(57)【要約】【課題】生活習慣病の新規な診断方法等を提供する。【解決手段】本発明が提供する生活習慣病の診断方法は、被験者から、生体試料を採取する工程、生体試料に含まれる脂肪酸アミドの濃度を測定する工程、および、被験者について得られた脂肪酸アミドの濃度の測定値が、健常者について得られた測定結果と比較して低い場合に生活習慣病に罹患しているかあるいは生活習慣病が進行していると判断する工程、を含む。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から、生体試料を採取する工程、
前記生体試料に含まれる脂肪酸アミドの濃度を測定する工程、および
前記被験者について得られた前記脂肪酸アミドの濃度の前記測定値が、健常者について得られた測定結果と比較して低い場合に生活習慣病に罹患しているかあるいは生活習慣病が進行していると判断する工程、
を含む、生活習慣病の診断方法。
【請求項２】
前記生体試料は、臓器または血液である、請求項１に記載の生活習慣病の診断方法。
【請求項３】
前記脂肪酸アミドの濃度測定は、液体クロマトグラフィー質量分析法により実施する、請求項１または２に記載の生活習慣病の診断方法。
【請求項４】
前記液体クロマトグラフィー質量分析法は、
前記生体試料中に含まれる２以上の成分を液体クロマトグラフィーで分離し、
分離された前記成分をイオン化して四重極型質量分析器で特定質量成分を選択し、
前記特定質量成分を解離させ、
前記解離された成分を質量分析器で検出する、
ことを含む、請求項３に記載の生活習慣病の診断方法。
【請求項５】
前記生活習慣病が、肥満、脂質異常症、糖尿病および耐糖能異常からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の生活習慣病の診断方法。
【請求項６】
前記脂肪酸アミドがオレアミドである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の生活習慣病の診断方法。
【請求項７】
生体中の脂肪酸アミドを含む、生活習慣病を診断するためのバイオマーカー。
【請求項８】
前記生活習慣病が、肥満、脂質異常症、糖尿病および耐糖能異常からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項７に記載の生活習慣病のバイオマーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生活習慣病の診断方法、およびこれに用いるバイオマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
生活習慣や社会環境の変化に伴い、生活習慣病の患者が年々増加している。生活習慣病とは、「食習慣、運動習慣、休養、喫煙、飲酒等の生活習慣が、その発症・進行に関与する疾患群」を意味し、代表的な疾患として、例えば、インスリン非依存糖尿病（以下、単に糖尿病という。）、脂質異常症（高脂血症）、高血圧、炎症性疾患などが挙げられる。現在の生活習慣病の治療は対症療法が主体となっている。しかしながら、生活習慣病には自覚症状が殆どないため、気づかないうちに病気が進行し、脳や心臓、血管などにダメージを与える。例えば、糖尿病は、一旦発症すると網膜症等の合併症を引き起こしたり、虚血性心疾患、脳卒中等の心血管疾患への進展が促進されたりする。したがって、より早い段階での生活習慣病の診断と、生活習慣病の進行を予防することとが大きな課題とされている。生活習慣病の診断に係る従来技術として、例えば、特許文献１〜２が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−１５１８００号公報
【特許文献２】特開２００３−１３０８６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、近年の医療現場では、生活習慣病に限らず、個々の患者の症状に合わせて治療法を的確に選択することが望まれるようになってきている。また、ＱＯＬ（Quality of life）の向上の観点からも、万人に共通した治療と併せて、個々の患者の症状に合わせて適切な治療を行うテイラーメイド医療の提供が求められてもいる。したがって、例えば、生活習慣病の診断についても、より多様な因子を反映可能な診断方法が提案されることが望まれている。一例として、病状が進行する前の比較的早い段階で病気の診断を行うことができれば特に好ましい。
