(57)【要約】【課題】本発明は、血液凝固又は抗凝固に関連するビタミンＫ依存性タンパク質を、昆虫細胞の発現系を使用して製造する方法を提供することを課題とする。【解決手段】ビタミンＫ、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼ、及び哺乳動物由来のビタミンＫ依存性γカルボヒシグルタミナーゼが存在する昆虫細胞内で、血液凝固又は抗凝固に関連する哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質を製造することを特徴とする、ビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＫ、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼ、及び哺乳動物由来のビタミンＫ依存性γカルボヒシグルタミナーゼが存在する昆虫細胞内で、血液凝固又は抗凝固に関連する哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質を製造することを特徴とする、ビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。
【請求項２】
プロテインジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子と、哺乳動物由来のビタミンＫ依存性γカルボヒシグルタミナーゼをコードする遺伝子と、哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子とを昆虫細胞に導入した形質転換体を、ビタミンＫ含有培地中で培養することにより、前記哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質を製造する、請求項１に記載のビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。
【請求項３】
前記形質転換体が、さらに、ビタミンＫエポキシドレダクターゼをコードする遺伝子が導入されている、請求項２に記載のビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。
【請求項４】
前記哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子が、
（ａ）  いずれかの哺乳動物が本来有しているビタミンＫ依存性タンパク質のＮ末端の分泌シグナルペプチドが切断された成熟型タンパク質のＮ末端側に、前記昆虫細胞内において分泌シグナルペプチドとして機能するペプチドが直接又は間接的に連結されたタンパク質、
（ｂ）  前記（ａ）のビタミンＫ依存性タンパク質のアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記（ａ）のビタミンＫ依存性タンパク質が有する血液凝固活性又は抗凝固活性を有するタンパク質、又は
（ｃ）  前記（ａ）のビタミンＫ依存性タンパク質のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ前記（ａ）のビタミンＫ依存性タンパク質が有する血液凝固活性又は抗凝固活性を有するタンパク質、
である、請求項２又は３に記載のビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。
【請求項５】
前記形質転換体外に分泌された前記ビタミンＫ依存性タンパク質を、培養上清から回収する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。
【請求項６】
前記プロテインジスルフィドイソメラーゼが、ＰＤＩＡ２（タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーＡ、メンバー２）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。
【請求項７】
前記ビタミンＫエポキシドレダクターゼが、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ複合体サブユニット1（ＶＫＯＲＣ１）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。
【請求項８】
前記昆虫細胞が、ショウジョウバエ由来の培養細胞株Ｓ２細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。
【請求項９】
前記ビタミンＫ依存性タンパク質が、血液凝固第ＩＩ因子、血液凝固第ＶＩＩ因子、血液凝固第ＩＸ因子、血液凝固第Ｘ因子、プロテインＣ、又はプロテインＳである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
ビタミンＫエポキシドレダクターゼ遺伝子を備える昆虫細胞を宿主細胞とし、プロテインジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子と、哺乳動物由来のビタミンＫ依存性γカルボヒシグルタミナーゼをコードする遺伝子と、血液凝固又は抗凝固に関連する哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子とが組み込まれている、形質転換体。
【請求項１１】
昆虫細胞を宿主細胞とし、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ遺伝子と、プロテインジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子と、哺乳動物由来のビタミンＫ依存性γカルボヒシグルタミナーゼをコードする遺伝子と、血液凝固又は抗凝固に関連する哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子とが組み込まれている、形質転換体。
【請求項１２】
プロテインジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子と、哺乳動物由来のビタミンＫ依存性γカルボヒシグルタミナーゼをコードする遺伝子と、血液凝固又は抗凝固に関連する哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子とが組み込まれており、昆虫細胞において、プロテインジスルフィドイソメラーゼと哺乳動物由来のビタミンＫ依存性γカルボヒシグルタミナーゼと血液凝固又は抗凝固に関連する哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質とを発現し得る、発現ベクター。
【請求項１３】
さらに、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ遺伝子が組み込まれており、昆虫細胞において、ビタミンＫエポキシドレダクターゼを発現し得る、請求項１２に記載の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、より安全性が高く、血液凝固薬や抗凝固薬として有用な血液凝固又は抗凝固に関連するビタミンＫ依存性タンパク質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固薬とは、出血を止めるために血液を凝固させる薬剤である。一方、抗凝固薬は、血液凝固を阻害する薬物であり、血栓塞栓症の治療及び予防やカテーテルの閉塞防止に用いられたり、人工透析装置や人工心肺装置の体外回路の凝固防止、輸血用血液の保存や血液検査の際に用いられている。
【０００３】
血液凝固薬や抗凝固薬としては、動物が本来有している血液凝固因子や抗凝固因子が用いられている。ヒトをはじめとする動物において、血液凝固第ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子や抗凝固因子のプロテインＣ、Ｓは、肝細胞によって合成分泌される。これらのタンパク質は、Ｎ末端にＧｌａ領域と呼ばれるグルタミン酸（Ｇｌｕ）が豊富な部位があり、このＧｌｕがビタミンＫ依存性γカルボヒシグルタミナーゼ（ＧＧＣＸ）（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅともいう。）の触媒作用でγカルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）に変換されることによって初めて活性のあるタンパク質になることが知られている。
【０００４】
従来、血液凝固因子や抗血液凝固因子は、専ら血液を原料に精製されていたが、昨今は組み換えタンパクの利用も進んできている。組み換えタンパク質技術により合成されたこれらの因子は、血液由来の原材料を用いて精製された因子よりも安全性の点から好ましい。通常これらの組み換えタンパク質を作成する場合、ヒト胎児腎臓細胞由来の培養細胞株ＨＥＫ２９３細胞を使用する。これは、ＨＥＫ２９３細胞がＧＧＣＸ活性を保持しているからである。ただし、その他の細胞に単純にＧＧＣＸをコードする遺伝子を導入しても活性のある組み換えタンパク質は得られない。その理由は未だ明確でない部分もあるが、数多の細胞腫ではビタミンＫの還元システムが備わっていないことが大きな原因の一つと考えられている。そこで、哺乳細胞を用いて血液凝固因子や抗血液凝固因子の組み換えタンパク質を合成する方法としては、ＧＧＣＸ遺伝子とビタミンＫの還元システムの中核をなすビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）遺伝子の両方を導入した哺乳培養細胞に、血液凝固又は抗凝固に関連するビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子を導入して発現させる方法が開示されている（例えば、特許文献１又は２参照。）。
【０００５】
組み換えタンパク質の合成に用いる発現系としては、昆虫細胞も使用されている。例えば、市販されているｐＭＴ−ＨｉｓＡベクターに全長遺伝子を組込んだ発現ベクターをショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来の培養細胞株Ｓ２細胞に導入した形質転換細胞を、ビタミンＫ無添加培地で培養するという至極簡便な方法でヒトの血液凝固第ＩＸ因子（Ｆ９）の発現に成功したことが報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００８−５２３８３７号公報
