(57)【要約】      （修正有）【課題】水への溶解性に優れ、試料中の共存物質の影響を受け難い酸化発色性化合物及び酸化発色試薬の提供。【解決手段】式（Ｉ）で表される酸化発色性化合物。2018141115.tif 000014（Ｒ１〜Ｒ４は夫々独立に１〜６の直鎖／分岐鎖のアルキル基；ＸはＣＯＯ−、ＳＯ３−、β−シクロデキストリン、又はγ−シクロデキストリン；ＬはＣＨ２ｊ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ又は（ＣＨ２）ｍ−Ｚ−（ＣＨ２）ｎ；ｊ〜ｎは夫々独立に１〜１０の整数；Ｚは−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＨＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＨ−又は−ＮＨＣＯＮＨ等）【選択図】図１
2018141115.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）で表される酸化発色性化合物。
【化１】
2018141115.tif 000012
ただし、前記一般式（Ｉ）において、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、炭素数１〜６の直鎖又は分岐鎖アルキル基であり、
Ｘは、親水性の官能基であり、
Ｌは、下記の一般式（II）〜（IV）のいずれかで表される原子団であり、
−（ＣＨ２）ｊ−  （II）
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−  （III）
−（ＣＨ２）ｍ−Ｚ−（ＣＨ２）ｎ−  （IV）
前記一般式（II）において、ｊは２〜１０の整数であり、
前記一般式（III）において、ｋは１〜１０の整数であり、
前記一般式（IV）において、ｍ及びｎは、それぞれ独立して１〜１０の整数であり、Ｚは、−Ｎ＋（ＣＨ３）２−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＨＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯＮＨ−及び−（ＣＨ２ＮＨＣＯ）ｑ−（ｑは１〜３の整数）からなる群より選択される原子団である。
【請求項２】
前記親水性の官能基Ｘが、−ＣＯＯ−、−ＳＯ３−、β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンであることを特徴とする請求項１に記載の酸化発色性化合物。
【請求項３】
下記の式（Ａ）〜（Ｈ）のいずれかで表されることを特徴とする請求項１又は２に記載の酸化発色性化合物。
【化２】
2018141115.tif 000013
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の酸化発色性化合物を含む酸化発色試薬。
【請求項５】
ペルオキシダーゼが関与する酸化反応の測定に用いられるものであることを特徴とする請求項４に記載の酸化発色試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化発色性化合物及び酸化発色試薬の改良に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野においては、酸化発色性化合物から成る試薬を用いてペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素を定量することが行われている。例えば、特許文献１に記載のフェノチアジン系構造を有する酸化発色性化合物（和光純薬工業製ＤＡ−６７。下記の構造式参照）は、分子吸光係数が高いので高感度の測定が可能である。
【０００３】
【化１】
2018141115.tif 000003
【０００４】
しかしながら、ＤＡ−６７には光安定性が低いという欠点があった。かかる課題に鑑みて、光安定性が向上したフェノチアジン系構造を有する酸化発色性化合物として、例えば、下記の構造式に示す構造を有するアダマンタン骨格を有する化合物が提案された（特許文献２参照）。
【０００５】
【化２】
2018141115.tif 000004
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公平７−１２１９０１号公報
【特許文献２】特開２０１５−４８３４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献２に記載のフェノチアジン系構造を有する化合物は、溶解性が低いため、試料に直接固体状の酸化発色性化合物を添加するドライ試薬としての利用が困難であるという問題に加え、試料中に共存する基質以外の物質の影響を受けるという問題があった。
