(57)【要約】      （修正有）【課題】バイオマスを加水分解するうえで有用な組成物、その組成物を使用してバイオマス材料を加水分解する方法、及びバイオマスの糖化混合物の粘度を低下させるための方法の提供。【解決手段】グリコシルヒドロラーゼファミリー６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素組成物は特定のアミノ酸配列を有し、この酵素組成物を用いて、バイオマス材料を加水分解、酵素を含まないバイオマス糖化混合物よりも低い粘度を有し、かつ／又は、混合物中の糖化度を高めたバイオマス糖化混合物を取得する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマス糖化混合物であって、
ａ．バイオマス材料と、
ｂ．エンドグルカナーゼ活性を有するグリコシルヒドロラーゼファミリー６１の酵素を含む酵素組成物であって、前記酵素組成物が、
ｉ．配列番号１〜２９及び１４８のいずれか１つと少なくとも６５％の配列同一性を有するか、
ｉｉ．配列番号２７の残基２２〜３４４と少なくとも６５％の配列同一性を有するか、
ｉｉｉ．配列番号８４〜９１からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列モチーフを有するか、
ｉｖ．（１）配列番号８４及び８８、（２）配列番号８５及び８８、（３）配列番号８６、（４）配列番号８７、（５）配列番号８４、８８及び８９、（６）配列番号８４、８８及び９１、（１０）配列番号８５、８８及び９１、（１１）配列番号８４、８８、８９及び９１、（１２）配列番号８４、８８、９０及び９１、（１３）配列番号８５、８８、８９及び９１、並びに（１４）配列番号８５、８８、９０及び９１からなる群から選択される１以上の配列モチーフを有するか、
ｖ．配列番号３０と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列又はその相補体によりコードされるか、又は、
ｖｉ．配列番号３０又はその相補体と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によりコードされる、酵素組成物と、を含み、
前記バイオマス糖化混合物が、グリコシルヒドロラーゼファミリー６１の酵素を含まないバイオマス糖化混合物よりも低い粘度を有し、かつ／又は、グリコシルヒドロラーゼファミリー６１の酵素を含まないか若しくはより低い濃度で含む混合物中の糖化度と比較して、前記混合物中の糖化度を高めることが可能である、バイオマス糖化混合物。
【請求項２】
前記糖化度が、前記バイオマスの糖化を生じるだけの充分な時間にわたって前記混合物がインキュベートされた後に、発酵性糖の収率によって測定される、請求項１に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項３】
前記グリコシルヒドロラーゼファミリー６１の酵素が、糸状菌に由来する、請求項１又は２に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項４】
前記糸状菌が、トリコデルマ（Trichoderma）、フミコラ（Humicola）、フザリウム（Fusarium）、アスペルギルス（Aspergillus）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）、セファロスポリウム（Cephalosporium）、アクリャ（Achlya）、ポドスポラ（Podospora）、エンドチア（Endothia）、ムコール（Mucor）、コクリオボルス（Cochliobolus）、ピリキュラリア（Pyricularia）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フェチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クルックウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レティクラタム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サムブシナム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコクロム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイド（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・サルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイド（Fusarium trichothecioides）、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、ブジェルカンデラ・アダスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレギエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブローサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオプシス・サブバーミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）、コリオラス・ヒルストゥス（Coriolus hirsutus）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ニューロスポラ・インターメディア（Neurospora intermedia）、ペニシリウム・パープロゲナム（Penicillium purpurogenum）、ペニシリウム・カネスセンス（Penicillium canescens）、ペニシリウム・ソリタム（Penicillium solitum）、ペニシリウム・フニクロサム（Penicillium funiculosum）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラジエート（Phlebia radiate）、プレウロタス・エリンギ（Pleurotus eryngii）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ビローサ（Trametes villosa��、トラメテス・ベルシコロル（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、ゲオスミチア・エメルソニイ（Geosmithia emersonii）、又はＧ．ステアロサーモフィルス（G. stearothermophilus）からなる群から選択されるものである、請求項３に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項５】
前記酵素組成物が、セロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド、及びβ−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドを更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項６】
前記セロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドが、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１、Ａｆ７Ａ（配列番号１５０）、Ａｆ７Ｂ（配列番号１５１）、Ｃｇ７Ａ（配列番号１５２）、Ｃｇ７Ｂ（配列番号１５３）、Ｔｔ７Ａ（配列番号１５４）、Ｔｔ７Ｂ（配列番号１５５）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２、Ｔｔ６Ａ（配列番号１５６）、Ｓｔ６Ａ（配列番号１５７）、Ｓｔ６Ｂ（配列番号１５８）、又はこれらと少なくとも９０％の配列同一性を有するこれらの変異体をコードするポリペプチドである、請求項５に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項７】
前記β−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドが、
ａ．Ｆｖ３Ｃ（配列番号１００）、Ｐａ３Ｄ（配列番号９４）、Ｆｖ３Ｇ（配列番号９６）、Ｆｖ３Ｄ（配列番号９８）、Ｔｒ３Ａ（配列番号１０２）、Ｔｒ３Ｂ（配列番号１０４）、Ｔｅ３Ａ（配列番号１０６）、Ａｎ３Ａ（配列番号１０８）、Ｆｏ３Ａ（配列番号１１０）、Ｇｚ３Ａ（配列番号１１２）、Ｎｈ３Ａ（配列番号１１４）、Ｖｄ３Ａ（配列番号１１６）、Ｐａ３Ｇ（配列番号１１８）、Ｔｎ３Ｂ（配列番号１１９）、若しくはこれらと少なくとも９０％の配列同一性を有するこれらの変異体をコードするポリペプチド、又は、
ｂ．（１）配列番号９９、９３、９５、９７、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、若しくは１１７と少なくとも９０％の配列同一性を有するか、（２）配列番号９９、９３、９５、９７、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、若しくは１１７、又はこれらの相補体と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである、請求項５又は６に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項８】
前記酵素組成物が、（１）キシラナーゼ活性を有するポリペプチド、（２）β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド、及び（３）Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの１以上又はすべてを更に含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項９】
前記キシラナーゼ活性を有するポリペプチドが、
ａ．Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３（配列番号７６）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２（配列番号７７）、ＡｆｕＸｙｎ２（配列番号５８）、及びＡｆｕＸｙｎ５（配列番号６０）、若しくはこれらと少なくとも９０％の配列同一性を有するこれらの変異体をコードするポリペプチド、又は、
ｂ．（１）配列番号７５、５７、若しくは５９と少なくとも９０％の配列同一性を有するか、又は（２）配列番号７５、５７、若しくは５９、又はこれらの相補体と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである、請求項８に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項１０】
前記β−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリヌクレオチドが、
ａ．Ｆｖ３Ａ（配列番号３６）、Ｆｖ４３Ａ（配列番号４４）、Ｐｆ４３Ａ（配列番号３８）、Ｆｖ４３Ｄ（配列番号６２）、Ｆｖ３９Ａ（配列番号４２）、Ｆｖ４３Ｅ（配列番号４０）、Ｆｏ４３Ａ（配列番号５２）、Ｆｖ４３Ｂ（配列番号４６）、Ｐａ５１Ａ（配列番号４８）、Ｇｚ４３Ａ（配列番号５０）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１（配列番号７８）、若しくはこれらと少なくとも９０％の配列同一性を有するこれらの変異体をコードするポリペプチド、又は、
ｂ．（１）配列番号３５、４３、３７、６１、４１、３９、５１、４５、４７、４９、若しくは１５９と少なくとも９０％の配列同一性を有するか、（２）配列番号３５、４３、３７、６１、４１、３９、５１、４５、４７、４９、１５９、若しくはこれらの相補体と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである、請求項８に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項１１】
前記Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリヌクレオチドが、
ａ．Ａｆ４３Ａ（配列番号５４）、Ｆｖ４３Ｂ（配列番号４６）、Ｐｆ５１Ａ（配列番号５６）、Ｐａ５１Ａ（配列番号４８）、Ｆｖ５１Ａ（配列番号６６）、若しくはこれらと少なくとも９０％の配列同一性を有するこれらの変異体をコードするポリペプチド、又は、
ｂ．（１）配列番号５３、４５、５５、４７、若しくは６５と少なくとも９０％の配列同一性を有するか、（２）配列番号５３、４５、５５、４７、若しくは６５、又はこれらの相補体と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである、請求項８に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項１２】
前記酵素組成物が、（１）前記酵素組成物中のタンパク質の全重量に対して約０．１重量％〜約５０重量％、約１重量％〜約２０重量％、約５重量％〜約１５重量％の、前記ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、又は（２）前記バイオマス材料中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、若しくはセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ、約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、若しくは約１ｍｇ〜約５ｍｇの、前記ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項１３】
前記酵素組成物が、（１）前記酵素組成物中のタンパク質の全重量に対して約０．１重量％〜約８０重量％、約５重量％〜約７０重量％、約１０重量％〜約６０重量％、約２０重量％〜約５０重量％、若しくは約２５重量％〜約５０重量％、又は（２）前記バイオマス糖化混合物中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、若しくはセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ、約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、若しくは約０．５ｍｇ〜約５ｍｇの量のセロビオヒドロラーゼ（cellulobiohydrolase）を含み、更に（１）前記酵素組成物中のタンパク質の全重量に対して約０．１重量％〜約５０重量％、約１重量％〜約３０重量％、約２重量％〜約２０重量％、約５重量％〜約２０重量％、若しくは約８重量％〜約１５重量％、又は（２）前記バイオマス糖化混合物中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、若しくはセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ、約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、若しくは約０．５ｍｇ〜約５ｍｇの量のβ−グルコシダーゼを含む、請求項５〜１２のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項１４】
前記酵素組成物が、（１）前記酵素組成物中のタンパク質の全重量に対して約０．１重量％〜約５０重量％、約１重量％〜約４０重量％、約４重量％〜約３０重量％、約５重量％〜約２０重量％、若しくは約８重量％〜約１５重量％の、前記キシラナーゼ活性を有するポリペプチド、又は（２）前記バイオマス糖化混合物中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、若しくはセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ、約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、若しくは約０．５ｍｇ〜約５ｍｇの、前記キシラナーゼ活性を有するポリペプチドを含む、請求項８〜１３のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項１５】
前記酵素組成物が、（１）前記酵素組成物中のタンパク質の全重量に対して約０．１重量％〜約５０重量％、約１重量％〜約４０重量％、約２重量％〜約３０重量％、約４重量％〜約２０重量％、若しくは約５重量％〜約１５重量％の、前記β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド、又は（２）前記バイオマス糖化混合物中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、若しくはセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ、約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、若しくは約０．５ｍｇ〜約５ｍｇの、前記β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドを含む、請求項８〜１４のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項１６】
前記酵素組成物が、（１）前記酵素組成物中のタンパク質の全重量に対して約０．１重量％〜約５０重量％、約０．１重量％〜約５０重量％、約１重量％〜約４０重量％、約２重量％〜約３０重量％、約４重量％〜約２０重量％、若しくは約５重量％〜約１５重量％の、前記Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド、又は（２）前記バイオマス糖化混合物中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、若しくはセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ、約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、若しくは約０．５ｍｇ〜約５ｍｇの、前記Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドを含む、請求項８〜１５のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項１７】
前記酵素組成物が、全セルラーゼ組成物である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項１８】
前記全セルラーゼ組成物が、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する宿主細胞に由来する、請求項１７に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項１９】
前記ＧＨ６１ファミリー酵素活性を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記宿主細胞とは異種のものである、請求項１８に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項２０】
前記全セルラーゼ組成物が、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを更に発現する宿主細胞に由来する、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項２１】
前記セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド、及び／又は前記β−グルコシダーゼを有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記宿主細胞とは異種のものである、請求項２０に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項２２】
前記全セルラーゼ組成物が、（１）β−キシロシダーゼ活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド、（２）キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び（３）Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリヌクレオチドペプチドの１以上又はすべてを発現する宿主細胞に由来する、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項２３】
前記β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド、前記キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド、又は前記Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記宿主細胞とは異種のものである、請求項２２に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項２４】
前記酵素組成物が、全ブロス配合物である、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項２５】
（１）前記ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（２）前記セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（３）前記β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（４）前記β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（５）前記キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及び（６）前記Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の１以上又はすべてが、前記宿主細胞の遺伝物質に組み込まれる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項２６】
前記宿主細胞が、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、又は真菌宿主細胞である、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項２７】
前記宿主細胞が、糸状菌宿主細胞である、請求項２６に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項２８】
前記糸状菌宿主細胞が、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Chrysosporium lucknowense）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フェチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、フザリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クルックウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レティクラタム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サムブシナム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコクロム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイド（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・サルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイド（Fusarium trichothecioides）、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、ブジェルカンデラ・アダスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレギエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブローサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオプシス・サブバーミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）、コリオラス・ヒルストゥス（Coriolus hirsutus）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ニューロスポラ・インターメディア（Neurospora intermedia）、ペニシリウム・パープロゲナム（Penicillium purpurogenum）、ペニシリウム・カネスセンス（Penicillium canescens）、ペニシリウム・ソリタム（Penicillium solitum）、ペニシリウム・フニクロサム（Penicillium funiculosum）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラジエート（Phlebia radiate）、プレウロタス・エリンギ（Pleurotus eryngii）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ビローサ（Trametes villosa）、トラメテス・ベルシコロル（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）の細胞から選択されるものである、請求項２７に記載のバイオマス糖化混���物。
【請求項２９】
前記糖化混合物が、前記ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む前記酵素組成物を最初にブレンドした後、前記酵素組成物を前記バイオマスと混合することにより調製される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項３０】
前記バイオマス材料が、ヘミセルロース、セルロース、又はヘミセルロースとセルロースとの混合物を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項３１】
前記バイオマス材料が、グルカン、キシラン、及び／又はリグニンを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項３２】
前記バイオマス材料が、種子、穀粒、塊茎、植物性廃棄物、食品加工又は工業プロセスの副生成物、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、草類、ソルガストラム・ニュータンス（Sorghastrum nutans）、スイッチグラス、多年生イネ科植物、木材、ウッドチップ、加工廃材、おがくず、紙、古紙、パルプ、及び再生紙、ジャガイモ、大豆、大麦、ライ麦、オート麦、小麦、ビーツ、サトウキビバガス、及び麦わらから選択される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項３３】
前記バイオマス材料が、酸又は塩基による前処理に供される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項３４】
前記前処理されたバイオマスが、前記酵素組成物と混合される前に約４．０〜６．５のｐＨに調整される、請求項３３に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項３５】
前記バイオマス材料が、前記混合物の全重量に対する固体状態のバイオマス材料の量として、約５重量％〜約６０重量％、約１０重量％〜約５０重量％、約１５重量％〜約４０重量％、約１５重量％〜約３０重量％、又は約２０重量％〜約３０重量％の量で前記混合物中に存在する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物。
【請求項３６】
バイオマス材料を加水分解するための方法であって、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のバイオマス糖化混合物を、該バイオマス糖化混合物中の前記バイオマス材料を加水分解するのに適した条件下で、充分な長さの時間にわたってインキュベートすることを含む、方法。
【請求項３７】
前記バイオマス糖化混合物中の前記バイオマス材料を加水分解するのに適した条件が、（１）約３．５〜約７．０のｐＨ、（２）約２時間以上の時間の長さ、及び／又は（３）約２５℃〜約７５℃の温度を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記充分な長さの時間が、約８時間〜約７２時間の長さの時間を含む、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
２時間以上の任意の所定の時間において、前記バイオマス糖化混合物により産生される発酵性糖の量が、同じ量及び種類のバイオマス材料、並びに同じ酵素成分の組成を有するが、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼを含まないコントロールバイオマス糖化混合物によって産生される発酵性糖の量と比較して少なくとも約５％増加する、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記バイオマス糖化により産生される発酵性糖の量が、前記コントロールバイオマス糖化混合物により産生される発酵性糖と比較して少なくとも約１０％増加する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記バイオマス材料が、固体状態で約１０重量％〜約５０重量％の量で存在する、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記バイオマス糖化混合物の粘度が、同じ量及び種類のバイオマス材料、並びに同じ酵素成分の組成を有するが、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼを含まない前記コントロールバイオマス糖化混合物の粘度と比較して、少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、又はそれ以上低下する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
バイオマス材料を、商業的酵素供給モデル又はオンサイトバイオ精錬モデルにおいて発酵性糖に変換するための、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の組成物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１１年３月１７日に出願された米国特許仮出願第６１／４５３，９２３号に基づく利益を主張するものであり、当該出願の全容を本明細書に援用するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、バイオマスを加水分解するうえで有用な組成物、その組成物を使用してバイオマス材料を加水分解する方法、及びバイオマスの糖化混合物の粘度を低下させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
再生可能なリグノセルロースバイオマスを発酵性糖に生物変換し、次いでこの糖を発酵させて液体燃料の代替物としてのアルコール（例えばエタノール）を製造することは、石油危機が起こった１９７０年代以降、研究者の多大な関心を集めてきた（Ｂｕｎｇａｙ，Ｈ．Ｒ．、「Ｅｎｅｒｇｙ：ｔｈｅ  ｂｉｏｍａｓｓ  ｏｐｔｉｏｎｓ」、ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ；１９８１；Ｏｌｓｓｏｎ  Ｌ，Ｈａｈｎ−Ｈａｇｅｒｄａｌ  Ｂ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  １９９６，１８：３１２〜３１；Ｚａｌｄｉｖａｒ，Ｊら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００１，５６：１７〜３４；Ｇａｌｂｅ，Ｍら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２，５９：６１８〜２８）。リグノセルロースバイオマス材料からの糖の製造は、それに続くエタノールへの糖の発酵及び蒸溜とともに、以前より知られている。以前の技術開発の大半は、第二次世界大戦の前後に、ドイツ、日本、及びソビエト連邦といった、燃料が高価であった国々で進められたものである。これらの初期のプロセスは主として酸加水分解に基づいたものであったが、加水分解は操作及び設計が複雑であり、温度、圧力、及び／又は酸濃度などの、プロセスにおけるわずかな変化の影響を一般的に受けやすかった。
これらの初期のプロセスの包括的な考察は、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｇａｒｓ  ｆｒｏｍ  Ｗｏｏｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｈｉｇｈ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ  ＸＸＶ，２７５７〜２７７３（１９８３）に示されている。
【０００４】
第二次世界大戦から１９７０年代初頭にかけての石油の豊富な供給は、エタノール変換の研究を遅らせることとなった。しかしながら、１９７３年の石油危機によって、研究者らは木材及び農業副産物を利用してエタノールを生産する方法を開発することに多くの努力を注ぐこととなった。この研究は、外国の石油生産に対する米国の依存度を低め、燃料のオクタン価を高め、環境対策として排気汚染物質を減らすためのガソリン添加剤としてのエタノールの開発にとって特に重要であった。
【０００５】
「石油危機」と時を同じくして、米国環境保護局によって鉛添加剤の低減を求める規制が公表された。エタノールを実質上、鉛の代用物とすることに関し、一部の精錬所では、エタノールが費用の嵩む設備投資を必要とせずに精錬所の運転に容易に導入することが可能であることからエタノールを代替物として選択している。
【０００６】
数十年前に開発された高圧及び高温のガス糖化プロセスは引き続き改良されている。新しい現在の研究は、セルロースを発酵性糖に分解する中温性及び好熱性の真菌類、酵母及び細菌などの様々な微生物からの酵素を使用した酵素的変換プロセスに主眼を置いたものとなっている。これらのプロセスには、主に商業化のための大規模化の可能性及びエタノールの製造効率の点で不安が残る。
【０００７】
セルロース及びヘミセルロースは、光合成によって生成される最もありふれた植物性材料である。これらは、重合体の基質を単量体の糖に加水分解することが可能な酵素を産生する細菌、酵母及び真菌類などの多くの微生物によりエネルギー源として用いられるために分解されうる（Ａｒｏら、２００１）。生物がどの糖を使用するかはしばしば制限されており、これにより、変換の際にどの糖を製造するのが最良であるかが規定される。再生不能な資源の限界に近づくに従って、我々は主要な再生可能なエネルギー資源となりうるセルロースの大きな可能性を認識するにいたっている（Ｋｒｉｓｈｎａら、２００１）。
生物学的なプロセスによるセルロースの効果的な利用は、食料、飼料及び燃料の不足を解消する可能性を秘めている（Ｏｈｍｉｙａら、１９９７）。
【０００８】
セルラーゼは、セルロースの（β−１，４−グルカン又はβ−Ｄ−グルコシド結合）を加水分解して、グルコース、セロビオース、セロオリゴ糖などを生成する酵素である。セルラーゼは、エンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）（「ＥＧ」）、エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）、及びβ−グルコシダーゼ（［β］−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ；ＥＣ  ３．２．１．２１）（「ＢＧ」）の３つの大きなクラスに以前より分類されてきた（Ｋｎｏｗｌｅｓら、１９８７、及びＳｈｕｌｅｉｎ、１９８８）。エンドグルカナーゼがセルロース繊維の非結晶部分に対して主に作用するのに対して、セロビオヒドロラーゼは結晶性セルロースを分解することも可能である。
【０００９】
セルラーゼは、機械的パルプの処理において（Ｐｅｒｅら、１９９６）、飼料添加剤として使用するため（国際特許出願公開第ＷＯ  ９１／０４６７３号）、また穀物の湿式粉砕において、セルロースバイオマスをエタノールに分解するうえで有用であることも示されている（その際、セルラーゼがセルロースをグルコースに分解し、酵母又は他の微生物がグルコースをエタノールへと更に発酵させる）。単行糖化発酵は、例えばトウモロコシ茎葉などのバイオマス中に存在するセルロースがグルコースに変換された後、酵母株がグルコースをエタノールに変換するプロセスである。同時糖化発酵は、例えばトウモロコシ茎葉などのバイオマス中に存在するセルロースがグルコースに変換されるのと同時に、同じ反応容器中で酵母株がグルコースをエタノールに変換するプロセスである。容易に入手可能なセルロース源からのエタノール製造は、安定した再生可能な燃料の供給源を与えるものである。
【００１０】
セルラーゼは、多くの細菌、酵母、及び真菌類によって産生される。特定の真菌類は、セルロースの結晶形態を分解することが可能な完全なセルラーゼ系（すなわち全セルラーゼ）を産生する。全セルラーゼ、特に天然に存在するものは、効率的な分解に必要とされるすべての成分／活性、例えばＣＢＨ、ＥＧ、及びＢＧの分類のそれぞれの活性を有さない場合があることから、必ずしも効率的な分解を行うことができるわけではない（Ｆｉｌｈｏら、１９９６）。個々のＣＢＨ、ＥＧ、及びＢＧ成分は、単独では効率的な加水分解は行えないが、ＥＧ型セルラーゼとＣＢＨ型セルラーゼとの組み合わせは、相互作用によって、いずれかの酵素が単独で使用される場合と比較してセルロースをより効率的に分解することが知られている（Ｗｏｏｄ、１９８５；Ｂａｋｅｒら、１９９４；及びＮｉｅｖｅｓら、１９９５）。
【００１１】
セルラーゼは、繊維製品の処理において、洗剤組成物の洗浄能力を高めるため、柔軟剤として使用するため、綿織物の感触及び外観を向上させるためなどの目的で有用であることが、当該技術分野において知られている（Ｋｕｍａｒら、１９９７）。セルラーゼ含有洗剤組成物として、洗浄性能が高められたもの（米国特許第４，４３５，３０７号、英国特許出願第２，０９５，２７５号、及び同第２，０９４，８２６号）、並びに繊維製品の感触及び外観を向上させるための布地の処理に使用されるもの（米国特許第５，６４８，２６３号、同第５，６９１，１７８号、及び同第５，７７６，７５７号、並びに英国特許出願第１，３５８，５９９号）がこれまでに述べられている。
【００１２】
このように、真菌類及び細菌において産生されるセルラーゼは多大な関心を集めてきた。詳細には、トリコデルマ属（Trichoderma spp.）（例えば、Ｔ．ロンギブラキアタム（T. longibrachiatum）又はＴ．リーゼイ（T. reesei））の発酵では、セルロースの結晶形態を分解可能な完全セルラーゼ系が産生されることが示されている。長年にわたって、トリコデルマのセルラーゼ産生は、古典的な突然変異誘発、スクリーニング、選択、及び高度に洗練された大規模な低コストの発酵条件の開発によって改良されてきた。トリコデルマ属の多成分セルラーゼ系は、セルロースをグルコースに加水分解することが可能であるが、効率的なセルロース加水分解に関する異なる性質を有する他の微生物、特に細菌株に由来するセルラーゼも存在し、工業的規模のセルラーゼ製造では、これらのタンパク質を糸状菌中で発現させることが効果的であると考えられる。しかしながら、多くの研究の結果により、糸状菌からの発現細菌酵素の収率は低いことが示されている（Ｊｅｅｖｅｓら、１９９１）。
【００１３】
グルコース及びセロビオースなどの可溶性糖は、化学物質及び生物学的製剤の製造において多くの用途を有する。セルロース加水分解の最適化により、可溶性糖の製造における酵素の使用量を低減し、費用対効果を高めることが可能である。
【００１４】
リグノセルロースバイオマスの発酵性糖への効率的変換は、費用効率が高く環境に優しい方法でバイオエタノールを製造するうえで重要な要素である。特に蒸留のエネルギー及び処理コストを低減するには、現実的なプロセスにより製造される最小のエタノール濃度は少なくとも４％（重量／体積）でなければならない。こうした高いエタノール濃度は、乾燥固形分の含量が高い基質を処理することによって実現可能である。しかしながら、乾燥分の含量が高いバイオマスを糖化することにともなう共通の問題点として、ポンプで圧送できない、又は取り扱いに際して大きなエネルギーの入力を必要とするスラリーを生じる、スラリーの高い粘度がある。高固形分基質の取り扱いに際しては、１）物質移動が制限された不充分な混合、２）酢酸、フルフラール、５−ヒドロキシメチルフルフラール、フェノール性リグニン分解物などの阻害物質の濃度上昇、３）グルコース、セロビオース、エタノールなどの生成の阻害、及び４）発酵微生物の生存率などの問題が生じる。高い粘度により、プロセス中の乾燥物質の濃度が制限され、エネルギー及び水の消費量が大きくなり、分離効率、蒸発及び熱交換率、更に最終的にはエタノールの収率が低下する。したがって粘度を低下させることは有益であり、高粘度につながる可溶性／不溶性化合物を分解するうえで酵素が重要な役割を担っている。
【００１５】
固形物装填量を高め、かつ／又は糖化プロセスの粘度を低くするための研究が行われている。例えば、バイオマス基質ロード量中の固形分濃度を高めるため、多くの研究で流加培養操作が用いられている。予め処理した麦わらを、最大で４０％の固形分濃度で回分式の酵素による液化及び加水分解を行うことが可能な重力式混合反応器の設計が用いられている。このような流加培養による手法では、酵素による加水分解の際にバイオマス基質又は基質と一緒に酵素を連続的に装填することによって、大量の基質の加水分解、加水分解の際の比較的低い濃度、及びプロセスの間の比較的高いグルコース濃度が実現される。また、スラリーの粘度を低下させてポンプによる圧送及び撹拌を可能とするために、例えば５０℃のような酵素の最適温度において、一定時間、酵素によるリグノセルロースバイオマスの前加水分解を行ってもよい。前加水分解における粘度の低下は、後発酵すなわちＳＳＦの発酵を可能とするものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
多くの手法が開発されたにもかかわらず、粘度を低くし、所望の発酵性糖の収量を高めるための更なる方法が、当該技術分野において依然求められている。
【００１７】
特許、特許出願、及び公開公報を含む、本明細書に引用するすべての参照文献を、それらの全容において援用するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本開示は、バイオマス糖化混合物中に特定のエンドグルカナーゼ酵素（例えば、グリコシルヒドロラーゼファミリー６１（「ＧＨ６１」）／エンドグルカナーゼ活性（Ｔ．リーゼイ（T. reesei）のエンドグルカナーゼ（「Ｅｇ４」）など）を有するポリペプチド）を含有させることにより、混合物の粘度が大幅に低下するという予期せざる発見に一部基づいたものである。本開示は、与えられたバイオマス基質からの糖化及び所望の発酵性糖の収率を大幅に高めるためにこうした酵素を含有させることにも関する。
【００１９】
本明細書では、グリコシルヒドロラーゼファミリー６１（「ＧＨ６１」）／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。「ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性」とは、そのポリペプチドがＧＨ６１活性及び／又はエンドグルカナーゼ活性を有することを意味する。一部の態様では、ポリペプチドは単離される。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば単離ポリペプチド）は、異なる種に由来するＧＨ６１エンドグルカナーゼ若しくはエンドグルカナーゼＩＶ（「ＥＧ  ＩＶ」）であるか、又はＧＨ６１エンドグルカナーゼに相当する（例えば、ＧＨ６１エンドグルカナーゼとホモロジーを共有するか、機能ドメインを共有するか、ＧＨ６１モチーフを共有するか、かつ／又は保存された残基を共有する）ポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）のＥＧ４ポリペプチド）である。このような種としては、トリコデルマ（Trichoderma）、フミコラ（Humicola）、フザリウム（Fusarium）、アスペルギルス（Aspergillus）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）、セファロスポリウム（Cephalosporium）、アクリャ（Achlya）、ポドスポラ（Podospora）、エンドチア（Endothia）、ムコール（Mucor）、コクリオボルス（Cochliobolus）、ピリキュラリア（Pyricularia）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フェチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クルックウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レティクラタム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サムブシナム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコクロム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイド（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・サルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイド（Fusarium trichothecioides）、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、ブジェルカンデラ・アダスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレギエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブローサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオプシス・サブバーミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、コプリ���ス・シネレウス（Coprinus cinereus）、コリオラス・ヒルストゥス（Coriolus hirsutus）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ニューロスポラ・インターメディア（Neurospora intermedia）、ペニシリウム・パープロゲナム（Penicillium purpurogenum）、ペニシリウム・カネスセンス（Penicillium canescens）、ペニシリウム・ソリタム（Penicillium solitum）、ペニシリウム・フニクロサム（Penicillium funiculosum）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラジエート（Phlebia radiate）、プレウロタス・エリンギ（Pleurotus eryngii）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ビローサ（Trametesvillosa）、トラメテス・ベルシコロル（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、ゲオスミチア・エメルソニイ（Geosmithia emersonii）、又はＧ．ステアロサーモフィルス（G. stearothermophilus）が挙げられる。
【００２０】
一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば単離ポリペプチド）は、本開示の図１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群から選択されるＧＨ６１エンドグルカナーゼである。例えば、好適なＧＨ６１エンドグルカナーゼとしては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ９７２８３．２、ＣＡＤ７０３４７．１、ＣＡＤ２１２９６．１、ＣＡＥ８１９６６．１、ＣＡＦ０５８５７．１、ＥＡＡ２６８７３．１、ＥＡＡ２９１３２．１、ＥＡＡ３０２６３．１、ＥＡＡ３３１７８．１、ＥＡＡ３３４０８．１、ＥＡＡ３４４６６．１、ＥＡＡ３６３６２．１、ＥＡＡ２９０１８．１、及びＥＡＡ２９３４７．１によって表されるもの、又は、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）２４６３０に由来するＳｔ６１と命名されたもの、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）２３８３９ｃに由来するＳｔ６１Ａ、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）４６５８３に由来するＳｔ６１Ｂ、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）８０３１２に由来するＳｔ６１Ｄ、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆｕ３ｇ０３８７０に由来するＡｆｕ６１ａ（ＮＣＢＩ参照番号：ＸＰ＿７４８７０７）、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆｕ６ｇ０９５４０に由来するＮＣＢＩ参照番号：ＸＰ＿７５０８４３．１のエンドグルカナーゼ、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）ＥＤＰ４７１６７のエンドグルカナーゼ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）１６３８０のエンドグルカナーゼ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）１５５４１８のエンドグルカナーゼ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６８９００のエンドグルカナーゼ、Ｃ．グロボサム（C. globosum）に由来するＣｇ６１Ａ（ＥＡＱ８６３４０．１）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ７、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４、及び、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆ２９３に由来するＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿７５２０４０のエンドグルカナーゼが挙げられる。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば単離ポリペプチド）は、配列番号１〜２９及び１４８のいずれか１つと少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。特定の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば単離ポリペプチド）は、（１）配列番号８４及び８８、（２）配列番号８５及び８８、（３）配列番号８６、（４）配列番号８７、（５）配列番号８４、８８及び８９、（６）配列番号８５、８８、及び８９、（７）配列番号８４、８８、及び９０、（８）配列番号８５、８８及び９０、（９）配列番号８４、８８及び９１、（１０）配列番号８５、８８及び９１、（１１）配列番号８４、８８、８９及び９１、（１２）配列番号８４、８８、９０及び９１、（１３）配列番号８５、８８、８９及び９１、並びに（１４）配列番号８５、８８、９０及び９１からなる群から選択される１以上の配列モチーフを有するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、少なくともアミノ酸残基約１００個（例えば、少なく���も約１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０個、又はそれ以上）分の長さを有する。
【００２１】
一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、例えば図１に列記されるものから選択されるもののようなＧＨ６１エンドグルカナーゼの変異体である。適当なポリペプチドとしては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ９７２８３．２、ＣＡＤ７０３４７．１、ＣＡＤ２１２９６．１、ＣＡＥ８１９６６．１、ＣＡＦ０５８５７．１、ＥＡＡ２６８７３．１、ＥＡＡ２９１３２．１、ＥＡＡ３０２６３．１、ＥＡＡ３３１７８．１、ＥＡＡ３３４０８．１、ＥＡＡ３４４６６．１、ＥＡＡ３６３６２．１、ＥＡＡ２９０１８．１、若しくはＥＡＡ２９３４７．１、又はＳ．サーモフィラム（S. thermophilum）２４６３０のＳｔ６１、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）２３８３９ｃのＳｔ６１Ａ、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）４６５８３のＳｔ６１Ｂ、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）８０３１２のＳｔ６１Ｄ、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆｕ３ｇ０３８７０のＡｆｕ６１ａ（ＮＣＢＩ参照番号：ＸＰ＿７４８７０７）、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆｕ６ｇ０９５４０の酵素（ＮＣＢＩ参照番号：ＸＰ＿７５０８４３．１）、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）ＥＤＰ４７１６７の酵素、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）１６３８０の酵素、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）１５５４１８の酵素、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６８９００の酵素、並びにＣ．グロボサム（C. globosum）Ｃｇ６１Ａ（ＥＡＱ８６３４０．１）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ７、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４、及びＡ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆ２９３の酵素（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿７５２０４０）が含まれる。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１〜２０、及び１４８のいずれか１つを有する酵素の変異体である。ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、（１）配列番号８４及び８８、（２）配列番号８５及び８８、（３）配列番号８６、（４）配列番号８７、（５）配列番号８４、８８及び８９、（６）配列番号８５、８８及び８９、（７）配列番号８４、８８及び９０、（８）配列番号８５、８８及び９０、（９）配列番号８４、８８及び９１、（１０）配列番号８５、８８及び９１、（１１）配列番号８４、８８、８９及び９１、（１２）配列番号８４、８８、９０及び９１、（１３）配列番号８５、８８、８９及び９１、並びに（１４）配列番号８５、８８、９０及び９１から選択される配列モチーフの１以上を有する、少なくともアミノ酸残基約１００個（例えば、少なくとも約１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０個、又はそれ以上）分の長さを有する酵素の変異体であってよい。
ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１〜１８のいずれか１つと少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のいずれか）の同一性を有するアミノ酸配列を有する、ＧＨ６１エンドグルカナーゼの変異体であってよい。
【００２２】
一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ＧＨ６１エンドグルカナーゼの変異体を含む単離ポリペプチド）は、エンドグルカナーゼ活性を有する。この変異体は、配列番号８４〜９１から選択される少なくとも１個のモチーフ（少なくとも１、２、３、４、５、６、７、又は８個のモチーフ）を有しうる。本開示の目的では、酵素はその機能によって呼称することができる。例えば、エンドグルカナーゼポリペプチドは、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドと呼称することもでき、また、その逆もありうる。
【００２３】
一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（ＧＨ６１エンドグルカナーゼの変異体を含む）は、（１）配列番号８４及び８８、（２）配列番号８５及び８８、（３）配列番号８６、（４）配列番号８７、（５）配列番号８４、８８及び８９、（６）配列番号８５、８８及び８９、（７）配列番号８４、８８及び９０、（８）配列番号８５、８８及び９０、（９）配列番号８４、８８及び９１、（１０）配列番号８５、８８及び９１、（１１）配列番号８４、８８、８９及び９１、（１２）配列番号８４、８８、９０及び９１、（１３）配列番号８５、８８、８９及び９１、並びに（１４）配列番号８５、８８、９０及び９１から選択される１以上の配列モチーフを有する。
【００２４】
一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（変異体を含む）は、ＣＢＭドメイン（例えば機能性ＣＢＭドメイン）を有する。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（ＧＨ６１エンドグルカナーゼの変異体を含む）は、触媒ドメイン（例えば機能性触媒ドメイン）を有する。
【００２５】
本明細書においては、ＥＧ  ＩＶポリペプチドの変異体も提供される。例えば、このような変異体は、配列番号１〜２９及び１４８のいずれか１つ、又はこれらの成熟ポリペプチドと少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有しうる。例えば本明細書では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドの変異体が提供される。このような変異体は、配列番号２７の残基２２〜３４４と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２．５％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有しうる。一部の態様では、ポリペプチド又はその変異体は単離される。一部の態様では、ポリペプチド又はその変異体は、エンドグルカナーゼ活性を有する。一部の態様では、ポリペプチド又はその変異体は、配列番号２７のＨ２２、Ｄ６１、Ｇ６３、Ｃ７７、Ｈ１０７、Ｒ１７７、Ｅ１７９、Ｈ１８４、Ｑ１９３、Ｃ１９８、Ｙ１９５、及びＹ２３２のうちの少なくとも約５個の残基（例えば、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のいずれか）に相当するか、又は他のポリペプチドのいずれかの任意の相当する保存された残基を有する。一部の態様では、ポリペプチド又はその変異体は、配列番号２７のＨ２２、Ｄ６１、Ｇ６３、Ｃ７７、Ｈ１０７、Ｒ１７７、Ｅ１７９、Ｈ１８４、Ｑ１９３、Ｃ１９８、Ｙ１９５、及びＹ２３２に相当する残基を有する。ポリペプチド又はその変異体は、配列番号２７のＧ３１３、Ｑ３１４、Ｃ３１５、Ｇ３１６、Ｇ３１７、Ｓ３２１、Ｇ３２２、Ｐ３２３、Ｔ３２４、Ｃ３２６、Ａ３２７、Ｔ３３１、Ｃ３３２、Ｎ３３６、Ｙ３３８、Ｙ３３９、Ｑ３４１、Ｃ３４２、及びＬ３４３のうちの少なくとも５個の残基（例えば、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個のいずれか）に相当する残基を有しうる。一部の態様では、ポリペプチド又はその変異体は、配列番号２７のＧ３１３、Ｑ３１４、Ｃ３１５、Ｇ３１６、Ｇ３１７、Ｓ３２１、Ｇ３２２、Ｐ３２３、Ｔ３２４、Ｃ３２６、Ａ３２７、Ｔ３３１、Ｃ３３２、Ｎ３３６、Ｙ３３８、Ｙ３３９、Ｑ３４１、Ｃ３４２、及びＬ３４３に相当する残基を有する。ポリペプチド及びその変異体は、ＣＢＭドメイン（例えば機能性ＣＢＭドメイン）を有しうる。一部の態様では、ポリペプチド及びその変異体は、触媒ドメイン（例えば機能性触媒ドメイン）を有する。
【００２６】
更に本明細書では、本明細書のポリペプチドのいずれか１つをコードした核酸又はポリヌクレオチドが提供される。例えば、本開示は、配列番号１〜２９及び１４８のいずれか１つと少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドを提供する。例えば、本開示は、配列番号３０と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２．５％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の同一性を有する単離された核酸を提供する。
更に、上記に述べた核酸を有する発現カセット、ベクター、及び細胞が提供される。
【００２７】
更に、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素組成物（例えば非天然組成物）が提供される。一部の態様では、組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）を含む全セルラーゼを含む。ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）エンドグルカナーゼＩＶ（「Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４」）又はその変異体である。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の変異体は、本明細書において提供される変異体のいずれであってもよい。
【００２８】
