(57)【要約】【課題】心機能の喪失を阻害することにより、そして理想的には、うっ血性心不全を持つ人あるいはリスクを持っている人の心機能を向上させることにより、この疾患を予防する。【解決手段】本発明は、ニューレグリン遺伝子によってコードされる上皮増殖因子を含むポリペプチドを投与することによってうっ血性心不全を処置または予防する方法を特徴とする。この方法は、哺乳動物におけるうっ血性心不全を処置または予防するための方法であって、該哺乳動物に対して、上皮増殖因子様（ＥＧＦ様）ドメインを含むポリペプトイドを投与する工程を包含し、ここで、該ＥＧＦ様ドメインが、ニューレグリン遺伝子によってコードされ、ここで、該投与工程が、該哺乳動物における心不全を処置または予防するのに有効量である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府の後援による研究に関する供述）
この研究は一部、ＮＩＨ助成金ＨＬ−３８１８９、ＨＬ−３６１４１、およびＮＡＳＡ  ａｗａｒｄからのサポートを得て行われた。政府はこの発明に関するある一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の分野）
発明の分野は、うっ血性心不全の治療および予防である。
【背景技術】
【０００３】
（本発明の背景）
うっ血性心不全は先進国において主要な死因の１つで、心臓に対する負荷の増大とそのポンプ機能が徐々に低下することに起因して起こる。初めに、高血圧、または収縮性組織の損失に起因して心臓への負荷が増大し、代償性心筋肥大と左心室壁の肥厚が誘発され、それによって収縮性を増大させ心機能を維持している。しかしながら、このような状態が継続すると、左心房が拡張し、収縮期のポンプ機能は低下し、心筋細胞はアポトーシス細胞死へと進み、心筋機能は次第に低下する。
【０００４】
うっ血性心不全の原因となる因子としては、高血圧、虚血性心疾患、アントラサイクリン抗生物質などの心臓毒性化合物への曝露、心不全のリスクを増大させることが公知の遺伝的欠陥が挙げられる。
【０００５】
ニューレグリン（ＮＲＧＳ）とＮＲＧ受容体は、神経、筋肉、上皮および他組織の器官形成に関係している細胞間シグナリングのための増殖因子−受容体チロシンキナーゼ系から構成されている（Ｌｅｍｋｅ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２４７−２６２，１９９６およびＢｕｒｄｅｎら、Ｎｅｕｒｏｎ  １８：８４７−８５５，１９９７）。ＮＲＧファミリーは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメイン、免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、および他の認め得るドメインを含む多数のリガンドをコードする３つの遺伝子から成る。少なくとも、２０（おそらく５０以上）の分泌性および膜結合性アイソフォームがリガンドとしてこのシグナル系で機能し得る。ＮＲＧリガンドに対する受容体は全てＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーであり、またヒトにおいてＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４としてもそれぞれ知られているＥＧＦＲ（またはＥｒｂＢＩ）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４を含んでいる（Ｍｅｙｅｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４：  ３５７５−３５８６，１９９７；Ｏｒｒ−Ｕｒｔｒｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１８６７−７１，１９９３；Ｍａｒｃｈｉｏｎｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：３１２−８，１９９３；Ｃｈｅｎら、Ｊ  Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３４９：３８９−４００，１９９４；Ｃｏｒｆａｓら、Ｎｅｕｒｏｎ  １４：１０３−１１５，１９９５；Ｍｅｙｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０６４−１０６８，１９９４；およびＰｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：２８０３−２８１５，１９９７）。
【０００６】
３つのＮＲＧ遺伝子、Ｎｒｇ−１、Ｎｒｇ−２、およびＮｒｇ−３は異なる染色体遺伝子座に位置しており（Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｓｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９３８７−９１，１９９４；Ｃａｒｒａｗａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：５１２−５１６，１９９７；Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：５０９−５１１，１９９７；およびＺｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：９５６２−９５６７，１９９７）、いずれも異なったアレイのＮＲＧ蛋白質をコードしている。今までのところ最も詳細に研究されているのはＮｒｇ−１の遺伝子産物で、これは構造的に類似しているおよそ１５の異なるアイソフォームの群を含む（Ｌｅｍｋｅ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２４７−２６２，１９９６および、Ｐｅｌｅｓ，Ｙａｒｄｅｎら、Ｂｉｏ  Ｅｓｓａｙｓ  １５：８１５−８２４，１９９３）。ＮＲＧ−１のアイソフォームのうち最初に同定されたものには、Ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ；Ｐｅｌｅｓら、Ｃｅｌｌ  ６９，２０５−２１６，１９９２および、Ｗｅｎら、Ｃｅｌｌ  ６９，５５９−５７２，１９９２）、ヘレグリン（ＨＲＧ；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２０５−１２１０，１９９２）、アセチルコリン受容体誘導アクチベーター（ＡＲＩＡ；Ｆａｌｌｓら、Ｃｅｌｌ  ７２：８０１−８１５，１９９３）、グリア増殖因子であるＧＧＦ１、ＧＧＦ２およびＧＧＦ３（Ｍａｒｃｈｉｏｎｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：３１２−８，１９９３）が含まれていた。
【０００７】
Ｎｒｇ−２遺伝子はホモロジークローニング（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：５０９−５１２，１９９７；Ｃａｒｒａｗａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：５１２−５１６，１９９７；およびＨｉｇａｓｈｉｙａｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２：６７５−６８０，１９９７）およびゲノムアプローチ（Ｂｕｓｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：４００７−４０１４，１９９７）によって同定された。ＮＲＧ−２  ｃＤＮＡはまた、ＥｒｂＢキナーゼの神経および胸腺由来アクチベーター（ＮＴＡＫ；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＢ００５０６０）、ニューレグリンの派生物（Ｄｏｎ−１）、および小脳由来増殖因子（ＣＤＧＦ；ＰＣＴ出願ＷＯ  ９７／０９４２５）として公知である。ＥｒｂＢ４を単独で発現している、またはＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ４を共発現している細胞がＮＲＧ−２に対して特に強い応答を示すようであるという実験証拠が示されている（Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６０９０−６１００、１９９８）。また、Ｎｒｇ−３遺伝子産物（Ｚｈａｎｇら、前出）はＥｒｂ４受容体に結合しそれを活性化するということが公知である（Ｈｉｊａｚｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１３：１０６１−１０６７，１９９８）。
【０００８】
ＥＧＦ様ドメインは全ての形態のＮＲＧ蛋白質のコアに存在しており、ＥｒｂＢ受容体に結合しそれを活性化するために必要である。３つのＮＲＧ遺伝子においてコードされているＥＧＦ様ドメインの推定アミノ酸配列は約３０〜４０％同一である（対形式（ｐａｉｒｗｉｓｅ）比較）。その上、ＮＲＧ−１およびＮＲＧ−２には、異なる生理活性と組織特異的能力を付与しうる少なくとも２つのＥＧＦ様ドメインのサブフォームがあると考えられる。
【０００９】
ＮＲＧに対する細胞応答は上皮増殖因子受容体ファミリーであるＮＲＧ受容体チロシンキナーゼＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４を介して媒介される。全てのＮＲＧリガンドの高親和性は、主にＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４のいずれかが媒介する。ＮＲＧリガンドの結合によって、他のＥｒｂＢサブユニットとの二量体がもたらされ、特定のチロシン残基に対するリン酸化によるトランス活性化が起こる。ある一定の条件下においては、ＥｒｂＢ受容体のほとんど全ての組み合わせでＮＲＧ−１アイソフォームの結合に応答して二量体を形成し得るようである。しかしながら、ＥｒｂＢ２はリガンド−受容体複合体の安定化において重要な役割を持ち得る、二量体形成のための好適なパートナーであると思われる。最近、ＮＲＧ−１、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ４の発現がマウスの発生過程における心室心筋の肉柱形成に必要であるという証拠が示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
世界全体でうっ血性心不全の有病率が高いという点から見て、心機能の喪失を阻害することにより、そして理想的には、うっ血性心不全を持つ人あるいはリスクを持っている人の心機能を向上させることにより、この疾患を予防するか、または進行を最小限に抑えるということは非常に有益である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明者らはニューレグリンが代償的な肥大型の増殖を刺激し、生理的ストレスにさらされている心筋細胞のアポトーシスを阻害するということを見出した。本発明者らの観察からニューレグリン処置が高血圧、虚血性心疾患、心臓毒性などの根底にある因子に起因するうっ血性心不全の予防、症状の進行抑制、回復に有用であることが示される。
【００１２】
本発明は哺乳動物におけるうっ血性心不全の治療方法または予防方法を提供する。本方法は、哺乳動物に対して上皮増殖因子様（ＥＧＦ様）ドメインを持つポリペプチドを投与することを包含する。ここで、ＥＧＦ様ドメインがニューレグリン遺伝子にコードされており、また哺乳動物の心不全を処置または予防するために効果的な量の本ポリペプチドが投与される。
【００１３】
本発明の様々な好適な実施形態において、ニューレグリン遺伝子はＮＲＧ−１遺伝子、ＮＲＧ−２遺伝子、またはＮＲＧ−３遺伝子であり得る。さらに、本ポリペプチドはこれら３つのニューレグリン遺伝子のどれによってもコードされ得る。またさらに、本方法で使われるポリペプチドはリコンビナントヒトＧＧＦ２であり得る。
【００１４】
本発明の別の好適な実施形態において、哺乳動物はヒトであり得る。
【００１５】
本発明の他の実施形態において、うっ血性心疾患は、高血圧、虚血性心疾患、心臓毒性化合物（例としては、コカイン、アルコール、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）のような抗ＥｒｂＢ２抗体または抗ＨＥＲ２抗体、あるいはドキソルビシンまたはダウノマイシンのようなアントラサイクリン抗生物質）への曝露、心筋炎、甲状腺疾患、ウイルス感染、歯肉炎、薬物濫用、アルコール濫用、心膜炎（ｐｅｒｉｏｃａｒｄｉｔｉｓ）、アテローム硬化、血管性疾患、肥大型心筋症、急性心筋梗塞、以前の心筋梗塞、左心室収縮機能不全、冠動脈バイパス手術、飢餓、摂食障害、または遺伝的欠陥に起因し得る。
【００１６】
本発明の別の実施形態において、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）などの抗ＥｒＢ２または抗ＨＥＲ２抗体を哺乳動物に対して、アントラサイクリン投与の前、中、後のいずれかに投与する。
【００１７】
本発明の他の実施様態において、ニューレグリン遺伝子にコードされているＥＧＦ様ドメインを含むポリペプチドを、心臓毒性物質に曝露する前、中、後に投与する。また他の実施形態において、ＥＧＦ様ドメインを含むポリペプチドを曝露前、中、後のうち２回、または３回全て投与する。
【００１８】
本発明のさらに他の実施形態おいて、本ポリペプチドを哺乳動物におけるうっ血性心疾患の診断前、あるいは後のどちらかに投与する。
【００１９】
本発明のさらに別の実施形態において、本ポリペプチドを既に代償性心肥大を受けた哺乳動物に投与する。
【００２０】
本発明の他の好適な実施形態において、本ポリペプチドの投与によって左心室肥大の状態を維持するか、心筋の薄膜化が予防されるか、または心筋細胞のアポトーシスが阻害される。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態において、本ポリペプチドをコードする発現ベクターを哺乳動物に投与することにより、本ポリペプチドを投与し得る。
【００２２】
「うっ血性心不全」とは、心臓による安静時または運動時の正常な血液の送り出しの維持が不可能になること、あるいは正常な心室充満期血圧の調整において正常な心拍出量の維持が不可能になるという、心機能の損失を意味している。左心室駆出率が約４０％以下であることは、うっ血性心不全の指標である（比較として、駆出率が６０％である場合は正常である）。うっ血性心不全患者は、周知の臨床徴候および前兆（例えば、頻呼吸、胸膜滲出液、安静時または運動時の疲労、収縮機能障害、浮腫）を示す。うっ血性心不全は周知の方法で容易に診断される（例として、「慢性心不全の管理における共通指針」、Ａｍ  Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，８３（２Ａ）：１Ａ−３８−Ａ，１９９９を参照のこと）。
【００２３】
相対的な重篤度および疾患の進行は、身体検査、心エコー図、放射性核種画像化、非侵襲性血液動態モニタリング、磁気共鳴血管造影法、および酸素取り込み研究と組み合わせた運動トレッドミルテスト（ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ｔｒｅａｄｍｉｌｌ  ｔｅｓｔｉｎｇ）などの周知の方法によって判定できる。
【００２４】
「虚血性心疾患」とは、心筋が必要とする酸素と適正な酸素供給との間の不均衡に起因する任意の疾患を意味している。虚血性心疾患のほとんどのケースがアテローム硬化または別の血管障害において起こるのと同様に、冠動脈狭窄に起因している。
【００２５】
「心筋梗塞」とは、虚血性心疾患によって結果的に心筋のある領域の組織が瘢痕組織に置き換わっていく過程を意味している。
【００２６】
「心臓毒性」とは、直接的または間接的に心筋細胞を傷害するか、または死滅させることによって心機能を低下させる化合物を意味している。
【００２７】
「高血圧」とは、資格を持つ医療従事者（例として、医師または看護士ら）によって、血圧が正常よりも高く、うっ血性心不全が起こるリスクが増大すると判断される血圧を意味する。
【００２８】
「処置をする」とは、ニューレグリンまたはニューレグリン様ポリペプチドの投与によって、治療中を通してうっ血性心不全の進行が、処置が行われない場合に起こる疾患の進行に比べて統計的に有意に遅くなる、または抑制されるということを意味している。疾患の進行程度は、生存率および入院率だけでなく左心室駆出率、運動能力、および前に列挙した他の臨床試験などの周知の指標を用いて評価することができる。処置によって疾患の進行が統計的に有意な様式で遅くなるか、あるいは阻害されるかどうかは、当該分野での周知の方法（例として、ＳＯＬＶＤ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：６８５−６９１，１９９２およびＣｏｈｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：１８１０−１８１６，１９９８を参照のこと）を用いて決定し得る。
