(57)【要約】      （修正有）【課題】正方向に生じるピークの近傍に負ピークが存在するクロマトグラムであっても、正確にピーク検出が可能なピーク検出方法を提供する。【解決手段】未処理のクロマトグラムに対して、ベースラインの基点となるデータ点を２以上選定し、データ点から近似計算による数学的処理によりベースラインを策定する工程と、未処理のクロマトグラムから、ベースラインを差し引き、ベースライン変動のないクロマトグラムを取得する工程と、ベースライン変動のないクロマトグラムに対して、出力値が負の場合のみに−１を乗じて又は出力値が正の場合のみに−１を乗じて出力値の符号を合わせる工程と、出力値の符号を合わせたクロマトグラムに対して、一次微分値を取得し、ピークスタート点及びピークエンド点の時間情報を取得する工程と、ピークスタート点及びピークエンド点の時間情報を、未処理のクロマトグラムに適応しピークを確定する工程と、を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の工程として、未処理のクロマトグラムに対して、ベースラインの基点となるデータ点を２以上選定し、前記データ点から近似計算による数学的処理によりベースラインを策定する工程と、
第二の工程として、前記未処理のクロマトグラムから、前記ベースラインを差し引き、ベースライン変動のないクロマトグラムを取得する工程と、
第三の工程として、前記ベースライン変動のないクロマトグラムに対して、出力値が負の場合のみに−１を乗じて又は出力値が正の場合のみに−１を乗じて前記出力値の符号を合わせる工程と、
第四の工程として、前記出力値の符号を合わせたクロマトグラムに対して、一次微分値を取得し、ピークスタート点及びピークエンド点の時間情報を取得する工程と、
第五の工程として、前記ピークスタート点及びピークエンド点の時間情報を、前記未処理のクロマトグラムに適応しピークを確定する工程と、
を含んでなる、クロマトグラムのピーク検出方法。
【請求項２】
第二の工程と第三の工程の間に、前記ベースライン変動のないクロマトグラムに対して平滑化処理を施す工程を含んでなる請求項１に記載のクロマトグラムのピーク検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、負ピークが存在するクロマトグラムにおいても、正確なピーク検出を可能とする方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィは複数成分を含む試料をカラムで分離定量する方法である。一般的には、各成分ピークの溶出時間から定性を行い、検出器の出力度合により定量を行う。定量分析を行うには、正確にピークを検出し、そのピークの面積または高さを算出することが重要となる。ピークの検出は、時間当たりの検出器の出力の変化量、つまり、クロマトグラムの微分値の変化を基に行うのが一般的な方法である。前記変化量が事前に定めた値（ピークスタート感度、ピークエンド感度）を閾値としてピークスタート点及びピークエンド点を決定し、ピーク高さ、面積等を算出する。
【０００３】
一般的にピークスタート感度（Ｓ）ピークエンド感度（−Ｅ）とした場合、検出器の出力がＳを超えた点をピークスタート点、ピークがスタートしてから検出器の出力が−Ｅを超えた点をピークエンド点としてピーク検出を行う（図１参照）。
【０００４】
しかしながら、図２に示すような正方向のピークと負方向のピークが存在し、しかも両者が近接する場合は正しくピーク検出できないことがある。図２ａはクロマトグラム、図２ｂは微分曲線を示している。このようなクロマトグラムでは図２ｃのようなピーク検出結果となる。負ピークの最下点から正ピークのピークエンドまでを直線で引き、正ピークのピークスタートで縦切りされ、２つのピークとして定量計算されてしまう。
【０００５】
