(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトヒストンメチルトランスフェラーゼEZH2の野生型及びある特定の変異型の阻害方法の提供。濾胞性リンパ腫及びびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫を含むがんを処置する方法、又は、EZH2の変異型に対する選択的小分子阻害剤を特定する為の方法及び対象におけるEZH2阻害剤に対する反応性を判定する為の方法の提供。【解決手段】特定配列の基質ポケットドメインに変異を含む変異体EZH2を発現している対象に、EZH2阻害剤の治療的有効量を投与する段階を含む、対象におけるがん又は前がん状態の症状を処置又は緩和する為の方法。対象由来のサンプルを提供する段階；特定配列の基質ポケットドメインにおける変異を検出する段階であって、該変異の存在は、対象がEZH2阻害剤に対して反応性であることを示す段階を含む、がん又は前がん状態を有する対象の、EZH2阻害剤に対する反応性を判定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:6に定義される通りの基質ポケットドメインに変異を含む変異体EZH2を発現している対象に、EZH2阻害剤の治療的有効量を投与する段階を含む、対象におけるがんまたは前がん状態の症状を処置または緩和するための方法。
【請求項２】
変異体EZH2が、変異体EZH2ポリペプチドであるか、または変異体EZH2ポリペプチドをコードする核酸配列である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
がんがリンパ腫、白血病、または黒色腫である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
リンパ腫が、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、およびびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫からなる群より選択される、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
白血病が慢性骨髄性白血病(CML)である、請求項3に記載の方法。
【請求項６】
前がん状態が骨髄異形成症候群(MDS、かつては前白血病として知られた)である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
変異体EZH2が、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677、687、674、685、または641に変異を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
変異が、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677における野生型残基アラニン(A)からグリシン(G)への置換(A677G); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置687における野生型残基アラニン(A)からバリン(V)への置換(A687V); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置674における野生型残基バリン(V)からメチオニン(M)への置換(V674M); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からヒスチジン(H)への置換(R685H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からシステイン(C)への置換(R685C); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からフェニルアラニン(F)への置換(Y641F); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からヒスチジン(H)への置換(Y641H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からアスパラギン(N)への置換(Y641N); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からセリン(S)への置換(Y641S); およびSEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からシステイン(C)への置換(Y641C)からなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
EZH2阻害剤が、表1に記載されている化合物から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
a) 対象由来のサンプルを提供する段階; および
b) SEQ ID NO:6に定義される通りのEZH2基質ポケットドメインにおける変異を検出する段階であって、該変異の存在は、対象がEZH2阻害剤に対して反応性であることを示す、段階
を含む、がんまたは前がん状態を有する対象の、EZH2阻害剤に対する反応性を判定する方法。
【請求項１１】
がんがリンパ腫、白血病、または黒色腫である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
リンパ腫が、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、およびびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫からなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
白血病が慢性骨髄性白血病(CML)である、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
前がん状態が骨髄異形成症候群(MDS、かつては前白血病として知られた)である、請求項10に記載の方法。
【請求項１５】
変異が、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677、687、674、685、または641における置換変異である、請求項10に記載の方法。
【請求項１６】
変異が、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677における野生型残基アラニン(A)からグリシン(G)への置換(A677G); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置687における野生型残基アラニン(A)からバリン(V)への置換(A687V); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置674における野生型残基バリン(V)からメチオニン(M)への置換(V674M); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からヒスチジン(H)への置換(R685H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からシステイン(C)への置換(R685C); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からフェニルアラニン(F)への置換(Y641F); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からヒスチジン(H)への置換(Y641H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からアスパラギン(N)への置換(Y641N); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からセリン(S)への置換(Y641S); およびSEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からシステイン(C)への置換(Y641C)からなる群より選択される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
EZH2阻害剤が、表1に記載されている化合物から選択される、請求項10に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連参照
本出願は、2012年3月12日付で出願された米国特許出願第13/418,242号の優先権を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヒストンH3のリジン27 (H3-K27)のモノメチル化からトリメチル化までを触媒するPRC2複合体の触媒サブユニットである、ヒトヒストンメチルトランスフェラーゼEZH2の野生型およびある特定の変異型の阻害、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)を含むがんを処置するための方法ならびに対象におけるEZH2阻害剤に対する反応性を判定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
真核細胞内では、DNAはヒストンとともにパッケージされてクロマチンを形成する。およそ150塩基対のDNAが、ヒストンのオクタマー(ヒストン2A、2B、3および4がそれぞれ2つずつ)の周囲に2回巻きついて、クロマチンの基本単位であるヌクレオソームを形成する。クロマチンの規則正しい構造の変化は、関連する遺伝子の転写の改変につながる可能性がある。この過程は高度に制御される。というのは、遺伝子発現パターンの変化が、分化、増殖およびアポトーシスなどの、基本的な細胞過程に多大な影響を与えうるからである。クロマチン構造の変化の(ゆえに転写の)制御はヒストン、最も顕著にはN末端尾部に対する共有結合修飾によって媒介される。これらの修飾は、遺伝子発現の遺伝的変化をもたらしうるが、DNA自体の配列には影響を与えないので、後成的といわれることも多い。アミノ酸の側鎖の共有結合修飾(例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化およびユビキチン化)は、酵素によって媒介される。
【０００４】
ヒストンの特定のアミノ酸部位へのメチル基の選択的付加は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ(HMT)として知られる独特の酵素ファミリーの作用によって制御される。特定の遺伝子の発現レベルは、関連するヒストン部位での1つまたは複数のメチル基の有無によって影響を受ける。特定のヒストン部位でのメチル基の特異的効果は、ヒストンデメチラーゼによってメチル基が除去されるまで、またはヌクレオソーム代謝回転を通じて修飾ヒストンが置き換えられるまで持続する。同じ方法で、他の酵素類はDNAおよびヒストンを他の化学種で修飾することができ、さらに他の酵素はこれらの種を除去して、遺伝子発現の制御をもたらすことができる。
【０００５】
転写調節の背後にある生化学系の組織的集合体は、細胞増殖および分化を最適に進行させるために厳しく制御されなければならない。これらの制御が、DNAおよびヒストン修飾に関わる酵素の異常な発現および/または活性によって妨げられる場合に、疾患状態が生じる。例えば、ヒトがんでは、後成的な酵素活性の調節不全が、がんと関連する細胞増殖の制御不能、ならびに細胞移動および浸潤の増強のような他のがん関連表現型に寄与することを示唆する証拠が相次いでいる。がんを超えて、代謝性疾患(糖尿病のような)、炎症性疾患(クローン病のような)、神経変性疾患(アルツハイマー病のような)、および心血管疾患を含む、いくつかの他のヒト疾患における後成的酵素の役割に関する証拠が増えている。それゆえ、後成的酵素の異常な作用を選択的に調節することは、さまざまな範囲の疾患の処置にかなり有望である。
【０００６】
ヒストンメチルトランスフェラーゼEZH2
ポリコーム群(PcG)およびトライソラクス群(trxG)タンパク質は、細胞記憶システムの一部であることが知られている。Francis et al. (2001) Nat Rev Mol Cell Biol 2:409-21（非特許文献1）; Simon et al. (2002) Curr Opin Genet Dev 12:210-8（非特許文献2）。両群のタンパク質は、一過性に発現される体節遺伝子によって胚発生初期に確立される、ホメオティックボックス(Hox)遺伝子発現の空間的パターンの維持に関与している。一般に、PcGタンパク質は、「オフ状態」を維持する転写リプレッサであり、trxGタンパク質は、「オン状態」を維持する転写アクチベータである。PcGおよびtrxGタンパク質の成員は、固有のヒストンメチルトランスフェラーゼ(HMTase)活性を含むので、PcGおよびtrxGタンパク質はコアヒストンのメチル化を通じて細胞記憶に関与しうる。Beisel et al. (2002) Nature 419:857-62（非特許文献3）; Cao et al. (2002) Science 298: 1039-43（非特許文献4）; Czermin et al. (2002) Cell 111 :185-96（非特許文献5）; Kuzmichev et al. (2002) Genes Dev 16:2893-905（非特許文献6）; Milne et al. (2002) Mol Cell 10: 1107-17（非特許文献7）; Muller et al. (2002) Cell 111:197-208（非特許文献8）; Nakamura et al. (2002) Mol Cell 10: 1119-28（非特許文献9）。
【０００７】
生化学的および遺伝的研究から、ショウジョウバエ(Drosophila) PcGタンパク質が、複合体の組成は動的でありうるものの、少なくとも2つの異なるタンパク質複合体、つまりポリコーム抑制複合体1 (PRC1)およびESC-E(Z)複合体(ポリコーム抑制複合体2 (PRC2)としても公知)において機能するという証拠が提供されている。Otte et al. (2003) Curr Opin Genet Dev 13:448-54（非特許文献10）。ショウジョウバエ(Czermin et al.（非特許文献5）(前記); Muller et al. （非特許文献8）(前記))および哺乳類細胞(Cao et al.（非特許文献4）(前記); Kuzmichev et al.（非特許文献6）(前記))での研究から、ESC-E(Z)/EED-EZH2 (すなわち、PRC2)複合体が固有のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有することが実証されている。異なるグループにより単離された複合体の組成は、わずかに異なるが、それらには概ね、EED、EZH2、SUZ12およびRbAp48、またはそのショウジョウバエ相同体が含まれる。しかしながら、EED、EZH2およびSUZ12しか含んでいない再構成された複合体が、ヒストンH3のリジン27に対するヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を保持している。米国特許第7,563,589号（特許文献1）(参照により組み入れられる)。
【０００８】
PRC2複合体を構成する各種タンパク質のなかで、EZH2 (Zeste相同体2のエンハンサー(Enhancer of Zeste Homolog 2))が触媒サブユニットである。次にEZH2の触媒部位は、トライソラクス群およびポリコーム群の両方の成員を含めて、いくつかのクロマチン結合タンパク質に見出される高度に保存された配列モチーフ(Su(var)3-9、Zesteのエンハンサー(Enhancer of Zeste)、トライソラクス(Trithorax)にちなんで名付けられた)である、SETドメインのなかに存在する。SETドメインは、H3-K79メチルトランスフェラーゼDOT1を除く、全ての公知のヒストンリジンメチルトランスフェラーゼに特徴的である。
【０００９】
Hox遺伝子サイレンシングに加えて、PRC2を介したヒストンH3-K27のメチル化がX-不活化に関与することが示されている。Plath et al. (2003) Science 300: 131-5（非特許文献11）; Silva et al. (2003) Dev Cell 4:481-95（非特許文献12）。XiへのPRC2複合体の動員およびその後のヒストンH3-K27でのトリメチル化は、X-不活化の初期段階中に起こり、Xist RNAに依存する。さらに、EZH2および関連するそのヒストンH3-K27メチルトランスフェラーゼ活性は、多能性胚盤葉上層細胞および分化した栄養外胚葉を差次的に特徴付けることが見出された。Erhardt et al. (2003) Development 130:4235-48（非特許文献13）)。
【００１０】
多能性胚盤葉上層細胞の後成的修飾パターンの維持におけるEZH2の役割と一致して、Creを介したEZH2の欠失が細胞におけるヒストンH3-K27メチル化の喪失を引き起こす。Erhardt et al.（非特許文献13）(前記)。さらに、前立腺および乳がん細胞株および組織における研究から、EZH2およびSUZ12のレベルとこれらのがんの侵襲性との間の強い相関関係が明らかにされており(Bracken et al. (2003) EMBO J 22:5323-35（非特許文献14）; Kirmizis et al. (2003) Mol Cancer Ther 2:113-21（非特許文献15）; Kleer et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100: 11606-11（非特許文献16）; Varambally et al. (2002) Nature 419:624-9（非特許文献17）)、PRC2複合体の機能不全が、がんに寄与する可能性のあることが示唆される。
【００１１】
最近になって、EZH2の体細胞変異は、濾胞性リンパ腫(FL)および胚中心B細胞様(GCB)サブタイプのびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)と関連していることが報告された。Morin et al. (2010) Nat Genet 42:181-5（非特許文献18）。いかなる場合でも、変異体EZH2遺伝子の出現は、ヘテロ接合性であることが分かり、野生型および変異体の両方の対立遺伝子の発現が、トランスクリプトーム配列決定によりプロファイルした変異体サンプルにおいて検出された。現在、DLBCLの大部分の症例の処置に向けた標準的治療は、 R-CHOPレジメンである。しかしながら、このレジメンの転帰は満足には程遠い。それゆえ、対象の遺伝子プロファイルに任意で基づいた新規かつ有効な治療法を特定する医学的必要性が大いにある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第7,563,589号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Francis et al. (2001) Nat Rev Mol Cell Biol 2:409-21
【非特許文献２】Simon et al. (2002) Curr Opin Genet Dev 12:210-8
【非特許文献３】Beisel et al. (2002) Nature 419:857-62
【非特許文献４】Cao et al. (2002) Science 298:1039-43
【非特許文献５】Czermin et al. (2002) Cell 111:185-96
【非特許文献６】Kuzmichev et al. (2002) Genes Dev 16:2893-905
【非特許文献７】Milne et al. (2002) Mol Cell 10:1107-17
【非特許文献８】Muller et al. (2002) Cell 111:197-208
【非特許文献９】Nakamura et al. (2002) Mol Cell 10:1119-28
【非特許文献１０】Otte et al. (2003) Curr Opin Genet Dev 13:448-54
【非特許文献１１】Plath et al. (2003) Science 300:131-5
【非特許文献１２】Silva et al. (2003) Dev Cell 4:481-95
【非特許文献１３】Erhardt et al. (2003) Development 130:4235-48
【非特許文献１４】Bracken et al. (2003) EMBO J 22:5323-35
【非特許文献１５】Kirmizis et al. (2003) Mol Cancer Ther 2:113-21
【非特許文献１６】Kleer et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100: 11606-11
【非特許文献１７】Varambally et al. (2002) Nature 419:624-9
【非特許文献１８】Morin et al. (2010) Nat Genet 42:181-5
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、ある特定のEZH2変異体を発現している細胞が、野生型EZH2を発現している細胞よりもEZH2阻害剤に対して反応性であるという発見に基づく。
【００１５】
本発明は、SEQ ID NO:6に定義される通りの基質ポケットドメインに変異を含む変異体EZH2を発現している対象に、EZH2阻害剤の治療的有効量を投与する、対象におけるがんまたは前がん状態の症状を処置または緩和するための方法を特徴とする。
【００１６】
本発明はまた、対象由来のサンプルを提供すること; およびSEQ ID NO:6に定義される通りのEZH2基質ポケットドメインにおける変異を検出すること; および該変異の存在は、対象がEZH2阻害剤に対して反応性であることを示すことにより、がんまたは前がん状態を有する対象の、EZH2阻害剤に対する反応性を判定する方法(またはインビトロの方法)を特徴とする。
【００１７】
本発明はまた、SEQ ID NO:6に定義される通りの基質ポケットドメインに変異を含む変異体EZH2を発現している対象においてがんまたは前がん状態の症状を処置または緩和するための医薬の製造における、治療的有効量のEZH2阻害剤の使用を提供する。
【００１８】
本発明の変異体EZH2は、変異体EZH2ポリペプチドであるか、または変異体EZH2ポリペプチドをコードする核酸配列である。好ましくは、変異体EZH2は、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677、687、674、685、または641に変異を含む。より好ましくは、変異は、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677における野生型残基アラニン(A)からグリシン(G)への置換(A677G); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置687における野生型残基アラニン(A)からバリン(V)への置換(A687V); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置674における野生型残基バリン(V)からメチオニン(M)への置換(V674M); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からヒスチジン(H)への置換(R685H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からシステイン(C)への置換(R685C); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からフェニルアラニン(F)への置換(Y641F); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からヒスチジン(H)への置換(Y641H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からアスパラギン(N)への置換(Y641N); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からセリン(S)への置換(Y641S); およびSEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からシステイン(C)への置換(Y641C)からなる群より選択される。
【００１９】
本発明の対象は、がんもしくは前がん状態と診断されたか、がんもしくは前がん状態の症状を有するか、またはがんもしくは前がん状態を発症するリスクがある任意のヒト対象を含む。例えば、がんはリンパ腫、白血病、または黒色腫である。好ましくは、リンパ腫は非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、またはびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫である。あるいは、白血病は慢性骨髄性白血病(CML)である。前がん状態は骨髄異形成症候群(MDS、かつては前白血病として知られた)である。
【００２０】
本発明の方法に好ましいEZH2阻害剤は、表1に記載されている化合物から選択される。
【００２１】
他に定義されていなければ、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において、文脈上別段の明確な記載がない限り、単数形は複数形も含む。本発明の実践または試験において本明細書に記述したものと類似または同等の方法および材料を用いることができるが、適した方法および材料を以下に記述する。本明細書において言及した全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照により組み入れられる。本明細書において引用される参考文献は、特許請求される発明に対する先行技術であるものと承認されるものではない。矛盾する場合には、定義を含めて、本明細書が優先される。さらに、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定するものであると意図されない。
【００２２】
[本発明1001]
SEQ ID NO:6に定義される通りの基質ポケットドメインに変異を含む変異体EZH2を発現している対象に、EZH2阻害剤の治療的有効量を投与する段階を含む、対象におけるがんまたは前がん状態の症状を処置または緩和するための方法。
[本発明1002]
変異体EZH2が、変異体EZH2ポリペプチドであるか、または変異体EZH2ポリペプチドをコードする核酸配列である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
がんがリンパ腫、白血病、または黒色腫である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
リンパ腫が、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、およびびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫からなる群より選択される、本発明1003の方法。
[本発明1005]
白血病が慢性骨髄性白血病(CML)である、本発明1003の方法。
[本発明1006]
前がん状態が骨髄異形成症候群(MDS、かつては前白血病として知られた)である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
変異体EZH2が、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677、687、674、685、または641に変異を含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
変異が、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677における野生型残基アラニン(A)からグリシン(G)への置換(A677G); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置687における野生型残基アラニン(A)からバリン(V)への置換(A687V); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置674における野生型残基バリン(V)からメチオニン(M)への置換(V674M); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からヒスチジン(H)への置換(R685H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からシステイン(C)への置換(R685C); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からフェニルアラニン(F)への置換(Y641F); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からヒスチジン(H)への置換(Y641H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からアスパラギン(N)への置換(Y641N); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からセリン(S)への置換(Y641S); およびSEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からシステイン(C)への置換(Y641C)からなる群より選択される、本発明1007の方法。
[本発明1009]
EZH2阻害剤が、表1に記載されている化合物から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1010]
a) 対象由来のサンプルを提供する段階; および
b) SEQ ID NO:6に定義される通りのEZH2基質ポケットドメインにおける変異を検出する段階であって、該変異の存在は、対象がEZH2阻害剤に対して反応性であることを示す、段階
を含む、がんまたは前がん状態を有する対象の、EZH2阻害剤に対する反応性を判定する方法。
[本発明1011]
がんがリンパ腫、白血病、または黒色腫である、本発明1010の方法。
[本発明1012]
リンパ腫が、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、およびびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫からなる群より選択される、本発明1011の方法。
[本発明1013]
白血病が慢性骨髄性白血病(CML)である、本発明1011の方法。
[本発明1014]
前がん状態が骨髄異形成症候群(MDS、かつては前白血病として知られた)である、本発明1010の方法。
[本発明1015]
変異が、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677、687、674、685、または641における置換変異である、本発明1010の方法。
[本発明1016]
変異が、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677における野生型残基アラニン(A)からグリシン(G)への置換(A677G); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置687における野生型残基アラニン(A)からバリン(V)への置換(A687V); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置674における野生型残基バリン(V)からメチオニン(M)への置換(V674M); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からヒスチジン(H)への置換(R685H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からシステイン(C)への置換(R685C); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からフェニルアラニン(F)への置換(Y641F); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からヒスチジン(H)への置換(Y641H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からアスパラギン(N)への置換(Y641N); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からセリン(S)への置換(Y641S); およびSEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からシステイン(C)への置換(Y641C)からなる群より選択される、本発明1015の方法。
[本発明1017]
EZH2阻害剤が、表1に記載されている化合物から選択される、本発明1010の方法。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】EZH2のB細胞性リンパ腫関連変異体が、活性なヒストンメチルトランスフェラーゼであることを確証する、2つのグラフである。EZH2の野生型および各種Y641変異体を含んだPRC2複合体のインビトロでのメチルトランスフェラーゼ活性を、(A) 基質としてペプチド(H3 21-44)を用いたメチル転移反応として、および(B) 基質として鳥類ヌクレオソーム用いたメチル転移反応として測定した。記号: 野生型(●)、Y641F (○)、Y641H (□)、Y641N (■)およびY641S (▲)。CPMはカウント毎分であり、3H放射線の結果としてのシンチレーション計数をいう。
【図２】変異体EZH2を含んだPRC2複合体がヒストンH3-K27のジメチル化およびトリメチル化を選択的に触媒することを確証する4つのグラフである。(A) 非メチル化ペプチド(白バー)、モノメチル化ペプチド(ハッシュバー)およびジメチル化ペプチド(黒バー)に対する変異体および野生型(WT)複合体のメチルトランスフェラーゼ活性。(B) K1/2によって判断した場合のペプチド基質に対する親和性は、野生型(○)、Y641F (●)、Y641H (□)、Y641N (■)およびY641S (▲) EZH2を含んだPRC2複合体に対し全てのペプチドメチル化状態にわたって類似である。全ての基質および全ての酵素形態にわたってK1/2値のバラツキが3.5倍未満であることに留意されたい。基質のいずれか特定のメチル化状態に対し、K1/2値のバラツキは2倍未満である。(C) 酵素代謝回転数(kcat)は、EZH2のWTおよびY641変異体に対して反対に基質メチル化状態で異なる。kcatは、野生型(○)の場合にはK27メチル化状態の増加とともに減少するが、しかしEZH2のY641F (●)、Y641H (□)、□  Y641N (■)およびY641S (▲)変異体の場合には増加する。(D) 触媒効率(kcat/K1/2)は野生型(○)の場合にはK27メチル化状態の増加とともに減少するが、しかしEZH2のY641F (●)、Y641H (□)、Y641N (■)およびY641S (▲)変異体の場合には増加する。パネルB〜Dにおいて、データ点を結び付けるように描かれた線は、何ら数学的関係を意味するよう意図されるものではない; むしろ、それらは視覚資料として役立つよう意図されるにすぎない。
【図３】図3Aは、異なるEZH2変異体を含んだ細胞に対して予測される相対的なH3-K27me3 (上パネル)、H3-K27me2 (中パネル)およびH3-K27me1 (下パネル)のレベルを示す3つのグラフである。共役酵素定常状態速度式および表2に示されている定常状態反応速度パラメータを用いて、模擬実験を行った。全ての値は、ホモ接合性WT EZH2を含んだ細胞と相対的であり、Kmに対しての、細胞内SAMの飽和濃度、およびKmと相似の細胞内ヌクレオソーム濃度を前提としている。図3Bは、WT EZH2についてホモ接合性、または表示のEZH2 Y641変異についてヘテロ接合性のリンパ腫細胞株に対するH3-K27メチル化状態の相対的パターンに関する一連のウエスタンブロット分析である。上から下へとパネルは、全EZH2に特異的な抗体; H3-K27me3に特異的な抗体; H3-K27me2に特異的な抗体; H3-K27me1に特異的な抗体; および添加対照として全ヒストンH3に特異的な抗体でプローブした結果を示す。
【図４】がんでのヒストンH3-K27に対する異常に高いトリメチル化レベルにつながる選択し提唱した機構を示す。これらには、a) 非メチル化ヒストンH3-K27からモノメチル化ヒストンH3-K27およびジメチル化ヒストンH3-K27への基質選好性の変化をもたらすEZH2におけるY641の変異; b) EZH2の過剰発現; c) H3-K27me3の脱メチルの減少を引き起こす、酵素機能を不活化するUTXにおける変異; ならびにd) 特異的遺伝子へのPRC2複合体の動員の増加およびヒストンH3-K27トリメチル化の増加につながるPRC2複合体サブユニットPHF19/PCL3の過剰発現が含まれる。全4つのモデルにおいて、改変は、がんでの重要な遺伝子の転写抑制を引き起こす、遺伝子の近位プロモーター領域における異常なヒストンH3-K27トリメチル化をもたらす。
【図５】5成分PRC2複合体の各々の発現レベルが変異体EZH2および野生型EZH2で類似していることを示したSDS-PAGEゲルを示す。
【図６】変異体および野生型(WT) PRC2複合体がH3-K27含有ペプチドに対して強い基質選好性を呈することを示した一対の表。H3およびH4の全てを網羅した重複する15merのペプチドのパネルに対して、各酵素を試験した。活性は速度(CPM/分)として測定されており、報告値は各反応に対する2回の独立した定量の平均に相当する。複合体の全てに対して、最も好適なペプチドはH3:16-30であった。WT複合体はこのペプチドに対して、変異体複合体のいずれよりも6倍超高い活性を有していた。
【図７】EZH2 WTおよびEZH2のY641変異体に対するS-アデノシル-L-ホモシステイン(SAH)の阻害効力を示すグラフである。X軸はSAHのlog濃度を示し; Y軸は阻害率(%)を示す。
【図８】EZH2 WTおよびEZH2のY641変異体に対する化合物75の阻害効力を示すグラフである。X軸は化合物75のlog濃度を示し; Y軸は阻害率(%)を示す。
【図９】WTまたはY641変異体EZH2を発現する複数のDLBCL系列を含む、細胞株パネル(pane)でのH3-K27me1、me2およびme3の相対レベルのウエスタンブロット分析を示す。ヒストンを表示の細胞株から抽出し、4〜20%ゲルでのSDS-PAGEによって分画し、ニトロセルロース膜に転写し、ヒストンH3、H3-K27me1、me2またはme3に対する抗体でプローブした。
【図１０】WTおよびY641変異体リンパ腫細胞株のパネルにおけるH3およびH3-K27me3レベルの免疫細胞化学分析を示す。表示した細胞株由来の細胞ペレットを固定し、パラフィン包埋した。スライドを調製し、ヒストンH3またはH3-K27me3に対する抗体を用いた免疫細胞化学によってH3およびH3-K27me3のレベルを評価した。
【図１１】WTおよびY641変異体リンパ腫細胞株のパネルにおけるH3およびH3-K27me2レベルの免疫細胞化学分析を示す。表示した細胞株由来の細胞ペレットを固定し、パラフィン包埋した。スライドを調製し、ヒストンH3またはH3-K27me2に対する抗体を用いた免疫細胞化学によってH3およびH3-K27me2のレベルを評価した。
【図１２】Y641変異体WSU-DLCL2細胞におけるEZH2阻害剤での処理による全体的なH3-K27me3レベルの阻害を示す図である。WSU-DLCL2細胞を表示濃度のEZH2阻害剤AまたはBで4日間処理した。化合物での処理の後、ヒストンを抽出し、4〜20%ゲルでのSDS-PAGEによって分画し、ニトロセルロース膜に転写し、ヒストンH3またはH3-K27me3に対する抗体でプローブした。
【図１３】EZH2阻害剤はY641変異体WSU-DLCL2細胞の増殖を遮断できるが、しかし非Y641変異体OCI-LY19細胞にはほとんど効果を及ぼさないことを示したグラフである。細胞を11日間、漸増濃度のEZH2阻害剤AまたはBの存在下でインキュベートした。媒体(DMSO)処理細胞を対照として含めた。Guava EasyCyte Plus機器でのGuava Viacountアッセイを用いて、細胞数および生存性を判定した。細胞は分割し、培地および化合物は3〜4日ごとに補充した。
【図１４】EZH2 (Y641)変異の存在ならびに/または高H3-K27me3レベルおよび低H3-K27me2レベルによってEZH2阻害剤に対する感受性が予測されることを示したグラフである。細胞株を最大25 μMまでの漸増濃度の1つのEZH2阻害剤の存在下で維持した。生存細胞のカウントを用いて、処理11日後のIC90値を導出した。EZH2変異状態にしたがって分けた(A)、またはH3-K27me2およびH3-K27me3レベルにしたがって分けた(B)細胞株で、結果をプロットしてある。両プロットにおいて、直線は、表示した細胞株の群由来の平均IC90値を示す。
【図１５】野生型EZH2、A677G EZH2またはA687V EZH2について測定された速度 対 酵素濃度を示すグラフのパネルである。無メチルリジン27、モノメチルリジン27、ジメチルリジン27またはトリメチルリジン27を含んだヒストンH3の21〜44番目の残基に相当するビオチン化ペプチド(H3K27me0〜H3K27me3)を固定濃度で、表示したEZH2酵素の希釈系列によりアッセイした。90分にわたっていくつかの時点でサンプリングを行い、H3ペプチドのリジン27の位置での3H-SAMの取込みを、Flashplateでのペプチドの捕捉およびカウント毎分(CPM)の読取りによって測定した。時間経過の直線回帰により、酵素濃度の関数としてプロットされた毎分のCPM (CPM/分)単位の酵素速度を得た。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
詳細な説明
クロマチン構造は、遺伝子調節および後成的遺伝において重要である。ヒストンの翻訳後修飾、例えばメチル化は、高次クロマチン構造の確立および維持に関わっている。
【００２５】
EZH2変異体
EZH2は、ヒストンH3のリジン27 (H3-K27)のモノメチル化からトリメチル化までを触媒するPRC2複合体の触媒サブユニットである、ヒストンメチルトランスフェラーゼである。
【００２６】
EZH2の単一のアミノ酸残基(例えばTyr641、本明細書においてY641といわれる)でのEZH2遺伝子の点突然変異は、ヒトB細胞性リンパ腫のサブセットと関連していることが報告されている。Morin et al. (2010) Nat Genet 42(2): 181-5。具体的には、Morinらは、EZH2のチロシン641の体細胞変異(Y641F、Y641H、Y641N、およびY641S)が濾胞性リンパ腫(FL)および胚中心B細胞様(GCB)サブタイプのびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)と関連していることを報告した。変異対立遺伝子は疾患細胞において野生型対立遺伝子と結び付けられて常に見出され(ヘテロ接合性)、変異は、非修飾ペプチド基質をメチル化するためのPRC2複合体の酵素活性を取り除くと報告された。
【００２７】
本発明は、一つには、EZH2変異体を発現している細胞が野生型EZH2を発現している細胞よりも本発明のEZH2阻害剤に対して感受性であるという驚くべき発見に基づく。したがって、本発明の局面は、EZH2阻害剤の治療的有効量を、変異体EZH2を発現している対象に投与することにより、対象におけるがんまたは前がん状態の症状を処置または緩和するための方法に関する。本発明の変異体EZH2は、変異体EZH2ポリペプチドか、または変異体EZH2ポリペプチドをコードする核酸配列をいう。好ましくは、変異体EZH2は、SEQ ID NO:6に定義される通りのその基質ポケットドメインにおいて1つまたは複数の変異を含む。例えば、変異は、置換、点突然変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異、欠失、または挿入でありうる。例示的な置換アミノ酸変異としては、限定されるものではないが、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677における野生型残基アラニン(A)からグリシン(G)への置換(A677G); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置687における野生型残基アラニン(A)からバリン(V)への置換(A687V); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置674における野生型残基バリン(V)からメチオニン(M)への置換(V674M); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からヒスチジン(H)への置換(R685H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からシステイン(C)への置換(R685C); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からフェニルアラニン(F)への置換(Y641F); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からヒスチジン(H)への置換(Y641H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からアスパラギン(N)への置換(Y641N); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からセリン(S)への置換(Y641S); またはSEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からシステイン(C)への置換(Y641C)のような、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677、687、674、685、または641における置換が挙げられる。
【００２８】
