(57)【要約】      （修正有）【課題】アレルギー反応を発症し得るガラクトオリゴ糖の製造方法及びその中間体の提供。【解決手段】式(５)のラクトース保護体の６位水酸基にガラクトビオース保護体の１位を付加した後、水酸基の保護基を脱保護する工程を含む一般式（１）で示されるガラクトオリゴ糖の製造方法。2018030828.tif 0000372018030828.tif 000038【選択図】図５
2018030828.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）：
【化１】
2018030828.tif 000030
で示されるガラクトオリゴ糖の製造方法であって、
一般式（２）：
【化２】
2018030828.tif 000031
（式中、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水酸基の保護基から選択され、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は２種以上が同一であってもよい）で示される化合物の水酸基の保護基を脱保護する工程を含むことを特徴とするガラクトオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載のガラクトオリゴ糖の製造方法であって、
一般式（３）：
【化３】
2018030828.tif 000032
［式中のＲ２は、水酸基の保護基から選択され、Ｙは、‐Ｆ、‐Ｃｌ、‐Ｂｒ、‐Ｉ、‐ＳＣＨ３、‐ＳＣＨ２ＣＨ３、‐ＳＣＨ（ＣＨ３）２、‐ＳＣ６Ｈ５及び一般式（４）：
【化４】
2018030828.tif 000033
（Ｘが、‐Ｆ、‐Ｃｌ、‐Ｂｒ、又は、‐Ｉである場合、Ｘ１は‐Ｈであり、Ｘが‐Ｈである場合、Ｘ１は‐ＣＨ３であり、Ｘが‐Ｓ‐ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＣＦ３である場合、Ｘ１は‐Ｃ６Ｈ５ＣＦ３である）から選択される］で示される化合物と、一般式（５）：
【化５】
2018030828.tif 000034
（式中のＲ、及びＲ１は、それぞれ独立して水酸基の保護基から選択され、ＲとＲ１は同一であってもよい）で示される化合物と、を反応させ、糖鎖付加物として、一般式（２）：
【化６】
2018030828.tif 000035
（式中Ｒ、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水酸基の保護基から選択され、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は２種以上が同一であってもよい）で示される化合物を得る工程を含むことを特徴とするガラクトオリゴ糖の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のガラクトオリゴ糖の製造方法であって、
ガラクトースとラクトースとから、糖転移反応によってガラクトビオースを生成する工程を含むことを特徴とするガラクトオリゴ糖の製造方法。
【請求項４】
前記糖転移反応によって生成された、前記ガラクトビオースを含む混合物を精製し精製物を得る第１精製工程と、
第１精製工程によって得られた、前記精製物に含まれる水酸基を保護し保護体を得る保護工程と、
前記保護工程によって得られた、前記保護体を精製する第２精製工程と、
を含む、請求項３に記載のガラクトオリゴ糖の製造方法。
【請求項５】
一般式（２）：
【化７】
2018030828.tif 000036
（式中Ｒ、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水酸基の保護基から選択され、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は２種以上が同一であってもよい）で示される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー反応を発症し得るガラクトオリゴ糖の製造方法及びその中間体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガラクトオリゴ糖（GOS）は、ラクトースの非還元末端にD-ガラクトースが複数個グリコシド結合したオリゴ糖の総称である。天然のGOSは人の母乳や牛の初乳中に存在し、その生理学的な機能は、腸内細菌叢のバランスを改善することによる整腸作用やミネラル吸収促進作用、免疫調節作用、及び炎症性腸疾患の予防・改善作用等が報告されている。特に、Bifidobacterium属やLactobacillus属等の腸内細菌に対する増殖を促進するプレバイオティクス効果が大きく注目され、育児用粉乳や乳酸菌飲料等に多く利用されている。日本国内では特定保健食品(トクホ、Food for Specified Health Uses: FOSHU) に認定され、アメリカではFDA（米国食品医薬品局）によってGRASに認定されている（GRAS Notice Nos. GRN 233, 236, 285 , 286, 334, 484, 489, 495, 518, 569）。一般的にGOSは微生物の生産するβガラクトシダーゼ（EC.3.2.1.23）の糖転移反応によって生成される。
【０００３】
これまでの研究で、βガラクトシダーゼを生産する多くの微生物（Bacillus circulans, Aspergillus oryzae, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Sporobolomyces singularis, Escherichia coli, Lactobacillus reuter，Bifidobacterium bifidum等）が報告されている。これらのβガラクトシダーゼは酵素の立体構造の違いにより、生成するGOSの結合様式が異なり、Aspergillus等のカビ類はβ1-6結合（6’-GOS）を、Bacillus等の細菌類やS. singularisはβ1-4結合（4’-GOS）を優先的に作ることが知られている。また、B. circulansが生産するβガラクトシダーゼにより製造されたGOSは、フリースランドカンピーナ社（オランダ）よりVivinal（登録商標）GOSとして販売されている。
【０００４】
しかしながら、これらGOSのアレルギー症状に関する論文がいくつか報告されている。その発端は1996年に日本で報告されたもので、広島県の牡蠣の養殖場で働く従業員数名が、カビ由来ラクターゼで生成されたガラクトオリゴ糖（6’-GOS）を含む乳酸菌飲料を飲んだ後にアレルギー症状を発症した。ホヤ喘息との関連性が指摘され、6’-GOSとホヤの抗原で共通した部分があるのではないかと推察されている。2014年に金子らによって報告された非特許文献１によると、Bacillus由来の4’-GOSの中で特に強いアレルギーを誘発する糖が明らかにされた。特に、ヒスタミン遊離試験の結果から、最も問題視されたのは通称“4P-X”と呼ばれる中性分岐四糖であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】K. Kaneko, Y. Watanabe, K. Kimura, K. Matsumoto, T. Mizobuchi, M. Onoue. Development of hypoallergenic galacto-oligosaccharides on the basis of allergen analysis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 78, 100-108 (2014)
【非特許文献２】Sander S. van Leeuwen, Bas J. H. Kuipers, Lubbert Dijkhuizen, Johannis P. Kamerling. 1H NMR analysis of the lactose/β-galactosidase-derived galacto-oligosaccharide components of Vivinal GOS up to DP5. Carbohydrate Research, 400, 59-73 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１では、βガラクトシダーゼによる糖転移反応の後に、オリゴ糖のピリジルアミン（PA）による誘導体化と3種類のHPLCカラム（Shodex KS-802、Shimadzu STR-ODS-II、Shimadzu ODS）を組み合わせることで4P-Xの単離を行っているが、分析系は非常に複雑である上に、得られた4P-Xはピリジルアミンにより誘導体化されている（非特許文献１）。
