(57)【要約】      （修正有）【課題】臨床検査室でのテスト方法を改善し、必要時間を少なくするためのＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸分子を抽出、分離するための迅速な試料調製システムの提供。【解決手段】サイズ安定剤の存在下で剪断力を用いて試料を破砕し、使用可能なサイズ範囲の核酸分子を得る試料を調製する多チャンバの使い捨てカートリッジの提供。核酸分子が得られると、磁性ナノ粒子は濃縮され、更なるテストのために核酸分子を洗浄するために使用される。【選択図】図２８Ａ
2018186816.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
使い捨てカートリッジであって、
内側円筒表面を画定し、且つ、シリンジポートを介して分析流体を流動させる動作をなすシリンジ、リリーフポート及び反応チャンバを有するカートリッジ本体と、
前記カートリッジ本体の前記内側円筒表面内に回転可能に接続されて配置された円筒状インサートと、を有し、
前記円筒状インサートは、第一のポートに流動的に接続された破砕チャンバと、第二のポートに流動的に接続された少なくとも１つのチャンバと、前記円筒状インサートの底面に沿って配置された第一及び第二の細長チャネルと、を有し、
前記第一及び第二の細長チャネルの各々は、前記円筒状インサートの前記底面の少なくとも一部分を横断し、
前記第一の細長チャネルは、前記第二の細長チャネルから流動的に隔離され、
前記第一の細長チャネルは、第一の回転位置において前記シリンジを前記反応チャンバに流動的に接続するチャネルポートの第一の対に流動的に接続され、
前記第二の細長チャネルは、第二の回転位置において前記シリンジを前記リリーフポートに流動的に接続するチャネルポートの第二の対に流動的に接続され、
前記円筒状インサートは、前記底面の少なくとも一部分を横断する細長洗浄チャネルを更に有し、
前記細長洗浄チャネルは、第一の幅を有する第一の部分と、前記第一の幅よりも大きい第二の幅を有する第二の部分と、からなり、
前記第二の部分は、洗浄ステップ中に磁性ナノ粒子を濃縮する場所を提供することを特徴とする使い捨てカートリッジ。
【請求項２】
前記第一のポートは、前記円筒状インサートの垂直側面に配置され且つ前記シリンジポートに整列するように回転され、前記破砕チャンバ及び前記シリンジの間の流体の移動を可能とすることを特徴とする請求項１に記載の使い捨てカートリッジ。
【請求項３】
前記第二のポートは、前記円筒状インサートの垂直側面に配置され且つ前記シリンジポートに整列するように回転され、前記少なくとも１つのチャンバ及び前記シリンジの間の流体の移動を可能とすることを特徴とする請求項１に記載の使い捨てカートリッジ。
【請求項４】
前記第一のポート及び前記第二のポートは、前記円筒状インサートの垂直面に沿った所定の高さにあることを特徴とする請求項１に記載の使い捨てカートリッジ。
【請求項５】
前記リリーフポートは、前記カートリッジ本体の前記内側円筒表面に沿って所定の高さで配置され、
前記リリーフポートの前記所定の高さは、前記第一のポート及び前記第二のポートの各々の所定の高さよりも垂直方向において高いことを特徴とする請求項４に記載の使い捨てカートリッジ。
【請求項６】
カラムチャンバを更に有することを特徴とする請求項１に記載の使い捨てカートリッジ。
【請求項７】
前記カラムチャンバは脱塩母材を有することを特徴とする請求項６に記載の使い捨てカートリッジ。
【請求項８】
バーコードを更に有することを特徴とする請求項１に記載の使い捨てカートリッジ。
【請求項９】
生物学的プローブを有するチップを更に有することを特徴とする請求項１に記載の使い捨てカートリッジ。
【請求項１０】
核酸試料を調整するシステムであって、
前記システムは使い捨てカートリッジと検出装置とを有し、
前記使い捨てカートリッジは、内側円筒表面を画定し、且つ、シリンジポートを介して分析流体を流動させる動作をなすシリンジ、リリーフポート及び反応チャンバを有するカートリッジ本体と、前記カートリッジ本体に回転可能に接続された円筒状インサートと、生物学的プローブを有するチップと、を有し、
前記円筒状インサートは、第一のポートに流動的に接続された破砕チャンバと、第二のポートに流動的に接続された少なくとも１つのチャンバと、前記円筒状インサートの底面に沿って配置された第一及び第二の細長チャネルと、を有し、
前記第一及び第二の細長チャネルの各々は、前記円筒状インサートの前記底面の少なくとも一部分を横断し、
前記第一の細長チャネルは、前記第二の細長チャネルから流動的に隔離され、
前記第一の細長チャネルは、第一の回転位置において前記シリンジを前記反応チャンバに流動的に接続するチャネルポートの第一の対に流動的に接続され、
前記第二の細長チャネルは、第二の回転位置において前記シリンジを前記リリーフポートに流動的に接続するチャネルポートの第二の対に流動的に接続され、
前記検出装置は、
前記チップを受容するセンサ載置部と、
前記チップからの電気信号を処理するマイクロプロセッサと、
超音波力を前記破砕チャンバに送る破砕器と、
前記円筒状インサートを回転させるカートリッジ駆動部と、
前記シリンジに接続するプランジャ駆動部と、
前記円筒状インサートの中心から外れて且つ前記円筒状インサートに近接して固定的に搭載されている磁石と、
を有し、
前記カートリッジ駆動部の作動時に、前記円筒状インサートが前記磁石に関して回転するように構成されていることを特徴とするシステム。
【請求項１１】
前記検出装置はバーコードリーダを更に有することを特徴とする請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記検出装置と通信するコンピュータネットワークを更に有することを特徴とする請求項１０に記載のシステム。
【請求項１３】
前記検出装置は全地球測位システムを更に有することを特徴とする請求項１０に記載のシステム。
【請求項１４】
前記検出装置は、各々独立して制御される第一のヒータ及び第二のヒータを有し、
前記第一のヒータ及び第二のヒータは、前記カートリッジ駆動部の作動時に、前記円筒状インサートが前記第一のヒータの作動時に前記第二のヒータに関して回転するように、前記円筒状インサートに近接して固定的に搭載されていることを特徴とする請求項１０に記載のシステム。
【請求項１５】
前記検出装置は携帯可能な検出装置であることを特徴とする請求項１０に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第６１／７１５，００３号（２０１２年１０月１７日出願）の優先権の利益を主張し、その内容が本明細書によって参考として組み入れられている。
【０００２】
［政府ライセンス権］  米国政府は、本発明の実施権及び、特許権者が適当な条件で他の者に使用許諾することを要求する限定された状況下の権利を有する。当該適当な条件は、科学基金によって与えられた助成金第ＤＭＩ−０４５０４７２号及び第ＩＩＰ−０４５０４７２号、米軍医療研究及び物資司令部によって与えられた契約第Ｗ８１ＸＷＨ−０７−２−０１０９号、米軍ＲＤＥＣ０Ｍ  ＡＣＱ  ＣＴＲによって与えられた契約番号第Ｗ９１１ＮＦ−０６−１−０２３８号及び第Ｗ９１１ＮＦ０９Ｃ０００１号のうちの１つ以上の条件であたえられる。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、生物学的試料を分析する方法及びシステムに関する。特に、本発明は、多チャンバ弁に関し、特に、生物学的試料分析に使用する多チャンバの使い捨てカートリッジに関する。
【背景技術】
【０００４】
臨床検査室でのテスト方法を改善し、必要時間を少なくすることについて継続的な関心がある。特定のテスト試料では、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸分子を抽出するために破砕されることが必要である。
【０００５】
米国の医療施設において２００７年に約３０００万回の分子診断テストが行われたと推定されている。このテストは、２００９年には６７００万回に増加すると予想されている。多くの、全てではないが、これらのアッセイの場合、使いやすく迅速な試料調製プロセスにより利益を得ることができる。該プロセスは、全くオペレータの介入を必要せず、効果的なコストと小型試料に敏感であることが求められている。
【０００６】
研究や医療診断における分子診断と遺伝子配列決定の使用が急速に成長している。分子技術は、抗体方法よりも特異性のある感度の高いレベルを提供する。遺伝配列決定は、以前に利用できない大量の情報を収集することができる。しかし、試料調製は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、遺伝子配列決定及び分子交雑テストを実行するための主要なコスト要素である。また、試料調製はテスト結果を遅延させ、よく訓練された人材のいる研究所にこれらアッセイを実行する機能が制限されている。
【０００７】
生物学的試料の核酸ベースの識別は、まず、試料からの核酸分子（ＮＡＭ）の分離を必要とする。ユーザの要求を有効的に効率的に満たすようなシステムを達成するためには、ユニバーサルな試料の調製処理が必要とされている。現行の試料調製処理は、困難であり、時間を要し、そして、研究能力を必要とする。
【０００８】
したがって、これらの欠点のいくつかに対処する改善された検査システム及び方法に対する需要がある。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は試料調製装置に関する。試料調製モジュールは、超音波破砕した核酸分子の磁気操作のための構成要素を識別し、検証するために設計されている。一実施例では、全ての処理ステップは、使い捨てカートリッジ内で発生する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】一実施例の使い捨てカートリッジを示す図である。
【図１Ｂ】一実施例の使い捨てカートリッジを示す図である。
【図２】一実施例の使い捨てカートリッジの分解図である。
【図３Ａ】一実施例の使い捨てカートリッジの断面図である。
【図３Ｂ】電磁石及び超音波発生器をカートリッジ内部に有する一実施例の使い捨てカートリッジの断面図である。
【図４Ａ】一実施例のカートリッジ本体を示す図である。
【図４Ｂ】一実施例のカートリッジ本体を示す図である。
【図４Ｃ】一実施例のカートリッジ本体を示す図である。
【図４Ｄ】一実施例のカートリッジ本体を示す図である。
【図５Ａ】カートリッジ本体に固定された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジの断面図である。
【図５Ｂ】カートリッジ本体に固定された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジの断面図である。
【図６Ａ】一実施例の多チャンバインサートを示す図である。
【図６Ｂ】一実施例の多チャンバインサートを示す図である。
【図６Ｃ】一実施例の多チャンバインサートを示す図である。
【図６Ｄ】一実施例の多チャンバインサートを示す図である。
【図６Ｅ】一実施例の多チャンバインサートを示す図である。
【図６Ｆ】一実施例の多チャンバインサートを示す図である。
【図６Ｇ】一実施例の多チャンバインサートを示す図である。
【図７Ａ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図７Ｂ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図８Ａ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図８Ｂ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図９Ａ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図９Ｂ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図１０Ａ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図１０Ｂ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図１１Ａ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図１１Ｂ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図１２Ａ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図１２Ｂ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図１２Ｃ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図１３Ａ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図１３Ｂ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図１４Ａ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図１４Ｂ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図１４Ｃ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図１５Ａ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図１５Ｂ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図１６Ａ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図１６Ｂ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図１６Ｃ】チャネル及びポートを介して所望の流体の流れのために配置された多チャンバインサートを有する一実施例の組み立てられた使い捨てカートリッジを示す図である。
【図１７】一実施例の使い捨てカートリッジを概略的に示す図である。
【図１８】一実施例の使い捨てカートリッジを１回使用する処理を示すフローチャートである。
【図１９Ａ】別の実施例の多チャンバインサートの構造を示す図である。
【図１９Ｂ】別の実施例の多チャンバインサートの構造を示す図である。
【図２０Ａ】別の実施例の多チャンバインサートの構造を示す図である。
【図２０Ｂ】別の実施例の多チャンバインサートの構造を示す図である。
【図２１Ａ】別の実施例の多チャンバインサートの構造を示す図である。
【図２１Ｂ】別の実施例の多チャンバインサートの構造を示す図である。
【図２２】一実施例に係るカートリッジ駆動部及びプランジャ駆動部を含むサンプリング装置を含むサンプリング装置を示す図である。
【図２３】一実施例に係る使い捨てカートリッジが一部取り除かれたカートリッジ駆動部を示す図である。
【図２４】一実施例に係るステッピングモータ及びウォームギア駆動部を示す図である。
【図２５】一実施例に係るヒータを示す図である。
【図２６】一実施例に係る使い捨てカートリッジを示す図である。
【図２７】例示的な使い捨てカートリッジを示す上面斜視図である。
【図２８Ａ】図２７の例示的な使い捨てカートリッジを示す底面斜視図である。
【図２８Ｂ】例示的な使い捨てカートリッジの底部と位置合わせされるコンポーネントを示す図である。
【図２９Ａ】例示的な使い捨てカートリッジの底部と位置合わせされるコンポーネントを示す図である。
【図２９Ｂ】例示的な使い捨てカートリッジの底部と位置合わせされるコンポーネントを示す図である。
【図３０】他の例示的な使い捨てカートリッジを示す上面斜視図である。
【図３１Ａ】核酸試料を調製する例示的なシステムを示す斜視図である。
【図３１Ｂ】核酸試料を調製する例示的なシステムを示す斜視図である。
【図３１Ｃ】核酸試料を調製する例示的なシステムを示す斜視図である。
【図３２】核酸試料を調製する例示的なシステムを示す斜視図である。
【図３３】サイズ安定剤を用いた超音波ビーズ破砕を使用した、胞子の溶解からの核酸分子の有効な放出を示している図である。
【図３４】ショウジョウバエから分離された核酸分子を示しており、レーン２及び３においてサイズ安定剤を添加することによって、核酸分子が過剰剪断されることが防止されるもの、変性剤のない試料は１００未満の塩基レベルまで剪断されたことを示している図である。
【図３５】処理過程を使用して、広範な異なる試料からの核酸分子が同じ電力レベルと処理時間の超音波処理によって処理され、同一サイズの断片分布が得られることを示している図である。
【図３６】磁性ナノ粒子からの核酸分子の放出を示すグラフである。
【図３７】牛の耳の生体組織を用いて得られた核酸分子の分離を示している図である。
【図３８】土壌で汚染されたショウジョウバエを使用して得られた核酸分子の分離を示している図である。
【図３９】ショウジョウバエから回復された精製ＤＮＡを示している図である。
【図４０】種々の緩衝液を用いてショウジョウバエから回復された精製ＤＮＡを示している図である。
【図４１】酵母、草及びブルーベリーからの核酸分子の回復を示している図である。
【図４２】大腸菌からの核酸分子の回復を示しており、長時間の超音波処理時間がサイズ分布を変化せしめないことを示している図である。
【図４３】本発明の実施例、すなわち、ＤＮＡ回復のための市販のＱｉａｇｅｎキット及び教本フェノール／クロロホルム法を使用した、容積が増大した細菌細胞培養液からのＤＮＡの回復を示すグラフである。
【図４４】超音波処理中の核酸分子を保護する高イオン強度緩衝液の有効性を示している図である。
【図４５】選択されたサイズ安定剤の存在下で超音波処理は限られたサイズ範囲のＤＮＡを高収率で与えることができることを実証している有効性を示している図である。
【図４６】例示的なカートリッジを示す図である。
【図４７Ａ】例示的な駆動アセンブリの断面図である。
【図４７Ｂ】例示的な駆動アセンブリのインサートの底面図である。
【図４７Ｃ】例示的な駆動アセンブリのインサートの切り取り図である。
【図４８Ａ】第一の例示的な実施例のインサートポッドを示す図である。
【図４８Ｂ】第一の例示的な実施例のインサートポッドを示す図である。
【図４８Ｃ】第二の例示的な実施例のインサートポッドを示す図である。
【図４８Ｄ】第二の例示的な実施例のインサートポッドを示す図である。
【図４９】駆動プラットフォームの斜視図である。
【図５０】試料前処理のための例示的なカバーを示す図である。
【図５１】液体試料を収集する装置を示す図である。
【図５２】例示的な多試料収集円盤を示す図である。
