(57)【要約】【課題】天然に由来し、安全性が高く、飲食料品への適用が可能である、優れた免疫調節用組成物を提供すること。【解決手段】キク科アザミ属ハマアザミ又はその抽出物を含有する免疫調節用組成物を調製する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハマアザミ又はハマアザミ抽出物を含有する免疫調節用組成物。
【請求項２】
アレルギー予防及び／又は改善用組成物である、請求項１記載の免疫調節用組成物。
【請求項３】
粘膜免疫賦活用組成物である、請求項１記載の免疫調節用組成物。
【請求項４】
前記ハマアザミ又はハマアザミ抽出物が、シルシマリンおよび／またはシルシマリチンを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫調節用組成物。
【請求項５】
前記ハマアザミが、ハマアザミの全草又は葉部、茎部、根部、種子、及び花部からなる群より選択される１又は２以上に由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫調節用組成物。
【請求項６】
前記ハマアザミ抽出物が、ハマアザミの酢酸エチル抽出物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫調節用組成物。
【請求項７】
シルシマリンおよび／またはシルシマリチンを含有する、免疫調節用組成物。
【請求項８】
経口、静脈内注射、吸入又は経皮により投与される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫調節用組成物。
【請求項９】
飲食料品、医薬部外品、又は医薬品である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫調節用組成物。
【請求項１０】
前記飲食料品が、茶飲料である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の免疫調節用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー予防及び／又は改善効果などの免疫調節機能を有し、飲食料品、医薬品、又は医薬部外品として有用な天然由来物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、日本国民の約３分の１が何らかのアレルギー症状を発症しているといわれている。アレルギーは発症機構により、即時型アレルギー（Ｉ型）から遅延型アレルギー（ＩＶ型）まで分類されるが、近年特に、花粉症、気管支喘息及びアトピー性皮膚炎などに代表される即時型アレルギーの症例数が急増している。I型アレルギー反応には肥満細胞や好塩基球が関わっており、細胞表面に結合しているIgEが抗原によって活性化されることで下流へとシグナルが伝達され、ヒスタミンやタンパク質分解酵素などの細胞内顆粒内容物が放出される。この現象を脱顆粒と呼ぶ。このようなI型アレルギーの発症を抑えるためには、肥満細胞や好塩基球からの脱顆粒の抑制が重要である。
【０００３】
また、腸管免疫とアレルギーに強い関係性があることが近年の研究から明らかとなっている。特に腸管の代表的なリンパ組織であるパイエル板から分泌されるIgAは、粘膜面への細菌やウイルスの付着防止、外来抗原を捕捉して体外に排出する異物排除、異種タンパク質によるアレルギー発症の予防などの作用を有しており、粘膜免疫機能において重要な働きを担っている。よって、IgAの分泌を促進することは、粘膜免疫機能を増強させ、感染症やアレルギー疾患を予防するなどの効果が期待できるため、IgA分泌促進作用を有する食品素材の開発が望まれている。
【０００４】
これまでに、茶カテキン、シソエキス、及び甜茶などからアレルギー抑制成分が見いだされ、これらの機能を付与した食品を毎日摂取することによって、アレルギー症状の軽減だけでなく、アレルギー体質の改善につなげることが期待されている（非特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】濃度茶カテキン飲料のアレルギー性鼻炎症状に及ぼす影響（医学と薬学  ５９（２），２０７−２１１，２００８）
【非特許文献２】シソエキスのＴＮＦ産生抑制作用と抗アレルギー活性（一般社団法人日本アレルギー学会  アレルギー  ４１（８），１０３５，１９９２−０８−３０）
【非特許文献３】甜茶抽出物の抗炎症・抗アレルギー活性成分について：食品（社団法人日本農芸化学会  日本農藝化學會誌  ６９（臨時増刊），１６５，１９９５−０７−０５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
安全性が高く、有効な免疫調節用組成物の開発が望まれている。
【０００７】
そこで本発明の目的は、天然物に由来し、安全性が高く、飲食料品への適用が可能である、優れた免疫調節用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、キク科アザミ属ハマアザミ、ハマアザミ抽出物、又はハマアザミ抽出物の精製物が、アレルギー予防及び／又は改善効果や粘膜免疫賦活作用などの免疫調節機能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］ハマアザミ又はハマアザミ抽出物を含有する免疫調節用組成物；
［２］アレルギー予防及び／又は改善用組成物である、項１記載の免疫調節用組成物；
［３］粘膜免疫賦活用組成物である、項１記載の免疫調節用組成物；
［４］上記ハマアザミ又はハマアザミ抽出物が、シルシマリンおよび／またはシルシマリチンを含む、項１〜３のいずれか１項に記載の免疫調節用組成物；
［５］上記ハマアザミが、ハマアザミの全草又は葉部、茎部、根部、種子、及び花部からなる群より選択される１又は２以上に由来する、項１〜４のいずれか１項に記載の免疫調節用組成物；
［６］上記ハマアザミ抽出物が、ハマアザミの酢酸エチル抽出物である、項１〜５のいずれか１項に記載の免疫調節用組成物。
［７］シルシマリンおよび／またはシルシマリチンを含有する、免疫調節用組成物。
［８］経口、静脈内注射、吸入又は経皮により投与される、項１〜７のいずれか１項に記載の免疫調節用組成物；
［９］飲食料品、医薬部外品、又は医薬品である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫調節用組成物；
［１０］前記飲食料品が、茶飲料である、項１〜９のいずれか１項に記載の免疫調節用組成物；
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の免疫調節用組成物は、天然由来のハマアザミから得られる有効成分を含有しており、安全性が高い。このような安全な免疫調節用組成物は、例えば抗アレルギー効果などを有しながら副作用の少ない飲食料品、医薬品又は医薬部外品に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ハマアザミの抽出物をクロマトグラフィーで分離したことを模式的に示す図である。
【図２】図２は、ハマアザミの葉または花の抽出物のβ‐ヘキソサミニダーゼ遊離抑制活性を示す図である。
【図３】図３は、ハマアザミの葉または花の抽出物の濃度依存的なβ‐ヘキソサミニダーゼ遊離抑制活性を示す図である。
【図４】図４は、ハマアザミの葉の酢酸エチル抽出物をカラムクロマトグラフィーによって分画した試料のβ‐ヘキソサミニダーゼ遊離抑制活性を示す図である。
【図５】図５Ａは、ハマアザミ抽出物の精製物の濃度依存的なβ‐ヘキソサミニダーゼ遊離抑制活性を示す図である。図５Ｂは、市販のシルシマリチンの濃度依存的なβ‐ヘキソサミニダーゼ遊離抑制活性を示す図である。
【図６】図６Ａは、マウス血清中の卵白リゾチーム（ＬＨＥ）特異的ＩｇＥ量を示す図である。図６Ｂは、マウス血清中のＬＨＥ特異的ＩｇＡ量を示す図である。図６Ｃは、マウス血清中のＬＨＥ特異的ＩｇＧ１量を示す図である。図６Ｄは、マウス血清中のＬＨＥ特異的ＩｇＧ２量を示す図である。
【図７】図７Ａは、マウス血清中の総ＩｇＥ量を示す図である。図７Ｂは、マウス血清中の総ＩｇＡ量を示す図である。図７Ｃは、マウス血清中の総ＩｇＧ量を示す図である。
【図８】図８Ａは、マウス糞中のＬＨＥ特異的ＩｇＡ量を示す図である。図８Ｂは、マウス糞中の総ＩｇＡ量を示す図である。
【図９】図９Ａは、脾臓リンパ球における卵白オボアルブミン（ＯＶＡ）特異的ＩｇＥ量を示す図である。図９Ｂは、脾臓リンパ球におけるＯＶＡ特異的ＩｇＧ１量を示す図である。図９Ｃは、脾臓リンパ球におけるＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａ量を示す図である。
