(57)【要約】      （修正有）【課題】十分な発酵力を維持し且つ有機酸生成能に優れた酒酵母株の提供。【解決手段】酒酵母株について、そのＰＥＸ２２遺伝子を変異ＰＥＸ２２遺伝子に変異させる変異工程を含み、前記変異工程において、前記ＰＥＸ２２遺伝子における特定の配列の塩基配列で示される部分領域について、塩基ＮＮＮを、ストップコドンに変異させる有機酸生成酒酵母株の製造方法。好ましくは、前記塩基配列とは異なる、特定の塩基配列において、塩基配列ＮＮＮを、ストップコドンに更に変異させる、有機酸生成酒酵母株の製造方法。好ましくは、酒酵母株が清酒酵母株であり、前記方法を用いて有機酸生成酵母を作製し、作製した酒酵母を用いて、清酒を製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酒酵母株について、そのＰＥＸ２２遺伝子を変異ＰＥＸ２２遺伝子に変異させる変異工程を含み、
前記変異工程において、前記ＰＥＸ２２遺伝子における配列番号１の塩基配列で示される部分領域について、塩基ＮＮＮを、ストップコドンに変異させることを特徴とする、有機酸生成酒酵母株の製造方法。
【請求項２】
前記ＰＥＸ２２遺伝子は、配列番号２の塩基配列からなり、
前記配列番号２の塩基配列における塩基ＮＮＮを、ストップコドンに変異させる、請求項１記載の有機酸生成酒酵母株の製造方法。
【請求項３】
前記酒酵母株は、清酒酵母株である、請求項１または２記載の有機酸生成酒酵母株の製造方法。
【請求項４】
酒酵母株から有機酸生成酒酵母株を作製する作製工程、および
前記有機酸生成酒酵母株を用いて、清酒を製造する製造工程を含み、
前記作製工程は、請求項１から３のいずれか一項に記載の有機酸生成酒酵母株の製造方法により実施されることを特徴とする、清酒の製造方法。
【請求項５】
前記清酒を容器に充填する充填工程を含む、請求項４記載の清酒の製造方法。
【請求項６】
ＰＥＸ２２遺伝子における配列番号１の塩基配列で示される部分領域において、塩基ＮＮＮが、ストップコドンであることを特徴とする、変異ＰＥＸ２２遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機酸生成酒酵母株の製造方法、清酒の製造方法、および変異ＰＥＸ２２遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸味の強い爽やかな口当たりの清酒を製造するために、近年、有機酸を高生成する酒酵母の改良が行われている。しかしながら、報告されている自然変異法による酵母の改良は、有機酸を高生成できるものの、発酵力が不十分であり、結果として清酒が甘口に、あるいは、低アルコールになるという問題があった（非特許文献１）。また、どのような改良であれば、有機酸の高生成と発酵力の維持とを両立できるかも不明である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Matsuda et al., “Selection of yeasts for giving a good sour taste to sake and a sake brewing test”, Journal of the brewing society of Japan, 2010, Vol.105, No.1, p.39-48.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、十分な発酵力を維持し且つ有機酸生成能に優れる酒酵母株の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の有機酸生成酒酵母株の製造方法は、酒酵母株について、そのＰＥＸ２２遺伝子を変異ＰＥＸ２２遺伝子に変異させる変異工程を含み、
前記変異工程において、前記ＰＥＸ２２遺伝子における配列番号１の塩基配列で示される部分領域について、塩基ＮＮＮを、ストップコドンに変異させることを特徴とする。
【０００６】
本発明の清酒の製造方法は、酒酵母株から有機酸生成酒酵母株を作製する作製工程、および
前記有機酸生成酒酵母株を用いて、清酒を製造する製造工程を含み、
前記作製工程は、前記本発明の有機酸生成酒酵母株の製造方法により実施されることを特徴とする。
【０００７】
本発明の変異ＰＥＸ２２遺伝子は、ＰＥＸ２２遺伝子における配列番号１の塩基配列で示される部分領域において、塩基ＮＮＮが、ストップコドンであることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、十分な発酵力を維持し且つ有機酸生成能に優れる酒酵母株を製造できる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
＜有機酸生成酒酵母株の製造方法＞
本発明の有機酸生成酒酵母株の製造方法（以下、「酵母株の製造方法」ともいう）は、前述のように、酒酵母株について、そのＰＥＸ２２遺伝子を変異ＰＥＸ２２遺伝子に変異させる変異工程を含み、前記変異工程において、前記ＰＥＸ２２遺伝子における配列番号１の塩基配列で示される部分領域について、塩基ＮＮＮを、ストップコドンに変異させることを特徴とする。本発明の酵母株の製造方法は、前記変異工程において、前記酒酵母株のＰＥＸ２２遺伝子における配列番号１の塩基配列で示される部分領域について、塩基ＮＮＮを、ストップコドンに変異させることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、前記酒酵母株のＰＥＸ２２遺伝子における配列番号１の塩基配列で示される部分領域について、塩基ＮＮＮを、ストップコドンに変異させた変異ＰＥＸ２２遺伝子とすることにより、酒酵母株の有機酸の生成量を増大できることを見出し、本発明を完成させるに至った。このため、本発明は、例えば、ＰＥＸ２２遺伝子以外が同一である酵母（以下、「親株」ともいう）と比較した場合、発酵力を維持し且つより優れた有機酸生成能を示す酵母株を製造できる。つまり、本発明によれば、本来、有機酸生成能に劣る酵母株（親株）であっても、例えば、前述のように、前記ＰＥＸ２２遺伝子を前記変異ＰＥＸ２２遺伝子に変異させた変異酵母株とすることで、前記親株と比較して有機酸の生成量を増大でき、優れた有機酸生成能を付与することができる。
【００１１】
前記変異工程は、前述のように、酒酵母株について、そのＰＥＸ２２遺伝子を変異ＰＥＸ２２遺伝子に変異させる工程である。前記変異工程では、前記ＰＥＸ２２遺伝子における配列番号１の塩基配列で示される部分領域について、塩基ＮＮＮを、ストップコドンに変異させる。
【００１２】
