(57)【要約】      （修正有）【課題】培養された複数個の細胞について分裂間時間と分裂時間を調べる細胞観察装置の提供。【解決手段】細胞を培養器２２中で培養する培養手段２１と、培養器２２を移動させる移動手段２５と、を有するステージ部２０と、励起光をステージ２３に照射する光照射手段１１と培養器２２中の細胞からの光を受光する受光手段１２と、を有する顕微鏡部１０と移動手段２５の移動量を制御するステージ位置制御手段３３と、受光手段１２が受光した画像データを取得するデータ取得手段３４と、前記画像データから細胞の分裂時間と分裂間時間を求めるデータ解析手段３５とを有する制御部３０を有し、データ取得手段３４は、１つの視野に対して焦点深度の異なる深度画像データを取得し、データ解析手段３５は、前記深度画像データから、前記画像データに映っている個々の細胞のジャストフォーカス画像を得る細胞観察装置１。【選択図】図１
2018033410.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも細胞核の外形を識別可能に色分けした細胞を培養器中で培養する培養手段と、
前記培養器をＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動させる移動手段と、
を有するステージ部と、
励起光を前記ステージに照射する光照射手段と
前記培養器中の細胞からの光を受光する受光手段と、
を有する顕微鏡部と
前記移動手段の移動量を制御するステージ位置制御手段と、
前記受光手段が受光した画像データを取得するデータ取得手段と、
前記画像データから細胞の分裂時間と分裂間時間を求めるデータ解析手段と
を有する制御部を有し、
前記データ取得手段は、１つの視野に対して焦点深度の異なる複数の画像データである深度画像データを取得し、
前記データ解析手段は、前記深度画像データから、前記画像データに映っている個々の細胞のジャストフォーカス画像を得ることを特徴とする細胞観察装置。
【請求項２】
前記データ取得手段は、前記深度画像データを色分けされた前記細胞の前記色毎に取得し、
前記データ解析手段は、前記色毎の深度画像データから、前記細胞に焦点のあった画像データを選び、それらを合成することで前記ジャストフォーカス画像を得ることを特徴とする請求項１に記載された細胞観察装置。
【請求項３】
前記データ解析手段は、
細胞毎の前記ジャストフォーカス画像から前記細胞核の形状を楕円近似で決定し、
前記楕円の長軸と短軸の比率（楕円率）が所定の値以下になった時に前記細胞が分裂を開始したと判断する分裂開始決定手段と、
分裂を開始したと判断された前記細胞が複数になった時点で分裂が完了したと判断する分裂完了決定手段を有することを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載された細胞観察装置。
【請求項４】
前記分裂完了決定手段は、分裂前の細胞を楕円近似した際の長軸方向に２つの細胞があって、それぞれの細胞を楕円近似した際の長軸長が前記分裂前の細胞を楕円近似した際の長軸長より小さいことで分裂完了を判断することを特徴とする請求項３に記載された細胞観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生きた状態のまま細胞を一定時間ごとに観察し、分裂による継代状態を自動的に記録する細胞観察装置に係るものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞を生きたまま長期間観察する技術がすでに開示されている。例えば、特許文献１や特許文献２では、顕微鏡下での細胞を特定し、追跡するための装置が開示されている。また、生きた細胞は分裂するため、親子関係の特定も重要である。
【０００３】
一方、本出願の発明者は、生きたまま細胞を長期間観察できることを利用し、細胞毒性検査方法を提案した。この細胞毒性検査方法では、被検査対象となる薬剤を細胞に付与し、細胞の活動を調べることで、その薬剤の毒性を調べる。特に、細胞が分裂してから次に分裂するまでの時間（分裂間時間）と、細胞が分裂するのに有する時間（分裂時間）を調べ、薬剤が添加されなかった場合と比較する。
【０００４】
図１０には、細胞が分裂する系譜を調べた例を示す。それぞれの代の細胞には、最初の親をＣ１とし、その後Ｃ２、Ｃ３・・、と番号を付与した。同じ世代の細胞には、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂなどのように数字の後にアルファベットを付与して区別する。
【０００５】
図中丸で囲んだ数字は、これらの細胞の分裂の回数を表す。また、世代間をつなぐ線の長さは、大まかに分裂間時間の長さを反映させている。この系譜図を見ると、最初の細胞Ｃ１が分裂して２つのＣ２（Ｃ２ａ、Ｃ２ｂ）ができ、それぞれの細胞からさらに分裂してＣ３（Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄ）を生んでいることを順次観察できていることが分かる。なお、図１０中で、「ＯＵＴ」は顕微鏡の視野から外れ、観察出来なくなったことを示す。
【０００６】
細胞が薬剤で影響を受ける受け方として、分裂してから次に分裂するまでの時間が延びるだけでなく、分裂の過程でなんらかの影響を受けている場合もある。したがって、分裂を安定に繰り返す細胞の増殖の過程を調べて、薬剤の効果を調べるのは、きわめて有効な手法と考えられる。
【０００７】
このような細胞の観察は、細胞の親子関係を特定するのはもとより、いつ分裂期に入ったかを判定する必要があるため容易ではない。また、たった１つの細胞を追っただけでは、毒性の判断として適切ではないので、ある程度の数の細胞の親子関係および、いつ分裂期に入ったかという点を調べる必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−２０９６９８号公報
