(57)【要約】      （修正有）【課題】微弱なラマン散乱光を検出することによる皮膚疾患を診断、検出又は観測する方法を提供する。【解決手段】患者の対象部位に特定の波長を有するレーザー光を照射し、そこから得られる蛍光ピーク値及び散乱光ピーク値を正常部位から得られる対応するピーク値を比較することによるピークの変動に基づいて診断する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における皮膚疾患の診断、検出又は観測を補助する方法であって、以下：
（ａ）患者の対象部位に、可視光及び／又は近赤外光であるレーザー光を照射するステップ；
（ｂ）前記対象部位から放出される蛍光及び／又は散乱光を分光検出器で受信し、蛍光ピーク及び／又は散乱光ピークを特定するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で特定されたピークと、患者における対象部位とは異なる正常部位で得られた対応するピークとを比較し、以下の場合に、対象部位が皮膚疾患であると判断するステップ
（ｉ）可視光のレーザー光を照射した場合に、対象部位においては、正常部位における１，５００〜２，５００ｃｍ−１の蛍光ピーク値より低下し、５，０００〜６，０００ｃｍ−１の散乱光ピーク値より低下する；及び／又は
（ｉｉ）近赤外光のレーザー光を照射した場合に、対象部位においては、正常部位の８００〜８５０ｃｍ−１の散乱光ピークが７５０〜８００ｃｍ−１にシフトする
を含む、上記方法。
【請求項２】
可視光の波長が４８８ｎｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
近赤外光の波長が７８５ｎｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
皮膚疾患が、悪性黒色腫、老人性色素斑、日光角化症、雀卵斑、老人性黒子、表皮母斑、日光角化症、母斑、爪の色素性疾患、脂漏性角化症、ボーエン病、基底細胞癌、パジェット病、又は色素沈着性有棘細胞癌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
対象部位における蛍光ピーク値が、正常部位の蛍光ピーク値と比較して５〜１００％減である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
対象部位における散乱光ピーク値が、正常部位の散乱光ピーク値と比較して５〜１００％減である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者における皮膚疾患を診断、検出又は観測する方法、あるいは該方法を補助する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性黒色腫の診断は、皮膚科臨床医の目視による診断から始まり、悪性が疑われた場合には組織を採取・固定した標本の病理診断（生検）によって確定診断が行われている。目視による診断は定量性に欠け、経験の浅い医師が行った場合は過少評価・過大評価を生じる可能性がある。また、生検による確定診断は、特異性は高いが、検体採取の際に腫瘍細胞の血管内流出〜遠隔転移のリスクがある。そこで、非侵襲的に悪性黒色腫の診断を行うことが可能な診断方法が望まれる。
【０００３】
これまで、皮膚の性状を調べるデバイスとしてダーモスコープが存在するが、基本的には、肉眼で所見を確認するものであり、それを使用する医師の熟練度が要求される。また、ラマン散乱光分析を生体組織に応用する試みがなされてきたが、多くは摘出・固定された標本を対象としており、生体から直接ラマン散乱光分析を行った研究例は少ない（特許文献１、非特許文献１、及び非特許文献２）。その理由として、（１）極めて微弱なラマン散乱光を検出するには大型の高感度検出器が必要であること、（２）微弱なラマン散乱光が生体に多く含まれる水分によって減弱したり、干渉を受けたりすること、（３）従来のラマン散乱光分析装置が顕微鏡型を主体としており、簡便性に欠けることなどが挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１５−５２６１３５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋｏｎｇ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１１０，ｐ．１５１８９−１５１９４（２０１３）
