(57)【要約】      （修正有）【課題】血管形成に起因する癌及び／又は眼疾患を治療するための組換え融合タンパク質を提供する。【解決手段】血管内皮成長因子（ＶＥＧＦＲ）及び／又は胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）に結合する融合タンパク質に関する。該融合タンパク質は、（ａ）２つの重鎖がジスルフィド結合によって連結されている、ＩｇＧ１のＦｃドメイン、及び（ｂ）４つのＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリンドメイン２、ここで２つの免疫グロブリンドメイン２は（ａ）のＦｃドメインの各重鎖に連続して融合されている、を含む。融合タンパク質は、細胞移動及び細胞浸潤を阻害する優れた活性を有し、様々な癌腫及び線維芽細胞に対して非常に強化された成長阻害効果を有する。従って、本発明の融合タンパク質は、癌又は眼疾患を治療するための薬剤の調製に使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）２つの重鎖がジスルフィド結合によって連結されている、ＩｇＧ１のＦｃドメイン；及び
（ｂ）４つのＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリンドメイン２、
を含む、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合する免疫グロブリン様ドメインの融合タンパク質であって、
１つの前記ＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリンドメイン２及びもう１つの前記ＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリンドメイン２が、（ａ）のＦｃドメインの各重鎖に連続して融合されている、融合タンパク質。
【請求項２】
（ａ）２つの重鎖がジスルフィド結合によって連結されている、ＩｇＧ１のＦｃドメイン；及び
（ｂ）４つのＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリンドメイン２
を含む融合タンパク質をコードする単離された核酸分子であって、
１つの前記ＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリンドメイン２（配列番号１）及びもう１つの前記ＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリンドメイン２（配列番号１）が、（ａ）のＦｃドメインの各重鎖（配列番号２）に連続して融合されており、
前記単離された核酸分子が、前記Ｆｃドメインをコードする核酸配列、及び４つの前記ＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリンドメイン２をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項３】
請求項２に記載の単離された核酸分子を含む、組換え発現ベクター。
【請求項４】
ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＹＥｐ（酵母エピソーム型プラスミド）、ＹＩｐ（酵母組込み型プラスミド）及び組換えウイルスからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項３に記載の組換え発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の前記組換え発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
細菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳動物細胞からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
ＶＥＧＦに結合する免疫グロブリン様ドメインの融合タンパク質を産生する方法であって、
（ａ）ポリペプチド産生のための条件下で請求項５から請求項７のいずれか一項に記載の宿主細胞をインキュベートするステップと；
（ｂ）上記（ａ）で産生されたポリペプチドを回収するステップと
を含む、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法に従って産生された、免疫グロブリン様ドメインの融合タンパク質。
【請求項１０】
薬理活性成分としての請求項１に記載の融合タンパク質及び医薬的に許容される賦形剤を含む、血管形成性腫瘍を治療するための医薬組成物。
【請求項１１】
前記腫瘍が、大腸癌、膵臓癌、直腸癌、胃癌、腎臓癌、前立腺癌、子宮肉腫、白血病又は皮膚癌である、請求項１０に記載の血管形成性腫瘍を治療するための医薬組成物。
【請求項１２】
薬理活性成分としての請求項１に記載の融合タンパク質及び医薬的に許容される賦形剤を含む、血管形成性眼疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項１３】
前記眼疾患が、老人性黄斑変性症、滲出性老人性黄斑変性症、脈絡膜新生血管、病的近視、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜血管閉塞、未熟児網膜症又は血管形成神経膠腫である、請求項１２に記載の血管形成性眼疾患を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌又は眼疾患を治療するための薬剤の調製に使用される血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）融合タンパク質に関する。本発明の融合タンパク質は、多価二重特異的抗体であって、ＶＥＧＦＲ細胞外ドメインが、免疫グロブリン様ドメインのＦｃ領域に融合されている。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、脈管形成及び血管形成の両方を増進するのに重要な役割を果たすシグナル伝達タンパク質である。ＶＥＧＦは、血液循環が不十分である場合に、組織に対する酸素を回復させ、供給する系の一部として機能する。ＶＥＧＦの周知の機能は、胚発生の間に、負傷した部位、運動後の筋肉、及び閉塞血管を迂回する血管の形成において新しい血管を作ることである。
【０００３】
しかしながら、ＶＥＧＦの量の増加は、異常な血管形成を引き起こす場合がある。特に、血管形成は、原発性又は転移性腫瘍生成に関与するように腫瘍発生に関連する。更に、癌転移は、原発性の癌細胞が血管形成によって血管に導入される場合に起こる。血管形成は、例えば、喘息、呼吸困難、子宮内膜症；急性及び慢性炎症、例えば、アテローム性動脈硬化症及び組織水腫；感染症、例えば、肝炎及びカポジ肉腫；自己免疫疾患、例えば、糖尿病、乾癬、関節リウマチ及び甲状腺炎；並びに糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、血管線維腫を含めた他の疾患等を引き起こすと報告されている（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．ｙ  Ｊａｉｎ，ＲＫ．２０００年  Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：２４９〜２５７頁；Ｋｕｗａｎｏ  Ｍら、２００１年  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  ４０：５６５〜５７２頁）。
