(57)【要約】【課題】筋肉の分解を抑制可能である新規な技術を提供することを目的とする。【解決手段】  リポテイコ酸を含有する、筋肉の分解抑制剤または筋肉分解抑制用飲食品。また、リポテイコ酸を摂取させることを含む、筋肉の分解を抑制する方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポテイコ酸を含有する、筋肉の分解抑制剤。
【請求項２】
リポテイコ酸を含有する、筋肉分解抑制用飲食品。
【請求項３】
リポテイコ酸を摂取させることを含む、筋肉の分解を抑制する方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は筋肉の分解抑制に関し、特にAtrogin-1の発現によって引き起こされる筋肉の分解の抑制に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトなどにおける筋肉の分解としては例えば加齢によるものが公知となっている。具体的には、加齢に伴う骨格筋の減少は30歳ごろから始まり、60歳を超えるとその減少率が高くなることが知られている。この骨格筋量および筋力の一定以上の低下をサルコペニアと呼び、60代では約10%、75歳以上の後期高齢者では実に35%がサルコペニアと判定されている。サルコペニアは、生活の質(QOL)の低下や、転倒による骨折、入院、寝たきり等のリスクを増加させるだけでなく、急性疾患や外科手術後の予後の悪化リスクにも関与している。
【０００３】
この加齢による骨格筋の減少は、筋肉分解の促進が主な原因とされている。
具体的に説明すると、骨格筋は合成と分解のバランスにより形成され、このうち、骨格筋の合成は運動や栄養の摂取により促進される。一方、骨格筋の分解は老化、不活動（ベットレスト、ギブス固定）、栄養飢餓、疾病等により促進される。
【０００４】
例えば、生体の老化やストレスにより体内に産生される炎症性サイトカイン（IL-6）、腫瘍壊死因子-α(tumor necrosis factor-α：TNF-α)および糖質コルチコイド等が増加する。これらは筋分解を促進することが知られている。
【０００５】
高齢者はこれらのサイトカインやホルモンの分泌が老化等により過多状態となっている場合が多く、その結果、骨格筋の分解が促進されている。
【０００６】
ここで、高齢者におけるQOLの低下を抑制可能である技術として、特許文献１に開示される技術が提案されている。特許文献１は、筋肉量および活動量増加を支援する身体活動促進剤に関し、乳酸菌の１種であるラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）を有効成分としている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2013-47192号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１に開示される身体活動促進剤はこれを摂取することにより筋肉量を増加させるものである一方、筋肉の分解を抑制するものではない。
本発明は、筋肉の分解を抑制可能である新規な技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
サルコペニアの予防・改善には運動や栄養摂取による筋肉の合成促進が着目されているが、内部環境から進行する筋肉の分解の原因を改善することで効率的なサルコペニアの予防が可能となる。
骨格筋の分解はタンパク分解酵素によって生じ、なかでもユビキチン−プロテアソーム系が亢進されることが知られている。また、これに関する2つの筋特異的ユビキチンリガーゼ遺伝子[MAFbx(muscle atrophy F-box)/Agrgoin-1 とMuRF1(muscle ring finger 1)]が知られている。
グルココルチコイド、低栄養、IL-6、TNF-αおよび不活動（ベットレスト、ギブス固定等）により、これら筋特異的ユビキチンリガーゼ遺伝子が亢進され、その結果、骨格筋が分解される。よって、これらの遺伝子はサルコペニアの指標となっている。
本発明者は鋭意研究の結果、ラクトバチルス・カルバタス CP2998株に含まれる成分を摂取することによりAtrogin-1の発現が抑制され、骨格筋の分解が抑制されること、および骨格筋の分解抑制に有効に作用する成分の探索を行ったところリポテイコ酸が見出されたことに基づき、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明の要旨は以下のとおりである。
[1]  リポテイコ酸を含有する、筋肉の分解抑制剤。
