(57)【要約】【課題】カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）を用い、フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素（ＦＡＤ−ＧＤＨ）を酵素として用いる場合において、高感度で正確なグルコースセンサを提供すること。【解決手段】グルコースを電気化学的に定量するためのグルコースセンサに用いられるグルコースセンサ用試薬であって、フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素と、単層カーボンナノチューブと、分散剤とを含む、グルコースセンサ用試薬。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースを電気化学的に定量するためのグルコースセンサに用いられるグルコースセンサ用試薬であって、
フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素と、単層カーボンナノチューブと、分散剤とを含む、グルコースセンサ用試薬。
【請求項２】
前記フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素が糖化されている、請求項１に記載のグルコースセンサ用試薬。
【請求項３】
前記フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素の分子量が９０ＫＤａ以上である、請求項２に記載のグルコースセンサ用試薬。
【請求項４】
前記フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素の分子量が１１０ＫＤａ以上である、請求項３に記載のグルコースセンサ用試薬。
【請求項５】
前記分散剤は、アニオン系化合物、カチオン系化合物およびノニオン系化合物から選択される少なくとも１種の化合物を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のグルコースセンサ用試薬。
【請求項６】
前記アニオン系化合物は、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウムおよびドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムの少なくともいずれかである、請求項５に記載のグルコースセンサ用試薬。
【請求項７】
前記カチオン系化合物は、セチルトリメチルアンモニウムブロミドである、請求項５または６に記載のグルコースセンサ用試薬。
【請求項８】
前記ノニオン系化合物は、オクチルフェノールエトキシレートおよびポリソルベート類の少なくともいずれかである、請求項５〜７のいずれか１項に記載のグルコースセンサ用試薬。
【請求項９】
前記フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌、Ｔｈｅｒｍｏａｃｕｓ属糸状菌またはＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌に由来する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のグルコースセンサ用試薬。
【請求項１０】
グルコースを電気化学的に定量するためのセンサであって、
電極を備え、
前記電極の表面の少なくとも一部が、請求項１〜９のいずれか１項に記載の試薬からなる試薬層で被覆されている、グルコースセンサ。
【請求項１１】
請求項１０に記載のグルコースセンサの製造方法であって、
前記単層カーボンナノチューブおよび前記分散剤を含有するカーボンナノチューブ液と、前記フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素を含有する酵素液と、をこの順で前記電極上に塗布し、乾燥させることにより、前記試薬層を形成する、製造方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載のグルコースセンサの製造方法であって、
前記フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素を含有する酵素液と、前記単層カーボンナノチューブおよび前記分散剤を含有するカーボンナノチューブ液と、をこの順で前記電極上に塗布し、乾燥させることにより、前記試薬層を形成する、製造方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載のグルコースセンサの製造方法であって、
