(57)【要約】【課題】  ステムセルファクター作用を呈するポリフェノール誘導体を提供する。【解決手段】  ポリフェノール誘導体はポリフェノール１分子、アルギニンの２分子とエチルフェノール２分子から構成される両親媒性の低分子化合物であり、ステムセルファクター様リガントとして作用する。さらに、粉末化した場合、精製水と反応して水素ガスを発生させる。また、ＥＧＦとの併用により相乗的な作用が認められる。ポリフェノール誘導体は化粧料や神経治療剤として利用される。さらに、植物の生育を促進する植物活性化剤としても利用される。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）で示されるステムセルファクター作用を呈するポリフェノール誘導体。
【化１】
2018083768.tif 000005
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明はステムセルファクター作用を呈するポリフェノール誘導体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞及び組織の再生には幹細胞（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ステムセル）が関与しており、また、老化を防止する目的で幹細胞の活性化が研究されている。幹細胞は全身の組織に存在し組織の再生に関わっている。しかし、幹細胞は自己の増殖のために増殖因子であるステムセルファクターが必要となる。このステムセルファクターには臓器に特有に成分と共通した有効成分がある。
【０００３】
幹細胞にはステムセルファクター受容体が存在しており、ステムセルファクター受容体に結合した結果、細胞に増殖のシグナル伝達系が刺激されて最終的には遺伝子が増幅される。すなわち、幹細胞の増殖のためには最初にステムセルファクター受容体の活性化が不可欠である。
【０００４】
ステムセルファクターを活性化する手段としてステムセルファクター受容体の結合部位の感受性の増加であるハイパーセンシタイゼーションとステムセルファクター受容体の数的な増加であるアップレギュレーションの両面が考えられる。この両面の手段でステムセルファクターを活性化することができれば、幹細胞の増殖と再生に対して相乗的な効果が期待される。
【０００５】
ステムセルファクターに関する発明の例は少ない。たとえば、細胞の遺伝子マーキングならびに疾病の予防および治療のためのその使用に関する発明がある。そこでは、ステムセルファクター受容体について言及されているもののステムセルファクター受容体を活性化する発明ではない（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００２−５２９０８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
既存の物質によるステムセルファクター作用は軽度であり、産業上への利用が限定されるという課題があり、また、化学合成された物質では安全性に問題があり、利用が限られている。
【０００８】
そこで、副作用が弱く優れたステムセルファクター作用を呈する天然物が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は下記の式（１）で示されるステムセルファクター作用を呈するポリフェノール誘導体に関するものである。
【００１０】
【化１】
2018083768.tif 000002
【発明の効果】
【００１１】
この発明は、以上のように構成されているため、次のような効果を奏する。
【００１２】
請求項１に記載のポリフェノール誘導体はステムセルファクター作用に優れている。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、この発明を具体化した実施形態について詳細に説明する。
【００１４】
ステムセルファクター作用を呈するポリフェノール誘導体とは、下記の式（１）で示される構造からなるものである。
【００１５】
【化２】
2018083768.tif 000003
【００１６】
前記の式（１）のようにステムセルファクター作用を呈するポリフェノール誘導体はポリフェノールの１分子、アルギニンの２分子及びエチルフェノールの２分子から構成されている。これらの分子及びその結合はすべて自然界に存在する天然型であり、各分子間はエーテル結合またはエーテル結合を介して結合している。
【００１７】
このポリフェノール誘導体はポリフェノール、アルギニン及びエチルフェノールを原料として化学的なエステル合成やエーテル合成の工程により得ることができる。たとえば、ポリフェノール、アルギニン及びエチルフェノールは市販されている化成品を利用でき、常法により有機合成することができる。
【００１８】
しかし、その化学的な合成では原料の損失が多く、製造コストが高くなるため、産業への利用は限定される。ここで化学合成された純度の高いポリフェノール誘導体は定量及び定性分析の標準品を得るために用いられる。
【００１９】
