(57)【要約】【課題】腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達の阻害剤によるフィードバック機構により誘導される腫瘍細胞増殖を鋭敏に検出する培養技術を提供すること。【解決手段】腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤によるフィードバック機構により該阻害剤に対する耐性を獲得した腫瘍細胞を、i）該阻害剤、及びii）該阻害剤によるフィードバック機構により活性化されたシグナル伝達経路の上流の増殖因子受容体のリガンドを含有する、細胞又は組織を浮遊培養することが可能な液状の培地組成物中で浮遊培養に付す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤によるフィードバック機構により該阻害剤に対する耐性を獲得した腫瘍細胞を、
i）該阻害剤、及び
ii）該阻害剤によるフィードバック機構により活性化されたシグナル伝達経路の上流の増殖因子受容体のリガンド
を含有する、細胞又は組織を浮遊培養することが可能な液状の培地組成物中で浮遊培養に付すことを含む、該腫瘍細胞の培養方法。
【請求項２】
該シグナル伝達経路がMAPKシグナル伝達経路である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
該阻害剤がMEK阻害剤である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
MEK阻害剤が、トラメチニブ、コビメチニブ又はピマセルチブである、請求項3記載の方法。
【請求項５】
該増殖因子受容体がEGF受容体である、請求項2〜4の何れか1項記載の方法。
【請求項６】
該増殖因子受容体のリガンドがEGFである、請求項2〜4の何れか1項記載の方法。
【請求項７】
該培地組成物が、2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物を含有する、請求項1〜6の何れか1項記載の方法。
【請求項８】
該高分子化合物が脱アシル化ジェランガムである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
該培地組成物中の脱アシル化ジェランガム濃度が0.005〜0.3％（w/v）である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
腫瘍細胞が上皮細胞由来である、請求項1〜9の何れか1項記載の方法。
【請求項１１】
以下の工程を含む、腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤に対する腫瘍細胞の耐性を評価する方法：
（1a）腫瘍細胞を、i）該阻害剤、及びii）該シグナル伝達経路における該阻害剤の標的分子の上流に位置する増殖因子受容体又は該シグナル伝達経路とは異なるシグナル伝達経路の上流の増殖因子受容体のリガンドを含有する、細胞又は組織を浮遊培養することが可能な液状の培地組成物中で浮遊培養に付すこと、
（2a）（1a）の浮遊培養における腫瘍細胞の増殖を測定すること、及び
（3a）（2a）において該阻害剤による腫瘍細胞の増殖促進が確認された場合、該腫瘍細胞は該阻害剤に耐性である可能性が高いと判断すること。
【請求項１２】
該シグナル伝達経路がMAPKシグナル伝達経路である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
該阻害剤がMEK阻害剤である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
MEK阻害剤が、トラメチニブ、コビメチニブ又はピマセルチブである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
該増殖因子受容体がEGF受容体である、請求項12〜14の何れか1項記載の方法。
【請求項１６】
該増殖因子受容体のリガンドがEGFである、請求項12〜14の何れか1項記載の方法。
【請求項１７】
該培地組成物が、2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物を含有する、請求項11〜16の何れか1項記載の方法。
【請求項１８】
該高分子化合物が脱アシル化ジェランガムである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
該培地組成物中の脱アシル化ジェランガム濃度が0.005〜0.3％（w/v）である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
腫瘍細胞が上皮細胞由来である、請求項11〜19の何れか1項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞又は組織を浮遊培養することが可能な培地組成物を用いた、薬剤耐性腫瘍細胞の培養方法、及び腫瘍細胞の薬剤耐性の評価方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗癌剤の研究開発或いは癌治療における適切な抗癌剤の選択のために、候補薬剤或いは抗癌剤を含有する培養液中で癌細胞を生体外で培養することによって、癌細胞に対する薬剤の抗癌活性を評価することが行われている。しかし、既存の抗癌活性の評価方法では、生体外では抗癌活性を示す薬剤が、生体内に投与した時には低い効果しか得られないため使用されない場合があるなど、生体外での評価結果と実際の臨床効果に乖離が生じる不具合が起きていた。特に最近では、癌細胞に発現する受容体や細胞内のシグナル伝達因子をターゲットにした分子標的治療薬に、予期せぬ副作用や薬剤耐性がヒトでの臨床試験で報告されている。この耐性機構の原因として、癌細胞における遺伝子変異が挙げられるが、最近では細胞内のシグナル伝達因子や細胞表面の受容体の作用を遮断することで、ターゲット因子の上流に位置する受容体の活性化あるいは別の受容体経路を活性化させるいわゆるフィードバック機構が報告されている。
【０００３】
MEK阻害剤は、種々の癌細胞の分化・増殖において重要なシグナル伝達経路であるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）経路中のMEKの活性化及びキナーゼ活性を阻害する抗腫瘍薬である。MEK阻害剤は、一部の活性化されたRAS変異を有するメラノーマや肺癌等において強力な治療効果が確認されているが、投与を継続することにより癌細胞がMEK阻害剤に対する耐性を獲得することが問題となっている。MEK阻害剤に対する耐性を獲得した癌細胞に対して、MEK阻害剤を投与すると、フィードバック機構によりかえって増殖が促進されることが報告されている（非特許文献1、2）。
【０００４】
これらの癌細胞における耐性機構は、現状ではヒトでの臨床試験結果で判明するケースが多い。そのため耐性機構の判明までに、多大な研究コストや臨床費用を費やしかつ長い時間がかかるため、創薬活動において大きなリスクとなっている。そのため、癌細胞の耐性機構を鋭敏に検出するin vitro試験方法、特にフィードバックによる細胞数増加を検出可能な試験方法の開発が求められている。
【０００５】
体内環境をできるだけ再現した細胞培養条件にて活性評価を行う手法が開発されてきた。例えば、軟寒天、コラーゲンゲル、ハイドロゲル等の支持体にて癌細胞を包埋することにより、培養容器への接着を阻害した環境にて癌細胞を培養し、抗癌剤の評価を行う方法が開発されている（特許文献1、非特許文献1〜4）。また、培養容器表面を細胞接着の阻害材料にてコーティングすることや、表面に特殊な加工を施すことにより細胞接着を阻害して癌細胞を凝集させた状態にて培養（スフェア培養）し、抗癌活性の評価を行う方法が開発されている（特許文献2、3）。しかしながら、これらの癌細胞培養法は、培養容器の作成過程及び細胞培養の操作が煩雑である、コラーゲン等の支持体から細胞を回収して抗癌活性を評価する際の操作が煩雑である、支持体が動物由来の成分である際には高価であるためにその供給が制限される場合がある、細胞凝集塊（スフェア）同士の会合が生じてその大きさが過剰になるために細胞生存率や再現性が低くなるなどの様々な問題を有している。
【０００６】
本発明者は、液体培地中の粘度を実質的に高めることなく、浮遊状態を維持したまま、細胞や組織を培養することが可能な培地組成物の開発に成功している（特許文献4、5）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2008-11797号公報
【特許文献２】特開2008-61609号公報
【特許文献３】特開2012-249547号公報
【特許文献４】国際公開第2014/017513号
【特許文献５】米国特許出願公開第2014/0106348 A1号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Walters DM, Lindberg JM, et al., NEOPLASIA, 2013; 15(2): 143-155.
【非特許文献２】Mizukami T, Togashi Y, et al., Int J Oncol, 2015; 47(2): 499-505.