このような、誤ったピーク検出をされてしまうクロマトグラムに対しては、ピークスタート感度、ピークエンド感度のみでは対応がつかないケースが多く、他の特殊なパラメータを駆使して正しい結果が得られるようにしたり、あるいは、手作業によりピークスタート点、ピークエンド点を修正するなどの方法がとられていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、正方向に生じるピークの近傍に負ピークが存在するクロマトグラムであっても、正確にピーク検出が可能なピーク検出方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一般的なピーク検出はクロマトグラムの１次微分値の変化を基に実施される。正方向のピークでは、ピークが生じると、微分値はゼロから上昇し、ピークトップ付近を極大とし、急激に減少し、負の極小値を経てゼロに近づく。一方、負方向のピークでは、ピークが生じると、微分値はゼロから減少し、ピークトップ付近を極小とし、急激に増加し、正の極大値を経てゼロに近づく。このように、正のピークと負のピークでは全く逆の変化を示す（図２ｂ参照）。このため、正のピークと負のピークが近傍に存在する場合、ピークスタートとピークエンドを正確に判別することができず、誤ったピーク検出を生じさせることが多い。
【０００８】
本発明は上述課題を解決するためになされたピーク検出法であって、クロマトグラムの出力値の符号を合わせることで、ピークスタートとピークエンドを正確に判別できることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、
第一の工程として、未処理のクロマトグラムに対して、ベースラインの基点となるデータ点を２以上選定し、前記データ点から近似計算による数学的処理によりベースラインを策定する工程と、
第二の工程として、前記未処理のクロマトグラムから、前記ベースラインを差し引き、ベースライン変動のないクロマトグラムを取得する工程と、
第三の工程として、前記ベースライン変動のないクロマトグラムに対して、出力値が負の場合のみに−１を乗じて又は出力値が正の場合のみに−１を乗じて前記出力値の符号を合わせる工程と、
第四の工程として、前記出力値の符号を合わせたクロマトグラムに対して、一次微分値を取得し、ピークスタート点及びピークエンド点の時間情報を取得する工程と、
第五の工程として、前記ピークスタート点及びピークエンド点の時間情報を、前記未処理のクロマトグラムに適応してピークを確定する工程と、
を含んでなる、クロマトグラムのピーク検出方法に関するものである。
【００１０】
また、本発明は第二の工程と第三の工程の間に、前記ベースライン変動のないクロマトグラムに対して平滑化処理を施す工程を含んでいてもよい。
【００１１】
以下に、本発明のピーク検出法を詳細に説明し、図３に工程処理後のクロマトグラムの変化を示す。
【００１２】
（第一の工程）
未処理のクロマトグラムに対してベースラインを差し引く工程を行う。
未処理のクロマトグラムでピークが存在しない領域から複数点をベースポイントとして選択する。次に、前記選択されたベースポイントを数学的に繋ぎ合わせ、仮想のベースラインを取得する処理を行う。数学的処理とは、前記の複数のベースポイント（Ｘｎ：時間、Ｙｎ：検出器出力）を最小二乗法等により近似式を算出すること、あるいはスプライン曲線を算出することを意味する。
【００１３】
近似式として１次式を採用する場合は、ベースポイントは最低で２点以上、望ましくは５点以上選択しておくことが良い。近似式として２次式を採用する場合は、ベースポイントは最低で３点以上、望ましくは５点以上選択しておくことが良い。近似式として３次式を採用する場合は、ベースポイントは最低で４点以上、望ましくは６点以上選択しておくことが良い。また、スプライン曲線を用いる場合は、できるだけ多くのベースポイントを選択しておくことが望ましい（図４参照）。
【００１４】
ベースポイントの選択／設定は、操作者がクロマトグラムを見て任意に行っても良いが、１次微分値の変化が少ない領域を自動絞り込み、自動でベースポイントの選択／設定を行っても良く、選択／設定を限定するものではない。
【００１５】
（第二の工程）
前記工程で得られたベースライン（近似式）を未処理のクロマトグラムから差し引き、ベースライン変動の無いクロマトグラムを取得する。