【図５３】液体試料を収集するために吸収する固体を使用してカバーを示す図である。
【図５４】吸収性の固体を使用するカバーの代替の実施例を示す図である。
【図５５Ａ】液体試料を収集するランスベースのシステムを示している図である。
【図５５Ｂ】液体試料を収集するランスベースのシステムを示している図である。
【図５５Ｃ】液体試料を収集するランスベースのシステムを示している図である。
【図５６】ランスベースのシステムの別の実施例を示している図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
添付図面を参照して、以下に本発明を説明する。
【００１２】
対応する参照符号は、いくつかの図面の対応する箇所を示している。本明細書の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を示しているもの、いかなる場合であっても、本発明を限定するものとして解釈されるべきでない。
【００１３】
図１Ａ及び図１Ｂにおいて、例示的に組み立てられた使い捨てカートリッジ１００が示されている。使い捨てカートリッジ１００は、円筒状インサート１０１を有する。円筒状インサート１０１はカートリッジ本体１０２内に回転可能に位置している。円筒状インサート１０１は、流体を含み処理するチャンバ１０３と、外部ポートにチャンバ１０３を接続する複数の流体通路と、流体を送るための流体通過チャネルとを備える。
【００１４】
使い捨てカートリッジ１００は、分析用の生物学的試料を調製する自動化されたプロセスを提供する。本発明の試料調製ステップは、１００〜１０，０００の塩基対のサイズ範囲内にＤＮＡとＲＮＡの断片を調製することができる。正確なサイズ分布は、界面活性剤の濃度、使用される界面活性剤又は超音波の周波数を変化させることによって、変化させることができる。所望のサイズ範囲内の断片を産生する能力は、電気泳動又はカラム分離を不要とする。これもまた、追加の精製ステップの必要性を解消することによって、有用な断片の全体の収率を増加させる。試料調製モジュールは、細胞の破砕、ＤＮＡ及びＲＮＡのサイジング（ｓｉｚｉｎｇ）、材料の集中及び洗浄を可能にする。円筒状インサート内の追加チャンバは、末端修復及びキナーゼ処理のために必要な試薬を配布するために用いることができる。酵素は、乾燥保存され、使用直前に、カートリッジ中で又はカートリッジに付加して、水を加えて元に戻されることができる。
【００１５】
回転設計の使用は、様々な時点で開閉する複雑なバルブシステムを必要とせずに、流体試料を引き且つ押し出す単一のプランジャを可能とする。これは、従来のシステムに比べて漏れや装置の故障の可能性を非常に減少させる。さらに、プランジャの使用により、引かれた流体の量を調整する構成の可能性を拡大する。使い捨てカートリッジ１００は、すべてのポート及び通気口を閉じたままに残す回転位置に格納することができる。これは、使い捨てカートリッジ１００内に装填された液体及び固体の試薬を用いた使い捨てカートリッジ１００の長期保存及び輸送を、可能とする。使用時には、使い捨てカートリッジ１００は、チップ１０７（図２参照）へ電気的に接続されている検出装置に挿入される。検出装置は、固定位置にカートリッジ本体１０２を付加した状態となる。
【００１６】
図２には、使い捨てカートリッジ１００の分解図が示されている。円筒状インサート１０１は、種々のチャンバ１０３内に複数の流体を含むことが可能である。円筒状インサート１０１の外側部は、カートリッジ本体１０２内に収納されたときに、その軸の周りに自由に回転できるような円筒形状である。円筒状インサート１０１の内側部は、任意のサイズ又は形状のチャンバを含むように変更可能である。カスタマイズされた使い捨てのカートリッジは、同じ外観形状及び寸法を保持し、既存の検出装置に挿入できる。検出装置の処理プロトコルは、新しいチャンバ、試料サイズ、処理時間又はポートの位置を考慮して容易に修正される。一実施例においては、円筒状インサート１０１は、射出成形技術によって形成されている。別の実施例では、円筒状インサート１０１とカートリッジ本体１０２との両方は、射出成形技術によって形成されている。射出成形により、最小限のコストでカスタマイズされた使い捨てカートリッジの製造を可能にする。使い捨てカートリッジ１００は、チャンバ１０３内に収容された流体が特定の流体通路を通過できるように構成されている。その設計は、製造及び組み立てを容易に可能にする。さらに、その設計は、複数の流体を必要とする機器に使用されるべき使い捨てカートリッジ１００の実現を可能にする。一実施例においては、使い捨てカートリッジ１００は、検出装置で使用する一回の使用部品である。使い捨てカートリッジ１００は、生物学的テストのために必要な流体を収納し、更に磁場試料を注入されることが可能である。
【００１７】
図２において、熱封止フィルム１０４は、流体を円筒状インサートに封止し、流体試料の操作を可能にしながら漏れを防いでいる。熱封止フィルム１０４は外部環境からチャンバ１０３を密封する。熱封止フィルム１０４はさらに、封止性を落とすことなく、流体をチャンバ１０３に追加し又は流体をチャンバ１０３から取出すことを可能にする。一実施例において、熱封止フィルム１０４は、円筒状インサート１０１のチャンバ１０３との間のエネルギー伝達を改善する。エネルギー伝達には熱伝達、超音波伝達及び磁気伝達を含むが、これらに限定されるものではない。場合によっては、フィルタ１０５は特定の流路上に配置され、流体から大きな固体物を濾過する。一実施例において、熱封止フィルム１０４が円筒状インサート１０１上にシールされ、そして円筒状インサート１０１がカートリッジ本体１０２に取り付けられる。一実施例において、円筒状インサート１０１はカートリッジ本体１０２にはめ込まれる（即ちスナップ挿入される）。円筒状インサート１０１がカートリッジ本体１０２に取り付けられた後に、熱封止フィルム１０４が円筒状インサート１０１を封止することも可能であることが理解される。
【００１８】
一実施例において、生物学的プローブを含むチップ１０７はカートリッジ本体１０２に取り付けられている。チャンバ１０３内に収容されている流体は、移送されて、化学的反応又は化学的検出を開始する生物学的プローブを含むチップ１０７に、接触する。チップ１０７は卓上の検出装置又は携帯型の検出装置のような検出装置と通信し、試料内における標的分析物の存在を示す。
【００１９】
図３Ａ及び３Ｂにおいては、使い捨てカートリッジ１００の断面図が示されている。使い捨てカートリッジ１００はカートリッジ駆動部１１０上に設置されている。カートリッジ駆動部１１０は円筒状インサート１０１を所望の位置へ回転させることができる。カートリッジ本体１０２が静止したままで、カートリッジ駆動部１１０は円筒状インサート１０１を回転させる。一実施例において、カートリッジ駆動部１１０はヒータ１１１を有する場合もある。ヒータ１１１はチャンバ１０３内に含まれる流体を所望の温度に加熱することができる。あるいは、加熱チャンバはヒータ１１１の上部に意図的に配置され、チャンバ１０３内の流体を過度に加熱することなくチャンバ１０３内の流体を加熱する。一実施例において、熱封止フィルム１０４はチャンバ１０３内の流体を過度に加熱することのない加熱ステップを実現する。処理チャンバは混合ステップ、加熱ステップ、破砕ステップ、加圧ステップ又は他の処理ステップを実現するために円筒状インサート１０１に組み込まれる。一実施例において、カートリッジ駆動部１１０は磁石１１４を含む。磁石１１４は電場を発生させるために用いられる。磁石１１４は円筒状インサート１０１において磁性ナノ粒子を引きつけ又は引き離す。磁石１１４は磁性ナノ粒子の試料を集結させることができ、また任意の磁性ナノ粒子を案内することによって拡散処理を加速させることができる。「磁気操作」と題した本明細書のセクションを参照してください。
【００２０】
剪断力のような機械的力が生物学的試料へ加えられて、試料を破砕し、核酸分子を放出させる。一実施例では、高速ナノ粒子を利用する超音波処理を用いて、試料材料を細かく断片化する。この処理は、細胞、組織又は他の材料を破砕して、核酸分子を放出させる。この機械的な力は、核酸分子を放出するために、試料を破砕するのに適したいかなる力であってもよいことが理解される。適切な機械的な力は、超音波処理、噴霧化、均質化処理等を含むがこれらに限定されない。ビーズ破砕は、核酸分子を試料から分離する処理である。これは、胞子又は組織試料との使用に適している堅牢なロバスト方法である。ビーズ破砕において、直径約１００ミクロンのガラスビーズが、試料を破砕せしめて、核酸分子を放出するのに用いられる。ビーズは、超音波源を使用して運動せしめられる。図３３は、胞子の試料からの核酸分子の有効な放出を例証している。別の実施例では、鋭利な破片が、ビーズの代わりに又はビーズに加えて使用される。これらの破片は、有機体生物全体（例えば、昆虫の体）又は同様の弾性構造体から核酸を放出させるのに有用であり得る。
【００２１】
例えば、一実施例では、カートリッジ駆動部１１０は、破砕器１１２を有する。破砕器１１２は、超音波力を加えることによってチャンバ１０３内に含まれる流体を混合又は破砕できる。例示的な使い捨てカートリッジ１００は、チャンバ１０３とは別個のチャンバ内で流体を混合する破砕チャンバ１１３を有している。一実施例では、小さなビーズは、破砕チャンバ１１３内又はチャンバ１０３の１つ内に配置され、流体を混合するか又は試料を破砕するのを補助する。破砕器１１２は流体中にて、超音波力を加え、ビーズを励起させ運動させる。
【００２２】
サイズ安定剤は、利用可能なサイズ範囲内の核酸分子を取得するために、破砕ステップ中に存在させる。一実施例においては、核酸分子は、長さ２００〜１００００の塩基対のサイズまで低減される。別の実施例において、核酸分子は、長さ３００〜３０００の塩基対のサイズまで低減され得る。別の実施例では、核酸分子は、長さ４００〜２０００の塩基対のサイズまで低減され得る。別の実施例では、核酸分子は、長さ２００〜５００の塩基対のサイズまで低減される。所望の塩基対の長さは下流の試料処理技術に依存して変化することが理解される。試料処理技術は、分子交雑、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ法、逆転写ＰＣＲ法、「ラブ・オン・チップ」プラットフォーム及びＤＮＡ塩基配列決定を含むが、これらに限定されない。
【００２３】
図４Ａ〜４Ｄにおいては、一実施例のカートリッジ本体１０２の様々な斜視図が示されている。様々なデザインが円筒状インサート１０１を収容するために使用され得ることが理解される。カートリッジ本体１０２は内側円筒表面１４０を有している。内側円筒表面１４０は円筒状インサート１０１を収容する（図２参照）。内側円筒表面１４０は滑らかであり、円筒状インサート１０１を自由に回転させることができる。カートリッジ本体は、カートリッジ本体１０２を支持するために十分にリッジ形状である部材であり、かつ円筒状インサートの回転を可能にするために十分に滑らかである任意の部材によって構成されている。一実施例において、内側円筒表面１４０はわずかにテーパ形状をなしており、わずかなテーパ形状の外側円筒表面を有する円筒状インサート１０１の取り付けを可能にしている。
【００２４】
図４Ａ〜４Ｄに示すように、一実施例において、カートリッジ本体はシリンジ状成形部（即ちモールド）１４１を有している。１つのシリンジ状成形部が示されているが、複数のシリンジ状成形部体を使用できることが理解される。図４Ｃの実施例では、シリンジ状成形部１４１は、カートリッジ本体１０２の垂直縁部から垂直に延びる中空管である。シリンジ状成形部１４１は、プランジャを収容することが可能である。プランジャは、円筒状インサート１０１の流体通路を介して流体を引き、押し出す。
【００２５】
図５Ａ及び図５Ｂにおいては、プランジャ１５０を有する組み立てられた使い捨てカートリッジ１００の断面図が示されている。プランジャ１５０はチャンバ１０３から流体を引き込むことができる。プランジャ１５０が流体を引き込むと、使い捨てカートリッジは流体通路を再位置決めして、反応チャンバ１４２又は異なるチャンバ１０３に連通状態にあるシリンジ状成形部１４１に別のポートを整列させる。そして、プランジャ１５０は、流体通路１５１を通して流体を反応チャンバ１４２又は別のチャンバ１０３へ押し出す。一実施例では、プランジャ１５０は、シリンジ状成形部１４１内に保持される。流体は他の流体と化学的に反応するか又は、反応チャンバ１４２に連通する装置と反応し、チップ１０７に接触する（図２参照）。一実施例において、チップ１０７は反応性表面を有し、センサ基板に実装される。一実施例において、チップ１０７は、反応チャンバ１４２の一側面を形成する。チップ１０７は検出装置と電気的に通信しており、テストの測定値及び結果を検出装置に提供する。図４Ｄに示すように、センサ載置部１４３は、センサ基板を保持することができる。センサ基板は、位置合わせポスト１４６によってセンサ載置部１４３に位置合わせされている。
【００２６】
流体出力部は、流体を使い捨てカートリッジ１００から所望の場所に移送することができるように、カートリッジ本体１０２に取り付けられ得ることが理解される。さらに、流体入力部は使い捨てカートリッジ１００への流体の導入を可能にする。本実施例で説明したプランジャ１５０は、任意の適切な流体配布装置を効果的にカートリッジ内に流体を移送するために置き換えられ得ることが理解される。
【００２７】
図６Ａ〜６Ｇにおいては、円筒状インサート１０１の様々な斜視図が示されている。円筒状インサート１０１のチャンバ１０３は、試料液、標準液、洗浄液、触媒液又は任意の他の所望の流体を保持し得る。一実施例において、チャンバ１０３は流体を排出する廃棄チャンバを含んでいる。円筒状インサートは複数のポート１６０をさらに含む。ポート１６０の各々は固有の流路を有している。各チャンバは、チャンバへのまたチャンバはから流体を移送するポートと連通する流体通路を有する。カートリッジ本体（図示せず）上のシリンジ状成形部はポートと整列しており流体を引き込み又は押し出す。生ずる圧力との圧力差を防ぐために、円筒状インサートに沿ってリリーフポート１６４が位置決めされている。固有の流路に加えて、円筒状インサートは少なくとも１つの流体通過チャネル１６１を含んでいる。流体通過チャネル１６１は流体が円筒状インサートの所定の端部から他の端部へ流れることを可能にする。例えば、流体はシリンジ状成形部からカートリッジ本体（図示せず）の反応チャンバへ流れることができる。流体通過チャネル１６１における流体の相互作用を防ぐために、複数の流体通過チャネルが使用される。第二の流体通過チャネル１６２は早期の反応又は他の有害な流体相互作用を防ぐために使用される。一実施例において、円筒状インサートはヒータ接触領域１６３を含んでいる。ヒータ接触領域はチャンバ内において流体を加熱するのに望ましいようにチャンバの下部に位置決めされる。さらに、ヒータは流体通過チャネル１６１を加熱することができる。
【００２８】
図７Ａ〜図１６Ｃにおいては、複数の位置に回転された場合の、組み立てられた使い捨てカートリッジの様々な図が示されている。図７Ａ及び７Ｂに示されているように、円筒状インサートは閉じた位置に存在する。シリンジ状成形部に整列するポートはない（図示せず）。これがチャンバからの流体の漏洩を防止する。一実施例において、少なくとも１つのチャンバは試料チャンバである。試料チャンバはユーザが流体試料を、熱封止フィルムを通ってチャンバへ注入することを可能にする。一実施例において、試料チャンバはガラスビーズのような破砕物を含み、テスト可能な核酸鎖へ試料を分解することを助長する。
【００２９】
図８Ａ及び８Ｂにおいては、円筒状インサート１０１はポート３Ｐがシリンジ状成形部１４１に整列して位置決めされるように回転位置を有する。一旦円筒状インサートが位置決めされると、流体はチャンバ３Ｒからポート３Ｐを通ってシリンジ状成形部１４１へ引き込まれることができる。一旦流体がチャンバ３Ｒから引き出され、チャンバ３Ｒからさらに流体が引き出される必要がないと、チャンバ３Ｒは廃液ストレージ用の代替的チャンバとして使用されることもできる。
【００３０】
図９Ａ及び９Ｂにおいては、円筒状インサート１０１はポート１１Ｐがシリンジ状成形部１４１に整列して位置決めされている。プランジャはチャンバ３から引き出された流体をポート１１Ｐへ押し出し、かつ流体は反応チャンバ１４２まで通過する。
【００３１】
図１０Ａ及び１０Ｂにおいては、円筒状インサート１０１はポート８Ｐがシリンジ状成形部１４１に整列するように位置決めされている。一実施例において、流体はシリンジ状成形部１４１からポート８Ｐ及び加熱チャンバへ押し出される。加熱チャンバ１７０において流体は所望の温度に所定時間に亘って加熱される。
【００３２】
加熱が完了すると、流体はシリンジ状成形部へ引き戻される。流体は同じポート８Ｐ又は加熱チャンバに連通する固有のポートを通って引き込まれてもよい。図１１Ａ及び１１Ｂに示されているように、流体は加熱チャンバ１７０につながっている固有のポート９Ｐからシリンジ状成形部へ引き込まれる。
【００３３】
図１２Ａ及び１２Ｃにおいては、シリンジ状成形部から反応チャンバ１４２までの流路１６１を通る流れが示されている。実施例において、流路を通る流れはポート１１Ｐに対応する。
【００３４】
図１３Ａ及び１３Ｂにおいては、ポート１４Ｐがシリンジ状成形部に整列するように位置決めされている、円筒状インサート１０１が示されている。チャンバ１４Ｒはポート１４に連通している。チャンバ１４Ｒに含まれる流体はシリンジ状成形部へ引き込まれる。円筒状インサート１０１は続いて図１４Ａ及び１４Ｃに示されているようにポート１３Ｐへ回転する。その後、流体はチャンバ１４Ｒからポート１３Ｐを通って反応チャンバ１４２へ押し出される。流体はポート１１Ｐに関するチャネルとは異なるチャネルを通過する。これはチャネル内において引き込まれた流体と押し出された流体が接触し互いに反応することを防いでいる。流体はまず初めに反応チャンバ１４２において接触する。
【００３５】
所望の反応時間の経過後、プランジャ１５０は流体を反応チャンバ１４２から引き出し、流体を廃棄チャンバ７へ押し出す。プランジャ１５０はポート１１Ｐを介して流体を引き込む。そして円筒状インサートは廃棄チャンバ７に連通しているポートに回転する。プランジャはその後流体を廃棄チャンバ７へ押し出す。使用後のチャンバは廃棄チャンバとして使用されることが可能である。別の実施例において、プランジャ１５０は流体が反応チャンバ１４２へ到達することを一旦止める。反応時間経過後、プランジャは流体を押し出すことを再開し、流体は反応チャンバを通過し、廃棄チャンバ又は別の保管チャンバに連通しているポートへ押し出される。保管チャンバはさらなるテスト又は検証用の試料を収容する。
【００３６】
図１５Ａ及び１５Ｂにおいては、ポート４Ｐがシリンジ状成形部に整列するように位置決めされた円筒状インサート１０１が示されている。ポート４Ｐは洗浄液を含むチャンバ４Ｒに連通している。洗浄液はチャンバ４Ｒからポート４Ｐを通ってシリンジ状成形部へ引き出される。
【００３７】
