(57)【要約】【課題】標的分子を検出する非侵襲的方法を提供すること。【解決手段】本発明の実施形態は、標的分子を収集、検出、測定および同定するための非侵襲的方法および組成物に関する。いくつかの実施形態では、方法および組成物は、胃腸洗浄液または糞便中の標的分子に関する。一局面において、被験体の生理学的状況を評価するための方法が提供され、この方法は、被験体から胃腸洗浄液を得ることと、胃腸洗浄液中の胃腸系の外側に由来する標的分子を検出することとを含む。別の局面では、被験体の生理学的状況を評価するための方法が提供され、この方法は、被験体から糞便試料を得ることと、糞便試料中の胃腸系の外側に由来する標的分子を検出することとを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃腸洗浄液中の標的分子の存在を、被験体における膵臓癌または膵臓癌の素因の指標とする方法であって、
該被験体に洗浄組成物を経口投与して、該被験体の胃腸系の浄化をもたらすことによって該被験体から得られた胃腸洗浄液中の該標的分子を検出すること
を含み、該標的分子は、膵臓癌または膵臓癌の素因と関連し、かつ、ポリペプチド、抗体およびグリカンからなる群より選択される、方法。
【請求項２】
前記胃腸洗浄液が、前記被験体の胃腸系を部分的に浄化することによって該被験体から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体の胃腸系が洗浄される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的分子がポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドがＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記洗浄組成物が、ポリエチレングリコール、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、クエン酸マグネシウム、アスコルビン酸、ピコスルファートナトリウムおよびビサコジルからなる群より選択される成分を含み、および／または
前記洗浄組成物が、ＧＯＬＹＴＥＬＹ、ＨＡＬＦＬＹＴＥＬＹ、ＮＵＬＹＴＥＬＹ、ＳＵＰＲＥＰ、ＦＬＥＥＴのＰＨＯＳＰＨＯ−ＳＯＤＡ、クエン酸マグネシウムおよびそれらの同等物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記洗浄組成物が浸透圧性の薬剤または緩下剤のうち少なくとも１種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記洗浄組成物が、アロエ、ビサコジル、カサンスラノール、カスカラ芳香族流体抽出物、カスカラサグラダ樹皮、カスカラ（Ｃａｓｃａｄａ）サグラダ抽出物、カスカラサグラダ流体抽出物、ヒマシ油、ダンスロン、デヒドロコール酸、フェノールフタレイン、センノシドＡ、センノシドＢ、ピコスルファートおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される緩下剤を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記胃腸洗浄液を、前記標的分子を安定化または保存するための材料に曝露することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記胃腸洗浄液のｐＨを、前記標的分子を安定化または保存するために調整することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記材料が、酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤または変性剤のうち少なくとも１種を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記胃腸洗浄液が、前記被験体による非侵襲性自己収集によって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記胃腸洗浄液が、大腸内視鏡検査手順の一部として得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験体が哺乳類である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記被験体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記胃腸洗浄液中の少なくとも５、１０、２０、３０、５０または１００種の標的分子を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的分子が膵臓に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
胃腸洗浄液中の標的分子の存在を、被験体における膵臓癌または膵臓癌の素因の指標として検出するためのキットであって、
該被験体に経口投与するのに適した、該被験体の胃腸系の浄化をもたらすための洗浄組成物と；
該被験体から該胃腸洗浄液を含む試料を収集するための容器と；
該胃腸洗浄液中の該標的分子を検出するための薬剤と
を含み、該標的分子は、膵臓癌または膵臓癌の素因と関連し、かつ、ポリペプチド、抗体およびグリカンからなる群より選択される、キット。
【請求項１９】
前記標的分子がポリペプチドを含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記ポリペプチドがＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭである、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記標的分子を安定化または保存するための材料をさらに含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２２】
前記標的分子を安定化または保存するために前記試料のｐＨを調整するための材料をさらに含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記材料が、酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤または変性剤のうち少なくとも１種を含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
前記洗浄組成物が、ポリエチレングリコール、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、クエン酸マグネシウム、アスコルビン酸、ピコスルファートナトリウムおよびビサコジルからなる群より選択される成分を含み、および／または
前記洗浄組成物が、ＧＯＬＹＴＥＬＹ、ＨＡＬＦＬＹＴＥＬＹ、ＮＵＬＹＴＥＬＹ、ＳＵＰＲＥＰ、ＦＬＥＥＴのＰＨＯＳＰＨＯ−ＳＯＤＡ、クエン酸マグネシウムおよびそれらの同等物からなる群より選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２５】
前記洗浄組成物が浸透圧性の薬剤または緩下剤のうち少なくとも１種を含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２６】
前記洗浄組成物が、アロエ、ビサコジル、カサンスラノール、カスカラ芳香族流体抽出物、カスカラサグラダ樹皮、カスカラ（Ｃａｓｃａｄａ）サグラダ抽出物、カスカラサグラダ流体抽出物、ヒマシ油、ダンスロン、デヒドロコール酸、フェノールフタレイン、センノシドＡ、センノシドＢ、ピコスルファートおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される緩下剤を含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記胃腸洗浄液中の少なくとも５、１０、２０、３０、５０または１００種の標的分子を検出するための追加の薬剤を含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２８】
前記標的分子が膵臓に由来する、請求項１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、標的分子を収集、検出、測定および同定するための非侵襲的方法および組成物に関する。いくつかの実施形態では、方法および組成物は、胃腸洗浄液（ＧＬＦ）または糞便中の標的分子に関する。
【０００２】
配列表への言及
本願は、電子形式で配列表とともに出願されている。配列表は、およそ２３１ＫＢの大きさである、２０１１年９月７日に作成されたＵＳＡ＿００７ＷＯ．ＴＸＴと題されたファイルとして提供されている。配列表の電子形式での情報は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
胃腸（ＧＩ）管および肝胆道ならびにＧＩ管と関連する器官／組織と関連する障害として、胃癌、食道癌、肝臓癌および膵臓癌などの癌が挙げられる。膵臓癌（例えば、膵臓腺癌）は、特に、膵管の細胞に主に生じる膵臓の悪性増殖である。この疾患は、癌のうち９番目に多い形であるが、男性および女性においてそれぞれ癌による死亡の４番目および５番目の原因である。膵臓の癌は、ほとんどの場合致死性であり、３％未満の５年生存率である。
【０００４】
膵臓癌の最も一般的な症状として、黄疸、腹痛および体重減少が挙げられ、これらは、その他の提示因子と一緒になって、実際は非特異的であることが多い。したがって、膵臓癌を、腫瘍増殖の初期の段階で診断することは、困難であることが多く、大規模な精密診断を必要とし、試験開腹の際に偶発的に発見されることも多い。内視鏡的超音波検査は、膵臓癌の診断に利用可能である１つの例示的非外科的技術である。しかし、小さい腫瘍ならびに限局性膵炎からの膵臓癌の分化の信頼できる検出は困難である。膵臓癌の患者の大部分は、現在、腫瘍がすでに膵臓を越えて広がり、周囲の器官に浸潤してしまった、および／または大規模に転移してしまった後期で診断される。参照によりその全文が本明細書に組み込まれる非特許文献１。死亡につながることが多い進行した疾患と診断されている患者の大部分で、疾患の遅い検出が一般的であり、少数の患者しか初期疾患で検出されない。
【０００５】
ＧＩ管と関連する障害および疾患を診断するための侵襲的技術は、不都合なものであり、被験体を重大な危険に曝す。したがって、ＧＩ管または関連する器官／組織から標的分子を検出および同定するための非侵襲的方法および組成物が必要である。いくつかの実施形態では、疾患、疾患素因、治療計画に対する正の応答または治療計画に対する応答がないこともしくは負の応答などの特定の特徴と関連しているバイオマーカーとして有用であるかどうかを決定するために、標的分子が評価され得る。さらに、ＧＩ管または関連する器官／組織に由来するバイオマーカーは、個体が、上記で列挙した特定の特徴のいずれかを有するかどうかを決定するために使用され得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｏｌｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（２００１年）３９巻：１４７〜５４頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の実施形態は、標的分子を収集、検出、測定および同定するための非侵襲的方法および組成物に関する。いくつかの実施形態では、方法および組成物は、胃腸洗浄液（ＧＬＦ）または糞便中の標的分子に関する。
【０００８】
いくつかの実施形態は、被験体の生理学的状況を評価するための方法であって、被験体から胃腸洗浄液を得ることと、胃腸洗浄液中の胃腸系の外側に由来する標的分子を検出することとを含む方法を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態は、被験体の生理学的状況を評価するための方法であって、被験体から糞便試料を得ることと、糞便試料中の胃腸系の外側に由来する標的分子を検出することとを含む方法を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、胃腸洗浄液は、被験体の胃腸系を部分的に浄化することによって被験体から得られる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、胃腸洗浄液は、糞便物質を含む。いくつかの実施形態では、糞便試料は、胃腸洗浄液を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、標的分子は、ポリペプチド、抗体、胆汁酸、代謝産物またはグリカンを含む。いくつかの実施形態では、標的分子は、バイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、疾患、治療に対する正の応答、治療に対する部分的応答、治療に対する負の応答または治療に対する応答がないことと関連している。いくつかの実施形態では、標的分子は、癌または癌の素因の存在と関連している。いくつかの実施形態では、癌は、膵臓癌、結腸直腸癌、肝臓癌または胃癌である。いくつかの実施形態では、標的分子は、付属消化腺に由来する。いくつかの実施形態では、付属消化腺は、唾液腺、膵臓、胆嚢または肝臓である。
【００１３】
いくつかの実施形態は、被験体に洗浄液を投与することを含む。いくつかの実施形態では、洗浄液は、経口投与される。いくつかの実施形態では、洗浄液は、ポリエチレングリコール、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、クエン酸マグネシウム、アスコルビン酸、ピコスルファートナトリウムおよびビサコジルからなる群より選択される成分を含む。いくつかの実施形態では、洗浄液は、ＧＯＬＹＴＥＬＹ、ＨＡＬＦＬＹＴＥＬＹ、ＮＵＬＹＴＥＬＹ、ＳＵＰＲＥＰ、ＦＬＥＥＴのＰＨＯＳＰＨＯ−ＳＯＤＡ、クエン酸マグネシウムおよびそれらの一般的な同等物からなる群より選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態は、被験体に対して大腸内視鏡検査を実施することを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、被験体は、哺乳類である。いくつかの実施形態では、被験体は、ヒトである。
【００１６】
いくつかの実施形態は、バイオマーカーを同定するための方法であって、目的の状態または生理学的状況を有する複数の試験被験体から試験胃腸洗浄液、および前記状態も前記生理学的状況も有さない複数の対照被験体から対照胃腸洗浄液を得ることと、試験胃腸洗浄液および対照胃腸洗浄液中の少なくとも５種の標的分子のレベルを決定することと、対照胃腸洗浄液中のレベルに対して試験胃腸洗浄液中で有意に異なるレベルで存在する標的分子を同定し、それによってバイオマーカーを同定することとを含む方法を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、胃腸洗浄液は、糞便物質を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、標的分子は、ポリペプチド、胆汁酸、抗体、代謝産物、グリカンおよびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００１９】
いくつかの実施形態は、試験胃腸洗浄液および対照胃腸洗浄液中の少なくとも１０種の標的分子のレベルを決定することを含む。いくつかの実施形態は、試験胃腸洗浄液および対照胃腸洗浄液中の少なくとも２０種の標的分子のレベルを決定することを含む。いくつかの実施形態は、試験胃腸洗浄液および対照胃腸洗浄液中の少なくとも３０種の標的分子のレベルを決定することを含む。いくつかの実施形態は、試験胃腸洗浄液および対照胃腸洗浄液中の少なくとも５０種の標的分子のレベルを決定することを含む。いくつかの実施形態は、試験胃腸洗浄液および対照胃腸洗浄液中の少なくとも１００種の標的分子のレベルを決定することを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、疾患、治療に対する正の応答、治療に対する部分的応答、治療に対する負の応答または治療に対する応答がないことと関連している。