このポリフェノール誘導体の構造を解析することは有効成分の特定ができる点から好ましい。また、製品や製剤に利用して販売する際の有効成分の含有量の指標として利用できることから好ましい。このポリフェノール誘導体は有機化学的な手法により合成され、標準品として構造解析に利用される。この構造はたとえばＮＭＲ分析装置（ブルカー製、４００ＭＨｚ）などにより解析される。
【００２０】
このポリフェノール誘導体の構造解析の一例として４００ＭＨｚのＮＭＲでは化学合成された高純度（純度９５％以上）の標準品は重水素化メタノール中Ｈ−ＮＭＲを測定することにより、ピークの位置は０．９０、０．９３、０．９６、１．０３、１．１３、１．１９、１．３０、１．３２、１．３７、１．３８、１．４４、１．４６、１．５０、１．５２、１．５３、１．５４、１．５９、１．６２、１．６３、１．６７、１．６８、１．７０、１．７４、１．７８、１．８１、１．８３、１．８５、１．９２、１．９４、２．０３、２．１１、２．４６、２．６１、２．８９、３．２１、３．２６、３．３９、３．８１、３．８３、３．９０、３．９２、３．９４、３．９７、４．０９、４．１３、４．２４、４．８５、５．３２、５．５１、５．５２、５．５６、６．０８、６．１４、６．３１、６．５０及び７．２８ｐｐｍに認められる。
【００２１】
さらに、Ｃ−ＮＭＲの解析結果、１０．５７、１２．９９、１３．４２、１４．４５、１４．８９、１７．２２、１７．２５、１７．４７、１７．７６、２８．１５、２８．５９、３０．０８、３１．０１、３１．０２、３３．９０、３３．９１、３４．８３、３５．３４、３９．５３、４０．８２、４１．３２、４２．０１、４２．３３、４２．４７、４４．４６、４４．８７、４４．９５、４４．９７、４６．４５、４６．８３、６５．８７、６６．０２、６６．６７、７０．２６、７１．２６、７２．８２、７２．８８、７４．７９、７５．５５、７６．２９、７７．７２、８１．３７、９９．９０、１２６．１８、１２７．７６、１２８．６２、１２９．６０、１３１．２９、１３３．５９、１３７．３１、１４１．２３、１４１．３６、１４７．３１、１５９．５４、１７２．０７、１７３．００及び１７５．３１ｐｐｍにピークが認められる。
【００２２】
さらに、このポリフェノール誘導体は高速液体クロマトグラフィーや質量分析装置で解析され、その構造が同定される。この構成成分であるポリフェノールは天然に存在している化合物であり、植物や微生物にも認められ、安全性も確認されている。
【００２３】
特に、藻類であるアファニゾメノン  フロス  アクエ（学名Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  Ｆｌｏｓ−Ａｑｕａｅ）、ユーグレナ、ヘマトコッカス藻、アオコ、マコモ、ユスラウメ、グレープフルーツや温州みかんなどのかんきつ類、蕎麦の実などにも含まれ、目的とするポリフェノール誘導体を製造するための原料としてこれらの藻類、果実や穀類を用いることは好ましい。
【００２４】
もともと、このポリフェノール自体には皮膚細胞の保護作用、抗炎症作用、抗腫瘍作用、脂肪燃焼作用、神経保護作用があるものの、体内への吸収、体内動態や薬力学的に十分ではなかった。そこで、より体内吸収が良く、効果の強い物質が望まれていた。
【００２５】
そこで、開発された新規のポリフェノール誘導体は体内吸収と効果の両面で優れ、その構造の特徴としてポリフェノールの４つある五員環の窒素元素の３つに水素が結合し、還元状態を呈して構造を安定化している。また、両端の五員環の水酸基は反応性が高く、エチルフェノール基とエーテル結合している。この結果、２つのエチルフェノール基が結合している。
【００２６】
このエチルフェノール基のベンゼン環の水素元素はすべてフリー体である。このエチルフェノール基の反応の高い官能基は維持されており、ベンゼン環は電子供与体としてこのポリフェノール誘導体を安定化している。
【００２７】
さらに、このポリフェノール誘導体の中央の五員環には内在する酪酸のカルボン酸が存在しており、そのカルボキシル基とアルギニンのアルファ位のアミノ基とエステル結合している。この結合は２分子ともに同一であり、２分子のアルギニンのグアニジン基はフリーのままである。
【００２８】
アルギニンのグアニジン基にはアミノ基が存在しており、このアミノ基は塩基、つまり、アルカリ性を呈する働きがある。さらに、このグアニジン基にはアミノ基は生体内の一酸化窒素合成酵素により分解されて一酸化窒素を放出する働きがある。
【００２９】
この一酸化窒素は極微量であり、活性酸素としての副作用はない。微量の一酸化窒素は血管平滑筋に作用して血管拡張作用を呈する。この反応は２分子のアルギニンにより生じ、その結果としてこのポリフェノール誘導体は血管拡張作用を呈し、末梢の血流の増加と血圧の低下をもたらすことは好ましい。
【００３０】
このポリフェノールとアルギニンとエチルフェノールの結合によりこのポリフェノール誘導体は安定的に、かつ、吸収率と反応性が高くなる。つまり、エチルフェノールのベンゼン環による疎水性とアルギニンによる塩基性が加わり、両親媒性を呈することにより体内への吸収が高まる。吸収率は構成されるポリフェノール単体と比較して約４倍に増加する。
