(57)【要約】【課題】神経疾患タンパク質の二重特異性抗体フラグメントおよび使用方法を提供すること。【解決手段】本発明は、神経疾患に関連するタンパク質を選択的に除去する二重特異性組換え抗体フラグメントを含む治療薬、および神経疾患を治療するためのこれらの治療薬の使用方法に関する。本発明の特定の実施形態は、（ａ）神経変性疾患に関連するタンパク質を特異的に認識する第１リガンド、および（ｂ）古典的補体経路成分を特異的に活性化またはミクログリア細胞を直接活性化する第２リガンドを含む二重特異性抗体フラグメントを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、本明細書に参照により組み入れる、２０１２年１月１１日に出願された米国特許出願第６１／５８５，５３９号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は多数の神経突起斑、神経原線維変化、およびニューロン欠損の存在を特徴とする。主にβ−アミロイド（Ａβ）ペプチドフラグメントからなる斑は、β−およびγ−セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の処理から誘導される。反応性ミクログリア、アストロサイト、および原線維Ａβ斑に関連する補体因子の存在は斑領域内での局所および慢性炎症反応の発生を示し、補体活性化がこの炎症プロセスに寄与するという仮説と一致する。ＡＤ脳では、Ｃ１ｑ、原線維Ａβに結合し、補体を活性化する古典的補体経路の第１成分は、原線維Ａβ斑に関連することが示された。斑領域では他の補体タンパク質も検出され、それらの合成はＡＤ脳内で起こることが示された。
【０００３】
アミロイドβ−タンパク質（Ａβまたはベータアミロイド）の凝集および沈着は、アルツハイマー病（ＡＤ）における主要な病理学的事象であると考えられる。より長い４２〜４３アミノ酸Ａβ型はアミロイド斑の形成に関連し、ペプチドの凝集状態はその神経毒性を決定するのに重要である。フィブリル、プロトフィブリル、環状構造、球状構造、アモルファス凝集体およびさまざまな可溶性オリゴマーを含むＡβの多くの異なる型が同定および特性解析された。多数の研究はＡβの小オリゴマー形態がＡＤにおける主要な毒性種であることを示す。これらの小オリゴマーは「ｌｏｗ−ｎオリゴマー」（すなわち、二量体、三量体、または四量体）とも称される。
【０００４】
従って、アルツハイマー病の治療のための新規治療法および試薬、とくに生理学的（例えば、非毒性）用量で治療的および診断的利点をもたらすことができる治療法および試薬の必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Akiyama H, Barger S, Barnum S, Bradt B, Bauer J, Cole GM, Cooper NR,Eikelenboom P, Emmerling M, Fiebich BL, Finch CE, Frautschy S, Griffin WS,Hampel H, Hull M, Landreth G, Lue L, Mrak R, Mackenzie IR, McGeer PL, O'BanionMK, Pachter J, Pasinetti G, Plata-Salaman C, Rogers J, Rydel R, Shen Y, StreitW, Strohmeyer R, Tooyoma I, Van Muiswinkel FL, Veerhuis R, Walker D, Webster S,Wegrzyniak B, Wenk G, Wyss-Coray T (2000) Inflammation and Alzheimer's disease.Neurobiol Aging 21:383-421.
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、神経疾患に関連するタンパク質を選択的に除去するための二重特異性組換え抗体フラグメントを含む治療薬、および神経疾患を治療するためのこれらの治療薬の使用方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の特定の実施形態は、（ａ）神経変性疾患に関連するタンパク質を特異的に認識する第１リガンド、および（ｂ）古典的補体経路成分を特異的に活性化またはミクログリア細胞を直接活性化する第２リガンドを含む二重特異性抗体フラグメントを提供する。
【０００８】
本発明の特定の実施形態は、（ａ）β−アミロイドに特異的なＨ１ｓｃＦｖであって、アミノ末端およびカルボキシ末端を有する、第１ｓｃＦｖ、（ｂ）Ｃ１ｑに特異的なｓｃＦｖであって、アミノ末端およびカルボキシ末端を有する、第２ｓｃＦＶ、ならびに（ｃ）第１ｓｃＦｖのカルボキシ末端を第２ｓｃＦｖのアミノ末端に操作可能に連結する（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドリンカーを含む二重特異性抗体を提供する。
【０００９】
本発明の特定の実施形態は、上述した二重特異性抗体をエンコードする核酸を提供する。
【００１０】
本発明の特定の実施形態は、上述した二重特異性抗体を生理学的に許容可能な非毒性担体と組み合わせて含む治療組成物を提供する。
【００１１】
本発明の特定の実施形態は、上述した二重特異性抗体を投与するステップを含む凝集および可溶性Ａβの除去方法を提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）神経疾患に関連するタンパク質を特異的に認識する第１リガンド、および（ｂ）古典的補体経路成分を特異的に活性化またはミクログリア細胞を直接活性化する第２リガンドを含む、二重特異性抗体フラグメント。
（項目２）
ダイアボディ構築物を形成するため第２二重特異性抗体フラグメントをさらに含む、項目１に記載の二重特異性抗体フラグメント。
（項目３）
前記第１および第２リガンドがｓｃＦｖフラグメントである、項目１〜２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体フラグメント。
（項目４）
前記第２リガンドがＣ１ｑに特異的に結合する、項目１〜３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体フラグメント。
（項目５）
前記第２リガンドが白血球上の受容体に特異的に結合する、項目１〜４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体フラグメント。
（項目６）
前記受容体がＣＤ１６またはＣＤ６４である、項目５に記載の二重特異性抗体フラグメント。
（項目７）
前記神経疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ルー・ゲーリッグ病、ハンチントン病、プリオン病または海綿状脳症である、項目１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体フラグメント。
（項目８）
前記神経疾患がアルツハイマー病であり、前記第１リガンドがＡβを特異的に認識する、項目７に記載の二重特異性抗体フラグメント。
（項目９）
前記第１リガンドが可溶性Ａβに特異的である、項目８に記載の二重特異性抗体フラグメント。
（項目１０）
前記第１リガンドが凝集Ａβに特異的である、項目８に記載の二重特異性抗体フラグメント。
（項目１１）
前記第１および第２リガンド間に操作可能に連結された（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３リンカーをさらに含む、項目１〜１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体フラグメント。
（項目１２）
前記第１または第２リガンドのいずれかに操作可能に連結されたポリ−Ｈｉｓテールをさらに含む、項目１１に記載の二重特異性抗体フラグメント。
（項目１３）
（ａ）β−アミロイドに特異的なＨ１ｓｃＦｖであって、アミノ末端およびカルボキシ末端を有する、第１ｓｃＦｖ、
（ｂ）Ｃ１ｑに特異的なｓｃＦｖであって、アミノ末端およびカルボキシ末端を有する、第２ｓｃＦｖ、ならびに
（ｃ）前記第１ｓｃＦｖの前記カルボキシ末端を前記第２ｓｃＦｖの前記アミノ末端に操作可能に連結する、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドリンカー
を含む、二重特異性抗体。
（項目１４）
前記第１ｓｃＦｖの前記アミノ末端に操作可能に連結されたｇＩＩＩシグナル配列をさらに含む、項目１３に記載の二重特異性抗体。
（項目１５）
前記第２ｓｃＦｖの前記カルボキシ末端に操作可能に連結されたｃ−ｍｙｃタグをさらに含む、項目１３に記載の二重特異性抗体。
（項目１６）
前記ｃ−ｍｙｃタグに操作可能に連結された（Ｈｉｓ）６タグをさらに含む、項目１５に記載の二重特異性抗体。
（項目１７）
項目１３に記載の二重特異性抗体をエンコードする核酸。
（項目１８）
プロモーターをさらに含む、項目１７に記載の核酸。
（項目１９）
５’末端にｇＩＩＩシグナル配列をさらに含む、項目１７に記載の核酸。
（項目２０）
前記二重特異性抗体をエンコードする配列の３’末端にインフレームで位置する、ｃ−ｍｙｃタグをエンコードする核酸および（Ｈｉｓ）６タグをエンコードする核酸をさらに含む、項目１９に記載の核酸。
（項目２１）
項目１７〜２０のいずれか１項に記載の核酸配列、および
プロモーター
を含む、発現カセット。
（項目２２）
項目２１に記載の発現カセットを含む、ベクター。
（項目２３）
項目１７〜２０のいずれか１項に記載の核酸、項目２１に記載の発現カセット、または項目２２に記載のベクターを含む、細胞。
（項目２４）
項目１〜１６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を生理学的に許容可能な非毒性担体と組み合わせて含む、治療組成物。
（項目２５）
項目１〜１６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を投与するステップを含む、凝集および可溶性Ａβの除去方法。
（項目２６）
前記凝集および可溶性Ａβが細胞にある、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記凝集および可溶性Ａβが脳組織にある、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記脳組織が哺乳類にある、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記哺乳類がヒトである、項目２８に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＡＰＰマウスにおける加齢に伴うＡβレベルの増加を示す。６、１２および２４月齢のＡＰＰトランスジェニックマウスおよび野生型対照マウスからの脳を均質化し、ギ酸により溶解した。Ａβ４０（パネルＡ）およびＡβ４２（パネルＢ）濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。
【図２】ダイアボディ遺伝子構築物（ｐＣａｎｔａｂ６／Ａβ＋Ｃ１ｑ）を示す概略図である：ｐｅｌＢ、細菌性ペクチン酸リアーゼのシグナルペプチド配列；ｃ−ｍｙｃ、モノクローナル抗体９Ｅ１０により認識されるエピトープをエンコードする配列；Ｈｉｓ６、６つのＣ末端ヒスチジン残基をエンコードする配列。
【図３】ＡβおよびＣ１ｑとの結合を示すダイアボディのＢＩＡコア結合分析である：フェーズＩ、ダイアボディと固定化Ａβチップとの結合；フェーズＩＩ、Ｃ１ｑとＡβ／ダイアボディ複合体との結合。
【図４】ｐ６ペプチドの選別である；左：抗原なし；右：１００ｎＭ抗原。象限２中の細胞は標的抗原に結合するはずである。太枠内は選別された細胞の選択基準を示す。
【図５】原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）バイオパニングプロトコルの概略である。
【図６】オリゴマー（Ａ）および原線維α−シクヌクレイン凝集体（Ｂ）の形成のＡＦＭ画像である。モノマーまたはモノマーおよびオリゴマーα−シヌクレインの混合物の試料を７０μＭの最終濃度まで溶解した。フィブリルを形成するため、試料を５６℃で１２日間、その後３７℃で７日間振盪せずにインキュベートし、最後に４℃でさらに１０日間インキュベートした。
【図７】Ｈ１ｖ２抗Ａｂ４０、Ｈ１ｖ３抗Ａｂ４０（Ｄ９抗Ａｂ４０とも称される）、およびＣ１抗Ａｂ４０の配列である。最初の２つの配列はもとのＨ１配列より良好に結合する異なる変異体である。Ｃ１抗Ａｂ４０ｓｃＦｖはＡβのｃ末端の近く、Ｃ１に結合する。これらの配列はＰＥＬＢリーダーおよびＮｏｔＩ／Ｈｉｓタグの端部を省略する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
特定の実施形態では、本発明は、神経疾患に関連するタンパク質を選択的に除去するための二重特異性抗体フラグメントを含む治療薬、および神経疾患を治療するためのこれらの治療薬の使用方法を提供する。本発明の特定の実施形態は、
（ａ）神経変性疾患に関連するタンパク質を特異的に認識する第１リガンド、および
（ｂ）古典的補体経路成分を特異的に活性化またはミクログリア細胞を直接活性化する第２リガンド
を含む二重特異性抗体フラグメントを提供する。
【００１４】
特定の実施形態では、二重特異性抗体フラグメントは、ダイアボディ構築物を形成するため第２二重特異性抗体フラグメントをさらに含む。特定の実施形態では、第１および第２リガンドはｓｃＦｖフラグメントである。特定の実施形態では、第２リガンドはＣ１ｑ（すなわち、古典的補体反応の第１成分）に特異的に結合する。特定の実施形態では、第２リガンドはＣＤ１６またはＣＤ６４のような白血球上の受容体に特異的に結合する。
【００１５】
特定の実施形態では、二重特異性抗体フラグメントは、アルツハイマー病、パーキンソン病、ルー・ゲーリッグ病、ハンチントン病、プリオン病または海綿状脳症のような神経変性疾患を治療する。特定の実施形態では、神経変性疾患はアルツハイマー病であり、第１リガンドはＡβを特異的に認識する（例えば、第１リガンドは可溶性Ａβに特異的、または凝集Ａβに特異的である）。特定の実施形態では、二重特異性抗体フラグメントは、第１および第２リガンドの間に操作可能に連結された（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３リンカーをさらに含む。特定の実施形態では、二重特異性抗体フラグメントは第１または第２リガンドのいずれかに操作可能に連結されたポリ−Ｈｉｓテールをさらに含む。
【００１６】
本発明の特定の実施形態は、
（ａ）β−アミロイドに特異的なＨ１ｓｃＦｖであって、アミノ末端およびカルボキシ末端を有する、第１ｓｃＦｖ；
（ｂ）Ｃ１ｑに特異的なｓｃＦｖであって、アミノ末端およびカルボキシ末端を有する、第２ｓｃＦｖ；ならびに
（ｃ）第１ｓｃＦｖのカルボキシ末端を第２ｓｃＦｖのアミノ末端に操作可能に連結する、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドリンカー
を含む二重特異性抗体を提供する。
【００１７】
特定の実施形態では、二重特異性抗体は、第１ｓｃＦｖのアミノ末端に操作可能に連結されたｇＩＩＩシグナル配列をさらに含む。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、第２ｓｃＦｖのカルボキシ末端に操作可能に連結されたｃ−ｍｙｃタグをさらに含む。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ｃ−ｍｙｃタグに操作可能に連結された（Ｈｉｓ）６タグをさらに含む。
【００１８】
本発明の特定の実施形態は、上述した二重特異性抗体をエンコードする核酸を提供する。特定の実施形態では、核酸はプロモーターをさらに含む。例としては、これらに限定されないが、ｌａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ即時初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ｐｏｌＩＩプロモーター、ｐｏｌＩＩＩプロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーター、等が挙げられる。加えて、マウスメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス遺伝子から誘導される配列も本発明に用いることができるだろう。こうしたプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州サンディエゴ）から市販されている。
【００１９】
特定の実施形態では、エンハンサー等のような他の制御要素は特定の用途を有するだろう。特定の実施形態では、ｇＩＩＩシグナル配列は５’末端に含まれる。特定の実施形態では、核酸は、二重特異性抗体の３’末端にインフレームで位置する、ｃ−ｍｙｃタグをエンコードする核酸および（Ｈｉｓ）６タグをエンコードする核酸をさらに含む。ｇＩＩＩシグナル配列はポリペプチドを周辺質空間内に配向し、そこではこれを可溶性型に正しく折り畳むことができる。二重特異性ｓｃＦｖの発現レベルを分析するにはｃ−ｍｙｃタグが用いられ、二重特異性ｓｃＦｖタンパク質を精製するには（Ｈｉｓ）６タグを用いることができる。
【００２０】
本発明の特定の実施形態は、上述した核酸配列およびプロモーターを含む発現カセットを提供する。
【００２１】
本発明の特定の実施形態は、上述した発現カセットを含むベクターを提供する。特定の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクターはアデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポリオウイルス、ＨＳＶ、またはマウスマロニー系ウイルスベクターである。
【００２２】
本発明の特定の実施形態は、上述したベクターまたは発現カセットを提供する。
【００２３】
本発明の特定の実施形態は、上述した二重特異性抗体を生理学的に許容可能な非毒性担体と組み合わせて含む治療組成物を提供する。
【００２４】
本発明の特定の実施形態は、上述した二重特異性抗体を投与するステップを含む凝集および可溶性Ａβの除去方法を提供する。特定の実施形態では、凝集および可溶性Ａβは脳組織のような細胞に存在する。特定の実施形態では、脳組織はヒトのような哺乳類に存在する。
【００２５】
本発明は、上述した核酸分子を細胞内に細胞における標的タンパク質（例えば、凝集および可溶性Ａβ）の蓄積を抑制するのに十分な量で導入することによる、細胞における標的タンパク質の蓄積の抑制方法を提供する。特定の実施形態では、標的タンパク質の蓄積は少なくとも１０％抑制される。標的タンパク質の蓄積は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％抑制される。
【００２６】
［神経疾患］
「神経疾患」および「神経障害」とは、神経系機能不全を特徴とし、罹患した中枢もしくは末端神経系構造の萎縮、または萎縮を伴わない機能の喪失に関連し得る、遺伝性および散発性疾患の両方を指す。萎縮を引き起こす神経疾患または障害は一般的には「神経変性疾患」または「神経変性障害」と称される。神経変性疾患および障害としては、これらに限定されないが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、遺伝性痙性片麻痺、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、ケネディ病、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、反復伸長神経変性疾患、例えば、トリヌクレオチド反復の伸長に関連する疾患、例えば、ポリグルタミン（ポリＱ）反復疾患、例えば、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、およびＳＣＡ１７）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）が挙げられる。萎縮を引き起こさないと考えられる障害性神経障害の例としてはＤＹＴ１ジストニアがある。対象の遺伝子は癌細胞の移動に関与するケモカインのリガンド、またはケモカイン受容体をエンコードすることができる。
【００２７】
（アルツハイマー病）
Ａβ、老人斑の主要タンパク質成分（４ｋＤａ）は、β−およびγ−セクレターゼ活性が関与する酵素消化により、その前駆体、ＡＰＰから生成される。主なＡβフラグメントとしてはＡβ１−４０およびＡβ１−４２がある。Ａβ１−４２はアミロイドフィブリル形成のシード分子として拡散斑において初期に沈着したタンパク質であると考えられるが、その後のＡβ１−４０の沈着は遅発性ＡＤにおける臨床症状の発症により密接に関連し、Ａβ濃度を低下させることが潜在的に実行可能な治療的または予防的アプローチであることを示す。２つの異なるアプローチをとることができ、１つめはＡβ生成を阻害することであり、も２つめは損傷を引き起こし得る前にＡβを除去することである。Ａβ生成を阻害するため、ＡＰＰからＡβを生成する２つの異なるプロテアーゼ：Ａβのアミノ末端を形成するためＡＰＰを開裂するβセクレターゼ；およびＡβのカルボキシル末端を形成するためＡＰＰを開裂するγ−セクレターゼの活性を阻害することができる。β−またはγ−セクレターゼ活性のいずれかの阻害は有望であり、いくつかの研究室および製薬会社により非常に積極的に追求されているが、ＡＰＰの開裂を阻害するには多数の細胞位置に阻害剤を送達しなければならないため、かなりの困難に直面している。これらの酵素の天然機能は比較的知られていないので、酵素の阻害は他の有害効果をもたらし得、阻害剤は他のプロテアーゼ活性も阻害し、望ましくない副作用を引き起こし得る。
