(57)【要約】【課題】検体をマイクロウエル内に入れることができ、マイクロ化学デバイス内で光が全反射することを防止できるマイクロ化学デバイスを提供する。【解決手段】検体１６となる細胞を保持するマイクロウエル３２が形成されたマイクロ化学デバイス１８であって、マイクロウエル３２は、底部３４と側壁部３６を有し、側壁部３６は、底部３４から開口部３８に向かって開口が広がる傾斜構造を有しており、マイクロウエル３２の底部３２の延長線と側壁部３６とのなす角をθ、マイクロ化学デバイス１８の材質の屈折率をｎ１、細胞培養液の屈折率をｎ２としたとき、細胞１６を観察する際の可視光を、マイクロウエル３２が形成された面の裏面側から細胞１６に照射する場合、式（１）を満たすマイクロ化学デバイス１８である。  ｎ１＜（ｎ２／ｓｉｎθ）      ・・・（１）【選択図】図２
2018201337.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体となる細胞を保持するマイクロウエルが形成されたマイクロ化学デバイスであって、
前記マイクロウエルは、底部と前記底部の周縁に設けられた側壁部を有し、前記側壁部は、前記底部から開口部に向かって開口が広がる傾斜構造を有しており、
前記マイクロウエルの前記底部の延長線と前記側壁部とのなす角で前記側壁部内の角をθ、前記マイクロ化学デバイスの材質の屈折率をｎ１、前記細胞を観察する際、細胞とともに供される細胞培養液の屈折率をｎ２としたとき、
前記細胞を観察する際の可視光を、前記マイクロウエルが形成された面の裏面側から前記細胞に照射する場合、式（１）を満たすマイクロ化学デバイス。
ｎ１＜（ｎ２／ｓｉｎθ）      ・・・（１）
【請求項２】
前記側壁部は、少なくとも１つの面が、前記底部から開口部に向かって広がる傾斜構造を有する階段形状であり、
前記底部の延長線と前記傾斜構造を有する前記側壁部とのなす角θのすべてが、前記式（１）を満たす請求項１に記載のマイクロ化学デバイス。
【請求項３】
検体となる細胞を保持するマイクロウエルが形成されたマイクロ化学デバイスであって、
前記マイクロウエルは、底部と前記底部の周縁に設けられた側壁部を有し、前記側壁部は、前記底部から開口部に向かって開口が広がる傾斜構造を有しており、
前記マイクロウエルの前記底部の延長線と前記側壁部とのなす角で前記側壁部内の角をθ、前記マイクロ化学デバイスの材質の屈折率をｎ１、前記細胞を観察する際、細胞とともに供される細胞培養液の屈折率をｎ２、前記マイクロ化学デバイスの周囲の雰囲気の屈折率をｎ３としたとき、
前記細胞を観察する際の可視光を、前記マイクロウエルが形成された面側から前記細胞に照射する場合、式（２）を満たすマイクロ化学デバイス。
｛π／２−ｓｉｎ−１［（ｎ２／ｎ１）・ｓｉｎθ］｝＜ｓｉｎ−１（ｎ１／ｎ３）
・・・（２）
【請求項４】
前記側壁部は、少なくとも１つの面が、前記底部から開口部に向かって広がる傾斜構造を有する階段形状であり、
前記底部の延長線と前記傾斜構造を有する前記側壁部とのなす角θのすべてが、前記式（２）を満たす請求項３に記載のマイクロ化学デバイス。
【請求項５】
検体となる細胞を保持するマイクロウエルが形成されたマイクロ化学デバイスであって、
前記マイクロウエルは、底部と前記底部の周縁に設けられた側壁部を有し、前記側壁部は、前記底部に対して水平である水平面と、立ち上がり面と、からなる階段形状であるマイクロ化学デバイス。
【請求項６】
前記立ち上がり面は、前記底部に対して垂直に形成されている請求項５に記載のマイクロ化学デバイス。
【請求項７】
前記立ち上がり面は、前記底部から開口部に向かって広がる傾斜構造を有する請求項５に記載のマイクロ化学デバイス。
【請求項８】
前記マイクロウエルに対応する裏面側にマイクロレンズを有する請求項１から７のいずれか１項に記載のマイクロ化学デバイス。
【請求項９】
検体となる細胞を保持するマイクロウエルが形成されたマイクロ化学デバイスであって、
前記マイクロウエルは、底部と前記底部の周縁に設けられた側壁部を有し、前記側壁部は、前記底部から開口部に向かって開口が広がる傾斜構造を有しており、
前記マイクロウエルに対応する裏面側にマイクロレンズを有するマイクロ化学デバイス。
【請求項１０】
前記マイクロウエルの表面に細胞低付着処理が施されている請求項１から９のいずれか１項に記載のマイクロ化学デバイス。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載のマイクロ化学デバイスと、
前記細胞が蛍光を発する光を出力する第１の光源装置と、可視光を出力する第２の光源装置と、
励起フィルタ、ダイクロイックミラー、および、蛍光フィルタを有するフィルタ群と、
前記細胞からの蛍光発光、および、前記細胞を通過した透過光を撮像する撮像装置と、を備える解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ化学デバイスおよび解析装置に係り、特に、細胞を保持するマイクロウエルが多数形成されたマイクロ化学デバイスおよび解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
末梢血から希少細胞を取り出すために、細胞を区画して保持するための構造体が知られている。例えば、ウエルプレートやチャンバープレートなどと呼ばれる比較的多数の細胞を区画するものから、１細胞単位で区画できるウエルスライドなどがある。
【０００３】
