(57)【要約】【課題】マイクロ粒子を用いた測定方法を提供する。【解決手段】  ａ）マイクロ粒子に結合させた第一の認識物質、  ｂ）標識された第二の認識物質、及び  ｃ）検出対象物質（但し、第一の認識物質と第二の認識物質は、いずれも検出対象物質と結合しうるものである）を分散状態で接触させ、上述のａ，ｂ，及びｃが結合した複合体を形成させ、当該複合体と、結合しなかったｂとを、ろ過分離し、得られた当該複合体の標識を検出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）マイクロ粒子に結合させた第一の認識物質、
ｂ）標識された第二の認識物質、及び
ｃ）検出対象物質
（但し、第一の認識物質と第二の認識物質は、いずれも検出対象物質と結合しうるものである）
を分散状態で接触させ、
上述のａ，ｂ，及びｃが結合した複合体を形成させ、
当該複合体と、結合しなかったｂとを、ろ過分離し、
得られた当該複合体の標識を検出することを特徴とする、検出対象物質の検出方法。
【請求項２】
認識物質が検出対象物に対する抗体である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ粒子を分子間相互作用の検出に利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原と抗体の相互作用検出に、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）が多く用いられる。ＥＬＩＳＡにおけるサンドイッチアッセイは一般的に、抗体を固相化した水に不溶の担体を用い、固相抗体と抗原を反応させた後、固相抗体と異なる部位を認識する酵素標識抗体を反応させ、未反応の酵素標識抗体を洗浄（Ｂ／Ｆ分離）し、酵素反応基質を加えることで、酵素反応由来の基質生成物を検出する方法である。ＥＬＩＳＡにおいてバックグランドシグナルを低減させるためのＢ／Ｆ分離工程は欠かせないものであるが、洗浄・分離の工程は煩雑であり、洗浄廃液も生じるためＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ）などの簡易的な測定にＥＬＩＳＡを用いることは困難であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＥＬＩＳＡは高いシグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を有するが、煩雑なＢ／Ｆ分離工程が必要なため、ＰＯＣＴなどの簡易的な測定方法へは適応が困難であった。本発明の目的は、Ｂ／Ｆ分離工程を簡便にした相互作用検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題に鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する。
（１）ａ）マイクロ粒子に結合させた第一の認識物質、
ｂ）標識された第二の認識物質、及び
ｃ）検出対象物質
（但し、第一の認識物質と第二の認識物質は、いずれも検出対象物質と結合しうるものである）
を分散状態で接触させ、
上述のａ，ｂ，及びｃが結合した複合体を形成させ、
当該複合体と、結合しなかったｂとを、ろ過分離し、
得られた当該複合体の標識を検出することを特徴とする、検出対象物質の検出方法。
（２）認識物質が検出対象物に対する抗体である、（１）に記載の方法。
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００６】
本発明で使用するマイクロ粒子の大きさは溶液中で分散可能な大きさであり、ろ過時にフィルターを素通りしない大きさであればよい。具体的には、電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した際の平均の直径が好ましくは０．３μｍ〜５０μｍ、さらに好ましくは１μｍ〜５μｍの直径であればよい。本発明で使用するマイクロ粒子の形状は真球が好ましいが、棒状であってもよく、不可避量の凝集体が含まれていても問題ない。
【０００７】
本発明で使用するマイクロ粒子の材質は、ラテックス粒子、シリカ粒子、ポリ乳酸粒子、アクリル粒子などの粒子を例示することができるが、これらに限定されるものではない。マイクロ粒子の作製方法としては、ゾルゲル法などを例示することができ、市販されているものを購入して使用しても問題ない。
【０００８】
