(57)【要約】      （修正有）【課題】フィラグリン、インボルクリン、ロリクリン、ヒスチダーゼ、ＳＰＲＲ１Ｂの産生を促進し、皮膚機能を正常化、シワ形成を抑制、肌荒れを防止、肌理正常化し、アトピー性皮膚炎等に有効な皮膚外用剤の提供。【解決手段】ユズの抽出物、好ましくはユズ果実をアルコール水溶液で抽出し、凍結乾燥することによる。【効果】前記外用剤は、シワ形成抑制、肌荒れ防止、肌理正常化、皮膚角化促進に効果がある。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユズの抽出物の１種以上を有効成分とするフィラグリン産生促進剤。
【請求項２】
ユズの抽出物の１種以上を有効成分とするインボルクリン産生促進剤。
【請求項３】
ユズの抽出物の１種以上を有効成分とするロリクリン産生促進剤。
【請求項４】
ユズの抽出物の１種以上を有効成分とするヒスチダーゼ産生促進剤。
【請求項５】
ユズの抽出物の１種以上を有効成分とするＳＰＲＲ１Ｂ産生促進剤。
【請求項６】
ユズの抽出物がユズの果実の抽出物である請求項１乃至５のいずれかに記載のフィラグリン産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、ロリクリン産生促進剤、ヒスチダーゼ産生促進剤、ＳＰＲＲ１Ｂ産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィラグリン、インボルクリン、ロリクリン、ヒスチダーゼ、ＳＰＲＲ１Ｂの産生を促進し、皮膚の角化を促進し、皮膚の水分を維持し、シワ形成抑制、肌荒れ防止、肌理正常化、アトピー性皮膚炎等の皮膚のトラブルを改善する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は体の最も外側に存在しており、細菌などの外界からの刺激に対するバリアとしての役割を有している。皮膚においては、表皮細胞が基底細胞から有棘細胞、顆粒細胞、さらには角層細胞へと約４週間かけて角化し、これらの細胞中で細胞間脂質やＮＭＦ（天然保湿因子）、さらにはコーニファイドエンベローブを形成することによってバリア機能を成し遂げている。
皮膚の加齢や外部環境の変化への不完全な角層の対応によって、シワの形成、肌理の不正常、荒れ肌等が起こるが、角層水分量の低下が重要な因子になっている。
角質の水分保持には天然保湿因子が関わっているがこの天然保湿因子の多くの部分がタンパク質の分解によって生じたアミノ酸が関わっている。
この天然保湿成分の主成分であるアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒に由来するフィラグリンが角質層内で分解することによって産生する。このフィラグリンは、表皮ケラチノサイトにおいてプロフィラグリンとして発現し、直ちにリン酸化し、ケラトヒアリン顆粒に蓄積する。その後脱リン酸、加水分解を経てフィラグリンへと分解され、角質層へと移行し、ケラチンフィラメントの凝集効率を高め、角質細胞の内部構築に関与する。近年、このフィラグリンが皮膚の水分保持に非常に重要かつ必要不可欠であること、及び乾燥などの条件によりフィラグリンの合成力が低下し、角質層におけるアミノ酸量が低下することが明らかになっている。
【０００３】
表皮細胞の角化過程において表皮顆粒層に存在するケラトヒアリン顆粒を構成するプロフィラグリンが角化する時に、脱リン酸化とプロテアーゼの作用で分解され、フィラグリンというタンパク質を遊離し、そのフィラグリンのアルギニン残基がペプチジルアルギニンデイミナーゼという酵素によってシトルリン残基になる等の修飾を受けて、フィラグリンが徐々にケラチン繊維の間からはずれ、分解されてＮＭＦ成分が作り出される。
また、フィラグリンの分解によって生じたヒスチジンからヒスチダーゼの作用によってtrans-ウロカニン酸が産生され、紫外線から皮膚を守る。
このようにフィラグリンの合成促進が角質の水分保持や紫外線からの防御機能に重要な役割を果たしている。
【０００４】
また、表皮は、角化細胞の分裂とその後の分化により、常に新しい角質細胞を作り出すことで、外界からの種々の刺激から皮膚を守る防御機能を有する。特に、角化細胞の分化過程において、有棘層から顆粒層にかけてインボルクリン等のタンパク質が発現し、角化細胞を包み込む不溶性の細胞膜様構造体であるコーニファイドエンベロープ（ＣＥ）を形成し、角質細胞の細胞骨格及び構造の安定性に寄与する。
しかし、様々な要因で表皮におけるインボルクリンの産生量が減少すると、コーニファイドエンベロープ（ＣＥ）形成が不完全な状態となり、角化が正常に行われなくなる。その結果、角質バリア機能及び皮膚の保湿機能が低下し、肌荒れや乾燥肌等の皮膚症状を呈するようになると考えられる。
このようなことから、角化細胞の表皮におけるインボルクリンの産生を高め、コーニファイドエンベロープの形成を促進して角化を正常化することによれば、乾燥や紫外線等の外部刺激に伴う皮膚バリア機能の低下を抑制し、肌の乾燥や肌荒れなど、様々な皮膚症状を予防・改善することができると考えられる。
【０００５】
また、ロリクリンは周辺帯(cornified cell envelope)の主要成分でありその発現はケラトヒアリン顆粒より始まり次第に周辺帯に組み込まれていく、周辺帯の構成タンパク質の重要な１つであり、天然保湿因子の形成をはじめ種々の角層機能に関わり、シワの形成、肌理の不正常、荒れ肌等の発生を抑制する。
勿論、アトピー性皮膚炎にも有効であり、さらに角質層の遊離アミノ酸量の低下が原因となって発症する皮膚疾患を予防及び／又は治療することができる。
【０００６】
ＳＰＲＲ１Ｂ（スモール・プロリン・リッチ・プロテイン）も周辺帯(cornified cell envelope)の主要成分であり正常な角化に関与しており、充分に機能していることが必要である。
このようにフィラグリン、インボルクリン、ロリクリン、ヒスチダーゼ、ＳＰＲＲ１Ｂの産生を促進することによって、皮膚機能を正常化し、シワ形成抑制、肌荒れ防止、肌理正常化、アトピー性皮膚炎等に有効な皮膚外用剤が得られる。
これらの産生を促進する物質はいくつか知られているが、充分に満足するものは得られていなかった。
【０００７】