【特許文献２】特開２０１２−０３９９２７号公報
【特許文献３】特開２０１２−０２９６７５号公報：特許第５７２８２０１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１、２では、観察する細胞毎に親子関係を特定しているので、分裂間時間の計測は、行えると考えられる。しかし、細胞が分裂するのにどの程度の時間がかかっているか（分裂時間）を測定することはできない。
【００１０】
また、複数個の細胞について分裂間時間と分裂時間を調べるには、膨大な量の写真を撮影し、どの細胞が分裂期に入っていたか、分裂が完了したのはいつか、といった点について目視で追跡しなければならず、非常に多くの時間と手間がかかっていた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は上記の課題に鑑みて想到されたもので、個々の細胞の分裂時間および分裂間時間をも測定することができる細胞観察装置を提供するものである。
【００１２】
本発明では、多数の細胞写真を効率的に撮影するために、１つの視野に対して焦点深度方向に複数の画像を撮影しておき、個々の細胞については、その中からジャストフォーカスの画像を選ぶ。
【００１３】
また、本発明では分裂期に入ったか否かを細胞核の形状を楕円近似し、その長軸長ａと短軸長ｂの比（ｂ／ａ：いわゆる楕円比）が所定の値以下になったら分裂期に入ったと判断し、分裂が終了するまでの時間を分裂時間とすることで上記の課題を解決する。
【００１４】
より具体的に本発明に係る細胞観察装置は、
少なくとも細胞核の外形を識別可能に色分けした細胞を培養器中で培養する培養手段と、
前記培養器をＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動させる移動手段と、
を有するステージ部と、
励起光を前記ステージに照射する光照射手段と
前記培養器中の細胞からの光を受光する受光手段と、
を有する顕微鏡部と
前記移動手段の移動量を制御するステージ位置制御手段と、
前記受光手段が受光した画像データを取得するデータ取得手段と、
前記画像データから細胞の分裂時間と分裂間時間を求めるデータ解析手段と
を有する制御部を有し、
前記データ取得手段は、１つの視野に対して焦点深度の異なる複数の画像データである深度画像データを取得し、
前記データ解析手段は、前記深度画像データから、前記画像データに映っている個々の細胞のジャストフォーカス画像を得ることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る細胞観察装置は、１つの視野に対して焦点深度方向に複数の画像を撮影しておき、視野中の個々の細胞については、その画像の中からジャストフォーカスの画像を選ぶので、１つの視野中に複数の細胞があっても、短時間で観察することができる。
【００１６】
また、この細胞装置は、細胞核の形状の変化でその細胞が分裂期に入ったと認識するため、細胞の分裂時間を測定することができる。したがって、薬剤が添加された細胞が継代的にどのように変化するかだけでなく、細胞分裂の周期に及ぼす影響も調べることができる。
【００１７】
また、本発明に係る細胞観察装置は、膨大な画像データを自動的に処理することができるので、特許第５７２８２０１号に示した細胞毒性検査をきわめて容易に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明に係る細胞観察装置の構成を示す図である。
【図２】細胞観察装置の全体処理のフローを示す図である。
【図３】細胞観察装置において、細胞の撮影を行う処理のフローを示す図である。
【図４】細胞観察によって得られるデータの概要を示す図である。
【図５】ジャストフォーカス画像を得る処理のフローを示す図である。
【図６】細胞を楕円近似する様子を示す図である。
【図７】細胞リストＬを例示する図である。
【図８】細胞観察装置でデータ解析を行う処理のフローを示す図である。
【図９】データ解析の処理において、現在観察対象として細胞ｐＣｊに対応する細胞が細胞リストＬになかった場合の処理のフローを示す図である。
【図１０】細胞の系譜を例示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に本発明に係る細胞観察装置について図面を参照しながら説明を行う。以下の説明は、本発明の一実施形態を例示するものであって、本発明に係る細胞観察装置は、以下の説明に限定されるものではない。本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて、以下の実施形態は改変することができる。
【００２０】
本発明に係る細胞観察装置は、試薬の細胞に対する効果を確認するために、試薬を添加した細胞を培養し、その分裂時間と分裂間時間を観察する。これは試薬を添加された細胞の継代情報を測定することで求められる。
【００２１】
図１は、本発明に係る細胞観察装置１の構成を示す図である。図１を参照し、細胞観察装置１は、顕微鏡部１０とステージ部２０と制御部３０で構成される。ステージ部２０は、細胞を培養する部分である。本発明に係る細胞観察装置１は、蛍光遺伝子を組み込んだ細胞を複数の培養器２２で培養し、一部の培養器２２には効果を調べるための試薬などを添加する。
【００２２】
ステージ部２０には、培養手段２１と、移動手段２５を有する。培養手段２１は、複数の培養器２２を細胞培養が可能な環境に維持する。例えば培養器２２を３７℃、５％のＣＯ２環境に維持する。培養器２２には細胞が培養される。培養された細胞は、顕微鏡部１０を介して観察される。したがって、培養器２２は少なくとも透過性を有する。
【００２３】