[2]  リポテイコ酸を含有する、筋肉分解抑制用飲食品。
[3]  リポテイコ酸を摂取させることを含む、筋肉の分解を抑制する方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、筋肉の分解を抑制可能である新規な技術を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】試験例１に係り、各乳酸菌とAtrogin-1/GAPDHとの関係を示すグラフである。
【図２】試験例２に係り、各乳酸菌と腓腹筋重量との関係を示すグラフである。
【図３】試験例３に係り、ラクトバチルス・カルバタス CP2998株の抽出物とAtrogin-1/GAPDHとの関係を示すグラフである。
【図４】試験例４に係り、ラクトバチルス・カルバタス CP2998株とMyogeninの発現量との関係を示すグラフである。
【図５】CP2998株に由来する菌体懸濁液上清とブタノール画分（粗精製リポテイコ酸）のウエスタンブロットに係る写真である。
【図６】CP2998株に由来する15%疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）、25%HIC、35%HIC、45%HIC濃縮画分のウエスタンブロットに係る写真である。
【図７】試験例５に係り、リポテイコ酸を含む25%HIC、35%HIC濃縮画分とAtroigin-1の発現との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の1つの実施形態について詳述する。
本実施形態は筋肉の分解抑制剤（以下、単に分解抑制剤ともいう）に関し、リポテイコ酸(Lipoteichoic acids: 以下、LTAとする)を含有する。リポテイコ酸は、例えば、乳酸菌であるラクトバチルス・カルバタス CP2998株（以下、単にCP2998株ともいう）から抽出することにより得ることができる。
乳酸菌は、健康の改善・維持に効果を示す。整腸効果、免疫賦活作用、抗皮膚炎および抗ストレス作用が知られている。これらは、生菌のみならず死菌体においても効果を有することが示されている。その活性成分は、乳酸菌に含まれる脂質、糖鎖、DNA、RNA、ペプチドグリカン、ポリリン酸、リポテイコ酸など多岐に渡る。
【００１４】
リポテイコ酸は、グリセロールリン酸ポリマーと糖脂質から構成される化合物である。乳酸菌においてリポテイコ酸は細胞壁中にその成分として存在するほか、糖脂質部位が細胞膜脂質の一部を構成する形で細胞膜にも結合している。
リポテイコ酸については免疫調節、腸管付着性などへの寄与についての報告があるが、筋肉の分解抑制についての報告は確認されていない。
なお、上述のとおり、リポテイコ酸はラクトバチルス・カルバタス CP2998株から抽出することにより得ることができるが、これに限定されず、他の方法で入手したものを用いるようにしてもよい。具体的には、他の微生物等から抽出したり、リポテイコ酸自体を入手したりして用いる場合が挙げられる。
【００１５】
以下、リポテイコ酸をCP2998株から抽出する場合を例に挙げて説明する。
ラクトバチルス・カルバタス CP2998株は乳酸菌の１種であり、受託番号：NITE P-02033として2015年4月15日に特許微生物寄託センターに寄託されている。CP2998株は特願2015-104500に記載されている。
【００１６】
CP2998株を培養する培地は、当該CP2998株が生育し得る培地であれば、特に限定されるものではなく、乳酸菌の培養において一般的に用いられる培地やその改変培地等から適宜選択して用いることができる。
また、CP2998株を培養する培地に含有される炭素源や窒素源についても、特に限定されない。例えば、炭素源としては、通常の微生物の培養に利用されるグルコース、蔗糖、乳糖、糖蜜等からなる群より選択される１又は２種以上を用いることができる。また、窒素源としては、ペプトン、カゼイン、カゼイン分解物、ホエー、ホエー分解物等からなる群より選択される1種類又は2種類以上を用いることができる。
また、その他の栄養素の供給源として、コーンスティプリカー(CSL)、酵母エキス、肉エキス、肝臓エキス、トマトジュース等からなる群より選択される１又は２種以上を用いるようにしてもよい。
さらに、CP2998株を培養するための培地は、L-システイン等の還元剤等；ビタミン、核酸関連物質、酢酸塩やクエン酸塩、脂肪酸エステル、特に好ましくはツイーン80等の生育促進因子；リン酸塩等の緩衝能を付与し得る化合物等が、適宜添加されてもよい。
CP2998株の培養に用いることのできる培地として、例えば、MRS培地等の合成培地や、野菜や果物等の搾汁等、牛乳、豆乳、還元脱脂粉乳培地等の発酵乳の製造に一般的に用いられる培地等が挙げられる。