【００２１】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、癌または癌の素因の存在と関連している。いくつかの実施形態では、癌は、膵臓癌、肝臓癌または胃癌である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的分子は、付属消化腺に由来する。いくつかの実施形態では、付属消化腺は、唾液腺、膵臓、胆嚢または肝臓である。
【００２３】
いくつかの実施形態は、試験被験体および対照被験体に洗浄液を投与することを含む。いくつかの実施形態では、洗浄液は、経口投与される。いくつかの実施形態では、洗浄液は、ポリエチレングリコール、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、クエン酸マグネシウム、アスコルビン酸、ピコスルファートナトリウムおよびビサコジルからなる群より選択される成分を含む。いくつかの実施形態では、洗浄液は、ＧＯＬＹＴＥＬＹ、ＨＡＬＦＬＹＴＥＬＹ、ＮＵＬＹＴＥＬＹ、ＳＵＰＲＥＰおよびＦＬＥＥＴのＰＨＯＳＰＨＯ−ＳＯＤＡ、クエン酸マグネシウムおよびそれらの一般的な同等物からなる群より選択される。
【００２４】
いくつかの実施形態は、試験被験体および対照被験体に対して大腸内視鏡検査を実施することを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、試験被験体および対照被験体は、哺乳類である。いくつかの実施形態では、試験被験体および対照被験体は、ヒトである。
【００２６】
いくつかの実施形態は、バイオマーカーを同定するための方法であって、目的の状態を有する複数の試験被験体から試験糞便試料および複数の対照被験体から対照糞便試料を得ることと、試験糞便試料および対照糞便試料中の少なくとも５種の標的分子のレベルを決定することと、対照糞便試料中のレベルに対して試験糞便試料中で有意に異なるレベルで存在する標的分子を同定し、それによってバイオマーカーを同定することとを含む方法を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、糞便試料は、胃腸洗浄液を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、標的分子は、ポリペプチド、胆汁酸、抗体、代謝産物、グリカンおよびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００２９】
いくつかの実施形態は、試験糞便試料および対照糞便試料中の少なくとも１０種の標的分子のレベルを決定することを含む。いくつかの実施形態は、糞便試料および対照糞便試料中の少なくとも２０種の標的分子のレベルを決定することを含む。いくつかの実施形態は、糞便試料および対照糞便試料中の少なくとも３０種の標的分子のレベルを決定することを含む。いくつかの実施形態は、糞便試料および対照糞便試料中の少なくとも５０種の標的分子のレベルを決定することを含む。いくつかの実施形態は、糞便試料および対照糞便試料中の少なくとも１００種の標的分子のレベルを決定することを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、疾患、治療に対する正の応答または治療に対する負の応答と関連している。
【００３１】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、癌または癌の素因の存在と関連している。いくつかの実施形態では、癌は、膵臓癌、結腸直腸癌、肝臓癌または胃癌である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の標的分子は、付属消化腺に由来する。いくつかの実施形態では、付属消化腺は、唾液腺、膵臓、胆嚢または肝臓である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、試験被験体および対照被験体は、哺乳類である。いくつかの実施形態では、試験被験体および対照被験体は、ヒトである。
【００３４】
いくつかの実施形態は、胃腸洗浄液中の標的分子を検出するためのキットであって、被験体へ経口投与するための洗浄液と、被験体から胃腸洗浄液を収集するための容器と、胃腸系の外側に由来する標的分子を検出するための薬剤とを含むキットを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態は、糞便試料中の標的分子を検出するためのキットであって、被験体へ経口投与するための洗浄液と、被験体から糞便試料を収集するための容器と、胃腸系の外側に由来する標的分子を検出するための薬剤とを含むキットを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態は、プロテアーゼ阻害剤を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、標的分子は、ポリペプチド、抗体、胆汁酸、代謝産物またはグリカンを含む。いくつかの実施形態では、標的分子は、バイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、疾患、治療に対する正の応答または治療に対する負の応答と関連している。
【００３８】
いくつかの実施形態では、標的分子は、癌または癌の素因の存在と関連している。いくつかの実施形態では、癌は、膵臓癌、肝臓癌、結腸直腸癌または胃癌である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、標的分子は、付属消化腺に由来する。いくつかの実施形態では、付属消化腺は、唾液腺、膵臓、胆嚢または肝臓である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、洗浄液は、ポリエチレングリコール、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、クエン酸マグネシウム、アスコルビン酸、ピコスルファートナトリウムおよびビサコジルからなる群より選択される成分を含む。いくつかの実施形態では、洗浄液は、ＧＯＬＹＴＥＬＹ、ＨＡＬＦＬＹＴＥＬＹ、ＮＵＬＹＴＥＬＹ、ＳＵＰＲＥＰ、ＦＬＥＥＴのＰＨＯＳＰＨＯ−ＳＯＤＡ、クエン酸マグネシウムおよびそれらの一般的な同等物からなる群より選択される。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
被験体の生理学的状況を評価するための方法であって、
上記被験体から胃腸洗浄液を得ることと、
上記胃腸洗浄液中の胃腸系の外側に由来する標的分子を検出することと
を含む方法。
（項目２）
被験体の生理学的状況を評価するための方法であって、
上記被験体から糞便試料を得ることと、
上記糞便試料中の胃腸系の外側に由来する標的分子を検出することと
を含む方法。
（項目３）
上記胃腸洗浄液が、上記被験体の胃腸系を部分的に浄化することによって上記被験体から得られる、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記胃腸洗浄液が、糞便物質を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記糞便試料が、胃腸洗浄液を含む、項目２に記載の方法。
（項目６）
上記標的分子が、ポリペプチド、抗体、胆汁酸、代謝産物またはグリカンを含む、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
上記標的分子が、バイオマーカーを含む、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
上記バイオマーカーが、疾患、治療に対する正の応答、治療に対する部分的応答、治療に対する負の応答または治療に対する応答がないことと関連している、項目７に記載の方法。
（項目９）
上記標的分子が、癌または癌の素因の存在と関連している、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
上記癌が、膵臓癌、結腸直腸癌、肝臓癌または胃癌である、項目８に記載の方法。
（項目１１）
上記標的分子が、付属消化腺に由来する、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
上記付属消化腺が、唾液腺、膵臓、胆嚢または肝臓である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記被験体に洗浄液を投与することをさらに含む、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
上記洗浄液が、経口投与される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
上記洗浄液が、ポリエチレングリコール、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、クエン酸マグネシウム、アスコルビン酸、ピコスルファートナトリウムおよびビサコジルからなる群より選択される成分を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
上記洗浄液が、ＧＯＬＹＴＥＬＹ、ＨＡＬＦＬＹＴＥＬＹ、ＮＵＬＹＴＥＬＹ、ＳＵＰＲＥＰ、ＦＬＥＥＴのＰＨＯＳＰＨＯ−ＳＯＤＡ、クエン酸マグネシウムおよびそれらの一般的な同等物からなる群より選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
上記被験体に対して大腸内視鏡検査を実施することをさらに含む、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
上記被験体が、哺乳類である、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
上記被験体が、ヒトである、項目１から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
バイオマーカーを同定するための方法であって、
目的の状態または生理学的状況を有する複数の試験被験体から試験胃腸洗浄液、および上記状態も上記生理学的状況も有さない複数の対照被験体から対照胃腸洗浄液を得ることと、
上記試験胃腸洗浄液および上記対照胃腸洗浄液中の少なくとも５種の標的分子のレベルを決定することと、
上記対照胃腸洗浄液中のレベルに対して上記試験胃腸洗浄液中で有意に異なるレベルで存在する標的分子を同定し、それによってバイオマーカーを同定することと
を含む方法。
（項目２１）
上記胃腸洗浄液が、糞便物質を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
上記標的分子が、ポリペプチド、胆汁酸、抗体、代謝産物、グリカンおよびそれらの組合せからなる群より選択される、項目２０から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
上記試験胃腸洗浄液および上記対照胃腸洗浄液中の少なくとも１０種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
上記試験胃腸洗浄液および上記対照胃腸洗浄液中の少なくとも２０種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
上記試験胃腸洗浄液および上記対照胃腸洗浄液中の少なくとも３０種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
上記試験胃腸洗浄液および上記対照胃腸洗浄液中の少なくとも５０種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
上記試験胃腸洗浄液および上記対照胃腸洗浄液中の少なくとも１００種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
上記バイオマーカーが、疾患、治療に対する正の応答、治療に対する部分的応答、治療に対する負の応答または治療に対する応答がないことと関連している、項目２０から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
上記バイオマーカーが、癌または癌の素因の存在と関連している、項目２０から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
上記癌が、膵臓癌、肝臓癌または胃癌である、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
少なくとも１種の標的分子が、付属消化腺に由来する、項目２０から３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
上記付属消化腺が、唾液腺、膵臓、胆嚢または肝臓である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
上記試験被験体および上記対照被験体に洗浄液を投与することをさらに含む、項目２０から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
上記洗浄液が、経口投与される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
上記洗浄液が、ポリエチレングリコール、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、クエン酸マグネシウム、アスコルビン酸、ピコスルファートナトリウムおよびビサコジルからなる群より選択される成分を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
上記洗浄液が、ＧＯＬＹＴＥＬＹ、ＨＡＬＦＬＹＴＥＬＹ、ＮＵＬＹＴＥＬＹ、ＳＵＰＲＥＰ、ＦＬＥＥＴのＰＨＯＳＰＨＯ−ＳＯＤＡ、クエン酸マグネシウムおよびそれらの一般的な同等物からなる群より選択される、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
上記試験被験体および上記対照被験体に対して大腸内視鏡検査を実施することをさらに含む、項目２０から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
上記試験被験体および上記対照被験体が、哺乳類である、項目２０から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
上記試験被験体および上記対照被験体が、ヒトである、項目２０から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
バイオマーカーを同定するための方法であって、
目的の状態を有する複数の試験被験体から試験糞便試料および複数の対照被験体から対照糞便試料を得ることと、
上記試験糞便試料および上記対照糞便試料中の少なくとも５種の標的分子のレベルを決定することと、上記対照糞便試料中のレベルに対して上記試験糞便試料中で有意に異なるレベルで存在する標的分子を同定し、それによってバイオマーカーを同定することと
を含む方法。
（項目４１）
上記糞便試料が、胃腸洗浄液を含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
上記標的分子が、ポリペプチド、核酸、胆汁酸、抗体、代謝産物、グリカンおよびそれらの組合せからなる群より選択される、項目４０から４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