図１６Ａ、１６Ｂ及び１６Ｃに示されているように、円筒状インサート１０１はポート１１Ｐに回転し、プランジャは洗浄液をポート１１Ｐを経て反応チャンバ１４２へ押し出す。
【００３８】
一旦使用された使い捨てカートリッジは取り外され、処分できる。次回の調製において、未使用の使い捨てカートリッジはその後同一又は特定の流体と共に検出装置へ挿入される。
【００３９】
図１７においては、一実施例の使い捨てカートリッジの全体図が示されている。円筒状インサートは複数のチャンバ内に６つの流体を含んでいる。５つの流体はそれぞれのチャンバからシリンジ状成形部へ移動し、メインチャネル１８０を通過し反応チャンバ１４２へ移動する。残りの１つの流体はいかなる汚染又は早期の反応を防ぐためにシリンジ状成形部から二次的なチャネル１８１を介して反応チャンバ１４２へ移動する。
【００４０】
図１８においては、一実施例の処理フローが示されている。一旦試料が試料チャンバに注入され、検出装置が起動するとテストが開始される。チャネルはまず少量の緩衝液と共に前処理される。その後試料は試料チャンバから加熱チャンバへ移送され、９５℃で５分間加熱される。続いて加熱された試料は反応チャンバに移送され、２０分間分子交雑される。分子交雑ステップは試料が反応チャンバに連通しているチップに含まれる生物学的プローブと化学的に結合することを可能にする。生物学的プローブは特に試料中の対象となる核酸分子と結合する。内容は２００２年６月４日にコノリーに発行された米国特許第６，３９９，３０３号に記載されており、参照として本明細書に組み込まれている。単一のチップは複数の異なる冗長な生物学的プローブを含み、これによって感度を増加させ、かつ複数の対象となる核酸分子をテストする。使い捨てカートリッジは複数の流体の操作及び移送を必要とするいかなるシステムにも使用され得る。
【００４１】
分子交雑後、試料は余分な化合物を取り除くために緩衝液と共に洗浄される。場合によっては、パラジウムのような触媒が反応チャンバへ移動され、１０分間反応を促進する。その後残存する触媒は水と共に洗浄される。還元剤とニッケル等の金属との混合物が反応チャンバへ移動される。金属は対象試料を被覆し、チップ上に導体を作り出す。余分な結合されなかった金属は水と共に取り除かれる。金属に被覆された対象試料によって結合された生物学的プローブ間の抵抗は大幅に減少し、対象試料の存在を明確に示すことが可能となる。検出装置はテスト結果を出力してテストは終了する。
【００４２】
図１９Ａ及び１９Ｂにおいては、円筒状インサートの変形例が示されている。インサートのチャンバは長方形の構成によって示されている。チャンバのサイズ及び形状は、特定の試薬及び廃棄チャンバを最適化するように変更され得る。
【００４３】
図２０Ａ及び２０Ｂにおいては、円筒状インサートの変形例が示されている。この実施例のチャンバは、放射状をなすチャンバを有するように示されている。一実施例において、複数のチャンバは一定のサイズを有しており、インサートの半径に基づいて作られる。
【００４４】
図２１Ａ及び２１Ｂにおいては、円筒状インサートの変形例が示されている。チャンバはインサートの半径に沿って様々なサイズを有しており、各チャンバに異なる量の試薬を保管する。複数の実施例においてインサートの変形例が示されているが、複数のポート及びチャンバを含む円筒状インサートの他の変形例も使用することができる。
【００４５】
図２２においては、使い捨てカートリッジ駆動部及びプランジャ駆動部を有するサンプリング装置が示されている。使い捨てカートリッジ１００は使い捨てカートリッジ駆動部に取り付けられている。プランジャ駆動部２２０は先端部２２０を有する長い円筒部２２１を含む。先端部２２０はシリンジ状成形部１４１内にあるプランジャに接続する。一実施例において、先端部２２１はプランジャとの円錐状の改善された接触部である。プランジャ駆動部は円筒部２２１を軸方向に移動させ、その結果プランジャは流体を使い捨てカートリッジ１００のチャンバから出したり引いたりする。
【００４６】
図２３には一実施例による使い捨てカートリッジ駆動部が示されている。使い捨てカートリッジは接触面２３０上に取り付けられている。接触面２３０は回転し、使い捨てカートリッジの所望の位置に円筒状インサートを位置決めする。一実施例において接触面２３０は駆動装置２３１の一部である。ウォームギア２３２は駆動装置２３１に取り付けられている。ウォームギア駆動部２３３はウォームギア２３２とかみあい、その結果駆動装置２３１が回転する。円筒状インサートを回転させる任意の適切な手段が使用されてもよい。
【００４７】
図２４には使い捨てカートリッジ駆動部の別の図が示されている。ウォームギア駆動部２３３はウォームギア２３２の移動させるように配置されたステッピングモータである。ホームフラグ２４０は駆動装置に取り付けられ、装置のゼロ点を設定する。ホームフラグは流体サンプリング中の任意のタイミングにてウォームギア駆動部２３３のゼロ点を設定することができ、適切な距離を示す。
【００４８】
図２５にはヒータを有する接触面が示されている。接触面はスプリングによる荷重がかけられており、使い捨てカートリッジとの接触を改善する。少なくとも１つのスプリング２５４が位置決めされて接触面の動きを可能にする。一実施例において、接触面は加熱要素を組み込むヒータ搭載部２５０を含む。少なくとも１つの抵抗器はヒータ搭載部２５０に位置決めされる。加熱板２５２は熱を抵抗器から加熱板２５２を通して使い捨てカートリッジの所望の位置まで伝える。一実施例において加熱板はアルミの加熱板である。場合によっては、温度センサ２５３は抵抗器又は加熱板の付近に位置決めされ、適用温度を検出する。接触面（図示せず）は加熱板に位置決めされてもよいことが理解される。接触面は加熱板から使い捨てカートリッジへ熱を効果的に伝える材料から作られる。
【００４９】
図２６において、使い捨てカートリッジ３００が示されている。使い捨てカートリッジ３００は、異なる円筒状インサート３０２が使用される点を除いて使い捨てカートリッジ１００に類似している。円筒状インサート３０２は、カートリッジ本体３０４の内側円筒表面内に配置され、回転可能に接続されている。円筒状インサート３０２は、各々が対応するチャンバに接続された複数のポート３０６を備える。図２６の実施例では、ポート３０６のそれぞれは、円筒状インサート３０２の垂直縁部に沿った所定の同じ高さにある。これは、ポート３０６の各々が選択的に単一のシリンジ状成形部３０８と位置合わせされることを可能とする。カートリッジ本体３０４に関して円筒状インサート３０２を回転させることにより、個別の各ポート３０６は選択的にシリンジ状成形部３０８に位置合わせ可能となり、これにより、流体が所望のチャンバから選択的に注入又は引き出されることを許容することができる。図２６において、ポート３０６は、円筒状インサート３０２の垂直縁部上にある。他の実施例において、ポート３０６は、上部縁部又は底縁部のような他の縁部に配置されている。
【００５０】
図２７において、円筒状インサート３０２の上面図が示されている。円筒状インサート３０２は、ポート３０６のうちの第一のポートに流動的に接続された破砕チャンバ３１０を備える（図２６、参照）。図２７の破砕チャンバ３１０は円筒状インサート３０２に関して中心にある。他の実施例では、破砕チャンバ３１０は、円筒状インサート３０２の他の場所に配置してもよい。図示の実施例では、第一のポートは、円筒状インサート３０２の底縁部の一部を横切る第一の細長チャネルによって、破砕チャンバ３１０に接続されている。円筒インサート３０２はさらに、少なくとも１つの追加のチャンバを有する。チャンバの例は、廃棄チャンバ３１２と試料処理チャンバ３１４と触媒チャンバ３１６を含む。追加のチャンバは、緩衝液、洗浄液、磁性ナノ粒子の懸濁液、現像液、ＰＣＲ試薬を含む酵素溶液、脱水試薬等を保持することができる。一実施例では、１つのチャンバは、処理された核酸分子が長期間保管されていてもよいアーカイブチャンバとして使用するために予約されている。
【００５１】
図２７の例示的な実施例では、円筒状インサート３０２は、円筒状インサート３０２は、カラムチャンバ３１８を含む。カラムチャンバ３１８は、第一の壁３２０と第二の壁３２２によって形成されている。図示の実施例では、第二の壁３２２は、第一の壁３２０よりも短い。カラムチャンバ３１８は、円筒状インサート３０２の底縁部の少なくとも一部を横切る細長チャネルによって、少なくとも１つのポートに接続されている。カラムチャンバ３１８は、カラムクロマトグラフィーに適したシリカゲルのようなクロマトグラフィー材料で充填されてもよい。流体は細長チャネルを通してカラムチャンバ３１８の下部に押し込まれることができる。流体はクロマトグラフィー材料を通過し、カラムチャンバ３１８を充填し始める。流体は第二の壁３２２の高に達すると、クロマトグラフィーにかけた流体はアーカイブチャンバ３２４に流入し、その後、別のポートを介して引き抜かれる。
【００５２】
図２８Ａは、円筒状インサート３０２の底面図である。図２８Ａは、円筒状インサート３０２の底縁部を横断する細長チャネルを示している。細長チャネル４００は、円筒状インサート３０２の縁部のポート（図示せず）の破砕チャンバ３１０に流動的に接続している。同様に、細長チャネル４０２、４０４及び４０６も、底縁部の少なくとも一部を横切る。細長チャネル４０２、４０４及び４０６は、チャンバとして機能するのに十分な容積を有しているが、細長チャネル４０２、４０４及び４０６が円筒状インサート３０２の底面に平行に延びているので、それら細長チャネルはカートリッジ駆動部の接触面に近接している。他の細長チャネルも、図２８Ａに示されている。
【００５３】
図２８Ｂは、カートリッジ駆動部（図示せず）の接触面４０８の平面図である。接触面４０８と円筒状インサート３０２は、これらが固定して接続されて番となるコネクタ４１０ａ／４１０ｂを有しており、それによって、接触面４０８を回転させたときに円筒状インサート３０２の回転を可能にする。接触面４０８は、破砕チャンバ３１０と位置合わせされた超音波破砕器等の破砕器４１２を含む。回転可能な接触面４０８の下には、磁石４１４、第一のヒータ４１６及び第二のヒータ４１８が配置されてある。磁石４１４、第一のヒータ４１６及び第二のヒータ４１８は、固定接触面４０８が回転するときに回転しないようにカートリッジ駆動部に取り付けられている。各々は、円筒状インサートの中心からオフセットされている。有利なことに、これは単に円筒状インサート３０２を回転させることにより、特定のゾーンを、磁場、第一のヒータ又は第二のヒータの近くに配置させることを可能にする。
【００５４】
実例としては、図２８Ａの円筒状インサート３０２は、第一のゾーン４２０、第二のゾーン４２２及び第三のゾーン４２４を有する。第三のゾーン４２４は、図２９Ａに示す回転位置に円筒状インサート３０２を回転させることにより、磁石４１４の磁場に曝露され得る。逆に、第三のゾーン４２４は、図２９Ｂに示す回転位置に円筒状インサート３０２を１８０度回転で回転させることにより、磁石４１４の磁場から除去され得る。別の実施例では、第三のゾーン４２４は、９０度回転して磁石４１４の磁場から除去されて、第三のゾーン４２４をヒータ４１６、４１８の１つの上に配置できる。
【００５５】
類似の方法においては、試料は、細長チャネル４０４内に導入することができる。細長チャネル４０４は、第一のゾーン４１０と第二のゾーン４２２の両方を横切る。第一のゾーン４１０は、第一のヒータ４１６の上に配置することができる（例えば、５０〜５５℃の温度を達成するために）と共に、図２９Ａに示す回転位置をとることによって、第二のゾーン４２２が第二のヒータ４１８の上に配置されてもよい（例えば、９０〜９５℃の温度を達成するため）。ゾーンの相対位置は、図２９Ｂに示す回転位置を採用することによって逆にすることができる。この構成は、ＰＣＲ操作が細長チャネルの１つ以上の範囲内で行われている場合に特に有利である。ＰＣＲ操作で使用される高温度及び低温度のサイクルは、円筒状インサート３０２を回転させて、細長チャネルを高温及び低温ヒータ上に配置することによって生み出すことができる。回転位置を繰り返して循環させることで、細長チャネル内の試料は、高温と低温の複数の反復を経験することになる。
【００５６】
動作において、図３０では、生物学的試料は、円筒状インサート３０２の破砕チャンバ３１０に配置されている。円筒状インサート３０２は、プランジャ（図示せず）にポート５０４Ｐが揃うように回転される。プランジャは、チャンバ５０４からの溶解緩衝液を引き出すために起動される。円筒状インサート３０２は、その後破砕チャンバ３１０と流体連通しているプランジャにポートを位置合わせするために回転される。図３０の実施例では、流体連通は、細長チャネル４００（図２８Ａ参照）を介して確立される。プランジャは、破砕チャンバ３１０内に溶解緩衝液を注入するために作動される。超音波力は破砕器１１２から印加され、生体試料を破砕し、核酸を放出する。一実施例では、サイズ安定剤は、破砕ステップの間に産生された断片のサイズを制御するために存在する。
【００５７】
円筒状インサート３０２は、次に、破砕チャンバ３１０と流体連通状態にあるポートにプランジャを位置合わせするために回転される。ポートは、０．８ミクロンのフィルタ等のインラインフィルタを含むことができる。プランジャは、破砕チャンバ３１０から溶液を引き出すように活性化され、同時にフィルタを通して溶液を通過させる。
【００５８】
円筒状インサート３０２は、プランジャにポート３１４Ｐを整列させるために回転される。プランジャは、処理チャンバ３１４内に溶液を注入するために作動される。処理チャンバ３１４は、磁性ナノ粒子の懸濁液を収容する。溶液は、核酸が磁性ナノ粒子に結合させるのに十分な時間の間、磁性ナノ粒子に曝露される。プランジャはその後、処理チャンバ３１４から、磁性ナノ粒子の懸濁液を引き込むように活性化される。
【００５９】
円筒状インサート３０２は、次に、細長チャンバ４０２と流体連通状態にあるポートと、プランジャを位置合わせするために回転される。プランジャは、磁性ナノ粒子の懸濁液を細長チャンバ４０２に注入するために作動される。細長チャンバ４０２は、円筒状インサート３０２の底縁部の少なくとも一部を横切る。細長チャンバ４０２は、磁石４１４等の磁石に近接して配置される。この磁石は、磁性ナノ粒子とそれに結合した核酸に、細長チャンバ４０２内の特定の領域に集中させる。有利なことに、これは、未結合物質を洗い流すことを可能にしながら所定の位置に磁性ナノ粒子を保持する。一実施例では、細長チャンバ４０２は、直径が細長チャンバ４０２の他の部分の直径よりも広い幅の広い領域４０２を含む。磁場が印加されると、ナノ粒子は細長チャンバ４０２を詰まらせることなく、広い領域４０２に集中する。それによって、洗浄液が凝縮ナノ粒子の上を通過することを可能にする。
【００６０】
磁性ナノ粒子を洗浄する洗浄溶液は、他のチャンバから引き出すことができる。一実施例では、円筒状インサート３０２は、プランジャとポート５０８Ｐを揃えるように回転される。プランジャは、チャンバ５０８からの洗浄溶液を引き出すように活性化されている。適切な洗浄溶液の例としては、水、エタノール、７０％エタノール、緩衝液等が挙げられる。筒状インサート３０２は、細長チャンバ４０２に接続されているポートをプランジャに再び揃えるように回転させられる。プランジャは、洗浄液を細長チャンバ４０２に注入するために作動される。洗浄溶液が磁性ナノ粒子の上を通過するので、過剰な液体が細長チャンバ４０２を通して穴３１２Ａからチャンバ３１２に通過する。図３０の実施例では、チャンバ３１２は、廃棄チャンバである。必要に応じてこの洗浄ステップを繰り返してもよい。
【００６１】
回転アプローチのさらなる利点としては、洗浄溶液を引く円筒状インサート３０２の回転もまた離れて磁石から離れて細長チャンバ４０２を動かすことである。これは、磁性ナノ粒子が再び懸濁されることを可能とし、ナノ粒子の間に挟まれるであろう非結合物質の除去を容易にする。円筒状インサート３０２が洗浄溶液を細長チャンバ４０２に注入する位置に回転されるとき、細長チャンバ４０２は再び磁石に近接する。
【００６２】
一実施例において、最終洗浄は、磁性ナノ粒子から核酸を放出するように構成された剥離液でなされる。剥離液が十分な時間、磁性ナノ粒子と接触させられた後、プランジャは剥離液と溶解された核酸を引くために活性化される。一実施例では、剥離液は、カートリッジ駆動部内のヒータを用いて核酸分子の放出を促進するために加熱される。
【００６３】
円筒状インサート３０２は、カラムチャンバ３１８と流体連通状態にあるポートとプランジャを位置合わせするために回転される。プランジャが作動すると、溶液はカラムチャンバ３１８の中に注入される。溶液がカラムチャンバ３１８内のゲルを通過し、カラムチャンバ３１８のアーカイブチャンバ３２４に収容される。ゲルは、溶液を洗浄するために有用であるシリカのような任意の適当な多孔質材料であってもよい。例えば、カラムチャンバ３１８は、ナノ粒子を除去又は溶液を脱塩するために使用することができる。カラムチャンバ３１８内のゲルは、初期は脱水状態であってもよい。核酸溶液を注入する前に、水、緩衝液又は他の溶液は、他のチャンバから引き出され、ポート３１８Ｐを介してカラムチャンバ３１８に注入され、ゲルを水和することができる。残留材料は、別のチャンバから洗浄液を引き出し、洗浄溶液をゲルを通して通過させることによって、カラムチャンバ３１８からオーバーフローチャンバ３２４内へと洗浄されることができる。
【００６４】
ナノ粒子が除去された後、自由な核酸がＰＣＲで処理されてもよい。一実施例では、ＰＣＲ試薬は、脱水状態で保存されている。カラムチャンバ３１８のゲルのように、水、緩衝液又は他の溶液は、他のチャンバから引き出され、試薬を水和するＰＣＲ試薬を保持するチャンバに注入されてもよい。例えば、脱水されたＰＣＲ試薬はチャンバ５１２内に保存されることができ、水はチャンバ５１４内に格納することができる。円筒状インサート３０２を回転させてプランジャを操作することにより、水がチャンバ５１４から引き出されチャンバ５１２内に注入される。水和したＰＣＲ試薬は、次に、チャンバ５１２内への核酸の溶液を注入する等して、核酸溶液と混合される。混合された溶液は、次いで、円筒状インサート３０２の底縁部の少なくとも一部を横断する細長チャンバ４０４（図２８Ａ参照）に注入される。細長チャンバ４０４は、核酸の濃度を増幅するＰＣＲプロセスを実行するように構成されている。別の実施例では、混合溶液の半分は細長チャンバ４０６ａに注入され、溶液の残りの半分は細長チャンバ４０６ｂに注入される。
【００６５】
細長チャンバ４０４は、本明細書の別の箇所に記載された細長チャンバ４０２に類似している。細長チャンバは、各ゾーンが２つの異なる温度で２つの異なるヒータの上に配置することができるように互いにから十分に離れた２つのゾーンを含む。高温ヒータを高温（例えば９０〜９５℃）で保持して、そのゾーンに近接して配置されている核酸試料中の水素結合を破壊することができる。しかし、これらの温度は、中国の試薬が機能するためには高すぎる。低温ヒータは、当該高温寄り低く且つ室温を超える温度（例えば５０〜５５℃）で保持することができる。これらの温度は、核酸試料中の水素結合を破壊するのには低すぎる。しかし、これらの温度は、ＰＲＣ試薬が機能するためには十分である。円筒状インサート３０２を回転させることによって、細長チャンバ４０４の両端は、順次、複数の高／低温サイクルを経て送ることができる。例えば、このサイクルを約３０回繰り返してもよい。