【００２８】
β−セクレターゼによるＡＰＰの開裂はＡＰＰの〜１００ｋＤａ可溶性ＮＨ２末端フラグメントおよび１２ｋＤａＣ末端スタブ（Ｃ９９）を生成し、これはプロテアーゼ、γ−セクレターゼによりさらに開裂することができる。この開裂はＡβの２つの主要な種、残基４０で終わるもの（Ａβ４０）および残基４２で終わるもの（Ａβ４２）をもたらす。ＡＰＰのエンドサイトーシスはＡβを生成する１つの経路であり；Ａβは分泌経路において生成することもできる。実際に、ＡＰＰをＣＨＯ細胞内にトランスフェクトした後、亜細胞分画した場合、ＥＲに富む小胞では主にＡβ４２が、ゴルジに富む小胞では主にＡβ４０が検出された。
【００２９】
β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）の過剰発現はＢＡＣＥ１開裂産物、Ｃ９９およびＣ８９の量を増加させる。インビトロＡβ生成におけるＢＡＣＥ１の役割は、ＡＤにおけるＡβペプチドの多量生成およびスウェーデン家族性アルツハイマー病の早期発症を説明し得る。ＢＡＣＥ１活性は散発性ＡＤ脳において増加することが示された。ＢＡＣＥノックアウト（ＫＯ）マウスを用いる実験は、ＢＡＣＥ１がＡβペプチドの生成の主要βな−セクレターゼであり、ＢＡＣＥ１阻害剤の開発がＡβ生成を低減する１つの効果的なアプローチとなり得ることを示した。
【００３０】
加えて、γ−セクレターゼもＡβ生成において重要な役割を果たし、第２アプローチ、脳からのＡβ除去は、他の細胞代謝活性への潜在的な干渉の問題を回避することができるという利点を提供する。変異ＡＰＰ２３またはＡＰＰ２３およびＰＳ１変異体の両方を過剰発現するトランスジェニックマウスは、ＡＤ患者に見られるものと同様のＡβ沈着物を発生させるように設計された。従って、これらのトランスジェニックマウスは、Ａβ沈着を阻害または除去するためのさまざまな戦略を試験するのに適した動物モデルを提供する。こうしたマウスの凝集Ａβでの免疫化は、Ａβの沈着を遅延させ、また脳にすでに存在するＡβ沈着物を除去することが示された。Ａβに対して作製された抗体の周期的注射によるこれらの同じマウスの受動免疫化も、Ａβの沈着を遅延させ、すでに存在していたＡβ沈着物を低減することが示された。エクスビボアッセイにおけるＡβ沈着物の脳組織からの除去は、Ｆｃ受容体媒介ファゴサイトーシスに相関した。
【００３１】
Ａβに対して免疫化されたマウスの行動実験は、記憶喪失および行動障害の低減も示した。これらの結果は非常に有望であるが、この戦略のヒトへの適用には、強い免疫反応が引き起こされ得る、または免疫化が脳組織における炎症を悪化させ得る可能性を含む、多数の潜在的な問題がある。ＡＤは炎症性疾患であり、ファゴサイトーシスによる抗体媒介除去は脳炎症および損傷を悪化させ得るというかなりの証拠がある。ヒトＡＤ患者において、凝集Ａβに対する活性免疫化は認知低下を減少させ、神経病理を低減し、ＡＤ病理におけるＡβの役割の臨床証拠をもたらしたが、患者の６％が髄膜脳炎を発症したため試験は中止された。
【００３２】
炎症反応は抗体反応に直接相関しなかったが、古典的補体タンパク質の全範囲はＡＤ脳において上方調節され、ＡβはＣ１ｑ、古典的補体反応の第１成分に結合することが示された。従って、Ａβは脳における炎症を促進し得、凝集Ａβの抗体媒介除去は潜在的にこの炎症をさらに悪化させ得る。抗体媒介除去はＡβ沈着を制御するための潜在的に強力な戦略であるが、補体活性化はＡＤ脳において注意深く調節されなければならず、病原体または神経毒性凝集体の除去をもたらし、ニューロンの修復を促進するには十分だが、炎症が認知損傷を引き起こさない程度に刺激されなければならない（Ｓｈｅｎ  ａｎｄ  Ｍｅｒｉ  ２００３）。
【００３３】
Ａβに対するモノクローナル抗体はすでに単離され、凝集Ａβの除去を開始することが示されたが、ここで提案するｓｃＦｖ抗体フラグメントの使用には、１）ｓｃＦｖ抗体はヒト細胞株から誘導され、免疫原性反応のリスクが少なく、インビボ分析および最終的には治療に用いることができること；２）ｓｃＦｖ抗体はモノクローナルよりかなり小さく、ＢＢＢを越える輸送を潜在的に促進すること；３）ＢＢＢを越える輸送を標的とするペプチド配列を組換え抗体構築物に付加し、脳への生体内分布をさらに促進することができること；４）ダイアボディ構築物を容易に修飾し、タウ、プリオンまたは他の潜在的な神経変性標的を除去することができること；ならびにおそらくもっとも重要なことには５）抗原性標的および除去機構の組み合わせを用い、炎症を制御することができることを含む、いくつかの顕著な利点がある。
【００３４】
Ａβのミクログリアによる除去を向上させるため、本発明者らは、具体的には治療戦略としてＡβ除去が現在直面する重大な炎症の問題を解決するように設計された二重特異性組換え抗体フラグメント（ダイアボディ）を用いることによる、ＡＤを治療するための革新的なアプローチを開発した。二重特異性抗体は２つの異なる結合活性を含有し、第１結合活性はＡβの異なる形態および型を選択的に標的とし、第２結合活性は古典的補体経路の異なる成分を活性化またはミクログリア細胞を直接活性化し、Ａβのファゴサイトーシスに必要な炎症反応をより選択的に制御するだろう。ダイアボディは可溶性または原線維Ａβのいずれかを標的としたｓｃＦｖフラグメントを除去機構の異なる成分を開始するｓｃＦｖフラグメントと組み合わせて含有する。
【００３５】
Ａβ蓄積はＡＤに強く相関し、従ってＡβ蓄積を阻害することは有望な治療戦略である。ヒトにおけるＡβ免疫化試験は、炎症反応を制御することができるなら、Ａβの除去がＡＤを治療するための実行可能な治療的アプローチとなり得るという強力な証拠をもたらす。健康な脳には見られないＡＤ脳における炎症反応はすでに同定された（Ａｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。炎症反応は抗体反応に直接相関しなかったが、古典的補体タンパク質の全範囲はＡＤ脳において上方調節され（Ａｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．２０００）、Ａβは古典的補体反応の第１成分であるＣ１ｑに結合することが示された。従って、Ａβは脳における炎症を促進し得、凝集Ａβの抗体媒介除去は潜在的にこの炎症をさらに悪化させ得る。脳には健康的な除去と破壊的な炎症との間の微妙なバランスがすでに存在するため、ヒト免疫化試験（Ｃｈｅｃｋ  ２００２）において見られた合併症により証明されるように、Ａβの治療的抗体媒介除去戦略はこのバランスを維持しなければならない。
【００３６】
（他の神経変性疾患）
ＡＤに対する素晴らしい潜在的な治療効果のほかに、ここで開発した抗体構築物は、パーキンソン病、ルー・ゲーリッグ病、ハンチントン病および海綿状脳症のような他の神経疾患を治療するのに適している。抗体構築物は個別の容易に置換される官能基から設計されるため、構築物は他の用途のために容易に修飾することができる。例えば、Ａβドメインをプリオン特異的ｓｃＦｖドメインと交換することにより、Ａβの代わりにプリオンを標的とすることができる。補体活性化ｓｃＦｖをタンパク質分解ｓｃＦｖと交換することにより、補体活性化の代わりに特定のプロテアーゼ活性を活性化することができる。
【００３７】
［抗体および抗体フラグメント］
本発明は、神経変性疾患に関連するタンパク質に特異的に結合し、細胞除去機構の成分に結合する精製された二重特異性リガンドを提供する。本明細書において用いられる場合、「抗体」の語は、ｓｃＦｖ、ヒト化、完全ヒトまたはキメラ抗体、一本鎖抗体、ダイアボディ、およびＦｃ領域を含有しない抗体の抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）を含む。特定の実施形態では、抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。「ヒト化」抗体は、３つのＣＤＲ（相補性決定領域）、ならびに場合によっては対応するフレームワーク上に組換え連結された各ドナー抗体可変領域およびヒト抗体配列の定常領域からのいくつかの注意深く選択された「フレームワーク」残基（可変領域の非ＣＤＲ部分）のみを含有する。「完全ヒト化抗体」は、ヒト由来抗体遺伝子のみを有するように遺伝子操作されたマウスからのハイブリドーマにおいて作製され、またはヒト由来抗体遺伝子のファージディスプレイライブラリーから選択される。
【００３８】
本明細書において用いられる場合、「抗体」の語は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖまたは「ナノボディ」）、ヒト化、完全ヒトまたはキメラ抗体、一本鎖抗体、ダイアボディ、および抗体の抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）を含む。ｓｃＦｖは、リンカーペプチドにより連結された免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常短く、約１０〜２５個のアミノ酸長である。柔軟性が重要である場合、リンカーは顕著な数のグリシンを含有するだろう。可溶性が重要である場合、セリンまたはチオニンがリンカーに用いられるだろう。リンカーはＶＨのアミノ末端をＶＬのカルボキシ末端に連結することができ、またはリンカーはＶＨのカルボキシ末端をＶＬのアミノ末端に連結することができる。二価ｓｃＦｖは２つのｓｃＦｖを連結することにより作製することができる。例えば、二価ｓｃＦｖは、２つのＶＨおよび２つのＶＬ領域を含有する単一のペプチドを生成することにより作製することができる。あるいは、それぞれ単一のＶＨおよび単一のＶＬ領域を含有する２つのペプチドを二量体化することができる（「ダイアボディ」とも称される）。Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ：ｓｍａｌｌ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，”ＰＮＡＳ，Ｊｕｌｙ  １９９３，９０：６４４４−６４４８。二価性は抗体が多量体抗原に高い結合力で結合することを可能にし、二重特異性は２つの抗原の架橋を可能にする。    
【００３９】
本明細書において用いられる場合、「モノクローナル抗体」とは、実質的に同種の抗体の群、すなわち、群を構成する抗体が、少量で存在する天然発生変異体を除き、同種である抗体群から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異性であり、単一の抗原部位と相互作用する。さらに、各モノクローナル抗体は、一般的にはさまざまな抗原決定基に対するさまざまな抗体を含有する一般的なポリクローナル抗体製剤とは対照的に、抗原上の単一の抗原決定基（エピトープ）を標的とする。その特異性に加えて、他の免疫グロブリンで汚染されていないハイブリドーマ培養物から産生されるという点で、モノクローナル抗体は有利である。
【００４０】
「モノクローナル」の形容詞は、実質的に同種の抗体の群から得られる抗体の特性を示し、特定の方法により作製される抗体を特定しない。例えば、本発明に用いるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５，１９７５）または組換え法（米国特許第４，８１６，５６７号）により作製することができる。本発明に用いられるモノクローナル抗体はファージ抗体ライブラリーから単離することもできる（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８，１９９１；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７，１９９１）。本発明のモノクローナル抗体はとくに、重（Ｈ）鎖および／または軽（Ｌ）鎖の一部が特定の種、特定の抗体クラスまたはサブクラスから誘導され、鎖の残りの部分が別の種、別の抗体クラスまたはサブクラスから誘導される「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含む。さらに、変異抗体およびその抗体フラグメントも本発明に含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５，１９８４）。
【００４１】
本明細書において用いられる場合、「変異抗体」の語は、１つ以上のアミノ酸残基が変更された変異アミノ酸配列を含む抗体を指す。例えば、抗体の可変領域を修飾し、その生物学的特性、例えば抗原結合を向上させることができる。こうした修飾は、部位特異的変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８（１９８５）参照）、ＰＣＲベースの変異誘発、カセット変異誘発、等により達成することができる。こうした変異体は、抗体の重鎖または軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも７０％、より好適には少なくとも７５％、さらにより好適には少なくとも８０％、さらにより好適には少なくとも８５％、さらにより好適には少なくとも９０％、もっとも好適には少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書において用いられる場合、「配列同一性」の語は、配列がアラインされ、必要に応じてギャップが配列同一性を最大化するように適切に導入された後決定される、抗体のもとのアミノ酸配列中のものと同一の残基の割合として定義される。
【００４２】
具体的には、あるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の別の配列との同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）による、アルゴリズムＢＬＡＳＴを用いて決定することができる。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸのようなプログラムはこのアルゴリズムに基づき開発された（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づくＢＬＡＳＴＮに従ってヌクレオチド配列を分析するため、パラメーターは、例えば、スコア＝１００およびワード長＝１２に設定される。一方、ＢＬＡＳＴに基づくＢＬＡＳＴＸによるアミノ酸配列の分析に用いられるパラメーターとしては、例えば、スコア＝５０およびワード長＝３がある。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、各プログラムのデフォルトパラメーターが用いられる。こうした分析の具体的な技術は当技術分野において知られている（米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。
【００４３】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は当業者に知られる方法により調製することができる。
【００４４】
別の実施形態では、抗体および抗体フラグメントは、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０））により報告された技術を用いることにより作製された抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１））およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１））は、それぞれマウスおよびヒト抗体のファージライブラリーからの単離について報告した。鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２））、ならびに大規模なファージライブラリーの構築方法である組み合わせ感染およびインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３））に基づく高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の作製について記載する報告もある。モノクローナル抗体作製の従来のハイブリドーマ技術を用いる代わりに、これらの技術を用いてモノクローナル抗体を単離することもできる。
【００４５】
本発明に用いる抗体は、タンパク質Ａ−セファロース法、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、硫酸塩での塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーのような既知の方法から適切に選択される方法により、またはこれらを組み合わせて用いることにより精製することができる。
【００４６】
本発明は遺伝子操作により作製された組換え抗体を用いることができる。上述した方法により得られた抗体をエンコードする遺伝子はハイブリドーマから単離される。遺伝子は適切なベクター内に挿入された後、宿主内に導入される（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ，１９９０参照）。本発明は、本発明の抗体をエンコードする核酸、およびこれらの核酸を含むベクターを提供する。具体的には、逆転写酵素を用い、抗体の可変領域（Ｖ領域）をエンコードするｃＤＮＡがハイブリドーマのｍＲＮＡから合成される。対象の抗体の可変領域をエンコードするＤＮＡを得た後、それらは抗体の所望の定常領域（Ｃ領域）をエンコードするＤＮＡにライゲートされ、得られたＤＮＡ構築物は発現ベクター内に挿入される。あるいは、抗体の可変領域をエンコードするＤＮＡは、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクター内に挿入してもよい。これらは、遺伝子が発現制御領域、例えば、エンハンサーおよびプロモーターの制御下で発現するように発現ベクター内に挿入される。次に、宿主細胞は抗体を発現するように発現ベクターで形質転換される。本発明は、本発明の抗体を発現する細胞を提供する。本発明の抗体を発現する細胞としては、こうした抗体の遺伝子で形質転換された細胞およびハイブリドーマがある。
【００４７】
本発明の抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ）、またはＣＤＲと機能的に同等の領域を含む抗体も挙げられる。「機能的に同等」の語は、実施例において単離されるモノクローナル抗体のいずれかのＣＤＲのアミノ酸配列と同様のアミノ酸配列を含むことを指す。「ＣＤＲ」の語は、抗体可変領域（「Ｖ領域」とも称される）中の領域を指し、抗原結合の特異性を決定する。Ｈ鎖およびＬ鎖はそれぞれ、Ｎ末端からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として示される、３つのＣＤＲを有する。これらのＣＤＲに隣接する４つの領域がある：これらの領域は「フレームワーク」と称され、それらのアミノ酸配列は高度に保存される。ＣＤＲは他の抗体内に移植することができ、よってＣＤＲを所望の抗体のフレームワークと組み合わせることにより組換え抗体を調製することができる。ＣＤＲの１つ以上のアミノ酸は、その抗原との結合能力を失うことなく修飾することができる。例えば、ＣＤＲ中の１つ以上のアミノ酸を置換、欠失、および／または付加することができる。
【００４８】
特定の実施形態では、アミノ酸残基はアミノ酸側鎖の特性を保存することを可能にするものに変異させる。アミノ酸側鎖の特性の例としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに下記の側鎖：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；水酸基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を含むアミノ酸が挙げられる。括弧内の文字は１文字アミノ酸コードを示す。各群内でのアミノ酸置換は保存的置換と称される。１つ以上のアミノ酸残基が欠失、付加、および／または置換された修飾アミノ酸配列を含むポリペプチドがもとの生物学的活性を保持することができることは周知である（Ｍａｒｋ  Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：５６６２−５６６６（１９８４）；Ｚｏｌｌｅｒ  Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００（１９８２）；Ｗａｎｇ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：１４３１−１４３３；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７９：６４０９−６４１３（１９８２））。変異アミノ酸の数は限定されないが、一般的にはその数は各ＣＤＲのアミノ酸の４０％以内、好適には３５％以内、さらにより好適には３０％以内（例えば、２５％以内）に入る。アミノ酸配列の同一性は本明細書において上述したように決定することができる。
【００４９】
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低減するように人工的に修飾された組換え抗体を用いることができる。例としてはキメラ抗体およびヒト化抗体が挙げられる。これらの修飾抗体は既知の方法を用いて作製することができる。キメラ抗体としては、互いに異なる種の可変および定常領域を含む抗体、例えば、マウスのような非ヒト哺乳類の抗体重鎖および軽鎖可変領域、ならびにヒトの抗体重鎖および軽鎖定常領域を含む抗体が挙げられる。こうした抗体は、（１）マウス抗体の可変領域をエンコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をエンコードするＤＮＡにライゲートするステップ；（２）これを発現ベクター内に組み込むステップ；および（３）ベクターを抗体産生の宿主内に導入するステップにより得ることができる。