上記試験糞便試料および上記対照糞便試料中の少なくとも１０種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目４０から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
上記糞便試料および上記対照糞便試料中の少なくとも２０種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目４０から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
上記糞便試料および上記対照糞便試料中の少なくとも３０種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目４０から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
上記糞便試料および上記対照糞便試料中の少なくとも５０種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目４０から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
上記糞便試料および上記対照糞便試料中の少なくとも１００種の標的分子のレベルを決定することを含む、項目４０から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
上記バイオマーカーが、疾患、治療に対する正の応答または治療に対する負の応答と関連している、項目４０から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
上記バイオマーカーが、癌または癌の素因の存在と関連している、項目４０から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
上記癌が、膵臓癌、結腸直腸癌、肝臓癌または胃癌である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
少なくとも１種の標的分子が、付属消化腺に由来する、項目４０から５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
上記付属消化腺が、唾液腺、膵臓、胆嚢または肝臓である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
上記試験被験体および上記対照被験体が、哺乳類である、項目４０から５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
上記試験被験体および上記対照被験体が、ヒトである、項目４０から５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
胃腸洗浄液中の標的分子を検出するためのキットであって、
被験体へ経口投与するための洗浄液と、
上記被験体から上記胃腸洗浄液を収集するための容器と、
胃腸系の外側に由来する標的分子を検出するための薬剤と
を含むキット。
（項目５６）
糞便試料中の標的分子を検出するためのキットであって、
被験体へ経口投与するための洗浄液と、
上記被験体から上記糞便試料を収集するための容器と、
胃腸系の外側に由来する標的分子を検出するための薬剤と
を含むキット。
（項目５７）
プロテアーゼ阻害剤をさらに含む、項目５５から５６のいずれか一項に記載のキット。
（項目５８）
上記標的分子が、ポリペプチド、抗体、胆汁酸、代謝産物またはグリカンを含む、項目５５から５７のいずれか一項に記載のキット。
（項目５９）
上記標的分子が、バイオマーカーを含む、項目５５から５８のいずれか一項に記載のキット。
（項目６０）
上記バイオマーカーが、疾患、治療に対する正の応答または治療に対する負の応答と関連している、項目５９に記載のキット。
（項目６１）
上記標的分子が、癌または癌の素因の存在と関連している、項目５５から６０のいずれか一項に記載のキット。
（項目６２）
上記癌が、膵臓癌、肝臓癌、結腸直腸癌または胃癌である、項目６１に記載のキット。
（項目６３）
上記標的分子が、付属消化腺に由来する、項目５５から６２のいずれか一項に記載のキット。
（項目６４）
上記付属消化腺が、唾液腺、膵臓、胆嚢または肝臓である、項目６３に記載のキット。
（項目６５）
上記洗浄液が、ポリエチレングリコール、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、クエン酸マグネシウム、アスコルビン酸、ピコスルファートナトリウムおよびビサコジルからなる群より選択される成分を含む、項目５５から６４のいずれか一項に記載のキット。
（項目６６）
上記洗浄液が、ＧＯＬＹＴＥＬＹ、ＨＡＬＦＬＹＴＥＬＹ、ＮＵＬＹＴＥＬＹ、ＳＵＰＲＥＰ、ＦＬＥＥＴのＰＨＯＳＰＨＯ−ＳＯＤＡ、クエン酸マグネシウムおよびそれらの一般的な同等物からなる群より選択される、項目５５から６４のいずれか一項に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、胃腸洗浄液の画分中に存在する種々の糖タンパク質に由来するグリカン構造の相対的存在量のグラフを表す図である。誘導体化されたグリカンを、０．２％ギ酸中の約２０〜２５％アセトニトリルでＱ−ＴＯＦ  ＭＳでのＣ１８逆相カラムから溶出した。質量分析計は、ＭＳのみの様式で毎秒ｍ／ｚ１５０〜２０００でスキャンし、誘導体化グリカンプロファイルデータを獲得した。
【図２】図２は、胃腸洗浄液の画分中に存在するコール酸などの代謝産物を含めた化合物の相対的存在量のグラフを表す図である。データは、ＬＣシステムからの入力を使用し、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアを使用してＷａｔｅｒｓ  Ｑ−ＴＯＦ質量分析計で獲得した。ＭＳは、毎秒ｍ／ｚ１００〜ｍ／ｚ２０００の質量範囲にわたってスキャンした。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明の実施形態は、標的分子を収集、検出、測定および同定するための非侵襲的方法および組成物に関する。いくつかの実施形態では、方法および組成物は、胃腸洗浄液（ＧＬＦ）または糞便中の標的分子に関する。
【００４３】
胃腸洗浄は、大腸内視鏡検査または結腸直腸手術のための下部胃腸（ＧＩ）管準備として広く使用されている（例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、ＤｉＰａｌｍａ  ＪＡ．ら、（１９８４年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８６巻：８５６〜６０頁参照のこと）。腸管の疾患の特定の病態生理学は、ＧＬＦ中のタンパク質を測定することによって調査されている（各々、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｅｖｇｅｎｉｋｏｓ  Ｎら（２０００年）Ｂｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ８７巻：８０８〜１３頁、Ｂｒｙｄｏｎ  ＷＧ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ａ．（１９９２年）Ｌａｎｃｅｔ３４０巻：１３８１〜２頁、Ｃｈｏｕｄａｒｉ  ＣＰら（１９９３年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０４巻：１０６４〜７１頁、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ａら（１９９６年）Ｇｕｔ  ３８巻：１２０〜４頁、Ｈａｎｄｙ  ＬＭら（１９９６年）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ３１巻：７００〜５頁、およびＳｔａｎｌｅｙ  ＡＪら（１９９６年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１１巻：１６７９〜８２頁）。
【００４４】
糞便のタンパク質の測定は、タンパク質喪失性腸症および粘膜炎症などの種々の病態生理学を調査するために有用であり得る。しかし、本明細書に記載されたいくつかの実施形態では、糞便が使用され得るが、ＧＬＦは、アッセイに干渉する物質をより少量しか含有せず、ＧＬＦでは、ＧＩ管を迅速に通過するために消化酵素および細菌プロテアーゼによるタンパク質の破壊が糞便試料よりも少ないので、ＧＬＦは、バイオマーカーを検出および同定するための試料として糞便を上回って好ましい。さらに、腸に沿った流体通過の速度が推定され得るので、粘膜からのタンパク質放出速度を推定することが可能である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ＧＬＦは、被験体に洗浄液を経口投与して、大容量の流体を腸管に通過させることによって製造され得、洗浄液は、塩の混合物ならびにポリエチレングリコールおよびビサコジルなどのその他の物質を含有し得る。洗浄液は、結腸への液体の流入を引き起こし、これによって固体が流し出される。洗浄液は、大腸内視鏡検査およびＧＩ管を検査するために使用されるその他の方法のための準備において一般的に使用されるように、ＧＩ管の清浄化を引き起こすために一般的に使用される。大部分が清浄化されたＧＩ管から流し出されたか、またはその中に留まるこれらの液体は、ＧＩ管に沿った口から肛門までの連続性のためにさまざまな疾患を評価するのに有用である。結果として、流体をＧＩ管中に入れるＧＩ管を含めたありとあらゆる器官が、本明細書において提供される方法および組成物の候補である。
【００４６】
ＧＩ管および関連する器官／組織
本明細書において提供される方法および組成物の一部は、ＧＩ管および付属消化腺を含めたＧＩ管と関連する器官／組織に関する。当技術分野では周知であるが、ＧＩ管は、上部ＧＩ管および下部ＧＩ管を含む。上部ＧＩ管は、口腔または頬側口腔、食道、胃および十二指腸を含む。下部ＧＩ管は、空腸、回腸および大腸および肛門を含む。大腸は、虫垂、盲腸、結腸および直腸を含む。
【００４７】
ＧＩ管と関連する器官および組織は、ＧＩ管の外側の構造を含む。このような構造の例として、唾液腺、例えば、耳下唾液腺、顎下唾液腺および舌下唾液腺、膵臓、例えば、外分泌膵臓、胆嚢、胆管および肝臓などの付属消化器官が挙げられる。ＧＩ管およびＧＩ管の外側と関連する構造のさらなる例として、膵管、胆樹および胆管が挙げられる。
【００４８】
胃腸洗浄液（ＧＬＦ）
一般に、洗浄液は、被験体に経口投与され得、経口洗浄液は、被験体のＧＩ管を通過し、得られるＧＬＦが被験体から収集される。本明細書において、用語「被験体」とは、哺乳動物、例えば、ヒトなどの動物を含み得る。上記のように、ＧＬＦは、糞便／便試料の検査よりも清潔なＧＩ管のサンプリングを提供する。ＧＬＦは、食物の摂取、種類および消化状態と関連する可変性を軽減すると思われる。
【００４９】
本明細書に記載されたいくつかの実施形態は、標的分子を検出するための、または胃腸管または関連する器官／組織の疾患および病状についてのスクリーニング、トリアージ、疾患検出、診断、予後、治療に対する応答、治療の選択および個別化医薬のためのＧＬＦの分析を含む。いくつかの実施形態は、被験体が患っている可能性がある、あり得る疾患または状態から、特定の疾患および病状を排除するためのＧＬＦ試料の分析を含む。いくつかの実施形態は、診断のためにさらに試験する必要性を示すためのＧＬＦの分析を含む。さらなる実施形態は、新規疾患診断を確立し、これまでの診断をさらに分類し、有望な治療計画に対する感受性を決定し、および／またはこれまでのもしくは進行中の治療計画に対する応答を評価するためのＧＬＦの分析を含む。
【００５０】
ＧＬＦを得るための方法
本明細書において提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、被験体からＧＬＦを得ることを含む。ＧＬＦを得る方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓ字結腸鏡検査、大腸内視鏡検査、Ｘ線検査、腸の手術を受ける患者のための準備などの医療手順およびまたは診断手順の際に、腸および結腸が、完全に浄化され、清浄化されることが重要である。特に、腸管粘膜の適切な可視化を可能にするよう、結腸からできるだけ多くの糞便物質が除去されることが必須である。これは、例えば、軟性Ｓ字結腸鏡検査または大腸内視鏡検査などの診断手順、結腸の疾患について患者をスクリーニングするために広く実施される診断検査の前には重要である。さらに、結腸の満足のいくＸ線写真を得るためには、腸管が完全に洗浄されることが重要である。同一状態はまた、結腸が手術のために術前準備される場合、糞便老廃物の除去が、患者の安全にとって非常に重要である場合にも当てはまる。内視鏡的検査のために結腸を準備するには、現在の清浄化手順は、直立歩行結腸洗浄を含む。直立歩行洗浄は、被験体に、４Ｌのポリエチレングリコール／電解質溶液（参照によりその全文が組み込まれる米国特許出願公開第２００７０２９８００８号）を含む洗浄組成物を経口投与することを含み得る。いくつかの実施形態は、順行性洗浄および逆行性洗浄を含む。
【００５１】
一般に、経口洗浄組成物は、硫酸、炭酸水素、塩化物、リン酸またはクエン酸のナトリウム、カリウムおよびマグネシウム塩などの電解質の溶液を含む。いくつかのこのような組成物はまた、非吸収性の浸透圧性薬剤として作用し得るポリエチレングリコールも含み得る。一般的な組成物は、電解質溶液とともにポリエチレングリコールを含み、場合により、ビサコジルまたはアスコルビン酸および硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウムまたは硫酸カリウムなどの硫酸塩を含めた組成物も含む。いくつかの実施形態では、経口洗浄液は、クエン酸マグネシウムを含み得る。いくつかの実施形態では、経口洗浄液は、ピコスルファートナトリウムを含み得る。電解質溶液とともにポリエチレングリコールを含む経口洗浄溶液の１種の例示的組成物として、ＧＯＬＹＴＥＬＹ（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ  Ｌａｂｓ．Ｉｎｃ．）がある。ＧＯＬＹＴＥＬＹは、以下：ポリエチレングリコール５９ｇ、硫酸ナトリウム５．６８ｇ、炭酸水素ナトリウム１．６９ｇ、塩化ナトリウム１．４６ｇ、塩化カリウム０．７４５ｇおよび１リットルを構成するための水に従って製剤される（参照によりその全文が組み込まれる、Ｄａｖｉｓら（１９８０年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ７８巻：９９１〜９９５頁）。ＧＯＬＹＴＥＬＹの摂取は、被験体の水および電解質バランスにおいて最小の変化しか伴わずに多量の液状便をもたらす。電解質溶液とともにポリエチレングリコールを含む経口洗浄組成物の別の例として、ＮＵＬＹＴＥＬＹがある（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ  Ｌａｂｓ．Ｉｎｃ．）。電解質溶液およびビサコジルとともにポリエチレングリコールを含む１種の例示的経口洗浄組成物として、ＨＡＬＦＬＹＴＥＬＹがある（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ  Ｌａｂｓ．Ｉｎｃ．）。硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウムまたは硫酸カリウムなどの硫酸塩を含む１種の例示的経口洗浄組成物として、ＳＵＰＲＥＰがある（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ  Ｌａｂｓ．Ｉｎｃ．）。電解質溶液およびアスコルビン酸とともにポリエチレングリコールを含む経口洗浄溶液の１種の例示的組成物として、ＭＯＶＩＰＲＥＰがある（Ｓａｌｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。