【図１０】図１０は、脾臓リンパ球におけるＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１量のバランスとハマアザミの濃度との関係を示す図である。
【図１１】図１１は、ハマアザミの葉または花の抽出物の細胞へのカルシウム流入阻害活性を測定した結果を示す図である。
【図１２】図１２は、PCA評価によって、DNP-HSA抗体をマウスの耳介に打ち込んだ際の変化を示す図である。図１２Ａは、PCA評価後のマウスの耳介の状態を示す図である。図１２Ｂは、耳介厚を測定した結果を示すグラフである。図１２Ｃは、耳介の色素量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の免疫調節用組成物は、キク科アザミ属ハマアザミ（Cirsium maritimum Makino）又はその抽出物を含有する。ここで、抽出物には、単一成分または単一成分に近い画分にまで精製された精製物も含まれる。
【００１３】
ハマアザミは、温帯の海岸に生育する多年草であり、日本では、千葉県以南以西で九州まで分布している。砂地、砂礫地、草原に多く見られる。根は、食用として用いられている。
【００１４】
本発明において、ハマアザミをそのまま用いることができるが、その場合は、その調製方法が特に制限されるものではない。ハマアザミは、ハマアザミの全草又は一部、特に葉部、茎部、根部、種子、花部を別々に１種類ずつ又はそれらの２以上の組合せを乾燥物として、あるいはその乾燥物を適宜裁断し、破砕又は粉砕した粉末として調製することができる。ハマアザミの乾燥物又はその粉砕物は、例えば、熱湯で煮出して用いることができる。ハマアザミの破砕物又は粉砕物は、必要により焙煎して調製することもできる。
【００１５】
ハマアザミの焙煎は、回転式焙煎機等を用いた公知の方法により行われ、特に限定はされない。焙煎温度は、例えば、１５０〜４００℃とすることができ、１８０〜３５０℃が好ましく、２００〜３３０℃がより好ましい。焙煎時間は、焙煎温度等の条件により適宜決定されるが、例えば、５〜１２０分とすることができ、１０〜９０分が好ましく、１５〜６０分がより好ましい。
【００１６】
本発明において、ハマアザミ抽出物を用いる場合は、その抽出方法は特に制限されるものではない。ハマアザミ抽出物は、ハマアザミの全草又は一部、特に葉部、茎部、根部、種子、花部を別々に１種類ずつ又はそれらの２以上の組合せの乾燥物から、あるいはその乾燥物を適宜裁断し、破砕又は粉砕した粉末から、溶媒により抽出される。ハマアザミは、自生しているものから容易に入手可能であり、市販品を用いることもできる。
【００１７】
ハマアザミの全草又は一部を乾燥させる場合は、限定はされないが、天日干し、風乾又は乾燥機を使用して行うことができる。天日干しを行う場合は、乾燥にかかる時間は天候等により左右されるが、例えば６時間以上、好ましくは１日以上、より好ましくは２日以上とすることができる。乾燥機を使用する場合は、一般的に１００℃以下、好ましくは４０℃以下の乾燥条件下で、例えば、回転乾燥機、熱風乾燥機、伝熱乾燥機、真空乾燥機、真空凍結乾燥機、冷風乾燥機、振動乾燥機、ろ過乾燥機、真空撹拌乾燥機等を用いることが可能である。
【００１８】
ハマアザミ抽出物を免疫調節用組成物として用いる場合は、溶媒からハマアザミを抽出操作して得た抽出液をそのまま用いてもよく、適宜に希釈又は濃縮した液を抽出物として用いてもよい。ハマアザミ抽出物を得る場合には、新鮮な植物体を用いることが可能であり、冷蔵、凍結、又は乾燥保存されたハマアザミを用いることや、ハマアザミ抽出物の濃縮物を水等の適宜な溶媒に溶解又は希釈して用いることもできる。ハマアザミ抽出物の濃縮物は、限定はされないが、液状、ペースト状、泥状のものを用いることができる。
【００１９】
ハマアザミの抽出に用いる溶媒としては、水、有機溶媒又は含水有機溶媒が挙げられる。適宜の抽出溶媒を用いることにより、ハマアザミの水抽出物、有機溶媒抽出物又は含水有機溶媒抽出物を得ることができる。これらの抽出溶媒は、限定はされないが、水、メタノール、エタノール、エチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、イソプロピレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、酢酸エチル、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、n-プロパノール、メチルエチルケトン、ジオキサン、アセトン、アセトニトリル、酢酸、ジメチルホルムアミド、n-ヘキサン又はこれらの混合物が好ましい。より高い本発明の効果を得ることの観点から、これらの抽出溶媒のうち、酢酸エチルが特に好ましい。酢酸エチルを用いる場合の濃度は、限定はされないが、より高い抽出効率を得ることの観点から、例えば、１００％〜４０％、好ましくは１００％〜６０％、より好ましくは１００％〜８０％の濃度で用いることができる。
【００２０】
抽出に用いるハマアザミの部位は、限定はされないが、例えば、葉部、茎部、根部、種子、花部等が挙げられ、より高い本発明の効果を得ることの観点から葉部、花部又はこれらの組合せが好ましく、さらには、葉部が好ましい。
【００２１】
抽出方法は特に限定はされないが、例えば、ハマアザミの全草または一部を裁断し、ミキサー等の公知の方法により破砕し、抽出溶媒を加えて撹拌し、室温ないし加熱を一定の抽出時間で処置後、抽出上清からハマアザミのエキスを分離抽出する方法が挙げられる。また、抽出方法は、ハマアザミを抽出溶媒に浸漬した後、室温ないし加熱する条件において、静置する方法でもよい。
【００２２】
破砕条件としては、限定はされないが、ハマアザミの全草または一部の裁断物が１ｋｇ〜１０ｋｇ等の大スケールである場合は、大型バーチカルカッターミキサー等を用いることができ、数十ｇ〜数百ｇの小スケールの場合は、家庭用ミキサー等を用いることができる。例えば、大スケールでの破砕条件を適用する場合は、原料の硬さ、含水率等によって適宜変更されるが、例えば、破砕時間は数十秒〜数分間、ミキサーの回転数は１０〜３０００ｒｐｍで行うことが可能である。
【００２３】
また、抽出条件は通常の条件を適用することができ、限定はされないが、ハマアザミの乾燥物を、例えば３〜１００℃で溶媒に浸漬、加熱還流又はマイクロウェーブ加熱をする方法を採用することができる。抽出温度は、適切な抽出量が得られる限り限定はされないが、例えば、酢酸エチルを用いた場合は、２０〜１００℃とすることができ、２２〜８０℃が好ましく、２５〜６０℃がより好ましい。また、抽出温度は、例えば、水を用いた場合は２０〜１００℃とすることができ、５０〜１００℃が好ましく、７０〜１００℃がより好ましい。抽出時間は、適切な抽出量が得られる限り限定はされないが、例えば、５分以上１４日以内、好ましくは１０分以上７日以内、より好ましくは１５分以上５日以内とすることができる。前記抽出は通常常圧下で行われるが、加圧下で行うことも可能である。溶媒の添加量は、ハマアザミの乾燥重量１ｋｇに対して１Ｌ〜１００Ｌ程度使用することができる。
【００２４】
抽出溶媒を加える前に、ハマアザミに、酸、アルカリ、または酵素を加えることで、抽出効率を高めることも可能である。
【００２５】
抽出溶媒を加えて撹拌する操作は、公知の方法を用いることができるが、例えば、ハマアザミの裁断物又は粉砕物と抽出溶媒とを含む抽出用容器を回転させる方法、前記抽出用容器を磁気式又は機械式の撹拌装置に設置して混合する方法、前記抽出用容器を振とうさせる方法等が挙げられる。
【００２６】
撹拌操作では、超音波処理により振動を起こし、抽出効率を高めることも可能である。超音波処理を行う場合は、限定はされないが、例えばハマアザミの全草または一部の裁断物が１ｋｇ〜１０ｋｇ等の大スケールである場合は、市販の超音波発生器にハマアザミの裁断物又は粉砕物と抽出溶媒とを含む抽出用容器を設置し、２６ｋＨｚ超音波で６０分間処理することにより、超音波処理物を得ることができ、数十ｇ〜数百ｇの小スケールの場合は、４０ｋＨｚの超音波で６０分間処理することにより、超音波処理物を得ることができる。超音波処理の温度条件は、適切な抽出量が得られる限り限定はされないが、２℃〜１００℃、好ましくは１０℃〜７０℃とすることができる。大スケール用の超音波発生器としては、例えば神明台工業（株）製ＵＴ−１２を使用することができ、小スケール用の超音波発生器としては、例えばＡＳ  ＯＮＥ（株）製ＵＳ−３Ｒを使用することができる。
【００２７】
抽出効率を高めるためには、同種又は複数種の抽出溶媒を用いた多段階抽出を行うことも可能である。多段階抽出を行う場合は、第１段階の抽出において得られた残渣に、さらに同種又は複数種の抽出溶媒を加え、室温ないし加熱を行った後、抽出上清からハマアザミのエキスを分離抽出することができる。