【０００４】
血管形成に重要な役割を果たすＶＥＧＦは、血管内皮細胞に主に影響を及ぼす。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験によれば、ＶＥＧＦは、内皮細胞の分裂及び遊走を刺激し、同様に毛細管の透過性を増加させる。
【０００５】
哺乳動物において、ＶＥＧＦは、５つの型、例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ及びＰＩＧＦ（胎盤成長因子）に分類される。ＶＥＧＦ−Ａは、血管形成、内皮細胞遊走、分裂、血管管腔形成、マクロファージ及び顆粒球の化学走性、並びに血管伸張を刺激する。ＶＥＧＦ−Ｂは、胚血管形成、特に、心筋組織の発生を増進させる。ＶＥＧＦ−Ｃは、リンパ血管形成を促進し、ＶＥＧＦ−Ｄは、肺細気管支を取り囲むリンパ管の成長に必要である。更に、ＰＩＧＦは、脈管形成、虚血、炎症、損傷の回復及び癌における血管形成に重要である。
【０００６】
ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）、即ちリガンドがＶＥＧＦである受容体は、３つのサブタイプ（ＶＥＧＦＲ１（ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ２（Ｋｄｒ／ｆｌｋ−１）及びＶＥＧＦＲ３（ｆｌｔ−４））からなり、遺伝子の選択的スプライシングによって膜結合型ＶＥＧＦＲ（ｍｂＶＥＧＦＲ）又は可溶性ＶＥＧＦＲ（ｓＶＥＧＦＲ）の形態で存在する。
【０００７】
ＶＥＧＦＲは、通常内皮細胞に見られるが、ニューロン、カポジ肉腫及び造血幹細胞において発現されるＶＥＧＦがＶＥＧＦＲに結合すると、シグナルは、受容体の二量体化及び受容体チロシン残基のリン酸化によって転送される。
【０００８】
ＶＥＧＦは、高い親和性でＶＥＧＦの受容体であるＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２に結合し、主にＶＥＧＦＲ２を介してシグナルを転送し、内皮細胞の成長及び移動を含む血管形成の機序を誘導する。
【０００９】
従って、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ２は、ＶＥＧＦによって誘導される血管形成を阻害又は抑制するための標的として研究されてきた（Ｅｌｌｉｓ及びＨｉｃｋｌｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、８：５７９頁、２００８年；Ｙｏｕｓｓｏｕｆｉａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：５５４４ｓ、２００７年）。
【００１０】
先行する研究に報告されている二重特異的抗体又は多重特異的抗体には、ｉ）ＶＥＧＦＲ１ドメイン２、ＶＥＧＦＲ２ドメイン３、ドメイン４及びＩｇＧ１Ｆｃからなるコンバセプト、ｉｉ）ＶＥＧＦＲ１ドメイン２、ＶＥＧＦＲ２ドメイン３及びＩｇＧ１ＦｃからなるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（アフリベルセプト）並びにｉｉｉ）ＶＥＧＦＲ１ドメイン２、ドメイン３及びＩｇＧ１ＦｃからなるＶＥＧＦ−Ｇｒａｂがある。
【００１１】
本発明者らは、血管形成を抑制又は阻害することによって癌及び眼疾患を治療するための多重特異的抗体を開発することを熱心に研究し、驚くべきことに、本発明の免疫グロブリン様ドメインの融合タンパク質構築物が、高い感度及び特異性の両方でＶＥＧＦ−Ａ及びＰｌＧＦに結合し、様々な腫瘍の増殖、成長及び／又は血管形成を阻害する有意に優れた効果を有することを見出した。
【００１２】
本明細書で引用した特許、公開されている出願及び文献の全ての教義を、全体として参照により組み込む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、本発明の目的は、血管形成に起因する癌及び／又は眼疾患を治療するための組換え融合タンパク質を提供することである。
【００１４】
本発明のもう一つの目的は、核酸、核酸を含む組換えベクター及び組換えベクターを発現するための宿主細胞を提供することである。
【００１５】
本発明のもう一つの目的は、宿主細胞によって発現される組換え融合タンパク質を含む医薬組成物を提供して、癌及び／又は眼疾患を予防又は治療することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
技術的な問題を解決するために、本発明は、４価の多重特異的抗体のＶＥＧＦＲ融合タンパク質を提供する。免疫グロブリン様ドメインの組換え融合タンパク質である本発明の融合タンパク質は、（ａ）２つの重鎖がジスルフィド結合によって連結されている、ＩｇＧ１のＦｃドメイン、及び（ｂ）４つのＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリンドメイン２を含み、２つの免疫グロブリンドメイン２は（ａ）のＦｃドメインの各重鎖に連続して融合されている。
【００１７】
更に、本発明は、前記組換え融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１８】
更に、本発明は、前記核酸分子を含む、組換え発現ベクターを提供する。
【００１９】
本発明の一実施形態において、前記組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞が提供される。組換え発現ベクターを宿主細胞に挿入して、形質転換細胞を産生する。組換え発現ベクター用として適当な宿主細胞は、原核生物、例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス属、シュードモナス属、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）属又はブドウ球菌属であり得る。
【００２０】
加えて、適当な宿主細胞は、例えば、真菌、例えば、アスペルギルス属；酵母、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）属、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母属及びアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；他の下等な真核生物細胞；並びに高等な真核生物細胞、例えば、昆虫細胞を含めた真核生物細胞であり得る。加えて、真核生物細胞は、植物細胞又は哺乳動物細胞であってもよく、ＣＯＳ７細胞（サル腎培養細胞）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、Ｗ１３８細胞、ＢＨＫ細胞（ベビーハムスター腎臓細胞）、ＭＤＣＫ細胞、多発性骨髄腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞及びＨＥＫ２９３細胞が、発現に使用され得るのが好ましい。
【００２１】
本発明において、宿主細胞形質転換の方法は、生物、細胞、組織又は器官に核酸を導入するステップを含むが、最適な方法は宿主細胞に従って選択され得る。利用可能な形質転換方法には、例えば電気穿孔法、プロトプラスト融合、ＣａＰＯ４沈殿、ＣａＣｌ２沈殿、炭化ケイ素線維攪拌、アグロバクテリウム媒介形質転換、及びＰＥＧ、硫酸デキストラン、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）並びに乾燥／阻害媒介形質転換がある。
