(57)【要約】      （修正有）【課題】脳腫瘍を検出および評価し、さらに治療に対する反応または治療後の状態の監視のための、簡易かつ非侵襲的な方法を提供する。【解決手段】５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）を含む医薬組成物を投与し、投与後に体液から分離された脳由来微小粒子上の、５−ＡＬＡのプロトポルフィリンＩＸ（ＰＰＩＸ）への変換・代謝酵素、または該酵素と結合したプロトポルフィリンＩＸを測定することによって脳腫瘍を検出し、そのような腫瘍の再発を評価する方法に関する。【選択図】図１４
2018141792.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＷＨＯグレードＩＩＩまたはグレードＩＶの脳腫瘍を検出する方法であって、
５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）を含む医薬組成物を被検者に投与するステップと、
上記被検者から得た生体試料における脳由来微小粒子と結合した５−ＡＬＡのプロトポルフィリンＩＸ（ＰＰＩＸ）への変換レベルを検出することによって、ＷＨＯグレードＩＩＩまたはグレードＩＶの脳腫瘍を検出するステップと、を含んでいる方法。
【請求項２】
上記被検者が、脳腫瘍の治療を以前に受けていた、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記被検者が、ＷＨＯグレードＩＩＩまたはグレードＩＶの脳腫瘍の治療を以前に受けていた、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記のＷＨＯグレードＩＩＩまたはグレードＩＶの腫瘍は、未分化星状細胞腫、膠芽腫、未分化乏突起膠腫、未分化上衣腫、未分化乏突起星細胞腫、極性海綿芽細胞腫、星芽腫、および大脳膠腫症からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記のＷＨＯグレードＩＩＩまたはグレードＩＶの脳腫瘍は、膠芽腫（ＧＢＭ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記生体試料は全血である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記生体試料は血漿または血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
上記生体試料は脳脊髄液である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記生体試料は、尿、涙、母乳、リンパ液、滑液、気管支肺胞洗浄液、羊水、唾液、眼液、腹水、および呼吸器飛沫からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
上記医薬組成物はグリオランＴＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記５−ＡＬＡを含む医薬組成物は経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記５−ＡＬＡを含む医薬組成物は腫瘍内投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
上記医薬組成物は、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇの濃度で５−ＡＬＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
上記５−ＡＬＡを含む医薬組成物は、３時間、４時間、または５時間投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
５−ＡＬＡのＰＰＩＸへの上記変換レベルは、蛍光を測定することによって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
５−ＡＬＡのＰＰＩＸへの上記変換レベルは、５−ＡＬＡからＰＰＩＸへの変換経路に沿って代謝物レベルを測定することによって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
５−ＡＬＡのＰＰＩＸへの上記変換レベルは、変換酵素レベルを測定することによって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
上記変換酵素は、コプロポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＣＰＯＸ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記脳由来微小粒子に結合した５−ＡＬＡの検出前に、上記生体試料から当該脳由来微小粒子を分離するステップをさらに含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ＷＨＯグレードＩＩＩおよびグレードＩＶの脳腫瘍の再発を評価する方法であって、
５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）を含む医薬組成物を被検者に投与するステップと、
上記被検者から得た生体試料における脳由来微小粒子と結合した５−ＡＬＡを検出することによって、ＷＨＯグレードＩＩＩおよびグレードＩＶの脳腫瘍の再発を評価するステップと、を含んでいる方法。
【請求項２１】
ＷＨＯグレードＩＩＩおよびグレードＩＶの脳腫瘍の再発は、脳由来微小粒子と結合した５−ＡＬＡの量を検出することによって評価される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
固形腫瘍を検出する方法であって、
固形腫瘍に選択的に局在するようになる癌治療薬を被検者に投与するステップであって、上記治療薬が代謝物に変換されるステップと、
上記被検者から得た生体試料における固形腫瘍由来微小粒子と結合した、代謝物または変換酵素を検出することによって、上記固形腫瘍を検出するステップと、を含んでいる方法。
【請求項２３】
固形腫瘍を標的とする癌治療薬のレベルを測定する方法であって、
固形腫瘍に選択的に局在するようになる癌治療薬を被検者に投与するステップであって、上記治療薬が代謝物に変換されるステップと、
上記被検者から得た生体試料における固形腫瘍由来微小粒子と結合した代謝物のレベルを検出するステップと、
上記代謝物のレベルに基づいて、上記固形腫瘍における、上記癌治療薬のレベル、または変換酵素のレベルを決定するステップと、を含んでいる方法。
【請求項２４】
上記固形腫瘍は、卵巣腫瘍、乳部腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、腎臓腫瘍、および膀胱腫瘍からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
上記固形腫瘍は、卵巣腫瘍、乳部腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、腎臓腫瘍、および膀胱腫瘍からなる群から選択されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願のクロスリファレンス〕
本出願は、２０１２年６月７日に出願された米国仮出願第６１／６５６，９４５号の利益を主張するものであり、当該米国仮出願は、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔技術分野〕
本開示は、脳腫瘍を検出する方法、および、そのような腫瘍の存在および再発を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
脳に発生する最も一般的な癌の形態は、膠芽腫と呼ばれる最も悪性で進行が早い悪性度ＩＶの腫瘍である。悪性度のより低い神経膠腫が進行し、その後、悪性度ＩＶのＧＢＭになることが多い。現在、この生命を脅かす疾患の標準的な管理の間に起こる疾患再発の区別は、非常に複雑であり、放射線療法後の腫瘍壊死と区別することが困難である。そのため、治療、およびリスクの基準が非常に複雑かつ不正確なものになっている。
【０００４】
ＧＢＭに対する現在の標準的な治療計画としては、外科的切除、体外照射療法、および経口化学療法等がある。しかしながら、切除することが難しい腫瘍の触手のような突起部、血液脳関門に起因する薬物アクセスの制限等を含む治療の難しさのため、平均余命は、一般的に１２〜１６ヶ月にすぎない。限られた治療効果および再発の可能性を考慮すると、治療後に患者を綿密に監視することが重要である。現在、ＭＲＩ画像では、放射線療法による放射性壊死と、固形腫瘍の再発とを適切に区別することは不可能である。そのため、医師は、ＭＲＩ等の複数の方法によって経験的に患者の進行状況を判断しなければならなかったり、あるいは先進的なＰＥＴやＳＰＥＣＴの画像検査のために腫瘍生検を用いる必要がある。これらの処置は、患者の幸福や治療費に大きな影響を与えるものである。
【０００５】
他のＷＨＯグレードＩＩＩおよびＩＶの腫瘍に対する標準的な治療計画、および治療の難しさは類似している。
【０００６】