【００２８】
マイクロウェーブ加熱は、本発明の有効成分の活性が失われない範囲で、マイクロウェーブ照射装置の出力、マイクロウェーブの波長、照射時間等の条件を適宜設定することが可能である。例えば、ハマアザミの乾燥物１００ｇに対して、２４５０ＭＨｚ、５００Ｗのマイクロウェーブを当てる場合は、１０秒〜１０分、好ましくは３０秒〜５分で処理することが可能である。
【００２９】
抽出上清をそのままハマアザミ抽出物として用いることができる。さらには、抽出上清からハマアザミ抽出物を分離抽出することもできる。この分離抽出段階においては、公知の方法を採用することができ、例えば、ろ過、遠心分離、吸引、圧搾等を行うことが可能である。
【００３０】
ろ過により分離抽出する場合は、限定はされないが、例えば、膜ろ過を行うことができる。膜ろ過を行う場合は、例えば、温度条件を２℃〜７０℃、好ましくは１０℃〜４０℃とすることができ、膜孔径を０．１μｍ〜１０μｍ、好ましくは０．１μｍ〜５μｍとすることが可能である。
【００３１】
遠心分離により分離抽出する場合は、公知の機器を用いることができ、遠心分離器としては、例えば、分離板型、円筒型、デカンター型等を挙げることができる。遠心分離を行う場合は、例えば、温度条件を２℃〜７０℃、好ましくは１０℃〜４０℃とすることができ、回転数を１０００ｒｐｍ〜１００００ｒｐｍ、好ましくは１５００ｒｐｍ〜８０００ｒｐｍ、さらに好ましくは２０００ｒｐｍ〜６０００ｒｐｍとすることができ、遠心時間を１０秒〜３０分、好ましくは２０秒〜２０分、さらに好ましくは３０秒〜１５分とすることができる。
【００３２】
圧搾による分離抽出は、圧搾機を用いることも可能であり、圧搾機としては公知の機器を用いることができ、例えば、空気圧式圧搾機、スクリュー式圧搾機等を挙げることができる。
【００３３】
ハマアザミ抽出物は、希釈や濃縮の前後等に、さらに精製処理に付することにより、精製物とすることができる。精製処理には、上記の溶媒による抽出以外に、当業者に公知な方法であるクロマトグラフ法、イオン交換クロマトグラフ法等を単独で、または組み合わせて用いることができる。
【００３４】
クロマトグラフ法を用いる場合であっては、例えば、順相若しくは逆相の担体又はイオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー又は遠心液体クロマトグラフィー等のいずれか、又はそれらを組み合わせて用いる方法が挙げられる。クロマトグラフ法を用いる場合の担体、溶出溶媒等の精製条件は、各種のクロマトグラフ法に対応して適宜選択することができる。
【００３５】
ハマアザミの裁断物又は粉砕物と抽出溶媒とを混合する比率としては、より高い抽出効率を得ることの観点から、例えば、含水有機溶媒抽出物または含水抽出物を得る場合は、溶媒１Ｌに対して、ハマアザミの裁断物又は粉砕物を５ｇ〜１ｋｇ、好ましくは１０ｇ〜５００ｇ、より好ましくは２０ｇ〜２００ｇとすることができる。酢酸エチル抽出物を得る場合は、例えば、酢酸エチル１Ｌに対して、ハマアザミ乾燥体の裁断物又は粉砕物を５ｇ〜３００ｇ、好ましくは１０ｇ〜２００ｇ、より好ましくは２０ｇ〜１００ｇとすることができる。
【００３６】
本発明において、ハマアザミ、ハマアザミ抽出物の含有量は、より高い本発明の効果を得る観点から、免疫調節用組成物の総量を基準として、固形分換算で０．０００００１〜１００ｗ／ｗ％、好ましくは０．００００１〜９０ｗ／ｗ％、さらに好ましくは０．０００１〜８０ｗ／ｗ％、最も好ましくは、０．０００１〜５０ｗ／ｗ％とすることができる。（ｗ／ｗ％は、重量％を表わす。以下同じ。）
【００３７】
また、本発明において、ハマアザミ、ハマアザミ抽出物の含有量は、より高い本発明の効果を得る観点から、免疫調節用組成物の総量を基準として、固形分換算で０．０００００１〜１００ｗ／ｖ％、好ましくは０．００００１〜９０ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．０００１〜８０ｗ／ｖ％、最も好ましくは、０．０００１〜５０ｗ／ｖ％とすることができる。なお、ここで、ｗ／ｖは、ｇ／ｍｌを示す。
【００３８】
本発明において、ハマアザミの精製物の含有量は、より高い本発明の効果を得る観点から、免疫調節用組成物の総量を基準として、固形分換算で０．００００００００１〜５ｗ／ｗ％、好ましくは０．０００００００１〜３ｗ／ｗ％、さらに好ましくは０．００００００１〜２ｗ／ｗ％とすることができる。
【００３９】
ここで、本発明においては、ハマアザミ抽出物又はさらなる精製物は、下記化学式を有するシルシマリチン（CAS Number:6601-62-3）またはシルシマリン（CAS Number:13020-19-4）を含有し得る。より好ましくは、ハマアザミ抽出物から精製して得られる物は、シルシマリチンおよび／またはシルシマリンである。
【００４０】
［用途］
本発明者らは、ハマアザミ又はその抽出物若しくは精製物であるシルシマリチンおよび／またはシルシマリンが、優れた免疫調節作用を有することを新たに見出した。ハマアザミは、天然に由来するものであり、古来より食用されていることから、安全で有効な免疫調節用途に好適である。
【００４１】
ここで、本明細書において、「免疫調節」とは、抗アレルギーや免疫賦活を含む慨念である。免疫賦活には、限定はされないが、主に粘膜免疫賦活が含まれる。
【００４２】
ここで、本明細書において、「アレルギー予防及び／又は改善」と、抗アレルギーとは互換可能に用いられる用語である。本発明のハマアザミ又はその抽出物、精製物を含む抗アレルギー作用は、特に限定はされないが、特には即時型アレルギーの抑制であり得る。食物アレルギーおよび花粉アレルギーに代表されるＩ型アレルギーは過敏反応として定義される。Ｉ型アレルギーは、肥満細胞および好塩基球に発現するIgEのレセプター（FcεRI）が、抗原により活性化されることで起るとされている。このことは、ヒスタミン、プロスタグランジンおよびロイコトリエンを含む多くの化学伝達物質の細胞外リリースを誘発する最初のステップであり、これらのメディエーターは、即時アレルギー反応を引き起こす。
【００４３】
本発明でいう抗アレルギー予防及び／又は改善用組成物は、特には、くしゃみ、かゆみ、鼻水、涙、皮膚炎、蕁麻疹、喘息等のアレルギー症状、および炎症性関節炎のような疾患の予防及び／改善に効果を有する。本発明の抗アレルギー予防及び／又は改善は、特にはＩ型アレルギーに効果を有する。あるいは本発明の予防及び／又は改善は、ＩｇＥ依存性の疾患に有効であるとも言える。
【００４４】
このような抗アレルギー効果は、例えば、細胞からのβ‐ヘキソサミニザーゼ放出抑制効果、すなわち好塩基球の脱顆粒抑制効果として検証することができる。
【００４５】
また、本明細書において、「免疫賦活」とは、抗アレルギー作用の他に、一般的な免疫賦活、粘膜免疫の賦活を含む意味である。
【００４６】
本発明でいう粘膜免疫賦活用組成物は、病原性細菌、寄生虫、病原性抗原、ウイルスによる感染や悪影響の予防またはそのような感染症や悪影響の改善に効果を有する。特には、腸管等の消化管免疫機能の低下や細菌性消化管感染による直接的な影響の他、間接的な影響の緩和にも有用である。
【００４７】
粘膜免疫賦活によって、例えば消化管粘膜における防御系の免疫機能の低下を防ぐことができる。これには、消化管への微生物の定着や増殖による消化管感染等により、発熱、嘔吐、下痢、腹痛等の症状が発症することがあるが、これらの症状の予防や緩和が含まれる。さらに、粘膜免疫賦活は、細菌性の下痢症等の予防や緩和にも有用である。幼児、老人、体力が低下した人における抵抗力の強化にも役立つ。このように、粘膜免疫賦活により、細菌やウイルスの中和、組織への細菌の付着の抑制、食物抗原によるアレルギーの抑制が可能となる。
【００４８】
このような免疫賦活作用に基づく抗アレルギー作用、免疫賦活作用は、血清中のＩｇＥ量の低下傾向や糞中のＩｇＡ量の増加として検証することができる。
【００４９】
［飲食料品］
本発明の免疫調節用組成物は、飲食料品の一つの成分として配合することが可能である。これらの飲食料品は、限定はされないが、抗アレルギー作用や免疫賦活作用、特には粘膜免疫賦活作用を有する飲食料品として用いることも可能であり、例えば、病院等の医療機関で患者のために提供され得る。またはこれらの飲食料品は、限定はされないが、機能性飲料又は機能性食品、栄養機能飲料又は栄養機能食品として提供することも可能であり、これらの機能性飲食料品は、医療機関の他、ドラッグストア、コンビニエンスストア、スーパーマーケット、百貨店等で提供され得る。機能性飲食料品とは、国や公共団体が許可・指定している医薬品的な効能を有する飲食品又は企業が国等に所定の効果を届け出た内容に基づき機能性を表示した飲食料品を意味する。機能性食品には、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、老人用食品、健康補助食品（バランス栄養食、サプリメント）等が例として挙げられる。医薬品的な効能又は機能性を表示したパッケージや容器、添付文書、取扱い説明書等を含む飲食品も含まれる。国等への申請書に医薬品と同様の効能又は機能性を表示した飲食品も含まれる。
