(57)【要約】      （修正有）【課題】試料中の標的ポリヌクレオチドの存在または不存在を決定する方法の提供。【解決手段】オリゴヌクレオチドの５’末端で終止し、標的ポリヌクレオチドの鎖の第１部分に相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第１プライマー成分と、オリゴヌクレオチドの３’末端で終止し、標的ポリヌクレオチドの鎖の第２部分に相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第２プライマー成分を含むプライマーオリゴヌクレオチドを準備すること、標的ポリヌクレオチドを含んでいる可能性のある試料を、第１プライマー成分と第２プライマー成分を標的ポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズさせるのに適当な条件下で、プライマーオリゴヌクレオチドと接触させることであって、そうすることで２本鎖デュプレックスが形成され、試料を標的ポリヌクレオチド鎖を鋳型として用いることができるポリメラーゼ酵素と接触させることを含む方法。【選択図】図１
2018075033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的ポリヌクレオチドの存在または不存在を決定する方法であって、
オリゴヌクレオチドの５’末端で終止し、標的ポリヌクレオチドの鎖の第１部分に相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第１プライマー成分と、
オリゴヌクレオチドの３’末端で終止し、標的ポリヌクレオチドの鎖の第２部分に相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第２プライマー成分
を含むプライマーオリゴヌクレオチドを準備すること、
標的ポリヌクレオチドを含んでいる可能性のある試料を、第１プライマー成分と第２プライマー成分を標的ポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズさせるのに適当な条件下で、プライマーオリゴヌクレオチドと接触させることであって、そうすることで２本鎖デュプレックスが形成され（ここでデュプレックスの中間部の少なくとも１本の鎖が、中間部の対向鎖に少なくとも４つのヌクレオチドの配列と塩基対相補性を共有するヌクレオチド配列が存在しないので中間部の対向鎖とハイブリダイズしないままである少なくとも４つのヌクレオチドの配列を含む）、
試料を標的ポリヌクレオチド鎖を鋳型として用いることができるポリメラーゼ酵素と接触させることであって、デュプレックスのプライマーオリゴヌクレオチドを伸長させ、そうすることで第１と第２の末端成分の中間の内部成分を含む単位複製配列が生成され（ここで
単位複製配列の第１末端成分が相補的塩基対合により標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１部分とハイブリダイズ可能であり、
単位複製配列の第２末端成分が相補的塩基対合により標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２部分とハイブリダイズ可能であり、
単位複製配列の第１および第２末端成分の標的ポリヌクレオチド鎖との前記ハイブリダイズにより、単位複製配列の内部成分は、標的ポリヌクレオチド鎖の第１および第２部分の間の内部成分と塩基対相補性を共有しない標的ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチドの中間配列に対向して位置する）および
単位複製配列が生成したかどうかを検出すること（ここで、単位複製配列の検出は、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示し、単位複製配列の検出失敗は、試料中の標的ポリヌクレオチドの不存在を示す）を含む、前記方法。
【請求項２】
前記検出することは、単位複製配列の内部成分、または単位複製配列の内部成分に相補的なヌクレオチドの配列を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
相補的塩基対合による標的ポリヌクレオチド鎖との前記ハイブリダイズ時、第１プライマー成分の融解温度が第２プライマー成分の融解温度よりも高い、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
２本鎖デュプレックスの中間部の少なくとも１本の鎖が、デュプレックスの対向鎖とハイブリダイズしないままである少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７または少なくとも８ヌクレオチドを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
プライマーオリゴヌクレオチドが、第１プライマー成分と第２プライマー成分の間に位置する第３プライマー成分を含み、第３プライマー成分は
標的ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチドの前記中間配列と塩基対相補性を共有せず、
単位複製配列の内部成分中のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列からなる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第３プライマー成分がプライマーオリゴヌクレオチドの３’ハーフに部分的または完全に位置する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第３プライマー成分とヌクレオチドの中間配列のヌクレオチド数が等しい、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
第３プライマー成分中のヌクレオチド数がヌクレオチドの前記中間配列のヌクレオチド数よりも多い、請求項５または６に記載の方法。
【請求項９】
第３プライマー成分中のヌクレオチド数がヌクレオチドの前記中間配列のヌクレオチド数よりも少ない、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１０】
第３プライマー成分中のヌクレオチド数が、第１と第２のプライマー成分とハイブリダイズした標的ポリヌクレオチドの部分の間に位置する標的ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも、１〜２００ヌクレオチド、１〜１５０ヌクレオチド、１〜１００ヌクレオチド、１〜７５ヌクレオチド、１〜５０ヌクレオチド１〜２５ヌクレオチド、５〜２００ヌクレオチド、５〜１５０ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜７５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド５〜２５ヌクレオチド、１０〜２００ヌクレオチド、１０〜１５０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜７５ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチドまたは１０〜２５ヌクレオチド少ない、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第１プライマー成分中のヌクレオチド数が第２プライマー成分中のヌクレオチド数よりも多い、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
２本鎖デュプレックスの中間部の前記少なくとも１本の鎖が標的ポリヌクレオチド鎖の成分である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
標的ポリヌクレオチド鎖の成分がヌクレオチドの前記中間配列からなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
第１プライマー成分と第２プライマー成分が相補的塩基対合によりハイブリダイズして標的ポリヌクレオチド鎖の非連続成分を分離することで、非連続成分が並列し、標的ポリヌクレオチド鎖中にハイブリダイズしないヌクレオチドを含むループ部分が生成される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
プライマーオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドが相補的塩基対合により標的オリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズする、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
標的ポリヌクレオチドのループ部分が、１〜２００ヌクレオチド、１〜１５０ヌクレオチド、１〜１００ヌクレオチド、１〜７５ヌクレオチド、１〜５０ヌクレオチド１〜２５ヌクレオチド、５〜２００ヌクレオチド、５〜１５０ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜７５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド５〜２５ヌクレオチド、１０〜２００ヌクレオチド、１０〜１５０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜７５ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチドまたは１０〜２５ヌクレオチドを含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記接触させることが、
前記第１標的ポリヌクレオチド鎖の相補鎖である第２標的ポリヌクレオチド鎖と塩基対相補性を共有する第２プライマーオリゴヌクレオチドを接触させることと、
第２標的ポリヌクレオチド鎖を鋳型として用い、ポリメラーゼ酵素を用いて第２プライマーオリゴヌクレオチドを伸長させて第２単位複製配列を生成することを含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出することが、該第２単位複製配列を検出することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のうちのいずれか１または複数の使用を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の２以上の個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
第１プライマー成分と第２プライマー成分がそれぞれ、多型領域の上流に位置する標的ポリヌクレオチド鎖の成分と配列相補性を共有する第１プライマー成分と、多型領域の下流に位置する標的ポリヌクレオチド鎖の成分と配列相補性を共有する第２プライマー成分により、集団の複数のメンバーとハイブリダイズすることが可能であり、
多型領域は、第１プライマー成分と第２プライマー成分が標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするとき、プライマーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないままである、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
多型領域が、多型領域の長さが標的ポリヌクレオチドの前記集団の２以上の個体メンバー間で異なるように１または複数ヌクレオチドの欠失を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
多型領域が、多型領域のヌクレオチド配列が標的ポリヌクレオチドの前記集団の２以上の個体メンバー間で異なるように１または複数ヌクレオチドの置換を有する、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
標的ポリヌクレオチド鎖が一塩基多型（ＳＮＰ）および／または点変異を含み、
単位複製配列が
（ｉ）ＳＮＰに相補的なヌクレオチドおよび／または
（ｉｉ）点変異に相補的なヌクレオチドを含み、
第１または第２プライマー成分が上記（ｉ）および／または（ｉｉ）と相補的塩基対合によりハイブリダイズできる、請求項１から１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
第２プライマー成分が、
第２プライマー成分の３’末端、
第２プライマー成分の３’末端の１、２、３、４、５ヌクレオチドまたは５以上のヌクレオチド上流、
第２プライマー成分の３’末端（ここで第２プライマー成分は、３’末端の２、３、４、５、６ヌクレオチドまたは６以上のヌクレオチド上流に位置する標的ポリヌクレオチドに非相補的なヌクレオチドも含む）、または
第２プライマー成分の３’末端の１、２、３、４、５ヌクレオチドまたは５以上のヌクレオチド上流（ここで第２プライマー成分は、標的に非相補的なさらなるヌクレオチドも含み、前記さらなるヌクレオチドはＳＮＰまたは点変異に相補的な前記ヌクレオチドの３’または５’に位置する）に位置する、ＳＮＰに相補的なヌクレオチドまたは点変異に相補的なヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の少なくとも２つの個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
多型領域が、多型領域が標的ポリヌクレオチドの前記集団の２以上の個体メンバー間で異なるように１または複数ヌクレオチドの欠失を含み、
第１プライマー成分または第２プライマー成分が、前記標的ポリヌクレオチド鎖中の多型領域に相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能であり、多型領域は集団メンバーの１サブセットのみの標的ポリヌクレオチド鎖中に存在する、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
単位複製配列が生成したかどうかを前記検出することが、二本鎖ＤＮＡおよび／または単位複製配列配列特異的プローブに結合する色素により与えられるシグナルを測定することを含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
二本鎖ＤＮＡに結合する色素がＳＹＢＲグリーンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
配列特異的プローブが分子標識、マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）プローブまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出することが、少なくとも２以上のパートザイム成分オリゴヌクレオチドを含む多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）の使用を含み、ここで少なくとも第１パートザイム成分と第２パートザイム成分が単位複製配列の存在下で自己集合して触媒活性ＭＮＡザイムを形成し、ここで第１および第２パートザイム成分は基質アーム部分、触媒コア部分およびセンサーアーム部分を含み、
自己集合時、第１および第２パートザイム成分のセンサーアーム部分がＭＮＡザイムのセンサーアームとして作用し、第１および第２パートザイム成分の基質アーム部分がＭＮＡザイムの基質アームとして作用し、第１および第２パートザイム成分の触媒コア部分がＭＮＡザイムの触媒コアとして作用し、
ＭＮＡザイムのセンサーアームが単位複製配列の一部または全部と相補的塩基対合によりハイブリダイズして第１と第２パートザイム成分を近くに維持するので第１と第２パートザイム成分はそれぞれの触媒コア部分と会合してＭＮＡザイムの触媒コアを形成し、触媒コアは少なくとも１つの基質を修飾可能であり、ＭＮＡザイムの基質アームが基質と結合してＭＮＡザイムの触媒コアが基質を修飾でき、そうすることで検出可能な効果が得られる、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＭＮＡザイムの第１および／または第２センサーアームが、
単位複製配列中の内部成分もしくはその成分または
単位複製配列中の内部成分もしくはその成分に相補的なヌクレオチドの配列を含むかそれからなるヌクレオチドの配列に相補的または実質的に相補的である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＭＮＡザイムの第１および／または第２センサーアームが、
単位複製配列の第１末端成分および／もしくは第２末端成分またはその成分あるいは
単位複製配列の第１末端成分および／もしくは第２末端成分またはその成分に相補的なヌクレオチドの配列を含むかそれからなる単位複製配列中の配列、にさらに相補的である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＭＮＡザイムの第１および／または第２センサーアームが、
単位複製配列中の内部成分もしくはその成分を含まないかまたはそれからならない単位複製配列中のヌクレオチドの配列あるいは
単位複製配列中の内部成分もしくはその成分を含まないかまたはそれからならない、単位複製配列中のヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチドの配列、に相補的または実質的に相補的である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＭＮＡザイムの第１および／または第２センサーアームが、
標的ポリヌクレオチド鎖中に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）および／または点変異または
標的ポリヌクレオチド鎖中に存在するＳＮＰに相補的なヌクレオチドおよび／または点変異に相補的なヌクレオチド、に相補的なヌクレオチドを含む、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の２以上の個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
前記ＭＮＡザイムの第１および／または第２センサーアームが、
集団の所与のメンバーの多型領域もしくはその成分、または
集団の所与のメンバーの多型領域もしくはその成分に相補的なヌクレオチドの配列、を含むかそれからなる単位複製配列中のヌクレオチド配列にさらに相補的である、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
多型領域が、ヌクレオチドの１または複数の欠失、挿入および／または置換を含み、多型領域の配列が集団の個々のメンバー間で異なる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＭＮＡザイムのセンサーアームが、第１センサーアーム成分、第２センサーアーム成分および第３センサーアーム成分を含むかそれらからなり、
第１センサーアーム成分は相補的塩基対合により単位複製配列とハイブリダイズでき、
第２センサーアーム成分は相補的塩基対合により単位複製配列とハイブリダイズでき、
第３センサーアーム成分は第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置し、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分が単位複製配列とハイブリダイズするときに単位複製配列と相補的塩基対合によりハイブリダイズできない、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
第３センサーアーム成分中のヌクレオチドの数は、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分とハイブリダイズした単位複製配列の部分の間に位置する単位複製配列中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数と等しいかそれよりも多い、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
第３センサーアーム成分中のヌクレオチドの数は、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分とハイブリダイズした単位複製配列の部分の間に位置する単位複製配列中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも少ない、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
第３センサーアーム成分中のヌクレオチドの数は、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分とハイブリダイズした単位複製配列の部分の間に位置する単位複製配列中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも１〜５０ヌクレオチド、１〜４０ヌクレオチド、１〜３０ヌクレオチド１〜２０ヌクレオチド、１〜１０ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド５〜２０ヌクレオチド、５〜１０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチドまたは１０〜２０ヌクレオチド少ない、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分が単位複製配列の別々の非連続成分と相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能なので、非連続成分が並列し、単位複製配列中にハイブリダイズしないヌクレオチドを含むループ部分が生成される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
単位複製配列のループ部分が、１〜５０ヌクレオチド、１〜４０ヌクレオチド、１〜３０ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチド、１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド５〜２０ヌクレオチド、５〜１０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチドまたは１０〜２０ヌクレオチドを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
単位複製配列のループ部分が、単位複製配列の前記内部成分を含む、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の２以上の個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
前記準備することが、プライマーオリゴヌクレオチドの複数の形態を準備することを含み、プライマーオリゴヌクレオチドの異なる形態は、
多型領域の異なる形態または
多型領域の１または複数の型に隣接または実質的に隣接する標的ポリヌクレオチド鎖の一部分と塩基対相補性を共有し、
プライマーオリゴヌクレオチドと前記接触させることが、標的ポリヌクレオチド集団の１または複数のメンバーを含んでいる可能性がある試料をプライマーオリゴヌクレオチドの前記複数の形態とハイブリダイゼーションに適した条件下で接触させることを含み、
プライマーオリゴヌクレオチドの複数の形態がそれぞれ、第１プライマー成分と第２プライマー成分の間に位置し、標的ポリヌクレオチド鎖中のヌクレオチドの前記中間配列と塩基対相補性を共有しないヌクレオチドの配列からなる前記第３プライマー成分を含む、請求項５から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記検出することが、第１センサーアーム成分、第２センサーアーム成分および第３センサーアーム成分を含むＭＮＡザイムを用いることを含み、
第１センサーアーム成分は単位複製配列の内部成分と、また所望により単位複製配列の第１末端成分と、相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第２センサーアーム成分は単位複製配列の第２末端成分と相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第３センサーアーム成分は第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置し、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分が単位複製配列とハイブリダイズするときに前記多型領域または前記多型領域に相補的なヌクレオチドの配列と相補的塩基対合によりハイブリダイズできない、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
多型領域を含む単位複製配列の複数の形態が、試料をポリメラーゼ酵素と前記接触させることにより生成され、単位複製配列の前記各複数の形態の多型領域が異なり、
センサーアームが、第１センサーアーム成分、第２センサーアーム成分および多型領域を含むかそれからなる単位複製配列中のヌクレオチドの配列に非相補的な第３センサーアーム成分を含み、
第１センサーアーム成分は、多型領域の上流の単位複製配列の前記形態のいずれかと相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第２センサーアーム成分は、多型領域の下流の単位複製配列の前記形態のいずれかと相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第３センサーアーム成分は第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置し、単位複製配列の前記形態のいずれかの前記多型領域と相補的塩基対合によりハイブリダイズできない、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
多型領域を含む単位複製配列の複数の形態が、試料をポリメラーゼ酵素と前記接触させることにより生成され、単位複製配列の前記形態の多型領域が異なり、
センサーアームが、第１センサーアーム成分および第２センサーアーム成分を含むかそれらからなり、
第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分が相補的塩基対合によりハイブリダイズして前記単位複製配列の任意の所与の形態の非連続成分を分離することで非連続成分が並列し、ハイブリダイズしないヌクレオチドを含む単位複製配列内にループ部分が形成され、
ループ部分のハイブリダイズしないヌクレオチドは単位複製配列の多型領域を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
多型領域が、標的ポリヌクレオチドの集団の前記２以上の個体メンバーが異なり得るように、ヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換のうちのいずれか１または複数を含む、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
プライマーオリゴヌクレオチドおよび／または標的ポリヌクレオチドおよび／または単位複製配列が、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの組合せを含むかそれらからなる、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
標的ポリヌクレオチドおよび／または単位複製配列が、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはＲＮＡである、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
プライマーオリゴヌクレオチドが機能的に活性な触媒的核酸に相補的なヌクレオチドの配列を含む、請求項１〜２９、３２、３６〜４１、４３または４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記単位複製配列が前記機能的に活性な触媒的核酸を含み、単位複製配列が生じたかどうかを前記検出することが、単位複製配列中に存在する前記機能的に活性な触媒的核酸の触媒活性を検出することを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
機能的に活性な触媒的核酸がＤＮＡザイムまたはリボザイムである、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
単位複製配列中に存在する前記機能的に活性な触媒的核酸の触媒活性を前記検出することが、単位複製配列を前記機能的に活性な触媒的核酸の基質と接触させることを含む、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
オリゴヌクレオチドの５’末端で終止し、第２ポリヌクレオチドの第１部分と相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第１成分、
オリゴヌクレオチドの３’末端で終止し、第２ポリヌクレオチドの第２部分と相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第２成分および
第１と第２成分の間に位置し、第１と第２成分が第２ポリヌクレオチドとハイブリダイズするとき第２ポリヌクレオチドのヌクレオチドの反対の配列と塩基対相補性を共有しない少なくとも４つのヌクレオチドの配列を含む第３成分であって、オリゴヌクレオチドの３’ハーフに部分的または完全に位置する第３成分を含む、単離されたプライマーまたはパートザイムオリゴヌクレオチド。
【請求項５５】
第３成分が、第２ポリヌクレオチドのヌクレオチドの反対の配列と塩基対相補性を共有しない、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７または少なくとも８ヌクレオチドの配列を含む、請求項５４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５６】
第１成分中のヌクレオチドの数が、
第３成分中のヌクレオチドの数よりも少ないか、
第３成分中のヌクレオチドの数よりも多い、請求項５４または５５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５７】
オリゴヌクレオチドがＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＲＮＡまたは任意のそれらの組合せを含む、請求項５４から５６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５８】
オリゴヌクレオチドがパートザイムセンサーアームの成分である、請求項５４から５７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５９】
請求項１から５３のいずれか一項に記載の方法における、請求項５４から５８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項６０】
第２ポリヌクレオチドに相補的塩基対合によりハイブリダイズする請求項５４〜５８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、単離された２本鎖核酸デュプレックスであって、
オリゴヌクレオチドの第１成分がオリゴヌクレオチドの５’末端で終止し、第２ポリヌクレオチドの第１部分と相補的塩基対合によりハイブリダイズし、
オリゴヌクレオチドの第２成分がオリゴヌクレオチドの３’末端で終止し、第２ポリヌクレオチドの第２部分と相補的塩基対合によりハイブリダイズし、
オリゴヌクレオチドの第３成分が前記第１と第２成分の間に位置し、第２ポリヌクレオチドのヌクレオチドの反対の配列と塩基対相補性を共有しない少なくとも２つのヌクレオチドの配列を含み、
オリゴヌクレオチドの第３成分がオリゴヌクレオチドの３’ハーフに部分的または完全に位置する、前記単離された２本鎖核酸デュプレックス。
【請求項６１】
前記第３成分中のヌクレオチドの数が、前記第１と第２の成分とハイブリダイズした第２ポリヌクレオチドの部分の間に位置する第２ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数と等しい、請求項６０に記載の２本鎖核酸デュプレックス。
【請求項６２】
前記第３成分中のヌクレオチドの数が、前記第１と第２の成分とハイブリダイズした第２ポリヌクレオチドの部分の間に位置する第２ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも多い、請求項６１に記載の２本鎖核酸デュプレックス。
【請求項６３】
前記第３成分中のヌクレオチドの数が、前記第１と第２の成分とハイブリダイズした第２ポリヌクレオチドの部分の間に位置する第２ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも少ない、請求項６１に記載の２本鎖核酸デュプレックス。
【請求項６４】
前記第３中のヌクレオチドの数が、前記第１と第２成分にハイブリダイズした第２ポリヌクレオチドの部分の間に位置する第２ポリヌクレオチドのハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも１〜２００ヌクレオチド、１〜１５０ヌクレオチド、１〜１００ヌクレオチド、１〜７５ヌクレオチド、１〜５０ヌクレオチド１〜２５ヌクレオチド、５〜２００ヌクレオチド、５〜１５０ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜７５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド５〜２５ヌクレオチド、１０〜２００ヌクレオチド、１０〜１５０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜７５ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチドまたは１０〜２５ヌクレオチド少ない、請求項６１に記載の２本鎖核酸デュプレックス。
【請求項６５】
オリゴヌクレオチドおよび／または第２ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはＲＮＡである、請求項６０から６４のいずれか一項に記載の２本鎖核酸デュプレックス。
【請求項６６】
第１センサーアーム成分および第２センサーアーム成分を含むかそれらからなるセンサーアームを含む多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）であって、
第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分は相補的塩基対合により集合促進因子ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能であり、それによって２本鎖デュプレックスを形成し、少なくともデュプレックスの中間成分の１本の鎖がデュプレックスの対向鎖にハイブリダイズしないままの少なくとも２個のヌクレオチドを含む、前記ＭＮＡザイム。
【請求項６７】
センサーアームが第１センサーアーム成分、第２センサーアーム成分および第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置する第３センサーアーム成分を含むかそれらからなり、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分が集合促進因子ポリヌクレオチドに前記ハイブリダイズする際に、第３センサーアーム成分が、前記集合促進因子ポリヌクレオチドとの塩基対相補性が不存在なので、集合促進因子ポリヌクレオチドにハイブリダイズできない、請求項６６に記載のＭＮＡザイム。
【請求項６８】
第３センサーアーム成分中のヌクレオチドの数は、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分とハイブリダイズした集合促進因子ポリヌクレオチドの部分の間に位置する集合促進因子ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数と等しいかまたはそれよりも多い、請求項６７に記載のＭＮＡザイム。
【請求項６９】
第３センサーアーム成分中のヌクレオチドの数は、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分とハイブリダイズした集合促進因子ポリヌクレオチドの部分の間に位置する集合促進因子ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも少ない、請求項６７に記載のＭＮＡザイム。
【請求項７０】
第３センサーアーム成分中のヌクレオチド数が、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分とハイブリダイズした集合促進因子ポリヌクレオチドの部分の間に位置する集合促進因子ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも、１〜２００ヌクレオチド、１〜１５０ヌクレオチド、１〜１００ヌクレオチド、１〜７５ヌクレオチド、〜５０ヌクレオチド、１〜２５ヌクレオチド、５〜２００ヌクレオチド、５〜１５０ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜７５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド５〜２５ヌクレオチド、１０〜２００ヌクレオチド、１０〜１５０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜７５ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチドまたは１０〜２５ヌクレオチド少ない、請求項６９に記載のＭＮＡザイム。
【請求項７１】
第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分が集合促進因子ポリヌクレオチドの別々の非連続成分と相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能なので、非連続成分が並列し、集合促進因子ポリヌクレオチド中にハイブリダイズしないヌクレオチドを含むループ部分が生成される、請求項６６に記載のＭＮＡザイム。
【請求項７２】
集合促進因子ポリヌクレオチドのループ部分が、１〜５０ヌクレオチド、１〜４０ヌクレオチド、１〜３０ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチド、１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド５〜２０ヌクレオチド、５〜１０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチドまたは１０〜２０ヌクレオチドを含む、請求項７１に記載のＭＮＡザイム。
【請求項７３】
集合促進因子ポリヌクレオチドが、ＭＮＡザイムによる検出の標的ポリヌクレオチドである、６６から７２のいずれか一項に記載のＭＮＡザイム。
【請求項７４】
前記集合促進因子ポリヌクレオチドに相補的塩基対合によりハイブリダイズした請求項６６から７３のいずれか一項に記載のＭＮＡザイムを含む核酸複合体。
【請求項７５】
ポリヌクレオチド標的が前記集合促進因子である、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在または不存在を検出するための、請求項６６から７３のいずれか一項に記載のＭＮＡザイムの使用。
【請求項７６】
試料中の標的ポリヌクレオチドの存在または不存在を決定する方法であって、
標的ポリヌクレオチドに相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能なプライマーオリゴヌクレオチドを準備すること、
標的ポリヌクレオチドを含んでいる可能性がある試料を、プライマーオリゴヌクレオチドと、プライマーオリゴヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドの相補的塩基対合によるハイブリダイゼーションに適した条件下で接触させることであって、そうすることで２本鎖デュプレックスが生成され、
試料を標的ポリヌクレオチドを鋳型として用いることができるポリメラーゼ酵素と接触させてデュプレックスのプライマーオリゴヌクレオチドを伸長させて、単位複製配列を生成すること、および
請求項６６に記載のＮＭＡザイムを用いて単位複製配列が生成したかどうかを検出すること（ここで、単位複製配列の検出は、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示し、単位複製配列の検出失敗は、試料中の標的ポリヌクレオチドの不存在を示す）を含む、前記方法。
【請求項７７】
前記第１センサーアーム成分が、
（ｉ）単位複製配列もしくはその成分または
（ｉｉ）単位複製配列もしくはその成分に相補的なヌクレオチドの配列、と塩基対相補性を共有するヌクレオチドの配列を含み、
前記検出することが、前記第１センサーアーム成分が相補的塩基対合により上記（ｉ）か（ｉｉ）にハイブリダイズするかどうかを決定することを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
標的ポリヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドの集団の２以上の個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
標的ポリヌクレオチド集団の少なくとも１つの前記標的ポリヌクレオチドに相補的塩基対合によりそれぞれハイブリダイズ可能な一連のプライマーオリゴヌクレオチドが準備され、ここで各前記プライマーオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド集団の前記メンバーの一部のみに存在する特定の形態の多型領域と塩基対相補性を共有し、
各前記プライマーオリゴヌクレオチドは、試料をポリメラーゼ酵素と前記接触させた後、前記単位複製配列の各集団に組み込まれる同一タグ部分ヌクレオチド配列を含み、ここで単位複製配列集団の各前記メンバーは、単位複製配列集団の各前記メンバーの一部にしか存在しない多型領域を含み、
前記検出することが、ＭＮＡザイムの前記第１センサーアームが、単位複製配列集団の前記メンバーのタグ部分と相補的塩基対合によりハイブリダイズするかどうかを決定することを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
試料中の標的ポリヌクレオチドの存在または不存在を決定する方法であって、ここで標的ポリヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドの集団の２以上の個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
標的ポリヌクレオチドに相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能なプライマーオリゴヌクレオチドを準備することであって、ここでプライマーオリゴヌクレオチドは、前記集団メンバーの一部のみに存在する多型領域の特異的形態と、または多型領域の特異的形態に隣接もしくは実質的に隣接する標的ポリヌクレオチドの一部分と、塩基対相補性を共有し、
標的ポリヌクレオチドを含んでいる可能性がある試料を、プライマーオリゴヌクレオチドと、プライマーオリゴヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドの相補的塩基対合によるハイブリダイゼーションに適した条件下で接触させることであって、そうすることで２本鎖デュプレックスが生成され、
試料を標的ポリヌクレオチドを鋳型として用いることができるポリメラーゼ酵素と接触させてデュプレックスのプライマーオリゴヌクレオチドを伸長させて、多型領域の特異的形態を含む単位複製配列を生成すること、および
請求項６６に記載のＮＭＡザイムを用いて単位複製配列が生成したかどうかを検出すること（ここで、単位複製配列の検出は、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示し、単位複製配列の検出失敗は、試料中の標的ポリヌクレオチドの不存在を示す）を含む、前記方法。
【請求項８０】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のうちのいずれか１または複数により、前記単位複製配列の複製を産生することを含む、請求項７６から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記準備することが、プライマーオリゴヌクレオチドの複数の形態を準備することを含み、ここでプライマーオリゴヌクレオチドの異なる形態は、多型領域の異なる形態と、または多型領域の１または複数の形態に隣接もしくは実質的に隣接する標的ポリヌクレオチドの一部分と、塩基対相補性を共有し、
プライマーオリゴヌクレオチドを前記接触させることが、標的ポリヌクレオチド集団の１または複数のメンバーを含んでいる可能性がある試料をプライマーオリゴヌクレオチドの複数の形態とハイブリダイゼーションに適した前記条件下で接触させることを含み、
前記検出することが、異なる多型領域を含む単位複製配列の複数の形態が生じたかどうかを増幅ＭＮＡザイムを用いて検出することを含む、請求項７９または８０に記載の方法。
【請求項８２】
試料をポリメラーゼ酵素と前記接触させることにより単位複製配列の複数の形態が生じ、ここで単位複製配列の複数の形態の多型領域は異なり、
ＭＮＡザイムのセンサーアームは単位複製配列の異なる部分に相補的なヌクレオチドの配列を含む第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分および第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置する第３センサーアーム成分を含むかそれらからなり、
第１センサーアーム成分は、多型領域の上流の単位複製配列の前記形態のいずれかと相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第２センサーアーム成分は、多型領域の下流の単位複製配列の前記形態のいずれかと相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第３センサーアーム成分は第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置し、第３センサーアーム成分中に単位複製配列のいずれかの前記形態の多型領域と塩基対相補性を共有するヌクレオチドの配列が存在しないので、相補的塩基対合により単位複製配列のいずれかの前記形態の多型領域にハイブリダイズできない、請求項７９から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
第３センサーアーム成分中のヌクレオチドの数は、多型領域を含む単位複製配列中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数と等しいかそれよりも多い、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
第３センサーアーム成分中のヌクレオチドの数は、多型領域を含む単位複製配列中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも少ない、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
第３センサーアーム成分中のヌクレオチドの数は、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分にハイブリダイズした集合促進因子ポリヌクレオチドの部分の間に位置する集合促進因子ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも１〜５０ヌクレオチド、１〜４０ヌクレオチド、１〜３０ヌクレオチド１〜２０ヌクレオチド、１〜１０ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド５〜２０ヌクレオチド、５〜１０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチドまたは１０〜２０ヌクレオチド少ない、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
多型領域を含む単位複製配列の複数の形態が、試料をポリメラーゼ酵素と前記接触させることにより生成され、単位複製配列の前記形態の多型領域が異なり、
センサーアームが、第１センサーアーム成分および第２センサーアーム成分を含むかそれらからなり、
第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分が相補的塩基対合によりハイブリダイズして前記単位複製配列の任意の所与の形態の非連続成分を分離することで非連続成分が並列し、単位複製配列中にハイブリダイズしないヌクレオチドを含むループ部分が形成され、
単位複製配列中のハイブリダイズしないヌクレオチドは多型領域を含む、請求項７９または８０に記載の方法。
【請求項８７】
標的ポリヌクレオチド中ハイブリダイズしないヌクレオチドを含むループ部分が、１〜２００ヌクレオチド、１〜１５０ヌクレオチド、１〜１００ヌクレオチド、１〜７５ヌクレオチド、〜５０ヌクレオチド、１〜２５ヌクレオチド、５〜２００ヌクレオチド、５〜１５０ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜７５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド５〜２５ヌクレオチド、１０〜２００ヌクレオチド、１０〜１５０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜７５ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチドまたは１０〜２５ヌクレオチドを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
標的ポリヌクレオチドの１または複数の増幅された複製を提供するために酵素反反応を用いることをさらに含む、請求項８１から８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
プライマーオリゴヌクレオチドとは違う成分に実質的に相補的な第２オリゴヌクレオチドを用いて、新生ポリヌクレオチドの１または複数を増幅することを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
多型領域が、標的ポリヌクレオチドの集団の前記個体メンバーが異なり得るように、ヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換のうちのいずれか１または複数を含む、請求項７８から８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
プライマーオリゴヌクレオチドおよび／または標的ポリヌクレオチドおよび／または単位複製配列および／またはＭＮＡザイムが、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの組合せを含むかそれらからなる、請求項７６から９０のいずれ一項に記載の方法。
【請求項９２】
標的ポリヌクレオチドおよび／または単位複製配列が、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはＲＮＡである、請求項７６から９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記ＭＮＡザイムが、検出可能部分とクエンチャー部分を含む基質を修飾可能であり、検出可能な効果が前記検出可能部分とクエンチャー部分を分離するＭＮＡザイムにより基質が切断されることでもたらされ、それによって試料中の標的ポリヌクレオチドの存在が示される、請求項２９から４２または７６から９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
ＭＮＡザイムによる基質の修飾で産生される検出可能な効果を増幅することをさらに含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
標的ポリヌクレオチドが細菌、ウイルス、真菌／酵母、原生生物または線虫由来である、請求項２９から４２または７６から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
標的ポリヌクレオチドがエンテロウイルス由来である、請求項２９から４２または７６から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
方法がインビトロまたはエクスビボで実施される、請求項１から５３または７６から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
試料が標的ポリヌクレオチドの集団を含み、
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の少なくとも２つの個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
前記準備することが、プライマーオリゴヌクレオチドの２つの形態を準備することを含み、ここで
プライマーオリゴヌクレオチドの第１の前記形態の第１または第２プライマー成分が、標的ポリヌクレオチド集団の第１メンバーの標的ポリヌクレオチド鎖の多型領域と塩基対相補性を共有し、
プライマーオリゴヌクレオチドの第２の前記形態の第１または第２プライマー成分が、標的ポリヌクレオチド集団の第２メンバーの標的ポリヌクレオチド鎖の多型領域と塩基対相補性を共有し、
標的ポリヌクレオチド集団の前記第１および第２メンバーの多型領域のヌクレオチド配列が異なり、
プライマーオリゴヌクレオチドの第１および第２形態の第３成分のヌクレオチド配列が異なり、
試料を前記接触させることが、試料をプライマーオリゴヌクレオチドの第１および第２形態と接触させることを含み、
試料をポリメラーゼ酵素と前記接触させることで前記単位複製配列の集団が生じ、ここで
前記単位複製配列集団の第１メンバーが、標的ポリヌクレオチド集団の第１メンバーの前記多型領域と配列相補性を共有する末端成分を含み、
前記単位複製配列集団の第２メンバーが、標的ポリヌクレオチド集団の第２メンバーの前記多型領域と配列相補性を共有する末端成分を含み、
前記単位複製配列集団の前記第１および第２メンバーの内部成分のヌクレオチド配列が異なる、請求項５から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
試料が標的ポリヌクレオチドの集団を含み、
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の少なくとも２つの個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
前記準備することが、プライマーオリゴヌクレオチドの２つの形態を準備することを含み、ここで
プライマーオリゴヌクレオチドの第１の前記形態の第１または第２プライマー成分が、標的ポリヌクレオチド集団の第１メンバーの標的ポリヌクレオチド鎖の多型領域と塩基対相補性を共有し、
プライマーオリゴヌクレオチドの第２の前記形態の第１または第２プライマー成分が、標的ポリヌクレオチド集団の第２メンバーの標的ポリヌクレオチド鎖の多型領域と塩基対相補性を共有し、
標的ポリヌクレオチド集団の前記第１および第２メンバーの多型領域のヌクレオチド配列が異なり、
プライマーオリゴヌクレオチドの第１前記形態にハイブリダイズされた標的ポリヌクレオチド鎖の前記非連続成分の間のヌクレオチドの数は、プライマーオリゴヌクレオチドの第２前記形態にハイブリダイズされた標的ポリヌクレオチド鎖の前記非連続成分の間のヌクレオチドの数と異なり、
プライマーオリゴヌクレオチドの第１形態の標的ポリヌクレオチド鎖への前記ハイブリダイゼーションにより生成されたループ部分のヌクレオチド配列は、プライマーオリゴヌクレオチドの第２形態の標的ポリヌクレオチド鎖への前記ハイブリダイゼーションにより生成されたループ部分のヌクレオチド配列と異なり、
試料を前記接触させることが、試料をプライマーオリゴヌクレオチドの第１および第２形態と接触させることを含み、
試料をポリメラーゼ酵素と前記接触させることで前記単位複製配列の集団が生じ、ここで
前記単位複製配列集団の第１メンバーが、標的ポリヌクレオチド集団の第１メンバーの前記多型領域と配列相補性を共有する末端成分を含み、
前記単位複製配列集団の第２メンバーが、標的ポリヌクレオチド集団の第２メンバーの前記多型領域と配列相補性を共有する末端成分を含み、
前記単位複製配列集団の前記第１および第２メンバーの内部成分のヌクレオチド配列が異なる、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
多型領域がヌクレオチドの１または複数の欠失、挿入および／または置換を含み、多型領域の配列が標的ポリヌクレオチド集団の第１と第２メンバーの間で異なる、請求項９８または９９に記載の方法。
【請求項１０１】
多型領域がＳＮＰおよび／または点変異を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
多型領域の長さが標的ポリヌクレオチド集団の第１と第２メンバーの間で異なる、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
単位複製配列が生成したかどうかを前記検出することが、二本鎖ＤＮＡおよび／または単位複製配列配列特異的プローブに結合する色素により与えられるシグナルを測定することを含む、請求項９８から１０２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０４】
二本鎖ＤＮＡに結合する色素がＳＹＢＲグリーンである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記方法が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のうちのいずれか１つまたは複数の使用を含む、請求項９８から１０４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０６】
前記検出することが、単位複製配列の集団の前記第１および第２メンバーの前記生成を融解曲線分析によりモニタリングすることを含む、請求項１０３から１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
標的ポリヌクレオチドおよび／または単位複製配列が、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはＲＮＡである、請求項９８から１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ＭＮＡザイムが、検出可能部分とクエンチャー部分を含む基質を修飾可能であり、検出可能な効果が前記検出可能部分とクエンチャー部分を分離するＭＮＡザイムにより基質が切断されることでもたらされ、それによって試料中の標的ポリヌクレオチドの存在が示される、請求項７５に記載の使用。
【請求項１０９】
ＭＮＡザイムによる基質の修飾で産生される検出可能な効果を増幅することをさらに含む、請求項７５に記載の使用。
【請求項１１０】
オリゴヌクレオチドの第３成分が、配列番号１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５もしくは１９６のいずれか１つに定義されるヌクレオチド配列または前記配列のいずれか１つの相補鎖を含むかそれからなる、請求項５４から５８のいずれか一項に記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項１１１】
請求項５４から５８または１１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項１１２】
請求項６０から６５のいずれか一項に記載の２本鎖核酸デュプレックスを含むキット。
【請求項１１３】
請求項６６から７３のいずれか一項に記載のＭＮＡザイムを含むキット。
【請求項１１４】
請求項７４に記載の核酸複合体を含むキット。
【請求項１１５】
第１センサーアーム成分は単位複製配列の内部成分と、また所望により単位複製配列の第１末端成分と、相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第２センサーアーム成分は単位複製配列の第２末端成分と相補的塩基対合によりハイブリダイズできる、請求項３６に記載の方法。
【請求項１１６】
第１センサーアーム成分は単位複製配列の内部成分および単位複製配列の第１末端成分と相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第２センサーアーム成分は単位複製配列の第２末端成分と相補的塩基対合によりハイブリダイズできる、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
プライマーオリゴヌクレオチドの第３成分が機能的に活性な触媒的核酸に相補的なヌクレオチドの配列を含む、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照による組込み
本願は、２０１２年２月２０日付け豪国特許仮出願第２０１２９００６２４号および２０１２年５月２９日同第２０１２９０２２１８号の優先権を主張し、それらの全容を相互参照により本願に組み込む。
【０００２】
本発明は、広くは分子生物学分野に関する。より具体的には、本発明は、修飾オリゴヌクレオチドと、標的核酸検出におけるそれらの使用方法を提供する。オリゴヌクレオチドと方法は、標的核酸配列における遺伝的変異部位の増幅および／または検出に特に利用される。
【背景技術】
【０００３】
様々な遺伝病および後天的疾病が、点変異、欠失および挿入などの遺伝的変異と関連している。一塩基多型などの遺伝的変異は、薬物に対する反応の予測に有益であり得、疾患リスクと重篤度の予後を示し得る。遺伝的バリアントは、疾患の存在と直接関連があるものもあるが、疾患リスクおよび／または予後と相関するものもある。１つの遺伝子の変異を原因とする５００を超えるヒト遺伝疾患がある。これらには、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、α１−アンチトリプシン欠損症、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球貧血症または体質、および様々な他の異常ヘモグロビン症が含まれる。さらに、アテローム硬化型心疾患などのいくつかの一般的な多遺伝子疾患に罹患しやすい個体は、特定のＤＮＡ配列多型の遺伝と関係があることが示されている。癌は、細胞増殖または分化に関与する遺伝子の遺伝子病変の蓄積により発症すると考えられている。
【０００４】
病原体中の遺伝子多様性は、関連疾患の重篤度と治療的介入の性質において役割を果たし得る。例としては、（ｉ）結核菌などの薬剤耐性細菌株に関連の変異、（ｉｉ）特定のヌクレオチドと関連するＨＩＶなどのウイルスの治療により誘導される耐性、および（ｉｉｉ）治療薬反応の予測に使えるＨＣＶ中の特定配列が含まれる。
【０００５】
病院では、遺伝子解析は、疾患リスクの評価、疾患診断、治療に対する患者の予後や反応の予測、患者の進行のモニタリングなどで日常的になっている。そのような遺伝子試験の導入は、簡易、廉価かつ迅速に遺伝的変異を見分けるアッセイに左右される。
【０００６】
インビトロの核酸増幅方法は、遺伝子学および疾患診断において広範に利用されている。そのような方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が含まれる。これらの標的増幅ストラテジーにはすべてオリゴヌクレオチドプライマーの使用が必要である。増幅処理により、オリゴヌクレオチドプライマーを５’末端に含み、新たに合成された複製配列をプライマーの間に有する単位複製配列の指数関数的増幅がもたらされる。
【０００７】
小規模な遺伝子変異を検出するために一般的に使用されるＰＣＲを含む方法は、高解像度融解曲線分析および分子標識の使用を含む。融解曲線と分子標識は、集団の大多数の割合を代表する配列を検出する方法としては適切であるが、癌に関連する後天的変異、稀な／新興ウイルス株の遺伝子型解析、または薬剤感受性細菌のバックグラウンドにおける薬剤耐性細菌の同定などの、大規模な非変異ＤＮＡバックグラウンドにおいて変異を検出しなければならない場合は不適当である。
【０００８】
一例として、ＰＣＲは高い汎用性があり、基本プロトコルの多くの改変が開発されている。ＰＣＲで使用されるプライマーは、標的配列と完全に一致し得るか、またはミスマッチもしくは修飾された塩基を含み得る。プライマーの５’末端の追加のタグ配列は、ＰＣＲ単位複製配列の捕捉を容易にし得、標識プライマーの使用により検出が容易になり得る。非標的関連配列（非相補的タグ配列）をオリゴヌクレオチドプライマーの５’部分に導入した他のプロトコルの目的は、クローン化のため制限部位を導入すること、またはもとの標的とは関係ない一般的プライマーを用いて２回目の増幅を行うための単位複製配列のタグ付けであった。当技術分野では所与のプライマーの５’ハーフは当初の標的とハイブリダイズしない塩基の挿入を許容できることが知られているが、プライマーの３’部分はミスマッチ塩基の存在に対する許容性が遥かに低いことも周知である。
【０００９】
この観察結果から、増幅抵抗変異システム（ＡＲＭＳ）、別名アレル特異的ＰＣＲ法（ＡＳ−ＰＣＲ）のオリゴヌクレオチドプライマーが開発された（非特許文献１）。ＡＲＭＳプライマーは、一塩基多型（ＳＮＰ）などの小さな遺伝的変異の区別を容易にする。この能力は、ミスマッチ３’残基を有するオリゴヌクレオチドは、完全一致配列と比べてプライマーとして有効機能しないという事実に基づく。Kwok et al.は、この区別は不完全であり、ミスマッチに関与するＤＮＡ塩基に依存することを示した（非特許文献２）。プライマーの３’末端に１つのミスマッチを有するプライマーと鋳型の間の二重ミスマッチにより、ＡＲＭＳプライマーがアレルを有効に区別する能力は高まる（非特許文献２）。ＡＲＭＳプライマーは、３’ミスマッチの強さが第２ミスマッチの強さとつり合うように注意深く設計しなければならない。このことは、ミスマッチプライマーがそれらの標的とアニールする効率に影響を及ぼすＰＣＲのアニーリング温度を慎重に選択することでもつり合いがとれる。ＡＲＭＳアッセイの設計は困難であり得、反応条件、たとえば全プライマーが有効に区別する温度の開発は面倒である。
【００１０】
ユニバーサル塩基は、大幅に近隣の塩基対の相互作用を不安定化させたり修飾オリゴヌクレオチドの予測される機能的生化学用途を混乱させることなく、４つの通常の塩基と置き換わる能力を示している。ユニバーサル塩基を含むオリゴヌクレオチドがＤＮＡシーケンシングまたはＰＣＲのプライマーとして機能することは、当技術分野では周知である。もっとも一般的に使用される変性修飾塩基は、親和性は均一ではないが（Ｉ−Ｃ＞Ｉ−Ａ＞Ｉ−Ｔ〜Ｉ−Ｇ＞Ｉ−Ｉ）４つの天然ヌクレオチド全てとゆらぎ塩基対合できるので、「ユニバーサル」塩基として機能するデオキシイノシンである。したがって、イノシンは、プライマーおよびプローブの特定の塩基位置に縮重を必要とするアンビギュオウス配列の増幅などの用途でＰＣＲにおいて広く使用されている。