【００５２】
多量のポリエチレングリコールが、大容量の希釈塩溶液中で投与される場合に、ポリエチレングリコールは、経口洗浄組成物として有効である。普通、約２５０〜４００ｇのポリエチレングリコールが、約４Ｌの電解質水溶液中で被験体に投与される。ポリエチレングリコールの経口投与は、一定期間、例えば、一晩にわたって便通を生じさせるために使用され得る。必要な用量は変わるが、８オンスの水中、約１０〜１００ｇのポリエチレングリコールが有効であり得る。重篤な下痢を伴わずに一晩の便通を生じさせるには、約６８〜８５ｇのポリエチレングリコールの用量が有効であり得る。等張性流体中のポリエチレングリコールの溶液の容量は、浸透圧性緩下薬の有効量であり得る。約０．５Ｌ〜約４Ｌの容量が有効であり得る。好ましくは、有効容量は、約１．５Ｌから約２．５Ｌの間である。２Ｌの等張性溶液の経口投与は、有効である。
【００５３】
経口洗浄組成物のさらなる例として、ポリエチレングリコールなどの浸透圧性緩下剤と組み合わせた非リン酸塩の高張液が挙げられる（参照によりその全文が組み込まれる米国特許出願公開第２００９０２５８０９０号）。リン酸塩を除く硫酸塩の混合物、例えば、以下の硫酸塩Ｎａ２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４およびＫ２ＳＯ４のうち１種または複数の有効量が有効であり得る（例えば、ＳＵＰＲＥＰ）。いくつかの実施形態は、約０．１ｇ〜約２０．０ｇのＮａ２ＳＯ４を含み、約１．０ｇ〜１０．０ｇのＮａ２ＳＯ４が有用であり得る。約０．０１ｇ〜約４０．０ｇのＭｇＳＯ４の投与量が有効であり得る。約０．１ｇ〜約２０．０ｇのＮａ２ＳＯ４の用量ならびに、１．０〜１０．０ｇの投与量も有利に使用され得る。約０．０１ｇ〜約２０．０ｇのＫ２ＳＯ４の投与量が、浄化をもたらすのに有効であり得、約０．１ｇ〜約１０．０ｇおよび約０．５ｇ〜約５．０ｇのＫ２ＳＯ４の用量も有用であり得る。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの浸透圧性緩下剤の添加は、上記の塩混合物の有効性を改善し得る。約１．０ｇ〜約１００ｇのＰＥＧの用量が有効である。約３４ｇの用量のように、約１０．０ｇ〜約５０ｇのＰＥＧの用量も有効である。投与の容易さのためには、上記の塩の混合物は、好都合な容量の水に溶解され得る。１リットル未満の容量の水は、ほとんどの被験体によって十分に許容され得る。混合物は、任意の小容量の水に溶解されてもよく、１００から５００ｍｌの間の容量が有用である。有効用量をわけて、適当な期間にわたる２回以上の投与で患者に投与してもよい。一般に、６〜２４時間隔てられた有効用量の同等部分の２用量の投与は、満足のいく浄化をもたらす。いくつかの実施形態は、経口洗浄組成物の投与の前およびその間の規定の期間の間の正常な経口摂取の中断を含む。
【００５４】
いくつかの洗浄組成物は、ビサコジルなどの緩下薬を含む。いくつかの実施形態では、緩下薬は、洗浄組成物とともに被験体に同時投与され得る。理解されるであろうが、このような同時投与は、例えば、被験体への洗浄組成物の投与の最大数時間前の緩下薬の投与、被験体への洗浄組成物の投与と組み合わせた緩下薬の投与または被験体への洗浄組成物の投与の最大数時間後の緩下薬の投与を含み得る。緩下薬およびその有効用量の例として、アロエ、２５０〜１０００ｍｇ；ビサコジル、約５〜８０ｍｇ；カサンスラノール、３０〜３６０ｍｇ；カスカラ芳香族流体抽出物、２〜２４ｍｌ；カスカラサグラダ樹皮、３００〜４０００ｍｇ；カスカラ（Ｃａｓｃａｄａ）サグラダ抽出物、３００〜２０００ｍｇ；カスカラサグラダ流体抽出物、０．５〜５．０ｍｌ；ヒマシ油、１５〜２４０ｍｌ；ダンスロン、７５〜３００ｍｇ；デヒドロコール酸、２５０〜２０００ｍｇ；フェノールフタレイン、３０〜１０００ｍｇ；センノシドＡおよびＢ、１２〜２００ｍｇ；およびピコスルファート、１〜１００ｍｇが挙げられる。
【００５５】
洗浄組成物のさらなる例として、濃縮リン酸塩の水溶液が挙げられる。水性リン酸塩濃縮物は、ＧＩ管の管腔内内容物に対して浸透圧性効果をもたらし、身体から結腸への水および電解質の大流入で腸の排泄が起こる。１種の例示的組成物は、安定化された緩衝水溶液中に４８０ｇ／Ｌのリン酸二水素ナトリウムおよび１８０ｇ／Ｌのリン酸水素二ナトリウムを含む（ＦＬＥＥＴのＰＨＯＳＰＨＯ−ＳＯＤＡ、Ｃ．Ｓ．Ｆｌｅｅｔ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）。被験体は、通常、合計６オンス（１８０ｍｌ）について、３〜１２時間の間隔で隔てられた、この組成物の２〜３オンスの用量を摂取することを必要とする。
【００５６】
ＧＬＦは、医療手順または診断手順の前、その間またはその後に被験体から収集され得る。いくつかの実施形態では、被験体は、例えば、流体を捕獲するトイレ挿入物（ｔｏｉｌｅｔ  ｉｎｓｅｒｔ）などの容器を使用してＧＬＦを収集し得る。ＧＬＦの品質を保つために酵素阻害剤および変性剤が使用され得る。いくつかの実施形態では、試料の安定化に役立つよう、試料のｐＨが調整され得る。いくつかの実施形態では、ＧＬＦ試料は、遠心分離などによって、一部またはすべての固体および／または細菌を除去するようさらに処理され得る。いくつかの実施形態では、ＧＩ管は、経口洗浄組成物の投与によって完全には浄化されない場合もある。例えば、被験体のＧＩ管を完全に浄化するのに必要な経口洗浄組成物の完全用量の一部が、被験体に投与される場合がある。いくつかの実施形態では、ＧＬＦは、糞便物質を含み得る。さらなる実施形態では、糞便物質は、ＧＬＦを含み得る。
【００５７】
標的分子
本明細書に記載されたいくつかの実施形態は、ＧＩ管から得られた試料中の標的分子を検出する方法またはこのような検出にとって有用な組成物に関する。本明細書において、「標的分子」は、ＧＩ管から得られた試料中で検出または測定または同定され得る任意の分子を含む。このような試料として、被験体から得られたＧＬＦおよび被験体から得られた糞便試料が挙げられる。標的分子の例として、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、突然変異体タンパク質、選択的スプライシングから生じたタンパク質、翻訳後修飾されたタンパク質、例えば、グリコシル化タンパク質、リン酸化タンパク質などの修飾されたタンパク質、抗体（例えば、自己抗体、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ）、抗体断片、糖、例えば、単糖、二糖、オリゴ糖およびグリカン、脂質、小分子、例えば、代謝産物、医薬組成物、代謝された医薬組成物およびプロドラッグなどの分子が挙げられる。標的分子のさらなる例として、胆汁酸塩および胆汁酸、例えば、コール酸が挙げられる。さらなる例として、ケノデオキシコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸およびリトコール酸が挙げられる。標的分子は、ＧＩ管およびＧＩ管の外側に由来し得る、例えば、付属消化腺などのＧＩ管と関連している器官および／または組織に由来し得る。いくつかの実施形態では、細胞の断片およびその他の副生成物（ｂｉｐｒｏｄｕｃｔ）、例えば、赤血球、白血球および内皮細胞を含めた細胞、生物、例えば、細菌、原虫ならびにウイルスおよびウイルス粒子が、ＧＬＦまたは糞便試料中で検出され得る。いくつかの実施形態では、標的分子は、本明細書における表１〜１０またはその一部のいずれかに列挙されるタンパク質またはその一部のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、表１〜１０のいずれかに列挙されるタンパク質の一部は、表１〜１０中に列挙されるタンパク質のいずれかの少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも５０個または５０個を超える連続するアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、標的分子は、配列番号０１〜８０４のうち１種のポリペプチドを含み得る、から本質的になり得る、またはからなり得る。配列番号０１〜８０４のうち１種から本質的になるポリペプチドは、配列番号０１〜８０４中のものに対してさらなるアミノ酸または置換アミノ酸を、このようなさらなるアミノ酸または置換アミノ酸が、ポリペプチドが検出可能であることを妨げない場合に含み得る。
【００５８】
標的分子はまた、バイオマーカーを含む。本明細書において、用語「バイオマーカー」は、疾患、疾患素因、特定の治療計画に対する正の応答、特定の治療計画に対する応答がないことまたは特定の治療計画に対する負の応答と関連している、ＧＬＦまたは糞便試料中に存在する任意の標的分子を含む。いくつかの実施形態では、バイオマーカーが、同定、測定および／または疾患の診断もしくは予後と相互に関連付けられ得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、標的分子は、血液、唾液、胃液、肝臓分泌物、胆汁、十二指腸液および膵液からなる群より選択される被験体の流体の構成成分である。いくつかの実施形態では、標的分子は、被験体の上部胃腸管または被験体の下部胃腸管において発現される。いくつかの実施形態では、標的分子は、頬側口腔、食道、胃、胆樹、胆嚢、十二指腸、空腸、回腸、虫垂、盲腸、結腸、直腸および肛門管からなる群より選択される被験体中の位置で発現される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、標的分子は、ＧＬＦ中に見られるタンパク質またはその他の化合物、例えば、ラクトフェリン、好酸球由来神経毒、好酸球カチオン性タンパク質、ビリルビン（Ｂｉｌ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ヘモグロビンまたは好酸球ペルオキシダーゼを含まない。いくつかの実施形態では、標的分子は、糞便中に見られるタンパク質、例えば、ヘプタグロブリン（ｈｅｐｔａｇｌｏｂｕｌｉｎ）、ヘモペキシン、α−２−マクログロブリン、カドヘリン−１７、カルプロテクチン、癌胚形成（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ）抗原、メタロプロテイナーゼ−１（ＴＩＭＰ−１）、Ｓ１００Ａ１２、Ｋ−ｒａｓまたはｐ５３を含まない。いくつかの実施形態では、標的分子は、膵液中に見られるタンパク質、例えば、前勾配（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）−２（ＡＧＲ２）、インスリン様増殖因子結合タンパク質−２、ＣＥＡＣＡＭ６、ＭＵＣ１、ＣＡ１９−９、セリンプロテイナーゼ−２（ＰＲＳＳ２）プレプロタンパク質、膵臓リパーゼ関連タンパク質−１（ＰＬＲＰ１）、キモトリプシノーゲンＢ（ＣＴＲＢ）、エラスターゼ３Ｂ（ＥＬＡ３Ｂ）、腫瘍拒絶抗原（ｐｇ９６）、アズロシジン、肝細胞癌−腸−膵臓／膵炎関連タンパク質Ｉ（ＨＩＰ／ＰＡＰ−Ｉ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）、癌遺伝子ＤＪ１（ＤＪ−１）またはα−１Ｂ−糖タンパク質前駆体（Ａ１ＢＧ）を含まない。
【００６１】
標的分子を特性決定する方法
本明細書において提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、ＧＬＦまたは糞便試料中の標的分子を特性決定することを含む。標的分子を特性決定することは、例えば、標的分子を同定すること、標的分子を検出することおよび／または標的分子を定量することを含み得る。標的分子を同定、検出および定量する方法は、当技術分野で周知である。
【００６２】
いくつかの実施形態は、ペプチド、ポリペプチドおよび／もしくはタンパク質を含む標的分子を同定すること、その有無を決定すること、ならびに／または標的分子を定量することを含む。このような標的分子は、本明細書に記載されるようなラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫測定法および２抗体サンドイッチアッセイを含めたイムノアッセイなどのさまざまな方法によって特性決定され得る。競合および非競合イムノアッセイ形式、抗原捕獲アッセイおよび２抗体サンドイッチアッセイを含めたさまざまなイムノアッセイ形式も有用である（参照によりその全文が組み込まれる、ＳｅｌｆおよびＣｏｏｋ、（１９９６年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７巻：６０〜６５頁）。いくつかの実施形態は、１種または複数の抗原捕獲アッセイを含む。抗原捕獲アッセイでは、抗体が、固相と結合しており、抗原、例えば、ＧＬＦまたは糞便試料中の標的分子が、抗体によって結合されるように試料が添加される。結合していないタンパク質が、洗浄によって除去された後、必要に応じて、例えば、ラジオアッセイを使用して、結合している抗原の量が定量化され得る（参照によりその全文が組み込まれる、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。イムノアッセイは、抗原の量を定量化し、ひいては、ＧＬＦまたは糞便試料中の標的分子のレベルを決定するために、抗体過剰または抗原競合のような状態下で実施され得る。
【００６３】
酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）は、本明細書において提供されるある特定の実施形態において有用であり得る。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼまたはウレアーゼなどの酵素は、本発明の方法において使用するために、例えば、抗ＨＭＧＢ１抗体と、または二次抗体と連結され得る。西洋ワサビ−ペルオキシダーゼ検出システムは、例えば、過酸化水素の存在下で、４５０ｎｍで検出可能である可溶性生成物を生じる発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とともに使用され得る。その他の好都合な酵素結合型システムとして、例えば、４０５ｎｍで容易に検出可能な可溶性生成物を生じる発色基質ｐ−ニトロフェニルリン酸とともに使用され得るアルカリホスファターゼ検出システムが挙げられる。同様に、β−ガラクトシダーゼ検出システムは、４１０ｎｍで検出可能な可溶性生成物を生じる発色基質ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）とともに使用され得、またはウレアーゼ検出システムは、尿素−ブロモクレゾールパープル（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）などの基質とともに使用され得る。有用な酵素結合型一次および二次抗体は、本明細書においてさらに記載されるようなＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、Ｐａ．）などのいくつかの市販の供給源から得ることができる。
【００６４】
ある特定の実施形態では、ＧＬＦまたは糞便試料中の標的分子は、化学発光検出を使用して検出および／または測定され得る。例えば、ある特定の実施形態では、生体試料、例えば、ＧＬＦまたは糞便試料中に存在する標的分子を捕獲するために特定の標的分子に対する特異的抗体が使用され、試料中に存在する標的分子を検出するために、標的分子特異的抗体に対して特異的であり、化学発光標識で標識される抗体が使用される。本方法において、任意の化学発光標識および検出システムが使用され得る。化学発光二次抗体は、Ａｍｅｒｓｈａｍなどの種々の供給源から商業的に入手できる。化学発光二次抗体を検出する方法は、当技術分野で公知である。
【００６５】
