(57)【要約】【課題】  反応液の通気により、反応器からの反応液の溢出や飛沫同伴による反応液の減少による歩留まり低下を生じさせることなく、効率良く反応液を製造することができる方法を提供すること。【解決手段】  生体触媒の存在下に水溶性化合物を製造する工程、マイクロ・ナノバブル発生装置を用いて、得られた水溶性化合物を含む反応液に気体を吹き込む工程、及び通気により反応液に形成された泡沫層を除去する工程を含む、水溶性化合物の製造方法。水溶性化合物としては、アミド化合物又はカルボン酸化合物が好ましく、アクリルアミドがより好ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体触媒の存在下に水溶性化合物を製造する工程、
マイクロ・ナノバブル発生装置を用いて、得られた水溶性化合物を含む反応液に気体を吹き込む工程、及び
通気により反応液に形成された泡沫層を除去する工程
を含む、水溶性化合物の製造方法。
【請求項２】
水溶性化合物がアミド化合物又はカルボン酸化合物である、請求項１記載の水溶性化合物の製造方法。
【請求項３】
水溶性化合物がアクリルアミドである、請求項１記載の水溶性化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性化合物の製造方法に関する。より詳細には、生体触媒を使用した水溶性化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
菌体、固定化菌体または固定化酵素等の生体触媒を用いる反応は、プロセスが簡略化できること、あるいは高純度の生成物が得られること等から、近年多くの化合物の製造に用いられている。しかし、そのようにして得られた化合物には、生体触媒由来の不純物（タンパク質等）が混入しているため、当該不純物を除去するためには精製工程が必須である。
【０００３】
発明者らは、これまでに、生体触媒による反応を行った後の反応液中に気体を泡状に吹き込み、泡表面に不純物を付着、浮上させ、形成される泡沫層を除去することにより、反応液中の不純物を除去する方法を提案している（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
このような精製方法は、簡便且つ反応生成物への悪影響が無い点で画期的であった。しかしながら、上記の方法では、ガラスの焼結体や多孔質ポリエチレンを通して気体を吹き込むことにより泡を形成することから、泡の大きさは目視で確認ができる程度に大きく（泡径は、少なくとも１００μｍ以上）、しかも比較的多量の泡（気体）を吹き込む必要があった。
【０００５】
そのため、反応液の液面上に厚い泡沫層が形成され、泡沫層とともに反応液が反応器からあふれ出るトラブルが発生したり、飛沫同伴により反応液も除去してしまったりする（歩留まり低下）という問題があった。
【０００６】
一方、近年、容易に微細な泡（例えば、マイクロ・ナノバブル：一般に、泡径は数百
ｎｍ〜数十μｍ以下。）を形成する方法が、種々提案されている。マイクロ・ナノバブルは、その比表面積の大きさ以外に、泡表面が帯電すること、生理活性効果を有すること、圧塊（液体中への溶解により泡が微小化、消滅すること）時に高温高圧場を形成すること等、特有の性質を有すると言われている。これらの性質を利用して、生体（細胞、菌体等）利用の分野でも様々な提案が成されている（例えば、特許文献２、特許文献３参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−０７８７４９号公報
【特許文献２】特開２０１２−０１６３１６号公報
【特許文献３】特開２００７−３１２６８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、生体触媒反応由来の不純物を除去するためにマイクロ・ナノバブルを利用する例はこれまでに報告されていない。
【０００９】