本発明の変異はまた、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置322における野生型残基アスパラギン(N)からセリン(S)への置換(N322S)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置288における野生型残基アルギニン(R)からグルタミン(Q)への置換(R288Q)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置573における野生型残基トレオニン(T)からイソロイシン(I)への置換(T573I)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置664における野生型残基アスパラギン酸(D)からグルタミン酸(E)への置換(D664E)、SEQ ID NO:5のアミノ酸位置458における野生型残基アルギニン(R)からグルタミン(Q)への置換(R458Q)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置249における野生型残基グルタミン酸(E)からリジン(K)への置換(E249K)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置684における野生型残基アルギニン(R)からシステイン(C)への置換(R684C)、SEQ ID NO:21のアミノ酸位置628における野生型残基アルギニン(R)からヒスチジン(H)への置換(R628H)、SEQ ID NO:5のアミノ酸位置501における野生型残基グルタミン(Q)からヒスチジン(H)への置換(Q501H)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置192における野生型残基アスパラギン酸(D)からアスパラギン(N)への置換(D192N)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置664における野生型残基アスパラギン酸(D)からバリン(V)への置換(D664V)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置704における野生型残基バリン(V)からロイシン(L)への置換(V704L)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置132における野生型残基プロリン(P)からセリン(S)への置換(P132S)、SEQ ID NO:21のアミノ酸位置669における野生型残基グルタミン酸(E)からリジン(K)への置換(E669K)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置255における野生型残基アラニン(A)からトレオニン(T)への置換(A255T)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置726における野生型残基グルタミン酸(E)からバリン(V)への置換(E726V)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置571における野生型残基システイン(C)からチロシン(Y)への置換(C571Y)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置145における野生型残基フェニルアラニン(F)からシステイン(C)への置換(F145C)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置693における野生型残基アスパラギン(N)からトレオニン(T)への置換(N693T)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置145における野生型残基フェニルアラニン(F)からセリン(S)への置換(F145S)、SEQ ID NO:21のアミノ酸位置109における野生型残基グルタミン(Q)からヒスチジン(H)への置換(Q109H)、SEQ ID NO:21のアミノ酸位置622における野生型残基フェニルアラニン(F)からシステイン(C)への置換(F622C)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置135における野生型残基グリシン(G)からアルギニン(R)への置換(G135R)、SEQ ID NO:5のアミノ酸位置168における野生型残基アルギニン(R)からグルタミン(Q)への置換(R168Q)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置159における野生型残基グリシン(G)からアルギニン(R)への置換(G159R)、SEQ ID NO:5のアミノ酸位置310における野生型残基アルギニン(R)からシステイン(C)への置換(R310C)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置561における野生型残基アルギニン(R)からヒスチジン(H)への置換(R561H)、SEQ ID NO:21のアミノ酸位置634における野生型残基アルギニン(R)からヒスチジン(H)への置換(R634H)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置660における野生型残基グリシン(G)からアルギニン(R)への置換(G660R)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置181における野生型残基チロシン(Y)からシステイン(C)への置換(Y181C)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置297における野生型残基ヒスチジン(H)からアルギニン(R)への置換(H297R)、SEQ ID NO:21のアミノ酸位置612における野生型残基システイン(C)からセリン(S)への置換(C612S)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置694���おける野生型残基ヒスチジン(H)からチロシン(Y)への置換(H694Y)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置664における野生型残基アスパラギン酸(D)からアラニン(A)への置換(D664A)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置150における野生型残基イソロイシン(I)からトレオニン(T)への置換(I150T)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置264における野生型残基イソロイシン(I)からアルギニン(R)への置換(I264R)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置636における野生型残基プロリン(P)からロイシン(L)への置換(P636L)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置713における野生型残基イソロイシン(I)からトレオニン(T)への置換(I713T)、SEQ ID NO:5のアミノ酸位置501における野生型残基グルタミン(Q)からプロリン(P)への置換(Q501P)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置243における野生型残基リジン(K)からグルタミン(Q)への置換(K243Q)、SEQ ID NO:5のアミノ酸位置130における野生型残基グルタミン酸(E)からアスパラギン酸(D)への置換(E130D)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置509における野生型残基アルギニン(R)からグリシン(G)への置換(R509G)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置566における野生型残基アルギニン(R)からヒスチジン(H)への置換(R566H)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置677における野生型残基アスパラギン酸(D)からヒスチジン(H)への置換(D677H)、SEQ ID NO:5のアミノ酸位置466における野生型残基リジン(K)からアスパラギン(N)への置換(K466N)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置78における野生型残基アルギニン(R)からヒスチジン(H)への置換(R78H)、SEQ ID NO:6のアミノ酸位置1における野生型残基リジン(K)からメチオニン(M)への置換(K6M)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置538における野生型残基セリン(S)からロイシン(L)への置換(S538L)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置149における野生型残基ロイシン(L)からグルタミン(Q)への置換(L149Q)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置252における野生型残基ロイシン(L)からバリン(V)への置換(L252V)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置674における野生型残基ロイシン(L)からバリン(V)への置換(L674V)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置656における野生型残基アラニン(A)からバリン(V)への置換(A656V)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置731における野生型残基アラニン(A)からアスパラギン酸(D)への置換(Y731D)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置345における野生型残基アラニン(A)からトレオニン(T)への置換(A345T)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置244における野生型残基アラニン(A)からアスパラギン酸(D)への置換(Y244D)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置576における野生型残基システイン(C)からトリプトファン(W)への置換(C576W)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置640における野生型残基アスパラギン(N)からリジン(K)への置換(N640K)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置675における野生型残基アスパラギン(N)からリジン(K)への置換(N675K)、SEQ ID NO:21のアミノ酸位置579における野生型残基アスパラギン酸(D)からチロシン(Y)への置換(D579Y)、SEQ ID NO:3のアミノ酸位置693における野生型残基アスパラギン(N)からイソロイシン(I)への置換(N693I)、およびSEQ ID NO:3のアミノ酸位置693における野生型残基アスパラギン(N)からリジン(K)への置換(N693K)を含みうる。
【００２９】
本発明の変異は、SEQ ID NO:3、5もしくは21のアミノ酸位置730、391、461、441、235、254、564、662、715、405、685、64、73、656、718、374、592、505、730、もしくは363でのフレームシフト、またはSEQ ID NO:3、5もしくは21をコードする核酸配列の、対応するヌクレオチド位置でのフレームシフトでありうる。EZH2の変異はまた、SEQ ID NO:3、5または21のアミノ酸位置148と149との間のグルタミン酸(E)の挿入でありうる。EZH2の変異の別の例は、SEQ ID NO:3、5または21のアミノ酸位置148および149のグルタミン酸(E)およびロイシン(L)の欠失である。変異体EZH2は、SEQ ID NO:3、5または21のアミノ酸位置733、25、317、62、553、328、58、207、123、63、137、または60にナンセンス変異をさらに含みうる。
【００３０】
また、野生型(WT)EZH2酵素は、H3-K27の非メチル化からモノメチル化反応の場合には最も高い触媒効率(kcat/K)を示し、後続(モノメチル化からジメチル化およびジメチル化からトリメチル化)の反応の場合には低い効率を示し; その一方で、全く対照的に、疾患に関連するY641変異は、最初のメチル化反応を行う能力が非常に限られていることを示すものの、しかし野生型酵素と比べて後続の反応に対して増強された触媒効率を有することが意外にも発見された。これらの結果から、疾患の悪性表現型では、トリメチル化形態(H3-K27me3)へのH3-K27の変換の増大のために、変異体EZH2を含んだPRC2とともにH3-K27モノメチル化酵素(WT EZH2またはEZH1を含んだPRC2)の複合活性が利用されることが暗示される。したがって、本発明の局面は、EZH2のある特定の変異型を含む、EZH2の活性を阻害することに関する。1つの態様において、本発明は、EZH2のある特定の変異型の活性を選択的に阻害することに関する。
【００３１】
いずれかの1つの理論によって束縛されることを意図するわけではないが、EZH2のその基質ポケットドメインにおける変異は、酵素-二基質三重複合体の活性部位でのH結合パターンおよび/または立体的な込み合いに影響を与え、反応性リジンの脱プロトン化に適した水チャネルの形成に影響を及ぼすことによって複数ラウンドのH3-K27メチル化を促進しうるという仮説が立てられている。
【００３２】
ヒトEZH2の核酸およびポリペプチドはこれまでに記述されている。例えば、Chen et al. (1996) Genomics 38:30-7 [746アミノ酸]; Swiss-Protアクセッション番号Q15910 [746アミノ酸]; GenBankアクセッション番号NM_004456およびNP_004447 (アイソフォームa [751アミノ酸]); ならびにGenBankアクセッション番号NM_152998およびNP_694543 (アイソフォームb [707アミノ酸])を参照されたく、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００３３】
2018083821.tif 000002
【００３４】
2018083821.tif 000003
【００３５】
2018083821.tif 000004
【００３６】
2018083821.tif 000005
【００３７】
2018083821.tif 000006
【００３８】
2018083821.tif 000007
【００３９】
2018083821.tif 000008
【００４０】
核内受容体結合SETドメインタンパク質1 (NSD1)のA鎖に基づく部分的EZH2タンパク質の構造モデルを、以下に提供する。このモデルは、SEQ ID NO:1のEZH2配列の533〜732番目のアミノ酸残基に相当する。
2018083821.tif 000009
【００４１】
この構造モデルの、対応するアミノ酸配列を以下に提供する。基質ポケットドメイン中の残基に下線を引いてある。SETドメイン中の残基は斜字体で示してある。
2018083821.tif 000010
【００４２】
EZH2の触媒部位は、SETドメインとして知られるタンパク質の保存ドメインにあるものと考えられる。EZH2のSETドメインのアミノ酸配列は、Swiss-Protアクセッション番号Q15910 (SEQ ID NO: 1)の613〜726番目のアミノ酸残基にわたる以下の部分配列によって提供される:
2018083821.tif 000011
。SEQ ID NO: 7において下線を引いて示したチロシン(Y)残基は、Swiss-Protアクセッション番号Q15910 (SEQ ID NO: 1)におけるTyr641 (Y641)である。
【００４３】
GenBankアクセッション番号NP_004447 (SEQ ID NO: 3)のSETドメインは、618〜731番目のアミノ酸残基にわたっており、かつSEQ ID NO:6と同一である。SEQ ID NO: 7において下線を引いて示したSwiss-Protアクセッション番号Q15910におけるY641に対応するチロシン残基は、GenBankアクセッション番号NP_004447 (SEQ ID NO: 3)におけるTyr646 (Y646)である。
【００４４】
GenBankアクセッション番号NP_694543 (SEQ ID NO: 5)のSETドメインは、574〜687番目のアミノ酸残基にわたっており、かつSEQ ID NO: 7と同一である。SEQ ID NO: 7において下線を引いて示したSwiss-Protアクセッション番号Q15910におけるY641に対応するチロシン残基は、GenBankアクセッション番号NP_694543 (SEQ ID NO: 5)におけるTyr602 (Y602)である。
【００４５】
GenBankアクセッション番号NP_004447のSETドメインをコードするヌクレオチド配列は
2018083821.tif 000012
であり、ここでY641をコードするコドンに下線を引いて示す。
【００４６】
本出願の目的上、ヒトEZH2のアミノ酸残基Y641は、Swiss-Protアクセッション番号Q15910におけるY641であるか、またはそれに対応するチロシン残基をいうものと理解されたい。
【００４７】
2018083821.tif 000013
【００４８】
また、本出願の目的上、ヒトEZH2のY641変異体、および同様の意味でEZH2のY641変異体は、野生型ヒトEZH2のY641に対応するアミノ酸残基がチロシン以外のアミノ酸残基によって置換されているヒトEZH2をいうものと理解されたい。
【００４９】
1つの態様において、EZH2のY641変異体のアミノ酸配列は、チロシン以外のアミノ酸残基による、野生型ヒトEZH2のY641に対応する単一のアミノ酸残基の置換によってのみ野生型ヒトEZH2のアミノ酸配列と異なる。
【００５０】
1つの態様において、EZH2のY641変異体のアミノ酸配列は、野生型ヒトEZH2のY641に対応する単一のアミノ酸残基の、フェニルアラニン(F)への置換によってのみ野生型ヒトEZH2のアミノ酸配列と異なる。この態様によるEZH2のY641変異体は、本明細書においてY641F変異体、または同様の意味でY641Fといわれる。
【００５１】
2018083821.tif 000014
【００５２】
1つの態様において、EZH2のY641変異体のアミノ酸配列は、野生型ヒトEZH2のY641に対応する単一のアミノ酸残基の、ヒスチジン(H)への置換によってのみ野生型ヒトEZH2のアミノ酸配列と異なる。この態様によるEZH2のY641変異体は、本明細書においてY641H変異体、または同様の意味でY641Hといわれる。
【００５３】
2018083821.tif 000015
【００５４】
1つの態様において、EZH2のY641変異体のアミノ酸配列は、野生型ヒトEZH2のY641に対応する単一のアミノ酸残基の、アスパラギン(N)への置換によってのみ野生型ヒトEZH2のアミノ酸配列と異なる。この態様によるEZH2のY641変異体は、本明細書においてY641N変異体、または同様の意味でY641Nといわれる。
【００５５】
2018083821.tif 000016
【００５６】
1つの態様において、EZH2のY641変異体のアミノ酸配列は、野生型ヒトEZH2のY641に対応する単一のアミノ酸残基の、セリン(S)への置換によってのみ野生型ヒトEZH2のアミノ酸配列と異なる。この態様によるEZH2のY641変異体は、本明細書においてY641S変異体、または同様の意味でY641Sといわれる。
【００５７】
2018083821.tif 000017
【００５８】
1つの態様において、EZH2のY641変異体のアミノ酸配列は、野生型ヒトEZH2のY641に対応する単一のアミノ酸残基の、システイン(C)への置換によってのみ野生型ヒトEZH2のアミノ酸配列と異なる。この態様によるEZH2のY641変異体は、本明細書においてY641C変異体、または同様の意味でY641Cといわれる。
【００５９】
2018083821.tif 000018
【００６０】
1つの態様において、EZH2のA677変異体のアミノ酸配列は、野生型ヒトEZH2のA677に対応する単一のアミノ酸残基の、アラニン以外のアミノ酸、好ましくはグリシン(G)への置換によってのみ野生型ヒトEZH2のアミノ酸配列と異なる。この態様によるEZH2のA677変異体は、本明細書においてA677変異体、および好ましくはA677G変異体、または同様の意味でA677Gといわれる。
【００６１】
2018083821.tif 000019
【００６２】
1つの態様において、EZH2のA687変異体のアミノ酸配列は、野生型ヒトEZH2のA687に対応する単一のアミノ酸残基の、アラニン以外のアミノ酸、好ましくはバリン(V)への置換によってのみ野生型ヒトEZH2のアミノ酸配列と異なる。この態様によるEZH2のA687変異体は、本明細書においてA687変異体、および好ましくはA687V変異体、または同様の意味でA687Vといわれる。
【００６３】
2018083821.tif 000020
【００６４】
1つの態様において、EZH2のR685変異体のアミノ酸配列は、野生型ヒトEZH2のR685に対応する単一のアミノ酸残基の、アルギニン以外のアミノ酸、好ましくはヒスチジン(H)またはシステイン(C)への置換によってのみ野生型ヒトEZH2のアミノ酸配列と異なる。この態様によるEZH2のR685変異体は、本明細書においてR685変異体、および好ましくはR685C変異体もしくはR685H変異体、または同様の意味でR685HもしくはR685Cといわれる。
【００６５】
2018083821.tif 000021
【００６６】
1つの態様において、EZH2の変異体のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:6に定義される通りのその基質ポケットドメインにおいて、1つまたは複数のアミノ酸残基が野生型ヒトEZH2のアミノ酸配列と異なる。この態様によるEZH2の変異体は、本明細書においてEZH2変異体といわれる。
【００６７】
2018083821.tif 000022
【００６８】
ヒト疾患に対する本結果の含意は、表2 (実施例5参照)にまとめられたデータによって明らかにされる。EZH2についてヘテロ接合性の細胞は、WT酵素によるH3-K27me1の効率的な形成と、変異酵素形態による、H3-K27me2および、とりわけ、H3-K27me3へのこの前駆体種の効率的な後続の遷移に起因して、悪性表現型を示すものと予想される。
【００６９】
H3-K27me1の形成はWT-EZH2触媒に依るだけではないことが報告されている。EZH2の、および別のPRC2サブユニットEEDのノックアウト研究から、H3-K27me1の形成が、触媒サブユニットとしてEZH2または関連タンパク質EZH1のどちらかを含んだPRC2複合体によって触媒されうることが実証されている。Shen, X. et al. (2008) Mol Cell 32:491-502。ゆえに、変異体EZH2種とWT-EZH2またはWT-EZH1のどちらかを含んだPRC2複合体との間の触媒的連関は、H3-K27me2/3の形成を増大するのに、かくして、付随する悪性表現型を生み出すのに十分であると考えられる。それゆえ、このデータから、EZH2の変異型の発現と関連した、濾胞性リンパ腫(FL)および胚中心B細胞(GCB)サブタイプのびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)の悪性表現型は、H3-K27のトリメチル化形態の形成に関する全体的な機能獲得の結果であることが示唆される。このデータ解釈は、EZH2もしくはPRC2関連タンパク質(例えば、PHF19/PCL3)のがんに関連した過剰発現の存在と、また、ヒストンH3-K27デメチラーゼUTXに対する機能喪失遺伝子型を調和させる手助けにもなる。UTX活性の喪失は、EZH2に対する機能獲得と酵素的に等価であり、どちらの状況でも、がん細胞におけるトリメチル化H3-K27のさらに高い定常状態レベルをもたらすと考えられる(図4)。
【００７０】
ヒストンH3-K27のモノメチル化、ジメチル化およびトリメチル化の状態は、転写制御での異なる機能と関連している。ヒストンH3-K27のモノメチル化は、転写の態勢にある遺伝子の活性な転写と関連している。Cui et al. (2009) Cell Stem Cell 4:80-93; Barski (2007) Cell 129:823-37。対照的に、ヒストンH3-K27のトリメチル化は、ヒストンH3-K4のトリメチル化がシス状態にある場合、転写の態勢にある転写的に抑制された遺伝子と関連している。Cui et al. (前記); Kirmizis et al. (2007) Genes Dev 18: 1592-1605; Bernstein et al. (2006) Cell 125:315-26。総合すれば、EZH2のY641変異を含めて、がんで報告されたPRC2複合体活性の変化は、ヒストンH3-K27のトリメチル化状態の増加をもたらし、かくして、転写抑制をもたらすものと予測される。
【００７１】
本発明の別の発見は、SEQ ID NO: 6に定義される通りの基質ポケットドメインに変異を含む変異体EZH2を発現する細胞が、概して、野生型(WT) EZH2を発現する細胞よりも小分子EZH2阻害剤に対して感受性であることである。具体的には、Y641変異体EZH2を発現する細胞は、EZH2阻害剤での処理後に成長、分裂もしくは増殖の低減を示し、またはアポトーシスもしくはネクローシスを起こしさえする。対照的に、WT EZH2を発現する細胞は、EZH2阻害剤の抗増殖効果に対して反応性ではない(図13および14)。特に、SEQ ID NO: 1のアミノ酸位置677における置換変異を発現する細胞は、他のEZH2変異体を発現する細胞よりもEZH2阻害剤に対してより高い感受性を示す(実施例19)。
【００７２】
EZH2および他のタンパク質メチルトランスフェラーゼは、創薬のための魅力的な標的であることが示唆されている。Copeland et al. (2009) Nat Rev Drug Discov 8:724-32; Copeland et al. (2010) Curr Opin Chem Biol 14(4):505-10; Pollock et al. (2010) Drug Discovery Today: Therapeutic Strategies 6(1):71-9。本データはまた、FLおよびGCBリンパ腫特異的な薬物の開発のための実験戦略を示唆する。WTと疾患に関連する変異体との間の基質認識の差異は遷移状態相互作用に由来するので、変異体EZH2の遷移状態を、WT酵素の遷移状態と比べて選択的に模倣する小分子阻害剤は、変異を保持している細胞でのH3-K27メチル化の遮断において有効であることが分かるはずである。この種の阻害剤は、標的を介した毒性がWT酵素しか保持していないどの細胞に対しても最小限であるので、大きな治療指数を示すものと予想される。遷移状態の擬態は、多くの疾患分野において薬物デザインのために有効な戦略であることが分かっている。例えば、Copeland, R. A. Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism and Data Analysis. 2nd ed, (Wiley, 2000)を参照されたい。
【００７３】
本結果は、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫の病因に対しての、H3-K27モノメチル化を行う酵素とEZH2のある特定の変異型との間の酵素的連関への、これまでに認識されていない、驚くべき依存を指摘する。いずれかの1つの理論によって束縛されることを意図するわけではないが、このデータは、正常(WT)酵素と疾患に関連した変異(例えばY641)酵素との間の触媒活性の、そのような連関に依存するヒト疾患の最初の実例を構成するものと考えられる。
【００７４】
本発明の局面は、SEQ ID NO:6に定義される通りの基質ポケットドメインに変異を含む変異体EZH2を発現している対象に、EZH2阻害剤の治療的有効量を投与することにより、対象におけるがんまたは前がん状態の症状を処置または緩和するための方法である。
【００７５】
本発明の別の局面は、対象において、トリメチル化H3-K27へのH3-K27の変換を阻害するための方法である。阻害は対象において、モノメチル化H3-K27への非メチル化H3-K27の変換、ジメチル化H3-K27へのモノメチル化H3-K27の変換、トリメチル化H3-K27へのジメチル化H3-K27の変換、または、例えば、ジメチル化H3-K27へのモノメチル化H3-K27の変換およびトリメチル化H3-K27へのジメチル化H3-K27の変換を含めた、それらの任意の組み合わせを阻害することを伴うことができる。本明細書において用いられる場合、非メチル化H3-K27は、リジン27のアミノ基と共有結合しているメチル基を持たないヒストンH3をいう。本明細書において用いられる場合、モノメチル化H3-K27は、リジン27のアミノ基と共有結合している単一のメチル基を持つヒストンH3をいう。モノメチル化H3-K27は本明細書においてH3-K27me1ともいわれる。本明細書において用いられる場合、ジメチル化H3-K27は、リジン27のアミノ基と共有結合している2つのメチル基を持つヒストンH3をいう。ジメチル化H3-K27は本明細書においてH3-K27me2ともいわれる。本明細書において用いられる場合、トリメチル化H3-K27は、リジン27のアミノ基と共有結合している3つのメチル基を持つヒストンH3をいう。トリメチル化H3-K27は本明細書においてH3-K27me3ともいわれる。
【００７６】
ヒストンH3は136アミノ酸長のタンパク質であり、その配列は公知である。例えば、GenBankアクセッション番号CAB02546を参照されたく、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。本明細書においてさらに開示されるように、全長ヒストンH3に加えて、全長ヒストンH3のK27に対応するリジン残基を含むヒストンH3のペプチド断片をEZH2に対する(および同様にEZH2の変異型に対する)基質として用い、H3-K27m2へのH3-K27m1の変換およびH3-K27m3へのH3-K27m2の変換を評価することができる。1つの態様において、そのようなペプチド断片は、ヒストンH3の21〜44番目のアミノ酸残基に対応する。そのようなペプチド断片は、アミノ酸配列
2018083821.tif 000023
を有する。
【００７７】
本発明の方法は、EZH2のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を阻害するEZH2阻害剤の治療的有効量を、変異体EZH2を発現している対象に投与し、それによって対象におけるトリメチル化H3-K27へのH3-K27の変換を阻害し、かくして対象における異常なヒストンメチル化レベルに関連した障害またはがんの症状を処置または緩和することを伴う。
【００７８】
本発明の変異体EZH2を発現している対象は、検出可能な量の変異体EZH2ポリペプチドを有する対象をいう。好ましくは、変異体EZH2ポリペプチドは、SEQ ID NO:6に定義される通りのその基質ポケットドメインにおいて1つまたは複数の変異を含む。例示的な変異としては、限定されるものではないが、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677における野生型残基アラニン(A)からグリシン(G)への置換(A677G); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置687における野生型残基アラニン(A)からバリン(V)への置換(A687V); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置674における野生型残基バリン(V)からメチオニン(M)への置換(V674M); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からヒスチジン(H)への置換(R685H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からシステイン(C)への置換(R685C); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からフェニルアラニン(F)への置換(Y641F); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からヒスチジン(H)への置換(Y641H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からアスパラギン(N)への置換(Y641N); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からセリン(S)への置換(Y641S); またはSEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からシステイン(C)への置換(Y641C)のような、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677、687、674、685、または641における置換が挙げられる。より具体的には、対象は、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677における野生型残基アラニン(A)からグリシン(G)への置換(A677G); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置687における野生型残基アラニン(A)からバリン(V)への置換(A687V); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からヒスチジン(H)への置換(R685H); またはSEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からシステイン(C)への置換(R685C)を含む、検出可能な量の変異体EZH2ポリペプチドを有する。
【００７９】
あるいは、本発明の変異体EZH2を発現している対象は、検出可能な量の、変異体EZH2ポリペプチドをコードする核酸配列を有する対象をいう。好ましくは、変異体EZH2ポリペプチドをコードする核酸配列は、SEQ ID NO:6に定義される通りのその基質ポケットドメインにおいて1つまたは複数の変異を含む。例示的な変異としては、限定されるものではないが、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677における野生型残基アラニン(A)からグリシン(G)への置換(A677G); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置687における野生型残基アラニン(A)からバリン(V)への置換(A687V); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置674における野生型残基バリン(V)からメチオニン(M)への置換(V674M); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からヒスチジン(H)への置換(R685H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からシステイン(C)への置換(R685C); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からフェニルアラニン(F)への置換(Y641F); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からヒスチジン(H)への置換(Y641H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からアスパラギン(N)への置換(Y641N); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からセリン(S)への置換(Y641S); またはSEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からシステイン(C)への置換(Y641C)のような、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677、687、674、685、または641における置換が挙げられる。より具体的には、対象は、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677における野生型残基アラニン(A)からグリシン(G)への置換(A677G); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置687における野生型残基アラニン(A)からバリン(V)への置換(A687V); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からヒスチジン(H)への置換(R685H); またはSEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からシステイン(C)への置換(R685C)を含む、検出可能な量の変異体EZH2ポリペプチドをコードする核酸配列を有する。
【００８０】
EZH2変異体の検出
変異体EZH2ポリペプチドは、任意の適当な方法を用いて検出することができる。例えば、変異体EZH2ポリペプチドは、変異体EZH2ポリペプチドに特異的に結合する、または変異体EZH2ポリペプチドに特有であるペプチド断片に特異的に結合する抗体を用いて検出することができる。変異体EZH2ポリペプチドに特有であるペプチド断片は、例えば、SEQ ID NO:6に定義される通りの基質ポケットドメインにおける、野生型残基以外のアミノ酸残基による1つまたは複数の残基の置換を除き、SEQ ID NO:7に示されるSETドメインを含みうる。別の態様において、変異体EZH2ポリペプチドに特有であるペプチド断片は、例えば、SEQ ID NO:6に定義される通りの基質ポケットドメインにおける、野生型残基以外のアミノ酸残基による1つまたは複数の残基の置換を除き、SEQ ID NO:7に示されるSETドメインの10〜113アミノ酸の断片を含みうるが、ただしこの断片は、EZH2の変異体に対応するアミノ酸残基を含むことを条件とする。抗体は、変異体EZH2ポリペプチドまたはそのペプチド断片に結合するが、しかし対応する野生型EZH2ポリペプチドまたはそのペプチド断片に結合しないなら、その変異体EZH2ポリペプチドに特異的に結合する、または変異体EZH2ポリペプチドに特有であるペプチド断片に特異的に結合するものと考えられる。1つの態様において、そのような抗体は、変異体EZH2ポリペプチドまたはそのペプチド断片に、対応する野生型EZH2ポリペプチドまたはそのペプチド断片に対するよりも少なくとも約100倍を超える親和性で結合するなら、その変異体EZH2ポリペプチドに特異的に結合する、または変異体EZH2ポリペプチドに特有であるペプチド断片に特異的に結合するものと考えられる。1つの態様において、そのような抗体は、変異体EZH2ポリペプチドまたはそのペプチド断片に、対応する野生型EZH2ポリペプチドまたはそのペプチド断片に対するよりも少なくとも約1000倍を超える親和性で結合するなら、その変異体EZH2ポリペプチドに特異的に結合する、または変異体EZH2ポリペプチドに特有であるペプチド断片に特異的に結合するものと考えられる。抗体は、例えば、酵素免疫測定法(ELISA)またはウエスタンブロット法において用いることができる。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、または抗体断片でありうる。反応産物を検出する段階は、任意の適当な免疫アッセイ法で行われうる。
【００８１】
1つの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、当技術分野において周知の従来の方法によって調製することができる。例えば、Kohler and Milstein (1975) Nature 256 (5517):495-7を参照されたい。
【００８２】
別の例として、変異体EZH2ポリペプチドは、質量分析(MS)、例えば、飛行時間と一体となったエレクトロスプレイイオン化(ESI-TOF)または飛行時間と一体となったマトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI-TOF)を用いて検出することができる。そのような方法は当技術分野において周知である。この分析では、関心対象の変異を含む1つまたは複数のペプチド断片、例えば、野生型EZH2での変異に対応するアミノ酸にまたがる配列を含んだ12〜24アミノ酸長のペプチドの特定を伴うと考えられる。
【００８３】
変異体EZH2ポリペプチドまたは変異体EZH2ポリペプチドに特有であるペプチド断片をコードする核酸配列は、任意の適当な方法を用いて検出することができる。例えば、変異体EZH2ポリペプチドをコードする核酸配列は、当技術分野において周知の方法にしたがって適切に選択されたDNA供給源およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーを用い全ゲノム再配列決定または標的領域再配列決定(後者は標的化再配列決定としても公知)によって検出することができる。例えば、Bentley (2006) Curr Opin Genet Dev. 16:545-52、およびLi et al. (2009) Genome Res 19: 1124-32を参照されたい。この方法は、典型的および一般的には、ゲノムDNA精製、関心対象の領域を増幅させるためのPCR増幅、サイクル配列決定、配列決定反応クリーンアップ、キャピラリー電気泳動、およびデータ分析の段階を伴う。コンピュータ内でのプライマーデザインツールを用いて、関心対象の領域を網羅する高品質のPCRプライマーをデザインする。サイクル配列決定は、サーマルサイクラー内での連続的なラウンドの変性、アニーリングおよび伸長が伸長産物の線形増幅をもたらす簡単な方法である。産物は、典型的には、末端ヌクレオチド塩基をG、A、TまたはCとして特定する蛍光タグで終結される。キャピラリー電気泳動注入液に競合する可能性がある、取り込まれていない色素ターミネータおよび塩を、洗浄によって除去する。キャピラリー電気泳動中に、サイクル配列決定反応の産物は、重合体で満たされたキャピラリーを通って移動する。負に帯電したDNA断片は、正極の方へキャピラリーを通って移動するので、サイズにより分離される。電気泳動後、データ収集ソフトウェアによって生データのサンプルファイルが作成される。下流のソフトウェア・アプリケーションを用い、さらなるデータ分析を行って、収集された色データ画像を、対応するヌクレオチド塩基に変換する。あるいはまたはさらに、この方法はマイクロアレイに基づく標的化領域のゲノムDNA捕捉および/または配列決定の使用を含みうる。適切なPCRプライマーの選択および再配列決定の実施のためのキット、試薬ならびに方法は、例えば、Applied Biosystems、AgilentおよびNimbleGen (Roche Diagnostics GmbH)から市販されている。これらのような方法は、JAK2および骨髄増殖性白血病遺伝子(MPL)の変異を検出するために、ならびに真性赤血球増加症、本態性血小板血症および特発性骨髄線維症を診断するために用いられている。本発明で用いる場合、PCRプライマーは、例えば、SEQ ID NO: 8の少なくとも関連性のある部分を増幅するように選択されうる(上記)。
【００８４】
あるいはまたはさらに、変異体EZH2ポリペプチドをコードする核酸配列は、当技術分野において周知の方法によりサザンブロットを用いて検出されうる。1つの態様において、変異体EZH2ポリペプチドをコードするDNA配列は、高度にストリンジェントな条件の下で行われる核酸ハイブリダイゼーションを用いて検出される。核酸プローブは、その配列が、野生型EZH2の変異に対応する変異体アミノ酸に対するコドンを含む標的核酸配列に相補的であるように選択される。そのような変異は、限定されるものではないが、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677における野生型残基アラニン(A)からグリシン(G)への置換(A677G); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置687における野生型残基アラニン(A)からバリン(V)への置換(A687V); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置674における野生型残基バリン(V)からメチオニン(M)への置換(V674M); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からヒスチジン(H)への置換(R685H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からシステイン(C)への置換(R685C); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からフェニルアラニン(F)への置換(Y641F); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からヒスチジン(H)への置換(Y641H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からアスパラギン(N)への置換(Y641N); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からセリン(S)への置換(Y641S); またはSEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からシステイン(C)への置換(Y641C)のような、EZH2の任意の変異、好ましくはEZH2のSEQ ID NO:6に定義される通りの基質ポケットドメインでの1つまたは複数の変異を含む。
【００８５】
配列特異的なプローブを、高度にストリンジェントな条件の下で試験されるサンプルと混ぜ合わせる。本明細書において用いられる「高度にストリンジェントな条件」という用語は、当技術分野で熟知されているパラメータをいう。核酸ハイブリダイゼーションのパラメータは、そのような方法を集めた参考文献、例えば、J. Sambrook, et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、またはF.M. Ausubel, et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkの中で見出すことができる。より具体的には、本明細書において用いられる、高度にストリンジェントな条件は、例えば、ハイブリダイゼーション用緩衝液(3.5×SSC、0.02% Ficoll、0.02%ポリビニルピロリドン、0.02%ウシ血清アルブミン(BSA)、2.5 mM NaH2PO4 (pH 7)、0.5% SDS、2 mM EDTA)中65℃でのハイブリダイゼーションをいう。SSCは0.15 M塩化ナトリウム/0.015 Mクエン酸ナトリウム, pH 7であり; SDSはドデシル硫酸ナトリウムであり; およびEDTAはエチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーション後、DNAが転写されている膜を、例えば、2×SSC中にて室温で、その後、0.1〜0.5×SSC/0.1×SDSにて最大68℃までの温度で洗浄する。