【００５０】
アレルギー予防や改善を目的とした表示の場合、限定はされないが、例えば、アレルギー体質の方用、花粉が気になる方用などの表示の他、鼻の調子を整える、目の調子を整える、目や鼻の不快感を緩和する、目の健康、鼻の健康、目の疲労感を緩和するなどの表示等が挙げられる。
【００５１】
免疫賦活を目的とした表示の場合、限定はされないが、例えば、体力のない方用、虚弱体質の方用、お腹の調子を整える、などの表示等が挙げられる。
【００５２】
食品としては、あらゆる食品が挙げられ、例えば、穀類、いも類、魚介類、肉類、卵類、油脂類、乳類、野菜類、豆類、果実類、砂糖類、海藻類、菓子類、調味料類、調理加工食品類等が挙げられる。
【００５３】
調味加工食品としては、限定はされないが、例えば、ちくわ、かまぼこ等の水産加工品；ハムやソーセージ等の畜産加工品；クッキー、ビスケット、スナック、チョコレート、ケーキ等の菓子；そば、うどん、生麺、中華麺、パスタ等の麺類；食パン、菓子パン等のパン；納豆、味噌等の発酵加工食品；豆腐、おから等の大豆食品；浅漬け、糠漬け等の漬け物、水産品、加工肉、野菜、果物等の缶詰；バター、マーガリン、ヨーグルト、チーズ、牛乳等の乳製品；アイスクリーム、シャーベット等の冷菓食品等が挙げられる。
【００５４】
飲料としては、あらゆる飲料が挙げられ、限定はされないが、例えば、ハマアザミそのものをお茶とする飲料、お茶の葉の代用としての焙煎乾燥物、果汁飲料、果汁１００％飲料、低果汁飲料、果肉飲料、野菜ジュース、フレーバー入り飲料、希釈用果実飲料等の果実飲料；炭酸飲料；コーヒー、コーヒー飲料、コーヒー入り清涼飲料、ココア飲料、紅茶、緑茶、抹茶、烏龍茶、麦茶、ほうじ茶等の嗜好飲料；食酢飲料；スポーツドリンク等の清涼飲料水；牛乳；乳飲料；乳性飲料；乳酸飲料；乳酸菌飲料；豆乳、調製豆乳等の大豆飲料；ビール、日本酒、焼酎、リキュール、ワイン等のアルコール飲料；タウリン、ローヤルゼリー、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、鉄分等を含む栄養飲料等が挙げられる。
【００５５】
本発明を飲食料品に適用する時期に制限はないが、例えば、飲食料品の製造工程において、加工工程、調理工程、加熱工程、保存工程等の前後において適用され得る。例えば、加工工程や調理工程においては、原料に本発明の免疫調節用組成物を含ませることができる。適用方法は、飲食料品の種類、原料の形態等に応じて適宜変更することができ、混入、添加、塗布、噴霧、浸漬等の様々な方法を採用し得る。
【００５６】
本発明の免疫調節用組成物を飲料品に適用する場合、一つの実施形態において、茶飲料とすることが特に好ましい。限定はされないが、乾燥したハマアザミの葉部及び／又は茎部は、公知の方法により裁断された後、破砕又は粉砕され粉状物とされる。ハマアザミの粉状物の状態で、茶飲料として販売することが可能である。また、必要により、ハマアザミの粉状物は焙煎される。ハマアザミの粉状物は焙煎された状態で茶飲料として販売することも可能である。焙煎されたハマアザミは、熱湯で煮出すことで飲用される。
【００５７】
また、前記飲料と他の茶飲料およびハマアザミ抽出液を混合物として、または水などで薄めてジュースやドリンク剤等として用いることができる。更に、前記混合物の濃縮品、噴霧乾燥等によって粉末状にした粉末茶、凍結乾燥したインスタント茶等として利用することができる。その場合、たとえば粉末茶やインスタント茶にお湯を注いで飲むことができる。また、例えば緑茶や紅茶などの茶調製物とハマアザミ調製物の混合物を飲料用茶葉としてそのまま用いることもできる。その場合、一般的な日本茶や紅茶の飲用物と同様にして、茶調製物とハマアザミ調製物との混合茶葉に湯を注いで飲むことができる。
【００５８】
本発明の免疫調節用組成物を食品に適用する場合、一つの実施形態において、青汁食品とすることが望ましい。限定はされないが、ここでの青汁食品とは、生のハマアザミの葉部及び／又は茎部もしくは乾燥したハマアザミの葉部及び／又は茎部を細断、粉砕、磨砕等の微細化処理したもの、あるいは原料や前記微細化処理物を圧搾して得られる搾汁であって、その形状としては、微細固形状、半固形状、ペースト状、液状である。さらにこれら形状のものを乾燥させた後、粉砕して得られる粉末状のものであっても良い。粉末状のものとしては、原料を細断せずそのまま乾燥させたものを粉砕しても良い。乾燥の方法としては、自然乾燥、加熱乾燥、噴霧乾燥等の方法が挙げられるが、凍結乾燥法を用いると、熱により変質がなく、粉砕も容易であり、嗜好性に優れたものが得られるため好ましい。また保存性の面からも好ましい。
【００５９】
また、ハマアザミの葉や茎部を、他の青汁原料と組み合わせて使用することができる。これら青汁原料は、上記の場合と同様に処理され青汁食品とする。処理はハマアザミの葉や茎部と原料の段階から混合して処理しても、途中の段階で混合しても、別々に調製した青汁食品を混合しても良い。本発明におけるハマアザミの葉や茎部以外の他の青汁の素材としては、特に限定はないが、例えば、ケール、ブロッコリー、キャベツ、小松菜、ダイコン葉、クレソン、ナズナ、大麦若葉、明日葉、セリ、パセリ、ニンジン、セロリ、アスパラガス、ホウレン草、ニガウリ、緑茶、シソ、春菊、ニワトコ、ハコベ、ヨモギ、桑、シモン葉、クマザサ、モロヘイヤ等が挙げられ、これらの１種、又は２種以上をハマアザミの葉及び／又は茎部と組み合わせることができる。本発明において、ハマアザミの葉や茎部と上記他の青汁原料を組合せて青汁食品とする場合、青汁食品におけるハマアザミの葉及び／又は茎部由来の成分が、乾燥残分として、全乾燥残分量の１０ｗ／ｗ％以上であることが望ましい。この範囲であると、ハマアザミ由来の栄養成分が有効に摂取され、青汁食品の嗜好性の改善効果に優れる。
【００６０】
本発明の免疫調節用組成物を飲食料品に適用する場合は、本発明の効果を損なわない範囲で通常の食品及び飲料に使用されている助剤を適宜配合することが可能である。そのような助剤としては、例えば、ブドウ糖、ショ糖、果糖、オリゴ糖、水飴、マルトース、マルチトース、キシリトール、ソルビトール、アスパルテーム、スクラロース、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄＬ−α−トコフェノール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸、ソルビタン脂肪酸エステル、エステルアラビアガム、カゼイン、ペクチン、ゼラチン、寒天、カラギーナン、ビタミンＢ類、ビタミンＣ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、カルシウム塩類、アミノ酸類、色素、香料、保存剤等が挙げられる。
【００６１】
本発明の免疫調節用組成物を飲食料品に適用する場合のハマアザミ又はその抽出物の含有量は、限定はされないが、固形分換算で、ヒト及び動物であれば、一般に１日あたり０．００００１〜５０００ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００６２】
本発明の免疫調節用組成物を飲料品に適用する場合のｐＨは、飲料品の種類によって適宜調整されるが、例えば、茶飲料の場合は、ｐＨ３．５〜７．５とすることができ、３．８〜７．２が好ましく、４．０〜７．０がより好ましく、４．５〜〜６．５がさらに好ましい。飲料品のｐＨは、例えば、炭酸水素ナトリウム、クエン酸等を適宜配合することにより調整することができる。
【００６３】
［医薬品、医薬部外品］
本発明の免疫調節用組成物は、医薬品や医薬部外品とされる場合は、適宜の形態に製剤化し、任意の投与形態でヒト又は動物に投与することができる。投与形態としては、限定はされないが、例えば、経口、経皮、経腸、経粘膜、注射などが挙げられる。本発明の効果を顕著に奏する観点から、投与形態は経口投与が好ましい。
【００６４】
本発明の免疫調節用組成物が経口投与される場合は、本発明の免疫調節用組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、散剤、フィルム状、ドロップ状、ゼリー状、半固体のプリン状等の剤型に、公知の方法で製剤化される。フィルム状、ドロップ状、ゼリー状、半固体のプリン状の剤型等により、経口投与の場合は、本発明の免疫調節用組成物は、水無しにより摂取されることが可能である。または、ハマアザミ又はその抽出物若しくは精製物の乾燥粉末を生薬又は漢方薬製剤として経口投与することも可能である。