前記単層カーボンナノチューブおよび前記分散剤を含有するカーボンナノチューブ液と、前記フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素を含有する酵素液と、を混合してなる混合液を前記電極上に塗布し、乾燥させることにより、前記試薬層を形成する、製造方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載のグルコースセンサを用いる、グルコース測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースセンサ用試薬、グルコースセンサ、グルコースセンサの製造方法、および、グルコース測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
電気化学法を利用した血糖値センサなどのグルコースセンサが知られている。このようなグルコースセンサは、一般に、少なくとも作用極と対極を含む２つ以上の電極を備えており、電極上に、キャビティを形成するためのスペーサを貼り合わせたのち、キャビティの一部に酵素、メディエータなどを含む試薬層を形成し、カバーを貼り合わせてなる構造を有している。
【０００３】
そして、グルコースセンサのキャビティ（スペーサに形成された溝によって形成される空間）に、検体（血液、間質液、汗など）を導入すると、検体に含まれるグルコース（基質）が、酵素を介してメディエータ（電極活物質）を還元する。ここで、電極に所定の電圧を印加すると、電気化学反応により、還元されたメディエータが逆に酸化される。このとき発生する酸化電流を測定することで、グルコース量を検出することができる。
【０００４】
また、カーボンナノチューブ（以下、「ＣＮＴ」と略すことがある）などの導電性微粒子を用いて、グルコースが結合した酵素と電極との間でのＣＮＴを介した直接電子伝達によって生じる電流を測定することで、グルコース量を測定することも検討されている。
【０００５】
例えば、特許文献１（国際公開第２０１４／００２９９９号）に開示されるグルコースセンサの試薬層は、酸化還元酵素、水溶性導電性ポリマーおよび導電性微粒子を含んでいる。なお、特許文献１には、酸化還元酵素として、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素（以下、「ＦＡＤ−ＧＤＨ」と略すことがある）を使用することが開示されている。
【０００６】
また、特許文献２（国際公開第２０１４／００２９９８号）に開示されるグルコースセンサの試薬層は、酵素、導電性微粒子および非導電性高分子を含んでいる。なお、特許文献２には、導電性微粒子としてＣＮＴを用いることが開示されている。
【０００７】
また、非特許文献１（六車ら、電子情報通信学会技術研究報告  有機エレクトロニクス  １１０（４０９）、ｐ．１５−１８、２０１１年１月３１日）には、具体的に、ＣＮＴをグルコースセンサの試薬層（グルコースセンサ用試薬）中のメディエータとして用いることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１４／００２９９９号
【特許文献２】国際公開第２０１４／００２９９８号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】六車ら、電子情報通信学会技術研究報告  有機エレクトロニクス  １１０（４０９）、ｐ．１５−１８、２０１１年１月３１日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、本発明者らの検討により、酵素としてＦＡＤ−ＧＤＨを使用する場合、ＣＮＴの種類によっては直接電子伝達が起こらない場合があることが判明した。
【００１１】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、ＣＮＴを用い、ＦＡＤ−ＧＤＨを酵素として用いる場合において、高感度で正確なグルコースセンサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
［１］
グルコースを電気化学的に定量するためのグルコースセンサに用いられるグルコースセンサ用試薬であって、
フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素（ＦＡＤ−ＧＤＨ）と、単層カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）と、分散剤とを含む、グルコースセンサ用試薬。
【００１３】
［２］
前記フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素が糖化されている、［１］に記載のグルコースセンサ用試薬。
【００１４】
［３］
前記フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素の分子量が９０ＫＤａ以上である、［２］に記載のグルコースセンサ用試薬。
【００１５】
［４］
前記フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素の分子量が１１０ＫＤａ以上である、［３］に記載のグルコースセンサ用試薬。
【００１６】
［５］
前記分散剤は、アニオン系化合物、カチオン系化合物およびノニオン系化合物から選択される少なくとも１種の化合物を含む、［１］〜［４］のいずれかに記載のグルコースセンサ用試薬。
【００１７】
［６］
前記アニオン系化合物は、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウムおよびドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムの少なくともいずれかである、［５］に記載のグルコースセンサ用試薬。
【００１８】
［７］
前記カチオン系化合物は、セチルトリメチルアンモニウムブロミドである、［５］または［６］に記載のグルコースセンサ用試薬。
【００１９】
［８］
前記ノニオン系化合物は、オクチルフェノールエトキシレートおよびポリソルベート類の少なくともいずれかである、［５］〜［７］のいずれかに記載のグルコースセンサ用試薬。
【００２０】
［９］
前記フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌、Ｔｈｅｒｍｏａｃｕｓ属糸状菌またはＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌に由来する、［１］〜［８］のいずれかに記載のグルコースセンサ用試薬。
【００２１】
［１０］
グルコースを電気化学的に定量するためのセンサであって、
電極を備え、
前記電極の表面の少なくとも一部が、［１］〜［９］のいずれかに記載の試薬からなる試薬層で被覆されている、グルコースセンサ。
【００２２】
［１１］
［１０］に記載のグルコースセンサの製造方法であって、
前記単層カーボンナノチューブおよび前記分散剤を含有するカーボンナノチューブ液と、前記フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素を含有する酵素液と、をこの順で前記電極上に塗布し、乾燥させることにより、前記試薬層を形成する、製造方法。
【００２３】
［１２］
［１０］に記載のグルコースセンサの製造方法であって、
前記フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素を含有する酵素液と、前記単層カーボンナノチューブおよび前記分散剤を含有するカーボンナノチューブ液と、をこの順で前記電極上に塗布し、乾燥させることにより、前記試薬層を形成する、製造方法。
【００２４】
［１３］
［１０］に記載のグルコースセンサの製造方法であって、
前記単層カーボンナノチューブおよび前記分散剤を含有するカーボンナノチューブ液と、前記フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素を含有する酵素液と、を混合してなる混合液を前記電極上に塗布し、乾燥させることにより、前記試薬層を形成する、製造方法。
【００２５】
［１４］
［１０］に記載のグルコースセンサを用いる、グルコース測定装置。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、ＣＮＴを用い、ＦＡＤ−ＧＤＨを酵素として用いる場合において、高感度で正確なグルコースセンサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施形態１のグルコースセンサの構成を示す分解斜視図である。
【図２】実施形態１のグルコースセンサの製造工程の一例を説明するための斜視図である。
【図３】実施形態１のグルコースセンサの製造工程の一例を説明するための別の斜視図である。