【００５０】
ヒト化抗体は、再構成ヒト抗体とも称され、マウスのような非ヒト哺乳類の抗体のＨまたはＬ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体のＣＤＲで置換することにより得られる。こうした抗体の調製には従来の遺伝子組換え技術が知られている（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）参照）。具体的には、マウス抗体のＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）にライゲートするように設計されたＤＮＡ配列が、その端部に重複部分を含むように構築されたいくつかのオリゴヌクレオチドを用い、ＰＣＲにより合成される。ヒト化抗体は、（１）得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をエンコードするＤＮＡにライゲートするステップ；（２）これを発現ベクター内に組み込むステップ；および（３）ベクターを抗体を産生する宿主内にトランスフェクトするステップにより得ることができる（欧州特許出願第ＥＰ２３９，４００号、および国際特許出願第ＷＯ９６／０２５７６号参照）。ＣＤＲによってライゲートされるヒト抗体ＦＲはＣＤＲが好ましい抗原結合部位を形成する場所で選択される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体内に導入されるＣＤＲにもフレームワーク配列にも含まれない追加のアミノ酸残基を含んでもよい。こうしたアミノ酸残基は通常、抗原を認識し、これに結合する抗体の能力をより正確に最適化するために導入される。例えば、必要に応じて、抗体可変領域のフレームワーク領域中のアミノ酸は、再構成ヒト抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
【００５１】
本発明の抗体のアイソタイプは限定されない。アイソタイプは、例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む。本発明の抗体は、抗原結合に関する部分を含む抗体フラグメント、またはその修飾フラグメントであってもよい。「抗体フラグメント」の語は、全長抗体の一部分、一般的には抗原結合ドメインまたは可変領域を含むフラグメントを指す。こうした抗体フラグメントとしては、例えば、抗体フラグメントから調製されるＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、適切なリンカーで連結された重鎖Ｆｖおよび軽鎖Ｆｖを含む一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、線状抗体、ならびに多重特異性抗体が挙げられる。従来、抗体フラグメントは天然抗体をプロテアーゼで消化することにより生成され、現在、遺伝子操作技術を用いて組換え抗体としてそれらを発現させる方法も知られている（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４，１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８９，１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８９，１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８９，１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ，１９９１，９，１３２−１３７参照）。
【００５２】
「Ｆｖ」フラグメントはもっとも小さな抗体フラグメントであり、完全抗原認識部位および結合部位を含有する。この領域は、重鎖および軽鎖のそれぞれの可変領域が非共有結合により強く連結された二量体（ＶＨ−ＶＬ二量体）である。可変領域のそれぞれの３つのＣＤＲは相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を形成する。換言すると、重鎖および軽鎖からの合計６つのＣＤＲは抗体の抗原結合部位として一緒に機能する。しかしながら、可変領域（または３つの抗原特異的ＣＤＲのみを含有する半Ｆｖ）単独でも、その親和性は結合部位全体の親和性より低いが、抗原を認識し、これに結合することができることが知られている。よって、本発明の好適な抗体フラグメントはＦｖフラグメントであるが、これに限定されない。こうした抗体フラグメントは、保存される重鎖または軽鎖ＣＤＲの抗体フラグメントを含み、その抗原を認識し、これに結合することができるポリペプチドであってもよい。
【００５３】
Ｆａｂフラグメント（Ｆ（ａｂ）とも称される）は、軽鎖定常領域および重鎖定常領域（ＣＨ１）も含有する。例えば、抗体のパパイン消化は、２種類のフラグメント：Ｆｂフラグメントと称され、単一の抗原結合ドメインとして機能する、重鎖および軽鎖の可変領域を含有する抗原結合フラグメント；ならびに容易に結晶化されるため「Ｆｃ」と称される残りの部分を生成する。Ｆａｂ'フラグメントは抗体のヒンジ領域からの１つ以上のシステイン残基を含有する重鎖ＣＨ１領域のカルボキシル末端から誘導されるいくつかの残基も有するという点で、Ｆａｂ'フラグメントはＦａｂフラグメントとは異なる。しかしながら、両方とも、単一の抗原結合ドメインとして機能する重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗原結合フラグメントであるという点で、Ｆａｂ'フラグメントはＦａｂと構造的に同等である。本明細書では、単一の抗原結合ドメインとして機能し、パパイン消化により得られるものと同等である、重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗原結合フラグメントは、プロテアーゼ消化により生成される抗体フラグメントと同一でない場合でも、「Ｆａｂ様抗体」と称される。Ｆａｂ'−ＳＨは、その定常領域中に遊離チオール基を有する１つ以上のシステイン残基を有するＦａｂ'である。Ｆ（ａｂ'）フラグメントは、Ｆ（ａｂ'）２のヒンジ領域中のシステイン残基間のジスルフィド結合を開裂することにより生成される。他の化学的に架橋された抗体フラグメントも当業者に知られている。抗体のペプシン消化は２つのフラグメントを生成する；１つは２つの抗原結合ドメインを含み、抗原と交差反応することができるＦ（ａｂ'）２フラグメントであり、もう１つは残りのフラグメント（ｐＦｃ'と称される）である。本明細書では、ペプシン消化により得られるものと同等の抗体フラグメントは、２つの抗原結合ドメインを含み、抗原と交差反応することができる場合、「Ｆ（ａｂ'）２様抗体」と称される。こうした抗体フラグメントは、例えば、遺伝子操作により作製することもできる。こうした抗体フラグメントは、例えば、上述した抗体ファージライブラリーから単離することもできる。あるいは、Ｆ（ａｂ'）２−ＳＨフラグメントを大腸菌のような宿主から直接回収した後、化学的架橋によりＦ（ａｂ'）２フラグメントを形成させることができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。代替方法では、Ｆ（ａｂ'）２フラグメントは組換え宿主の培養物から直接単離することができる。
【００５４】
「ダイアボディ（Ｄｂ）」の語は、遺伝子融合（例えば、Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１）により構築された二価抗体フラグメントを指す。一般的には、ダイアボディは２つのポリペプチド鎖の二量体である。ポリペプチド鎖のそれぞれにおいて、同一鎖中の軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）は、それらが結合することができないように、短いリンカー、例えば、約５つの残基のリンカーによって連結される。２つの領域間のリンカーは短すぎるため、同じポリペプチド鎖中のＶＬおよびＶＨは一本鎖Ｖ領域フラグメントを形成することはできないが、代わりに二量体を形成する。よって、ダイアボディは２つの抗原結合ドメインを有する。２つのタイプの抗原（ａおよびｂ）に対するＶＬおよびＶＨ領域を組み合わせ、約５つの残基のリンカーによってＶＬａ−ＶＨｂおよびＶＬｂ−ＶＨａを形成した後、共発現する場合、それらは二重特異性Ｄｂとして分泌される。本発明の抗体はこうしたＤｂであってもよい。
【００５５】
一本鎖抗体（「ｓｃＦｖ」とも称される）は、抗体の重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域を連結することにより調製することができる（ｓｃＦｖの概要についてはＰｌｕｃｋｔｈｕｎ  “Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”Ｖｏｌ．１１３，ｅｄｓ．Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）参照）。一本鎖抗体の調製方法は当技術分野において知られている（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号；第５，２６０，２０３号；第５，０９１，５１３号；および第５，４５５，０３０号参照）。こうしたｓｃＦｖでは、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域はリンカー、好適にはポリペプチドリンカー（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，１９８８，８５，５８７９−５８８３）によって連結される。ｓｃＦｖ中の重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域は同じ抗体から、または異なる抗体から誘導してもよい。Ｖ領域をライゲートするのに用いられるペプチドリンカーは１２〜１９個の残基からなるいずれかの一本鎖ペプチドであってもよい。ｓｃＦｖをエンコードするＤＮＡは、全ＤＮＡ、または上記抗体の重鎖もしくは重鎖のＶ領域をエンコードするＤＮＡ、および上記抗体の軽鎖もしくは軽鎖のＶ領域をエンコードするＤＮＡから選択される、所望のアミノ酸配列をエンコードする部分ＤＮＡのいずれかをテンプレートとして用い；２つの端部を画定するプライマー対を用いる、ＰＣＲにより増幅することができる。さらなる増幅はその後、ペプチドリンカー部分をエンコードするＤＮＡ、ならびにそれぞれ重鎖および軽鎖にライゲートするＤＮＡの両端を画定するプライマー対の組み合わせを用いて行うことができる。ｓｃＦｖをエンコードするＤＮＡを構築した後、従来の方法を用い、これらのＤＮＡを含む発現ベクター、およびこれらの発現ベクターにより形質転換された宿主を得ることができる。さらに、ｓｃＦｖは、従来の方法に従い、得られた宿主を用いて得ることができる。これらの抗体フラグメントは、上述したように、抗体フラグメントをエンコードする遺伝子を得、これらを発現させることにより、宿主において産生することができる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような、さまざまなタイプの分子に結合させた抗体を修飾抗体として用いてもよい。抗体の修飾方法は当技術分野においてすでに構築されている。本発明における「抗体」の語は上述した抗体も含む。
【００５６】
得られた抗体は均質性まで精製することができる。抗体は、タンパク質を単離および精製するのに通常用いられる方法により、単離および精製することができる。抗体は、例えば、カラムクロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析、透析、予備ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動から適切に選択される１つ以上の方法を組み合わせて用いることにより、単離および精製することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。こうした方法は上に挙げたものに限定されない。クロマトグラフ法としては、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィーが挙げられる。これらのクロマトグラフ法は、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣのような、液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。親和性クロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムとしては、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。抗体は、抗原結合を用いることにより、その上に抗原が固定された担体を用いて精製することもできる。
【００５７】
本発明の抗体は標準的な方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ参照）に従って製剤することができ、医薬的に許容可能な担体および／または添加剤を含んでもよい。本発明は、本発明の抗体、ならびに医薬的に許容可能な担体および／または添加剤を含む組成物（試薬および医薬品を含む）に関する。例となる担体としては、界面活性剤（例えば、ＰＥＧおよびＴｗｅｅｎ）、賦形剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、着色剤、着香剤、防腐剤、安定化剤、緩衝剤（例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、懸濁化剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、流動性促進剤、および矯味剤が挙げられる。しかしながら、本発明に用いてもよい担体はこれらに限定されない。実際に、他の一般的に用いられる担体を適切に用いることができる：軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセリド、ポリオキシエチレン水添ヒマシ油６０、ショ糖、カルボキシメチルセルロース、トウモロコシデンプン、無機塩、等。組成物は他の低分子量ポリペプチド、タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、および免疫グロブリン、ならびにアミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、およびリジンを含むこともできる。組成物が注射用の水溶液として調製される場合、これは、例えば、生理的食塩水、ブドウ糖、ならびに例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、および塩化ナトリウムを含む他の補助剤を含み、適切な可溶化剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコールおよびＰＥＧ）、および非イオン性洗剤（ポリソルベート８０およびＨＣＯ−５０）も含有することができる、等張溶液を含むことができる。
【００５８】
必要に応じて、本発明の抗体は、マイクロカプセル（ヒドロキシセルロース、ゼラチン、ポリメチルメタクリレート、等からなるマイクロカプセル）に封入し、コロイド状薬物送達系（リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）の成分としてもよい（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｏｓｌｏ  Ｅｄ．（１９８０）参照）。また、徐放性薬物の製造方法が知られ、これらを本発明の抗体に適用することができる（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２）；米国特許第３，７７３，９１９号；ＥＰ特許出願第５８，４８１号；Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６（１９８３）；ＥＰ：１３３，９８８）。
【００５９】
［抗体をエンコードする核酸分子］
本発明は、上述した抗体をエンコードする核酸配列をさらに提供する。
【００６０】
「核酸」の語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、ならびに糖、リン酸塩およびプリンまたはピリミジンのいずれかである塩基を含有するモノマー（ヌクレオチド）からなる、一本鎖または二本鎖型のいずれかの、そのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、その語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然発生ヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの既知のアナログを含有する核酸を含む。とくに指示のない限り、特定の核酸配列は、明示された配列のみならず、その保存的修飾変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列も暗に含む。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することにより達成することができる（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：５０８（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ，２６０：２６０５（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１（１９９４））。「核酸フラグメント」とは所定の核酸分子の断片である。ほとんどの生物にあるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は遺伝子材料であり、リボ核酸（ＲＮＡ）はＤＮＡ内に含まれる情報のタンパク質内への転送に関与する。「ヌクレオチド配列」の語は、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーであって、任意でＤＮＡまたはＲＮＡポリマー内に組み込むことができる合成、非天然または修飾ヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖であり得るＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを指す。「核酸」、「核酸分子」、「核酸フラグメント」、「核酸配列もしくはセグメント」、または「ポリヌクレオチド」の語はまた、遺伝子、遺伝子によりエンコードされるｃＤＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡと互換的に用いてもよい。
【００６１】
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」の語は本明細書では互換的に用いられる。
【００６２】
本発明は、単離または実質的に精製された核酸またはタンパク質組成物を含む。本発明の文脈では、「単離」もしくは「精製」ＤＮＡ分子または「単離」もしくは「精製」ポリペプチドとは、その天然環境から離れて存在し、従って天然の産物ではないＤＮＡ分子またはポリペプチドである。単離ＤＮＡ分子もしくはポリペプチドは精製型で存在し得、または非天然環境、例えばトランスジェニック宿主細胞中に存在し得る。例えば、「単離」もしくは「精製」核酸分子もしくはタンパク質、またはその生物学的活性部分は、他の細胞材料、もしくは組換え技術により生成される場合培養培地を実質的に含まず、または化学的に合成される場合化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。１つの実施形態では、「単離」核酸は、核酸が誘導される生物のゲノムＤＮＡにおいて核酸に天然に隣接する配列（すなわち、核酸の５'および３'端に位置する配列）を含まない。例えば、さまざまな実施形態では、単離核酸分子は、核酸が誘導される細胞のゲノムＤＮＡにおいて核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有することができる。細胞材料を実質的に含まないタンパク質としては、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量）未満の混在タンパク質を有するタンパク質またはポリペプチド製剤が挙げられる。本発明のタンパク質、またはその生物学的活性部分が組換え生成される場合、好適には培養培地は約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量）未満の化学的前駆体または対象のタンパク質ではない化学物質を含有する。開示されたヌクレオチド配列およびこれによりエンコードされるタンパク質または部分長タンパク質のフラグメントおよび変異体も本発明に含まれる。「フラグメント」または「部分」とは、全長または全長未満の、ポリペプチドもしくはタンパク質をエンコードするヌクレオチド配列、またはそのアミノ酸配列を意味する。
【００６３】
「天然発生」とは、人工的に生成されたものとは異なり、天然に見ることができる対象を表すのに用いられる。例えば、天然の供給源から単離することができ、研究室において人の手により意図的に修飾されていない生物（ウイルスを含む）に存在するタンパク質またはヌクレオチド配列は、天然発生である。
【００６４】
