(57)【要約】【課題】喘息患者の重症発作の発生可能性の予測補助方法を提供することを課題とする。【解決手段】喘息患者の血液試料中のバイオマーカーを測定する工程と、前記バイオマーカーの測定値に基づいて、前記喘息患者の重症発作の発生可能性を判定する工程とを含み、前記バイオマーカーがIL-17を含む、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助する方法によって上記の課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
喘息患者の血液試料中のバイオマーカーを測定する工程と、
前記バイオマーカーの測定値に基づいて、前記喘息患者の重症発作の発生可能性を判定する工程と
を含み、
前記バイオマーカーがIL-17を含む、
喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助する方法。
【請求項２】
前記判定工程において、前記バイオマーカーの測定値が所定の閾値以上である場合、前記喘息患者の重症発作の発生可能性が高いと判定され、
前記バイオマーカーの測定値が所定の閾値未満である場合、前記喘息患者の重症発作の発生可能性が低いと判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バイオマーカーが、IL-10、IL-4、IL-25、IL-9及びIFN-γからなる群から選択される少なくとも一つをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記判定工程において、前記測定工程で取得した前記バイオマーカーの測定値と、各バイオマーカーに対応する所定の閾値とを比較し、比較結果に基づいて、前記喘息患者の重症発作の発生可能性が判定される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記判定工程において、前記IL-17の測定値が所定の閾値以上であり、かつ、前記IL-17以外のいずれか１つのバイオマーカーの測定値が対応する所定の閾値以上である場合、前記喘息患者の重症発作の発生可能性は高く、かつ、薬剤奏功性は低いと判定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記IL-17の測定値が所定の閾値以上であり、かつ、前記IL-17以外のバイオマーカーの測定値の全てが対応する所定の閾値未満である場合、または前記IL-17の測定値が所定の閾値未満である場合、前記喘息患者の重症発作の発生可能性は高いが薬剤奏功性は高いか、または前記喘息患者の重症発作の発生可能性は低いと判定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記判定工程において、前記測定工程で取得した前記バイオマーカーの測定値から多変量解析によって取得される値と、前記多変量解析によって取得される値に対応する所定の閾値とを比較し、比較結果に基づいて、前記喘息患者の重症発作の発生可能性が判定される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記多変量解析が、多重ロジスティック解析である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
喘息患者の血液試料中のIL-17と、IL-10、IL-4、IL-25、IL-9及びIFN-γからなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーとを測定し、バイオマーカーのパラメータセットを取得する工程と、
前記バイオマーカーのパラメータセット、第１のパラメータセット及び第２のパラメータセットを用いてクラスタ解析を行うことにより、前記喘息患者を、最も相関の高い群に分類する工程と、
前記分類工程において得られた結果に基づき、前記喘息患者の重症発作の発生可能性を判定する工程とを含み、
前記バイオマーカーのパラメータセットは、IL-17バイオマーカーの測定値と、IL-10、IL-4、IL-25、IL-9及びIFN-γからなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含み、
前記第１のパラメータセットは、重症発作の発生履歴があり、かつ、薬剤奏功性が低いことが予めわかっている喘息患者の血液試料中のIL-17の測定値と、当該喘息患者の血液試料中の前記選択された少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含み、
前記第２のパラメータセットは、重症発作の発生履歴はあるが薬剤奏功性は高いか、または重症発作の発生履歴がないことが予めわかっている喘息患者の血液試料中のIL-17の測定値と、当該喘息患者の血液試料中の前記選択された少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含む、
喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助する方法。
【請求項１０】
前記分類工程において、前記クラスタ解析が、前記測定工程において測定された前記バイオマーカーのパラメータセットと、前記第１のパラメータセットと、前記第２のパラメータセットとを比較することによって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記判定工程において、
前記第１のパラメータセットと同じ群に分類された場合、前記喘息患者は、重症発作の発生可能性が高く、かつ、薬剤奏功性が低いと判定され、
前記第２のパラメータセットと同じ群に分類された場合、前記喘息患者は、重症発作の発生可能性は高いが薬剤奏功性は高いか、または重症発作の発生可能性が低いと判定される、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記判定工程において、前記喘息患者に12ヶ月以内に重症発作が生じる可能性が判定される、請求項１〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、
前記メモリには、下記のステップ：
喘息患者の血液試料中のバイオマーカーを測定するステップと、
前記バイオマーカーの測定値に基づいて、前記喘息患者の重症発作の発生可能性を判定するステップと
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録され、
前記バイオマーカーがIL-17を含む、
喘息患者の重症発作の発生可能性の予測補助装置。
【請求項１４】
プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、
前記メモリには、下記のステップ：
喘息患者の血液試料中のIL-17と、IL-10、IL-4、IL-25、IL-9及びIFN-γからなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーとを測定し、バイオマーカーのパラメータセットを取得するステップと、
前記バイオマーカーのパラメータセット、第１のパラメータセット及び第２のパラメータセットを用いてクラスタ解析を行うことにより、前記喘息患者を、最も相関の高い群に分類するステップと、
前記分類ステップにおいて得られた結果に基づき、前記喘息患者の重症発作の発生可能性を判定するステップと
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録され、
前記メモリが、第１のパラメータセット及び第２のパラメータセットを記録しており、
前記プロセッサが、
前記測定ステップにおいて測定された前記バイオマーカーのパラメータセットを受信し、
前記第１のパラメータセット及び前記第２のパラメータセットを前記メモリから読み出し、
前記分類ステップにおいて、前記クラスタ解析を、前記測定ステップにおいて測定された前記バイオマーカーのパラメータセットと、前記第１のパラメータセットと、前記第２のパラメータセットとを比較することによって行い、前記喘息患者を最も相関の高い群に分類し、
前記判定ステップにおいて、前記第１のパラメータセットと同じ群に分類された場合、喘息患者を、重症発作の発生可能性が高く、かつ、薬剤奏功性が低いと判定し、前記第２のパラメータセットと同じ群に分類された場合、喘息患者を、重症発作の発生可能性は高いが薬剤奏功性は高いか、または重症発作の発生可能性が低いと判定し、
前記バイオマーカーのパラメータセットは、IL-17の測定値と、IL-10、IL-4、IL-25、IL-9及びIFN-γからなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含み、
前記第１のパラメータセットが、重症発作の発生履歴があり、かつ、薬剤奏功性が低いことが予めわかっている喘息患者の血液試料中のIL-17の測定値と、当該喘息患者の血液試料中の前記選択された少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含み、
前記第２のパラメータセットが、重症発作の発生履歴はあるが薬剤奏功性は高いか、または重症発作の発生履歴がないことが予めわかっている喘息患者の血液試料中のIL-17の測定値と、当該喘息患者の血液試料中の前記選択された少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含む、
喘息患者の重症発作の発生可能性の予測補助装置。
【請求項１５】
コンピュータが読み取り可能な媒体に記録されているコンピュータプログラムであって、
前記コンピュータプログラムが、下記のステップ：
喘息患者の血液試料中のバイオマーカーを測定するステップと、
前記バイオマーカーの測定値に基づいて、前記喘息患者の重症発作の発生可能性を判定するステップと
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムであり、
前記バイオマーカーがIL-17を含む、
喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するためのコンピュータプログラム。
【請求項１６】
コンピュータが読み取り可能な媒体に記録されているコンピュータプログラムであって、
前記コンピュータプログラムが、下記のステップ：
喘息患者の血液試料中のIL-17と、IL-10、IL-4、IL-25、IL-9及びIFN-γからなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーとを測定し、バイオマーカーのパラメータセットを取得するステップと、
前記バイオマーカーのパラメータセット、第１のパラメータセット及び第２のパラメータセットを用いてクラスタ解析を行うことにより、前記喘息患者を、最も相関の高い群に分類するステップと、
前記分類ステップにおいて得られた結果に基づき、前記喘息患者の重症発作の発生可能性を判定するステップと
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムであり、
前記バイオマーカーのパラメータセットは、IL-17の測定値と、IL-10、IL-4、IL-25、IL-9及びIFN-γからなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含み、