【０００８】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、水への溶解性に優れ、試料中の共存物質の影響を受けにくい酸化発色性化合物及びそれを用いた酸化発色試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的に沿う本発明の第１の態様は、下記の一般式（Ｉ）で表される酸化発色性化合物を提供することにより上記課題を解決するものである。
【００１０】
【化３】
2018141115.tif 000005
【００１１】
ただし、前記一般式（Ｉ）において、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、炭素数１〜６の直鎖又は分岐鎖アルキル基であり、
Ｘは、親水性の官能基であり、
Ｌは、下記の一般式（II）〜（IV）のいずれかで表される原子団であり、
−（ＣＨ２）ｊ−  （II）
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−  （III）
−（ＣＨ２）ｍ−Ｚ−（ＣＨ２）ｎ−  （IV）
前記一般式（II）において、ｊは２〜１０の整数であり、
前記一般式（III）において、ｋは１〜１０の整数であり、
前記一般式（IV）において、ｍ及びｎは、それぞれ独立して１〜１０の整数であり、Ｚは、−Ｎ＋（ＣＨ３）２−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＨＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯＮＨ−及び−（ＣＨ２ＮＨＣＯ）ｑ−（ｑは１〜３の整数）からなる群より選択される原子団である。
【００１２】
本発明の第１の態様に係る酸化発色性化合物において、前記親水性の官能基Ｘが、−ＣＯＯ−、−ＳＯ３−、β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンであってもよい。
【００１３】
本発明の第１の態様に係る酸化発色性化合物は、下記の式（Ａ）〜（Ｈ）のいずれかで表されることが好ましい。
【００１４】
【化４】
2018141115.tif 000006
【００１５】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様に係る酸化発色性化合物を含む酸化発色試薬を提供することにより上記課題を解決するものである。
【００１６】
本発明の第２の態様に係る酸化発色試薬は、ペルオキシダーゼが関与する酸化反応の測定に用いられるものであってもよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によると、光安定性に優れ、溶解性が高く、試料中の共存物質の影響を受けにくいため、感度及び信頼性の両者に優れた酸化発色性化合物及び酸化発色試薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明化合物が酸化発色試薬として用いられる場合の光安定性を既存試薬として対比して示すものである。
【図２】本発明化合物が酸化発色試薬として用いられる場合の夾雑物の影響を既存試薬として対比して示すものである。
【図３】本発明化合物が酸化発色試薬として用いられる場合のｐＨの影響を既存試薬として対比して示すものである。
【図４】本発明化合物が酸化発色試薬として用いられる場合のＧＳＨ（還元型グルタチオン）の影響を既存試薬として対比して示すものである。
【図５】本発明化合物が酸化発色試薬として用いられる場合のＢＳＡ（牛血清アルブミン）の影響を既存試薬として対比して示すものである。
【図６】本発明化合物の水溶性を既存試薬として対比して示すものである。
【図７】既存化合物が酸化発色試薬として用いられる場合のＵＡ項目においての直線性、ブランク発色を示すものである。
【図８】本発明化合物Ａが酸化発色試薬として用いられる場合のＵＡ項目においての直線性、ブランク発色を示すものである。
【図９】本発明化合物Ｂが酸化発色試薬として用いられる場合のＵＡ項目においての直線性、ブランク発色を示すものである。
【図１０】本発明化合物Ｃが酸化発色試薬として用いられる場合のＵＡ項目においての直線性、ブランク発色を示すものである。
【図１１】本発明化合物Ｄが酸化発色試薬として用いられる場合のＵＡ項目においての直線性、ブランク発色を示すものである。
【図１２】本発明化合物が酸化発色試薬として用いられる場合のＵＡ項目においての直線性、ブランク発色を既存試薬として対比して示すものである。
