(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｃａｓ９蛋白質と複合体を形成できる、操作された核酸ターゲティング核酸の提供。【解決手段】ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９蛋白質と複合体を形成することができる、操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸であって、標的核酸配列とハイブリダイズすることができる配列を含むスペーサー配列と、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列と最小ｔｒａｃｒ配列の間のハイブリダイズ領域、ここで当該ハイブリダイズ領域は第一の二重鎖を形成し、前記スペーサー配列が当該第一の二重鎖の５’である、及び、その後に第一のステムが続いていないバルジ領域、ここで当該バルジ領域は不対のヌクレオチドの領域を含む二重鎖と、前記二重鎖の末端を接続し、ヘアピン構造を形成する、シングルガイドコネクター配列と、３’のｔｒａｃｒ配列と、を含む、操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの複合体が互いに近接しているかどうかを検出するための方法であって、
（ａ）第１の標的核酸を第１の複合体と接触させる工程であって、前記第１の複合体は、第１の部位特異的ポリペプチド、第１の改変された核酸ターゲティング核酸および第１のエフェクタータンパク質を含み、前記エフェクタータンパク質は、前記改変された核酸ターゲティング核酸に結合するように適合されており、前記第１のエフェクタータンパク質は、分割システムの第１の部分を含む非天然配列を含む、工程、および
（ｂ）第２の標的核酸を第２の複合体と接触させる工程であって、前記第２の複合体は、第２の部位特異的ポリペプチド、第２の改変された核酸ターゲティング核酸および第２のエフェクタータンパク質を含み、前記エフェクタータンパク質は、前記改変された核酸ターゲティング核酸に結合するように適合されており、前記第２のエフェクタータンパク質は、分割システムの第２の部分を含む非天然配列を含む、工程
を含む前記方法。
【請求項２】
前記分割システムは、個々には活性化されていないが、複合体を形成すると活性のあるタンパク質複合体を生じる２つ以上のタンパク質断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の部分と前記第２の部分の間の相互作用を検出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記検出する工程は、前記第１および第２の複合体が互いに近接していることを示す、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記検出する工程は遺伝子移動事象の発生を決定することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子移動事象は転座を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子移動事象の前に、前記分割システムの前記２つの部分は相互作用しない、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子移動事象の後に、前記分割システムの前記２つの部分は相互作用する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子移動事象は、ＢＣＲとＡｂ１遺伝子の間の転座である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記分割システムは、分割ＧＦＰシステム、分割ユビキチンシステム、分割転写因子システムおよび分割親和性タグシステムまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出する工程は遺伝子型を示す、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子型に基づいて疾患の処置の経過を決定することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患を処置する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記処置する工程は、薬物を投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記処置する工程は、核酸ターゲティング核酸および部位特異的ポリペプチドを含む複合体を投与することを含み、前記複合体は、前記疾患に関与する遺伝子エレメントを改変することができる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
核酸ターゲティング核酸のＰ−ドメインに変異を含む操作された核酸ターゲティング核酸。
【請求項１７】
核酸ターゲティング核酸のバルジ領域に変異を含む操作された核酸ターゲティング核酸。
【請求項１８】
多重化遺伝子ターゲティング剤を含む組成物であって、前記多重化遺伝子ターゲティング剤は１つまたはそれ以上の核酸モジュールを含み、前記核酸モジュールは非天然配列を含み、前記核酸モジュールは、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１０％のアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドに結合するように構成されており、前記核酸モジュールは標的核酸にハイブリダイズするように構成されている前記組成物。
【請求項１９】
改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチドと比較して第２のプロトスペーサー隣接モチーフを標的とするように適合されているように改変されている前記組成物。
【請求項２０】
ドナーポリヌクレオチドをタグ付けした細胞を生成するための方法であって、
（ａ）部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む複合体を使用して細胞内で標的核酸を切断する工程、
（ｂ）ドナーポリヌクレオチドを切断した標的核酸に挿入する工程、
（ｃ）前記ドナーポリヌクレオチドを有する前記細胞を増殖させる工程、および
（ｄ）前記ドナーポリヌクレオチドをタグ付けした細胞の起源を決定する工程
を含む前記方法。
【請求項２１】
（ａ）エフェクタータンパク質と、
（ｂ）
（ｉ）６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性、
（ｉｉ）６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮに対して少なくとも５０％の配列同一性、および
（ｉｉｉ）非天然配列
を含み、
前記エフェクタータンパク質に結合するように適合されている核酸と
を含む組成物。
【請求項２２】
Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１０％のアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドをさらに含み、前記核酸が前記ポリペプチドに結合する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインにおいてＣａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ポリペプチドはＣａｓ９である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記核酸はリンカー配列をさらに含み、前記リンカー配列は、６つの連続するヌクレオ
チドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む前記配列および６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む前記配列とを連結する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記非天然配列は、５’末端および３’末端またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される前記核酸に位置する、請求項２１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、その内容全体を参照により本明細書に組み入れる、２０１３年５月１日出願の米国特許仮出願第６１／８１８，３８６号［代理人整理番号４４２８７−７１０．１０１］、２０１３年１１月１１日出願の米国特許仮出願第６１／９０２，７２３号［代理人整理番号４４２８７−７１０．１０３］、２０１３年５月１日出願の米国特許仮出願第６１／８１８，３８２号［代理人整理番号４４２８７−７１２．１０１］、２０１３年７月２９日出願の米国特許仮出願第６１／８５９，６６１号［代理人整理番号４４２８７−７１２．１０２］、２０１３年７月２６日出願、米国特許仮出願第６１／８５８，７６７号［代理人整理番号４４２８７−７１３．１０２］、２０１３年５月１０日出願、米国特許仮出願第６１／８２２，００２号［代理人整理番号４４２８７−７１７．１０１］、２０１３年６月７日出願、米国特許仮出願第６１／８３２，６９０号［代理人整理番号４４２８７−７１９．１０１］、２０１３年１１月１９日出願、米国特許仮出願第６１／９０６，２１１号［代理人整理番号４４２８７−７１９．１０２］、２０１３年１１月５日出願、米国特許仮出願第６１／９００，３１１号［代理人整理番号４４２８７−７１９．１０３］、２０１３年７月１２日出願、米国特許仮出願第６１／８４５，７１４号［代理人整理番号４４２８７−７２１．１０１］、２０１３年９月２７日出願、米国特許仮出願第６１／８８３，８０４号［代理人整理番号４４２８７−７２１．１０２］、２０１３年３月１４日出願、米国特許仮出願第６１／７８１，５９８号［代理人整理番号４４２８７−７２２．１０１］、２０１３年１１月４日出願、米国特許仮出願第６１／８９９，７１２号［代理人整理番号４４２８７−７２７．１０１］、２０１３年８月１４日出願、米国特許仮出願第６１／８６５，７４３号［代理人整理番号４４２８７−７３３．１０１］、２０１３年１１月２２日出願、米国特許仮出願第６１／９０７，７７７号［代理人整理番号４４２８７−７３４．１０１］、２０１３年１１月１２日出願、米国特許仮出願第６１／９０３，２３２号［代理人整理番号４４２８７−７５１．１０１］、２０１３年１１月１９日出願、米国特許仮出願第６１／９０６，３３５号［代理人整理番号４４２８７−７５２．１０１］、２０１３年１１月２１日出願、米国特許仮出願第６１／９０７，２１６号［代理人整理番号４４２８７−７５３．１０１］の恩典を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電気的に提出され、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、配列表を含む。２０１４年３月１０日作成のこのＡＳＣＩＩコピーは、４４２８７−７２２−６０１＿ＳｅｑＬｉｓｔと命名され、７，８２８，９６４バイトの大きさである。
【背景技術】
【０００３】