蛍光検出はまた、本明細書において提供されるある特定の方法において標的分子を検出するために有用であり得る。有用な蛍光色素として、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｒ−フィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッドおよびリサミンが挙げられる。本発明において、フルオレセインもしくはローダミン標識された抗体またはフルオレセイン−もしくはローダミン−標識された二次抗体は、有用であり得る。
【００６６】
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もまた、本明細書において提供されるある特定の方法において有用であり得る。このようなアッセイは、当技術分野で周知である。ラジオイムノアッセイは、例えば、１２５Ｉ−標識された一次または二次抗体（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前掲、１９８８年）を用いて実施され得る。
【００６７】
検出可能な試薬からのシグナルは、例えば、発色基質からの色を検出するための分光光度計；１２５Ｉの検出のためのγカウンターなどの、放射線を検出するための放射線カウンター；またはある特定の波長の光の存在下で蛍光を検出するための蛍光光度計を使用して分析され得る。酵素結合型アッセイが使用される場合には、標的分子の量の定量的分析が、ＥＭＡＸ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．）などの分光光度計を製造業者の使用説明書に従って使用して実施され得る。本発明のアッセイは、必要に応じて、自動化またはロボット制御で実施することができ、さらに複数の試料からのシグナルを同時に検出することができる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、標的分子を検出および／または測定するために、必要に応じて自動化され得るキャピラリー電気泳動をベースとするイムノアッセイ（ＣＥＩＡ）が使用され得る。イムノアッセイはまた、例えば、各々、参照によりその全文が組み込まれるＳｃｈｍａｌｚｉｎｇおよびＮａｓｈａｂｅｈ，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １８巻：２１８４〜９３頁（１９９７年）およびＢａｏ，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  ６９９巻：４６３〜８０頁（１９９７年）に記載されるようなレーザー誘導性蛍光とともに使用され得る。本明細書において提供されるある特定の方法に従って、標的分子を検出するために、または標的分子のレベルを決定するために、フローインジェクションリポソームイムノアッセイおよびリポソームイムノセンサーなどのリポソームイムノアッセイもまた使用され得る（参照によりその全文が組み込まれる、Ｒｏｎｇｅｎら、（１９９７年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０４巻：１０５〜１３３頁）。
【００６９】
ある特定の実施形態では、サンドイッチ酵素イムノアッセイも有用であり得る。２抗体サンドイッチアッセイでは、一次抗体が固相支持体と結合され、抗原が、一次抗体と結合することが許可される。それと結合する二次抗体の量を測定することによって、標的分子の量が定量化される。
【００７０】
本明細書において提供される方法において、標的分子を検出するために、または標的分子のレベルを決定するために、定量的ウエスタンブロッティングも使用され得る。ウエスタンブロットは、走査デンシトメトリーなどの周知の方法によって定量化され得る。一例として、タンパク質試料が、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｌａｅｍｍｌｉゲルで電気泳動される。例えば、標的分子に対する一次マウスモノクローナル抗体がブロットと反応させられ、予備的スロットブロット実験を使用して、抗体結合が直線的であることが確認される。二次抗体としてヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型抗体（ＢｉｏＲａｄ）が使用され、シグナル検出は、化学発光、例えば、Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ化学発光キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）を、製造業者の使用説明書に従って使用して実施される。ブロットのオートラジオグラフが、走査デンシトメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）を使用して分析され、陽性対照に対して正規化される。値は、例えば、実測値対陽性対照の間の比（濃度測定指数）として報告される。このような方法は、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｐａｒｒａら、Ｊ．  Ｖａｓｃ．  Ｓｕｒｇ．  ２８巻：６６９〜６７５頁（１９９８年）に記載されるように、当技術分野で周知である。
【００７１】
本明細書に記載されるように、標的分子を検出するためまたは標的分子のレベルを決定するためのいくつかの実施形態では、例えば、酵素結合免疫吸着法、ラジオイムノアッセイおよび定量的ウエスタン分析を含めたイムノアッセイは有用であり得る。このようなアッセイは、通常、１種または複数の抗体に依存する。当業者には理解されるであろうが、本明細書に記載された方法を使用して、翻訳後修飾の代替形態を有するタンパク質、例えば、リン酸化タンパク質およびグリコシル化タンパク質を容易に区別できる。
【００７２】
タンパク質標的分子などの標的分子は、さまざまな方法によって特性決定され得る。タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドは、タンパク質沈殿、クロマトグラフィー（例えば、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー）、親和性捕獲および分画抽出（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓ）などの当技術分野で周知のさまざまな方法によって単離され得る。
【００７３】
単離タンパク質は、酵素消化または化学的切断を受けて、ポリペプチド断片およびペプチドを生じ得る。このような断片は、同定および定量され得る。ポリペプチド／ペプチド断片およびその他の標的分子の分析にとって特に有用な方法は、質量分析である（参照によりその全文が組み込まれる、米国特許出願第２０１００２７９３８２号）。各試料中に含有されるタンパク質を同定し、試料にわたって同定されたタンパク質各々の相対的存在量を決定する、いくつかの質量分析ベースの定量的プロテオミクス法が開発されている（各々、参照によりその全文が組み込まれる、Ｆｌｏｒｙら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０巻：Ｓ２３〜２９頁（２００２年）、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ、Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  １４巻：６８５〜６９５頁（２００３年）、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ、Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １８７巻  付録２：Ｓ３１５〜３２０頁（２００３年）、ＰａｔｔｅｒｓｏｎおよびＡｅｂｅｒｓｏｌｄ、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３３巻  付録、３１１〜３２３頁（２００３年）、ＡｅｂｅｒｓｏｌｄおよびＭａｎｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ４２２巻：１９８〜２０７頁（２００３年）、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，  Ｒ．およびＣｒａｖａｔｔ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０巻：Ｓ１〜２頁（２００２年）、ＡｅｂｅｒｓｏｌｄおよびＧｏｏｄｌｅｔｔ、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  １０１巻、２６９〜２９５頁（２００１年）、ＴａｏおよびＡｅｂｅｒｓｏｌｄ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４巻：１１０〜１１８頁（２００３年））。一般に、各試料中のタンパク質は、その起源の試料を同定し、正確な質量分析的定量の基礎を提供する同位体識別特性を獲得するよう標識される。次いで、異なる同位体識別特性を有する試料が組み合わされ、通常、多次元的クロマトグラフィータンデム質量分析によって分析される。次いで、得られた衝突誘起解離（ＣＩＤ）スペクトルが、ペプチド配列に割り当てられ、同一配列の異なって同位体標識されたペプチドの相対シグナル強度に基づいて、各試料中の検出されたタンパク質各々の相対的存在量が算出される。
【００７４】
標的分子を同定および定量するためのさらなる技術、標識を含まない定量的プロテオミクス法。このような方法は、（ｉ）タンパク質抽出、還元、アルキル化および消化を含めた試料調製、（ｉｉ）液体クロマトグラフィー（ＬＣまたはＬＣ／ＬＣ）およびＭＳ／ＭＳによる分析による試料分離、（ｉｉｉ）ペプチド／タンパク質同定、定量および統計分析を含めたデータ分析を含む。各試料は、別個に調製され、次いで、個別のＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＬＣ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実施に付され得る（参照によりその全文が組み込まれる、Ｚｈｕ  Ｗ．ら、Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１０年）Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ８４０５１８、６頁）。１種の例示的技術として、ペプチドの質量に、ペプチド配列を独特に規定するペプチド特性としてのその対応するクロマトグラフ溶出時間が加味される、ＬＣ−ＭＳ、精密質量および時間（ＡＭＴ）タグアプローチと呼ばれる方法が挙げられる。クロマトグラフおよび高質量精度情報を得るためにフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴を加えたＬＣ（ＬＣ−ＦＴＩＣＲ）ＭＳを使用して、ＡＭＴタグを、データベースに保存されたこれまでに獲得されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳ配列情報と対応させることによって、ペプチド配列が同定され得る。測定されたペプチドのピーク面積とその存在量の間で観察される線形相関を利用することによって、これらのペプチドは、ＭＳ実施間で比較されるその対応するピークのシグナル強度比によって相対的に定量され得る（参照によりその全文が組み込まれる、Ｔａｎｇ，  Ｋ．ら、（２００４年）Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  １５巻：１４１６〜１４２３頁、およびＣｈｅｌｉｕｓ，  Ｄ．およびＢｏｎｄａｒｅｎｋｏ，  Ｐ．  Ｖ．（２００２年）Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １巻：３１７〜３２３頁）。スチューデントのｔ検定などの統計ツールを使用して、各試料の複数のＬＣ−ＭＳ実施から得られるデータが分析され得る（参照によりその全文が組み込まれる、Ｗｉｅｎｅｒ，  Ｍ．  Ｃ．ら、（２００４年）Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７６巻：６０８５〜６０９６頁）。試料間の存在量の統計的に有意な差を有するペプチドを検出するために、獲得時間およびｍ／ｚの各点で、複数のＬＣ−ＭＳ実施から得られたシグナル強度の振幅が、２種の試料間で比較され得る。
【００７５】
理解されるであろうが、ポリペプチド／ペプチド断片を同定および／または定量するための方法では、さまざまな質量分析システムが使用され得る。高質量精度、高感度および高解像度を有する質量分析器として、イオントラップ、トリプル四重極および飛行時間型、四重極飛行時間型質量分析計およびフーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析器（ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ）が挙げられる。質量分析計は、通常、マトリックス支援レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ）またはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）イオン源を備えているが、ペプチドイオン化のその他の方法も使用され得る。イオントラップＭＳでは、分析物は、ＥＳＩまたはＭＡＬＤＩによってイオン化され、次いで、イオントラップ中に入れられる。次いで、トラップされたイオンは、イオントラップからの選択的放出の際にＭＳによって別個に分析され得る。また、断片が、イオントラップ中で作製され、分析され得る。放出されたポリペプチド／ペプチド断片などの試料分子が、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦまたはＥＳＩ−ＴＯＦシステムを備えたシングルステージ型質量分析によって分析され得る。質量分析の分析方法は、当業者には周知である（例えば、各々、参照によりその全文が組み込まれる、Ｙａｔｅｓ，  Ｊ．（１９９８年）Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔ．  ３３巻：１〜１９頁、ＫｉｎｔｅｒおよびＳｈｅｒｍａｎ、（２０００年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ．  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ならびにＡｅｂｅｒｓｏｌｄおよびＧｏｏｄｌｅｔｔ、（２００１年）Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  １０１巻：２６９〜２９５頁参照のこと）。高解像度ポリペプチド断片分離のために、液体クロマトグラフィーＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳまたは分離方法としてキャピラリー逆相クロマトグラフィーを利用する自動化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳが使用され得る（参照によりその全文が組み込まれる、Ｙａｔｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １１２巻：５５３〜５６９頁（１９９９年））。質量分析法として、動的排除を用いるデータ依存性衝突誘起解離（ＣＩＤ）も使用され得る（参照によりその全文が組み込まれる、Ｇｏｏｄｌｅｔｔら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７２巻：１１１２〜１１１８頁（２０００年））。
【００７６】