【００２２】
本発明の融合タンパク質を発現させるには、組換え発現ベクター及び宿主細胞の様々な組合せを使用することができる。真核生物細胞に好ましい発現ベクターは、これらに限定されないが、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス及びレトロウイルス由来の遺伝子発現調節配列を含む。
【００２３】
細菌宿主に使用できる発現ベクターは、細菌プラスミド、例えば、大腸菌から得られるｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びその派生物；広宿主範囲を有するプラスミド、例えば、ＲＰ４；様々なファージλ派生物によって例証されているファージＤＮＡ、例えば、λｇｔ１０、λｇｔ１１及びＮＭ９８９；他のＤＮＡファージ、例えば、Ｍ１３及び繊維状一本鎖ＤＮＡファージを含む。酵母細胞で利用可能な発現ベクターは、プラスミド及びその派生物であることができる。昆虫細胞用の発現ベクターには、ｐＶＬ９４１がある。従って、本発明において、組換え発現ベクターは、プラスミド、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＹＥｐ（酵母エピソーム型プラスミド）、ＹＩｐ（酵母組込み型プラスミド）又は組換えウイルスであることができる。
【００２４】
本発明の一実施形態において、ＶＥＧＦＲ融合タンパク質を産生する方法が提供される。本方法は、（ａ）融合ポリペプチド産生のための条件下で宿主細胞をインキュベートするステップと、（ｂ）産生された融合ポリペプチドを回収するステップとを含む。宿主細胞は、融合ポリペプチドをコードする核酸配列が発現調節配列に作動可能に連結されている組換え発現ベクターを有する。
【００２５】
融合ポリペプチドは、原核生物又は真核生物発現系において（ａ）第１のＶＥＧＦＲ１免疫グロブリン様ドメイン２；（ｂ）第２のＶＥＧＦＲ１免疫グロブリン様ドメイン２；及び（ｃ）ヒトＩｇＧのＦｃ領域ポリペプチド、をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを使用して発現させ得る。得られた融合ポリペプチドは、生物学的に安定したタンパク質を産生する従来通りの方法によって精製することができる。例えば、透析、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィ）、及びＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）をこの目的に使用できるが、これらに限定されない。
【００２６】
更に、本発明は、上記の方法によって調製されるＶＥＧＦＲ融合タンパク質を提供する。本明細書の実施例２〜４によれば、本発明の融合タンパク質は、アフリベルセプト及びベバシズマブと比較して、標的リガンド、ＶＥＧＦ−Ａ及びＰＩＧＦに対する結合親和性が有意に増大した。更に、実施例５によれば、ＶＥＧＦ関連疾患の治療を必要とする対象に本発明の融合タンパク質（ＫＰ−ＶＲ２）を投与した場合に、融合タンパク質（ＫＰ−ＶＲ２）は高い感度及び選択性でＶＥＧＦに結合するので、融合タンパク質（ＫＰ−ＶＲ２）は、抗ＶＥＧＦとして使用することができる。更に、実施例６によれば、融合タンパク質（ＫＰ−ＶＲ２）は、アフリベルセプトと類似の薬物速度論プロファイルを有し、従って、融合タンパク質（ＫＰ−ＶＲ２）は、市販の抗ＶＥＧＦにとって代わる又は市販の抗ＶＥＧＦと併用して使用することができる。従って、本発明の融合タンパク質は、腫瘍を治療するための医薬組成物及び眼における血管形成に起因する眼疾患を治療するための医薬組成物を提供する。
【００２７】
本発明において、血管形成に関連する眼疾患は、例えば、加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）、滲出性加齢性黄斑変性、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、脈絡膜脈管障害、病的近視、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜血管閉塞、未熟児網膜症（ＲＯＰ）及び血管新生緑内障（ＮＶＧ）を含む。更に、脈絡膜新生血管は、近視ＣＮＶ、外傷ＣＮＶ、ブドウ膜炎によるＣＮＶ、眼性ヒストプラスマ症、又は特発性脈絡膜新生血管であり得る。
【００２８】
更に、実施例７によれば、本発明の融合タンパク質は、より低濃度でヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及びＥａ−ｈｙ９２６（ヒト内皮雑種細胞株）の移動及び浸潤をより効率的に阻害又は抑制する。これは、内皮細胞の脈管形成の進行に細胞の移動及び浸潤が重要なことから、融合タンパク質が、癌及び血管形成性眼疾患を含む疾患を治療するのに有効な血管形成阻害薬剤として使用され得ることを示唆する。
【００２９】
更に、実施例８〜１０は、融合タンパク質（ＫＰ−ＶＲ２）が、ヒト由来の様々な癌腫及び線維芽細胞株に対する阻害活性並びにヌードマウスにおけるヒト由来の様々な癌腫及び線維芽細胞株の異種移植片に対する阻害活性を有することを支持する。
【００３０】
一実施形態において、本発明の融合タンパク質によって治療できる腫瘍は、例えば、類上皮腫、頭頸部の扁平上皮腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺癌、乳癌、肺癌（小細胞肺癌及び非小細胞肺癌を含む）、膵臓癌、甲状腺癌、卵巣癌、肝臓癌、カポジ肉腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の増殖異常（神経芽細胞腫、毛細管癌、髄膜腫及び脳転移）、黒色腫、腎臓癌、消化管腫瘍、横紋筋肉腫（ＲＭＳ）、神経芽細胞腫、平滑筋肉腫等を含む。
【００３１】
本発明の医薬組成物は、治療しようとする疾患に従って、他の治療と別々に投与してもよいし、又は他の治療と同時に若しくは逐次的に併用して投与してもよい。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、緩衝液、安定剤又は当業技術の専門家に周知の薬学的に許容される担体又は他の材料を含むことができる。これらの材料は、無毒性であり、活性成分の薬理効果と干渉せず、また相互作用もせず、活性成分の厳密な特性は、投与経路、例えば、経口、粘膜及び非経口（例えば、静脈内）によって決まり得る。本発明の融合タンパク質は、０．００１〜５ｍｇ／片眼、又は１〜１０ｍｇ／ｋｇの量で注射することができる。
【発明の効果】
【００３２】
４価の抗体である本発明のＶＥＧＦＲは、免疫グロブリン様ドメインの融合タンパク質であり、（ａ）２つの重鎖がジスルフィド結合によって連結されている、ＩｇＧ１のＦｃドメイン、及び（ｂ）４つのＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリンドメイン２を含み、２つの免疫グロブリンドメイン２は（ａ）のＦｃドメインの各重鎖に連続して融合されている。本発明のＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦ及びＰＩＧＦに対する結合親和性が有意に強化されており、内皮細胞の移動及び浸潤に対する優れた阻害活性を有し、様々な癌並びに線維芽細胞の成長及び増殖を阻害する。従って、融合タンパク質は、血管形成に起因する癌及び眼疾患を治療するための医薬品の開発に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の融合タンパク質及び先行技術の他の融合タンパク質を含めた融合タンパク質構築物を例示する図である。