分子の「変異体」とは、天然分子の配列と実質的に類似した配列である。ヌクレオチド配列について、変異体は、遺伝子コードの縮重のため、天然タンパク質の同一のアミノ酸配列をエンコードする配列を含む。これらのような天然発生対立遺伝子変異体は、周知の分子生物学技術、例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術を用いて同定することができる。変異体ヌクレオチド配列は、例えば、部位特異的変異誘発を用いることにより生成される、天然タンパク質をエンコードするもの、およびアミノ酸置換を有するポリペプチドをエンコードするもののような合成誘導ヌクレオチド配列も含む。一般的には、本発明のヌクレオチド配列変異体は、天然（内因性）ヌクレオチド配列に対して少なくとも４０、５０、６０、７０％、例えば、好適には７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、一般的には少なくとも８０％、例えば、８１％〜８４％、少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列同一性を有するだろう。
【００６５】
特定の核酸配列の「保存的修飾変異」とは、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をエンコードする核酸配列、または核酸配列がアミノ酸配列をエンコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸がいずれかの所定のポリペプチドをエンコードする。例えば、コドンＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧはすべてアミノ酸アルギニンをエンコードする。よって、アルギニンがコドンにより特定されるすべての位置で、コドンは、エンコードされたタンパク質を変更することなく、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。こうした核酸変異は、「保存的修飾変異」の１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをエンコードする本明細書に記載されたすべての核酸配列は、とくに記述がある場合を除き、すべての考えられるサイレント変異も表す。当業者であれば、核酸中の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンである、ＡＴＧを除く）を標準的な技術により機能的に同一の分子をもたらすように修飾することができることを認識するだろう。従って、ポリペプチドをエンコードする核酸の各「サイレント変異」は記載された各配列中に暗示されている。
【００６６】
「組換えＤＮＡ分子」とは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）に記載されるような、ＤＮＡ配列をつなぎ合わせるのに用いられる組換えＤＮＡ技術および手順を用いてつなぎ合わされたＤＮＡ配列の組み合わせである。
【００６７】
「異種ＤＮＡ配列」、「外因性ＤＮＡセグメント」または「異種核酸」の語はそれぞれ、特定の宿主細胞に外来性の供給源に由来する、または同じ供給源に由来する場合、その原型から修飾された配列を指す。よって、宿主細胞中の異種遺伝子は、特定の宿主細胞に内因性であるが、修飾された遺伝子を含む。その語は、天然発生ＤＮＡ配列の非天然発生の複数のコピーも含む。よって、その語は、細胞に対して外来性もしくは異種である、または細胞と同種であるが、宿主細胞核酸内の要素が通常見られない位置にある、ＤＮＡセグメントを指す。外因性ＤＮＡセグメントは発現し、外因性ポリペプチドを生成する。
【００６８】
「同種」ＤＮＡ配列とは、導入される宿主細胞に天然に関連するＤＮＡ配列である。
【００６９】
「野生型」とは、いずれの既知の変異も含まない天然に見られる正常遺伝子、または生物を指す。
【００７０】
「ゲノム」とは、生物の完全遺伝子材料を指す。
【００７１】
「ベクター」は、とくに、自己伝播性または可動性であってもなくてもよく、細胞ゲノム内に組み込むまたは染色体外に存在させることのいずれかにより原核または真核宿主を形質転換することができる、二本鎖または一本鎖、線状または環状型のいずれかのプラスミド、コスミド、ファージまたはバイナリーベクター（例えば、複製起点を有する自己複製プラスミド）を含むように定義される。
【００７２】
「クローニングベクター」は一般的には、外来性ＤＮＡ配列をベクターの本質的な生物学的機能を失うことなく確定的に挿入することができる１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択に用いるのに適した１つのマーカー遺伝子を含有する。マーカー遺伝子は一般的には、テトラサイクリン耐性、ハイグロマイシン耐性またはアンピシリン耐性をもたらす遺伝子を含む。
【００７３】
「発現カセット」とは、本明細書において用いられる場合、終止シグナルに操作可能に連結された対象のヌクレオチド配列に操作可能に連結されたプロモーターを含む、適切な宿主細胞における特定のヌクレオチド配列の発現を配向することができるＤＮＡ配列を意味する。これは一般的にはヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も含む。コード領域は通常は対象のタンパク質についてコードするが、対象の機能性ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡまたは非翻訳ＲＮＡについて、センスまたはアンチセンス方向にコードし得る。対象のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、その成分の少なくとも１つがその他の成分の少なくとも１つに対して異種であることを意味する、キメラであってもよい。発現カセットはまた、天然発生であるが、異種発現に有用な組換え型で得られたものであってもよい。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞がいくつかの特定の外部刺激に曝露した場合のみ転写を開始する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。多細胞生物の場合、プロモーターは特定の組織もしくは臓器または発達段階にも特異的であり得る。
【００７４】
こうした発現カセットは、対象のヌクレオチド配列に連結された本発明の転写開始領域を含むだろう。こうした発現カセットは、対象の遺伝子の挿入を制御領域の転写制御下に置くための複数の制限部位を備える。発現カセットは選択可能なマーカー遺伝子をさらに含有してもよい。
【００７５】
「ＲＮＡ転写物」の語は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写から得られる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全相補的コピーである場合、これは一次転写物と称され、または一次転写物の後転写処理から誘導されるＲＮＡ配列であってもよく、これは成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）とは、イントロンを含まず、細胞によりタンパク質に翻訳することができるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに相補的であり、これから誘導される一本鎖または二本鎖ＤＮＡを指す。
【００７６】
「制御配列」および「適切な制御配列」とはそれぞれ、コード配列の上流（５'非コード配列）、その中、または下流（３'非コード配列）に位置し、関連コード配列の転写、ＲＮＡ処理もしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。制御配列としては、エンハンサー、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニレーションシグナル配列が挙げられる。それらは天然および合成配列ならびに合成および天然配列の組み合わせであり得る配列を含む。上記のように、「適切な制御配列」の語はプロモーターに限定されない。しかしながら、本発明において有用ないくつかの適切な制御配列としては、これらに限定されないが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発達特異的プロモーター、誘導性プロモーターおよびウイルスプロモーターが挙げられるだろう。
【００７７】
「５'非コード配列」とは、コード配列に対して５'（上流）に位置するヌクレオチド配列を指す。これは開始コドンの上流の完全に処理されたｍＲＮＡ中に存在し、ｍＲＮＡへの一次転写物の処理、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に影響を及ぼし得る（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３：２２５（１９９５））。
【００７８】
「３'非コード配列」とは、コード配列に対して３'（下流）に位置するヌクレオチド配列を指し、ｍＲＮＡ処理または遺伝子発現に影響を及ぼすことができる、ポリアデニレーションシグナル配列および制御シグナルをエンコードする他の配列を含む。ポリアデニレーションシグナルは通常はｍＲＮＡ前駆体の３'端へのポリアデニル酸路の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。
【００７９】
「翻訳リーダー配列」の語は、ＲＮＡに転写され、翻訳開始コドンの上流（５'）の完全処理ｍＲＮＡ中に存在する、プロモーターとコード配列との間の遺伝子のそのＤＮＡ配列部分を指す。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡへの一次転写物の処理、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に影響を及ぼし得る。
【００８０】
「成熟」タンパク質の語は、そのシグナルペプチドを含まない後翻訳処理ポリペプチドを指す。「前駆体」タンパク質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物を指す。「シグナルペプチド」とはポリペプチドのアミノ末端伸長部を指し、これはポリペプチドと合わせて翻訳され、前駆体ペプチドを形成し、これは分泌経路に入るのに必要である。「シグナル配列」の語は、シグナルペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を指す。
【００８１】
「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼおよび適切な転写に必要な他の因子の認識をもたらすことによりコード配列の発現を制御する、通常はそのコード配列に対して上流（５'）の、ヌクレオチド配列を指す。「プロモーター」は、ＴＡＴＡボックスおよび転写開始の部位を特定するのに役立つ他の配列からなる短いＤＮＡ配列である最小プロモーターを含み、これに発現の制御のため制御要素が付加される。「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することができる、最小プロモータープラス制御要素を含むヌクレオチド配列も指す。このタイプのプロモーター配列は近位およびより遠位の上流要素を含み、後者の要素はよくエンハンサーと称される。従って、「エンハンサー」とはプロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの本来の要素またはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を向上させるために挿入された異種要素であってもよい。プロモーターはその全体を天然遺伝子から誘導してもよく、天然に見られる異なるプロモーターから誘導される異なる要素で構成してもよく、またはさらに合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。プロモーターはまた、生理学的または発達条件に応じて転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列を含有してもよい。
【００８２】
「開始部位」とは転写配列の一部である第１ヌクレオチドを囲む位置であり、これはまた位置＋１として定義される。この部位に関して、遺伝子およびその制御領域のすべての他の配列に番号がつけられる。下流配列（すなわち、３'方向のさらなるタンパク質コード配列）はプラスとされ、上流配列（主に５'方向の制御領域）はマイナスとされる。
【００８３】
不活性である、または上流活性化の非存在下でプロモーター活性が大きく低減したプロモーター要素、とくにＴＡＴＡ要素は、「最小またはコアプロモーター」と称される。適切な転写因子の存在下、最小プロモーターは転写を可能にするように機能する。「最小またはコアプロモーター」はよって転写開始に必要なすべての基本要素、例えば、ＴＡＴＡボックスおよび／またはイニシエーターのみで構成される。
【００８４】
「構成的発現」とは、構成的または制御プロモーターを用いる発現を指す。「条件的」および「制御発現」とは、制御プロモーターにより制御された発現を指す。
【００８５】
「操作可能に連結」とは、単一の核酸フラグメント上の核酸配列の、一方の機能が他方により影響されるような関連を指す。例えば、制御ＤＮＡ配列はＲＮＡまたはポリペプチドについてコードするＤＮＡ配列に、２つの配列を制御ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響を及ぼす（すなわち、コード配列または機能性ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）ように位置させた場合、「操作可能に連結」または「関連」しているといわれる。コード配列はセンスまたはアンチセンス方向で制御配列に操作可能に連結することができる。
【００８６】
「発現」とは、内因性遺伝子、導入遺伝子の細胞における転写および／または翻訳、ならびにセンス（ｍＲＮＡ）または機能性ＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。アンチセンス構築物の場合、発現はアンチセンスＤＮＡの転写のみを指し得る。発現はタンパク質の産生も指し得る。
【００８７】
「転写終止フラグメント」とは、転写を終了することができる、ポリアデニレーションシグナル配列のような、１つ以上の制御シグナルを含有するヌクレオチド配列を指す。転写終止フラグメントの例は当技術分野に知られる。
【００８８】
「翻訳終止フラグメント」とは、翻訳を終了することができる、３つのフレームすべてにおける１つ以上の終止コドンのような、１つ以上の制御シグナルを含有するヌクレオチド配列を指す。コード配列の５'端の開始コドンに隣接した、またはその近くへの翻訳終止フラグメントの挿入は、翻訳または適切な翻訳をもたらさないだろう。部位特異的組換えによる翻訳終止フラグメントの切除は、コード配列中に開始コドンを用いる適切な翻訳に干渉しない部位特異的配列を残すだろう。
【００８９】
「シス作用性配列」および「シス作用性要素」の語は、その機能がそれらが同じ分子上にあることを必要とするＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。
【００９０】
「トランス作用性配列」および「トランス作用性要素」の語は、その機能がそれらが同じ分子上にあることを必要としないＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。
【００９１】
下記の用語は、２つ以上の核酸またはポリヌクレオチド間の配列関係を表すのに用いられる：（ａ）「参照配列」；（ｂ）「比較ウィンドウ」；（ｃ）「配列同一性」；（ｄ）「配列同一性の割合」；および（ｅ）「実質的な同一性」。
【００９２】
（ａ）本明細書において用いられる場合、「参照配列」とは、配列比較の基準として用いられる定義された配列である。参照配列は、特定の配列のサブセットまたは全体；例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列であってもよい。
【００９３】
（ｂ）本明細書において用いられる場合、「比較ウィンドウ」とはポリヌクレオチド配列の連続した特定のセグメントを指し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列は２つの配列の最適なアラインメントのため、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。一般的には、比較ウィンドウは少なくとも２０個の連続したヌクレオチドの長さであり、任意で３０個、４０個、５０個、１００個以上とすることができる。当業者であれば、ポリヌクレオチド配列中にギャップを含むことによる参照配列との高い類似性を回避するため、ギャップペナルティが一般的には導入され、マッチの数から引かれることを理解する。
【００９４】
比較のための配列のアラインメントの方法は当技術分野において周知である。よって、いずれかの２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。こうした数学的アルゴリズムの非限定的な例としては、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１（１９８８）のアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）の局所ホモロジーアルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，ＪＭＢ，４８：４４３（１９７０）のホモロジーアラインメントアルゴリズム；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法；Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ, ９０：５８７３（１９９３）において修正されたＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４（１９９０）のアルゴリズムがある。
【００９５】
配列同一性を決定するための配列比較には、これらの数学的アルゴリズムのコンピュータ実装を用いることができる。こうした実装としては、これらに限定されないが、ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州マウンテンビューから市販）；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８のＡＬＩＧＮプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡから市販）が挙げられる。これらのプログラムを用いるアラインメントは、デフォルトパラメーターを用いて行うことができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムについてはＨｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７３：２３７（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：１０８８１（１９８８）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＡＢＩＯＳ，８：１５５（１９９２）；およびＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４：３０７（１９９４）によりよく記載されている。ＡＬＩＧＮプログラムはＭｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ、同上のアルゴリズムに基づく。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２１５：４０３（１９９０）；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９（１９９０）のＢＬＡＳＴプログラムはＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ、同上のアルゴリズムに基づく。
【００９６】
ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（ワールドワイドウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインさせた場合いくらかの正の値の閾値スコアＴと一致する、またはこれを満たす、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを含む。Ｔは近傍ワードスコア閾値と称される。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するシードとして作用する。ワードヒットは次に、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（マッチ残基対の報酬スコア：常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基のペナルティスコア：常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列について、累積スコアを計算するにはスコアリングマトリックスが用いられる。各方向のワードヒットの延長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値からＸ低下した場合、累積スコアが１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの累積のため０以下になった場合、またはいずれかの配列の端に到達した場合停止される。