【００１１】
ＷＯ２００６／０９２９４１は、ＰＣＲの特異的増幅を増強するために３つの異なるＴｍ部分で構成される二重特異性オリゴヌクレオチドの使用を記載している。二重特異性オリゴヌクレオチド（ＤＳＯ）は、３つの配列領域で構成される。ＤＳＯの５’部分は、標的特異的であり、高いＴｍを有する。ＤＳＯの中間部分は、標準的なＤＮＡ塩基のどれでもない（つまりＧ、Ａ、ＴまたはＣではない）、２から１０の「ユニバーサル」塩基で構成された分離部分である。ＤＳＯの３’部分は標的特異的である。ＤＳＯは、オリゴヌクレオチドの５’および３’部分のミスマッチを許容できるので、小さな遺伝的変異を有効に区別するのにＤＳＯをプライマーとして使用することは、プライマーアニーリングの厳密な条件を要する。中間部分のユニバーサル塩基は、一般的な４つのＤＮＡ塩基全てと非特異的に塩基対合できる。したがって、これらのＤＳＯプライマーは、ユニバーサル部分がプライマーアニーリング中に結合されないように温度設定されていたとしても、（塩基はミスマッチではなくユニバーサルであるため）プライマーの全長に沿って当初の標的と結合できる。しかし、単位複製配列は、複製されると、ユニバーサル塩基と反対の位置にバリアント配列を含むので、ユニバーサル塩基の存在のせいでＤＳＯプライマーにより生成された単位複製配列に何らかの特定のユニーク配列が導入されることはない。
【００１２】
比較的多数の技法が配列を増幅、検出および分析するために開発されているにもかかわらず、遺伝的変異を区別するより高速、正確および廉価なアッセイは大いに必要とされている。多様性が有用ではなく、増幅を複雑にするような場合の遺伝的多様性の領域を含む配列の増幅を改善する方法も必要とされている。さらに、マルチプレックスフォーマットにおける２つ以上の標的を分析する能力を高めるための、特に小さな遺伝的変異（たとえば一塩基多型−ＳＮＰ）を検出する際のよりよい方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Newton et al 1989 Nucleic Acids Research 17:2503-2516
【非特許文献２】Kwok, et al. 1990 Nucleic Acids Research 18: 999-10005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ユニーク特異配列を単位複製配列に導入することができるオリゴヌクレオチドを提供することにより、上述のニーズの少なくとも１つに応える。本明細書で提供するオリゴヌクレオチドにより単位複製配列に導入されるユニーク配列は、さもなくば小さな遺伝的変異（たとえばＳＮＰ）しか含まない増幅された標的ポリヌクレオチド中により大きい変異領域を提供するのに使用され得るので、区別が容易になる。あるいは、標的配列における遺伝子多様性が非有用である場合および／または増幅を困難にする場合、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、単位複製配列中のそれらの可変領域をユニーク配列で置換するのに使用され得るので、関連配列の増幅と検出の効率が高まる。
【００１５】
本発明は、少なくとも部分的には以下の実施形態１〜１１８に関する。
実施形態１
試料中の標的ポリヌクレオチドの存在または不存在を決定する方法であって、
オリゴヌクレオチドの５’末端で終止し、標的ポリヌクレオチドの鎖の第１部分に相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第１プライマー成分と、
オリゴヌクレオチドの３’末端で終止し、標的ポリヌクレオチドの鎖の第２部分に相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第２プライマー成分
を含むプライマーオリゴヌクレオチドを準備すること、
標的ポリヌクレオチドを含んでいる可能性のある試料を、第１プライマー成分と第２プライマー成分を標的ポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズさせるのに適当な条件下で、プライマーオリゴヌクレオチドと接触させることであって、そうすることで２本鎖デュプレックスが形成され（ここでデュプレックスの中間部の少なくとも１本の鎖が、中間部の対向鎖に少なくとも４つのヌクレオチドの配列と塩基対相補性を共有するヌクレオチド配列が存在しないので中間部の対向鎖とハイブリダイズしないままである少なくとも４つのヌクレオチドの配列を含む）、
試料を標的ポリヌクレオチド鎖を鋳型として用いることができるポリメラーゼ酵素と接触させることであって、デュプレックスのプライマーオリゴヌクレオチドを伸長させ、そうすることで第１と第２の末端成分の間の中間成分を含む単位複製配列が生成され（ここで
単位複製配列の第１末端成分が相補的塩基対合により標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１部分とハイブリダイズ可能であり、
単位複製配列の第２末端成分が相補的塩基対合により標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２部分とハイブリダイズ可能であり、
単位複製配列の第１および第２末端成分の標的ポリヌクレオチド鎖との前記ハイブリダイズにより、単位複製配列の内部成分は、標的ポリヌクレオチド鎖の第１および第２部分の間の内部成分と塩基対相補性を共有しない標的ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチドの中間配列に対向して位置する）および
単位複製配列が生成したかどうかを検出すること（ここで、単位複製配列の検出は、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示し、単位複製配列の検出失敗は、試料中の標的ポリヌクレオチドの不存在を示す）を含む、方法。
【００１６】
実施形態２
前記検出することは、単位複製配列の内部成分、または単位複製配列の内部成分に相補的なヌクレオチドの配列を検出することを含む、実施形態１による方法。
【００１７】
実施形態３
相補的塩基対合による標的ポリヌクレオチド鎖との前記ハイブリダイズ時、第１プライマー成分の融解温度が第２プライマー成分の融解温度よりも高い、実施形態１または２による方法。
【００１８】
実施形態４
２本鎖デュプレックスの中間部の少なくとも１本の鎖が、デュプレックスの対向鎖とハイブリダイズしないままである少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７または少なくとも８ヌクレオチドを含む、実施形態１から３のいずれか１つによる方法。
【００１９】
実施形態５
プライマーオリゴヌクレオチドが、第１プライマー成分と第２プライマー成分の間に位置する第３プライマー成分を含み、第３プライマー成分は
標的ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチドの前記中間配列と塩基対相補性を共有せず、
単位複製配列の内部成分中のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列からなる、実施形態１から４のいずれか１つによる方法。
【００２０】
実施形態６
第３プライマー成分がプライマーオリゴヌクレオチドの３’ハーフに部分的または完全に位置する、実施形態５による方法。
【００２１】
実施形態７
第３プライマー成分とヌクレオチドの中間配列のヌクレオチド数が等しい、実施形態５または６による方法。
【００２２】
実施形態８
第３プライマー成分中のヌクレオチド数がヌクレオチドの前記中間配列のヌクレオチド数よりも多い、実施形態５または６による方法。
【００２３】
実施形態９
第３プライマー成分中のヌクレオチド数がヌクレオチドの前記中間配列のヌクレオチド数よりも少ない、実施形態５または６による方法。
【００２４】
実施形態１０
第３プライマー成分中のヌクレオチド数が、第１と第２のプライマー成分とハイブリダイズした標的ポリヌクレオチドの部分の間に位置する標的ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも、１〜２００ヌクレオチド、１〜１５０ヌクレオチド、１〜１００ヌクレオチド１〜７５ヌクレオチド、１〜５０ヌクレオチド、１〜２５ヌクレオチド、５〜２００ヌクレオチド、５〜１５０ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜７５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド、５〜２５ヌクレオチド、１０〜２００ヌクレオチド、１０〜１５０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜７５ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、または１０〜２５ヌクレオチド少ない、実施形態９による方法。
【００２５】
実施形態１１
第１プライマー成分中のヌクレオチド数が第２プライマー成分中のヌクレオチド数よりも多い、実施形態１から１０のいずれか１つによる方法。
【００２６】
実施形態１２
２本鎖デュプレックスの中間部の前記少なくとも１本の鎖が標的ポリヌクレオチド鎖の成分である、実施形態１から４のいずれか１つによる方法。
【００２７】
実施形態１３
標的ポリヌクレオチド鎖の成分がヌクレオチドの前記中間配列からなる、実施形態１２による方法。
【００２８】
実施形態１４
第１プライマー成分と第２プライマー成分が相補的塩基対合によりハイブリダイズして標的ポリヌクレオチド鎖の非連続成分を分離することで、非連続成分が並列し、標的ポリヌクレオチド鎖中にハイブリダイズしないヌクレオチドを含むループ部分が生成される、実施形態１２または１３による方法。
【００２９】
実施形態１５
プライマーオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドが相補的塩基対合により標的オリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズする、実施形態１２から１４のいずれか１つによる方法。
【００３０】
実施形態１６
標的ポリヌクレオチドのループ部分が、１〜２００ヌクレオチド、１〜１５０ヌクレオチド、１〜１００ヌクレオチド、１〜７５ヌクレオチド、１〜５０ヌクレオチド１〜２５ヌクレオチド、５〜２００ヌクレオチド、５〜１５０ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜７５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド５〜２５ヌクレオチド、１０〜２００ヌクレオチド、１０〜１５０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜７５ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチドまたは１０〜２５ヌクレオチドを含む、実施形態１４または１５による方法。
【００３１】
実施形態１７
前記接触させることが、
前記第１標的ポリヌクレオチド鎖の相補鎖である第２標的ポリヌクレオチド鎖と塩基対相補性を共有する第２プライマーオリゴヌクレオチドを接触させることと、
第２標的ポリヌクレオチド鎖を鋳型として用い、ポリメラーゼ酵素を用いて第２プライマーオリゴヌクレオチドを伸長させて第２単位複製配列を生成することを含む、実施形態１から１６のいずれか１つによる方法。
【００３２】
実施形態１８
前記検出することが、第２単位複製配列を検出することを含む、実施形態１７による方法
【００３３】
実施形態１９
前記方法が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のうちのいずれか１または複数を含む、実施形態１から１７のいずれか１つによる方法。
【００３４】
実施形態２０
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の２以上の個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
第１プライマー成分と第２プライマー成分がそれぞれ、多型領域の上流に位置する標的ポリヌクレオチド鎖の成分と配列相補性を共有する第１プライマー成分と、多型領域の下流に位置する標的ポリヌクレオチド鎖の成分と配列相補性を共有する第２プライマー成分により、集団の複数のメンバーとハイブリダイズすることが可能であり、
多型領域は、第１プライマー成分と第２プライマー成分が標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするとき、プライマーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないままである、実施形態１から１９のいずれか１つによる方法。
【００３５】
実施形態２１
多型領域が、多型領域のヌクレオチド配列が標的ポリヌクレオチドの前記集団の２以上の個体メンバー間で異なるように１または複数ヌクレオチドの置換を有する、実施形態２０または２１による方法。
【００３６】
実施形態２２
多型領域が、多型領域のヌクレオチド配列が標的ポリヌクレオチドの前記集団の２以上の個体メンバー間で異なるように１または複数ヌクレオチドの置換を有する、実施形態２０または２１による方法。
【００３７】
実施形態２３
標的ポリヌクレオチド鎖が一塩基多型（ＳＮＰ）および／または点変異を含み、
単位複製配列が
（ｉ）ＳＮＰに相補的なヌクレオチドおよび／または
（ｉｉ）点変異に相補的なヌクレオチドを含み、
第１または第２プライマー成分が上記（ｉ）および／または（ｉｉ）と相補的塩基対合によりハイブリダイズできる、実施形態１から１９のいずれか１つによる方法。
【００３８】
実施形態２４
第２プライマー成分が、
第２プライマー成分の３’末端、
第２プライマー成分の３’末端の１、２、３、４、５ヌクレオチドまたは５以上のヌクレオチド上流、
第２プライマー成分の３’末端（ここで第２プライマー成分は、３’末端の２、３、４、５、６ヌクレオチドまたは６以上のヌクレオチド上流に位置する標的ポリヌクレオチドに非相補的なヌクレオチドも含む）、または
第２プライマー成分の３’末端の１、２、３、４、５ヌクレオチドまたは５以上のヌクレオチド上流（ここで第２プライマー成分は、標的ポリヌクレオチドに非相補的なさらなるヌクレオチドも含み、前記さらなるヌクレオチドはＳＮＰまたは点変異に相補的な前記ヌクレオチドの３’または５’に位置する）
に位置する、ＳＮＰに相補的なヌクレオチドまたは点変異に相補的なヌクレオチドを含む、実施形態２３による方法。
【００３９】
実施形態２５
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の少なくとも２つの個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
多型領域が、多型領域が標的ポリヌクレオチドの前記集団の２以上の個体メンバー間で異なるように１または複数ヌクレオチドの欠失を含み、
第１プライマー成分または第２プライマー成分が、前記標的ポリヌクレオチド鎖中の多型領域に相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能であり、多型領域は集団メンバーの１サブセットのみの標的ポリヌクレオチド鎖中に存在する、実施形態１から１９のいずれか１つによる方法。
【００４０】
実施形態２６
単位複製配列が生成したかどうかを前記検出することが、二本鎖ＤＮＡおよび／または単位複製配列配列特異的プローブに結合する色素により与えられるシグナルを測定することを含む、実施形態１から２５のいずれか１つによる方法。
【００４１】
実施形態２７
二本鎖ＤＮＡに結合する色素がＳＹＢＲグリーンである、実施形態２６による方法。
【００４２】
実施形態２８
配列特異的プローブが分子標識、マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）プローブまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブである、実施形態２６による方法。
【００４３】
実施形態２９
前記検出することが、少なくとも２以上のパートザイム成分オリゴヌクレオチドを含む多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）の使用を含み、ここで少なくとも第１パートザイム成分と第２パートザイム成分が単位複製配列の存在下で自己集合して触媒活性ＭＮＡザイムを形成し、ここで第１および第２パートザイム成分は基質アーム部分、触媒コア部分およびセンサーアーム部分を含み、
自己集合時、第１および第２パートザイム成分のセンサーアーム部分がＭＮＡザイムのセンサーアームとして作用し、第１および第２パートザイム成分の基質アーム部分がＭＮＡザイムの基質アームとして作用し、第１および第２パートザイム成分の触媒コア部分がＭＮＡザイムの触媒コアとして作用し、
ＭＮＡザイムのセンサーアームが単位複製配列の一部または全部と相補的塩基対合によりハイブリダイズして第１と第２パートザイム成分を近くに維持するので第１と第２パートザイム成分はそれぞれの触媒コア部分と会合してＭＮＡザイムの触媒コアを形成し、触媒コアは少なくとも１つの基質を修飾可能であり、ＭＮＡザイムの基質アームが基質と結合してＭＮＡザイムの触媒コアが基質を修飾でき、そうすることで検出可能な効果が得られる、
実施形態１から２５のいずれか１つによる方法。
【００４４】
実施形態３０
前記ＭＮＡザイムの第１および／または第２センサーアームが、
単位複製配列中の内部成分もしくはその成分または
単位複製配列中の内部成分もしくはその成分に相補的なヌクレオチド配列
を含むかそれからなるヌクレオチドの配列に相補的または実質的に相補的である、実施形態２９による方法。
【００４５】
実施形態３１
前記ＭＮＡザイムの第１および／または第２センサーアームが、
単位複製配列の第１末端成分および／もしくは第２末端成分またはその成分あるいは
単位複製配列の第１末端成分および／もしくは第２末端成分またはその成分に相補的なヌクレオチドの配列
を含むかそれからなる単位複製配列の配列にさらに相補的である、実施形態３０による方法。
【００４６】
実施形態３２
前記ＭＮＡザイムの第１および／または第２センサーアームが、
単位複製配列中の内部成分もしくはその成分を含まないかまたはそれからならない、単位複製配列中のヌクレオチドの配列または
単位複製配列中の内部成分もしくはその成分を含まないかまたはそれからならない単位複製配列中のヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチドの配列
に相補的または実質的に相補的である、実施形態２９による方法。
【００４７】
実施形態３３
前記ＭＮＡザイムの第１および／または第２センサーアームが、
標的ポリヌクレオチド鎖中に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）および／または点変異または
標的ポリヌクレオチド鎖中に存在するＳＮＰに相補的なヌクレオチドおよび／または点変異に相補的なヌクレオチド
に相補的なヌクレオチドを含む、実施形態２９から３２のいずれか１つによる方法。
【００４８】
実施形態３４
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の２以上の個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
前記ＭＮＡザイムの第１および／または第２センサーアームが、
集団の所与のメンバーの多型領域もしくはその成分、または
集団の所与のメンバーの多型領域もしくはその成分に相補的なヌクレオチドの配列
を含むかそれからなる単位複製配列中の配列にさらに相補的である、実施形態２９から３３のいずれか１つによる方法。
【００４９】
実施形態３５
多型領域が、ヌクレオチドの１または複数の欠失、挿入および／または置換を含み、多型領域の配列が集団の個々のメンバー間で異なる、実施形態３４による方法。
【００５０】
実施形態３６
ＭＮＡザイムのセンサーアームが、第１センサーアーム成分、第２センサーアーム成分および第３センサーアーム成分を含むかそれらからなり、
第１センサーアーム成分は相補的塩基対合により単位複製配列とハイブリダイズでき、
第２センサーアーム成分は相補的塩基対合により単位複製配列とハイブリダイズでき、
第３センサーアーム成分は第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置し、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分が単位複製配列とハイブリダイズするときに相補的塩基対合により単位複製配列とハイブリダイズできない、実施形態２９による方法。
【００５１】
実施形態３７
第３センサーアーム成分中のヌクレオチドの数は、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分とハイブリダイズした単位複製配列の部分の間に位置する単位複製配列中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数と等しいかそれよりも多い、実施形態３６による方法。
【００５２】
実施形態３８
第３センサーアーム成分中のヌクレオチドの数は、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分とハイブリダイズした単位複製配列の部分の間に位置する単位複製配列中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも少ない、実施形態３６による方法。
【００５３】
実施形態３９
第３センサーアーム成分中のヌクレオチドの数は、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分とハイブリダイズした単位複製配列の部分の間に位置する単位複製配列中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも１〜５０ヌクレオチド、１〜４０ヌクレオチド、１〜３０ヌクレオチド１〜２０ヌクレオチド、１〜１０ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド５〜２０ヌクレオチド、５〜１０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチドまたは１０〜２０ヌクレオチド少ない、実施形態３８による方法。
【００５４】
実施形態４０
第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分が単位複製配列の別々の非連続成分と相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能なので、非連続成分が並列し、単位複製配列中にハイブリダイズしないヌクレオチドを含むループ部分が生成される、実施形態２９による方法。
【００５５】
実施形態４１
単位複製配列のループ部分が、１〜５０ヌクレオチド、１〜４０ヌクレオチド、１〜３０ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチド、１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド５〜２０ヌクレオチド、５〜１０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチドまたは１０〜２０ヌクレオチドを含む、実施形態４０による方法。
【００５６】
実施形態４２
単位複製配列のループ部分が、単位複製配列の前記内部成分を含む、実施形態４０または４１による方法。
【００５７】
実施形態４３
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の２以上の個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
前記準備することが、プライマーオリゴヌクレオチドの複数の形態を準備することを含み、プライマーオリゴヌクレオチドの異なる形態は、
多型領域の異なる形態または
多型領域の１または複数の型に隣接または実質的に隣接する標的ポリヌクレオチド鎖の一部分と塩基対相補性を共有し、
プライマーオリゴヌクレオチドを前記接触させることが、標的ポリヌクレオチド集団の１または複数のメンバーを含んでいる可能性がある試料をプライマーオリゴヌクレオチドの前記複数の形態とハイブリダイゼーションに適した条件下で接触させることを含み、
プライマーオリゴヌクレオチドの複数の形態がそれぞれ、第１プライマー成分と第２プライマー成分の間に位置し、標的ポリヌクレオチド鎖中のヌクレオチドの前記中間配列と塩基対相補性を共有しないヌクレオチドの配列からなる前記第３プライマー成分を含む、実施形態５から１１のいずれか１つによる方法。
【００５８】
実施形態４４
前記検出することが、第１センサーアーム成分、第２センサーアーム成分および第３センサーアーム成分を含むＭＮＡザイムを用いることを含み、
第１センサーアーム成分は単位複製配列の内部成分と、また所望により単位複製配列の第１末端成分とハイブリダイズでき、
第２センサーアーム成分は単位複製配列の第２末端成分と相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第３センサーアーム成分は第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置し、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分が単位複製配列とハイブリダイズするときに前記多型領域または前記多型領域に相補的なヌクレオチドの配列と相補的塩基対合によりハイブリダイズできない、実施形態４３による方法。
【００５９】
実施形態４５
多型領域を含む単位複製配列の複数の形態が、試料をポリメラーゼ酵素と前記接触させることにより生成され、単位複製配列の前記各複数の形態の多型領域が異なり、
センサーアームが、第１センサーアーム成分、第２センサーアーム成分および多型領域を含むかそれからなる単位複製配列中のヌクレオチドの配列に非相補的な第３センサーアーム成分を含み、
第１センサーアーム成分は、多型領域の上流の単位複製配列の前記形態のいずれかと相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第２センサーアーム成分は、多型領域の下流の単位複製配列の前記形態のいずれかと相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第３センサーアーム成分は第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置し、単位複製配列の前記形態のいずれかの前記多型領域と相補的塩基対合によりハイブリダイズできない、実施形態４４による方法。
【００６０】
実施形態４６
多型領域を含む単位複製配列の複数の形態が、試料をポリメラーゼ酵素と前記接触させることにより生成され、単位複製配列の前記形態の多型領域が異なり、
センサーアームが、第１センサーアーム成分および第２センサーアーム成分を含むかそれらからなり、
第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分が相補的塩基対合によりハイブリダイズして前記単位複製配列の任意の所与の形態の非連続成分を分離することで非連続成分が並列し、ハイブリダイズしないヌクレオチドを含む単位複製配列内にループ部分が形成され、
ループ部分のハイブリダイズしないヌクレオチドは単位複製配列の多型領域を含む、実施形態４３による方法。
【００６１】
実施形態４７
多型領域が、標的ポリヌクレオチドの集団の前記２以上の個体メンバーが異なり得るように、ヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換のうちのいずれか１または複数を含む、実施形態４３から４６のいずれか１つによる方法。
【００６２】
実施形態４８
プライマーオリゴヌクレオチドおよび／または標的ポリヌクレオチドおよび／または単位複製配列が、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの組合せを含むかそれらからなる、実施形態１から４７のいずれか１つによる方法。
【００６３】
実施形態４９
標的ポリヌクレオチドおよび／または単位複製配列が、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはＲＮＡである、実施形態１から４８のいずれか１つによる方法。
【００６４】
実施形態５０
プライマーオリゴヌクレオチドが機能的に活性な触媒的核酸に相補的なヌクレオチドの配列を含む、実施形態１〜２９、３２、３６〜４１、４３または４６のいずれか１つによる方法。
【００６５】
実施形態５１
前記単位複製配列が前記機能的に活性な触媒的核酸を含み、単位複製配列が生じたかどうかを前記検出することが、単位複製配列中に存在する前記機能的に活性な触媒的核酸の触媒活性を検出することを含む、実施形態５０による方法。
【００６６】
実施形態５２
機能的に活性な触媒的核酸がＤＮＡザイムまたはリボザイムである、実施形態５０または５１による方法。
【００６７】
実施形態５３
単位複製配列中に存在する前記機能的に活性な触媒的核酸の触媒活性を前記検出することが、単位複製配列を前記機能的に活性な触媒的核酸の基質と接触させることを含む、実施形態５１または５２による方法。
【００６８】
実施形態５４
単離されたプライマーまたはパートザイムオリゴヌクレオチドであって、
オリゴヌクレオチドの５’末端で終止し、第２ポリヌクレオチドの第２部分と相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第１成分、
オリゴヌクレオチドの３’末端で終止し、第２ポリヌクレオチドの第２部分と相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第２成分、および
第１と第２成分の間に位置し、第１と第２成分が第２ポリヌクレオチドとハイブリダイズするとき第２ポリヌクレオチドのヌクレオチドの反対の配列と塩基対相補性を共有しない少なくとも４つのヌクレオチドの配列を含む第３成分を含み、
第３成分はオリゴヌクレオチドの３’ハーフに部分的または完全に位置する、単離されたプライマーまたはパートザイムオリゴヌクレオチド。
【００６９】
実施形態５５
第３成分が、第２ポリヌクレオチドのヌクレオチドの反対の配列と塩基対相補性を共有しない、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７または少なくとも８ヌクレオチドの配列を含む、実施形態５４によるオリゴヌクレオチド。
【００７０】
実施形態５６
第１成分中のヌクレオチドの数が、
第３成分中のヌクレオチドの数よりも少ないか、
第３成分中のヌクレオチドの数よりも多い、実施形態５４または５５によるオリゴヌクレオチド。
【００７１】
実施形態５７
オリゴヌクレオチドがＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＲＮＡまたは任意のそれらの組合せを含む、実施形態５４から５６のいずれか１つによるオリゴヌクレオチド。
【００７２】
実施形態５８
オリゴヌクレオチドがパートザイムセンサーアームの成分である、実施形態５４から５７のいずれか１つによるオリゴヌクレオチド。
【００７３】
実施形態５９
実施形態１から５３のいずれか１つによる方法における、実施形態５４から５８のいずれか１つによるオリゴヌクレオチドの使用。
【００７４】
実施形態６０
第２ポリヌクレオチドに相補的塩基対合によりハイブリダイズする実施形態５４〜５８のいずれか１つのオリゴヌクレオチドを含む、単離された２本鎖核酸デュプレックスであって、
オリゴヌクレオチドの第１成分がオリゴヌクレオチドの５’末端で終止し、第２ポリヌクレオチドの第１部分と相補的塩基対合によりハイブリダイズし、
オリゴヌクレオチドの第２成分がオリゴヌクレオチドの３’末端で終止し、第２ポリヌクレオチドの第２部分と相補的塩基対合によりハイブリダイズし、
オリゴヌクレオチドの第３成分が前記第１と第２成分の間に位置し、第２ポリヌクレオチドのヌクレオチドの反対の配列と塩基対相補性を共有しない少なくとも２つのヌクレオチドの配列を含み、
オリゴヌクレオチドの第３成分がオリゴヌクレオチドの３’ハーフに部分的または完全に位置する、２本鎖核酸デュプレックス。
【００７５】
実施形態６１
前記第３成分中のヌクレオチドの数が、前記第１と第２の成分とハイブリダイズした第２ポリヌクレオチドの部分の間に位置する第２ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数と等しい、実施形態６０による２本鎖核酸デュプレックス。
【００７６】
実施形態６２
前記第３成分中のヌクレオチドの数が、前記第１と第２の成分とハイブリダイズした第２ポリヌクレオチドの部分の間に位置する第２ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも多い、実施形態６１による２本鎖核酸デュプレックス。
【００７７】
実施形態６３
前記第３成分中のヌクレオチドの数が、前記第１と第２の成分とハイブリダイズした第２ポリヌクレオチドの部分の間に位置する第２ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも少ない、実施形態６１による２本鎖核酸デュプレックス。
【００７８】
実施形態６４
前記第３中のヌクレオチドの数が、前記第１と第２成分にハイブリダイズした第２ポリヌクレオチドの部分の間に位置する第２ポリヌクレオチドのハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも１〜２００ヌクレオチド、１〜１５０ヌクレオチド、１〜１００ヌクレオチド、１〜７５ヌクレオチド、１〜５０ヌクレオチド１〜２５ヌクレオチド、５〜２００ヌクレオチド、５〜１５０ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜７５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド５〜２５ヌクレオチド、１０〜２００ヌクレオチド、１０〜１５０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜７５ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチドまたは１０〜２５ヌクレオチド少ない、実施形態６１による２本鎖核酸デュプレックス。
【００７９】
実施形態６５
オリゴヌクレオチドおよび／または第２ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはＲＮＡである、実施形態６０から６４のいずれか１つによる２本鎖核酸デュプレックス。
【００８０】
実施形態６６
第１センサーアーム成分および第２センサーアーム成分を含むかそれらからなるセンサーアームを含む多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）であって、
第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分は相補的塩基対合により集合促進因子ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能であり、それによって２本鎖デュプレックスを形成し、少なくともデュプレックスの中間成分の１本の鎖がデュプレックスの対向鎖にハイブリダイズしないままの少なくとも２個のヌクレオチドを含む。
【００８１】
実施形態６７
センサーアームが第１センサーアーム成分、第２センサーアーム成分および第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置する第３センサーアーム成分を含むかそれらからなり、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分が集合促進因子ポリヌクレオチドに前記ハイブリダイズする際に、第３センサーアーム成分が、前記集合促進因子ポリヌクレオチドとの塩基対相補性が不存在なので、集合促進因子ポリヌクレオチドにハイブリダイズできない、実施形態６６によるＭＮＡザイム。
【００８２】
実施形態６８
第３センサーアーム成分中のヌクレオチドの数は、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分とハイブリダイズした集合促進因子ポリヌクレオチドの部分の間に位置する集合促進因子ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数と等しいかまたはそれよりも多い、実施形態６７によるＭＮＡザイム。
【００８３】
実施形態６９
第３センサーアーム成分中のヌクレオチドの数は、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分とハイブリダイズした集合促進因子ポリヌクレオチドの部分の間に位置する集合促進因子ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも少ない、実施形態６７によるＭＮＡザイム。
【００８４】
実施形態７０
第３センサーアーム成分中のヌクレオチド数が、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分とハイブリダイズした集合促進因子ポリヌクレオチドの部分の間に位置する集合促進因子ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも、１〜２００ヌクレオチド、１〜１５０ヌクレオチド、１〜１００ヌクレオチド、１〜７５ヌクレオチド、〜５０ヌクレオチド、１〜２５ヌクレオチド、５〜２００ヌクレオチド、５〜１５０ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜７５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド５〜２５ヌクレオチド、１０〜２００ヌクレオチド、１０〜１５０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜７５ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチドまたは１０〜２５ヌクレオチド少ない、実施形態６９によるＭＮＡザイム。
【００８５】
実施形態７１
第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分が集合促進因子ポリヌクレオチドの別々の非連続成分と相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能なので、非連続成分が並列し、集合促進因子ポリヌクレオチド中にハイブリダイズしないヌクレオチドを含むループ部分が生成される、実施形態６６によるＭＮＡザイム。
【００８６】
実施形態７２
集合促進因子ポリヌクレオチドのループ部分が、１〜５０ヌクレオチド、１〜４０ヌクレオチド、１〜３０ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチド、１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド５〜２０ヌクレオチド、５〜１０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチドまたは１０〜２０ヌクレオチドを含む、実施形態７１によるＭＮＡザイム。
【００８７】
実施形態７３
集合促進因子ポリヌクレオチドが、ＭＮＡザイムによる検出の標的ポリヌクレオチドである、実施形態６６から７２のいずれか１つによるＭＮＡザイム。
【００８８】
実施形態７４
前記集合促進因子ポリヌクレオチドに相補的塩基対合によりハイブリダイズした実施形態６６から７３のいずれか１つのＭＮＡザイムを含む核酸複合体。
【００８９】
実施形態７５
ポリヌクレオチド標的が前記集合促進因子である、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在または不存在を検出するための、実施形態６６から７３のいずれか１つによるＭＮＡザイムの使用。
【００９０】
実施形態７６
試料中の標的ポリヌクレオチドの存在または不存在を決定する方法であって、
標的ポリヌクレオチドに相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能なプライマーオリゴヌクレオチドを準備すること、
標的ポリヌクレオチドを含んでいる可能性がある試料を、プライマーオリゴヌクレオチドと、プライマーオリゴヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドの相補的塩基対合によるハイブリダイゼーションに適した条件下で接触させることであって、そうすることで２本鎖デュプレックスが生成され、
試料を標的ポリヌクレオチドを鋳型として用いることができるポリメラーゼ酵素と接触させてデュプレックスのプライマーオリゴヌクレオチドを伸長させて、単位複製配列を生成すること、および
実施形態６６によるＮＭＡザイムを用いて単位複製配列が生成したかどうかを検出すること（ここで、単位複製配列の検出は、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示し、単位複製配列の検出失敗は、試料中の標的ポリヌクレオチドの不存在を示す）を含む、方法。
【００９１】
実施形態７７
前記第１センサーアーム成分が、
（ｉ）単位複製配列もしくはその成分または
（ｉｉ）単位複製配列もしくはその成分に相補的なヌクレオチドの配列と塩基対相補性を共有するヌクレオチドの配列を含み、
前記検出することが、前記第１センサーアーム成分が相補的塩基対合により上記（ｉ）か（ｉｉ）にハイブリダイズするかどうかを決定することを含む、実施形態７６による方法。
【００９２】
実施形態７８
標的ポリヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドの集団の２以上の個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
標的ポリヌクレオチド集団の少なくとも１つの前記標的ポリヌクレオチドに相補的塩基対合によりそれぞれハイブリダイズ可能な一連のプライマーオリゴヌクレオチドが準備され、ここで各前記プライマーオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド集団の前記メンバーの一部のみに存在する特定の形態の多型領域と塩基対相補性を共有し、
各前記プライマーオリゴヌクレオチドは、試料をポリメラーゼ酵素と前記接触させた後、前記単位複製配列の各集団に組み込まれる同一タグ部分ヌクレオチド配列を含み、ここで単位複製配列集団の各前記メンバーは、単位複製配列集団の各前記メンバーの一部にしか存在しない多型領域を含み、
前記検出することが、ＭＮＡザイムの前記第１センサーアームが、単位複製配列集団の前記メンバーのタグ部分と相補的塩基対合によりハイブリダイズするかどうかを決定することを含む、実施形態７６による方法。
【００９３】
実施形態７９
試料中の標的ポリヌクレオチドの存在または不存在を決定する方法であって、ここで標的ポリヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドの集団の２以上の個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
相補的塩基対合により標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なプライマーオリゴヌクレオチドを準備することであって、ここでプライマーオリゴヌクレオチドは、前記集団メンバーの一部のみに存在する多型領域の特異的形態と、または多型領域の特異的形態に隣接もしくは実質的に隣接する標的ポリヌクレオチドの一部分と、塩基対相補性を共有し、
標的ポリヌクレオチドを含んでいる可能性がある試料を、プライマーオリゴヌクレオチドと、プライマーオリゴヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドの相補的塩基対合によるハイブリダイゼーションに適した条件下で接触させることであって、そうすることで２本鎖デュプレックスが生成され、
試料を標的ポリヌクレオチドを鋳型として用いることができるポリメラーゼ酵素と接触させてデュプレックスのプライマーオリゴヌクレオチドを伸長させて、多型領域の特異的形態を含む単位複製配列を生成すること、および
実施形態６６によるＮＭＡザイムを用いて単位複製配列が生成したかどうかを検出すること（ここで、単位複製配列の検出は、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示し、単位複製配列の検出失敗は、試料中の標的ポリヌクレオチドの不存在を示す）を含む、方法。
【００９４】
実施形態８０
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のうちのいずれか１または複数により、前記単位複製配列の複製を産生することを含む、実施形態７６から７９のいずれか１つによる方法。
【００９５】
実施形態８１
前記準備することが、プライマーオリゴヌクレオチドの複数の形態を準備することを含み、ここでプライマーオリゴヌクレオチドの異なる形態は、多型領域の異なる形態と、または多型領域の１または複数の形態に隣接もしくは実質的に隣接する標的ポリヌクレオチドの一部分と、塩基対相補性を共有し、
プライマーオリゴヌクレオチドを前記接触させることが、標的ポリヌクレオチド集団の１または複数のメンバーを含んでいる可能性がある試料をプライマーオリゴヌクレオチドの複数の形態とハイブリダイゼーションに適した前記条件下で接触させることを含み、
前記検出することが、異なる多型領域を含む単位複製配列の複数の形態が生じたかどうかを増幅ＭＮＡザイムを用いて検出することを含む、実施形態７９または８０による方法。
【００９６】
実施形態８２
試料をポリメラーゼ酵素と前記接触させることにより単位複製配列の複数の形態が生じ、ここで単位複製配列の複数の形態の多型領域は異なり、
ＭＮＡザイムのセンサーアームは単位複製配列の異なる部分に相補的なヌクレオチドの配列を含む第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分および第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置する第３センサーアーム成分を含むかそれらからなり、
第１センサーアーム成分は、多型領域の上流の単位複製配列の前記形態のいずれかと相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第２センサーアーム成分は、多型領域の下流の単位複製配列の前記形態のいずれかと相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第３センサーアーム成分は第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置し、第３センサーアーム成分中に単位複製配列のいずれかの前記形態の多型領域と塩基対相補性を共有するヌクレオチドの配列が存在しないので、相補的塩基対合により単位複製配列のいずれかの前記形態の多型領域にハイブリダイズできない、実施形態７９から８１のいずれか１つによる方法。
【００９７】
実施形態８３
第３センサーアーム成分中のヌクレオチドの数は、多型領域を含む単位複製配列中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数と等しいかそれよりも多い、実施形態８２による方法。
【００９８】
実施形態８４
第３センサーアーム成分中のヌクレオチドの数は、多型領域を含む単位複製配列中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも少ない、実施形態８２による方法。
【００９９】
実施形態８５
第３センサーアーム成分中のヌクレオチドの数は、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分にハイブリダイズした集合促進因子ポリヌクレオチドの部分の間に位置する集合促進因子ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも１〜５０ヌクレオチド、１〜４０ヌクレオチド、１〜３０ヌクレオチド１〜２０ヌクレオチド、１〜１０ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド５〜２０ヌクレオチド、５〜１０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチドまたは１０〜２０ヌクレオチド少ない、実施形態８４による方法。
【０１００】
実施形態８６
多型領域を含む単位複製配列の複数の形態が、試料をポリメラーゼ酵素と前記接触させることにより生成され、単位複製配列の前記形態の多型領域が異なり、
センサーアームが、第１センサーアーム成分および第２センサーアーム成分を含むかそれらからなり、
第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分が相補的塩基対合によりハイブリダイズして前記単位複製配列の任意の所与の形態の非連続成分を分離することで非連続成分が並列し、単位複製配列中にハイブリダイズしないヌクレオチドを含むループ部分が形成され、
単位複製配列中のハイブリダイズしないヌクレオチドは多型領域を含む、実施形態７９または８０による方法。
【０１０１】
実施形態８７
標的ポリヌクレオチド中ハイブリダイズしないヌクレオチドを含むループ部分が、１〜２００ヌクレオチド、１〜１５０ヌクレオチド、１〜１００ヌクレオチド、１〜７５ヌクレオチド、〜５０ヌクレオチド、１〜２５ヌクレオチド、５〜２００ヌクレオチド、５〜１５０ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜７５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド５〜２５ヌクレオチド、１０〜２００ヌクレオチド、１０〜１５０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜７５ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチドまたは１０〜２５ヌクレオチドを含む、実施形態８６による方法。
【０１０２】
実施形態８８
標的ポリヌクレオチドの１または複数の増幅された複製を提供するために酵素反応を用いることをさらに含む、実施形態８１から８７のいずれか１つによる方法。
【０１０３】
実施形態８９
標的ポリヌクレオチドのプライマーオリゴヌクレオチドとは違う成分に実質的に相補的である第２オリゴヌクレオチドを用いて新生ポリヌクレオチドの１または複数を増幅することを含む、実施形態８８による方法。
【０１０４】
実施形態９０
多型領域が、標的ポリヌクレオチドの集団の前記個体メンバーが異なり得るように、ヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換のうちのいずれか１または複数を含む、実施形態７８から８９のいずれか１つによる方法。
【０１０５】
実施形態９１
プライマーオリゴヌクレオチドおよび／または標的ポリヌクレオチドおよび／または単位複製配列および／またはＭＮＡザイムが、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの組合せを含むかそれらからなる、実施形態７６から９０のいずれか１つによる方法。
【０１０６】
実施形態９２
標的ポリヌクレオチドおよび／または単位複製配列が、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはＲＮＡである、実施形態７６から９１のいずれか１つによる方法。
【０１０７】
実施形態９３
前記ＭＮＡザイムが、検出可能部分とクエンチャー部分を含む基質を修飾可能であり、検出可能な効果が前記検出可能部分とクエンチャー部分を分離するＭＮＡザイムにより基質が切断されることでもたらされ、それによって試料中の標的ポリヌクレオチドの存在が示される、実施形態２９から４２または７６から９２のいずれか１つによる方法。
【０１０８】
実施形態９４
ＭＮＡザイムによる基質の修飾で産生される検出可能な効果を増幅することをさらに含む、実施形態９３による方法。
【０１０９】
実施形態９５
標的ポリヌクレオチドが細菌、ウイルス、真菌／酵母、原生生物または線虫由来である、実施形態２９から４２または７６から９３のいずれか１つによる方法。
【０１１０】
実施形態９６
標的ポリヌクレオチドがエンテロウイルス由来である、実施形態２９から４２または７６から９３のいずれか１つによる方法。
【０１１１】
実施形態９７
方法がインビトロまたはエクスビボで実施される、実施形態１から５３または７６から９６のいずれか１つによる方法。
【０１１２】
実施形態９８
試料が標的ポリヌクレオチドの集団を含み、
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の少なくとも２つの個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
前記準備することが、プライマーオリゴヌクレオチドの２つの形態を準備することを含み、ここで
プライマーオリゴヌクレオチドの第１の前記形態の第１または第２プライマー成分が、標的ポリヌクレオチド集団の第１メンバーの標的ポリヌクレオチド鎖の多型領域と塩基対相補性を共有し、
プライマーオリゴヌクレオチドの第２の前記形態の第１または第２プライマー成分が、標的ポリヌクレオチド集団の第２メンバーの標的ポリヌクレオチド鎖の多型領域と塩基対相補性を共有し、
標的ポリヌクレオチド集団の前記第１および第２メンバーの多型領域のヌクレオチド配列が異なり、
プライマーオリゴヌクレオチドの第１および第２形態の第３成分のヌクレオチド配列が異なり、
試料を前記接触させることが、試料をプライマーオリゴヌクレオチドの第１および第２形態と接触させることを含み、
試料をポリメラーゼ酵素と前記接触させることで前記単位複製配列の集団が生じ、ここで
前記単位複製配列集団の第１メンバーが、標的ポリヌクレオチド集団の第１メンバーの前記多型領域と配列相補性を共有する末端成分を含み、
前記単位複製配列集団の第２メンバーが、標的ポリヌクレオチド集団の第２メンバーの前記多型領域と配列相補性を共有する末端成分を含み、
前記単位複製配列集団の前記第１および第２メンバーの内部成分のヌクレオチド配列が異なる、実施形態５から１０のいずれか１つによる方法。
【０１１３】
実施形態９９
試料が標的ポリヌクレオチドの集団を含み、
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の少なくとも２つの個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
前記準備することが、プライマーオリゴヌクレオチドの２つの形態を準備することを含み、ここで
プライマーオリゴヌクレオチドの第１の前記形態の第１または第２プライマー成分が、標的ポリヌクレオチド集団の第１メンバーの標的ポリヌクレオチド鎖の多型領域と塩基対相補性を共有し、
プライマーオリゴヌクレオチドの第２の前記形態の第１または第２プライマー成分が、標的ポリヌクレオチド集団の第２メンバーの標的ポリヌクレオチド鎖の多型領域と塩基対相補性を共有し、
標的ポリヌクレオチド集団の前記第１および第２メンバーの多型領域のヌクレオチド配列が異なり、
プライマーオリゴヌクレオチドの第１前記形態にハイブリダイズされた標的ポリヌクレオチド鎖の前記非連続成分の間のヌクレオチドの数は、プライマーオリゴヌクレオチドの第２前記形態にハイブリダイズされた標的ポリヌクレオチド鎖の前記非連続成分の間のヌクレオチドの数と異なり、
プライマーオリゴヌクレオチドの第１形態の標的ポリヌクレオチド鎖への前記ハイブリダイゼーションにより生成されたループ部分のヌクレオチド配列は、プライマーオリゴヌクレオチドの第２形態の標的ポリヌクレオチド鎖への前記ハイブリダイゼーションにより生成されたループ部分のヌクレオチド配列と異なり、
試料を前記接触させることが、試料をプライマーオリゴヌクレオチドの第１および第２形態と接触させることを含み、
試料をポリメラーゼ酵素と前記接触させることで前記単位複製配列の集団が生じ、ここで
前記単位複製配列集団の第１メンバーが、標的ポリヌクレオチド集団の第１メンバーの前記多型領域と配列相補性を共有する末端成分を含み、
前記単位複製配列集団の第２メンバーが、標的ポリヌクレオチド集団の第２メンバーの前記多型領域と配列相補性を共有する末端成分を含み、
前記単位複製配列集団の前記第１および第２メンバーの内部成分のヌクレオチド配列が異なる、実施形態１４から１６のいずれか１つによる方法。
【０１１４】
実施形態１００
多型領域がヌクレオチドの１または複数の欠失、挿入および／または置換を含み、多型領域の配列が標的ポリヌクレオチド集団の第１と第２メンバーの間で異なる、実施形態９８または９９による方法。
【０１１５】
実施形態１０１
多型領域がＳＮＰおよび／または点変異を含む、実施形態１００による方法。
【０１１６】
実施形態１０２
多型領域の長さが標的ポリヌクレオチド集団の第１と第２メンバーの間で異なる、実施形態１００による方法。
【０１１７】
実施形態１０３
単位複製配列が生成したかどうかを前記検出することが、二本鎖ＤＮＡおよび／または単位複製配列配列特異的プローブに結合する色素により与えられるシグナルを測定することを含む、実施形態９８から１０２のいずれか１つによる方法。
【０１１８】
実施形態１０４
二本鎖ＤＮＡに結合する色素がＳＹＢＲグリーンである、実施形態１０３による方法。
【０１１９】
実施形態１０５
前記方法が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のうちのいずれか１または複数を含む、実施形態９８から１０４のいずれか１つによる方法。
【０１２０】
実施形態１０６
前記検出することが、単位複製配列の集団の前記第１および第２メンバーの前記生成を融解曲線分析によりモニタリングすることを含む、実施形態１０３から１０５のいずれか１つによる方法。
【０１２１】
実施形態１０７
標的ポリヌクレオチドおよび／または単位複製配列が、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはＲＮＡである、実施形態９８から１０６のいずれか１つによる方法。
【０１２２】
実施形態１０８
前記ＭＮＡザイムが、検出可能部分とクエンチャー部分を含む基質を修飾可能であり、検出可能な効果が前記検出可能部分とクエンチャー部分を分離するＭＮＡザイムにより基質が切断されることでもたらされ、それによって試料中の標的ポリヌクレオチドの存在が示される、実施形態７５による使用。
【０１２３】
実施形態１０９
ＭＮＡザイムによる基質の修飾で産生される検出可能な効果を増幅することをさらに含む、実施形態７５による使用。
【０１２４】
実施形態１１０
オリゴヌクレオチドの第３成分が、配列番号１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５もしくは１９６のいずれか１つに定義されるヌクレオチド配列または前記配列のいずれか１つの相補鎖を含むかそれからなる、実施形態５４から５８のいずれか１つによる単離オリゴヌクレオチド。
【０１２５】
実施形態１１１
実施形態５４から５８、１１０または１１０のいずれか１つによるオリゴヌクレオチドを含むキット。
【０１２６】
実施形態１１２
実施形態６０から６５のいずれか１つによる２本鎖核酸デュプレックスを含むキット。
【０１２７】
実施形態１１３
実施形態６６から７３のいずれか１つによるＭＮＡザイムを含むキット。
【０１２８】
実施形態１１４
実施形態７４による核酸複合体を含むキット。
【０１２９】
実施形態１１５
第１センサーアーム成分は単位複製配列の内部成分と、また所望により単位複製配列の第１末端成分と、相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第２センサーアーム成分は単位複製配列の第２末端成分と相補的塩基対合によりハイブリダイズできる、実施形態３６による方法。
【０１３０】
実施形態１１６
第１センサーアーム成分が単位複製配列の内部成分および単位複製配列の第１末端成分と相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第２センサーアーム成分が単位複製配列の第２末端成分と相補的塩基対合によりハイブリダイズできる、実施形態１１５による方法。
【０１３１】
実施形態１１７
プライマーオリゴヌクレオチドの第３成分が機能的に活性な触媒的核酸に相補的なヌクレオチドの配列を含む、実施形態５０による方法。
【０１３２】
本発明は、少なくとも部分的には以下の実施形態１〜３３にも関する。
実施形態１
（ｉ）カーステン・ラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）野生型遺伝子、
（ｉｉ）Ｇ１２ＶまたはＧ１２Ｓ変異をコードするヌクレオチド配列を含むカーステン・ラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）遺伝子または
（ｉｉｉ）エンテロウイルス
の成分である標的ポリヌクレオチドの試料中の存在または不存在を決定する方法であって、
オリゴヌクレオチドの５’末端で終止し、標的ポリヌクレオチドの鎖の第１部分に相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第１プライマー成分と、
オリゴヌクレオチドの３’末端で終止し、標的ポリヌクレオチドの鎖の第２部分に相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第２プライマー成分
を含むプライマーオリゴヌクレオチドを準備すること、
標的ポリヌクレオチドを含んでいる可能性のある試料を、第１プライマー成分と第２プライマー成分を標的ポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズさせるのに適当な条件下で、プライマーオリゴヌクレオチドと接触させることであって、そうすることで２本鎖デュプレックスが形成され（ここでデュプレックスの中間部の少なくとも１本の鎖が、中間部の対向鎖に少なくとも４つのヌクレオチドの配列と塩基対相補性を共有するヌクレオチド配列が存在しないので中間部の対向鎖とハイブリダイズしないままである少なくとも４つのヌクレオチドの配列を含む）、
試料を標的ポリヌクレオチド鎖を鋳型として用いることができるポリメラーゼ酵素と接触させることであって、デュプレックスのプライマーオリゴヌクレオチドを伸長させ、そうすることで第１と第２の末端成分の中間の内部成分を含む単位複製配列が生成され（ここで
単位複製配列の第１末端成分が相補的塩基対合により標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１部分とハイブリダイズ可能であり、
単位複製配列の第２末端成分が相補的塩基対合により標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２部分とハイブリダイズ可能であり、
単位複製配列の第１および第２末端成分の標的ポリヌクレオチド鎖との前記ハイブリダイズにより、単位複製配列の内部成分は、標的ポリヌクレオチド鎖の第１および第２部分の間の内部成分と塩基対相補性を共有しない標的ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチドの中間配列に対向して位置する）および
単位複製配列が生成したかどうかを検出すること（ここで、単位複製配列の検出は、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示し、単位複製配列の検出失敗は、試料中の標的ポリヌクレオチドの不存在を示す）を含む、方法。
【０１３３】
実施形態２
標的ポリヌクレオチドが、Ｇ１２Ｖ変異をコードするヌクレオチド配列を含むカーステン・ラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）遺伝子の成分であり、
プライマーオリゴヌクレオチドが第１プライマー成分と第２プライマー成分の間に位置する第３プライマー成分を含み、
第３プライマー成分は標的ポリヌクレオチド鎖中のヌクレオチドの前記中間配列と塩基対相補性を共有しない、単位複製配列の内部成分中のヌクレオチドの配列と同一のヌクレオチド配列からなり、
プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、５０、５９、６０、６１、６２、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、２９２、２９７、２９３、２９８、２９４、２９９、２９５、３００、２９６、３０１、６６、８７、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９または９９のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなる、実施形態１による方法。
【０１３４】
実施形態３
試料を前記第１標的ポリヌクレオチド鎖の相補鎖である第２標的ポリヌクレオチド鎖と塩基対相補性を共有する第２プライマーオリゴヌクレオチドと接触させることであって、前記接触させることは第２プライマーオリゴヌクレオチドと第２標的ポリヌクレオチド鎖の相補的塩基対合によるハイブリダイゼーションに適した条件下で行われ、
第２標的ポリヌクレオチド鎖を鋳型として用い、ポリメラーゼ酵素を用いて第２プライマーオリゴヌクレオチドを伸長させて第２単位複製配列を生成することを含み、ここで
（ｉ）プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、５０、５９、６０、６１、６２、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、２９２、２９７、２９３、２９８、２９４、２９９、２９５、３００、２９６または３０１のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなり、第２プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号２６に定義される配列を含むかそれからなり、
（ｉｉ）プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号６６または８７に定義される配列を含むかそれからなり、第２プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号６５に定義される配列を含むかそれからなり、
（ｉｉｉ）プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号７０〜７９または９９のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなり、第２プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号６９に定義される配列を含むかそれからなり、または