【図２ａ】アフリベルセプト及び本発明のＫＰ−ＶＲ２（ＶＥＧＦＲ融合タンパク質）の構造を例示する図である。
【図２ｂ】アフリベルセプト及び本発明のＫＰ−ＶＲ２（ＶＥＧＦＲ融合タンパク質）の構造を例示する図である。
【図３】アフリベルセプト及び本発明のＫＰ−ＶＲ２（ＶＥＧＦＲ融合タンパク質）の構造を例示する図である。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによって確認したＫＰ−ＶＲ２融合タンパク質の分子量を示す図である。
【図５】ＶＥＧＦ−Ａ１６５又はＶＥＧＦ−Ａ１２１に対する本発明の融合タンパク質、アフリベルセプト及びベバシズマブの結合親和性を示す図である。
【図６】ＰＩＧＦに対する本発明の融合タンパク質、アフリベルセプト及びベバシズマブの結合親和性を示す図である。
【図７】融合タンパク質又はアフリベルセプトとＶＥＧＦ−Ａ１６５との最大結合相互作用を示す図である。
【図８ａ】融合タンパク質の投与経路に応じた薬物速度論プロファイルをアフリベルセプトと比較して示す図である。
【図８ｂ】融合タンパク質の投与経路に応じた薬物速度論プロファイルをアフリベルセプトと比較して示す図である。
【図９ａ】ＨＵＶＥＣ浸潤に対する本発明の融合タンパク質、アフリベルセプト及びベバシズマブの効果を示す図である。
【図９ｂ】ＨＵＶＥＣ浸潤に対する本発明の融合タンパク質、アフリベルセプト及びベバシズマブの効果を示す図である。
【図１０ａ】Ｅａ−ｈｙ９２６移動に対する本発明の融合タンパク質、アフリベルセプト及びベバシズマブの効果を示す図である。
【図１０ｂ】Ｅａ−ｈｙ９２６移動に対する本発明の融合タンパク質、アフリベルセプト及びベバシズマブの効果を示す図である。
【図１１ａ】９つ（９）の癌腫の増殖を阻害する本発明の融合タンパク質の能力をアフリベルセプトと比較して示す図である。
【図１１ｂ】９つ（９）の癌腫の増殖を阻害する本発明の融合タンパク質の能力をアフリベルセプトと比較して示す図である。
【図１２】抗ＶＥＧＦ抵抗性癌腫及び線維芽細胞の細胞生存度に対する本発明の融合タンパク質の阻害能力をアフリベルセプトと比較して示す図である。
【図１３】抗ＶＥＧＦ抵抗性癌腫及び線維芽細胞の細胞生存度に対する本発明の融合タンパク質の阻害能力をアフリベルセプトと比較して示す図である。
【図１４】ヒト癌モデル（ＨＴ−２９、ＬＯＶＯ及びＳＫＵＴ１Ｂ）における腫瘍成長及び腫瘍重量の比較を表す図である。
【図１５ａ】ヒト癌モデル（ＨＴ−２９、ＬＯＶＯ及びＳＫＵＴ１Ｂ）における腫瘍成長及び腫瘍重量の比較を表す図である。
【図１５ｂ】ヒト癌モデル（ＨＴ−２９、ＬＯＶＯ及びＳＫＵＴ１Ｂ）における腫瘍成長及び腫瘍重量の比較を表す図である。
【図１６ａ】ヒト癌モデル（ＨＴ−２９、ＬＯＶＯ及びＳＫＵＴ１Ｂ）における腫瘍成長及び腫瘍重量の比較を表す図である。
【図１６ｂ】ヒト癌モデル（ＨＴ−２９、ＬＯＶＯ及びＳＫＵＴ１Ｂ）における腫瘍成長及び腫瘍重量の比較を表す図である。
【図１７ａ】ヒト癌モデル（ＨＴ−２９、ＬＯＶＯ及びＳＫＵＴ１Ｂ）における腫瘍成長及び腫瘍重量の比較を表す図である。
【図１７ｂ】ヒト癌モデル（ＨＴ−２９、ＬＯＶＯ及びＳＫＵＴ１Ｂ）における腫瘍成長及び腫瘍重量の比較を表す図である。
【図１８】ＫＰ−ＶＲ２用の組換え発現ベクターを示す図である。
【図１９】ＫＰ−ＶＲ３用の組換え発現ベクターを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、４価のＦｃ融合タンパク質、特に、Ｆｃ融合タンパク質を一般に目的とする。Ｆｃ融合タンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ断片と受容体のリガンド結合領域との融合によって通常は形成され、抗体のリガンド結合領域と類似の構造を有する。
【００３５】
多種多様な免疫接着分子が文献に示唆されている。しかしながら、本発明による免疫接着分子は、従来の免疫接着分子とは異なる構造を有しており、本発明による免疫接着分子の調製について予測又は説明している先行技術も存在しない。
【実施例】
【００３６】
以下の実施例によって、本発明を更に詳細に述べる。これらの実施例が、いかなる形であれ本発明を限定するものと解釈されるべきでないことが理解されよう。
【００３７】
実施例１：ＶＥＧＦＲ融合タンパク質ＫＰ−ＶＲ２の産生
ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインに融合されたヒトＶＥＧＦＲ２ドメイン３（ＫＰ−ＶＲ１）；ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン（配列番号２）に融合されたヒトＶＥＧＦＲ１ドメイン２（配列番号１）（ＫＰ−ＶＲ２）；ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインに融合されたヒトＶＥＧＦＲ２ドメイン３（配列番号３）及びＶＥＧＦＲ１ドメイン２（ＫＰ−ＶＲ３）；ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインに融合されたヒトＶＥＧＦＲ１ドメイン２及びＶＥＧＦＲ２ドメイン３（ＫＰ−ＶＲ４、アフリベルセプト）を、ｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にそれぞれクローニングした。
【００３８】
ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＫＰ−ＶＲ１、ＫＰ−ＶＲ２、ＫＰ−ＶＲ３及びＫＰ−ＶＲ４構築物それぞれでトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を、メトトレキセート及びピューロマイシンを使用して選択した。ＫＰ−ＶＲ２及びＫＰ−ＶＲ４（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ；アフリベルセプト；Ｅｙｌｅａ）を、プロテインＡ−セファロースアフィニティクロマトグラフィで精製した。精製したタンパク質をＨＰＬＣ分析によって定量化し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを逐次的に実行した。図１は、各構築物を示す。図３は、ウエスタンブロットの結果を表す。図３に示すように、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインに融合されたヒトＶＥＧＦＲ１ドメイン２（ＫＰ−ＶＲ２）は、約１２０ｋＤａのバンドサイズを有した。
【００３９】
実施例２：ＶＥＧＦ−Ａに対する本発明のＫＰ−ＶＲ２、アフリベルセプト及びベバシズマブの結合親和性の決定