【００２９】
「予防する」とは、うっ血性心不全発症のリスク（「うっ血性心不全の管理に対する共通指針」Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，８３（２Ａ）：１Ａ−３８−Ａ，１９９９において定義されている）を持つ哺乳動物におけるうっ血性心不全の発症を最小限に抑える、または部分的あるいは完全に阻害するということを意味している。うっ血性心不全がニューレグリンまたはニューレグリン様ポリペプチドの投与によって最小限に抑えられるか、または予防されるかということは、ＳＯＬＶＤ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ、前出、およびＣｏｒｎら、前出で記述されている方法などの公知の方法を用いて判断される。
【００３０】
「うっ血性心不全のリスクがある」とは、喫煙者、肥満（すなわち、理想体重を２０％以上上回っている）、心臓毒性化合物（アントラサイクリン抗生物質など）に曝露されているか、または将来曝露されるか、現在、高血圧、虚血性心疾患、心筋梗塞である（または過去これらの既往があった）か、心疾患のリスクを増やすことが公知の遺伝的欠陥があるか、家族に心不全、心筋肥大、肥大型心筋症、左心室収縮機能不全、冠動脈バイパス手術、血管性疾患、アテローム硬化、アルコール中毒症、心膜炎、ウイルス感染、歯肉炎または摂食障害（例えば、食欲不振または過食症）の既往歴があるか、アルコール中毒またはコカイン常用者である個体を意味している。
【００３１】
「心筋の薄膜化の進行を低下させる」とは心室壁の厚さを維持するまたは増大させるように、心室心筋細胞の肥厚を維持することを意味している。
【００３２】
「心筋細胞のアポトーシスを阻害する」とは、ニューレグリン処置が、処置していない心筋細胞と比較して、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも１５％、なおより好ましくは少なくとも２５％、さらみ好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％まで心筋細胞死を阻害することを意味している。
【００３３】
「ニューレグリン」または「ＮＲＧ」とは、ＮＲＧ−１、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３の遺伝子または核酸（例えばｃＤＮＡ）にコードされており、かつＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４受容体またはそれらの組合わせと結合しそれらを活性化するポリペプチドを意味している。
【００３４】
「ニューレグリン１」、「ＮＲＧ−１」、「ヘレグリン」、「ＧＧＦ２」、または「ｐ１８５  ｅｒｂＢ２リガンド」とはＥｒｂＢ２受容体と結合し、ＵＳＰＮ５，５３０，１０９；ＵＳＳＮ５，７１６，９３０号；およびＵＳＳＮ０８／４６１，０９７に記述されているｐ１８５ｅｒｂＢ２リガンド遺伝子にコードされるポリペプチドを意味している。
【００３５】
「ニューレグリン様ポリペプチド」とはニューレグリン遺伝子にコードされたＥＧＦ様ドメインを持っていて、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４またはそれらの組合わせと結合しそれらを活性化するポリペプチドを意味している。
【００３６】
「上皮増殖因子様ドメイン」または「ＥＧＦ様ドメイン」とはＮＲＧ−１、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３遺伝子にコードされるポリペプチドモチーフを意味し、これらの遺伝子は、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４受容体またはそれらの組合わせと結合しそれらを活性化し、そしてＨｏｌｍｅｓらに開示しているように、ＥＧＦ受容体結合ドメインと構造的に類似性を持っている（Ｈｏｌｍｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２０５−１２１０，１９９２；ＵＳＰＮ５，５３０，１０９；ＵＳＰＮ５，７１６，９３０；ＵＳＳＮ０８／４６１，０９７；Ｈｉｊａｚｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ，１３：１０６１−１０６７，１９９８；Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ３８７：５０９−５１２，１９９７；Ｃａｒｒａｗａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：５１２−５１６，１９９７；Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２：６７５−６８０，１９９７；およびＷＯ  ９７／０９４２５）。
【００３７】
「抗ＥｒｂＢ２抗体」または「抗ＨＥＲ２抗体」とはＥｒｂＢ２（ヒトＨＥＲ２としても公知）受容体細胞外ドメインと特異的に結合し、ニューレグリンの結合によって開始されるＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）依存的シグナル伝達を妨げる抗体を意味している。
【００３８】
「形質転換細胞」とは、ニューレグリンまたはニューレグリン  ＥＧＦ様ドメインをもったポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子を、リコンビナントＤＮＡ技術または既存の遺伝子療法技術を用いて導入した細胞（またはその細胞由来の細胞）を意味している。
【００３９】
「プロモーター」とは、転写を指向するに十分な最小限の配列を意味している。本発明には、細胞種あるいは生理学的な状態（例えば低酸素対正酸素状態）についてプロモーター依存性遺伝子発現を制御可能を可能にするか、または外来のシグナルや薬剤によって遺伝子発現を誘導可能にするに十分なプロモーターエレメントも含まれる；そのようなエレメントはネイティブ遺伝子の５’または３’または内部領域に位置している可能性がある。
【００４０】
「作動可能に連結されている」とは、適切な分子（例えば、転写アクチベーター蛋白質）が調節配列に結合される場合、ポリペプチドをコードしている核酸（例えば、ｃＤＮＡ）と、１つ以上の調節配列が、遺伝子発現が可能になる形式で連結されていることを意味している。
【００４１】
「発現ベクター」とは、遺伝子操作されたプラスミドまたはウイルス（例えばバクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、または人工的な染色体に由来する）を意味しており、それらは、宿主細胞の中でコードされたペプチドまたはポリペプチドが発現されるように、プロモーターと作動可能に連結しているポリペプチド（例えばニューレグリン）コード配列を宿主細胞に移入するために使用される。
本願発明は、例えば以下を提供する。
（項目１）  哺乳動物におけるうっ血性心不全を処置または予防するための方法であって、該方法が、該哺乳動物に対して、上皮増殖因子様（ＥＧＦ様）ドメインを含むポリペプトイドを投与する工程を包含し、ここで、該ＥＧＦ様ドメインが、ニューレグリン遺伝子によってコードされ、ここで、該投与工程が、該哺乳動物における心不全を処置または予防するのに有効量である、方法。
（項目２）  項目１に記載の方法であって、ここで、前記ニューレグリン遺伝子が、ＮＲＧ−１遺伝子である、方法。
（項目３）  項目２に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドが、ＮＲＧ−１遺伝子によってコードされる、方法。
（項目４）  項目３に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドが、組換えヒトＧＧＦ２である、方法。
（項目５）  項目１に記載の方法であって、ここで、前記ニューレグリン遺伝子が、ＮＲＧ−２遺伝子である、方法。
（項目６）  項目５に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドが、ＮＲＧ−２遺伝子によってコードされる、方法。
（項目７）  項目１に記載の方法であって、ここで、前記ニューレグリン遺伝子が、ＮＲＧ−３遺伝子である、方法。
（項目８）  項目７に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドが、ＮＲＧ−３遺伝子によってコードされる、方法。
（項目９）  項目１に記載の方法であって、ここで、前記哺乳動物が、ヒトである、方法。
（項目１０）  項目１に記載の方法であって、ここで、前記うっ血性心不全が、高血圧；虚血性心臓疾患；心臓毒性化合物への曝露；心筋炎；甲状腺疾患；ウイルス感染；歯肉炎；薬物濫用；アルコール濫用；心膜炎；アテローム硬化；血管性疾患；肥大型心筋症；急性心筋梗塞；左心室収縮機能不全；冠動脈バイパス手術；飢餓；摂食障害；または遺伝的欠陥から生じる、方法。
（項目１１）  項目１０に記載の方法であって、ここで、前記哺乳動物が、心筋梗塞を被っている、方法。
（項目１２）  項目１０に記載の方法であって、ここで、前記心臓毒性化合物が、アントラサイクリン；アルコール；またはコカインである、方法。
（項目１３）  項目１２に記載の方法であって、ここで、前記アントラサイクリンが、ドキソルビシンまたはダウノマイシンである、方法。
（項目１４）  項目１３に記載の方法であって、ここで、抗ＥｒｂＢ２抗体または抗ＨＥＲ２抗体が、アントラサイクリンの投与の前、投与の間、または投与の後に前記哺乳動物に投与される、方法。
（項目１５）  項目１０に記載の方法であって、ここで、前記心臓毒性化合物が、抗ＥｒｂＢ２抗体または抗ＨＥＲ２抗体である、方法。
（項目１６）  項目１４または１５に記載の方法であって、ここで、前記抗ＥｒｂＢ２抗体または抗ＨＥＲ２抗体が、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）である、方法。
（項目１７）  項目１０に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドが、前記心臓毒性化合物に曝露される前に投与される、方法。
（項目１８）  項目１０に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドが、前記心臓毒性化合物に曝露される間に投与される、方法。
（項目１９）  項目１０に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドが、前記心臓毒性化合物に曝露された後に投与される、方法。
（項目２０）  項目１に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドが、前記哺乳動物におけるうっ血性心不全の診断の前に投与される、方法。
（項目２１）  項目１に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドが、前記哺乳動物におけるうっ血性心不全の診断の後に投与される、方法。
（項目２２）  項目１に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドが、代償性心肥大を被る哺乳動物に投与される、方法。
（項目２３）  項目１に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドの投与が、左心室肥大を維持する、方法。
（項目２４）  項目１に記載の方法であって、ここで、前記方法が、心筋の薄膜化の進行を妨げる、方法。
（項目２５）  項目１に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドの投与が、心筋細胞アポトーシスを阻害する、方法。
（項目２６）  項目１に記載の方法であって、ここで、前記ポリペプチドが、該ポリペプチドをコードする発現ベクターを該哺乳動物に投与する工程によって投与される、方法。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１Ａは、心臓の発生の間、および成体ラット心筋細胞中のニューレグリンレセプターの発現を示す半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の図面である。  図１Ｂは、組換えヒト神経膠増殖因子２（ｒｈＧＧＦ２）で処置された心筋細胞中のＥｒｂＢ４レセプターのチロシンリン酸化を示す、アッセイの図面である。
【図２Ａ】図２Ａは、ミオシン重鎖（図２Ａ）についての、新生仔ラットの心室筋細胞の染色を示す顕微鏡写真の図面である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＢｒｄＵポジティブ核（図２Ｂ）についての、新生仔ラットの心室筋細胞の染色を示す顕微鏡写真の図面である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ｒｈＧＧＦ２が、新生仔ラット心室筋細胞中でＤＮＡ合成（％ＢｒｄＵポジティブ筋細胞で表される）を刺激することを示すグラフである。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、ｒｈＧＧＦ２が、新生仔ラット心室筋細胞中でＤＮＡ合成（％相対3Ｈ−チミジン取込みで表される）を刺激することを示すグラフである。
【図４】図４は、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４が、新生仔ラット心室筋細胞中で相対3Ｈ−チミジン取込みに対するＧＧＦ２の効果を仲介することを示すグラフである。
【図５】図５は、ＧＧＦ２が、新生仔ラット心室筋細胞の初代培養物における生存を促進することを示すグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、ＧＧＦ２が、新生仔ラット心室筋細胞の初代培養物におけるアポトーシス細胞死を減少させることを示す顕微鏡写真の図面である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＧＧＦ２が、新生仔ラット心室筋細胞の初代培養物におけるアポトーシス細胞死を減少させることを示す顕微鏡写真の図面である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＧＧＦ２が、新生仔ラット心室筋細胞の初代培養物におけるアポトーシス細胞死を減少させることを示す顕微鏡写真の図面である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ｒｈＧＧＦ２が、新生仔ラット心室筋細胞の初代培養物におけるアポトーシス細胞死を減少させることを示すグラフである（ＴＵＮＥＬポジティブ筋細胞の百分率の減少によって表される）。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ＧＧＦ２が、新生仔ラット心室筋細胞の初代培養物におけるアポトーシス細胞死を減少させることを示す顕微鏡写真の図面である。
【図６Ｆ】図６Ｆは、ＧＧＦ２が、新生仔ラット心室筋細胞の初代培養物におけるアポトーシス細胞死を減少させることを示す顕微鏡写真の図面である。
【図６Ｇ】図６Ｇは、ＧＧＦ２が、新生仔ラット心室筋細胞の初代培養物におけるアポトーシス細胞死を減少させることを示す顕微鏡写真の図面である。
【図６Ｈ】図６Ｈは、ｒｈＧＧＦ２が、新生仔ラット心室筋細胞の初代培養物におけるアポトーシス細胞死を減少させることを示すグラフである（ｒｈＧＧＦ２処置細胞のヨウ化プロピジウム染色の後のｓｕｂ−Ｇ１画分のフローサイトメトリー分析によって決定）。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ｒｈＧＧＦ２が、成体ラット心室筋細胞の初代培養物における生存を増加させ、アポトーシス細胞死を減少させることを示すグラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、ＧＧＦ２が、新生仔ラット心室筋細胞の肥大性増殖を誘導することを示す顕微鏡写真の図面である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＧＧＦ２が、新生仔ラット心室筋細胞の肥大性増殖を誘導することを示す顕微鏡写真の図面である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、プレプロ心房性ナトリウム利尿因子（プレプロ−ＡＮＦ）、心室肥大のマーカー、およびα−骨格アクチンが、ＧＧＦ２で処置された新生仔ラット心室筋細胞中でアップレギュレートされることを示す、ノーザンブロットの図面である。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ＧＧＦ２が、新生仔ラット心室筋細胞におけるタンパク質の合成（相対3Ｈ−ロイシン取込みによって表される）を刺激することを示すグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは、ＧＧＦ２が、成体ラット心室筋細胞の初代培養物における肥大性増殖を誘導することを示す顕微鏡写真である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＧＧＦ２が、成体ラット心室筋細胞の初代培養物における肥大性増殖を誘導することを示す顕微鏡写真である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＧＧＦ２が、成体ラット心室筋細胞の初代培養物における肥大性増殖を誘導することを示す顕微鏡写真である。