【図４】実施形態１のグルコースセンサの製造工程の一例を説明するための別の斜視図である。
【図５】実施形態１のグルコースセンサの製造工程の一例を説明するための別の斜視図である。
【図６】実施形態１のグルコースセンサの製造工程の一例を説明するための別の斜視図である。
【図７】実施例１、比較例１および比較例２における試薬層の形成工程を示す模式図である。
【図８】実施例１のカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）液における分散剤の作用を説明するための模式図である。
【図９】ＦＡＤ−ＧＤＨの活性中心とＣＮＴの大きさとの関係を説明するための模式図である。
【図１０】試験例１の電流値の測定結果を示すグラフである。
【図１１】試薬層形成プロセス（プロセスＡ〜Ｃ）を示す模式図である。
【図１２】試験例２の電流値の測定結果を示すグラフである。
【図１３】試験例２の電流値の測定結果を示す別のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。なお、図面において、同一の参照符号は、同一部分または相当部分を表す。また、長さ、幅、厚さ、深さなどの寸法関係は図面の明瞭化と簡略化のために適宜変更されており、実際の寸法関係を表すものではない。各実施形態は例示であり、異なる実施形態で示した構成の部分的な置換または組み合わせが可能であることは言うまでもない。
【００２９】
［実施形態１］
図１を参照して、本実施形態のグルコースセンサは、試料液中に含まれるグルコース（基質）を測定するためのグルコースセンサ（センサチップ）であって、絶縁性基板１と、電極と、試薬層３と、スペーサ４と、カバー５とを備える。
【００３０】
電極は、絶縁性基板１の一方の面に設けられた作用極２１および対極２２を含む。試薬層３は、電極の絶縁性基板１と反対側の表面の一部に形成される。
【００３１】
スペーサ４は、試料液を試薬層３に誘導するキャビティ４１を形成するための切欠部４２を有し、切欠部４２（キャビティ４１）の内部に試薬層３が位置するように電極上に配置される。なお、電極の表面のうち、少なくともキャビティ４１内に露出している部分が試薬層で被覆されていることが好ましい。
【００３２】
カバー５は、少なくとも切欠部４２を覆うように、スペーサ４の絶縁性基板１と反対側の面に設けられる。また、カバー５は、キャビティ４１に連通する空気孔５ａを有している。
【００３３】
本実施形態においては、試薬層３が、フラビンアデニンジヌクレオチドグルコース脱水素酵素（ＦＡＤ−ＧＤＨ）と、単層カーボンナノチューブ（単層ＣＮＴ）と、分散剤とを含む試薬（グルコースセンサ用試薬）から構成される。
【００３４】
発明者らの検討により、酵素としてＦＡＤ−ＧＤＨを用いたグルコースセンサにおいて、ＣＮＴとして、多層ＣＮＴまたは凝集（Bundling）した単層ＣＮＴを用いた場合は、ＣＮＴを介した酵素と電極との間の直接電子伝達が起こりにくいことが分かった。一方、非凝集（Debundling）の単層ＣＮＴを用いると、直接電子伝達が起こることが分かった。
【００３５】
これらの結果は、ＦＡＤ−ＧＤＨ（酵素３３）の活性中心が１ｎｍ前後の大きさであり、それより大きい粒子径を有する多層ＣＮＴまたは凝集した単層ＣＮＴを用いた場合、ＣＮＴ３１が活性中心の中に入ることができず（図９（ｂ）および（ｃ）参照）、ＣＮＴ３１が酵素３３と電子授受できないためであると推測される。一方、凝集していない単層ＣＮＴを用いた場合（単層ＣＮＴおよび分散剤を試薬液中に配合した場合）は、ＣＮＴ３１が酵素３３の活性中心の中に入ることができ（図９（ａ）参照）、ＣＮＴ３１が酵素３３と電子授受できると推測される。
【００３６】
したがって、ＦＡＤ−ＧＤＨを酵素として用いる場合において、非凝集の単層ＣＮＴ（単層ＣＮＴおよび分散剤を含む試薬液）を用いることで、ＣＮＴをメディエータとして用いた高感度で正確なグルコースセンサを提供することが可能となる。
【００３７】
ＦＡＤ−ＧＤＨの活性中心の大きさとの関係において、上述の単層ＣＮＴの外径（円柱の直径）は、好ましくは０．７５〜２．０ｎｍであり、より好ましくは０．７５〜１．７ｎｍである。単層ＣＮＴの粒径は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）や原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によって測定することができる。
【００３８】