ＶＥＧＦ−Ａに対する本発明のＫＰ−ＶＲ２、アフリベルセプト及びベバシズマブの結合親和性を、本実験で比較した。ＥＬＩＳＡアッセイを、ＢＥＶＡＣＩＺＵＭＡＢ  Ｓｕｍｍａｒｙ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  Ｒｅｐｏｒｔ（２０１４年２月２８日）に従って実施した。９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ）を、５０ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦＡ１６５（Ｉ）又はＶＥＧＦＡ１２１（ＩＩＩ）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングし、続いてＫＰ−ＶＲ２、ＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）又はアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（ベバシズマブ）を、０．０１２２〜１０００ｎｇ／ｍＬに量を段階的に増加させてウェルに添加した。次に、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＦｃ抗体と反応させた。続いて、３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液（Ｒｏｃｈｅ）を添加し、その後吸光度をＥＬＩＳＡリーダー（分光光度計、Ｂｉｏｒａｄ）を使用して４５０ｎｍで検出した。図５（Ｉ及びＩＩＩ）は、結果を示す。
【００４０】
更に、９６ウエルプレートを、２ｎＭ  ＫＰ−ＶＲ２又はＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）でコーティングし、続いて、ＶＥＧＦ１６５（ＩＩ）又はＶＥＧＦ１２１（ＩＶ）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を、０．０３１２５〜６４ｎＭに量を段階的に増加させて９６ウエルプレートに添加して、ＶＥＧＦ−Ａに対するＫＰ−ＶＲ２又はＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）の結合量を比較した。次に、プレートを洗浄し、抗ヒトＶＥＧＦ抗体と１時間反応させた。続いて、プレートを再び洗浄し、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヤギＩｇ抗体と反応させた。次に、３，３，５，５−テトラメチルベンジジン溶液を添加し、その後、吸光度をＥＬＩＳＡリーダー（分光光度計、Ｂｉｏｒａｄ）を使用して４５０ｎｍで検出した。図５（ＩＩ及びＩＶ）は、結果を示す。
【００４１】
実施例３：本発明のＫＰ−ＶＲ２、アフリベルセプト又はベバシズマブの、ＰｌＧＦ（胎盤成長因子）に対する中和活性の比較
ＥＬＩＳＡを実行して、ＰｌＧＦ（胎盤成長因子）に対する本発明のＫＰ−ＶＲ２、アフリベルセプト又はベバシズマブの結合親和性を検出した。９６ウエルプレートを、５０ｎｇ／ｍＬ  ＰｌＧＦ（Ｉ）でコーティングし、続いてＫＰ−ＶＲ２（０．０１２２〜１０００ｎｇ／ｍＬ）、ＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）（０．３９０６２５〜１６０００ｎｇ／ｍＬ）又はアバスチン（ベバシズマブ）（０．０１２２〜１０００ｎｇ／ｍＬ）を、量を段階的に増加させてウェルに添加した。続いて、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＦｃ抗体と反応させた。次に、３，３，５，５−テトラメチルベンジジン溶液を添加し、吸光度をＥＬＩＳＡリーダー（分光光度計、Ｂｉｏｒａｄ）を使用して４５０ｎｍで検出した。
【００４２】
更に、９６ウエルプレートを、４００ｎｇ／ｍＬ  ＫＰ−ＶＲ２又はＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）でコーティングし、続いて、ＰｌＧＦを０．８〜１２５００ｎｇ／ｍＬに量を増加させて９６ウエルプレートに添加して、ＰｌＧＦに対するＫＰ−ＶＲ２又はＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）の結合量を比較した。次に、プレートをビオチン化ＰＩＧＦ抗体と１時間反応させ、続いて洗浄した。その後、プレートをペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヤギＩｇ抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）と更に反応させた。次に、３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液を添加し、続いて吸光度をＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで検出した。
【００４３】
更に、９６ウエルプレートを、５０ｎｇ／ｍＬ  ＰｌＧＦでコーティングし、続いて、ＫＰ−ＶＲ２又はアフリベルセプトを、２〜３１２５０ｎｇ／ｍＬに量を段階的に増加させて９６ウエルプレートに添加して、ＰＩＧＦに対するＫＰ−ＶＲ２及びＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）の結合量を比較した。次に、プレートを洗浄し、抗ヒトＦｃ抗体と反応させた。その後、３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液（Ｒｏｃｈｅ）を添加し、吸光度をＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで検出した。図６（Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ）は、結果を示す。
【００４４】
図６（Ｉ）に示すように、ＰＩＧＦに対するＫＰ−ＶＲ２の力価は、ＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）と比較して約４２倍増加し、ＰＩＧＦに対するＫＰ−ＶＲ２の最大結合量は、ＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）と比較して約５４．３％増加した（図６（ＩＩ））。これらの結果は、ＫＰ−ＶＲ２が、ＰＩＧＦに対して有意に高い結合親和性を有することを支持する。一方で、本発明のＫＰ−ＶＲ２は、ＰＩＧＦに対してＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）と同程度の結合親和性を示した。
【００４５】
実施例４：ＫＰ−ＶＲ２のリガンド（ＶＥＧＦＡ１６５、ＶＥＧＦＡ１２１又はＰｌＧＦ）に対するＫＰ−ＶＲ２の融合タンパク質の全結合活性の比較
ＶＥＧＦＡ１６５、ＶＥＧＦＡ１２１又はＰｌＧＦに対するＫＰ−ＶＲ２及びＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）の結合活性をＥＬＩＳＡによって決定し、結果を以下の表１（ＶＥＧＦ及びＰＩＧＦに対するＫＰ−ＶＲ２及びアフリベルセプトの結合活性の比較）に示した。
【００４６】
【表１】
2018186822.tif 000002
【００４７】
表１に示すように、ＫＰ−ＶＲ２は、ＶＥＧＦＡに対してアフリベルセプトより約４５〜５５％高い結合親和性を有し、ＰＩＧＦに対してアフリベルセプトより約５５％高い結合親和性を有した。
【００４８】
実施例５：ＶＥＧＦ−Ａ１６５に対するＫＰ−ＶＲ２の融合タンパク質及びアフリベルセプトの結合親和性の比較