５−ＡＬＡが有効成分であるグリオランは、蛍光下で、通常の脳組織と腫瘍組織との差の可視化を可能とすると共に、神経外科医によるより完全な切除率を可能とする試薬としてヨーロッパで使用が認可されている。高いグレードの脳腫瘍（ＷＨＯグレードＩＩＩおよびＩＶ、例えば、ＧＢＭ、神経膠肉腫、未分化星状細胞腫等）は、通常の脳組織、および低いグレードの脳腫瘍（ＷＨＯグレードＩおよびＩＩ、例えば、髄芽腫、乏突起膠腫等）より高い速度で、５−ＡＬＡを蛍光ポルフィリンに代謝させるため、増強された蛍光を有している。しかし、５−ＡＬＡのシグナルを非侵襲的に検出することが可能であるか否かは知られていない。
【０００７】
したがって、種々の被検者において、ＷＨＯグレードＩＩＩおよびＩＶの脳腫瘍を検出し、そのような腫瘍の存在および再発を評価する簡易かつ非侵襲的な方法に対する要求は依然としてある。
【０００８】
また、全てのタイプの固形腫瘍を検出および評価し、さらに治療に対する反応、または疾患再発をもたらす突破を検出する簡易かつ非侵襲的な方法に対する一般的な要求も依然としてある。
【発明の概要】
【０００９】
上記の要求に応えるために、本開示は本明細書に記載された方法を提示している。
【００１０】
本開示は、ＷＨＯグレードＩＩＩおよびグレードＩＶの脳腫瘍を検出する方法と、そのような腫瘍の存在および再発を評価する方法とを記載している。これらの方法は、腫瘍から放出され、有効成分として５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）を有する医薬組成物の投与後に体液から分離された微小粒子と結合されたアミノレブリン酸の代謝における酵素バイオマーカーまたは最終生成物を定量し、脳由来微小粒子と結合する５−ＡＬＡを検出することによって行われる。
【００１１】
一態様では、本開示は、ＷＨＯグレードＩＩＩまたはグレードＩＶの脳腫瘍を検出する方法を提供し、上記方法は、５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）を含む医薬組成物を被検者に投与するステップと、上記被検者から得た生体試料において、放出された微小粒子の量を測定し、脳由来微小粒子と結合したＰＰＩＸの存在を検出する手段によって、腫瘍内のプロトポルフィリンＩＸ（ＰＰＩＸ）への５−ＡＬＡの変換レベルを検出することによって、ＷＨＯグレードＩＩＩまたはグレードＩＶの脳腫瘍の存在または再発を検出するステップとを含んでいる。
【００１２】
上記方法を実施する時、５−ＡＬＡのＰＰＩＸへの変換レベルは、蛍光を測定すること、５−ＡＬＡのＰＰＩＸへの変換経路に沿って代謝物のレベルを測定すること、または、コプロポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＣＰＯＸ）のような変換酵素のレベルを測定することによって検出されうる。
【００１３】
上記方法のいくつかの実施形態では、上記方法は、上記脳由来微小粒子に結合した５−ＡＬＡの検出前に、上記生体試料から得た当該脳由来微小粒子を分離するステップを含んでいる。
【００１４】
別の態様では、本開示は、ＷＨＯグレードＩＩＩおよびグレードＩＶの脳腫瘍の再発を評価する方法を記載しており、上記方法は、５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）を含む医薬組成物を被検者に投与するステップと、上記被検者から得た生体試料における脳由来微小粒子と結合した５−ＡＬＡを検出することによって、ＷＨＯグレードＩＩＩおよびグレードＩＶの脳腫瘍の再発を評価するステップとを含んでいる。ＷＨＯグレードＩＩＩおよびグレードＩＶの脳腫瘍の再発は、脳由来微小粒子と結合した５−ＡＬＡ量を検出することによって評価してもよい。いくつかの実施形態では、上記方法は、上述した態様に記載された方法を用いて５−ＡＬＡのＰＰＩＸへの変換レベルを検出することによって再発を検出する。
【００１５】
上記態様のある実施形態では、上記被検者が、脳腫瘍、特に、ＷＨＯグレードＩＩＩまたはグレードＩＶの脳腫瘍の治療を以前に受けている。治療される腫瘍は、未分化星状細胞腫、膠芽腫、未分化乏突起膠腫、未分化上衣腫、未分化乏突起星細胞腫、極性海綿芽細胞腫、星芽腫、または大脳膠腫症であってもよい。
【００１６】
さらに別の態様では、本開示は固形腫瘍を検出する方法を提供し、上記方法は、固形腫瘍に選択的に局在するようになる癌治療薬を被検者に投与するステップであって、上記治療薬が代謝物に変換されるステップと、上記被検者から得た生体試料における固形腫瘍由来微小粒子と結合した、代謝物または変換酵素を検出することによって、上記固形腫瘍を検出するステップとを含んでいる。
【００１７】
さらに別の態様では、本開示は固形腫瘍を標的とする癌治療薬のレベルを測定する方法を提供し、上記方法は、固形腫瘍に選択的に局在するようになる癌治療薬を被検者に投与するステップであって、上記治療薬が代謝物に変換されるステップと、上記被検者から得た生体試料における固形腫瘍由来微小粒子と結合した代謝物のレベルを検出するステップと、上記代謝物のレベルに基づいて、上記固形腫瘍における、上記癌治療薬のレベル、または変換酵素のレベルを決定するステップとを含んでいる。
【００１８】
上述した態様に関する好ましい固形腫瘍には、卵巣腫瘍、乳部腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、腎臓腫瘍、および膀胱腫瘍が含まれる。
【００１９】
上記全態様のある実施形態では、上記生体試料は、全血、血清、血漿、または脳脊髄液である。別の実施形態では、上記生体試料は、血清、尿、涙、母乳、リンパ液、滑液、気管支肺胞洗浄液、羊水、唾液、眼液、腹水、または呼吸器飛沫である。
【００２０】
上記全態様のある実施形態で用いられる上記医薬組成物は、５−ＡＬＡを含む任意の組成物であってもよいが、概してグリオランＴＭである。上記医薬組成物は、経口投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、また腫瘍内投与してもよい。好ましい実施形態では、上記医薬組成物は、１ｋｇあたり２０ｍｇの濃度で５−ＡＬＡを含んでいる。上記医薬組成物は、３時間、４時間、または５時間投与してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
特許または出願書類は、カラー印刷された少なくとも１つの図面を含んでいる。カラーの図面を備えた本特許または出願公開公報の写しは、請求および手数料の支払いによって特許庁から提供される。
【図１Ａ】図１Ａは、ｄｄＨ２０中のコントロール血清のサイズ排除クロマトグラフィー（左軸、青線、吸光度：２８０ｎｍ）、および伝導率測定（右軸、茶線）の結果を示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、１００％ＰＢＳ中のコントロール血清のサイズ排除クロマトグラフィー（左軸、青線、吸光度：２８０ｎｍ）、および伝導率測定（右軸、茶線）の結果を示している。
【図２Ａ】図２Ａは、ｄｄＨ２０中の被検者の血清のサイズ排除クロマトグラフィー（左軸、青線、吸光度：２８０ｎｍ）、および伝導率測定（右軸、茶線）の結果を示している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、１０％ＰＢＳ中の被検者の血清のサイズ排除クロマトグラフィー（左軸、青線、吸光度：２８０ｎｍ）、および伝導率測定（右軸、茶線）の結果を示している。
【図２Ｃ】図２Ｃは、１００％ＰＢＳ中の被検者の血清のサイズ排除クロマトグラフィー（左軸、青線、吸光度：２８０ｎｍ）、および伝導率測定（右軸、茶線）の結果を示している。
【図３Ａ】図３は、光散乱ＮＴＡによって分析されたＧＢＭ患者の試料の典型的な微小粒子に関する。図３Ａは、微小粒子試料の粒径分布および濃度を示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＮＴＡ分析により得た試料のビデオ画像を示しており、赤い点は、追跡された粒子を示している。
【図３Ｃ】図３Ｃは、微小粒子試料の粒径および相対強度を示している。
【図３Ｄ】図３Ｄは、微小粒子試料の粒径および相対強度を３Ｄプロットで示している。
【図４Ａ】図４は、ＮＴＡによって蛍光モードで分析されたコントロールの青色蛍光微小粒子に関する。図４Ａは、微小粒子試料の粒径分布および濃度を示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＮＴＡ分析により得た試料のビデオ画像を示しており、赤い点は、追跡された粒子を示している。
【図４Ｃ】図４Ｃは、微小粒子試料の粒径および相対強度を示している。
【図４Ｄ】図４Ｄは、微小粒子試料の粒径および相対強度を３Ｄプロットで示しており、青が低い値、赤が高い値をそれぞれ示している。
【図５Ａ】図５は、ＮＴＡによって蛍光モードで分析された、ＰＢＳで処理した被検者の試料に関しており、当該試料は、小さい微小粒子をほとんど有していない、大きい微小粒子の明確な分布と、低い多分散指数とを示している。図５Ａは、微小粒子試料の粒径分布および濃度を示している。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＮＴＡ分析により得た試料のビデオ画像を示しており、赤い点は、追跡された粒子を示している。
【図５Ｃ】図５Ｃは、微小粒子試料の粒径および相対強度を示している。
【図５Ｄ】図５Ｄは、微小粒子試料の粒径および相対強度を３Ｄプロットで示しており、青が低い値、赤が高い値をそれぞれ示している。