本発明の主な目的は、反応器からの反応液の溢出や飛沫同伴による反応液の減少による歩留まり低下を生じさせることなく、効率良く反応液を製造することができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
このような状況に鑑み、鋭意検討した結果、生体触媒による反応で得られた反応液中に気体を微細な泡状（マイクロ・ナノバブル）で吹き込むことにより上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］生体触媒の存在下に水溶性化合物を製造する工程、マイクロ・ナノバブル発生装置を用いて、得られた水溶性化合物を含む反応液に気体を吹き込む工程、及び通気により反応液に形成された泡沫層を除去する工程を含む、水溶性化合物の製造方法。
［２］水溶性化合物がアミド化合物又はカルボン酸化合物である、［１］記載の水溶性化合物の製造方法。
［３］水溶性化合物がアクリルアミドである、［１］記載の水溶性化合物の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、従来よりも格段に少ない気体吹き込み量で、従来と同等以上の不純物除去効果を得ることができる。また、本発明により、反応液の液面上に高い泡沫層が形成し、反応器からあふれ出るトラブルの発生や、飛沫同伴により反応液が減少するという課題（歩留まり低下）が解決され、生産性を向上しながら、従来と同等以上の高純度の製品を得ることが可能となった。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（１）生体触媒の存在下に水溶性化合物を製造する工程
本発明における生体触媒により製造する水溶性化合物としては、微生物や酵素触媒を使用して（バイオテクノロジーの技術を用いて）製造できる化合物であれば、特には限定されない。
【００１４】
当該水溶性化合物としては、アミド化合物やカルボン酸化合物を挙げることができる。アミド化合物は特に限定されないが、重合体の原料となる不飽和結合を有するアミド化合物は産業上の利用価値が高い。そのような不飽和結合を有するアミド化合物としては、例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド、ニコチンアミド、５−シアノバレロアミド、クロトンアミド、チグリックアミド、２−ペンテン酸アミド、３−ペンテン酸アミド、４−ペンテン酸アミド、２−ヘキセン酸アミド、３−ヘキセン酸アミド、５−ヘキセン酸アミド等のモノアミド化合物、フマル酸ジアミド、マレイン酸ジアミド、シトラコン酸ジアミド、メサコン酸ジアミド、イタコン酸ジアミド、２−ペンテン二酸ジアミド、３−ヘキセン二酸ジアミド等のジアミド化合物などが挙げられる。好ましくは、モノアミド化合物であり、より好ましくは、アクリルアミド、メタクリルアミド、ニコチンアミド及び５−シアノバレロアミドである。カルボン酸化合物としては、例えば、Ｓ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸等である。これらの中でも、本発明の効果を奏しやすいという観点から、アクリルアミド、ニコチンアミド、５−シアノバレロアミド、Ｓ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸が好ましく、アクリルアミドがより好ましい。反応液中の水溶性化合物の濃度は限定されず、製造条件や製造規模等に応じて適宜選択することができる。
【００１５】
生体触媒とは、菌体若しくはその処理物、または目的とする反応を触媒する酵素を含有する菌体若しくは酵素自体を包括法、架橋法、担体結合法等で固定化したものである。固定化担体としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、寒天、ゼラチン等が例示できる（特開２００１−０７８７４９号公報参照）。
【００１６】