【００１６】
（平滑化処理工程）
前記ベースライン変動の無いクロマトグラムに対して平滑化処理を施す。本工程は必要に応じて行えば良いため必須の工程ではないが、ノイズ等の影響によるピークの誤検知を抑えることができるため、実施しておくことが好ましい。一般的にクロマトグラムに対する平滑化処理は、目的成分ピークの形状が変化しない程度の処理とするが、本発明では、ピーク形状が若干変化しても最終的な定量計算には影響をほとんど与えないことから、強めの平滑化処理を施しても問題ない。平滑化処理は、移動平均法、ローパスフィルタ等さまざまあるが、方法を限定するものではない。
【００１７】
（第三の工程）
次に、ベースライン変動のないクロマトグラム（平滑化処理工程を行った場合は平滑化されたクロマトグラム）について、出力値が負の場合のみに−１を乗じて又は出力値が正の場合のみに−１を乗じて前記出力値の符号を合わせる。
【００１８】
（第四の工程）
次に、前記出力値の符号を合わせたクロマトグラムに対して、１次微分を採る。一般的なピーク検出法と同様に、事前に設定した閾値と比較し、ピークスタート点及びピークエンド点の時間情報を取得する。図３ｄは閾値として、ピークスタート感度Ｓを５０（ｍＡＢＵ／分）、ピークエンド感度Ｅを−５０（ｍＡＢＵ／分）と設定したものである。
【００１９】
（第五の工程）
次に、前記工程で得られた、ピークスタート点及びピークエンド点の時間情報を、未処理のクロマトグラムに適用し、未処理のクロマトグラムでのピークスタート点（時間、出力）及びピークエンド点（時間、出力）を取得し、それに基づき定量計算（高さ、面積等）を実施する。上述のように、各種処理を実施して取得するのは、ピークスタート点及びピークエンド点の時間情報のみで、その値を未処理のクロマトグラムに適用し、定量計算（高さ、面積等）を実施することから、未処理のクロマトグラムのベース変動やピーク形状に影響を与えることは全くない。また、本発明の目的である、負ピークの検出も確実に行われていることが分かる。
【００２０】
比較のために、一般的な未処理のクロマトグラムに対して、１次微分を取得し、事前に設定した閾値と比較し、ピークスタート点及びピークエンド点の時間情報を取得した場合の結果を図５に示す。閾値は前述と同様に、ピークスタート感度Ｓを５０（ｍＡＢＵ／分）、ピークエンド感度Ｅを−５０（ｍＡＢＵ／分）と設定したものである。図５ｄから分かるように、負のピークとその後に現れる正のピークの領域で、ピーク検出が異常になっており、定量計算に問題が生じている。また７．５分以降の負ピーク及び正ピークの領域では、ピークスタート及びピークエンドが検出できていない。これは、クロマトグラムが正の方向にドリフトしていることが要因である。
【００２１】
上述した通り、本発明のピーク検出方法は、クロマトグラムの出力値の符号を合わせたことで、負ピーク及び正ピークが近傍に存在するクロマトグラムであっても、正確にピーク検出が可能であり、さらに、ベースラインサプレッション処理を盛り込んだことで、ベースラインがドリフトしていたり、うねりがある場合であっても、正確にピーク検出が可能であり、本発明の優位性を示している。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】一般的なピーク検出によるピーク検出結果の一例を示した図である（正ピークのみ）。
【図２】一般的なピーク検出によるピーク検出結果の一例を示した図である（正、負ピーク混在）。
【図３】本発明でのピーク検出によるピーク検出結果の一例を示した図である。図３ａは未処理のクロマトグラム、図３ｂはベースポイントの指定及びベースライン確定工程、図３ｃはベースラインサプレッション、平滑化処理及び信号の出力値の符号を合わせる工程、図３ｄは一次微分結果、図３ｅはピークスタート／エンド位置、図３ｆは最終的なピーク検出結果を示している。
【図４】本発明でのベースポイントの指定及びベースライン確定工程の一例を示した図である。
【図５】一般的なピーク検出によるピーク検出結果の一例を示した図である。図５ａは未処理のクロマトグラム、図５ｂは一次微分結果、図５ｃはピークスタート／エンド位置、図５ｄは最終的なピーク検出結果を示している。