【図１３】本発明化合物が酸化発色試薬として用いられる場合のＵＡ項目においての夾雑物の影響を既存試薬として対比して示すものである。
【図１４】本発明化合物が酸化発色試薬として用いられる場合のＵＡ項目においての加速安定性の影響を既存試薬として対比して示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
続いて、本発明を具体化した実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。
【００２０】
本発明の第１の実施の形態に係る酸化発色性化合物（以下、「酸化発色性化合物」と略称する場合がある。）は、下記の一般式（Ｉ）で表される。
【００２１】
【化５】
2018141115.tif 000007
【００２２】
ただし、前記一般式（Ｉ）において、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、炭素数１〜６の直鎖又は分岐鎖アルキル基であり、
Ｘは、親水性の官能基であり、
Ｌは、下記の一般式（II）〜（IV）のいずれかで表される原子団であり、
−（ＣＨ２）ｊ−  （II）
−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−  （III）
−（ＣＨ２）ｍ−Ｚ−（ＣＨ２）ｎ−  （IV）
前記一般式（II）において、ｊは２〜１０の整数であり、
前記一般式（III）において、ｋは１〜１０の整数であり、
前記一般式（IV）において、ｍ及びｎは、それぞれ独立して１〜１０の整数であり、Ｚは、−Ｎ＋（ＣＨ３）２−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＨＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯＮＨ−及び−（ＣＨ２ＮＨＣＯ）ｑ−（ｑは１〜３の整数）からなる群より選択される原子団である。
【００２３】
フェノチアジン系構造と親水性の官能基Ｘとを連結するＬは、酸化発色性化合物の水溶性、光安定性、試料中の共存物質の影響等に悪影響を与えない限りにおいて、任意の原子団を適宜選択して用いることができる。Ｌの具体例としては、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−、−（ＣＨ２）−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）−、−（ＣＨ２）２−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−Ｎ＋（ＣＨ３）２−（ＣＨ２）３−が挙げられる。
【００２４】
直鎖又は分岐鎖アルキル基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等が挙げられるが、好ましくはメチル基である。
【００２５】
親水性官能基Ｘの具体例としては、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＣＯＯ−、−ＳＯ３−、β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンが挙げられる。なお、−ＣＯＯ−、−ＳＯ３−は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の任意の塩であってよい。
【００２６】
好ましい酸化発色性化合物の具体例としては、下記の式（Ａ）〜（Ｈ）で表される化合物が挙げられる。
【００２７】
【化６】
2018141115.tif 000008
【００２８】
酸化発色性化合物は、任意の公知の方法を用いて合成することができるが、例えば、上記の式（Ｂ）で表される化合物の場合、下記のスキームに示すように、メチレンブルーを還元して得られるロイコメチレンブルーを、トリホスゲンとアミノプロピオン酸エステルより調製したイソシアネートプロピオン酸エステルと反応させた後、エステルを加水分解することにより製造することができる。アミノプロピオン酸エステルの代わりに、アミノエタンスルホン酸を用いることにより、上記の式（Ａ）で表される化合物を合成することができる。また、アミノプロピオン酸エステルの代わりに、グリシルグリシンエステルを用いることにより、上記の式（Ｄ）で表される化合物を合成することができる。
【００２９】
【化７】
2018141115.tif 000009
【００３０】