一部の態様では、酵素組成物は、セルラーゼ組成物である。酵素組成物は、更に、１以上のヘミセルラーゼを含んでもよく、したがって、ヘミセルラーゼ組成物であってもよい。一部の態様では、酵素組成物は、少なくとも１種類（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、又は８種類）のセルラーゼポリペプチドを含む。一部の態様では、少なくとも１種類のセルラーゼポリペプチドは、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、又はβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドである。一部の態様では、組成物は、少なくとも１種類（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、又は８種類）のヘミセルラーゼポリペプチドを更に含む。一部の態様では、少なくとも１種類のヘミセルラーゼポリペプチドは、キシラナーゼ活性を有するポリペプチド、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド、若しくはＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド、又はキシラナーゼ／β−キシロシダーゼ活性の組み合わせを有するポリペプチド、β−キシロシダーゼ／Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性の組み合わせを有するポリペプチド、若しくはキシラナーゼ／Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性の組み合わせを有するポリペプチドである。一部の態様では、組成物は、少なくとも１種類（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、又は８種類）のセルラーゼポリペプチド及び少なくとも１種類（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、又は８種類）のヘミセルラーゼポリペプチドを含む。
【００２９】
一部の態様では、酵素組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有し、更に、エンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも１種類（例えば、少なくとも２、３、４、又は５種類）のポリペプチド、セロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１種類（例えば、少なくとも２、３、４、又は５種類）のポリペプチド、β−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１種類（例えば、少なくとも２、３、４、又は５種類）のポリペプチド、キシラナーゼ活性を有する少なくとも１種類（例えば、少なくとも２、３、４、又は５種類）のポリペプチド、β−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも１種類（例えば、少なくとも２、３、４、又は５種類）のポリペプチド、及び／又は、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する少なくとも１種類（例えば、少なくとも２、３、４、又は５種類）のポリペプチドを含む。
【００３０】
一部の態様では、組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）、及びキシラナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、又はこれらの変異体）を含む。一部の態様では、組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、Ｔｎ３Ｂ、又はこれらの変異体）を更に含む。一部の態様では、組成物は、セロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）７Ａ，７Ｂ、Ｃ．グロボサム（C. globosum）７Ａ，７Ｂ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）７Ａ，７Ｂ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６Ａ、Ｓ．サーモファイル（S. thermophile）６Ａ、６Ｂ、又はこれらの変異体）を更に含む。一部の態様では、組成物は、ＧＨ６１酵素以外のエンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ２、又はこれらの変異体）を更に含む。
【００３１】
組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）、及びβ−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、Ｔｎ３Ｂ又はこれらの変異体）を含んでもよい。組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、及びセロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）７Ａ、７Ｂ、Ｃ．グロボサム（C. globosum）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６Ａ、Ｓ．サーモファイル（S. thermophile）６Ａ、６Ｂ、又はこれらの変異体）を含んでもよい。組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、及びエンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ２、又はこれらの変異体）を含んでもよい。組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、及びβ−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１、又はこれらの変異体）を含んでもよい。組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、Ｆｖ５１Ａ、又はこれらの変異体）を含んでもよい。
【００３２】
本明細書に述べられる組成物のいずれか１つは全セルラーゼを含みうる。例えば、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む全セルラーゼを含む組成物が提供される。あるいは、全セルラーゼに加えて、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む組成物が提供される。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、並びにＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド以外のエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、及びβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドを含む組成物が提供される。組成物は、１以上のヘミセルラーゼポリペプチドを更に含む。例えば、組成物は、キシラナーゼ活性を有する１以上のポリペプチド、β−キシロシダーゼ活性を有する１以上のポリペプチド、及び／又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する１以上のポリペプチドを含んでもよい。組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、キシラナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、又はこれらの変異体）、及び全セルラーゼを含みうる。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、キシラナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、又はこれらの変異体）、及びヘミセルラーゼ活性を有する少なくとも１種類の他のポリペプチドを含む組成物が提供される。
【００３３】
一部の態様では、全セルラーゼは、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドではない、エンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ２、又はこれらの変異体）を含む。全セルラーゼは、セロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）７Ａ、７Ｂ、Ｃ．グロボサム（C. globosum）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６Ａ、Ｓ．サーモファイル（S. thermophile）６Ａ、６Ｂ、又はこれらの変異体）を含みうる。全セルラーゼは、β−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、Ｔｎ３Ｂ、又はこれらの変異体）を含みうる。
【００３４】
一部の態様では、本明細書に述べられる組成物のいずれか１つにおいて、エンドグルカナーゼ活性を有するが、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するものではない、少なくとも１種類のポリペプチドは、例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ１（又はその変異体）及び／又はＴ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ２（又はその変異体）である。一部の態様では、セロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドは、例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）７Ａ、７Ｂ、Ｃ．グロボサム（C. globosum）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６Ａ、Ｓ．サーモファイル（S. thermophile）６Ａ、６Ｂ、又はこれらの変異体である。一部の態様では、β−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドは、例えば、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、及び／若しくはＴｎ３Ｂ、又はこれらの変異体である。一部の態様では、キシラナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドは、例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ２、及び／若しくはＡｆｕＸｙｎ５、又はこれらの変異体である。一部の態様では、β−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドは、例えば、グループ１のβ−キシロシダーゼ又はグループ２のβ−キシロシダーゼであり、ただし、グループ１のβ−キシロシダーゼは、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ａポリペプチド、又はこれらの変異体であってよく、グループ２のβ−キシロシダーゼは、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１ポリペプチド、又はこれらの変異体であってよい。一部の態様では、β−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドは、例えばＦｖ３Ａ（又はその変異体）及び／又はＦｖ４３Ｄ（又はその変異体）である。一部の態様では、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドは、Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、及び／若しくはＦｖ５１Ａ、又はこれらの変異体であってよい。
【００３５】
一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する単離ポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）を含む組成物が提供される。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードした核酸が遺伝子操作により導入された宿主細胞により発現される。例えば、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは宿主細胞により発現され、そのポリペプチドをコードする核酸は宿主細胞とは異種のものである。
【００３６】
一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）を含み、更に１以上のセルラーゼポリペプチド及び／又は１以上のヘミセルラーゼポリペプチドを含む組成物であって、セルラーゼポリペプチド及び／又はヘミセルラーゼポリペプチドが宿主細胞により発現され、かつ、セルラーゼポリペプチド及び／又はヘミセルラーゼポリペプチドが宿主細胞とは異種のものである、組成物が提供される。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含み、更に少なくとも１種類のセルラーゼポリペプチド及び／又は少なくとも１種類のヘミセルラーゼポリペプチドを含む組成物であって、セルラーゼポリペプチド及び／又はヘミセルラーゼポリペプチドが宿主細胞により発現され、かつ、セルラーゼポリペプチド及び／又はヘミセルラーゼポリペプチドが宿主細胞に内因性のものである、組成物が提供される。一部の態様では、セルラーゼポリペプチドは、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドとは異なるエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ２、又はこれらの変異体）、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）７Ａ、７Ｂ、Ｃ．グロボサム（C. globosum）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６Ａ、Ｓ．サーモファイル（S. thermophile）６Ａ、６Ｂ、又はこれらの変異体）、又はβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、Ｔｎ３Ｂ、又はこれらの変異体）を含む。一部の態様では、ヘミセルラーゼポリペプチドは、キシラナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、又はこれらの変異体）、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１、又はこれらの変異体）、又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、Ｆｖ５１Ａ、又はこれらの変異体）を含む。
【００３７】
一部の態様では、組成物は発酵ブロスから調製される。一部の態様では、組成物は、組み込み株（例えば、本明細書の実施例に示されるＨ３Ａ／Ｅｇ４、＃２７）の発酵ブロスから調製され、宿主株の遺伝物質にＧＨ６１エンドグルカナーゼ遺伝子が組み込まれる。
一部の態様では、組成物は、ある株の発酵ブロスから調製され、その場合、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）をコードする核酸は宿主細胞と異種であり、ＧＨ６１エンドグルカナーゼは、例えば株に組み込まれているか、又は宿主株に導入されたベクターにより発現される。
【００３８】
ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）を含む、本明細書において提供されるいずれか１つの組成物又は方法は、全セルラーゼでありうる。組成物は、最小限の製造後処理（例えば精製、濾過、殺細胞工程、及び／又は限外濾過など）を行った発酵ブロスであってよく、全ブロス配合物として使用される。
【００３９】
一部の態様では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ及びＦｖ５１Ａ、又はこれらの対応する変異体を含む組成物（例えば非天然組成物）が提供される。組成物は全セルラーゼであってよい。組成物は、最小限の製造後処理（例えば濾過、精製、限外濾過、殺細胞工程など）を行った発酵ブロスであってよく、したがって全ブロス配合物として使用される。一部の態様では、組成物は、単離されたＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体を含む。一部の態様では、組成物は、単離されたＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、単離されたＴ．リーゼイ（T. reesei）ｘｙｎ３、単離されたＦｖ３Ａ、単離されたＦｖ４３Ｄ、及び単離されたＦｖ５１Ａのうちの少なくとも１つを含む。例えば、上記に述べたいずれかのポリペプチドは、単純に加えるか又は精製若しくは単離されたポリペプチドを混合することによって組成物中に導入することができる。また、本明細書におけるポリペプチドは、適当な組換え技術を用いて宿主株によって発現させることも可能であり、上記に述べたポリペプチドの特定のものが、宿主細胞におけるそれらの天然のレベルと比較して過剰発現又は過小発現されてもよい。一部の態様では、上記に述べたいずれか１つのポリペプチドをコードした遺伝子を宿主株に組み込むことができる。一部の態様では、本開示の組成物は、宿主株の発酵ブロスから調製される。一部の態様では、組成物は、組み込み株（例えば、本明細書の実施例に示されるＨ３Ａ／Ｅｇ４、＃２７）の発酵ブロスから得られる。一部の実施形態では、発酵ブロスは最小限の製造後処理に供され、全ブロス配合物として使用される。一部の態様では、ＧＨ６１エンドグルカナーゼをコードした核酸は、宿主細胞とは異種のものである。一部の態様では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、又はＦｖ５１Ａをコードした核酸の少なくとも１つは、本発明のＧＨ６１エンドグルカナーゼを発現する宿主細胞とは異種である。一部の態様では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、又はＦｖ５１Ａをコードした少なくとも１つの核酸は、ＧＨ６１エンドグルカナーゼを発現する宿主細胞に内因性のものである。
【００４０】
ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）は、組成物中の酵素又は他の成分の種類及び濃度に関して同様であるが、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含まないコントロール酵素組成物又はコントロールバイオマス糖化混合物によって得られる収率と比較して、バイオマス材料の加水分解により得られる発酵性糖の収率を（例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％だけ）増大させるのに充分な量で酵素組成物又はバイオマス糖化混合物中に存在しうる。ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、組成物中の酵素又は他の成分の種類及び濃度に関して同様であるが、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含まないコントロール混合物の粘度と比較して、組成物中のバイオマス材料の加水分解の間のバイオマス糖化混合物の粘度を（例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％だけ）低下させるのに充分な量で酵素組成物又はバイオマス糖化混合物中に存在しうる。一部の態様では、酵素組成物又はバイオマス糖化混合物は、エンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド、セロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド、β−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドを、各ポリペプチドが接触するバイオマス材料の加水分解を生じるうえで充分な全量で含む。酵素組成物又はバイオマス糖化混合物は、キシラナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド、β−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド、及び／若しくは全セルラーゼ、又はこれらの混合物を、各ポリペプチドが接触するバイオマス材料の加水分解を生じるうえで充分な全量で更に含みうる。
【００４１】
一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）は、酵素組成物中又はバイオマス糖化混合物中のタンパク質の全重量の約０．１重量％〜約５０重量％（例えば、約０．５重量％〜約３０重量％、約１重量％〜約２０重量％、約５重量％〜約２０重量％、約７重量％〜約２０重量％、又は約８〜約１５重量％）の量で存在する。例えば、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、酵素組成物中又はバイオマス糖化混合物中のタンパク質の全重量の約８重量％、約１０重量％、又は約１２重量％の量で存在する。
酵素組成物又はバイオマス糖化混合物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する複数のポリペプチドを含みうる。例えば酵素組成物又はバイオマス糖化混合物は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ７（又はその変異体）を含んでもよく、その場合、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの全量（Ｅｇ４＋Ｅｇ７）は、酵素組成物中又はバイオマス糖化混合物中のタンパク質の全重量の約０．１重量％〜約５０重量％（例えば、約０．５重量％〜約３０重量％、約２重量％〜約２０重量％、約５重量％〜約２０重量％、約７重量％〜約２０重量％、又は約８重量％〜約１５重量％）である。ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、宿主細胞とは異種の、又は宿主細胞に内在性のポリヌクレオチドから発現されるものであってよい。また、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、単離又は精製された形態で酵素組成物又はバイオマス糖化混合物中に導入することもできる。
【００４２】
一部の態様では、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）７Ａ、７Ｂ、Ｃ．グロボサム（C. globosum）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６Ａ、Ｓ．サーモファイル（S. thermophile）６Ａ、６Ｂ、又はこれらの変異体）が、酵素組成物又はバイオマス糖化混合物中のタンパク質の全重量の約０．１重量％〜約８０重量％（例えば、約５重量％〜約７０重量％、約１０重量％〜約６０重量％、約２０重量％〜約５０重量％、又は約２５重量％〜約５０重量％）の量で存在する。酵素組成物又はバイオマス糖化混合物は、セロビオヒドロラーゼ活性を有する複数のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）７Ａ、７Ｂ、Ｃ．グロボサム（C. globosum）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６Ａ、Ｓ．サーモファイル（S. thermophile）６Ａ、６Ｂ、又はこれらの変異体）を含んでもよく、その場合、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの全量は、酵素組成物又はバイオマス糖化混合物中のタンパク質の全重量の約０．１重量％〜約８０重量％（例えば、約５重量％〜約７０重量％、約１０重量％〜約６０重量％、約２０重量％〜約５０重量％、又は約２５重量％〜約５０重量％）である。セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、一部の態様では、宿主細胞とは異種の、又は宿主細胞に内因性の核酸から発現される。一部の態様では、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、単離又は精製された形態で酵素組成物又はバイオマス糖化混合物中に導入することができる。
【００４３】
酵素組成物又はバイオマス糖化混合物は、β−グルコシダーゼ活性を有する１以上のポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、Ｔｎ３Ｂ、又はこれらの変異体）を含んでもよく、その場合、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドの全量は、酵素組成物又はバイオマス糖化混合物中のタンパク質の全重量の約０．１重量％〜約５０重量％（例えば、約１重量％〜約３０重量％、約２重量％〜約２０重量％、約５重量％〜約２０重量％、又は約８重量％〜約１５重量％）である。β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、宿主細胞とは異種の、又は宿主細胞に内因性の核酸から発現させることができる。また、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、単離又は精製された形態で酵素組成物又はバイオマス糖化混合物中に導入することもできる。
【００４４】
一部の態様では、酵素組成物又はバイオマス糖化混合物は、キシラナーゼ活性を有する１以上のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、又はこれらの変異体）を含んでもよく、その場合、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドの全量は、酵素組成物又はバイオマス糖化混合物中のタンパク質の全重量の約０．１重量％〜約５０重量％（例えば、約１重量％〜約４０重量％、約４重量％〜約３０重量％、約５重量％〜約２０重量％、又は約８重量％〜約１５重量％）である。キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、宿主細胞とは異種の、又は宿主細胞に内因性の核酸から発現させることができる。一部の態様では、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、単離又は精製された形態で酵素組成物又はバイオマス糖化混合物中に導入又は混合することができる。
【００４５】
酵素組成物又はバイオマス糖化混合物は、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する１以上のポリペプチド（例えば、Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、Ｆｖ５１Ａ、又はこれらの変異体）を含んでもよく、その場合、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの全量は、酵素組成物又はバイオマス糖化混合物中のタンパク質の全重量の約０．１重量％〜約５０重量％（例えば、約１重量％〜約４０重量％、約２重量％〜約３０重量％、約４重量％〜約２０重量％、又は約５重量％〜約１５重量％）である。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドは、宿主細胞とは異種の、又は宿主細胞に内因性の核酸から発現させることができる。一部の態様では、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドは、単離又は精製された形態で酵素組成物又はバイオマス糖化混合物中に導入又は混合することができる。
【００４６】
酵素組成物又はバイオマス糖化混合物は、β−キシロシダーゼ活性を有する１以上のポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１、又はこれらの変異体）を含んでもよく、その場合、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドの全量は、酵素組成物又はバイオマス糖化混合物中のタンパク質の全重量の約０．１重量％〜約５０重量％（例えば、約１重量％〜約４０重量％、約４重量％〜約３５重量％、約５重量％〜約２５重量％、又は約５重量％〜約２０重量％）である。β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドは、宿主細胞とは異種の、又は宿主細胞に内因性の核酸から発現させることができる。また、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドは、単離又は精製された形態で酵素組成物又はバイオマス糖化混合物中に導入することもできる。
【００４７】
一部の態様では、本明細書において提供される酵素組成物は全セルラーゼでありうる。
全セルラーゼは、宿主細胞とは異種の、又は宿主細胞に内因性の核酸から発現される、エンドグルカナーゼ活性を有する１以上のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４、Ｅｇ１、Ｅｇ２、Ｅｇ７、又はこれらの変異体）を含みうる。全セルラーゼはまた、宿主細胞とは異種の、又は宿主細胞に内因性の核酸から発現される、セロビオヒドロラーゼ活性を有する１以上のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）７Ａ、７Ｂ、Ｃ．グロボサム（C. globosum）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６Ａ、Ｓ．サーモファイル（S. thermophile）６Ａ、６Ｂ、又はこれらの変異体）も含みうる。全セルラーゼは、宿主細胞とは異種の、又は宿主細胞に内因性の核酸から発現される、β−グルコシダーゼ活性を有する１以上のポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、Ｔｎ３Ｂ、又はこれらの変異体）を更に含みうる。全セルラーゼは、宿主細胞の発酵ブロスの形態で使用することができる。ブロスは、例えば濾過、精製、限外濾過、又は殺細胞工程などの最小限の製造後処理に供することができ、したがってこのブロスを、全ブロス配合物としてバイオマスの加水分解に使用することができる。
【００４８】
一部の態様では、本明細書において提供される酵素組成物は、バイオマス材料を発酵性糖（例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、及び／又はセロビオース）に変換することが可能である。一部の態様では、酵素組成物は、本明細書に述べられるカルコフロールアッセイによって測定した場合に、少なくとも約０．１（例えば０．１〜０．４）の生成率（fraction product）を得ることが可能である。
【００４９】
一部の態様では、酵素組成物は、セルラーゼ組成物又はヘミセルラーゼ組成物であってよい。酵素組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含んでよく、更に、１以上のセルラーゼポリペプチド及び／又は１以上のヘミセルラーゼポリペプチドを含んでよく、その場合、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する１以上のポリペプチド、並びに１以上のセルラーゼポリペプチド及び／又は１以上のヘミセルラーゼポリペプチドを、混合物中にブレンドしてから、この混合物を使用してバイオマス糖化混合物中のバイオマス基質と接触させて加水分解する。
【００５０】
一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する１以上のポリペプチド、１以上のセルラーゼポリペプチド、及び１以上のヘミセルラーゼポリペプチドは、異なる時点でバイオマス材料に加えられる。例えば、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、セルラーゼポリペプチド及び／又はヘミセルラーゼポリペプチドが同じバイオマス材料に加えられる前又は後でバイオマス材料に加えられる。
【００５１】
一部の態様では本発明の組成物は、例えば混合物中にＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド及びバイオマス材料を含む。例えば、組成物は、加水分解混合物、発酵ブロス／混合物、又はバイオマス糖化混合物であってよい。混合物は、１以上の発酵性糖を含みうる。
【００５２】
本明細書では、バイオマス材料を加水分解する方法であって、得られるバイオマス糖化混合物中のバイオマス材料を加水分解するうえで充分な量の、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素組成物（例えば非天然組成物）と、バイオマス材料とを接触させることを含む方法が更に提供される。
【００５３】
本明細書では、バイオマス混合物及び／又はバイオマス糖化混合物の粘度を低下させる方法であって、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素組成物（例えば天然組成物）と、混合物とを接触させることを含み、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、組成物中に混合物の粘度を低下させるうえで充分な量で存在するような方法が更に提供される。一部の態様では、バイオマス混合物又はバイオマス糖化混合物は、バイオマス材料、場合により更に発酵性糖、全セルラーゼ、並びに／又はセルラーゼ活性を有するポリペプチド及び／若しくはヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドを含む組成物を含む。混合物の粘度は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが混合物中に含まれていない以外は同じ成分を同じ濃度で含むコントロール混合物の粘度と比較して、少なくとも約５％（例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％）低下しうる。バイオマス材料は、ヘミセルロース、セルロース、又はこれらの混合物を含みうる。バイオマス材料は、グルカン、キシラン及び／若しくはリグニン、又はこれらの混合物を含みうる。
【００５４】
一部の態様では、バイオマス材料は、酸又は塩基で適当な処理又は前処理を行うことができる。一部の態様では、塩基はアンモニアである。本発明の方法は、バイオマス混合物のｐＨを約４．０〜約６．５のｐＨ（例えば約４．５〜約５．５のｐＨ）に調整することを更に含みうる。一部の態様では、本方法は、約４．０〜約６．５のｐＨ（例えば約４．５〜約５．５のｐＨ）で行われる。一部の態様では、本方法は、約２時間〜約７日間（例えば、約４時間〜約６日間、約８時間〜約５日間、又は約８時間〜約３日間）にわたって行われる。このようなｐＨの調整は、バイオマス混合物をポリペプチド又は酵素組成物と接触させる前に適当に行うことができる。
【００５５】
一部の態様では、バイオマス材料は高い固形分濃度で糖化混合物中に存在し、例えば固体状態のバイオマス材料が、糖化混合物中の酵素とバイオマス材料を合わせた全重量の少なくとも約５重量％〜約６０重量％（例えば、約１０重量％〜約５０重量％、約１５重量％〜約４０重量％、約１５重量％〜約３０重量％、又は約２０重量％〜約３０重量％）を構成する。固体状態のバイオマス材料の重量とは、乾燥状態、乾燥固体状態、天然の状態、若しくは未処理の状態、又はバイオマスが酵素組成物中のポリペプチドと接触させられる前のバイオマス材料の重量のことを意味する。好ましくは、固体状態のバイオマス材料は、糖化混合物中の酵素とバイオマス材料を合わせた全重量の少なくとも約１５重量％、及び更により好ましくは少なくとも約２０重量％又は２５重量％を構成する。
【００５６】
一部の態様では、本方法は、発酵性糖を生産することを含む。発酵性糖の量は、本発明の方法を用いて増大したレベルで生産することができる。例えば、本明細書における方法又は組成物を使用して生産される発酵性糖の量は、同じバイオマス材料が、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含まない以外は同じポリペプチド成分を同じ濃度で含む酵素組成物によって加水分解される場合に生産される発酵性糖の量と比較して、少なくとも約５％（例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％）増加する。
【００５７】
一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素組成物の量は、発酵性糖の収率を、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含まない以外は同じ成分を同じ濃度で有する酵素組成物による同じバイオマス材料からの発酵性糖の収率と比較して、少なくとも約５％（例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％）増加させるのに充分な量である。一部の態様では、バイオマス糖化混合物中のＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの量は、混合物の粘度を、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含まない以外は同じバイオマス及び同じポリペプチドの構成を同じ濃度で含むコントロールバイオマス糖化混合物の粘度と比較して、少なくとも約５％（例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％）低下させるのに充分な量である。
【００５８】
一部の態様では、糖化又は加水分解プロセスにおいて使用されるＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む組成物の量は、バイオマス材料中のセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たりのタンパク質が約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇ（例えば、約０．２ｍｇ〜約４０ｍｇのタンパク質、約０．５ｍｇ〜約３０ｍｇのタンパク質、約１ｍｇ〜約２０ｍｇのタンパク質、又は約５ｍｇ〜約１５ｍｇのタンパク質）となる量である。本明細書に述べられるタンパク質の量とは、酵素組成物又はバイオマス糖化混合物中の全タンパク質の重量のことを指す。タンパク質には、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが含まれ、セルラーゼポリペプチド及び／又はヘミセルラーゼポリペプチドなどの他の酵素も含まれうる。一部の態様では、加水分解又は糖化プロセスにおいて使用されるＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの量は、バイオマス材料中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロース１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ（例えば、約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、又は約１ｍｇ〜約５ｍｇ）のタンパク質となる量である。
【００５９】
加水分解又は糖化プロセスにおけるＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド及びエンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ２、及び／又はこれらの変異体）を含む酵素組成物又はバイオマス糖化混合物は、バイオマス材料中のセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロース１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ（例えば、約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、又は約１ｍｇ〜約５ｍｇ）のタンパク質を含みうる。
【００６０】
加水分解又は糖化プロセスにおけるＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド及びセロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）７Ａ、７Ｂ、Ｃ．グロボサム（C. globosum）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６Ａ、Ｓ．サーモファイル（S. thermophile）６Ａ、６Ｂ、又はこれらの変異体）を含む酵素組成物又はバイオマス糖化混合物は、バイオマス材料中のセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロース１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ（例えば、約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、又は約１ｍｇ〜約５ｍｇ）のタンパク質を含みうる。
【００６１】
一部の態様では、加水分解又は糖化プロセスにおけるＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド及びβ−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、Ｔｎ３Ｂ、又はこれらの変異体）を含む酵素組成物又はバイオマス糖化混合物は、バイオマス材料中のセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロース１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ（例えば、約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、又は約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ）のタンパク質を含みうる。
【００６２】
加水分解又は糖化プロセスにおけるＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド及びキシラナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、又はこれらの変異体）を含む酵素組成物又はバイオマス糖化混合物は、バイオマス材料中のセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロース１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ（例えば、約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、又は約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ）のタンパク質を含みうる。
【００６３】
加水分解又は糖化プロセスに使用されるＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド及びβ−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１、及び／又はこれらの変異体）を含む酵素組成物又はバイオマス糖化混合物は、バイオマス材料中のセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロース１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ（例えば約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、又は約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ）のタンパク質を含みうる。
【００６４】
加水分解又は糖化プロセスに使用されるＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、Ｆｖ５１Ａ、及び／又はこれらの変異体）を含む酵素組成物又はバイオマス糖化混合物は、バイオマス材料中のセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロース１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ（例えば、約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、又は約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ）のタンパク質を含みうる。
【００６５】
一部の態様では、本発明の方法は、約３０℃〜約６５℃（例えば、約３５℃〜約６０℃、約４０℃〜約６０℃、又は約４５℃〜約５５℃）の温度で行われる。
【００６６】
本発明の方法は、バイオマス材料を、全セルラーゼを含む酵素組成物と接触させる工程を更に含みうる。一部の態様では、バイオマス材料を、全セルラーゼを含む組成物と更に接触させる工程は、バイオマス材料を、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素組成物と接触させる前、後、又は同時に行われる。
【００６７】
一部の態様では、本発明の方法は、バイオマス材料を、セルラーゼ活性を有するポリペプチド及び／又はヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素組成物と接触させる工程を更に含む。バイオマス材料を、セルラーゼ活性を有するポリペプチド及び／又はヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドを含む組成物と接触させる工程は、バイオマス材料を、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素組成物と接触させる前、後、又は同時に行うことができる。
【００６８】
一部の態様では、組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含み、更に、少なくとも１種類のセルラーゼポリペプチド及び／又は少なくとも１種類のヘミセルラーゼポリペプチドを含み、その場合、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドと、少なくとも１種類のセルラーゼポリペプチド及び／又は少なくとも１種類のヘミセルラーゼポリペプチドとは、混合物がバイオマス材料と接触させるために使用される前に混合物中にブレンドされる。
【００６９】
一部の態様では、組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含み、更に、１以上のセルラーゼポリペプチド及び／又は１以上のヘミセルラーゼポリペプチドを含み、その場合、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドと、１以上のセルラーゼポリペプチド及び／又は１以上のヘミセルラーゼポリペプチドとは、異なる時点でバイオマス材料に加えられる。例えば、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）は、１以上のセルラーゼポリペプチド及び／又は１以上のヘミセルラーゼポリペプチドが加えられる前又は後で加えられる。
【００７０】
一部の態様では、工業的状況及び／又は商業的状況において本発明を適用する方法が想到される。したがって、適当なＧＨ６１エンドグルカナーゼを含む本組成物を製造、販売、又は他の何らかの態様で商業化する方法は、本開示の範囲に含まれるものである。本方法には、例えば、商業的酵素供給モデルにおいて本組成物又はＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチド若しくはその変異体を適用することが含まれ、その場合、酵素及び変異体、並びに本開示の組成物は、セルロース糖製造業者、特定のエタノール（バイオオエタノール）精錬所、又は他のバイオケミカル若しくはバイオ材料の製造業者に供給又は販売される。本方法はまた、一部の態様において、オンサイトバイオ精錬モデルにおいて本組成物又はＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチド若しくはその変異体を適用することであってもよく、その場合、本発明のポリペプチド若しくは変異体、又は非天然セルラーゼ及びヘミセルラーゼ組成物は、酵素製造業者により、セルロース糖工場、バイオエタノール精錬所、又はバイオケミカル／バイオ材料の製造業者に位置するか若しくはその近くに位置する場所に建設される酵素製造システムにおいて製造される。一部の態様では、好ましくは本明細書に述べられるような適当な前処理を行った適当なバイオマス基質を、バイオエタノール精錬所又はバイオケミカル／バイオ材料の製造施設で若しくはその近くにおいて、本明細書に述べられる糖化方法並びに酵素及び／又は酵素組成物を用いて加水分解することができる。次いで得られた発酵性糖を、同じ施設又は近くの設備において発酵に供することができる。
【００７１】
本明細書に述べられる実施形態の任意の、複数の、又はすべての特性を組み合わせることによって本発明の他の実施形態を構成しうることは理解されるであろう。本発明のこれらの態様及び他の態様は、当業者にとっては自明のものであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
当業者であれば、図面はあくまで説明を目的としたものに過ぎず、本発明の教示の範囲をいかなる意味においても限定するものではないことは理解されるであろう。
【図１Ａ】ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドの特定のアミノ酸配列を示す。
【図１Ｂ】ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドの特定のアミノ酸配列を示す。
【図１Ｃ】ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドの特定のアミノ酸配列を示す。
【図１Ｄ】ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドの特定のアミノ酸配列を示す。
【図１Ｅ】ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドの特定のアミノ酸配列を示す。
【図２】図１に示されるもの（配列番号１〜２８）などのＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドの多数のアミノ酸配列を比較した、ＣｌｕｓｔａｌＶ（ＰＡＭ２５０）を使用した一致率（％）及び分散を示す。
【図２Ａ】図１に示されるもの（配列番号１〜２８）などのＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドの多数のアミノ酸配列を比較した、ＣｌｕｓｔａｌＶ（ＰＡＭ２５０）を使用した一致率（％）及び分散を示す。
【図２Ｂ】図１に示されるもの（配列番号１〜２８）などのＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドの多数のアミノ酸配列を比較した、ＣｌｕｓｔａｌＶ（ＰＡＭ２５０）を使用した一致率（％）及び分散を示す。
【図２Ｃ】図１に示されるもの（配列番号１〜２８）などのＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドの多数のアミノ酸配列を比較した、ＣｌｕｓｔａｌＶ（ＰＡＭ２５０）を使用した一致率（％）及び分散を示す。
【図２Ｄ】図１に示されるもの（配列番号１〜２８）などのＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドの多数のアミノ酸配列を比較した、ＣｌｕｓｔａｌＶ（ＰＡＭ２５０）を使用した一致率（％）及び分散を示す。
【図３】図１に示されるもの（配列番号１〜２８）などのＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドのアラインメントを示す。
【図３Ａ】図１に示されるもの（配列番号１〜２８）などのＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドのアラインメントを示す。
【図３Ｂ】図１に示されるもの（配列番号１〜２８）などのＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドのアラインメントを示す。
【図３Ｃ】図１に示されるもの（配列番号１〜２８）などのＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドのアラインメントを示す。
【図３Ｄ】図１に示されるもの（配列番号１〜２８）などのＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドのアラインメントを示す。
【図３Ｅ】図１に示されるもの（配列番号１〜２８）などのＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドのアラインメントを示す。
【図３Ｆ】図１に示されるもの（配列番号１〜２８）などのＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドのアラインメントを示す。
【図３Ｇ】図１に示されるもの（配列番号１〜２８）などのＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドのアラインメントを示す。
【図３Ｈ】図１に示されるもの（配列番号１〜２８）などのＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドのアラインメントを示す。
【図３Ｉ】図１に示されるもの（配列番号１〜２８）などのＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドのアラインメントを示す。
【図３Ｊ】図１に示されるもの（配列番号１〜２８）などのＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドのアラインメントを示す。
【図３Ｋ】図１に示されるもの（配列番号１〜２８）などのＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドのアラインメントを示す。
【図３Ｌ】図１に示されるもの（配列番号１〜２８）などのＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する異なるポリペプチドのアラインメントを示す。
【図４Ａ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４（配列番号３０）のヌクレオチド配列を示す。
【図４Ｂ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４（配列番号２７）のアミノ酸配列を示す。予想されるシグナル配列は下線で示し、予想される保存領域は太字で示し、予想されるリンカーは斜体で示している。
【図５】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４（ＴｒＥＧ４）（配列番号２７）と、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ７（ＴｒＥＧ７又はＴｒＥＧｂ）（配列番号２６）及びＴｔＥＧ（配列番号２９）とのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図６Ａ】配列アラインメント並びにＴｒＥＧ７（蛋白質構造データバンクアクセッションｐｄｂ：２ｖｔｃの結晶構造）及びＴｔＥＧ（蛋白質構造データバンクアクセッションｐｄｂ：３ＥＩＩの結晶構造）の既知の構造より推測したＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４（ＴｒＥｇ４）の保存された残基を示す。
【図６Ｂ】Ｔｒ６Ａ及びＴｒ７Ａの既知の配列との配列アラインメントから推測した保存されたＣＢＭ領域の残基を示す。
【図７】ＧＨ６１エンドグルカナーゼの多数のアミノ酸配列モチーフを示す。配列モチーフ中の「ａ」はそれぞれ、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンのいずれか１つでありうるアミノ酸を表す。
【図８Ａ】ｐＥＮＴＲ−ＴＯＰＯ−Ｂｇｌ１−９４３／９４２プラスミドを示す。
【図８Ｂ】ｐＴｒｅｘ３ｇ  ９４３／９４２発現ベクターを示す。
【図８Ｃ】ｐＥＮＴＲ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）  Ｘｙｎ３プラスミドを示す。
【図８Ｄ】ｐＴｒｅｘ３ｇ／Ｔ．リーゼイ（T. reesei）  Ｘｙｎ３発現ベクターを示す。
【図８Ｅ】ｐＥＮＴＲ−Ｆｖ３Ａプラスミドを示す。
【図８Ｆ】ｐＴｒｅｘ６ｇプラスミドを示す。
【図８Ｇ】ｐＴｒｅｘ６ｇ／Ｆｖ３Ａ発現ベクターを示す。
【図８Ｈ】ＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ４３Ｄプラスミドを示す。
【図８Ｉ】ＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ５１Ａプラスミドを示す。
【図９】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａの酵素組成を示す。
【図１０】実施例２の各試料に個別に加えた（精製又は未精製）酵素、及びこれらの酵素のストックタンパク質濃度を示す。
【図１１Ａ】実施例２に基づくＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａに図１０の異なる精製及び未精製酵素を含む酵素組成物を加えることによる、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化後のグルコース放出量を示す。
【図１１Ｂ】実施例２に基づくＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａに図１０の異なる精製及び未精製酵素を含む酵素組成物を加えることによる、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化後のセロビオース放出量を示す。
【図１１Ｃ】実施例２に基づくＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａに図１０の異なる精製及び未精製酵素を含む酵素組成物を加えることによる、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化後のキシロビオース放出量を示す。
【図１１Ｄ】実施例２に基づくＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａに図１０の異なる精製及び未精製酵素を含む酵素組成物を加えることによる、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化後のキシロース放出量を示す。
【図１２Ａ】実施例３に述べられる発現カセットＰｅｇｌ１−ｅｇ４−ｓｕｃＡを示す。
【図１２Ｂ】実施例３に述べられる発現カセットｐＥＧ１−ＥＧ４−ｓｕｃＡを含むｐＣＲ  ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯのプラスミドマップを示す。
【図１３】実施例３に基づくＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を発現するＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａの形質転換体により産生される酵素を含む酵素組成物によるグルカン及びキシランの、セロビオース、グルコース、キシロビオース及びキシロースへの変換量又は変換率を示す。
【図１４】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を発現するＨ３Ａの形質転換体により産生される酵素組成物の量を増やした場合に観察されるグルカン変換率の増加を示す。実験の詳細については実施例３に述べられている。
【図１５】実施例４のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の用量のチャートを示す（実験１）。試料「＃２７」は、実施例４に述べられるＨ３Ａ／Ｅｇ４組み込み株である。加えられた精製Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の量は、重量％又は質量（ｍｇ（タンパク質）／ｇ（Ｇ＋Ｘ））のいずれかで「試料の説明」の下に示した。
【図１６Ａ】実施例４に基づく希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化におけるグルコースの放出量に対するＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の効果を示す。
【図１６Ｂ】希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化におけるキシロースの放出量に対するＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の効果を示す。これらの図のＹ軸は、反応混合物中に放出されたグルコース又はキシロースの濃度を示す。Ｘ軸には、酵素組成物試料の名前／簡単な説明が示されている。これは、実施例４（実験１）に基づいたもの。
【図１７Ａ】実施例４の別のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の用量のチャートを示す（実験２）。各試料は図１５の試料と同様に説明している。加えた精製Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の量は、実施例４の実験１（上記）よりも小さな増分で変化させている。
【図１７Ｂ】実施例４の別のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の用量のチャートを示す（実験３）。各試料は図１６及び１７Ａの試料と同様に説明している。加えた精製Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の量は、実施例４の実験１及び２（上記）よりも更に細かな増分で変化させている。
【図１８Ａ】実施例４に述べられる希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化からのグルコース放出量に対する異なる量（０．０５ｍｇ／ｇ〜１．０ｍｇ／ｇ）のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の効果を示す。
【図１８Ｂ】実施例４に述べた希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化からのグルコース放出量に対する異なる量（０．１ｍｇ／ｇ〜０．５ｍｇ／ｇ）のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の効果を示す。
【図１９】実施例５に述べられる希アンモニアで前処理したトウモロコシ茎葉の異なる固形分ロード量の糖化からのグルコース／キシロースの放出量に対する、酵素組成物中のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の効果を示す。固形分ロード量は、Ｘ軸上に（数値）％として示されている。
【図２０】実施例６に基づくＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を含む酵素組成物を使用した場合に、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸から放出されるキシロースモノマーの収率（％）を示す。
【図２１】実施例６に基づくＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を含む酵素組成物を使用した場合に、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸から放出されるグルコースモノマーの収率（％）を示す。
【図２２】実施例６に基づくＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を含む酵素組成物を使用した場合に、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸から放出される全発酵性モノマーの収率（ｍｇ／ｍＬ）を示す。