【０００７】
他方、Leeuwenらによって報告された非特許文献２では、イオンクロマトグラフィー（Dionex ICS-3000）を用いることで、誘導体化せずに構造異性体間の分離が概ね可能となり、NMRデータが公開された。しかしながら、目的の4P-Xに関しては、他の異性体との混合物であり、異性体等が存在していない単一品（高純度品）のデータは未だ取得されていない。4P-Xは危険性・重要性の高いオリゴ糖であり、今後の詳細の検討のためにも高純度の目的物を取得する重要性は高いと考えられる。
【０００８】
即ち、本発明に係る、目的のガラクトオリゴ糖（４Ｐ−Ｘ）は、従来技術において純度の高い製品として製造する方法が確立されていない。従って、従来の製造方法においては、複雑な単離精製工程を必須とし、この単離精製工程が容易でなく、精製コストの問題がある。他方、種々の合成方法を組み合わせた場合には、収率及び工程数が増加するという点で課題がある。よって、本発明は、工程数が少なく、得られる目的のガラクトオリゴ糖の純度が高い、新規な製造方法、及びその中間体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、新規な化合物である中間体を介した、収率と工程数及び得られる本発明のガラクトオリゴ糖の純度等において優れた、新規な製造方法を見出し、本発明を完成させたものである。
即ち、
本発明［１］は、
一般式（１）：
【化１】
2018030828.tif 000003
で示されるガラクトオリゴ糖の製造方法であって、
一般式（２）：
【化２】
2018030828.tif 000004
（式中、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水酸基の保護基から選択され、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は２種以上が同一であってもよい）で示される化合物の水酸基の保護基を脱保護する工程を含むことを特徴とするガラクトオリゴ糖の製造方法である。
本発明［２］は、
本発明［１］に記載のガラクトオリゴ糖の製造方法であって、
一般式（３）：
【化３】
2018030828.tif 000005
［式中のＲ２は、水酸基の保護基から選択され、Ｙは、‐Ｆ、‐Ｃｌ、‐Ｂｒ、‐Ｉ、‐ＳＣＨ３、‐ＳＣＨ２ＣＨ３、‐ＳＣＨ（ＣＨ３）２、‐ＳＣ６Ｈ５及び一般式（４）：
【化４】
2018030828.tif 000006
（Ｘが、‐Ｆ、‐Ｃｌ、‐Ｂｒ、又は、‐Ｉである場合、Ｘ１は‐Ｈであり、Ｘが‐Ｈである場合、Ｘ１は‐ＣＨ３であり、Ｘが‐Ｓ‐ＣＨ２Ｃ６Ｈ4ＣＦ３である場合、Ｘ１は‐Ｃ６Ｈ５ＣＦ３である）から選択される］で示される化合物と、一般式（５）：
【化５】
2018030828.tif 000007
（式中のＲ、及びＲ１は、それぞれ独立して水酸基の保護基から選択され、ＲとＲ１は同一であってもよい）で示される化合物と、を反応させ、糖鎖付加物として、一般式（２）：
【化６】
2018030828.tif 000008
（式中Ｒ、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水酸基の保護基から選択され、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は２種以上が同一であってもよい）で示される化合物を得る工程を含むことを特徴とするガラクトオリゴ糖の製造方法である。
本発明［３］は、
本発明［１］又は［２］に記載のガラクトオリゴ糖の製造方法であって、
ガラクトースとラクトースとから、糖転移反応によってガラクトビオースを得る工程を含むことを特徴とする、ガラクトオリゴ糖の製造方法である。
本発明［４］は、
前記糖転移反応によって生成された、前記ガラクトビオースを含む混合物を精製し精製物を得る第１精製工程と、
第１精製工程によって得られた、前記精製物に含まれる水酸基を保護し保護体を得る保護工程と、
前記保護工程によって得られた、前記保護体を精製する第２精製工程と、
を含む、本発明［３］に記載のガラクトオリゴ糖の製造方法である。
本発明［５］は、
一般式（２）：
【化７】
2018030828.tif 000009
（式中Ｒ、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水酸基の保護基から選択され、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は２種以上が同一であってもよい）で示される化合物である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、新規な化合物である中間体を介した、収率と工程数及び得られる本発明のガラクトオリゴ糖の純度等において優れた、新規な製造方法及びその中間体を提供することが可能となる。
【００１１】
本明細書、又は、請求の範囲の記載において、「水酸基」とは、「−OH」を意味する。
本明細書、又は、請求の範囲の記載において、「水酸基の保護基」（本明細書中、又は、請求の範囲の記載において、R、R1、R２）とは、特にことわりが無い限り、水酸基の保護基として知られている公知の保護基を含むものとする。例えば、アシル系保護基（アセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、クロロアセチル基、レブイノイル基等）、エーテル系保護基（ベンジル基、パラメトキシベンジル基、アリル基、シリルエーテル基、トリチル基等）、１〜３個のアリール基で置換されたメチル基、アルキル、アルコキシ、ハロゲン原子、又は、シアノ及びニトロから選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい１〜３個のアリール基で置換されたメチル基、又はシリル基であり、更に好ましくは、アシル系保護基、エーテル系保護基である。最も好ましくは、アシル系保護基であり、中でも、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基が好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、Acetyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3-di-O-acetyl-D-glucopyranosideの1H NMRスペクトルを示す。
【図２】図２は、2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3,6-tri-O-acetyl-α-D-glactopyranosyl 2,2,2-trichloroacetimidateの1H NMRスペクトルを示す。
【図３】図３は、Acetyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3,6-tri-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→6)-[2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)]-2,3-di-O-acetyl-β-D-glucopyranosideの1H NMRスペクトルを示す。
【図４】図４は、β-D-galactopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranosyl-(1→6)-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranose（4Ｐ-Ｘ）の1H NMRスペクトルを示す。
【図５】図５は、図４の1H NMRスペクトルの主要なピーク部分を拡大した、1H NMRスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜＜＜本発明に係るガラクトオリゴ糖＞＞＞
