(57)【要約】【課題】本発明の目的は、マクロファージ活性化能を有し、かつ安全性の高い飲食品を提供することである。【解決手段】前記課題は、ミリスティカ・フラグランスの種子及び／又は仮種皮の抽出物を有効成分として含むことを特徴とするマクロファージ活性化剤によって解決することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミリスティカ・フラグランスの種子及び／又は仮種皮の抽出物を有効成分として含むことを特徴とするマクロファージ活性化剤。
【請求項２】
前記抽出物が、アルコール、水性溶媒、又はアルコールと水性溶媒との混合物による抽出物である、請求項１に記載のマクロファージ活性化剤。
【請求項３】
前記抽出物が、ナツメグ及び／又はメースの抽出物である、請求項１又は２に記載のマクロファージ活性化剤。
【請求項４】
前記マクロファージ活性化が、サイトカイン産生促進、貪食活性促進、活性酸素産生促進、一酸化窒素産生促進、及び抗原提示機能強化から選択される１つ又は２つ以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のマクロファージ活性化剤。
【請求項５】
ミリスティカ・フラグランスの種子及び／又は仮種皮の抽出物を有効成分として含むことを特徴とするマクロファージ活性化用食品組成物。
【請求項６】
前記抽出物が、アルコール、水性溶媒、又はアルコールと水性溶媒との混合物による抽出物である、請求項５に記載のマクロファージ活性化用食品組成物。
【請求項７】
前記抽出物が、ナツメグ及び／又はメースの抽出物である、請求項５又は６に記載のマクロファージ活性化用食品組成物。
【請求項８】
前記マクロファージ活性化が、サイトカイン産生促進、貪食活性促進、活性酸素産生促進、一酸化窒素産生促進、及び抗原提示機能強化から選択される１つ又は２つ以上である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のマクロファージ活性化用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロファージ活性化剤及びマクロファージ活性化用食品組成物に関する。本発明のマクロファージ活性化剤及びマクロファージ活性化用食品組成物によれば、マクロファージを活性化することができる。
【背景技術】
【０００２】
マクロファージは、組織において単球の分化により作られる白血球である。マクロファージは体内の老廃物の処理、並びに病原体（例えば、ウイルス又は微生物など）及び腫瘍細胞に対する防御機能を担っている。また、Ｔ細胞への抗原の提示とインターロイキン（ＩＬ）の産生を介し、細胞性免疫のエフェクターとしての機能も有している。したがって、感染症及び腫瘍などの治療にはマクロファージを活性化させることが重要である。
【０００３】
従来よりマクロファージを活性化する様々な物質が提案されており、近年では、突然変異を導入した酵母によりマクロファージを活性化する試みがなされている（特許文献１）。また、ある種の多糖類がマクロファージ活性化能を有することが知られている（特許文献２）。しかしながら、所望のマクロファージ活性化機能を十分に有しており、医薬品又は食品として実際に使用できる安全な物質の開発は未だなされていない現状にある。
【０００４】
一方で、香辛料は我々の食生活において使用頻度の高い食品の１つであり、その中でも、ミリスティカ・フラグランス（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ  ｆｒａｇｒａｎｓ）の種子及び仮種皮は独特の芳香を有し、ミリスティカ・フラグランスの種子及び仮種皮の乾燥物は、香辛料として、肉料理、乳製品、及び焼き菓子などに主に用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−２８４０８５号公報
【特許文献２】特開２００１−３１４１７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、種々の香辛料について、その抽出物のマクロファージ活性化能を比較検討したところ、ミリスティカ・フラグランスの種子又は仮種皮の抽出物がマクロファージ活性化能を示すことを新たに見出した。ミリスティカ・フラグランスの種子又は仮種皮の抽出物がマクロファージを活性化することは全く知られておらず、本発明はこうした知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、本発明は、
［１］ミリスティカ・フラグランスの種子及び／又は仮種皮の抽出物を有効成分として含むことを特徴とするマクロファージ活性化剤、
［２］前記抽出物が、アルコール、水性溶媒、又はアルコールと水性溶媒との混合物による抽出物である、［１］に記載のマクロファージ活性化剤、
［３］前記抽出物が、ナツメグ及び／又はメースの抽出物である、［１］又は［２］に記載のマクロファージ活性化剤、
［４］前記マクロファージ活性化が、サイトカイン産生促進、貪食活性促進、活性酸素産生促進、一酸化窒素産生促進、及び抗原提示機能強化から選択される１つ又は２つ以上である、［１］〜［３］のいずれかに記載のマクロファージ活性化剤、
［５］ミリスティカ・フラグランスの種子及び／又は仮種皮の抽出物を有効成分として含むことを特徴とするマクロファージ活性化用食品組成物、
［６］前記抽出物が、アルコール、水性溶媒、又はアルコールと水性溶媒との混合物による抽出物である、［５］に記載のマクロファージ活性化用食品組成物、
［７］前記抽出物が、ナツメグ及び／又はメースの抽出物である、［５］又は［６］に記載のマクロファージ活性化用食品組成物、及び