【０００５】
本発明はかかる点に鑑みてなされたものであり、その目的は、生活習慣病の新規な診断（スクリーニング）方法等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、生体内に含まれ、様々な生理的活性を有することから新規脂質メディエーターとして注目されている長鎖脂肪酸のアシル化物について鋭意研究を行ってきた。その結果、長鎖脂肪酸アシル化物のうち脂肪酸アミドが、高脂血症患者の生体内において、健常者と比べて低濃度に存在することを知見し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、ここに開示される発明は、生活習慣病の診断方法を提供する。この生活習慣病の診断方法は、被験者から、生体試料を採取する工程、生体試料に含まれる脂肪酸アミドの濃度を測定する工程、および、被験者について得られた脂肪酸アミドの濃度の測定値が、健常者について得られた測定結果と比較して低い場合に生活習慣病に罹患しているかあるいは生活習慣病が進行していると判断する工程、を含む。
【０００７】
上記構成によると、被験者の生体試料中の脂肪酸アミドの濃度が測定される。そしてこのオレアミドの濃度の測定値を基に、当該被験者が生活習慣病に罹患しているかあるいは生活習慣病が進行していると判断することができる。このことにより、脂肪酸アミドという生体化合物を生活習慣病のバイオマーカーとした、新規な生活習慣病の診断方法が提供される。
【０００８】
ここに開示される診断方法の好ましい一態様において、上記生体試料は、臓器または血液である。血液は比較的容易に採取でき、また他の検査に伴い入手しやすいことから、脂肪酸アミドの濃度測定に関して患者に余分な負担を与えることなく診断を行うことができる。しかしながら、上記脂肪酸アミドの濃度は、検体を血液に限定することなく、例えば、臓器等を検体とした場合であっても測定することができる。これにより、多様な検査手法にて、生活習慣病の診断を行うことができる。
【０００９】
ここに開示される診断方法の好ましい一態様において、上記脂肪酸アミドの濃度測定は、液体クロマトグラフィー質量分析法により実施する。この液体クロマトグラフィー質量分析法は、上記生体試料中に含まれる２以上の成分を液体クロマトグラフィーで分離し、分離された上記成分をイオン化して四重極型質量分析器で特定質量成分を選択し、上記特定質量成分を解離させ、上記解離された成分を質量分析器で検出する、ことを含むことが好ましい。かかる構成により、脂肪酸アミドの濃度を高精度に測定することができる。延いては、精度よく生活習慣病の診断を行うことができる。
【００１０】
ここに開示される診断方法の好ましい一態様では、上記生活習慣病が、肥満、脂質異常症、糖尿病および耐糖能異常からなる群から選択される少なくとも１つである。脂肪酸アミドの濃度は、例えば、グルコース濃度と比較的高い相関を示す。したがって、この診断方法は、生活習慣病の中でも、肥満、脂質異常症、糖尿病および耐糖能異常等の診断に特に好適に利用することができる。
【００１１】
ここに開示される診断方法の好ましい一態様では、上記脂肪酸アミドがオレアミドである。これにより、生活習慣病の存在や進行度をその濃度により一層精度よく反映することができ、生活習慣病の診断をより確かなものとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】生体内において脂肪酸アミドの生成を説明した図である。
【図２】血清中のオレアミド濃度の測定結果を、健常者群と高脂血症患者群とに分けて示したヒストグラムである。
【図３Ａ】糖尿病患者群の血清中のオレアミド濃度を測定した結果を、血中グルコース濃度が８０ｍｇ／ｄＬ以上１１０ｍｇ／ｄＬ未満（ｃｏｎｔｒｏｌ）、１１０ｍｇ／ｄＬ以上１２５ｍｇ／ｄＬ未満（Ｉ群）、１２５ｍｇ／ｄＬ以上２００ｍｇ／ｄＬ未満（ＩＩ群）、２００ｍｇ／ｄＬ以上（III群）、の４グループに分けて示したヒストグラムである。
【図３Ｂ】図３Ａのデータを示す散布図である。
【図４】肥満マウス群と正常マウス群とについて、血漿中のオレアミド濃度の測定結果を示したヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄は、当該分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書および図面に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。