前記第１のパラメータセットが、重症発作の発生履歴があり、かつ、薬剤奏功性が低いことが予めわかっている喘息患者の血液試料中のIL-17の測定値と、当該喘息患者の血液試料中の前記選択された少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含み、
前記第２のパラメータセットが、重症発作の発生履歴はあるが薬剤奏功性は高いか、または重症発作の発生履歴がないことが予めわかっている喘息患者の血液試料中のIL-17の測定値と、当該喘息患者の血液試料中の前記選択された少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含む、
喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するためのコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助する方法、装置およびコンピュータプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
喘息は、気道の慢性炎症と種々の程度の可逆的気道狭窄と気道過敏性の亢進、そして臨床的には繰り返し起こる咳、喘鳴、呼吸困難によって特徴づけられる。喘息の鑑別診断においては、（１）発作性の咳、喘鳴、呼吸困難の反復、（２）可逆性の気流制限、（３）他の心肺疾患などに関連していないこと、が重要視されている。また、喘息の治療は発作の発生頻度をコントロールし、健常人と変わらない日常生活が送れることが目標とされており、現在のガイドラインでは、喘息症状や呼吸機能をモニタリングして治療方針が決定されている。すなわち、現状では喘息症状や呼吸機能をモニタリングして治療方針を決定するという、いわゆる対処療法が主流であり、重症発作が発生するリスクなどの喘息重症化リスクを予め予測する確立した方法は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ioana Agacheら,“Increased serum IL-17 is an independent risk factor for severe asthma”Respir Med 2010, 104(8):1131-1137
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ヘルパーＴ細胞の一つであるＴｈ１７細胞が分泌するサイトカインであるインターロイキン１７（IL-17）が、重症喘息患者の血清中で高値を示すことが知られている（非特許文献１）。しかしながら、IL-17高値患者は軽症、中等症患者においても存在し、また、血清中のIL-17の濃度と将来的な重症発作の発生の可能性などの重症化リスクとの関係については何ら知られていなかった。なお、IL-17は、IL-17A、IL-17Bなどを含むIL-17ファミリーを形成するが、本発明でバイオマーカーとして用いられるのはIL-17Aである。以下、IL-17Aを単に「IL-17」ということがある。
【０００５】
なお、非特許文献１には、“risk factor”や“predictor” という用語が使われているが、本発明でいう重症化リスク（将来の重症化する可能性の予測）とは異なる意味で用いている。すなわち、非特許文献１は、Global Initiative for Asthma (GINA)の喘息ガイドラインに従い、喘息患者を重症・中等症・軽症に分類し、この分類において重症と分類された患者では有意にIL-17の血清濃度が高値であったと報告している。この結果に基づき、血中IL-17濃度のみで患者が重症喘息と診断できるかどうかを示すものとしてこれらの用語を使用している。また、GINAガイドラインにおいて重症と診断される診断基準は、高容量の吸入ステロイド(ICS)によっても喘息の症状がコントロールできるか否かが基準となっており、同ガイドラインにて重症と診断された患者においても本発明で述べられるような重症発作が起こる否かは明らかにされていない。
【０００６】
本発明は、喘息が重症化するリスクに関する情報を取得し、その情報に基づき患者の治療方針の決定に寄与することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、喘息患者の血清中の各種サイトカインの濃度と患者の臨床データとを検討した結果、IL-17の濃度とその後の患者の重症化履歴との間に有意な相関があることを見出し、本発明を完成するに至った。また、IL-17の濃度と他のインターロイキンの濃度とを組み合わせることにより重症化リスクの高い患者群を鑑別できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明によれば、喘息患者の血液試料中のバイオマーカーを測定する工程と、前記バイオマーカーの測定値に基づいて、前記喘息患者の重症発作の発生可能性を判定する工程とを含み、前記バイオマーカーがIL-17を含む、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助する方法が提供される。
【０００９】
また、本発明によれば、喘息患者の血液試料中のIL-17と、IL-10(インターロイキン10)、IL-4(インターロイキン4)、IL-25(インターロイキン25)、IL-9(インターロイキン9)及びIFN-γ(インターフェロン・ガンマ)からなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーとを測定し、バイオマーカーのパラメータセットを取得する工程と、前記バイオマーカーのパラメータセット、第１のパラメータセット及び第２のパラメータセットを用いてクラスタ解析を行うことにより、前記喘息患者を、最も相関の高い群に分類する工程と、前記分類工程において得られた結果に基づき、前記喘息患者の重症発作の発生可能性を判定する工程とを含み、前記バイオマーカーのパラメータセットは、IL-17の測定値と、IL-10、IL-4、IL-25、IL-9及びIFN-γからなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含み、前記第１のパラメータセットは、重症発作の発生履歴があり、かつ、薬剤奏功性が低いことが予めわかっている喘息患者の血液試料中のIL-17の測定値と、当該喘息患者の血液試料中の前記選択された少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含み、前記第２のパラメータセットは、重症発作の発生履歴はあるが薬剤奏功性は高いか、または重症発作の発生履歴がないことが予めわかっている喘息患者の血液試料中のIL-17の測定値と、当該喘息患者の血液試料中の前記選択された少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含む、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助する方法が提供される。
【００１０】
さらに、本発明によれば、プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、前記メモリには、下記のステップ：喘息患者の血液試料中のバイオマーカーを測定するステップと、前記バイオマーカーの測定値に基づいて、前記喘息患者の重症発作の発生可能性を判定するステップとを前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録され、前記バイオマーカーがIL-17を含む、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測補助装置が提供される。
【００１１】
さらに、本発明によれば、プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、前記メモリには、下記のステップ：喘息患者の血液試料中のIL-17と、IL-10、IL-4、IL-25、IL-9及びIFN-γからなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーとを測定し、バイオマーカーのパラメータセットを取得するステップと、前記バイオマーカーのパラメータセット、第１のパラメータセット及び第２のパラメータセットを用いてクラスタ解析を行うことにより、前記喘息患者を、最も相関の高い群に分類するステップと、前記分類ステップにおいて得られた結果に基づき、前記喘息患者の重症発作の発生可能性を判定するステップとを前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録され、前記メモリが、第１のパラメータセット及び第２のパラメータセットを記録しており、前記プロセッサが、前記測定ステップにおいて測定された前記バイオマーカーのパラメータセットを受信し、前記第１のパラメータセット及び前記第２のパラメータセットを前記メモリから読み出し、前記分類ステップにおいて、前記クラスタ解析を、前記測定ステップにおいて測定された前記バイオマーカーのパラメータセットと、前記第１のパラメータセットと、前記第２のパラメータセットとを比較することによって行い、前記喘息患者を最も相関の高い群に分類し、前記判定ステップにおいて、前記第１のパラメータセットと同じ群に分類された場合、喘息患者を、重症発作の発生可能性が高く、かつ、薬剤奏功性が低いと判定し、前記第２のパラメータセットと同じ群に分類された場合、喘息患者を、重症発作の発生可能性は高いが薬剤奏功性は高いか、または重症発作の発生可能性が低いと判定し、前記バイオマーカーのパラメータセットは、IL-17の測定値と、IL-10、IL-4、IL-25、IL-9及びIFN-γからなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含み、前記第１のパラメータセットが、重症発作の発生履歴があり、かつ、薬剤奏功性が低いことが予めわかっている喘息患者の血液試料中のIL-17の測定値と、当該喘息患者の血液試料中の前記選択された少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含み、前記第２のパラメータセットが、重症発作の発生履歴はあるが薬剤奏功性は高いか、または重症発作の発生履歴がないことが予めわかっている喘息患者の血液試料中のIL-17の測定値と、当該喘息患者の血液試料中の前記選択された少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含む、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測補助装置が提供される。
【００１２】
さらに、本発明によれば、コンピュータが読み取り可能な媒体に記録されているコンピュータプログラムであって、前記コンピュータプログラムが、下記のステップ：喘息患者の血液試料中のバイオマーカーを測定するステップと、前記バイオマーカーの測定値に基づいて、前記喘息患者の重症発作の発生可能性を判定するステップとを前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムであり、前記バイオマーカーがIL-17を含む、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するためのコンピュータプログラムが提供される。