【００９７】
配列同一性パーセントの計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計分析も行う。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりもたらされる類似性の１つの尺度は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間にマッチが偶然に起こる確率を示す。例えば、試験核酸配列は、試験核酸配列の参照核酸配列に対する比較における最小合計確率が約０．１未満、より好適には約０．０１未満、もっとも好適には約０．００１未満である場合、参照配列に類似するとみなされる。
【００９８】
比較を目的としてギャップアラインメントを得るため、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９（１９９７）に記載されるようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０）を用いることができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０）を用い、分子間の遠位関係を検出する反復検索を行うことができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、同上を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いる場合、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列にはＢＬＡＳＴＮ、タンパク質にはＢＬＡＳＴＸ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列）はデフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いる。ワールドワイドウェブｎｃｂｉ．ｎ１ｍｉｒｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。アラインメントはまた目視検査により手動で行ってもよい。
【００９９】
本発明の目的のため、本明細書において開示されたプロモーター配列に対する配列同一性パーセントの決定のためのヌクレオチド配列の比較は、好適には、そのデフォルトパラメーターでＢｌａｓｔＮプログラム（１．４．７バージョン以降）またはいずれかの同等のプログラムを用いて行われる。「同等のプログラム」とは、いずれかの問題の２つの配列について、好適なプログラムにより生成された対応するアラインメントと比較された場合、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基マッチおよび同一の配列同一性パーセントを有するアラインメントを生成するいずれかの配列比較プログラムを意図する。
【０１００】
（ｃ）本明細書において用いられる場合、２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈の「配列同一性」または「同一性」とは、配列比較アルゴリズムまたは目視検査により測定される、特定の比較ウィンドウにわたり最大一致のためにアラインされた場合同じである、２つの配列中の残基の特定の割合を指す。配列同一性の割合がタンパク質に関して用いられる場合、同一ではない残基位置は、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換され、従って分子の機能的特性を変化させない、保存的アミノ酸置換により異なることが多いことが認識される。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは置換の保存的性質を修正するように上方調節してもよい。こうした保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するといわれる。この調節を行うための手段は当業者に周知である。一般的には、これは保存的置換を完全ではなく部分ミスマッチとしてスコアリングし、これにより配列同一性パーセントを増加させることを含む。よって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換に０のスコアが与えられる場合、保存的置換には０〜１のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州マウンテンビュー)で実行されるように計算される。
【０１０１】
（ｄ）本明細書において用いられる場合、「配列同一性の割合」とは、比較ウィンドウにわたり最適にアラインされた２つの配列を比較することにより決定された値を意味し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は２つ配列の最適なアラインメントのため、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。割合は、両配列中に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定し、マッチした位置の数を求め、マッチした位置の数を比較のウィンドウ中の位置の総数で割り、結果に１００を掛け、配列同一性の割合を求めることにより計算される。
【０１０２】
（ｅ）（ｉ）ポリヌクレオチド配列の「実質的な同一性」の語は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメーターを用いる記載されたアラインメントプログラムの１つを用いて参照配列と比較し、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、または７９％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、および少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者であれば、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム配置、等を考慮することにより、これらの値を適切に調節し、２つのヌクレオチド配列によりエンコードされるタンパク質の対応する同一性を決定することができることを認識するだろう。これらの目的のためのアミノ酸配列の実質的な同一性は通常は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、９０％、少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【０１０３】
ヌクレオチド配列が実質的に同一であるということの別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下（以下参照）で互いにハイブリダイズする場合である。一般的には、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。しかしながら、ストリンジェントな条件は、本明細書においてとくに限定されるストリンジェンシーの所望の程度に応じて、約１℃〜約２０℃の範囲内の温度を含む。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがエンコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、まだ実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝子コードにより可能になる最大コドン縮重を用いて作製される場合起こり得る。２つの核酸配列が実質的に同一であるということの１つの指標は、第１核酸によりエンコードされるポリペプチドが第２核酸によりエンコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性である場合である。
【０１０４】
（ｅ）（ｉｉ）ペプチドの文脈の「実質的な同一性」の語は、ペプチドが、特定の比較ウィンドウにわたり参照配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、または７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、または９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する配列を含むことを示す。最適なアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジーアラインメントアルゴリズムを用いて行われる。２つのペプチド配列が実質的に同一であるということの指標は、１つのペプチドが第２ペプチドに対して作製された抗体と免疫学的に反応性であることである。よって、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、１つのペプチドは第２ペプチドと実質的に同一である。
【０１０５】
配列比較のため、一般的には１つの配列は試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列はコンピュータに入力され、サブ配列座標が必要に応じて指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。配列比較アルゴリズムは次に、指定されたプログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【０１０６】
上記のように、２つの核酸配列が実質的に同一であるということの別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。「〜に特異的にハイブリダイズする」の句は、その配列が複合体混合物（例えば、総細胞ＤＮＡまたはＲＮＡ）中に存在する場合、ストリンジェントな条件下での特定のヌクレオチド配列のみとの分子の結合、デュプレキシング、またはハイブリダイゼーションを指す。「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的ハイブリダイゼーションを指し、標的核酸配列の所望の検出を達成するため、ハイブリダイゼーション培地のストリンジェンシーを低減することにより対応することができるわずかなミスマッチを含む。
【０１０７】
サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションのような核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈の「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、異なる環境パラメーター下では異なる。より長い配列はより高温で特異的にハイブリダイズする。熱融点（Ｔｍ）とは、標的配列の５０％が完全マッチプローブにハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度およびｐＨ下）である。特異性は一般的にはポストハイブリダイゼーション洗浄の機能であり、重要な因子は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、Ｔｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｈｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：２６７（１９８４）の式：Ｔｍ８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから概算することができ、式中、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの割合であり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔｍはミスマッチ１％毎に約１℃低減され；よって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするように調節することができる。例えば、＞９０％の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍは１０℃低下させることができる。一般的には、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで特定の配列およびその補体のＴｍより約５℃低くなるように選択される。しかしながら、高度にストリンジェントな条件はＴｍより１、２、３、または４℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を用いることができ；中程度にストリンジェントな条件はＴｍより６、７、８、９、または１０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を用いることができ；低ストリンジェンシー条件はＴｍより１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を用いることができる。式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望の温度を用い、当業者であれば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変動は本質的に記載されていることを理解するだろう。所望のミスマッチの程度が４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満の温度をもたらす場合、より高温を用いることができるようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションの広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）に見られる。一��的には、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで特定の配列のＴｍより約５℃低くなるように選択される。
【０１０８】
高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、７２℃で約１５分間の０．１５ＭのＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃で１５分間の０．２倍ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液についてはＳａｍｂｒｏｏｋ、下記参照）。高ストリンジェンシー洗浄は、バックグラウンドプローブシグナルを除去するため、低ストリンジェンシー洗浄より好まれることが多い。例えば、１００個より多いヌクレオチドの、デュプレックスの中程度ストリンジェンシー洗浄の例は、４５℃で１５分間の１倍ＳＳＣである。例えば、１００個より多いヌクレオチドの、デュプレックスの低ストリンジェンシー洗浄の例は、４０℃で１５分間の４〜６倍ＳＳＣである。短いプローブ（例えば、約１０〜５０個のヌクレオチド）について、ストリンジェントな条件は一般的には約１．５Ｍ未満、より好適には約０．０１〜１．０Ｍの塩濃度、ｐＨ７．０〜８．３のＮａイオン濃度（または他の塩）を含み、温度は一般的には少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、＞５０個のヌクレオチド）について少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまたホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成してもよい。一般的には、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける非関連プローブについて見られるものの２倍（以上）のシグナルノイズ比は、特定のハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがエンコードするタンパク質が実質的に同一である場合、まだ実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝子コードにより可能になる最大コドン縮重を用いて作製される場合起こる。
【０１０９】
非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍと等しくなるように選択される。サザンまたはノーザンブロットにおけるフィルター上に１００個より多い相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件の例は、５０％のホルムアミド、例えば、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中３７℃でのハイブリダイゼーション、および０．１倍ＳＳＣ中６０〜６５℃での洗浄である。例となる低ストリンジェンシー条件としては、３０〜３５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液中３７℃でのハイブリダイゼーション、および１倍〜２倍ＳＳＣ（２０倍ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中５０〜５５℃での洗浄がある。例となる中程度ストリンジェンシー条件としては、４０〜４５％のホルムアミド、１．０ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中３７℃でのハイブリダイゼーション、および０．５倍〜１倍ＳＳＣ中５５〜６０℃での洗浄がある。
【０１１０】
「変異体」ポリペプチドとは、１つ以上のアミノ酸の欠失（いわゆるトランケーション）もしくは天然タンパク質のＮ末端および／もしくはＣ末端への付加；天然タンパク質中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失もしくは付加；または天然タンパク質中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の置換により、天然タンパク質から誘導されるポリペプチドを意図する。こうした変異体は、例えば、多型遺伝子から、または人工操作からもたらされ得る。こうした操作の方法は一般的には当技術分野において知られている。
【０１１１】
よって、本発明のポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、トランケーション、および挿入を含むさまざまな方法で修飾することができる。こうした操作の方法は当技術分野において一般的に知られている。例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡにおける変異により調製することができる。変異誘発およびヌクレオチド配列変更の方法は当技術分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：３６７（１９８７）；米国特許第４，８７３，１９２号；Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（１９８３）、およびそれらの中で引用される参考文献を参照されたい。対象のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換についてのガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．１９７８）のモデルにおいて見ることができる。１つのアミノ酸を類似の特性を有する別アミノ酸で交換するような、保存的置換が好ましい。
【０１１２】
よって、本発明の遺伝子およびヌクレオチド配列は、天然発生配列および変異型の両方を含む。同様に、本発明のポリペプチドは、天然発生タンパク質ならびにその変異および修飾型を含む。こうした変異体は所望の活性を持ち続けるだろう。本明細書に含まれるポリペプチド配列の欠失、挿入、および置換は、ポリペプチドの特性に急激な変化はもたらさないと考えられる。しかしながら、置換、欠失、または挿入の正確な効果をこれを行う前に予測するのが難しい場合、当業者であれば、効果は通常のスクリーニングアッセイにより評価されることを理解するだろう。
【０１１３】
エンコードされた配列において単一のアミノ酸または小さな割合のアミノ酸（一般的には５％未満、より一般的には１％未満）を変更、付加または欠失する個別の置換、欠失または付加は、変更がアミノ酸の化学的に類似したアミノ酸との置換をもたらす「保存的修飾変異」である。機能的に類似したアミノ酸を示す保存的置換表は当技術分野において周知である。下記の５つの群はそれぞれ互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：脂肪族：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性：アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。また、エンコードされた配列において単一のアミノ酸または小さな割合のアミノ酸を変更、付加または欠失する個別の置換、欠失または付加も「保存的修飾変異」である。
【０１１４】
「形質転換」の語は、遺伝子的に安定な遺伝をもたらす、宿主細胞のゲノム内への核酸フラグメントの導入を指す。形質転換核酸フラグメントを含有する宿主細胞は「トランスジェニック」細胞と称され、トランスジェニック細胞を含む生物は「トランスジェニック生物」と称される。