【００１４】
〔バイオマーカー〕
脂質は、細胞膜の主要構成成分であるとともに、タンパク質、糖質と並ぶ３大栄養素のひとつであって、効率の良いエネルギー源としての役割、および、シグナル分子としての役割を持つ重要な生体分子である。そして、脂質のうち、生理活性を有する脂質を脂質メディエーターという。脂質メディエーターとして機能する脂肪酸アミドについては、一例として、アラキドニルセリンやアラキドン酸アミド、オレイン酸アミド等の多様なものが知られている。ここで、オレイン酸アミドについては、（１）睡眠誘導分子、（２）ＣＢ１受容体を介しての食欲調節機能、（３）セロトニン２Ｃ受容体の正のアロステリック調節機能、（４）アミロイドβ沈着の抑制機能等が発現されることが報告されているのみであった。これに対し、ここで開示される技術は、脂肪酸アミドが、生活習慣病のバイオマーカーとして機能し得ることを見出し、新たな機能を発現する脂質メディエーターとしての脂肪酸アミドとその利用を提示するものである。
【００１５】
〔脂肪酸アミド〕
ヒトを含めた動物、植物、微生物の体内では、脂肪酸シンターゼによってアセチルＣｏＡ（コエンザイムＡ）とマロニルＣｏＡから直鎖の飽和脂肪酸が作られている。この脂肪酸は小胞体等で炭素数を増やし、例えば脂肪酸合成が炭素数１８（ステアリン酸）に達すると、ステアリン酸の中央（ω−９位）に二重結合が生成されて体内で一価不飽和脂肪酸であるオレイン酸が生成される。また、これらの脂肪酸はアシルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）により触媒されて、図１に示すように、チオエステル結合を有する脂肪酸のアシル化物（例えば、脂肪酸アシルＣｏＡ）へと変換されて活性化される。この脂肪酸アシル化物が、体内のアミノ酸と酵素的に反応してアシル化アミノ酸となり、さらに酵素的な反応によりアミド型の脂肪酸アミドが形成されると考えられる。バイオマーカーとしての脂肪酸アミドは、かかる生体内脂質由来の脂肪酸アミドおよびその誘導体を広く対象とすることができる。
【００１６】
なお、図１に示される脂肪酸アミドのアミド部分（−ＮＨ２）は、その化学構造中に、アンモニア，第一級アミンまたは第二級アミンから水素を除去した１価の官能基（すなわち、図中の−ＮＨ２あるいは−ＮＨＲ，−ＮＲＲ’。ここで、式中のＲ，Ｒ’は水素以外の炭化水素基である。）を有するものであればその他の具体的な構造は特に限定されない。
【００１７】
また、脂肪酸アミドの脂肪酸部分は、生体細胞中に多く見られる炭素数が１４から２０（以下、単に「Ｃ１４〜Ｃ２０」のように示す。）の長鎖脂肪酸であり得る。これらの脂肪酸部分をＩＵＰＡＣ生化学命名法により炭素数と二重結合の数の組み合わせで表すと、典型的には、例えば、Ｃ１４：０（ミリスチン酸）、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（９）（オレイン酸）、１８：２（９，１２）（リノール酸）、１８：３（Δ９，Δ１２，Δ１５））（リノレン酸）等であり得る。そして当該脂肪酸部分を備える脂肪酸アミドとして、典型的には、下記に示す脂肪酸アミドが挙げられる。
【００１８】
【化１】
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【００１９】
ここに開示される脂肪酸アミドとしては、上記のオレイン酸からなる脂肪酸部分と、アミド部分とが結合してなるものであれば各種の化合物であってよい。このような脂肪酸アミドは、本発明者らの試験によると、その生体中の濃度がいずれも生活習慣病の症状の進行度合いに沿って有意に変化し得ることが確認されている。なかでも、上記脂肪酸アミドのうち、細胞中により多く見られるＣ１６およびＣ１８の長鎖脂肪酸アミドについては、生活習慣病の症状の進行度合いとより顕著な相関性を示すために、バイオマーカー等として特に好適であると考えられる。かかる長鎖脂肪酸アミドの具体例としては、例えば、オレイン酸アミド、リノール酸アミド、パルミトレイン酸アミド、パルミチン酸アミド等が挙げられる。より好ましくはオレイン酸アミド（オレアミド）であり得る。
【００２０】
〔脂肪酸アミドの生体内濃度と診断方法〕
