(57)【要約】【課題】生体試料から小胞を効率よく濃縮できる新たな手段を提供すること。【解決手段】小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に吸着又は結合する部位を１又は複数有する物質Ａとを接触させて小胞凝集物を形成させる凝集工程、及び前記生体試料から前記小胞凝集物を回収する回収工程、を含むことを特徴とする、小胞凝集物の回収方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に吸着又は結合する部位を１又は複数有する物質Ａとを接触させて小胞凝集物を形成させる凝集工程、及び
前記生体試料から前記小胞凝集物を回収する回収工程、を含むことを特徴とする、
小胞凝集物の回収方法。
【請求項２】
前記凝集工程が、前記生体試料及び物質Ａに加えて、前記小胞の表面に吸着又は結合する部位とは別の部位で複数の前記物質Ａが結合する物質Ｂを接触させて小胞凝集物を形成させる凝集工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記凝集工程が、前記生体試料と、物質Ａ及び物質Ｂよりなる複合体とを接触させて小胞凝集物を形成させる凝集工程である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記凝集工程が、前記生体試料と物質Ａとを接触させ、得られた小胞及び物質Ａよりなる複合体に物質Ｂを接触させて小胞凝集物を形成させる凝集工程である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記物質Ａが、小胞表面に存在する分子を特異的に認識する抗体及び小胞表面に存在する分子を特異的に認識するビオチン化抗体から選ばれる１種以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記物質Ａが、アネキシンＶ及びビオチン化したアネキシンＶから選ばれる１種以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記物質Ａが、小胞表面に存在する分子を特異的に認識するビオチン化抗体、ビオチン化したアネキシンＶ、又はビオチン化したＴｉｍタンパク質であり、且つ前記物質Ｂが、アビジン類又はアビジン類結合担体である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記物質Ａが、小胞表面に存在する分子を特異的に認識する抗体であり、且つ前記物質Ｂが、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記物質Ａが、小胞表面に存在する分子を特異的に認識する抗体、アネキシンＶ、又はＴｉｍタンパク質であり、且つ前記物質Ｂが、ラテックス担体である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記物質Ｂが、物質Ａと結合する部位を２〜４個有する物質である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記小胞が、エクソソーム、マイクロベシクル、ナノ小胞、アポトーシス小体、デキソソーム、ブレブ、小水疱、プロスタソーム、微小粒子、腔内小胞、エンドソーム小胞又は細胞外ベシクルである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に吸着又は結合する部位を１又は複数有する物質Ａとを接触させて小胞凝集物を形成させる凝集工程、
前記生体試料から前記小胞凝集物を回収する回収工程、及び
前記回収工程で回収した小胞凝集物から小胞を解離させる解離工程、を含むことを特徴とする、
小胞の回収方法。
【請求項１３】
小胞の表面に吸着又は結合する部位を１又は複数有する物質Ａと、小胞の表面に吸着又は結合する部位とは別の部位で複数の前記物質Ａが結合する物質Ｂとを含むことを特徴とする、
小胞凝集物回収用の複合体。
【請求項１４】
小胞の表面に吸着又は結合する部位を１又は複数有する物質Ａと、小胞の表面に吸着又は結合する部位とは別の部位で複数の前記物質Ａが結合する物質Ｂとを含むことを特徴とする、
小胞凝集物回収用のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小胞凝集物の回収方法、小胞の回収方法、並びに小胞凝集物回収用の複合体及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
小胞は脂質二重膜に包まれた構造を有するものであり、斯様な小胞のうち、生体内の体液中に存在する小胞顆粒としてエクソソームが知られている。エクソソームの表面には、一般的な細胞表面と同様に、種々の膜タンパク質が存在することが知られており、その一方で、エクソソームの内部には、サイトカイン等各種タンパク質以外にもｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれることも分かってきた。また、免疫系の細胞や各種癌細胞等の種々の細胞からエクソソームが分泌されることが知られており、生体内の細胞間コミュニケーションの媒介役としてのエクソソームの機能、エクソソームと生理現象や癌等の疾患との関連性が注目され、これについて検討が進められている。
【０００３】
分析や診断に小胞を用いるためには、まずは生体試料から小胞を濃縮、回収する必要がある。エクソソーム等の小胞を濃縮、回収する従来の方法として、超遠心分離法、限外濾過法、ＰＥＧやＰＶＡ等の体積排除ポリマー（ｖｏｌｕｍｅ−ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ）により沈殿させる手法、磁性粒子を用いた分離法が知られている（特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１５８２０３号パンフレット
【特許文献２】特開２０１３−１８８２１２号公報
【特許文献３】特表２０１２−５３３３０８号公報
【特許文献４】特表２０１３−５２１２５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、超遠心分離法や磁性粒子を用いた手法で、多量の生体試料から小胞を回収するためには、生体試料を小分けにして操作を複数回行う必要があり、多くの時間・コストを要とするといった問題があった。特に、超遠心分離法は、高額な装置を必要とし、また、濃縮・回収効率の再現性を満足させるためには熟練の技能を要するものであった。
また、限外濾過法やＰＥＧ等による沈殿法には、目的物である小胞以外の夾雑物（例えば高分子量のタンパク質など）の混入が避けられないなどの問題があった。
一方、特許文献４には、免疫グロブリン又はＦｃドメインを含む標的タンパク質を選択的に濃縮する方法として、プロテインＡ又はプロテインＧのＦｃ結合ドメインのダイマーを使用する方法が記載されている。しかしながら、この方法は、小胞凝集物や小胞を濃縮、回収するというものではなく、アフィニティシンキング法を利用した小胞凝集物や小胞の濃縮、回収は、これまで検討されていなかった。