【図２３】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を含まない酵素組成物に対して０．５３ｍｇ／ｇのＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を含む酵素組成物による加水分解の結果、放出されたグルコースの量を比較したものである。実験については実施例７に述べられている。
【図２４】実施例７に基づき、精製Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４単独を使用してアンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を処理した結果のグルコースモノマーの放出量を示す。
【図２５】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ及び組み込み株Ｈ３Ａ／Ｅｇ４（株＃２７）により産生された酵素組成物の、酵素用量１４ｍｇ／ｇでの糖化効率を示し、比較したものである。これは実施例８の説明に基づくもの。
【図２６】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ及び組み込み株Ｈ３Ａ／Ｅｇ４（株＃２７）により産生された酵素組成物の、異なる酵素用量での、酸で前処理したトウモロコシ茎葉に対する糖化効率を示す。これは実施例９の説明に基づくもの。
【図２７】実施例１０に基づく、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ及び組み込み株Ｈ３Ａ／Ｅｇ４（株＃２７）により産生された酵素組成物の、希アンモニアで前処理したトウモロコシ葉、茎、又は穂軸に対する糖化効率を示す。
【図２８】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ及び組み込み株Ｈ３Ａ／Ｅｇ４（株＃２７）により産生された酵素組成物の糖化効率を、放出されたグルコース又はキシロースの量に関して比較したものである。これは実施例１１に基づくもの。
【図２９】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ／Ｅｇ４（株＃２７）により産生された酵素組成物の量を増やした場合のグルカン及びキシラン変換率（％）の変化を示す。これは実施例１２の説明に基づくもの。
【図３０】希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化に対するＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の添加の効果を示した表である。実験条件については実施例１３に述べられている。
【図３１】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４によるＣＭＣの加水分解を示す。実験条件については実施例１３に述べられている。
【図３２】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４によるセロビオースの加水分解を示す。実験条件については実施例１３に述べられている。
【図３３Ａ】糖化用の異なる酵素組成物の量を示す。実験条件については実施例１４に述べられている。
【図３３Ｂ】糖化用の異なる酵素組成物の量を示す。実験条件については実施例１４に述べられている。
【図３３Ｃ】糖化用の異なる酵素組成物の量を示す。実験条件については実施例１４に述べられている。
【図３４Ａ】図３３の対応する各酵素組成物によって生産されるグルコース、グルコース＋セロビオース、又はキシロースの量を示す。実験条件については実施例１４に述べられている。
【図３４Ｂ】図３３の対応する各酵素組成物によって生産されるグルコース、グルコース＋セロビオース、又はキシロースの量を示す。実験条件については実施例１４に述べられている。
【図３４Ｃ】図３３の対応する各酵素組成物によって生産されるグルコース、グルコース＋セロビオース、又はキシロースの量を示す。実験条件については実施例１４に述べられている。
【図３５】実施例１５に述べられるＣＢＨ１、ＣＢＨ２、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ２の異なる比を示す。
【図３６Ａ】異なる酵素組成物を使用したグルカン変換率（％）を示す。実験条件については実施例１５に述べられている。
【図３６Ｂ】異なる酵素組成物を使用したグルカン変換率（％）を示す。実験条件については実施例１５に述べられている。
【図３７】実施例２２に基づき、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を含む組成物を使用してＣＢＨ  Ｉの存在下又は非存在下でアビセルを処理した場合のアスコルビン酸の効果を示す。
【図３８】実施例２２に基づき、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を含む組成物を使用してＣＢＨ  ＩＩの存在下／非存在下でアビセルを処理した場合のアスコルビン酸の効果を示す。
【図３９Ａ】結果を図３７に示す、実施例２２の実験で使用した基質及び異なる酵素の量を示す。
【図３９Ｂ】結果を図３８に示す、実施例２２の実験で使用した基質及び異なる酵素の量を示す。
【図４０】実施例１６に述べられる実験に基づく、異なる酵素組成物を使用したトウモロコシ穂軸の加水分解によるグルコース生産量を示す。
【図４１】実施例１６の説明に基づく、異なる酵素組成物を使用したトウモロコシ穂軸の加水分解によるキシロース生産量を示す。
【図４２】実施例１７の説明に基づく、Ｈ３Ａ及び精製Ｅｇ４とともに加えたＨ３Ａを用いた糖化混合物の経時的な粘度を示す。
【図４３】実施例１８の説明に基づく、Ｈ３Ａ及びＨ３Ａ／Ｅｇ４＃２７を用いた糖化混合物の経時的な粘度を示す。
【図４４】実施例１９の説明に基づく、１４ｍｇ／ｇ（セルロース）のＨ３Ａ又はＨ３Ａ／Ｅｇ４＃２７の発酵ブロスを使用した場合の固形分２５％及び３０％の希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化の粘度を示す。
【図４５】実施例２０に基づく、異なる酵素組成物を使用した６時間の糖化（乾燥物質２５％、５０℃、ｐＨ５．０）におけるグルコース濃度を示す。
【図４６】実施例２０に基づく、異なる酵素組成物を使用した２４時間の糖化（乾燥物質２５％、５０℃、ｐＨ５．０）におけるグルコース濃度を示す。
【図４７】実施例２０に基づく、異なる酵素組成物を使用した経時的な糖化（乾燥物質２５％、５０℃、ｐＨ５．０）におけるグルコース濃度を示す。
【図４８】実施例２０に基づく、異なる酵素組成物を使用した経時的な糖化（乾燥物質２５％、５０℃、ｐＨ５．０）におけるグルカン変換率を示す。
【図４９Ａ】本開示における配列同一性の一覧を示す。
【図４９Ｂ】本開示における配列同一性の一覧を示す。
【図４９Ｃ】本開示における配列同一性の一覧を示す。
【図４９Ｄ】本開示における配列同一性の一覧を示す。
【図４９Ｅ】本開示における配列同一性の一覧を示す。
【図５０Ａ】Ｆｖ３Ａをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号３５）。
【図５０Ｂ】Ｆｖ３Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号３６）。予想されるシグナル配列は下線で示し、予想される保存領域は太字で示している。
【図５１Ａ】Ｐｆ４３Ａをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号３７）。
【図５１Ｂ】Ｐｆ４３Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号３８）。予想されるシグナル配列は下線で示し、予想される保存領域は太字で示し、予想される炭水化物結合モジュール（「ＣＢＭ」）は大文字で示し、ＣＤとＣＢＭとを分離する予想されるリンカーは斜体で示している。
【図５２Ａ】Ｆｖ４３Ｅをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号３９）。
【図５２Ｂ】Ｆｖ４３Ｅのアミノ酸配列を示す（配列番号４０）。予想されるシグナル配列は下線で示し、予想される保存領域は太字で示している。
【図５３Ａ】Ｆｖ３９Ａをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号４１）。
【図５３Ｂ】Ｆｖ３９Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号４２）。予想されるシグナル配列は下線で示し、予想される保存領域は太字で示している。
【図５４Ａ】Ｆｖ４３Ａをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号４３）。
【図５４Ｂ】Ｆｖ４３Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号４４）。予想されるシグナル配列は下線で示し、予想される保存領域は太字で示し、予想されるＣＢＭは大文字で示し、保存領域とＣＢＭとを分離する予想されるリンカーは斜体で示している。
【図５５Ａ】Ｆｖ４３Ｂをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号４５）。
【図５５Ｂ】Ｆｖ４３Ｂのアミノ酸配列を示す（配列番号４６）。予想されるシグナル配列は下線で示している。予想される保存領域は太字で示している。
【図５６Ａ】Ｐａ５１Ａをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号４７）。
【図５６Ｂ】Ｐａ５１Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号４８）。予想されるシグナル配列は下線で示している。予想されるＬ−α−アラビノフラノシダーゼの保存領域は太字で示している。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）で発現させるため、ゲノムＤＮＡをコドン最適化した（図７３Ｃを参照）。
【図５７Ａ】Ｇｚ４３Ａをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号４９）。
【図５７Ｂ】Ｇｚ４３Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号５０）。予想されるシグナル配列は下線で示し、予想される保存領域は太字で示している。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）で発現させるため、予想されるシグナル配列をＴ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１シグナル配列（ｍｙｒｋｌａｖｉｓａｆｌａｔａｒａ（配列番号１２０））に置換した。
【図５８Ａ】Ｆｏ４３Ａをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号５１）。
【図５８Ｂ】Ｆｏ４３Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号５２）。予想されるシグナル配列は下線で示し、予想される保存領域は太字で示している。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）で発現させるため、予想されるシグナル配列をＴ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１シグナル配列（ｍｙｒｋｌａｖｉｓａｆｌａｔａｒａ（配列番号１２０））に置換した。
【図５９Ａ】Ａｆ４３Ａをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号５３）。
【図５９Ｂ】Ａｆ４３Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号５４）。予想される保存領域は太字で示している。
【図６０Ａ】Ｐｆ５１Ａをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号５５）。
【図６０Ｂ】Ｐｆ５１Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号５６）。予想されるシグナル配列は下線で示し、予想されるＬ−α−アラビノフラノシダーゼの保存領域は太字で示している。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）で発現させるため、予想されるシグナル配列をコドン最適化によりＴ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１シグナル配列（ｍｙｒｋｌａｖｉｓａｆｌａｔａｒａ（配列番号１２０））に置換し（下線）、Ｐｆ５１Ａのヌクレオチド配列は発現のためにコドン最適化した。
【図６１Ａ】ＡｆｕＸｙｎ２をコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号５７）。
【図６１Ｂ】ＡｆｕＸｙｎ２のアミノ酸配列を示す（配列番号５８）。予想されるシグナル配列は下線で示し、予想されるＧＨ１１の保存領域は太字で示している。
【図６２Ａ】ＡｆｕＸｙｎ５をコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号５９）。
【図６２Ｂ】ＡｆｕＸｙｎ５のアミノ酸配列を示す（配列番号６０）。予想されるシグナル配列は下線で示し、予想されるＧＨ１１の保存領域は太字で示している。
【図６３Ａ】Ｆｖ４３Ｄをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号６１）。
【図６３Ｂ】Ｆｖ４３Ｄのアミノ酸配列を示す（配列番号６２）。予想されるシグナル配列は下線で示している。予想される保存領域は太字で示している。
【図６４Ａ】Ｐｆ４３Ｂをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号６３）。
【図６４Ｂ】Ｐｆ４３Ｂのアミノ酸配列を示す（配列番号６４）。予想されるシグナル配列は下線で示し、予想される保存領域は太字で示している。
【図６５Ａ】Ｆｖ５１Ａをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号６５）。
【図６５Ｂ】Ｆｖ５１Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号６６）。予想されるシグナル配列は下線で示し、予想されるＬ−α−アラビノフラノシダーゼの保存領域は太字で示している。
【図６６Ａ】Ｃｇ５１Ｂをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号６７）。
【図６６Ｂ】Ｃｇ５１Ｂのアミノ酸配列を示す（配列番号６８）。対応する予想されるシグナル配列は下線で示し、予想される保存領域は太字で示している。
【図６７Ａ】Ｆｖ４３Ｃをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号６９）。
【図６７Ｂ】Ｆｖ４３Ｃのアミノ酸配列を示す（配列番号７０）。予想されるシグナル配列は下線で示し、予想される保存領域は太字で示している。
【図６８Ａ】Ｆｖ３０Ａをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号７１）。
【図６８Ｂ】Ｆｖ３０Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号７２）。予想されるシグナル配列は下線で示している。
【図６９Ａ】Ｆｖ４３Ｆをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号７３）。
【図６９Ｂ】Ｆｖ４３Ｆのアミノ酸配列を示す（配列番号７４）。予想されるシグナル配列は下線で示している。
【図７０Ａ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３をコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号７５）。
【図７０Ｂ】Ｘｙｎ３のアミノ酸配列を示す（配列番号７６）。予想されるシグナル配列は下線で示し、予想される保存領域は太字で示している。
【図７１Ａ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２のアミノ酸配列を示す（配列番号７７）。シグナル配列は下線で示している。予想される保存領域は太字で示している。このコーディング配列は、Ｔｏｒｒｏｎｅｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：１４６１〜６５に見ることができる。
【図７１Ｂ】Ｘｙｎ２をコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号１６０）。
【図７２Ａ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１のアミノ酸配列を示す（配列番号７８）。シグナル配列は下線で示している。予想される保存領域は太字で示している。このコーディング配列は、Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ−Ｃｌａｒｋら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９６，６２（１０）：３８４０〜４６に見ることができる。
【図７２Ｂ】Ｂｘｌ１をコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号１５９）。
【図７３Ａ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１のアミノ酸配列を示す（配列番号７９）。シグナル配列は下線で示している。予想される保存領域は太字で示している。このコード配列は、Ｂａｒｎｅｔｔら、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９１，９（６）：５６２〜５６７に見ることができる。
【図７３Ｂ】Ｐａ５１Ａの推定されるｃＤＮＡを示す（配列番号８０）。
【図７３Ｃ】Ｐａ５１Ａのコドン最適化されたｃＤＮＡを示す（配列番号８１）。
【図７３Ｄ】成熟Ｇｚ４３ＡをコードしたゲノムＤＮＡの上流にＣＢＨ１シグナル配列（下線で示される）を含むコンストラクトのコーディング配列を示す（配列番号８２）。
【図７３Ｅ】成熟Ｆｏ４３ＡをコードしたゲノムＤＮＡの上流にＣＢＨ１シグナル配列（下線で示される）を含むコンストラクトのコーディング配列を示す（配列番号８３）。
【図７３Ｆ】成熟Ｐｆ５１Ａをコードしたコドン最適化されたＤＮＡの上流にＣＢＨ１シグナル配列（下線で示される）を含むコンストラクトのコドン最適化されたコーディング配列を示す（配列番号９２）。
【図７４Ａ】Ｐａ３Ｄをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号９３）。
【図７４Ｂ】Ｐａ３Ｄのアミノ酸配列を示す（配列番号９４）。予測されるシグナル配列は下線で示し、予測される保存領域は太字で示している。
【図７５Ａ】Ｆｖ３Ｇをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号９５）。
【図７５Ｂ】Ｆｖ３Ｇのアミノ酸配列を示す（配列番号９６）。予測されるシグナル配列は下線で示し、予測される保存領域は太字で示している。
【図７６Ａ】Ｆｖ３Ｄをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号９７）。
【図７６Ｂ】Ｆｖ３Ｄのアミノ酸配列を示す（配列番号９８）。予測されるシグナル配列は下線で示し、予測される保存領域は太字で示している。
【図７７Ａ】Ｆｖ３Ｃをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号９９）。
【図７７Ｂ】Ｆｖ３Ｃのアミノ酸配列を示す（配列番号１００）。予測されるシグナル配列は下線で示し、予測される保存領域は太字で示している。
【図７８Ａ】Ｔｒ３Ａをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号１０１）。
【図７８Ｂ】Ｔｒ３Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号１０２）。予測されるシグナル配列は下線で示し、予測される保存領域は太字で示している。
【図７９Ａ】Ｔｒ３Ｂをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号１０３）。
【図７９Ｂ】Ｔｒ３Ｂのアミノ酸配列を示す（配列番号１０４）。予測されるシグナル配列は下線で示し、予測される保存領域は太字で示している。
【図８０Ａ】Ｔｅ３Ａをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号１０５）。
【図８０Ｂ】Ｔｅ３Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号１０６）予測されるシグナル配列は下線で示し、予測される保存領域は太字で示している。
【図８１Ａ】Ａｎ３Ａをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号１０７）。
【図８１Ｂ】Ａｎ３Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号１０８）。予測されるシグナル配列は下線で示し、予測される保存領域は太字で示している。
【図８２Ａ】Ｆｏ３Ａをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号１０９）。
【図８２Ｂ】Ｆｏ３Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号１１０）。予測されるシグナル配列は下線で示し、予測される保存領域は太字で示している。
【図８３Ａ】Ｇｚ３Ａをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号１１１）。
【図８３Ｂ】Ｇｚ３Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号１１２）。予測されるシグナル配列は下線で示し、予測される保存領域は太字で示している。
【図８４Ａ】Ｎｈ３Ａをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号１１３）。
【図８４Ｂ】Ｎｈ３Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号１１４）。予測されるシグナル配列は下線で示し、予測される保存領域は太字で示している。
【図８５Ａ】Ｖｄ３Ａをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号１１５）。
【図８５Ｂ】Ｖｄ３Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号１１６）。予測されるシグナル配列は下線で示し、予測される保存領域は太字で示している。
【図８６Ａ】Ｐａ３Ｇをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号１１７）。
【図８６Ｂ】Ｐａ３Ｇのアミノ酸配列を示す（配列番号１１８）。予測されるシグナル配列は下線で示し、予測される保存領域は太字で示している。
【図８７】Ｔｎ３Ｂをコードしたアミノ酸配列を示す（配列番号１１９）。標準的なシグナル予想プログラムであるＳｉｇｎａｌ  Ｐ（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）によって予想されるシグナルは存在しなかった。
【図８８】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４（配列番号２７）のＣＢＭドメインと、Ｔｒ６Ａ（配列番号３１）及びＴｒ７Ａ（配列番号３２）のＣＢＭドメインとの部分的なアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図８９Ａ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）に由来するＥｇ６（配列番号３３）のアミノ酸配列を示す。太字で示したアミノ酸配列は、予想されるシグナルペプチド配列。
【図８９Ｂ】Ｓ．コッコスポラム（S. coccosporum）エンドグルカナーゼのアミノ酸配列を示す（配列番号３４）。
【図８９Ｃ】サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）に由来するＧＨ６１Ａをコードしたヌクレオチド配列を示す（配列番号１４９）。
【図９０Ａ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）のＣＢＨ１のホモログであるＡｆｕ７Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号１５０）。
【図９０Ｂ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）のＣＢＨ１のホモログであるＡｆｕ７Ｂのアミノ酸配列を示す（配列番号１５１）。
【図９０Ｃ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）のＣＢＨ１のホモログであるＣｇ７Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号１５２）。
【図９０Ｄ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）のＣＢＨ１のホモログであるＣｇ７Ｂのアミノ酸配列を示す（配列番号１５３）。
【図９０Ｅ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）のＣＢＨ１のホモログであるＴｔ７Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号１５４）。
【図９０Ｆ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）のＣＢＨ１のホモログであるＴｔ７Ｂのアミノ酸配列を示す（配列番号１５５）。
【図９０Ｇ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）のＣＢＨ２のホモログであるＳｔ６Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号１５６）。
【図９０Ｈ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）のＣＢＨ２のホモログであるＳｔ６Ｂのアミノ酸配列を示す（配列番号１５７）。
【図９０Ｉ】Ｔ．リーゼイ（T. reesei）のＣＢＨ２のホモログであるＴｔ６Ａのアミノ酸配列を示す（配列番号１５８）。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
特に断らないかぎり、本明細書で使用するすべての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解される意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２Ｄ  ＥＤ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、並びにＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）は、当業者にとって、本発明において使用される用語の多くの一般的な辞書となるものである。本明細書において述べられるものと同様又は同等のあらゆる方法及び材料を本発明を実施するにあたって使用することができるが、好ましい方法及び材料については本明細書に述べる。数値の範囲は、範囲を定義する数値を包含する。本発明は、述べられる特定の方法論、プロトコール、及び試薬に限定されるものではなく、これらは変更しうるものである点は理解されるべきである。
【００７４】
本明細書に示される見出しは、明細書全体を参照することにより実現可能となる本発明の異なる態様又は実施形態を限定するものではない。したがって、以下に定義される用語は、明細書全体を参照することによってより完全に定義されるものである。
【００７５】
本開示は、グリコシルヒドロラーゼファミリー６１（「ＧＨ６１」）／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む組成物、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、本明細書において提供されるポリペプチドをコードしたヌクレオチド、本明細書において提供されるヌクレオチドを含むベクター、並びに本明細書において提供されるヌクレオチド及び／又はベクターを含む細胞を提供する。本開示は、バイオマス材料を加水分解する方法、及び本明細書において提供される組成物を使用してバイオマス含有混合物の粘度を低下させる方法を更に提供する。
【００７６】
ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸に関して本明細書で使用するところの「単離された」なる用語は、天然の核酸供給源中に存在する他のＤＮＡ又はＲＮＡからそれぞれ分離された分子のことを指す。更に、「単離された核酸」とは、フラグメントとして自然界に存在せず、自然の状態において見られない核酸フラグメントが含まれることを意味する。「単離された」なる用語は、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドのことを指しても用いられ、精製及び組換えポリペプチドの両方が含まれることを意味する。本明細書で使用するところの「単離された」なる用語は、組換えＤＮＡ法によって作製される場合には、細胞性物質、ウイルス性物質、又は培地を実質上含まない可能性のある核酸又はポリペプチドのことも指す。本明細書で使用するところの「単離された」なる用語は、化学的に合成される場合には、化学的前駆体又は他の化学物質を実質上含まない可能性のある核酸又はポリペプチドのことを更に指す。
【００７７】
本明細書で使用するところの、ポリペプチドＸの「変異体」とは、１以上のアミノ酸残基が変化したポリペプチドＸのアミノ酸配列を有するポリペプチドのことを指す。変異体は、保存的又は非保存的変化を有しうる。生物活性に影響することなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入、又は欠失させることが可能であるかを決定するうえでの指標は、例えばＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ディーエヌエースター社（DNASTAR））などの当該技術分野では周知のコンピュータプログラムを使用して見つけることができる。本開示の変異体には、前駆体酵素のアミノ酸配列と比較してアミノ酸配列が変化したポリペプチドが含まれ、その場合、変異体酵素は前駆体酵素の固有のセルロース分解性を維持してはいるが、例えば、前駆体酵素と比較して上昇又は低下したｐＨ最適値、上昇又は低下した酸化安定性、上昇又は低下した熱安定性、及び、１以上の基質に対する上昇又は低下した特異的活性のレベルなど、何らかの特定の側面における性質の変化を有しうる。
【００７８】
本明細書で使用するところの、宿主細胞に対して「異種」であるポリペプチド又は核酸とは、宿主細胞中に自然に存在しないポリペプチド又は核酸のことを指す。
【００７９】
本明細書において「約」（値又はパラメータ）と言う場合には、その値又はパラメータ自体に対する変化が含まれる（かつ記載される）。例えば、「約Ｘ」という記載には、「Ｘ」の記載が含まれる。
【００８０】
本明細書及び付属の「特許請求の範囲」において使用するところの単数形「ａ」、「ｏｒ」及び「ｔｈｅ」には、内容によってそうでないことが明示されないかぎり、複数の指示対象が含まれる。
【００８１】
本明細書において述べられる方法及び組成物の各態様及び変形例には、「〜からなる」及び／又は「から基本的になる」という態様及び変形例が含まれる点は理解される。
【００８２】
ポリペプチド
本開示は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、単離、合成又は組換えポリペプチド）を提供する。例えば、本開示は、異なる種に由来するＧＨ６１エンドグルカナーゼ、又はその変異体、異なる種に由来するエンドグルカナーゼＩＶ（又はエンドグルカナーゼ４）ポリペプチド（本明細書では、「Ｅｇ４」又は「ＥＧ４」とも記載され、これらは本明細書では互換可能に用いられる）、又はその変異体、及び、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）のＥｇ４、又はその変異体を提供する。
一部の態様では、ポリペプチドは単離される。
【００８３】
グリコシドヒドロラーゼファミリー６１（「ＧＨ６１」）酵素
グリコシドヒドロラーゼファミリー６１（「ＧＨ６１」）酵素は、真核生物において特定されている。ハイポクレア・ジェコリーナ（Hypocrea jecorina）に由来するＣｅｌ６１Ａにおいて弱いエンドグルカナーゼ活性が観察されており（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００１，２６８（２４）：６４９８〜６５０７）、そのためＣｅｌ６１ＡはＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するとされる。ＧＨ６１ポリペプチドは、セルラーゼによるリグノセルロース基質の酵素的加水分解を増強する（Ｈａｒｒｉｓら、２０１０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９（１５）３３０５〜１６）。キチン分解に関与する同種のポリペプチドに関する研究によって、ＧＨ６１ポリペプチドは、電子供与体基質を必要とし、２価の金属イオンが関与する酸化的加水分解の機構を利用している可能性が予想されている（Ｖａａｊｅ−Ｋｏｌｓｔａｄ，２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３０（６００１），２１９〜２２）。これは、リグノセルロース基質の分解に対するＧＨ６１ポリペプチドの相乗効果が２価のイオンに依存するという観察と一致している（Ｈａｒｒｉｓら、２０１０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９（１５）３３０５〜１６）。多くの存在するＧＨ６１ポリペプチドの構造が、多数の保存されたアミノ酸残基が結合した２価の原子を有している（Ｋａｒｋｅｈａｂａｄｉ，２００８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３８３（１）１４４〜５４；Ｈａｒｒｉｓら、２０１０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４９（１５）３３０５〜１６）。ＧＨ６１ポリペプチドは、保存された残基によって形成された平らな表面を金属結合部位に有しており、これが基質の結合に関与している可能性があることが報告されている（Ｋａｒｋｅｈａｂａｄｉ，２００８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３８３（１），１４４〜５４）。
【００８４】
本開示は、異なる種に由来するＧＨ６１エンドグルカナーゼ若しくはエンドグルカナーゼＩＶ（「ＥＧ  ＩＶ」）でありうるか、又はＧＨ６１エンドグルカナーゼに相当する（ＧＨ６１エンドグルカナーゼとホモロジーを共有するか、機能ドメインを共有するか、ＧＨ６１モチーフを共有するか、かつ／又は保存された残基を共有する）異なる種に由来するポリペプチド（例えばトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）のＥｇ４ポリペプチド）であってもよい、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば単離ポリペプチド）を提供する。このような種としては、トリコデルマ（Trichoderma）、フミコラ（Humicola）、フザリウム（Fusarium）、アスペルギルス（Aspergillus）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）、セファロスポリウム（Cephalosporium）、アクリャ（Achlya）、ポドスポラ（Podospora）、エンドチア（Endothia）、ムコール（Mucor）、コクリオボルス（Cochliobolus）、ピリキュラリア（Pyricularia）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フェチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クルックウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レティクラタム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サムブシナム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコクロム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイド（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・サルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイド（Fusarium trichothecioides）、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、ブジェルカンデラ・アダスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレギエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブローサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオプシス・サブバーミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）、コリオラス・ヒルストゥス（Coriolus hirsutus）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ���クラッサ（Neurospora crassa）、ニューロスポラ・インターメディア（Neurospora intermedia）、ペニシリウム・パープロゲナム（Penicillium purpurogenum）、ペニシリウム・カネスセンス（Penicillium canescens）、ペニシリウム・ソリタム（Penicillium solitum）、ペニシリウム・フニクロサム（Penicillium funiculosum）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラジエート（Phlebia radiate）、プレウロタス・エリンギ（Pleurotus eryngii）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ビローサ（Trametesvillosa）、トラメテス・ベルシコロル（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、ゲオスミチア・エメルソニイ（Geosmithia emersonii）、又はＧ．ステアロサーモフィルス（G. stearothermophilus）が挙げられる。
【００８５】
ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドには、図１に示される多数のＧＨ６１エンドグルカナーゼが含まれる。例えば、適当なＧＨ６１エンドグルカナーゼには、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ９７２８３．２、ＣＡＤ７０３４７．１、ＣＡＤ２１２９６．１、ＣＡＥ８１９６６．１、ＣＡＦ０５８５７．１、ＥＡＡ２６８７３．１、ＥＡＡ２９１３２．１、ＥＡＡ３０２６３．１、ＥＡＡ３３１７８．１、ＥＡＡ３３４０８．１、ＥＡＡ３４４６６．１、ＥＡＡ３６３６２．１、ＥＡＡ２９０１８．１、及びＥＡＡ２９３４７．１によって表されるもの、又は、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）２４６３０に由来するＳｔ６１、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）２３８３９ｃに由来するＳｔ６１Ａ、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）４６５８３に由来するＳｔ６１Ｂ、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）８０３１２に由来するＳｔ６１Ｄ、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆｕ３ｇ０３８７０に由来するＡｆｕ６１ａ（ＮＣＢＩ参照番号：ＸＰ＿７４８７０７）、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆｕ６ｇ０９５４０に由来するＮＣＢＩ参照番号：ＸＰ＿７５０８４３．１を有するエンドグルカナーゼ、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）ＥＤＰ４７１６７に由来するエンドグルカナーゼ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）１６３８０に由来するエンドグルカナーゼ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）１５５４１８に由来するエンドグルカナーゼ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６８９００に由来するエンドグルカナーゼ、Ｃ．グロボサム（C. globosum）に由来するＣｇ６１Ａ（アクセッション番号ＥＡＱ８６３４０．１）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ７、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４、及び、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆ２９３に由来するＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿７５２０４０のエンドグルカナーゼを含む、図１に示される異なる配列と少なくとも約６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するものが挙げられる。一部の態様では、本発明の適当なＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドは、配列番号１〜２９及び１４８のいずれか１つと少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。一部の態様では、本発明の適当なＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドは、（１）配列番号８４及び８８、（２）配列番号８５及び８８、（３）配列番号８６、（４）配列番号８７、（５）配列番号８４、８８及び８９、（６）配列番号８５、８８及び８９、（７）配列番号８４、８８及び９０、（８）配列番号８５、８８及び９０、（９）配列番号８４、８８及び９１、（１０）配列番号８５、８８及び９１、（１１）配列番号８４、８８、８９及び９１、（１２）配列番号８４、８８、９０及び９１、（１３）配列番号８５、８８、８９及び９１、並びに（１４）配列番号８５、８８、９０及び９１から選択される１以上のアミノ酸配列モチーフを有する。ポリペプチドは、少なくとも残基１００個（例えば１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、２００、２���０、２５０個、又はそれ以上）分の長さでありうる。
【００８６】
本明細書において提供されるＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば単離ポリペプチド）は、例えば本開示の図１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのいずれかのようなＧＨ６１エンドグルカナーゼの変異体であってもよい。例えば、適当なＧＨ６１エンドグルカナーゼとしては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ９７２８３．２、ＣＡＤ７０３４７．１、ＣＡＤ２１２９６．１、ＣＡＥ８１９６６．１、ＣＡＦ０５８５７．１、ＥＡＡ２６８７３．１、ＥＡＡ２９１３２．１、ＥＡＡ３０２６３．１、ＥＡＡ３３１７８．１、ＥＡＡ３３４０８．１、ＥＡＡ３４４６６．１、ＥＡＡ３６３６２．１、ＥＡＡ２９０１８．１、及びＥＡＡ２９３４７．１によって表されるもの、又は、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）２４６３０に由来するＳｔ６１、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）２３８３９ｃに由来するＳｔ６１Ａ、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）４６５８３に由来するＳｔ６１Ｂ、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）８０３１２に由来するＳｔ６１Ｄ、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆｕ３ｇ０３８７０に由来するＡｆｕ６１ａ（ＮＣＢＩ参照番号：ＸＰ＿７４８７０７）、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆｕ６ｇ０９５４０に由来するＮＣＢＩ参照番号：ＸＰ＿７５０８４３．１を有するエンドグルカナーゼ、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）ＥＤＰ４７１６７に由来するエンドグルカナーゼ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）１６３８０に由来するエンドグルカナーゼ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）１５５４１８に由来するエンドグルカナーゼ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６８９００に由来するエンドグルカナーゼ、Ｃ．グロボサム（C. globosum）に由来するＣｇ６１Ａ（ＥＡＱ８６３４０．１）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ７、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４、及び、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆ２９３に由来するＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿７５２０４０のエンドグルカナーゼが挙げられる。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば単離ポリペプチド）はＥＧＩＶの変異体である。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば単離ポリペプチド）は、配列番号１〜２９及び１４８のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を有する、ＧＨ６１エンドグルカナーゼの変異体である。
【００８７】
配列番号１〜２９及び１４８のアミノ酸配列を用いたアラインメントを行い、アラインメントの結果を図３に示す。図２は、ポリペプチドのアミノ酸配列の比較からの一致率及び分散の結果を示す。このアラインメントは、各ＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドが特定の配列モチーフを共有していることを示しており、こうしたモチーフを本開示の図７に示す。
【００８８】
したがって、本開示は、ＧＨ６１エンドグルカナーゼ又はその変異体でありうる、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、単離、合成、又は組換えポリペプチド）を提供するものであり、変異体は、配列番号８４〜９１から選択される少なくとも１つのモチーフ（２、３、４、５、６、７、又は８つの少なくともいずれか）を有しうる。（図７に示される）配列番号８４〜９１を有する配列モチーフ中の「ａ」のそれぞれは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンのいずれか１つでありうるアミノ酸を表す。例えば一部の態様では、本開示は、配列番号８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、及び９１の少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５、６、７、又は８つ）のような、少なくとも１つの配列モチーフを有するポリペプチド（例えば、単離、合成、又は組換えポリペプチド）を提供する。一部の態様では、本開示は、少なくとも約１０個、例えば少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５若しくは３５０個のいずれかの残基の領域にわたって、又は未成熟ポリペプチドの完全長、成熟ポリペプチドの完全長、保存領域の完全長、及び／又は完全長のＣＢＭにわたって、（１）配列番号８４及び８８、（２）配列番号８５及び８８、（３）配列番号８６、（４）配列番号８７、（５）配列番号８４、８８及び８９、（６）配列番号８５、８８、及び８９、（７）配列番号８４、８８、及び９０、（８）配列番号８５、８８及び９０、（９）配列番号８４、８８及び９１、（１０）配列番号８５、８８及び９１、（１１）配列番号８４、８８、８９及び９１、（１２）配列番号８４、８８、９０及び９１、（１３）配列番号８５、８８、８９及び９１、並びに（１４）配列番号８５、８８、９０及び９１からなる群から選択される配列モチーフの１以上を含むポリペプチド（例えば、単離、合成、又は組換えポリペプチド）を提供する。保存領域は、予想された触媒ドメイン（「ＣＤ」）でありうる。例示的なポリペプチドには、少なくとも残基約１０個、例えば、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００個のいずれか分の長さのフラグメントが含まれる。このフラグメントは、保存領域及び／又はＣＢＭを含みうる。フラグメントが、酵素の保存領域及びＣＢＭを含む場合、フラグメントは両者を隔てるリンカーを場合により含む。リンカーは、天然リンカー又は異種リンカーでありうる。一部の態様では、ポリペプチドはＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する。
【００８９】
一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、ＧＨ６１エンドグルカナーゼ若しくはその変異体、配列番号１〜２９及び１４８のいずれか１つを有する酵素若しくはその変異体、ＥＧ  ＩＶ若しくはその変異体、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４若しくはその変異体である。本明細書に述べられる変異体は、エンドグルカナーゼ活性を有する。ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（変異体を含む）は、ＣＢＭドメイン（例えば機能ＣＢＭドメイン）を有しうる。ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（変異体を含む）は、触媒ドメイン（例えば機能触媒ドメイン）を有しうる。
【００９０】
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４は、ＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドである。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４のアミノ酸配列（配列番号２７）は、図１、４Ｂ及び５に示される。配列番号２７は、未成熟なＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の配列である。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４は、配列番号２７の残基１〜２１（下線で示される）に相当する予想されるシグナル配列を有する。シグナル配列の切断によって、配列番号２７の残基２２〜３４４に相当する配列を有する成熟ポリペプチドが生成すると予想される。予想される保存領域は、配列番号２７の残基２２〜２５６及び３０７〜３４３に相当し、後者は予想される炭水化物結合ドメイン（ＣＢＭ）である。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４は、例えばカルボキシルメチルセルロースを基質として使用した酵素アッセイにおいて、エンドグルカナーゼ活性を有することが示されている。エンドグルカナーゼ活性を測定する方法も、当業者にやはり周知のものである。
【００９１】
本開示は、配列番号２７の残基２２〜３４４のうちの少なくとも５０個（例えば、少なくとも約５５、６０、６５、７０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、又は３００個）の連続したアミノ酸残基と、少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有する配列を有しうる、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）のＥｇ４ポリペプチドの変異体を更に提供する。例えば、本開示は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）のＥｇ４ポリペプチドの変異体を提供する。このような変異体は、配列番号２７の残基２２〜３４４と少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２．５％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）の同一性を有しうる。このポリペプチド又はその変異体は単離することができる。このポリペプチド又はその変異体は、エンドグルカナーゼ活性を有しうる。
【００９２】
例えば、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）に由来するエンドグルカナーゼ（アクセッション番号ＡＣＥ１０２３４、本明細書では「ＴｔＥＧ」とも称される）（配列番号２９）、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）に由来する別のエンドグルカナーゼＥｇ７（アクセッション番号ＡＤＡ２６０４３．１）（本明細書では「ＴｅＥＧｂ」又は「ＴｒＥｇ７」とも称される）などの既知の多数のエンドグルカナーゼと、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４（図５を参照）とのアミノ酸配列のアラインメントに基づき、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の残基Ｈ２２、Ｈ１０７、Ｈ１８４、Ｑ１９３、及びＹ１９５は、金属を配位させる残基として機能するものと予想され、残基Ｄ６１及びＧ６３は、保存された表面残基であると予想され、残基Ｙ２３２は、活性に関与しているものと予想されている。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４  Ａにおいて予想される保存された残基を、図６Ａ及び６Ｂに示す。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドの変異体は、天然のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４と比較した場合に、残基Ｈ２２、Ｈ１０７、Ｈ１８４、Ｑ１９３、Ｙ１９５、Ｄ６１、Ｇ６３、及びＹ２３２において変化していなくともよい。
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドの変異体は、図５のアラインメントに示されるように、ＴｒＥＧｂ、ＴｔＥＧ及びＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の間で保存されたアミノ酸残基の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％で変化していなくともよい。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドの変異体は、天然のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の予想される保存領域の全体を含んでもよい。図５及び６を参照されたい。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドの代表的な変異体の１つは、図４Ｂに示される成熟したＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４配列（例えば、配列番号２７の残基２２〜３４４）と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のいずれかの同一性を有する配列を有する。一部の態様では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドの変異体は、エンドグルカナーゼ（例えばエンドグルカナーゼＩＶ（ＥＧＩＶ））活性を有する。
【００９３】
一部の態様では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドの変異体はエンドグルカナーゼ活性を有し、配列番号２７のアミノ酸配列、又は配列番号２７の残基（ｉ）２２〜２５５、（ｉｉ）２２〜３４３、（ｉｉｉ）３０７〜３４３、（ｉｖ）３０７〜３４４、若しくは（ｖ）２２〜３４４と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のいずれかの配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００９４】
一部の態様では、ポリペプチド又はその変異体は、配列番号２７のＨ２２、Ｄ６１、Ｇ６３、Ｃ７７、Ｈ１０７、Ｒ１７７、Ｅ１７９、Ｈ１８４、Ｑ１９３、Ｃ１９８、Ｙ１９５、及びＹ２３２のうちの少なくとも約３個の残基（例えば、少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のいずれか）に相当する残基を有する。一部の態様では、ポリペプチド又はその変異体は、配列番号２７のＨ２２、Ｄ６１、Ｇ６３、Ｃ７７、Ｈ１０７、Ｒ１７７、Ｅ１７９、Ｈ１８４、Ｑ１９３、Ｃ１９８、Ｙ１９５、及びＹ２３２に相当する残基を有する。一部の態様では、ポリペプチド又はその変異体は、配列番号２７のＧ３１３、Ｑ３１４、Ｃ３１５、Ｇ３１６、Ｇ３１７、Ｓ３２１、Ｇ３２２、Ｐ３２３、Ｔ３２４、Ｃ３２６、Ａ３２７、Ｔ３３１、Ｃ３３２、Ｎ３３６、Ｙ３３８、Ｙ３３９、Ｑ３４１、Ｃ３４２、及びＬ３４３のうちの少なくとも３個の残基（例えば、少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個のいずれか）に相当する残基を有する。一部の態様では、ポリペプチド又はその変異体は、配列番号２７のＧ３１３、Ｑ３１４、Ｃ３１５、Ｇ３１６、Ｇ３１７、Ｓ３２１、Ｇ３２２、Ｐ３２３、Ｔ３２４、Ｃ３２６、Ａ３２７、Ｔ３３１、Ｃ３３２、Ｎ３３６、Ｙ３３８、Ｙ３３９、Ｑ３４１、Ｃ３４２、及びＬ３４３に相当する残基を有する。一部の態様では、ポリペプチド及びその変異体は、ＣＢＭドメイン（例えば機能性ＣＢＭドメイン）を有する。一部の態様では、ポリペプチド及びその変異体は、触媒ドメイン（例えば機能性触媒ドメイン）を有する。ポリペプチドは、好ましくはエンドグルカナーゼ活性を有する。
【００９５】
ＧＨ６１エンドグルカナーゼの変異体、配列番号１〜２９及び１４８のいずれか１つを有するエンドグルカナーゼ、ＥＧ  ＩＶ、又はトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）Ｅｇ４ポリペプチドは、アミノ酸置換を用いて作製することができる。下記表の「保存的置換」の見出しの下に各保存的置換を示す。置換は、下記表に示される代表的置換であってもよい。
【００９６】
【表１】
2018075020.tif 000002
【００９７】
（ａ）例えばシート又は螺旋コンフォメーションとしての置換領域内のポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩の維持に与える影響において大きく異なる置換を選択することによって、ポリペプチドの酵素特性を大きく改変することができる。天然に存在する残基は、共通の側鎖の性質に基づいて異なるグループに分類される。すなわち、
（１）非極性のもの：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）電荷のない極性のもの：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性（負の電荷を有する）のもの：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性（正の電荷を有するもの）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）残基が鎖の向きに影響するもの：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族性のもの：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓである。
【００９８】
非保存的置換は、これらの部類の１つのメンバーを別の部類のものに交換することによって行われる。ポリペプチドの適正なコンフォメーションの維持に関与していないすべてのシステイン残基を通常はセリンに置換することも可能であり、これにより分子の酸化安定性を高め、異常な架橋結合を防止することができる。逆に、システイン結合をポリペプチドに加えることによってその安定性を高めることができる。
【００９９】
一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、単離、合成、又は組換えポリペプチド）は、一般的に当該ポリペプチドとは異種（例えば、本開示のポリペプチドとは異なる供給源に由来する）の１以上の融合セグメントに結合された本開示のポリペプチドのドメインを有する融合又はキメラポリペプチドである。適当な融合又はキメラセグメントとしては、これらに限定されるものではないが、ポリペプチドの安定性を高め、他の所望の生物学的活性又は高いレベルの所望の生物学的活性を与え、かつ／又はポリペプチドの精製を促進する（例えば、アフィニティクロマトグラフィーにより）ことが可能なセグメントが挙げられる。適当な融合セグメントは、所望の機能（例えば、高い安定性、溶解度、作用又は生物学的活性を与え、かつ／又はポリペプチドの精製を単純化する）を有する任意のサイズのドメインであってよい。本発明の融合又はハイブリッドポリペプチドは、それぞれ又はそのうちの少なくとも２つが異なる供給源又は微生物に由来する２以上の融合又はキメラセグメントから構築することができる。融合又はハイブリッドセグメントは、本開示のポリペプチドのドメインのアミノ及び／又はカルボキシ末端に連結することができる。融合セグメントは、切断に対する感受性を有するものであってもよい。こうした感受性を有することには一定の利点があり、例えば、対象となるポリペプチドを簡単に回収することが可能となる。融合ポリペプチドは、ポリペプチド又はそのドメインのカルボキシ若しくはアミノ末端のいずれかに結合した融合セグメント、又はカルボキシ及びアミノ末端の両方に結合した融合セグメントを有するポリペプチドをコードした融合核酸をトランスフェクトした組換え細胞を培養することによって生産することができる。
【０１００】
したがって、本開示のポリペプチドには、遺伝子融合（例えば、発現産物の過剰発現、可溶性、及び活性形態）、突然変異誘発遺伝子（例えば、遺伝子の転写及び翻訳を促進するためのコドン改変を有する遺伝子）、及び短縮遺伝子（例えば、シグナル配列を除去するか又は異種のシグナル配列で置換した遺伝子）の発現産物も含まれる。