［８］前記マクロファージ活性化が、サイトカイン産生促進、貪食活性促進、活性酸素産生促進、一酸化窒素産生促進、及び抗原提示機能強化から選択される１つ又は２つ以上である、［５］〜［７］のいずれかに記載のマクロファージ活性化用食品組成物
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のマクロファージ活性化剤によれば、マクロファージを活性化することができる。さらに、本発明のマクロファージ活性化剤によれば、マクロファージ活性化能を有し、かつ安全性の高い飲食品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】溶媒コントロール（エタノールのみ）で処理したＲａｗ２６４．７細胞の写真である。
【図２】ナツメグのエタノール抽出物で処理したＲａｗ２６４．７細胞の写真である。
【図３】ナツメグのアルコール抽出物でＲａｗ２６４．７細胞を処理した実験の実験結果を示す表である。
【図４】溶媒コントロール（エタノールのみ）で処理したマウス腹腔マクロファージの写真である。
【図５】ナツメグのエタノール抽出物で処理したマウス腹腔マクロファージの写真である。
【図６】ナツメグのアルコール抽出物でマウス腹腔マクロファージを処理した実験の実験結果を示す表である。
【図７】ナツメグのアルコール抽出物で処理したＲａｗ２６４．７細胞をフローサイトメトリーに供した実験の実験結果を示すグラフである。
【図８】ナツメグのアルコール抽出物で処理したＲａｗ２６４．７細胞の一酸化窒素放出量を測定した実験の実験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［１］マクロファージ活性化剤
本発明のマクロファージ活性化剤は、ミリスティカ・フラグランスの種子及び／又は仮種皮の抽出物を有効成分として含む。
【００１１】
（ミリスティカ・フラグランス）
ミリスティカ・フラグランスは、ニクズク科の常緑高木の一種である。ミリスティカ・フラグランスは、樹高約２０メートルに達する常緑樹であり、幹の樹皮は灰褐色で滑らかな表面を有し、葉は長さ８〜１５ｃｍで表側が濃緑であり、そして裏側が淡い緑の単葉である。ミリスティカ・フラグランスは、スモモ又はアンズに似た長さ約５ｃｍの卵型の黄色い果実をつけ、果実中には網目状の赤い仮種皮とこの仮種皮に包まれた暗褐色の種子が存在する。
【００１２】
（種子）
ミリスティカ・フラグランスの種子は、仮種皮に覆われている。種子中には、堅い種皮の内部に直径約２．５ｃｍの卵型で灰褐色である仁が存在する。種子又は種子中の仁を乾燥させたものは、香辛料のナツメグとして一般的に使用されている。
【００１３】
（仮種皮）
仮種皮とは、種子の表面を覆っている付属物であり、種衣とも呼ばれる。仮種皮は、花の珠柄又は胎座が発達して種子の外側を覆っている構造である。ミリスティカ・フラグランスの仮種皮を乾燥させたものは、香辛料のメースとして一般的に使用されている。
【００１４】
本発明のマクロファージ活性化剤の有効成分の抽出に用いるミリスティカ・フラグランスの使用部位は、種子及び／又は仮種皮、好ましくは種子である。ミリスティカ・フラグランスは、抽出操作を行う際に、生のまま用いてもよいが、乾燥させたものの方が、抽出効率がよいので好ましく使用できる。また、抽出効率が向上するように、破砕物又は粉体の状態に加工することが好ましい。
【００１５】
（ナツメグ）
本明細書において、ナツメグとは、ミリスティカ・フラグランスの種子又は種子中の仁を乾燥させたものを意味する。ナツメグは、香辛料として一般的に使用されている。ナツメグは、甘く刺激的な香りを有しており、肉料理の臭み消しに主に用いられる。また、ナツメグは、野菜料理、乳製品を用いた料理、又は洋菓子などにも用いられる。
ナツメグは、粉体にしてから瓶に封入されて販売されていることが多いが、香りが失われやすいため、種子のままでも販売されていることがある。種子のまま販売されている場合は、使用時にナツメグミルなどを用いて細かくしてから使用される。
【００１６】
（メース）
本明細書において、メースとは、ミリスティカ・フラグランスの仮種皮を乾燥させたものを意味する。メースは、香辛料として一般的に使用されている。メースは、甘く刺激的な香りを有している。メースは、ナツメグと同様に、肉料理、野菜料理、乳製品を用いた料理、又は洋菓子などに用いられる。
【００１７】
本発明のマクロファージ活性化剤の有効成分は、ミリスティカ・フラグランスの種子及び／又は仮種皮の抽出物を、適切な溶媒で抽出することにより得ることができる。ミリスティカ・フラグランスの種子の乾燥物は、香辛料のナツメグであり、そして、ミリスティカ・フラグランスの仮種皮の乾燥物は、香辛料のメースである。ナツメグとメースは同様の風味を有しており、そして香気成分などの成分も共通している。本発明の抽出物に含まれるマクロファージを活性化する有効成分は、ミリスティカ・フラグランスの植物体全体に含まれていると考えられるが、特に種子及び仮種皮の部分に濃縮されて多く含まれていると考えられる。例えば、種子から調製されるナツメグと仮種皮から調製されるメースは共通の成分を含んでおり、マクロファージを活性化する有効成分を多く含んでいると考えられる。
【００１８】
（抽出物）
本発明のマクロファージ活性化剤に含まれるミリスティカ・フラグランスの種子及び／又は仮種皮の抽出物を抽出するための抽出溶媒は、抽出液中に有効成分が充分に抽出されることができる限りにおいては限定されないが、例えば、有機溶媒、水性溶媒、又は有機溶媒及び水性溶媒の混合物を使用することができる。