末梢血からごくわずかな量しか存在しない希少細胞を取り出すためには、１細胞単位で区画できる複数のウエルからなる構造体が必要である。また、その希少細胞を取り出すためには、区画された細胞から目的の細胞である希少細胞を見分ける光学的手段、その希少細胞だけを選択的に取り出す手段から構成される装置が必要である。
【０００４】
１細胞単位で区画できる構造体は、円筒形状や円錐形状から形成されることが一般的であり、また、開口部側が底面側よりも拡径となる、いわゆるテーパー形状のウエルが形成された構造体も提供されている。希少細胞としては、癌の診断を目的としたＣＴＣ（血中循環腫瘍細胞：Circulating Tumor Cells）、出生前診断を目的とした有核赤血球などが挙げられる。
【０００５】
このようなマイクロ化学デバイスとして、例えば、下記の特許文献１には、ウエルの側壁が傾斜を有するテーパー形状であるマイクロ化学デバイスが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５７５１１８７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記の特許文献１に記載されているテーパー形状のウエルプレートでは、ウエル内にある細胞の明視野を観察しようとすると、テーパー形状において明視野用の照明光が内部反射され、ウエルの外接部（テーパー）が黒く認識され、ウエルに到達する光量の低下、テーパーによる黒い影の影響で、細胞の確認が難しくなるという問題があった。また、ウエル内での細胞の位置が、ウエルの外接部に接した位置で配置されている場合、細胞の外形形状の認識が難しくなるという問題があった。また、ウエルの側壁がテーパー形状ではなく、ウエルの底面に対して垂直に形成されている場合、ウエルの外接部が黒く認識されることはない。しかし、細胞がウエル内に入りにくい、あるいは、細胞が縦に入り、細胞の観察がしにくいとの問題があった。
【０００８】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、ウエル内の細胞を確実に選別することができるマイクロ化学デバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記目的を達成するために、検体となる細胞を保持するマイクロウエルが形成されたマイクロ化学デバイスであって、マイクロウエルは、底部と底部の周縁に設けられた側壁部を有し、側壁部は、底部から開口部に向かって開口が広がる傾斜構造を有しており、マイクロウエルの底部の延長線と側壁部とのなす角で側壁部内の角をθ、マイクロ化学デバイスの材質の屈折率をｎ１、細胞を観察する際、細胞とともに供される細胞培養液の屈折率をｎ２としたとき、細胞を観察する際の可視光を、マイクロウエルが形成された面の裏面側から細胞に照射する場合、式（１）を満たすマイクロ化学デバイスを提供する。
【００１０】
ｎ１＜（ｎ２／ｓｉｎθ）      ・・・（１）
本発明のマイクロ化学デバイスによれば、マイクロウエルの側壁部を底部から開口部に向かって開口が広がる傾斜構造としているので、検体となる細胞を確実にウエル内に入れることができる。また、マイクロウエルの側壁部の底部に対する角度、マイクロ化学デバイスの材質および細胞培養液の屈折率を式（１）の関係を満たすことで、細胞を観察する際の可視光を、マイクロ化学デバイスと細胞培養液との境界で反射することなく、撮像装置で撮像することができる。
【００１１】
本発明の別の態様においては、側壁部は、少なくとも１つの面が、底部から開口部に向かって広がる傾斜構造を有する階段形状であり、底部の延長線と傾斜構造を有する側壁部とのなす角θのすべてが、式（１）を満たすことが好ましい。
【００１２】
この態様によれば、階段形状である側壁部が傾斜構造であっても、傾斜構造の角度を、式（１）を満たすようにすることで、可視光を、マイクロ化学デバイスと細胞培養液との境界で反射することなく、撮像装置で撮像することができる。
【００１３】
本発明は、上記目的を達成するために、検体となる細胞を保持するマイクロウエルが形成されたマイクロ化学デバイスであって、マイクロウエルは、底部と底部の周縁に設けられた側壁部を有し、側壁部は、底部から開口部に向かって開口が広がる傾斜構造を有しており、マイクロウエルの底部の延長線と側壁部とのなす角で側壁部内の角をθ、マイクロ化学デバイスの材質の屈折率をｎ１、細胞を観察する際、細胞とともに供される細胞培養液の屈折率をｎ２、マイクロ化学デバイスの周囲の雰囲気の屈折率をｎ３としたとき、細胞を観察する際の可視光を、マイクロウエルが形成された面側から細胞に照射する場合、式（２）を満たすマイクロ化学デバイスを提供する。
【００１４】
｛π／２−ｓｉｎ−１［（ｎ２／ｎ１）・ｓｉｎθ］｝＜ｓｉｎ−１（ｎ１／ｎ３）
・・・（２）
本発明のマイクロ化学デバイスによれば、マイクロウエルの側壁部を底部から開口部に向かって開口が広がる傾斜構造としているので、検体となる細胞を確実にウエル内に入れることができる。また、マイクロウエルの側壁部の底部に対する角度、マイクロ化学デバイスの材質、細胞培養液の屈折率およびマイクロ化学デバイスの周囲の雰囲気を式（２）の関係を満たすことで、マイクロ化学デバイスから透過光が抜ける際、透過光がマイクロ化学デバイスの裏面で反射することを防止することができる。したがって、マイクロウエル内の細胞を多くの光量で撮像することができ、細胞の識別を確実に行うことができる。
【００１５】
本発明の別の態様においては、側壁部は、少なくとも１つの面が、底部から開口部に向かって広がる傾斜構造を有する階段形状であり、底部の延長線と傾斜構造を有する側壁部とのなす角θのすべてが、前記式（２）を満たすことが好ましい。