前記酒酵母株は、特に制限されず、例えば、商品としての酒の製造に使用する酵母でもよいし、酒製造の実験に使用する酵母でもよい。具体例として、前記酒酵母は、例えば、清酒の製造または清酒製造の実験に使用する清酒酵母等があげられる。また、前記酒酵母の分類は、例えば、Saccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Candida属、Yarrowia属、Hansenula属、Kluyveromyces属等があげられ、好ましくはSaccharomyces属である。Saccharomyces属の中でも、例えば、Saccharomyces cerevisiaeが特に好ましい。前記酒酵母の具体例としては、例えば、Saccharomyces cerevisiaeに属しているものがあげられ、一倍体でも、二倍体でもよく、二倍体が好ましい。前記酒酵母株は、例えば、広義の意味で市販（契約酵母も含む）されているものでもよく、また、天然界から単離しても良い（例えば、特開2014-212782号公報）が、清酒酵母（清酒醸造用酵母）として市販されているものがより好ましい。前記清酒醸造用酵母として市販されているものは、例えば、日本醸造協会が販売している酵母（K-6、K-7、K-9、K-10、K-11、K-14、K-601、K-701、K-901、K-1001、K-1401、K-1501、K-1801、K-1601、K-1701、きょうかいNo.28、きょうかいNo.77等）、その他公的機関が開発した清酒醸造用酵母、例えば、青森県工業総合研究センター開発酵母（まほろば華酵母、イ号酵母・ロ号酵母等）等があげられる。前記清酒醸造用酵母は、例えば、前述のように入手し得る清酒醸造用酵母を直接用いてもよいし、自然変異等でさらに育種改良したもの（例えば、セルレニン耐性が付与され、吟醸香生産の高くなった清酒醸造用酵母等）を用いてもよく、具体例として、日本醸造協会が販売しているK-701（別名：きょうかい701号酵母）があげられる。前記清酒醸造用酵母は、コメを原料とした清酒の製造に使用できればよく、例えば、焼酎用の酵母等であってもよい。
【００１３】
本発明において、前記親株は、例えば、中でも、優れた有機酸生成能を示す変異酵母株の取得が困難であった二倍体清酒酵母であるＫ−７、またはその派生株である二倍体清酒酵母であるＫ−７０１、もしくはＫ−７０１をさらに変異原で処理し、育種改良した清酒酵母（例えば、5’,5’,5’-トリフルオロロイシン耐性が付与され、酢酸イソアミルの生成量が増大した清酒醸造用酵母）（以下、併せて、「Ｋ−７派生株」ともいう）を、親株として使用することが好ましい。本発明によれば、このような親株であっても、優れた有機酸生成能を有する変異酵母株を得ることができる。
【００１４】
前記酒酵母株は、例えば、前記ＰＥＸ２２遺伝子が欠失しておらず且つ前記変異ＰＥＸ２２遺伝子を有していないことが好ましい。具体例として、前記酒酵母株が一倍体の場合、前記酒酵母株は、例えば、前記ＰＥＸ２２遺伝子が欠失しておらず、且つ前記変異ＰＥＸ２２遺伝子を有していないことが好ましい。また、前記酒酵母株が二倍体の場合、前記酒酵母株は、例えば、２つのＰＥＸ２２遺伝子が欠失しておらず、且つ変異ＰＥＸ２２遺伝子をホモ接合で有していないこと、すなわち、２つのＰＥＸ２２遺伝子が欠失しておらず、且つＰＥＸ２２遺伝子をホモ接合で有する、またはＰＥＸ２２遺伝子および変異ＰＥＸ２２遺伝子をヘテロ接合で有することが好ましい。前記ＰＥＸ２２遺伝子の欠失は、例えば、前記ＰＥＸ２２遺伝子の機能欠損を意味し、具体例として、塩基の欠失もしくは挿入、またはこれらの組合せにより生じるフレームシフトによる機能的なＰＥＸ２２タンパク質の発現の欠失、前記ＰＥＸ２２遺伝子の部分または全塩基配列の欠失による機能的なＰＥＸ２２タンパク質の発現の欠失等があげられる。
【００１５】
前記ＰＥＸ２２遺伝子における部分領域は、下記配列番号１で示される塩基配列（例えば、下記配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド）である。下記配列番号１の塩基配列において、塩基ＮＮＮは、後述するストップコドン以外のコドンである。下記配列番号１の塩基配列において、各塩基Ｎは、例えば、前記塩基ＮＮＮがストップコドンとならない塩基であり、且つＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）、およびＣ（シトシン）のいずれかである。具体例として、前記ＮＮＮは、例えば、ＴＧＧである。
【００１６】
ＰＥＸ２２遺伝子における部分領域（配列番号１）
5’-GATGGATTANNNTCATGT-3’
【００１７】
前記変異ＰＥＸ２２遺伝子における部分領域は、前記配列番号１の塩基配列において、前記ＮＮＮが、ストップコドンである塩基配列である。前記ストップコドンは、特に制限されず、例えば、ＴＡＧ、ＴＡＡ、ＴＧＡ等があげられ、好ましくは、ＴＡＧである。
【００１８】
前記ＰＥＸ２２遺伝子は、例えば、Saccharomyces Genome Database、Genbank等公知のデータベースに登録された塩基配列を参照できる。前記ＰＥＸ２２遺伝子は、例えば、Saccharomyces Genome DatabaseにアクセッションＩＤ（SGD ID）：S000000051で登録された塩基配列、GenbankにアクセッションＮｏ：DG000037で登録された塩基配列等があげられる。具体例として、前記ＰＥＸ２２遺伝子は、例えば、下記配列番号２の塩基配列からなる（例えば、下記配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド）。下記配列番号２の塩基配列は、例えば、酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiae）のＰＥＸ２２遺伝子の全長配列に相当する。下記配列番号２の塩基配列において、下線で示す塩基配列が、前記ＰＥＸ２２遺伝子の部分領域に対応する塩基配列である。下記配列番号２の塩基配列における塩基ＮＮＮおよび塩基Ｎの説明は、例えば、それぞれ、前記配列番号１における塩基ＮＮＮおよび塩基Ｎの説明を援用できる。
【００１９】
ＰＥＸ２２遺伝子（配列番号２）
5’-ATGCCACCACCATCAAGAAGTAGAATAAACAAAACAAGAACATTAGGAATAATGGGTACAGCTATAGCAGTGTTGGTCACGTCCTACTATATATATCAAAAGGTGACAAGTGCAAAGGAAGATAATGGGGCACGACCTCCAGAGGGTGATTCAGTAAAAGAGAACAAAAAGGCAAGGAAGAGCAAATGTATTATAATGAGCAAGTCGATACAAGGACTGCCCATAAAGTGGGAGGAGTACGCCGCTGATGAAGTGGTTTTGCTGGTACCTACGAGCCACACTGATGGATCAATGAAACAAGCCATTGGGGATGCCTTTCGCAAGACGAAAAACGAACACAAAATCATATATTGCGATAGCATGGATGGATTANNNTCATGTGTAAGACGGCTAGGTAAATTTCAGTGCATATTGAACTCCAGGGACTTCACAAGTAGTGGTGGTAGCGATGCAGCAGTTGTTCCTGAAGATATAGGCAGGTTTGTCAAATTTGTTGTTGATAGCGATGTAGAGGATGTGCTGATTGACACTTTATGCAATTAA-3’
【００２０】
前記変異ＰＥＸ２２遺伝子は、前記配列番号２の塩基配列において、前記ＮＮＮが、ストップコドンである塩基配列である。前記ストップコドンは、特に制限されず、例えば、ＴＡＧ、ＴＡＡ、ＴＧＡ等があげられ、好ましくは、ＴＡＧである。
【００２１】