培養器２２は、少なくともコントロール（何も試薬をいれないもの）と、試薬を入れたものの２種類が用意される。図１では、培養器２２ａと培養器２２ｂが用意されている状態を示している。これらの培養器２２は、観察が継続される間、上記の環境条件に維持される。
【００２４】
移動手段２５は、培養器２２を顕微鏡部１０の視野内に移動させる。移動手段２５は、Ｘ，Ｙ方向だけでなく、Ｚ方向（顕微鏡部１０の光学系１３の光軸方向とする）にも移動可能なものであるのが望ましい。細胞をジャストフォーカスするためである。移動手段２５は、ステージ２３と、ステージ２３をＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動できる駆動装置２４で構成される。
【００２５】
ステージ部２０では、少なくとも移動手段２５は後述する制御部３０によって移動量および移動方向が制御できるように構成されている。
【００２６】
顕微鏡部１０は、光照射手段１１と、受光手段１２を有する。光照射手段１１は各蛍光タンパク質に対する励起光を出力する。励起光の種類は複数あってよい。受光手段１２は、蛍光タンパクを発現している細胞に充てられた励起光によって発生する蛍光を受光する。なお、受光手段１２は受光した映像を受光素子上に結像させ、画像データ化することができる。つまり、受光手段１２は画像データを生成すると言ってよい。
【００２７】
光照射手段１１と受光手段１２は、同一の光軸を有する顕微鏡部１０の光学系１３に組み込まれる。光照射手段１１がどの波長の励起光を、どの程度の出力で、いつ出力するかは後述する制御部３０によって制御される。また、受光手段１２が生成した画像データも後述する制御部３０によって取得される。
【００２８】
なお、図１の説明では、顕微鏡部１０がステージ部２０より上にあるようにしたが、顕微鏡部１０は倒立顕微鏡を用いてもよく、顕微鏡部１０はステージ部２０の下側に配置されてもよい。また、移動手段２５は、ステージ部２０を移動させるようにしたが、顕微鏡部１０を移動させるようにしてもよい。
【００２９】
制御部３０は、ＭＰＵ（Ｍｉｃｒｏ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  Ｕｎｉｔ）３１とメモリ３２で構成されるコンピュータで構成される。メモリ３２上には、細胞観察装置１全体を制御するためのプログラムが記憶されている。以下のステージ位置制御手段３３、データ取得手段３４およびデータ解析手段３５は、このプログラムの実行によってソフト的に実現される。なお、制御部３０には、ディスプレイ３１ａおよび入出力装置３１ｂが接続されているのが望ましい。画像データに基づいた解析や結果表示をするのに必要となるからである。
【００３０】
ステージ位置制御手段３３は、ステージ部２０のステージ２３を顕微鏡部１０に対して移動させる。つまり、ステージ位置制御手段３３は、ステージ部２０の移動手段２５を制御する。データ取得手段３４は、現在光学系１３の下にある培養器２２を光学系１３を通して得た視野に対して励起光を照射させ、細胞が発現している蛍光タンパク質が発生する蛍光を受光し、生成される画像データを取得する。
【００３１】
データ解析手段３５は、画像データを時系列に連続的に表示させ、細胞の分裂が始まる時刻（分裂開始時刻Ｔｂ）と分裂が終了した時刻（分裂完了時刻Ｔｆ）を特定し、そこから分裂時間Ｔｄと分裂間時間Ｔｗを決定する。
【００３２】
以上の構成を有する細胞観察装置１の使用について詳説する。細胞観察装置１は、細胞に対する薬剤の効果を、細胞の継代的な状態を観察することで調べる。したがって、使用する細胞は、培養液中で培養し、増殖できる細胞が望ましい。例えば、特許第５７２８２０１号に開示されているｍ５Ｓという細胞は好適に利用することができる。もちろんこれ以外の細胞を用いることもできる。
【００３３】
細胞には、公知の方法によって蛍光タンパク質の遺伝子が導入される。細胞を観察するためである。導入される部位は所望の部位であってよい。ただし、本発明に係る細胞観察装置１では、細胞の分裂が開始された時刻を特定するために、細胞核の形状を判断する必要がある。
【００３４】
したがって、細胞核の外形が分かるように蛍光タンパク質を導入する。なお、細胞核の外形が分かるのであれば、特に蛍光タンパク質を使わなくてもよい。すなわち、蛍光タンパク質以外の方法でも細胞核を識別できればよい。このように蛍光タンパク質などを用いて細胞を発色若しくは発色可能にすることを「細胞を色分けする」と呼ぶ。
【００３５】
細胞は培養器２２中で培養される。培養液は使用する細胞に好適なものを用いることができる。ただし、培養液は透明であることが望ましい。顕微鏡部１０を通じて培養されている細胞を観察するからである。
【００３６】
培養器２２中を培養に必要な状態に維持するための装置は培養手段２１として適宜使用される。少なくとも培養液の温度と培養器２２内の空気のＣＯ２濃度は所定の範囲に維持する必要がある。これらの装置は、制御部３０が制御してもよいが、人手によって維持されていてもよい。
【００３７】
培養器２２はステージ部２０のステージ２３上に固定される。なお、培養器２２は複数の培養器２２が用意される。
【００３８】
まず、細胞観察装置１の大まかな使用について説明する。上記のように細胞が用意された培養器２２がステージ部２０に固定されたら、観察が開始される。観察が開始されたら、顕微鏡部１０は培養器２２の所定の箇所で観察を行う。ここで観察を行うとは、細胞の画像データを得ることである。観察を行う場所は、培養器２２の大きさと、顕微鏡部１０の視野Ｗの広さで決めてよい。
【００３９】
観察を行う箇所は複数設定する。観察を行った箇所で、顕微鏡部１０を通じて見える範囲が視野Ｗである。視野Ｗの中には少なくとも１つ以上の細胞があるようにするのが望ましい。以後、観察が継続する限り、この視野Ｗは巡回的に観察される。したがって、全ての視野Ｗを撮影し終わると、最初の視野Ｗに戻ってくる。つまり、全ての視野Ｗを撮影する時間が、１つの視野Ｗの観察間隔となる。