【００１６】
この態様によれば、階段形状である側壁部が傾斜構造であっても、傾斜構造の角度を、式（２）を満たすようにすることで、透過光がマイクロ化学デバイスの裏面で反射することを防止することができる。したがって、マイクロウエル内の細胞を多くの光量で撮像することができる。
【００１７】
本発明は、上記目的を達成するために、検体となる細胞を保持するマイクロウエルが形成されたマイクロ化学デバイスであって、マイクロウエルは、底部と底部の周縁に設けられた側壁部を有し、側壁部は、底部に対して水平である水平面と、立ち上がり面と、からなる階段形状であるマイクロ化学デバイスを提供する。
【００１８】
本発明のマイクロ化学デバイスによれば、マイクロウエルの側壁部を階段形状にすることで、開口部を広くすることができ、細胞をマイクロウエル内に入りやすくすることができる。また、階段形状を底部に対して水平である水平面と立ち上がり面とで構成することで、可視光が水平面を通過することにより、ウエルの外接部が黒く認識されることがなく、細胞を認識することができる。なお、マイクロウエルの底部は、可視光の進行方向に対して垂直に形成されていることが好ましい。また、本発明において、底部に対して水平とは、底部に対して水平面が０°±１°以内の範囲を含む。
【００１９】
本発明の別の態様においては、立ち上がり面は、底部に対して垂直に形成されていることが好ましい。
【００２０】
この態様によれば、立ち上がり面を底部に対して垂直とすることで、立ち上がり面は可視光の進行方向と平行になる。したがって、可視光は水平面を透過するため、マイクロ化学デバイスと細胞培養液との境界で反射することなく、多くの光量で撮像することができる。なお、本発明において、底部に対して垂直とは、底部に対して立ち上がり面が９０°±１°以内の範囲を含む。
【００２１】
本発明の別の態様においては、立ち上がり面は、底部から開口部に向かって広がる傾斜構造を有することが好ましい。
【００２２】
この態様によれば、階段形状の側壁部を傾斜構造とすることで、細胞をマイクロウエル内に入りやすくすることができる。
【００２３】
本発明の別の態様においては、マイクロウエルに対応する裏面側にマイクロレンズを有することが好ましい。
【００２４】
この態様によれば、マイクロレンズを通過した光をマイクロウエル内に集光させることができるので、細胞を多くの光量で照射でき、細胞を透過した透過光で細胞の選別を行うことができる。
【００２５】
本発明は、上記目的を達成するために、検体となる細胞を保持するマイクロウエルが形成されたマイクロ化学デバイスであって、マイクロウエルに対応する裏面側にマイクロレンズを有するマイクロ化学デバイスを提供する。
【００２６】
本発明のマイクロ化学デバイスによれば、マイクロウエルに対応する裏面側に、マイクロレンズが形成されているので、マイクロレンズを通過した光をマイクロウエル内に集光させることができる。したがって、マイクロウエル内の細胞を多くの光量で照射でき、細胞を透過した透過光で細胞の選別を行うことができる。
【００２７】
本発明の別の態様においては、マイクロウエルの表面に細胞低付着処理が施されていることが好ましい。
【００２８】
この態様によれば、マイクロウエルの表面に細胞低付着処理が施されているので、マイクロウエルの側壁部と細胞とが接触した状態で、保持されることを防止することができる。したがって、細胞の形状観察の精度を高めることができる。
【００２９】
本発明は、上記目的を達成するために、上記記載のマイクロ化学デバイスと、細胞が蛍光を発する光を出力する第１の光源装置と、可視光を出力する第２の光源装置と、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、および、蛍光フィルタを有するフィルタ群と、細胞からの蛍光発光、および、細胞を通過した透過光を撮像する撮像装置と、を備える解析装置を提供する。
【００３０】
上記記載のマイクロ化学デバイスは、細胞の多くの光量で撮像することができ、細胞の選別を確実に行うことができるので、解析装置に用いることで、解析の精度を向上させることができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のマイクロ化学デバイスおよび解析装置によれば、光がマイクロ化学デバイスを通過する際の、マイクロ化学デバイスの境界での反射を防止することができ、多くの光量で細胞の形状を撮像することができる。したがって、細胞の選別、解析を確実に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】第１実施形態の解析装置の構成を示す概略構成図である。
【図２】マイクロウエルの形状を示す断面図である。
【図３】従来のマイクロ化学デバイスの課題を説明する図である。
【図４】従来のマイクロ化学デバイスの別の課題を説明する図である。
【図５】他のマイクロウエルの形状を示す断面図である。
【図６】さらに他のマイクロウエルの形状を示す断面図である。
【図７】さらに他のマイクロウエルの形状を示す断面図である。
【図８】第２実施形態の解析装置の構成を示す概略構成図である。
【図９】マイクロ化学デバイス内での光の進行方向を説明する図である。
【図１０】マイクロ化学デバイスの製造方法を示す工程図である。
【図１１】他のマイクロ化学デバイスの製造方法を示す工程図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、添付図面に従って本発明に係るマイクロ化学デバイスおよび解析装置について説明する。なお、本明細書において「〜」とは、その前後に記載される数値を下限値および上限値として含む意味で使用される。