【００８６】
同程度のストリンジェンシーをもたらす、使用可能な他の条件、試薬などが存在する。当業者はそのような条件を熟知しているものと考えられ、したがって、本明細書ではそれらを示さない。しかしながら、当業者は、特に、EZH2の変異体をコードする核酸を含む、本発明のEZH2に関連する核酸の明確な特定を可能とするように(例えば、より低いストリンジェンシー条件を用いることにより)条件を操作することができるものと理解されよう。当業者はまた、そのような分子の発現に向けて細胞およびライブラリをスクリーニングするための方法論を熟知しており、その後、それらは定法により単離され、引き続き関連のある核酸分子の単離および配列決定が行われる。
【００８７】
治療的有効量のEZH2阻害剤を対象に投与する。本明細書において用いられる場合、EZH2阻害剤は、一般に、EZH2のヒストンメチルトランスフェラーゼ酵素活性を妨害できる、小分子、すなわち、約1.5キロダルトン(kDa)未満の分子量の分子をいう。
【００８８】
1つの態様において、EZH2阻害剤は、野生型EZH2のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を阻害する。1つの態様において、EZH2阻害剤は、変異体EZH2のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を阻害する。1つの態様において、EZH2阻害剤は、野生型EZH2のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性および変異体EZH2のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を阻害する。1つの態様において、EZH2阻害剤は、変異体EZH2のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を選択的に阻害する。
【００８９】
本明細書において開示される場合、EZH2のある特定の変異体(例えばY641)は、H3-K27me1への非メチル化H3-K27の変換には比較的不十分な触媒であるが、意外にも、H3-K27me3へのH3-K27me2の変換には有効な触媒である。EZH2のある特定の変異体(例えばA687)はモノメチルH3-K27基質を選好する。対照的に、EZH2のある特定の変異体(例えばA677)は、非メチル化、モノメチル化、およびジメチル化H3-K27に対して等価の選好性を示す。逆に、野生型EZH2は、H3-K27me1への非メチル化H3-K27の変換には比較的有効な触媒であるが、意外にも、H3-K27me3へのH3-K27me2の変換には無効な触媒である。これは、H3-K27のモノメチル化、ジメチル化およびトリメチル化状態が転写制御において異なる機能を示すので、重要である。例えば、H3-K27me1は、転写の態勢にある遺伝子の活性な転写と関連しているが、H3-K27me3は、H3-K4トリメチル化がシスである場合に転写の態勢にある転写抑制された遺伝子と関連している。したがって、EZH2の変異体のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性の選択的阻害は、H3-K27の様々なメチル化形態の産生の選択的阻害に影響を及ぼし、それによって、H3-K27メチル化レベルと関連する転写を改変する。
【００９０】
EZH2阻害剤は、野生型EZH2のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を阻害するよりも効果的に変異体EZH2のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を阻害する場合に、変異体EZH2のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を「選択的に阻害する」。例えば、1つの態様において、選択的阻害剤は、野生型EZH2に対するIC50よりも少なくとも40パーセント低い変異体EZH2に対するIC50を有する。1つの態様において、選択的阻害剤は、野生型EZH2に対するIC50よりも少なくとも50パーセント低い変異体EZH2に対するIC50を有する。1つの態様において、選択的阻害剤は、野生型EZH2に対するIC50よりも少なくとも60パーセント低い変異体EZH2に対するIC50を有する。1つの態様において、選択的阻害剤は、野生型EZH2に対するIC50よりも少なくとも70パーセント低い変異体EZH2に対するIC50を有する。1つの態様において、選択的阻害剤は、野生型EZH2に対するIC50よりも少なくとも80パーセント低い変異体EZH2に対するIC50を有する。1つの態様において、選択的阻害剤は、野生型EZH2に対するIC50よりも少なくとも90パーセント低い変異体EZH2に対するIC50を有する。
【００９１】
1つの態様において、変異体EZH2の選択的阻害剤は、野生型EZH2に阻害効果を本質的に及ぼさない。
【００９２】
阻害剤はH3-K27me3へのH3-K27me2の変換を阻害する。1つの態様において、阻害剤はH3-K27のトリメチル化を阻害するといわれる。H3-K27me2へのH3-K27me1の変換はH3-K27me3へのH3-K27me2の変換に先行するので、H3-K27me2へのH3-K27me1の変換の阻害剤は、必然的に、H3-K27me3へのH3-K27me2の変換も阻害し、すなわち、その阻害剤はH3-K27のトリメチル化を阻害する。H3-K27me2へのH3-K27me1の変換の阻害なしにH3-K27me3へのH3-K27me2の変換を阻害することも可能である。この種の阻害はまた、H3-K27のジメチル化の阻害がないとはいえ、H3-K27のトリメチル化の阻害を引き起こすと考えられる。
【００９３】
1つの態様において、阻害剤はH3-K27me2へのH3-K27me1の変換およびH3-K27me3へのH3-K27me2の変換を阻害する。そのような阻害剤はH3-K27me2へのH3-K27me1の変換だけを直接阻害しうる。あるいは、そのような阻害剤はH3-K27me2へのH3-K27me1の変換およびH3-K27me3へのH3-K27me2の変換の両方を直接阻害しうる。
【００９４】
阻害剤はヒストンメチラーゼ活性を阻害する。ヒストンメチラーゼ活性の阻害は、任意の適当な方法を用いて検出することができる。阻害は、例えば、ヒストンメチラーゼ活性の比率に関してまたはヒストンメチラーゼ活性の産物として測定することができる。これらの読み出しのどちらかに適した方法は、以下の実施例に含まれている。
【００９５】
阻害は適当な陰性対照と比べて測定可能な阻害である。1つの態様において、阻害は適当な陰性対照と比べて少なくとも10パーセントの阻害である。すなわち、酵素活性の比率または阻害剤による生成物の量は、対応する比率または阻害剤なしで作製された量の90パーセント未満または90パーセントに等しい。さまざまな他の態様において、阻害は適当な陰性対照と比べて少なくとも20、25、30、40、50、60、70、75、80、90、または95パーセントの阻害である。1つの態様において、阻害は適当な陰性対照と比べて少なくとも99パーセントの阻害である。すなわち、酵素活性の比率または阻害剤による生成物の量は、対応する比率または阻害剤なしで作製された量の1パーセント未満または1パーセントに等しい。
【００９６】
1つの態様において、阻害剤はS-アデノシル-L-ホモシステイン(SAH)である。SAHは構造式
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を有し、例えば、Sigma-Aldrich, St. Louis, MOを含む、いくつかの供給業者から市販されている。SAHはS-アデノシルメチオニン依存的なメチルトランスフェラーゼによるメチル基移転の阻害剤として記述されている。
【００９７】
1つの態様において、阻害剤は化合物75
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またはその薬学的に許容される塩である。
【００９８】
ある特定の態様において、本発明は、対象由来のサンプルにおけるEZH2の変異体を検出するためのアッセイを行う段階を含む。この種のアッセイは前述されている。本明細書において用いられる場合、「対象由来のサンプル」は、対象から得られたまたは対象に由来する細胞または細胞の成分を含有する任意の適当なサンプルをいう。1つの態様において、サンプルは、変異体EZH2を発現することが疑われる細胞、例えば、がん細胞を含む。1つの態様において、サンプルは血液サンプルである。1つの態様において、サンプルは、例えば、リンパ組織(例えば、リンパ節)または骨髄から得られた生検サンプルである。1つの態様において、サンプルは、リンパ組織(例えば、リンパ節)もしくは骨髄以外のまたはリンパ組織(例えば、リンパ節)もしくは骨髄の他の組織から得られた生検サンプルである。例えば、1つの態様において、サンプルはがん、例えば、がん細胞から構成される腫瘍由来の生検である。サンプル中の細胞は、サンプルの他の成分から単離することができる。例えば、末梢血単核細胞(PBMC)は、当業者に熟知されている方法にしたがって遠心分離された血液サンプル由来のバフィーコートとして単離することができる。
【００９９】
対象由来のサンプルに関するアッセイの結果から、変異体EZH2がサンプル中に存在することが示される場合、対象は変異体EZH2を発現しているといわれる。実際に、1つの態様において、対象由来のサンプルに関するアッセイの結果から、変異体EZH2がサンプル中に存在することが示される場合、対象は、変異体EZH2のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を選択的に阻害するEZH2阻害剤による処置の候補として特定される。
【０１００】
がん由来のサンプルに関するアッセイの結果から、変異体EZH2が、がん中に存在することが示される場合、がんは、変異体EZH2を発現しているといわれる。
【０１０１】
同様に、がんを有する対象由来のがん細胞を含むサンプルに関するアッセイの結果から、変異体EZH2がサンプル中に存在することが示される場合、対象は、変異体EZH2を発現しているといわれる。
【０１０２】
ジメチル化H3-K27またはトリメチル化H3-K27の検出は、当技術分野における任意の適当な方法を用いて達成することができる。1つの態様において、メチル化レベルはジメチル化H3-K27またはトリメチル化H3-K27に特異的な抗体を用いて検出される。例えば、単離された組織は長期保存のためにホルマリン固定され、パラフィンブロックに包埋される。このブロックを用いて、メチル化H3-K27に対する抗体での免疫組織化学染色または蛍光染色のためのスライドを調製することができる。あるいは、全細胞溶解物またはヒストン抽出物を、単離された組織サンプルから調製し、その後、免疫組織化学染色、ウエスタンブロット分析または蛍光染色のために用いることができる。別の態様において、メチル化レベルは、ジメチル化H3-K27またはトリメチル化H3-K27に特異的なポリペプチドまたはアプタマーを用いて検出される。別の態様において、メチル化レベルは、質量分析(MS)を用いて検出される。
【０１０３】
対照のジメチル化H3-K27または対照のトリメチル化H3-K27は対照サンプル、例えば、対象から単離された隣接する非腫瘍組織または健常対象由来の健常組織から確立することができる。あるいは、H3-K27me2またはH3-K27me3の対照メチル化レベルは、当技術分野において公知の方法で病理学者により確立されてもよい。
【０１０４】
スクリーニング方法
本発明の1つの局面は、変異体EZH2の阻害剤としての試験化合物を特定するための方法である。1つの態様において、本方法は、非メチル化H3-K27、モノメチル化H3-K27、ジメチル化H3-K27、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるH3-K27の形態を含むヒストン基質、メチル基供与体(S-アデノシルメチオニン(SAM)のような)、ならびに試験化合物と、単離された変異体EZH2とを混ぜ合わせる段階; およびヒストン基質におけるH3-K27のメチル化を検出するためのアッセイを行い、それによって、試験化合物の存在下でのH3-K27のメチル化が試験化合物の非存在下でのH3-K27のメチル化よりも少ない場合に、試験化合物を変異体EZH2の阻害剤と特定する段階を含む。H3-K27のメチル化を検出するためのアッセイは、メチル化の比率、メチル化の程度、またはメチル化の比率および程度の両方を測定するように選択することができる。
【０１０５】
変異体EZH2はPRC2複合体またはその機能的等価体として単離される。本明細書において用いられる場合、「単離された」という用語は、複合体が、天然に存在する際に見出されうる他の成分から実質的に分離されていることを意味する。化合物は、必ずしも精製されていなくても、単離することができる。1つの態様において、EZH2の変異体は、EEDおよびSUZ12とともに変異体EZH2の複合体として単離される。別の態様において、EZH2の変異体は、EED、SUZ12およびRbAp48とともに変異体EZH2の複合体として単離される。適切な条件の下で、PRC2複合体またはその機能的等価体は、H3-K27に対するヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を示す。1つの態様において、複合体は、組換えにより発現された成分ポリペプチド、例えば、RbAp48有りまたは無しでEZH2、EED、SUZ12から構成される。
【０１０６】
単離された変異体EZH2をヒストン基質と混ぜ合わせる。ヒストン基質は、EZH2に対する基質として働きうるヒストンポリペプチドまたはその断片の任意の適当な供給源を含む。1つの態様において、ヒストン基質は対象から単離されたヒストンを含む。ヒストンは任意の適当な方法を用いて対象の細胞から単離することができる; そのような方法は当業者に周知であり、本明細書でさらに明記する必要はない。例えば、Fang et al. (2004) Methods Enzymol 377:213-26を参照されたい。以下の実施例によれば、1つの態様において、ヒストン基質はヌクレオソームとして提供される。以下の実施例によれば、1つの態様において、ヒストン基質は鳥類(ニワトリ)赤血球ヌクレオソームとして提供される。
【０１０７】
そのようにして提供されたヒストン基質は、H3-K27メチル化状態特異的な抗体でのウエスタンブロッティングによって判断した場合に、さまざまなH3-K27メチル化状態を含む、ヒストン修飾状態の混和物を含みうる。1つの態様において、ヒストン基質は、精製された全長ヒストンH3として提供されうる。そのような精製された全長ヒストンH3は、H3-K27メチル化状態に関して均質な調製物として、またはさまざまなH3-K27メチル化状態の混和物として提供されうる。H3-K27メチル化状態に関して単離されたヒストンH3の均質な調製物は、一つには、適当なH3-K27メチル化状態特異的な抗体を添加した免疫親和性カラムに通すことにより、または適当なH3-K27メチル化状態特異的な抗体でコーティングした磁気ビーズを用いた免疫沈降により調製されうる。あるいはまたはさらに、H3-K27のメチル化状態は、アッセイを行う一環として特徴付けることができる。例えば、出発材料のヒストン基質は、50パーセントの非メチル化H3-K27、40パーセントのモノメチル化H3-K27、10パーセントのジメチル化H3-K27、および0パーセントのトリメチル化H3-K27を含有すると特徴付けられうる。
【０１０８】
1つの態様において、ヒストン基質は、特に、H3-K27を包含する配列を含めて、ヒストンH3に関連する1つまたは複数のアミノ酸配列を含んだペプチドライブラリまたは適当なペプチドを含む。例えば、1つの態様において、ヒストン基質は、ヒストンH3の21〜44番目のアミノ酸残基に対応するペプチド断片である。そのようなペプチド断片はアミノ酸配列
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を有する。ペプチドライブラリまたはペプチドは、当技術分野において周知の技法によるペプチド合成によって調製されてもよく、H3-K27に対応するリジンの任意の所望とされるメチル化度を取り込むように任意で修飾されてもよい。以下の実施例において記述されるように、そのようなペプチドは下流のアッセイの実施において有用な、ビオチンなどの、標識を取り込むように修飾されてもよい。1つの態様において、標識はペプチドのアミノ(N)末端に付加される。1つの態様において、標識はペプチドのカルボキシ(C)末端に付加される。
【０１０９】
H3-K27メチル化特異的な抗体は、例えば、Cell Signaling Technology (Danvers, MA)およびActive Motif (Carlsbad, CA)を含む、種々の市販の供給源から入手可能である。
【０１１０】
単離された変異体EZH2を試験化合物と混ぜ合わせる。本明細書において用いられる場合、「試験化合物」は、約1.5 kDa未満の分子量を有する有機小分子をいう。1つの態様において、試験化合物は公知の化合物である。1つの態様において、試験化合物は新規の化合物である。1つの態様において、試験化合物は、例えば、何十もの、何百もの、何千もの、またはさらに多くの化合物を含む、そのような化合物のライブラリの一部として提供することができる。化合物のライブラリは、例えば、当技術分野において周知の一般的技法により試験化合物のアレイおよびロボット操作を用いて、高速大量処理スクリーニングアッセイで好都合にスクリーニングされうる。
【０１１１】
ある特定の態様において、試験化合物は、SAHの誘導体または化合物75の誘導体である化合物である。
【０１１２】
H3-K27のメチル化の検出は、任意の適当な方法を用いて達成することができる。1つの態様において、供与体メチル基の供給源は、検出可能な標識で標識されているメチル基を含む。検出可能な標識は1つの態様において、同位体標識、例えば、トリチウムである。他の種類の標識は、例えば、蛍光標識を含みうる。
【０１１３】
トリメチル化H3-K27の形成の検出は、任意の適当な方法を用いて達成することができる。例えば、トリメチル化H3-K27の形成の検出は、クロマトグラフィー法またはサイズによって標識産物を分離する他の方法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)、キャピラリー電気泳動(CE)または高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)と任意で組み合わされてもよい、上記のような、標識されたメチル基の取り込みを検出するアッセイを用いて達成することができる。あるいはまたはさらに、トリメチル化H3-K27の形成の検出は、トリメチル化H3-K27に特異的である抗体を用いて達成することができる。
【０１１４】
ジメチル化H3-K27へのモノメチル化H3-K27の変換の検出は、任意の適当な方法を用いて達成することができる。1つの態様において、変換は、モノメチル化H3-K27およびジメチル化H3-K27に特異的な抗体を用いて測定される。例えば、モノメチル化H3-K27およびジメチル化H3-K27の出発の量または濃度は、モノメチル化H3-K27およびジメチル化H3-K27に特異的な適切な抗体を用いて決定されうる。酵素、基質、メチル基供与体、および試験化合物を組み合わせた後に、結果として生じたモノメチル化H3-K27およびジメチル化H3-K27の量または濃度がその後、モノメチル化H3-K27およびジメチル化H3-K27に特異的な適切な抗体を用いて決定されうる。モノメチル化H3-K27およびジメチル化H3-K27の最初のおよび結果の量または濃度を次いで、比較することができる。あるいはまたはさらに、モノメチル化H3-K27およびジメチル化H3-K27の最初のおよび結果の量または濃度を次いで、陰性対照由来の対応する量または濃度と比較することができる。アッセイに試験薬剤が含まれていない、陰性対照反応を並行してまたは既存対照として行うことができる。そのような対照反応の結果は、上記の比較を行う前にまたは行うと同時に、実験反応の対応する結果から任意で差し引かれてもよい。
【０１１５】
H3-K27のジメチル化形態は同じアッセイにおいてさらにメチル化されうるので、モノメチル化H3-K27の量または濃度の低減がジメチル化H3-K27の増加に直接対応しないように見えることもある。しかしながら、この場合には、モノメチル化H3-K27の量または濃度の低減が、それ自体で、ジメチル化H3-K27へのモノメチル化H3-K27の変換を反映するものと推定することができる。
【０１１６】
トリメチル化H3-K27へのジメチル化H3-K27の変換の検出は、任意の適当な方法を用いて達成することができる。1つの態様において、変換は、ジメチル化H3-K27およびトリメチル化H3-K27に特異的な抗体を用いて測定される。例えば、ジメチル化H3-K27およびトリメチル化H3-K27の出発の量または濃度は、ジメチル化H3-K27およびトリメチル化H3-K27に特異的な適切な抗体を用いて決定されうる。酵素、基質、および試験化合物を組み合わせた後に、結果として生じたジメチル化H3-K27およびトリメチル化H3-K27の量または濃度がその後、ジメチル化H3-K27およびトリメチル化H3-K27に特異的な適切な抗体を用いて決定されうる。ジメチル化H3-K27およびトリメチル化H3-K27の最初のおよび結果の量または濃度を次いで、比較することができる。あるいはまたはさらに、ジメチル化H3-K27およびトリメチル化H3-K27の最初のおよび結果の量または濃度を次いで、陰性対照由来の対応する量または濃度と比較することができる。アッセイに試験薬剤が含まれていない、陰性対照反応を並行してまたは既存対照として行うことができる。そのような対照反応の結果は、上記の比較を行う前にまたは行うと同時に、実験反応の対応する結果から任意で差し引かれてもよい。
【０１１７】
試験薬剤は、試験化合物ありでのH3-K27のメチル化が試験化合物なしでのH3-K27のメチル化よりも少ない場合に、変異体EZH2の阻害剤と特定される。1つの態様において、試験薬剤は、試験化合物の存在下でのトリメチル化H3-K27の形成が試験化合物の非存在下でのトリメチル化H3-K27の形成よりも少ない場合に、変異体EZH2の阻害剤と特定される。
【０１１８】
本発明の1つの局面は、変異体EZH2の選択的阻害剤を特定するための方法である。1つの態様において、本方法は、モノメチル化H3-K27、ジメチル化H3-K27、およびモノメチル化H3-K27とジメチル化H3-K27との組み合わせからなる群より選択されるH3-K27の形態を含むヒストン基質、メチル基供与体(例えば、SAM)、ならびに試験化合物と、単離された変異体EZH2とを混ぜ合わせ、それによって試験混合物を形成させる段階; モノメチル化H3-K27、ジメチル化H3-K27、およびモノメチル化H3-K27とジメチル化H3-K27との組み合わせからなる群より選択されるH3-K27の形態を含むヒストン基質、メチル基供与体(例えば、SAM)、ならびに試験化合物と、単離された野生型EZH2とを混ぜ合わせ、それによって対照混合物を形成させる段階; 試験混合物および対照混合物のそれぞれにおけるヒストン基質のトリメチル化を検出するためのアッセイを行う段階; (a)試験化合物ありでの変異体EZH2(M+)によるトリメチル化と(b)試験化合物なしでの変異体EZH2(M-)によるトリメチル化の比率を算出する段階; (c)試験化合物ありでの野生型EZH2(WT+)によるトリメチル化と(d)試験化合物なしでの野生型EZH2(WT-)によるトリメチル化の比率を算出する段階; 比率(a)/(b)を比率(c)/(d)と比較する段階; ならびに比率(a)/(b)が比率(c)/(d)未満である場合に、試験化合物を変異体EZH2の選択的阻害剤と特定する段階を含む。1つの態様において、本方法は、試験混合物および対照混合物の一方または両方に対して試験化合物なしの陰性対照を考慮する段階をさらに含む。
【０１１９】
本発明はまた、EZH2阻害剤に対する患者の反応性の、これまでに認識されていない、驚くべき相関関係を示す。したがって、本発明の局面は、がんまたは前がん状態を有する対象におけるEZH2阻害剤に対する反応性を判定するための方法である。この方法は一般に、SEQ ID NO:6に定義される通りのEZH2基質ポケットドメインにおける変異を検出する段階を伴う。例えば、変異は、上記の置換、点突然変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異、欠失、または挿入でありうる。好ましい置換アミノ酸変異としては、限定されるものではないが、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677における野生型残基アラニン(A)からグリシン(G)への置換(A677G); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置687における野生型残基アラニン(A)からバリン(V)への置換(A687V); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置674における野生型残基バリン(V)からメチオニン(M)への置換(V674M); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からヒスチジン(H)への置換(R685H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からシステイン(C)への置換(R685C); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からフェニルアラニン(F)への置換(Y641F); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からヒスチジン(H)への置換(Y641H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からアスパラギン(N)への置換(Y641N); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からセリン(S)への置換(Y641S); またはSEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からシステイン(C)への置換(Y641C)のような、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677、687、674、685、または641における置換が挙げられる。
【０１２０】
好ましい態様において、対象は、がんまたはがん状態を有する。例えば、がんはリンパ腫、白血病、または黒色腫である。好ましくは、リンパ腫は非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、またはびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫である。あるいは、白血病は慢性骨髄性白血病(CML)である。前がん状態は骨髄異形成症候群(MDS、かつては前白血病として知られた)である。
【０１２１】
別の好ましい態様において、本発明の変異体EZH2ポリペプチドまたは変異体EZH2ポリペプチドをコードする核酸配列は、SEQ ID NO:6に定義される通りのEZH2の基質ポケットドメインにおいて1つまたは複数の変異を含む。より好ましくは、本発明の変異体EZH2ポリペプチドまたは変異体EZH2ポリペプチドをコードする核酸配列は、限定されるものではないが、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677における野生型残基アラニン(A)からグリシン(G)への置換(A677G); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置687における野生型残基アラニン(A)からバリン(V)への置換(A687V); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置674における野生型残基バリン(V)からメチオニン(M)への置換(V674M); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からヒスチジン(H)への置換(R685H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からシステイン(C)への置換(R685C); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からフェニルアラニン(F)への置換(Y641F); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からヒスチジン(H)への置換(Y641H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からアスパラギン(N)への置換(Y641N); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からセリン(S)への置換(Y641S); またはSEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からシステイン(C)への置換(Y641C)のような、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677、687、674、685、または641における置換を含む。
【０１２２】
薬学的組成物
1つまたは複数のEZH2アンタゴニストをヒト患者に単独で、または本明細書において記述される疾患もしくは状態を処置もしくは改善するための用量でそれらを適当な担体もしくは賦形剤と混合した薬学的組成物中で投与することができる。これらのEZH2アンタゴニストの混合物を患者に、単純混合物としてまたは適当な配合化された薬学的組成物中で投与することもできる。例えば、本発明の1つの局面は治療的有効用量のEZH2アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩、水和物、鏡像異性体もしくは立体異性体; および薬学的に許容される希釈剤または担体を含む薬学的組成物に関する。
【０１２３】
EZH2アンタゴニストの配合および投与のための技法はRemingtonの「The Science and Practice of Pharmacy」, 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins 2005のような、当業者に周知の参考文献の中で見出されうる。
【０１２４】
適当な投与経路は、例えば、経口投与、直腸投与または腸内投与; 静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射または髄内注射、および髄膜注射、直接脳室内注射または眼内注射を含む、非経口送達; 点眼薬および経皮送達を含む、局所送達; ならびに鼻腔内送達および他の経粘膜送達を含みうる。
【０１２５】
あるいは、EZH2アンタゴニストを全身的様式ではなく局所的様式で、例えば、多くの場合、デポー配合物または持続放出配合物中で、浮腫部位に直接的にEZH2アンタゴニストを注射することによって投与してもよい。
【０１２６】
1つの態様において、EZH2アンタゴニストは腫瘍またはリンパ節への直接的な注射によって投与される。
【０１２７】
さらに、EZH2アンタゴニストを標的薬物送達システムで、例えば、がん細胞特異的な抗体でコーティングされたリポソーム中で投与してもよい。
【０１２８】
本発明の薬学的組成物は、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の過程によって製造されうる。
【０１２９】
本発明によって用いるための薬学的組成物はしたがって、薬学的に使用できる調製物への活性なEZH2アンタゴニストの加工処理を容易にする賦形剤および補助剤を含む1つまたは複数の生理学的に許容される担体を用い従来の様式で配合されうる。適切な配合は、選択した投与経路に依存する。
【０１３０】
注射の場合、本発明の薬剤は水溶液中で、好ましくは、ハンクス溶液、リンゲル溶液または生理的食塩緩衝液のような生理学的に適合する緩衝液中で配合されうる。経粘膜投与の場合、透過されるバリアに適した浸透剤が配合に用いられる。そのような浸透剤が当技術分野において一般に知られている。
【０１３１】
経口投与の場合、EZH2アンタゴニストは、活性なEZH2アンタゴニストを当技術分野において周知の薬学的に許容される担体と混ぜ合わせることによって容易に配合することができる。そのような担体は、本発明のEZH2アンタゴニストが、処置される患者によって経口摂取されるための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、溶液、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして配合されることを可能にする。経口用の薬学的調製物は、活性なEZH2アンタゴニストを固体賦形剤と混ぜ合わせ、得られた混合物を任意で粉砕し、顆粒の混合物を、錠剤または糖衣錠コアを得るために、必要なら、適当な補助剤を加えた後で、加工処理することによって得ることができる。適切な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む、糖のような増量剤; 例えば、トウモロコシデンプン、 小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース調製物; および/またはポリビニルピロリドン(PVP)を含む。必要なら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩などの、崩壊剤が加えられてもよい。
【０１３２】
糖衣錠コアには、適当なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液が用いられてもよく、これはアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適当な有機溶媒または有機溶媒混合物を任意で含有してもよい。活性なEZH2アンタゴニストの用量の特定のために、または活性なEZH2アンタゴニストの用量のさまざまな組み合わせを特徴付けるために、染料または色素が錠剤または糖衣錠コーティングに加えられてもよい。
【０１３３】
経口的に使用できる薬学的調製物は、ゼラチンで作られている押し込み型のカプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤、例えばグリセロールまたはソルビトールで作られている密封された軟質カプセルを含む。押し込み型のカプセルは、有効成分をラクトースのような増量剤、デンプンのような結合剤、および/またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤ならびに、任意で、安定剤との混和物で含有することができる。軟質カプセルでは、活性なEZH2アンタゴニストは脂肪油、流動パラフィンまたは液状ポリエチレングリコールなどの、適当な液体に溶解または懸濁されてもよい。さらに、安定剤が加えられてもよい。
【０１３４】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合される錠剤またはトローチ剤の形態を取ってよい。
【０１３５】
吸入による投与の場合、本発明によって用いるためのEZH2アンタゴニストは、好都合には、適当な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを用いて、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレイ提示物の形態で送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、一定の量を送達するためのバルブを提供することによって決定されうる。EZH2アンタゴニストおよびラクトースまたはデンプンなどの適当な粉末基剤の粉末混合物を含有する、例えば、吸入器または注入器で用いるゼラチンのカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
【０１３６】
EZH2アンタゴニストは、注射による非経口投与のために、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合することができる。注射用の配合物は、保存剤が添加された単位投与量形態で、例えば、アンプル中でまたは多用量容器中で提示されうる。組成物は、油性媒体または水性媒体における懸濁液、溶液または乳濁液のような形態を取ってよく、懸濁化剤、可溶化剤および/または分散化剤のような配合剤を含有してもよい。
【０１３７】
非経口投与のための薬学的配合物は、水溶性形態での活性なEZH2アンタゴニストの水溶液を含む。さらに、活性なEZH2アンタゴニストの懸濁液を適切な油性の注射用懸濁液として調製してもよい。適当な親油性溶媒または親油性媒体は、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、あるいはリポソームを含む。水性の注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有してもよい。任意で、懸濁液はまた、適当な安定剤、または高濃度溶液の調製を可能にするためにEZH2アンタゴニストの溶解性を増大させる適当な薬剤を含有してもよい。
【０１３８】
あるいは、有効成分は、適当な媒体、例えば、無菌の発熱性物質除去水で使用前に再構成される粉末形態であってもよい。
【０１３９】
EZH2アンタゴニストはまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの、従来の坐薬基剤を含んだ、坐薬または停留浣腸剤のような、直腸用組成物に配合されてもよい。
【０１４０】
前述の配合物に加えて、EZH2アンタゴニストはまた、デポー調製物として配合されてもよい。そのような長時間作用性配合物は埋め込みにより(例えば、皮下にもしくは筋肉内にまたは筋肉内注射により)投与されうる。したがって、例えば、EZH2アンタゴニストは、(例えば、許容される油中の乳濁液として)適当な重合体材料もしくは疎水性材料とともに、またはイオン交換樹脂とともに、あるいは難溶性の誘導体として(例えば、難溶性の塩として)配合されうる。
【０１４１】
あるいは、疎水性の薬学的EZH2アンタゴニストのための他の送達システムが利用されてもよい。リポソームおよび乳濁液は、疎水性薬物のための送達媒体または担体の例である。ジメチルスルホキシド(dimethysulfoxide)のような、ある特定の有機溶媒も利用されてよい。あるいは、EZH2アンタゴニストは、治療剤を含有する固体の疎水性重合体の半透過性マトリックスのような、持続放出システムを用いて送達されてもよい。さまざまな持続放出材料が確立されており、当業者によって周知である。持続放出カプセルは、その化学的性質に依存して、EZH2アンタゴニストを数週間から100日を超えるまで放出しうる。治療試薬の化学的性質および生物学的安定性に依存して、タンパク質安定化のためのさらなる方策が利用されてもよい。
【０１４２】
薬学的組成物はまた、適当な固相またはゲル相の担体または賦形剤を含んでもよい。そのような担体または賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、さまざまな糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールのような重合体が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０１４３】
処置の方法
本明細書において提供されるのは、ヒストンまたは他のタンパク質のメチル化状態を調節することによって経過に影響が出る可能性のある、がんおよび前がん状態などの状態および疾患の症状を処置、予防、または緩和する方法であり、ここで該メチル化状態は、少なくともある程度は、EZH2の活性によって媒介される。ヒストンのメチル化状態の調節は、次に、メチル化によって活性化される標的遺伝子および/またはメチル化によって抑制される標的遺伝子の発現のレベルに影響を及ぼしうる。
【０１４４】
例えば、本発明の1つの局面は、がんまたは前がん状態の症状を処置または緩和するための方法に関する。この方法は、がんまたは前がん状態を有しかつ変異体EZH2を発現している対象に、EZH2阻害剤の治療的有効量を投与する段階を含む。好ましくは、変異体EZH2ポリペプチドまたは変異体EZH2ポリペプチドをコードする核酸配列は、SEQ ID NO:6に定義される通りのその基質ポケットドメインにおいて変異を含む。より好ましくは、変異体EZH2ポリペプチドまたは変異体EZH2ポリペプチドをコードする核酸配列は、限定されるものではないが、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677における野生型残基アラニン(A)からグリシン(G)への置換(A677G); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置687における野生型残基アラニン(A)からバリン(V)への置換(A687V); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置674における野生型残基バリン(V)からメチオニン(M)への置換(V674M); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からヒスチジン(H)への置換(R685H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置685における野生型残基アルギニン(R)からシステイン(C)への置換(R685C); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からフェニルアラニン(F)への置換(Y641F); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からヒスチジン(H)への置換(Y641H); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からアスパラギン(N)への置換(Y641N); SEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からセリン(S)への置換(Y641S); またはSEQ ID NO:1のアミノ酸位置641における野生型残基チロシン(Y)からシステイン(C)への置換(Y641C)のような、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置677、687、674、685、または641における置換変異を含む。
【０１４５】
1つの態様において、阻害剤は変異体EZH2のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を阻害する。1つの態様において、阻害剤は変異体EZH2のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を選択的に阻害する。任意で、がんはリンパ腫である。好ましくは、がんは非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、またはびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL)である。あるいは、がんは白血病(CMLのような)または黒色腫である。前がん状態は、骨髄異形成症候群(MDS、かつては前白血病として知られた)を含むが、これに限定されることはない。
【０１４６】
がんおよび神経疾患のような疾患をタンパク質(例えば、ヒストン)メチル化の調節因子、例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼまたはヒストンデメチラーゼ酵素活性の調節因子の投与によって処置することができる。ヒストンメチル化は、がんにおけるある特定の遺伝子の異常な発現に関わること、および非ニューロン細胞におけるニューロン遺伝子のサイレンシングに関わることが報告されている。本明細書において記述される調節因子を用いて、そのような疾患を処置すること、すなわち、病的細胞においてヒストンのメチル化を阻害することができる。
【０１４７】
少なくとも、異常なヒストンメチル化がある特定のがんおよび前がん状態と関連していることが判明したという事実に基づき、対象における変異体EZH2を有するがんまたは前がん状態を処置するための方法は、それを必要としている対象に、メチル化を阻害するまたはメチル化を正常対応細胞における大体そのレベルまで回復する化合物の治療的有効量を投与する段階を含む。1つの態様において、対象におけるがんまたは前がん状態を処置するための方法は、それを必要としている対象に、モノメチル化H3-K27 (H3-K27me1)への非メチル化H3-K27の変換を阻害する化合物の治療的有効量を投与する段階を含む。1つの態様において、対象におけるがんまたは前がん状態を処置するための方法は、それを必要としている対象に、ジメチル化H3-K27 (H3-K27me2)へのモノメチル化H3-K27 (H3-K27me1)の変換を阻害する化合物の治療的有効量を投与する段階を含む。1つの態様において、対象におけるがんまたは前がん状態を処置するための方法は、それを必要としている対象に、トリメチル化H3-K27 (H3-K27me3)へのH3-K27me2の変換を阻害する化合物の治療的有効量を投与する段階を含む。1つの態様において、対象におけるがんまたは前がん状態を処置するための方法は、それを必要としている対象に、H3-K27me2へのH3-K27me1の変換およびH3-K27me3へのH3-K27me2の変換の両方を阻害する化合物の治療的有効量を投与する段階を含む。メチル化の疾患特異的な増加は、ヒストンまたはタンパク質メチル化の細胞レベルでの全体的な増加なしに重要なゲノム遺伝子座のクロマチンで起こりうることに留意することが重要である。例えば、重要な疾患関連遺伝子での異常な高メチル化は、ヒストンまたはタンパク質全体での低メチル化を背景にして起こることが可能である。
【０１４８】
一般的に、細胞増殖を調節するためにメチル化の調節因子を用いることができる。例えば、場合によっては、メチル化を減少させる薬剤で過剰な増殖が低減されてもよく、その一方、メチル化を増加させる薬剤で不十分な増殖が刺激されてもよい。したがって、処置されうる疾患は、良性細胞増殖および悪性細胞増殖(がん)のような、過剰増殖性疾患を含む。
【０１４９】