ＳＰＲ（表面プラスモン共鳴）を使用する結合親和性比較実験を、参考文献に従って実施した（Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ、ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ  ａｎｄ  ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２０１２年、１５（２）：１７１〜１８５頁）。最初に、ＳＰＲチップを、ＨＢＳＴ緩衝液（５０ｎＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｎＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で安定化し、続いてＳＰＲチップに１０００ＲＵ（共鳴単位）の密度になるようにプロテインＡを結合させた。チップを、１０ｍＭグリシン緩衝液を使用して洗浄し、残留した未結合のプロテインＡをチップから除去した。次に、ＫＰ−ＶＲ２、ＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）及びベバシズマブ（２ｎＭ）をそれぞれ添加し、チップに結合させた。ＶＥＧＦＡ１６５（０．５〜８ｎＭ）を、チップに流し入れた。結果を、図７及び表２に示した（ＶＥＧＦに対するＫＰ−ＶＲ２、ＫＰ−ＶＲ４及びＫＰ−ＶＲ３の結合親和性）。
【００４９】
【表２】
2018186822.tif 000003
【００５０】
図７に示すように、ＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）及びベバシズマブは、４ｎＭで最大結合値に達したが、ＫＰ−ＶＲ２の量は、ＶＥＧＦＡ１６５の濃度に比例して増加した。更に、表２に示すように、ＶＥＧＦ−Ａに対するＫＰ−ＶＲ２の最大結合値は約１２０ＲＵであり、ＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）及びベバシズマブ（アバスチン）の最大結合値は、それぞれ８７ＲＵ及び７５ＲＵであった。従って、本発明のＫＰ−ＶＲ２は、ＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）及びベバシズマブと比較して、ＶＥＧＦ−Ａに対する全結合活性を有意に増加させたことが確認された。
【００５１】
実施例６．ラットにおける本ＫＰ−ＶＲ２の薬物速度論プロファイル
ＶＲ−２及びＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）の薬物速度論プロファイルを評価するために、ラットを２つの群に分類した。１ｍｇ／ｋｇ  ＫＰ−ＶＲ２及び１ｍｇ／ｋｇ  ＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）を、一方の群のラットにｉ．ｖ．（静脈内）注射し、別の群のラットにｓ．ｃ．（皮下）注射した。
【００５２】
ｉ．ｖ．注射群に関しては、体重１８０〜２００ｇ、６週齢の雌ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットにＫＰ−ＶＲ２及びＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）それぞれを尾静脈注射して、０分、５分、１５分、４５分、３時間、５時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１６８時間後にラット頸静脈から血液を集め（ＶＥＧＦ−ＴＲＡＰ：Ａ  ＶＥＧＦ  ＢＩＯＣＫＥＲ  ＷＩＴＨ  ＰＯＴＥＮＴ  ＡＮＴＩ  ＴＵＭＯＲ  ＥＦＦＥＣＴＳ．ＰＮＡＳ．２００２年、９９（１７）：１３９３１１３９８）、その後注射した材料の変化量を評価した。次に、ｓ．ｃ．注射群に関しては、体重１８０〜２００ｇ、６週齢の雌ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットのラット頸部の背部にＫＰ−ＶＲ２及びＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）それぞれを注射して、０時間、１時間、２時間、４時間、６時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、２８時間、４８時間、９６時間、１６８時間、２４０時間及び３３６時間後にラット頸静脈から血液を集め、その後注射した材料の変化量を評価した。結果を図８に示した。図８ａ及び８ｂに示すように、ＫＰ−ＶＲ２は、ＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）と同程度のｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期及び薬物速度論プロファイルを示した。
【００５３】
実施例７：内皮細胞におけるＫＰ−ＶＲ２による細胞移動及び浸潤阻害の分析
実施例７−１．ＫＰ−ＶＲ２及びＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）でＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）を処理した後にＶＥＧＦ−Ａによって誘導される細胞浸潤阻害の検出
細胞移動を、トランスウェル系で化学走性運動性アッセイを使用することにより評価して、ＫＰ−ＶＲ２による内皮細胞の細胞移動及び浸潤を検出した。成長因子を減らしたマトリゲル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、トランスウェル系にコーティングし、続いて細胞浸潤を、浸潤アッセイを使用することにより決定した。細胞移動及び細胞浸潤アッセイの定量分析を以下の通り行った。トランスウェルの底部を０．１％ゼラチン１０μＬでコーティングし、２４時間乾燥させた。ＱＣＭ  ２４ウェル細胞浸潤アッセイキット（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を本実験に使用した。分離した細胞を、細胞浸潤アッセイ培地（内皮細胞基礎培地、ＥＢＭ、０．１％ＦＢＳ）で集めた。細胞数を５×１０４個細胞／３００μＬ細胞浸潤培地に調整し、細胞を各挿入物に播種した。６つのウェルを、０〜２００ｎＭ  ＫＰ−ＶＲ２、ＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）（Ｅｙｌｅａ、商標）又はベバシズマブ（アバスチン、商標）で処理した。６つのウェルにＶＥＧＦ（３５０ｎｇ／ｍＬ）を処理し、続いて３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後に、残留した細胞及び培地を除去し、挿入物を新しいウェルへ移動させた。次に、挿入物を細胞単離溶液２２５μＬに入れ、インキュベータ中で、３７℃で３０分間更にインキュベートした。
【００５４】
挿入物を攪拌して、残留している細胞を分離させた。その後、溶解緩衝液／色素溶液７５μＬを、細胞単離溶液と細胞の混合溶液に更に添加し、得られた溶液を室温に１５分間置いた。次に、溶液２００μＬを９６ウェルに移動し、５９５ｎｍの蛍光像を得た。結果を、図９ａ、９ｂ及び表３（ＫＰ−ＶＲ２による内皮細胞移動及び浸潤の阻害の分析）に示した。
【００５５】
【表３】
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【００５６】