【非特許文献３】Takamura et al., Int. J. Cancer 2002, 98: 450-455
【非特許文献４】Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979, 76: 3401-3405
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達の阻害剤によるフィードバック機構により誘導される腫瘍細胞増殖を鋭敏に検出する培養技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、鋭意検討の結果、腫瘍細胞を、細胞又は組織を浮遊培養することが可能な液状の培地組成物中で、浮遊培養すると、腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達の阻害剤によるフィードバック機構により誘導される腫瘍細胞増殖を鋭敏に検出し得ることを見出した。A431細胞（ヒト皮膚癌由来細胞株）を、脱アシル化ジェランガムを含む液体培地中で、MEK阻害剤で処理し、浮遊培養に付すと、MEK阻害剤は、EGFによるA431細胞の細胞増殖を促進した。このようなMEK阻害剤による細胞増殖促進は、2D培養（単層培養）法では、検出できなかった。これらの知見に基づき、更に検討を加え、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
本発明の主たる構成は、以下のとおりである。
［1］腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤によるフィードバック機構により該阻害剤に対する耐性を獲得した腫瘍細胞を、
i）該阻害剤、及び
ii）該阻害剤によるフィードバック機構により活性化されたシグナル伝達経路の上流の増殖因子受容体のリガンド
を含有する、細胞又は組織を浮遊培養することが可能な液状の培地組成物中で浮遊培養に付すことを含む、該腫瘍細胞の培養方法。
［2］該シグナル伝達経路がMAPKシグナル伝達経路である、［1］記載の方法。
［3］該阻害剤がMEK阻害剤である、［2］記載の方法。
［4］MEK阻害剤が、トラメチニブ、コビメチニブ又はピマセルチブである、［3］記載の方法。
［5］該増殖因子受容体がEGF受容体である、［2］〜［4］の何れか記載の方法。
［6］該増殖因子受容体のリガンドがEGFである、［2］〜［4］の何れか記載の方法。
［7］該培地組成物が、2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物を含有する、［1］〜［6］の何れか記載の方法。
［8］該高分子化合物が脱アシル化ジェランガムである、［7］記載の方法。
［9］該培地組成物中の脱アシル化ジェランガム濃度が0.005〜0.3％（w/v）である、［8］記載の方法。
［10］腫瘍細胞が上皮細胞由来である、［1］〜［9］の何れか記載の方法。
［11］以下の工程を含む、腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤に対する腫瘍細胞の耐性を評価する方法：
（1a）腫瘍細胞を、i）該阻害剤、及びii）該シグナル伝達経路における該阻害剤の標的分子の上流に位置する増殖因子受容体又は該シグナル伝達経路とは異なるシグナル伝達経路の上流の増殖因子受容体のリガンドを含有する、細胞又は組織を浮遊培養することが可能な液状の培地組成物中で浮遊培養に付すこと、
（2a）（1a）の浮遊培養における腫瘍細胞の増殖を測定すること、及び
（3a）（2a）において該阻害剤による腫瘍細胞の増殖促進が確認された場合、該腫瘍細胞は該阻害剤に耐性である可能性が高いと判断すること。
［12］該シグナル伝達経路がMAPKシグナル伝達経路である、［11］記載の方法。
［13］該阻害剤がMEK阻害剤である、［12］記載の方法。
［14］MEK阻害剤が、トラメチニブ、コビメチニブ又はピマセルチブである、［13］記載の方法。
［15］該増殖因子受容体がEGF受容体である、［12］〜［14］の何れか記載の方法。
［16］該増殖因子受容体のリガンドがEGFである、［12］〜［14］の何れか記載の方法。
［17］該培地組成物が、2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物を含有する、［11］〜［16］の何れか記載の方法。
［18］該高分子化合物が脱アシル化ジェランガムである、［17］記載の方法。
［19］該培地組成物中の脱アシル化ジェランガム濃度が0.005〜0.3％（w/v）である、［18］記載の方法。
［20］腫瘍細胞が上皮細胞由来である、［11］〜［19］の何れか記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達の阻害剤によるフィードバック機構により誘導される腫瘍細胞増殖を、インビトロで再現することができる。本発明の培養方法を用いることにより、フィードバック機構による腫瘍細胞増殖を誘導する可能性がある腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達の阻害剤を選択し得る。例えば、腫瘍患者からバイオプシーにより腫瘍細胞を摘出し、本発明の培養方法により、種々のシグナル伝達阻害剤で処理することにより、フィードバック機構による腫瘍細胞増殖を誘導してしまうリスクの高いシグナル伝達阻害剤と、当該リスクの低いシグナル伝達阻害剤とを選別し、当該リスクの高いシグナル伝達阻害剤を治療に使用する医薬の候補から除外することにより、腫瘍患者に対して、効果的な治療戦略を提供し得ることが期待できる。
【００１３】
（I）本発明に用いる培地組成物
本発明に用いられる培地組成物は、細胞又は組織を浮遊培養することが可能な液状の培地組成物である。当該培地組成物は、浮遊状態を維持したまま、培養対象の細胞（即ち、腫瘍細胞）を培養することを可能にする。当該培地組成物は、WO2014/017513 A1及びUS2014/0106348 A1の記載に従い、調製することが可能である。以下、当該培地組成物を培地組成物Iと称することがある。
【００１４】
本発明における細胞又は組織の浮遊とは、培養容器に対して細胞又は組織が接着しない状態（非接着）であることをいう。本発明において、細胞又は組織を培養する際、液状の培地組成物に対する外部からの圧力や振動或いは当該培地組成物中での振とう、回転操作等を伴わずに細胞又は組織が当該培地組成物中で均一に分散しかつ浮遊状態にあることを「浮遊静置」といい、当該状態で細胞又は組織を培養することを「浮遊静置培養」という。また、「浮遊静置」において浮遊させることのできる期間としては、5分以上、1時間以上、24時間以上、48時間以上、7日以上等が含まれるが、浮遊状態を保つ限りこれらの期間に限定されない。
【００１５】
培地組成物Iは、細胞又は組織の培養が可能な温度範囲（例えば、0〜40℃）の少なくとも1点において、細胞又は組織の浮遊静置が可能である。本発明に用いる培地組成物は、好ましくは25〜37℃の温度範囲の少なくとも1点において、最も好ましくは37℃において、細胞又は組織の浮遊静置が可能である。
【００１６】
浮遊静置が可能か否かは、例えば、培養対象の細胞を、2×104 cells/mlの濃度で、評価対象の培地組成物中に均一に分散させ、15mlコニカルチューブ中に10ml注入し、少なくとも5分以上（例、1時間以上、24時間以上、48時間以上、7日以上）、37℃にて静置し、当該細胞の浮遊状態が維持されるか否かを観察することにより、評価することができる。全細胞のうちの70％以上が浮遊状態の場合、浮遊状態が維持されたと結論できる。細胞に代えて、ポリスチレンビーズ（Size 500-600μm、Polysciences Inc.製）に代替して評価してもよい。
【００１７】
培地組成物Iは、2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物を含有する。本発明に用いる培地組成物においては、該高分子化合物が2価金属カチオンを介して結びつくことにより、水中で分散した三次元ネットワーク（不定型な構造体）を形成する。この三次元ネットワークを含む液体培地中で細胞を培養すると、この三次元ネットワークが細胞を浮遊させる担体として機能し、培地中の細胞は、この三次元ネットワークにトラップされ、沈まないため、振とう、回転操作等を要することなく、細胞を浮遊状態で均一に分散させたまま、培養する（浮遊静置培養する）ことが可能となる。
【００１８】
一態様において、培地組成物Iの粘度は、37℃において、8mPa・s以下であり、好ましくは4mPa・s以下であり、より好ましくは2mPa・s以下である。培地組成物の粘度は、例えば、37℃条件下でE型粘度計（東機産業株式会社製、TV-22型粘度計、機種：TVE -22L、コーンロータ：標準ロータ  1°34´×R24、回転数100rpm）を用いて測定することができる。培地組成物Iは、このように低い粘度で、細胞や組織の浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）を実施し得るので、継代などにおける操作性に優れている。