【図９Ｄ】図９Ｄは、プレプロ−ＡＮＦおよびα−骨格アクチンが、ＧＧＦ２で処置された成体ラット心室筋細胞中でアップレギュレートされることを示す、ノーザンブロットの図面である。
【図９Ｅ】図９Ｅは、ＧＧＦ２が、成体ラット心室筋細胞におけるタンパク質の合成（相対3Ｈ−ロイシン取込みによって表される）を刺激することを示すグラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、コントロールおよび大動脈狭窄のラットの心臓の左心室におけるＥｒｂＢ２（図１０Ａ）、ＥｒｂＢ４（図１０Ｂ）、およびβ−アクチンの発現レベルを示す、リボヌクレアーゼ保護アッセイの図面である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、コントロールおよび大動脈狭窄のラットの心臓の左心室におけるＥｒｂＢ２（図１０Ａ）、ＥｒｂＢ４（図１０Ｂ）、およびβ−アクチンの発現レベルを示す、リボヌクレアーゼ保護アッセイの図面である。
【図１１】図１１は、コントロールおよび大動脈狭窄のラットの心臓の左心室由来の筋細胞における、ＡＮＦおよびグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ、ハウスキーピング遺伝子）の発現を示す、ノーザンブロットの図面である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、コントロールおよび大動脈狭窄のラットの心臓の左心室由来の筋細胞におけるＥｒｂＢ２（図１２Ａ）、およびβ−アクチンの発現レベルを示す、リボヌクレアーゼ保護アッセイの図面である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、コントロールおよび大動脈狭窄のラットの心臓の左心室由来の筋細胞におけるＥｒｂＢ４（図１２Ｂ）、およびβ−アクチンの発現レベルを示す、リボヌクレアーゼ保護アッセイの図面である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、６週齢（図１３Ａ）の大動脈狭窄およびコントロールのラット心臓におけるＥｒｂＢ２の発現レベルを示す、ウェスタンブロットの図面である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、２２週齢（図１３Ｂ）の大動脈狭窄およびコントロールのラット心臓におけるＥｒｂＢ２の発現レベルを示す、ウェスタンブロットの図面である。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、６週齢（図１３Ｃ）の大動脈狭窄および対照のラット心臓におけるＥｒｂＢ４の発現レベルを示す、ウェスタンブロットの図面である。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、２２週齢（図１３Ｄ）の大動脈狭窄および対照のラット心臓におけるＥｒｂＢ４の発現レベルを示す、ウェスタンブロットの図面である。
【図１４】図１４は、ＩＧＦ−１またはＮＲＧ−１で予め処置されたラット心筋細胞培養物が、ダウノルビシンで誘導されるアポトーシスに対して感受性が低いことを示す、グラフである。
【図１５】図１５Ａは、ＩＧＦ−およびＮＲＧ−１で刺激されたＡｋｔのリン酸化がＰＩ−３キナーゼインヒビターであるウォルトマンニン（ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）によって阻害されることを示す、リン酸化アッセイの図面である。  図１５Ｂは、ダウノルビシンに曝露された細胞中のカスパーゼ３活性化のＩＧＦ−１阻害およびＮＲＧ−１阻害がＰＩ−３キナーゼ依存性であることを示す、グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、ニューレグリンが、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４レセプターの活性化を通じて、培養心筋細胞の生存および肥大性増殖を促進することを見いだした。
【００４４】
さらに、本発明者らは、実験的に心臓内圧の過負荷を誘導した動物において、心筋細胞のＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４のレベルが初期の代償性肥大の間は正常であり、そして初期心不全への移行期の間は減少することを観察した。
【００４５】
それと共に、本発明者らのインビトロおよびインビボでの知見は、ニューレグリンが、増大した生理学的ストレスに応答した代償性肥大性増殖の刺激に関与し、同時に、このようなストレスに曝された心筋細胞のアポトーシスを阻害することを示す。これらの観察は、ニューレグリン処置が、うっ血性心疾患の予防、最小化、または逆転に有用であることを示す。理論で拘束されることを望むものではないが、ニューレグリン処置は、心筋細胞の肥大を刺激することによって、心臓のポンプ能力を強化するようであり、そして、心筋細胞のアポトーシスを抑制することによって、心臓の更なる劣化を、部分的または完全に阻害する。
【００４６】
（ニューレグリン）
ＮＲＧ−１、ＮＲＧ−２、およびＮＲＧ−３遺伝子によってコードされるポリペプチドはＥＧＦ様ドメインを有し、これにより、これらはＥｒｂＢレセプターに結合し、そしてＥｒｂＢレセプターを活性化することが可能となる。Ｈｏｌｍｅｓら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２０５−１２１０、１９９２）は、ＥＧＦ様ドメインが単独で、ｐ１８５ｅｒｂＢ２レセプターに結合し、そしてこれを活性化するに十分であることを示した。従って、ＮＲＧ−１、ＮＲＧ−２、またはＮＲＧ−３の遺伝子によってコードされる任意のポリペプチド産物、あるいは任意のニューレグリン様ポリペプチド（例えば、ニューレグリン遺伝子またはｃＤＮＡによってコードされるＥＧＦ様ドメイン（例えば、米国特許第５，５３０，１０９号、米国特許第５，７１６，９３０号、および米国特許出願第０８／４６１，０９７号に記載されるようなＮＲＧ−１ペプチドサブドメインＣ−Ｃ／ＤまたはＣ−Ｃ／Ｄ’を含むＥＧＦ様ドメイン；またはＷＯ  ９７／０９４２５に開示のようなＥＧＦ様ドメイン）を有するポリペプチド）が、本発明において、うっ血性心不全の予防または処置のために使用され得る。
【００４７】
（危険因子）
個体のうっ血性心不全を発症する確立を増大させる危険因子は周知である。これには、限定されないが、喫煙、肥満、高血圧、虚血性心疾患、血管疾患、冠状動脈バイパス手術、心筋梗塞、左心室収縮機能不全、心臓毒性化合物（アルコール、コカインのような薬物、ドキソルビシン、およびダウノルビシンのようなアントラサイクリン系抗生物質）に対する曝露、ウイルス感染、心膜炎、心筋炎、歯肉炎、甲状腺疾患、心不全のリスクを高めることが知られている遺伝子欠損（例えば、ＢａｃｈｉｎｓｋｉおよびＲｏｂｅｒｔｓ、Ｃａｒｄｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．１６：６０３−６１０、１９９８；Ｓｉｕら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８：１０２２−１０２６、１９９９；およびＡｒｂｕｓｔｉｎｉら、Ｈｅａｒｔ  ８０：５４８−５５８、１９９８に記載のようなもの）、飢餓、食欲不振および過食症のような摂食障害、心不全の家族歴、および心筋肥大が包含される。
【００４８】
従って、ニューレグリンは、リスクがあると確認された個体のうっ血性心疾患を防ぐために、またはうっ血性心疾患の進行速度を減少させるために、投与され得る。例えば、ニューレグリンを初期代償性肥大の患者に投与すると、肥大状態を維持させ得、そして心不全への進行を妨げ得る。加えて、上記のように、リスクがあると確認された個体は、代償性肥大の発生の前に、心臓保護的な（ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）ニューレグリン処置を受け得る。
【００４９】
癌患者への、アントラサイクリン化学療法またはアントラサイクリン／抗ＥｒｂＢ２（抗ＨＥＲ２）抗体（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）併用療法の前またはその最中のニューレグリン投与は、患者の心筋細胞がアポトーシスすることを防ぎ得、これにより心臓の機能を保護する。既に心筋細胞を損失した患者もまた、ニューレグリン処置の恩恵を被ることができる。なぜなら、残った心筋組織は、肥大性増殖および収縮性の増大を示すことによって、ニューレグリン曝露に対して応答するからである。
【００５０】
（処置）
ニューレグリン、およびニューレグリン遺伝子でコードされるＥＧＦ様ドメインを含むポリペプチドは、患者または実験動物に、薬学的に受容され得る希釈剤、キャリア、または賦形剤と共に、単位投与形態で投与され得る。従来の薬学実践が、このような組成物を患者または実験動物に投与するための適切な処方または組成物を提供するために使用され得る。静脈内投与が好ましいが、任意の適切な投与経路、例えば、非経口、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼、心室内、包内、脊髄内、槽内、腹腔内、鼻腔内、エアーゾル、経口、または局所（例えば、皮膚を透過し得、そして血流に入ることができる処方物を保有する接着性パッチの適用による）投与が使用され得る。治療処方物は、液状の溶液または懸濁液の形態であり得る。経口投与のためには、処方物は錠剤またはカプセル剤の形態であり得る。鼻腔内処方物のためには、散剤、鼻用ドロップ、またはエアーゾルであり得る。上記のいずれの処方物も、持続放出処方物であり得る。
【００５１】
処方物を作製するための当該分野で周知の方法は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に見いだされる。非経口投与のための処方物は、例えば、賦形剤、滅菌水、または生理食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、植物起源の油、または水素化ナフタレン（ｎａｐｔｈａｌｅｎｅ）を含み得る。持続放出性、生体適合性、生分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを用いて、化合物の放出を制御し得る。本発明の分子を投与するための他の潜在的に有用な非経口送達系は、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透性ポンプ、移植できる灌流系、およびリポソームを包含する。吸入のための処方物は、賦形剤、例えば、ラクトースを含み得、あるいは、例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸およびデオキシコール酸塩を含む水溶液であり得、あるいは鼻用ドロップの形態、あるいはゲルとして投与するためには油性溶液であり得る。
【００５２】
（遺伝子治療）
ニューレグリン、およびニューレグリンＥＧＦ様ドメインを含むニューレグリン様ポリペプチドはまた、体細胞遺伝子治療によって投与され得る。ニューレグリン遺伝子治療のための発現ベクター（例えば、プラスミド、人工染色体、またはウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルス由来のもの）は、ニューレグリンコード（またはニューレグリン様ポリペプチドコード）ＤＮＡを、適切なプロモーターの転写制御下で保有する。プロモーターは、当該分野で公知の任意の非組織特異的プロモーターであり得る（例えば、ＳＶ−４０またはサイトメガロウイルスプロモーター）。あるいは、プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば、横紋筋特異的、心房または心室の心筋細胞特異的（例えば、Ｆｒａｎｚら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：５６０−５６６、１９９７に記載のような）、あるいは内皮細胞特異的なプロモーターであり得る。プロモーターは、誘導性プロモーター、例えば、Ｐｒｅｎｔｉｃｅら（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：５６７−５７４、１９９７）に記載のような虚血誘導性プロモーターであり得る。プロモーターはまた、内在性ニューレグリンプロモーターであり得る。
【００５３】
発現ベクターは、裸のＤＮＡとして、ＤＮＡの細胞中への進入を増強する薬剤、例えば、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTM、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、ＤＯＴＡＰTM（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）または類似の化合物のようなカチオン性脂質、リポソーム、あるいはＤＮＡを特定の型の細胞（例えば、心筋細胞または内皮細胞）に向けて標的化する抗体と混合して、あるいはこれと結合させて、投与され得る。投与の方法は、上記の「治療」のセクションに記載の方法のいずれかであり得る。特に、体細胞遺伝子治療のためのＤＮＡは、静脈内注射、心臓灌流、および心筋層に直接注入することによって心臓への送達に成功している（例えば、Ｌｏｓｏｒｄｏら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８：２８００−２８０４、１９９８；Ｌｉｎら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ３３：２１９−２２４、１９９９；Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．  ８７：１３４７−１３５０、１９９８；Ｙａｙａｍａら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ３１：１１０４−１１１０，１９９８を参照のこと）。治療用ＤＮＡは、患者の細胞中に進入して発現し、そしてベクターがコードする治療的ポリペプチドが心筋細胞ＥｒｂＢレセプターに結合してこのレセプターを活性化させるように、投与される。
【００５４】
以下の実施例は、当業者が本発明ならびにその原理および利点をよりよく理解するための一助となる。これらの実施例は、本発明の例示であり、本発明の範囲を限定するものではないことが意図される。
【実施例】
【００５５】
（実施例Ｉ：一般的方法）
（心筋細胞および非筋細胞の初代培養物の調製）
新生仔ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）初代培養物を、以前に記載されたようにして（Ｓｐｒｉｎｇｈｏｒｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４３６０−１４３６５、１９９２）調製した。筋細胞を選択的に富化するために、解離した細胞を２回、５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、７５分間、２回、予備プレーティング（ｐｒｅ−ｐｌａｔｅｄ）し、そして最後に低密度（０．７〜１×１０4細胞／ｃｍ2）で、７％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充したダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥ）培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中にプレーティングした。シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ；１０μＭ；Ｓｉｇｍａ）を、チミジン取込み測定のために用いる培養物以外では、最初の２４〜４８時間の間に培養物に添加して、非筋細胞の増殖を防いだ。他に指示のない限り、全ての実験は、無血清培地であるＤＭＥ＋ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、およびセレン；Ｓｉｇｍａ）に替えた後、３６〜４８時間後に行った。この方法を用いて、本発明者らは、自発的収縮の顕微鏡観察によって、そしてモノクローナル抗心臓ミオシン重鎖抗体（抗ＭＨＣ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ｓａｎｄｏｗｎ、ＮＨ）を用いた免疫蛍光染色によって評価して、＞９５％筋細胞を含む初代培養物を慣用的に得た。