【００３１】
このポリフェノール誘導体自体がステムセルファクター受容体のリガンドとしてステムセルファクター受容体の活性中心に働き、ステムセルファクター作用を呈する。
【００３２】
さらに、このポリフェノール誘導体はステムセルファクター作用を呈する。その働きはステムセルファクター受容体に直接作用してステムセルファクター受容体を活性化しステムセルファクターとの結合が増加する機序による。つまり、このポリフェノール誘導体はステムセルファクター受容体の活性中心近傍のリジン由来アミノ基とアスパラギン酸由来のカルボキシル基と反応して立体的な構造に変化を生じさせる。この立体構造の変化がステムセルファクターとの結合を増加させる。
【００３３】
すなわち、このポリフェノール誘導体はステムセルファクターのリガンドへの直接的な働きとステムセルファクター受容体の間接的活性化の２つの働きによりステムセルファクター作用を呈する。
【００３４】
このポリフェノール誘導体の構成成分であるアルギニンはＬ型の天然型であり、自然界に豊富に存在しており、その安全性は確認されている。また、エチルフェノールについても自然界にアミノ酸の成分として存在しており、その安全性は高い。
【００３５】
さらに、ステムセルファクター作用としてステムセルファクターそのものの他にＥＧＦ（上皮由来成長因子）、ＩＬ−３（インターロイキン−３）、ＩＧＦ−１（インスリン様成長因子−１）の働きを増強することは好ましい。特に、ポリフェノール誘導体はＥＧＦと相乗作用を示す。また、ポリフェノール誘導体は粉末化した場合、水溶性溶媒と反応して水素ガスを発生させる。水素ガスはヒドロキシラジカルなどの活性酸素を消去することから細胞機能の回復に優れていることから好ましい。
【００３６】
ステムセルファクター受容体は各臓器の幹細胞に存在しており、反応性は臓器に特異的であり、年齢、性別の他に遺伝子多型による差異も認められる。
【００３７】
しかし、このポリフェノール誘導体によるステムセルファクター作用は２つの異なるメカニズムにより発現するため、遺伝子多型や病的な状態などを含めたすべての状態とすべての組織に対して働くことが可能である。
【００３８】
特に、皮膚基底層の幹細胞及び神経細胞の幹細胞のステムセルファクター受容体に対してはこのポリフェノール誘導体の反応性は高いことは好ましい。したがって、このポリフェノール誘導体は皮膚や神経の増殖効果や皮膚疾患や神経疾患の治療効果及び予防効果に優れている。
【００３９】
ポリフェノール誘導体は植物活性化剤として利用される。このポリフェノール誘導体は塩基性と水溶性の性質を呈することから動物の細胞膜及び植物や酵母の細胞壁を通過し、細胞内に吸収されやすい。植物に対するステムセルファクターとしては植物ホルモンがある。
【００４０】
このポリフェノール誘導体はオーキシン、サイトカイニン、アブシシン酸、ジベレリンなどの反応性を高めて植物の生育を促進させることは好ましい。
【００４１】
このポリフェノール誘導体は植物活性化剤や植物生育剤として発芽、成長、開花、結実、収穫などの植物の全体的な成長を促進することから農業分野の発展と食糧の増産に寄与できる点は好ましい。特に、蘭やマツバランなどの貴重な花や盆栽などの生育に利用できることは好ましい。
【００４２】
ポリフェノール誘導体は微生物活性化剤として利用される。また、このポリフェノール誘導体は有用な微生物の成長を促進できる点では発酵工程の短縮化と合理化に利用できる。酒造、みそ、しょうゆ、納豆などの製造などの増産と製造期間の短縮に活用できる点は好ましい。
【００４３】
このポリフェノール誘導体は皮膚の角質細胞膜も通過しやすく、角質層のバリア機能を維持することは皮膚の健康や美容の点から好ましい。さらに、水素ガスを発生して抗炎症作用を発揮する点も好ましい。
【００４４】
また、このポリフェノール誘導体は水溶性と塩基性であり、水溶性の化粧水とクリームのいずれにも配合できる点は好ましい。
【００４５】
このポリフェノール誘導体は幹細胞の増殖、コラーゲンやエラスチン産生を促進することにより皮膚細胞機能を促進することは好ましい。さらに、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）との併用により相乗的な効果が得られることは好ましい。ＥＦＧとの併用により約５倍の皮膚幹細胞の増殖が得られる。
【００４６】
神経細胞においても幹細胞のステムセルファクター作用を呈して神経細胞の増殖を活性化する。神経細胞は認知症、アルツハイマー症などで活性酸素やアミロイドβたんぱく質による細胞機能を低下させるという弱点がある。そのため、このポリフェノール誘導体によるステムセルファクター作用により神経細胞の働きを回復させることは神経疾患の防御と回復の目的で好ましい。
【００４７】
また、神経終末からの神経伝達物質の放出を促進して神経伝達を高めることは好ましい。さらに、ＮＧＦとの併用により相乗的な効果が得られることは好ましい。ＮＦＧとの併用により約４倍の神経細胞の増殖が得られることはさらに好ましい。