【００１９】
（有機溶媒）
本発明のマクロファージ活性化剤に含まれるミリスティカ・フラグランスの種子及び／又は仮種皮の抽出物は、有機溶媒、例えば、アルコール、アセトン、ベンゼン、エステル、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム、及びジエチルエーテルなどにより抽出されることができるが、好ましくはアルコールにより抽出されることができる。アルコールとしては、抽出液中に有効成分が充分に抽出されることができる限りにおいては限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、及びペンタノール等の炭素数１〜５の一価アルコールを使用することができる。１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、及びグリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールを使用することもできる。好ましいアルコールは、炭素数１〜５の一価アルコールであり、より好ましいアルコールは、メタノール及びエタノールである。
【００２０】
（水性溶媒）
本発明のマクロファージ活性化剤に含まれるミリスティカ・フラグランスの種子及び／又は仮種皮の抽出物は、水性溶媒により抽出されることができる。水性溶媒としては、水を含んでいる限りにおいて限定されるものではなく、例えば、水、生理食塩水、又は緩衝液などを使用することができる。緩衝液としては、リン酸緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、炭酸ナトリウム緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、及びトリス緩衝液などが挙げられる。前記水性溶媒のｐＨは、特に制限されず、例えば、３〜１０、５〜８、又は７〜８である。
【００２１】
（有機溶媒と水性溶媒との混合物）
本発明のマクロファージ活性化剤に含まれるミリスティカ・フラグランスの種子及び／又は仮種皮の抽出物は、有機溶媒と水性溶媒との混合物により抽出されることができる。抽出溶媒中に含まれる水性溶媒の量は、抽出液中に有効成分が充分に抽出されることができる限りにおいては限定されないが、抽出溶媒の全体量に対して、例えば、５０質量％以下、４０質量％以下、３０質量％以下、２０質量％以下、１５質量％以下、１０質量％以下、５．０質量％以下、４．０質量％以下、３．０質量％以下、２．０質量％以下、若しくは１．０質量％以下であることができ、又は、５０質量％以上、６０質量％以上、７０質量％以上、８０質量％以上、８５質量％以上、９０質量％以上、９５質量％以上、９６質量％以上、９７質量％以上、９８質量％以上、若しくは９９質量％以上であることができる。
【００２２】
抽出温度は、抽出液中に有効成分が充分に抽出されることのできる温度である限り、特に限定されるものではないが、−５０℃〜１００℃であることが好ましく、−２５℃〜５０℃であることがより好ましく、−２０℃〜２５℃であることがさらに好ましく、−１０℃〜２０℃であることがさらに好ましく、０℃〜１５℃であることが最も好ましい。
【００２３】
また、抽出の際には、抽出効率が向上するように、撹拌又は振盪しながら実施することが好ましい。抽出時間は、例えば、ミリスティカ・フラグランスの部位、ミリスティカ・フラグランスの状態（生、又は乾燥物であるか、更には破砕物又は粉体の状態に加工した場合にはその加工状態）、抽出液の温度、又は撹拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、適宜決定することができるが、通常、１分〜７２時間であり、１時間〜４８時間であることが好ましく、１２時間〜３６時間であることが最も好ましい。
【００２４】
本発明における有効成分である、ミリスティカ・フラグランスの種子及び／又は仮種皮の抽出物は、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、結核及びインフルエンザなどの各種感染症、並びに肺癌及び胃がんなどの癌の治療又は予防が必要な対象［動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）］に有効量で投与することができる。また、ヒト以外の動物には、飼料として飲食物の形で与えることも可能である。
【００２５】
本発明のマクロファージ活性化剤の投与剤型としては、特には限定がなく、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は非経口剤を挙げることができる。
【００２６】
前記経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、若しくは合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００２７】
非経口剤としては、例えば、注射剤を挙げることができる。注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
【００２８】
本発明のマクロファージ活性化剤は、これに限定されるものではないが、ナツメグの抽出物を、例えば、１〜１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは、３〜５００μｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜３００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０〜２５０μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０〜２００μｇ／ｍＬ、最も好ましくは１５〜１５０μｇ／ｍＬ含むことができる。