【００１７】
CP2998株の培養法は、例えば静置培養あるいはpHを一定にコントロールした中和培養等で行うことができるが、菌が良好に生育する条件であれば特に培養法に制限はない。例えば菌体は、乳酸菌培養の常法に従って培養され、得られた培養物から遠心分離等の集菌手段によって得ることができる。
【００１８】
リポテイコ酸の抽出には、CP2998株の生菌体、湿潤菌、乾燥菌、処理物等が適宜使用可能である。
処理物として、例えば、CP2998株を含む発酵乳の濃縮物、ペースト化物、乾燥物、液状物、希釈物、破砕物等が挙げられる。乾燥物としては、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、およびドラム乾燥物から選ばれる少なくともひとつとすることができる。また、抽出に用いるCP2998株は、死菌体であってもよい。死菌体は通常、菌体を加熱することにより得ることができる。加熱条件は菌体が死滅する条件であれば特に限定されないが、一般的には90℃、30分程度の加熱で十分な結果を得ることができる。加熱処理の方法も特に限定されず、例えば加熱殺菌処理、放射線殺菌処理、または破砕処理等を挙げることができる。
抽出溶媒としては、例えば、ブタノール、クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサン、ジエチルエーテル、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、水、またはこれらの混合溶媒を用いることができる。
【００１９】
リポテイコ酸の抽出の一例をより具体的に説明する。まず菌体を破砕する。破砕方法は一定の破砕が行われれば湿式、乾式は問わない。ジェットミル、ホールミル、スターバーストなどを用いることができる。粉砕した菌体を水などの溶液に懸濁し、遠心により上清を回収する。上清からブタノールまたはエタノールを用いて抽出したものを、リポテイコ酸含有画分として得ることができる。
【００２０】
本実施形態の分解抑制剤の態様については特に限定されず、医薬品、医薬部外品または飲食品などとして製造することができる。
医薬品、医薬部外品または飲食品とする場合、本実施形態に係るリポテイコ酸含有画分等を有効成分として用いるとともに、例えば賦型剤、結合剤、安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の成分と適宜混合して定法どおり製剤化することができる。剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤等が可能であり、これらを経口的に投与することが望ましい。
または、特に限定されないが、飲食品としての態様で製造される場合、通常の飲食品のほか、特定保健用食品等の特別用途食品や栄養機能食品などであってもよい。飲食品の具体例としては、例えば、栄養補助食品（サプリメント）、乳飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、調製粉乳、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品などの乳製品、果汁飲料、ゼリー、キャンディ、マヨネーズ等の卵加工品、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、バターケーキ、アイスクリーム、グミ、ガムなどの菓子・パン類、流動食、病者用食品等を挙げることができる。
また、本実施形態の分解抑制剤は、例えばリポテイコ酸含有画分を飼料原料に配合するなどして例えば家畜用のための飼料としてもよい。
【００２１】
本実施形態の分解抑制剤の一日あたりの摂取量についても特に限定されず、例えば、成人の場合、本実施形態に係るリポテイコ酸を、0.1〜10ｇ、好ましくは0.5〜5g摂取できるように配合量等を調整すればよい。本実施形態の筋肉の分解抑制剤におけるリポテイコ酸の含有割合も特に限定されず、製造の容易性や好ましい一日の投与量等に合わせて適宜調節すればよい。
【００２２】
以上、本実施形態によれば、筋肉の分解を抑制可能である新規な技術を提供できる。
