認され、ＥＬＩＳＡプレート上で活性なままであった。Ｈ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ（ＡＴＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ、１３４５０）を、ＤＰＰ４、ＤＰＰ９およびＤＰＰ８の存在および活性を確認するために使用した。Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ（ＢａＣｈｅｍ、Ｉ１１４５）を、ＦＡＰおよびＰＯＰ／ＰＲＥＰの活性を評価するために使用した。それぞれの酵素標的に対するＮＩ−２０６．８２Ｃ２の結合効率を明らかにするために、抗体をＨＲＰにより標識し、ＰＢＳにおける４００ｎＭ、１２６．５ｎＭ、４０．１ｎＭ、１２．７ｎＭ、４ｎＭ、１．３ｎＭ、０．４ｎＭ、０．１３ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０１３ｎＭ、０．００４ｎＭおよび０ｎＭの濃度で加えた。洗浄工程の後、結合した抗体を、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を使用して検出した。反応を、２ＮのH2SO4を加えることによって１０分後に停止させ、光学密度において生じた変化を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して４５０ｎＭの吸光度で定量した（図７Ｅ）。
【０４１４】
抗体の阻害能を明らかにするために、黒色の９６ウエルプレートをブロッキング緩衝液により１時間にわたってブロッキング処理した。ＮＩ−２０６．８２Ｃ２を、ＰＢＳにおける１０００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、３．０３ｎＭ、１．０１ｎＭ、０．０３１ｎＭ、０．００１ｎＭおよび０ｎＭの濃度で対応のウエルにピペット分注した。酵素を０．２ｎＭの濃度で加えた。最後に、蛍光発生基質をその後、ミカエリス定数（Ｋｍ）に等しい濃度でウエルに加え、基質切断速度を３６０ｎｍの励起および４６０ｎｍの放射での蛍光によって定量した。Ｈ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ（ＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ、１３４５０）を、ＤＰＰ４、ＤＰＰ９およびＤＰＰ８のために使用した。Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ（ＢａＣｈｅｍ、Ｉ１１４５）を、ＰＯＰ／ＰＲＥＰの活性を評価するために使用した。ＦＡＰ活性を、ＤＱ−ゼラチン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄ１２０５４）を使用して評価し、切断を４９５ｎＭの励起および５１５ｎＭの放射で定量した。
【０４１５】
実施例７：以前に試験されたＦＡＰ阻害剤と比較される、活性な組換えヒトＦＡＰおよび活性な組換えマウスＦＡＰに対するＮＩ−２０６．８２Ｃ２阻害能の決定
活性な組換えヒトＦＡＰ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、１０４６４−Ｈ０７Ｈ）に対するＮＩ−２０６．８２Ｃ２の阻害能を明らかにするために、黒色の９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを、滅菌された５％ＢＳＡ／ＰＢＳにより３７℃で１時間にわたってブロッキング処理した。ブロッキング溶液を除いた後、ＰＢＳにおける４０ｕＬの１２．５％ＢＳＡをそれぞれのウエルに加えた。その後、ＦＡＰ標的化薬剤（ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、Ｆ１９およびＶａｌ−Ｂｏｒｏ−Ｐｒｏ（ＰＴ−１００；Ｐｏｉｎｔ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ））を、５００ｎＭ、１０ｎＭ、３．０３ｎＭ、１．０１ｎＭ、０．０３１ｎＭ、０．００１ｎＭおよび０ｎＭの最終濃度のための適切なウエルに加えた。  その後、１０ｕＬの活性な組換えヒトＦＡＰをウエルのすべてに、２０ｎＭの最終アッセイ濃度のために加えた。最後に、１０μＬのＤＱ−ゼラチン溶液をそれぞれのウエルに、６０μｇ／ｍＬの濃度のために加えた。その後、蛍光強度を、プレートをそれぞれの測定の前に２０分間穏やかに撹拌しながら、４５分間にわたって３分毎に４８５ｎＭの励起および５３０ｎＭの放射で測定した。その後、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６ソフトウエアを使用するとき、定常状態速度を使用して、阻害剤が何ら与えられなかった定常状態濃度と比較したそれぞれの濃度での活性割合を計算し、３つのパラメーター変数適合モデルに合わせて、ＩＣ５０（最大阻害の５０％が達成された濃度）を計算した（図８Ａ）。
【０４１６】
活性な組換えマウスＦＡＰに対するＮＩ−２０６．８２Ｃ２の阻害能を明らかにするために、組換えマウスＦＡＰを、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインならびにＮ末端の６Ｘヒスチジンタグを伴うことなく、ＨＥＫ２９３細胞株において発現させた。その後、９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳにおける６μｇ／ｍＬでの５０ｕＬのマウス抗Ｈｉｓタグ抗体により４℃で一晩被覆した。その後、ウエルをＰＢＳにおける６０ｕＬの２％ＢＳＡにより室温で１時間にわたってブロッキング処理し、５０μＬの１：４希釈された組換えマウスＦＡＰ含有細胞培養上清をウエルに加え、穏やかに振とうしながら４℃で一晩インキュベーションした。ＰＢＳによる３回の洗浄工程の後、２０ｕＬの滅菌された１２．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液をすべてのウエルに加えた。その後、ＦＡＰ標的化薬剤（ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、Ｆ１９およびＶａｌ−Ｂｏｒｏ−Ｐｒｏ（ＰＴ−１００；Ｐｏｉｎｔ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ））を、５００ｎＭ、１０ｎＭ、３．０３ｎＭ、１．０１ｎＭ、０．０３１ｎＭ、０．００１ｎＭおよび０ｎＭの最終濃度のための適切なウエルに加えた。最後に、ＰＢＳにおける５μＬのＤＱ−ゼラチン溶液をその後、２４μｇ／ｍＬの最終アッセイ濃度のために加えた。その後、ＤＱゼラチンの切断を、プレートをそれぞれの測定の前に２０秒間穏やかに振とうしながら、６０分の総時間にわたって３分毎に４８５ｎＭの励起および５３０ｎＭの放射での蛍光強度によって測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６ソフトウエアを使用するとき、定常状態での速度を使用して、活性割合をそれぞれの濃度で計算し、３パラメーター変数モデル回帰を行って、ＩＣ５０（最大阻害の５０％が達成された濃度）を計算した（図８Ｂ）。
【０４１７】
実施例８：ヒトガン腫凍結切片に対するＮＩ−２０６．８２Ｃ２結合の共焦点免疫蛍光による決定