（ｉｖ）プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号８７に定義される配列を含むかそれからなり、第２プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号２６または１７１に定義される配列を含むかそれからなる、実施形態２による方法。
【０１３５】
実施形態４
標的ポリヌクレオチドが、Ｇ１２Ｖ変異をコードするヌクレオチド配列を含むカーステン・ラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）遺伝子の成分であり、
第１プライマー成分と第２プライマー成分が相補的塩基対合によりハイブリダイズして標的ポリヌクレオチド鎖の非連続成分を分離することで、非連続成分が並列し、標的ポリヌクレオチド鎖中にハイブリダイズしないヌクレオチドを含むループ部分が生成され、
プライマーオリゴヌクレオチドが配列番号１７７、１７８または１７１のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなる、実施形態１による方法。
【０１３６】
実施形態５
試料を前記第１標的ポリヌクレオチド鎖の相補鎖である第２標的ポリヌクレオチド鎖と塩基対相補性を共有する第２プライマーオリゴヌクレオチドと接触させることであって、前記接触させることは第２プライマーオリゴヌクレオチドと第２標的ポリヌクレオチド鎖の相補的塩基対合によるハイブリダイゼーションに適した条件下で行われ、
第２標的ポリヌクレオチド鎖を鋳型として用い、ポリメラーゼ酵素を用いて第２プライマーオリゴヌクレオチドを伸長させて第２単位複製配列を生成することを含み、ここで
（ｉ）プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号１７７または１７８に定義される配列を含むかそれからなり、第２プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号２６に定義される配列を含むかそれからなり、または
（ｉｉ）プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号１７１に定義される配列を含むかそれからなり、第２プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号８７に定義される配列を含むかそれからなる、実施形態４による方法。
【０１３７】
実施形態６
単位複製配列が生じたかどうかを前記検出することが、第１および第２パートザイムの使用を含み、ここで
（ｉ）第１パートザイムは配列番号２２、２４、２３、４７、５３、５４、６４、１６４、１６５、２８７、２８８、２８９、２９０または２９１のいずれか１つに定義される配列を含み、第２パートザイムは配列番号１８に定義される配列を含み、
（ｉｉ）第１パートザイムは配列番号６４、２４、６７、６８または８８のいずれか１つに定義される配列を含み、第２パートザイムは配列番号６３に定義される配列を含み、または
（ｉｉｉ）第１パートザイムは配列番号２４に定義される配列を含み、第２パートザイムは配列番号１８に定義される配列を含む、実施形態３または５による方法。
【０１３８】
実施形態７
標的ポリヌクレオチドが、Ｇ１２Ｓ変異をコードするヌクレオチド配列を含むカーステン・ラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）遺伝子の成分であり、
プライマーオリゴヌクレオチドが第１プライマー成分と第２プライマー成分の間に位置する第３プライマー成分を含み、
第３プライマー成分は、標的ポリヌクレオチド鎖中のヌクレオチドの前記中間配列と塩基対相補性を共有しない、単位複製配列の内部成分中のヌクレオチドの配列と同一のヌクレオチドの配列からなり、
プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号１６６〜１６９のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなる、実施形態１による方法。
【０１３９】
実施形態８
試料を前記第１標的ポリヌクレオチド鎖の相補鎖である第２標的ポリヌクレオチド鎖と塩基対相補性を共有する第２プライマーオリゴヌクレオチドと接触させることであって、前記接触させることは第２プライマーオリゴヌクレオチドと第２標的ポリヌクレオチド鎖の相補的塩基対合によるハイブリダイゼーションに適した条件下で行われ、
第２標的ポリヌクレオチド鎖を鋳型として用い、ポリメラーゼ酵素を用いて第２プライマーオリゴヌクレオチドを伸長させて第２単位複製配列を生成することを含み、ここで
（ｉ）プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号１６６〜１６９のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなり、第２プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号２６に定義される配列を含むかそれからなり、または
（ｉｉ）プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号１６６に定義される配列を含むかそれからなり、第２プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号１７１に定義される配列を含むかそれからなる、実施形態７による方法。
【０１４０】
実施形態９
標的ポリヌクレオチドが、Ｇ１２Ｓ変異をコードするヌクレオチド配列を含むカーステン・ラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）遺伝子の成分であり、
第１プライマー成分と第２プライマー成分が相補的塩基対合によりハイブリダイズして標的ポリヌクレオチド鎖の非連続成分を分離することで、非連続成分が並列し、標的ポリヌクレオチド鎖中にハイブリダイズしないヌクレオチドを含むループ部分が生成され、
プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号１７０または１７１に定義される配列を含むかそれからなる、実施形態１による方法。
【０１４１】
実施形態１０
試料を前記第１標的ポリヌクレオチド鎖の相補鎖である第２標的ポリヌクレオチド鎖と塩基対相補性を共有する第２プライマーオリゴヌクレオチドと接触させることであって、前記接触させることは第２プライマーオリゴヌクレオチドと第２標的ポリヌクレオチド鎖の相補的塩基対合によるハイブリダイゼーションに適した条件下で行われ、
第２標的ポリヌクレオチド鎖を鋳型として用い、ポリメラーゼ酵素を用いて第２プライマーオリゴヌクレオチドを伸長させて第２単位複製配列を生成することを含み、ここで
（ｉ）プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号１７０に定義される配列を含むかそれからなり、第２プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号２６または１７１に定義される配列を含むかそれからなり、または
（ｉｉ）プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号１７１に定義される配列を含むかそれからなり、第２プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号１６６または１７０に定義される配列を含むかそれからなる、実施形態９による方法。
【０１４２】
実施形態１１
単位複製配列が生じたかどうかを前記検出することが、第１および第２パートザイムの使用を含み、ここで第１パートザイムは配列番号１６１または１６２に定義される配列を含み、第２パートザイムは配列番号１８に定義される配列を含む、実施形態８または１０による方法。
【０１４３】
実施形態１２
標的ポリヌクレオチドはエンテロウイルス遺伝子の成分であり、
プライマーオリゴヌクレオチドが第１プライマー成分と第２プライマー成分の間に位置する第３プライマー成分を含み、第３プライマー成分は、標的ポリヌクレオチド鎖中のヌクレオチドの前記中間配列と塩基対相補性を共有しない、単位複製配列の内部成分中のヌクレオチドの配列と同一のヌクレオチドの配列からなり、
プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号３１７に定義される配列を含むかそれからなる、実施形態１による方法。
【０１４４】
実施形態１３
試料を前記第１標的ポリヌクレオチド鎖の相補鎖である第２標的ポリヌクレオチド鎖と塩基対相補性を共有する第２プライマーオリゴヌクレオチドと接触させることであって、前記接触させることは第２プライマーオリゴヌクレオチドと第２標的ポリヌクレオチド鎖の相補的塩基対合によるハイブリダイゼーションに適した条件下で行われ、
第２標的ポリヌクレオチド鎖を鋳型として用い、ポリメラーゼ酵素を用いて第２プライマーオリゴヌクレオチドを伸長させて第２単位複製配列を生成することを含み、ここでプライマーオリゴヌクレオチドは配列番号３１７に定義される配列を含むかそれからなり、第２プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号３１８に定義される配列を含むかそれからなる、実施形態１２による方法。
【０１４５】
実施形態１４
単位複製配列が生じたかどうかを前記検出することが、第１および第２パートザイムの使用を含み、ここで第１パートザイムは配列番号３１４に定義される配列を含み、第２パートザイムは配列番号３１５に定義される配列を含む、実施形態１３による方法。
【０１４６】
実施形態１５
試料中、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子の成分である標的ポリヌクレオチドの存在または不存在を決定する方法であって、標的ポリヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドの集団の２以上の個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
標的ポリヌクレオチドに相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能なプライマーオリゴヌクレオチドを準備することであって、ここでプライマーオリゴヌクレオチドは、前記集団メンバーの一部のみに存在する多型領域の特異的形態と、または多型領域の特異的形態に隣接もしくは実質的に隣接する標的ポリヌクレオチドの一部分と、塩基対相補性を共有し、
標的ポリヌクレオチドを含んでいる可能性がある試料を、プライマーオリゴヌクレオチドと、プライマーオリゴヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドの相補的塩基対合によるハイブリダイゼーションに適した条件下で接触させることであって、そうすることで２本鎖デュプレックスが生成され、
試料を標的ポリヌクレオチドを鋳型として用いることができるポリメラーゼ酵素と接触させてデュプレックスのプライマーオリゴヌクレオチドを伸長させて、多型領域の特異的形態を含む単位複製配列を生成すること、および
多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）を用いて、単位複製配列が生じたかどうかを検出することを含み、ここで
ＭＮＡザイムのセンサーアームは単位複製配列の異なる部分に相補的なヌクレオチドの配列を含む第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分および第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置する第３センサーアーム成分を含むかそれらからなり、
第１センサーアーム成分は、多型領域の上流の単位複製配列の前記形態のいずれかと相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第２センサーアーム成分は、多型領域の下流の単位複製配列の前記形態のいずれかと相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第３センサーアーム成分は第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置し、第３センサーアーム成分中に単位複製配列のいずれかの前記形態の多型領域と塩基対相補性を共有するヌクレオチドの配列が存在しないので、相補的塩基対合により単位複製配列のいずれかの前記形態の多型領域にハイブリダイズできない、方法。
【０１４７】
実施形態１６
前記センサーアームの第１センサーアーム成分が、配列番号１２０、１２７、１２８または１２９のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなる、実施形態１５による方法。
【０１４８】
実施形態１７
前記ＭＮＡザイムが、単位複製配列のいずれかの前記形態と相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第２センサーアームを含み、
（ｉ）センサーアームは配列番号１２０に定義される配列を含むかそれからなり、第２センサーアームは配列番号１１９に定義される配列を含むかそれからなり、または
（ｉｉｉ）センサーアームは配列番号１２７、１２８もしくは１２９のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなり、第２センサーアームは配列番号１１９に定義される配列を含むかそれからなる、実施形態１６による方法。
【０１４９】
実施形態１８
センサーアームは配列番号１２８または１２９に定義される配列を含むかそれからなり、第２センサーアームは配列番号１１９に定義される配列を含むかそれからなり、
プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号１３１に定義される配列を含むかそれからなる、実施形態１７による方法。
【０１５０】
実施形態１９
試料を前記第１標的ポリヌクレオチド鎖の相補鎖である第２標的ポリヌクレオチド鎖と塩基対相補性を共有する第２プライマーオリゴヌクレオチドと接触させることであって、前記接触させることは第２プライマーオリゴヌクレオチドと第２標的ポリヌクレオチド鎖の相補的塩基対合によるハイブリダイゼーションに適した条件下で行われ、
第２標的ポリヌクレオチド鎖を鋳型として用いてポリメラーゼ酵素を使用して第２プライマーオリゴヌクレオチドを伸長させて、第２単位複製配列を生成することを含み、ここでプライマーオリゴヌクレオチドは配列番号１３１に定義される配列を含むかそれからなり、第２プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号１２２に定義される配列を含むかそれからなる、実施形態１８による方法。
【０１５１】
実施形態２０
試料を前記第１標的ポリヌクレオチド鎖の相補鎖である第２標的ポリヌクレオチド鎖と塩基対相補性を共有する第２プライマーオリゴヌクレオチドと接触させることであって、前記接触させることは第２プライマーオリゴヌクレオチドと第２標的ポリヌクレオチド鎖の相補的塩基対合によるハイブリダイゼーションに適した条件下で行われ、
第２標的ポリヌクレオチド鎖を鋳型として用い、ポリメラーゼ酵素を用いて第２プライマーオリゴヌクレオチドを伸長させて第２単位複製配列を生成することを含み、ここでプライマーオリゴヌクレオチドは配列番号１２２に定義される配列を含むかそれからなり、第２プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号１２３〜１２６または１３０に定義される配列を含むかそれからなる、実施形態１７による方法。
【０１５２】
実施形態２１
単離されたプライマーまたはパートザイムオリゴヌクレオチドであって、
オリゴヌクレオチドの５’末端で終止し、第２ポリヌクレオチドの第１部分と相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第１成分、
オリゴヌクレオチドの３’末端で終止し、第２ポリヌクレオチドの第２部分と相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第２成分および
第１と第２成分の間に位置し、第１と第２成分が第２ポリヌクレオチドとハイブリダイズするとき第２ポリヌクレオチドのヌクレオチドの反対の配列と塩基対相補性を共有しない少なくとも４つのヌクレオチドの配列を含む第３成分を含み、ここで
第３成分がオリゴヌクレオチドの３’ハーフに部分的または完全に位置し、
オリゴヌクレオチドが配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、５０、５９、６０、６１、６２、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、２９２、２９７、２９３、２９８、２９４、２９９、２９５、３００、２９６、３０１、６６、８７、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、９９、１６６〜１７１、３１７、１２０、１２７、１２８、１２９または１３１のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなる、単離されたプライマーまたはパートザイムオリゴヌクレオチド。
【０１５３】
実施形態２２
プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、５０、５９、６０、６１、６２、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、２９２、２９７、２９３、２９８、２９４、２９９、２９５、３００、２９６、３０１、６６、８７、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、９９、１６６〜１７１、３１７または１３１のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなる、実施形態２１によるプライマーオリゴヌクレオチド。
【０１５４】
実施形態２３
パートザイムオリゴヌクレオチドが配列番号１２０、１２７、１２８または１２９のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなる、実施形態２１によるパートザイムオリゴヌクレオチド。
【０１５５】
実施形態２４
配列番号１７７、１７８、１７０または１７１のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなる、単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
【０１５６】
実施形態２５
実施形態２１から２４のいずれか１つによる１または複数の単離されたオリゴヌクレオチドを含むキット。
【０１５７】
実施形態２６
（ｉ）配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、５０、５９、６０、６１、６２、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、２９２、２９７、２９３、２９８、２９４、２９９、２９５、３００、２９６または３０１のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなる第１プライマーオリゴヌクレオチド、および配列番号２６に定義される配列を含むかそれからなる第２プライマーオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号６６または８７のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなる第１プライマーオリゴヌクレオチド、および配列番号６５に定義される配列を含むかそれからなる第２プライマーオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）配列番号７０〜７９または９９のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなる第１プライマーオリゴヌクレオチド、および配列番号６９に定義される配列を含むかそれからなる第２プライマーオリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）配列番号８７に定義される配列を含むかそれからなる第１プライマーオリゴヌクレオチド、および配列番号２６または１７１に定義される配列を含むかそれからなる第２プライマーオリゴヌクレオチド、
（ｖ）配列番号１７７または１７８に定義される配列を含むかそれからなる第１プライマーオリゴヌクレオチド、および配列番号２６に定義される配列を含むかそれからなる第２プライマーオリゴヌクレオチド、
（ｖｉ）配列番号１７１に定義される配列を含むかそれからなる第１プライマーオリゴヌクレオチド、および配列番号８７に定義される配列を含むかそれからなる第２プライマーオリゴヌクレオチド、
（ｖｉｉ）配列番号１６６〜１６９のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなる第１プライマーオリゴヌクレオチド、および配列番号２６に定義される配列を含むかそれからなる第２プライマーオリゴヌクレオチド、
（ｖｉｉｉ）配列番号１６６に定義される配列を含むかそれからなる第１プライマーオリゴヌクレオチド、および配列番号１７１に定義される配列を含むかそれからなる第２プライマーオリゴヌクレオチド、
（ｉｘ）配列番号１７０に定義される配列を含むかそれからな第１プライマーオリゴヌクレオチド、および配列番号２６または１７１に定義される配列を含むかそれからなる第２プライマーオリゴヌクレオチド、
（ｘ）配列番号１７１に定義される配列を含むかそれからなる第１プライマーオリゴヌクレオチド、および配列番号１６６または１７０に定義される配列を含むかそれからなる第２プライマーオリゴヌクレオチド、
（ｘｉ）配列番号３１７に定義される配列を含むかそれからなる第１プライマーオリゴヌクレオチド、および配列番号３１８に定義される配列を含むかそれからなる第２プライマーオリゴヌクレオチド、
（ｘｉｉ）配列番号１２０、１２７、１２８または１２９のいずれか１つに定義される配列を含む第１パートザイムオリゴヌクレオチド、および配列番号１１９に定義される配列を含む第２センサーアームパートザイムオリゴヌクレオチド、または
（ｘｉｉｉ）配列番号１３１に定義される配列を含むかそれからなる第１プライマーオリゴヌクレオチド、および配列番号１２２に定義される配列を含むかそれからなる第２プライマーオリゴヌクレオチドを含む、実施形態２５によるキット。
【０１５８】
実施形態２７
（ｉ）配列番号２２、２４、２３、４７、５３、５４、６４、１６４、１６５、２８７、２８８、２８９、２９０または２９１のいずれか１つに定義される配列を含む第１パートザイム、および配列番号１８に定義される配列を含む第２パートザイム、
（ｉｉ）配列番号６４、２４、６７、６８または８８のいずれか１つに定義される配列を含む第１パートザイム、および配列番号６３に定義される配列を含む第２パートザイム、
（ｉｉｉ）配列番号２４に定義される配列を含む第１パートザイム、および配列番号１８に定義される配列を含む第２パートザイム、
（ｉｖ）配列番号１６１または１６２に定義される配列を含む第１パートザイム、および配列番号１８に定義される配列を含む第２パートザイム、
（ｖ）配列番号３１４に定義される配列を含む第１パートザイム、および配列番号３１５に定義される配列を含む第２パートザイム、
（ｖｉ）配列番号１２２に定義される配列を含むかそれからなるプライマーオリゴヌクレオチド、および配列番号１２３〜１２６または１３０に定義される配列を含むかそれからなる第２プライマーオリゴヌクレオチド、または
（ｖｉｉ）配列番号１２８または１２９に定義される配列を含む第１パートザイム、および配列番号１１９に定義される配列を含む第２パートザイムを含む、実施形態２６によるキット。
【０１５９】
実施形態２８
実施形態２３によるパートザイムオリゴヌクレオチドを含むＭＮＡザイム。
【０１６０】
実施形態２９
標的ポリヌクレオチドが、カーステン・ラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）遺伝子の成分であり、
プライマーオリゴヌクレオチドが第１プライマー成分と第２プライマー成分の間に位置する第３プライマー成分を含み、
第３プライマー成分は、標的ポリヌクレオチド鎖中のヌクレオチドの前記中間配列と塩基対相補性を共有しない、単位複製配列の内部成分中のヌクレオチドの配列と同一のヌクレオチドの配列からなり、
プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、４９、３３、３４、５５、５６、５７、５８、８３、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５または２８６のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなる、実施形態１による方法。
【０１６１】
実施形態３０
試料を前記第１標的ポリヌクレオチド鎖の相補鎖である第２標的ポリヌクレオチド鎖と塩基対相補性を共有する第２プライマーオリゴヌクレオチドと接触させることであって、前記接触させることは第２プライマーオリゴヌクレオチドと第２標的ポリヌクレオチド鎖の相補的塩基対合によるハイブリダイゼーションに適した条件下で行われ、
第２標的ポリヌクレオチド鎖を鋳型として用い、ポリメラーゼ酵素を用いて第２プライマーオリゴヌクレオチドを伸長させて第２単位複製配列を生成することを含み、ここで
（ｉ）プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、４９、３３、３４、５５、５６、５７または５８のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなり、第２プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号２６に定義される配列を含むかそれからなり、
（ｉｉ）プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号８３に定義される配列を含むかそれからなり、第２プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号６９に定義される配列を含むかそれからなり、または
（ｉｉｉ）プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５または２８６のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなり、第２プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号６５に定義される配列を含むかそれからなる、実施形態２９による方法。
【０１６２】
実施形態３１
単位複製配列が生じたかどうかを前記検出することが、第１および第２パートザイムの使用を含み、ここで
（ｉ）第１パートザイムは配列番号１９〜２１、５１または５２のいずれか１つに定義される配列を含み、第２パートザイムは配列番号１８に定義される配列を含み、
（ｉｉ）第１パートザイムは配列番号８０に定義される配列を含み、第２パートザイムは配列番号６３に定義される配列を含み、
（ｉｉｉ）第１パートザイムは配列番号２４２〜２５６のいずれか１つに定義される配列を含み、第２パートザイムは配列番号２４１に定義される配列を含む、実施形態３０による方法。
【０１６３】
実施形態３２
配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、４９、３３、３４、５５、５６、５７、５８、８３、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５または２８６のいずれか１つに定義される配列を含むかそれからなる単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
【０１６４】
実施形態３３
実施形態３２による１または複数の単離されたオリゴヌクレオチドを含むキット。
【０１６５】
本発明は、少なくとも部分的には以下の実施形態１〜４０にも関する。
実施形態１
標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
標的ポリヌクレオチドに実質的に相補的な第１成分と、標的ポリヌクレオチドに実質的に非相補的な第２成分を含む第１オリゴヌクレオチドを準備すること、
第１オリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションするのに適した条件下で標的ポリヌクレオチドを第１オリゴヌクレオチドと接触させ、酵素的反応により標的ポリヌクレオチドを増幅して、第１オリゴヌクレオチドの第２成分を含む前記標的ポリヌクレオチドの増幅された複製を産生することと、
標的ポリヌクレオチドの増幅された複製を検出すること、を含む方法。
【０１６６】
実施形態２
第１オリゴヌクレオチドの前記第２成分が第１オリゴヌクレオチドの標的ポリヌクレオチドに実質的に相補的な第１と第３成分の間に位置する、実施形態１による方法。
【０１６７】
実施形態３
第１および第３成分中のヌクレオチドの数が第２成分中のヌクレオチドの数よりも少ない、実施形態２による方法。
【０１６８】
実施形態４
第１および第３成分中のヌクレオチドの数が第２成分中のヌクレオチドの数と等しい、実施形態２による方法。
【０１６９】
実施形態５
第１および第３成分中のヌクレオチドの数が第２成分中のヌクレオチドの数よりも多い、実施形態２による方法。
【０１７０】
実施形態６
第１オリゴヌクレオチドがポリヌクレオチド標的に結合すると第２成分がループを形成する、実施形態１から３による方法。
【０１７１】
実施形態７
前記検出することが、増幅された複製中のオリゴヌクレオチドの第２部分を検出することを含む、実施形態１から６による方法。
【０１７２】
実施形態８
前記検出することが、第１オリゴヌクレオチドの第２部分に相補的な増幅された複製中のヌクレオチドの配列を検出することを含む、実施形態１から６による方法。
【０１７３】
実施形態９
標的ポリヌクレオチドを増幅することが、第１オリゴヌクレオチドとは違う標的ポリヌクレオチドの成分に実質的に相補的である第２オリゴヌクレオチドを用いることを含む、実施形態１から８のいずれか１つによる方法。
【０１７４】
実施形態１０
酵素反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のうちのいずれか１または複数である、実施形態１から９のいずれか１つによる方法。
【０１７５】
実施形態１１
酵素反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、実施形態１から１０のいずれか１つによる方法。
【０１７６】
実施形態１２
前記検出することが、少なくとも２つ以上のパートザイム成分を含むＭＮＡザイムを使用することを含み、ここで少なくとも第１パートザイム成分と第２パートザイム成分が標的ポリヌクレオチドの増幅された複製の存在下で自己集合して触媒活性多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）を形成し、ここで第１と第２パートザイム成分のそれぞれが基質アーム部分、触媒コア部分およびセンサーアーム部分を含み、
自己集合時、第１および第２パートザイム成分のセンサーアーム部分がＭＮＡザイムのセンサーアームとして作用し、第１および第２パートザイム成分の基質アーム部分がＭＮＡザイムの基質アームとして作用し、第１パートザイム成分と第２パートザイム成分の触媒コア部分がＭＮＡザイムの触媒コアとして作用し、
ＭＮＡザイムのセンサーアームが標的ポリヌクレオチドの増幅された複製と相互作用して第１と第２パートザイム成分を近くに維持するので第１と第２パートザイム成分はそれぞれの触媒コア部分と会合してＭＮＡザイムの触媒コアを形成し、触媒コアは少なくとも１つの基質を修飾可能であり、ＭＮＡザイムの基質アームが基質と結合してＭＮＡザイムの触媒コアが基質を修飾でき、そうすることで検出可能な効果が得られる、実施形態１から１１のいずれか１つによる方法。
【０１７７】
実施形態１３
前記ＭＮＡザイムの第１センサーアームが
（ｉ）第１オリゴヌクレオチドの第２部分もしくはその成分および
（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの一部分
を含む増幅された複製中のヌクレオチドの配列に実質的に相補的である、実施形態１２による方法。
【０１７８】
実施形態１４
前記ＭＮＡザイムの第１センサーアームが
（ｉ）第１オリゴヌクレオチドの第２部分に相補的なヌクレオチドの配列もしくはその成分および
（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの一部分
を含む増幅された複製中のヌクレオチドの配列に実質的に相補的である、実施形態１２による方法。
【０１７９】
実施形態１５
標的ポリヌクレオチドが一塩基多型（ＳＮＰ）または点変異を含む、実施形態１から１４のいずれか１つによる方法。
【０１８０】
実施形態１６
第１オリゴヌクレオチドが、ＳＮＰまたは点変異に相補的な前記第２成分の３’側に位置するヌクレオチドを含む、実施形態１５による方法。
【０１８１】
実施形態１７
第１オリゴヌクレオチドが、前記第２成分の３’側にヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドはポリヌクレオチド標的に非相補的である、実施形態１５または１６による方法。
【０１８２】
実施形態１８
ポリヌクレオチド標的が、ポリヌクレオチド標的を構成する所与の種の固体間で異なるヌクレオチドの多型配列を含み、
第１オリゴヌクレオチドの第１成分がヌクレオチドの多型配列のポリヌクレオチド標的５’に結合し、
第１オリゴヌクレオチドの第３成分がヌクレオチドの多型配列のポリヌクレオチド標的３’に結合し、
第１オリゴヌクレオチドの第２成分がヌクレオチドの多型配列に非相補的である、実施形態２から１７のいずれか１つによる方法。
【０１８３】
実施形態１９
前記基質が、検出可能部分とクエンチャー部分を含み、検出可能な効果が前記検出可能部分とクエンチャー部分を分離するＭＮＡザイムにより基質が切断されることでもたらされる、実施形態１２から１８のいずれか１つによる方法。
【０１８４】
実施形態２０
ＭＮＡザイムによる基質の修飾で産生される検出可能な効果をカスケード式に増幅することをさらに含む、実施形態１２から１９のいずれか１つによる方法。
【０１８５】
実施形態２１
第１標的ポリヌクレオチドと配列が異なる第２標的ポリヌクレオチドを検出することをさらに含む、実施形態１から２０のいずれか１つによる方法。
【０１８６】
実施形態２２
第２標的ポリヌクレオチドに実質的に相補的な第１成分と、第２標的オリゴヌクレオチドに実質的に非相補的な第２成分を含む追加のオリゴヌクレオチドを準備すること、
追加のオリゴヌクレオチドが第２標的ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションするのに適した条件下で第２標的ポリペプチドを追加のオリゴヌクレオチドと接触させ、第２の酵素的反応により第２標的ポリヌクレオチドを増幅して、追加のオリゴヌクレオチドの第２成分を含む前記第２標的ポリヌクレオチドの増幅された複製を産生することと、
第２標的ポリヌクレオチドの増幅された複製を検出することを含む、実施形態２１による方法。
【０１８７】
実施形態２３
追加オリゴヌクレオチドの前記第２成分が、第１オリゴヌクレオチドの標的ポリヌクレオチドに実質的に相補的な第１と第３成分の間に位置する、実施形態２２による方法。
【０１８８】
実施形態２４
追加オリゴヌクレオチドの第１および第３成分中のヌクレオチドの数が、
（ｉ）第２成分中のヌクレオチドの数よりも少ない、
（ｉｉ）第２成分中のヌクレオチドの数と等しい、または
（ｉｉｉ）第３成分中のヌクレオチドの数よりも多い、実施形態２３による方法。
【０１８９】
実施形態２５
追加オリゴヌクレオチドが第２ポリヌクレオチド標的に結合すると追加オリゴヌクレオチドの第２成分がループを形成する、実施形態２２から２４による方法。
【０１９０】
実施形態２６
第２酵素反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のうちのいずれか１または複数である、実施形態２２から２５のいずれか１つによる方法。
【０１９１】
実施形態２７
前記第１および第２ポリヌクレオチド標的の検出が同時に行われる、実施形態２１から２６のいずれか１つによる方法。
【０１９２】
実施形態２８
前記第１および第２ポリヌクレオチド標的の検出が順次行われる、実施形態２１から２６のいずれか１つによる方法。
【０１９３】
実施形態２９
方法がインビトロまたはエクスビボで実施される、実施形態１から２８いずれか１つによる方法。
【０１９４】
実施形態３０
第１または第２標的ポリヌクレオチドがＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡである、実施形態１から２９のいずれか１つによる方法。
【０１９５】
実施形態３１
３成分を含むオリゴヌクレオチドであって、
オリゴヌクレオチドの第１および第３成分は、標的ポリヌクレオチドの別々の成分に実質的に相補的であり、
第１と第３成分の間に位置するオリゴヌクレオチドの第２成分は標的ポリペプチドに非相補的である、オリゴヌクレオチド
【０１９６】
実施形態３２
第２成分の長さが３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドよりも長い、実施形態３１によるオリゴヌクレオチド。
【０１９７】
実施形態３３
第１成分の長さが３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドよりも長い、実施形態３１または３２によるオリゴヌクレオチド。
【０１９８】
実施形態３４
第３成分の長さが３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドよりも長い、実施形態３１から３３のいずれか１つによるオリゴヌクレオチド。
【０１９９】
実施形態３５
第１および第３成分中のヌクレオチドの数が第２成分中のヌクレオチドの数よりも少ない、実施形態３１から３３のいずれか１つによるオリゴヌクレオチド。
【０２００】
実施形態３６
第１および第３成分中のヌクレオチドの数が第２成分中のヌクレオチドの数と等しい、実施形態３１から３３のいずれか１つによるオリゴヌクレオチド。
【０２０１】
実施形態３７
第１および第３成分中のヌクレオチドの数が第２成分中のヌクレオチドの数よりも多い、実施形態３１から３３のいずれか１つによるオリゴヌクレオチド。
【０２０２】
実施形態３８
オリゴヌクレオチドがポリヌクレオチド標的に結合すると第２成分がループを形成する、実施形態３１から３５のいずれか１つによるオリゴヌクレオチド。
【０２０３】
実施形態３９
オリゴヌクレオチドがＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡである、実施形態３１から３８のいずれか１つによるオリゴヌクレオチド。
【０２０４】
実施形態４０
実施形態１から３０のいずれか１つによる方法における、実施形態３１から３９のいずれか１つによるオリゴヌクレオチドの使用。
【０２０５】
次に、本発明の好ましい実施形態を、単なる例として、以下のとおりの添付の図１〜１６を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】ポリヌクレオチド補助（Assisted）配列スイッチング（ＰＡＳＳ）プライマーとＭＮＡザイム読み取り：目的の標的配列に非相補的なユニーク配列の一部分を含むＰＡＳＳプライマーを含む、例示的ＰＡＳＳ  ＰＣＲストラテジーを示す。ユニーク配列（ＵＳ）は、どちらも標的に実質的に相補的なＰＡＳＳプライマーの２つの配列（Ｓ１とＳ２）の間に位置する。Ｓ１は、標的に相補的なＰＡＳＳプライマーの領域であり、ＵＳに対し５’側である。Ｓ２は、標的に実質的に相補的なＰＡＳＳプライマーの領域であり、ＵＳに対し３’側である。ＰＡＳＳプライマーは、標的配列に結合すると異なる立体構造を生じるように設計され得る。たとえば、Ｓ１とＳ２の結合部位の間（標的−ギャップ）の標的配列中の塩基の数は、ＵＳ中の塩基の数よりも少なく、この場合ＵＳはＰＡＳＳプライマーが標的に結合すると「ループ」化する（パネル（ｉ））。Ｓ１とＳ２の結合部位の間の標的中の塩基数がＵＳ中の塩基数と同じである場合、ＵＳはループ化せずに「平坦」な非相補的領域を形成する（パネル（ｉｉ））。別の実施形態では、Ｓ１とＳ２の結合部位の間の標的中の塩基数は、ＵＳ中の塩基数よりも多いかもしれず、この場合はＰＡＳＳプライマーが標的配列に結合すると標的配列はループ化する。ＰＣＲの連続運転を通じて、ＵＳは１本鎖のＰＣＲ単位複製配列へと組み込まれ、ＵＳの相補鎖（ｃＵＳ）はＰＣＲ単位複製配列の逆鎖へと組み込まれる。ＵＳのループ（パネル（ｉ））または平坦領域（パネル（ｉｉ））のいずれかを有するＰＡＳＳプライマーにより生じた単位複製配列は多くのストラテジーにより検出され得る。一例として、この図面ではＭＮＡザイムによる検出を示す（パネル（ｉｉｉ））。  ＰＡＳＳプライマーをＭＮＡザイムｑＰＣＲと組み合わせる場合、ＭＮＡザイムは、図示したようにユニーク配列の相補鎖（ｃＵＳ）あるいはユニーク配列に結合するパートザイムを含み得、他方のパートザイムは目的の増幅された標的配列上で隣接して結合する。パートザイム成分からの活性ＭＮＡザイムの形成により、フルオロフォアとクエンチャーで標識されたユニバーサルプローブが切断され得、リアルタイムでモニタリングできるシグナルが生じる。
【図２】一塩基多型（ＳＮＰ）および／または後天的点変異を区別するように設計されたＰＡＳＳプライマー：ＰＡＳＳプライマーは、ＳＮＰや点変異などの一塩基の変化の区別を増強するように設計され得る。一実施形態では、ループ化ＰＡＳＳプライマー（パネル（ｉ））または平坦ＰＡＳＳプライマー（パネル（ｉｉ））のいずれかのＳ２が、ＳＮＰまたは点変異を標的とし特異的に結合するのに使用され得る。  ＰＡＳＳプライマーのＳ２中のＳＮＰまたは点変異とマッチする塩基がプライマーの３’末端に位置し得るか、またはＳ２内の他の位置に配置され得る（パネル（ｉ）と（ｉｉ）の上部）。さらに、追加の塩基がＳ２と目的とする標的の間でミスマッチであり得、ＳＮＰをさらに区別しやすくする（パネル（ｉ）と（ｉｉ）の下部）。
【図３】ＰＡＳＳプライマーを用いてマルチプレックスＭＮＡザイム読み取りにより一塩基変化を区別する：ＰＡＳＳプライマーは、ＳＮＰや変異などのバリアント配列がより強力に区別できるように設計され得る。これは、マルチプレックスＭＮＡザイムｑＰＣＲ反応において実施され得る。１個の塩基が違うだけの２つの配列の検出と区別がこの図面で例示され、バリアント１は左側のパネルで円で示され、バリアント２は右側のパネルで三角形で示されている。ＰＡＳＳプライマー１のＳ２はバリアント１と特異的にマッチし、ＰＡＳＳプライマー１のＵＳはループ形態（ループ１）の第１非標的ユニーク配列（ＵＳ１）である。ＰＡＳＳプライマー２のＳ２はバリアント２と特異的にマッチし、ＰＡＳＳプライマー２のＵＳはループ形態（ループ１）の第２非標的ユニーク配列（ＵＳ２）である。これらのＰＡＳＳプライマーを使用すると、（ａ）バリアント塩基と（ｂ）ＰＡＳＳプライマーにより組み込まれたＵＳの両方において異なる、各バリアントの単位複製配列が得られる。  得られた単位複製配列の検出をＭＮＡザイムが仲介し得る。一例では、バリアント１とＵＳ１の相補鎖の両方に特異的な配列で構成されるパートザイムセンサーアームを設計することで、ＭＮＡザイム１がバリアント１単位複製配列を検出するように設計され得る。ＭＮＡザイム１は、バリアント１を有する単位複製配列の存在下でのみ、フルオロフォア１で標識されたユニバーサルプローブ１（Ｓｕｂ１）を切断するように設計され得る。ＭＮＡザイム２は、バリアント２とＵＳ２の相補鎖の両方に特異的な配列で構成されるパートザイムセンサーアームを設計することで、バリアント２単位複製配列を検出するように設計され得る。ＭＮＡザイム２は、バリアント２を有する単位複製配列の存在下でのみ、フルオロフォア２で標識されたユニバーサルプローブ２（Ｓｕｂ２）を切断するように設計され得る。  このストラテジーでは、バリアント１と２両方のリアルタイムの検出、区別および定量化が１つの反応チューブ内で同時に生じ得る。
【図４】ＰＡＳＳプライマーをＭＮＡザイムｑＰＣＲと組み合わせる：ＰＡＳＳプライマーをｑＰＣＲにおいてＭＮＡザイム読取と組み合わせた。この例ではＰＡＳＳプライマーにもなり得るフォワードプライマーをパートザイムジャンクションに対し異なる位置に配置した。フォワード／ＰＡＳＳプライマーの３’末端は、（ｉ）パートザイムジャンクションから５塩基か、（ｉｉ）パートザイムジャンクションから３塩基か、（ｉｉｉ）パートザイムジャンクションのいずれかに位置した。  ｑＰＣＲ反応では、ＭＮＡザイムは、ＰＡＳＳプライマーによる３つのシナリオ（ｉ〜ｉｉｉ）のそれぞれを標的とするように設計した。各シナリオで、ループ化ＵＳ（中黒三角形−試験１）または平坦ＵＳ（白い四角形−試験２）を有するＰＡＳＳプライマーを、マッチするＭＮＡザイム（黒丸−ポジティブ対照）を有する標準（非ＰＡＳＳ）プライマーまたはＵＳを検出するように設計されたパートザイムと組み合わされた標準（非ＰＡＳＳ）プライマー（×−ネガティブ対照）と比較した。
【図５】ＰＡＳＳプライマーを高可変配列のスキッピングに用いる：ＰＡＳＳプライマーを用いて単位複製配列に組み込まれたＵＳは、検出目的の保存配列の間に存在する非有用遺伝的変異部位のスキッピングにも利用され得る。ＰＡＳＳプライマーは、Ｓ１とＳ２が、標的の２つの保存された隣接しない配列に相補的であるように設計され得る。標的配列中のＳ１とＳ２にハイブリダイズする部位の間のギャップ（標的−ギャップ）は、検出される３つのバリアント間で配列が異なっている。ＰＡＳＳプライマーのＵＳは、Ｓ１とＳ２の間の標的−ギャップ中に同数のヌクレオチドを含むように設計され得る。ＵＳは３バリアントすべてに対しミスマッチであり得る。ＵＳの相補鎖にハイブリダイズし単一のプローブを切断してバリアント１、２および／または３を検出するパートザイムセンサーアームを有する単一のＭＮＡザイムが設計され得る。
【図６】ＰＡＳＳプライマーを高可変配列のループ化に用いる：ＰＡＳＳプライマーを用いて単位複製配列に組み込まれたＵＳは、検出目的の保存配列の間に存在する非有用遺伝的変異部位の除去にも利用され得る。標的ループＰＡＳＳプライマーは、ＰＡＳＳプライマーのＵＳがＳ１とＳ２の間の標的−ギャップ中のヌクレオチドよりも少数のヌクレオチドを含むように設計され得る。標的ループＰＡＳＳプライマーを用いてバリアント１からＤＮＡを増幅すると、標的−ギャップ中のバリアント配列が、ＰＡＳＳプライマーのＵＳ中の少数のヌクレオチドで置換される。ＵＳの相補鎖とハイブリダイズし単一プローブを切断するパートザイムセンサーアームを有する単一のＭＮＡザイムが設計され得、ＰＡＳＳプライマーから生成した任意の単位複製配列を検出する。
【図７】一塩基多型（ＳＮＰ）および／または後天的点変異を区別するのに使用されるＰＡＳＳプライマーの設計：ＰＡＳＳプライマーは、ＳＮＰや点変異などの１個の塩基の変化を区別するように設計され得る。一実施形態では、ループ化または平坦ＰＡＳＳプライマーのいずれかのＳ２が、ＳＮＰまたは点変異を標的とし特異的に結合するのに使用され得る。一例として、ＰＡＳＳプライマーのＳ２のＳＮＰまたは点変異と一致する塩基が、プライマーの３’末端に（設計１）、３’末端から３塩基のところに（設計２）、３’末端から３塩基のところにミスマッチ塩基が挿入されて、プライマーの３’末端に（設計３）または３’末端から５塩基のところにミスマッチ塩基が挿入されて、プライマーの３’末端に（設計４）位置し得る。各ＰＡＳＳプライマー設計と適合するＭＮＡザイムのパートザイムＡ標的センサーアームが示されているが、パートザイムＢは全設計で同じである。
【図８】ＰＡＳＳパートザイムを、ＭＮＡザイムｑＰＣＲ読取によるバリアント株の検出に使用する：目的の標的配列はバリアント塩基の鎖を含み得、それぞれの中のバリアントは互いに異なり得、たとえばバリアント１（Ｖ１）、バリアント２（Ｖ２）およびバリアント３（Ｖ３）配列である。プライマーセットは、Ｖ１、Ｖ２およびＶ３の各バリアント配列に特異的であり、それぞれの単位複製配列を産生するように設計され得る。ＰＡＳＳパートザイムを使用すると、バリアント株を区別することなくリアルタイムで配列を検出するストラテジーが提供される。このことは、ＭＮＡザイムｑＰＣＲの利用を含むので、ＭＮＡザイムはＰＡＳＳパートザイムを含み得る。ＰＡＳＳパートザイムは、標的配列（複数可）／目的の単位複製配列（複数可）に非相補的なユニーク配列（ＵＳ）の一部分を含む。ＵＳは、標的に実質的に相補的な２つの相補的標的特異領域の間でＰＡＳＳパートザイムセンサーアーム内に含まれる。パートザイム中のＵＳはバリアント塩基を含むＶ１、Ｖ２およびＶ３のバリアント領域と揃う。ＰＡＳＳパートザイム中のＵＳは活性ＭＮＡザイムの形成に影響を及ぼさないので、あらゆるバリアントまたはそれらの組合せの存在によりフルオロフォアとクエンチャーで標識されたユニバーサルプローブが切断されることになり得、リアルタイムでモニタリングできるシグナルが生成される。
【図９】ＰＡＳＳパートザイムとＰＡＳＳプライマーを、ＭＮＡザイムｑＰＣＲ読取によるバリアント株の検出に使用する：目的の標的配列はバリアント塩基の鎖を含み得、それぞれの中のバリアントは互いに異なり得、たとえばバリアント１（Ｖ１）、バリアント２（Ｖ２）およびバリアント３（Ｖ３）配列である。ＰＡＳＳプライマーセットは、Ｖ１、Ｖ２およびＶ３の各バリアント配列に特異的であるように設計され得るが、同じＵＳ（ＵＳ１）を含み、それぞれのバリアント塩基を含みながらも同じＵＳの相補的配列（ｃＵＳ１）を含む単位複製配列がもたらされる。ＰＡＳＳパートザイムを使用すると、バリアント株を区別することなくリアルタイムで配列を検出するストラテジーが提供される。これは、ＭＮＡザイムｑＰＣＲの使用を含むので、ＭＮＡザイムは、第１ＰＡＳＳパートザイムおよび増幅された目的の標的配列上で隣接して結合する完全マッチ「標準」パートザイムを含み得る。第１ＰＡＳＳパートザイムセンサーアームは、（ｉ）すべてのバリアントの単位複製配列の保存配列に完全マッチする領域、（ｉｉ）バリアントのどの単位複製配列にも相補的でなく、バリアント単位複製配列間で異なる領域に整列するユニーク配列（ＵＳ２）および（ｉｉｉ）バリアント特異的ＰＡＳＳプライマーセット（すべてｃＵＳ１を含む）を使用して生成するすべての単位複製配列のｃＵＳ１に結合するＵＳ１を含む領域を含む。このＭＮＡザイムはすべてのバリアントを認識し結合できる。  ＰＡＳＳパートザイム中のＵＳ配列は活性ＭＮＡザイムの形成に影響を及ぼさないので、あらゆるバリアント配列またはそれらの組合せの存在によりフルオロフォアとクエンチャーで標識されたユニバーサルプローブが切断されることになり得、リアルタイムでモニタリングできるシグナルが生成される。
【図１０】ＰＡＳＳパートザイムを、ＭＮＡザイムｑＰＣＲ読取によるバリアント欠失株の検出に使用する：目的のバリアント標的配列は、異なる領域が欠失している野生型配列由来であり得る（パネルｉ、欠失１および欠失２）。プライマーセットは、各欠失バリアント配列に特異的であり、それぞれの単位複製配列を産生するように設計され得る。これは、ＭＮＡザイムｑＰＣＲを用いて達成され得るので、ＭＮＡザイムは、第１ＰＡＳＳパートザイムおよび増幅された目的の標的配列上で隣接して結合する第２完全マッチ（「標準」）パートザイムを含み得る。第１ＰＡＳＳパートザイムは、欠失単位複製配列の間で領域が異なるところに整列するように設計された、ユニーク配列（ＵＳ）と呼ばれる増幅された標的配列に非相補的な配列の領域を含むので、１つのＭＮＡザイムを全てのバリアントの検出に使用できる（パネルｉｉ）。ＰＡＳＳパートザイム中に存在するＵＳは、ＰＡＳＳパートザイム中の非相補的塩基の数が増幅された標的配列中の結合しない塩基数と一致していれば「平坦」構造（パネルｉｉ（ａ））であり得、あるいは、パートザイム中の非相補的塩基の数が増幅された標的配列よりも多く、パートザイム配列が張り出してループ化する場合は「ループ化」（パネルｉｉ（ｂ））し得、あるいはパートザイム中の非相補的塩基の数が増幅された標的配列よりも少なく、標的配列がループ化する。  ＰＡＳＳパートザイム中のＵＳは活性ＭＮＡザイムの形成に影響を及ぼさないので、フルオロフォアとクエンチャーで標識されたユニバーサルプローブが切断され得、リアルタイムでモニタリングが可能なシグナルが生成される。
【図１１】ＰＡＳＳパートザイムとＰＡＳＳプライマーを、ＭＮＡザイムｑＰＣＲ読取によるバリアント株の検出に使用する：目的のバリアント標的配列は、異なる領域が欠失している野生型配列由来であり得る（パネル（ｉ）、欠失１および欠失２）。ＰＡＳＳプライマーセットは、欠失１および欠失２の各欠失バリアント配列に特異的であるように設計され得るが、同じＵＳ（ＵＳ１）を含み得、欠失特異的バリアント塩基ならびに同じＵＳ（ｃＵＳ１）の相補的配列を含む各欠失の単位複製配列がもたらされる。バリアント株を区別せずにリアルタイムで単位複製配列を検出する例示的ストラテジーでは、ＰＡＳＳパートザイムをＰＡＳＳプライマーと一緒に使用し得る。これは、ＭＮＡザイムｑＰＣＲを用い得るので、ＭＮＡザイムは、第１ＰＡＳＳパートザイムおよび増幅された目的の標的配列上で隣接して結合する第２完全マッチ（「標準」）パートザイムを含み得る。ＰＡＳＳパートザイムは、ユニーク配列（ＵＳ２）と呼ばれる、増幅された標的配列に非相補的な配列の領域（欠失単位複製配列の間の配列が異なるところに整列するように設計されている）と、ＵＳ１に対応する別の領域を含むので、単一のＭＮＡザイムを用いてすべてのバリアントを検出できる（パネル（ｉｉ））。ＰＡＳＳパートザイム中に存在するＵＳ２は、ＰＡＳＳパートザイム中の非相補的塩基の数は増幅された標的配列中の結合していない塩基の数と一致する場合は平坦構造であり得、またはＰＡＳＳパートザイム中の非相補的塩基の数が増幅された標的配列よりも多いか少ないので配列が張り出すかループ化する場合はループ化する（パネル（ｉｉ））。  ＰＡＳＳパートザイム内のＵＳは活性ＭＮＡザイムの形成を妨げないので、フルオロフォアとクエンチャーで標識されたユニバーサルプローブが切断され得、リアルタイムでモニタリング可能なシグナルが生成される。
【図１２】標的ループＰＡＳＳプライマーまたはピンチＰＡＳＳプライマーを用いて異なる長さの標的配列をループ化する：ＰＡＳＳプライマー、標的ループＰＡＳＳプライマーまたはピンチＰＡＳＳプライマーを介して単位複製配列に組み込まれたユニーク配列インサート（ＵＳＩ）またはユニーク配列ジャンクション（ＵＳＪ）は、検出目的の保存配列の間に存在する非有用遺伝的変異などの配列の部位を除去するのにも使用され得る。  ＰＡＳＳプライマーは、（ｉ）ＰＡＳＳプライマーのＵＳＩが、ｃＳ１とｃＳ２の間に位置する標的配列中のヌクレオチドよりも少数のヌクレオチドを含むように、標的ループＰＡＳＳプライマーとして、または（ｉｉ）ピンチＰＡＳＳプライマーのＵＳＪがｃＳ１とｃＳ２の間に位置する標的配列をループ化させるように設計され得る。ループ化する標的配列の長さは、たとえば、１０塩基、２０塩基、４０塩基、６０塩基、１００塩基または２００塩基（ｉまたはｉｉ）であり得、たとえばループの下に２つの非結合塩基を含み得るオリジナルのループＰＡＳＳプライマー（ｉｉｉ）と比較され得る。  標的ループＰＡＳＳプライマーまたはピンチＰＡＳＳプライマーを用いてＤＮＡ増幅を行うと、ループ化された標的配列が標的ループＰＡＳＳプライマーのＵＳＩ中またはピンチＰＡＳＳプライマーのＵＳＪ中のより少数のヌクレオチドで置換される。ＭＮＡザイムは、パートザイムセンサーアームを有し、ＵＳＩまたはＵＳＪの相補鎖とハイブリダイズしレポータープローブを切断するように設計され得、ＰＡＳＳプライマーまたはピンチＰＡＳＳプライマーから生じたあらゆる単位複製配列を検出する。
【図１３】ＰＡＳＳパートザイムまたはピンチＰＡＳＳパートザイムを用いて異なる長さの標的配列をループ化する：  ＰＡＳＳパートザイムは、（ｉ）平坦ＰＡＳＳパートザイムのＵＳＩが、たとえば５、１０または１５塩基であり得るｃＳ１とｃＳ２の間に位置する標的配列と同数のヌクレオチドを含むように、（ｉｉ）ループＰＡＳＳパートザイムのＵＳＩが、ｃＳ１とｃＳ２の間に位置する標的配列よりも多いか少ない数のヌクレオチドを含み、たとえばＵＳＩが５、１０または１５塩基であるように、または（ｉｉｉ）ピンチＰＡＳＳパートザイムのＵＳＪが、ｃＳ１とｃＳ２の間に位置する標的配列のたとえば５、１０、１５、２０または４０塩基をループ化させるように、設計され得る。  ＰＡＳＳパートザイムはＭＮＡザイムｑＰＣＲで使用され得るので、ＭＮＡザイムは、第１ＰＡＳＳパートザイムまたはピンチＰＡＳＳパートザイムおよび目的の増幅された標的配列上で隣接して結合する完全マッチ（「標準」）パートザイムを含み得る。ＰＡＳＳパートザイム中のＵＳＩまたはＵＳＪ配列は活性ＭＮＡザイムの形成に影響を及ぼさないので、フルオロフォアとクエンチャーで標識されたユニバーサルプローブが切断され得、リアルタイムでモニタリングが可能なシグナルが生成される。
【図１４】ゲノム中の可変領域の省略または選択のためのプライマーとパートザイムＡの組合せの選択。ピンチＰＡＳＳパートザイムを開発することで、ＭＮＡザイムにより検出される配列の選択に柔軟性がもたらされ、標的配列が可変領域を含む場合は利点となり得る。多くの異なるプライマーとＭＮＡザイムのシナリオを使用できる。ストラテジーには、（ｉ）野生型を含むすべてのバリアントを検出する上流の一般フォワードプライマーが含まれ、（ｉＡ）可変領域を標的とする下流標準ＭＮＡザイム（異なるパートザイムＡ（ＰｚＡ）が各バリアント用に設計され得るが、共通パートザイムＢ（ＰｚＢ）と共に使用して複数のバリアントを検出できる）、または（ｉＢ）可変領域をそのユニーク配列ジャンクション（ＵＳＪ）で押し出し（ピンチアウトし）、単一のＭＮＡザイムで全バリアントを検出することを可能にするピンチＰＡＳＳパートザイムＡと共に使用され得る。「Ｘ」は、バリアント塩基を表し、「０」はバリアント塩基の相補鎖を表す。別のシナリオでは、（ｉｉ）ＭＮＡザイムと重複するバリアント特異的なフォワードプライマーが、選択的に野生型配列よりもバリアントを増幅するのに使用され得る。標準ＭＮＡザイム（ｉｉＡ）と組み合わせると特定のバリアントの検出が可能だが複数のバリアントの検出にはバリアント当たりの特異的なプライマーとパートザイムＡのセットが必要である（共通ＰｚＢを含む）。あるいは、いずれかのバリアントの存在の検出は、そのユニーク配列ジャンクション（ＵＳＪ）で可変領域を押し出して単一のＭＮＡザイムにより全バリアントの検出を可能にするピンチＰＡＳＳパートザイムＡ（ｉｉＢ）と組み合わせた各可変領域を増幅する特定のプライマーを使用することで達成され得る。あるいは、（ｉｉｉ）ＭＮＡザイムと重複するバリアント特異的なフォワードプライマーが選択的にバリアント配列を増幅するのに使用され得、各バリアント特異的プライマーは５’末端に非標的関連タグ配列を含み得、これが各バリアントの単位複製配列に組み込まれる。これによって単位複製配列の同じ鎖へのＭＮＡザイムとプライマーの結合競合が軽減し、マルチプレックス反応におけるプライマー間の競合が軽減する。このタグ付きプライマーは、（ｉｉｉＡ）標準ＭＮＡザイムと組合せられて特定のバリアントを検出し得（各ＰｚＡはゲノム中の異なる可変領域を検出するように設計される）、または（ｉｉｉＣ）タグ付きピンチＰＡＳＳパートザイムＡと組合せられ得、パートザイムＡがそのユニーク配列ジャンクション（ＵＳＪ）で可変領域を押し出し、単位複製配列中のタグ配列の相補鎖（ｃ−ｔａｇ）に結合し、単一のＭＮＡザイムで全バリアントを検出することが可能になる。
【図１５】アンチセンスＤＮＡザイムで構成されたＵＳを含むＰＡＳＳプライマー。ＰＡＳＳプライマーを用いて単位複製配列に組み込まれたユニーク配列は、機能的配列を単位複製配列に挿入するのにも使用され得る。ＰＡＳＳプライマーは、ユニーク配列がＤＮＡザイムの不活性アンチセンス型で構成され、なおも標的配列に非相補的であるように設計され得る。ＰＣＲ中に増幅されると、触媒活性のあるセンスＤＮＡザイムが単位複製配列に挿入され、基質を切断してリアルタイムのシグナルを生成し得る（図１５パネル（ｉｉ））。これに対し、標準ＰＡＳＳプライマーは触媒能力のないＵＳを有し得、標的配列に非相補的である（図１５パネル（ｉ））。ＰＡＳＳプライマーはＭＮＡザイムｑＰＣＲと組み合わされ得、その結果ＭＮＡザイムはユニーク配列（ｃＵＳ）の相補鎖ならびに増幅された標的配列に結合する第１パートザイムを含む。第２パートザイムは、目的の単位複製配列上で第１パートザイムに隣接して結合し得る。活性ＭＮＡザイムは次いで基質１（Ｓｕｂ１）を切断してリアルタイムでモニタリング可能なシグナルを生成する。第２基質２（Ｓｕｂ２）が両方の反応に添加され得るが、標準ＰＡＳＳパートザイムが使用される場合は基質２は切断されないままであり、シグナルは生じない（図１５パネル（ｉ））。しかし、ＵＳとしてＤＮＡザイムのアンチセンスを含むＰＡＳＳプライマーが使用される場合、増幅により基質２を切断する活性ＤＮＡザイムが形成され、リアルタイムでモニタリング可能なシグナルが生成される（図１５パネル（ｉｉ））。基質２は、２つの信号が区別できるように基質１とは違うフルオロフォアで標識され得、あるいは基質２は基質１と同じフルオロフォアで標識されて生成されるシグナルを増強しＣｔ値を軽減できる。
【図１６】多成分核酸（ＭＮＡザイム）の例示的設計を示す図である。例示的開示として、ＭＮＡザイムはたとえば標的ＤＮＡまたはＲＮＡなどの集合促進因子の存在下で自己集合する２つのオリゴヌクレオチド成分（パートザイムＡおよびパートザイムＢ）で構成される。２つのパートザイムが集合促進因子の存在下で集合するとき、基質を修飾（たとえば切断または結合）できる触媒活性ＭＮＡザイムが形成される。２つの成分パートザイムは、（ｉ）集合促進因子と結合するセンサーアーム、（ｉｉ）基質に結合する基質アームおよび（ｉｉｉ）部分触媒コア配列を有する。集合促進因子分子（たとえば標的核酸配列）の存在は、パートザイム成分を高特異的な態様で集合させる「入力」シグナルを与える。一部の実施形態では，集合促進因子は、試験試料中に存在する、たとえば標的核酸配列であり得る。他の実施形態では、集合促進因子は、検出可能な物質または事象の存在下でパートザイム成分の自己集合を指令する、たとえば環境に含まれる合成オリゴヌクレオチドであり得る。集合ＭＮＡザイムによる基質の修飾（基質プローブ、レポータープローブまたはレポーター基質）は、検出および／または定量化され得る「検出可能な効果」をもたらし得る。たとえば、基質がフルオロフォア（Ｆ）とクエンチャー（Ｑ）で二重に標識されている場合、活性ＭＮＡザイムによる基質の切断によってフルオロフォアとクエンチャーが分離し、結果として蛍光強度が同時に増加する。
【発明を実施するための形態】
【０２０７】
定義
本願では、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数形の指示物を包含する。たとえば単数形の「ポリヌクレオチド」は、複数のポリヌクレオチドも含む。
【０２０８】
本明細書では、「含む（comprising）」という用語は「含む（including）」を意味する。「comprising」という用語の変化形の「comprise」や「comprises」は相当の変化した意味を有する。したがって、たとえば、ヌクレオチド配列を「含む」ポリヌクレオチドは、排他的にそのヌクレオチド配列からなり得るし、または１または複数の追加のヌクレオチドを含み得る。
【０２０９】
本明細書では、「複数の」という用語は、２つ以上を意味する。特定の態様または実施形態では、複数とは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１またはそれ以上、ならびにそれらから引き出されるあらゆる整数およびその中のあらゆる範囲を意味し得る。
【０２１０】
本明細書では、「対象」という用語は、ウシ、ウマ、ヒツジ、霊長類、鳥類およびげっ歯類の種を含む経済的、社会的または研究上の重要性のある、あらゆる動物を含む。したがって、「対象」は、たとえばヒトまたは非ヒト動物などの哺乳動物であり得る。また、限定ではないが、細菌、ウイルス、真菌／酵母、原生生物および線虫を含む微生物的対象も包含される。本発明によると「対象」はプリオンなどの感染病原体も含む。
【０２１１】
本明細書では、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語はそれぞれペプチド結合で連結されたアミノ酸でできた高分子を指し、交換可能に使用される。本発明の目的では、「ポリペプチド」は全長タンパク質または全長タンパク質の一部分を構成し得る。
【０２１２】
本明細書では、「ポリヌクレオチド」と「核酸」という用語は交換可能に使用され得、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の、またはそれらの類似体、誘導体、バリアント、断片または組合せの一本鎖または二本鎖の高分子を指し、限定ではないが、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレおよびプリマイクロＲＮＡ、他の非翻訳ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、それらの誘導体、それらの単位複製配列またはそれらの任意の組合せを含む。非限定的な例として、核酸の供給源は、合成、哺乳動物、ヒト、動物、植物、真菌、細菌、ウイルス、古細菌またはそれらの任意の組合せからなる群より選択され得る。「ポリヌクレオチド」および「核酸」「オリゴヌクレオチド」という用語は、特に断らない限り、任意の特定の配列ならびにその相補的配列への言及を含む。
【０２１３】
本明細書では、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡもしくはＤＮＡを含む核酸分子、またはＲＮＡもしくはＲＮＡを含む分子、またはそれらの組合せのセグメントを指す。オリゴヌクレオチドの例としては、核酸標的、たとえばＭＮＡザイムにより修飾され得るような基質、ＰＣＲなどの方法によりインビトロの標的増幅に使用されるようなプライマー、およびＭＮＡザイムの成分が含まれる。「オリゴヌクレオチド」という用語は、特に断らない限り、任意の特定の配列ならびにその相補的配列への言及を含む。オリゴヌクレオチドは、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、βＤ−ガラクトシルケウオシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルシュードウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、βＤ−マンノシルメチルウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ−（（９−β−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチル−カルバモイル）スレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン、シュードウリジン、ケウオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ワイブトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン、βＤ−アラビノシルウリジン、βＤ−アラビノシルチミジンからなる群を含むがこれらに限定されない少なくとも１つの付加または置換を含み得る。
【０２１４】