【００１９】
アニオン性の官能基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基及びそれらの塩が挙げられ、カルボキシ基またはその塩が好ましい。
本発明に用いる高分子化合物は、前記アニオン性の官能基の群より選択される1種又は2種以上を有するものを使用できる。
【００２０】
本発明に用いる高分子化合物の好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等）が10個以上重合した多糖類が挙げられ、より好ましくは、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類が挙げられる。ここにいう酸性多糖類とは、その構造中にアニオン性の官能基を有すれば特に制限されないが、例えば、ウロン酸（例えば、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸）を有する多糖類、構造中の一部に硫酸基又はリン酸基を有する多糖類、或いはその両方の構造を持つ多糖類であって、天然から得られる多糖類のみならず、微生物により産生された多糖類、遺伝子工学的に産生された多糖類、或いは酵素を用いて人工的に合成された多糖類も含まれる。より具体的には、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム（以下、DAGという場合もある）、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩からなる群より1種又は2種以上から構成されるものが例示される。多糖類は、好ましくは、ヒアルロン酸、DAG、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン又はそれらの塩であり、低濃度の使用で細胞又は組織を浮遊させることができることを考慮すると、最も好ましくは、DAGである。
【００２１】
ここでいう塩とは、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩、カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩又はアルミニウム、亜鉛、銅、鉄、アンモニウム、有機塩基及びアミノ酸等の塩が挙げられる。
【００２２】
これらの高分子化合物（多糖類等）の重量平均分子量は、好ましくは10，000乃至50，000，000であり、より好ましくは100，000乃至20，000，000、更に好ましくは1，000，000乃至10，000，000である。例えば、当該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）によるプルラン換算で測定できる。
【００２３】
更に、DAGはリン酸化したものを使用することもできる。当該リン酸化は公知の手法で行うことができる。
【００２４】
本発明においては、上記多糖類を複数種（好ましくは2種）組み合わせて使用することができる。多糖類の組み合わせの種類は、上述の構造体を液体培地中に形成し、細胞又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできるものであれば特に限定されないが、好ましくは、当該組合せは少なくともDAG又はその塩を含む。即ち、好適な多糖類の組合せには、DAG又はその塩、及びDAG又はその塩以外の多糖類（例、キサンタンガム、アルギン酸、カラギーナン、ダイユータンガム、メチルセルロース、ローカストビーンガム又はそれらの塩）が含まれる。具体的な多糖類の組み合わせとしては、DAGとラムザンガム、DAGとダイユータンガム、DAGとキサンタンガム、DAGとカラギーナン、DAGとザンタンガム、DAGとローカストビーンガム、DAGとκ−カラギーナン、DAGとアルギン酸ナトリウム、DAGとメチルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
脱アシル化ジェランガムとは、1-3結合したグルコース、1-4結合したグルクロン酸、1-4結合したグルコース及び1-4結合したラムノースの4分子の糖を構成単位とする直鎖状の高分子多糖類であり、以下の一般式（I）において、R1、R2が共に水素原子であり、nは2以上の整数で表わされる多糖類である。ただし、R1がグリセリル基を、R2がアセチル基を含んでいてもよいが、アセチル基及びグリセリル基の含有量は、好ましくは10％以下であり、より好ましくは1％以下である。
【００２６】
【化１】
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【００２７】
培地中の上記高分子化合物の濃度は、高分子化合物の種類に依存し、高分子化合物が上述の構造体を液体培地中に形成し、細胞又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができるが、通常0.0005％乃至1.0％（w/v）、好ましくは0.001％乃至0.4％（w/v）、より好ましくは0.005％乃至0.1％（w/v）、更に好ましくは0.005％乃至0.05％（w/v）となるようにすれば良い。例えば、脱アシル化ジェランガムの場合、0.001％乃至1.0％（w/v）、好ましくは0.003％乃至0.5％（w/v）、より好ましくは0.005％乃至0.3％（w/v）、更に好ましくは0.01％乃至0.05％（w/v）、最も好ましくは、0.01％乃至0.03％（w/v）培地中に添加すれば良い。キサンタンガムの場合、0.001％乃至5.0％（w/v）、好ましくは0.01％乃至1.0％（w/v）、より好ましくは0.05％乃至0.5％（w/v）、最も好ましくは、0.1％乃至0.2％（w/v）培地中に添加すれば良い。κ−カラギーナンおよびローカストビーンガム混合系の場合、0.001％乃至5.0％（w/v）、好ましくは0.005％乃至1.0％（w/v）、より好ましくは0.01％乃至0.1％（w/v）、最も好ましくは、0.03％乃至0.05％（w/v）培地中に添加すれば良い。ネイティブ型ジェランガムの場合、0.05％乃至1.0％(w/v)、好ましくは、0.05％乃至0.1％(w/v)培地中に添加すれば良い。
【００２８】
上記多糖類を複数種（好ましくは2種）組み合わせて使用する場合、当該多糖類の濃度は、当該多糖類の組み合わせが上述の構造体を液体培地中に形成し、細胞又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができる。例えば、DAG又はその塩と、DAG又はその塩以外の多糖類との組合せを用いる場合、DAG又はその塩の濃度としては0.005〜0.02％（w/v）、好ましくは0.01〜0.02％（w/v）が例示され、DAG又はその塩以外の多糖類の濃度としては、0.0001〜0.4％（w/v）、好ましくは0.005〜0.4％（w/v）、より好ましくは0.1〜0.4％（w/v）が例示される。具体的な濃度範囲の組合せとしては、以下が例示される。
DAG又はその塩：0.005〜0.02％（好ましくは0.01〜0.02％）（w/v）
DAG以外の多糖類
キサンタンガム：0.1〜0.4％（w/v）
アルギン酸ナトリウム：0.0001〜0.4％（w/v）（好ましくは、0.1〜0.4％（w/v））
ネイティブジェランガム：0.0001〜0.4％（w/v）
ローカストビーンガム：0.1〜0.4％（w/v）
メチルセルロース：0.1〜0.4％（w/v）（好ましくは0.2〜0.4％（w/v））
カラギーナン：0.05〜0.1％（w/v）
ダイユータンガム：0.05〜0.1％（w/v）
【００２９】
なお該濃度は、以下の式で算出できる。
濃度［％（w/v）］＝特定化合物の重量（g）/培地組成物の容量（ml）×100
【００３０】
培地組成物Iは、2価金属カチオンを含有する。2価金属カチオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、マンガンイオン、鉄イオン、銅イオン等が挙げられる。2価金属カチオンの種類は、上記高分子化合物が、当該2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することが可能であれば特に限定されないが、好ましくは培地組成物Iはカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの少なくとも一方を含み、より好ましくはカルシウムイオンを含む。培地組成物I中の2価金属カチオン濃度は、上記高分子化合物が上述の構造体を液体培地中に形成し、細胞又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができる。例えば、培地組成物中のカルシウムイオン濃度は、0.1mM及至300mMで、好ましくは、0.5mM及至100mMであるが、これらに限定されない。哺乳動物培養に使用する一般的な液状培地には、上記高分子化合物が上述の構造体を形成するのに十分な濃度のカルシウムイオンが含まれる。