ＮＩ−２０６．８２Ｃ２を蛍光画像化のためにシアニン３により標識し（Ｃｙ３コンジュゲート化キット：Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、３４０−００３０）、抗体の標識化を、分光光度計を使用して確認した。ヒト浸潤性腺管ガン組織からの凍結切片（図９Ａ）およびヒト浸潤性小葉ガンからの凍結切片（図９Ｂ）を氷冷アセトンにおいて５分間にわたって固定処理し、１０分間乾燥させ、その後、ＰＢＳで洗浄した。その後、切片を５％ＢＳＡ／ＰＢＳにおいて室温で１時間インキュベーションした。その後、組織切片を、シアニン３により事前に標識された抗体と４℃で一晩インキュベーションし、その後、ＰＢＳで３回洗浄し、その後、０．５μｇ／ｍＬでのＤＡＰＩとインキュベーションした。その後、切片をＰＢＳでさらに３回洗浄し、Ｌｉｓｂｅｔｈ封入剤での封入標本にし、その後、ＳＰ８共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で画像化した。
【０４１８】
実施例９：ヒト乳ガン組織切片に対するＮＩ−２０６．８２Ｃ２結合の免疫組織化学による決定
ヒト乳ガン組織切片を室温で１０分間乾燥させ、その後、４％パラホルムアルダヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄａｈｙｄｅ）において１５分間にわたって固定処理し、その後、ＰＢＳで３回、５分間洗浄した。その後、スライド片をＰＢＳにおける０．３％Ｈ２Ｏ２において５分間インキュベーションして、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキング処理し、続いて、ＰＢＳで３回、５分間洗浄した。その後、内因性ビオチンを、Ｂｉｏｔｉｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ  Ｘ０５９０）を使用してブロッキング処理し、その後、ＰＢＳによる数回の洗浄を行った。非特異的な抗体結合のブロッキング処理および組織切片の透過処理を、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳにおける５％ヤギ血清、５％ウマ血清、０．３Ｍグリシン、５％ＢＳＡおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）を使用して行った。その後、組織切片を、マウス定常ドメインと、元の抗体のヒト可変ドメインとを伴うＮＩ−２０６．８２Ｃ２の組換え操作されたキメラ形態、および、一致させたアイソタイプコントロール（４３Ａ１１）を透過処理緩衝液において１０μｇ／ｍＬで用いて４℃で一晩染色した。３回のＰＢＳ洗浄工程の後、切片をビオチン化ヤギ抗マウス抗体と室温で１時間インキュベーションした。標的抗原を増幅するために、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を使用し、その後、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）により発色させ、マイヤーのヘマトキシリンブルーにより対比染色した。サンプルを微温の流水で１０分間洗浄し、水性封入剤での封入標本にし、その後、画像化を組織学スライドスキャナー（Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｒａｘ  ＭＩＤＩ）により行った。結果が図１０および図１１に示される。
【０４１９】
実施例１０：マウス結腸直腸ガン組織に対するＮＩ−２０６．８２Ｃ２結合の決定
ＮＩ−２０６．８２Ｃ２をシアニン５抗体標識化キット（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、３４２−００１０）により事前に標識化し、抗体の標識化が十分であることを分光光度計により確認した。同系のＣＴ−２６肝臓転移物を含有するマウス肝臓の凍結切片を室温で３０分間乾燥させ、ＰＢＳにおける４％ホルマリンにおいて１０分間にわたって固定処理した。その後、スライド片を、ＰＢＳで５分間、３回洗浄し、ＰＢＳにおける５％ウシ血清アルブミンにより室温で１時間ブロッキング処理した。  その後、スライド片を、０．５μｇ／ｍＬでのＤＡＰＩと、製造者の説明書に従うＡｌｅｘａ５４７ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、１０μｇ／ｍＬの濃度でのＣｙ５標識されたＮＩ−２０６．８２Ｃ２またはＣｙ５標識されたアイソタイプ一致コントロール抗体３Ａ１のどちらかとを、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含むブロッキング緩衝液において含有する染色溶液と４℃で一晩インキュベーションした。その後、スライド片をＰＢＳで３回洗浄し、Ｌｉｓｂｅｔｈ封入剤での封入標本にし、ＳＰ８共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）により画像化した。結果が図１２に示される。
【０４２０】
実施例１１：マウス多発性骨髄腫組織に対するＮＩ−２０６．８２Ｃ２結合の決定
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２×１０６個のマウス多発性骨髄腫細胞株ＭＯＰＣ３１５．４を静脈内注入した。いくつかのＢＡＬＢ／ｃマウスには、ビヒクルのみのコントロールが注入された。骨組織を採取し、４％ＰＦＡにおいて固定処理し、１０％ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）において脱灰し、パラフィンに包埋し、その後、切片化し（４μｍ）、再水和した。その後、ＣＤ１３８  ｍＡｂ（クローン２８１−２、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＣｙ５標識されたＮＩ−２０６．８２Ｃ２を使用して、ＭＯＰＣ３１５．ＢＭ．Ｌｕｃ細胞の浸潤、ならびに、組織切片におけるこれらの細胞および周囲の間質細胞に対するＮＩ−２０６．８２Ｃ２結合を特定した。その後、染色された組織切片を、蛍光顕微鏡を使用して画像化した（図１３）。
【０４２１】
実施例１２：ヒトアテローム斑および閉塞性冠状動脈血栓に対するＮＩ−２０６．８２Ｃ２結合の共焦点免疫蛍光による決定
ＮＩ−２０６．８２Ｃ２を蛍光画像化のためにシアニン３により標識し（Ｃｙ３コンジュゲート化キット：Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、３４０−００３０）、抗体の標識化を、分光光度計を使用して確認した。閉塞性のヒト冠状動脈血栓を引き起こす心筋梗塞からの凍結切片（図１４Ａ）、および、ヒト大動脈アテローム斑からの凍結切片（図１４Ｂ）を、氷冷アセトンにおいて５分間にわたって固定処理し、１０分間乾燥させ、その後、ＰＢＳで洗浄した。その後、切片をＰＢＳにおける５％ＢＳＡにおいて室温で１時間インキュベーションし、その後、シアニン３標識抗体と４℃で一晩インキュベーションし、その後、ＰＢＳで３回洗浄し、その後、０．５μｇ／ｍＬでのＤＡＰＩとインキュベーションした。その後、切片をＰＢＳでさらに３回洗浄し、Ｌｉｓｂｅｔｈ封入剤での封入標本にし、その後、ＳＰ８共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で画像化した。
【０４２２】
実施例１３：回転式トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ（商標））を使用する、血液凝固におけるＮＩ−２０６．８２Ｃ２の役割の決定