【図６】実施例１、比較例１で使用したシステム構成を示した図である。
【図７】実施例１での本発明でのピーク検出結果を示した図である。図７ａは未処理のクロマトグラム、図７ｂはベースポイントの指定、ベースライン、ベースラインサプレッション、平滑化処理及び信号の出力値の符号合わせを行ったピークスタート／エンド位置を示した図である。図７ｃは前記処理を施した後の１次微分曲線、図７ｄは最終的なピーク検出結果を示している。
【図８】比較例１で用いたクロマトグラムに対して、従来のピーク検出結果を示した図である。図８ａは未処理のクロマトグラム、図８ｂは一次微分結果、図８ｃは最終的なピーク検出結果を示している。
【図９】実施例２、比較例２で使用したシステム構成を示した図である。
【図１０】実施例２での本発明でのピーク検出結果を示した図である。図１０ａは未処理のクロマトグラム、図１０ｂはベースポイントの指定、ベースライン、ベースラインサプレッション、平滑化処理及び信号の出力値の符号合わせを行ったピークスタート／エンド位置をした図である。図１０ｃは前記処理を施した後の１次微分曲線、図１０ｄは最終的なピーク検出結果を示している。
【図１１】比較例２で用いたクロマトグラムに対して、従来のピーク検出結果を示した図である。図１１ａは未処理のクロマトグラム、図１１ｂは一次微分結果、図１１ｃは最終的なピーク検出結果を示している。
【実施例】
【００２３】
本発明の効果を、実際のクロマトグラムを用いて検証を行った。
【００２４】
（実施例１）
ＧＰＣ（分子排除クロマトグラフィー）の系で検証を実施した。図６に示す、液体クロマトグラムシステムを使用し、実際の測定を行った。システムは、溶媒脱気装置（ＳＤ−８０２０）２、サンプル側送液ポンプ（ＤＰ−８０２０）３、リファレンス側送液ポンプ（ＤＰ−８０２０）１０、試料注入装置（ＡＳ−８０２０）４、カラムオーブン（ＣＯ−８０２０）６、示差屈折計（ＲＩ−８０２０）１２、及びデータ処理装置（ＬＣ−８０２０ＩＩ）９で構成した（いずれも、東ソー（株）製）。分析カラム５としては、東ソー（株）製  ＳｕｐｅｒＭｕｌｔｉｐｏｒｅＰＷ−Ｎ（４μｍ  ６．０ｍｍＩ．Ｄ．×１５  ｃｍ×２）を使用し、Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ  Ｋ  １５（ＭＷ：１０，０００、２５ｍｇ／ｍＬ、東京化成工業(株)）の分離を行った。その他の条件は下記の通りである。
注入量：５０ｕＬ、カラム温度：４０℃、サンプル側流速：０．６００  ｍＬ／ｍｉｎ、リファレンス側流速：０．３  ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液：２００ｍＭ  ＮａＮＯ３＋２０％アセトニトリル
【００２５】
図７は、本発明のピーク検出法による、ピーク検出の過程、結果である。図７ａは未処理のクロマトグラム及びベースポイントを示した図である。図７ｂは０分と１２分をベースポイントとし１次式（直線）でベースラインを策定し、未処理のクロマトグラムから差し引き、負の出力値のみに−１を乗じて出力値の符号を合せ、及び単純移動平均法（６１点）により平滑化して得られたクロマトグラムを示した図である。図７ｃは前記処理したクロマトグラムの１次微分曲線及び、ピークスタート点、エンド点を示した図である。図７ｄは前記処理されたクロマトグラムでのピークスタート点（時間）、エンド点（時間）を未処理のクロマトグラムに適用し、ピーク検出を行った図である。
【００２６】
図７ｂで明らかなように、クロマトグラムは全て正の値を持つ曲線に変換されるため、１次微分曲線の変化によるピーク検出が容易に行える。クロマトグラムの１次微分値が０．３ｍＡＢＵ／分を超えた点（時間）をピークスタート（白丸）とし、ピークがスタートしてから−０．３ｍＡＢＵ／分を超えた点（時間）をピークエンド（黒丸）として認識される（図７ｃ）。
【００２７】
表１にその結果を示す。
【００２８】
【表１】
2018116027.tif 000002
【００２９】