【００３１】
培地組成物Iは、細胞及び／又は組織を培養する際に用いられる基礎培地と、上述の高分子化合物を混合することにより調製することができる。細胞又は組織が哺乳動物由来である場合、哺乳動物細胞の培養に用いられる基礎培地であればいずれも用いることができる。このような基礎培地としては、例えばダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium；DMEM）、ハムF12培地（Ham’s Nutrient Mixture F12）、DMEM/F12培地、マッコイ5A培地（McCoy’s 5A medium）、イーグルMEM（Eagles’s Minimum Essential Medium；EMEM）、αMEM（alpha Modified Eagles’s Minimum Essential Medium；αMEM）、MEM（Minimum Essential Medium）、RPMI1640培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM）、MCDB131培地、ウィリアム培地E、IPL41培地、Fischer’s培地、StemPro34（インビトロジェン社製）、X-VIVO 10（ケンブレックス社製）、X-VIVO 15（ケンブレックス社製）、HPGM（ケンブレックス社製）、StemSpan H3000（ステムセルテクノロジー社製）、StemSpanSFEM（ステムセルテクノロジー社製）、StemlineII（シグマアルドリッチ社製）、QBSF-60（クオリティバイオロジカル社製）、StemProhESCSFM（インビトロジェン社製）、Essential8（登録商標）培地（ギブコ社製）、mTeSR1或いは2培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロFF或いはリプロFF2（リプロセル社製）、PSGro hESC/iPSC培地（システムバイオサイエンス社製）、NutriStem（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、CSTI-7培地（細胞科学研究所社製）、MesenPRO RS培地（ギブコ社製）、MF-Medium（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、Sf-900II（インビトロジェン社製）、Opti-Pro（インビトロジェン社製）、などが挙げられる。
【００３２】
培地組成物Iには、ナトリウム、カリウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などを当業者は目的に応じて自由に添加してもよい。哺乳動物由来の細胞又は組織培養の際には、当業者は目的に応じてその他の化学成分あるいは生体成分を一種類以上組み合わせて添加することもできる。
哺乳動物由来の細胞（又は組織）の培地に添加される成分としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、2−メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子などが挙げられる。
【００３３】
培地組成物Iは、WO2014/017513 A1及びUS2014/0106348 A1の記載に従い、調製することが可能である。
【００３４】
好ましい態様において、培地組成物Iは、脱アシル化ジェランガムを含有する。一態様において、培地組成物中の脱アシル化ジェランガムまたはその塩の濃度は、0.001％乃至1.0％（w/v）、好ましくは0.003％乃至0.5％（w/v）、より好ましくは0.005％乃至0.3％（w/v）、更に好ましくは0.01％乃至0.05％（w/v）、最も好ましくは、0.01％乃至0.03％（w/v）である。該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムまたはその塩以外の多糖類を含有し得る。該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムが細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を形成するのに十分な濃度のカルシウムイオンを含有する。該濃度は、例えば、0.1mM及至300mM、好ましくは、0.5mM及至100mMである。該培地組成物の粘度は、37℃において、8mPa・s以下、好ましくは4mPa・s以下であり、より好ましくは2mPa・s以下であり得る。
【００３５】
（II）腫瘍細胞の培養方法
本発明は、腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤に対する耐性を獲得した腫瘍細胞の培養方法（以下、本発明の培養方法ともいう）を提供するものである。
【００３６】
本発明に用いる腫瘍細胞は、哺乳動物の腫瘍細胞である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくはげっ歯類（マウス等）又は霊長類であり、より好ましくはヒトである。
【００３７】
本発明に用いる腫瘍細胞としては、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、尿管癌、肝癌、胆管癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、頭蓋咽頭癌、喉頭癌、舌癌、線維肉腫、粘膜肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、精上皮腫、ウィルムス腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫等の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に用いる腫瘍細胞は、好ましくは、上皮細胞由来の悪性腫瘍、即ち癌腫（カルシノーマ）細胞（例、大腸癌腫、乳癌腫、卵巣癌腫、結腸癌腫、扁平上皮癌腫）である。
【００３８】
「腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路」は、腫瘍細胞の分裂や増殖を促進させる方向に作用するシグナル伝達経路であり、腫瘍細胞の種類により様々である。腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路としては、例えば、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）シグナル伝達経路、PI3K-AKTシグナル伝達経路、JAK-STAT3等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３９】
「腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤」は、腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路内の特定の因子の活性化及び／又は活性を阻害することにより、該シグナル伝達経路を途中で遮断する化合物であり、好適には、該シグナル伝達経路内の特定の酵素の阻害剤である。該酵素は、キナーゼであり得る。MAPKシグナル伝達経路の阻害剤としては、MEK阻害剤、ERK阻害剤、Raf阻害剤等が知られているが、これらに限定されない。PI3K-AKTシグナル伝達経路の阻害剤としては、PI3K阻害剤、Akt阻害剤等が知られているが、これらに限定されない。
【００４０】
MEK阻害剤としては、トラメチニブ、コビメチニブ、ピマセルチブ、PD98059等が挙げられるが、これらに限定されない。MEK阻害剤は、好ましくは、トラメチニブ、コビメチニブ又はピマセルチブである。
【００４１】
「腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤に対する耐性」とは、当該阻害剤の反復使用によって薬効が低下し、当該阻害剤使用開始時の投与量では、使用開始時と同等の効果を得ることができないことをいう。
【００４２】
本発明の培養方法においては、腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤によるフィードバック機構により該阻害剤に対する耐性を獲得した腫瘍細胞が培養される。「シグナル伝達経路の阻害剤によるフィードバック機構」とは、シグナル伝達経路の阻害剤によって該シグナル伝達経路を遮断することにより、該シグナル伝達経路における該阻害剤の標的分子の上流に位置する増殖因子受容体又は該シグナル伝達経路とは異なるシグナル伝達経路が活性化されることをいう。腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤によるフィードバック機構により該阻害剤に対する耐性を獲得した腫瘍細胞に対して、当該阻害剤を投与しても、腫瘍細胞の増殖が阻害されないか、むしろ増殖が促進され得る。