ユズ（柚子、学名：Citrus junos）はミカン属の常緑小高木。柑橘類の1つで香辛料・薬味として使用されている。また、柚子湯として入浴時にも利用されている。さらに防腐効果、くま改善剤、ヒアルロン酸産生促進剤等の目的でも利用されている。（特許文献１〜３）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平０８−２９５６２１号公報
【特許文献２】特開２００１−０７２５６４号公報
【特許文献３】特開２００１−１５８７２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的はフィラグリン、インボルクリン、ロリクリン、ヒスチダーゼ、ＳＰＲＲ１Ｂの産生を促進することによって、皮膚機能を正常化し、シワ形成抑制、肌荒れ防止、肌理正常化、アトピー性皮膚炎等に有効な皮膚外用剤が得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らが鋭意検討した結果、ユズの抽出物が上記目的を達することがわかった。
ユズは特に果実の抽出物が効果が高いことも判明した。
ユズは、必要により乾燥を行い、抽出効率を考えると、細切，乾燥，粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。
乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。
前記抽出に用いる溶媒としては、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を用いる。
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
前記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。
なお、前記水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して３〜２０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して３〜１５質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水１０質量部に対して３〜２０質量部添加することが好ましい。
抽出に使用する有機溶媒の量は、原料となる植物に対して望ましくは５〜１００倍量程度、さらに望ましくは１０〜５０倍量程度が良い。さらに抽出効率を上げるため、抽出溶媒中で撹拌やホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
尚、抽出操作は１回のみの操作に限定されるものではない。抽出後の残渣に再度新鮮な溶媒を添加し、抽出操作を施すこともできるし、抽出溶媒を複数回抽出原料に接触させることも可能である。
必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良く、エバポレーターのような減圧濃縮装置や加熱による溶媒除去などにより、濃縮することができる。
また、この抽出物を合成吸着剤（ダイアイオンＨＰ２０やセファビースＳＰ８２５、アンバーライトＸＡＤ４、ＭＣＩｇｅｌＣＨＰ２０Ｐ等）やデキストラン樹脂（セファデックスＬＨ−２０など）、限外濾過等を用いてさらに精製することも可能である。
【００１１】
本発明の製剤は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、皮膚外用剤として用いるのが好ましい。皮膚外用剤には、皮膚化粧料、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。
【００１２】
また、本発明の製剤には、上記成分の他に医薬品や化粧品の各種製剤において使用されている界面活性剤、油性成分、保湿剤、高分子化合物、紫外線吸収剤、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、防腐剤、ビタミン類、色素、香料、水等を配合することができる。
【００１３】
上記界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、非イオン性、天然、合成のいずれの界面活性剤も使用できるが、皮膚に対する刺激性を考慮すると非イオン性のものを使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキルグリコシド等が挙げられる。
【００１４】
油性成分としては、油脂類、ロウ類、炭化水素類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、精油類、シリコーン油類などを挙げることができる。油脂類としては、例えば大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド等の合成トリグリセリド等が；ロウ類としては、例えばカルナバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等が；炭化水素類としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、ブリスタン等が；高級脂肪酸類としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等が；高級アルコール類としては、例えばラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール等が；エステル類としては、例えばオクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル等が；精油類としては、例えばハッカ油、ジャスミン油、ショウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、ショウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、タイム油、ペパーミント油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等が；シリコーン油類としては、例えばジメチルポリシロキサン等が挙げられる。