【００３４】
≪解析装置≫
〔第１実施形態〕
図１は、第１実施形態の解析装置１０の構成を示す概略構成図である。マイクロ化学デバイスを用いた解析装置では、細胞培養液中に分散された細胞からの抗原抗体反応による免疫染色などによる蛍光発光を撮影する蛍光撮影、可視光透過により細胞の光透過画像を撮影する明視野撮影を行う。
【００３５】
第１実施形態の解析装置１０は、分析の対象となる検体（細胞）の発する蛍光を測定するための光を照射する蛍光用励起光源装置（第１の光源装置）１２、検体の透過光を測定するための光（可視光）を照射する明視野用光源装置（第２の光源装置）１４、分析の対象となる検体１６を保持するマイクロ化学デバイス（マイクロウエルプレート）１８、レンズ２０、励起フィルタ２２、ダイクロイックミラー２４および蛍光フィルタ２６とを保持したフィルタキューブ（フィルタ群に相当）２８、検体１６からの蛍光および透過光を撮像する撮像装置３０を備える。
【００３６】
蛍光用励起光源装置１２は、高圧水銀ランプ、高圧キセノンランプ、ＬＥＤ（light emitting diode）、または、ＬＡＳＥＲ（light amplification by stimulated emission of radiation）を用いることができる。これらの光源を用いることで、検体１６に照射する波長領域を狭くすることができ、分析を確実に行うことができる。また、蛍光用励起光源装置１２としては、タングステンランプ、ハロゲンランプ、白色ＬＥＤなどを用いることができる。これらの光源を用いても励起フィルタ２２で、目的の波長のみ通過させることで、検体１６に目的の波長の光を照射させることができる。なお、明視野用光源装置１４としても、蛍光用励起光源装置１２と同様の光源を用いることができる。
【００３７】
マイクロ化学デバイス１８は、分析の対象となる検体１６を保持するサンプル台である。検体１６は、細胞培養液とともに、マイクロ化学デバイス１８上に供される。マイクロ化学デバイスは、細胞個々の撮影を行うため、細胞１個単位で区分けできるマイクロウエル（井戸）３２を有するウエル構造体であり、マイクロウエル３２に細胞を区分けする。これにより、細胞が重ならず、１個単位で、細胞の撮影を確実に行うことができる。マイクロ化学デバイス１８については後述する。
【００３８】
レンズ２０は、蛍光用励起光源装置１２から出力された光により検体１６が発した蛍光、および、明視野用光源装置１４から出力された光が検体１６を透過した透過光を拡大する。レンズ２０は、一般的に用いられるレンズを用いることができる。
【００３９】
フィルタキューブ２８は、励起フィルタ２２、ダイクロイックミラー２４、蛍光フィルタ２６を備える。このようなフィルタキューブ２８としては、例えば、Zeiss Filter Set 49 (DAPI)を用いることができる。蛍光用励起光源装置１２から照射された光は、励起フィルタ２２により、目的の波長領域の光のみ通過する。励起フィルタ２２を通過した光は、ダイクロイックミラー２４で、マイクロ化学デバイス１８の方向に反射する。蛍光用励起光源装置１２からの光が照射された検体１６から発する蛍光は、レンズ２０、ダイクロイックミラー２４、蛍光フィルタ２６を経て撮像装置３０で画像が撮像される。励起光とその励起光により発する蛍光は、蛍光の方が励起光より波長が長くなるので、ダイクロイックミラー２４で、励起光の波長を反射させ、蛍光の波長を通過させることができる。また、蛍光フィルタ２６は、励起光は通過させず、蛍光のみを通過させることで、撮像装置３０において、検体１６の蛍光を撮像することができる。蛍光フィルタ２６により、蛍光のみを通過させることで、撮像装置３０で撮像される画像が励起光に影響されることなく、画像を取得することができる。したがって、検査の精度を向上させることができる。
【００４０】
蛍光用励起光源装置１２から照射された光による蛍光撮影は、通常２〜３種類の色素により免疫蛍光染色され、この免疫蛍光染色された細胞を、フィルタキューブ２８を用いて撮影する。また、フィルタキューブ２８を切替えて、異なる波長が透過または反射するフィルタキューブを用いて撮影することで、異なる波長の光学的情報を得ることができる。なお、明視野用光源装置１４により、検体１６の透過光を撮像する場合は、フィルタキューブ２８を取り外した状態で撮像する。これにより、透過光を撮像装置３０で撮像することができる。
【００４１】
撮像装置３０としては、マイクロ化学デバイス１８上の検体１６の蛍光または透過光を撮像することができれば特に限定されず、例えば、ＣＣＤ（charge-coupled device）カメラを用いることができる。
【００４２】
第１実施形態の解析装置に備えられるマイクロ化学デバイス１８は、図１に示すように、明視野用光源装置１４から照射された光が、マイクロ化学デバイス１８の裏面側から入射し、表面側から光が透過していく。なお、本明細書においては、マイクロ化学デバイス１８のマイクロウエル３２が形成され、細胞が配置される側を表面、その反対側の面を裏面とする。
【００４３】
図２は、マイクロ化学デバイス１８のマイクロウエル３２の断面図である。マイクロウエル３２は、底部３４と底部３４の周縁に設けられた側壁部３６を有し、側壁部３６は
底部３４から開口部３８に向かって開口が広がる傾斜構造を有するテーパー形状である。マイクロウエル３２の側壁部３６をテーパー形状とすることにより、細胞をマイクロウエル３２内に配置する際、細胞を入りやすくすることができる。