本発明が解決しようとする課題は、生体試料から小胞を効率よく濃縮できる新たな手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、下記の手段により解決された。
【０００７】
＜１＞  小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に吸着又は結合する部位を１又は複数有する物質Ａ（以下、単に物質Ａとも称する）とを接触させて小胞凝集物を形成させる凝集工程、及び前記生体試料から前記小胞凝集物を回収する回収工程、を含むことを特徴とする、小胞凝集物の回収方法（以下、本発明の小胞凝集物回収方法とも称する）。
＜２＞  前記凝集工程が、前記生体試料及び物質Ａに加えて、前記小胞の表面に吸着又は結合する部位とは別の部位で複数の前記物質Ａが結合する物質Ｂ（以下、単に物質Ｂとも称する）を接触させて小胞凝集物を形成させる凝集工程である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞  前記凝集工程が、前記生体試料と、物質Ａ及び物質Ｂよりなる複合体とを接触させて小胞凝集物を形成させる凝集工程である、＜２＞に記載の方法。
＜４＞  前記凝集工程が、前記生体試料と物質Ａとを接触させ、得られた小胞及び物質Ａよりなる複合体に物質Ｂを接触させて小胞凝集物を形成させる凝集工程である、＜２＞に記載の方法。
【０００８】
＜５＞  前記物質Ａが、小胞表面に存在する分子を特異的に認識する抗体及び小胞表面に存在する分子を特異的に認識するビオチン化抗体から選ばれる１種以上である、＜１＞に記載の方法。
＜６＞  前記物質Ａが、アネキシンＶ及びビオチン化したアネキシンＶから選ばれる１種以上である、＜１＞に記載の方法。
【０００９】
＜７＞  前記物質Ａが、小胞表面に存在する分子を特異的に認識するビオチン化抗体、ビオチン化したアネキシンＶ、又はビオチン化したＴｉｍタンパク質であり、且つ前記物質Ｂが、アビジン類又はアビジン類結合担体である、＜２＞〜＜４＞のいずれかに記載の方法。
＜８＞  前記物質Ａが、小胞表面に存在する分子を特異的に認識する抗体であり、且つ前記物質Ｂが、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬである、＜２＞〜＜４＞のいずれかに記載の方法。
＜９＞  前記物質Ａが、小胞表面に存在する分子を特異的に認識する抗体、アネキシンＶ、又はＴｉｍタンパク質であり、且つ前記物質Ｂが、ラテックス担体である、＜２＞〜＜４＞のいずれかに記載の方法。
【００１０】
＜１０＞  前記物質Ｂが、物質Ａと結合する部位を２〜４個有する物質である、＜２＞〜＜４＞のいずれかに記載の方法。
＜１１＞  前記小胞が、エクソソーム、マイクロベシクル、ナノ小胞、アポトーシス小体、デキソソーム、ブレブ、小水疱、プロスタソーム、微小粒子、腔内小胞、エンドソーム小胞又は細胞外ベシクルである、＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の方法。
【００１１】
＜１２＞  小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に吸着又は結合する部位を１又は複数有する物質Ａとを接触させて小胞凝集物を形成させる凝集工程、前記生体試料から前記小胞凝集物を回収する回収工程、及び前記回収工程で回収した小胞凝集物から小胞を解離させる解離工程、を含むことを特徴とする、小胞の回収方法（以下、本発明の小胞回収方法とも称する）。
【００１２】
＜１３＞  小胞の表面に吸着又は結合する部位を１又は複数有する物質Ａと、小胞の表面に吸着又は結合する部位とは別の部位で複数の前記物質Ａが結合する物質Ｂとを含むことを特徴とする、小胞凝集物回収用の複合体（以下、本発明の小胞凝集物回収用複合体とも称する）。
＜１４＞  小胞の表面に吸着又は結合する部位を１又は複数有する物質Ａと、小胞の表面に吸着又は結合する部位とは別の部位で複数の前記物質Ａが結合する物質Ｂとを含むことを特徴とする、小胞凝集物回収用のキット（以下、本発明の小胞凝集物回収用キットとも称する）。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の小胞凝集物回収方法によれば、小胞濃縮物を凝集物として効率よく得ることができる。
また、本発明の小胞回収方法によれば、小胞を効率よく回収できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】小胞表面に存在する分子を特異的に認識する抗体を物質Ａとして用いた場合の凝集工程の模式図である。
【図２】小胞表面に存在する分子を特異的に認識するビオチン化抗体を物質Ａとして使用し、アビジン類を物質Ｂとして使用した場合の凝集工程の模式図である。
【図３】ビオチン化したアネキシンＶを物質Ａとして使用し、アビジン類を物質Ｂとして使用した場合の凝集工程（２）の模式図である。
【図４】ビオチン化したアネキシンＶを物質Ａとして使用し、アビジン類を物質Ｂとして使用した場合の凝集工程（３）の模式図である。
【図５】抗ＣＤ９抗体を物質Ａとして用いた場合のエクソソーム凝集物の回収結果を示す図である。
【図６】ビオチン化抗体を物質Ａとして用いた場合、及びビオチン化抗体を物質Ａとして、ストレプトアビジンを物質Ｂとしてそれぞれ用いた場合のエクソソーム凝集物の回収結果を示す図である。
【図７】ビオチン化抗体を物質Ａとして、ストレプトアビジンを物質Ｂとしてそれぞれ用いた場合のエクソソーム凝集物の回収結果を示す図である。
【図８】ビオチン化アネキシンＶを物質Ａとして用いた場合、及びビオチン化アネキシンＶを物質Ａとして、ストレプトアビジンを物質Ｂとしてそれぞれ用いた場合のエクソソーム凝集物の回収結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について詳細に説明する。なお、数値範囲を表す「ａ〜ｂ」等の記載は、「ａ以上、ｂ以下」と同義であり、Ａ及びＢをその数値範囲内に含む。
【００１６】
＜小胞凝集物回収方法＞
本発明の小胞凝集物回収方法は、小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に吸着又は結合する部位を１又は複数有する物質Ａとを接触させて小胞凝集物を形成させる凝集工程、及び前記生体試料から前記小胞凝集物を回収する回収工程を含むことを特徴とするものである。
【００１７】
（小胞）
本発明における小胞としては、エクソソーム、マイクロベシクル（微小胞）、ナノ小胞、アポトーシス小体、デキソソーム、ブレブ（ｂｌｅｂ）、小水疱（ｂｌｅｂｂｙ）、プロスタソーム、微小粒子、腔内小胞（ｉｎｔｒａｌｕｍｅｎａｌ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、エンドソーム小胞、細胞外ベシクル等が挙げられる。これらの中でも、本発明の小胞凝集物回収方法は、エクソソーム凝集物の回収に特に適する。
小胞の直径は、好ましくは１〜１００００ｎｍ、より好ましくは５〜１０００ｎｍ、更に好ましくは１０〜８００ｎｍ、更に好ましくは１５〜５００ｎｍ、更に好ましくは２０〜２００ｎｍ、特に好ましくは３０〜１５０ｎｍである。
【００１８】
（生体試料）