【００６６】
いくつかの実施例において、核酸は、使い捨てカートリッジから除去され、後続の処理のために外部機器に提供される。それらは使い捨てカートリッジから除去する準備が整うまで、これらの特定の実施例では、核酸は、アーカイブチャンバ５１６に格納される。
【００６７】
他の実施例では、核酸が使い捨てカートリッジ内に残ると、標的分析物の有無を識別するために、その後の検出技術に供される。このような実施例では、増幅された溶液は、細長チャネル４０２から取り出され、その後、反応チャンバ１４２等に流体連通しているポートと整列される。プランジャが作動され、増幅された溶液は、反応チャンバ１４２内に注入される。反応チャンバ１４２は、特定の核酸配列の存在を検出するチップを含む。例示的なチップは、米国特許第６３９９３０３号に開示されている。特定の核酸配列を検出するチップを可能にするのに必要な触媒溶液、洗浄溶液及び現像液は、他のチャンバに保存されている。これらのチャンバは、他のチャンバと同じ回転式の方法でアクセスされる。
【００６８】
［核酸試料を調製するシステム］  図３１Ａにおいて、核酸試料を調製するシステムが示されている。システム６００は、検出装置６０２と使い捨てカートリッジ６０４を含む。使い捨てカートリッジ６０４が着脱可能でカートリッジ駆動部６０６に取り付けられ、これは、使い捨てカートリッジ６０４へ回転可能に接続された円筒状インサートを、回転させるように構成されている。使い捨てカートリッジ６０４が検出装置６０２内に適切に配置されると、プランジャ駆動装置によって操作されるプランジャは、シリンジ状成形部６０８と整列する。さらに、使い捨てカートリッジ６０４上のチップが検出装置６０２におけるチップレセプタクルに電気的に接続する。このチップレセプタクルは、検出装置６０２のマイクロプロセッサと電気的通信状態にチップを配置して、チップからの電気信号が標的分析物の存在を検出するために処理されることができるようになっている。データは、検出装置６０２のデータ記憶媒体に格納されてもよい。データ記憶媒体としては、ハード円盤ドライブ、フラッシュメモリドライブ等が挙げられる。
【００６９】
一実施例において、使い捨てカートリッジ６０４は、特定の使い捨てカートリッジの識別情報を符号化したバーコードラベルを含む。この情報は、例えば、その特定の使い捨てカートリッジに関わるチップの識別についての情報を含む。これには、製造情報、製造場所、ロット番号等が含まれていてもよい。一実施例では、独特の識別子は、具体的に、特定のテスト（患者Ｚの日付Ｙ上の疾病Ｘ用等のテスト）と相関する使い捨てカートリッジを可能にするバーコードが設けられている。バーコードは、一次元又は二次元バーコードであってもよい。
【００７０】
検出装置６０２は、使い捨てカートリッジ６０４上のバーコードを読み取るように位置決めバーコードスキャナを含むことができる。この情報は、マイクロプロセッサによって使用されてもよい。例えば、バーコードスキャナは、特定の使い捨てカートリッジ上のバーコードを読み取り、この使い捨てカートリッジが条件Ｘのテスト用であるかを決定することができる。検出装置６０２は、画面６１０上に、条件Ｘが意図されたテストであることを確認するようにユーザに促すメッセージを表示できる。追加的又は代替的に、検出装置は、この特定の使い捨てカートリッジが既に使い捨てカートリッジに関連付けられた独特の識別子をデータベースに照会することにより使用されたことを検出することができる。いくつかの実施例では、以前のテスト結果が搭載される。
【００７１】
図３１Ｂ及び図３１Ｃの実施例において、２台のポータブル検出装置６１６，６１８が示されている。ポータブル検出装置は、例えば、個人がフィールド状況に装置を輸送できるように寸法が決定される。このようなポータブル検出装置は、遠隔地において特に有用であり、軍事用途において特に有用性を見出す。蓋６１２は、使い捨てカートリッジを受けるためのカートリッジ駆動部を明らかにするために開く。タッチスクリーン６１４は、ディスプレイとユーザインタフェースを提供する。他の実施例では、キーボードやボタン制御ユーザインタフェースが提供される。
【００７２】
図３２の実施例において、ベンチトップ検出装置７００が示されている。単一の検出装置は、蓋部６１２ａ−ｆの下にそれぞれ、複数の使い捨てカートリッジを受け取るように構成されている。ライト７０２は各蓋に設けられ、テストが完了し、装置が使用する準備ができたときに、点灯する。例えば、赤色光はチャンバが使用中であり、緑色光はテストが完了したことを示すことができる。
【００７３】
一実施例において、検出装置６００、６１６、６１８又は７００等の検出装置は、コンピュータネットワークに接続することができる。このような一実施例では、この接続は無線接続である。得られたデータは、後続の処理のためにサーバにコンピュータネットワークを介して送信されてもよい。例えば、分析物の正又は負の検出、使い捨てカートリッジの独特の識別子、日付及び時刻、ならびにその他の関連情報を含む得られたデータは、サーバに送信されてもよい。一実施例において、検出装置は、全地球測位システム（ＧＰＳ）を備え、検出装置の地理的位置が同様に伝送される。有利なことに、これは、１つ以上の検出装置からのデータをコンパイルし、時間と地理の両方の関数としてデータを分析するサーバを可能とする。この機能は、フィールド検出装置６１６及び６１８等と組み合わせて使用する場合、は特に有用である。この情報はユーザの介入なしで送信することができるので、データ伝送プロトコルの遵守を増加させる。特定の実施例では、データが正常にネットワークに接続することができる検出装置等の時間まで、データ記憶媒体に格納されている。正常な接続が確立されると、蓄積されたデータがサーバに送信される。
【００７４】
［処理された試料の種類］  生物学的試料中の多くのタイプを処理することができる。試料調製ステップは、液体、固体、土壌試料、動物組織、昆虫の死骸、ＤＮＡ、細菌細胞、胞子及びウイルスの使用に適している。生物学的試料は、核酸を含むすべての生物学的な生物を含む。試料は、細菌、胞子、血液、組織、真菌、植物、昆虫を含むが、これらに限定されない。図３５に示すように、いくつかの異なる試料が同一のパラメータを用いて処理された。精製されたＤＮＡ、細菌細胞、胞子、ウイルス及びショウジョウバエの試料は、以下のすべての技術を用いて処理され、各試料は、磁性ナノ粒子と１００ミクロンのガラスビーズの存在下で２分間超音波処理を行った。図３５に示すようには、すべての試料タイプは類似の断片分布を示した。
【００７５】
様々なタイプの生物学的試料を使用することができるので、単一のシステムは、調製プロセスを変更することなく、多種多様な標的生物で使用することができる。さらに、試料が２つの異なる標的を含む場合でも、核酸分子は、両方の成分から精製することができる。例えば、ウイルスと胞子の両方を含む試料では、ウイルス材料が失われて胞子を効率的に溶解するためにパラメータが設定される必要があるか又は、胞子が溶解されウイルス試料を最大化するように設定される必要があり、その場合、標準的な手順は動作しないことがある。したがって、サイズ安定剤を含めることの利点は明らかである。
【００７６】
単一の試料調製技術を利用することによって、偽陰性の可能性が低減される。サイズ安定剤は核酸分子の塩基対の長さの範囲を制限するので、過剰超音波処理による材料損失の可能性が低下する。一実施例では、試料調製システムは、少量で動作し、核酸分子断片の狭い分布を生成する。一実施例では、調製システムは、剪断力を加える前に試料をフィルタリングするステップを経て、試料を通過させる。
【００７７】
［調製破砕］  一実施例において、核酸分子の放出に用いられる機械的力は音波振動である。当該音波振動は、保護的緩衝液において懸濁された断片の容器を、音波振動のソースに接触せしめることによって達成される。かかるソースは、超音波振動子又は交流電圧により活性化されるピエゾ電気的水晶であり得る。かかる装置は、当業者には周知のものである。剪断周波数は、１００００Ｈｚから１０ＭＨｚまで、望ましくは、２０ＫＨｚから４ＭＨｚまで及び望ましくは２０ＫＨｚから４０ＫＨｚまでの間であり得る。例えば、胞子等、保護された核酸分子試料の剪断を促進するために、小なるビーズは試料に添加され得る。音波によって誘起されたビーズの運動は、胞子の壁を破砕して、そこに含まれる核酸分子を放出せしめる。ビーズのサイズは、約１ミクロンから約１ｍｍまでの範囲内にあり得る。一実施例において、ビーズのサイズは、約１０ミクロンから約５００ミクロンまでの範囲内にあり得る。一実施例において、約５０ミクロンから約２００ミクロンまでの範囲内にあり得る。ビーズは、例えば、ステンレス等の金属、ガラス又はジルコニウム酸化物等の高密度金属酸化物であり得る。核酸分子を剪断するのに必要とされる時間は、部分的には、試料のサイズ及び試料からトランスデューサまで伝送された出力に依存する。しかしながら、剪断された試料が、保護的な緩衝液の成分に依存する定常状態に達するとき、さらなる超音波処理によって、核酸分子のサイズ分布において更なる変化はない。実際、１５秒から２分の超音波処理時間は、１ワットから２ワットの出力レベルにおいて、１マイクログラムの核酸分子の緩衝液を含む１００μＬの試料サイズにおいて、定常状態に至らしめるのに十分である。
【００７８】
一実施例において、直径約１００ミクロンのガラスビーズのような破砕ビーズは、試料を破砕して核酸分子を放出するために使用される。試料上の剪断力を発生させる超音波源を使用してビーズを振動させる。一実施例において、約０．１ｍｌ〜０．５ｍｌの水に約０．１％〜１％の核酸を含む試料懸濁液に対して、約３〜７ワットのレベルの超音波パワーが、約１〜３分の期間に使用される。一実施例において、試料に使用されるガラスビーズの体積は、総懸濁物の体積の約１０％〜５０％の間である。ガラスビーズを攪拌するために使用される超音波周波数は、ブランソンソニファイアー１５０（Branson Sonifier 150）等の市販の装置から従来的に２０ｋＨｚである。また、約ｌ０ＫＨｚ〜１００ＫＨｚの周波数が試料パラメータに応じて適切であることが理解される。別の実施例において、剪断力は、噴霧器又はホモジナイザにより印加される。
【００７９】
図４０は胞子試料からの核酸分子の効果的な放出を示す。胞子溶解の効率を決定するために、胞子から予想された最大の量の核酸出力が推定されて、図４０でゲルの上で測定された量と比較された。この技術を使用して、その方法において、８５−９０％の効率が見積もられた。あるいは、胞子溶解の効率は、超音波処理の後に生存する胞子を測定することによって、計られ得る。表１に示されているように、生存テストに基づいて、実験中に２分の超音波処理の後の効率は、胞子の８６％であった。
【００８０】
【表１】
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【００８１】
ユニバーサルな試料調製方法として使用されるビーズ破砕等の機械的剪断に対しては、異なる標的材料（ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質）とそれらソース（環境、血液又は生体組織）に関する操作パラメータを特徴付け且つ最適化することが、必要である。単一のシステムが異なるタイプの試料を破砕するのに適切であるもの、入力パワー及び音波扇動適用時間等の結果パラメータを最適化することは、異なるタイプの細胞に関して変動し得る。その上、サイズ安定剤の濃度、ガラスビーズのサイズ、並びに、コラゲナーゼ及びヒアルロナーゼ等の酵素の含有物のすべてが、本発明のさらなる実施形態であり、決して限定するものではないと理解される。
【００８２】
磁性ナノ粒子、ガラスビーズ又はそれら双方の組み合わせが本発明から出発することなく破砕に使用され得ると理解される。一実施例においては、磁性ナノ粒子は、鉄酸化物から形成される。一実施例において、粒子は、４０〜２００ｎｍのサイズ範囲内にある。粒子は、超音波力を使用して加速され得るし、試料を破断し得る。一実施例においては、ガラスビーズは、胞子の効率的な溶解のための抽出混合物において使用される。
【００８３】
別の実施例では、試料の調製処理は、試料の劣化を防ぐためのＲＮアーゼ阻害剤の添加をさらに含む。一実施例においては、試料の調製処理は、ジエチルピロカルボン酸（DEPC:diethylpyrocarbonate）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA:ethylene diamine tetraacetic acid）、プロテナーゼＫ又はそれらの組合せを含む。
【００８４】
［サイズ安定剤］  一実施例において、緩衝液は、破砕ステップ中生物学的試料と混合される。所定の試料サイズに維持するために、緩衝液はサイズ安定剤として機能する。サイズ安定剤は、塩類、洗浄剤、補助溶剤又はポリマーを含み得る水溶液である。サイズ安定剤によって、その後の剪断ステップにおいて、過小であるため、分子交雑、遺伝子配列決定、合成酵素連鎖反応（ＰＣＲ）増幅等の操作において有用でない核酸分子の断片が生成されることが防止される。分子交雑において、約１８の塩基対よりも小なる核酸分子の断片は、特定性を喪失し、常温で不安定である。遺伝子配列決定法とＰＣＲ応用に対して、約２００〜約５００の塩基対からの核酸分子断片が、望ましい。純水緩衝液を使用することによって、約１００の塩基対よりも小なる核酸分子断片が与えられる。これは、多くの応用に対して過小である。
【００８５】
本発明の試料調製でのサイズ安定剤の添加は、限られたサイズ範囲の核酸の高収量結果をもたらす。本発明のサイズ安定剤は、洗浄剤、界面活性剤及び石鹸が含まれている。適切な安定剤の例としては、アニオン性界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムが挙げられる。サイズ安定剤は、約０．１％と１０％の間の量で超音波処理した懸濁液中に存在する。別の実施例では、サイズ安定剤は、約０．２％から２％の間の量で存在する。さらに別の実施例では、サイズ安定剤は、約０．５から１．５％の間の量で存在する。
【００８６】
サイズ安定剤の使用によって、所望の塩基対範囲において核酸分子断片を収集することが可能となる。従来のビーズ破砕処理において、所望の塩基対範囲内の核酸分子断片の量を最大化するために要する特定時間の後、機械的剪断力は、オフにされる。しかしながら、処理が時間敏感であるので、広範囲の長さを有する塩基対が試料に存在していたままで残存する。サイズ安定剤を利用することによって、試料の大部分の塩基対長は、所望の塩基対範囲に収まるよう断片化され得る。一実施例においては、核酸分子の少なくとも６０％は、試料における、メディアン核酸分子断片塩基対の長さの５０％以内の長さにある。前述とは別に、メディアン核酸分子断片が４００の塩基対を有する場合、試料の６０％は、２００〜６００の塩基対を有するだろう。別の実施例では、前記核酸分子の少なくとも７５％は、試料における、メディアン核酸分子断片塩基対の長さの５０％以内の長さにある。さらに別の例示実施形態において、前記核酸分子の少なくとも７５％は、試料における、メディアン核酸分子断片塩基対の長さの３０％以内の長さにある。
【００８７】
サイズ安定剤が存在しない場合、核酸分子は、超音波処理等の機械的力を印加するときに、劣化する傾向がある。サイズ安定剤が存在している状態で、超音波ビーズ破砕は、核酸分子を、１００の塩基対長よりも短い短断片に剪断する（図３４，レーン５及び６を参照されたい）。ほとんどの適用に対しては、断片は、１００の塩基よりも大である必要がある。図４２に示されているように、精製されたＤＮＡ及びＲＮＡによって剪断されたポリマーを、４００塩基よりも小さくなるように超音波処理する一連のテストが実行された。かかるテストは、長時間の超音波処理下においてさえも実行された。複合試料において、核酸分子は、より小なる断片まで分解しつつ、細胞膜及びタンパク質に吸着する。この問題を克服するために、溶解緩衝液は、ナトリウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）等の洗浄剤等のサイズ安定剤を含むように、修飾される。図３４に示されているように、レーン３及び４に示されたサイズ安定剤の添加によって、核酸分子が過剰剪断されることが防止される。サイズ安定剤のない試料は、レーン５及び６に示されているように、１００未満の塩基にまで剪断された。
【００８８】
サイズ安定剤は、保護的な緩衝溶液に含まれる。保護的な緩衝溶液は所望の範囲の塩基対を得るために多数のサイズ安定剤を含み得ると理解される。保護的な緩衝溶液において使用され得る塩類は、リン酸ナトリウム、グアニジウム塩酸塩及びデキストラン硫酸を包含する。さらに保護的な緩衝溶液は、例えば、ナトリウムドデシル硫酸、ナトリウムドデシルベンゼン硫酸及びポリエチレングリコール等の洗浄剤を含み得る。ＡＬＫＡＮＯＬ（登録商標）ＸＣ等の多くの市販の陰イオン界面活性剤も使用され得る。別の実施例では、保護的な緩衝溶液は、補助溶剤を含む。補助溶剤は、例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、ヘキサメチルリン酸アミド及びテトラメチル尿素等のダイポールアプロチック溶媒を含む。別の実施例では、保護溶液は、例えば、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸及び他の高分子酸等のポリマーを含む。塩類、洗浄剤、補助溶媒及びポリマーの濃度は、１０ｍＭから５Ｍまでの範囲内にあり得るし、望ましくは１００ｍＭから１Ｍまでである。本発明の他のサイズ安定剤は、グアニジウムチオシアネート等のカオトロピック塩を含む。かかる塩類は、核酸に関連付けられたタンパク質の通常の折り重なりを破粋せしめて、自由形状の核酸を放出すると知られている。
【００８９】
別の実施例では、サイズ安定装置の存在はリボ核酸をも安定せしめる。ＳＤＳ及びグアニジニウムチオシアン酸塩は、試料内のＲＮＡｓｅｓを破砕せしめて、ＲＮＡを保護する。
【００９０】
［断片化核酸の清浄］  一実施例において、方法はさらに、核酸分子を浄化するのに必要なステップを含む。核酸分子の解放と有用なサイズ範囲の剪断後に、細胞デブリ、タンパク質、超音波処理ビーズ及び保護緩衝液から核酸分子を浄化することは、後続の核酸分子の操作及び手順と適合する緩衝液中の精製核酸分子の溶液を提供するために、有利である。
【００９１】
一実施例において、追加の濯ぎステップが試料を精製するために使用される。濯ぎステップは、核酸分子の結合を阻害し得る化合物を除去する。適切なリンス液としては、に限定されるものではないが、エタノール等のアルコール溶液がある。試料は、追加の沈降緩衝液又は複合体を妨害しない洗浄緩衝液で洗浄することができる。洗浄後、緩衝液は、試料から排出され、精製濃縮試料が得られる。