【図６Ａ】図６は、ＮＴＡによって蛍光モードで分析された、ＰＢＳで処理した被検者の試料に関しており、当該試料は、小さい微小粒子をほとんど有していない、大きい微小粒子の明確な分布と、低い多分散指数とを示している。図６Ａは、微小粒子試料の粒径分布および濃度を示している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＮＴＡ分析により得た試料のビデオ画像を示しており、淡青色の点は、蛍光によって追跡された粒子を示している。
【図６Ｃ】図６Ｃは、微小粒子試料の粒径および相対強度を示している。
【図６Ｄ】図６Ｄは、微小粒子試料の粒径および相対強度を３Ｄプロットで示しており、青が低い値、赤が高い値をそれぞれ示している。
【図７Ａ】図７は、ＮＴＡによって蛍光モードで分析された、水で処理した被検者の試料に関しており、当該試料は、大きい微小粒子の明確な分布を有する、大量の小さい微小粒子と、高い多分散指数とを示している。図７Ａは、微小粒子試料の粒径分布および濃度を示している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＮＴＡ分析により得た試料のビデオ画像を示しており、淡青色の点は、蛍光によって追跡された粒子を示している。
【図７Ｃ】図７Ｃは、微小粒子試料の粒径および相対強度を示している。
【図７Ｄ】図７Ｄは、微小粒子試料の粒径および相対強度を３Ｄプロットで示しており、青が低い値、赤が高い値をそれぞれ示している。
【図８Ａ】図８は、ＮＴＡによって蛍光モードで分析された、水で処理した被検者の試料に関しており、当該試料は、大きい微小粒子の明確な分布を有する、大量の小さい微小粒子と、高い多分散指数とを示している。図８Ａは、微小粒子試料の粒径分布および濃度を示している。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＮＴＡ分析により得た試料のビデオ画像を示しており、淡青色の点は、蛍光によって追跡された粒子を示している。
【図８Ｃ】図８Ｃは、微小粒子試料の粒径および相対強度を示している。
【図８Ｄ】図８Ｄは、微小粒子試料の粒径および相対強度を３Ｄプロットで示しており、青が低い値、赤が高い値をそれぞれ示している。
【図９Ａ】図９は、ＮＴＡによって蛍光モードで分析された、水で処理した被検者の試料に関しており、当該試料は、大きい微小粒子の明確な分布を有していない、大量の小さい微小粒子と、高い多分散指数とを示している。図９Ａは、微小粒子試料の粒径分布および濃度を示している。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＮＴＡ分析により得た試料のビデオ画像を示しており、淡青色の点は、蛍光によって追跡された粒子を示している。
【図９Ｃ】図９Ｃは、微小粒子試料の粒径および相対強度を示している。
【図９Ｄ】図９Ｄは、微小粒子試料の粒径および相対強度を３Ｄプロットで示しており、青が低い値、赤が高い値をそれぞれ示している。
【図１０Ａ】図１０は、ＮＴＡによって蛍光モードで分析された、水で処理した被検者の試料に関しており、当該試料は、大きい微小粒子の明確な分布を有していない、大量の小さい微小粒子と、高い多分散指数とを示している。図１０Ａは、微小粒子試料の粒径分布および濃度を示している。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＮＴＡ分析により得た試料のビデオ画像を示しており、淡青色の点は、蛍光によって追跡された粒子を示している。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、微小粒子試料の粒径および相対強度を示している。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、微小粒子試料の粒径および相対強度を３Ｄプロットで示しており、青が低い値、赤が高い値をそれぞれ示している。
【図１１Ａ】図１１は、ＮＴＡによって蛍光モードで分析された、水で処理した被検者の試料に関しており、当該試料は、大きい微小粒子の明確な分布を有していない、大量の小さい微小粒子と、非常に高い多分散指数とを示している。図１１Ａは、微小粒子試料の粒径分布および濃度を示している。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＮＴＡ分析により得た試料のビデオ画像を示しており、赤い点は、追跡された粒子を示している。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、微小粒子試料の粒径および相対強度を示している。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、微小粒子試料の粒径および相対強度を３Ｄプロットで示しており、青が低い値、赤が高い値をそれぞれ示している。
【図１２Ａ】図１２は、ＮＴＡによって蛍光モードで分析された、水で処理した被検者の試料に関しており、当該試料は、大きい微小粒子の明確な分布を有していない、大量の小さい微小粒子と、非常に高い多分散指数とを示している。図１２Ａは、微小粒子試料の粒径分布および濃度を示している。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＮＴＡ分析により得た試料のビデオ画像を示しており、赤い点は、追跡された粒子を示している。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、微小粒子試料の粒径および相対強度を示している。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、微小粒子試料の粒径および相対強度を３Ｄプロットで示しており、青が低い値、赤が高い値をそれぞれ示している。
【図１３Ａ】図１３は、光散乱ＮＴＡおよび蛍光ＮＴＡによる、水中とＰＢＳ中とにおけるサイズ排除クロマトグラフィー後の微小粒子の定量結果を対比したまとめを示している。図１３Ａは、ＰＢＳで調製して得られた結果を示している。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、水で調製して得られた結果を示している。
【図１４】図１４は、未処理のＵ８７細胞、５−ＡＬＡで４時間処理したＵ８７細胞、５−ＡＬＡで２４時間処理したＵ８７細胞におけるＰＰＩＸ値を検出するためのフローサイトメトリー実験の結果を示している。
【図１５】図１５は、癌由来の微小粒子中にＣＰＯＸが検出されたことを示すウエスタンブロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
〔定義〕
本明細書において用いられる「５−ＡＬＡ」は、５−アミノレブリン酸を指している。
【００２３】
本明細書において用いられる「ＰＰＩＸ」は、プロトポルフィリンＩＸを指している。
【００２４】
本明細書において用いられる「微小粒子」は、あらゆる種類の細胞から放出された任意の小胞を指しており、当該微小粒子として、例えば、エキソソーム、微小胞等が挙げられる。
【００２５】
本明細書において用いられる「ＷＨＯグレードＩＩＩまたはＩＶ」は、ＷＨＯグレードＩＩＩまたはＩＶの基準を満たす腫瘍として実際に等級付けされている腫瘍、または、ＷＨＯ基準の下で評価された場合に、ＷＨＯグレードＩＩＩまたはＩＶの腫瘍であったと等級付けられたであろうと考えられる腫瘍を指している。
【００２６】
〔概要〕
本開示は、腫瘍細胞の蛍光誘導による視覚化のために用いられる、選択的に固形腫瘍に局在するようになる癌治療薬を投与し、被検者から得た生体試料中の固形腫瘍由来の微小粒子と結合した、薬物代謝物または変換酵素を検出することによって、固形腫瘍を検出する方法に関する。
【００２７】
より具体的には、本開示は、有効成分として５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）を有する医薬組成物を被検者に投与し、当該被検者から得た生体試料中の５−ＡＬＡがＰＰＩＸへ変換したレベルを検出することによって、ＷＨＯグレードＩＩＩまたはＩＶの脳腫瘍を検出する方法、または、そのような腫瘍の再発を検出する方法に関する。
【００２８】
また、本開示は、固形腫瘍に対する蛍光ガイド下手術の添加剤として用いられる内因性アミノ酸を高容量で投与し、被検者から得た生体試料中の固形腫瘍由来の微小粒子と結合した、代謝物または変換酵素を検出することによって、固形腫瘍を検出する方法に関する。
【００２９】
また、本開示は、固形腫瘍に選択的に局在するようになる癌治療薬を投与し、被検者から得た生体試料中の固形腫瘍由来の微小粒子と結合した代謝物のレベルを検出し、当該代謝物のレベルに基づいて固形腫瘍中の癌治療薬のレベルを決定することにより、固形腫瘍を対象としたガン治療薬のレベルを測定する方法に関する。
【００３０】
本開示は、５−ＡＬＡのポルフィリン代謝物であるＰＰＩＸが選択的に脳腫瘍細胞に蓄積するという理解、および、ＰＰＩＸの細胞内濃度と均衡する濃度で、ＷＨＯグレードＩＩＩおよびＩＶの脳腫瘍から放出された微小粒子中にＰＰＩＸが検出されるという新たな知見に少なくとも部分的に基づいている。
【００３１】
〔固形腫瘍の検出方法〕
本明細書に記載の方法は、未分化星状細胞腫、多形性膠芽腫、未分化乏突起膠腫、未分化上衣腫、未分化乏突起星細胞腫、極性海綿芽細胞腫、星芽腫、または大脳膠腫症のようなＷＨＯグレードＩＩＩおよびＩＶの脳腫瘍を検出する。