生体試料は、小胞を含有するものであれば特に限定されないが、例えば、体液、菌体液、細胞培養の培地、細胞培養上清、組織細胞の破砕液等の各種液体が挙げられる。培地、培養上清、破砕液に含まれる細胞は、真核生物由来でも細菌由来でもよい。これらの中でも、生体試料としては、体液、細胞培養上清が好ましい。
体液としては、全血、血清、血漿、血液成分、各種血球、血餅、血小板、末梢血、臍帯血等の血液や血液組成成分の他、汗、胃液、間質液、関節液、滑液、眼房水、喀痰、胸水、口腔粘膜群、骨髄液、精液、前立腺液、カウパー腺液、射精前液、女性射精液（ｆｅｍａｌｅ  ｅｊａｃｕｌａｔｅ）、月経分泌液、嚢胞液、囲心腔液、消化液、組織液、体腔液、唾液、胆汁、膣液、涙、乳汁、尿、脳脊髄液、膵液、鼻腔液、糞便、水便、糜粥（ｃｈｙｍｅ）、乳糜（ｃｈｙｌｅ）、腹水、羊水、膿、皮脂、胚盤胞腔液、嘔吐物、粘膜からの分泌液、リンパ液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺胞洗浄液等が挙げられ、好ましくは血液組成成分である。なお、血液組成成分は、クエン酸、ＥＤＴＡ等の抗凝固剤で処理されたものでもよい。
生体試料の採取元には、上記小胞を有する全ての動物が包含される。例えば、哺乳動物、ヒト又は非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、他の農場動物又は齧歯類（たとえば、マウス、ラット、モルモット等）が挙げられる。生体試料は、限外ろ過や超遠心分離法、磁気分離法などによる濃縮や精製といった前処理を予め行ったものを用いてもよいが、生体から摂取したものや回収した培養上清をそのまま用いることもできる。
【００１９】
（凝集工程）
凝集工程は、小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に吸着又は結合する部位を１又は複数有する物質Ａとを接触させて小胞凝集物を形成させる工程である。
【００２０】
小胞の濃度は特に限定されないが、系内の液相の総量（小胞や緩衝液などを含む全容積）に対して、１〜５０００μｇ／ｍＬが好ましく、５〜１０００μｇ／ｍＬがより好ましく、１０〜５００μｇ／ｍＬが特に好ましい。
【００２１】
凝集工程において、小胞を含む生体試料を接触させる温度は、好ましくは２〜４２℃の範囲内、より好ましくは２〜３２℃の範囲内である。また、小胞を含む生体試料を接触させる時間は合計で、好ましくは１〜１２０時間、より好ましくは３〜６０時間である。小胞を含む生体試料の接触は、水系媒体中で行うのが好ましい。水系媒体としては、水の他、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等の各種緩衝液が挙げられる。
また、小胞を含む生体試料を接触させる際の系中のｐＨは特に限定されないが、好ましくはｐＨ３〜１１の範囲、より好ましくはｐＨ５〜９の範囲である。目的のｐＨを維持するためには、上記緩衝液が用いられる。
【００２２】
（物質Ａ）
物質Ａは、小胞の表面に吸着又は結合する部位を１又は複数有する物質である。
物質Ａとしては、回収効率の点で、小胞の表面に吸着又は結合する部位を複数有するものが好ましく、小胞の表面に吸着又は結合する部位を２〜４個有するものがより好ましい。
【００２３】
物質Ａとしては、例えば、小胞表面に存在する分子を特異的に認識する抗体、小胞表面に存在する分子を特異的に認識するビオチン化抗体、アネキシンＶ、ビオチン化したアネキシンＶ、Ｔｉｍタンパク質、ビオチン化したＴｉｍタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー（ＤＮＡ／ＲＮＡ）、ペプチド、ペプトイド、ｚＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、レクチン、デンドリマー、その他の薬物や標識試薬が挙げられる。これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
これらの中でも、物質Ａとしては、回収効率の点で、小胞表面に存在する分子を特異的に認識する抗体、小胞表面に存在する分子を特異的に認識するビオチン化抗体、アネキシンＶ、ビオチン化したアネキシンＶ、Ｔｉｍタンパク質、ビオチン化したＴｉｍタンパク質が好ましい。ここで、小胞表面に存在する分子を特異的に認識する抗体を物質Ａとして用いた場合の凝集工程の模式図を図１に示す。なお、小胞表面に存在する分子を特異的に認識する抗体は、小胞の表面に吸着又は結合する部位を２個有するものである。
なお、上記ビオチン化には、ビオチンのみならずその誘導体も使用できる。ビオチン、ビオチン誘導体としては、例えば、国際公開第２０１１／０３４１１５号パンフレット、国際公開第２０１４／１２９４４６号パンフレット、国際公開第２０１５／１２５８２０号パンフレットに記載のものが挙げられる。
【００２４】
ここで、小胞表面に存在する分子を特異的に認識する抗体、小胞表面に存在する分子を特異的に認識するビオチン化抗体における「抗体」について説明する。
抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、合成抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ'フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖ断片、Ｆｖ’断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。また、抗体のクラスとしては、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡが挙げられる。なお、サブクラスは特に限定されない。
【００２５】
上記抗体としては、エクソソーム凝集物の回収に適する点で、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗ＭＦＧ−Ｅ８抗体、抗ＰＣＳＡ抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗ＰＳＣＡ抗体、抗Ｒａｂ抗体、抗ＳＴＥＡＰ抗体、抗ＴＮＦＲ抗体、抗５Ｔ４抗体が好ましい。中でも、エクソソームの表面抗原ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のテトラスパニン類を認識する抗体が特に好ましい。
【００２６】
また、上記Ｔｉｍタンパク質、ビオチン化したＴｉｍタンパク質における「Ｔｉｍタンパク質」は、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメインタンパク質のことを意味し、具体的には、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子１（Ｔｉｍ１）タンパク質、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子３（Ｔｉｍ３）タンパク質、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子４（Ｔｉｍ４）タンパク質等が挙げられる。
【００２７】