生体触媒と基質とを反応させる条件も特には限定されず、基質の種類、生体触媒の種類、製造規模等に応じて適宜選択することができる。例えば、固定層、移動層、流動層、撹拌槽等のいずれの反応装置を用いて反応を行っても良く、また、回分反応を行っても連続反応を行っても良い。連続反応を行う場合には、２つ以上の撹拌槽を連続的に繋げた多槽連続撹拌槽が好ましい。
【００１７】
（２）マイクロ・ナノバブル発生装置を用いて通気する工程
本発明では、上記反応液にマイクロ・ナノバブル発生装置を通して通気する、すなわち、反応液にマイクロ・ナノバブルを導入する。反応液に通気する方法としては、回分式でも連続式でもいずれの方法も可能である。反応液に吹き込む気体としては、目的とする水溶液化合物に対して不活性なものであれば如何なるものでも構わないが、空気、窒素、酸素、二酸化炭素、アルゴン等が挙げられ、費用、運転の容易さ等の観点から、空気や窒素を用いることが好ましい。
【００１８】
気泡の大きさ（直径）が非常に小さい場合、正確に測定することが困難である場合が多いが、概ね以下のように定義することができる。本発明で使用するマイクロ・ナノバブルには、マイクロバブル、マイクロナノバブル、ナノバブルを含む。マイクロバブルとは、気体発生時の気泡の直径が１０μｍ〜数十μｍであり、マイクロナノバブルとは、気体発生時の気泡の直径が数百ｎｍ〜１０μｍであり、ナノバブルとは、気体発生時の気泡の直径が１ｎｍ〜数百ｎｍである。
【００１９】
また、本明細書では、マイクロ・ナノバブルを以下のようにも定義することができる。マイクロ・ナノバブルの大きさ（の目安）として、反応液が透明な場合、その透明な反応液の液深が１ｍ程度の場所から微細泡を導入した場合に、微細泡の導入を停止した瞬間から反応液が透明になるまでの時間（すなわち、導入した微細泡のほぼ全てが上昇する等して、反応液の色が透明に戻るまでの時間。泡の大きさが小さいほど、その時間は長くなる。）が、少なくとも１分以上、好ましくは３分以上、より好ましくは５分以上、さらに好ましくは１０分以上となるように調整する。
【００２０】
マイクロ・ナノバブルを導入することにより、例えば連続的に通気処理する場合にも、反応液に通気する気体の量を、反応液流量の０．５〜５倍量程度に抑制することが可能になる。
【００２１】
使用するマイクロ・ナノバブル発生装置の種類は限定されない。例えば、エジェクターノズル方式のマイクロ・ナノバブル発生装置が簡便にマイクロ・ナノバブルを導入することが可能であるため好ましく、その中でも、エンバイロ・ビジョン社製の「ＹＪノズル」や、ＯＫエンジニアリング社製の「ＯＫノズル」等がより好ましい。その他のマイクロ・ナノバブルを発生させる方式としては、膜を介して気体を微細化する方式（ＳＰＧテクノ社製のＳＰＧ膜を使用する方法等）や、多孔質セラミックを介して気体を微細化する方式（安斎管鉄社製の多孔質セラミックを使用する方法等）等が例示できる。
【００２２】
反応液にマイクロ・ナノバブルを通気させる気体の量や通気する時間も特には限定されず、製造する水溶性化合物の種類や反応の規模等に応じて適宜選択することができる。
例えば、エジェクターノズル方式のマイクロ・ナノバブル発生装置を使用するにおいては、選択したマイクロ・ナノバブル発生装置に応じて、通気できる気体の量（最大）が決定する。
ポンプの流量（反応液の循環流量）が４０Ｌ／分の場合、マイクロ・ナノバブル発生装置：ＹＪ−７（エンバイロ・ビジョン社製）を使用して通気する気体の量は1〜２０Ｌ／
分となり、ポンプの流量（反応液の循環流量）が８０Ｌ／分の場合、マイクロ・ナノバブル発生装置：ＹＪ−９（エンバイロ・ビジョン社製）を使用して通気する気体の量は1〜
２８Ｌ／分となり、ポンプの流量（反応液の循環流量）が１８０Ｌ／分の場合、マイクロ・ナノバブル発生装置：ＹＪ−１５（エンバイロ・ビジョン社製）を使用して通気する気体の量は1〜５０Ｌ／分となり、ポンプの流量（反応液の循環流量）が３００Ｌ／分の場
合、マイクロ・ナノバブル発生装置：ＹＪ−２１（エンバイロ・ビジョン社製）を使用して通気する気体の量は1〜９０Ｌ／分となる。コスト低減の観点から、いずれも、所望の