【００６５】
非経口投与する場合は、例えば、皮下注射、静脈内注射、筋肉注射、髄腔内注射、経皮吸収剤、吸入薬、坐剤、点眼剤、点鼻剤等の剤型に公知の方法で製剤化することが可能である。
【００６６】
投与形態の一態様として、ハマアザミ又はその抽出物又はその精製物の安定性及び生体利用性を高め、あるいは患者の服薬コンプライアンスを向上するため、又はこれらを組み合わせた目的のために、公知の薬物送達システムを利用して、吸収部位まで本発明の免疫調節用組成物を送達することが可能である。
【００６７】
薬物送達システムとしては、限定されないが、例えばセルロース、デキストラン、澱粉、ポリビニルアルコール、アセチル化若しくはメタクリル化されたポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸及びそのブロック共重合体、ポリエチレングリコール等のポリマーを利用する方法、アルブミン等の輸送タンパク質を利用する方法、その他ミセル、リポソーム、ミクロスフェア、ナノ粒子、複合エマルジョン、デンドリマー等を利用する方法が挙げられる。これらの薬物送達システムは、吸収部位等の目的の部位へ本発明の免疫調節用組成物を運搬する目的だけでなく、適時に本発明の免疫調節用組成物を放出する放出制御の目的にも用いられ得る。
【００６８】
本発明の免疫調節用組成物は、本発明の効果を損なわない範囲で、固形の製剤においては、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等を、液状の製剤においては、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等を適宜配合することが可能である。
【００６９】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、ぶどう糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが挙げられる。
【００７０】
滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、精製タルク、コロイドシリカ、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
【００７１】
結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、結合セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００７２】
崩壊剤としては、例えば、デンプン、乾燥デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルメロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。
【００７３】
溶剤としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油等が挙げられる。
【００７４】
溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００７５】
懸濁化剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤や、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。
【００７６】
等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。
【００７７】
緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液等が挙げられる。
【００７８】
無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール等が挙げられる。
【００７９】
防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。
【００８０】
本発明の免疫調節用組成物を経口により投与する場合のハマアザミ又はその抽出物の有効投与量は、限定はされないが、固形分換算で、ヒト及び動物であれば、一般に１日あたり０．００００１〜５０００ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。本発明の免疫調節用組成物を非経口投与する場合のハマアザミ又はその抽出物の有効投与量は、限定はされないが、固形分換算で、ヒト及び動物であれば、一般に一日あたり０．０００００１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００００１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、０．００００１〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。投与回数は、通常は１日１〜４回程度であるが、投与経路によって、適宜調整することができる。
【実施例】
【００８１】
次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８２】
（実施例１）乾燥粉砕物からの酢酸エチルによる抽出方法
ハマアザミの葉及び花の乾燥粉砕物、それぞれ１００ｇを、それぞれ１００％酢酸エチル１０００ｍｌに分散、撹拌させ、室温にて１週間抽出した。抽出上清を濾別したのち、残渣を再び酢酸エチルに分散させ、加熱還流後、抽出上清を濾別した。上清を順次減圧濃縮、窒素ガス雰囲気下で減圧乾燥、凍結乾燥を行い、ハマアザミの葉による抽出物１（４ｇ）及びハマアザミの花による抽出物２（４ｇ）を得た。
【００８３】
（実施例２）乾燥粉砕物からの水による抽出方法
ハマアザミの葉の乾燥粉砕物１００ｇに水１．５Ｌを加え、ミキサーで粉砕後、撹拌及び超音波付与を行い、抽出上清を濾別及び脱水することにより、水と併せて抽出液（２Ｌ）を得た。更に、順次減圧濃縮、窒素ガス雰囲気下で減圧乾燥、凍結乾燥を行い、抽出物３（１５ｇ）を得た。
【００８４】
（実施例３）搾汁による抽出方法
ハマアザミの生葉及び生茎の混合物（１ｋｇ）に水１Ｌを加え、ミキサーで粉砕後、撹拌及び超音波付与を行い、抽出上清を濾別、洗浄、及び脱水する事により、水と併せて抽出液（２Ｌ）を得た。更に、順次減圧濃縮、窒素ガス雰囲気下で減圧乾燥、凍結乾燥を行い、抽出物４（１５ｇ）を得た。
【００８５】
（実施例４）圧搾による抽出方法
ハマアザミの生葉及び生茎の混合物（１ｋｇ）に水１Ｌを加え、ミキサーで粉砕後、撹拌及び超音波付与を行い、抽出上清を濾別及び脱水後、圧搾する事により、抽出液（１．５Ｌ）を得た。更に、順次減圧濃縮、窒素ガス雰囲気下で減圧乾燥、凍結乾燥を行い、抽出物（２０ｇ）を得た。
【００８６】
（実施例５）乾燥粉末の製造方法
ハマアザミの生葉、生茎（１ｋｇ）を、４０℃冷風乾燥機で一晩乾燥後、粉砕機で微粉砕し、ハマアザミ乾燥粉末（１００ｇ）を得た。
【００８７】
（実施例６）乾燥粉砕物からの熱水による抽出方法
実施例５で得られたハマアザミの葉及び茎の乾燥粉砕物１００ｇに熱水１．５Ｌを加え、抽出上清を濾別することにより、水と併せて抽出液（２Ｌ）を得た。更に、順次減圧濃縮、窒素ガス雰囲気下で減圧乾燥、凍結乾燥を行い、抽出物３（２０ｇ）を得た。
【００８８】
（実施例７）生葉及び生茎からの熱水による抽出方法
ハマアザミの生葉及び生茎の混合物（１ｋｇ）に熱水１Ｌを加え、抽出上清を濾別することにより、水と併せて抽出液（１．５Ｌ）を得た。更に、順次減圧濃縮、窒素ガス雰囲気下で減圧乾燥、凍結乾燥を行い、抽出物３（１５ｇ）を得た。
【００８９】
（実施例８）ハマアザミ抽出物の画分分離
ハマアザミの葉から実施例１のようにして得られた酢酸エチル抽出物５００ｍｇをシリカゲルクロマトグラフィーに供した。条件は、下記の通りである。
・シリカゲル：和光純薬製、Ｗａｋｏｓｉｌ  Ｃ−２００、２５ｇ
・カラムサイズ；２０ｍｍφ×１００ｃｍ
・溶離液：アセトン／ヘキサン＋メタノール（濃度０ｗ／ｗ％〜１００ｗ／ｗ％）、各５００ｍＬ
このような条件で、０、５−１、５−２、１０、２０、３０、５０、１００％アセトン画分及び１００％メタノール画分の計９画分（図１）の試料を分取して、それぞれ試験例１によって分析した。
【００９０】
（実施例９）