【００１３】
さらに、本発明によれば、コンピュータが読み取り可能な媒体に記録されているコンピュータプログラムであって、前記コンピュータプログラムが、下記のステップ：喘息患者の血液試料中のIL-17と、IL-10、IL-4、IL-25、IL-9及びIFN-γからなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーとを測定し、バイオマーカーのパラメータセットを取得するステップと、前記バイオマーカーのパラメータセット、第１のパラメータセット及び第２のパラメータセットを用いてクラスタ解析を行うことにより、前記喘息患者を、最も相関の高い群に分類するステップと、前記分類ステップにおいて得られた結果に基づき、前記喘息患者の重症発作の発生可能性を判定するステップとを前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムであり、前記バイオマーカーのパラメータセットは、IL-17の測定値と、IL-10、IL-4、IL-25、IL-9及びIFN-γからなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含み、前記第１のパラメータセットが、重症発作の発生履歴があり、かつ、薬剤奏功性が低いことが予めわかっている喘息患者の血液試料中のIL-17の測定値と、当該喘息患者の血液試料中の前記選択された少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含み、前記第２のパラメータセットが、重症発作の発生履歴はあるが薬剤奏功性は高いか、または重症発作の発生履歴がないことが予めわかっている喘息患者の血液試料中のIL-17の測定値と、当該喘息患者の血液試料中の前記選択された少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含む、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するためのコンピュータプログラムが提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測補助方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】本実施形態の試薬キットの外観の一例である。
【図１Ｂ】本実施形態の試薬キットの外観の一例である。
【図１Ｃ】本実施形態の試薬キットの外観の一例である。
【図２】予測補助装置の一例を示した概略図である。
【図３】図２の予測補助装置の機能構成を示すブロック図である。
【図４】図２に示された予測補助装置のハードウェア構成を示すブロック図である。
【図５Ａ】図２に示された予測補助装置を用いた、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するデータを取得するための判定のフローチャートの一例である。
【図５Ｂ】図２に示された予測補助装置を用いた、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するデータを取得するための判定のフローチャートの一例である。
【図５Ｃ】図２に示された予測補助装置を用いた、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するデータを取得するための判定のフローチャートの一例である。
【図６Ａ】本実施形態の予測補助方法による判定の一例である。
【図６Ｂ】実施例１の症例におけるROC曲線である。
【図７】実施例３のクラスタ解析の結果を示す図である。
【図８Ａ】実施例３の解析対象となった喘息患者の治療ステップを示すグラフである。
【図８Ｂ】実施例３の解析対象となった喘息患者のコントロール状況を示すグラフである。
【図８Ｃ】実施例３の解析対象となった喘息患者の12ヶ月以内の重症発作履歴の有無を示すグラフである。
【図９Ａ】実施例４における、IL-17及びIL-25を用いて行ったクラスタ解析の結果を示す図である。
【図９Ｂ】実施例４における、IL-17及びIL-4を用いて行ったクラスタ解析の結果を示す図である。
【図９Ｃ】実施例４における、IL-17及びIL-9を用いて行ったクラスタ解析の結果を示す図である。
【図９Ｄ】実施例４における、IL-17及びIL-10を用いて行ったクラスタ解析の結果を示す図である。
【図９Ｅ】実施例４における、IL-17及びIFN-γを用いて行ったクラスタ解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本実施形態の喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助する方法(以下、単に「予測補助方法」ともいう)は、喘息患者の血液試料中のバイオマーカーを測定する工程を含む。
喘息患者は、例えば医師により喘息に罹患していると診断された患者をはじめ、喘息に罹患している可能性がある成人または小児などである。
血液試料とは、血液（全血）、血清または血漿である。血液試料は、採取が簡便なものがとりわけ好ましく、例えば末梢血およびそれから取得される血清および血漿などが挙げられる。
【００１７】
バイオマーカーは、IL-17を含む。IL-17は、自己免疫疾患や細菌性炎症応答と関連するTh17型炎症を引き起こすサイトカインとして知られており、IL-8、IL-6を誘導し、好中球性炎症を引き起こす。本実施形態では、喘息患者の血液試料中のIL-17を測定することにより、重症発作の発生可能性の予測を補助するデータを医師に提供できる。このことは、喘息症状や呼吸機能をモニタリングして治療方針を決定するという、いわゆる対処療法が主流の喘息治療の現場に、重症発作が発生するリスクなどの喘息重症化リスクを予め予測することが可能な確立した新たな方法を提供できるという点で画期的である。
【００１８】
バイオマーカーは、好ましくはIL-10、IL-4、IL-25、IL-9及びIFN-γからなる群から選択される少なくとも一つをさらに含む。IL-10は、TregやMSC,M2マクロファージなど抗炎症性細胞から産生されるサイトカインで、抗炎症サイトカインとして知られている。IL-4は、アトピーなどのアレルギー性免疫応答を誘発するTh2サイトカインとして知られている。IL-25は、Th2型炎症を引き起こすProTh2サイトカインとして知られている。IL-9は、Th2型免疫細胞から分泌されるサイトカインとして知られており、マスト細胞やTh2型免疫応答を司る細胞を増殖させる。IFN-γは、ウイルス感染症などに応答するTh1サイトカインとして知られており、Th1細胞や細胞障害性のCD8細胞などから分泌され、マクロファージなどを活性化すると共に、Th2免疫応答を抑制する。IL-17に加えて、IL-10、IL-4、IL-25、IL-9及びIFN-γからなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーを測定することによって、重症発作の発生可能性が高いか否かの判定精度を高めたり、あるいは、IL-17の測定値が高いために重症発作の発生可能性が高いと判定された喘息患者のうち、さらに薬剤奏功性が高いか否かという情報を医師に提供したりすることができる。なお、「薬剤奏功性が高い」とは、喘息治療のために処方される薬剤、例えば吸入ステロイド、ロイコトリエン受容体拮抗薬(LTRA)、長時間作用性β2刺激薬(LABA)などが相対的に効きやすいことを意味する。例えば、薬剤奏功性の高い喘息患者は、喘息予防・管理ガイドライン2009に規定のステップ３又は４の治療を受けていれば、重症発作を起こさない。一方、「薬剤奏功性が低い」とは、喘息治療のために処方される薬剤が相対的に効きにくいことを意味する。例えば、薬剤奏功性の低い喘息患者は、喘息予防・管理ガイドライン2009に規定のステップ３又は４の治療を受けていても、重症発作を起こす。
【００１９】
バイオマーカーの測定方法は、当業者に周知の抗原抗体反応に基づく測定法であれば特に限定されないが、例えばELISA法、ウェスタンブロット法などが挙げられ、好ましくはELISA法である。これらの測定方法に用いられる抗体は、血液試料中の各バイオマーカーを特異的に認識して結合することができる抗体であれば特に限定されない。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルの全長抗体または抗体フラグメント（Fab、F(ab')2）などであり得る。このような抗体の作製方法は、当業者に公知である。あるいは、抗体は市販製品であってもよい。例えば、当業者に公知の市販のタンパク質定量キット、例えば、R＆Dシステム社製Human IL-17 Quantikine ELISA Kit、biolegend社製LEGEND MAX(商標) Human IL-17A ELISA Kitなどを用いてもよい。測定工程の一例として、サンドイッチELISA法によりバイオマーカーを測定する場合について、以下に説明する。
【００２０】
まず、血液試料中のバイオマーカーと、当該バイオマーカーを捕捉するための抗体(以下、「捕捉用抗体」ともいう)と、当該バイオマーカーを検出するための抗体(以下、「検出用抗体」ともいう)とを含む複合体を固相上に形成させる。この複合体は、血液試料と、捕捉用抗体と、検出用抗体とを混合することにより形成できる。そして、複合体を含む溶液を、捕捉用抗体を捕捉できる固相と接触させることにより、上記の複合体を固相上に形成させることができる。あるいは、捕捉用抗体をあらかじめ固定した固相を用いてもよい。すなわち、捕捉用抗体を固定した固相と、血液試料と、検出用抗体とを接触させることにより、上記の複合体を固相上に形成させることができる。ここで、捕捉用抗体及び検出用抗体がいずれもモノクローナル抗体の場合は、互いのエピトープが異なっていることが好ましい。
【００２１】
捕捉用抗体の固相への固定の態様は特に限定されない。例えば、捕捉用抗体と固相とを直接結合させてもよいし、捕捉用抗体と固相とを別の物質を介して間接的に結合させてもよい。直接の結合としては、例えば、物理的吸着などが挙げられる。間接的な結合としては、例えば、ビオチンと、アビジン又はストレプトアビジン(以下、「アビジン類」ともいう)との組み合わせを介した結合が挙げられる。この場合、捕捉用抗体をあらかじめビオチンで修飾し、固相にアビジン類をあらかじめ結合させておくことにより、ビオチンとアビジン類との結合を介して、捕捉用抗体と固相とを間接的に結合させることができる。
【００２２】
固相の素材は特に限定されず、例えば、有機高分子化合物、無機化合物、生体高分子などから選択できる。有機高分子化合物としては、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。無機化合物としては、磁性体(酸化鉄、酸化クロム及びフェライトなど)、シリカ、アルミナ、ガラスなどが挙げられる。生体高分子としては、不溶性アガロース、不溶性デキストラン、ゼラチン、セルロースなどが挙げられる。これらのうちの２種以上を組み合わせて用いてもよい。固相の形状は特に限定されず、例えば、粒子、膜、マイクロプレート、マイクロチューブ、試験管などが挙げられる。
【００２３】