【００４４】
また、本実施形態においては、マイクロ化学デバイス１８の材質の屈折率ｎ１と、細胞培養液の屈折率ｎ２と、マイクロウエル３２の側壁部３６のテーパー形状の傾斜角θ（図２で示すように、マイクロウエル３２の底部３４の延長線と側壁部３６のなす鋭角）との関係が、以下の式（１）を満たすように、細胞培養液の選択、マイクロウエル３２の設計を行う。
【００４５】
ｎ１＜（ｎ２／ｓｉｎθ）      ・・・（１）
式（１）を満たすように、マイクロ化学デバイス１８の材質、側壁部３６の傾斜角θ、細胞培養液を選択することで、明視野の観察において、マイクロ化学デバイス１８から細胞培養液に光が進む時、全反射を防止することができる。したがって、明視野用光源装置１４から出力された光を透過させることができ、テーパー形状の側壁部においても、検体１６を明確に識別できる画像を得ることができる。なお、屈折率は、観察する可視光における屈折率を考える必要があるが、計算ではナトリウムのＤ線（５８９．３ｎｍ）における屈折率で計算すれば良い。
【００４６】
図３、および、図４は、従来のマイクロ化学デバイスの課題を説明する図である。図３（ａ）がマイクロウエル１３２の上面図、図３（ｂ）は断面図である。図中、矢印は光の進行方向を示す。上記式（１）を満たさない場合は、マイクロ化学デバイス１１８のマイクロウエル１３２の側壁部１３６に当った光は、側壁部１３６で全反射するため、光が細胞培養液側に進まない。したがって、図３（ａ）に示すように、明視野用光源装置１４から照射された光は十分に透過せず、撮像された画像の側壁部１３６の領域が暗くなり、細胞が見えにくくなる。上記式（１）を満たすことで、マイクロ化学デバイスの裏面側からの光を透過させることができ、光の透過量を増やすことができるので、細胞の確認を容易に行うことができる。
【００４７】
また、図４は、側壁部２３６が傾斜構造ではなく、底部２３４に対して垂直に形成されたマイクロ化学デバイス２３２であり、図４（ａ）、（ｂ）が上面図、（ｃ）が断面図である。側壁部２３６が底部２３４に対して垂直に形成されている場合、光が全反射により通過しないことはない。しかしながら、図４（ａ）に示すように、検体２１６がマイクロウエル２３２の角に引っかかってしまいマイクロウエル２３２内に入らない、また、図４（ｂ）に示すように、検体２１６が側壁部２３６に接触して、検体の形状が正確に判別できないとの問題があった。
【００４８】
本実施形態によれば、マイクロウエル３２の側壁部３６をテーパー形状とすることで、検体１６をマイクロウエル３２内に入りやすくすることができる。また、テーパー形状の角度、マイクロ化学デバイス１８の材質の屈折率、細胞培養液の屈折率の関係を、式（１）を満たすように設計することで、光を透過させることができ、細胞を明確に識別できる画像を取得することができる。
【００４９】
マイクロ化学デバイス１８上に保持される検体１６としては、特に限定されないが、例えば、末梢血に含まれる希少細胞を挙げることができ、癌の診断を目的としたＣＴＣ、出生前診断を目的とした有核赤血球などが挙げられる。検体１６は、細胞培養液とともに供される。
【００５０】
一例として、有核赤血球のサンプルの調製方法について説明する。まず、血液試料である母体血を採取する。母体血としては、侵襲のおそれのない妊娠母体の末梢血であることが好ましい。次に、母体血の有核赤血球の濃縮を行う。濃縮の方法としては、公知の方法で行うことができ、例えば、密度勾配遠心分離法、ＭＡＣＳ法（Magnetic activated cell sorting）、ＦＡＣＳ法（Fluorescence activated cell sorting）、レクチン法、あるいは、フィルタ濾過法などを用いることができる。なかでも、血球細胞の特性を利用し、簡便な濃縮方法として、密度勾配遠心分離法により濃縮を行うことが好ましい。
【００５１】
次に、有核赤血球が濃縮された母体血の画分の細胞固定処理を行う。細胞固定処理は、一般的には、細胞の形態や組織細胞の安定化、細胞サンプルの強化、染色性向上、タンパク質分解酵素の不活性化、微生物のコンタミネーション・腐食の抑制を目的に行う。細胞質や核内のタンパク質の凝固・脱水を行い、細胞の変質を防ぎ、形態学的特徴の変化を最小限に止めることが可能である。固定処理方法としては、分子架橋やタンパク質不溶化を行う化学的固定、乾燥や凍結を行う物理的固定などがあり、具体的には、サンプルを固定液に浸けて固定化する浸漬法、採取して生理食塩水を潅流した後、固定液を潅流することで、深部組織に迅速に固定化する潅流法、低温凍結用包理剤（OCT（Optimal Cutting Temperature）コンパウンド等）に浸してから凍結して液体窒素中で保存する凍結法、サンプルを風乾してから炎等により基板上に加熱固定する乾燥法等により行うことができる。
【００５２】
また、母体血の洗浄を行いことが好ましい。洗浄液としてリン酸緩衝液（ＰＢＳ：Phosphate Buffered Saline）を用い、洗浄液を母体血、または母体血の画分に添加し、血球を分散後、遠心分離を行うことで、洗浄することができる。また、洗浄液に細胞処理剤を添加することで、細胞質の保護、乾燥による物理的ダメージの低減をすることができる。
【００５３】