酸化発色性化合物は、分子吸光係数が高いので高感度の測定が可能であるというフェノチアジン系化合物の特性を維持しつつ、水への溶解性が高いため、予め水や水溶性の有機溶媒等の溶媒に溶解することなく、いわゆるドライ試薬として、固体の状態で試料に添加して用いることができる。また、酸化発色性化合物は、光安定性が高く、抱合型ビリルビン、グルタチオン等の生体試料中の共存物質の影響を受けにくいため、測定対象となる物質について、高感度で信頼性の高い定量分析が可能になる。
【００３１】
本発明の第２の実施の形態に係る酸化発色試薬は、上述の本発明の第１の実施の形態に係る酸化発色性化合物を含んでいる。酸化発色試薬としての特に好ましい用途として、ペルオキシダーゼが関与する酸化反応の測定が挙げられる。すなわち、被測定試料中に酸化発色試薬を添加して発色させて吸収スペクトルを測定し、該スペクトルの吸光度から、過酸化水素の濃度の定量、ペルオキシダーゼの活性の定量等を行うことができる。
【００３２】
さらに、酸化発色性化合物は、酸化性物質により酸化されて発色するので、この性質を利用する他の用途も可能である。例えば、酸化発色性化合物は、塩素により酸化されて発色するので、水中の残留塩素濃度の測定にも応用される。すなわち、被測定サンプル中に本発明の化合物を添加して発色させて吸収スペクトルを測定し、該スペクトルの吸光度から残留塩素濃度を検知することもできる。
【実施例】
【００３３】
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。
【００３４】
実施例１：酸化発色性化合物の合成
上記の式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）で表される化合物（以下、それぞれ、「（本発明）化合物Ａ」、「（本発明）化合物Ｂ」、「（本発明）化合物Ｃ」、「（本発明）化合物Ｄ」という。）の合成は、下記のスキーム（Ｉ）〜（Ｘ）にしたがって行った。
【００３５】
【化８】
2018141115.tif 000010
【００３６】
【化９】
2018141115.tif 000011
【００３７】
＜化合物Ａの合成＞
上記のスキーム（Ｉ）にしたがい、ロイコメチレンブルーを次のように合成した。３Ｌナスフラスコにメチレンブルー８１．５ｇ（０．２１８ｍｏｌ）、純水１．３Ｌを加え超音波照射しながら加温溶解した。マグネチックスターラーで攪拌しながらクロロホルム１．３Ｌを加えＮａＢＨ４水溶液を滴下した。分液し、クロロホルム層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ひだ折りろ紙でろ過した。クロロホルム層を濃縮乾固し、淡青色粉末６5ｇを得た。本中間体はＡ、Ｂ、Ｃ及びＤで使用した。
【００３８】
上記のスキーム（II）にしたがい、目的の本発明化合物Ａを次のように合成した。５００ｍＬナスフラスコに合成したロイコメチレンブルー２．３２ｇ（８．１２ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ１００ｍＬを加えマグネチックスターラーで攪拌溶解した。別途、クロロホルム１００ｍLと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１００ｍＬを入れた５００ｍＬナスフラスコにタウリン２．０３ｇ（１６．２４ｍｍｏｌ）を加え氷浴で攪拌しながらトリホスゲン１．６ｇ（５．４１ｍｍｏｌ）を加え、３０分攪拌を継続しイソシアネートタウリンを調製した。先のロイコメチレンブルーにイソシアネートタウリンを加え、室温で１７時間反応させた。反応後、反応液を濃縮乾固し、水酸化ナトリウムでｐＨ１２に調整後、カラムクロマトグラムで精製した。カラム精製後、淡青色粉末６４０ｍｇを得た。
【００３９】
同定データ：1H-NMR(400  MHz,  D2O)δ:2.64(s,  12H),  2.86-2.89(dd,  2H,  J=12  Hz),  3.37-3.40(dd,  2H,  J=12  H),  6.61-6.68(m,  4H,  J＝28  Hz),  7.07-7.09  (d,  2H,  J=8  Hz)
【００４０】
＜化合物Ｂの合成＞
上記のスキーム（III）にしたがい、本発明化合物Ｂの中間体であるメチルエステル体を次のように合成した。１００ｍＬナスフラスコに、合成したロイコメチレンブルー９８５ｍｇ（３．４５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ５０ｍＬを加えマグネチックスターラーで攪拌溶解した。別途、β-アラニンメチルエステル塩酸塩１．４５ｇ（１０．３５ｍｍｏｌ）とトリホスゲン１．０２ｇ（３．４５ｍｍｏｌ）より調製したイソシアネートβ-アラニンメチルエステルを加え３時間撹拌を継続した。反応後、反応液を濃縮乾固し、カラムクロマトグラムで精製した。カラム精製後、濃青色粉末１．３１７ｇを得た。
