(57)【要約】【課題】肺線維症モデル動物、および当該モデル動物を用いる肺線維症の治療薬のスクリーニング方法等を提供する。【解決手段】本開示は、SFTPA1（Y208H）を発現する遺伝子改変非ヒト哺乳動物および肺線維症の治療薬のスクリーニング方法等に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
SFTPA1（Y208H）を発現する、遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項１に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
肺線維症モデル動物である、請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
肺線維症の治療薬のスクリーニング方法であって、
SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物に候補物質を投与すること、および
前記哺乳動物の前記候補物質への応答を評価すること、
を含む方法。
【請求項６】
非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
候補物質への応答の評価が、候補物質を投与した前記哺乳動物の肺線維症の指標を対照と比較することすることを含む、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
肺線維症の指標が、肺線維症症状である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
肺線維症の指標が、生存率の低下である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
候補物質の投与前に、前記哺乳動物をインフルエンザウイルスに感染させることを含む、請求項５〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
インフルエンザウイルスが、A型インフルエンザウイルスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
肺線維症モデル動物の作製方法であって、SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物を作製することを含む方法。
【請求項１４】
SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物の、肺線維症モデル動物としての使用。
【請求項１５】
肺線維症の治療薬のスクリーニング方法であって、
SFTPA1（Y208H）を発現する細胞をインビトロで候補物質と接触させること、および
前記細胞のNotchシグナルまたはネクロプトーシスを評価すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子改変動物の分野に関し、特に、肺線維症モデル動物および当該モデル動物を用いる肺線維症の治療薬のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺線維症は、肺の線維性病変を特徴とする致死性の疾患である。肺線維症は薬剤や膠原病など様々な原因で起こりうるが、中でも原因の特定できない特発性肺線維症（IPF）は診断後の平均寿命が３−５年である予後不良の難病であり、有効な治療法が存在しない。肺線維症の治療薬開発には適切な疾患モデルが不可欠であるが、現在用いられているブレオマイシン誘発モデルなどの肺線維症モデルは臨床の病態を十分に反映しておらず、より適切なモデルが求められている。IPFに関連する遺伝子変異として、テロメラーゼや、肺サーファクタントタンパク質であるSFTPA1およびSFTPA2の変異が報告されているが、いずれも肺線維症モデルの確立には到っていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Nathan, N. et al. Germline SFTPA1 mutation in familial idiopathic interstitial pneumonia and lung cancer. Hum Mol Genet 25, 1457-1467 (2016).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、肺線維症モデル動物、および当該モデル動物を用いる肺線維症の治療薬のスクリーニング方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ある態様において、SFTPA1（Y208H）を発現する遺伝子改変非ヒト哺乳動物を提供する。
【０００６】
本発明は、さらなる態様において、肺線維症の治療薬のスクリーニング方法であって、
SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物に候補物質を投与すること、および
前記哺乳動物の前記候補物質への応答を評価すること、
を含む方法を提供する。
【０００７】
本発明は、さらなる態様において、肺線維症モデル動物の作製方法であって、SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物を作製することを含む方法を提供する。
【０００８】
本発明は、さらなる態様において、SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物の、肺線維症モデル動物としての使用を提供する。
【０００９】
本発明は、さらなる態様において、肺線維症の治療薬のスクリーニング方法であって、
細胞をインビトロで候補物質と接触させること、および
前記細胞のNotchシグナルまたはネクロプトーシスを評価すること
を含む方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、肺線維症モデル動物および肺線維症の治療薬のスクリーニング方法等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１ａ】日本人血縁家族におけるSFTPA1のホモ接合型ミスセンス変異の同定（ａ）。日本人IPF家族の家系図であり、二重線は血縁関係を、黒塗りはIPF患者を、斜線は死亡した家族を示す。アスタリスクは試料を得た家族を示す。
【図１ｂ】日本人血縁家族におけるSFTPA1のホモ接合型ミスセンス変異の同定（ｂ）。2人の患者（3Pおよび4P）の胸部X線写真およびコンピュータ断層撮影スキャンを示す。
【図１ｃ】日本人血縁家族におけるSFTPA1のホモ接合型ミスセンス変異の同定（ｃ）。キャピラリーシークエンシングにより示された、SFTPA1におけるヘテロ接合性（親）またはホモ接合型（患者）のミスセンス変異（Y208H）。矢印は、SFTPA1タンパク質ドメインにおけるミスセンス変異の位置を示す。
【図１ｄ】日本人血縁家族におけるSFTPA1のホモ接合型ミスセンス変異の同定（ｄ）。種間のSFTPA1タンパク質の比較を示す。下線はミスセンス変異の位置を示す。
【図２ａ】SFTPA1変異によるSFTPA1タンパク質の分泌障害（ａ）。A549細胞に、対照ベクター（EV）、c-mycタグ付き野生型SFTPA1のcDNA（WT）、または変異型SFTPA1のcDNAを遺伝子導入した。遺伝子導入の2日後の、細胞ペレットまたは上清中のSFTPA1の発現を、ウェスタンブロッティングにより評価した。細胞ペレットの内部標準として、β−アクチンの発現を用いた。両方の群において、同量の上清を用いた。
【図２ｂ】SFTPA1変異によるSFTPA1タンパク質の分泌障害（ｂ）。図２ａの細胞溶解物を、ブルーネイティブゲル電気泳動法において泳動させ、SFTPA1の発現をウェスタンブロッティングにより評価した。
【図２ｃ】SFTPA1変異によるSFTPA1タンパク質の分泌障害（ｃ）。Flagタグ付き野生型SFTPA1またはSFTPA2のcDNAを、mycタグ付き野生型または変異型SFTPA1のcDNAと共に、A459細胞に遺伝子導入した。細胞ペレット（P）または上清（S）を、抗Flag抗体で免疫沈降し、免疫沈降物を抗myc抗体でブロッティングした。本図のデータは、4つの独立した実験を代表するものである。