【特許文献２】特表２００８−５３５５１７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Vatandoost，et al.，Biotechnology Progress，2012，vol.28(1)，p.45-51．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、血液凝固又は抗凝固に関連するビタミンＫ依存性タンパク質を、昆虫細胞の発現系を使用して製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ビタミンＫの還元システムを備える昆虫細胞内において、哺乳細胞由来のＧＧＣＸと共発現させることにより、ビタミンＫ存在下で血液凝固又は抗凝固に関連するビタミンＫ依存性タンパク質を製造できること、さらにＰＤＩＡ２（プロテインジスルフィドイソメラーゼファミリーＡ、メンバー２）を共発現させることにより、より比活性の高いビタミンＫ依存性タンパク質を製造し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下のビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法、形質転換体、及び発現ベクターを提供するものである。
［１］  ビタミンＫ、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼ、及び哺乳動物由来のビタミンＫ依存性γカルボヒシグルタミナーゼが存在する昆虫細胞内で、血液凝固又は抗凝固に関連する哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質を製造することを特徴とする、ビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。
［２］  プロテインジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子と、哺乳動物由来のビタミンＫ依存性γカルボヒシグルタミナーゼをコードする遺伝子と、哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子とを昆虫細胞に導入した形質転換体を、ビタミンＫ含有培地中で培養することにより、前記哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質を製造する、前記［１］のビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。
［３］  前記形質転換体が、さらに、ビタミンＫエポキシドレダクターゼをコードする遺伝子が導入されている、前記［２］のビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。
［４］  前記哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子が、
（ａ）  いずれかの哺乳動物が本来有しているビタミンＫ依存性タンパク質のＮ末端の分泌シグナルペプチドが切断された成熟型タンパク質のＮ末端側に、前記昆虫細胞内において分泌シグナルペプチドとして機能するペプチドが直接又は間接的に連結されたタンパク質、
（ｂ）  前記（ａ）のビタミンＫ依存性タンパク質のアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記（ａ）のビタミンＫ依存性タンパク質が有する血液凝固活性又は抗凝固活性を有するタンパク質、又は
（ｃ）  前記（ａ）のビタミンＫ依存性タンパク質のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ前記（ａ）のビタミンＫ依存性タンパク質が有する血液凝固活性又は抗凝固活性を有するタンパク質、
である、前記［２］又は［３］のビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。
［５］  前記形質転換体外に分泌された前記ビタミンＫ依存性タンパク質を、培養上清から回収する、前記［１］〜［４］のいずれかのビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。
［６］  前記プロテインジスルフィドイソメラーゼが、ＰＤＩＡ２（タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーＡ、メンバー２）である、前記［１］〜［５］のいずれかのビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。
［７］  前記ビタミンＫエポキシドレダクターゼが、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ複合体サブユニット1（ＶＫＯＲＣ１）である、前記［１］〜［６］のいずれかのビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。
［８］  前記昆虫細胞が、ショウジョウバエ由来の培養細胞株Ｓ２細胞である、前記［１］〜［７］のいずれかのビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。
［９］  前記ビタミンＫ依存性タンパク質が、血液凝固第ＩＩ因子、血液凝固第ＶＩＩ因子、血液凝固第ＩＸ因子、血液凝固第Ｘ因子、プロテインＣ、又はプロテインＳである、前記［１］〜［８］のいずれかのビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。
［１０］  ビタミンＫエポキシドレダクターゼ遺伝子を備える昆虫細胞を宿主細胞とし、プロテインジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子と、哺乳動物由来のビタミンＫ依存性γカルボヒシグルタミナーゼをコードする遺伝子と、血液凝固又は抗凝固に関連する哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子とが組み込まれている、形質転換体。
［１１］  昆虫細胞を宿主細胞とし、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ遺伝子と、プロテインジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子と、哺乳動物由来のビタミンＫ依存性γカルボヒシグルタミナーゼをコードする遺伝子と、血液凝固又は抗凝固に関連する哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子とが組み込まれている、形質転換体。
［１２］  プロテインジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子と、哺乳動物由来のビタミンＫ依存性γカルボヒシグルタミナーゼをコードする遺伝子と、血液凝固又は抗凝固に関連する哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子とが組み込まれており、昆虫細胞において、プロテインジスルフィドイソメラーゼと哺乳動物由来のビタミンＫ依存性γカルボヒシグルタミナーゼと血液凝固又は抗凝固に関連する哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質とを発現し得る、発現ベクター。
［１３］  さらに、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ遺伝子が組み込まれており、昆虫細胞において、ビタミンＫエポキシドレダクターゼを発現し得る、前記［１２］の発現ベクター。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法により、血液凝固又は抗凝固に関連する哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質を、昆虫細胞内でより安全かつ容易に製造することができる。また、本発明に係る形質転換体及び発現ベクターを用いることにより、当該ビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法を容易に実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】共発現ベクターｐＣｏＰＵＲＯの構造と使用したプライマーの位置を示した図である。
【図２】ベクターｐＭＴ−ＰＵＲＯ２Ｇの構造を示した図である。
【図３】共発現ベクターｐＣｏＰＵＲＯ２Ｇの構造と使用したプライマーの位置を示した図である。
【図４】共発現ベクターｐＣｏＧＧＣＸの構造と使用したプライマーの位置を示した図である。
【図５】共発現ベクターｐＣｏＶＫＯＲＣ１構造と使用したプライマーの位置を示した図である。
【図６】共発現ベクターｐＣｏＰＤＩＡ２の構造と使用したプライマーの位置を示した図である。
【図７】共発現ベクターｐＣｏＰＧＥの構造を示した図である。
【図８】共発現ベクターｐＣｏＶＫＥの構造を示した図である。
【図９】共発現ベクターｐＭＡＫ８０の構造と使用したプライマーの位置を示した図である。
【図１０】共発現ベクターｐＭＡＫ８５の構造を示した図である。
【図１１】共発現ベクターｐＭＡＫ８６の構造を示した図である。
【図１２】共発現ベクターｐＭＡＫ２１９の構造を示した図である。
【図１３】共発現ベクターｐＭＡＫ１３２の構造を示した図である。
【図１４】実施例１において、Ｓ２細胞と各共発現ベクターを導入した形質転換体の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。
【図１５】実施例１において、Ｓ２細胞と各共発現ベクターを導入した形質転換体の培養上清の血液凝固第ＶＩＩ因子（ｈＦ７）活性（ＩＵ／ｍＬ）（図１５（Ａ））、Ｓ２細胞と各共発現ベクターを導入した形質転換体の培養上清中のｈＦ７量（ｎｇ／ｍＬ）（図１５（Ｂ））、及びＳ２細胞と各共発現ベクターを導入した形質転換体の培養上清のタンパク質１ｎｇ当たりのｈＦ７活性（ＩＵ／ｎｇ）（図１５（Ｃ））を示した図である。
【図１６】共発現ベクターｐＭＡＫ７９の構造を示した図である。
【図１７】共発現ベクターｐＭＡＫ８７の構造を示した図である。
【図１８】実施例２において、Ｓ２細胞と各共発現ベクターを導入した形質転換体の培養上清ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。
【図１９】実施例２において、Ｓ２細胞と各共発現ベクターを導入した形質転換体の培養上清の血液凝固第ＩＩ因子（ｈＦ２）活性（ＩＵ／ｍＬ）を示した図である。