処置されうる例示的ながんには、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫(FL)、およびびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBCL); 黒色腫; ならびにCMLを含む白血病を含む、リンパ腫が含まれる。例示的な前がん状態には、骨髄異形成症候群(MDS、かつては前白血病として知られた)が含まれる。
【０１５０】
他のがんには、急性リンパ性白血病; 急性骨髄性白血病; 副腎皮質がん; エイズによるがん; エイズによるリンパ腫; 肛門がん; 星細胞腫、小児小脳; 星細胞腫、小児大脳; 基底細胞がん、皮膚がん(非黒色腫)参照; 胆管がん、肝外; 膀胱がん; 骨がん、骨肉腫/悪性線維性組織球腫; 脳幹グリオーマ; 脳腫瘍; 脳腫瘍、小脳星細胞腫; 脳腫瘍、大脳星細胞腫/悪性神経膠腫; 脳腫瘍、上衣腫; 脳腫瘍、髄芽腫; 脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉腫瘍;脳腫瘍、視経路および視床下部膠腫; 乳がん; 気管支腺腫/カルチノイド; バーキットリンパ腫; カルチノイド腫瘍; カルチノイド腫瘍、胃腸; 原発不明がん; 中枢神経系リンパ腫、原発性; 小脳星細胞腫; 子宮頸がん; 小児がん; 慢性リンパ球性白血病; 慢性骨髄性白血病; 慢性骨髄性白血病、毛様細胞; 慢性骨髄増殖性疾患; 結腸がん; 結腸直腸がん; 皮膚T細胞性リンパ腫、菌状息肉腫およびセザリー症候群参照; 子宮内膜がん; 食道がん; ユーイングファミリーの腫瘍; 肝外胆管がん; 眼がん、眼内黒色腫; 眼がん、網膜芽細胞腫; 胆嚢がん; 胃がん; 消化管カルチノイド腫瘍; 胚細胞腫瘍、頭蓋外; 胚細胞腫瘍、性腺外; 胚細胞腫瘍、卵巣; 妊娠性絨毛腫瘍; 神経膠腫; 神経膠腫、小児脳幹; 神経膠腫、小児大脳星細胞腫; 神経膠腫、小児視経路および視床下部; 有毛細胞白血病; 頭頸部がん; 肝細胞(肝臓)がん、成人(原発性); 肝細胞(肝臓)がん、小児(原発性); ホジキンリンパ腫; 妊娠中のホジキンリンパ腫; 下咽頭がん; 視経路および視床下部膠腫; 眼内黒色腫; 島細胞がん(内分泌性膵臓); カポジ肉腫; 腎臓(腎細胞)がん; 腎臓がん; 喉頭がん; 白血病; 口唇がんおよび口腔がん; 肝臓がん、成人(原発性); 肝臓がん、小児(原発性); 肺がん、非小細胞; 肺がん、小細胞; リンパ腫、原発性中枢神経系; マクログロブリン血症、ヴァルデンストレーム; 骨悪性線維性組織球腫/骨肉腫; 髄芽腫; 黒色腫; メルケル細胞がん; 中皮腫; 中皮腫、成人悪性; 原発不明の転移性頸部扁平上皮がん; 多発性内分泌腫瘍症候群; 多発性骨髄腫; 多発性骨髄腫/形質細胞腫 菌状息肉腫; 骨髄異形成症候群; 骨髄異形成/骨髄増殖性疾患; 骨髄性白血病、成人急性; 骨髄性白血病、小児急性骨髄増殖性疾患、慢性; 副鼻腔および鼻腔がん; 鼻咽腔がん神経芽細胞腫; 非ホジキンリンパ腫; 妊娠中の非ホジキンリンパ腫; 口腔がん; 口腔がん、口唇および; 口腔咽頭がん; 骨肉腫/骨悪性線維性組織球腫; 卵巣がん; 上皮性卵巣がん; 卵巣低悪性度腫瘍; 膵臓がん; 膵臓がん、島細胞; 副鼻腔および鼻腔がん; 副甲状腺がん; 陰茎がん; 褐色細胞腫; 松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉腫瘍; 下垂体部腫瘍; 形質細胞腫/多発性骨髄腫; 膜肺芽腫; 妊娠および乳がん; 前立腺がん; 直腸がん; 網膜芽細胞腫; 横紋筋肉腫; 唾液腺がん; 肉腫、ユーイング腫瘍; 肉腫、軟組織; 肉腫、子宮; セザリー症候群; 皮膚がん; 皮膚がん(非黒色腫); 小腸がん; 軟部組織肉腫; 扁平上皮がん、皮膚がん(非黒色腫)参照; 原発不明の頸部扁平上皮がん、転移性; 胃がん; 睾丸がん; 胸腺腫; 胸腺腫および胸腺がん; 甲状腺がん; 腎盂および尿管の移行上皮がん; 絨毛性腫瘍、妊娠性; 原発部位不明、のがん(Cancer of); 小児の珍しいがん; 尿道がん; 子宮がん、子宮内膜; 子宮肉腫; 膣がん; 小児視経路および視床下部膠腫; 外陰がん; ヴァルデンストレームマクログロブリン血症; ウィルムス腫瘍; ならびに女性のがんが含まれる。
【０１５１】
EZH2によって媒介される、後成的なメチル化が関与する他の任意の疾患は、本明細書において記述される化合物および方法を用いて処置可能または予防可能でありうる。
【０１５２】
例えば、処置されうる神経疾患は、てんかん、統合失調症、双極性障害または他の心理的および/もしくは精神的障害、神経障害、骨格筋萎縮、ならびに神経変性疾患、例えば、神経変性疾患を含む。例示的な神経変性疾患としては、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、およびパーキンソン病が挙げられる。別のクラスの神経変性疾患は、少なくとも部分的には、ポリグルタミンの凝集によって引き起こされる疾患を含む。このクラスの疾患は、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症(Spinalbulbar Muscular Atrophy; SBMAまたはケネディー病)、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPLA)、脊髄小脳性失調症1 (SCA1)、脊髄小脳性失調症2 (SCA2)、マシャド・ジョセフ病(MJD; SCA3)、脊髄小脳性失調症6 (SCA6)、脊髄小脳性失調症7 (SCA7)、および脊髄小脳性失調症12 (SCA12)を含む。
【０１５３】
併用療法
本発明の1つの局面において、EZH2アンタゴニスト、またはその薬学的に許容される塩を別の治療剤と併用して、がんおよび/または神経障害などの疾患を処置することができる。例えば、さらなる薬剤は、本発明の化合物によって処置される疾患または状態を処置するのに有用であると当技術分野において認識されている治療剤でありうる。さらなる薬剤はまた、治療用組成物に有益な特性を与える薬剤(例えば、組成物の粘度に影響を与える薬剤)でありうる。
【０１５４】
本発明によって企図される併用療法は、例えば、単一の薬学的配合物中での本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩、およびさらなる薬剤の投与、ならびに別個の薬学的配合物中での本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩、およびさらなる薬剤の投与を含む。言い換えれば、共投与は、両薬剤の併用の有益な効果を提供するように対象に少なくとも2つの薬剤を投与することを意味するものとする。例えば、薬剤は、同時にまたはある時間にわたって順次投与されてもよい。
【０１５５】
以下に記載される薬剤は、例示を目的としており、限定することを意図するものではない。本発明の一部である、併用は、本発明の化合物および以下の一覧から選択される少なくとも1つのさらなる薬剤であることができる。併用は、形成される組成物がその意図した機能を果たすことができるようなものであるなら、併用は2つ以上のさらなる薬剤、例えば、2つまたは3つのさらなる薬剤を含むこともできる。
【０１５６】
例えば、本発明の1つの局面は、がんおよび/または神経障害の処置のための別の薬剤と併せてEZH2アンタゴニストを用いることに関する。1つの態様において、さらなる薬剤は、HDAC阻害剤のような、ヒストンメチル化に影響を与える化合物である抗がん剤である。ある特定の態様において、さらなる抗がん剤は、化学療法薬(2CdA、5-FU、6-メルカプトプリン、6-TG、Abraxane(商標)、Accutane(登録商標)、アクチノマイシン-D、 Adriamycin(登録商標)、Alimta(登録商標)、全トランス型レチノイン酸、アメトプテリン、Ara-C、アザシチジン、BCNU、Blenoxane(登録商標)、Camptosar(登録商標)、CeeNU(登録商標)、クロファラビン、Clolar(商標)、Cytoxan(登録商標)、塩酸ダウノルビシン、DaunoXome(登録商標)、Dacogen(登録商標)、DIC、Doxil(登録商標)、Ellence(登録商標)、Eloxatin(登録商標)、Emcyt(登録商標)、リン酸エトポシド、Fludara(登録商標)、FUDR(登録商標)、Gemzar(登録商標)、Gleevec(登録商標)、ヘキサメチルメラミン、Hycamtin(登録商標)、Hydrea(登録商標)、Idamycin(登録商標)、Ifex(登録商標)、イクサベピロン、Ixempra(登録商標)、L-アスパラギナーゼ、Leukeran(登録商標)、リポソームAra-C、L-PAM、リソドレン、Matulane(登録商標)、ミトラシン、マイトマイシン-C、Myleran(登録商標)、Navelbine(登録商標)、Neutrexin(登録商標)、ニロチニブ、Nipent(登録商標)、ナイトロジェンマスタード、Novantrone(登録商標)、Oncaspar(登録商標)、Panretin(登録商標)、Paraplatin(登録商標)、Platinol(登録商標)、カルムスチンインプラントを伴うプロリフェプロスパン20、Sandostatin(登録商標)、Targretin(登録商標)、Tasigna(登録商標)、Taxotere(登録商標)、Temodar(登録商標)、TESPA、Trisenox(登録商標)、Valstar(登録商標)、Velban(登録商標)、Vidaza(商標)、硫酸ビンクリスチン、VM26、Xeloda(登録商標)およびZanosar(登録商標)のような); 生物製剤(アルファインターフェロン、カルメット-ゲラン桿菌、Bexxar(登録商標)、Campath(登録商標)、Ergamisol(登録商標)、エルロチニブ、Herceptin(登録商標)、インターロイキン-2、Iressa(登録商標)、レナリドマイド、Mylotarg(登録商標)、Ontak(登録商標)、Pegasys(登録商標)、Revlimid(登録商標)、Rituxan(登録商標)、Tarceva(商標)、Thalomid(登録商標)、Velcade(登録商標)およびZevalin(商標)のような); 小分子(Tykerb(登録商標)のような); コルチコステロイド(リン酸デキサメタゾンナトリウム、DeltaSone(登録商標)およびDelta-Cortef(登録商標)のような); ホルモン療法(Arimidex(登録商標)、Aromasin(登録商標)、Casodex(登録商標)、Cytadren(登録商標)、Eligard(登録商標)、Eulexin(登録商標)、Evista(登録商標)、Faslodex(登録商標)、Femara(登録商標)、Halotestin(登録商標)、Megace(登録商標)、Nilandron(登録商標)、Nolvadex(登録商標)、Plenaxis(商標)およびZoladex(登録商標)のような); ならびに放射性医薬品(Iodotope(登録商標)、Metastron(登録商標)、Phosphocol(登録商標)およびサマリウムSM-153のような)からなる群より選択される。
【０１５７】
投与量
本明細書において用いられる場合、「治療的有効量」または「治療的有効用量」は、状態の進行を完全にもしくは部分的に阻害するか、または状態の1つもしくは複数の症状を少なくとも部分的に軽減する、EZH2アンタゴニストまたは2つもしくはそれ以上のそのような化合物の組み合わせの量である。治療的有効量は、予防的に有効な量であることもできる。治療的に有効な量は、患者のサイズおよび性別、処置される状態、状態の重症度および求められる結果に依存すると考えられる。1つの態様において、治療的有効用量は、患者における症状の軽減をもたらすEZH2アンタゴニストのその量をいう。所与の患者について、治療的有効量は、当業者に公知の方法により判定されうる。
【０１５８】
EZH2アンタゴニストの毒性および治療効果は、例えば、最大耐量(MTD)およびED50 (50%最大反応のための有効用量)を判定するための、細胞培養物または実験動物における標準の薬学的手順によって判定することができる。毒性効果と治療効果との用量比が治療指数であり、これはMTDとED50との比として表すことができる。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトで用いるためのある範囲の投与量を配合するのに用いることができる。投与量は、病変組織または代用組織における酵素阻害の薬力学的マーカー(例えば、ヒストンメチル化または標的遺伝子発現)に及ぼすEZH2アンタゴニストの効果をモニタリングすることによってガイドされてもよい。細胞培養または動物実験を用いて、薬力学的マーカーの変化に必要な用量と治療効果に必要な用量との関係を判定することができ、細胞培養もしくは動物実験または初期段階の臨床試験において判定することができる。そのようなEZH2アンタゴニストの投与量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性なくED50を含む血中濃度の範囲内にある。投与量は、採用される投与量形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変わってもよい。的確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されうる。危機状態の処置においては、MTDに近づく緊急のボーラスまたは注入の施行が、急速な反応を得るために必要とされうる。
【０１５９】
投与量および間隔は、メチルトランスフェラーゼ調節効果、または最小限の有効濃度(MEC)を、治療効果の達成に必要とされる時間、維持するのに十分な活性部分の血漿レベルを提供するために個々に調節されてもよい。MECはEZH2アンタゴニストごとに変わると考えられるが、インビトロでのデータおよび動物実験から推定することができる。MECを達成するために必要な投与量は、投与の個々の特徴および経路に依存すると考えられる。しかしながら、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)アッセイまたはバイオアッセイを用いて血漿濃度を判定することができる。
【０１６０】
投与間隔は、MEC値を用いて判定することもできる。ある特定の態様において、EZH2アンタゴニストは、症状の所望の改善が達成されるまで、10〜90%、好ましくは30〜90%および最も好ましくは50〜90%の時間にMECを超える血漿レベルを維持する投薬レジメンを用いて投与されるべきである。他の態様において、さまざまな時間、さまざまなMEC血漿レベルが維持される。局所投与または選択的摂取の場合、薬物の有効局所濃度は、血漿濃度に関連しなくてもよい。
【０１６１】
当業者は、種々の投与レジメンから選択することができ、投与されるEZH2アンタゴニストの量は、もちろん、処置される対象に依存し、対象の体重、苦痛の重症度、投与の方法および処方医師の判断に依存すると考えられる。
【０１６２】
化合物および薬学的組成物
本発明の局面は、本発明の方法によって有用である化合物に関する。これらの化合物は、本明細書において「EZH2阻害剤」および同様の意味で「EZH2アンタゴニスト」といわれる。化合物は、化合物それ自体、化合物の薬学的に許容される塩として、または薬学的組成物として提示されてもよい。
【０１６３】
本発明の方法で用いるのに適した化合物は、式(I)の化合物またはその塩を含む:
2018083821.tif 000027
式中、
V1はNもしくはCR7であり、
V2はNもしくはCR2であり、ただしV1がNである場合、V2はNであることを条件とし、
XおよびZは、水素、(C1〜C8)アルキル、(C2〜C8)アルケニル、(C2〜C8)アルキニル、非置換もしくは置換(C3〜C8)シクロアルキル、非置換もしくは置換(C3〜C8)シクロアルキル-(C1〜C8)アルキルもしくは-(C2〜C8)アルケニル、非置換もしくは置換(C5〜C8)シクロアルケニル、非置換もしくは置換(C5〜C8)シクロアルケニル-(C1〜C8)アルキルもしくは-(C2〜C8)アルケニル、(C6〜C10)ビシクロアルキル、非置換もしくは置換ヘテロシクロアルキル、非置換もしくは置換ヘテロシクロアルキル-(C1〜C8)アルキルもしくは-(C2〜C8)アルケニル、非置換もしくは置換アリール、非置換もしくは置換アリール-(C1〜C8)アルキルもしくは-(C2〜C8)アルケニル、非置換もしくは置換ヘテロアリール、非置換もしくは置換ヘテロアリール-(C1〜C8)アルキルもしくは-(C2〜C8)アルケニル、ハロ、シアノ、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-CONRaNRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、ニトロ、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-NRaNRaRb、-NRaNRaC(O)Rb、-NRaNRaC(O)NRaRb、-NRaNRaC(O)ORa、-ORa、-OC(O)Ra、および-OC(O)NRaRbからなる群より独立して選択され;
YはHもしくはハロであり;
R1は(C1〜C8)アルキル、(C2〜C8)アルケニル、(C2〜C8)アルキニル、非置換もしくは置換(C3〜C8)シクロアルキル、非置換もしくは置換(C3〜C8)シクロアルキル-(C1〜C8)アルキルもしくは-(C2〜C8)アルケニル、非置換もしくは置換(C5〜C8)シクロアルケニル、非置換もしくは置換(C5〜C8)シクロアルケニル-(C1〜C8)アルキルもしくは-(C2〜C8)アルケニル、非置換もしくは置換(C6〜C10)ビシクロアルキル、非置換もしくは置換ヘテロシクロアルキルもしくは-(C2〜C8)アルケニル、非置換もしくは置換ヘテロシクロアルキル-(C1〜C8)アルキル、非置換もしくは置換アリール、非置換もしくは置換アリール-(C1〜C8)アルキルもしくは-(C2〜C8)アルケニル、非置換もしくは置換ヘテロアリール、非置換もしくは置換ヘテロアリール-(C1〜C8)アルキルもしくは-(C2〜C8)アルケニル、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-CONRaNRaRbであり;
R2は水素、(C1〜C8)アルキル、トリフルオロメチル、アルコキシ、もしくはハロであり、ここで該(C1〜C8)アルキルは、アミノおよび(C1〜C3)アルキルアミノより選択される1〜2個の基で置換されていてもよく;
R7は水素、(C1〜C3)アルキル、もしくはアルコキシであり;
R3は水素、(C1〜C8)アルキル、シアノ、トリフルオロメチル、-NRaRb、もしくはハロであり;
R6は、水素、ハロ、(C1〜C8)アルキル、(C2〜C8)アルケニル、(C2〜C8)アルキニル、非置換もしくは置換(C3〜C8)シクロアルキル、非置換もしくは置換(C3〜C8)シクロアルキル-(C1〜C8)アルキル、非置換もしくは置換(C5〜C8)シクロアルケニル、非置換もしくは置換(C5〜C8)シクロアルケニル-(C1〜C8)アルキル、(C6〜C10)ビシクロアルキル、非置換もしくは置換ヘテロシクロアルキル、非置換もしくは置換ヘテロシクロアルキル-(C1〜C8)アルキル、非置換もしくは置換アリール、非置換もしくは置換アリール-(C1〜C8)アルキル、非置換もしくは置換ヘテロアリール、非置換もしくは置換ヘテロアリール-(C1〜C8)アルキル、シアノ、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-CONRaNRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、ニトロ、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-NRaNRaRb、-NRaNRaC(O)Rb、-NRaNRaC(O)NRaRb、-NRaNRaC(O)ORa、-ORa、-OC(O)Ra、-OC(O)NRaRbからなる群より選択され;
ここでいずれかの(C1〜C8)アルキル、(C2〜C8)アルケニル、(C2〜C8)アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリール基が、-O(C1〜C6)アルキル(Rc)1〜2、-S(C1〜C6)アルキル(Rc)1〜2、-(C1〜C6)アルキル(Rc)1〜2、-(C1〜C8)アルキル-ヘテロシクロアルキル、(C3〜C8)シクロアルキル-ヘテロシクロアルキル、ハロ、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、(C5〜C8)シクロアルケニル、(C1〜C6)ハロアルキル、シアノ、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、ニトロ、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra、OC(O)NRaRb、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール(C1〜C4)アルキル、およびヘテロアリール(C1〜C4)アルキルからなる群より独立して選択される1、2もしくは3個の基により置換されていてもよく;
ここで該アリール、ヘテロアリール、アリール(C1〜C4)アルキル、もしくはヘテロアリール(C1〜C4)アルキルのいずれかのアリール部分もしくはヘテロアリール部分が、ハロ、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、(C5〜C8)シクロアルケニル、(C1〜C6)ハロアルキル、シアノ、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、ニトロ、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra、および-OC(O)NRaRbからなる群より独立して選択される1、2もしくは3個の基により置換されていてもよく;
RaおよびRbはそれぞれ独立して、水素、(C1〜C8)アルキル、(C2〜C8)アルケニル、(C2〜C8)アルキニル、(C3〜C8)シクロアルキル、(C5〜C8)シクロアルケニル、(C6〜C10)ビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリールであり、ここで該(C1〜C8)アルキル、(C2〜C8)アルケニル、(C2〜C8)アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールもしくはヘテロアリール基は、ハロ、ヒドロキシル、(C1〜C4)アルコキシ、アミノ、(C1〜C4)アルキルアミノ、((C1〜C4)アルキル)((C1〜C4)アルキル)アミノ、-CO2H、-CO2(C1〜C4)アルキル、-CONH2、-CONH(C1〜C4)アルキル、-CON((C1〜C4)アルキル)((C1〜C4)アルキル)、-SO2(C1〜C4)アルキル、-SO2NH2、-SO2NH(C1〜C4)アルキル、およびSO2N((C1〜C4)アルキル)((C1〜C4)アルキル)より独立して選択される1、2もしくは3個の基により置換されていてもよく;
またはRaおよびRbは、それらが結合している窒素と一緒になって、酸素、窒素、および硫黄より選択されるさらなるヘテロ原子を含んでいてもよい5〜8員飽和環もしくは不飽和環を表し、ここで該環は、(C1〜C4)アルキル、(C1〜C4)ハロアルキル、アミノ、(C1〜C4)アルキルアミノ、((C1〜C4)アルキル)((C1〜C4)アルキル)アミノ、ヒドロキシル、オキソ、(C1〜C4)アルコキシ、および(C1〜C4)アルコキシ(C1〜C4)アルキルより独立して選択される1、2もしくは3個の基により置換されていてもよく、ここで該環は、(C3〜C8)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリール環と縮合していてもよく;
またはRaおよびRbは、それらが結合している窒素と一緒になって、(C3〜C8)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリール環と縮合していてもよい6〜10員架橋二環式環系を表し;
各Rcは独立して、(C1〜C4)アルキルアミノ、-NRaSO2Rb、-SORa、-SO2Ra、-NRaC(O)ORa、-NRaRb、もしくは-CO2Raである。
【０１６４】
式(I)の一般構造によって包含される化合物のサブグループは、以下のように表される。
【０１６５】
式(I)のサブグループA
XおよびZは、(C1〜C8)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、-NRaRb、および-ORaからなる群より選択され;
YはHもしくはFであり;
R1は、(C1〜C8)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル,ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群より選択され;
R2は水素、(C1〜C8)アルキル、トリフルオロメチル、アルコキシ、もしくはハロであり、ここで該(C1〜C8)アルキルは、アミノおよび(C1〜C3)アルキルアミノより選択される1〜2個の基で置換されていてもよく;
R7は水素、(C1〜C3)アルキル、もしくはアルコキシであり;
R3は、水素、(C1〜C8)アルキル、シアノ、トリフルオロメチル、-NRaRb、およびハロからなる群より選択され;
R6は、水素、ハロ、シアノ、トリフルオロメチル、アミノ、(C1〜C8)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル; アリール、ヘテロアリール、アシルアミノ; (C2〜C8)アルキニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキニル; -SO2Ra; -SO2NRaRbおよび-NRaSO2Rbからなる群より選択され;
ここでいずれかの(C1〜C8)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、(C2〜C8)アルキニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキニル基が、-O(C1〜C6)アルキル(Rc)1〜2、-S(C1〜C6)アルキル(Rc)1〜2、-(C1〜C6)アルキル(Rc)1〜2、-(C1〜C8)アルキル-ヘテロシクロアルキル、(C3〜C8)シクロアルキル-ヘテロシクロアルキル、ハロ、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、(C5〜C8)シクロアルケニル、(C1〜C6)ハロアルキル、シアノ、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、ニトロ、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra、-OC(O)NRaRb、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール(C1〜C4)アルキル、およびヘテロアリール(C1〜C4)アルキルより独立して選択される1、2もしくは3個の基により置換されていてもよく;
RaおよびRbはそれぞれ独立して、水素、(C1〜C8)アルキル、(C2〜C8)アルケニル、(C2〜C8)アルキニル、(C3〜C8)シクロアルキル、(C5〜C8)シクロアルケニル、(C6〜C10)ビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリールであり、ここで該(C1〜C8)アルキル、(C2〜C8)アルケニル、(C2〜C8)アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールもしくはヘテロアリール基は、ハロ、ヒドロキシル、(C1〜C4)アルコキシ、アミノ、(C1〜C4)アルキルアミノ、((C1〜C4)アルキル)((C1〜C4)アルキル)アミノ、-CO2H、-CO2(C1〜C4)アルキル、-CONH2、-CONH(C1〜C4)アルキル、-CON((C1〜C4)アルキル)((C1〜C4)アルキル)、-SO2(C1〜C4)アルキル、-SO2NH2、-SO2NH(C1〜C4)アルキル、および-SO2N((C1〜C4)アルキル)((C1〜C4)アルキル)より独立して選択される1、2もしくは3個の基により置換されていてもよく;
またはRaおよびRbは、それらが結合している窒素と一緒になって、酸素、窒素、および硫黄より選択されるさらなるヘテロ原子を含んでいてもよい5〜8員飽和環もしくは不飽和環を表し、ここで該環は、(C1〜C4)アルキル、(C1〜C4)ハロアルキル、アミノ、(C1〜C4)アルキルアミノ、((C1〜C4)アルキル)((C1〜C4)アルキル)アミノ、ヒドロキシル、オキソ、(C1〜C4)アルコキシ、および(C1〜C4)アルコキシ(C1〜C4)アルキルより独立して選択される1、2もしくは3個の基により置換されていてもよく、ここで該環は、(C3〜C8)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリール環と縮合していてもよく;
またはRaおよびRbは、それらが結合している窒素と一緒になって、(C3〜C8)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリール環と縮合していてもよい6〜10員架橋二環式環系を表す。この特定のサブグループAにおけるアリールもしくはヘテロアリール基は、フラン、チオフェン、ピロール、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、ピラゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、トリアゾール、テトラゾール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、フェニル、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、テトラジン、キノリン、シンノリン、キナゾリン、キノキサリン、およびナフチリジンまたは以下の通りの別のアリールもしくはヘテロアリール基からなる群より独立して選択される:
2018083821.tif 000028
ここで(1)において、
AはO、NH、もしくはSであり; BはCHもしくはNであり、かつCは水素もしくはC1〜C8アルキルであり; または
2018083821.tif 000029
ここで(2)において、
Dは、Nであるか、または水素もしくはC1〜C8アルキルにより置換されていてもよいCであり; または
2018083821.tif 000030
ここで(3)において、
EはNHもしくはCH2であり; FはOもしくはCOであり; かつGはNHもしくはCH2であり; または
2018083821.tif 000031
ここで(4)において、
JはO、SもしくはCOであり; または
2018083821.tif 000032
ここで(5)において、
QはCHもしくはNであり;
MはCHもしくはNであり; かつ
L/(5)は水素、ハロ、アミノ、シアノ、(C1〜C8)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-CONRaNRaRb、-SO2Ra、-SO2NRaRb、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-NRaNRaRb、-NRaNRaC(O)Rb、-NRaNRaC(O)NRaRb、もしくは-ORaであり、
ここでいずれかの(C1〜C8)アルキルもしくは(C3〜C8)シクロアルキル基が、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、(C5〜C8)シクロアルケニル、(C1〜C6)ハロアルキル、シアノ、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、ニトロ、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra、および-OC(O)NRaRbより独立して選択される1、2もしくは3個の基により置換されていてもよく; ここでRaおよびRbが上記のように定義され; または
2018083821.tif 000033
ここで(6)において、
L/(6)はNHもしくはCH2であり; または
2018083821.tif 000034
ここで7において、
M/(7)は水素、ハロ、アミノ、シアノ、(C1〜C8)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-CONRaNRaRb、-SO2Ra、-SO2NRaRb、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-NRaNRaRb、-NRaNRaC(O)Rb、-NRaNRaC(O)NRaRb、もしくは-ORaであり、
ここでいずれかの(C1〜C8)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、もしくはヘテロシクロアルキル基が、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、(C5〜C8)シクロアルケニル、(C1〜C6)ハロアルキル、シアノ、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、ニトロ、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra、および-OC(O)NRaRbより独立して選択される1、2もしくは3個の基により置換されていてもよく; ここでRaおよびRbが上記のように定義され; または
2018083821.tif 000035
ここで(8)において、
PはCH2、NH、O、もしくはSであり; Q/(8)はCHもしくはNであり; かつnは0〜2であり; または
2018083821.tif 000036
ここで(9)において、
S/(9)およびT/(9)はCであるか、またはS/(9)がCでありかつT/(9)がNであるか、またはS/(9)がNでありかつT/(9)がCであり;
Rは水素、アミノ、メチル、トリフルオロメチル、もしくはハロであり;
Uは水素、ハロ、アミノ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、(C1〜C8)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SO2Ra、-SO2NRaRb、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-NRaNRaRb、-NRaNRaC(O)Rb、-ORa、もしくは4-(1H-ピラゾール-4-イル)であり、
ここでいずれかの(C1〜C8)アルキルもしくは(C3〜C8)シクロアルキル基が、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、(C5〜C8)シクロアルケニル、(C1〜C6)ハロアルキル、シアノ、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SRa、SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、ニトロ、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra、および-OC(O)NRaRbより独立して選択される1、2もしくは3個の基により置換されていてもよく; ここでRaおよびRbが上記のように定義される。
【０１６６】
式(I)のサブグループB
XおよびZは、(C1〜C8)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、-NRaRb、および-ORaからなる群より独立して選択され;
YはHであり;
R1は(C1〜C8)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、もしくはヘテロシクロアルキルであり;
R2は水素、(C1〜C3)アルキル、もしくはハロであり、ここで該(C1〜C3)アルキルは、アミノおよび(C1〜C3)アルキルアミノより選択される1〜2個の基で置換されていてもよく;
R7は水素、(C1〜C3)アルキル、もしくはアルコキシであり;
R3は水素、(C1〜C8)アルキルもしくはハロであり;
R6は水素、ハロ、シアノ、トリフルオロメチル、アミノ、(C1〜C8)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アシルアミノ; (C2〜C8)アルキニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキニル、-SO2Ra、-SO2NRaRb、もしくは-NRaSO2Rbであり;
ここでいずれかの(C1〜C8)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、(C2〜C8)アルキニル、アリールアルキニル、もしくはヘテロアリールアルキニル基が、ハロ、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、(C5〜C8)シクロアルケニル、(C1〜C6)ハロアルキル、シアノ、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、ニトロ、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra、-OC(O)NRaRb、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール(C1〜C4)アルキル、およびヘテロアリール(C1〜C4)アルキルより独立して選択される1、2もしくは3個の基により置換されていてもよく;
RaおよびRbはそれぞれ独立して、水素、(C1〜C8)アルキル、(C2〜C8)アルケニル、(C2〜C8)アルキニル、(C3〜C8)シクロアルキル、(C5〜C8)シクロアルケニル、(C6〜C10)ビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリールであり、ここで該(C1〜C8)アルキル、(C2〜C8)アルケニル、(C2〜C8)アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールもしくはヘテロアリール基は、ハロ、ヒドロキシル、(C1〜C4)アルコキシ、アミノ、(C1〜C4)アルキルアミノ、((C1〜C4)アルキル)((C1〜C4)アルキル)アミノ、-CO2H、-CO2(C1〜C4)アルキル、-CONH2、-CONH(C1〜C4)アルキル、-CON((C1〜C4)アルキル)((C1〜C4)アルキル)、-SO2(C1〜C4)アルキル、-SO2NH2、-SO2NH(C1〜C4)アルキル、および-SO2N((C1〜C4)アルキル)((C1〜C4)アルキル)より独立して選択される1、2もしくは3個の基により置換されていてもよく;
またはRaおよびRbは、それらが結合している窒素と一緒になって、酸素、窒素、および硫黄より選択されるさらなるヘテロ原子を含んでいてもよい5〜8員飽和環もしくは不飽和環を表し、ここで該環は、(C1〜C4)アルキル、(C1〜C4)ハロアルキル、アミノ、(C1〜C4)アルキルアミノ、((C1〜C4)アルキル)((C1〜C4)アルキル)アミノ、ヒドロキシル、オキソ、(C1〜C4)アルコキシ、および(C1〜C4)アルコキシ(C1〜C4)アルキルより独立して選択される1、2もしくは3個の基により置換されていてもよく、ここで該環は、(C3〜C8)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリール環と縮合していてもよく;
またはRaおよびRbは、それらが結合している窒素と一緒になって、(C3〜C8)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、もしくはヘテロアリール環と縮合していてもよい6〜10員架橋二環式環系を表す。この定義におけるアリールおよびヘテロアリールは、フラン、チオフェン、ピロール、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、ピラゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、トリアゾール、テトラゾール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、フェニル、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、テトラジン、キノリン、シンノリン、キナゾリン、キノキサリン、およびナフチリジンまたは以下の通りの別のアリールもしくはヘテロアリール基の化合物からなる群より選択される:
2018083821.tif 000037
ここで(1)において、
AはO、NH、もしくはSであり; BはCHもしくはNであり、かつCは水素もしくはC1〜C8アルキルであり; または
2018083821.tif 000038
ここで(2)において、
Dは、Nであるか、または水素もしくはC1〜C8アルキルにより置換されていてもよいCであり; または
2018083821.tif 000039
ここで(3)において、
EはNHもしくはCH2であり; FはOもしくはCOであり; かつGはNHもしくはCH2であり; または
2018083821.tif 000040
ここで(4)において、
JはO、SもしくはCOであり; または
2018083821.tif 000041
ここで(5)において、
QはCHもしくはNであり;
MはCHもしくはNであり; かつ
L/(5)は水素、ハロ、アミノ、シアノ、(C1〜C8)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-CONRaNRaRb、-SO2Ra、-SO2NRaRb、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-NRaNRaRb、-NRaNRaC(O)Rb、-NRaNRaC(O)NRaRb、もしくは-ORaであり、
ここでいずれかの(C1〜C8)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル基が、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、(C5〜C8)シクロアルケニル、(C1〜C6)ハロアルキル、シアノ、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、ニトロ、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra、および-OC(O)NRaRbより独立して選択される1、2もしくは3個の基により置換されていてもよく、
ここでRaおよびRbが上記のように定義され; または
2018083821.tif 000042
ここで(6)において、
L/(6)はNHもしくはCH2であり; または
2018083821.tif 000043
ここで(7)において、
M/(7)は水素、ハロ、アミノ、シアノ、(C1〜C8)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-CONRaNRaRb、-SO2Ra、-SO2NRaRb、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-NRaNRaRb、-NRaNRaC(O)Rb、-NRaNRaC(O)NRaRb、もしくは-ORaであり、
ここでいずれかの(C1〜C8)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル基が、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、(C5〜C8)シクロアルケニル、(C1〜C6)ハロアルキル、シアノ、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SRa、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、ニトロ、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra、-OC(O)NRaRbより独立して選択される1、2もしくは3個の基により置換されていてもよく; ここでRaおよびRbが上記のように定義され; または
2018083821.tif 000044
ここで(8)において、
PはCH2、NH、O、もしくはSであり; Q/(8)はCHもしくはNであり; かつnは0〜2であり; または
2018083821.tif 000045
ここで(9)において、
S/(9)およびT/(9)はCであるか、またはS/(9)がCでありかつT/(9)がNであるか、またはS/(9)がNでありかつT/(9)がCであり;
Rは水素、アミノ、メチル、トリフルオロメチル、ハロであり;
Uは水素、ハロ、アミノ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、(C1〜C8)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SO2Ra、-SO2NRaRb、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-NRaNRaRb、-NRaNRaC(O)Rb、-ORa、もしくは4-(1H-ピラゾール-4-イル)であり、
ここでいずれかの(C1〜C8)アルキルもしくは(C3〜C8)シクロアルキル基が、(C1〜C6)アルキル、(C3〜C8)シクロアルキル、(C5〜C8)シクロアルケニル、(C1〜C6)ハロアルキル、シアノ、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-SORa、-SO2Ra、-SO2NRaRb、ニトロ、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)NRaRb、-NRaC(O)ORa、-NRaSO2Rb、-NRaSO2NRaRb、-ORa、-OC(O)Ra、および-OC(O)NRaRbより独立して選択される1、2もしくは3個の基により置換されていてもよく; ここでRaおよびRbが上記のように定義される。
【０１６７】
式(I)のサブグループC
Xはメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、トリフルオロメチル、テトラヒドロピラン、ヒドロキシメチル、メトキシメチル、もしくはベンジルであり;
YはHであり;
Zはメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、トリフルオロメチル、もしくはベンジルであり;
R1はイソプロピル、tert-ブチル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、(1-メチルエチル)シクロプロピル、1,1-ジオキソ-テトラヒドロチオフェン-3-イル、1-Me-ピペリジン-4-イル、テトラヒドロフラン-3-イル、テトラヒドロピラン-4-イル、N,N-ジメチル-1-プロパンアミニル、ベンジル、もしくは4-ピリジルであり;
R2は水素、(C1〜C3)アルキル、もしくはハロであり、ここで該(C1〜C3)アルキルは、アミノおよび(C1〜C3)アルキルアミノより選択される1〜2個の基で置換されていてもよく;