ゲノム操作とは、特定の核酸配列を欠失すること、挿入すること、変異すること、または置換することによってゲノムを変更することを指し得る。この変更は、遺伝子または位置特異的であり得る。ゲノム操作は、ヌクレアーゼを用いて核酸を切断し、それによって変更の部位を生成する。非ゲノム核酸の操作も企図される。ヌクレアーゼドメインを含むタンパク質は、核酸ターゲティング核酸との複合体を形成することによって標的核酸を結合および切断し得る。一例では、切断は、標的核酸中の二重鎖破壊をもたらし得る。核酸は、例えば、内因性の非相同末端連結（ＮＨＥＪ）機構によって修復され得る。さらなる例では、一片の核酸を挿入してもよい。核酸ターゲティング核酸および部位特異的ポリペプチドの改変は、ゲノム操作に用いられるべき新しい機能を導入し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様では、本開示は、操作された核酸ターゲティング核酸であって、核酸ターゲティング核酸のＰ−ドメインに変異を含む、核酸ターゲティング核酸を提供する。いくつかの実施形態では、Ｐ−ドメインは、核酸ターゲティング核酸のＣＲＩＳＰＲ反復とｔｒａｃｒＲＮＡ配列の間の二重鎖の最終の対のヌクレオチドの下流で開始する。いくつかの実施形態では、操作された核酸ターゲティング核酸は、リンカー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、ＣＲＩＳＰＲ反復およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結する。いくつかの実施形態では、操作された核酸ターゲティング核酸は、単離された操作された核酸ターゲティング核酸である。いくつかの実施形態では、操作された核酸ターゲティング核酸は、組換えの操作された核酸ターゲティング核酸である。いくつかの実施形態では、操作された核酸ターゲティング核酸は、標的核酸にハイブリダイズするように適合されている。いくつかの実施形態では、Ｐ−ドメインは、２つの隣接するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ−ドメインは、３つの隣接するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ−ドメインは、４つの隣接するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ−ドメインは、５つの隣接するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ−ドメインは、６つまたはそれ以上の隣接するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ−ドメインは、二重鎖の最後の対のヌクレオチドの１ヌクレオチド下流で開始する。いくつかの実施形態では、Ｐ−ドメインは、二重鎖の最後の対のヌクレオチドの２ヌクレオチド下流で開始する。いくつかの実施形態では、Ｐ−ドメインは、二重鎖の最後の対のヌクレオチドの３ヌクレオチド下流で開始する。いくつかの実施形態では、Ｐ−ドメインは、二重鎖の最後の対のヌクレオチドの４ヌクレオチド下流で開始する。いくつかの実施形態では、Ｐ−ドメインは、二重鎖の最後の対のヌクレオチドの５ヌクレオチド下流で開始する。いくつかの実施形態では、Ｐ−ドメインは、二重鎖の最後の対のヌクレオチドの６ヌクレオチドまたはそれ以上下流で開始する。いくつかの実施形態では、変異は、１つまたはそれ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上の変異は、互いに隣接する。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上の変異は、互いから隔てられる。いくつかの実施形態では、変異は、操作された核酸ターゲティング核酸が、異なるプロトスペーサー隣接モチーフに対してハイブリダイズすることを可能にするように適合されている。いくつかの実施形態では、異なるプロトスペーサー隣接モチーフは、少なくとも４ヌクレオチド含む。いくつかの実施形態では、異なるプロトスペーサー隣接モチーフは、少なくとも５ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、異なるプロトスペーサー隣接モチーフは、少なくとも６ヌクレオチド含む。いくつかの実施形態では、異なるプロトスペーサー隣接モチーフは、少なくとも７つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、異なるプロトスペーサー隣接モチーフは、２つの非隣接領域を含む。いくつかの実施形態では、異なるプロトスペーサー隣接モチーフは、３つの非隣接領域を含む。いくつかの実施形態では、変異は、操作された核酸ターゲティング核酸が、操作されていない核酸ターゲティング核酸よりも低い解離定数で標的核酸に結合することを可能にするように適合されている。いくつかの実施形態では、変異は、操作された核酸ターゲティング核酸が、操作されていない核酸ターゲティング核酸よりも大きい特異性で標的核酸に結合することを可能にするように適合されている。いくつかの実施形態では、変異は、操作されていない核酸ターゲティング核酸よりも、標的核酸中の非特異的配列に対する操作された核酸ターゲティング核酸の結合を低下するように適合されている。いくつかの実施形態では、操作された核酸ターゲティング核酸は、２つのヘアピンをさらに含む、ここで２つのヘアピンのうちの１つが、６つの連続するヌクレオチドにまたがってＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡに対して少なくとも５０％同一性を含むポリヌクレオチドと、６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％同一性を含むポリヌクレオチドの間の二重鎖を含み；ここで２つのヘアピンのうちの１つが第１のヘアピンのうちの３’であり、ここで第２のヘアピンが、操作されたＰ−ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２のヘアピンは、核酸が標的核酸と接触される場合、脱二重鎖するように適合されている。いくつかの実施形態では、Ｐ−ド
メインは、操作された核酸ターゲティング核酸の領域を含む第１のポリヌクレオチドとハイブリダイズし、標的核酸を含む第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、第１のまたは第２のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするように適合されている。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％同一性を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、６つの連続するヌクレオチドにおいてＣＲＩＳＰＲ反復に対して少なくとも５０％の同一性を含むポリヌクレオチドと、６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％の同一性を含むポリヌクレオチドの間の二重鎖の下流に位置する。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、プロトスペーサー隣接モチーフを含む。いくつかの実施形態では、操作された核酸ターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドに対して結合するように適合されている。いくつかの実施形態では、変異は、Ｐ−ドメインへの１つまたはそれ以上のヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、変異は、Ｐ−ドメインからの１つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、変異は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、核酸ターゲティング核酸が異なるプロトスペーサー隣接モチーフに対してハイブリダイズすることを可能にするように構成されている。いくつかの実施形態では、異なるプロトスペーサー隣接モチーフは、５’−ＮＧＧＮＧ−３’、５’−ＮＮＡＡＡＡＷ−３’、５’−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３’、５’−ＧＮＮＮＣＮＮＡ−３’、および５’−ＮＮＮＡＣＡ−３’、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるプロトスペーサー隣接モチーフを含む。いくつかの実施形態では、変異は、操作された核酸ターゲティング核酸が、操作されていない核酸ターゲティング核酸よりも低い解離定数で結合することを可能にするように構成されている。いくつかの実施形態では、変異は、操作された核酸ターゲティング核酸が、操作されていない核酸ターゲティング核酸よりも大きい特異性で結合することを可能にするように構成されている。いくつかの実施形態では、変異は、標的核酸中の非特異的配列に対する操作された核酸ターゲティング核酸の結合を、操作されていない核酸ターゲティング核酸よりも低下するように構成されている。
【０００５】
一態様では、本開示は、標的核酸を改変するための方法であって、標的核酸を、核酸ターゲティング核酸のＰ−ドメインに変異を含む操作された核酸ターゲティング核酸と接触させる工程と、標的核酸を改変する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、標的核酸中にドナーポリヌクレオチドを挿入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、改変する工程は、標的核酸を切断する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、改変する工程は、標的核酸の転写を改変する工程を含む。
【０００６】
一態様では、本開示は、核酸ターゲティング核酸のＰ−ドメインに変異を含む操作された核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
【０００７】
一態様では、本開示は、核酸ターゲティング核酸のＰ−ドメインに変異を含む操作された核酸ターゲティング核酸；および緩衝液を備えるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、部位特異的ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、ドナーポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、使用説明書をさらに備える。
【０００８】
一態様では、本開示は、核酸ターゲティング核酸のバルジ領域に変異を含む操作された核酸ターゲティング核酸を提供する。いくつかの実施形態では、バルジは、核酸ターゲティング核酸のＣＲＩＳＰＲ反復とｔｒａｃｒＲＮＡ配列の間の二重鎖内に位置する。いくつかの実施形態では、操作された核酸ターゲティング核酸は、リンカー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、ＣＲＩＳＰＲ反復およびｔｒａｃｒＲＮＡ