【００３２】
ＷＨＯグレードＩＩＩおよびＩＶの脳腫瘍を被検者において検出するために、有効成分として５−ＡＬＡを有する医薬組成物を用いることができる。ここでいう被検者とは、この方法を用いてそのような腫瘍を検出することによる利点が、上記医薬組成物を投与することによって生じ得るいかなる有害な影響にも勝っている被検者であればいずれの被検者でもよい。いくつかの実施形態において、上記の被検者には、他の非侵襲的検出手段が適切でない脳腫瘍を示す症状、または、５−ＡＬＡを用いる検出が他の方法と比較してより高い感度を示す脳腫瘍を示す症状に苦しむ被検者が含まれる。
【００３３】
ある実施形態では、上記医薬組成物が、少なくとも１つの脳腫瘍、場合によってはＷＨＯグレードＩＩＩまたはＩＶの腫瘍の治療を以前に受けた被検者に対して投与される。これらの被検者は、以前に、外科手術、放射線療法、化学療法、それらの組み合わせ、または他の適した治療を受けていてもよい。本方法がグレードＩＩＩまたはグレードＩＶの腫瘍の治療を以前に受けていた被検者に対して用いられるという特別な場合には、本方法は腫瘍の再発を検出するために用いられる。
【００３４】
また、本明細書に記載の方法は、区別されることが必要な組織、例えば、通常の組織よりも高い速度で５−ＡＬＡを代謝する、他の種類の脳腫瘍およびＷＨＯのあらゆるグレードの固形腫瘍を検出するためにもに利用できる。特に、上記方法は、増殖性の高い腫瘍に用いてもよい。そのような腫瘍として、卵巣、乳房、膵臓、前立腺、肺、結腸、腎臓、および膀胱の腫瘍が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書の実施形態のいくつかは脳腫瘍に関してのみ記載されているが、これらの実施形態は、他の固形腫瘍の検出に関しても存在すると理解されるべきである。
【００３５】
〔他の方法〕
本明細書に記載の方法は、いずれも、腫瘍由来の微小胞と結合するＰＰＩＸへの５−ＡＬＡの変換レベルを本明細書に記載の方法を用いて検出することによって、固形腫瘍の再発、固形腫瘍の体積、または固形腫瘍量の程度を評価するために用いることができる。
【００３６】
〔有効成分として５−アミノレブリン酸を有する医薬組成物〕
本明細書に開示された医薬組成物は、有効成分として５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）を有している。医薬組成物中の５−ＡＬＡの好ましい濃度の例として、１ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、および６０ｍｇ／ｍＬが挙げられ、いずれも粉末状である。５−ＡＬＡは、被検者への投与に適した形態であればいずれの形態であってもよく、例えば、遊離性粉末、液体で再構成される粉末、錠剤、またはカプセル等の形態である。
【００３７】
いくつかの実施形態において、５−ＡＬＡは、本明細書に開示されている医薬組成物中の唯一の有効成分である。その他の実施形態では、上記組成物は、固形腫瘍細胞に特異的に局在するようになる５−ＡＬＡの能力を高める他の有効成分、あるいは、自体固形腫瘍細胞に特異的に局在するようになる他の有効成分を含んでいる。
【００３８】
特に好ましい実施形態では、有効成分として５−アミノレブリン酸を有する上記医薬組成物は、グリオランＴＭであり、グリオラン中には、粉末状の５−ＡＬＡが３０ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれている。
【００３９】
〔有効成分として５−アミノレブリン酸を有する医薬組成物の投与〕
上記の医薬組成物は、重大な副作用を引き起こすものではないと共に、本明細書に記載の方法に適した時間の経過後に腫瘍のサイトゾルに十分に負荷されるように、被検者によって代謝され得る任意の投与量で被検者に投与してもよい。５−ＡＬＡの投与量の例として、１ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、および６０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。
【００４０】
上記医薬組成物は、その利便性から経口投与することが好ましい。しかし、上記医薬組成物は、他の経路を介して、例えば、静脈内、くも膜下腔内、腫瘍内、または、手術中に洗浄液または注入液として嚢胞性空間内へ直接投与されるように製剤されてもよい。
【００４１】
腫瘍のサイトゾルが５−ＡＬＡで負荷されて微小粒子を放出し始めるように、上記医薬組成物は、微小粒子と結合する５−ＡＬＡを検出するための所望の時間が経過する前に、十分に投与される。微小粒子中の５−ＡＬＡの含有量が腫瘍のサイトゾル中の５−ＡＬＡと平衡状態となるのに十分なくらい前に、上記医薬組成物を投与することが好ましい。例えば、微小粒子と結合した５−ＡＬＡが検出される、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、２４時間、または４８時間前に、上記医薬組成物を投与してもよい。検出の２〜４時間前に５−ＡＬＡを投与することが最も好ましく、４時間前がさらに好ましい。
【００４２】
〔生体試料〕
本明細書に記載された方法において用いられる生体試料としては、５−ＡＬＡの検出を可能とするのに十分な量の固形腫瘍由来の微小粒子を含む任意の生体試料が挙げられる。上記試料は、全血、血清、または血漿であることが好ましい。いくつかの実施形態において、上記生体試料は、血清、尿、涙、母乳、リンパ液、滑液、気管支肺胞洗浄液、羊水、唾液、眼液、腹水、または呼吸器飛沫である。
【００４３】
〔固形腫瘍由来微小粒子と結合した５−アミノレブリン酸のＰＰＩＸへの変換レベルの検出〕
固形腫瘍由来微小粒子と結合した５−アミノレブリン酸のＰＰＩＸへの変換レベルは、当業者に公知の任意の方法を用いて検出しうる。
【００４４】
＜微小粒子の分離＞
これらの方法における最初のステップは、当業者に公知の標準的な方法を用いて全種類の組織に由来する微小粒子を分離することを含んでいてもよく、結果として特定のアイデンティティ・マーカー（例えば、アネキシン）で微小粒子が分離されることになる。上記の標準的な方法として、超遠心分離、ショ糖勾配、親和性精製、濾過、ゲル濾過、または親和性捕捉が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００４５】
上記の方法の次のステップは、組織特異的微小粒子集団の分離であってもよい。
【００４６】
脳由来の微小粒子が必要であると共に、生体試料に脳由来微小粒子のみが含まれると予想される場合、特異的に脳に由来する微小粒子を分離または特定するために特定のステップを行う必要はない。しかし、５−ＡＬＡは脳以外の組織と結合するので、生体試料が非脳組織由来の微小粒子を含む可能性がある場合、本方法は、脳由来の微小粒子を分離または特定するステップを含むべきである。脳特異的腫瘍マーカーの例として、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、テネイシン−Ｃが挙げられる。代替的な方法には、微小粒子源としての他の組織を排除するために、他の細胞種に見られる他の抗体−抗原を用いる方法が含まれる。骨髄細胞と、脳と、内皮細胞とからそれぞれ発生した微小粒子間の区別をするために、例えば、ＲＧＤインテグリン（アルファＶベータ３）およびグリコフォリンＡモノクローナルを用いてもよい。例えば、グリコフォリンを有する微小粒子は、骨髄に由来している。
【００４７】
＜５−ＡＬＡのＰＰＩＸへの変換の検出＞
腫瘍由来の微小粒子を分離した後、これらの微小粒子と結合する５−ＡＬＡのＰＰＩＸへの変換レベルを様々な方法によって測定することができる。かかる方法の一例は、５−ＡＬＡの代謝の結果生じるＰＰＩＸが検出される。この方法は、ＰＰＩＸの蛍光を検出することによって行うことができる。青色光（波長４００〜４１０ｎｍ）で励起すると、ＰＰＩＸは赤紫光を発する。蛍光は、ナノ粒子トラッキング解析において検出されてもよい。ナノ粒子トラッキング解析は、例えば、ＮＴＡ分析法（Nanosight Ltd, Wiltshire, UK）を用いて行うことができる。これにより、微小粒子の総数が直接測定され、定量される。
【００４８】
他の方法によれば、５−ＡＬＡをＰＰＩＸへ変換する酵素の検出が行われる。当該酵素としては、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、ＡＬＡデヒドラターゼ、ＰＢＧデアミナーゼ、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩシンターゼ、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ、およびコプロポルフィリノーゲンＩＩＩオキシダーゼ（ＣＰＯＸ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに他の方法によれば、変換経路における主要な代謝物または中間体を検出する。主要な代謝物または中間体としては、ポルホビリノーゲン（ＰＢＧ）、ヒドロキシメチルビラン、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩ、コプロフィリノーゲンＩＩＩ、またはプロトポルフィリノーゲンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
〔実施例〕