【００４８】
運動神経細胞の神経末端からのアセチルコリンの放出を高めることにより筋肉の収縮を高めて神経と筋肉の活動性を増すことは好ましい。
【００４９】
このポリフェノール誘導体は心筋梗塞においては冠状動脈の梗塞や虚血状態でも心筋幹細胞のステムセルファクター受容体を活性化して心筋細胞を増殖させ、障害部位の再生を促進することは好ましい。
【００５０】
特に、梗塞部位の血管においてはこのポリフェノール誘導体はアルギニン側鎖による一酸化窒素の産生を介して血管新生を促進し、血流を改善し、血圧を低下させる。
【００５１】
また、このポリフェノール誘導体はアスリートや運動時、筋肉を増強したい場合、筋肉幹細胞のステムセルファクター作用を呈して骨格筋細胞を増殖させることにより筋肉組織を増強させることは好ましい。特に、肉離れや筋肉切断のような筋肉細胞の消失に対して筋肉細胞を再生させることは好ましい。
【００５２】
このポリフェノール誘導体は生体内では腎臓や肝臓のエステラーゼにより分解され、尿中に排泄される。分解されて構成成分である安全性の高いポリフェノール、アルギニン及びエチルフェノールに分解される。したがって、このポリフェノール誘導体は体内に蓄積されず、分解も生体内酵素で行われ、さらに、分解物も天然物であることから安全性が高い。
【００５３】
藻類であるアファニゾメノン  フロス  アクエ（学名Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  Ｆｌｏｓ−Ａｑｕａｅ）、ユスラウメの果実、グレープフルーツや温州みかんなどのかんきつ類、蕎麦の実などにも含まれ、目的とするポリフェノール誘導体を製造するための原料としてこれらの藻類、果実や穀類を用いることは好ましい。アファニゾメノン  フロス  アクエの場合、タンパク質とこのポリフェノール誘導体が結合していることからプロテアーゼ処理することは抽出の効率が高くなることから好ましい。
【００５４】
このポリフェノール誘導体を精製により上記の植物から抽出することは可能である。ただし、精製には大量の原料を必要としコストが高く、また、有機溶媒などを利用することから産業上への利用は制限される。
【００５５】
さらに、発酵法による製造も可能である。このポリフェノール誘導体の産生に適していることから好ましい。得られたポリフェノール誘導体を医薬品素材として利用する場合、目的とするポリフェノール誘導体を精製することは、目的とするポリフェノール誘導体の純度が高まり、不純物を除去できる点から好ましい。
【００５６】
医薬品としては注射剤または経口剤または塗布剤などの非経口剤として利用され、医薬部外品としては錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、石鹸、塗布剤、ゲル剤、歯磨き粉等に配合されて利用される。
【００５７】
経口剤としては錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、ドリンク剤等が挙げられる。前記の錠剤及びカプセル剤に混和される場合には、結合剤、賦形剤、膨化剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤等とともに用いることができる。前記の錠剤はシェラックまたは砂糖などで被覆することもできる。
【００５８】
また、前記のカプセル剤の場合には、上記の材料にさらに油脂等の液体担体を含有させることができる。前記のシロップ剤及びドリンク剤の場合には、甘味剤、防腐剤、色素香味剤等を添加することができる。
【００５９】
非経口剤としては、軟膏剤、クリーム剤、水剤等の外用剤の他に、注射剤が挙げられる。外用剤の基材としては、ワセリン、パラフィン、油脂類、ラノリン、マクロゴールド等が用いられ、通常の方法によって軟膏剤やクリーム剤等とすることができる。
【００６０】
注射剤には、液剤があり、その他、凍結乾燥剤がある。これは使用時、注射用蒸留水や生理食塩液等に無菌的に溶解して用いられる。
【００６１】
また、食品製剤として皮膚の再生、神経の再生、筋肉の再生などの組織の再生を目的とした食品に利用できる。保健機能食品として栄養機能食品や特定保健用食品に利用することは好ましい。
【００６２】
得られた食品製剤をイヌやネコなどのペットや家畜動物に利用する場合、皮膚障害や神経障害の回復、老化の抑制と運動能力の向上を目的とした飼料やペット用サプリメントとして利用される。
【００６３】
化粧料として常法に従って界面活性化剤、溶剤、増粘剤、賦形剤等とともに用いることができる。例えば、クリーム、毛髪用ジェル、洗顔剤、美容液、化粧水等の形態とすることができる。
【００６４】
化粧料の形態は任意であり、溶液状、クリーム状、ペースト状、ゲル状、ジェル状、固形状または粉末状として用いることができる。
【００６５】
ここで製造された化粧料は障害された皮膚の修復やコラーゲンやエラスチンなどの増加及び肌の健康維持の目的で利用される。
【００６６】
また、このポリフェノール誘導体は老化により減少した歯肉細胞の増殖と機能の維持を目的とした歯磨き剤、洗口液や歯磨きペーストなどに利用できる。