【００４３】
腫瘍細胞が獲得した、腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤に対する耐性が、フィードバック機構によるものであることは、評価対象の腫瘍細胞を当該阻害剤で処理し、シグナル伝達経路における該阻害剤の標的分子の上流に位置する増殖因子受容体や、該シグナル伝達経路とは異なるシグナル伝達経路が活性化されたことを、該増殖因子受容体やシグナル伝達経路に関与する因子のリン酸化等を調べることにより、確認することができる。例えば、MEK阻害剤に対する耐性がフィードバック機構によるものであることは、評価対象の腫瘍細胞をMEK阻害剤で処理し、MAPKシグナル伝達経路の上流の増殖因子受容体であるEGFRやHER2のリン酸化や、MAPKシグナル伝達経路とは異なるシグナル伝達経路（例、PI3K-AKTシグナル伝達経路）に関与する因子のリン酸化を検出することにより、確認することができる。リン酸化された受容体やタンパク質の種類を同定することにより、フィードバック機構により活性化された増殖因子受容体やシグナル伝達経路の種類を同定することができる。
【００４４】
本発明の培養方法においては、腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤によるフィードバック機構により該阻害剤に対する耐性を獲得した腫瘍細胞を、
i）該阻害剤、及び
ii）該阻害剤によるフィードバック機構により活性化されたシグナル伝達経路の上流の増殖因子受容体のリガンド
を含有する、上記培地組成物I中で浮遊培養（好ましくは、静置浮遊培養）に付す。
【００４５】
腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤によるフィードバック機構により活性化されたシグナル伝達経路の上流の増殖因子受容体は、シグナル伝達経路における該阻害剤の標的分子の上流の増殖因子受容体、又は該阻害剤が阻害するシグナル伝達経路とは異なる腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の上流の増殖因子受容体であり得る。例えば、MAPKシグナル伝達経路の阻害剤（例、MEK阻害剤）によるフィードバック機構により活性化されたシグナル伝達経路の上流の増殖因子受容体は、MAPKシグナル伝達経路の上流の増殖因子受容体、又はMAPKシグナル伝達経路とは異なるシグナル伝達経路（例、PI3K-AKTシグナル伝達経路）の上流の増殖因子受容体であり得る。MAPKシグナル伝達経路の上流の増殖因子受容体としては、EGF受容体、HER2、FGF受容体、HGF受容体、PDGF受容体等が挙げられるが、これらに限定されない。PI3K-AKTシグナル伝達経路の上流の増殖因子受容体としては、EGF受容体、HER2、FGF受容体、HGF受容体、PDGF受容体等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
各増殖因子受容体のリガンドは、当業者に周知である。EGF受容体のリガンドはEGFである。HER2はEGFRと結合してヘテロ二量体を形成し、EGF刺激によるシグナル伝達を行う。
【００４７】
培地組成物I中に含有される、リガンドの濃度は、評価対象の腫瘍細胞の増殖を促進する濃度であり得る。リガンドの濃度は、該リガンド刺激によるインビトロ細胞増殖試験等において使用されている濃度を参照に、当業者であれば容易に設定することができる。例えば、リガンドとしてEGFを用いる場合、培地組成物中に含有されるEGF濃度は、通常、1〜1000 ng/ml、好ましくは5〜100 ng/mlである。
【００４８】
腫瘍細胞を浮遊培養する際には、細胞の培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養器材を用いて培養することが可能である。これらの培養基材は細胞低接着性であることが望ましい。細胞非接着性の培養容器としては、培養容器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないもの、あるいは培養容器の表面が、細胞との接着性を低減させる目的で人工的に処理されているものを使用できる。
【００４９】
機械的な制御のもと閉鎖環境下で細胞播種、培地交換、細胞画像取得、培養細胞回収を自動で実行し、pH、温度、酸素濃度などを制御しながら、高密度での培養が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。
【００５０】
培養する腫瘍細胞の形態や状態は、当業者が任意に選択することができる。その好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、腫瘍細胞が単一細胞の状態で培地組成物I中に分散した状態、癌細胞が担体表面上に接着した状態、腫瘍細胞が担体内部に包埋した状態、複数個の腫瘍細胞が集合し細胞凝集塊（スフェア（スフェロイド））を形成した状態等が挙げられる。腫瘍細胞は、好ましくは、単一細胞の状態で培地組成物I中に分散した状態、又は複数個の細胞が集合し細胞凝集塊（スフェア（スフェロイド））を形成した状態で、培地組成物I中で浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）される。即ち、好ましくは、腫瘍細胞を接着や包埋するための担体を用いない。これらの状態の内、細胞凝集塊（スフェア（スフェロイド））を形成した状態は、生体内環境に近い細胞−細胞間相互作用及び細胞構造体が再構築されており、細胞機能を長期的に維持したまま培養でき、また細胞の回収が比較的容易であるため、好ましい。スフェアの大きさは最大径の平均値として、500μm以下であることが好ましく、50〜100μmが最も好ましい。
【００５１】
細胞凝集塊（スフェア（スフェロイド））を形成させる方法は、特に制限は無く、当業者が適宜選択することができる。その例としては、細胞非接着表面を有する容器を用いた方法、ハンギングドロップ法、旋回培養法、3次元スキャフォールド法、遠心法、電場や磁場による凝集を用いた方法等が挙げられる。
【００５２】
培養組成物Iを用いてスフェアを形成させることもできる。例えば、スフェアは、目的とする腫瘍細胞を細胞分散用酵素処理により単一細胞として回収したのち、培養組成物I中に均一に分散させ、3日間乃至10日間静置して浮遊培養することにより調製される。ここで調製されたスフェアは、遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。
【００５３】
本発明の培養方法において腫瘍細胞を培養する際には、
i）腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤、及び
ii）該阻害剤によるフィードバック機構により活性化されたシグナル伝達経路の上流の増殖因子受容体のリガンド
を含有する、上記培養組成物Iに対して、別途調製した、該阻害剤によるフィードバック機構により該阻害剤に対する耐性を獲得した腫瘍細胞を添加し、均一に分散される様に混合すればよい。その際の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、スターラー、ヴォルテックスミキサー、マイクロプレートミキサー、振とう機等の機器を用いた混合が挙げられる。混合後は、得られた腫瘍細胞懸濁液を静置で培養してもよいし、必要に応じて培養液を回転、振とう或いは撹拌してもよい。その回転数と頻度は、当業者の目的に合わせて適宜設定すればよい。また、静置培養の期間において培地組成物の交換が必要となった際には、遠心やろ過処理を行うことにより腫瘍細胞と培地組成物を分離した後、新鮮な上記i）の阻害剤、及び上記ii）のリガンドを含有する培地組成物Iを腫瘍細胞に添加すればよい。或いは、遠心やろ過処理を行うことにより腫瘍細胞を適宜濃縮した後、上記i）の阻害剤、及び上記ii）のリガンドを含有する新鮮な培地組成物Iをこの濃縮液に添加すればよい。
【００５４】
一態様において、上記i）の阻害剤によるフィードバック機構により該阻害剤に対する耐性を獲得した接着性の腫瘍細胞の浮遊培養に際して、例えば、当該腫瘍細胞を継代培養から回収し、これを、単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散する。腫瘍細胞の分散は、適切な細胞解離液を用いて行われる。細胞解離液としては、例えば、EDTA；トリプシン、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。分散された接着性の腫瘍細胞を、上記i）の阻害剤、及び上記ii）のリガンドを含有する培地組成物I中に懸濁し、これを浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）する。培養物中、腫瘍細胞は、単一細胞の状態で、又はスフェアの状態で、培地組成物I中に浮遊しながら、増殖する。この培養においては、細胞非接着性培養器を用いることが好ましいが、その限りではない。