図９ａ及び９ｂに示すように、ＶＥＧＦは、ＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ）において細胞移動及び浸潤を誘導したが、ＫＰ−ＶＲ２、ＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）及びベバシズマブは、誘導された細胞移動及び浸潤を阻害した。本発明のＫＰ−ＶＲ２は、同じ濃度（１３ｎＭ）でＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）及びベバシズマブより高い阻害活性を示した。更に、表３に示すように、ＫＰ−ＶＲ２、ＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）及びベバシズマブのＩＣ５０は、それぞれ約１１ｎＭ、２０ｎＭ及び２１ｎＭであり、これはＫＰ−ＶＲ２が、細胞浸潤に対して顕著な阻害活性を有することを説明する。
【００５７】
実施例７−２．ＫＰ−ＶＲ２、ＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）又はベバシズマブでＥＡ−ｈｙ９２６細胞株を処理した後にＶＥＧＦ−Ａによって誘導される細胞浸潤阻害の検出
ＥＡ−ｈｙ９２６細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２９２２（商標））（３．５×１０５個細胞／ｍＬ）を、９６ウエルプレートで０．１％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地  Ｓｉｇｍａ）に播種した。次に、プレートを、ＫＰ−ＶＲ２（１５００μｇ／ｍＬ）、ＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）（３０００μｇ／ｍＬ）及びベバシズマブ（３０００μｇ／ｍＬ）それぞれにより３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間処理した。陰性対照として、融合タンパク質で処理していない培地を使用した。結果を図１０ａ及び１０ｂに示した。図１０ａ及び１０ｂに示すように、本発明のＫＰ−ＶＲ２は、ＶＥＧＦによって誘導されるＥＡ−ｈｙ９２６細胞の成長及び増殖をＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）及びベバシズマブより低い濃度で非常に効果的に阻害した。
【００５８】
実施例８：ＫＰ−ＶＲ２とＫＰ−ＶＲ４の間の癌細胞増殖阻害能の比較
ＭＴＳ細胞増殖比色アッセイを、９種類の癌細胞株について実行して、癌細胞分裂に対するＫＰ−ＶＲ２の阻害能を決定した。表４は本実験で使用した９つの癌細胞株を示す。
【００５９】
【表４】
2018186822.tif 000005
【００６０】
９種類の癌細胞株、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８（商標））、ＬＯＶＯ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２９（商標））、ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４７（商標））、ＳＫＵＴ１ｂ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１１５（商標））、Ｃａｋｉ−１（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−４６（商標））、ＡＧＳ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７３９（商標））、Ｐａｎｃ０２０３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５５３（商標））、ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２８（商標））及びＰＣ−３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４３５（商標））を、３７℃、５％ＣＯ２条件でインキュベートして、最大の集密度に到達させた。次に、癌細胞株を取り出し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）に播種した（３×１０３個細胞／ウェル）。その後、細胞株を、３７℃で２４時間インキュベートした。次に、培地を、０．５％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）で置換した。その後、細胞株を、２、４又は６ｎＭのＫＰ−ＶＲ２又はＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）で処理し、７２時間更にインキュベートした。ＭＴＳ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）をプレートに添加し、吸光度を４９０ｎｍで検出した。結果を図１１ａ、図１１ｂ及び表５に示した。図１１ａ及び１１ｂに示すように、本発明のＫＰ−ＶＲ２は、本実験に利用したすべての癌株に対して有意に優れた細胞分裂阻害活性を示した。
【００６１】
【表５】
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【００６２】
更に、表５（細胞成長阻害活性）に開示されるように、本発明のＫＰ−ＶＲ２は、ＶＥＧＦ及びＰＩＧＦを標的とする９つの癌腫に対して非常に強化された細胞成長阻害効果を示した。
【００６３】
実施例９：抗ＶＥＧＦ抵抗性癌腫及び線維芽細胞株におけるＫＰ−ＶＲ２及びアフリベルセプトの細胞分裂阻害の活性の比較
ＭＴＳ細胞成長アッセイを、抗ＶＥＧＦＡ又は抗ＶＥＧＦＲに抵抗性の癌細胞及び線維芽細胞株に対して実行し、癌細胞分裂に対するＫＰ−ＶＲ２の阻害活性を評価した。表６は、本実験に使用した４種類の癌細胞株及び２種類の線維芽細胞株を示す。
【００６４】
【表６】
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【００６５】
４種類の癌細胞株、ＥＬ−４（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−３９（商標））、ＬＬＣ１（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−３９（商標））、Ｂ１６Ｆ１０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６４７５（商標））、ＣＴ−２６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６３８（商標））及びＰＣ−３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４３５（商標））；並びに線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３（ＫＣＬＢ  ２１６５８番）及びＨｓ２７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３４（商標））を、３７℃、５％ＣＯ２条件でインキュベートして、最大の集密度に到達させた。次に、癌及び線維芽細胞株を取り出し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）に播種した（３×１０３個細胞／ウェル）。その後、細胞株を、３７℃で２４時間インキュベートした。続いて、培地を、０．５％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）で置換し、細胞株をそれぞれ２、４又は６ｎＭのＫＰ−ＶＲ２又はＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）で処理した。その後、処理した細胞株を、７２時間更にインキュベートした。次に、ＭＴＳ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）をプレートに添加し、吸光度を４９０ｎｍで検出した。結果を、図１２、図１３及び表７（癌及び線維芽細胞株）に例示した。