【００６７】
このポリフェノール誘導体の製造方法としては、たとえば、アファニゾメノン  フロス  アクエをプロテアーゼ処理し、濾過した液を滅菌して製造することは好ましい。
【００６８】
アファニゾメノン  フロス  アクエはアメリカ大陸の奥深く清涼な水により育まれた湖沼に生息する藻類で、起源は太古であり、豊富な栄養素を含有している点から好ましい。また化粧品と食品の原料として使用されている実績があることは安全性の点から好ましい。
【００６９】
アファニゾメノン  フロス  アクエは株式会社ドクターズチョイスから購入することは可能である。また、プロテアーゼは食品加工用のものが利用できる。たとえば、アマノエンザイム製のプロテアーゼＮは食品加工用として実績が豊富で安全性も高いことから好ましい。
【００７０】
アファニゾメノン  フロス  アクエは清浄なタンクに入れられて精製水により分散される。これを３７〜４３℃に加温した後、プロテアーゼＮを添加して撹拌しながら３時間から６時間タンパク質を分解する。
【００７１】
精製水１０Ｌに対してアファニゾメノン  フロス  アクエの重量は３００ｇ〜１ｋｇ、プロテアーゼＮの添加重量は１０〜３０ｇが好ましい。
【００７２】
この反応後、ろ紙による濾過によりろ液を採取することは分解されていないアファニゾメノン  フロス  アクエの残渣を除去できる点から好ましい。さらに、このろ液を９５℃以上の温度で煮沸することはプロテアーゼの失活の目的と滅菌の目的から好ましい。
【００７３】
ろ液は純度を高くするために精製することは好ましい。例えば、分離用担体または樹脂により分離され、分取されることにより目的とするポリフェノール誘導体が得られる。分離用担体または樹脂としては、表面が後述のようにコーティングされた、多孔性の多糖類、酸化珪素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン−ビニルベンゼン共重合体等が用いられる。０．１〜３００μｍの粒度を有するものが好ましく、粒度が細かい程、精度の高い分離が行なわれるが、分離時間が長い欠点がある。
【００７４】
例えば、逆相担体または樹脂として表面が疎水性化合物でコーティングされたものは、疎水性の高い物質の分離に利用される。陽イオン物質でコーティングされたものは陰イオン性に荷電した物質の分離に適している。また、陰イオン物質でコーティングされたものは陽イオン性に荷電した物質の分離に適している。特異的な抗体をコーティングした場合には、特異的な物質のみを分離するアフィニティ担体または樹脂として利用される。
【００７５】
アフィニティ担体または樹脂は、抗原抗体反応を利用して抗原の特異的な調製に利用される。分配性担体または樹脂は、シリカゲル（メルク社製）等のように、物質と分離用溶媒の間の分配係数に差異がある場合、それらの物質の単離に利用される。
【００７６】
これらのうち、製造コストを低減することができる点から、吸着性担体または樹脂、分配性担体または樹脂、分子篩用担体または樹脂及びイオン交換担体または樹脂が好ましい。さらに、分離用溶媒に対して分配係数の差異が大きい点から、逆相担体または樹脂及び分配性担体または樹脂はより好ましい。
【００７７】
分離用溶媒として有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒に耐性を有する担体または樹脂が用いられる。また、医薬品製造または食品製造に利用される担体または樹脂は好ましい。
【００７８】
これらの点から吸着性担体としてダイヤイオン（三菱化学（株）社製）及びＸＡＤ−２またはＸＡＤ−４（ロームアンドハース社製）、分子篩用担体としてセファデックスＬＨ−２０（アマシャムファルマシア社製）、分配用担体としてシリカゲル、イオン交換担体としてＩＲＡ−４１０（ロームアンドハース社製）、逆相担体としてＤＭ１０２０Ｔ（富士シリシア社製）がより好ましい。
【００７９】
これらのうち、三菱化学製のダイヤイオンＨＰ２０、セファデックスＬＨ−２０及びＤＭ１０２０Ｔはさらに好ましい。
【００８０】
得られた抽出物は、分離前に分離用担体または樹脂を膨潤化させるための溶媒に溶解される。その量は、分離効率の点から抽出物の重量に対して２〜４０倍量が好ましく、４〜２０倍量がより好ましい。分離の温度としては物質の安定性の点から１０〜３０℃が好ましく、１２〜２５℃がより好ましい。
【００８１】
分離用溶媒には、水、または、水を含有する低級アルコール、親水性溶媒、親油性溶媒が用いられる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが用いられるが、食用として利用されているエタノールが好ましい。
【００８２】
セファデックスＬＨ−２０を用いる場合、分離用溶媒には低級アルコールが好ましい。シリカゲルを用いる場合、分離用溶媒にはクロロホルム、メタノール、酢酸またはそれらの混合液が好ましい。
【００８３】
ダイヤイオン及びＤＭ１０２０Ｔを用いる場合、分離用溶媒はメタノール、エタノール等の低級アルコールまたは低級アルコールと水の混合液が好ましい。