本明細書では、「相補的」「相補性」「マッチ（一致）」および「マッチした（一致した）」という用語は、ヌクレオチド（たとえばデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの組合せ）が、ワトソン−クリック塩基対合またはゆらぎ塩基対合のいずれかにより互いにハイブリダイズする能力を指す。結合は、アデニン（Ａ）塩基とウラシル（Ｕ）塩基の間、アデニン（Ａ）塩基とチミン（Ｔ）塩基の間、シトシン（Ｃ）塩基とグアニン（Ｇ）塩基の間にワトソン−クリック塩基対合により形成され得る。ゆらぎ塩基対は、ポリヌクレオチド二本鎖（たとえばグアニン−ウラシル、イノシン−ウラシル、イノシン−アデニンおよびイノシン−シトシン）における２つのヌクレオチド間の非ワトソン−クリック塩基対合である。「相補的」な、または互いの「相補鎖」とされるヌクレオチドは、ワトソン−クリック塩基対合またはゆらぎ塩基対合によりそれぞれの塩基間でハイブリダイズすることができるヌクレオチドである。
【０２１５】
本明細書では、「非相補的」「相補的でない」「ミスマッチ」および「ミスマッチの」という用語は、ワトソン−クリック塩基対合またはゆらぎ塩基対合のいずれかによりそれぞれの塩基間で互いにハイブリダイズする能力がないヌクレオチド（たとえばデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの組合せ）を指す。
【０２１６】
本明細書では、「酵素」は、化学反応（たとえばポリヌクレオチド増幅、ポリヌクレオチド切断など）を触媒できるあらゆる分子を指す。
【０２１７】
本明細書では、「単位複製配列」は、限定ではないが、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＨＤＡ、ＲＰＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、３ＳＲまたはＮＡＳＢＡを含む天然もしくは人工的核酸増幅または複製事象の産物である核酸（たとえばＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの組合せ）を指す。
【０２１８】
本明細書では、「核酸酵素」、「触媒的核酸」、「触媒能のある核酸」および「触媒的核酸酵素」は交換可能に使用され、少なくとも１つの基質を認識し、少なくとも１つの基質の修飾（結合や切断など）を触媒し得る、ＤＮＡもしくはＤＮＡを含む分子または複合体、またはＲＮＡもしくはＲＮＡを含む分子または複合体、またはそれらの組合せ（つまりＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子または複合体）を意味する。触媒的核酸のヌクレオチド残基は、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵならびにそれらの誘導体および類似体を含み得る。上記の用語は、少なくとも１つの基質を認識し、少なくとも１つの基質の修飾（結合や切断など）を触媒し得るＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子である、１つのＤＮＡもしくはＤＮＡを含む分子（当技術分野では「ＤＮＡ酵素」「デオキシリボザイム」または「ＤＮＡザイム」としても知られる）またはＲＮＡもしくはＲＮＡを含む分子（当技術分野では「リボザイム」としても知られる）またはそれらの組合せを含み得る単分子核酸酵素を含む。上記の用語は、少なくとも１つの基質を認識し、該少なくとも１つの基質の修飾（結合や切断など）を触媒し得るＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド複合体である、ＤＮＡもしくはＤＮＡを含む複合体またはＲＮＡもしくはＲＮＡを含む複合体またはそれらの組合せを含む核酸酵素を含む。「核酸酵素」「触媒的核酸」「触媒能のある核酸」および「触媒的核酸酵素」という用語は、その意味するものにＭＮＡザイムを含む。
【０２１９】
本明細書では、「ＭＮＡザイム」と「多成分核酸酵素」という用語は、同じ意味を有し、ＭＮＡザイム集合促進因子（たとえば標的）の存在下においてのみ基質を触媒的に修飾できる活性核酸酵素を形成する、２つ以上のオリゴヌクレオチド配列（たとえばパートザイム）を指す。ＭＮＡザイムは、基質の切断、基質の結合および基質（複数可）の他の酵素的修飾を含む様々な反応を修飾し得る。切断活性を有し、パートザイムＡとパートザイムＢを含む例示的ＭＮＡザイムを図１６に示す。エンドヌクレアーゼまたは切断活性を有するＭＮＡザイムは、「ＭＮＡザイムクリーバー」としても知られる。図１６を参照すると、パートザイムＡとＢはそれぞれワトソン−クリック塩基対合により集合促進因子（たとえば標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列）と結合する。ＭＮＡザイムは、パートザイムＡとＢのセンサーアームが互いに隣接して集合促進因子上でハイブリダイズするときのみ形成される。ＭＮＡザイムの基質アームは基質と結合し、その修飾（たとえば切断）は、パートザイムＡとＢの触媒ドメインの相互作用により形成されるＭＮＡザイムの触媒コアにより触媒される。ＤＮＡ／ＲＮＡキメラレポーター基質の切断を図面に示す。ＭＮＡザイムは、フルオロフォアとクエンチャー色素の対の間で基質を切断してシグナルを生成し得る。「多成分核酸酵素」と「ＭＮＡザイム」という用語は、２分子で構成される二分構造、または３つの核酸分子で構成される三分構造、または４つ以上の核酸分子で形成されるような多分構造を含む。
【０２２０】
なお、「ＭＮＡザイム」と「多成分核酸酵素」という用語は、本明細書では、ＰＣＴ特許公報ＷＯ／２００７／０４１７７４、ＷＯ／２００８／０４００９５、ＷＯ２００８／１２２０８４および関連の米国特許公報ＵＳ２００７−０２３１８１０、ＵＳ２０１０−０１３６５３６およびＵＳ２０１１−０１４３３３８（すべてその全容を参照により本明細書組み込む）のうちのいずれか１または複数に開示されるものも含め、すべての既知のＭＮＡザイムおよび修飾ＭＮＡザイムを包含するものとする。「ＭＮＡザイム」および「多成分核酸酵素」という用語に包含されるＭＮＡザイムと修飾ＭＮＡザイムの非限定的な例は、切断触媒活性（本明細書で例示のとおり）を有するＭＮＡザイム、１または複数の結合阻害因子を含む解離または部分結合ＭＮＡザイム、１または複数のアプタマーを含むＭＮＡザイム（「アプタＭＮＡザイム」）、１または複数の切断されたセンサーアームおよび随意に１または複数の安定化オリゴヌクレオチドを含むＭＮＡザイム、１または複数の活性阻害因子を含むＭＮＡザイム、多成分核酸不活プロ酵素（ＭＮＡｉ）およびリガーゼ触媒活性を有するＭＮＡザイム（「ＭＮＡザイムリガーゼ」）を含むが、これらは全てＷＯ／２００７／０４１７７４、ＷＯ／２００８／０４００９５、ＷＯ２００８／１２２０８４、ＵＳ２００７−０２３１８１０、ＵＳ２０１０−０１３６５３６および／またはＵＳ２０１１−０１４３３３８の１または複数に詳述されている。
【０２２１】
本明細書では、「パートザイム」、「成分パートザイム」および「パートザイム成分」という用語は、ＤＮＡを含むか、ＲＮＡを含むか、ＤＮＡ−ＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドを指し、本明細書で定義するようなＭＮＡザイム集合促進因子の存在下でのみ、その２つ以上が一緒に「ＭＮＡザイム」を形成できる。ある好ましい実施形態では、１または複数の成分パートザイム、好ましくは少なくとも２つが３つの領域またはドメインを含み得る：「触媒」ドメインは修飾を触媒する触媒コアの一部を形成し、「センサーアーム」ドメインは集合促進因子と会合および／または結合し得、「基質アーム」ドメインは基質と会合および／または結合し得る。パートザイムは、限定ではないが、本明細書では「アプタパートザイム」と呼ばれるアプタマーを含む、少なくとも１つの追加成分を含み得る。パートザイムは、限定ではないが、切断されたセンサーアームと、集合促進因子か基質との相互作用によりＭＮＡザイム構造を安定化させる安定化アーム成分とを有するパートザイム成分を含む複数の成分を含み得る。
【０２２２】
ポリヌクレオチド補助（Assisted）配列スイッチング（ＰＡＳＳ）オリゴヌクレオチドという用語は、本明細書では、目的の核酸標的に相補的または実質的に相補的な５’成分、核酸標的配列には存在しないヌクレオチドの「ユニーク配列」（本明細書では「ＵＳ」とも呼ばれる）を含む中心成分、および目的の核酸標的に相補的または実質的に相補的な３’成分を含むオリゴヌクレオチドを指す。ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、プライマー（本明細書では「ＰＡＳＳプライマー」と呼ばれる）として提供され得る。ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、部分触媒ドメインと基質アームドメインをさらに含み得るパートザイム（本明細書では「ＰＡＳＳパートザイム」と呼ばれる）のセンサーアーム成分であり得る。
【０２２３】
「ユニーク配列インサート」「ＵＳＩ」「ユニークインサート配列」および「ＵＳインサート」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、同じ意味を有する。「ユニーク配列インサート」という用語は、より大きいポリヌクレオチドが相補的塩基対合により標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするとき、標的ポリヌクレオチドに相補的ではないより大きいポリヌクレオチド（たとえばＰＡＳＳオリゴヌクレオチド）内のヌクレオチドの配列を指す。
【０２２４】
「ユニーク配列ジャンクション」「ＵＳＪ」および「ＵＳジャンクション」という用語は、２成分ヌクレオチド配列を組み合わせることで形成されるヌクレオチドのユニーク配列を指し、各成分は、介在配列により分離される標的ポリヌクレオチドの別々の部分に相補的である。
【０２２５】
「ユニーク配列」という用語は、本明細書では「ユニーク配列インサート」または「ユニーク配列ジャンクション」を含み得る。
【０２２６】
「集合促進因子分子」「集合促進因子」「ＭＮＡザイム集合促進因子分子」および「ＭＮＡザイム集合促進因子」という用語は、本明細書では、成分パートザイムの自己集合を促進してＭＮＡザイムのセンサーアームとの相互作用により触媒活性ＭＮＡザイムが形成できる物質を指す。本明細書では、集合促進因子は、切断、リガーゼまたは他の酵素活性をもつＭＮＡザイムの集合を促進し得る。好ましい実施形態では、集合促進因子は、ＭＮＡザイムの自己集合に必要である。集合促進因子は、１分子で構成され得、または１もしくは複数のオリゴヌクレオチド「パートザイム」のセンサーアームと対合もしくは結合し得る２つ以上の「集合促進因子成分」で構成され得る。集合促進因子は、ＭＮＡザイムのセンサーアーム（複数可）と配列相補性を共有しない１または複数のヌクレオチド成分（複数可）を含み得る。集合促進因子は標的であり得る。標的は、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレおよびプリマイクロＲＮＡ、他の非翻訳ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、それらの誘導体、単位複製配列、またはそれらの任意の組合せからなる群より選択される核酸であり得る。核酸は増幅され得る。増幅は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＨＤＡ、ＲＰＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡまたはリガーゼ連鎖反応のうちの１または複数を含み得る。
【０２２７】
「検出可能な効果」という用語は、本明細書では基質（複数可）の修飾が生じたことの指標として検出または定量化できる効果を指す。効果の大きさは、集合促進因子（たとえば標的）などの入力量の指標になり得る。検出可能な効果は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴法、質量分析法、ＮＭＲ、電子スピン共鳴法、分極蛍光分光法、円偏光二色性測定、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射測定、測光法、シンチグラフィー、電子法、電気化学的方法、ＵＶ、可視光または近赤外線分光法、酵素的方法またはそれらの任意の組合せを含む様々な方法により検出され得る。
【０２２８】
「ポリヌクレオチド基質」および「基質」という用語は、本明細書では、限定ではないが、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレおよびプリマイクロＲＮＡ、他の非翻訳ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、それらの類似体、それらの単位複製配列またはそれらの任意の組合せ（デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド塩基の混合の高分子を含む）を含む、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基、それらの類似体、誘導体、バリアント、断片または組合せの任意の一本鎖または二本鎖高分子を含み、触媒的核酸酵素を含む酵素により認識され、作用を受け、または修飾されることが可能である。「ポリヌクレオチド基質」または「基質」は、限定ではないが、切断や結合を含む様々な酵素活性により修飾され得る。「ポリヌクレオチド基質」または「基質」の修飾は、酵素の触媒活性をモニタリングする「検出可能な効果」を提供し得る。
【０２２９】
「レポーター基質」は、本明細書では、特に触媒反応に関連する基質の消失または産物の出現を測定しやすくするようにされた基質である。レポーター基質は、溶液中に遊離し得、またはたとえば表面または別の分子に結合（または「係留」）され得る。レポーター基質は、たとえばフルオロフォア（クエンチャーなどの１または複数の追加成分とともに、またはそれらなしで）、放射性標識、ビオチン（たとえばビオチン化）または化学蛍光標識を含む多種多様な任意の手段により標識され得る。
【０２３０】
本明細書では、「一般的な基質」または「ユニバーサル基質」は、それぞれ違う集合促進因子を認識できる複数のＭＮＡザイムにより触媒的に認識され作用される基質、たとえばレポーター基質である。そのような基質を用いることで、いずれもユニバーサル基質を認識する構造的に関連のあるＭＮＡザイムを用いて様々な集合促進因子を検出、特定または定量化する別々のアッセイを開発しやすくなる。これらのユニバーサル基質は、それぞれ１または複数の標識で標識され得る。好ましい実施形態では、個別に検出可能な標識で１または複数のユニバーサル基質を標識することで、ＭＮＡザイムを用いて様々な集合促進因子を別個または同時に検出する便利な系が作製できる。一部の実施形態では、ＭＮＡザイムにより切断された基質はＭＮＡザイムまたはＤＮＡザイムリガーゼを用いて再構成され得、リサイクルされ得る。一部の実施形態では、ＭＮＡザイムにより切断または結合された基質（複数可）は、追加のＭＮＡザイム（複数可）またはＤＮＡザイム（複数可）の成分または修飾因子としてさらに使用できる。
【０２３１】
「プローブ」という用語は、本明細書では、標的核酸の検出に使用されるオリゴヌクレオチドを指す。プローブの非限定的な例としては、ＴａｑＭａｎプローブ、分子標識プローブおよび核酸酵素による触媒修飾が可能な核酸酵素基質が挙げられる。
【０２３２】
「一般的プローブ」および「ユニバーサルプローブ」という用語は、本明細書では、複数の非同一核酸酵素により触媒修飾されて１または複数の標的核酸の検出を容易にし得るプローブを指す。
【０２３３】
「一般的プローブ」または「ユニバーサルプローブ」は、本明細書では、「ユニバーサル基質」としても言及される。ユニバーサル基質は、一部の実施形態では、固体支持体の異なる位置に係留されて基質アレイを提供し得る。そのような実施形態では、係留されたユニバーサル基質はすべて同じフルオロフォアで標識され得る。場合によっては、各ユニバーサル基質は特定のＭＮＡザイム集合促進因子分子の存在下で形成されるＭＮＡザイムによってのみ切断され得、シグナルは表面上の基質の位置により局在化し得るので、異なる集合促進因子を特異的に検出できる。
【０２３４】
「産物（生成物）」という用語は、基質の酵素修飾の結果産生された新しい分子（複数可）を指す。「切断産物」という用語は、本明細書では、酵素による切断またはエンドヌクレアーゼ活性の結果産生された新しい分子（複数可）を指す。「結合産物」という用語は、酵素による基質の結合の結果産生された新しい分子を指す。
【０２３５】
本明細書では、ポリヌクレオチドで使用する「融解温度」および「Ｔｍ」という用語は、特に断らない限り、Ｗａｌｌａｃｅルールにより計算される融解温度（Ｔｍ）を参照するものとし、Ｔｍ＝２℃（Ａ＋Ｔ）＋４℃（Ｇ＋Ｃ）である（Wallace et al., (1979) Nucleic Acids Res. 6, 3543を参照）。
【０２３６】
本明細書では、「塩基」は「ヌクレオチド」と同じ意味とする。
【０２３７】
本明細書では、「キット」という用語は、物質を送達するためのあらゆる送達系を指す。そのような送達系は、反応試薬（たとえば然るべき容器に収容された標識、基準試料、支持材料など）および／または支持材料（たとえば緩衝液、アッセイを実施するための取扱説明書など）を保存、輸送または別の場所に配達可能な系を含む。たとえば、キットは、関連の反応試薬および／または支持材料を収容する１または複数の囲い、たとえば箱を含み得る。「キット」という用語はばらばらの、および一体型のキットの両方を含む。
【０２３８】
本明細書では、「ばらばらのキット」という用語は、全キット構成要素の準部分をそれぞれ収容する２つ以上の別々の容器を含む送達系を指す。容器は、一緒か別々に、意図されるレシピエントに送達され得る。全キット構成要素の準部分をそれぞれ収容する２つ以上の別々の容器を含むあらゆる送達系が「ばらばらのキット」という用語の意味に含まれる。
【０２３９】
本明細書では、「一体型キット」は、単一の容器（たとえば所望の各構成要素を収容する単一の箱）内に反応アッセイのすべての構成要素を収容する送達系を指す。
【０２４０】
本明細書では、記載した数値に関して使用される「約」という用語は、記載した数値と、記載した数値のプラスマイナス１０％の数値を含むものとする。
【０２４１】
本明細書では、ある数値範囲に関して使用される「から（〜）」という用語は、その範囲の各端点の数値も含むものとする。たとえば１０残基〜２０残基の長さのポリペプチドには、１０残基の長さのポリペプチドと２０残基の長さのポリペプチドが含まれる。
【０２４２】
本明細書内の先行技術文献の記載、またはそれらの文献に由来しまたは基づく本明細書の記述は、いずれもそれらの文献や由来の記述が当技術分野の一般常識の一部であることを容認するものではない。
【０２４３】
特に断らない限り、本明細書で参照する文献は、開示の目的で、参照によりすべてその全容を本明細書に組み込む。
【０２４４】
略語
以下の略語を本明細書全体で使用する。
ＭＮＡザイム：多成分核酸酵素または多分核酸酵素
パートザイム：オリゴヌクレオチドを含む部分酵素
Ｓ１：ＵＳの５’に位置する配列１
Ｓ２：ＵＳの３’に位置する配列２
ｃＳ１：ＵＳの３’に位置する配列１の相補鎖
ｃＳ２：ＵＳの５’に位置する配列２の相補鎖
ＰＡＳＳ：ポリヌクレオチド補助配列スイッチング
ＵＳ：ユニーク配列
ｃＵＳ：ユニーク配列の相補鎖
ＵＳＩ：ユニーク配列インサート
ＵＳＪ：ユニーク配列ジャンクション
ｃＵＳＩ：ユニーク配列インサートの相補鎖
ｃＵＳＪ：ユニーク配列ジャンクションの相補鎖
ａｖｅ：平均
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ｇＤＮＡ：ゲノムＤＮＡ
ｒｃ：逆相補鎖
ＮＴＣ：鋳型なし対照
ｑＰＣＲ：リアルタイム定量ＰＣＲ
Ｃｔ：サイクル閾値
Ｒ２：相関係数
ｎＭ：ナノモル
ｍＭ：ミリモル
μＬ：マイクロリットル
ｄＮＴＰ：デオキシリボヌクレオチド三リン酸
ＡＲＭＳ：増幅抵抗変異システム
ＷＥ−ＡＲＭＳ：ゆらぎ増強ＡＲＭＳ
ＮＦ−Ｈ２Ｏ：ヌクレアーゼを含まない水；
ＬＮＡ：ロックド核酸；
Ｆ：フルオロフォア；
Ｑ：クエンチャー；
Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇまたはそれらの任意の類似体；
Ｎ’＝Ｎに相補的であるか、Ｎと塩基対合可能な任意のヌクレオチド；
（Ｎ）ｘ：Ｎの任意の数；
（Ｎ’）ｘ：Ｎ’の任意の数；
Ｗ：ＡまたはＴ；
Ｒ：Ａ、ＧまたはＡＡ；
ｒＮ：任意のリボヌクレオチド塩基；
（ｒＮ）ｘ：ｒＮの任意の数；
ｒＲ：ＡまたはＧ；
ｒＹ：ＣまたはＵ；
Ｍ：ＡまたはＣ；
Ｈ：Ａ、ＣまたはＴ；
Ｄ：Ｇ、ＡまたはＴ；
ＪＯＥまたは６−ＪＯＥ：６−カルボキシ−４’、５’−ジクロロ−２’、７’−ジメトキシフルオレセイン；
ＦＡＭまたは６−ＦＡＭ：６−カルボキシフルオレセイン
ＢＨＱ１：ブラックホールクエンチャー１
ＢＨＱ２：ブラックホールクエンチャー２
ＲＴ−ＰＣＲ：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＤＡ：ストランド置換増幅
ＨＤＡ：ヘリカーゼ依存増幅
ＲＰＡ：リコンビナーゼポリメラーゼ増幅
ＬＡＭＰ：ループ媒介等温増幅
ＲＣＡ：ローリングサークル増幅
ＴＭＡ：転写媒介増幅
３ＳＲ：自家持続配列複製
ＮＡＳＢＡ：核酸配列ベース増幅
ＩＢ：アイオワブラック（登録商標）ＦＱ
ＩＢＲ：アイオワブラック（登録商標）ＲＱ
ｓｈＲＮＡ：短ヘアピンＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ：短干渉ＲＮＡ
ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ
ｔＲＮＡ：トランスファーＲＮＡ
ｓｎｏＲＮＡ：核小体低分子ＲＮＡ
ｓｔＲＮＡ：一過性低分子（small temporal）ＲＮＡ
ｓｍＲＮＡ：調節性低分子（small modulatory）ＲＮＡ
プレマイクロＲＮＡ：前駆マイクロＲＮＡ
プリマイクロＲＮＡ：一次（primary）マイクロＲＮＡ
【０２４５】
以下の詳細な説明は、当業者が本発明を実施できるよう十分詳しく本発明の例示的実施形態を詳述する。記載する様々な実施形態の特徴や限界は、必ずしも本発明の他の実施形態や本発明全体を制限するものではない。したがって、本発明の範囲は以下の詳細な説明には制限されず、特許請求の範囲によってのみ定義される。
【０２４６】
本発明は、ポリヌクレオチド補助配列スイッチング（ＰＡＳＳ）オリゴヌクレオチドを提供する。ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、ＰＡＳＳプライマーとして、ユニークな特定の配列を単位複製配列内に導入しやすくするのに使用され得る。このオリゴヌクレオチドにより単位複製配列に導入されたユニーク配列は、所与の核酸標的中の小さな遺伝的変異（たとえばＳＮＰ）の検出を増強したり、あるいは単位複製配列中の可変配列領域を置換して関連配列の増幅および／または検出の効率を高めるのに使用され得る。ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、ＰＡＳＳパートザイムのセンサーアーム成分であり得、それによってＰＡＳＳパートザイムのセンサーアームは１つまたは一群の核酸標的に対し相補的ではない「ユニーク配列」ならびに一群の核酸標的に対し相補的な配列の両方を含む。ＰＡＳＳパートザイムセンサーアームは、したがって、一部の実施形態では、ＰＡＳＳパートザイムセンサーアームとハイブリダイズできない成分によってのみ互いに異なる複数の異なる核酸標的とハイブリダイズし得る。ＰＡＳＳパートザイムは次に核酸標的の異なる成分に相補的なセンサーアームを含む第２の他のパートザイムと相互作用し、類似の効率で複数の異なる核酸配列を検出できるＭＮＡザイムを形成し得る。
【０２４７】
したがって、本発明のある実施形態は、核酸の検出に有用なオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチドを含む組成物とキットも提供される。
【０２４８】
本発明の他の実施形態は、核酸を検出する方法に関する。方法は、所与の標的核酸中の遺伝的多型を検出したり、あるいはオリゴヌクレオチドプライマー由来のユニーク配列で標的配列の所望ではない領域（複数可）を置換することで、その領域が単位複製配列に組み込まれるのを防止するのに使用され得る。方法は、オリゴヌクレオチドプライマー（たとえばＰＡＳＳプライマー）を使用して標的配列を増幅することと、産生された単位複製配列を検出することを含み得る。単位複製配列は、増幅した標的配列とは異種のオリゴヌクレオチドプライマー由来のユニーク配列インサートまたはジャンクションを含み得る。あるいは、方法は、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて標的配列を増幅することおよび／またはＰＡＳＳパートザイム（複数可）を含むＭＮＡザイムを用いて標的配列を検出することを含み得る。
【０２４９】
ＰＡＳＳオリゴヌクレオチド
本発明のＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド中に存在する配列に非相補的なユニーク配列（ＵＳ）を含む。ＵＳは、ユニーク配列インサート（ＵＳＩ）またはユニーク配列ジャンクション（ＵＳＪ）として準備され得る。ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼベース酵素反応のプライマー（ＰＡＳＳプライマー）として使用され得、および／またはパートザイム（ＰＡＳＳパートザイム）のセンサーアーム成分および／または基質アーム成分として含まれ得る。
【０２５０】
一部の実施形態では、ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの成分を含み得る。一方の成分は標的ポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的であり得、他方の成分はその標的オリゴヌクレオチドに非相補的または実質的に非相補的であり得る。
【０２５１】
一部の実施形態では、ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、さらに３成分を含み得る。第１と第２の成分は標的ポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的であり得、第３の成分は同じ標的ポリヌクレオチドに非相補的または実質的に非相補的であり得る。オリゴヌクレオチドの第１と第２の成分はこの標的オリゴヌクレオチドの異なる部分に相補的または実質的に相補的であり得る。標的に非相補的なオリゴヌクレオチドの第３の成分は、オリゴヌクレオチドの第１と第２の成分の間に位置し得る。
【０２５２】
一部の実施形態では、第３成分中のヌクレオチドの数は、第１と第２の成分とハイブリダイズした標的ポリヌクレオチドの部分の間に位置する標的ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数と等しいかもしれない。この特徴を有するＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、本明細書では平坦ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドとも呼ばれる。
【０２５３】
他の実施形態では、第３成分中のヌクレオチドの数は、第１と第２の成分とハイブリダイズした標的ポリヌクレオチドの部分の間に位置する標的ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも多い。そのような場合、ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドのハイブリダイズしないヌクレオチドは、ループ構造をとり得る。この特性を有するＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、本明細書ではループＰＡＳＳオリゴヌクレオチドとも呼ばれる。
【０２５４】
さらに他の実施形態では、第３成分中のヌクレオチドの数は、第１と第２の成分とハイブリダイズした標的ポリヌクレオチドの部分の間に位置する標的ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも少ない。この特徴を有するＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、本明細書では標的ループＰＡＳＳオリゴヌクレオチドとも呼ばれる。
【０２５５】
たとえば、第３成分は、第１と第２の成分とハイブリダイズした標的ポリヌクレオチドの部分の間に位置する標的ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも１〜３００ヌクレオチド、１〜２５０ヌクレオチド、１〜２００ヌクレオチド、１〜１５０ヌクレオチド、１〜１００ヌクレオチド、１〜７５ヌクレオチド、１〜５０ヌクレオチド１〜２５ヌクレオチド、５〜３００ヌクレオチド、５〜２５０ヌクレオチド、５〜２００ヌクレオチド、５〜１５０ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜７５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド、５〜２５ヌクレオチド、１０〜３００ヌクレオチド、１０〜２５０ヌクレオチド、１０〜２００ヌクレオチド、１０〜１５０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜７５ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、または１０〜２５少ないヌクレオチドを含み得る。そのような場合、第１と第２の成分の間に位置する標的ポリヌクレオチドのハイブリダイズしないヌクレオチドは、ループ構造をとり得る。ループ構造は、１〜３００ヌクレオチド、１〜２５０ヌクレオチド、１〜２００ヌクレオチド、１〜１５０ヌクレオチド、１〜１００ヌクレオチド、１〜７５ヌクレオチド、１〜５０ヌクレオチド１〜２５ヌクレオチド、５〜３００ヌクレオチド、５〜２５０ヌクレオチド、５〜２００ヌクレオチド、５〜１５０ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜７５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド５〜２５ヌクレオチド、１０〜３００ヌクレオチド、１０〜２５０ヌクレオチド、１０〜２００ヌクレオチド、１０〜１５０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜７５ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチドまたは１０〜２５ヌクレオチドを含み得る。ループ構造は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、１００または２００ヌクレオチドを含み得る（図１２）。
【０２５６】
一部の実施形態では、第１成分はＰＡＳＳオリゴヌクレオチドの５’末端で終止し得、第２成分はＰＡＳＳオリゴヌクレオチドの３’末端で終止し得る。５’成分は３’成分よりも短いかもしれない。他の実施形態では、５’成分は３’成分よりも長いかもしれない。他の実施形態では、中心成分は５’成分および／または３’成分よりも短いかもしれない。さらに他の実施形態では、中心成分は５’成分および／または３’成分よりも長いかもしれない。
【０２５７】
ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、５’成分の５’および／または３’成分の３’のいずれかに位置し得る追加の非相補的配列をさらに含み得る。
【０２５８】
非限定的な一例だが、ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドの５’成分、３’成分および／または中心成分は、７５未満、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１７、５５、１３、１０、９、８、７、６未満、または５未満のヌクレオチド長であり得る。たとえば、中心成分は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１のヌクレオチド長であり得る。代替実施形態では、ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、第１成分と第２成分を含み得、各々標的ポリヌクレオチドの個々の部分に対し相補的または実質的に相補的である。標的ポリヌクレオチドの個々の部分は、介在ヌクレオチド（複数可）で分けられている。したがって、相補的塩基対合によるＰＡＳＳオリゴヌクレオチドの標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション時、標的ポリヌクレオチドの非連続的ヌクレオチドは並列してＵＳＪを生成する。標的ポリヌクレオチド中の空間的に分かれているヌクレオチド配列成分が一緒になると、その標的ポリヌクレオチド中でループ構造をとり得る。これらの特性を有するＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、本明細書ではピンチＰＡＳＳオリゴヌクレオチドとも呼ばれる。標的ポリヌクレオチド中のループ構造は、１〜１００ヌクレオチド、１〜７５ヌクレオチド、１〜５０ヌクレオチド１〜２５ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜７５ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド５〜２５ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜７５ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、または１０〜２５ヌクレオチドを含み得る。ループ構造は１０、２０、３０、４０、５０または６０ヌクレオチドを含み得る。
【０２５９】
本発明のＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、パートザイム（ＰＡＳＳパートザイム）の一成分であり得る。たとえば、ＰＡＳＳパートザイムのセンサーおよび／または基質アーム（複数可）は、ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドを含み得る。したがって、ＰＡＳＳパートザイムは、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズし標的ポリヌクレオチドの隣接部分とハイブリダイズできる第２パートザイムと結合する能力をもち得、集合して検出可能なイベントを与えて基質を修飾できるＭＮＡザイムになり得る。
【０２６０】
本発明のＰＡＳＳパートザイムは、本明細書に記載の平坦ＰＡＳＳオリゴヌクレオチド、ループＰＡＳＳオリゴヌクレオチド、標的ループＰＡＳＳオリゴヌクレオチドまたはピンチＰＡＳＳオリゴヌクレオチドを含むかそれからなるセンサーアームおよび／または基質アームを含み得る。
【０２６１】
標的ループＰＡＳＳオリゴヌクレオチドまたはピンチＰＡＳＳオリゴヌクレオチドを含むかそれからなるセンサーアームおよび／または基質アームを含むＰＡＳＳパートザイムは、センサーアームおよび／または基質アームとハイブリダイズしたポリヌクレオチド中にループ構造が形成される原因となり得る。標的ポリヌクレオチド中のループ構造は、１〜６０ヌクレオチド、１〜５０ヌクレオチド、１〜４０ヌクレオチド、１〜３０ヌクレオチド１〜２０ヌクレオチド、１〜１０ヌクレオチド、５〜６０ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド５〜２０ヌクレオチド、５〜１０ヌクレオチド、１０〜６０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチドまたは１０〜２０ヌクレオチドを含み得る。標的ポリヌクレオチド中のループ構造は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０ヌクレオチドを含み得る（図１３）。
【０２６２】
本明細書では、別のヌクレオチド配列に「実質的に相補的」なヌクレオチド配列を指す場合、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のヌクレオチドの領域で第１配列が第２配列の相補鎖と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であることを意味し得る。
【０２６３】
本明細書では、別のヌクレオチド配列に「相補的」なヌクレオチド配列は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のヌクレオチドの領域で第１配列が第２配列の相補鎖と１００％同一であることを意味し得る。
【０２６４】
本明細書では、別のヌクレオチド配列に「実質的に非相補的」なヌクレオチド配列を指す場合、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のヌクレオチドの領域で第１配列が第２配列の相補鎖と少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％または４０％未満しか同一でないことを意味し得る。
【０２６５】
本明細書では、別のヌクレオチド配列に「非相補的」なヌクレオチド配列は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のヌクレオチドの領域で第１配列が第２配列の相補鎖と０％同一であることを意味し得る。
【０２６６】
本明細書で提供されるＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、所望の用途により任意適当な長さでよい。非限定的な一例だが、オリゴヌクレオチドは１００未満、７５未満、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１７、５５、１３、１０、９、８、７、６未満または５未満のヌクレオチド長であり得る。
【０２６７】
ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドが結合し得る標的核酸（つまりポリヌクレオチド）の非限定的な例としては、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレおよびプリマイクロＲＮＡ、他の非翻訳ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、それらの誘導体、それらの単位複製配列、またはそれらの任意の組合せ（デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチド塩基を混合した高分子を含む）が挙げられる。
【０２６８】
したがって、本明細書で提供されるＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレおよびプリマイクロＲＮＡ、他の非翻訳ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、それらの誘導体、それらの単位複製配列、またはそれらの任意の組合せ（デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチド塩基を混合した高分子を含む）を含むかそれらからなり得る。
【０２６９】
ある実施形態では、本発明のＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、核酸の標的配列を増幅する場合のプライマーとして使用され得る。
【０２７０】
図１に示す実施形態を参照すると、ＰＡＳＳプライマーは３つの領域を含み得る。プライマーの５’成分（Ｓ１）は目的の核酸標的に実質的に相補的な配列を含み、プライマーの中間部分は非標的特異的ユニーク配列（ＵＳ）であり、プライマーの３’成分（Ｓ２）は目的の核酸標的に実質的に相補的な配列を含む。Ｓ１とＳ２は、Ｓ２がＳ１よりも標的配列の５’に向けて結合するように設計され得る。パネル（ｉ）に示すように、Ｓ１とＳ２が結合する標的の領域の間のギャップ内のヌクレオチドの数は、ＵＳ中の塩基数よりも少ない可能性があるので、ＵＳはＰＡＳＳプライマーが標的と結合するときループを形成する（図１、パネル（ｉ））。あるいは、図１のパネル（ｉｉ）に示すように、Ｓ１とＳ２に結合される標的配列の間にギャップがあり得る。ＵＳはＳ１とＳ２の間のギャップと同数（図１パネル（ｉｉ））のヌクレオチド、それより少ないヌクレオチド、またはそれより多くのヌクレオチド（図１、パネル（ｉ））を含み得る。
【０２７１】
一部の実施形態では、Ｓ１の融解温度（「Ｔｍ」）は、Ｓ２のＴｍよりも高い。
【０２７２】
したがって、一部の実施形態では、ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは３つの領域、すなわち（ｉ）標的核酸の第１成分に相補的または実質的に相補的であり標的にアニーリングできる、３’領域（Ｓ２）よりも高いＴｍを有する５’領域（Ｓ１）；（ｉｉ）Ｓ１よりも低いＴｍを有し得、標的に相補的または実質的に相補的である３’領域（Ｓ２）；および（ｉｉｉ）Ｓ１とＳ２の間に位置し、標的に非相補的または実質的に非相補的であるユニーク配列（ＵＳ）を含む介在領域（ＵＳ）を有し得る。
【０２７３】
一般に、目的の配列を増幅するのにＰＡＳＳプライマーが使用される場合、得られる単位複製配列にＵＳが組み込まれる（図１、パネル（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ））。ＵＳは、たとえばＵＳまたはＵＳの相補鎖に結合するように設計された分子標識またはＭＮＡザイムパートザイムを用いて単位複製配列検出を補助するなど、様々な目的のために設計され得る（図１、パネル（ｉｉｉ））。ＭＮＡザイムパートザイムまたは分子標識は、ＰＡＳＳプライマーの３’末端から増幅される標的配列にも結合してもしなくてもよい。
【０２７４】
ＰＡＳＳプライマーの具体的かつ非限定的な例は、配列番号１０、１１、１３、１４、１６または１７のいずれか１つに定義される配列を含むものである。
【０２７５】
ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドの例示的適用
ＰＡＳＳプライマーを用いての標的の増幅
本発明のＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列を増幅し、得られる単位複製配列にユニーク配列（ＵＳ）を組み込むプライマー（ＰＡＳＳプライマー）として使用され得る。ＰＡＳＳプライマーが適用され得る増幅法については特に制限はない。ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドを用いて様々な反応により生成する単位複製配列は、任意既知の技法により検出され得る。非限定的な例としては、二本鎖ＤＮＡに結合する色素（たとえばＳＹＢＲグリーン）に提供されるシグナルを用いる検出法、および／または単位複製配列の配列特異的プローブ（たとえば分子標識、マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）プローブ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）を用いる検出法が挙げられる。
【０２７６】
一般に、核酸増幅法は、酵素（たとえばポリメラーゼ）を用いて１または複数のオリゴヌクレオチドプライマーにより特異的に結合される標的核酸の複製を生成する。ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドが使用され得る増幅法の非限定的な例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）のうちの１または複数を含む。
【０２７７】
本明細書に記載するＰＡＳＳオリゴヌクレオチド由来のＵＳを単位複製配列に導入すると、一塩基多型または後天的点変異などの１個の塩基の差をより区別しやすくなり得る。たとえば、ＰＡＳＳプライマーは、ＳＮＰや変異（たとえば点変異）などのバリアント配列がより強力に区別できるように設計され得る。
【０２７８】
図２を参照すると、ＰＡＳＳプライマーは、ＳＮＰや点変異などの１個の塩基の変化より強力に区別できるように設計され得る。たとえば、ループＰＡＳＳプライマー（図２パネル（ｉ））または平坦ＰＡＳＳプライマー（図２パネル（ｉｉ））のいずれかの３’成分（Ｓ２）は、ＳＮＰまたは点変異を標的とし特異的に結合するように使用され得る。ＰＡＳＳプライマーのＳ２中のＳＮＰまたは点変異にマッチする塩基がプライマーの３’末端に位置し得（図２パネル（ｉ）と（ｉｉ）の上部）、またはＳ２内の他の位置、たとえば、プライマーの３’末端の５’側の１、２、３、４、５または５以上の塩基などに位置し得る。さらに、追加の塩基はＳ２と目的の標的配列の間でミスマッチであり得、ＳＮＰを区別しやすくする（図２パネル（ｉ）と（ｉｉ）の下部）。たとえば、１、２、または３個の塩基がＳ２と標的配列の間でミスマッチであり得る。このようなミスマッチ塩基（複数可）はプライマーの３’末端の５’側の１、２、３、４、５または５以上の塩基などに位置し得る。
【０２７９】
ＰＡＳＳプライマーは、複数の標的ポリヌクレオチドが関与するマルチプレックス反応においてバリアント配列間の区別（たとえばＳＮＰまたは変異）を強化するように設計され得る。これらの実施形態では、異なる標的ポリヌクレオチド結合特異性を有する２つ以上のＰＡＳＳプライマーが異なる標的ポリヌクレオチドの検出に使用され得る。異なる標的ポリヌクレオチド標的由来の単位複製配列を区別するために、一方のポリヌクレオチドに特異的な第１ＰＡＳＳプライマーの中心成分（ＵＳ）は、他方の異なる標的ポリヌクレオチドに特異的な第２プライマーの中心成分（ＵＳ）の中心成分（ＵＳ）とは異なり得る。
【０２８０】
１個の塩基だけが違う２つの配列間の検出と区別を図３に示す。バリアント１を左側のパネルに円で示し、バリアント２を右側のパネルに三角形で示す。ＰＡＳＳプライマー１のＳ２はバリアント１と特異的にマッチし、ＰＡＳＳプライマー１のＵＳはループ形態の第１ＵＳ（ＵＳ１）である（ループ１）。ＰＡＳＳプライマー２のＳ２はバリアント２と特異的にマッチし、ＰＡＳＳプライマー２のＵＳはループ形態の第２ＵＳ（ＵＳ２）である（ループ２）。ＰＣＲでこれらのＰＡＳＳプライマーを使用すると、（ａ）バリアント塩基と（ｂ）ＰＡＳＳプライマーにより組み込まれたＵＳの両方において配列が異なる、各バリアントの単位複製配列が得られる。異なる単位複製配列は任意適当な手段により検出され得る。図３に示す実施形態では、マルチプレックスＭＮＡザイムｑＰＣＲ反応を用いて検出が達成され得る。
【０２８１】
ＰＡＳＳプライマー由来のユニーク配列（ＵＳ）は、「スキッピング」すなわち検出対象の標的保存配列の間に存在する非有用な遺伝的変異の部位を除去するために、単位複製配列に組み込まれ得る。これにより、たとえば、配列の保存領域が可変領域により分けられている単一のウイルスまたは細菌の複数株の検出が容易になり得る。そのような実施形態では、異なるポリヌクレオチド標的に由来する間の単位複製配列を区別することが不要であり得、その場合、異なるＰＡＳＳプライマーの中心成分（ＵＳ）は同一であり得る。あるいは、異なるＰＡＳＳプライマーの中心成分（ＵＳ）の配列は、単位複製配列の供給源を区別するために異なり得る。
【０２８２】
非限定的な一例だが、特定の治療に対する反応を予測するＳＮＰ（ＳＮＰ−１）は、治療反応について何ら有用な情報を提供しない（ＳＮＰ−２）のすぐ下流であり得る。ＡＲＭＳプライマーのＳＮＰ−１に対する設計は、ＳＮＰ−２の複数のアレルの存在により複雑になる。ＰＡＳＳプライマーは、ＳＮＰ−１に有用なアレルに特異的なＳ２を用いて設計され得る。ＰＡＳＳプライマーは、Ｓ１とＳ２がその間に非ハイブリダイズ標的配列を残すように標的に対し設計される。この非ハイブリダイズ標的配列はＳＮＰ−２を含むことになる。ＰＡＳＳプライマーを用いての増幅中、ＰＡＳＳプライマー中のユニーク配列（ＵＳ）はＳＮＰ−２の配列を置換し、この外来性の変異を反応から除去する。ＳＮＰ−１の異なるアレルの区別は、２つのＰＡＳＳプライマーにより達成され得る。ＳＮＰのアレル１は、アレル１と特異的にマッチするＳ２を含むＰＡＳＳプライマー１およびＵＳ１により増幅される。ＰＡＳＳプライマー２はＳＮＰのアレル２を増幅する。ＰＡＳＳプライマー２は、アレル２と特異的にマッチするＳ２およびＵＳ２を含む（ＵＳ１とは異なる配列）。ＰＣＲでこれらのＰＡＳＳプライマーを使用すると、（ａ）バリアント塩基と（ｂ）ＰＡＳＳプライマーにより組み込まれたＵＳ（ただしＳＮＰ−２のバリアントはない）の両方において配列が異なる、各バリアントの単位複製配列が得られる。ＰＡＳＳプライマー１およびＰＡＳＳプライマー２の単位複製配列は、図３に記載のＭＮＡザイム（ＭＮＡザイム１とＭＮＡザイム２を参照）により検出され得る。
【０２８３】
図５と図６に示す実施形態を具体的に参照すると、ＰＡＳＳプライマーは、Ｓ１とＳ２が、標的の保存された隣接しない２つの配列に相補的または実質的に相補的であるように設計され得る（図５、ＰＡＳＳプライマー）。標的配列中のＳ１とＳ２にハイブリダイズする部位の間のギャップ（標的−ギャップ）は、検出される３つのバリアント間で配列が異なり得る。バリアントはウイルス株または細菌株であり得る。ＰＡＳＳプライマーのＵＳは、Ｓ１とＳ２の間の標的−ギャップ中に同数のヌクレオチドを含むように設計され得（図５）、またはＰＡＳＳプライマーのＵＳはＳ１とＳ２の間の標的−ギャップ中に含まれるよりも少数のヌクレオチドを含むように設計され得る（図６）。
【０２８４】
図５のＰＡＳＳプライマーを用いる図５のバリアント１、２および３からのＤＮＡ増幅により、標的−ギャップの変異に関わらず同一の配列の単位複製配列が得られ得る。ＰＡＳＳプライマーのＵＳは、Ｓ１とＳ２の間の標的−ギャップにおいて遺伝的変異を置換し得る。したがって、産生されたすべての単位複製配列を検出する方法は、異なる標的ポリヌクレオチドから増幅された単位複製配列に関わらず、単一のＵＳの検出に依存し得る。たとえば、図５に示すように、ＵＳの相補鎖とハイブリダイズし（ｃＵＳ、図５）単一プローブを切断するパートザイムセンサーアームを有するＭＮＡザイムが設計され得、たとえばウイルスまたは細菌のバリアント１、２および３を検出する。
【０２８５】
図６を具体的に参照すると、図示の標的ループＰＡＳＳプライマーを用いてバリアント１からＤＮＡを増幅すると、標的−ギャップ中のバリアント配列がＰＡＳＳプライマーのＵＳ中の小数のヌクレオチドで置換される。これと同じ標的−ギャップ領域に変位を有する他のウイルス株または細菌株も、このＰＡＳＳプライマーにより高効率で増幅される。得られる単位複製配列は、標的−ギャップの配列に関わらず、すべて同じ配列を有する。ＵＳの相補鎖とハイブリダイズし（ｃＵＳ、図６）一本鎖プローブを切断するパートザイムセンサーアームと一緒に単一のＭＮＡザイムが設計され得、ＰＡＳＳプライマーから生成した任意の単位複製配列を検出する。
【０２８６】
上述したＰＡＳＳオリゴヌクレオチド／プライマーの増幅は、非限定的な一例でしかないことを、当業者であれば容易に理解する。開示されるＰＡＳＳオリゴヌクレオチド／プライマーは、あらゆるプライマーベースの核酸増幅法で使用され得るので、本発明は具体的に記載される実施形態には限定されない。
【０２８７】
ＰＡＳＳプライマーを用いて生成した単位複製配列の検出
上述したように、本発明のＰＡＳＳプライマーは、あらゆるポリヌクレオチド増幅法で使用され得、その非限定的な例としてはＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＨＤＡ、ＲＰＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、３ＳＲまたはＮＡＳＢＡが挙げられる。
【０２８８】
ＰＡＳＳプライマーを用いる技法により生成する単位複製配列は、当技術分野で既知の任意適当な技法により検出され得る。
【０２８９】
非限定的な例としては、標識プローブ、検出可能な標識のプライマーへの組込み、触媒的核酸の使用などが挙げられる。
【０２９０】
たとえば、単位複製配列は、（ＳＹＢＲグリーンと融解曲線解析）により検出され得、第１ＰＡＳＳプライマーのユニーク配列（ＵＳ１）のＴｍと第２ＰＡＳＳプライマーのユニーク配列（ＵＳ２）のＴｍの違いが単位複製配列の融解温度により大きい差をもたらす。加えて、または代わりに、分子標識がＵＳ１またはＵＳ２を包含するように設計して分子標識を使用してもよい。加えて、または代わりに、ＭＮＡザイムを使用して単位複製配列を検出してもよい。
【０２９１】
ある実施形態では、使用される検出方法は、単位複製配列に組み込まれたＰＡＳＳプライマーの中心成分（ＵＳ）またはＵＳの成分を検出するように設計され得る。このことは、別個のポリヌクレオチド由来の単位複製配列の検出を目的とするマルチプレックスアッセイにおいて特に有利である。たとえば、ＳＮＰや他の変異など、別個の標的ポリヌクレオチドにおける小さな遺伝的変異を容易に区別することができ得る。
【０２９２】
加えて、または代わりに、使用される検出方法は、単位複製配列に組み込まれたＰＡＳＳプライマーの５’（Ｓ１）および／または３’（Ｓ２）成分を検出するように設計され得る。
【０２９３】
多くの適用では、単位複製配列を配列特異的技法（たとえば単位複製配列に組み込まれたＰＡＳＳオリゴヌクレオチドの中心成分の特異配列に基づく技法）により検出することが好ましいかもしれないが、他の技法も考えられる。たとえば、異なる標的ポリヌクレオチドに由来する単位複製配列を区別するために増幅を実施しない実施形態では、産生された単位複製配列をその大きさにより検出すれば十分であろう。これは、たとえば、増幅が、検出対象である標的の保護配列の間に存在する非有用な遺伝的変異の領域を除去することを含むような場合であり得る。
【０２９４】
ＭＮＡザイムは、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＨＤＡ、ＲＰＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡ、３ＳＲおよびＮＡＳＢＡなどの技法によりＰＡＳＳプライマーを用いて生成された単位複製配列の検出に使用され得る。ＭＮＡザイムは、１または複数のＰＡＳＳパートザイム（複数可）を含み得る。ＭＮＡザイムは、集合した、ＰＡＳＳプライマーを用いてポリヌクレオチド配列から生成された単位複製配列などの検出対象の標的であり得る集合促進因子の存在下でのみ触媒活性を有する、多成分核酸酵素である。ＭＮＡザイムは複数のパート酵素（part-enzymes）すなわちパートザイムで構成され、１または複数の集合促進因子の存在下で自己集合し、基質を触媒的に修飾する活性ＭＮＡザイムを形成する（図１６）。基質と集合促進因子（標的）は別の核酸分子である。パートザイムは、（ｉ）集合促進因子（たとえば標的核酸）に結合するセンサーアーム；（ｉｉ）基質を結合する基質アームおよび（ｉｉｉ）集合すると結合して完全触媒コアを与える部分触媒コア配列を含む複数のドメインを有する。ＭＮＡザイムは、たとえば異なる標的核酸配列を含む、あらゆる集合促進因子を認識するように設計され得る。集合促進因子の存在に反応して、ＭＮＡザイムはその基質を修飾する。この基質修飾は、シグナル生成と結びつき得るので、ＭＮＡザイムは酵素増幅された出力シグナルを生成し得る。集合促進因子は、生物学的または環境的試料（たとえばＰＡＳＳプライマーを用いてポリヌクレオチド標的から生成する単位複製配列）中に存在する標的核酸であり得る。そのような場合、ＭＮＡザイム活性による基質修飾の検出は、標的の存在を示す。核酸基質を切断することができるいくつかのＭＮＡザイムが報告されており、核酸基質を結合できるさらなるＭＮＡザイムも当技術分野では知られている。ＭＮＡザイムおよびその修飾型が当技術分野では既知であり、ＰＣＴ公報ＷＯ／２００７／０４１７７４、ＷＯ／２００８／０４００９５、ＷＯ２００８／１２２０８４および関連の米国特許公報２００７−０２３１８１０、２０１０−０１３６５３６および２０１１−０１４３３３８に開示されている（すべてその全容を参照により本明細書に組み込む）。
【０２９５】
たとえば、ＭＮＡザイムの片方または両方のセンサーアームがＰＡＳＳプライマーまたはその成分に相補的または実質的に相補的であり得る。ある実施形態では、ＭＮＡザイムの一方のセンサーアームがＰＡＳＳプライマーまたはその成分の中心成分（ＵＳ）に相補的または実質的に相補的であり、中心成分を含む単位複製配列の残りの部分にも相補的である。ＭＮＡザイムの第２センサーアームは、第１センサーアームに相補的ではなくＵＳを含まない、同じ単位複製配列の別の部分に相補的である。
【０２９６】
ＭＮＡザイムは、異なるＰＡＳＳプライマー由来の異なる中心成分（ＵＳ）を含む複数の別個の単位複製配列の存在を検出するように設計されたマルチプレックスアッセイで使用され得る。たとえば第１ＭＮＡザイムのセンサーアーム（複数可）は、第１ポリヌクレオチド標的に結合しその増幅を促進できる第１ＰＡＳＳプライマー由来の第１中心成分（ＵＳ）を含む第１単位複製配列に特異的であり得、第２ＭＮＡザイムのセンサーアーム（複数可）は、第１ポリヌクレオチド標的とは異なる配列を含む第２ポリヌクレオチド標的に結合しその増幅を促進できる第２ＰＡＳＳプライマー由来の第２中心成分（ＵＳ）を含む第２単位複製配列に特異的であり得る。これによって、別個のポリヌクレオチド標的に由来する複数の別個の単位複製配列の検出が１つのアッセイにおいて容易になる。当業者であれば、他の別個のポリヌクレオチド標的に由来する追加の別個の単位複製配列に特異性を有する追加のＭＮＡザイムもそのようなアッセイに含むことができることを容易に理解する。
【０２９７】
非限定的な一例だが、図３を参照すると、ＭＮＡザイム１は、バリアント１とＵＳ１の相補鎖の両方に特異性のある配列で構成されるパートザイムセンサーアームを設計することで、バリアント１単位複製配列を検出できるように設計され得る。ＭＮＡザイム１は、バリアント１の単位複製配列の存在下でのみフルオロフォア１で標識されたユニバーサルプローブ１（Ｓｕｂ１）を切断できるように設計され得る。ＭＮＡザイム２は、バリアント２とＵＳ２の相補鎖の両方に特異性のある配列で構成されるパートザイムセンサーアームを設計することで、バリアント２単位複製配列を検出できるように設計され得る。ＭＮＡザイム２は、バリアント２の単位複製配列の存在下でのみフルオロフォア２で標識されたユニバーサルプローブ２（Ｓｕｂ２）を切断できるように設計され得る。このストラテジーでは、バリアント１と２両方のリアルタイムの検出、区別および定量化が１つの反応チューブ内で同時に生じ得る。図７は、標的ポリヌクレオチド中のＳＮＰや点変異などのバリアント塩基を選択的に増幅するように設計されたＰＡＳＳプライマーの例示的設計を示す。ＰＡＳＳプライマーにより生成した単位複製配列は、たとえばＭＮＡザイムにより検出され得る。ＰＡＳＳプライマーは、ＳＮＰや点変異などの１個の塩基の変化を区別するように設計され得る。たとえば、図７においてループおよび平坦ＰＡＳＳプライマーで示すＳ２は、ＳＮＰまたは点変異を標的として特異的に結合するのに使用され得る。ＰＡＳＳプライマーのＳ２のＳＮＰまたは点変異と一致するヌクレオチドが、プライマーの３’末端に（設計１）、３’末端から３ヌクレオチドのところに（設計２）、３’末端から３塩基のところにミスマッチヌクレオチドが挿入されて、プライマーの３’末端に（設計３）または３’末端から５塩基のところにミスマッチヌクレオチドが挿入されて、プライマーの３’末端に（設計４）位置し得る。ＰＡＳＳプライマーにより生成された単位複製配列を検出するのにＭＮＡザイムが使用され得る。各ＰＡＳＳプライマー設計に適合するパートザイムＡ標的センサーアームが示されているが、パートザイムＢは全設計で同じものとして示されている。
【０２９８】
当業者であれば、平坦、ループ、標的ループおよびピンチＰＡＳＳプライマーが図７に示す例示的設計により使用され得ることを容易に理解する。また、当業者であれば、Ｓ２成分中に示すＳＮＰとマッチするヌクレオチドおよび／またはミスマッチヌクレオチドの位置が変更可能であることも容易に理解する。たとえばどちらも３’末端か、３’末端から１、２、３、４または５ヌクレオチドのところに位置し得る。
【０２９９】
ＰＡＳＳパートザイムを用いての単位複製配列の検出
ＰＡＳＳパートザイム（複数可）を含むＭＮＡザイムは、標的核酸および標的核酸の単位複製配列の検出に使用され得る。標的核酸の単位複製配列は、任意適当な技法により生成し得る。一部の実施形態では、標的核酸の単位複製配列は、ＰＡＳＳプライマーを利用する技法により生成し得る。
【０３００】
図８に示す例示的実施形態を参照すると、ＰＡＳＳパートザイムは、関連のバリアント配列に由来する複数の単位複製配列を検出するように設計され得る。非限定的な一例だが、目的の標的配列は、異なる標的（図８ではバリアント１（Ｖ１）、バリアント２（Ｖ２）およびバリアント３（Ｖ３）配列とする）により異なるバリアントヌクレオチドのストリングを含み得る。プライマーセットは、Ｖ１、Ｖ２およびＶ３の各バリアント配列に特異的であり、それぞれの単位複製配列を産生するように設計され得る。ＰＡＳＳパートザイムは、バリアント株を区別せずリアルタイムで配列を検出するストラテジーを提供する。このことは、ＭＮＡザイムｑＰＣＲの利用を含むので、ＭＮＡザイムはＰＡＳＳパートザイムを含み得る。一例として、ＰＡＳＳパートザイムは、目的の標的配列（複数可）／単位複製配列（複数可）に非相補的なユニーク配列（ＵＳ）の一部分を含み得る。ＵＳは標的に相補的な２つの領域の間のＰＡＳＳパートザイムセンサーアーム内に位置し得る。パートザイム中のＵＳはバリアント塩基を含むＶ１、Ｖ２およびＶ３のバリアント領域と揃い得る。この設計の１つのＰＡＳＳパートザイムは、Ｖ１、Ｖ２およびＶ３の単位複製配列に等しいか類似の効率で結合し得、それらの同時検出を可能にする。
【０３０１】
図８に示す例示的実施形態をさらに参照すると、ＰＡＳＳパートザイム中のＵＳは活性ＭＮＡザイムの形成を妨げないので、あらゆるバリアントまたはそれらの組合せの存在によりユニバーサルプローブが切断され、検出可能な事象が得られる。たとえば、プローブがフルオロフォアとクエンチャーで標識されている場合、リアルタイムでモニタリングできるシグナルが生じ得る。
【０３０２】
当業者であれば、図８に示すＰＡＳＳパートザイムのセンサーアームは、相補的塩基の単位複製配列のバリアント領域へのハイブリダイゼーションを防止するように各々設計される、本明細書に記載の平坦ＰＡＳＳオリゴヌクレオチド、ループＰＡＳＳオリゴヌクレオチド、標的ループＰＡＳＳオリゴヌクレオチドまたはピンチＰＡＳＳオリゴヌクレオチドを含むかそれからなり得ることを理解する。
【０３０３】
次に図１０に示す例示的実施形態を参照すると、ＰＡＳＳパートザイムは、ＭＮＡザイムｑＰＣＲの読み取りによりバリアント欠失株を検出するように設計され得るので、目的のバリアント標的配列は、非一致欠失領域（図１０パネルｉ、欠失１および欠失２）を有するメンバーを含む野生型配列群に由来し得る。プライマーセットは、各欠失バリアント配列に特異的であり、それぞれの単位複製配列を産生するように設計され得る。ＰＡＳＳパートザイムを使用すると、必ずしも特異的欠失を区別する必要なくリアルタイムで配列を検出するストラテジーが提供される。これは、ＭＮＡザイムｑＰＣＲを用いて達成され得るので、ＭＮＡザイムは、第１ＰＡＳＳパートザイムおよび増幅された目的の標的配列上で隣接して結合する完全マッチ（「標準」）パートザイムを含み得る。ＰＡＳＳパートザイムは、欠失単位複製配列の間で領域が異なるところに整列するように設計された、ユニーク配列（ＵＳ）と呼ばれる標的配列に非相補的な配列の領域を含み得るので、１つのＭＮＡザイムを全てのバリアントの検出に使用できる（図１０パネルｉｉ）。ＰＡＳＳパートザイムに存在するＵＳは、平坦形態であり得、ＰＡＳＳパートザイムのセンサーアームの非相補的塩基の数は標的配列中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数と一致する（図１０パネルｉｉ（ａ））。あるいは、ＰＡＳＳパートザイムセンサーアームに存在するＵＳはループ形態であり得、ＰＡＳＳパートザイムのセンサーアームの非相補的／ハイブリダイズしないヌクレオチドの数は、標的配列中の非相補的／ハイブリダイズしないヌクレオチドの数よりも多い（図１０パネルｉｉ（ｂ））。
【０３０４】
当業者であれば、図１０は平坦およびループＰＡＳＳオリゴヌクレオチドの使用を示すが、図１０に示すＰＡＳＳパートザイムのセンサーアームは、相補的塩基の単位複製配列の可変欠失領域へのハイブリダイゼーションを防止するように各々設計される、本明細書に記載の標的ループＰＡＳＳオリゴヌクレオチドまたはピンチＰＡＳＳオリゴヌクレオチドを含むかそれからなり得ることを理解する。
【０３０５】
１つのＰＡＳＳパートザイムは増幅欠失バリアント１および２により生成した単位複製配列に等しいか類似の効率で結合し得、それらの同時検出を可能にする。
【０３０６】
ＰＡＳＳパートザイム内のＵＳは活性ＭＮＡザイムの形成を妨げないので、フルオロフォアとクエンチャーで標識されたユニバーサルプローブが切断され得、検出可能な事象が提供される。これによりリアルタイムで監視可能なシグナルが生じる。
【０３０７】
図９に示すさらに別の例示的実施形態では、標的の検出は、ＰＡＳＳパートザイムとＰＡＳＳプライマーを組み合わせて達成され得る。目的の標的配列はバリアントのヌクレオチド配列を含み得、異なる標的のバリアントヌクレオチド配列は同一ではなく、たとえばバリアント１（Ｖ１）、バリアント２（Ｖ２）およびバリアント３（Ｖ３）配列である。ＰＡＳＳプライマーセットは、Ｖ１、Ｖ２およびＶ３の各バリアント配列に特異的であるように設計され得、さらに同じＵＳ（ＵＳ１）を含み得るので、増幅により（ｉ）バリアント塩基と（ｉｉ）共通のＵＳ（ｃＵＳ１）に相補的な配列とバリアント間で保存された配列を含む、各バリアントの単位複製配列が産生される。これらのＰＡＳＳプライマーとＰＡＳＳパートザイムの併用により、バリアント株を区別することなくリアルタイムで全てのバリアント配列を検出するストラテジーが提供される。これは、ＭＮＡザイムｑＰＣＲの使用を含むので、ＭＮＡザイムは、第１ＰＡＳＳパートザイムおよび増幅された目的の標的配列上で隣接して結合する完全マッチ「標準」パートザイムを含み得る。例示されるＰＡＳＳパートザイムセンサーアームは、（ｉ）すべてのバリアントの単位複製配列の保存配列に完全マッチする領域、（ｉｉ）バリアントのどの単位複製配列にも相補的でなく、バリアント単位複製配列間で異なる領域に整列するユニーク配列（ＵＳ２）および（ｉｉｉ）バリアント特異的プライマーセット（すべてｃＵＳを含む）を使用して生成するすべての単位複製配列に結合できるＵＳ１を含む領域を含む。このＭＮＡザイムはすべてのバリアントを認識しハイブリダイズできる。
【０３０８】
いずれかの設計の１つのＰＡＳＳパートザイムは、バリアント配列の増幅により生成した単位複製配列に等しいか類似の効率で結合し得、それらの同時検出を可能にする。当業者であれば、図９は平坦ＰＡＳＳプライマーの使用を示すが、図９に示すＰＡＳＳプライマーは、生成した標的配列の複製中にＵＳを与えるように各々設計される、本明細書に記載のループＰＡＳＳプライマーまたはピンチＰＡＳＳプライマーで置換され得ることを理解する。当業者であれば、図９は平坦ＰＡＳＳパートザイム立体構造を示すが、センサーアームＵＳ２が単位複製配列の可変配列に非相補的であるループまたは標的ループＰＡＳＳオリゴヌクレオチド、あるいはピンチＰＡＳＳオリゴヌクレオチドセンサーアームが利用可能な単位複製配列内の結合領域としての可変配列の除去を促進するセンサーアームを含む等価バージョンで置換され得ることも理解する。
【０３０９】
各ＰＡＳＳパートザイム中の複数のＵＳは活性ＭＮＡザイムの形成を妨げないので、あらゆるバリアントまたはそれらの組合せの存在によりユニバーサルプローブが切断され、検出可能な事象が得られる。たとえば、プローブがフルオロフォアとクエンチャーで標識されている場合、リアルタイムでモニタリングできるシグナルが生じ得る。