【００５５】
腫瘍細胞の培養期間は、特に限定されないが、通常1日以上、好ましくは3日以上、より好ましくは6日以上である。培養期間の上限は、理論的には無限であるが、腫瘍細胞の形質が変化してしまうのを避ける観点からは、例えば30日以内程度、好ましくは10日以内程度に留めておくことが好ましい。
【００５６】
腫瘍細胞を培養する際の温度は、通常25乃至39℃、好ましくは37℃である。CO2濃度は、通常、培養の雰囲気中、4乃至10体積％であり、好ましくは5体積％である。酸素濃度は、培養の雰囲気中、15〜50体積％であり、好ましくは20体積％である。
【００５７】
このような培養操作により、腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤によるフィードバック機構により該阻害剤に対する耐性を獲得した腫瘍細胞の、該阻害剤によるフィードバック機構により活性化されたシグナル伝達経路の上流の増殖因子受容体のリガンド刺激による増殖が、該阻害剤により促進され、該腫瘍細胞が増殖する。従って、本発明の培養方法は、腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤によるフィードバック機構により該阻害剤に対する耐性を獲得した腫瘍細胞の増殖方法とも捉えることが出来る。腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤によるフィードバック機構による腫瘍細胞の増殖を、腫瘍細胞の2D培養（単層培養）においては、インビトロにおいて再現が困難であったが、培地組成物Iを用いた浮遊培養を採用することにより、これをインビトロにおいて再現し得る。
【００５８】
（III）シグナル伝達経路阻害剤に対する腫瘍細胞の耐性を評価する方法
上述のように、本発明の培養方法を用いることにより、腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤によって誘導されるフィードバック機構による腫瘍細胞の増殖を、インビトロにおいて再現し得る。従って、本発明の培養方法を用いれば、該シグナル伝達経路阻害剤に対して腫瘍細胞が耐性であるか否かを評価することができる。即ち、本発明は以下の工程を含む、腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤に対する腫瘍細胞の耐性を評価する方法（以下、本発明の評価方法ともいう）をも提供するものである：
（1a）腫瘍細胞を、i）該阻害剤、及びii）該シグナル伝達経路における該阻害剤の標的分子の上流の増殖因子受容体又は該シグナル伝達経路とは異なるシグナル伝達経路の上流の増殖因子受容体のリガンドを含有する、培地組成物I中で浮遊培養に付すこと、
（2a）（1a）の浮遊培養における腫瘍細胞の増殖を測定すること、及び
（3a）（2a）において該阻害剤による腫瘍細胞の増殖促進が確認された場合、該腫瘍細胞は該阻害剤に耐性である可能性が高いと判断すること。
【００５９】
工程（1a）の浮遊培養は、上記本発明の培養方法に準じて実施することができる。i）の腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤は、任意のものを選択することができる。ii）の増殖因子受容体のリガンドは、i）で選択したシグナル伝達経路の阻害剤の種類に応じて、適宜選択される。例えば、i）のシグナル伝達経路の阻害剤として、MAPKシグナル伝達経路の阻害剤（例、MEK阻害剤）を選択した場合、ii）の増殖因子受容体のリガンドとして、EGF受容体リガンド（即ち、EGF）が選択され得る。
【００６０】
腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤により、フィードバック機構が誘導されているか否か、フィードバック機構により該阻害剤の標的分子の上流に位置する増殖因子受容体が活性化されているか否か、或いは、該阻害剤が標的とするシグナル伝達経路とは異なるシグナル伝達経路が活性化されているか否かについては、本発明の評価方法の実施前には不明であり得る。そこで、ii）の増殖因子受容体のリガンドとして、複数種類の増殖因子受容体のリガンドを採用し、各リガンドについて、（1a）の浮遊培養、及び（2a）の測定を実施してもよい。例えば、増殖因子受容体のリガンドのライブラリー（コレクション）を調製し、ライブラリー中の各リガンドについて、（1a）の浮遊培養、及び（2a）の測定を実施する。例えば、i）のシグナル伝達経路の阻害剤として、MAPKシグナル伝達経路の阻害剤（例、MEK阻害剤）を選択した場合、ii）の増殖因子受容体のリガンドとして、EGF受容体リガンド（即ち、EGF）を含む、複数種類の増殖因子受容体のリガンドを含む増殖因子受容体のリガンドのライブラリー（コレクション）を調製し、ライブラリー中の各リガンドについて、（1a）の浮遊培養、及び（2a）の測定を実施する。
【００６１】
増殖因子受容体のリガンドとしては、代表的には、上皮成長因子（Epidermal growth factor：EGF）、インスリン様成長因子（Insulin-like growth factor：IGF）、トランスフォーミング成長因子（Transforming growth factor：TGF／例：TGF-beta, TGF-alpha）、神経成長因子（Nerve growth factor：NGF）、脳由来神経栄養因子（Brain-derived neurotrophic factor：BDNF）、血管内皮細胞増殖因子（Vascular endothelial growth factor：VEGF／例：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E）、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-colony stimulating factor：G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor：GM-CSF）、血小板由来成長因子（Platelet-derived growth factor：PDGF／例、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D）、エリスロポエチン（Erythropoietin：EPO）、トロンボポエチン（Thrombopoietin：TPO）、線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor：例：FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-19、FGF-20、FGF-21、FGF-22、FGF-23）、肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor：HGF）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６２】
各リガンドが結合する増殖因子受容体の種類や、各増殖因子受容体がいずれのシグナル伝達経路の上流に位置するかについては、当業者に周知である。
【００６３】
ネガティブコントロールとして、腫瘍細胞を、i）の阻害剤を含有せず、ii）該シグナル伝達経路における該阻害剤の標的分子の上流の増殖因子受容体又は該シグナル伝達経路とは異なるシグナル伝達経路の上流の増殖因子受容体のリガンドを含有する、培地組成物I中で浮遊培養に付してもよい。ネガティブコントロールは、i）の阻害剤を含有しないこと以外は、工程（1a）と同一の培養条件で実施される。実験の精度、再現性の観点から、好適には、ネガティブコントロールは、工程（1a）と並行して実施される。
【００６４】
工程（2a）においては、工程（1a）の浮遊培養における腫瘍細胞の増殖を測定する。細胞増殖の測定方法は当業者に周知であり、例えば、WST試薬、ATP測定試薬等を用いた方法があるが、これに限定されない。生存細胞数を直接カウントしてもよい。
【００６５】
i）の阻害剤存在下で浮遊培養した腫瘍細胞の増殖を、該阻害剤の不在下で浮遊培養したネガティブコントロールと比較することが好ましい。増殖の比較は、好ましくは、統計学的有意差の有無に基づいて行なわれ得る。
【００６６】
そして、工程（2a）においてi）の阻害剤による腫瘍細胞の増殖促進が確認された場合、該腫瘍細胞はi）の阻害剤に耐性である可能性が高いと判断することができる。例えば、i）の阻害剤存在下で浮遊培養した腫瘍細胞の増殖が、ネガティブコントロールを上回った場合、i）の阻害剤は腫瘍細胞の増殖を促進したことになるので、該腫瘍細胞はi）の阻害剤に耐性である可能性が高いと判断することができる。該腫瘍細胞においては、i）の阻害剤によるフィードバック機構により、該阻害剤の標的分子の上流の増殖因子受容体又は該シグナル伝達経路とは異なるシグナル伝達経路が活性化し、ii）の増殖因子受容体リガンドに応答して細胞増殖が促進されたと判断することができる。ii）の増殖因子受容体のリガンドとして、複数種類の増殖因子受容体のリガンドを採用した場合、少なくとも1つの増殖因子受容体のリガンドを使用した際に、i）の阻害剤による腫瘍細胞の増殖促進が確認された場合、該腫瘍細胞はi）の阻害剤に耐性である可能性が高いと判断することができる。