【００４０】
細胞観察は細胞を観察して画像データを得る処理と、得られた画像データを分析する処理で構成される。
【００４１】
図２には、処理の大まかな流れを示す。細胞がセットされたら細胞観察装置１をスタートさせる（ステップＳ１００）。次に各視野Ｗに対して撮影を行う（ステップＳ１０２）。ステップＳ１０２は、各視野Ｗ毎に巡回的に、かつ継続的に行われる。次に画像データがある程度蓄積されたところで、データ解析を行う（ステップＳ１０４）。
【００４２】
このデータ解析によって、細胞毎の分裂時間Ｔｄや分裂間時間Ｔｗが算出される。これらの情報は細胞リストＬに記録される。この細胞リストＬを用いれば、継代図を作成することもできる。なお、データ解析（ステップＳ１０４）の間も、ステップＳ１０２の撮影は継続して行われていてよい。
【００４３】
データ解析（ステップＳ１０４）が終了したら終了判定を行う（ステップＳ１０６）。終了判定は人の判断であって構わない。終了しない場合（ステップＳ１０６のＮ判定）は、再び撮影処理をおこなってもよい（ステップＳ１０２）。終了する場合（ステップＳ１０６のＹ分岐）は、停止する（ステップＳ１０８）。
【００４４】
図３には、ステップＳ１０２の撮影処理をより詳しく示した。撮影処理（ステップＳ１２０）では、まず、移動手段２５で視野Ｗに移動する（ステップＳ１２２）。次に所定の色で深度方向に複数（例えば１０枚）の画像データを取得する（ステップＳ１２４）。ある色についての１枚の画像データを色画像データＶｄと呼ぶ。そして、焦点深度方向に撮影した複数の色画像データＶｄを深度画像データΣＶｄと呼ぶ。
【００４５】
通常１つの視野Ｗには複数の細胞がいると考えられる。これらの細胞毎にジャストフォーカスされた画像データを得るのは時間がかかる。そこで、焦点深度方向に１０枚の深度画像データΣＶｄを取得しておき、後から各細胞についてのジャストフォーカスの画像データを選択する。なお、ここでは焦点深度方向に１０枚の画像データ（色画像データＶｄ）を得ることとしたが、枚数については、１０枚に限定されるものではない。
【００４６】
そして、同じ視野Ｗで色画像データＶｄを取得していない色があるかを判断する（ステップＳ１２６）。未取得の色がある場合（ステップＳ１２６のＹ分岐）は、励起光の波長を変えて再び深度方向に複数の深度画像データΣＶｄを得る（ステップＳ１２４）。
【００４７】
全ての色について撮影が終了した場合（ステップＳ１２６のＮ分岐）は、撮影を終了するか否かを判断する（ステップＳ１２８）。終了判断の基準は、特に限定されない。人為的に停止してもよいし、一定時間の経過を判断の基準としてもよい。撮影を終了しない場合（ステップＳ１２８のＮ分岐）は再びステップＳ１２２に処理を戻し、ステージ部２０を移動させ新たな視野Ｗに向かう。なお、複数の色を同時に取得できてもよい。その場合深度画像データΣＶｄは、１枚に複数の色が撮影された色画像データＶｄで構成される。
【００４８】
撮影を終了する場合（ステップＳ１２８のＹ分岐）は、次のデータ解析（ステップＳ１３０）に処理を移す。なお、ステップＳ１２８でＮ分岐に進んだ場合でも、ステップＳ１２２に戻り、巡回的に撮影を継続するようにしてもよい。
【００４９】
図４には、このようにして取得される画像データのイメージと取得のタイミングを示す。図４（ａ）を参照して、培養器２２をｎ個の視野Ｗに分け、順に撮影を行う。なお、ここでは簡単のために、色は「色１」と「色２」の２色で発光させたとする。もちろん、３色以上で発光させてもよい。ある視野Ｗｉ（１≦ｉ≦ｎ）での「色１」についての１枚の画像データが色画像データＶｄである。「色１」の色画像データを符号「Ｖｄ１」で表す。
【００５０】
この視野Ｗｉでの色画像データＶｄ１は焦点深度方向に複数枚撮影される。これが深度画像データΣＶｄである。「色１」に関する深度画像データを符号「ΣＶｄ１」で表す。ここでは色が２色としたので、視野Ｗｉでは、色１と色２で発色させた場合の深度画像データΣＶｄ１と深度画像データΣＶｄ２の２つの画像データの集合ができる。
【００５１】
このような深度画像データΣＶｄを撮影時刻に従って並べたのが図４（ｂ）である。横方向に時刻が進む。縦方向は色の違いを表す。図４（ｂ）を参照して、最初に時刻ｔ１１に視野Ｗ１を得る。次に時刻ｔ２１に視野Ｗ２というように、次々に深度画像データΣＶｄを取得する。視野はｎ個あるとしているので、時刻ｔｎ１に視野Ｗｎの深度画像データΣＶｄを取得する。そして次の時刻ｔ１２には、再び視野Ｗ１の深度画像データΣＶｄを取得する。そして一般的に時刻ｔｉｍの時に視野Ｗｉの深度画像データΣＶｄを取得する。つまり、時刻ｔｉｍは、視野Ｗｉのｍ回目の撮影をした時刻である。
【００５２】
例えば、細胞を発光させる色が１色で、視野Ｗｉが１０か所あり、６分で全視野を撮影できるとする。すると６分毎に、１００枚の色画像データＶｄ（画像データ）を得る。観察を７２時間行ったとすると、７２，０００枚の画像データが得られる。色が２色だと１４４，０００枚にもなる。これらの画像データに映っている細胞の１つ１つについて人手だけで追跡するのは、容易ではない。
【００５３】
各時刻の間には、図４（ａ）で示したように、各視野Ｗについて各色毎に深度画像データΣＶｄを取得している。したがって、各視野Ｗ毎の撮影時間と、視野Ｗ間を移動する時間が、各時刻（例えばｔ１１とｔ２１）の間隔となる。また、同じ視野Ｗｉはｔｉｍ−ｔｉ（ｍ−１）の時間間隔毎に撮影が行われる。図４（ｂ）では、視野Ｗ２において、ｔ２１とｔ２２の間Ｔｓｍが視野Ｗ２の撮影間隔となる。
【００５４】
以上のように、細胞観察装置１は、培養器２２中に細胞を培養しながら、決められた視野Ｗについて細胞に蛍光発光させながら撮影を行っていく。撮影が進めば、培養されている細胞が映っている視野Ｗの時系列の変化が深度画像データΣＶｄとしてメモリ３２（図１参照）に蓄積されていく。
