(57)【要約】      （修正有）【課題】定量的ポリメラーゼ連鎖反応プロトコールにより、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料になっている細胞又は組織においてテロメア長を確実に定量化する方法、及び様々な方法と共に用いられるキットの提供。【解決手段】テロメア長を決定するステップは、単一遺伝子コピー定量的ＰＣＲの閾値サイクルをテロメア定量的ポリメラーゼ連鎖反応の閾値サイクルから引き算することによる。単一コピー遺伝子ポリメラーゼ連鎖反応のテロメアポリメラーゼ連鎖反応に対する平均サイクル数の差は、テロメア長を決定する。テロメア長は、個体について決定され、個体集団において観察されるテロメア長と、又は参照個体と関連づけられる。あるいは、テロメラーゼ阻害剤、テロメア損傷剤、又はテロメラーゼ活性化剤での処理に対する個体の応答をあらかじめ決定するために用いられてもよい。【選択図】図５Ａ
2018075030.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料においてテロメア長を定量化する方法、およびそのような方法に用いられるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
テロメアは、真核生物の線状染色体の末端に存在する反復性核酸配列である。テロメア結合タンパク質と共にテロメア配列は、染色体に安定性を与える。テロメアは、一般的に、生物体に特有のテロメラーゼ酵素により特定化される反復配列単位を有する短いタンデム反復で構成される。テロメア反復配列は、様々な生物体について知られている。ヒトテロメア反復配列単位は、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎである。二本鎖反復配列に加えて、いくつかのテロメアの３’末端は、一本鎖領域を含有し、ヒトについてのその領域は、Ｇリッチな鎖上に位置する。
【０００３】
テロメラーゼは、テロメアＤＮＡを合成するリボタンパク質である。テロメラーゼの非存在下において、ＤＮＡポリメラーゼは線状二重鎖ＤＮＡの末端を複製することができないため、テロメアは、徐々に短くなる。テロメアが徐々に短くなることにより、最終的に、細胞周期の停止または細胞死がもたらされる。ヒトにおいて、細胞におけるテロメア長依存性死亡は、出生前の正常体細胞におけるテロメラーゼ抑圧、出生時の最初のテロメア長、および一生を通じての、前駆細胞または幹細胞におけるテロメラーゼの厳重に制御された発現という理由により、生じる。ヒトは、「完全長」のテロメアを有して誕生する。テロメラーゼは体細胞組織において下方制御されているため、このことにより、細胞年齢および暦年と共に、テロメアＤＮＡの損失がもたらされる。したがって、テロメアは、正常ヒト細胞に有限の分裂能力を与える、有糸分裂時計として働く。短いテロメアは、幹細胞が増殖する能力を損なう。例えば、上皮性幹細胞における短いテロメアは、皮膚および毛髪成長を損なう。
【０００４】
正常細胞から生じる腫瘍細胞は、正常組織より短いテロメアを有する場合が多いが、テロメラーゼの発現によってそれらのテロメアを維持する。細胞死亡に関する３つのテロメア依存性制御チェックポイントがある。第１のＤＮＡ損傷チェックポイントは、平均テロメア長が５ｋｂｐ未満である場合、複製老化を引き起こす。第２のチェックポイントは、平均テロメア長が１〜３ｋｂｐまで低下した場合、細胞死を引き起こす。テロメア無キャップと呼ばれる第３のチェックポイントは、任意のテロメア長で起こることができ、異常な構造のテロメアによって引き起こされる（Ｈａｒｌｅｙ  Ｎａｔｕｒｅ、８巻（２００８年３月））。腫瘍形成中に数ラウンドの突然変異およびクローン増殖を起こす腫瘍細胞は、テロメア長を急速に消耗し、テロメラーゼが活性化されない場合には、死ぬであろう。癌の進行中、腫瘍細胞集団は、連続的な遺伝子変化およびエピジェネティック変化を通して進化し、それらが正常な体細胞性調節を逃避するのを可能にする。腫瘍の逃避機構の１つは、細胞死亡のテロメア依存性経路を回避するテロメラーゼ活性化である。テロメラーゼは、あらゆる癌型由来の腫瘍の大部分において発現している。したがって、腫瘍は、正常組織より有意に短いテロメアを有するが、テロメラーゼ発現が増加している場合が多い（Ｈａｒｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ、８巻、１６７−１７９頁、２００８）。
【０００５】
ホルマリン固定パラフィン包埋組織は、医療処置からの生体試料の極めて有益な資源である。そのような組織には、例えば、癌または腫瘍の生検が挙げられる。これらの組織は、患者からの除去後、ホルマリン固定パラフィン包埋されており、将来的参照のために記録として保存される。これらの記録として保存された組織は、腫瘍組織および周囲の正常組織におけるテロメアの長さに関する有用な情報源であり得た。ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料においてテロメア長を測定することは、有用であろう。しかしながら、ホルマリン固定パラフィン包埋組織において平均テロメア長を測定する、迅速かつ高処理の方法は、まだ開発されていない。
【０００６】
いくつかのより遅い、骨の折れる方法が、組織においてテロメア長を決定するのに利用できる。１つの方法において、テロメア長は、末端制限酵素断片（ＴＲＦ）の平均長を測定することにより決定される。ＴＲＦは、テロメア配列およびサブテロメア配列内の核酸を切断せず、単一コピーのゲノム配列内で頻繁に切断する制限酵素（複数可）でのゲノムＤＮＡの完全消化から生じる断片の長さ、一般的には平均長として定義される。生じた末端制限酵素断片は、テロメア反復およびサブテロメアＤＮＡの両方を含有する。制限酵素消化ゲノムＤＮＡは、電気泳動により分離され、ナイロン膜などの支持体上へブロットされる。テロメア配列を含有する断片は、テロメア配列に特異的なプローブをその膜にハイブリダイズさせることにより検出される。断片を含有するテロメアの可視化により、末端制限酵素断片の平均長を計算することができる。サザンブロッティングによるＴＲＦ推定により、細胞または組織内のテロメア長の分布、およびそれにしたがって、平均テロメア長が示される。しかしながら、ＴＲＦアッセイは、骨の折れる工程であり、比較的大量のゲノムＤＮＡを必要とする。加えて、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料について、組織のホルマリン固定に起因する重いＤＮＡ架橋および断片化のため、それは適していない。
【０００７】
通常の新鮮な（固定されていない）組織試料における相対的テロメア長測定のための定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）に基づいた方法が、Ｃａｗｔｈｏｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０巻１０号（２００２）およびＣａｗｔｈｏｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３７巻３号（２００９）に記載された。そのプロトコールは、２つのプライマーセットを利用する。一方のプライマーセットは、テロメア六量体反復を増幅するために用いられる。他方のプライマーセットは、酸性リボソームリン酸化タンパク質（３６Ｂ４）などのゲノムにおける単一コピー遺伝子を増幅するために用いられる。テロメア長は、単一コピー遺伝子産物によって標準化されたテロメア産物として表される。換言すれば、試料の相対的テロメア長は、実験試料が、テロメア反復コピー数対単一遺伝子コピー数の比において参照ＤＮＡ試料と何倍異なるかという、倍数である。各実験試料におけるテロメア反復の量は、ＰＣＲ増幅の指数関数期中のテロメアＰＣＲ産物の所定の量を生じるのに必要とされるＰＣＲのサイクル数に関して、実験試料と参照試料を等価にさせる、任意に選択された参照ＤＮＡ試料の希釈のレベルとして測定される。同様に、各実験試料における単一コピー遺伝子の相対的量は、ＰＣＲの指数関数期中の単一コピー遺伝子ＰＣＲ産物の所定の量を生じるのに必要とされるＰＣＲのサイクル数に関して、実験試料に参照ＤＮＡ試料を一致させるのに必要とされる、参照ＤＮＡ試料の希釈のレベルとして表される。各実験試料について、これらの希釈率の比は、相対的なテロメア対単一コピー遺伝子（Ｔ／Ｓ）比である。したがって、未知のＤＮＡが、テロメア反復コピー数対単一コピー数のその比において参照ＤＮＡと同一である場合、Ｔ／Ｓ＝１である。参照ＤＮＡ試料（所定の研究における全部の実験試料が比較される）は、単一の個体由来であり得、またはそれは、複数の個体由来のプールされた試料であり得る。参照個体またはプールされた試料のＴ／Ｓ比に対する、１個体のＴ／Ｓ比は、その個体由来のＤＮＡの相対的テロメア長に対応する。
【０００８】