【０１１５】
「形質転換」、「トランスジェニック」、および「組換え」とは、異種核酸分子が導入された宿主細胞または生物を指す。核酸分子は、当技術分野において一般的に知られるゲノム内に安定に組み込むことができ、これはＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ、同上において開示される。Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｇｅｌｆａｎｄ，ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；およびＩｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）も参照されたい。ＰＣＲの既知の方法としては、これらに限定されないが、対プライマー、ネステッドプライマー、単一特異性プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマー、等を用いる方法が挙げられる。例えば、「形質転換」、「形質転換体」、および「トランスジェニック」細胞は形質転換プロセスを経ており、それらの染色体内に組み込まれた外来性遺伝子を含有する。「非形質転換」の語は、形質転換プロセスを経ていない正常細胞を指す。
【０１１６】
「トランスジェニック」生物とは、発現ベクターを含有する１つ以上の細胞を有する生物である。
【０１１７】
本発明の核酸分子、配列またはセグメントに関する「部分」または「フラグメント」とは、発現のため他の配列と連結される場合、少なくとも８０個のヌクレオチド、より好適には少なくとも１５０個のヌクレオチド、さらにより好適には少なくとも４００個のヌクレオチドを有する配列を意味する。発現に用いられない場合、「部分」または「フラグメント」は、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列に対応する、少なくとも９個、好適には１２個、より好適には１５個、さらにより好適には少なくとも２０個の連続したヌクレオチド、例えば、プローブおよびプライマー（オリゴヌクレオチド）を意味する。
【０１１８】
本明細書において用いられる場合、「治療薬」の語は、哺乳類レシピエントに対して有益な効果を有するいずれかの薬剤または材料を指す。よって、「治療薬」は、核酸またはタンパク質成分を有する治療および予防分子の両方を含む。
【０１１９】
「治療する」とは、本明細書において用いられる場合、所定の疾患または病状の少なくとも１つの症状を改善、治癒および／またはその発症を予防することを指す。
【０１２０】
［製剤および投与方法］
インビボ使用のため、本明細書に記載される治療薬は、一般的には投与前に医薬組成物中に組み込まれる。こうした組成物中、本明細書に記載される１つ以上の治療化合物は活性成分として存在する（すなわち、代表的なアッセイを用いて測定されるように、嚢胞性線維症の症状に対して統計的に有意な効果をもたらすのに十分な濃度で存在する）。医薬組成物は１つ以上のこうした化合物を、特定の投与様式に適していることが当業者に知られるいずれかの医薬的に許容可能な担体と組み合わせて含む。加えて、他の医薬的に活性な成分（他の治療薬を含む）が組成物中に、存在しなくてもよいが、存在してもよい。
【０１２１】
「治療に効果的な量」の語は、病態／病状の治療に関して、単回用量としてまたは複数回用量で投与される場合、病態／病状のいずれかの症状、態様、または特徴に対していずれかの検出可能なプラスの効果を有することができる、単独のまたは医薬組成物に含まれる化合物の量を指す。こうした効果は絶対に有益でなくてもよい。
【０１２２】
「治療する」および「治療」の語は、本明細書において用いられる場合、化合物をいずれかの症状を予防するため病態／病状の臨床症状の発症前に投与すること、および化合物を病態／病状のいずれかの症状、態様または特徴を軽減または除去するため病態／病状の臨床症状の発症後に投与することを含む。こうした治療は絶対に有用でなくてもよい。
【０１２３】
特定の実施形態では、本治療薬は、不活性希釈剤または吸収性食用担体のような医薬的に許容可能な担体と組み合わせて、全身投与、例えば、経口投与してもよい。それらは硬質または軟質シェルゼラチンカプセルに封入してもよく、錠剤に圧縮してもよく、または患者の食事の食物に直接混ぜ込んでもよい。経口治療投与のため、活性化合物は１つ以上の賦形剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハース、等の剤形で用いてもよい。こうした組成物および製剤は少なくとも０．１％の活性化合物を含有すべきである。組成物および製剤の割合はもちろん変えてもよく、好都合には所定の単位剤形の重量の約２〜約６０％であってもよい。こうした治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は効果的な投与量レベルが得られるようなものである。
【０１２４】
錠剤、トローチ、丸剤、カプセル、等はまた下記：トラガカントゴム、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸等のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；およびショ糖、果糖、乳糖もしくはアスパルテームのような甘味剤を含有してもく、またはペパーミント、ウィンターグリーンの油、もしくはチェリーフレーバーのような香味剤を添加してもよい。単位剤形がカプセルである場合、これは上記タイプの材料に加えて、植物油またはポリエチレングリコールのような液体担体を含有してもよい。さまざまな他の材料がコーティングとして、または固体単位剤形の物理的形状を修飾するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルは、ゼラチン、ワックス、シェラックまたは糖等でコーティングしてもよい。シロップまたはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてショ糖または果糖、防腐剤としてメチルおよびプロピルパラベン、色素、ならびにチェリーまたはオレンジフレーバーのような香料を含有してもよい。もちろん、いずれの単位剤形を調製するのにも用いられるいずれの材料も、用いられる量で医薬的に許容可能であり、実質的に非毒性であるべきである。また、活性化合物は徐放性製剤およびデバイス中に組み込んでもよい。
【０１２５】
活性化合物は注入また注射により静脈内または腹腔内投与してもよい。活性化合物またはその塩の溶液は水で調製し、任意で非毒性界面活性剤と混合してもよい。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびこれらの混合物、ならびに油で分散液を調製することもできる。通常の貯蔵および使用条件下、これらの製剤は微生物の増殖を防止するため防腐剤を含有する。
【０１２６】
注射または注入に適した医薬剤形としては、任意でリポソームに封入した、無菌注射可能または注入可能溶液または分散液の即座の調製に適合した活性成分を含む、無菌水溶液もしくは分散液または無菌粉末を挙げることができる。すべての場合において、最終的な剤形は、製造および貯蔵条件下で無菌、流体および安定であるべきである。液体担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、等）、植物油、非毒性グリセリルエステル、およびこれらの適切な混合物を含む、溶媒または液体分散媒体とすることができる。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成により、分散液の場合必要な粒子サイズの維持により、または界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の活動の防止は、さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、等によりもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、緩衝液または塩化ナトリウムを含むことが好ましいだろう。注射可能組成物の持続的吸収は、組成物における吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらすことができる。
【０１２７】
無菌注射可能溶液は、活性化合物を必要な量で適切な溶媒中に、必要に応じて上に挙げたさまざまな他の成分とともに組み込んた後、滅菌濾過を行うことにより調製される。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、好適な調製方法は、前述の滅菌濾過した溶液中に存在する活性成分プラスいずれかの追加の所望な成分の粉末を生成する、真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１２８】
局所投与について、本化合物は純粋形、すなわち、それらが液体である状態で塗布してもよい。しかしながら、一般的には、それらを組成物または製剤として、固体または液体であってもよい、皮膚科学的に許容可能な担体と組み合わせて皮膚に投与することが望ましいだろう。
【０１２９】
有用な固体担体としては、タルク、クレー、微結晶セルロース、シリカ、アルミナ等のような微粉固体が挙げられる。有用な液体担体としては、水、アルコールもしくはグリコールまたは水−アルコール／グリコールブレンドが挙げられ、これに本化合物を効果的な濃度で、任意で非毒性界面活性剤の補助によって、溶解または分散させることができる。香料のような補助剤および追加の抗細菌剤を添加し、所定の用途のための特性を最適化することができる。得られた液体組成物は、吸収パッドから塗布する、包帯および他の創被覆材にしみ込ませるのに用いる、またはポンプ式もしくはエアロゾルスプレーを用いて患部に吹き付けることができる。
【０１３０】
合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪族アルコール、修飾セルロースまたは修飾鉱物材料のような増粘剤を液体担体とともに用い、使用者の皮膚に直接適用するための広げることができるペースト、ゲル、軟膏、石鹸、等を形成することもできる。
【０１３１】
本発明の化合物を皮膚に送達するのに用いることができる有用な皮膚科学的組成物の例は当技術分野に知られ；例えば、Ｊａｃｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第４，６０８，３９２号）、Ｇｅｒｉａ（米国特許第４，９９２，４７８号）、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第４，５５９，１５７号）およびＷｏｒｔｚｍａｎ（米国特許第４，８２０，５０８号）を参照されたい。
【０１３２】
本発明の化合物の有用な投与量は、それらのインビトロ活性、および動物モデルにおけるインビボ活性を比較することにより決定することができる。マウス、および他の動物からヒトまでにおける効果的な投与量の外挿方法は当技術分野に知られ；例えば、米国特許第４，９３８，９４９号を参照されたい。    
【０１３３】
一般的には、ローションのような液体組成物中の本発明の化合物の濃度は、約０．１〜２５ｗｔ％、好適には約０．５〜１０ｗｔ％であるだろう。ゲルまたは粉末のような半固体または固体組成物中の濃度は、約０．１〜５ｗｔ％、好適には約０．５〜２．５ｗｔ％であるだろう。
【０１３４】
化合物、またはその活性塩もしくは誘導体の、治療に用いるのに必要な量は、選択される特定の塩だけでなく、投与の経路、治療する病状の性質ならびに患者の年齢および状態にも応じて変わり、最終的には担当医または臨床医の裁量によるだろう。
【０１３５】
一般的には、しかしながら、適切な用量は、１日当たり体重の約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１０〜約７５ｍｇ／ｋｇの範囲内、例えば１日当たりレシピエントの体重１キログラム当たり３〜約５０ｍｇ、好適には６〜９０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内、もっとも好適には１５〜６０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内であるだろう。
【０１３６】
化合物は好都合には、例えば、単位剤形当たり５〜１０００ｍｇ、好都合には１０〜７５０ｍｇ、もっとも好都合には５０〜５００ｍｇの活性成分を含有する単位剤形で投与される。
【０１３７】
理想的には、活性成分は、約０．５〜約７５μＭ、好適には約１〜５０μＭ、もっとも好適には約２〜約３０μＭの活性化合物のピーク血漿濃度を達成するように投与されるべきである。これは、例えば、任意で生理的食塩水中の、活性成分の０．０５〜５％溶液の静脈注射により達成してもよく、または約１〜１００ｍｇの活性成分を含有する巨丸剤として経口投与してもよい。所望の血中濃度は、約０．０１〜５．０ｍｇ／ｋｇ／時間の活性成分をもたらす連続注入または約０．４〜１５ｍｇ／ｋｇの活性成分を含有する間欠注入により維持してもよい。
【０１３８】
所望の用量は好都合には、単回用量でまたは適切な間隔で投与される分割用量として、例えば、１日当たり２回、３回、４回以上の部分用量として提供してもよい。部分用量自体を、例えば、注入器からの複数回の吸入または複数滴の点眼のような、多数の別々の緩く間隔をあけた投与に、さらに分割してもよい。
【実施例】
【０１３９】
［実施例１］
ＡＰＰの変異型を過剰発現し、神経病理学的Ａβ斑を発生させ、Ａβで免疫化するとこれらの斑の沈着の遅延およびさらには除去を示す、トランスジェニックマウスが開発された。これらの結果を展開し、Ａβ沈着に対する同じ保護を、Ａβに対して作製された抗体がマウスに周期的に注射された、受動免疫化によっても達成することができたことが示された（Ｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。これらの研究は、注意深く設計された受動免疫化アプローチを用い、除去と炎症との間の微妙なバランスを制御しながら、ヒトにおけるＡβを除去することができる可能性を高める。抗体媒介ファゴサイトーシスをどのようにＡＤの治療により効果的に用いることができるかを理解するため、以下は抗体媒介補体反応系の重要な成分のいくつかの簡単な概要である。
【０１４０】
補体系は、抗原除去を促進および増幅する産物を生成する高度に組織化された一連の酵素反応において相互作用する、２０を超える異なるタンパク質で構成される。補体系は２つの異なる経路、古典的または代替経路により活性化することができ、その両方は最終的には同じ複合体を活性化する。古典的経路は抗体結合により開始され、代替経路は一般的には外来性細胞表面成分により開始される。古典的経路は従ってＡβの抗体媒介除去における対象の経路である。古典的経路は抗体−抗原複合体の形成により開始される。ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３を含む特定の抗体は、抗原結合後、古典的補体反応を活性化することができる。これらの抗体がそれらの標的抗原に結合した場合、得られた複合体は抗体Ｆｃ領域におけるコンホメーションの変化を誘発する。Ｆｃ領域におけるコンホメーションの変化は、古典的補体系の第１成分、高分子タンパク質複合体Ｃ１の結合部位を露出する。Ｃ１は血清中に１つのＣ１ｑ分子ならびにそれぞれ２つのＣ１ｒおよびＣ１ｓ分子を含有する複合体として存在する。安定な複合体を形成するには一般的には２つのＣ１−抗体相互作用が必要である。ＩｇＧはＣ１ｑの結合部位を１つしか有さないため、補体活性化には３０〜４０ｎｍの距離内で抗原表面上に結合した２つのＩｇＧ分子が必要である。ＩｇＭは、しかしながら、抗原に結合すると五量体構造を適合することができ、従ってＩｇＭの単一分子はＣ１に安定に結合し、補体反応を開始することができる。可溶性または凝集Ａβ沈着物のいずれかを貧食するため、抗体は、抗体のＦｃ部分上のＣ１ｑ結合部位を露出する表面に結合しなければならない。２つのＣ１ｑ結合部位は安定な抗体−Ｃ１複合体を形成するのに十分に近接して位置しなければならないが、これはその後抗原表面に結合したＣ３ｂおよびＣ５ｂで終わる補体反応カスケードを開始する。食細胞は次にＣＲ１受容体によってＣ３ｂに結合し、ファゴサイトーシスを開始し、Ｃ３ｂｉも形成するが、これはその後ＣＲ３受容体に結合し、ファゴサイトーシスをさらに促進する。
【０１４１】
モノクローナル抗体製剤は、安定な抗体Ｃ１複合体の形成が２つの隣接するＦｃ部位を必要とするため、Ａβ、とくに可溶性Ａβを除去するのに問題を有し得る。異なる機構による抗体除去を活性化することができる、可溶性および凝集Ａβの両方に対する二重特異性組換え抗体を作製する。本発明者らは、補体反応カスケードの異なる成分に配向されたｓｃＦｖフラグメントを開発した。１つのｓｃＦｖフラグメントは除去を開始するようにＣ１ｑに結合する。鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）に結合するｓｃＦｖおよびＣ１ｑに結合するｓｃＦｖを含有するダイアボディ構築物は、ＨＥＬで覆われた赤血球のファゴサイトーシスを促進することが示された。第２ｓｃＦｖフラグメントは血清Ｉｇに結合し、ＩｇＭおよびＩｇＧの両方に結合する。血清Ｉｇに結合するｓｃＦｖとともにＨＥＬを標的とするｓｃＦｖを含有するダイアボディ構築物も、ＨＥＬで覆われた赤血球のファゴサイトーシスを促進した。また、白血球における炎症または食細胞反応を活性化する異なる受容体（抗ＣＤ１６および抗ＣＤ６４）に結合するｓｃＦｖは、機能的に関連したミクログリア細胞との反応を誘発するのに利用可能である。さらに、ミクログリア細胞を直接活性化する新規ｓｃＦｖを単離する。エクスビボアッセイはマウスにおけるＡβ沈着物のインビボ除去を予測できる（Ｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２０００）ので、Ａβの異なる形態を標的とし、異なる除去機構を活性化する二重特異性抗体のさまざまな組み合わせをスクリーニングする方法としてエクスビボアッセイを用いる。
【０１４２】
（ＡＰＰ２３／Ｃ１ｑ−／−マウスの作製）
アルツハイマーマウスモデル、ＡＰＰ２３は、Ａβを過剰生成し、顕著なアミロイド沈着物を発生させる。ＥＬＩＳＡおよびＡβレベルの免疫沈降ブロットにより、ＡＰＰ２３マウスからの脳ホモジネートを分析した。サンドイッチＥＬＩＳＡを用い、ＡＰＰマウスにおける加齢に伴うＡβレベルの増加を観察した（図１Ａおよび１Ｂ）。さらに、尿素ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルを用いることにより、Ａβ４０およびＡβ４２を可視化した。手短に、マウス脳ホモジネートをギ酸緩衝液に溶解し、ウサギ抗Ａβポリクローナル抗体で免疫沈降させ、試料を１２％尿素ゲル上に分離した。６Ｅ１０抗体によりＡβ４０およびＡβ４２を検出した。ＡＰＰ２３マウスをＣ１ｑが枯渇した（Ｃ１ｑ−／−）マウスと交配させ、ＡＰＰ２３／Ｃ１ｑ−／−マウスを作製した。
【０１４３】
（ＡβＣ１ｑダイアボディの構築）
Ａβをインビボで除去する治療薬を開発するため、可溶性および原線維Ａβの両方に結合するｓｃＦｖフラグメントを、補体カスケードの異なる成分を活性化、白血球上の異なる受容体に結合、またはミクログリア細胞を直接活性化するｓｃＦｖフラグメントと組み合わせる。各ｓｃＦｖは短いリンカー配列で単一のペプチドに連結された軽鎖および重鎖フラグメントで構成される。特定の実施形態では、ダイアボディは、長く柔軟な（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３リンカーを用いて２つのｓｃＦｖを直列に遺伝子的に連結することにより構築される。特定の実施形態では、ダイアボディは、金属イオン親和性クロマトグラフィーを用いる精製を促進するためポリ−Ｈｉｓテールも含有するように設計される。
【０１４４】
補体反応を活性化し、それらの標的化合物をファゴサイトーシスによって除去することがすでに示された、２つのｓｃＦｖダイアボディクローンが得られ、一方は血清免疫グロブリン、他方は補体成分Ｃ１ｑに結合する。本発明者らは、Ｈ１ｖ２−Ｃ１ｑ抗体を構築し、完全機能性二重特性ダイアボディタンパク質を精製した。他の実施形態では、Ａβ４２、オリゴマーおよび原線維Ａβに特異的なダイアボディ分子が構築される（実施例２）。加えて、両方とも食細胞による除去を活性化するＣＤ１６およびＣＤ６４に結合するｓｃＦｖが利用可能であり、両方とも二重特異性ダイアボディ構築物として腫瘍細胞を標的化および殺滅するのに効果的であることが示された（Ｃｕｒｎｏｗ  １９９７；ＭｃＣａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。
【０１４５】
β−アミロイドおよびＣ１ｑの両方に対するｓｃＦｖを含有するダイアボディを作製するため、本発明者らは、Ｃ１ｑに対するｓｃＦｖの下流のβ−アミロイドに対して単離されたＨ１ｖ２ｓｃＦｖ遺伝子をクローニングした。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドリンカーを用い、Ｈ１ｖ２のカルボキシル末端を抗Ｃ１ｑｓｃＦｖのアミノ酸末端に連結した。得られたダイアボディは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドリンカーにより連結された、２つのドメインを有する（図２）。ダイアボディ遺伝子はｌａｃプロモーターの制御下にあり、５’末端のｇＩＩＩシグナル配列とインフレームである。ダイアボディの検出および回収を促進するため、ｃ−ｍｙｃタグおよび（Ｈｉｓ）６タグを二重特異性ｓｃＦｖの３’末端のフレームに挿入した。ｇＩＩＩシグナル配列はポリペプチドを周辺質空間内に配向し、そこではこれを可溶性型に正しく折り畳むことができる。ｃ−ｍｙｃタグは二重特異性ｓｃＦｖの発現レベルを分析するのに用いられ、（Ｈｉｓ）６タグは二重特異性ｓｃＦｖタンパク質を精製するのに用いることができる。