前記ピークスタートの時間（１）とピークエンドの時間（４）を未処理のクロマトグラムに適用し、未処理のクロマトグラムでの出力値（３）、（６）を取得した。これにより、未処理のクロマトグラムでのピークスタートは時間（１）と出力（３）、ピークエンドは時間（４）と出力（６）となった（図７ｄ）。これを基に、ピーク面積、高さ等の定量計算を実施した。
【００３０】
表２に本発明のピーク検出法でのピーク検出／定量結果を示す。
【００３１】
【表２】
2018116027.tif 000003
【００３２】
（比較例１）
実施例１で用いたのと同一の未処理のクロマトグラムについて、１次微分をとり、その閾値によりピークスタート及びピークエンドを見つけ、定量計算を実施するという従来の検出法によりピーク検出を行った。なお、ピーク検出感度を０．３ｍＡＢＵ／分と指定し、ピーク検出を行った。つまり、クロマトグラムの１次微分値が０．３ｍＡＢＵ／分を超えた点（時間）をピークスタートとし、ピークがスタートしてから−０．３ｍＡＢＵ／分を超えた点（時間）をピークエンドとして認識される（図８ｂ）。
【００３３】
この結果、従来のピーク検出法では図８ｃの如く、モノマーや添加剤由来のシャープな正のピークから溶媒由来の負のピークの間でピーク検出が異常となる。これは、負ピークの最下点をモノマーや添加剤由来のピークのピークエンド及び、溶媒ピークのピークスタートと認識してしまうことが原因である。
【００３４】
表３に従来のピーク検出法でのピーク検出／定量結果を示す。
【００３５】
【表３】
2018116027.tif 000004
【００３６】
表２と表３を比較して明らかなように、７．２６分に溶出する高分子成分ピークに関しては面積、高さ等の定量値に変化はないが、１０．１８分に溶出する低分子成分ピークでは、従来のピーク検出法では、ピーク高さで３倍、面積で７倍、本発明の方法より大きく計算されてしまう。また溶出時間は、信号が負に転じるポイントをピークトップと判別されるため、正しい値にならない。１０．６４分に溶出する溶媒ピークでは、従来のピーク検出法では正のピークとして判別されることで、面積、高さとも正の値であり、ピークトップも信号が負からゼロになる付近をピークトップと判別されるため、正しい値にならない。本発明の方法では、１０．１８分に溶出する低分子成分ピーク、１０．６４分に溶出する溶媒ピークとも正確に定量できており、本発明の優位性を示している。
【００３７】
（実施例２）
実施例２では、イオンクロマトの系で検証を実施した。図９に示す、液体クロマトグラムシステムを使用し、実際の測定を行った。システムは、溶媒脱気装置（ＳＤ−８０２０）２、送液ポンプ（ＤＰ−８０２０）３、試料注入装置（ＡＳ−８０２０）４、カラムオーブン（ＣＯ−８０２０）６、電気伝導度計（ＣＭ−８０００）７、及びデータ処理装置（ＬＣ−８０２０ＩＩ）９で構成した（いずれも、東ソー（株）製）。分析カラム５としては、東ソー（株）製  ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＩＣ−ＡｎｉｏｎＨＳ（４．６  ｍｍＩＤ×１０ｃｍ＋ガードカラム）を使用し、標準アニオン混合物（２０倍希釈、関東化学(株)）の分離を行った。その他の条件は下記の通りである。
注入量：３０ｕＬ、カラム温度：４０℃、流速：１．５０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液：３．８ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３  ＋  ３．０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ２ＣＯ３  （ｐＨ＝１０．１）
【００３８】