〔実施例１：５−ＡＬＡを投与されたＧＢＭ患者からの血液由来の微小粒子の検出および評価〕
本実施例では、経口投与後の小分子薬物の検出を実施する。上記薬物は腫瘍細胞に吸収され、酵素的に変換され、そして投与から数時間以内に循環する微小粒子に再流入されうる。さらに、上記の腫瘍細胞中での小分子薬物の酵素的な変換は、蛍光によって、血液由来の微小粒子から検出可能であった。
【００５０】
この研究の目的は、（ｉ）グリオランＴＭを経口投与された膠芽腫（ＧＢＭ）患者の血清から採取したナノメートル径の微小粒子を分離し、（ｉｉ）２つの異なる分離方法（ｄｄＨ２０およびＰＢＳに基づくクロマトグラフィー）を用いて微小粒子の数を定量し、および、（ｉｉｉ）ＵＶレーザーで励起した時、これらの微小粒子が、検出可能なレベルの内因性蛍光を含んでいるか否かを判断することである。
【００５１】
グリオラン（登録商標）（５−アミノレブリン酸塩酸塩）は、現在、神経膠腫（ＷＨＯグレードＩＩＩおよびＩＶ）の手術中に、悪性組織を可視化するためにヨーロッパで認可されている。当該剤は、現在、腫瘍の切除を最大にするために、蛍光ガイド下手術の添加剤として研究されている。本研究は、腫瘍由来の微小粒子を内因的に標識化、追跡、および定量するための新規な手段として、グリオラン（登録商標）で負荷された腫瘍が、５−ＡＬＡ由来の蛍光物質を含む循環微小粒子を放出することが可能であるか否かを明らかにするために行われた。
【００５２】
グリオラン（登録商標）（２０ｍｇ／ｋｇ）の経口投与前、および、経口投与後４８時間までの異なる時点で、手術中のＧＢＭ患者（ｎ＝１９、口腔腫瘍選択性、手術結果向上）から血清試料を収集した。ゲル濾過によって微小粒子を分離し、微小粒子の粒径／数、およびタンパク質含有量について、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）およびＢＣＡを用いて評価した。微小粒子からの内因性蛍光を、ＮＴＡを用いて蛍光検出モード（λｅｘ＝４０５ｎｍ、λｅｍ＞４３０ｎｍ）にて評価した。その結果は、微小粒子（モード直径：５０〜１００ｎｍ）が、血清（タンパク質含有量＝血清に対して２８３．５＋４７μｇ／ｍｌ）１ｍＬに対して、約１０１１粒子／ｍＬの濃度で含まれることを示している。粒径（約２０ｎｍ〜約２００ｎｍ）に基づいた多数の微小粒子の表現型が、蛍光モード下で観察された。これは、放出された微小粒子の少なくとも２つの主な集団の生合成中にサイトゾル蛍光物質が捕捉されることを示している。グリオラン（登録商標）を投与されたＧＢＭ患者からの微小粒子は、投与後に全微小粒子数のごく一部（約０．１％）で観察された蛍光種を含んでいる。このことは、放出された微小粒子と共に細胞サイトゾルが循環する可能性があることを示唆している。これらの結果は、４〜４８時間で定量化できる。
【００５３】
この実施例は、経口投与後の小分子薬物が、腫瘍細胞によって吸収され、酵素的に変換され、そして投与から数時間以内に循環微小粒子に再流入可能であるということを初めて証明した。このように腫瘍の機能を直接測定することによって、この新規の「液体生検」手法に関する多様な治療および薬剤開発の提供が可能となる。
〔材料および方法の概要〕
＜微小粒子の分離＞
２つの医療センターで手術中のＧＢＭ患者からの凍結された血清試料を受領した。これらの血清試料は、グリオラン（登録商標）（５−アミノレブリン酸、５−ＡＬＡ）を経口投与する直前、および、投与後の異なる時点で採取された。
【００５４】
２％アガロース（アガロース２Ｂ、ＡＢＴ、www.abtbeads.com）を固定相とし、ｄｄＨ２０またはｐＨ７．４のＰＢＳを移動相とするサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、コントロール（「健常」なＡＢ血清、Sigma Aldrich, St. Louis, MO）、および、患者の血清または血漿試料から微小粒子を分離した。カラムを、１００ｍＬの４０％ｖ／ｖのアガローススラリーのｄｄＨ２０溶液を入れたバイオラッドエコノカラム（２．５ｃｍＩＤ×１０ｃｍ）に装填した。その結果、最終装填ベッドボリュームが約４０ｍＬのカラムが得られ、当該カラムを４℃で一晩おいて平衡状態にした。実験日にカラムを平衡状態にするために、当該カラムを３００ｍＬの移動相で洗浄した。ベッドボリュームへの装填試料は、１〜２．５％ｖ／ｖの間で変動したが、これはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の製造業者の指示書の範囲（＜５％ｖ／ｖ）に十分入っている。
【００５５】
血清試料、血漿試料、および微小粒子試料は、実施可能な範囲でできるだけ暗い周囲条件下で処理した。微小粒子を回収し、アンバーエッペンドルフチューブ内に保存した。カラムの空隙（除外）容量（約１０ｍＬ：微小粒子が溶出すると考えられる）と、カラムの保持（充填）容量（約４０ｍＬ）とを明確にするために、タンパク質スタンダードとブルーデキストリンとの混合物を用いた。
【００５６】
Ｆｒａｃ９５０フラクションコレクターを備えたＧＥ  ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  １０システム（GE Healthcare, Piscataway, NJ）を用いて、試料のＡ２８０と、試料の伝導率をモニターしながら、２ｍＬ／分の流速で希釈剤を流して、室温で試料を処理した。２ｍＬ／分の流速と３０秒の収集周期性とを用いて、１ｍＬの溶出試料を得た。
【００５７】
研究用試料またはヒトの健常コントロール群（ＡＢ血清、Sigma Aldrich）からのいずれかの血清は、Ａ２８０でモニターした時、保持容量が約１０ｍＬと約４０ｍＬの２つの部分的な分離されたピーク（＃１および＃２）をもたらした。複数の供血者の部位からの血清は、同様の溶出プロファイルをもたらした。試料中の伝導率の大部分は、２％アガロースサイズ排除カラムから溶出された時に、イオン、電荷を有するアミノ酸／ペプチド、および他の低分子量種の物であると予想されるように、２つのピークのうちの後者（溶出量が約４０ｍＬ）に関連していた。このパラメーターは、第２のピーク（ピーク＃２）の始まりを区分するために使用した。
【００５８】
その高い分子量を考慮すると、微小粒子は、アガロースカラムの空隙（除外）容量（ピーク＃１）に溶出する。ピーク＃１の吸光度Ａ２８０と関連する第１の７×１ｍＬ分画を収集、貯留し、次の処理のために７×１ｍＬのアリコートに分けて、−８０°Ｃで保管した。全タンパク質および微小粒子含有量について、研究セットにおける各試料に関しピーク＃１から得た１ミリの分画を分析した（下記参照）。
【００５９】
＜微小粒子のタンパク質含有量＞
標準曲線を作成するために、ＢＳＡを用いて、製造業者の指示書に従って、サーモサイエンティフィックマイクロビシンコニン酸タンパク質アッセイ（Thermo Scientific Micro bicinchoninic acid (BCA) Protein Assay）を用いて、微小粒子の調合液における総タンパク質濃度を定量した。
【００６０】
＜微小粒子含有量および粒径分布＞
ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）法（Nanosight, LM 10 system, NanoSight Ltd.Wiltshire, UK）を用いて、平均流体力学的直径が５０〜５００ｎｍの微小粒子を定量した。この確率論的な単一粒子検出方法は、個々の粒子からの光の散乱に基づいて、平均（時間平均、視野）粒子数、および粒子の予想流体力学的直径を測定するために、ストークス・アインシュタインの関係を用いる。さらなる詳細については、www.nanosight.com、Dragovicらの文献（２０１１）、および、それらの参考文献から入手可能である。
【００６１】
５０〜４００ｎｍの標準ビーズを用いて計器を校正および検定した。システムを校正するために１００ｎｍのビーズに対して実験をした。標準ビーズ（直径：１００ｎｍ）は、室温で、低粘度（約１ｃＰ）水溶液中で約９７（±２）ｎｍの実験直径をもたらした。測定対象である微小粒子は、５０〜１５０ｎｍの平均流体力学的直径を有すると予想される。
【００６２】
例えば、１フレームごとの対象粒子、データ収集期間；ＰＭＴ電圧、識別設定等についての製造業者の指示書を利用してすべての測定を実施した（www.nanosight.com、および標準的な計器設定の詳細については、Dragovic et al.,（２０１１）（ナノ粒子トラッキング解析を用いた細胞小胞の粒径および表現型）Nanomedicine: NBM 2011;7:780-788, doi:10.1016/j.nano.2011.04.003）。
【００６３】
標準的な蛍光の読取工程（６０秒）の間に、光安定性が高い蛍光物質のみが観察される。これは、蛍光粒子は、少しでもあるとすれば、総収集期間の大部分にわたって発光領域に存在しているためである。したがって、観察細胞中を一定の低流速で移動する試料から収集した蛍光から得られたデータを分析するＬＭ１０ＮＴＡ解析ソフトウェアの改良版が用いられた。各分析測定を３回繰り返して各試料を分析した。
【００６４】
〔結果〕
＜微小粒子の分離＞
ＡＢコントロール血清：移動相としてｄｄＨ２０を用いた場合、装填されたＡＢコントロール血清試料は、２つの部分的に分離されたＡ２８０ｎｍのピークと、ほぼ例外なく第２溶出ピーク（Ｖｐｅａｋ約４０ｍＬ、図１Ａ）と相関する伝導率の測定可能な溶出（イオン、電荷を有するペプチド／代謝物等によると考えられる）とをもたらした。これとは対照的に、伝導率は、ピーク＃１（Ｖｐｅａｋ約１０ｍＬ）と関連していなかった。これは、高い分子量を有する対象の微小粒子が含まれているためであると考えられる。