また、上記アネキシンＶ、ビオチン化したアネキシンＶ、Ｔｉｍタンパク質、ビオチン化したＴｉｍタンパク質を物質Ａとして使用する場合は、凝集促進の観点から、カルシウムイオン等のアルカリ土類金属イオンの存在下で凝集工程を行うのが好ましい。このような凝集を行う場合、塩化カルシウム等のハロゲン化カルシウムを凝集工程の系に添加すればよい。
【００２８】
物質Ａの使用量は特に限定されないが、系内の液相の総量に対して、０．０００１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、０．０００５〜５％（ｗ／ｖ）がより好ましい。
【００２９】
（物質Ｂ）
凝集工程としては、回収効率の点で、前記生体試料と、物質Ａと、小胞の表面に吸着又は結合する部位とは別の部位で複数の物質Ａが結合する物質Ｂとを接触させて小胞凝集物を形成させる工程が好ましい。物質Ｂは、物質Ａと小胞との吸着又は結合を阻害しない部位で物質Ａと結合するものである。
【００３０】
物質Ｂを用いる場合における凝集工程の手法としては、小胞を含む生体試料と物質Ａと物質Ｂとを同時に共存せしめてこれらを接触させ小胞凝集物を形成させる手法（この手法による凝集工程を凝集工程（１）とも称する）、小胞を含む生体試料と物質Ａ及び物質Ｂよりなる複合体とを接触させて小胞凝集物を形成させる手法（この手法による凝集工程を凝集工程（２）とも称する）、小胞を含む生体試料と物質Ａとを接触させ、得られた小胞及び物質Ａよりなる複合体に物質Ｂを接触させて小胞凝集物を形成させる手法（この手法による凝集工程を凝集工程（３）とも称する）が挙げられる。これらの中では、回収効率やハンドリング性の点で、凝集工程（２）、（３）が好ましい。
なお、凝集工程（２）において、物質Ａ及び物質Ｂよりなる複合体は、物質Ａ及び物質Ｂを接触させることで形成させることができ、この際の物質Ａ及び物質Ｂの接触時間は、５分間〜２４時間程度でよい。
【００３１】
物質Ｂとしては、回収効率の点で、物質Ａと結合する部位を２個以上有するものが好ましく、物質Ａと結合する部位を２〜２０個有するものがより好ましく、物質Ａと結合する部位を２〜４個有するものが特に好ましい。このような物質Ｂを用いることによって、複数個の物質Ａが橋かけされて小胞が凝集しやすくなり、回収効率が向上する。
物質Ｂの使用量は特に限定されないが、系内の液相の総量に対して、０．００００１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、０．００００１〜５％（ｗ／ｖ）がより好ましい。
物質Ａと物質Ｂとの使用量のモル比率〔（Ａ）：（Ｂ）〕は、回収効率の点で、１００：０〜３０：７０が好ましく、９５：５〜４０：６０がより好ましく、９０：１０〜５０：５０が特に好ましい。
【００３２】
物質Ｂとしては、例えば、水溶性又は非水溶性の化合物、固相担体が挙げられる。固相担体としては、複数の物質Ａと結合する化合物を担体表面に担持させたものが使用できる。固相担体の具体例としては、例えば、ラテックス担体、磁性粒子が挙げられる。このような物質Ｂの中では、低コストという点で、水溶性化合物、ラテックス担体が好ましく、水溶性化合物がより好ましい。また、凝集工程（２）の手法で凝集させる場合には、物質Ａ及び物質Ｂよりなる複合体が水溶性となるような化合物であることが好ましい。なお、温度やｐＨ条件により水に対する溶解性が変化するものであってもよい。また、物質Ｂとして、反応性官能基等の結合部位を複数有する低分子化合物も用いることができる。当該低分子化合物としては、多官能エポキシ化合物（好ましくは２〜４官能のエポキシ化合物）等が挙げられる。
【００３３】
物質Ｂは、使用する物質Ａとの結合性が高く凝集させやすいものが好ましい。
具体的には、小胞表面に存在する分子を特異的に認識する抗体を物質Ａとして用いる場合においては、物質Ｂとしては、抗体結合性物質が担持された担体、抗体結合性タンパク質が好ましい。
また、小胞表面に存在する分子を特異的に認識するビオチン化抗体を物質Ａとして用いる場合においては、物質Ｂとしては、回収効率やハンドリング性の点で、アビジン類又はアビジン類結合担体が好ましい。ここで、小胞表面に存在する分子を特異的に認識するビオチン化抗体を物質Ａとして使用し、アビジン類を物質Ｂとして使用した場合の凝集工程の模式図を図２に示す。なお、小胞表面に存在する分子を特異的に認識するビオチン化抗体は、小胞の表面に吸着又は結合する部位を２個有するものであり、アビジン類は、上記ビオチン化抗体と結合する部位を２個有するものである。
アネキシンＶ、Ｔｉｍタンパク質を物質Ａとして用いる場合においては、物質Ｂとしては、回収効率の点で、固相担体が好ましい。
ビオチン化したアネキシンＶ、ビオチン化したＴｉｍタンパク質を物質Ａとして用いる場合においては、物質Ｂとしては、回収効率やハンドリング性の点で、アビジン類又はアビジン類結合担体が好ましい。ここで、ビオチン化したアネキシンＶを物質Ａとして使用し、アビジン類を物質Ｂとして使用した場合の凝集工程（２）の模式図を図３に示す。また、ビオチン化したアネキシンＶを物質Ａとして使用し、アビジン類を物質Ｂとして使用した場合の凝集工程（３）の模式図を図４に示す。なお、ビオチン化したアネキシンＶやビオチン化したＴｉｍタンパク質は、小胞の表面に吸着又は結合する部位を１個有するものであり、アビジン類は、上記ビオチン化したアネキシンＶやビオチン化したＴｉｍタンパク質と結合する部位を４個有するものである。すなわち、ビオチン化したアネキシンＶ、ビオチン化したＴｉｍタンパク質を物質Ａとして、アビジン類を物質Ｂとして使用した場合、図３に示すように、物質Ａ及びＢはアネキシンＶ四量体のような複合体を形成するため、効率的に小胞が凝集し、優れた回収効率が得られる。
【００３４】
上記抗体結合性タンパク質としては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬの他、当該タンパク質の多量体、２つ以上の抗体結合性タンパク質と水溶性化合物との複合体が挙げられる。上記多量体、複合体としては、特表２０１３−５２１２５８号公報に記載のようなプロテインＡ又はプロテインＧのＦｃ結合ドメインのダイマー、当該ダイマーの２つのプロテインを水溶性化合物で連結してなる化合物、複数のプロテインＡのドメインを連結したタンパク質等が挙げられる。抗体結合性タンパク質の中では、Ｆｃ結合タンパク質が好ましく、プロテインＡが特に好ましい。
また、抗体結合性タンパク質は、固相担体に結合させずに使用するのが好ましい。
【００３５】
上記アビジン類としては、アビジン、ストレプトアビジン、タマビジン、ニュートラアビジン、これらの改変体が挙げられる。当該改変体としては、アビジンをポリ（メタ）アクリル酸で改変したもの、特開２０１６−４１０７５号公報、特開２０１１−０５５８２７号公報、国際公開第２０１２／０９１１１０号パンフレット、国際公開第２００９／０２８６２５号パンフレット等に記載の改変型ビオチン結合タンパク質等が挙げられる。アビジン類としては、アビジン、ストレプトアビジンが好ましい。
【００３６】
本発明においては、物質Ａ及び物質Ｂは、回収効率やハンドリング性、コストの点で、以下の（α）〜（ε）の態様で使用するのが好ましく、（α）〜（γ）の態様で使用するのがより好ましく、（γ）の態様で使用するのが特に好ましい。