２回分の末梢血を一人の健康な対象からクエン酸ナトリウムチューブに採取し、血小板非含有血漿を遠心分離によって調製した。それぞれのチューブからの血漿をプールし、−８０℃での貯蔵のために直ちに小分けした。この血漿はＦＡＰレベルがＥＬＩＳＡによって１３０ｎｇ／ｍｌである。血漿サンプルを、滅菌された生理的食塩水で希釈されるＦＡＰに対するＮＩ−２０６．８２Ｃ２（ｎ＝３）または４３Ａ１１コントロール（ｎ＝３）により処理し、新鮮な迅速解凍血漿に加え、その結果、サンプルにおける抗体の最終濃度が、０．０００６６７ｎＭ、０．００６６７ｎＭ、０．０６６７ｎＭ、０．６６７ｎＭ、６．６６７ｎＭの血漿であるようにした。３７℃における抗体との１時間のインキュベーションの後、ＮＡＴＥＭ分析を、測定開始前における抗体との３７℃での１時間の抗体とのインキュベーション時間の後での生来的な血液凝固プロセスを観察するためにＳＴＡＲ−ＴＥＭ試薬を使用することによって、製造者の説明書に従って行った。統計学的分析を、二元配置ＡＮＯＶＡを使用して行った（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１）。結果が図１５に示される。
【０４２３】
実施例１４：ＮＩ−２０６．８２Ｃ２に基づく免疫沈殿を使用する、ヒト血漿からのＦＡＰクリアランスの決定
１００μＬのＰｕｒｅＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｇ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＬＳＫＭＡＧＧ０２）を、２５ｍＭのＴＲＩＳ、０．１５ＭのＮａＣｌおよび０．１％のＴｗｅｅｎ２０の５００μＬに懸濁した。ヒト血漿を１２５μＬの最終体積にＰＢＳにおいて１：５で希釈し、４つのチューブに分け、回転とともにＲＴで３０分間インキュベーションした。その後、ビーズを磁石スタンドにより集め、プレ除去処理された上清を、８２Ｃ２、４３Ａ１１または３Ａ１により被覆された磁石ビーズを含有する新しいチューブに移した。抗体コンジュゲート化ビーズを、回転を行いながら４℃で一晩、血漿希釈物とインキュベーションした。その後、ビーズを磁石スタンドにより集め、上清をα２ＡＰ−ＡＭＣ切断活性の分析のために取り出した。上清におけるα２ＡＰ−ＡＭＣ活性を明らかにするために、半分の領域が黒色である９６ウエルプレートを、無菌ろ過された５％ＢＳＡにより３７℃で１時間にわたってブロッキング処理した。その後、４０μＬのＰＢＳをすべてのウエルに加え、５μＬの上清溶液を適切なウエルに加え、５μＬのα２ＡＰ−ＡＭＣのメタノール溶液を１０μＭの最終アッセイ濃度のために加えた。  蛍光強度（切断ＡＭＣ）を３０分の総時間にわたって３分毎に３６０ｎＭの励起および４６０ｎＭの放射で測定し、反応速度を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６ソフトウエアを使用して計算した。結果が図１６に示される。
【０４２４】
実施例１５：ＮＩ−２０６．８２Ｃ２抗原のレベルを測定するためのサンドイッチＥＬＩＳＡの特徴づけ
ヒトサンプルにおけるＮＩ−２０６．８２Ｃ２抗原のレベルを定量するために、透明な９６ウエルプレートを炭酸塩の被覆緩衝液における８μｇ／ｍＬでの３０μＬのＦ１９（ＣＲＬ−２７３３）により室温で２時間〜４時間被覆した。被覆溶液を除き、プレートをＰＢＳブロッキング緩衝液における４０μＬの２％ＢＳＡにより室温で１時間にわたってブロッキング処理し、その後、捨てた。その後、３０ｕＬのサンプル溶液を加えた。サンプル溶液には、組換えヒトＦＡＰ標準物（図１７Ａ）、様々な希釈度でのヒト血清（図１７Ｂ）、ＦＡＰホモログ（図１７Ｃ）、健康な患者に由来する血清サンプル（図１８および図１９）、転移性結腸直腸ガンの患者に由来する血清サンプル（図１８）、心臓血管疾患の患者に由来する血清サンプル（図１９）、健康な患者に由来するクエン酸ナトリウム血漿サンプル（図２０）、および、症候性頸動脈アテローム斑を有する患者に由来するクエン酸ナトリウムサンプル（図２０）が含まれた。サンプル溶液を３０μＬの総体積で加えた。プレートを４０μＬのＰＢＳにより３回洗浄し、ドライブロッティングした。３０μＬのＨＲＰ標識された８２Ｃ２をすべてのウエルに加え、ＲＴで１時間インキュベーションした。その後、プレートを３×ＰＢＳにより３回、再び洗浄し、ドライブロッティングした。その後、３０μＬのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液をそれぞれのウエルに加え、室温で５分間〜１０分間発色させた。その後、反応を、３０μＬの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることによって停止させ、４５０ｎＭでの吸光度をプレートリーダーにより読み取った。
【０４２５】
実施例１６：抗ＦＡＰ抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２は動脈閉塞時間をマウス血栓症モデルにおいて延長することができる
頸動脈光化学的傷害誘発血栓症モデルが、ナトリウムペントバルビタール（８７ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射による麻酔により開始される。尾の軽い加温（温水を使用する）の後、ローズベンガル（ＰＢＳにおける１０ｍｇ／ｍＬ）が０．１２ｍＬの体積で、５０ｍｇ／ｋｇの濃度で尾静脈に注入される。その後、マウスは、（頭部が術者の方を向いて）背臥位で固定され、解剖顕微鏡下において加熱パッドに置かれる（直腸温度がモニターされる）。（２．５ｃｍ〜３ｃｍの）正中頸部切開と、気管瘻をもたらすための、鈍的調製による咽頭の小さい切開との後、右総頸動脈を露出させ、結合組織が除かれる。手術用縫合糸を用いて、胸鎖乳突筋を右側に寄せて固定し、右頸動脈へのアクセス領域を増大させる。手順中の過度な血管操作を避けるように注意しなければならない。先の曲がったピンセットを用いて、血管の下を（左側から）滑らせ、血管を優しく持ち上げ、その結果、プローブを血管の下および周囲に配置する。プローブは、アクセス領域により、プローブが近位にあることが可能となるほどに近位に設置され、また、その接続ワイヤがその後、その位置を微調整するためにマイクロマニピュレーターで設置されなければならない（プローブは好ましくは、流れに対する抵抗を何ら生じさせないように血管にそろえなければならない）。少量の手術用超音波ゲルが、シグナル品質を増大させるためにプローブの上部に塗布されなければならない。ローズベンガル注入の６分以内に、レーザービームが頸動脈に向けられ、６ｃｍの固定された距離で６０分間保たれる。流れが、これらの６０分の期間中およびさらなる６０分間（１２０分の最大時間経過）、または閉塞が生じるまで測定される。閉塞が、０．１ｍｌ／分未満の一定（１分以上の）流れとして見なされる。マウスは、閉塞分析が完了した後直ちに、過量のペントバルビタール（２５ｍｇ）によって安楽死させられる。
【０４２６】
マウスは、体温の低下を避けるために加熱パッドに置かれる。心拍数（血流を測定するプローブはまた、心拍数を測定する）が手術中にモニターされる。麻酔の深さが、足の引込め反射によって手術開始前および実験中に調べられる（無外傷性鉗子の使用によって、動物の後肢が延ばされ、また、足の趾間水かきがしっかりと挟まれる；つま先を挟んだことに対する引込み反応が全くないならば、動物は、十分に深いと判断されるであろう）。
【０４２７】