有核赤血球と他の細胞を識別するために細胞核の染色を行い、細胞核の有無の識別を行うことができる。核染色色素としては、蛍光色素、あるいは、一般的な染色色素を使用することができる。蛍光色素とは、照射された光エネルギーを吸収して発光する色素のことであり、細胞染色に良く用いられている。また、一般的な染色色素として公知の色素を使用することができる。しかしながら、染色色素成分としてヘモグロビンの吸収体と重なる波長領域に吸収をもつ色素成分を含む場合、ヘモグロビンの検出能力が低下する弊害が生じる場合があり、求める有核赤血球の識別が困難となる場合がある。したがって、染色色素成分は、ヘモグロビンが有する吸収波長領域と重ならない染色色素を用いることが好ましい。このようにして調整されたサンプルをマイクロ化学デバイス上に供する。
【００５４】
［マイクロ化学デバイスの材質］
マイクロ化学デバイス１８に用いられる材料としては、ポリメチルメタクリレートなどのポリメタクリル酸エステル、ポリカーボネイト、ポリスチレン、ＡＢＳ（Acrylonitrile、Butadiene、Styrene共重合剛性樹脂）、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレートなどの芳香族ポリエステル、ポリプロピレン、ポリシクロオレフィンなどの各種ポリオレフィン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリフェニレンサルファイド、ポリ乳酸、ポリパーフルオロアルコキシ樹脂のような熱可塑性剛性樹脂、ポリジメチルシロキサンなどの熱硬化性剛性樹脂、ポリテトラフルオロエチレンを用いることができる。例えば、ポリスチレンの屈折率は１．５９であり、フッ素樹脂の屈折率は１．３５である。
【００５５】
また、マイクロウエル３２内は、親液処理または細胞低付着処理を行うことが好ましい。親液処理または細胞低付着処理を行うことで、マイクロウエル３２の側壁部３６に検体１６が付着することを防止することができる。検体１６の側壁部３６への付着を防止することで、検体１６の形状を正確に確認することができる。したがって、検査精度を向上させることができる。親液処理および細胞付着処理としては、例えば両方を兼ね備えたリピジュア（日油（株）製）を付与することで行うことができる。処理方法としては、リピジュアを水に希釈して、マイクロ化学デバイスを浸漬、乾燥することで処理することができる。また、真空装置内で気化させて真空蒸着させることで処理することができる。
【００５６】
［細胞培養液］
また、マイクロ化学デバイス１８に検体１６を配置する際用いられる細胞培養液としては、次の培養液を用いることができる。ＰＢＳ（リン酸緩衝液：Phosphate buffered saline）、Ｄ−ＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eaggle’s Medium）、RPMI1640（コージンバイオ株式会社）、TC199、Ham’s F12（コージンバイオ株式会社）などを用いることができる。例えば、ＰＢＳの屈折率は１．３５である。
【００５７】
これらの培養液中には、無機塩類（細胞の浸透圧の安定、膜電位の制御、酵素の補因子）、バッファー類（ｐＨ調整［約ｐＨ７．２〜７．４に調整、例外あり］）、炭水化物（エネルギー源）、アミノ酸（細胞寿命と増殖を助長する、グルタミンが特に重要）、脂肪酸・脂質（血清の代替、細胞の構成に必要）、たんぱく質・ペプチド（血清の代替）、血清、微量元素（Ｚｎ、Ｃｕ、Ｓｅ、クエン酸中間体。Ｓｅは抗酸化作用が高く、毒素を排出すると言われている）などが含まれている。
【００５８】
［他のマイクロウエルの形状］
図５、図６は、他のマイクロウエルの形状を示す断面図である。図５は、マイクロウエル３３２の側壁部３３６が、立ち上がり面３３６ａと、底部３３４に対して水平である水平面３３６ｂと、からなる階段形状であり、明視野用光源装置１４から照射される光に対して、立ち上がり面３３６ａが水平に形成されている。なお、底部３３４は、光の進行方向に対して垂直に形成されており、立ち上がり面３３６ａは、底部３３４に対して垂直に形成されている。マイクロウエル３３２の側壁部３３６を、図５に示す階段形状とすることで、検体３１６のマイクロウエル３３２内への入りやすさを確保することができる。また、光の進行方向に対して、垂直、および、水平の面で形成されているので、水平の面に対しては、光が当たることがなく、垂直の面に対しては、光が反射することなく透過するので、明視野用光源装置１４の光により細胞を確認することができる。この場合、光がマイクロウエルの側壁部３３６を通過するのは、光の進行方向に対して垂直（９０°）の場合のみであるので、マイクロ化学デバイス３１８の材質の屈折率と、細胞培養液の屈折率に関わらず、光を透過させることができる。したがって、図５のような階段形状でマイクロウエル３３２を形成した場合は、マイクロ化学デバイス３１７の材質および細胞培養液の屈折率に関係なく、明るく見えやすい画像を取得することができる。
【００５９】
図６は、マイクロウエル４３２の側壁部４３６を階段形状とし、さらに、立ち上がり面４３６ｂを底部４３４から開口部に向かって広がる傾斜構造とした実施形態である。この場合、立ち上げ面４３６ａと底部４３４の延長線とのなす角（鋭角）θと、マイクロ化学デバイス４１８の材質および細胞培養液の屈折率との関係が、全ての傾斜構造を有する角度θ（ただし、０°、９０°を除く）において式（１）を満たすことが好ましい。立ち上げ面４３６ａにおいて、上記式（１）を満たすように、マイクロウエル４３２の設計、または、マイクロ化学デバイス４１８の材質、細胞培養液を選択することで、側壁部４３６で光が全反射することを防止することができる。
【００６０】