脂肪酸アミドは、詳細は不確かであるものの、より具体的には、生活習慣病患者の生体内において、その濃度がグルコース（血糖）濃度と負の相関を示す。したがって、例えば、慢性的に血中のグルコース濃度が高い人は、グルコース濃度が正常な人と比較して、慢性的に生体内の上記脂肪酸アミドの濃度が低くなる。また、通常は血中のグルコース濃度が正常な人については、たとえ一過的に血中のグルコース濃度が高くなったとしても、生体内の脂肪酸アミドの濃度は低くはならない。さらに、慢性的に血中のグルコース濃度が高い人は、たとえ一過的に脂肪酸アミドを含む食べ物を摂取するなどして生体中の脂肪酸アミドの濃度が上昇したとしても、その後数時間（例えば１時間後、典型的には約４時間後）には生体内の脂肪酸アミドの濃度は再び低い値に落ち着く。なお、この傾向は、生体中の血液に限定されず、臓器等においても同様に見られる。そこで、かかる特性を利用し、生体内の脂肪酸アミドの濃度が高い場合、当該生体が慢性的に血中のグルコース濃度が高いと推測することができる。
【００２１】
なお、診断に際しては、健常者について測定した生体内の脂肪酸アミドの濃度に基づいて、健常者と生活習慣病罹患者とを区別するための脂肪酸アミドの濃度の閾値を予め設定することができる。そして、例えば、被験者の生体内の脂肪酸アミドの濃度がこの閾値未満である場合に、当該被験者が生活習慣病に罹患していると診断することができる。
なお、後述するように、医学的には生活習慣病に完全に罹患していないと判断され得る被験者であっても、生活習慣病の症状が進行しつつある被験者については、健常者と比べて生体内の脂肪酸アミドの濃度が低くなる傾向がみられる。したがって、例えば、生活習慣病の回復が比較的容易な初期の段階を、生体内の脂肪酸アミドの濃度により評価することが考慮される。
【００２２】
そこで、ここに開示される技術では、例えば、健常者と比較した場合に生体内の脂肪酸アミドの濃度が有意に低いと判断できる範囲であって、なるべく高い脂肪酸アミドの濃度を閾値として設定することができる。これにより、例えば、脂肪酸アミドの濃度が有意に低い被験者について、生活習慣病の進行が予見される生活習慣病予備軍として診断又はスクリーニングして、生活習慣病への罹患の予防を促すことができる。あるいは、生活習慣病の進行を効果的に防止・改善できる生活習慣病集中治療対象群として診断又はスクリーニングすることで、回復が可能な生活習慣病患者を優先的に治療することができる。
【００２３】
〔脂肪酸アミドの生体内濃度測定〕
なお、脂肪酸アミドの濃度測定のために被験者から採取する生体材料は、体液を含む生体部分であればよく、例えば、血液や組織液、リンパ液等の体液、臓器等とすることができる。好ましくは、血液（例えば、血漿、血清）である。これらの生体材料は、体液に存在する全タンパク質を除去してから、脂肪酸アミドの濃度測定に供することが好ましい。
【００２４】
脂肪酸アミドは、例えば、比色定量、ガスクロマトグラム（ＧＣ）法、ガスクロマトグラム質量分析（ＧＣ／ＭＳ）法、液体クロマトグラム質量分析（ＬＣ／ＭＳ）法、高速液体クロマトグラフ質量分析（ＨＰＬＣ／ＭＳ）法、薄層クロマトグラム（ＴＬＣ）ゲル画像解析法、キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）法、核磁気共鳴分光（ＮＭＲ）法等により定量することができる。なかでも、試料中に含まれる成分をクロマトグラフィーで分離したのち、四重極型質量分析器で特定質量を選択し、さらに飛行時間型又は四重極型等の質量分析器で検出する、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の採用が好ましい。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法によると、８種類の脂肪酸を一度の分析（例えば、１インジェクション）で、網羅的で高精度に定量することができるために好ましい。
【００２５】