固相上に形成された複合体を、当該技術において公知の方法で検出することにより、バイオマーカーを測定することができる。例えば、検出用抗体として、標識物質で標識した抗体を用いた場合は、その標識物質により生じるシグナルを検出することにより、バイオマーカーを測定することができる。あるいは、検出用抗体に対する標識二次抗体を用いた場合も、同様にしてバイオマーカーを測定することができる。
【００２４】
本実施形態では、複合体の形成工程と複合体の検出工程との間に、複合体を形成していない未反応の遊離成分を除去するB/F(Bound/Free)分離を行ってもよい。未反応の遊離成分とは、複合体を構成しない成分をいう。例えば、バイオマーカーと結合しなかった捕捉用抗体及び検出用抗体などが挙げられる。B/F分離の手段は特に限定されないが、固相が粒子であれば、遠心分離により、複合体を捕捉した固相だけを回収することによりB/F分離ができる。固相がマイクロプレートやマイクロチューブなどの容器であれば、未反応の遊離成分を含む液を除去することによりB/F分離ができる。また、固相が磁性粒子の場合は、磁石で磁性粒子を磁気的に拘束した状態でノズルによって未反応の遊離成分を含む液を吸引除去することによりB/F分離ができる。未反応の遊離成分を除去した後、複合体を捕捉した固相をPBSなどの適切な水性媒体で洗浄してもよい。
【００２５】
本明細書において、「シグナルを検出する」とは、シグナルの有無を定性的に検出すること、シグナル強度を定量すること、及び、シグナルの強度を半定量的に検出することを含む。半定量的な検出とは、シグナルの強度を、「シグナル発生せず」、「弱」、「中」、「強」などのように段階的に示すことをいう。本実施形態では、シグナルの強度を定量的又は半定量的に検出することが好ましい。
【００２６】
標識物質は、検出可能なシグナルが生じるかぎり特に限定されない。例えば、それ自体がシグナルを発生する物質(以下、「シグナル発生物質」ともいう)であってもよいし、他の物質の反応を触媒してシグナルを発生させる物質であってもよい。シグナル発生物質としては、例えば、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。他の物質の反応を触媒して検出可能なシグナルを発生させる物質としては、例えば、酵素などが挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、Alexa Fluor(登録商標)などの蛍光色素、GFPなどの蛍光タンパク質などが挙げられる。放射性同位元素としては、125Ｉ、14Ｃ、32Ｐなどが挙げられる。それらの中でも、標識物質として、酵素が好ましく、アルカリホスファターゼ及びペルオキシダーゼが特に好ましい。
【００２７】
シグナルを検出する方法自体は、当該技術において公知である。本実施形態では、上記の標識物質に由来するシグナルの種類に応じた測定方法を適宜選択すればよい。例えば、標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を反応させることによって発生する光、色などのシグナルを、分光光度計などの公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。
【００２８】
酵素の基質は、該酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択できる。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、基質として、CDP-Star(登録商標)(4-クロロ-3-(メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2'-(5'-クロロ)トリシクロ[3. 3. 1. 13, 7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)、CSPD(登録商標)(3-(4-メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2-(5'-クロロ)トリシクロ[3. 3. 1. 13, 7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)などの化学発光基質、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)、5-ブロモ-6-クロロ−インドリルリン酸２ナトリウム、p-ニトロフェニルリン酸などの発色基質が挙げられる。また、酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合、基質としては、ルミノール及びその誘導体などの化学発光基質、2, 2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸アンモニウム)(ABTS)、1, 2-フェニレンジアミン(OPD)、3, 3',5, 5'-テトラメチルベンジジン(TMB)などの発色基質が挙げられる。
【００２９】
標識物質が放射性同位体である場合は、シグナルとしての放射線を、シンチレーションカウンターなどの公知の装置を用いて測定できる。また、標識物質が蛍光物質である場合は、シグナルとしての蛍光を、蛍光マイクロプレートリーダーなどの公知の装置を用いて測定できる。なお、励起波長及び蛍光波長は、用いた蛍光物質の種類に応じて適宜決定できる。
【００３０】
シグナルの検出結果は、バイオマーカーの測定値として用いてもよい。例えば、シグナルの強度を定量的に検出する場合は、シグナル強度値自体又は該強度値から取得される値を、バイオマーカーの測定値として用いることができる。シグナル強度値から取得される値としては、例えば、バイオマーカーのシグナル強度値から陰性対照試料のシグナル強度値又はバックグラウンドの値を差し引いた値が挙げられる。陰性対照試料は適宜選択できるが、例えば、健常者から得た尿などが挙げられる。バイオマーカーの測定値は、例えば濃度、強度、レベル、質量（重量）、比、などのいずれの形式又は単位でも表すことができる。
【００３１】
本実施形態では、バイオマーカー濃度が既知の複数の標準試料についてバイオマーカーの測定データを取得し、バイオマーカー濃度とバイオマーカーの測定データとの関係を示す検量線を作成してもよい。血液試料から取得したバイオマーカーの測定データをこの検量線に当てはめて、血液試料中のバイオマーカー濃度の値を取得し、これをバイオマーカーの測定値として用いることができる。
【００３２】
本実施形態では、磁性粒子に固定された捕捉用抗体と、標識物質で標識された検出用抗体とを用いるサンドイッチELISA法により、血液試料中のバイオマーカーを測定してもよい。この場合、測定は、HISCLシリーズ(シスメックス株式会社製)などの市販の全自動免疫測定装置を用いて行ってもよい。
【００３３】
本実施形態の予測補助方法は、上記のようにして得られたバイオマーカーの測定値に基づいて、喘息患者の重症発作の発生可能性を判定する工程を含む。
喘息患者の重症発作の発生可能性は、好ましくは喘息患者に12ヶ月以内に重症発作が生じる可能性である。
【００３４】
好ましい実施形態では、バイオマーカーの測定値が所定の閾値以上である場合、喘息患者の重症発作の発生可能性が高いと判定され、バイオマーカーの測定値が所定の閾値未満である場合、喘息患者の重症発作の発生可能性が低いと判定される。
【００３５】
上記の所定の閾値は特に限定されず、適宜設定できる。例えば、次のようにして所定の閾値を設定してもよい。まず、複数の喘息患者から血液を採取し、血液試料中のバイオマーカー濃度を測定する。測定したバイオマーカー濃度のデータを、重症発作の発生履歴がある喘息患者群のデータと、重症発作の発生履歴がない喘息患者群のデータとに分類する。なお、「重症発作の発生履歴がある」とは、喘息患者が過去に重症発作を起こしたことがあることを意味する。そして、重症発作の発生履歴がある喘息患者群の血液試料中のバイオマーカー濃度と、重症発作の発生履歴がない喘息患者群の血液試料中のバイオマーカー濃度とを最も精度よく区別可能な値を求め、その値を所定の閾値として設定する。閾値の設定においては、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などを考慮することが好ましい。
【００３６】
好ましい実施形態では、IL-17の測定値に加えて、IL-10、IL-4、IL-25、IL-9及びIFN-γからなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーの測定値がさらに用いられる。複数のバイオマーカーを用いることにより、判定の精度を高めたり、薬剤奏功性をさらに判定したりすることができる。
【００３７】
１つの実施形態では、例えば、各バイオマーカーの測定値を、それぞれに対応する所定の閾値と比較し、比較結果に基づいて判定が行われる。より具体的には、IL-17の測定値が所定の閾値以上であり、かつ、IL-17以外のいずれか１つのバイオマーカーの測定値が対応する所定の閾値以上である場合、喘息患者の重症発作の発生可能性は高く、かつ、薬剤奏功性は低いと判定することができる。このような判定は、図９Ａ〜Ｅに支持される。例えば、図９Ａの判定では、IL-17の測定値がIL-17に対応する所定の閾値より高く、かつ、IL-25の測定値がIL-25に対応する所定の閾値よりも高い患者群(G4)は、重症発作を起こした経歴のある患者が多い。
【００３８】
一方、IL-17の測定値が所定の閾値以上であり、かつ、IL-17以外のバイオマーカーの測定値の全てが対応する所定の閾値未満である場合、またはIL-17の測定値が所定の閾値未満である場合には、喘息患者の重症発作の発生可能性は高いが薬剤奏功性は高いか、または喘息患者の重症発作の発生可能性は低いと判定することができる。このような判定は、図７に支持される。
【００３９】
別の実施形態では、例えば、多重ロジスティック解析(ロジスティック回帰分析)のような多変量解析を用いて判定が行われる。このような多変量解析は、IL-17の測定値に加えて、IL-10、IL-4、IL-25、IL-9及びIFN-γからなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーの測定値を、多変量解析、例えば多重ロジスティック解析により作成した判別式に代入して、バイオマーカーの測定値から多変量解析によって取得される値、例えば予測値を取得し、判定工程において、バイオマーカーの測定値から多変量解析によって取得される値と、多変量解析によって取得される値に対応する所定の閾値とを比較し、比較結果に基づいて、喘息患者の重症発作の発生可能性が判定される。
【００４０】
多変量解析として多重ロジスティック解析を用いる判定の一例をより具体的に説明する。例えば、IL-17及びIL-10の測定値を取得している場合、予測値は、下記の式(I)の回帰式を用いて算出してもよい。また、IL-17、IL-10及びIL-4の測定値を取得している場合、予測値は、下記の式(II)の回帰式を用いて算出してもよい。これらの回帰式は、多重ロジスティックモデルに基づいて構築された式である。式中、[IL-17]、[IL-10]及び[IL-4]は、それぞれ、IL-17、IL-10及びIL-4の測定値である。b0は切片の係数、b1〜b3は各遊離タンパク質バイオマーカーの係数である。係数は、最尤法などの公知の方法により決定できる。