【００５５】
一定数以上の深度画像データΣＶｄが蓄積したら、データ解析手段３５で画像データを解析する。まず、データ解析を説明するにあたって、ジャストフォーカス画像処理（以後「ＪＦＰ処理」と呼ぶ。）と分裂の判断、および細胞リストＬについて説明する。
【００５６】
＜ＪＦＰ処理＞
ＪＦＰ（Ｊｕｓｔ  Ｆｏｃｕｓ  Ｐｉｃｔｕｒｅ）処理とは、ある視野Ｗｉにおける各細胞に関してジャストフォーカス画像を得る処理をいう。培養器２２中の細胞は、幾分浮遊しているので、深度方向に細胞毎に位置が違う。視野Ｗｉ中にある複数個の細胞についてそれぞれ焦点を合わせながら色画像データＶｄを撮影すると、時間がかかる。
【００５７】
そこで、視野Ｗｉ毎に深度方向に複数枚の色画像データＶｄを撮影しておく。そして、あとから映っている個々の細胞につい焦点が最もよくあっている１枚の色画像データＶｄを選び、その細胞のジャストフォーカス画像（以後「ＪＦＰ」という。）とする。
【００５８】
図５（ａ）にはこの処理のフローを示す。また、図５（ｂ）乃至図５（ｄ）にはこの処理の概念図を示す。なお、後述するデータ解析のフロー中では、ＪＦＰの処理はステップＳ２０４に相当する。また、ＪＦＰ処理の入力は、ある観察時刻ｔｉｍにおける視野Ｗｉの色画像データＶｄの全部である。言い換えると、全ての色についての細胞の深度画像データΣＶｄである。そして、出力は、細胞毎のジャストフォーカス画像である。これは細胞毎に１枚ある。
【００５９】
処理が始まる（ステップＳ４００）と、深度画像データΣＶｄを読み込む（ステップＳ４０２）。ここで読み込む深度画像データΣＶｄは、時刻ｔｉｍの視野Ｗｉについてのものである。また、視野Ｗｉ中の全ての色についての深度画像データΣＶｄである。図４のΣＶｄ１およびΣＶｄ２に相当する。次にこの深度画像データΣＶｄ中の細胞を特定する（ステップＳ４０４）。細胞を特定するとは、深度画像データΣＶｄ中に映っているどれかの細胞を部分的な領域に切り出し、抽出するとしてもよい。
【００６０】
この抽出した領域で焦点の合った画像を探すためである。そして、その細胞について最も輝度の高い色画像データＶｄを選択する（ステップＳ４０６）。言い換えると、抽出した領域で輝度が最も高くなる色画像データＶｄを選択する。焦点が合った画像の輝度が最も高くなると考えられるからである。なお、最初にＪＦＰ処理を行う場合は、細胞核を映した深度画像データΣＶｄについて処理をするのが望ましい。細胞核の色画像データＶｄが細胞を位置で区別する場合わかりやすいからである。
【００６１】
そして他の色に関する深度画像データΣＶｄがあるか否かを判断する（ステップＳ４０８）。他の色がある場合（ステップＳ４０８のＹ分岐）は、ステップＳ４０６に戻り、他の色の深度画像データΣＶｄ中で最高輝度の色画像データＶｄを選ぶ。なお、この時ステップＳ４０４で使った切り出し領域を用いてよい。色が変わってもこの領域内に特定された細胞があるからである。
【００６２】
他の色がなければ（ステップＳ４０８のＮ分岐）、色毎の色画像データＶｄを合成する（ステップＳ４１０）。合成された画像データは、時刻ｔｉｍの時の視野Ｗｉに映っているある細胞のジャストフォーカス画像（ＪＦＰ）である。
【００６３】
次に読み込んだ深度画像データΣＶｄ中の全ての細胞について処理を行ったかを判断する（ステップＳ４１２）。処理を行っていない場合（ステップＳ４１２のＮ分岐）は、再びステップＳ４０４に処理を移し、細胞特定から処理を繰り返す。読み込んだ深度画像データΣＶｄ中の全ての細胞について処理が終わった場合（ステップＳ４１２のＹ分岐）は、細胞毎のＪＦＰを出力（ステップＳ４１４）し処理を終える（ステップＳ４１８）。
【００６４】
次に図５（ｂ）乃至図５（ｄ）を用いて、このフローの動作を説明する。図５（ｂ）を参照して、色１の深度画像データΣＶｄ１の中に細胞が２つ映っている場合を示している。それぞれＣ１、Ｃ２とする。また、細胞は２つの色で発光することができるとする。言い換えると、細胞は２つの色で色分けされている。
【００６５】
今、「色１」について細胞Ｃ１を部分的な領域Ｖｃで切り出すことで特定した（ステップＳ４０４）。そして、深度画像データΣＶｄ１の中から、領域Ｖｃの輝度が最も高いものを選ぶ（ステップＳ４０６）。これが細胞Ｃ１の「色１」についてのジャストフォーカス画像（「ＪＦＰ１」とする。）である。つまり、細胞Ｃ１に焦点があった画像データ（色画像データＶｄ１）である。
【００６６】
図５（ｃ）を参照して、細胞Ｃ１は他の色もあるので（ステップＳ４０８のＹ分岐）、色２についての深度画像データΣＶｄ２に対して、再び細胞特定を行う（ステップＳ４０４）。ここで使う部分的な領域Ｖｃは、色１の場合に用いた領域と同じ領域を使ってよい。次に深度画像データΣＶｄ２において、部分的な領域Ｖｃの輝度が最も高い画像データを選択する（ステップＳ４０６）。これが細胞Ｃ１につていのジャストフォーカス画像（「ＪＦＰ２」とする。）である。つまり、細胞Ｃ２に焦点があった画像データ（色画像データＶｄ２）である。
【００６７】
ＪＦＰ１とＪＦＰ２を合成したものが、この視野Ｗにおける細胞Ｃ１のジャストフォーカス画像である（図５（ｄ））。符号ＪＦＰＣ１として示した。この視野Ｗには、他の細胞Ｃ２もあるので、細胞Ｃ１の場合同様に、ジャストフォーカス画像（ＪＦＰＣ２）を得る。
【００６８】
以上のようにＪＦＰ処理は、ある時刻の視野Ｗについて撮影された深度画像データΣＶｄを読み込んで、そこに映っている各細胞のジャストフォーカス画像ＪＦＰを出力する。
【００６９】
＜分裂の判断＞
次に分裂の判断について説明する。図６には、細胞が分裂する様子を概念的に示す。細胞の外膜はさまざまな形状を示すが、細胞核に注目すると、通常はほぼ円状態にある。しかし、分裂が始まると楕円形になり、真ん中がくびれ、やがてほぼ円状態の２つの細胞核に分かれる。本発明に係る細胞観察装置１では、細胞核を楕円近似する。図６では、図６（ａ）の変化が実際の核の変化であり、図６（ｂ）の実線が楕円近似した状態である。