結果（不純物の除去）が得られる最低の気体量とすることが望ましい。
【００２３】
なお、本工程を行う前に、必要に応じて、生体触媒を除去することも可能である。後の工程でより効率良く反応液を精製することができるからである。生体触媒を除去する方法も限定されず、例えば、ろ過や遠心分離等の技術を使用することができる。
【００２４】
（３）反応液に形成した泡沫層を除去する工程
上述したように、反応液に通気することにより、反応液の液面付近に泡沫層が形成され、本発明ではその泡沫層の一部または全部を除去する。泡沫層の除去の程度は、目的とする製品のスペック等に応じて適宜選択することができる。形成された泡沫層の除去方法としては、泡沫層が除去できれば限定されない。反応液と泡沫層の界面を調節して泡沫層の一部をオーバーフローさせる方法、反応槽の底面又は側面の下の方から反応液を抜き出して泡沫層を含まないようにする方法、反応液の下方（底面に近い部分）から反応液を採取して泡沫層を含まないようにする方法、泡沫層を気流により反応液から押し出す方法、泡沫層を吸引する方法、泡沫層を掻き取る方法等が例示できる。泡沫層を除去する処理槽は、１つでもよいし、直列、または並列に複数繋いで使用することも可能である。除去された泡沫層が反応液を含む場合、泡成分を除いた反応液は必要に応じて泡沫層が除去された反応液に戻すことも可能である。
【実施例】
【００２５】
以下、本明細書において、「％」は「質量％」を表すものとする。
【００２６】
＜泡立ち性と泡消え性の評価方法＞
反応液に空気を吹き込んだ後、反応液の下層部分（泡沫層は上部に形成されるため、これを含まないように）をサンプリングすることで泡沫層を除去し（精製処理）、該反応液を５００ｍＬのガラス製メスシリンダーに３１５ｍＬ投入した。その後、反応液の温度を２５℃±０．５℃に、０．１Ｍ硫酸水溶液を添加することにより反応液のｐＨを６．５±０．５に調整した。
【００２７】
上記の反応液に、木下式ガラスろ過器ボールフィルター（木下理科工業社製、品番：５０４Ｇ、タイプ：Ｎｏ．２（精密）、球径：２５ｍｍφ）を通して、８００ｍＬ／分（０．０５ＭＰａ）で空気を導入し、泡の体積が安定したら、目視で泡の体積を測定し、「泡立ち性」［ｍＬ］として評価した。
【００２８】
また、空気の導入を停止してから、泡が消えるまでの時間を、「泡消え性」［ｓ］として評価した。
【００２９】
＜反応液の調製＞
（生体触媒の調製）
ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス ロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）を、グルコース２％、尿
素１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、塩化コバルト０．０５％を含む培地（ｐＨ７．０）により３０℃で５０時間、好気的に培養した。培養した微生物を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄して菌体懸濁液（乾燥菌体で１５％）を調製した。
【００３０】
アクリルアミド、メチレンビスアクリルアミド及び２ージメチルアミノプロピルメタクリルアミドが、それぞれ３０％、１％、４％となるようにモノマー混合水溶液を調製した。続いて、菌体懸濁液、モノマー混合水溶液、１０％のＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン水溶液、１０％の過硫酸アンモニウム水溶液を、それぞれ、５Ｌ／ｈｒ、２Ｌ／ｈｒ、０．１Ｌ／ｈｒ、０．１Ｌ／ｈｒで順々にラインミキシングし、その流出液を３００×３００×３０ｍｍのバットに次々と受け、そのバット上で重合させた。
【００３１】