【００６５】
移動相として（１００％ｖ／ｖ）ＰＢＳを用いた場合、ピーク＃２に対するピーク＃１の相対的なＡ２８０のピークの高さが、移動相としてｄｄＨ２０を用いて観察された高さと比較して大きく減少した（約９０％）（図１Ｂ）。ピーク＃２に関連する伝導率は、ＰＢＳの基線から約１７ｍＳ／ｃｍほど一時的に減少したが、これはピーク＃２のピーク伝導率（＜＜１７ｍＳ／ｃｍ）と一致する。
【００６６】
ＧＢＭ患者の血清：それほど目立たないが同様の効果が、臨床のＧＢＭ患者から得た血清を用いた場合に観察された（図２Ａ〜２Ｃ参照）。この特定の患者については、ピーク＃１のＡ２８０は、ｄｄＨ２０中の約２０００ｍＡＵから、１０％ＰＢＳ中の約１０００ｍＡＵ、及び、１００％ＰＢＳ中の約８００ｍＡＵにそれぞれ減少した。同等に、ピーク＃２のＡ２８０は、約１５００ｍＡＵから、約１９００ｍＡＵ、および、約２００ｍＡＵにそれぞれ増加した。また、伝導率のプロファイルは条件に応じて予想通りに変化した。
【００６７】
６人の患者の試料を使用して、０．５ｍＬの血清を用いて、上述したようにｄｄＨ２０およびＰＢＳ中で微小粒子を分離し、その後、（図１Ａ、１Ｂ、図２Ａ〜２Ｃに記載されているように）ピーク＃１に含まれる（７つのうちの）１つのアリコートのタンパク質濃度を測定した。結果を表１に示す。これらの６人の患者の総タンパク質濃度は、水中で約２００〜３００μｇ／ｍＬの範囲であり、ＰＢＳ中で約５〜１０μｇ／ｍＬの範囲であった。
【００６８】
【表１】
2018141792.tif 000003
【００６９】
分離処理において２つの移動相を比較した場合、１０％のＰＢＳ、または漸次的に、１００％ｖ／ｖのＰＢＳの移動相と比較して、試料が水の移動相に溶出したときに、コントロール試料と患者の試料の両方に対して高いＵＶ吸光度が観測された。ＧＢＭ患者から得た微小粒子（（ピークでプールされた７ｍＬのうちの）１ｍＬ中の総タンパク質濃度は、水と共に溶出した時は約２００〜３００μｇ／ｍＬ（元の血清中においては約５ｍｇ／ｍＬ）であり、ＰＢＳで溶出した時は５〜１０μｇ／ｍＬ（元の血清中においては約１００〜２００μｇ／ｍＬ）であった。ピーク＃１中に検出された分子源または超分子源（例えば、「エクソソーマル」、他の高ＭＷ粒子等）は、現在のデータからは決定できない。これらのデータは、空隙容量中に溶出している全ての微小粒子源から得られる総タンパク質の加重平均を示している。
【００７０】
＜微小粒子の定量＞
クロマトグラフィー分離のピーク＃１から得た微小粒子の定量（図１Ａ、１Ｂ、図２Ａ〜２Ｃ参照）を、ＮＴＡ解析法（Nanosight Ltd, Wiltshire, UK）を用いて行った。
【００７１】
図３Ａ〜３Ｄに標準的なナノサイト（Nanosight）ＮＴＡ分析結果を示す。この報告書には、粒子／粒径分布（左上）、試料のビデオ画像（右上）、強度に対する粒径（両下）が含まれている。分析前に、概して、１０００倍に試料を希釈した。
【００７２】
＜微小粒子の定量に与える水およびＰＢＳの影響＞
（図２Ａ〜２Ｃにおいて参照された）２つの微小粒子試料については、３つの条件下（水、１０％ＰＢＳ、及び１００％ＰＢＳ）で分離した場合の総微小粒子数を、光散乱によりＮＴＡを用いて定量した（表２参照）。
【００７３】
希釈係数：次のことに注意すること：１ｍＬの装填血清から得た高分子重量分画は、クロマトグラフィー中に、７〜１０倍に希釈されると推定される（０．５ｍＬの装填血清では１５〜２０倍に希釈される）。したがって、表２に示される貯留された微小粒子分画における総粒子数は、約３×１０１１／ｍＬであるのに対し、元の血清ごとの概算粒子数は、約２×または１０１２／ｍＬと概算される。「ＬＳ」は、光散乱検出モードを指し、「ＦＬ」は蛍光検出モードを指している。
【００７４】
【表２】
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【００７５】
ＮＴＡ法は、定義上は、単一粒子解析法であるため、あらゆる確率的測定に関連する長所および制限を有している。測定時間（３０〜６０秒）は、データ量の管理と、全体としての試料集団を表すデータ精度の追及との間の実際的な折衷案として選択された。必然的に、少数の大きい（それゆえ比較的静止している）粒子が、視野におけるその滞留時間と、光散乱特性との両方に基づいて、統計に影響を与え得る。集団レベルで、ＮＴＡは、粒径分布分析を提供する。この粒径分布分析から、粒径分布に対する粒子数を要約するために、平均、モード、中央値、および他の統計パラメーターが定義されてもよい。本研究において、粒径分布に対する粒子数を表すために使用したアルゴリズムは、Ｄ９０／Ｄ１０インデックスであった。このインデックスは、粒子のうち最も大きい１０％の粒子を含んでいる粒子直径と、最も小さい１０％の粒子を含んでいる直径との比率である。Ｄ９０／Ｄ１０の比率は、「多分散指数」である。同一の流体力学的直径を有する粒子の完全に均質的な集団は、多分散指数１．０を有する。多分散指数は、多分散の適用可能な唯一の測定方法であり、完全な粒径分布曲線の代わりとして容易に利用可能であるものと考えられる（図３Ａ）。
【００７６】
ＰＣＳ、ＦＣＳまたはＦＩＤＡのような、あらゆる単一粒子検出／確率論的な技術（と同様に、フレーム／視野ごとに測定された事象の最適値がある。試料は、時間平均で１視野につき約５０粒子をもたらすよう希釈された（光散乱を介して総粒子数を測定する時、微小粒子試料を概して２００〜２０００倍希釈することになる）。したがって、微小粒子数は、およそ１視野において約１０８／ｍＬであり、それゆえ、微小粒子試料の希釈前は約１０１１／ｍＬであった。
【００７７】
表２は、光散乱（ＬＳ）モードで測定した場合、水中（約３×１０１１ｍＬ−１）において１ｍＬの血清のクロマトグラフィーを行った時、ＰＢＳ（約０．３×１０１１ｍＬ−１）と比較して、試料において検出された微小粒子が約１／１０に減少したことを示している。Ａ２８０の値（図２Ａ〜２Ｃ）と整合して、純水と、１０％ｖ／ｖＰＢＳとの間に最大の差が観察され、１０％ＰＢＳと１００％ＰＢＳとの間にわずかな差が観察された。ＰＢＳ中で分離された試料についてはモード粒子径が増加しているように見える。但し、この差は大きなものではなく、Ｄ９０／Ｄ１０の多分散指数は大きく変化していない（３．５〜４．１の範囲）。
【００７８】
それにもかかわらず、表２から、図２Ａ〜２Ｃにおいて観察されるＡ２８０のピークの減少は、光散乱モード下でＮＴＡによって測定した場合に、５０〜１５０ｎｍの流体力学的直径を有する微小粒子の対応する減少に関連するという結論に至る。
【００７９】
微小粒子数は、分子の組成または細胞源と関係なく、１５〜５００ｎｍの流体力学的直径を有する光（又は蛍光、下記参照）を散乱する微小粒子の数として、運用上定義されている。
【００８０】
＜微小粒子の定量およびタンパク質濃度に対する水およびＰＢＳの影響＞
ＧＢＭ患者から得た、他の一連の６つの０．５ｍＬの血清試料に対して、１０％ＰＢＳを除外した以外は表２に類似した実験を行った（表３）。この表には、総タンパク質含有量（μｇ／ｍＬ）に対する微小粒子数／ｍＬ（光散乱下）の比率が含まれている。この比率の単位はuｇ−１（×１０８）である。
【００８１】
６つの試料のすべてについて、光散乱ＮＴＡによって測定した場合、水中における微小粒子の分離が、４〜５倍高い微小粒子数をもたらした（約１０倍高い−表２）。しかし、ＰＢＳ中で微小粒子を分離した場合、タンパク質の濃度は１／４０〜５０に低下するため（表６）、粒子数／タンパク質（μｇ）の比率は、ＰＢＳ中において、約１０倍高くなる。
【００８２】
この差の分子的機序はすぐに明らかになるものではない。しかし、既に説明したように、また、下記に記載するように、測定した微小粒子は、「細胞エキソソーム」に加えて、脂質、タンパク脂質、および他の構成要素から寄与を受けている可能性がある。これらの種のいくつか、またはすべては、ｐＨ、イオン強度、または、特定の塩の相互作用によってかなり影響される可溶特性および凝集特性を有している可能性がある。上記のｐＨ、イオン強度、または、特定の塩の相互作用は、水、１０％ＰＢＳ、およびＰＢＳの間で顕著に相違し得るので、サイズ排除クロマトグラフィー、および、その後のＮＴＡ測定に関するそれらの特性に影響を与え得る。
【００８３】
【表３】
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【００８４】
ＬＭ１０ＮＴＡ計器およびソフトフェアは、２つのモード（帯域フィルターを有さないモード（光散乱モード）、あるいは帯域フィルターまたは他の干渉フィルターを備えたモード（蛍光モード））で駆動させることができる。現在の計器の構成では、試料観察チャンバとＣＣＤ検出器との間にカットオンフィルターが備えられている。このフィルターは、約４３０ｎｍ未満の波長で低透過率を示すと共に、約４３０ｎｍより高い波長で高透過率を示すような光学的性質を有している（しかしながら、低透過率から高透過率への遷移は、正確に丁度４３０ｎｍで生じるわけではない）。
【００８５】