（α）物質Ａが、小胞表面に存在する分子を特異的に認識する抗体及び小胞表面に存在する分子を特異的に認識するビオチン化抗体から選ばれる１種以上である態様（物質Ａ及びＢのうち物質Ａのみを使用する）。
（β）物質Ａが、アネキシンＶ及びビオチン化したアネキシンＶから選ばれる１種以上である態様（物質Ａ及びＢのうち物質Ａのみを使用する）。
（γ）物質Ａが、小胞表面に存在する分子を特異的に認識するビオチン化抗体、ビオチン化したアネキシンＶ、又はビオチン化したＴｉｍタンパク質であり、且つ物質Ｂが、アビジン類又はアビジン類結合担体である態様。この態様の中でも、回収効率の点で、物質Ａが、小胞表面に存在する分子を特異的に認識するビオチン化抗体であり、且つ物質Ｂが、アビジン類又はアビジン類結合担体である態様が特に好ましい。
（δ）物質Ａが、小胞表面に存在する分子を特異的に認識する抗体であり、且つ物質Ｂが、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬである態様。
（ε）物質Ａが、小胞表面に存在する分子を特異的に認識する抗体、アネキシンＶ、又はＴｉｍタンパク質であり、且つ物質Ｂが、ラテックス担体である態様。なお、（ε）の態様において、物質Ａが、小胞表面に存在する分子を特異的に認識する抗体である場合は、抗体結合性物質が担持されたラテックス担体がより好ましい。
【００３７】
また、物質Ａの種類によっては、物質Ｂとして水溶性高分子を用いることもでき、物質Ｂの種類によっては、物質Ａとして水溶性高分子を用いることもできる。水溶性高分子を使用する場合における物質Ａ及び物質Ｂの組み合わせとしては、物質Ａが、小胞表面に存在する分子を特異的に認識する抗体、アネキシンＶ又はＴｉｍタンパク質であり、物質Ｂが水溶性高分子である組み合わせ、物質Ａがビオチン化水溶性高分子であり、物質Ｂがアビジン類である組み合わせが挙げられる。
【００３８】
上記水溶性高分子としては、酸性基を有するものが好ましい。酸性基としては、カルボキシ基、リン酸基、スルホ基、フェノール性ヒドロキシル基、ジヒドロキシボリル基、これらの塩やイオン等が挙げられる。
また、酸性基を有する高分子は天然高分子でも合成高分子でもよく、１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。なお、高分子が酸性基としてカルボキシ基を有する場合、カルボキシ基の一部がエチレングリコールやプロピレングリコール等でエステル化されていてもよく、また、酸性基を有する高分子がフェノール性ヒドロキシル基を有する場合や酸性基とは別にアルコール性ヒドロキシル基を有する場合、フェノール性ヒドロキシル基の一部、アルコール性ヒドロキシル基の一部又は全部が、酢酸、硝酸、硫酸、リン酸などと反応していてもよい。
【００３９】
酸性基を有する天然高分子としては、酸性基を有する乳タンパク質；ヘパリンやその誘導体；ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等のポリペプチド類の他、キサンタンガム、カラギーナン、アルギン酸、ペクチン、ファーセラン、アラビアガム、ガッチガム、カラヤガム、トラガントガム、カンテン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ペントサンポリスルファート、カルボキシメチル化又はサクシニル化した多糖類（セルロース、デキストラン、デンプン、キトサンなどをカルボキシメチル化又はサクシニル化したもの）、これらの塩が挙げられ、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。酸性基を有する乳タンパク質としては、例えば、カゼイン、乳漿タンパク質濃厚物、無脂肪乾燥ミルク、スキムミルクが挙げられる。なお、酸性基を有する乳タンパク質として、部分加水分解物や架橋タンパク質等の乳タンパク質の誘導体を用いてもよい。ヘパリン誘導体としては、未処理のヘパリンに加え、低分子量化ヘパリン、脱Ｎ−硫酸化ヘパリン、脱２−Ｏ−硫酸化ヘパリン、脱６−Ｏ−硫酸化ヘパリン等が挙げられる。
【００４０】
酸性基を有する合成高分子としては、酸性基を有する重合性不飽和モノマー若しくはその塩に由来する繰り返し単位を有する重合体又は共重合体の他、無機ポリリン酸等が挙げられる。
ここで、酸性基を有する重合性不飽和モノマーとは、重合性不飽和基と酸性基を１分子中に有する化合物を意味する。酸性基を有する重合性不飽和モノマーとしては、リン酸基を有する重合性不飽和モノマー、カルボキシ基を有する重合性不飽和モノマー、スルホ基を有する重合性不飽和モノマーが挙げられ、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらの中では、リン酸基を有する重合性不飽和モノマー、カルボキシ基を有する重合性不飽和モノマーが好ましい。
【００４１】
リン酸基を有する重合性不飽和モノマーとしては、リン酸基含有（メタ）アクリル酸エステル類が好ましく、例えば、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルアシッドホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルアシッドホスフェートが挙げられる。
カルボキシ基を有する重合性不飽和モノマーとしては、例えば、（メタ）アクリル酸、クロトン酸、ビニル安息香酸、ケイ皮酸、へキサヒドロフタル酸モノ−２−（メタ）アクリロイルオキシエチル等の不飽和モノカルボン酸類；フマル酸、マレイン酸、イタコン酸等の不飽和ジカルボン酸類；マレイン酸モノメチル、マレイン酸モノエチル、イタコン酸モノメチル、イタコン酸モノエチル等の不飽和ジカルボン酸類の部分エステル化物等が挙げられ、無水マレイン酸、無水イタコン酸等の不飽和ジカルボン酸類の酸無水物を用いることもできる。
スルホ基を有する重合性不飽和モノマーとしては、スチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸、アリルスルホン酸、メタアリルスルホン酸、２−スルホエチル（メタ）アクリレート、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸等が挙げられる。
【００４２】
酸性基を有する合成高分子は、酸性基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩に由来する繰り返し単位以外の繰り返し単位（以下、他の繰り返し単位とも称する）を有していてもよい。
他の繰り返し単位としては、芳香族ビニル系モノマー、（メタ）アクリレート系モノマー、（メタ）アクリルアミド系モノマー、飽和カルボン酸と不飽和アルコールとのエステル類、アルキルビニルエーテル類、ビニル基含有アルコール類等に由来する繰り返し単位が挙げられる。これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４３】