そのアッセイは、新鮮に単離された白血球におけるテロメア長測定について採用されている。しかしながら、それは、ＦＦＰＥ試料に用いるのには成功していない。（Ｋｏｐｐｅｌｓｔａｅｔｔｅｒら、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ａｇｅｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６巻  １３３１（２００５））。大きな技術的難題は、ＤＮＡ架橋および断片化、単離されたＤＮＡ中の不純物、変わりやすいＰＣＲ増幅効率、および同じ試料におけるテロメアシグナルの単一コピー遺伝子シグナルでの標準化である。
【０００９】
本発明者らは、ホルマリン固定パラフィン包埋されている細胞または組織においてテロメア長を確実に測定できる定量的ＰＣＲプロトコールをここに記載する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の上記目的に従って、本発明は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応により、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料においてテロメア長を決定する方法を提供する。
【００１１】
一実施形態において、ホルマリン固定パラフィン包埋組織においてテロメア長を測定する方法は、
ａ）ポリメラーゼ連鎖反応において、ホルマリン固定パラフィン包埋組織における実質的に相補的な第１鎖と第２鎖を含む標的テロメア核酸、標的テロメア核酸の第１鎖にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し、伸長したテロメアプライマーを形成する能力がある第１テロメアプライマー、および伸長した第１テロメアプライマーにハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する能力があるが、標的テロメア核酸にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する能力がない第２テロメアプライマーを合わせるステップ、
ｂ）単一の核酸鎖を生じるのに十分な温度までポリメラーゼ連鎖反応を加熱し、前記プライマーがそれらの標的にハイブリダイズして伸長するのを可能にする温度まで、前記温度を低下させるステップ、ならびに
ｃ）ステップ（ｂ）を少なくとも５サイクル、繰り返すステップ、
ｄ）閾値ＰＣＲシグナルを通過する時点の複製サイクルを同定するステップ、ならびに
ｅ）平均テロメア長を決定するステップ
を含む。
【００１２】
一実施形態において、ホルマリン固定パラフィン包埋組織においてテロメア長を測定する方法は、
ａ）ポリメラーゼ連鎖反応において、ホルマリン固定パラフィン包埋組織における実質的に相補的な第１鎖と第２鎖を含む標的テロメア核酸、標的テロメア核酸の第１鎖にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し、伸長したテロメアプライマーを形成する能力がある第１テロメアプライマー、および伸長した第１テロメアプライマーにハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する能力があるが、標的テロメア核酸にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する能力がない第２テロメアプライマーを合わせるステップ、
ｂ）単一の核酸鎖を生じるのに十分な温度までポリメラーゼ連鎖反応を加熱し、前記プライマーがそれらの標的にハイブリダイズして伸長するのを可能にする温度まで、前記温度を低下させるステップ、ならびに
ｃ）ステップ（ｂ）を少なくとも４サイクル、繰り返すステップ、
ｄ）閾値ＰＣＲシグナルを通過する時点の複製サイクルを同定するステップ、ならびに
ｅ）平均テロメア長を決定するステップ
を含む。
【００１３】
一実施形態において、第１テロメアプライマーおよび第２テロメアプライマーの両方は、テロメア標的配列に正確に相補的ではない。一実施形態において、第１テロメアプライマーは、４〜６ヌクレオチドごとにミスマッチの配列を有する。一実施形態において、第２テロメアプライマーは、４〜６ヌクレオチドごとにミスマッチの配列を有する。一実施形態において、第２テロメアプライマーは、その３’末端に、標的テロメア配列の相補体に相補的ではないヌクレオチドを含み、それにより、第２プライマーが標的テロメア配列の相補体にハイブリダイズしたならば、第２プライマーがＤＮＡポリメラーゼによって伸長することを防ぐ。一実施形態において、第２テロメアプライマーが、伸長した第１テロメアプライマーにハイブリダイズした場合には、それがＤＮＡポリメラーゼによって伸長することができるように、第２プライマー上のミスマッチ３’ヌクレオチドは、伸長した第１テロメアプライマー上の対応するヌクレオチドに正確に相補的である。
【００１４】
一実施形態において、第１テロメアプライマーの配列は、Ｔｅｌｇ  ５’−ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  Ｔ（配列番号１）であり、第２テロメアプライマーは、Ｔｅｌｃ  ５’−ＴＧＴ  ＴＡＧ  ＧＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＣＡ（配列番号２）である。
【００１５】
一実施形態において、単一の核酸鎖を生じるのに十分な温度までポリメラーゼ連鎖反応を加熱し、プライマーがそれらの標的にハイブリダイズして伸長するのを可能にする温度まで、前記温度を低下させる、５サイクルから１０サイクルまでのステップがある。一実施形態において、少なくとも５サイクル、少なくとも６サイクル、少なくとも７サイクル、少なくとも８サイクル、少なくとも９サイクル、または少なくとも１０サイクルある。このサイクル段階において、温度範囲は、４９℃から６０℃まで、または５０℃から４８℃まで、または５６℃、または５７℃、または５８℃、または５９℃である。
【００１６】
一実施形態において、さらなる２０〜４０サイクル、または２０〜３０サイクル、または２５〜３０サイクルの間、単一の核酸鎖を生じるのに十分な温度までポリメラーゼ連鎖反応を加熱し、プライマーがそれらの標的にハイブリダイズして伸長するのを可能にする温度まで、前記温度を低下させる、さらなるステップがある。このステップにおいて、温度は、プライマーの伸長したプライマーへのハイブリダイゼーションを最大にするのに十分であり、その結果、そのアンプリコンが優先的に生成される。ＰＣＲ反応のこの段階において、温度範囲は、５５℃から６５℃まで、または５８℃から６３℃まで、または５９℃、または６０℃、または６１℃、または６２℃である。
【００１７】
一実施形態において、テロメア長は、ホルマリン固定正常体細胞から測定される。適切な試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料から得られる。適切な試料は、固体組織から得られる。
【００１８】
別の実施形態において、テロメア長は、ホルマリン固定腫瘍組織から測定される。適切な試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料から得られる。適切な試料は、固体組織から得られる。
【００１９】
一実施形態において、ホルマリン固定パラフィン包埋組織においてテロメア長を測定する方法は、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応において、実質的に相補的な第１鎖と第２鎖を含む、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から得られる標的テロメア核酸、標的テロメア核酸の第１鎖にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し、伸長したテロメアプライマーを形成する能力がある第１テロメアプライマーＴｅｌｇ  ５’−ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  Ｔ（配列番号１）、および伸長した第１テロメアプライマーにハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する能力があるが、標的テロメア核酸にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する能力がない第２テロメアプライマーＴｅｌｃ  ５’−ＴＧＴ  ＴＡＧ  ＧＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＣＡ（配列番号２）を合わせるステップ、