【図３ａ】Sftpa1-KIマウスの自発的な肺線維症の発症（ａ）。野生型（WT）またはSftpa1-KIマウスの、肺組織におけるSftpa1およびアクチンのレベルのウェスタンブロット解析、または気管支肺胞洗浄（BAL）液中のSftpa1のレベルのウェスタンブロット解析を示す。
【図３ｂ】Sftpa1-KIマウスの自発的な肺線維症の発症（ｂ）。SPF条件下における野生型（黒四角）またはSftpa1-KIマウス（白丸）の生存解析結果を示す（各n=20）。**ログランク検定によりP<0.01。
【図３ｃ】Sftpa1-KIマウスの自発的な肺線維症の発症（ｃ）。30週齢の野生型またはSftpa1-KIマウス由来の肺切片の、Massonのトリクローム染色の代表的な画像を示す。
【図３ｄ】Sftpa1-KIマウスの自発的な肺線維症の発症（ｄ）。35週齢の野生型またはSftpa1-KIマウス（各n=5）におけるヒドロキシプロリン含量の定量結果を示す。データは平均値±S.D.である。* P<0.05。本図のデータは、4つの独立した実験を代表するものである。
【図４ａ】IAV感染によるSftpa1-KIマウスの肺線維症発症の促進（ａ）。IAV感染後の野生型（丸）またはSftpa1-KI（四角）マウスの生存解析結果を示す（各n=10）。**ログランク検定によりP<0.01。
【図４ｂ】IAV感染によるSftpa1-KIマウスの肺線維症発症の促進（ｂ）。IAV感染の3日後（左カラム）または7日後（右カラム）に、野生型またはSftpa1-KIマウス（各n=5）においてBAL液中の総細胞数を数えた。データは平均値±S.D.である。
【図４ｃ】IAV感染によるSftpa1-KIマウスの肺線維症発症の促進（ｃ）。IAV感染の10日後の、野生型またはSftpa1-KIマウス由来の肺切片の、Massonのトリクローム染色の代表的な画像を示す。
【図４ｄ】IAV感染によるSftpa1-KIマウスの肺線維症発症の促進（ｄ）。IAV感染の10日後の野生型またはSftpa1-KIマウス（各n=8）におけるヒドロキシプロリン含量の定量結果を示す。データは平均値±S.D.である。 * P<0.05。本図のデータは、独立した5つの実験を代表するものである。
【図５ａ】Sftpa1-KIマウスにおけるAEII細胞のネクロプトーシスの増加（ａ）。IAV感染の10日後の野生型またはSftpa1-KIマウス由来の、AEII細胞における7AAD陽性細胞の割合を示す。データは平均値±S.D.である。**P<0.01。
【図５ｂ】Sftpa1-KIマウスにおけるAEII細胞のネクロプトーシスの増加（ｂ）。IAV感染の10日後の野生型またはSftpa1-KIマウス由来の、活性型カスパーゼ3の発現の割合を示す。各図の数字は、活性型カスパーゼ3陽性細胞の割合を示す。
【図５ｃ】Sftpa1-KIマウスにおけるAEII細胞のネクロプトーシスの増加（ｃ）IAV感染後の、野生型（丸）、Sftpa1-KI（三角）またはSftpa1-KI;Ripk3-/-（四角）マウスの生存解析結果を示す（各n=10）。**ログランク検定によりP<0.01。
【図５ｄ】Sftpa1-KIマウスにおけるAEII細胞のネクロプトーシスの増加（ｄ）。IAV感染の10日後の、野生型、Sftpa1-KIまたはSftpa1-KI;Ripk3-/- マウス由来のAEII細胞における7AAD陽性細胞の割合を示す。データは平均値±S.D.である。**P<0.01。
【図５ｅ】Sftpa1-KIマウスにおけるAEII細胞のネクロプトーシスの増加（ｅ）。IAV感染後の野生型（黒四角）、Sftpa1-KI（白丸）またはSftpa1-KI;Ripk3-/-（白三角）マウスの生存解析結果を示す（各n=10）。*ログランク検定により* P<0.05。本図のデータは、4つの独立した実験を代表するものである。
【図６ａ】Sftpa1-KIマウスのAEII細胞におけるNotchシグナル伝達の増強（ａ）。リアルタイムPCRによる、IAV感染の10日後の、Sftpa1-KIおよび野生型マウスのAEII細胞における、Dtx1およびHes1の発現を示す。Wild type (WT);IAVおよびSftpa1-KI;IAVのカラムはIAVに感染したマウス、WTおよびSftpa1-KIのカラムはウイルスに感染していないマウスの結果を示す（図６ｃ、図６ｄおよび図１２において同じ）。**P<0.01。
【図６ｂ】Sftpa1-KIマウスのAEII細胞におけるNotchシグナル伝達の増強（ｂ）。IAV感染後の、野生型（四角）、Sftpa1-KI（三角）またはSftpa1-KI;Rbpj-/-（丸）マウスの生存解析結果を示す（各n=10）。**ログランク検定によりP<0.01。
【図６ｃ】Sftpa1-KIマウスのAEII細胞におけるNotchシグナル伝達の増強（ｃ）。IAV感染の10日後の、野生型またはSftpa1-KIマウス由来のBAL液中の、可溶性 Dll1、Dll4、Jagged1およびJagged2の濃度を、ELISAを用いて評価した。データは平均値±S.D.である。**P<0.01 ND;不検出。
【図６ｄ】Sftpa1-KIマウスのAEII細胞におけるNotchシグナル伝達の増強（ｄ）。IAV感染の10日後の野生型またはSftpa1-KIマウス由来のBAL液を、TP-1レポーター遺伝子を遺伝子導入した293T細胞に添加した。ホタルルシフェラーゼ活性（R1）を、pRL-TKのウミシイタケルシフェラーゼ活性（R2）に標準化した。膜結合型Dll1を添加した結果をあわせて示す（membrane-bound Dll1のカラム）。結果は、平均値±S.D.として示している。**は統計学的に有意な差を示す（P<0.01）。ND; 不検出。
【図６ｅ】Sftpa1-KIマウスのAEII細胞におけるNotchシグナル伝達の増強（ｅ）。IAV感染後の、野生型（四角）、Sftpa1-KI（三角）またはSftpa1-KI; Dll1-/-（丸）マウスの生存解析結果を示す（各n=10）。**ログランク検定によりP<0.01。本図のデータは、独立した3つの実験を代表するものである。
【図７ａ】Sftpa1-KIマウスのIPF発症におけるNotch仲介Ripk3発現の関与（ａ）。非感染の野生型マウス、または、IAV感染の7日後の、野生型、Sftpa1-KI、およびSftpa1-KI; Rbpj-/-マウスのAEII細胞におけるRipk3、およびアクチンのレベルについてのウェスタンブロット解析結果を示す。
【図７ｂ】Sftpa1-KIマウスのIPF発症におけるNotch仲介Ripk3発現の関与（ｂ）。抗Rbpj抗体による、野生型マウスのAEII細胞のChIP解析結果を示す。回収されたRipk3プロモーターの量を、リアルタイムPCRを用いて定量した。対照IgGの値を、1と設定した。結果は、平均値±S.D.として示している。**は統計学的に有意な差を示す（P<0.01）。示した結果は、独立して行われた3つの実験を代表するものである。
【図７ｃ】Sftpa1-KIマウスのIPF発症におけるNotch仲介Ripk3発現の関与（c）IAV感染後の、野生型（黒丸）、Sftpa1-KI（黒三角）、Sftpa1-KI;Rbpj-/-（白丸）、またはRipk3を有するアデノウイルスに感染したSftpa1-KI;Rbpj-/-マウス（黒四角）、または対照ウイルスに感染したSftpa1-KI;Rbpj-/-マウス（白四角）の生存解析結果を示す（各n=10）。**ログランク検定によりP<0.01。本図のデータは、独立した3つの実験を代表するものである。
【図８ａ】Sftpa1-KIマウスの構築（ａ）。Sftpa1-KIマウスの作成のための、交配スキーム。点変異は208番目に挿入した（Y208H）。
【図８ｂ】Sftpa1-KIマウスの構築（ｂ）。野生型およびSftpa1-KIマウス由来のゲノムDNAのサザンブロット解析結果を示す。ホモ接合型の変異対立遺伝子を有するマウス、または野生型マウス由来のゲノムDNAを、EcoRIで切断し、3'および5'プローブでブロッティングした。
【図９ａ】Sftpa1-KIマウスにおけるIAV感染（ａ）。IAVに感染した野生型（四角）またはSftpa1-KI（丸）マウスにおいて、肺組織中のウイルス力価を評価した。結果は、平均値±S.E.として示している。