なお、図６においては、マイクロウエル４３２の側壁を、傾斜を有する立ち上げ面４３６ａと底部４３４と水平な水平面４３６ｂとで構成されているが、これに限定されない。例えば、水平面４３６ｂを、傾斜を有する面としても良い。また、立ち上げ面４３６ａの底部４３４に対する角度は、全て同じ角度としても良いし、異なる角度としても良い。立ち上げ面４３６ａの底部４３４に対する角度が式（１）を満たさなくとも、水平面４３６ｂで光を透過させることができるので、マイクロウエルの外接部が黒く認識されることを防止でき、細胞の外形形状の認識を行うことができる。ただし、全ての角度が、式（１）を満たすように、マイクロウエル４３２の設計をすることで、光が全反射する面が無くなるので、多くの光量で撮像することができる。
【００６１】
図７は、さらに、他の実施形態のマイクロウエル５３２の形状を示す断面図である。図７に示すマイクロ化学デバイス５１８は、マイクロウエル５３２の側壁部５３６に傾斜構造を有し、マイクロ化学デバイス５１８の裏面側の、マイクロウエル５３２に対応する位置に、光集光機構としてマイクロレンズ５４０を有する点が他の実施形態と異なっている。マイクロレンズ５４０を備えることで、明視野用光源装置１４から照射された光を、マイクロレンズ５４０で集光し、検体５１６に照射することで、明るく見えやすい画像を取得することができる。なお、マイクロレンズ５４０を有する場合、マイクロ化学デバイスの材質および細胞培養液の屈折率は、特に限定されず使用することができる。
【００６２】
〔第２実施形態〕
図８は、第２実施形態の解析装置６１０の構成を示す概略構成図である。第２実施形態の解析装置６１０は、マイクロ化学デバイス１８を配置する位置が第１実施形態の解析装置１０と異なっている。具体的には、明視野用光源装置１４からの光が、マイクロ化学デバイス１８のマイクロウエル３２側から照射され、蛍光用励起光源装置１２からの励起光が、マイクロ化学デバイス１８の裏面側から照射される。他の構成については、第１実施形態と同様の構成であるため、説明を省略する。
【００６３】
第２実施形態の解析装置６１０においては、マイクロ化学デバイス１８の裏面側から励起光を照射、また、マイクロ化学デバイス１８を通過して細胞からの蛍光を受光するため、マイクロ化学デバイス１８の材料が透明であること、自家蛍光しないこと、散乱しないことなどの条件が必要となる。
【００６４】
また、第１実施形態と異なり、細胞培養液からマイクロ化学デバイス１８に光が進む時は、入射側（細胞培養液）の屈折率は、透過側（マイクロ化学デバイス）の屈折率より小さいので、全反射により、光がマイクロ化学デバイス１８に進まないことはない。しかしながら、マイクロ化学デバイス１８から光が透過する際、周囲のガス（空気など）の屈折率とマイクロ化学デバイス１８の材質の屈折率との関係で、全反射角が存在し、光が透過しない場合がある。第２実施形態においては、このマイクロ化学デバイス１８から光が透過する際、マイクロ化学デバイス１８の裏面への光の入射角が全反射角にならないように、マイクロ化学デバイス１８の材質、テーパー形状の傾斜角θ、細胞培養液の設計、選択をする。具体的には、以下の式を満たすように、マイクロ化学デバイス１８の材質、テーパー形状の傾斜角θ、細胞培養液の設計、選択をする。
【００６５】
｛π／２−ｓｉｎ−１［（ｎ２／ｎ１）・ｓｉｎθ］｝＜ｓｉｎ−１（ｎ１／ｎ３）
・・・（２）
式中、ｎ１はマイクロ化学デバイス１８の材質の屈折率、ｎ２は細胞培養液の屈折率、ｎ３はマイクロ化学デバイス１８の周囲のガスの屈折率であり、θはテーパー形状の傾斜角である。図９は、式（２）を満たさない場合の光の進行方向を説明する図である。図９中、θ１は側壁部３６への入射角であり、θと等しい。θ２は、光が側壁部３６を通過した時の屈折角であり、θ２＝ｓｉｎ−１［（ｎ２／ｎ１）・ｓｉｎθ１］＝ｓｉｎ−１［（ｎ２／ｎ１）・ｓｉｎθ］で表すことができる。また、θ３は、マイクロ化学デバイス１８の裏面を通過した時の入射角であり、θ３＝π／２−θ２で表すことができる。このθ２が、全反射角を超えないように、式（２）を満たすように、マイクロウエルの設計、マイクロ化学デバイスの材質、細胞培養液、雰囲気ガスの選択を行うことで、光の透過量を増やすことができ、明るい画像を取得することができる。なお、屈折率は、観察する可視光における屈折率を考える必要があるが、計算ではナトリウムのＤ線（５８９．３ｎｍ）における屈折率で計算すれば良い。
【００６６】
また、第２実施形態において、マイクロウエルの側壁部を階段形状とした場合においても、第１実施形態と同様に、水平面で光を通過させることができるので、マイクロウエルの外接部が黒く認識されるのを防止することができる。立ち上げ面は、底部に対して垂直であることが好ましく、立ち上げ面が傾斜構造を有する場合は、式（２）を満たすように設計することで、マイクロ化学デバイスの裏面で光が全反射することを防止することができ、撮像時の光量を増やすことができるため好ましい。また、水平面をマイクロウエルの底部から傾斜させた場合においても、水平面が式（２）を満たすように設計することで、マイクロ化学デバイスの裏面で光が全反射することを防止することができる。
【００６７】
［マイクロ化学デバイスの製造方法］
図１０、図１１は、マイクロ化学デバイスの製造方法を示す工程図であり、図１０は、図５に示す階段形状の側壁部を有するマイクロ化学デバイスを製造する図、図１１は、裏面側にマイクロレンズを有するマイクロ化学デバイスを製造する図である。なお、図２に示す傾斜構造を有するマイクロ化学デバイス、図６に示すマイクロウエルの側壁部が階段形状で、かつ、傾斜構造を有するマイクロ化学デバイスについても同様の方法により、製造することができる。