（ｂ）単一の核酸鎖を生じるのに十分な温度までポリメラーゼ連鎖反応を加熱し、前記プライマーがそれらの標的にハイブリダイズして伸長するのを可能にする温度まで、前記温度を低下させるステップであって、ＰＣＲ反応が、ＤＮＡポリメラーゼ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸、５ｍＭジチオスレイトール、１％ジメチルスルホキシド、および１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０を含む、ステップ、ならびに
（ｃ）９５℃で１５秒間、５０℃で１０秒間の少なくとも５サイクル、ステップ（ｂ）を繰り返すステップ、ならびに
（ｄ）９５℃で１５秒間、６０℃で１５秒間の２５サイクル、ステップ（ｂ）を繰り返すステップ、
（ｅ）閾値ＰＣＲシグナルを通過する時点の複製サイクルを同定するステップ、ならびに
（ｆ）平均テロメア長を決定するステップ
を含む。
【００２０】
一実施形態において、ホルマリン固定パラフィン包埋組織においてテロメア長を測定する方法は、
（ｇ）ポリメラーゼ連鎖反応において、実質的に相補的な第１鎖と第２鎖を含む、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から得られる標的テロメア核酸、標的テロメア核酸の第１鎖にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し、伸長したテロメアプライマーを形成する能力がある第１テロメアプライマーＴｅｌｇ  ５’−ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  Ｔ（配列番号１）、および伸長した第１テロメアプライマーにハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する能力があるが、標的テロメア核酸にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する能力がない第２テロメアプライマーＴｅｌｃ  ５’−ＴＧＴ  ＴＡＧ  ＧＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＣＡ（配列番号２）を合わせるステップ、
（ｈ）単一の核酸鎖を生じるのに十分な温度までポリメラーゼ連鎖反応を加熱し、前記プライマーがそれらの標的にハイブリダイズして伸長するのを可能にする温度まで、前記温度を低下させるステップであって、ＰＣＲ反応が、ＤＮＡポリメラーゼ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸、５ｍＭジチオスレイトール、１％ジメチルスルホキシド、および１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０を含む、ステップ、ならびに
（ｉ）９５℃で１５秒間、５０℃で１０秒間の少なくとも４サイクル、ステップ（ｂ）を繰り返すステップ、ならびに
（ｊ）９５℃で１５秒間、６０℃で１５秒間の少なくとも２５サイクル、ステップ（ｂ）を繰り返すステップ、
（ｋ）閾値ＰＣＲシグナルを通過する時点の複製サイクルを同定するステップ、ならびに
（ｌ）平均テロメア長を決定するステップ
を含む。
【００２１】
第１プライマーおよび第２プライマーの伸長によって生成されるテロメアアンプリコンが、約５０ヌクレオチドから１００ヌクレオチドまで、６０ヌクレオチドから９０ヌクレオチドまで、７０ヌクレオチドから８０ヌクレオチドまでである本発明の方法。
【００２２】
ポリメラーゼ連鎖反応において合わせるステップの前に、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐであるテロメア標的核酸断片の大部分を保持する、穏やかな抽出方法を用いて、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から標的テロメア核酸が抽出される、本発明の方法。一実施形態において、抽出方法は、６０ｂｐ未満である核酸断片、７０ｂｐ未満である核酸断片、８０ｂｐ未満である核酸断片、９０ｂｐ未満である核酸断片、１００ｂｐ未満である核酸断片、１１０ｂｐ未満である核酸断片を保持する。一実施形態において、穏やかなＤＮＡ抽出方法は、ＤＮＡ断片を単離するためにカラムを用いない。小さいＤＮＡ断片が、ＦＦＰＥ試料に見出され、カラム抽出中に損失され得る。一実施形態において、核酸抽出方法は、ＢｉｏＣｈａｉｎ  ＦＦＰＥ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡ抽出キットである。
【００２３】
一実施形態において、ＦＦＰＥ試料は、ＤＮＡの抽出前に脱パラフィンされる。別の実施形態において、ＤＮＡは、ＦＦＰＥ試料の事前の脱パラフィンなしに、ＦＦＰＥ試料から抽出される。この実施形態において、パラフィンは、ＦＦＰＥ試料から除去されない。
【００２４】
一実施形態において、抽出された核酸が、核酸配列の架橋を逆戻りさせるために、緩衝溶液中、長時間、加熱される、さらなるステップがある。一実施形態において、抽出された核酸は、少なくとも８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃で、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間、少なくとも７０分間、少なくとも８０分間、加熱される。
【００２５】
本発明の方法はまた、さらなるステップで、ポリメラーゼ連鎖反応において、実質的に相補的な第１鎖と第２鎖を含む、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から得られる標的単一コピー核酸、標的単一コピー遺伝子核酸の第１鎖にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し、伸長した単一コピー遺伝子プライマーを形成する能力がある第１単一コピー遺伝子プライマー、および伸長した第１単一コピー遺伝子プライマーおよび／または標的ＤＮＡにハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する能力がある第２単一コピー遺伝子プライマーを合わせること、ポリメラーゼ連鎖反応が、変性および伸長のサイクルで進行するのを可能にすること、ならびに閾値ＰＣＲシグナルを通過する時点の複製サイクルを同定することを含む。
【００２６】
一実施形態において、ＰＣＲ反応における単一コピー遺伝子アンプリコンのサイズは、テロメアＰＣＲ反応についてのアンプリコンのサイズと類似している。一実施形態において、第１プライマーおよび第２プライマーの伸長により生成される単一遺伝子アンプリコンは、約５０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドまで、６０ヌクレオチドから９０ヌクレオチドまで、７０ヌクレオチドから８０ヌクレオチドまでである。
【００２７】
テロメア長を決定するステップは、単一遺伝子コピー定量的ＰＣＲの閾値サイクルをテロメア定量的ポリメラーゼ連鎖反応の閾値サイクルから引き算することによる（ΔＣｔ試料＝Ｃｔテロメア−Ｃｔ単一コピー遺伝子）。単一コピー遺伝子ポリメラーゼ連鎖反応のテロメアポリメラーゼ連鎖反応に対する平均サイクル数の差は、テロメア長を決定する（ΔＣｔ＝Ｃｔテロメア−Ｃｔ単一コピー遺伝子）。
【００２８】
テロメア長は、個体について決定され、個体集団において観察されるテロメア長と、または参照個体と関連づけられる。一実施形態において、個体集団は、試験されることになっている個体の年齢とマッチした年齢である。ヒトについて、年齢をマッチさせた集団は、個体の年齢の約１０歳以内、より好ましくは５歳以内、最も好ましくは１歳以内である。
【００２９】
個体と集団の測定されたテロメア長の相関は、コックス比例ハザード回帰モデル、カプラン・マイヤー生存分布推定値、ピトー・ウィルコクソン検定、最尤分析、重回帰分析などを含む、生存分析などの様々な統計的方法により調べられる。
【００３０】
本発明の方法は、テロメラーゼ阻害剤、テロメア損傷剤、またはテロメラーゼ活性化剤での処理に対する個体の応答をあらかじめ決めるために用いられてもよい。本発明の方法は、腫瘍組織においてテロメアの長さを決定する。
【００３１】
本発明の方法は、テロメラーゼ阻害剤、テロメア損傷誘導剤、またはテロメラーゼ活性化剤での処理に対する個体の反応を測定するために用いられてもよい。テロメラーゼ阻害剤またはテロメア損傷誘導剤に対する個体の反応を決定するために、相対的テロメア長が固形腫瘍において処理時間にわたって短くなる速度が測定される。テロメラーゼ活性化剤に対する個体の反応を決定するために、相対的テロメア長が個体について処理時間にわたって増加する速度が測定される。テロメラーゼ阻害剤は、Ｉｍｅｔｅｌｓｔａｔ（ＧＲＮ１６３Ｌ）であってもよい（米国特許第７，４９４，９８２号）。
【００３２】