【図９ｂ】Sftpa1-KIマウスにおけるIAV感染（ｂ）。IAV感染の5日後の、野生型またはSftpa1-KIマウス由来のBAL液中の細胞を、抗TCRβ抗体、抗B220抗体、抗CD11b抗体、および抗Gr1抗体で染色し、フローサイトメトリーで発現を解析した。数字は、各セクションにおける相対頻度を示す。本図のデータは、独立した3つの実験を代表するものである。
【図１０】Sftpa1-KIマウスのIAV感染後の死亡率に対するサーファクタントタンパク質A（SP-A）の影響。IAVに感染した野生型（丸）、Sftpa1-KI（三角）、SP-Aで処理したSftpa1-KIマウス（四角）の生存解析結果を示す（各n=10）。SP-Aは、IAV感染の1日前、並びに、感染の1、3、5および7日後に投与した。**ログランク検定によりP<0.01。本図のデータは、独立した3つの実験を代表するものである。
【図１１】抗ST2抗体によるSftpa1-KIマウスの肺線維症を部分的回復。野生型マウス（黒四角）、対照IgGで処理したSftpa1-KIマウス（黒丸）、抗ST2 mAbで処理したSftpa1-KIマウス（白丸）の生存解析結果を示す（各n=10）。抗ST2mAbまたは対照IgGは、IAV感染の1日前、並びに、感染の1、3、5および7日後に投与した。*ログランク検定によりP<0.05。本図データは、独立した3つの実験を代表するものである。
【図１２】AEII細胞におけるAdam10およびAdam12の発現。IAV感染の10日後の野生型またはSftpa1-KIマウス由来のAEII細胞における、Adam10およびAdam12の発現を、リアルタイムPCRで評価した。データは平均値±S.D.である。**P<0.01。本図のデータは、独立した4つの実験を代表するものである。
【図１３】ヒトおよびマウスの野生型および変異型SFTPA1のアミノ酸配列。208番目のYまたはHを下線で示す。
【図１４】ヒトおよびマウスの野生型SFTPA1のcDNA配列。622番目のTを下線で示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
【００１３】
本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０〜３０」は、「２０±１０％〜３０±１０％」を含むものとする。
【００１４】
SFTPA1（surfactant protein A1）は、主にII型肺胞上皮細胞（AEII細胞）によって産生される肺サーファクタントの成分であり、PSP-A（pulmonary surfactant-associated protein A1）とも呼ばれる。本明細書において、SFTPA1（Y208H）とは、Y208H変異を含むSFTPA1の変異体を意味し、本明細書中、変異型SFTPA1とも称する。本明細書において、Y208H変異とは、配列番号１のヒトSFTPA1のアミノ酸配列と最適に（配列の一致が最大となる状態に）アラインメントしたときに配列番号１の208番目のアミノ酸残基に対応する残基における、Y（チロシン）からH（ヒスチジン）への変異を意味し、208番目のアミノ酸残基における変異に限定されない。SFTPA1は、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、またはヒトのSFTPA1である。SFTPA1（Y208H）は、これを発現する哺乳動物または細胞の種と同種のSFTPA1の変異体であっても異種のSFTPA1の変異体であってもよいが、好ましくは同種のSFTPA1の変異体である。ヒトおよびマウスの野生型SFTPA1のアミノ酸配列を配列番号１および２に、変異型SFTPA1のアミノ酸配列を配列番号３および４それぞれ示すが、当業者は公知の情報に基づき適切なSFTPA1のアミノ酸配列を選択することができる。
【００１５】
ある実施形態において、SFTPA1（Y208H）は、配列番号３または４のアミノ酸配列と７１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、SFTPA1（Y208H）は、配列番号３または４のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、配列番号３または４のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。配列同一性とは、２つの配列間の配列の類似の程度を意味し、比較対象の配列の領域にわたって最適に（配列の一致が最大となる状態に）アラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）は両方の配列に存在する同一の残基を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内の残基の総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、BLASTアルゴリズム、FASTAアルゴリズムなど）が挙げられる。配列同一性は、例えばBLAST、FASTAなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。さらなる実施形態において、SFTPA1（Y208H）は、配列番号３または４のアミノ酸配列を含むか、配列番号３または４のアミノ酸配列からなる。
【００１６】
非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サルなどが例示される。ある実施形態において、非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどの齧歯類、好ましくはマウスである。
【００１７】
本明細書において、遺伝子改変非ヒト哺乳動物とは、遺伝子工学的手法により人為的に改変された遺伝情報を有する非ヒト哺乳動物を意味する。
【００１８】
SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物は、公知の遺伝子改変動物の作製方法により、作製することができる。例示的な作製方法を以下に説明する。
【００１９】
まず、Y208H変異を生じる点変異を導入した配列を含むターゲティングベクターを作製する。点変異は、部位特異的突然変異誘発などにより導入することができる。YをHに変異させるには、YをコードするTATまたはTACをCATまたはCACに変異させればよく、かかる点変異として、例えば、ヒトまたはマウスSFTPA1をコードする配列（配列番号５または６）の622番目のT（チミン）のC（シトシン）への変異（T622C）が挙げられる。ターゲティングベクターは、所望の組換えが起こった細胞の選別が容易になるよう、前記配列の他、ネオマイシン耐性遺伝子(neo)、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(HSV-tk)、ジフテリア毒素A遺伝子などの選択マーカー遺伝子をコードする配列を含むことが好ましい。ターゲティングベクターは、選択マーカー遺伝子をCre/loxPシステムなどにより組換え体の選別の後に除去できるよう、構築してもよい。
【００２０】
次いで、ターゲティングベクターを非ヒト哺乳動物のES細胞に導入する。ターゲティングベクターの導入は、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、DEAE−デキストラン法、リポソーム法などにより行うことができる。ターゲティングベクターを細胞に導入すると、相同組み換えにより、前記点変異を含む配列が対応するゲノムの配列と置換され、所望の配列がゲノムに導入される。所望の配列が導入された細胞は、サザンブロットやPCRにより確認することができる。
【００２１】
相同組換えの結果得られた組換えES細胞を、8細胞期又は胚盤胞の胚内に移植し、このES細胞移植胚を偽妊娠仮親の子宮内に移植して出産させることにより、キメラ動物を作製する。そして、所望の配列が生殖系列に導入されたキメラ動物を野生型動物と交配し、ヘテロ接合体を得て、ヘテロ接合体同士を交配することにより、ホモ接合体を得る。本発明のSFTPA1（Y208H）を発現する遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、ホモ接合体である。ヘテロ接合体またはホモ接合体が得られたことは、サザンブロットやPCRにより確認することができる。