上記芳香族ビニル系モノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ビニルトルエン、２−メチルスチレン、３−メチルスチレン、４−メチルスチレン、４−エチルスチレン、４−ｔｅｒｔ−ブチルスチレン、３，４−ジメチルスチレン、４−メトキシスチレン、４−エトキシスチレン、２−クロロスチレン、３−クロロスチレン、４−クロロスチレン、２，４−ジクロロスチレン、２，６−ジクロロスチレン、４−クロロ−３−メチルスチレン等のスチレン系モノマーの他、１−ビニルナフタレン、２−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン等が挙げられる。
上記（メタ）アクリレート系モノマーとしては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート等のアルキル（メタ）アクリレート；ベンジル（メタ）アクリレート等の芳香環構造を有する（メタ）アクリレート；イソボルニル（メタ）アクリレート、アダマンチル（メタ）アクリレート、ジシクロペンタニル（メタ）アクリレート等の脂環構造を有する（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記（メタ）アクリルアミド系モノマーとしては、例えば、Ｎ−ｔ−ブチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）オクチルアクリルアミド、ジアセトン（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
上記飽和カルボン酸と不飽和アルコールとのエステル類としては、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ネオデカン酸ビニル等が挙げられる。
また、アルキルビニルエーテル類としては、メチルビニルエーテル、エチルビニルエーテル等が挙げられる。
また、ビニル基含有アルコール類としては、ビニルアルコール等が挙げられる。
【００４４】
酸性基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩と他の繰り返し単位を誘導するモノマーとの組み合わせとしては、リン酸基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩と（メタ）アクリレート系モノマーとの組み合わせ、カルボキシ基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩と芳香族ビニル系モノマーとの組み合わせが好ましく、リン酸基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩とブチル（メタ）アクリレートとの組み合わせ、カルボキシ基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩とスチレン及びα−メチルスチレンから選ばれる１種又は２種との組み合わせがより好ましい。
【００４５】
（回収工程）
回収工程は、凝集工程で形成された小胞凝集物を生体試料から回収する工程である。
回収の手法は、例えば、凝集工程の系中から上清を除去する方法が挙げられる。具体的には、遠心分離、濾過が挙げられるが、回収効率の点で、遠心分離が好ましい。遠心分離で回収を行う場合、小胞凝集物は残渣として回収される。
遠心分離としては、非超遠心の遠心分離、超遠心分離が挙げられるが、非超遠心の遠心分離が好ましい。本発明の小胞凝集物回収方法によれば、超遠心分離を行わない場合でも、非超遠心の遠心分離で小胞凝集物を効率よく回収できる。
【００４６】
遠心分離における遠心力としては、１００〜１０００００×ｇが好ましく、５００〜５００００×ｇがより好ましく、１０００〜３００００×ｇが更に好ましく、３０００〜２２０００×ｇが特に好ましい。
本発明の小胞凝集物回収方法によれば、上記のような遠心力でも小胞凝集物を効率よく回収できる。
【００４７】
遠心分離時間は、遠心分離１回あたり、２０分間〜２４時間が好ましく、３０分間〜１２時間がより好ましく、４５分間〜６時間が更に好ましく、６０分間〜３時間が特に好ましい。
また、遠心分離の回数は、１回以上が好ましく、１〜１０回がより好ましく、１〜５回が特に好ましい。
なお、遠心分離で回収を行う場合、得られた残渣を水や各種緩衝液で洗浄してもよい。
【００４８】
そして、本発明の小胞凝集物回収方法によれば、小胞濃縮物を凝集物として効率よく得ることができる。また、スケールアップも容易である。
【００４９】
＜小胞回収方法＞
本発明の小胞回収方法は、小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に吸着又は結合する部位を１又は複数有する物質Ａとを接触させて小胞凝集物を形成させる凝集工程、前記生体試料から前記小胞凝集物を回収する回収工程、及び前記回収工程で回収した小胞凝集物から小胞を解離させる解離工程、を含むことを特徴とするものである。
上記凝集工程、回収工程は、本発明の小胞凝集物回収方法における凝集工程、回収工程と同様である。
【００５０】
（解離工程）
小胞の解離は、特表２０１３−５２１２５８号公報、国際公開第２０１６／０８８６８９号パンフレット等に記載の公知の手法を参考にして行うことができる。
具体的には、アネキシンＶ、ビオチン化したアネキシンＶ、Ｔｉｍタンパク質、ビオチン化したＴｉｍタンパク質を物質Ａとして使用した場合は、ＥＤＴＡ等のキレート剤を小胞凝集物に接触させることで、小胞を解離させることができる。
また、小胞表面に存在する分子を特異的に認識するビオチン化抗体、ビオチン化したアネキシンＶ、ビオチン化したＴｉｍタンパク質を物質Ａとして使用し、アビジン類又はアビジン類結合担体を物質Ｂとして使用した場合は、アビジン類やアビジン類結合担体との親和性が物質Ａよりも高い、別のビオチン類を添加することで、物質Ａと物質Ｂとの間のアビジン−ビオチン結合が解離され、アビジン類やアビジン類結合担体から小胞を解離させることができる。
また、小胞表面に存在する分子を特異的に認識する抗体を物質Ａとして使用し、抗体結合性タンパク質を物質Ｂとして使用した場合は、酸性条件（好ましくはｐＨ２〜４．５の範囲）に調整することで、小胞を解離させることができる。
【００５１】
このようにして小胞凝集物から小胞を解離させることにより、小胞を効率よく回収することもできる。回収した小胞は、分析や診断に利用可能である。
【００５２】
＜小胞凝集物回収用の複合体、キット＞
本発明の小胞凝集物回収用複合体は、小胞の表面に吸着又は結合する部位を１又は複数有する物質Ａと、小胞の表面に吸着又は結合する部位とは別の部位で複数の前記物質Ａが結合する物質Ｂとを含むことを特徴とするものである。具体的には、ビオチン化したアネキシンＶ及び／又はビオチン化したＴｉｍタンパク質とアビジン類又はアビジン類結合担体とを含む複合体が挙げられ、ビオチン化したアネキシンＶとアビジン類又はアビジン類結合担体とを含む複合体が好ましく、ビオチン化したアネキシンＶ４個とアビジン類１個とからなる複合体が特に好ましい。
本発明の小胞凝集物回収用キットは、小胞の表面に吸着又は結合する部位を１又は複数有する物質Ａと、小胞の表面に吸着又は結合する部位とは別の部位で複数の前記物質Ａが結合する物質Ｂとを含むことを特徴とするものである。