前述の方法で調製したシート状の菌体固定化物を、ナイフで０．５ｍｍ角程度に細かく裁断し固定化菌体粒子を得た。この固定化菌体粒子を、０．１質量％のアクリル酸ナトリウム水溶液中（ｐＨ７．０に調整）で流動化させつつ通液洗浄し、固定化菌体触媒を得た。
【００３２】
（固定化菌体によるアクリロニトリルからアクリルアミドへの反応）
ジャケット付き反応槽に、０．２ｇ／Ｌのアクリル酸ナトリウム水溶液３５１０ｋｇ、固定化菌体触媒３ｋｇを添加し、ｐＨ７．０、温度１０℃に制御しながら、撹拌、混合した。これに、アクリロニトリル濃度が常に２質量％となるように、アクリロニトリルを連続的にフィードし、反応生成物であるアクリルアミドの濃度が４０質量％となるまで蓄積反応を行った。反応終了後、目開き３００μｍの金網を用いて固定化菌体を分離し、反応液を得た。
【００３３】
＜実施例１＞
内径：３００ｍｍ、高さ：２．３ｍの、アクリル製円筒状の処理槽に、上記の反応で得た反応液を、液面高さ：１．８ｍとなるように仕込んだ。
【００３４】
処理槽の最下部に、反応液を処理槽から抜き出して戻すための２０Ａ配管と遠心ポンプを設置し、マイクロ・ナノバブル発生装置：ＹＪ−７（エンバイロ・ビジョン社製）を使用して、遠心ポンプの流量（反応液の循環流量）を４０Ｌ／分（ｍｉｎ）、気体（空気）量を３Ｌ／ｍｉｎ、処理時間を０．５時間（ｈｒ）とした。
【００３５】
微細泡の処理槽への導入を停止してから処理槽内の反応液が透明になるまでの時間は、概ね１５〜２０分であった。
【００３６】
処理槽の最下部より内容液のサンプリングを行い、「泡立ち性」と「泡消え性」の評価を行ったところ、泡立ち性は５０ｍＬ、泡消え性は５秒（ｓ）であった。処理条件及び結果を表１に示した。
【００３７】
＜実施例２＞
処理時間を１時間とした以外は、実施例１と同様に実験を行った。その結果、泡立ち性は３０ｍＬ、泡消え性は４秒であった。また、微細泡の処理槽への導入を停止してから処理槽内の反応液が透明になるまでの時間は、概ね１５〜２０分であった。処理条件及び結果を併せて表１に示した。
【００３８】
＜実施例３＞
処理時間を１．５時間とした以外は、実施例１と同様に実験を行った。その結果、泡立ち性は２０ｍＬ、泡消え性は２秒であった。また、微細泡の処理槽への導入を停止してから処理槽内の反応液が透明になるまでの時間は、概ね１５〜２０分であった。処理条件及び結果を併せて表１に示した。
【００３９】
＜実施例４＞
気体量を１０Ｌ／ｍｉｎとした以外は、実施例１と同様に実験を行った。その結果、泡
立ち性は２０ｍＬ、泡消え性は２秒であった。また、微細泡の処理槽への導入を停止してから処理槽内の反応液が透明になるまでの時間は、概ね１５〜２０分であった。処理条件及び結果を併せて表１に示した。
【００４０】
＜実施例５＞
処理時間を１時間とした以外は、実施例４と同様に実験を行った。その結果、泡立ち性は２０ｍＬ、泡消え性は２秒であった。また、微細泡の処理槽への導入を停止してから処理槽内の反応液が透明になるまでの時間は、概ね１５〜２０分であった。処理条件及び結果を併せて表１に示した。
【００４１】
＜実施例６＞
処理時間を１．５時間とした以外は、実施例４と同様に実験を行った。その結果、泡立ち性は２０ｍＬ、泡消え性は２秒であった。また、微細泡の処理槽への導入を停止してから処理槽内の反応液が透明になるまでの時間は、概ね１５〜２０分であった。処理条件及び結果を併せて表１に示した。
【００４２】
＜比較例１＞
マイクロ・ナノバブル発生装置の変わりに、エアストーン（キング砥石株式会社製、いぶきエアストーン５０ｍｍφ丸）を使用して空気（大きな泡：目視より、少なくとも１ｍｍ以上）を処理槽に導入した以外は、実施例４と同様に実験を行った。
【００４３】
泡の処理槽への導入を停止してから処理槽内の反応液が透明になるまでの時間は、概ね数秒〜１０秒であった。反応液も泡（泡沫層）もオーバーフローしてしまい、泡立ち性は測定できなかった。泡消え性は２０００秒以上であった。処理条件及び結果を併せて表１に示した。
【００４４】
【表１】
2018201461.tif 000002