【００２２】
SFTPA1（Y208H）を発現する哺乳動物は、肺線維症を自然発症する。本明細書において、SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物には、肺線維症の発症前および発症後の動物が含まれる。肺線維症の発症時期は、哺乳動物の種類および実験条件によって異なるが、例えばマウスでは、通常３０〜４０週齢頃である。肺線維症の発症は、肺胞、肺胞壁、および／または肺胞間質への炎症性細胞の浸潤、肺コラーゲン量の増加、AEII細胞死などの肺組織の変化により調べることができる。本明細書において、SFTPA1（Y208H）を発現する遺伝子改変非ヒト哺乳動物には、前記のようにして得られたホモ接合体およびその子孫が含まれる。
【００２３】
SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物は、肺線維症モデル動物として、肺線維症の治療薬のスクリーニングに用いることができる。よって、本発明は、前記動物に候補物質を投与することを含む、肺線維症の治療薬のスクリーニング方法を提供する。ある実施形態において、本スクリーニング方法は、SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物に候補物質を投与すること、および、前記哺乳動物の前記候補物質への応答を評価することを含む。
【００２４】
本明細書において、肺線維症とは、肺の線維性病変を特徴とする疾患を意味する。線維性病変は、線維芽細胞から産生されたコラーゲン等の細胞外タンパク質の過剰蓄積により生じる。肺線維症には、薬剤、膠原病、感染、放射線、または粉塵への暴露などの特定の原因による肺線維症、および原因の特定できない特発性肺線維症（Idiopathic pulmonary fibrosis, 本明細書中、IPFとも称する)が含まれる。好ましい態様において、肺線維症は、特発性肺線維症である。
【００２５】
候補物質は、例えば、低分子化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、または抗体、あるいは微生物、植物または動物の細胞抽出物または培養上清などであるが、これらに限定されない。候補物質は、合成低分子化合物ライブラリー、合成ペプチドライブラリー、抗体ライブラリー等の、ライブラリーの形態で提供されてもよい。
【００２６】
候補物質は、経口投与で投与しても、非経口投与（例えば、静脈内投与、経肺投与、皮下投与、筋肉内、腹腔内投与）で投与してもよい。投与回数および投与期間は特に限定されず、１日あたり１回〜数回を、1日〜数日間または数週間、連日または数日おきに行うことが考えられる。候補物質は、哺乳動物が肺線維症を発症する前に投与してもよく、発症した後に投与してもよい。
【００２７】
SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物をインフルエンザウイルスに感染させると肺線維症の発症が早まることから、候補物質の投与前または投与後に、好ましくは投与前に、哺乳動物をインフルエンザウイルスに感染させてもよい。インフルエンザウイルス感染により、短期間で候補物質への応答を評価することが可能になる。インフルエンザウイルスとしては、A型インフルエンザウイルスが好ましく、特にH3N2型が好ましい。ウイルス量は、哺乳動物に応じて適宜変更されるが、例えば、マウスであれば１個体あたり103〜105PFU、例えば約104PFUを投与すればよく、当業者は使用する哺乳動物に応じて適切なウイルス量を決定することができる。インフルエンザウイルスは、通常の方法により、例えば、鼻腔内に接種することにより、哺乳動物に感染させることができる。
【００２８】
哺乳動物の候補物質への応答の評価は、通常、候補物質を投与した哺乳動物の肺線維症の指標を、対照（通常、候補物質を投与していない、候補物質の投与の有無以外は同一条件の哺乳動物の、肺線維症の指標）と比較することにより行う。対照と比較して肺線維症の指標を改善する候補物質が、肺線維症の治療薬として選択される。肺線維症の指標の改善には、程度の改善および発現の遅延が含まれる。例えば、対照と比較して候補物質を投与した哺乳動物の肺線維症の発症が遅れた場合、または肺線維症症状または生存率が改善した場合、候補物質は肺線維症の治療薬として選択されうる。哺乳動物の候補物質への応答の評価は、哺乳動物の種類および評価する肺線維症の指標等に応じて、適切な時期に実施すればよい。
【００２９】
肺線維症の指標としては、肺胞、肺胞壁、および／または肺胞間質への炎症性細胞の浸潤、肺コラーゲン量の増加、AEII細胞死などの肺線維症症状、および生存率の低下などが挙げられる。SFTPA1（Y208H）を発現する哺乳動物における肺線維症の発症にNotchシグナルおよびネクロプトーシスが関与することが確認されたことから、Notchシグナルの活性化またはネクロプトーシスの亢進を肺線維症の指標とすることもできる。Notchシグナルの活性化は、AEII細胞におけるNotch標的遺伝子であるDtx1またはHes1の発現、BAL液中のNotchリガンドであるDll1のレベル、AEII細胞におけるDll1生成に関与するプロテアーゼであるAdam10および／またはAdam12の発現などにより、調べることができる。ネクロプトーシスの亢進は、AEII細胞におけるネクロプトーシス関連酵素であるRIPK3の発現、BAL液中の損傷関連分子パターン（damage-associated molecular pattern; DAMP）（例えばIL-33）のレベルなどにより、調べることができる。
【００３０】
Notchシグナルおよびネクロプトーシスが肺線維症に関与することが確認されたことから、インビトロでNotchシグナルまたはネクロプトーシスを評価することによっても、肺線維症の治療薬をスクリーニングすることができる。ある実施形態において、本スクリーニング方法は、細胞をインビトロで候補物質と接触させること、および、当該細胞のNotchシグナルまたはネクロプトーシスを評価することを含む。ある実施形態において、細胞は、SFTPA1（Y208H）を発現する。Notchシグナルを阻害する候補物質、およびネクロプトーシスを抑制する候補物質は、肺線維症の治療薬として選択されうる。
【００３１】
Notchシグナルの評価は、公知の方法により行うことができる。膜貫通型受容体であるNotchは、リガンドの結合により活性化されると細胞内ドメインが切断され、切断された細胞内ドメインが転写因子であるRBPJに結合して、Hes1やDtx1などの標的遺伝子の転写を活性化する。それゆえ、Notchシグナル伝達は、例えば、Notchの下流分子の制御下にレポータータンパク質を発現するレポーターシステムにより、またはNotchの細胞内ドメインの切断に基づき、評価することができる。前記レポーターシステムは、例えば、RBPJ結合配列またはNotch標的遺伝子のプロモーターの下流に、レポータータンパク質を発現する遺伝子（本明細書中、レポーター遺伝子とも称する）を含むポリヌクレオチドを用いる。レポータータンパク質としては、GFP、eGFP、BFP、YFP、EYFP、CFP、RFP、dsRed、およびmCherry等の蛍光タンパク質が挙げられる。Notchの細胞内ドメインの切断は、例えば、切断された細胞内ドメインを特異的に認識する抗体を用いたウェスタンブロッティングなどにより、調べることができる。
【００３２】
ある実施形態において、細胞は、Notchおよびその下流分子を発現し、かつ当該下流分子の制御下にレポータータンパク質を発現するポリヌクレオチドを有する。下流分子としては、限定はされないが、RBPJが挙げられ、当該下流分子の制御下にレポータータンパク質を発現するポリヌクレオチドとしては、RBPJ結合配列またはNotch標的遺伝子のプロモーター（例えば、Hes-1プロモーター）の下流にレポーター遺伝子を含むポリヌクレオチドが挙げられる。NotchリガンドによるNotchシグナルの活性化を阻害する候補物質が、肺線維症の治療薬として選択されうる。Notchリガンドとしては、Delta-like 1（Dll1）が例示される。
【００３３】