【非特許文献２】Ｏｒｒｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．，ｖｏｌ．１，ｐ．１−１２（２０１７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、光ファイバー型プローブを皮膚に直接当てることにより、微弱なラマン散乱光を効率良く皮膚疾患を診断、検出若しくは観測できる方法、又は該方法を補助する方法を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、患者の対象部位に特定の波長を有するレーザー光を照射し、そこから得られる蛍光ピーク（値）及び散乱光ピーク（値）を正常部位から得られる対応するピーク（値）を比較することによるピークの変動に基づいた診断等の方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、悪性黒色腫を皮内に移植されたマウスにおいて、腫瘍部と非腫瘍部（正常皮膚）にレーザー（短波長４８８ｎｍ及び長波長７８５ｎｍ）を照射し、散乱光を分光分析器を通して測定した場合、各波長のレーザー光による照射に基づいて、非腫瘍部と比較して、腫瘍部における蛍光の減弱、及び散乱光の消失及びシフトが観察されたことに基づいて、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］患者における皮膚疾患の診断、検出又は観測を補助する方法であって、以下：
（ａ）患者の対象部位に、可視光及び／又は近赤外光であるレーザー光を照射するステップ；
（ｂ）前記対象部位から放出される蛍光及び／又は散乱光を分光検出器で受信し、蛍光ピーク及び／又は散乱光ピークを特定するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で特定されたピークと、患者における対象部位とは異なる正常部位で得られた対応するピークとを比較し、以下の場合に、対象部位が皮膚疾患であると判断するステップ
（ｉ）可視光のレーザー光を照射した場合に、対象部位においては、正常部位における１，５００〜２，５００ｃｍ−１の蛍光ピーク値より低下し、５，０００〜６，０００ｃｍ−１の散乱光ピーク値より低下する；及び／又は
（ｉｉ）近赤外光のレーザー光を照射した場合に、対象部位においては、正常部位の８００〜８５０ｃｍ−１の散乱光ピークが７５０〜８００ｃｍ−１にシフトする
を含む、上記方法。
［２］可視光の波長が４８８ｎｍである、上記［１］に記載の方法。
［３］近赤外光の波長が７８５ｎｍである、上記［１］に記載の方法。
［４］皮膚疾患が、悪性黒色腫、老人性色素斑、雀卵斑、老人性黒子、表皮母斑、日光角化症、母斑、爪の色素性疾患、脂漏性角化症、ボーエン病、基底細胞癌、パジェット病、又は色素沈着性有棘細胞癌である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］対象部位における蛍光ピーク値が、正常部位の蛍光ピーク値と比較して５〜１００％減である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］対象部位における散乱光ピーク値が、正常部位の散乱光ピーク値と比較して５〜１００％減である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の診断等の方法は、皮膚疾患、例えば、悪性黒色腫に対して、皮膚科専門医でなくとも診断等が可能にすることができ、特に、早期発見及び治療が望まれる悪性黒色腫の早期診断等を可能にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】４８８ｎｍの緑色レーザーを用いた場合のマウス悪性黒色腫におけるラマン散乱光分析の結果を示す。
【図２】７８５ｎｍの近赤外レーザーを用いた場合のマウス悪性黒色腫におけるラマン散乱光分析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ラマン散乱光分析に基づく、皮膚疾患の診断、検出又は観測を可能にする方法を提供する。
【００１２】
１．対象疾患
本発明は、ラマン散乱光分析システムにより、皮膚疾患を診断、検出若しくは観測すること、又はこれらの補助することを目的とする。本明細書で使用するとき、「皮膚疾患」とは、皮膚の異常又は機能不全によって特徴付けられる疾患又は障害を意味する。特に、後述するラマン散乱光分析システムを用いた診断等に適した皮膚疾患としては、限定されないが、悪性黒色腫、老人性色素斑、雀卵斑、老人性黒子、表皮母斑、日光角化症、母斑（サットン母斑、クラーク母斑、スピッツ母斑、先天性色素細胞母斑、青色母斑など）、爪の色素性疾患、脂漏性角化症、ボーエン病、基底細胞癌、パジェット病、色素沈着性有棘細胞癌等が挙げられる。
【００１３】
本発明によれば、哺乳動物の皮膚疾患を診断、検出又は観測の対象とすることができる。ここで、「哺乳動物」としては、限定されないが、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が挙げられる。また、本明細書で使用するとき、「診断」とは、被験体（例えば、患者）における疾患、障害、状態などに関連する種々のパラメータを同定し、このような疾患、障害、状態の現状を判定することをいう。「検出」とは、被験体（例えば、患者）における疾患、障害、状態などに関連する種々のパラメータを同定することをいう。さらに、「観測」とは、医師又は検査技師等による目視や撮像など、皮膚疾患を視覚的に評価するという一般的な意味に限定されず、より具体的にはラマン散乱光の測定などによって皮膚疾患の程度を数値化して評価することも含む。
【００１４】