【００４１】
【数１】
2018141677.tif 000002
【００４２】
【数２】
2018141677.tif 000003
【００４３】
上記の各バイオマーカーに対応する所定の閾値及び予測値に対応する閾値は特に限定されず、例えば、喘息患者から採取した血液試料におけるバイオマーカーのデータを蓄積することにより、経験的に設定できる。あるいは、次のようにして所定のカットオフ値を設定してもよい。健常人及び喘息患者から血液試料を採取し、バイオマーカーの測定値を取得する。そして、取得した測定値から、各バイオマーカーについて健常人と喘息患者とを区別可能な値を求め、得られた値を、各バイオマーカーに対応する所定のカットオフ値として設定する。あるいは、健常人及び喘息患者から液体試料から取得したバイオマーカーの測定値を、多変量解析により作成した判別式に代入して、健常人の予測値及び喘息患者の予測値を取得する。そして、取得した予測値から、健常人と喘息患者とを区別可能な値を求め、得られた値を、予測値に対応する所定のカットオフ値として設定する。
【００４４】
別の実施形態では、クラスタ解析を用いて判定が行われる。この実施形態では、喘息患者の血液試料中のIL-17と、IL-10、IL-4、IL-25、IL-9及びIFN-γからなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーとを測定し、バイオマーカーのパラメータセットを取得する工程を含む。ここで、バイオマーカーのパラメータセットとは、IL-17の測定値と、IL-10、IL-4、IL-25、IL-9及びIFN-γからなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含む、１人の喘息患者について得られた複数種類のバイオマーカーの測定値の群を意味する。例えば、ある喘息患者の血液試料中のIL-17、IL-10、IL-25及びIFN-γを測定する場合、バイオマーカーのパラメータセットは、その喘息患者の血液試料中のIL-17の測定値、IL-10の測定値、IL-25の測定値及びIFN-γの測定値を意味する。
【００４５】
この実施形態では、第２の工程として、上記の測定工程で得られたバイオマーカーのパラメータセット、第１のパラメータセット及び第２のパラメータセットを用いてクラスタ解析を行うことにより、喘息患者を、最も相関の高い群に分類する工程を含む。
クラスタ解析は、好ましくは階層的クラスタ解析である。最も相関の高い群は、最遠隣法によって求められたユークリッド距離を用いて決定することが好ましい。
【００４６】
第１のパラメータセットとは、重症発作の発生履歴があり、かつ、薬剤奏功性が低いことが予めわかっている喘息患者の血液試料中のIL-17の測定値と、当該喘息患者の血液試料中の上記で選択された少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含む。第２のパラメータセットとは、重症発作の発生履歴はあるが薬剤奏功性は高いか、または重症発作の発生履歴がないことが予めわかっている喘息患者の血液試料中のIL-17の測定値と、当該喘息患者の血液試料中の上記で選択された少なくとも一つのバイオマーカーの測定値とを含む。
【００４７】
例えば、バイオマーカーのパラメータセットが、ある喘息患者の血液試料中のIL-17の測定値、IL-10の測定値、IL-25の測定値及びIFN-γの測定値を含む場合、第１のパラメータセットは、重症発作の発生履歴があり、かつ、薬剤奏功性が低いことが予めわかっている喘息患者の血液試料中のIL-17の測定値、IL-10の測定値、IL-25の測定値及びIFN-γの測定値を含み、第２のパラメータセットは、重症発作の発生履歴はあるが薬剤奏功性は高いか、または重症発作の発生履歴がないことが予めわかっている喘息患者の血液試料中のIL-17の測定値、IL-10の測定値、IL-25の測定値及びIFN-γの測定値を含む。
【００４８】
クラスタ解析による分類は、好ましくは、バイオマーカーのパラメータセットと、第１のパラメータセットと、第２のパラメータセットとを比較することによって行われる。
【００４９】
判定にクラスタ解析を用いる本実施形態の予測補助方法は、上記の分類工程で得られた結果に基づき、喘息患者の重症発作の発生可能性を判定する、第３の工程を含む。例えば、判定工程において、第１のパラメータセットと同じ群に分類された場合、喘息患者は、重症発作の発生可能性が高く、かつ、薬剤奏功性が低いと判定され、第２のパラメータセットと同じ群に分類された場合、喘息患者は、重症発作の発生可能性は高いが薬剤奏功性は高いか、または重症発作の発生可能性が低いと判定される。このような判定は、図８Ａ及びＣによって支持される。すなわち、図８Ａ及びＣに示されるように、重症発作の発生可能性が高く、かつ、薬剤奏功性が低いクラスタ(G4)では、表３に示されるStep3の治療を受けていても12ヶ月以内に重症発作を起こした患者が多い。一方、図８Ａ及びＣに示されるように、重症発作の発生可能性は高いが薬剤奏功性は高いか、または重症発作の発生可能性が低いクラスタ(G1〜G3)では、表３に示されるStep2やStep3の治療を受けた結果、12ヶ月以内に重症発作を起こさない患者が半数を超える。
【００５０】
上記のような多変量解析やクラスタ解析を行う場合、解析における測定値の重みを均一にするために、測定値を正規化してもよい。正規化は特に限定されず、当業者に公知の方法、例えば対数正規分布に従うように測定値を正規化することにより行うことができる。
【００５１】
一実施形態では、重症発作の発生可能性が高いと判定された喘息患者に対して、発作治療薬を投与する工程を含む。重症発作が実際に発生するよりも前に発作治療薬を投与することにより、患者の重症発作の可能性や発作の程度を低減できる可能性が高くなる。発作治療薬としては、たとえば、オマリズマブやメポリズマブなどの抗体医薬や経口ステロイドなどが挙げられる。
【００５２】
本発明の範囲には、上記の喘息患者の重症発作の発生可能性の予測補助方法に用いられる試薬キットも含まれる。すなわち、本実施形態では、IL-17を捕捉するためのIL-17と特異的に結合する第１の捕捉体と、IL-17を検出するためのIL-17と特異的に結合する第２の捕捉体と、標識物質とを含む、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測用試薬キット(以下、「試薬キット」ともいう)が提供される。標識物質が酵素である場合、本実施形態の試薬キットは、該酵素に対する基質をさらに含んでいてもよい。
【００５３】
本実施形態において、第１の捕捉体、第２の捕捉体、標識物質及び基質の形態は特に限定されず、固体(例えば、粉末、結晶、凍結乾燥品など)であってもよいし、液体(例えば、溶液、懸濁液、乳濁液など)であってもよい。本実施形態では、第１の捕捉体、第２の捕捉体、標識物質及び基質は、それぞれ別の容器に保存されているか又は個別に包装されていることが好ましい。なお、血液試料、第１の捕捉体、第２の捕捉体、標識物質及び基質についての詳細は、上記の予測補助方法の説明で述べたことと同様である。本実施形態では、第１の捕捉体及び第２の捕捉体はいずれも抗IL-17抗体であることが好ましい。第１の捕捉体及び第２の捕捉体がいずれもモノクローナル抗体の場合は、互いのエピトープが異なっていることが好ましい。
【００５４】
本実施形態では、上記の各種試薬を収容した容器を箱に梱包して、ユーザに提供してもよい。この箱には、試薬キットの添付文書を同梱していてもよい。この添付文書には、たとえば、試薬キットの構成、血液試料中のバイオマーカー濃度の測定プロトコールなどが記載されることが好ましい。図１Ａに、本実施形態の試薬キットの外観の一例を示す。図中、５１０は、試薬キットを示し、５１１は、第１の捕捉体を収容した第１容器を示し、５１２は、第２の捕捉体を収容した第２容器を示し、５１３は、標識物質としての酵素を収容した第３容器を示し、５１４は、酵素の基質を収容した第４容器を示し、５１５は、添付文書を示し、５１６は、梱包箱を示す。
【００５５】
本実施形態の試薬キットは、第１の捕捉体を固定化するための固相をさらに含んでいてもよい。この場合、第１の捕捉体、第２の捕捉体、標識物質、基質及び固相は、それぞれ別の容器に保管されているか又は個別に包装されていることが好ましい。図１Ｂに、固相をさらに含む試薬キットの外観の一例を示した。固相についての詳細は、上記の予測補助方法の説明で述べたことと同様である。図中、５２０は、試薬キットを示し、５２１は、第１の捕捉体を収容した第１容器を示し、５２２は、第２の捕捉体を収容した第２容器を示し、５２３は、標識物質としての酵素を収容した第３容器を示し、５２４は、酵素の基質を収容した第４容器を示し、５２５は、固相(96ウェルマイクロプレート)を示し、５２６は、添付文書を示し、５２７は、梱包箱を示す。
【００５６】
さらなる実施形態では、第１の捕捉体はあらかじめ固相に固定化されていてもよい。さらに、標識物質はあらかじめ第２の捕捉体に結合されていてもよい。この場合、試薬キットは、第１の捕捉体を固定化した固相、標識物質を結合させた第２の捕捉体、及び基質を含む。図１Ｃに、当該試薬キットの外観の一例を示した。図中、５３０は、試薬キットを示し、５３１は、標識物質としての酵素を結合させた第２の捕捉体を収容した第１容器を示し、５３２は、酵素の基質を収容した第２容器を示し、５３３は、第１の捕捉体を固定化した固相(96ウェルマイクロプレート)を示し、５３４は、添付文書を示し、５３５は、梱包箱を示す。
【００５７】
試薬キットは、IL-10、IL-4、IL-25、IL-9及びIFN-γからなる群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーの測定値を取得するための、上記少なくとも一つのバイオマーカーと特異的に結合する１以上の捕捉体と、当該少なくともバイオマーカーを検出するための当該少なくとも一つのバイオマーカーと特異的に結合する１以上の捕捉体とをさらに含んでいてもよい。
また、本実施形態の試薬キットは、上述の各種試薬の他、固相の洗浄液、酵素反応の停止剤、キャリブレーターなどを適宜含んでいてもよい。
【００５８】
本発明の範囲には、上記の試薬を、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測用試薬キットの製造のために使用することも含まれる。すなわち、本発明は、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測用試薬キットの製造のための、IL-17を捕捉するためのIL-17と特異的に結合する第１の捕捉体、IL-17を検出するためのIL-17と特異的に結合する第２の捕捉体、及び標識物質の使用にも関する。
【００５９】
本発明には、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するデータの取得に適する装置が含まれる。また、本発明には、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するデータの取得をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム製品も含まれる。なお、該コンピュータプログラム製品が備える媒体は、コンピュータプログラムが非一時的に記録され、且つ、コンピュータが読取可能な媒体であってもよい。