ネクロプトーシスの評価は、公知の方法により行うことができる。ネクロプトーシスでは、活性化されたRIPK3（Receptor-interacting protein kinase 3）によりMLKL（Mixed lineage kinase domain-like）がリン酸化され、リン酸化MLKLの働きにより細胞膜が破壊され、DAMPが放出される。それゆえ、ネクロプトーシスは、ネクロプトーシス性刺激による細胞膜の破壊（例えば、細胞膜の破壊により放出されるIL-33などのDAMPのレベル）に基づき、評価することができる。
【００３４】
ある実施形態において、細胞は、RIPK3およびMLKLを発現する。ネクロプトーシス性刺激としては、TNF-αが挙げられる。
【００３５】
インビトロでのスクリーニングに使用可能な細胞としては、HEK293細胞、293T細胞、A549細胞、Jurkat細胞などが例示される。スクリーニングに必要なタンパク質およびポリヌクレオチド等の分子は、細胞に内在するものであってもよく、人為的に細胞に導入したもの、または細胞で発現させたものであってもよい。細胞への人為的導入および細胞での人為的発現は、公知の遺伝子工学的手法により行うことができる。
【００３６】
本発明の例示的実施形態を以下に記載する。
１．SFTPA1（Y208H）を発現する、遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
２．非ヒト哺乳動物がマウスである、前記１に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
３．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列と７１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記１または２に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
４．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、前記３に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
５．肺線維症モデル動物である、前記１〜４のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
６．肺線維症の治療薬のスクリーニング方法であって、
SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物に候補物質を投与すること、および
前記哺乳動物の前記候補物質への応答を評価すること、
を含む方法。
７．非ヒト哺乳動物がマウスである、前記６に記載の方法。
８．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列と７１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記６または７に記載の方法。
９．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、前記８に記載の方法。
１０．候補物質への応答の評価が、候補物質を投与した前記哺乳動物の肺線維症の指標を対照と比較することすることを含む、前記６〜９のいずれかに記載の方法。
１１．肺線維症の指標が、肺線維症症状である、前記１０に記載の方法。
１２．肺線維症の指標が、生存率の低下である、前記１０に記載の方法。
１３．候補物質の投与前に、前記哺乳動物をインフルエンザウイルスに感染させることを含む、前記６〜１２のいずれかに記載の方法。
１４．インフルエンザウイルスが、A型インフルエンザウイルスである、前記１３に記載の方法。
１５．A型インフルエンザウイルスが、H3N2型である、前記１４に記載の方法。
１６．肺線維症モデル動物の作製方法であって、SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物を作製することを含む方法。
１７．非ヒト哺乳動物がマウスである、前記１６に記載の方法。
１８．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列と７１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記１６または１７に記載の方法。
１９．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、前記１８に記載の方法。
２０．SFTPA1（Y208H）を発現する非ヒト哺乳動物の、肺線維症モデル動物としての使用。
２１．非ヒト哺乳動物がマウスである、前記２０に記載の使用。
２２．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列と７１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記２０または２１に記載の使用。
２３．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、前記２２に記載の使用。
２４．肺線維症の治療薬のスクリーニング方法であって、
細胞をインビトロで候補物質と接触させること、および
前記細胞のNotchシグナルを評価すること
を含む方法。
２５．細胞が、SFTPA1（Y208H）を発現する、前記２４に記載の方法。
２６．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列と７１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記２４または２５に記載の方法。
２７．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、前記２６に記載の方法。
２８．細胞が、Notchおよびその下流分子を発現し、かつ前記下流分子の制御下にレポータータンパク質を発現するポリヌクレオチドを有する、前記２４〜２７のいずれかに記載の方法。
２９．候補物質の投与前もしくは投与後、または候補物質の投与と同時に、Notchリガンドで細胞を刺激することを含む、前記２４〜２８のいずれかに記載の方法。
３０．肺線維症の治療薬のスクリーニング方法であって、
細胞をインビトロで候補物質と接触させること、および
前記細胞のネクロプトーシスを評価すること
を含む方法。
３１．細胞が、SFTPA1（Y208H）を発現する、前記３０に記載の方法。
３２．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列と７１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記３０または３１に記載の方法。
３３．SFTPA1（Y208H）が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、前記３２に記載の方法。
３４．細胞が、RIPK3およびMLKLを発現する、前記３０〜３３のいずれかに記載の方法。
３５．候補物質の投与前もしくは投与後、または候補物質の投与と同時に、ネクロプトーシス性刺激で細胞を刺激することを含む、前記３０〜３４のいずれかに記載の方法。
【００３７】
以下、実施例により本発明を説明するが、如何なる意味においても本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
１．方法
エキソームリシーケンスおよびDNAシーケンス
エキソームシーケンスおよびデータ解析は、既報のとおり行った（Kitamura, A. et al., J Clin Invest 121, 4150-4160 (2011).; Kitamura, A. et al., J Exp Med 211, 2385-2396 (2014).）。簡潔に言うと、ゲノムDNAからペアードエンドライブラリーを作製し、SureSelect Human All Exon Kit（Agilent Technologies）由来のビオチン化cRNAオリゴヌクレオチドベイトにハイブリダイズさせた。ライブラリーは、Illumina Hiseq2000シークエンシングシステムの1レーンに対し、ペアードエンド、75bpの読み取りデータで、配列決定した。当該読み取りデータを、UCSC Genome Browserのヒト参照配列（hg19）に対してアライメントした。標的エキソーム全体の90％が、10を超える読み取りデータで網羅されていた。候補領域に存在するDNA変異は、dbSNP build 134、1000人ゲノムプロジェクト、およびNHLBI エキソームシーケンスプロジェクトに対して、選別した。ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、およびスプライス部位対立遺伝子を評価した。SFTPA1における変異は、ABI Prism 3100 遺伝子解析装置（PE Applied Biosystems）を用いて配列決定した。