【図２０】共発現ベクターｐＭＡＫ８１の構造を示した図である。
【図２１】共発現ベクターｐＭＡＫ８８の構造を示した図である。
【図２２】実施例３において、Ｓ２細胞と各共発現ベクターを導入した形質転換体の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。
【図２３】共発現ベクターｐＭＡＫ８２の構造を示した図である。
【図２４】共発現ベクターｐＭＡＫ８９の構造を示した図である。
【図２５】実施例４において、Ｓ２細胞と各共発現ベクターを導入した形質転換体の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。
【図２６】共発現ベクターｐＭＡＫ８３の構造を示した図である。
【図２７】共発現ベクターｐＭＡＫ９０の構造を示した図である。
【図２８】実施例５において、Ｓ２細胞と各共発現ベクターを導入した形質転換体の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。
【図２９】共発現ベクターｐＭＡＫ８４の構造を示した図である。
【図３０】共発現ベクターｐＭＡＫ２５４の構造を示した図である。
【図３１】実施例６において、各共発現ベクターを導入した形質転換体の培養上清中のヒトプロテインＳ量（ｎｇ／ｍＬ）（左図）、各共発現ベクターを導入した形質転換体の培養上清のプロテインＳ活性（ｎｇ／ｍＬ）（中図）、及び各共発現ベクターを導入した形質転換体の培養上清のタンパク質１ｎｇ当たりのプロテインＳ活性（右図）を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に係るビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法（以下、「本発明に係る製造方法」ということがある。）は、ビタミンＫ、ＶＫＯＲ、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、及び哺乳動物由来のＧＧＣＸが存在する昆虫細胞内で、血液凝固又は抗凝固に関連する哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質を製造することを特徴とする。
【００１４】
哺乳細胞は、培養にＣＯ２インキュベーターを必要とし、かつ細胞増殖速度も遅く、培養には血清を要する。このため、哺乳細胞を用いた組み換えタンパク質の合成はコストが大きい。また、ウイルス感染等の懸念を完全に払しょくするには至っていないという問題もある。これに対して、昆虫細胞は、培養にＣＯ２インキュベーターを必要とせず、増殖速度も速く、無血清培地でも問題なく培養可能である。さらに、一般的に哺乳類の細胞培養で問題となるウイルス感染や混入タンパク質の諸問題も昆虫細胞系では哺乳類と相互作用するものが極めて少ないため安全性の面でも利点が高い。本発明に係る製造方法は、目的のビタミンＫ依存性タンパク質の合成を昆虫細胞内で行うため、目的のビタミンＫ依存性タンパク質を、哺乳細胞内で製造する場合に比べてより安価かつ容易に製造できる。加えて、より安全性の高いビタミンＫ依存性タンパク質も製造可能である。
【００１５】
本発明に係る製造方法において、目的のビタミンＫ依存性タンパク質の製造を行う昆虫細胞（以下、「宿主細胞」ということがある。）としては、特に限定されるものではなく、組み換えタンパク質の発現系として使用可能な昆虫細胞であればよく、野生型であってもよく、遺伝子の欠損又は変異や外来遺伝子の導入等を生じさせた変異体であってもよい。当該昆虫細胞としては、培養や取扱いが容易であることから、Ｓ２細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、ＢｍＮ細胞、Ｔｎｉ  ＰＲＯ細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞等の培養細胞株及びこれらの変異体が好ましい。中でも、ショウジョウバエ由来の培養細胞株Ｓ２細胞は、細胞増殖も早く分泌タンパク質生成能力も高いことから数多くの組み換えタンパク質発現実験に用いられていること、ショウジョウバエ由来のＶＫＯＲ（Ｄ）の存在が確認されており、ビタミンＫの還元システムの存在が確認されていることから、本発明において用いられる宿主細胞として特に好ましい。
【００１６】
本発明に係る製造方法において製造する目的のビタミンＫ依存性タンパク質は、血液凝固又は抗凝固に関連しており、かつビタミンＫ依存的に活性を示すタンパク質である。当該ビタミンＫ依存性タンパク質としては、例えば、血液凝固第ＩＩ因子（プロトロンビン）、血液凝固第ＶＩＩ因子、血液凝固第ＩＸ因子、血液凝固第Ｘ因子、プロテインＣ、又はプロテインＳ等が挙げられる。
【００１７】
本発明に係る製造方法において製造する目的のビタミンＫ依存性タンパク質は、哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質である。当該ビタミンＫ依存性タンパク質としては、ヒトや、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、サル、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、ロバ、イヌ、ネコ等の家畜や実験動物に由来するビタミンＫ依存性タンパク質が好ましく、ヒト由来のビタミンＫ依存性タンパク質が特に好ましい。
【００１８】
なお、一般的に何らかの生理活性を有するタンパク質は、その生理活性を損なうことなく、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。そこで、「ヒト由来のタンパク質」は、ヒトが本来有している、すなわち、ゲノム上に当該タンパク質をコードする遺伝子が存在するタンパク質と、当該タンパク質に機能や活性を損なうことなく各種改変を施したタンパク質の両方を意味する。その他の動物由来のタンパク質も同様である。
【００１９】
血液凝固因子や抗凝固因子は、Ｎ末端に分泌シグナルペプチドを有しており、細胞内で合成された後、分泌シグナルペプチドが切断された成熟型で細胞外へ分泌される。この成熟型タンパク質が血液凝固や抗凝固に機能する。そこで、本発明に係る製造方法においても、目的のビタミンＫ依存性タンパク質は、分泌シグナルペプチドが切断された成熟型のタンパク質として昆虫細胞外へ分泌されることが好ましい。
【００２０】
哺乳動物が本来有する血液凝固因子等の分泌シグナルペプチドは、昆虫細胞内では適切に機能しない場合がある。この場合には、哺乳動物が本来有する血液凝固因子の分泌シグナルペプチドを、宿主細胞として用いる昆虫細胞内において分泌シグナルペプチドとして機能するペプチドに置換したタンパク質を、本発明に係る製造方法において製造する目的のビタミンＫ依存性タンパク質とすることが好ましい。哺乳動物が本来有する血液凝固因子の分泌シグナルペプチドが宿主細胞内でも分泌シグナルペプチドとして機能する場合には、哺乳動物が本来有する血液凝固因子をそのまま宿主細胞内で発現させればよい。昆虫細胞内において分泌シグナルペプチドとして機能するペプチドとしては、当該昆虫細胞が本来有している分泌タンパク質の分泌シグナルペプチドが挙げられる。宿主細胞としてＳ２細胞を用いる場合には、例えば、ショウジョウバエのＢｉＰタンパク質の分泌シグナルペプチドが挙げられる。
【００２１】
本発明に係る製造方法において製造する目的のビタミンＫ依存性タンパク質としては、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかが好ましい。
（ａ）  いずれかの哺乳動物が本来有しているビタミンＫ依存性タンパク質のＮ末端の分泌シグナルペプチドが切断された成熟型タンパク質のＮ末端側に、昆虫細胞内において分泌シグナルペプチドとして機能するペプチドが直接又は間接的に連結されたタンパク質。
（ｂ）  前記（ａ）のビタミンＫ依存性タンパク質のアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記（ａ）のビタミンＫ依存性タンパク質が有する血液凝固活性又は抗凝固活性を有するタンパク質。
（ｃ）  前記（ａ）のビタミンＫ依存性タンパク質のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ前記（ａ）のビタミンＫ依存性タンパク質が有する血液凝固活性又は抗凝固活性を有するタンパク質。
【００２２】
前記（ａ）において、成熟型タンパク質のＮ末端側と昆虫細胞内において分泌シグナルペプチドとして機能するペプチドのＣ末端側は、直接連結していてもよく、１個又は２個以上のアミノ酸からなるポリペプチドを介して連結されていてもよい。リンカーとなるポリペプチドのアミノ酸鎖長やアミノ酸配列の種類は、当該成熟型タンパク質の活性を損なわないものであれば特に限定されるものではなく、例えば、１〜２０個のポリペプチドを用いることができる。
【００２３】
本発明及び本願明細書において、「タンパク質においてアミノ酸が欠失する」とは、タンパク質を構成しているアミノ酸の一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「タンパク質においてアミノ酸が置換する」とは、タンパク質を構成しているアミノ酸が別のアミノ酸に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「タンパク質においてアミノ酸が付加される」とは、タンパク質中に新たなアミノ酸が挿入されることを意味する。
【００２４】
前記（ｂ）のタンパク質において、前記（ａ）のビタミンＫ依存性タンパク質のアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
【００２５】
前記（ｃ）のタンパク質において、前記（ａ）のビタミンＫ依存性タンパク質のアミノ酸配列との配列同一性は、８５％以上１００％未満であることが好ましく、９０％以上１００％未満であることがより好ましく、９５％以上１００％未満であることがさらに好ましい。
【００２６】