【０３１０】
図１１に例示するさらなる実施形態では、ＰＡＳＳパートザイムをＰＡＳＳプライマーと併用してバリアント欠失を検出できる。目的のバリアント標的配列は、異なる領域が欠失している野生型配列由来であり得る（図１１パネルｉ、欠失１および欠失２）。ＰＡＳＳプライマーセットは、欠失１および欠失２の各欠失バリアント配列に特異的であるように設計され得るが、さらに同じＵＳ（ＵＳ１）を含み得るので、欠失特異的バリアント塩基ならびに同じＵＳの相補鎖配列（ｃＵＳ１）および保存された共通の標的配列を含む各欠失の単位複製配列がもたらされ得る。バリアント欠失を区別しないリアルタイムの単位複製配列検出の例示的ストラテジーでは、ＰＡＳＳパートザイムをＰＡＳＳプライマーと一緒に使用する。これは、ＭＮＡザイムｑＰＣＲを用い得るので、ＭＮＡザイムは、第１ＰＡＳＳパートザイムおよび増幅された目的の標的配列上で隣接して結合する完全マッチ（「標準」）パートザイムを含み得る。ＰＡＳＳパートザイムは、（ｉ）欠失単位複製配列の間で配列が異なるところで整列するように設計された、ユニーク配列（ＵＳ２）（パネルｉｉ）と呼ばれる増幅された標的配列に非相補的な配列の領域、（ｉｉ）１つのＭＮＡザイムがすべてのバリアントの検出に使用できるように、ＵＳ１に対応する別の領域（パネルｉｉ）および（ｉｉｉ）すべての欠失単位複製配列で保存されている共通の相補配列を含み得る。ＰＡＳＳパートザイムに存在するＵＳ２は、平坦形態であり得、ＰＡＳＳパートザイムの非相補的塩基の数は標的配列中の結合しない塩基の数と一致する。あるいは、ＰＡＳＳパートザイム内に存在するＵＳ２は、ループ立体構造であり得るので、パートザイム中の非相補的塩基の数は標的配列中よりも多くなり、配列は張り出し、つまりループ化する（パネルｉｉ）。いずれかの設計の１つのＰＡＳＳパートザイムは、欠失バリアントの増幅により生成した単位複製配列に等しいか類似の効率で結合し得、それらの同時検出を可能にする。
【０３１１】
当業者であれば、図１１はループＰＡＳＳプライマーの使用を示すが、図１１に示すＰＡＳＳプライマーは、生成した標的配列の複製中にＵＳを与えるように各々設計される、本明細書に記載の平坦ＰＡＳＳプライマー、標的ループＰＡＳＳプライマーまたはピンチＰＡＳＳプライマーで置換され得ることを理解する。当業者であれば、図１１は平坦およびループＰＡＳＳパートザイムの立体構造を示すが、センサーアームが、単位複製配列中の可変欠失配列にＵＳ２が非相補的な標的ループＰＡＳＳオリゴヌクレオチドを含む等価バージョンか、あるいは単位複製配列中のセンサーアームの利用可能な結合領域として可変欠失配列の除去を促進するピンチＰＡＳＳオリゴヌクレオチドセンサーアームで置き換えられ得ることも理解する。
【０３１２】
ＰＡＳＳパートザイム内のＵＳは活性ＭＮＡザイムの形成を妨げないので、フルオロフォアとクエンチャーで標識されたユニバーサルプローブが切断され得、リアルタイムでモニタリング可能なシグナルが生成される。
【０３１３】
次に図１４を参照すると、１または複数のプライマーを用いる標的配列の増幅により、プライマー（複数可）と標的配列を含む標的配列の単位複製配列が得られ得る。そのような場合、ＭＮＡザイムは、単位複製配列を検出するように設計され得る。ＭＮＡザイムは、図１４Ｂと図１４Ｃに示すように、ＰＡＳＳパートザイムを含み得る。たとえば図１４（ｉ）、１４Ａ（ｉ）および１４Ｂ（ｉ）に示すように、ＭＮＡザイムは、片方または両方のパートザイム成分（複数可）のセンサーアームが、塩基対の相補性により、単位複製配列のプライマー配列を含まない一領域か、またはプライマー配列に相補的な配列（たとえば各々の末端が別々のプライマー配列を含むか、または各々の末端が別々のプライマー配列に相補的な配列を含む、単位複製配列の２つの末端の間の領域）とハイブリダイズするように、設計され得る。あるいは、ＭＮＡザイムは、片方または両方のパートザイム成分（複数可）のセンサーアームが、プライマー配列を含む単位複製配列の一領域か、またはプライマー配列に相補的な配列とハイブリダイズするように、設計され得る（図１４（ｉｉ）／（ｉｉｉ）、１４Ａ（ｉｉ）／（ｉｉｉ）、１４Ｂ（ｉｉ）および１４Ｃ（ｉｉｉ））。そのような場合、プライマー配列とハイブリダイズするセンサーアームは、ＰＡＳＳパートザイムの成分であり得る。たとえば図１４Ｂ（ｉ）／（ｉｉ）および１４Ｃ（ｉｉｉ）に示すように、ピンチＰＡＳＳパートザイムが使用され得、プライマー配列の一部分および所望によりプライマー配列の上流または下流の単位複製配列の追加配列のループ化が得られる。一部の実施形態では、標的配列の単位複製配列は、タグ配列を含むプライマー（複数可）を含み得る（図１４（ｉｉｉ）、１４Ａ（ｉｉｉ）、１４Ｃ（ｉｉｉ））。ＭＮＡザイムは、片方または両方のパートザイム成分（複数可）のセンサーアームが、タグ配列を含む単位複製配列か、またはタグ配列に相補的な配列とハイブリダイズするように、設計され得る。そのような場合、プライマー配列とハイブリダイズするセンサーアームは、ＰＡＳＳパートザイムの成分であり得る。たとえば図１４Ｃ（ｉｉｉ）に示すように、ピンチＰＡＳＳパートザイムが使用され得、プライマー配列の一部分および所望により追加のタグ配列および所望によりプライマー配列の上流または下流の単位複製配列の追加配列のループ化が得られる。当業者であれば、平坦、ループ、標的ループおよびピンチＰＡＳＳパートザイムが本明細書に記載の例示的方法にしたがい使用され得ることを容易に理解する。
【０３１４】
ＰＡＳＳパートザイムを用いる非増幅標的核酸の検出
本発明のＰＡＳＳパートザイムは、ポリメラーゼベースの増幅法により増幅されたことがない核酸の検出に使用され得る。
【０３１５】
たとえば、ＰＡＳＳパートザイムは、バリアント標的配列を検出するように設計され得る。非限定的な一例だが、目的の標的配列は、標的によって異なるバリアント領域を含み得る。可変領域は、ヌクレオチド置換（複数可）、挿入（複数可）および／または欠失（複数可）を含み得る。ＰＡＳＳパートザイムは、標的配列のいずれにも相補的でないか、または少なくとも所与のバリアント標的配列集団内の可変領域のいずれにも相補的でない、ユニーク配列（ＵＳ）の一部分を含み得る。ＵＳは、１または複数の標的配列に各々相補的であるＰＡＳＳパートザイムセンサーアームの２つの領域の間に位置し得る。一方の相補的領域は、標的（複数可）のバリアント領域の３’の相補的塩基対合により標的配列（複数可）とハイブリダイズでき得、他方は標的（複数可）の可変領域の５’の相補的塩基対合により同じ標的配列（複数可）とハイブリダイズでき得る。こうして、ＰＡＳＳパートザイムの可変領域を含む標的（複数可）とのハイブリダイゼーションは、ＵＳをＵＳがハイブリダイズしないままであり得るバリアント領域と整合し得る。この設計の１つのＰＡＳＳパートザイムは、したがって、等しいか類似の効率で複数の異なる標的に結合し得、同時検出を可能にする。一般に、検出は、ＰＡＳＳパートザイムにハイブリダイズされた標的配列の部分にすぐ隣接する標的配列の一部分に相補的なセンサーアームを含む第２パートザイムの付加により容易になり得、基質を修飾できる触媒活性ＭＮＡザイムの集合が促進され、検出可能シグナルがもたらされる。当業者であれば、ＰＡＳＳパートザイムのセンサーアームは、相補的塩基の標的配列のバリアント領域へのハイブリダイゼーションを防止するように各々設計される、本明細書に記載の平坦ＰＡＳＳオリゴヌクレオチド、ループＰＡＳＳオリゴヌクレオチド、標的ループＰＡＳＳオリゴヌクレオチドまたはピンチＰＡＳＳオリゴヌクレオチドを含むかそれからなり得ることを理解する。
【０３１６】
ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドの使用による機能的核酸の単位複製配列への組み込み
ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、機能的核酸の単位複製配列への組み込みに使用され得る。機能的配列は、ＵＳまたはＵＪＳを単位複製配列に組み込むＰＡＳＳオリゴヌクレオチド（たとえばＰＡＳＳプライマー）により形成され得、新たなＵＳに相補的な配列、またはＵＪＳにより形成された新たな配列は、機能を有する。たとえば組み込まれる配列はＤＮＡザイムまたはリボザイムのものであり得る。
【０３１７】
次に図１５、特に図１５のパネル（ｉｉ）を参照すると、ＵＳを含むＰＡＳＳプライマーが標的核酸（たとえばゲノムＤＮＡ）の増幅に使用され得、そうすることでＵＳは単位複製配列に組み込まれる。ＰＡＳＳプライマーのＵＳは、不活性なアンチセンス型の機能的核酸を含み得る。標的核酸が増幅されると、触媒活性のあるセンス型の機能的核酸が単位複製配列に挿入される。当業者であれば、平坦、ループおよび標的ループＰＡＳＳプライマーが、ＵＳを通じて産生される単位複製配列に機能的核酸を組み込む結果を得るのに使用され得ることを容易に理解する。代替実施形態では、ピンチＰＡＳＳプライマーが単位複製配列にＵＳＪを生成するのに使用され得、そうすることで単位複製配列内に機能的核酸を生成する。
【０３１８】
図１５のパネル（ｉｉ）の例示的実施形態に示すように、不活性なアンチセンス型の触媒的核酸（この場合はＤＮＡザイム）を含むＵＳが使用され、ＵＳの機能的活性型を含む単位複製配列が得られる。単位複製配列に存在する触媒的核酸の機能的活性センス型は、基質を切断し検出可能信号を産生できるので、そうして生成した単位複製配列の存在を通知する。図１５パネル（ｉｉ）の最下部に示すように、所望によりＭＮＡザイムを用いて、機能的触媒的核酸（この場合はＤＮＡザイム）を含む単位複製配列の検出を補助させてもよい。たとえば、機能的触媒的核酸ならびに単位複製配列部分の基質に隣接するか実質的に隣接する、相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第１パートザイムを含むＭＮＡザイムが使用できる。ＭＮＡザイムの第２パートザイム成分は第１パートザイムに隣接する単位複製配列と（やはり相補的塩基対合により）にハイブリダイズし得、単位複製配列内の触媒的核酸と同じかまたは異なる基質を切断することができる触媒的に活性なＭＮＡザイムの集合を促進して単位複製配列の存在を示す追加の検出可能シグナルを生じさせる。
【０３１９】
診断への適用
ＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の方法にしたがい、診断および／または予後の目的に使用され得る。診断および／または予後の方法は、エクスビボまたはインビトロで実施され得る。しかし、本発明の方法は、必ずしも診断および／または予後の目的で使用される必要はなく、診断または予後ではない用途も企図される。
【０３２０】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象における感染を診断するのに使用され得る。たとえば、方法は、対象における細菌、ウイルス、真菌／酵母、原生生物および／または線虫による感染の診断に使用され得る。一実施形態では、ウイルスはエンテロウイルスであり得る。対象は、ウシ、ウマ、ヒツジ、霊長類、鳥類およびげっ歯類の種であり得る。たとえば対象は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギまたはウシなどの哺乳動物であり得る。対象は、感染から発症する疾患に罹患しているかもしれない。たとえば対象は、エンテロウイルスの感染から髄膜炎を有し得る。したがって、本発明の方法は、特定の実施形態では髄膜炎の診断に使用され得る。
【０３２１】
本発明の方法は、試料において実施され得る。試料はあらゆる供給源由来であってよい。たとえば試料は、環境的供給源や産業的供給源から、または化学合成により得られ得る。
【０３２２】
本明細書では、「試料」とは、たとえば精製、希釈または任意他の成分（複数可）の付加など、元の状態から改変された試料を含むものとする。
【０３２３】
診断および／または予後の方法を限定ではなく含む本発明の方法は、生体試料に対し実施できる。生体試料は対象から採取され得る。保存された生体試料も使用できる。適当な生体試料の非限定的な例は、全血もしくはその成分（たとえば血球、血漿、血清）、尿、唾液、リンパ液、胆汁、痰、涙、脳脊髄液、気管支洗浄液、滑膜液、精液、腹水腫瘍液（ascitic tumour fluid）、母乳および膿を含む。
【０３２４】
キット
本発明は、本発明の方法を実施するための１または複数の剤を含むキットを提供する。典型的には、本発明の方法を実施するためのキットは、方法を実施するのに必要なすべての試薬を含む。
【０３２５】
一部の実施形態では、キットは、適切な集合促進因子（たとえば本明細書に記載のＰＡＳＳプライマーを含む単位複製配列）の存在下でＭＮＡザイムを形成できるオリゴヌクレオチド成分を含み得る。たとえば、キットは、少なくとも、第１および第２パートザイムを含む第１および第２のオリゴヌクレオチド成分と、基質を含む第２容器とを含み得、第１および第２パートザイムと基質が自己集合してＭＮＡザイムになるには、試験試料に存在する集合促進因子（たとえば単位複製配列）の会合が必要である。したがって、そのような実施形態では、第１および第２パートザイムと基質は、１または複数の標的単位複製配列の存在を判定するために、試験試料に加えられ得る。
【０３２６】
一般に、キットは、本明細書で提供される少なくとも１つのＰＡＳＳオリゴヌクレオチドを含む。したがって、キットは、たとえば、平坦ＰＡＳＳオリゴヌクレオチド、ループＰＡＳＳオリゴヌクレオチド、標的ループＰＡＳＳオリゴヌクレオチドおよび／またはピンチＰＡＳＳオリゴヌクレオチドなどのＰＡＳＳオリゴヌクレオチドを含み得る。
【０３２７】
加えて、または代わりに、キットは、ＰＡＳＳプライマーｓｕｃｈａｓ、たとえば、平坦ＰＡＳＳプライマー、ループＰＡＳＳプライマー、標的ループＰＡＳＳプライマーおよび／またはピンチＰＡＳＳプライマーを含み得る。
【０３２８】
加えて、または代わりに、キットは本明細書に記載のＰＡＳＳオリゴヌクレオチド（たとえば平坦ＰＡＳＳオリゴヌクレオチド、ループＰＡＳＳオリゴヌクレオチド、標的ループＰＡＳＳオリゴヌクレオチドまたはピンチＰＡＳＳオリゴヌクレオチド）を含むかそれからなるセンサーアームおよび／または基質アームを含むＰＡＳＳパートザイムを含み得る。キットは、同じ標的ポリヌクレオチドを結合し、基質を修飾できる触媒活性ＮＭＡザイムの集合を促進して検出可能な信号を与えることに関連する、ＰＡＳＳパートザイムに相補的に設計された標準パートザイムをさらに含み得る。
【０３２９】
典型的には、本発明のキットは、ＰＣＲや他の核酸増幅法など、本発明の方法の実施に必要な他の試薬、洗浄試薬、酵素および／または他の試薬も含む。
【０３３０】
キットは、本明細書に記載したようなばらばらのキットでも一体のキットでもよい。
【０３３１】
ばらばらのキットは、別の容器に納められた試薬を含み、小さいガラス容器、プラスチック容器またはプラスチックや紙の小片を含み得る。そのような容器は、コンパートメント間で試薬を高効率に移すことが可能であり得る一方で、試料や試薬の交雑や、各容器の試薬や溶液のコンパートメント間での量的追加を防止する。そのようなキットは、試験試料を入れるための容器、アッセイで使用する試薬が入った容器、洗浄試薬が入った容器および検出試薬が入った容器も含む。
【０３３２】
一体型キットは、単一の容器（たとえば所望の各構成要素を収容する単一の箱）内に反応アッセイのすべての構成要素を収容する。
【０３３３】
本発明のキットは、適切に方法を実施するためのキット構成要素を使用する取扱説明書も含み得る。本発明のキットおよび方法は、たとえば限定ではないがリアルタイムＰＣＲ器を含む自動解析装置やシステムと関連して使用され得る。
【０３３４】
異なる標的の増幅、検出、特定または定量化の用途に本発明の１つのキットが適用され得、あるいは違うキット、たとえば各標的に特異的な試薬を含むキットが必要になり得る。本発明のキットおよび方法は、あらゆる物質を検出、特定または定量化することが望まれるあらゆる状況に適用される。
【０３３５】
当業者であれば、広く記載されるような本発明の精神または範囲を逸脱することなく、特定の実施形態に開示するように数多くの変形および／または改変が本発明に加えられ得ることを理解する。したがって、これらの実施形態は、説明目的であり限定的ではないと考えるべきである。
【０３３６】
次に、本発明を以下の具体的な例を参照しながら説明するが、それらの例はいかようにも限定的であると理解してはならない。
【実施例】
【０３３７】
実施例１：ＰＡＳＳプライマーを介して単位複製配列に挿入された配列を検出するＭＮＡザイムの使用
ＰＡＳＳ  ＰＣＲストラテジーは、目的の標的配列に非相補的なユニーク配列を含む領域を有するプライマーを含む。ＰＡＳＳプライマー中に存在するユニーク配列（ＵＳ）は、ＰＡＳＳプライマーが標的と結合するときループ化するか平坦であり得る（図１）。
【０３３８】
この実施例では、ＰＡＳＳプライマーがＭＮＡザイムｑＰＣＲと組み合わされるので、ＭＮＡザイムは、ユニーク配列（ｃＵＳ）の相補鎖ならびに増幅された目的の標的配列に結合する第１パートザイムを含み、第２パートザイムは第１パートザイムに隣接して増幅された目的の標的配列に結合する。パートザイムＡが目的の標的配列上でパートザイムＢに隣接して結合する点は、パートザイムジャンクションと呼ばれる。パートザイム成分から活性ＭＮＡザイムを形成すると、フルオロフォアとクエンチャー色素の対で標識されたユニバーサルプローブが切断され、リアルタイムでモニタリングできるシグナルが生成される。
【０３３９】
プライマーとパートザイムは、ＰＡＳＳプライマーのＳ２ドメイン（図１）と相補的パートザイム配列の間の重複の様々なシナリオが、ＣＣＢ遺伝子の検出と適合するかどうかを判定するように設計された。この結果、ＰＡＳＳプライマーの３’末端はパートザイムジャンクションから５塩基、パートザイムジャンクションから３塩基またはパートザイムジャンクションに結合した。ＰＡＳＳプライマーと非ＰＡＳＳ「標準」プライマーを各シナリオ用に設計した。
【０３４０】
１．１パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムは、ＣＣＢ遺伝子および／またはＰＡＳＳプライマーにより単位複製配列に導入されたいずれかのｃＵＳを特異的に標的とするように設計した。以下の配列では、太字の塩基は目的の標的配列とハイブリダイズし、下線の塩基はｃＵＳにハイブリダイズし、ＵＳのインサート２（ｉ２）を含む。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。全ての配列を５’から３’方向に記す。
【０３４１】
【化１】
2018075033.tif 000003
【０３４２】
１．２  レポーター基質
この実施例のレポーター基質を以下の５’から３’方向に記した配列に示す。この実施例では、基質の５’末端をＦＡＭ部分で末端標識し（以下の基質名中「Ｆ」で示される）、３’末端をアイオワブラック（登録商標）ＦＱクエンチャー部分で末端標識した（以下の基質名中「ＩＢ」で示される）。基質の切断は、４８５ｎｍで励起し（ＦＡＭ励起波長）、５３０ｎｍでモニタリングした（ＦＡＭ放射波長）。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
【０３４３】
【化２】
2018075033.tif 000004
【０３４４】
１．３．ＣＣＢ  ＤＮＡの増幅のためのＰＣＲプライマー
この実施例の標的配列は、以下に挙げるオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いてのヒトゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）のインビトロの増幅により生成された。ＰＡＳＳプライマーを、プライマーが標的に結合するとＵＳがループ化し「ループ」と呼ばれるように設計する。プライマーが標的に結合したときＵＳがループ化しないＰＡＳＳプライマーを「平坦（プラナー）」と呼ぶ。全ての配列を５’から３’方向に記す。以下の配列において下線の塩基はＵＳである。
【０３４５】
【化３】
2018075033.tif 000005
【０３４６】
１．４．標的配列
ＩＭ９細胞株（プロメガ）から抽出したヒトｇＤＮＡをＣＣＢ遺伝子増幅の鋳型として用いた。
【０３４７】
１．５．反応成分：標的配列の増幅と検出
標的配列のリアルタイムの増幅と検出を総反応体積２５μＬで実施した。Ｍｘ３００５ｐ（ストラタジーン）中で反応させた。サイクルパラメータは９５℃２分、９５℃１５秒と５５℃３０秒の５サイクル、９５℃１５秒と５２℃６０秒の４０サイクル（５２℃のステップでデータを収集）であった。すべての反応は、二連で実施し、４０ｎＭのフォワードプライマーと１００ｎＭのパートザイムＡ（表１に挙げる組合せ）、２００ｎＭのリバースプライマー（３ＣＣＢ）、２００ｎＭのパートザイムＢ（ＣＣＢＢ／７２−Ｐ）、２００ｎＭの基質（Ｓｕｂ７２−ＦＩＢ）、８ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０単位のＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮＡｓｅインヒビター（バイオライン）１×ＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（バイオライン）、２単位のＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（バイオライン）と、ｇＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）または無標的（ヌクレアーゼなしＨ２Ｏ（ＮＦ  Ｈ２Ｏ））のいずれかを含んだ。
【０３４８】
【表１】
2018075033.tif 000006
【表２】
2018075033.tif 000007
【０３４９】
１．６．結果：標的の増幅およびレポーター基質の切断
ポジティブ対照「標準」フォワードプライマー（非ＰＡＳＳプライマーつまりＵＳを含有せず）を用いて、目的の標的配列だけに結合するＭＮＡザイムによるＣＣＢのリアルタイム検出と定量化のための単位複製配列を産生した。この反応は、使用された標的配列がＰＣＲ増殖されたヒトｇＤＮＡの場合、経時的な蛍光の増加を示した（図４（ｉ）〜（ｉｉｉ）、ポジティブ対照）。ＤＮＡなし標的対照の蛍光度は、ＤＮＡ標的を含む反応のものよりも低く、反応中に増加しなかった。このことは、標的を含む反応で産生された蛍光増加は、その後でレポーター基質を切断した触媒活性ＮＭＡザイムの標的依存性集合によることを示している。
【０３５０】
フォワードプライマーがＰＡＳＳプライマーであり、パートザイムＡがｃＵＳと標的特異配列の両方に結合される場合、蛍光の増加が経時的に見られた（図４（ｉ）〜（ｉｉｉ）、試験１＆試験２）。さらに、反応がＰＡＳＳプライマーループタイプと平坦タイプの両方を含むので、シグナルはポジティブ対照と類似していた。標準非ＰＡＳＳプライマーやループＰＡＳＳプライマーと比べて平坦ＰＡＳＳプライマーが使用された場合、パートザイムジャンクションからＰＡＳＳプライマーが始まる反応でシグナル発生にわずかな遅れがあった（図４（ｉｉｉ）試験２平坦）。
【０３５１】
標準非ＰＡＳＳフォワードプライマー（つまりノーマルプライマー）とＵＳと標的特異配列の両方を含むパートザイムＡを含むネガティブ対照の反応の蛍光は、試験１、試験２およびポジティブ対照の反応よりも低く、図４のパネル（ｉ）および（ｉｉｉ）に示される反応の閾値を超えなかった。しかし、図４のパネル（ｉｉ）に示される反応のネガティブ対照は、閾値より僅かに増加した蛍光を示す。このことは、パートザイムアーム中のＵＳとこの設計用に増幅されたＣＣＢ標的配列の間には相同性があるので、予想されなかったことではなく、この相同性が、非効率的ではあっても、ＭＮＡザイムが形成するのに十分パートザイムアームを安定させ得る。
【０３５２】
パートザイムＡとＰＡＳＳプライマーのＳ２ドメインの間の重複の全シナリオは良好に許容され、試験１と試験２で強力なシグナルが見られた（図４（ｉ）〜（ｉｉｉ））。
【０３５３】
これらの結果は、ＵＳがＰＣＲ単位複製配列にＰＡＳＳプライマーを通じて（ループまたは平坦ＰＡＳＳタイプのプライマーにより）挿入され得、これらの単位複製配列が次いでＭＮＡザイムで検出され得、ＰＡＳＳプライマーのＳ２とパートザイムＡの間の重複が良好に許容されることを示している。
【０３５４】
実施例２：配列中の一塩基変化を検出するためＭＮＡザイムと組み合わせたＰＡＳＳプライマーの使用
ＰＡＳＳプライマーは、１個の塩基が違う２つの配列を区別するように設計され得、標的特異的３’末端（Ｓ２）がバリアント塩基を含み（図２（ｉ）と（ｉｉ）の上）、バリアント塩基の５’に位置する１個のミスマッチ塩基も含み得る（図２（ｉ）と（ｉｉ）下）。さらに、ＵＳはバリアントごとに異なり得、別のレベルの選択性と特異性を付加する（図３）。
【０３５５】
この実施例では、Ｇ１２Ｖと呼ばれるコドン１２中のＫＲＡＳ点変異が、野生型ＫＲＡＳ配列Ｇ１２に対しアッセイされる。コドン１２の野生型（Ｇ１２；ＧＧＴ）のバリアント塩基は２位のＧであり、変異体（Ｇ１２Ｖ；ＧＴＴ）ではバリアント塩基はコドン１２の２位のＴである。ループまたは平坦ＵＳのいずれかを含むＰＡＳＳプライマーを、Ｇ１２Ｖ配列またはＧ１２配列のいずれかに特異的であるように設計した。バリアント塩基はＳ２の、３’末端（図７、設計１）または３’末端から３塩基（図７、設計２）のいずれかに位置した。設計１と２は、やはりバリアント塩基の５’から２塩基にそれぞれミスマッチ（Ｍ）が挿入されている設計３と４と比較された（図７、設計３および設計４）。野生型（ＵＳ１）とバリアント（ＵＳ２）では異なるＵＳがＰＡＳＳプライマーに挿入される。
【０３５６】
ＰＡＳＳプライマーがＭＮＡザイムｑＰＣＲと組み合わされ、それによりＭＮＡザイムはユニーク配列（ｃＵＳ）の相補鎖ならびに各バリアント塩基に合わせた（野生型または変異体、ミスマッチを有するかまたは有さない）増幅された標的配列に結合する第１パートザイムを含む（図７）。第２パートザイムは、増幅された目的の標的配列上で第１パートザイムに隣接して結合する。
【０３５７】
ＰＡＳＳプライマーとパートザイムは、様々なシナリオがＫＲＡＳのバリアント塩基、野生型Ｇ１２または点変異Ｇ１２Ｖに特異的かどうかを判定するように設計された。
【０３５８】
２．１．パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムは、ＫＲＡＳ遺伝子の野生型Ｇ１２または変異体Ｇ１２Ｖアレルに加えてＰＡＳＳプライマーを介して導入されたあらゆるｃＵＳを特異的に標的とするように設計した。以下の配列では、太字の塩基が目的の標的配列とハイブリダイズし、下線の塩基は出発鋳型に対しミスマッチのユニーク配列（野生型インサートｉ１およびバリアントインサートｉ２）である。一部のパートザイムＡは、より長い（Ｌ）３’標的特異領域を有する。太字斜体の塩基はバリアント塩基を表し、下線斜体の塩基は追加のミスマッチ塩基を表す。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。全ての配列を５’から３’方向に記す。
【０３５９】
【化４】
2018075033.tif 000008
【０３６０】
２．２レポーター基質
この実施例では、基質の５’末端を６−ＦＡＭ部分で末端標識し（以下の基質名中「Ｆ」で示される）、３’末端をアイオワブラック（登録商標）ＦＱクエンチャー部分で末端標識した（以下の基質名中「ＩＢ」で示される）。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍで励起し（ＣＦＸ９６（バイオラッド）上のＦＡＭ励起波長範囲）、５１０〜５３０ｎｍでモニタリングした（ＣＦＸ９６（バイオラッド）上のＦＡＭ放射波長範囲）。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。この実施例のレポーター基質を以下の５’から３’方向の配列で示す。
【０３６１】
【化５】
2018075033.tif 000009
【０３６２】
２．３．ＫＲＡＳ  ＤＮＡの増幅のためのＰＣＲプライマー
ヒトｇＤＮＡのＫＲＡＳ遺伝子のインビトロ増幅を、以下に挙げるオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて実施した。ＰＡＳＳプライマーは、野生型に特異的なフォワードプライマーがＵＳ、インサート１（ｉ１）を含み、および変異体に特異的なフォワードプライマーがＵＳ、インサート２（ｉ２）を含むように設計した。一部のフォワードプライマーは、より長い（Ｌ）３’標的特異領域を有する。以下の配列では太字の塩基は標的配列とハイブリダイズし、下線の塩基は出発鋳型に対しミスマッチのユニーク配列であり、太字下線の塩基はバリアント塩基であり、斜体の塩基は両方の標的にミスマッチ（Ｍ）の追加の塩基を表す。全ての配列を５’から３’方向に記す。
【０３６３】
【化６】
2018075033.tif 000010
【化７】
2018075033.tif 000011
【０３６４】
２．４．標的配列
Ｋ５６２細胞株から抽出したヒトｇＤＮＡを野生型ＫＲＡＳ遺伝子のインビトロ増幅の鋳型として用い、ＳＷ６２０細胞株から抽出したｇＤＮＡを点変異Ｇ１２Ｖを含むＫＲＡＳのインビトロ増幅に用いた。
【０３６５】
２．５．反応成分：標的配列の増幅と検出
標的配列のリアルタイム増幅と検出を総反応体積２５μＬで実施した。反応はＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（バイオラッド）により実施された。サイクルパラメータは９５℃２分、９５℃１５秒および６４℃６０秒の１０サイクル（１サイクル毎に温度を１℃下げる）、９５℃１５秒および５４℃５０秒の４０サイクル（データは５４℃で収集）であった。すべての反応は、二連で実施し、４０ｎＭのフォワードプライマーと１００ｎＭのパートザイムＡ（表２に挙げる組合せ）、２００ｎＭのリバースプライマー（３ＫＲＡＳ）、２００ｎＭのパートザイムＢ（ＫＲＡＳ＿Ｂ／５５−Ｐ）、２００ｎＭの基質（Ｓｕｂ５５−ＦＩＢ）、８ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０単位のＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮＡｓｅインヒビター（バイオライン）、１×ＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（バイオライン）、２単位のＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（バイオライン）と、Ｋ５６２もしくはＳＷ６２０ｇＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）または無標的（ＮＦ  Ｈ２Ｏ）のいずれかを含んだ。
【０３６６】
【表３】
2018075033.tif 000012
【表４】
2018075033.tif 000013
【０３６７】
２．６．結果：標的の増幅とレポーター基質の切断
表３に示すように、増殖され、経時的に蛍光強度が増加し閾値Ｃｔ値に達した特異的ＫＲＡＳアレルを検出されたＧ１２とｃＵＳ１、またはＧ１２ＶとｃＵＳ２のいずれかに特異的なフォワードＰＡＳＳプライマーとパートザイムＡ。野生型Ｇ１２プライマー／パートザイム設計１（平坦およびループ）、設計３（平坦およびループ）および設計４（平坦）を含む反応において、「試験」ＤＮＡ（Ｋ５６２）のＣｔ値はＫ５６２における野生型ＫＲＡＳアレルの成功裏の増幅と検出を示したが、ネガティブ対照（ＳＷ６２０）のシグナルの欠如は変異体アレルがこれらの系では検出されないことを示す。これらの系は、ｇＤＮＡにおける野生型と変異体ＫＲＡＳを完全に区別することを可能にする。野生型Ｇ１２プライマー／パートザイム設計２（平坦およびループ）および設計４（ループ）を含む反応では「試験」ＤＮＡ（Ｋ５６２）のＣｔ値は、Ｋ５６２における野生型ＫＲＡＳアレルの成功裏の増幅と検出を示した。ネガティブ対照（ＳＷ６２０）のシグナルは、表３に示すように閾値Ｃｔ値に達し、変異体鋳型が使用された場合いくらかのバックグラウンドシグナルが生成されたことを示すが、ΔＣｔ値は十分高く、野生型配列と変異体配列が明白に区別できた。
【０３６８】
Ｇ１２Ｖプライマー／パートザイム設計３（ループ）を含む反応では、「試験」ＤＮＡ（ＳＷ６２０）のＣｔ値は、ＳＷ６２０における変異体ＫＲＡＳアレルの成功裏の増幅と検出を示したが、ネガティブ対照（Ｋ５６２）のシグナルの欠如は野生型アレルがこの系では検出されないことを示した。この系は、ｇＤＮＡにおける変異体と野生型ＫＲＡＳの完全な区別を可能にした。変異体Ｇ１２Ｖプライマー／パートザイム設計１、２および４（平坦およびループ）および設計３（平坦）を含む反応では、「試験」ＤＮＡ（ＳＷ６２０）のＣｔ値はＳＷ６２０における変異体ＫＲＡＳアレルの成功裏の増幅と検出を示した。ネガティブ対照（Ｋ５６２）のシグナルは、表３に示すように閾値Ｃｔ値に達し、野生型鋳型が使用された場合いくらかのバックグラウンドシグナルが生成されたことを示すが、ΔＣｔ値は十分高く、変異体配列と野生型配列が明白に区別できた。
【０３６９】
全系で、ｇＤＮＡが欠如した鋳型なし対照では増幅が観察されなかった。
【０３７０】
これらの結果は、ＵＳがＰＣＲ単位複製配列にＰＡＳＳプライマーを通じて（ループまたは平坦ＰＡＳＳタイプのプライマーにより）挿入され得、これらの単位複製配列が次いでＭＮＡザイムで検出され得ることを示している。パートザイムは、バリアント塩基および付随する挿入されたユニーク配列を含む単位複製配列を特異的に検出する。
【０３７１】
【表５】
2018075033.tif 000014
【表６】
2018075033.tif 000015
【０３７２】
実施例３：配列中の一塩基変化を検出するためどちらもＭＮＡザイムと組み合わせたＰＡＳＳプライマーとゆらぎ増強ＡＲＭＳプライマーの特異性の比較
この実施例では、Ｇ１２Ｖと呼ばれるコドン１２中のＫＲＡＳ点変異が、野生型ＫＲＡＳ配列Ｇ１２に対しアッセイされる。平坦ＰＡＳＳプライマーを、Ｇ１２Ｖ配列またはＧ１２配列のいずれかに特異的であるように設計した。バリアント塩基（野生型はＧ、変異体はＴ）を３’末端の３’標的特異領域（Ｓ２）に配置し、ミスマッチをバリアント塩基の５’側２塩基のところに挿入した（図７、設計３）。異なるＵＳが野生型配列（ＵＳ１）と変異体配列（ＵＳ２）のＰＡＳＳプライマーに含まれた。これらのＰＡＳＳプライマーをゆらぎ増強ＡＲＭＳ（ＷＥ−ＡＲＭＳ）プライマー（Hamfjord et al, (2011), "Wobble-enhanced ARMS Method for detection of KRAS and BRAF Mutations", Diagn Mol Pathol; 20:158-165を参照）と比較し、それによってプライマーは、Ｇ１２ＶまたはＧ１２の配列に特異的であるのに加えて一塩基が異なるＫＲＡＳ配列を区別しやすくする、両アレルに対するミスマッチの導入を含んで設計される。この実施例で使用されるＷＥ−ＡＲＭＳプライマーについては、バリアント（変異体または野生型）塩基は３’末端に配置され、ミスマッチはバリアント塩基の５’側２塩基のところに配置された。
【０３７３】
ＰＡＳＳプライマーはＭＮＡザイムｑＰＣＲと組み合わされ、それによりＭＮＡザイムはユニーク配列（ｃＵＳ）、バリアント塩基（野生型または変異体）およびミスマッチ塩基の相補鎖ならびに増幅された標的配列に結合する第１パートザイムを含む。第２パートザイムは、第１パートザイムに隣接して結合し増幅された目的の標的配列にハイブリダイズする。ＷＥ−ＡＲＭＳプライマーはＭＮＡザイムと組み合わされ、それにより第１パートザイムは増幅された標的配列およびバリアント塩基（野生型または変異体）および塩基の相補鎖と結合する。第２パートザイムは、第１パートザイムに隣接して結合し増幅された目的の標的配列にハイブリダイズする。
【０３７４】
標的Ｇ１２とＧ１２Ｖの一塩基変化を区別する能力について、ＰＡＳＳプライマーをＷＥ−ＡＲＭＳプライマーと比較した。
【０３７５】
３．１．パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムをＧ１２またはＧ１２Ｖ配列、およびあらゆるプライマーを通じて導入されたミスマッチおよびＰＡＳＳプライマーを通じて導入されたｃＵＳを特異的に標的とするように設計した。以下の配列では、太字の塩基は目的の標的配列とハイブリダイズし、下線の塩基は出発鋳型に対しミスマッチのユニーク配列（野生型インサートｉ１およびバリアントインサートｉ２）である。一部のパートザイムＡは、より長い（Ｌ）３’標的特異領域を有する。太字斜体の塩基はバリアント塩基（野生型または変異体）を表し、下線斜体の塩基は追加のミスマッチ塩基を表す。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。全ての配列を５’から３’方向に記す。
【０３７６】
【化８】
2018075033.tif 000016
【０３７７】
３．２．レポーター基質
この実施例では、基質の５’末端を６−ＦＡＭ部分で末端標識し（以下の基質名中「Ｆ」で示される）、３’末端をアイオワブラック（登録商標）ＦＱクエンチャー部分で末端標識した（以下の基質名中「ＩＢ」で示される）。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍで励起し（ＣＦＸ９６（バイオラッド）上のＦＡＭ励起波長範囲）、５１０〜５３０ｎｍでモニタリングした（ＣＦＸ９６（バイオラッド）上のＦＡＭ放射波長範囲）。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。この実施例のレポーター基質を以下の５’から３’方向の配列で示す。
【０３７８】
【化９】
2018075033.tif 000017
【０３７９】
３．３．ＫＲＡＳ  ＤＮＡの増幅のためのＰＣＲプライマー
ヒトｇＤＮＡのインビトロ増幅を、以下に挙げるオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて実施した。ＰＡＳＳプライマーを、Ｇ１２に特異的なフォワードプライマーがＵＳインサート１（ｉ１）を含み、Ｇ１２Ｖに特異的なフォワードプライマーがＵＳインサート２（ｉ２）を含むように設計する。一部のフォワードプライマーは、より長い（Ｌ）標的特異領域を有する。以下の配列では太字の塩基は標的配列とハイブリダイズし、下線の塩基は出発鋳型に対しミスマッチのユニーク配列であり、太字下線の塩基はバリアント塩基であり、斜体の塩基は両方の標的にミスマッチ（Ｍ）の追加の塩基を表す。全ての配列を５’から３’方向に記す。
【０３８０】
【化１０】
2018075033.tif 000018
【０３８１】
３．４．標的配列
Ｋ５６２細胞株から抽出したヒトｇＤＮＡを野生型遺伝子のインビトロ増幅の鋳型として用い、ＳＷ６２０細胞株から抽出したｇＤＮＡを点変異Ｇ１２Ｖのインビトロ増幅に用いた。
【０３８２】
３．５．反応成分：標的配列の増幅と検出
標的配列のリアルタイム増幅と検出を総反応体積２５μＬで実施した。反応はＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（バイオラッド）により実施された。サイクルパラメータは９５℃２分、９５℃１５秒および６４℃６０秒の１０サイクル（１サイクル毎に温度を１℃下げる）、９５℃１５秒および５４℃５０秒の４０サイクル（データは５４℃のステップで収集）であった。すべての反応は、二連で実施し、４０ｎＭのフォワードプライマーと１００ｎＭのパートザイムＡ（表４に挙げる組合せ）、２００ｎＭのリバースプライマー（３ＫＲＡＳ）、２００ｎＭのパートザイムＢ（ＫＲＡＳ＿Ｂ／５５−Ｐ）、２００ｎＭの基質（Ｓｕｂ５５−ＦＩＢ）、８ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０単位のＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮＡｓｅインヒビター（バイオライン）、１×ＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（バイオライン）、２単位のＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（バイオライン）と、Ｋ５６２もしくはＳＷ６２０ｇＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）または無標的（ＮＦ  Ｈ２Ｏ）のいずれかを含んだ。
【０３８３】
【表７】
2018075033.tif 000019
【０３８４】
３．６．結果：標的の増幅およびレポーター基質の切断
ＰＡＳＳプライマーとＷＥ−ＡＲＭＳプライマーを用いて増幅してからプライマー特異的パートザイムを用いて検出した結果を表５に示す。
【０３８５】
【表８】
2018075033.tif 000020
【０３８６】
野生型バリアントにマッチするＰＡＳＳプライマーは試験Ｋ５６２ＤＮＡ中のＧ１２アレルを増幅し、このことは野生型単位複製配列とＵＳ１にマッチするパートザイムＡを含むＭＮＡザイムにより検出された。この野生型ＰＡＳＳプライマー／パートザイム系は野生型アレルに特異的であり、ネガティブ対照の鋳型（ＳＷ６２０）を用いた場合シグナルは生成されなかった。バリアント変異体とＵＳ２に特異的なパートザイムＡを野生型ＰＡＳＳプライマーと共に用いた場合に反応交差性は見られなかった。
【０３８７】
野生型バリアントにマッチするＷＥ−ＡＲＭＳプライマーは試験Ｋ５６２ＤＮＡ中のＧ１２アレルを増幅し、このことは野生型単位複製配列にマッチするパートザイムＡを含むＭＮＡザイムにより検出された。この野生型ＡＲＭＳプライマー／パートザイム系は野生型アレルに特異的であり、ネガティブ対照の鋳型（ＳＷ６２０）を用いた場合シグナルは生成されなかった。
【０３８８】
変異体バリアントにマッチするＰＡＳＳプライマーは試験ＳＷ６２０ＤＮＡ中のＧ１２Ｖアレルを増幅し、このことは変異体単位複製配列とＵＳ２にマッチするパートザイムにより検出された。この変異体ＰＡＳＳプライマー／パートザイム系は優先的に変異体アレルを増幅し、検出し、シグナルはネガティブ対照の鋳型（Ｋ５６２）が用いられたとき反応後期で初めて生成された。変異体ＳＷ６２０と野生型Ｋ５６２ＤＮＡのＣｔの差は１５サイクルよりも大きく（表５）、ＰＡＳＳプライマーおよびマッチするパートザイムＡは変異体と野生型アレルの区別を可能にすることを示した。バリアント野生型とＵＳ１に特異的なパートザイムを変異体ＰＡＳＳプライマーと共に用いた場合に反応交差性は見られなかった。
【０３８９】
変異体バリアントにマッチするＷＥ−ＡＲＭＳプライマーは試験ＳＷ６２０ＤＮＡ中のＧ１２Ｖアレルを増幅し、このことは変異体単位複製配列にマッチするパートザイムにより検出された。この変異体ＷＥ−ＡＲＭＳプライマー／パートザイム系は優先的に変異体アレルを増幅し、検出し、シグナルはネガティブ対照の鋳型（Ｋ５６２）が用いられたとき反応後期で初めて生成された。変異体ＳＷ６２０と野生型Ｋ５６２ＤＮＡのＣｔの差は１４サイクルよりも大きく（表５）、ＡＲＭＳプライマーおよびマッチするパートザイムは変異体と野生型アレルの区別を可能にすることを示した。
【０３９０】
鋳型なし（ＤＮＡなし）が添加されると、どのプライマー／パートザイム対を用いた場合も増幅が検出されなかった。
【０３９１】
この実施例のデータは、当技術分野では既知の代替の一塩基変化（ＡＲＭＳ）検出法と同様のまたはそれに勝るＰＡＳＳプライマーの能力を示している。
【０３９２】
実施例４：配列中の一塩基変化を検出するためどちらもＭＮＡザイムと組み合わせたＰＡＳＳプライマーとゆらぎ増強ＡＲＭＳ（ＷＥ−ＡＲＭＳ）プライマーの感受性の比較
この実施例では、Ｇ１２Ｖと呼ばれるコドン１２中のＫＲＡＳ点変異が、野生型ＫＲＡＳ鋳型のバックグラウンドでＧ１２Ｖ鋳型の段階的希釈を用いてアッセイされる。野生型バックグラウンドでＧ１２Ｖの１／１０、１／１００および１／１０００の希釈が試験された。
【０３９３】
設計３（図７）平坦ＰＡＳＳプライマーをＧ１２Ｖ配列の増幅に用いた。これをＧ１２Ｖ  ＷＥ−ＡＲＭＳプライマーと比較した。ＰＡＳＳプライマーはＭＮＡザイムｑＰＣＲと組み合わされ、それによりＭＮＡザイムはユニーク配列（ｃＵＳ）の相補鎖ならびにバリアント（変異体）塩基およびミスマッチ塩基の相補鎖を含む増幅された標的配列に結合する第１パートザイムを含む。第２パートザイムは、増幅された目的の標的配列内で第１パートザイムに隣接して結合する。ＷＥ−ＡＲＭＳプライマーはＭＮＡザイムと組み合わされ、それにより第１パートザイムがバリアント（変異体）塩基およびミスマッチ塩基の相補鎖を含む増幅された標的配列に結合する。第２パートザイムは、増幅された目的の標的配列内で第１パートザイムに隣接して結合する。
【０３９４】
ＰＡＳＳプライマーをＷＥ−ＡＲＭＳプライマーと比較して各ストラテジーの効率、線形性および感受性を調査した。
【０３９５】
４．１．パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムをＧ１２Ｖ配列およびプライマーを通じて導入されたあらゆるミスマッチならびにＰＡＳＳプライマーの場合はｃＵＳを特異的に標的とするように設計した。以下の配列では、太字の塩基は目的の標的配列とハイブリダイズし、下線の塩基は出発鋳型に対しミスマッチのＵＳ（インサートｉ２）である。一部のパートザイムＡは、より長い（Ｌ）標的特異領域を有する。太字斜体の塩基はバリアント（変異体）塩基を表し、下線斜体の塩基は追加のミスマッチ塩基を表す。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。全ての配列を５’から３’方向に記す。
【０３９６】
【化１１】
2018075033.tif 000021
【０３９７】
４．２．レポーター基質
この実施例では、基質の５’末端を６−ＦＡＭ部分で末端標識し（以下の基質名中「Ｆ」で示される）、３’末端をアイオワブラック（登録商標）ＦＱクエンチャー部分で末端標識した（以下の基質名中「ＩＢ」で示される）。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍで励起し（ＣＦＸ９６（バイオラッド）上のＦＡＭ励起波長範囲）、５１０〜５３０ｎｍでモニタリングした（ＣＦＸ９６（バイオラッド）上のＦＡＭ放射波長範囲）。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。この実施例のレポーター基質を以下の５’から３’方向の配列で示す。
【０３９８】
【化１２】
2018075033.tif 000022
【０３９９】
４．３．ＫＲＡＳ  ＤＮＡの増幅のためのＰＣＲプライマー
ヒトｇＤＮＡのインビトロ増幅を、以下に挙げるオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて実施した。以下の配列では太字の塩基は標的配列とハイブリダイズし、下線の塩基は出発鋳型に対しミスマッチのＵＳ（インサートｉ２）であり、太字下線の塩基はバリアント塩基であり、斜体の塩基は両方の標的にミスマッチ（Ｍ）の追加の塩基を表す。全ての配列を５’から３’方向に記す。
【０４００】
【化１３】
2018075033.tif 000023
【０４０１】
４．４．標的配列
ＳＷ６２０細胞株から抽出したヒトｇＤＮＡを点変異Ｇ１２Ｖのインビトロ増幅の鋳型として用いた。Ｋ５６２細胞株から抽出された野生型ｇＤＮＡの一定のバックグラウンドで段階的にＳＷ６２０ｇＤＮＡを希釈して検量線を作成した。
【０４０２】
４．５．反応成分：標的配列の増幅と定量化
標的配列のリアルタイム増幅と定量化を総反応体積２５μＬで実施した。反応はＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（バイオラッド）により実施された。サイクルパラメータは９５℃２分、９５℃１５秒および６４℃６０秒の１０サイクル（１サイクル毎に温度を１℃下げる）、９５℃１５秒および５４℃５０秒の４０サイクル（データは５４℃のステップで収集）であった。すべての反応は、二連で実施し、４０ｎＭのフォワードプライマーと１００ｎＭのパートザイムＡ（表６に挙げる組合せ）、２００ｎＭのリバースプライマー（３ＫＲＡＳ）、２００ｎＭのパートザイムＢ（ＫＲＡＳ＿Ｂ／５５−Ｐ）、２００ｎＭの基質（Ｓｕｂ５５−ＦＩＢ）、８ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０単位のＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮＡｓｅインヒビター（バイオライン）、１×ＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（バイオライン）、２単位のＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（バイオライン）と、Ｋ５６２ｇＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）、Ｋ５６２ｇＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）または標的なし（ＮＦ  Ｈ２Ｏ）の一定のバックグラウンドで１／１０、１／１００または１／１０００に希釈されたＳＷ６２０ｇＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）かＳＷ６２０ｇＤＮＡ鋳型を含んだ。
【０４０３】
【表９】
2018075033.tif 000024
【０４０４】
４．６．結果：標的の増幅およびレポーター基質の切断
ＰＡＳＳフォワードプライマーとＷＥ−ＡＲＭＳフォワードプライマーを用いて単位複製配列を生成しＫＲＡＳ点変異（Ｇ１２Ｖ）のリアルタイム検出と定量化を実施した。ＭＮＡザイムは、変異体配列を検出するのに用いられる特異的ＰＡＳＳプライマーまたはＡＲＭＳプライマーに特異的であるように設計した。この反応は、Ｇ１２Ｖに特異的な標的配列を含む場合に蛍光強度の経時的な増加を示した（表７）。
【０４０５】
Ｇ１２Ｖ変異を含むＳＷ６２０ｇＤＮＡ鋳型を、野生型（Ｇ１２）配列を含むＫ５６２鋳型バックグラウンドで段階的に１０倍に希釈した。ｇＤＮＡをＰＡＳＳフォワードプライマーまたはＷＥ−ＡＲＭＳフォワードプライマーのいずれかで増幅した。サイクル閾値（Ｃｔ）に対しｇＤＮＡ濃度の対数をプロットし曲線プロットとしてＰＡＳＳプライマーとＷＥ−ＡＲＭＳプライマー両方の標準曲線を生成した。各希釈系列の平均Ｃｔ値を表７に示す。各標的の相関係数（Ｒ２）および反応効率も表７に示す。両プライマーの曲線性は類似しているが、ＰＡＳＳプライマーはＷＥ−ＡＲＭＳプライマー（７８％）よりも高効率（１０３％）である。最適効率は９０〜１１０％内であるべきである。
【０４０６】
どちらのプライマーセットも、Ｇ１２バックグラウンドで１／１０００に希釈された場合Ｇ１２Ｖ配列を検出できた。ＷＥ−ＡＲＭＳプライマーでは、ネガティブ対照Ｋ５６２鋳型のシグナルは１／１０００に希釈した試料（Ｋ５６２ＤＮＡ中ＳＷ６２０）のＣｔより１．３Ｃｔ遅いだけだが、ＰＡＳＳプライマーは、１／１０００に希釈した試料のＣｔよりも４．８Ｃｔ遅いシグナルを生成し（表７）、このＰＡＳＳプライマー／パートザイム系のＧ１２Ｖ変異体ＤＮＡに対する特異性のほうがこのＡＲＭＳ系で観察されたよりも高いことを示した。
【０４０７】
鋳型なし対照の蛍光度は反応の間増加しなかった。このことは、標的を含む反応で産生された蛍光増加は、その後でレポーター基質を切断した触媒活性ＮＭＡザイムの標的依存性集合によることを示している。
【０４０８】
【表１０】
2018075033.tif 000025
【０４０９】
実施例５：ＫＲＡＳコドン１２の野生型と変異体アレルをＭＮＡザイムの検出と組み合わせてＰＡＳＳプライマーを用いてマルチプレックスし各配列中の一塩基変化を区別する
Ｇ１２Ｖと呼ばれるコドン１２中のＫＲＡＳ点変異は、野生型（Ｇ１２）と１ヌクレオチドにより異なる。この実施例は、野生型Ｇ１２と変異体Ｇ１２Ｖアレルの検出をマルチプレックス反応において組み合わせる。アッセイの鋳型には、Ｇ１２Ｖ鋳型（ＳＷ４８０ＤＮＡ）をＧ１２鋳型（Ｋ５６２ＤＮＡ）のバックグラウンドで１／１０、１／１００および１／１０００の比率で段階希釈すること、またはＧ１２鋳型（Ｋ５６２ＤＮＡ）をＧ１２Ｖ鋳型（ＳＷ４８０ＤＮＡ）のバックグラウンドで１／１０、１／１００および１／１０００の比率で段階希釈することが含まれた。
設計３による平坦ＰＡＳＳプライマー（図７）をＧ１２配列の特異的増幅に使用し、設計３によるループＰＡＳＳプライマー（図７）をＧ１２Ｖ配列の特異的増幅に使用した。野生型（ＵＳ１）には変異体（ＵＳ２）とは異なるＵＳがＰＡＳＳプライマーに挿入される。ＰＡＳＳプライマーはＭＮＡザイムｑＰＣＲと組み合わされ、それによりＧ１２単位複製配列を検出するＭＮＡザイムはユニーク配列１（ｃＵＳ１）、野生型バリアント塩基および追加のミスマッチ塩基の相補鎖ならびに増幅された標的配列に結合する第１パートザイムを含む。Ｇ１２Ｖ単位複製配列を検出するＭＮＡザイムはユニーク配列２（ｃＵＳ２）、変異体バリアント塩基および追加のミスマッチ塩基の相補鎖ならびに増幅された標的配列に結合する第１パートザイムを含む。２つの「第１パートザイム」は、異なるフルオロフォアで標識された異なる部分基質配列に結合し、野生型と変異体の単位複製配列の蓄積を別々にモニタリング可能にする。Ｇ１２とＧ１２Ｖ両方の第２パートザイムは増幅された目的の標的配列上で第１パートザイムに隣接して結合するが、このパートザイムはＧ１２とＧ１２Ｖの両方のＭＮＡザイムで同一であり、両方で同じ部分基質配列に結合する。
野生型（Ｇ１２）と変異体（Ｇ１２Ｖ）配列の同時増幅と検出を組み合わせたマルチプレックス反応におけるＰＡＳＳプライマーの使用を、各アッセイの感受性および特異性に及ぼす効果を決定するために調査した。
５．１．パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムＡをＧ１２ＶまたはＧ１２配列およびＰＡＳＳプライマーにより導入されたあらゆるミスマッチとｃＵＳを特異的に標的とするように設計した。以下の配列では、太字の塩基が目的の標的配列とハイブリダイズし、下線の塩基は出発鋳型に対しミスマッチのユニーク配列である。太字斜体の塩基はバリアント変異体または野生型の塩基を表し、下線斜体の塩基は追加のミスマッチ塩基を表す。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。全ての配列を５’から３’方向に記す。
【０４１０】
【化１４】
2018075033.tif 000026
【０４１１】
５．２．レポーター基質
この実施例のレポーター基質を以下の５’から３’方向に記した配列に示す。この実施例では、Ｓｕｂ５５の５’末端をクエーサー（Ｑｕａｓａｒ）６７０で末端標識し（以下の基質名中「Ｑ６７０」で示される）、３’末端をブラックホールクエンチャー（登録商標）２部分で末端標識し（以下の基質名中「Ｂ２」で示される）、Ｓｕｂ５５−Ｑ６７０Ｂ２とされた。Ｓｕｂ５５−Ｑ６７０Ｂ２の切断は、６２０〜６５０ｎｍで励起し（ＣＦＸ９６（バイオラッド）上のクエーサー６７０励起波長範囲）、６７５〜６９０ｎｍでモニタリングした（ＣＦＸ９６（バイオラッド）上のクエーサー６７０放射波長範囲）。Ｓｕｂ６＿５５は、基質の５’末端をＦＡＭ部分で末端標識し（以下の基質名中「Ｆ」で示される）、３’末端をアイオワブラック（登録商標）ＦＱクエンチャー部分で末端標識した（以下の基質名中「ＩＢ」で示され、Ｓｕｂ６＿５５-ＦＩＢと表される）。Ｓｕｂ６＿５５-ＦＩＢの切断は、４５０〜４９０ｎｍで励起し（ＣＦＸ９６（バイオラッド）上のＦＡＭ励起波長範囲）、５１０〜５３０ｎｍでモニタリングした（ＣＦＸ９６（バイオラッド）上のＦＡＭ放射波長範囲）。これらの基質は両方に共通の１本のアーム（各ＲＮＡ塩基の３’）を有し、これは両方のＭＮＡザイムに共通のパートザイムに結合する。第２基質アーム（各ＲＮＡ塩基の５’）は野生型または変異体ＰＡＳＳプライマーのいずれかによる増幅に由来する開裂を検出するパートザイムに特異的に結合する。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。この実施例のレポーター基質を以下の５’から３’方向の配列で示す。
【０４１２】
【化１５】
2018075033.tif 000027
【０４１３】
５．３．ＫＲＡＳ  ＤＮＡの増幅のためのＰＣＲプライマー
この実施例の標的配列は、以下に挙げるオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いてのヒトｇＤＮＡのインビトロの増幅により生成された。以下の配列では太字の塩基は標的配列とハイブリダイズし、下線の塩基は出発鋳型に対しミスマッチのユニーク配列（Ｇ１２インサートｉ１とＧ１２Ｖインサートｉ２）であり、太字下線の塩基はバリアント塩基であり、斜体の塩基は両方の標的にミスマッチ（Ｍ）の追加の塩基を表す。全ての配列を５’から３’方向に記す。
【０４１４】
【化１６】
2018075033.tif 000028
【０４１５】
５．４．標的配列
Ｋ５６２細胞株から抽出したヒトｇＤＮＡを野生型ＫＲＡＳ  Ｇ１２のインビトロ増幅の鋳型として用いた。Ｋ５６２を変異体ｇＤＮＡであるＳＷ４８０の一定のバックグラウンドで連続的に希釈して検量線を作成した。ＳＷ４８０細胞株から抽出したヒトｇＤＮＡを点変異Ｇ１２Ｖのインビトロ増幅の鋳型として用いた。ＳＷ４８０  ｇＤＮＡを野生型ｇＤＮＡのＫ５６２の一定のバックグラウンドで連続的に希釈して検量線を作成した。
【０４１６】
５．５．反応成分：標的配列のマルチプレックス増幅と定量化
標的配列のリアルタイム増幅と定量化を総反応体積２５μＬで実施した。反応はＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（バイオラッド）により実施された。サイクルパラメータは９５℃２分、９５℃１５秒および６４℃６０秒の１０サイクル（１サイクル毎に温度を１℃下げる）、９５℃１５秒および５４℃５０秒の５０サイクル（データは５４℃のステップで収集）であった。反応は、二連または四連で実施し、４０ｎＭの各フォワードプライマー（５Ｇ１２＿ＬＭ３ｉ１Ｌ平坦および５Ｇ１２Ｖ＿ＬＭ３ｉ２Ｌループ）、１００ｎＭの各パートザイムＡ（Ｇ１２＿ＬＭｉ１Ａ／５５−ＰおよびＧ１２Ｖ＿ＬＭｉ２Ａ／６−Ｐ）および２００ｎＭの各基質（Ｓｕｂ６＿５５−ＦＩＢおよびＳｕｂ５５−Ｑ６７０Ｂ２）を含んだ。ならびに４００ｎＭのリバースプライマー（３ＫＲＡＳ）、４００ｎＭパートザイムＢ（ＫＲＡＳ＿Ｂ／５５−Ｐ）、８ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０単位のＲｉｂｏＳａｆｅＲＮＡａｓｅインヒビター（バイオライン）、１×ＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（バイオライン）、２単位のＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（バイオライン）およびＳＷ４８０もしくはＫ５６２  ｇＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）またはＫ５６２  ｇＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）の一定のバックグラウンドで１／１０、１／１００もしくは１／１０００に希釈されたＳＷ４８０  ｇＤＮＡ鋳型もしくはＳＷ４８０  ｇＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）の一定のバックグラウンドで１／１０、１／１００もしくは１／１０００に希釈されたＫ５６２  ｇＤＮＡ鋳型のいずれか、または標的なし（ＮＦ  Ｈ２Ｏ）。
【０４１７】
５．６．結果：標的のマルチプレックス増幅およびレポーター基質の切断
アレルにおけるＧ１２とＧ１２Ｖの増幅と検出はそれぞれに特異的なＰＡＳＳプライマーとパートザイムＡにより同時に生じた。ＤＮＡ試料は、ＳＷ４８０（Ｇ１２Ｖ）をＫ５６２（Ｇ１２）のバックグラウンドで、またはＫ５６２（Ｇ１２）をＳＷ４８０（Ｇ１２Ｖ）のバックグラウンドで、１０倍段階的に希釈した。表８に示すＣｔ値は、二連（ｎ＝２）または四連（ｎ＝４）反応の結果の平均である。
Ｇ１２またはＧ１２Ｖの両方のＰＡＳＳプライマーセットは、他方の鋳型のバックグラウンドで１／１０００に希釈されたとき、感受性があり、特異配列を検出した。マルチプレックスアッセイは非常に特異性が高く、野生型とバリアントの両方で、Ｇ１２Ｖ（ＳＷ４８０）またはＧ１２（Ｋ５６２）それぞれに特異的な鋳型が存在した場合のみ、ネガティブ対照反応でシグナルは生成されなかった（表８）。
鋳型無し対照の蛍光度は、試験したすべての組合せにおいて、ＤＮＡ標的を含む反応のものよりも低く、反応中に増加しなかった。このことは、標的を含む反応で産生された蛍光増加は、その後でレポーター基質を切断した触媒活性ＮＭＡザイムの標的依存性集合によることを示している。
【０４１８】
【表１１】
2018075033.tif 000029
【０４１９】
この実施例は、マルチプレックス反応における複数のユニーク配列の使用を示す。この結果、オリジナルの鋳型は一塩基の差異しか含んでいなかったにもかかわらず、パートザイムＡが結合する領域内に非常に異なる配列を含む単位複製配列が生じる。ＰＡＳＳプライマー／マッチングパートザイムのストラテジーは近縁の標的由来の単位複製配列の配列差異を大幅に増加させるので、高次のマルチプレックスを可能にする。
【０４２０】
実施例６：ＰＡＳＳプライマー中の異なるユニーク配列インサートの比較とＭＮＡザイムとの組合せにより配列中の一塩基変化を検出する
【０４２１】
ＰＡＳＳプライマーは、１塩基が違う２つの配列を区別するように設計され得、標的特異的３’末端（Ｓ２）がバリアント塩基を含む（図２（ｉ）および（ｉｉ）上部）。さらに、ＵＳはバリアントごとに異なり得、別のレベルの選択性と特異性を付加する（図３）。
【０４２２】
この実施例では、Ｇ１２Ｖと呼ばれるコドン１２と野生型ＫＲＡＳ配列Ｇ１２の両方のＫＲＡＳ点変異の３つの異なるユニーク配列をＰＡＳＳプライマーに挿入した。ループまたは平坦形成のいずれかのＵＳを含むＰＡＳＳプライマーをＧ１２ＶまたはＧ１２のいずれかの配列に特異的であるように設計し、特異的プライマーはＵＳインサートのｉ１、ｉ２、ｉ３またはｉ３ａも含んだ。変異体と野生型の両方のバリアント塩基が３’末端でＳ２に位置した（図７設計１）。
【０４２３】
ＰＡＳＳプライマーはＭＮＡザイムｑＰＣＲと組み合わされ、それによりＭＮＡザイムはユニーク配列（ｃＵＳ）の相補鎖ならびに各バリアント塩基に合わせた（野生型または変異体）増幅された標的配列に結合する第１パートザイムを含む。第２パートザイムは、増幅された目的の標的配列上で第１パートザイムに隣接して結合する。
【０４２４】
ＰＡＳＳプライマーとパートザイムは、各ＵＳが、様々なシナリオが反応効率とＫＲＡＳ野生型Ｇ１２または点変異Ｇ１２Ｖ特異性を改善したかどうか決定するように設計した。
【０４２５】
６．１．  パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムは、ＫＲＡＳ遺伝子の野生型Ｇ１２または変異体Ｇ１２Ｖアレルに加えてＰＡＳＳプライマーを介して導入されたあらゆるｃＵＳを特異的に標的とするように設計した。以下の配列では、太字の塩基が目的の標的配列とハイブリダイズし、下線の塩基は出発鋳型に対しミスマッチのユニーク配列（インサートｉ１、ｉ２またはｉ３）である。太字斜体の塩基はバリアント塩基を表す。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。全ての配列を５’から３’方向に記す。
【０４２６】
【化１７】
2018075033.tif 000030
【０４２７】
６．２．レポーター基質
この実施例では、基質の５’末端を６−ＦＡＭ部分で末端標識し（以下の基質名中「Ｆ」で示される）、３’末端をアイオワブラック（登録商標）ＦＱクエンチャー部分で末端標識した（以下の基質名中「ＩＢ」で示される）。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍで励起し（ＣＦＸ９６（バイオラッド）上のＦＡＭ励起波長範囲）、５１０〜５３０ｎｍでモニタリングした（ＣＦＸ９６（バイオラッド）上のＦＡＭ放射波長範囲）。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。この実施例のレポーター基質を以下の５’から３’方向の配列で示す。
【０４２８】
【化１８】
2018075033.tif 000031
【０４２９】
６．３．ＫＲＡＳ  ＤＮＡの増幅のためのＰＣＲプライマー
ヒトｇＤＮＡのＫＲＡＳ遺伝子のインビトロ増幅を、以下に挙げるオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて実施した。ＰＡＳＳプライマーは、野生型に特異的なフォワードプライマーがＵＳインサートｉ１、ｉ２、ｉ３またはｉ３ａを含み、変異体に特異的なフォワードプライマーがＵＳインサートｉ１、ｉ２またはｉ３を含むように設計した。以下の配列では太字の塩基は標的配列とハイブリダイズし、下線の塩基は出発鋳型に対しミスマッチのユニーク配列であり、太字下線の塩基はバリアント塩基である。全ての配列を５’から３’方向に記す。
【０４３０】
【化１９】
2018075033.tif 000032
【化２０】
2018075033.tif 000033
【０４３１】
６．４．標的配列
Ｋ５６２細胞株から抽出したヒトｇＤＮＡを野生型ＫＲＡＳ遺伝子のインビトロ増幅の鋳型として用い、ＳＷ６２０細胞株から抽出したヒトｇＤＮＡを点変異Ｇ１２Ｖを含むＫＲＡＳのインビトロ増幅に用いた。
【０４３２】
６．５．反応成分：標的配列の増幅と検出
標的配列のリアルタイム増幅と検出を総反応体積２５μＬで実施した。反応はＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（バイオラッド）により実施された。サイクルパラメータは９５℃２分、９５℃１５秒および６４℃６０秒の１０サイクル（１サイクル毎に温度を１℃下げる）、９５℃１５秒および５４℃５０秒の４０サイクル（データは５４℃で収集）であった。すべての反応は、二連で実施し、４０ｎＭのフォワードプライマーと１００ｎＭのパートザイムＡ（表９に挙げる組合せ）、２００ｎＭのリバースプライマー（３ＫＲＡＳ）、２００ｎＭのパートザイムＢ（ＫＲＡＳ＿Ｂ／５５−Ｐ）、２００ｎＭの基質（Ｓｕｂ５５−ＦＩＢ）、８ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０単位のＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮＡｓｅインヒビター（バイオライン）、１×ＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（バイオライン）、２単位のＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（バイオライン）と、Ｋ５６２もしくはＳＷ６２０ｇＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）または無標的（ＮＦ  Ｈ２Ｏ）のいずれかを含んだ。
【０４３３】
【表１２】
2018075033.tif 000034
【表１３】
2018075033.tif 000035
【０４３４】
６．６．結果：標的の増幅およびレポーター基質の切断
異なるＵＳを含むＰＡＳＳプライマーを用いてＫＲＡＳ野生型および点変異（Ｇ１２Ｖ）のリアルタイム検出の単位複製配列を産生した。この反応は、使用された標的配列がＰＣＲ増殖された試験ヒトｇＤＮＡ（それぞれＫ５６２とＳＷ６２０）の場合、経時的な蛍光の増加を示した。鋳型なし対照の蛍光度は、ＤＮＡ標的を含む反応のものよりも低く、反応中に増加しなかった。このことは、標的を含む反応で産生された蛍光増加は、その後でレポーター基質を切断した触媒活性ＮＭＡザイムの標的依存性集合によることを示している。
【０４３５】