配列を連結する。いくつかの実施形態では、操作された核酸ターゲティング核酸は、単離された操作された核酸ターゲティング核酸である。いくつかの実施形態では、操作された核酸ターゲティング核酸は、組換えの操作された核酸ターゲティング核酸である。いくつかの実施形態では、バルジは、少なくとも１つの不対のヌクレオチドをＣＲＩＳＰＲ反復上に、および１つの不対のヌクレオチドをｔｒａｃｒＲＮＡ配列上に含む。いくつかの実施形態では、バルジは、少なくとも１つの不対のヌクレオチドをＣＲＩＳＰＲ反復上に、および少なくとも２つの不対のヌクレオチドをｔｒａｃｒＲＮＡ配列上に含む。いくつかの実施形態では、バルジは、少なくとも１つの不対のヌクレオチドをＣＲＩＳＰＲ反復上に、および少なくとも３つの不対のヌクレオチドをｔｒａｃｒＲＮＡ配列上に含む。いくつかの実施形態では、バルジは、少なくとも１つの不対のヌクレオチドをＣＲＩＳＰＲ反復上に、および少なくとも４つの不対のヌクレオチドをｔｒａｃｒＲＮＡ配列上に含む。いくつかの実施形態では、バルジは、少なくとも１つの不対のヌクレオチドをＣＲＩＳＰＲ反復上に、および少なくとも５つの不対のヌクレオチドをｔｒａｃｒＲＮＡ配列上に含む。いくつかの実施形態では、バルジは、少なくとも２つの不対のヌクレオチドをＣＲＩＳＰＲ反復上に、および１つの不対のヌクレオチドをｔｒａｃｒＲＮＡ配列上に含む。いくつかの実施形態では、バルジは、少なくとも３つの不対のヌクレオチドをＣＲＩＳＰＲ反復上に、および少なくとも２つの不対のヌクレオチドをｔｒａｃｒＲＮＡ配列上に含む。いくつかの実施形態では、バルジは、少なくとも４つの不対のヌクレオチドをＣＲＩＳＰＲ反復上に、および少なくとも３つの不対のヌクレオチドをｔｒａｃｒＲＮＡ配列上に含む。いくつかの実施形態では、バルジは、少なくとも５つの不対のヌクレオチドをＣＲＩＳＰＲ反復上に、および少なくとも４つの不対のヌクレオチドをｔｒａｃｒＲＮＡ配列上に含む。いくつかの実施形態では、バルジは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列上の少なくとも１つのヌクレオチドとの不安定な対を形成するように適合されている、ＣＲＩＳＰＲ反復上の少なくとも１つのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、変異は、１つまたはそれ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上の変異は互いに隣接される。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上の変異は、互いから隔てられる。いくつかの実施形態では、変異は、操作された核酸ターゲティング核酸が、異なる部位特異的ポリペプチドに結合することを可能にするように適合されている。いくつかの実施形態では、異なる部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９の相同体である。いくつかの実施形態では、異なる部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９の変異されたバージョンである。いくつかの実施形態では、異なる部位特異的ポリペプチドは、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン、およびＨＮＨヌクレアーゼドメイン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるヌクレアーゼドメイン中でＣａｓ９に対して１０％のアミノ酸配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、変異は、操作された核酸ターゲティング核酸が異なるプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズすることを可能にするように適合されている。いくつかの実施形態では、変異は、操作された核酸ターゲティング核酸が、部位特異的ポリペプチドに対して、操作されていない核酸ターゲティング核酸よりも低い解離定数で結合することを可能にするように適合されている。いくつかの実施形態では、変異は、操作された核酸ターゲティング核酸が、部位特異的ポリペプチドに対して、操作されていない核酸ターゲティング核酸よりも大きい特異性で結合することを可能にするように適合されている。いくつかの実施形態では、変異は、操作された核酸ターゲティング核酸が部位特異的ポリペプチドを指向して、標的核酸を操作されていない核酸ターゲティング核酸よりも大きい特異性で切断することを可能にするように適合されている。いくつかの実施形態では、変異は、操作されていない核酸ターゲティング核酸よりも、操作された核酸ターゲティング核酸の標的核酸中の非特異的配列に対する結合を低下するように適合されている。いくつかの実施形態では、操作された核酸ターゲティング核酸は、標的核酸に対してハイブリダイズするように適合されている。いくつかの実施形態では、変異は、バルジへの１つまたはそれ以上のヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、変異は、バルジからの１つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、変異は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの変異を含む。いくつかの実施形態で
は、変異は、操作された核酸ターゲティング核酸が、操作されていない核酸ターゲティング核酸と比較して、異なるプロトスペーサー隣接モチーフに対してハイブリダイズすることを可能にするように構成されている。いくつかの実施形態では、変異は、操作された核酸ターゲティング核酸が、操作されていない核酸ターゲティング核酸よりも低い解離定数で部位特異的ポリペプチドに対して結合することを可能にするように構成されている。いくつかの実施形態では、変異は、操作された核酸ターゲティング核酸が、操作されていない核酸ターゲティング核酸よりも大きい特異性で部位特異的ポリペプチドに対して結合することを可能にするように構成されている。いくつかの実施形態では、変異は、標的核酸中の非特異的配列に対する操作された核酸ターゲティング核酸の結合を、操作されていない核酸ターゲティング核酸よりも低減するように構成されている。
【０００９】
一態様では、本開示は、標的核酸を改変するための方法であって、標的核酸を、核酸ターゲティング核酸のバルジ領域に変異を含む操作された核酸ターゲティング核酸と接触させる工程と；標的核酸を改変する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ドナーポリヌクレオチドを標的核酸に挿入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、改変する工程は、標的核酸を切断する工程を含む。いくつかの実施形態では、改変する工程は、標的核酸の転写を改変する工程を含む。
【００１０】
一態様では、本開示は、核酸ターゲティング核酸のバルジ領域に変異を含む操作された核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター；および標的核酸を改変する工程を提供する。
【００１１】
一態様では、本開示は、核酸ターゲティング核酸のバルジ領域に変異を含む操作された核酸ターゲティング核酸および標的核酸を改変する工程；および緩衝液を備えるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、部位特異的ポリペプチドをさらに備える。いくつかの実施形態では、キットは、ドナーポリヌクレオチドをさらに備える。いくつかの実施形態では、キットは使用説明書をさらに備える。
【００１２】
一態様では、本開示は、ドナーポリヌクレオチドをタグ付けした細胞を生成するための方法であって、部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む複合体を用いて細胞中で標的核酸を切断する工程と、ドナーポリヌクレオチドを切断された標的核酸中に挿入する工程と、ドナーポリヌクレオチドを担持する細胞を増殖する工程と、ドナー−ポリヌクレオチドをタグ付けした細胞の起源を決定する工程と含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。いくつかの実施形態では、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。いくつかの実施形態では、方法は、インサイチュで行われる。いくつかの実施形態では、増殖する工程は、細胞のある集団を生成する。いくつかの実施形態では、増殖する工程は、細胞株を生じる。いくつかの実施形態では、方法は、細胞中で核酸の核酸配列を決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、細胞の起源を決定する。いくつかの実施形態では、決定する工程は、細胞の遺伝子型を決定する工程を含む。いくつかの実施形態では、増殖する工程は、細胞を分化する工程を含む。いくつかの実施形態では、増殖する工程は、細胞を脱分化する工程を含む。いくつかの実施形態では、増殖する工程は、細胞を分化する工程、次いで細胞を脱分化する工程を含む。いくつかの実施形態では、増殖する工程は、細胞を継代する工程を含む。いくつかの実施形態では、増殖する工程は、細胞が分裂することを誘導する工程を含む。いくつかの実施形態では、増殖する工程は、細胞が細胞周期に入るように誘導する工程を含む。いくつかの実施形態では、増殖する工程は、転移を形成する細胞を含む。いくつかの実施形態では、増殖する工程は、多能性細胞を分化した細胞に分化する工程を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、分化した細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、脱分化した細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、真
核生物細胞株である。いくつかの実施形態では、細胞は、初代細胞株である。いくつかの実施形態では、細胞は、患者由来の細胞株である。いくつかの実施形態では、方法は、生物体へ細胞を移植する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、生物体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、生物体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、生物体は、ヒト、イヌ、ラット、マウス、ニワトリ、魚、ネコ、植物および霊長類からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、細胞を選択する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、１つの細胞状態で発現される標的核酸に挿入される。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、複数の細胞型で発現される標的核酸中に挿入される。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、多能性状態で発現される標的核酸中に挿入される。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、分化した状態で発現される標的核酸に挿入される。
【００１３】