【００４１】
上記のスキーム（IV）にしたがい、本発明化合物Ｂを次のように合成した。１００ｍＬナスフラスコにメチルエステル体１．３１７ｇ（３．３ｍｍｏｌ）、メタノール１００ｍＬを加え加温溶解した。１ｍｏｌ／Ｌ  ＫＯＨ／メタノール溶液３．３ｍＬ（３．３ｍｍｏｌ）を加え、濃縮乾固した。濃縮乾固後、メタノール１００ｍＬに溶解し、再度濃縮乾固した。この操作を３回行った。水酸化ナトリウムでｐＨ１２に調整後、カラムクロマトグラムで精製した。カラム精製後、淡青色粉末５２０ｍｇを得た。
【００４２】
同定データ：1H-NMR(400  MHz,  DMSO-d6)δ:1.95-1.97(dd,  2H,  J=8  Hz),  3.05(s,  12H),  3.09-3.13(m,  2H,  J=16  Hz),  6.62-6.68(m,  4H,  J=24  H),  6.84-6.86(dd,  1H,  J＝8  Hz),  7.23-7.25  (d,  2H,  J=8  Hz)
【００４３】
＜化合物Ｃの合成＞
上記のスキーム（Ｖ）にしたがい、本発明化合物Ｃの中間体であるエチルエステル体を次のように合成した。５００ｍＬナスフラスコに合成したロイコメチレンブルー２．７７ｇ（９．６９ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ３００ｍLを加え、マグネチックスターラーで攪拌溶解した。別途、４−アミノブタン酸エチル塩酸塩３２４９ｍｇ（１９．３８ｍｍｏｌ）とトリホスゲン１．９２ｇ（６．４６ｍｍｏｌ）より調製したイソシアネートブタン酸エチルエステルを加え、３時間撹拌を継続した。反応後、反応液を濃縮乾固し、カラムクロマトグラムで精製した。カラム精製後、濃青色粉末４．３６ｇを得た。
【００４４】
上記の反応スキーム（VI）にしたがい、本発明化合物Ｃを次のように合成した。２００ｍＬナスフラスコに、エチルエステル体４．３６ｇ（９．８５ｍｍｏｌ）、メタノール１００ｍＬを加え加温溶解した。１ｍｏｌ／Ｌ  ＫＯＨ／メタノール溶液９．８５ｍＬ（９．８５ｍｍｏｌ）を加え、濃縮乾固した。濃縮乾固後、メタノール１００ｍＬに溶解し、再度濃縮乾固した。この操作を３回行った。水酸化ナトリウムでｐＨ１２に調整後、カラムクロマトグラムで精製した。カラム精製後、青色粉末９００ｍｇを得た。
【００４５】
同定データ：1H-NMR(400  MHz,  DMSO-d6)δ:1.50-1.53(m,  2H,  J=12  Hz),  1.78-1.81(dd,  2H,  J=12  H),  2.88(s,  12H),  2.88(s,  12H),  3.04-3.07(dd,  1H,  J＝12  Hz),  6.11-6.14(dd,  1H,  J=12  Hz),   6.84-6.86(m,  4H,  J＝16  Hz),  7.25-7.27(d,  2H,  J=8  Hz)
【００４６】
＜化合物Ｄの合成＞
上記のスキーム（VII）にしたがい、本発明化合物Ｃの中間体であるグリシルグリシンメチルエステル体を次のように合成した。５００ｍＬナスフラスコにグリシルグリシン５０００ｍｇ（３７．８４ｍｍｏｌ）、メタノール２００ｍＬ、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物７１６７ｍｇ（４１．６２ｍｍｏｌ）を加え超音波照射し溶解した。反応液を濃縮乾固した。濃縮乾固後、メタノール１００ｍＬに溶解し、再度濃縮乾固した。この操作を３回行った。白色結晶１１．５ｇを得た。
【００４７】
上記のスキーム（VIIIおよびIX）にしたがい、本発明化合物Ｄの中間体であるメチルエステル体を次のように合成した。３００ｍＬナスフラスコに合成したロイコメチレンブルー３．３５ｇ（１１．７５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ２００ｍＬを加えマグネチックスターラーで攪拌溶解した。別途、グリシルグリシンメチルエステル体３４３５ｍｇ（２３．５ｍｍｏｌ）とトリホスゲン２．３２ｇ（７．８３ｍｍｏｌ）より調製したイソシアネートグリシルグリシンメチルエステルを加え、１８時間撹拌を継続した。反応後、反応液を濃縮乾固し、カラムクロマトグラムで精製した。カラム精製後、濃青色粉末２．９７ｇを得た。
【００４８】
上記のスキーム（Ｘ）にしたがい、本発明化合物Ｄを次のように合成した。２００ｍＬナスフラスコにメチルエステル体２．９７ｇ（６．４９ｍｍｏｌ）、メタノール１００ｍＬを加え加温溶解した。１ｍｏｌ／Ｌ  ＫＯＨ／メタノール溶液６．４９ｍＬ（６．４９ｍｍｏｌ）を加え、濃縮乾固した。濃縮乾固後、メタノール１００ｍＬに溶解し、再度濃縮乾固した。この操作を３回行った。水酸化ナトリウムでｐＨ１２に調整後、カラムクロマトグラムで精製した。カラム精製後、青色粉末４４０ｍｇを得た。