【００９２】
一実施例において、核酸分子は、試料の残りからそれらを磁気的に分離することによって洗浄される。核酸分子は、磁性ナノ粒子に結合する。一実施例では、結合は高い塩／アルコールの状態で起こり、核酸分子は上昇した温度でのクエン酸ナトリウム等の低塩キレート緩衝液を用いて溶出される。一実施例において、試料は、溶出の収率を増加させるために、少なくとも６０℃に加熱する。
【００９３】
磁性ナノ粒子が核酸に一旦付着された後、磁場が反応チャンバに印加される。磁場の印加は、磁性ナノ粒子と付着したすべての標的分析物を反応チャンバの一部に集中させる。試料は試料チャンバの濃縮領域から引き出され、抽出された体積の量と比較して大量の標的分析物を提供する。試料を濃縮することによって、より高感度のテストが実行できる。
【００９４】
別の実施例では、残りの試料がチャンバから除去されるので、磁場が磁気ナノ粒子を安定に保持している。磁性ナノ粒子と標的分析物との結合力は、標的分析物が除去されるのを防止するのに十分である。磁石は、磁場を生成するために利用される。磁石は磁性ナノ粒子を引っ張ったり、押したりすることができる。磁石は磁性ナノ粒子の試料を凝集又は濃縮して、すなわち磁性ナノ粒子を導くことによって拡散プロセスをスピードアップすることができる。
【００９５】
一実施例において、磁性ナノ粒子は、標的分析物と一緒に試料チャンバ内に配置される。磁性ナノ粒子は、標的分析物に対する親和性を有する。標的分析物に磁性ナノ粒子を付着させて磁場を印加することによって、標的分析物が試料チャンバ内の所望の位置に操作される。
【００９６】
一実施例において、沈降緩衝液は、標的分析物の断片及び磁性ナノ粒子を有する溶液である。沈降緩衝液は標的分析物を析出し、標的分析物は磁性ナノ粒子へ引かれる。沈降緩衝液は、これから標的分析物を沈殿させる任意の緩衝液であることができる。タンパク質について、適切な沈降緩衝液の例としては限定されるものではないが、例えば硫酸アンモニウム、トリクロロ酢酸、アセトン又はクロロホルムとメタノールの混合物等の有機沈殿剤が挙げられる。核酸分子に適した沈降緩衝液としては限定されるものではないが、水混和性有機溶媒、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロフランが挙げられる。沈殿緩衝液の例が提供されるが、任意の適切な沈降緩衝液が本請求項に係る発明を偏向することなく利用できることが理解される。
【００９７】
一実施例においては、分散化した磁性ナノ粒子が試料に添加される。混合物は、結合を促進するために約６０℃で培養される。沈殿緩衝液は、混合物に添加される。核酸分子及びマグネタイトの結合された合成体は、磁場中で収集される。一実施例においては、合成体は容器の側壁で収集される。よって、結合されていないあらゆる固体が、除去を容易にせしめるために、容器の底まで落下し得る。緩衝液及び結合されていない固体が、試料から除去される。
【００９８】
核酸分子の更なる処理のために、いくつかの処理において、マグネタイト粒子を除去する必要がある。一実施例において、核酸分子は、溶出緩衝液とその合成体の混合物を９５℃まで加熱することによって、核酸分子及びマグネタイトの合成体から溶出される。マグネタイトは、磁場又は遠心沈殿により収集されて、精製された核酸分子が溶出緩衝液において提供される。一実施例において、溶出緩衝液は、鉄酸化物表面と強く相互作用する塩類を含む。好ましい緩衝液は、リン酸塩水溶液及びクエン酸塩水溶液である。
【００９９】
別の実施例では、磁性ナノ粒子は超常磁性ナノ粒子を含む。超常磁性ナノ粒子には、酸化鉄のような金属酸化物が挙げられる。一実施例において、磁性ナノ粒子は、マグネタイトナノ粒子（Ｆｅ3Ｏ4）である。マグネタイト粒子は、性質において一般的であり、磁石を用いてスクリーニングすることによって、海辺の海砂から収集され得る。これら粒子を研摩すると、比較的粗い磁性粉末が生成されるであろう。より小なるサイズの粒子は、混合された第二鉄塩化物及び第一鉄塩化物の溶液を、ナトリウム若しくは水酸化アンモニウムの攪拌された水溶性アルカリ性水溶液に添加することによって、製造され得る。より小なるサイズの粒子は、ヘキサデカンジオール、オレイルアミン及びオレイン酸の存在下において、ジベンジルエーテルにおける鉄アセトニルアセトナートの熱分解によって生成される。マグネタイトを製造する多数の方法が、知られている。例えば、Ｓｕｎ他は、混合された第二鉄塩化物及び第一鉄塩化物の混合物を、攪拌アンモニアにゆっくりと添加するステップを開示している（Langmuir, 2009, 25 (10), pp 5969-5973.）。米国特許第４，６９８，３０２号において、第二鉄塩化物及び第一鉄塩化物を水酸化ナトリウムに混合するステップが教唆されている。Ｓａｍａｎｔａ他は、不活性雰囲気においてアンモニアを第二鉄塩化物及び第一鉄塩化物に添加するステップを開示している（Journal of Materials Chemistry, 2008, 18, 1204-1208.）。Ｄｕａｎ他は、マグネタイトナノ粒子を形成する錯体を形成するために、３００℃まで加熱して、オレイン酸における酸化鉄を溶解するステップを教唆している（J. Phys. nucleic acid molecule Chem.C, 2008, 112(22), pp 8127-8131.）。さらに、Ｙｉｎ他は、オレイン酸の存在下において、鉄カルボニルを熱的に分解するステップを開示している（Journal of Materials Research, 2004, 19, 1208-1215.）。
【０１００】
適切な結合性緩衝液が、溶液に任意に添加される。核酸分子／マグネタイト合成物に対する結合性緩衝液は、概ね、核酸分子が不溶である緩衝液である。核酸分子の沈殿は、マグネタイト粒子に対する核酸分子の結合を促進する。核酸分子及びマグネタイト合成物に対する結合性緩衝液は、水、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、エタノール、プロパノール、ブタノール、グリコーゲン若しくは他の糖類、ポリアクリルアミド又はそれの混合物を含み得る。一実施例においては、結合性緩衝液はイソプロパノールである。
【０１０１】
マグネタイト粒子に対する核酸分子の結合は、瞬時的ではない。一実施例においては、混合物は、結合処理を促進せしめるために、室温より高温で培養される。
【０１０２】
［磁気操作］  一実施例において、磁石１１４は、電場を生成するために利用される。磁石は、円筒状インサートにて磁性ナノ粒子を引いたり、押すことができる。磁石１１４は、磁性ナノ粒子の試料を凝集又は濃縮して、すなわち磁性ナノ粒子を導くことによって拡散プロセスをスピードアップすることができる。
【０１０３】
磁性ナノ粒子は、標的分析物（例えば、標的核酸）に沿って試料チャンバに配置される。磁性ナノ粒子は、標的分析物に対する親和性を有する。標的分析物に磁性ナノ粒子を付着させて磁場を印加することによって、標的分析物が試料チャンバ内の所望の位置に操作される。
【０１０４】
一実施例において、標的分析物の結合要素は、少なくとも１つの中間連結基を介して、磁性ナノ粒子に結合されているが、リンカー、足場、安定剤又は立体安定剤に限定されるものではない。
【０１０５】
磁性ナノ粒子の磁気特性を呈する。一実施例において、コバルト、ニッケル、鉄又はこれらの組み合わせが磁性ナノ粒子を作成するために使用される。一実施例では、磁性ナノ粒子は、さらに、触媒粒子を含有する。一実施例では、触媒粒子は、パラジウム、白金、銀又は金である。
【０１０６】
１つの形態において、フラナガン他、ラングミュア Langmuir, 2007, 23, 12508-12520に記載されているように、４−ジメチルアミノピリジンの表面層によって安定化されたニッケル−パラジウムナノ粒子は、複数のエチジウムブロマイドインターカレーター分子、複数の吸着によって処理され、核酸結合部位を生成する。
エチジウム部分は核酸ポリマーに結合し、それによってニッケル−パラジウムナノ粒子を核酸ポリマーに付ける。
【０１０７】
他の形態において、オリゴエチレングリコール（ＰＥＧ）等の単純な直鎖状の骨格分子は、一方の端部にて核酸結合要素で、他端にてリンカーで固定されている。核酸結合要素は核酸ポリマーに結合し、リンカーは磁性ナノ粒子に結合する。核酸結合要素は、エチジウムブロマイド又はジスタマイシン等のマイナーグルーブバインダー等のインターカレーターである。リンカーは、フェナントロリン誘導体である。Hainfeld, J. Structural Biology, 127, 177-184 (1999)は、パラジウム粒子の作成にフェナントロリン誘導体の利点を報告している。足場は、図示のように、単純な二官能性直鎖状であってもよく又は複数のナノ粒子又は核酸結合要素を接続する多官能性分岐状足場であってもよい。核酸結合要素は核酸ポリマーに結合に結合し、それによってナノ粒子を核酸ポリマーに付着する。また、付加的な核酸結合要素と中間連結基が範囲内であり、使用されてもよいことが理解される。
【０１０８】
［標的分析物の凝集］  標的分析物を含む試料は反応チャンバ内に配置されている。反応チャンバには、試料と磁性ナノ粒子の両方が含まれている。磁性ナノ粒子は、標的分析物に結合する。一実施例において、反応チャンバは、標的分析物へのアクセスを提供するために試料を破砕するのを助ける破砕ビーズを更に含む。
【０１０９】
核酸分子が解放されたら、核酸分子は、試料の残部から磁気的に分離することができる。核酸分子は、磁性ナノ粒子に結合する。一実施例では、結合が高い塩／アルコールの状態で起こり、複合体を形成する。複合体は、温度上昇とクエン酸ナトリウムのような低塩キレート緩衝液を用いて溶出される。一実施例では、複合体は、溶出の収率を増加させるために、少なくとも９５℃に加熱される。
【０１１０】
磁性ナノ粒子が標的分析物に付着されると、磁場は、反応チャンバに印加される。磁場の印加は、磁性ナノ粒子とこれに接続されているすべての標的分析物を、反応チャンバの一部に集中させる。試料は試料チャンバの濃縮領域から引き出され、抽出された容積に比較して大量の標的分析物を提供する。試料を濃縮することによって、より高感度のテストが予備形成することができる。
【０１１１】
別の実施例では、残りの試料がチャンバから除去されるので、磁場が磁気ナノ粒子を安定に保持している。磁性ナノ粒子と標的分析物との結合力は、標的分析物が除去されるのを防止するのに十分である。いくつかの実施例では、追加の濯ぎステップが試料を精製するために使用される。
【０１１２】
［迅速な動きと増加した感度］  一般的に、溶液中の標的分析物は、流体の流れと拡散速度によって動きが制限される。システムを通して標的分析物の移動を高速化するために、磁場が磁性ナノ粒子を所望の位置に進行させるために印加される。磁場の印加は、１つのチャンバから別の標的分析物の迅速な移送を可能にする。
【０１１３】
センサのアレイは、標的分析物を迅速に検出するために使用される。磁場は磁性ナノ粒子と付着した分析物を第一のセンサの近傍に案内するために印加される。明確な磁場は、磁性ナノ粒子と接続されているすべての標的分析を第二のセンサに案内する。磁場は、アレイ内の各センサに標的分析物を移動させるために操作される。一実施例では、センサは、磁場による結合の破壊を防ぐために十分な力で、特定の標的分析物に結合する。体系的に磁場を印加することにより、分析時間が通常の拡散分析と比較して大幅に低減される。
【０１１４】
［磁性ナノ粒子］  磁性ナノ粒子のゾル又はクラスタの形態での使用は、標的核酸ポリマー又は他の標的分析物の磁性材料の付着を可能にする。試料に磁場を印加することによって、核酸ポリマーは、添付の常磁性体材料を介して操作することができる。
【０１１５】
常磁性ナノ粒子は、安定剤を含む溶液中で形成される。一実施例において、金属塩が用いられる。ジメチルアミンボラン又は水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤が、溶液に添加される。必要に応じて、溶媒及び過剰の塩は、金属クラスタの遠心分離、デカンテーション、洗浄及び再懸濁することによって除去されることができる。排出と濯ぎが与えられる代わりに、磁性ナノ粒子を所定の位置に保持するように磁場が溶液に印加され得る。
【０１１６】
［標的分析物結合要素］  標的分析物結合要素は、直接又は中間の連結基を介して、磁性ナノ粒子に付着する。さらに、標的分析物結合要素は核酸ポリマーに結合する。一実施例では、標的分析物の結合要素は、分子、断片又は核酸ポリマーに結合する官能基等の核酸結合要素である。潜在的な核酸結合要素は、インターカレーター、マイナーグルーブバインダー、カチオン、アルデヒドとアルキル化剤等のアミン反応基、タンパク質及び界面活性剤の疎水性基との関連等を含む。また、アルデヒド官能基は、核酸中の遊離アミンと反応して、接続を作成するために使用される。このようなマイケル付加反応において使用する求電子剤のような他のアミン反応性基が好適である。
【０１１７】
インターカレーターとマイナーグルーブバインダー構造の基礎を形成する構造の例は次の式とおりである。
【０１１８】
【化１】
2018186816.tif 000004
【０１１９】
特定のインターカレーターとマイナーグルーブバインダー構造の範囲は、分野として５０年以上の激しい研究の対象となっているようには、膨大である。R. Martinez and L Chacon-Garcia, Current Medicinal Chemistry, 2005, 12, 127-151を参照してください。従って、Ｒ基は、有機官能基の広い範囲を含む。Ｒが、水素結合性、カチオン性又は親水性の特徴が含まれている場合、多くの場合、相互作用を高めることができる。
【０１２０】
さらに、ポリエチレンイミン等カチオン性ポリマー等の化合物は核酸と相互作用し、かつＸｕ他、InternationalJournal of Nanoscience、2006、5、753-756及びピーターセン他、バイオコンジュゲートケミストリー、２００２、１３、８４５から８５４（Xu et al, International Journal of Nanoscience, 2006, 5, 753-756 and Petersen et al, Bioconjugate Chemistry, 2002, 13, 845-854）によって証明されるように、遺伝子キャリアとして提案されている。タンパク質は有用な核酸の相互作用を提供し、核酸にナノ粒子を付着させるための基礎となり得る材料の別の周知のクラスである。核酸上の官能基との直接反応は、本発明の範囲内である。例えば、アミン基はアルデヒドと反応して、結合を生成させることができる（Braun et al, Nano Letters, 2004, 4, 323-326）。
【０１２１】
一実施例において、核酸結合成分は、一本鎖核酸分子と結合しないが具体的に二本鎖核酸分子を標的とする特異的結合剤である。例えば、副溝結合化合物は、具体的には、分子交雑した二本鎖ＤＮＡ分子に結合するが、一本鎖オリゴヌクレオチド捕獲プローブに結合しない。対照的に、塩化パラジウム試薬は無差別に標的分子と捕獲プローブの両方に結合する。非標的分子に対するほとんど又は全く親和性を有しつつ、結合要素は、標的核酸分子に特異的に結合する。これは、特異的結合要素が含まれ得るが、インターカレーター、副溝結合化合物、主要な溝結合化合物、抗体及びＤＮＡ結合タンパク質に限定されるものではないことを理解されたい。特異的結合要素は、非所望の領域に結合することなく、標的核酸上の特定の部位に結合する。一実施例において、特異的結合要素は、臭化エチジウムである。代替の実施例では、特異的結合要素はジスタマイシン、イダルビシン又はヘキスト色素である。
【０１２２】
一実施例において、  本明細書の他の箇所に記載されるよう、核酸結合要素はまた、安定剤として機能する。
【０１２３】
［安定剤］  一実施例において、磁性ナノ粒子は、表面の所望の特性を付与するために安定剤で官能化されている。これらの安定化された磁性ナノ粒子は、コロイド安定性、最小限の非特異的結合を示す。さらに、溶液中の安定剤の存在は、磁性ナノ粒子を形成しつつ、ナノ粒子サイズを制御する。
【０１２４】
安定剤は、コロイド安定性を提供し、磁性ナノ粒子の凝集や沈降を防止する。安定剤は、さらに、形成プロセス中に磁性ナノ粒子のサイズを制限するのに役立つ。一実施例では、金属磁性ナノ粒子は、安定剤と金属イオンを含む溶液中で形成されている。一実施例において、安定剤は、化合物はキレート化剤である。大きな磁性ナノ粒子は、それらが溶液から沈殿する可能性が高いので望ましくない。したがって、磁性ナノ粒子は、溶液中に残存するのに十分小さくなければならない。一実施例では、磁性ナノ粒子は、形状が略球形で約０．５〜１０００ｎｍの直径を有する。一実施例では、磁性ナノ粒子は形状がほぼ球形であり、直径約１〜１００ｎｍを有する。
【０１２５】
好適な安定剤としては、限定されないが、ポリエチルオキサゾリン、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrollidinone）、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリエステルアイオノマー、シリコーンイオン性ポリマー、イオン性ポリマー、コポリマー、デンプン、アラビアゴム、界面活性剤、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、フッ素含有界面活性剤及び糖が挙げられる。一実施例では、安定剤は以下の式のフェナントロリン類、ビピリジン類、オリゴビニルピリジン（oligovinylpyridine）類が挙げられる。
【０１２６】
【化２】
2018186816.tif 000005
【０１２７】
磁性ナノ粒子がパラジウムを含んでいる一実施例では、これらの安定剤は、パラジウムイオンに対するリガンドとして作用することにより、リンクし、従って密接粒子形成と関連している。リンクに加えて、安定剤が水相と相互作用し、親水性基を有する。パラジウム粒子形成におけるフェナントロリン類等の分子のリンクと安定化の機能は、さらに Hainfeld, J. Structural Biology, 127, 177-184 (1999)に記載されている。
【０１２８】
水中の材料（プラスチック、顔料、油等）の広いクラスから派生した粒子は、特定の配位に依存していない界面活性剤及び分散剤の幅広いアレイにより安定化され得ることが理解される。安定剤のこれらのクラスも、本発明の範囲内である。
【０１２９】
一実施例では、安定剤は、析出、凝固から磁性ナノ粒子を安定化させ、そしてランダム表面への非特異的結合を最小限に抑える。別の実施例では、安定剤は、以下に説明するように核酸結合要素としてさらに機能する。
【０１３０】