本発明に係る製造方法においては、哺乳動物由来のＧＧＣＸの存在する昆虫細胞内で目的のビタミンＫ依存性タンパク質を発現させて製造する。例えば、Ｓ２細胞では、ショウジョウバエ由来のＧＧＣＸ（Ｄ）の存在が確認されているが、後記実施例に示すように、ＧＧＣＸ（Ｄ）のみでは、活性を有する目的のビタミンＫ依存性タンパク質が製造できない。哺乳動物由来のＧＧＣＸとしては、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＧＧＣＸ（ＮＭ＿０００８２１．１）、マントヒヒ（Ｐａｐｉｏ  ｈａｍａｄｒｙａｓ）ＧＧＣＸ（ＡＣ１１６６６５．１）、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）ＧＧＣＸ（ＮＭ＿１７４０６６．２）、ヒツジ（Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ）ＧＧＣＸ（ＡＦ３１２０３５）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＧＧＣＸ（ＮＭ＿０３１７５６．１）、マウス（ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＧＧＣＸ（ＮＭ＿０１９８０２．１）等が挙げられる。なお、番号は、データベースＮＣＢＩのアクセッション番号である。
【００２７】
本発明において用いられる哺乳動物由来のＧＧＣＸとしては、哺乳動物が本来有しているＧＧＣＸに、ＧＧＣＸ活性、すなわち、ビタミンＫ依存的に、グルタミンのγ位にもう一つカルボキシル基を付加させる反応を触媒する活性を保持したまま、各種改変を施したタンパク質であってもよい。当該改変としては、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させる態様が挙げられる。
【００２８】
本発明に係る製造方法においては、ＶＫＯＲの存在する昆虫細胞内で目的のビタミンＫ依存性タンパク質を発現させて製造する。Ｓ２細胞のように、宿主細胞とする昆虫細胞に元々ＶＫＯＲが発現している場合には、内在性のＶＫＯＲをそのまま使用することができる。また、宿主細胞がＶＫＯＲを発現していない場合には、ＶＫＯＲをコードする遺伝子を外来遺伝子として宿主細胞に導入して発現させる。内在性のＶＫＯＲが存在する宿主細胞であっても、ＶＫＯＲをコードする遺伝子を導入して外来のＶＫＯＲを発現させてもよい。宿主細胞に導入する外来のＶＫＯＲとしては、ＶＫＯＲの複合体サブユニット1（ＶＫＯＲＣ１）であることが好ましい。
【００２９】
本発明において用いられるＶＫＯＲとしては、ＶＫＯＲ活性、すなわち、ビタミンＫエポキシド及びビタミンＫの還元し、還元型ビタミンＫを合成する還元酵素活性（ＥＣ１．１．４．２）を有するものであればよく、いずれの生物種由来のＶＫＯＲであってもよく、人工的に合成されたＶＫＯＲ又はＶＫＯＲＣ１であってもよい。宿主細胞に導入する外来のＶＫＯＲとしては、ヒトＶＫＯＲ（ＮＰ＿７７５７８８）、ウシＶＫＯＲ（ＮＰ＿００１００３９０３）、ラットＶＫＯＲ（ＮＰ＿９７６０８０）、マウスＶＫＯＲ（ＮＰ＿８４８７１５）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）ＶＫＯＲ（ＮＰ＿００１００１３２８）、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）ＶＫＯＲ（ＡＡＨ４３７４２）、ショウジョウバエＶＫＯＲ（ＤＡＡ０２５６１）、及びこれらの複合体サブユニット1（ＶＫＯＲＣ１）等が挙げられ、哺乳動物由来のＶＫＯＲ又はＶＫＯＲＣ１が好ましい。番号は、データベースＮＣＢＩのアクセッション番号である。
【００３０】
本発明において用いられるＶＫＯＲとしては、いずれかの生物種由来のＶＫＯＲ又はＶＫＯＲＣ１に、ＶＫＯＲ活性を保持したまま、各種改変を施したタンパク質であってもよい。当該改変としては、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させる態様が挙げられる。
【００３１】
本発明に係る製造方法においては、ＰＤＩ（ＥＣ  ５．３．４．１）の存在する昆虫細胞内で目的のビタミンＫ依存性タンパク質を発現させて製造する。宿主細胞とする昆虫細胞に元々ＰＤＩが発現している場合には、内在性のＰＤＩをそのまま使用することができる。また、宿主細胞がＰＤＩを発現していない場合には、ＰＤＩをコードする遺伝子を外来遺伝子として宿主細胞に導入して発現させる。内在性のＰＤＩが存在する宿主細胞であっても、ＰＤＩをコードする遺伝子を導入して外来のＰＤＩを発現させてもよい。宿主細胞に導入する外来のＰＤＩとしては、ＰＤＩＡ２（タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーＡ、メンバー２）であることが好ましい。
【００３２】
本発明において用いられるＰＤＩとしては、ＰＤＩ活性、すなわち、ジスルフィド結合形成反応に対する触媒活性を（ＥＣ５．３．４．１）を有するものであればよく、いずれの生物種由来のＰＤＩであってもよく、人工的に合成されたＰＤＩ又はＰＤＩＡ２であってもよい。宿主細胞に導入する外来のＰＤＩとしては、哺乳動物由来のＰＤＩが好ましく、哺乳動物由来のＰＤＩＡ２がより好ましく、ヒトＰＤＩＡ２（ＮＰ＿００６８４０）又はマウスＰＤＩＡ２（ＮＰ＿００１０７４５３９）がさらに好ましい。番号は、データベースＮＣＢＩのアクセッション番号である。
【００３３】
本発明において用いられるＰＤＩとしては、いずれかの生物種由来のＰＤＩに、ＰＤＩ活性を保持したまま、各種改変を施したタンパク質であってもよい。当該改変としては、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させる態様が挙げられる。
【００３４】
本発明に係る製造方法は、具体的には、ＰＤＩをコードする遺伝子と、哺乳動物由来のＧＧＣＸをコードする遺伝子と、ＶＫＯＲをコードする遺伝子と、目的のビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子とを、昆虫細胞に導入した形質転換体を、ビタミンＫ含有培地中で培養することにより行う。宿主細胞とする昆虫細胞がＶＫＯＲを発現している細胞であれば、ＶＫＯＲをコードする遺伝子の導入は省略してもよい。
【００３５】
各遺伝子を発現可能な状態で導入した形質転換体は、各遺伝子がコードするタンパク質を発現させるために必要なＤＮＡの組み合わせからなる発現カセットを組み込んだ発現ベクターを、宿主となる昆虫細胞に導入することによって得られる。発現カセットは、発現させるタンパク質をコードする遺伝子と、当該遺伝子の発現を制御するプロモーターとを備える。発現カセットは、さらに、ターミネーター、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。好ましい発現カセットは、タンパク質をコードする遺伝子配列、プロモーター、ターミネーター、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域を全て含む発現カセットである。
【００３６】
プロモーターとターミネーターは、宿主である昆虫細胞内で機能するものであればよい。昆虫細内で機能するプロモーター及びターミネーターとしては、昆虫細胞が本来有するものであってもよく、昆虫細胞が本来有していないものであってもよい。昆虫細内で機能するプロモーターとしては、例えば、ポリヘドリン（多角体）プロモーター、Ｐ１０プロモーター、ウイルス感染初期発現タンパク質（ＩＥ−１）プロモーター、ＭＴプロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、熱ショックタンパク質プロモーター、ＯＰＩＥ２プロモーター、及びアクチン５Ｃプロモーター等が挙げられる。
【００３７】
各遺伝子の発現カセットを組み込んで発現ベクターを作製するためのベクターは、昆虫細胞への導入に通常用いられる任意のベクターを用いることができる。当該ベクターは、環状のプラスミドベクターであってもよく、直鎖状のベクターであってもよく、バキュロウイルス等のウイルスベクターであってもよい。市販されている昆虫細胞発現用ベクターのクローニングサイトに目的のタンパク質をコードする遺伝子を組込むことによっても、発現ベクターを作製することができる。
【００３８】
各遺伝子の発現カセットは、１のベクターに纏めて組込んでもよく、２以上のベクターに分けて組込んでもよく、１のベクターに１の発現カセットのみを組込んでもよい。１の昆虫細胞に必要な全ての発現カセットをより確実に導入可能であることから、全ての発現カセットを１のベクターに組込んだ発現ベクターを用いて形質転換を行うことが好ましい。具体的には、１のベクターに、ＰＤＩ遺伝子の発現カセットと、哺乳動物由来のＧＧＣＸ遺伝子の発現カセットと、ＶＫＯＲ遺伝子の発現カセットと、目的のビタミンＫ依存性タンパク質遺伝子の発現カセットと、が全て組込まれた発現ベクターや、１のベクターに、ＰＤＩ遺伝子の発現カセットと、哺乳動物由来のＧＧＣＸ遺伝子の発現カセットと、目的のビタミンＫ依存性タンパク質遺伝子の発現カセットと、が全て組込まれた発現ベクターを宿主細胞である昆虫細胞に導入して形質転換体を製造することが好ましい。
【００３９】
本発明において使用される形質転換体を製造するための発現ベクターは、目的の遺伝子の発現カセットのほかに、発現カセットが導入されたベクターを選択したり、形質転換体を選択するためのマーカーを有することが好ましい。該マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子（ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）、ゼオシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子等が挙げられる。
【００４０】
本発明に係る製造方法に使用される形質転換体は、各外来遺伝子の発現カセットが、宿主細胞の細胞内で染色体外遺伝子として保持される形質転換体であってもよく、宿主細胞の染色体中に組み込まれた形質転換体であってもよい。また、発現ベクターを昆虫細胞へ導入する形質転換方法は、公知の形質転換方法の中から適宜選択して行うことができる。例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム沈殿法、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、組換えバキュロウイルスを感染させる方法等が挙げられる。また、市販の昆虫細胞形質転換用キットを用いてもよい。
【００４１】
当該形質転換体をビタミンＫ含有培地中で培養することにより、目的のビタミンＫ依存性タンパク質が成熟型として、形質転換体外へ分泌された状態で製造される。ビタミンＫの存在下で発現させることにより、活性を有するビタミンＫ依存性タンパク質が製造できる。ビタミンＫ含有培地のビタミンＫ濃度は、形質転換体内のビタミンＫ濃度が充分に高くなる濃度であれば特に限定されるものではない。例えば、培地中のビタミンＫ濃度を５〜１０μｇ／ｍＬとすることにより、活性を有する状態のビタミンＫ依存性タンパク質が培地に分泌される。