前記変異工程における前記変異の導入方法は、特に制限されず、例えば、遺伝子編集技術、遺伝子組換え技術、部位特異的突然変異誘発等の公知の遺伝子工学的手法により実施してもよいし、変異原等を用いる非遺伝子工学的手法により実施してもよい。前記変異の種類は、特に制限されず、例えば、塩基の欠失、置換、挿入、もしくは付加、またはこれらの組合せがあげられる。前記ＰＥＸ２２遺伝子は、例えば、ＰＥＸ２２遺伝子座に座乗する。このため、前記変異工程では、例えば、前記ＰＥＸ２２遺伝子座に座乗するＰＥＸ２２遺伝子に対して変異を導入する（以下、同様）。前記変異ＰＥＸ２２遺伝子により付与される形質、すなわち、有機酸の生成量の増大は、例えば、劣性形質である。このため、前記親株が一倍体の場合、前記変異工程では、例えば、１つのＰＥＸ２２遺伝子を変異ＰＥＸ２２遺伝子に変異させる。また、前記親株が二倍体であり、２つのＰＥＸ２２遺伝子を有する場合、前記変異工程では、例えば、２つのＰＥＸ２２遺伝子を、２つの変異ＰＥＸ２２遺伝子に変異させる、すなわち、前記変異ＰＥＸ２２遺伝子のホモ接合となるように変異させる。さらに、前記親株が二倍体であり、前記ＰＥＸ２２遺伝子および前記変異ＰＥＸ２２遺伝子をヘテロ接合で有する場合、前記変異工程では、１つのＰＥＸ２２遺伝子を変異ＰＥＸ２２遺伝子に変異させること、すなわち、前記変異ＰＥＸ２２遺伝子のホモ接合となるように変異させることが好ましい。
【００２２】
前記変異工程は、例えば、前記ＰＥＸ２２遺伝子に変異を導入する変異導入工程と、前記ＰＥＸ２２遺伝子における配列番号１の塩基配列で示される部分領域について、塩基ＮＮＮが、ストップコドンである酒酵母株を、有機酸生成酒酵母株として選抜する選抜工程とを含む。前記ＰＥＸ２２遺伝子が前記配列番号２の塩基配列からなる場合、前記選抜工程では、例えば、前記配列番号２の塩基配列における塩基ＮＮＮが、ストップコドンである酒酵母株を、前記有機酸生成酒酵母株として選抜してもよい。
【００２３】
前記変異導入工程は、前記ＰＥＸ２２遺伝子に変異を導入する工程である。前記変異導入工程における変異の導入方法は、例えば、前記変異工程における変異の導入方法の説明を援用できる。前記親株が一倍体の場合、前記変異導入工程では、例えば、１つのＰＥＸ２２遺伝子に変異を導入する。また、前記親株が二倍体であり、２つのＰＥＸ２２遺伝子を有する場合、前記変異導入工程では、例えば、２つのＰＥＸ２２遺伝子に変異を導入する。さらに、前記親株が二倍体であり、前記ＰＥＸ２２遺伝子および前記変異ＰＥＸ２２遺伝子をヘテロ接合で有する場合、前記変異導入工程では、例えば、１つのＰＥＸ２２遺伝子に変異を導入する、または、前記ＰＥＸ２２遺伝子および前記変異ＰＥＸ２２遺伝子に変異を導入する。
【００２４】
つぎに、前記選抜工程では、前記ＰＥＸ２２遺伝子における配列番号１の塩基配列で示される部分領域について、塩基ＮＮＮが、ストップコドンである酒酵母株を、有機酸生成酒酵母株として選抜する工程である。前記選抜工程では、例えば、変異が導入された親株について、ＰＥＸ２２遺伝子における部分領域の塩基配列に対応する塩基配列を解読する。そして、前記部分領域の塩基配列に対応する塩基配列における塩基ＮＮＮが、例えば、ストップコドンであるか否かを確認することにより実施できる。具体的には、前記親株が一倍体の場合、例えば、１つのＰＥＸ２２遺伝子における配列番号１の塩基配列で示される部分領域の塩基配列と対応する塩基配列について、塩基ＮＮＮが、ストップコドンである酵母株を、有機酸生成酒酵母株として選抜する。また、前記親株が二倍体である場合、例えば、２つのＰＥＸ２２遺伝子における配列番号１の塩基配列で示される部分領域の塩基配列と対応する塩基配列について、塩基ＮＮＮが、両者ともストップコドンである酵母株を有機酸生成酒酵母株として選抜する。
【００２５】
また、前記選抜工程は、例えば、前記ＰＥＸ２２遺伝子の部分領域に代えて、前記ＰＥＸ２２遺伝子の全領域、すなわち、前記配列番号２の塩基配列における塩基ＮＮＮに基づき、選抜してもよい。この場合、前記選抜工程では、例えば、変異が導入された親株について、ＰＥＸ２２遺伝子における全領域、すなわち、配列番号２の塩基配列に対応する塩基配列を解読する。そして、前記配列番号２の塩基配列に対応する塩基配列における前記塩基ＮＮＮが、例えば、ストップコドンであるか否かを確認することにより実施できる。具体的には、前記親株が一倍体の場合、例えば、１つの配列番号２の塩基配列に対応する塩基配列における塩基ＮＮＮが、ストップコドンである酵母株を、有機酸生成酒酵母株として選抜する。また、前記親株が二倍体である場合、例えば、２つの配列番号２の塩基配列に対応する塩基配列における塩基ＮＮＮが、両者ともストップコドンである酵母株を有機酸生成酒酵母株として選抜する。
【００２６】
以上のようにして、有機酸生成酒酵母株を製造できる。
【００２７】
前記有機酸生成酒酵母株において、生成量が増大される有機酸は、特に制限されず、例えば、生成される有機酸の合計量が、前記親株と比較して、増大されてもよいし、生成される有機酸のうち、一部の有機酸の生成量が、前記親株と比較して、増大されてもよい。具体的に、前記親株と比較して生成量が増大される有機酸は、例えば、リンゴ酸である。また、前記親株と比較して生成量が増大される有機酸は、例えば、コハク酸を含んでもよい。前記親株と比較して生成量が増大される有機酸は、例えば、酢酸を除く。前記リンゴ酸の生成量の増大割合の下限は、特に制限されず、前記親株の生成量に対して、例えば、１．５倍以上、１．８倍以上、２倍以上、３倍以上である。前記リンゴ酸の生成量の増大割合の上限は、特に制限されず、前記親株の生成量に対して、例えば、１０倍以下、８倍以下、６倍以下、５．５倍以下である。前記リンゴ酸の生成量の増大割合の範囲は、特に制限されず、前記親株の生成量に対して、例えば、１．５〜１０倍、１．８〜６倍、２〜５.５倍である。前記親株として、Ｋ−７派生株を用いる場合、前記リンゴ酸の生成量の増大割合の範囲は、特に制限されず、前記親株の生成量に対して、例えば、３〜１０倍、３〜６倍、３〜５.５倍である。前記コハク酸の生成量の変化割合は、特に制限されないが、前記親株の生成量に対して、同程度であってもよく、例えば、０．９〜２倍、０．９５〜１．８倍、０．９５〜１．７倍である。
【００２８】
前記有機酸生成酒酵母株において、例えば、リンゴ酸およびコハク酸以外の有機酸であり、且つ有機酸生成酵母において生成される各種有機酸（例えば、αケトグルタル酸、クエン酸、ピルビン酸、乳酸、フマル酸、ピログルタミン酸）は、例えば、前記親株と比較した場合、その生成量が増大されてもよいし、同程度でもよい。
【００２９】
前記有機酸生成酒酵母株において、エタノールの生成量の下限は、特に制限されず、前記親株の生成量に対して、例えば、０．９倍以上、０．９１倍以上、０．９３倍以上、０．９４倍以上である。前記エタノールの生成量の上限は、特に制限されず、前記親株の生成量に対して、例えば、１．２倍以下、０．９８倍以下、０．９７倍以下である。前記エタノールの生成量の範囲は、特に制限されず、前記親株の生成量に対して、例えば、０．９〜１．２倍、０．９４〜０．９７倍である。
【００３０】
前記有機酸生成酒酵母株は、優れた有機酸生成能を有するため、これを使用することで、例えば、前記親株を使用するよりも、高含量の有機酸を含む発酵産物を得ることができる。
【００３１】