さらに、実施例８で得られた画分のうちで試験例１の評価結果の高かった３０％アセトン画分の精製を進めた。
すなわち、実施例８で得られた３０％アセトン画分７０ｍｇを、以下の条件のＨＰＬＣに供した。
・析装置：  島津製作所製、ＬＣ−１０Ａ
・カラム：  ナカライテスク社製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ
・カラムサイズ；１０ｍｍφ×２５０ｍｍ
・溶離液：８０％メタノール
・流量：  １．５  ｍｌ／ｍｉｎ
・入口圧：      ＭＰａ
・検出器：紫外分光検出器（ＵＶ）
・カラム温度：３５℃
・注入量：５０μｌ
【００９１】
上記の条件でＨＰＬＣを行い、紫外線吸収のあったピークを分取し、活性成分（シルシマリチン）を１２ｍｇ得た。
1H NMR：（500 MHz, CDCl3）：  dH 7.90 (1H, d), 7.81 (1H, d), 6.97 (1H, m), 6.56, dd), 3.96(3H,s) 3.92(3H,s)
【００９２】
（試験例１）β‐ヘキソサミニダーゼ遊離抑制の評価
１．細胞培養
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ナカライテスク社製）、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ナカライテスク社製）を含む、ダルベッコ改変イーグル培地（ナカライテスク社製、ＤＭＥＭ）中で培養した。この時、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃の条件であった。
【００９３】
２．βーヘキソサミニダーゼ遊離活性
上記１で培養したＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中に、２．５×１０５細胞／ウェルで、２４ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩培養した。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。この細胞を、２時間５０ｎｇ／ｍＬのＤＮＰ特異的ＩｇＥ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて感作した。細胞を、ＭＴ緩衝液で洗浄した後、ＭＴ緩衝液中に希釈したハマアザミ抽出試料または精製物を添加した。ここで、ハマアザミ抽出試料は、実施例１と同様の方法で、１００％の酢酸エチルでハマアザミの葉または花を抽出処理後、濃縮したサンプルを１０ｍｇ/ｍLの濃度になるようにジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、MT緩衝液中に０．５％濃度になるよう希釈して使用した。実施例８および９で得られたハマアザミの抽出物から精製して得られたシルシマリチンは、濃縮したサンプルを１０ｍｇ/ｍLの濃度になるようにジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、MT緩衝液中に０．５％濃度になるよう希釈して使用した。同様に市販されているシルシマリチンも参考のため試験に供した。１０分間のインキュベーション後、ＤＮＰ−ＨＳＡ（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）を添加し、そして培養物を３０分間インキュベートした。上清を回収し、そして細胞を、０．１％ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル（トリトンＸ１００、ナカライテスク社製）を含むＭＴ緩衝液で溶解した。各上清および細胞溶解物のアリコートを３７℃で３０分間、０．１  Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ  ４．５）中で可溶化した、１ｍＭのｐ−ニトロフェニルＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミド（和光純薬社製）と共にインキュベートした。酵素反応を、２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ  １０．４）を添加することにより停止し、吸光度を４０５ｎｍで測定した。ハマアザミ抽出試料によるＲＢＬ−２Ｈ３細胞からβ−ヘキソサミニダーゼ放出活性の割合を、以下の式を用いて計算した。
酵素放出活性（％）＝｛（細胞上清の吸収／細胞上清の吸収＋細胞溶解物の吸収）×１００｝
【００９４】
その結果をそれぞれ図２〜図５に示す。データは、３回の実験の平均±標準偏差で示している。
【００９５】
図２および図３からわかるように、ハマアザミの葉および花の抽出物に、特に優れたβ−ヘキソサミニザーゼ遊離抑制作用が見出された。
【００９６】
また、ハマアザミの葉の酢酸エチル抽出物カラムクロマトグラフィーによって分画した実施例８の試料について、図４に示すように、いくつかの分画（Ｄ．Ｃ．Ｃ．３０、５０、１００）は、有意にβ‐ヘキソサミニダーゼの放出を減弱することがわかった。特に、Ｄ．Ｃ．Ｃ．３０とＤ．Ｃ．Ｃ．５０は５０μｇ／ｍＬで、８６．１から８８．６パーセント阻害、ポジティブコントロールとの比較でβ−ヘキソサミニダーゼの放出に対する強力な阻害効果を有していることがわかった。
【００９７】
さらに、実施例９で得られたハマアザミ精製物または市販のシルシマリチンを用いた試験により、図５Ａおよび図５Ｂに示す通り、濃度依存的なβ−ヘキソサミニダーゼの放出に対する強力な阻害効果が見られた。ここで、図５Ａは、ハマアザミ精製物を使用した結果を示し、図５Ｂは、市販のシルシマリチンを使用した結果を示す。
【００９８】
（試験例２）生体を用いた抗体産生評価
１．動物と抗原
５週齢の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（体重１５〜２０ｇ）は、日本ＳＬＣ（浜松、静岡県、日本）から購入した。動物を、室温２４±３℃、１２／１２ｈ（Ａ．Ｍ．７：００−Ｐ．Ｍ．７：００）の明暗サイクルの条件で飼育した。実験計画は、高知県立大学の動物実験委員会（承認番号：２０１５−００６）によって承認されている、動物実験のためのガイドラインに従った。抗原は、ＬＨＥであり、和光純薬から購入した。
【００９９】
２．給餌、感作およびサンプリング
マウスは水とＡＩＮ−９３Ｇ食餌を自由に摂取できるようにした。次いで、マウスを体重に応じて、１０匹ずつからなる３グループに割り当て、４週間、以下の食餌を自由に供給した。
非感作グループ：ＡＩＮ−９３Ｇ
ＬＨＥ感作グループ：ＡＩＮ−９３Ｇ
ＬＨＥ感作−ハマアザミグループ：１％ハマアザミ（ＣＭＭ）を添加したＡＩＮ−９３Ｇ。
【０１００】
【表１】
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【０１０１】
実験期間を通して、マウスの体重を３回／週記録した。１つの感作群のマウスは、１４日目および２１日目に、ＬＨＥ５０μｇおよび４ｍｇの水酸化アルミニウムを含む０．２ｍＬのＰＢＳを腹腔内投与した（ＬＨＥ感作グループおよびＬＨＥ感作‐ハマアザミグループの両方）。非感作グループは、４ｍｇの水酸化アルミニウムを含む０．２ｍＬのＰＢＳのみを腹腔内投与した。抗体レベルを評価するために、２７日目に軽い麻酔下において、血液をマウスの眼窩静脈から得た。糞ペレットは、３１日目に採取した。次に、糞ペレットをＡＬＰＨＡ  ２−４  ＬＤｐｌｕｓ（クリスト社製、オステロード、ドイツ）により乾燥した。これらのサンプルは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に供し、総抗体およびＬＨＥに対する特異的抗体を測定した。
【０１０２】
３．血清ＬＨＥ特異的ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａの測定