すなわち、本実施形態に係るリポテイコ酸を、摂取の態様は特に限定されないが、例えば上述のリポテイコ酸を含む医薬品、医薬部外品、食品などの態様で摂取することにより、筋肉の分解を抑制することができる。具体的には、筋肉の分解に関与する筋特異的ユビキチンリガーゼ遺伝子Atrogin-1の発現を抑制することができる。そのため、個人差はあるが、例えば加齢などによる筋肉の分解を抑制して筋肉量の低下を抑える効果が期待できる。また、本実施形態に係るリポテイコ酸は例えば乳酸菌株から得ることができ、比較的安価に大量供給が可能であり、かつ、極めて安全性が高い。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例によって本実施形態の分解抑制剤をより具体的に説明する。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２４】
［乳酸菌懸濁液の調製］
各乳酸菌は、グリセロールストックから一白金耳程度をMRS寒天培地（Difco）に塗沫し、嫌気条件下で、30℃24〜48時間培養した。寒天上に発育したコロニーを釣菌し、MRS液体培地（Difco）に懸濁し、30℃24時間培養した。その後、乳酸菌培養液から遠心にて菌体を回収した。回収した菌体に蒸留水を加えて再度遠心し、上清を取り除き菌体を洗浄した。得られた乳酸菌菌体を105℃20分加熱し、その後凍結乾燥器にて乾燥死菌体を作成した。得られた乾燥死菌体である乳酸菌菌体を水または溶媒に懸濁したものを乳酸菌懸濁液とした。
［試験例１］Atrogin-1発現抑制評価  
In vitro試験としてマウス横紋細胞であるC2C12細胞(DSファーマバイオメディカル)を用いた。C2C12細胞は10%ウシ胎児血清、1%Penicillin-Streptomaycin含有、低グルコース含有ダルベッコ改良イーグル培地（シグマ）社に1.9×104個/mlになるように懸濁し、12ウエルプレートに1mlずつ加えた後、37℃、5%CO2条件下で、2〜3日おきに培地を交換しながら72時間、80%コンフルエントまで培養した。
次に培地を2%ウマ血清、1%Penicillin-Streptomaycin含有低グルコース含有ダルベッコ改良培地に交換し、2〜3日おきに培地を交換しながら、4日間培養し、C2C12細胞を分化させた。その後、1%Penicillin-Streptomaycin含有低グルコースダルベッコ改良培地を添加した。その培地に、乳酸菌懸濁液を、100mg/mlの濃度になるように添加するとともに、骨格筋においてAtorogin-1の発現を上昇させることが知られているデキサメタゾン(DX)を50mMになるように培地に添加した。その後、RNeasy Plus Mini（QIAGEN）を用いて、細胞のRNAを回収した。RNAは100ng/mlになるように滅菌蒸留水を用いて希釈し、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosytems)を用いて、cDNAを作成した。さらに7500Fast (Applied Biosystems)を用いてのGAPDHおよび Atorogin-1の発現量測定を行い、Atrogin-1/GAPDHの値を求めた。測定にはFast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)を用いた。また、プライマーとして、Atrogin-1の発現はAtrogin-1F、5'  ATCCCAGCACACGACAACAC  3'およびAtrogin-1R、5' CGGCAACTGCATCTCTTC 3'を、GAPDHの発現はGAPDH F 5' ATGGCCTTCCGTGTTCCTAC 3'およびGAPDH R、5' TGCCTGCTTCACCACCTTC 3'を用いた。
デキサメタゾンを指標としてN=3で測定を実施した。
【００２５】
結果を図1に示す。乳酸菌10株について評価した結果、ラクトバチルス・アミロボラスNo1株、2006年2月20日に特許生物寄託センターに国際寄託され、また国際公開第2006／093313号に記載されているCP1750株（受託番号：FERM BP-10532）、およびラクトバチルス・カルバタスCP2998株が高い活性を示した。
【００２６】
［試験例2］ ラットを用いた筋肉分解抑制試験
7週齢オスSDラットを1週間慣化させ、次いで体重が均一になるように群わけを行った。各郡は1群8匹とした。乳酸菌投与群には1g/kgの投与割合で各乳酸菌懸濁液を経口投与した。また、陽性コントロールとしてロイシンを1g/kg経口投与した群も設定した。デキサメタゾン（メサドロン注：小林化工株式会社）は600mg/kgを皮下投与した。乳酸菌懸濁液の経口投与を一週間行った後に、乳酸菌懸濁液およびデキサメタゾンを2日間投与し、3日目に剖検し、腓腹筋を抽出し筋肉量の測定を行った。
【００２７】
結果を図2に示す。腓腹筋重量は、コントロールと比較し、デキサメタゾン投与群において有意に低下した。ロイシン投与群は、デキサメタゾン投与群に比べて回復傾向が見られた。乳酸菌投与群では、CP1750株およびCP2998株投与群が、ロイシンと同様に腓腹筋の回復傾向が認められた。