【００５６】
非筋細胞を富化した新生仔心臓から単離された細胞画分の初代培養物を、予備プレーティング手順の間に組織培養皿に接着した細胞を２回継代することによって調製した。これらの非筋細胞培養物は、抗ＭＨＣポジティブ細胞をわずかしか含んでおらず、２０％ＦＢＳを補充したＤＭＥ中でサブコンフルエンス（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）まで増殖させ、その後、ＤＭＥ−ＩＴＳに替えて、引き続き３６から４８時間増殖させた。
【００５７】
成体ラット心室筋細胞（ＡＲＶＭ）初代培養物の単離および調製を、以前に記載された技術（Ｂｅｒｇｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６６：Ｈ３４１−３４９、１９９４）を用いて行った。棒状の心筋細胞を培地中で、ラミニン（１０μｇ／ｍｌ；Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、  ＭＡ）を予めコーティングしたディッシュ上で６０分間プレーティングし、次に培地を１回替えて、弱く付着した細胞を除いた。ＡＲＶＭ初代培養物への非筋細胞の混入は、血球計算板で計数して測定すると、典型的には５％未満であった。全てのＡＲＶＭ初代培養物を「ＡＣＣＩＴＴ」（Ｅｌｌｉｎｇｓｅｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６５：Ｈ７４７−Ｈ７５４、１９９３）と名付けられた、ＤＭＥで構成され、２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、２ｍＭのＬ−カルニチン、５ｍＭのクレアチン、５ｍＭのタウリン、０．１μＭのインスリン、および１０ｎＭのトリヨウドスレオニンが補充され、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む、規定された培地中で維持した。筋細胞の生存および／またはアポトーシスを検査するように設計された実験プロトコルにおいては、インスリンはこの規定培地から除外され、従ってこれは、「ＡＣＣＴＴ」と名付けられる。
【００５８】
（ラット心臓中のＥｒｂＢレセプターのＰＣＲ分析）
ＥｒｂＢレセプターのＣ末端の一部をコードするｃＤＮＡ配列を、以下の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した：ＥｒｂＢ２コドン８５７位から１２０７位（Ｂａｒｇｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：２２６−２３０、１９８６）の増幅のためのＥｒｂＢ２Ａ（５’−ＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣ−３’：センス；配列番号１）およびＥｒｂＢ２Ｂ（５’−ＣＣＴＴＣＴＣＴＣＧＧＴＡＣＴＡＡＧＴＡＴＴＣＡＧ−３’：アンチセンス；配列番号２）；ＥｒｂＢ３コドン７１２位から１０８５位（Ｋｒａｕｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：９１９３−９１９７、１９８９）の増幅のためのＥｒｂＢ３Ａ（５’−ＧＣＴＴＡＡＡＧＴＧＣＴＴＧＧＣＴＣＧＧＧＴＧＴＣ−３’：センス；配列番号３）およびＥｒｂＢ３Ｂ（５’−ＴＣＣＴＡＣＡＣＡＣＴＧＡＣＡＣＴＴＴＣＴＣＴＴ−３’：アンチセンス；配列番号４）；ＥｒｂＢ４コドン８９６位から１２６２位（Ｐｌｏｗｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１７４６−１７５０、１９９３）の増幅のためのＥｒｂＢ４Ａ（５’−ＡＡＴＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＣＧＴＴＴＧＧ−３’：センス；配列番号５）およびＥｒＢ４Ｂ（５’−ＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧ：アンチセンス：配列番号６）。ラット心臓または新たに単離した新生仔ラットおよび成体ラットの心室筋細胞由来のＲＮＡ試料（１μｇ）を逆転写して、第１鎖ｃＤＮＡを生成した。ＰＣＲ反応を、およそ５０ｎｇの第１鎖ｃＤＮＡを含む最終容量５０μｌで、ＰＴＣ−１００ＴＭプログラム式熱コントローラー（Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．；Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）中で３０サイクル行った。各サイクルは、９４℃で３０秒間、６３℃で７５秒間、および７２℃で１２０秒間を含んでいた。各反応混合物の３０μｌのアリコートを１％アガロースゲル中の電気泳動と臭化エチジウム染色によって分析した。ＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中に直接クローニングし、そして自動ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００５９】
（ＥｒｂＢレセプターのリン酸化分析）
どのレセプターサブタイプがチロシンリン酸化されるかを分析するために、新生仔および成体の心室の筋細胞を無血清培地中で２４から４８時間維持し、次いで組換えヒトグリア増殖因子２（ｒｈＧＧＦ２）を２０ｎｇ／ｍｌ用いて３７℃で５分間処理した。細胞を、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回素早くリンスし、１％  ＮＰ４０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．５％  デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  オルトバナジウム酸ナトリウム、１０ｍＭ  モリブデン酸ナトリウム、８．８ｇ／Ｌ  ピロリン酸ナトリウム、４ｇ／Ｌ  ＮａＦｌ、１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１０μｇ／ｍｌ  アプロチニンおよび２０μＭ  ロイペプチンを含んだ冷たい溶解緩衝液に溶解した。溶解産物を１２，０００×ｇで４℃で２０分間遠心分離し、上清の５００μｇ（新生仔の筋細胞）または２０００μｇ（成体の筋細胞）のアリコートをＥｒｂＢ２またはＥｒｂＢ４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）に特異的な抗体とともに４℃で一晩インキュベートし、プロテインＡ−アガロース（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で沈降させた。免疫沈降物を回収し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプル緩衝液中で煮沸することにより、遊離させた。サンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分画し、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に転写し、ＰＹ２０抗ホスホチロシン抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）でプローブした。ＥｒｂＢ２の検出については、上清をまた、ビオチン化したＲＣ２０抗ホスホチロシン抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）で免疫沈降し、ＥｒｂＢ２（Ａｂ−２；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に対するモノクローナル抗体でブロットした。
【００６０】
（［3Ｈ］チミジンおよび［3Ｈ］ロイシンの取り込み）
ＤＮＡ合成の指標として、以前に述べられているように（Ｂｅｒｋら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  １３：３０５−３１４，１９８９）、［3Ｈ］チミジンの取り込みを測定した。無血清培地（ＤＭＥ＋ＩＴＳ）で３６から４８時間インキュベートした後、その細胞を２０時間、異なった濃度のｒｈＧＧＦ２（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＮｅｕｒｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で刺激した。次いで［3Ｈ］チミジン（０．７  Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ｄｕｐｏｎｔ）を５μＣｉ／ｍｌの濃度でこの培地に加え、その細胞をさらに８時間培養した。細胞をＰＢＳで２回、１０％  ＴＣＡで１回洗浄し、１０％  ＴＣＡを加え、４℃で４５分間、タンパク質を沈殿させた。ｒｈＧＧＦ２にさらしていない筋細胞の並行培養物を、コントロールと同様の条件下で採取した。沈殿物を９５％  エタノールで２回洗浄し、０．１５Ｎ  ＮａＯＨに再懸濁し、１Ｍ  ＨＣｌで飽和させ、次いで、アリコートをシンチレーションカウンターでカウントした。結果を、それぞれの実験でのコントロール細胞の平均ｃｐｍに対して正規化した１ディッシュ当りの相対ｃｐｍとして表す。抗体をブロックする実験として、ｒｈＧＧＦ２またはｒｈＦＧＦ２のどちらかを加える前に、それぞれのニューレグリンレセプター（ｃ−ｎｅｕ  Ａｂ−２，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；およびＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に特異的な抗体（０．５ｇ／ｍｌ）とともに細胞を２時間プレインキュベートしたという点を除き、同様の手順を適用した。
【００６１】
［3Ｈ］ロイシンの取り込みの割合をタンパク質合成の指標として使用した。これらの実験のために、１０μＭのシトシンアラビノシドを培養培地に加えた。細胞を無血清培地で３６から４８時間増殖させ、次いで異なった用量のｒｈＧＧＦ２で刺激した。４０時間後、［3Ｈ］ロイシン（５μＣｉ／ｍｌ）を８時間加え、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％  ＴＣＡで採取した。ＴＣＡで沈殿可能な放射能を、上述のようにシンチレーションカウンティングによって決定した。
【００６２】
（５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジンの取り込みおよび免疫蛍光染色）
核の５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みおよび心筋特異的抗原のミオシン重鎖（ＭＨＣ）を二重間接免疫蛍光を用いて同時に可視化した。初代ＮＲＶＭ培養物をＤＭＥ＋ＩＴＳ中で４８時間維持し、次いでｒｈＧＧＦ２（４０ｎｇ／ｍｌ）で３０時間刺激した。コントロール培養物も同様に、しかし、ｒｈＧＧＦ２を除いて調製した。ＢｒｄＵ（１０μＭ）を最後の２４時間にわたって加えた。細胞を、ｐＨ  ２．０の５０ｍＭグリシン緩衝液中の７０％エタノールの溶液中で−２０℃、３０分間固定化し、ＰＢＳ中で再水和し、４Ｎ  ＨＣｌ中で２０分間インキュベートした。次いで細胞をＰＢＳ中で３回洗浄して中和し、１％  ＦＢＳで１５分間インキュベートし、続いてマウスのモノクローナル抗体の抗ＭＨＣ（１：３００；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｓａｎｄｏｗｎ，ＮＨ）で３７℃、６０分間処理した。一次抗体を、ＴＲＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：３００，Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）で検出し、核ＢｒｄＵの取り込みを、インサイチュ細胞増殖キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏ．Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）からのフルオレセイン結合体化抗ＢｒｄＵ抗体で検出した。カバーグラスをＦｌｕ−ｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）の上に置き、免疫蛍光顕微鏡によって検査した。約５００個の筋細胞がそれぞれのカバーグラスにおいてカウントされ、ＢｒｄＵ陽性の筋細胞のパーセンテージを計算した。
【００６３】
ｒｈＧＧＦ２を用いての筋細胞表現型の変化を検査するために、細胞を４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド中で３０分間、室温で固定し、ＰＢＳでリンスし、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１５分間浸透性にし、次いで１％  ＦＢＳとともにさらに１５分間インキュベートし、続いて抗ＭＨＣ（１：３００）とともにインキュベートし、ＴＲＩＴＣ結合体化二次抗体（ＮＲＶＭ）またはＦＩＴＣ結合体化二次抗体（ＡＲＶＭ）を用いて可視化した。ＡＲＶＭを、ＭＲＣ６００共焦点顕微鏡（ＢｉｏＲａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）とＫｒ／Ａｒレーザーを用いて検査した。
【００６４】
（細胞生存アッセイおよびアポトーシスの検出）
細胞の生存率を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ，Ｓｉｇｍａ）細胞呼吸アッセイによって決定した。このアッセイは、生細胞のミトコンドリアの活性に依存している（Ｍｏｓｍａｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６５：５５−６３，１９８３）。無血清培地中で２日後、ＮＲＶＭの初代培養物を４日間または６日間のいずれかにわたって、異なる濃度のｒｈＧＧＦ２で刺激した。ＡＲＶＭをＡＣＣＴＴ培地中またはＡＣＣＴＴ培地＋異なった濃度のｒｈＧＧＦ２中で６日間維持した。次いでＭＴＴをこの細胞と３時間、３７℃でインキュベートした。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ）で細胞融解した後、生細胞は、テトラゾリウム環を、５７０ｎｍで光学密度を読み取ることによって定量され得る暗青色のホルマザン結晶に変化させる。
【００６５】
アポトーシスを、新生仔および成体の筋細胞中で、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介ｄＵＴＰニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）検定を用いて検出した。フルオレセイン結合体化ｄＵＴＰを用いたＤＮＡの３’末端ラベリングを製造者の指示通りにインサイチュ細胞死検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて行った。細胞を上述のように抗ＭＨＣ抗体を用いて対比染色し、核もまた、Ｈｏｅｓｃｈｔ  ３３２５８（１０μＭ，Ｓｉｇｍａ）を用いて５分間染色した。５００個を超える筋細胞をそれぞれのカバーグラスで数え、ＴＵＮＥＬ陽性の筋細胞のパーセンテージを計算した。７０％エタノール／ＰＢＳ中で固定し、そしてヨウ化プロピジウムで染色した新生仔の筋細胞のフローサイトメトリー分析をまた、アポトーシスが起こっている細胞のパーセンテージを定量するために行った。この方法はアポトーシスが起こっている細胞は低２倍体量のＤＮＡを有し、ＤＮＡヒストグラムのＧ０／Ｇ１ピークより下の、広い範囲に局在するという観察に基づいている。手短には、細胞をトリプシン処理によって採取し、非接着細胞と一緒にプールし、７０％エタノール中で固定した。ＰＢＳで１回リンスした後、細胞を室温で３０分間、ＲＮａｓｅＡ（５Ｋｕｎｉｚ単位／ｍｌ）を含んだヨウ化プロピジウム（２０μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）溶液でインキュベートした。データを、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて収集した。それぞれのサンプルについて、１０，０００の事象を収集した。凝集した細胞および極端に小さい細胞破片は除去した。