【００６８】
マイクロ化学デバイスの製造は、まず、図１０（ａ）に示すように、マイクロ化学デバイスの型となる第１の型６０６を準備する。図１０（ａ）においては、上側型６０２、下側型６０４を準備する。第１の型６０６は、３Ｄ造形、ＬＩＧＡ（Lithographie、Galvanoformung、Abformung）プロセスにより製造することができる。
【００６９】
３Ｄ造形により、次のように製造することができる。液体樹脂または粉末素材にレーザーを照射し、液体樹脂または粉末素材のレーザーが照射された部分を硬化させる。液体樹脂または粉末素材の硬化を一層ずつ行い、重ねていくことで、目的の形状、本実施形態においては、第１の型６０６を製造することができる。また感光性樹脂を感光波長(紫外)のレーザーで照射、硬化させて形成することもできる。
【００７０】
ＬＩＧＡプロセスは、Ｘ線リソグラフィ、電鋳、および、モールディングを組み合わせて型を作る方法である。まず、金属基板上に圧さ数百μｍのレジスト層（例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ））を形成し、ＳＲ（シンクロトン）光Ｘ線を照射し、Ｘ線マスクのパターンをレジスト層に転写する。レジスト層のＸ線露光部分は、高分子の連鎖が切れて分子量が減少し現像液に溶解する。未露光部分は変化せずにそのまま残る。これにより、Ｘ線マスクのパターンと同一形状のレジストの微細構造体が形成される。次に、電鋳法により、レジスト層の溶解した部分に金属を堆積させ、金属構造体を形成する。この段階で、未露光部分のレジスト層を除去し、金属構造体をモールドとして用いることもできるし、金属構造体を第１の型６０６として用いることもできる。金属構造体をモールドとして用いる場合は、樹脂を型成形し、第１の型６０６を製造する。本実施形態においては、ウエルの傾斜部の角度と、ウエルの材質の屈折率と細胞培養液の屈折率との関係を規定しており、ウエルの傾斜部の角度は、金型の製造により決定するため、第１の型６０６を精度良く形成することが好ましい。
【００７１】
次に、図１０（ｂ）に示すように、第１の型６０６内に樹脂６１０を流し込み、冷却することで、樹脂６１０を固化し、マイクロ化学デバイスを形成する。マイクロ化学デバイスの材質としては、上述した樹脂を用いることができる。第１の型６０６の凸部６０８の反転形状が樹脂６１０に形成され、マイクロウエル６１４を形成する部分となる。
【００７２】
樹脂６０８を固化させた後、図１０（ｃ）に示すように、第１の型６０６を剥離することで、マイクロ化学デバイス６１２が製造される（図１０（ｄ））。
【００７３】
また、マイクロ化学デバイスの製造は、第１の型６０６の上側型６０２を用いて樹脂に押圧することで、形成することもできる。樹脂上に上側型６０２を押圧した状態で、紫外線照射、または、冷却により樹脂を固化することで、マイクロ化学デバイスを形成する。その後、上側型６０２を剥離することで、マイクロ化学デバイスが製造される。
【００７４】
図１１は、裏面側にマイクロレンズを備えるマイクロ化学デバイスの製造方法である。裏面側にマイクロレンズを有するマイクロ化学デバイスについても、同様の方法により製造することができる。
【００７５】
まず、図１１（ａ）に示すように、マイクロ化学デバイスの第２の型７０６を用意する。図１１（ａ）においては、上側型７０２、下側型７０４を準備する。第２の型７０６は、上述したような、３Ｄ造形、および、ＬＩＧＡプロセスなどにより製造することができる。上側型７０２のマイクロウエルを形成する位置に凸部７０８が形成される。また、下側型７０４の、上側型７０２の凸部（マイクロ化学デバイスのマイクロウエル）に対応する位置に、マイクロレンズの反転型である凹部７１０を形成する。この凹部７１０を有する下側型７０４も３Ｄ造形、ＬＩＧＡプロセスなどにより形成することができる。
【００７６】
次に、図１１（ｂ）に示すように、第２の型７０６内に樹脂７１２を流し込み、冷却することで、樹脂７１２を固化し、マイクロ化学デバイスを形成する。使用する材料としては、上記のマイクロ化学デバイスで使用される材料を用いることができる。固化条件については、樹脂により適宜設定することができる。
【００７７】
樹脂７１２を固化させた後、図１１（ｃ）に示すように、第３の型７０６を剥離することで、マイクロレンズ７１６を有するマイクロ化学デバイス７１４が製造される（図１１（ｄ））。
【符号の説明】
【００７８】
１０、６１０…解析装置、１２…蛍光用励起光源装置（第１の光源装置）、１４…明視野用光源装置（第２の光源装置）、１６、１１６、２１６、３１６、４１６、５１６…検体、１８、１１８、２１８、３１８、４１８、５１８、６１２、７１４…マイクロ化学デバイス、２０…レンズ、２２…励起フィルタ、２４…ダイクロイックミラー、２６…蛍光フィルタ、２８…フィルタキューブ、３０…撮像装置、３２、１３２、２３２、３３２、４３２、５３２、６１４…マイクロウエル、３４、１３４、２３４、３３４、４３４、５３４…底部、３６、１３６、２３６、３３６、４３６、５３６…側壁部、３８…開口部、５４０、７１６…マイクロレンズ、６０２、７０２…上側型、６０４、７０４…下側型、６０６…第１の型、６０８、７０８…凸部、６１０、７１２…樹脂、７０６…第２の型、７１０…凹部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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