【００２９】
本発明のマクロファージ活性化剤を用いる場合の投与量は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができるが、ミリスティカ・フラグランスの抽出物（乾固物）として、例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重／日以上、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重／日以上、０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日以上、０．３ｍｇ／ｋｇ体重／日以上、０．５ｍｇ／ｋｇ体重／日以上、０．７５ｍｇ／ｋｇ体重／日以上、１ｍｇ／ｋｇ体重／日以上、２ｍｇ／ｋｇ体重／日以上、５ｍｇ／ｋｇ体重／日以上、１０ｍｇ／ｋｇ体重／日以上、２０ｍｇ／ｋｇ体重／日以上、３０ｍｇ／ｋｇ体重／日以上、５０ｍｇ／ｋｇ体重／日以上、若しくは７５ｍｇ／ｋｇ体重／日以上、又は１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日以下、７５０ｍｇ／ｋｇ体重／日以下、５００ｍｇ／ｋｇ体重／日以下、２５０ｍｇ／ｋｇ体重／日以下、２００ｍｇ／ｋｇ体重／日以下、１５０ｍｇ／ｋｇ体重／日以下、１２５ｍｇ／ｋｇ体重／日以下、若しくは１００ｍｇ／ｋｇ体重／日以下であることができる。具体的な範囲としては、例えば、０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、０．０５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重／日、０．３〜２５０ｍｇ／ｋｇ体重／日、０．５〜２００ｍｇ／ｋｇ体重／日、０．７５〜１５０ｍｇ／ｋｇ体重／日、又は１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日であることができる。
【００３０】
（マクロファージ活性化）
本発明のマクロファージ活性化剤が奏する具体的なマクロファージ活性化の作用としては、例えば、サイトカイン産生促進、貪食活性促進、活性酸素産生促進、一酸化窒素産生促進、及び抗原提示機能の増強から選択される１つ又は２つ以上が挙げられる。
【００３１】
産生が促進されるサイトカインとしては、例えば、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、造血因子、細胞増殖因子、及び細胞傷害因子などが挙げられる。インターロイキンとしては、ＩＬ１、６、１０、１２、１５、及び１８などが挙げられる。インターフェロンとしては、ＩＦＮ−αなどが挙げられる。ケモカインとしては、ＭＩＰ及びＣＣＬなどが挙げられる。造血因子としては、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などが挙げられる。細胞増殖因子としては、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）などが挙げられる。細胞傷害因子としては、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βなどが挙げられる。分泌が促進されるサイトカインは、好ましくは、ＩＬ−６及び／又はＴＮＦ−αである。分泌が促進されるサイトカインは、これらの１種であってもよく、又は２種以上であってもよい。
【００３２】
マクロファージの貪食作用とは、マクロファージが、細菌、ウイルス、又は死細胞等の異物を取り込み、これらを分解する機能であり、食作用又はファゴサイトーシスとも呼ばれる。本発明のマクロファージ活性化剤は、このマクロファージの貪食作用を促進することができる。
【００３３】
マクロファージは、微生物、ウイルス、及び癌細胞などの異物に対して強い毒性を示す、活性酸素、例えばスーパーオキサイド若しくは過酸化水素、又は一酸化窒素を産生することにより、これらの異物を殺傷又は排除する。本発明のマクロファージ活性化剤は、このマクロファージの活性酸素産生促進作用及び／又は一酸化窒素産生促進作用を促進することができる。
【００３４】
抗原提示とは、抗原提示細胞が細菌などの抗原を細胞内へ取り込んで分解を行った後に、細胞表面へその一部を提示する機構である。マクロファージは、貪食作用により取り込みそして分解した細菌などをいくつかの断片にして、マクロファージ内に存在するＭＨＣクラスＩＩ分子と結合させ、細胞表面に提示する。本発明のマクロファージ活性化剤は、このマクロファージの抗原提示機能を促進することができる。
【００３５】
［２］マクロファージ活性化用食品組成物
本発明のマクロファージ活性化用食品組成物は、ミリスティカ・フラグランスの種子及び／又は仮種皮の抽出物を有効成分として含む。具体的には、ミリスティカ・フラグランスの種子及び／又は仮種皮の抽出物を含む飲料、又はミリスティカ・フラグランスの種子及び／又は仮種皮の抽出物を適当な手段（例えば、凍結乾燥）で水分を除去した乾燥体として含む、飲料又は食品を挙げることができる。
【００３６】