図１０は、本発明のピーク検出法による、ピーク検出の過程、結果である。図１０ａは未処理のクロマトグラム及びベースポイントを示した図である。図１０ｂは０分と５分をベースポイントとし１次式（直線）でベースラインを策定し、未処理のクロマトグラムから差し引き、更に負の出力値のみに−１を乗じて出力値の符号を合せ、及び単純移動平均法（２１点）により平滑化して得られたクロマトグラムを示した図である。図１０ｃは前記処理したクロマトグラムの１次微分曲線及び、ピークスタート点、エンド点を示した図である。図１０ｄは前記処理されたクロマトグラムでのピークスタート点（時間）、エンド点（時間）を未処理のクロマトグラムに適用し、ピーク検出を行った図である。
【００３９】
図１０ｂで明らかなように、クロマトグラムは全て正の値を持つ曲線に変換されるため、１次微分曲線の変化によるピーク検出が容易に行える。クロマトグラムの１次微分値が２．０ｍＡＢＵ／分を超えた点（時間）をピークスタート（白丸）とし、ピークがスタートしてから−２．０ｍＡＢＵ／分を超えた点（時間）をピークエンド（黒丸）として認識される（図１０ｃ）。
【００４０】
表４にその結果を示す。
【００４１】
【表４】
2018116027.tif 000005
【００４２】
前記ピークスタートの時間（１）とピークエンドの時間（４）を未処理のクロマトグラムに適用し、未処理のクロマトグラムでの出力値（３）、（６）を取得する。これにより、未処理のクロマトグラムでのピークスタートは時間（１）と出力（３）、ピークエンドは時間（４）と出力（６）となる（図１０ｄ）。これを基に、ピーク面積、高さ等の定量計算を実施する。
【００４３】
表５に本発明のピーク検出法でのピーク検出／定量結果を示す。
【００４４】
【表５】
2018116027.tif 000006
【００４５】
（比較例２）
実施例２で用いたのと同一の未処理のクロマトグラムについて、１次微分をとり、その閾値によりピークスタート及びピークエンドを見つけ、定量計算を実施するという従来の検出法によりピーク検出を行った。なお、ピーク検出感度は２．０ｍＡＢＵ／分と指定し、ピーク検出を行った。つまり、クロマトグラムの１次微分値が２．０ｍＡＢＵ／分を超えた点（時間）をピークスタートとし、ピークがスタートしてから−２．０ｍＡＢＵ／分を超えた点（時間）をピークエンドとして認識される（図１１ｂ）。
【００４６】
この結果、従来のピーク検出法では図１１ｃの如く、負ピークであるウォーターディップと最初に溶出するＦイオンピークの間でピーク検出が異常となる。これは、負ピークの最下点をピークスタートとし、本来のＦイオンのピークスタートが検知できないことが原因である。このような状態になると、Ｆイオンの定量値が異常となってしまう。
【００４７】
表６に従来のピーク検出法でのピーク検出／定量結果を示す。
【００４８】
【表６】
2018116027.tif 000007
【００４９】
表５と表６を比較して明らかなように、１．８４分以降に溶出するＣｌイオンのピークに関しては面積、高さ等の定量値に変化はないが、１．４４分に溶出するＦイオンのピークでは、従来のピーク検出法では、ピーク高さで７％、面積で１７％、本法より大きく計算されてしまう。本発明の方法では、負のウォーターディップのピークは、負のピークとしてピーク検出及び定量でき、ウォーターディップ直後に溶出するＦイオンのピークでも、正しいピーク検出及び定量できており、本発明の優位性を示している。
【符号の説明】
【００５０】
１．溶離液
２．脱気装置
３．送液ポンプ（サンプル側）
４．試料注入バルブ
５．分析カラム
６．カラム恒温槽
７．示差屈折計
８．廃液
９．システム制御及びデータ処理装置
１０．送液ポンプ（リファレンス側）
１１．抵抗管
１２．電気伝導度計
【図１】
2018116027.tif 000008
【図２】
2018116027.tif 000009
【図３】
2018116027.tif 000010
【図４】
2018116027.tif 000011
【図５】
2018116027.tif 000012
【図６】
2018116027.tif 000013
【図７】
2018116027.tif 000014
【図８】
2018116027.tif 000015
【図９】
2018116027.tif 000016
【図１０】
2018116027.tif 000017
【図１１】
2018116027.tif 000018