【０１４６】
（タンパク質精製）
ＩＰＴＧでの誘発後、大腸菌培養の可溶性周辺質内容物をＩＭＡＣ（固定化金属親和性クロマトグラフィー）により精製した。５０ｍＭのイミダゾールを用いて溶出したピーク画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、１つの画分が、ダイアボディの予想サイズである、サイズ６０ｋＤａの単一の強いバンドを含有することを示した。この試料のｍｙｃタグ部位に対する二次抗体を用いるウエスタンブロット分析は、６０ｋＤの予想サイズを有する、単一の反応性バンドを示した。
【０１４７】
（精製二重特異性抗体フラグメントの抗原結合活性）
バイオセンサーチップ表面上に固定したＡβを用いるバイオセンサーサンドイッチアッセイを用い、ＡβおよびＣ１ｑ結合活性の両方が存在したことを示した。精製ダイアボディ試料の添加後、シグナルは、ダイアボディとＡβとの結合のため予想されるとおり約１００ＲＵ増加した（図３、フェーズ１）。非特異的に結合したダイアボディを解離するリンス工程後、第２抗原、Ｃ１ｑをチップ表面上に注射し、観察したシグナルにＣ１ｑとダイアボディとの結合に対応するさらに２００ＲＵの増加をもたらした（図３、フェーズ２）。これらの結果は、両方の結合活性がダイアボディ構築物において機能性であることを示す。
【０１４８】
（ミクログリア細胞を活性化する抗体の単離）
白血球を活性化するｓｃＦｖが利用可能であるが、ｓｃＦｖは類似の受容体、ほとんど特性解析されていない、ミクログリア細胞には結合しない場合があり得る。ｓｃＦｖが確実にミクログリア細胞を直接活性化できるようにするため、ファージディスプレイライブラリーをミクログリア細胞を活性化するメンバーについてパニングする。２つの異なるアプローチを用い、ミクログリア細胞を活性化するｓｃＦｖを単離することができる：第１はマイクロタイターウェルを用いる従来のバイオパニングに類似し、第２は細胞選別フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いるものである。
【０１４９】
第１アプローチでは、ミクログリア細胞を抗体ライブラリーからのアリコートとインキュベートする。非結合ファージは溶出し、結合したファージは他のバイオパニングプロトコルにおいて通常行われるように大腸菌での感染により回収する。この方法での数回のパニング後、単一抗体クローンをミクログリアの活性化についてアッセイされる。ミクログリア細胞を活性化するクローンはダイアボディ構築物においてエクスビボＡβ標的化および除去アッセイに用いる。
【０１５０】
あるいは、活性化ミクログリア細胞を直接単離し、結合したファージを回収することにより、ミクログリア細胞を活性化するファージを同定する。ＦＡＣＳを用い、細胞受容体部位に結合したファージディスプレイ抗体を含有する活性化ミクログリア細胞を選別する。具体的には、ミクログリア細胞はファージディスプレイ抗体とさまざまな時間培養し、その後非結合ファージを洗い流す。細胞を次に蛍光標識抗ファージ抗体で染色する。活性化ミクログリア細胞は休止細胞よりかなり大きいので、蛍光強度および前方散乱／サイズ散乱の両方に基づき活性化ミクログリア細胞を単離することができる。回収したｓｃＦｖフラグメントは、ミクログリア細胞を活性化する能力について試験した後、ダイアボディ構築物およびエクスビボアッセイに用いる。
【０１５１】
（ミクログリア細胞を用いるエクスビボＡβ除去アッセイ）
インビボ免疫化実験には時間がかかり、高額であるので、もっとも有望な抗体構築物を選択するアッセイは価値あるスクリーニングツールとなる。Ａβ除去のエクスビボアッセイは、インビボＡβ除去実験において得られる結果を確実に予測することが示された（Ｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。補体カスケードを開始するには互いに３０〜４０ｎｍ以内での２つの隣接するＦｃ領域の結合が必要であるため、特定の実施形態では、Ａβ分子の２つの異なる領域を認識するｓｃＦｖを含有する２つの異なるｓｃＦｖダイアボディが用いられる。しかしながら、Ａβは単独でＣ１ｑに結合することもできるので、特定の実施形態では、ｓｃＦｖの第２結合部位は除去を開始するのに十分である。特定の実施形態では、ＩｇＭおよびＩｇＧに結合することができるので、血清Ｉｇに配向されたｓｃＦｖは可溶性Ａβ単独の除去を開始する。ＩｇＭの１つの分子のみがＣ１ｑに結合し、安定な複合体を形成することができるので、特定の実施形態では、可溶性Ａβおよび血清Ｉｇを標的とする単一のダイアボディはファゴサイトーシスを開始する。
【０１５２】
ａ）ミクログリアの単離および特性解析
ミクログリア細胞をマウス脳組織から得、以前記載された方法に従って調製および単離する（Ｌｕｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。手短に、無菌条件下での解剖で前頭皮質試料を取り出し、素早く氷冷ハンクス平衡塩液（ＨＢＳＳ）（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カリフォルニア州）に浸漬する。酵素解離を他で記載されたように行う（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．１９８３）。試料をＨＢＳＳを数回取り替えながら洗浄し、その後すべての可視結合組織および血管を取り出す。組織を細かく刻み、２．５％トリプシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州）および２ｍｇ／ｍＬのデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州）を含むＣａ２＋およびＭｇ２＋フリーのＨＢＳＳ溶液でインキュベートした後、振盪水槽において３７℃で３０分間１５０ｒｐｍでインキュベートする。インキュベーション後、２ｍＬのウシ胎児血清を添加し、酵素消化を停止する。消化された試料を粉砕し、１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。ペレットを４０ｍＬのＨＢＳＳに再懸濁し、１３０μｍ、１００μｍおよび２００μｍメッシュを通して濾過する。濾液をその後１００％のパーコール（Ｓｉｇｍａ）中３０分間３℃で１５，０００ｒｐｍで回転させる。生細胞層（中間層）を５０ｍＬの遠心管に移し、ＨＢＳＳで２回洗浄する。３回目の洗浄を、高グルコース（２５ｍＭ）、２％のＨＥＰＥＳ、１％のピルビン酸ナトリウム、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および０．１％のゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなる増殖培地において行う。３回目の洗浄後、細胞を増殖培地に再懸濁し、ポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングした２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州）にウェル当たり約１．０×１０６細胞の密度で播種する。細胞を３７℃で５％のＣＯ２中１８〜２４時間増殖培地でインキュベートし、このときミクログリア細胞は培養器表面に接着する。非接着アストロサイトを除去する。ミクログリア細胞を次に増殖培地において、毎週培地を取り替えながら培養し、細胞を最初の播種の２週間後実験に用いる。
【０１５３】
ｂ）二重特異性抗体の処理での免疫蛍光ファーゴサイトーシスアッセイ
ミクログリア食細胞活性は、吸収されたフルオ−Ａβ４２（ともに作りたての凝集型）またはフルオレセイン標識大腸菌Ｋ−１２  ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ（フルオ−大腸菌）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、オレゴン州ユージーン）の蛍光を測定することにより定量化する。細胞を２４ウェルプレートにおいて培養する。モノマーまたはオリゴマーおよびフィブリルＡβ処理に対してさまざまな濃度の二重特異性抗体（１０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌおよび８００ｎｇ／ｍｌ）を用いて一般的な食細胞活性を決定するため、細胞をフルオ−大腸菌と２時間室温でインキュベートする。細胞からフルオ−大腸菌を除去した直後にトリパンブルーを添加し、細胞外プローブを消光する。プレートのウェルをＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２  １４２０マルチラベルカウンター（Ｗａｌｌａｃ、メリーランド州）により、４８０ｎｍの励起および５２０ｎｍの発光を用いて読む。データをＷａｌｌａｃＥｘｐｌｏｒｅを用いて分析する。Ａβの凝集の効果を測定するため、フルオ−ＡβをＤＭＳＯに溶解した後、血清フリー培地に希釈し、１時間室温で凝集させる。凝集Ａβを渦動させ、超音波処理した後、ミクログリア培養物に添加する。調整培地および細胞溶解物をＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２  １４２０マルチラベルカウンターにより測定する。
【０１５４】
（ｃ）免疫細胞化学アッセイ  ミクログリア細胞の免疫細胞化学アッセイを、ポリクローナル抗体Ｆｃ受容体ガンマ、およびポリクローナルＭＨＣＩＩで行う。細胞を４％のパラホルムアルデヒドで１５分間室温で固定し、ＰＢＳで３回洗浄した後、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中２％ＢＳＡ、２％ヤギ血清および０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で３０分間室温でブロックする。細胞を一次抗体と３日間４℃でインキュベートする。次に細胞をＰＢＳで３回リンスし、二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カリフォルニア州）と１時間室温でインキュベートする。ミクログリアによるＡβの吸収を検証するため、２セットの細胞を非標識Ａβ４２（Ｂａｃｈｅｍ、カリフォルニア州）とインキュベートする。細胞を抗Ａβ抗体（１：５００希釈、Ｎ末端１６〜２４）（Ｓｅｎｅｔｅｋ、ニューヨーク州）でブロットする前に、一方のセットの細胞には０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００での透過処理を行い、他方には行わない。視野当たり多数の細胞を観察するため、２５倍および１００倍対物レンズを備える蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ドイツ）を用いるだろう。
【０１５５】
（ＡＰＰ２３トランスジェニックマウスを用いるインビボアッセイ）
インビボアッセイ：Ａβの特定の形態の除去に配向されたダイアボディがＡＤのトランスジェニックマウスモデルにおいてアミロイド形成的ＡＰＰ処理を低減することができるかを決定する試験を行う。Ａβの除去および斑沈着の防止におけるダイアボディ構築物の有効性のインビボ検証として、ダイアボディをＡＤのトランスジェニックマウスモデルに腹腔内投与する。同様の方法を用いるＡβ毒性を低減するための手段としてのＡβ除去抗体の投与のインビボ有効性をさらに試験する。各処理群について１群当たり５匹の同じ性別のＰＳＡＰＰマウスを選択する。８週齢で開始し、ＰＳＡＰＰマウスに１、２、および３ヶ月間、１００μｇの適切なダイアボディを１０日に１回腹腔注射する。これらのダイアボディの初期試験用量（１μｇ〜１ｍｇ）は、ＰＳＡＰＰマウスにおいて抗体のＢＢＢ透過が起こることを確認するために試す。マウス脳を９Ｅ１０のような標識抗ｍｙｃ抗体を用いて染色し、腹腔注射されたダイアボディの透過を検出する。マウスは病理学の分析のため３ヶ月齢で屠殺する。Ａβまたは除去機構に対する活性を有さない対照ダイアボディも投与する。ＡＰＰ処理に対するダイアボディの効果を、脳における斑沈着の程度ならびにＡβ、Ｃ９９、およびＣ８３を含むさまざまなＡＰＰタンパク質分解産物のレベルを観察することにより評価する。
【０１５６】
［実施例２］
ＡβはＡＤの病因において重要な成分であると考えられている。可溶性Ａβの蓄積はＡＤの重症度に相関し、拡散斑形成をもたらし、ミクログリア細胞の活性化および炎症を含む一連の事象を引き起こすと考えられる。これらの事象の組み合わせは、神経機能不全、細胞死およびタウの誤処理をもたらし、ＡＤの他の主要な病理学的特徴、神経原繊維変化を引き起こすと考えられる。さらに、ＡＤの早期発症型家族性形態は、Ａβの産生および沈着において中心的な役割を果たすアミロイド前駆体タンパク質およびプレセニリン遺伝子における変異に関連する。小さな可溶性オリゴマーおよびプロトフィブリルを含む中間体Ａβ形態はＡＤに関与してきた。Ａβの可溶性オリゴマーは、細胞毒性であり、ＬＴＰおよび学習を含む神経機能を混乱させ、ＡＤの進行とより良く相関することが示され、ＡＤ脳において同定された。従って、Ａβの個別の形態を同定することができる、十分に定義された高度に特異性の試薬は、ＡＤを研究し、潜在的に治療するための価値あるツールである。本発明者らは、特定のタンパク質形態を同定し、同時に標的形態に結合するｓｃＦｖを単離するためＡＦＭを用いる新規技術を開発した。この技術を特定のＡβ形態に対するｓｃＦｖの単離に適用するには、まずさまざまなＡβ型のそれぞれの選択を補助するようにパニングプロトコルを改良する必要がある。
【０１５７】
（ｓｃＦｖでのＡβ凝集の阻害）
本発明者らは、全長Ａβの異なる領域に対するｓｃＦｖを単離し、ｓｃＦｖがＡβの凝集および毒性を成功裏に阻害することができることを示した。本発明者らは、さまざまなＡβペプチドをバイオセンサー表面に固定し、結合について試験することにより、Ａβに対する２つのｓｃＦｖを特性解析し、それらの結合エピトープを定義した。チオフラビン蛍光アッセイおよびＡＦＭ画像分析の両方を用い、ｓｃＦｖはＡβ凝集を阻害することができたことが示された。我々はＡＦＭによりさまざまなＡβ形態を撮像することができ、オリゴマー凝集体サイズの分布を定量化することができたことが示された。神経芽腫細胞株、ＳＨ−ＳＹ５Ｙに対するＡβ凝集の毒性効果をｓｃＦｖとのインキュベーションにより軽減することができたことも示された。
【０１５８】
タンパク質の凝集状態を制御するＡβの重要な領域がさらに同定された。我々は、Ａβのさまざまなペプチドフラグメントを単独でまたはＡβと合わせてインキュベートし、残基１７−２０および３０−３５が凝集プロセスにおいて本質的な役割を果たすことを示した。また、我々は、細胞に対して高度に毒性であることが以前示された２５−３５ペプチドはＡβ４２において、フィブリルは形成しないが、オリゴマーおよびプロトフィブリルの形成を促進し、ペプチド単独で小さなオリゴマー構造および非常に薄くて長いフィラメントを形成することを示した。これらの結果に促され、発明者らは、Ａβの２５−３５領域に対するｓｃＦｖを単離し、それらが凝集および毒性をどのように変化させるのかを試験した。この領域に対して作製されたｓｃＦｖは、凝集および細胞毒性の両方の低減に非常に効果的であることが示された（Ｚａｍｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。
【０１５９】
（Ａβに対する抗体の親和性変異）
本発明者らは、Ａβについて適度の親和性（高いナノモル親和性）を有するｓｃＦｖ、Ｈ１（図７参照）を同定し、このｓｃＦｖをＡβについての親和性が増加したｓｃＦｖを作製する親和性変異研究に親配列として用いた。本発明者らは、親配列Ｈ１ｓｃＦｖの親和性を、標準的な親和性変異プロトコル（Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）によって成功裏に５倍（Ｈ１ｖ２のＫＤ＝２．４７×１０−７Ｍ）増加させた。本発明者らは、ＢＩＡＣｏｒｅバイオセンサーを用い、より遅いオフレートを有するｓｃＦｖを直接選択する修正プロトコルを開発し、標準的なプロトコル（Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００６）を用いて同じライブラリーから単離されたＨ１ｖ２クローンより１０倍良好なＫＤ値を有するｓｃＦｖを単離した。本発明者らはまた、酵母ディスプレイライブラリーを用い、α−シヌクレインのそれらのＮ末端のビオチン化ペプチドに対するｓｃＦｖを単離したが、これは親和性変異研究に行うことができるものと本質的に同一である。４回の磁気ビーズ濃縮および方法セクションにおいて記載したＦＡＣＳ選別後、１０％を超える細胞が標的抗原の１つと陽性結合を示す（図４）。
【０１６０】
（形態特異的ｓｃＦｖの単離）
ますます多くの研究が、多数の異なる神経疾患、すなわち、ＡＤ、ＰＤ、ハンチントンおよびＡＬＳは共通の病理学的メカニズム、すなわち、凝集し、中枢神経系の機能不全をもたらす誤って折り畳まれたタンパク質を共有することを示す（Ｆｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。タンパク質は関与するタンパク質および疾患に応じて脳の特定の領域および細胞中に原線維β−プリーツシート構造として蓄積する。すべてのタンパク質は凝集プロセスにおいて同様の経路を辿る；まずβ−シート含有量を増加させ、次に小さいオリゴマーおよびプロトフィブリル中間体を形成し、最後に原線維アミロイド沈着物を形成すると考えられる。さまざまな疾患におけるこれらの中間体の役割を定義するため、異なるタンパク質型を同定する高度に特異性の試薬を有することは極めて有益であるだろう。この目標に向けて、本発明者らは、特定の形態に結合するｓｃＦｖの単離を可能にするバイオパニング技術を開発した。本発明者らは、ＡＦＭの撮像能力をファージディスプレイ抗体技術と組み合わせ、特定のタンパク質形態の存在の同定を可能にし、その形態に結合するｓｃＦｖを単離した（Ｂａｒｋｈｏｒｄａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。基本プロトコルは図５に示す。
【０１６１】
この技術の能力を示すため、α−シヌクレインおよびＡβのオリゴマーまたは原線維形態のいずれかに結合するｓｃＦｖを単離した。まず、オリゴマーまたはフィブリルの形成を補助するインキュベーション条件を同定した。タンパク質形態を確認するため、インキュベートした溶液のアリコート（１０μｌ）を割りたての雲母上に沈着させ、５分間固定した。次に基質を１ｍｌの超純水で３回洗浄した。試料を次に穏やかなアルゴンガス流下で乾燥させ、ＡＦＭにより撮像した。このプロトコルを用い、本発明者らはオリゴマーおよび原線維試料を確実に再現することができた（図６Ａおよび６Ｂ参照）。
【０１６２】
新規ＡＦＭバイオパニング技術（図５参照）を用い、本発明者らは、原線維（Ｂａｒｋｈｏｒｄａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００６）およびオリゴマーａ−ｓｙｎ（Ｅｍａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．２００７）型に対するｓｃＦｖを単離した。両方のパニング例について、わずか２回のバイオパニング後、予備ＥＬＩＳＡ試験において回収されたクローンの約５０％が所望の標的との陽性結合を示した。より強い結合クローンの１つを予備試験に基づき選択し、抗オリゴマーａ−ｓｙｎｓｃＦｖは、モノマーまたは原線維型ではなく、ａ−ｓｙｎのオリゴマー型のみに特異的に結合したことを示した。我々は、抗オリゴマーｓｃＦｖが、オリゴマーではなく、フィブリルの形成を阻害することができ、モノマーまたは原線維ａ−ｓｙｎではなく、オリゴマーが、細胞外で神経細胞株に添加した場合細胞毒性を示し、抗オリゴマーｓｃＦｖが予め形成されたａ−ｓｙｎオリゴマー（Ｅｍａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．２００７）の毒性を阻害することができたことも示した。我々は、ａ−ｓｙｎのより大きいオリゴマー型に対する第２ｓｃＦｖも単離した。２つの異なる抗オリゴマーｓｃＦｖは交差反応性を示さず、より小さい初期オリゴマーに結合するｓｃＦｖはより大きい後期オリゴマーと反応せず、より大きい後期ａ−ｓｙｎオリゴマーに対するｓｃＦｖはより小さい初期オリゴマーとは反応しない（図６Ａおよび図６Ｂ）。加えて、抗ｓｙｎオリゴマーｓｃＦｖはＡβオリゴマーと交差反応しない。顕著なことに、両方の抗ｓｙｎオリゴマーｓｃＦｖは、アルツハイマーまたは対照脳ではなく、パーキンソン脳からとったヒト組織試料において凝集体を認識した。
【０１６３】
本発明者らは、オリゴマーＡβに対するｓｃＦｖも単離した。ｓｃＦｖはＡβのより大きい後期オリゴマー型を認識する。オリゴマーＡβに対するｓｃＦｖはａ−ｓｙｎオリゴマーと交差反応せず、またパーキンソン脳または対照脳組織ではなく、ヒトＡＤ脳組織からとった試料を標識した。抗オリゴマーＡβｓｃＦｖはＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対するＡβの凝集および毒性も阻害した（Ｚａｍｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。
【０１６４】
（Ａβ凝集）