【０１０１】
不溶性基質を利用するグリコシルヒドロラーゼはしばしばモジュラー酵素である。これらの酵素は、１以上の非触媒炭水化物結合ドメイン（ＣＢＭ）に付加された触媒モジュールを有しうる。自然界では、ＣＢＭは、グリコシルヒドロラーゼとその標的基質である多糖類との相互作用を促進するものと考えられている。すなわち、本開示は、例えば異種ＣＢＭが「スプライシングにより組み込まれた」結果、複数の基質を有するキメラ酵素のように、基質特異性が変化したキメラ酵素を提供する。本開示のキメラ酵素の異種ＣＢＭも、やはり同様にグリコシルヒドロラーゼと異種又は同種のものでありうる触媒モジュール又は触媒ドメイン（「ＣＤ」、例えば活性部位における）に付加されるように、モジュール状の設計とすることができる。
【０１０２】
したがって、本開示は、キメラ（異種）ＣＢＭ／ＣＤペアを形成するように同種でペアとするか又は連結することができるＣＢＭ／ＣＤモジュールからなるか、又はこれを含むペプチド及びポリペプチドを提供する。したがって、これらのキメラポリペプチド／ペプチドを用いて、対象とする酵素の性能を高めるか、又は変化させることができる。
【０１０３】
一部の態様では、本開示の図１に示される配列を有するポリペプチドのいずれか１つの少なくとも１つのＣＤ及び／又はＣＢＭを含む、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが提供される。例えば、図１の適当なＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチドとしては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ９７２８３．２、ＣＡＤ７０３４７．１、ＣＡＤ２１２９６．１、ＣＡＥ８１９６６．１、ＣＡＦ０５８５７．１、ＥＡＡ２６８７３．１、ＥＡＡ２９１３２．１、ＥＡＡ３０２６３．１、ＥＡＡ３３１７８．１、ＥＡＡ３３４０８．１、ＥＡＡ３４４６６．１、ＥＡＡ３６３６２．１、ＥＡＡ２９０１８．１、及びＥＡＡ２９３４７．１によって表されるもの、又は、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）２４６３０に由来するＳｔ６１、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）２３８３９ｃに由来するＳｔ６１Ａ、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）４６５８３に由来するＳｔ６１Ｂ、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）８０３１２に由来するＳｔ６１Ｄ、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆｕ３ｇ０３８７０に由来するＡｆｕ６１ａ（ＮＣＢＩ参照番号：ＸＰ＿７４８７０７）、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆｕ６ｇ０９５４０に由来するＮＣＢＩ参照番号：ＸＰ＿７５０８４３．１のエンドグルカナーゼ、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）ＥＤＰ４７１６７のエンドグルカナーゼ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）１６３８０のエンドグルカナーゼ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）１５５４１８のエンドグルカナーゼ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６８９００のエンドグルカナーゼ、Ｃ．グロボサム（C. globosum）に由来するＣｇ６１Ａ（ＥＡＱ８６３４０．１）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ７、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４、及び、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆ２９３に由来するＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿７５２０４０のエンドグルカナーゼが挙げられる。ポリペプチドは、好適には、２以上の異なるポリペプチドに由来する機能ドメインを有する融合ポリペプチドでありうる（例えば、１つのポリペプチドからのＣＢＭが別のポリペプチドからのＣＤに連結されたもの）。
【０１０４】
本開示のポリペプチドは、好適には「実質上純粋な」形態で得るか、かつ／又は使用することができる。例えば、本開示のポリペプチドは、緩衝液又は溶液などの他の成分も含む、与えられた組成物中の全タンパク質の少なくとも約８０重量％（例えば、少なくとも約８５重量％、９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９６重量％、９７重量％、９８重量％、又は９９重量％のいずれか）を構成する。
【０１０５】
本開示のポリペプチドはまた、培養ブロス（例えば糸状菌培養ブロス）中で好適に得るか、かつ／又は使用することができる。培養ブロスは、遺伝子操作された酵素組成物であってもよい。例えば培養ブロスは、本開示の異種ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された組換え宿主細胞によって、又は内因性の本開示のポリペプチドを内因性の発現レベルよりも高いか又は低い量（例えば、内因性の発現レベルよりも１、２、３、４、５倍、又はそれ以上高いか又は低い量）で発現するように遺伝子操作された組換え宿主細胞によって製造することができる。更に、培養ブロスは、複数の本開示のポリペプチドを所望の比で発現するように遺伝子操作された特定の「組み込み」宿主細胞株によって製造することもできる。
【０１０６】
核酸、発現カセット、ベクター、及び宿主細胞本開示は、例えばＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、ＧＨ６１エンドグルカナーゼ又はその変異体、ＥＧ  ＩＶ又はその変異体、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体などの上記に示したポリペプチドをコードした核酸（例えば、単離、合成又は組換え核酸）を提供する。特定の態様では、本開示は、配列番号１〜２９及び１４８のいずれか１つを有するポリペプチド、又は配列番号１〜２９及び１４８のいずれか１つと少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有するポリペプチドをコードした核酸（例えば、単離、合成又は組換え核酸）を提供する。
【０１０７】
特定の態様では、本開示は、（１）配列番号８４及び８８、（２）配列番号８５及び８８、（３）配列番号８６、（４）配列番号８７、（５）配列番号８４、８８及び８９、（６）配列番号８５、８８、及び８９、（７）配列番号８４、８８、及び９０、（８）配列番号８５、８８及び９０、（９）配列番号８４、８８及び９１、（１０）配列番号８５、８８及び９１、（１１）配列番号８４、８８、８９及び９１、（１２）配列番号８４、８８、９０及び９１、（１３）配列番号８５、８８、８９及び９１、並びに（１４）配列番号８５、８８、９０及び９１から選択される１以上の配列モチーフを含む、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（ＧＨ６１エンドグルカナーゼの変異体を含む）のいずれか１つをコードした核酸（例えば、単離、合成又は組換え核酸）を提供する。本開示は、ＣＢＭドメイン（例えば機能ＣＢＭドメイン）及び／又は触媒ドメイン（例えば機能触媒ドメイン）を含む、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（ＧＨ６１エンドグルカナーゼの変異体を含む）をコードした核酸（例えば、単離、合成又は組換え核酸）を更に提供する。
【０１０８】
本開示は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドの変異体をコードした核酸（例えば、単離、合成又は組換え核酸）を更に提供する。このような変異体は、配列番号２７の残基２２〜３４４と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２．５％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のいずれか）の配列同一性を有しうる。一部の態様では、ポリペプチド又はその変異体は、エンドグルカナーゼ活性を有する。ポリペプチド又はその変異体は、配列番号２７のＨ２２、Ｄ６１、Ｇ６３、Ｃ７７、Ｈ１０７、Ｒ１７７、Ｅ１７９、Ｈ１８４、Ｑ１９３、Ｃ１９８、Ｙ１９５、及びＹ２３２のうちの少なくとも約５個の残基（例えば、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のいずれか）に相当する残基を有しうる。ポリペプチド又はその変異体は、配列番号２７のＨ２２、Ｄ６１、Ｇ６３、Ｃ７７、Ｈ１０７、Ｒ１７７、Ｅ１７９、Ｈ１８４、Ｑ１９３、Ｃ１９８、Ｙ１９５、及びＹ２３２に相当する残基を有しうる。ポリペプチド又はその変異体は、配列番号２７のＧ３１３、Ｑ３１４、Ｃ３１５、Ｇ３１６、Ｇ３１７、Ｓ３２１、Ｇ３２２、Ｐ３２３、Ｔ３２４、Ｃ３２６、Ａ３２７、Ｔ３３１、Ｃ３３２、Ｎ３３６、Ｙ３３８、Ｙ３３９、Ｑ３４１、Ｃ３４２、及びＬ３４３のうちの少なくとも５個の残基（例えば、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個のいずれか）に相当する残基を有しうる。一部の態様では、ポリペプチド又はその変異体は、配列番号２７のＧ３１３、Ｑ３１４、Ｃ３１５、Ｇ３１６、Ｇ３１７、Ｓ３２１、Ｇ３２２、Ｐ３２３、Ｔ３２４、Ｃ３２６、Ａ３２７、Ｔ３３１、Ｃ３３２、Ｎ３３６、Ｙ３３８、Ｙ３３９、Ｑ３４１、Ｃ３４２、及びＬ３４３に相当する残基を有する。
【０１０９】
本開示は、少なくとも約１０個、例えば少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、又は１０５０個のいずれかのヌクレオチドの領域にわたって、配列番号３０の核酸配列と少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％、又は完全な（１００％）同一性を有する核酸配列を有する核酸（例えば、単離、合成又は組換え核酸）を提供する。
一部の態様では、本開示は、本明細書に示されるポリペプチドのいずれか１つをコードした核酸を提供する。本明細書では更に、配列番号３０と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、８８％、９０％、９２．５％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のいずれか）の同一性を有する単離された核酸が提供される。
【０１１０】
一部の態様では、配列番号２７のアミノ酸配列と、又は配列番号２７の残基（ｉ）２２〜２５５、（ｉｉ）２２〜３４３、（ｉｉｉ）３０７〜３４３、（ｉｖ）３０７〜３４４、又は（ｖ）２２〜３４４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードした核酸（例えば、単離、合成又は組換え核酸）が提供される。一部の態様では、配列番号３０と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）の配列同一性を有する核酸（例えば、単離、合成又は組換え核酸）、又は配列番号３０の相補体若しくはそのフラグメントと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸が提供される。本明細書で使用するところの「低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、及び極めて高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」なる用語は、ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件について述べたものである。ハイブリダイゼーション反応を行うための手引きは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１〜６．３．６に見ることができる。この参照文献には水性及び非水性の方法が述べられているが、いずれの方法を使用することもできる。本明細書で言及する具体的なハイブリダイゼーション条件は以下のものである。すなわち、１）約４５℃の６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）の後、少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー条件では各洗浄液の温度を５５℃にまで上昇させることができる）で０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳにより２回洗浄を行う低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、２）約４５℃で６Ｘ  ＳＳＣの後、６０℃で０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳにより１回以上洗浄を行う中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、３）約４５℃で６Ｘ  ＳＳＣの後、６５℃で０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳにより１回以上洗浄を行う高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、及び好ましくは、４）６５℃で０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％  ＳＤＳの後、６５℃で０．２Ｘ  ＳＳＣ、１％  ＳＤＳにより１回以上洗浄を行う極めて高いストリンジェンシー条件、である。特に断らないかぎり、極めて高いストリンジェンシー条件（４）が好ましい条件である。
【０１１１】
本開示は、上記に述べた核酸のいずれかを含む発現カセット及び／又はベクターを更に提供する。本開示の酵素などのポリペプチドをコードした核酸は、プロモーターと機能的に連結することができる。詳細には、糸状菌宿主内での組換え発現が望ましい場合には、プロモーターは糸状菌のプロモーターとすることができる。核酸は、例えば異種プロモーターの制御下とすることができる。核酸は、構成的又は誘導性プロモーターの制御下で発現させることもできる。使用可能なプロモーターの例としては、これらに限定されるものではないが、セルラーゼプロモーター、キシラナーゼプロモーター、１８１８プロモーター（トリコデルマのＥＳＴマッピングによって高度に発現されるタンパク質としてこれまでに特定されている）が挙げられる。例えば、プロモーターは、好適にはセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、又はβ−グルコシダーゼのプロモーターとすることができる。特に好適なプロモーターは、例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）のセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、又はβ−グルコシダーゼのプロモーターであってよい。例えば、プロモーターはセロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）プロモーターである。プロモーターの非限定的な例としては、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｐｋｉ１、ｇｐｄ１、ｘｙｎ１、又はｘｙｎ２プロモーターが挙げられる。プロモーターの更なる非限定的な例としては、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）のｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｐｋｉ１、ｇｐｄ１、ｘｙｎ１、又はｘｙｎ２プロモーターが挙げられる。
【０１１２】
本明細書で使用するところの「機能的に連結された」なる用語は、選択されたヌクレオチド配列（例えば、本明細書に述べられるポリペプチドをコードしたもの）が、プロモーターに近接していることにより、プロモーターが選択されたＤＮＡの発現を調節することができることを意味する。更に、プロモーターは、転写及び翻訳の方向において、選択されたヌクレオチド配列の上流に配置される。「機能的に連結された」とは、調節配列に適当な分子（例えば転写活性化タンパク質）が結合する際に遺伝子が発現されるように、ヌクレオチド配列と調節配列とが連結されていることを意味する。
【０１１３】
本開示は、本明細書に述べられるポリヌクレオチドのベクター又は発現カセットのいずれかを含んだ宿主細胞を更に提供する。本開示は、本開示の１以上のポリペプチドを発現させるために使用可能な宿主細胞を更に提供する。好適な宿主細胞としては、あらゆる微生物の細胞（例えば、細菌、原生生物、藻類、真菌（例えば酵母又は糸状菌）、又は他の微生物の細胞）が挙げられ、好ましくは細菌、酵母、又は糸状菌の細胞である。
【０１１４】
好適な細菌属の宿主細胞としては、これらに限定されるものではないが、エシェリキア（Escherichia）属、バチルス（Bacillus）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、及びストレプトマイセス（Streptomyces）属の細胞が挙げられる。好適な細菌種の細胞としては、例えばエシェリキア・コライ（Escherichia coli）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、又はストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）の細胞が挙げられる。
【０１１５】
好適な酵母属の宿主細胞としては、これらに限定されるものではないが、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、カンジダ（Candida）属、ハンセヌラ（Hansenula）属、ピチア（Pichia）属、クリヴェロマイセス（Kluyveromyces）属、及びファフィア（Phaffia）属の細胞が挙げられる。好適な酵母種の細胞としては、これらに限定されるものではないが、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンべ（Schizosaccharomyces pombe）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、Ｐ．カナデンシス（P. canadensis）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、及びファフィア・ロードザイマ（Phaffia rhodozyma）の細胞が挙げられる。
【０１１６】
好適な糸状菌細胞の宿主細胞としては、ユーミコチナ（Eumycotina）亜門のすべての糸状形態のものが挙げられる。好適な糸状菌属の細胞としては、これらに限定されるものではないが、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ブジェルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysoporium）、コプリナス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、コリナスカス（Corynascus）、ケトミウム（Chaertomium）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィロバシジウム（Filobasidium）、フザリウム（Fusarium）、ジベレラ（Gibberella）、フミコラ（Humicola）、マグナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、マイセリオフトラ（Myceliophthora）、ムコール（Mucor）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ニューロスポラ（Neurospora）、パエシロマイセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フレビア（Phlebia）、ピロマイセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、スキタリジウム（Scytaldium）、シゾフィラム（Schizophyllum）、スポロトリカム（Sporotrichum）、タラロマイセス（Talaromyces）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、及びトリコデルマ（Trichoderma）が挙げられる。好適な糸状菌種の細胞としては、これらに限定されるものではないが、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フェチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クルックウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レティクラタム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サムブシナム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコクロム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイド（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・サルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイド（Fusarium trichothecioides）、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、ブジェルカンデラ・アダスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレギエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブローサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオプシ���・サブバーミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）、コリオラス・ヒルストゥス（Coriolus hirsutus）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ニューロスポラ・インターメディア（Neurospora intermedia）、ペニシリウム・パープロゲナム（Penicillium purpurogenum）、ペニシリウム・カネスセンス（Penicillium canescens）、ペニシリウム・ソリタム（Penicillium solitum）、ペニシリウム・フニクロサム（Penicillium funiculosum）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラジエート（Phlebia radiate）、プレウロタス・エリンギ（Pleurotus eryngii）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ビローサ（Trametesvillosa）、トラメテス・ベルシコロル（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、及びトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）の細胞が挙げられる。
【０１１７】
本開示は、例えばＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）を組換えにより発現するように遺伝子操作された、組換え真菌宿主細胞又は組換え糸状菌などの宿主細胞を提供する。
【０１１８】
本開示は、組換え宿主細胞、例えば組換え真菌宿主細胞又は組換え微生物、例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１（「Ｔｒ３Ａ」とも称される）、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、及びＦｖ５１Ａポリペプチドを組換えにより発現するように遺伝子操作された、組換えＴ．リーゼイ（T. reesei）などの糸状菌を更に提供する。例えば組換え宿主細胞は、好適にはＴ．リーゼイ（T. reesei）宿主細胞である。組換え真菌は、好適には組換えＴ．リーゼイ（T. reesei）である。本開示は、例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、及びＦｖ５１Ａポリペプチドを組換えにより発現するように遺伝子操作されたＴ．リーゼイ（T. reesei）宿主細胞を提供する。また、本開示は、本明細書に述べられるポリペプチドを組換えにより発現するように遺伝子操作された、例えばアスペルギルス（Aspergillus）（Ａ．オリザエ（A. oryzae）、Ａ．ニガー（A. niger）など）宿主細胞又は組換えアスペルギルスである組換え宿主細胞又は組換え微生物も提供する。
【０１１９】
更に、本開示は、好適な複数の酵素を糖化に適した比で含む酵素ブレンドを発現するように遺伝子操作された組換え宿主細胞又は組換え微生物を提供する。組換え宿主細胞は、例えば真菌宿主細胞又は細菌宿主細胞である。組換え真菌は、例えば組換えＴ．リーゼイ（T. reesei）、Ａ．オリザエ（A. oryzae）、Ａ．ニガー（A. niger）、又は酵母である。組換え真菌宿主細胞は、例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）、Ａ．オリザエ（A. oryzae）、Ａ．ニガー（A. niger）、又は酵母細胞であってよい。組換え細菌宿主細胞は、例えばバチルス・サブティリス（Bascillus subtilis）、又はＥ．コライ（E. coli）細胞であってよい。組換え細菌微生物は、例えばバチルス・サブティリス（Bascillus subtilis）、又はＥ．コライ（E. coli）であってよい。好適な酵素ブレンド中に存在する酵素の比／量の例は、下記のように本明細書に述べられるものである。
【０１２０】
組成物
【０１２１】
本開示は、また、バイオマス材料を加水分解し、かつ／又はバイオマス混合物（例えば、酵素及び基質を含んだバイオマス糖化混合物）の粘度を低下させるために使用することが可能な、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを含んだ酵素組成物などの組成物（例えば非天然組成物）も提供する。
【０１２２】
セルラーゼには、セルロース（β−１，４−グルカン又はβ−Ｄ−グルコシド結合）ポリマーをグルコース、セロビオース、セロオリゴ糖などに加水分解することが可能な酵素が含まれる。セルラーゼは、エンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）（「ＥＧ」）、エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）、及びβ−グルコシダーゼ（β−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ；ＥＣ  ３．２．１．２１）（「ＢＧ」）の３つの大きなクラスに以前より分類されてきた（Ｋｎｏｗｌｅｓら、１９８７，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５（９）：２５５〜２６１；Ｓｈｕｌｅｉｎ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１６０：２３４〜２４２）。エンドグルカナーゼがセルロース繊維の非結晶部分に対して主に作用するのに対して、セロビオヒドロラーゼは結晶性セルロースを分解することも可能である。ヘミセルラーゼには、例えばキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼが含まれる。
【０１２３】
本発明の組成物は、１種類よりも多い酵素を含む複数の酵素のブレンドとすることができる。本発明の酵素組成物は好適には、他の微生物、植物、又は生物に由来する１以上の更なる酵素を含みうる。相乗的な酵素の組み合わせ及び関連する方法が考えられる。本開示は、異なる種類のバイオマス材料を分解するための酵素組成物中に含まれる各酵素の最適な比を特定するための方法を含む。これらの方法には、例えば、異なる基質（例えばリグノセルロース基質）をそれらの構成成分である発酵性糖に効率的に変換するために、本発明の酵素組成物中に含まれるべき各酵素の最適な割合又は相対重量を特定するための試験が含まれる。
【０１２４】
高等植物の細胞壁は、様々な炭水化物ポリマー（ＣＰ）成分で構成されている。これらのＣＰは共有結合及び非共有結合により相互作用することによって、堅い細胞壁を形成するとともに膨圧に耐えるために必要とされる構造的一体性を植物に与える。植物に見られる主なＣＰは、細胞壁の構造骨格を形成するセルロースである。セルロースの生合成時に、ポリ−β−１，４−Ｄ−グルコース鎖は水素結合及び疎水性相互作用によって自己会合してセルロースミクロフィブリルを形成し、これが更に自己会合してより大きな繊維を形成する。セルロースミクロフィブリルはしばしば構造的に不規則であり、結晶化度の異なる領域を含む。セルロース繊維の結晶化度は、セルロース繊維の構成成分であるセルロース鎖間で水素結合がどのくらい緊密に秩序化されているかによって決まる。結合の秩序化の程度が低い領域、すなわちグルコース鎖へのアクセス性がより高い領域は、非結晶領域と呼ばれる。セルロースのグルコースへの脱重合の一般的モデルには、最低でも３つの異なる酵素活性が関与している。エンドグルカナーゼは、完全なセルロース鎖よりもエキソグルカナーゼ活性の作用を受けやすいアクセス点の数を増やす過程において、セルロース鎖を分子内部でより短い鎖に切断する。これらのエキソグルカナーゼ（例えばセロビオヒドロラーゼ）は、還元末端又は非還元末端に特異的に作用し、多くの場合、グルコースの二量体であるセロビオースを遊離させる。蓄積したセロビオースは、次いでセロビアーゼ（例えばβ−１，４−グルコシダーゼ）によってグルコースに切断される。セルロースは無水グルコースのみを含んでいる。これに対して、ヘミセルロースは多くの異なる糖モノマーを含んでいる。例えば、ヘミセルロース中の糖モノマーには、グルコース以外に、キシロース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、及びアラビノースも含まれうる。ヘミセルロースは大部分はＤ−ペントース糖を含み、場合により少量のＬ−糖を含む。一般的にはキシロースが最も多量に存在するが、マンヌロン酸及びガラクツロン酸も存在する傾向がある。ヘミセルロースとしては、キシラン、グルクロノキシラン、アラビノキシラン、グルコマンナン、及びキシログルカンが挙げられる。
【０１２５】
本開示の組成物（例えば酵素及び多酵素組成物）は、セルロース材料（例えばグルカン）及び／又はヘミセルロース材料（例えばキシラン、アラビノキシラン、及びキシラン−又はアラビノキシラン含有基質）の糖化に使用することができる。酵素ブレンド／組成物は、好適には非天然組成物である。
【０１２６】
本明細書において提供される酵素組成物は、グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ、キシラナーゼ、β−グルコシダーゼ、及びβ−キシロシダーゼなどのセルラーゼの少なくとも１種類、複数、又はすべてを含む、キシラン−加水分解性、ヘミセルロース−及び／又はセルロース加水分解性酵素の混合物を含みうる。本開示は、非天然組成物でありうる酵素組成物を更に提供する。本明細書で使用するところの「酵素組成物」なる用語は、（１）発酵ブロスの形態、又は部分的又は完全に単離若しくは精製された形態の成分酵素を合わせることにより調製される組成物、（２）１以上の成分酵素を発現するように改変された生物により産生される組成物（特定の実施形態では、１以上の成分酵素を発現させるために用いられる生物は、１以上の遺伝子が欠失するように改変することができ、特定の他の実施形態では、１以上の成分酵素を発現させるために用いられる生物は、キシラン加水分解、ヘミセルロース加水分解及び／又はセルロース加水分解に影響するタンパク質を更に含みうる）、（３）糖化又は発酵反応の際に各構成酵素を、同時に、別々に、又は順次合わせることにより調製される組成物、（４）例えば糖化又は発酵反応の際にインサイチュで調製される酵素混合物、（５）上記（１）〜（４）のいずれか又はすべてに従って調製される組成物のことを指す。
【０１２７】
本明細書で使用するところの「発酵ブロス」なる用語は、発酵後の回収及び／又は精製をまったく行わないか又は最小限に留めた、発酵によって調製された酵素調製物のことを指す。例えば、微生物の培養を飽和状態まで増殖させ、炭素制限条件下でインキュベートしてタンパク質を合成させる（例えば酵素を発現させる）。この後、酵素が細胞培地中に分泌された時点で発酵ブロスを使用することができる。本開示の発酵ブロスは、発酵終了時に誘導された、分画されていないか又は分画された発酵物質の含有物を含みうる。例えば、本発明の発酵ブロスは分画されず、使用済みの培地、及び微生物細胞（例えば糸状菌細胞）が発酵過程を行った後に存在する細胞破片を含む。発酵ブロスは、好適には、使用済みの細胞培地、細胞外酵素、及び生きた又は殺された微生物細胞を含みうる。また、発酵ブロスは、微生物細胞を除去するために分画してもよい。このような場合、発酵ブロスは例えば、使用済みの細胞培地及び細胞外酵素を含みうる。
【０１２８】
本明細書において提供されるセルラーゼ組成物などの酵素組成物は、カルコフロールアッセイによって求めた場合に、少なくとも０．１（例えば０．１〜０．４）の生成率（fraction product）を得ることが可能である。使用した化学物質はすべて分析グレードのものである。Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ−１０１は、エフ・エム・シー・バイオポリマー社（FMC BioPolymer）（ペンシルベニア州フィラデルフィア）より購入した。セロビオース及びカルコフロールホワイトは、シグマ社（Sigma）（ミズーリ州セントルイス）より購入した。リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）は、Ｗａｌｓｅｔｈ，ＴＡＰＰＩ  １９７１，３５：２２８及びＷｏｏｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９７１，１２１：３５３〜３６２の適合プロトコールを用いてＡｖｉｃｅｌ  ＰＨ−１０１から調製した。簡単に述べると、Ａｖｉｃｅｌを濃リン酸に溶解してから冷たい脱イオン水を用いて沈殿させた。セルロースを回収し、更なる水で洗浄してｐＨを中和した後、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中で１％固形分となるまで希釈した。酵素希釈液はすべて、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中で調製した。ＧＣ２２０セルラーゼ（ダニスコ・ユー・エス社、ジェネンコア（Danisco US Inc., Genencor））を、２．５、５、１０及び１５ｍｇのタンパク質／Ｇ  ＰＡＳＣとなるまで希釈し、直線の検量線を得た。試験する試料を、検量線の範囲内に収まるように希釈した（すなわち、０．１〜０．４の生成率（fraction product）を得た）。１５０μＬの冷たい１％  ＰＡＳＣを、９６穴マイクロタイタープレート中で２０μＬの酵素溶液に加えた。プレートをカバーし、Ｉｎｎｏｖａインキュベーター／シェーカー中、５０℃、２００ｒｐｍで２時間インキュベートした。１００ｍＭのグリシン緩衝液に加えた１００μＬの５０μｇ／ｍＬカルコフロール（ｐＨ１０）で反応を停止させた。蛍光マイクロプレートリーダー（モレキュラー・デバイス社（Molecular Devices）のＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５）上で、励起波長Ｅｘ＝３６５ｎｍ、放射波長Ｅｍ＝４３５ｎｍで蛍光を読み取った。結果を、下式に基づき生成率（fraction product）として表す。すなわち、
ＦＰ＝１−（Ｆｌ試料−Ｆｌセロビオースを含む緩衝液）／（Ｆｌ酵素なし−Ｆｌセロビオースを含む緩衝液）
式中、ＦＰ＝生成率（fraction product）であり、ＦＩ＝蛍光単位である。
【０１２９】
本明細書で具体的に述べられる酵素のいずれかを、本明細書に述べられる酵素のいずれか１以上のものと、又は他の任意の入手可能な好適な酵素と組み合わせることによって、適当な多酵素ブレンド／組成物を調製することができる。本開示は、以下に示す特定の例示的な組み合わせに制限されるものでも、限定されるものでもない。
【０１３０】
例示的組成物
ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む非天然組成物を提供する。本発明はまた、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む全セルラーゼ（例えばエンドグルカナーゼＩＶなどのＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを濃縮化した全セルラーゼ（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド濃縮化全セルラーゼ））を含む非天然組成物も提供する。ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、本明細書で提供されるＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有する任意のポリペプチドであってよい。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体である。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の変異体は、上記に示される変異体のいずれであってもよい。
【０１３１】
図面を含む本開示においては、エンドグルカナーゼを互換可能に「Ｅｇ」又は「Ｅｇｌ」と呼ぶ。
【０１３２】
本明細書で使用するところの「天然組成物」なる用語は、１以上の酵素成分又は活性を有する、天然に存在する供給源によって産生される組成物のことを言い、各成分又は活性のそれぞれは、天然に存在する供給源によって産生される比及び濃度で、自然に、人の手によって触れられず、改変されない状態のままで見出される。したがって、天然組成物とは、例えば、セルロース分解性又はヘミセルロース分解性酵素に関して改変されていない生物によって産生されることにより、成分酵素の比又は濃度が天然の生物によりその天然の環境において産生されるものから変化していない組成物である。これに対して、「非天然組成物」とは、（１）成分であるセルロース分解性又はヘミセルロース分解性酵素を、天然の存在比又は天然の存在比ではない、すなわち改変された比で組み合わせるか、又は（２）１以上の内因性又は外因性酵素を発現、過剰発現、若しくは過小発現するように生物を改変するか、又は（３）少なくとも１つの内因性酵素が欠失するように生物を改変することによって生成される組成物のことを指す。「非天然組成物」とはまた、天然に存在し、改変されていないが、その生物の天然の環境とは異なる人工培地又は環境中で培養された生物によって産生される組成物のことも指し、こうした組成物中の各酵素の量は、その天然の生息環境中で増殖された天然の生物によって産生される組成物中に存在する酵素の量と異なっている。
【０１３３】
ＧＨ６１エンドグルカナーゼポリペプチド又はその変異体のいずれか１つを、本明細書に述べられる組成物のいずれかにおいて使用することができる。好適なＧＨ６１エンドグルカナーゼは、本開示の図１に示されるポリペプチドの１つを含みうる。好適なＧＨ６１エンドグルカナーゼとしては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ９７２８３．２、ＣＡＤ７０３４７．１、ＣＡＤ２１２９６．１、ＣＡＥ８１９６６．１、ＣＡＦ０５８５７．１、ＥＡＡ２６８７３．１、ＥＡＡ２９１３２．１、ＥＡＡ３０２６３．１、ＥＡＡ３３１７８．１、ＥＡＡ３３４０８．１、ＥＡＡ３４４６６．１、ＥＡＡ３６３６２．１、ＥＡＡ２９０１８．１、及びＥＡＡ２９３４７．１によって表されるもの、又は、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）２４６３０に由来するＳｔ６１、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）２３８３９ｃに由来するＳｔ６１Ａ、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）４６５８３に由来するＳｔ６１Ｂ、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）８０３１２に由来するＳｔ６１Ｄ、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆｕ３ｇ０３８７０に由来するＡｆｕ６１ａ（ＮＣＢＩ参照番号：ＸＰ＿７４８７０７）、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆｕ６ｇ０９５４０に由来するＮＣＢＩ参照番号：ＸＰ＿７５０８４３．１のエンドグルカナーゼ、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）ＥＤＰ４７１６７のエンドグルカナーゼ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）１６３８０のエンドグルカナーゼ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）１５５４１８のエンドグルカナーゼ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６８９００のエンドグルカナーゼ、Ｃ．グロボサム（C. globosum）に由来するＣｇ６１Ａ（ＥＡＱ８６３４０．１）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ７、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４、及び、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）Ａｆ２９３に由来するＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＸＰ＿７５２０４０のエンドグルカナーゼが挙げられる。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば単離ポリペプチド）は、ＧＨ６１エンドグルカナーゼ又はＥＧ  ＩＶの変異体である。
【０１３４】
一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（ＧＨ６１エンドグルカナーゼの変異体を含む）は、配列番号１〜２９及び１４８のいずれか１つを含むもの、又は配列番号１〜２９及び１４８のいずれか１つと少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２．５％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含むものである。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（ＧＨ６１エンドグルカナーゼの変異体を含む）は、配列番号８４〜９１から選択される少なくとも１個のモチーフ（少なくとも２、３、４、５、６、７、又は８個のいずれか）を含みうる。ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、（１）配列番号８４及び８８、（２）配列番号８５及び８８、（３）配列番号８６、（４）配列番号８７、（５）配列番号８４、８８及び８９、（６）配列番号８５、８８、及び８９、（７）配列番号８４、８８、及び９０、（８）配列番号８５、８８及び９０、（９）配列番号８４、８８及び９１、（１０）配列番号８５、８８及び９１、（１１）配列番号８４、８８、８９及び９１、（１２）配列番号８４、８８、９０及び９１、（１３）配列番号８５、８８、８９及び９１、並びに（１４）配列番号８５、８８、９０及び９１からなる群から選択される１以上の配列モチーフを含みうる。
【０１３５】
本明細書に述べられる組成物又は方法のいずれか１つの一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（ＧＨ６１エンドグルカナーゼの変異体を含む）は、配列番号２７の残基２２〜３４４と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２．５％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のいずれか）の配列同一性を有しうる。一部の態様では、ポリペプチド又はその変異体は、配列番号２７のＨ２２、Ｄ６１、Ｇ６３、Ｃ７７、Ｈ１０７、Ｒ１７７、Ｅ１７９、Ｈ１８４、Ｑ１９３、Ｃ１９８、Ｙ１９５、及びＹ２３２のうちの少なくとも約５個の残基（例えば、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のいずれか）に相当する残基を有する。一部の態様では、ポリペプチド又はその変異体は、配列番号２７のＨ２２、Ｄ６１、Ｇ６３、Ｃ７７、Ｈ１０７、Ｒ１７７、Ｅ１７９、Ｈ１８４、Ｑ１９３、Ｃ１９８、Ｙ１９５、及びＹ２３２に相当する残基を有する。一部の態様では、ポリペプチド又はその変異体は、配列番号２７のＧ３１３、Ｑ３１４、Ｃ３１５、Ｇ３１６、Ｇ３１７、Ｓ３２１、Ｇ３２２、Ｐ３２３、Ｔ３２４、Ｃ３２６、Ａ３２７、Ｔ３３１、Ｃ３３２、Ｎ３３６、Ｙ３３８、Ｙ３３９、Ｑ３４１、Ｃ３４２、及びＬ３４３のうちの少なくとも５個の残基（例えば、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個のいずれか）に相当する残基を有する。一部の態様では、ポリペプチド又はその変異体は、配列番号２７のＧ３１３、Ｑ３１４、Ｃ３１５、Ｇ３１６、Ｇ３１７、Ｓ３２１、Ｇ３２２、Ｐ３２３、Ｔ３２４、Ｃ３２６、Ａ３２７、Ｔ３３１、Ｃ３３２、Ｎ３３６、Ｙ３３８、Ｙ３３９、Ｑ３４１、Ｃ３４２、及びＬ３４３に相当する残基を有する。一部の態様では、ポリペプチド又はその変異体は、ＣＢＭドメイン（例えば機能性ＣＢＭドメイン）を有する。一部の態様では、ポリペプチド又はその変異体は、触媒ドメイン（例えば機能性触媒ドメイン）を有する。一部の態様では、ポリペプチド又はその変異体は単離される。一部の態様では、ポリペプチド又はその変異体は、エンドグルカナーゼ活性を有する。
【０１３６】
一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、エンドグルカナーゼＩＶ、例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド又はその変異体である。例えば、本開示は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド又はその変異体を含む非天然組成物を提供する。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドの変異体は、本明細書に述べられるＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチドの変異体のいずれであってもよい。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列又は配列番号２７の残基２２〜３４４を含む。
【０１３７】
一部の態様では、グリコシルヒドロラーゼファミリー６１（「ＧＨ６１」）／エンドグルカナーゼ活性を有する単離された（又は実質上精製された）ポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）を含む組成物が提供される。ポリペプチドを製造する方法、ポリペプチドを回収する方法、及びポリペプチドを単離又は精製する方法は、当業者には周知のものである。
【０１３８】
本明細書に述べられる組成物又は方法のいずれかの一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードした核酸が遺伝子操作により導入された宿主細胞により発現される。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現する宿主細胞とは異種である。
【０１３９】
本開示は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含み、更に少なくとも１種類のセルラーゼポリペプチド及び／又は少なくとも１種類のヘミセルラーゼポリペプチド、又はこれらの混合物を含む組成物を提供する。一部の態様では、組成物は、少なくとも１種類（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、又は８種類）のセルラーゼポリペプチドを含む。一部の態様では、セルラーゼポリペプチドは、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、又はβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドである。一部の態様では、組成物は、少なくとも１種類（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、又は８種類）のヘミセルラーゼポリペプチドを含む。一部の態様では、ヘミセルラーゼポリペプチドは、キシラナーゼ活性を有するポリペプチド、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド、又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドである。一部の態様では、組成物は、少なくとも１種類（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、又は８種類）のセルラーゼポリペプチド及び少なくとも１種類（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、又は８種類）のヘミセルラーゼポリペプチドを更に含む。本明細書で提供される組成物中に含まれる各ポリペプチドの異なる量を、下記の「組成物中の各成分の量」の項に示す。
【０１４０】
本開示の方法及び組成物に基づいて使用するためのセルラーゼ及びヘミセルラーゼは、とりわけ以下の生物の１以上から得るか、又は組換えによって産生させることができる。
すなわち、クリニペリス・スカペラ（Crinipellis scapella）、マクロフォミナ・ファゼオリナ（Macrophomina phaseolina）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ソルダリアフィミコラ（Sordaria fimicola）、ボルテラ・コッレトトリコイド（Volutella colletotrichoides）、チエラビア・テレストリス（Thielavia thermophila）、アクレモニウムｓｐ．（Acremonium sp.）、ヒメキクラゲ（Exidia glandulosa）、ツリガネタケ（Fomes fomentarius）、スポンジペリスｓｐ．（Spongipellis sp.）、リゾフリクティス・ロゼア（Rhizophlyctis rosea）、リゾムコール・プシラス（Rhizomucor pusillus）、サイコマイセス・ニテウス（Phycomyces niteus）、ケトスチラム・フレセニイ（Chaetostylum fresenii）、ディプロディア・ゴシピナ（Diplodia gossypina）、ウロスポラ・ビルグラミ（Ulospora bilgramii）、サッコボルス・ジルテルス（Saccobolus dilutellus）、ペニシリウム・ベルクロサム（Penicillium verruculosum）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicilliumchrysogenum）、サーモマイセス・ヴェルコサス（Thermomyces verrucosus）、ディアポルテ・シンゲネシア（Diaporthe syngenesia）、コレトトリカム・ラゲナリウム（Colletotrichum lagenarium）、ニグロスポラｓｐ．（Nigrospora sp.）、キシラリア・ヒポキシロン（Xylaria hypoxylon）、ネクトリア・ピネア（Nectria pinea）、ソルダリア・マクロスポラ（Sordaria macrospora）、チエラビア・サーモフィラ（Thielavia thermophila）、ケトミウム・モロラム（Chaetomium mororum）、ケトミウム・ビレッセンス（Chaetomium virscens）、ケトミウム・ブラジリエンシス（Chaetomium brasiliensis）、ケトミウム・クニコロラム（Chaetomium cunicolorum）、シスパトスポラ・ボニネンシス（Syspastospora boninensis）、クラドリナム・フォエクンジシマム（Cladorrhinum foecundissimum）、スシタリジウム・サーモフィラ（Scytalidium thermophila）、グリオクラジウム・カテヌラタム（Gliocladium catenulatum）、フザリウム・オキシスポラムｓｓｐ．リコペリシシ（Fusarium oxysporum ssp. lycopersici）、フザリウム・オキシスポラムｓｓｐ．パシフローラ（Fusarium oxysporum ssp. passiflora）、フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）、フザリウム・アンギオイド（Fusarium anguioides）、フザリウム・ポアエ（Fusarium poae）、フミコラ・ニグレッセンス（Humicola nigrescens）、フミコラ・グリセア（Humicola grisea）、パナエオラス・レチルギス（Panaeolus retirugis）、トラメテス・サンジーナ（Trametes sanguinea）、シゾフィラム・コミューン（Schizophyllum commune）、トリコテシウム・ローゼウム（Trichothecium roseum）、ミクロスフェロプシスｓｐ．（Microsphaeropsis sp.）、アクソボラス・スチクトイデス（Acsobolus stictoideus spej.）、ポロニア・パンクタタ（Poronia punctata）、ノズリスポラムｓｐ．（Nodulisporum sp.）、トリコデルマｓｐ．（Trichoderma sp.）（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei））及びシリンドロカルポンｓｐ．（Cylindrocarpon sp.）である。
【０１４１】
本開示では、セルラーゼ又はヘミセルラーゼは、セルロース系材料を加水分解可能な酵素の発現につながる任意の周知の微生物培養方法によって調製することができる。発酵としては、セルラーゼの発現又は単離を可能とする好適な培地中及び条件下で行われる、フラスコ振盪培養法、実験用又は工業用発酵槽中での連続培養、回分培養、流加培養、又は固体発酵などの小規模又は大規模発酵を挙げることができる。一般的に微生物は、セルロース系材料を加水分解可能な酵素の産生に適した細胞培地中で培養される。培養は、当該技術分野では周知の手順を用い、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む適当な栄養培地中で行われる。増殖及びセルラーゼ産生に適した培地、温度範囲及び他の条件は、当該技術分野では周知のものである。非限定的な例として、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）がセルラーゼを産生する通常の温度範囲は２４℃〜２８℃である。
【０１４２】
本開示は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド及びその変異体などのエンドグルカナーゼＩＶポリペプチド）を含む非天然組成物であって、エンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、エンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも２、３、４又は５種類のポリペプチド）、セロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、セロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも２、３、４又は５種類のポリペプチド）、グルコシダーゼ活性（例えばβ−グルコシダーゼ）を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、β−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも２、３、４又は５種類のポリペプチド）、キシラナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、キシラナーゼ活性を有する少なくとも２、３、４又は５種類のポリペプチド）、キシロシダーゼ活性（例えばβ−キシロシダーゼ）を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、β−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも２、３、４又は５種類のポリペプチド）、及び／又は、アラビノフラノシダーゼ活性（例えばＬ−α−アラビノフラノシダーゼ）を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する少なくとも２、３、４又は５種類のポリペプチド）を更に含む組成物を提供する。本明細書で提供される組成物中に含まれる各ポリペプチドの異なる量を、下記の「組成物中の各成分の量」の項に示す。
【０１４３】
本開示は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む全セルラーゼ（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド又はその変異体などのエンドグルカナーゼＩＶポリペプチドを濃縮化した全セルラーゼ）を含む非天然組成物であって、エンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、エンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも２、３、４又は５種類のポリペプチド）、セロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、セロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも２、３、４又は５種類のポリペプチド）、グルコシダーゼ活性（例えばβ−グルコシダーゼ）を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、β−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも２、３、４又は５種類のポリペプチド）、キシラナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、キシラナーゼ活性を有する少なくとも２、３、４又は５種類のポリペプチド）、キシロシダーゼ活性（例えばβ−キシロシダーゼ）を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、β−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも２、３、４又は５種類のポリペプチド）、及び／又は、アラビノフラノシダーゼ活性（例えばＬ−α−アラビノフラノシダーゼ）を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する少なくとも２、３、４又は５種類のポリペプチド）を更に含む非天然組成物を提供する。本明細書で提供される組成物中に含まれる各ポリペプチドの異なる量を、下記の「組成物中の各成分の量」の項に示す。
【０１４４】
一部の態様では、組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）、及びキシラナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、又はこれらの変異体）を含む。一部の態様では、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３である。組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、及び／又はＴｎ３Ｂ）を更に含みうる。組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、Ｔｎ３Ｂ、及び／又はこれらの変異体）を更に含みうる。組成物は、セロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）７Ａ、７Ｂ、Ｃ．グロボサム（C. globosum）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６Ａ、Ｓ．サーモファイル（S. thermophile）６Ａ、６Ｂ、又はこれらの変異体）を含みうる。組成物は、エンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ１（又はその変異体）及び／又はＴ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ２（又はその変異体））を更に含みうる。
【０１４５】
一部の態様では、組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）、及びβ−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、Ｔｎ３Ｂ、又はこれらの変異体）を含む。組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）、及びセロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（又は少なくとも２種類のポリペプチド）（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）７Ａ、７Ｂ、Ｃ．グロボサム（C. globosum）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６Ａ、Ｓ．サーモファイル（S. thermophile）６Ａ、６Ｂ、又はこれらの変異体）を含みうる。組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）を含み、更にエンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（又は少なくとも２種類のポリペプチド）（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ１（又はその変異体）及び／又はＴ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ２（又はその変異体））を含みうる。組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）、及びβ−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（又は少なくとも２種類のポリペプチド）（例えば、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、及び／又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１）を含みうる。組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）、及びβ−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（又は少なくとも２種類のポリペプチド）（例えば、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１、及び／又はこれらの変異体）を含みうる。組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）、及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（又は少なくとも２種類のポリペプチド）（例えばＡｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、Ｆｖ５１Ａ、又はこれらの変異体）を含みうる。