【００７０】
細胞核の形状を楕円近似し、楕円の長軸ａと短軸ｂの比（ｂ／ａ：楕円率Ｒｏ）によって分裂開始を判断する。つまり、楕円率Ｒｏが所定の値以下であれば（細長くなれば）、分裂を開始したと判断する。この時の時刻が分裂開始時刻Ｔｂである。
【００７１】
また、分裂が完了すると、元の細胞核の付近に新たなほぼ円形の細胞核が出現する。この時をもって細胞分裂は完了したと判断する。この時の時刻が分裂完了時刻Ｔｆである。また、分裂完了時刻Ｔｆは新たな細胞の誕生時刻Ｔｓでもある。
【００７２】
なお、分裂開始時刻Ｔｂから分裂完了時刻Ｔｆまでの時間が分裂時間Ｔｄであり、分裂完了時刻Ｔｆ（＝新たな細胞の誕生時刻Ｔｓ）からその細胞が分裂を開始するまでの時間が分裂間時間Ｔｗである。
【００７３】
＜細胞リストＬ＞
画像データ中に撮影された全ての細胞についての記録が細胞リストＬである。個々の細胞について時間的な状態の変化を記録できれば、特に限定されるものではない。図７にはその一例を示す。図７を参照して、縦方向には細胞番号、横方向には観察時刻が配置されている。なお、視野Ｗはｎ個あるとしている。
【００７４】
ここでは視野Ｗ１に２つの細胞があり、それぞれＣ１、Ｃ２という番号が付与されたとする。時刻ｔ１１の時の細胞Ｃ１の状態をＣ１Ｓ１１とする。これを状態情報と呼ぶ。なお、状態情報は符号Ｓであらわし、特定の細胞についての状態情報をいう場合は、細胞番号を先頭につける。状態情報Ｃ１Ｓ１１には、視野Ｗ、観察時刻、視野中の位置座標（ｘ、ｙ）、長軸長（ａ）、短軸長（ｂ）、楕円率Ｒｏ、分裂開始時刻Ｔｂ、分裂完了時刻Ｔｆ、誕生時刻Ｔｓ、ジャストフォーカス画像（ＪＦＰ）等が記録される。細胞Ｃ２についても同様である。
【００７５】
視野Ｗ１の次の観察は、時刻ｔ１２であるので、それまでの時刻に細胞Ｃ１、細胞Ｃ２についての情報が記録されることはない。このように１つの視野はＴｓｍ毎に観察される。
【００７６】
視野Ｗ２には細胞Ｃ３、細胞Ｃ４があるとした。これらの細胞についても、細胞Ｃ１、細胞Ｃ２と同じように記録される。ただし、これらの細胞は視野Ｗが異なるので、観察時刻は異なる。
【００７７】
視野Ｗｋには、細胞Ｃｋがあるとする。この細胞Ｃｋは時刻ｔｋ１に観察されている。したがって、状態情報ＣｋＳｋ１が記録される。視野Ｗｋは次の観察時刻がｔｋ２である。そして、この時細胞Ｃｋは分裂していたとする。このような場合、状態情報ＣｋＳｋ２には、分裂完了時刻Ｔｆが記録される。分裂完了時刻Ｔｆが記録されたら、細胞Ｃｋは存在しなくなったことを意味する。
【００７８】
細胞Ｃｋの分裂によって、新たな細胞が生まれている。それらを細胞Ｃｋ１、細胞Ｃｋ２とする。細胞番号には、親子関係が分かるようにしておくのが便利である。細胞Ｃｋ１が分裂したら細胞Ｃｋ１１と細胞Ｃｋ１２が生まれるといったように、番号を付与すると便利である。
【００７９】
細胞Ｃｋ１および細胞Ｃｋ２は、時刻ｔｋ２に生まれたと判断されるので、状態情報Ｃｋ１Ｓｋ２と状態情報Ｃｋ２Ｓｋ２には、誕生時刻Ｔｓがその他の情報に加えて記録される。
【００８０】
以下に説明するデータ解析手段３５（図１参照）は、撮影された全ての画像データを解析し、この細胞リストＬを作成するのが、目的である。なお、本発明において、細胞リストＬを更新するとは、従前の情報を残したまま新たに観察データを記録する意味である。細胞リストＬから、系譜図を得るためには、全ての経過情報が必要だからである。
【００８１】
＜データ解析＞
以上のように、ＪＦＰ処理、細胞分裂の開始の判断、細胞リストＬを用意してから、データ解析手段３５が行う処理に関して説明する。データ解析のフローを図８に示す。データ解析処理は図２の全体フローのステップＳ１０４に示した処理である。すでに説明したように、この処理は、画像データ（深度画像データΣＶｄ）が蓄積すればいつでも行うことができる。
【００８２】
図８を参照して、データ処理が開始されたら（ステップＳ２００）、解析を行う深度画像データΣＶｄを読み込む（ステップＳ２０２）。この深度画像データΣＶｄは、時刻ｔｉｍの視野Ｗｉの全ての色についてのものである。従って、図８では「ｔｉｍＷｉ」と示した。なお、図への記載は省略したが、処理が開示されたら初期設定を行い、変数ｉ、ｍ、ｊは１に初期化されているものとする。変数ｉは、視野Ｗの番号を示し、変数ｍはその視野Ｗの観察回数を示し、変数ｊはその視野内での細胞の仮番号を示す。
【００８３】
全ての色の深度画像データΣＶｄを読み込んだら、ＪＦＰ処理を行う（ステップＳ２０４）。このＪＦＰ処理の詳細は、図５に示した通りである。このＪＦＰ処理によって、視野Ｗｉに映っている細胞毎のジャストフォーカス画像（ＪＦＰ）が得られる。
【００８４】
次にこのＪＦＰ上の細胞について仮番号を付与する（ステップＳ２０６）。仮番号は今解析を行おうとしている視野にある細胞（ステップＳ２０４で得たＪＦＰに映っている細胞）にだけ有効な細胞番号である。ここでは、仮番号をｐＣｊ（ｊ＝１、２、・・・）とする。最終的な細胞番号は、後の処理で付与され、細胞リストＬには、最終的な細胞番号で登録、管理される。
【００８５】
次に細胞リストＬ中に、すでに細胞ｐＣｊに対応する細胞があるか否かを調べる（ステップＳ２０８）。細胞ｐＣｊは視野Ｗｉ内にあるので、細胞リストＬにそもそも視野Ｗｉの記録がなければ、対応する細胞は細胞リストＬにはないと判断できる。また、視野Ｗｉの記録があった場合、細胞ｐＣｊの座標と同じ座標を持つ細胞があるかを調べれば、すでに記録された細胞であるか否かを判断することができる。
【００８６】