【００６７】
一方、工程（2a）においてi）の阻害剤による腫瘍細胞の増殖促進が確認できない場合（例えば、i）の阻害剤による腫瘍細胞の増殖阻害が確認された場合）、該腫瘍細胞はi）の阻害剤に対して耐性ではなく、該阻害剤により殺傷できる可能性が高いと判断することができる。例えば、i）の阻害剤存在下で浮遊培養した腫瘍細胞の増殖が、ネガティブコントロールを下回った場合、i）の阻害剤は腫瘍細胞の増殖を阻害したことになるので、該腫瘍細胞はi）の阻害剤に対して耐性ではなく、該阻害剤により殺傷できる可能性が高いと判断することができる。該腫瘍細胞においては、少なくともii）の増殖因子受容体リガンドが結合する増殖因子受容体及びその下流のシグナル伝達経路が、i）の阻害剤によるフィードバック機構により活性化されている可能性が低いと判断することができる。
【００６８】
本発明の評価方法によれば、腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤に対して、腫瘍細胞が耐性を有するか否か、該阻害剤により腫瘍細胞が殺傷されるか否かを判断することができるので、腫瘍細胞として、腫瘍患者から単離された腫瘍細胞を用いることにより、該腫瘍患者に対する該阻害剤による治療の有効性を予測することができる。即ち、本発明は、以下の工程を含む、腫瘍患者に対する腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤による治療の有効性を予測する方法（以下、本発明の予測方法ともいう）を提供する：
（1b）腫瘍患者から単離された腫瘍細胞を、i）該阻害剤、及びii）該シグナル伝達経路における該阻害剤の標的分子の上流に位置する増殖因子受容体又は該シグナル伝達経路とは異なるシグナル伝達経路の上流の増殖因子受容体のリガンドを含有する、細胞又は組織を浮遊培養することが可能な液状の培地組成物中で浮遊培養に付すこと、
（2b）（1b）の浮遊培養における腫瘍細胞の増殖を測定すること、及び
（3b）（2b）において該阻害剤による腫瘍細胞の増殖促進が確認された場合、該腫瘍細胞は該阻害剤に耐性であり、該腫瘍患者に対する該阻害剤による治療が有効である可能性が低いと判断すること。
【００６９】
腫瘍患者からの腫瘍細胞の単離は、自体公知の方法により実施することができる。例えば、外科的手術やバイオプシーにより患者から摘出した腫瘍組織をコラゲナーゼ等の酵素により分散することにより、腫瘍細胞を単離することが出来る。
【００７０】
工程（1b）及び（2b）は、上述の本発明の評価方法の工程（1a）及び（2a）に準じて実施することができる。
【００７１】
工程（2b）においてi）の阻害剤による腫瘍細胞の増殖促進が確認された場合、該腫瘍細胞はi）の阻害剤に耐性であり、該腫瘍患者に対する該阻害剤による治療が有効である可能性が低いと判断することができる。例えば、i）の阻害剤存在下で浮遊培養した腫瘍細胞の増殖が、ネガティブコントロールを上回った場合、i）の阻害剤は腫瘍細胞の増殖を促進したことになるので、該腫瘍細胞はi）の阻害剤に耐性であり、該腫瘍患者に対する該阻害剤による治療が有効である可能性が低いと判断することができる。該腫瘍患者から単離した腫瘍細胞においては、i）の阻害剤によるフィードバック機構により、該阻害剤の標的分子の上流の増殖因子受容体又は該シグナル伝達経路とは異なるシグナル伝達経路が活性化し、ii）の増殖因子受容体リガンドに応答して細胞増殖が促進された可能性が高い。このようなケースで該腫瘍患者に対してi）の阻害剤を投与しても、かえって腫瘍細胞の増殖を促進してしまう可能性があるので、該腫瘍患者に対しては、i）の阻害剤による治療は行わず、i）の阻害剤以外の治療方法（例えば、i）の阻害剤が標的とするシグナル伝達経路以外の腫瘍細胞増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤による治療）を腫瘍患者に対して提案する。
【００７２】
一方、工程（2b）においてi）の阻害剤による腫瘍細胞の増殖阻害が確認された場合、該腫瘍細胞はi）の阻害剤に対して耐性ではなく、該腫瘍患者に対する該阻害剤による治療が有効である可能性が高いと判断することができる。例えば、i）の阻害剤存在下で浮遊培養した腫瘍細胞の増殖が、ネガティブコントロールを下回った場合、i）の阻害剤は腫瘍細胞の増殖を阻害したことになるので、該腫瘍細胞はi）の阻害剤に対して耐性ではなく、該腫瘍患者に対する該阻害剤による治療が有効である可能性が高いと判断することができる。このような場合、i）の阻害剤による治療を進め、該腫瘍患者に対して治療的有効量のi）の阻害剤を投与することにより、該腫瘍患者における腫瘍を治療することができる。本発明は、このような腫瘍の治療方法をも提供する。
【００７３】
また、一態様において、複数の腫瘍患者（腫瘍患者群）に対して、本発明の予測方法を実施し、i）の阻害剤による腫瘍細胞の増殖促進が確認された患者に対しては、i）の阻害剤による治療は行わず、i）の阻害剤以外の治療方法（例えば、i）の阻害剤が標的とするシグナル伝達経路以外の腫瘍細胞増殖に関与するシグナル伝達経路の阻害剤による治療）を腫瘍患者に対して提案する。一方、i）の阻害剤による腫瘍細胞の増殖阻害が確認された患者は、該阻害剤による治療が有効である可能性が高い患者として選別することができる。該患者に対して治療的有効量のi）の阻害剤を投与することにより、該腫瘍患者における腫瘍を治療することができる。本発明は、このような患者の選別方法をも提供する。
【００７４】
（III）項における各用語の定義は、特にことわりのない限り、上記（I）及び（II）において記載したものと同一である。
【００７５】
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００７６】
以下に本発明の製造方法及び本発明の評価方法の実施例を具体的に述べることで、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例】
【００７７】
（試験例1：3次元培養におけるTrametinibとGefitinibのA431細胞増殖に対する効果）
脱アシル化ジェランガム（0.015 %(w/v)）を含むFCeM-D培地（日産化学工業社製、Cat. No. 387-06265）を用いて、10％（v/v）胎児ウシ血清を含むFCeM-D培地組成物を調製した。引き続き、3次元培養法では、ヒト皮膚癌由来細胞株A431（DSファーマバイオメディカル社製）を、37000 細胞/mLとなるように上記の10% FBS-FCeM-D培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃3474）のウェルに1ウェル当たり135 μLになるように分注した。プレートはCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度30 ng/mlになるように、10倍濃度のヒトEGF（PEPROTECH社製）とEGF受容体阻害剤であるGefitinib（Santa Cruz Biotechnology社製）、MEK阻害剤であるTrametinib（Santa Cruz Biotechnology社製）を含んだ10% FBS-FCeM-D培地組成物（3次元培養法）を15μLずつ添加し、引き続き培養を3日間継続した。4日目の培養液に対してATP試薬150 μL（CellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay, Promega社製）を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3（Molecular Devices社製）にて発光強度（RLU値）を測定し、培地のみの発光置を差し引くことで生細胞の数を測定した。
【００７８】
その結果、FCeM-D培地組成物を用いた3次元培養法を用いることで、MEK阻害剤であるTrametinibは0.001 μMという低い濃度からbell-shape様のA431細胞の増殖促進作用を示した。一方、EGF受容体阻害剤であるGefitinibは増殖促進作用を示さなかった。3次元培養法におけるRLU値（ATP測定、発光強度）を表1に示す。
【００７９】
【表１】
2018186764.tif 000003
【００８０】
（試験例2：EGF刺激下におけるTrametinibの増殖促進効果に対する3次元培養法と2次元培養法の比較）