一態様では、本開示は、クローンとして増殖された細胞株を作成するための方法であって、細胞中に、部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む複合体を導入する工程と、複合体を標的核酸に接触させる工程と、標的核酸を切断する工程であって、切断は複合体によって行われる、工程と、それによって切断された標的核酸を生成する工程と、ドナーポリヌクレオチドを切断された標的核酸に挿入する工程と、細胞を増殖する工程であって、増殖する工程によってクローンとして増殖された細胞株が生じる、工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、２９３−Ｔ細胞、褐色細胞腫、神経芽細胞腫線維芽細胞、横紋筋肉腫、後根神経節細胞、ＮＳＯ細胞、ＣＶ−Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋｌ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、Ｃ１２７１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１７１）、Ｌ細胞、ＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬｌ５７３）およびＰＣ１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７２１）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８）、ＲＢＬ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１３７８）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２６６）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４）、ＳＪ−ＲＨ３０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０６１）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６５）、ＮＤ７／２３（ＥＣＡＣＣ  ９２０９０９０３）、ＣＨＯ（ＥＣＡＣＣ  ８５０５０３０２）、Ｖｅｒａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８１）、Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  ３７）、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２４３）、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２）、Ｐｅｒ．Ｃｏ、Ｈｕｖｅｃ（ＡＴＣＣヒト初代ＰＣＳ１００−０１０、マウスＣＲＬ２５１４、ＣＲＬ２５１５、ＣＲＬ２５１６）、ＨｕＨ−７Ｄ１２（ＥＣＡＣＣ０１０４２７１２）、２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０８５２）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１８５）、ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１８６）、ＭＣＦ−７（ＡＴＣ  ＨＴＢ−２２）、Ｕ−２  ＯＳ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−９６）、およびＴ８４（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２４８）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は分化した細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は多能性細胞である。
【００１４】
一態様では、本開示は、多重の細胞型解析のための方法であって、部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む複合体を用いて２つまたはそれ以上の細胞中で少なくとも１つの標的核酸を切断して、２つの切断された標的核酸を作成する工程、異なるドナーポリヌクレオチドを各々の切断された標的核酸に挿入する工程、および２つまたはそれ以上の細胞を分析する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、分析する工程は、２つまたはそれ以上の細胞を同時に分析する工程を含む。いくつかの実施形態では、分析する工程は、標的核酸の配列を決定する工程を含む。いくつかの実施形態では、分析する工程は、２つまたはそれ以上の細胞を比較する工程を含む。いくつかの実施形態では、分析する工程は、２つまたはそれ以上の細胞の遺伝子型を決定する工程を含む
。いくつかの実施形態では、細胞は分化した細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は脱分化した細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は真核生物細胞株である。いくつかの実施形態では、細胞は初代細胞株である。いくつかの実施形態では、細胞は、患者由来の細胞株である。いくつかの実施形態では、複数のドナーポリヌクレオチドは、細胞中の複数の切断された標的核酸に挿入される。
【００１５】
一態様では、本開示は、３’ハイブリダイズ伸長を含む操作された核酸ターゲティング核酸と、３’ハイブリダイズ伸長に対してハイブリダイズされるドナーポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、３’ハイブリダイズ伸長は、ドナーポリヌクレオチドの５’から少なくとも５ヌクレオチドにハイブリダイズするように適合されている。いくつかの実施形態では、３’ハイブリダイズ伸長は、ドナーポリヌクレオチド中の少なくとも５つの隣接するヌクレオチドに対してハイブリダイズするように適合されている。いくつかの実施形態では、３’ハイブリダイズ伸長は、ドナーポリヌクレオチドの全てに対してハイブリダイズするように適合されている。いくつかの実施形態では、３’ハイブリダイズ伸長は、逆転写鋳型を含む。いくつかの実施形態では、逆転写鋳型は、逆転写酵素によって逆転写されるように適合されている。いくつかの実施形態では、組成物は、逆転写されたＤＮＡポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、逆転写されたＤＮＡポリヌクレオチドは、逆転写鋳型にハイブリダイズするように適合されている。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドはＤＮＡである。いくつかの実施形態では、３’ハイブリダイズ伸長はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、操作された核酸ターゲティング核酸は、単離された操作された核酸ターゲティング核酸である。いくつかの実施形態では、操作された核酸ターゲティング核酸は、組換えの操作された核酸ターゲティング核酸である。
【００１６】
一態様では、本開示は、標的核酸中にドナーポリヌクレオチドを導入するための方法であって、標的核酸を、３’ハイブリダイズ伸長を含む操作された核酸ターゲティング核酸およびドナーポリヌクレオチドを含む組成物と接触させる工程であって、ドナーポリヌクレオチドが３’ハイブリダイズ伸長にハイブリダイズされる工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、標的核酸を切断して、切断された標的核酸を生成する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、切断する工程は、部位特異的ポリペプチドによって行われる。いくつかの実施形態では、方法は、ドナーポリヌクレオチドを切断された標的核酸に挿入する工程をさらに含む。
【００１７】
一態様では、本開示は、エフェクタータンパク質と、ｃｒＲＮＡに対して６つの連続するヌクレオチドにおいて少なくとも５０％の配列同一性、ｔｒａｃｒＲＮＡに対して６つの連続するヌクレオチドにおいて少なくとも５０％の配列同一性；および非天然配列を含み、エフェクタータンパク質に結合するように適合されている核酸とを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１０％のアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドをさらに含み、ここで核酸は、ポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して、ヌクレアーゼドメイン中で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、核酸は、リンカー配列をさらに含み、ここでリンカー配列は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列および６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列を連結する。いくつかの実施形態では、非天然配列は、５’末端および３’末端、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸の一部に位置する。いくつかの実施形態では、核酸は、２つの核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、単一の連続の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、非天然配列は
、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ結合タンパク質結合配列を含む。いくつかの実施形態では、非天然配列は、Ｃａｓ５ＲＮＡ結合配列、Ｃａｓ６ＲＮＡ結合配列、およびＣｓｙ４ＲＮＡ結合配列、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される結合配列を含む。いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、およびＣｓｙ４、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質に対して少なくとも１５％のアミノ酸配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質のＲＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、およびＣｓｙ４、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質のＲＮＡ結合ドメインに対して少なくとも１５％のアミノ酸配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、およびＣｓｙ４、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質は、１つまたはそれ以上の非天然配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、非天然配列は、エフェクタータンパク質に対して酵素活性を付与する。いくつかの実施形態では、酵素活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチル化活性、脱アセチル化活性、ユビキチン化活性、脱ユビキチン化活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、トランスポーゼース活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性またはグリコシラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、リモデリング活性、プロテアーゼ活性、酸化還元酵素活性、トランスフェラーゼ活性、加水分解酵素活性、リアーゼ活性、イソメラーゼ活性、シンターゼ活性、シンテターゼ活性、および脱ミリストイル化活性、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質は、ＲＮＡ結合タンパク質およびＤＮＡ結合タンパク質を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ドナーポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡ結合タンパク質に直接結合され、かつここでＲＮＡ結合タンパク質は、核酸ターゲティング核酸に結合される。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドの５’末端は、ＤＮＡ結合タンパク質に結合される。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドの３’末端は、ＤＮＡ結合タンパク質に結合される。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドの少なくとも５ヌクレオチドが、ＤＮＡ結合タンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、核酸は単離された核酸である。いく��かの実施形態では、核酸は組換えの核酸である。