別の実施形態において、本発明の方法は、個体の死亡リスクを決定するために用いられてもよい。集団の死亡リスクは、年齢／死亡率に対する相対的テロメア長の減少の比率に基づいて決定される。相対的テロメア長が個体における正常体細胞について短くなる速度が、その個体の死亡リスクを決定するために測定される。
【００３３】
別の実施形態において、本発明の方法は、集団および集団内の個体において、加齢性疾患の発生の可能性を予想するために用いられてもよい。調べることができる加齢性疾患には、循環器疾患および変性疾患が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３４】
一実施形態において、第１テロメアプライマー、第２テロメアプライマー、第１単一コピー遺伝子プライマー、第２単一コピー遺伝子プライマー、ＰＣＲ緩衝液、およびデオキシヌクレオシド三リン酸を含むキットがある。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】４つの参照細胞系およびヒト乳房腫瘍（Ｔ−６４５およびＴ−６５４）のヘモリシンおよびエオシン染色の写真である。
【図２Ａ】ＢｉｏＣｈａｉｎキットを用いてＦＦＰＥ細胞系検体から抽出されたゲノムＤＮＡのアガロースゲルの写真である。ＤＮＡは断片化され、ＤＮＡ断片のサイズは、５０ｂｐから２ｋｂまでの範囲である。
【図２Ｂ】Ｂｉｏｃｈａｉｎ抽出キット、Ｑｉａｇｅｎキット、およびＴｒｉｍＧｅｎｅ抽出キットで抽出されたゲノムＤＮＡのアガロースゲルの写真である。
【図３Ａ】ＦＦＰＥ組織切片サイズおよびＤＮＡ収量の写真である。図３Ａ：円で囲まれた面積におけるＦＦＰＥ組織検体は、ＤＮＡ単離に用いられ、それぞれ、約１６ｍｍ２、３６ｍｍ２、１００ｍｍ２、および１５０ｍｍ２に対応する。
【図３Ｂ】図３Ｂ：テロメア配列および単一コピー遺伝子３６Ｂ４のＣｔ値は、異なる検体上の円で囲まれた面積から抽出されたＦＦＰＥ  ＤＮＡにおいて導き出された（１０ｎｇ／反応）。
【図４Ａ】それぞれの副試料採取ＤＮＡは、５つの同一のマウス異種移植片ヒト腫瘍検体からＢｉｏＣｈａｉｎ  ＦＦＰＥ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔによって単離された。各検体の組織面積は、別々に１５０ｍｍ２、１００ｍｍ２、３６ｍｍ２、および１６ｍｍ２であった。
【図４Ｂ】抽出物のＤＮＡ濃度の増加は、ＤＮＡ単離のための組織面積の増加と高く相関した。
【図５Ａ】各細胞系検体由来の８つの副試料を、単一のＰＣＲ実行において３連でアッセイした。グラフ上の各点は、１つの副試料からのＴ／Ｓ比を示した。相対的テロメア長は、各細胞系のＴ／Ｓ比の平均によって決定された。癌細胞系の最短から最長までの相対的テロメア長は、Ｏｖｃａｒ５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、およびＡ５４９であった。
【図５Ｂ】腫瘍組織Ｔ−６４５およびＴ−６５４由来の８つの副試料および７つの副試料をアッセイした。Ｔ−６４５の相対的テロメア長の平均は、Ｔ−６５４についてのそれより長かった。
【図６】ＦＦＰＥ定量的ＰＣＲアッセイの独立した実行における相対的Ｔ／Ｓ比の再現性を示す図である。同じ３２個の副試料を、３つの異なる日において、３連でアッセイした。線形回帰方程式および相関係数を、Ｐｒｉｓｍを用いて決定した。
【図７Ａ】４つの細胞系および２つの腫瘍のテロメア長を、ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ  Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ａｓｓａｙ（Ｒｏｃｈｅ）を用いることにより決定した。２つの独立したアッセイからの平均テロメア長は、２．７ｋｂ（Ｏｖｃａｒ−５）、３．７ｋｂ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、６．３ｋｂ（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）、８．６ｋｂ（Ａ５４９）、８ｋｂ（Ｔ−６４５）、および５ｋｂ（Ｔ−６５４）であった。
【図７Ｂ】ＰＣＲによって測定された場合の相対的テロメア長を、各細胞系または腫瘍組織における副試料の平均Ｔ／Ｓ比によって決定した。このアッセイにおいて、各細胞系における８つの副試料のうちの４つをアッセイした。
【図８Ａ】４つの細胞系および２つのヒト腫瘍におけるＴＲＦとＴ／Ｓ比の間の相関、Ｒ２＝０．７９、Ｐ＜０．０１７を示す図である。
【図８Ｂ】４つの細胞系のみにおけるＴＲＦとＴ／Ｓ比の間の相関、Ｒ２＝０．９９９９２、Ｐ＜０．０００６を示す図である。
【図９】１５％非変性アクリルアミドゲル上に泳動した定量的ＰＣＲ産物の写真である。（ａ）ＡＢＩ緩衝液条件および実施例１の緩衝液の両方において、Ｔｅｌ１／Ｔｅｌ２（Ｃａｗｔｈｏｎ、２００２）によって複数のサイズのＰＣＲ産物が生成された。再現性およびＰＣＲ効率は各アッセイによって異なった。（ｂ）Ｔｅｌｇ／Ｔｅｌｃプライマー：一連のＰＣＲ産物サイズが生じ、ＡＢＩ緩衝液において１００〜１５０ｎｔ産物の中位の濃縮があった。（ｃ）実施例１の緩衝液においてＴｅｌｇ／Ｔｅｌｃプライマーを用いて、ＦＦＰＥ  ＤＮＡから均一な７９ｎｔ産物が生成された。
【図１０】テロメア産物および３６Ｂ４単一コピー遺伝子産物は、異なる細胞系から単離されたＦＦＰＥ  ＤＮＡにおいて類似したアンプリコンサイズを示す。計算されるテロメアアンプリコンは７９ｎｔであり、単一コピー遺伝子３６Ｂ４アンプリコンは７６ｎｔである。
【図１１Ａ】テロメアおよび単一コピー遺伝子の定量的ＰＣＲ反応における投入量ＤＮＡ滴定を示す図である。高いＰＣＲ増幅効率が、ＯＶＣＡＲ−５細胞系から新鮮に単離されたゲノムＤＮＡを用いた、テロメアおよび３６Ｂ４単一コピー遺伝子の両方において６０ｎｇ〜０．０８ｎｇ  ＤＮＡから得られた。
【図１１Ｂ】同上。
【図１２】ＰＣＲ増幅産物の特異性は、実施例１の緩衝液を用いた融解温度の増加によって実証されている。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、ホルマリン固定組織においてテロメアの相対的長さを決定するための方法を提供する。
【００３７】
一実施形態において、ホルマリン固定パラフィン包埋組織においてテロメア長を測定する方法は、
ａ．ポリメラーゼ連鎖反応において、ホルマリン固定パラフィン包埋組織における実質的に相補的な第１鎖と第２鎖を含む標的テロメア核酸、標的テロメア核酸の第１鎖にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し、伸長したテロメアプライマーを形成する能力がある第１テロメアプライマー、および伸長した第１テロメアプライマーにハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する能力があるが、標的テロメア核酸にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する能力がない第２テロメアプライマーを合わせるステップ、
ｂ．単一の核酸鎖を生じるのに十分な温度までポリメラーゼ連鎖反応を加熱し、前記プライマーがそれらの標的にハイブリダイズして伸長するのを可能にする温度まで、前記温度を低下させるステップ、ならびに
ｃ．ステップ（ｂ）を少なくとも５サイクル、繰り返すステップ、
ｄ．閾値ＰＣＲシグナルを通過する時点の複製サイクルを同定するステップ、ならびに
ｅ．平均テロメア長を決定するステップ
を含む。
【００３８】
一実施形態において、ホルマリン固定パラフィン包埋組織においてテロメア長を測定する方法は、
ａ）ポリメラーゼ連鎖反応において、ホルマリン固定パラフィン包埋組織における実質的に相補的な第１鎖と第２鎖を含む標的テロメア核酸、標的テロメア核酸の第１鎖にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し、伸長したテロメアプライマーを形成する能力がある第１テロメアプライマー、および伸長した第１テロメアプライマーにハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する能力があるが、標的テロメア核酸にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する能力がない第２テロメアプライマーを合わせるステップ、
ｂ）単一の核酸鎖を生じるのに十分な温度までポリメラーゼ連鎖反応を加熱し、前記プライマーがそれらの標的にハイブリダイズして伸長するのを可能にする温度まで、前記温度を低下させるステップ、ならびに
ｃ）ステップ（ｂ）を少なくとも４サイクル、繰り返すステップ、
ｄ）閾値ＰＣＲシグナルを通過する時点の複製サイクルを同定するステップ、ならびに
ｅ）平均テロメア長を決定するステップ
を含む。
【００３９】