【００４２】
目的のビタミンＫ依存性タンパク質の製造のために用いられる培地は、ビタミンＫを含有する以外は、通常、昆虫細胞の培養に用いられる培地を用いることができる。また、培養温度等の培養条件も、宿主とした昆虫細胞の培養と同様にして行うことができる。
【００４３】
培地に分泌された目的のビタミンＫ依存性タンパク質は、公知の方法により培地から精製することができる。例えば、培養終了後の液体培地から遠心分離により菌体を分離し、回収された培養上清をアフィニティカラムに通し、目的のビタミンＫ依存性タンパク質が溶出された分画のみを回収することにより、目的のビタミンＫ依存性タンパク質を精製できる。
【実施例】
【００４４】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
なお、以降の実験において、ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用い、製品に添付の指示に従って行った。
また、  Ｓ２細胞の継代培養は、継代用培地（「ＥｘｐｒｅｓｓＦｉｖｅ  ＳＦＭ」（サーモフィッシャー社）に１０％  ＦＣＳ（サーモフィッシャー社）と抗生物質「ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（シグマ社）を添加した培地）中で、２７℃で培養した。
【００４５】
［実施例１］
＜ｐＣｏＰＧＥとｐＣｏＶＫＥの作製＞
共発現ベクターｐＣｏＰＵＲＯ（イワキ社製、製品番号：２００３  ＃１１９１）（図１、配列番号１）を鋳型とし、ｐＭＴ−ＰＵＲＯ２．ｔａｇＦ（５’−ＧＡＧＧＣＣＣＡＣＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＧＣ、配列番号２）をフォワードプライマーとして、ｐＭＴ−ＰＵＲＯ２．ＫｏｚａｋＲ（５’−ＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＣＡＡＧＣＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧ、１〜９番目の領域はＫｏｚａｋ配列を示す。配列番号３）をリバースプライマーとして用いてインバースＰＣＲを行い、得られた増幅産物を、ｐＣｏＰＵＲＯ２Ｇ、ｐＣｏＧＧＣＸ、ｐＣｏＶＫＯＲＣ１、及びｐＣｏＰＤＡＩ２を作製するための土台とした。
【００４６】
ＭＴプロモーターの下流にショウジョウバエのＢｉＰタンパク質の分泌シグナルペプチド（図中、「ＢｉＰ」）及び外来遺伝子を導入するマルチクローニングサイトを備えるｐＭＴ−ＰＵＲＯ２Ｇ（イワキ社製、製品番号：２００８  ＃１４４７）（図２、配列番号４）を鋳型とし、ＰＵＲＯ．Ｆ（５’−ＡＴＧＡＣＣＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＴＧ、配列番号５）をフォワードプライマーとして、ＥＧＦＰ．Ｒ（５’−ＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ、配列番号６）をリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによって、ピューロマイシン耐性マーカー（ｐａｃ）とＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の融合タンパク質をコードする塩基配列からなる断片を得た。得られた増幅産物を、Ｔ４ヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ  Ｊａｐａｎ社製）でリン酸化した後、Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ  Ｊａｐａｎ社製）を用いて前記土台と連結させ、共発現ベクターｐＣｏＰＵＲＯ２Ｇ（図３、配列番号７）を作製した。
【００４７】
ＦＡＮＴＯＭクローン（ＩＤ＃６８２０４１８Ｌ０５、ダナフォーム社製）を鋳型とし、Ｇｇｃｘ．Ｆ（５’−ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＣＣＧＣＧＧＣＴＣＣＧＣ、配列番号８）をフォワードプライマーとして、Ｇｇｃｘ．Ｒ（５’−ＴＣＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＧＴＧＡＡＣＡＴＧＣＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＧ、配列番号９）をリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによって、マウスのＧＧＣＸをコードする遺伝子の塩基配列からなる断片を得た。得られた増幅産物を、リン酸化した後、前記土台と連結させ、共発現ベクターｐＣｏＧＧＣＸ（図４、配列番号１０）を作製した。
【００４８】
ＦＡＮＴＯＭクローン（ＩＤ＃１１１０００１Ｋ０５、ダナフォーム社製）を鋳型とし、Ｖｋｏｒｃ１．Ｆ（５’−ＡＴＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＣＣ、配列番号１１）をフォワードプライマーとして、Ｖｋｏｒｃ１．Ｒ（５’−ＴＣＡＧＴＧＣＴＴＴＴＴＧＧＴＣＴＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＴＴＣＴＧ、配列番号１２）をリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによって、マウスのＶＫＯＲＣ１をコードする遺伝子の塩基配列からなる断片を得た。得られた増幅産物を、リン酸化した後、前記土台と連結させ、共発現ベクターｐＣｏＶＫＯＲＣ１（図５、配列番号１３）を作製した。
【００４９】
ＦＡＮＴＯＭクローン（ＩＤ＃１８１００４１Ｆ１３、ダナフォーム社製）を鋳型とし、Ｐｄｉａ２．Ｆ（５’−ＡＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＴＴＧＣＴＧＣ、配列番号１４）をフォワードプライマーとして、Ｐｄｉａ２．Ｒ（５’−ＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＣＡＡＧＧ、配列番号１５）をリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによって、マウスのＰＤＩＡ２をコードする遺伝子の塩基配列からなる断片を得た。得られた増幅産物を、リン酸化した後、前記土台と連結させ、共発現ベクターｐＣｏＰＤＩＡ２（図６、配列番号１６）を作製した。
【００５０】
共発現ベクターｐＣｏＰＵＲＯ２Ｇを鋳型とし、ＶＫＢｉｎｖＦ（５’−ＡＧＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣ、５〜１２番目の領域は制限酵素ＮｏｔＩサイト、１５〜２２番目の領域はＡｓｃＩサイトを示す。配列番号１７）をフォワードプライマーとして、ＶＫＢ／ＭｉｎｖＲ（５’−ＣＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＴＴＧＴＡＣＡＴＴＣＣＴＡＧＧＣＣＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＣＴＴＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＧＡＴＡＣＣ、５〜１２番目の領域は制限酵素ＮｏｔＩサイト、２５〜３０番目の領域はＡｖｒＩＩサイトを示す。配列番号１８）をリバースプライマーとして用いてインバースＰＣＲを行い、得られた増幅産物を、制限酵素ＮｏｔＩとＡｖｒＩＩ（いずれもＮＥＢ  Ｊａｐａｎ社製）で消化した後、得られた断片をｐＣｏＰＧＥを作製するための土台とした。
【００５１】
ｐＣｏＧＧＣＸを鋳型とし、ＶＫＭｉｎｖＦ（５’−ＧＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣ、５〜９番目の領域は制限酵素ＳｐｅＩサイトを示す。配列番号１９）をフォワードプライマーとして、ＶＫＢ／ＭｉｎｖＲをリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、ＣＯＰＩＡプロモーターとポリＡシグナルを含むＧＧＣＸ発現カセットを得た。得られた増幅産物を、ＳｐｅＩとＮｏｔＩ（いずれもＮＥＢ  Ｊａｐａｎ社製）で消化した後、得られた消化断片を前記土台と連結させ、共発現ベクターｐＣｏＰＧＥ（図７、配列番号２０）を作製した。
【００５２】
同様に、ｐＣｏＶＫＯＲＣ１を鋳型としてＰＣＲにより得られたＣＯＰＩＡプロモーターとポリＡシグナルを含むＶＫＯＲＣ１発現カセットの増幅産物を、ｐＣｏＰＧＥに連結させた後、得られたベクターに、ｐＣｏＰＤＩＡ２を鋳型としてＰＣＲにより得られたＣＯＰＩＡプロモーターとポリＡシグナルを含むＰＤＩＡ２発現カセットの増幅産物を連結させることにより、共発現ベクターｐＣｏＶＫＥ（図８、配列番号２１）を作製した。
【００５３】
＜ｐＭＡＫ８０、ｐＭＡＫ８５、ｐＭＡＫ８６、ｐＭＫＡ１３２、及びｐＭＡＫ２１９の作製＞
ｃＤＮＡクローン（ＭＧＣ：１６３３４０、ＩＭＡＧＥ：４０１４６４９９）を鋳型とし、ＭＡＫ８０Ｆ（５’−ＣＴＣＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＴＣＧＴＡＡＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣ、１１〜１６番目の領域は制限酵素ＢｇｌＩＩサイトを示す。配列番号２２）をフォワードプライマーとして、ＭＡＫ８０Ｒ（５’−ＣＧＡＡＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＧＧＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＣＡＧＧ、１１〜１６番目の領域は制限酵素ＸｂａＩサイトを示す。配列番号２３）をリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによって、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子（ｈＦ７）の分泌シグナルペプチド欠損体のｃＤＮＡ断片（ｈＦ７δＳｉｇ）を得た。得られた断片を、制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで消化したｐＭＴ−ＰＵＲＯ２Ｇにサブクローニングし、共発現ベクターｐＭＡＫ８０（図９、配列番号２４）を作製した。サブクローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用い、製品に添付の指示に従って行った。