ＵＳインサートｉ１、ｉ２、ｉ３（ループ）またはｉ３ａ（平坦）を含む野生型Ｇ１２ＰＡＳＳプライマー（平坦またはループ）を含む反応において、「試験」ＤＮＡ（Ｋ５６２）のＣｔ値はＫ５６２における野生型ＫＲＡＳアレルの成功裏の増幅と検出を示したが、ネガティブ対照（ＳＷ６２０）のシグナルの欠如は変異体アレルがこれらの系では検出されないことを示した。ＵＳインサートｉ３またはｉ３ａを含むＰＡＳＳプライマーアッセイ（ループおよび平坦）はＵＳインサートｉ１およびｉ２よりも低いＣｔ値を有した（表１０）。
【０４３６】
【表１４】
2018075033.tif 000036
【表１５】
2018075033.tif 000037
【０４３７】
ＵＳインサートｉ１、ｉ２またはｉ３を含むＧ１２Ｖ  ＰＡＳＳプライマー（平坦またはループ）を含む反応では、「試験」ＤＮＡ（ＳＷ６２０）のＣｔ値はＳＷ６２０における変異体ＫＲＡＳアレルの成功裏の増幅と検出を示した。ネガティブ対照（Ｋ５６２）のシグナルは、表１０に示すように閾値Ｃｔ値に達し、野生型鋳型が使用された場合いくらかのバックグラウンドシグナルが生成されたことを示すが、ΔＣｔ値は十分高く、変異体配列と野生型配列が明白に区別できた。ＵＳインサートｉ３を含むＰＡＳＳプライマーアッセイ（ループおよび平坦）は、ＵＳインサートｉ１およびｉ２よりもわずかに低いＣｔを有したが（表１０）、ΔＣｔはＵＳインサートｉ２を有するものがより大きかった。
【０４３８】
全体的に、３つのＵＳインサートはすべて野生型および変異体ＫＲＡＳ標的配列の分析に適していた。結果には、野生型アッセイで観察されたより広範なＣｔ値から明らかなように、変異体よりもわずかに変動性があるという差異があった。両方のアッセイで、ＵＳインサートｉ３の組込みはより低いＣｔ値をもたらしたが、ＵＳインサートｉ２の組込みはより高いＣｔ値をもたらした。しかし、この実験は、様々な異なるユニークインサート配列が同一のまたは異なる標的の増幅と検出に用いられ得ることを示した。このように、ユニーク配列は、多くの分析的アッセイに組み込まれ得るので、ユニバーサルユニーク配列ともされ得る。
【０４３９】
実施例７
標準および短時間熱サイクリング条件下における、相補鎖を増幅するために設計したＰＡＳＳプライマーとＫＲＡＳの逆相補鎖を増幅するために設計したＰＡＳＳプライマーの特異性と感受性の比較
前記の実施例において、Ｇ１２Ｖと呼ばれるコドン１２内のＫＲＡＳの点変異を特異的に増幅するために設計されたＰＡＳＳプライマーは相補鎖を標的としていた。そのためＰＡＳＳプライマーはチミン（Ｔ）で終了しており、野生型のＫＲＡＳ配列とＴ：Ｃのミスマッチを引き起こしていた。もし、逆行鎖を標的にＰＡＳＳプライマーを設計すれば、ＰＡＳＳプライマーはＡで終了するので野生型とのミスマッチはＡ：Ｇに変わる。
【０４４０】
本実施例では、前記実施例にて強固かつ特異的に機能することが既に示されているＰＡＳＳプライマー（５Ｇ１２Ｖ＿ＬＭ３ｉ２Ｐｌａｎａｒ、配列番号４０）を用いてＧ１２Ｖの相補鎖を増幅するアッセイとＧ１２Ｖの逆相補鎖（ｒｃＧ１２Ｖ）（５ｒｃＧ１２Ｖ＿ＬＭ３ｉ１Ｌｏｏｐ、配列番号６６）を増幅するアッセイを比較する。これにより、ｒｃＧ１２Ｖを増幅させる強固かつ感受性の高いＰＡＳＳプライマーを得る。ＰＡＳＳプライマーは、ＭＮＡザイムｑＰＣＲと併用される。この時、ＭＮＡザイムの第一パートザイムはユニーク配列の相補鎖（ｃＵＳ）およびバリアント（変異）塩基とミスマッチ塩基の相補鎖を含む増幅された標的配列に結合し、第二パートザイムは増幅された目的の標的配列内で第一パートザイムの近接に結合する。さらに、短時間熱サイクリングプロトコルと前記の実験で用いている標準プロトコルを比較し、特異性への影響の有無を評価した。
いずれもデザイン３のフォーマット（図７）を導入した相補鎖または逆相補鎖を増幅するＰＡＳＳプライマーを２種類の熱サイクリング条件下で比較し、各方法の効率、線形性、感受性を調べた。
【０４４１】
７．１．パートザイムオリゴヌクレオチド
ＰＡＳＳプライマーにより導入されたｃＵＳとすべてのミスマッチおよびＧ１２Ｖ配列の相補鎖または逆相補鎖（ｒｃ）を特異的に標的とするようパートザイムを設計した。以下の配列内で目的の標的配列とハイブリダイズする塩基は太字、開始時の鋳型に対してミスマッチが存在するユニーク配列（Ｇ１２Ｖインサートｉ２とｒｃＧ１２Ｖインサートｉ１）の塩基は下線で示す。パートザイムＡはより長い（Ｌ）標的特異的領域を持つ。バリアント（変異）塩基は太字斜体、追加ミスマッチ塩基は下線斜体で表す。「−Ｐ」はオリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。すべての配列は５’から３’方向へ記載されている。
【０４４２】
【化２１】
2018075033.tif 000038
【０４４３】
７．２．レポーター基質
本実施例において、基質は５’末端を６−ＦＡＭで標識（以下、基質名中では「Ｆ」で示す）、３’末端をＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱクエンチャーで標識（以下、基質名中では「ＩＢ」で示す）した。基質の切断は４５０から４９０ｎｍ間（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）のＦＡＭ励起波長範囲）で励起し、５１０から５３０ｎｍ間（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）のＦＡＭ発光波長範囲）で測定した。本実施例で用いたレポーター基質の配列は５’から３’方向へ以下に示す。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
【０４４４】
【化２２】
2018075033.tif 000039
【０４４５】
７．３．ＫＲＡＳ  ＤＮＡ増幅のためのＰＣＲプライマー
ヒトｇＤＮＡのインビトロ増幅は以下に記載したオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて行った。以下の配列中で標的配列とハイブリダイズする塩基は太字、開始時の鋳型に対してミスマッチが存在するユニーク配列（Ｇ１２Ｖインサートｉ２とｒｃＧ１２Ｖインサートｉ１）の塩基は下線、バリアント塩基は太字下線、いずれの標的に対してもミスマッチ（Ｍ）な追加塩基は斜体で表す。すべての配列は５’から３’方向へ記載されている。
【０４４６】
【化２３】
2018075033.tif 000040
【０４４７】
７．４．標的配列
Ｇ１２Ｖ点変異のインビトロ増幅にはＳＷ４８０細胞株から抽出したヒトｇＤＮＡを鋳型として用いた。Ｋ５６２細胞株から抽出した野生型ｇＤＮＡをコンスタントバックグラウンドとして段階希釈したＳＷ４８０を用いて検量線を作成した。また、Ｃａｌｕ１、Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＨＣＴ１１６の各細胞株から抽出したヒトｇＤＮＡはそれぞれその他のＫＲＡＳバリアントＧ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１３ＤおよびＧ１３Ｄのネガティブ対照鋳型として用いた。
【０４４８】
７．５．反応成分：標的配列の増幅と定量
標的配列のリアルタイム増幅および定量は総反応体積２５μＬで行った。反応にはＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ解析システム（ＢｉｏＲａｄ）を用いた。サイクリングパラメータとして以下のいずれかを用いた。
１）「標準」熱サイクリング；９５℃２分、９５℃１５秒と６４℃６０秒を１０サイクル（１サイクル毎に温度を１℃下げる）、９５℃１５秒と５４℃５０秒を４０サイクル（５４℃のステップでデータを取得）または
２）「短時間」熱サイクリング；９５℃２分、９５℃５秒と６４℃２０秒を１０サイクル（１サイクル毎に温度を１℃下げる）、９５℃５秒と５４℃２０秒を４０サイクル（５４℃のステップでデータを取得）。
表１１に従い、反応用のプライマーとパートザイムを用意した。各反応条件は２連で試験し、４０ｎＭフォワードプライマー、２００ｎＭリバースプライマー、１００ｎＭパートザイムＡ、２００ｎＭパートザイムＢ、２００ｎＭ基質（Ｓｕｂ５５−ＦＩＢ）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ各ｄＮＴＰ、１０ユニットＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｘＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２ユニットＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）にＳＷ４８０ｇＤＮＡ鋳型（３５ｎｇ）またはＫ５６２ｇＤＮＡ鋳型（３５ｎｇ）をコンスタントバックグランドに用い１０倍、１００倍、１０００倍希釈したＳＷ４８０ｇＤＮＡ鋳型またはネガティブ対照のｇＤＮＡであるＫ５６２、Ｃａｌｕ１、Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＨＣＴ−１１６（３５ｎｇ）、または標的なし（ＮＦＨ２Ｏ）のいずれかを加えた。
【０４４９】
【表１６】
2018075033.tif 000041
【０４５０】
７．６．結果：標的の増幅とレポーター基質の切断
すべての反応において鋳型なし対照の蛍光強度は標的ＤＮＡを含むものよりも低かった。これは標的を含む反応液中、標的依存的に構築された触媒活性ＭＮＡザイムがユニバーサルレポーター基質を切断した結果、蛍光強度が増加したことを示している。
相補鎖または逆相補鎖のいずれかを増幅するよう設計したフォワードＰＡＳＳプライマーを用いて、ＫＲＡＳ点変異Ｇ１２Ｖのリアルタイム検出および定量を行う単位複製配列を生成させた。ＭＮＡザイムは相補鎖または逆相補鎖のいずれか、および変異配列を検出するための特異的ＰＡＳＳプライマーにより導入されたそれぞれのＵＳに対して特異的に設計された。この反応では、Ｇ１２Ｖ特異的な標的配列が含まれる場合、蛍光強度が経時的に増加した（表１２）。
【０４５１】
【表１７】
2018075033.tif 000042
【表１８】
2018075033.tif 000043
【０４５２】
Ｇ１２Ｖ特異的なＳＷ４８０ＤＮＡ鋳型を野生型Ｋ５６２をバックグラウンドとして１０倍段階希釈した。相補または逆相補フォワードＰＡＳＳプライマーのいずれかを用いて段階希釈したＤＮＡを増幅させた。野生型鋳型をバックグラウンドとして１０００倍希釈した場合、いずれのプライマーセットでもＧ１２Ｖ配列を検出することができた。ＤＮＡ濃度の対数を閾値に達したときのサイクル数に対してプロットし、双方のＰＡＳＳプライマーについて検量線を作成したところ線形プロットが得られた。各希釈段階におけるＣｔを表１２に示す。表に示したＣｔ値はそれぞれ２連で行った結果の平均である。反応係数（Ｒ２）および各標的に対する反応効率も併せて表１２に示す。
標準熱サイクル条件下では相補鎖に対して設計したＰＡＳＳプライマーではトップスタンダード（３５ｎｇ）とネガティブ対照である野生型（Ｋ５６２）、Ｇ１２Ｃ（Ｃａｌｕ１）、Ｇ１２Ｓ（Ａ５４９）およびＧ１３Ｄ（ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＨＣＴ１１６）のシグナルとのＣｔ値の差（ΔＣｔ）は逆相補鎖（ｒｃＧ１２Ｖ）に対して設計したＰＡＳＳプライマーより小さかった。さらに、ｒｃＧ１２Ｖアッセイにおいていくつかのネガティブ対照はＣｔ値が得られなかった（表１２）。これはｒｃＧ１２Ｖ  ＰＡＳＳプライマーのアッセイがこれらの実験条件下ではより特異的である可能性を示している。
また、短時間熱サイクリング条件下で得られたＣｔ値と標準熱サイクリング条件下のＣｔ値をＧ１２ＶおよびｒｃＧ１２Ｖアッセイについて比較すると、短時間熱サイクリング条件下でΔＣｔ値が増加しており、これらの実験条件下ではサイクル時間を短くすることによりいずれのアッセイにおいても特異性が向上していることを示している（表１２）。しかし、ｒｃＧ１２Ｖのアッセイについてはサイクリング時間を短くすることにより反応の効率と線形性が低下した（表１２）。
【０４５３】
標準および短時間のいずれの熱サイクリングにおいてもバックグラウンドである野生型（〜１０、０００コピー）に対して１０００分の１濃度までのＧ１２Ｖ（〜１０コピー）を検出し、相補および逆相補ＰＡＳＳプライマーによるＧ１２Ｖの増幅および検出アッセイは優れた感度を発揮した。全体的にＧ１２Ｖに比べｒｃＧ１２Ｖアッセイの方がより特異的であった。サイクル時間を短縮によりｒｃＧ１２Ｖ反応の線形性および効率は低下したが、サイクル時間の短縮は線形性と効率に影響を与えることなくＧ１２Ｖアッセイの特異性を向上させた。
本実施例において、１塩基置換検定の特異性はＰＡＳＳプライマーが結合し増幅させる鎖の種類により影響を受けうることが示された。さらに、サイクル時間など実験条件を改変することにより反応の特異性を向上させることができた。
【０４５４】
実施例８：ＰＡＳＳプライマーのループ型ユニーク配列下にある標的配列中の非結合塩基数の影響を評価
本実施例ではｒｃＧ１２Ｖと呼ばれるコドン１２内のＫＲＡＳ点変異の逆相補鎖を用いて、標的配列中のＳ１とＳ２間のループ下に０、１、２、３、４、または５塩基の非結合塩基ギャップ（前記実施例ではＳ１とＳ２間の塩基ギャップは１塩基以下）ができるように設計したループＰＡＳＳプライマーを試験した。２つの異なる設計をしたｒｃＧ１２Ｖを用いた（ｉ）バリアント塩基「Ａ」を３’側標的特異的領域（Ｓ２）の３’末端に配置し、Ｓ２のＴｍを２６℃とし、ミスマッチをバリアント塩基の２塩基５’側に挿入したもの（図７、デザイン３）と（ｉｉ）バリアント塩基「Ａ」を３’側標的特異的領域（Ｓ２）の３’末端から３塩基の位置に配置し、Ｓ２のＴｍを２０℃とし、ミスマッチをバリエント塩基の５’から２塩基の位置に挿入したもの（図７、デザイン４）。
ＰＡＳＳプライマーをＭＮＡザイムｑＰＣＲと併用する。この時、ＭＮＡザイムはユニーク配列の相補鎖（ｃＵＳ）、バリアント塩基およびミスマッチ塩基、さらに増幅された標的配列と結合する第一パートザイムからなる。第二パートザイムは第一パートザイムの近接に結合し、増幅された目的の標的配列とハイブリダイズする。
標的配列に結合した際、Ｓ１とＳ２間に異なる大きさのギャップを形成するＰＡＳＳプライマーが標的となるＧ１２とＧ１２Ｖの１塩基置換を識別する能力を比較した。
【０４５５】
８．１．パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムはＧ１２Ｖ配列、あらゆるミスマッチおよびＰＡＳＳプライマーにより導入されたｃＵＳの逆相補鎖の単位複製配列を特異的に標的とするよう設計された。以下の配列中で目的の標的配列とハイブリダイズする塩基は太字、開始時の鋳型とミスマッチのあるユニーク配列の塩基は下線で示す。バリアント塩基は太字斜体、追加ミスマッチ塩基は下線斜体で示す。「−Ｐ」はオリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。すべての配列は５’から３’方向へ記載されている。
【０４５６】
【化２４】
2018075033.tif 000044
【０４５７】
８．２．レポーター基質
本実施例において、基質は５’末端を６−ＦＡＭで標識（以下、基質名中では「Ｆ」で示す）、３’末端をＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱクエンチャーで標識（以下、基質名中では「ＩＢ」で示す）した。基質の切断は４５０から４９０ｎｍ間（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）のＦＡＭ励起波長範囲）で励起し、５１０から５３０ｎｍ間（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）のＦＡＭ発光波長範囲）で測定した。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。本実施例で用いたレポーター基質の配列を５’から３’方向へ以下に示す。
【０４５８】
【化２５】
2018075033.tif 000045
【０４５９】
８．３．ＫＲＡＳ  ＤＮＡ増幅のためのＰＣＲプライマー
ヒトｇＤＮＡのインビトロ増幅は以下に記載したオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて行った。ＰＡＳＳプライマーの設計はＧ１２Ｖ特異的フォワードプライマーがＵＳ（インサートｉ２）を含むようする。以下の配列中で標的配列とハイブリダイズする塩基は太字、開始時の鋳型に対してミスマッチが存在するユニーク配列の塩基は下線、バリアント塩基は太字下線、追加ミスマッチ塩基（Ｍ）は斜体で表す。また、ループという単語の後に続くカッコ内の数字は標的配列中のＳ１とＳ２間の非結合塩基数を表す。すべての配列は５’から３’方向へ記載されている。
【０４６０】
【化２６】
2018075033.tif 000046
【化２７】
2018075033.tif 000047
【０４６１】
８．４．標的配列
Ｋ５６２細胞株から抽出したヒトｇＤＮＡを野生型遺伝子のインビトロ増幅の鋳型として用いた。また、Ｇ１２Ｖ点変異のインビトロ増幅にはＳＷ６２０細胞株から抽出したヒトｇＤＮＡを用いた。
【０４６２】
８．５．反応成分：標的配列の増幅と検出
標的配列のリアルタイム増幅および定量は総反応体積２５μＬで行った。反応にはＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ解析システム（ＢｉｏＲａｄ）を用いた。サイクリングパラメータは、９５℃２分、９５℃１５秒と６４℃６０秒を１０サイクル（１サイクル毎に温度を１℃下げる）、９５℃１５秒と５４℃５０秒を４０サイクル（５４℃のステップでデータを取得）とした。すべての反応条件は２連で試験し、反応液中には４０ｎＭフォワードプライマー、１００ｎＭパートザイムＡ（表１３記載の組み合わせ）、２００ｎＭリバースプライマー（３ｒｃＫＲＡＳ＿２）、２００ｎＭパートザイムＢ（ｒｃＫＲＡＳ＿Ｂ／５５−Ｐ）、２００ｎＭ基質（Ｓｕｂ５５−ＦＩＢ）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ各ｄＮＴＰ、１０ユニットＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮＡａｓｅ阻害剤（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｘＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２ユニットＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）およびＫ５６２またはＳＷ６２０のいずれかのｇＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）または標的なし（ＮＦＨ２Ｏ）を加えた。
【０４６３】
【表１９】
2018075033.tif 000048
【０４６４】
８．６．結果：標的の増幅とレポーター基質の切断
ＰＡＳＳプライマーを用いた増幅をプライマー特異的パートザイムにより検出した結果を表１４に示す。
【０４６５】
【表２０】
2018075033.tif 000049
【０４６６】
変異バリアントとマッチさせたＰＡＳＳプライマーを用いたすべての組み合わせのＳＷ６２０ＤＮＡ試験においてＧ１２Ｖアレルが増幅した。これはＵＳ２と変異にマッチしたパートザイムにより検出された。鋳型を加えなかった場合（ＤＮＡなし）、いずれのプライマー／パートザイム組を用いても増幅は確認されなかった。この変異ＰＡＳＳプライマー／パートザイム系は優先的に変異アレルを増幅、検出し、ネガティブ対照の鋳型（Ｋ５６２）を用いた時にシグナルが検出されたのは１組のみだった（表１４）。
Ｔｍが２６℃となるデザイン３（図７）に基づくＰＡＳＳプライマーは、ＰＡＳＳプライマーのループ領域下にある標的配列に結合しないギャップ塩基数が変化しても（１から４）Ｇ１２Ｖ標的配列の増幅にほとんど変化がなかった（表１４）。
Ｔｍが２０℃となるデザイン４（図７）に基づくＰＡＳＳプライマーは、ＰＡＳＳプライマーのループ領域下にあるギャップ塩基数が３、４、５と変化するのに伴いＣｔ値が向上した。しかしこれにより、ΔＣｔが１２．９ではあったが、ネガティブ対照（野生型）を用いた反応でもシグナルが検出された（表１４）。より短いＳ２領域を持つＰＡＳＳプライマーは、Ｓ１とＳ２間のループ領域下にある標的配列に結合しないギャップ塩基数が多くなるほど有利に働く可能性が示唆される。一方、より長いＳ２領域を持ち、Ｔｍがより高くなったＰＡＳＳプライマーでは、Ｓ１とＳ２間のループ領域下のギャップ塩基数による影響はほとんどない。
本実験と前記の実験を総合するとデザインには柔軟性がありそうで、いくつかの非結合塩基が標的領域内であるプライマーのＳ１とＳ２領域間の相補鎖にあってもループＰＡＳＳプライマーは機能できることが示された。
【０４６７】
実施例９：ＰＡＳＳプライマーとＷＥ−ＡＲＭＳプライマーをそれぞれＭＮＡザイムと併用し、配列中の１塩基置換を検出するアッセイを行ったときの両プライマーの交差反応性の比較
バリアント（変異）配列をＷＥ−ＡＲＭＳプライマーを用いて増幅し得られた単位複製配列は変異塩基および追加されたミスマッチ塩基が野生型配列と異なる。一方、ＰＡＳＳプライマーを用いて変異配列を増幅し得られた単位複製配列は変異塩基およびミスマッチ塩基のみならず挿入されたＵＳも野生型配列と異なる。ＷＥ−ＡＲＭＳプライマーを用いて増幅された変異単位複製配列をＭＮＡザイムによりリアルタイムで検出した場合、パートザイムＡは野生型配列とは変異とミスマッチ塩基のみが異なるだけだが、ＰＡＳＳプライマーにより生成した単位複製配列ではパートザイムＡはもとの野生型配列とは異なるＵＳをも含むであろう。さらにもし、同一のウェルで野生型も増幅し検出したい場合、異なるＵＳを用いれば変異型との比較に用いることができ、ひいては配列多様性が増し、ＭＮＡザイムによる変異型と野生型単位複製配列の判別能を向上させられる。
【０４６８】
本実施例では、変異型特異的プライマーと野生型特異的パートザイムＡを組み合わせた場合（またその逆）のＷＥ−ＡＲＭＳとＰＡＳＳプライマー系のあらゆる交差反応性を試験した。ここではｒｃＧ１２Ｖと呼ばれるコドン１２内のＫＲＡＳ点変異とｒｃＧ１２と呼ばれる野生型ＫＲＡＳ配列の逆相補鎖の増幅を行う。ＰＡＳＳプライマーはＧ１２ＶまたはｒｃＧ１２配列のいずれかに特異的に設計した。変異型のバリアント塩基は３’末端にある３’標的特異的領域（Ｓ２）に配置し、ミスマッチ塩基は３’末端から４塩基の場所に挿入した。野生型のバリアント塩基は３’末端から３塩基の場所に配置し、ミスマッチ塩基は３’末端から５塩基の場所に挿入した。野生型（インサートｉ４）と変異型（インサートｉ１）配列のＰＡＳＳプライマーでは異なるＵＳが含まれている。これらのＰＡＳＳプライマーをゆらぎ増幅型ＡＲＭＳ（ＷＥ−ＡＲＭＳ）プライマー（Hamfjord et al, (2011), “Wobble-enhanced ARMS Method for Detection of KRAS and BRAF Mutations”, Diagn Mol Pathol; 20:158-165参照）と比較した。ＷＥ−ＡＲＭＳプライマーはｒｃＧ１２ＶまたはｒｃＧ１２配列特異的に設計されており、さらにこれらには１塩基異なるＫＲＡＳ配列同士の判別を助けるため、いずれの単位複製配列に対してもミスマッチが導入されている。本実施例で用いたＷＥ−ＡＲＭＳプライマーではバリアント（変異または野生型）塩基は３’末端に配置し、ミスマッチは３’末端から５塩基の場所に挿入した。
【０４６９】
ＰＡＳＳプライマーとＭＮＡザイムｑＰＣＲを併用する。この時、ＭＮＡザイムはユニーク配列の相補鎖（ｃＵＳ）、バリアント塩基およびミスマッチ塩基、さらに増幅された標的配列と結合する第一パートザイムからなる。第二パートザイムは第一パートザイムの近接に結合し、増幅された目的の標的配列とハイブリダイズする。ＷＥ−ＡＲＭＳプライマーとＭＮＡザイムを併用する。この時、第一パートザイムはバリアント塩基（野生型または変異型）とミスマッチ塩基の相補鎖を含む増幅された標的配列と結合する。第二パートザイムは第一パートザイムの近接に結合し、増幅された目的の標的配列とハイブリダイズする。
プライマーとパートザイムにミスマッチが存在した場合のＰＡＳＳプライマーとＷＥ−ＡＲＭＳプライマーの交差反応性を比較した。
【０４７０】
９．１．パートザイムオリゴヌクレオチド
ｒｃＧ１２またはｒｃＧ１２Ｖ配列およびプライマーにより導入されたあらゆるミスマッチとＰＡＳＳプライマーにより導入されたｃＵＳを特異的に標的とするようパートザイムは設計された。以下の配列において目的の標的配列とハイブリダイズする塩基は太字、開始時の鋳型とミスマッチが存在するユニーク配列（野生型インサートｉ４とバリアントインサートｉ１）の塩基は下線で示す。いくつかのパートザイムＡはより長い（Ｌ）３’標的特異的領域を持つ。バリアント塩基（野生型または変異型）は太字斜体、追加ミスマッチ塩基は下線斜体で表す。「−Ｐ」はオリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。すべての配列は５’から３’方向へ記載されている。
【０４７１】
【化２８】
2018075033.tif 000050
【０４７２】
９．２．レポーター基質
本実施例において、基質は５’末端を６−ＦＡＭで標識（以下、基質名中では「Ｆ」で示す）、３’末端をＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱクエンチャーで標識（以下、基質名中では「ＩＢ」で示す）した。基質の切断は４５０から４９０ｎｍ間（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）のＦＡＭ励起波長範囲）で励起し、５１０から５３０ｎｍ間（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）のＦＡＭ発光波長範囲）で測定した。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。本実施例で用いたレポーター基質の配列は５’から３’方向へ以下に示す。
【０４７３】
【化２９】
2018075033.tif 000051
【０４７４】
９．３．ＫＲＡＳ  ＤＮＡ増幅のためのＰＣＲプライマー
ヒトｇＤＮＡのインビトロ増幅は以下に記載したオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて行った。ｒｃＧ１２特異的フォワードプライマーはＵＳインサートｉ４を、ｒｃＧ１２Ｖ特異的フォワードプライマーはＵＳインサートｉ１を含むようＰＡＳＳプライマーを設計した。いくつかのフォワードプライマーはより長い（Ｌ）標的特異的領域を持つ。以下の配列において標的配列にハイブリダイズする塩基は太字、開始時の鋳型とミスマッチなユニーク配列の塩基は下線、バリアント塩基は太字下線、いずれの標的に対してもミスマッチ（Ｍ）な追加の塩基は斜体で示す。すべての配列は５’から３’方向へ記載されている。
【０４７５】
【化３０】
2018075033.tif 000052
【０４７６】
９．４．標的配列
Ｋ５６２細胞株から抽出したヒトｇＤＮＡを野生型遺伝子のインビトロ増幅の鋳型として用いた。また、ＳＷ４８０細胞株から抽出したヒトｇＤＮＡをＧ１２Ｖ点変異のインビトロ増幅に用いた。
【０４７７】
９．５．反応成分：標的配列の増幅と検出
標的配列のリアルタイム増幅および定量は総反応体積２５μＬで行った。反応にはＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ解析システム（ＢｉｏＲａｄ）を用いた。サイクリングパラメータは、９５℃２分、９５℃５秒と６４℃２０秒を１０サイクル（１サイクル毎に温度を１℃下げる）、９５℃５秒と５４℃２０秒を５０サイクル（５４℃のステップでデータを取得）とした。すべての反応条件は２連で試験し、反応液中には４０ｎＭフォワードプライマー、１００ｎＭパートザイムＡ（表１５記載の組み合わせ）、２００ｎＭリバースプライマー（３ｒｃＫＲＡＳ＿２）、２００ｎＭパートザイムＢ（ｒｃＫＲＡＳ＿Ｂ／５５−Ｐ）、２００ｎＭ基質（Ｓｕｂ５５−ＦＩＢ）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ各ｄＮＴＰ、１０ユニットＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮＡａｓｅ阻害剤（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｘＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２ユニットＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）およびＫ５６２またはＳＷ４８０のいずれかのｇＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）または標的なし（ＮＦＨ２Ｏ）を加えた。
【０４７８】
【表２１】
2018075033.tif 000053
【表２２】
2018075033.tif 000054
【０４７９】
９．６．結果：標的の増幅とレポーター基質の切断
ＰＡＳＳプライマーとＷＥ−ＡＲＭＳプライマーを用いた増幅をプライマー特異的パートザイムまたはミスマッチパートザイムのいずれかにより検出した結果を表１６に示す。
【０４８０】
【表２３】
2018075033.tif 000055
【０４８１】
試験（Ｋ５６２）ＤＮＡでは、野生型の逆相補鎖と一致するＰＡＳＳプライマーによりｒｃＧ１２アレルを増幅させた。この検出には野生型およびＵＳインサートｉ４と一致するパートザイムを用いた。逆相補野生型ＰＡＳＳプライマー／パートザイム系は野生型アレルを優先的に増幅および検出した。また、本実験条件下では、ネガティブ対照鋳型（ＳＷ４８０）を用いて実験を行った場合、シグナルが得られるのはより反応が進んでからであった。野生型（Ｋ５６２）と変異型（ＳＷ４８０）ＤＮＡから得られるＣｔの差は１２サイクルであり（表１６）、ＰＡＳＳプライマーと適合パートザイムにより変異型と野生型の単位複製配列を識別できることが示された。バリアント変異およびＵＳインサートｉ１に特異的なミスマッチパートザイムを野生型ＰＡＳＳプライマーと共に使った場合、交差反応性は認められなかった（表１６）。
試験（Ｋ５６２）ＤＮＡでは、野生型と一致するＷＥ−ＡＲＭＳプライマーはｒｃＧ１２アレルを増幅させた。これは野生型と一致したパートザイムにより検出した。この野生型ＡＲＭＳプライマー／パートザイム系は野生型アレルに特異的であり、ネガティブ対照鋳型（ＳＷ４８０）を用いるとシグナルが遅延して発生した。野生型（Ｋ５６２）から得られたＣｔと変異型（ＳＷ４８０）ＤＮＡから得られたＣｔの差は２２サイクルよりも大きかった（表１６）。バリアント変異特異的なミスマッチパートザイムを野生型ＷＥ−ＡＲＭＳプライマーと併用した場合、交差反応性が認められた。ミスマッチ反応のＣｔは一致しているものと同等であったので、バリアント変異特異的に設計されたパートザイムは野生型とＷＥ−ＡＲＭＳプライマーから生成された変異型単位複製配列を本実験条件下では識別できなかったことを示している（表１６）。
試験（ＳＷ４８０）ＤＮＡにおいて、変異バリアントの逆相補鎖と一致するＰＡＳＳプライマーはｒｃＧ１２Ｖアレルを増幅させた。これは変異型およびＵＳインサートｉ１と一致するパートザイムにより検出した。この変異型ＰＡＳＳプライマー／パートザイム系は変異型アレルを特異的に検出した一方、ネガティブ対照鋳型（Ｋ５６２）を用いた場合にはシグナルは生成されなかった。野生型およびＵＳインサートｉ４特異的なパートザイムを変異型ＰＡＳＳプライマーと併用した場合、交差反応性は認められなかった（表１６）。
試験（ＳＷ４８０）ＤＮＡにおいて、変異型バリアントの逆相補鎖に一致したＷＥ−ＡＲＭＳプライマーはｒｃＧ１２Ｖアレルを増幅した。これは変異型に一致したパートザイムにより検出した。この変異型ＷＥ−ＡＲＭＳプライマー／パートザイム系は変異型アレルを特異的に検出した。一方、ネガティブ対照鋳型（Ｋ５６２）の解析において、シグナルは生成しなかった。ミスマッチな野生型特異的パートザイムと野生型ＷＥ−ＡＲＭＳプライマーを併用した場合、交差反応性が認められた。ミスマッチな反応におけるＣｔは一致している反応に比べて９未満のＣｔ遅延が認められた。すなわち、本反応条件下ではバリアント変異特異的に設計されたパートザイムは野生型とＷＥ−ＡＲＭＳプライマーにより生成した変異型単位複製配列を識別する能力が劣っていることが示された（表１６）。
鋳型を加えなかった場合（ＤＮＡなし）、いずれのプライマー／パートザイム組を用いても増幅は確認されなかった。
本実施例のデータはＰＡＳＳプライマーが当技術分野で既に周知の１塩基置換検出法の代替技術であるＷＥ−ＡＲＭＳと比較してより優れた能力を持つことを示している。さらに、ＰＡＳＳプライマーが単位複製配列に導入したＵＳにより、パートザイムが密接に関連した２つの配列を識別しなければならない時、たとえば多重ｑＰＣＲの時などにさらに特異性を向上させうる。ＰＡＳＳプライマーは追加のユニーク配列を単位複製配列に導入することができた。異なるユニーク配列を野生型および変異型バリアント単位複製配列に導入した。この追加配列が差異を強調し、別の単位複製配列に対するパートザイムの交差反応を抑制する。たとえば、野生型ＰＡＳＳ単位複製配列は変異型ＰＡＳＳ単位複製配列に一致するパートザイムでは検出されず、その逆も同様である。これにより、多重反応とアッセイを併用することが可能となり、バリアントと野生型の特定ができる。しかし、２塩基のわずかな違いしかない野生型と変異型ＷＥ−ＡＲＭＳ単位複製配列およびそれらと完璧にマッチしたパートザイムであっても他方の単位複製配列に対するパートザイムの交差反応性を防ぐことはできなかった。たとえば、野生型ＷＥ−ＡＲＭＳ単位複製配列は変異型ＷＥ−ＡＲＭＳ単位複製配列と一致するパートザイムによっても検出され、その逆も同様であった。よって、これらは多重反応中で併用することはできなかった。
【０４８２】
実施例１０：ＰＡＳＳプライマーのＳ２領域の長さが標的配列の増幅に与える影響
ＰＡＳＳプライマー中内には複数の領域が存在する。具体的には、ＰＡＳＳプライマーを目的の標的配列と固定させるよう設計されたＵＳの５’側にあるＳ１、ＰＡＳＳプライマーの開始部分を担いユニーク配列の３’側にあるＳ２、Ｓ１とＳ２間に存在するＵＳである。本実施例ではＵＳによりユニーク配列領域を単位複製配列に挿入する（図１）。すべての領域はその配列の長さを調整することにより、個別の反応に適合させることができる。
本実施例では、ＭＮＡザイム検出を併用してｑＰＣＲの出力を行い、ＰＡＳＳプライマーのＳ２領域の長さがＣＣＢ遺伝子の増幅に与える影響を調べた。ＰＡＳＳプライマーのＳ２領域の長さを変えた場合においても、ＣＣＢ遺伝子の増幅と検出が行えるか調べるためにＰＡＳＳプライマーおよびパートザイムの設計を行った。ＰＡＳＳプライマーのＳ２領域（ループまたは平坦ＵＳのいずれかを含む）の３’末端を３、４、５、６または７塩基に、もしくは５’末端を５、６または７塩基に長さを変えた。
【０４８３】
１０．１．パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムはＣＣＢ遺伝子を特異的に標的とするよう設計し、ｃＵＳはＰＡＳＳプライマーにより導入した。以下の配列において、目的の標的配列とハイブリダイズする塩基は太字、ｃＵＳとハイブリダイズする塩基は下線で示した。「−Ｐ」はオリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。すべての配列は５’から３’方向へ記載されている。
【０４８４】
【化３１】
2018075033.tif 000056
【０４８５】
１０．２．レポーター基質
本実施例において、基質は５’末端を６−ＦＡＭで標識（以下、基質名中では「Ｆ」で示す）、３’末端をＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱクエンチャーで標識（以下、基質名中では「ＩＢ」で示す）した。基質の切断は４８５ｎｍ（ＦＡＭ励起波長）で励起し、５３０ｎｍ（ＦＡＭ発光波長）で測定した。本実施例で用いたレポーター基質の配列は５’から３’方向へ以下に示す。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
【０４８６】
【化３２】
2018075033.tif 000057
【０４８７】
１０．３．標的配列およびＣＣＢ  ＤＮＡの増幅用ＰＣＲプライマー
本実施例の標的配列はＩＭ９細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ）から抽出したヒトｇＤＮＡ中のＣＣＢ遺伝子である。オリゴヌクレオチドＰＡＳＳプライマーは以下に記載した。以下の配列中、ＵＳインサートｉ２の塩基は下線で示した。すべての配列は５’から３’方向へ記載されている。
【０４８８】
【化３３】
2018075033.tif 000058
【化３４】
2018075033.tif 000059
【０４８９】
１０．４．反応成分：標的配列の増幅と検出
標的配列のリアルタイム増幅および検出は総反応体積２５μＬで行った。反応にはＭｘ３００５ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた。サイクリングパラメータは、９５℃２分、９５℃１５秒と５５℃３０秒を５サイクル、９５℃１５秒と５２℃６０秒を４０サイクル（５２℃のステップでデータを取得）とした。すべての反応条件は２連で試験し、反応液中には４０ｎＭフォワードプライマー、２００ｎＭパートザイムＡ（表１７記載の組み合わせ）、２００ｎＭリバースプライマー（３ＣＣＢ）、２００ｎＭパートザイムＢ（ＣＣＢＢ／２−Ｐ）、２００ｎＭ基質（Ｓｕｂ２−ＦＩＢ）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ各ｄＮＴＰ、１０ユニットＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮＡａｓｅ阻害剤（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｘＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２ユニットＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）およびｇＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）またはＤＮＡなし（ＮＦＨ２Ｏ）のいずれかを加えた。
【０４９０】
【表２４】
2018075033.tif 000060
【表２５】
2018075033.tif 000061
【０４９１】
１０．６．結果：標的の増幅とレポーター基質の切断
ＣＣＢ遺伝子をリアルタイムに検出、定量するための単位複製配列がＰＡＳＳプライマーにより生成し、パートザイムがｃＵＳおよび増幅された標的特異的配列のいずれにも結合した。この反応において、ｑＰＣＲにより増幅されたヒトｇＤＮＡを標的配列として用いた場合、経時的な蛍光強度の増加が観察された。標的ＤＮＡを含まない対照の蛍光強度は標的ＤＮＡを含む反応のものより低く、反応中増加することはなかった。これにより、標的を含む反応中の蛍光強度の増加は標的依存的に構築された触媒活性ＭＮＡザイムがレポーター基質を切断したことによるものと考えられる。
【０４９２】
【表２６】
2018075033.tif 000062
【表２７】
2018075033.tif 000063
【０４９３】
ループ状のＵＳを含むフォワードＰＡＳＳプライマーのＳ２領域の長さを７塩基から６および５塩基と３’末端から短くしても検出可能なシグナルが得られたが、Ｃｔはそれぞれ５．２および８．７増加した（表１８）。Ｓ２の３’末端をさらに短くすると本実験条件下では検出可能なシグナルは得られなくなった。ループＰＡＳＳプライマーのＳ２領域を７塩基から６塩基へ５’末端から短くするとＣｔは２．５増加した。しかし、本実験条件下では、プライマー長をさらに短くすると検出可能なシグナルは得られなくなった。
平坦なＵＳを含むフォワードＰＡＳＳプライマーのＳ２領域の長さを７塩基から６および５塩基と３’末端から短くしたいずれの場合でも検出可能なシグナルが得られ、Ｃｔ値にほとんど影響はなかった（表１８）。Ｓ２の３’末端をさらに４および３塩基と短くしても検出可能なシグナルが得られたが、Ｃｔはそれぞれ１．８および４．３増加した（表１８）。平坦ＰＡＳＳプライマーのＳ２領域を７塩基から６および５塩基へ５’末端から短くしても検出可能なシグナルは得られ、Ｃｔ値に大きな影響はなかった（表１８）。
短縮したＰＡＳＳプライマー特異的なパートザイムを伸長したＰＡＳＳプライマーと、またその逆を組み合わせて対照として用いた。その結果、単位複製配列またはパートザイムのいずれからか塩基が押し出された。本実験条件下ではループおよび平坦ＰＡＳＳプライマーのいずれにおいても、単位複製配列またはパートザイムから押し出された塩基が１つのみの場合Ｃｔの増加は１未満と小さかった。ただし、ループＰＡＳＳプライマーでパートザイムからの押し出しが１塩基だった場合のみＣｔが３．１増加した。さらに、本実験条件下ではパートザイムまたは単位複製配列が２塩基の押し出し領域を含む場合、Ｃｔは５未満増え６まで増加した。ただし、ループＰＡＳＳプライマーにおいてパートザイムから押し出しがあった場合のみ検出可能なシグナルが得られなかった。
まとめると、ＵＳが平坦な状態でＰＡＳＳプライマーに含まれる場合、反応の効率（Ｃｔ値）に大きな影響を及ぼすことなくＳ２領域を４塩基まで削除することが可能であった。しかし、ＰＡＳＳプライマーにループ状のＵＳが含まれる場合、Ｓ２領域を１塩基削るだけでもＣｔ値に大きな影響を与えた。特にループＰＡＳＳプライマーを用いた場合にはループ領域のＳ１とＳ２間にギャップがなく、反応の厳密性が増加していた可能性がある。
本実験の結果より、ループまたは平坦のいずれかとなるＰＡＳＳプライマーの領域設計にあたりかなりの柔軟性が存在することが示された。それぞれの領域における最適な長さは標的配列、具体的な適用、実験条件、例えば緩衝液、塩濃度、反応温度、サイクル時間、その他の要因（ただし必ずしもこれらに限定されない）に依存する。
【０４９４】
実施例１１：ＰＡＳＳプライマーに含まれるＵＳインサートの長さを変化させた場合の検討
本実施例では、ＰＡＳＳプライマー中のＵＳインサートの長さが増幅効率に与える影響を検討した。前記の実施例でＵＳＩは１０塩基であった。
ループＵＳなら８、９、１０、１２または１３塩基のいずれかの長さ、平坦ＵＳなら１０、１２、１３、１７、２２または２９塩基のいずれかの長さとなるようにＰＡＳＳプライマーを設計した。各ＰＡＳＳプライマーをＭＮＡザイム検出と併用してｑＰＣＲの出力に用い、ＰＡＳＳプライマー内のＵＳインサートの長さを変化させてもＣＣＢ遺伝子の増幅および検出が可能か調べた。
【０４９５】
１１．１．パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムはＣＣＢ遺伝子とＰＡＳＳプライマーにより導入したｃＵＳを特異的に標的とするよう設計した。以下の配列において、目的の標的配列とハイブリダイズする塩基は太字、ｃＵＳとハイブリダイズする塩基は下線で示した。「−Ｐ」はオリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。すべての配列は５’から３’方向へ記載されている。
【０４９６】
【化３５】
2018075033.tif 000064
【０４９７】
１１．２．レポーター基質
本実施例において、基質は５’末端を６−ＦＡＭで標識（以下、基質名中では「Ｆ」で示す）、３’末端をＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱクエンチャーで標識（以下、基質名中では「ＩＢ」で示す）した。基質の切断は４８５ｎｍ（ＦＡＭ励起波長）で励起し、５３０ｎｍ（ＦＡＭ発光波長）で測定した。本実施例で用いたレポーター基質の配列は５’から３’方向へ以下に示す。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
【０４９８】
【化３６】
2018075033.tif 000065
【０４９９】
１１．３．標的配列およびＣＣＢ  ＤＮＡの増幅用ＰＣＲプライマー
本実施例の標的配列はＩＭ９細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ）から抽出したヒトｇＤＮＡ中のＣＣＢ遺伝子である。オリゴヌクレオチドＰＡＳＳプライマーは以下に記載した。以下の配列中、ＵＳインサートの塩基は下線で示した。すべての配列は５’から３’方向へ記載されている。
【０５００】
【化３７】
2018075033.tif 000066
【化３８】
2018075033.tif 000067
【０５０１】
１１．４．反応成分：標的配列の増幅と検出
標的配列のリアルタイム増幅および定量は総反応体積２５μＬで行った。反応にはＭｘ３００５ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた。サイクリングパラメータは、９５℃２分、９５℃１５秒と５５℃３０秒を５サイクル、９５℃１５秒と５２℃６０秒を４０サイクル（５２℃のステップでデータを取得）とした。すべての反応条件は２連で試験し、反応液中には４０ｎＭフォワードＰＡＳＳプライマー、２００ｎＭパートザイムＡ（ＣＣＢ＿２ｉ２Ａ／２−Ｐ）、２００ｎＭリバースプライマー（３ＣＣＢ）、２００ｎＭパートザイムＢ（ＣＣＢＢ／２−Ｐ）、２００ｎＭ基質（Ｓｕｂ２−ＦＩＢ）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ各ｄＮＴＰ、１０ユニットＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮＡａｓｅ阻害剤（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｘＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２ユニットＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）およびｇＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）または標的なし（ＮＦＨ２Ｏ）を加えた。
【０５０２】
１１．６．結果：標的の増幅とレポーター基質の切断
ＣＣＢをリアルタイムに検出するための単位複製配列をＰＡＳＳプライマーにより生成し、増幅した標的特異的配列とｃＵＳの両方に相補的なパートザイムと併用した。この反応において、ｑＰＣＲにより増幅されたヒトｇＤＮＡを標的配列として用いた場合、経時的な蛍光強度の増加が観察された。標的ＤＮＡを含まない対照の蛍光強度は標的ＤＮＡを含む反応のものより小さく、反応中増加することはなかった。これにより、標的を含む反応中の蛍光強度の増加は標的依存的に構築された触媒活性ＭＮＡザイムがレポーター基質を切断したことによるものと考えられる。
【０５０３】
【表２８】
2018075033.tif 000068
【０５０４】
ループ状のＵＳを含むフォワードＰＡＳＳプライマーのＵＳの長さを９および８塩基に短くしてもＣｔ値に影響はなく、１０塩基のＵＳインサートを含むもとのＰＡＳＳプライマーで観察されたシグナルと同等の検出可能なシグナルが得られた（表１９）。同様にして、本実験条件下ではＵＳを１２塩基に伸長してもＣｔ値に影響はなかったが、ＵＳを１３塩基まで伸長するとＣｔ値に僅かな増加が認められた（表１９）。
平坦なＵＳを含むフォワードＰＡＳＳプライマーの場合、ＵＳの長さを２２塩基まで伸長させてもＣｔ値にほとんど影響はなかった（表１９）。本実験条件下では、ＵＳを２９塩基まで伸長するとＣｔ値は１．２増加し、標的配列の増幅に僅かな影響があった（表１９）。
特に本実施例においては、ＵＳがループであるか平坦であるかに関わらずすべての長さのＵＳの試験において同一のＭＮＡザイムを用いた。これにより、異なるＭＮＡザイムを使用したことによるばらつきは排除され、得られた結果は純粋にＰＡＳＳプライマーの増幅効率を反映していることになる。
この実験結果はループまたは平坦のいずれかの形状をなすＰＡＳＳプライマー内のＵＳインサートの長さの設計にはかなりの柔軟性が存在することを示す
【０５０５】
実施例１２：ＰＡＳＳプライマーを用いた関連する単位複製配列内のバリアント配列のスキッピング
ＭＮＡザイムｑＰＣＲ反応において、ＰＡＳＳパートザイムはバリアント特異的プライマーと併用される。ＰＡＳＳプライマーと同様、ＰＡＳＳパートザイムはもとの鋳型標的配列とミスマッチのある領域を含むよう設計できる（図１０）。本実施例では野生型配列とは異なる欠損バリアント配列を特異的に増幅させるプライマーを設計する。ＭＮＡザイムは第一ＰＡＳＳパートザイムおよび完璧にマッチしている第二「標準」パートザイムからなり、第二パートザイムは増幅された目的の標的配列の近隣に結合する。ＰＡＳＳパートザイムは標的配列と相補的ではない配列領域、ユニーク配列（ＵＳ）を含んでおり、この領域はひとつのＭＮＡザイムを使ってすべてのバリアントが検出できるよう単位増幅配列中のバリアント配列と並ぶように設計する。ＰＡＳＳパートザイム中の相補的でない塩基数が標的配列中の非結合塩基数と一致している場合、ＰＡＳＳパートザイム中のＵＳは平坦な状態で存在できる（図１０、パネルｉｉ（ａ））。あるいは、パートザイム中の非相補的な塩基数が標的配列よりも多いまたは少ない場合は、配列が膨張またはループアウトし、ＰＡＳＳパートザイム中のＵＳはループ状で存在できる（図１０、パネルｉｉ（ｂ））。パートザイム成分から活性ＭＮＡザイムが形成することによりフルオロフォアで標識したユニバーサルプローブとクエンチャ−色素間が切断され、リアルタイムで観察可能なシグナルが得られる。
【０５０６】
本実施例では、４つのＥＧＦＲエクソン１９欠損バリアント（ｃ．２２３６−２２５０ｄｅｌ１５（ｖ４）、ｃ．２２３９−２２４８＞Ｃ（ｖ１３）、ｃ．２２３９−２２５３ｄｅｌ１５（ｖ１５）またはｃ．２２４０−２２５７ｄｅｌ１８（ｖ２０））をそれぞれ増幅させるための特異的なプライマーを設計した。各バリアント配列は異なる長さの欠損配列を含んでいるため、様々な標的が生成し、それぞれに特異的な５’プライマーが必要となる。これらのプライマーはそれぞれの欠損接合部をまたぐよう設計した。ＰＡＳＳパートザイムのＵＳ領域が欠損単位複製配列の可変領域と並ぶように設計してあるので、ＰＡＳＳパートザイムＡは４つすべてのバリアント単位複製配列を検出するよう設計した。ＰＡＳＳパートザイムＡはｖ１３に対しては平坦、バリアントｖ４、ｖ１５およびｖ２０に対してはループ状を呈した。増幅されたバリアントのアッセイはＰＡＳＳパートザイムＡと「標準」パートザイムＢを含むＭＮＡザイムまたは完璧に一致した標準パートザイムＡおよびＢ（すべてのバリアント単位複製配列または野生型鋳型のミスプライミングが起こった場合に派生し得るすべての単位複製配列の中核をなす完全に保存された領域の相補鎖）を含むＭＮＡザイムのいずれかにより行った。これを対照として用い、バリアント配列を検出する際にＰＡＳＳパートザイム内のＵＳがＭＮＡザイムの特異性に与える影響を調べる。
【０５０７】
１２．１  パートザイムオリゴヌクレオチド
センサーアームが標的配列と完全に相補的な完全一致「標準」パートザイムと単位複製配列に相補的なセンサーアームの２領域間に単位複製配列に相補的でない配列領域（ＵＳ）が挿入された「ＰＡＳＳ」パートザイムを設計した。以下の配列で、目的の標的配列とハイブリダイズする塩基は太字、４つすべての標的配列に対してミスマッチのあるユニーク配列（ＵＳ）の塩基は下線で示した。「−Ｐ」はオリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。すべての配列は５’から３’方向へ記載されている。
【０５０８】
【化３９】
2018075033.tif 000069
【０５０９】
１２．２  レポーター基質
本実施例において、基質は５’末端を６−ＦＡＭで標識（以下、基質名中では「Ｆ」で示す）、３’末端をＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱクエンチャーで標識（以下、基質名中では「ＩＢ」で示す）した。基質の切断は４５０から４９０ｎｍ間（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）のＦＡＭ励起波長範囲）で励起し、５１０から５３０ｎｍ間（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）のＦＡＭ発光波長範囲）で測定した。本実施例で用いたレポーター基質の配列は５’から３’方向へ以下に示す。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
【０５１０】
【化４０】
2018075033.tif 000070
【０５１１】
１２．３  ＥＧＦＲ  ＤＮＡ増幅のためのＰＣＲプライマー
プラスミドＤＮＡのインビトロ増幅は以下に示したオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて行った。以下の配列中、野生型に対してバリアント塩基を下線で示した。フォワードプライマーは欠損特異的で、リバースプライマーはすべて同一である。すべての配列は５’から３’方向へ記載されている。
【０５１２】
【化４１】
2018075033.tif 000071
【０５１３】
１２．４  標的配列
ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９領域に対応する配列を含むＤＮＡプラスミドを鋳型として用いた（ＩＤＴ）。プラスミドは野生型配列またはＥＧＦＲエクソン１９欠損バリアントに対応する配列（ｃ．２２３６−２２５０ｄｅｌ１５（ｖ４）、ｃ．２２３９−２２４８＞Ｃ（ｖ１３）、ｃ．２２３９−２２５３ｄｅｌ１５（ｖ１５）またはｃ．２２４０−２２５７ｄｅｌ１８（ｖ２０））のいずれかを含む。メーカーの指示通り用いた制限酵素ＥｃｏＲ１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりプラスミドを消化し、使用前に直線化した。
ヒト野生型ＥＧＦＲ  ＤＮＡとしてＩＭ９細胞株から抽出したゲノムＤＮＡを対照ＤＮＡサンプルとして用いた。
【０５１４】
１２．５  反応成分：標的配列の増幅
標的配列のリアルタイム増幅および検出は総反応体積２５μＬで行った。反応にはＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ解析システム（ＢｉｏＲａｄ）を用いた。サイクリングパラメータは、９５℃２分、９５℃１５秒と６１℃６０秒を１０サイクル（１サイクル毎に温度を１℃下げる）、９５℃１５秒と５２℃６０秒を４０サイクル（５２℃のステップでデータを取得）とした。各反応条件は２連で試験し、反応液中には４０ｎＭ欠損特異的フォワードプライマー、１００ｎＭパートザイムＡおよび２００ｎＭパートザイムＢ（表２０参照）を加えた。さらに、すべての反応液中には２００ｎＭリバースプライマー（３ＥＧＦＲ）、２００ｎＭ基質（Ｓｕｂ５６−ＦＩＢ）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ各ｄＮＴＰ、１０ユニットＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｘＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２ユニットＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）およびｖ４（１０４コピー）、またはｖ１３（１０４コピー）またはｖ１５（１０４コピー）またはｖ２０（１０４コピー）または野生型（ＷＴ）（１０４コピー）またはＩＭ９  ｇＤＮＡ（３５ｎｇ）またはＩＭ９  ｇＤＮＡ鋳型（１００ｎｇ）をコンスタントバックグラウンドにｖ４、ｖ１３、ｖ１５またはｖ２０プラスミド鋳型を〜１／１００希釈したものいずれかまたはＤＮＡなし（ＮＦＨ２Ｏ）を加えた。
【０５１５】
【表２９】
2018075033.tif 000072
【表３０】
2018075033.tif 000073
【表３１】
2018075033.tif 000074
【表３２】
2018075033.tif 000075
【０５１６】
１２．６  結果：標的配列の増幅とレポーター基質の切断
すべての反応において、鋳型なしの蛍光強度がＤＮＡ鋳型を含有する反応のものよりも低かった。これにより、標的を含む反応中の蛍光強度の増加は標的依存的に構築された触媒活性ＭＮＡザイムがレポーター基質を切断したことによるものと考えられる。
ＥＧＦＲ欠損バリアントのリアルタイム検出を行う単位複製配列を得るために欠損特異的なフォワードプライマーを用いた。プライマー／パートザイムＡの組み合わせの特異性を評価する指標としてΔＣｔを用いた。ΔＣｔは欠損単位複製配列のＣｔと野生型鋳型を増幅させたバックグラウンドＣｔの差として計算する。欠損ｖ４およびｖ１５を増幅するため設計したプライマーはすべての反応においてΔＣｔが９．６以上と大きく、欠損に対して高い特異性を示した。反対にｖ２０欠損特異的に設計したプライマーは非特異的にｖ２０および野生型配列の両方を増幅させた。ｖ１３特異的に設計したプライマーは標準パートザイムを用いた場合、野生型プラスミドおよびＩＭ９  ｇＤＮＡにおけるΔＣｔはそれぞれ６．６および４．８であった。
ｖ４およびｖ１５ＰＡＳＳパートザイムアッセイでは、ｇＤＮＡ（ＩＭ９）鋳型を単独で用いた場合シグナルは得られなかったが、ＷＴプラスミドではバリアント鋳型のＣｔと比較し、ΔＣｔは１５より大きくなった。ｖ２０では、ＷＴプラスミドおよびＩＭ９  ｇＤＮＡでΔＣｔはそれぞれ４．６および５．５となり、ｖ１３ではＷＴプラスミドおよびＩＭ９  ｇＤＮＡでΔＣｔはそれぞれ１０．３および１０．２となった（表２１）。
【０５１７】
【表３３】
2018075033.tif 000076
【表３４】
2018075033.tif 000077
【０５１８】
バリアント鋳型を１００倍希釈した場合、ｖ４、ｖ１３およびｖ１５のアッセイではＰＡＳＳおよび標準パートザイムの両方のアッセイにおいてシグナルを検出し、欠損単位複製配列を非特異的な野生型バックグラウンドと区別することができたが、標準パートザイムの方がその感度は低かった。
全体として、標準パートザイムにより単位複製配列を検出した反応においてもΔＣｔは得られたが、ＰＡＳＳパートザイムのアッセイで得られたものより小さかった（表２１）。これにより、標準パートザイムを用いた場合と比較してＰＡＳＳパートザイムを用いることにより反応の特異性が格段に向上することが示された。さらに、結合形状がループ（Ｖ４、ｖ１５、ｖ２０）もしくは平坦（ｖ１３）であっても、同一のＰＡＳＳパートザイムが欠損配列に関わらず４つすべてのバリアントを検出可能であった。本アッセイ中のＭＮＡザイムでは同一のパートザイムを用いており、そのセンサーアームは４つすべての欠損バリアントに対して相補的な２領域と単位複製配列ごとに異なる領域においては４つすべてにおいてミスマッチな１領域（ＵＳインサート）からなる。このパートザイムは４つすべての単位複製配列と同等の効率で結合すると期待され、単一のＭＮＡザイムにより４つすべてのバリアントを同時に検出可能とする。
【０５１９】
実施例１３：  単位複製配列におけるバリアント配列をスキップするための、および、バリアントと野生型配列との区別を向上させるための、ＰＡＳＳパートザイムのＰＡＳＳプライマーとの組合せ
他のＰＡＳＳのＰＣＲストラテジーは、関連される単位複製配列を分析するときに、反応効率および特異性をさらに向上させるためのＰＡＳＳパートザイムのＰＡＳＳプライマーとの組合せを含む。このストラテジーは、（ｉ）ＥＧＦＲエクソン１９における欠失バリアントに特異的なＳ２、（ｉｉ）すべてのＥＧＦＲ配列に共通するＳ１領域、および（ｉｉｉ）標的配列に対して相補的ではない、Ｓ１とＳ２との間に配置される第１ＵＳインサート（ＵＳ１）（図１１、パネル（ｉ））で設計されたＰＡＳＳプライマーを含む。また、ストラテジーは、ＰＡＳＳパートザイムＡを含むＭＮＡザイムを有する。ＰＡＳＳパートザイムＡの標的センサーアームは、（ｉ）ＵＳ１（ＰＡＳＳプライマーから生成される全ての単位複製配列にマッチされる）、（ｉｉ）第２ＵＳインサートＵＳ２（ＰＡＳＳプライマーから生成される全ての単位複製配列にミスマッチである）、および（ｉｉｉ）標的の開始配列に対して相補的である領域、を含むいくつかのドメインを含む。ＰＡＳＳパートザイムのＵＳ２領域は、増幅された標的配列に対して相補的ではなく、異なる欠失の存在に起因して配列が変化する単位複製配列上にＵＳ２が配置するように設計される。ＰＡＳＳパートザイムは、標的単位複製配列に結合する場合に、平坦またはループアウト構造を形成することとしてもよい（図１１、パネル（ｉｉ））。
【０５２０】
本実施例では、完全にマッチされる「標準」欠失−特異的プライマーおよび欠失−特異的ＰＡＳＳプライマーが、ＥＧＦＲエクソン１９欠失ｃ．２２３５−２２４９ｄｅｌ１５（ｖ２）を増幅させるために設計された。増幅された欠失バリアントは、（ｉ）平坦もしくはループアウトＵＳ２のいずれかを形成するがＵＳ１を欠如するＰＡＳＳパートザイムを含むＭＮＡザイム（標準プライマーによる使用に関する）、または（ｉｉ）平坦またはループ形成におけるＵＳ１とＵＳ２の両方が組み込まれるＰＡＳＳパートザイムを含むＭＮＡザイム（ＰＡＳＳプライマーによる使用に関する）によりリアルタイムでいずれかが分析された。
【０５２１】
１３．１．  パートザイム  オリゴヌクレオチド
パートザイムは、（ｉ）センサーアームが単位複製配列に対して完全に相補的である標準パートザイム、（ｉｉ）代替的なＵＳ２インサートのみを含むＰＡＳＳパートザイム（ＵＳ１５またはＵＳ９のいずれかで指定される；つまり、標的単位複製配列に対して相補的ではない配列の領域）、または（ｉｉｉ）ＵＳ２（ＵＳ１５またはＵＳ９のいずれか）およびＵＳ１（ｉ４）を含む、ＰＡＳＳパートザイム（ＰＡＳＳプライマーにより単位複製配列内に挿入されたｃＵＳ１に結合する）のいずれかであるように設計された。さらに、標準パートザイムは、単位複製配列のプライマー領域と重複しない領域における、可変領域（バリアントおよび野生型）の外側に、全ての単位複製配列を結合するように設計された。ＰＡＳＳパートザイムは、バリアント欠失−特異的プライマーで増幅されたときに、ＥＧＦＲエクソン１９における可変領域にわたる全ての欠失バリアントの単位複製配列に結合するように設計された。以下の配列において、太字の塩基は関心標的配列とハイブリダイズし、下線部の塩基は、鋳型に関してミスマッチである第２ユニーク配列のインサート（ＵＳ２）である。下線部かつイタリック体の領域は、ＰＡＳＳプライマーにより単位複製配列内に組み込まれるＵＳ１（ｉ４）を示す。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０５２２】
【化４２】
2018075033.tif 000078
【０５２３】
１３．２．  レポーター基質
本実施例では、基質は、５’末端で６−ＦＡＭ部分により（以下の基質の名称で、「Ｆ」により示される）、および３’末端でアイオワブラック（登録商標）ＦＱクエンチャー部分により（以下の基質の名称で、「ＩＢ」により示される）末端標識された。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ励起波長範囲）間の励起により、５１０〜５３０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ発光波長範囲）の間でモニターされた。本実施例のレポーター基質は、配列５’から３’までを有して以下に示される。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
【０５２４】
【化４３】
2018075033.tif 000079
【０５２５】
１３．３．  ＥＧＦＲ  ＤＮＡの増幅に関するＰＣＲプライマー
プラスミドＤＮＡのインビトロの増幅は、以下に挙げられる欠失−特異的オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて実施された。以下の配列において、下線部の塩基はバリアント塩基であり、下線部かつイタリック体の塩基はＵＳ１（ｉ４）を表す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０５２６】
【化４４】
2018075033.tif 000080
【０５２７】
１３．４．  標的配列
ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９の領域に対応する配列を含むＤＮＡプラスミドは、鋳型（ＩＤＴ）として用いられた。プラスミドは、野生型配列またはＥＧＦＲ欠失バリアントｖ２に対応する配列のいずれかを含んだ。プラスミドは、製造業者の指示に従って、制限酵素ＥｃｏＲ１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による消化により、使用前に直線にされた。ＩＭ９細胞株から抽出されたゲノムＤＮＡは、ヒト野生型ＥＧＦＲのＤＮＡを表す対照ＤＮＡ試料として用いられた。
【０５２８】
１３．５．  反応成分：標的配列の増幅
標的配列のリアルタイムの増幅および検出が２５μＬの総反応量で行われた。反応は、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）で行われた。サイクリングパラメータは、９５℃で２分、１０サイクルの９５℃で１５秒、および６１℃で６０秒（１サイクルあたりマイナス１℃）、４０サイクルの９５℃で１５秒、および５２℃で６０秒（５２℃のステップでデータが採取された）。反応条件の各セットは、２回試験されて、表２２で示されるように、４０ｎＭフォワード欠失−特異的プライマー、１００ｎＭのパートザイムＡ、および２００ｎＭのパートザイムＢを含んだ。全ての反応は、２００ｎＭのリバースプライマー（３ＥＧＦＲ）、２００ｎＭ基質（Ｓｕｂ５６−ＦＩＢ）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ユニットのＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮａｓｅインヒビター（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｘＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２ユニットのＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、およびｖ２に関するプラスミドＤＮＡ鋳型（１０４複製物）、一定のバックグラウンドのＩＭ９ｇ  ＤＮＡ鋳型（３５ｎｇ）で約１を１００に希釈したｖ２プラスミド（１０２複製物）鋳型もしくは野生型プラスミド（ＷＴ）（１０４複製物）、またはＩＭ９  ｇＤＮＡ（３５ｎｇ）もしくは鋳型なし（ＮＦ  Ｈ２Ｏ）のいずれかを含んだ。
【０５２９】
【表３５】
2018075033.tif 000081
【表３６】
2018075033.tif 000082
【０５３０】
１３．６．  結果：標的の増幅およびレポーター基質の切断
全ての反応に関し、鋳型なしの対照の蛍光は、ＤＮＡ標的含有反応におけるそれよりも低かった。このことは、標的含有反応で産生される蛍光における増加は、その後普遍的なレポーター基質を切断した、触媒作用的にアクティブなＭＮＡザイムの標的依存アッセンブリに起因することを実証する。
【０５３１】
ＰＡＳＳパートザイムを含むＭＮＡザイムとプライマーの全ての組合せは、標準プライマーおよび標準ＭＮＡザイムを含む分析と比較した場合により高い特異性をもたらした（表２３）。ｖ２の完全にマッチした「標準」検出に関するΔＣｔは、１を１００で希釈した試料のたった約１〜２Ｃｔ低い野生型シグナルを有する６〜７Ｃｔの範囲であった。
【０５３２】
【表３７】
2018075033.tif 000083
【表３８】
2018075033.tif 000084
【０５３３】