ＬＨＥ特異的ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａのレベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。具体的には、ヌンク‐イムノプレート（サーモサイエンティフィック社製、ロスキレ、デンマーク）を、ＬＨＥを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ  ９．６）１００μＬでコーティングし、そして４℃で一晩インキュベートした。ウェルを、０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０、和光純薬、大阪、日本）を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ溶液にて３７℃で１時間インキュベートした。各血清試料の１００μＬ量（ＩｇＥとＩｇＡでは１：５０、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａでは、１：２５０の割合で、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴにて希釈）を各ウェルに適用し、そして混合物を３７℃にて１時間インキュベートした。２００μＬのＰＢＳＴで各ウェルを５回洗浄後、ＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＩｇＥ（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴにて１：１０００希釈、サンタクルーズバイオテクノロジー社製）１００μＬ、ＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＩｇＡ（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴにて１：１０００希釈、サンタクルーズバイオテクノロジー社製）、ＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ１（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴにて１：５０００希釈、サンタクルーズバイオテクノロジー社製）、およびＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ２ａ（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴにて１：５０００希釈、サンタクルーズバイオテクノロジー社製）を各ウェルに添加し、そして３７℃にて１時間インキュベートした。各ウェルを２００μＬのＰＢＳＴで５回洗浄後、合成基質であるο−ｐｈｅｎｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ（一級；和光純薬工業）２ｍｇを５ｍｌのクエン酸バッファーに加え、さらにＨ２Ｏ２（特級；和光純薬工業）を０．００６％加えたものを、各ウェルに１００μｌずつ入れ、室温にて１−５分以内の反応後、２．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４（ナカライテスク社製）５０μＬで反応を終了させ、そして４９０ｎｍでの吸光度をｘＭａｒｋＴＭマイクロプレートリーダー（バイオラッドラボラトリー社製）で測定した。
【０１０３】
４．血清総ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＧの測定
総ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＡレベルを、製造業者の説明書に従ってＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて定量した。
【０１０４】
５．糞便中の総ＩｇＡとＬＨＥ特異的ＩｇＡの測定
糞ペレットの抽出物は、以下のようにして調製した。すなわち、糞ペレット１００ｍｇを、ＰＢＳ  １ｍＬに混合し、そして一晩４℃でインキュベートした。その後、ペレットを５分間ボルテックスした。この混合物を遠心分離（４，０００×ｇで、１５分間）後、上清を回収し、−３０℃で保存した。総ＩｇＡおよびＬＨＥ特異的ＩｇＡの検出のための手順は、上述と同様に行った。
【０１０５】
３つのグループの間に体重差は認められなかった。
【０１０６】
血清中のＬＨＥ特異的ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａの産生の確認の結果（図６〜図８）、以下のことが分かった。なお、図６および図７においては、データは、１０匹のマウスの平均±標準誤差で示され、星印は、ｐ＜０．０５を表わし、十字印は、ｐ＜０．１０を表わす。また、図８においては、データは、７匹のマウスの平均±標準誤差で示され、星印は、ｐ＜０．０５を表わし、十字印は、ｐ＜０．１０を表わす。
【０１０７】
食餌によって１％ハマアザミ抽出物を与えた場合は、抗原特異ＩｇＥの産生を抑える傾向があることが示唆された。（図６Ａ）
【０１０８】
食餌によって１％ハマアザミ抽出物を与えた場合は、抗原特異ＩｇＡの産生を促進することが示唆された（図６Ｂ）。
【０１０９】
食餌によって１％ハマアザミ抽出物を与えた場合は、抗原特異ＩｇＧ１の産生に影響しないと考えられた（図６Ｃ）。
【０１１０】
食餌によって１％ハマアザミ抽出物を与えた場合は、抗原特異ＩｇＧ２ａの産生に影響しないと考えられた（図６Ｄ）。
【０１１１】
ＴｈバランスでみるとＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比に違いの変化は認められず、ＩｇＧにおいてはＴｈ２（免疫抑制）へシフトしないことが示唆された。
【０１１２】
また、１％ハマアザミ抽出物投与では、抗原特異ＩｇＥの産生を抑える傾向があるが、総ＩｇＥを抑えるわけではないことが明らかとなった。１％ハマアザミ抽出物投与では血清中の抗原特異ＩｇＡ産生を促進するが、総ＩｇＡを促進するわけではないことが明らかとなった。ハマアザミ群の血清中の総ＩｇＧ１は、ポジディブコントロールであるＬＨＥ感作群及びネガティブコントロールである非感作群と比較し同程度であった。一方、ＬＨＥ感作群では非感作群と比較し、有意な上昇が認められた。（図６および図７）
このことは、ハマアザミにアレルギーを抑制する作用があることを意味すると考えられる。
【０１１３】
１％ハマアザミ抽出物投与では、糞便中抗原特異ＩｇＡの産生を促進することが示唆された。１％ハマアザミ抽出物投与では糞便中抗原特異ＩｇＡの産生を促進するが、総ＩｇＡを促進するわけではないことが明らかとなった。（図８）。このことは、ハマアザミに粘膜免疫の上昇作用があることを意味すると考えられる。
【０１１４】
（試験例３）脾臓リンパ球を用いた抗体産生評価
卵白オボアルブミン（OVA）感作したマウスを用いて、特に抗体を産生する組織である脾臓からリンパ球を分離し、酢酸エチル抽出したハマアザミの抗体産生に及ぼす影響を評価した。さらに、抗アレルギー効果についてTh1/Th2バランスについて検討した。
１．動物と抗原
５週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（体重１５〜２０ｇ）は、日本ＳＬＣ（浜松、静岡県、日本）から購入した。動物を、２４±３℃で維持し、１２時間の明／暗サイクルで部屋に収容した。実験計画は、高知県立大学の動物実験委員会によって承認されている、動物実験のためのガイドラインに従った。抗原は、卵白オボアルブミン（ＯＶＡ）であり、和光純薬から購入した。
【０１１５】
２．給餌、感作およびサンプリング
マウスは水とMF飼料（オリエンタル酵母工業）を自由に摂取できるようにした。
【０１１６】
マウスの感作は、１週間間隔で合計３回の腹腔免疫を行うことで実行した。すなわち、それぞれ、ＯＶＡ５０μｇおよび水酸化アルミニウムの４ｍｇを含む０．２ｍＬのＰＢＳを腹腔内投与した。抗体産生の状況を評価するために、２７日目に軽い麻酔下において、血液をマウスの眼窩静脈から得た。抗体産生が確認できたマウスから、脾臓を取りだした。
【０１１７】
まず、５ｍＬのチューブにＲＰＭＩ１６４０培地を３ｍＬ入れ、取りだした脾臓を浸した。その後、５ｍＬディッシュにＲＰＭＩ１６４０培地を５ｍＬ入れ、脾臓をすりガラス２枚ですり潰した。ナイロンメッシュ（グライナー：７０μｍメッシュ）を使い、５０ｍＬの遠沈管に細胞懸濁液を作り、４００×ｇで５分間遠心分離した。遠心分離後の上清を除去し、新しいＲＰＭＩ１６４０培地を１０ｍＬ加えて懸濁した。この操作を２回繰り返した。その後、ＲＰＭＩ１６４０培地を１０ｍＬ加えて細胞懸濁液を作った。
【０１１８】
別の１５ｍＬ遠沈管にＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（コスモ・バイオ）を４ｍＬ入れておき、この上に細胞懸濁液を静かに重層し、１０００×ｇで３０分間遠心した。中間層に集まったリンパ球をピペットで取り出し、１５ｍＬの遠沈管に移した後、新しいＲＰＭＩ１６４０培地を１０ｍＬ加えて懸濁した。さらに、３５０×ｇで５分間遠心した。遠心分離後の上清を除去し、新しいＲＰＭＩ１６４０培地を１０ｍＬ加えて懸濁した。この操作を２回繰り返した。その後、ＲＰＭＩ１６４０培地を１０ｍＬ加えて細胞懸濁液を作った。
【０１１９】