【００３９】
SNPホモ接合性マッピングおよび連鎖解析
1つの血縁家族由来の、肺線維症を発症した同胞、および発症していない同胞を、Illumina Human 610 Quad（San Diego, CA, USA）で調べた。サンプルの処理およびラベリングは、製造業者の指示に従い行った。99％を超える平均コールレートが得られた。ホモ接合領域は、HomozygosityMapperを用いて同定した。異なる家族由来の3人の患者間で共通するホモ接合領域の簡単な比較を可能にする図形インターフェイスは、本発明者らが開発した。連鎖解析については、Merlin softwareを用いて多点ロッドスコアを得た。
【００４０】
マウス
C57BL/6は、Japan SLC（Hamamatsu, Japan）から購入した。Sftpa1-KIマウスは、Sftpa1に変異を有するターゲティングベクターを作成することにより構築した。
【００４１】
気管支肺胞上皮の洗浄
マウスを安楽死させ、肺組織およびBAL液を0.8ml量のPBSを用いて回収した。Notchリガンドを測定するために、無細胞BAL液を−80℃のフリーザーで保管した。
【００４２】
フローサイトメトリー
細胞を染色バッファーに懸濁し、抗FcγRII/IIIモノクローナル抗体（mAb）（2.4G2）とインキュベートし、その後抗体で染色した。抗F4/80（BM8）抗体、抗CD11b（M1/70）抗体、抗CD11c（N418）抗体、抗Gr-1（RB6-8C5）抗体、抗CD4（GK1.5）抗体、および抗CD8（53-6.7）抗体は、BioLegend（San Diego, CA）より入手した。7−AADに陽性である細胞を除いた後、105個の細胞の蛍光強度をFACSCanto IIフローサイトメーター（BD Biosciences, CA）で測定し、FACSDiva（BD Biosciences）ソフトウエアで解析した。
【００４３】
ウェスタンブロッティングおよびブルーネイティブゲル電気泳動法（Blue Native PAGE）
細胞ペレットを、冷却したRIPAバッファー（Wako Pure Chemical Industries）およびプロテアーゼ阻害薬（Roche）中で溶解し、溶解物をSDSローディングダイ中で加熱した。サンプルをSDS-PAGEにより分離して、ブロットを抗Flag抗体（F1804; Sigma-Aldrich）、抗myc抗体（9E10; Santa Cruz）、または抗Ripk3抗体（ウサギポリクローナル抗体; Novus Biologicals, NBP1-77299）とインキュベートした。次いで、それらをペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG抗体（31430; Pierce Biotechnology）またはヤギ抗ウサギIgG抗体（170-6515; BioRad）とインキュベートした。対照として、メンブレンをポリクローナル抗アクチン抗体（A2066; Sigma-Aldrich）およびHRP結合ヤギ抗ウサギIgG抗体（170-6515; BioRad）でプローブした。一部の実験では、メンブレンを抗Flag抗体および抗アクチン抗体でブロットした後に、HRP結合抗マウスIgG抗体および抗ウサギIgG抗体でブロットした。バンドはECL Prime Chemiluminescent Substrate（GE Healthcare）およびImageQuant LAS-4000ミニシステム（GE Healthcare）で検出した。ブルーネイティブゲル電気泳動法を、Novex Native PAGE Bis-Tris Gel System（Invitrogen）を用いて、製造業者のプロトコールに従い行った。簡潔に言うと、細胞を1%ジギトニンおよびプロテアーゼ阻害薬（Roche）を含む1x Native PAGEサンプルバッファー（Invitrogen）中で懸濁し、その後氷上で10分間インキュベートした。遠心分離後、25μgの上清を、1.0μLの5% G250サンプル添加剤および10μLの1x Native PAGEサンプルバッファー（Invitrogen）で懸濁した。サンプルを3％〜12％のBis-Tris Native PAGEゲル上にロードし、その後1x Native PAGE Running buffer system（Invitrogen）で電気泳動した。NativeMarkタンパク質スタンダード（Invitrogen）を分子量マーカーとして用いた。ECL prime Chemiluminescent Substrate（GE Healthcare）をメンブレンに添加し、その後Lumino Image Analyzer（GE Healthcare）でメンブレンを解析した。
【００４４】
リアルタイムPCR
全RNAを単離し（ReliaPrep RNA Cell Miniprep System, Promega）、cDNAを合成した（0.1μgのRNA）。相対的発現は、サイクル閾値の比較試験を用いて計算した。PCR解析は、プライマーを用いたStepOnePlus（Applied Biosystems）を使用して行った。CypAのmRNAレベルを、内部標準として用いた。
【００４５】
AEIIの精製
肺を、肺動脈を通じて右心室を介して、5mlのPBSで灌流した。1ミリリットルのブタエラスターゼ（4.5U; Roche Diagnostics）を、気管カニューレを通じて注入した。肺葉を静かに気管支から分離し、20%FBSおよび100 U/ml DNAse I（Qiagen）を含むRPMI 1640培地中ですりつぶした。続いて、懸濁液中の細胞を、100-、70-、および40-μｍナイロンメッシュで濾過した。混入している白血球、内皮細胞およびI型肺胞上皮細胞を、ビオチン化抗CD45抗体、抗CD11b抗体、抗CD11c抗体、抗CD31抗体、および抗ポドプラニン抗体（Biolegends）、並びに、ストレプトアビジン常磁性マイクロビーズ（Miltenyi Biotec）を用いて消失させた。
【００４６】
ヒドロキシプロリンの測定
肺組織中のヒドロキシプロリンは、ヒドロキシプロリンアッセイキット（QuickZyme Hydroxyproline Assay, QuickZyme Biosciences, Leiden）により測定した。ヒドロキシプロリン含量は、他に特に規定がない限り、「肺当たりのμg」で表す。
【００４７】
共焦点レーザー走査顕微鏡法
GFPタグ付き野生型または変異型SFTPA1で遺伝子導入した293T細胞をスライド上に置き、PBSで2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定して、0.3% Triton X-100および3% BSAを含有するPBSで透過処理した。細胞を、抗カルネキシン抗体、抗Rab5抗体、抗RCAS1抗体、または抗COX IV抗体（Cell Signaling Technology）で染色した。PBSで洗浄後、細胞を、Alexa594結合抗ウサギIgG抗体と、1時間、室温で反応させた。サンプルを、DAPIを含むProlong Gold退色防止剤と共に包埋し、共焦点レーザー走査顕微鏡（NIKON, A1R+）により解析した。
【００４８】
ChIPアッセイ
細胞（1×106細胞）を、1％ホルムアルデヒドで、37℃で10分間インキュベートし、その後、架橋されたクロマチンを超音波処理して剪断クロマチンフラグメント（200-1000 bp）にした。超音波処理したクロマチンを抗Rbpj抗体で免疫沈降し、陰性対照を対照抗体で免疫沈降した。免疫複合体を、Protein Aアガロースビーズで回収した。プロテイナーゼKで処理した後、DNAをフェノール/クロロホルム抽出により精製した。リアルタイムPCRを行い、Rbpjの結合するRipk3プロモーターフラグメントを定量した。