【００８４】
ポリフェノール誘導体を含む画分を採取して乾燥または真空乾燥により溶媒を除去し、目的とするポリフェノール誘導体を粉末または濃縮液として得ることは溶媒による影響を除外できることから好ましい。
【００８５】
一方、最終的な抽出を食用油や化粧料に用いる油脂で実施することも可能である。例えば、大豆油、米ぬか油、グレープシード油、オリーブ油、ホホバ油で抽出することが可能である。
【００８６】
また、このポリフェノール誘導体をスプレードライまたは凍結乾燥法により粉末化することは防腐と保存期間を長くする目的から好ましい。なお、これらの精製工程を繰り返して実施することは純度の高い精製物が得られる点から好ましい。
【００８７】
このように製造されたポリフェノール誘導体はＨＰＬＣやＮＭＲにより構造解析を行うことは高い品質のポリフェノール誘導体を提供できる点から好ましい。
【００８８】
以下、前記実施形態を実施例及び試験例を用いて具体的に説明する。なお、これらは一例であり、素材、原料や検体の違いに応じて常識の範囲内で条件を変更させることが可能である。
【実施例１】
【００８９】
原料となるアファニゾメノン  フロス  アクエを株式会社ドクターズチョイスから購入した。アファニゾメノン  フロス  アクエはアメリカ合衆国のクラマス湖原産であった。また、プロテアーゼＮをアマノエンザイム社より購入した。
【００９０】
清浄なステンレス製２０Ｌ容タンクに精製水を１０Ｌ添加した。ここにアファニゾメノン  フロス  アクエの５００ｇを添加してステンレス製撹拌棒により撹拌した。これを投げ込み式加温器（遠藤科学製）により４０〜４２℃に加温した。
【００９１】
ここにプロテアーゼＮの２０ｇを添加した。さらに、加温して撹拌しながら４時間反応させた。
【００９２】
この反応後、ろ紙（アドバンテックＮｏ．４）により濾過した。得られたろ液を採取して９５℃で１時間煮沸した。これを冷却して目的とするポリフェノール誘導体含有液とした。４．５ｋｇ得られ、これを検体１とした。この溶液を凍結乾燥により粉末化した。この粉末０．１ｇに水溶性溶媒１０ｍＬを添加したところ、１．６ｐｐｍの水素ガスが発生した。
【００９３】
さらに、精製物を得た。つまり、前述の検体１のポリフェノール誘導体の１００ｇに１０％エタノール含有精製水の２Ｌを添加し、ダイヤイオン（ＨＰ２０型、三菱化学製）５００ｇを５％エタノール液に懸濁して充填したガラス製カラム（遠藤科学製）に供した。
【００９４】
これに１０Ｌの５％エタノール液を添加して清浄し、さらに、２０％エタノール液を１Ｌ添加して洗浄した。また、６０％エタノール液を１Ｌ添加して目的とするポリフェノール誘導体を溶出させ、この溶出液を濃縮した。この精製工程を３回繰り返した。精製されたポリフェノール誘導体を減圧蒸留により、エタノール部分を除去し、水溶液とした。これを真空乾燥させ、ポリフェノール誘導体の精製物３ｇを得た。これを検体２とした。
【００９５】
以下に、ポリフェノール誘導体の構造解析に関する試験方法及び結果について説明する。
（試験例１）
【００９６】
上記のように得られた検体２をエタノールに溶解し、質量分析器付き高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、島津製作所）で分析した。
【００９７】
さらに、これを核磁気共鳴装置（４００ＭＨｚ、ブルカー製）で解析した結果、検体１と検体２から目的とするポリフェノール誘導体が同定できた。
【００９８】
すなわち、検体２を重水素化メタノール中Ｈ−ＮＭＲを測定した結果、ピークの位置は０．９０、０．９３、０．９６、１．０３、１．１３、１．１９、１．３０、１．３２、１．３７、１．３８、１．４４、１．４６、１．５０、１．５２、１．５３、１．５４、１．５９、１．６２、１．６３、１．６７、１．６８、１．７０、１．７４、１．７８、１．８１、１．８３、１．８５、１．９２、１．９４、２．０３、２．１１、２．４６、２．６１、２．８９、３．２１、３．２６、３．３９、３．８１、３．８３、３．９０、３．９２、３．９４、３．９７、４．０９、４．１３、４．２４、４．８５、５．３２、５．５１、５．５２、５．５６、６．０８、６．１４、６．３１、６．５０及び７．２８ｐｐｍに認められた。
【００９９】
さらに、検体２のＣ−ＮＭＲの解析により１０．５７、１２．９９、１３．４２、１４．４５、１４．８９、１７．２２、１７．２５、１７．４７、１７．７６、２８．１５、２８．５９、３０．０８、３１．０１、３１．０２、３３．９０、３３．９１、３４．８３、３５．３４、３９．５３、４０．８２、４１．３２、４２．０１、４２．３３、４２．４７、４４．４６、４４．８７、４４．９５、４４．９７、４６．４５、４６．８３、６５．８７、６６．０２、６６．６７、７０．２６、７１．２６、７２．８２、７２．８８、７４．７９、７５．５５、７６．２９、７７．７２、８１．３７、９９．９０、１２６．１８、１２７．７６、１２８．６２、１２９．６０、１３１．２９、１３３．５９、１３７．３１、１４１．２３、１４１．３６、１４７．３１、１５９．５４、１７２．０７、１７３．００及び１７５．３１ｐｐｍにピークが認められた。