麻酔のナトリウムペントバルビタールの選ばれた用量（８７ｍｇ／ｋｇ体重）は、動物を実験の全継続期間にわたって深い麻酔で保つために十分である。２回目の投薬は必要ない。リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ｐＨ７）ビヒクルにおける２０ｍｇ／ｋｇのＮＩ−２０６．８２Ｃ２が、マウスを飽和させ、薬物動態学のどのような影響も打ち消すために予想される（Ｔａｂｒｉｚｉ他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８章、２１８〜２１９）。リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ｐＨ７）単独が、ビヒクルのみのコントロールとして投与される。結果が図２１に示される。実際、本発明に従って行われた実験により、抗ＦＡＰ抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２は、光化学的傷害誘発動脈閉塞時間を生体マウスにおいてコントロール抗体４３Ａ１１（生物学的に不活性なアイソタイプ一致のコントロール抗体）と比較して延長させることによって立証されるように、血栓症を用量依存的様式でマウスにおいて軽減させることが明らかにされる。抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２は、閉塞までのメジアン時間における用量依存的な増大をマウスにおいて示し、２ｍｇ／ｋｇの用量から始まる有意な増大、ならびに、７ｍｇ／ｋｇ超および２０ｍｇ／ｋｇでのさらなる増大が、コントロールとしてのＰＢＳおよび２０ｍｇ／ｋｇの一定用量での抗体４３Ａ１１と比較して認められる；図２３を参照のこと。
【０４２８】
実施例１７：抗ＦＡＰ抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２は同所性腫瘍成長を同系の結腸直腸ガンマウスモデルにおいて抑止することができる
ＣＪ５７／ＢＬ６マウスをイソフルオラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）吸入によって麻酔し、肝門脈へのアクセスを（剣状突起から４ｃｍ尾方向への）正中開腹によって得た。マウスには１００万個のマウスＭＣ３８結腸直腸ガン細胞を注入した。これらの細胞の起源がＳｃｉｅｎｃｅ（１９８６年９月１９日）に記載される。ＭＣ−３８腫瘍を処置前の７日間にわたって形成させた。 マウスを５回の処置サイクルについて７２時間毎にＰＢＳまたはＮＩ−２０６．８２Ｃ２（２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）のどちらかにより処置し、その後、イソフルオラン吸入によって麻酔した。小動物ＭＲＩ画像化を、Ｂｒｕｋｅｒ  ４．７  Ｔｅｓｌａ  ＭＲＩを使用して行い、肝臓転移物の画像を取得した。腫瘍画像を、Ｍｙｒｉａｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｎｔｒａｓｅｎｓｅ）で分析して、腫瘍転移物および累積腫瘍直径総腫瘍負荷量を定量した。結果が図２２に示される。
【０４２９】
実施例１８：膜貫通ＦＡＰに対する、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２およびＮＩ−２０６．６Ｄ３の結合はｐＨ依存的である
膜貫通ヒトＦＡＰに対するＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２およびＮＩ−２０６．６Ｄ３の結合を評価するために、ＦＡＰを発現するＨＥＫ２９３細胞株を国立衛生研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）から受け取った。このＦＡＰ発現ＨＥＫ２９３細胞の作製が、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１３（第２１０巻、第６号）、１１２５〜１１３５に記載される。ＨＥＫ２９３細胞を、全長のヒトＦＡＰのｃＤＮＡをコードするレトロウイルスにより形質導入した。クローニングを、Ｆａｓｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ＰａｃｋおよびＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ制限酵素（ともにＦｅｒｍｅｎｔａｓから得られる）を使用して行った。一過性のレトロウイルス上清を、２９３ＧＰ細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）を使用してＦＡＰプラスミドによりトランスフェクションすることによって作製した。レトロウイルス上清をトランスフェクション後４８時間で集め、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ被覆（１０μｇ／ｍｌ；Ｔａｋａｒａ）された組織培養非処理の６ウエルプレートに対して３２℃で２時間、２，０００Ｇで遠心分離した。その後、これらのレトロウイルス上清を使用して、ＨＥＫ２９３細胞の一晩の形質導入に供した。形質導入されたＦＡＰ−ＨＥＫ２９３細胞を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ＣｅｌｌＧｒｏ）により選抜した。
【０４３０】
蛍光活性フローサイトメトリーのための蛍光標識抗体を作製するために、ＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２およびＮＩ−２０６．６Ｄ３、ならびに、アイソタイプ一致の生物学的に不活性なコントロール抗体４３Ａ１１を、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ  Ｃｙ５  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を製造者の説明書に従って使用して、Ｃｙａｎｉｎｅ  Ｄｙｅ  ５色素（Ｃｙ５）により標識した。
【０４３１】
５００，０００個のＦＡＰ−ＨＥＫ２９３細胞を、７つの異なるｐＨ調節されたＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、６．８、６．６、６．５、６．４、６．３および６．２）において４つの異なる抗体濃度（０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭ）での、Ｃｙ５標識されたＮＩ−２０６．８２Ｃ２、ＮＩ−２０６．５９Ｂ４、ＮＩ−２０６．２７Ｅ８、ＮＩ−２０６．１２Ｇ４、ＮＩ−２０６．１８Ｈ２もしくはＮＩ−２０６．６Ｄ３と、またはＣｙ５標識された４３Ａ１１とのどちらかと４℃で１時間インキュベーションした。ＰＢＳ緩衝液を、ＭＥＳ一水和物（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して調節した。インキュベーション後、細胞を、一致させたｐＨ調節ＰＢＳにより２００ｕＬで３回洗浄し、４００Ｇで４分間にわたって遠心分離し、２００μＬのｐＨ調節緩衝液に再懸濁した。
【０４３２】
抗体結合を分析するために、蛍光活性化フローサイトメトリーを、前方散乱、側方散乱について、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓａデバイスを使用して行い、Ｃｙ５チャネルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、６３３ｎＭのレーザー励起および６００／２０フィルターを使用して記録した。生細胞を前方散乱および側方散乱ならびに一重項／二重項排除によってゲート処理し、Ｃｙ５についてのＭＦＩを、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（バージョン１０．１）を使用して定量した。Ｃｙ５標識された４３Ａ１１についてのＭＦＩシグナルを、Ｃｙ５標識された８２Ｃ２、５９Ｂ４、２７Ｅ８、１２Ｇ４、１８Ｈ２および６Ｄ３から差し引いて、ｐＨ７．４、６．８、６．６、６．５、６．４、６．３および６．２におけるΔＭＦＩを計算し、これにより、ｐＨ７．４における場合と比較して、酸性条件のもとでの増大したパラトープ特異的な８２Ｃ２、５９Ｂ４、２７Ｅ８、１８Ｈ２および６Ｄ３のアビディティー（図２４Ａ、図２４Ｂ、図２４Ｃ、図２４Ｅおよび図２４Ｆ）、ならびに、ｐＨ７．４における場合と比較して、酸性条件のもとでの低下したパラトープ特異的な１２Ｄ３アビディティー（図２４Ｄ）が明らかにされた。