R7は水素、(C1〜C3)アルキル、もしくはアルコキシであり;
R3はH、メチル、もしくはBrであり; かつ
R6はメチル、ビス(1,1-ジメチルエチル)、ビス(1-メチルエチル)、シクロプロピル、プロピル、ジメチルアミノ、エチルアミノ、(2-ヒドロキシエチル)アミノ、2-プロペン-1-イルアミノ、1-ピペラジニル、1-ピペリジニル、4-モルホリニル、4-ピペリジニルアミノ、テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ、フェニルアミノ、(フェニルメチル)アミノ、(4-ピリジニルメチル)アミノ、[2-(2-ピリジニルアミノ)エチル]アミノ、2-(ジメチルアミノ)エチル]アミノ、4-ピリジニルアミノ、4-(アミノカルボニル)フェニル]アミノ、3-ヒドロキシ-3-メチル-1-ブチン-1-イル、4-ピリジニルエチニル、フェニルエチニル、2-フラニル、3-チエニル; 1H-ピラゾール-4-イル、1H-ピラゾール-5-イル、1H-インダゾール-6-イル、3-メチル-1H-インダゾール-5-イル、1H-1,2,3-ベンゾトリアゾール-5-イル、2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾイミダゾール-5-イル、2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-イル、2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-6-イル、2,1,3-ベンゾオキサジアゾール-5-イル、2-アミノ-6-キナゾリニル、2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロ-5-ピリミジニル、2-アミノ-5-ピリミジニル、7-オキソ-1,5,6,7-テトラヒドロ-1,8-ナフチリジン-3-イル、フェニル、2-メチルフェニル、2-ニトロフェニル、2-フェニルエチル、3-アミノフェニル、4-アミノフェニル、4-クロロフェニル、4-フルオロフェニル、4-(メチルオキシ)フェニル、3-(アセチルアミノ)フェニル、4-(アセチルアミノ)フェニル、4-(アミノカルボニル)フェニル、4-(1H-ピラゾール-4-イル)フェニル、4-(アミノスルホニル)フェニル、4-(メチルスルホニル)フェニル、4-[(ジメチルアミノ)スルホニル]フェニル、4-[(メチルアミノ)カルボニル]フェニル、4-[(メチルアミノ)スルホニル]フェニル、4-[(メチルスルホニル)アミノ]フェニル、3-ピリジニル、4-ピリジニル、2-(4-モルホリニル)-4-ピリジニル、2-アミノ-4-ピリジニル、5-(メチルオキシ)-3-ピリジニル、5-(メチルスルホニル)-3-ピリジニル、5-[(シクロプロピルスルホニル)アミノ]-6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル、5-[(フェニルスルホニル)アミノ]-3-ピリジニル、6-(4-メチル-1-ピペラジニル)-3-ピリジニル、6-(4-モルホリニル)-3-ピリジニル、6-(アセチルアミノ)-3-ピリジニル、6-(ジメチルアミノ)-3-ピリジニル、6-(メチルオキシ)-3-ピリジニル、6-[(メチルアミノ)カルボニル]-3-ピリジニル、6-[(メチルアミノ)スルホニル]-3-ピリジニル、6-メチル-3-ピリジニル、もしくは4-ピリジニルオキシである。(例えばWO 2011/140325; WO 2011/140324; およびWO 2012/005805を参照されたく、これらはそれぞれ、その全体が参照により組み入れられる。)
【０１６８】
本発明の方法で用いるのに適した化合物はまた、式(II)の化合物を含む:
2018083821.tif 000046
式中、
X1はNもしくはCR11であり;
X2はNもしくはCR13であり;
Z1はNR7R8、OR7、SR7、もしくはCR7R8R14であり;
R1、R5、R9、およびR10はそれぞれ、独立して、Hであるか、またはハロ、ヒドロキシル、COOH、C(O)O-C1〜C6 アルキル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、および5員もしくは6員ヘテロアリールからなる群より選択される1つもしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルであり;
R2、R3、およびR4はそれぞれ、独立して、-Q1-T1であり、ここでQ1は結合であるか、またはハロ、シアノ、ヒドロキシルもしくはC1〜C6アルコキシで置換されていてもよいC1〜C3アルキルリンカーであり、かつT1はH、ハロ、ヒドロキシル、COOH、シアノ、もしくはRS1であり、ここでRS1はC1〜C3アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、C1〜C6アルコキシル、C(O)O-C1〜C6アルキル、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、4〜12員ヘテロシクロアルキル、または5員もしくは6員ヘテロアリールであり、かつRs1は、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、COOH、C(O)O-C1〜C6アルキル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、および5員もしくは6員ヘテロアリールからなる群より選択される1つもしくは複数の置換基で置換されていてもよく;
R6はC6〜C10アリールまたは5員もしくは6員ヘテロアリールであり、これらのそれぞれは1つもしくは複数の-Q2-T2で置換されていてもよく、ここでQ2は結合であるか、またはハロ、シアノ、ヒドロキシルもしくはC1〜C6アルコキシで置換されていてもよいC1〜C3アルキルリンカーであり、かつT2はH、ハロ、シアノ、-ORa、-NRaRb、-(NRaRbRc)+A-、-C(O)Ra、-C(O)ORa、-C(O)NRaRb、-NRbC(O)Ra、-NRbC(O)ORa、-S(O)2Ra、-S(O)2NRaRbもしくはRS2であり、ここでRa、Rb、およびRcはそれぞれ、独立して、HもしくはRS3であり、A-は薬学的に許容される陰イオンであり、RS2およびRS3はそれぞれ、独立して、C1〜C6アルキル、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、または5員もしくは6員ヘテロアリールであり、またはRaおよびRbは、それらが結合しているN原子と一緒に、0もしくは1個のさらなるヘテロ原子を有する4〜12員ヘテロシクロアルキル環を形成し、かつRS2、RS3、ならびにRaおよびRbにより形成される4〜12員ヘテロシクロアルキル環はそれぞれ、1つもしくは複数の-Q3-T3で置換されていてもよく、ここでQ3は結合であるか、またはハロ、シアノ、ヒドロキシルもしくはC1〜C6アルコキシでそれぞれ置換されていてもよいC1〜C3アルキルリンカーであり、かつT3は、ハロ、シアノ、C1〜C6アルキル、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、5員もしくは6員ヘテロアリール、ORd、COORd、-S(O)2Rd、-NRdRe、および-C(O)NRdReからなる群より選択され、RdおよびReはそれぞれ、独立して、HもしくはC1〜C6アルキルであり、または-Q3-T3はオキソであり; またはいずれか2つの隣接した-Q2-T2は、それらが結合している原子と一緒に、N、OおよびSより選択される1〜4個のヘテロ原子を含んでいてもよい、かつハロ、ヒドロキシル、COOH、C(O)O-C1〜C6アルキル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、および5員もしくは6員ヘテロアリールからなる群より選択される1つもしくは複数の置換基で置換されていてもよい、5員もしくは6員環を形成し; ただし-Q2-T2がHではないことを条件とし;
R7は-Q4-T4であり、ここでQ4は結合、C1〜C4アルキルリンカー、もしくはC2〜C4アルケニルリンカーであり、各リンカーはハロ、シアノ、ヒドロキシルもしくはC1〜C6アルコキシで置換されていてもよく、かつT4はH、ハロ、シアノ、NRfRg、-ORf、-C(O)Rf、-C(O)ORf、-C(O)NRfRg、-C(O)NRfORg、-NRfC(O)Rg、-S(O)2Rf、もしくはRS4であり、ここでRfおよびRgはそれぞれ、独立して、HもしくはRS5であり、RS4およびRS5はそれぞれ、独立して、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、または5員もしくは6員ヘテロアリールであり、かつRS4およびRS5はそれぞれ、1つもしくは複数の-Q5-T5で置換されていてもよく、ここでQ5は結合、C(O)、C(O)NRk、NRkC(O)、S(O)2、もしくはC1〜C3アルキルリンカーであり、RkはHもしくはC1〜C6アルキルであり、かつT5はH、ハロ、C1〜C6アルキル、ヒドロキシル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、5員もしくは6員ヘテロアリール、またはS(O)qRqであり、ここでqは0、1、もしくは2であり、かつRqはC1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、または5員もしくは6員ヘテロアリールであり、かつT5がH、ハロ、ヒドロキシル、もしくはシアノである場合を除き、T5は、ハロ、C1〜C6アルキル、ヒドロキシル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C 10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、および5員もしくは6員ヘテロアリールからなる群より選択される1つもしくは複数の置換基で置換されていてもよく; または-Q5-T5はオキソであり; ただしR7がHではないことを条件とし;
R8、R11、R12、およびR13はそれぞれ、独立して、H、ハロ、ヒドロキシル、COOH、シアノ、RS6、ORS6、もしくはCOORS6であり、ここでRS6はC1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、C3〜C8シクロアルキル、4〜12員ヘテロシクロアルキル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、もしくはジ-C1〜C6アルキルアミノであり、かつRS6は、ハロ、ヒドロキシル、COOH、C(O)O-C1〜C6アルキル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、およびジ-C1〜C6アルキルアミノからなる群より選択される1つもしくは複数の置換基で置換されていてもよく; またはR7およびR8は、それらが結合しているN原子と一緒に、0〜2個のさらなるヘテロ原子を有する4〜11員ヘテロシクロアルキル環を形成し、またはR7およびR8は、それらが結合しているC原子と一緒に、C3〜C8シクロアルキルを形成するか、または1〜3個のヘテロ原子を有する4〜11員ヘテロシクロアルキル環を形成し、かつR7およびR8により形成される4〜11員ヘテロシクロアルキル環もしくはC3〜C8シクロアルキルはそれぞれ、1つもしくは複数の-Q6-T6で置換されていてもよく、ここでQ6は結合、C(O)、C(O)NRm、NRmC(O)、S(O)2、もしくはC1〜C3アルキルリンカーであり、RmはHもしくはC1〜C6アルキルであり、かつT6はH、ハロ、C1〜C6アルキル、ヒドロキシル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、5員もしくは6員ヘテロアリール、またはS(O)pRpであり、ここでpは0、1、もしくは2であり、かつRpはC1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、または5員もしくは6員ヘテロアリールであり、かつT6がH、ハロ、ヒドロキシル、もしくはシアノである場合を除き、T6は、ハロ、C1〜C6アルキル、ヒドロキシル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C 10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、および5員もしくは6員ヘテロアリールからなる群より選択される1つもしくは複数の置換基で置換されていてもよく; または-Q6-T6はオキソであり; かつ
R14は存在しないか、Hであるか、またはハロ、ヒドロキシル、COOH、C(O)O-C1〜C6アルキル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、および5員もしくは6員ヘテロアリールからなる群より選択される1つもしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルである。
【０１６９】
式(II)の化合物の1つのサブセットは、式(IIa)の化合物を含む:
2018083821.tif 000047
。
【０１７０】
式(II)の化合物の別のサブセットは、式(IIb)、(IIc)、または(IId)の化合物を含む:
2018083821.tif 000048
。
【０１７１】
式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、および(IId)の化合物は、以下の特徴の1つまたは複数を含みうる。
【０１７２】
例えば、X1はCR11であり、かつX2はCR13である。
【０１７３】
例えば、X1はCR11であり、かつX2はNである。
【０１７４】
例えば、X1はNであり、かつX2はCR13である。
【０１７５】
例えば、X1はNであり、かつX2はNである。
【０１７６】
例えば、Z1はNR7R8である。
【０１７７】
例えば、Z1はCR7R8R14である。
【０１７８】
例えば、Z1はOR7である。
【０１７９】
例えば、Z1はSR7である。
【０１８０】
例えば、R6は、1つまたは複数の-Q2-T2で置換されたフェニルである。
【０１８１】
例えば、R6は、N、O、およびSより選択される1〜3個のさらなるヘテロ原子を含みかつ1つまたは複数の-Q2-T2で置換されていてもよい5〜6員ヘテロアリールである。
【０１８２】
例えば、R6はピリジニル、ピラゾリル、ピリミジニル、キノリニル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、フリル、またはチエニルであり、これらのそれぞれは1つまたは複数の-Q2-T2で置換されていてもよい。
【０１８３】
例えば、Q2は結合である。
【０１８４】
例えば、Q2は非置換C1〜C3アルキルリンカーである。
【０１８５】
例えば、T2は、1つまたは複数の-Q3-T3でそれぞれ置換されていてもよい、C1〜C6アルキルまたはC6〜C10アリールである。
【０１８６】
例えば、T2は、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、s-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、s-ペンチルおよびn-ヘキシルを含むが、これらに限定されない、非置換置換直鎖C1〜C6または分枝C3〜C6アルキルである。
【０１８７】
例えば、T2はフェニルである。
【０１８８】
例えば、T2はハロ(例えば、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素)である。
【０１８９】
例えば、T2は、1つまたは複数の-Q3-T3で置換されていてもよい4〜7員ヘテロシクロアルキル(例えば、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、3,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、テトラヒドロ-2H-チオピラン、モルホリニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニルなど)である。
【０１９０】
例えば、T2は、-ORa、-NRaRb、-(NRaRbRc)+A-、-C(O)Ra、-C(O)ORa、-C(O)NRaRb、-NRbC(O)Ra、-NRbC(O)ORa、-S(O)2Ra、または-S(O)2NRaRbである。
【０１９１】
例えば、T2は-NRaRbまたは-C(O)NRaRbであり、ここでRaおよびRbは、それぞれ、独立してHもしくはC1〜C6アルキルであるか、またはRaおよびRbは、それらが結合しているN原子と一緒に、0もしくは1個のさらなるヘテロ原子を有する4〜7員ヘテロシクロアルキル環を形成し、C1〜C6アルキルおよび4〜7員ヘテロシクロアルキル環は、1つもしくは複数の-Q3-T3で置換されていてもよい。
【０１９２】
例えば、Q2は、ハロまたはヒドロキシルで置換されていてもよいC1〜C3アルキルリンカーである。
【０１９３】
例えば、Q2は結合またはメチルリンカーであり、かつT2はH、ハロ、-ORa、-NRaRb、-(NRaRbRc)+A-、または-S(O)2NRaRbである。
【０１９４】
例えば、Ra、Rb、およびRcはそれぞれ、独立して、Hであるか、または1つもしくは複数の-Q3-T3で置換されていてもよいC1〜C6アルキルである。
【０１９５】
例えば、Ra、Rb、およびRcの1つはHである。
【０１９６】
例えば、RaおよびRbは、それらが結合しているN原子と一緒に、該N原子に加えて0または1個のさらなるヘテロ原子を有する4〜7員ヘテロシクロアルキル環(例えば、アゼチジニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニルなど)を形成し、この環は1つまたは複数の-Q3-T3で置換されていてもよい。
【０１９７】
例えば、-Q3-T3はオキソである。
【０１９８】
例えば、T2は、4〜7員ヘテロシクロアルキルまたはC3〜C8シクロアルキルであり、かつ1つまたは複数の-Q3-T3はオキソである。
【０１９９】
例えば、Q3は結合または非置換もしくは置換C1〜C3アルキルリンカーである。
【０２００】
例えば、T3はH、ハロ、4〜7員ヘテロシクロアルキル、C1〜C3アルキル、ORd、COORd、-S(O)2Rd、または-NRdReである。
【０２０１】
例えば、RdおよびReの1つはHである。
【０２０２】
例えば、R7は-C(O)Rfである。
【０２０３】
例えば、R7は-C(O)Rfであり、ここでRfはC3〜C8シクロアルキルである。
【０２０４】
例えば、R7は、1つまたは複数の-Q5-T5で置換されたC6〜C10アリールである。
【０２０５】
例えば、R7は、1つまたは複数の-Q5-T5で置換されていてもよいフェニルである。
【０２０６】
例えば、R7は、1つまたは複数の-Q5-T5で置換されていてもよいC1〜C6アルキルである。
【０２０７】
例えば、R7は、1つまたは複数の-Q5-T5で置換されていてもよいC3〜C8シクロアルキルである。
【０２０８】
例えば、R7は、1つまたは複数の-Q5-T5で置換されていてもよい4〜7員ヘテロシクロアルキル(例えば、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、3,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、テトラヒドロ-2H-チオピラン、およびモルホリニルなど)である。
【０２０９】
例えば、R7は、1つまたは複数の-Q5-T5で置換されていてもよい5〜6員ヘテロシクロアルキルである。
【０２１０】
例えば、R7はイソプロピルである。
【０２１１】
例えば、R7は、1つまたは複数の-Q5-T5でそれぞれ置換されていてもよい、ピロリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラン、テトラヒドロ-2H-チオピラニル、シクロペンチル、またはシクロヘキシル、シクロヘプチルである。
【０２１２】
例えば、R7は、1つまたは複数の-Q5-T5でそれぞれ置換されていてもよい、シクロペンチル シクロヘキシルまたはテトラヒドロ-2H-チオピラニルである。
【０２１３】
例えば、1つまたは複数の-Q5-T5はオキソである。
【０２１４】
例えば、R7は1-オキシド-テトラヒドロ-2H-チオピラニルまたは1,1-ジオキシド-テトラヒドロ-2H-チオピラニルである。
【０２１５】
例えば、Q5は結合であり、かつT5はアミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノである。
【０２１６】
例えば、Q5はNHC(O)であり、かつT5はC1〜C6アルキルまたはC1〜C6アルコキシである。
【０２１７】
例えば、T4は、4〜7員ヘテロシクロアルキルまたはC3〜C8シクロアルキルであり、かつ1つまたは複数の-Q5-T5はオキソである。
【０２１８】
例えば、T5はH、ハロ、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシル、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、または4〜7員ヘテロシクロアルキルである。
【０２１９】
例えば、Q5は結合であり、かつT5はC1〜C6アルキル、C3〜C8シクロアルキル、または4〜7員ヘテロシクロアルキルである。
【０２２０】
例えば、Q5はCO、S(O)2、またはNHC(O)であり; かつT5はC1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシル、C3〜C8シクロアルキル、または4〜7員ヘテロシクロアルキルである。
【０２２１】
例えば、T5は、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、またはC3〜C8シクロアルキルでそれぞれ置換されていてもよい、C1〜C6アルキルまたはC1〜C6アルコキシルである。
【０２２２】
例えば、Q5はC1〜C3アルキルリンカーであり、かつT5はHまたはC6〜C10アリールである。
【０２２３】
例えば、Q5はC1〜C3アルキルリンカーであり、かつT5はC3〜C8シクロアルキル、4〜7員ヘテロシクロアルキル、またはS(O)qRqである。
【０２２４】
例えば、R11はHである。
【０２２５】
例えば、R2およびR4はそれぞれ、独立して、Hであるか、またはアミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、もしくはC6〜C10アリールで置換されていてもよいC1〜C6アルキルである。
【０２２６】
例えば、R2およびR4はそれぞれ、独立して、C1〜C6アルコキシルで置換されていてもよいC1〜C3アルキルである。
【０２２７】
例えば、R2およびR4はそれぞれ、メチルである。
【０２２８】
例えば、R1はHである。
【０２２９】
例えば、R12はH、メチル、エチル、エテニル、またはハロである。
【０２３０】
例えば、R12はメチルである。
【０２３１】
例えば、R12はエチルである。
【０２３２】
例えば、R12はエテニルである。
【０２３３】
例えば、R8はH、メチル、エチル、またはエテニルである。
【０２３４】
例えば、R8はメチルである。
【０２３５】
例えば、R8はエチルである。
【０２３６】
例えば、R8は、4〜7員ヘテロシクロアルキル(例えば、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、3,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、テトラヒドロ-2H-チオピラン、モルホリニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニルなど)である。
【０２３７】
例えば、R8はテトラヒドロピランである。
【０２３８】
例えば、R8はテトラヒドロピランであり、かつR7は-Q4-T4であり、ここでQ4は結合またはC1〜C4アルキルリンカーであり、かつT4はH、C1〜C6アルキル、C3〜C8シクロアルキルまたは4〜7員ヘテロシクロアルキルである。
【０２３９】
例えば、Z1はNR7R8またはCR7R8R14であり、ここでR7およびR8は、それらが結合している原子と一緒に、1つまたは複数の-Q6-T6でそれぞれ置換されていてもよい、1〜3個のヘテロ原子を有する4〜11員ヘテロシクロアルキル環(例えば、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、3,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、テトラヒドロ-2H-チオピラン、およびモルホリニルなど)またはC3〜C8シクロアルキルを形成する。
【０２４０】
例えば、R7およびR8により形成される環は、1つの-Q6-T6でそれぞれ置換されていてもよい、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、およびシクロヘキセニルからなる群より選択される。
【０２４１】
例えば、-Q6-T6はオキソである。
【０２４２】
例えば、T6はH、ハロ、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシル、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、または4〜7員ヘテロシクロアルキルである。
【０２４３】
例えば、Q6は結合であり、かつT6はC1〜C6アルキル、C3〜C8シクロアルキル、または4〜7員ヘテロシクロアルキルである。
【０２４４】
例えば、Q6はCO、S(O)2、またはNHC(O)であり; かつT6はC1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシル、C3〜C8シクロアルキル、または4〜7員ヘテロシクロアルキルである。
【０２４５】
例えば、T6は、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、またはC3〜C8シクロアルキルでそれぞれ置換されていてもよい、C1〜C6アルキルまたはC1〜C6アルコキシルである。
【０２４６】
例えば、Q6はC1〜C3アルキルリンカーであり、かつT6はHまたはC6〜C10アリールである。
【０２４７】
例えば、Q6はC1〜C3アルキルリンカーであり、かつT6はC3〜C8シクロアルキル、4〜7員ヘテロシクロアルキル、またはS(O)pRpである。
【０２４８】
例えば、RpおよびRqはそれぞれ、独立して、C1〜C6アルキルである。
【０２４９】
例えば、R13はHまたはメチルである。
【０２５０】
例えば、R13はHである。
【０２５１】
例えば、R3はHである。
【０２５２】
例えば、A-はBr-である。
【０２５３】
例えば、R5、R9、およびR10はそれぞれ、Hである。
【０２５４】
式(II)の化合物の別のサブセットは、式(IIe)の化合物を含む:
2018083821.tif 000049
。
【０２５５】
式(IIe)の化合物は、以下の特徴の1つまたは複数を含みうる。
【０２５６】
例えば、RaおよびRbはそれぞれ、独立して、Hであるか、または1つもしくは複数の-Q3-T3で置換されていてもよいC1〜C6アルキルである。
【０２５７】
例えば、RaおよびRbの1つはHである。
【０２５８】
例えば、RaおよびRbは、それらが結合しているN原子と一緒に、該N原子に加えて0または1個のさらなるヘテロ原子を有する4〜7員ヘテロシクロアルキル環(例えば、アゼチジニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニルなど)を形成し、この環は1つまたは複数の-Q3-T3で置換されていてもよい。
【０２５９】
例えば、RaおよびRbは、それらが結合しているN原子と一緒に、アゼチジニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、またはモルホリニルを形成し、この環は1つまたは複数の-Q3-T3で置換されていてもよい。
【０２６０】
例えば、1つまたは複数の-Q3-T3はオキソである。
【０２６１】
例えば、Q3は結合または非置換もしくは置換C1〜C3アルキルリンカーである。
【０２６２】
例えば、T3はH、ハロ、4〜7員ヘテロシクロアルキル、C1〜C3アルキル、ORd、COORd、-S(O)2Rd、または-NRdReである。
【０２６３】
例えば、RdおよびReの1つはHである。
【０２６４】
例えば、R7は、1つまたは複数の-Q5-T5でそれぞれ置換されていてもよい、C3〜C8シクロアルキルまたは4〜7員ヘテロシクロアルキルである。
【０２６５】
例えば、R7は、1つまたは複数の-Q5-T5でそれぞれ置換されていてもよい、ピペリジニル、テトラヒドロピラン、テトラヒドロ-2H-チオピラニル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ピロリジニル、またはシクロヘプチルである。
【０２６６】
例えば、R7は、1つまたは複数の-Q5-T5でそれぞれ置換されていてもよい、シクロペンチル シクロヘキシルまたはテトラヒドロ-2H-チオピラニルである。
【０２６７】
例えば、Q5はNHC(O)であり、かつT5はC1〜C6アルキルまたはC1〜C6アルコキシである。
【０２６８】
例えば、1つまたは複数の-Q5-T5はオキソである。
【０２６９】
例えば、R7は1-オキシド-テトラヒドロ-2H-チオピラニルまたは1,1-ジオキシド-テトラヒドロ-2H-チオピラニルである。
【０２７０】
例えば、Q5は結合であり、かつT5はアミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノである。
【０２７１】
例えば、Q5はCO、S(O)2、またはNHC(O)であり; かつT5はC1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシル、C3〜C8シクロアルキル、または4〜7員ヘテロシクロアルキルである。
【０２７２】
例えば、R8はH、メチル、またはエチルである。
【０２７３】
本発明の方法で用いるのに適した化合物はまた、式(III)の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを含む:
2018083821.tif 000050
式(III)中、
X1'はNもしくはCR11'であり;
X2'はNもしくはCR13'であり;
X3はNもしくはCであり、かつX3がNである場合、R6'は存在せず;
Z2はNR7'R8'、OR7'、S(O)a'R7'、またはCR7'R8'R14'であり、ここでa'は0、1、もしくは2であり;
R1'、R5'、R9'、およびR10'はそれぞれ、独立して、Hであるか、またはハロ、ヒドロキシル、COOH、C(O)O-C1〜C6アルキル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、および5員もしくは6員ヘテロアリールからなる群より選択される1つもしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルであり;
R2'、R3'、およびR4'はそれぞれ、独立して、-Q1'-T1'であり、ここでQ1'は結合であるか、またはハロ、シアノ、ヒドロキシルもしくはC1〜C6アルコキシで置換されていてもよいC1〜C3アルキルリンカーであり、かつT1'はH、ハロ、ヒドロキシル、COOH、シアノ、アジド、もしくはRS1'であり、ここでRS1'はC1〜C3アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、C1〜C6アルコキシル、C(O)O-C1〜C6アルキル、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、4〜12員ヘテロシクロアルキル、または5員もしくは6員ヘテロアリールであり、かつRS1'は、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、COOH、C(O)O-C1〜C6アルキル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、および5員もしくは6員ヘテロアリールからなる群より選択される1つもしくは複数の置換基で置換されていてもよく;
R6'はH、ハロ、シアノ、アジド、ORa'、-NRa'Rb'、-C(O)Ra'、-C(O)ORa'、-C(O)NRa'Rb'、-NRb'C(O)Ra'、-S(O)b'Ra'、-S(O)b'NRa'Rb'、もしくはRS2'であり、ここでRS2'はC1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、C3〜C8シクロアルキル、もしくは4〜12員ヘテロシクロアルキルであり、b'は0、1、もしくは2であり、Ra'およびRb'はそれぞれ、独立して、HもしくはRS3'であり、かつRS3'はC1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、または5員もしくは6員ヘテロアリールであり; あるいはRa'およびRb'は、それらが結合しているN原子と一緒に、0もしくは1個のさらなるヘテロ原子を有する4〜12員ヘテロシクロアルキル環を形成し; かつRS2'、RS3'ならびにRa'およびRb'により形成される4〜12員ヘテロシクロアルキル環はそれぞれ、1つもしくは複数の-Q2'-T2'で置換されていてもよく、ここでQ2'は結合であるか、またはハロ、シアノ、ヒドロキシルもしくはC1〜C6アルコキシでそれぞれ置換されていてもよいC1〜C3アルキルリンカーであり、かつT2'はH、ハロ、シアノ、-ORc'、-NRc'Rd'、-C(O)Rc'、-C(O)ORc'、-C(O)NRc'Rd'、-NRd'C(O)Rc'、-NRd'C(O)ORc'、-S(O)2Rc'、-S(O)2NRc'Rd'、もしくはRS4'であり、ここでRc'およびRd'はそれぞれ、独立してHもしくはRS5'であり、RS4'およびRS5'はそれぞれ、独立してC1〜C6アルキル、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、または5員もしくは6員ヘテロアリールであり、あるいはRc'およびRd'は、それらが結合しているN原子と一緒に、0もしくは1個のさらなるヘテロ原子を有する4〜12員ヘテロシクロアルキル環を形成し、かつRS4'、RS5'、ならびにRc'およびRd'により形成される4〜12員ヘテロシクロアルキル環はそれぞれ、1つもしくは複数の-Q3'-T3'で置換されていてもよく、ここでQ3'は結合であるか、またはハロ、シアノ、ヒドロキシルもしくはC1〜C6アルコキシでそれぞれ置換されていてもよいC1〜C3アルキルリンカーであり、かつT3'は、ハロ、シアノ、C1〜C6アルキル、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、5員もしくは6員ヘテロアリール、ORe'、COORe'、-S(O)2Re'、-NRe'Rf'、および-C(O)NRe'Rf'からなる群より選択され、Re'およびRf'はそれぞれ、独立してHもしくはC1〜C6アルキルであり、または-Q3'-T3'はオキソであり; または-Q2'-T2'はオキソであり; ただし-Q2'-T2'がHではないことを条件とし;
R7'は-Q4'-T4'であり、ここでQ4'は結合、C1〜C4アルキルリンカー、またはC2〜C4アルケニルリンカーであり、各リンカーはハロ、シアノ、ヒドロキシルもしくはC1〜C6アルコキシで置換されていてもよく、かつT4'はH、ハロ、シアノ、NRg'Rh'、-ORg'、-C(O)Rg'、-C(O)ORg'、-C(O)NRg'Rh'、-C(O)NRg'ORh'、-NRg'C(O)Rh'、-S(O)2Rg'、もしくはRS6'であり、ここでRg'およびRh'はそれぞれ、独立してHもしくはRS7'であり、RS6'およびRS7'はそれぞれ、独立して、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、または5員もしくは6員ヘテロアリールであり、かつRS6'およびRS7'はそれぞれ、1つもしくは複数の-Q5'-T5'で置換されていてもよく、ここでQ5'は結合、C(O)、C(O)NRk'、NRk'C(O)、S(O)2、もしくはC1〜C3アルキルリンカーであり、Rk'はHもしくはC1〜C6アルキルであり、かつT5'は、H、ハロ、C1〜C6アルキル、ヒドロキシル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、5員もしくは6員ヘテロアリール、またはS(O)q'Rq'であり、ここでq'は0、1、もしくは2であり、かつRq'はC1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、または5員もしくは6員ヘテロアリールであり、かつT5がH、ハロ、ヒドロキシル、もしくはシアノである場合を除き、T5'は、ハロ、C1〜C6アルキル、ヒドロキシル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C 10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、および5員もしくは6員ヘテロアリールからなる群より選択される1つもしくは複数の置換基で置換されていてもよく; または-Q5'-T5'はオキソであり; ただしR7'がHではないことを条件とし;
R8'、R11'、R12'、およびR13'はそれぞれ、独立して、H、ハロ、ヒドロキシル、COOH、シアノ、RS8'、ORS8'、またはCOORS8'であり、ここでRS8'は、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、C3〜C8シクロアルキル、4〜12員ヘテロシクロアルキル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、もしくはジ-C1〜C6アルキルアミノであり、かつRS8'は、ハロ、ヒドロキシル、COOH、C(O)O-C1〜C6アルキル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、およびジ-C1〜C6アルキルアミノからなる群より選択される1つもしくは複数の置換基で置換されていてもよく; またはR7'およびR8'は、それらが結合しているN原子と一緒に、0〜2個のさらなるヘテロ原子を有する4〜12員ヘテロシクロアルキル環を形成し、またはR7'およびR8'は、それらが結合しているC原子と一緒に、C3〜C8シクロアルキルを形成するか、または1〜3個のヘテロ原子を有する4〜12員ヘテロシクロアルキル環を形成し、かつR7'およびR8'により形成される4〜12員ヘテロシクロアルキル環もしくはC3〜C8シクロアルキルはそれぞれ、1つもしくは複数の-Q6'-T6'で置換されていてもよく、ここでQ6'は結合、C(O)、C(O)NRm' 、NRm'C(O)、S(O)2、もしくはC1〜C3アルキルリンカーであり、Rm'はHもしくはC1〜C6アルキルであり、かつT6'はH、ハロ、C1〜C6アルキル、ヒドロキシル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、5員もしくは6員ヘテロアリール、またはS(O)p'Rp'であり、ここでp'は0、1、もしくは2であり、かつRp'はC1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、または5員もしくは6員ヘテロアリールであり、かつT6'がH、ハロ、ヒドロキシル、もしくはシアノである場合を除き、T6'は、ハロ、C1〜C6アルキル、ヒドロキシル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C 10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、および5員もしくは6員ヘテロアリールからなる群より選択される1つもしくは複数の置換基で置換されていてもよく; または-Q6'-T6'はオキソであり; かつ
R14'は存在しないか、Hであるか、またはハロ、ヒドロキシル、COOH、C(O)O-C1〜C6アルキル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、4〜12員ヘテロシクロアルキル、および5員もしくは6員ヘテロアリールからなる群より選択される1つもしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜C6アルキルである。
【０２７４】
式(III)の化合物の1つのサブセットは、式(IIIa)の化合物を含む:
2018083821.tif 000051
。
【０２７５】
式(III)の化合物の別のサブセットは、式(IIIb)、(IIIc)、または(IIId)の化合物を含む:
2018083821.tif 000052
。
【０２７６】
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、および(IIId)の化合物は、以下の特徴の1つまたは複数を含みうる。
【０２７７】
例えば、式(III)の化合物は、
N-(5-(((4,6-ジメチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリジン-3-イル)メチル)カルバモイル)-2-メチルフェニル)フラン-2-カルボキサミド、
N,N'-(5-(((4,6-ジメチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリジン-3-イル)メチル)カルバモイル)-1,3-フェニレン)ジアセトアミド、
N-((4,6-ジメチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリジン-3-イル)メチル)-3-ピバルアミドベンズアミド、
3-(3,4-ジヒドロ-2H-ベンゾ[b][1,4]ジオキセピン-7-スルホンアミド)-N-((4,6-ジメチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリジン-3-イル)メチル)ベンズアミド、
N-((4,6-ジメチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリジン-3-イル)メチル)-3,5-ジメトキシベンズアミド、
N-((4,6-ジメチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリジン-3-イル)メチル)-3,4,5-トリメトキシベンズアミド、
3-アリル-N-((4,6-ジメチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリジン-3-イル)メチル)-4,5-ジメトキシベンズアミド、
4-(2-アミノ-2-オキソエトキシ)-3-クロロ-N-((4,6-ジメチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリジン-3-イル)メチル)-5-メトキシベンズアミド、
3-クロロ-N-((4,6-ジメチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリジン-3-イル)メチル)-4-ヒドロキシ-5-メトキシベンズアミド、または
3-ブロモ-N-((4,6-ジメチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリジン-3-イル)メチル)-5-メトキシ-4-プロポキシベンズアミド
ではない。
【０２７８】
例えば、X1'はCR11'であり、かつX2'はCR13'である。
【０２７９】
例えば、X1'はCR11'であり、かつX2'はNである。
【０２８０】
例えば、X1'はNであり、かつX2'はCR13'である。
【０２８１】
例えば、X1'はNであり、かつX2'はNである。
【０２８２】
例えば、X3はCである。
【０２８３】
例えば、X3はNであり、かつR6'は存在しない。
【０２８４】
例えば、Z2はNR7'R8'である。
【０２８５】
例えば、Z2はCR7'R8'R14'である。
【０２８６】
例えば、Z2はOR7'である。
【０２８７】
例えば、Z2はS(O)a'R7'であり、ここでa'は0、1、または2である。
【０２８８】
例えば、R6'はHである。
【０２８９】
例えば、R6'はハロ(例えば、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素)である。
【０２９０】
例えば、R6'は、1つまたは複数の-Q2'-T2'で置換されていてもよいC1〜C3アルキルである。
【０２９１】
例えば、R6'はCF3である。
【０２９２】
例えば、R6'は、1つまたは複数の-Q2'-T2'でそれぞれ置換されていてもよい、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、またはC3〜C6シクロアルキルである。
【０２９３】
例えば、R6'はエテニルである。
【０２９４】
例えば、R6'はエチニルである。
【０２９５】
例えば、R6'は、1つまたは複数の-Q2'-T2'で置換されたエチニルであり、ここでQ2'は結合またはC1〜C3アルキルリンカーであり、かつT2'は、1つまたは複数の-Q3'-T3'で置換されていてもよい、C1〜C6アルキル、C3〜C6シクロアルキル、または4〜7員ヘテロシクロアルキル(例えば、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、3,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、テトラヒドロ-2H-チオピラニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、およびモルホリニルなど)である。
【０２９６】
例えば、R6'はシアノである。
【０２９７】
例えば、R6'はアジドである。
【０２９８】
例えば、R6'はC(O)Hである。
【０２９９】
例えば、R6'はORa'または-C(O)Ra'である。
【０３００】
例えば、Ra'は、C1〜C6アルキルまたは4〜7員ヘテロシクロアルキル(例えば、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、3,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、テトラヒドロ-2H-チオピラニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、およびモルホリニルなど)であり、これは1つまたは複数の-Q2'-T2'で置換されていてもよい。
【０３０１】
例えば、R6'は、1つまたは複数の-Q2'-T2'で置換されていてもよい4〜7員ヘテロシクロアルキル(例えば、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、3,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、テトラヒドロ-2H-チオピラニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、およびモルホリニルなど)である。