細胞リストＬ中に細胞ｐＣｊに対応する記録がすでにある場合（ステップＳ２０８のＹ分岐）は、細胞ｐＣｊの状態情報Ｓを調べ、細胞リストＬを更新する（ステップＳ２１０）。具体的には、撮影時刻Ｔｉｍ、細胞の位置座標（ｘ、ｙ）、楕円近似から求める楕円率Ｒｏ、分裂開始時刻Ｔｂ、分裂完了時刻Ｔｆ、誕生時刻Ｔｓといったものである。なお、楕円率Ｒｏは、この処理において、ＪＦＰに基づいて画像処理で求められる。この楕円率Ｒｏを求める工程で、細胞ｐＣｊはその形状を楕円近似で決定される。また、楕円率Ｒｏが閾値Ｔｈ以下であったら、観察時刻Ｔｉｍを分裂開始時刻Ｔｂとして記録する。この処理は、細胞が分裂したと判断しているので、分裂開始決定手段と呼んでよい。なお、細胞リストＬを更新する際には仮番号ｐＣｊではなく、本来の細胞番号として更新する。以下についても同じである。
【００８７】
分裂開始時刻Ｔｂが記録されると、同じ細胞の誕生時刻Ｔｓが記録されてあれば、分裂間時間ＴｗをＴｂ−Ｔｓとして求める。
【００８８】
対応する細胞が細胞リストＬ中にない場合（ステップＳ２０８のＮ分岐）は、「不明細胞処理」を行う（ステップＳ２１４）。細胞リストＬ中に細胞ｐＣｊが見当たらないというのは、いくつかの場合が考えられる。「不明細胞処理」とは、細胞ｐＣｊが（１）新細胞であった、（２）以前の位置から移動した、（３）まだ細胞リストＬに記録されていなかった、（４）移動して追跡不可となった、の４つの結果に分ける。そしてそれぞれについて細胞リストＬを更新する。
【００８９】
細胞ｐＣｊが新細胞であると判断された場合は、細胞リストＬの視野Ｗｉの部分に新たな細胞として記録する。この処理は、細胞分裂が完了したことを決定しているので、分裂完了決定手段と呼んでよい。これは、図７の細胞Ｃｋから新細胞Ｃｋ１と新細胞Ｃｋ２を分岐させたように記録する（ステップＳ２１６）。つまり、分裂完了時刻Ｔｆが記録される。なお、新細胞が生まれた時点で、すでに分裂開始時刻Ｔｂが記録されていたら分裂時間ＴｄをＴｆ−Ｔｂで求める。
【００９０】
また、細胞ｐＣｊが元の位置から移動してしまったと判断された場合は、新たな座標の状態で細胞リストＬを更新する（ステップＳ２１８）。
【００９１】
また、細胞ｐＣｊは、元の位置から大きく移動してしまい、元の位置を推定できない場合は、細胞リストＬに追跡不能の記録をする。（ステップＳ２２０）視野Ｗは同じ培養器２２中に複数箇所設けられるので、その視野Ｗ内に存在していた細胞が移動して視野の外に移動したり、視野Ｗ外からその視野Ｗに入ってくる場合もある。そのような細胞については、記録の対象から外す。
【００９２】
具体的には、そのような細胞を特定して、行方不明と記録する。例えば、ｍ回目の測定に対する分析が終了したら、細胞リストＬ中に更新されなかった細胞を探す。その細胞には行方不明と記録することができる。
【００９３】
また、細胞ｐＣｊがまだ細胞リストＬに記録されたものでない場合は、新たに細胞リストＬに細胞番号を付与したうえで、登録する（ステップＳ２２２）。観察の初期には、細胞リストＬに細胞は登録されていないので、視野Ｗ内の全ての細胞は、この処理で細胞リストＬに登録される。
【００９４】
以上の処理によって、視野Ｗｉ中の細胞は、細胞リストＬ上で更新される。次に視野Ｗｉ中の全ての細胞について処理が終了したかを判断する（ステップＳ２２４）。これは全ての細胞ｐＣｊについて処理が終了したかで判断することができる。
【００９５】
まだ視野Ｗｉ中に未処理の細胞が残っている場合（ステップＳ２２４のＮ分岐）は、変数ｊをインクリメントして、再度ステップＳ２０８に戻って細胞リストＬの更新を行う。全ての細胞ｐＣｊについて処理が終了したら（ステップＳ２２４のＹ分岐）、全ての視野Ｗｉについて処理が終了したかを判断する（ステップＳ２２６）。未処理の視野Ｗｉがある場合（ステップＳ２２６のＮ分岐）、変数ｊは１に初期化し、変数ｉをインクリメントしてステップＳ２０４に戻る。新たな視野ＷｉのＪＦＰを得るためである。
【００９６】
全ての視野Ｗｉについて処理が終了している場合（ステップＳ２２６のＹ分岐）は、全ての観察時刻について処理が終了したかを判断する（ステップＳ２２８）。
【００９７】
まだ未処理の観察時刻が残っている場合（ステップＳ２２８のＮ分岐）は、変数ｉおよびｊを１に初期化し、変数ｍをインクリメントしたうえで、ステップＳ２０２に戻る。新たな深度画像データΣＶｄ（ｔｉｍＷｉで表される）を取得するためである。
【００９８】
観察時刻について未処理の深度画像データΣＶｄがない場合（ステップＳ２２８のＹ分岐）は、データ解析の処理を終了する（ステップＳ２３０）。以上の処理が終了すると、細胞リストＬには各視野Ｗｉ中に映された全ての細胞の状態情報Ｓについて、観察時間中の経過が全て記録される。
【００９９】
図９は、図８のステップＳ２１４の「不明細胞処理」を詳細に示すフローである。このフローの処理は、細胞リストＬ中に細胞ｐＣｊに対応する細胞が見当たらない場合であった（図８参照）。細胞ｐＣｊは、視野Ｗｉ中の細胞で仮番号を付与されている細胞である。このフローが始まると（ステップＳ３００）、細胞リストＬの中に視野Ｗｉが存在するかを調べる（ステップＳ３０２）。細胞リストＬ中に視野Ｗｉの記録がなければ（ステップＳ３０２のＮ分岐）、視野Ｗｉ中の細胞ｐＣｊの記録はないので、初記録としてステップＳ２２２へ処理を移す（ステップＳ３１８）。
【０１００】
細胞リストＬ中に視野Ｗｉの記録はある場合（ステップＳ３０２のＹ分岐）は、視野Ｗｉ中の記録に分裂開始時刻Ｔｂが記録されている細胞があるか否かを調べる（ステップＳ３０４）。ここでは、今対象とされている仮番号が付与された細胞ｐＣｊは、細胞分裂の結果新しくできた細胞ではないかという観点を調べる。
【０１０１】
分裂開始時刻Ｔｂが記録されている細胞があったら（ステップＳ３０４のＹ分岐）、細胞ｐＣｊはその分裂開始時刻Ｔｂが記録された細胞の近傍に存在するか否かを調べる（ステップＳ３０６）。これは分裂開始時刻Ｔｂが記録された細胞の座標と、細胞ｐＣｊの座標を比較することで、調べることができる。なお、「近傍」とは２つの細胞の距離が予め決めておいた距離ｒ０内にあるか否かで判断することができる。