本発明の製造方法の最終産物であるガラクトオリゴ糖（4P-X）は、下記一般式（１）：
【化８】
2018030828.tif 000010
で示される、中性分岐四糖のオリゴ糖であり、ラクトースに対して、ガラクトースがβ1,6-結合し、そのガラクトースに対して、更にガラクトースがβ1,4-結合した構造を有する（或いは、グルコースに対して、ガラクトースがβ1,4-及びβ1,6-結合し、β1,6-結合したガラクトースに対して、更にガラクトースがβ1,4-結合した構造を有する）。前述のとおり、本化合物4P-XはB. circulans由来の酵素を用いて乳糖からGOSを製造した際に生成することが分かっている。従って、4P-Xを含んだGOSを乳飲料、ヨーグルト、育児用粉乳など各種乳製品に添加することにより、食品中へ混入する危険性が考えられる。尚、4P-Xが高純度であるかについては、NMRスペクトルやマススペクトル等によって確認が可能である。
【００１４】
＜＜＜本発明に係るガラクトオリゴ糖の中間体＞＞＞
本発明の製造方法の中間体であるガラクトオリゴ糖は、下記一般式（２）：
【化９】
2018030828.tif 000011
（式中Ｒ、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水酸基の保護基から選択され、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は２種以上が同一であってもよい）で示される、ガラクトオリゴ糖（4P-X；ラクトースに対して、ガラクトースがβ1,6-結合し、そのガラクトースに対して、更にガラクトースがβ1,4-結合した構造を有する）の水酸基が保護された化合物である。その原料、及び合成経路によって、Ｒ、Ｒ１及びＲ２の水酸基の保護基は相違し得る。また、当該中間体におけるＲ、Ｒ１及びＲ２が全て同一の場合であっても、２以上の工程により合成されることが好適である。１の工程としては、例えば、4P-Xを出発物質として、水酸基の保護基を導入する場合が挙げられる。
【００１５】
＜＜＜本発明に係るガラクトオリゴ糖の製造方法＞＞＞
本発明に係るガラクトオリゴ糖の製造方法を説明する。当該ガラクトオリゴ糖は、市場で入手できる原料物質から、後述の製造例、又はそれに準じた方法により合成することができる。例えば、以下に示す方法により製造することができる。
【００１６】
本発明に係る製造方法は、ガラクトオリゴ糖（4P-X）を得る工程である。本発明者らは、4P-X を効率よく合成するために、ラクトース部分とガラクトビオース部分をそれぞれ合成し、二糖同士のカップリング反応により、四糖を合成するルートについて検討した。すなわち、4P-Xはラクトース保護体とガラクトビオース保護体のカップリング反応により合成できることを見出した。用いたラクトース保護体は、グルコースから合成したグルコース保護体と市販のガラクトース保護体のグリコシル化により合成できることを見出した。ガラクトビオース保護体は、ラクトースとガラクトースを原料に、β-ガラクトシダーゼによる糖転移反応で調製したガラクトビオースから合成できることを見出した。上述したように、ガラクトビオース保護体の合成に酵素合成法と化学合成法を組み合わせることで、効率的なガラクトビオース保護体の合成が可能となる。
【００１７】
以下に本発明のガラクトオリゴ糖（4P-X）の製造方法の好適な一例を示す。大きく分けて、ラクトース保護体の合成（Scheme 1）、ガラクトビオース保護体の合成（Scheme 2）、及び、前記ラクトース保護体と、前記ガラクトビオース保護体とのカップリングにより、本発明のガラクトオリゴ糖（4P-X）を合成する工程（Scheme 3）である。以下、詳細に説明する。
【００１８】
＜＜ラクトース保護体の合成＞＞
[Scheme 1]
【化１０】
2018030828.tif 000012
【００１９】
＜１−１の工程＞
本工程は、グルコース I を出発原料に4、6 位の水酸基を選択的に保護したグルコース保護体 II を得る工程である。４、６位の水酸基を選択的に保護する方法としては、イソプロピリデン、ベンジリデン、パラメトキシベンジリデン等の一般的な方法を用いることができるが、後のグリコシル化の収率の観点から、ベンジリデン保護を行うことが好適である。溶媒は、DMF、アセトニトリル、クロロホルムなどを用いることができる。反応は、20〜80℃で、1〜24時間で行うことができる。
【００２０】
＜１−２の工程＞
次に、グルコース保護体II の1、2、3 位の水酸基を保護する方法として、アシル系保護基（アセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、クロロアセチル基、レブイノイル基等）やエーテル系保護基（ベンジル基、パラメトキシベンジル基、アリル基、シリルエーテル基、トリチル基）等の一般的な方法を用いることができるが、工程数、反応速度及び収率の観点から、アシル系保護基による保護を行うことが好適であり（具体的には、３‐２の工程において、塩基を用いて一工程で全保護基を脱保護できるため）、溶媒はピリジンを用いることができる。反応は0〜30℃で、0.5〜10時間で行うことができ、グルコース保護体 III とした。
【００２１】
＜１−３工程＞
グルコース保護体 III に酸性条件下、還元剤（トリエチルシランやシアノ水素化ホウ素ナトリウム等）を作用させることで、ベンジリデンアセタールを位置選択的に脱保護し、糖受容体 IV を合成することができる。収率及び反応速度の観点から、還元剤として、トリエチルシランが好適である。溶媒は、ジクロロメタン、THFを用いることができる。反応は-5〜30℃で、１〜10時間で行うことができる。
【００２２】
＜１−４の工程＞
合成した糖受容体 IV と市販の糖供与体 V のグリコシル化反応を行い、ラクトース保護体 VI を得ることができる。使用する活性化剤としては、BF3・OEt2（三フッ化ホウ素-エーテル錯体）やTMSOTf（トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル）等のルイス酸を使用し得るが、イミデート糖を用いたグルコシル化反応においては、反応速度、収率等の観点から、TMSOTfが好適である。溶媒はジクロロメタン、クロロホルムなどを用いることができる。反応は-50〜0℃で、0.5〜10時間で行うことができる。
【００２３】
＜１−５の工程＞
得られたラクトース保護体 VI のベンジル基を脱保護することで、ラクトース保護体 VII を合成することができる。溶媒は、アセトニトリル、又は、メタノール、エタノール、2−プロパノールなどのアルコール類を用いることができる。反応は0〜60℃で、1〜30時間で行うことができる。
【００２４】
＜＜ガラクトビオース保護体の合成＞＞
[Scheme 2]
【化１１】
2018030828.tif 000013
【００２５】
＜２−１の工程＞
（酵素による糖転移反応）
本発明の製造方法は、微生物由来の酵素による、糖転移反応の工程を含むことができる。ガラクトビオース保護体XIを得るための好適な例として、ガラクトース VIII をアクセプター、ラクトース IX をドナーとして、B. circulans由来のβ-ガラクトシダーゼの糖転移反応によりガラクトビオース X を含むGOSを合成する方法が挙げられる。尚、その他の方法として、ガラクトース同士の酵素反応によるグルコシル化反応でも調製可能である。
【００２６】
（酵素の種類）
使用する酵素は、ガラクトビオースを生成する能力を有する酵素であれば限定されないが、ガラクトースとラクトースから、ガラクトビオースを生成する酵素が好適である。
【００２７】
このような酵素として、例えば、前述のβ-ガラクトシダーゼ以外にホスホリラーゼや他の糖転移酵素なども挙げられる。特に、ガラクトビオース Xのβ1,4グリコシド結合を優先的に作る酵素が好適に使用可能である。ただし、酵素の入手の容易さと反応系の容易さの観点から、β-ガラクトシダーゼが好適である。また、当該酵素を回収できるものであれば、動物、植物、微生物由来であってもよく、特に限定はされない。このような起源となる微生物としては、Bacillus circulans、Kluyveromyces lactis、Aspergillus oryzae、Kluyveromyces fragilis、Sporobolomyces singularis、Escherichia coli、Lactobacillus reuter、Bifidobacterium bifidumが挙げられる。反応効率と入手し易さの観点から、Bacillus circulansが好適である。更に、遺伝子組み換え技術、部分加水分解等による人工酵素であってもよい。また、糖転移酵素の形態は特に限定されず、酵素蛋白質の乾燥物、酵素蛋白質を含む粒子、及び酵素蛋白質を含む液体等を用いることができる。