生体材料として血液等の液状試料を採取した場合は、例えば、タンパク質沈殿剤としてのアセトンを、液状試料（例えば、血清または血漿等）に対し約２倍程度の割合で加えることで、生体材料からタンパク質を沈殿除去することができる。タンパク質は親水性部分が血液中の水分に接することで溶解しているが、水溶性有機溶媒であるアセトンを加えることで、タンパク質と水分子との結合が切断されて溶解度が低下する。このことにより、生体材料は、脂質等の可溶性物質を血液中に残したまま、タンパク質成分のみが凝集して液中に沈殿する。なお、タンパク質の沈殿手法はこれに限定されず、例えば、公知の硫酸アンモニウム（塩析）沈殿法、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿法、ＴＣＡ／アセトン沈殿法、酢酸アンモニウム含有メタノールによる沈殿法等を適宜採用することができる。
【００２６】
また、液状試料中に遊離糖やアミノ酸のような非脂質成分が混入することは好ましくない。そこで、例えば、ＦＯＬＣＨ法等により、液状試料から総脂質を分離、抽出することができる。液状試料中の水素結合・疎水結合はエーテル、クロロホルム、ベンゼン、ヘキサンなどの非極性溶媒で弱めることができ、イオン結合の場合は極性の高いメタノール，エタノールなどの極性溶媒で弱めることができる。そこで、例えば、具体的には、上記のタンパク質を除去した血液に対し、クロロホルムおよびメタノールの混合溶液（２：１）を加えてよく撹拌したのち、遠心分離により２層に分離させることで、クロロホルム、脂質等の脂溶性の成分が含まれる上澄み部分を回収して、測定試料とすることができる。
【００２７】
一方で、生体材料として臓器等の組織試料を採取した場合は、例えば、採取した組織試料を破砕装置等で均一なペースト状にし、ペースト状の組織試料に対して、上記タンパク質の分離・除去、脂質の分離・抽出を行うことができる。なお、脂質の分離・抽出方法は上記の例に限定されることなく、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法等の公知の各種の手法を採用することができる。
【００２８】
上記の生体試料の前処理方法からもわかるように、以上の測定によると、脂肪酸アミドは、オレイン酸（脂肪酸）として検出される。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法に使用するカラムおよびその他の分析条件は、使用する装置に応じて適切に設定することができる。例えば、後述の実施例に開示のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析条件を参考にすると、測定試料に含まれ得る上記に例示した８種類の脂肪酸アミドに対する定量を好適に実施することができる。
【００２９】
〔利用〕
すなわち、ここに開示される技術によると、例えば、以下のことが可能とされる。
・生活習慣病を診断するためのバイオマーカーであって、生体中の脂肪酸アミドを含むバイオマーカーが提供される。
・脂肪酸アミドは、例えば、オレアミドであり得る。
・生活習慣病に罹患している被験者および生活習慣病に罹患しているとは言えないがその症状が進行しつつある被験者においては、生体内における脂肪酸アミドの濃度が健常者と比較して有意に減少する（例えばｐ＜０．０５）。したがって、生体内における脂肪酸アミドの濃度が、健常者と比較して有意に減少していることを確認することで、かかる生体が生活習慣病に罹患しているか、あるいは生活習慣病の症状が進行していると診断することができる。換言すると、生活習慣病の罹患者だけでなく、生活習慣病の罹患予備軍とされる人を診断することができ、生活習慣病の対策および予防を効果的に図ることができる。
【００３０】
・生体内における脂肪酸アミドの濃度は、例えば、血中の総コレステロール（Ｔ−Ｃｈｏ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、グルコース（血糖）等の濃度と相関性を有する。特に、グルコースとは比較的高い相関性を有する。このことから、生活習慣病としては、肥満、脂質異常症、脂肪肝、糖尿病、耐糖能異常症の少なくとも１つの疾患を対象とすることができる。特に、糖尿病、脂質異常症について、高い精度で診断することができる。
【００３１】
（実施例）
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
【００３２】
１．ヒト血液中の脂肪酸アミド濃度の測定（高血糖）