［リンカー］  リンカーは磁性ナノ粒子に直接結合し、他の中間連結基又は標的分析物結合要素の付着を可能にする。リンカーはまた、安定剤又は足場としての役割を果たすことができることが理解される。
【０１３１】
リンカーは、様々な結合エネルギーを介して結合することができる。全結合エネルギーはすべて共有結合、イオン結合、エントロピー、ファンデルワールス及び磁性ナノ粒子へのリンカーを結合する他の力の合計で構成されている。一実施例では、リンカー及び磁性ナノ粒子との間の全結合エネルギーは、約１０ｋＪ／モル以上である。他の実施態様では、リンカーと磁性ナノ粒子との間の全結合エネルギーは約４０ｋＪ／モル以上である。適当なリンカーとしては、限定されるものではないが、リガンド、フェナントロリン、二座配位子、三座配位子、ビピリジン、ピリジン、トリピリジン、ポリビニルピリジン、ポルフィリン類、ジスルフィド類、アミンアセトアセテート、アミン、チオール、カルボン酸、アルコール及び疎水性基が挙げられる。
【０１３２】
［足場組成物］  磁性酸結合要素は、磁性ナノ粒子又はリンカーに直接接続されてもよい。あるいは、核酸結合要素は、個々に又は多重度に、足場に取り付けられている。核酸の特異的認識結合及び取り付けられた磁気ナノ粒子のいずれの場合も、最終的なコンジュゲートは、２つの本質的な特性に恵まれている。足場への核酸の結合要素を取り付けることは、例えばエステル、アミド等のような一般的な有機結合基のいずれかの方法によることができる。
【０１３３】
一般的な足場への取り付けは、可能なサイズ、形状、構造や追加機能の巨大な範囲を作成する。一実施例では、足場組成物は、両端に２つの官能基を有する線状鎖である。鎖部自体は、任意の組成、長さ及びオン性のものであってもよい。以下の式の例に含まれる代替の実施例では、多くの場合、生物学的用途で使用される、反応性アミン、酸又はアルコール末端基を有するポリエチレングリコールが使用される。
【０１３４】
【化３】
2018186816.tif 000006
【０１３５】
カチオン性短直鎖スペーサは、それらがインターカレーション性能を向上させることができるので、望ましい。
【０１３６】
【化４】
2018186816.tif 000007
【０１３７】
ポリマー又はオリゴマーの足場は、直鎖のサイズのみによって制限される同じ構造で結合されるべき複数基を可能とする。
【０１３８】
【化５】
2018186816.tif 000008
【０１３９】
短鎖及び長鎖の構造の足場のほかには、分枝状又は非常に高度に分岐した構造を使用して構築することができる。さらに、足場は、膨潤ポリビニルピリジンル内部に結合したナノ粒子を有するミクロゲル粒子とすることができ、周辺の核酸結合要素が図示されている。別の実施例において、足場は、磁性ナノ粒子の中心及び周辺の表面に移入した核酸認識基を有するコア−シェルラテックス粒子である。また、任意の足場組成物は、中間接続基、磁性ナノ粒子又は核酸結合要素に接続するために組み込まれ得ることが理解される。
【０１４０】
［立体安定剤］  一実施例において、立体安定剤は、磁性ナノ粒子に標的分析物結合要素を取り付けるために使用される。立体安定剤は、上記のように安定剤、リンカー及び足場として機能することができる。一実施例において、立体安定剤は、ポリエチレンイミン、ポリエチルオキサゾリン又はポリビニルピロリドンである。立体安定剤は、少なくとも１０ｋＪ／モルの全結合エネルギーを有する磁性ナノ粒子に結合する。別の実施例において、立体安定剤は、少なくとも４０ｋJ／モルの全結合エネルギーを有する磁性ナノ粒子に結合する。立体安定剤の使用は、異なる安定剤、リンカー又は足場の必要性を排除する。１つ又は複数の核酸の結合要素は、立体安定剤に結合させることができる。さらに、１つ又は複数の磁性ナノ粒子は、立体安定剤に結合させることができる。
【０１４１】
［標的分析物結合物質］  磁性ナノ粒子上の標的分析物結合性物質を形成する一実施例では、磁性ナノ粒子は、例えば、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等の安定剤を含む溶液中で形成される。安定化された磁性ナノ粒子は精製され、所望の大きさのクラスタを保持する。ナノ粒子は、その後、臭化エチジウム等の核酸結合要素で又はリンカーに接続された核酸結合要素で又は核酸結合要素を含む足場組成物で、直接処理される。足場組成物は、ナフタルイミド又はアクリジン等の核酸結合成分を含むポリマーであり得る。ポリマーは、ＤＭＡＰの一部を置換し、粒子に付着する。また、要素を結合する核酸は、化学的に粒子に足場組成物の付着の前に足場組成物に取り付けることができることが理解される。
【０１４２】
磁性ナノ粒子上の標的分析物結合物質を形成する別の実施例では、磁性ナノ粒子は溶液中で、臭化エチジウム等の核酸結合要素の存在下で又はリンカーに接続された核酸結合要素の存在下で又は核酸結合要素を含む足場組成物の存在下で、形成される。足場組成物は、ナフタルイミド又はアクリジン等の核酸結合成分を含むポリマーであり得る。また、核酸結合物質が粒子形成プロセスの間に粒子に接続して、分散液に、いくつかのコロイド安定性を提供し得ることが理解される。また、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、水溶性オリゴマー及びポリマーの形態の安定剤はまた、コロイドの安定性及び制御粒度を高めるために添加することができる。
【０１４３】
一実施例において、核酸分子は、調製後のＰＣＲ適用のために使用される。これは、ＰＣＲ適用は洗剤やアルコールの存在下で正常に動作しないことが知られている。したがって、ＰＣＲ適用及び追加のフィルタリング又は洗浄ステップのためにテスト前に試料を調製するために利用される。
【実施例】
【０１４４】
［超音波処理ビーズ破粋］  胞子が調製され、胞子形成媒体＋からの枯草菌から分離された。培養液から取られた胞子の１００μＬのアリコートに対して、等容積である０．１ｍｍのガラスビーズが、マイクロフュージチューブ内に添加された。マイクロフュージチューブの先は、ブランソン超音波処理器のソケットに、載置された。２の出力設定を使用して、チューブ内のビーズは、２分間、激しく動かされた。その後、グラム染色は、胞子のうちの９０％以上がこの処理によって破粋されたことを示した。これは、この処理を生存した胞子から形成されたコロニーを計数することによって、プレーティング分析を用いて確認された。放出されたＤＮＡの量に関する推定が、溶解物のアリコートを、１ｍｇ／ｍｌのエチジウム臭素を含む１％のアガロースゲルの表面に対して滴下することによって、得られた。Bio-Rad Fluor-Sイメージャは、ゲル表面で染みなって周知の標準量ＤＮＡに対する試料蛍光の強度を比較した。この技術を使用して、約１０ｎｇのＤＮＡが、２．５×１０5の胞子から分離され得る。
【０１４５】
［磁気的実施例］  少量のパラジウム塩と金属塩（ニッケル、コバルト、鉄）を、安定剤（フェナントロリン、ビピリジン、ポリビニルピロリジノン）とともに、溶媒（水及び／又は極性有機溶媒）に溶解する。還元剤（ジメチルアミンボラン、水素化ホウ素ナトリウム）を添加し、そして、金属クラスタが形成されるまで混合物を保持する。必要に応じて、遠心分離、デカンテーション、洗浄及び金属クラスタの再懸濁によって、溶媒及び過剰の塩を除去することができる。
【０１４６】
溶液Ａ−２４ｇの塩化ニッケル六水和物と４４ｇのクエン酸ナトリウムを５００ｍｌの水に溶解した。
【０１４７】
溶液Ｂ−２４ｇのエタノールアミンを５００ｍｌの水に溶解した。
【０１４８】
溶液Ｃ−５ｇの塩化コバルト六水和物を水１００ｍｌに溶解した。
【０１４９】
溶液Ｄ−２ｇのカリウムテトラクロロパラダート（tetrachloropallidate）及び６ｇの塩化カリウムを１００ｍｌの水に溶解した。
【０１５０】
溶液Ｅ−１ｇのバソフェナントロリンジスルホン酸、二ナトリウム塩の水和物を１００ｍｌの水に溶解した。
【０１５１】
溶液Ｆ−３ｇのジメチルアミンボランを１００ｍｌの水に溶解した。
【０１５２】
［磁気的実施例１］  ２０ｍｌのガラスバイアル中にて、１ｍｌの溶液Ａと１ｍｌの溶液Ｂを混合した。０．１ｍｌの溶液Ｄを加え、すぐ後０．２ｍｌの溶液Ｅを加えた。次いで、０．５ｍｌの溶液Ｆを加えて、混合物を３０分間６０℃で保持した。室温に冷却後、混合物を１０秒間、強い磁場に置いた（磁場は廃棄コンピュータのハードドライブから削除した永久磁石からであった）、そして金属クラスタの大部分は磁石最寄りのバイアルの壁に移動することが観察された。
【０１５３】
［磁気的実施例２］  ２０ｍｌのガラスバイアル中で、０．２ｍｌの溶液Ａと０．８ｍｌの溶液Ｃと１ｍｌの溶液Ｂを混合した。０．１ｍｌの溶液Ｄを加え、すぐ後０．２ｍｌの溶液Ｅを加えた。次いで、０．５ｍｌの溶液Ｆを加えて、混合物を３０分間６０℃で保持した。室温に冷却後、混合物を１０秒間、強い磁場に置いた（磁場は廃棄コンピュータのハードドライブから削除した永久磁石からであった）、そして金属クラスタの大部分は磁石最寄りのバイアルの壁に移動することが観察された。
【０１５４】
［マグネタイトクラスタの調製例］  塩化第二鉄（０．８Ｍ）、塩化第一鉄（０．４Ｍ）及び塩酸（０．４Ｍ）からなる第一の溶液が、混合されて、０．２ミクロンのフィルタにかけられた。第二の溶液は、水で７２ｍｌの水酸化アンモニウム（３０％）が１リットルとなるように調製された。
【０１５５】
１ｍｌの塩化第二鉄／塩化第一鉄溶液が、２０ｍｌのアンモニウム水酸化物水溶液を攪拌するのに、添加された。攪拌は、１５秒継続された。（２０ｍｌのバイアルの）溶液は、強磁石上に載置され、１分間、置かれた。その後に、すべての生成物が、バイアルの下部に引っ張られた。透明な上澄み液が、静かに注がれ、水と置換され、混ぜられ、磁石の近くで載置された。再び、生成物は、バイアルの下部に引っ張れた。この処理は、残留アンモニウム及び鉄塩が全くない生成物を洗浄するために、３回繰り返された。バイアルは、２０ｍｌの水で満たされて、５分間、４ワットの出力にて、超音波処理された。懸濁液は、１ミクロンのガラス濾過器を介してフィルタにかけられ、マグネタイト粒子の安定懸濁液が得られた。マグネタイト粒子は、磁場又は遠心沈殿によって引き下げられるまで懸濁液に残存する。
【０１５６】
［磁性ナノ粒子の付着の例］  核酸分子は、ショウジョウバエから精製され、その後、磁気分離及び溶出したフェライトナノ粒子で溶解した。磁気ビーズは、使用可能な核酸分子の９０％以上を捕獲した。
【０１５７】
［プローブを捕獲する分子交雑の例］  核酸分子が調製されたら、それらはセンサ電極上のプローブを捕獲するために分子交雑させられる。バチルス細胞からの核酸分子の試料は、超音波溶解と磁気濃縮によって調製した。溶出したＤＮＡは、分子交雑のない阻害剤が存在しないことを実証するために、センサチップ上のプローブに結合させた。
【０１５８】
［試料清浄］  一実施例において、試料は、潜在的に、センサへの核酸分子の結合を阻害し得る化合物を除去するために洗浄される。磁性ナノ粒子を試料に付着させ、磁場で試料を操作することにより、双方を濃縮し、不純物を洗浄した。
【０１５９】
［清浄例］  土壌と混合した細菌及び胞子の試料は、複合試料を評価するために処理された。土壌は、ＰＣＲベースのシステムを阻害することが知られている複雑な媒体である。土壌は６匹の全ショウジョウバエを含む試料に加えられた。該ハエは、マラリアのような疾患を運ぶために評価されるかもしれない昆虫を表すことを意図している。土壌の最大３２０マイクログラムの試料のミリリットルごとに追加された。ショウジョウバエは溶解され、ＤＮＡ及びＲＮＡは、エタノール添加したフェライトナノ粒子を用いて捕獲された。磁性ナノ粒子は、磁気的に収集され、次いでマグネで濃縮汚染物質を除去するために緩衝液、エタノールで洗浄された。核酸分子は、その後、ＤＮＡ成分を変性させるために９０℃で分子交雑緩衝液で溶出させた。第二鉄ナノ粒子は、土壌の存在下で成功した。試料内の土壌のレベルが１００マイクロリットル当たり３２ミリグラムに達する（ここで、溶液が粘稠になり、粒子の移動が困難である）まで、最小限の損失が見られた。
【０１６０】
［複合試料からのＤＮＡ例］  バシラス細胞が、牛の耳の生体組織又はショウジョウバエと混合された。混合物は、試料調製処理を介して得られた。得られた核酸は、センサチップで観察するために分子交雑された。チップは、分子交雑されたＤＮＡを検出するために、ＹＯＹＯ−Ｉ色素を用いて処理された。細胞における標的ＤＮＡ配列は、別々に処理されたバシラス細胞と同程度のレベルにて、センサチップに分子交雑された。バシラス細胞のいない負の制御は、分子交雑されたＤＮＡを全く示さなかった。実験は、試料に添加された上述の土壌を用いて繰り返された。少なくとも６０％の分子交雑を残す分子交雑効率が、真核生物細胞及び土壌がない試料において示した。
【０１６１】
［粒子を流液で洗浄する例］  磁性ナノ粒子はＤＮＡに結合され、溶液は２ｍｍの直径を有する透明なプラスチックチューブに導入された。磁石は、チューブの中心下に載置された。洗浄緩衝液は、シリンジポンプを使用してチューブに押し込められた。粒子は、洗浄を介して、見たところ、その場所に留まった。洗浄後、磁石が除去され、磁性ナノ粒子はチューブから洗浄された。ＤＮＡは高温にて溶出されゲル上で動かされた。顕著なＤＮＡの損失は観測されなかった。
【０１６２】
［磁性ナノ粒子の結合効率と放出の例］  放射性標識化ＤＮＡが使用されて、フェライトに対する結合効率と核酸分子の放出が決定された。磁性懸濁溶液及び３つの容積のエタノールを有する放射性標識化ＤＮＡが、混合された。マグネタイトは、磁石を使用して、チューブ下部に引き付けられた。上澄み液が、ペレットから除去された。両方の断片が、シンチレーション計数器では、計数された。結合は、混合物のエタノールの成分の関数として、測定された。結果が図３６に示されている。
【０１６３】
放出効率を判定するために、結合されたＤＮＡペレットが、以下で表に示されるように、１００μＬの緩衝液において懸濁され、１０分間、９５℃にて培養され、磁石で収集された。上澄み液が、ペレットから除去され、双方が計数された。
【０１６４】
【表２】
2018186816.tif 000009
【０１６５】
ＳＤＳとトリス緩衝液は、センサの近くにＤＮＡ又はＲＮＡの磁気濃度を可能にするために、マグネタイト結合ＤＮＡとの分子交雑のために使用することができる。
【０１６６】
［磁性ナノ粒子の急速移動の例］  マイクロチップは、１ミクロンの線幅を有する金属コイルを有するように作製した。電流は磁場を発生するコイルに通された。磁性ナノ粒子を含む溶液を、次いで、コイルの上に滴下した。チップを顕微鏡下に配置し、電流がコイルに流された。１０秒以内に、クラスタは、コイル内の隅に集まった。電流がオフになった後は、磁性ナノ粒子は消磁して、バック溶液中に拡散し始める。
【０１６７】
［生体組織試料］  図３７に示すように、診断試料のために、牛の耳の生体組織を使用するアプローチが評価された。耳の生体組織は、評価するために、多くの場合、牛から取られ、皮膚、髪、大量の軟骨量を有し、血液が豊富である。直径約３ｍｍの耳栓に対してテストが行われた。約１マイクログラムの核酸分子のロバスト試料が、超音波処理及び４０ｎｍのフェライト粒子を使用して、耳栓から分離された。核酸分子は、予想されたサイズ範囲内にあった。ガラスビーズが、生体組織からの抽出のために必要とされなかった。ビーズ破砕を用いた耳栓の後処理によって、さらなる核酸分子は抽出されなかった。超音波処理の出力及び時間設定は、先の実施例で使用されたものと同じであった。
【０１６８】
［土壌で汚染された試料］  図３８に示されているように、複合試料を評価するためには、土壌に混合された細菌性試料及び胞子試料が処理された。土壌は、ＰＣＲベースのシステムを抑制することが知られた複合培地である。土壌は、６匹のショウジョウバエを含む試料に添加された。ハエはマラリア等の疾病を運ぶと評価され得る昆虫を代表するものと意図されている。最大３２ミリグラムの土壌が、１ミリリットルの試料毎に添加された。ショウジョウバエは、フェライト粒子の存在下で二分間、超音波処理を使用して破砕された。ＤＮＡ及びＲＮＡは、エタノールを添加したフェライト粒子を使用して得られた。粒子は、磁気的に収集され、汚染物を除去するために緩衝液及びエタノールを用いて洗浄され、そして、磁性を用いて凝集された。核酸分子は、９０℃の分子交雑用緩衝液において溶出されて、ＤＮＡの要素が変性された。最小量の損失が、試料の土壌レベルが１００マイクロリットル当たり３２ミリグラム（レーン８）に達するまで、観測された。ここで、溶液は粘着性になり、粒子運動は、現行のテスト条件下では困難である。破粋パワーを増大させ、溶液を変更し、破粋粒子サイズ及び特性を変更することによって、結果は、極端に汚染された試料に対して最適化され得ることが理解される。
【０１６９】
［マグネタイトクラスタの調製例］  塩化第二鉄（０．８Ｍ）、塩化第一鉄（０．４Ｍ）及び塩酸（０．４Ｍ）からなる第一の溶液が、混合されて、０．２ミクロンのフィルタにかけられた。第二の溶液は、水で７２ｍｌの水酸化アンモニウム（３０％）が１リットルとなるように調製された。
【０１７０】
１ｍｌの塩化第二鉄／塩化第一鉄溶液が、２０ｍｌのアンモニウム水酸化物水溶液を攪拌するのに、添加された。攪拌は、１５秒継続された。（２０ｍｌのバイアルの）溶液は、強磁石上に載置され、１分間、置かれた。その後に、すべての生成物が、バイアルの下部に引っ張られた。透明な上澄液が、静かに注がれ、水と置換され、混ぜられ、磁石の近くで載置された。再び、生成物は、バイアルの下部に引っ張れた。この処理は、残留アンモニウム及び鉄塩が全くない生成物を洗浄するために、３回繰り返された。バイアルは、２０ｍｌの水で満たされて、５分間、４ワットの出力にて、超音波処理された。懸濁液は、１ミクロンのガラス濾過器を介してフィルタにかけられ、マグネタイト粒子の安定懸濁液が得られた。マグネタイト粒子は、磁場又は遠心沈殿によって引き下げられるまで懸濁液に残存する。
【０１７１】
［実施例Ａ］  ３匹のショウジョウバエが、２つの１．５ｍｌのエッペンドルフチューブの各々に載置された。一方は、１００ｍＭのＴＲＩＳヒドロクロリド（ｐＨ７．５）、１．５％のデキストラン硫酸及び０．２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）からなる１００マイクロリットルの混合物を用いて搭載された。もう一方は、１００マイクロリットルのイソプロピルアルコール及び１００マイクロリットルの２０％ドデシル硫酸が搭載された。双方のチューブは、１０マイクロリットルの０．６％マグネタイトナノ粒子を搭載された。双方のチューブは、２０ｋＨｚにて、４５秒間（２ワット）、超音波処理された。そして、１ｍｌのイソプロピルアルコールが、第一のチューブに添加された。１／２ミリリットルのイソプロピルアルコールが、第二のチューブに添加された。磁気ペレットは、永久磁石により収集され、静かに注がれた上澄み液尾帯５０μＬの１００ｍＭリン酸水素ナトリウムが、各チューブに添加された、ピペットは、反復性ピペットによって再懸濁し、９５℃にて２分間培養された。ペレットは、磁石により再び収集された。溶出されたＤＮＡは、ＴＥＡ緩衝液において、７７ボルトで１％のアガロースゲル上で動かされた。ＤＮＡのラダーも、ゲル上で動かされた。