【０３０２】
例えば、R6'は、ピペリジニル、2,2,6,6-テトラメチル-ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、2,2,6,6-テトラメチル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、3,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、またはピロリジニルであり、これらはそれぞれ、1つまたは複数の-Q2'-T2'で置換されていてもよい。
【０３０３】
例えば、R6'は、1つまたは複数の-Q2'-T2'で置換されていてもよい4〜7員ヘテロシクロアルキルであり、かつ-Q2'-T2'はオキソであるか、またはQ2'が結合でありかつT2'が-ORc'、-NRc'Rd'、-C(O)Rc'、-C(O)ORc'、-S(O)2Rc'、C1〜C6アルキル、または4〜7員ヘテロシクロアルキルであり、これらはそれぞれ、Rc'またはRd'がHではない場合に1つまたは複数の-Q3'-T3'で置換されていてもよい。
【０３０４】
例えば、R6'は、-NRa'Rb'、-C(O)Ra'、-C(O)ORa'、-C(O)NRa'Rb'、-NRb'C(O)Ra'、-SRa'、-S(O)2Ra'、または-S(O)2NRa'Rb'である。
【０３０５】
例えば、Ra'およびRb'はそれぞれ、独立して、Hであるか、1つもしくは複数の-Q2'-T2'で置換されていてもよい、C1〜C6アルキルまたはC3〜C8シクロアルキルである。
【０３０６】
例えば、Ra'およびRb'の1つはHである。
【０３０７】
例えば、Ra'およびRb'は、それらが結合しているN原子と一緒に、該N原子に加えて0または1個のさらなるヘテロ原子を有する4〜7員ヘテロシクロアルキル環(例えば、アゼチジニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、およびモルホリニルなど)を形成し、この環は1つまたは複数の-Q2'-T2'で置換されていてもよい。
【０３０８】
例えば、-Q2'-T2'はオキソである。
【０３０９】
例えば、Q2'は結合である。
【０３１０】
例えば、Q2'は非置換C1〜C3アルキルリンカーである。
【０３１１】
例えば、T2'は、1つまたは複数の-Q3'-T3'でそれぞれ置換されていてもよい、C1〜C6アルキルまたはC6〜C10アリールである。
【０３１２】
例えば、T2'は、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、s-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、s-ペンチルおよびn-ヘキシルを含むが、これらに限定されない、非置換置換直鎖C1〜C6または分枝C3〜C6アルキルである。
【０３１３】
例えば、T2'はフェニルである。
【０３１４】
例えば、T2'はハロ(例えば、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素)である。
【０３１５】
例えば、T2'は、1つまたは複数の-Q3'-T3'で置換されていてもよい4〜7員ヘテロシクロアルキル(例えば、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、3,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、テトラヒドロ-2H-チオピラニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、およびモルホリニルなど)である。
【０３１６】
例えば、T2'は-ORc'、-NRc'Rd'、-C(O)Rc'、-C(O)ORc'、または-S(O)2Rc'である。
【０３１７】
例えば、Rc'は、C1〜C6アルキルまたは4〜7員ヘテロシクロアルキル(例えば、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、3,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、テトラヒドロ-2H-チオピラニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、およびモルホリニルなど)であり、これは1つまたは複数の-Q3'-T3'で置換されていてもよい。
【０３１８】
例えば、Rc'およびRd'はそれぞれ、独立して、Hであるか、または1つもしくは複数の-Q3'-T3'で置換されていてもよいC1〜C6アルキルである。
【０３１９】
例えば、Rc'はHである。
【０３２０】
例えば、Rd'はHである。
【０３２１】
例えば、Rc'およびRd'は、それらが結合しているN原子と一緒に、該N原子に加えて0または1個のさらなるヘテロ原子を有する4〜7員ヘテロシクロアルキル環(例えば、アゼチジニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、およびモルホリニルなど)を形成し、この環は1つまたは複数の-Q3'-T3'で置換されていてもよい。
【０３２２】
例えば、Q2'は結合であり、かつT2'は-ORc'、-NRc'Rd'、-C(O)Rc'、-C(O)ORc'、-S(O)2Rc'、C1〜C6アルキル、または4〜7員ヘテロシクロアルキルであり、これらはそれぞれ、Rc'またはRd'がHではない場合に1つまたは複数の-Q3'-T3'で置換されていてもよい。
【０３２３】
例えば、-Q3'-T3'はオキソである。
【０３２４】
例えば、T2'は4〜7員ヘテロシクロアルキルまたはC3〜C8シクロアルキルであり、かつ1つまたは複数の-Q3'-T3'はオキソである。
【０３２５】
例えば、Q3'は結合または非置換もしくは置換C1〜C3アルキルリンカーである。
【０３２６】
例えば、T3'はH、ハロ、4〜7員ヘテロシクロアルキル、C1〜C3アルキル、ORe'、COORe'、-S(O)2Re'、-NRe'Rf'、または-C(O)NRe'Rf'である。
【０３２７】
例えば、Rd'およびRe'の1つはHである。
【０３２８】
例えば、Q3'は結合またはC1〜C3アルキルリンカーであり、かつT3'は、C1〜C3アルキル、ハロ、ORe'、-S(O)2Re'、-NRe'Rf'、および-C(O)NRe'Rf'からなる群より選択される。
【０３２９】
例えば、Q3'は結合またはC1〜C3アルキルリンカーであり、かつT3'は、C1〜C3アルキル、ORe'、-S(O)2Re'、または-NRe'Rf'からなる群より選択される。
【０３３０】
例えば、Re'はHである。
【０３３１】
例えば、Rf'はHである。
【０３３２】
例えば、R7'は-C(O)Rg'である。
【０３３３】
例えば、R7'は-C(O)Rg'であり、ここでRg'はC3〜C8シクロアルキル、4〜7員ヘテロシクロアルキル、C3〜C8シクロアルキルである。
【０３３４】
例えば、R7'は、1つまたは複数の-Q5'-T5'で置換されたC6〜C10アリールである。
【０３３５】
例えば、R7'は、1つまたは複数の-Q5'-T5'で置換されていてもよいフェニルである。
【０３３６】
例えば、R7'は、1つまたは複数の-Q5'-T5'で置換されていてもよいC1〜C6アルキルである。
【０３３７】
例えば、R7'は、1つまたは複数の-Q5'-T5'で置換されていてもよいC3〜C8シクロアルキルである。
【０３３８】
例えば、R7'は、1つまたは複数の-Q5'-T5'で置換されていてもよい4〜7員ヘテロシクロアルキル(例えば、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、3,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、テトラヒドロ-2H-チオピラニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、およびモルホリニルなど)である。
【０３３９】
例えば、R7'は、1つまたは複数の-Q5'-T5'で置換されていてもよい5〜6員ヘテロシクロアルキルである。
【０３４０】
例えば、R7'はイソプロピルである。
【０３４１】
例えば、R7'は、1つの-Q5'-T5'でそれぞれ置換されていてもよい、ピロリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラン、シクロペンチル、またはシクロヘキシル、シクロヘプチルである。
【０３４２】
例えば、R7'は、1つの-Q5'-T5'でそれぞれ置換されていてもよい、シクロペンチルまたはシクロヘキシルである。
【０３４３】
例えば、Q5'はNHC(O)であり、かつT5'はC1〜C6アルキルまたはC1〜C6アルコキシである。
【０３４４】
例えば、-Q5'-T5'はオキソである。
【０３４５】
例えば、T4'は4〜7員ヘテロシクロアルキル、C3〜C8シクロアルキル、またはC6〜C10アリールであり、かつ1つまたは複数の-Q5'-T5'はオキソである。
【０３４６】
例えば、R7'は1-オキシド-テトラヒドロ-2H-チオピラニルまたは1,1-ジオキシド-テトラヒドロ-2H-チオピラニルである。
【０３４７】
例えば、R7'はシクロヘキサノニル、例えば、シクロヘキサノン-4-イルである。
【０３４８】
例えば、T5'はH、ハロ、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシル、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、または4〜7員ヘテロシクロアルキルである。
【０３４９】
例えば、Q5'は結合であり、かつT5'はC1〜C6アルキル、C3〜C8シクロアルキル、または4〜7員ヘテロシクロアルキルである。
【０３５０】
例えば、Q5'は結合であり、かつT5'は5員または6員ヘテロアリール、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノであり、T5'は、ハロ、ヒドロキシル、C1〜C6アルコキシル、またはC3〜C8シクロアルキルからなる群より選択される1つまたは複数の置換基で置換されていてもよい。
【０３５１】
例えば、Q5'はCO、S(O)2、またはNHC(O)であり; かつT5'はC1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシル、C3〜C8シクロアルキル、または4〜7員ヘテロシクロアルキルである。
【０３５２】
例えば、T5'は、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、またはC3〜C8シクロアルキルでそれぞれ置換されていてもよい、C1〜C6アルキルまたはC1〜C6アルコキシルである。
【０３５３】
例えば、Q5'はC1〜C3アルキルリンカーであり、かつT5'はHまたはC6〜C10アリールである。
【０３５４】
例えば、Q5'はC1〜C3アルキルリンカーであり、かつT5'はC3〜C8シクロアルキル、4〜7員ヘテロシクロアルキル、またはS(O)q'Rq'である。
【０３５５】
例えば、R6'はハロ(例えば、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素)であり、かつZ2はS(O)a'R7'であり、ここでa'は0、1、または2であり、かつR7'はC1〜C6アルキル(例えば、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、ブチル、もしくはt-ブチル)、C3〜C8シクロアルキル(例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、もしくはシクロヘプチル)または4〜7員ヘテロシクロアルキル(例えば、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、3,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、テトラヒドロ-2H-チオピラニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、およびモルホリニルなど)であり、かつR7'は1つまたは複数の-Q5'-T5'で置換されていてもよい。
【０３５６】
例えば、R6'はハロ(例えば、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素)であり、かつZ2はOR7'であり、ここでR7'は4〜7員ヘテロシクロアルキル(例えば、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、3,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、テトラヒドロ-2H-チオピラニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、およびモルホリニルなど)であり、かつR7'は1つまたは複数の-Q5'-T5'で置換されていてもよい。
【０３５７】
例えば、R11'はHである。
【０３５８】
例えば、R2'およびR4'はそれぞれ、独立して、Hであるか、またはアジド、ハロ、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、もしくはC6〜C10アリールで置換されていてもよいC1〜C6アルキルである。
【０３５９】
例えば、R2'およびR4'はそれぞれ、独立して、C1〜C6アルコキシルで置換されていてもよいC1〜C3アルキルである。
【０３６０】
例えば、R2'およびR4'はそれぞれ、メチルである。
【０３６１】
例えば、R1'はHである。
【０３６２】
例えば、R1'は、アジド、ハロ、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、またはC6〜C10アリールで置換されていてもよいC1〜C6アルキルである。
【０３６３】
例えば、R12'はH、メチル、エチル、エテニル、またはハロである。
【０３６４】
例えば、R12'はメチルである。
【０３６５】
例えば、R12'はエチルである。
【０３６６】
例えば、R12'はエテニルまたはプロペニルである。
【０３６７】
例えば、R12'はメトキシルである。
【０３６８】
例えば、R8'はH、メチル、エチル、またはエテニルである。
【０３６９】
例えば、R8'はメチルである。
【０３７０】
例えば、R8'はエチルである。
【０３７１】
例えば、R8'はプロピルである。
【０３７２】
例えば、R8'はエテニルまたはプロペニルである。
【０３７３】
例えば、R8'は、ハロ(例えば、F、Cl、もしくはBr)、ヒドロキシル、またはC1〜C6アルコキシルからなる群より選択される1つまたは複数の置換基で置換されたC1〜C6アルキルである。
【０３７４】
例えば、R8'は、4〜7員の置換されていてもよいヘテロシクロアルキル(例えば、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、3,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、テトラヒドロ-2H-チオピラニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、およびモルホリニルなど)である。
【０３７５】
例えば、R8'はピペリジニルである。
【０３７６】
例えば、R8'は、4〜7員の置換されていてもよいヘテロシクロアルキルであり、かつR7'は-Q4'-T4'であり、ここでQ4'は結合またはC1〜C4アルキルリンカーであり、かつT4'はH、C1〜C6アルキル、C3〜C8シクロアルキルまたは4〜7員ヘテロシクロアルキルである。
【０３７７】
例えば、Z2はNR7'R8'またはCR7'R8'R14'であり、ここでR7'およびR8'は、それらが結合している原子と一緒に、1〜3個のヘテロ原子を有する4〜11員ヘテロシクロアルキル環(例えば、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、3,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、テトラヒドロ-2H-チオピラニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、モルホリニルなど)またはC3〜C8シクロアルキルを形成し、それぞれは1つまたは複数の-Q6'-T6'で置換されていてもよい。
【０３７８】
例えば、R7'およびR8'により形成される環は、1つの-Q6'-T6'でそれぞれ置換されていてもよい、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、およびシクロヘキセニルからなる群より選択される。
【０３７９】
例えば、-Q6'-T6'はオキソである。
【０３８０】
例えば、T6'はH、ハロ、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシル、C3〜C8シクロアルキル、C6〜C10アリール、または4〜7員ヘテロシクロアルキルである。
【０３８１】
例えば、Q6'は結合であり、かつT6はC1〜C6アルキル、C3〜C8シクロアルキル、または4〜7員ヘテロシクロアルキルである。
【０３８２】
例えば、Q6'はCO、S(O)2、またはNHC(O)であり; かつT6'はC1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシル、C3〜C8シクロアルキル、または4〜7員ヘテロシクロアルキルである。
【０３８３】
例えば、T6'は、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、C1〜C6アルコキシル、アミノ、モノ-C1〜C6アルキルアミノ、ジ-C1〜C6アルキルアミノ、またはC3〜C8シクロアルキルでそれぞれ置換されていてもよい、C1〜C6アルキルまたはC1〜C6アルコキシルである。
【０３８４】
例えば、Q6'はC1〜C3アルキルリンカーであり、かつT6'はHまたはC6〜C10アリールである。
【０３８５】
例えば、Q6'はC1〜C3アルキルリンカーであり、かつT6'はC3〜C8シクロアルキル、4〜7員ヘテロシクロアルキル、またはS(O)p'Rp'である。
【０３８６】
例えば、Rp'およびRq'はそれぞれ、独立して、C1〜C6アルキルである。
【０３８７】
例えば、R6'は-S(O)b'Ra'またはアジドであり、ここでb'は0、1、または2であり、かつRa'はC1〜C6アルキルまたはC3〜C8シクロアルキルであり; かつZ2はNR7'R8'であり、ここでR7'は、1つまたは複数の-Q5'-T5'でそれぞれ置換されていてもよい、C3〜C8シクロアルキル(例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、もしくはシクロヘプチル)または4〜7員ヘテロシクロアルキル(例えば、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、3,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、テトラヒドロ-2H-チオピラニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、およびモルホリニルなど)であり、かつR8'はHまたはC1〜C6アルキル(例えば、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、ブチル、もしくはt-ブチル)である。
【０３８８】
例えば、R6'はハロ(例えば、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素)であり、かつZ2はNR7'R8'またはCR7'R8'R14'であり、ここでR7'およびR8'は、それらが結合している原子と一緒に、1つまたは複数の-Q6'-T6'でそれぞれ置換されていてもよい、1〜3個のヘテロ原子を有する4〜11員ヘテロシクロアルキル環(例えば、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、3,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、テトラヒドロ-2H-チオピラニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、モルホリニルなど)またはC3〜C8シクロアルキルを形成する。
【０３８９】
例えば、R13'はHまたはメチルである。
【０３９０】
例えば、R13'はHである。
【０３９１】
例えば、R3'はHである。
【０３９２】
例えば、R5'、R9'、およびR10'はそれぞれ、Hである。
【０３９３】
本発明の方法に適した他の化合物は、2012年2月28日付で出願されたPCT/US2012/026953; 2011年4月13日付で出願された米国仮特許出願第61/474821号; 2011年4月13日付で出願された同第61/474825号; 2011年6月21日付で出願された同第61/499595号; および2011年7月8日付で出願された同第61/505676号に記述されており、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０３９４】
本発明の例示的なEZH2阻害剤化合物は、表1に示される。下記表において、
2018083821.tif 000053
の各存在は、
2018083821.tif 000054
と解釈されるべきである。
【０３９５】
（表１）
2018083821.tif 000055
2018083821.tif 000056
2018083821.tif 000057
2018083821.tif 000058
2018083821.tif 000059
2018083821.tif 000060
2018083821.tif 000061
2018083821.tif 000062
2018083821.tif 000063
2018083821.tif 000064
2018083821.tif 000065
2018083821.tif 000066
2018083821.tif 000067
2018083821.tif 000068
2018083821.tif 000069
2018083821.tif 000070
2018083821.tif 000071
2018083821.tif 000072
2018083821.tif 000073
2018083821.tif 000074
2018083821.tif 000075
【０３９６】
別段の指示がない限り、「置換された」という用語は、定義された1つまたは複数の基により置換されていることを意味する。基をいくつかの代替可能な基より選択してよい場合、選択される基は、同じであってもまたは異なってもよい。
【０３９７】
「独立して」という用語は、2つ以上の置換基がいくつかの可能な置換基より選択される場合に、これらの置換基が同じであってもまたは異なってもよいことを意味する。
【０３９８】
「有効量」は、例えば、研究者または臨床医によって求められる、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する薬物または医薬剤の量を意味する。さらに、「治療的有効量」という用語は、このような量を摂取していない対応する対象と比べて、疾患、障害もしくは副作用の処置、治癒、予防、寛解の改善、または疾患もしくは障害の進行速度の減少をもたらすいずれかの量を意味する。この用語は、正常な生理的機能を増強するために有効な量もその範囲内に含む。
【０３９９】
本明細書において用いられる場合、「アルキル」、「C1、C2、C3、C4、C5もしくはC6アルキル」または「C1〜C6アルキル」は、C1、C2、C3、C4、C5またはC6直鎖(線状)飽和脂肪族炭化水素基、およびC3、C4、C5またはC6分枝飽和脂肪族炭化水素基を含むように意図される。例えば、C1〜C6アルキルは、C1、C2、C3、C4、C5およびC6アルキル基を含むように意図される。アルキルの例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、s-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、s-ペンチルまたはn-ヘキシルのような、1〜6個の炭素原子を有する部分が挙げられる。
【０４００】
ある特定の態様において、直鎖または分枝アルキルは、6個またはそれ以下の炭素原子(例えば、直鎖の場合C1〜C6、分枝鎖の場合C3〜C6)を有し、別の態様において、直鎖または分枝アルキルは、4個またはそれ以下の炭素原子を有する。
【０４０１】
本明細書において用いられる場合、「シクロアルキル」という用語は、3〜30個の炭素原子(例えば、C3〜C10)を有する飽和または不飽和非芳香族炭化水素単環または多環(例えば、縮合環、架橋環、もしくはスピロ環)系をいう。シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、およびアダマンチルが挙げられるが、これらに限定されることはない。「ヘテロシクロアルキル」という用語は、特別の定めのない限り、1個または複数個のヘテロ原子(O、N、S、またはSeのような)を有する飽和または不飽和非芳香族3〜8員単環式環系、7〜12員二環式環系(縮合環、架橋環、もしくはスピロ環)、または11〜14員三環式環系(縮合環、架橋環、もしくはスピロ環)をいう。ヘテロシクロアルキル基の例としては、ピペリジニル、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、テトラヒドロフラニル、イソインドリニル、インドリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、オキシラニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、ピラニル、モルホリニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニルなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０４０２】
「置換されていてもよいアルキル」という用語は、非置換アルキル、または炭化水素骨格の1個もしくは複数個の炭素上の1個もしくは複数個の水素原子に取って代わる指定の置換基を有するアルキルをいう。そのような置換基は、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む)、アシルアミノ(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む)、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族部分もしくはヘテロ芳香族部分を含みうる。
【０４０３】
「アリールアルキル」または「アラルキル」部分は、アリールで置換されたアルキル(例えば、フェニルメチル(ベンジル))である。「アルキルアリール」部分は、アルキルで置換されたアリール(例えば、メチルフェニル)である。
【０４０４】
本明細書において用いられる場合、「アルキルリンカー」は、C1、C2、C3、C4、C5またはC6直鎖(線状)飽和二価脂肪族炭化水素基、およびC3、C4、C5またはC6分枝飽和脂肪族炭化水素基を含むように意図される。例えば、C1〜C6アルキルリンカーは、C1、C2、C3、C4、C5およびC6アルキルリンカー基を含むように意図される。アルキルリンカーの例としては、限定されるものではないが、メチル(-CH2-)、エチル(-CH2CH2-)、n-プロピル(-CH2CH2CH2-)、i-プロピル(-CHCH3CH2-)、n-ブチル(-CH2CH2CH2CH2-)、s-ブチル(-CHCH3CH2CH2-)、i-ブチル(-C(CH3)2CH2-)、n-ペンチル(-CH2CH2CH2CH2CH2-)、s-ペンチル(-CHCH3CH2CH2CH2-)またはn-ヘキシル(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)のような、1〜6個の炭素原子を有する部分が挙げられる。
【０４０５】
「アルケニル」は、長さおよび可能な置換が上記アルキルと類似であるが、少なくとも1つの二重結合を含む、不飽和脂肪族基を含む。例えば、「アルケニル」という用語は、直鎖アルケニル基(例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル)、および分枝アルケニル基を含む。ある特定の態様において、直鎖または分枝アルケニル基は、その骨格中に6個またはそれ以下の炭素原子を有する(例えば、直鎖の場合C2〜C6、分枝鎖の場合C3〜C6)。「C2〜C6」という用語は、2〜6個の炭素原子を含むアルケニル基を含む。「C3〜C6」という用語は、3〜6個の炭素原子を含むアルケニル基を含む。
【０４０６】
「置換されていてもよいアルケニル」という用語は、非置換アルケニル、または1個もしくは複数個の炭化水素骨格炭素原子上の1個もしくは複数個の水素原子に取って代わる指定の置換基を有するアルケニルをいう。そのような置換基は、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む)、アシルアミノ(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む)、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族部分もしくはヘテロ芳香族部分を含みうる。
【０４０７】
「アルキニル」は、長さおよび可能な置換が上記アルキルと類似であるが、少なくとも1つの三重結合を含む、不飽和脂肪族基を含む。例えば、「アルキニル」は、直鎖アルキニル基(例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニル)、および分枝アルキニル基を含む。ある特定の態様において、直鎖または分枝アルキニル基は、その骨格中に6個またはそれ以下の炭素原子を有する(例えば、直鎖の場合C2〜C6、分枝鎖の場合C3〜C6)。「C2〜C6」という用語は、2〜6個の炭素原子を含むアルキニル基を含む。「C3〜C6」という用語は、3〜6個の炭素原子を含むアルキニル基を含む。
【０４０８】
「置換されていてもよいアルキニル」という用語は、非置換アルキニル、または1個もしくは複数個の炭化水素骨格炭素原子上の1個もしくは複数個の水素原子に取って代わる指定の置換基を有するアルキニルをいう。そのような置換基は、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む)、アシルアミノ(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む)、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族部分もしくはヘテロ芳香族部分を含みうる。
【０４０９】
他の置換されていてもよい部分(置換されていてもよいシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールのような)は、置換されていない部分と、指定の置換基の1個または複数個を有する部分との両方を含む。例えば、置換されたヘテロシクロアルキルは、2,2,6,6-テトラメチル-ピペリジニルおよび2,2,6,6-テトラメチル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジニルのような、1個または複数個のアルキル基で置換されたものを含む。
【０４１０】
「アリール」は、「共役」系を含む、または少なくとも1個の芳香族環を有しかつ環構造中にいずれのヘテロ原子も含まない多環式系を含む、芳香族性を有する基を含む。例としては、フェニル、ベンジル、1,2,3,4-テトラヒドロナフタレニルなどが挙げられる。
【０４１１】
「ヘテロアリール」基は、環構造中に1〜4個のヘテロ原子を有することを除いて、上記で定義した通りの、アリール基であり、「アリール複素環」または「ヘテロ芳香族」といわれることもある。本明細書において用いられる場合、「ヘテロアリール」という用語は、安定な5員、6員もしくは7員単環式、または7員、8員、9員、10員、11員もしくは12員二環式の芳香族複素環式環を含むように意図され、これは、窒素、酸素および硫黄からなる群より独立して選択される、1個または複数個のヘテロ原子、例えば、1個もしくは1〜2個もしくは1〜3個もしくは1〜4個もしくは1〜5個もしくは1〜6個のヘテロ原子、または例えば、1、2、3、4、5もしくは6個のヘテロ原子と、炭素原子とからなる。窒素原子は、置換されていてもまたは置換されていなくてもよい(すなわち、NまたはNR、ここでRはHまたは定義された通りの、他の置換基である)。窒素および硫黄ヘテロ原子は、酸化されていてもよい(すなわち、N→OおよびS(O)p、ここでp = 1または2)。芳香族複素環中のSおよびO原子の総数は、1以下であることに留意すべきである。
【０４１２】
ヘテロアリール基の例としては、ピロール、フラン、チオフェン、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジンなどが挙げられる。
【０４１３】
さらに、「アリール」および「ヘテロアリール」という用語は、多環式のアリール基およびヘテロアリール基、例えば、三環式、二環式、例えば、ナフタレン、ベンゾオキサゾール、ベンゾジオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチオフェン、メチレンジオキシフェニル、キノリン、イソキノリン、ナフチリジン、インドール、ベンゾフラン、プリン、ベンゾフラン、デアザプリン、インドリジンを含む。
【０４１４】
多環式芳香族環の場合、これらの環のうちの1つのみが芳香族であればよい(例えば、2,3-ジヒドロインドール)が、これらの環の全てが芳香族であってもよい(例えば、キノリン)。第2の環は、縮合されていてもまたは架橋されていてもよい。
【０４１５】
シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環は、1つまたは複数の環位置(例えば、環形成炭素またはNのようなヘテロ原子)で、上記のような置換基、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む)、アシルアミノ(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む)、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族部分もしくはヘテロ芳香族部分で置換されていてもよい。アリールおよびヘテロアリール基は、脂環式環または複素環式環と縮合していてもまたは架橋されていてもよく、これらの環は、多環式系を形成することに関して、芳香族ではない(例えば、テトラリン、メチレンジオキシフェニル)。
【０４１６】
本明細書において用いられる場合、「炭素環」または「炭素環式環」は、特定された数の炭素を有する、任意の安定な単環式、二環式または三環式の環であって、そのいずれかが飽和、不飽和または芳香族でありうる該環を含むように意図される。炭素環は、シクロアルキルおよびアリールを含む。例えば、C3〜C14炭素環は、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13または14個の炭素原子を有する、単環式、二環式または三環式の環を含むように意図される。炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロブテニル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘプテニル、シクロヘプチル、シクロヘプテニル、アダマンチル、シクロオクチル、シクロオクテニル、シクロオクタジエニル、フルオレニル、フェニル、ナフチル、インダニル、アダマンチル、およびテトラヒドロナフチルが挙げられるが、これらに限定されることはない。架橋環も、例えば、[3.3.0]ビシクロオクタン、[4.3.0]ビシクロノナン、[4.4.0]ビシクロデカンおよび[2.2.2]ビシクロオクタンを含めて、炭素環の定義に含まれる。架橋環は、1個または複数個の炭素原子が2個の隣接しない炭素原子を連結する場合に、生じる。1つの態様において、架橋環は、1個または2個の炭素原子である。橋は常に、単環式環を三環式環に転換させることに留意されたい。環が架橋される場合、その環に関して記載される置換基は、その橋にも存在しうる。縮合環(例えば、ナフチル、テトラヒドロナフチル)およびスピロ環も含まれる。
【０４１７】
本明細書において用いられる場合、「複素環」または「複素環式基」は、少なくとも1個の環ヘテロ原子(例えば、N、OまたはS)を含む、任意の環構造(飽和、不飽和または芳香族)を含む。複素環は、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールを含む。複素環の例としては、モルホリン、ピロリジン、テトラヒドロチオフェン、ピペリジン、ピペラジン、オキセタン、ピラン、テトラヒドロピラン、アゼチジン、およびテトラヒドロフランが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０４１８】
複素環式基の例としては、アクリジニル、アゾシニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサゾリニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾテトラゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾイミダゾリニル、カルバゾリル、4aH-カルバゾリル、カルボリニル、クロマニル、クロメニル、シンノリニル、デカヒドロキノリニル、2H,6H-1,5,2-ジチアジニル、ジヒドロフロ[2,3-b]テトラヒドロフラン、フラニル、フラザニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、1H-インダゾリル、インドレニル、インドリニル、インドリジニル、インドリル、3H-インドリル、イサチノイル、イソベンゾフラニル、イソクロマニル、イソインダゾリル、イソインドリニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、メチレンジオキシフェニル、モルホリニル、ナフチリジニル、オクタヒドロイソキノリニル、オキサジアゾリル、1,2,3-オキサジアゾリル、1,2,4-オキサジアゾリル、1,2,5-オキサジアゾリル、1,3,4-オキサジアゾリル、1,2,4-オキサジアゾール 5(4H)-オン、オキサゾリジニル、オキサゾリル、オキシインドリル、ピリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチニル、フェノキサジニル、フタラジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピペリドニル、4-ピペリドニル、ピペロニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドオキサゾール、ピリドイミダゾール、ピリドチアゾール、ピリジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピロリニル、2H-ピロリル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、4H-キノリジニル、キノキサリニル、キヌクリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラゾリル、6H-1,2,5-チアジアジニル、1,2,3-チアジアゾリル、1,2,4-チアジアゾリル、1,2,5-チアジアゾリル、1,3,4-チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、チエノチアゾリル、チエノオキサゾリル、チエノイミダゾリル、チオフェニル、トリアジニル、1,2,3-トリアゾリル、1,2,4-トリアゾリル、1,2,5-トリアゾリル、1,3,4-トリアゾリルおよびキサンテニルが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０４１９】
「置換された」という用語は、本明細書において用いられる場合、指定の原子上のいずれか1個または複数個の水素原子が、示された基から選択されたもので置き換えられているが、ただし、指定の原子の通常の原子価を超えないこと、そしてその置換が安定な化合物をもたらすことを意味する。置換基がオキソまたはケト(すなわち、=O)である場合、その原子上の2個の水素原子が置き換えられる。ケト置換基は、芳香族部分には存在しない。環二重結合は、本明細書において用いられる場合、2個の隣接する環原子間に形成される二重結合(例えば、C=C、C=NまたはN=N)である。「安定な化合物」および「安定な構造」は、反応混合物からの有用な純度への単離、および有効な治療剤への処方に耐えるのに十分に頑強な化合物を指すことを意味する。
【０４２０】
ある置換基への結合が、環内の2個の原子をつなぐ結合を横切るように示される場合、このような置換基は、この環内の任意の原子に結合されうる。置換基が、その置換基と所与の式の化合物の残部との結合に介在する原子を示さずに、列挙される場合、このような置換基は、そのような式中の任意の原子を介して結合されうる。置換基および/または可変物の組み合わせが許されるが、このような組み合わせが安定な化合物をもたらす場合に限る。
【０４２１】
任意の可変物(例えば、R1)が、ある化合物についての任意の構成要素または式中に2回以上存在する場合、各存在におけるその定義は、他のいずれの存在におけるその定義とも無関係である。したがって、例えば、ある基が0〜2個のR1部分で置換されているように示されるなら、その基は、最大2個のR1部分で置換されていてもよく、各存在におけるR1は、R1の定義から独立に選択される。また、置換基および/または可変物の組み合わせが許されるが、このような組み合わせが安定な化合物をもたらす場合に限る。
【０４２２】
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」という用語は、-OHまたは-O-を有する基を含む。
【０４２３】
本明細書において用いられる場合、「ハロ」または「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素をいう。「過ハロゲン化」という用語は一般に、全ての水素原子がハロゲン原子により置き換えられた部分をいう。「ハロアルキル」または「ハロアルコキシル」という用語は、1個または複数個のハロゲン原子で置換されたアルキルまたはアルコキシルをいう。
【０４２４】
「カルボニル」という用語は、二重結合で酸素原子につながれた炭素を含む、化合物および部分を含む。カルボニルを含む部分の例としては、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、アミド、エステル、無水物などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０４２５】
「カルボキシル」という用語は、-COOHまたはそのC1〜C6アルキルエステルをいう。
【０４２６】
「アシル」は、アシルラジカル(R-C(O)-)またはカルボニル基を含んだ部分を含む。「置換(された)アシル」は、水素原子の1個または複数個が、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む)、アシルアミノ(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む)、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族部分もしくはヘテロ芳香族部分により置き換えられているアシル基を含む。
【０４２７】
「アロイル」は、カルボニル基に結合したアリール部分またはヘテロ芳香族部分を有する部分を含む。アロイル基の例としては、フェニルカルボキシ、ナフチルカルボキシなどが挙げられる。
【０４２８】
「アルコキシアルキル」、「アルキルアミノアルキル」および「チオアルコキシアルキル」は、酸素原子、窒素原子または硫黄原子が、1個または複数個の炭化水素骨格炭素原子に取って代わっている、上記の通りのアルキル基を含む。
【０４２９】
「アルコキシ」または「アルコキシル」という用語は、酸素原子に共有結合している、置換および非置換のアルキル基、アルケニル基およびアルキニル基を含む。アルコキシ基またはアルコキシルラジカルの例としては、メトキシ基、エトキシ基、イソプロピルオキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基およびペントキシ基が挙げられるが、これらに限定されることはない。置換されたアルコキシ基の例としては、ハロゲン化アルコキシ基が挙げられる。アルコキシ基は、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む)、アシルアミノ(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む)、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールのような基、または芳香族部分もしくはヘテロ芳香族部分で置換されうる。ハロゲンで置換されたアルコキシ基の例としては、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシおよびトリクロロメトキシが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０４３０】
「エーテル」または「アルコキシ」という用語は、2個の炭素原子またはヘテロ原子に結合した酸素を含む、化合物または部分を含む。例えば、この用語は「アルコキシアルキル」を含み、これは、アルキル基に共有結合した酸素原子と共有結合している、アルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基をいう。
【０４３１】
「エステル」という用語は、カルボニル基の炭素に結合している酸素原子と結合した炭素またはヘテロ原子を含む、化合物または部分を含む。「エステル」という用語は、アルコキシカルボキシ基、例えばメトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ペントキシカルボニルなどを含む。
【０４３２】
「チオアルキル」という用語は、硫黄原子とつながれたアルキル基を含む、化合物または部分を含む。チオアルキル基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、カルボキシ酸(carboxyacid)、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む)、アシルアミノ(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む)、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールのような基、または芳香族部分もしくはヘテロ芳香族部分で置換されうる。