それにもかかわらず、光路に設けられたカットオンフィルターを有する蛍光モードで、約１０８ｍＬ−１の濃度で１００ｎｍの蛍光微小球を容易に検出することができ、室温で測定した場合、概して、約９５〜１０５ｎｍの流体力学的直径がもたらされた。典型的な蛍光粒子分布分析の概要を図４Ａ〜４Ｃに示す。このようにして、我々は、約１０８粒子／ｍＬの濃度で、ストークスシフトが大きく、光安定性が良く、しかも量子収量／消衰係数が高いナノメートルサイズの外因性蛍光物質を容易に検出および定量することができるという結論に至った。
【００８６】
＜ＧＢＭ患者における蛍光微小球の検出＞
示されているように、サイズ排除クロマトグラフィー用の移動相として水（図１３Ｂ）、またはＰＢＳ（図１３Ａ）を用いて、ＧＢＭ患者から分離した微小粒子であって、標識化されていない微小粒子に関する同様の実験を行った場合に得られたデータを図１３にまとめた。４０５ｎｍのレーザー（以下「蛍光」と称す）で試料を励起した後に４３０ｎｍのカットオンフィルターを透過し、ＣＣＤによって検出された光は、外因的に標識化されていないので、微小粒子内の内因性の蛍光物質からのみ発生するということを我々は重要視している（Ｄｒａｇｏｖｉｃ et al.（２０１１）と比較）。
【００８７】
これらの実験において、我々は、（散乱）総粒子数（約１０１０／ｍＬ）と比較して非常に低濃度（約１０８／ｍＬ）であるにもかかわらず、試料中に蛍光微小粒子と見られるものを観察した。したがって、微小粒子試料を分析した結果、それらはクロマトグラフィー法によって得られたアリコートから予め希釈されたものではなかった（「純微小粒子」とも称される）。
【００８８】
次に、長時間の間に光退色したと見られる明らかな蛍光を観察したので、流速に基づいた測定を行った。それによって、微小粒子の新しい（「光退色していない」）アリコートで視野を「満たす」ために、低速（ｎＬ／分）で試料をフローセルに注入し、そして該フローセルから試料を取り出した。試料流速を制御し確認するＮＴＡ分析ソフトウェアを使用した。最後に、これらの実験で用いた計器の光路は、視野において干渉した。この干渉は、この影響を除去するために分析法の変更を必要とした。このことによって、得られたデータの質が必然的に損なわれた。３つの主な手順および光散乱方法に対する計器変更によって、表１３に示すデータを得た。
【００８９】
〔考察〕
蛍光測定に関して図１３に示すモードサイズ、粒子数、および多分散指数（Ｄ９０／Ｄ１０）の計算は、光散乱について用いたものと同一であり、ＮＴＡ分析ソフトウェアから得られたものであることに注目することは重要である。
【００９０】
具体的には、このレポートのデータについて、ＮＴＡ分析法ソフトウェアは、ゲーティングなしに、最も多い粒径（モードサイズ）および粒子数を選択する。多くの試料について、比較的狭い分布内に、多くの小さな粒子（１５〜３０ｎｍ）が観察された。それゆえ、上記の粒子は、一般に、モード（最も一般的な）粒径として表される。このモード粒径を割り出すための自動分析は、多くの試料に存在する、より大きい（５０〜５００ｎｍ）微小粒子を確認するものではない。小さい蛍光粒子および大きい蛍光粒子が広範囲であることは、高Ｄ９０／Ｄ１０多分散指数（多くの試料において１０よりも大きい）に反映されている。ＰＢＳ中で調製された試料については、２つの粒子集団のうち大きい方がモード値である場合がある。したがって、その場合、自動分析は、この粒径範囲を自動値として選択する。
【００９１】
現在用いられている自動分析の制限の結果、手動で各蛍光集団ファイルを再検討し、その粒径分布に従って、それらを定性的に４つの容器に分類した（表６；実施例１の末尾のデータ付録）。実施例ＸＰＳの結果、およびデータ記述をデータ付録にまとめた。
【００９２】
〔データのまとめ〕
５０〜１００ｎｍのモード流体力学的直径を有する微小粒子を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分離し、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）を用いて微小粒子の粒径／数を特徴づけ、ＢＣＡを用いてタンパク質含有量を特徴づけた。移動相として、ｄｄＨ２０、またはｐＨ７．４のＰＢＳのいずれかを用いてクロマトグラフィーによって微小粒子を得た。また、このようにして得られた微小粒子中の内因性蛍光を、蛍光検出モード（λｅｘ＝４０５ｎｍ、λｅｍ＞４３０ｎｍ）で、ＮＴＡを用いて評価した。
【００９３】
これらの結果は、光散乱によって測定した５０〜１００ｎｍのモード直径を有する微小粒子が、ｄｄＨ２０中でクロマトグラフィーを用いて分離した場合、約１０１２粒子／ｍＬの血清濃度でＧＢＭ患者の血清に存在することを示している。しかしながら、ＰＢＳ中でサイズ排除クロマトグラフィーを行った場合、水中における場合と比較して、モードサイズが著しく少ない（４〜１０倍少ない）微小粒子が得られた。さらに、ＰＢＳ中で分離された微小粒子は、水中で分離された微小粒子と比較して、より少ないタンパク質含有量を有すると思われる。この差異の根拠はすぐに明らかになるものではない。
【００９４】
ほぼこれらの寸法（約１５〜５００＋ｎｍの不均一性の高い見かけの粒径分布であるにもかかわらず）の微小粒子が、蛍光モード下で観測されている。このことは、４０５ｎｍで励起された時、これらの微小粒子が、４３０ｎｍより高い波長の蛍光を有する内因性蛍光物質を含有することを意味している。これらの蛍光微小粒子の数は、光散乱によって測定した微小粒子総数の１％より遥かに小さいと思われる。
【００９５】
結論として、グリオラン／５−ＡＬＡを経口投与されたＧＢＭ患者の血清から調製した微小粒子は、サイズ排除クロマトグラフィーによって分離された場合、投与から約４〜４８時間後に、定量可能な、微小粒子の総数のうちのごく少数（＜＜１％）に観測される内因性の蛍光物質を含有している。
【００９６】
表４は、血清から分離された微小粒子から示されたデータのまとめの概略を示している。ＮＴＡ分析によって評価された微小粒子の量、それらの粒径、および蛍光の範囲が示されている。
【００９７】
【表４】
2018141792.tif 000006
【００９８】
〔実施例１の物質および方法の詳細〕
＜物質＞
ＡＢ血清（血液型がＡＢ型であるグループの供血者から得たヒトの血清）：Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ
バイオラッド、エコノカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｅｃｏｎｏｍ  Ｃｏｌｕｍｎ）クロマトグラフィーカラム（２．５ｃｍ  ＩＤｘ１０ｃｍ）
マイクロＢＣＡタンパク質アッセイキット（サーモサイエンティフック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））
ＰＳビーズ：１００ｎｍのポリスチレンビーズ
２％架橋アガロース（ＡＢＴ，www.abtbeads.com，  Ｆｌｏｒｉｄａ，  ＵＳＡ）
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ：７．４）
ＧＥ  ＡＫＴＡ  Purifier１０、およびＦＲＡＣ９５０システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ），  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）
＜サイズ排除クロマトグラフィーパラメーター＞
【００９９】
【表５】
2018141792.tif 000007
【０１００】
＜臨床試料＞
血清の研究試料は、ミュンスター（ドイツ）のスポンサー、および米国のエモリー（Emory）大学から提供され、約１〜２ｍＬのアリコートにおいてドライアイスで凍結された状態で、ＤＨＭＲＩで受領した。室温（約２２℃）で作業台上で一旦解凍し、下記に記載のように、微小粒子を分離するために０．４〜１ｍＬのアリコートを処理した。残った試料があれば再び凍結させ、−８０℃で保管した。
【０１０１】
＜蛍光ＮＴＡ  ＸＰＳの結果＞
図５〜１２において、粒子数（ｎ）は、ＮＴＡソフトウェアによって直接的に生成された。つまり、粒径分布範囲にわたって全粒子が均等にカウントされるように、ゲーティングが適用されなかった。モード（ｎｍ）は、ＮＴＡソフトウェアによって直接的に生成され、最も一般的なサイズを指している。平均（ｎｍ）はＮＴＡソフトウェアによって直接的に生成され、全値の平均値を指している。Ｄ９０／Ｄ１０は、ＮＴＡソフトウェアによって得られた値から計算され、試料の幅／分散性の程度を指している。定性的ピークは、ソフトウェアがバイモーダル分布を検出した場合に、どこに第２の「大きい」ピークが生じるかに関する定性的評価を指している。「カテゴリー」は、主観的に選択された４つのカテゴリー（または特徴）の（Ａ〜Ｄの）うちの１つを指している。
【０１０２】
〔データ付録〕
この付録は、上記の結果および考察の項目で言及された表６を含んでいる。
【０１０３】
【表６】
2018141792.tif 000008
【０１０４】
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【０１０５】
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【０１０６】
表６に示されている特徴を下記に記載する。
タイプＡの特徴：小さい（１０〜３０ｎｍ）粒子がほとんどない；大きい粒子（概して１００〜３００ｎｍ）が明確に分布する；平均直径およびモード直径が比較可能（２倍以内）である、低Ｄ９０／Ｄ１０（１０未満、概して４〜７）である；高粒子数（１．０×１０８／ｍＬより大きい）と関連付けられることが多い；溶出緩衝剤としてＰＢＳを用いる。