【００２８】
（酵素の使用量）
糖転移酵素の使用量は、糖転移反応の条件、糖の種類等によって異なるが、例えば、β‐ガラクトシダーゼの場合、0.1〜10ＬＵ／ｍＬが好ましい。ここで活性は以下に示す方法により測定される。乳糖（終濃度10％）に酵素を添加し、pH 6.0, 40℃で反応後のグルコース量を測定して定量する。１分間に１μmolのグルコースを生成するのに必要な酵素量を１ユニット（ＬＵ）とする。
【００２９】
（反応条件）
糖転移反応の条件は、使用する酵素の特性に合わせて反応温度や反応液のｐＨを選択することが可能であるが、例えば、ｐＨ5〜8とすることが好ましく、更に6〜7とすることが好適である。
【００３０】
また、反応温度は、糖転移酵素の安定性の点、糖転移反応の反応速度向上の点から、30〜70℃とすることが好適であり、40〜60℃とすることがより好適であり、更に45〜55℃とすることが最も好適である。
【００３１】
反応時間は、糖転移酵素の種類等によって異なるが、反応効率向上の点から、例えば、1〜100時間が好適であり、12〜60時間とすることがより好適であり、24〜48時間とすることが最も好適である。
【００３２】
＜２−２の工程＞
活性炭カラムでガラクトビオース X とラクトース の混合画分（ガラクトビオース:ラクトース = 3.3:1）を回収し（第１精製工程と称することがある）、混合物の水酸基をアセチル化することができる。水酸基を保護する方法として、アシル系保護基（アセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、クロロアセチル基、レブイノイル基等）やエーテル系保護基（アリル基、シリルエーテル基、トリチル基）等の一般的な方法を用いることができる。２−３工程において、アノマー位の脱保護を選択的に行えることから、工程数、反応速度、及び収率の観点から、アシル系保護基による保護を行うことが好適であり、溶媒はピリジンを用いることができる。反応は0〜40℃で、0.5〜24時間で行うことができる。
この反応後のシリカゲルカラムを用いた精製操作（第２精製工程と称することがある）で、ガラクトビオースのアセチル化体 XI をラクトースのアセチル化体から分離することができる。
【００３３】
特に、＜２−１の工程＞の糖転移酵素による酵素反応終了時点では、単糖（グルコース、ガラクトース）、二糖（ガラクトビオース、ラクトース）、三糖、四糖の６成分以上の混合物である。この混合物を活性炭カラムにより、二糖画分を取得し（第１精製工程）、＜２−２の工程＞において、この二糖画分の混合物をアセチル化した後、シリカゲルカラムで、アセチル化ガラクトビオースとアセチル化ラクトースに分離する（第２精製工程）ことが好適である。単糖、二糖、三糖、四糖間の分離は、活性炭カラムの方が分離し易く、他方、二糖同士についてはアセチル化後に、シリカゲルカラムにより分離する方が分離し易いからである。よって、二つの工程において、段階的な二つの精製方法を組み合わせることで、効率的に純度の高い目的物を取得することが可能となる。また、＜２−１の工程＞において、活性炭カラムで粗精製する工程を含むことで、アセチル化剤等の試薬、シリカゲル、有機溶媒の使用量を削減することもできる。尚、第１精製工程において用いる精製方法は、活性炭カラムに限定されず、単糖、二糖、三糖、四糖等の混合物から二糖画分を分離可能な精製方法であればよい。更に、第２精製工程において用いる精製方法もシリカゲルクロマトグラフィーには限定されず、アセチル化された二糖類を効率よく分離可能な精製方法であればよい。
【００３４】
尚、上述したガラクトビオース保護体XIを得る工程として、化学合成による工程を取り得る。しかし、二糖 XI を合成する場合、化学合成による一般的な方法によれば、例えば６工程が必要となる。一例として以下に示す。具体的には、ガラクトースを出発原料として、４、６位の水酸基を選択的にベンジリデン保護したガラクトース保護体 i を得ることができる（Ａ−１の工程)。更に、ガラクトース保護体 i の１、２、３位の水酸基をアセチル基で保護して、ガラクトース保護体 ii とすることができる（Ａ−２の工程）。ガラクトース保護体 ii に酸性条件下、トリエチルシランを作用させることで、ベンジリデンアセタールを位置選択的に脱保護し、糖受容体 iii を合成することができる（Ａ−３の工程）。合成した糖受容体 iii と市販の糖供与体Ｖのグリコシル化反応を行い、ガラクトビオース保護体 iv を得ることができる（Ａ−４の工程）。得られたガラクトビオース保護体 iv のベンジル基を脱保護することで、ガラクトビオース保護体 v を得ることができる（Ａ−５の工程）。更に、水酸基をアセチル基で保護することにより、ガラクトビオースのアセチル化体 XI を得ることができる（Ａ−６の工程）。
【００３５】
[Scheme A]
【化１２】
2018030828.tif 000014
【００３６】
しかし、前記工程では６工程という工程数に加えて、特に厳密な条件設定を必要とする工程（Ａ-３の工程）を含み、収率、工程数の面から好ましくない。他方、本発明の糖転移酵素を用いた工程であれば、比較的単離操作が容易であり、収率の面からも有利となる。よって、工程数を減らすことができ、全工程の迅速化の面から糖転移反応を含む工程を採用することが好適である。
【００３７】
＜２−３の工程＞
得られたガラクトビオースのアセチル化体 XI に対し、ピペリジン、N-メチルピペラジン等の2級アミンを作用させることで、アノマー位のアセチル基を位置選択的に脱保護し、ガラクトビオース保護体 XII を合成することができる。溶媒はTHFを用いることができる。反応は0〜30℃で、1〜48時間で行うことができる。
【００３８】
＜２−４の工程＞
ガラクトビオース保護体 XII のアノマー位の水酸基を置換することにより、糖供与体としての下記一般式（３）で示される、ガラクトビオース保護体 XIII を合成することができる。後述するScheme３におけるカップリング反応（グリコシル化反応）に適用できれば、糖供与体としては特に限定はされないが、例えば、イミデート糖として、イミデート糖、チオホルムイミデート糖、又は、グリコシルハライド、又は、チオグリコシド等が挙げられる。尚、下記に示すＹ、Ｘ、及びＸ１等についても本発明の効果を奏する限り下記に挙げた置換基に限定されるものではない。
【００３９】
一般式（３）：
【化１３】
2018030828.tif 000015
［式中のＲ２は、水酸基の保護基から選択され、Ｙは、‐Ｆ、‐Ｃｌ、‐Ｂｒ、‐Ｉ、‐ＳＣＨ３、‐ＳＣＨ２ＣＨ３、‐ＳＣＨ（ＣＨ３）２、‐ＳＣ６Ｈ５及び一般式（４）：
【化１４】
2018030828.tif 000016
（Ｘが、‐Ｆ、‐Ｃｌ、‐Ｂｒ、又は、‐Ｉである場合、Ｘ１は‐Ｈであり、Ｘが‐Ｈである場合、Ｘ１は‐ＣＨ３であり、Ｘが‐Ｓ‐ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＣＦ３である場合、Ｘ１は‐Ｃ６Ｈ５ＣＦ３である）から選択される］
【００４０】
（イミデート糖）
ガラクトビオース保護体XIIIの更に好適な一例として、下記の一般式（６）で示されるイミデート糖が、一般的な製法により合成可能である。溶媒はジクロロメタンを用いることができる。反応は0〜30℃で、1〜10時間で行うことができる。
【００４１】
一般式（６）：
【化１５】
2018030828.tif 000017
（式中のＲ２は、水酸基の保護基から選択され、Ｘが、‐Ｆ、‐Ｃｌ、‐Ｂｒ、及び‐Ｉから選択される場合、Ｘ１は‐Ｈであり、Ｘが‐Ｈである場合、Ｘ１は‐ＣＨ３であり、Ｘが‐Ｓ‐ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＣＦ３である場合、Ｘ１は‐Ｃ６Ｈ４ＣＦ３である）
【００４２】
（グリコシルハライド、又は、チオグリコシド）