【００４９】
ELISA
BAL液を、プレート上に4℃で一晩コーティングした。まずビオチン結合抗Dll1抗体、抗Dll4抗体、抗Jagged1抗体、または抗Jagged2抗体を、次いでストレプトアビジン-HRP（eBiosciences）を、当該液と共にインキュベートした。TMB（eBiosciences）の添加後、各ウェルの吸光度を415nmで測定した。
【００５０】
ルシフェラーゼアッセイ
BAL液の存在下または非存在下に、FuGENE6トランスフェクション試薬（Roche Diagnostics）を用いて、293T細胞にNotch1全長マウスcDNAおよびTP-1レポーター遺伝子を遺伝子導入した。遺伝子導入の24時間後、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Promega, Madison, USA）により、製造業者のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した。ホタルルシフェラーゼ活性を、pRL-TKのウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化した。値は全て、3連で行い、かつ、少なくとも4回繰り返した実験から得た。
【００５１】
組織診断
パラフィン包埋切片を、Massonのトリクローム染色に用いた。
【００５２】
インフルエンザ感染
マウスに麻酔をかけ、20μlの滅菌PBS中のインフルエンザウイルスを鼻腔内に接種した（１個体あたり104PFU）。ウイルス力価は、既報のとおり測定した（Kashima, Y. et al., Vaccine 27, 7402-7408 (2009).）。感染したマウスの生存は、毎日観察した。一部の実験では、マウスに対し、気管内にSP-A（25 μg/50 μl/投与）を処理した。処理は、IAV感染の1日前に始め、その後2日間の間隔で行った（0日目：感染、−1、1、3、5、7日目）。他の実験では、マウスに対し、静脈内に抗ST2抗体（R&D Systems）（100μg/マウス）を、同じスケジュールで処理した（0日目：感染、−1、1、3、5、7日目）。
【００５３】
アデノウイルス感染
サイトメガロウイルスプロモーター下にマウスRipk3を有する、E1欠失組換えアデノウイルスベクターを作成して精製した。対照ウイルスとしては、Ripk3を含まないウイルスを用いた。IAV感染の1日後に、組換えアデノウイルスを気管内に109 pfu/マウスで注入し、マウスに感染させた。
【００５４】
統計
群間差の統計学的有意性を、独立、両側t検定、パラメトリックダネット検定、またはログランク検定により評価した。p値<0.05を、有意であると判断した。
【００５５】
２．結果
患者病歴および遺伝子解析
近親婚をした1つの日本人家族において、2人の息子が24歳と27歳の年齢でIPF（特発性肺線維症）と診断され、それぞれ32歳と34歳で死亡した（図１ａ）。末の弟もまた、40歳の年齢で呼吸困難を発症し始めた。胸部Ｘ線は両側の網状陰影を示し、上の兄達のコンピュータ断層撮影解析は、末梢領域および胸膜下領域において、引性気管支拡張および蜂巣嚢胞（honeycomb cyst）を伴う異常な網目を示した（図１ｂ）。当該家族の血縁関係と、彼らの両親に肺線維症の臨床徴候がなかったことを考えると、常染色体劣性遺伝疾患発症性の変異が疑われた。ホモ接合性マッピング、連鎖解析、およびエキソームリシーケンス法を行い、2人の上の兄の間で共通する15のまれな変異を発見し、このうち、2人に共通するホモ接合領域に位置するSFTPA1のホモ接合型ミスセンス変異（T622C）を発見した（図１ｃ）。この変異は、1000人ゲノムプロジェクトおよびExome Aggregation Consortiumを含むいくつかのヒト遺伝子変異データベースには存在しなかった。両親が共に検出された変異に対しヘテロ接合性であるため、当該変異は、常染色体劣性遺伝との仮定のもと、当該疾病と同時分離を示した。この変異は、208番目のアミノ酸をチロシンからヒスチジンに変化させており（図１ｃ）、糖鎖認識部位中に存在した（図１ｃ）。この領域は、8つの種で保存されている（図１ｄ）。
【００５６】
SFTPA1の変異はSFTPA1の分泌を妨げる
SFTPA1タンパク質の発現および分泌における、SFTPA1の当該変異の影響を評価するために、mycタグ付きの野生型または変異型SFTPA1をA549細胞に形質導入して、細胞ペレットおよび上清中のSFTPA1の発現を調べた（図２ａ）。細胞ペレット中の変異型SFTPA1の発現は、野生型SFTPA1と同等であった。しかしながら、野生型SFTPA1は上清中に検出されたが、変異型SFTPA1は検出されず、このことは、SFTPA1の変異がSFTPA1の分泌を妨げることを示している。次に、ブルーネイティブゲル電気泳動法により、野生型および変異型SFTPA1タンパク質を調べた（図２ｂ）。変異型SFTPA1タンパク質は細胞内で凝集体を作り、一方、野生型SFTPA1の大半はモノマーとして存在していた。野生型および変異型SFTPA1の局在性を評価するために、GFPタグ付き野生型または変異型SFTPA1を遺伝子導入したA549細胞を、オルガネラマーカーで染色した（データ不掲載）。野生型SFTPA1は斑点模様を示したが、変異型SFTPA1を遺伝子導入した細胞では、斑点模様は検出されなかった。野生型SFTPA1はERおよびゴルジ体に局在し、ミトコンドリアおよびエンドソームには存在しなかった。対照的に、変異型SFTPA1はERに局在し、ゴルジ体、ミトコンドリア、およびエンドソームには存在しなかった。これらのデータは、ERからゴルジ体への変異型SFTPA1の輸送が障害されていることを示唆している。
【００５７】
SFTPA1はSFTPA2と複合体を形成するため、変異型SFTPA1とSFTPA2との相互作用を評価した。Flagタグ付きの野生型SFTPA1またはSFTPA2を、mycタグ付きの野生型または変異型SFTPA1と共に導入し、細胞ペレットまたは上清中のこれらの会合を、抗Flag抗体による免疫沈降および抗myc抗体によるブロッティングによって評価した（図２ｃ）。既報の通り、野生型SFTPA1タンパク質は細胞ペレットおよび上清中においてSFTPA2と複合体を形成した。変異型SFTPA1タンパク質は細胞ペレット中で、野生型SFTPA1よりも低効率でSFTPA2と複合体を形成し、変異型SFTPA1-SFTPA2複合体は上清中には検出されなかった（図２ｃ）。
【００５８】
SFTPA1に変異を有するマウスは自発的に肺線維症を発症する
当該家族のSFTPA1の変異が実際にIPF発症の一因であったのかを調べるため、マウス遺伝子Sftpa1に同じ変異（Y208H）を有するマウス（Sftpa1-KI）を作製した（図８ａ）。変異型SFTPA1を含むコンストラクトの相同組換えを、サザンブロッティングにより確認した（図８ｂ）。
【００５９】
最初に、Sftpa1-KIマウスにおけるSftpa1の分泌を評価した。Sftpa1-KIマウス由来の肺組織は、対照マウスと同等レベルでSftpa1を発現した（図３ａ）。一方、Sftpa1-KIマウスのBAL液はSftpa1を含んでいなかったが、野生型マウスのBALではSftpa1の高生産がみられた（図３ａ）。これらの知見は、遺伝子導入A459細胞において変異ヒトSFTPA1の分泌が障害されたことと一致している。
【００６０】
Sftpa1-KIマウスは、8〜30週齢では健常であるが、およそ40週齢で死亡し始める（図３ｂ）。Sftpa1-KIマウスの肺切片は、30週齢において細胞浸潤および線維性領域の増加を示す（図３ｃ）。当該週齢において、Sftpa1-KIマウスの肺のコラーゲン量は対照マウスより多かった（図３ｄ）。これらのデータは、マウスSftpa1における当該変異が自発的に肺線維症を引き起こすことを示している。これは、当該家族で見られたヒトSFTPA1における対応する変異がIPFの原因となる変異であることを、強く示唆している。
【００６１】
インフルエンザウイルス感染がSftpa1-KIマウスにおける肺線維症の進行を早める