【００１８】
一態様では、本開示は、ドナーポリヌクレオチドを標的核酸に導入するための方法であって、標的核酸を、部位特異的ポリペプチドとエフェクタータンパク質および核酸を含む組成物とを含む複合体と接触させる工程であって、核酸は、６つの連続するヌクレオチドについてｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性、６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性；および非天然配列を含み、核酸は、エフェクタータンパク質に結合するように適合されている、工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、標的核酸を切断する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、切断する工程は、部位特異的ポリペプチドによって行われる。いくつかの実施形態では、方法は、ドナーポリヌクレオチドを標的核酸に挿入する工程をさらに含む。
【００１９】
一態様では、本開示は、標的核酸を調整するための方法であって、標的核酸を１つまたはそれ以上の複合体と接触させる工程であって、各々の複合体が部位特異的ポリペプチド、ならびにエフェクタータンパク質と、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡ
に対して少なくとも５０％の配列同一性、６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性；および非天然配列を含み、エフェクタータンパク質に結合するように適合されている核酸と含む組成物を含む、工程、ならびに標的核酸を調整する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１０％のアミノ酸配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、調整する工程は、エフェクタータンパク質によって行われる。いくつかの実施形態では、調整する工程は、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチル化活性、脱アセチル化活性、ユビキチン化活性、脱ユビキチン化活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、トランスポーゼース活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性またはグリコシラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、リモデリング活性、プロテアーゼ活性、酸化還元酵素活性、トランスフェラーゼ活性、加水分解酵素活性、リアーゼ活性、イソメラーゼ活性、シンターゼ活性、シンテターゼ活性、および脱ミリストイル化活性、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される活性を含む。いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質は１つまたはそれ以上のエフェクタータンパク質を含む。
【００２０】
一態様では、本開示は、２つの複合体が互いに対して近位であるか否かを決定するための方法であって、第１の標的核酸を第１の複合体と接触させる工程であって、第１の複合体は、第１の部位特異的ポリペプチド、第１の改変された核酸ターゲティング核酸、および第１のエフェクタータンパク質を含み、ここでエフェクタータンパク質は、改変された核酸ターゲティング核酸に結合するように適合されており、ここで第１のエフェクタータンパク質は、分割システムの第１の部分を含む非天然配列を含む、工程と、第２の標的核酸を第２の複合体と接触させる工程であって、第２の複合体は、第２の部位特異的ポリペプチド、第２の改変された核酸ターゲティング核酸、および第２のエフェクタータンパク質を含み、ここでエフェクタータンパク質は、改変された核酸ターゲティング核酸に結合するように適合されており、ここで第２のエフェクタータンパク質は、分割システムの第２の部分を含む非天然配列を含む、工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、第１の標的核酸および第２の標的核酸は、同じポリヌクレオチドポリマー上にある。いくつかの実施形態では、分割システムは、個々には活性ではないが、複合体に形成された場合、活性なタンパク質複合体を生じる２つまたはそれ以上のタンパク質フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、方法は、第１の部分と第２の部分の間の相互作用を検出する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、検出する工程は、第１のおよび第２の複合体が互いに近位であることを示す。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、標的核酸を切断できないように適合されている。いくつかの実施形態では、検出する工程は、遺伝子移動事象の発生を決定する工程を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子移動事象は、転座を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子移動事象の前に、分割システムの２つの部分は、相互作用しない。いくつかの実施形態では、遺伝子移動事象の後に、分割システムの２つの部分は、相互作用する。いくつかの実施形態では、遺伝子移動事象は、ＢＣＲ遺伝子とＡｂｌ遺伝子の間の転座である。いくつかの実施形態では、その相互作用は、分割システムを活性化する。いくつかの実施形態では、相互作用は、複合体によって結合される標的核酸がすぐ近くであることを示す。いくつかの実施形態では、分割システムは、分割ＧＦＰシステム、分割ユビキチンシステム、分割転写因子システム、および分割親和性タグシステム、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、分割システムは、分割ＧＦＰシステムを含む。いくつかの実施形態では、検出する工程は、遺伝子型を示す。いくつかの実施形態では、方法は、遺伝子型に基づいて疾患の処置の経過を決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態
では、方法は、疾患を処置する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、処置する工程は、薬物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、処置する工程は、核酸ターゲティング核酸および部位特異的ポリペプチドを含む複合体を投与することを含み、複合体は、疾患に関与する遺伝子エレメントを改変することができる。いくつかの実施形態では、改変する工程は、核酸配列を遺伝子エレメントに追加する工程、遺伝子エレメントにおける核酸配列を置き換える工程、および遺伝子エレメントから核酸配列を欠失させる工程、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、介護者から患者に遺伝子型を連絡する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、連絡する工程は、記憶メモリシステムから遠隔のコンピュータへ連絡する工程を含む。いくつかの実施形態では、検出する工程は疾患を診断する。いくつかの実施形態では、方法は、診断を介護者から患者に連絡する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、検出する工程は、一塩基多型（ＳＮＰ）の存在を示す。いくつかの実施形態では、方法は、遺伝子移動事象の発生を介護者から患者へ連絡する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、連絡する工程は、記憶メモリシステムから遠隔のコンピュータへ連絡する工程を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９に対して少なくとも２０％のアミノ酸配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して、ヌクレアーゼドメイン中で少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、改変された核酸ターゲティング核酸は、非天然配列を含む。いくつかの実施形態では、非天然配列は、５’末端、および３’末端、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される改変された核酸ターゲティング核酸の一部に配置される。いくつかの実施形態では、改変された核酸ターゲティング核酸は、２つの核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、６つの連続するヌクレオチドにおいてＣＲＩＳＰＲ反復に対して少なくとも５０％の同一性を含む第１の部分、および６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％の同一性を含む第２の部分を含む単一の連続の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、第１の部分および第２の部分は、リンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、非天然配列は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ結合タンパク質結合配列を含む。いくつかの実施形態では、非天然配列は、Ｃａｓ５  ＲＮＡ結合配列、Ｃａｓ６  ＲＮＡ結合配列、およびＣｓｙ４  ＲＮＡ結合配列、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される結合配列を含む。