また、ガラクトビオース保護体 XIII のような糖供与体としては、イミデート糖に限定されず、グルコシルハライドや、チオグリコシドを一般的な製法により合成可能であり、糖供与体とすることもできる。具体的には、グリコシルハライドの場合、無保護糖にハロゲンを反応させる方法や、アシル化糖にハロゲン化水素を反応させる方法、アシル化糖にトリメチルシリルブロミドや四塩化チタン、四臭化チタン、塩化アルミニウムを反応させる方法により合成することができる。チオグリコシドの場合、アシル化糖にチオールとルイス酸を反応させる方法や、アシル化糖にチオール（PhSH, MeSH, EtSH, iPrSH等）とルイス酸（BF3・OEt2, TMSOTf, MeOTf 等）を反応させる方法やチオアルキル化剤（Bu3SnSMe, Me3SiSMe等）と親硫黄性重金属塩（SnCl4）を反応させる方法、チオアルキル化剤（Bu3SnSMe, Me3SiSMe等）とルイス酸（BF3・OEt2, TMSOTf, MeOTf 等）をさせる方法により合成することができる。
【００４３】
＜＜ラクトース保護体と、ガラクトビオース保護体とのカップリング＞＞
[Scheme 3]
【化１６】
2018030828.tif 000018
【００４４】
（３−１の工程）
合成したラクトース保護体 VII とガラクトビオース保護体 XIII のカップリング反応を行い、四糖 XIV を合成することができる。１−３の工程と同様に、使用する活性化剤としては、BF3・OEt2（三フッ化ホウ素-エーテル錯体）やTMSOTf（トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル）等のルイス酸を使用し得るが、イミデート糖を用いたグルコシル化反応の場合、反応速度、収率等の観点から、TMSOTfが好適である。溶媒はジクロロメタン、クロロホルムを用いることができる。反応は-50〜0℃で、0.5〜10時間で行うことができる。
【００４５】
尚、上述したように、イミデート糖以外の糖供与体を用いたグルコシル化反応も可能であり、その場合、イミデート糖とは相違する活性化剤を用いることができる。例えば、糖供与体として、チオホルムイミデート糖を用いる場合には、活性化剤として、TfOH 等のブレンステッド酸を使用することができる。また、糖供与体として、グリコシルハライドを用いる場合には、活性化剤として、第四級アンモニウム塩（Bu4NCl 等）、水銀塩（HgBr2, Hg(CN)2 等）、銀塩（AgOSO2CF3, AgClO4 等」を用いることができる。特に、上記一般式（３）において、Y = F の場合は LiClO4 や強いブレンステッド酸（TfOH 等）を用いても良い。更に、糖供与体として、チオグリコシドを用いる場合には、活性化剤として、水銀塩（HgBr2, Hg(CN)2 等）、銀塩（AgOSO2CF3, AgClO4 等）、ルイス酸（BF3・OEt2, TMSOTf, MeOTf 等）、N-ヨードこはく酸イミド/トリフルオロメタンスルホン酸を用いることができる。
【００４６】
（３−２の工程）
合成した四糖 XIV のアセチル基を脱保護することで ガラクトオリゴ糖 XV (4P-X)を合成することができる。脱保護に試薬として、ナトリウムメトキシド、カリウムメトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基を使用することができる。溶媒は、水やメタノールを用いることができる。反応は0〜30℃で、1〜24時間で行うことができる。
グルコース I から ガラクトオリゴ糖 XV (4P-X) までの総収率は 5.4% であった。
【００４７】
≪本発明に係るガラクトオリゴ糖及びその中間体の用途≫
本発明に係るガラクトオリゴ糖は、例えば、食物のアレルギー性を評価する場合の標品、又はそのアレルギー反応の発症のメカニズム等を解明する場合の研究材料として有用である。また、本発明のガラクトオリゴ糖の中間体は、本化合物を出発原料とすることで、迅速かつ網羅的な4P-X類縁体及び4P-X構造を含む種々のオリゴ糖及び多糖の創製が可能となる。これら4P-X類縁体を含む化合物の構造活性相関研究から得られる知見は、GOS由来アレルギーのメカニズムの詳細解明、安全性の高い糖転移酵素やGOSの開発研究、或いは糖鎖関連医薬品等の研究開発などに有用と考えられ、学術分野及び食品関連産業及び医薬品産業分野での利用が期待出来、有用である。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により具体的に本発明について説明をするが、本発明はこれらの実施例に記載された態様には何ら限定されるものではない。
【００４９】
試薬類は、特に断りがなければ市販品を精製することなく使用した。β-ガラクトシダーゼは、ビオラクタFN5（天野エンザイム社）を用いた。反応の経過は、分析用薄層クロマトグラフィー（Merck社製 TLC Silica gel 60 F254 Glass plate 20×20 cm）で追跡した。呈色はアニスアルデヒドを用いた。シリカゲルクロマトグラフィーは、関東化学社製 Silica Gel 60N (Spherical, neutral, 63-210 μm)、又は関東化学社製 Silica Gel 60N (Spherical, 40-100 μm)、を用いた。また、活性炭クロマトグラフィーは、和光純薬社製の活性炭（酸処理済）を用いた。1H 核磁気共鳴スペクトルは、JEOL JNM-ECX-400P (400 MHz)、もしくはVarian NMR System 600 (600 MHz) を用いて測定した。1H 核磁気共鳴スペクトルにおける化学シフト値は、重クロロホルム溶媒ではトリメチルシラン（0.00 ppm）を内部標準とし、重水溶媒中ではアセトン（2.225 ppm）を内部標準とした。
【００５０】
以下の記載において、4P-Xの製造工程を、ラクトース保護体を製造する工程（実施例１）、ガラクトビオース保護体を製造する工程（実施例２）、ガラクトオリゴ糖（4P-X）を製造する工程（実施例３）に分けて説明する。
【００５１】
[実施例１]
Acetyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3-di-O-acetyl-D-glucopyranosideの合成
（１−１）4,6-O-Benzyliden-D-glucopyranoseの合成
グルコース(1.00g、5.55mmol)をN, N-ジメチルホルムアミド溶液 (11.0 mL)に加え、60 °C に加温し溶解させた。そこへベンズアルデヒドジメチルアセタール (1.24 mL, 8.33 mmol)、パラトルエンスルホン酸一水和物 (10 mg) を加え、60 °C で 6 時間撹拌した。1 時間おきに 10 分間減圧操作を行った。6 時間後、反応溶液を減圧下、溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、メタノール/酢酸エチル (1/10) 溶出部より、白色結晶として、4,6-O-Benzyliden-D-glucopyranose(799.5 mg, 2.98 mmol, 収率53.7%) を得た。尚、グルコースは、D-(+)-グルコース（関東化学社製）のものを使用した。
【００５２】
【化１７】
2018030828.tif 000019
【００５３】
目的物の1H NMRにより、その構造を確認した。
【００５４】
（１−２）Acetyl 2,3-di-O-acetyl-4,6-O-benzyliden-D-glucopyranosideの合成
4,6-O-Benzyliden-D-glucopyranose(1.416 g, 5.28 mmol) のピリジン溶液 (26 mL) に無水酢酸 (7.5 mL, 79.2 mmol) と 4-ジメチルアミノピリジン (193.0 mg, 1.58 mmol) を加え、室温で 1 時間撹拌した。1 時間後、反応溶液を減圧下、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル/ヘキサン (1/1) 溶出部より、白色結晶として、Acetyl 2,3-di-O-acetyl-4,6-O-benzyliden-D-glucopyranoside (1.954 g, 4.955 mmol, 収率93.8%) を得た。
【００５５】
【化１８】
2018030828.tif 000020
【００５６】
目的物の1H NMRにより、その構造を確認した。
【００５７】