肺感染症がIPF患者の臨床症状を悪化させることが知られているため、Sftpa1-KIマウスにおける肺線維症の分子メカニズムを評価する目的で、当該マウスにインフルエンザウイルスA（IAV）を感染させた。対照マウスおよびSftpa1-KIマウスはいずれも、IAV感染の3〜12日後に肺において同様のウイルス力価を示し（図９ａ）、最終的に感染後12日目に当該ウイルスを根絶させた（図９ａ）。このことは、Sftpa1変異がIAV感染に対する易感染性に影響しないことを示している。しかしながら、Sftpa1-KIマウスは感染後13日目から死亡し始め、感染後28日目までに当該マウスの70%が死亡した（図４ａ）。対照マウスおよびSftpa1-KIマウスは、感染後3日目および7日目に、同様の総細胞数を有し（図４ｂ）、感染後7日目にT細胞、B細胞および好中球について同様の出現頻度（frequency）を有した（図９ｂ）。IAV感染Sftpa1-KIマウスの肺病理組織診断では、感染後10日目に細胞浸潤を伴う肺線維症を示し、一方対照の肺は肺線維症の徴候をほとんど示さなかった（図４ｃ）。肺コラーゲン量は、対照マウスよりもSftpa1-KIマウスにおいて多かった（図４ｄ）。
【００６２】
Sftpa1の当該変異はSftpa1の分泌を障害するため、細胞外Sftpa1の欠如が肺線維症の原因である可能性がある。そこで、IAVに感染したSftpa1-KIマウスに対し、ヒトSP-Aを気管内投与した。しかしながら、SP-Aによる処理によって肺線維症は回復せず（図１０）、このことは、Sftpa1-KIマウスの肺線維症は細胞外SP-Aの欠如に起因しないことを示唆している。
【００６３】
インフルエンザウイルス感染がSftpa1-KIマウスにおける肺線維症の進行を早める
上皮細胞死が肺線維症に関連するため、Sftpa1-KIマウスのAEII細胞死を調べた。Sftpa1-KIマウスにおいて、IAVによる感染後、より多くのAEII細胞が7AADに陽性であった（図５ａ）。Sftpa1-KIマウスのAEII細胞における活性型カスパーゼ3の発現は、野生型と同等であり（図５ｂ）、このことは、アポトーシスがSftpa1-KIマウスにおける細胞死の増加に関連しないことを示唆した。次に、当該細胞死へのネクロプトーシスの寄与を調べることを試みた。Sftpa1-KIマウスをRipk3欠損マウスと交配し（Sftpa1-KI;Ripk3-/-）、Sftpa1-KI;Ripk3-/-マウスにIAVを感染させた。60%を超える対照Sftpa1-KIマウスがIAV感染後に死亡したが、Sftpa1-KI;Ripk3-/-マウスは約90%がIAV感染後も生存した（図５ｃ）。Sftpa1-KI;Ripk3-/-マウスにおいて、IAV感染後の7AAD陽性のAEII細胞数は、野生型と同等であった（図５ｄ）。その上、Sftpa1-KI;Ripk3-/-マウスは、少なくとも48週齢までは、自発的に肺線維症を発症しなかった（図５ｅ）。これらのデータは、ネクロプトーシスの増加がSftpa1-KIマウスの死の原因であることを示唆している。ネクロプトーシスを起こした細胞から放出される損傷関連分子パターン（DAMP）の1つがIL-33であることから、IAVに感染した野生型またはSftpa1-KIマウスを抗ST2抗体で処理した。抗ST2抗体による処理は、Sftpa1-KIマウスの生存を部分的に助け（図１１）、このことは、IL-33が、ネクロプトーシスを起こしたAEII細胞から放出されたDAMPの1つであり、肺線維症に関係していることを示唆している。
【００６４】
AEII由来の可溶性Dll1が、IAV感染後のSftpa1-KIマウスの肺線維症の原因である
DNAマイクロアレイを用いて、野生型のAEII細胞と変異型Sftpa1を有するAEII細胞との間で示差的に発現される遺伝子を同定した（データ不掲載）。インフルエンザウイルスに感染したSftpa1-KIマウス由来のAEII細胞において、Dtx1およびHes1の発現の増加が見られ、このことは、Notchシグナル伝達がSftpa1-KIマウスのAEII細胞で活性化していることを示唆している。Sftpa1-KIマウスにおいて、AEII細胞での標準的Notch標的遺伝子であるDtx1およびHes1の発現が野生型マウスより高いことを、リアルタイムPCRにより確認した（図６ａ）。Notchシグナル伝達の影響を評価するために、Rbpjf/f-SPC-Creマウスと交配したSftpa1-KIマウス（Sftpa1-KI;Rbpj-/-）を構築し、Sftpa1-KI;Rbpj-/-マウスおよびSftpa1-KIマウスにおける、IAV感染後のマウスの生存を比較した。Sftpa1-KI;Rbpj-/-マウスは、Sftpa1-KIマウスと比較して、IAV感染後の生存が改善されており、このことは、Notchシグナル伝達の増強が、Sftpa1変異が引き起こす肺線維症の進行の原因であることを示唆している（図６ｂ）。
【００６５】
Notchシグナル伝達は、NotchとNotchリガンドとの相互作用により開始されるため、IAV感染したSftpa1-KIマウスおよび野生型マウスのBAL液中の、可溶性Notchリガンドのレベルを評価した。Sftpa1-KI;Rbpj-/-マウスにおいて、BAL液中の可溶性Dll1のレベルは、対照マウスと比較して高かった（図６ｃ）。Sftpa1-KIマウスの可溶性Dll4のレベルは、野生型マウスと同等であり、BAL液中の可溶性Jagged1およびJagged2は、IAVに感染したSftpa1-KIまたは対照マウスのいずれにおいても検出されなかった（図６ｃ）。可溶性 Dll1はADAM10またはADAM12により生じることから、IAVに感染した野生型およびSftpa1-KIマウスにおけるAEII細胞でのAdam10およびAdam12の発現を調べた。AEII細胞において、Adam10およびAdam12の発現はいずれも、野生型マウスと比較してSftpa1-KIマウスにおいて増加していた（図１２）。さらに、Notchレポーターアッセイは、Sftpa1-KIマウスのBAL液が野生型マウスよりも強いNotch刺激活性を有することを示した（図６ｄ）。
【００６６】
AEII細胞においてDll1を欠失しているSftpa1-KIマウス（Sftpa1-KI;Dll1-/-）を用いて、肺線維症の進行に対するBAL液中のDll1の寄与を確認した。Sftpa1-KI;Dll1-/-マウスは、IAV感染後に死亡率の低下を示した（図６ｅ）。これらのデータは、Notchシグナル伝達増強後の、AEII細胞におけるDll1の発現の増加が、Sftpa1-KIマウスの肺線維症の原因であることを示唆している。
【００６７】
Ripk3は、Notchシグナル伝達により制御される
Notchとネクロプトーシスとの関連を解析するために、IAV感染後のAEII細胞におけるRipk3の発現を評価した。Ripk3の発現は、IAVに感染したSftpa1-KIマウス由来のAEII細胞において、IAVに感染した野生型マウス由来の細胞よりもはるかに高く、AEII細胞におけるRbpjの欠失は、Sftpa1欠損が引き起こすRipk3の高発現を低下させた（図７ａ）。Ripk3遺伝子のプロモーター領域に4つの推定Rbpj結合部位が存在することから、Rbpjが直接Ripk3の発現を制御するかどうかを、ChIPアッセイを用いて調べた。ChIPアッセイにより、Ripk3のプロモーター領域（−1344から−1333）にRbpjが直接結合していることが示された（図７ｂ）。
【００６８】
最後に、Rbpj仲介Ripk3発現が、Sftpa1-KIマウスの肺線維症の原因であるかどうかを解析した。Ripk3をコードするアデノウイルスベクターを構築し、IAVに感染したSftpa1-KI;Rbpj-/-マウスの気管内にRipk3−アデノウイルスを感染させた。Ripk3−アデノウイルスの感染は、対照ウイルスを感染させたマウスと比較して、Sftpa1-KI;Rbpj-/-マウスの生存を悪化させ（図７ｃ）、このことは、Notch仲介Ripk3発現がSftpa1-KIマウスの肺線維症の原因であることを示している。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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