脱アシル化ジェランガム（0.015 %(w/v)）を含むFCeM-D培地（日産化学工業社製、Cat. No. 387-06265）を用いて、10％（v/v）胎児ウシ血清を含むFCeM-D培地組成物を調製した。引き続き、3次元培養法では、ヒト皮膚癌由来細胞株A431（DSファーマバイオメディカル社製）を、37000 細胞/mLとなるように上記の10%FBS-FCeM-D培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃3474）のウェルに1ウェル当たり135 μLになるように分注した。一方、2次元培養法では、細胞/mLとなるように上記の10％（v/v）胎児ウシ血清を含むDMEM培地（WAKO社製）に播種した後、96ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃3585）のウェルに1ウェル当たり135 μLになるように分注した。プレートはCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度30 ng/mlになるように、10倍濃度のヒトEGF（PEPROTECH社製）とMEK阻害剤であるTrametinib（Santa Cruz Biotechnology社製）を含んだ10% FBS-FCeM-D培地組成物（3次元培養法）あるいは10% FBS-DMEM（2次元培養法）を15 μLずつ添加し、引き続き培養を3日間継続した。4日目の培養液に対してATP試薬150 μL（CellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay, Promega社製）を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3（Molecular Devices社製）にて発光強度（RLU値）を測定し、培地のみの発光置を差し引くことで生細胞の数を測定した。
【００８１】
その結果、FCeM-D培地組成物を用いた3次元培養法を用いることで、MEK阻害剤であるTrametinibは0.001 μMという低い濃度からbell-shape様のA431細胞の増殖促進作用を示した。一方、2次元培養法では促進傾向を示さなかった。3次元培養法におけるRLU値（ATP測定、発光強度）の％Control値を表2に、2次元培養法におけるRLU値（ATP測定、発光強度）の％Control値を表3に示す。
【００８２】
【表２】
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【００８３】
【表３】
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【００８４】
（試験例3：3次元培養におけるTrametinibのA431細胞増殖に対する各増殖因子併用効果）
脱アシル化ジェランガム（0.015 %(w/v)）を含むFCeM-D培地（日産化学工業社製、Cat. No. 387-06265）を用いて、10％（v/v）胎児ウシ血清を含むFCeM-D培地組成物を調製した。引き続き、3次元培養法では、ヒト皮膚癌由来細胞株A431（DSファーマバイオメディカル社製）を、37000 細胞/mLとなるように上記の10%FBS-FCeM-D培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃3474）のウェルに1ウェル当たり135 μLになるように分注した。プレートはCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度30 ng/mlになるように、10倍濃度のヒトEGF（PEPROTECH社製）あるいは、10倍濃度のヒトFGF2（PEPROTECH社製）あるいは10倍濃度のヒトTGF-beta（PEPROTECH社製）とMEK阻害剤であるTrametinib（Santa Cruz Biotechnology社製）を含んだ10% FBS-FCeM-D培地組成物（3次元培養法）を15 μLずつ添加し、引き続き培養を3日間継続した。4日目の培養液に対してATP試薬150 μL（CellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay, Promega社製）を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3（Molecular Devices社製）にて発光強度（RLU値）を測定し、培地のみの発光置を差し引くことで生細胞の数を測定した。
【００８５】
その結果、FCeM-D培地組成物を用いた3次元培養法とEGF刺激条件下において、MEK阻害剤であるTrametinibはbell-shape様のA431細胞の増殖促進作用を示した。一方、FGF2との共存下ではTrametinibの増殖促進効果を認めず、TGF-betaとの共存下ではむしろ増殖抑制作用を示した。EGF共存におけるRLU値（ATP測定、発光強度）を表4に、FGF2共存におけるRLU値（ATP測定、発光強度）を表5に、TGF-beta共存におけるRLU値（ATP測定、発光強度）を表6に示す。
【００８６】
【表４】
2018186764.tif 000006
【００８７】
【表５】
2018186764.tif 000007
【００８８】
【表６】
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【００８９】
（試験例4：3次元培養におけるA431細胞増殖に対する各MEK阻害剤の効果）
脱アシル化ジェランガム（0.015 %(w/v)）を含むFCeM-D培地（日産化学工業社製、Cat. No. 387-06265）を用いて、10 ％（v/v）胎児ウシ血清を含むFCeM-D培地組成物を調製した。引き続き、3次元培養法では、ヒト皮膚癌由来細胞株A431（DSファーマバイオメディカル社製）を、37000細胞/mLとなるように上記の10 %FBS-FCeM-D培地組成物に播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃3474）のウェルに1ウェル当たり135 μLになるように分注した。プレートはCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養した。培養1日目に、終濃度30 ng/mlになるように、10倍濃度のヒトEGF（PEPROTECH社製）と各MEK阻害剤；Trametinib（Santa Cruz Biotechnology社製）、Cobimetinib（Santa Cruz Biotechnology社製）、Pimasertib（Santa Cruz Biotechnology社製）を含んだ10%FBS-FCeM-D培地組成物（3次元培養法）を15 μLずつ添加し、引き続き培養を3日間継続した。4日目の培養液に対してATP試薬150 μL（CellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay, Promega社製）を添加し縣濁させ、約10分間室温で静置した後、FlexStation3（Molecular Devices社製）にて発光強度（RLU値）を測定し、培地のみの発光置を差し引くことで生細胞の数を測定した。
【００９０】
その結果、FCeM-D培地組成物を用いた3次元培養法とEGF刺激条件下において、MEK阻害剤であるCobimetinibおよびPimasertibはA431細胞の増殖促進作用を示した。TrametinibにおけるRLU値（ATP測定、発光強度）を表7に、CobimetinibにおけるRLU値（ATP測定、発光強度）を表8に、PimasertibにおけるRLU値（ATP測定、発光強度）を表9に示す。
【００９１】
【表７】
2018186764.tif 000009
【００９２】
【表８】
2018186764.tif 000010
【００９３】
【表９】
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【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明によれば、腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達の阻害剤によるフィードバック機構により誘導される腫瘍細胞増殖を、インビトロで再現することができる。本発明の培養方法を用いることにより、フィードバック機構による腫瘍細胞増殖を誘導する可能性がある腫瘍細胞の増殖に関与するシグナル伝達の阻害剤を選択し得る。例えば、腫瘍患者からバイオプシーにより腫瘍細胞を摘出し、本発明の培養方法により、種々のシグナル伝達阻害剤で処理することにより、フィードバック機構による腫瘍細胞増殖を誘導してしまうリスクの高いシグナル伝達阻害剤と、当該リスクの低いシグナル伝達阻害剤とを選別し、当該リスクの高いシグナル伝達阻害剤を治療に使用する医薬の候補から除外することにより、腫瘍患者に対して、効果的な治療戦略を提供し得ることが期待できる。