【００５４】
ｐＭＡＫ８０を鋳型とし、ＭＡＫ８０Ｆ−ＬＩＣ（５’−ＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＣＣＴＡＧＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧ、１１〜１６番目の領域は制限酵素ＡｖｒＩＩサイトを示す。配列番号２５）をフォワードプライマーとして、ＭＡＫ８０Ｒ−ＬＩＣ（５’−ＧＣＧＣＧＣＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＣＧＡＧＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧ、１０〜１７番目の領域は制限酵素ＮｏｔＩサイトを示す。配列番号２６）をリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによって、ＭＴプロモーターとＢｉＰ分泌シグナルペプチドとポリＡシグナルを含むＢｉＰ−ｈＦ７δＳｉｇ発現カセットを得た。得られた増幅産物を、制限酵素ＡｖｒＩＩとＮｏｔＩで消化したｐＣｏＰＧＥ及びｐＣｏＶＫＥにそれぞれサブクローニングし、共発現ベクターｐＭＡＫ８５（図１０、配列番号２７）及び共発現ベクターｐＭＡＫ８６（図１１、配列番号２８）を作製した。
【００５５】
ｐＣｏＶＫＯＲＣ１を鋳型とし、ＶＫＭｉｎｖＦをフォワードプライマーとして、ＶＫＢ／ＭｉｎｖＲをリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、ＣＯＰＩＡプロモーターとポリＡシグナルを含むＶＫＯＲＣ１発現カセットを得た。得られた増幅産物を、ＳｐｅＩとＡｖｒＩＩで消化した後、得られた消化断片を、ＡｖｒＩＩで消化したｐＭＡＫ８５と連結させ、共発現ベクターｐＭＡＫ２１９（図１２、配列番号２９）を作製した。
【００５６】
ｃＤＮＡクローン（ＭＧＣ：１６３３４０、ＩＭＡＧＥ：４０１４６４９９）を鋳型とし、ＭＡＫ１３２Ｆ（５’−ＡＴＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＣ、１〜３番目の領域は開始コドンを示す。配列番号３０）をフォワードプライマーとして、ＭＡＫ１３２Ｒ（５’−ＧＧＣＡＣＣＧＡＣＡＧＧＡＧＣＧＣＴＴＧＧ、１３〜１８番目の領域は制限酵素ＡｆｅＩサイトを示す。配列番号３１）をリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによって、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子が本来有する分泌シグナルペプチドを得た。得られた断片とｐＭＡＫ８０を鋳型とし、ＭＡＫ８０Ｆ−ＬＩＣをフォワードプライマーとして、ＭＡＫ１３２ＯＬＲ（５’−ＧＧＣＣＴＧＧＧＡＧＡＣＣＡＴＡＴＴＧＡＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＣＴＴＴＡＧ、配列番号３２）をリバースプライマーとして用いてオーバーラップ・エクステンションＰＣＲを行うことによって、ＭＴプロモーターの下流にヒト血液凝固第ＶＩＩ因子が本来有する分泌シグナルペプチドがある増幅断片を得た。得られた増幅断片を、制限酵素ＡｖｒＩＩとＡｆｅＩで消化したｐＭＡＫ８６にサブクローニングし、共発現ベクターｐＭＡＫ１３２（図１３、配列番号３３）を作製した。ｐＭＡＫ１３２は、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子（ｈＦ７）のｃＤＮＡの全長が組み込まれている。
【００５７】
＜Ｓ２細胞の形質転換体の作製＞
Ｓ２細胞（サーモフィッシャー社製）に、ｐＭＡＫ８０、ｐＭＡＫ８５、ｐＭＡＫ８６、ｐＭＫＡ１３２、及びｐＭＡＫ２１９をそれぞれトランスフェクションし、形質転換体を得た。具体的には、２４ウェルプレートに細胞密度が２×１０５個／１ウェルとなるように播き、１ｍＬ／１ウェルの継代用培地中で１６時間後のＳ２細胞に、１μｇの各共発現ベクターを、「ＨｉｌｌｙＭａｘ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ」（同仁化学研究所社製）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの４時間後に培地を交換し、さらに４８時間培養後、培地を、継代用培地にピューロマイシンを最終濃度が２μｇ／ｍＬとなるように添加したＰＵＲＯ含有培地に交換し、共発現ベクターが導入された形質転換体の選抜を行った。ピューロマイシン存在下での培養により選抜された形質転換体は、いずれも緑色蛍光が観察された。
【００５８】
＜ｈＦ７発現＞
選抜された各形質転換体を、６ウェルプレートに細胞密度が１×１０７個／１ウェルとなるように播いて３ｍＬ／１ウェルの継代用培地中で培養した後、ＰＵＲＯ含有培地に硫酸銅を最終濃度が５００μＭとなるように添加した誘導培地、又は誘導培地にさらにビタミンＫを最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように添加したビタミンＫ含有培地中で４８時間培養した後、培養上清を回収した。回収された培養上清は、遠心分離処理を行うことによって菌体を除去した。なお、対照として、ベクターを導入していないＳ２細胞についても同様の処理を行った。
【００５９】
得られた培養上清のうち５μＬを２−メルカプトエタノール含有ローディングバッファー５μＬと混合した後、９９℃で３分間処理することにより、泳動用サンプルを調製した。この泳動用サンプルを、１２％のポリアクリルアミドゲルにアプライしてＳＤＳ電気泳動を行った。泳動終了後、ゲル内のタンパク質をＰＤＶＦ膜（ミリポア社）に転写した。タンパク質を転写したＰＶＤＦ膜を、ウサギを免疫して得られたヒト第ＶＩＩ因子に対する特異抗体（アバカム社製）と反応させ、さらにＨＲＰ標識された抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と反応させて、「ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ」（サーモフィッシャー社製）を用いて発光させることによって、当該ＰＶＤＦ膜に転写されたタンパク質を可視化した。結果を図１４に示す。図中、「−ＶｉｔＫ」は誘導培地で培養した培養上清の結果を、「＋ＶｉｔＫ」はビタミンＫ含有培地で培養した培養上清の結果を、それぞれ示す。また、「８０」、「８５」、「８６」、「１３２」、及び「２１９」は、それぞれ、ｐＭＡＫ８０、ｐＭＡＫ８５、ｐＭＡＫ８６、ｐＭＫＡ１３２、及びｐＭＡＫ２１９を導入した形質転換体の結果を示す。この結果、ｐＭＡＫ８０、ｐＭＡＫ８５、ｐＭＡＫ８６、及びｐＭＡＫ２１９を導入した形質転換体では、誘導培地とビタミンＫ含有培地のいずれの培地で培養した場合にも、成熟型のｈＦ７から予想される質量４７ｋＤａ近傍にバンドが認められた。一方で、ｐＭＡＫ１３２を導入した形質転換体では、誘導培地とビタミンＫ含有培地のいずれの培地でも、ｈＦ７のバンドは確認されなかった。
【００６０】
また、得られた培養上清のうち１μＬ中のｈＦ７の量を、市販のキット（製品名：Ｆ７（Ｈｕｍａｎ）  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ、Ａｂｎｏｖａ社製）により測定した。測定結果を図１５（Ｂ）に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果と同様に、ビタミンＫの有無にかかわらず、ｐＭＡＫ８０、ｐＭＡＫ８５、ｐＭＡＫ８６、及びｐＭＡＫ２１９を導入した形質転換体では培養上清中にｈＦ７が確認されたが、ｐＭＫＡ１３２を導入した形質転換体では確認されなかった。ｐＭＫＡ１３２を導入した形質転換体の培養上清にｈＦ７が確認されなかったことから、ｈＦ７が本来有している分泌シグナルペプチドは、Ｓ２細胞内では適切に機能しないことが推察された。
【００６１】
また、得られた培養上清のうち１００μＬを用いて、ｈＦ７の活性を測定した。ｈＦ７活性の測定は、市販のキット（製品名：Ｆ７（Ｈｕｍａｎ）  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｋｉｔ、Ａｂｎｏｖａ社製）を用い、製品に添付の指示に従って行った。測定結果を図１５（Ａ）に示す。また、ｈＦ７のタンパク質１ｎｇ当たりのｈＦ７活性（ｈＦ７比活性）を図１５（Ｃ）に示す。この結果、ｐＭＡＫ８５、ｐＭＡＫ８６、及びｐＭＡＫ２１９を導入した形質転換体では、ｈＦ７活性は、ビタミンＫを添加していない誘導培地の培養上清では確認されなかったが、ビタミンＫ含有培地の培養上清では確認された。中でも、ｐＭＡＫ８６を導入した形質転換体、すなわち、ＧＧＣＸとＶＫＯＲＣ１とＰＤＩＡ２の全てを外来遺伝子として導入して発現させた形質転換体が、ｈＦ７比活性が顕著に高かった。また、ｐＭＡＫ８０を導入した形質転換体では、成熟型のｈＦ７の存在が確認されているにもかかわらず、ビタミンＫ含有培地でもｈＦ７活性は確認されなかった。これらの結果から、昆虫細胞内でｈＦ７等のビタミンＫ依存性タンパク質を活性を備えた状態で発現させるためには、ビタミンＫの存在下でタンパク質発現を行う必要があること、Ｓ２細胞の内在性のＧＧＣＸは、ｈＦ７等の哺乳動物由来のビタミンＫ依存性タンパク質を発現させる場合には機能せず、哺乳動物由来のＧＧＣＸの導入が必要であること、特に、ＧＧＣＸとＶＫＯＲとＰＤＩの全てを過剰発現させることにより、比活性の高いビタミンＫ依存性タンパク質が合成できること、が判明した。
【００６２】
［実施例２］
＜ｐＭＡＫ７９及びｐＭＡＫ８７の作製＞
ｃＤＮＡクローン（ＭＧＣ：５９８０３、ＩＭＡＧＥ：６２８３４２０）を鋳型とし、ＭＡＫ７９Ｆ（５’−ＣＴＣＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＧＣＴＣＣ、１１〜１６番目の領域は制限酵素ＢｇｌＩＩサイトを示す。配列番号３４）をフォワードプライマーとして、ＭＡＫ７９Ｒ（５’−ＣＧＡＡＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＴＣＴＣＣＡＡＡＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧＡＣＣＴＴＣ、１１〜１６番目の領域は制限酵素ＸｂａＩサイトを示す。配列番号３５）をリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによって、ヒト血液凝固第ＩＩ因子（ｈＦ２）の分泌シグナルペプチド欠損体のｃＤＮＡ断片（ｈＦ２δＳｉｇ）を得た。得られた断片を、制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで消化したｐＭＴ−ＰＵＲＯ２Ｇにサブクローニングし、共発現ベクターｐＭＡＫ７９（図１６、配列番号３６）を作製した。