【００６０】
以下に、上記の本実施形態の方法を実施するのに好適な装置の一例を、図面を参照して説明する。しかし、本発明はこの例に示される形態のみに限定されない。図２は、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するデータを取得するための、予測補助装置の概略図である。図２に示された予測補助装置１１は、測定装置２２と、該測定装置２２と接続された判定装置３３とを含んでいる。
【００６１】
本実施形態において、測定装置の種類は特に限定されず、バイオマーカーの測定方法に応じて適宜選択できる。図２に示される例では、測定装置２２は、標識抗体を用いるELISA法により生じるシグナルを検出可能なプレートリーダーである。プレートリーダーは、バイオマーカーの測定に用いた標識物質に基づくシグナルの検出が可能であれば特に限定されず、標識物質の種類に応じて適宜選択できる。以下に説明する例では、シグナルは、化学発光シグナルや蛍光シグナルなどの光学的情報である。
【００６２】
抗原抗体反応を行ったプレートを測定装置２２にセットすると、測定装置２２は、バイオマーカーと特異的に結合した標識抗体に基づく光学的情報を取得し、得られた光学的情報を判定装置３３に送信する。なお、測定装置２２に取得される光学的情報には、バイオマーカーの測定値などの算出ための濃度既知の検体の情報も含まれている。
【００６３】
判定装置３３は、コンピュータ本体３３ａと、入力部３３ｂと、検体情報や判定結果などを表示する表示部３３ｃとを含む。判定装置３３は、測定装置２２から光学的情報を受信する。そして、判定装置３３のプロセッサは、光学的情報に基づいて、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するデータを取得するプログラムを実行する。
【００６４】
図３は、予測補助装置１１のコンピュータ本体３３ａのソフトウェアを機能ブロックで示すブロック図である。図３に示されるように、判定装置３３は、受信部３０１と、記憶部３０２と、算出部３０３と、判定部３０４と、出力部３０５とを備える。受信部３０１は、測定装置２２と、ネットワークを介して通信可能に接続されている。
【００６５】
受信部３０１は、測定装置２２から送信された情報を受信する。記憶部３０２は、判定に必要な閾値及び各バイオマーカーの測定値を算出するための式や処理プログラム(例えば、多重ロジスティック解析のような多変量解析やクラスタ解析を実施するためのプログラム)などを記憶する。算出部３０３は、受信部３０１で取得された情報を用い、記憶部３０２に記憶された式にしたがって、バイオマーカーの測定値又は多変量解析によって取得される値を算出する。判定部３０４は、算出部３０３によって算出されたバイオマーカーの測定値又は多変量解析によって取得される値が、記憶部３０２に記憶された閾値以上であるか又はそれ未満であるかを判定する。出力部３０５は、判定部３０４による判定結果を、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するデータとして出力する。
【００６６】
図４は、図３に示すコンピュータ本体３３ａのハードウェア構成を示すブロック図である。図４に示されるように、コンピュータ本体３３ａは、ＣＰＵ(Central Processing Unit)３３０と、ＲＯＭ(Read Only Memory)３３１と、ＲＡＭ(Random Access Memory)３３２と、ハードディスク３３３と、入出力インターフェイス３３４と、読出装置３３５と、通信インターフェイス３３６と、画像出力インターフェイス３３７とを備えている。ＣＰＵ３３０、ＲＯＭ３３１、ＲＡＭ３３２、ハードディスク３３３、入出力インターフェイス３３４、読出装置３３５、通信インターフェイス３３６及び画像出力インターフェイス３３７は、バス３３８によってデータ通信可能に接続されている。
【００６７】
ＣＰＵ３３０は、ＲＯＭ３３１に記憶されているコンピュータプログラム及びＲＡＭ３３２にロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。ＣＰＵ３３０がアプリケーションプログラムを実行することにより、図３に示す各機能が実行される。これにより、判定装置３３が、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するデータを取得するための装置として機能する。
【００６８】
ＲＯＭ３３１は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３３１には、ＣＰＵ３３０によって実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。
【００６９】
ＲＡＭ３３２は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ３３２は、ＲＯＭ３３１及びハードディスク３３３に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。ＲＡＭ３３２はまた、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３３０の作業領域として利用される。
【００７０】
ハードディスク３３３は、ＣＰＵ３３０に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム(喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するデータを取得するためのコンピュータプログラム)などのコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
【００７１】
読出装置３３５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読出装置３３５は、可搬型記録媒体３４０に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。
【００７２】
入出力インターフェイス３３４は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス３３４には、キーボード、マウスなどの入力部３３ｂが接続されている。操作者は、当該入力部３３ｂにより、コンピュータ本体３３ａに各種の指令やデータを入力することが可能である。
【００７３】
通信インターフェイス３３６は、例えば、Ethernet(登録商標)インターフェイスなどである。コンピュータ本体３３ａは、通信インターフェイス３３６により、プリンタなどへの印刷データの送信が可能である。測定装置２２は、通信インターフェイス３３６により、判定装置３３への測定データ(光学的情報)の送信が可能である。
【００７４】
画像出力インターフェイス３３７は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部３３ｃに接続されている。これにより、表示部３３ｃは、ＣＰＵ３３０から与えられた画像データに応じた映像信号を出力することができる。表示部３３ｃは、入力された映像信号にしたがって画像(画面)を表示する。
【００７５】
次に、予測補助装置１１による、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するデータ取得の処理手順を説明する。図５Ａは、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測データ取得のフローチャートの一例である。ここでは、IL-17と特異的に結合した標識抗体に基づく光学的情報などからIL-17の測定値を取得し、得られた値を用いて判定を行なう場合を例として挙げて説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されるものではない。
【００７６】
まず、ステップＳ１−１において、予測補助装置１１の受信部３０１は、測定装置２２から光学的情報を受信する。次に、ステップＳ１−２において、算出部３０３は、受信部３０１が受信した光学的情報から、記憶部３０２に記憶されたIL-17の測定値を算出するための式にしたがって、IL-17の測定値を算出する。
【００７７】
その後、ステップＳ１−３において、判定部３０４は、ステップＳ１−２で算出された値が、記憶部３０２に記憶された閾値未満であるか、それともそれ以上であるかを判定する。ここで、算出された値が閾値以上であるとき、ルーチンは、ステップＳ１−４に進行し、判定部３０４は、喘息患者の重症発作の発生可能性が高いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。また、算出された値が閾値未満であるとき、ルーチンは、ステップＳ１−５に進行し、判定部３０４は、喘息患者の重症発作の発生可能性が低いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
【００７８】
そして、ステップＳ１−６において、出力部３０５は、判定結果を出力し、表示部３３ｃに表示させる。これにより、予測補助装置１１は、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するデータを医師などに提供することができる。
【００７９】
図５Ｂは、多重ロジスティック分析を用いて、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測データを取得するフローチャートの一例である。この実施形態における予測補助装置１１による、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するデータ取得の処理手順を説明する。ここでは、バイオマーカーと特異的に結合した標識抗体に基づく光学的情報などからバイオマーカーの測定値を取得し、得られた測定値を判別式に代入して予測値Ｐを取得し、それを用いて判定を行なう場合を例として挙げて説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されるものではない。
【００８０】
まず、ステップＳ２−１において、予測補助装置１１の受信部３０１は、測定装置２２から光学的情報を受信する。次に、ステップＳ２−２において、算出部３０３は、受信部３０１が受信した光学的情報から、記憶部３０２に記憶されたバイオマーカーの測定値を算出するための式にしたがって、バイオマーカーの測定値を算出し、さらに、ステップＳ２−３において、記憶部３０２に記憶された判別式にしたがって、予測値Ｐを算出する。
【００８１】
その後、ステップＳ２−４において、判定部３０４は、ステップＳ２−３で算出された予測値Ｐが、記憶部３０２に記憶された閾値未満であるか、それともそれ以上であるかを判定する。ここで、予測値Ｐが閾値以上であるとき、ルーチンは、ステップＳ２−５に進行し、判定部３０４は、喘息患者の重症発作の発生可能性が高いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。また、予測値Ｐが閾値未満であるとき、ルーチンは、ステップＳ２−６に進行し、判定部３０４は、喘息患者の重症発作の発生可能性が低いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