一実施形態において、第１テロメアプライマーおよび第２テロメアプライマーの両方は、テロメア標的配列に正確に相補的ではない。一実施形態において、第１テロメアプライマーは、４〜６ヌクレオチドごとにミスマッチの配列を有する。一実施形態において、第２テロメアプライマーは、４〜６ヌクレオチドごとにミスマッチの配列を有する。一実施形態において、第２テロメアプライマーは、その３’末端に、標的テロメア配列の相補体に相補的ではないヌクレオチドを含み、それにより、第２プライマーが標的テロメア配列の相補体にハイブリダイズしたならば、第２プライマーがＤＮＡポリメラーゼによって伸長することを防ぐ。一実施形態において、第２テロメアプライマーが、伸長した第１テロメアプライマーにハイブリダイズした場合には、それがＤＮＡポリメラーゼによって伸長することができるように、第２プライマー上のミスマッチ３’ヌクレオチドは、伸長した第１テロメアプライマー上の対応するヌクレオチドに正確に相補的である。
【００４０】
一実施形態において、第１テロメアプライマーの配列は、Ｔｅｌｇ  ５’−ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  Ｔ（配列番号１）であり、第２テロメアプライマーは、Ｔｅｌｃ  ５’−ＴＧＴ  ＴＡＧ  ＧＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＣＡ（配列番号２）である。
【００４１】
一実施形態において、単一の核酸鎖を生じるのに十分な温度までポリメラーゼ連鎖反応を加熱し、プライマーがそれらの標的にハイブリダイズして伸長するのを可能にする温度まで、前記温度を低下させるステップの５サイクルから１０サイクルまである。一実施形態において、少なくとも５サイクル、少なくとも６サイクル、少なくとも７サイクル、少なくとも８サイクル、少なくとも９サイクル、または少なくとも１０サイクルある。このサイクル段階において、温度範囲は、４９℃から６０℃まで、または５０℃から４８℃まで、または５６℃、または５７℃、または５８℃、または５９℃である。
【００４２】
一実施形態において、さらに２０〜４０サイクル、または２０〜３０サイクル、または２５〜３０サイクルの間、単一の核酸鎖を生じるのに十分な温度までポリメラーゼ連鎖反応を加熱し、プライマーがそれらの標的にハイブリダイズして伸長するのを可能にする温度まで、前記温度を低下させる、さらなるステップがある。このステップにおいて、温度は、プライマーの伸長したプライマーへのハイブリダイゼーションを最大にするのに十分であり、その結果、そのアンプリコンが優先的に生成される。ＰＣＲ反応のこの段階において、温度範囲は、５５℃から６５℃まで、または５８℃から６３℃まで、または５９℃、または６０℃、または６１℃、または６２℃である。
【００４３】
一実施形態において、テロメア長は、ホルマリン固定正常体細胞から測定される。適切な試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料から得られる。適切な試料は、固体組織から得られる。
【００４４】
別の実施形態において、テロメア長は、ホルマリン固定腫瘍組織から測定される。適切な試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料から得られる。適切な試料は、固体組織から得られる。
【００４５】
一実施形態において、ホルマリン固定パラフィン包埋組織においてテロメア長を測定する方法は、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応において、実質的に相補的な第１鎖と第２鎖を含む、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から得られる標的テロメア核酸、標的テロメア核酸の第１鎖にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し、伸長したテロメアプライマーを形成する能力がある第１テロメアプライマーＴｅｌｇ  ５’−ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  Ｔ（配列番号１）、および伸長した第１テロメアプライマーにハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する能力があるが、標的テロメア核酸にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する能力がない第２テロメアプライマーＴｅｌｃ  ５’−ＴＧＴ  ＴＡＧ  ＧＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＣＡ（配列番号２）を合わせるステップ、
（ｂ）単一の核酸鎖を生じるのに十分な温度までポリメラーゼ連鎖反応を加熱し、前記プライマーがそれらの標的にハイブリダイズして伸長するのを可能にする温度まで、前記温度を低下させるステップであって、ＰＣＲ反応が、ＤＮＡポリメラーゼ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸、５ｍＭジチオスレイトール、１％ジメチルスルホキシド、および１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０を含む、ステップ、ならびに
（ｃ）９５℃で１５秒間、５０℃で１０秒間の少なくとも５サイクル、ステップ（ｂ）を繰り返すステップ、ならびに
（ｄ）９５℃で１５秒間、６０℃で１５秒間の２５サイクル、ステップ（ｂ）を繰り返すステップ、
（ｅ）閾値ＰＣＲシグナルを通過する時点の複製サイクルを同定するステップ、ならびに
（ｆ）平均テロメア長を決定するステップ
を含む。
【００４６】
一実施形態において、ホルマリン固定パラフィン包埋組織においてテロメア長を測定する方法は、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応において、実質的に相補的な第１鎖と第２鎖を含む、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から得られる標的テロメア核酸、標的テロメア核酸の第１鎖にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し、伸長したテロメアプライマーを形成する能力がある第１テロメアプライマーＴｅｌｇ  ５’−ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  Ｔ（配列番号１）、および伸長した第１テロメアプライマーにハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する能力があるが、標的テロメア核酸にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する能力がない第２テロメアプライマーＴｅｌｃ  ５’−ＴＧＴ  ＴＡＧ  ＧＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＣＡ（配列番号２）を合わせるステップ、
（ｂ）単一の核酸鎖を生じるのに十分な温度までポリメラーゼ連鎖反応を加熱し、前記プライマーがそれらの標的にハイブリダイズして伸長するのを可能にする温度まで、前記温度を低下させるステップであって、ＰＣＲ反応が、ＤＮＡポリメラーゼ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸、５ｍＭジチオスレイトール、１％ジメチルスルホキシド、および１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０を含む、ステップ、ならびに
（ｃ）９５℃で１５秒間、５０℃で１０秒間の少なくとも４サイクル、ステップ（ｂ）を繰り返すステップ、ならびに
（ｄ）９５℃で１５秒間、６０℃で１５秒間の少なくとも２５サイクル、ステップ（ｂ）を繰り返すステップ、
（ｅ）閾値ＰＣＲシグナルを通過する時点の複製サイクルを同定するステップ、ならびに
（ｆ）平均テロメア長を決定するステップ
を含む。
【００４７】
第１プライマーおよび第２プライマーの伸長による本発明の方法により生成されるアンプリコンが、約５０塩基対から約１００塩基対まで、６０塩基対から９０塩基対まで、７０塩基対から８０塩基対までである。
【００４８】
ポリメラーゼ連鎖反応において合わせるステップの前に、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐであるテロメア標的核酸断片の大部分を保持する、穏やかな抽出方法を用いて、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から標的テロメア核酸が抽出される、本発明の方法。一実施形態において、抽出方法は、６０ｂｐ未満である核酸断片、７０ｂｐ未満である核酸断片、８０ｂｐ未満である核酸断片、９０ｂｐ未満である核酸断片、１００ｂｐ未満である核酸断片、１１０ｂｐ未満である核酸断片を保持する。一実施形態において、穏やかなＤＮＡ抽出方法は、ＤＮＡ断片を単離するためにカラムを用いない。小さいＤＮＡ断片が、ＦＦＰＥ試料に見出され、カラム抽出中に損失され得る。一実施形態において、核酸抽出方法は、ＢｉｏＣｈａｉｎ  ＦＦＰＥ組織ＤＮＡ抽出キットである。