前記発酵産物の種類は、特に制限されず、例えば、原料の種類によって種々の発酵産物を得ることができる。前記原料としては、例えば、コメ類、ムギ類等の穀類、芋類、マメ類等の野菜、ブドウ類等の果実等が原料としてあげられる。前記発酵産物としては、例えば、コメ類を用いた清酒、各種原料を用いた焼酎、ビール、ワイン、原料の一部にコメ等の副原料を用いたビール様飲料（発泡酒、リキュール等）、果実酒、その他酒税法で雑酒に分類される醸造飲料等があげられる。
【００３２】
なお、本発明の酒酵母株の製造方法では、ＰＥＸ２２遺伝子に基づき、有機酸生成酒酵母株を製造したが、例えば、前記有機酸生成酒酵母株は、例えば、後述する本発明の有機酸生成酒酵母株のスクリーニング方法（以下、「スクリーニング方法」ともいう）により製造することもできる。
【００３３】
＜第１の清酒の製造方法＞
本発明の第１の清酒の製造方法（以下、「第１の製造方法」ともいう）は、前述のように、酒酵母株から有機酸生成酒酵母株を作製する作製工程、および前記有機酸生成酒酵母株を用いて、清酒を製造する製造工程を含み、前記作製工程は、前記本発明の有機酸生成酒酵母株の製造方法により実施されることを特徴とする。本発明の第１の製造方法は、前記作製工程が、前記本発明の酒酵母株の製造方法により実施されることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の第１の製造方法は、例えば、前記本発明の酒酵母株の製造方法の説明を援用できる。本発明の第１の製造方法によれば、例えば、前記変異工程で得られた有機酸生成酒酵母株を使用することによって、親株で清酒を製造した場合と比較して、清酒の有機酸の含有量を増大できる。
【００３４】
本発明において、清酒は、例えば、アルコールを含むコメ類の発酵液でもよいが、好ましくは、日本国の酒税法（以下、「酒税法」ともいう）で定義される合成清酒または清酒であることが好ましく、酒税法で定義される清酒であることがより好ましい。前記アルコールは、例えば、エタノールである。
【００３５】
前記作製工程は、酒酵母株から有機酸生成酒酵母株を作製する工程である。前記作製工程は、例えば、前記本発明の酒酵母株の製造方法の説明を援用できる。本発明の第１の製造方法は、例えば、前記作製工程で得られた有機酸生成酒酵母株をすぐに前記製造工程に用いてもよいし、前記有機酸生成酒酵母株を保存し、保存後の有機酸生成酒酵母株を前記製造工程に用いてもよい。また、前記有機酸生成酒酵母株を増殖させた後、増殖後の有機酸生成酒酵母株を前記製造工程に用いてもよい。
【００３６】
前記製造工程は、前記有機酸生成酒酵母株を用いて、清酒を製造する工程である。前記製造工程は、例えば、前記有機酸生成酒酵母株により、原料を発酵させる発酵工程を含む。前記原料は、例えば、コメ類である。前記発酵の条件は、特に制限されず、例えば、従来の酵母による発酵条件と同様の条件を採用できる。前記製造工程では、さらに、有機酸生成酒酵母株以外の酒酵母株を用いてもよい。前記有機酸生成酒酵母株以外の酒酵母株は、例えば、前述の清酒醸造用酵母の説明が援用でき、好ましくは、5’,5’,5’-トリフルオロロイシン耐性が付与され、酢酸イソアミルの生成量が増大した清酒醸造用酵母である。このように、複数の酒酵母株を用いることにより、混合醸造を実施できる。
【００３７】
前記製造工程は、例えば、前記清酒を混合する工程を含んでもよい。前記清酒の混合は、例えば、異なる酒酵母株を用いて製造（醸造）したそれぞれの清酒を混合することを意味するが、前述の複数の酒酵母株を併用して製造（混合醸造）することを意味してもよい。前記清酒の混合の時期は、特に制限されず、例えば、醪を上槽する前に混合してもよいし、上槽後に混合してもよい。前記清酒の混合の割合は、特に制限されず、前記有機酸生成酒酵母株で製造した清酒と、他の清酒との総量を１００％とした場合、前記有機酸生成酒酵母株で製造した清酒の割合の下限は、例えば、０．０１％、０．０３％、０．１％、０．３％、１％、３％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％である。前記有機酸生成酒酵母株で製造した清酒の割合は、例えば、前記下限値の例示における２つの数値を両端とする数値範囲を満たしてもよい。また、前記清酒の混合が混合醸造の場合、醸造開始時の前記有機酸生成酒酵母株と、前記有機酸生成酒酵母株以外の酒酵母株の植菌（接種）割合を、前記清酒の混合の割合を満たすように、設定してもよい。
【００３８】
前記製造工程は、例えば、前記原料の発酵で得られた醪を上糟する上糟工程を含む。前記上糟の条件は、特に制限されず、例えば、一般的な清酒の製造における上糟の条件と同様の条件を採用できる。
【００３９】
前記製造工程は、例えば、前記上糟後の清酒について、火入れ（加熱処理）する火入れ工程を含んでもよい。前記加熱処理の条件は、特に制限されず、例えば、一般的な清酒の製造における加熱処理の条件と同様の条件を採用できる。前記火入れ工程は、例えば、前記上糟工程後、後述する容器詰め工程前等に実施する。前記火入れの回数は、特に制限されず、例えば、１回以上であり、具体例として、１回または２回である。前記容器詰め工程前のみに火入れを１回のみ行ったものは、例えば、「生貯蔵酒」、前記上槽工程後に火入れを１回のみおこなったものは、例えば、「生詰め」（ひやおろし）ということができる（酒税法にかかる清酒の製法品質表示基準（平成元年１１月２２日付国税庁告示第８号、改正  平成２９年  国税庁告示第４号））。また、前記製造工程において、前記火入れ工程を実施しない場合、前記清酒は、例えば、「生酒」ということができる（前記酒税法にかかる清酒の製法品質表示基準）。
【００４０】
前記製造工程後の清酒は、例えば、吟醸香として知られている成分である酢酸イソアミルを含む。前記製造工程後の清酒における酢酸イソアミルの濃度の下限値は、特に制限されず、例えば、０．０３、０．１、０．３、１、３、５、１０、２０、３０、５０、１００ｍｇ／Ｌである。前記酢酸イソアミルの濃度は、例えば、前記下限値の例示における２つの数値を両端とする数値範囲を満たしてもよい。前記製造工程後の清酒における酢酸イソアミルの濃度は、例えば、前記酒酵母株の種類を変更することにより、具体的には、酢酸イソアミルの生成能が異なる酒酵母株を用いることにより、調整できる。
【００４１】
本発明の第１の製造方法は、さらに、前記清酒を容器に充填する充填工程を含むことが好ましい。本発明の第１の製造方法が前記充填工程を含む場合、容器詰めされた清酒を製造することができる。このため、本発明の第１の製造方法は、例えば、「容器詰め清酒の製造方法」ということもできる。前記容器は、特に制限されず、例えば、ガラス瓶、ガラス製コップ等のガラス容器；アルミ缶等の金属容器；凸版印刷社製清酒用紙パック容器、大日本印刷社製の清酒用紙パック容器等のアルコール飲料用紙パック；凸版印刷社製パウチ容器またはボトル容器、大日本印刷社製パウチ容器またはボトル容器等の複合プラスチック容器等があげられる。前記容器には、例えば、前述の「生酒」、「生貯蔵酒」、または「ひやおろし」等が表示されてもよい。そして、前記容器への充填後、例えば、前記容器の開口を封止することにより密封する。
【００４２】
このようにして、清酒を製造できる。
【００４３】