【０４３３】
実施例１９：インビボでのＮＩ−２０６．８２Ｃ２の腫瘍関与
抗ＦＡＰ抗体ＮＩ−２０６．８２Ｃ２と、生物学的に不活性なアイソタイプ一致のコントロール抗体４３Ａ１１とを、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ａ２０１８８）を製造者の説明書に従って使用してＡｌｅｘａ６８０色素により蛍光標識した。これらの抗体は、Ａ６８０−８２Ｃ２（Ａｌｅｘａ６８０標識された８２Ｃ２）およびＡ６８０−４３Ａ１１（Ａｌｅｘａ６８０標識された４３Ａ１１）と称される。
【０４３４】
マウスのガンモデルを、１００，０００個の培養された４Ｔ１乳腫瘍細胞をＢａｌｂ／ｃ免疫適格マウスの第２左乳房に同所性に注入することによって作製し、７日間成長させた。インビボ画像化の前に、動物を入射光の最小限の吸光度および散乱のために剃毛し、脱毛して、柔毛を除いた。インビボ画像化を、Ｍａｅｓｔｒｏ５００画像化システム（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ、Ｗｏｂｕｒｎ、米国）を用いて行った。Ａ６８０−８２Ｃ２の検出のために、６１５ｎｍから６６５ｎｍまでの帯域フィルターと、７００ｎｍ超の高域フィルターとを、励起光および放射光のためにそれぞれ使用し、蛍光を（１１℃に冷却された）ＣＣＤカメラによって検出した。一連の画像を異なる波長で取得し、その後、スペクトル分離（ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｕｎｍｉｘｉｎｇ）（収集された光学スペクトルのデコンボリューション）に供した（これにより、組織の自己蛍光および他のスペクトル寄与からのＡｌｅｘａ６８０蛍光パターンの分離が可能となった）。
【０４３５】
４Ｔ１乳腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウス（それぞれの群において３匹〜４匹）に、その後、２ｍｇ／ｋｇのＡ６８０−８２Ｃ２またはＡ６８０−４３Ａ１１を接種後の７日目に注入した。全身マウス画像を下記の時点で取得した：抗体注入前、抗体注入直後、抗体注入後６時間、２４時間、４８時間および６日。その後、強度データを自己蛍光に対して正規化し、これら２つの群の間で比較した。抗体濃度が抗体注入後６時間から４８時間まで動物においてピークに達すること、そして、Ａ６８０−８２Ｃ２抗体は、コントロール抗体Ａ６８０−４３Ａ１１よりも有意に大きい腫瘍取り込みを有することが見出された。結果が図２５に示される。
【０４３６】
実施例２０：８２Ｃ２−４１ＢＢ−ＣＤζ（抗ＦＡＰ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構築
ＦＡＰ結合性の８２Ｃ２由来ＳｃＦｖと、４−１ＢＢの共刺激性ドメインと、ならびに、ＣＤ３ζエンドドメインとを有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が構築される（８２Ｃ２−４１ＢＢ−ＣＤζ）。８２Ｃ２の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を、ＰＣＲ駆動オーバーラップ伸長を使用してリンカー配列と融合し、ｐＵＫＢＫベクター（ＨｅｃｋｍａｎおよびＰｅａｓｅ、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２（２００７）、９２４〜９２３；Ｋｏｈｌｉ他、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．１１（２０１２）、４０７５〜４０９０）のＳｆｉ１部位およびＰｍｅ１部位にクローン化する。ＰＣＲベースのクローニングを使用して、８２Ｃ２の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）をリンカーの後のＰｍｅ１部位に挿入し、これにより、ｐＵＫＢＫ−ＦＡＰ−ＳｃＦｖを得る。ＶＬの３’末端におけるＰｍｅ１部位が、５’−ＡＣＣＣ伸長を有する逆方向プライマーを使用することによって保たれる。Ｔ２Ａ−ｅＧＦＰをＰＣＲによってＡｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６９５３６から増幅し、このベクターのＰｍｅ１部位にクローン化する。ＶＬの３’末端におけるＰｍｅ１部位が、５’−ＧＴＴＴ伸長を有する順方向プライマーを使用することによって保たれる。ＣＤ８ｈｉｎｇｅ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζの配列が米国特許第８，９０６，６８２号（Ｂ２）から得られ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒによって合成され、このベクターのＰｍｅ１部位にクローン化される。ＶＬの３’末端におけるＰｍｅ１部位が、５’−ＧＴＴＴ伸長を有する順方向プライマーを使用することによって保たれる。Ｔ２ａおよびｅＧＦＰに読み枠を合わせて融合されるこのようにして得られた構築物８２Ｃ２−ＣＤ８ｈｉｎｇｅ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζはｐＲＲＬレンチウイルス骨格（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド  ７４９２２）に移され、その後で８２Ｃ２−４１ＢＢ−ＣＤζと命名される。
【０４３７】
コントロール実験のために、第２のＣＡＲが、ＦＡＰ結合抗体シブロツズマブのＳｃＦｖをクローン化することによって構築される（Ｓｉｂｒｏ−４１ＢＢ−ＣＤζ）。シブロツズマブのＶＨ配列およびＶＬ配列が米国特許出願公開第２００３／０１０３９６８号（Ａ１）から得られ、相互連結リンカーと一緒に合成され（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）、ｐＵＫＢＫのＳｆｉ１およびＰｍｅ１にクローン化される。シブロツズマブ由来のＳｃＦｖを、Ｓｆｉ１部位およびＰｍｅ１部位を使用してレンチウイルスプラスミド８２Ｃ２−４１ＢＢ−ＣＤζにクローン化し、このようにしてＳｉｂｒｏ−４１ＢＢ−ＣＤζを得る。
【０４３８】
コントロール実験のために、８２Ｃ２由来ＳｃＦｖおよび短縮型エンドドメインを有する第３のＣＡＲが調製される（８２Ｃ２−Δ）。ＣＤ８ｈｉｎｇｅの配列が米国特許第８，９０６，６８２号（Ｂ２）から得られ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒによって合成され、ＰＵＫＢＫ．ＦＡＰ−ＳｃＦＶ−Ｔ２Ａ−ｅＧＦＰのＰｍｅ１部位にクローン化される。このようにして得られた構築物はｐＲＲＬレンチウイルス骨格に移され、その後で８２Ｃ２−Δと命名される。
【０４３９】
ＥＦ１αプロモーターによるＣＡＲ発現のために使用される様々なレンチウイルスプラスミドが、以前に報告されたように、他の日常的に使用されているプロモーターと比較して、Ｔ細胞におけるそれらの大きい長期に及ぶ発現のために選ばれる；Ｍｉｌｏｎｅ他、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（２００９）、１４５３〜１４６４を参照のこと。ＣＡＲ発現効率の簡便な評価のために、ｅＧＦＰのバイシストロニック発現が選ばれる。
【０４４０】
すべての構築物が、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ配列決定サービスを使用して配列決定される。
【０４４１】
実施例２１：８２Ｃ２−４１ＢＢ−ＣＤζレンチウイルスおよび８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の作製