【００４９】
一実施形態において、ＦＦＰＥ試料は、ＤＮＡの抽出前に脱パラフィンされる。別の実施形態において、ＤＮＡは、ＦＦＰＥ試料の事前の脱パラフィンなしに、ＦＦＰＥ試料から抽出される。この実施形態において、パラフィンは、ＦＦＰＥ試料から除去されない。
【００５０】
一実施形態において、抽出された核酸は、少なくとも８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃で、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間、少なくとも７０分間、少なくとも８０分間、加熱される。
【００５１】
本発明の方法はまた、さらなるステップで、ポリメラーゼ連鎖反応において、実質的に相補的な第１鎖と第２鎖を含む、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から得られる標的単一コピー核酸、標的単一コピー遺伝子核酸の第１鎖にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し、伸長した単一コピー遺伝子プライマーを形成する能力がある第１単一コピー遺伝子プライマー、および伸長した第１単一コピー遺伝子プライマーおよび／または標的ＤＮＡにハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する能力がある第２単一コピー遺伝子プライマーを混合すること、ポリメラーゼ連鎖反応が、変性および伸長のサイクルで進行するのを可能にすること、ならびに閾値ＰＣＲシグナルを通過する時点の複製サイクルを同定することを含む。
【００５２】
一実施形態において、ＰＣＲ反応における単一コピー遺伝子アンプリコンのサイズは、テロメアＰＣＲ反応についてのアンプリコンのサイズと類似している。一実施形態において、第１プライマーおよび第２プライマーの伸長により生成される単一遺伝子アンプリコンは、約５０ヌクレオチドから１００ヌクレオチドまで、６０ヌクレオチドから９０ヌクレオチドまで、７０ヌクレオチドから８０ヌクレオチドまでである。
【００５３】
テロメア長を決定するステップは、単一遺伝子コピー定量的ＰＣＲの閾値サイクルをテロメア定量的ポリメラーゼ連鎖反応の閾値サイクルから引き算することによる（ΔＣｔ試料＝Ｃｔテロメア−Ｃｔ単一コピー遺伝子）。単一コピー遺伝子ポリメラーゼ連鎖反応のテロメアポリメラーゼ連鎖反応に対する平均サイクル数の差は、テロメア長を決定する（ΔＣｔ＝Ｃｔテロメア−Ｃｔ単一コピー遺伝子）。
【００５４】
テロメア長は、個体について決定され、個体集団において観察されるテロメア長と、または参照個体と関連づけられる。一実施形態において、個体集団は、試験されることになっている個体の年齢とマッチした年齢である。ヒトについて、年齢をマッチさせた集団は、個体の年齢の約１０歳以内、より好ましくは５歳以内、最も好ましくは１歳以内である。
【００５５】
個体と集団の測定されたテロメア長の相関は、コックス比例ハザード回帰モデル、カプラン・マイヤー生存分布推定値、ピトー・ウィルコクソン検定、最尤分析、重回帰分析などを含む、生存分析などの様々な統計的方法により調べられる。
【００５６】
本発明の方法は、テロメラーゼ阻害剤、テロメア損傷誘導剤、またはテロメラーゼ活性化剤での処理に対する個体の反応を測定するために用いられてもよい。テロメラーゼ阻害剤またはテロメア損傷誘導剤に対する個体の反応を決定するために、相対的テロメア長が固形腫瘍において処理時間にわたって短くなる速度が測定される。テロメラーゼ活性化剤に対する個体の反応を決定するために、相対的テロメア長が個体について処理時間にわたって増加する速度が測定される。
【００５７】
別の実施形態において、本発明の方法は、個体の死亡リスクを決定するために用いられてもよい。集団の死亡リスクは、年齢／死亡率に対する相対的テロメア長の減少の比率に基づいて決定される。相対的テロメア長が個体における正常体細胞について短くなる速度が、その個体の死亡リスクを決定するために測定される。
【００５８】
別の実施形態において、本発明の方法は、集団および集団内の個体において、加齢性疾患の発生の可能性を予想するために用いられてもよい。調べることができる加齢性疾患には、循環器疾患および変性疾患が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５９】
テロメラーゼを測定するためのホルマリン固定パラフィン包埋組織試料は、当技術分野において知られた方法を用いて作製される。テロメア含有試料は、脳、肝臓、脾臓、乳房、筋肉、皮膚、腎臓、膵臓、前立腺、卵巣、肺の組織、および生検試料から得られるものを含む他の組織を含む、任意の生物体の任意の固形組織から採取され得る。
【００６０】
組織が採取され得る生物体は、任意の哺乳類生物である。そのような哺乳類生物には、ヒトが挙げられる。そのような哺乳類生物には、イヌ、ネコ、サル、オランウータン、マウス、ラット、ウマ、ウシ、ブタなどを挙げることができる。
【００６１】
本明細書で用いられる場合、「テロメア核酸」は、哺乳類のテロメア配列をコードする二本鎖または一本鎖核酸における核酸配列を意味する。ヒトにおいて、テロメア反復配列は、一方の鎖においてＴＴＡＧＧＧであり、他方の鎖においてＣＣＣＴＡＡである。
【００６２】
核酸は、一般的に、ホスホジエステル結合を含有するが、代替のバックボーンを有する核酸類似体を含有してもよい。核酸は、定量的ＰＣＲ工程においてポリメラーゼにより３’伸長する能力がなければならない。
【００６３】
テロメア核酸を含有する試料は、よく知られた技術を用いて調製されてもよい。例えば、試料は、細胞を破壊するために界面活性剤、超音波処理、エレクトロポレーション、変性剤などを用いて処理されてもよい。標的核酸は、必要に応じて精製されてもよい。反応の成分は、同時に、または任意の順番で連続的に加えられてもよい。核酸を単離するためにカラムを用いない穏やかな抽出方法が有益であることが見出されており、これらの方法は、最終核酸調製物において、より小さい断片の核酸を保持するからである。
【００６４】
加えて、最適なハイブリダイゼーション、増幅、および検出を促進するためにＰＣＲ反応に様々な作用物質が加えられてもよい。これらには、塩、緩衝液、中性タンパク質、界面活性剤などが挙げられる。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などの他の作用物質が、反応の効率を向上させるために加えられてもよい。
【００６５】
テロメア長は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて平均テロメア長を評価することにより決定される。ＰＣＲについての手順は広く用いられ、よく知られている。標的核酸を、標的核酸にハイブリダイズするプライマーの存在下でインキュベートする。標的核酸が二本鎖である場合、プライマーのハイブリダイゼーションを可能にするために、その鎖を、まず、変性して、第１の一本鎖および第２の一本鎖を生じさせる。温度、塩濃度、ｐＨ変化、またはその変性技術の組み合わせを含む様々な変性技術が用いられ得る。条件は、第１のテロメアプライマーがそのＤＮＡの鎖の一方にハイブリダイズすることができるように変更される。ＤＮＡポリメラーゼ酵素が用いられて、ハイブリダイズしたプライマーを伸長させ、それにしたがって、標的核酸の新しいコピーが生じる。合成された二重鎖は変性され、第２のプライマーが、第１の伸長したプライマーにハイブリダイズすることが可能になる。変性、ハイブリダイゼーション、および伸長のこのサイクルを、２つのプライマーの間の配列が指数関数的に増幅されるまで、何回も繰り返される。
【００６６】