ペプチドがＭＳ／ＭＳによって分析されると、得られたＣＩＤスペクトルを、単離ペプチドの同一性の決定のためにデータベースに対して比較できる。単一ペプチドを使用するタンパク質同定のための方法は、これまでに記載されている（各々、参照によりその全文が組み込まれる、ＡｅｂｅｒｓｏｌｄおよびＧｏｏｄｌｅｔｔ、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  １０１巻：２６９〜２９５頁（２００１年）、Ｙａｔｅｓ，  Ｊ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ．  ３３巻：１〜１９頁（１９９８年）、Ｄａｖｉｄ  Ｎ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２０巻  ３５５１〜６７頁（１９９９年））。特に、ペプチドが親ポリペプチドの独特の識別特性を提供する場合には、１種または２、３種のペプチド断片を使用して、断片が由来した親ポリペプチドを同定できるということがあり得る。さらに、単独またはグリコシル化の部位についての知識と組み合わせた、単一ペプチドの同定を使用して、グリコペプチド断片が由来した親のグリコポリペプチドを同定できる。理解されるであろうが、ＭＳを含む方法を使用して、タンパク質、その断片ならびにその他の種類の本明細書に記載された標的分子を特性決定できる。
【００７７】
いくつかの実施形態は、タンパク質および／またはＧＬＦのタンパク質画分を濃縮することを含み得る。例示的方法は、タンパク質沈殿、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーならびに親和性捕獲、分画抽出法および遠心分離を含み得る。トップダウンプロテオミクスなどの無処理タンパク質法またはＳＤＳ−ＰＡＧＥなどのゲルクロマトグラフィーを使用して、タンパク質および／またはタンパク質画分をさらに検査することができる。
【００７８】
いくつかの実施形態は、グリコシル化タンパク質および／もしくはグリカンを含む標的分子を同定すること、その有無を決定すること、ならびに／または標的分子を定量することを含む。グリコシル化タンパク質およびグリカンは、当技術分野で周知の種々の方法によって分析され得る。グリコシル化の変化は、疾患または疾患状況を示し得る。したがって、特定の標的分子は、特定のグリコシル化タンパク質および／またはグリカンを含み得る。理解されるであろうが、グリカンは、糖タンパク質、プロテオグリカンまたはその他のグリカン含有化合物の構成成分であり得る。
【００７９】
いくつかの実施形態は、代謝産物を含む標的分子を同定すること、その有無を決定すること、および／または標的分子を定量することを含む。代謝産物は、ＧＬＦまたは糞便試料中で、さまざまな方法を使用して分析され得る。例えば、ＧＬＦまたは糞便試料は、クロマトグラフィーなどの方法を使用して代謝産物について分析され得る。メタボロームのいくつかの構成成分は、胆汁酸およびその他の小さい有機化合物を含む。代謝産物は、ＧＬＦまたは糞便試料中に存在するペプチドを含み得る。
【００８０】
バイオマーカーを同定するための方法
いくつかの実施形態では、ＧＬＦまたは糞便試料中で検出される標的分子を、評価して、それらが、疾患または生理学的状況などの特定の状態と関連しているバイオマーカーであるかどうかを決定できる。このようなバイオマーカーは、特定の疾患、疾患素因、予後、特定の治療計画に対する正の応答または特定の治療計画に対する負の応答を示し得る。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの有無またはそのレベルが、疾患または生理学的状況などの特定の状態と関連している場合がある。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの有無またはそのレベルを、疾患または生理学的状況などの特定の状態と統計的に相互に関連付けることができる。いくつかの実施形態では、生理学的状況は、疾患を含み得る。いくつかの実施形態では、疾患または生理学的状況などの状態を有する被験体におけるバイオマーカーの発現のレベルを、状態または生理学的状況を有さない被験体におけるバイオマーカーの発現のレベルと比較することによって、バイオマーカーを疾患または生理学的状況などの特定の状態と相互に関連付けることができる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、状態を有さない被験体におけるバイオマーカーの発現と比較した、状態を有する被験体におけるバイオマーカーの差次的発現は、状態または生理学的状況を示す。本明細書において、「差次的発現」とは、疾患または生理学的状況などの状態を有する被験体と疾患または生理学的状況などの状態を有さない被験体におけるバイオマーカーの発現レベルの差を指す。例えば、用語「差次的発現」は、状態または生理学的状況を有さない被験体と比較した、疾患または生理学的状況などの状態を有する被験体におけるバイオマーカーの有無を指し得る。いくつかの実施形態では、差次的発現は、疾患または生理学的状況などの状態を有さない被験体におけるバイオマーカーの発現のレベルと比較した、疾患または生理学的状況などの状態を有する被験体におけるバイオマーカーの発現レベルの差を指し得る。
【００８２】
バイオマーカーのレベルの差は、本明細書において提供された方法を使用して、バイオマーカーの発現の量またはレベルを測定することによって決定できる。いくつかの実施形態では、差次的発現は、状態または生理学的状況を有するか、または有さない参照被験体／集団間の、１種または複数のバイオマーカー生成物のレベルの比として決定でき、ここで、比は、統計的に有意である。集団間の差次的発現は、ｐ値の関数として統計的に有意であると決定できる。統計的有意性を決定するためにｐ値を使用する場合には、バイオマーカー、ｐ値は、０．２未満であることが好ましい。別の実施形態では、ｐ値が、０．１５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．０００１など未満である場合に、バイオマーカーは差次的に発現されると同定される。比に基づいて差次的発現を決定する場合には、バイオマーカー生成物は、第２の試料と比較した、第１の試料における発現のレベルの比が、１．０より大きいか、１．０未満である場合に差次的に発現される。例えば、１．０より大きい比として、例えば、１．１、１．２、１．５、１．７、２、３、４、１０、２０などより大きい比が挙げられる。１．０未満の比として、例えば、０．９、０．８、０．６、０．４、０．２、０．１、０．０５など未満の比が挙げられる。別の実施形態では、バイオマーカーは、第２の集団の発現の平均レベルと比較した、第１の集団の発現のレベルの平均の比が、１．０より大きいか、１．０未満である場合に差次的に発現され得る。例えば、１．０より大きい比として、１．１、１．２、１．５、１．７、２、３、４、１０、２０などより大きい比が挙げられ、１．０未満の比として、例えば、０．９、０．８、０．６、０．４、０．２、０．１、０．０５など未満の比が挙げられる。別の実施形態では、バイオマーカーは、第２の集団の平均と比較した、第１の試料における発現のレベルの比が、１．０より大きいか、１．０未満である場合に、差次的に発現され、例えば、１．１、１．２、１．５、１．７、２、３、４、１０、２０より大きい比または１未満、例えば、０．９、０．８、０．６、０．４、０．２、０．１、０．０５の比が挙げられる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、状態または生理学的状況を有する少なくとも１種の試験被験体から得られた試験ＧＬＦまたは試験糞便試料および状態または生理学的状況を有さない少なくとも１種の対照被験体から得られた対照ＧＬＦまたは対照糞便試料中の少なくとも１種の標的分子のレベルを測定することと、試験ＧＬＦまたは試験糞便試料中の少なくとも１種の標的分子のレベルを、対照ＧＬＦまたは対照糞便試料中の少なくとも１種の標的分子のレベルと比較することとによって同定され得、ここで、少なくとも１種の標的のレベルにおける有意差が、バイオマーカーを同定する。いくつかの実施形態は、状態または生理学的状況を有する複数の試験被験体から得られた試験ＧＬＦまたは試験糞便試料および状態または生理学的状況を有さない複数の対照被験体から得られた対照ＧＬＦまたは対照糞便試料中の複数の標的分子を測定および比較することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００種の標的分子が測定および比較され得る。いくつかの実施形態では、ＧＬＦまたは糞便試料は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００種の試験被験体から得られる場合がある。いくつかの実施形態では、ＧＬＦまたは糞便試料は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００種の対照被験体から得られる場合がある。いくつかの実施形態では、対照ＧＬＦまたは対照糞便試料と比較した、試験ＧＬＦまたは試験糞便試料における標的分子のレベルにおける有意差は、統計的に有意であり得る。
【００８４】
キット
本明細書において提供された方法および組成物のいくつかの実施形態は、ＧＬＦまたは糞便試料中の標的分子を検出するため、ＧＬＦまたは糞便試料中の標的分子の有無を決定するため、ＧＬＦまたは糞便試料中の標的分子を定量するため、またはＧＬＦまたは糞便試料中の標的分子を同定するためのキットに関する。いくつかのこのようなキットは、被験体に経口投与するための洗浄組成物を含み得る。いくつかの実施形態では、洗浄液は、ポリエチレングリコール、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、クエン酸マグネシウムおよびビサコジルなどの成分を含み得る。いくつかの実施形態では、洗浄液は、場合により、ビサコジルまたはアスコルビン酸も含めた電解質溶液とともにポリエチレングリコールを含み得る（例えば、ＧＯＬＹＴＥＬＹ、ＨＡＬＦＬＹＴＥＬＹ、ＮＵＬＹＴＥＬＹ、ＭＯＶＩＰＲＥＰ）。いくつかの実施形態では、洗浄液は、リン酸塩（例えば、ＦＬＥＥＴのＰＨＯＳＰＨＯ−ＳＯＤＡ）を含み得る。いくつかの実施形態では、洗浄液は、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウムまたは硫酸カリウムなどの硫酸塩を含み得る（例えば、ＳＵＰＲＥＰ）。いくつかの実施形態では、洗浄液は、クエン酸マグネシウムを含み得る。いくつかの実施形態では、洗浄液は、ピコスルファートナトリウムを含み得る。
【００８５】
いくつかの実施形態では、キットはまた、被験体からＧＬＦおよび／または糞便試料を収集するための容器を含み得る。ＧＬＦを収集するための容器は、ＧＬＦまたは糞便試料などを捕獲するトイレ用挿入物を含み得る。いくつかの実施形態では、容器は、１種または複数の単離プロテアーゼ阻害剤などの標的分子を安定化および／または保存するための材料を含み得る。いくつかの実施形態では、容器は、標的分子を検出するため、標的分子の有無を決定するため、標的分子を定量するため、または標的分子を同定するための薬剤を含み得る。
【００８６】
疾患
本明細書において提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、特定の疾患の診断、予後に関する。いくつかの実施形態は、ＧＩ管およびそれと関連している器官と関連している疾患および障害を含む。例示的疾患として、ＧＩ管およびそれと関連している器官の癌、例えば、胃癌、肝臓癌、膵臓癌が挙げられる。疾患のさらなる例として、膵炎、膵臓腺癌、胃腸神経内分泌腫瘍、胃腺癌、結腸腺癌、肝細胞癌腫、胆管癌、胆嚢腺癌（ａｄｅｎｏｃｃａｒｃｉｎｏｍａ）、潰瘍性大腸炎およびクローン病が挙げられる。いくつかの疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に関する。本明細書において、用語「炎症性腸疾患」とは、胃腸管の少なくとも一部の炎症を特徴とする広範なクラスの疾患を指し得る。ＩＢＤ症状は、腸管の炎症を含み、腹部の筋痙攣および持続性の下痢をもたらし得る。炎症性腸疾患として、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、不確定大腸炎、慢性大腸炎、不連続または斑状疾患、回腸炎症、結腸外炎症、破裂した陰窩に応じた肉芽腫性炎症、アフタ性潰瘍、貫壁性炎症、顕微鏡的大腸炎、憩室炎および空置性大腸炎が挙げられる。疾患のさらなる例として、セリアックスプルー、吸収不良障害ならびに消化管、肝臓、膵臓および胆樹のその他の状態が挙げられる。
【００８７】
本明細書において提供された方法および組成物のいくつかの実施形態は、治療（個別化医薬と呼ばれることが多い）の選択、治療に対する被験体の正の応答、治療に対する負の応答または治療に対する応答がないことを決定することに関する。いくつかのこのような実施形態は、治療計画に対する患者の部分的応答を決定することを含む。例えば、最初の時点で、被験体から得られたＧＬＦまたは糞便試料において、バイオマーカーの存在、バイオマーカーの不在またはバイオマーカーのレベルが決定され得る。治療が始まったおよび／または治療が完了した後の第２の時点で、被験体から得られたＧＬＦまたは糞便試料においてバイオマーカーの存在、バイオマーカーの不在またはバイオマーカーのレベルが決定され得る。第１の時点から得られたＧＬＦまたは糞便試料におけるバイオマーカーの存在、バイオマーカーの不在またはバイオマーカーのレベルと比較した、第２の時点でのＧＬＦまたは糞便試料におけるバイオマーカーの存在、バイオマーカーの不在またはバイオマーカーのレベルの差が、治療に対する被験体の正の応答、治療に対する負の応答、治療に対する部分的応答または治療に対する応答がないことを示し得る。あるいは、被験体は、治療計画を与えられ、正の応答、負の応答、部分的応答を有するか、または応答を有さないと分類され得る。各被験体群の標的分子の存在、不在またはレベルが決定され得、応答の各カテゴリーと統計的に有意な関連を有する標的分子が同定され得る。いくつかの実施形態はまた、以前のまたは現在の治療計画に対する被験体の正の応答、負の応答、部分的応答または応答がないことの決定を考慮して、被験体に提供される将来の治療計画を決定することも含む。したがって、以前のまたは現在の治療計画は、本明細書において提供された方法によって行われた決定に基づいて改変され得る。
【００８８】
さらなる実施形態は、複数のバイオマーカーを評価することによって、被験体の生理学的状況を決定するための方法を含む。いくつかのこのような方法は、複数のバイオマーカーの存在、不在および／またはレベルを決定することを含む。複数のバイオマーカーの存在、不在および／またはレベルは、被験体の疾患を発症する尤度および／または特定の疾患を治療するための治療計画に対する被験体の起こり得る応答などの被験体の生理学的状況の尤度と相互に関連付けられ得る。いくつかのこのような方法では、複数のバイオマーカーの存在、不在および／またはレベルを相互に関連付けて、被験体が疾患を有するか、疾患を発症する尤度を決定することによって、被験体の「臨床的リスクスコア」が決定され得る（例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｓｏｏｎｍｙｕｎｇ  Ｐ．ら、（２００４年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５１巻：２８１７〜２８２６頁、およびＣｈｏ  Ｃ．Ｓ．ら、（２００８年）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｏｌｌ．  Ｓｕｒｇ．  ２０６巻：２８１〜２９１頁参照のこと）。
【００８９】
本発明は、明確さおよび理解を目的として、幾分か詳細に記載されたが、当業者ならば、形態および詳細の種々の変更は、本発明の真の範囲から逸脱することなく行われ得ると理解するであろう。
【実施例】
【００９０】
（実施例１）
硫酸塩ベースのＧＬＦのプロテオミクス解析