飲料としては、お茶、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料、又はヨーグルトなどを挙げることができる。また、食品としては、クッキー、パン、ビスケット、乾パン、ケーキ、煎餅、羊羹、プリン、ゼリー、アイスクリーム類、チューインガム、クラッカー、チップス、若しくは飴等の菓子類、うどん若しくはそば等の麺類、かまぼこ、ハム、若しくは魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品、チーズ若しくはバターなどの乳製品、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ若しくは甘味料等の調味類、豆腐、又はこんにゃくなどを挙げることができる。
【００３７】
食品組成物には、機能性食品や健康食品（飲料）が含まれる。本明細書において「健康食品」とは、健康に何らかの効果を与えるか、又は、効果を期待することができる食品を意味し、「機能性食品」とは、前記「健康食品」の中でも、前記の種々の生体調節機能（すなわち、消化器系、循環器系、内分泌系、免疫系、又は神経系などの生理系統の調節機能）を充分に発現することができるように設計及び加工された食品を意味する。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３９】
《製造例１：ミリスティカ・フラグランスのアルコール抽出物の調製》
ミリスティカ・フラグランスの種子中の仁を乾燥させたものを粉砕し、ナツメグ粉末を調製した。ナツメグ粉末６グラムを秤量した。１００％エタノール又は１００％メタノール３５ｍＬを秤量したナツメグ粉末に添加した。低温室（８℃）において、ローテーターを用いて２４時間回転抽出した。遠心（１４００×ｇ、２０分）して上清を回収した。エバポレーターを用いて濃縮し、乾固物量を秤量した。１００％エタノール又は１００％メタノールを添加し、乾固物濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるように調整したものを実験に使用した。
【００４０】
《実施例１：ミリスティカ・フラグランスのアルコール抽出物によるＲａｗ２６４．７細胞における貪食活性促進効果の検討》
本実施例では、ミリスティカ・フラグランスのアルコール抽出物によるＲａｗ２６４．７細胞における貪食活性促進効果の検討を行った。
【００４１】
（１．Ｒａｗ２６４．７細胞の前培養）
Ｒａｗ２６４．７細胞培養シャーレから上清を除去し、ＰＢＳ  １０ｍＬを用いてＲａｗ２６４．７細胞を洗浄し、そして培養シャーレに１ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳを２ｍＬ添加した。その後、３分間インキュベートを行い、スクレーパーを用いてＲａｗ２６４．７細胞を掻きはがした。掻きはがしたＲａｗ２６４．７細胞をピペットを用いて懸濁し、遠心（６００×ｇ、５分）を行った。血球計算板を用いて細胞数を計測し、細胞数を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。２０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ  ５００μＬを添加した２４ウェルプレートに細胞数を調整した細胞懸濁液を５００μＬ／ウェルとなるように添加し、一晩インキュベートした。
【００４２】
（２．アルコール抽出物の添加）
ナツメグエタノール抽出物（１００ｍｇ／ｍＬ）及びナツメグメタノール抽出物（１００ｍｇ／ｍＬ）を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地で１６００倍希釈した。１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭに添加したエタノール又はメタノールの濃度は０．０６２５％となった。１６００倍希釈したものをそれぞれ２倍及び４倍に段階希釈した。そして、ナツメグエタノール抽出物をＨｉｇｈ群（６２．５μｇ／ｍＬ）、Ｍｅｄｉｕｍ群（３１．３μｇ／ｍＬ）、及びＬｏｗ群（１５．６μｇ／ｍＬ）としてＲａｗ２６４．７細胞を添加した各ウェルに１ｍＬ／ウェル添加した。ナツメグメタノール抽出物をＨｉｇｈ群（６２．５μｇ／ｍＬ）、Ｍｅｄｉｕｍ群（３１．３μｇ／ｍＬ）、及びＬｏｗ群（１５．６μｇ／ｍＬ）としてＲａｗ２６４．７細胞を添加した各ウェルに１ｍＬ／ウェル添加した。サンプル添加時に、ラテックスビーズ０．５μＬ／ウェルを添加し、２４時間培養した。０．０６２５％エタノール−１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地と０．０６２５％メタノール−１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地とを調製し、コントロールとした。１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地を調製し、ネガティブコントロールとした。培養上清を回収し、ＰＢＳ  １ｍＬで５回洗浄後、１００％メタノールで細胞を固定した。
【００４３】
（３．貪食活性の評価）
細胞を顕微鏡を用いて観察し、細胞の様子を撮影した。撮影した写真の全細胞数、貪食している細胞の数、及び細胞が貪食したビーズの数を計測した。貪食をしている細胞数を一視野に存在する細胞数で割ることで、一視野に存在する貪食している細胞の割合（貪食率）として算出した、貪食されたビーズの数を全細胞数で割ることで、マクロファージが貪食したビーズの割合（貪食能）として算出した。
【００４４】