このようにして得られた脾臓リンパ球溶液（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を、２４穴プレートに４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの脾臓リンパ球溶液をそれぞれ０．５ｍｌ播いた。培地で添加した濃度の２倍量のハマアザミ抽出物（０．２、２、１０、２０、１００、２００、１０００ｍｇ／ｍｌ）を０．５ｍｌ添加し、２．５  ｍｇ／ｍＬのアレルゲン（ＯＶＡ）を１０μＬ（２５μｇのアレルゲン）添加し、抗原刺激した。そのまま脾臓リンパ球を７２時間培養した。
【０１２０】
この後、培地上清中に含まれるＯＶＡ特異的抗体ＩｇＥ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａの量を測定した。測定結果を図９に示す。さらに、測定結果から得られたＩｇ２ａ／ＩｇＧ１の割合を図１０に示す。
【０１２１】
この結果から、IgEおよびIgG1は濃度依存的に抗体価が低下していることがわかった。抗体産生が活発な脾臓においてアレルギーに関係する抗体価が低下したことから、ハマアザミ抽出物は、血清中の抗体量に加え、抗体産生の中心である脾臓リンパ球においてもアレルギーを抑制する可能性が示唆された。
【０１２２】
Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスに関しては、ハマアザミ抽出物の濃度依存的に、Ｔｈ１値が上昇し、Ｔｈ１／Ｔｈ２がバランスの取れた良好な状態になっていることがわかる。このことからも、ハマアザミ抽出物が、アレルギーを抑制する可能性が示唆される。
【０１２３】
（試験例４）
試験例１と同様に調製したＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、９６ウェルのブラックマイクロプレートに６．０×１０４細胞／ウェルとなるよう播種し、３７℃で一晩培養した。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。この細胞に、２時間、５０ｎｇ／ｍＬのＤＮＰ特異的ＩｇＥ（抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて感作した。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、Ｆｌｕｏ−３ＡＭ（アセトキシメチル）とともに１時間反応させた。反応後、さらにＰＢＳで2回洗浄し、ＰＢＳで溶解した１００μｌの試料を添加し１０分間反応させた。その後、ＭＴバッファーで０．６２５μｇ／ｍｌに調整したＤＮＰ−ＨＳＡを１０μｌ加え、ただちに蛍光・発光マイクロプレートリーダー（Thermo）で、４８５ｎｍ、５３８ｎｍの吸光度を測定した。
ここで、試料としては、実施例１で調製したハマアザミの葉の抽出物（１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌに濃度を調整）、ブランク（ＤＮＰ−ＨＳＡを含まないＭＴバッファー）、およびコントロール（ハマアザミを含まないＰＢＳ）を使用した。
【０１２４】
データは、平均±標準偏差（ｎ＝４）で表わす。コントロールと比較して、ハマアザミを添加した場合には、顕著な抑制効果が見られた（図１１）。
【０１２５】
（試験例５）
ＰＢＳで１μｇ／２０μＬ（５０μｇ／ｍＬ）に調整した抗−ＤＮＰ  ＩｇＥ抗体（Ｓｉｇｍａ）を麻酔下のＢＡＬＢ／ｃマウスの耳介に皮内投与した。２３時間後、ＰＢＳで５％に調整した試料溶液を強制経口投与（５ｍｇ／１００μｇ／匹（２０ｇ）；２５０ｍｇ／５ｍＬ／ｋｇ）した。コントロールはＰＢＳを同様に強制経口投与した。１時間後、１％エバンスブルーを含むＰＢＳで１００μｇ／２００μＬ（５００μｇ／ｍＬ）に調整したＤＮＰ−ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を静脈に投与した。ＤＮＰ−ＨＡＳを投与３０分後、マウスの両耳介厚をｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｇａｕｇｅで３回測定した後、頸椎脱臼によりマウスを屠殺し、耳介を採取した。採取した耳介は、１ｍＬのホルムアミドで６３℃、４８ｈインキュベートし耳から色素が抽出されたことを確認し、試験管から耳を取り除き、上清の吸光度を６１０ｎｍで測定した。
【０１２６】
その結果を図１２に示す。図１２における説明は以下を意味する。
Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ：抗体感作なし‐抗原投与
Ａｎｔｉ  ＤＮＰ−ＨＳＡ：抗体感作有‐抗原投与
Ａｎｔｉ  ＤＮＰ−ＨＳＡ‐ＣＭＭ：抗体感作有‐ハマアザミ溶液投与‐抗原投与
Ear swellingは、耳介厚測定結果を指す。
Ear dye intensityは、Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌの色素量を１とした時の相対的値で示す。
【０１２７】
ハマアザミの経口投与により、耳介の膨張が抑えられ、色素量も抑制できていることがわかる。
【０１２８】
（処方例）
以下の各処方例中の数値の単位は、全体量を１００とした、「ｗ／ｗ％」で示す。
【０１２９】
（処方例１）アレルギーの予防または治療のための組成物（錠剤）
上記の実施例で得られた抽出物を用いて、常法により下記組成のアレルギー予防又は治療のための錠剤を製造することができる。ここで、ハマアザミ抽出物としては、実施例１で得られるような試料を用いる。
【表２】
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【０１３０】
（処方例２）アレルギー予防または治療のための組成物（顆粒剤）
上記の実施例１で得られた抽出物を用いて、下記組成を混合及び撹拌して均一に調製し、流動層造粒装置により顆粒を得ることができる。顆粒剤は、飲料と共に服用することが可能である。
【０１３１】
【表３】
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【０１３２】
（処方例３）アレルギー予防または治療のための飲料
上記の実施例１で得られた抽出物を用いて、常法により下記組成のアレルギー予防又は治療のための飲料を製造することができる。
【０１３３】
【表４】
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【０１３４】
（処方例５）お茶
（処方例）：粉末茶  
成    分                                      配合量
ハマアザミ水抽出物（粉末）                        ２２
香料                                                ３
デキストリン                                      ７５
合    計                                      １００
（処方例）：粉末茶  
成    分                                      配合量
ハマアザミ熱水抽出物（粉末）                      ２２
香料                                                ３
デキストリン                                      ７５
合    計                                      １００
【０１３５】
（処方例）
水９００ｍｌを６０℃まで加熱し、これにハマアザミ葉または茎、または葉及び茎の混合物３０ｇを加え６分間抽出した。これを３０メッシュのストレーナーで残渣を除去し、濾紙濾過（工業用濾紙No.26：ADVANTEC社製、捕集粒子径=3μm）により清澄化を行い、茶７６０ｍｌを得た。
【０１３６】
（処方例）
ハマアザミ葉及び茎部１００ｇを長さ３ｍｍ程度に刻んだものを常法により１００℃において１時間撹拌して焙煎した。
この組成物を浸透性の良い薄紙製袋に詰めてティ−パック等の袋部を得た。この袋部１個当たりに含まれるセンナ茎部は粉砕物１．２ｇである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2018083764.tif 000016
【図１１】
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【図１２】
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