【０４３３】
「チオカルボニル」または「チオカルボキシ」という用語は、二重結合で硫黄原子につながれた炭素を含む、化合物または部分を含む。
【０４３４】
「チオエーテル」という用語は、2個の炭素原子またはヘテロ原子に結合した硫黄原子を含んだ部分を含む。チオエーテルの例としては、アルカチオアルキル(alkthioalkyl)、アルカチオアルケニル(alkthioalkenyl)およびアルカチオアルキニル(alkthioalkynyl)が挙げられるが、これらに限定されることはない。「アルカチオアルキル」という用語は、アルキル基に結合している硫黄原子と結合した、アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を有する部分を含む。同様に、「アルカチオアルケニル」という用語は、アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基が、アルケニル基に共有結合した硫黄原子と結合している部分をいい; 「アルカチオアルキニル」とは、アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基が、アルキニル基に共有結合した硫黄原子と結合している部分をいう。
【０４３５】
本明細書において用いられる場合、「アミン」または「アミノ」は、非置換または置換-NH2をいう。「アルキルアミノ」は、-NH2の窒素が少なくとも1個のアルキル基と結合している化合物の群を含む。アルキルアミノ基の例としては、ベンジルアミノ、メチルアミノ、エチルアミノ、フェネチルアミノなどが挙げられる。「ジアルキルアミノ」は、-NH2の窒素が少なくとも2個のさらなるアルキル基と結合している基を含む。ジアルキルアミノ基の例としては、ジメチルアミノおよびジエチルアミノが挙げられるが、これらに限定されることはない。「アリールアミノ」および「ジアリールアミノ」は、窒素がそれぞれ少なくとも1個または2個のアリール基と結合している基を含む。「アミノアリール」および「アミノアリールオキシ」は、アミノで置換されたアリールおよびアリールオキシをいう。「アルキルアリールアミノ」、「アルキルアミノアリール」または「アリールアミノアルキル」は、少なくとも1個のアルキル基および少なくとも1個のアリール基に結合しているアミノ基をいう。「アルカミノアルキル」は、アルキル基にも結合した窒素原子と結合している、アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基をいう。「アシルアミノ」は、窒素がアシル基と結合している基を含む。アシルアミノの例としては、アルキルカルボニルアミノ基、アリールカルボニルアミノ基、カルバモイル基およびウレイド基が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０４３６】
「アミド」または「アミノカルボキシ」という用語は、カルボニル基またはチオカルボニル基の炭素に結合している窒素原子を含む、化合物または部分を含む。この用語は、「アルカミノカルボキシ」基を含み、これは、カルボニル基またはチオカルボニル基の炭素に結合しているアミノ基と結合した、アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を含む。これはまた、「アリールアミノカルボキシ」基を含み、これは、カルボニル基またはチオカルボニル基の炭素に結合しているアミノ基と結合した、アリール部分またはヘテロアリール部分を含む。「アルキルアミノカルボキシ」、「アルケニルアミノカルボキシ」、「アルキニルアミノカルボキシ」および「アリールアミノカルボキシ」という用語は、アルキル部分、アルケニル部分、アルキニル部分およびアリール部分が、それぞれ窒素原子と結合しており、この窒素原子が次に、カルボニル基の炭素と結合している、部分を含む。アミドは、直鎖アルキル、分枝アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素環のような置換基で置換されていてもよい。アミド基の置換基がさらに置換されていてもよい。
【０４３７】
「されていてもよい」という用語は、記述される事象が行われていてもまたは行われていなくてもよいこと、ならびに行われる事象と、行われない事象との両方を含むことを意味する。
【０４３８】
本明細書において、「薬学的に許容される塩」という用語は、対象化合物の所望の生物学的活性を保持しており、かつ望ましくない毒性学的影響が最小限である塩をいう。これらの薬学的に許容される塩は、化合物の最終的な単離および精製中にその場(in situ)で調製されてもよく、または遊離酸もしくは遊離塩基の形態である精製化合物を別個に、それぞれ、適当な塩基もしくは酸と反応させることによって調製されてもよい。
【０４３９】
本明細書において用いられる「共投与する」という用語およびその派生語は、がんの処置か、がんもしくはがん治療の副作用の処置か、または他の何らかの疾患の処置かにかかわらず、1つまたは複数の薬学的に活性なさらなる化合物の同時投与または任意の様式の別々での連続投与のいずれかを意味する。好ましくは、投与が同時でないなら、化合物は互いにごく近接した時間で投与される。さらに、化合物が同じ投与形態で投与されるかどうかは問題ではなく、例えば、1つの化合物が局所投与され、かつ別の化合物が経口投与されてもよい。
【０４４０】
式(I)〜(III)の化合物は、化合物それ自体、ならびに、妥当な場合、その塩、その溶媒和物、そのN-オキシドおよびそのプロドラッグを含む。ある特定の態様において、式(I)〜(III)による化合物は、酸性官能基、塩を形成するために十分酸性なものを含みうる。代表的な塩には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩、および亜鉛塩のような薬学的に許容される金属塩; ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、および亜鉛のような薬学的に許容される金属塩の炭酸塩および重炭酸塩; 脂肪族アミン、芳香族アミン、脂肪族ジアミン、およびヒドロキシアルキルアミン、例えばメチルアミン、エチルアミン、2-ヒドロキシエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、およびシクロヘキシルアミンを含む薬学的に許容される有機第一級、第二級、および第三級アミンが含まれる。
【０４４１】
ある特定の態様において、式(I)〜(III)による化合物は、塩基性官能基を含んでもよく、それゆえ、適当な酸での処理により薬学的に許容される酸付加塩を形成することができる。適当な酸には、薬学的に許容される無機酸および薬学的に許容される有機酸が含まれる。代表的な薬学的に許容される酸付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、メチル硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、スルファミン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、ヒドロキシ酢酸塩、フェニル酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、イソ酪酸塩、吉草酸塩、マレイン酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、アクリル酸塩、フマル酸塩、リンゴ塩酸、酒石酸塩、クエン酸塩、サリチル酸塩、p-アミノサリチル酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ヘプタン酸塩、フタル酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、o-アセトキシ安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、マンデル酸塩、タンニン酸塩、ギ酸塩、ステアリン酸塩、アスコルビン酸塩、パルミチン酸塩、オレイン酸塩、ピルビン酸塩、パモ酸塩、マロン酸塩、ラウリン酸塩、グルタル酸塩、グルタミン酸塩、エストル酸塩、メタンスルホン酸塩(メシル酸塩)、エタンスルホン酸塩(エシル酸塩)、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩(ベシル酸塩)、p-アミノベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩(トシル酸塩)およびナフタレン-2-スルホン酸塩が挙げられる。
【０４４２】
窒素を含有する本発明の化合物は、酸化剤(例えば、3-クロロペルオキシ安息香酸(mCPBA)および/または過酸化水素)で処理することによりN-オキシドに変換され、本発明の他の化合物を得ることができる。かくして、示されかつ特許請求される窒素含有化合物は全て、原子価および構造により許容される場合、示される通りの化合物と、そのN-オキシド誘導体(これはN→OまたはN+-O-と表されうる)との両方を含むと考えられる。さらに、他の場合において、本発明の化合物中の窒素はN-ヒドロキシまたはN-アルコキシ化合物に変換されうる。例えば、N-ヒドロキシ化合物は、m-CPBAのような酸化剤による親アミンの酸化によって調製されうる。示されかつ特許請求される含窒素化合物は全て、原子価および構造により許容される場合、示される通りの化合物と、そのN-ヒドロキシ(すなわち、N-OH)およびN-アルコキシ(すなわち、N-OR、ここでRは置換または非置換C1〜C6アルキル、C1〜C6アルケニル、C1〜C6アルキニル、3員〜14員炭素環または3員〜14員複素環である)誘導体との両方を包含すると考えられる。
【０４４３】
本明細書において、化合物の構造式は、場合によっては便宜的にある特定の異性体を表すが、本発明は、幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体などのような、全ての異性体を含む。加えて、式によって表される化合物について結晶多形が存在しうる。いずれの結晶形、結晶形の混合物、またはその無水物もしくは水和物も本発明の範囲内に含まれることに留意されたい。さらに、本発明の化合物のインビボでの分解により生成される、いわゆる代謝産物は、本発明の範囲内に含まれる。
【０４４４】
「異性」は、同一の分子式を有するが、その原子の結合の順序またはその原子の空間配置が異なる、化合物を意味する。その原子の空間配置が異なる異性体は「立体異性体」と称される。互いに鏡像ではない立体異性体は「ジアステレオ異性体」と称され、互いに重ね合わせることができない鏡像である立体異性体は「鏡像異性体」または時に光学異性体と称される。逆のキラリティーの個々の鏡像異性体型を等量含有する混合物は、「ラセミ混合物」と称される。
【０４４５】
4つの同一でない置換基に結合した炭素原子は、「キラル中心」と称される。
【０４４６】
「キラル異性体」は、少なくとも1個のキラル中心を有する化合物を意味する。2個以上のキラル中心を有する化合物は、個々のジアステレオ異性体として、または「ジアステレオ異性体混合物」と称されるジアステレオ異性体の混合物として存在しうる。1個のキラル中心が存在する場合、立体異性体は、そのキラル中心の絶対配置(RまたはS)によって特徴付けられうる。絶対配置は、キラル中心に結合した置換基の空間配置をいう。想定されるキラル中心に結合した置換基は、Cahn, Ingold and Prelogの順位則にしたがってランク付けされる(Cahn et al., Angew. Chem. Inter. Edit. 1966, 5, 385; errata 511; Cahn et al., Angew. Chem. 1966, 78, 413; Cahn and Ingold, J. Chem. Soc. 1951 (London), 612; Cahn et al., Experientia 1956, 12, 81; Cahn, J. Chem. Educ. 1964, 41, 116)。
【０４４７】
「幾何異性体」は、二重結合またはシクロアルキルリンカー(例えば、1,3-シクロブチル)の周りの回転障害があるために存在する、ジアステレオ異性体を意味する。これらの配置は、その名称にて、Cahn-Ingold-Prelog順位則にしたがって、基が分子内で二重結合に対して同じ側または異なる側にあることを示す、接頭辞のシスおよびトランス、またはZおよびEを付すことにより区別される。
【０４４８】
本発明の化合物は、異なるキラル異性体または幾何異性体として描かれうることが理解されるべきである。また、化合物がキラル異性体型または幾何異性体型を有する場合、全ての異性体型は本発明の範囲内に含まれるように意図され、化合物の命名はいずれの異性体型も排除するものではないことが理解されるべきである。
【０４４９】
さらに、本発明において論じられる構造および他の化合物は、その全てのアトロプ異性体を含む。「アトロプ異性体」は、2つの異性体の原子が空間中で異なる配置にある、立体異性体の一種である。アトロプ異性体は、中心結合の周りの大きな基の回転の障害によって引き起こされる制限された回転があるために存在する。このようなアトロプ異性体は、典型的には、混合物として存在するが、クロマトグラフィー技術の近年の進歩の結果として、選択の事例で、2つのアトロプ異性体の混合物を分離することが可能になっている。
【０４５０】
「互変異性体」は、平衡状態で存在する2つまたはそれ以上の構造異性体のうちの1つであり、1つの異性体型から別の型へと容易に転換される。この転換は、水素原子の形式的な移動をもたらし、隣接する共役二重結合の切り替えを伴う。互変異性体は、溶液中で互変異性体のセットの混合物として存在する。互変異性化が可能である溶液中では、互変異性体の化学平衡に達する。互変異性体の正確な比率は、温度、溶媒およびpHを含めて、いくつかの要因に依る。互変異性化により相互転換可能な互変異性体の概念は、互変異性と呼ばれる。
【０４５１】
可能性のあるさまざまなタイプの互変異性のうち、2つのものが一般的に観察される。ケト-エノール互変異性では、電子および水素原子の同時シフトが起こる。環-鎖互変異性は、糖鎖分子中のアルデヒド基(-CHO)が、同じ分子中のヒドロキシ基(-OH)の1つと反応して、グルコースにより示されるような環状(環形状)の形態を与える結果として生じる。
【０４５２】
一般的な互変異性の対は、ケトン-エノール、アミド-ニトリル、ラクタム-ラクチム、複素環式環における(例えば、グアニン、チミンおよびシトシンのような核酸塩基における)アミド-イミド酸互変異性、イミン-エナミンならびにエナミン-エナミンである。ケト-エノール平衡の一例は、以下に示されるように、ピリジン-2(1H)-オンとその対応するピリジン-2-オールとの間の平衡である。
2018083821.tif 000076
【０４５３】
本発明の化合物は、さまざまな互変異性体として描かれうることが理解されるべきである。化合物が互変異性体型を有する場合、全ての互変異性体型が、その混合物を含めて、本発明の範囲内に含まれるように意図され、それらの化合物の命名は、いずれの互変異性体型も除外しないことも、理解されるべきである。
【０４５４】
式(I)〜(III)の化合物は、結晶形または非結晶形で調製されてもよく、結晶性なら、例えば、水和物として、任意で溶媒和されてもよい。本発明はその範囲のなかに、化学量論的な溶媒和物(例えば、水和物)および可変量の溶媒(例えば、水)を含有する化合物を含む。
【０４５５】
本明細書において記述されるある特定の化合物は、1個もしくは複数個のキラル原子を含んでもよく、またはそうでなければ、2つの鏡像異性体として存在可能であってもよい。以下で特許請求される化合物は、鏡像異性体の混合物、および精製された鏡像異性体または鏡像異性的に濃縮された混合物を含む。式(I)〜(III)によって表される、または以下で特許請求される、化合物の個々の異性体、および任意の完全にまたは部分的に平衡化したその混合物も、本発明の範囲内に含まれる。本発明はまた、特許請求される化合物の個々の異性体を、1個または複数個のキラル中心が反転したその異性体との混合物として包含する。
【０４５６】
異なる異性体型が存在する場合、従来の方法によってそれらを互いに分離または分割してもよく、あるいは従来の合成方法によってまたは立体特異的合成もしくは不斉合成によって任意の所与の異性体を得てもよい。
【０４５７】
治療で用いるため、式(I)〜(III)の化合物、および塩、溶媒和物、N-オキシドなどが純調製物(neat preparation)として、すなわち、追加の担体なしで投与されうることが可能であるが、担体または希釈剤とともに調製された活性成分を提示することが常とうな手段である。したがって、本発明は、式(I)〜(III)の化合物および塩、溶媒和物などと、1つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、薬学的組成物をさらに提供する。式(I)〜(III)の化合物、および塩、溶媒和物、N-オキシドなどは、上記の通りである。担体、希釈剤、または賦形剤は、製剤の他の成分に適合し、その受容者に有害でないという意味において許容されなければならない。本発明の別の局面によれば、式(I)〜(III)の化合物、または塩、溶媒和物、N-オキシドなどを、1つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と混合することを含む、薬学的製剤の調製のためのプロセスも提供される。
【０４５８】
最終的な脱保護段階の前に作製されうる、式(I)〜(III)の化合物のある特定の保護された誘導体は、それ自体は薬理活性を保有しえないが、しかし、場合により、経口的または非経的に投与され、その後、体内で代謝されて薬理学的に活性な本発明の化合物を形成しうることを当業者は理解するであろう。それゆえ、そのような誘導体は「プロドラッグ」と記述されうる。さらに、本発明のある特定の化合物は、本発明の他の化合物のプロドラッグとして作用しうる。本発明の化合物の保護された誘導体およびプロドラッグは全て、本発明の範囲内に含まれる。さらに、適切な官能基が本発明の化合物内に存在する場合、「プロ部分」として当業者に公知の、ある特定の部分が、そのような官能基に配置されうることを当業者は理解するであろう。本発明の化合物に好ましいプロドラッグにはエステル、炭酸エステル、ヘミエステル、リン酸エステル、ニトロエステル、硫酸エステル、スルホキシド、アミド、カルバミン酸エステル、アゾ化合物、ホスファミド、グリコシド、エーテル、アセタールおよびケタールが含まれる。
【０４５９】
加えて、本発明の化合物、例えば、該化合物の塩は、水和形態もしくは非水和(無水)形態のいずれかで、または他の溶媒分子との溶媒和物として存在しうる。水和物の非限定的な例としては、一水和物、二水和物などが挙げられる。溶媒和物の非限定的な例としては、エタノール溶媒和物、アセトン溶媒和物などが挙げられる。
【０４６０】
「溶媒和物」は、化学量論量または非化学量論量のいずれかの溶媒を含む、溶媒付加形態を意味する。いくつかの化合物は、一定モル比の溶媒分子を結晶性固体の状態で捕捉し、これによって溶媒和物を形成する傾向を有する。溶媒が水であるなら、形成される溶媒和物は水和物であり、溶媒がアルコールであるなら、形成される溶媒和物はアルコール和物である。水和物は1つまたは複数の水分子と1つの物質分子との組み合わせにより形成され、ここで水はH2Oとしてその分子状態を維持する。
【０４６１】
本明細書において用いられる場合、「類似体」という用語は、構造的にはもう一つ別の化合物と類似するが、組成が(1つの原子の異なる元素の原子による置き換えにおいて、または特定の官能基の存在において、あるいは1個の官能基の別の官能基による置き換えにおいてなど)わずかに異なる化合物をいう。したがって、類似体は、参照化合物に対して、機能および外観が類似または匹敵するが、構造または起源が類似も匹敵もしない、化合物である。
【０４６２】
本明細書において定義されるように、「誘導体」という用語は、共通コア構造を有し、本明細書において記述されるさまざまな基で置換されている化合物をいう。例えば、式(I)により表される化合物は全て、アリール置換またはヘテロアリール置換されたベンゼン化合物であり、共通コアとして式(I)を有する。
【０４６３】
「生物学的等価体(bioisostere)」という用語は、原子または原子団と、別の、広範には類似の、原子または原子団との交換から生じる化合物をいう。生物学的等価体交換の目的は、親化合物と類似の生物学的特性を有する新たな化合物を作ることである。生物学的等価体交換は、物理化学または位相幾何学ベースでありうる。カルボン酸の生物学的等価体の例としては、アシルスルホンイミド、テトラゾール、スルホネートおよびホスホネートが挙げられるが、これらに限定されることはない。例えば、Patani and La Voie, Chem. Rev. 96, 3147-3176, 1996を参照されたい。
【０４６４】
本発明は、本発明の化合物に存在する原子の全ての同位体を含むように意図される。同位体は、同じ原子番号を有するが異なる質量数を有する原子を含む。一般例として限定ではなく、水素の同位体は三重水素および重水素を含み、炭素の同位体はC-13およびC-14を含む。
【０４６５】
そのような化合物は化合物75
2018083821.tif 000077
およびその薬学的に許容される塩を具体的に含む。
【０４６６】
本発明は、化合物75
2018083821.tif 000078
またはその薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物をさらに含む。
【０４６７】
EZH2アンタゴニストおよび任意で他の治療用物質は、それ自体(そのまま)でまたは薬学的に許容される塩の形態で投与することができる。医学の分野で用いられる場合、塩は薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩を好都合に用いて、その薬学的に許容される塩を調製することができる。
【０４６８】
本発明によって有用な化合物は塩として、薬学的に適合する対イオン(すなわち、薬学的に許容される塩)で提供されてもよい。「薬学的に許容される塩」は、レシピエントへの投与により、直接的にまたは間接的に、本発明によって有用な化合物または化合物のプロドラッグを提供できる任意の無毒性の塩を意味する。「薬学的に許容される対イオン」は、対象への投与によって塩から放出された場合に無毒性である塩のイオン性部分である。薬学的に適合する塩は、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、およびコハク酸を含むが、これらに限定されない、多くの酸と形成されうる。塩は、その対応する遊離塩基形態よりも水または他のプロトン性溶媒に可溶性である傾向がある。本発明はそのような塩の使用を含む。
【０４６９】
薬学的に許容される酸付加塩には、塩酸および臭化水素酸のような鉱酸と形成されるもの、ならびにまた、マレイン酸のような有機酸と形成されるものが含まれる。例えば、薬学的に許容される塩を形成するためによく利用される酸には、二硫化水素、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸およびリン酸のような無機酸、ならびにパラトルエンスルホン酸、サリチル酸、酒石酸、重酒石酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ベシル酸、フマル酸、グルコン酸、グルクロン酸、ギ酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、乳酸、シュウ酸、パラブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸および酢酸のような有機酸、ならびに関連する無機酸および有機酸が含まれる。そのような薬学的に許容される塩にはしたがって、硫酸塩、ピロ硫酸塩、硫酸水素塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプリン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン-1,4-二酸塩、ヘキシン-1,6-二酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、β-ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン-1-スルホン酸塩、ナフタレン-2-スルホン酸塩、マンデル酸塩などが含まれる。
【０４７０】
酸性官能基と薬学的に許容される塩を形成させるのに適した塩基には、ナトリウム、カリウムおよびリチウムのようなアルカリ金属の水酸化物; カルシウムおよびマグネシウムのようなアルカリ土類金属の水酸化物; アルミニウムおよび亜鉛のような他の金属の水酸化物; アンモニア、および無置換またはヒドロキシ置換モノアルキルアミン、ジアルキルアミンもしくはトリアルキルアミンのような有機アミン; ジシクロヘキシルアミン; トリブチルアミン; ピリジン；N-メチル,N-エチルアミン; ジエチルアミン; トリエチルアミン; モノ-(2-ヒドロキシエチル)アミン、ビス-(2-ヒドロキシエチル)アミンもしくはトリ-(2-ヒドロキシエチル)アミンのようなモノ-(2-ヒドロキシ-低級アルキルアミン)、ビス-(2-ヒドロキシ-低級アルキルアミン)もしくはトリ-(2-ヒドロキシ-低級アルキルアミン)、2-ヒドロキシ-tert-ブチルアミン、またはN,N-ジメチル-N-(2-ヒドロキシエチル)アミンもしくはトリ-(2-ヒドロキシエチル)アミンのような、トリ-(ヒドロキシメチル)メチルアミン、N,N-ジアルキル-N-(ヒドロキシアルキル)-アミン; N-メチル-D-グルカミン; ならびにアルギニン、リジンなどのようなアミノ酸が含まれるが、これらに限定されることはない。
【０４７１】
本発明によって有用なある特定の化合物およびその塩は、2種以上の結晶形態(すなわち、多形体)で存在してもよい; 本発明は結晶形態の各々およびその混合物の使用を含む。
【０４７２】
本発明によって有用なある特定の化合物は、1つまたは複数のキラル中心を含有してもよく、種々の光学的に活性な形態で存在してもよい。本発明によって有用な化合物が1つのキラル中心を含有する場合、化合物は2つの鏡像異性形態で存在し、本発明は鏡像異性体および鏡像異性体の混合物、例えばそのラセミ混合物の両方の使用を含む。鏡像異性体は当業者に公知の方法によって分割されうる; 例えば、鏡像異性体は、例えば、結晶化によって分離されうるジアステレオ異性体塩の形成; 例えば、結晶化、気体-液体もしくは液体クロマトグラフィーによって分離されうるジアステレオ異性体の誘導体もしくは錯体の形成; 例えば、酵素的エステル化による、一方の鏡像異性体と鏡像異性体特異的試薬との選択的反応; またはキラル環境中での、例えば、キラル支持体(例えば、結合したキラルリガンドを有するシリカ)上でのもしくはキラル溶媒の存在下での気体-液体もしくは液体クロマトグラフィーによって分割されうる。所望の鏡像異性体が上記の分離手順のうちの1つによってもう1つの化学的実体に変換される場合、所望の精製された鏡像異性体を遊離するためには、さらなる段階が必要になることがある。あるいは、特定の鏡像異性体は、光学的に活性な試薬、基質、触媒もしくは溶媒を用いた不斉合成により、または不斉転換によって一方の鏡像異性体を他方に変換することにより合成されうる。
【０４７３】
本発明によって有用な化合物が2つ以上のキラル中心を含有する場合、化合物はジアステレオ異性形態で存在してもよい。ジアステレオ異性化合物は当業者に公知の方法(例えば、クロマトグラフィーまたは結晶化)によって分離されてもよく、個々の鏡像異性体が上記のように分離されてもよい。本発明は、本発明によって有用な化合物のさまざまなジアステレオ異性体、およびその混合物の使用を含む。本発明によって有用な化合物は、種々の互変異性形態でまたは種々の幾何異性体として存在してもよく、本発明は、本発明によって有用な化合物の各互変異性体および/または幾何異性体、ならびにその混合物の使用を含む。本発明によって有用な化合物は、両性イオンの形態で存在してもよい。本発明は、本発明によって有用な化合物の各両性イオンの形態、およびその混合物の使用を含む。
【０４７４】
キット
EZH2アンタゴニストは、必要なら、EZH2アンタゴニストを含有する1つまたは複数の単位投与量形態を含んでよいキット(例えば、包装または分注装置)中で与えられてもよい。包装は、例えば、ブリスタ包装のような、金属箔またはプラスチック箔を含んでもよい。包装または分注装置には投与のための使用説明書が付随していてもよい。適合する薬学的担体中に配合された本発明のEZH2アンタゴニストを含む組成物を、調製し、適切な容器中に配し、適応される状態の処置についてラベル付けしてもよい。使用説明書が提供されてもよい。
【０４７５】
本明細書において同様に提供されるのは、メチル化H3-K27を検出する複数のメチル化検出試薬を含むキットである。例えば、キットはモノメチル化H3-K27、ジメチル化H3-K27およびトリメチル化H3-K27検出試薬を含む。
【０４７６】
キットはまた、キットの形態で一緒に包装された、EZH2変異体検出試薬、例えば、変異体EZH2核酸配列の一部分に相補的な、オリゴヌクレオチド配列などの、相同核酸配列を有することにより変異体EZH2核酸配列を特異的に特定する核酸または変異体EZH2核酸配列によってコードされるタンパク質に対する抗体を含んでもよい。オリゴヌクレオチドはEZH2遺伝子の断片でありうる。例えば、オリゴヌクレオチドは200、150、100、50、25、10またはそれ以下のヌクレオチド長でありうる。検出試薬は、例えば、抗体もしくはその断片、ポリペプチドまたはアプタマーである。キットは個別の容器中に、特に、アプタマーもしくは抗体、対照配合物(陽性および/もしくは陰性)、ならびに/または検出可能な標識、例えばフルオレセイン、緑色蛍光タンパク質、ローダミン、シアニン色素、アレクサ(Alexa)色素、ルシフェラーゼ、放射性標識を含んでもよい。アッセイを行うための使用説明書(例えば、書面、テープ、VCR、CD-ROMなど)がキット中に含まれてよい。アッセイは、例えば、当技術分野において公知のようにウエスタンブロット分析、免疫組織化学(IHC)、免疫蛍光(IF)、配列決定、および質量分析(MS)の形態であってよい。
【０４７７】
定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲内で利用される特定の用語をここに集める。本明細書において定義され使用される、全ての定義は、辞書的定義、参照により組み入れられる文章中の定義、および/または定義される用語の通常の意味に優先する。
【０４７８】
冠詞「1つの(a)」および「1つの(an)」は、この冠詞の文法上の対象の1つをまたは2つ以上を(すなわち、少なくとも1つを)いうように本明細書において用いられる。例として、「1つの要素(an element)」は、1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
【０４７９】
「および/または」という語句は、本明細書においておよび特許請求の範囲において用いられる場合、そのように等位接続される要素、すなわち、ある場合には接続的に存在し、他の場合には離接的に存在する要素の「一方または両方」を意味すると理解されるべきである。「および/または」を用いて列挙される複数の要素は、同じように、すなわち、要素の「1つまたは複数」がそのように等位接続されていると解釈されるべきである。具体的に特定される要素に関係しているか関係していないかを問わず、「および/または」節によって具体的に特定される要素以外の、他の要素が任意で存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Aおよび/またはB」への言及は、「含む(comprising)」のような制約がない言語と連結して用いられる場合、1つの態様においては、Aのみ(B以外の要素を任意で含んでもよい)をいうことができ; 別の態様においては、Bのみ(A以外の要素を任意で含んでもよい)をいうことができ; さらに別の態様においては、AおよびBの両方(他の要素を任意で含んでもよい)などをいうことができる。
【０４８０】
本明細書においておよび特許請求の範囲において用いられる場合、「または」は、上に定義されたような「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、一覧において項目を分離する場合、「または」または「および/または」は包括的である、すなわち、いくつかの要素または一覧の要素、および、任意で、一覧に載っていないさらなる項目の、少なくとも1つの包含であるが、それらの2つ以上をまた包むと解釈されるものとする。「の1つだけ」もしくは「の厳密に1つ」または特許請求の範囲において用いられる場合、「からなる」のような、それとは反対であることが明確に示された用語だけが、いくつかの要素または一覧の要素の厳密に1つの要素の包含をいう。一般に、本明細書において用いられる「または」という用語は、「どちらか」、「の1つ」、「の1つだけ」または「の厳密に1つ」のような、排他性の用語に先行される場合、排他的な別の可能性(すなわち、「1つまたはその他、しかし両方ではない」)を示唆すると解釈されるにすぎないものとする。「から本質的になる」は、特許請求の範囲において用いられる場合、特許法の分野において用いられるようなその普通の意味を有するものとする。
【０４８１】
本明細書においておよび特許請求の範囲において用いられる場合、「少なくとも1つ」という語句は、1つまたは複数の要素の一覧に関連して、要素の一覧における要素の任意の1つまたは複数から選択されるが、要素の一覧内に具体的に列挙されたありとあらゆる要素の少なくとも1つを必ずしも含む必要はなく、そして要素の一覧中の要素の任意の組み合わせを排除しない、少なくとも1つの要素を意味すると理解されるべきである。この定義はまた、具体的に特定される要素に関係しているか関係していないかを問わず、「少なくとも1つ」という語句が言及する要素の一覧内で具体的に特定される要素以外の要素が、任意で存在してもよいことを可能にする。したがって、非限定的な例として、「AおよびBの少なくとも1つ」(または、同等に、「AまたはBの少なくとも1つ」または、同等に「Aおよび/またはBの少なくとも1つ」)は、1つの態様においては、Bがまったく存在せずに(およびB以外の要素を任意で含んでよい）、2つ以上を任意で含んでよい、少なくとも1つのAをいうことができ; 別の態様においては、Aがまったく存在せずに(およびA以外の要素を任意で含んでよい）、2つ以上を任意で含んでよい、少なくとも1つのBをいうことができ; さらに別の態様においては、2つ以上を任意で含んでよい、少なくとも1つのA、および2つ以上を任意で含んでよい(および他の要素を任意で含んでよい)、少なくとも1つのBなどをいうことができる。
【０４８２】
それとは反対であることが明確に示されない限り、2つ以上の段階または行為を含む本明細書において特許請求される任意の方法において、この方法の段階または行為の順番が、この方法の段階または行為が列挙される順番に必ずしも限定されないことも理解されるべきである。
【０４８３】
上記の本明細書においてだけでなく、特許請求の範囲において、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「保有する(carrying)」、「有する(having)」、「含有する(containing)」、「伴う(involving)」、「保持する(holding)」、「から構成される(composed of)」などのような全ての移行句は、制約がないこと、すなわち、含むが限定されないことを意味するものと理解されるべきである。「からなる(consisting of)」、「から本質的になる(consisting essentially of)」という移行句だけは、United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03に記載されているように、それぞれ、制限されたまたは半ば制限された移行句であるものとする。
【０４８４】
「共投与」および「共投与する」という用語は、治療剤が患者の体内に同時にある程度、存在する限りは、同時投与(2種類またはそれ以上の治療剤を同時に投与すること)および異なる時間での投与(1種類または複数の治療剤をさらなる治療剤の投与時間とは異なる時間に投与すること)の両方をいう。
【０４８５】
「前がん状態」または「前悪性状態」という用語は、治療しないままにしておいた場合にがんにつながりうる疾患、症候群、または所見をいう。これは、顕著に増大したがんのリスクと関連した全身性の状態である。
【０４８６】
本明細書において用いられる「処置する」という用語は、疾患、障害または状態の少なくとも1つの症状の軽減をいう。この用語は、状態の管理、または状態の治療を提供するという目的のための、対象への、本明細書において記述される1つまたは複数の化合物の投与および/または塗布を包含する。本開示の目的のための「処置」は、治療を提供してもよいが、提供しなければならないわけではなく; むしろ「処置」は状態の管理の形態にあってもよい。本明細書において記述される化合物が、がんを含む、望ましくない増殖性細胞を処置するために用いられる場合、「処置」は、正常細胞に及ぼす破壊的影響は最小限で、望ましくない増殖性細胞の部分的または全面的破壊を含む。細胞レベルでの、がん細胞を含む、望ましくない急速増殖性細胞の処置の所望の機構はアポトーシスである。
【０４８７】
本明細書において用いられる「予防する」という用語は、臨床的に明らかな疾患進行の開始を完全に防ぐこともしくは遅らせること、またはリスクのある個体において前臨床的に明らかな疾患段階の開始を防ぐこともしくは遅らせることのどちらかを含む。これには、疾患を発症するリスクがあるものの予防的処置が含まれる。
【０４８８】
処置の目的のために本明細書において用いられる「対象」という用語は、がんまたは前がん状態と診断されている、その症状を有する、またはそれを発症するリスクがある任意のヒト対象を含む。予防の方法の場合、対象は任意のヒト対象である。予防の目的上、例示するために、対象は、がんのような、望ましくない急速な細胞増殖によって特徴付けられる障害のリスクがある、または障害にかかる遺伝的素因があるヒト対象であってもよい。対象は、発がん物質への暴露、望ましくない急速な細胞増殖によって特徴付けられる障害にかかる遺伝的素因があることなどに起因したリスクがあってもよい。
【０４８９】
特に指定のない限り、組換えおよび合成ポリペプチド、融合タンパク質、抗体またはその抗原結合断片の産生、核酸配列の操作、形質転換細胞の作製などのために標準的な方法を用いることができる。そのような技法は当業者に公知である。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor, N.Y., 2001); F.M. Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York)を参照されたい。
【０４９０】
「EZH2ポリペプチド」という用語は、全長ポリペプチドの機能的断片、および実質的に類似のまたは実質的に同一のアミノ酸配列(少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、98%またはそれ以上のアミノ酸配列類似性または同一性)を有する前記のどちらかの機能的等価体を包含し、ここで機能的断片または機能的等価体は天然ポリペプチドの機能的特性の1つまたは複数を保持している。
【０４９１】
「機能的」とは、ポリペプチド(または核酸)が天然ポリペプチド(または核酸)の生物学的特性の1つまたは複数に関して同じまたは実質的に類似の活性、例えば、天然ポリペプチド(または核酸)の少なくとも約50%、75%、85%、90%、95%もしくは98%またはそれ以上の活性を有することを意味する。
【０４９２】
「調節する」という用語(および文法的な相当語句)は、活性の増加または減少をいう。特定の態様において、「増加させる」または「増強する」という用語(および文法的な相当語句)は、少なくとも約25%、50%、75%、2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、20倍またはそれ以上の上昇を意味する。特定の態様において、「減少させる」または「低減する」という用語(および文法的な相当語句)は、少なくとも約25%、40%、50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、98%またはそれ以上の縮減を意味する。いくつかの態様において、示される活性、物質または他のパラメータは検出可能ではない。具体的に提供されるのは、EZH2のアンタゴニストである。
【０４９３】
「薬力学的マーカー」という用語は、薬物の投与を受けている患者において測定されうる薬物反応の分子マーカーをいう。このマーカーは、薬物標的の調節の直接的尺度でなければならず、用量に対する反応の定量的変化を示すことが可能でなければならない。EZH2アンタゴニストに対する潜在的な薬力学的マーカーは、疾患組織または代用組織でのヒストンH3-K27メチル化のレベルでありうる。
【０４９４】
本明細書において用いられる場合、「反応性」という用語は、「反応性の」、「感受性の」および「感受性」という用語と互換的であり、EZH阻害剤の投与時に治療反応を示す対象、例えば、対象の腫瘍細胞または腫瘍組織がアポトーシスおよび/もしくはネクローシスを起こし、ならびに/または成長、分裂もしくは増殖の低減を示すことを意味する。
【０４９５】
「対照」または「参照基準」という用語は、対象から単離された隣接する非腫瘍組織において検出された、健常対象由来の健常組織において検出された、または当技術分野における標準的な方法で病理学者によって確立されたメチル化レベル(例えば、モノメチル化レベル、ジメチル化レベルまたはトリメチル化レベル)をいう。
【０４９６】
「サンプル」とは、対象に由来する任意の生体サンプルを意味し、細胞、組織サンプルおよび体液(粘液、血液、血漿、血清、尿、唾液および精液を含むが、これらに限定されない)を含むが、これらに限定されることはない。
【０４９７】
記述の全体にわたって、組成物が特定の成分を有する、含む(including)、または含む(comprising)と記述される場合、組成物はまた、記載される成分から本質的になる、またはからなることが企図される。同様に、方法またはプロセスが特定のプロセス段階を有する、含む(including)、または含む(comprising)と記述される場合、プロセスはまた、記載されるプロセス段階から本質的になる、またはからなる。さらに、段階の順序またはある特定の動作を行う順序は、本発明が実行可能なままである限り、重要でないことが理解されるべきである。さらに、2つまたはそれ以上の段階または動作が、同時に行われてもよい。
【０４９８】
本発明の合成プロセスは、多種多様の官能基を容認することができ、それゆえさまざまな置換された出発材料を用いることができる。これらのプロセスは一般に、所望の最終化合物を、そのプロセス全体の終了時にまたは終了間近に提供するが、場合により、この化合物を、その薬学的に許容される塩、エステル、またはプロドラッグにさらに転換することが望ましい場合がある。
【０４９９】
本発明の化合物は種々の方法で、市販の出発材料、文献にて公知の化合物を用いてまたは容易に調製される中間体から、当業者に既知であるか、または本明細書における教示に照らして当業者には明らかであると考えられるかのいずれかの、標準的な合成方法および手順を利用することによって調製することができる。有機分子の調製ならびに官能基の転換および操作のための標準的な合成方法および手順は、関連する科学文献から、または当該分野における標準的な教科書から得ることができる。いかなる1つまたはいくつかの供給源にも限定されないが、参照により本明細書に組み入れられる、Smith, M. B., March, J., March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5th edition, John Wiley & Sons: New York, 2001; およびGreene, T.W., Wuts, P.G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons: New York, 1999などの古典的な教科書は、当業者に公知である有機合成の、有用なかつ認識された参考書である。以下の合成方法の記述は、本発明の化合物の調製のための一般手順を説明するためにデザインされており、限定するためではない。
【０５００】
本発明の化合物は、当業者によく知られている種々の方法によって都合よく調製することができる。本明細書において記述される式の各々を有する本発明の化合物は、市販の出発材料または文献の手順を用いて調製されうる出発物質から、以下の手順にしたがって調製されうる。これらの手順は、本発明の代表的な化合物の調製を示す。
【０５０１】
上記の方法によりデザインされ、選択されおよび/または最適化され、いったん生成された化合物は、当業者に知られている種々のアッセイ法を用いて特徴付けして、該化合物が生物活性を有するかどうかを判定することができる。例えば、該分子は、限定されるものではないが、下記のアッセイ法を含む、従来のアッセイ法により特徴付けして、それらが予測される活性、結合活性および/または結合特異性を有するかどうかを判定することができる。
【０５０２】
さらに、ハイスループットスクリーニング法を用いて、そのようなアッセイ法を用いる分析の速度を上げることができる。結果として、当技術分野において公知の技法を用い、本明細書において記述される分子を活性について速やかにスクリーニングすることが可能でありうる。ハイスループットスクリーニング法を行うための一般的な方法は、例えば、Devlin (1998) High Throughput Screening, Marcel Dekker; および米国特許第5,763,263号に記述されている。ハイスループットアッセイ法では、下記のものを含むが、それらに限定されない、1つまたは複数の異なるアッセイ技法を用いることができる。
【０５０３】
本明細書において引用される全ての刊行物および特許文献は、そのような刊行物または文献の各々が具体的かつ個別的に参照により本明細書に組み入れられることが示されるかのごとく、参照により本明細書に組み入れられる。刊行物および特許文献の引用は、いずれかが関連のある先行技術であることの承認と意図されるものではなく、その内容または日付に関するいずれの承認にもならない。本発明は今や、明細書によって記述されたが、当業者は、本発明を種々の態様において実践できること、ならびに先の記述および以下の実施例は、以下に続く特許請求の範囲の限定ではなく例示の目的のためである。
【実施例】
【０５０４】
本発明を一般的に記述してきたが、本発明のある特定の局面および態様を例示する目的で単に含まれ、本発明を限定することを意図するものではない、以下の実施例を参照することによって、本発明はさらに容易に理解されよう。
【０５０５】
実施例1 - 組換え5成分PRC2複合体
バキュロウイルス発現システムを用いスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda) (Sf9)細胞において、野生型EZH2 (GenBankアクセッション番号NM_004456)またはTyr641変異体を野生型AEBP2 (GenBankアクセッション番号NM_153207)、EED (GenBankアクセッション番号NM_003797)、SUZ12 (GenBankアクセッション番号NM_015355)およびRbAp48 (GenBankアクセッション番号NM_005610)と共発現させた。EED上のN末端FLAGタグを用いて、細胞溶解物から活性なPRC2複合体を精製した(BPS Bioscience、カタログ番号51004)。最終のPRC2調製物の純度をSDS-PAGEにより、クマシーブルー染色で評価した。