定量的（またはリアルタイム）ＰＣＲにおいて、ＤＮＡ結合色素は、全ての二本鎖ＤＮＡに結合して、色素の蛍光を発する。ＰＣＲ反応中のＤＮＡ産物の増加は、蛍光強度の増加をもたらし、ＰＣＲ反応のサイクルごとに測定される。このことにより、ＤＮＡ濃度を定量化することが可能になる。反応の指数関数期中に存在するＤＮＡの相対的濃度は、片対数スケールにおいて、蛍光のレベルをＰＣＲサイクル数に対してプロットすることにより、決定される。バックグラウンドより上の蛍光の検出についての閾値が決定される。試料からの蛍光が閾値を交差する時点のサイクルが、サイクル閾値Ｃｔと呼ばれる。ＤＮＡの量は、理論的に、指数関数期中、サイクルごとに２倍になるため、ＤＮＡの相対的量を計算することができる。ベースラインはＰＣＲの最初のサイクルであり、その時点において、蛍光シグナルの変化はほとんどない。閾値は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓソフトウェアにより自動的に、または手作業で決定され、かつリアルタイムアッセイにおいてＣｔ決定に用いられる、ΔＲｎのレベルである。そのレベルは、ベースラインより上で、かつ増幅曲線の指数関数的成長領域内にあるように十分低く設定される。閾値とは、増幅プロットとの交差がＣｔを定義するという線である。閾値サイクル（Ｃｔ）は、蛍光が閾値を通過する時点の分別的サイクル数である。試料の閾値サイクルは、テロメアポリメラーゼ連鎖反応の閾値サイクルから参照試料の閾値サイクルを引き算することにより決定される（ΔＣｔ試料＝Ｃｔテロメア−Ｃｔ参照）。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、参照としての単一コピー数遺伝子に方向づけられたプライマーで実施され、単一コピー数遺伝子についての閾値サイクルを決定する。テロメアポリメラーゼ連鎖反応に対する単一コピー遺伝子の平均サイクル数の差は、テロメア長を決定する（ΔＣｔ＝Ｃｔテロメア−Ｃｔ単一コピー遺伝子）。
【００６７】
用語「相補的な」または「実質的に相補的な」は、プローブまたはプライマーが、それらが通常のＰＣＲ条件下でハイブリダイズすることができるように標的配列に十分相補的であることを意味する。完全に相補的であることから逸脱することは、その逸脱が、ハイブリダイゼーションを完全に排除するほど十分ではない限り、想定される。
【００６８】
第１および第２テロメアプライマーによって増幅されるアンプリコンのサイズは変わり得る。サイズは、５０塩基対から１００塩基対まで、６０塩基対から９０塩基対まで、７０塩基対から８０塩基対までの範囲であり得る。
【００６９】
本明細書に示された方法を用いる、定量的ＰＣＲによる相対的平均テロメア長の測定は、ＦＦＰＥ組織で行うことができる。
【００７０】
本明細書に引用された全ての参考文献は、全体として参照により組み入れられている。以下の実施例は、参照のために提供され、限定するものではない。
【実施例】
【００７１】
実施例１
この実施例は、ホルマリン固定され、かつパラフィン包埋されている細胞または組織の相対的テロメア長を決定するための定量的ポリメラーゼ連鎖反応の性能を実証する。４つのヒト癌細胞系、ＯＶＣＡＲ−５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、およびＡ５４９を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＶＡ）から入手した。２つのヒト乳癌腫試料、Ｔ−６４５およびＴ−６５４を、Ａｓｔｅｒａｎｄ（Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）から、８０℃で新鮮凍結組織としてか、またはホルマリン固定パラフィン包埋組織としてかのいずれかで、購入した。４つの細胞系を、ＴＲＦによるテロメア長とＦＦＰＥ  ｑＰＣＲ  ＴＬアッセイによる相対的テロメア長の関係を実証するための参照として用いた。
【００７２】
４つのヒト癌細胞系を、播種し、細胞ペレットを得た。細胞ペレットの１部分を−８０℃で凍結した。ホルマリン固定パラフィン包埋参照細胞ペレットを、ＨｉｓｔｏＧｅｌ  Ｋｉｔカタログ番号Ｒ９０４０１２（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａｌｌｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒの子会社、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ）を用いて調製した。細胞を、８０〜９０％コンフルエンスまで培養した。細胞ペレット（１０６個／ペレット）をまず、５０±５℃で融解した２００〜５００μｌのＨｉｓｔｏＧｅｌ中に優しく混合し、その後、氷上で冷却して、凝固させた。凝固後、試料を速やかに回転させ、残留液体を除去した。１０ｍｌの４％ホルマリンをゲル化ペレットへ加え、細胞ペレットを室温で４８時間、固定させた。その後、固定された細胞ペレットを、Ｈｉｓｔｏ−Ｔｅｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡにおいて標準組織学技術を用いて包埋した。ＦＦＰＥ細胞ペレットのヘモキシリンおよびエオシン染色は、図１に示されている。
【００７３】
ＤＮＡ抽出
４つのヒトＦＦＰＥ細胞系（Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＣＣＲＦ−  ＣＥＭ、およびＯｖｃａｒ５）のゲノムＤＮＡを、ＢｉｏＣｈａｉｎ、ＱＩＡＧＥＮ、およびＴｒｉｍＧｅｎｅによって製造された３つのＦＦＰＥ  ＤＮＡ抽出キット、それぞれにより単離した。その後、単離されたゲノムＤＮＡを、０．８％アガロースゲル上に泳動させた。図２ｂは、小さいＤＮＡ断片（＜１００ｂｐ）が、ＢｉｏＣｈａｉｎのキットによってのみ捕獲され、ＱＩＡＧＥＮおよびＴｒｉｍＧｅｎｅのキットによっては捕獲されなかったことを示している。カラム精製段階はＢｉｏＣｈａｉｎのキットには必要とされなかったが、他の２つのキットには必要とされた。カラム精製は、ＤＮＡ単離工程を通して小さいＤＮＡ断片の損失を引き起こす可能性があった。
【００７４】
ゲノムＤＮＡを、４つの新鮮凍結された、およびＦＦＰＥ処理された参照ヒト癌細胞系から単離した。ゲノムＤＮＡをまた、２つの新鮮凍結された、およびＦＦＰＥの腫瘍組織Ｔ６５４およびＴ−６４５からも単離した。ＦＦＰＥ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カタログ番号：Ｋ５０１９１００、Ｈａｙｗａｒｄ  ＣＡ）を用いて、ＦＦＰＥ細胞ペレットおよび組織試料からゲノムＤＮＡを抽出した。Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ精製キット、カタログ番号Ａｌ  １２０（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、製造会社の使用説明書に従って、新鮮な、または新鮮凍結された細胞ペレット、および組織試料からゲノムＤＮＡを抽出した。組織を、１８０μＬのキット緩衝液および２０μＬのプロテイナーゼＫ中に混合した。その混合物を５６℃で１時間、インキュベートし、温度を９０℃まで、１時間、上昇させ、その後、再び、９８℃まで１０分間、上昇させた。混合物を、１４，０００ｒｐｍで２分間、遠心分離し、上清を回収した。ＤＮＡ濃度を、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ｐ７５８９、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって決定した。上清におけるＤＮＡの濃度は、Ｈ２Ｏで１ｎｇ／μＬに調整した。
【００７５】
ＴＲＦアッセイ
４つの参照細胞系および２つの乳癌試料のテロメア長を評価した。各細胞系または組織由来の約１〜２μｇのゲノムＤＮＡを、Ｈｉｎｆ／ＲｓａＩにより３７℃で２時間、消化させた。ＤＮＡ消化後、ゲノムＤＮＡ断片を、０．８％アガロースゲル上で分離し、ブロッティングによりナイロン膜に転写した。全ての膜ハイブリダイゼーションおよび検出試薬は、ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ  Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ａｓｓａｙキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｇｅｒｍａｎｙ）中に供給された。ブロットされた膜を、テロメア反復に特異的なジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＰＮＡプローブとハイブリダイズさせ、続いて、製造会社の使用説明書に従って、抗ＤＩＧ抗体−アルカリフォスファターゼとインキュベートした。アルカリフォスファターゼを、化学発光基質を用いて定量化した。テロメア長を、製造会社の使用説明書に従って、計算した。
【００７６】
定量的ＰＣＲアッセイ