上記キットにおいては、物質Ａ、物質Ｂは複合体を形成していても形成していなくてもよい。上記キットとしては、具体的には、物質Ａ又は物質Ａを含む液剤と、物質Ｂ又は物質Ｂを含む液剤と、緩衝液とを備えるキットや、物質Ａ及び物質Ｂよりなる複合体又は当該複合体を含む液剤と、緩衝液とを備えるキットが挙げられる。また、キットは、小胞凝集物回収方法を記載した説明書等を備えていてもよい。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５４】
〔試験例１〕
（実施例１−１）
（１）ＨＴ２９細胞（ヒト大腸がん由来の細胞株）を、１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎児血清（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）含有Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ−１２培地（和光純薬社製）を用いて、細胞密度が約８０％（ｗ／ｖ）に達するまで培養した。次いで、ＰＢＳ（和光純薬社製）で細胞を２回洗浄し、無血清Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ−１２培地（和光純薬社製）で約３日間培養し、培養上清を回収した。この培養上清を、４℃、３００×ｇで１０分間遠心分離して上清を回収し、この回収した上清を、４℃、２０００×ｇで１０分間遠心分離して上清を回収し、次いで、孔径０．２２μｍのフィルターでろ過した。この培養上清を、分画分子量１００Ｋの限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製アミコンウルトラ−１５（ＭＷＣＯ：１００Ｋ））を用いて１００倍濃縮した。ここで得られた濃縮液を「濃縮液Ｘ」と称する。
次に、上記濃縮液Ｘ５０μＬに、抗ＣＤ９抗体（ＭＢＬ社製Ｄ２５２−３）１μｇを添加し、ＰＢＳを加えて１００μＬとした。なお、ここで得られた試料において、抗ＣＤ９抗体の濃度は約０．００１％（ｗ／ｖ）である。この試料を、４℃で一晩静置した後、１５０００ｒｐｍ、４℃で９０分間遠心分離（装置：ＣＦ１６ＲＮ、ローター：Ｔ１５Ａ３９（日立工業株式会社）、遠心力：約２１５００×ｇ）し、上清と残渣に分けた。この遠心分離で回収した上清を「検体Ａ」と称する。
次いで、上記残渣をＰＢＳ０．５ｍＬで洗浄し、１５０００ｒｐｍ、４℃で９０分間遠心分離（装置：ＣＦ１６ＲＮ、ローター：Ｔ１５Ａ３９（日立工業株式会社）、遠心力：約２１５００×ｇ）し、上清を廃棄し、残渣をＰＢＳ１００μＬで回収した。ここで得られた試料を「検体Ｂ」と称する。
（２）次に、上記検体Ａ、検体Ｂに含まれるエクソソームを、ウェスタンブロッティング法で検出した。
すなわち、検体Ａ、検体ＢについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。次に、トランスブロット  Ｔｕｒｂｏブロッティングシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて、分離ゲルをＰＶＤＦ膜（トランスブロットＴｕｒｂｏ転写パックＰＶＤＦ（ミディ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製））に転写し、転写後の膜を、５０％  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（ナカライテスク社製）／ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製）に３７℃で約２時間浸した。これに、一次抗体Ａｎｔｉ−ＣＤ９  ｍＡｂ（ＭＢＬ社製、ＭＥＸ００１−３）を、１μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で約１時間浸した。これを洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）にて３回洗浄した後、標識抗体として１μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｕｓｅ  ＴｒｕｅＢｌｏｔ  ＵＬＴＲＡ：  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＨＲＰ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  １８−８８１７−３３）を２５℃で１時間反応させた。これを洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）にて５回洗浄した後、発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ＃３４０９５）を反応させ、発光測定機（ＬＡＳ−５００、  ＧＥヘルスケア社製）にてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ像を確認した。
（実施例１−２）
抗ＣＤ９抗体の使用量を１０μｇに変更した以外は、実施例１−１の（１）と同様にして検体Ａ及び検体Ｂを得て、得られた検体Ａ及び検体Ｂについて、実施例１−１の（２）と同様にしてウェスタンブロッティング法でエクソソームの検出を行った。
（比較例１）
抗ＣＤ９抗体を添加せずに処理した以外は、実施例１−１の（１）と同様にして検体Ａ及び検体Ｂを得て、得られた検体Ａ及び検体Ｂについて、実施例１−１の（２）と同様にしてウェスタンブロッティング法でエクソソームの検出を行った。
【００５５】
試験例１の結果を図５に示す（レーン１：比較例１の検体Ａ、レーン２：比較例１の検体Ｂ、レーン３：実施例１−１の検体Ａ、レーン４：実施例１−１の検体Ｂ、レーン５：実施例１−２の検体Ａ、レーン６：実施例１−２の検体Ｂ）。
図５に示すとおり、実施例１−１、１−２の検体Ｂ中に、エクソソーム凝集物が多く含まれていた。
この結果から、抗ＣＤ９抗体を物質Ａとして用いてエクソソーム凝集物を形成させることによって、エクソソーム凝集物を効率よく回収できることがわかった。
【００５６】
〔試験例２〕
（実施例２−１）
（１）抗体ビオチン標識キット（Ｔｈｅｒｍｏ社製＃２１３３５）を使用して、抗ＣＤ８１抗体（ＭＢＬ社製ＭＥＸ００３−３）をビオチン化した。得られたビオチン化抗体を「ビオチン化抗体Ｙ」と称する。なお、ビオチン化は添付のプロトコールに準じて行った。
（２）実施例１−１と同様にして調製した濃縮液Ｘ５０μＬに、ビオチン化抗体Ｙ１０μｇを添加し、４℃で一晩静置した後、ストレプトアビジン（ロッシュ社製３５３５４５２１０３）０．２５μｇを添加し、ＰＢＳを加えて１００μＬとした。なお、ここで得られた試料において、ビオチン化抗体の濃度は約０．０１％（ｗ／ｖ）であり、ストレプトアビジンの濃度は約０．０００２５％（ｗ／ｖ）である。この試料を、２５℃で６０分間静置した後、１５０００ｒｐｍ、４℃で９０分間遠心分離（装置：ＣＦ１６ＲＮ、ローター：Ｔ１５Ａ３９（日立工業株式会社）、遠心力：約２１５００×ｇ）し、上清と残渣に分けた。この遠心分離で回収した上清を「検体Ｃ」と称する。