【０５０６】
実施例2 - H3、H4ペプチドパネル
21st Century Biochemicals (Marlboro, MA)により、各15アミノ酸の44種のペプチドからなるライブラリを合成した。このペプチドパネルには、連続的なペプチド配列の間で5残基が重複するようにして、ヒトヒストンH3およびH4のアミノ酸の全てが包含された。各ペプチドのN末端にビオチンを付加し、C末端はアミドとして表した。液体クロマトグラフィー/質量スペクトル分析によって、純度(>95%)および同一性を確認した。
【０５０７】
酵素活性のH3-K27メチル化状態依存に関する研究のため、非メチル化、モノメチル化、ジメチル化またはトリメチル化側鎖アミンとしたリジン27を有するヒトH3の21〜44番目の残基(H3:21-44)のアミノ酸配列に相当する、ペプチドを合成した。これらのペプチドは、各ペプチドのC末端にビオチンを付加させた状態でNew England Peptide (Gardner, MA)から購入した。
【０５０８】
実施例3 - 細胞におけるH3-K27メチル化状態の評価
細胞株OCI-LY19 (ACC 528)、KARPAS-422 (ACC 32)およびWSU-DLCL2 (ACC 575)はDSMZから入手した。細胞株DB (CRL-2289)およびSU-DHL6 (CRL-2959)はATCCから入手した。OCI-LY19、WSU-DLCL2およびDB細胞株は、10% FBSを含むRPMI-1640中で増殖させ、KARPAS-422およびSU-DHL6細胞株は、20% FBSを加えたRPMI-1640中で増殖させた。細胞を細胞1.5〜2×106個/mLの密度まで増殖させ、細胞1×107個を264×gでの遠心分離によって収集し、氷冷PBS中で洗浄し、50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.25% DOC、1% NP-40および1 mM EDTA (Millipore #20-188)に加えて0.1% SDSおよびプロテアーゼ阻害剤錠剤(Roche # 1836153)を含有する10×ペレット容量のRIPA溶解緩衝液に再懸濁することによって溶解させた。溶解物を、設定3でMisonix XL-2000を用い2ラウンドの101秒のバーストによって超音波処理し、効率的なヒストン抽出を確実とし、卓上遠心分離機を10分間14,000 rpmで用い4℃での遠心分離によって清澄化した。タンパク質濃度をBCAアッセイ(Pierce)によって決定した。各溶解物4マイクログラムを4〜20%のTris-Glycineゲル(Invitrogen)上で分画し、PVDFに転写し、Odysseyブロッキング緩衝液中の以下の抗体: マウス抗EZH2 (CST 3147; 2000分の1に希釈)、ウサギ抗H3-K27me3 (CST 9733; 10000分の1に希釈)、ウサギ抗H3-K27me2 (CST 9755; 5000分の1に希釈)、ウサギ抗H3-K27me1 (Active Motif 39377; 5000分の1に希釈)、およびマウス抗Total H3 (CST 3638; 20000の1に希釈)でプローブした。一次Abインキュベーションの後、膜をIRDye 800CWロバ抗マウスIgG (LiCOR #926-32212)またはAlexa Fluor 680ヤギ抗ウサギIgG (Invitrogen #A-21076)二次Abでプローブし、LiCOR Odysseyシステムを用いて画像化した。
【０５０９】
実施例4 - 酵素学
上記のように、Tyr641での、疾患に関連した変化は、EZH2が触媒するH3-K27のメチル化に関する機能の喪失をもたらすものとこれまでに結論付けられた。しかし、酵素のヘテロ接合性によるH3-K27メチル化の比率の推定的低減は、殊のほか、H3-K27トリメチル化の増大に関わる、EZH2の過剰発現、対応するH3-K27デメチラーゼUTXにおける機能喪失型変異、またはPHF19/PCL3のような、PRC2成分の過剰発現が、どれも、特定のヒトがんにおいて悪性の表現型をもたらすことを示す過去のデータを考慮すると、悪性の表現型の根拠として理論的に説明することが困難であった。Morin et al. (2010) Nat Genet 42: 181-5; Martinez-Garcia et al. (2010) Nat Genet 42:100-1; Bracken et al. (2003) EMBO J 22:5323-35; Kleer et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100: 11606-11; Varambally et al. (2002) Nature 419:624-9; Simon et al. (2008) Mutat Res 647:21-9; van Haaften et al. (2009) Nat Genet 41:521-3; Wang et al. (2004) Gene 343:69-78; Cao et al. (2008) Mol Cell Biol 28: 1862-72; およびSarma et al. (2008) Mol Cell Biol 28:2718-31)。それゆえ、これらの変異の酵素学をさらに詳細に探った。
【０５１０】
組換えPRC2複合体をWTおよびTyr641変異体型のヒトEZH2で調製した(上記の実施例1; Cao et al. (2004) Mol Cell 15:57-67を参照のこと)。等しい濃度(タンパク質定量に基づき、名目上8 nM)の各複合体を、標識S-アデノシルメチオニン(SAM)からH3-K27周囲のアミノ酸配列(H3:21-44)に相当する非修飾ペプチドへのまたは天然の鳥類赤血球オリゴヌクレオソームへの3H-メチルの転移を触媒する能力について最初に試験した。これまでに報告されているように(Morin et al. (2010) Nat Genet 42: 181-5)、WT酵素はこの非メチル化ペプチド基質へのメチル転移に対する強い活性を示すこと、しかし、変異酵素のどれも有意なメチルトランスフェラーゼ活性を示さないことが分かった(図1A)。過去に報告されたデータおよび図1Aにおけるデータとは対照的に、変異体EZH2構築体の全てが鳥類ヌクレオソーム基質に対して活性なメチルトランスフェラーゼであることが分かった(図1B)。鳥類の天然源から単離されたヌクレオソームは、H3-K27メチル化特異的な抗体でのウエスタンブロッティングによって判断した場合に、さまざまなH3-K27メチル化状態を含む、ヒストン修飾状態の混和物に相当する。
【０５１１】
ペプチドおよびヌクレオソーム基質に対する変異体PRC2複合体の不一致な活性について可能な説明はいくつかある。1つの可能性は、酵素活性部位の遠位にある基質認識部位(すなわち、エキソサイト)が基質結合および代謝回転の重要な決定因子であり; これらの部位は、小さなペプチド基質では利用できない、ヌクレオソームの相補的認識要素に結合しうるということである。しかし、大腸菌(E. coli)で発現された組換えヒトヒストンH3をWTおよび変異体PRC2複合体の基質として試験した場合、得られた活性パターンはペプチド基質で見られたものと同一であった; つまり、WT酵素はH3基質に対して強いメチルトランスフェラーゼ活性を示し、Y641F変異体はWT複合体の活性の7%を示し、他の全ての変異体はWT複合体の活性の1%以下を呈した。ゆえに、エキソサイト結合が今回の結果の説明となる可能性は低いように見える。ヌクレオソームは、小さなペプチド基質に存在しないであろう潜在的なメチル化部位としてH3-K27を超える多くのリジン残基を提示する。したがって、別の可能性は、Y641の変異がEZH2の基質特異性を変化させて、H3-K27以外のリジン残基のメチル化をもたらすということである。小さなペプチド基質および組換えH3タンパク質基質に対する変異体の活性が極めて一致していることを考慮すると、この可能性は低い。
【０５１２】
本結果とこれまでに報告された結果との明らかな不一致は、WTおよび変異体PRC2複合体の酵素活性を、ヒストンH3およびヒストンH4の可能な全てのリジン(K)残基に相当するペプチド基質のパネルに対して試験した場合に解決された(上記の実施例2を参照のこと)。酵素形態の全てが、残基H3-K27の等価体を含んだペプチドに対してのみ有意な活性を示した。しかしながら、変異体の特異的活性は、やはり、過去に報告された所見と一致して、WT >> Y641F > Y641S 〜 Y641H > Y641Nの順にWTと比べて大いに低減された。
【０５１３】
実施例5 - 酵素学
これらの変異体の酵素活性をさらに理解するために、およびペプチド基質に対する活性とヌクレオソーム基質に対する活性との明らかな矛盾に折り合いをつけるために、H3:21-44ペプチドに関連してさまざまなH3-K27メチル化状態のメチル化をさらに触媒する酵素形態の能力について調べた。上記のように、変異酵素の全てがWT酵素と比べて、非修飾H3-K27ペプチドメチル化の不十分な触媒であることが分かった。しかしながら、顕著には、変異酵素の全てが、モノメチル化H3-K27ペプチド、およびとりわけジメチル化H3-K27ペプチドのさらなるメチル化の触媒においてはWT酵素よりも優れていることが分かった(図2)。したがって、このデータから、WT酵素が、非メチル化からモノメチル化の反応の触媒では最も効率的であることが示唆される。変異酵素はこの初期段階の触媒において欠陥があるものの、モノメチルH3-K27からジメチルH3-K27およびトリメチルH3-K27に至る後続の段階の触媒においてはWT酵素よりも効率的である。
【０５１４】
WTおよび変異体EZH2の差次的な基質特異性の由来を、定常状態酵素反応速度を通じて探った。表2にまとめられているように、変異は、ヌクレオソームに対するKmの、およびペプチド基質に対するK1/2の類似値によって示される通り、基底状態の基質認識にわずかな影響を与える。いかなる場合でも、ペプチド基質はS字状の結合挙動を示した; ゆえに半最大速度をもたらすペプチド濃度を、より一般的なミカエリス定数Kmの代わりにK1/2としてここに報告する。Copeland (2005) Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide to Medicinal Chemists and Pharmacologists, Wiley。SAMのKmは同様に、208±50から304±64 nMに及び、酵素形態の間で最小のバラツキを示した。代わりに、基質利用の差異は、さまざまな基質に対する酵素間のkcat値の差異によって示される通り、遷移状態認識に端を発するように見える(表2)。結果として、kcat/K (ここでKは基質同一性に依り、KmまたはK1/2のどちらかである; 上記参照)比として定量化した触媒効率は、異なるH3-K27メチル化状態についてWT酵素と変異酵素との間で異なる(表2)。
【０５１５】
（表２）EZH2の野生型またはY641変異体を含有するPRC2によって触媒されるメチル化反応に対する定常状態反応速度パラメータ
2018083821.tif 000079
a活性が低すぎて測定できない。
【０５１６】
実施例6 - 酵素学
表2に記載されている定常状態反応速度パラメータにより、WT酵素についてホモ接合性の細胞と比べて、さまざまな変異体EZH2の形態についてヘテロ接合性の細胞に対して種々のH3-K27メチル化状態の予想レベルを算出することが可能になった。これらの模擬実験を実施するため、(1) 定常状態酵素反応速度が細胞の状況においてPRC2により触媒されるH3-K27メチル化と関連しているという、および全ての測定が細胞増殖における同じ時点で行われるという; (2) 変異酵素およびWT酵素がヘテロ接合性細胞において等しいレベルで発現されるという、ならびに総EZH2レベルが全ての細胞において等しいという; (3) SAMの細胞濃度は、そのKmと比べて、飽和しており、細胞の間で変化しないという; (4) ヌクレオソームの細胞濃度は、そのKmと類似しており、同様に、細胞の間で変化しないという; (5) EZH1により触媒されるH3-K27のメチル化は重要ではなく、細胞の間で一定であったという; ならびに(6) いずれのH3-K27デメチラーゼ活性も細胞の間で一定であったという、いくつかの簡素化した仮定を立てた。
【０５１７】
適切にこのような仮定をすることで、図3Aに示されている予測をH3-K27me3 (上パネル)、H3-K27me2 (中パネル)およびH3-K27me1 (下パネル)の相対レベルについて得た。これらの模擬実験から明らかなパターンが浮かび上がる。H3-K27me3のレベルは、変異体を持っている全ての細胞についてWT細胞と比べて増加し、Y641H変異体の場合30%の増加からY641N変異体の場合 > 400%に及ぶ。同時に、H3-K27me2のレベルは変異体の全てについてWTの < 50%まで減少し、H3-K27me1のレベルはWTと比べて、全ての変異体についておよそ半分に低減されている。
【０５１８】
WT EZH2についてホモ接合性であることが知られているB細胞性リンパ腫細胞株(OCI-LY19)またはEZH2 Y641Nについてヘテロ接合性であることが知られているB細胞性リンパ腫細胞株(DB、KARPAS 422およびSU-DHL-6)もしくはEZH2 Y641Fについてヘテロ接合性であることが知られているB細胞性リンパ腫細胞株(WSU-DLCL2)におけるH3-K27メチル化状態の相対レベルを次に、ウエスタンブロッティングによって測定した(図3B)。図3bにおいて見られる相対的なH3-K27メチル化状態のパターンは、模擬実験において用いた仮定および基質としての非生理的ペプチド代用物の使用にもかかわらず、インビトロでの定常状態反応速度パラメータに基づく模擬実験の結果と極めてよく一致している。
【０５１９】
このように、H3-K27me3の増加がWTと比べてY641変異体を持っている全ての細胞で認められ、H3-K27me2の減少がWTと比べてY641変異体を持っている全ての細胞で認められ、かつH3-K27me1の減少が4種の変異体細胞株のうちの少なくとも2種で認められた。WTならびにKARPAS 422およびSU-DHL-6細胞におけるH3-K27me1のほぼ同等のレベルは、WTおよび変異体EZH2の異なる発現レベル、EZH1の異なる寄与、または模擬実験では説明されない他の要因を反映している可能性がある。とは言っても、H3-K27メチル化状態の予測パターンと実験パターンとの一致は注目に値し、WTと変異体EZH2との間の酵素的連関がH3-K27me3の増加をもたらし、かくして、これらの変異体についてヘテロ接合性である細胞の悪性の表現型を引き起こすという考えを裏付けている。
【０５２０】
実施例7 - PRC2メチルトランスフェラーゼ活性のインビトロアッセイ
ペプチド基質を用いたフラッシュプレートアッセイ
EZH2のWTおよびY641変異体の初期比較のため、800 nMの濃度で非メチル化K27 (New England Peptide)、モノメチル化K27 (Millipore)またはジメチル化K27 (Millipore)を含有するビオチン化ヒストンH3:21-44ペプチドを1,700 nMのS-アデノシルメチオニン-Cl (SAM)および300 nMのトリチウム化SAM (Perkin Elmer)の混合物と混ぜ合わせた。この基質の組み合わせを次いで、アッセイ緩衝液(20 mM BICINE、1 mM DTT、0.002% Tween 20、0.005%ウシ皮膚ゼラチン(BSG), pH 7.6)中のPRC2に加えた。反応を表示の時間間隔の間、進行させ、その後、過剰の非放射性SAM (600 μMの終濃度)の添加により反応停止した。反応停止された反応混合物をストレプトアビジンでコーティングされたフラッシュプレート(Perkin Elmer、カタログ番号SMP410)に移し、1時間結合させ、その後、TopCount NXT HTSシンチレーションおよび発光カウンタ(Perkin Elmer)にて検出した。各時点は6回の個別反応の平均を表した。ペプチドまたはSAMの濃度は変化させ、一方で他の基質は飽和条件としたことを除き、同一の反応条件の下で定常状態反応速度パラメータを決定した。速度をさまざまな基質濃度の関数としてプロットし、データを未変形ミカエリス・メンテン式または未変形S状反応速度式にあてはめて、Kおよびkcatの値を算出した。あてはめたパラメータの標準誤差が表2に記載されており、これを用いて、図2パネルBおよびCに示したエラーバーを作図した。kcat/Kに関連した誤差(表2)を標準的な誤差伝播法にしたがって算出した; kcat/Kの相対誤差(fractional error)は
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として決定したが、ここでμkcatはkcatの標準誤差であり、μKはKの標準誤差である。
【０５２１】
オリゴヌクレオソームを用いたフィルタプレートアッセイ
ニワトリ赤血球オリゴヌクレオソームを既述のように精製した。Fang et al. (2004) Methods Enzymol 377:213-26。ヌクレオソームをSAMおよびトリチウム化SAMの混合物と混ぜ合わせ、アッセイ緩衝液(20 mM BICINE、100 mM KCl、1 mM DTT、0.002% Tween 20、0.005% BSG, pH 7.6)中のPRC2に加えた。上記のように反応を行い、反応停止した。反応停止された反応混合物をガラス繊維フィルタプレート(Millipore、カタログ番号MSFBN6B)に移し、10%トリクロル酢酸で3回洗浄し、乾燥させた。Microscint Zero (30 μL)を加え、トリチウムの取り込みをTopCountシンチレーションおよび発光カウンタにて検出した。ヌクレオソームまたはSAMの濃度は変化させ、一方で他の基質は飽和条件としたことを除き、同一の反応条件の下で定常状態パラメータを決定した。速度をさまざまな基質濃度の関数としてプロットし、これを未変形ミカエリス・メンテン式にあてはめて、上記のようにKmおよびkcatの値を導き出した。
【０５２２】
実施例8 - 化合物の調製
A. 化合物63の調製
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9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(アミノメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)-9H-プリン-6-アミン(Townsend, A. P. et al. (2009) Org. Let. 11 :2976-2979) (3.05 g, 9.96 mmol)のDCE (250 mL)溶液に、カルバミン酸(9H-フルオレン-9-イル)メチル(2-オキソエチル) (2.8 g, 9.96 mmol)およびNaB(OAc)3H (2.96 g, 13.95 mmol)を加え、混合物を室温で4時間撹拌した。K2CO3溶液を8〜9のpHまで加えた。DCMを加え、有機層をNa2SO4で乾燥させ、濃縮し、SGC (DCM : MeOH = 30 : 1)により精製して、63 (2.9 g, 収率: 50.9%)を得た。
【０５２３】
B. 化合物65の調製
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63 (2.9 g, 5.08 mmol)のDCE (250 mL)溶液に、2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-4-オキソブタン酸(S)-ベンジル(1.56 g, 5.08 mmol)およびNaB(OAc)3H (1.51 g, 7.11 mmol)を加え、混合物を室温で4時間撹拌した。K2CO3溶液を8〜9のpHまで加えた。DCMを加え、有機層をNa2SO4で乾燥させ、濃縮し、SGC (DCM : MeOH = 100 : 1)で精製して、65 (2.8 g, 収率: 63.9%)を得た。
【０５２４】
C. 化合物75の調製
2018083821.tif 000083
段階1.
65B (2.2 g, 2.55 mmol)のDCM (10 mL)溶液に、Et2NH (1.1 g, 15.3 mmol)を加え、混合物を室温で4時間撹拌した。混合物を濃縮して粗製物72 (2.2 g)を得た。
【０５２５】
段階2.
72 (167 mg, 0.26 mmol)のMeOH (4 mL)撹拌溶液に、2-(4-クロロフェニル)アセトアルデヒド(40 mg, 0.26 mmol)を加え、20分間室温で撹拌した。その後、Na(OAc)3BH (83 mg, 0.39 mmol)およびHOAc (0.4 mL)を加え、終夜撹拌した。その後、NaHCO3 (aq)を加え、DCM (25 mL×3)で抽出し、塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。粗生成物を分取TLC (DCM / MeOH = 10: 1)により精製して、73 (30 mg, 収率: 14%)を白色の粉末として得た。LC/MS (m/z): 779.7 [M+1]+。
【０５２６】
段階3.
73 (30 mg, 0.038 mmol)および10% Pd/C (15 mg)のMeOH (2 mL)混合物を終夜H2下、室温で撹拌した。混合物をろ過し、ろ液を濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を分取TLC (DCM / MeOH = 8: 1)により精製して、74 (20 mg, 収率: 69%)を白色の粉末として得た。LC/MS (m/z): 689.7 [M+1]+。
【０５２７】
段階4.
74 (20 mg, 0.028 mmol)の90% TFA (1 mL)溶液を1時間室温で撹拌し、固形物として濃縮し、TFAを除去して、化合物75 (TFA塩)を精製なしに無色の油状物として得た。LC/MS (m/z): 549.7 [M+1]+。
【０５２８】
実施例9 - SAHによるEZH2野生型およびY641変異体の阻害
S-アデノシル-L-ホモシステイン(SAH)を10点についてDMSOで3倍連続希釈し、1 μLを384ウェルマイクロタイタープレートに配した。陽性対照(100%阻害の標準物質)は終濃度100 μMのSAHとし、陰性対照(0%阻害の標準物質)にはDMSO 1 μLを含めた。SAHを次いで、pH 7.6のアッセイ緩衝液(20 mM BICINE、100 mM KCl、1 mM DTT、0.002% Tween 20、0.005% BSG)中8 nMのEZH2野生型および変異体40 μL/ウェルとともに30分間インキュベートした。pH 7.6のアッセイ緩衝液中150 nMのS-アデノシルメチオニン-Cl (SAM)および100 nMのトリチウム化SAMおよび150 nMのビオチン化オリゴヌクレオソームを含めた基質混合物を、10 μL/ウェルで加えた。反応停止された酵素反応液をストレプトアビジンでコーティングされたフラッシュプレート(Perkin Elmer、カタログ番号SMP410)に移し、1時間結合させ、TopCount NXT HTS (Perkin Elmer)にて検出した。
【０５２９】
結果を図7に示す。IC50値を表3に示す。
【０５３０】
（表３）SAHによるWT EZH2およびEZH2のY641変異体の阻害
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【０５３１】
実施例10 - 化合物75によるEZH2野生型およびY641変異体の阻害
化合物75を10点についてDMSOで3倍連続希釈し、1 μLを384ウェルマイクロタイタープレートに配した。陽性対照(100%阻害の標準物質)は終濃度100 μMのSAHとし、陰性対照(0%阻害の標準物質)にはDMSO 1 μLを含めた。化合物75を次いで、pH 7.6のアッセイ緩衝液(20 mM BICINE、100 mM KCl、1 mM DTT、0.002% Tween 20、0.005% BSG)中8 nMのEZH2野生型および変異体40 μL/ウェルとともに30分間インキュベートした。pH 7.6のアッセイ緩衝液中150 nMのS-アデノシルメチオニン-Cl (SAM)および100 nMのトリチウム化SAMおよび150 nMのビオチン化オリゴヌクレオソームを含めた基質混合物を、10 μL/ウェルで加えた。反応停止された酵素反応液をストレプトアビジンでコーティングされたフラッシュプレート(Perkin Elmer、カタログ番号SMP410)に移し、1時間結合させ、TopCount NXT HTS (Perkin Elmer)にて検出した。
【０５３２】
結果を図8に示す。IC50値を表4に示す。
【０５３３】
（表４）化合物75によるWT EZH2およびEZH2のY641変異体の阻害
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【０５３４】
実施例11 - H3-K27me2/me3比はEZH2阻害剤に対する感受性を予測する
EZH2 (Y641)変異についてヘテロ接合性の腫瘍細胞株は、H3-K27me3のレベルの増加を示し、H3-K27のメチル化状態が腫瘍形成には重要であるものと考えられた。EZH2についてWTであった、またはEZH2 (Y641)変異についてヘテロ接合性であった細胞株のパネルにおけるH3-K27のモノメチル化(H3-K27me1)、ジメチル化(H3-K27me2)またはトリメチル化(H3-K27me3)形態のレベルを評価した。用いた細胞株は表5に記載されている。細胞株の大半はB細胞性リンパ腫系列であるが、しかし2種の黒色腫系列も含めた。IGR1は、EZH2におけるY641N変異を含むことが最近になって分かった黒色腫系列であり、A375細胞はWT EZH2の黒色腫対照系列として含めた。図9AおよびBは、H3-K27me1、H3-K27me2またはH3-K27me3を認識する抗体で、この細胞株パネルから単離されたヒストンをプローブしたウエスタンブロット分析の結果を示す。概して、WT EZH2を排他的に発現している細胞株でよりもY641変異体を含んだ細胞株で全体的なH3-K27me3レベルは高い。例外はFarage細胞であり、この場合にH3-K27me3レベルはWT系列におけるものと類似していた。より顕著なのは、野生型細胞株と比べてEZH2 Y641変異体細胞株におけるH3-K27me2の劇的に低いレベルである。Y641変異体細胞株から抽出されたヒストンのウエスタンブロットにおいてH3-K27me2シグナルは、ほとんどまたは全く認められなかったが、WT細胞株において同じ抗体で認められたシグナルは、H3-K27me3に特異的な抗体で認められたシグナルよりも強かった。全体としては、WT細胞株において、HK27me2抗体でのウエスタンブロットシグナルはH3-K27me3抗体で認められたシグナルよりも高かったが、Y641変異体細胞株では逆のことが当てはまった。このように、Y641系列におけるH3-K27me3/me2シグナルの比率は、WT系列で認められたものよりも高い。
【０５３５】
H3-K27メチル化状態を質量分析(MS)法、つまり抗体試薬に依らない独立した方法によって調べることもできる。MS分析から、H3-K27me3レベルは他のWT系列でよりもY641変異体系列およびPfeiffer系列(A677G)で高いが、H3-K27me2レベルについてはこの逆が当てはまることが実証された。Y641変異体系列およびPfeiffer系列(A677G)において、H3-K27me3レベルはH3-K27me2レベルよりも高かったが、他のWT系列では逆のことが当てはまった。これらの結果は、図9AおよびBにおけるウエスタンブロット分析により認められたものと一致する。
【０５３６】
H3-K27メチル化状態の差異は、H3-K27me2またはH3-K27me3に対する抗体を用いた免疫細胞化学によっても検出された。この免疫細胞化学アッセイは、ホルマリン固定されパラフィン包埋された患者腫瘍組織サンプルにおけるY641変異体EZH2と関連する異常なH3-K27me2/3比を検出するために用いられる。5種のWTおよび5種のY641変異体リンパ腫細胞株ペレットのパネルを固定し、パラフィンブロックに包埋し、抗H3-K27me2抗体または抗H3-K27me3抗体で染色した。全ての細胞が核ヒストンH3を含有するはずなので、ヒストンH3に対する抗体を陽性対照として含めた。図10は、H3-K27me3およびH3の両染色に対して細胞の100%で、全ての細胞株が陽性であったことを示す。これらの条件の下で、H3-K27me3染色強度の明らかな差異は、WT細胞株とY641変異体細胞株との間で認められなかった。これは、他の検出法と比べて、発色性の免疫細胞化学染色のダイナミックレンジが限定されていることを反映している可能性がある。しかしながら、図11に示されるように、細胞株は、H3-K27me2に対して陽性または陰性に染まるものに明らかに分けることができた。全てのWT細胞株がH3-K27me2について陽性に染色されたのに対し、全てのY641変異体細胞株およびPfeiffer細胞(A677G)がH3-K27me2抗体による染色を示さなかった。これらの結果は、ウエスタン分析およびMS分析によって得られた結果と一致している。
【０５３７】
理論によって束縛されることを望むわけではないが、機能獲得型EZH2 (Y641)変異と関連するH3-K27me3レベルの増加は、EZH2変異を持つ細胞を、小分子EZH2阻害剤に対していっそう感受性にしうる。EZH2 Y641変異なしのPfeiffer細胞において認められたH3-K27me3レベルの増加および/またはH3-K27me2レベルの減少がまた、EZH2阻害剤に対する感受性と相関しているかどうか評価するために、それぞれ85 nMおよび16 nMのIC50を有し、生化学的アッセイにおいてEZH2の強力な阻害を示す2種の化合物を試験した。どちらかの化合物でのWSU-DLCL2細胞の処理によって、全体的なH3-K27me3レベルの阻害につながり、細胞に侵入し、細胞のEZH2メチルトランスフェラーゼ活性を阻害するその能力が確認された(図12)。
【０５３８】
各化合物に対するWTおよびY641変異体細胞株のパネルの感受性を増殖アッセイにおいて評価した。EZH2阻害剤の抗増殖活性は顕在化するのに数日かかるので、11日間の増殖アッセイにおいて化合物を評価した。図13は、試験化合物で処理されたWT (OCI-LY19)、またはY641変異体(WSU-DLCL2) 細胞株に対する代表的な増殖曲線を示す。両化合物は抗増殖活性を、WSU-DLCL2細胞に対して示したが、しかしOCI-LY19細胞に対してはほとんど示さなかった。阻害剤Aは阻害剤BよりもWSU-DLCL2増殖の、より強力な阻害剤であったが、これは、阻害剤Aが生化学的アッセイにおいて、より強力なEZH2阻害剤であることと一致している。増殖アッセイを阻害剤Bで、WTおよびY641変異体リンパ腫細胞株のパネルにて行い、11日目のIC90値を導出した。図14Aは、EZH2 Y641状態によって分類されたリンパ腫細胞株のIC90値を示す。全体としては、Y641変異体細胞株はWT細胞株と比べてEZH2阻害剤に対し感受性の増加を示したが、RLおよびSUDHL4細胞は他の変異体系列よりも感受性が顕著に低かった。Pfeiffer細胞(A677G)は高いH3-K27me3レベルおよび低いH3-K27me2レベルを示し、そのため、高いH3-K27me3および低いH3-K27me2にしたがって細胞株を分類することにより、図14Bで阻害剤Bに対して示されるようにEZH2阻害剤の感受性に関するさらに良好な識別が得られる。このように、高いH3-K27me3レベルおよび低いH3-K27me2レベルを用いて、変異状態に関する認識とは独立的に、EZH2阻害剤に対する感受性を予測することができる。
【０５３９】
これらの結果は、患者腫瘍においてEZH2 Y641変異を特定すること、および/または患者においてウエスタンブロット、MSもしくはIHCのような技法を使ってH3-K27me3と比べH3-K27me2のレベルの低さを検出することを用いて、どの患者がEZH2阻害剤での処置に反応するかを特定できることを実証している。
【０５４０】
（表５）本研究において用いた細胞株
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【０５４１】
実施例12 - 組換え4成分PRC2複合体
バキュロウイルス発現系を用い、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda) (Sf9)細胞において、野生型(WT)EZH2 (GenBankアクセッション番号NM_004456)またはA677GおよびA687V変異体を野生型EED (GenBankアクセッション番号NM_003797)、SUZ12 (GenBankアクセッション番号NM_015355)およびRbAp48 (GenBankアクセッション番号NM_005610)と共発現させた。EED上のN末端FLAGタグを用いて、細胞溶解物から活性なPRC2複合体を精製した。最終のPRC2調製物の純度をSDS-PAGEにより、クマシーブルー染色で評価し、タンパク質濃度をBradfordアッセイ法においてウシ血清アルブミン標準曲線を用い決定した。
【０５４２】
実施例13 - PRC2メチルトランスフェラーゼ活性のインビトロでのアッセイ法
ペプチド基質を用いたフラッシュプレートアッセイ法の標準手順
修飾に供されるH3-K27リジンに下線を引いた、以下の配列
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からなる、非修飾、モノメチル化、ジメチル化またはトリメチル化側鎖アミンとして表されるリジン27を有するヒトH3の21〜44番目の残基(H3:21-44)のアミノ酸配列に相当する一連の4種のペプチドを用いて、野生型または変異体EZH2を含んだPRC2複合体の活性について調べた。リジン側鎖アミンに付着されたアミノヘキシルリンカー(AHX)を通じてC末端リジン(K)残基にビオチン(Biot)を追加した(21st Century Biochemicals)。WTおよび変異体EZH2活性の変異体比較のため、ビオチン化ヒストンH3:21-44ペプチドを、S-アデノシルメチオニン(SAM; Sigma-Aldrich)およびトリチウム化SAM (3H-SAM; American Radiolabeled Chemicals)ならびに組換え4成分PRC2のアッセイ緩衝液(20 mM BICINE、1 mM DTT、0.002% Tween 20、0.005%ウシ皮膚ゼラチン(BSG), pH 7.6)の混合物と混ぜ合わせた。反応を表示の時間間隔の間、進行させ、その後、過剰の非放射性SAM (100 μMの終濃度)の添加により反応停止した。反応停止された反応混合物を、ストレプトアビジンでコーティングされたフラッシュプレート(Perkin Elmer、カタログ番号SMP410)に移し、1時間結合させ、その後、プレートをBiotek EL-405xプレートウォッシャー中で洗浄し、TopCount NXT HTSシンチレーションおよび発光カウンタ(Perkin Elmer)にて読み取った。
【０５４３】
実施例14 - 酵素学
組換え4成分PRC2複合体を、野生型およびA677GまたはA687Vのどちらかの変異体型のEZH2で調製した(上記の実施例12; Cao et al. (2004) Mol Cell 15:57-67を参照のこと)。各複合体を、標識S-アデノシルメチオニン(SAM)から4種のH3:21-44ペプチドの各々への3H-メチルの転移を触媒する能力について最初に試験した。酵素を連続希釈し、ペプチド(200 nM)ならびにSAM (200 nM 3H-SAMおよび800 nM非標識SAM)の混合物を加えた。過剰の非標識SAMの添加により15分の間隔で反応を停止させ、未加工のカウント毎分(CPM) 対 時間の線形回帰に基づき反応速度を計算した。図15に示されるように、変異体酵素は野生型酵素とは異なるパターンの活性を呈した。A677GおよびA687V変異体は、非メチル化、モノメチル化およびジメチル化H3:21-44ペプチドの全てに対して強い活性を有していたが、野生型酵素は非メチル化およびモノメチル化ペプチドに対して強い活性を示しただけであった。完全にトリメチル化されたH3-K27を含む対照ペプチドは、このアッセイ法においてメチル化されず、H3-K27が標的リジンであることが示唆された。
【０５４４】
実施例15 - 酵素学
これらの変異体の酵素活性をさらに理解するため、定常状態酵素反応速度論を通じて野生型および変異体EZH2の差次的な基質特異性の起源を探索した。酵素(4 nM)ならびにSAM (200 nM 3H-SAMおよび800 nM非標識SAM)を固定して滴定量のH3-K27ペプチドを含む反応を行った。いかなる場合でも、ペプチド基質はS字形の結合挙動を呈した; ゆえに半最大速度をもたらすペプチドの濃度を最も一般的なミカエリス・メンテン定数Kmの代わりにK1/2としてここで報告する(Copeland (2005) Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide to Medicinal Chemists and Pharmacologists, Wiley)。表6にまとめられているように、変異は、非メチル化ペプチド基質に対するいっそう低いK1/2およびジメチル化ペプチド基質に対するいっそう高いK1/2値によって実証される通り、基底状態の基質認識に影響を及ぼす。さらに、酵素の最大速度は変異の影響を受ける。A677G変異は各非メチル、モノメチル、およびジメチルH3-K27ペプチド基質に対してkcatの2.9倍、3.7倍および22倍の増加をもたらす一方で、A687V変異は非メチルH3-K27ペプチドに対してkcatの3倍の低減をもたらすが、しかしモノメチルおよびジメチルH3-K27ペプチドに対してkcatの各3.5倍および2.5倍の増加を生ずる。SAM Kmは酵素型の間で、H3-K27残基の位置に好ましいメチル化状態を含んだ基質に対して最小のバラツキ、403±64 nM〜899±89 nMを呈した。
【０５４５】
（表６）WTおよび変異体EZH2酵素に対する定常状態酵素反応速度論の概要
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＊野生型のデータは4成分EZH2を用いWigle et al., Febs Lett (2011) Oct 3;585(19):3011-4において既に公表された。
【０５４６】
実施例16 - EZH2阻害剤による野生型EZH2およびEZH2変異体の阻害
試験化合物を10点曲線においてDMSOで3倍連続希釈し、384チャンネルヘッドを備えたPlatemate Plus (Thermo Scientific)を用いて1 μLを384ウェルマイクロプレートの中に二つ組でスポットした。アッセイにおける試験化合物の最終の最高濃度は、10 μMであった。陽性対照(100%阻害の標準物質)は終濃度1 mMのSAHとし、陰性対照(0%阻害の標準物質)にはDMSO 1 μLを含めた。試験化合物を次いで、1×アッセイ緩衝液(20 mM BICINE pH = 7.6、1 mM DTT、0.002% Tween 20、0.005% BSG)中、野生型EZH2 (終濃度は4 nMであった)、Y641F EZH2 (終濃度は0.1 nMであった)およびA677GかつA687V EZH2 (それぞれに対し、終濃度は2 nMであった)ならびにペプチド40 μL/ウェルとともに30分間インキュベートした。野生型EZH2およびA677G EZH2アッセイの場合、非メチル化K27を有するビオチン化ペプチドH3:21-44が200 nMの終濃度で存在したが、A687V EZH2アッセイでは、モノメチル化K27を有するビオチン化ペプチドH3:21-44が200 nMの終濃度で存在し、Y641F EZH2アッセイでは、ジメチル化K27を有するビオチン化ペプチドH3:21-44が200 nMの終濃度で存在した。野生型EZH2酵素を含む反応を開始させるため、1×アッセイ緩衝液中に非標識SAM (終濃度は1800 nMであった)および3H-SAM (終濃度は200 nMであった)を含んだ基質混合物10 μL/ウェルを加えた。Y641F EZH2酵素を含む反応を開始させるため、1×アッセイ緩衝液中に非標識SAM (終濃度は700 nMであった)および3H-SAM (終濃度は300 nMであった)を含んだ基質混合物10 μL/ウェルを加えた。A677GまたはA687V EZH2を含む反応を開始させるため、非標識SAM (終濃度は400 nMであった)および3H-SAM (終濃度は100 nMであった)を含んだ基質混合物10 μL/ウェルを加えた。反応は90分間進み、その後、過剰の非標識SAM (167 μM)で反応停止させ、その後、ストレプトアビジンでコーティングされたフラッシュプレート(Perkin Elmer、カタログ番号SMP410)に移し、1時間結合させ、TopCount NXT HTS (Perkin Elmer)にて検出した。IC50値は、酵素活性の阻害率(%)の4パラメータの当てはめから得られ、表7に示されている。IC50値を導き出すために用いた式を以下に示す。
阻害率(%)の計算
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ここでdpm = 毎分崩壊量、cmpd = アッセイウェル中のシグナル、そしてminおよびmaxはそれぞれの最小および最大シグナル対照である。
4パラメータIC50の当てはめ
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【０５４７】
式中、上限および下限は、通常変動してもよいが、3パラメータの当てはめにおいてそれぞれ100または0に固定されてもよい。ヒル係数は通常変動してもよいが、3パラメータの当てはめにおいて1に固定されてもよい。Yは阻害率(%)であり、Xは化合物濃度である。
【０５４８】
（表７）EZH2阻害剤による野生型および変異体EZH2の阻害
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【０５４９】
実施例17 - A677変異体はEZH2阻害剤に対して最も高い感受性を示す
Pfeiffer細胞はATCC (CRL-2632)から入手した。WSU-DLCL2 (ACC 575)細胞およびOCI-Ly19 (ACC 528)細胞はDSMZから入手した。細胞は全て、RPMI + 10% FBS中で維持した。細胞増殖分析のため、指数関数的に増殖しているPfeiffer細胞、WSU-DLC2細胞、またはOCI-Ly19細胞を終容量150 uLにて細胞1×105個/mL、細胞5×104個/mL、または細胞2.5×105個/mL (それぞれ)の密度で96ウェルプレート中に、三つ組で、プレーティングした。11日の時間的経過にわたるIC50の判定のために0.011〜25 uMに及ぶ終濃度の化合物番号7とともに、細胞をインキュベートした。11日の時間的経過にわたるIC50の判定のために0.00004〜10 uMに及ぶ終濃度の化合物番号13とともに、細胞をインキュベートした。3〜4日ごとに、生存細胞数を、Guava Viacountアッセイ法(Millipore #4000-0040)を用いて判定し、Guava EasyCyte Plus機器にて分析した。細胞計数の後、増殖培地およびEPZ2阻害剤(化合物番号7または化合物番号13)を交換し、細胞を分割して当初のプレーティング密度に戻した。時間的経過11日目からの、最終の分割調整後の生存細胞数/mLを使い、Graphpad Prismソフトウェアを用いて、増殖IC50値を計算した。
【０５５０】
ヘテロ接合性のEZH2変異体A677Gを含むPfeiffer細胞株は、小分子阻害剤である化合物番号7によるEZH2の阻害に感受性であることが示される。増殖阻害は阻害剤による処置から早くも96時間後に認められる。化合物番号7で処理されたPfeiffer細胞に対する11日後の増殖IC50は、Y641Fヘテロ接合性変異を含みかつ270 nMのIC50を有したWSU-DLCL2細胞と比べて、またはEZH2についてWTでありかつ3000 nMのIC50を有したOCI-Ly19細胞と比べて、5.2 nMである。これらの結果は、細胞との関連で、小分子阻害剤による阻害に対してのWTおよび変異体EZH2の感受性が、増殖によって測定された場合に、A677G>>>Y641F>>WTであることを示す。
【０５５１】
ヘテロ接合性のEZH2変異体A677Gを含むPfeiffer細胞株は、小分子阻害剤である化合物番号13によるEZH2の阻害に感受性であることが示される。増殖阻害は阻害剤による処置から早くも96時間後に認められる。化合物番号13で処理されたPfeiffer細胞に対する11日後の増殖IC50は、Y641Fヘテロ接合性変異を含みかつ4.9 nMのIC50を有したWSU-DLCL2細胞と比べて、またはEZH2についてWTでありかつ430 nMのIC50を有したOCI-Ly19細胞と比べて、0.4 nMである。これらの結果は、細胞との関連で、小分子阻害剤による阻害に対してのWTおよび変異体EZH2の感受性が、増殖によって測定された場合に、A677G>>>Y641F>>WTであることを示す。
【０５５２】
均等物
本発明のいくつかの態様を本明細書において記述し、例示してきたが、当業者は、機能を果たすための、ならびに/あるいは本明細書において記述される結果および/または利点の1つもしくは複数を得るための種々の他の手段および/または構造を容易に想定するものと考えられ、そのような変形および/または修正のそれぞれが本発明の範囲内にあると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書において記述される全てのパラメータ、寸法、材料および構成が例示的であると意図されること、ならびに実際のパラメータ、寸法、材料および/または構成は、本発明の教示が用いられる具体的な用途に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、通常の実験を用いるだけで、本明細書において記述される本発明の具体的な態様の多くの均等物を認識するか、または均等物を確認することができるであろう。それゆえ、前述の態様は例として提示されているにすぎないこと、ならびに添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内で、本発明は、具体的に記述され、特許請求されるようなもの以外の別のやり方で実践されてもよいことが理解されるべきである。本発明は、本明細書において記述される各個々の特徴、システム、物品、材料、キットおよび/または方法に関する。さらに、2つまたはそれ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キットおよび/または方法の任意の組み合わせは、そのような特徴、システム、物品、材料、キットおよび/または方法が相互に矛盾していないなら、本発明の範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月19日(2018.1.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:6に定義される通りの基質ポケットドメインに変異を含む変異体EZH2を発現している対象に、EZH2阻害剤の治療的有効量を投与する段階を含む、対象におけるがんまたは前がん状態の症状を処置または緩和するための方法。