マイクロ粒子への認識物質の固定化方法としては、マイクロ粒子上に物理的に吸着させてもよいし、粒子表面に官能基を有する粒子を用いて化学結合により固定化してもよい。例えば、表面にカルボキシ基を有するマイクロ粒子を使用する場合、ＥＤＣ／ＮＨＳにより表面官能基を活性エステルへと変化し、認識物質に存在するアミノ基と反応させてもよい。
【０００９】
本発明で使用する認識物質は、構築する反応系によって適宜選択することができ、検出対象物質を認識する物質であればよく特に限定されない。クラウンエーテルやシクロデキストリンなどの包接分子、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、レクチン、抗体などのタンパクが例示できるが、特に抗体が好ましい。認識物質は、物理吸着や化学結合、又は何らかのタグを介してマイクロ粒子に結合すればよい。本発明では、第一の認識物質と第二の認識物質とを用いるが、それらが検出対象物質に対して同時に結合状態をとりうる限り、それらは同一であっても異なっていてもよい。
【００１０】
標識物質としては、金コロイド、色素、蛍光色素、微粒子、蛍光微粒子、酵素などをあげることができ、それら標識物質に応じた検出方法で検出すればよい。もちろん感度を高めるために通常知られている方法を併用することも可能である。
【００１１】
検出対象物質に関しては、特に限定はなく、例えば、抗原、タンパク質、低分子有機化合物、ウイルス、細菌、細胞等を例示することができる。
【００１２】
本発明では、まず、
ａ）マイクロ粒子に結合させた第一の認識物質、
ｂ）標識された第二の認識物質、及び
ｃ）検出対象物質
を溶液中で分散状態で接触させ、ａ，ｂ，及びｃが結合した複合体を形成させる。このときの接触順序には特に限定はなく、順次接触させてもよく、また同時に接触させてもよい。好ましくは、ａ、ｂ、ｃを同時に接触させて結合させた後、結合しなかったｃをろ過分離して除去するという順序であり、優れた感度を有するため好ましい方法である。
【００１３】
また、マイクロ粒子の分散性を高めるために、検出系に陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤等を添加してもよい。
【００１４】
認識物質と検出対象物質との反応時間は、認識物質の結合力、マイクロ粒子の大きさや分散度によって異なるが、通常１０分以下、好ましくは３分以下、さらに好ましくは１分以下である。
【００１５】
次いで、上述のａ，ｂ，及びｃが結合した複合体と、結合しなかったｂとを、ろ過分離する。ろ過の方法は特に限定されず、自然ろ過、減圧ろ過、加圧ろ過、遠心ろ過等で問題ない。使用するろ過膜としては、ろ過の際に前述の複合体は通過せず、結合しなかったｂは通過するようなものを選択すればよい。たとえば通常のろ紙、ガラスファイバー、ＰＶＤＦなどの材料や、０．２２、０．４５、０．６マイクロメーターのポアサイズのフィルター等を例示することができるが、材質および膜厚は特に限定されない。
【００１６】
この後、ろ過分離された複合体の標識を検出することにより、検出対象物質を検出することができる。このときの検出は測定機器を用いて定量的に行ってもよいし、目視による定性的な検出を行ってもよく、第二の認識物質の標識方法に応じて適宜適当なものを選択すればよい。例えば、第二の認識物質が酵素で標識してある場合、酵素基質を添加し酵素反応生成物を検出すればよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、マイクロ粒子を用いる検出方法は、簡便にＢ／Ｆ分離を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１でＢＮＰ検出時のろ過膜の呈色度を示す図である。
【図２】図１の呈色度をイムノクロマトリーダーで測定した際のグラフである。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例によって具体的に示すが、本発明はこれに限定されない。
【００２０】
実施例１  抗体結合マイクロ粒子と金コロイド標識抗体でのＢＮＰ検出
第一の認識物質としてＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）の環状部位を認識する抗体（ＢＭ３３−２８、特開２０１２−１４０３３１号公報に記載）を用いた。ＢＭ３３−２８のマイクロ粒子への固定化方法を以下に記載する。
（１）白色マイクロ粒子（粒子径：３μｍ、表面修飾：‐ＮＨ２、ラテックス粒子、Ｍｉｃｒｏｍｅｒ製）懸濁溶液（５．６４×１０−１ｐＭ）１００μＬに５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．０）を２００μＬ加える。