タイプＢの特徴：小さい（１０〜５０ｎｍ）粒子が多い；大きい粒子（概して１００〜５００ｎｍ）が明確に分布する；平均直径とモード直径が大きく異なる（概して１０倍より大きい）；高Ｄ９０／Ｄ１０（概して１０〜２０）である；低粒子数または中間的な粒子数（概して０．５〜１．０×１０８／ｍＬ）と関連付けられることが多い。溶出緩衝剤として、ＰＢＳ、および特に水を用いた時に観察される。
タイプＣの特徴：小さい（１０〜５０ｎｍ）粒子が多い；大きい粒子の明確な分布がない；平均直径およびモード直径が比較可能（かつ直径が小さい）；高Ｄ９０／Ｄ１０（概して１０〜２０）である；低粒子数または中間的な粒子数（概して０．５〜１．０×１０８／ｍＬ）と関連付けられることが多い；溶出緩衝剤として水を用いる。
タイプＤの特徴：小さい（１０〜５０ｎｍ）粒子が多い；大きい粒子の明確な分布がない；平均直径およびモード直径が比較可能（かつ直径が小さい）；高Ｄ９０／Ｄ１０（概して２０〜４０）である；低粒子数または中間的な粒子数（概して０．５〜１．０×１０８／ｍＬ）と関連付けられることが多い；溶出緩衝剤として水または１０％ＰＢＳを用いる。
【０１０７】
〔実施例２：放出微小粒子中に観察されるＣＰＯＸの媒介による変換処理を介した、Ｕ８７細胞株による５−ＡＬＡのＰＰＩＸへの変換〕
本実施例は、Ｕ８７細胞培養が活発に５−ＡＬＡをＰＰＩＸに変換することを示しており、これらの細胞がコプロポルフィリノーゲンＩＩＩオキシダーゼ（ＣＰＯＸタンパク質）を生成し、ＣＰＯＸタンパク質およびＰＰＩＸが、癌細胞株中の放出微小粒子中に存在していることを示している。
【０１０８】
＜Ｕ８７のインビトロ研究＞
Ｔ−７５フラスコ内で成長したＧＢＭ腫瘍の典型的なＵ８７細胞を、血清の非存在下で、４時間または２４時間５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ；２５０μｇ／ｍｌ）に曝露し、その後、４０６ｎＭの紫波長での励起により、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターにて細胞を蛍光励起させた。プロトポルフィリンＩＸ（ＰＰＩＸ）を検出するために、フィルターの仕様を、４５０／５０、または６１０／２０のいずれかに設定した。
【０１０９】
時間の関数としての平均蛍光指数（ＭＦＩ）は、５−ＡＬＡの非存在下では変化しなかったことが分かった。反対に、ＭＦＩは、５−ＡＬＡへの曝露の４時間後、および２４時間後に観察され、５−ＡＬＡに曝露した後増加した（図１４）。これらのデータは、ヘム合成経路における細胞代謝の生成物として、５−ＡＬＡのその代謝物への変換から得られる代謝生成物としてのＰＰＩＸの一時的な状態を示している。
【０１１０】
＜癌細胞由来の微小粒子へのＣＰＯＸの蓄積＞
酵素コプロポルフィリノーゲンＩＩＩオキシダーゼ（ＣＰＯＸ）は、ヘムポルフィリン代謝に関与する。この酵素が、放出される癌細胞由来の微小粒子に存在するか否かを調べるため、および５―ＡＬＡのＰＰＩＸへの代謝変換における当該酵素の役割を調べるため、癌細胞由来微小粒子のタンパク質試料についてタンパク質分析を行った。
【０１１１】
調整培地中の微小粒子を、Ｖｅｎｃｅｒｅｍｉｎペプチド（New England Peptide, Gardner MA）のうちの１つを用いて培養上清から回収した。微小粒子を回収するために、Ｈｅｌａｄｏｎｉｎ(Hdn; H2N-LKLFEGLTLAGWSFRSLSLGRGKGQSP-OH)と称されるＶｅｎｃｅｒｅｍｉｎペプチドＶｎ９６ｒｅｖｅｒｓｅと、スクランブルペプチドＮＤＮとを用いた。Ｕ８７（ＧＢＭ）およびＨＥＬＡ細胞を、Ｉｎｔｅｇｒａバイオリアクターで培養し、下部チャンバの上清試料（２ｍｌ）を採取し、１０μｌのプロテアーゼ阻害剤、および５０μｇのＨｄｎペプチド原液と混合した。微小粒子をバイオリアクター上清試料から調製し、ＣＰＯＸの存在についてウエスタンブロットで分析した。調整培地の他のアリコートを、放出微小粒子を分離するためにＥｘｏＱｕｉｃｋ(SBI,Systems Biology)に曝露した。ＭＦＣ７およびＫ５６２細胞株の細胞溶解物から得た全てのタンパク質も分析した。表７は、図１４に示す各レーンで分析されたタンパク質試料源の名称を示している。
【０１１２】
【表７】
2018141792.tif 000011
【０１１３】
図１５に示されるように、ＧＢＭおよびＨＥＬＡ細胞株から分離された微小粒子は、抗ＣＰＯＸ抗体を用いて調査したウエスタンブロットに見られるようにＣＰＯＸタンパク質を蓄積した。非特定Ｎｄｎペプチドで分離した試料は、ＣＰＯＸタンパク質を蓄積しなかった。これらのデータは、癌細胞から放出された微小粒子中のＣＰＯＸ酵素の存在を示している。理論化を目的とするわけではないが、ＣＰＯＸは微小粒子中の５−ＡＬＡのＰＰＩＸへの変換に関わると考えられる。さらに、これらのデータは、５−ＡＬＡのＰＰＩＸへの変換に関わる、微小粒子中のミトコンドリア内のバイオマーカー（ＣＰＯＸ）を追跡する能力を明らかにし、腫瘍細胞のバイオマーカーとしてのＣＰＯＸの使用を示唆している。
【０１１４】
〔実施例３：グリオランＴＭの投与によるＧＢＭの検出〕
被検者は、外科的切除、体外照射療法、およびテモゾロマイドによってＧＢＭ治療を受けている。
【０１１５】
各病院の基準プロトコルによって、ＧＢＭの再発についての観察的およびＭＲＩ評価を用いて病気の再発の臨床的症状について定期的に（毎月）被検者を評価する。
【０１１６】
グリオランＴＭ（５−ＡＬＡ）を、採血の予定時間の３時間前に２０ｍｇ／ｋｇ投与する。
【０１１７】
採血を行い、血清を生成するために凝固させるか、あるいは血漿を生成するために５分間１０００ｇで遠心分離する。生体液を−８０℃で凍結させ、後の処理のために保存した。固体相として２％アガロースを用いるサイズ排除クロマトグラフィーを用いて微小粒子を分離する。移動相として、再蒸留したＨ２０（１００％ｖ／ｖ）またはＰＢＳを用い、血清または血漿の装填容量はベッドボリュームの２％未満であり、高分子量物質のための溶出分離はタンパク質スタンダードを用いて確認される。
【０１１８】
これらの微小粒子と関連する５−ＡＬＡを介した蛍光を、ＮＴＡ分析処理（Nanosight Ltd, Wiltshire, UK）を用いて検出する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2018141792.tif 000018
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2018141792.tif 000022
【図４Ｃ】
2018141792.tif 000023
【図４Ｄ】
2018141792.tif 000024
【図５Ａ】
2018141792.tif 000025
【図５Ｂ】
2018141792.tif 000026
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
2018141792.tif 000029
【図６Ｂ】
2018141792.tif 000030
【図６Ｃ】
2018141792.tif 000031
【図６Ｄ】
2018141792.tif 000032
【図７Ａ】
2018141792.tif 000033
【図７Ｂ】
2018141792.tif 000034
【図７Ｃ】
2018141792.tif 000035
【図７Ｄ】
2018141792.tif 000036
【図８Ａ】
2018141792.tif 000037
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
2018141792.tif 000039
【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2018141792.tif 000042
【図９Ｃ】
2018141792.tif 000043
【図９Ｄ】
2018141792.tif 000044
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
2018141792.tif 000046
【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
2018141792.tif 000048
【図１１Ａ】
2018141792.tif 000049
【図１１Ｂ】
2018141792.tif 000050
【図１１Ｃ】
2018141792.tif 000051
【図１１Ｄ】
2018141792.tif 000052
【図１２Ａ】
2018141792.tif 000053
【図１２Ｂ】
2018141792.tif 000054
【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
2018141792.tif 000056
【図１３Ａ１】
2018141792.tif 000057
【図１３Ａ２】
2018141792.tif 000058
【図１３Ｂ】
2018141792.tif 000059
【図１４】
2018141792.tif 000060
【図１５】
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