諸処の理由で来院した患者８１名について、インフォームドコンセプトを得たうえで、空腹時に採血することでヒト血液試料を得た（名古屋大学医学部附属病院が採取）。これらの血液試料から血清を抽出し、（株）日立ハイテクノロジーズ社製の臨床化学自動分析装置ＬＡＢＯＳＰＥＣＴ００８を用いて、血清中の総コレステロール（Ｔ−Ｃｈｏ）、中性脂肪（ＴＧ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）およびグルコースの濃度（ｍｇ／ｄＬ）を測定した。これらの測定結果から、血中のグルコース濃度が１２５ｍｇ／ｄＬ未満の被験者を健常者とし、その他の人を高血糖患者として、健常者と高血糖患者とについてそれぞれの測定値の平均を算出し、下記の表１に示した。なお、全８１名の被験者のうち、健常者は５５人、高血糖患者は２６人であった。
【００３３】
また、同じ血液試料について、脂肪酸アミドの定量を行った。具体的には、採血した血液を遠心分離に供して血漿を得た。得られた血漿に氷冷アセトンを２倍量（体積）加え、−２０℃で３０分間インキュベートした後、遠心分離を行って上清を回収することによりタンパク質を除去した。続いて、クロロホルム：メタノール＝２：１の溶液を回収した上清の１０倍量（体積）加えてよく撹拌したのち、遠心分離を行って上清を回収した。これを測定試料としてウルトラパフォーマンス液体クロマトグラム（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）システムに供し、脂肪酸アミドの同定および定量を行った。
【００３４】
なお、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定条件は以下の通りとした。また、脂肪酸アミドとしては、ミリスチン酸アミド（Ｃ１４：０）、パルミチン酸アミド（Ｃ１６：０）、パルミトレイン酸アミド（Ｃ１６：１）、ステアリン酸アミド（Ｃ１８：０）、オレイン酸アミド（Ｃ１８：１）、リノール酸アミド（Ｃ１８：２）、α−リノレン酸アミド（Ｃ１８：３）、アラキドン酸アミド（Ｃ２０：４）について定量した。この場合、例えばオレアミドは、ＬＣの保持時間７．２分の位置に、マススペクトルの質量電荷比（ｍ／ｚ）を２８２として検出される。なお、定量に際しては、安定同位体標識した脂肪酸アミドをそれぞれ内部標準物質として用いた安定同位体希釈法により検量線を作成して濃度（μＭ）を算出した。得られた結果は、健常者群と高血糖患者群とに分けて、図２にヒストグラムとして示した。
【００３５】
装置：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ−Ｘｅｖｏ−ＴＱＤ（Waters社製）
移動相流量：０．３ｍｌ/ｍｉｎ
移動相：（Ａ）０．１％ギ酸含有水（Ｈ２Ｏ）
（Ｂ）０．１％ギ酸含有水アセトニトリル
カラム：Develosil HB C30-UG-3（2.0/100mm）（野村化学株式会社製）
カラムヒーター温度：４０℃
イオン化モード：ESI-Positive、Cone 25V, Collision 12V
分析時間：１５分
【００３６】
【表１】
2018141728.tif 000004
【００３７】
表１に示されるように、測定した全ての項目（Ｔ−Ｃｈｏ，ＴＧ，ＬＤＬ，グルコース）で、高血糖患者群の測定平均値の方が健常者群の測定平均値よりも有意に高い値であることが確認できた。
一方で、血中の脂肪酸アミドは、高血糖患者群の測定平均値の方が健常者群の測定平均値よりも低くなることが確認された。また、測定した８種の脂肪酸アミドの中でも、特にオレアミドについては、健常者群の血中のオレアミド濃度に比べて高血糖患者群のオレアミド濃度の方が大きく減少することがわかった。図２に、オレアミドの血中濃度を健常者群と高血糖患者群との間で散布図として示した。
【００３８】
以上のことから、高脂血症患者の血清において脂肪酸アミド（例えばオレアミド）の濃度が有意に低下することが認められた。したがって、この脂肪酸アミドを、例えば生活習慣病の診断を下すための新規バイオマーカーとして利用できることが分かった。
【００３９】
２．ヒト血液中のオレアミド濃度の測定（糖尿病患者）
糖尿病患者２０名について、インフォームドコンセプトを得たうえで空腹時に採血し、ヒト血液試料を得た（名古屋大学医学部附属病院が採取）。これらの血液試料から血清を抽出し、上記と同様にして、血清中のグルコース（血糖）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、中性脂肪（ＴＧ）および総コレステロール（Ｔ−Ｃｈｏ）の濃度（ｍｇ／ｄＬ）と、オレアミドの濃度（μＭ）とを測定した。その結果、糖尿病患者群の血清のグルコース濃度とオレアミド濃度との間に負の相関が見られることが確認できた。