【０１０２】
より具体的には、分裂開始時刻Ｔｂが記録されている場合は、その細胞を楕円近似した際の長軸ａの方向に細胞を探すことが効果的である。図６を再度参照して、細胞の分裂は、細胞を楕円近似した際の長軸ａの方向に長軸ａよりも小さい長軸を有する子細胞が２つできるからである。
【０１０３】
再び図９を参照する。分裂開始時刻Ｔｂが記録された細胞の近傍に細胞ｐＣｊがあった場合（ステップＳ３０６のＹ分岐）は、分裂してできた新細胞であるか否かを調べる（ステップＳ３０８）。これは、分裂開始時刻Ｔｂが記録された細胞の近傍にもう１つ細胞が存在しているか否かで調べることができる。
【０１０４】
すでに、上記に説明したように、分裂する前の細胞を楕円近似した際の長軸ａの方向に他の細胞が存在し、これら２つの細胞を楕円近似した際の長軸長が分裂する前の細胞の長軸長より短ければ、これらの細胞は細胞分裂によって生じた２つの細胞と判断することができる。
【０１０５】
細胞ｐＣｊが分裂の結果生成した新細胞である場合（ステップＳ３０８のＹ分岐）は、新細胞の登録（図８のステップＳ２１６）へ処理を移す（ステップＳ３１２）。細胞ｐＣｊが分裂して生成した細胞でない場合（ステップＳ３０８のＮ分岐）は、後述する移動によって位置が変化したか否かの判断（ステップＳ３１０）に処理を移行する。
【０１０６】
ステップＳ３０４に戻って、視野Ｗｉ中に分裂開始時刻Ｔｂを記録した細胞がない場合（ステップＳ３０４のＮ分岐）は、細胞ｐＣｊは視野Ｗｉ内で移動してしまった結果、元の場所で発見できなかったという観点で調べる。具体的には、移動によって座標を変えたのか否かを調べる（ステップＳ３１０）。
【０１０７】
これを判断するための手段はいろいろとあるが、簡単な方法としては、視野Ｗｉ中に記録された細胞の最新の位置座標から所定の距離ｒ２内に細胞ｐＣｊが存在するか否かを調べる。つまり、ｒ２までの細胞の移動は追跡するという趣旨である。
【０１０８】
所定の範囲ｒ２内にすでに記録された細胞があれば、細胞ｐＣｊはその細胞が現在の位置まで移動してきたと判断する（ステップＳ３１０のＹ分岐）。この場合は、細胞が移動したと判断し、新たな座標で細胞リストＬを更新する処理（図８のステップＳ２１８）に処理を移す（ステップＳ３１４）。
【０１０９】
また、所定の距離ｒ２内にすでに記録された細胞がなければ（ステップＳ３１０のＮ分岐）、細胞ｐＣｊは追跡不可能な細胞であるとして、追跡不可の処理（図８のステップＳ２２０）へ処理を移す（ステップＳ３１６）。
【０１１０】
ステップＳ３０６に戻って、視野Ｗｉ中に分裂開始時刻Ｔｂが記録されている細胞があるが、細胞ｐＣｊは、その細胞の近傍ではなかった場合（ステップＳ３０６のＮ分岐）は、細胞ｐＣｊは移動したものではないかと考え、ステップＳ３１０に処理を移す。ここでの処理は上記に説明したとおりである。
【０１１１】
このように「不明細胞処理」は、細胞ｐＣｊが（１）新細胞であった、（２）以前の位置から移動した、（３）まだ細胞リストＬに記録されていなかった、（４）移動して追跡不可となった、の４つの結果に分けることができる。
【０１１２】
以上のように、本発明に係る細胞観察装置１は、培養した細胞の写真を色毎に撮影し、データ分析手段によって、観察できる細胞の分裂を細胞毎に追跡し、分裂開始時刻Ｔｂと、分裂完了時刻Ｔｆを細胞毎に得ることができる。
【０１１３】
細胞観察装置１では、細胞分裂の開始と、細胞分裂の完了は生物学的な意味での細胞分裂および分裂完了とは異なる。しかし、膨大な画像データから個々の細胞の分裂の開始と、分裂の完了を画像処理で画一的に調べることができる。
【０１１４】
このような観察系において、複数の培養器２２を用意しておき、一方のグループに被試験用薬剤を投入し、他方のグループには薬剤を投入せず、観察を一定期間行う。このようにすることで、被試験用薬剤が細胞分裂をどれくらいの時間で行うか（分裂時間）、分裂してから次の分裂までどの程度の時間がかかっているか（分裂間時間）を自動的に調べることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明は細胞を生きたまま観察する細胞観察装置として好適に利用することができる。また、この装置により、細胞の毒性評価を自動で行うことができる。
【符号の説明】
【０１１６】
１  細胞観察装置
１０  顕微鏡部
１１  光照射手段
１２  受光手段
１３  光学系
２０  ステージ部
２３  ステージ
２４  駆動装置
２１  培養手段
２２  培養器
２５  移動手段
３０  制御部
３１  ＭＰＵ（Ｍｉｃｒｏ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  Ｕｎｉｔ）
３２  メモリ
３１ａ  ディスプレイ
３１ｂ  入出力装置
３３  ステージ位置制御手段
３４  データ取得手段
３５  データ解析手段
Ｗ  視野
Ｖｄ  色画像データ
ΣＶｄ  深度画像データ
Ｔｂ  分裂開始時刻
Ｔｆ  分裂完了時刻
Ｔｄ  分裂時間
Ｔｗ  分裂間時間
Ｖｃ  領域
Ｔｓ  誕生時刻
Ｌ  細胞リスト
【図１】
2018033410.tif 000003
【図２】
2018033410.tif 000004
【図３】
2018033410.tif 000005
【図４】
2018033410.tif 000006
【図５】
2018033410.tif 000007
【図６】
2018033410.tif 000008
【図７】
2018033410.tif 000009
【図８】
2018033410.tif 000010
【図９】
2018033410.tif 000011
【図１０】
2018033410.tif 000012