（１−３）Acetyl 2,3-di-O-acetyl-6-O-benzyl-D-glucopyranosideの合成
Acetyl 2,3-di-O-acetyl-4,6-O-benzyliden-D-glucopyranoside (1.012 g, 2.57 mmol) のジクロロメタン溶液 (26 mL) にモレキュラーシーブス4A  を加え、室温で 10 分間撹拌した。その後、トリエチルシラン (4.09 mL, 25.7 mmol) を加えた。反応溶液を 0 ℃に冷却し、トリフルオロ酢酸 (1.97 mL, 25.7 mmol) を 5 分かけてゆっくり加えた。反応溶液を室温で 4.5 時間撹拌した。4.5 時間後、0 ℃でトリエチルアミン (4.0 mL)、水 (40 mL) を加えた。溶液の水層とジクロロメタン層を分離後、水層を酢酸エチル (50 mL×2) で抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層をろ過後、減圧下溶媒を留去した。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル/ヘキサン (1/1) 溶出部より、無色油状物質として、Acetyl 2,3-di-O-acetyl-6-O-benzyl-D-glucopyranoside(621.9 mg, 1.569 mmol, 収率 61.0%) を得た。
【００５８】
【化１９】
2018030828.tif 000021
【００５９】
目的物の1H NMRにより、その構造を確認した。
【００６０】
（１−４）Acetyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3-di-O-acetyl-6-O-benzyl-D-glucopyranosideの合成
Acetyl 2,3-di-O-acetyl-6-O-benzyl-D-glucopyranoside (200.7 mg, 0.506 mmol) と2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α-D-galactopyranosyl 2,2,2-Trichloroacetimidate (373.9 mg, 0.759 mmol)（東京化成工業社製）をトルエン溶液 (2 mL) に溶解し、減圧下溶媒を留去した。Acetyl 2,3-di-O-acetyl-6-O-benzyl-D-glucopyranoside及び2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α-D-galactopyranosyl 2,2,2-Trichloroacetimidateの水分を除去した。溶媒留去後の結晶にジクロロメタン溶液 (2 mL)、モレキュラーシーブス4A を加え、室温で 30 分間撹拌した。その後、-40 °C （ドライアイスによりアセトン溶液を冷却し調製） で TMSOTf のジクロロメタン溶液 (50.6 mM, 1 mL, 50.6 μmol) を 2 分かけて滴下し、撹拌を続けた。反応開始から 30 分後、TMSOTf のジクロロメタン溶液 (506 mM, 0.2 mL, 101 μmol) を滴下し、撹拌を続けた。反応開始から 1 時間後、反応温度を -40 °C から -20 °C に昇温した。-20 °C にて 2 時間撹拌を続けた。反応開始から 3 時間後、-20 °C にてジクロロメタン溶液 (10 mL) を加えて反応溶液を希釈し、30 分間撹拌を続けた。この溶液を別途調製した飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (20 mL) に、0 °C にて加え、撹拌した。溶液の水層とジクロロメタン層を分離後、水層を酢酸エチル (50 mL×2) で抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層をろ過後、減圧下溶媒を留去した。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル/ヘキサン (1/1→2/1) 溶出部より、白色結晶として、Acetyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3-di-O-acetyl-6-O-benzyl-D-glucopyranoside(195.4 mg, 0.269 mmol, 収率 53.1%) を得た。NMRで分析したところ、グリコシル化反応が進行し、下記式で表される Acetyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3-di-O-acetyl-6-O-benzyl-D-glucopyranosideが得られており、その収率は53.1%であった。
【００６１】
【化２０】
2018030828.tif 000022
【００６２】
目的物の1H NMRにより、その構造を確認した。
【００６３】
（１−５）Acetyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3-di-O-acetyl-D-glucopyranosideの合成
Acetyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3-di-O-acetyl-6-O-benzyl-D-glucopyranoside (150.6 mg, 75.4 μmol) のメタノール溶液 (4.1 mL) に窒素雰囲気下、パラジウム炭素（パラジウム 5% 担持、55% 水湿潤品、150.6 mg）を加えた。フラスコ内の窒素ガスを水素ガスに置換し、室温で 22 時間撹拌した。22 時間後、反応溶液中のパラジウム炭素をセライトでろ過した。このとき、セライトは酢酸エチル (10 mL×4)、メタノール (10 mL×4) で洗浄した。 ろ液を回収し、減圧下、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル/ヘキサン (2/1→4/1→1/0) 溶出部より、無色油状物質として、Acetyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3-di-O-acetyl-D-glucopyranoside (122.9 mg, 0.1932 mmol, 収率 93.3%) を得た。
【００６４】
【化２１】
2018030828.tif 000023
【００６５】
目的物の1H NMRにより、その構造を確認した。その1H NMRスペクトルを図１に示す。
(α:β= 3:1): 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): σ6.27 (d, J = 3.7 Hz, 0.75H), 5.69 (d, J = 8.2 Hz, 0.25H), 5.47 (t, J = 9.9 Hz, 0.75H), 5.35 (dd, J = 3.24, 3.20Hz, 1H), 5.24 (t, J = 9.4 Hz, 0.25H), 5.15-5.08 (m, 1H), 5.05-4.95 (m, 2H), 4.64 (d, J = 8.2 Hz, 0.75H), 4.63 (d, J = 8.2 Hz, 0.25H), 4.17-4.05 (m, 2.25H), 4.03-3.89 (m, 2.25H), 3.87-3.74 (m, 2.5H), 3.54 (d, J = 9.6 Hz, 0.25H), 2.18 (s, 2.25H), 2.16 (s, 2.25H), 2.15 (s, 0.75H), 2.10 (s, 0.75H), 2.06 (s, 7.5H), 2.052 (s, 0.75H), 2.048 (s, 0.75H), 2.03 (s, 0.75H), 2.02 (s, 2.25H), 1.971 (s, 2.25H), 1.968 (s, 0.75H);
【００６６】
[実施例２]
2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3,6-tri-O-acetyl-α-D-glactopyranosyl 2,2,2-trichloroacetimidateの合成
（２−１）β-D-galactopyranosyl-(1→4)-D-galactopyranoseの合成