【００２８】
［試験例3］抽出物によるAtrogin-1発現抑制
CP2998株を用いて、菌体の抽出物の各画分のAtrogin-1発現抑制効果を比較した。
CP2998株菌体0.5gに5mlの蒸留水（DW）を加え、よく懸濁した後に、6,000ｒｐｍ、10分遠心した。その後、菌体が入らないように上清をのみを回収し、凍結乾燥しDW画分を得た。
また、CP2998株菌体0.5gに5mlの蒸留水（DW）を加え、よく懸濁した後に、クロロホルム：メタノール（1:2）を15ml加えさらに懸濁した。その後、DWおよびクロロホルムをそれぞれ5mlずつ加え、よく懸濁した。6,000rpm、10分間遠心し、下層のクロロホルム層を回収した。得られたクロロホルム層は、減圧乾固し、固形分を回収した（クロロホルム画分）。固形分に10mg/mlになるように1%BSA(Sigma)を添加し、試験例１と同様の細胞試験
に供した。上層のDW：メタノール層も回収し、減圧乾固により固形分を回収した（DW：メタノール画分）。10mg/mlになるようにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解し、同じく試験例１と同様の細胞試験に供した。
対照群として終濃度100ng/mlのIGF-1（TAKARA）およびPBSを添加し、それぞれ37℃16時間インキュベーションを行った。
【００２９】
結果を図3に示す。図3においてはPBSを１としたときの値を示している。クロロホルム画分、DW：メタノール画分、DW画分ともにAtrogin-1の発現抑制効果が見られた。その中でも、クロロホルム画分は特に活性が高いことが確認された。
【００３０】
［試験例4］Myogenin発現量促進評価
骨格筋の分化の指標として知られているMyogeninの発現量の比較を実施した。すなわちC2C12細胞は10%ウシ胎児血清、1%Penicillin-Streptomaycin含有、低グルコース含有ダルベッコ改良イーグル培地を用いて80%コンフルエントまで培養した後に、2%ウマ血清、1%Penicillin-Streptomaycin含有低グルコース含有ダルベッコ改良培地に交換した。さらに、CP2998株の乳酸菌懸濁液およびロイシンを終濃度10mg/mlになるように添加し、4日間培養した。その後、RNAを抽出し、Real time PCRを用いて、Miyata らの方法（Miyata et al. Journal of Physical Therapy Science, 21(1): 81-84 2009）に準拠しMyogeninの遺
伝子発現量を測定した。
結果を図４に示す。ロイシンによるMyogeninの発現量はPBSよりも高いのに対して、CP2998株によるMyogeninの発現量はPBSよりも低かった。このことからCP2998株は骨格筋の合成促進作用を有しておらず、かつロイシンとはC2C12細胞への影響が異なることが明らかとなった。
【００３１】
［菌体からのリポテイコ酸抽出および定性試験］
方法（粗LTA抽出方法）：6.4gの乳酸菌（CP2998株、加熱死菌体）を80mL超純水（D.W.）に溶解した。湿式粉砕装置（スギノマシン、スターバースト）を用いて、245MPaの条件で12回実施し、菌体を破砕した。その後、5,900g、25分の条件で遠心し、上清を得た。さらにブタノールを等量添加し、常温で30分間撹拌した後、5,900g、17分遠心し水層を凍結乾燥し、得られたものをリポテイコ酸含有ブタノール抽出画分とした。
方法（プロパノール溶出方法）：LTA含有ブタノール抽出画分0.2gに対して、15%（v/v）プロパノール/100mM酢酸ナトリウムHICバッファー（以降15%HICバッファー）を20mL添加して溶解した。0.45umフィルター（ADVANTEC）にて処理後、HICカラムOctyl Sepharose 4 Fast Flow（50mL）に供した。LTAをカラム内に結合後、15%HICバッファーをカラムの2倍量（100mL）流した。なお、LTA含有ブタノール抽出画分20mLと、15%HICバッファー100mLの溶出液は同一画分として回収した。以下同様に、25%HICバッファーをカラム容量の1倍量（50mL）、35%HICバッファーをカラムの2倍量（100mL）、45%HICバッファーをカラムの1倍量（50mL）流して、溶出画分を回収した（1回目のHIC）。1回目のHICで得られたLTA含有ブタノール抽出画分のアプライ時の素通り画分と、15%HICバッファーの溶出画分をもう一度カラムにアプライし、プロパノールが異なる各HICバッファーで再度溶出を行った（2回目のHIC）。各溶出画分を減圧濃縮し、透析したものをそれぞれ15%HIC、25%HIC、35%HIC、45%HIC濃縮画分とした。