＜有機酸生成酒酵母株＞
本発明の有機酸生成酒酵母株は、そのＰＥＸ２２遺伝子における配列番号１の塩基配列で示される部分領域について、塩基ＮＮＮがストップコドンである変異ＰＥＸ２２遺伝子を含むことを特徴とする。本発明の有機酸生成酒酵母株は、そのＰＥＸ２２遺伝子における配列番号１の塩基配列で示される部分領域について、塩基ＮＮＮがストップコドンである変異ＰＥＸ２２遺伝子を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の有機酸生成酒酵母株は、例えば、ＰＥＸ２２遺伝子以外が同一である酵母と比較した場合、発酵力を維持し且つより優れた有機酸生成能を示す。本発明の有機酸生成酒酵母株は、例えば、前記本発明の酒酵母株の製造方法または後述の本発明のスクリーニング方法により製造できる。本発明の有機酸生成酒酵母株は、例えば、前記本発明の酒酵母株の製造方法、第１の製造方法およびスクリーニング方法の説明を援用できる。
【００４４】
前記変異ＰＥＸ２２遺伝子は、例えば、前記配列番号１の塩基配列からなり、且つ前記配列番号１の塩基配列における塩基ＮＮＮが、ストップコドンであるポリヌクレオチドということもできる。
【００４５】
本発明において、前記変異ＰＥＸ２２遺伝子は、例えば、配列番号２の塩基配列からなり且つ前記配列番号２の塩基配列における塩基ＮＮＮが、ストップコドンであるポリヌクレオチドであってもよい。
【００４６】
本発明の有機酸生成酒酵母株において、例えば、前記変異ＰＥＸ２２遺伝子は、そのＰＥＸ２２遺伝子が、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドからなる変異ＰＥＸ２２タンパク質をコードする変異ＰＥＸ２２遺伝子であってもよい。
【００４７】
変異ＰＥＸ２２タンパク質（配列番号３）
MPPPSRSRINKTRTLGIMGTAIAVLVTSYYIYQKVTSAKEDNGARPPEGDSVKENKKARKSKCIIMSKSIQGLPIKWEEYAADEVVLLVPTSHTDGSMKQAIGDAFRKTKNEHKIIYCDSMDGL
【００４８】
本発明の有機酸生成酒酵母株が一倍体の場合、前記有機酸生成酒酵母株は、例えば、１つの変異ＰＥＸ２２遺伝子を有する。また、本発明の有機酸生成酒酵母株が二倍体の場合、前記有機酸生成酒酵母株は、例えば、２つの変異ＰＥＸ２２遺伝子を有する、すなわち、未変異（野生型）のＰＥＸ２２遺伝子を有さない。
【００４９】
＜第２の清酒の製造方法＞
本発明の第２の清酒の製造方法（以下、「第２の製造方法」ともいう）は、前記本発明の有機酸生成酒酵母株を用いて、清酒を製造する製造工程を含むことを特徴とする。本発明の第２の清酒の製造方法は、前記本発明の有機酸生成酒酵母株を用いることが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の第２の製造方法は、前記本発明の有機酸生成酒酵母株を使用することによって、親株で清酒を製造した場合と比較して、清酒の有機酸の含有量を増大できる。本発明の第２の製造方法は、例えば、前記本発明の酒酵母株の製造方法、第１の製造方法および有機酸生成酒酵母株の説明を援用できる。
【００５０】
本発明の第２の製造方法は、例えば、前記本発明の有機酸生成酒酵母株により、原料を発酵させる工程を含む。前記原料は、例えば、コメ類であり、発酵の条件は、特に制限されず、従来の酵母による発酵条件と同様の条件が採用できる。前記製造工程は、例えば、前記本発明の第１の製造方法における製造工程の説明を援用できる。また、本発明の第２の製造方法は、例えば、前述の充填工程を含んでもよい。
【００５１】
＜有機酸生成酒酵母株のスクリーニング方法＞
本発明の有機酸生成酒酵母株のスクリーニング方法は、酒酵母株を、生存率０．０１〜９０％となるように変異原を用いて処理する変異工程と、
前記変異処理後の酒酵母株から、下記条件（１）および（２）を満たす酒酵母株を、有機酸生成酒酵母株として選択する選択工程とを含むことを特徴とする。
（１）変異原を用いて処理する前と比較して、アルコール生成量が０．９〜１．２倍である。
（２）変異原を用いて処理する前と比較して、リンゴ酸生成量が１．５〜１０倍である。
【００５２】
本発明のスクリーニング方法によれば、前記変異処理を施す前の酵母株（以下、「親株」ともいう）と比較して、十分な発酵力を維持し且つ有機酸生成能に優れる酒酵母株、すなわち、本発明の有機酸生成酒酵母株を得ることができる。本発明の有機酸生成酒酵母株が得られることから、例えば、有機酸生成酒酵母株の製造方法ということもできる。
【００５３】
前記変異工程において、前記変異原は、例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、アクリジン系色素等があげられ、好ましくは、ＥＭＳである。また、前記変異は、例えば、ＵＶ照射、各種イオンビーム、各種放射線照射等によって、誘発してもよい。
【００５４】
前記変異工程において、前記変異原による変異処理の方法は、特に制限されず、例えば、前記変異原の存在下で、前記親株をインキュベートすればよく、具体的には、前記変異原を含有する溶媒中で、前記親株をインキュベートすればよい。前記溶媒の種類は、特に制限されず、例えば、緩衝液、培地等があげられる。前記溶媒中の前記変異原の濃度は、特に制限されず、例えば、０．１％〜１０％である。前記変異処理の条件は、特に制限されず、処理温度は、例えば、４〜５０℃であり、処理時間は、例えば、０．５〜３６０分である。
【００５５】
前記変異工程においては、生存率は、０．０１〜９０％に設定し、好ましくは、０．０１〜５０％、０．１〜４０％、０．５〜４０％、１〜３０％、５〜３０％に設定する。前記生存率を前記範囲に設定する方法は、特に制限されず、例えば、変異処理の時間によって調整してもよいし、前記変異原の量によって調整してもよいし、処理温度によって調整してもよく、中でも、経時変化により、生存率をモニターすることが好ましい。
【００５６】
本発明における前記生存率とは、前記変異処理に供する全親株のうち、前記変異処理後にも生存する親株の割合を意味する。本発明においては、例えば、以下の方法により、前記生存率を算出できる。まず、親株の混合液を準備し、前記混合液のうち所定量Ｙを下記培養条件Ａで培養し、得られた生存コロニー数Ｘ０を１００％とする。そして、前記混合液のうち同量Ｙについて、前記変異処理を施した後、同じ培養条件Ａで培養し、得られた生存コロニー数Ｘ１の割合（１００×［Ｘ１／Ｘ０］）を、生存率％とする。前記培養条件は、例えば、以下の通りである。
培地：ＹＰＤ寒天培地、ＹＰＤ培地に相当する栄養源豊富な培地、ＹＭ寒天培地（独立行政法人製品評価技術基盤機構推奨培地、http://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/cultures/cultures.html：平成２７年７月１４日付）
培養温度：３０℃前後（例えば、２５℃±７℃）
培養時間：数日間（例えば、１〜１０日間）
培養方法：静置培養
生存率の調整方法：ＥＭＳ処理中に、前記混合液から数分ごとにサンプリングし、前記条件で培養を行い、目的となる生存率のものを選択する。
【００５７】