β-ガラクトシダーゼの糖転移反応によりガラクトビオースを合成した。アクセプターをガラクトース、ドナーをラクトースとし、β-ガラクトシダーゼは B. circulans 由来のビオラクタFN5使用した。10 mlの基質溶液〔ガラクトース25%（2.5 g, 13.9 mmol）, ラクトース25%（2.50 g, 7.30 mmol）, 100 mMリン酸ナトリウムBuffer（pH 6.5）〕に0.01％となるよう酵素を添加し、50 ℃で24 時間穏やかに振とうした。その後、100 ℃で5 分間加熱して酵素を失活させ、遠心（15,000 rpm, 5 min, 4 ℃）により上清を回収した。上清を活性炭カラム（φ4.6 cm×20 cm）にアプライし、エタノール濃度を段階的に上昇させてガラクトビオース（β-D-galactopyranosyl-(1→4)-D-galactopyranose）とラクトースが含まれたエタノール画分を濃縮し、白色結晶として、ガラクトビオースとラクトースの混合物（1.13 g、混合物としての収率45%、ガラクトビオース:ラクトース = 3.3:1）を回収した。ガラクトビオースとラクトースの混合比はHPLCで確認した。HPLCのカラムはToransgenomic社のCARBOSep CHO-620CAを用いた。尚、ガラクトースは、特級ガラクトース（和光純薬社製）、ラクトースは、ラクトース一水和物（関東化学社製）を使用した。
【００６７】
【化２２】
2018030828.tif 000024
【００６８】
（２−２）Acetyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3,6-tri-O-acetyl-D-glactopyranosideの合成
ガラクトビオースとラクトースの混合物 (554.7 mg, 1.62 mmol) のピリジン溶液 (16 mL) に無水酢酸 (2.3 mL, 24.3 mmol) と 4-ジメチルアミノピリジン (19.5 mg, 0.16 mmol) を加え、室温で 3 時間撹拌した。3 時間後、無水酢酸 (2.3 mL, 24.3 mmol) と 4-ジメチルアミノピリジン (19.5 mg, 0.16 mmol) を追加で加え、室温で 18.5 時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧下、溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル/ヘキサン (1/1.5→1/1→1/0) →  メタノール/酢酸エチル (1/10) 溶出部より、白色結晶として、Acetyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3,6-tri-O-acetyl-D-glactopyranoside(748.4 mg, 1.10 mmol, 収率67.9%) を得た。
【００６９】
【化２３】
2018030828.tif 000025
【００７０】
目的物の1H NMRにより、その構造を確認した。
【００７１】
（２−３）2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3,6-tri-O-acetyl-D-glactopyranoseの合成
Acetyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3,6-tri-O-acetyl-D-glactopyranoside (86.7 mg, 0.128 mmol) のテトラヒドロフラン溶液 (2.4 mL) にピペリジンのテトラヒドロフラン溶液 (2 M, 0.25 mL, 0.500 mmol) を加え、室温で 30 時間撹拌した。その後、0 °C で 1 N 塩酸 (1 mL)、水 (10 mL) を順に加え撹拌した。反応溶液を酢酸エチル (30 mL×2) で抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層をろ過後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル/ヘキサン(2/1→4/1) 溶出部より、白色結晶として、2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3,6-tri-O-acetyl-D-glactopyranose (61.9 mg, 0.0973 mmol, 収率 76.0%) を得た。
【００７２】
【化２４】
2018030828.tif 000026
【００７３】
目的物の1H NMRにより、その構造を確認した。 
【００７４】
（２−４）2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3,6-tri-O-acetyl-α-D-glactopyranosyl 2,2,2-trichloroacetimidateの合成
2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3,6-tri-O-acetyl-D-glactopyranose (270.2 mg, 0.425 mmol) のジクロロメタン溶液 (8.4 mL)にトリクロロアセトニトリル (17.2 mL, 17.0 mmol)、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセンのジクロロメタン溶液 (0.85 mM, 0.3 mL, 0.255 mmol) を加え、室温で 4 時間撹拌した。その後、反応溶液を減圧濃縮し溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、0.5% トリエチルアミン含有酢酸エチル/ヘキサン  (2/1) 溶出部より、白色結晶として、2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3,6-tri-O-acetyl-α-D-glactopyranosyl 2,2,2-trichloroacetimidate (285.7 mg, 0.366 mmol, 収率 86.1%) を得た。
【００７５】
【化２５】
2018030828.tif 000027
【００７６】
目的物の1H NMRにより、その構造を確認した。目的物の1H NMRスペクトルを図２に示す。
(α:β = 1:0): 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): σ8.64 (s, 1H), 6.51 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 5.40-5.35 (m, 2H), 5.28 (dd, J = 2.8, 11.0 Hz, 1H), 5.20 (dd, J = 7.8, 10.5 Hz, 1H), 5.00 (dd, J = 3.2, 10.5 Hz, 1H), 4.43 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.38 (dd, J = 4.1, 11.9 Hz, 1H), 4.31 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.29 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 7.3, 11.5 Hz, 1 H), 4.10 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 3.86 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 2.17 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 2.00 (s, 3H);
【００７７】
[実施例３]
β-D-galactopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranosyl-(1→6)-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranose（4P-X）の合成