【００６３】
ｐＭＡＫ７９を鋳型とし、ＭＡＫ８０Ｆ−ＬＩＣをフォワードプライマーとして、ＭＡＫ８０Ｒ−ＬＩＣをリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによって、ＭＴプロモーターとＢｉＰ分泌シグナルペプチドとポリＡシグナルを含むＢｉＰ−ｈＦ２δＳｉｇ発現カセットを得た。得られた増幅産物を、制限酵素ＡｖｒＩＩとＮｏｔＩで消化したｐＣｏＶＫＥにサブクローニングし、共発現ベクターｐＭＡＫ８７（図１７）を作製した。
【００６４】
＜Ｓ２細胞の形質転換体の作製＞
実施例１と同様にして、Ｓ２細胞に、ｐＭＡＫ７９及びｐＭＡＫ８７をそれぞれトランスフェクションし、形質転換体を得た。ピューロマイシン存在下での培養により選抜された形質転換体は、いずれも緑色蛍光が観察された。
【００６５】
＜ｈＦ２発現＞
実施例１と同様にして、選抜された各形質転換体を誘導培地又はビタミンＫ含有培地中で４８時間培養した後、培養上清を回収した。回収された培養上清は、遠心分離処理を行うことによって菌体を除去した。なお、対照として、ベクターを導入していないＳ２細胞についても同様の処理を行った。
【００６６】
得られた培養上清の一部を用い、実施例１と同様にしてＳＤＳ電気泳動を行った後、ＣＢＢ染色し、タンパク質のバンドを可視化した。結果を図１８に示す。図中、「−ＶｉｔＫ」は誘導培地で培養した培養上清の結果を、「＋ＶｉｔＫ」はビタミンＫ含有培地で培養した培養上清の結果を、それぞれ示す。また、「７９」及び「８４」は、それぞれ、ｐＭＡＫ７９及びｐＭＡＫ８４を導入した形質転換体の結果を示す。この結果、ｐＭＡＫ７９及びｐＭＡＫ８４を導入した形質転換体では、誘導培地とビタミンＫ含有培地のいずれの培地で培養した場合にも、成熟型のｈＦ２から予想される質量６７ｋＤａ近傍にバンドが認められた。
【００６７】
得られた培養上清のうち１μＬを用いて、ｈＦ２の活性を測定した。ｈＦ２活性の測定は、市販のキット（製品名：ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ  ＡＦＣ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、ＡｎａＳｐｅｃ社製）を用い、製品に添付の指示に従って行った。測定結果を図１９に示す。この結果、ｈＦ７と同様に、ｈＦ２も、ｐＭＡＫ８７を導入した形質転換体、すなわち、ｈＦ２をＧＧＣＸとＶＫＯＲとＰＤＩと共発現させた形質転換体をビタミンＫ含有培地で培養した培養上清ではｈＦ２活性が確認されたが、ビタミンＫを含まない培地で培養した形質転換体やＧＧＣＸを共発現させていないｐＭＡＫ７９を導入した形質転換体では、ｈＦ２活性は確認できなかった。
【００６８】
［実施例３］
＜ｐＭＡＫ８１及びｐＭＡＫ８８の作製＞
ｃＤＮＡクローン（ＭＧＣ：１２９６４２、ＩＭＡＧＥ：４０００７６３７）を鋳型とし、ＭＡＫ８１Ｆ（５’−ＣＴＣＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＧＴＴＴＴＴＣＴＴＧＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＣ、１１〜１６番目の領域は制限酵素ＢｇｌＩＩサイトを示す。配列番号３７）をフォワードプライマーとして、ＭＡＫ８１Ｒ（５’−ＣＧＡＡＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＧＴＧＡＧＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＡＡＴＣＣＡＧＴＴＧ、１１〜１６番目の領域は制限酵素ＸｂａＩサイトを示す。配列番号３８）をリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによって、ヒト血液凝固第ＩＸ因子（ｈＦ９）の分泌シグナルペプチド欠損体のｃＤＮＡ断片（ｈＦ９δＳｉｇ）を得た。得られた断片を、制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで消化したｐＭＴ−ＰＵＲＯ２Ｇにサブクローニングし、共発現ベクターｐＭＡＫ８１（図２０、配列番号３９）を作製した。
【００６９】
ｐＭＡＫ８１を鋳型とし、ＭＡＫ８０Ｆ−ＬＩＣをフォワードプライマーとして、ＭＡＫ８０Ｒ−ＬＩＣをリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによって、ＭＴプロモーターとＢｉＰ分泌シグナルペプチドとポリＡシグナルを含むＢｉＰ−ｈＦ９δＳｉｇ発現カセットを得た。得られた増幅産物を、制限酵素ＡｖｒＩＩとＮｏｔＩで消化したｐＣｏＶＫＥにサブクローニングし、共発現ベクターｐＭＡＫ８８（図２１）を作製した。
【００７０】
＜Ｓ２細胞の形質転換体の作製＞
実施例１と同様にして、Ｓ２細胞に、ｐＭＡＫ８１及びｐＭＡＫ８８をそれぞれトランスフェクションし、形質転換体を得た。ピューロマイシン存在下での培養により選抜された形質転換体は、いずれも緑色蛍光が観察された。
【００７１】
＜ｈＦ９発現＞
実施例１と同様にして、選抜された各形質転換体を誘導培地又はビタミンＫ含有培地中で４８時間培養した後、培養上清を回収した。回収された培養上清は、遠心分離処理を行うことによって菌体を除去した。なお、対照として、ベクターを導入していないＳ２細胞についても同様の処理を行った。
【００７２】
得られた培養上清の一部を用い、実施例１と同様にしてＳＤＳ電気泳動を行った後、ＣＢＢ染色し、タンパク質のバンドを可視化した。結果を図２２に示す。図中、「−ＶｉｔＫ」は誘導培地で培養した培養上清の結果を、「＋ＶｉｔＫ」はビタミンＫ含有培地で培養した培養上清の結果を、それぞれ示す。また、「８１」及び「８８」は、それぞれ、ｐＭＡＫ８１及びｐＭＡＫ８８を導入した形質転換体の結果を示す。この結果、ｐＭＡＫ８１及びｐＭＡＫ８８を導入した形質転換体では、誘導培地とビタミンＫ含有培地のいずれの培地で培養した場合にも、成熟型のｈＦ９から予想される質量４９ｋＤａ近傍にバンドが認められた。
【００７３】
［実施例４］
＜ｐＭＡＫ８２及びｐＭＡＫ８９の作製＞
ｃＤＮＡクローン（ＭＧＣ：５７５８８、ＩＭＡＧＥ：５７２３５１０）を鋳型とし、ＭＡＫ８２Ｆ（５’−ＣＴＣＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣＧＣＡＧＧＧＡＧＣＡＧ、１１〜１６番目の領域は制限酵素ＢｇｌＩＩサイトを示す。配列番号４０）をフォワードプライマーとして、ＭＡＫ８２Ｒ（５’−ＣＧＡＡＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＣＴＴＴＡＡＴＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＴＴＡＴＧＡＣ、１１〜１６番目の領域は制限酵素ＸｂａＩサイトを示す。配列番号４１）をリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによって、ヒト血液凝固第Ｘ因子（ｈＦ１０）の分泌シグナルペプチド欠損体のｃＤＮＡ断片（ｈＦ１０δＳｉｇ）を得た。得られた断片を、制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで消化したｐＭＴ−ＰＵＲＯ２Ｇにサブクローニングし、共発現ベクターｐＭＡＫ８２（図２３、配列番号４２）を作製した。
【００７４】
ｐＭＡＫ８２を鋳型とし、ＭＡＫ８０Ｆ−ＬＩＣをフォワードプライマーとして、ＭＡＫ８０Ｒ−ＬＩＣをリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによって、ＭＴプロモーターとＢｉＰ分泌シグナルペプチドとポリＡシグナルを含むＢｉＰ−ｈＦ１０δＳｉｇ発現カセットを得た。得られた増幅産物を、制限酵素ＡｖｒＩＩとＮｏｔＩで消化したｐＣｏＶＫＥにサブクローニングし、共発現ベクターｐＭＡＫ８９（図２４）を作製した。
【００７５】
＜Ｓ２細胞の形質転換体の作製＞
実施例１と同様にして、Ｓ２細胞に、ｐＭＡＫ８２及びｐＭＡＫ８９をそれぞれトランスフェクションし、形質転換体を得た。ピューロマイシン存在下での培養により選抜された形質転換体は、いずれも緑色蛍光が観察された。
【００７６】
＜ｈＦ１０発現＞
実施例１と同様にして、選抜された各形質転換体を誘導培地又はビタミンＫ含有培地中で４８時間培養した後、培養上清を回収した。回収された培養上清は、遠心分離処理を行うことによって菌体を除去した。なお、対照として、ベクターを導入していないＳ２細胞についても同様の処理を行った。
【００７７】
得られた培養上清の一部を用い、実施例１と同様にしてＳＤＳ電気泳動を行った後、ＣＢＢ染色し、タンパク質のバンドを可視化した。結果を図２５に示す。図中、「−ＶｉｔＫ」は誘導培地で培養した培養上清の結果を、「＋ＶｉｔＫ」はビタミンＫ含有培地で培養した培養上清の結果を、それぞれ示す。また、「８２」及び「８９」は、それぞれ、ｐＭＡＫ８２及びｐＭＡＫ８９を導入した形質転換体の結果を示す。この結果、ｐＭＡＫ８２及びｐＭＡＫ８９を導入した形質転換体では、誘導培地とビタミンＫ含有培地のいずれの培地で培養した場合にも、成熟型のｈＦ１０から予想される質量５２ｋＤａ近傍にバンドが認められた。
【００７８】
［実施例５］
＜ｐＭＡＫ８３及びｐＭＡＫ９０の作製＞
ｃＤＮＡクローン（ＭＧＣ：３４５６５、ＩＭＡＧＥ：５１８８６０４）を鋳型とし、ＭＡＫ８３Ｆ（５’−ＣＴＣＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＴＧＡＣＴＣ、１１〜１６番目の領域は制限酵素ＢｇｌＩＩサイトを示す。配列番号４３）をフォワードプライマーとして、ＭＡＫ８３Ｒ（５’−ＣＧＡＡＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＧ、１１〜１６番目の領域は制限酵素ＸｂａＩサイトを示す。配列番号４４）をリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによって、ヒトプロテインＣの分泌シグナルペプチド欠損体のｃＤＮＡ断片（ｈＰｒｏｃδＳｉｇ）を得た。得られた断片を、制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで消化したｐＭＴ−ＰＵＲＯ２Ｇにサブクローニングし、共発現ベクターｐＭＡＫ８３（図２６、配列番号４５）を作製した。