溶媒コントロール（エタノールのみ）で処理したＲａｗ２６４．７細胞の写真とナツメグのエタノール抽出物で処理したＲａｗ２６４．７細胞の写真とを、それぞれ、図１及び２に示す。溶媒コントロール（エタノールのみ）で処理したＲａｗ２６４．７細胞よりも、ナツメグのエタノール抽出物で処理したＲａｗ２６４．７細胞の方が、全体の細胞数に対するラテックスビーズを貪食している細胞数の割合が多いことが観察できる。
【００４５】
ナツメグエタノール抽出物及びメタノール抽出物を添加した群の各々において、コントロール群と比較して、貪食率及び貪食能の増加傾向が認められた（図３）。ナツメグエタノール抽出物では、Ｍｅｄｉｕｍ群及びＨｉｇｈ群において貪食率と貪食能とがコントロールに対し、統計学的に有意に増加した。ナツメグエタノール抽出物のＬｏｗ群においては、貪食率及び貪食能が増加する傾向が認められた。ナツメグメタノール抽出物では、全ての群において、貪食率と貪食能とがコントロールに対して統計学的に有意に増加した。これらの結果から、ナツメグエタノール抽出物及びナツメグメタノール抽出物は、Ｒａｗ２６４．７細胞の貪食活性を向上させることが分かった。
【００４６】
《実施例２：ミリスティカ・フラグランスのアルコール抽出物によるマウス腹腔マクロファージにおける貪食活性促進効果の検討》
本実施例では、ミリスティカ・フラグランスのアルコール抽出物によるマウス腹腔マクロファージにおける貪食活性促進効果の検討を行った。
【００４７】
（１．マウス腹腔マクロファージの前培養）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢・メス）の腹腔に３％チオグリコレート培地を腹腔注射し、３日間飼育した。マウスを頸椎脱臼により屠殺した。マウスの腹部を７０％エタノールで消毒した。腹部中央に少し切れ目を入れ、両端をはさんで皮膚を裂き腹膜を露出させた。冷却ＥＤＴＡ−ＰＢＳ約５ｍＬを注射器を用いて腹腔内注射し、マウスの足をつかんで３分間揺すり、腹部をマッサージした。冷却ＥＤＴＡ−ＰＢＳを注入した部分から、ＰＢＳを回収し、遠心管に移した。細胞数計測用にＰＢＳを５０μＬ取り、残りを遠心（１０００ｒｐｍ、５分）した。細胞数を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。２０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ  ５００μＬを添加した２４ウェルプレートに細胞数を調整した細胞懸濁液を５００μＬ／ウェルとなるように添加し、一晩インキュベートした。
【００４８】
（２．アルコール抽出物の添加）
ナツメグエタノール抽出物（１００ｍｇ／ｍＬ）及びナツメグメタノール抽出物（１００ｍｇ／ｍＬ）を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地で８００倍希釈した。１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭに添加したエタノール又はメタノールの濃度は０．１２５％となった。８００倍希釈したものをそれぞれ２倍及び４倍に段階希釈した。そして、ナツメグエタノール抽出物をＨｉｇｈ群（１２５μｇ／ｍＬ）、Ｍｅｄｉｕｍ群（６２．５μｇ／ｍＬ）、及びＬｏｗ群（３１．３μｇ／ｍＬ）としてマウス腹腔マクロファージを添加した各ウェルに１ｍＬ／ウェル添加した。ナツメグメタノール抽出物をＨｉｇｈ群（１２５μｇ／ｍＬ）、Ｍｅｄｉｕｍ群（６２．５μｇ／ｍＬ）、及びＬｏｗ群（３１．３μｇ／ｍＬ）としてマウス腹腔マクロファージを添加した各ウェルに１ｍＬ／ウェル添加した。サンプル添加時に、ラテックスビーズ０．５μＬ／ウェルを添加し、２４時間培養した。ＬＰＳを最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬになるように１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地で調整し、ポジティブコントロールとした。０．１２５％メタノール−１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地と０．１２５％メタノール−１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地とを調製し、コントロールとした。１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地を調製し、ネガティブコントロールとした。培養上清を回収し、ＰＢＳ  １ｍＬで５回洗浄した。１００％メタノールで固定した。ポジティブコントロール群以外のウェル、すなわち、コントロール、Ｈｉｇｈ群、Ｍｅｄｉｕｍ群、及びＬｏｗ群の各々のウェルに、ＬＰＳの最終濃度が１ｎｇ／ｍＬになるようにＬＰＳを添加した。
マウス腹腔マクロファージにおいては、マクロファージの反応がＲａｗ２６４．７細胞よりも弱かったことから、ポジティブコントロール群は２０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ濃度で実験を行い、そして、コントロール、Ｈｉｇｈ群、Ｍｅｄｉｕｍ群、及びＬｏｗ群の各々のウェルには、ＬＰＳの最終濃度が１ｎｇ／ｍＬになるようにＬＰＳを添加して実験を行った。
【００４９】
（３．貪食活性の評価結果）
細胞を顕微鏡を用いて観察し、細胞の様子を撮影した。撮影した写真の全細胞数、貪食している細胞の数、及び細胞が貪食したビーズの数を計測した。貪食をしている細胞数を一視野に存在する細胞数で割ることで、一視野に存在する貪食している細胞の割合（貪食率）として算出した、貪食されたビーズの数を全細胞数で割ることで、マクロファージが貪食したビーズの割合（貪食能）として算出した。
【００５０】