（２）２５０ｍＭのＳＭ（ＰＥＧ）６（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）のＤＭＳＯ溶液を５μＬ添加し、３０分室温で反応させマレイミド基をマイクロ粒子表面に導入した。
（３）５，０００ｇで１０分間の遠心操作を行い、マイクロ粒子を沈殿させ、上清を除く操作を２回繰り返し、未反応のＳＭ（ＰＥＧ）６を除いた。
（４）次に定法に従いＦａｂ’化したＢＭ３３−２８抗体溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ、５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ  ８．０）を５００μＬ添加し室温で３０分反応させ、チオールを介してマイクロ粒子に抗体を固定化させた。
（５）次に８０ｍＭのＨＳ−ＰＥＧ６−ＯＭｅ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を１０μＬ添加し未反応のマレイミド基をブロックした。
（６）１０％のＢＳＡ溶液１００μＬを加え、５，０００ｇで１０分間の遠心操作を行い、マイクロ粒子を沈殿させ上清を捨てた。
（７）ＰＢＳ緩衝液１ｍＬを加えボルテックス操作によりマイクロ粒子を分散させた後、５，０００ｇで１０分間の遠心操作を行い、マイクロ粒子を沈殿させ、上清を除く操作を２回行うことで、未反応の抗体を除去した。
（８）得た沈殿物をＰＢＳ緩衝液５００μＬに懸濁させた。
【００２１】
第二の認識物質としてＢＮＰのＣ末端を認識する抗体（ＢＣ２３−１１、特許第５８１０５１４号公報に記載）を用い、金コロイドを用いて標識を行った。ＢＣ２３−１１の金コロイド標識方法を以下に示す。金コロイドは、ワインレッドケミカル社製の直径６０ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＨ１−６０ＮＭ）を用いた。
（１）２５０μＬの金コロイド溶液にｐＨ９．２の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液を２５０μＬ添加しｐＨを調整した。
（２）０．１ｍｇ／ｍＬのＢＣ２３−１１溶液（ｐＨ９．２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を５００μＬ添加し、１５分間静置した。
（３）２５０ｍＭのＭｅｔｈｙｌ−ＰＥＧ−ＮＨＳ２４−Ｅｓｔｅｒ（ＴｈｅｒｏｍｏＦｉｓｈｅｒＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）のＤＭＳＯ溶液１０μＬを添加し、３０分静置した。
（４）ＢＳＡとポリエチレングリコール２０，０００（和光純薬社製）の混合液を１０００μＬ添加し、１５分静置した。
（５）８，０００ｇで９分間の遠心操作を行い、金コロイドを沈殿させ、透明になった上清を廃棄した。
（６）ＢＳＡとポリエチレングリコール２０，０００の混合液を１０００μＬ添加し、（５）の操作を繰り返した。
（７）金コロイド保存用の緩衝液を用いＯＤ５２０＝６．０となるよう沈殿を懸濁させた。
【００２２】
上記のＢＭ３３−２８固定化マイクロ粒子及び、ＢＣ２３−１１標識金コロイドを用いて、ＢＮＰの測定を以下のように行った。
まず、上記抗体固定化マイクロ粒子溶液２０μＬと、上記抗体標識金コロイド溶液２０μＬ及び、濃度既知ＢＮＰ溶液６種類（０、１５、４２、１５７、５９９、２４２０ｐｇ／ｍＬ、各２１０μＬ）をそれぞれ混合し、５分静置した。
次に０．６μｍのＤｕｒａｐｏｒｅフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）でろ過し、フィルター上に残った金コロイドによる呈色を確認した。
【００２３】
ろ過にはバイオドットＳＦ装置（ＢＩＯＲＡＤ社製）を用いた吸引ろ過を行い、フィルターの下には吸収パッド（綿繊維製）を敷いた。ろ過後のフィルターの様子を図１に示す。
図１の呈色強度をイムノクロマトリーダー（浜松フォトニクス社製）で検出した結果を図２に示す。
図１、図２からＢＮＰの濃度に応じて金コロイド由来の呈色強度が強くなることが確認できた。
【００２４】
以上の結果から、ろ過を用いた本発明の測定方法により検出対象を検出可能であることが確認された。
【図１】
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【図２】
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