【００７９】
ｐＭＡＫ８３を鋳型とし、ＭＡＫ８０Ｆ−ＬＩＣをフォワードプライマーとして、ＭＡＫ８０Ｒ−ＬＩＣをリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによって、ＭＴプロモーターとＢｉＰ分泌シグナルペプチドとポリＡシグナルを含むＢｉＰ−ｈＰｒｏｃδＳｉｇ発現カセットを得た。得られた増幅産物を、制限酵素ＡｖｒＩＩとＮｏｔＩで消化したｐＣｏＶＫＥにサブクローニングし、共発現ベクターｐＭＡＫ９０（図２７）を作製した。
【００８０】
＜Ｓ２細胞の形質転換体の作製＞
実施例１と同様にして、Ｓ２細胞に、ｐＭＡＫ８３及びｐＭＡＫ９０をそれぞれトランスフェクションし、形質転換体を得た。ピューロマイシン存在下での培養により選抜された形質転換体は、いずれも緑色蛍光が観察された。
【００８１】
＜ヒトプロテインＣ発現＞
実施例１と同様にして、選抜された各形質転換体を誘導培地又はビタミンＫ含有培地中で４８時間培養した後、培養上清を回収した。回収された培養上清は、遠心分離処理を行うことによって菌体を除去した。なお、対照として、ベクターを導入していないＳ２細胞についても同様の処理を行った。
【００８２】
得られた培養上清の一部を用い、実施例１と同様にしてＳＤＳ電気泳動を行った後、ＣＢＢ染色し、タンパク質のバンドを可視化した。結果を図２８に示す。図中、「−ＶｉｔＫ」は誘導培地で培養した培養上清の結果を、「＋ＶｉｔＫ」はビタミンＫ含有培地で培養した培養上清の結果を、それぞれ示す。また、「８３」及び「９０」は、それぞれ、ｐＭＡＫ８３及びｐＭＡＫ９０を導入した形質転換体の結果を示す。この結果、ｐＭＡＫ８３及びｐＭＡＫ９０を導入した形質転換体では、誘導培地とビタミンＫ含有培地のいずれの培地で培養した場合にも、成熟型のヒトプロテインＣから予想される質量５０ｋＤａ近傍にバンドが認められた。
【００８３】
［実施例６］
＜ｐＭＡＫ８４、ｐＭＡＫ９１、及びｐＭＡＫ２５４の作製＞
ｃＤＮＡクローン（ＭＧＣ：９２０７、ＩＭＡＧＥ：３９０９０２３）を鋳型とし、ＭＡＫ８４Ｆ（５’−ＣＴＣＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＡＡＣＴＴＴＴＴＧＴＣＡＡＡＧＣＡＡＣＡＧＧＣＴＴＣＡＣ、１１〜１６番目の領域は制限酵素ＢｇｌＩＩサイトを示す。配列番号４６）をフォワードプライマーとして、ＭＡＫ８４Ｒ（５’−ＣＧＡＡＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＧＡＡＴＴＣＴＴＴＧＴＣＴＴＴＴＴＣＣＡＡＡＣＴＧＡＴＧＧＡＣ、１１〜１６番目の領域は制限酵素ＸｂａＩサイトを示す。配列番号４７）をリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによって、ヒトプロテインＳの分泌シグナルペプチド欠損体のｃＤＮＡ断片（ｈＰｒｏｓ１δＳｉｇ）を得た。得られた断片を、制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで消化したｐＭＴ−ＰＵＲＯ２Ｇにサブクローニングし、共発現ベクターｐＭＡＫ８４（図２９、配列番号４８）を作製した。
【００８４】
ｐＶＡＣ１−ｍｃｓ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を鋳型とし、ＥＭ−Ｆ（５’−ＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＡＴＡＧＴＡＴＡＴＣＧ、１１〜１６番目の領域は制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを示す。配列番号４９）をフォワードプライマーとして、ＺＥＯ−Ｔ２Ａ−Ｒ（５’−ＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＧＣＣＡＣＧＡＡＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＡＴＴＣＴＣＣＴＣＧＡＣＧＴＣＡＣＣＧＣＡＴＧＴＴＡＧＣＡＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＧＣＣ、２３〜８５番目の領域はＴ２Ａペプチドをコードする。配列番号５０）をリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによって、ＥＭ７プロモーター（図中、「ＰＥＭ７」）の下流に、ゼオシン耐性遺伝子（図中、「ＺＥＯ」）及びＴ２Ａペプチドを含むタンパク質のｃＤＮＡ断片（ＥＭ７−ＺＥＯ−Ｔ２Ａ）を取得した。次に、赤色蛍光タンパク質であるＤｓＲＥＤで標識したタンパク質を発現するためのベクターｐＤｓＲＥＤ２（タカラバイオ社製、製品番号：６３２４０４）を鋳型として、ＤｓＲＥＤ２−Ｆ（５’−ＧＴＣＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＡＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＡＡＣＧＴＣ、配列番号５１）をフォワードプライマーとして、ＤｓＲＥＤ２−Ｒ（５’−ＧＣＴＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣ、１１〜１６番目の領域は制限酵素ＸｈｏＩサイトを示す。配列番号５２）をリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによって、ＤｓＲＥＤのｃＤＮＡ断片（ＤｓＲＥＤ）を得た。ｃＤＮＡ断片（ＥＭ７−ＺＥＯ−Ｔ２Ａ）とｃＤＮＡ断片（ＤｓＲＥＤ）を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化したｐＭＴ−ＰＵＲＯ２にサブクローニングし、ＥＭ７−ＺＥＯ−Ｔ２Ａ−ＤｓＲＥＤ２が連結されたゼオシン耐性ＤｓＲＥＤ２発現カセットを含むｐＭＴ−ＺＥＯＲを取得した。サブクローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用い、製品に添付の指示に従って行った。ｐＭＡＫ８４から制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで切り出したＢｉＰ−ｈＰｒｏｓ１δＳｉｇ発現カセットの断片を、制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで消化したｐＭＴ−ＺＥＯＲにサブクローニングし、共発現ベクターｐＭＡＫ２５４（図３０）を作製した。
【００８５】
＜Ｓ２細胞の形質転換体の作製＞
実施例１と同様にして、Ｓ２細胞に、ｐＭＡＫ８４をトランスフェクションし、ピューロマイシン存在下で培養し、ピューロマイシン耐性を獲得した形質転換体を得た。選抜された形質転換体では、緑色蛍光が観察された。
【００８６】
これとは別に、実施例１と同様にして、Ｓ２細胞に、ｐＣｏＶＫＥをトランスフェクションし、ピューロマイシン耐性を獲得した形質転換体を得た。このピューロマイシン耐性形質転換体に、同様にしてｐＭＡＫ２５４をトランスフェクションし、ピューロマイシン及びゼオシン存在下で培養し、ピューロマイシン耐性とゼオシン耐性の両方を獲得した形質転換体を得た。この両耐性を獲得した形質転換体では、緑色蛍光と同時に赤色蛍光も観察された。
【００８７】
＜ヒトプロテインＳ発現＞
実施例１と同様にして、選抜された各形質転換体をビタミンＫ含有培地中で４８時間培養した後、培養上清を回収した。回収された培養上清は、遠心分離処理を行うことによって菌体を除去した。なお、対照として、ベクターを導入していないＳ２細胞についても同様の処理を行った。
【００８８】
得られた培養上清を用いて、ヒトプロテインＳのタンパク質量と活性を測定した。プロテインＳのタンパク質量はラテックス凝集法により測定し、ヒトプロテインＳの活性は比色法により測定した。これらの測定値から、培養上清中のヒトプロテインＳ１のタンパク質１ｎｇ当たりのプロテインＳ活性（プロテインＳ比活性）を算出した。
【００８９】
ラテックス凝集法は以下の通りに行った。まず、第一反応として、検体（培養上清）中の遊離プロテインＳにＣ４ｂＢＰ（C4b binding protein）を結合させ、全てのプロテインＳを複合体型プロテインＳにした後、第二反応として、複合体型プロテインＳを抗ヒトプロテインＳマウスモノクローナル抗体感作ラテックスと反応させて凝集させた。凝集反応前後の検体の吸光度を測定し、生成された凝集物による吸光度変化（濁度変化量）からプロテインＳ量とした。吸光度の測定値からのプロテインＳ量の算出は、濃度既知の遊離プロテインＳを用いて予め作成した検量線を利用して行った。
【００９０】
比色法は以下の通りに行った。まず、第一反応として、検体（培養上清）、活性化プロテインＣ及び活性化第Ｖ因子（ＦＶａ）を反応させてＦＶａを分解した。次いで、第二反応として、前記第一反応における残存ＦＶａ、活性化Ｆ１０、プロトロンビン及びトロンビンの発色合成基質ＰＰＡ−ｐＮＡ（Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・塩酸塩）を反応させ、生成するトロンビンによりトロンビン基質を発色させた。前記第一反応における残存ＦＶａ量は、総プロテインＳ活性に依存するため、ＰＰＡ−ｐＮＡの発色は総プロテインＳ活性を反映する。これを利用し、ＰＰＡ−ｐＮＡの発色による吸光度変化を指標として、検体中の総プロテインＳ活性を測定できる。
【００９１】
図３１の左図にヒトプロテインＳ量の測定結果を、図３１の中図にプロテインＳ活性の測定結果を、図３１の右図に培養上清中のヒトプロテインＳ１のタンパク質１ｎｇ当たりのプロテインＳ活性（プロテインＳ比活性）の算出結果を、それぞれ示す。図中、「８４」及び「２５４」は、それぞれ、ｐＭＡＫ８４のみを導入した形質転換体及びｐＭＡＫ２５４とｐＣｏＶＫＥを導入した形質転換体の結果を示す。この結果、ｐＭＡＫ２５４とｐＣｏＶＫＥを導入した形質転換体では、プロテインＳ活性が確認されたが、ｐＭＡＫ８４のみが導入された形質転換体では、成熟型のプロテインＳ１の存在が確認されているにもかかわらず、プロテインＳ活性は確認されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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