生存率の測定において、前記変異処理後の親株は、例えば、洗浄処理を施した後、培養を行うことが好ましい。前記洗浄方法は、特に制限されず、例えば、滅菌水等の滅菌溶媒で洗浄する方法があげられる。
【００５８】
前記変異処理工程後、前記変異処理した酒酵母株（親株）を培養し、生存した酒酵母株を採取する工程を含んでもよい。前記培養の方法および条件は、特に制限されないが、例えば、前述した生存率の測定方法における培養の方法および条件が例示できる。また、前記変異処理した親株は、例えば、前記培養に先立って、例えば、滅菌水等の滅菌溶媒で洗浄することが好ましい。
【００５９】
前記選択工程は、前記変異工程によって得られた酒酵母株から、前記条件（１）および（２）を満たす酒酵母株を選択する工程である。前記変異工程によって得られた酒酵母株とは、例えば、前記変異処理した親株のうち、前記変異処理後の培養によって生存を示した酒酵母株である（以下、変異酵母株ともいう）。
【００６０】
前記変異酵母株からの前記条件（１）および（２）の条件を満たす酒酵母株の選択は、例えば、以下のようにして行うことができる。すなわち、まず、前記変異処理を施す前の前記親株について、所定の条件下、コメ原料のアルコール発酵を行い、得られた発酵産物中のアルコールおよびリンゴ酸を測定する。そして、前記変異処理によって得られた前記変異酵母株について、同様の条件でアルコール発酵を行い、得られた発酵産物中のアルコールおよびリンゴ酸を測定する。そして、前記親株を用いた発酵産物中のアルコールおよびリンゴ酸の生成量と、前記変異酵母株を用いた発酵産物中のアルコールおよびリンゴ酸の生成量とを比較する。そして、前記条件（１）および（２）を満たす変異酵母株を、本発明の有機酸生成酒酵母株として選択することができる。前記アルコールとは、例えば、エタノールである。前記アルコールの生成量およびリンゴ酸の生成量は、例えば、それぞれ、前述のエタノールの生成量およびリンゴ酸の生成量の増大割合の説明を援用できる。
【００６１】
前記選択工程では、例えば、さらに、下記（３）を満たす酒酵母株を、有機酸生成酒酵母株として選択してもよい。
（３）変異原を用いて処理する前と比較して、コハク酸生成量が０．９〜２倍である。
【００６２】
前記変異酵母株からの前記条件（３）の条件を満たす酒酵母株の選択は、例えば、以下のようにして行なうことができる。すなわち、まず、前記条件（１）および（２）を満たす酒酵母株の選択と同様の条件において得られた発酵産物中のコハク酸を測定し、前記親株を用いた発酵産物中のコハク酸と、前記変異酵母株を用いた発酵産物中のコハク酸とを比較する。そして、前記条件（１）および（２）に加え、条件（３）を満たす変異酵母株を、本発明の有機酸生成酒酵母株として選択することができる。前記コハク酸の生成量は、例えば、前述のコハク酸の生成量の変化割合の説明を援用できる。
【００６３】
本発明において、前記有機酸生成酒酵母株の選択は、前記親株を使用した生成量に対する前記変異処理株を使用した生成量の倍率により判断できることから、前記親株と前記変異処理株とにおける前記アルコール発酵は、例えば、同条件であればよく、その方法は、特に制限されない。
【００６４】
前記コメ原料のアルコール発酵は、例えば、コメを含む仕込み液を使用できる。前記仕込み液は、例えば、１トンスケール程度の大型仕込みでも、小仕込みでもよく、前記小仕込みで調製されていることが好ましい。
【００６５】
前記小仕込みは、特に制限されず、例えば、一段仕込みでもよく、三段仕込みでもよい。また、前記仕込みに使用するコメの総量、すなわち総米は、例えば、１０ｇから１ｋｇ程度が例示できる。使用するコメの種類は、特に制限されず、例えば、酒造好適米でもよいし、コシヒカリ等の飯米等でもよい。また、前記コメの精米歩合は、特に制限されず、例えば、６０〜８５％である。また、前記仕込み液の調製においては、例えば、乳酸を仕込み時に添加することが好ましい。仕込み時には、例えば、前記総米に、掛米、麹米、汲水、乳酸および酵母を加えて、発酵を開始することが好ましい。
【００６６】
前記仕込み液に対する被検酵母株（前記変異処理株または前記親株）の添加量は、特に制限されず、例えば、前記仕込み液中の最終濃度が、１０の６乗〜１０の７乗ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度であればよい。
【００６７】
前記アルコール発酵の発酵工程は、例えば、温度一定で管理してもよいし、適宜温度調整してもよく、具体例として、例えば、４℃〜２０℃で温度調整を行うことが好ましい。発酵期間は、特に限定されず、例えば、１０日〜２５日程度が好ましい。
【００６８】
前記発酵産物中のアルコール、有機酸（リンゴ酸およびコハク酸）の生成量の測定方法および発酵経過に伴う炭酸ガスの生成量の測定は、特に制限されず、従来の方法や機器が使用できる。前記機器としては、アルコール生成量の測定には、例えば、市販のアルコール濃度計（例えば、商品名アルコメイトＡＬ−３、ウッドソン社）等が使用でき、前記有機酸生成量の測定には、例えば、汎用ＨＰＬＣ、具体的には、例えば、汎用ＨＰＬＣシステム（例えば、商品名ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎで制御されたＨＰＬＣシステム、島津製作所社製）が使用でき、前記炭酸ガス生成量の測定には、例えば、ガス発生量自動計測装置（例えば、商品名ファーモグラフ、アトー社製）等があげられる。前記アルコール発酵の終了後、前記発酵産物におけるアルコール（例えば、エタノール）、日本酒度、酸度、アミノ酸度は、例えば、市販の汎用機器を用いて測定することができ、具体例として、国税庁が定める所定分析法（国税庁訓令第１号、改正平１９国税庁訓令第６号、http://www.nta.go.jp/shiraberu/zeiho-kaishaku/tsutatsu/kobetsu/sonota/kaisei070622/01.pdf：平成２７年７月１５日付）に従うことが好ましく、また、それに準じた方法でもよい。
【００６９】
＜変異ＰＥＸ２２遺伝子＞
本発明の変異ＰＥＸ２２遺伝子は、前述のように、ＰＥＸ２２遺伝子における配列番号１の塩基配列で示される部分領域において、塩基ＮＮＮが、ストップコドンであることを特徴とする。本発明の変異ＰＥＸ２２遺伝子は、前記ＰＥＸ２２遺伝子における配列番号１の塩基配列で示される部分領域において、塩基ＮＮＮが、ストップコドンであることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の変異ＰＥＸ２２遺伝子は、例えば、前記本発明の酒酵母株の製造方法、第１の製造方法、有機酸生成酒酵母株、第２の製造方法、およびスクリーニング方法の説明を援用できる。
【００７０】
本発明において、前記変異ＰＥＸ２２遺伝子は、例えば、配列番号２の塩基配列からなり、塩基ＮＮＮが、ストップコドンであることが好ましい。
【００７１】
＜変異ＰＥＸ２２タンパク質＞
本発明の変異ＰＥＸ２２タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする。本発明の変異ＰＥＸ２２タンパク質は、前記配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドであることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の変異ＰＥＸ２２タンパク質は、本発明の有機酸生成酒酵母株の説明を援用できる。