いくつかの実施形態では、改変された核酸ターゲティング核酸は、エフェクタータンパク質に結合するように適合されている。いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ結合タ��パク質である。いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、およびＣｓｙ４、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質に対して少なくとも１５％のアミノ酸配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質のＲＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、およびＣｓｙ４、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質のＲＮＡ結合ドメインに対して少なくとも１５％のアミノ酸配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、およびＣｓｙ４、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、相互作用は、親和性タグを形成する工程を含む。いくつかの実施形態では、検出する工程は、親和性タグを捕捉する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、第１のおよび第２の複合体に対して結合した核酸を配列決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、捕捉の前に核酸を断片化する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、相互作用は、活性化されたシステムを形成する。いくつかの実施形態では、方法は、第１の標的核酸または第２の標的核酸の転写を変更する工程をさらに含み、ここで変更は、活性化されたシステムによって行われる。いくつかの実
施形態では、第２の標的核酸は、第１の標的核酸には結合されない。いくつかの実施形態では、第２の標的核酸の転写を変更する工程は、トランスで行われる。いくつかの実施形態では、第１の標的核酸の転写を変更する工程は、シスで行われる。いくつかの実施形態では、第１のまたは第２の標的核酸は、内因性の核酸、および外因性の核酸、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、変更する工程は、第１のまたは第２の標的核酸の転写を増大する工程を含む。いくつかの実施形態では、第１のまたは第２の標的核酸は、細胞死を生じる１つまたはそれ以上の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のまたは第２の標的核酸は、細胞溶解誘導性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のまたは第２の標的核酸は、免疫細胞補充性抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のまたは第２の標的核酸は、アポトーシスに関与する１つまたはそれ以上の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、アポトーシスに関与する１つまたはそれ以上の遺伝子は、カスパーゼを含む。いくつかの実施形態では、アポトーシスに関与する１つまたはそれ以上の遺伝子は、サイトカインを含む。いくつかの実施形態では、アポトーシスに関与する１つまたはそれ以上の遺伝子は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１）、ＴＮＦ受容体２（ＴＮＦＲ２）、Ｆａｓ受容体、ＦａｓＬ、カスパーゼ−８、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９、カスパーゼ−３、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、Ｂｃｌ−２、およびアポトーシス誘導性因子（ＡＩＦ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のまたは第２の標的核酸は、１つまたはそれ以上の核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上の核酸ターゲティング核酸は、複数の標的核酸を標的とする。いくつかの実施形態では、検出する工程は、遺伝的データを生成する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、遺伝的データを記憶メモリシステムから遠隔のコンピュータへ連絡する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝的データは、遺伝子型を示す。いくつかの実施形態では、遺伝的データは、遺伝子移動事象の発生を示す。いくつかの実施形態では、遺伝的データは遺伝子の空間的位置を示す。
【００２１】
一態様では、本開示は、部位特異的ポリペプチド、非天然配列を含む改変された核酸ターゲティング核酸、非天然配列に結合するように適合されているエフェクタータンパク質、および緩衝液を備えるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、使用説明書をさらに備える。
【００２２】
一態様では、本開示は、改変された核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、改変された核酸ターゲティング核酸は非天然配列を含む、前記ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターである。
【００２３】
一態様では、本開示は、改変された核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、改変された核酸ターゲティング核酸がエフェクタータンパク質および部位特異的ポリペプチドに結合するように構成された配列を含む、前記ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、プロモーターに対して作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターである。
【００２４】
一態様では、本開示は、非天然配列を含む改変された核酸ターゲティング核酸、部位特異的ポリペプチド、およびエフェクタータンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、プロモーターに対して作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、プロモーターは誘導
性プロモーターである。
【００２５】
一態様では、本開示は、エフェクタータンパク質と、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性、６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性；および非天然配列を含み、エフェクタータンパク質に結合するように適合されている核酸とを含む組成物を含む遺伝子的に改変された細胞を提供する。
【００２６】
一態様では、本開示は、改変された核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む遺伝的に改変された細胞であって、改変された核酸ターゲティング核酸が非天然配列を含む、細胞を提供する。
【００２７】
一態様では、本開示は、改変された核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む遺伝的に改変された細胞であって、改変された核酸ターゲティング核酸は、エフェクタータンパク質、および部位特異的ポリペプチドに結合するように構成されている配列を含む、細胞を提供する。
【００２８】
一態様では、本開示は、非天然配列を含む改変された核酸ターゲティング核酸、部位特異的ポリペプチド、およびエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む遺伝的に改変された細胞を提供する。
【００２９】
一態様では、本開示は、非天然配列を含む改変された核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター、および緩衝液を備えるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、使用説明書をさらに備える。
【００３０】
一態様では、本開示は、改変された核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、改変された核酸ターゲティング核酸は、エフェクタータンパク質、および部位特異的ポリペプチドに結合するように構成されている配列を含む、ベクター、ならびに緩衝液を備えるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは使用説明書をさらに備える。
【００３１】
一態様では、本開示は、非天然配列を含む改変された核酸ターゲティング核酸、部位特異的ポリペプチド、およびエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター、ならびに緩衝液を備えるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは使用説明書をさらに備える。
【００３２】
一態様では、本開示は、多重化遺伝子ターゲティング剤を含む組成物であって、多重化遺伝子ターゲティング剤は、１つまたはそれ以上の核酸モジュールを含み、ここで核酸モジュールは非天然配列を含み、かつここで核酸モジュールは、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１０％のアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドに結合するように構成され、ここで核酸モジュールは、標的核酸に対してハイブリダイズするように構成されている、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、核酸モジュールは、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む第１の配列、および６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む第２の配列を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、第１のおよび第２の配列を連結するリンカー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上の核酸モジュールは、１つまたはそれ以上の標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上の核酸モジュールは、１つまたはそれ以上の核酸モジュールのスペーサー領域中で、少なくとも１つのヌクレオチドずつ異なる。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上の核酸モジュールは、ＲＮＡで