【０１７２】
図３９に示されているように、ゲルは、エチジウム臭素により染み付けられ、３０２ｎｍの励起及び６１０ｎｍのフィルタを用いてカメラで撮像された。精製されたＤＮＡは写真で明確に目に見えるものである。最上部のレーンは第二のチューブを表している。中央のレーンは第一のチューブを表している。最下部のレーンは、ＤＮＡのラダーを表している。
【０１７３】
［実施例Ｂ］  ４本のチューブの各々が、３つのショウジョウバエ、１００マイクロリットルの緩衝液及び１０μＬの０．６％マグネタイトナノ粒子を有し、３０秒間、５ワットで、２０ｋＨｚで超音波処理された。図４０に示すように、ＤＮＡは、実施例Ａと同様に、収集され、溶出され、ゲルにおいて作用され、染み付けされ及び撮像された。４つの緩衝液は、下記の通りであった。
１．１００ｍｍのＴＲＩＳ、１．５％のデキストラン硫酸及び０．２％のＳＤＳ
２．イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）
３．９０％のＩＰＡ、１％のドデシルベンゼン硫酸、９％の水
４．９０％のＩＰＡ、１％のポリアクリル酸ナプタラム、９％の水
【０１７４】
［実施例１３］  酵母、草及びブルーベリーの一部が、１００ｍＭのＴＲＩＳ、１．５％のデキストラン硫酸及び０．２％のＳＤＳにおいて、実施例Ａと同様に超音波処理された。精製、ゲル及び写真が実施例Ａと同様に得られ、図４１に示されている。
【０１７５】
［実施例Ｃ］  ３つの１．５ｍｌのエッペンドルフチューブの各々は、約１００億の大腸菌細胞及び（直径約１００ミクロンの）３０ｍｇのガラスビーズ及び４０マイクロリットルの０．５モルリン酸ナトリウムｐＨ７．５を含み、４ｍｍの音波のチップをチューブ内に挿入して、４０ｋＨｚ、１０％の振幅で、１５秒間、３０秒間及び６０秒間、超音波処理された。精製、ゲル及び現像が、実施例Ａと同様に行われ、図４２に示されている。
【０１７６】
この例は、長時間の超音波処理時間がサイズ分布を変化せしめないこと、すなわち、定常状態条件が適用されることを示している。
【０１７７】
［実施例Ｄ］  この実施例では、２つの標準方法を使用して、ＤＮＡは、容積が増大した細菌細胞培養から回復される。当該２つの標準方法は、ＤＮＡ回復のための市販のＱｉａｇｅｎキット及び教本のフェノール／クロロホルム法である。これらは、緩衝液として０．２％のＳＤＳと０．５Ｍのリン酸ナトリウムを使用して、実施例Ａにおける方法と比較された。結果が図４３に示されている。
【０１７８】
グラフは、本発明の方法はＱＩＡＧＥＮキットとフェノール／クロロホルム法の双方よりも優れていることを示している。
【０１７９】
［保護緩衝液の例］  この例では、超音波処理によってＤＮＡ剪断するための保護緩衝液の比較例を図４に示す。
【０１８０】
５μｇのＤＮＡを含有する５μＬプラスミドＤＮＡ溶液は、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ内で、約１００ミクロンの大きさのジルコニアビーズを４４ｍｇを有する５０μＬ緩衝液と混合された。チューブは、ブランソンＳＬＰｔ４０ｋＨｚの超音波処理のソケットに挿入された。超音波処理器は、１０”オン及び２０”オフのパルス周期で１２分間、５０％の振幅で運転された。超音波処理の後、混合物を２０μＬ部分は、ＴＡＥ緩衝液中で１００ボルトで１％アガロースゲル上で電気泳動処理された。全ての緩衝液は、ｐＨ７〜８の間に調整された。ＤＮＡラダーは、試料レーンの両側で運転された。
レーンは以下のとおり。
レーン１：ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を有するＴＥ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）
レーン２：１０ｍＭトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン
レーン３：５００ｍＭリン酸ナトリウム
レーン４：５０ｍＭリン酸ナトリウム
レーン５：６０ｍＭクエン酸ナトリウム
レーン６：３％塩化ナトリウム
【０１８１】
この実施例は、金属塩等の高イオン強度緩衝液が超音波処理中にＤＮＡを保護するのに有効であることを示している。緩衝液は、定常状態の超音波処理において大きなＤＮＡ断片を可能にする。トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン等のより低いイオン強度の緩衝液は、保護性が低く、特定の用途に適したＤＮＡ断片の収率が小さくなる。
【０１８２】
一実施例において、サイズ安定剤は保護性の高イオン強度緩衝液であり、これは、周期表の第１族及び第２族の金属を含むカチオンと、周期表の第７族を含むアニオン又は同様により複雑なアニオンと、の水溶性塩を含み、例えば硫酸塩、リン酸塩及び酢酸塩を含む。別の実施例において、緩衝液は、ｐＨ７〜８の間の値で安定かつ可溶性である。一実施例では、緩衝液の可溶性濃度は１％を超える。別の実施例では、その濃度が５％以上である。
【０１８３】
［界面活性剤の例］  二匹のショウジョウバエが、バイオスペックプロダクツから１００ミクロンのガラスビーズの２５μＬを含む３本のエッペンドルフ管のそれぞれに入れられた。第一の管に、水１００マイクロリットルを加えた。第二の管に、１％ドデシル硫酸ナトリウムの１００マイクロリットルを加えた。第三の管に、１％のナトリウムドデシルベンゼンの１００マイクロリットルを加えた。全３管は各々、ブランソンソニファイアー１５０の電力レベル２で２分間、超音波処理された。なお、各管の先端は超音波コンバータのねじ穴にねじ込まれて正常に配置された。パワーメータは約８ワットの初期読み取りを示し、３０秒間に約４ワットへ下げ、そのレベルで超音波処理が残り時間継続された。超音波処理後、ガラスビーズの上の流体の２０マイクロリットルを除去し、ＴＡＥ緩衝液を用いて作られたアガロース電気泳動ゲルのウェルに配置された。ＤＮＡラダーは、超音波処理ＤＮＡ断片のサイズを決定するためにレーン１に納められた。９０分間、７０ボルトで電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイド溶液に浸し、穏やかに撹拌した。図３８に示すように、ゲルのブラックライトの写真が撮影された。
【０１８４】
図４５において、ＤＮＡラダー上のレーン１は、水の超音波処理した結果を示す。ＤＮＡの収率が低いのが見られ、そして断片は４００塩基対未満である。ラダー上のレーン２は、ドデシル硫酸ナトリウムを超音波処理した結果を示す。ＤＮＡの収率は非常に高く、断片サイズは３００〜２０００塩基対のサイズ範囲である。ラダー上のレーン３は、ナトリウムドデシルベンゼン結果を示す。再び、ＤＮＡの収量は高く、写真上の明るいスポットによって証明されており、サイズの範囲は３００〜１０００塩基対である。この例では、選択される界面活性剤の存在下で超音波処理は、ショウジョウバエ等の生体源からの限られたサイズ範囲のＤＮＡを高収率で与えることができることを示している。
【０１８５】
［例示的なプロセス］  液状又は固体状の試料は、特定の試料タイプ又はソースに設計された特殊なカバーの１つを使用して、中心リザーバ内に装填される。かかるカバーは、例えば、採血、大きな破片を排除するフリット又はカートリッジの中央チャンバにのみ特定の材料、細胞又は所望のサイズ範囲内の病原体を通過させるフィルタのセットのためのランスを含むことができる。
【０１８６】
器具の実行操作は、その貯蔵リザーバからの溶解緩衝液の十分な量を抽出し、それを中心試料リザーバにポンピングすることから始まる。搭載した試料との混合は、試料及び溶解緩衝液を合わせた液量よりもやや少ない容量のポンピング方向を交互にすることによって行われる。
【０１８７】
化学的溶解が困難である特定のタイプの試料のために、計器駆動ユニット内に統合された超音波ホーンは、溶解混合物のガラスビーズ叩解を駆動するために起動される。ガラスビーズ叩解ステップを利用又は利用せずとも、溶解混合物は、試料の化学的溶解を可能にするために５〜１０分間周囲温度で培養される。試料を培養しながら、下流の処理ステップのための特定の調製用処理を行うことができる。例えば、１００μＬのＤＩ水が添加され、脱塩ポッド内にて収納された乾燥Ｐ３０サイズ排除樹脂を再構成される。
【０１８８】
化学溶解培養が完了すると、溶解物混合物は、３０μｍフィルタを通して抽出され、１５μＬフェライト磁性粒子を含むリザーバ（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖類、グリセロール等又はＰＶＰ等の他の有機高分子等の粘性液体中の懸濁液として調製されたものを含む）に搭載される。溶液は混合し、５分間培養された。この培養中に、核酸（ＤＮＡ／ＰｖＮＡ）は磁性粒子に結合される。
【０１８９】
試料磁性粒子複合体が抽出されチャネルを通過させられ、小容量パルス（１〜１０μＬ）内の磁石上を通過する。各パルスは、磁石上に少なくとも２秒間存在するようになされている。これにより、磁性粒子が磁石に引き寄せられるのに十分な時間が確保される。残った液は、チャネルを介して、カートリッジの廃棄リザーバに流される。
【０１９０】
フェライトリザーバチャンバは、その後、残存核酸−フェライトの複合体を収集するために、磁石上を通過した水の適切な量（４０μＬ〜２００μＬ）で流される。このステップは、汚染物質の以前に結合した磁性粒子、残りの緩衝液を洗浄、濯ぐステップである。磁性チャネルは空気でパージされ、任意の残留洗浄水を除去する。
【０１９１】
フェライトから効率的に結合した核酸を放出するために、ヒータを作動し、８０℃で安定化させた。２２μＬ体積の溶出緩衝液（１〜１５重量％の有機ポリマー（２％ＰＶＰが好ましい）を有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム）は、そのリザーバから取り出され、その後、磁性チャネル内に圧送され、フェライト／試料ペレット上に流される。カートリッジ弁は数回回転され離れて磁石へ戻り、フェライト／試料ペレットを緩める。フェライト／試料ペレットはヒータ上にて回転させ、８０℃で５分間培養する。この時間の間に、試料は、磁性粒子から溶出緩衝液中に放出される。
【０１９２】
磁気チャネルは回転させられ、磁性粒子が再び磁石に引きつけられた磁石上の位置に戻される。このステップは、チャネルからの溶出液を抽出することによって解放ＮＡ材料が尽くされたフェライト粒子から分離されることを可能とすることができる。リン酸塩や他の汚染物質の除去は、脱塩ポッドに溶出液をポンピングすることにより達成される。溶出液の体積が小さいため、ＤＩ水の最小量（１０〜１００μＬ、初期５５μＬ使用）がポッドを介して試料を押し出すために使用される。精製された試料は、０．２μｍフィルタを通してポッドを出て、オーバーフローリザーバに流出する。そこで試料は、ＰＣＲ（又は、制限酵素消化、リン酸化、脱リン酸化、ライゲーション（結紮）、ヌクレアーゼ処理含まれる他の処理）の準備状態となる。
【０１９３】
［核酸増幅］  カートリッジ試料前処理由来の精製物質は、４５〜９０μＬの体積を取って、脱塩オーバーフローリザーバから抽出される。この溶液は、１つ又は２つの別々の増幅反応をセットアップするために使用されている。例えば、２つの独立したＰＣＲ反応を行うために、精製された核酸物質は分割され、半分溶液をＰＣＲミックス１リザーバにポンピングすることによって増幅プライマーの１つの特定のセットを有する凍結乾燥ＰＣＲペレットを再構成し、溶液の残りの半分は、増幅プライマーの異なるセットを有するＰＣＲミックス２リザーバ内の凍結乾燥ＰＣＲペレットを再構成するために使用される。
【０１９４】
ＰＣＲペレットの再構成後、３９μＬの各ＰＣＲミックスは、カートリッジロータバルブの下側にて見得るように、その指定されたＰＣＲチャンネル（混合１がチャネル１に、混合２がチャネル２に）に分配される。器具を事前加熱し、開始温度（例えば、ＲＴ−ＰＣＲのために４５〜６５℃及びＰＣＲのために９３〜９８℃）に２つのヒータを安定させる。続いて、カートリッジ弁は回転され、ＰＣＲチャンネルはヒータ上に位置合わせされ、そして、入口及び出口ポートはブロックされ、ＰＣＲ溶液の加熱に起因する圧力を含むようになる。逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）とＰＣＲ反応（すなわち、２段階又は３段階ＰＣＲ）との両方のための標準的な方法及び変形方法は、最適な製品の生成のための最適な方法に従って行い、人工産物又は試料調製から引き継がれる問題のある阻害剤に少なくとも敏感である物を回避する。ＰＣＲサイクルが完了すると、ヒータをオフにして、装置をチャネル内の温度を周囲温度まで冷却させる。機械は弁を回転させて、シリンジポンプを使用して、それぞれのチャネルからのＰＣＲ試料１及び２の３０μＬを抽出する。これらの容量は結合され、検出のための貯蔵及び調製用のＰＣＲミックスリザーバに入れられる。
【０１９５】
［検出方法ステップ］  プールしたＰＣＲ産物（１０〜５０μＬ）の一部は全容積から採取され、ＰＣＲミックス２リザーバ内に保持され、その後、混合チャンバ内に分配される。次に、分子交雑緩衝液（２５０ｍＭのＮａＰｉ／０．１％ＳＤＳ）はリザーバから吸引され、混合コンパートメント内にてＰＣＲ溶液の選択量と混合される。最適なパフォーマンスを得るには、センサマイクロチップの表面は、分子交雑緩衝液のみの濯ぎ処理を用いて事前加湿すべきであり、そして、分子交雑テスト溶液（プールされたＰＣＲ反応出力材料を含んでいる）の７０μＬを圧送する前に数分間、到達６０℃を維持する。
【０１９６】
一旦反応チャンバに分配されると、標的の由来のＰＣＲ産物は、検査用マイクロチップの表面上に適切なセンサ電極領域に分子交雑する。多重化能力は、異なる捕獲オリゴヌクレオチドプローブを利用することによって付与された配列特異性により、達成され、該プローブは、マイクロチップ上の独立したセンサのパターン化されたグループを重ね合わせるアレイとして、空間的にアドレス指定されている。分子交雑反応の持続時間は、より高い感度や、結果の貯めのより短い時間に応じて、３０〜６００秒であってもよい。テスト分子交雑溶液は、分子交雑の間に表面上に静的に保持され又はパルス的に流され若しくは連続的に流されことができる。その後、増幅反応の任意の残留物（非分子交雑した核酸、ＰＣＲ産物又はプライマーオリゴヌクレオチド、並びにｄＮＴＰ及び任意の反応副産物）を除去するために、反応チャンバは、チップヒータで６０℃に維持して、分子交雑緩衝液のみの溶液の１つの１３０μＬアリコートで濯いだ。
【０１９７】
触媒溶液（貴金属イオン性化合物、コロイド又はクラスタ）との培養は、すぐに洗い流す。コロイド又はクラスタの触媒は、オリゴヌクレオチド、抗体又は他の標的の汎用又は特定の認識分子で官能化され得る。触媒試薬は静的に保持され又は２５〜６５℃で３０〜６００秒間の反応面上のパルス状又は連続的に流されてもよい。触媒は、分子交雑緩衝液の２×１００μＬのアリコートで洗い流される。チップ表面温度は、現像準備のために６８℃に上昇させる。
【０１９８】
現像化学物質の凍結乾燥ペレットは、９６μＬのＤＩ水と現像剤貯留チャンバ内での混合との１０〜６０秒間で水和される。再構成された現像剤は、吸引され、その後１０５秒間、非常に遅い流速で分配される。約２５μＬの現像液は、この時間に亘ってチップ表面と反応する。チップ温度は、５０℃に下げられ、１００μＬのＨ２０で濯がれる。シリンジ状成形部は、指定されたチャンバから空気を吸引し、それを乾燥させるためにチップ表面の上に分配する。５０℃のヒータでの６０秒の遅延時間は、表面乾燥を確保する。センサの抵抗値が測定される。
【０１９９】
［例示的なカートリッジ］  カートリッジは、２つのプラスチック片：本体と内部ローター（図４６）を備える。カートリッジ本体は、流体を移動させるスクリュー型モータによって駆動されるシリンジプランジャを有している。反応チャンバはカートリッジ本体の反対側に配置され、カートリッジ本体の一壁がマイクロチップセンサによって形成されている。複数の試薬チャンバはカートリッジロータ上部に構築され、反応チャンバとフローチャネルはカートリッジロータの底部に成形されている。チャンバは、ロータの上下のプラスチックシールで封止されている。
【０２００】
カートリッジは駆動機構上に着座され、内側のプラスチック部品を回転させ、シリンジ状成形部及び検出チャンバのために外側ハウジング内のポートと様々なロータリー弁チャネルポートとを整列させる。アセンブリ内の第二のモータは、カートリッジシリンジプランジャを駆動して、試薬及び溶液を移動させるために使用される。駆動アセンブリは、図４７Ａの一部破断図にて示されている。試料及び生物／細胞破砕のために、超音波ホーンは、駆動アセンブリ内に統合され、カートリッジの下面に接している。駆動プラットフォームは、埋め込まれた磁石と２つの抵抗素子を備えている。磁石は常磁性粒子と協働して生物学的分子を濃縮する機能を果たし、同時に、調整されたヒータ４９０と冷却板４９２の対（図４９参照）は、生物学的反応が実行されるためのカートリッジの底部上の特定のチャネル領域の加熱／冷却及び温度制御をなすために使用される。冷却板は金属板等の熱伝導性材料からなり、使い捨てインサートから熱を移送する。
【０２０１】
［フィルタリング］  血液や昆虫等の試料のような投入材料の様々なタイプに関して柔軟性を提供するために、カートリッジは濾過ポッド（図４７Ｃ）で設計され、これは基本設計を変えることなく、試料のニーズに合うよう変更可能に出来ている。モジュール式ポッドはフィルタリングとカラム分離とをカートリッジ内に組み込んで使用される。フィルタはリングに取り付けられ、カラムはシリンダ内に予め取り付けられて、そして、これらはカートリッジ内に溶接されて製造されている。ポッドの数と種類は、標的試料に基づいて選択することができる。例えば、試料は、破砕前に大きなデブリ粒子を除去するために事前にフィルタリングされ、一方、昆虫の試料は砕前にフィルタリングされないようにすることができる。
【０２０２】
［脱塩］  インサートポッドはロータ弁（図４７Ｃ参照）内に配置され、脱塩樹脂／マトリックス材料を含有することができる。インサートを通して部分的に精製された試料を流すことは、生物学的反応に干渉する可能があるイオン（すなわちＰＣＲ増幅の鉄阻害）
を除去する。
【０２０３】
インサートはまた、脱塩処理中に流体の流れを制御／管理する必要がある。プラスチックのリザーバの幾何学的形状及び気泡の表面特性は、流体の流れに影響を与え得る。代替の設計コンセプトは、これらの収差（図４８Ａ〜Ｄ）を最小化する試みがなされている。左のデザイン（図４８Ａ及び４８Ｂ）はポッドの側面上へ流体を向かわせるキャップを利用している。キャップがない場合、プラスチックの疎水性の性質は、流出に必要な体積変動を引き起こす可能性がある。同様に、右のデザイン（図４８Ｃ及び図４８Ｄ）は、表面張力を破るために少ない量を必要とする小さな出口ポートを利用する。