【００４９】
同定データ：
1H-NMR(400  MHz,  D2O)δ:2.64(s,  12H),  3.63(s,  2H),  3.69(s,  2H),  6.62-6.69(m,  4H,  J＝28  Hz),  7.14-7.17  (d,  2H,  J=8  Hz)
【００５０】
実施例２：酸化発色性化合物の特性評価
本発明に従う酸化発色性化合物として、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄと、既存酸化発色試薬であるＤＡ−６７の比較を以下の項目について行った。
【００５１】
＜溶液安定性＞
光照射下における溶液安定性を次のように試験した。本発明化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＤＡ−６７のそれぞれを５０ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．５）で０．２５ｍＭとなるように調製した。調製した各試薬を蛍光灯下に静置して、６５０ｎｍの吸光度の経時変化を追跡した。その結果を図１に示す。光安定性は、ＤＡ−６７≒本発明化合物Ｂ≒本発明化合物Ｃ＜本発明化合物Ａ＜本発明化合物Ｄの順に安定であり、本発明化合物のすべてが、ＤＡ−６７と同等、もしくはそれ以上に安定であることが分かった。
【００５２】
＜干渉チェック（夾雑物の影響チェック）＞
夾雑物として溶血ヘモグロビン（Ｈｂ）、ビリルビン−Ｆ（ＢＩＬ−Ｆ）、及びビリルビン−Ｃ（ＢＩＬ−Ｃ）を用いてその干渉の程度をチェックした。各溶液の調製は次のように行った。
【００５３】
酸化発色試薬（本発明化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＤＡ−６７）＋ＰＯＤ：酸化発色試薬を５０ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．５）で溶解し、酸化発色試薬濃度３ｍＭの溶液を調製した。その溶液にＰＯＤを加え、超純水で４．５ｍＬにした。干渉チェック溶液：１ボトル／２ｍＬ超純水に溶解し、１０倍希釈した。Ｈ２Ｏ２／バッファー溶液：１ｍＭ  Ｈ２Ｏ２水溶液３００μＬ／５ｍＬバッファーとした。その結果を図２に示す。本発明化合物の夾雑物の影響はＤＡ−６７と同等であった。
【００５４】
＜ｐＨの影響＞
本発明化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＤＡ−６７について、ｐＨ５．５、６．５、７．５それぞれにおける６５０ｎｍの吸光度を測定し、ｐＨの影響を評価した。各溶液の調製は次のように行った。
【００５５】
酸化発色試薬（本発明化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＤＡ−６７）＋ＰＯＤ：酸化発色試薬を５０ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ５．５）、５０ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．５）、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）で溶解し、酸化発色試薬濃度３ｍＭの溶液を調製した。その溶液にＰＯＤを加え、超純水で４．５ｍＬにした。Ｈ２Ｏ２／バッファー溶液：１ｍＭ  Ｈ２Ｏ２水溶液３００μＬ／５ｍＬバッファーとした。その結果を図３に示す。本発明化合物のｐＨの影響はＤＡ−６７と同等であった。
【００５６】
＜ＧＳＨの影響＞
本発明化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＤＡ−６７のＧＳＨ（還元型グルタチオン）の影響を評価した。各溶液の調製は次のように行った。
【００５７】
酸化発色試薬（本発明化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＤＡ−６７）＋ＰＯＤ：酸化発色試薬を５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）で溶解し、酸化発色試薬濃度３ｍＭの溶液を調製した。その溶液にＰＯＤを加え、超純水で４．５ｍＬにした。Ｈ２Ｏ２／バッファー溶液：１ｍＭ  Ｈ２Ｏ２水溶液３００μＬ／５ｍＬバッファーとした。ＧＳＨ／超純水溶液：１０ｍＭＧＳＨ水溶液１０μＬ／２００μＭバッファーとした。その結果を図４に示す。本発明化合物のＧＳＨ（還元型グルタチオン）の影響はＤＡ−６７と同等であった。