ある。いくつかの実施形態では、多重化遺伝子ターゲティング剤は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、非天然配列は、リボザイムを含む。いくつかの実施形態では、非天然配列は、エンドリボヌクレアーゼ結合配列を含む。いくつかの実施形態では、エンドリボヌクレアーゼ結合配列は、核酸モジュールの５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、エンドリボヌクレアーゼ結合配列は、核酸モジュールの３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、エンドリボヌクレアーゼ結合配列は、ＣＲＩＳＰＲエンドリボヌクレアーゼによって結合されるように適合されている。いくつかの実施形態では、エンドリボヌクレアーゼ結合配列は、ＲＡＭＰドメインを含むエンドリボヌクレアーゼによって結合されるように適合されている。いくつかの実施形態では、エンドリボヌクレアーゼ結合配列は、Ｃａｓ５スーパーファミリーメンバーエンドリボヌクレアーゼ、およびＣａｓ６スーパーファミリーメンバーエンドリボヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるエンドリボヌクレアーゼによって結合されるように適合されている。いくつかの実施形態では、エンドリボヌクレアーゼ結合配列は、Ｃｓｙ４、Ｃａｓ５、およびＣａｓ６からなる群から選択されるタンパク質に対して少なくとも１５％のアミノ酸配列同一性を含むエンドリボヌクレアーゼによって結合されるように適合されている。いくつかの実施形態では、エンドリボヌクレアーゼ結合配列は、Ｃｓｙ４、Ｃａｓ５、およびＣａｓ６からなる群から選択されるタンパク質のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１５％のアミノ酸配列同一性を含むエンドリボヌクレアーゼによって結合されるように適合されている。いくつかの実施形態では、エンドリボヌクレアーゼ結合配列はヘアピンを含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、少なくとも４つの連続するヌクレオチドをステムループ構造中に含む。いくつかの実施形態では、エンドリボヌクレアーゼ結合配列は、
５’−ＧＵＵＣＡＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧＣＵＡＡＧＡＡＡ−３’；
５’−ＧＵＵＧＣＡＡＧＧＧＡＵＵＧＡＧＣＣＣＣＧＵＡＡＧＧＧＧＡＵＵＧＣＧＡＣ−３’；
５’−ＧＵＵＧＣＡＡＡＣＣＵＣＧＵＵＡＧＣＣＵＣＧＵＡＧＡＧＧＡＵＵＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＧＡＵＣＧＡＵＡＣＣＣＡＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＡＣＧＡＧＡＡＣ−３’；
５’−ＧＵＣＧＵＣＡＧＡＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＡＵＡＵＡＡＡＣＣＵＡＡＵＵＡＣＣＵＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＣＣＣＣＡＧＵＣＡＣＣＵＣＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＵＵＣＣＡＡＵＵＡＡＵＣＵＵＡＡＡＣＣＣＵＡＵＵＡＧＧＧＡＵＵＧＡＡＡＣ−３’。
５’−ＧＵＵＧＣＡＡＧＧＧＡＵＵＧＡＧＣＣＣＣＧＵＡＡＧＧＧＧＡＵＵＧＣＧＡＣ−３’；
５’−ＧＵＵＧＣＡＡＡＣＣＵＣＧＵＵＡＧＣＣＵＣＧＵＡＧＡＧＧＡＵＵＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＧＡＵＣＧＡＵＡＣＣＣＡＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＡＣＧＡＧＡＡＣ−３’；
５’−ＧＵＣＧＵＣＡＧＡＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＡＵＡＵＡＡＡＣＣＵＡＡＵＵＡＣＣＵＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＣＣＣＣＡＧＵＣＡＣＣＵＣＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＵＵＣＣＡＡＵＵＡＡＵＣＵＵＡＡＡＣＣＣＵＡＵＵＡＧＧＧＡＵＵＧＡＡＡＣ−３’，
５’−ＧＵＣＧＣＣＣＣＣＣＡＣＧＣＧＧＧＧＧＣＧＵＧＧＡＵＵＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＣＣＡＧＣＣＧＣＣＵＵＣＧＧＧＣＧＧＣＵＧＵＧＵＧＵＵＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＵＣＧＣＡＣＵＣＵＡＣＡＵＧＡＧＵＧＣＧＵＧＧＡＵＵＧＡＡＡＵ−３’；
５’−ＵＧＵＣＧＣＡＣＣＵＵＡＵＡＵＡＧＧＵＧＣＧＵＧＧＡＵＵＧＡＡＡＵ−３’；および
５’−ＧＵＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＡＵＧＧＧＧＣＧＣＧＵＧＧＡＵＵＧＡＡＡ−３’、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列に対して少なくとも６０％同一性を含む。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上の核酸モジュールは、異なるエンドリボヌクレアーゼによって結合されるように適合されている。いくつかの実施形態では、多重化遺伝子ターゲティング剤は、単離された多重化遺伝子ターゲティング剤である。いくつかの実施形態では、多重化遺伝子ターゲティング剤は、組換えの多重化遺伝子ターゲティング剤である。
【００３３】
一態様では、本開示は、多重化遺伝子ターゲティング剤をコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、多重化遺伝子ターゲティング剤は、１つまたはそれ以上の核酸モジュールを含み、ここで核酸モジュールは、非天然配列を含み、かつここで核酸モジュールは、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１０％のアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドに対して結合するように構成されており、ここで核酸モジュールは、標的核酸に対してハイブリダイズするように構成されている、ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、プロモーターに対して作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。
【００３４】
一態様では、本開示は、多重化遺伝子ターゲティング剤を含む遺伝的に改変された細胞であって、多重化遺伝子ターゲティング剤は、１つまたはそれ以上の核酸モジュールを含み、ここで核酸モジュールは非天然配列を含み、ここで核酸モジュールは、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１０％のアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドに結合するように構成されており、ここで核酸モジュールは、標的核酸に対してハイブリダイズするように構成されている、細胞を提供する。
【００３５】
一態様では、本開示は、多重化遺伝子ターゲティング剤をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む遺伝的に改変された細胞であって、多重化遺伝子ターゲティング剤は１つまたはそれ以上の核酸モジュールを含み、ここで核酸モジュールは非天然配列を含み、ここで核酸モジュールは、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１０％のアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドに対して結合するように構成されており、ここで核酸モジュールは標的核酸に対してハイブリダイズするように構成されている、細胞を提供する。
【００３６】
一態様では、本開示は、多重化遺伝子ターゲティング剤であって、多重化遺伝子ターゲティング剤は１つまたはそれ以上の核酸モジュールを含み、ここで核酸モジュールは非天然配列を含み、ここで核酸モジュールはＣａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１０％のアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドに対して結合するように構成されており、ここで核酸モジュールは標的核酸に対してハイブリダイズするように構成されている多重化遺伝子ターゲティング剤と、緩衝液とを備えるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは使用説明書をさらに備える。
【００３７】
一態様では、本開示は、多重化遺伝子ターゲティング剤をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、ここで多重化遺伝子ターゲティング剤は１つまたはそれ以上の核酸モジュールを含み、ここで核酸モジュールは非天然配列を含み、かつ、ここで核酸モジュールはＣａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１０％のアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドに対して結合するように構成されており、ここで核酸モジュールは標的核酸に対してハイブリダイズするように構成されているベクターと、緩衝液と
を備えるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは使用説明書をさらに備える。
【００３８】
一態様では、本開示は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１０％のアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドに対して結合し、標的核酸にハイブリダイズする核酸を生成するための方法であって、多重化遺伝子ターゲティング剤を導入する工程であって、多重化遺伝子ターゲティング剤は１つまたはそれ以上の核酸モジュールを含み、ここで核酸モジュールは非天然配列を含み、ここで核酸モジュールはＣａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１０％のアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドに対して結合するように構成されており、ここで核酸モジュールは宿主細胞内の標的核酸に対してハイブリダイズするように構成されている、工程と、多重化遺伝子ターゲティング剤を１つまたはそれ以上の核酸モジュールにプロセシングする工程と、プロセシングした１つまたはそれ以上の核酸モジュールを１つまたはそれ以上の標的核酸に細胞中で接触させる工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、標的核酸を切断する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、標的核酸を改変する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、改変する工程は、標的核酸の転写を変更する工程を含む。いくつかの実施形態では、改変する工程は、ドナーポリヌクレオチドを標的核酸に挿入する工程を含む。