溶媒コントロール（エタノールのみ）で処理したマウス腹腔マクロファージの写真とナツメグのエタノール抽出物で処理したマウス腹腔マクロファージの写真とを、それぞれ、図４及び５に示す。溶媒コントロール（エタノールのみ）で処理したマウス腹腔マクロファージよりも、ナツメグのエタノール抽出物で処理したマウス腹腔マクロファージの方が、全体の細胞数に対するラテックスビーズを貪食している細胞数の割合が多いことが観察できる。
【００５１】
ナツメグメタノール抽出物では、全ての群において、貪食率と貪食能とが統計学的に有意に増加した（図６）。同様に、ナツメグエタノール抽出物のＬｏｗ群においても、コントロールに対して貪食率及び貪食能が増加する傾向が認められた。これらの結果から、ナツメグエタノール抽出物及びナツメグメタノール抽出物は、マウス腹腔マクロファージの貪食活性を向上させることが分かった。
【００５２】
《実施例３：フローサイトメトリーを用いた、ミリスティカ・フラグランスのアルコール抽出物によるＲａｗ２６４．７細胞における貪食活性促進効果検討》
本実施例では、フローサイトメトリーを用いて、ミリスティカ・フラグランスのアルコール抽出物によるＲａｗ２６４．７細胞における貪食活性促進効果を検討した。
【００５３】
（１．Ｒａｗ２６４．７細胞の前培養）
Ｒａｗ２６４．７細胞培養シャーレから上清を除去し、ＰＢＳ  １０ｍＬを用いてＲａｗ２６４．７細胞を洗浄し、そして培養シャーレに１ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳを２ｍＬ添加した。その後、３分間インキュベートを行い、スクレーパーを用いてＲａｗ２６４．７細胞を掻きはがした。掻きはがしたＲａｗ２６４．７細胞をピペットを用いて懸濁し、遠心（６００×ｇ、５分）を行った。血球計算板を用いて細胞数を計測し、細胞数を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。２０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ  ５００μＬを添加した２４ウェルプレートに細胞数を調整した細胞懸濁液を５００μＬ／ウェルとなるように添加し、一晩インキュベートした。
【００５４】
（２．アルコール抽出物の添加及びフローサイトメトリー）
ナツメグエタノール抽出物（１００ｍｇ／ｍＬ）及びナツメグメタノール抽出物（１００ｍｇ／ｍＬ）を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地で８００倍希釈した。１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭに添加したエタノール又はメタノールの濃度は０．１２５％となった。８００倍希釈したものをそれぞれ２倍及び４倍に段階希釈した。そして、ナツメグエタノール抽出物をＨｉｇｈ群（１２５μｇ／ｍＬ）、Ｍｅｄｉｕｍ群（６２．５μｇ／ｍＬ）、及びＬｏｗ群（３１．３μｇ／ｍＬ）としてＲａｗ２６４．７細胞を添加した各ウェルに１ｍＬ／ウェル添加した。ナツメグメタノール抽出物をＨｉｇｈ群（１２５μｇ／ｍＬ）、Ｍｅｄｉｕｍ群（６２．５μｇ／ｍＬ）、及びＬｏｗ群（３１．３μｇ／ｍＬ）としてＲａｗ２６４．７細胞を添加した各ウェルに１ｍＬ／ウェル添加した。サンプル添加時に、テキサスレッドの蛍光ビーズ０．５μＬ／ウェルを添加し、２４時間培養した。ＬＰＳを最終濃度が１ｎｇ／ｍＬになるように１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地で調製し、ポジティブコントロールとした。０．１２５％メタノール−１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地と０．１２５％メタノール−１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地とを調製し、コントロールとした。１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地を調製し、ネガティブコントロールとした。サンプルを一晩インキュベートした。培養上清を除去し、室温のＰＢＳで２回洗浄した。氷冷ＥＤＴＡ−ＰＢＳを１ｍＬ／ウェル添加し、懸濁し、細胞をエッペンチューブに回収した。遠心分離し（４００×ｇ、５分）、上清を除去した。エッペンに残った上清で細胞を軽く懸濁した。抗体（ＣＤ１１ｂ：ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ  ＣＤ１１ｂ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（クローンＭ１／７０）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を０．５μＬ添加した。遮光し、４℃で３０分間インキュベートした。室温のＰＢＳを添加し、遠心分離を行い（４００×ｇ、５分）、上清を除去した。ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（２％ＦＢＳ−ＰＢＳ）１ｍＬを添加し、さらに遠心分離を行い（４００×ｇ、５分）、上清を除去した。再度、ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（２％ＦＢＳ−ＰＢＳ）１ｍＬを添加し、懸濁し、４０μｍセルストレーナーでフィルトレーションを行った後、氷上に置き、フローサイトメーターで計測を行った。
【００５５】
（３．貪食活性の評価結果）