方法（LTA定性方法）：上記サンプルとSDS-PAGEサンプルバッファーを1:1で混合し、ヒートブロックにて100℃、5分加熱した。泳動槽にポリアクリルアミドゲルをセットし、SDS-PAGEバッファーで満たした後、冷却したサンプルを20uL、分子量マーカーを5uLアプライした。SDS-PAGEは20mA、75分間行った。予めPVDF膜を転写バッファーに浸漬させておき、泳動後にゲルとともに転写装置にセットした。転写は120mA、90分行った。転写後、膜を5%（w/v）スキムミルク溶液に入れ、振盪しながら1時間ブロッキングを行った。その後、5%（w/v）スキムミルクを捨て、膜を500倍希釈したマウス由来抗LTAモノクローナル抗体Clone55（Hycult biotech）溶液に浸漬させて、1.5時間抗原抗体反応を行った。反応後、PBS-Tにて洗浄し、1,000倍希釈したHRP結合抗マウス抗体（Cell Signaling Technology）溶液に浸漬し、1.5時間反応を行った。反応後、PBS-Tにて洗浄を行い、SignalFire ECL Reagent（Cell Signaling Technology）で化学発光を行い、X線フィルムに露光した。
各精製段階のブタノール抽出画分のウエスタンブロットをLTA抗体を用いてを実施したところ、LTAが存在することが確認された。具体的に説明すると、まずLTAは菌体懸濁液上清とブタノール画分（粗精製LTA）に含まれていた（図5）。粗精製LTAをHICバッファーにより分取した15%HIC、25%HIC、35%HIC、45%HIC濃縮画分においては、25%および35%HIC濃縮画分にリポテイコ酸が含まれることを確認した（図6）。
【００３２】
［試験例5］Atrogin-1発現抑制試験
方法：In vitro試験としてマウス横紋細胞であるC2C12細胞(DSファーマバイオメディカルメーカー)を用いた。C2C12細胞は10%ウシ胎児血清、1%Penicillin-Streptomaycin含有、低グルコース含有ダルベッコ改良イーグル培地（シグマ）社に2.0×104個/mlになるように懸濁し、12ウエルプレートに1mlずつ加えた後、37℃、5%CO2条件下で100%コンフルエントまで培養した。HS培地に交換後、72時間培養し、分化させた。次に培地を2%ウマ血清、1%Penicillin-Streptomaycin含有低グルコース含有ダルベッコ改良培地に交換し、2~3日おきに培地を交換しながら、6日間培養し、C2C12細胞を分化させた。その後、1%Penicillin-Streptomaycin含有低グルコースダルベッコ改良培地を添加した。その培地に、乳酸菌懸濁液を、100mg/mlの濃度になるように添加し、デキサメタゾンを1uMになるように培地に添加した。また、LTA含有画分は菌体相当を添加し、HIC画分はLTA含有画分相当を添加した。
その後、RNeasy Plus Mini（QIAGEN）を用いて、細胞のRNAを回収した。RNAは100ng/mlになるように滅菌蒸留水にて希釈し、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosytems)を用いて、cDNAを作成した。さらにGAPDHおよび Atorogin-1の発現量を7500Fast (Applied Biosystems)を用いて測定し、Atrogin-1/GAPDHの値を求めた。測定にはFast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)を用いた。プライマーは試験例１において用いたものを使用した。無添加（PBSのみ）デキサメタゾンを100としてN=3で測定を実施した。
【００３３】
図7にAtrogin-1抑制試験の結果を示す。コントロール（CON, PBS）を1として比較し結果を示した。菌体に対して、菌体含量に相当するリポテイコ酸含有画分のAtrogin-1抑制効果を確認したところ、菌体と同程度の抑制効果があることを確認した。さらに、その結果、25%および35%HIC分取画分にて菌体およびLTA含有画分と同程度のAtorign-1抑制効果を示した。図6に示す通り25%および35%分画はリポテイコ酸が含まれており、リポテイコ酸を含む画分に活性が存在した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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