なお、電極の表面には、例えば、親水性高分子膜が形成されていてもよい。電極（電極膜）の表面を試薬層で被覆する際に、試薬液による電極表面の濡れ性がよくなり、試薬層を形成し易くなるからである。親水性高分子膜としては、例えば、アセトニトリルプラズマ重合膜、カルボキシメチルセルロースやメチルセルロールなどの親水性高分子、または、ポリビニルピロリドンなどの両親媒性高分子からなる膜などが挙げられる。
【００３９】
ＦＡＤ−ＧＤＨは、糖化されている（糖鎖が付加されている）ことが好ましい。ＦＡＤＧＤＨが糖化されていることにより、試薬層の剥離が抑制され、酵素（ＦＡＤ−ＧＤＨ）の失活が抑制される。
【００４０】
試薬層を形成するプロセスで、ＣＮＴなどの微粒子を搭載する際に、酵素などの試薬層が微粒子層の膜応力により剥離する場合がある。試薬が剥離すると、ＣＮＴを介した酵素と電極間で直接電子伝達が効果的に行われない。また、作製したセンサ間で品位、特性等のばらつきが大きくなる。
【００４１】
また、ＣＮＴ液を酵素と接触させた場合に、ＣＮＴ液中に含まれる分散剤の影響により、酵素が失活してしまう場合がある。
【００４２】
これに対し、ＦＡＤ−ＧＤＨが糖化されている場合は、酵素の３次元の立体構造が強く保持される。そのため、酵素を下地にしてＣＮＴ液を滴下し、試薬層を形成する際に、試薬層が剥離することが抑制される。それにより、ＣＮＴを介した酵素と電極間で直接電子伝達が効果的に行える。このため、作製したセンサ間での品位、特性等のばらつきが低減される。
【００４３】
また、ＣＮＴ液を酵素と接触させた場合に、分散剤またはＣＮＴが酵素に作用しても、酵素の３次元の立体構造が糖鎖により強く保持されるため、酵素が失活せず、酵素本来の活性を担保できる。
【００４４】
なお、ＦＡＤ−ＧＤＨとしては、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌、Ｔｈｅｒｍｏａｃｕｓ属糸状菌またはＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属糸状菌に由来するＦＡＤ−ＧＤＨを好適に用いることができる（例えば、特開２０１５−１６７５０６号公報、特開２０１６−７１９１号公報、特開２０１６−７１９２号公報、特開２０１６−７１９３号公報参照）。
【００４５】
分散剤は、単層ＣＮＴの凝集（bundling）を防止することができる化合物であれば特に限定されない。分散としては、例えば、アニオン系化合物、カチオン系化合物およびノニオン系化合物から選択される少なくとも１種の化合物を用いることができる。
【００４６】
アニオン系化合物としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウムまたはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムが挙げられる。カチオン系化合物としては、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミドが挙げられる。ノニオン系化合物としては、オクチルフェノールエトキシレート（ダウケミカル社製のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−３０５、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−４０５など）、または、ポリソルベート類（ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリソルベート４０（Ｔｗｅｅｎ４０）、ポリソルベート６０（Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）など）が挙げられる。
【００４７】
なお、試薬層３は、親水性高分子（カルボキシメチルセルロースなど）を含んでいてもよい。このような親水性高分子は、試薬層３を電極の表面へ容易に固定化する効果、または、試料液中の夾雑物（血液中の血球など）をろ過する効果を有している。
【００４８】
絶縁性基板１の材料としては、特に限定されないが、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）フィルムなどのプラスチック材料、感光性材料、紙、ガラス、セラミック、または、生分解性材料などが挙げられる。これらの材料は、スペーサ４、カバー５の材料としても用いられる。
【００４９】