標的配列を有する平坦アラインメントを形成するＵＳ２のみを含むＰＡＳＳパートザイムで構成されるＭＮＡザイムと標準プライマーの組合せは、標的配列（Ｃｔ２５．３）を有するループアラインメントを形成するＰＡＳＳパートザイムと比較して、より早く（Ｃｔ２３．３）標的ｖ２を検出した。ループおよび平坦なＰＡＳＳパートザイムの両方が、野生型鋳型（プラスミドおよびｇＤＮＡ）、約１４．５のΔＣｔで分析したときに、同様の高い特異性を示した（表２３）。バリアント鋳型は１を１００で希釈されたときに、標準プライマーを含むｖ２分析およびＵＳ２のみを含むＰＡＳＳパートザイムがそれを検出することができ、約５〜６のΔＣｔを有する野生型の非特異的な増幅由来のシグナルを区別する（表２３）。
【０５３４】
標的配列を有する平坦アラインメントを形成するＵＳ２およびＵＳ１を含むＰＡＳＳパートザイムで構成されるＭＮＡザイムとＰＡＳＳプライマーの組合せは、標的配列（Ｃｔ１９．０）を有するループアラインメントを形成するＰＡＳＳパートザイムと比較して、わずかに早く（Ｃｔ１８．２）標的ｖ２を検出した。平坦なＰＡＳＳパートザイムを含む分析は、野生型鋳型（プラスミドおよびｇＤＮＡ）で分析したときに、ループＰＡＳＳパートザイムと比較してわずかにより特異性を示した。バリアント鋳型は１を１００で希釈したときに、ＰＡＳＳプライマーを含むｖ２分析およびＵＳ２およびＵＳ１を含むＰＡＳＳパートザイムは、約１０のΔＣｔを有する野生型の非特異的な増幅由来のシグナルを検出し、区別した。
【０５３５】
ＰＡＳＳパートザイムを含むＰＡＳＳ  ＰＣＲストラテジーに対するＰＡＳＳプライマーの追加は、より早いＣｔを有する反応の効率およびより高いΔＣｔを有する反応の特異性を向上させた。実験は、非常に特異的で有効である分析において関連する配列の分析のために、ＰＡＳＳプライマーをＰＡＳＳパートザイムと組合せるための性能を実証する。本実施例では、不完全であるが、バリアント配列と同じであり、相補性を有する単一のＰＡＳＳパートザイムとともに欠失−特異的ＰＡＳＳプライマーを使用することは、リアルタイムで同時に欠失単位複製配列の検出を可能にした。
【０５３６】
実施例１４：ＰＡＳＳパートザイムを含むＭＮＡザイム（ＭＮＡｚｍｅ）とＰＡＳＳプライマーを含むＰＡＳＳ  ｑＰＣＲストラテジーの感受性の試験
本実施例では、ｖ２として言及されるエクソン１９におけるＥＧＦＲ欠失バリアントは、野生型の鋳型のバックグラウンドにおけるｖ２鋳型の段階希釈を用いて分析される。野生型の鋳型のバックグラウンドにおけるｖ２の１を１０で、１００を１０００で希釈したものを試験した。
【０５３７】
ＵＳ１（ｉ４）を含む平坦構造におけるＰＡＳＳプライマーは、ｖ２配列の特異的な増幅に使用される。ＰＡＳＳプライマーはＭＮＡザイムｑＰＣＲと組み合わされ、これにより、ＭＮＡザイムは、ユニーク配列（ｃＵＳ１）の相補鎖に結合する第１ＰＡＳＳパートザイムならびに増幅された標的配列を含み、また、バリアント配列が位置する単位複製配列上にＵＳ２が配置するように設計される、増幅された標的配列（ＵＳ２）に対して相補的でない配列の領域を含む。第２パートザイムは、増幅された関心標的配列内の第１パートザイムに隣接して結合する。
ＰＡＳＳ  ｑＰＣＲは、ストラテジーの効率、および感受性に関して試験された。
【０５３８】
１４．１．  パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムは、センサーアームが、単位複製配列またはＵＳ２（指定されるＵＳ９）およびＵＳ１インサートｉ４（ＰＡＳＳプライマーにより単位複製配列内に挿入されるｃＵＳ１に対して結合する）を含むＰＡＳＳパートザイムに対して完全に相補的である、標準パートザイムのいずれかとなるように設計された。以下の配列では、太字の塩基は関心標的配列とハイブリダイズし、下線部の塩基は鋳型に対してミスマッチであるユニーク配列（ＵＳ２）である。下線部かつイタリック体の領域はＵＳ１（ｉ４）を表す。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０５３９】
【化４５】
2018075033.tif 000085
【０５４０】
１４．２．  レポーター基質
本実施例では、基質は、５’末端で６−ＦＡＭ部分により（以下の基質の名称で、「Ｆ」により示される）、および３’末端でアイオワブラック（登録商標）ＦＱクエンチャー部分により（以下の基質の名称で、「ＩＢ」により示される）末端標識された。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ励起波長範囲）間の励起により、５１０〜５３０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ発光波長範囲）の間でモニターされた。本実施例のレポーター基質は、配列５’から３’までを有して以下に示される。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
【０５４１】
【化４６】
2018075033.tif 000086
【０５４２】
１４．３．  ＥＧＦＲ  ＤＮＡ増幅のためのＰＣＲプライマー
プラスミドＤＮＡのインビトロの増幅は、以下に挙げられる欠失−特異的オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて実施された。以下の配列において、下線部の塩基はバリアント塩基（野生型配列に対する）であり、下線部かつイタリック体の塩基はＵＳ１（ｉ４）を表す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０５４３】
【化４７】
2018075033.tif 000087
【０５４４】
１４．４．  標的配列
ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９の領域に対応する配列を含むＤＮＡプラスミドは、鋳型（ＩＤＴ）として用いられた。プラスミドは、野生型配列またはＥＧＦＲ欠失バリアントｖ２に対応する配列のいずれかを含んだ。プラスミドは、製造業者の指示に従って、制限酵素ＥｃｏＲ１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による消化により、使用前に直線にされた。ＩＭ９細胞株から抽出されたゲノムＤＮＡは、ヒト野生型ＥＧＦＲのｇＤＮＡを表す対照ＤＮＡ試料として用いられた。
【０５４５】
１４．５．  反応成分：標的配列の増幅
標的配列のリアルタイムの増幅および検出が２５μＬの総反応量で行われた。反応は、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）で行われた。サイクリングパラメータは、９５℃で２分、１０サイクルの９５℃で１５秒、および６１℃で６０秒（１サイクルあたりマイナス１℃）、４０サイクルの９５℃で１５秒、および５２℃で６０秒（５２℃のステップでデータが採取された）。反応条件の各セットは、２回試験されて、４０ｎＭフォワードプライマー（５ＥＧＦＲｖ２＿ｉ４）、１００ｎＭのパートザイムＡ（ＥＧＦＲ＿２ｉ４ＵＳ９Ａ／５６−Ｐ）、２００ｎＭのパートザイムＢ（ＥＧＦＲ＿２Ｂ／５６−Ｐ）、２００ｎＭのリバースプライマー（３ＥＧＦＲ）、２００ｎＭ基質（Ｓｕｂ５６−ＦＩＢ）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ユニットのＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮａｓｅインヒビター（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｘＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２ユニットのＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、およびｖ２に関するプラスミドＤＮＡ鋳型（１０４複製物）、ＷＴに関するプラスミドＤＮＡ鋳型（１０４複製物）、ＩＭ９  ｇＤＮＡ鋳型（３５ｎｇ）、ＩＭ９  ｇＤＮＡ鋳型（３５ｎｇ）または標的なし（ＮＦ  Ｈ２Ｏ）の一定のバックグラウンドで１を１０に、１を１００に、または１を１０００に希釈したｖ２に関するプラスミドＤＮＡ鋳型（１０４複製物）のいずれかを含んだ。
１４．６．  結果：標的の増幅およびレポーター基質の切断
ＰＡＳＳストラテジーは、リアルタイム検出およびＥＧＦＲ欠失バリアント（ｖ２）の定量化に関する単位複製配列を産生するために使用された。この反応は、反応がｖ２に特異的な標的配列を含む場合に、時間の経過とともに蛍光における増加を示した（表２３）。
【０５４６】
【表３９】
2018075033.tif 000088
【０５４７】
プラスミドＤＮＡ鋳型、特にｖ２欠失に関し、野生型（ＩＭ９）鋳型のバックグラウンドにおいて１０倍に連続的に希釈された。閾値サイクル数（Ｃｔ）に対するＤＮＡ濃度のログをプロットすることにより作成される標準曲線は、９２％の効率および０．９９４のＲ２を有する直線のプロットをもたらした。各希釈のＣｔは、表２３に示される。表に示されるＣｔ値は、２回の反応の結果の平均である。
【０５４８】
ＰＡＳＳ分析は、野生型のバックグラウンドにおいて１を１０００で希釈した場合に、ｖ２配列を検出することができた。ネガティブ対照の野生型の鋳型からのシグナルは、バリアント鋳型の同じ数の複製物からのシグナルより低い約１５．７Ｃｔであった。
【０５４９】
鋳型なしの対照の蛍光は、反応中に増加しなかった。このことは、標的含有反応で産生される蛍光の増加は、触媒作用的にアクティブなＭＮＡザイムの標的依存アッセンブリに起因し、その後レポーター基質を切断したということを実証する。
【０５５０】
このことは、ＰＡＳＳプライマーをＰＡＳＳパートザイムと組合せる、図１１に示されるＰＡＳＳストラテジーが、バリアント配列の検出に関して非常に有効であり、特異的であり、感受性があることを実証する。
【０５５１】
実施例１５：標的配列の異なる長さをループアウトし得るＰＡＳＳプライマーおよびピンチＰＡＳＳプライマー
本実施例では、ＰＡＳＳプライマーのＳ１およびＳ２領域に対して相補的な標的配列間に位置する標的特異的領域のサイズは、２（オリジナルループＰＡＳＳプライマー）（図１２（ｉｉｉ））から２０、４０、６０、１００、および２００標的塩基（標的ループＰＡＳＳプライマー）（図１２（ｉ））までのサイズに増加した。これを行うために、ＰＡＳＳプライマーのＳ１領域は、ＰＡＳＳプライマーの３’および５’標的特異的領域に対して相補的な配列間の標的配列が非相補的な介在配列のループアウトのサイズを増加させるように、さらに５’が移動された。
【０５５２】
ピンチＰＡＳＳオリゴヌクレオチドにおけるＵＳは、非相補的配列の１配列ごと（ｐｅｒ  ｓｅｃ）のインサートではなく、むしろ標的の２つの非連続的配列を並置することにより作成される、ユニーク配列ジャンクション（ＵＳＪ）を含む。ピンチＰＡＳＳオリゴヌクレオチドにおいて、配列Ｓ１およびＳ２は、標的に対して相補的であり、配列に介在することにより分離された２つの領域に結合する。ピンチＰＡＳＳオリゴヌクレオチドは標的に対してハイブリダイズし、介在標的配列はループアウトし、ＵＳＪを含む、近接して作成される単位複製配列内に相補的標的領域をもたらす。本実施例では、ピンチＰＡＳＳプライマーは、Ｓ１およびＳ２領域に対して相補的な標的配列間に配置される介在標的領域のサイズを変化させながら試験された。非相補的な介在配列のループアウトは、１０から、２０、６０、および１００までの標的塩基サイズの範囲であった（図１２（ｉｉ））。
【０５５３】
本実施例では、ループＰＡＳＳプライマー、標的ループＰＡＳＳプライマー、およびピンチＰＡＳＳプライマーは、ＣＣＢ遺伝子の領域を増幅させるために使用され、それぞれのものが、異なるＰＡＳＳプライマータイプによりループする標的の種々のシナリオが遺伝子の増幅および検出と適合するかどうかを測定するためのｑＰＣＲにおけるリードアウトのためにＭＮＡザイム検出と組合せられた。
【０５５４】
１５．１．  パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムは、具体的に、ＰＡＳＳプライマーを介して導入された、ＣＣＢ遺伝子および／またはあらゆるｃＵＳを標識するように設計された。以下の配列において、太字の塩基は関心標的配列とハイブリダイズし、太字かつ下線部の塩基はＵＳＪのいずれかの側の２つの塩基を表し、下線部の塩基はｃＵＳインサートに対してハイブリダイズする。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０５５５】
【化４８】
2018075033.tif 000089
【０５５６】
１５．２．  レポーター基質
本実施例では、基質は、５’末端で６−ＦＡＭ部分により（以下の基質の名称で、「Ｆ」により示される）、および３’末端でアイオワブラック（登録商標）ＦＱクエンチャー部分により（以下の基質の名称で、「ＩＢ」により示される）末端標識された。基質の切断は、４８５ｎｍ（ＦＡＭ励起波長）での励起により、５３０ｎｍ（ＦＡＭ発光波長）でモニターされた。本実施例のレポーター基質は、配列５’から３’までを有して以下に示される。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
【０５５７】
【化４９】
2018075033.tif 000090
【０５５８】
１５．３．  ＣＣＢ  ＤＮＡの増幅に関する標的配列およびＰＣＲプライマー
本実施例に関する標的配列は、ＩＭ９細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ）から抽出されたヒトｇＤＮＡにおけるＣＣＢ遺伝子であった。オリゴヌクレオチドＰＡＳＳプライマーは、以下に挙げられる。以下の配列において、太字の塩基は関心標的配列とハイブリダイズし、太字かつ下線部の塩基はＵＳＪのいずれかの側の２つの塩基を表し、下線部の塩基はＵＳＩである。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０５５９】
【化５０】
2018075033.tif 000091
【化５１】
2018075033.tif 000092
【０５６０】
１５．４．  反応成分：標的配列の増幅および検出
標的配列のリアルタイムの増幅および検出が２５μＬの総反応量で行われた。反応は、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）で行われた。サイクリングパラメータは、９５℃で２分、５サイクルの９５℃で１５秒、および５５℃で３０秒、５０サイクルの９５℃で１５秒、および５２℃で５０秒（５２℃のステップでデータが採取された）。全ての反応は２回行われて、４０ｎＭフォワードプライマー、２００ｎＭのパートザイムＡ（組合せは表２４に挙げられる）、２００ｎＭのリバースプライマー（３ＣＣＢ）、２００ｎＭのパートザイムＢ（ＣＣＢＢ／２−Ｐ）、２００ｎＭ基質（Ｓｕｂ２−ＦＩＢ）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ユニットのＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮａｓｅインヒビター（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｘＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２ユニットのＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、およびｇＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）または標的なし（ＮＦ  Ｈ２Ｏ）のいずれかを含んだ。
【０５６１】
【表４０】
2018075033.tif 000093
【表４１】
2018075033.tif 000094
【０５６２】
１５．５．  結果：標的の増幅およびレポーター基質の切断
増幅および検出の結果が以下の表２５に要約される。
【０５６３】
【表４２】
2018075033.tif 000095
【０５６４】
Ｃｔ値は、ループまたはピンチ設計のいずれかを有するＰＡＳＳプライマーが標的遺伝子を全て効率的に増幅し得ることを示す（表２５）。ループ／２設計は、２０（ループ／２０）から４０（ループ／４０）まで６０（ループ／６０）まで１００（ループ／１００）までおよびその後２００（ループ／２００）の範囲の標的ループＰＡＳＳプライマーと結合しない標的の配列の長さを有する、標的ループ設計と比較されたとき、Ｃｔ値はそれぞれ１．４、２．５、４．４、７．３、および１０．６まで増加した（表２５）。このことは、プライマーに対してハイブリダイズしない標的の長い配列ストレッチの存在に関わらず、プライマーが標的に結合して標的から伸長し得るということを示す。
【０５６５】
ループ／２設計が、１０（ピンチ／１０）、２０（ピンチ／４０）、６０（ピンチ／６０）または１００（ピンチ／１００）塩基のＳ１およびＳ２間の非結合配列を有するピンチＰＡＳＳプライマー設計と比較されたとき、Ｃｔはそれぞれ０．５、０．７、４．７および１１．１まで増加した（表２５）。このことは、プライマーに対してハイブリダイズしない標的の長い配列ストレッチの存在に関わらず、ピンチプライマーが標的に結合して標的から伸長するということを実証する。ピンチ／６０（ｖｉ）およびループ／６０（ｉｖ）に関するＣｔ値は非常に比較可能であり、ｃＳ１およびｃＳ２間の非ハイブリダイズ標的の少なくとも６０の塩基を有するピンチＰＡＳＳプライマーと標的ループが、同様におよび効率的に機能し得ることを示す。
【０５６６】
本実施例は、標的における配列にわたって「ジャンプ」し得るＰＡＳＳプライマーを使用することが実行可能であることを実証する。これは、たとえば、相同の領域および可変の領域を有する２つの標的を増幅することが所望される場合に適用する。ＰＡＳＳプライマー（ピンチまたはループ）は、標的の可変領域に結合しないが、相同領域に結合するように設計され得る。このことは、プライマーにより結合される塩基の数が２つの標的で同じであるため、同じ効率を有する２つの標的を増幅し得る１つのプライマーをもたらし得る。
【０５６７】
実施例１６：異なる長さの標的配列をループアウトするためのＰＡＳＳパートザイムおよびピンチＰＡＳＳパートザイムの研究
ＰＡＳＳプライマーまたはピンチＰＡＳＳプライマーに類似する態様で、ＰＡＳＳパートザイムまたはピンチＰＡＳＳパートザイムは、また、それがパートザイムセンサーアームもしくは標的配列または両方であるかに関わらず、配列の領域をループアウトするために設計され得る。
【０５６８】
本実施例では、プライマーはＴＦＲＣ遺伝子を特異的に増幅するように設計され、ＭＮＡザイムは第１のＰＡＳＳまたはピンチＰＡＳＳパートザイム、および、増幅された関心標的配列に隣接して結合する第２の完全にマッチした「標準」パートザイムを含む。ＰＡＳＳパートザイムは、関心標的配列（ｃＳ１およびｃＳ２）に対して相補的である配列の２つの領域（Ｓ１およびＳ２）間に配置される、標的配列に対して相補的ではないＵＳＩ領域を含む。ＰＡＳＳパートザイムに存在するＵＳＩは、ＰＡＳＳパートザイムにおける非相補的塩基の数が、本実施例では、５、１０または１５ｂｐ（図１３（ｉ））であった標的配列における非結合塩基の数とマッチする平坦構造であり得、または、パートザイムにおける非相補的塩基の数が標的配列の数よりも多いもしくは少ないところでループされ、および配列（パートザイムまたは標的）はバルジまたはループアウトし、本実施例では、パートザイムは５、１０または１５ｂｐまでループアウトされた（図１３（ｉｉ））。代替的に、ピンチＰＡＳＳパートザイムは、ＵＳＩを含まず、標的配列（ｃＳ１およびｃＳ２）に対して相補的である配列の２つの領域（Ｓ１およびＳ２）間における標的配列の領域をそれがループアウトするようにその標識に対してそれが結合する場合に作成されるＵＳＪをむしろ含んで使用され得る。本実施例においてピンチＰＡＳＳパートザイムによりループアウトされる領域は、５、１０、１５、２０または４０ｂｐの長さであった（図１３（ｉｉｉ））。パートザイムは、パートザイム成分由来のアクティブなＭＮＡザイムの構造がフルオロフォアおよびクエンチャー色素ペアを用いて標識された普遍的なプローブの切断をもたらし得るように設計され、リアルタイムでモニターし得るシグナルを産生する。
【０５６９】
各平坦、ループおよびピンチＰＡＳＳパートザイムは、ループもしくは平坦ＰＡＳＳパートザイムまたはピンチＰＡＳＳパートザイムにより作成されるｃＳ１およびｃＳ２間の非結合標的の種々のシナリオが、リアルタイムでの検出可能なシグナルを産生するアクティブなＭＮＡザイムの構造およびＴＦＲＣ遺伝子の検出に適合するかどうかを測定するために、ｑＰＣＲにおけるリードアウトに関するＰＣＲ増幅と組み合わされた。
【０５７０】
１６．１．  パートザイムオリゴヌクレオチド
ａ）センサーアームが標的配列に対して完全におよび連続的に相補的である、完全にマッチする「標準」パートザイムと、ｂ）単位複製配列（ＵＳＩ）に対して相補的ではない配列の領域が単位複製配列に対して相補的である２つの領域間のセンサーアーム内に挿入された「ＰＡＳＳ」パートザイム、またはｃ）標的配列の領域が、パートザイムのセンサーアームにおけるＵＳＪの存在をもたらす、単位複製配列に対して相補的である、２つの領域間でループアウトした、ピンチＰＡＳＳパートザイムのいずれかであるパートザイムが設計された。以下の配列において、太字の塩基は関心標的配列とハイブリダイズし、太字かつ下線部の塩基は、ＵＳＪのいずれかの側の２つの塩基を表し、下線部の塩基は、すべての３つの標的配列に対してミスマッチであるＵＳＩである。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０５７１】
【化５２】
2018075033.tif 000096
【化５３】
2018075033.tif 000097
【０５７２】
１６．２．  レポーター基質
本実施例では、基質は、５’末端で６−ＦＡＭ部分により（以下の基質の名称で、「Ｆ」により示される）、および３’末端でアイオワブラック（登録商標）ＦＱクエンチャー部分により（以下の基質の名称で、「ＩＢ」により示される）末端標識された。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ励起波長範囲）間の励起により、５１０〜５３０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ発光波長範囲）の間でモニターされた。本実施例のレポーター基質は、配列５’から３’までを有して以下に示される。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
【０５７３】
【化５４】
2018075033.tif 000098
【０５７４】
１６．３．  ＴＦＲＣの増幅のための標的配列およびＰＣＲプライマー
本実施例に関する標的配列は、ＩＭ９細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ）から抽出されたヒトゲノムＤＮＡにおけるＴＦＲＣ遺伝子であった。オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーは以下に示される。プライマー配列の５’末端での太字の配列は、標的遺伝子に対するプライマーの特異性に影響を与えることなく、プライマーのＴｍを増加させるタグ（Ｔ１またはＴ２）に対応する。これらのタグは、ＰＣＲ反応の後のラウンドにおいて増幅効率を改善する。プライマー配列は、５’から３’まで挙げられる。
【０５７５】
【化５５】
2018075033.tif 000099
【０５７６】
１６．４．  反応成分：標的配列の増幅
標的配列のリアルタイムの増幅および検出が２５μＬの総反応量で行われた。反応は、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）で行われた。サイクリングパラメータは、９５℃で２分、１０サイクルの９５℃で１５秒、および５９℃で６０秒（１サイクルあたりマイナス１℃）、５０サイクルの９５℃で１５秒、および５０℃で５０秒（５０℃のステップでデータが採取された）。反応条件の各セットは、２回試験されて、表２６で示されるように、１００ｎＭのパートザイムＡを含んだ。全ての反応は、４０ｎＭフォワードプライマー（５ＴＦＲＣ＿Ｔ１）、２００ｎＭのパートザイムＢ（ＴＦＲＣ＿２Ｂ／８４−Ｐ）、２００ｎＭのリバースプライマー（３ＴＦＲＣ＿Ｔ２）、２００ｎＭ基質（Ｓｕｂ８４−ＦＩＢ）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ユニットのＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮａｓｅインヒビター（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｘＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２ユニットのＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、およびＩＭ９  ｇＤＮＡ（５０ｎｇまたは５０ｐｇ）または標的なし（ＮＦ  Ｈ２Ｏ）のいずれかを含んだ。
【０５７７】
【表４３】
2018075033.tif 000100
【０５７８】
１６．５．  結果：標的の増幅およびレポーター基質の切断
全ての反応に関し、鋳型なしの対照の蛍光は、ＤＮＡ標的含有反応におけるものよりも低かった。このことは、標的含有反応で産生される蛍光における増加は、その後普遍的なレポーター基質を切断した、触媒作用的にアクティブなＭＮＡザイムの標的依存アッセンブリに起因することを実証する。
【０５７９】
ＰＡＳＳパートザイムは、ループまたは平坦に関わらず、５、１０または１５ｂｐのユニーク配列を有し、ＰＡＳＳパートザイムを含まない標準ＭＮＡザイムと比較したときに、５０ｎｇの鋳型に関する０．６Ｃｔおよび５０ｐｇの鋳型に関する０．７Ｃｔの最大の差異を有して全て同様に実施された（表２７）。
【０５８０】
【表４４】
2018075033.tif 000101
【０５８１】
５ｂｐの単位複製配列をループアウトする、ピンチＰＡＳＳパートザイムは、標準ＭＮＡザイム反応よりもわずかによく機能した。１０、１５および２０ｂｐへの単位複製配列の配列ループアウトのサイズの増加は、ＰＡＳＳパートザイムを含まない標準ＭＮＡザイムと比較した場合、鋳型の５０ｎｇに関する０．６Ｃｔおよび５０ｐｇに関する０．４Ｃｔの最大の増加を有するＣｔにおける最小のシフトのみをもたらした（表２７）。４０ｂｐの単位複製配列をループアウトするピンチＰＡＳＳパートザイムが標準ＭＮＡザイムと比較された場合、Ｃｔは９．１および２１．８（それぞれ５０ｎｇおよび５０ｐｇ）まで増加した。このことは、４０ｂｐまでのより大きな領域が、必要な場合には、単位複製配列ループアウトとなり得るが、しかしながら、実験条件下で、Ｃｔ値に影響を及ぼすかもしれない、ということを示す。
【０５８２】
概して、単位複製配列の配列と完全には結合しないピンチＰＡＳＳパートザイムまたはＰＡＳＳパートザイムを含むＭＮＡザイムを用いる標的配列の検出は、標準ＭＮＡザイム分析と同様の態様で、５０ｐｇの鋳型を強く検出する全てのＰＡＳＳのバラエティーを有する分析の感受性およびＣｔ値に最小の影響を有した。このことは、パートザイムセンサーアームの１つが連続的な標的配列に完全にマッチしない場合であっても、アクティブなＭＮＡザイムが形成し得、本実験において、ループアウト標的配列は少なくとも４０ｂｐまでになり得る、ということを実証する。
【０５８３】
実施例１７：配列における単一の塩基の変更を検出するためのＭＮＡザイムによりともに結合されたＰＡＳＳプライマーおよびピンチＰＡＳＳプライマー
ＵＳＩまたはＵＳＪのいずれかを含むＰＡＳＳプライマーの特異性は、Ｇ１２ＶおよびＧ１２Ｓとして言及されるＫＲＡＳのコドン１２における点変異を標的とする分析において実証された。実施例は、バリアントＧ１２ＶおよびＧ１２Ｓを検出するための性能、ならびにこれらと野生型および他のＫＲＡＳ  Ｇ１２／Ｇ１３バリアントとを区別するための性能を研究した。
【０５８４】
本実施例では、標的ループＰＡＳＳプライマーのＳ１およびＳ２領域に対して相補的な標的配列間に配置される標的特異的領域のサイズは、Ｇ１２Ｖに関して１（図１２（ｉｉｉ））から２０、４０、６０、１００、および２００までの標的塩基に、Ｇ１２Ｓに関して１０から２０、４０、および６０標的塩基に（図１２（ｉ））、サイズが変化した。これを達成するために、ＰＡＳＳプライマーのＳ１領域は、ＰＡＳＳプライマーの３’と５’標的特異的領域に対して相補的な配列間の標的配列が、非相補的に介在する標的配列ループアウトのサイズを増加させるように、５’から遠くへ移動された。ピンチＰＡＳＳオリゴヌクレオチドにおけるＵＳは、それ自体は非相補的配列のインサートではないが、むしろ標的の２つの非連続的な配列を並置することにより作成される、ユニーク配列ジャンクション（ＵＳＪ）を含む。ピンチＰＡＳＳオリゴヌクレオチドにおいて、配列Ｓ１およびＳ２は、標的に対して相補的であり、配列を介在することにより分離される２つの領域に対して結合する。ピンチＰＡＳＳオリゴヌクレオチドが標的にハイブリダイズする場合、介在する標的配列は、ＵＳＪを含む単位複製配列を作成している近位に相補的な標的領域をもたらしてループアウトする。本実施例では、ピンチＰＡＳＳプライマーは、Ｇ１２Ｖに関する１０または１００の標的塩基およびＧ１２Ｓに関する１０の標的塩基である、Ｓ１およびＳ２領域に対して相補的な標的配列間に配置される介在標的配列のサイズにより試験された（図１２（ｉｉ））。
【０５８５】
標的ループＰＡＳＳプライマーまたはピンチＰＡＳＳプライマーのそれぞれは、標的ループＰＡＳＳプライマーまたはピンチＰＡＳＳプライマーによりループする標的の種々のシナリオが、野生型からのバリアント配列および／または他のバリアントを区別するための性能に対する反応の特異性に影響したかどうかを測定するために、蛍光のリードアウトを行うｑＰＣＲにおけるＭＮＡザイム検出と組み合わされた。
【０５８６】
１７．１．  パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムは、ＰＡＳＳプライマーを介して導入されるあらゆるｃＵＳインサートおよび／またはバリアントＧ１２ＳもしくはＧ１２Ｖに関する特異的にＫＲＡＳ遺伝子を標的とするように設計された。以下の配列において、太字の塩基は関心標的配列とハイブリダイズし、太字かつ下線部の塩基はＵＳＪ側のいずれか２つの塩基を表し、下線部の塩基はｃＵＳインサートにハイブリダイスし、ならびに太字かつイタリック体の塩基はバリアント塩基（Ｇ１２ＳまたはＧ１２Ｖ）を表し、下線部かつイタリック体の塩基は追加のミスマッチ塩基を表す。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０５８７】
【化５６】
2018075033.tif 000102
【０５８８】
１７．２．  レポーター基質
本実施例において、基質は、５’末端で６−ＦＡＭ部分により（以下の基質の名称で、「Ｆ」により示される）、および３’末端でアイオワブラック（登録商標）ＦＱクエンチャー部分により（以下の基質の名称で、「ＩＢ」により示される）末端標識された。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ励起波長範囲）間の励起により、５１０〜５３０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ発光波長範囲）の間でモニターされた。本実施例のレポーター基質は、配列５’から３’までを有して以下に示される。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
【０５８９】
【化５７】
2018075033.tif 000103
【０５９０】
１７．３．  ＫＲＡＳ  ＤＮＡの増幅に関するＰＣＲプライマー
ヒトｇＤＮＡのインビトロの増幅が、以下に挙げられるオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて行われた。以下の配列では、太字の塩基は標的配列とハイブリダイズし、下線部の塩基は開始鋳型に対してミスマッチであるＵＳＩ（Ｇ１２Ｓインサートｉ２およびｒｃＧ１２Ｖインサートｉ１）であり、太字およびイタリック体の塩基はバリアント塩基であり、太字かつ下線部の塩基はＵＳＪであり、下線部かつイタリック体の塩基は両方の標的に対してミスマッチの追加の塩基を表す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０５９１】
【化５８】
2018075033.tif 000104
【化５９】
2018075033.tif 000105
【０５９２】
１７．４．  標的配列
Ａ５４９細胞株から抽出されたヒトｇＤＮＡは点変異Ｇ１２Ｓのインビトロ増幅に関する鋳型として使用され、ＳＷ４８０細胞株から抽出されたヒトｇＤＮＡは点変異Ｇ１２Ｖのインビトロ増幅に関する鋳型として使用された。細胞株ＩＭ９（野生型）、Ｃａｌｕ１（Ｇ１２Ｃ）、ＭＤＡ−ＭＢ２３１（Ｇ１３Ｄ）およびＳＷ４８０（Ｇ１２Ｖ）から抽出されたヒトｇＤＮＡは、ＫＲＡＳバリアントＧ１２Ｓに関するネガティブ対照鋳型として用いられ、細胞株ＩＭ９およびＣａｌｕ１から抽出されたヒトｇＤＮＡは、ＫＲＡＳバリアントＧ１２Ｖに関するネガティブ対照鋳型として使用された。
【０５９３】
１７．５．  反応成分：標的配列の増幅および検出
標的配列のリアルタイムの増幅および検出が２５μＬの総反応量で行われた。反応は、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）で行われた。サイクリングパラメータは、９５℃で２分、１０サイクルの９５℃で１５秒および６４℃で６０秒、５０サイクルの９５℃で１５秒、ならびに５４℃で５０秒（５４℃のステップでデータが採取された）。反応は２回行われて、４０ｎＭフォワードＰＡＳＳプライマー、１００ｎＭパートザイムＡ、２００ｎＭのリバースプライマーおよび２００ｎＭパートザイムＢ（組合せは表２８に挙げられる）を含んだ。全ての反応は、２００ｎＭ基質（Ｓｕｂ５５−ＦＩＢ）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ユニットのＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮａｓｅインヒビター（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｘＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２ユニットのＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含んだ。３５ｎｇのＡ５４９ｇＤＮＡ鋳型のいずれかが、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ標的に関するポジティブ対照として使用され、３５ｎｇのＳＷ４８０（Ｇ１２Ｖ）、ＩＭ９（ＷＴ）、Ｃａｌｕ１（Ｇ１２Ｃ）およびＭＤＡ−ＭＢ２３１（ＭＤＡ）（Ｇ１３Ｄ）がネガティブ対照として使用され、３５ｎｇのＳＷ４８０ｇＤＮＡ鋳型がＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ標的に関するポジティブ対照として使用され、ならびに３５ｎｇのＩＭ９（ＷＴ）がネガティブ対照および標的（ＮＦ  Ｈ２Ｏ）を含まない追加の対照として使用された。
【０５９４】
【表４５】
2018075033.tif 000106
【表４６】
2018075033.tif 000107
【０５９５】
１７．６．  結果：標的の増幅およびレポーター基質の切断
増幅および検出の結果は以下の表２９に要約される。
【０５９６】
【表４７】
2018075033.tif 000108
【表４８】
2018075033.tif 000109
【表４９】
2018075033.tif 000110
【表５０】
2018075033.tif 000111
【０５９７】
Ｃｔ値（表２９）は、標的ループまたはピンチ設計のいずれかを有するＰＡＳＳプライマーが標的遺伝子を全て増幅させ得るということを示す。Ｇ１２Ｓ平坦／１０設計が、ＰＡＳＳプライマーに結合しない標的の配列の長さが２０（ループ／２０）から４０（ループ／４０）、およびその後６０（ループ／６０）まで増加した標的ループ設計と比較された場合、Ｃｔ値は、それぞれ３．０、６．２および７．１まで増加した。また、特異性は、標的ループを含まない、平坦／１０を有する標的ループのサイズにより影響を受け、野生型からのオフターゲットシグナルに関して最も特異的であったが、ループ／２０およびループ／４０は他のバリアント配列からのオフターゲットシグナルに関するより高い特異性を示した。このことは、プライマーにハイブリダイズしない標的の長い配列ストレッチの存在に関わらず、プライマーが標的に対して結合して標的から伸長し得るということ、およびこのことが分析の特異性をさらに向上させ得るということを示す。
【０５９８】
ピンチＰＡＳＳプライマーがＧ１２Ｓ（ピンチ／１０）に関する１０塩基のＳ１およびＳ２間の標識において非結合非相補的配列と使用された場合、ピンチ／１０により効率的なプライミングを示すオリジナルの平坦ＰＡＳＳプライマーと比較されたとき、Ｃｔは０．７まで増加した（表２９）。しかしながら、特異性は、ネガティブ対照のいずれかに関する明確なシグナルを有しないピンチＰＡＳＳプライマーに関して優れていた。このことは、プライマーにハイブリダイズしない標的の長い配列ストレッチの存在に関わらず、ピンチＰＡＳＳプライマーが標的に対して結合して標的から伸長し得るということ、およびこのことが反応の特異性を向上させるかもしれないということを実証する。
【０５９９】
Ｇ１２Ｖループ／１ＰＡＳＳプライマー設計が、Ｓ１およびＳ２間の標的ループＰＡＳＳプライマーに結合しない標的の配列の長さが２０（ループ／２０）から４０（ループ／４０）、６０（ループ／６０）、１００（ループ／１００）およびその後２００（ループ／２００）まで増加したループ標的設計と比較された場合、Ｃｔ値は、それぞれ３．０、７．５、１３、１４．４、および１８．２まで増加した（表２９）。また、特異性は、ループ／２０、ループ／４０、およびループ／６０に由来する最も特異的な反応を有する標的ループのサイズにより影響を受けた。しかしながら、ループ／２０と比較すると、Ｃｔのポジティブ反応はループ／４０およびループ／６０に関して増加した。ループが１００または２００ｂｐ（ループ／１００またはループ／２００）であった場合、Ｃｔが大きく増加したため特異性の利点は失われた。このことは、プライマーにハイブリダイズしない標的の長い配列ストレッチの存在に関わらず、プライマーが標的に対して結合して標的から伸長し得るということ、およびこのことが分析の特異性をさらに向上させ得るということを示す。
【０６００】
ピンチＰＡＳＳプライマーＧ１２Ｖ（ピンチ／１０）（１０塩基のＳ１およびＳ２間の非結合配列を有しない）が使用された場合、ピンチ／１０により効率的なプライミングを示すオリジナルのループＰＡＳＳプライマー（ループ／１）と比較されたとき、Ｃｔは０．８まで増加した（表２９）。また、特異性は比較可能であった。１００ｂｐのＳ１およびＳ２間の非結合配列を有するピンチＰＡＳＳプライマーが使用された場合、特異性のよいレベルを維持しながら、ループ／１と比較したときに、Ｃｔは１４．１まで増加した（表２９）。このことは、プライマーにハイブリダイズしない標的の長い配列ストレッチの存在に関わらず、ピンチＰＡＳＳプライマーが標的に対して結合して標的から伸長し得るということ、およびこのことが反応の特異性をさらに向上させるかもしれないということを実証する。
【０６０１】
本実施例は、標的における配列にわたって「ジャンプ」し得るＰＡＳＳプライマーを使用することが実行可能であるということを実証する。さらに、ＵＳＪまたはＵＳＩを含むかどうかのＰＡＳＳプライマーのタイプは、バリアント配列が区別されようとする場合に最も特異的な分析を決定するためにスクリーニングされ得る。
【０６０２】
実施例１８：配列における単一の塩基の変更を検出するためのアレル特異的ＭＮＡザイム、一般的なＭＮＡザイムまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）のいずれかとともに組み合わされる、ゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）増強ＡＲＭＳ（ＷＥ−ＡＲＭＳ）プライマーに対するＰＡＳＳプライマーの感受性の比較
本実施例では、Ｇ１２Ｖとして言及されるコドン１２におけるＫＲＡＳ点変異が野生型ＫＲＡＳ鋳型のバックグラウンドにおけるＧ１２Ｖ鋳型の段階希釈を用いて分析される。野生型のバックグラウンドにおいてＧ１２Ｖの１を１０で、１００を１０００で希釈したものが試験された。
【０６０３】
設計３（図７）平坦ＰＡＳＳプライマーがＧ１２Ｖ配列の増幅に関して使用される。これがＧ１２Ｖ  ＷＥ−ＡＲＭＳプライマーと比較された。ＰＡＳＳプライマーが、アレル特異的ＭＮＡザイムｑＰＣＲリードアウト、一般的なＭＮＡザイムｑＰＣＲのリードアウトまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブのリードアウトと組み合わされた。アレル特異的システムにおいて、ＭＮＡザイム結合領域は、プライマー結合領域（ＰＡＳＳまたはＷＥ−ＡＲＭＳプライマー）と重複し；他方では、一般的なシステムにおいて、ＭＮＡザイムまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、ＰＡＳＳまたはＷＥ−ＡＲＭＳプライマー関する配列に対して重複しない、単位複製配列に対して内部に配置された。ＰＡＳＳ分析において、アレル特異的ＭＮＡザイムは、ユニーク配列（ｃＵＳ）の相補鎖に結合する第１パートザイム、ならびに、ＰＡＳＳプライマーにより導入されるバリアント（変異体）塩基およびミスマッチ塩基の相補鎖を含む増幅された標的配列を含む。第２パートザイムは、増幅された関心標的配列内の第１パートザイムに隣接して結合する。一般的なＭＮＡザイムおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブはともにバリアント（変異体）塩基の下流の配列に結合し、これらの分析は、野生型および変異体配列間の識別に関するあらゆる固有のメカニズムを提供しないため、変異に関する特異性を付与するプライマーのみに依存する。ＷＥ−ＡＲＭＳプライマーは、ＭＮＡザイムと、アレル特異的ＭＮＡザイムｑＰＣＲのリードアウト、一般的なＭＮＡザイムｑＰＣＲのリードアウトまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブのいずれかと組み合わされた。これらのＷＥ−ＡＲＭＳプライマー分析において、アレル特異的ＭＮＡザイムは、ＷＥ−ＡＲＭＳプライマーにより導入されるバリアント（変異体）塩基およびミスマッチ塩基の相補鎖を含む、増幅された標的配列に結合する第１パートザイムを含む。第２パートザイムは、増幅された関心標的配列内で、第１パートザイムに隣接して結合する。一般的なＭＮＡザイムおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブはともにバリアント（変異体）塩基の下流の配列に結合し、野生型および変異体配列間の識別に関するあらゆる追加のメカニズムを依然として提供しない。
【０６０４】
ＰＡＳＳプライマーは、各増幅および検出ストラテジーの効率性、直線性および感受性を研究するために、ＷＥ−ＡＲＭＳプライマーと比較された。
【０６０５】
１８．１．  パートザイムオリゴヌクレオチド
アレル特異的ＭＮＡザイムは、Ｇ１２Ｖ配列、およびプライマーを介して導入されるあらゆるミスマッチを特異的に標的とするパートザイム、ならびに、ＰＡＳＳプライマーの場合にはｃＵＳインサートとともに設計された。一般的なＭＮＡザイムは、バリアント塩基またはプライマーを介して導入されるあらゆる追加のミスマッチと結合しない、つまり、ＰＡＳＳプライマーの場合にはｃＵＳと結合しない、パートザイムとともに設計された。以下の配列において、太字の塩基は関心標的配列とハイブリダイズし、下線部の塩基は、開始鋳型に対してミスマッチであるＵＳインサート（ｉ２）である。太字かつイタリック体の塩基はバリアント（変異体）塩基を表し、下線部かつイタリック体の塩基は追加のミスマッチ塩基を表す。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０６０６】
【化６０】
2018075033.tif 000112
【０６０７】
１８．２．  レポーター基質
本実施例において、基質は、５’末端で６−ＦＡＭ部分により（以下の基質の名称で、「Ｆ」により示される）、および３’末端でアイオワブラック（登録商標）ＦＱクエンチャー部分により（以下の基質の名称で、「ＩＢ」により示される）末端標識された。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ励起波長範囲）間の励起により、５１０〜５３０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ発光波長範囲）の間でモニターされた。本実施例のレポーター基質は、配列５’から３’までを有して以下に示される。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
【０６０８】
【化６１】
2018075033.tif 000113
【０６０９】
１８．３．  ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、バリアント塩基にもしくはプライマーを介して導入されるあらゆるミスマッチに、または、ＰＡＳＳプライマーである場合にはｃＵＳと結合しないように設計された。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、５’末端で６−ＦＡＭ部分により（以下のプローブの名称で、「Ｆ」により示される）、および３’末端で副溝結合部分により（以下のプローブの名称で、「ＭＧＢ」により示される）末端標識された。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの切断は、４５０〜４９０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ励起波長範囲）間の励起により、５１０〜５３０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ発光波長範囲）の間でモニターされた。以下の配列において、太字の塩基は関心標的配列とハイブリダイズする。配列５’から３’まで記載される。
【０６１０】
【化６２】
2018075033.tif 000114
【０６１１】
１８．４．  ＫＲＡＳ  ＤＮＡの増幅に関するＰＣＲプライマー
ヒトｇＤＮＡのインビトロ増幅は、以下に挙げられるオリゴヌクレオチド  ＰＣＲプライマーを用いて行われた。以下の配列において、太字の塩基は関心標的配列とハイブリダイズし、下線部の塩基は、開始鋳型に対してミスマッチであるＵＳインサートｉ２であり、太字かつ下線部の塩基はバリアント塩基であり、イタリック体の塩基は両方の標的に対してミスマッチ（Ｍ）である追加の塩基を表す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０６１２】
【化６３】
2018075033.tif 000115
【０６１３】
１８．５．  標的配列
ＳＷ４８０細胞株から抽出されたヒトｇＤＮＡは、バリアント点変異Ｇ１２Ｖを含むＫＲＡＳ遺伝子のインビトロ増幅の鋳型として用いられた。検量線は、細胞株Ｋ５６２から抽出された、ＫＲＡＳ野生型ｇＤＮＡの一定のバックグラウンドにおけるＳＷ４８０を連続して連続的に希釈することにより作成された。
【０６１４】
１８．６．  反応成分：標的配列の増幅および定量化
標的配列のリアルタイム増幅および定量化が２５μＬの総反応量で行われた。反応は２回行われて、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）で行われた。サイクリングパラメータは、９５℃で２分、６０サイクルの９５℃で５秒および５４℃で２０秒（５４℃のステップでデータが採取された）。ＭＮＡザイム反応は、４０ｎＭフォワードＰＡＳＳプライマー、１００ｎＭパートザイムＡ、および２００ｎＭパートザイムＢ（組合せは表３０に挙げられる）、ならびに４００ｎＭのリバースプライマー（３ＫＲＡＳ）、２００ｎＭ基質（Ｓｕｂ５５−ＦＩＢ）および８ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含んだ。ＴａｑＭａｎ反応は、３００ｎＭフォワードプライマー、９００ｎＭのリバースプライマー（３ＫＲＡＳ）、２５０ｎＭ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（ＫＲＡＳ＿５−ＦＭＧＢ）および４ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含んだ。全ての反応は、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ユニットのＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮａｓｅインヒビター（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｘＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２ユニットのＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、およびＳＷ４８０ｇＤＮＡ鋳型（３５ｎｇ）、Ｋ５６２ｇＤＮＡ鋳型（３５ｎｇ）の一定のバックグラウンドで１を１０に、１を１００に、もしくは１を１０００に希釈したＳＷ４８０ｇＤＮＡ鋳型、Ｋ５６２ｇＤＮＡ鋳型（３５ｎｇ）、または標的なし（ＮＦ  Ｈ２Ｏ）のいずれかを含んだ。
【０６１５】
【表５１】
2018075033.tif 000116
【０６１６】
１８．７．  結果：標的の増幅およびレポーター基質の切断
ＰＡＳＳおよびＷＥ−ＡＲＭＳフォワードプライマーは、ＫＲＡＳ点変異（Ｇ１２Ｖ）のリアルタイム検出および定量化のために単位複製配列を産生するために使用された。ＭＮＡザイムは、アレル特異的となるようにいずれも設計され、よって、変異体配列を増幅するために使用される特異的なＰＡＳＳまたはＷＥ−ＡＲＭＳプライマーのいずれかの相補鎖の検出に関して適合させ；またはＭＮＡザイムは一般的であり、これによりＭＮＡザイムにハイブリダイズされた配列は標的ＫＲＡＳバリアントの増幅由来またはオフターゲット野生型由来で産生された全ての単位複製配列に存在した。また、同様に、全てのＫＲＡＳバリアントおよび野生型単位複製配列に存在する配列に結合するＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが設計された。これらの反応は、反応がＧ１２Ｖに特異的な標的配列を含む場合に、時間の経過とともに蛍光の増加を示した（図３１）。
【０６１７】
ＳＷ４８０  ＤＮＡ鋳型は、Ｇ１２Ｖに関して特異的であり、Ｇ１２を含むＫ５６２鋳型のバックグラウンドにおいて連続的に１０倍に希釈した。ＤＮＡの段階希釈液は、ＰＡＳＳまたはＷＥ−ＡＲＭＳフォワードプライマーのいずれかにより増幅され、アレル特異的ＭＮＡザイム、一般的なＭＮＡザイムまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブのいずれかによりリアルタイムで検出され、各希釈液のＣｔは表３１に示される。表に示されるＣｔ値は、２回の反応に関する結果の平均である。ΔＣｔ値は、等量のＤＮＡが存在した場合に、オフターゲット野生型対照単位複製配列と比較されるＫＲＡＳ変異体単位複製配列の検出に関して観察されるサイクルの数における差を示す。
【０６１８】
アレル特異的ＭＮＡザイムによる検出に関するＣｔ値は、一般的なＭＮＡザイムおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと比較してわずかに増加する（図３１）；しかしながら、この新規な設計は、反応に対してより高い特異性を提供した。アレル特異的ＭＮＡザイムによるＰＡＳＳプライマーの使用は、野生型ネガティブ対照から発生されるシグナルを有しない非常に特異的な反応をもたらした。また、アレル特異的ＭＮＡザイムをＷＥ−ＡＲＭＳプライマーと組合せることは、変異体および野生型間のΔＣｔを一般的なＭＮＡザイムおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに関するそれぞれ８．７および７．０に対して１６．９に増加させる反応の特異性を向上させた。
【０６１９】
一般的なＭＮＡザイムまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブのリードアウトを有するＷＥ−ＡＲＭＳプライマーに代えてＰＡＳＳプライマーを適用することは、ＷＥ−ＡＲＭＳプライマーと比較した場合に、増加したΔＣｔを有する、より高い特異性を示した（表３１）。さらに、ＰＡＳＳプライマーの使用は、野生型由来のＧ１２Ｖ配列の検出の限界を増加させた。ＷＥ−ＡＲＭＳプライマーを用いて、一般的なＭＮＡザイムは、１を１００にした変異体希釈と１．２のＣｔの差異を有するネガティブ対照（Ｋ５６２−野生型）間を明確に区別することはできなかった。対照的に、ＰＡＳＳプライマーは、１を１００にしたものを容易に検出でき、１を１０００に希釈したものとネガティブ対照間で１．６のＣｔの差異を有した。同様の利点が、ＴａｑＭａｎ（登録商標）リードアウトを有するＷＥ−ＡＲＭＳと比較して、ＰＡＳＳプライマーを用いる場合にもみられた。ＷＥ−ＡＲＭＳプライマーを用いるとき、ＴａｑＭａｎ（登録商標）リードアウトは、１を１００にしたものと０．２のＣｔの差異を有するネガティブ対照（Ｋ５６２−野生型）間を明確に区別することはできず；他方では、ＰＡＳＳプライマーは、１を１００にしたものを容易に検出でき、１を１０００にした試料とネガティブ対照間で０．６のＣｔの差異を有した。このことは、ＰＡＳＳプライマーの利点がＰＡＳＳプライマーの設計に固有のものであり、すぐれた結果はリードアウトに関して使用される方法に全く関連していないことを実証する（アレル特異的ＭＮＡザイム対一般的なＭＮＡザイム対ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）。本実験で実証されるように、ＰＡＳＳプライマーは、また、ＴａｑＭａｎ（登録商標）のような他のｑＰＣＲの化学作用と結びつけられる場合に利点を有する。さらに、ＰＡＳＳプライマーは、分子標識（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ）またはスコーピオンプローブ（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ）のような追加のｑＰＣＲの化学作用と組み合わされ得る。
【０６２０】
【表５２】
2018075033.tif 000117
【０６２１】
実施例１９：ＭＮＡザイムのリードアウトと組み合わされたＰＡＳＳプライマーにおける異なるユニーク配列（ＵＳ）の比較
本実施例では、１５の異なるユニーク配列（ＵＳ）が、ＣＣＢ遺伝子に関して特異的なＰＡＳＳプライマーに挿入された。ループまたは平坦構造のいずれかにおける、ＵＳインサートを含むＰＡＳＳプライマーは、ＵＳｉ１、ｉ１ａ、ｉ２、ｉ２ａ、ｉ２ｂ、ｉ３、ｉ４、ｉ５、ｉ５ａ、ｉ６、ｉ７、ｉ８、ｉ９、ｉ１０またはｉ１１を含んだ（表３２）。
【０６２２】
ＰＡＳＳプライマーは、ＭＮＡザイムｑＰＣＲと組み合わされ、これによりＭＮＡザイムは、ユニーク配列（ｃＵＳ）の相補鎖に結合する第１パートザイム、ならびに、ＣＣＢに適合される増幅された標的配列を含む。第２パートザイムは、増幅された関心標的配列上の第１パートザイムに隣接して結合する。
【０６２３】
ＰＡＳＳプライマーおよびパートザイムは、種々のユニーク配列が遺伝子の増幅および検出に適合するかどうかを測定するために、各ＵＳに関して設計された。
【０６２４】
【表５３】
2018075033.tif 000118
【０６２５】
１９．１．  パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムは、ＰＡＳＳプライマーを介して導入されるあらゆるｃＵＳに加えてＣＣＢ遺伝子を特異的に標的とするように設計された。以下の配列において、太字の塩基は関心標的配列とハイブリダイズし、下線部の塩基は、開始鋳型に対してミスマッチである、ユニーク配列のインサート（ｉ１、ｉ１ａ、ｉ２、ｉ２ａ、ｉ２ｂ、ｉ３、ｉ４、ｉ５、ｉ５ａ、ｉ６、ｉ７、ｉ８、ｉ９、ｉ１０またはｉ１１）である。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０６２６】
【化６４】
2018075033.tif 000119
【化６５】
2018075033.tif 000120
【０６２７】
１９．２．  レポーター基質
本実施例では、基質は、５’末端で６−ＦＡＭ部分により（以下の基質の名称で、「Ｆ」により示される）、および３’末端でアイオワブラック（登録商標）ＦＱクエンチャー部分により（以下の基質の名称で、「ＩＢ」により示される）末端標識された。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ励起波長範囲）間の励起により、５１０〜５３０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ発光波長範囲）の間でモニターされた。本実施例のレポーター基質は、配列５’から３’までを有して以下に示される。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
【０６２８】
【化６６】
2018075033.tif 000121
【０６２９】
１９．３．  ＣＣＢ  ＤＮＡの増幅に関するＰＣＲプライマー
ヒトｇＤＮＡにおけるＣＣＢ遺伝子のインビトロ増幅は、以下に挙げられるオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて行われた。ＰＡＳＳプライマーは、フォワードプライマーがＣＣＢに関して特異的であり、ＵＳインサート（ｉ１、ｉ１ａ、ｉ２、ｉ２ａ、ｉ２ｂ、ｉ３、ｉ４、ｉ５、ｉ５ａ、ｉ６、ｉ７、ｉ８、ｉ９、ｉ１０またはｉ１１）を含んだように設計される。以下の配列において、下線部の塩基は、開始鋳型に対してミスマッチであるユニーク配列のインサートである。Ｌはループ構造におけるＵＳを表し、Ｐは平坦構造におけるＵＳを表す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０６３０】
【化６７】
2018075033.tif 000122
【化６８】
2018075033.tif 000123
【化６９】
2018075033.tif 000124
【化７０】
2018075033.tif 000125
【０６３１】
１９．４．  標的配列
ＩＭ９細胞株から抽出されたヒトｇＤＮＡは、ＣＣＢ遺伝子のインビトロ増幅に関する鋳型として用いられた。
【０６３２】
１９．５．  反応成分：標的配列の増幅および検出
標的配列のリアルタイムの増幅および検出が２５μＬの総反応量で行われた。反応は、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）で行われた。サイクリングパラメータは、９５℃で２分、５サイクルの９５℃で１５秒および５５℃で３０秒、４０サイクルの９５℃で１５秒および５２℃で５０秒（５２℃のステップでデータが採取された）。全ての反応は、２回行われて、４０ｎＭフォワードプライマーおよび２００ｎＭのパートザイムＡ（表３３に要約される）、２００ｎＭのリバースプライマー（３ＣＣＢ）、２００ｎＭパートザイムＢ（ＣＣＢＢ／２−Ｐ）、２００ｎＭ基質（Ｓｕｂ２−ＦＩＢ）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ユニットのＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮａｓｅインヒビター（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｘＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２ユニットのＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、およびＩＭ９  ｇＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ）または標的なし（ＮＦ  Ｈ２Ｏ）のいずれかを含んだ。
【０６３３】
【表５４】
2018075033.tif 000126
【表５５】
2018075033.tif 000127
【０６３４】
１９．６．  結果：標的の増幅およびレポーター基質の切断
ＵＳ、ｉ１、ｉ１ａ、ｉ２、ｉ２ａ、ｉ２ｂ、ｉ３、ｉ４、ｉ５、ｉ５ａ、ｉ６、ｉ７、ｉ８、ｉ９、ｉ１０またはｉ１１を含むＣＣＢ  ＰＡＳＳプライマー（平坦およびループ）を含む反応において、５０ｎｇｇＤＮＡ（ＩＭ９）に関するＣｔ値は、上出来の増幅および検出を示した（表３４）。
【０６３５】
ループＰＡＳＳプライマー分析のＣｔは、２１．３から２２．９までの範囲のＣｔを有する、インサート配列ｉ１、ｉ１ａ、ｉ２、ｉ２ｂ、ｉ５、ｉ５ａ、ｉ６、ｉ７、ｉ８、ｉ１０およびｉ１１に関して、非常に少ない変量を示した（表３４）。他のループＰＡＳＳプライマーｉ２ａ、ｉ３、ｉ４、およびｉ９は、これらの反応条件下でこの標的と結合する場合、ユニーク配列が増幅の効率に影響を与えることを示している、２６．０から３０．９までの範囲のＣｔ（表３４（下線部））を有した。インサートｉ２ａ、ｉ３、またはｉ４に関するユニーク配列を含むループＰＡＳＳプライマーから生成される単位複製配列の二次構造の分析は、増幅効率に影響を与えるかもしれない強いヘアピンのポテンシャル構造を示した。
【０６３６】
平坦ＰＡＳＳプライマー分析のＣｔは、２１．２から２２．５までの範囲のＣｔを有する、インサート配列ｉ１、ｉ１ａ、ｉ２、ｉ２ｂ、ｉ４、ｉ５、ｉ５ａ、ｉ６、ｉ７、ｉ８、ｉ１０およびｉ１１に関して、非常に少ない変量を示した（表３４）。他の平坦ＰＡＳＳプライマーｉ２ａ、ｉ３、およびｉ９は、これらの反応条件下でこの標的と結合する場合、ユニーク配列が増幅の効率に影響を与えることを示している、２５．０から２９．０までの範囲のＣｔ（表３４（下線部））を有した。インサートｉ２ａおよびｉ３に関するユニーク配列を含む平坦ＰＡＳＳプライマーから生成される単位複製配列の二次構造の分析は、増幅効率に影響を与えるかもしれない強いヘアピンのポテンシャル構造を示した。
【０６３７】
全体では、１１（ループ）および１２（平坦）の１５のＵＳインサートが、ＣＣＢ配列の分析に適していた。しかしながら、実験は、種々の異なるユニークインサート配列は、同じ標的の増幅および検出のために使用され得、増幅効率が影響されると考えられる場合には、その後の他のインサート配列の試験はシグナルを向上させるかもしれないということを実証した。このＣＣＢ単位複製配列の構成内で十分に実行されないこれらのＵＳインサートは、他の遺伝子を標的とするＰＡＳＳシステムにおいて有用であるかもしれない。
【０６３８】
【表５６】
2018075033.tif 000128
【０６３９】
実施例２０：ＰＡＳＳプライマーにおける異なるユニーク配列のインサートの比較および配列における単一の塩基の変更を検出するＭＮＡザイムとの組合せ
ＰＡＳＳプライマーは、標的特異的３’末端（Ｓ２）がバリアント塩基およびミスマッチ塩基を含むように、単一の塩基により変化する２つの配列間で区別するために設計され得る（図２（ｉ）および（ｉｉ）下部）。さらに、ＵＳは、もう１つのレベルの選択的および特異性を加える各バリアントに関して異なり得る（図３）。
【０６４０】
本実施例では、１５の異なるユニーク配列が、ｒｃＧ１２として言及されるコドン１２におけるリバース相補鎖ＫＲＡＳ野生型配列に関してＰＡＳＳプライマー内に挿入された。ループまたは平坦構造のいずれかにおけるＵＳを含むＰＡＳＳプライマーは、Ｇ１２配列に関して特異的となるように設計され、ＵＳインサートｉ１、ｉ１ａ、ｉ２、ｉ２ａ、ｉ２ｂ、ｉ３、ｉ４、ｉ５、ｉ５ａ、ｉ６、ｉ７、ｉ８、ｉ９、ｉ１０またはｉ１１を含んだ（表３２）。
【０６４１】
ＰＡＳＳプライマーはＭＮＡザイムｑＰＣＲと組み合わされ、これによりＭＮＡザイムは、ユニーク配列（ｃＵＳ）の相補鎖と結合する第１パートザイム、ならびに、野生型配列およびミスマッチ塩基の相補鎖を含む増幅された標的配列を含む。第２パートザイムは、増幅された関心標的配列上の第１パートザイムに隣接して結合する。
【０６４２】
ＰＡＳＳプライマーおよびパートザイムは、種々のシナリオが、変異バリアントＧ１２ＳにわたってＫＲＡＳ野生型Ｇ１２に関する反応効率および特異性を向上させたかどうかを測定するために各ＵＳに関して設計された。
【０６４３】
２０．１．  パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムは、ＰＡＳＳプライマーを介して導入されるミスマッチおよびあらゆるｃＵＳインサートに加えて、ＫＲＡＳ遺伝子の野生型ｒｃＧ１２を特異的に標識とするように設計された。以下の配列において、太字の塩基は関心標的配列とハイブリダイズし、太字かつ下線部の塩基は、Ｇ１２Ｓ鋳型と比較される場合に異なる野生型バリアント塩基を表し、下線部かつイタリック体の塩基はミスマッチ塩基を表し、下線部の塩基は、開始鋳型に対してミスマッチであるユニーク配列インサート（ｉ１、ｉ１ａ、ｉ２、ｉ２ａ、ｉ２ｂ、ｉ３、ｉ４、ｉ５、ｉ５ａ、ｉ６、ｉ７、ｉ８、ｉ９、ｉ１０またはｉ１１）である。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０６４４】
【化７１】
2018075033.tif 000129
【化７２】
2018075033.tif 000130
【０６４５】
２０．２．  レポーター基質
本実施例では、基質は、５’末端で６−ＦＡＭ部分により（以下の基質の名称で、「Ｆ」により示される）、および３’末端でアイオワブラック（登録商標）ＦＱクエンチャー部分により（以下の基質の名称で、「ＩＢ」により示される）末端標識された。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ励起波長範囲）間の励起により、５１０〜５３０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ発光波長範囲）の間でモニターされた。本実施例のレポーター基質は、配列５’から３’までを有して以下に示される。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
【０６４６】
【化７３】
2018075033.tif 000131
【０６４７】
２０．３．  ＫＲＡＳ  ＤＮＡの増幅に関するＰＣＲプライマー
ヒトｇＤＮＡにおけるＫＲＡＳ遺伝子のインビトロ増幅は、以下に挙げられるオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて実行された。ＰＡＳＳプライマーは、フォワードプライマーが野生型に関して特異的となるように設計され、ＵＳインサート（ｉ１、ｉ１ａ、ｉ２、ｉ２ａ、ｉ２ｂ、ｉ３、ｉ４、ｉ５、ｉ５ａ、ｉ６、ｉ７、ｉ８、ｉ９、ｉ１０またはｉ１１）を含んだ。以下の配列において、下線部の塩基は、開始鋳型に対してミスマッチであるユニーク配列のインサートであり、太字の塩基は標的配列とハイブリダイズし、太字かつ下線部の塩基は、Ｇ１２Ｓ鋳型と比較される場合に異なる野生型バリアント塩基を表し、イタリック体の塩基は標的に対してミスマッチである塩基を表す。Ｌはループ構造におけるＵＳを表し、Ｐは平坦構造おけるＵＳを表す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０６４８】
【化７４】
2018075033.tif 000132
【化７５】