全ての定量的ＰＣＲ反応を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００  ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を用いて行った。各試料について２つのＰＣＲを実施し、一方は、テロメア（Ｔ）増幅についてのサイクル閾値（Ｃｔ）の値を決定するために、他方は、単一コピー遺伝子（酸性リボソームリン酸化タンパク質Ｐ、３６ｂ４）の増幅につてのＣｔ値を決定するためであった。テロメア増幅のためのプライマー配列は、Ｔｅｌｇ  ５’−ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  Ｔ（配列番号１）およびＴｅｌｃ  ５’−ＴＧＴ  ＴＡＧ  ＧＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＣＡ（配列番号２）（Ｃａｗｔｈｏｎ、２００９）であり、３６Ｂ４増幅のためのプライマー配列は、３６Ｂ４ｕ：５’−ＣＡＧ  ＣＡＡ  ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＴＧＴ  ＡＡＴ  ＣＣ（配列番号３）および３６Ｂ４ｄ：５’−ＣＣＣ  ＡＴＴ  ＣＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＡＣＧ  ＧＧＴ  ＡＣＡ  Ａ（配列番号４）（Ｃａｗｔｈｏｎ、２００２）であった。
【００７７】
テロメア増幅のための各ＰＣＲ反応を、１０ｎｇ／１０μｌの試料（１ｎｇ／μｌ）、ならびに１．２５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１５０ｎＭ  ６−ＲＯＸ蛍光色素、０．２×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ核酸染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）、５ｍＭジチオスレイトール、１％ジメチルスルホキシド、および１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、およびプライマー対ＴｅｌｇとＴｅｌｃ（どちらも９００ｎＭ）を含有する４０μｌのＰＣＲ混合物を用いて実施した。より高いプライマー濃度は、ＦＦＰＥ  ＤＮＡを用いる場合、テロメアＤＮＡについて好ましく、高濃度のプライマーにより複数のアニーリング部位が可能になるからである。
【００７８】
テロメア配列を、３つの段階で増幅した。段階１：ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼを活性化するために９５℃で１０分間、段階２：増幅の次のサイクルのための鋳型として働くＰＣＲ産物を生成するために９５℃で１５秒間、５０℃で１０秒間の５サイクル。段階２におけるアニーリング温度は、４９℃から５８℃までの範囲であり得た。段階３：９５℃で１５秒間、６０℃で１５秒間の２５サイクルで、６０℃でシグナル取得。総実行時間は５５分間であった。
【００７９】
単一コピー３６Ｂ４遺伝子の増幅を以下のように行った。ＡｍｐｌｉＴａｇ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼを活性化するために９５℃で１０分間、続いて、９５℃で１５秒間、５８℃で１分間の４０サイクル、５８℃でシグナル取得。３６Ｂ４増幅を、１０ｎｇ／１０μｌの試料（１ｎｇ／μｌ）、４０μｌのＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）、およびプライマー対３６Ｂ４ｄ（３００ｎＭ）と３６Ｂ４ｕ（３００ｎＭ）を用いて実施した。
【００８０】
いくつかの市販のＦＦＰＥ  ＤＮＡ抽出キットを評価した。これらのキットの中で、ＦＦＰＥ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．  Ｈａｙｗａｒｄ  ＣＡ）が、ＦＦＰＥ試料からゲノムＤＮＡを抽出するのに信頼のおける方法を提供した。（１）検体の脱パラフィンは、ＤＮＡ抽出前に必要とされない。（２）精製は、カラム上でのサイズ分離に頼らない。小さいＤＮＡ断片は、一般的に、ＦＦＰＥ試料内に見られ、カラム精製で喪失され得る。（３）ＤＮＡ架橋は、緩衝溶液中、長時間、ＤＮＡを加熱することにより部分的に逆戻りさせることができる。（４）総ＰＣＲ反応体積の２０％までについて、抽出緩衝液によるＰＣＲ反応への検出可能な干渉はない。
【００８１】
ＦＦＰＥ試料または新鮮凍結試料からの単離されたゲノムＤＮＡの例は、図２ａに示されている。ＦＦＰＥ試料由来のＤＮＡの大部分は、５０ｂｐ〜２ｋｂのサイズ範囲で相対的に短い。図２ｂは、他のキットで抽出されたＤＮＡがその小さいＤＮＡ断片を保持しないことを示している。スライド上の１６ｍｍ２ほどの小ささのＦＦＰＥ組織切片（１０μｍ厚さ）からの試料を用いて、ＦＦＰＥ  ｑＰＣＲ  ＴＬアッセイによるテロメア長の測定に成功することができる（図３）。ＤＮＡ収量と用いられた組織切片のサイズは相関した（図４）。
【００８２】
ＰＣＲ増幅
段階２におけるサイクル数は、各ＰＣＲ反応において１０ｎｇのＤＮＡを用いる場合、適切なΔＣｔ値（ΔＣｔ試料＝Ｃｔテロメア−Ｃｔ参照）を有するために、５サイクルに改変した。反応あたり１０ｎｇ〜２０ｎｇのＤＮＡは、再現性研究において＞９４％ＰＣＲ効率を有した。単一コピー遺伝子ＰＣＲについてのサイクル数は、十分な単一コピー遺伝子ＰＣＲ産物を産生するためにテロメアＰＣＲについてのサイクル数より９サイクル多いことが必要である。４つの細胞系間でのテロメアに対する単一コピー遺伝子の平均サイクル数差（Ｃｔ３６Ｂ４−Ｃｔテロメア、またはΔＣｔ）は、−８．９３から−１１．１７までの範囲であり、ＴＲＦアッセイによる２．０ｋｂから８．７ｋｂまでのテロメア長に対応した。ΔＣｔのアッセイ間係数は、４つの参照細胞系について、１．４８％、１．３４％、１．２５％、および１．４９％であった。
【００８３】
３つの独立した実行における相対的Ｔ／Ｓ比の再現性を評価した。３２個のＤＮＡ副試料、すなわち、各細胞系由来の８個の副試料を、３連で、３つの異なる日にアッセイした。図６は、１回目の実行と２回目の実行と３回目の実行により決定されたＴ／Ｓ比の平均の間の強い相関、Ｒ２＝０．９５および９５％信頼度でＰ＜０．０００１を示している。データを通しての線形回帰線の傾きはほぼ一致し、ｙ切片はほぼゼロであった。Ｔ／Ｓ比のアッセイ間変動係数の平均は１５％であった。傾きのアッセイ間変動係数は１３％であった。
【００８４】
アッセイの分解能を、３つの異なる日のＰＣＲ実行の結果からの多重ｔ検定（ボンフェローニ多重比較）によって評価した。Ｏｖｃａｒ−５とＭＤＡ−ＭＢ−２３１の間の差（Ｐ＞０．０５）を除いて、細胞系および２つの腫瘍のうちの任意の２つの間のＴ／Ｓ比の差は、９５％信頼レベルにおいて非常に有意であった（Ｐ＜０．００１）。Ｏｖｃａｒ−５とＭＤＡ−ＭＢ−２３１の間のテロメア長の差はＴＲＦアッセイにより≦１ｋｂであるため、平均テロメア長についてのアッセイの分解能は約１ｋｂである（図５）。
【００８５】
平均ＴＲＦと相対的Ｔ／Ｓ比の間の相関
この改変型ｑＰＣＲ増幅方法を用いて、本発明者らは、テロメア長を、Ｔ／Ｓ比により、ＦＦＰＥ試料において定量的に測定できることを示している。そのプロトコールを用いて４つのＦＦＰＥ参照腫瘍細胞系、加えて２つの乳房腫瘍において測定されたテロメア長は、同じ試料からの新鮮に単離された、または新鮮凍結されたゲノムＤＮＡにおいてＴＲＦアッセイによって測定されたテロメア長と相関している（Ｒ２＝０．７９、ｐ＜０．０１７）。４つの腫瘍細胞系の間に、より強い相関が見られた（Ｒ２＝０．８９、ｐ＜０．０００６）（図７および図８）。
【００８６】
ＦＦＰＥ試料由来のゲノムＤＮＡにおけるＤＮＡ架橋および断片化は、特に、長く、反復性のテロメア配列を増幅することにとって、独特の難題をもたらすが、同じ試料における７６ｂｐ断片の単一コピー遺伝子のリボソームリン酸化タンパク質Ｐ（本明細書では３６Ｂ４と名付けられている）の増幅は影響を受けない場合が多い。この問題を解決するために、テロメアアンプリコンサイズを短縮し、かつＰＣＲ増幅効率を向上させるという目標を達成するように、いくつかのＰＣＲ条件、すなわち、ＰＣＲプライマーの選択、ＰＣＲ反応緩衝液条件、および温度サイクリング条件を変更した。
【００８７】
Ｃａｗｔｈｏｎは、テロメア配列プライマー、すなわち、Ｔｅｌｇ／Ｔｅｌｃを発表した（２００９）。Ｔｅｌｇ／Ｔｅｌｃプライマーセットは、理論的には、約７９ｎｔのアンプリコンを生じる。しかしながら、ＰＣＲ反応においてＡＢＩマスターミックス緩衝液を用いる、以前のＰＣＲ条件下では、一連のＰＣＲ産物サイズが生じ、１００〜１５０ｎｔの産物の中程度の濃縮があった。これは、ＰＣＲサイクリング温度条件を変化させると、解決された。均一な７９ヌクレオチドのテロメア産物が増幅された（図９）。その新しい条件下で、テロメア産物および３６Ｂ４単一コピー遺伝子産物は、類似したアンプリコンサイズを示し（図１０）、そのことは、ＰＣＲ増幅へのＤＮＡ架橋および断片化における示差的な効果を低下させるであろう。典型的なテロメア反応および単一コピー遺伝子増幅のＰＣＲ増幅効率は、９６〜１００％である（図１１）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【配列表】
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