【００５８】
＜ＢＳＡの影響＞
本発明化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＤＡ−６７のＢＳＡ（牛血清アルブミン）の影響を評価した。各溶液の調製は次のように行った。
【００５９】
酸化発色試薬（本発明化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＤＡ−６７）＋ＰＯＤ：酸化発色試薬を５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）で溶解し、酸化発色試薬濃度３ｍＭの溶液を調製した。その溶液にＰＯＤを加え、超純水で４．５ｍＬにした。Ｈ２Ｏ２／バッファー溶液：１ｍＭＨ２Ｏ２水溶液３００μＬ／５ｍＬバッファーとした。ＢＳＡ／超純水溶液：２０％ＢＳＡ水溶液１０μＬ／２００μＭバッファーとした。その結果を図５に示す。本発明化合物のＢＳＡ（牛血清アルブミン）の影響はＤＡ−６７と同等であった。
【００６０】
＜水溶性＞
ＤＡ-６７は光安定性に加え、水溶性が悪い問題を抱えている。本発明化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＤＡ−６７の水溶性の違いを評価した。各溶液の調製は次のように行った。
【００６１】
酸化発色試薬（本発明化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＤＡ−６７）／超純水で加温操作（＋）（−）で溶解し、酸化発色試薬濃度３ｍＭの溶液を調製した。その溶液をフィルター濾過後、ＨＰＬＣで分析し、面積比から水溶性の違いを評価した。
【００６２】
ＨＰＬＣ測定条件
＜カラム＞        Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３，φ４．６×１５０ｍｍ
＜温度＞          ４０℃
＜溶離液＞        ０．１％ＴＦＡ水溶液／アセトニトリル＝２０／８０
＜流速＞          １．０ｍＬ／分
＜検出器＞        ＵＶ  ２５４ｎｍ
＜サンプル量＞    ５μＬ注入
＜検出時間＞      １５分
【００６３】
その結果を図６に示す。ＤＡ−６７以上に本発明化合物の水溶性は向上していた。
【００６４】
＜ＵＡ（尿酸）項目における直線性＞
ＵＡ濃度０〜２０ｍｇ／ｄＬの範囲での直線性を比較した。採取したデータを専用アルゴリズムで演算処理して吸光度に換算した。その結果を図７〜１１に示す。各化合物のブランク発色の経時変化を図１２に示す。直線性に関しては、本発明化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの全てにおいてＤＡ−６７と同等であった。ブランク発色に関しては本発明化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの全てがＤＡ−６７より優秀であった。
【００６５】
＜ＵＡ（尿酸）項目における干渉チェック（夾雑物の影響チェック）＞
夾雑物として溶血ヘモグロビン（Ｈｂ）、アスコルビン酸、及び、ビリルビン−Ｃ（ＢＩＬ−Ｃ）を用いてその干渉の程度をチェックした。直線性試験で得た３次回帰式を用いて濃度換算し、各夾雑物質濃度に対する、換算濃度の５回平均値の変動関係を求めて比較した。その結果を図１３に示す。アスコルビン酸、ビリルビン−Ｃ（ＢＩＬ−Ｃ）においては低濃度、高濃度においても本発明化合物のすべてはＤＡ−６７と同等であった。溶血ヘモグロビン（Ｈｂ）においては、高濃度では本発明化合物のすべてはＤＡ−６７と同等であったが、低濃度では本発明化合物のすべてがＤＡ−６７より優秀であった。
【００６６】
＜ＵＡ（尿酸）項目における加速安定性＞
４０℃環境に保管した試薬（アルミ包装）を、７、１４、２１、２８日経過時に取り出して室温に戻し、冷凍保管した試料を取り出し、室温下で自然解凍した後にボルテックス撹拌してから測定に使用した。直線性測定時と同様の操作を行って吸光度を求めた。その結果を図１４に示す。ＵＡ高濃度域（１８．１３ｍｇ／ｄＬ）での加速安定性は、本発明化合物はすべてＤＡ−６７と同等であった。ＵＡ低濃度域（２．１ｍｇ／ｄＬ）での加速安定性は、本発明化合物Ａ＞本発明化合物Ｄ≒ＤＡ−６７＞本発明化合物Ｂ＞本発明化合物Ｃの順に安定であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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