この解析では、硫酸塩ベースのＧＬＦの、プロテオミクス解析を支援する能力を評価した。硫酸塩ベースの洗浄組成物を使用して得ているＧＬＦにおいて標的分子を同定するために、ＳＵＰＲＥＰを３人のヒト被験体に投与し、得られたＧＬＦ中のタンパク質を、質量分析によって解析した。この実施例では、ＧＬＦは、大腸内視鏡検査手順の一部として被験体から収集した。
【００９１】
収集の際に、完全プロテアーゼ阻害剤錠（ＲＯＣＨＥ）を添加し、試料を１０００ｒｐｍ、４℃で３０分間回転させた。上清を、１４，０００×ｇで３０分間再度回転させて、細菌および細片をペレットにした。１．８ｍｌの上清を、６容量のアセトンを用いて沈殿させ、続いて、等容量のクロロホルムを用いて抽出し、続いて、Ｃ−２逆相ＳＰＥカラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ、Ｗａｔｅｒｓ）で分離した。０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、０．１％ＴＦＡ中、１０％、２０％および３０％アセトニトリル（ＡＣＮ）の各々、３カラム容量を用いてカラムを洗浄し、０．１％ＴＦＡ中の、６０％ＡＣＮの３カラム容量を用いて溶出した。試料を遠心分離凍結乾燥によって乾燥させ、１００μｌの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム／１０ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンに再懸濁し、１０ｍＭの配列決定等級トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）２μｌを用いて消化した。
【００９２】
データは、ＬＣシステムからの入力を使用してＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計で獲得した。Ａ溶媒は、３％のＢおよび水中、０．２％のギ酸を含有していた。Ｂ溶媒は、３％のＡおよびアセトニトリル中、０．２％のギ酸を含有していた。溶媒は、Ｆｉｓｈｅｒ製のＨＰＬＣ等級とした。１２０分の実施のために、出発溶媒は、５％Ｂとし、７分間そのままである。勾配は、１３分までに１０％に、８３分までに４０％に、１０３分までに９０％に変更し、次いで、１１１分で９０％から５％に低下させた。次いで、それを次の注入のために再平衡化させた。再現性決定のために各試料について３回の注入を実施した。
【００９３】
ＭＳは、毎秒４００ｍ／ｚ〜２０００ｍ／ｚの質量範囲にわたってスキャンし（Ｏｒｂｉｔｒａｐ）、ＬＴＱ（Ｔｒａｐ）は、最大５ＭＳＭＳ（ペプチド配列）スペクトルを並行して獲得した。データは、標準Ｔｈｅｒｍｏ  Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェアを使用して獲得した。ＭＳデータ（Ｏｒｂｉｔｒａｐ）は、２〜３ｐｐｍまで安定であり、バックグラウンドイオンは、質量ドリフト評価のために使用された。ＭＳＭＳデータ（ＬＴＱ）は、およそ０．６Ｄａまで測定したが、親の質量は、低ｐｐｍＯｒｂｉｔｒａｐデータから獲得した。ペプチドは、Ｃ１８  ＬＣカラムから、データの信頼性および再現性を確実にするために３連の注入を使用して溶出した。検索ファイルは、各洗浄調製物（患者試料）からの３連の注入から作成し、ＸｃａｌｉｂｕｒおよびＭａｓｃｏｔ  ソフトウェアパッケージの組合せを使用してＭＧＦ（Ｍａｓｃｏｔ  Ｇｅｎｅｒｉｃ  Ｆｏｒｍａｔ）ファイルに変換した。
【００９４】
データベース検索は、ヒト（ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）として特定された生物分類学、親イオンについて（ＭＳ）１０ｐｐｍおよび断片イオンについて（ＭＳ／ＭＳ）０．６Ｄａの質量精度を用い、ＲｅｆＳｅｑデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＲｅｆＳｅｑ／）に対してＭａｓｃｏｔ検索エンジン（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ）を使用して行い、「酵素ではない」が選択された。試料における、検査されているペプチドを修飾または末端切断し得る消化酵素の存在のために、酵素特異性を用いない検索を実施した。ＲｅｆＳｅｑデータベースは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔタンパク質データベース中に含まれる抗体配列の付加によって補完したが、その理由は、これらの抗体配列が、標準ＲｅｆＳｅｑリストの一部ではないからである。
【００９５】
高いＭａｓｃｏｔスコアほど、良好なタンパク質ヒットを示し、相対タンパク質レベルと相互に関連付けられ得る。「＞４０」というスコア閾値は、酵素特異性を用いないこのデータベースの検索に基づいてＭａｓｃｏｔスコアリングシステムによって決定されるような＜０．０５というｐ値有意性を示し；４０というスコアは、ｐ＜０．０１と一致する。ＭＳ／ＭＳ複数回の間にサンプリングされたとしても、検出される各ペプチドの最高スコアのみが付加される標準Ｍａｓｃｏｔスコアリングを使用した。含まれるすべてのデータについて、スコアは、タンパク質系統あたり少なくとも１種の試料において、すべて＞４０であった。さらなる信頼のために、有意なペプチドの数も報告し、少なくとも２種のペプチドという最低基準が選択された。極めて少ないものが３未満のペプチドを有していた。カウントされたすべての有意なペプチドが、そのそれぞれのタンパク質に由来する異なる配列（個々のペプチド）に相当していた。スコアおよび有意なペプチドの数は、形式ｘ／ｙで報告される（式中、ｘは、スコアであり、ｙは、有意なペプチドの数である）。特定の試料においてタンパク質が検出されなかった場合には、「ＮＤ」として列挙されている。タンパク質は、タンパク質名として報告され、ＮＣＢＩのタンパク質データベースによって定義される「ｇｉ」番号が提供された。本願を通じて列挙されたＮＣＢＩデータベースにおいて「ｇｉ」番号の各々の中に含有される配列は、参照により本明細書に組み込まれる。タンパク質が、プレタンパク質またはその他の非成熟形態で名付けられる場合には、シグナル配列の除去および翻訳後修飾の付加などの変更を含めてタンパク質の成熟形態も等しく暗示される。すべての場合において、タンパク質は、一貫性を提供するためにその遺伝子由来配列によって名付けられた。
【００９６】
表１は、上記の形式で示される、患者３、４および６として定義される３人の別個の患者から得られたＧＬＦにおいて同定された最も豊富なタンパク質の例を列挙する。表１からわかるように、多数のタンパク質が、ＧＬＦから同定され得、これらのうち多数が、膵臓と関連している可能性がある。その他のタンパク質は、結腸癌およびその他の癌と関連している可能性があるＤＭＢＴ１（ｇｉ番号１４８５３９８４０）を含む。抗体および推定グリコシル化タンパク質も同定された。
【００９７】
【表１−１】
2018201524.tif 000002
【００９８】
【表１−２】
2018201524.tif 000003
【００９９】
別の実験では、被験体にＳＵＰＲＥＰを、製造業者のガイドラインに従って投与し、得られたＧＬＦは、被験体によって、大腸内視鏡検査の直前にトイレの中に入れられた収集容器中に自己収集された。ＧＬＦのプロテオームは上記のようにＭＳによって解析された。存在する最も豊富な種のＭａｓｃｏｔスコアを示す結果が表２にまとめられている。結果は、幾分かの尿の混入を示した。大腸内視鏡検査の際に続いて収集された試料について、同様のプロテオミクスプロファイルが観察された。表２は、被験体によって収集されたＧＬＦにおいて多数の異なるタンパク質が同定されたことを示す。同定されたタンパク質は、表１中のデータと一致して、ＤＭＢＴ１、膵臓タンパク質および抗体を含んでいた。
【０１００】
【表２−１】
2018201524.tif 000004
【０１０１】
【表２−２】
2018201524.tif 000005
【０１０２】
前述の解析は、硫酸塩ベースのＧＬＦを使用して得られた試料では、多数の標的分子が検出され得るということを実証する。
【０１０３】
（実施例２）
ポリエチレングリコールベースのＧＬＦのプロテオミクス解析
この解析では、ポリエチレングリコールベースのＧＬＦの、プロテオミクス解析を支援する能力を評価した。ポリエチレンベースの洗浄組成物を使用して得ているＧＬＦにおいて標的分子を同定するために、ポリエチレングリコールベースの洗浄組成物を２人のヒト被験体に投与し、得られたＧＬＦ中のタンパク質を、実施例１に記載されるように質量分析によって解析した。ポリエチレングリコールの除去は、洗浄液のクロロホルム抽出によって大部分が達成された。ポリエチレングリコールベースの洗浄組成物を投与されたこれらの被験体から得られたＧＬＦにおいて、多数の異なるタンパク質が同定された。これまでの表において観察されたものと一致している、同定された最も豊富な同定されたタンパク質の例が、表３に示されている。
【０１０４】
【表３】
2018201524.tif 000006
【０１０５】
別の実験では、被験体にＰＥＧベースの洗浄組成物を投与し、被験体が、得られたＧＬＦを大腸内視鏡検査の直前にトイレの中に入れられた収集容器中に自己収集した。ＧＬＦのプロテオームは本明細書に記載されるようにＭＳによって解析された。自己収集されたＧＬＦ試料において多数の異なるタンパク質が同定された。最も豊富な同定されたタンパク質の例ならびに対応するＭａｓｃｏｔスコアおよび各タンパク質の有意なペプチドの数が、表４に列挙されている。より大規模なタンパク質リストが、尿の混入の証拠を示した。大腸内視鏡検査の際に続いて収集された試料について、同様のプロテオミクスプロファイルが観察された。
【０１０６】
【表４】
2018201524.tif 000007
【０１０７】
硫酸塩ベースの洗浄組成物の投与から得られた、大腸内視鏡検査手順の一部としてその際に収集されたか、または被験体によって自己収集されたＧＬＦのプロテオームを比較した。最も豊富なタンパク質のＭａｓｃｏｔスコアおよび有意なペプチドの数が、表５にまとめられている。観察された２種のプロテオームの間に密接な相関があったが、少なくとも２種のタンパク質について異なるアイソフォームが同定された。異なるアイソフォームの選択は、ＭＳ／ＭＳの際の配列データの収集および検索エンジンの結果であり得る。大腸内視鏡検査の際に収集されたものよりも希薄であった自己収集された試料では、より少ないタンパク質が検出された。
【０１０８】
【表５−１】
2018201524.tif 000008
【０１０９】
【表５−２】
2018201524.tif 000009
【０１１０】
【表５−３】
2018201524.tif 000010
【０１１１】
前述の解析は、ポリエチレングリコールベースのＧＬＦを使用して得られた試料では、多数の標的分子が検出され得るということを実証する。
【０１１２】
（実施例３）
クエン酸マグネシウムベースのＧＬＦのプロテオミクス解析
この解析では、クエン酸マグネシウムベースのＧＬＦの、プロテオミクス解析を支援する能力を評価した。クエン酸マグネシウムベースの洗浄組成物を投与されたヒト被験体から得られたＧＬＦにおいて標的分子を同定するために、クエン酸マグネシウムベースの洗浄組成物を被験体に投与し、ＧＬＦを、大腸内視鏡検査手順の一部として被験体から収集した。ＧＬＦのプロテオームを、実施例１に記載されるように質量分析によって解析した。ＧＬＦにおいて多数の異なるタンパク質が同定された。最も豊富な同定されたタンパク質の例が、表６に列挙されている。同定されたタンパク質の多くは、異なる大腸内視鏡検査調製物を用いて検出され、このことは、プロテオームが、使用された腸調製物に依存していないことを示唆する。
【０１１３】
【表６−１】
2018201524.tif 000011
【０１１４】
【表６−２】
2018201524.tif 000012
【０１１５】
前述の解析は、クエン酸マグネシウムベースのＧＬＦを使用して得られた試料では、多数の標的分子が検出され得るということを実証する。
【０１１６】
（実施例４）
ＧＬＦをＳＳＬ−７濃縮と組み合わせて使用して得られた試料における、ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２抗体の検出
この解析では、ＧＬＦをＳＳＬ−７濃縮と組み合わせて使用して得られた試料の、ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２抗体を検出する能力を評価した。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ超抗原様タンパク質７（ＳＳＬ−７）に対する親和性を用いて、ＧＬＦにおいて標的分子を同定するために、ヒト被験体に硫酸塩ベースの洗浄組成物（ＳＵＰＲＥＰ）を投与し、ＳＳＬ−７親和性ビーズを使用して各ＧＬＦにおいてタンパク質を濃縮した。ＧＬＦは、大腸内視鏡検査手順の一部として被験体から収集した。
【０１１７】
ＳＳＬ−７親和性ビーズを使用して、ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２を特異的に単離した。１ｍｌの試料に、２０μｌのＳＳＬ−７アガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を添加し、４℃、ローラー上で一晩インキュベートした。試験管を、１，０００×ｇで２分間回転させて、ビーズをペレットにし、上清を廃棄した。ビーズを、１×リン酸緩衝生理食塩水を用いて４回洗浄し、シェーカー中の１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．７の２０μｌを用いて、３７℃、６００ｒｐｍで１時間溶出した。溶出された抗体を、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム／１０ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンの６０μｌを用いて希釈し、２μｌの配列決定等級トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて消化した。質量分析およびデータベース検索を、上記のように実施した。ＳＳＬ−７に対する親和性を有するＧＬＦ中に存在する最も豊富な同定されたタンパク質およびその対応するＭａｓｃｏｔスコアが表７にまとめられている。先の実施例において観察されたように、抗体は、ＧＬＦ中に存在しており、これらの濃縮および解析は、アフィニティー試薬を使用して可能であり、したがって、ＧＬＦにおけるこのサブプロテオームの特異的解析を可能にする。最も豊富な抗体は、ＩｇＡであった。ＩｇＡは、腸管中に存在すると一貫して報告されている。
【０１１８】
【表７】
2018201524.tif 000013
【０１１９】
前述の解析は、ＧＬＦをＳＳＬ−７濃縮と組み合わせて使用して得られた試料において、ＩｇＡ抗体が検出され得るということを実証する。
【０１２０】
（実施例５）
ＧＬＦをプロテインＬ濃縮と組み合わせて使用して得られた試料における、ＩｇＡおよびＩｇＭの検出
この解析では、ＧＬＦをプロテインＬ濃縮と組み合わせて使用して得られた試料の、ＩｇＡおよびＩｇＭ抗体を検出する能力を評価した。プロテインＬに対する親和性を用いてＧＬＦにおいて標的分子を同定するために、ヒト被験体に硫酸塩ベースの洗浄組成物（ＳＵＰＲＥＰ）を投与し、プロテインＬ親和性ビーズを使用して各ＧＬＦにおいてタンパク質を濃縮した。ＧＬＦは、大腸内視鏡検査手順の一部として被験体から収集した。
【０１２１】