【０１４６】
一部の態様では、本明細書に述べられるポリペプチドのいずれ（例えば、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、グルコシダーゼ活性（例えばβ−グルコシダーゼ）を有するポリペプチド、キシラナーゼ活性を有するポリペプチド、キシロシダーゼ活性（例えばβ−キシロシダーゼ）を有するポリペプチド、又はアラビノフラノシダーゼ活性（例えばＬ−α−アラビノフラノシダーゼ）を有するポリペプチド）も、本明細書に述べられる全セルラーゼなどの全セルラーゼの成分でありうる。本明細書に述べられるポリペプチドはいずれも、対応するポリペプチドをコードした内因性又は外因性の遺伝子を発現させることによって製造することができる。ポリペプチドは、状況によって、過剰発現又は過小発現させることができる。
【０１４７】
上記に述べた組成物のすべてに関し、組成物中に含まれるポリペプチドの異なる量を、下記の「組成物中の各成分の量」の項に示す。
【０１４８】
エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド
エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドには、内部のβ−１，４結合の切断を触媒するポリペプチドが含まれる。エンドグルカナーゼ（「ＥＧ」）は、ＥＣ  ３．２．１．４．として分類されるセルラーゼ酵素群のことを指す。ＥＧ酵素は、セルロースの内部のβ−１，４グルコシド結合を加水分解する。ＥＧは、セルロース、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース）、リケニンの１，４−β−Ｄ−グルコシド結合、穀類のβ−Ｄ−グルカン又はキシログルカンなどのβ−１，３グルカン混合物、及びセルロース成分を含有する他の植物性材料のβ−１，４結合の内部加水分解を触媒する。ＥＧ活性は、Ｇｈｏｓｅ，１９８７，Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５９：２５７〜２６８の方法に従って、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）加水分解を用いて測定することができる。一部の態様では、エンドグルカナーゼを有する少なくとも１種類のポリペプチドには、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＨＭ６４１８６２．１）及び／又はＴ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ２ポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＡ６４５５３．１）が含まれる。
【０１４９】
熱安定性を有するＴ．テレストリス（T. terrestris）エンドグルカナーゼ（Ｋｖｅｓｉｔａｄａｚｅら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９５，５０：１３７〜１４３）が、別の例において、本開示の方法及び組成物で使用される。更に、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ３４２１３．１）（Ｏｋａｄａら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８８，６４：５５５〜５６３）、ＥＧ５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＰ５７７５４）（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９４，１３：２１９〜２２８）、ＥＧ６（図８９Ａ）（米国特許出願公開第２００７０２１３２４９号）、又はＥＧ７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＰ５７７５３）（米国特許出願公開第２００９０１７０１８１号）、Ａ．セルロリティカス（A. cellulolyticus）ＥＩエンドグルカナーゼ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ５４５８３．１）（米国特許第５，５３６，６５５号）、Ｈ．インソレンス（H. insolens）エンドグルカナーゼＶ（ＥＧＶ）（蛋白質構造バンク登録番号４ＥＮＧ）、Ｓ．ココスポラム（S. coccosporum）エンドグルカナーゼ（図８９Ｂ）（米国特許出願公開第２００７０１１１２７８号）、Ａ．アクリータス（A. aculeatus）エンドグルカナーゼＦ１−ＣＭＣ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ２２６６９．１）（Ｏｏｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９９０，１８：５８８４）、Ａ．カワチイ（A. kawachii）ＩＦＯ４３０８エンドグルカナーゼＣＭＣアーゼ−１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ９６ＷＱ８．１）（Ｓａｋａｍｏｔｏら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９９５，２７：４３５〜４３９）、Ｅ．カロトボーラ（E. carotovara）エンドグルカナーゼＣｅｌＳ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ２４８１７．１）（Ｓａａｒｉｌａｈｔｉら、Ｇｅｎｅ  １９９０，９０：９〜１４）、又はＡ．サーモフィラム（A. thermophilum）ＡＬＫＯ４２４５エンドグルカナーゼ（米国特許出願公開第２００７０１４８７３２号）を使用することもできる。更なる好適なエンドグルカナーゼが例えば、国際特許出願公開第ＷＯ  ９１／１７２４３号、同第ＷＯ  ９１／１７２４４号、同第ＷＯ  ９１／１０７３２号、米国特許第６，００１，６３９号に述べられている。エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、本明細書に示されるエンドグルカナーゼのいずれか１つの変異体であってよい。
【０１５０】
セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド
セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドには、セルロース、セロテトリオース、又はβ−１，４−結合したグルコースを含むあらゆるポリマー内の１，４−β−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒し、鎖の末端からセロビオースを放出させる、１，４−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９１）活性を有するポリペプチドが含まれる。本発明の目的では、セロビオヒドロラーゼ活性は、Ｌｅｖｅｒら、１９７２，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４７：２７３〜２７９のＰＨＢＡＨ法によって測定されるように、セルロースからの水溶性の還元糖の放出によって測定することができる。セロビオヒドロラーゼのエキソグルカナーゼ型の攻撃と、エンドグルカナーゼ型の攻撃との区別は、カルボキシメチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロースなどの置換セルロースからの還元糖の放出を同様に測定することによって行うことができる（Ｇｈｏｓｅ，１９８７，Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５９：２５７〜２６８）。真のセロビオヒドロラーゼは、置換セルロースに対して非置換のセルロースに極めて高い活性比を有している（Ｂａｉｌｅｙら、１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：６５〜７６）。
【０１５１】
好適なＣＢＨは、Ａ．ビスポラス（A. bisporus）ＣＢＨ１（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９２４００）、Ａ．アクリータス（A. aculeatus）ＣＢＨ１（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｏ５９８４３）、Ａ．ニデュランス（A. nidulans）ＣＢＨＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４２００１９）又はＣＢＨＢ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４２００２０）、Ａ．ニガー（A. niger）ＣＢＨＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１５６２６８）又はＣＢＨＢ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１５６２６９）、Ｃ．パープレア（C. purpurea）ＣＢＨ１（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｏ０００８２）、Ｃ．カルボナラム（C. carbonarum）ＣＢＨ１（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ００３２８）、Ｃ．パラシティカ（C. parasitica）ＣＢＨ１（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ００５４８）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）ＣＢＨ１（Ｃｅｌ７Ａ）（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ４６２３８）、Ｈ．グリセア（H. grisea）ＣＢＨ１．２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ５０５９４）、Ｈ．グリセアｖａｒ．サーモイデア（H. grisea var. thermoidea）ＣＢＨ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ６３５１５）、ＣＢＨＩ．２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１２３４４１）、又はｅｘｏ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ００３１０５）、Ｍ．アルボマイセス（M. albomyces）Ｃｅｌ７Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ５１５７０５）、Ｎ．クラッサ（N. crassa）ＣＢＨＩ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７７７７８）、Ｐ．フニクロサム（P. funiculosum）ＣＢＨＩ（Ｃｅｌ７Ａ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ３１２２９５）（米国特許出願公開第２００７０１４８７３０号）、Ｐ．ジャンチネラム（P. janthinellum）ＣＢＨＩ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ５６１７８）、Ｐ．クリソスポリウム（P. chrysosporium）ＣＢＨ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２２２２０）、又はＣＢＨＩ−２（Ｃｅｌ７Ｄ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２２６５６）、Ｔ．エメルソニイ（T. emersonii）ＣＢＨ１Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４３９９３５）、Ｔ．ビリデ（T. viride）ＣＢＨ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５３９３１）、又はＶ．ボルバセア（V. volvacea）Ｖ１４  ＣＢＨ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１５６６９３）から選択することができる。セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、本明細書に示されるＣＢＨのいずれか１つの変異体であってよい。
【０１５２】
一部の態様では、セロビオヒドロラーゼを有する少なくとも１種類のポリペプチドには、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ  １（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ６２６９４．１）（又はその変異体）及び／又はＴ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０７９８７．１）（又はその変異体）のポリペプチド（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９８３，１：６９１〜６９６を参照、また、Ｔｅｅｒｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９８３，１：６９６〜６９９も参照）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１のホモログである、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）７Ａ、７Ｂ、Ｃ．グロボサム（C. globosum）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）７Ａ、７Ｂ；Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２のホモログである、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６Ａ、Ｓ．サーモファイル（S. thermophile）６Ａ、６Ｂ、又はこれらの変異体が含まれる。
【０１５３】
グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド
グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドには、セロビオースの加水分解を触媒してβ−Ｄ−グルコースを放出させるβ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）活性を有するポリペプチドが含まれる。本発明の目的では、β−グルコシダーゼ活性は、例えばＨＰＬＣなどの当該技術分野では周知の方法によって測定することができる。グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドには、これらに限定されるものではないが、セロビオースの加水分解を触媒してβ−Ｄ−グルコースを放出させるＧＨファミリー１、３、９又は４８のメンバーを含む特定のＧＨファミリーのメンバーが含まれる。グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドには、組換え手法によって多くの微生物から得られるか又は販売元から購入されるβ−グルコシダーゼなどのβグルコシダーゼが含まれる。微生物に由来するβ−グルコシダーゼの例としては、これらに限定されるものではないが、細菌及び真菌類に由来するものが挙げられる。例えば、β−グルコシダーゼは好適には糸状菌から得られる。一部の態様では、グルコシダーゼ活性（例えばβ−グルコシダーゼ活性）を有する少なくとも１種類のポリペプチドは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）のＢｇｌ１ポリペプチドである。
【０１５４】
β−グルコシダーゼは、特にＡ．アクリータス（A. aculeatus）（Ｋａｗａｇｕｃｈｉら、Ｇｅｎｅ  １９９６，１７３：２８７〜２８８）、Ａ．カワチイ（A. kawachi）（Ｉｗａｓｈｉｔａら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９，６５：５５４６〜５５５３）、Ａ．オリザエ（A. oryzae）（国際特許出願公開第ＷＯ  ２００２／０９５０１４号）、Ｃ．ビアゾテア（C. biazotea）（Ｗｏｎｇら、Ｇｅｎｅ，１９９８，２０７：７９〜８６）、Ｐ．フニクロサム（P. funiculosum）（国際特許出願公開第ＷＯ  ２００４／０７８９１９号）、Ｓ．フィブリゲラ（S. fibuligera）（Ｍａｃｈｉｄａら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８８，５４：３１４７〜３１５５）、Ｓ．ポムベ（S. pombe）（Ｗｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ２００２，４１５：８７１〜８８０）、又はＴ．リーゼイ（T. reesei）（例えば、β−グルコシダーゼ１（米国特許第６，０２２，７２５号）、β−グルコシダーゼ３（米国特許第６，９８２，１５９号）、β−グルコシダーゼ４（米国特許第７，０４５，３３２号）、β−グルコシダーゼ５（米国特許第７，００５，２８９号）、β−グルコシダーゼ６（米国特許出願公開第２００６０２５８５５４号）、β−グルコシダーゼ７（米国特許出願公開第２００６０２５８５５４号））から得るか、又は組換えによって産生させることができる。β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、本明細書に示されるβ−グルコシダーゼのいずれか１つの変異体であってよい。
【０１５５】
β−グルコシダーゼは、β−グルコシダーゼをコードした内因性又は外因性遺伝子を発現させることにより産生させることもできる。例えば、β−グルコシダーゼは、グラム陽性菌（例えば、バチルス（Bacillus）又はアクチノマイセス（Actinomycetes））、又は真核生物宿主（例えば、トリコデルマ（Trichoderma）、アスペルギルス（Aspergillus）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、又はピチア（Pichia））によって細胞外空間に分泌させることができる。β−グルコシダーゼは、状況によって、過剰発現又は過小発現させることができる。
【０１５６】
β−グルコシダーゼは販売元から入手することもできる。使用に適した市販のβ−グルコシダーゼ調製物の例としては、例えば、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＢＧ（ダニスコ・ユー・エス社、ジェネンコア（Danisco US Inc., Genencor））中のＴ．リーゼイ（T. reesei）β−グルコシダーゼ；ＮＯＶＯＺＹＭ（商標）１８８（Ａ．ニガー（A. niger）由来のβ−グルコシダーゼ）；アグロバクテリウムｓｐ．（Agrobacterium sp.）のβ−グルコシダーゼ、及びＭｅｇａｚｙｍｅ（メガザイム・インターナショナル・アイルランド社（Megazyme International Ireland Ltd.）（アイルランド））より得られるＴ．マリティマ（T. maritima）β−グルコシダーゼが挙げられる。
【０１５７】
β−グルコシダーゼ活性は、Ｃｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １９９２，１２１：５４〜６０に述べられるアッセイなどの、当該技術分野では周知の多くの適当な手段によって測定すること可能であり、当該アッセイでは、１ｐＮＰＧは、５０℃（１２２°Ｆ）及びｐＨ  ４．８で、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドから１μｍｏＬのニトロフェノールが１０分間に遊離することを示す。
【０１５８】
キシラナーゼ活性を有するポリペプチド
キシラナーゼ活性は、比色アゾ−バーチウッドキシランアッセイ（Ｓ−ＡＸＢＬ、メガザイム・インターナショナル・アイルランド社（Megazyme International Ireland Ltd.）（アイルランド））を使用して測定することができる。
【０１５９】
キシラナーゼ活性を有するポリペプチドとしては、例えばＸｙｎ、Ｘｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ２、及び／又はＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチド、又はこれらの変異体から選択されるグループＡのキシラナーゼが挙げられる。
【０１６０】
本明細書に述べられる組成物のいずれも、以上のグループＡキシラナーゼに加えて、又はそれに代えて１以上のキシラナーゼを必要に応じて含みうる。更なる１以上のキシラナーゼとして、任意のキシラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８）を使用することができる。好適なキシラナーゼとしては、例えばＣ．サッカロリティカム（C. saccharolyticum）キシラナーゼ（Ｌｕｔｈｉら、１９９０，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６（９）：２６７７〜２６８３）、Ｔ．マリティマ（T. maritima）キシラナーゼ（Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ  ＆  Ｌｉｅｂｅｌ，１９９５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１（５）：１８１０〜１８１５）、サーマトガＳｐ．株（Thermatoga Sp. Strain）ＦＪＳＳ−Ｂ．１キシラナーゼ（Ｓｉｍｐｓｏｎら、１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７７，４１３〜４１７）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）キシラナーゼ（ＢｃＸ）（米国特許第５，４０５，７６９号）、Ａ．ニガー（A. niger）キシラナーゼ（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら、１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７９（５）：４２２〜４２８）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）キシラナーゼ（Ｓｈａｒｅｃｋら、１９９１，Ｇｅｎｅ  １０７：７５〜８２；Ｍｏｒｏｓｏｌｉら、１９８６  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３９：５８７〜５９２；Ｋｌｕｅｐｆｅｌら、１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８７：４５〜５０）、Ｂ．サブティリス（B. subtilis）キシラナーゼ（Ｂｅｒｎｉｅｒら、１９８３，Ｇｅｎｅ  ２６（１）：５９〜６５）、Ｃ．フィミ（C. fimi）キシラナーゼ（Ｃｌａｒｋｅら、１９９６，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １３９：２７〜３５）、Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）キシラナーゼ（Ｇｉｌｂｅｒｔら、１９８８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３４：３２３９〜３２４７）、Ｃ．サーモセラム（C. thermocellum）キシラナーゼ（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚら、１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：５６９〜５７６）、Ｂ．プミラス（B. pumilus）キシラナーゼ（Ｎｕｙｅｎｓら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００１，５６：４３１〜４３４；Ｙａｎｇら、１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６（１４Ｂ）：７１８７）、Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）Ｐ２６２キシラナーゼ（Ｚａｐｐｅら、１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（８）：２１７９）、又はＴ．ハルジアナム（T. harzianum）キシラナーゼ（Ｒｏｓｅら、１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９４（４）：７５５〜７５６）が挙げられる。キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、本明細書に示されるキシラナーゼのいずれか１つの変異体であってよい。
【０１６１】
キシロシダーゼ（β−キシロシダーゼ）活性を有するポリペプチド
キシロシダーゼ（例えばβ−キシロシダーゼ）活性は、発色性基質である４−ニトロフェニルβ−Ｄ−キシロピラノシド（ｐＮＰＸ、シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）Ｎ２１３２）を使用して測定することができる。
【０１６２】
キシロシダーゼ（例えばβ−キシロシダーゼ）活性を有するポリペプチドは、グループ１のβ−キシロシダーゼ酵素（例えばＦｖ３Ａ又はＦｖ４３Ａ）又はグループ２のβ−キシロシダーゼ酵素（例えば、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１、又はこれらの変異体）でありうる。一部の態様では、本明細書で提供される組成物のいずれも、１以上のグループ１のβ−キシロシダーゼ及び１以上のグループ２のβ−キシロシダーゼを好適に含みうる。
【０１６３】
本開示の酵素ブレンド／組成物のような、本明細書で提供される組成物のいずれのものも、上記のグループ１及び／又はグループ２のβ−キシロシダーゼに加えて、又はこれに代えて１以上のβ−キシロシダーゼを必要に応じて含みうる。更なるβ−キシロシダーゼとして、任意のβ−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３７）を使用することができる。好適なβ−キシロシダーゼとしては、例えば、Ｔ．エメルソニイ（T. emersonii）Ｂｘｌ１（Ｒｅｅｎら、２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３０５（３）：５７９〜８５）、Ｇ．ステアロサーモフィラス（G. stearothermophilus）β−キシロシダーゼ（Ｓｈａｌｌｏｍら、２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：３８７〜３９７）、Ｓ．サーモフィラム（S. thermophilum）β−キシロシダーゼ（Ｚａｎｏｅｌｏら、２００４，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：１７０〜１７６）、Ｔ．リグノラム（T. lignorum）β−キシロシダーゼ（Ｓｃｈｍｉｄｔ，１９９８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６０：６６２〜６７１）、Ａ．アワモリ（A. awamori）β−キシロシダーゼ（Ｋｕｒａｋａｋｅら、２００５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １７２６：２７２〜２７９）、Ａ．ベルシカラー（A. versicolor）β−キシロシダーゼ（Ａｎｄｒａｄｅら、２００４，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１９３１〜１９３８）、ストレプトマイセスｓｐ．（Streptomyces sp.）β−キシロシダーゼ（Ｐｉｎｐｈａｎｉｃｈａｋａｒｎら、２００４，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：７２７〜７３３）、Ｔ．マリティマ（T. maritima）β−キシロシダーゼ（Ｘｕｅ  ａｎｄ  Ｓｈａｏ，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２６：１５１１〜１５１５）、トリコデルマｓｐ．（Trichoderma sp.）ＳＹ  β−キシロシダーゼ（Ｋｉｍら、２００４，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：６４３〜６４５）、Ａ．ニガー（A. niger）β−キシロシダーゼ（Ｏｇｕｎｔｉｍｅｉｎ  ａｎｄ  Ｒｅｉｌｌｙ，１９８０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２２：１１４３〜１１５４）、又はＰ．ウォートマニイ（P. wortmanni）β−キシロシダーゼ（Ｍａｔｓｕｏら、１９８７，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１：２３６７〜２３７９）が挙げられる。キシロシダーゼ（例えばβ−キシロシダーゼ）活性を有するポリペプチドは、本明細書に示されるキシロシダーゼのいずれか１つの変異体であってよい。
【０１６４】
アラビノフラノシダーゼ活性は、発色性基質である４−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシド（ｐＮＰＡ、シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）Ｎ３６４１）により測定することができる。
【０１６５】
本開示の酵素ブレンド／組成物のような、本明細書で提供される組成物のいずれのものも、例えばＬ−α−アラビノフラノシダーゼなどのアラビノフラノシダーゼ活性（例えばＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性）を有する少なくとも１種類のポリペプチドを好適に含みうる。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼは、例えば、Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、Ｆｖ５１Ａ、又はこれらの変異体であってよい。
【０１６６】
本開示の酵素ブレンド／組成物は、上記のＬ−α−アラビノフラノシダーゼに加えて、又はこれに代えて１以上のＬ−α−アラビノフラノシダーゼを必要に応じて含みうる。更なるＬ−α−アラビノフラノシダーゼとして、任意の適当な生物に由来するＬ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５５）を使用することができる。好適なＬ−α−アラビノフラノシダーゼとしては、例えば、Ａ．オリザエ（A. oryzae）（Ｎｕｍａｎ  ＆  Ｂｈｏｓｌｅ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６，３３：２４７〜２６０）、Ａ．ソジャエ（A. sojae）（Ｏｓｈｉｍａら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．２００５，５２：２６１〜２６５）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）（Ｎｕｍａｎ  ＆  Ｂｈｏｓｌｅ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６，３３：２４７〜２６０）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（B. stearothermophilus）（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４，１４：４７４〜４８２）、Ｂ．ブレビ（B. breve）（Ｓｈｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，６９：７１１６〜７１２３）、Ｂ．ロンガム（B. longum）（Ｍａｒｇｏｌｌｅｓら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，６９：５０９６〜５１０３）、Ｃ．サーモセラム（C. thermocellum）（Ｔａｙｌｏｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００６，３９５：３１〜３７）、Ｆ．オキシスポラム（F. oxysporum）（Ｐａｎａｇｉｏｔｏｕら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，４９：６３９〜６４４）、Ｆ．オキシスポラムｆ．ｓｐ．ディアンチ（F. oxysporum f. sp. dianthi）（Ｎｕｍａｎ  ＆  Ｂｈｏｓｌｅ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６，３３：２４７〜２６０）、Ｇ．ステアロサーモフィルス（G. stearothermophilus）Ｔ−６（Ｓｈａｌｌｏｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７：４３６６７〜４３６７３）、Ｈ．ブルゲア（H. vulgare）（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，２７８：５３７７〜５３８７）、Ｐ．クリソゲニウム（P. chrysogenum）（Ｓａｋａｍｏｔｏら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２００３，１６２１：２０４〜２１０）、ペニシリウムｓｐ．（Penicillium sp.）（Ｒａｈｍａｎら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，４９：５８〜６４）、Ｐ．セルローサ（P. cellulosa）（Ｎｕｍａｎ  ＆  Ｂｈｏｓｌｅ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６，３３：２４７〜２６０）、Ｒ．プシラス（R. pusillus）（Ｒａｈｍａｎら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２００３，３３８：１４６９〜１４７６）、Ｓ．シャルトロイシス（S. chartreusis）、Ｓ．サーモビオラカス（S. thermoviolacus）、Ｔ．エタノリカス（T. ethanolicus）、Ｔ．キシラニリティカス（T. xylanilyticus）（Ｎｕｍａｎ  ＆Ｂｈｏｓｌｅ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６，３３：２４７〜２６０）、（Ｔ．フスカ）（T. fusca）（Ｔｕｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，（Ｐｒａｈａ）４８：１６８〜１７２）、Ｔ．マリティマ（T. maritima）（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  ２００５，９：３９９〜４０６）、トリコデルマｓｐ．（Trichoderma sp.）ＳＹ（Ｊｕｎｇら、Ａｇｒｉｃ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，４８：７〜１０）、Ａ．カワチイ（A. kawachii）（Ｋｏｓｅｋｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２００６，１７６０：１４５８〜１４６４）、Ｆ．オキシスポラムｆ．ｓｐ．ディアンチ（F. oxysporum f. sp. dianthi）（Ｃｈａｃｏｎ−Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．２００４，６４：２０１〜２０８）、Ｔ．キシラニリティカス（T. xylanilyticus）（Ｄｅｂｅｃｈｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．２００２，１５：２１〜２８）、Ｈ．インソレンス（H. insolens）、Ｍ．ギガンテウス（M. giganteus）（Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００７，２３：１００〜１０７）、又は、Ｒ．サティバス（R. sativus）（Ｋｏｔａｋｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．２００６，５７：２３５３〜２３６２）のＬ−α−アラビノフラノシダーゼが挙げられる。アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドは、本明細書に述べられるアラビノフラノシダーゼのいずれか１つの変異体でありうる。
【０１６７】
本明細書に述べられる組成物のいずれか１つの一部の態様では、エンドグルカナーゼ活性を有する１種類のポリペプチドは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ１（又はその変異体）及び／又はＴ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ２（又はその変異体）を含む。本明細書に述べられる組成物のいずれか１つの一部の態様では、セロビオヒドロラーゼ（「ＣＢＨ」）活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）７Ａ、７Ｂ、Ｃ．グロボサム（C. globosum）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６Ａ、Ｓ．サーモファイル（S. thermophile）６Ａ、６Ｂ、又はこれらの変異体を含む。本明細書に述べられる組成物のいずれか１つの一部の態様では、β−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドは、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、及び／又はＴｎ３Ｂを含む。本明細書に述べられる組成物のいずれか１つの一部の態様では、β−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドは、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、Ｔｎ３Ｂ、及び／又はこれらの変異体を含む。本明細書に述べられる組成物のいずれか１つの一部の態様では、キシラナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ２、及び／又はＡｆｕＸｙｎ５を含む。本明細書に述べられる組成物のいずれか１つの一部の態様では、キシラナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、及び／又はこれらの変異体を含む。本明細書に述べられる組成物のいずれか１つの一部の態様では、β−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドは、グループ１のβ−キシロシダーゼ又はグループ２のβ−キシロシダーゼであり、ただし、グループ１のβ−キシロシダーゼは、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、又はこれらの変異体を含み、グループ２のβ−キシロシダーゼは、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１、又はこれらの変異体を含む。一部の態様では、β−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドは、Ｆ．バーディシロイデス（F. verticillioides）Ｆｖ３Ａ、Ｆ．バーディシロイデス（F. verticillioides）Ｆｖ４３Ｄ、又はこれらの変異体を含む。本明細書に述べられる組成物のいずれか１つの一部の態様では、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドは、Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、及び／又はＦｖ５１Ａを含む。本明細書に述べられる組成物のいずれか１つの一部の態様では、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドは、Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ���１Ａ、Ｐａ５１Ａ、Ｆｖ５１Ａ、及び／又はこれらの変異体を含む。
【０１６８】
全セルラーゼ
本開示の酵素ブレンド／組成物などの、本明細書で提供される組成物のいずれも、全セルラーゼを含みうる。
【０１６９】
本明細書で使用するところの「全セルラーゼ」とは、（１）エンドグルカナーゼ、（２）セロビオヒドロラーゼ、及び（３）β−グルコシダーゼの少なくとも３つの異なる種類の酵素を含むか、又は、（１）内部のβ−１，４結合の切断を触媒し、より短鎖のグルコオリゴ糖を生じるエンドグルカナーゼ活性、（２）セロビオース単位（β−１，４グルコース−グルコースの二糖）の「エキソ」型の放出を触媒するセロビオヒドロラーゼ活性、及び（３）短鎖のセロオリゴ糖（例えばセロビオース）からのグルコースモノマーの放出を触媒するβ−グルコシダーゼ活性の少なくとも３つの異なる酵素活性を有する、天然又は非天然のセルラーゼ含有組成物のいずれかのことを指す。全セルラーゼは、エンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、ＥＧ２（又はその変異体）及び／又はＥＧ４（又はその変異体））、セロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、ＣＢＨ１（又はその変異体）及び／又はＣＢＨ２（又はその変異体））、及び、β−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えばＢｇｌ１又はその変異体）を含みうる。
【０１７０】
「天然セルラーゼ含有」組成物とは、１以上のセロビオヒドロラーゼ型の成分又は活性、１以上のエンドグルカナーゼ型の成分又は活性、及び１以上のβ−グルコシダーゼ型の成分又は活性含む、天然の供給源によって産生される組成物のことであり、これらの成分又は活性のそれぞれは、人の手が加えられていない自然界で生じる比及び濃度で見出される。したがって、天然セルラーゼ含有組成物とは、例えば、セルロース分解酵素に関する改変が行われていない微生物によって産生されることにより、自然界において天然の微生物により産生されるものと成分酵素の比又は濃度が変化していない組成物である。「非天然セルラーゼ含有組成物」とは、（１）セルロース分解成分酵素を天然の存在比、若しくは非天然、すなわち改変された比のいずれかで合わせること、又は（２）１以上のセルロース分解酵素を過剰発現若しくは過小発現するように微生物を改変すること、又は（３）少なくとも１つのセルロース分解性酵素が欠失するように微生物を改変することによって生成される組成物を指す。「非天然セルラーゼ含有」組成物とは、天然の微生物が非天然条件下で増殖して、濃度又は比が変化した酵素を産生するように天然微生物の培養条件を調整することで得られる組成物のことも指す場合がある。したがって、一部の実施形態では、本開示の全セルラーゼ調製物は、１以上のＥＧ及び／又はＣＢＨ及び／又はβ−グルコシダーゼが欠失及び／又は過剰発現されている。
【０１７１】
一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド又はその変異体などのエンドグルカナーゼＩＶポリペプチド）を含む非天然組成物、又はＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド又はその変異体などのエンドグルカナーゼＩＶポリペプチドが濃縮化された全セルラーゼ）を含む非天然組成物が提供され、ただしその組成物は、全セルラーゼ、エンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも１種類（例えば、エンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも２、３、４、又は５種類）のポリペプチド、セロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１種類（例えば、セロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも２、３、４、又は５種類）のポリペプチド、グルコシダーゼ（例えばβ−グルコシダーゼ）活性を有する少なくとも１種類（例えば、β−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも２、３、４、又は５種類）のポリペプチド、キシラナーゼ活性を有する少なくとも１種類（例えば、キシラナーゼ活性を有する少なくとも２、３、４、又は５種類）のポリペプチド、キシロシダーゼ（例えばβ−キシロシダーゼ）活性を有する少なくとも１種類（例えば、β−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも２、３、４、又は５種類）のポリペプチド、及び／又は、アラビノフラノシダーゼ（例えばＬ−α−アラビノフラノシダーゼ）活性を有する少なくとも１種類（例えば、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼを有する少なくとも２、３、４、又は５種類）のポリペプチドを更に含む。異なる酵素活性を有するこれらのポリペプチドについては、上記に述べた。
【０１７２】
一部の態様では、全セルラーゼは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ２、又はこれらの変異体などのエンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドを含む。一部の態様では、全セルラーゼは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２、又はこれらの変異体などのセロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドを含む。一部の態様では、全セルラーゼは、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、Ｔｎ３Ｂ、又はこれらの変異体などのβ−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドを含む。
【０１７３】
本開示では、全セルラーゼ調製物は、セルロース系材料を加水分解可能な任意の微生物由来のものでありうる。一部の実施形態では、全セルラーゼ調製物は、真菌又は細菌の全セルラーゼである。例えば、全セルラーゼ調製物は、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、エメリセラ（Emericella）、フザリウム（Fusarium）、フミコラ（Humicola）、ムコール（Mucor）、マイセリオフトラ（Myceliophthora）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicillium）、スシタリジウム（Scytalidium）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トリコデルマ（Trichoderma）属、又は酵母種由来のものでありうる。
【０１７４】
全セルラーゼ調製物は、例えば、アスペルギルス・アクリータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フォエチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillusjaponicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）の全セルラーゼでありうる。更に、全セルラーゼ調製物は、フザリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クルックウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・レティクラタム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サムブシナム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコクロム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイド（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・サルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイド（Fusarium trichothecioides）、又はフザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）の全セルラーゼ調製物でありうる。全セルラーゼ調製物は、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Chrysosporium lucknowence）、フミコラ ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・パープロゲナム（Penicillium purpurogenum）、ペニシリウム・フニクロサム（Penicillium funiculosum）、スシタリジウム・サーモフィラム（Scytalidium thermophilum）、又はチエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）の全セルラーゼ調製物でもあってもよい。全セルラーゼ調製物は、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）（例えば、ＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  Ｇら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８４，２０，ｐｐ．４６〜５３）、ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６９２１）、ＮＲＲＬ  １５７０９、ＡＴＣＣ  １３６３１、５６７６４、５６４６６、５６７６７）、又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）（例えば、ＡＴＣＣ  ３２０９８及び３２０８６）の全セルラーゼ調製物であってもよい。
【０１７５】
全セルラーゼ調製物は、組み込み株であるＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｈ３Ａ又はＨ３Ａ／Ｅｇ４＃２７（本明細書の実施例で述べる）調製物であってもよい。
全セルラーゼ調製物は、好適には、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＡＴＣＣ  ５６７６５として入手可能なＴ．リーゼイ（T. reesei）ＲｕｔＣ３０全セルラーゼ調製物でありうる。例えば、全セルラーゼ調製物は、好適には、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより、Ｐ．フニクロサム（P. funiculosum）ＡＴＣＣ番号：１０４４６として入手可能なＰ．フニクロサム（P. funiculosum）の全セルラーゼであってもよい。
【０１７６】
全セルラーゼ調製物は販売元から入手することもできる。本開示の方法及び組成物における使用に適した市販のセルロース調製物の例としては、例えば、ＣＥＬＬＵＣＬＡＳＴ（商標）及びＣｅｌｌｉｃ（商標）（ノボザイム社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ））、並びにＬＡＭＩＮＥＸ（商標）ＢＧ、ＩｎｄｉＡｇｅ（商標）４４Ｌ、Ｐｒｉｍａｆａｓｔ（商標）１００、Ｐｒｉｍａｆａｓｔ（商標）２００、Ｓｐｅｚｙｍｅ（商標）ＣＰ、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１０００、及びＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００（ダニスコ・ユー・エス社、ジェネンコア（Danisco US Inc., Genencor））が挙げられる。
【０１７７】
好適な全セルラーゼ調製物は、セルロース系材料を加水分解可能な酵素の発現につながる、任意の公知の微生物培養法、特に発酵を用いて調製することができる。本明細書で使用するところの「発酵」なる用語は、セルラーゼ及び／又は対象とする酵素の発現及び／又は単離を可能とする好適な培地中及び条件下で行われる、フラスコ振盪培養法、実験用又は工業用発酵槽中での連続培養、回分培養、流加培養、又は固体発酵などの小規模又は大規模発酵のことを指す。一般的に微生物は、セルロース系材料を加水分解可能な酵素の産生に適した細胞培地中で培養される。培養は、周知の方法及び変法を用いて、炭素源及び窒素源並びに無機塩類を含む栄養培地中で行なわれる。増殖及びセルラーゼ産生用の培地、温度範囲及び他の条件は周知のものである。非限定的な例として、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）がセルラーゼを産生する一般的な温度範囲は２４℃〜２８℃である。
【０１７８】
全セルラーゼ調製物は、回収及び／又は精製をまったく行わないか又は最小限に留めて、発酵により産生されたものをそのまま使用することができる。この意味では、全セルラーゼ調製物を全ブロス配合物に用いることができる。例えば、細胞培地にセルラーゼが分泌された後、セルラーゼを含有する細胞培地を直接使用することができる。全セルラーゼ調製物は、使用済み細胞培地、細胞外酵素及び細胞を含む、発酵材料の未分画含有物を含みうる。その一方で、全セルラーゼ調製物は、例えば、沈殿、遠心分離、アフィニティクロマトグラフィー、濾過などの多くの通常行われる工程で更なる処理を行うこともできる。例えば全セルラーゼ調製物は、濃縮した後、更なる精製を行わずに使用することができる。全セルラーゼ調製物は、例えば発酵後の細胞生存率を低下させるか又は細胞を死滅させる特定の化学物質を含むように配合することができる。細胞は、例えば周知の方法を用いて溶解又は透過処理することができる。
【０１７９】
全セルラーゼ調製物のエンドグルカナーゼ活性は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を基質として用いて測定することができる。好適なアッセイでは、１単位を毎分１μｍｏＬの生成物を遊離する酵素の量として、酵素混合物がＣＭＣに対して作用することで生成される還元末端の生成量を測定する（Ｇｈｏｓｅ，Ｔ．Ｋ．Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７，５９，ｐｐ．２５７〜２６８）。
【０１８０】
全セルラーゼは、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを濃縮化した、例えば、ＥＧ  ＩＶ濃縮化（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド又はその変異体を濃縮化した）セルラーゼとすることができる。ＥＧ  ＩＶ濃縮化全セルラーゼは、ＥＧ  ＩＶポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド又はその変異体）及び全セルラーゼ調製物を一般的に含む。ＥＧ  ＩＶ濃縮化全セルラーゼ組成物は、組み換え手段によって生成することができる。例えば、このような全セルラーゼ調製物は、全セルラーゼを産生することが可能な微生物中でＥＧ  ＩＶを発現させることで得ることができる。ＥＧ  ＩＶ濃縮化全セルラーゼ組成物は、例えば全セルラーゼ調製物及びＥＧ  ＩＶ（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド又はその変異体）を含んでもよい。例えば、ＥＧ  ＩＶ濃縮化（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド又はその変異体を濃縮化した）全セルラーゼ組成物は、好適には、そのブレンド／組成物中のタンパク質の全重量に対して少なくとも０．１重量％、１重量％、２重量％、５重量％、７重量％、１０重量％、１５重量％、又は２０重量％、かつ最大で２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、又は５０重量％のＥＧ  ＩＶを含みうる。
【０１８１】
全セルラーゼは、β−グルコシダーゼ濃縮化セルラーゼであってもよい。β−グルコシダーゼ濃縮化全セルラーゼは一般的に、β−グルコシダーゼ及び全セルラーゼ調製物を含む。β−グルコシダーゼ濃縮化全セルラーゼ組成物は、組み換え手法により生成することができる。例えばこのような全セルラーゼ調製物は、全セルラーゼを産生することが可能な微生物中でβ−グルコシダーゼを発現させることで得ることができる。β−グルコシダーゼ濃縮化全セルラーゼ組成物は、例えば全セルラーゼ調製物及びβ−グルコシダーゼを一般的に含んでもよい。例えばβ−グルコシダーゼ濃縮化全セルラーゼ組成物は、好適には、そのブレンド／組成物中のタンパク質の総重量に対して少なくとも０．１重量％、１重量％、２重量％、５重量％、７重量％、１０重量％、１５重量％、又は２０重量％、かつ最大で２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、又は５０重量％のβ−グルコシダーゼを含みうる。
【０１８２】
ある種の真菌は、エキソセロビオヒドロラーゼ又はＣＢＨ型セルラーゼ、エンドグルカナーゼ又はＥＧ型セルラーゼ、及びβ−グルコシダーゼ又はＢＧ型セルラーゼを含む完全セルラーゼ系を産生する（Ｓｃｈｕｌｅｉｎ，１９８８）。しかしながら、時としてこれらの系はＣＢＨ型セルラーゼを含んでおらず、例えば、細菌セルラーゼも一般的にＣＢＨ型セルラーゼをほとんど又はまったく含んでいない。更に、ＥＧ成分及びＣＢＨ成分は、相乗的に相互作用することでセルロースをより効率的に分解することが示されている。（例えば、Ｗｏｏｄ，１９８５を参照）異なる成分、すなわち多成分又は完全セルラーゼ系中の異なるエンドグルカナーゼ及びエキソセロビオヒドロラーゼは、一般的に、例えば等電点、分子量、グリコシル化度、基質特異性及び酵素の作用パターンなどの異なる特性を有している。
【０１８３】
一部の態様では、セルラーゼは、回収及び／又は精製をまったく行わないか又は最小限に留め、発酵により産生されたものがそのまま使用される。例えば、細胞により細胞培地中にセルラーゼが分泌された後、このセルラーゼを含有する細胞培地を使用することができる。一部の態様では、全セルラーゼ調製物は、細胞培地、細胞外酵素及び細胞を含む、発酵材料の未分画の含有物を含みうる。また、全セルラーゼ調製物は、例えば沈殿、遠心分離、親和性、濾過、又は当該技術分野では周知の他の任意の方法などの任意の便宜のよい方法によって処理することもできる。一部の態様では、全セルラーゼ調製物は、例えば濃縮した後、更なる精製を行うことなく使用することができる。一部の態様では、全セルラーゼ調製物は、細胞生存率を低下させるか、又は細胞を死滅させる化学物質を含む。一部の態様では、当該技術分野では周知の方法を用いて細胞を溶解又は透過処理することができる。
【０１８４】
ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）を含み、更に少なくとも１種類のセルラーゼポリペプチド及び／又は少なくとも１種類のヘミセルラーゼポリペプチドを含む組成物であって、セルラーゼポリペプチド及び／又はヘミセルラーゼポリペプチドが、そのセルラーゼポリペプチド及び／又はヘミセルラーゼポリペプチドを発現する宿主細胞とは異種である、組成物が提供される。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）を含み、更に少なくとも１種類のセルラーゼポリペプチド及び／又は少なくとも１種類のヘミセルラーゼポリペプチドを含む組成物であって、セルラーゼポリペプチド及び／又はヘミセルラーゼポリペプチドが宿主細胞により発現され、かつ、セルラーゼポリペプチド及び／又はヘミセルラーゼポリペプチドが宿主細胞に内因性のものである、組成物が提供される。セルラーゼポリペプチドは、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ１又はその変異体、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ２又はその変異体）、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）７Ａ、７Ｂ、Ｃ．グロボサム（C. globosum）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）７Ａ、７Ｂ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２、Ｔ．テレストリス（T. terrestris）６Ａ、Ｓ．サーモファイル（S. thermophile）６Ａ、６Ｂ、又はこれらの変異体）、又はβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、Ｔｎ３Ｂ、又はこれらの変異体）を含みうる。ヘミセルラーゼポリペプチドは、キシラナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、又はこれらの変異体）、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１、又はこれらの変異体）、又はＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、Ｆｖ５１Ａ、又はこれらの変異体）を含みうる。
【０１８５】
一部の態様では、組成物は発酵ブロスから得られる。組成物は、ある株の発酵ブロスから得られるものであってよく、その場合、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ４又はその変異体）をコードした核酸は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現する（例えば、株に組み込まれるか又は宿主株内のベクターにより発現される）宿主細胞とは異種である。組成物は、組み込み株（例えば、実施例に示されるＨ３Ａ／Ｅｇ４、＃２７）の発酵ブロスから得られるものであってもよい。
【０１８６】
ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）を含む組成物は、全セルラーゼを含んでもよい。したがって、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４（又はその変異体）、Ｔ．リーゼイ（T. reeseｉ）Ｂｇｌ１（又はその変異体）、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ｘｙｎ３（又はその変異体）、Ｆｖ３Ａ（又はその変異体）、Ｆｖ４３Ｄ（又はその変異体）、及びＦｖ５１Ａ（又はその変異体）を含む組成物（例えば非天然組成物）が提供される。