【実施例】
【００７２】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、以下の実施例により何ら制限されない。
【００７３】
［実施例１］
本発明の有機酸生成酒酵母株が、親株と比較して、優れた有機酸生成能を有することを確認した。
【００７４】
（１）変異型酵母株の取得
清酒醸造用酵母Ｋ−７０１を親株として使用した。変異型酵母株は、下記参考文献を参照し、取得した。具体的には、５重量％  ＥＭＳ含有カリウムリン酸緩衝液にＫ−７０１を懸濁し、撹拌しながら３０℃で６０分間インキュベートして変異処理を実施した。前記変異処理後の親株（以下、「第１変異処理株」という）を、１ｍｍｏｌ／Ｌ  5’,5’,5’-トリフルオロロイシン存在下、ＹＮＢ寒天培地（０．６７％Difco yeast nitrogen base、２％グルコース、２％寒天）で生育および選抜することにより、5’,5’,5’-トリフルオロロイシン耐性が付与され、Ｋ−７０１と同等以上のエタノール産生能を示し、Ｋ−７０１と比較して、酢酸イソアミルの生成量が増大した酒酵母株（以下、「Ｆ−１９株」ともいう）が得られた。
参考文献：Shinzo ASHIDA et.al., “Isolation and Application of Mutant Producing Sufficient Isoamyl Acetate, a Sake Flaovr Component”, Argic. Biol. Chem, 1987, vol.51, No.8, pages 2061-2065
【００７５】
つぎに、３重量％  ＥＭＳ含有カリウムリン酸緩衝液にＦ−１９株を懸濁し、処理後の生存率が２０−３０％となるように、変異処理を実施した。前記変異処理後の親株（以下、「第２変異処理株」という）のうち生存した約８０００株を選抜し、小仕込み試験を行い、親株よりも多酸性を示し、さらに、親株と同程度以上のエタノール生成能を示す４株を選抜した（試験例１）。
【００７６】
前記試験例１で得られた多酸性かつエタノール生産に優れる４株を、さらに総米２００ｇの小仕込み試験に供し、１株選抜して、これをＦ−１９Ｈとした。なお、Ｆ−１９Ｈの発酵経過をファーモグラフィで測定したところ良好であった。
【００７７】
つぎに、得られたＦ−１９Ｈと親株であるＦ−１９との比較を行った。比較は、総米２００ｇの小仕込み試験により行った。前記小仕込み試験は、使用した株が異なる以外、掛米量、酒酵母株の最終濃度、発酵温度（１５℃一定）等、全て同じ条件とした。前記小仕込み試験において、仕込み液の発酵経過をファーモグラフィで測定したところ、Ｆ−１９ＨとＦ−１９との間において、発酵経過の遅延等の差異は見られなかった。つまり、Ｆ−１９Ｈは、親株Ｆ−１９と同様の発酵力であることがわかった。
【００７８】
下記表１に、前記仕込み試験の結果、すなわち、前記仕込み開始から１５日経過時の発酵産物における各測定項目の結果を示す。測定した項目は、エタノール、酸度、アミノ酸度、リンゴ酸、コハク酸、酢酸イソアミル、およびその他各種有機酸（αケトグルタル酸、クエン酸、ピルビン酸、乳酸、ピログルタミン酸等）である。
【００７９】
【表１】
2018186759.tif 000002
【００８０】
前記表１に示すように、Ｆ−１９Ｈによれば、アルコール生成量に関して、Ｆ−１９の０．９６倍であり、Ｆ−１９と同等のアルコール生成量（エタノール生成量）を維持していた。また、前記アルコール発酵の過程において、経時的に炭酸ガスの発生量と炭酸ガスの発生速度を確認した結果、Ｆ−１９Ｈは、Ｆ−１９と同様の挙動を示した。そして、Ｆ−１９Ｈは、リンゴ酸生成量に関しては、親株の約５．４倍であった。つまり、取得した変異酵母株Ｆ−１９Ｈは、前記条件（１）および条件（２）を満たすことが確認できた。さらに、Ｆ−１９Ｈの酸度は、Ｆ−１９と比較して、１．５５倍であった。これらの結果から、本発明の有機酸生成酒酵母株が、親株と同程度の発酵能を維持しつつ、且つ、親株よりも優れた有機酸生成能を有することがわかった。
【００８１】
（２）Ｆ−１９Ｈの遺伝子解析
Ｆ−１９Ｈは、Ｆ−１９と異なり優れた有機酸生成能を有することから、Ｆ−１９Ｈについて、この特性に対応する遺伝子変異の解析を行った。その結果、Ｆ−１９Ｈは、Ｋ−７０１と比較して、複数の変異を有していた。そのうちの１つは、Ｋ−７０１が、配列番号２の塩基配列における塩基ＮＮＮが、ＴＧＧであるＰＥＸ２２遺伝子をホモ接合で有するのに対し、Ｆ−１９Ｈが、配列番号２の塩基配列における塩基ＮＮＮが、ＴＡＧ（ストップコドン）である変異ＰＥＸ２２遺伝子をホモ接合で有しているという変異であった。すなわち、Ｆ−１９Ｈでは、２つのＰＥＸ２２遺伝子について、その３７４番目の塩基がＧからＡに変異する点変異が生じていた。なお、Ｆ−１９についても、ＰＥＸ２２遺伝子の塩基配列を調べたところ、Ｆ−１９は、配列番号２の塩基配列における塩基ＮＮＮが、ＴＧＧであるＰＥＸ２２遺伝子と、配列番号２の塩基配列における塩基ＮＮＮが、ＴＡＧ（ストップコドン）である変異ＰＥＸ２２遺伝子とをヘテロ接合で有していた。
【００８２】
［実施例２］
前記実施例１において得られた点変異の前記変異ＰＥＸ２２遺伝子を、親株S. cerevisiae 4011（水津、醸協、９１、８７、１９９２年）に、遺伝子工学的に導入した。そして、得られた点変異導入株について、発酵試験を行い、エタノール発酵性を損じることなく、有機酸を前記親株よりも向上させることを確認した。
【００８３】
（１）点変異導入株の調製
前記親株S. cerevisiae 4011から、一倍体４０１１ａ（ＭＡＴａ）を分離し、これにウラシル要求性を付与し、これを宿主ＧＸ−１１として使用した。前記宿主は、ＵＲＡ３遺伝子について、４６番目のアミノ酸残基が終止コドン（アンバーコドン）となっていることを確認済みである。
【００８４】
Ｆ−１９Ｈのゲノムにおける変異ＰＥＸ２２遺伝子のＯＲＦ領域（配列番号２の塩基配列の全ての塩基）と、ターミネーター領域とを下記プライマーセット１を用いて、ＰＣＲで増幅し、第１の増幅断片を得た。
【００８５】
プライマーセット１
フォワードプライマー１（PEX22(1)InFusion-F、配列番号４）
5’-CTATAGGGCGAATTGATGCCACCACCATCAAGAAGTAGAATAAACAAAACAAGAACATTAGGAATAG-3’
リバースプライマー１（PEX22(743)InFusion-R、配列番号５）
5’-AGGGAACAAAAGCTGGGCATTGTTAGACATCTAATTGATTCGGTCAAGTTGTAATGATGATTTC-3’
【００８６】
また、プラスミドｐＲＳ４０６を鋳型として、下記プライマーセット２を用いて、ＰＣＲで増幅し、増幅断片を得た。
【００８７】
プライマーセット２
フォワードプライマー２（pRS406InFusion-F、配列番号６）
5’- CAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGG-3’