【００８２】
そして、ステップＳ２−７において、出力部３０５は、判定結果を出力し、表示部３３ｃに表示させる。これにより、予測補助装置１１は、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するデータを医師などに提供することができる。
【００８３】
図５Ｃは、クラスタ解析を用いて、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測データを取得するフローチャートの一例である。この実施形態における予測補助装置１１による、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するデータ取得の処理手順を説明する。ここでは、バイオマーカーと特異的に結合した標識抗体に基づく光学的情報などからバイオマーカーのパラメータセットを取得し、得られたパラメータセットを用いて判定を行なう場合を例として挙げて説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されるものではない。
【００８４】
この実施形態において、記憶部３０２は、第１及び第２のパラメータセットを記憶しており、判定部３０４は、クラスタ解析を行って喘息患者を第１及び第２のパラメータセットのいずれかと同じ群に分類し、分類結果に基づいて重症発作の発生可能性が高いか否か、薬剤奏功性が高いか否かを判定する。
【００８５】
より具体的には、まず、ステップＳ３−１において、予測補助装置１１の受信部３０１は、測定装置２２から光学的情報を受信する。次に、ステップＳ３−２において、算出部３０３は、受信部３０１が受信した光学的情報から、記憶部３０２に記憶されたバイオマーカーの測定値などを算出するための式にしたがって、バイオマーカーの測定値を算出し、バイオマーカーのパラメータセットを取得する。
【００８６】
その後、ステップＳ３−３において、判定部３０４は、記憶部３０２に記憶された第１及び第２のパラメータセットを読み出し、ステップＳ３−４において、ステップＳ３−２で取得したバイオマーカーのパラメータセットと、ステップＳ３−３で読み出した第１及び第２のパラメータセットとを用いてクラスタ解析を行い、喘息患者を第１及び第２のパラメータセットのいずれかと同じ群に分類し、ルーチンはステップＳ３−５に進行する。喘息患者が第１のパラメータセットと同じ群に分類された場合、ルーチンは、ステップＳ３−６に進行し、判定部３０４は、喘息患者の重症発作の発生可能性は高く、かつ、薬剤奏功性は低いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。一方、喘息患者が第１のパラメータセットと同じ群に分類されなかった場合、すなわち喘息患者が第２のパラメータセットと同じ群に分類された場合、ルーチンは、ステップＳ３−７に進行し、判定部３０４は、喘息患者の重症発作の発生可能性は高いが薬剤奏功性は高いか、または喘息患者の重症発作の発生可能性は低いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
【００８７】
そして、ステップＳ３−８において、出力部３０５は、判定結果を出力し、表示部３３ｃに表示させる。これにより、予測補助装置１１は、喘息患者の重症発作の発生可能性の予測を補助するデータを医師などに提供することができる。
【００８８】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００８９】
実施例１
（１）試料
喘息患者77名の血清試料を入手した。これらの試料には以下の臨床データが付与されているものであった。
・12ヶ月以内の重症発作履歴
・喘息のコントロール状況
・12ヶ月以内のER搬送履歴
・治療ステップ
・投与されている治療薬の量
・呼吸機能
・アトピー素因
【００９０】
（２）ELISA測定
上記で得た血清試料を用いて、以下のようにしてELISA測定を行い、IL-17の量を測定した。ELISA測定は、抗-IL-17A抗体(eBio64CAP17[eBioscience])を固相抗体、抗IL-17A抗体(eBio64DEC17[eBioscience])を検出用抗体に用いて、標準的な化学発光ELISA法にて実施した。すなわち、まず、96または384ウェルELISAプレートに50μLの固相抗体希釈液(1μg/mL固相抗体,0.05% NaN3, PBS PH7.4)を添加し、４℃で一晩抗体を固相化した。洗浄バッファー(0.05%Tween20, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)で3回洗浄し、250μLのブロッキングバッファー(1% BSA,0.5% Casein, 0.05% Tween20, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)で、室温で2時間以上ブロッキングした。ELISA Dilution Buffer (1% BSA, 0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)で４倍希釈した血清を50μL添加し、4℃で一晩反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し50μLの標識抗体液(0.5μg/mL標識抗体, 1% BSA, 0.5% Casein,  0.05% NaN3, PBS PH7.4)を添加した。2時間室温で反応し、洗浄バッファーで3回洗浄した。50μLのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン液(1：1000希釈Streptavidin-Alkaline Phosphatase [R&D systems AR001 ], 1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)を添加し、20分間反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのALP活性化バッファー(20mM Tris 10mM  MgCl pH9.8)で1回洗浄し、基質(CDP-Star Ready-to-use Sapphire II Tropix)を100μL添加し、化学発光検出装置(FLUO star OPTIMA BMG LabTech)で発光シグナルを検出した。
【００９１】
（３）ELISA測定結果の解析
各サイトカインについて、濃度既知のスタンダードの発光シグナルから検量線を作成した。検体から得られた発光シグナルを検量線にあてはめ、血清中のサイトカイン濃度を算出した。解析には解析ソフトMARS(BGM LABTECH)を使用した。
【００９２】
（４）統計解析
統計解析にはStatFlex Version 6.0 (YUMIT)を使用した。12ヶ月以内の重症発作履歴がある患者群と12ヶ月以内の重症発作履歴がない患者群の2群に分け、血清IL-17濃度差を検定した。その結果、重症発作発生患者群で有意に高値であることが認められた。また、ROC曲線を求め重症発作発生と不発生のカットオフを設定し感度および特異度を算出した。カットオフの設定は、ROC曲線において、（感度，１−特異度）が（１，０）である点から最も近いポイント（図６Ｂ中に矢印で表記）に設定した。
【００９３】
結果を図６Ａ及びＢ並びに表１に示す。これらの結果から、血中IL-17濃度に基づいて、重症発作履歴のある喘息患者群と、重症発作履歴のない喘息患者群とを有意差をもって分離できることが示された。
【表１】
2018141677.tif 000004
【００９４】
実施例２
実施例１で得られたデータに基づき、IL-17の濃度が試験した喘息患者の75％タイルよりも高値の患者群（20名）と低値の患者群（57名）とに分け、重症化状況と対比した。結果を以下の表２に示す。表２に示されるように、12ヶ月以内の重症発作履歴がない喘息患者は、51人中43人においてIL-17値が低かった。これに対し、12ヶ月以内の重症発作履歴がある喘息患者は、26人中12人においてIL-17値が高く、IL-17値の高い患者の割合が増えていた。これらの結果から、12ヶ月以内の重症発作履歴のある喘息患者群と、12ヶ月以内の重症発作履歴のない喘息患者群との間では、血中IL-17A濃度に有意差(P値＝0.006)があることが認められた。
【００９５】
【表２】
2018141677.tif 000005
【００９６】
以上、実施例１および２の結果より、被験者の血液試料中のIL-17の量を測定し、得られた測定値に基づいて、被験者における喘息の重症発作の発生可能性に関する情報が取得できることが明らかとなった。
【００９７】
実施例３
実施例１と同様にして、IL-17以外の各サイトカインの量を測定するために以下のようにしてELISA測定を行った。
・IL-10
ELISA測定は、抗-IL-10抗体(JES3-9D7[eBioscience])を固相抗体、抗IL-10抗体(JES3-12G8[eBioscience])を検出用抗体に用いて、標準的な化学発光ELISA法にて実施した。すなわち、まず、96または384ウェルELISAプレートに50μLの固相抗体希釈液(2μg/mL固相抗体,0.05% NaN3, PBS PH7.4)を添加し、４℃で一晩抗体を固相化した。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのブロッキングバッファーで、室温で2時間以上ブロッキングした。ELISA Dilution Bufferで４倍希釈した血清を50μL添加し、4℃で一晩反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し50μLの標識抗体液(0.5μg/mL標識抗体, 1% BSA, 0.5% Casein,  0.05% NaN3, PBS PH7.4)を添加した。2時間室温で反応し、洗浄バッファーで3回洗浄した。50μLのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン液(1：1000希釈Streptavidin-Alkaline Phosphatase [R&D systems AR001 ], 1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)を添加し、20分間反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのALP活性化バッファー(20mM Tris 10mM  MgCl pH9.8)で1回洗浄し、基質(CDP-Star Ready-to-use Sapphire II Tropix)を100μL添加し、化学発光検出装置(FLUO star OPTIMA BMG LabTech)で発光シグナルを検出した。
【００９８】
・IL-4