【０２０４】
［ウイルス分離］  試料調製システムは、複合試料からのウイルスや細菌を濃縮して、検出システムの感度及び遺伝子配列決定（遺伝子シーケンシング）の効率を改善する能力を提供すべきである。自動化された遺伝子シーケンシングは、よりコスト効率になって、未知の病原体を同定する最良の機能を提供している。最新世代のイルミナのＭｙＳｅｑ等の遺伝子シーケンサは、数時間でウイルスや細菌の遺伝子配列を決定する能力を提供する。しかし、試料調製は、効率的な遺伝子配列決定に不可欠である。特に、ヒト血液試料又は昆虫等の試料中に見出された真核物質から離れてウイルス及び細菌物質を単離することによって、標的病原体のための試料を濃縮することが必要である。それ以外の場合、はるかに大きい真核生物の遺伝子は、試料を支配して、ウイルスや細菌を同定するために、材料の大きな体積の遺伝子シーケンシングが必要となる。遺伝子シーケンシングの主な利点は未知の病原体を同定する能力があることので、濃縮プロセスは、病原体の従来知識に依存しないことが重要である。
【０２０５】
本発明のアプローチは、遺伝的材料（例えば、宿主細胞）の試料バックグラウンドにおける標的病原体の精製を選択的に豊富化することである。例示的なカートリッジは、カラムインサート（図４６を参照）を収納するように設計された特別チャンバを備えている。元々、脱塩カラムは、このコンパートメント内に配置されるように意図されていた。
【０２０６】
試料を機械的に破砕した後、材料を第一のフィルタにて通過させ、無傷の真核細胞を除去する。細菌について、フィルタは２〜４ミクロンの細孔を有し、細菌を通過可能にして、どんな真核細胞をも回収することになる。ウイルスについて、フィルタが２００ｎｍと小さい細孔を有することができる。細菌又はウイルスは、病原体を捕獲する小さな孔を有するフィルタを用いて、分離、濃縮される。２００ｎｍ以下の開口部を有するフィルタは細菌のために使用され、３０ｎｍ以下の開口部を有するフィルタはウイルス又は細菌及びウイルスの組み合わせを捕獲するために使用される。このステップでは、細菌やウイルスは影響されず無傷で残り、破砕された真核細胞から放出された核酸はフィルタを通して洗い流される。洗浄されたウイルス及び／又はウイルスは、その後、溶解され、そして核酸は、さらに処理されるフィルタを介して移動できる。
【０２０７】
試料の主要部分は、大きい破片や全真核生物細胞を除去するフィルタを通過し、その後、細菌又はウイルスは、ｐｎｃ−Ｓｉに基づく新規なフィルタすなわちトラックエッチングされた膜（track etched membrane）を使用して捕獲される。該膜は、サイズが３０ｎｍのより大きい粒子を捕獲する。これらの膜は、自体に流れ得る物質の大きさの微調整を可能にし、フィルタに捕獲される材料の損失を最小化する。
【０２０８】
多孔質ナノ結晶（ｐｎｃ−Ｓｉ）シリコンの膜は、膜技術の革命的進歩を表す。ｐｎｃ−Ｓｉの最も重要な構造的特徴は、分子スケールの膜厚（１０〜５０ｎｍ）であり、これは、大きさのオーダーでｐｎｃ−Ｓｉよりも１００〜１００００倍厚い従来の膜よりも低い移送抵抗と損失をもたらす。対流通過及び拡散通過の両方の増加に対する膜通過抵抗が膜厚に比例するので、分子的に薄い膜は、膜透過性に悪影響を与える重要なパラメータを効果的に最小化する。その結果、水、ガス及び拡散種に対するｐｎｃ−Ｓｉの透過性については、実験や商用ナノ多孔膜について最も高い報告がなされている。多くの実用的な設定では、ｐｎｃ−Ｓｉ膜はシステム内の他の成分に比べて非常に小さい移送抵抗を提供し、それらを無視することができる。ｐｎｃ−Ｓｉのナノスケールの膜厚にもかかわらず、該膜は機械的に堅牢であり、大量に製造することができる。
【０２０９】
分離の分解能も、より薄い膜について改善されることが知られており、ｐｎｃ−Ｓｉ膜は、通過モードに関係なく、５ｎｍを超える解像度でナノ粒子とタンパク質とを分離することが示されている。膜はまた、グラフトポリマーを用い得るシランの化学反応を介して変更可能であり、タンパク質の結合及び汚損を軽減し又は電荷ベースの分離のための表面電荷を操作することができる。また、極薄の膜は、低濃度の小さな体積を含むプロセスのための低損失膜を提供し、内部表面への吸収を介して試料の損失を最小限に抑える。
【０２１０】
これらの病原体の選択的濃縮及び洗浄は、阻害剤をより効果的に除去することと後段の溶解ステップ前に余分な真核生物の核酸の存在を制限することによって、下流の分析性能を向上させる必要がある。我々の磁性粒子での核酸の結合と溶出ステップは、きれいな核酸が入力されたときに良好に機能する。
【０２１１】
収集カラムで取り込まれた材料は、リンス緩衝液で洗浄した後、我々の試料処理が行われる。カラム材料を通して除外され、保持され、通過された材料は、除外膜の特定のペアがベスト節足動物材料の上にてウイルスを豊富化するかどうか決定するために、増幅反応に滴定される。ウイルスがカラム保持部分に濃縮されるようになるとき、ＲＴ−ＰＣＲ検出は、滴定シリーズの最も希薄な操作で持続又は改善すべきである。節足動物ＤＮＡの検出は、フィルタセットにより効果的な分別に減少する必要がある。
【０２１２】
［試料入力］  異なるカートリッジ蓋アクセサリは、試料入力の様々なタイプに対処するように設計されている。例えば、図５０は昆虫ベクター又は組織試料の入力用に設計されたカートリッジカバーを示している。ここで、試料材料は、超音波処理前に破砕されることが必要な場合がある。
【０２１３】
［試料入力・液体（例えば血液）収集］  図５１に示す装置は、ランセット又は他の鋭利な穿刺器具に埋め込まれたプラスチック製の球状部を使用している。球状部は、押されると、圧力を生成し変形し始める。球状部上のチェック弁は開いて圧力を緩和し、球状部が崩壊し続ける。球状部が一旦十分に変形されると、埋め込みランセットは、薄膜シールを穿刺し、その後、対象物の皮膚／膜を穿刺する。チェック弁のため、球状部には空気が非常に少なくほとんど無い。これは対象物の皮膚／膜の直下に形成されるエアポケットを防ぎ、最大流体抽出を可能とすることができる。そして球状部は解放され、その自然な傾向として、元の形状に戻ることができる。そうすることで、生成された真空は刺し傷から流体を引き込む。抽出された体積は、変位した球状部容積（少量のシール漏れ）に匹敵する。
【０２１４】
収集された試料は、単純にチェック弁を遮断することができるベースバルブ部を固定することによって行われる調剤。バルブを押すと、再び、圧力が生成されるが、チェック弁がブロックされているため、試料は、元の穿刺孔を通って収集容器内に押し戻される。
【０２１５】
装置は３つの部分、ベース、真空機構及びプランジャを含む。ベースは、表面に接触して良好な真空を確保する際にガスケットのように機能するソフトプラスチックリング／周囲を含む。ベースの１つの縁部は、真空機構に位置するチェック弁を詰めるときに使用されるタブを有する。該タブは、装置が充填又は閉位置にあるときにチェック弁が開くことを防ぐ。ベースは、真空機構又は隣接機器に接続するヒンジを有していてもよい。ベースは、試料を保持／含むように働く押下される領域を有していてもよい。最後に、ベースの床は、容易に穿刺されることができる薄いプラスチックフィルムである。
【０２１６】
真空機構は、圧縮された後に元の形状に戻ることができる軟質プラスチック球状部を含む。統合されたチェック弁は、エアポケットの形成を防止するために球状部の端部に形成されている。球状部の頂点に埋め込まれたものは、対象物を穿刺するために使用されるランセットある。（ベースと同様）薄いプラスチックフィルムは、真空の球状部からベースを分離する。球状部の上は、球状部を均等に圧縮するために使用されるプラスチックの平坦な片部である。この片部は、プランジャに取り付けられている。必要に応じて、球状部の再形成を補助するためにスプリングが追加されてもよい。
【０２１７】
プランジャは、単に操作を支援する梃子ツールである。これは、完全な圧縮を確実にするために捩じって止められて押し下げられた状態になるように改変することができる。
【０２１８】
ランセットを破砕縁部又はチョッピング縁部に置き換えることによって、分析の困難な媒体を調製するために、装置を改変することができる。このシナリオでは、例えば、昆虫や組織片等の試料は、第一の装置の基部における凹状ポケット内に配置される。真空機構は、次に、切断／チョッピングブレードが試料の上にあるベースに取り付けられている。真空はこの操作に必要とされないので、真空機構ではシールが必要とされない。球状部は押圧されて、ブレードを試料上に下げる。球状部を解放すると、ブレードが上昇してカットが繰り返される。十分な処理が完了すると、ブレードと試料は、別の容器に試料を押し出す底部シールを破壊するのに十分な力で押圧されることができる。
【０２１９】
共通チャネルで接続された複数の球状部の構成は、グループ化された収集及び分析を可能にする（図５１）。これを行うには、追加のチェック弁は、球状部とチャネルの間に含まれている必要がある。これは、バルブが押されたときに空気がチャネルへ作動されることを防ぐ。これを行うために、追加のフラップは、球状部と一緒に成形され得る。該フラップは、それが押され流れを防止したとき、チャンネルへ崩壊する。フラップ機構は、球状部を圧縮するために使用される機構と容易にリンクされ得る。
【０２２０】
別の容器に試料を結合し分配するために、装置は、試料を収集するために使用されるものと同様のツール（ハンマー／プランジャコンプレッサー）に組み込まれている。違いは、全ての球状部、共通チャネルのフラップ弁が開いたことを維持しながら、圧縮されることである。共通チャネルは、収集容器に嵌合する出力ポートに導かれている。流体が分配されるまで、このポートは接続されている。ポートが開いて収集容器が取り付られと、すべての球状部を一度に圧縮される。チャネルフラップが開いたままにされているので、流体は、共通チャネルを介して、収集容器内に押し込まれる。収集の球状部の下のピンホールは、ハンマー／プランジャが圧縮されて漏れを防止するとき、ツールのベースで封止されている。
【０２２１】
［多試料収集ツール・試料収集］  図５１、図５２に示すように、多試料収集円盤を離脱タブは、上に向けてツール（ボタン側）の搭載側に挿入される。円盤は、収集球状部がハンマータブの下であるように配向されている。ユーザは、円盤と底板との間に試料（例えば、動物の耳）を挿入し、底のレバーを圧搾する。これは、底板を上げ、それと円盤の間の試料を摘まむ。さらに、圧搾されたレバーは、チャネルフラップ弁ハンマーを枢動させチャンネルフラップ弁上に下げて、その結果、それを閉じる。まだレバーをつかんだまま、上部ランセットボタンが押され球状部を圧縮し、埋め込まれたランセットで試料を穿刺する。（スプリングの補助で）ボタンが解放されると、球状部は真空の生成と試料中の吸引から元の形に戻る。レバーが解放され、チャネルフラップ弁ハンマーが上がり、底板は試料から放出される。円盤は、その後、更なる収集のために利用可能な次の球状部に回転させられる。
【０２２２】
［多試料収集ツール・試料移送］  全体の多試料収集円盤は、離脱タブを下にしてツールの移動側に挿入される。円盤は、すべての球状部が圧縮ハンマーの下になるように、整列されている。離脱タブが削除され、開いているポートを生成する。適切な容器は、底板（捩じって止める）に取り付けられている。レバーが圧搾され、下部板／容器が上昇し、円盤底部に対して圧縮される（分配ポートは、薄膜シールが破壊されることを可能にする穿孔縁部を有している）。下部板が円盤に押し付けられているので、ハンマーは球状部を圧縮し、ダック／フラップ弁は共通チャネルを介して容器に試料を強制する。レバーが解放され、円盤が除去される。
【０２２３】
［第一の代表的な試料調製の蓋（固体）］  図５３に示すように、この方法は、後続の容器に移す前に、試料（血液）を吸収して固体を湿潤させる従来の毛管作用を利用する。多くの血液分析と同様に、この装置は、試料が材料に吸収されることを可能にする皮膚を穿刺するランセットが含まれている。該材料は、吸収した液体試料を保持するもの（紙、セルロース母材等）でよい。該材料は、切ったり、板状にしたり、織物にして集めた体積量を調整できるものがよい。
【０２２４】
装置は、４つの部分、本体、試料リング、ランセット及び試料リングエジェクタを含む。本体は、固定器、構造的完全性を提供する内部の３つのコンポーネントを含み。試料リングは、吸収性材料が周り伸ばされ、所定の位置に保持している小さいフレームである。試料リングは、本体内に圧入されているが、十分な力で除去されることを意図されている。ランセットは、スプリング装填され、ハンドル／ボタンに接続されている。ランセットはまた、ランセットを作動させると、試料リングを噴出を切り替えることができる独特なキータイプの小片を持っている。試料リングエジェクタは、試料リング上に直接座している円筒状の小片である。ランセットとそのキータイプの小片は、中心を通過している。静的及び穿刺の条件下では、キータイプの小片は、試料リングエジェクタにおいてロックハウジングの内側にスライドする。しかし、ユーザがハンドルを引き上げ９０°回転した場合、キータイプの小片は、ロックハウジングから除去され、試料リングエジェクタの上に載置される。そして、ユーザがハンドルを押し下げた場合、試料リングエジェクタを試料リング上に強制し、試料リングを取り除く。無菌環境を維持するために、ハウジングの各端部は、従来の熱フィルムを用いて封止されることができる。フィルムは、対象物を穿刺する前に除去される。
【０２２５】
代替設計は、キーロック方式を使用しないように使用することができる。むしろ、ランセットスプリングは、ハンドル（現在のボタン）と試料リングエジェクタ（代わりに本体）との間に配置されている。ボタンが押されてもはや試料リングを排出するために使用されない場合、スプリングは依然として作動する。試料リングを取り出すには、試料リングエジェクタ片はボタン板上のポートを介して独立したボタン／レバーに接続されている。
【０２２６】
この方法は、多試料収集円盤で使用されるように改変することができる。このツールは、ランセットと試料リングエジェクタを作動させるために、試料クランプと２つのボタン含む。さらに、自動インデクサと容器クランプとを付加することができる。
【０２２７】
［動作の説明］  第一の装置の場合、ユーザは、フィルタリングからの保護膜を除去し、装置の試料リング側を対象物上に配置する。次に、ユーザは、ハンドルを押し下げ、ランセットを作動させ、対象物を穿刺する。試料が創傷から漏れるので、試料リングは、一定量の液体を吸収する。装置は、次に収集容器上に配置される。ユーザはハンドを引き９０度回転して、強制的に押し下げ、試料リングを容器に排出する。この方法は、ボタンの押すだけを必要とする試料リング排出を除き、代替装置でも同じである。
【０２２８】
［第二の実施試料調製の蓋（固体）］  図５４のカバーは、フィルタリングが試料調製チャンバに排出されないことを除いて、以前の設計に非常に類似している。代わりに、蓋はカートリッジに再び取り付けられ、フィルタ母材は、それを抽出することができるチャンバに浸漬される。無菌環境を維持するために、蓋を別々に格納され、プラスチックスリープはシリンジ／フィルタ領域（シリンジキャップ）の上に配置される。
【０２２９】
［第三の実施試料調製の蓋（固体）］  図５５Ａ、５５Ｂ及び５５Ｃに示すように、このカバーは、機械的な動作の点で第二の例示的な試料調製蓋に非常に類似している。上記のように試料は、プリック、吸収及び搭載方法により回収される。第一の違いは、人間工学に基づいたデザインである。収集ツールは、ハンドリングを単純化し（図４９Ａ、４９Ｂ及び４９Ｃ）を使用する「シリンジ様」のフォームファクタに輪郭付けされている。第二の変形例は、ランセットの機械的作動の方法にしている。単一の利用を確保するために、作動機構は、一度作動させるように設計されている。内装ランスを有するカバーは図５６に示されており、シリンジのようなフォームファクタを使用していない。
【０２３０】
［多試料の採取（固体）ｖ．１Ｂ］  前述したように、固体試料調製ｖ．１Ｂ装置は、複数の試料を収集するために改変することができる。これは、複数シリンジ／エジェクタ／試料リングモジュールを単一使い捨て円盤へ組み込むことにより行われる。円盤は、図５３中の設計と同様に収集ツールに搭載されることができる。図５３中のツールのように、ツールは、試料を安定化させるための一対のクランプを有している。ランセット及びリングイジェクトはボタンを介して作動される。このツールは、試料を採取した後に次の空き位置に円盤をインデックス付けすることも可能である。試料を収集／結合／除去するために、容器はツールに取り付けられている。ツールは利用可能な位置を通してインデックス付けするので、使用される領域は回転し、最終的に収集容器上を通過し、それらは容器内に排出され得る。すべての空き領域が使用されると、ユーザは、収集されたすべての試料が容器内に装填されるまで、円盤の取り出す／インデックス付けを続ける。これが発生すると、円盤が除去され、廃棄され／格納される。すべての試料が収集されることを確認するには、ユーザは「完了／未搭載」の位置にインデックス付けされるまで円盤を削除することができない。簡単にするために、ランセット、リングエジェクタ及びンデックス機能を組み合わせることができる。
【０２３１】
［試料調製蓋（液体濃縮器）］  １００μＬより大きい液体試料を処理するために、吸収方法の変形を用いることができる。所望の試料が真空管（すなわち血液）又は他の容器に収集された仮定すると、試料は、一連のフィルタ（１０μｍと０．２μｍ）を介して抽出して通過されることができる。最後の（最小）フィルタはトラップとして働き、所望の核酸、胞子等を含む。吸収方法と同様に、トラップフィルタは、外（ｅｘ）に排出することができる。
【０２３２】
本発明は特定の実施例を参照して記載されたが、当業者であれば本発明の範囲を離れない範囲で様々な変更されたものが作られ及び均等なものが本発明の要素に置き換えられることも理解できるだろう。さらに、本発明の範囲を離れない範囲で、多くの変形物が本発明の効果を導く特定の状況又は材料を適用させることによって作られてもよい。
【０２３３】
従って、本発明は、本発明を実行する想定した最良の形態として開示された特定の実施例に限定されるものではないが、本発明は特許請求の範囲の技術範囲及び精神に含まれる全ての実施形態を包含する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４８Ｃ】
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【図４８Ｄ】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５５Ｃ】
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【図５６】
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