【００６６】
（ＲＮＡの単離およびハイブリダイゼーション）
総細胞ＲＮＡをＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、酸性グアジニウム／チオシアネート−フェノール／クロロホルム抽出法（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９，１９８７）の改変法によって単離した。ＲＮＡをホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動によってサイズ分画し、一晩のキャピラリーブロッティングによって、ナイロンフィルター（Ｄｕｐｏｎｔ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に転写し、ランダムプライミング（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）によって［α−32Ｐ］ｄＣＴＰでラベルしたｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。フィルターをストリンジェント条件下で洗浄し、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｏｍａｔ  ＡＲ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に曝露した。シグナルの強度を、デンシトメトリー（Ｕｌｔｒａｓｃａｎ  ＸＬ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって決定した。次のｃＤＮＡプローブを用いた：ラットプレプロ心房性ナトリウム利尿因子（ｐｒｅｐｒｏ−ＡＮＦ；心筋細胞の肥大のマーカー）（０．６ｋｂのコード領域）（Ｓｅｉｄｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２５：３２４−３２６、１９８４）およびラット骨格α−アクチン（２４０ｂｐの３’非翻訳領域）（Ｓｈａｎｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：５７９−５８９，１９８１）。ラットグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＤＰＨ；ハウスキーピング遺伝子）ｃＤＮＡプローブ（２４０ｂｐのコード領域）（Ｔｓｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：２４８５−２５０２，１９８５）をローディングおよび転写効率のコントロールとして使用した。
【００６７】
（大動脈狭窄モデル）
上行大動脈狭窄を、乳離れしたばかりの雄ウィスターラット（体重５０〜７０ｇ、３〜４週間、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓより入手）で以前に記載されたように行った（Ｓｃｈｕｎｋｅｒｔら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８７：１３２８−１３３９，１９９３；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９０：１４１０−１４２２，１９９４；Ｆｅｌｄｍａｎら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，７３：１８４−１９２，１９９３；Ｓｃｈｕｎｋｅｒｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：２７６８−２７７４，１９９５；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９５：１５９２−１６００，１９９７；Ｌｉｔｗｉｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９１：２６４２−２６５４；１９９５）。擬似手術の動物は、年齢が一致したコントロールとして役立った。大動脈狭窄動物および年齢が一致した擬似手術のコントロールを、手術後６および２２週間に、６５ｍｇ／ｋｇの腹腔内ペントバルビタールで麻酔した後に屠殺した（１グループ当りｎ＝２０〜２９）。このモデルでの血流力学および心エコーの研究は、正常な左心室（ＬＶ）腔の大きさおよび収縮指数を伴う代償肥大が結紮の６週間後に存在し、一方、動物は結紮の２２週間後までに早期不全を発達させ、この不全は左心室腔の膨大発症、および柏出指数の軽い抑制、ならびに左心室グラム質量当りの圧力増加、の開始によって特徴付けられることを示した。本研究では、以前に記載されたように、屠殺する前にインビボ左心室圧力の測定を行った（Ｓｃｈｕｎｋｅｒｔら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８７：１３２８−１３３９，１９９３；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９０：１４１０−１４２２，１９９４；Ｆｅｌｄｍａｎら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，７３：１８４−１９２，１９９３；Ｓｃｈｕｎｋｅｒｔら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：２７６８−２７７４，１９９５；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９５：１５９２−１６００，１９９７；Ｌｉｔｗｉｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９１：２６４２−２６５４；１９９５）。また動物を、頻呼吸、腹水および胸水の存在を含む心不全の臨床マーカーについて検査した。体重および左心室の重さの両方を記録した。
【００６８】
（ＲＮＡ抽出のための左心室筋細胞の単離）
動物の部分集合（グループ当りｎ＝１０）の中で、心臓を迅速に切除し、大動脈カニューレに付着させた。筋細胞のコラゲナーゼ灌水による解離を以前に記載されたように行った（Ｋａｇａｙａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９４：２９１５−２９２２，１９９６；Ｉｔｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：１２５−１３５，１９９７；Ｔａｊｉｍａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９９：１２７−１３５，１９９９）。最終細胞懸濁液中の筋細胞のパーセンテージを評価するために、筋細胞のアリコートを固定し、浸透化し、ブロックした。次いで細胞懸濁液を、筋細胞と内皮細胞との間を区別するために、α−サルコメアアクチンに対する抗体（ｍＡｂ，Ｓｉｇｍａ，１：２０）およびフォンビルブラント因子に対する抗体（ｐＡｂ，Ｓｉｇｍａ，１：２００）とともにインキュベートした。テキサスレッド（あるいはオレゴングリーン）結合体とともに二次抗体（ヤギ抗ウサギ、ヤギ抗マウスｐＡｂ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ、１：４００）を検出系として用いた。９８％の筋細胞および２％未満の内皮細胞または非染色細胞（線維芽細胞）のフラグメントを慣用的に得た。
【００６９】
（ＲＮＡ分析）
全ＲＮＡを、ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、コントロールの筋細胞および肥大した筋細胞（それぞれのグループでｎ＝１０の心臓）から、ならびに左心室組織（それぞれのグループでｎ＝１０の心臓）から単離した。組織および筋細胞のＲＮＡを次のプロトコールに使用した。筋細胞ＲＮＡを用い、ノーザンブロットを用いて、ＧＡＰＤＨに対して標準化し、心房性ナトリウム利尿ペプチドのメッセージレベルを評価した（Ｆｅｌｄｍａｎら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７３：１８４−１９２，１９９３；Ｔａｊｉｍａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９９：１２７−１３５，１９９９）。これらの実験を行って、この肥大の分子マーカーを用いて、ＲＮＡの筋細胞起源の特異性を確かめた。
【００７０】
本発明者らはまた、成体のラットの心臓および成体の筋細胞に由来するサンプル中のＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ４およびニューレグリンの存在の最初の見積もりのために、次のプライマー対を用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った：ＥｒｂＢ２センス  ５’ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＧＡＴ  ＧＴＡ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ３’（配列番号７）、ＥｒｂＢ２アンチセンス  ５’ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＴＧＴ  ＣＣＣ  ＴＴＴ  ３’（配列番号８）（Ｓａｒｋａｒら、Ｄｉａｇｎ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．２：２１０−２１８，１９９３）；ＥｒｂＢ３センス  ５’ＧＣＴ  ＴＡＡ  ＡＧＴ  ＧＣＴ  ＴＧＧ  ＣＴＣ  ＧＧＧ  ＴＧＴ  Ｃ  ３’（配列番号３）、ＥｒｂＢ３アンチセンス  ５’ＴＣＣ  ＴＡＣ  ＡＣＡ  ＣＴＧ  ＡＣＡ  ＣＴＴ  ＴＣＴ  ＣＴＴ  ３’（配列番号４）（Ｋｒａｕｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９１９３−９１９７；１９８９）、ＥｒｂＢ４センス  ５’ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＣＣＣ  ＡＴＣ  ＡＧＡ  ＧＴＧ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＧＧ  ３’（配列番号５）、ＥｒｂＢ４アンチセンス  ５’ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＴＡＧ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＴＧＣ  ＴＧ  ３’（配列番号６）（Ｐｌｏｗｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１７４６−１７５０；１９９３）；ニューレグリンセンス  ５’ＧＣＡ  ＴＣＡ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  Ｇ  ３’（配列番号９）、ニューレグリンアンチセンス  ５’ＣＡＣ  ＡＴＧ  ＣＣＧ  ＧＴＴ  ＡＴＧ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  Ａ  ３’（配列番号１０）。後者のプライマーはＮＲＧ−１遺伝子によってコードされた核酸を認識するが、そのアイソフォーム間を区別しない。増幅を、１分間の変性、遺伝子に特異的な温度での２分間のアニーリング、および７２℃にて２分間の伸長によって開始した。ＰＣＲ反応物全体を１％アガロースゲルで電気泳動し、予想サイズのＰＣＲ産物をゲル精製した。
【００７１】
ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にこれらのフラグメントをクローンニングした後、これらのフラグメントのベクター内での正確さおよび方向を配列決定によって確かめた。クローニングされたＰＣＲフラグメントを用いて、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔインビトロ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）およびα−32Ｐ−ＵＴＰを用いて、放射性標識したリボプローブを生成した。ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ４またはニューレグリンフラグメントを含んだプラスミドを直鎖にし、そして、Ｔ７またはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって、放射性標識したプローブを合成した。キットによって提供されたβ−アクチンプローブを、Ｔ７またはＴ３ポリメラーゼを用いて転写し、それぞれ３３０および３００ｂｐのフラグメントを得た。ＲＰＡＩＩキット（Ａｍｂｉｏｎ）のプロトコールにより、後の標準化のための２×１０4ｃｐｍのβ−アクチンと一緒に、５×１０5ｃｐｍのＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ４またはニューレグリンのｃ−ＲＮＡに対して２０μｇの全ＲＮＡをハイブリダイズさせた。
【００７２】
ＲＮａｓｅＡ／ＲＮａｓｅＴ１で消化した後、サンプルを沈殿させ、乾燥し、再溶解し、最後に２時間にわたって５％ポリアクリルアミドゲルによって分離した。ゲルをＫｏｄａｋ  ＭＲフィルムに１２から４８時間曝露し、アッセイをＩｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、オートラジオグラフのデンシトメトリースキャニングで定量した。ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ４およびニューレグリンのｍＲＮＡレベルをβ−アクチンに対して標準化した。
【００７３】
（ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４のウエスタンブロッティング）
左心室組織（１グループ当りｎ＝５の心臓）を、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ  ７．４、１％  ＮＰ−４０、０．１％  ＳＤＳ、０．２５％  Ｎａ−デオキシコール酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌぺプスタチンおよび１ｍＭ  Ｎａ3ＰＯ４を含んだＲＩＰＡ緩衝液中で迅速にホモジナイズした。タンパク質を、ローリーアッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて定量した。レムリＳＤＳサンプル緩衝液中の５０μｇのタンパク質を５分間煮沸し、遠心分離した後、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングした。電気泳動の後、タンパク質を１００ｍＡで一晩、ニトロセルロースメンブレンに転写した。フィルターを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、５％脱脂乳でブロッキングし、次いで、抗ＥｒｂＢ２または抗ＥｒｂＢ４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、それぞれ１：１００、１μｇ／ｍｌに希釈）とともにインキュベートした。１：２０００に希釈したヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ結合体化二次抗体とともにインキュベートした後、ブロットを増強化学発光（ＥＣＬ）検出法（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に供し、その後Ｋｏｄａｋ  ＭＲフィルムに３０〜１８０秒間曝露した。タンパク質レベルを抗β−アクチン（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出されたβ−アクチンのタンパク質レベルに対して標準化した。
【００７４】
（ニューレグリンについてのインサイチュハイブリダイゼーション）
左心室組織（ｎ＝２コントロールおよび６週間大動脈の狭窄した心臓）の１０μｍ凍結切片をインサイチュハイブリダイゼーションに使用した。アンチセンスＲＮＡプローブおよびセンスＲＮＡプローブを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中のｃＤＮＡフラグメントから、Ｔ７  ＲＮＡポリメラ−ゼまたはＴ３  ＲＮＡポリメラ−ゼのいずれかおよびジゴキシゲニン標識のＵＴＰ（ＤＩＧ  ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて合成した。組織切片を、最初に４％パラホルムアルデヒドで２０分間処理し、続いてプロテイナーゼＫ（１０μｇ／ｍｌ）で３７℃、３０分間消化し、さらに５分間４％パラホルムアルデヒドで固定した。