２．ラマン散乱光分析システム
本発明の皮膚疾患の診断等を補助する方法に使用されるラマン散乱光分析システムは、砲弾型プローブ、レーザー照射装置、分光器、及び検出器から構成される。
（１）ラマン散乱
本発明の皮膚疾患を診断する等の方法は、ラマン分光法に基づくラマン散乱光分析による。分析物を適切な光源で照射すると、大多数の反射した光子が入射光のエネルギーと同じエネルギー（周波数）で放出される（レイリー散乱）が、少数の光子は分子の振動による「ラマン散乱」として知られる、変化したエネルギーレベルで出現する。分析物の分子による光散乱が検出され、分子に特異的な振動スペクトルが得られる。結果として生じるラマンスペクトルは、分析物内の光吸収分子の化学的組成物及び構造の特徴を反映する。したがって、分析物によって異なるラマン応答を示し、各スペクトルは特定の分析物に対して特徴的であるため、ラマン散乱光を分析することにより、各種の皮膚疾患の診断等が可能になる。
【００１５】
（２）砲弾型プローブ
本発明の方法に使用されるラマン散乱光分析システムは、本発明者らによって開発された砲弾型プローブ（以下、単に「プローブ」と称することがある。）によって特徴付けられる。砲弾型プローブは、光源となるレーザー照射装置（後述）からのレーザーを皮膚に照射するために接続される照射ファイバーと、皮膚から反射されたラマン散乱光を採光し、分光器で検出するために接続される採光ファイバーとで構成された光ファイバー型プローブである。照射ファイバーと採光ファイバーの各本数と配置は、特に限定されないが、１本の照射ファイバーに対して、複数本、例えば、６本の照射ファイバーが照射ファイバーを取り囲むように束ねられた形状が好ましい。砲弾型プローブが、このような形状的特徴を有することにより、ラマン散乱光を効率良く検出することができるため、本発明の診断方法等が可能になる。
【００１６】
（３）レーザー照射装置
本発明において使用されるレーザー照射装置は、約３００〜２，０００ｎｍの波長出力を有するダイオードレーザーをレーザー光源とし、照射ファイバーに接続された上述したプローブの先端からレーザーを皮膚に照射するための装置であって、当該技術分野において一般的に使用されているものであってもよい。
【００１７】
（４）分光器
本発明において使用される分光器は、皮膚にレーザー光を照射後に放出される蛍光や散乱光を受信するための装置であって、受信後に検出器で各スペクトルを検出可能にするための装置であって、当該技術分野において一般的に使用されているものであってもよい。
【００１８】
（５）検出器
本発明において使用される検出器は、上記の通り、散乱光を分光後に得られるスペクトルを検出し、例えば、画像化することができる装置であって、当該技術分野において一般的に使用されているものであってもよい。例えば、微弱なラマン散乱光の分析を可能とする高感度ＣＣＤカメラであってもよい。
【００１９】
３．皮膚疾患の診断、検出及び観測方法
本発明は、患者における皮膚疾患を診断、検出又は観測する方法、あるいは該方法を補助する方法に関する。具体的には、本発明の方法は、以下のステップを含む。
（ａ）患者の対象部位に、可視光及び／又は近赤外光であるレーザー光を照射するステップ；
（ｂ）前記対象部位から放出される蛍光及び／又は散乱光を分光検出器で受信し、蛍光ピーク及び／又は散乱光ピークを特定するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で特定されたピークと、患者における対象部位とは異なる正常部位で得られた対応するピークとを比較し、以下の場合に、対象部位が皮膚疾患であると判断するステップ
（ｉ）可視光のレーザー光を照射した場合に、対象部位においては、正常部位における１，５００〜２，５００ｃｍ−１の蛍光ピーク値より低下し、５，０００〜６，０００ｃｍ−１の散乱光ピーク値より低下する；及び／又は
（ｉｉ）近赤外光のレーザー光を照射した場合に、対象部位においては、正常部位の８００〜８５０ｃｍ−１の散乱光ピークが７５０〜８００ｃｍ−１にシフトする。
【００２０】
上記の通り、本発明の方法は、患者の対象部位、すなわち、疾患であることが予測される皮膚の部位に、可視光及び／又は近赤外光を照射し、該部位から放出される蛍光及び／又は散乱光の各ピークを特定し、正常部位から得られる対応する各ピークを比較することにより、皮膚疾患を診断等することにより特徴付けられる。
【００２１】
本明細書で使用するとき、用語「可視光」とは、波長が３８０〜８３０ｎｍの光を意味するが、採用される波長は、特定のピークを検出するのに適したものであればよく、当業者であれば適宜選択することができる。可視光のレーザー光を照射した場合に、対象部位においては、限定されないが、正常部位における１，５００〜２，５００ｃｍ−１の蛍光ピーク値より低下し、５，０００〜６，０００ｃｍ−１の散乱光ピーク値より低下する。例えば、後述する実施例１に示されるように、励起光として４８８ｎｍの波長を用いた場合、正常皮膚では、励起光に近い波長成分の強い蛍光が認められたが、悪性黒色腫においては、対応する蛍光が減弱していたことが観察されている。さらに、励起光から離れた波長成分のラマン散乱光が認められたが、これに対応する散乱光は悪性黒色腫においては観察されていない。