リバースプライマー２（pRS406InFusion-R、配列番号７）
5’- CAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3’
【００８８】
つぎに、サブクローニングキット（In Fusion（登録商標）、タカラバイオ社製）を用いて、ｐＲＳ４０６のマルチクローニングサイトに前記第１の増幅断片をサブクローニングすることにより、組換え用プラスミドベクターを作製した。前記ベクターは、マーカー配列として、ＵＲＡ３遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子を有する。そして、前記組換えプラスミド制限酵素処理物を、酢酸リチウム法により、宿主ＧＸ−１１に導入して形質転換を行い、ウラシル未添加のＳＤ培地での培養により、前記組換えベクターが、前記宿主のＰＥＸ２２遺伝子座に挿入された形質転換体の選択を行った。さらに、選択された形質転換体について、５−フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）とウラシルを含むアミノ酸未添加のＳＤ培地での培養を行い、さらに、ループアウトにより前記ＵＲＡ３遺伝子およびアンピシリン遺伝子が除かれた形質転換体のみを選択した。このようにして選択された形質転換体を、目的の変異酵母株として、変異ＰＥＸ２２遺伝子の確認を行った。その結果、配列番号２の塩基配列において３７４番目の塩基がＧからＡに点変異した変異ＰＥＸ２２遺伝子を有することが確認された。得られた変異酵母株を、以下、ＧＸ−ＰＥＸ２２という。なお、ＧＸ−ＰＥＸ２２は、２株取得した。
【００８９】
（２）エタノール生成量および有機酸生成量の測定
前記宿主および前記ＧＸ−ＰＥＸ２２について、総米１００ｇの小仕込み試験とした以外は、前記実施例１と同様にして、エタノール生成量および有機酸生成量を測定した。下記表２に、前記仕込み試験の結果、すなわち、前記仕込み開始から１５日経過時の発酵産物における各測定項目の結果（２株の平均値）を示す。測定した項目は、エタノール、酸度、アミノ酸度、リンゴ酸、コハク酸、およびその他各種有機酸（αケトグルタル酸、クエン酸、ピルビン酸、乳酸、ピログルタミン酸等）である。
【００９０】
【表２】
2018186759.tif 000003
【００９１】
前記表２に示すように、前記ＧＸ−ＰＥＸ２２は、アルコール生成量（エタノール生成量）に関しては、宿主ＧＸ−１１の約０．９５倍であり、前記宿主と同等のアルコール生成量を維持しており、エタノール発酵性を損じていないことが確認できた。また、前記ＧＸ−ＰＥＸ２２は、リンゴ酸生成量に関しては、前記宿主の約２．０５倍であり、コハク酸生成量に関しては、前記宿主の約１．５９倍であり、有機酸生成量を宿主よりも向上させることを確認した。また、前記ＧＸ−ＰＥＸ２２の酸度は、前記宿主の１．３８倍であった。この結果から、本発明の有機酸生成酒酵母株が、宿主と同程度の発酵能を維持しつつ、且つ、宿主よりも優れた有機酸生成能を有すること、また、このような性質が、ＰＥＸ２２遺伝子の３７４番目の塩基の点変異、すなわち、配列番号１または２における塩基ＮＮＮがストップコドンに変異することにより得られることが確認できた。
【００９２】
［実施例３］
前記変異ＰＥＸ２２遺伝子により付与される形質、すなわち、有機酸の生成量の増大は、劣性形質であることを確認した。
【００９３】
Ｋ−７０１、Ｆ−１９、およびＦ−１９Ｈについて、Yeast extract Malt（ＹＥＭ）培地で培養した。つぎに、５ｍＬのＹＥＭ培地（グルコース１０ｇ／１００ｍＬ）に、ＯＤ６００＝０．１となるように植菌し、３０℃で４日間培養した。得られた培養液について、有機酸生成量を測定した。下記表３にこの結果を示す。
【００９４】
【表３】
2018186759.tif 000004
【００９５】
前記表３に示すように、Ｆ−１９Ｈは、リンゴ酸およびコハク酸の生成量に関して、変異ＰＥＸ２２遺伝子を有さないＫ−７０１の３．２５倍および１．４２倍であった。また、Ｆ−１９Ｈは、リンゴ酸およびコハク酸の生成量に関して、変異ＰＥＸ２２遺伝子をヘテロ接合で有するＦ−１９の３．２８倍および１．６９倍であった。これらの結果から、前記変異ＰＥＸ２２遺伝子により付与される形質、すなわち、有機酸の生成量の増大は、劣性形質であることがわかった。
【００９６】
［実施例４］
本発明の有機酸生成酒酵母株の製造方法により得られた有機酸生成酒酵母株と、他の酒酵母株とを用い、混合醸造できることを確認した。
【００９７】
実施例１で得られたＦ−１９とＦ−１９Ｈとの醸造開始時の混合割合を変えて、総米６５６ｇの仕込みとした以外は、実施例１と同様にして、エタノール生成量、有機酸生成量、および酢酸イソアミルの生成量を測定した。Ｆ−１９とＦ−１９Ｈとの混合割合（Ｆ−１９：Ｆ−１９Ｈ）は、１０：０、７：３、５：５、４：６、３：７、または０：１０とし、１０７酒酵母数（ｃｅｌｌｓ）／ｍＬとなるように接種した。その結果、エタノール、有機酸（リンゴ酸＋コハク酸）、酢酸イソアミルの濃度は、Ｆ−１９およびＦ−１９Ｈを、それぞれ単独で醸造した清酒を混合したもの（理論値）と１０％程度の誤差であり、精度良く混合醸造できることがわかった。また、Ｆ−１９およびＦ−１９Ｈを、それぞれ単独で醸造した結果のみを下記表４に示す。
【００９８】
【表４】
2018186759.tif 000005
【００９９】
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明によれば、十分な発酵力を維持し且つ有機酸生成能に優れる酵母株を製造できる。このため、本発明は、例えば、酒造分野において極めて重要である。
【配列表】
2018186759000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年7月7日(2017.7.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酒酵母株について、その全ＰＥＸ２２遺伝子を変異ＰＥＸ２２遺伝子に変異させる変異工程を含み、
前記変異工程において、前記ＰＥＸ２２遺伝子における配列番号１の塩基配列で示される部分領域について、塩基ＮＮＮを、ストップコドンに変異させることを特徴とする、有機酸生成酒酵母株の製造方法。
【請求項２】
前記ＰＥＸ２２遺伝子は、配列番号２の塩基配列からなり、
前記配列番号２の塩基配列における塩基ＮＮＮを、ストップコドンに変異させる、請求項１記載の有機酸生成酒酵母株の製造方法。
【請求項３】
前記酒酵母株は、清酒酵母株である、請求項１または２記載の有機酸生成酒酵母株の製造方法。
【請求項４】
酒酵母株から有機酸生成酒酵母株を作製する作製工程、および
前記有機酸生成酒酵母株を用いて、清酒を製造する製造工程を含み、
前記作製工程は、請求項１から３のいずれか一項に記載の有機酸生成酒酵母株の製造方法により実施されることを特徴とする、清酒の製造方法。
【請求項５】
前記清酒を容器に充填する充填工程を含む、請求項４記載の清酒の製造方法。
【請求項６】
ＰＥＸ２２遺伝子における配列番号１の塩基配列で示される部分領域において、塩基ＮＮＮが、ストップコドンであることを特徴とする、変異ＰＥＸ２２遺伝子。