フローサイトメトリーの結果を図７に示す。縦軸は、全体の細胞数に対するビーズを貪食した細胞数の割合を示す。フローサイトメーターを用いて、ナツメグエタノール抽出物及びナツメグメタノール抽出物の貪食活性促進能を評価した結果、ナツメグエタノール抽出物及びナツメグメタノール抽出物の各々において、コントロールと比較して、蛍光ビーズを貪食したＲａｗ２６４．７細胞の割合が増加傾向を示した（図７）。フローサイトメーターを用いた実験からも、ナツメグ抽出物はＲａｗ２６４．７細胞の貪食活性を上昇させ、自然免疫を活性化させる可能性が推定された。
【００５６】
《実施例４：ミリスティカ・フラグランスのアルコール抽出物によるＲａｗ２６４．７細胞における一酸化窒素産生促進効果の検討》
本実施例では、グリース法を用いて、ミリスティカ・フラグランスのアルコール抽出物によるＲａｗ２６４．７細胞における一酸化窒素産生促進効果の検討を行った。
【００５７】
（１．Ｒａｗ２６４．７細胞の前培養）
Ｒａｗ２６４．７細胞培養シャーレから上清を除去し、ＰＢＳ  １０ｍＬを用いてＲａｗ２６４．７細胞を洗浄し、そして培養シャーレに１ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳを２ｍＬ添加した。その後、３分間インキュベートを行い、スクレーパーを用いてＲａｗ２６４．７細胞を掻きはがした。掻きはがしたＲａｗ２６４．７細胞をピペットを用いて懸濁し、遠心（６００×ｇ、５分）を行った。血球計算板を用いて細胞数を計測し、細胞数を２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。２０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ  ５００μＬを添加した２４ウェルプレートに細胞数を調整した細胞懸濁液を５００μＬ／ウェルとなるように添加し、２時間インキュベートした。
【００５８】
（２．アルコール抽出物の添加及びグリース法）
ナツメグエタノール抽出物（１００ｍｇ／ｍＬ）及びナツメグメタノール抽出物（１００ｍｇ／ｍＬ）を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地で８００倍希釈した。１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭに添加したエタノール又はメタノールの濃度は０．１２５％となった。そして、調製した１２５μｇ／ｍＬのナツメグエタノール抽出物及びナツメグメタノール抽出物の各々をＲａｗ２６４．７細胞を添加した各ウェルに１ｍＬ／ウェル添加した。サンプル添加時に、テキサスレッドの蛍光ビーズ０．５μＬ／ウェルを添加し、２４時間培養した。０．１２５％メタノール−１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地と０．１２５％メタノール−１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地とを調製し、コントロールとした。１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地を調製し、ネガティブコントロールとした。サンプルを２４時間インキュベートし、培養上清を回収した。リン酸１ｍＬをミリＱ水３９ｍＬで溶解してリン酸緩衝液を調製し、このリン酸緩衝液にスルファニルアミド４００ｍｇ、Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩４０ｍｇを溶解し、Ｇｒｉｅｓｓ試薬を調製した。亜硝酸ナトリウム６９ｍｇをミリＱ水１０ｍＬで溶解し、１００ｍＭ亜硝酸ナトリウム水溶液を調製した。１００ｍＭ亜硝酸ナトリウム水溶液を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地で１０００倍希釈し、１００μＭ亜硝酸ナトリウム水溶液を調製した１００μＭ亜硝酸ナトリウム水溶液を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地で５０〜１．５６μＭにそれぞれ段階希釈を行い、スタンダード溶液を調製した。回収した培養上清及びスタンダード溶液を９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェル添加した。Ｇｒｉｅｓｓ試薬を１００μＬ／ウェル添加した。室温で２０分間インキュベートした。５４０ｎｍで吸光度を測定した。スタンダード溶液の値から検量線を作成し、培養上清中の亜硝酸濃度を計算した。
【００５９】
（３．一酸化窒素産生促進効果の評価結果）
Ｇｒｉｅｓｓ法を用い、マクロファージが細菌などを貪食した際に、細菌などの異物を排除するために放出するＮＯの濃度を測定した。その結果、ナツメグエタノール抽出物及びナツメグメタノール抽出物の処理群においてコントロールと比較して、貪食を行ったＲａｗ２６４．７細胞が産生したＮＯ濃度が増加傾向を示した。この結果から、ナツメグ抽出物は貪食活性を促進し、貪食反応に関連する一酸化窒素の濃度を増加させる事が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明のマクロファージ活性化剤は、マクロファージを活性化することができる。さらに、本発明のマクロファージ活性化剤は、マクロファージ活性化作用を有し、かつ安全性の高い飲食品を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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