2018075033.tif 000133
【化７６】
2018075033.tif 000134
【化７７】
2018075033.tif 000135
【０６４９】
２０．４．  標的配列
ＩＭ９細胞株から抽出されたヒトｇＤＮＡは、野生型ＫＲＡＳ遺伝子のインビトロ増幅に関する鋳型として使用され、Ａ５４９細胞株から抽出されたヒトｇＤＮＡは、ホモ接合性点変異Ｇ１２Ｓを含むネガティブ対照としてとして使用された。
【０６５０】
２０．５．  反応成分：標的配列の増幅および検出
標的配列のリアルタイムの増幅および検出が２５μＬの総反応量で行われた。反応は、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）で行われた。サイクリングパラメータは、９５℃で２分、１０サイクルの９５℃で１５秒および６４℃で６０秒（１サイクルあたりマイナス１℃）、４０サイクルの９５℃で１５秒および５４℃で５０秒（５４℃でデータが採取された）。全ての反応は、２回行われて、４０ｎＭフォワードプライマーおよび１００ｎＭのパートザイムＡ（表３５に概要が述べられる）、２００ｎＭのリバースプライマー（３ｒｃＫＲＡＳ）、２００ｎＭパートザイムＢ（ｒｃＧ１２＿２Ｂ／５５−Ｐ）、２００ｎＭ基質（Ｓｕｂ５５−ＦＩＢ）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ユニットのＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮａｓｅインヒビター（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｘＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２ユニットのＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、および試験としてのＩＭ９  ｇＤＮＡ鋳型（３５ｎｇ）、ネガティブ対照としてのＡ５４９  ｇＤＮＡ鋳型（３５ｎｇ）、または標的なし（ＮＦ  Ｈ２Ｏ）のいずれかを含んだ。
【０６５１】
【表５７】
2018075033.tif 000136
【表５８】
2018075033.tif 000137
【０６５２】
２０．６．  結果：標的の増幅およびレポーター基質の切断
異なるＵＳインサートを含むＰＡＳＳプライマーは、ＫＲＡＳ野生型（Ｇ１２）のリアルタイム検出に関して単位複製配列を産生するために使用された。この反応は、使用された標的配列がＰＣＲを介して増幅された試験ヒトｇＤＮＡ（Ｋ５６２）である場合に、時間の経過とともに蛍光における増加を示した。鋳型なしの対照の蛍光は、ＤＮＡ標的含有反応におけるそれよりも低かった。このことは、標的含有反応で産生される蛍光の増加は、触媒作用的にアクティブなＭＮＡザイムの標的依存アッセンブリに起因し、その後レポーター基質を切断したということを実証する。
【０６５３】
ＵＳ、ｉ１、ｉ１ａ、ｉ２、ｉ２ａ、ｉ２ｂ、ｉ３、ｉ４、ｉ５、ｉ５ａ、ｉ６、ｉ７、ｉ８、ｉ９、ｉ１０またはｉ１１を含む、野生型Ｇ１２ＰＡＳＳプライマー（平坦およびループ）を含む反応においては、「試験」ＤＮＡ（Ｋ５６２）に関するＣｔ値は、Ｋ５６２における野生型ＫＲＡＳアレルの上出来の増幅および検出を示した。「ネガティブ対照」（Ｇ１２Ｓ）に関するシグナルは、バリアントアレルが使用される場合にいくらかのバックグラウンドシグナルが発生したということ、および野生型およびバリアントＧ１２Ｓ間のΔＣｔ値がＰＡＳＳプライマー内に挿入されるユニーク配列の組成により影響され得るということを示す、表３６に示されるようにＣｔ値が閾値に達した。
【０６５４】
試験試料に関するループＰＡＳＳプライマー分析のＣｔは、１８．６から２１．３までの範囲のＣｔを有する、非常に少ない変量を示したが、ネガティブ対照は、ＵＳが反応の特異性に影響を与え得たことを示す、２９．７から３７．３までの範囲のＣｔを有した（表３６）。ループＰＡＳＳプライマーに関し、試験とネガティブ対照間で算出された最も高いΔＣｔは、ＵＳｉ７が使用された場合に１８．５であり、ともにΔＣｔ＞１５であるＵＳｉ３およびｉ９がこれに続いた。他のＵＳインサートに関するΔＣｔは全て非常に類似していた。
【０６５５】
試験試料に関する平坦ＰＡＳＳプライマー分析のＣｔｓは、１７．９から２０．９までの範囲のＣｔを有する、非常に少ない変量を示したが、ネガティブ対照は、ＵＳが反応の特異性に影響を与え得たことを示す、２６．１から３３．９までの範囲のＣｔを有した（表３６）。平坦ＰＡＳＳプライマーに関し、試験とネガティブ対照間で算出された最も高いΔＣｔは、ＵＳｉ６が使用された場合に１１．８であった。他のＵＳインサートに関する他のΔＣｔの全ては、互いに２．３Ｃｔ内に入り、非常に類似していた。
【０６５６】
【表５９】
2018075033.tif 000138
【表６０】
2018075033.tif 000139
【表６１】
2018075033.tif 000140
【０６５７】
全体では、全ての１５のＵＳのものが野生型標的配列の分析に関して適切であった。得られたＣｔ値のより大きな範囲により明らかである、平坦ＰＡＳＳプライマー分析よりもループＰＡＳＳプライマー分析で観察されるわずかにより多くの変異性を有する結果において差異があった。しかしながら、実験は、種々の異なるユニークインサート配列が、同じ標的の増幅および検出に関して使用され得、ベストなＰＡＳＳプライマー／ＵＳインサートの組合せを見つけるためのスクリーニングが、反応の特異性を向上させるのに役立ち得る、ということを実証した。
【０６５８】
実施例２１：配列における単一の塩基の変更を検出するＭＮＡザイムとともに組合せられるリバースピンチＰＡＳＳプライマーとフォワードＰＡＳＳプライマーを組合せるものに対するＰＡＳＳプライマー反応の特異性の比較
ＵＳＩまたはＵＳＪのいずれかを含むＰＡＳＳプライマーの特異性は、Ｇ１２ＶおよびＧ１２Ｓとして言及されるＫＲＡＳのコドン１２における点変異を標的とする分析において研究された。本実施例は、バリアント株Ｇ１２ＶおよびＧ１２Ｓを検出するための、ならびに野生型および他のＫＲＡＳ  Ｇ１２／Ｇ１３バリアント由来のこれらを区別するための性能を研究する。
【０６５９】
本実施例では、リバース標準プライマーは、フォワードＰＡＳＳプライマーまたはフォワードピンチＰＡＳＳプライマー（Ｇ１２Ｓのみ）およびＭＮＡザイムリードアウトによる両方の組合せで、リバースピンチＰＡＳＳプライマーを使用することと比較された。リバースピンチＰＡＳＳプライマーの３’のＳ２領域は、標準リバースプライマーよりもパートザイムセンス領域の近くに結合し、標準リバースプライマーを有する１６０ｂｐと比較して１００ｂｐの単位複製配列をもたらす、標的配列由来の４３塩基をループアウトした。
【０６６０】
標準リバースプライマーを含む分析は、フォワードＰＡＳＳプライマーがリバースピンチＰＡＳＳプライマーと組み合われ得るかどうか、および追加のＰＡＳＳプライマーが、野生型および／または他のバリアント由来のバリアント配列を区別するための性能に対する反応の特異性に影響を与え得たか、を測定するために、蛍光リードアウトを行うｑＰＣＲにおいてフォワードＰＡＳＳプライマーおよびＭＮＡザイムの両方と組み合わされるリバースピンチＰＡＳＳプライマーを含むものと比較された。
【０６６１】
２１．１．  パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムは、ＰＡＳＳプライマーを介して導入される、バリアントＧ１２ＳもしくはＧ１２Ｖおよび／またはあらゆるｃＵＳに関するＫＲＡＳ遺伝子を特異的に標識するように設計された。以下の配列において、太字の塩基は関心標的配列とハイブリダイズし、太字かつ下線部の塩基は、ＵＳＪのいずれかの側の２つの塩基を表し、下線部の塩基はｃＵＳインサートとハイブリダイズし、および太字かつイタリック体の塩基はバリアント塩基（Ｇ１２ＳまたはＧ１２Ｖ）を表し、および下線部かつイタリック体の塩基は追加のミスマッチ塩基を表す。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０６６２】
【化７８】
2018075033.tif 000141
【０６６３】
２１．２．  レポーター基質
本実施例では、基質は、５’末端で６−ＦＡＭ部分により（以下の基質の名称で、「Ｆ」により示される）、および３’末端でアイオワブラック（登録商標）ＦＱクエンチャー部分により（以下の基質の名称で、「ＩＢ」により示される）末端標識された。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ励起波長範囲）間の励起により、５１０〜５３０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ発光波長範囲）の間でモニターされた。本実施例のレポーター基質は、配列５’から３’までを有して以下に示される。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
【０６６４】
【化７９】
2018075033.tif 000142
【０６６５】
２１．３．  ＫＲＡＳ  ＤＮＡの増幅に関するＰＣＲプライマー
ヒトｇＤＮＡのインビトロ増幅は、以下に挙げられるオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて行われた。以下の配列において、太字の塩基は標的配列とハイブリダイズし、下線部の塩基は、開始鋳型に対してミスマッチであるＵＳＩであり、太字かつイタリック体の塩基はバリアント塩基であり、太字かつ下線部の塩基はＵＳＪであり、下線部かつイタリック体の塩基は、両方の標的に対してミスマッチの追加の塩基を表す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０６６６】
【化８０】
2018075033.tif 000143
【０６６７】
２１．４．  標的配列
Ａ５４９細胞株から抽出されるヒトｇＤＮＡは、点変異Ｇ１２Ｓのインビトロ増幅に関する鋳型として使用され、ＳＷ４８０細胞株から抽出されるヒトｇＤＮＡは、点変異Ｇ１２Ｖのインビトロ増幅に関する鋳型として使用された。細胞株ＩＭ９（野生型）、およびＳＷ４８０（Ｇ１２Ｖ）から抽出されるヒトｇＤＮＡは、ＫＲＡＳバリアントＧ１２Ｓに関するネガティブ対照鋳型として使用され、細胞株ＩＭ９（野生型）およびＡ５４９（Ｇ１２Ｓ）から抽出されるヒトｇＤＮＡは、ＫＲＡＳバリアントＧ１２Ｖに関するネガティブ対照鋳型として使用された。
【０６６８】
２１．５．  反応成分：標的配列の増幅および検出
標的配列のリアルタイムの増幅および検出が２５μＬの総反応量で行われた。反応は、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）で行われた。サイクリングパラメータは、９５℃で２分、１０サイクルの９５℃で１５秒および６４℃で６０秒（１サイクルあたりマイナス１℃）、５０サイクルの９５℃で１５秒および５４℃で５０秒（５４℃のステップでデータが採取された）。全ての反応は、２回行われて、４０ｎＭフォワードプライマーおよび１００ｎＭのパートザイムＡ、および２００ｎＭのリバースプライマー（組合せは表３７に挙げられる）を含んだ。また、全ての反応は、２００ｎＭパートザイムＢ（ＫＲＡＳ＿Ｂ／５５−Ｐ）、２００ｎＭ基質（Ｓｕｂ５５−ＦＩＢ）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ユニットのＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮａｓｅインヒビター（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｘＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２ユニットのＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、およびＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ標的に関するポジティブ対照として使用される３５ｎｇのＡ５４９ｇＤＮＡ鋳型および３５ｎｇのＳＷ４８０（Ｇ１２Ｖ）およびネガティブ対照として使用されるＩＭ９（ＷＴ）、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ標的に関するポジティブ対照として３５ｎｇのＳＷ４８０ｇＤＮＡ鋳型が使用され、およびネガティブ対照として３５ｎｇのＩＭ９（ＷＴ）およびＡ５４９（Ｇ１２Ｓ）が使用され、および標的を含まない（ＮＦ  Ｈ２Ｏ）追加の対照、のいずれかを含んだ。
【０６６９】
【表６２】
2018075033.tif 000144
【０６７０】
２１．６．  結果：標的の増幅およびレポーター基質の切断
増幅および検出の結果は、以下の表３８に要約される。
【０６７１】
【表６３】
2018075033.tif 000145
【表６４】
2018075033.tif 000146
【０６７２】
Ｃｔ値（表３８）は、プライマーの全ての組合せが標的遺伝子を効率的に増幅し得ることを示す。標準リバースプライマーと組み合わされるＧ１２ＳフォワードＰＡＳＳプライマーがリバースピンチＰＡＳＳプライマーと組み合わされることと比較されたとき、ポジティブ試料のＣｔは両方に関して類似していたが、ネガティブ対照試料が試験されたとき、リバースピンチＰＡＳＳプライマーは、約５まで増加したΔＣｔを有するより高い特異性を実証した（表３８）。フォワードピンチＰＡＳＳプライマーを採用するＧ１２Ｓ分析は、標準リバースプライマーを使用した場合に、すぐれた増幅および特異性を実証した。リバースピンチＰＡＳＳプライマーとそれを組合せることは、類似のＣｔおよびΔＣｔのものを付与する効率的な増幅および高い特異性を実証した（表３８）。
【０６７３】
Ｇ１２ＶフォワードＰＡＳＳプライマーを標準リバースプライマーと組合せた場合を、リバースピンチＰＡＳＳプライマーと組合せた結果と比較したとき、ポジティブ試料のＣｔは両方に関して類似していたが、ネガティブ対照試料が試験されたとき、リバースピンチＰＡＳＳプライマーは、１１より大きく増加したΔＣｔを有するより高い特異性を実証した（表３８）。
【０６７４】
本実施例は、フォワードＰＡＳＳプライマーを、増幅効率に影響を与えないリバースＰＡＳＳプライマーと組合せることが実行可能であるということを実証する。さらに、フォワードＰＡＳＳプライマーをリバースＰＡＳＳプライマーと組合せることは、また、反応の特異性を改善するかもしれない。
【０６７５】
実施例２２：配列における単一の塩基の変更を検出するためのＭＮＡザイムと組み合わされる異なる位置におけるミスマッチ塩基を有するＰＡＳＳプライマーの感受性の比較
異なる位置で、種々のタイプのミスマッチ塩基を含むＰＡＳＳプライマーの特異性が、Ｇ１２Ｖとして言及されるＫＲＡＳのコドン１２における点変異を標的とする分析において研究された。実施例は、バリアント株Ｇ１２Ｖを検出するための、および野生型からそれを区別するための性能を研究した。
【０６７６】
設計３（図７）平坦およびループＰＡＳＳプライマーは、Ｇ１２Ｖ配列の増幅に関して用いられた。ミスマッチ塩基は、Ｓ２の３’末端からの位置２、３、または４に配置され、Ｃ：Ｃ、Ａ：Ｃ、Ａ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ａ：Ａ、またはＣ：Ａミスマッチのいずれかであった。ＰＡＳＳプライマーは、ＭＮＡザイムｑＰＣＲと組み合わされ、これにより、ＭＮＡザイムがユニーク配列（ｃＵＳ）の相補鎖、ならびに、バリアント（変異体）塩基およびミスマッチ塩基の相補鎖を含む増幅された標的配列に結合する第１パートザイムを含む。第２パートザイムは、増幅された関心標的配列内で第１パートザイムと隣接して結合する。
【０６７７】
異なるミスマッチの組合せを有するＰＡＳＳプライマーは、特異性の効果を研究するために比較された。
【０６７８】
２２．１．  パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムは、Ｇ１２Ｖ配列を特異的に標識するように設計され、あらゆるミスマッチおよびｃＵＳがＰＡＳＳプライマーを介して導入された。以下の配列において、太字の塩基は関心標的配列とハイブリダイズし、および下線部の塩基は、開始鋳型に対してミスマッチであるユニーク配列インサート（ｉ２）である。太字かつイタリック体の塩基はバリアント（変異体）塩基を表し、下線部かつイタリック体の塩基は追加のミスマッチ塩基を表す。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０６７９】
【化８１】
2018075033.tif 000147
【０６８０】
２２．２．  レポーター基質
本実施例において、基質は、５’末端で６−ＦＡＭ部分により（以下の基質の名称で、「Ｆ」により示される）、および３’末端でアイオワブラック（登録商標）ＦＱクエンチャー部分により（以下の基質の名称で、「ＩＢ」により示される）末端標識された。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ励起波長範囲）間の励起により、５１０〜５３０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ発光波長範囲）の間でモニターされた。本実施例のレポーター基質は、配列５’から３’までを有して以下に示される。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
【０６８１】
【化８２】
2018075033.tif 000148
【０６８２】
２２．３．  ＫＲＡＳ  ＤＮＡの増幅に関するＰＣＲプライマー
ヒトｇＤＮＡのインビトロ増幅は、以下に挙げられるオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いて実施された。以下の配列において、太字の塩基は標的配列とハイブリダイズし、下線部の塩基は、開始鋳型に対してミスマッチであるユニーク配列であり、太字かつイタリック体の塩基はバリアント塩基であり、およびイタリック体かつ下線部の塩基は両方の標的に対してミスマッチである追加の塩基を表す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０６８３】
【化８３】
2018075033.tif 000149
【化８４】
2018075033.tif 000150
【０６８４】
２２．４．  標的配列
ＳＷ４８０細胞株から抽出されたヒトｇＤＮＡは、点変異Ｇ１２Ｖのインビトロ増幅に関する鋳型として使用された。細胞株ＩＭ９（野生型）から抽出されたヒトｇＤＮＡは、ＫＲＡＳバリアントＧ１２Ｖに関するネガティブ対照鋳型として使用された。
【０６８５】
２２．５．  反応成分：標的配列の増幅および定量化
標的配列のリアルタイムの増幅および定量化が総反応量の２５μＬで行われた。反応は、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）で行われた。サイクリングパラメータは、９５℃で２分、１０サイクルの９５℃で５秒および６０℃で２０秒（１サイクルあたりマイナス０．６℃）、５０サイクルの９５℃で５秒および５４℃で２０秒（５４℃のステップでデータが採取された）であった。全ての反応は、２回行われて、４０ｎＭフォワードプライマーおよび１００ｎＭのパートザイムＡ（表３９に概要が示される）、２００ｎＭのリバースプライマー（３ＫＲＡＳ）、２００ｎＭパートザイムＢ（ＫＲＡＳ＿Ｂ／５５−Ｐ）、２００ｎＭ基質（Ｓｕｂ５５−ＦＩＢ）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ユニットのＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮａｓｅインヒビター（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｘＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２ユニットのＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、および試験鋳型としてのＳＷ４８０ｇＤＮＡ（３５ｎｇ）、ネガティブ対照鋳型としてのＫ５６２ｇＤＮＡ（３５ｎｇ）、または標的なし（ＮＦ  Ｈ２Ｏ）のいずれかを含んだ。
【０６８６】
【表６５】
2018075033.tif 000151
【０６８７】
２２．６．  結果：標的の増幅およびレポーター基質の切断
異なる位置で異なるミスマッチ塩基を含むＰＡＳＳプライマーは、ＫＲＡＳバリアントＧ１２Ｖのリアルタイム検出に関する単位複製配列を産生するために使用された。この反応は、使用された標的配列がＰＣＲを介して増幅された試験ヒトｇＤＮＡ（ＳＷ４８０）である場合に、時間の経過とともに蛍光における増加を示した。鋳型なし対照の蛍光は、ＤＮＡ標的含有反応におけるそれよりも低かった。このことは、標的含有反応で産生される蛍光の増加は、触媒作用的にアクティブなＭＮＡザイムの標的依存アッセンブリに起因し、その後レポーター基質を切断したということを実証する。
【０６８８】
位置３でミスマッチを有するＰＡＳＳプライマーを含む反応において、Ｃ：Ａミスマッチは、２４．２／２３．９のＣｔ（ループ／平坦）を有するＡ：Ａミスマッチと比較した試験反応に関し、より早い２２．７／２２．５のＣｔ（ループ／平坦）を生じた（表４０）。また、Ｃ：Ａミスマッチは、試験間のΔＣｔを有するＡ：ＡミスマッチおよびＡ：Ａミスマッチに関する１５．４／１４．２（ループ／平坦）対１２．６／１４．０（ループ／平坦）のネガティブ対照よりも特異的であった（表４０）。
【０６８９】
位置３にＧ：Ａミスマッチを有するＰＡＳＳプライマーは、試験と、ループおよび平坦設計の両方に関するネガティブΔＣｔを有するネガティブ対照鋳型とを区別することができなかった（表４０）。「Ｃ」または「Ａ」とは反対に、位置３で挿入される「Ｇ」を有することにより作成されるＰＡＳＳプライマー配列のさらなる分析は、Ｓ２の３’末端での最初の３塩基が、Ｓ２領域がバリアント鋳型において結合し得る野生型鋳型１塩基の３’に結合し得、この結合が、ＰＡＳＳプライマーがもはやバリアントに特異的でないほど十分に強く結合することを示した。このことは、ＰＡＳＳプライマーが設計されるたびに研究されるべき重要な特徴であり、あらゆる試験およびネガティブ対照鋳型で、選択されるミスマッチ塩基に起因して生じるかもしれない、考えられるあらゆるミスプライミングに関して確認すべき重要な特徴である。
【０６９０】
Ｓ２の３’末端からの位置２でミスマッチ塩基を含んだＰＡＳＳプライマーは、１５．０から＞２４．０までの範囲のΔＣｔのものを有する特異性の増加を実証した（表４０）。しかしながら、試験反応のＣｔ値もまた増加するため、位置２でのミスマッチの配置は、位置３よりも不安定である。位置２でのＣ：Ｃミスマッチは、３２．１／３１．７（ループ／平坦）へＣｔを増加させるＣ：Ａよりも不安定であり、また、位置３のミスマッチよりも実質的に１０Ｃｔ高くまで増加した（表４０）。Ａ：Ｃミスマッチは、位置３でのベストなミスマッチよりも３Ｃｔのみ高いループおよび平坦ＰＡＳＳプライマーの両方に関し、約２５までＣｔを増加させるのみで、より少ない不安定性となるようにみられた。位置２でのＡ：Ｃミスマッチを含むＰＡＳＳプライマーは、ループ構造におけるＵＳが、平坦に関する１５．０と比較して＞２４．３のΔＣｔを有する平坦構造におけるＵＳにわたって利点を示す設計のみであったことは留意すべきである（表４０）。
【０６９１】
位置４でのミスマッチを有するＰＡＳＳプライマーは、また、１３．１／１４．４（ループ／平坦）のΔＣｔを有する位置３のミスマッチを有することと比較して、すぐれた特異性を実証した（表４０）。
【０６９２】
本実施例は、ミスマッチ塩基が、ＰＡＳＳプライマーのＳ２領域における種々の位置に配置されてなお有効性を維持し得ること、およびミスマッチのタイプは考えられるあらゆるミスプライミングまたは二次構造を避けるために適合され得るということを実証する。
【０６９３】
【表６６】
2018075033.tif 000152
【０６９４】
実施例２３：モデルシステムにおける異なるプライマーおよびパートザイムＡ設計の組合せの使用の研究
本実施例では、ＴＦＲＣゲノムは、図１４に記載されるように、プライマーおよびパートザイムＡ設計の異なる組合せを試験するためにモデルシステムとして使用された。
【０６９５】
より具体的には、以下の、（ｉ）標準フォワードプライマーは、フォワードプライマーの下流に結合する標準ＭＮＡザイム（図１４（ｉＡ））もしくはフォワードプライマーの下流に結合するピンチＰＡＳＳパートザイムＡを含む、ＭＮＡザイム（図１４（ｉＢ））のいずれかと組み合わされ、（ｉｉ）標準フォワードプライマーは、フォワードプライマーと重複する領域において結合する標準ＭＮＡザイム（図１４（ｉｉＡ））もしくはフォワードプライマーと重複する領域において結合するピンチＰＡＳＳパートザイムＡを含むＭＮＡザイム（図１４（ｉｉＢ））のいずれかと組み合わされ、または、（ｉｉｉ）フォワードプライマーと重複する領域において結合する標準ＭＮＡザイム（図１４（ｉｉｉＡ））もしくはフォワードプライマーのタグを付けた部分と重複する領域において結合するタグをつけたピンチＰＡＳＳパートザイムＡを含むＭＮＡザイム（図１４（ｉｉｉＣ））のいずれかと組み合わされるタグを含むフォワードプライマー、のシナリオが試験された。
【０６９６】
フォワードプライマーとパートザイムＡのものとの異なる組合せが、ＴＦＲＣ遺伝子の増幅および検出に適合するかどうかを測定するために、リアルタイムでのリードアウトに関するＰＣＲ増幅と組み合わされた。
【０６９７】
２３．１．  パートザイムオリゴヌクレオチド
ａ）センサーアームが標的配列に対して完全におよび連続的に相補的である、完全にマッチする「標準」パートザイム、またはｂ）パートザイムＡが、単位複製配列の一部分がパートザイムのセンサーアームにおけるＵＳＪでループアウトするように、標的単位複製配列における非連続ストレッチの配列に対して相補的である、ピンチＰＡＳＳパートザイムのいずれかであるパートザイムが設計された。以下の配列において、太字の塩基は関心標的配列とハイブリダイズし、小文字の塩基はＵＳＪのいずれかの側の第１塩基を表し、および下線部の塩基は、タグをつけたフォワードプライマーにより単位複製配列内に挿入される相補的なタグ配列と結合する。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０６９８】
【化８５】
2018075033.tif 000153
【０６９９】
２３．２．  レポーター基質
本実施例において、基質は、５’末端で６−ＦＡＭ部分により（以下の基質の名称で、「Ｆ」により示される）、および３’末端でアイオワブラック（登録商標）ＦＱクエンチャー部分により（以下の基質の名称で、「ＩＢ」により示される）末端標識された。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ励起波長範囲）での励起および５１０〜５３０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ発光波長範囲）での発光により、リアルタイムでモニターされた。本実施例で使用されるレポーター基質は、配列５’から３’までを有して以下に示される。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
【０７００】
【化８６】
2018075033.tif 000154
【０７０１】
２３．３．  ＴＦＲＣの増幅に関する標的配列およびＰＣＲプライマー
本実施例に関する標的配列は、ＩＭ９細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ）から抽出されるヒトゲノムＤＮＡにおけるＴＦＲＣ遺伝子であった。オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーは以下に挙げられる。プライマー配列の５’末端における太字の配列は、標的遺伝子配列にみられない、タグ（Ｔ１、Ｔ２、またはＴ３）に対応する。Ｔ１およびＴ２は、遺伝子標的に対するプライマーの特異性に影響を及ぼさないプライマーのＴｍを増加させるために使用される。Ｔ３は、単位複製配列の５’末端にタグ配列のストレッチを導入するために使用されるより長いタグである。プライマー配列は、５’から３’まで挙げられる。
【０７０２】
【化８７】
2018075033.tif 000155
【０７０３】
２３．４．  反応成分：標的配列の増幅
標的配列のリアルタイムの増幅および検出が２５μＬの総反応量で行われた。反応は、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）で行われた。サイクリングパラメータは、９５℃で２分、５サイクルの９５℃で１５秒および５５℃で３０秒、５０サイクルの９５℃で１５秒および５２℃で６０秒（５２℃のステップでデータが採取された）。反応条件の各セットは２回試験されて、表４１に要約されるように、４０ｎＭフォワードプライマーおよび１００ｎＭのパートザイムＡ、２００ｎＭパートザイムＢ（ＴＦＲＣ＿２Ｂ／８４−Ｐ）、２００ｎＭのリバースプライマー（３ＴＦＲＣ＿２Ｔ２）、２００ｎＭ基質（Ｓｕｂ８４−ＦＩＢ）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ユニットのＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮａｓｅインヒビター（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｘＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２ユニットのＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、およびＩＭ９  ｇＤＮＡ（５０ｎｇまたは５０ｐｇ）または標的なし（ＮＦ  Ｈ２Ｏ）のいずれかを含んだ。
【０７０４】
【表６７】
2018075033.tif 000156
【０７０５】
２３．５．  結果：標的の増幅およびレポーター基質の切断
鋳型なし対照反応の最終的な蛍光は、ＤＮＡ標的含有反応におけるそれよりも低かった。このことは、標的含有反応において生じる蛍光の増加は、触媒作用的にアクティブなＭＮＡザイムの標的依存アッセンブリおよびその後のレポーター基質の切断に起因するということを実証する。
【０７０６】
標準パートザイムＡ（反応ｉＡ）の上流の標準プライマーを用いることは、５０ｎｇおよび５０ｐｇに関してそれぞれ１５．２＆２６のＣｔ値を有するＴＦＲＣ遺伝子の検出をもたらした（表４２）。
【０７０７】
【表６８】
2018075033.tif 000157
【０７０８】
ピンチＰＡＳＳパートザイムＡ（反応ｉＢ）の使用は、同様に、５０ｐｇの標的の効率的な検出により、ＴＦＲＣ遺伝子（表４２）を検出した。
【０７０９】
標準パートザイムＡ（反応ｉｉＡ）と重複する標準フォワードプライマーの使用は、５０ｎｇの鋳型に関して非常に遅いＣｔ値（２６．５）をもたらし、パートザイムの５’末端がプライマーの３’末端と重複する場合の結合に関する競合に起因して反応の効率を低減する、上流のプライマーの使用（表４２）と比較した場合、５０ｐｇの鋳型を検出しなかった。しかしながら、比較により、これと同じプライマーを用いる増幅後のピンチＰＡＳＳパートザイムＡ（反応ｉｉＢ）を用いる検出は、反応ｉｉＢの設計が結合の競合における低減に起因する利点を示す反応ｉｉＡに関し、より早いＣｔ値をもたらした。
【０７１０】
標準パートザイムＡ（反応ｉｉｉＡ）と重複するタグを付けた標準フォワードプライマーの使用は、重複する標準フォワードプライマー（反応ｉｉＡ）と比較してＣｔ値を改善した（表４２）。タグを付けたピンチＰＡＳＳパートザイムＡと組合せて使用される場合、反応は（ｉｉｉＣ）、標準パートザイムＡ（反応ｉＡ）を有する上流プライマーを用いる場合と同様に行われ、ピンチＰＡＳＳパートザイムＡ（反応ｉＢ）を有する上流プライマーを用いるときと同様に行われた（表４２）。
【０７１１】
全体では、ピンチＰＡＳＳパートザイムおよび重複するフォワードプライマーを含むＭＮＡザイムを使用する標的配列の検出は、フォワードプライマーおよびパートザイムＡに対する追加のタグ配列により向上され得た。これは、たとえば、相同の領域および可変の領域を有する２つの標的を増幅することが所望される場合に適用する。タグプライマーを有するピンチＰＡＳＳパートザイムは、標的の相同領域に結合するように設計され得、タグはピンチＰＡＳＳパートザイムが可変領域を「ジャンプ」するように使用される。本実施例は、図１４に示される全てのまたはあらゆる設計の使用の実行可能性を実証し、分析の具体的な適用は設計の選択に影響するかもしれない。
【０７１２】
実施例２４：アンチセンスＤＮＡザイムで構成されるＵＳインサートを含むＰＡＳＳプライマーの使用の研究
ＰＡＳＳプライマーは、標的配列に対して非相補的であり、ゆえにＰＣＲ中に単位複製配列に挿入されるときに結合するためのパートザイムに関するユニーク配列を提供する、ＵＳを含むことが示された。また、機能的配列を、ＤＮＡザイム、アプタマー、または集合促進因子のような単位複製配列に挿入するために、ＵＳを使用することが可能である。
【０７１３】
本実施例では、ＵＳのＰＡＳＳプライマーは、ＤＮＡザイムの不活性な、アンチセンス形態であるが標的配列に対して非相補的なままである配列で構成されるように設計された。ＰＣＲ中の増幅にあたり、アクティブな、センスＤＮＡザイムは、単位複製配列中に挿入され、リアルタイムでシグナルを産生する基質を切断し得る（図１５パネル（ｉｉ））。これは、標準ＰＡＳＳプライマーと比較され、これにより、ＵＳは機能を有さず、標的配列に対して非相補的であった（図１５パネル（ｉ））。ＰＡＳＳプライマーはともにＭＮＡザイムｑＰＣＲと組み合わされ、これにより、ＭＮＡザイムは、ユニーク配列の相補鎖（ｃＵＳ）ならびに増幅された標的配列に結合する第１パートザイムを含む。第２パートザイムは、増幅された関心標的配列上の第１パートザイムに隣接して結合する。アクティブなＭＮＡザイムは、その後、リアルタイムでモニターされ得るシグナルを産生する、基質１（Ｓｕｂ１）を切断する。第２基質２（Ｓｕｂ２）は、標準ＰＡＳＳパートザイムが使用される場合に、基質２が非切断を保持してシグナルを産生しないように両方の反応に追加された（図１５パネル（ｉ））。しかしながら、増幅時に、ＤＮＡザイムのアンチセンスを含むＰＡＳＳプライマーが使用される場合、アクティブなＤＮＡザイムが形成されて、リアルタイムでモニターされ得るシグナルを産生する基質２を切断し得る（図１５パネル（ｉｉ））。基質２は、２つのシグナルが区別され得るように基質１とは異なるフルオロフォアで標識され得、または、基質２は、シグナル産生を後押しし、おそらくＣｔ値を低減する、基質１と同じフルオロフォアで標識され得る。
【０７１４】
標準ＰＡＳＳプライマーおよび機能的ＰＡＳＳプライマーは、ＲＯＣＫ１遺伝子の増幅および検出に適合するかどうかを測定するために、比較され、リアルタイムでのリードアウトに関するＰＣＲ増幅と組み合わされた。さらに、追加の基質が、アクティブなＤＮＡザイムが単位複製配列内に挿入され得るかかどうかおよびシグナル強度上のその影響を測定するために、ｑＰＣＲミックスに追加された。
【０７１５】
２４．１．  パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムは、ＲＯＣＫ１遺伝子に加えてＰＡＳＳプライマーを介して導入されるあらゆるｃＵＳを特異的に標的とするように設計された。以下の配列において、太字の塩基は関心標的配列とハイブリダイズし、下線部の塩基はユニーク配列の相補鎖と結合する。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０７１６】
【化８８】
2018075033.tif 000158
【０７１７】
２４．２．  レポーター基質
本実施例では、Ｓｕｂ２およびＳｕｂ８４基質は、５’末端で６−ＦＡＭ部分により（以下の基質の名称で、「Ｆ」により示される）、および３’末端でアイオワブラック（登録商標）ＦＱクエンチャー部分により（以下の基質の名称で、「ＩＢ」により示される）末端標識された。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ励起波長範囲）間の励起により、５１０〜５３０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ発光波長範囲）の間でモニターされた。Ｓｕｂ８４基質は、５’末端でクエーサー（Ｑｕａｓａｒ）６７０部分（以下の基質の名称で、「Ｑ６」により示される）および３’末端でブラックホールクエンチャー（登録商標）２部分（以下の基質の名称で、「Ｂ２」により示される）により末端標識された。基質の切断は、６２０〜６５０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のクエーサー６７０励起波長範囲）間の励起により、６７５〜６９０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のクエーサー６７０発光波長範囲）の間でモニターされた。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。本実施例のレポーター基質は配列５’から３’までを有して以下に示される。
【０７１８】
【化８９】
2018075033.tif 000159
【０７１９】
２４．３．  ＴＦＲＣの増幅に関する標的配列およびＰＣＲプライマー
本実施例に関する標的配列は、ＩＭ９細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ）から抽出されるヒトゲノムＤＮＡにおけるＲＯＣＫ１遺伝子であった。以下の配列において、太字の塩基は関心標的配列とハイブリダイズし、下線部の塩基はユニーク配列であり、および下線部かつイタリック体の塩基は、アンチセンスＤＮＡザイムで構成されるユニーク配列である。オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーは以下に挙げられる。プライマー配列は、５’から３’まで挙げられる。
【０７２０】
【化９０】
2018075033.tif 000160
【０７２１】
２４．４．  反応成分：標的配列の増幅
標的配列のリアルタイムの増幅および検出が２５μＬの総反応量で行われた。反応は、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）で行われた。サイクリングパラメータは、９５℃で２分、１０サイクルの９５℃で１５秒および６１℃で６０秒（−１℃／サイクル）、４０サイクルの９５℃で１５秒および５２℃で５０秒（５２℃のステップでデータが採取された）。反応条件の各セットは２回試験されて、表４３に概要が示されるように、４０ｎＭフォワードプライマーおよび２００ｎＭの追加の基質を含んだ。全ての反応は、１００ｎＭのパートザイムＡ（ＲＯＣＫ１＿ｉ１３Ａ／２−Ｐ）、２００ｎＭパートザイムＢ（ＲＯＣＫ１＿Ｂ／２−Ｐ）、および２００ｎＭのリバースプライマー（３ＲＯＣＫ１）、２００ｎＭ基質（Ｓｕｂ２−ＦＩＢ）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ユニットのＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮａｓｅインヒビター（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｘＩｍｍｏＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２ユニットのＭｙＴａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、およびＩＭ９  ｇＤＮＡ（５０ｐｇ）または標的なし（ＮＦ  Ｈ２Ｏ）のいずれかを含んだ。
【０７２２】
【表６９】
2018075033.tif 000161
【０７２３】
２４．５．  結果：標的の増幅およびレポーター基質の切断
標準または機能的ＵＳのいずれかを含むＲＯＣＫ１  ＰＡＳＳプライマーを含む反応において、５０ｐｇ  ｇＤＮＡ（ＩＭ９）に関するＣｔ値は、上出来の増幅および検出を示した（表４４）。
【０７２４】
標準ＰＡＳＳプライマーを含む分析は、Ｓｕｂ２−ＦＩＢを切断するＭＮＡザイムにより、５０ｐｇに関して約２４のＣｔで、追加の基質、Ｓｕｂ８４がＦＡＭまたはクエーサー６７０（Ｑ６７０）で標識されているかどうかに関わらず、比較可能に実行した（表４４）。アクティブなＤＮＡザイムを単位複製配列に組み込む機能的なＰＡＳＳプライマーが使用された場合、Ｓｕｂ２−ＦＩＢのＭＮＡザイム切断およびＳｕｂ８４−Ｑ６７０のＤＮＡザイム切断はともに、約２５のＣｔを生じた（表４４）。基質のＭＮＡザイムとＤＮＡザイム切断の両方に関する単一のカーブを産み出す、ともにＦＡＭで標識されたＳｕｂ２およびＳｕｂ８４の使用は、約２３のＣｔをもたらした。
【０７２５】
このことは、ＤＮＡザイムが、ＭＮＡザイム反応の効率に影響を及ぼすことなく単位複製配列に挿入され得るということ、およびＭＮＡザイムとＤＮＡザイムシグナルを組合せることは、得られるＣｔ値を向上させ得るということを実証する。
【０７２６】
本実施例は、ＤＮＡザイムを単位複製配列内に組み込むためにＰＡＳＳプライマーを使用するが、ＰＡＳＳプライマーが、他の機能的配列を、アプタマー、パートザイム、または追加のＭＮＡザイム集合促進因子のような単位複製配列内に組み込むためにも使用されることは当業者にとって明らかである。
【０７２７】
【表７０】
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【０７２８】
実施例２５：シングルＰＡＳＳプライマーおよびシングルＭＮＡザイムを用いる複数のエンテロウイルスＲＮＡの検出
エンテロウイルス属は、密接に関連する６０以上の群であるが固有のウイルスである。あらゆるエンテロウイルスの存在を検出することが、髄膜炎に関する治療計画における重大なステップである。それ自体として、できるだけ多くのエンテロウイルスを効率的に検出可能なシンプルで安価な試験が非常に望まれる。ここで、全てのエンテロウイルスでみられる共通の配列に対するその５’末端（Ｓ１）および３’末端（Ｓ２）に結合するように設計される、ＰＡＳＳプライマーの使用を記載するが、Ｓ１およびＳ２間における追加のユニーク配列（ＵＳ）を通して各エンテロウイルスにおける６８ｂｐ可変領域をスキップする（図６および図１２（ｉｉ）に記載されるように）。ＰＡＳＳプライマーは、全ての既知のエンテロウイルスＲＮＡを増幅するように設計され、可変配列の代わりに単位複製配列にＵＳの相補鎖を導入するであろう。単一のＭＮＡザイムは、その後、ＵＳの相補鎖および共通の（保護された）エンテロウイルス配列を標的とすることにより、あらゆる増幅されたエンテロウイルス配列を検出するために使用される（図６および図１２（ｉｉ）に記載される）。
【０７２９】
本実施例では、エンテロウイルス７１およびポリオウイルス３の両方を増幅するために設計され、ｑＰＣＲにおけるＭＮＡザイム検出と組み合わされ、これにより、両方のウイルスが、エンテロウイルス７１およびポリオウイルス３の両方に関する増幅された共通の標的配列およびＵＳインサート（ｃＵＳ）の相補鎖と結合する第１パートザイムを含む同じＭＮＡザイムにより検出され得る、ＰＡＳＳプライマーの使用を実証する。第２パートザイムは、増幅された関心標的配列にハイブリダイズする第１パートザイムに隣接して結合する。これは、エンテロウイルス７１およびポリオウイルス３の両方を増幅するために設計され、ｑＰＣＲにおけるＭＮＡザイム検出と組み合わされ、これにより、各ウイルスが、各ウイルスを特異的に標的とする第１パートザイム、および両方に関して使用され得、かつ第１パートザイムに隣接して結合し、増幅された関心標的配列に対してハイブリダイズする第２パートザイムを含む固有のＭＮＡザイムを必要とする、標準プライマー設計の使用と比較された。
【０７３０】
２５．１．  パートザイムオリゴヌクレオチド
パートザイムは、（ｉ）エンテロウイルス７１ＲＮＡ、（ｉｉ）ポリオウイルス３ＲＮＡ、または（ｉｉｉ）全てのエンテロウイルスＲＮＡのいずれかを（ＰＡＳＳプライマーの使用を通じて、単位複製配列において、ＵＳに対する可変配列をスイッチすることにより）検出するために設計された。太字の塩基は、２つのウイルス標的に関して特異的な配列を示し、イタリック体の塩基は共通のエンテロウイルス配列を示し、下線部の塩基はＵＳを表す。「−Ｐ」は、オリゴヌクレオチドの３’リン酸化を示す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０７３１】
【化９１】
2018075033.tif 000163
【０７３２】
２５．２．  レポーター基質
本実施例では、基質は、５’末端で６−ＦＡＭ部分により（以下の基質の名称で、「Ｆ」により示される）、および３’末端でアイオワブラック（登録商標）ＦＱクエンチャー部分により（以下の基質の名称で、「ＩＢ」により示される）末端標識された。基質の切断は、４５０〜４９０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ励起波長範囲）間の励起により、５１０〜５３０ｎｍ（ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）上のＦＡＭ発光波長範囲）の間でモニターされた。本実施例のレポーター基質は、配列５’から３’までを有して以下に示される。小文字の塩基はＲＮＡを表し、大文字の塩基はＤＮＡを表す。
【０７３３】
【化９２】
2018075033.tif 000164
【０７３４】
２５．３．  エンテロウイルスＲＮＡに関するＰＣＲプライマー
標準およびＰＡＳＳプライマーが、全てのエンテロウイルスＲＮＡ種における共通の配列に結合するように設計された。以下の配列において、太字の塩基は、両方のエンテロウイルス種に共通な配列とハイブリダイズし、一方、下線部の塩基は、エンテロウイルスＲＮＡの可変領域に対してミスマッチであるユニーク配列を表す。イタリック体の塩基は、プライマーのＴｍを増加させるために追加される標的配列の一部ではない短いタグ配列（Ｔ１またはＴ２）を示す。全ての配列は、５’から３’まで記載される。
【０７３５】
【化９３】
2018075033.tif 000165
【０７３６】
２５．４．  鋳型
抽出されたエンテロウイルス７１ＲＮＡがＶｉｒｉｃｅｌｌから得られた。ポリオウイルス３ＲＮＡは、バクテリオファージでコートされたＲＮＡ（アーマードＲＮＡ（Ａｒｍｏｒｅｄ  ＲＮＡ））としてＡｓｕｒａｇｅｎから得られた。ポリオウイルス３ＲＮＡは、７５℃で３分間の加熱により、バクテリオファージから放出された。
【０７３７】
２５．５．  反応成分
標的配列の逆転写ならびにリアルタイムの増幅および検出は、２５μＬの総反応量で行われた。反応は、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）で行われた。サイクリングパラメータは、４８℃で２０分、９５℃で２分、５サイクルの９５℃で１５秒および５５℃で３０秒、４０サイクルの９５℃で１５秒および５４℃で６０秒（５４℃のステップでデータが採取された）。反応条件の各セットは２回試験されて、表４５に概要が示されるように、４０ｎＭフォワードプライマーおよび２００ｎＭのパートザイムＡ（ｉ）もしくは（ｉｉ）または１００ｎＭパートザイムＡ（ｉｉｉ）を含んだ。全ての反応は、２００ｎＭの基質（Ｓｕｂ５５−ＦＩＢ）、リバースプライマー（３Ｅｎｔ＿Ｔ２）およびパートザイムＢ（Ｅｎｔ＿Ｂ／５５−Ｐ）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰおよびＳｅｎｓｉＦＡＳＴ（商標）Ｐｒｏｂｅ  Ｎｏ−ＲＯＸ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｍｉｘを含む１ｘＳｅｎｓｉＦＡＳＴ（商標）Ｐｒｏｂｅ  Ｎｏ−ＲＯＸ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、ＲｉｂｏＳａｆｅ  ＲＮＡｓｅインヒビター、逆転写酵素（製造業者の指示により使用される）を含んだ。使用された鋳型は、エンテロウイルス７１（１０００および１００複製物）またはポリオウイルス３ＲＮＡ鋳型（１０００および１００複製物）または標的なしの対照（ＮＦ  Ｈ２Ｏ）のいずれかであった。
【０７３８】
【表７１】
2018075033.tif 000166
【０７３９】
２５．６．  結果：標的の増幅およびレポーター基質の切断
ＰＡＳＳプライマーは、非常に類似するＣｔ値で産生されるシグナルによりエンテロウイルス７１鋳型（反応（３ａ））およびポリオウイルス３鋳型（反応（３ｂ））を検出し、ＰＡＳＳプライマーが、同様の効率により複数のエンテロウイルス配列を検出することが可能であることを示す（表４６）。さらに、ＰＡＳＳシステムは、低い複製数（１００複製物）の存在下であっても（表４６）、それらの同等の標準プライマーに対して同様の効果を有する各ウイルスを検出し、パートザイムの組合せにマッチし（反応（１）＆（２））、ＰＡＳＳプライマーシステムが、システムに特異的に完全にマッチした種に対して、同様の感受性を有することを示した。
【０７４０】
【表７２】
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【０７４１】
実験は、ＰＡＳＳプライマーが、特異的におよび感度よく増幅するが、完全にマッチする標準プライマーに対して類似の効率を有する配列に関連するバリアントに対して使用され得るということを実証する。さらに、このＰＡＳＳプライマーは、ウイルスファミリーの異なる種間で変化する配列の大きな領域のループアウトを可能にした。本実施例では、ＰＡＳＳプライマーによりスキップされる領域は、実質的に７０塩基の長さであり、エンテロウイルス７１ＲＮＡおよびポリオウイルス３ＲＮＡ間で非常に可変的であった。
【０７４２】
本明細書の実施例で使用されるパートザイム／ＭＮＡザイムに関する附記
上記実施例に関するＭＮＡザイムは、相補的な塩基対合により標的配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる、第１および第２のパートザイム成分を含む。ＤＮＡポリメラーゼが、単位複製配列を生成するためにプライマーと合わせて使用される（たとえば、ＰＣＲ）、標的ポリヌクレオチド配列の複製物を産生することを含むアプリケーションにおいてこのようなＭＮＡザイムが使用されるとき、標的ポリヌクレオチドまたはその単位複製配列がハイブリダイズされる場合には、ＤＮＡポリメラーゼがパートザイムを伸長するのを防止するために、パートザイムの３’末端を修飾することが好ましい。このような伸長は、（ｉ）ＰＣＲプライマー由来の増幅および（ｉｉ）ＭＮＡザイムパートザイムを用いる検出から反応成分を分離する、増幅産生物を産生し得た。
【０７４３】
オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を防止するための多くの方法で修飾されることとしてもよい。上記実施例では、パートザイムは、ｑＰＣＲにおける使用のために３’がリン酸化されている。しかしながら、当業者は、他の修飾が使用され得るということを認識するであろう。たとえば、以下の修飾は、ＤＮＡポリメラーゼによるオリゴヌクレオチドの伸長を防止するために当該技術分野で使用された：オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドの３’リン酸化（ヌクレオチドのリボースまたは２−デオキシリボース糖の３’カーボンのリン酸化）；オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドとしての「ジデオキシ」ヌクレオチド（２’，３’ジデオキシヌクレオチド）の使用；オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドに対するＣ３−スペーサー（３’プロピル基）の追加；オリゴヌクレオチドにおける末端と最後から２番目のヌクレオチド間の３’３’結合の使用（「反転」末端ヌクレオチド）。当業者であれば、これらの方法のいずれもが、ＰＣＲのような増幅方法の間のパートザイムの伸長を防止するために使用され得ることを理解するであろう。さらに、当業者であれば、標的配列が増幅されなかったが直接ＭＮＡザイムにより検出されるとき、パートザイムの伸長のリスクがない場合には、その後、上記実施例において使用されるパートザイムのいずれもが、３’の修飾なしに使用され得ることも認識するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月31日(2018.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的ポリヌクレオチドの存在または不存在を決定する方法であって、
−オリゴヌクレオチドの５’末端で終止し、標的ポリヌクレオチドの鎖の第１部分に相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第１プライマー成分と、
オリゴヌクレオチドの３’末端で終止し、標的ポリヌクレオチドの鎖の第２部分に相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第２プライマー成分を含むプライマーオリゴヌクレオチドを準備すること、
−標的ポリヌクレオチドを含んでいる可能性のある試料を、第１プライマー成分と第２プライマー成分を標的ポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズさせるのに適当な条件下で、プライマーオリゴヌクレオチドと接触させることであって、そうすることで２本鎖デュプレックスが形成すること、
ここで前記デュプレックスの中間部の少なくとも１本の鎖が、中間部の対向鎖に少なくとも４つのヌクレオチドの配列と塩基対相補性を共有するヌクレオチド配列が存在しないので中間部の対向鎖とハイブリダイズしないままである少なくとも４つのヌクレオチドの配列を含み、
−試料を標的ポリヌクレオチド鎖を鋳型として用いることができるポリメラーゼ酵素と接触させることであって、デュプレックスのプライマーオリゴヌクレオチドを伸長させ、そうすることで第１と第２の末端成分の中間の内部成分を含む単位複製配列を生成すること、
ここで単位複製配列の第１末端成分が相補的塩基対合により標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１部分とハイブリダイズ可能であり、
単位複製配列の第２末端成分が相補的塩基対合により標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２部分とハイブリダイズ可能であり、
単位複製配列の第１および第２末端成分の標的ポリヌクレオチド鎖との前記ハイブリダイズにより、単位複製配列の内部成分は、標的ポリヌクレオチド鎖の第１および第２部分の間の内部成分と塩基対相補性を共有しない標的ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチドの中間配列に対向して位置し、
−前記第１の標的ポリヌクレオチド鎖の相補鎖である第２の標的ポリヌクレオチド鎖と塩基対相補性を共有する第２プライマーオリゴヌクレオチドを接触すること、
−第２の標的ポリヌクレオチド鎖を鋳型として用い、ポリメラーゼ酵素を用いて第２プライマーオリゴヌクレオチドを伸長させて第２単位複製配列を生成することおよび
−単位複製配列が生成したかどうかを検出することを含み、
ここで、単位複製配列の検出は、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示し、単位複製配列の検出失敗は、試料中の標的ポリヌクレオチドの不存在を示す、前記方法。
【請求項２】
前記単位複製配列が生成したかどうかを検出することは、単位複製配列の内部成分、または単位複製配列の内部成分に相補的なヌクレオチドの配列を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
相補的塩基対合による標的ポリヌクレオチド鎖との前記ハイブリダイズ時、第１プライマー成分の融解温度が第２プライマー成分の融解温度よりも高い、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
プライマーオリゴヌクレオチドが、第１プライマー成分と第２プライマー成分の間に位置する第３プライマー成分を含み、第３プライマー成分は
標的ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチドの前記中間配列と塩基対相補性を共有せず、
単位複製配列の内部成分中のヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列からなる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）第３プライマー成分とヌクレオチドの中間配列のヌクレオチド数が等しい、または
（ｉｉ）第３プライマー成分中のヌクレオチド数がヌクレオチドの前記中間配列のヌクレオチド数よりも多い、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第３プライマー成分中のヌクレオチド数がヌクレオチドの前記中間配列のヌクレオチド数よりも少ない、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の２以上の個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
第１プライマー成分と第２プライマー成分がそれぞれ、多型領域の上流に位置する標的ポリヌクレオチド鎖の成分と配列相補性を共有する第１プライマー成分と、多型領域の下流に位置する標的ポリヌクレオチド鎖の成分と配列相補性を共有する第２プライマー成分により、集団の複数のメンバーとハイブリダイズすることが可能であり、
多型領域は、第１プライマー成分と第２プライマー成分が標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするとき、プライマーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないままである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
標的ポリヌクレオチド鎖が一塩基多型（ＳＮＰ）および／または点変異を含み、
単位複製配列が
（ｉ）ＳＮＰに相補的なヌクレオチドおよび／または
（ｉｉ）点変異に相補的なヌクレオチドを含み、
第１または第２プライマー成分が上記（ｉ）および／または（ｉｉ）と相補的塩基対合によりハイブリダイズできる、請求項１から６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
第２プライマー成分が、
第２プライマー成分の３’末端、
第２プライマー成分の３’末端の１、２、３、４、５ヌクレオチドまたは５以上のヌクレオチド上流、
第２プライマー成分の３’末端であって、第２プライマー成分が、３’末端の２、３、４、５、６ヌクレオチドまたは６以上のヌクレオチド上流に位置する標的ポリヌクレオチドに非相補的なヌクレオチドも含む第２プライマー成分の３’末端、または
第２プライマー成分の３’末端の１、２、３、４、５ヌクレオチドまたは５以上のヌクレオチド上流であって、第２プライマー成分が、標的に非相補的なさらなるヌクレオチドも含み、前記さらなるヌクレオチドがＳＮＰまたは点変異に相補的な前記ヌクレオチドの３’または５’に位置する第２プライマー成分の３’末端の前記上流
に位置する、ＳＮＰに相補的なヌクレオチドまたは点変異に相補的なヌクレオチドを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の少なくとも２つの個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
多型領域が、多型領域が標的ポリヌクレオチドの前記集団の２以上の個体メンバー間で異なるように１または複数ヌクレオチドの欠失を含み、
第１プライマー成分または第２プライマー成分が、前記標的ポリヌクレオチド鎖中の多型領域に相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能であり、多型領域は集団メンバーの１サブセットのみの標的ポリヌクレオチド鎖中に存在する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記単位複製配列が生成したかどうかを検出することが、少なくとも２以上のパートザイム成分オリゴヌクレオチドを含む多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）の使用を含み、ここで少なくとも第１パートザイム成分と第２パートザイム成分が単位複製配列の存在下で自己集合して触媒活性ＭＮＡザイムを形成し、ここで第１および第２パートザイム成分は基質アーム部分、触媒コア部分およびセンサーアーム部分を含み、
自己集合時、第１および第２パートザイム成分のセンサーアーム部分がＭＮＡザイムのセンサーアームとして作用し、第１および第２パートザイム成分の基質アーム部分がＭＮＡザイムの基質アームとして作用し、第１および第２パートザイム成分の触媒コア部分がＭＮＡザイムの触媒コアとして作用し、
ＭＮＡザイムのセンサーアームが単位複製配列の一部または全部と相補的塩基対合によりハイブリダイズして第１と第２パートザイム成分を近くに維持するので第１と第２パートザイム成分はそれぞれの触媒コア部分と会合してＭＮＡザイムの触媒コアを形成し、触媒コアは少なくとも１つの基質を修飾可能であり、ＭＮＡザイムの基質アームが基質と結合してＭＮＡザイムの触媒コアが基質を修飾でき、そうすることで検出可能な効果が得られる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＮＡザイムの第１および／または第２センサーアームが、
単位複製配列中の内部成分もしくはその成分または
単位複製配列中の内部成分もしくはその成分に相補的なヌクレオチドの配列を含むかそれからなるヌクレオチドの配列に相補的または実質的に相補的である、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＮＡザイムの第１および／または第２センサーアームが、
標的ポリヌクレオチド鎖中に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）および／または点変異または
標的ポリヌクレオチド鎖中に存在するＳＮＰに相補的なヌクレオチドおよび／または点変異に相補的なヌクレオチド、に相補的なヌクレオチドを含む、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の２以上の個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
前記ＭＮＡザイムの第１および／または第２センサーアームが、
集団の所与のメンバーの多型領域もしくはその成分、または
集団の所与のメンバーの多型領域もしくはその成分に相補的なヌクレオチドの配列、
を含むかそれからなる単位複製配列中のヌクレオチド配列にさらに相補的である、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＭＮＡザイムのセンサーアームが、第１センサーアーム成分、第２センサーアーム成分および第３センサーアーム成分を含むかそれらからなり、
第１センサーアーム成分は相補的塩基対合により単位複製配列とハイブリダイズでき、
第２センサーアーム成分は相補的塩基対合により単位複製配列とハイブリダイズでき、
第３センサーアーム成分は第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置し、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分が単位複製配列とハイブリダイズするときに単位複製配列と相補的塩基対合によりハイブリダイズできない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の２以上の個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
前記準備することが、プライマーオリゴヌクレオチドの複数の形態を準備することを含み、プライマーオリゴヌクレオチドの異なる形態は、
多型領域の異なる形態または
多型領域の１または複数の型に隣接または実質的に隣接する標的ポリヌクレオチド鎖の一部分と塩基対相補性を共有し、
プライマーオリゴヌクレオチドと前記接触させることが、標的ポリヌクレオチド集団の１または複数のメンバーを含んでいる可能性がある試料をプライマーオリゴヌクレオチドの前記複数の形態とハイブリダイゼーションに適した条件下で接触させることを含み、
プライマーオリゴヌクレオチドの複数の形態がそれぞれ、第１プライマー成分と第２プライマー成分の間に位置し、標的ポリヌクレオチド鎖中のヌクレオチドの前記中間配列と塩基対相補性を共有しないヌクレオチドの配列からなる前記第３プライマー成分を含む、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出することが、第１センサーアーム成分、第２センサーアーム成分および第３センサーアーム成分を含むＭＮＡザイムを用いることを含み、
第１センサーアーム成分は単位複製配列の内部成分とハイブリダイズでき、
第２センサーアーム成分は単位複製配列の第２末端成分と相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第３センサーアーム成分は第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置し、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分が単位複製配列とハイブリダイズするときに前記多型領域または前記多型領域に相補的なヌクレオチドの配列と相補的塩基対合によりハイブリダイズできない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
多型領域を含む単位複製配列の複数の形態が、試料をポリメラーゼ酵素と前記接触させることにより生成され、単位複製配列の前記各複数の形態の多型領域が異なり、
センサーアームが、第１センサーアーム成分、第２センサーアーム成分および多型領域を含むかそれからなる単位複製配列中のヌクレオチドの配列に非相補的な第３センサーアーム成分を含み、
第１センサーアーム成分は、多型領域の上流の単位複製配列の前記形態のいずれかと相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第２センサーアーム成分は、多型領域の下流の単位複製配列の前記形態のいずれかと相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第３センサーアーム成分は第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置し、単位複製配列の前記形態のいずれかの前記多型領域と相補的塩基対合によりハイブリダイズできない、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
単位複製配列が生成したかどうかを前記検出することが、二本鎖ＤＮＡおよび／または単位複製配列の配列特異的なプローブに結合する色素により与えられるシグナルを測定することを含み、かつ前記検出することが、単位複製配列の集団の前記第１および第２メンバーの前記生成を融解曲線分析によりモニタリングすることを含んでいてもよい、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【外国語明細書】
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