【００６６】
【表７】
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【００６７】
図１２、１３及び表７に示すように、本発明のＫＰ−ＶＲ２は、癌細胞（実施例８を参照のこと）に対してだけでなく、抗ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ抵抗性癌細胞株（ＥＬ−４、ＬＬＣ１、Ｂ１６Ｆ１０及びＣＴ−２６）及び線維芽細胞株（Ｈｓ２７及びＮＩＨ３Ｔ３）に対しても、細胞成長阻害の有意に強化された活性を示した。
【００６８】
実施例１０：ヌードマウスにおけるＫＰ−ＶＲ２及びアフリベルセプトの腫瘍成長阻害の比較
様々な腫瘍異種移植片モデル（ＨＴ−２９、ＬＯＶＯ及びＳＫＵＴ１ｂ）をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスで利用してｉｎ  ｖｉｖｏ実験を実行し、それによりＫＰ−ＶＲ２の腫瘍成長阻害活性を評価した。
【００６９】
実験１０−１．ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＨＴ−２９の異種移植片
ＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８（商標））（５×１０６個細胞／０．２ｍＬ）を、ヌードマウス（Ｏｒｉｅｎｔ  ｂｉｏ、雌、４週齢）の背部の皮下に注射した。腫瘍の体積が、２００ｍｍ３より大きくなったら、ＫＰ−ＶＲ２（１ｍｇ／ｋｇ又は２ｍｇ／ｋｇ）及びＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）（２ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇ）それぞれをマウスの腹腔に週２回注射し、同量のＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を同時間及び同期間陰性対照マウスの腹腔に注射した。腫瘍の体積を３〜４日毎に測定し、結果を図１４に開示した。図１４に示すように、本発明のＫＰ−ＶＲ２は、ＨＴ−２９大腸癌細胞株に対し２ｍｇ／ｋｇの用量で、同量のアフリベルセプト（ＫＰ−ＶＲ４）と比較して約４０％増加した成長阻害活性を示した。更に、同程度の効果がＫＰ−ＶＲ２（１ｍｇ／ｋｇ）とアフリベルセプト（ＫＰ−ＶＲ４）（３ｍｇ／ｋｇ）の間に観察された。
【００７０】
実施例１０−２．ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＬＯＶＯの異種移植片
ＨＴ−２９細胞株の代わりにＬＯＶＯ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２９（商標））細胞株を使用して実施例１０−１と同じ実験を実行した。ＬＯＶＯ細胞株（５×１０６個細胞／０．２ｍＬ）を、ヌードマウス（Ｏｒｉｅｎｔ  ｂｉｏ、雌、４週齢）の背部の皮下に注射した。腫瘍の体積が、２００ｍｍ３より大きくなったら、ＫＰ−ＶＲ２（１ｍｇ／ｋｇ）及びＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）（１ｍｇ／ｋｇ）それぞれを、ヌードマウスの腹腔に週２回注射し、同量のＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を同時間及び同期間陰性対照マウスの腹腔に注射した。腫瘍の体積を３〜４日毎に測定し、最後の４２日目に腫瘍を摘出して重量を比較した。結果を図１５ａ及び１５ｂに開示した。図１５ａ及び１５ｂに示すように、本発明のＫＰ−ＶＲ２は、直腸癌細胞株（ＬＯＶＯ）に対し１ｍｇ／ｋｇの用量で、同量のアフリベルセプト（ＫＰ−ＶＲ４）と比較して５０％〜６０％増加した成長阻害活性を有した（Ｐ＜０．０５）。本発明のＫＰ−ＶＲ２の腫瘍成長阻害活性は初回の注射から観察され、ＫＰ−ＶＲ２とアフリベルセプト（ＫＰ−ＶＲ４）の間の阻害活性の差異は注射以後に増加した。更に、本ＫＰ−ＶＲ２の注射は、同じ注射用量のアフリベルセプトと比較して約５０％の腫瘍重量の減少をもたらした。
【００７１】
実施例１０−３．ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳＫＵＴ１Ｂの異種移植片
ＶＥＧＦＲ１陽性細胞株である子宮癌ＳＫＵＴ１Ｂ細胞株（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１１５（商標））を、ヌードマウスに注射した。ＳＫＵＴ１Ｂ細胞株（１×１０７個細胞／０．２ｍＬ）を、ヌードマウスの背部の皮下に注射し、ＫＰ−ＶＲ２（２ｍｇ／ｋｇ）及びＫＰ−ＶＲ４（アフリベルセプト）（２ｍｇ／ｋｇ）それぞれを、ヌードマウスの腹腔に注射の１日〜３２日後まで週２回注射した。同量のＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を同時間及び同期間陰性対照マウスの腹腔に注射した。腫瘍の体積を３〜４日毎に観察し、最後の３７日目に腫瘍を摘出して腫瘍の重量を比較した。結果を図１６に開示した。図１６ａ及び１６ｂに示すように、本発明のＫＰ−ＶＲ２は、本実験に使用した細胞株に対し２ｍｇ／ｋｇの用量で、同量のアフリベルセプト（ＫＰ−ＶＲ４）と比較して６０％〜７０％増加した成長阻害活性を有した（Ｐ＜０．０５）。更に、本ＫＰ−ＶＲ２の注射は、同じ注射用量のアフリベルセプトと比較して約７０％の腫瘍重量の減少をもたらした。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
上述の通り、本発明の（ＶＥＧＦＲ）融合タンパク質は、（ａ）２つの重鎖がジスルフィド結合によって連結されている、ＩｇＧ１のＦｃドメイン、及び（ｂ）４つのＶＥＧＦＲ１の免疫グロブリンドメイン２を含み、２つの免疫グロブリンドメイン２は（ａ）のＦｃドメインの各重鎖に連続して融合されている。従って、本発明により、血管形成に起因する癌及び／又は眼疾患を治療するための医薬組成物を提供することが可能になる。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
2018186822.tif 000017
【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
2018186822.tif 000026
【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
2018186822.tif 000031
【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
2018186822.tif 000033
【図１８】
2018186822.tif 000034
【図１９】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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