【０１８７】
一部の態様では、組成物は単離されたＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を含む。一部の態様では、組成物は、単離されたＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、単離されたＴ．リーゼイ（T. reesei）ｘｙｎ３、単離されたＦｖ３Ａ、単離されたＦｖ４３Ｄ、及び単離されたＦｖ５１Ａのうちの少なくとも１つ（少なくとも２、３、４、又は５つ）を含む。
【０１８８】
一部の態様では、組成物は発酵ブロスから得られる。一部の態様では、組成物は、組み込み株（例えば、本明細書の実施例に示されるＨ３Ａ／Ｅｇ４、＃２７）の発酵ブロスから得られる。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４をコードした核酸は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を発現する宿主細胞とは異種であってよい。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ５１Ａ、又はこれらの変異体をコードした少なくとも１つの核酸は、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を発現する宿主細胞などの宿主細胞と異種であってよい。一部の態様では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ５１Ａ、又はその変異体をコードした少なくとも１つの核酸が、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を発現する宿主細胞などの宿主細胞に内因性である。
【０１８９】
上記に述べた組成物のすべてに関し、組成物中に含まれるポリペプチドの異なる量を、下記の「組成物中の各成分の量」の項に述べる。
【０１９０】
組成物中の各成分の量
本明細書において提供されるＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む非天然組成物（又はＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む全セルラーゼを含む非天然組成物）は、本明細書に述べられるような異なる成分を含みうるものであり、各成分は組成物中に異なる量で存在する。
【０１９１】
本明細書において提供される組成物又は方法のいずれか１つの一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）は、バイオマス材料の加水分解から得られる発酵性糖の収率を、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）の非存在下での収率と比較して高める（例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％のいずれか）うえで充分な量で組成物中に存在する。本明細書において提供される組成物又は方法のいずれか１つでは、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）は、バイオマス材料の加水分解の際のバイオマス混合物の粘度を、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）の非存在下での加水分解の際のバイオマス混合物の粘度と比較して低下させる（例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％のいずれか）うえで充分な量で組成物中に存在しうる。組成物は、エンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド、セロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド、β−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド、キシラナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド、β−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド、及び／若しくは全セルラーゼ、又はこれらの混合物を更に含みうる。エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの量、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの量、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドの量、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドの量、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドの量、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの量、又は全セルラーゼの量は、バイオマス材料の加水分解から得られる発酵性糖の収率を、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、キシラナーゼ活性を有するポリペプチド、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド、又は全セルラーゼの非存在下での収率と比較して高める（例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％のいずれか）うえで充分な量である。一部の態様では、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの量、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの量、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドの量、キシラ���ーゼ活性を有するポリペプチドの量、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドの量、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの量、又は全セルラーゼの量は、バイオマス材料の加水分解の際のバイオマス混合物の粘度を、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、キシラナーゼ活性を有するポリペプチド、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド、又は全セルラーゼの非存在下でのバイオマス混合物の粘度と比較して低下させる（例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％のいずれか）うえで充分な量である。
【０１９２】
ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド又はその変異体を含むＥＧ  ＩＶなど）は、本明細書に述べられるいずれかの組成物（本明細書において提供されるいずれかの酵素ブレンド／組成物中など）中に、組成物中のタンパク質の全重量の少なくとも約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、又は５０重量％のいずれかの量で存在しうる。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド又はその変異体を含むＥＧ  ＩＶなど）は、本明細書に述べられるいずれかの組成物（本明細書において提供されるいずれかの酵素ブレンド／組成物など）中に、組成物中のタンパク質の全重量の約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、又は８０重量％のいずれかを超えない量で存在しうる。ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド又はその変異体を含むＥＧ  ＩＶなど）は、本明細書に述べられるいずれかの組成物（本明細書において提供されるいずれかの酵素ブレンド／組成物など）中に、上限値及び下限値を有する範囲を有する量で存在しうる。例えば、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの下限値は、組成物中のタンパク質の全重量の約０．０１重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、又は５０重量％のいずれかである。ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの上限値は、組成物中のタンパク質の全重量の約１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、又は７０重量％のいずれかである。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド又はその変異体を含むＥＧ  ＩＶなど）は、本明細書に述べられるいずれかの組成物（本明細書において提供されるいずれかの酵素ブレンド／組成物など）中に、組成物中のタンパク質の全重量の約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、又は８０重量％のいずれかの量で存在しうる。ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又���その変異体）は、組成物中のタンパク質の全重量の約１０重量％又は１２重量％で存在しうる。組成物は、エンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも２種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ１、及び／若しくはＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ２、又はこれらの変異体）を有してもよく、その場合、エンドグルカナーゼを有するポリペプチドの全量は、組成物中のタンパク質の全重量の約０．１〜約５０重量％（例えば、約０．５〜約４５重量％、約１〜約３０重量％、約２〜約２０重量％、約５〜約２０重量％、又は約８〜約１５重量％）である。ＧＨ６１／エンドグルカナーゼを有するポリペプチドは、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現する宿主細胞と異種であっても、宿主細胞に内因性のものであってもよい。組成物中に含まれるＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、単離されてもよい。
【０１９３】
一部の態様では、本明細書に述べられる酵素組成物（例えば酵素組成物）は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む全セルラーゼ組成物である。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド又はその変異体を含むＥＧ  ＩＶなど）は、全セルラーゼの全重量の少なくとも約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、又は５０重量％のいずれかの量で存在しうる。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド又はその変異体を含むＥＧ  ＩＶなど）は、全セルラーゼの全重量の約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、又は８０重量％のいずれかを超えない量で存在しうる。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド又はその変異体を含むＥＧ  ＩＶなど）は、全セルラーゼの全重量の約０．０１重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、又は５０重量％のいずれかの下限値と、全セルラーゼの全重量の約１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、又は７０重量％のいずれかの上限値とを有する量で存在しうる。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド又はその変異体を含むＥＧ  ＩＶなど）は、全セルラーゼの全重量の約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１３重量％、１４重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、又は８０重量％のいずれかの量で存在しうる。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えばＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド又はその変異体を含むＥＧ  ＩＶなど）は、全セルラーゼの全重量の約１０重量％又は１２重量％の量で存在する。
【０１９４】
一部の態様では、本明細書において提供される組成物のいずれも、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ１若しくはその変異体、及び／又はＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ２若しくはその変異体を含む、エンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチドを（ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド以外に）含みうる。一部の態様では、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの全量は、本明細書に述べられるいずれかの組成物（本明細書において提供されるいずれかの酵素ブレンド／組成物など）中に、組成物中のタンパク質の全重量の少なくとも約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、又は５０重量％の量で存在しうる。一部の態様では、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの全量は、本明細書に述べられるいずれかの組成物（本明細書において提供されるいずれかの酵素ブレンド／組成物など）中に、組成物中のタンパク質の全重量の約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、又は８０重量％のいずれかを超えない量で存在しうる。一部の態様では、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの全量は、本明細書に述べられるいずれかの組成物（本明細書において提供されるいずれかの酵素ブレンド／組成物など）中に、上限値及び下限値を有する範囲を有する量で存在しうる。例えば、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの全量の下限値は、組成物中のタンパク質の全重量の約０．０１重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、又は５０重量％のいずれかである。エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの全量の上限値は、組成物中のタンパク質の全重量の約１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、又は７０重量％のいずれかである。一部の態様では、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの全量は、本明細書に述べられるいずれかの組成物（本明細書において提供されるいずれかの酵素ブレンド／組成物など）中に、組成物中のタンパク質の全重量の約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、又は８０重量％のいずれかの量で存在しうる。
【０１９５】
一部の態様では、本明細書において提供される組成物のいずれも、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、グルコシダーゼ（例えばβ−グルコシダーゼ）活性を有するポリペプチド、キシラナーゼ活性を有するポリペプチド、キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド、及び／又はアラビノフラノシダーゼを有するポリペプチドなどの異なる酵素活性を有する１以上のポリペプチドを含みうる。一部の態様では、同じ酵素活性を有する複数のポリペプチドが存在しうる。上記に述べたポリペプチドのそれぞれ（又は特定の酵素活性を有するポリペプチドの全量、例えば、セロビオヒドロラーゼ活性、グルコシダーゼ（β−グルコシダーゼ）活性、キシラナーゼ活性、キシロシダーゼ活性、又はアラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの全量）は、本明細書に述べられるいずれかの組成物（本明細書において提供されるいずれかの酵素ブレンド／組成物など）中に、組成物中のタンパク質の全重量の少なくとも約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、又は５０重量％のいずれかの量で存在しうる。一部の態様では、上記に述べたポリペプチドのそれぞれ（又は特定の酵素活性を有するポリペプチドの全量、例えば、セロビオヒドロラーゼ活性、グルコシダーゼ（β−グルコシダーゼ）活性、キシラナーゼ活性、キシロシダーゼ活性、又はアラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの全量）は、組成物中のタンパク質の全重量の約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、又は８０重量％のいずれかを超えない量で存在しうる。上記に述べたポリペプチドのそれぞれ（又は特定の酵素活性を有するポリペプチドの全量、例えば、セロビオヒドロラーゼ活性、グルコシダーゼ（β−グルコシダーゼ）活性、キシラナーゼ活性、キシロシダーゼ活性、又はアラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの全量）は、本明細書に述べられるいずれかの組成物（本明細書において提供されるいずれかの酵素ブレンド／組成物など）中に、上限値及び下限値を有する範囲を有する量で存在しうる。例えば、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの全量の下限値は、組成物中のタンパク質の全重量の約０．０１重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、又は５０重量％のいずれかである。上限値は、組成物中のタンパク質の全重量の約１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、又は７０重量％のいずれかである。一部の態様では、上記に述べたポリペプチドのそれぞれ（又は特定の酵素活性を���するポリペプチドの全量、例えば、セロビオヒドロラーゼ活性、グルコシダーゼ（β−グルコシダーゼ）活性、キシラナーゼ活性、キシロシダーゼ活性、又はアラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの全量）は、本明細書に述べられるいずれかの組成物（本明細書において提供されるいずれかの酵素ブレンド／組成物など）中に、組成物中のタンパク質の全重量の約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、又は８０重量％のいずれかの量で存在しうる。
【０１９６】
一部の態様では、本明細書において提供される組成物のいずれも、全セルラーゼを更に含みうる。全セルラーゼは、本明細書に述べられるいずれかの組成物（本明細書において提供されるいずれかの酵素ブレンド／組成物など）中に、組成物中のタンパク質の全重量の少なくとも約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、又は９５重量％のいずれかの量で存在しうる。全セルラーゼは、本明細書に述べられるいずれかの組成物（本明細書において提供されるいずれかの酵素ブレンド／組成物など）中に、組成物中のタンパク質の全重量の約１０重量％、１１重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、又は９５重量％のいずれかを超えない量で存在しうる。全セルラーゼは、本明細書に述べられるいずれかの組成物（本明細書において提供されるいずれかの酵素ブレンド／組成物など）中に、組成物中のタンパク質の全重量の約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、又は９５重量％のいずれかの量で存在しうる。
【０１９７】
本明細書において提供される組成物又は方法のいずれか１つの一部の態様では、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２、又はこれらの変異体）は、組成物中のタンパク質の全重量の約０．１〜約７０重量％（例えば、約０．５〜約６０重量％、約５〜約７０重量％、約１０〜約６０重量％、約２０〜約５０重量％、又は約３０〜約５０重量％）の量で存在する。一部の態様では、組成物は、セロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも２種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１（又はその変異体）及びＴ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２（又はその変異体））を有し、その場合、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの全量は、組成物中のタンパク質の全重量の約０．１〜約７０重量％（例えば、約０．５〜約６０重量％、約５〜約７０重量％、約１０〜約６０重量％、約２０〜約５０重量％、又は約３０〜約５０重量％）である。
セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、宿主細胞とは異種の、又は宿主細胞に内因性の核酸から発現させることができる。一部の態様では、組成物中に含まれるセロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは単離される。
【０１９８】
本明細書において提供される組成物又は方法のいずれか１つの一部の態様では、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、Ｔｎ３Ｂ、又はこれらの変異体）は、組成物中のタンパク質の全重量の約０．１〜約５０重量％（例えば、約０．５〜約４０重量％、約１〜約３０重量％、約２〜約２０重量％、約５〜約２０重量％、又は約８〜約１５重量％）の量で存在する。一部の態様では、組成物は、β−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも２種類のポリペプチドを有し、その場合、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドの全量は、組成物中のタンパク質の全重量の約０．１〜約５０重量％（例えば、約０．５〜約４０重量％、約１〜約３０重量％、約２〜約２０重量％、約５〜約２０重量％、又は約８〜約１５重量％）である。β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、宿主細胞とは異種の、又は宿主細胞に内因性の核酸から発現させることができる。一部の態様では、組成物中に含まれるβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは単離される。
【０１９９】
本明細書において提供される組成物又は方法のいずれか１つでは、キシラナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、又はこれらの変異体）は、組成物中のタンパク質の全重量の約０．１〜約５０重量％（例えば、約０．５〜約４０重量％、約１〜約４０重量％、約４〜約３０重量％、約５〜約２０重量％、又は約８〜約１５重量％）の量で存在しうる。組成物は、キシラナーゼ活性を有する少なくとも２種類のポリペプチドを有してもよく、その場合、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドの全量は、組成物中のタンパク質の全重量の約０．１〜約５０重量％（例えば、約０．５〜約４０重量％、約１〜約４０重量％、約４〜約３０重量％、約５〜約２０重量％、又は約８〜約１５重量％）である。キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、宿主細胞とは異種の、又は宿主細胞に内因性の核酸から発現させることができる。組成物中に含まれるキシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、単離されてもよい。
【０２００】
本明細書において提供される組成物又は方法のいずれか１つでは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、Ｆｖ５１Ａ、又はこれらの変異体）は、組成物中の酵素の全重量の約０．１〜約５０重量％（例えば、約０．５〜約４５重量％、約１〜約４０重量％、約２〜約３０重量％、約４〜約２０重量％、又は約５〜約１５重量％）の量で存在しうる。組成物は、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する少なくとも２種類のポリペプチドを有してもよく、その場合、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの全量は、組成物中のタンパク質の全重量の約０．１〜約５０重量％（例えば、約０．５〜約４５重量％、約１〜約４０重量％、約２〜約３０重量％、約４〜約２０重量％、又は約５〜約１５重量％）である。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドは、宿主細胞とは異種の、又は宿主細胞とは異種の核酸から発現させることができる。組成物中に含まれるＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドは、単離されてもよい。
【０２０１】
本明細書において提供される組成物又は方法のいずれか１つでは、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１、又はこれらの変異体）は、組成物中の酵素の全重量の約０．１〜約５０重量％（例えば、約０．５〜約４５重量％、約１〜約４０重量％、約４〜約３５重量％、約５〜約２５重量％、又は約５〜約２０重量％）の量で存在しうる。組成物は、β−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも２種類のポリペプチドを有してもよく、その場合、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドの全量は、組成物中のタンパク質の全重量の約０．１〜約５０重量％（例えば、約０．５〜約４５重量％、約１〜約４０重量％、約４〜約３５重量％、約５〜約２５重量％、又は約５〜約２０重量％）である。
β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドは、宿主細胞とは異種の、又は宿主細胞に内因性の核酸から発現させることができる。組成物中に含まれるβ−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドは、単離されてもよい。
【０２０２】
本明細書において提供される組成物又は方法のいずれか１つでは、組成物中の全セルラーゼは、組成物中のタンパク質の全重量の約０．１〜約１００重量％（例えば、約１〜約９５重量％、約５〜約９０重量％、約１０〜約８５重量％、約２０〜約８０重量％、又は約３０〜約７５重量％）でありうる。全セルラーゼは、宿主細胞とは異種の、又は宿主細胞に内因性の核酸から発現されるエンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ１又はその変異体、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ２又はその変異体など）を含みうる。全セルラーゼは、宿主細胞とは異種の、又は宿主細胞に内因性の核酸から発現されるセロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１又はその変異体、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２又はその変異体）を含みうる。全セルラーゼは、宿主細胞とは異種の、又は宿主細胞に内因性の核酸から発現されるβ−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、Ｔｎ３Ｂ、又はこれらの変異体）を含みうる。
【０２０３】
一部の態様では、本発明の組成物は、バイオマス材料を発酵性糖（例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、及び／又はセロビオース）に変換することが可能である。
一部の態様では、組成物は、カルコフロールアッセイによって求めた場合に、少なくとも０．１（例えば０．１〜０．４）の生成率（fraction product）を得ることが可能である。
【０２０４】
一部の態様では、組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）を含み、更に、少なくとも１種類のセルラーゼポリペプチド及び／又は少なくとも１種類のヘミセルラーゼポリペプチドを含み、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）と、少なくとも１種類のセルラーゼポリペプチド及び／又は少なくとも１種類のヘミセルラーゼポリペプチドとは、バイオマス材料との接触の前に互いに混合される。
【０２０５】
一部の態様では、組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）を含み、更に、少なくとも１種類のセルラーゼポリペプチド及び／又は少なくとも１種類のヘミセルラーゼポリペプチドを含み、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）と、少なくとも１種類のセルラーゼポリペプチド及び／又は少なくとも１種類のヘミセルラーゼポリペプチドとは、異なる時点でバイオマス材料に加えられる（例えば、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドは、少なくとも１種類のセルラーゼポリペプチド及び／又は少なくとも１種類のヘミセルラーゼポリペプチドがバイオマス材料に加えられる前又は後でバイオマス材料に加えられる）。
【０２０６】
一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）を含む組成物は、バイオマス材料を含む混合物であり、例えば組成物は、加水分解混合物、発酵混合物、又は糖化混合物である。このような混合物は、発酵性糖を更に含みうる。
【０２０７】
他の成分
本開示の酵素組成物は、好適には、１以上のアクセサリータンパク質を更に含みうる。
アクセサリータンパク質の例としては、これらに限定されるものではないが、マンナナーゼ（例えばエンドマンナナーゼ、エキソマンナナーゼ、及びβ−マンノシダーゼ）、ガラクタナーゼ（例えば、エンド型及びエキソ型ガラクタナーゼ）、アラビナーゼ（例えばエンド型アラビナーゼ及びエキソ型アラビナーゼ）、リグニナーゼ、アミラーゼ、グルクロニダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ（例えば、フェルラ酸エステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、クマリン酸エステラーゼ又はペクチンメチルエステラーゼ）、リパーゼ、他のグリコシドヒドロラーゼ、キシログルカナーゼ、ＣＩＰ１、ＣＩＰ２、スウォレニン、エクスパンシン、及びセルロース破壊タンパク質が挙げられる。例えば、セルロース破壊タンパク質はセルロース結合モジュールである。
【０２０８】
方法及びプロセス
本開示は、本開示の酵素、酵素ブレンド／組成物を使用したバイオマス糖化のための方法及びプロセスを提供する。詳細には、本開示は、本明細書において提供されるポリペプチド又は組成物のいずれか１つを用いて、バイオマス材料を加水分解するための方法及びプロセスを提供する。更に、本開示は、本明細書において提供されるポリペプチド又は組成物のいずれか１つを用いて、バイオマス混合物（例えば、糖化プロセスにおいてバイオマス基質及び酵素を含むバイオマス混合物）の粘度を低下させるための方法を提供する。
一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む非天然組成物とバイオマス材料とを接触させることを含む、バイオマス材料を加水分解する方法が提供される。一部の態様では、ポリペプチドは、バイオマス材料を加水分解するうえで充分な量である。
【０２０９】
本明細書で使用するところの「バイオマス」なる用語は、セルロース及び／又はヘミセルロース（リグノセルロースバイオマス材料中のリグニンを含む）を含む任意の組成物のことを指す。本明細書で使用するところのバイオマスとしては、これらに限定されるものではないが、種子、穀粒、塊茎、植物性廃棄物、又は食品加工若しくは工業プロセスの副生成物（例えば茎）、トウモロコシ（例えば穂軸、茎葉など）、草類（例えば、ソルガストラム・ニュータンス（Sorghastrum nutans）などのインディアングラス；又はスイッチグラス、例えばパニカム・バーガタム（Panicum virgatum）などのパニカム種など）、多年生イネ科植物（例えばダンチク（giant reed））、木材（例えばウッドチップ、加工廃材）、紙（古紙など）、パルプ、及び再生紙（例えば新聞紙、プリンター用紙など）が挙げられる。他のバイオマス材料としては、これらに限定されるものではないが、ジャガイモ、大豆（例えば菜種）、大麦、ライ麦、オート麦、小麦、ビーツ、及びサトウキビバガスが挙げられる。好適なリグノセルロースバイオマス材料としては、これらに限定されるものではないが、種子、穀粒、塊茎、食品加工又は工業プロセスの植物性廃棄物若しくは副生成物（例えば茎）、トウモロコシ（例えば穂軸、茎葉など）、草類（例えば、ソルガストラム・ニュータンス（Sorghastrum nutans）などのインディアングラス；又はスイッチグラス、例えばパニカム・バーガタム（Panicum virgatum）などのパニカム種など）、多年生イネ科植物（例えばダンチク（giant reed））、木材（例えばウッドチップ、加工廃材）、紙、パルプ、再生紙（例えば新聞紙）、ウッドパルプ、又はおがくずが挙げられる。草類の例としては、これらに限定されるものではないが、インディアングラス及びスイッチグラスが挙げられる。アシ類の例としては、これらに限定されるものではないが、ダンチク（giant reed）などの特定の多年生イネ科植物が挙げられる。古紙の例としては、これらに限定されるものではないが、廃棄された又は使用済みのコピー用紙、コンピュータのプリンター用紙、ノートブック用紙、ノートバッド用紙、タイプライター用紙、新聞紙、雑誌、ボール紙、紙を使用した包装材が挙げられる。
【０２１０】
糖化されたバイオマスは、例えば微生物発酵及び／又は化学合成などのプロセスにより、多くのバイオ製品に転換することができる。本明細書で使用するところの「微生物発酵」とは、適当な条件下で発酵微生物を増殖及び収穫するプロセスのことを指す。発酵微生物は、バイオ製品を製造するための望ましい発酵プロセスで使用するのに適した任意の微生物でありうる。好適な発酵微生物としては、これらに限定されるものではないが、糸状菌類、酵母、及び細菌が挙げられる。糖化されたバイオマスは、例えば、発酵及び／又は化学合成によって燃料（例えばバイオエタノール、バイオブタノール、バイオメタノール、バイオプロパノール、バイオディーゼル、ジェット燃料など）に転換することができる。糖化されたバイオマスは、例えば、発酵及び／又は化学合成によってコモディティーケミカル（例えば、アスコルビン酸、イソプレン、１，３−プロパンジオール）、脂質、アミノ酸、タンパク質、及び酵素に転換することもできる。
【０２１１】
バイオマス材料は、セルロース、ヘミセルロース、又はこれらの混合物を含みうる。例えばバイオマス材料は、グルカン及び／又はキシランを含みうる。
【０２１２】
一部の態様では、バイオマス混合物の粘度を低下させる方法であって、そのバイオマス混合物を、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む非天然組成物と接触させることを含む、方法が提供される。ポリペプチドは、粘度を低下させるうえで充分な量である。バイオマス混合物は、バイオマス材料（例えば前処理されたバイオマス材料）を含みうる。バイオマス混合物は、本明細書において提供されるいずれかの酵素組成物などの酵素組成物、又はそれらの混合物を含みうる。
【０２１３】
一部の態様では、本明細書において提供されるいずれかのポリペプチド、組成物を使用して、バイオマス材料などの基質を加水分解するか、又は糖化プロセスにおける基質／酵素混合物の粘度を低下させることができる。基質は、バイオマス材料であってよい。基質は、単離されたセルロース又は単離されたヘミセルロースであってよい。基質は、グルカン及び／又はキシランであってよい。一部の態様では、バイオマス材料は前処理されたバイオマス材料である。
【０２１４】
バイオマス材料の前処理
糖化に先立って、バイオマス材料を１以上の前処理工程に供することにより、キシラン、ヘミセルロース、セルロース、及び／又はリグニン材料と酵素との接触性を高めるか又は酵素の作用を受けやすくし、これにより本開示の酵素及び／又は酵素ブレンド／組成物による加水分解をより受けやすくすることが好ましい。
【０２１５】
前処理には、化学的、物理的、及び生物学的前処理が含まれうる。例えば、物理的前処理の方法としては、これらに限定されるものではないが、各種の粉砕処理、破砕処理、蒸気処理／蒸気爆発、放射線照射、及び熱加水分解が挙げられる。化学的前処理の方法としては、これらに限定されるものではないが、希釈酸、アルカリ、有機溶媒、アンモニア、二酸化硫黄、二酸化炭素、及びｐＨ調整熱加水分解が挙げられる。生物学的前処理の方法としては、これに限定されるものではないが、リグニン可溶化微生物を適用することが挙げられる。前処理は、約１時間〜約１２０時間など、数分〜数時間にわたって行うことができる。
【０２１６】
一部の態様では、本明細書において提供される方法又はプロセスのいずれも、バイオマスを酸又は塩基で前処理することなど、バイオマス材料を前処理することを更に含みうる。酸又は塩基は、アンモニア、水酸化ナトリウム、又はリン酸であってよい。本方法は、バイオマス材料をアンモニアで前処理することを更に含みうる。前処理は、蒸気爆発、パルプ化、粉砕、酸加水分解、又はこれらの組み合わせであってよい。
【０２１７】
一実施形態では、前処理は、高温、及び、希釈酸、濃縮酸、又は希釈アルカリ溶液のいずれかを添加することによるものでもよい。前処理溶液は、ヘミセルロース成分を少なくとも一部加水分解するのに充分な時間加えた後で中和することができる。
【０２１８】
例示的な一実施形態では、前処理において、バイオマス材料を反応器中で強酸の希釈溶液及び金属塩を含む触媒に接触させることを行う。バイオマス材料は、例えば未加工材料又は乾燥材料であってもよい。この前処理により、セルロース加水分解の活性化エネルギー又は温度を低下させ、最終的に発酵性糖の収率をより高めることが可能となる。例えば、米国特許第６，６６０，５０６号、同第６，４２３，１４５号を参照されたい。
【０２１９】
別の例示的な前処理の方法では、水性媒質中で、セルロースをグルコースに大きく脱重合させることなく、主としてヘミセルロースの脱重合が行われるように選択された温度及び圧力で第１の加水分解工程にバイオマス材料を供することにより、バイオマスを加水分解することを行う。この工程により、液体水相にヘミセルロースの脱重合から生じた単糖が溶解し、固体相がセルロース及びリグニンを含むスラリーが得られる。次いでこのスラリーを、セルロースの大部分が脱重合されるような条件下で第２の加水分解工程に供することで、セルロースの溶解した／可溶性の脱重合生成物を含む液体水相が得られる。例えば、米国特許第５，５３６，３２５号を参照されたい。
【０２２０】
本方法の更なる一例では、約０．４％〜約２％の強酸を使用した１以上の希釈酸加水分解の段階によりバイオマス材料を処理した後、酸加水分解された材料の未反応の固体リグノセルロース成分をアルカリ脱リグニン化によって処理することを行う。例えば、米国特許第６，４０９，８４１号を参照されたい。
【０２２１】
前処理の方法の別の例は、予備加水分解反応器中でバイオマス（例えばリグノセルロース材料）を予備加水分解することと、固体リグノセルロース材料に酸性の液体を加えて混合物とすることと、その混合物を反応温度にまで加熱することと、リグノセルロース材料が、少なくとも約２０％のリグノセルロース材料に由来するリグニンを含む可溶化部分と、セルロースを含む固体画分とに分画されるだけの充分な時間にわたって反応温度を維持することと、可溶化部分を固体画分から分離し、可溶化部分が反応温度か又はそれに近い温度にある間に可溶化部分を除去することと、可溶化部分を回収することと、を含む。固体画分中のセルロースは、酵素による消化をより受けやすくする。例えば、米国特許第５，７０５，３６９号を参照されたい。
【０２２２】
更なる前処理の方法では、過酸化水素Ｈ２Ｏ２を使用することができる。Ｇｏｕｌｄ，１９８４，Ｂｉｏｔｅｃｈ，ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｒ．２６：４６〜５２を参照されたい。
【０２２３】
前処理はまた、バイオマス材料を化学量論的な量の水酸化ナトリウム及び水酸化アンモニウムと極めて低濃度で接触させることも含みうる。Ｔｅｉｘｅｉｒａら、１９９９，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７７〜７９：１９〜３４を参照されたい。前処理はまた、リグノセルロースを、ｐＨ約９〜約１４、穏やかな温度、圧力及びｐＨで化学物質（例えば、炭酸ナトリウム又は水酸化カリウムなどの塩基）と接触させることも含みうる。国際特許出願公開第ＷＯ２００４／０８１１８５号を参照されたい。
【０２２４】
前処理の方法においてアンモニアを使用することもできる。こうした前処理の方法は、バイオマス材料を高固形分の条件下で低濃度のアンモニアに曝露することを含む。例えば、米国特許出願公開第２００７００３１９１８号、国際特許出願公開第ＷＯ  ０６１１０９０１号を参照されたい。
【０２２５】
糖化プロセス及び粘度の低下
本開示は、バイオマス混合物の粘度を低下させる方法であって、バイオマス混合物を、バイオマス混合物の粘度を低下させるうえで充分な量のグリコシルヒドロラーゼファミリー６１（「ＧＨ６１」）エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む組成物（例えば非天然組成物）と接触させることを含む、方法を提供する。一部の態様では、バイオマス混合物は、バイオマス材料と、発酵性糖と、全セルラーゼと、セルラーゼ活性を有するポリペプチド及び／又はヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドを含む組成物とを含む。一部の態様では、粘度は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４ポリペプチド又はその変異体）の非存在下でのバイオマス混合物の粘度と比較して、少なくとも約５％（例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％のいずれか）低下させられる。本明細書に述べられるいずれかの方法の一部の態様では、バイオマス材料は、ヘミセルロース、セルロース、又はこれらの混合物を含む。一部の態様では、バイオマス物質は、グルカン、キシラン、及び／又はリグニンを含む。
【０２２６】
本明細書において提供される方法及びプロセスは、様々な条件下で行うことができる。
例えば、本明細書において提供されるいずれの方法も、約３．５〜約７．０のｐＨの範囲、例えば約４．０〜約６．５のｐＨ、約４．４〜約６．０のｐＨ、約４．８〜約５．６のｐＨ、又は約４．５〜約５．５で行うことができる。バイオマス材料を含む糖化混合物は、当業者には周知の任意の方法に従って、塩基又は酸（硫酸など）を使用して所望のｐＨに調整することができる。例えば、前処理したバイオマス材料に、塩基又は酸（硫酸など）を加えることによって糖化に望ましいｐＨとすることができる。バイオマス材料を加水分解するための、又はバイオマス混合物の粘度を低下させるためのいずれの方法も、約４．８〜約５．６のｐＨ（例えば、約４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、又は５．６のいずれかのｐＨ）で行うことができる。一部の態様では、本方法は更に、バイオマス混合物のｐＨを約４．０〜約６．５のｐＨ（例えば約４．５〜約５．５のｐＨ）に調整することを含む。
【０２２７】
本明細書において提供される方法及びプロセスは、例えば、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、１０日間、１４日間、３週間、又は４週間などの任意の長さの時間にわたって行うことができる。本明細書に述べられるいずれかの糖化時間の後では、発酵性糖の量は増加し、かつ／又は糖化混合物の粘度が低下する。一部の態様では、本方法は、約２時間〜約７日間（例えば約４時間〜約６日間、約８時間〜約５日間、又は約８時間〜約３日間）にわたって行われる。
【０２２８】
ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧ  ＩＶ又はその変異体）を含む組成物（例えば非天然組成物）を、バイオマス材料を前処理した後に加えることができる。ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧ  ＩＶ又はその変異体）を含む組成物（例えば非天然組成物）は、別の酵素組成物（ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、又は全セルラーゼを含む酵素組成物など）をバイオマス材料に加える前又は後でバイオマス材料に加えることができる。ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧ  ＩＶ又はその変異体）を含む組成物（例えば非天然組成物）は、（ａ）バイオマス材料及び／又は発酵性糖、並びに（ｂ）酵素（ヘミセルラーゼ、又は全セルラーゼを含むセルラーゼなど）を含むバイオマス混合物に加えることができる。一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧ  ＩＶ又はその変異体）を含む組成物（例えば非天然組成物）は、一定時間（約５分間、１０分間、３０分間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、又は５日間のいずれかなど）加水分解されたバイオマス混合物に加えられる。
【０２２９】
ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧ  ＩＶ又はその変異体）を含む組成物（例えば非天然組成物）は、糖化の際にバイオマス材料に加えることができる。ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧ  ＩＶ又はその変異体）を含む全セルラーゼを含む組成物（例えば非天然組成物）を、糖化の際にバイオマス材料に加えることができる。
【０２３０】
本方法のいずれか１つにおいて使用されるバイオマス材料は、液体形態、固体形態、又はこれらの混合物であってよい。本方法のいずれか１つにおいて使用されるバイオマス材料は、湿潤形態、乾燥形態、異なる含水量を有する材料、又はこれらの混合物であってよい。本方法のいずれか１つにおいて使用されるバイオマス材料は、乾燥固体形態（開始物質としての乾燥固体形態など）であってよい。バイオマス材料は、当業者には周知の任意の方法に従って、以下の形態、すなわち、湿潤形態、乾燥形態、固体形態、液体形態、又はこれらの混合物のいずれかに加工処理することができる。
【０２３１】
本方法のいずれかにおいて使用されるバイオマス材料は、加水分解混合物又は糖化混合物の全重量の少なくとも約０．５重量％、１重量％、５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、又は６０重量％のいずれかの量で糖化混合物中に存在しうるものであり、その場合、バイオマス材料の量とは、固体状態のバイオマス材料（又は乾燥状態、乾燥固体状態、天然の状態、若しくは未処理の状態のバイオマス材料）の重量のことを指す。バイオマス材料は、バイオマス材料を含む加水分解混合物の約０．５重量％〜約５５重量％、１重量％〜約４０重量％、５重量％〜約６０重量％、約１０重量％〜約５５重量％、約１０重量％〜約５０重量％、約１５重量％〜約５０重量％、約１５重量％〜約４０重量％、約１５重量％〜約３５重量％、約１５重量％〜約３０重量％、約２０重量％〜約３５重量％、又は約２０重量％〜約３０重量％の量であってもよく、その場合、バイオマス材料の量とは、固体状態のバイオマス材料（又は乾燥状態、乾燥固体状態、天然の状態、若しくは未処理の状態のバイオマス材料）の重量のことを指す。本方法のいずれかにおいて使用されるバイオマス材料は、加水分解混合物又は糖化混合物の全重量の約０．５重量％、１重量％、５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、又は６０重量％のいずれかの量で糖化混合物中に存在してもよく、その場合、バイオマス材料の量とは、固体状態のバイオマス材料（又は乾燥状態、乾燥固体状態、天然の状態、若しくは未処理の状態のバイオマス材料）の重量のことを指す。
【０２３２】
加水分解混合物又は糖化混合物には、バイオマス材料、酵素（例えば、本明細書において提供されるいずれか１つのポリペプチド）、酵素組成物（例えば、本明細書において提供される組成物のいずれか１つ）、及び／又は糖化に必要な成分などの他の成分が含まれる。
【０２３３】
上記の「例示的組成物」の項に示した組成物のいずれか１つなどの、本明細書において提供されるいずれの組成物も、本明細書に述べられる方法において使用することができる。本明細書において提供されるいずれか１つの方法において使用される、本明細書に述べられるいずれかの組成物の量は、バイオマス材料中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たりのタンパク質が約０．０５ｍｇ〜約５０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約４０ｍｇ、約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約２５ｍｇ、約１ｍｇ〜約２５ｍｇ、約２ｍｇ〜約２５ｍｇ、約５ｍｇ〜約２５ｍｇ、又は約１０ｍｇ〜約２５ｍｇとなる範囲であってよい。バイオマス材料を加水分解するための方法及び／又はバイオマス混合物の粘度を低下させるための方法のいずれか１つにおいて使用される、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧ  ＩＶ又はその変異体）を含む非天然組成物は、バイオマス材料などの基質中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たりのタンパク質が約０．０５ｍｇ〜約５０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約４０ｍｇ、約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約２５ｍｇ、約１ｍｇ〜約２５ｍｇ、約２ｍｇ〜約２５ｍｇ、約５ｍｇ〜約２５ｍｇ、又は約１０ｍｇ〜約２５ｍｇであってよい。
【０２３４】
一部の態様では、バイオマス材料を加水分解するための方法及び／又はバイオマス混合物の粘度を低下させるための方法のいずれかにおいて使用される、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧ  ＩＶ又はその変異体）を含む非天然組成物は、バイオマス材料などの基質中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たりのタンパク質が少なくとも約０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇ、７．５ｍｇ、１０ｍｇ、１２ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７．５ｍｇ、１８ｍｇ、２０ｍｇ、２２．５ｍｇ、２５ｍｇ、２７．ｇ  ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、又は５０ｍｇのいずれかとなる量である。一部の態様では、バイオマス材料を加水分解するための方法及び／又はバイオマス混合物の粘度を低下させるための方法のいずれかにおいて使用される、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧ  ＩＶ又はその変異体）を含む非天然組成物は、バイオマス材料などの基質中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たりのタンパク質が約０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇ、７．５ｍｇ、１０ｍｇ、１２ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７．５ｍｇ、１８ｍｇ、２０ｍｇ、２２．５ｍｇ、２５ｍｇ、２７．５ｇｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、６５ｍｇ、７５ｍｇ、又は１００ｍｇのいずれかを超えない量である。一部の態様では、バイオマス材料を加水分解するための方法及び／又はバイオマス混合物の粘度を低下させるための方法のいずれかにおいて使用される、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧ  ＩＶ又はその変異体）を含む非天然組成物は、バイオマス材料などの基質中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たりのタンパク質が約０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇ、７．５ｍｇ、１０ｍｇ、１２ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７．５ｍｇ、１８ｍｇ、２０ｍｇ、２２．５ｍｇ、２５ｍｇ、２７．５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、又は５０ｍｇのいずれかとなる量である。バイオマス材料などの基質中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロースとの混合物の量は、当業者には周知の任意の方法を用いて計算することができる。バイオマス材料は、グルカン、キシラン、及び／又はリグニンを含みうる。
【０２３５】
本明細書に述べられるいずれかの方法の一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）を含む組成物の量は、バイオマス材料中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たりのタンパク質が約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇ（例えば、約０．２ｍｇ〜約４０ｍｇのタンパク質、約０．５ｍｇ〜約３０ｍｇのタンパク質、約１ｍｇ〜約２０ｍｇのタンパク質、又は約５ｍｇ〜約１５ｍｇのタンパク質）となる量である。本明細書に述べられるタンパク質の量とは、組成物中の全タンパク質の重量のことを指す。タンパク質には、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）が含まれ、組成物中のセルラーゼポリペプチド及び／又はヘミセルラーゼポリペプチドなどの他の酵素も含まれる。
【０２３６】
本明細書に述べられるいずれかの方法の一部の態様では、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）の量は、バイオマス材料中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ（例えば、約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇのタンパク質、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇのタンパク質、又は約１ｍｇ〜約５ｍｇのタンパク質）である。
【０２３７】
本明細書に述べられるいずれかの方法の一部の態様では、組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）及びエンドグルカナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ２、及び／又はこれらの変異体）を含み、その場合、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの全量は、バイオマス材料中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ（例えば、約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇのタンパク質、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇのタンパク質、又は約１ｍｇ〜約５ｍｇのタンパク質）である。
【０２３８】
一部の態様では、組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）及びセロビオヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２、及び／又はこれらの変異体）を含み、その場合、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの量は、バイオマス材料中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ（例えば、約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇのタンパク質、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇのタンパク質、又は約１ｍｇ〜約５ｍｇのタンパク質）である。
【０２３９】
本明細書に述べられるいずれかの方法の一部の態様では、組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）及びβ−グルコシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ｃ、Ｐａ３Ｄ、Ｆｖ３Ｇ、Ｆｖ３Ｄ、Ｔｒ３Ａ、Ｔｒ３Ｂ、Ｔｅ３Ａ、Ａｎ３Ａ、Ｆｏ３Ａ、Ｇｚ３Ａ、Ｎｈ３Ａ、Ｖｄ３Ａ、Ｐａ３Ｇ、Ｔｎ３Ｂ、又はこれらの変異体）を含み、その場合、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドの量は、バイオマス材料中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ（例えば、約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇのタンパク質、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇのタンパク質、又は約０．５ｍｇ〜約５ｍｇのタンパク質）である。
【０２４０】
一部の態様では、組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）及びキシラナーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、又はこれらの変異体）を含み、その場合、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドの量は、バイオマス材料中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ（例えば、約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇのタンパク質、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇのタンパク質、又は約０．５ｍｇ〜約５ｍｇのタンパク質）である。
【０２４１】
一部の態様では、組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）及びβ−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｘｌ１、又はこれらの変異体）を含み、その場合、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドの量は、バイオマス材料中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ（例えば、約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇのタンパク質、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇのタンパク質、又は約０．５ｍｇ〜約５ｍｇのタンパク質）である。
【０２４２】
一部の態様では、組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する少なくとも１種類のポリペプチド（例えば、Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、Ｆｖ５１Ａ、又はこれらの変異体）を含み、その場合、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの量は、バイオマス材料中に含まれるセルロース、ヘミセルロース、又はセルロースとヘミセルロースとの混合物１ｇ当たり約０．２ｍｇ〜約３０ｍｇ（例えば、約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇのタンパク質、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇのタンパク質、又は約０．５ｍｇ〜約５ｍｇのタンパク質）である。
【０２４３】
本明細書において提供されるいずれか１つの方法では、バイオマス混合物の粘度を、本明細書において提供される酵素組成物の非存在下でのバイオマス混合物の粘度と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％のいずれかだけ低下させることができる。例えば、バイオマス混合物の粘度を低下させる方法であって、そのバイオマス組成物を、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧ  ＩＶ又はその変異体）を含む非天然組成物と接触させることを含み、粘度が、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧ  ＩＶ又はその変異体）の非存在下でのバイオマス混合物の粘度と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％のいずれかだけ低下させられる方法が提供される。一部の態様では、粘度は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧ  ＩＶ又はその変異体）の非存在下でのバイオマス混合物の粘度と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％のいずれかだけ低下させられる。本明細書に述べられる粘度の低下は、一定時間の糖化の後に見られる。例えば、粘度の低下は、３０分間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、又は５日間の糖化の後に見られる。