ＣＡＲをレンチウイルスによってヒトＴ細胞に送達することは、効率的な臨床的に確認された手順である；Ｄｏｔｔｉ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５７（２０１４）、１０７〜１２６を参照のこと。８２Ｃ２−４１ＢＢ−ＣＤζ  ＣＡＲレンチウイルスプラスミドまたはコントロールプラスミドを、ＣＡＲレンチウイルスを作製するために使用する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）から購入し、１０％のＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）が補充されるＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において３７℃および５％ＣＯ２で培養する。維持のために、コンフルエントな細胞をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）により洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）により解離し、新鮮な培地において１：１０の希釈度で置床する。ＨＥＫ２９３を、２５ｋＤＡのポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してウイルスおよびヘルパープラスミドによりトランスフェクションする。トランスフェクション後４８時間で、ウイルス含有上清をＦａｌｃｏｎチューブに移し、５００ｒｃｆで１５分間遠心分離して、細胞破片を除く。ウイルス含有培地を小分けし、−８０℃で貯蔵する。
【０４４２】
初代Ｔ細胞を８２Ｃ２−４１ＢＢ−ＣＤζレンチウイルスにより形質導入して、８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔを産生させる。健康な志願者ドナーからの血液をそれぞれの規則に従って得る。Ｔ細胞を、汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者の説明書に従って使用する負の選択によってＰＢＭＣから抽出し、Ｔ細胞を以前に記載されるように増殖させる；Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６（２００９）、３３６０〜３３６５を参照のこと。初代Ｔ細胞を活性化後２４時間で、８２Ｃ２−４１ＢＢ−ＣＤζ発現レンチウイルスにより形質導入する。ｅＧＦＰの発現を形質導入後およそ２４時間でフローサイトメトリーによって分析する。形質導入効率が、以前に示されたように（Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６（２００９）、３３６０〜３３６５）、７５％超に達することが予想される。これらの細胞は本明細書中下記では８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔと称される。
【０４４３】
コントロールのＣＡＲ  Ｔ細胞が、Ｓｉｂｒｏ−４１ＢＢ−ＣＤζまたは８２Ｃ２−Δによる初代Ｔ細胞の形質導入によって作製され、これらは、類似する形質導入効率を有することが予想される。これらの細胞は本明細書中下記では、Ｓｉｂｒｏ−ＣＡＲ  Ｔ、および、８２Ｃ２−Δ−ＣＡＲ  Ｔとそれぞれ称される。
【０４４４】
実施例２２：被覆された組換えＦＡＰに対する８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔの特異的結合およびエフェクターサイトカインの放出の決定
８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔのエフェクター機能を明らかにするために、８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔの標的関与時のサイトカイン放出が測定される。ＣＡＲ−Ｔが標的エピトープに結合したときのサイトカインの放出は、ガン細胞およびその環境の損傷を引き起こすことになり、ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍効果の機構の１つである。
【０４４５】
９６ウエル平底プレートをマウス抗Ｈｉｓ抗体（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）により一晩被覆する。６×ＨｉｓのＮ末端精製タグを有する組換えヒトＦＡＰを、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから購入し、ＰＢＳにおいて１μｇ／ｍｌで希釈されて抗体被覆プレートに４時間にわたって加えて、プレートをＰＢＳにより３回洗浄する。１０，０００個の８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔを、被覆された９６ウエルプレートにウエルあたり置床し、３７℃で２時間インキュベーションする。細胞培地上清を集め、ＥＬＩＳＡプレートに移す。ＩＦＮγおよびＴＮＦαのＥＬＩＳＡキットを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、製造者の説明書に従って使用する。サンプルをＴｅｃａｎ吸光度リーダーで測定する。組換えヒトＦＡＰによる刺激により、以前に明らかにされたように、８２Ｃ２−ＣＡＲ  ＴにおけるＩＦＮγおよびＴＮＦαの強い産生がもたらされることが予想される；Ｔｒａｎ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２１０（２０１３）、１１２５〜１１３５を参照のこと。
【０４４６】
サイトカインが、ヒトＦＡＰとの８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔ相互作用に対する応答において特異的に放出されることを示すために、８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔを、ＦＡＰにより被覆されない９６ウエル平底プレートに置床する。ヒトＦＡＰの非存在下における８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔの培養はサイトカイン産生を引き起こさないこと、すなわち、サイトカイン産生がＦＡＰとの相互作用の後で特異的に開始されることが予想される。
【０４４７】
エフェクターエンドドメイン機能が、８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔのサイトカイン放出のために必要であることを示すために、８２Ｃ２−Δ−ＣＡＲ  Ｔを、上記で記載されるような組換えＦＡＰ被覆プレートに置床する。８２Ｃ２−Δ−ＣＡＲ  Ｔは、サイトカインの有意な産生を示さないことが予想される。
【０４４８】
実施例２３：正常なｐＨ条件のもとでの、ヒトＦＡＰを発現する細胞に対する８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔの結合およびサイトカインの放出の決定
ヒトＦＡＰを発現するプラスミドを得るために、ＰＣＲを、ヒトＦＡＰをコードするｃＤＮＡに対して行う。ＰＣＲ産物をｐＵＫＢＫ−ＣベクターのＡｓｃ１部位とＳｆｉ１部位との間にクローン化し、したがって、これにより、ＣＭＶプロモーターからのＦＡＰの発現が可能となり、Ｃ末端のＨＡタグが備わる（Ｋｏｈｌｉ他、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．１１（２０１２）、４０７５〜４０９０）。ＦＡＰ−ＨＡ構築物の正しさが、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ配列決定サービスを使用して確認される。