【００２２】
上記のように、いずれかの皮膚疾患を有する対象部位では、正常部位と比較して、蛍光ピーク値及び／又は散乱光ピーク値の低下が認められるが、皮膚疾患の診断等において、このような対象部位における蛍光ピーク値及び／又は散乱ピーク値は、正常部位での対応するピーク値と比較して、５〜１００％減であることが好ましく、５〜１００％内に含まれる任意の範囲であってもよい。例えば、５〜９０％減、５〜８０％減、５〜７０％減、５〜６０％減、５〜５０％減、５〜４０％減、５〜３０％減、５〜２０％減、５〜１０％減、１０〜９０％減、１０〜８０％減、１０〜７０％減、１０〜６０％減、１０〜５０％減、１０〜４０％減、１０〜３０％減、１０〜２０％減、３０〜９０％減、３０〜８０％減、３０〜７０％減、３０〜６０％減、３０〜５０％減、３０〜４０％減などであってもよい。
【００２３】
用語「近赤外光」とは、波長が７００〜１５００ｎｍの光を意味するが、採用される波長は、特定のピークを検出するのに適したものであればよく、当業者であれば適宜選択することができる。近赤外光のレーザー光を照射した場合に、例えば、後述する実施例１に示されるように、７８５ｎｍの励起光を照射した場合、正常皮膚において励起光から波長が８００〜８５０ｎｍｃｍ−１遷移した部分に観察されたラマン散乱光のピークが、悪性黒色腫においては励起光から７５０〜８００ｃｍ−１遷移した部分へシフトした。
【００２４】
本発明の別の態様によれば、患者の対象部位に可視光及び／又は近赤外光であるレーザー光を照射した後に、対象部位から放出され、分光検出器で受信される蛍光及び／又は散乱光をマッピング又はモニタリングし、これと正常部位で得られるデータとを比較することによって、患者における皮膚疾患の診断、検出もしくは観測する、又はそれを補助する方法が提供される。この場合、蛍光及び／又は散乱光をマッピング又はモニタリングするための装置は、当該技術分野において一般的に使用されているものであってもよい。
【００２５】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
［実施例１］マウス悪性黒色腫モデルにおける皮膚病変部の測定
本実施例に使用されるマウスは全て、実験前後に食物と水を無制限に摂取できるようにした。本研究は、大分大学医学部の動物研究の倫理委員会によって承認されている。
（１）マウス悪性黒色腫モデルの作製
ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ）を日本チャールス・リバー株式会社から購入した。マウス悪性黒色腫細胞（Ｂ１６Ｆ１０；ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣから購入した）をマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃３５４２３０）とＰＢＳを１：１で混合した溶液中において、３×１０５個／ｍｌの細胞濃度で調整し、０．１ｍＬをヌードマウスの背部の皮内及び皮下に移植した。
【００２７】
（２）悪性黒色腫の測定
ラマン分光検出は、スペクトル安定化した短波長４８８ｎｍ（１６３−Ｃ１２ＫＷ、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌａｓｅｒ  Ｉｎｃ．）と長波長７８５ｎｍのダイオードレーザー（ＭＤＬ−７８５−３００ｍＷ−１６０８０２５２、Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ  Ｎｅｗ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いて行った。移植から１週間後の上記で作製したマウス悪性黒色腫モデルをペントバルビタールで麻酔し、レーザー（短波長と長波長の励起光）を１０秒間照射した。蛍光及び散乱光を分光分析器（ＭｉｃｒｏＲａｍ−ＴＥ−ＵＳ、株式会社ラムダビジョン）を用いて測定した。
【００２８】
４８８ｎｍの緑色レーザーをマウスに照射した場合の結果を図１に示す。正常皮膚に照射した場合、照射光からは２，０００ｃｍ−１の部分に最大ピークが検出され、さらに、５，５００ｃｍ−１にシフトした部分にはラマン散乱光に特徴的なピークが検出された。一方、悪性黒色腫に照射した場合、正常皮膚で検出された上記ピークは、消失又は減弱した。
【００２９】
次に、７８５ｎｍの近赤外レーザーをマウスに照射した場合の結果を図２に示す。正常皮膚に照射した場合、励起光から８００〜８５０ｎｍ遷移した部分にラマン散乱光のピークが検出された。一方、悪性黒色腫に照射した場合、ラマン散乱光のピークは、励起光から７５０〜８００ｎｍ遷移した。
【００３０】
本発明の診断等の方法は、皮膚疾患の早期発見及び治療のための早期診断を可能にする。
【００３１】
本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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