【００４０】
そこで、得られた測定結果を、血中グルコース濃度が８０ｍｇ／ｄＬ以上１１０ｍｇ／ｄＬ未満のグループ（ｃｏｎｔｒｏｌ）と、１１０ｍｇ／ｄＬ以上１２５ｍｇ／ｄＬ未満のグループ（Ｉ群）、１２５ｍｇ／ｄＬ以上２００ｍｇ／ｄＬ以下のグループ（ＩＩ群）、２００ｍｇ／ｄＬ超過のグループ（III群）、の４グループに分けて、図３Ａにヒストグラムとして、図３Ｂに散布図として示した。
「ｃｏｎｔｒｏｌ」は、空腹時血糖値が１１０ｍｇ／ｄＬ未満であり、医学的には正常型と判断される患者からなるグループである。「Ｉ群」は、空腹時血糖が１１０ｍｇ／ｄＬ以上１２５ｍｇ／ｄＬ未満であり、医学的に境界型にあると判断される患者からなるグループである。そして、「ＩＩ群」および「III群」は、空腹時血糖が１２５ｍｇ／ｄＬ以上であり、医学的に概ね糖尿病型にあると判断される患者からなるグループである。つまり、本試験では、糖尿病型に分類される空腹時血糖を、糖尿病の初期段階である「ＩＩ群」と、比較的重度の糖尿病（空腹時血糖２００ｍｇ／ｄＬ超過）である「III群」とに分類している。
【００４１】
図３Ａおよび図３Ｂに示されるように、血中のグルコース濃度が増えるにつれて、全体として、オレアミド濃度が減少する傾向にあることがわかる。そして図３Ｂに示されるように、グルコース濃度がＩＩ群に入るまで増加すると、急激にオレアミド濃度が減少することが確認できる。ＩＩ群で減少後のオレアミド濃度は、III群におけるオレアミド濃度とさほど変わらない。
【００４２】
このことから、例えば、糖尿病と診断されるＩＩ群の患者であっても、オレアミド濃度が比較的高い（例えば１．５μＭ以上）患者については、糖尿病からの改善・回復が比較的容易であると判断して、重点的な治療を促すことができる。
または、人間ドックなどの定期検診におけるオレアミド濃度の測定によって、オレアミド濃度が有意に低下したときに、たとえ血糖値が比較的低い（例えば空腹時血糖１８０ｍｇ／ｄＬ以下、特に１５０ｍｇ／ｄＬ以下）であっても、糖尿病が進行し始めたとして、早期の対応および予防を促すことができる。
【００４３】
３．肥満モデルマウスの血液中のオレアミド濃度の測定
肥満のモデルマウスとして、６週齢の雄のｏｂ／ｏｂマウス５匹を肥満マウス群とした。また、比較対照のマウスとして、６週齢の雄のＢＡＬＢ／ｃ正常マウス５匹を正常マウス群とした。これらのマウスを１週間飼育した後、７週齢時に採血した。
そして上記と同様に、採血した血液を遠心分離して血漿を得たのち、氷冷アセトンを血漿の２倍量加え、−２０℃で３０分インキュベートした後、遠心分離を行って上清を回収することによりタンパク質を除去した。続いて、クロロホルム：メタノール＝２：１の溶液を血漿の１０倍量加え、よく撹拌したのち、遠心分離を行って上清を回収した。これを測定試料として、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供し、脂肪酸アミドの同定および定量を行った。このとき、安定同位体標識したオレアミドを内部標準物質として用いた。なお、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定条件は、上記と同じである。オレアミド濃度の測定結果を肥満マウス群と正常マウス群とに分けて、図４に示した。
【００４４】
図４に示されるように、肥満モデルマウスにおいてオレアミドの濃度が有意に減少していることがわかった。このことから、オレアミドの作用について、マウスをヒト疾患のモデル動物として使うことが有効であることが確認できた。また、肥満モデルマウスにおけるオレアミド量はサンプル間でばらつきが少なく、モデルマウスを活用することで、オレアミドの作用に関連する糖尿病等の生活習慣病に対する新しい予防・診断・治療法の開発が可能であるといえる。
【００４５】
以上、本発明の具体例を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。ここで開示される発明には上述の具体例を様々に変形、変更したものが含まれ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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