【０４４９】
ヒト肺ガン細胞株Ａ５４９はＦＡＰを発現しないことが、ＲＴ−ＰＣＲおよびフローサイトメトリーを使用して以前に示された；Ｋａｋａｒｌａ他、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２１（２０１３）、１６１１〜１６２０を参照のこと。Ａ５４９をＡＴＣＣから購入し、Ｆ−１２Ｋ培地において製造者の説明書に従って維持する。２００×１０３個を２４ウエル細胞培養皿にウエルあたり置床し、翌日、１μｇのＦＡＰ−ＨＡ  ＤＮＡおよびリポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）を製造者の説明書に従って使用してトランスフェクションする。１μｇ／ｍｌのＧ４１８の選抜用抗生物質（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を、ＦＡＰプラスミドによりトランスフェクションされたＡ５４９細胞を選抜するためにリポフェクションの１日後に細胞培養培地に補充する。選抜培地におけるおよそ２週間の維持の後、ＦＡＰを発現する混合した安定な細胞株が得られ、これは本明細書中下記ではＡ５４９−ＦＡＰと呼ばれる。この細胞株におけるヒトＦＡＰの安定な発現を確認するために、抗ＨＡ抗体による免疫細胞化学染色が行われる。ウエルあたり８０×１０３個のＡ５４９−ＦＡＰ細胞を４ウエルのガラス製チャンバースライド（ＬａｂＴｅｋ）に置床する。置床後２４時間で、細胞を４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により固定処理し、抗ＨＡ抗体（１：１００；Ｒｏｃｈｅ）と２時間インキュベーションし、二次Ｃｙ３抗ラット（１：２５０；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とインキュベーションし、Ｍｏｗｉｏｌ（Ｓｉｇｍａ）を使用して封入標本にする。細胞を、以前に記載されたように（Ｇｅｒｓｂａｃｈｅｒ他、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、８／２０１３、ｅ６９３６３）、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ８共焦点顕微鏡を使用して画像化する。ＣＭＶプロモーターを使用しているために、強いＦＡＰ発現（すなわち、蛍光シグナル）がＡ５４９−ＦＡＰ細胞において予想される。選抜手順のために、ＦＡＰ発現（すなわち、蛍光シグナル）は、９０％超のＡ５４９−ＦＡＰ細胞において認められることが予想される。Ａ５４９親細胞株がＨＡ染色についての陰性として役立ち、したがって、有意な蛍光シグナルを示さないことが予想される。
【０４５０】
８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔのエフェクター機能を評価するために、Ａ５４９−ＨＡ細胞との共培養を調製し、サイトカイン分泌を測定する。３，０００個のＡ５４９−ＦＡＰ細胞を５０μｌの培地において丸底９６ウエルプレートにウエルあたり置床する。その後、８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔを異なる密度で含有する５０μｌの培地を、標識されたＡ５４９−ＦＡＰ細胞に加え、１：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１および５０：１の、８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔ対Ａ５４９−ＦＡＰ細胞比を得る。４時間後、培地をＥＬＩＳＡプレートに移し、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生を、以前に記載されたように測定する。８２Ｃ２−ＣＡＲ  ＴのＡ５４９−ＦＡＰ細胞との共培養は、これら２つの測定されたサイトカインの産生をもたらさないこと（すなわち、有意な産生をもたらさないこと）が予想される。加えて、エフェクター（８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔ）および標的（Ａ５４９−ＦＡＰ）の比率はサイトカイン産生に対して影響を有しないことが予想される。
対照的に、上記で記載されるように、Ｓｉｂｒｏ−ＣＡＲ  ＴのＡ５４９−ＦＡＰ細胞との共培養は、用量依存的様式でのサイトカインの有意な産生をもたらすことが予想される。Ｓｉｂｒｏ−ＣＡＲ  ＴのナイーブＡ５４９細胞との共培養は、サイトカインの有意な産生を示さないことが予想される。
【０４５１】
実施例２４：低ｐＨ条件のもとでの、ヒトＦＡＰを発現する細胞に対する８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔの結合およびサイトカインの放出の決定
腫瘍微小環境は、ワールブルク効果のために酸性環境を有することが記録されている。８２Ｃ２可変ドメインの予想された利点が、他の記録された抗ＦＡＰ抗体可変ドメインと比較した場合には、中性ｐＨのもとでの膜結合型ＦＡＰに対する比較的より低いアビディティーに対して、低いｐＨのもとでの膜結合型ＦＡＰに対する選択的なアビディティーである。
【０４５２】
８２Ｃ２−ＣＡＲ  ＴのｐＨ依存的結合を調べるために、ＣＡＲ  Ｔを、Ａ５４９−ＦＡＰ細胞とｐＨ６．３で共培養する。ウエルあたり３，０００個のＡ５４９−ＦＡＰ細胞を、８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔを異なる密度で含有する５０μｌの培地（ｐＨ６．３）と一緒に、５０μｌの培地（ｐＨ６．３）において丸底９６ウエルプレートに置床して、１：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１および５０：１の、８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔ対Ａ５４９−ＦＡＰ細胞比を得る。上清をＥＬＩＳＡプレートに移し、サイトカイン産生を上記のように測定する。８２Ｃ２−ＣＡＲ  ＴのＡ５４９−ＦＡＰ細胞との共培養はサイトカインの強い産生をもたらすこと、そして、その産生は用量依存的であることが予想される。
【０４５３】
サイトカインが、ヒトＦＡＰとの８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔ相互作用に対する応答において特異的に放出されることを示すために、８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔを、低いｐＨ（ｐＨ６．３）のもと、以前に使用されたエフェクター対標的細胞比でナイーブＡ５４９細胞と共培養する。８２Ｃ２−ＣＡＲ  ＴおよびナイーブＡ５４９細胞の共培養では、サイトカインの有意な産生がどのような所与のエフェクター対標的細胞比においても引き起こされないことが予想される。
【０４５４】
エフェクターエンドドメイン機能が、８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔのサイトカイン産生のために必要であることを示すために、８２Ｃ２−Δ−ＣＡＲ  Ｔを、低いｐＨ（ｐＨ６．３）のもと、以前に使用されたエフェクター対標的細胞比でＡ５４９−ＦＡＰ細胞と共培養する。８２Ｃ２−Δ−ＣＡＲ  ＴおよびＡ５４９−ＦＡＰ細胞の共培養では、サイトカインの有意な産生がどのような所与のエフェクター対標的細胞比においても引き起こされないことが予想される。
【０４５５】