ELISA測定は、抗-IL-4抗体(8D4-8[Biolegend])を固相抗体、抗IL-4抗体(MP4-25D2[Biolegend])を検出用抗体に用いて、標準的な化学発光ELISA法にて実施した。すなわち、まず、96または384ウェルELISAプレートに50μLの固相抗体希釈液(2μg/mL固相抗体,0.05% NaN3, PBS PH7.4)を添加し、４℃で一晩抗体を固相化した。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのブロッキングバッファーで、室温で2時間以上ブロッキングした。ELISA Dilution Buffer(1% BSA, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)で４倍希釈した血清を50μL添加し、4℃で一晩反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し50μLの標識抗体液(0.5μg/mL標識抗体, 1% BSA, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)を添加した。2時間室温で反応し、洗浄バッファーで3回洗浄した。50μLのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン液(1：1000希釈Streptavidin-Alkaline Phosphatase [R&D systems AR001 ], 1% BSA, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)を添加し、20分間反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのALP活性化バッファー(20mM Tris 10mM  MgCl pH9.8)で1回洗浄し、基質(CDP-Star Ready-to-use Sapphire II Tropix)を100μL添加し、化学発光検出装置(FLUO star OPTIMA BMG LabTech)で発光シグナルを検出した。
【００９９】
・IL-25
ELISA測定にはPeprotech社製 ELISA development kit (900-K234)を使用した。
まず、ELISAプレートに100μLの抗体希釈液(1μg/mL固相抗体, PBS pH12.0)を添加し、４℃で一晩抗体を固相化した。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのブロッキングバッファーで、室温で2時間以上ブロッキングした。ELISA Dilution Buffer(1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)で４倍希釈した血清を100μL添加し、4℃で一晩反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し100μLの標識抗体液(0.25μg/mL標識抗体, 1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS)を添加した。2時間室温で反応し、洗浄バッファーで3回洗浄した。100μLのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン液(1：1000希釈Streptavidin-Alkaline Phosphatase, 1% BSA, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)100μL添加し、20分間反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのALP活性化バッファーで洗浄し、100μLの基質を添加し、化学発光検出装置で発光シグナルを検出した。
【０１００】
・IL-9
ELISA測定にはPeprotech社製 ELISA development kit (900-K20)を使用した。
まず、ELISAプレートに100μLの抗体希釈液(2μg/mL固相抗体, PBS pH12.0)を添加し、４℃で一晩抗体を固相化した。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのブロッキングバッファーで、室温で2時間以上ブロッキングした。ELISA Dilution Buffer(lowcross buffer[CANDOR])で４倍希釈した血清を100μL添加し、4℃で一晩反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し100μLの標識抗体液(0.25μg/mL標識抗体, lowcross buffer[CANDOR])を添加した。2時間室温で反応し、洗浄バッファーで3回洗浄した。100μLのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン液(1：1000希釈lowcross buffer[CANDOR])100μL添加し、20分間反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのALP活性化バッファーで洗浄し、100μLの基質を添加し、化学発光検出装置で発光シグナルを検出した。
【０１０１】
・IFN-γ
ELISA測定は、抗IFN-γ抗体(NIB42[Biolegend])を固相抗体、抗IFN-γ抗体(4S.B3[Biolegend])を検出用抗体に用いて、標準的な化学発光ELISA法にて実施した。すなわち、まず、96または384ウェルELISAプレートに50μLの固相抗体希釈液(2μg/mL固相抗体,0.05% NaN3, PBS PH7.4)を添加し、４℃で一晩抗体を固相化した。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのブロッキングバッファーで、室温で2時間以上ブロッキングした。ELISA Dilution Buffer(1% BSA, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)で４倍希釈した血清を50μL添加し、4℃で一晩反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し50μLの標識抗体液(0.5μg/mL標識抗体, 1% BSA, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)を添加した。2時間室温で反応し、洗浄バッファーで3回洗浄した。50μLのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン液(1：1000希釈Streptavidin-Alkaline Phosphatase [R&D systems AR001 ], 1% BSA, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)を添加し、20分間反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのALP活性化バッファー(20mM Tris 10mM  MgCl pH9.8)で1回洗浄し、基質(CDP-Star Ready-to-use Sapphire II Tropix)を100μL添加し、化学発光検出装置(FLUO star OPTIMA BMG LabTech)で発光シグナルを検出した。
【０１０２】
上記実施例で得られたIL-17およびその他のサイトカインの血清濃度を標準化し、クラスタ解析を行った。より具体的には、各サイトカインのELISA測定結果を対数変換し、正規化後、平均値と標準偏差を用いて標準化した。Rのパッケージstatsに含まれるhclust関数を用いて、最遠隣法・ユークリッド距離にて階層的クラスタ分析を行った。その後、階層的クラスタ解析の結果得られた系統樹に基づいて、患者をG1〜G4のクラスタに分類した。
結果を図７に示す。図７に示されるように、IL-17、IL-10、IL-4、IL-25、IL-9、IFN-γの測定値が総じて高い患者クラスタ（Ｇ４）を鑑別することができた。なお、図８Ａ〜Ｃは、本実施例のクラスタ解析の対象となった患者のプロフィールを示す。図７の下段のヒートマップに記載された症状の表記の内容は以下の通りである。
【０１０３】
【表３】
2018141677.tif 000006
【０１０４】
また、各症状における各クラスター（Ｇ１〜Ｇ４）毎の重症度の割合を図８Ａ〜Ｃに示す。Ｇ４と鑑別された患者群は、100％の患者が中−高容量の吸入ステロイド治療およびその他の喘息薬の治療を受けているが(図８Ａ)、いずれもコントロール不十分であり(図８Ｂ)、また75％の患者で12ヶ月以内に重症発作が発生していた(図８Ｃ)。
【０１０５】
実施例４
上記実施例で得られたIL-17およびその他のサイトカインの血清濃度を標準化し、IL-17の濃度と他のいずれか一つのサイトカインの濃度とのクラスタ解析を行った。クラスタ解析の結果得られた系統樹に基づいて、患者をG1〜G4のクラスタに分類した。
結果を図９Ａ〜Ｅに示す。図９Ａ〜Ｅに示されるように、IL-17と他の1つのサイトカインの測定値に基づき、Ｇ４患者（中−高容量の吸入ステロイド治療およびその他の喘息薬の治療によってもコントロール不十分な難治性喘息患者集団）を鑑別することができた。
【符号の説明】
【０１０６】
１１      予測補助装置
２２      測定装置
３３      判定装置
３３ａ    コンピュータ本体
３３ｂ    入力部
３３ｃ    表示部
３０１    受信部
３０２    記憶部
３０３    算出部
３０４    判定部
３０５    出力部
３３０    ＣＰＵ
３３１    ＲＯＭ
３３２    ＲＡＭ
３３３    ハードディスク
３３４    入出力インターフェイス
３３５    読出装置
３３６    通信インターフェイス
３３７    画像出力インターフェイス
３３８    バス
３４０    記録媒体
５１０、５２０、５３０    試薬キット
５１１、５２１、５３１    第１容器
５１２、５２２、５３２    第２容器
５１３、５２３            第３容器
５１４、５２４            第４容器
５１５、５２６、５３４    添付文書
５１６、５２７、５３５    梱包箱
５２５、５３３            固相
【図１Ａ】
2018141677.tif 000007
【図１Ｂ】
2018141677.tif 000008
【図１Ｃ】
2018141677.tif 000009
【図２】
2018141677.tif 000010
【図３】
2018141677.tif 000011
【図４】
2018141677.tif 000012
【図５Ａ】
2018141677.tif 000013
【図５Ｂ】
2018141677.tif 000014
【図５Ｃ】
2018141677.tif 000015
【図６Ａ】
2018141677.tif 000016
【図６Ｂ】
2018141677.tif 000017
【図７】
2018141677.tif 000018
【図８Ａ】
2018141677.tif 000019
【図８Ｂ】
2018141677.tif 000020
【図８Ｃ】
2018141677.tif 000021
【図９Ａ】
2018141677.tif 000022
【図９Ｂ】
2018141677.tif 000023
【図９Ｃ】
2018141677.tif 000024
【図９Ｄ】
2018141677.tif 000025
【図９Ｅ】
2018141677.tif 000026