絶縁性基板１上に設ける電極は、少なくとも作用極２１と対極２２を含む。電極は、作用極２１および対極２２以外に、電極電位の測定時に電位の基準となる参照電極や、キャビティ４１に試料が供給されたことを検知するための検知電極を含んでいてもよい。
【００５０】
これらの電極（作用電極、対極、参照極、検知用電極など）の材料としては、白金、金、パラジウムなどの貴金属、カーボン、銅、アルミニウム、ニッケル、チタン、ＩＴＯ（Ｉｎｄｉｕｍ  Ｔｉｎ  Ｏｘｉｄｅ：酸化インジウム錫）、ＺｎＯ（酸化亜鉛）などが挙げられる。
【００５１】
カバー５の材料は、絶縁性材料であることが好ましく、例えば、ＰＥＴフィルムなどプラスチック、感光性材料、紙、ガラス、セラミック、生分解性材料を用いることができる。なお、カバー５は、スペーサ４によって形成されるキャビティ４１と連通する空気孔５ａを有していることが好ましい。毛細管現象により試料が空気孔５ａに向かって吸引されて、キャビティ４１内への試料の導入が容易になるからである。
【００５２】
＜グルコースセンサの製造方法＞
本実施形態のグルコースセンサの製造方法の一例について、図１〜図６を参照して説明する。図１は、本実施形態のグルコースセンサの構成を示す分解斜視図である。図２〜図６は、本実施形態のグルコースセンサの製造工程の一例を説明するための図であって、それぞれ異なる工程を示している。本実施形態では、複数のグルコースセンサを同時に作製することができる。
【００５３】
まず、図２を参照して、電極（基質を定量するための作用極２１および対極２２）を、複数の絶縁性基板１の各々の上に形成する。具体的には、絶縁性基板１の一方の面に、導電層をスパッタリング法等により形成し、形成された導電層にレーザー加工、フォトリソグラフィー等によりパターン形成することで、電極（電極膜）を形成する。なお、作用極２１および対極２２以外に、上述の参照電極、検知電極などを形成してもよい。また、電極および絶縁性基板１の表面にプラズマ処理を施しておいてもよい。
【００５４】
電極膜は、例えば、スパッタリング法、真空蒸着法、イオンプレーティング法、ＣＶＤ（化学蒸着）法、ＭＢＥ（分子線エピタキシー）法、融液輸送法、融液温度降下法、ゾル−ゲル法、めっき法、塗布法、スクリーン印刷等を用い形成することができる。電極膜の厚みは、特に限定されないが、例えば、５〜５００ｎｍである。
【００５５】
次に、図３を参照して、電極（作用極２１および対極２２）の絶縁性基板１と反対側の一部、および、絶縁性基板１の電極が形成されていない領域の電極側の表面の一部に、切欠部４２を有するスペーサ４を貼り合わせる。
【００５６】
〔試薬層形成プロセス〕
次に、図４を参照して、電極（作用極２１および対極２２）の絶縁性基板１と反対側（切欠部４２の内部）に、酵素（ＦＡＤ−ＧＤＨ）、単層ＣＮＴおよび分散剤を含む試薬液を滴下し、試薬液を乾燥させることによって試薬層３を形成することができる。
【００５７】
（プロセスＡ）
より具体的には、例えば、図１１（ａ）を参照して、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）液（ＣＮＴ３１および分散剤３２）および酵素液（酵素３３）を、この順で電極２（親水性高分子膜２０）上に塗布する工程（プロセスＡ）により試薬層３を形成することができる。
【００５８】
（プロセスＢ）
また、図１１（ｂ）を参照して、ＣＮＴ液（ＣＮＴ３１および分散剤３２）より先に酵素液（酵素３３）を塗布する工程（プロセスＢ）により試薬層３を形成してもよい。
【００５９】
（プロセスＣ）
また、図１１（ｃ）を参照して、まずＣＮＴ液（ＣＮＴ３１および分散剤３２）と酵素液（酵素３３）とを混合した混合液を調製し、該混合液を電極２（親水性高分子膜２０）上に塗布する工程（プロセスＣ）により試薬層３を形成してもよい。
【００６０】
次に、図５を参照して、空気孔５ａを有するカバー５が、スペーサ４上に、少なくとも切欠部４２を覆うように積層されることで、試薬層３に試料液を誘導するためのキャビティ４１が形成される。なお、空気孔５ａはキャビティ４１の開口の反対側においてキャビティ４１の内部と連通するように設けられている。
【００６１】
次に、以上の工程によって形成されたグルコースセンサの集合基板を分割することで、キャビティ４１を有するグルコースセンサが得られる（図６、図１）。
【００６２】
＜グルコースセンサの使用方法＞
本発明のグルコースセンサ（センサチップ）は、測定器に装着されて使用されるものである。すなわち、測定器に装着されたグルコースセンサのキャビティ４１に試料（血液など）を供給すると、試料中の測定対象物質（グルコース）と酵素（ＦＡＤ−ＧＤＨ）が結合し、活性中心であるＦＡＤのごく近傍に設置されたＣＮＴへ、トンネル効果によって電子が伝達され、電流が生じる。グルコースセンサの作用極２１および対極２２と電気的に接続された測定器により、この電流を計測することで、試料に含まれる測定対象物質の定量が行われる。