（３−１）Acetyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3,6-tri-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→6)-[2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)]-2,3-di-O-acetyl-β-D-glucopyranoside の合成
Acetyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3-di-O-acetyl-D-glucopyranoside(26.0 mg, 40.9 μmol) と2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3,6-tri-O-acetyl-α-D-glactopyranosyl 2,2,2-trichloroacetimidate (47.9 mg, 61.4 μmol)にトルエン溶液 (2 mL) を加え、減圧下溶媒を留去した。溶媒留去後の結晶にジクロロメタン溶液 (1 mL)、モレキュラーシーブス4A (0.5 g) を加え、-40 °C で 30 分間撹拌した。その後、 -40 °C （ドライアイスによりアセトン溶液を冷却し調製） で TMSOTf のジクロロメタン溶液 (4.09 mM, 1 mL, 4.09 μmol) を 3 分かけて滴下し、撹拌を続けた。2 時間後、室温にてジクロロメタン溶液 (10 mL) を加え、反応溶液を希釈した。別途調製した飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (30 mL) の入った 100 mL ナス型フラスコに 0 °C 下、希釈した反応溶液を加え、10分間撹拌した。溶液の水層とジクロロメタン層を分離後、水層を酢酸エチル (50 mL×2) で抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層をろ過後、減圧下溶媒を留去した。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル/ヘキサン (4/1→1/0) 溶出部より、無色油状物質として、Acetyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3,6-tri-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→6)-[2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)]-2,3-di-O-acetyl-β-D-glucopyranoside (22.3 mg, 17.8 μmol, 収率 43.4%) を得た。
【００７８】
【化２６】
2018030828.tif 000028
【００７９】
目的物の1H NMRにより、その構造を確認した。目的物の1H NMRスペクトルを図３に示す。
(α:β= 4:1): 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): σ6.25 (d, J = 3.7 Hz, 0.8H), 5.62 (d, J = 8.2 Hz, 0.2H), 5.42 (dd, J = 7.8, 8.3 Hz, 1H), 5.37 (t, J = 3.6 Hz, 2H), 5.22-5.05 (m, 4.8H), 5.03-4.97 (m, 2.2H), 4.89 (dd, J = 3.2, 10.3 Hz, 1H), 4.66 (d, J = 7.3 Hz, 0.8H), 4.60-4.56 (m, 1H), 4.46-4.37 (m, 1H), 4.23-4.05 (m, 6.4H), 4.00 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 3.94-3.85 (m, 4.8 H), 3.72 (dd, J = 5.0, 6.0 Hz, 1H), 2.19 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 2.150 (s, 3H), 2.146 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.054 (s, 3H), 2.047 (s, 3H), 2.002 (s, 3H), 2.000 (s, 3H), 1.96 (s, 3H);
【００８０】
（３−２）β-D-galactopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranosyl-(1→6)-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranoseの合成
Acetyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2,3,6-tri-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→6)-[2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)]-2,3-di-O-acetyl-β-D-glucopyranoside (21.9 mg, 17.4 μmol) の 45% メタノール水溶液 (1 mL) に、ナトリウムメトキシドの45% メタノール水溶液 (34.8 mM, 1 mL, 34.8 μmol) を加え、室温で 9 時間撹拌した。9 時間後、減圧下溶媒を留去した。残渣を MQ (2 mL) に溶解し、透析膜（Spectra 社製、Biotech 透析膜、MWCO: 0.1 ‐ 0.5 kDa、FW: 31 mm、Dia: 20 mm、vol/L: 3.1 mL/cm）を用いて、MQ 水 (1 L) に対して透析を 6 時間行った。精製した溶液を凍結乾燥し、白色結晶として、4P-X (9.5 mg, 14.25 μmol, 81.9%) を取得した。
【００８１】
【化２７】
2018030828.tif 000029
【００８２】
目的物の1H NMRにより、その構造を確認した。目的物の1H NMRスペクトルを図４、及び、その拡大図を図５に示す。
(α:β= 1:1.5); 1H-NMR (600 MHz, D2O): σ5.23 (d, J = 4.2 Hz, 0.4H), 4.68 (d, J = 8.4 Hz, 0.6H), 4.59 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.50 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 7.8 Hz, 0.6H), 4.48 (d, J = 7.8 Hz, 0.4H), 4.28 (dd, J = 11.1, 1.8 Hz, 0.6H), 4.20 (dd, J = 11.1, 2.4 Hz, 0.4H), 4.18 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 4.10-4.07 (m, 0.4H), 3.96 (dd, J = 11.4, 3.6 Hz, 0.4H), 3.93-3.52 (m, 20.6H), 3.30 (dd, J = 6.2, 5.2 Hz, 0.6H);
【００８３】
本発明者らはアレルゲン性四糖4P-Xを初めて合成することに成功した。グルコースからの総収率は5.4%であった。これまでの酵素反応だけによる調製では、本発明のガラクトオリゴ糖（4P-X）を他の構造の四糖から精製するのが困難であった。4P-Xをピリジルアミノ化などで誘導体化することなしに、効率的に取得することができる製法は前例がない。今後は、本発明の高純度品の4P-Xを用いることで、市販されている様々なGOS含有食品に対して、迅速かつ正確な定量分析系の確立することが大いに期待される。
【００８４】
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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