【００７５】
固定の次に、スライドをＰＢＳ中で５分間にわたって３回洗浄し、その後０．２５％無水酢酸中の０．１Ｍ塩化トリエタノールアミン緩衝液中に切片を１０分間浸漬して切片上の極性基および荷電した基をブロックし、それゆえプローブの非特異的な結合を妨げた。２×ＳＳＣ中でスライドを洗浄した後、次いでこれらのスライドを、４５℃で６０分間、５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣを充填した湿気のあるチャンバー内で、プレハイブリダイズをした（５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、５％デキストラン硫酸、０．１％ＳＤＳ、１×デンハルト、４００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）。１時間後、プローブをプレハイブリダイゼーション溶液に加え、スライドを１６〜１８時間４５℃でハイブリダイズした。
【００７６】
一晩のハイブリダイゼーションの後、スライドを、振盪しながら４×ＳＳＣ中で３０分間４５℃で２回洗浄し、次いで、ＲＮａｓｅＡ（４０μｇ／ｍｌ）を加えた５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中で、３０分間３７℃でインキュベートして、ハイブリダイズしていないプローブを除いた。ＲＮａｓｅで処理した後、切片を２×ＳＳＣ中で５０℃で３０分間浸漬し、次いで０．２×ＳＳＣ中で同じ温度でさらに３０分浸漬した。スライドをＴＢＳＩ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５）で平衡化し、次いで製造者のプロトコール（ＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に従い、３０分間室温でブロッキング試薬でブロックした。
【００７７】
ブロッキング試薬を取り除いた後、スライドをＴＢＳＩ中に１分間浸漬し、次いで、抗ＤＩＧ−ＡＰ結合体溶液（ＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）をそれぞれの切片に１．５時間室温で、湿気のあるチャンバー内で適用した。その後スライドをＴＢＳＩ中で１回の洗浄当り１０分間ずつ３回洗浄して、過度の抗体を洗浄除去し、ＴＢＳＩＩ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ９．５、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ2・７Ｈ2Ｏ）で５分間平衡化した。色の基質を製造者の指示に従って調製し、青色着色反応が可視化するまでそれぞれの切片に適用した。反応を止め、スライドをＰＢＳおよび蒸留水でそれぞれ５分間洗浄した。核の対比染色の後、切片をエタノールシリーズを通して脱水し、キシレンに浸漬し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ中でのカバーグラスによって検鏡用に作製した。
【００７８】
（統計的解析）
全ての数値を平均値±ＳＥＭで表す。大動脈狭窄症グループ（結紮（ｂａｎｄｉｎｇ）してから６週間、２２週間）と年齢を合わせた（ａｇｅ−ｍａｔｃｈｅｄ）コントロールのグループとの間に見られる差異の統計的な解析を、ＡＮＯＶＡ比較によって行った。片側（ｕｎｐａｉｒｅｄ）スチューデント検定を用いて、両グループ間で結紮後に同じ年齢での比較を行った。ｐ＜０．０５のレベルを統計的有意とした。
【００７９】
（実施例ＩＩ：ニューレグリンは心筋細胞の生存と増殖を促進する）
（心臓におけるニューレグリン受容体の発現）
ラットの心筋においてどのＮＲＧ受容体（すなわちＥｒｂＢ２，  ＥｒｂＢ３，  ＥｒｂＢ４）が発現しているかを決定するために、ラット心臓組織の発生の各段階、および分離したばかりの新生仔および成体の心室筋細胞由来のＲＮＡを、ＥｒｂＢ受容体の可変性Ｃ末端に隣接したプライマーを用いてＰＣＲによって逆転写し、そして増幅した。図１Ａは心臓発生の間のニューレグリン受容体ｍＲＮＡレベルの半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。胎児（Ｅ１４、Ｅ１６、Ｅ１９）、新生仔（Ｐｌ）または成体（Ａｄ）のラット心臓、および新生仔ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）または成体ラット心室筋細胞（ＡＲＶＭ）に由来する総ＲＮＡを、ｃＤＮＡへと逆転写し、受容体アイソフォームに特異的なプライマーを用いて増幅した（方法を参照のこと）。逆転写、ＰＣＲによる増幅、およびゲルのローディングの際のコントロールとして、ＧＡＰＤＨを用いた（「Ｍ」は、１ｋｂまたは１２０ｂｐのＤＮＡ分子量標準を示す）。ＲＴ−ＰＣＲ産物を、ＤＮＡ配列決定によって確かめた。
【００８０】
三種全てのＥｒｂＢ受容体は、中期胚発生（Ｅ１４）の発生期ラット心臓において発現した。その相対的なｍＲＮＡ量の順序は、ＥｒｂＢ４＞ＥｒｂＢ２＞ＥｒｂＢ３であった。ＥｒｂＢ受容体の発現は、胚発生の後期においてダウンレギュレートされた。Ｅ１６およびＥ１９において、ならびに出生後１日目（Ｐ１）においては、ＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ４のｍＲＮＡのみが検出され得た。成体ラット心臓においては、ＥｒｂＢ４は検出されたものの、そのｍＲＮＡ量は胚発生および新生仔の心臓において検出されたものに比べて低かった。それに対して、ＥｒｂＢ２  ｍＲＮＡおよび、まれにではあるがＥｒｂＢ３  ｍＲＮＡが、成体心筋においてごく低いレベルで検出し得た。分離されたばかりの新生仔および成体のラット心室筋細胞の初代培養において、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４両方のｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによって容易に検出したが、ＥｒｂＢ４の発現レベルはＥｒｂＢ２の発現レベルよりも矛盾なく高かった。さらに、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４についての受容体特異的ｃＤＮＡプローブを用いたときには、ＥｒｂＢ４の転写のみを、分離されたばかりの新生仔および成体のラット心室筋細胞において、ノーザンブロットにより容易に検出し得た。
【００８１】
どのＥｒｂＢ受容体がニューレグリン処理後にチロシンリン酸化されたかを決定するために、２４〜４８時間の間、無血清培地中に維持されていたＮＲＶＭまたはＡＲＶＭの初期培養物を、ニューレグリン添加あるいは無添加のいずれか（すなわち、組換えヒトグリア増殖因子２（ｒｈＧＧＦ２））（２０ｎｇ／ｍｌ）で５分間処理を行った。ＥｒｂＢ４受容体タンパク質は、抗ＥｒｂＢ４抗体とともに５００μｇのＮＲＶＭ溶解物あるいは２０００μｇのＡＲＶＭ溶解物から免疫沈降した。そしてリン酸化形態のＥｒｂＢ４を抗ホスホチロシン抗体を用いて検出した。図１Ｂに示されたブロットは３回の独立した実験を示す。図１Ｂに示すように、リン酸化されたＥｒｂＢ４は新生仔の筋細胞において顕著に存在したが、あまり強くはなかった。しかし、成体の筋細胞において検出可能であった。このことは、我々が上記で観察したＥｒｂＢ４  ｍＲＮＡ量のレベルと一致した。リン酸化形態のＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３は、たとえビオチン化抗ホスホチロシン抗体とともに免疫沈降したとしても、検出され得なかった。このことは、出生後の心筋細胞において、これら２つのニューレグリン受容体のｍＲＮＡ量がはるかに減少していることと一致した。
【００８２】
（ＧＧＦ２は、新生仔心室筋細胞におけるＤＮＡ合成を刺激する）
ＮＲＶＭ初代培養物におけるＧＧＦ２のＤＮＡ合成刺激能を調べるために、二日間無血清培地で維持した筋細胞を、４０ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＧＦ２で３０時間続いて処理した。ＢｒｄＵ（図２Ｂ）あるいは［3Ｈ］チミジン（図３Ａ、３Ｂ）いずれかの取り込みを測定することによって、ＤＮＡ合成をモニタリングした。これらの物質は、各実験が終わる２４時間あるいは８時間前に、それぞれ培地に添加した。
【００８３】
図２Ａは、ＮＲＶＭにおいてＴＲＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウス抗体によって視覚化された筋細胞のミオシン重鎖を示す（赤）。図２Ｂは、フルオレセイン結合体化マウス抗ＢｒｄＵ抗体によって視覚化されたＢｒｄＵ陽性核を示す（緑）。図２Ａおよび２Ｂのスケールバーは１０μｍを示す。図２Ｃはコントロール条件下およびＧＧＦ２存在下でのＢｒｄＵ陽性筋細胞の割合を示す（データは三回の実験の平均±ＳＤである（＊ｐ＜０．０１））。図２Ｃに示されているように、４０ｍｇ／ｍｌ（およそ０．７ｎＭ）のｒｈＧＧＦ２は、ＢｒｄＵで標識した筋細胞（出生後１日目のラット心室由来）の割合を約８０％増加させた。この増加の大きさは、［3Ｈ］チミジンの取り込みによって観察された増加と類似した（図３Ａ）。
【００８４】
図３Ａおよび図３Ｂは、ラット心室筋細胞の初代単離物由来の筋細胞リッチ画分および非筋細胞画分におけるＤＮＡ合成に対するＧＧＦ２の影響を示す。図３Ａにおいて、ＮＲＶＭリッチ初代単離物あるいは非筋細胞リッチ画分（方法を参照のこと）を、コントロール（すなわち、無血清）培地のみ（Ｃｔｌ）、あるいは４０ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＧＦ２（ＧＧＦ）または７％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）のいずれかを含む培地に曝した。図３Ｂにおいて、ＮＲＶＭのＤＮＡ合成に対するＧＧＦ２濃度依存性の効果を示す。［3Ｈ］チミジンの取り込みによってＤＮＡ合成を評価し、そしてデータを、それぞれの実験においてコントロール細胞の平均ｃｐｍに対して正規化した相対的ｃｐｍ／ディッシュとして表す（三つの独立した実験から、三連で分析した平均±ＳＤ、＊コントロールに対してｐ＜０．０１）。２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＧＦ２は、ＮＲＶＭへの［3Ｈ］チミジン取り込みのおよそ６０％の増加を引き起こす。これは、７％ＦＢＳ添加で観察された値の約半分であった。ＮＲＶＭに対するｒｈＧＧＦ２の細胞分裂促進効果は濃度依存的であり、５０ｎｇ／ｍｌの濃度（すなわち、０．９ｎＭ）においては、約８０％増加であった（図３Ｂ）。ＧＧＦ２は、ラットの胚性心室筋細胞（Ｅ１９）および出生後の心室筋細胞（Ｐ５）におけるＢｒｄＵまたは［3Ｈ］チミジン取り込みに対して、類似の細胞分裂促進効果を持っていた。それに対して、１００ｎｇ／ｍｌ程度のＧＧＦ２高濃度は、成体ラット心室筋細胞初代培養物において、ＤＮＡ合成に影響しなかった。
【００８５】
新生仔ラット心室筋細胞単離手順の前プレート化工程の後に得られた、非筋細胞画分に対するｒｈＧＧＦ２の影響も調べた。図３Ａに示すように、ｒｈＧＧＦ２は非筋細胞への［3Ｈ］チミジンの取り込みにおいて、有意な変化を誘導しなかった。これは、７％ＦＢＳ（この細胞集団への［3Ｈ］チミジンの取り込みにおいて約１０倍の増加を誘導した）とは対照的である。それゆえ、ＧＧＦ２は、我々がここで採った筋細胞単離方法を用いた場合には、主として繊維芽細胞および内皮細胞から構成される筋細胞枯渇細胞集団と比較して、心筋細胞に対して比較的特異的な作用を示す。
【００８６】
どの公知のニューレグリン受容体が胎児および新生仔の心室筋細胞に対するＧＧＦ２の細胞分裂促進効果を媒介するのかを決定するために、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４に特異的な抗体と共にインキュベートした後、初代ＮＲＶＭ培養物において、ＤＮＡ合成を測定した。新生仔の筋細胞を二日間、無血清培地中で培養した後、なし（コントロール）、またはｒｈＧＧＦ２存在下（１０ｎｇ／ｍｌ）、またはｒｈＦＧＦ２存在下（２０ｎｇ／ｍｌ）、またはＧＧＦ２／ＦＧＦ２存在下のいずれかと、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４に対する抗体で３０時間、示したように、単独で、または組み合わせのいずれかで処理した。抗体（０．５μｇ／ｍｌ／抗体）を２時間細胞と共にプレインキュベートした後、ＧＧＦ２またはＦＧＦ２のいずれかを添加した。［3Ｈ］チミジンは最後の８時間の間添加した（各実験において、コントロール細胞の平均ｃｐｍに対して正規化した相対的ｃｐｍ／ディッシュとして、データを表す。また、データは平均±ＳＤとして表される。ｎ＝３（独立した実験）；＊ｒｈＧＧＦ２のみに対してｐ＜０．０４；＃ｒｈＧＧＦ２のみに対してｐ＞０．１）。
【００８７】
図４に示すように、ｃ−ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体は、ＧＧＦ２によるＮＲＶＭへのＧＧＦ２に依存した［3Ｈ］チミジン取り込みの増加を阻害した。同様に、ＥｒｂＢ４のＣ末端に対する抗体もまた、ＧＧＦ２により誘導される［3Ｈ］チミジンの取り込みの増加を約５０％ブロックした。これら二つの抗体を組み合わせて使った場合にも、抗ＥｒｂＢ２抗体あるいは抗ＥｒｂＢ４抗体のいずれか単独の場合と同じ効果が得られた。対照的に、ＥｒｂＢ３に対する抗体はＧＧＦ２により誘導されるＤＮＡ合成に対して効果がなかった。ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４に対する抗体で見られた効果がＧＧＦ特異的であったことを立証するために、姉妹ＮＲＶＭ初代培養物を２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ２（組換えヒトｂＦＧＦ２）で処理した。どちらの抗体も、ｒｈＦＧＦ２を用いた［3Ｈ］チミジンの取り込みのおよそ二倍の増加に影響を与えなかった。これらの結果は、少なくとも二種の公知のニューレグリン受容体チロシンキナーゼが存在し、新生仔心室筋細胞における下流のシグナル伝達カスケードと共役したことを示唆する。
【００８８】
（ＧＧＦ２はインビトロでの心筋細胞の生存を促進する）
発生過程において、機能性の胚性筋細胞数の正味の増加は、筋細胞の増殖能と生存との両方に依存している。それ故に、ＧＧＦ２が心筋細胞の増殖に加えて生存を促進しうるかどうかを調べることは非常に興味深い。１０μＭのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）存在、非存在下、無血清培地で培養したＮＲＶＭの初代培養液を４日間、示された濃度のＧＧＦ２で処理した。また、ＭＴＴ細胞呼吸アッセイ（方法を参照のこと）により、代謝活性を有する細胞の相対数を測定した。データはＧＧＦを添加した時を０日とし、三つの培養ディッシュにおいて、筋細胞の平均ＭＴＴ活性のパーセントで表されている。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３実験；*、コントロールに対してｐ＜０．０５）として表されている。本発明者らは、およそ２５％の細胞が４日目までに死滅しているのを観察した。これに対し、ＧＧＦ２の添加により、コントロールに比べてＭＴＴ活性が３０％上昇した。その効果は０．２ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を用いたときには濃度依存的であった（図５）。このような生存効果はＮＲＶＭ初期培養において７日目まで見られた。また、増殖阻害剤であるシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）存在下においても見られた。図５に示すように、ＧＧＦ２の生存効果はシトシアラビノシドの連続存在下で４日間見られた。このとき、筋細胞の生存能力はコントロールではおよそ７０％であったのに対し、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＧＦ２存在下では９０％であった。これに対し、筋細胞を欠失した「非筋細胞」リッチな初期単離物の４日目までの生存には重大な効果を示さなかった。
【００８９】