【０１００】
以下に、１３Ｃ−ＮＭＲの解析結果のチャートを示した。（横軸単位はｐｐｍ、縦軸単位はピーク強度を示す。）
2018083768.tif 000004
【０１０１】
上記の解析結果から化学的に合成した標準品と同一構造を呈することが判明した。すなわち、検体２からポリフェノール１分子、アルギニンの２分子、エチルフェノールの２分子が結合した目的とするポリフェノール誘導体であると確認できた。また、ＨＰＬＣによる解析の結果、ピークは１本のみであり、純度は９９．２％であった。なお、検体１の中のポリフェノール誘導体の純度は６９．９％であった。
【０１０２】
以下にヒト皮膚表皮幹細胞を用いたステムセルファクター作用試験について述べる。なお、この試験方法は生化学的に成分の効果を検証できる再現性のある常法である。
（試験例２）
【０１０３】
クラボウより購入したヒト由来表皮幹細胞（表皮由来、エピーダーセル）を用いた。培養液として５％牛胎児血清含有ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ製）を用いて培養した１０００個の細胞を３５ｍｍ培養シャーレ（ＦＡＬＣＯＮ製）に播種し、５％炭酸ガス下、３７℃で培養した。ここに紫外線照射装置（クオークテクノロジー製）により２８０ｎｍの紫外線を１時間照射した。ここに、前記の検体１、検体２及び陽性対照としてＥＧＦ（フナコシ製、表皮成長因子）およびリコンビナントＳＣＦタンパク質（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社）をいずれも０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。同時に、ＥＧＦ（フナコシ製、商品コードＮＯ２０）との併用による働きを調べた。これを４８時間培養して試験した。
【０１０４】
培養液を採取後、表皮細胞の生存率をトリパンブルー法により計数した。その後、表皮細胞の懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を用いてステムセルファクター受容体の活性化状態を測定した。ステムセルファクター受容体と検体との結合親和性は上記のリコンビナントＳＣＦタンパク質との結合性を測定することにより測定した。測定にはＢＩＡ（ＧＥ社製、Ｔ２００型）を用いた。
【０１０５】
ＢＩＡとはＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓのことである。つまり、生物物理学的相互作用解析法であり、生体内での分子間相互作用を測定する方法である。
【０１０６】
さらに、細胞懸濁液からｍＲＮＡを核酸抽出キット（フナコシ製）により抽出した。常法に従い、タカラバイオ製のプライマーを使用しＲＴ−ＰＣＲ法（タカラバイオ株式会社、ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｕｓｅ  ＰＣＲ  Ｐａｎｅｌ）によりステムセルファクター受容体のｍＲＮＡ量を定量した。Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社から購入したヒト由来の組換え体リコンビナントＳＣＦタンパク質（Ｎｏ．２５５−ＳＣ−０５０）をステムセルファクター受容体のリガンドとして用いた。
【０１０７】
ステムセルファクター受容体との結合親和性は上記のリコンビナントＳＣＦタンパク質との結合性を測定することにより測定した。測定には前記のＢＩＡを用いた。
【０１０８】
なお、シャーレは５枚を用いてその平均値を算出した。溶媒を添加した溶媒対照群と比較した。
【０１０９】
その結果、検体１の０．１ｍｇ／ｍｌの添加によりヒト由来表皮幹細胞数は溶媒対照群に比して平均値として１８７％に増加した。また、検体２では２４３％に増加した。一方、ＥＧＦ添加では１３３％となり、ＳＣＦ添加では１８０％となった。この結果、検体１及び検体２の方がＥＧＦ及びＳＣＦよりも優れたヒト由来表皮幹細胞増殖作用を呈した。さらに、検体２とＥＧＦとの併用により溶媒対照群に比して８１０％に増加し、ＥＧＦとの相乗的な効果が認められた。
【０１１０】
ＢＩＡによるステムセルファクター受容体との結合親和性の測定の結果、溶媒対照群に比して検体１添加では平均値として１９０％に増加した。また、検体２では３３０％に増加した。一方、ＥＧＦ添加では１０８％となり、ＳＣＦ添加では１５５％となった。この結果、検体１及び検体２の方がＥＧＦ及びＳＣＦよりも優れたステムセルファクター受容体との結合性を示した。これはステムセルファクター受容体との親和性を高めたということである。さらに、検体２とＥＧＦとの併用により６７０％となり、ＥＧＦとの併用による相乗効果が認められた。
【０１１１】
上記の細胞中のステムセルファクター受容体のｍＲＮＡ発現量（コピー数）は溶媒対照群では２０コピー、検体１処理群では５６コピー、検体２処理群では３２０コピ−、ＥＧＦ処理群では３０コピー及びＳＣＦ処理群では５０コピーであった。さらに、検体２とＥＧＦとの併用により８５０コピーとなった。この併用による結果は検体２とＥＧＦが相乗的に作用したことを示している。