プロテインＬ親和性ビーズは、κ軽鎖を含有する抗体を単離するために使用した。１ｍｌの試料に２０μｌのプロテインＬアガロース（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を添加し、４℃、ローラー上で一晩インキュベートした。試験管を、１，０００×ｇで２分間回転させて、ビーズをペレットにし、上清を廃棄した。ビーズを、１×リン酸緩衝生理食塩水を用いて４回洗浄し、シェーカー中の１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．７の２０μｌを用いて、３７℃、６００ｒｐｍで１時間溶出した。溶出された抗体を、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム／１０ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンの６０μｌを用いて希釈し、２μｌの配列決定等級トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて消化した。プロテインＬに対する親和性を有するＧＬＦ中に存在する最も豊富な同定されたタンパク質ならびにその対応するＭａｓｃｏｔスコアおよび有意なペプチドの数が表８にまとめられている。予測されたように、抗体に由来するＩｇＡおよび関連する鎖を再度検出した。プロテインＬは、ＩｇＡ抗体に対して完全に特異的ではないので、ＩｇＭ抗体（ｇｉ番号１９３８０６３７４）も検出された。
【０１２２】
【表８】
2018201524.tif 000014
【０１２３】
前述の解析は、ＧＬＦをプロテインＬ濃縮と組み合わせて使用して得られた試料において、ＩｇＡおよびＩｇＭ抗体が検出され得るということを実証する。
【０１２４】
（実施例６）
ＧＬＦを使用して得られた試料における、細菌起源のタンパク質の検出
この解析では、ＧＬＦの細菌起源のタンパク質の検出を容易にする能力を評価した。ＧＬＦにおいて細菌と関連している標的分子を同定するために、２人のヒト被験体に硫酸塩ベースの洗浄組成物（ＳＵＰＲＥＰ）を投与し、得られたＧＬＦを、大腸内視鏡検査手順の一部として被験体から収集した。各ＧＬＦから１００μｌを用いて、Ｓｕｐｅｒ  Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｂｒｏｔｈ（ＳＯＢ）培地に播種し、３７℃、２２０ｒｐｍ振盪で一晩インキュベートした。ペレットを、８Ｍ尿素中でビーズビーターにおいて溶解し、溶解物を、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム／１０ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンで２Ｍ尿素に希釈し、配列決定等級のトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて消化した。データは、先に記載されるように、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳシステムで１２０分の実施を使用して獲得した。ＭＧＦ検索ファイルを作成し、真正細菌として特定された生物分類学、親イオンについて（ＭＳ）１０ｐｐｍおよび断片イオンについて（ＭＳ／ＭＳ）０．６Ｄａの質量精度を用い、ＲｅｆＳｅｑデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＲｅｆＳｅｑ／）に対してＭａｓｃｏｔ検索エンジン（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ）を使用して検索した。細菌と関連しているＧＬＦ中に存在する最も豊富な同定されたタンパク質ならびにその対応するＭａｓｃｏｔスコアおよび有意なペプチドの数が、表９にまとめられている。示された試料では、培養された細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであった。その他の試料は、洗浄液が依然として腸細菌の一部を保持していることを示す異なる細菌を示す。
【０１２５】
【表９】
2018201524.tif 000015
【０１２６】
前述の解析は、ＧＬＦを使用して得られた試料において細菌起源のタンパク質が検出され得るということを実証する。
【０１２７】
（実施例７）
いくつかの被験体から得られた組み合わされた試料のプロテオミクス解析
ＧＬＦを使用して得られた試料において検出可能である多数の標的タンパク質の同定をさらに容易にするために、１２人の被験体から個別に獲得したデータから作製した検索ファイルを、単一の検索ファイルに連結させ、Ｏｒｂｉｔｒａｐデータについてこれまでに特定したパラメータを使用して検索した。種々のＧＬＦ試料において多数のタンパク質を分析し、ｐ＜０．０５（Ｍａｓｃｏｔスコアおよそ４１）の閾値で検出された少なくとも３種の独特の有意なペプチドを（主に）有するタンパク質を選択した。３種のみの列挙されたタンパク質（ｇｉの５０３１８６３、６４６６８０１および１１５４３０２２３）が３種未満の有意なペプチドを有していたが、これらは、タンパク質同定のための９５％信頼レベルを十分に上回るおよそ４００のＭａｓｃｏｔスコアを有していた。この組み合わされた解析において同定されたタンパク質は、特定のタンパク質の報告された起源および報告された関連する癌とともに表１０に列挙されている。表１０はまた、独特の同定されたタンパク質各々について４０以上のＭａｓｃｏｔスコアを有していた同定されたペプチドの配列番号を列挙する。多数の同定されたタンパク質が、膵液中に存在すると報告されている。表１０中に列挙される参考文献は、本願において提供される。
【０１２８】
【表１０−１】
2018201524.tif 000016
【０１２９】
【表１０−２】
2018201524.tif 000017
【０１３０】
【表１０−３】
2018201524.tif 000018
【０１３１】
【表１０−４】
2018201524.tif 000019
【０１３２】
【表１０−５】
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【０１３３】
【表１０−６】
2018201524.tif 000021
【０１３４】
【表１０−７】
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【０１３５】
【表１０−８】
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【０１３６】
【表１０−９】
2018201524.tif 000024
【０１３７】
【表１０−１０】
2018201524.tif 000025
【０１３８】
前述の解析は、ＧＬＦを使用して得られた試料において多数のタンパク質が検出され得るということを実証する。
【０１３９】
（実施例８）
糞便試料のプロテオミクス解析
この解析では、糞便試料の、プロテオミクス解析を支援する能力を評価した。糞便試料において標的分子を同定するために、ヒト被験体に洗浄組成物を投与しなかった。糞便試料は、正常な排便の際に、トイレの中に入れられた収集容器を使用して被験体から収集した。少量の糞便（便）試料を、０．１％ＴＦＡ中でホモジナイズし、次いで、１３０００×ｇで遠心分離した。タンパク質を、実施例１に記載されるように、６容量のアセトンを用いて沈殿させ、０．１％ＴＦＡに再懸濁し、等容量のクロロホルムを用いて抽出し、次いで、ＳＰＥカラム中で処理した。最も豊富な同定されたタンパク質ならびにその対応するＭａｓｃｏｔスコアおよび有意なペプチドの数が、表１１にまとめられている。試料において、大部分はおそらくは膵臓起源であるタンパク質が検出され、これは、ＧＬＦにおける発見後は、便が、これらのバイオマーカータンパク質の検出のための供給源であるということを示す。しかし、試料はまた、分析を、特に、バイオマーカーの発見についてはるかに制限されたものにする、いくつかのその他の非ヒト物質を含有していた。
【０１４０】
【表１１】
2018201524.tif 000026
【０１４１】
前述の解析は、糞便試料において多数の標的分子が検出され得るということを実証する。
【０１４２】
（実施例９）
ＧＬＦを使用して得られた試料におけるグリカンの検出
この解析では、グリカンの、ＧＬＦを使用する試料において得られた試料において検出される能力を評価した。ＧＬＦにおいてグリカンを含めた標的分子を同定および分析するために、ＧＬＦをヒト被験体から収集した。１２ｍＬの氷冷アセトンに１．８ｍＬのＧＬＦを添加し、１時間インキュベートしてタンパク質をペレットにした。試料を１２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、アセトンを除去した。氷冷アセトンを用いて洗浄した後、ペレットを０．１％ＴＦＡに再懸濁し、５ｍＬのシリンジスタイルのＳｅｐＰａｋ  Ｃ２カラムに通した。６０％アセトニトリル／４０％  ０．１％ＴＦＡを用いてタンパク質を溶出した。真空下で溶媒を除去した後、タンパク質画分を１００μＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウムに再溶解し、２μＬのＰＮＧａｓｅＦを用い、３７℃、シェーカー中で一晩脱グリコシル化した。１ｍＬの０．１％ＴＦＡを用いてクエンチした後、グリカンを、真空マニフォールドを使用して、１ｍＬのシリンジスタイルのＳｅｐＰａｋ  Ｃ１８カラムからフロースルー画分として収集した。乾燥グリカンを、４−ＡＢＥＥ（エチル４−アミノベンゾエート）を用い、乾燥グリカンに、２５μＬの誘導体化溶液（３５ｍＭ  ＡＢＥＥおよび１００ｍＭ  ２−ＰＢを含有する９０：１０  ＭｅＯＨ：ＨＡｃ）を添加することおよび６５℃で２時間インキュベートすることによって還元的アミノ化によって標識した。１ｍＬのエチルエーテルを添加すること、ボルテックス処理することおよびエーテルを廃棄することによって過剰のＡＢＥＥを除去した。第２のエーテル抽出後、試料を、ＳｐｅｅｄＶａｃ中に短時間入れて、あらゆる残存するエーテルを除去した。次いで、標識されたグリカンをＨＰＬＣで実施し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃ８逆相カラムから２０〜２５％の間のアセトニトリルで溶出した。この画分を真空乾燥させ、５０μＬの０．１％ＴＦＡに再溶解し、グリカン解析のためにＷａｔｅｒｓ  Ｑ−ＴＯＦ  ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳで実施した。誘導体化したグリカンは、Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳでのＣ１８逆相カラムから０．２％ギ酸中、約２０〜２５％アセトニトリルで溶出された。質量分析計は、ＭＳのみの様式で毎秒ｍ／ｚ１５０〜２０００でスキャンして、誘導体化グリカンプロファイルデータを獲得した。図１は、これらの結果をまとめており、胃腸洗浄液の画分中に存在する種々の糖タンパク質に由来するグリカン構造の相対的存在量のグラフを表す。図１に示されるように、いくつかの糖タンパク質に由来するグリカン構造は、鎖の末端切断と関連している特定の修飾を含む。これらの修飾は、細菌が、タンパク質からグリカンを消化し、消費し得ると知られるように、ＧＬＦ試料中に存在する細菌活性によるものであり得る。しかし、このような修飾はまた、疾患、特に、異常なグリコシル化が疾患と関係している癌と関連している可能性がある。
【０１４３】
前述の解析は、ＧＬＦを使用して得られた試料において多数のグリカンが検出され得るということを実証する。
【０１４４】
（実施例１０）
ＧＬＦを使用して得られた試料における代謝産物の検出
この解析では、代謝産物の、ＧＬＦを使用して得られた試料において検出される能力を評価した。ＧＬＦにおいて代謝産物を含めた標的分子を同定および解析するために、ヒト被験体にクエン酸マグネシウムベースの洗浄組成物を投与し、コール酸およびその他の胆汁酸塩などの代謝産物について得られたＧＬＦを解析した。得られたＧＬＦは、大腸内視鏡検査手順の一部として被験体から収集した。
【０１４５】
３ｍｌのＧＬＦを、最大速度で２０分間遠心分離し、０．１％ＴＦＡを用いて上清を酸性化した。上清をＣ１８  ＳＰＥカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ）にアプライし、３容量の０．１％ＴＦＡを用いて洗浄し、０．１％ＴＦＡ中の、５０％ＡＣＮを用いて溶出した。溶出物を、遠心凍結乾燥によって乾燥させ、５００μｌの０．１％ＴＦＡに再溶解した。
【０１４６】
データは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｑ−ＴＯＦ質量分析計でＬＣシステムからの入力を使用して獲得した。Ａ溶媒は、３％のＢおよび水中、０．２％のギ酸を含有していた。Ｂ溶媒は、３％のＡおよびアセトニトリル中、０．２％のギ酸を含有していた。溶媒は、Ｆｉｓｈｅｒ製のＨＰＬＣ等級とした。出発溶媒は、５％Ｂとし、５分間そのままとし、次いで、２５分までに４０％、３０分までに９０％に変更し、次いで、３６で５％に再設定した。ＭＳは、毎秒ｍ／ｚ１００ｍ／ｚ〜２０００の質量範囲にわたってスキャンした。データは、標準ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアを使用して獲得した。コール酸ピークをマークした溶出化合物が、図２にまとめられている。Ｏｒｂｉｔｒａｐ機器で、コール酸ピークが標準およびＭＳ／ＭＳデータを使用して同定された同様のピークのプロファイルが観察された。コール酸を含めた代謝産物が同定された。
【０１４７】
前述の解析は、ＧＬＦを使用して得られた試料において代謝産物が検出され得るということを実証する。
【０１４８】
用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、本明細書において、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義であり、包括的なものであるか、または制約がなく、さらなる、列挙されていない要素または方法工程を排除しない。
【０１４９】
本明細書において使用される成分の分量、反応条件などを表すすべての数は、用語「約」によって、すべての例において修飾されていると理解されるものとする。したがって、反対に示されない限り、本明細書に示される数的パラメータは、得られるよう捜し求められる所望の特性に応じて変わり得る近似値である。最低限でも、本願に優先権を主張する任意の出願における任意の請求項の範囲の同等物の原則の適用を制限しようとするものではなく、各数的パラメータは、有効桁の数字および普通の丸めのアプローチを考慮して解釈されなければならない。
【０１５０】
上記の説明は、本発明のいくつかの方法および材料を開示する。本発明は、方法および材料における修飾ならびに製造方法および装置における変更を受けやすい。このような修飾は、本明細書に開示された本発明のこの開示内容を考慮することまたはその実施から当業者には明らかとなろう。結果として、本発明が本明細書において開示された具体的な実施形態に制限されることは意図されず、本発明の真の範囲および趣旨内にあるすべての修飾および変更を網羅すると意図される。
【０１５１】
参考文献
以下の参考文献の各々は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【０１５２】
【化１】
2018201524.tif 000027
【０１５３】
【化２】
2018201524.tif 000028
【０１５４】
【化３】
2018201524.tif 000029
【０１５５】
【化４】
2018201524.tif 000030
【０１５６】
【化５】
2018201524.tif 000031
【０１５７】
それだけには限らないが、公開されたおよび公開されていない出願、特許および文献参照を含めた本明細書において引用されるすべての参考文献が、参照によりその全文が本明細書に組み込まれ、これによって本明細書の一部を成す。参照により組み込まれる刊行物および特許または特許出願が、本明細書に含有される開示内容と相反する限り、本明細書が、あらゆるこのような相反する材料を上回って優先するおよび／または上位にあるものとする。
【図１】
2018201524.tif 000032
【図２】
2018201524.tif 000033
【配列表】
2018201524000001.app
【外国語明細書】
2018201524000001.pdf