次に本発明者らは、ＧＧＦ２の生存効果がプログラム細胞死（アポトーシス）の阻害によって仲介されているかどうかについて調べた。無血清培地で２日間培養したＮＲＶＭ初代培養液を、ｒｈＧＧＦ２不在下（図６Ａ〜Ｃ）または２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＧＦ２存在下（図６Ｅ〜Ｇ）のいずれかで４日間培養した。次に細胞を固定し、心筋を視覚化するために抗ＭＨＣ抗体およびＴＲＩＴＣを結合した二次抗体を用いて（図６ＡおよびＥ）、またはアポトーシスを起こしている細胞を明らかにするためにフルオレセイン結合ｄＵＴＰ（すなわち、ＴＵＮＥＬ）を用いて（図６Ｂおよび６Ｆ）染色した。ＴＵＮＥＬによる染色でポジティブであった筋細胞は、細胞の収縮およびクロマチンの濃縮を示した。これらはヘキスト３３２５８による染色により同定された（図６Ｃおよび６Ｇ）。アポトーシスはＴＵＮＥＬポジティブな細胞の数をカウントすることにより（図６Ｄ）、または、示された濃度のｒｈＧＧＦ２（Ｈ）で４日間処理したＮＲＶＭ初代培養液をプロピジウムヨウ素で染色し、フローサイトメトリーでサブＧ１画分を解析する事によるのいずれかで、定量した。図６Ｄおよび図６Ｈに示されているデータは、３回の独立した実験についての平均±ＳＤとして与えられる。図６Ａ〜６Ｃおよび図６Ｅ〜６Ｇに示すスケールバーは、１０μＭを意味する。
【００９０】
無血清培地に入れてから６日後に、低い細胞濃度（すなわち、サブコンフルエント）でコントロール条件下で培養したＮＲＶＭの約１７％が、ＴＵＮＥＬ染色により検出し、アポトーシスの証拠を示した。これらの細胞では、アポトーシスによる細胞死と一致して、核は凝縮して小さくなり、細胞の収縮が見られた（図６Ａ〜６Ｃ、６Ｅ〜６Ｇ）。２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＧＦ２存在下では、ＴＵＮＥＬポジティブな筋細胞の数は約８％にまで減少した（図６Ｄ）。アポトーシス阻害に対するＧＧＦ２の効果もまた、プロピジウムヨウ素で標識したＮＲＶＭ初代培養液のフローサイトメトリーによる解析により定量した。無血清培地およびインスリン欠乏培地で４日間培養した後、２２％のＮＲＶＭが低二倍体になっていた。これはプログラム細胞死の開始と一致している。１０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度のｒｈＧＧＦ２存在下では、１０％未満のＮＲＶＭが、アポトーシスの兆候を示した（図６Ｈ）。
【００９１】
成体ラット心室筋細胞（ＡＲＶＭ）に対するＧＧＦ２の生存および抗アポトーシス効果もまた、ＭＴＴ細胞呼吸アッセイおよびＴＵＮＥＬ染色により調べられた。図７Ａに示された実験において、ＡＲＶＭ初代培養液を無血清およびインスリン欠乏培地（すなわち「ＡＣＣＴＴ」、方法を参照のこと）、あるいは、ＧＧＦ２を添加したＡＣＣＴＴ培地中のいずれかで６日間培養した。代謝活性を持つ細胞の数は、ＭＴＴ細胞呼吸アッセイにより決定した。データは、処理していないコントロール細胞の平均吸光度に対して正規化された相対吸光度として表されている。それぞれのバーは平均±ＳＤ（ｎ＝３実験；*、コントロールに対してｐ＜０．０５）を表している。図７Ｂに示された実験において、ＡＲＶＭ初代培養液はＡＣＣＴＴ培地（コントロール）あるいはｒｈＧＧＦ２を添加（２５ｎｇ／ｍｌ）したＡＣＣＴＴ培地中で３日間培養した。４％パラホルムアルデヒドにより固定した後、筋細胞を抗ＭＨＣ抗体およびＴＲＩＴＣを結合した二次抗体で可視化し、アポトーシス細胞をＴＵＮＥＬ染色により同定した。それぞれのカバーグラス上で約５００の筋細胞を計数した（データは三回の独立した実験の平均±ＳＤである；*、コントロールに対してｐ＜０．０５）。１０％より多い細胞がＴＵＮＥＬ標識にポジティブである、未処理のＡＲＶＭ初代培養液に比べた場合、ｒｈＧＧＦ２処理（２０ｎｇ／ｍｌ）を行った成体の筋細胞培養液は、約３％のＴＵＮＥＬポジティブ染色しか示さなかった（図７Ｂ）。これらの結果は、ニューレグリンは、新生仔と成体の両方の心室筋細胞において、少なくとも部分的にプログラム細胞死を抑制することによる、生存因子として作用するということを示している。
【００９２】
（ＧＧＦ２は心筋細胞の肥大増殖を誘導する）
ニューレグリンシグナルが心筋細胞において肥大（増殖）応答を誘導しうるかどうかを調べるために、本発明者らは、新生仔と成体の両方のラットの心室筋細胞初代培養液において、ＧＧＦが筋細胞の肥大増殖に誘導に対する効果について調べた。図８Ａと８Ｂは２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＧＦ２存在（図８Ｂ）および非存在（図８Ａ）下のいずれかで無血清培地で７２時間インキュベートしたサブコンフルエントなＮＲＶＭ初期単離物の顕微鏡写真を示している。その後、細胞を固定し、心臓ＭＨＣに対する抗体（赤；ＴＲＩＴＣ）で染色し、間接免疫蛍光顕微鏡下で観察した。図中のスケールバーは、１０μＭを表す。２０ｎｇ／ｍｌ（すなわち０．３６ｎＭ）のｒｈＧＧＦ２存在下、無血清培地で７２時間インキュベートした後、新生仔の心筋細胞（ＮＲＶＭ）は、細胞の大きさおよび筋繊維の発達に大きな増加を示した。
【００９３】
心筋細胞における肥大応答は、細胞の大きさの増加に加え、表現型の変化の数によっても特徴づけられた。例えば、細胞の増殖を伴わない、収縮性のあるタンパク含量の増加および「胚性の」遺伝子プログラムの再活性化が挙げられる。それゆえ、本発明者らは、ｐｒｅｐｒｏ−ＡＮＦおよび骨格のα−アクチンｍＲＮＡレベル（新生仔および成体の心室筋細胞において比較的低存在量で正常に見出される転写物）に対して、そしてＮＲＶＭ初代培養液におけるタンパク質合成率としての［3Ｈ］ロイシンの取り込みに対するニューログリンの効果を調べた。図８Ｃは、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＧＦ２存在または非存在下のいずれかでインキュベートしたＮＲＶＭ由来の全ＲＮＡ（２０μｇ／レーン）中のｐｒｅｐｒｏ−ＡＮＦおよび骨格α−アクチンｍＲＮＡの、示された時間におけるノーザンブロット解析を示す。等量のＲＮＡがロードおよび移入されていることは、ＧＡＰＤＨハイブリダイゼーションにより確かめた。ｒｈＧＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）は６０分以内にｐｒｅｐｒｏ−ＡＮＦおよび骨格αーアクチンのｍＲＮＡレベルを上昇させ、１６時間経過時にはおよそ２倍になっていた。
【００９４】
タンパク合成に対するＧＧＦ２の効果を調べるために、ＮＶＲＭを２４時間、無血清培地中で培養し、その後、それらを示されている濃度のｒｈＧＧＦ２で４０時間処理し、［3Ｈ］ロイシンのパルスを与え、８時間後、ＧＧＦ２による刺激を終結した。各ＧＧＦ２濃度における［3Ｈ］ロイシンの取り込みは、各ディッシュのタンパク含量に対して正規化され、データは各実験において未処理のコントロール細胞の平均ｃｐｍに対して正規化した相対ｃｐｍ／ディッシュで表されている（平均±ＳＤ、ｎ＝３実験、コントロールに対してｐ＜０．０１）。図８Ｄはまた、５ｎｇ／ｍｌの濃度において、ＧＧＦ２は［3Ｈ］ロイシンの取り込みを刺激しているということを示している。このとき、４８時間で約１２０％に増加する。非筋細胞コンタミタント細胞への［3Ｈ］ロイシンの取り込み速度に対するＧＧＦ２の、起こりうる、困惑させるような効果を最小にするために、これらの実験を、シトシンアラビノシドの連続的な存在下において繰り返し、その結果、同様の実験結果が得られた。
【００９５】
ＧＧＦ２はまた、培養された成体のラット心室筋細胞（ＡＲＶＭ）における肥大応答を引き起こした。ＡＲＶＭの初代培養液を２４ウェルディッシュ中のカバーグラス上に置き、ｒｈＧＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）存在（図９Ｂおよび図９Ｃ）、非存在（図９Ａ）下のいずれかで、ＡＣＣＩＴＴ培地中で５日間維持した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ミオシン重鎖に対する抗体（緑、ＦＩＴＣ）で染色し、共焦点顕微鏡で観察した。スケールバーは１０μＭを示す。２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＧＦ２の連続的な存在下において、７２時間までに、いくらかの成体の筋細胞は、主にインターカレートされた円盤領域から「ｐｓｅｕｄｏｐｏｄ」様膨張をし始めた。そして５日目までに、ＧＧＦ処理された成体の心筋細胞の６０％より多くが、図９Ｂおよび９Ｃに示されたのと一致して表現型の変化を見せた。その一方で、未処理のＡＲＶＭの８０％より多くは、図９Ａに示された表現型を維持した。
【００９６】
ＧＧＦ２はまた、ＡＲＶＭにおけるｐｒｅｐｒｏ−ＡＮＦおよび骨格α−アクチンの発現を高めた。ＡＲＶＭの初期単離物は、示された時間、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＧＦ２存在、非存在下のいずれかで刺激を与えた。全ＲＮＡを単離し、ｐｒｅｐｒｏ−ＡＮＦおよび骨格α−アクチンｃＤＮＡプローブを用いたノーザンブロット（２５μｇ／レーン）により解析した。等量のローディング及び移入条件を、ＧＡＰＤＨハイブリダイゼーションにより確認した。肥大増殖のポジティブコントロールとして、フェニレフリン（ＰＥ、１０μＭ）を用いた。図９Ｄに示すように、ｒｈＧＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）は、ＡＲＶＭ初代培養液におけるｐｒｅｐｒｏ−ＡＮＦのｍＲＮＡの存在量を、８時間で二倍に、２０時間で３〜４倍に増加させた。また、骨格α−アクチンｍＲＮＡ量の増加も見られたが、これは、成体のラットの心室筋細胞において肥大増殖および多くの胎児遺伝子の再発現を誘導することが公知の、α−アドレナリン作動性アゴニストであるフェニレフリン（１０μＭ）を用いた時に見られるよりもはるかに大きかったことが観察された。７時間の間に、骨格α−アクチンｍＲＮＡレベルは容易に検出できるようになり、３０時間ＧＧＦ２で処理することにより、さらに２５０％もの増加を示した。ここで用いた条件下において、ＧＧＦ２、フェニレフリンは共にＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ存在量に何ら影響を与えなかった。
【００９７】
タンパク質合成に対するＧＧＦ２の効果を試験するために、ＡＲＶＭ（ＡＣＣＩＴＴ培地で２日）を刺激し、４０時間、ｒｈＧＧＦ２の濃度の増加し、そして［3Ｈ］ロイシンを最後の１４時間で加えた。ＧＧＦ２処置培養物中への［3Ｈ］ロイシン取り込みを、非刺激コントロール筋細胞における［3Ｈ］ロイシン取り込みの平均に対して正規化した。データをまた、ディッシュ間の細胞数の任意の可変性を調節するために各ディッシュのタンパク質含有量に対して正規化した（平均±Ｓ．Ｄ；ｎ＝４；*、コントロールに対するｐ＜０．０１）。図９Ｅに示されるように、ＧＧＦ２は、［3Ｈ］ロイシン取り込みにおける容量依存性増加を誘導し、５ｎｇ／ｍｌの濃度で７０％が増加する。従って、このニューレグリンは、サブナノモルの濃度で、新生仔と成体の両方のラット心室筋細胞での肥大性適応と一致して表現型変化を誘導する。
【００９８】
（実施例ＩＩＩ：ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４発現レベルは、慢性肥大から初期心不全への遷移での大動脈弁狭窄ラットにおいて減少する）
（ＬＶ肥大および血流力学）
表１に示されるように、左心室（ＬＶ）を秤量し、そしてＬＶ／体重比は、年齢を一致させたコントロールと比較して、６週齢および２２週齢の大動脈弁狭窄動物において有意に（ｐ＜０．０５）増加した。インビボＬＶ収縮期圧は、年齢を一致させたコントロールと比較して、６週齢と２２週齢の両方の大動脈弁狭窄動物において有意に増加した。インビボＬＶ終端（ｅｎｄ）心拡張圧はまた、年齢を一致させたコントロールと比較して、大動脈弁狭窄動物においてより高かった。このモデルにおける先行研究と一致して、１グラムあたりのＬＶ心収縮発生（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）圧は、年齢を一致させたコントロールと比較して、６週齢大動脈弁狭窄動物で有意に高いが、２２週齢の大動脈弁狭窄動物において抑制された。結紮（ｂａｎｄｉｎｇ）２２週間後、大動脈弁狭窄動物はまた、頬呼吸、小胸水および心嚢貯留液を含む破壊の臨床的マーカーを示した。
（表１。左心室の肥大および血流力学）
【００９９】
【表１】
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表１の説明：ＬＶＨ、左心室肥大を持っている心臓であり、大動脈狭窄後６および２２週たったもの；Ｃ、一致した年齢のコントロール；ＢＷ、体重；ＬＶ  Ｗｔ、左心室の重さ；ＬＶＥＤＰ、ＬＶ終端心拡張圧力；ＬＶＳＰ、ＬＶ心収縮圧；ＬＶ  ｄｅｖＰ、１ｇあたりのＬＶ発生圧。値は平均±ＳＥＭ；*一致した年齢のコントロールに対してｐ＜０．０５；６週齢のＬＶＨに対してｐ＜０．０５。ｎ＝１４〜２０／グループ。
【０１００】
（大動脈狭窄における、ＬＶ  ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ４およびニューレグリンの発現）
ＲＴ−ＰＣＲを用いることにより、本発明者らは、通常および肥大筋細胞においてならびに、左心室肥大の存在、非存在の成体のオスのラットの心臓由来のＬＶ組織において、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ４およびニューレグリンｍＲＮＡを検出し得たが、ＥｒｂＢ３  ｍＲＮＡを検出することがし得なかった。図１０Ａは６週齢の大動脈狭窄を起こした心臓およびコントロールならびに２２週齢の大動脈狭窄を起こした心臓およびコントロールにおけるＬＶ  ＥｒｂＢ２およびβ−アクチンｍＲＮＡの発現を示す、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイの結果を示す。図１０Ｂは６週齢の大動脈狭窄を起こした心臓およびコントロール、ならびに２２週齢の大動脈狭窄を起こした心臓およびコントロールにおけるＬＶ  ＥｒｂＢ４およびβ−アクチンｍＲＮＡの発現を示すリボヌクレアーゼプロテクションアッセイの結果を示す。次いで、大動脈狭窄ラットおよびコントロール由来のＬＶ組織におけるＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ４およびニューレグリンｍＲＮＡのレベルの安定した状態のレベル（ｎ＝５心臓／１群）は、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）により測定され、β−アクチンに対して正規化された。ＬＶニューレグリンｍＲＮＡレベルは、６週齢の大動脈狭窄ラットと一致した年齢のコントロールラット由来の組織において有意な差は無かった（０．６８±０．１２ｖｓ０．４５±０．１２単位、ＮＳ）。これは、２２週齢の大動脈狭窄ラットと一致した年齢のコントロールラット由来の組織において有意なさは無かった（０．７８±０．２１ｖｓ０．５１±０．２１単位、ＮＳ）。さらに、β−アクチンのレベルに対して正規化したＬＶ  ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４のｍＲＮＡレベルは、６週齢の大動脈狭窄ラットにおいて、コントロールに対して代償的な肥大を伴って保存されていた。これに対し、ＬＶ  ＥｒｂＢ２（ｐ＜０．０５）およびＥｒｂＢ４（ｐ＜０．０１）伝達レベルは、初期不全の段階にある２２週齢の大動脈狭窄ラットにおいて顕著に弱められていた（図１０および表２）。
【０１０１】
表２．ＥｒｂＢレセプターのＬＶ  ｍＲＮＡ及びタンパク質のレベル
【０１０２】
【表２】
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表２の説明：ＬＶＨ，大動脈狭窄後６および２２週齢の左心室肥大を有する心臓；Ｃ，相応の年齢のコントロール；左心室（ＬＶ）ｍＲＮＡレベルをリボヌクレアーゼ保護アッセイによって測定しβ−アクチンに対して正規化した；ｍＲＮＡレベルはＬＶ組織（ｍＲＮＡ、ＬＶ；ｎ＝５心臓／群）およびＬＶ筋細胞（ｍＲＮＡ、筋細胞；ＥｒｂＢ２  ｎ＝５心臓／群；ＥｒｂＢ４  ｎ＝３〜４心臓／群）の両方由来のＲＮＡにおいて測定した。ＬＶタンパク質レベルをウエスタンブロッティングによりＬＶ組織（ｎ＝５／群）において測定し、β−アクチンに対して正規化した。値は平均±ＳＥＭで表しており；*ｐ＜０．０５  相応の年齢のコントロールに対して；**ｐ＜０．０１  相応の年齢のコントロールに対して、である。
【０１０３】
次に本発明者らは、６週および２２週齢の大動脈狭窄動物およびコントロールのＬＶ筋細胞由来のＲＮＡにおける遺伝子発現について調べた。筋細胞における発現の特異性を、筋細胞のＲＮＡおよびＧＡＰＤＨレベルに対する正規化を用いて、圧負荷肥大のポジティブ分子マーカーである心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）のメッセージレベルを試験することにより決定した。図１１に示すように、ＡＮＰはコントロール（ｎ＝５／群）に比べて、６週齢の大動脈狭窄動物（７１０±１６  対  ２３０±４０単位、ｐ＜０．０５）および２２週齢の大動脈狭窄動物（８９８±５２  対  ３３９±１３単位、ｐ＜０．０５）の両方からの筋細胞において、上方制御された。ニューレグリンは、ＲＰＡによっては、どの群の筋細胞由来のＲＮＡにおいても検出されなかった。