【０１１２】
ステムセルファクター受容体のｍＲＮＡ発現量は検体１及び検体２で著しく、ＥＧＦ及びＳＣＦより優っていた。これは検体１及び検体２によるステムセルファクター受容体のｍＲＮＡ誘導作用を示していた。また、検体２とＥＧＦとの併用による相乗効果が認められた。
【０１１３】
一方、安全性試験の一環として人工皮膚であるＥｐｉＳｋｉｎ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ社製）を用いた皮膚刺激性試験を行った。この結果、検体１及び検体２の添加により刺激性は認められず、検体１及び検体２の安全性が確認された。なお、この人工皮膚を用いる安全性試験法は細胞を用いる皮膚刺激性試験評価法であり、動物を使用しない動物実験の代替法として確立され、信頼性が高い方法である。
【０１１４】
以下にヒト神経細胞の障害モデルを用いた障害に対する試験について述べる。なお、この試験方法は生化学的及び分子生物学的に有効成分の働きを検証できる再現性のある常法であり、試験成績も豊富であり、信頼性も高い方法である。
（試験例３）
【０１１５】
コスモバイオから購入したヒト神経細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｒｏｎｓ（ＨＮ））を用いた。培養液として専用の培養液（神経細胞増殖培地）を用いて培養した１０００個の細胞を３５ｍｍ培養シャーレに播種し、５％炭酸ガス下、３７℃で培養した。これに１％の神経毒であるアクリルアミド水溶液を添加して神経細胞を刺激した。
【０１１６】
ここに、前記の実施例１で得られた検体１及び検体２、陽性対照としてＮＧＦ（フナコシ(株)、ヒトタイプ）及びヒト由来ＳＣＦをいずれも０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。これを４８時間培養した。さらに、ＮＧＦ（フナコシ製、β型、商品コード４５０−０１）と検体２を併用して実験した。
【０１１７】
培養終了後、神経細胞数を顕微鏡的に計数した。さらに、上記と同様の方法により、ステムセルファクター受容体の働き（ＢＡ法）とｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲ法（タカラバイオ株式会社、ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｕｓｅ  ＰＣＲ  Ｐａｎｅｌ）により測定した。
【０１１８】
その結果、検体１の０．１ｍｇ／ｍｌの添加により神経細胞数は溶媒対照群に比して平均値として１４４％に増加した。また、検体２では２３３％に増加した。一方、ＮＧＦでは１４０％となった。ＳＣＦの添加では１２２％となった。この結果、検体１及び検体２の方がＮＧＦ及びＳＣＦよりも優れた細胞活性化作用を呈した。また、ＮＧＦと検体２の併用により細胞数は５２０％となり、検体２による相乗的な増殖効果が認められた。
【０１１９】
ＢＩＡによるステムセルファクター受容体との結合親和性の測定の結果、溶媒対照群に比して検体１の添加では平均値として１７７％に増加した。また、検体２の添加では２２２％に増加した。一方、ＮＧＦ添加では１０９％となり、ＳＣＦ添加では１２１％となった。この結果、検体１及び検体２の方がＮＧＦ及びＳＣＦよりも優れたステムセルファクター受容体と強い結合性を示した。これは検体１及び検体２がステムセルファクター受容体との親和性を高めたという結果である。さらに、検体２とＮＧＦとの併用により５２０％となり、検体２による相乗的効果が認められた。
【０１２０】
上記の細胞中のステムセルファクター受容体のｍＲＮＡ発現量（コピー数）は溶媒対照群では１８コピー、検体１処理群では７７コピー、検体２処理群では１４９コピ−、ＮＧＦ処理群では１１２コピー及びＳＣＦ処理群では１３０コピーであった。また、検体２とＮＧＦとの併用により６４４コピーとなり、ＮＧＦとの相乗的な効果が認められた。
【０１２１】
ステムセルファクター受容体のｍＲＮＡ発現量は検体１及び検体２で著しく、ＮＧＦ及びＳＣＦより優っていた。これは検体１及び検体２によるステムセルファクター受容体のｍＲＮＡ誘導作用を示していた。また、ＮＧＦとの併用による相乗的な効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明で得られるポリフェノール誘導体はステムセルファクター作用を呈し、皮膚幹細胞や神経細胞などの細胞機能を増進させる。これにより国民のＱＯＬを改善し、健康な労働人口を増加させ、かつ、医療費を削減できる。
【０１２３】
本発明で得られるポリフェノール誘導体は皮膚幹細胞を増加させ、化粧料としてシワやタルミなどの皮膚トラブルに悩む方の皮膚の改善に貢献し、化粧品業界の発展に寄与する。
【０１２４】
本発明で得られるポリフェノール誘導体は神経細胞を増加させ、認知症やアルツハイマー症の治療のために利用でき、国民の健康維持に貢献する。