粘度の測定方法は当該技術分野では周知のものである。例えば粘度は肉眼で測定することが可能であり、あるいはＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度計（ブルックフィールド・エンジニアリング社（Brookfield Engineering, Inc））などの粘度計によって測定することもできる。例えば糖化反応混合物の粘度は、アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸を基質として用いて、粘度計を使用して測定することができる。粘度計は、スラリー中でスピンドルを一定の速度で回転させるために必要とされる抵抗（トルク）を測定することができる。
【０２４４】
本明細書において提供される方法は、糖化に適した温度で実施することができる。例えば、本明細書に述べられるいずれか１つの方法は、約２０℃〜約７５℃、約２５℃〜約７０℃、約３０℃〜約６５℃、約３５℃〜約６０℃、約３７℃〜約６０℃、約４０℃〜約６０℃、約４０℃〜約５５℃、約４０℃〜約５０℃、又は約４５℃〜約５０℃で行うことができる。一部の態様では、本明細書に述べられるいずれか１つの方法は、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、約４５℃、約４８℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、又は約７５℃で行うことができる。
【０２４５】
本明細書に述べられるいずれかの方法の一部の態様では、その方法は、発酵性糖を製造することを含み、発酵性糖の量が、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）の非存在下で製造される発酵性糖の量と比較して、少なくとも約５％（例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％のいずれか）増加する。
【０２４６】
更に本明細書では、バイオマス材料の加水分解においてＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧ  ＩＶ又はその変異体）を含む組成物（例えば非天然組成物）を使用することにより、発酵性糖の量を増加させる（及び／又は、グルカン変換率などの、バイオマス材料から発酵性糖への変換率を増大させる）方法も提供される。これらに限定されるものではないが、グルコース、キシロース、及び／又はセロビオースなどの様々な発酵性糖がバイオマス材料の加水分解により製造される。一部の態様では、バイオマス材料の加水分解により製造される発酵性糖の量は、本明細書において提供される酵素組成物の非存在下での発酵性糖の量と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％のいずれかだけ増加させられる。例えば、発酵性糖の量を増加させる方法であって、バイオマス材料を、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧ  ＩＶ又はその変異体）を含む非天然組成物と接触させることを含み（糖化プロセスを開始又は更に進行させるため）、糖化による発酵性糖の量が、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧ  ＩＶ又はその変異体）の非存在下での糖化による発酵性糖の量と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％のいずれかだけ増加する方法が提供される。一部の態様では、糖化による発酵性糖の量は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４などのＥＧ  ＩＶ又はその変異体）の非存在下での糖化による発酵性糖の量と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％のいずれかだけ増加する。
本明細書に述べられるバイオマス材料の加水分解による発酵性糖の量の増加は、一定時間の糖化の後に見られる。例えば、発酵性糖の量の増加は、３０分間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、又は５日間の糖化の後に見られる。発酵性糖の量及び／又はグルカン変換率の測定方法は、当業者には周知のものである。
【０２４７】
糖化混合物の粘度の低下は、所望の発酵性糖の収率の改善と相関していると考えられる。
【０２４８】
一部の態様では、本方法は、バイオマス材料を、全セルラーゼを含む組成物と接触させる工程を更に含む。一部の態様では、バイオマス材料を、全セルラーゼを含む組成物と接触させる工程は、バイオマス材料を、グリコシルヒドロラーゼ６１（「ＧＨ６１」）エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）を含む組成物と接触させる前、後、又は同時に行われる。
【０２４９】
本明細書に述べられるいずれかの方法の一部の態様では、本方法は、バイオマス材料を、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、及び／又はヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドを含む組成物と更に接触させる工程を含む。一部の態様では、バイオマス材料を、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、及び／又はヘミセルラーゼ活性を有するポリペプチドを含む組成物と更に接触させる工程は、バイオマス材料を、グリコシルヒドロラーゼ６１（「ＧＨ６１」）エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）を含む組成物と接触させる前、後、又は同時に行われる。
【０２５０】
一部の態様では、組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）を含み、更に、少なくとも１種類のセルラーゼポリペプチド及び／又は少なくとも１種類のヘミセルラーゼポリペプチドを含み、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）と、少なくとも１種類のセルラーゼポリペプチド及び／又は少なくとも１種類のヘミセルラーゼポリペプチドとは、バイオマス材料を、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）を含む組成物と接触させる前に互いに混合される。
【０２５１】
一部の態様では、組成物は、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）を含み、更に、少なくとも１種類のセルラーゼポリペプチド及び／又は少なくとも１種類のヘミセルラーゼポリペプチドを含み、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）と、少なくとも１種類のセルラーゼポリペプチド及び／又は少なくとも１種類のヘミセルラーゼポリペプチドとは、異なる時点でバイオマス材料に加えられる（例えば、ＧＨ６１／エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４又はその変異体）は、少なくとも１種類のセルラーゼポリペプチド及び／又は少なくとも１種類のヘミセルラーゼポリペプチドがバイオマス材料に加えられる前又は後に加えられる）。
【０２５２】
例えば以下の米国特許出願公開第２００５００５４０３９号、同第２００５００３７４５９号、同第２００６０２０５０４２号、同第２００５００４８６１９Ａ１号、及び同第２００６０２１８６７１号のいずれか１つに述べられるように、ＣＢＨポリペプチドを使用し、より高い温度で高いセルロース変換率を実現することができる。β−グルコシダーゼを過剰発現させる方法は当該技術分野では周知のものである。例えば、米国特許第６，０２２，７２５号を参照されたい。また、例えば米国特許出願第２００５０２１４９２０号も参照されたい。
【０２５３】
本開示の方法は、微生物用の化学発酵原料、並びに、タンパク質、有機生成物、化学物質及び燃料、プラスチック、並びに他の製品又は中間体の製造用の誘引物質としての単糖類、二糖類、及び多糖類の製造に使用することができる。詳細には、セルロース又はヘミセルロースを部分的又は完全に可溶化することにより、加工処理残渣（乾燥した醸造用穀物、醸造より生ずる使用済み穀物、サトウキビバガスなど）の価値を高めることができる。エタノール以外に、セルロース及びヘミセルロースから製造することが可能な化学物質としては、アセトン、アセテート、グリシン、リシン、有機酸（例えば乳酸）、１，３−プロパンジオール、ブタンジオール、グリセロール、エチレングリコール、フルフラール、ポリヒドロキシアルカノエート、シス，シス−ムコン酸、動物用飼料及びキシロースが挙げられる。
【０２５４】
商業的方法
本開示のセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ組成物は、工業的及び／又は商業的な状況で更に使用することができる。したがって、本発明の非天然セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ組成物を製造、販売、又は商業化する方法もまた、想到されるものである。
【０２５５】
特定の実施形態では、例えば本明細書に述べられる１以上のＧＨ６１エンドグルカナーゼ又はその変異体を含む、本発明の非天然セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ組成物は、特定のエタノール（バイオエタノール）精錬所又は他のバイオケミカル若しくはバイオ材料の製造業者に供給又は販売することができる。第１の例では、非天然セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ組成物は、工業的規模での酵素の製造を専門に行う酵素製造施設において製造することができる。この後、非天然セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ組成物は包装されるか、又は酵素製造業者の顧客に販売される。このような操業手法を、本明細書では「商業的酵素供給モデル」と呼ぶ。
【０２５６】
別の操業手法では、本発明の非天然セルラーゼ及びヘミセルラーゼ組成物は、バイオエタノール精錬所又はバイオケミカル／バイオ材料製造業者に位置するか若しくはその近くに位置する場所（「オンサイト」）に酵素製造業者によって建設される最新の酵素製造システムで製造することができる。一部の実施形態では、酵素製造業者と、バイオエタノール精錬所又はバイオケミカル／バイオ材料製造業者とにより、酵素供給の取り決めが行われる。酵素製造業者は、本明細書に述べられる宿主細胞、発現、及び製造方法を用いてオンサイトで酵素製造システムを設計、制御、及び稼働して、非天然セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ組成物を製造する。特定の実施形態では、好ましくは本明細書に述べられるような適当な前処理を行った適当なバイオマスを、バイオエタノール精錬所又はバイオケミカル／バイオ材料製造施設若しくはその近くにおいて、本明細書に述べられる糖化方法並びに酵素及び／又は酵素組成物を用いて加水分解することができる。次いで得られた発酵性糖を、同じ施設又は近くの設備において発酵に供することができる。このような操業手法を、本明細書では「オンサイトバイオ精錬モデル」と呼ぶ。
【０２５７】
オンサイトバイオ精錬モデルは、例えば、商業的酵素供給業者からの酵素の供給に対する依存度が最小限に留められるような自給自足型の操業が可能となるなど、商業的な酵素供給モデルと比較して所定の利点を与えるものである。これにより、バイオエタノール精錬所又はバイオケミカル／バイオ材料製造業者が、リアルタイム又はほぼリアルタイムの需要に基づいて酵素の供給をより効果的に調整することが可能となる。特定の実施形態では、互いに近くに位置する２箇所又は２箇所以上のバイオエタノール精錬所及び／又はバイオケミカル／バイオ材料製造業者の間でオンサイト酵素製造施設を共有して、酵素の輸送及び保管のコストを低減することが考えられる。更に、これによって、オンサイトでの酵素製造施設における「ドロップイン」技術の速やかな改善が可能となり、発酵性糖、ひいてはバイオエタノール又はバイオケミカルの収率を高めるような酵素組成物の改良の間のタイムラグが短縮される。
【０２５８】
オンサイトバイオ精錬モデルは、本開示のセルラーゼ及び非天然ヘミセルラーゼ組成物ばかりでなく、デンプン（例えばトウモロコシ）を処理することでデンプンのバイオエタノール又はバイオケミカルへのより効率的かつ効果的な直接変換を可能とする酵素及び酵素組成物を製造、供給及び生産するために使用することができるという点で、バイオエタノール及びバイオケミカルの工業的生産及び商業化におけるより一般的な応用性を有するものである。こうしたデンプン処理酵素は、特定の実施形態では、オンサイトのバイオ精錬所において製造した後、バイオエタノール精錬所又はバイオケミカル／バイオ材料製造施設に速やかかつ容易に取り入れて、バイオエタノールを製造することができる。
【０２５９】
したがって、特定の態様では、本発明は、本明細書に述べられる酵素（例えば、特定のＧＨ６１エンドグルカナーゼ及びその変異体）、細胞、組成物（例えば、適当なＧＨ６１エンドグルカナーゼ又はその変異体を含む）、及びプロセスを、特定のバイオエタノール、バイオ燃料、バイオケミカル、又は他のバイオ材料の製造及び販売に適用する特定の商業的方法にも関するものである。一部の実施形態では、本発明は、オンサイトバイオ精錬モデルにおけるこのような酵素、細胞、組成物及びプロセスの適用に関する。他の実施形態では、本発明は、商業用酵素供給モデルにおけるこのような酵素、細胞、組成物及びプロセスの適用に関する。
【０２６０】
これに関連して、本開示は、商業的状況における本発明の酵素及び／又は酵素組成物の使用を提供する。例えば、本開示の酵素及び／又は酵素組成物は、酵素及び／又は組成物の一般的又は好ましい使用方法の説明書とともに、適当な市場で販売することができる。
したがって、本開示の酵素及び／又は酵素組成物は、商業的酵素供給者モデルにおいて使用又は商業化することが可能であり、その場合、本開示の酵素及び／又は酵素組成物は、燃料又はバイオ製品の業界におけるバイオエタノールの製造業者、燃料精錬所、又はバイオケミカル若しくはバイオ材料の製造業者に販売される。一部の態様では、本開示の酵素及び／又は酵素組成物は、オンサイトバイオ精錬モデルを用いて販売又は商業化することが可能であり、その場合、酵素及び／又は酵素組成物は、燃料精錬所又はバイオケミカル／バイオ材料製造業者の施設又はこれに近い施設において製造又は調製され、本発明の酵素及び／又は酵素組成物は、燃料精錬所又はバイオケミカル／バイオ材料製造業者の具体的なニーズに合わせて、リアルタイムに調整される。更に、本開示は、所望のバイオ製品（例えばバイオ燃料、バイオケミカル、バイオ材料など）の製造及び販売を可能とするように、酵素及び／又は酵素組成物を使用するためのテクニカルサポート及び／又は使用説明書をこれらの製造業者に提供することに関する。
【０２６１】
以下に、本発明の方法及び組成物の実施例を示す。上記に示した一般的な説明を考慮することで、他の異なる実施形態も実施可能である点は理解されるであろう。
【実施例】
【０２６２】
実施例１：アッセイ／方法
以下のアッセイ／方法を、下記に述べる実施例において一般的に使用した。下記に示すプロトコールからのすべての変更点は、具体的な実施例に示す。
【０２６３】
Ａ．バイオマス基質の前処理
国際特許出願公開第ＷＯ０６１１０９０１Ａ号に述べられる方法及び処理範囲に従って（特に断らないかぎり）、酵素加水分解に先立ってトウモロコシの穂軸、トウモロコシの茎葉、及びスイッチグラスの前処理を行った。前処理に関するこれらの参照文献は、米国特許出願公開第２００７００３１９１８−Ａ１号、同第２００７００３１９１９−Ａ１号、同第２００７００３１９５３−Ａ１号、及び／又は同第２００７００３７２５９−Ａ１号の開示内容にも含まれている。
【０２６４】
アンモニア繊維爆発処理（ＡＦＥＸ）したトウモロコシ茎葉を、ミシガン・バイオテクノロジー・インスティテュート・インターナショナル社（Michigan Biotechnology Institute International）（ＭＢＩ）より入手した。トウモロコシ茎葉の組成は、米国立再生可能エネルギー研究所（National Renewable Energy Laboratory）（ＮＲＥＬ）の手法であるＮＲＥＬ  ＬＡＰ−００２を用い、ＭＢＩ（Ｔｅｙｍｏｕｒｉ，Ｆら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，１１３：９５１〜９６３）により決定されている。ＮＲＥＬの手順は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｒｅｌ．ｇｏｖ／ｂｉｏｍａｓｓ／ａｎａｌｙｔｉｃａｌ＿ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．ｈｔｍｌにおいて入手可能である。
【０２６５】
ＦＰＰパルプ及び紙基質を、スマーフィット・カッパ・セルロース・ド・パン社（SMURFIT KAPPA CELLULOSE DU PIN）（フランス）より入手した。
蒸気膨張サトウキビバガス（ＳＥＢ）を、サン・オプタ社（SunOpta）より入手した（Ｇｌａｓｓｅｒ，ＷＧら、Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  １９９８，１４（３）：２１９〜２３５；Ｊｏｌｌｅｚ，Ｐら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅｒｍｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｍａｓｓ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ，１９９４，２：１６５９〜１６６９）。
【０２６６】
Ｂ．バイオマスの組成分析
「バイオマス中の構造性炭水化物及びリグニンの測定（Determination of structural carbohydrates and lignin in the biomass）」、（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ  ２００８  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｒｅｌ．ｇｏｖ／ｂｉｏｍａｓｓ／ｐｄｆｓ／４２６１８．ｐｄｆ）に述べられる２工程の酸加水分解法を用いてバイオマス基質の組成物を測定した。この方法を用いて、酵素加水分解の結果を、基質の開始時のグルカン及びキシラン含量からの理論的収率に対する変換率（％）として本明細書に報告した。
【０２６７】
Ｃ．全タンパク質アッセイ
ＢＣＡタンパク質アッセイは、分光光度計によってタンパク質濃度を測定する比色分析アッセイである。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ピアース・ケミカル社（Pierce Chemical）、製品番号２３２２７）を製造者の指示に従って使用した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５）を使用して、酵素希釈液を試験チューブ中で調製した。希釈した酵素溶液（０．１ｍＬ）を、１ｍＬの１５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）が入った２ｍＬのエッペンドルフ遠心チューブに加えた。チューブをボルテックスにかけ、氷浴中に１０分間置いた。次いで、各試料を１４，０００ｒｐｍで６分間遠心した。上清を捨て、ペレットを１ｍＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨに再懸濁し、ペレットが溶解するまでチューブをボルテックスした。ＢＳＡ標準溶液を２ｍｇ／ｍＬのストック溶液から調製した。ＢＣＡ作用溶液を、０．５ｍＬの試薬Ｂを２５ｍＬの試薬Ａと混合することにより調製した。０．１ｍＬの酵素再懸濁試料を３本のエッペンドルフ遠心チューブに加えた。２ｍＬのＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ作用溶液を、各試料及びＢＳＡ標準エッペンドルフチューブに加えた。すべてのチューブを３７℃の水浴中で３０分間インキュベートした。次いで各試料を室温にまで冷却し（１５分間）、分光光度計で５６２ｎｍの吸光度を測定した。
【０２６８】
各標準についてタンパク質吸光度の平均値を計算した。このタンパク質の標準の平均値を、Ｘ軸上に吸光度を、Ｙ軸上に濃度（ｍｇ／ｍＬ）をとってプロットした。各点を下記の直線の式にあてはめた。すなわち、
ｙ＝ｍｘ＋ｂ
【０２６９】
酵素試料の非処理濃度を、吸光度をＸの値に代入することによって計算した。全タンパク質濃度を、希釈係数を掛けることによって計算した。
【０２７０】
精製された試料の全タンパク質を、Ａ２８０（Ｐａｃｅ，ＣＮら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４：２４１１〜２４２３）によって求めた。
【０２７１】
発酵産物の全タンパク質含量は、ケルダール法（アールテック・ラボラトリーズ社（rtech laboratories）、ｗｗｗ．ｒｔｅｃｈｌａｂｓ．ｃｏｍ）又はデュマ（DUMAS）法によりインハウスで（トゥルースペック・シー・エヌ社（TruSpec CN）、ｗｗｗ．ｌｅｃｏ．ｃｏｍ）、燃焼、放出される窒素の捕捉及び測定により全窒素としてしばしば測定されている（Ｓａｄｅｒ，Ａ．Ｐ．Ｏ．ら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，９（２）：７３〜７９）。例えば発酵ブロスなどの複雑なタンパク質含有試料の場合には、平均で１６％のＮ含有率、タンパク質への窒素の変換係数として６．２５を用いた。場合により、全沈殿タンパク質を測定して、干渉する非タンパク質性の窒素を除外した。１２．５％の最終ＴＣＡ濃度を用い、タンパク質含有ＴＣＡペレットを０．１Ｍ  ＮａＯＨに再懸濁した。
【０２７２】
場合により、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ−ｔｈｅ  Ｂｅｔｔｅｒ  Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（サーモ・サイエンティフィック社（Thermo Scientific）、イリノイ州、ロックフォード、製品番号２３２３８）を、製造者の推奨するところに従って使用した。また、場合により、ワイクセルバウム（Weichselbaum）及びゴルナール（Gornall）によりウシ血清アルブミンを検量物質として使用して改変されたビウレット法を用いて、全タンパク質を測定した（Ｗｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍ，Ｔ．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．１９６０，１６：４０；Ｇｏｒｎａｌｌ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９４９，１７７：７５２）。
【０２７３】
Ｄ．ＡＢＴＳを用いたグルコースの測定
グルコース測定用のＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチレンチアゾリン−６）−スルホン酸）アッセイは、Ｏ２の存在下では、グルコース酸化酵素が、化学量論的な量の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成しながらグルコースの酸化を触媒するという原理に基づいたものである。この反応の後に、Ｈ２Ｏ２の濃度と線形の相関を示す、ＡＢＴＳの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）により触媒される酸化を行う。酸化型ＡＢＴＳの生成は、４０５ｎｍのＯＤにおいて定量される緑色の呈色によって示される。ＡＢＴＳ粉末（シグマ社（Sigma）、＃Ａ１８８８−５ｇ、２．７４ｍｇ／ｍＬ）、０．１Ｕ／ｍＬのＨＲＰ（１００Ｕ／ｍＬ、シグマ社（Sigma）、＃Ｐ８３７５）、及び１Ｕ／ｍＬのグルコースオキシダーゼ（ＯｘｙＧＯ（登録商標）ＨＰ  Ｌ５０００、５０００Ｕ／ｍＬ、ダニスコ・ユー・エス・エー社ジェネンコア部門（Genencor Division, Danisco USA））の混合物を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）中で調製し、暗所で保管した（基質）。グルコース標準溶液（０、２、４、６、８、１０ｎｍｏｌ）を５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）中で調製し、１０μＬの各標準溶液を９６穴平底ＭＴＰ中に３重で加えた。１０μＬの連続希釈した試料もＭＴＰに加えた。１００μＬのＡＢＴＳ基質溶液を各ウェルに加え、プレートを分光光度プレートリーダー上に置いて、ＡＢＴＳの酸化を４０５ｎｍで５分間、速度論的に読み取った。
【０２７４】
また、１５〜３０分間のインキュベート後に、２％  ＳＤＳを含む５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）によって反応を停止させた後で４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【０２７５】
Ｅ．ＨＰＬＣによる糖の分析
透明な不溶性物質が得られるまで遠心し、０．２２μｍのナイロンフィルター（Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心チューブフィルター、コーニング社（Corning Incorporated）、ニューヨーク州コーニング）に通して濾過し、蒸留水で適当な濃度の可溶性糖にまで希釈することによって、バイオマス糖化からの試料を調製した。モノマー糖は、６×５０ｍｍのＳＨ−１０１１Ｐガードカラムを備えたＳｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＨ−Ｇ  ＳＨ１０１１、８×３００ｍｍ（ｗｗｗ．ｓｈｏｄｅｘ．ｎｅｔ）で測定した。溶媒は、０．０１ＮのＨ２ＳＯ４を０．６ｍＬ／分で流した。カラム温度は５０℃とし、屈折率により検出を行った。
また、Ｗａｔｅｒｓ  ２４１０屈折率検出器を備えたＢｉｏｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムを使用して、糖の分析を行った。分析時間は２０分間であり、注入体積は２０μＬの希釈試料であり、移動相は、０．２μｍで濾過し、脱気した０．０１Ｎ硫酸であり、流速は０．６ｍＬ／分であり、カラム温度は６０℃であった。グルコース、キシロース、及びアラビノースの外部標準を各試料群とともに流した。
【０２７６】
オリゴマー糖を、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ  Ｇ２０００ＰＷカラム、７．５ｍｍｘ６０ｃｍ（ｗｗｗ．ｔｏｓｏｈｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｄｅ）を使用し、ＨＰＬＣ中でサイズ排除クロマトグラフィーによって分離した。溶媒は０．６ｍＬ／分の蒸留水であり、カラムは室温で操作した。サイズの較正に使用した六炭素糖の標準物質は、スタキオース、ラフィノース、セロビオース及びグルコースであり、五炭素糖は、キシロヘキソース、キシロペントース、キシロテトロース、キシロトリオース、キシロビオース及びキシロースであった。キシロ−オリゴマーは、メガザイム社（Megazyme）より入手した（ｗｗｗ．ｍｅｇａｚｙｍｅ．ｃｏｍ）。検出は屈折率により行い、定量的に報告されている場合、結果は、ピーク面積単位又は相対ピーク面積（％）である。
【０２７７】
全可溶性糖を、上記に述べた遠心分離及びフィルターで清澄化した試料の加水分解により測定した。清澄化した試料を０．８ＮのＨ２ＳＯ４により１：１で希釈し、得られた溶液を、キャップしたバイアル中で１時間の全サイクル時間にわたって１２１℃でオートクレーブした。結果は、加水分解の間のモノマー糖の損失について補正せずに報告した。
【０２７８】
Ｆ．穂軸からのオリゴマーの調製及び酵素アッセイ
トウモロコシ穂軸のＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３による加水分解によるオリゴマーを、グルカン及びキシラン１ｇ当たり８ｍｇのＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３と、乾燥重量で２５０ｇの希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸とを、５０ｍＭ、ｐＨ  ５．０の酢酸ナトリウム緩衝液（１Ｎ硫酸によりｐＨを調整したもの）中でインキュベートすることにより調製した。反応は、４８℃で７２時間、１８０ｒｐｍで回転振盪を行って進行させた。上清を９，０００×Ｇで遠心した後、０．２２μｍのＮａｌｇｅｎｅフィルターに通して濾過して可溶性糖を回収した。その後の酵素アッセイを行うため、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３オリゴマーを含む上清の１００μＬのアリコートを、１μｇ／μＬのＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ、１μｇ／μＬのＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ／ＥＧ４＃２７、又はコントロールとしての水とともに、エッペンドルフチューブ中、４８℃で２．５時間インキュベートした。次に上清を氷冷したＭｉｌｌｉＱ水で４倍に希釈し、濾過して、オリゴマーからの糖の放出についてＨＰＬＣにより分析した。
【０２７９】
Ｇ．トウモロコシ穂軸の糖化アッセイ
本明細書における一般的な実施例では、特定の実施例により具体的に述べられないかぎりは、トウモロコシ穂軸の糖化は、以下の手順に従ってマイクロタイタープレートのフォーマットで行った。例えば希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸のようなバイオマス基質を、水で薄め、硫酸でｐＨを調整してｐＨ  ５の７％セルローススラリーとした後、これを更なる処理を行わずにアッセイにおいて直接使用した。酵素試料を、基質（例えばトウモロコシ穂軸）中のセルロース１ｇ当たりの全タンパク質のｍｇ数（例えば上記の実施例１Ａにおいて述べた方法を用い、従来の組成分析法によって決定される）に基づいてロードした。次いで各酵素を５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）に希釈して、所望のローディング濃度を得た。４０μＬの酵素溶液を、７０ｍｇの希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸に、７％セルロース／ウェルとなるように加えた（４．５％セルロース／ウェルの最終濃度に相当）。各アッセイプレートにアルミニウムのプレートシーラーを被せ、室温で混合し、５０℃、２００ｒｐｍで３日間（「３ｄ」）インキュベートした。インキュベーション時間の最後に、各ウェルに１００μＬの１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ１０．０）を加えることにより糖化反応を停止させた。プレートを３，０００ｒｐｍで５分間遠心した。次いで１０μＬの上清を、９６穴ＨＰＬＣプレート中で２００μＬのＭｉｌｌｉＱ水に加え、ＨＰＬＣにより可溶性糖を測定した。
【０２８０】
実施例２：トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）の組み込み発現株の構築
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）β−グルコシダーゼ遺伝子ｂｇｌ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）エンドキシラナーゼ遺伝子ｘｙｎ３、Ｆ．バーティシリオイデス（F. verticillioides）β−キシロシダーゼ遺伝子ｆｖ３Ａ、Ｆ．バーティシリオイデス（F. verticillioides）β−キシロシダーゼ遺伝子ｆｖ４３Ｄ、及びＦ．バーティシリオイデス（F. verticillioides）α−アラビノフラノシダーゼ遺伝子ｆｖ５１Ａの５つの遺伝子を同時発現するトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）の組み込み発現株を構築した。
【０２８１】
これらの異なる遺伝子の発現カセットの構築、及びＴ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換について以下に述べる。
【０２８２】
Ａ．β−グルコシダーゼ発現ベクターの構築
天然β−グルコシダーゼ遺伝子ｂｇｌ１のＮ末端部分を、ディーエヌエー２．０社（DNA 2.0）（メンローパーク、米国）によりコドン最適化した。この合成された部分は、コーディング領域の最初の４４７個の塩基からなるものであった。このフラグメントを、プライマーとしてＳＫ９４３及びＳＫ９４１を用いてＰＣＲ増幅した。天然ｂｇｌ１遺伝子の残りの領域は、プライマーとしてＳＫ９４０及びＳＫ９４２を用いて、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株ＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，Ｇら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９８４，２０：４６〜５３）から抽出したゲノムＤＮＡ試料からＰＣＲ増幅した。ｂｇｌ１遺伝子のこれら２つのＰＣＲフラグメントを、プライマーとしてＳＫ９４３及びＳＫ９４２を用いて融合ＰＣＲ反応で互いに融合した。
順方向プライマーＳＫ９４３：（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＴＡＴＡＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＴ−３’）（配列番号１２１）
逆方向プライマーＳＫ９４１：（５’−ＣＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＧＧＡＧＴＣＴＴＧＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＧ−３’）（配列番号１２２）
順方向プライマー（ＳＫ９４０）：（５’−ＣＴＧＴＣＧＣＧＧＧＡＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＡＧＡＣＴＣＣＧＣＡＧＧＧＣＧＧＴＣＧ−３’）（配列番号１２３）
逆方向プライマー（ＳＫ９４２）：（５’−ＣＣＴＡＣＧＣＴＡＣＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧ−３’）（配列番号１２４）
【０２８３】
得られた融合ＰＣＲフラグメントをＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＥｎｔｒｙベクターｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローニングし、大腸菌Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学コンピテント細胞（インビトロジェン社（Invitrogen））に形質転換することにより、中間体ベクターｐＥＮＴＲ−ＴＯＰＯ−Ｂｇｌ１−（９４３／９４２）を得た（図８Ａ）。挿入されたＤＮＡのヌクレオチド配列を決定した。インビトロジェン社（Invitrogen）により概略が示されるＬＲクロナーゼ（登録商標）反応プロトコールを用い、正しいｂｇｌ１配列を有するｐＥＮＴＲ−９４３／９４２ベクターとｐＴｒｅｘ３ｇとの組換えを行った。このＬＲクロナーゼ反応混合物を大腸菌Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学コンピテント細胞（インビトロジェン社（Invitrogen））に形質転換することにより、最終的な発現ベクターとしてｐＴｒｅｘ３ｇ  ９４３／９４２を得た（図８Ｂ）。このベクターは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換の選択マーカーとしてアセトアミダーゼをコードしたアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）のａｍｄＳ遺伝子を更に含むものである。この発現カセットを、プライマーとしてＳＫ７４５及びＳＫ７７１を用いてＰＣＲにより増幅して、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換用の産物を生成した。
順方向プライマーＳＫ７７１：（５’−ＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＣＧＣＡＡＣ−３’）（配列番号１２５）
逆方向プライマーＳＫ７４５：（５’−ＧＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣ−３’）（配列番号１２６）
【０２８４】
Ｂ．エンドキシラナーゼ発現カセットの構築
天然Ｔ．リーゼイ（T. reesei）エンドキシラナーゼ遺伝子ｘｙｎ３を、ｘｙｎ３Ｆ−２及びｘｙｎ３Ｒ−２をプライマーとして用いて、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）から抽出したゲノムＤＮＡ試料からＰＣＲ増幅した。
順方向プライマーｘｙｎ３Ｆ−２：（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＣＧＴＣＡＴＣＴＴＧＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧ−３’）（配列番号１２７）
逆方向プライマー（ｘｙｎ３Ｒ−２）：（５’−ＣＴＡＴＴＧＴＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＣＡＡＴＧＣＴＧＴＴＡＴＡＴＧＣＣＧＧＣＴＴＧＧＧＧ−３’）（配列番号１２８）
【０２８５】
得られたＰＣＲフラグメントをＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＥｎｔｒｙベクターｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローニングし、大腸菌Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学コンピテント細胞に形質転換した（図８Ｃ）。挿入されたＤＮＡのヌクレオチド配列を決定した。インビトロジェン社（Invitrogen）により概略が示されるＬＲクロナーゼ（登録商標）反応プロトコールを用い、正しいｘｙｎ３配列を有するｐＥＮＴＲ／Ｘｙｎ３ベクターとｐＴｒｅｘ３ｇとの組換えを行った。このＬＲクロナーゼ反応混合物を大腸菌Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学コンピテント細胞（インビトロジェン社（Invitrogen））に形質転換することにより、最終的な発現ベクターとしてｐＴｒｅｘ３ｇ／Ｘｙｎ３を得た（図８Ｄ）。このベクターは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換の選択マーカーとしてアセトアミダーゼをコードしたアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）のａｍｄＳ遺伝子を更に含むものである。この発現カセットを、プライマーとしてＳＫ７４５及びＳＫ８２２を用いてＰＣＲにより増幅して、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換用の産物を生成した。
順方向プライマーＳＫ７４５：（５’−ＧＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣ−３’）（配列番号１２９）
逆方向プライマーＳＫ８２２：（５’−ＣＡＣＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＧＡＴＴＣ−３’）（配列番号１３０）
【０２８６】
Ｃ．β−キシロシダーゼＦｖ３Ａ発現ベクターの構築
Ｆ．バーティシリオイデス（F. verticillioides）β−キシロシダーゼｆｖ３Ａ遺伝子を、プライマーとしてＭＨ１２４及びＭＨ１２５を用いてＦ．バーティシリオイデス（F. verticillioides）のゲノムＤＮＡから増幅した。
順方向プライマーＭＨ１２４：（５’−ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＡＧ−３’）（配列番号１３１）
逆方向プライマーＭＨ１２５：（５’−ＴＴＡ  ＣＧＣ  ＡＧＡ  ＣＴＴ  ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＴＴＧ  ＡＧ−３’）（配列番号１３２）
【０２８７】
ＰＣＲフラグメントをＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＥｎｔｒｙベクターｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローニングし、大腸菌Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学コンピテント細胞（インビトロジェン社（Invitrogen））に形質転換することにより、中間体ベクターｐＥＮＴＲ−Ｆｖ３Ａを得た（図８Ｅ）。挿入されたＤＮＡのヌクレオチド配列を決定した。インビトロジェン社（Invitrogen）により概略が示されるＬＲクロナーゼ（登録商標）反応プロトコールを用い、正しいｆｖ３Ａ配列を有するｐＥＮＴＲ／Ｆｖ３ＡベクターとｐＴｒｅｘ６ｇ（図８Ｆ）との組換えを行った。このＬＲクロナーゼ反応混合物を大腸菌Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学コンピテント細胞（インビトロジェン社（Invitrogen））に形質転換することにより、最終的な発現ベクターとしてｐＴｒｅｘ６ｇ／Ｆｖ３Ａを得た（図８Ｇ）。このベクターは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換の選択マーカーとしてその天然のプロモーター及びターミネーターとともに使用される、ａｌｓＲと呼ばれる天然のＴ．リーゼイ（T. reesei）アセトラクテートシンターゼ（ａｌｓ）遺伝子のクロリムロンエチル耐性突然変異体を更に含むものである（国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０３９３７０  Ａ１号）。この発現カセットを、プライマーとしてＳＫ１３３４、ＳＫ１３３５及びＳＫ１２９９を用いてＰＣＲにより増幅して、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換用の産物を生成した。
順方向プライマーＳＫ１３３４：（５’−ＧＣＴＴＧＡＧＴＧＴＡＴＣＧＴＧＴＡＡＧ−３’）（配列番号１３３）
順方向プライマーＳＫ１３３５：（５’−ＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＣＡＣＴＴＣ−３’）（配列番号１３４）
逆方向プライマーＳＫ１２９９：（５’−ＧＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＡＴＣＴＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣ−３’）（配列番号１３５）
【０２８８】
Ｄ．β−キシロシダーゼＦｖ４３Ｄ発現カセットの構築
Ｆ．バーティシリオイデス（F. verticillioides）β−キシロシダーゼＦｖ４３Ｄ発現カセットを構築するため、ｆｖ４３Ｄ遺伝子産物を、プライマーとしてＳＫ１３２２及びＳＫ１２９７を用いてＦ．バーティシリオイデス（F. verticillioides）のゲノムＤＮＡ試料から増幅した。エンドグルカナーゼ遺伝子ｅｇｌ１のプロモーターの領域を、プライマーとしてＳＫ１２３６及びＳＫ１３２１を用い、株ＲＬ−Ｐ３７から抽出したＴ．リーゼイ（T. reesei）のゲノムＤＮＡ試料からＰＣＲによって増幅した。次に、これら２つのＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントを、プライマーとしてＳＫ１２３６及びＳＫ１２９７を用いて融合ＰＣＲ反応で互いに融合した。得られた融合ＰＣＲフラグメントをｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社（Invitrogen））にクローニングして、プラスミドＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ４３Ｄ（図８Ｈ）を得て、このプラスミドを用いて大腸菌Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学コンピテント細胞（インビトロジェン社（Invitrogen））を形質転換した。複数の大腸菌クローンからプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で消化して確認した。
順方向プライマーＳＫ１３２２：（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＴＴＣＴＧＴＣ−３’）（配列番号１３６）
逆方向プライマーＳＫ１２９７：（５’−ＧＧＴＴＡＣＴＡＧＴＣＡＡＣＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＧ−３’）（配列番号１３７）
順方向プライマーＳＫ１２３６：（５’−ＣＡＴＧＣＧＡＴＣＧＣＧＡＣＧＴＴＴＴＧＧＴＣＡＧＧＴＣＧ−３’）（配列番号１３８）
逆方向プライマーＳＫ１３２１：（５’−ＧＡＣＡＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＧＡＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＧ−３’）（配列番号１３９）
【０２８９】
この発現カセットを、プライマーとしてＳＫ１２３６及びＳＫ１２９７を用い、ＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ４３ＤからＰＣＲ増幅してＴ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換用の産物を生成した。
【０２９０】
Ｅ．α−アラビノフラノシダーゼ発現カセットの構築
Ｆ．バーティシリオイデス（F. verticillioides）のα−アラビノフラノシダーゼ遺伝子ｆｖ５１Ａの発現カセットを構築するため、ｆｖ５１Ａ遺伝子産物を、プライマーとしてＳＫ１１５９及びＳＫ１２８９を用いてＦ．バーティシリオイデス（F. verticillioides）のゲノムＤＮＡ試料から増幅した。エンドグルカナーゼ遺伝子ｅｇｌ１のプロモーターの領域を、プライマーとしてＳＫ１２３６及びＳＫ１２６２を用い、株ＲＬ−Ｐ３７から抽出したＴ．リーゼイ（T. reesei）のゲノムＤＮＡ試料からＰＣＲによって増幅した。次に、これら２つのＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントを、プライマーとしてＳＫ１２３６及びＳＫ１２８９を用いて融合ＰＣＲ反応で互いに融合した。得られた融合ＰＣＲフラグメントをｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社（Invitrogen））にクローニングしてプラスミドＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ５１Ａ（図８Ｉ）を得て、このプラスミドを用いて大腸菌Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学コンピテント細胞（インビトロジェン社（Invitrogen））を形質転換した。
順方向プライマーＳＫ１１５９：（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＴＣＡＡＴＣＣＴＡＧ−３’）（配列番号１４０）
逆方向プライマーＳＫ１２８９：（５’−ＧＴＧＧＣＴＡＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＣ−３’）（配列番号１４１）
順方向プライマーＳＫ１２３６：（５’−ＣＡＴＧＣＧＡＴＣＧＣＧＡＣＧＴＴＴＴＧＧＴＣＡＧＧＴＣＧ−３’）（配列番号１４２）
逆方向プライマーＳＫ１２６２：（５’−ＧＡＡＣＴＧＡＡＧＣＧＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＧＡＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＧＡＣ−３’）（配列番号１４３）
【０２９１】
この発現カセットを、プライマーとしてＳＫ１２９８及びＳＫ１２８９を用いてＰＣＲにより増幅して、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）の形質転換用の産物を生成した。
順方向プライマーＳＫ１２９８：（５’−ＧＴＡＧＴＴＡＴＧＣＧＣＡＴＧＣＴＡＧＡＣ−３’）（配列番号１４４）
逆方向プライマーＳＫ１２８９：（５’−ＧＴＧＧＣＴＡＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＣ−３’）（配列番号１４５）
【０２９２】
Ｆ．β−グルコシダーゼ及びエンドキシラナーゼのＴ．リーゼイ（T. reesei）発現カセットの同時形質転換
ＲＬ−Ｐ３７より誘導し（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，Ｇら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９８４，２０：４６〜５３）、高いセルラーゼの産生量について選択したトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）突然変異株に、ＰＥＧ媒介形質転換法（Ｐｅｎｔｔｉｌａ，Ｍら、Ｇｅｎｅ  １９８７，６１（２）：１５５〜６４）を用いて、β−グルコシダーゼ発現カセット（ｃｂｈ１プロモーター、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）β−グルコシダーゼ１遺伝子、ｃｂｈ１ターミネーター、及びａｍｄＳマーカー）及びエンドキシラナーゼ発現カセット（ｃｂｈ１プロモーター、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ｘｙｎ３、及びｃｂｈ１ターミネーター）を同時形質転換した。多数の形質転換体が単離され、これらをβ−グルコシダーゼ及びエンドキシラナーゼの産生について調べた。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株＃２２９と呼ばれる形質転換体を、他の発現カセットとともに形質転換に使用した。
【０２９３】
Ｇ．２種類のβ−キシロシダーゼ及びα−アラビノフラノシダーゼの発現カセットによるＴ．リーゼイ（T. reesei）株＃２２９の同時形質転換
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株＃２２９に、エレクトロポレーション（例えば国際特許出願公開第ＷＯ  ０８１５３７１２号を参照）を用いて、β−キシロシダーゼｆｖ３Ａ発現カセット（ｃｂｈ１プロモーター、ｆｖ３Ａ遺伝子、ｃｂｈ１ターミネーター、及びａｌｓＲマーカー）、β−キシロシダーゼｆｖ４３Ｄ発現カセット（ｅｇｌ１プロモーター、ｆｖ４３Ｄ遺伝子、天然ｆｖ４３Ｄターミネーター）、及びｆｖ５１Ａα−アラビノフラノシダーゼ発現カセット（ｅｇｌ１プロモーター、ｆｖ５１Ａ遺伝子、ｆｖ５１Ａ天然ターミネーター）を同時形質転換した。形質転換体を、クロリムロンエチル（８０ｐｐｍ）を含むフォーゲル（Vogels）寒天平板培地上で選択した。フォーゲル寒天は、１Ｌ当たりにつき以下のように調製した。
【０２９４】
【表２】
2018075020.tif 000003
【０２９５】
多数の形質転換体が単離され、これらをβ−キシロシダーゼ及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼの産生について調べた。形質転換体は、実施例１（前出）において述べたトウモロコシ穂軸糖化アッセイに従ってバイオマス変換効率についてもスクリーニングした。
本明細書に述べられるＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み発現株の例は、Ｈ３Ａ、３９Ａ、Ａ１０Ａ、１１Ａ、及びＧ９Ａであり、これらは、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）β−グルコシダーゼ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ、及びＦｖ４３Ｄの遺伝子のすべてを異なる比で発現するものである。他の組み込みＴ．リーゼイ（T. reesei）株としては、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）β−グルコシダーゼ１、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ、及びＦｖ４３Ｄの遺伝子の多くが異なる比で発現されたものが含まれる。例えば、あるものは過剰発現されたＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３を欠き、別のものはウェスタンブロットにより測定した場合にＦｖ５１Ａを欠き、他の２つのものはＦｖ３Ａを欠き、また１つのものは過剰発現されたＢｇｌ１を欠いている（例えば株Ｈ３Ａ−５）。
【０２９６】
Ｈ．Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａの組成物
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａの発酵により以下のタンパク質、すなわち、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ、及びＦｖ４３Ｄが、本明細書に述べられ、図９に示されるようにして測定した比で生成する。
【０２９７】
Ｉ．ＨＰＬＣによるタンパク質分析
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及び質量分析（ＭＳ）を行って、発酵ブロス中に含まれる酵素を分離、同定、及び定量した。酵素試料を、Ｓ．プリカタス（S. plicatus）（例えばＮＥＢ  Ｐ０７０２Ｌ）から組換えにより発現されたｅｎｄｏＨグリコシダーゼで最初に処理した。ｅｎｄｏＨは、１μｇの試料の全タンパク質当たり０．０１〜０．０３μｇのｅｎｄｏＨタンパク質となる比で使用し、３７℃、ｐＨ  ４．５〜６．０で３時間インキュベートすることにより、ＨＰＬＣ分析に先立ってＮ結合型グリコシル化を酵素的に除去した。次いで、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムをＨＩＣフェニルカラム及び３５分間にわたる高〜低塩勾配とともに使用して、約５０μｇのタンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィーを行うために注入した。この勾配は、高塩濃度緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸カリウムを含む４Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ  ６．７５）及び低塩濃度緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ  ６．７５）を用いて得た。ピークは２２２ｎｍの紫外線により検出し、分画を回収し、質量分析により同定を行った。タンパク質の濃度は、試料の全積分面積に対する各ピークの面積の比率（％）として報告した。
【０２９８】
Ｊ．Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａの発酵ブロスへの精製タンパク質の添加が、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化に対して与える効果
精製タンパク質（及び１種類の非精製タンパク質）をストック溶液から連続希釈し、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａの発酵ブロスに加えることにより、前処理したバイオマスの糖化に対する効果を調べた。希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）の各ウェルに２０％固形分（ｗ／ｗ）（１ウェル当たり約５ｍｇのセルロース）（ｐＨ  ５）となるようにロードした。Ｈ３Ａタンパク質（発酵ブロスの形態）を、２０ｍｇタンパク質／セルロース１ｇとなるように各ウェルに加えた。希釈したタンパク質のそれぞれ（図１０）の１０、５、２及び１μＬの量を、個々のウェルに加え、各ウェルへの液体の添加量が全体で１０μＬとなるように水を加えた。参照ウェルには、１０μＬの水又は更なるＨ３Ａ発酵ブロスの希釈液を加えた。ＭＴＰをホイルでシールし、Ｉｎｎｏｖａインキュベーターシェーカー中で２００ＲＰＭで振盪しながら５０℃で３日間インキュベートした。各試料を、１００μＬの１００ｍＭグリシン、ｐＨ  １０で反応停止した。反応停止させた試料をプラスチックシールで覆い、３０００ＲＰＭで５分間、４℃で遠心した。反応停止させた反応液のアリコート（５μＬ）を１００μＬの水で希釈し、反応液中に生成したグルコースの濃度をＨＰＬＣを用いて測定した。グルコースのデータを、２０ｍｇ／ｇのＨ３Ａに加えたタンパク質濃度の関数としてプロットした（タンパク質の添加濃度は、異なる開始濃度及び添加体積のために異なりうる）。結果を図１１Ａ〜１１Ｄに示す。
【０２９９】
実施例３：Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株の構築
Ａ．Ｔ．リーゼイ（T. reesei）株Ｈ３Ａ／ＥＧ４＃２７の構築及びスクリーニング
トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）に由来するＴ．リーゼイ（T. reesei）ｅｇｌ１（「Ｃｅｌ  ７Ｂ」とも称される）プロモーター、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ｅｇ４（「ＴｒＥＧ４」又は「Ｃｅｌ  ６１Ａ」とも称される）オープンリーディングフレーム、及びｃｂｈ１（Ｃｅｌ  ７Ａ）ターミネーター配列を含む発現カセット（図１２Ａ）、並びにアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）に由来するｓｕｃＡ選択マーカー（Ｂｏｄｄｙら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９９３，２４：６０〜６６を参照）を、ｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ  ＴＯＰＯ（インビトロジェン社（Invitrogen））にクローニングした（図１２Ｂ）。
【０３００】
この発現カセットＰｅｇｌ１−ｅｇ４−ｓｕｃＡを以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。すなわち、
ＳＫ１２９８：５’−ＧＴＡＧＴＴＡＴＧＣＧＣＡＴＧＣＴＡＧＡＣ−３’（配列番号１４６）
２１４：５’−ＣＣＧＧＣＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＣＣＡＣＴＡＡＧＣＡＣＡＴ−３’（配列番号１４７）
【０３０１】
Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ（ストラタジーン社（Stratagene））をＰＣＲ反応のポリメラーゼとして使用した。ＰＣＲ反応の生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（キアゲン社（Qiagen））を用い、製造者のプロトコールに従って精製した。次いでＰＣＲ反応の生成物を、スピードバックを使用して１〜３μｇ／μＬにまで濃縮した。形質転換（Ｈ３Ａ）しようとするＴ．リーゼイ（T. reesei）宿主株を、ポテトデキストロース寒天プレート上で５日間、２８℃で完全な胞子形成が見られるまで増殖させた。２個のプレートからの胞子をＭｉｌｉＱ水を用いて収穫し、４０μＭセルストレーナー（ビー・ディー・ファルコン社（BD Falcon））に通して濾過した。胞子を５０ｍＬの円錐チューブに移し、５０ｍＬの水で繰り返し遠心することにより３回洗浄した。１．１Ｍソルビトール溶液により最終的な洗浄を行った。この胞子を、１．１Ｍソルビトール溶液を用いて小さい体積（ペレットの体積の２倍以下）に再懸濁した。次いで、この胞子懸濁液を氷上に維持した。胞子懸濁液（６０μＬ）を１０〜２０μｇのＤＮＡと混合し、エレクトロポレーションキュベット（Ｅ−ｓｈｏｔ、インビトロジェン社（Invitrogen）より販売される０．１ｃｍ標準エレクトロポレーションキュベット）に移した。胞子を、１６ｋＶ／ｃｍ、２５μＦ、４００Ωに設定したＢｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌを用いてエレクトロポレートした。エレクトロポレーションの後、１ｍＬの１．１Ｍソルビトール溶液を胞子懸濁液に加えた。胞子懸濁液を、炭素源として２％スクロースを含むフォーゲル寒天（実施例２Ｇを参照）上にプレートした。
【０３０２】
これらの形質転換プレートを、３０℃で５〜７日間インキュベートした。この最初の形質転換体を、スクロースを含む二次フォーゲル寒天プレート上に再ストリークし、３０℃で更に５〜７日間増殖させた。次いで二次選択プレート上で増殖したシングルコロニーを、国際特許出願公開第ＷＯ／２００９／１１４３８０号に述べられる方法を用いてマイクロタイタープレートのウェル中で増殖させた。上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して、糖化効率についてスクリーニングを行う前に発現レベルを確認した。
【０３０３】
全部で９４個の形質転換体が、株Ｈ３ＡにおいてＥＧ４を過剰発現していた。２個のＨ３Ａコントロール株を、Ｈ３Ａ／ＥＧ４株とともにマイクロタイタープレートで増殖させた。ＥＧ４タンパク質を発現しているＴ．リーゼイ（T. reesei）株の効率についてのスクリーニングを、アンモニア前処理したトウモロコシ穂軸を使用して行った。希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を水に懸濁し、硫酸でｐＨ  ５．０に調整して７％セルロースとした。スラリーを平底９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社（Nunc）２６９７８７）に分注し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心した。
【０３０４】
トウモロコシ穂軸の糖化反応を、１ウェルの基質当たり２０μＬのＨ３Ａ又はＨ３Ａ／ＥＧ４株の培養ブロスを加えることにより開始させた。トウモロコシ穂軸の糖化反応液をアルミニウム（イー・アンド・ケー・サイエンティフィック社（E&K scientific））でシールし、６５０ｒｐｍ、２４℃で５分間混合した。次いで、プレートを５０℃、２００ｒｐｍで７２時間、Ｉｎｎｏｖａインキュベーター内に置いた。７２時間の糖化終了時に、１００μＬの１００ｍＭグリシン（ｐＨ  １０．０）を加えることにより反応を停止した。次いで、プレートを十分に混合して３，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清（１０μＬ）をＨＰＬＣ  ９６穴マイクロタイタープレート（アジレント社（Agilent）、５０４２−１３８５）中で２００μＬの水に加えた。グルコース、キシロース、セロビオース、及びキシロビオースの濃度を、ガードカラムを予め取り付けたＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｐカラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ、１２５−００９８）を使用し、てＨＰＬＣにより測定した。
【０３０５】
トウモロコシ穂軸でのスクリーニングにより、以下のＨ３Ａ／ＥＧ４株、すなわち１、２、３、４、５、６、１４、２２、２７、４３、及び４９がＨ３Ａコントロール株と比較して、高いグルカン及びキシラン変換率を有するものとして同定された（図１３）。