８２Ｃ２由来ＣＡＲ  Ｔの、他の抗ＦＡＰ  ＣＡＲ  Ｔを上回る予想された利点（これは、中性ｐＨのもとでの膜結合型ＦＡＰに対する比較的より低いアビディティーに対して、低いｐＨのもとでの膜結合型ＦＡＰに対するその選択的なアビディティーである）をモニターするために、様々なｐＨ条件における８２Ｃ２−ＣＡＲ  ＴおよびＳｉｂｒｏ−ＣＡＲ  Ｔのエフェクターサイトカイン放出の比較が行われる（２．８７５刻みでの６．３から７．４までのｐＨ範囲）。Ａ５４９−ＦＡＰ細胞を、上記のように、２０：１のエフェクター対標的細胞比で、８２Ｃ２−ＣＡＲ  ＴまたはＳｉｂｒｏ−ＣＡＲ  Ｔのどちらかと共培養する。Ｓｉｂｒｏ−ＣＡＲ  Ｔの溶解効率がｐＨに依存していないであろうことが予想される。対照的に、８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔは、ｐＨ７．４における溶解効率が低いこと（すなわち、有意でないこと）が予想され、しかし、溶解効率がｐＨの低下とともに増大することが予想される。
【０４５６】
実施例２５：異なるｐＨ条件のもとでの、ヒトＦＡＰを発現する細胞に対する８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔ特異的細胞溶解活性の決定
８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔの細胞溶解活性を明らかにするために、標準的な５１Ｃｒ（クロム）放出アッセイが使用される。Ａ５４９−ＦＡＰ細胞を標識するために、２×１０６個の細胞を洗浄し、２０μｌのクロム−５１（５ｍＣｉ／ｍｌ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）と３７℃で１時間インキュベーションする。その後、細胞をＲＰＭＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により２回洗浄し、３，０００個の細胞を、ｐＨ６．３である５０μｌの培地において丸底９６ウエルプレートにウエルあたり置床する。その後、８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔを異なる密度で含有する５０μｌの培地（ＲＰＭＩ、ｐＨ６．３）を、標識されたＡ５４９−ＦＡＰ細胞に加え、１：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１および５０：１の、８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔ対Ａ５４９−ＦＡＰ細胞比を得る。共培養物を３７℃で４時間インキュベーションし、上清を集め、５１Ｃｒ放出をγ粒子カウンターで測定する。％での溶解を下記の式に従って計算する：
【０４５７】
（（サンプルの５１Ｃｒ放出）−（自発的５１Ｃｒ放出））／（（最大５１Ｃｒ放出）−（自発的５１Ｃｒ放出））
上記低ｐＨ条件（ｐＨ６．３）において、８２Ｃ２−ＣＡＲ  ＴによるＡ５４９−ＦＡＰの用量依存的かつ効率的な溶解が予想される。
【０４５８】
８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔの細胞溶解活性が、ヒトＦＡＰとの特異的な相互作用に依存していることを示すために、ナイーブＡ５４９を上記のようにクロム−５１により標識し、８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔと共培養する。８２Ｃ２−ＣＡＲ  ＴはナイーブＡ５４９細胞の有意な細胞溶解を引き起こさないことが予想される。エフェクターエンドドメイン機能が、８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔの細胞溶解機能のために必要であることを示すために、８２Ｃ２−Δ−ＣＡＲ  Ｔを、上記のように、低いｐＨ（ｐＨ６．３）のもと、クロム−５１標識のＡ５４９−ＦＡＰ細胞と共培養する。８２Ｃ２−Δ−ＣＡＲ  ＴはＡ５４９−ＦＡＰ細胞の有意な細胞溶解を引き起こさないことが予想される。
【０４５９】
８２Ｃ２由来ＣＡＲ  Ｔの、他の抗ＦＡＰ  ＣＡＲ  Ｔを上回る予想された利点（これは、中性ｐＨのもとでの膜結合型ＦＡＰに対する比較的より低いアビディティーに対して、低いｐＨのもとでの膜結合型ＦＡＰに対するその選択的なアビディティーである）をモニターするために、様々なｐＨ条件における８２Ｃ２−ＣＡＲ  ＴおよびＳｉｂｒｏ−ＣＡＲ  Ｔの細胞溶解機能の比較が行われる（２．８７５刻みでの６．３から７．４までのｐＨ範囲）。Ａ５４９−ＦＡＰ細胞を上記のようにクロム−５１により標識し、８２Ｃ２−ＣＡＲ  ＴまたはＳｉｂｒｏ−ＣＡＲ  Ｔのどちらかと共培養する。Ｓｉｂｒｏ−ＣＡＲ  Ｔの溶解効率がｐＨに依存していないであろうことが予想される。対照的に、８２Ｃ２−ＣＡＲ  Ｔは、ｐＨ７．４における溶解効率が低いこと（すなわち、有意でないこと）が予想され、しかし、溶解効率がｐＨの低下とともに増大することが予想される。
【図１−１】
2018035137.tif 000007
【図１−２】
2018035137.tif 000008
【図１−３】
2018035137.tif 000009
【図１−４】
2018035137.tif 000010
【図２−１】
2018035137.tif 000011
【図２−２】
2018035137.tif 000012
【図２−３】
2018035137.tif 000013
【図２−４】
2018035137.tif 000014
【図３】
2018035137.tif 000015
【図４−１】
2018035137.tif 000016
【図４−２】
2018035137.tif 000017
【図５】
2018035137.tif 000018
【図６】
2018035137.tif 000019
【図７−１】
2018035137.tif 000020
【図７−２】
2018035137.tif 000021
【図７−３】
2018035137.tif 000022
【図７−４】
2018035137.tif 000023
【図７−５】
2018035137.tif 000024
【図８】
2018035137.tif 000025
【図９】
2018035137.tif 000026
【図１０】
2018035137.tif 000027
【図１１】
2018035137.tif 000028
【図１２】
2018035137.tif 000029
【図１３】
2018035137.tif 000030
【図１４】
2018035137.tif 000031
【図１５−１】
2018035137.tif 000032
【図１５−２】
2018035137.tif 000033
【図１６】
2018035137.tif 000034
【図１７】
2018035137.tif 000035
【図１８】
2018035137.tif 000036
【図１９】
2018035137.tif 000037
【図２０】
2018035137.tif 000038
【図２１】
2018035137.tif 000039
【図２２】
2018035137.tif 000040
【図２３】
2018035137.tif 000041
【図２４−１】
2018035137.tif 000042
【図２４−２】
2018035137.tif 000043
【図２４−３】
2018035137.tif 000044
【図２５】
2018035137.tif 000045
【図２６】
2018035137.tif 000046
【図２７】
2018035137.tif 000047
【配列表】
2018035137000001.app
【外国語明細書】
2018035137000001.pdf