次いで、上記残渣をＰＢＳ０．５ｍＬで洗浄し、１５０００ｒｐｍ、４℃で９０分間遠心分離（装置：ＣＦ１６ＲＮ、ローター：Ｔ１５Ａ３９（日立工業株式会社）、遠心力：約２１５００×ｇ）し、上清を廃棄し、残渣をＰＢＳ１００μＬで回収した。ここで得られた試料を「検体Ｄ」と称する。
（３）次に、上記検体Ｃ、検体Ｄに含まれるエクソソームを、ウェスタンブロッティング法で検出した。なお、ウェスタンブロッティングは、一次抗体にＡｎｔｉ−ＣＤ８１  ｍＡｂ（ＭＢＬ社製、ＭＥＸ００３−３）を用いる以外は、実施例１−１の（２）と同様にして行った。
【００５７】
（実施例２−２）
ストレプトアビジンを添加せずに処理した以外は、実施例２−１の（２）と同様にして検体Ｃ及び検体Ｄを得て、得られた検体Ｃ及び検体Ｄについて、実施例２−１の（３）と同様にしてウェスタンブロッティング法でエクソソームの検出を行った。
【００５８】
試験例２の結果を図６に示す（レーン１：実施例２−２の検体Ｃ、レーン２：実施例２−２の検体Ｄ、レーン３：実施例２−１の検体Ｃ、レーン４：実施例２−１の検体Ｄ）。
図６に示すとおり、実施例２−１、２−２の検体Ｄ中に、エクソソーム凝集物が多く含まれていた。特に、実施例２−１の検体Ｄ中に、エクソソーム凝集物がより多く含まれていた。
この結果から、ビオチン化抗体を物質Ａとして用いてエクソソーム凝集物を形成させること（実施例２−２）、ビオチン化抗体を物質Ａとして、ストレプトアビジンを物質Ｂとしてそれぞれ用いてエクソソーム凝集物を形成させること（実施例２−１）によって、エクソソーム凝集物を効率よく回収でき、特に、ビオチン化抗体を物質Ａとして、ストレプトアビジンを物質Ｂとしてそれぞれ用いてエクソソーム凝集物を形成させることによって、エクソソーム凝集物をより効率よく回収できることがわかった。
【００５９】
〔試験例３〕
（実施例３−１）
ビオチン化抗体Ｙの使用量を１μｇに、ストレプトアビジンの使用量を０．０２５μｇに、それぞれ変更した以外は、実施例２−１の（２）と同様にして検体Ｃ及び検体Ｄを得て、得られた検体Ｃ及び検体Ｄについて、実施例２−１の（３）と同様にしてウェスタンブロッティング法でエクソソームの検出を行った。
（実施例３−２）
ＨＴ２９細胞（ヒト大腸がん由来の細胞株）を、１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎児血清（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）含有Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ−１２培地（和光純薬社製）を用いて、細胞密度が約８０％（ｗ／ｖ）に達するまで培養した。次いで、ＰＢＳ（和光純薬社製）で細胞を２回洗浄し、無血清Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ−１２培地（和光純薬社製）で約３日間培養し、培養上清を回収した。この培養上清を、４℃、３００×ｇで１０分間遠心分離して培養上清を回収した。
得られた培養上清を、濃縮液Ｘに替えて使用する以外は、実施例３−１と同様にして検体Ｄを得て、得られた検体Ｄについて、実施例３−１と同様にしてウェスタンブロッティング法でエクソソームの検出を行った。
【００６０】
試験例３の結果を図７に示す（レーン１：実施例３−１の検体Ｃ、レーン２：実施例３−１の検体Ｄ、レーン３：実施例３−２の検体Ｄ）。
図７に示すとおり、実施例３−２の検体Ｄにも、実施例３−１の検体Ｄと同様に、エクソソーム凝集物が多く含まれていた。
この結果から、ビオチン化抗体を物質Ａとして、ストレプトアビジンを物質Ｂとしてそれぞれ用いてエクソソーム凝集物を形成させることによって、限外ろ過による濃縮工程を行わない場合でも、エクソソーム凝集物を効率よく回収できることがわかった。
【００６１】
〔試験例４〕
（実施例４−１）
（１）０．１ｍｇ／ｍＬのビオチン化アネキシンＶ溶液（溶媒：ＰＢＳ）５０μＬに、ストレプトアビジン（ロッシュ社製３５３５４５２１０３）６．２５μｇを添加し、２５℃で６０分間静置した後、実施例１−１と同様にして調製した濃縮液Ｘ５０μＬ、５×Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、９ｍＭ  ＣａＣｌ2）２５μＬを添加した。なお、ここで得られた試料において、ビオチン化アネキシンＶの濃度は約０．００４％（ｗ／ｖ）であり、ストレプトアビジンの濃度は約０．００５％（ｗ／ｖ）である。この試料を、４℃で一晩静置した後、１５０００ｒｐｍ、４℃で９０分間遠心分離（装置：ＣＦ１６ＲＮ、ローター：Ｔ１５Ａ３９（日立工業株式会社）、遠心力：約２１５００×ｇ）し、上清と残渣に分けた。
次いで、上記残渣をＰＢＳ０．５ｍＬで洗浄し、１５０００ｒｐｍ、４℃で９０分間遠心分離（装置：ＣＦ１６ＲＮ、ローター：Ｔ１５Ａ３９（日立工業株式会社）、遠心力：約２１５００×ｇ）し、上清を廃棄し、残渣をＰＢＳ１００μＬで回収した。ここで得られた試料を「検体Ｅ」と称する。
（２）次に、上記検体Ｅに含まれるエクソソームを、ウェスタンブロッティング法で検出した。なお、ウェスタンブロッティングは、実施例１−１の（２）と同様にして行った。
（実施例４−２）
ストレプトアビジンを添加せずに処理した以外は、実施例４−１の（１）と同様にして検体Ｅを得て、得られた検体Ｅについて、実施例４−１の（２）と同様にしてウェスタンブロッティング法でエクソソームの検出を行った。
【００６２】
試験例４の結果を図８に示す（レーン１：実施例４−２の検体Ｅ、レーン２：実施例４−１の検体Ｅ）。
図８に示すとおり、実施例４−１、４−２の検体Ｅ中に、エクソソーム凝集物が多く含まれていた。特に、実施例４−１の検体Ｅ中に、エクソソーム凝集物がより多く含まれていた。
この結果から、ビオチン化アネキシンＶを物質Ａとして用いてエクソソーム凝集物を形成させること（実施例４−２）、ビオチン化アネキシンＶを物質Ａとして、ストレプトアビジンを物質Ｂとしてそれぞれ用いてエクソソーム凝集物を形成させること（実施例４−１）によって、エクソソーム凝集物を効率よく回収でき、特に、ビオチン化アネキシンＶを物質Ａとして、ストレプトアビジンを物質Ｂとしてそれぞれ用いてエクソソーム凝集物を形成させることによって、エクソソーム凝集物をより効率よく回収できることがわかった。
【００６３】
試験例１〜４の結果を総合的に勘案するとともに、アネキシンＶとエクソソームの解離が極めて容易であることを考慮すると、各実施例の物質Ａ、Ｂの組み合わせの中では、物質Ａがビオチン化抗体であり、物質Ｂがストレプトアビジンである組み合わせ、物質Ａがビオチン化アネキシンＶであり、物質Ｂがストレプトアビジンである組み合わせが、エクソソーム凝集物の回収に適していると推察される。特に、物質Ａがビオチン化抗体であり、物質Ｂがストレプトアビジンである組み合わせが、エクソソーム凝集物の回収効率が殊更良好であり、エクソソーム凝集物の回収に特に適している。
また、各実施例で得られたエクソソーム凝集物からエクソソームを簡便に解離させることができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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