【０３０６】
選択されたＨ３Ａ／ＥＧ４株を振盪フラスコ中で再増殖させた。全体で３０ｍＬのタンパク質培養濾過物を振盪フラスコ１個当たり、株１個当たり回収した。培養濾過物を、１０ｋＤａ膜遠心濃縮器（ザルトリウス社（Sartorious）、ＶＳ２００１）を使用して１０倍に濃縮し、全タンパク質濃度を実施例１Ｃに述べるようにしてＢＣＡにより測定した。
トウモロコシ穂軸の糖化反応を、セルロース１ｇ当たり、トウモロコシ穂軸基質１ウェル当たり２．５、５、１０、又は２０ｍｇのＨ３Ａ／ＥＧ４株の試料から得たタンパク質を用いて行った。１４Ｌの発酵スケールで産生されたＨ３Ａ株、及び振盪フラスコスケールで産生された予め同定された低効率試料（Ｈ３Ａ／ＥＧ４株＃２０）をコントロールとして含めた。実施例４（下記）に述べられるようにして糖化反応を行った。タンパク質の用量の増加にともなうグルカン変換率の増大が、ＥＧ４発現株のすべての培養上清で認められた（図１４）。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ／ＥＧ４＃２７を更なる糖化反応において使用し、この株を、シングルコロニーをポテトデキストロースプレート上にストリークし、このプレートからシングルコロニーを単離することによって単離した。
【０３０７】
実施例４：希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化効率を高めるＴ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ４の濃度範囲
好ましい用量を決定するため、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸（２５％固形分、８．７％セルロース、７．３％キシラン）の加水分解を、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ／ＥＧ４  ＃２７、又は精製したＥＧ４を反応混合物に加えたＨ３Ａ株から得られた発酵ブロスを用いてｐＨ  ５．３で行った。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ／ＥＧ４  ＃２７又はＨ３Ａの全体のロード量は、グルカン（Ｇ）及びキシラン（Ｘ）１ｇ当たり１４ｍｇのタンパク質とした。
【０３０８】
反応混合物（全質量５ｇ）を、図１５、１７Ａ及び１７Ｂの用量チャートに従って、２０ｍＬシンチレーションバイアル中に５ｍＬの全反応体積となるようにロードした。
【０３０９】
実験１の条件を図１５に示す。ＭｉｌｌｉＱ水及び６Ｎ硫酸を円錐チューブ中で混合し、それぞれのバイアルに加え、バイアルを回転させて内容物を混合した。各酵素試料をバイアルに加え、バイアルを５０℃で６日間インキュベートした。異なる時点において、１００μＬの試料をバイアルから取り出し、９００μＬの５ｍＭ硫酸で希釈し、ボルテックスにかけてから遠心し、上清を使用してＨＰＬＣにより可溶性糖の濃度を測定した。グルカン及びキシラン変換率の結果を図１６Ａ及び１６Ｂにそれぞれ示す。
【０３１０】
実験２の条件を図１７Ａに示す。好ましいＥＧ４の濃度を更に決定するため、希アンモニアトウモロコシ穂軸（２５％固形分、８．７％セルロース、７．３％キシラン）の糖化を、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ／ＥＧ４  ＃２７、又は精製したＥＧ４を反応混合物に加えた（０．０５〜１．０ｍｇの範囲のタンパク質／ｇ（Ｇ＋Ｘ））Ｈ３Ａから得られた発酵ブロスを用いてｐＨ  ５．３で行った。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ／ＥＧ４  ＃２７又はＨ３Ａの全体のロード量は、１４ｍｇのタンパク質／ｇ（グルカン＋キシラン）とした。実験結果を図１８Ａに示す。
【０３１１】
実験３の条件を図１７Ｂに示す。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の好ましい濃度範囲を更に絞り込むため、希アンモニアトウモロコシ穂軸（２５％固形分、８．７％セルロース、及び７．３％キシラン）を、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ／ＥＧ４  ＃２７、又は精製したＥＧ４を０．１〜０．５ｍｇのタンパク質／ｇ（Ｇ＋Ｘ）の範囲の濃度で加えたＨ３Ａを用いてｐＨ  ５．３で加水分解した。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ／ＥＧ４  ＃２７又はＨ３Ａの全体のロード量は、グルカン及びキシラン１ｇ当たり１４ｍｇのタンパク質とした。
【０３１２】
結果を図１８Ｂに示す。
【０３１３】
実施例５：異なる固形物ロード量の希アンモニアで前処理したトウモロコシ茎葉の糖化に対するＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の効果
【０３１４】
希アンモニアで前処理したトウモロコシ茎葉を、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ又はＨ３Ａ／ＥＧ４＃２７（１４ｍｇのタンパク質／ｇ（グルカン及びキシラン））から得られた発酵ブロスと、７、１０、１５、２０及び２５％の固形分（％Ｓ）で３日間、５０℃、ｐＨ  ５．３でインキュベートした（２０ｍＬバイアル中、全体で５ｇの湿潤バイオマス）。反応は、上記実施例４で述べたようにして行った。グルコース及びキシロースをＨＰＬＣにより分析した。結果を図１９に示す。固形分が２０％以下の試料はいずれも１日目に、視認できる程度に液化した。
【０３１５】
実施例６：希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の加水分解に対するＴ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ４の過剰発現の効果
希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化に対する、株Ｈ３ＡにおけるＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の過剰発現の効果を、株Ｈ３Ａ／ＥＧ４  ＃  ２７及びＨ３Ａから得られた発酵ブロスを用いて試験した。３ｇのスケールのトウモロコシ穂軸の糖化を、以下のようにして２０ｍＬガラスバイアル中で行った。酵素調製物、１Ｎ硫酸、及び５０ｍＭ（ｐＨ  ５．０）酢酸ナトリウム緩衝液（０．０１％アジ化ナトリウム及び５ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含む）を加え、酵素のロード量が１ｇのグルカン＋キシラン当たり１．７〜２１．０ｍｇの全タンパク質の範囲で変化する、全体で３ｇの反応液として最終的なスラリーを得た（乾燥固形分２２％、ｐＨ  ５．０）。糖化バイアルはすべて、４８℃で１８０ｒｐｍの回転速度でインキュベートした。７２時間後、１２ｍＬの濾過したＭｉｌｌｉＱ水を各バイアルに加えて糖化反応液全体を５倍に希釈した。各試料を１４，０００×ｇで５分間遠心してから０．２２μｍナイロンフィルター（Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心チューブフィルター、コーニング社（Corning Incorporated）、ニューヨーク州コーニング）に通して濾過し、濾過したＭｉｌｌｉＱ水で更に４倍に希釈して最終的に２０倍の希釈液とした。２０μＬの注入液をＨＰＬＣにより分析して、放出された糖を測定した。
【０３１６】
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の過剰発現又は添加により、Ｈ３Ａ単独の場合と比較して、キシロース及びグルコースモノマーの放出量が高められた（図２０及び２１）。
異なる用量でＨ３Ａ／ＥＧ４＃２７を添加することにより、株Ｈ３Ａと比較して、又はＥｇ４＋一定の１．１２ｍｇのＸｙｎ３／ｇ（グルカン＋キシラン）の場合と比較して、キシロースの収率が向上した（図２０）。
【０３１７】
異なる用量でＨ３Ａ／ＥＧ４＃２７を添加することにより、株Ｈ３Ａと比較して、又はＥｇ４＋一定の１．１２ｍｇのＸｙｎ３／ｇ（グルカン＋キシラン）の場合と比較して、グルコースの収率が向上した（図２１）。
【０３１８】
組み込み株Ｈ３Ａ／ＥＧ４＃２７又はＨ３Ａによる全発酵性モノマー（キシロース、グルコース、及びアラビノース）の放出量に対するＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の効果を、図２２に示す。Ｈ３Ａ／ＥＧ４＃  ２７組み込み株により、組み込み株Ｈ３Ａと比較して、又はＥｇ４＋１．１２ｍｇのＸｙｎ３／ｇ（グルカン＋キシラン）と比較して、全発酵性モノマーの放出量は増大した。
【０３１９】
実施例７：精製されたＴ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ４は、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸中のグルコースの放出を生じる
放出される糖の濃度に対する精製されたＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４の効果について、１．０５ｇの希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を、０．５３ｍｇのＸｙｎ３／ｇ（グルカン＋キシラン）の存在下又は非存在下で使用して試験した。各実験は、実施例６で述べたようにして行った。結果を図２３に示す。これらのデータは、精製されたＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼなどの他のセルラーゼの作用がなくとも、グルコースモノマーの放出を生じることを示している。
【０３２０】
精製したＥｇ４を単独で加えた（Ｘｙｎ３を加えない）、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を使用して、更に糖化実験を行った。３．３μＬの精製したＥｇ４（１５．３ｍｇ／ｍＬ）を、８７２μＬの５０ｍＭ（ｐＨ  ５．０）酢酸ナトリウム緩衝液（０．０１％アジ化ナトリウム及び５ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含む）、１６５ｍｇの希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸（６７．３％乾燥固形分、１１１ｍｇの乾燥固形分を加えたもの）及び１６．５μＬの１Ｎ硫酸に５ｍＬバイアル中で加えた。各バイアルを４８℃でインキュベートし、１８０ｒｐｍで回転させた。一定周期で２０μＬのアリコートを取り、フィルター滅菌した二重蒸留水で１０倍に希釈し、ナイロンフィルターを通して濾過してから、Ｄｉｏｎｅｘイオンクロマトグラフィーシステムで放出グルコースの分析を行った。信頼性の高いグルコース溶液を外部標準として使用した。図２４に示される結果は、精製したＥｇ４を添加することにより、他のセルラーゼ又はエンドキシラナーゼの非存在下で４８℃で７２時間にわたるインキュベーションにおいて、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸からグルコースモノマーが放出されることを示している。
【０３２１】
実施例８：異なる基質に対するＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ及びＨ３Ａ／ＥＧ４  ＃２７の糖化効率
この実験では、１４ｍｇのタンパク質／ｇ（グルカン＋キシラン）の用量で用いた、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ又はＨ３Ａ／ＥＧ４＃２７より得た発酵ブロスを、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸、洗浄した希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸、アンモニア繊維膨張トウモロコシ茎葉（ＡＦＥＸ  ＣＳ）、蒸気膨張サトウキビバガス（ＳＥＢ）、並びにクラフト前処理した紙パルプＦＰＰ２７（脱リグニン化した針葉樹工業用未漂白パルプ−κ  １３．５、グルカン８１．９％、キシラン８．０％、クラーソンリグニン１．９％）、ＦＰＰ−３１（脱リグニン化した広葉樹未漂白パルプ−κ  １０．１、グルカン７５．１％、キシラン１９．１％、クラーソンリグニン２．２％）及びＦＰＰ−３７（空気乾燥した針葉樹未漂白パルプ−κ  ８２、グルカン７１．４％、キシラン８．７％、クラーソンリグニン１１．３％）を含む異なる基質に対する糖化効率について試験した。
【０３２２】
糖化反応は、２５ｍＬガラスバイアル中で、０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）中１０ｇの最終質量となるように調整し、５０℃、２００ｒｐｍで６日間インキュベートした。６日目の最後に１００μＬのアリコートを５ｍＭ硫酸で１：１０に希釈し、各試料をＨＰＬＣにより分析してグルコース及びキシロースの生成量を測定した。結果を図２５に示す。
【０３２３】
実施例９：酸で前処理したトウモロコシ茎葉の糖化に対するＴ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ４の効果
酸で前処理したトウモロコシ茎葉の糖化に対するＥｇ４の効果について試験を行った。
希硫酸で前処理したトウモロコシ茎葉（Ｓｃｈｅｌｌ，ＤＪら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，１０５（１〜３）：６９〜８５）を、ＮＲＥＬより入手し、２０％固形分に調整し、ソーダ灰溶液を加えてｐＨ  ５．０に調整した。前処理した基質の糖化を、２０％全固形分を用いてマイクロタイタープレート中で行った。発酵ブロス中の全タンパク質は、ビウレットアッセイ（上記実施例１を参照）により測定した。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ／ＥＧ４  ＃２７及びＨ３Ａより得た発酵ブロスの基質への添加量を増やし、５０℃、５日間、２００ＲＰＭの振盪でのインキュベーション後の糖化効率を測定した。グルコースの生成量（ｍｇ／ｇ）をＨＰＬＣにより測定した。結果を図２６に示す。
【０３２４】
実施例１０：希アンモニアで前処理したトウモロコシ葉、茎、及び穂軸に対するＴ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ及びＨ３Ａ／ＥＧ４＃２７の糖化効率
Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａ及びＨ３Ａ／ＥＧ４＃２７の糖化効率を、希アンモニアで前処理したトウモロコシ葉、茎、又は穂軸で比較した。前処理は、国際特許出願公開第ＷＯ０６１１０９０１Ａ号に述べられるようにして行った。５ｇの全質量（７％固形分）を、２０ｍＬバイアル中、ｐＨ  ５．３（６Ｎ  Ｈ２ＳＯ４によりｐＨを調整した）で、１４ｍｇのタンパク質／ｇ（グルカン＋キシラン）を使用して加水分解した。糖化反応は５０℃で行い、試料は４日目に放出されたグルコース及びキシロースについてＨＰＬＣにより分析した。結果を図２７に示す。
【０３２５】
実施例１１：Ｔ．リーゼイ（T. reesei）からの過剰発現ＥＧ４に応じた希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸に対する糖化効率
希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を用いて、３ｇのスケールの糖化反応を行った。充分な前処理を行った穂軸調製物を、２０ｍＬガラスバイアル中に０．７５ｇ乾燥固形分となるように計量して入れた。酵素調製物、１Ｎ硫酸及び５０ｍＭ（ｐＨ  ５．０）酢酸ナトリウム緩衝液（０．０１％アジ化ナトリウムを含むもの）を加えて、全体で３ｇの反応液として最終的なスラリーを得た（２５％乾燥固形分、ｐＨ  ５．０）。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）組み込み株Ｈ３Ａから得た細胞外タンパク質（発酵ブロス）を１４ｍｇのタンパク質／ｇ（グルカン＋キシラン）となるように加え、更に５％の１４ｍｇのタンパク質ロードを、Ｅｇ４を過剰発現するＴ．リーゼイ（T. reesei）株（Δｃｂｈ１  Δｃｂｈ２  Δｅｇ１  Δｅｇ２）（国際特許出願公開第ＷＯ  ０５／００１０３６号を参照）より得た未精製の培養上清として加えるか、又は加えなかった。糖化反応液は、５０℃で７２時間インキュベートした。インキュベーションの後、反応内容物を３倍に希釈し、濾過し、グルコース及びキシロース濃度についてＨＰＬＣにより分析した。結果を図２８に示す。Ｅｇ４を過剰発現するＴ．リーゼイ（T. reesei）株より得た細胞外タンパク質の形態のＥｇ４タンパク質をＨ３Ａに加えることにより、モノマーグルコースの放出量が大幅に増加し、モノマーキシロースの放出量はわずかに増加した。
【０３２６】
実施例１２：アンモニアで前処理したスイッチグラスに対する株Ｈ３Ａ／ＥＧ４＃２７の糖化効率
タンパク質の用量を増やした場合のアンモニアで前処理したスイッチグラスに対する株Ｈ３Ａ／ＥＧ４＃２７の糖化効率（国際特許出願公開第ＷＯ０６１１０９０１Ａ号）を、株Ｈ３Ａ（１８．５％固形分）の糖化効率と比較した。前処理したスイッチグラス調製物を、０．９２５ｇの乾燥固形分となるように２０ｍＬガラスバイアル中に計量して入れた。１Ｎ硫酸及び５０ｍＭ（ｐＨ  ５．３）酢酸ナトリウム緩衝液（０．０１％アジ化ナトリウムを含むもの）を加えて、全体で５ｇの反応液として最終的なスラリーを得た。試験したＨ３Ａの酵素の用量は、１４、２０、及び３０ｍｇ／ｇ（グルカン＋キシラン）であり、Ｈ３Ａ−ＥＧ４＃２７の用量は、５、８、１１、１４、２０、及び３０ｍｇ／ｇ（グルカン＋キシラン）であった。反応液を５０℃で３日間インキュベートした。インキュベーションの後、反応内容物を３倍に希釈し、濾過し、グルコース及びキシロース濃度についてＨＰＬＣにより分析した。グルカン及びキシランの変換率を、スイッチグラス基質の組成に基づいて計算した。結果（図２９）は、Ｈ３Ａ−ＥＧ４＃２７の効率は、同じ酵素用量のＨ３Ａよりもグルカンの変換においてより効果的であることを示している。
【０３２７】
実施例１３：トウモロコシ穂軸の糖化並びにＣＭＣ及びセロビオースの加水分解に対するＴ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ４の添加の効果
Ａ．トウモロコシ穂軸の糖化
希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を、２０％固形分、７％セルロースに調整し、マイクロタイタープレートの１ウェル当たり６５ｍｇを分注した。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１を５ｍｇのタンパク質／ｇ（グルカン）（最終濃度）で、関連酵素（ＣＢＨ１又はＥｇ４）を０、１、２、３、４及び５ｍｇ／ｇ（グルカン）の最終濃度で含む３５μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）緩衝液を加えることにより、糖化反応を開始した。Ｅｇ４コントロールには同じ用量のＥＧ４のみを加えたため、これらのウェルでは全体のタンパク質の添加量はより少なかった。各マイクロタイタープレートを、アルミニウムプレートシール（イー・アンド・ケー・サイエンティフィック社（E&K scientific））でシールし、６００ｒｐｍ、２４℃で２分間混合した。次いでプレートを、５０℃、２００ｒｐｍで７２時間、Ｉｎｎｏｖａインキュベーター内に置いた。
【０３２８】
７２時間の糖化終了時に、１００μＬの１００ｍＭグリシン（ｐＨ  １０．０）を加えることによりプレートの反応を停止した。次いで、プレートを３０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清（２０μＬ）をＨＰＬＣ  ９６穴マイクロタイタープレート（アジレント社（Agilent）５０４２−１３８５）中で１００μＬの水に加えたグルコース及びセロビオースの濃度を、ガードカラムを予め取り付けたＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｐカラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ、１２５−００９８）を使用してＨＰＬＣにより測定した。グルカンの変換率（％）を、１００×（セルロースのｍｇ数＋グルコースのｍｇ数）／（基質中の全グルカン）によって計算した（図３０）。
【０３２９】
Ｂ．ＣＭＣの加水分解：
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、シグマ社（Sigma）Ｃ４８８８）を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）で１％に希釈した。ＥＧ４、ＥＧ１及びＣＢＨ１の３種類のＴ．リーゼイ（T. reesei）の精製酵素のそれぞれを、２０、１０、５、２．５、１．２５及び０ｍｇ／ｇの最終濃度で１００μＬの１％  ＣＭＣに９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社（NUNC）＃２６９７８７）中で別々に加えることにより、加水分解反応を開始した。酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０、５０ｍＭ）を、各ウェルに１５０μＬの最終体積となるように加えた。このＣＭＣ加水分解反応液を、アルミニウムプレートシール（イー・アンド・ケー・サイエンティフィック社（E&K scientific））でシールし、６００ｒｐｍ、２４℃で２分間混合した。次いでプレートを、５０℃、２００ｒｐｍで３０分間、Ｉｎｎｏｖａインキュベーター内に置いた。
【０３３０】
３０分間のインキュベーション終了時に、プレートを氷水に１０分間入れて反応を停止させ、各試料をエッペンドルフチューブに移した。各チューブに３７５μＬのジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）溶液を加えた（下記を参照）。次いで各試料を１０分間沸騰させ、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  ２５０（モレキュラー・デバイシーズ社（Molecular Devices））により５４０ｎｍのＯ．Ｄを測定した。結果を図３１に示す。
ＤＮＳ溶液：
４０ｇ  ３．５−ジニトロサリチル酸（シグマ社（Sigma）、Ｄ０５５０）
８ｇフェノール
２ｇ亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）
８００ｇ  Ｎａ−Ｋ酒石酸塩（ロッシェル塩）
上記のものすべてを２Ｌの２％  ＮａＯＨに加える。
一晩攪拌し、アルミニウム箔で覆う。
蒸留した脱イオン水を４Ｌの最終体積となるように加える。
これをよく混ぜる。
暗ビン中で冷蔵保管する。
【０３３１】
Ｃ．セロビオースの加水分解
セロビオースを、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）で５ｇ／Ｌに希釈した。ＥＧ４及びＢＧＬ１の２種類の酵素のそれぞれを、２０、１０、５、２．５及び０ｍｇ／ｇの最終濃度で１００μＬの５ｇ／Ｌセロビオース溶液に別々に加えることにより、加水分解反応を開始した。酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）を１２０μＬの最終体積にまで各ウェルに加えた。反応プレートをアルミニウムプレートシール（イー・アンド・ケー・サイエンティフィック社（E&K scientific））でシールし、６００ｒｐｍ、２４℃で２分間混合した。次いでプレートを、５０℃、２００ｒｐｍで２時間、Ｉｎｎｏｖａインキュベーター内に置いた。
【０３３２】
２時間の加水分解工程終了時に、１００μＬの１００ｍＭグリシン（ｐＨ  １０．０）を加えることによりプレートの反応を停止した。次いで、プレートを３０００ｒｐｍで５分間遠心した。グルコース濃度を、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス−３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アッセイ（実施例１）により測定した。１０μＬの上清を、９６穴マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｃｏｓｔａｒ  ９０１７  ＥＩＡ／ＲＩＡプレート、９６穴平底、中度結合性）中で９０μＬのＡＢＴＳ溶液に加えた。
ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  ２５０（モレキュラー・デバイス社（Molecular Devices））によりＯＤ  ４２０ｎｍを測定した。結果を図３２に示す。
【０３３３】
実施例１４：精製したＥＧ４は、異なるセルラーゼ混合物と混合されると希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸からのグルコース産生を向上させる
精製したＥｇ４と精製した各セルラーゼ（Ｔ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ１、ＥＧ２、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、及びＢｇｌ１）との組み合わせの、放出される糖の濃度に対する効果について、１ｇのグルカン＋キシラン当たり０．５３ｍｇのＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｘｙｎ３の存在下で、１．０５ｇの希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を使用して試験した。１．０６ｇの反応液を、０．１１１ｇの乾燥穂軸固形分（１０．５％固形分）が入った５ｍＬバイアル中で調製した。酵素調製物（図３３）、１Ｎ硫酸、及び５０ｍＭ（ｐＨ  ５．０）酢酸ナトリウム緩衝液（０．０１％アジ化ナトリウム及び５ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含んだもの）を加えて、最終的な反応重量とした。反応バイアルを、４８℃で１８０ｒｐｍの回転速度でインキュベートした。７２時間後、濾過したＭｉｌｌｉＱ水を加えて各糖化反応を５倍に希釈した。各試料を１４，０００×ｇで５分間遠心してから０．２２μｍナイロンフィルター（Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心チューブフィルター、コーニング社（Corning Incorporated）、ニューヨーク州コーニング）に通して濾過し、濾過したＭｉｌｌｉＱ水で更に４倍に希釈して最終的に２０倍の希釈液とした。２０μＬの注入液をＨＰＬＣにより分析して、放出された糖（グルコース、セロビオース、及びキシロース）を測定した。
【０３３４】
図３４は、それぞれの組み合わせにより生成したグルコース（Ａ）、グルコース＋セロビオース（Ｂ）、又はキシロース（Ｃ）を示す。精製したＥｇ４は、個々のセルラーゼ及び混合物の効率を高めた。精製したセルラーゼのすべてが存在する場合、１ｇの（グルカン＋キシラン）当たり０．５３ｍｇのＥｇ４を加えることにより、変換率は約４０％向上した。Ｅｇ４をＣＢＨ１、Ｅｇｌ１及びＢｇｌ１の組み合わせに加えた場合にも改善が認められた。個々のセルラーゼが穂軸とともに存在する場合、全グルコース放出の絶対量は、セルラーゼの組み合わせが穂軸とともに存在する実験から得られるものよりも大幅に低かったが、それぞれの場合で、Ｅｇ４の存在下での改善率（％）は有意であった。Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４を精製セルラーゼに加えることにより、全グルコース放出量には以下のような改善率（％）が認められた。すなわち、Ｂｇｌ１（１２１％）、Ｅｇｌ２（１１２％）、ＣＢＨ２（２３９％）及びＣＢＨ１（７１％）。このことは、Ｅｇ４は、バイオマスに対するセルラーゼの効率を向上させる有意かつ幅広い効果を有することを示している。
【０３３５】
実施例１５：ＥＧ４をＣＢＨ１、ＣＢＨ２及びＥＧ２と混合した場合に認められた効果（基質：希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸）
希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化反応液を、９６穴ＭＴＰ（ブイ・ダブリュ・アール社（VWR））中で以下のようにして酵素混合物をトウモロコシ穂軸（６５ｍｇ／ウェル（２０％固形分、７％セルロース））に加えることによって調製した。８０μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）、１ｍｇのＢｇｌ１／ｇ（グルカン）、及び０．５ｍｇのＸｙｎ３／ｇ（グルカンバックグランド）もすべてのウェルに加えた。
【０３３６】
Ｅｇ４をＣＢＨ１、ＣＢＨ２及びＥＧ２と個別に混合した場合の効果を試験するため、それぞれのウェルに、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２及びＥＧ２のそれぞれを、０、１．２５、２．５、５、１０及び２０ｍｇ／ｇ（グルカン）で加え、ＥＧ４を、２０、１８．７５、１７．５、１５、１０及び０ｍｇ／ｇ（グルカン）の濃度で加えて、個々のウェル中の全タンパク質を２０ｍｇ／ｇ（グルカン）とした。コントロールウェルには、ＣＢＨ１又はＣＢＨ２又はＥＧ２又はＥＧ４のみを同じ用量で加えたことにより、これらのウェル中の全添加タンパク質は２０ｍｇ／ｇよりも少なくなっている。
【０３３７】
セルラーゼの組み合わせに対するＥｇ４の効果を試験するため、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２及びＥＧ２の異なる比の混合物（図３５を参照）を、０、１．２５、２．５、５、１０及び２０ｍｇ（タンパク質）／ｇ（グルカン）で加え、これらの混合物にＥＧ４を、２０、１８．７５、１７．５、１５、１０及び０ｍｇ（タンパク質）／ｇ（グルカン）の濃度で加えることにより、個々のウェル中の全タンパク質を２０ｍｇ（タンパク質）／ｇ（グルカン）とした。上記と同様、コントロールウェルには１種類のタンパク質のみを加えたことにより、全タンパク質添加量は２０ｍｇ（タンパク質）／ｇよりも少なくなっている。
【０３３８】
トウモロコシ穂軸の各糖化反応液をアルミニウムプレートシール（イー・アンド・ケー・サイエンティフィック社（E&K scientific））でシールし、６００ｒｐｍ、２４℃で２分間混合した。次いでプレートを、５０℃、２００ｒｐｍで７２時間、Ｉｎｎｏｖａ  ４４インキュベーターシェーカー（ニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック社（New Brunswick Scientific））内に置いた。７２時間の糖化工程終了時に、１００μＬの１００ｍＭグリシン（ｐＨ  １０．０）を加えることによりプレートの反応を停止した。
次いでプレートを、３０００ｒｐｍで５分間遠心した（Ｒｏｔａｎｔａ  ４６０Ｒ遠心分離機、ヘティヒ・ゼントリフューゲン社（Hettich Zentrifugen））。２０μＬの上清を、ＨＰＬＣ  ９６穴マイクロタイタープレート（アジレント社（Agilent）、５０４２−１３８５）中で１００μＬの水に加えた。グルコース及びセロビオースの濃度を、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｐカラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ、１２５−００９８）及びガードカラム（バイオラド社（BioRad））を使用して、ＨＰＬＣにより測定した。
【０３３９】
結果を図３６の表に示したが、表中、グルカン変換率（％）は、１００×（グルコース＋セロビオース）／全グルカンとして定義されている。
【０３４０】
この実験は、Ｅｇ４がＣＢＨ１、ＣＢＨ２及び／又はＥＧ２に加えられた場合、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の糖化効率を高めるうえで効果的であることを示している。更に、Ｅｇ４と他の酵素（ＣＢＨ１、ＣＢＨ２又はＥＧ２）を糖化混合物に等量で加えた場合に最も高い改善率が認められた。また、Ｅｇ４の効果は、ＣＢＨ１とＣＢＨ２との混合物に対して顕著であることも観察された。ＣＢＨ１及びＣＢＨ２に対するＥｇ４の量が１：１である場合に、Ｅｇ４による最適な改善効果が認められた。
【０３４１】
実施例１６：ＥＧ４は異なるセルラーゼ組成物の糖化効率を向上させる
市販のセルラーゼ酵素調製物であるＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰ、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００、及びＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴ（ダニスコ・ユー・エス社ジェネンコア部門（Genencor Division, Danisco US））の全タンパク質濃度を、改変ビウレットアッセイ（本明細書に述べられる）によって測定した。
【０３４２】
精製したＴ．リーゼイ（T. reesei）ＥＧ４を各酵素調製物に加え、次いでアンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の２５％固形分のロードを使用し、１ｇのグルカン及びキシラン基質当たり１４ｍｇの全タンパク質となる用量（１ｇのグルカン及びキシラン当たり５ｍｇのＥＧ４＋１ｇのグルカン及びキシラン当たり９ｍｇの全セルラーゼ）で、糖化効率について各試料をアッセイした。糖化反応は、２０ｍＬバイアル中、ｐＨ  ５で５ｇの全反応混合物を使用して行い、２００ｒｐｍに設定したロータリーシェーカー中、５０℃で７日間インキュベーションを行った。各糖化試料は５ｍＭ硫酸で１０倍に希釈し、０．２μｍフィルターに通して濾過してからＨＰＬＣに注入した。バイオラド社（BioRad）のＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）を使用して、ＨＰＬＣ分析を行った。
【０３４３】
図４０に示されるように、精製したＥＧ４を全セルラーゼに置換することにより、試験を行ったすべてのセルラーゼ産物においてグルカン変換率が向上した。図４１に示されるように、キシラン変換率にはＥｇ４の置換による影響は見られなかった。
【０３４４】
実施例１７：バイオマス糖化における粘度の低下
本実験で使用したバイオマスは、以下の組成（表２）を有するＩｎｂｉｃｏｎで酸性化し蒸気膨張で前処理した麦わらである。すなわち、
【０３４５】
【表３】
2018075020.tif 000004
【０３４６】
前処理した麦わらを水に希釈して硫酸でｐＨ５．０に調整し、その１０．５％の固形分濃度を、第１の試料では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｈ３Ａ株（図９）の発酵ブロスと、５０℃で２０．５ｍｇ（タンパク質）／ｇ（バイオマス基質中のセルロース）の全タンパク質濃度で、又は第２の試料では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｈ３Ａ（図９）の発酵ブロスと、１８．５ｍｇ（タンパク質）／ｇ（バイオマス基質中のセルロース）の全タンパク質濃度で、更に２ｍｇ／ｇ（セルロース）の精製したＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４と混合した。粘度の低下は、粘度変化を最大で約６時間監視するブルックフィールド粘度計（ブルックフィールド・エンジニアリング社（Brookfield Engineering, Inc））を使用して測定した。結果を図４２に示す。
【０３４７】
実施例１８：バイオマス糖化における粘度の低下
本実験で使用したバイオマスは、ＮＲＥＬより入手した希釈酸で前処理したトウモロコシ茎葉（未洗浄ＰＣＳ）である。
【０３４８】
未洗浄で前処理したトウモロコシ茎葉を、５０℃の温度、ｐＨ  ５．０、及び乾燥固形分２０％の固形分濃度で、第１の試料では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｈ３Ａ株（図９）の発酵ブロスと２０ｍｇ／ｇ（バイオマス基質中のセルロース）の全タンパク質濃度で、第２の試料では、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｈ３Ａ／Ｅｇ４  ＃２７組み込み株の発酵ブロスとやはり２０ｍｇ／ｇ（セルロース）で混合した。粘度の低下は、粘度変化を最大で約１６０時間以上にわたって監視するブルックフィールド粘度計（ブルックフィールド・エンジニアリング社（Brookfield Engineering, Inc））を使用して測定した。結果を図４３に示す。
【０３４９】
実施例１９：バイオマス糖化における粘度の低下
本実験で使用したバイオマスは、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸である。
希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を、乾燥固形分２５％及び乾燥固形分３０％の２つの固形分ローディング条件で酵素組成物と混合した。具体的には、前処理したバイオマスを、５０℃、ｐＨ  ５．０で、Ｔ．リーゼイ（T. reesei）Ｈ３Ａ（図９）又はＨ３Ａ／Ｅｇ４  ＃２７株のいずれかの発酵ブロスからの１４ｍｇ（タンパク質）／ｇ（セルロース）と混合した。粘度の低下は、ブルックフィールド粘度計（ブルックフィールド・エンジニアリング社（Brookfield Engineering, Inc））を使用して測定した。結果を図４４に示す。
【０３５０】
実施例２０：糖化プロセスにおける粘度低下及びグルコース産生に対する異なるセルラーゼの効果の判定
本実験では、糖化プロセスにおいて、ＯＰＴＩＭＡＳＨ（商標）ＢＧ、ＯＰＴＩＭＡＳＨ（商標）ＴＢＧ、ＯＰＴＩＭＡＳＨ（商標）ＶＲなどの異なる粘度低下酵素、又はＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＢＧなどのβ−グルコシダーゼを、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴの存在下で使用し、グルコース産生及び粘度低下におけるこれらの粘度低下酵素の効果を判定した。Ｈ３Ａ／ＥＧ４組み込み株＃２７から産生された酵素組成物も含まれた。Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴ、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＢＧ、ＯＰＴＩＭＡＳＨ（商標）ＢＧ、ＯＰＴＩＭＡＳＨ（商標）ＴＢＧ、及びＯＰＴＩＭＡＳＨ（商標）ＶＲは、ダニスコ・ユー・エス社ジェネンコア（Danisco US Inc., Genencor）より販売される製品である。
【０３５１】
上記に述べたような前処理した麦わらを使用した。組成分析を行い、表２に示した（実施例１７参照）。
【０３５２】
糖化プロセスは、前処理した麦わら（２５％乾燥物質）を異なる酵素と反応チャンバ内でインキュベートすることによって行った。Ｌａｒｓｅｎら、Ｔｈｅ  ＩＢＵＳ  Ｐｒｏｃｅｓｓ−Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ  Ｃｌｏｓｅ  ｔｏ  Ａ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｒｅａｌｉｔｙ，（２００８）Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｔｅｃｈ．３１（５）：７６５〜７７２を参照されたい。実験条件を表３及び４に示す。各チャンバ内の全質量は１０ｋｇとした。麦わらの初期のｐＨは約３．５０であり、Ｎａ２ＣＯ３を加えることによりｐＨ  ５．０に調整した。グルコース濃度を経時的に測定して、セルロース変換率を計算した。
【０３５３】
【表４】
2018075020.tif 000005
【０３５４】
【表５】
2018075020.tif 000006
【０３５５】
実験条件１〜６は、初日（「１日目」）に行い、実験条件７〜１２は翌日（「２日目」）に行った。
【０３５６】
各実験条件について、６時間の糖化後にグルコース濃度を測定した。０．２５ｍＬ／ｇ（セルロース）のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴでは、６時間の糖化後に４０．８ｇ／ｋｇのグルコースが得られた。図４５を参照されたい。Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴ＋ＯＰＴＩＭＡＳＨ  ＢＧ（又はＴＢＧ）（０．１５＋６）（すなわち０．１５ｍＬのＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴ／ｇ（セルロース）＋６ｇのＯＰＴＩＭＡＳＨ  ＢＧ（又はＴＢＧ）／ｋｇ（乾燥物質））の場合のグルコース濃度は、０．２２ｍＬ／ｇ（セルロース）のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００の場合のグルコース濃度と同様であった。図４５を参照されたい。０．１５＋６（すなわち０．１５ｍＬのＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴ／ｇ（セルロース）＋６ｇのＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ  ＢＧ／ｋｇ（乾燥物質））のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴ＋Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ  ＢＧの場合のグルコース濃度は、０．２２ｍＬ／ｇ（セルロース）のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００の場合のグルコース濃度と同様であり、０．１５ｍＬ／ｇ（セルロース）のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴの場合のグルコース濃度よりも高かった。図４５を参照されたい。高濃度のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＢＧは、糖化反応混合物の粘度を低下させることができた。０．１５ｍＬ／ｇ（セルロース）の量の発酵中のＨ３Ａ／ＥＧ４  ＃２７により産生される酵素組成物によって、６時間の糖化後に３７．５ｇ／ｋｇのグルコースが生成したが、これは、０．２２ｍＬ／ｇ（セルロース）のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００及び０．１５ｍＬ／ｇ（セルロース）のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴの場合のグルコース産生量よりも大幅に高かった。図４５を参照されたい。
【０３５７】
１日目の実験の異なる実験条件におけるグルコース濃度を、２４時間の糖化後に再び測定した。図４６を参照されたい。２日目の実験の実験条件７〜１２については、グルコース濃度及びセルロース変換率を経時的に測定し、結果を図４７及び４８に示す。
【０３５８】
１日目の実験では、粘度を６時間の糖化後に肉眼で観察し、これを表６にまとめた。「＋」の数が多いほど、より粘度の低い糖化反応混合物を示す。一般的に、粘度の低い糖化反応混合物（例えばより薄いスラリー）は、より多いグルコースの産生量と相関している。
【０３５９】
【表６】
2018075020.tif 000007
【０３６０】
２日目の実験では、異なるチャンバ内の糖化反応混合物の粘度を、各チャンバ内の金属部品の視認性に関して肉眼で観察した。５０℃で６日間の糖化の後、チャンバ３内の糖化混合物（実験条件９、０．１５ｍＬ／ｇ（セルロース）のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴ）は、チャンバ１（実験条件７）又は２内の糖化混合物（実験条件８、０．２２ｍＬ／ｇ（セルロース）のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００）よりもより粘度が高かった。チャンバ３内の金属部品は視認できなかった。チャンバ４内の糖化混合物（実験条件１０、０．１５ｍＬ／ｇ（セルロース）のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ  ＤＵＥＴ（登録商標）＋０．１ｇ／ｋｇ（乾燥物質）のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＢＧ）の粘度は、チャンバ３内の糖化混合物（０．１５ｍＬ／ｇ（セルロース）のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴ）の粘度と比較して低下していた。チャンバ５内の糖化混合物（実験条件１１、０．１５ｍＬ／ｇ（セルロース）のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ  ＤＵＥＴ（登録商標）＋６ｇ／ｋｇ（乾燥物質）のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＢＧ）の粘度は、チャンバ４内の糖化混合物（０．１５ｍＬ／ｇ（セルロース）のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴ＋０．１ｇ／ｋｇ（乾燥物質）のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＢＧ）の粘度と比較して更に低下していた。高量のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ  ＢＧを含む場合であっても、糖化混合物（チャンバ５、０．１５ｍＬ／ｇ（セルロース）のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ  ＤＵＥＴ（登録商標）＋６ｇ／ｋｇ（乾燥物質）のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ  ＢＧ）は、０．２２ｍＬ／ｇ（セルロース）のＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００（チャンバ１及び２）よりも高い粘度を依然示した。しかしながら、発酵中のＨ３Ａ／ＥＧ４  ＃２７から産生された酵素組成物を加えた場合では、糖化混合物（チャンバ６）の粘度は、チャンバ４又は５内の糖化混合物の粘度と比較して、大幅に低下していることが期せずして明らかとなった。チャンバ６内の金属部品は視認することができた。
【０３６１】
実施例２１：糖化プロセスにおける粘度低下及びグルコース産生に対する異なるセルラーゼの効果の判定
Ｉｎｂｉｃｏｎで前処理した麦わら（２５％乾燥物質）を異なる酵素と反応チャンバ内でインキュベートすることによって、糖化プロセスを行った。実験条件を表７に示す。各チャンバ内の全質量は１０ｋｇとした。麦わらの初期のｐＨは約３．５０であり、Ｎａ２ＣＯ３を加えることによりｐＨ  ５．０に調整した。Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴ、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＢＧ、Ｏｐｔｉｍａｓｈ（商標）ＢＧ、及びＰｒｉｍａｆａｓｔ（登録商標）ＬＵＮＡは、ジェネンコア社（Genecor）より販売される製品である。
【０３６２】
【表７】
2018075020.tif 000008
【０３６３】
グルコース濃度を、６時間、２４時間、５０時間、及び６日間の糖化後に測定した。糖化反応混合物の粘度を肉眼で観察し、６時間、２４時間、５０時間、及び６日間の糖化後に、当業者には周知の方法を用いて粘度計により測定した。
【０３６４】
実験条件３〜１６のそれぞれのグルコース産生量は、実験条件１のグルコース産生量と比較して増加したことが分かった。更に、実験条件３〜１６のそれぞれの粘度は、実験条件１の粘度と比較して低下したことが分かった。
【０３６５】
この実験では、上記と同じ実験条件で、ただしより長時間の予備加水分解時間の後（６時間、９時間、１２時間、２４時間など）に、糖化プロセスにおけるグルコース産生量及び粘度の低下を更に調べた。
【０３６６】
実施例２２：ＣＢＨ１及びＥＧ４によるアビセル（Avicel）の加水分解に対するアスコルビン酸の効果
図３９Ａに示したように、精製したＴ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ１（最終濃度５ｍｇ／ｇ）、精製したＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４（最終濃度１０ｍｇ／ｇ）、アスコルビン酸（５０ｍＭストック、最終濃度８．８ｇ／Ｌ）、及びマンガン溶液（最終濃度１０ｍＭ）の組み合わせを互いに混合することにより、結晶性セルロース（５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）に加えた１０％アビセル（Avicel）の溶液５０μＬ）の反応を開始させた。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）を、各試料に３００μＬの最終体積となるように加えた。
【０３６７】
反応用エッペンドルフチューブをボルテックスにかけてから、５０℃、２００ｒｐｍでＩｎｎｏｖａ  ４４インキュベーター（ニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック社（New Brunswick Scientific））内に置いた。各チューブから５０μＬの試料を３つの時点（２．５、４．５、２４時間）で取り、５０μＬの１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ  １０．０）により反応を停止させた。各試料を３０００ｒｐｍで５分間遠心し（Ｒｏｔａｎｔａ  ４６０Ｒ遠心分離機、ヘティヒ・ゼントリフューゲン社（Hettich Zentrifugen））、上清（２０μＬ）を、ＨＰＬＣ  ９６穴マイクロタイタープレート（アジレント社（Agilent）、５０４２−１３８５）中で１００μＬの水に加えた。グルコース及びセロビオースの濃度を、ガードカラムを予め取り付けたＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｐカラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ、１２５−００９８）を使用して、ＨＰＬＣにより測定した。結果を図３７に示す。
【０３６８】
次に、ＣＢＨ２及びＥＧ４によるアビセルの加水分解に対するアスコルビン酸の効果を測定した。図３９Ｂに示されるように、精製したＴ．リーゼイ（T. reesei）ＣＢＨ２（最終濃度５ｍｇ／ｇ）、精製したＴ．リーゼイ（T. reesei）Ｅｇ４（最終濃度１０ｍｇ／ｇ）、アスコルビン酸（５０ｍＭストック、最終濃度８．８ｇ／Ｌ）、及びマンガン溶液（最終濃度１０ｍＭ）の組み合わせを互いに混合することにより、結晶性セルロース（５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０）に加えた１０％アビセル（Avicel）の溶液８０μＬ）の反応を開始させた。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）を、各試料に５００μＬの最終体積となるように加えた。
【０３６９】
反応用エッペンドルフチューブをボルテックスにかけてから、５０℃、２００ｒｐｍでＩｎｎｏｖａ  ４４インキュベーター（ニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック社（New Brunswick Scientific））内に置いた。各チューブから５０μＬの試料を３つの時点（５、２４、４８時間）で取り、５０μＬの１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ  １０．０）により反応を停止させた。各試料を３０００ｒｐｍで５分間遠心し（Ｒｏｔａｎｔａ  ４６０Ｒ遠心分離機、ヘティヒ・ゼントリフューゲン社（Hettich Zentrifugen））、上清（２０μＬ）を、ＨＰＬＣ  ９６穴マイクロタイタープレート（アジレント社（Agilent）、５０４２−１３８５）中で１００μＬの水に加えた。グルコース及びセロビオースの濃度を、ガードカラムを予め取り付けたＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｐカラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ、１２５−００９８）を使用して、ＨＰＬＣにより測定した。結果を図３８に示す。
【図１Ａ】
2018075020.tif 000009
【図１Ｂ】
2018075020.tif 000010
【図１Ｃ】
2018075020.tif 000011
【図１Ｄ】
2018075020.tif 000012
【図１Ｅ】
2018075020.tif 000013
【図２】
2018075020.tif 000014
【図２Ａ】
2018075020.tif 000015
【図２Ｂ】
2018075020.tif 000016
【図２Ｃ】
2018075020.tif 000017
【図２Ｄ】
2018075020.tif 000018
【図３】
2018075020.tif 000019
【図３Ａ】
2018075020.tif 000020
【図３Ｂ】
2018075020.tif 000021
【図３Ｃ】
2018075020.tif 000022
【図３Ｄ】
2018075020.tif 000023
【図３Ｅ】
2018075020.tif 000024
【図３Ｆ】
2018075020.tif 000025
【図３Ｇ】
2018075020.tif 000026
【図３Ｈ】
2018075020.tif 000027
【図３Ｉ】
2018075020.tif 000028
【図３Ｊ】
2018075020.tif 000029
【図３Ｋ】
2018075020.tif 000030
【図３Ｌ】
2018075020.tif 000031
【図４Ａ】
2018075020.tif 000032
【図４Ｂ】
2018075020.tif 000033
【図５】
2018075020.tif 000034
【図６Ａ】
2018075020.tif 000035
【図６Ｂ】
2018075020.tif 000036
【図７】
2018075020.tif 000037
【図８Ａ】
2018075020.tif 000038
【図８Ｂ】
2018075020.tif 000039
【図８Ｃ】
2018075020.tif 000040
【図８Ｄ】
2018075020.tif 000041
【図８Ｅ】
2018075020.tif 000042
【図８Ｆ】
2018075020.tif 000043
【図８Ｇ】
2018075020.tif 000044
【図８Ｈ】
2018075020.tif 000045
【図８Ｉ】
2018075020.tif 000046
【図９】
2018075020.tif 000047
【図１０】
2018075020.tif 000048
【図１１Ａ】
2018075020.tif 000049
【図１１Ｂ】
2018075020.tif 000050
【図１１Ｃ】
2018075020.tif 000051
【図１１Ｄ】
2018075020.tif 000052
【図１２Ａ】
2018075020.tif 000053
【図１２Ｂ】
2018075020.tif 000054
【図１３】
2018075020.tif 000055
【図１４】
2018075020.tif 000056
【図１５】
2018075020.tif 000057
【図１６Ａ】
2018075020.tif 000058
【図１６Ｂ】
2018075020.tif 000059
【図１７Ａ】
2018075020.tif 000060
【図１７Ｂ】
2018075020.tif 000061
【図１８Ａ】
2018075020.tif 000062
【図１８Ｂ】
2018075020.tif 000063
【図１９】
2018075020.tif 000064
【図２０】
2018075020.tif 000065
【図２１】
2018075020.tif 000066
【図２２】
2018075020.tif 000067
【図２３】
2018075020.tif 000068
【図２４】
2018075020.tif 000069
【図２５】
2018075020.tif 000070
【図２６】
2018075020.tif 000071
【図２７】
2018075020.tif 000072
【図２８】
2018075020.tif 000073
【図２９】
2018075020.tif 000074
【図３０】
2018075020.tif 000075
【図３１】
2018075020.tif 000076
【図３２】
2018075020.tif 000077
【図３３Ａ】
2018075020.tif 000078
【図３３Ｂ】
2018075020.tif 000079
【図３３Ｃ】
2018075020.tif 000080
【図３４Ａ】
2018075020.tif 000081
【図３４Ｂ】
2018075020.tif 000082
【図３４Ｃ】
2018075020.tif 000083
【図３５】
2018075020.tif 000084
【図３６Ａ】
2018075020.tif 000085
【図３６Ｂ】
2018075020.tif 000086
【図３７】
2018075020.tif 000087
【図３８】
2018075020.tif 000088
【図３９Ａ】
2018075020.tif 000089
【図３９Ｂ】
2018075020.tif 000090
【図４０】
2018075020.tif 000091
【図４１】
2018075020.tif 000092
【図４２】
2018075020.tif 000093
【図４３】
2018075020.tif 000094
【図４４】
2018075020.tif 000095
【図４５】
2018075020.tif 000096
【図４６】
2018075020.tif 000097
【図４７】
2018075020.tif 000098
【図４８】
2018075020.tif 000099
【図４９Ａ】
2018075020.tif 000100
【図４９Ｂ】
2018075020.tif 000101
【図４９Ｃ】
2018075020.tif 000102
【図４９Ｄ】
2018075020.tif 000103
【図４９Ｅ】
2018075020.tif 000104
【図５０Ａ】
2018075020.tif 000105
【図５０Ｂ】
2018075020.tif 000106
【図５１Ａ】
2018075020.tif 000107
【図５１Ｂ】
2018075020.tif 000108
【図５２Ａ】
2018075020.tif 000109
【図５２Ｂ】
2018075020.tif 000110
【図５３Ａ】
2018075020.tif 000111
【図５３Ｂ】
2018075020.tif 000112
【図５４Ａ】
2018075020.tif 000113
【図５４Ｂ】
2018075020.tif 000114
【図５５Ａ】
2018075020.tif 000115
【図５５Ｂ】
2018075020.tif 000116
【図５６Ａ】
2018075020.tif 000117
【図５６Ｂ】
2018075020.tif 000118
【図５７Ａ】
2018075020.tif 000119
【図５７Ｂ】
2018075020.tif 000120
【図５８Ａ】
2018075020.tif 000121
【図５８Ｂ】
2018075020.tif 000122
【図５９Ａ】
2018075020.tif 000123
【図５９Ｂ】
2018075020.tif 000124
【図６０Ａ】
2018075020.tif 000125
【図６０Ｂ】
2018075020.tif 000126
【図６１Ａ】
2018075020.tif 000127
【図６１Ｂ】
2018075020.tif 000128
【図６２Ａ】
2018075020.tif 000129
【図６２Ｂ】
2018075020.tif 000130
【図６３Ａ】
2018075020.tif 000131
【図６３Ｂ】
2018075020.tif 000132
【図６４Ａ】
2018075020.tif 000133
【図６４Ｂ】
2018075020.tif 000134
【図６５Ａ】
2018075020.tif 000135
【図６５Ｂ】
2018075020.tif 000136
【図６６Ａ】
2018075020.tif 000137
【図６６Ｂ】
2018075020.tif 000138
【図６７Ａ】
2018075020.tif 000139
【図６７Ｂ】
2018075020.tif 000140
【図６８Ａ】
2018075020.tif 000141
【図６８Ｂ】
2018075020.tif 000142
【図６９Ａ】
2018075020.tif 000143
【図６９Ｂ】
2018075020.tif 000144
【図７０Ａ】
2018075020.tif 000145
【図７０Ｂ】
2018075020.tif 000146
【図７１Ａ】
2018075020.tif 000147
【図７１Ｂ】
2018075020.tif 000148
【図７２Ａ】
2018075020.tif 000149
【図７２Ｂ】
2018075020.tif 000150
【図７３Ａ】
2018075020.tif 000151
【図７３Ｂ】
2018075020.tif 000152
【図７３Ｃ】
2018075020.tif 000153
【図７３Ｄ】
2018075020.tif 000154
【図７３Ｅ】
2018075020.tif 000155
【図７３Ｆ】
2018075020.tif 000156
【図７４Ａ】
2018075020.tif 000157
【図７４Ｂ】
2018075020.tif 000158
【図７５Ａ】
2018075020.tif 000159
【図７５Ｂ】
2018075020.tif 000160
【図７６Ａ】
2018075020.tif 000161
【図７６Ｂ】
2018075020.tif 000162
【図７７Ａ】
2018075020.tif 000163
【図７７Ｂ】
2018075020.tif 000164
【図７８Ａ】
2018075020.tif 000165
【図７８Ｂ】
2018075020.tif 000166
【図７９Ａ】
2018075020.tif 000167
【図７９Ｂ】
2018075020.tif 000168
【図８０Ａ】
2018075020.tif 000169
【図８０Ｂ】
2018075020.tif 000170
【図８１Ａ】
2018075020.tif 000171
【図８１Ｂ】
2018075020.tif 000172
【図８２Ａ】
2018075020.tif 000173
【図８２Ｂ】
2018075020.tif 000174
【図８３Ａ】
2018075020.tif 000175
【図８３Ｂ】
2018075020.tif 000176
【図８４Ａ】
2018075020.tif 000177
【図８４Ｂ】
2018075020.tif 000178
【図８５Ａ】
2018075020.tif 000179
【図８５Ｂ】
2018075020.tif 000180
【図８６Ａ】
2018075020.tif 000181
【図８６Ｂ】
2018075020.tif 000182
【図８７】
2018075020.tif 000183
【図８８】
2018075020.tif 000184
【図８９Ａ】
2018075020.tif 000185
【図８９Ｂ】
2018075020.tif 000186
【図８９Ｃ】
2018075020.tif 000187
【図９０Ａ】
2018075020.tif 000188
【図９０Ｂ】
2018075020.tif 000189
【図９０Ｃ】
2018075020.tif 000190
【図９０Ｄ】
2018075020.tif 000191
【図９０Ｅ】
2018075020.tif 000192
【図９０Ｆ】
2018075020.tif 000193
【図９０Ｇ】
2018075020.tif 000194
【図９０Ｈ】
2018075020.tif 000195
【図９０Ｉ】
2018075020.tif 000196
【配列表】
2018075020000001.app