【００６３】
以下、本発明のグルコースセンサの使用方法の一例について説明する。まず、キャビティ４１の先端部分（入口４１ｃ）に血液を接触させ、血液を、毛細管現象を利用してキャビティ４１内部に導入する。そして、作用極２１と対極２２間に電圧を印加し、一定のタイミングで電流値を測定する。印加電圧は、例えば０．３Ｖとする。キャビティ４１内に血液が導入されると、血中の分析対象物が酵素とCNTの直接電子伝達が起こる。作用極２１と対極２２の間に電圧を印加した際に流れる電流は、分析対象物濃度と相関がある。
【００６４】
次に、電圧印加から一定時間経過後の電流値を測定する。例えば、３〜５秒後の電流値を測定する。この電流値を用いて、あらかじめ求めておいた検量線から分析対象物の濃度を決定することができる。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６６】
［実施例１］
基本的には、上記実施形態１で説明した図１に示されるような構成を有するグルコースセンサを作製した。電極の材料としては金を用いた。スパッタリング法によって金からなる金属膜を形成し、これをパターン形成することにより、電極（作用極および対極）を作製した。また、電極の表面（試薬層が形成される部分）には、アセトニトリルプラズマ重合膜を形成した。なお、参照極、検知用電極は作製しなかった。
【００６７】
酵素液としては、ＦＡＤ−ＧＤＨの水分散液を用いた。ＦＡＤ−ＧＤＨとしては、表１に示される酵素番号１のＦＡＤ−ＧＤＨを用いた。
【００６８】
ＣＮＴ液としては、０．１５質量％の単層ＣＮＴ（非凝集：外径１．１〜１．７ｎｍ）と、２．０質量％の分散剤（コール酸ナトリウム）とを含有し、水を分散媒とする分散液を用いた。
【００６９】
なお、図８を参照して、このようなＣＮＴ液においては、凝集した単層ＣＮＴ３１を添加した場合でも、分散剤３２の存在により、単層ＣＮＴ３１は非凝集の状態となる。このような単層ＣＮＴの入手、ＣＮＴ液の調製等については、例えば、非特許文献１を参照することができる。
【００７０】
そして、図７（ａ）に示されるように、上記のＣＮＴ液（単層ＣＮＴ３１および分散剤３２を含む）および酵素液（酵素３３を含む）をこの順で電極２（親水性高分子膜２０）上に滴下し、乾燥させることにより、試薬層３を形成した（上記プロセスＡ）。
【００７１】
［比較例１］
ＣＮＴ液として、０．１質量％の多層ＣＮＴ（非凝集：外径１０〜１５ｎｍ、５〜１５層）と、２．０質量％の分散剤（コール酸ナトリウム）とを含有し、水を分散媒とする分散液を用いた点以外は、実施例１と同様にして、比較例１のグルコースセンサを作製した。なお、試薬層３は、図７（ｂ）に示される実施例１と同様の工程（プロセスＡ）により形成した。
【００７２】
［比較例２］
ＣＮＴ液中に、分散剤を添加しなかったこと以外は、実施例１と同様にして、比較例２のグルコースセンサを作製した。すなわち、比較例２では、ＣＮＴ液として、０．１５質量％の単層ＣＮＴ（凝集）を含有し、分散剤を含有せず、水とエタノールの混合液（水：エタノール＝  ５０：５０）を分散媒とする分散液を用いた。なお、試薬層３は、図７（ｃ）に示される実施例１と同様の工程（プロセスＡ）により形成した。
【００７３】
＜試験例１＞
測定対象となる試料液（グルコース溶液）として、グルコースを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させた溶液を調製した。なお、グルコースの濃度は、０、２．５、１４または４８ｍＭとした。
【００７４】
この試料液を、上記の実施例１、比較例１および比較例２で作製されたグルコースセンサのキャビティ内に供給し、サイクリックボルタンメトリー（走査速度：０．０５Ｖ／Ｓ）により、作用極と対極の間に流れる電流値を測定した
電流値の測定結果を、図１０に示す。なお、図１０の（ａ）〜（ｃ）がそれぞれ実施例１、比較例１および比較例２に対応する。
【００７５】
図１０に示されるように（特に電圧０．８Ｖの箇所を参照）、非凝集の多層ＣＮＴを用いた場合（比較例１）、および、凝集したＣＮＴを用いた場合（比較例２）は、グルコース濃度に依存した電気化学反応（電流）の発生が検出できなかった。これに対して、非凝集の単層ＣＮＴ（単層ＣＮＴおよび分散剤を含む試薬液）を用いた場合（実施例１）は、電流が検出された。