これら上述の油性成分は一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、このうち特にミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド、ラノリン、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、イソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、オクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、ミリスチレン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ハッカ油、トウヒ油、ケイ皮油、ローズ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ゲラニオール、ピネン、リモネン、ジメチルポリシロキサンを使用することが好ましい。
【００１５】
本発明の製剤には、さらに下記のような成分を配合することができるが、その成分もこれらに限定されるものではない。
色素類；黄色４号、青色１号、黄色２０２号等の厚生省令に定められたタール色素別表Ｉ及びIIの色素、クロロフィル、リボフラビン、クロシン、紅花、アントラキノン等の食品添加物として認められている天然色素等。
ビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等。
その他；殺菌剤、防腐剤、その他製剤上必要な成分等。
【００１６】
本発明の製剤は、前記必須成分に必要に応じて前記任意成分を加え、常法に従って製造することができ、クリーム、乳液、化粧水等の形態とすることができる。
【実施例】
【００１７】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００１８】
実施例１
ユズの果実（青ユズ）１００ｇを細断したのち５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液１リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２４時間抽出後、濾過（Ｎｏ５Ｃ）し、エバポレートしたのち、これを凍結乾燥した。
【００１９】
確認試験
２継代目のヒト包皮由来表皮細胞（クラボウ）を５０−７０％コンフルエントとなるようＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（フェノールレッド不含）で培養後、前日にカルシウム濃度を１．８ｍＭに変更したＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地に、実施例を添加し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で２日間培養した。
【００２０】
＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からの Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離後、illustra RNA Mini RNA Isolation Kit（GE Healthcare社）を用い、GE Healthcare社の添付マニュアルに従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。
【００２１】
＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
２．５μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使い、ＭＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＲＮａｓｅＨ−（東洋紡社）を用い、東洋紡社推奨プロトコール（ＴＯＹＯＢＯ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＦＯＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ２００８／２００９のページ１−４２）に従いＲＴ反応を行なった。
リアルタイムＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用い、以下のように実施した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を用い（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，東洋紡社）、７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの操作マニュアル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝３）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。なお、対象遺伝子はフィラグリン、ロリクリン、インボルクリン、ヒスチダーゼ、ＳＰＲＲ１Ｂである。
【００２２】
確認試験の結果を図１及び図２に示す。
【００２３】
また、実施例を配合した外用剤を作成し、実際に使用してみた結果、シワ形成抑制、肌荒れ防止、肌理正常化、皮膚角化促進に改善がみられた。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例１を作用濃度０．２％で作用させたときの遺伝子発現量を、コントロールを１として示した。左より、ロリクリン、フィラグリン、ヒスチダーゼの遺伝子発現量である。
【００２５】
【図２】実施例１を作用濃度０．２％で作用させたときの遺伝子発現量を、コントロールを１として示した。左より、インボルクリン、ＳＰＲＲ１Ｂの遺伝子発現量である。
【図１】
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【図２】
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