Ａβの可溶性オリゴマーは、モノマーＡβの原線維アミロイドへの凝集中に一過性中間体として形成される。Ａβ凝集体形態を再現可能に形成するため、予め形成されたＡβ凝集体シードを除去することが重要である。本発明者らは、記載されたように凍結乾燥Ａβをヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）に溶解し、遠心分離し、エッペンドルフ管にアリコートした後、窒素で乾燥させ（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００４；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００５）、標準的なモノマーＡβストック溶液を調製する。Ａβオリゴマーは、記載されたようにＡβストック溶液をＤＭＳＯを含む溶液に溶解し、緩衝液に希釈する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００４；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００５）またはＨＦＩＰに溶解し、希釈する（Ｋａｙｅｄ  ｅｔ  ａｌ．２００３；Ｓｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００３）ことにより、形成することができる。Ａβの濃度の増加は原線維凝集体をより迅速に形成させ、ＤＭＳＯの濃度の増加は凝集速度を低下させるだろう。
【０１６５】
（ＡＦＭ撮像）
ＡＦＭは表面を、微細な先端部でラスターパターンに走査することにより撮像する。ＡＦＭ先端部は表面構造の輪郭に従い、これを走査中に直接コンピュータ画面上に示す。本発明者らは、凝集体試料の割りたての未修飾雲母上への沈着がタンパク質凝集体の高品質画像を取得する能力を可能にすることを見出した。裸の雲母を用いる主な利点は、しかしながら、ファージ粒子がこの表面によく結合せず、予備試験結果セクションにおいて記載したように非結合ファージを容易に洗い流すことができることである。
【０１６６】
ファージ調製
Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（イングランド、ケンブリッジ）より供給されるトムリンソンＩおよびＪｓｃＦｖライブラリーをファージ調製に用いる。両ライブラリー（ＩおよびＪ）はＶＨおよびＶＬの単一ヒトフレームワークに基づき、ｐＩＴ２をファージミドベクターとして用いる。重鎖のＣＤＲ３は、まだ抗原結合は可能だが、できるだけ短くなるように設計された。側鎖多様性はＣＤＲ３およびＣＤＲ２領域中に、抗原に接触し、それらの成熟天然レパートリーが高度に多様である位置で導入された。ＣＤＲ１領域は一定に保つ。各ライブリーのサイズは１．４×１０８である。ライブラリーは、タンパク質−Ｌおよびタンパク質−Ａに結合することにより活性折り畳みドメインについて予め選択されたクローンを含有する。両ライブラリーは別々に増殖させ、選択プロトコルのためそれらのファージを１：１で混合する。ファージは、ＣＡＴにより記載されたように細菌培養物のヘルパーファージＫＭ１３での重感染により、初期細菌ライブラリーストックから作製する。ファージ試料をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿による上澄みから精製し、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水）に再懸濁し、パニングに用いる。
【０１６７】
ＡＦＭパニングおよび選択
ａ−ｓｙｎの特定の形態に対するｓｃＦｖを単離するＡＦＭバイオパニングおよび選択プロトコルを、本質的に記載されたように行う（Ｂａｒｋｈｏｒｄａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００６；Ｅｍａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｚａｍｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。  
【０１６８】
（結合動力学）
抗体結合実験をプラズモン共鳴によりＢＩＡｃｏｒｅＸバイオセンサーを用いて行う。表面プラズモン共鳴は、光波は金属表面で共鳴によって電気振動、または表面プラズモンとカップリングさせることができるという原理に基づく。表面プラズモンは、金属表面からの距離の増加とともに減衰するエバネッセント波を発生する。表面でのタンパク質相互作用はエバネッセント波およびプラズモン特性を変更し、内部反射光シグナルを変化させる。反射光におけるこの変化は、ダイオードアレイを用いて定量的に観察することができる。さまざまなＡβ形態に対する結合親和性について試験するため、異なるｓｃＦｖをアミンカップリングによりカルボキシメチルデキストランセンサーチップ（ＣＭ５、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）上に個別に固定する。センサーチップのデキストラン表面をまずＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１−エチル−３−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いて活性化し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを生成する（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）。ｓｃＦｖを次に第１級アミン基によって活性化表面に固定する。異なるＡβ形態の１つを含有する溶液をペプチド表面上に５μＬ／分の速度で注射する。次に、表面上に緩衝液（０．００５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ）を流すことにより、結合Ａβを完全に解離させた後、次の試料を注射する。２つの速度定数、ｋｏｎおよびｋｏｆｆ、ならびに対応する平衡解離定数、Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎを、得られたデータのカーブフィッティングにより求めることができる。この方法では、各ｓｃＦｖのＡβの各形態またはいずれかの他のタンパク質凝集体形態についての親和性が正確に計算される。特定の抗体について計算された解離定数がインビボ実験に十分には高くない場合、抗体の親和性を第２抗体ライブラリーを作製することにより増加させ、再スクリーニングする。
【０１６９】
（凝集動力学）
異なるｓｃＦｖの存在下でのＡβ凝集をチオフラビン蛍光およびＡＦＭ分析により観察する。チオフラビン蛍光はフィブリル形成を観察するのに有用であり、ＡＦＭ実験は原線維およびオリゴマー凝集の程度を決定することができる。ＡＦＭ分析を行い、凝集粒子のサイズ分布を決定し、抗体特異性を解析する。
【０１７０】
（細胞毒性アッセイ）
ｓｃＦｖを添加した、および添加していない、さまざまな凝集体試料の細胞毒性を、２つの異なる毒性アッセイ、ＭＴＴアッセイを用いるミトコンドリア活性の低減、およびＬＤＨアッセイを用いる放出された乳酸デヒドロゲナーゼ活性の増加を用いて試験する。これらのアッセイについては以前記載された（Ｅｍａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００４；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００５；Ｚａｍｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００６；Ｅｍａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｎａｎｎｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｚａｍｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。
【０１７１】
（親和性変異）
ファージライブラリー
異なるＡβ形態についてピコモル親和性を有する抗体は、ＡＤ試料における個別の形態の存在を検出する診断薬として、または特定のＡβ形態をインビボで標的化する潜在的な治療薬として用いるのに十分に特異性である。Ａβは通常はＣＳＦ中に低ナノモル濃度で存在するので、ピコモル親和性を有する抗体は通常のレベルで十分な量の可溶性Ａβに容易に結合するはずである。Ａβのオリゴマー形態のインビボでの濃度は知られていないが、ｓｃＦｖは必要に応じてより高い親和性まで親和性成熟させることができる。原繊維Ａβに対してナノモル親和性を有する抗体は、Ａβ沈着物の抗体媒介除去を成功裏に開始することが示された（Ｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。ピコモル親和性を有する抗体を作製するため、特定の実施形態では、親和性変異技術を用いてもよい。抗体軽鎖および重鎖フラグメントのそれぞれのＣＤＲ領域を別々にランダム化し、鎖をランダムにシャッフルして組換え、抗体の第２ライブラリーを作製するが、ここでライブラリー全体はＡβに特異的な抗体配列に基づく。このライブラリーの第１世代は、本質的に記載されたように軽鎖のＣＤＲ３領域をランダム化することにより構築する（Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。この新規ライブラリーからのもっとも良好なバインダーを上述したようにパニングにより選択する。もっとも高い親和性を有するそれらのｓｃＦｖは、同様に本質的に記載されたように重鎖および軽鎖遺伝子のＣＤＲ２領域をランダム化し（Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）、軽鎖および重鎖をシャッフルすることにより形成される第２世代ライブラリーのフレームワークとして機能する。この第２世代ライブラリーからのもっとも良好なバインダーを単離し、これは軽鎖および重鎖のＣＤＲ１領域をランダム化することにより形成される第３世代ライブラリーのフレームワークとして機能する。各世代でＡβについて良好な親和性を有するｓｃＦｖを単離する。このタイプの親和性変異を、Ａβの異なる形態についてピコモル親和性を有するｓｃＦｖを単離するまで継続する。ファージディスプレイペプチドの親和性変異は親抗体の親和性を常に向上させ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５；Ｉｒｖｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９６；Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ  １９９９；Ｏｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００）、さらにはフェムトモル範囲まで向上させた（Ｂｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。
【０１７２】
また、特定の実施形態では、親和性成熟ｓｃＦｖは、特定の形態だけでなく、特定のタンパク質の特定の形態に結合するように開発される。現在のオリゴマー抗体は多くの異なるタンパク質のオリゴマー構造を認識する（Ｋａｙｅｄ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。こうした抗体にはいくつかの利点があるが、これらの抗体はインシュリン、Ａβ、またはシヌクレインオリゴマーの存在を区別することができないという不利点もある。本ＡＦＭパニングプロトコルで、２段階陰性／陽性選択を用いることにより、特定のタンパク質形態についてｓｃＦｖを選択することが可能である。例えば、オリゴマーＡβに対するｓｃＦｖの第２ライブラリーを作製することができる。この第２ライブラリーを用い、パニングプロトコルを修正することにより、Ａβオリゴマーにのみ特異的なｓｃＦｖについてパニングすることができる。まずｓｃＦｖライブラリーを望ましくないオリゴマータンパク質（例えば、シヌクレイン、ハンチングチン、プリオン）とインキュベートすることにより陰性パニング工程を行い、これらの凝集体を認識するｓｃＦｖを除去する。次に、残りの非結合ファージを用いることにより陽性パニング工程を行い、Ａβオリゴマーに結合するものを選択する。本発明者らは、この２段階パニングプロトコルを成功裏に用い、関連タンパク質のファミリーのなかでも特定のタンパク質に対するｓｃＦｖを単離した（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。
【０１７３】
親和性変異はファージディスプレイライブラリーまたは酵母ディスプレイライブラリーを用いて行うことができる。これらのライブラリーのそれぞれは異なる状況について特定の利点を有する。選択プロトコルにＡＦＭを用いなければならないＡβのオリゴマー形態について、パニングプロセスにはファージディスプレイライブラリーを用いなければならない。タンパク質をビオチンで標識することができるモノマーまたは原線維形態には、酵母ディスプレイライブラリーを用いることができる。酵母ディスプレイライブラリーの利点は、フローサイトメトリー選別プロセス中に高親和性変異体を直接選択することができることである。従って、これらの親和性変異プロトコルの両方について後述する。
【０１７４】
ファージディスプレイ抗体の親和性変異は親の親和性を常に向上させ、さらにフェムトモル親和性を得るまでに進化した。これらの第２世代抗体ライブラリーを作製するためのプロトコルはさまざまな参考文献に記載されている（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５；Ｉｒｖｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９６；Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ  １９９９；Ｏｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。基本的に、第２世代ライブラリーは、下記のようないくつかの小さな修正を含みつつ、本質的に記載されたように構築されるだろう（Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｔａｎｚｉ  １９９７）。親Ｈ１ｓｃＦｖのＣＤＲ３軽鎖領域を、２段階ＰＣＲプロトコルを用いてランダム化する。ｓｃＦｖ遺伝子を、第１ＰＣＲにおいて２つのプライマー：ＬＭＢ３（５’−ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＡＣ−３’）およびＣＤＲ３−６−ＶＬ−ＦＯＲ（５’−ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＧＡＡ  ＴＡＣ  ＣＡＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＣＴＣ−３’；Ｎはランダムヌクレオチドを表す）を用いて増幅する。得られたＰＣＲ産物は５'端にＮｃｏ１制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。第２ＰＣＲ工程では、ランダム化ＣＤＲ３軽鎖フラグメントをさらに下記の２つのプライマー：ＬＭＢ３（５’−ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＡＣ−３’）およびＪＬ−ＮＯＴ−ＦＯＲ（５’−ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＴＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＧＣＣ  ＴＡＧ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＴＣＣ  ＧＣＣ−３’）を用いて増幅し、３’端にＮｏｔ１制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する。２つのＰＣＲ工程後に得られたＰＣＲ産物をＮｃｏ１およびＮｏｔ１の両方で消化し、Ｎｏｔ１およびＮｃｏ１で予め消化したプラスミドｐＨＥＮ２にライゲートする。ライゲート混合物をエレクトロポレーションにより大腸菌ＴＧ１細胞に形質転換し、第２世代ファージディスプレイライブラリーをもたらす。第２世代ライブラリーはその後、上述したバイオパニング実験に用いる。異なるＣＤＲ領域を変化させることにより、追加のライブラリー世代を構築することができる。プライマーは標的ＣＤＲ配列に隣接するように変化するが、プロトコルは本質的に同じである。
【０１７５】
酵母ライブラリーでの親和性変異
ｓｃＦｖ抗体の酵母表面ディスプレイを用い、独特の抗原結合ｓｃＦｖクローンから作製された小さい（〜１×１０６）変異原性ライブラリーからより高い親和性のクローンを単離することもできる（Ｂｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。第２変異原性ライブラリーは、３〜７点変異／ｓｃＦｖを導入する誤りがちなＰＣＲを用いて親ｓｃＦｖ遺伝子を増幅することにより構築する（Ｓｔｅｍｍｅｒ  １９９４；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。材料を、「ギャップ修復」として知られる、酵母中に存在する内因性同種組換え系を用い、表面発現ベクターにクローニングする（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ  １９８３）。ギャップ修復は、対象の遺伝子とその標的部位との間のホモロジーの３０個ほどの少ない塩基対の領域を用いることにより、正確な部位での染色体またはプラスミドにおける遺伝子挿入を可能にする出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の内因性同種組換え系である。これは、出発親クローンのＫＤに対して低下する量の抗原を用い、選別された細胞群のもっとも明るい抗原結合断片を選択することにより、１〜１０×１０６クローンの変異ライブラリーを急速に作製およびスクリーニングすることを可能にする。スクリーニングは、３〜４回の上述したフローサイトメトリー選別を含む。フローサイトメトリーは、ＡＳＵのバイオデザイン研究所または継続する共同研究契約によって、すべての予備試験データを得た、Ｂａｒｒｏｗ’ｓ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの中にある共有ユーザー施設で行われるだろう。
【０１７６】
本明細書および実施例は本発明を十分に開示し、これを可能にするが、それらは添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１７７】
すべて文献、特許および特許出願は本明細書に参照により組み入れる。本明細書では本発明はその特定の実施形態に関して記載され、例示を目的として多くの詳細が説明されたが、本発明は追加の実施形態を含んでもよく、本明細書に記載された詳細のいくつかを、本発明の基本原理から逸脱することなく、かなり変えることができることは当業者には明らかであるだろう。
【０１７８】
本発明について記載する文脈における「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の語ならびに類似の指示語の使用は、本明細書にとくに指示または文脈による明らかな矛盾のない限り、単数および複数の両方を含むと解釈されるものである。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を含む）」、「ｈａｖｉｎｇ（〜を有する）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（〜を含む）」、および「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（〜を含有する）」の語は、とくに記述のない限り、オープンエンド用語（すなわち「〜を含むが、これらに限定されない」を意味する）として解釈されるものである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書にとくに指示のない限り、ただその範囲内に入るそれぞれの別の値を個別に指す簡単な方法として役立つことを意図するものであり、それぞれの別の値は本明細書に個別に列挙されたように組み入れる。本明細書に記載されたすべての方法は、本明細書にとくに指示または文脈による明らかな矛盾のない限り、いずれかの適切な順で行うことができる。本明細書に記載されるいずれかおよびすべての例、または例示語（例えば、「〜のような」）の使用は、ただ本発明をより明瞭にすることを意図するものであり、とくに指定のない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいずれの文言もいずれかの特許請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すものと解釈されるべきではない。
【０１７９】
本発明を実施するための本発明者らに知られるもっとも良好な態様を含む、本発明の実施形態が本明細書に記載される。これまでの記載を読めば、それらの実施形態の変更は当業者には明らかとなり得る。本発明者らは当業者であれば必要に応じてこうした変更を用いることを期待し、本発明者らは本発明が本明細書に具体的に記載された以外の方法で実施されることを意図する。従って本発明は、適用法により認められるように、添付の特許請求の範囲に挙げられる対象のすべての変更および同等物を含む。さらに、そのすべての考えられる変更における上述の要素いずれかの組み合わせは、本明細書にとくに指示または文脈による明らかな矛盾のない限り、本発明に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【外国語明細書】
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