【０１０４】
ＥｒｂＢ２（ｎ＝５／群）およびＥｒｂＢ４（ｎ＝３〜４／群）のメッセージレベルもまた、両方の大動脈狭窄群由来の筋細胞ＲＮＡにおいて測定した（図１２および表２）。図１２Ａは、６週齢の大動脈狭窄心臓およびコントロールならびに２２週齢の大動脈狭窄心臓およびコントロールにおけるＬＶ筋細胞ＥｒｂＢ２およびβ−アクチンのｍＲＮＡの発現を示す、リボヌクレアーゼ保護アッセイの結果を示す。図１２Ｂは、６週齢の大動脈狭窄心臓およびコントロールおよび２２週齢の大動脈狭窄心臓およびコントロールにおけるＬＶ筋細胞ＥｒｂＢ４およびβ−アクチンのｍＲＮＡの発現を示す、リボヌクレアーゼ保護アッセイの結果を示す。ＬＶ組織サンプルにおける測定結果と一致して、β−アクチンレベルに対して正規化された心筋ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４のｍＲＮＡレベルは、代償性肥大（ＮＳ）のステージにある６週齢の大動脈狭窄動物におけるコントロールと比較して保存される。しかし、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４の両方の発現は、不全への遷移途中にある２２週齢の大動脈狭窄動物においては有意に下方制御を受ける。
【０１０５】
（ＬＶ  ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４タンパク質のレベル）
相応の年齢のコントロールと比較して、６週および２２週齢の大動脈狭窄ラットのＬＶ組織由来のタンパク質サンプルを用いて、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４に対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った（ｎ＝５／群）。図１３Ａおよび１３Ｂは、６週齢（図１３Ａ）の大動脈狭窄心臓およびコントロールおよび２２週齢（図１３Ｂ）の大動脈狭窄心臓およびコントロールにおける、ＬＶ  ＥｒｂＢ２およびβ−アクチンのタンパク質レベルを示すウェスタンブロットを示す。図１３Ｃおよび１３Ｄは、６週齢（図１３Ａ）の大動脈狭窄心臓およびコントロールおよび２２週齢（図１３Ｂ）の大動脈狭窄心臓およびコントロールにおける、ＬＶ  ＥｒｂＢ４およびβ−アクチンのタンパク質レベルを示すウェスタンブロットを示す。図１３Ａ〜１３Ｄおよび表２に示されているように、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４のｍＲＮＡ発現は、代償性肥大（ＮＳ）のステージにある６週齢の大動脈狭窄動物におけるコントロールと比較して保存されている。しかし、ＥｒｂＢ２（ｐ＜０．０５）およびＥｒｂＢ４（ｐ＜０．０１）は、初期不全の間に２２週齢の大動脈狭窄動物において下方制御される。このように、ＬＶメッセージならびにＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４のタンパク質レベルの両方の減少が、この圧負荷のモデルにおいて初期不全のステージにおいて現れる。
【０１０６】
（ニューレグリンに対するインサイチュハイブリダイゼーショ）
ディゴキシゲニン標識ニューレグリンのアンチセンスｍＲＮＡは、ＬＶ凍結切片上に再現性のあるハイブリダイゼーションシグナルを生成した。その一方で、対応するセンス転写物は、バックグラウンドの上にシグナルを示さなかった。成人の心臓の凍結切片におけるニューレグリンシグナルは、心臓の微小血管の上皮細胞において観察され、他の細胞区分においては弱いか、全く観察されなかった。コントロールと大動脈狭窄動物の間には違いは全く存在しなかった。
【０１０７】
（実施例ＩＶ：ニューレグリンー１のＥＧＦ様ドメインを有するポリぺプチドによる、大動脈狭窄マウスにおける心不全の阻害）
上記の実施例のデータは、ｒｈＧＧＦ２が、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４依存性様式でアポトーシスを抑制し、心筋細胞の肥大を刺激するとことを示す。さらに、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４レセプターは、圧負荷誘導心不全を有するラットの左心室において下方制御される。心筋細胞のアポトーシスは大動脈狭窄マウスにおいて、初期の代償性肥大ステージ（すなわち、大動脈染色から４週間後）の間にはほとんど見られないが、初期心不全への遷移の間には一貫して見られる（すなわち、大動脈染色から７週間後）。
【０１０８】
これらの上記の観察は、ニューレグリン遺伝子によってコードされているＥＧＦ様ドメインを有するポリぺプチドの投与が、うっ血性心不全の進行阻害あるいは防止に対して有用であるということを示す。理論によって束縛されることを望まないが、ニューレグリン処置は心筋細胞の肥大を刺激することにより心臓のポンプ能力を増強し、そして心筋細胞のアポトーシスを抑制することにより、それ以上心臓が悪化することを部分的にまたは完全に防ぐようである。
【０１０９】
当業者は、当該分野で公知のうっ血性心不全のための多くのモデル動物の１つを使用することにより、うっ血性心不全に対する予防法を提供するか、またはすでに存在している心臓病の進行を遅くかもしくは停止させるために必要とされる最適な処方量を容易に決定し得る。例えば、出発点として、大動脈狭窄マウスモデルにおける血管疾患の初期および後期ステージで投与された０．３ｍｇ／ｋｇの量のＧＧＦ２の相対的な効果は、以下のようにして評価され得る。
【０１１０】
群１（ｎ＝６）；処理：大動脈染色後の４８時間後にｒｈＧＧＦ２の注入（一日おきに０．３ｍｇ／ｋｇ）を開始し、そして７週間続けた。
【０１１１】
群２（ｎ＝６）；処理：大動脈染色後、４週目の始まりにｒｈＧＧＦ２（０．３ｍｇ／ｍｌ）処理を開始し、７週間続けた。
【０１１２】
群３（ｎ＝６）；コントロール：大動脈染色後の４８時間後に偽物の（ｓｈａｍ）注入を開始し、そして７週間続けた。
【０１１３】
群４（ｎ＝６）；コントロール：大動脈染色後、４週目の始まりに偽物の注入を開始し、そして７週間続けた。
【０１１４】
モデル動物を７週目の終わりに屠殺する。屠殺の前に、上記の実施例Ｉあるいは標準プロトコールを用いて左心室の血行動態を測定した。標準プロトコールまたは実施例Ｉに記載される方法を用いて、インサイチュニック末端標識化（ＴＵＮＥＬ）法、および細胞死を測定するための同様の技術による筋細胞の増殖（肥大）および筋細胞のアポトーシスを定量するために、共焦点顕微鏡を使用し得る。
【０１１５】
当業者は、うっ血心不全を最小にするか、予防するか、または復帰するための最適なニューレグリン用量レジメン（例えば、処方量、投与の頻度、疾患の経過の中でニューレグリン処置を開始するための最適時間など）を決定するために必要とされる実験を実施する方法かを完全に理解し、認識する。
【０１１６】
（実施例Ｖ：ラット心筋細胞において、ＮＲＧ−１はアントラサイクリンによって誘導されるアポトーシスを阻害する）
２０年以上の間、アントラサイクリン抗体（ダウノルビシンおよびドキソルビシンなど）は、癌の化学的治療の大黒柱であった。しかし、これらの薬物の短期および長期に渡る心臓毒性は、患者に送達され得る個々の用量および累積用量の両方をを制限する。
【０１１７】
アントラサイクリンによって誘導される心臓毒性には２つの臨床タイプがある。一度のアントラサイクリンの投与の後により生じ得る急性のタイプは、心電図変化、不整脈および心室の収縮性機能における可逆的な疾患によって特徴付けられる。慢性遅延タイプは、拡大性の心筋症およびうっ血性心不全へと進行する、心室の収縮機能における大きな不可逆性疾患によって特徴付けられる。この慢性の心臓毒性の範囲は、蓄積性のアントラサイクリン投与に対して正比例（ｄｉｒｅｃｔ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）する。
【０１１８】
本発明者らは、ＧＧＦ２（ＮＲＧ−１）がラット心筋細胞においてアントラサイクリンにより誘導されるアポトーシスを阻害することを見出した。図１４は、ＩＧＦ−１あるいはＮＲＧ−１で前処理したラット心筋細胞培養液が、１μＭダウノルビシンによって誘導されるアポトーシス（ＴＵＮＥＬ染色により示される）に対してほとんど感受性ではないことを示す。ＩＧＦ−１について、この保護効果は迅速であり、そして３０分のプレインキュベーションの間に達成され得た。これは、仔ウシ心筋細胞について報告されたのと同じである。対照的に、この効果は、ＮＲＧ−１との２４時間のプレインキュベーションを要する。
【０１１９】
図１５Ａは、ＩＧＦ−１およびＮＲＧ−１の両方がＡｋｔの迅速なリン酸化を引き起こす（図１５Ａ）こと、およびこれはＰＩ−３キナーゼインヒビターであるワートマニン（ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）によって阻害される。Ａｋｔは、プロアポトーシスタンパク質であるカスパーゼ３のリン酸化および不活性化を介して、いくつかのシステムにおいて、生存シグナルを媒介する際に関与してきた。ＩＧＦ−１と共に３０分間プレインキュベートまたはＮＲＧ−１と共に２４時間プレインキュベートすることにより、アントラサイクリンにより誘導されるカスパーゼの活性化を予防する。この効果およびＩＧＦ−１の生存効果は、ワートマニンにより完全に妨げられる（図１５Ｂ）。このように、ＰＩ−３キナーゼの活性化は、筋細胞に対するＩＧＦの細胞保護効果にとって必要不可欠である。しかし、同様の時間経過にわたるＮＲＧ−１による細胞保護の欠如は、ＰＩ−３キナーゼおよびＡｋｔの活性化が細胞保護にとって十分でないことを示す。細胞保護に必要とされる比較的長期間のＮＲＧ−１の露出期間は、アポトーシスに対するＮＲＧ−１依存的な心筋細胞の保護が新規のタンパク質合成を必要とすることを示唆する。この観察と一致して、シクロヘキサミドでの細胞の処理は、心筋細胞に対するＮＲＧ−１の抗アポトーシス効果を阻害した。
【０１２０】
上記の結果は、ＮＲＧ−１がアントラサイクリンによって誘導されるアポトーシスを効果的に阻害することを示す。従って、ＮＲＧ−１はアントラサイクリン化学治療を受けている患者において心臓毒性を制限するかまたは予防するために使用され、そしてアントラサイクリンや他の心臓毒性を有する薬物によって誘導された心臓毒性により引き起こされたうっ血性心不全を有する患者に対して使用され得る。
【０１２１】
当該分野において、アントラサイクリンによって誘導される心臓毒性の、種々の周知の動物モデルが存在する。アントラサイクリンによって誘導された心臓毒性を寛解するための治療組成物の相対的な効果を評価するためのマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ブタおよびサルのモデルが「Ａｍｅｋｉｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｃｉｔｙ」Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５（４）Ｓｕｐｐｌ．１０，Ａｕｇｕｓｔ  １９９８（例えば、Ｍｙｅｒｓ，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：１０−１４，１９９８；ＨｅｒｍａｎおよびＦｅｒｒａｎｓ，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：１５−２１，１９９８；ならびにＩｍｏｎｄｉ，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：２２−３０，１９９８を参照のこと）。これらのモデルは、アントラサイクリンによって誘導される心臓毒性を最小にするか、予防するかまたは復帰するめの最適のニューレグリンあるいはニューレグリン様ポリぺプチド処置レジメンを決定するために使用され得る（投与の量および頻度ならびにアントラサイクリンの投与に関するタイミングなど）。
【０１２２】
（実施例ＶＩ：アントラサイクリン／抗ＥｒｂＢ２（抗ＨＥＲ２）の併用療法によって誘導される心不全のニューレグリン依存性阻害）
様々なタイプの癌細胞は、ＥｒｂＢレセプターの増加した発現、または増加した生物学的活性を示す。これらの膜貫通レセプターチロシンキナーゼは、ニューレグリン（へレグリンとしてもまた公知である）ファミリーに属する増殖因子に結合する。癌細胞におけるＥｒｂＢ２レセプター（ＨＥＲ２およびｎｅｕとしても知られる）の発現は、様々な組織由来の癌細胞の増殖における増加と関連している。これらの組織には胸、卵巣、前立腺、結腸、膵臓、唾液腺などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
近年、ヒトＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）レセプターの細胞外ドメインに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体であるＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）が、インビトロおよびインビボにおいてＥｒｂＢ２活性を下方制御することにより、胸部の癌細胞の増殖を阻害するということが示されている。乳癌患者においてＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）治療と伝統的なアントラサイクリン（ドキソルビシン）化学療法との組み合わせの安全性および有効性を評価するためのＰｈａｓｅＩＩＩ臨床試験は、併用治療を施された患者が、どちらか一方の治療法のみを施された患者よりも、より強い腫瘍の収縮および癌進行阻害を示すことを示した。しかし、併用治療法を施された患者では、どちらか一方の治療法のみを施された患者に比べ、増加した心臓毒性を受ける。このことは、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）のような抗ＥｒｂＢ２（抗ＨＥＲ２）抗体が、アントラサイクリンにより誘導される心臓毒性を増加することを示す。さらに、始めにドキソルビシンで処置され、後からＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）を受けた患者もまた、ドキソルビシンのみで処置された患者に比べて、心臓毒性の増加した程度を示した。
【０１２４】
近年示された、寛解されつつあるＥｒｂＢ２過剰発現胸部腫瘍におけるＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）／アントラサイクリンの併用療法の成功を考慮すると、同様の併用療法が、他のＥｒｂＢ２過剰発現腫瘍を処置するためにまもなく使用されることになるだろう。しかし、その関連する心臓毒性が減少あるいは予防され得る場合、抗ＥｒｂＢ２抗体／アントラサイクリンの併用療法の利点／リスクの比は、非常に改善されるだろう。
【０１２５】
アントラサイクリンによって誘導される心臓毒性の動物モデル（例えば、ＨｅｒｍａｎおよびＦｅｒｒａｎｓ，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：１５−２１，１９９８ならびにＨｅｒｍａｎら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：１９５−１９７，１９９８を参照のこと）は、当該分野において周知である。さらに、上記のような、ニューレグリンのＥｒｂＢ２レセプターへの結合をブロックする抗体もまた周知である。アントラサイクリン毒性のための公知の動物モデルにおいてアントラサイクリン／抗ＥｒｂＢ２抗体依存的心不全を誘導することにより、当業者は、そのような心不全を最小にする、または予防するために必要なニューレグリン用量レジメンを容易に決定し得る。
【０１２６】
（他の実施形態）
本明細書中に列挙される全ての刊行物および特許出願は、それぞれの独立した刊行物または特許出願が参考として具体的かつ個別に援用されるように示されるような程度と同程度に本明細書中で参考として援用される。
【０１２７】
本発明は、それらの特定の実施形態と共に記載してきたが、さらなる改変が可能であり、本願が、一般に発明の原理に従う本発明の任意の変化、使用または適応をカバーすることを意図されるということが理解される：このような本開示からの逸脱が公知になるかまたは本発明が属する分野において慣行になること、および本明細書中上文に記載されそして添付のクレームの範囲に従う本質的な特色に適用され得ることを含む。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2018083850.tif 000010
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2018083850000001.pdf