【００７６】
これは、図９（ｂ）および（ｃ）を参照して、ＦＡＤ−ＧＤＨ（酵素３３）の活性中心（２つの黒色三角印の間）が１ｎｍ前後の大きさであり、それより大きい粒子径を有する多層ＣＮＴ３１（図９（ｂ））または凝集した単層ＣＮＴ３１（図９（ｃ））を用いた場合（比較例１および２）は、ＣＮＴ３１が酵素３３の活性中心の中に入ることができず、ＣＮＴ３１が酵素３３と電子授受できないためであると推測される。一方、図９（ａ）を参照して、凝集していない単層ＣＮＴ３１を用いた場合（実施例１）は、ＣＮＴ１３が酵素３３の活性中心の中に入ることができ、ＣＮＴ３１が酵素３３と電子授受できると推測される。
【００７７】
［実施例２］
表１に示す７種類のＦＡＤ−ＧＤＨ（酵素番号１〜７）の各々を用いた点以外は、実施例１と同様の工程により、実施例２のグルコースセンサ（７種類）を作製した。なお、酵素番号１を用いた場合は、実施例１と重複するものである。ＦＡＤ−ＧＤＨの製造については、例えば、特開２０１５−１６７５０６号公報、特開２０１６−７１９１号公報、特開２０１６−７１９２号公報、特開２０１６−７１９３号公報が参照可能である。
【００７８】
［実施例３］
実施例１における試薬層の形成工程（プロセスＡ）の代わりに、上述のプロセスＢ（ＣＮＴ液より先に酵素液を塗布する工程：図１１（ｂ）参照）により試薬層を形成した以外は、実施例２と同様にして、実施例３のグルコースセンサ（７種類）を作製した。
【００７９】
［実施例４］
実施例１における試薬層の形成工程（プロセスＡ）の代わりに、上述のプロセスＣ（まずＣＮＴ液と酵素液とを混合した混合液を調製し、該混合液を電極２（親水性高分子膜２０）上に塗布する工程：図１１（ｃ）参照）により試薬層を形成した以外は、実施例２と同様にして、実施例４のグルコースセンサ（７種類）を作製した。
【００８０】
【表１】
2018033325.tif 000003
【００８１】
＜試験例２＞
測定対象となる試料液（グルコース溶液）として、グルコースを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させた溶液を調製した。なお、グルコースの濃度は、０、１４または４８ｍＭとした。
【００８２】
この試料液を、上記の実施例２〜４で作製されたグルコースセンサ（計２１種類）の各々のキャビティ内に供給し、試験例１と同様にサイクリックボルタンメトリーによる電流値の測定を行った。測定結果を図１２および図１３に示す。
【００８３】
また、図１２および図１３の測定結果について、センサ動作（電流の検出の有無）の評価結果を表１に示す。なお、表１の「センサ動作（電流検出）」の項において、「+」は、電流値が発生したことを意味し、「-」は、電流値が発生しなかったことを意味する。
【００８４】
表１、図１２および図１３に示される結果から、酵素液を滴下後に単層ＣＮＴ分散液を滴下した実施例３（プロセスＢ）、および、酵素液と単層ＣＮＴ分散液を混合し、その後当該混合液を滴下した実施例４（プロセスＣ）のグルコースセンサでは、全体的に見かけの分子量が大きい（糖鎖付加量が多い）ＦＡＤ−ＧＤＨほど、電流が安定的に検出できることが分かる。
【００８５】
特に、ＦＡＤ−ＧＤＨの分子量が９０万以上であると、プロセスＡおよびＢ（実施例２および３）のいずれの場合でも、ＣＮＴを介した酵素と電極間で直接電子伝達が担保されやすいと考えられる。
【００８６】
さらに、ＦＡＤ−ＧＤＨの分子量が１１０万以上であると、プロセスＡ、ＢおよびＣ（実施例２、３および４）のいずれの場合でも、ＣＮＴを介した酵素と電極間で直接電子伝達が担保されやすいと考えられる。
【００８７】
なお、プロセスＡで製造された実施例２、プロセスＢで製造された実施例３、プロセスＣで製造された実施例４の順に、電流が安定的に検出される傾向があると考えられる。このように電流が安定的に検出されることにより、高感度で正確なグルコースセンサを提供することができる。
【符号の説明】
【００８８】
１  絶縁性基板、２  電極、２０  親水性高分子膜、２１  作用極、２２  対極、３  試薬層、３１  ＣＮＴ、３２  分散剤、３３  酵素、４  スペーサ、４１  キャビティ、４１ｃ  入口、４２  切欠部、５  カバー、５ａ  空気孔、６  試料液。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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