【００３９】
一態様では、本開示は、第１のヌクレアーゼドメイン、第２のヌクレアーゼドメイン、および挿入されたヌクレアーゼドメインを含む、改変された部位特異的ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１５％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、第１のヌクレアーゼドメインは、ＨＮＨドメイン、およびＲｕｖＣドメイン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２のヌクレアーゼドメインは、ＨＮＨドメイン、およびＲｕｖＣドメイン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレアーゼドメインは、ＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレアーゼドメインはＲｕｖＣドメインを含む。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレアーゼドメインは、第１のヌクレアーゼドメインに対してＮ末端である。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレアーゼドメインは、第２のヌクレアーゼドメインに対してＮ末端である。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレアーゼドメインは、第１のヌクレアーゼドメインに対してＣ末端である。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレアーゼドメインは、第２のヌクレアーゼドメインに対してＣ末端である。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレアーゼドメインは、第１のヌクレアーゼドメインに対して直列である。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレアーゼドメインは、第２のヌクレアーゼドメインに対して直列である。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレアーゼドメインは、第１のまたは第２のヌクレアーゼドメインとは異なる部位で標的核酸を切断するように適合されている。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中でＲＮＡを切断するように適合されている。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中でＤＮＡを切断するように適合されている。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレアーゼドメインは、標的核酸に対する改変された部位特異的ポリペプチドの結合の特異性を増大するように適合されている。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレアーゼドメインは、標的核酸に対する改変された部位特異的ポリペプチドの結合の強度を増大するように適合されている。
【００４０】
一態様では、本開示は、第１のヌクレアーゼドメイン、第２のヌクレアーゼドメイン、および挿入されたヌクレアーゼドメインを含む、改変された部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
【００４１】
一態様では、本開示は、第１のヌクレアーゼドメイン、第２のヌクレアーゼドメイン、および挿入されたヌクレアーゼドメインを含む改変された部位特異的ポリペプチドと、緩衝液とを備えるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは使用説明書をさらに備える。
【００４２】
一態様では、本開示は、改変された部位特異的ポリペプチドを含み、ここでポリペプチドが、野性型部位特異的ポリペプチドと比較して第２のプロトスペーサー隣接モチーフを標的とするように適合されるように改変されている組成物を提供する。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、アミノ酸付加、アミノ酸置換、アミノ酸交換、およびアミノ酸欠失、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される改変によって改変される。いくつかの実施形態では、改変された部位特異的ポリペプチドは、非天然配列を含む。いくつかの実施形態では、改変された部位特異的ポリペプチドは、第２のプロトスペーサー隣接モチーフを、野性型部位特異的ポリペプチドよりも大きい特異性で標的とするように適合されている。いくつかの実施形態では、改変された部位特異的ポリペプチドは、第２のプロトスペーサー隣接モチーフを、野性型部位特異的ポリペプチドと比較して低い解離定数で標的とするように適合されている。いくつかの実施形態では、改変された部位特異的ポリペプチドは、第２のプロトスペーサー隣接モチーフを、野性型部位特異的ポリペプチドと比較して高い解離定数で標的とするように適合されている。いくつかの実施形態では、第２のプロトスペーサー隣接モチーフは、５’−ＮＧＧＮＧ−３’、５’−ＮＮＡＡＡＡＷ−３’、５’−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３’、５’−ＧＮＮＮＣＮＮＡ−３’、および５’−ＮＮＮＡＣＡ−３’、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるプロトスペーサー隣接モチーフを含む。
【００４３】
一態様では、本開示は、改変された部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、ここでポリペプチドが、野性型部位特異的ポリペプチドと比較して第２のプロトスペーサー隣接モチーフを標的とするように適合されるように改変されている、ベクターを提供する。
【００４４】
一態様では、本開示は、野性型部位特異的ポリペプチドと比較して第２のプロトスペーサー隣接モチーフを標的とするように適合されているように改変されている改変された部位特異的ポリペプチドと、緩衝液とを備えるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは使用説明書をさらに備える。
【００４５】
一態様では、本開示は、改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物であって、ここでポリペプチドが、野性型部位特異的ポリペプチドと比較して第２の核酸ターゲティング核酸を標的とするように適合されているように改変されている、組成物を提供する。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、アミノ酸付加、アミノ酸置換、アミノ酸交換、およびアミノ酸欠失、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される改変によって改変されている。いくつかの実施形態では、改変された部位特異的ポリペプチドは、非天然配列を含む。いくつかの実施形態では、改変された部位特異的ポリペプチドは、第２の核酸ターゲティング核酸を、野性型部位特異的ポリペプチドよりも大きい特異性で標的とするように適合されている。いくつかの実施形態では、改変された部位特異的ポリペプチドは、第２の核酸ターゲティング核酸を、野性型部位特異的ポリペプチドと比較して低い解離定数で標的とするように適合されている。いくつかの実施形態では、改変された部位特異的ポリペプチドは、第２の核酸ターゲティング核酸を、野性型部位特異的ポリペプチドと比較して高い解離定数で標的とするように適合されている。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、第２の核酸ターゲティング核酸のｔｒａｃｒＲＮＡ部分を標的とする。
【００４６】
一態様では、本開示は、改変された部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、ここでポリペプチドが、第２の核酸ターゲティング核酸を、野性型部位特異的ポリペプチドと比較して標的とするように適合されているように改変されているベクターを提供する。
【００４７】
一態様では、本開示は、改変された部位特異的ポリペプチドであって、ここでポリペプチドが、第２の核酸ターゲティング核酸を野性型部位特異的ポリペプチドと比較して標的とするように適合されるように改変されているポリペプチドと、緩衝液とを備えるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは使用説明書をさらに備える。
【００４８】
一態様では、本開示は、配列番号８と比較して架橋らせん中に改変を含む改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、標的核酸を切断するように構成されている。
【００４９】
一態様では、本開示は、配列番号８と比較して高度に塩基性のパッチ中に改変を含む改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、標的核酸を切断するように構成されている。
【００５０】
一態様では、本開示は、配列番号８と比較してポリメラーゼ様ドメイン中に改変を含む改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、標的核酸を切断するように構成されている。
【００５１】
一態様では、本開示は、配列番号８と比較して、架橋らせん中の改変、高度に塩基性のパッチ、ヌクレアーゼドメイン、およびポリメラーゼドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物を提供する。
【００５２】
一態様では、本開示は、配列番号８と比較して、架橋らせん中の改変、高度に塩基性のパッチ、ヌクレアーゼドメイン、およびポリメラーゼドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む改変された部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
【００５３】
一態様では、本開示は、配列番号８と比較して、架橋らせん中の改変、高度に塩基性のパッチ、ヌクレアーゼドメイン、およびポリメラーゼドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む改変された部位特異的ポリペプチドと、緩衝液とを備えるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは使用説明書をさらに備える。いくつかの実施形態では、キットは核酸ターゲティング核酸をさらに備える。
【００５４】
一態様では、本開示は、配列番号８と比較して、架橋らせん中の改変、高度に塩基性のパッチ、ヌクレアーゼドメイン、およびポリメラーゼドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む改変された部位特異的ポリペプチドを含む遺伝的に改変された細胞を提供する。
【００５５】
一態様では、本開示は、ゲノム操作のための方法であって、標的核酸を複合体と接触させる工程であって、複合体は、改変された部位特異的ポリペプチドを含み、ポリペプチドは、配列番号８と比較して、架橋らせん中の改変、高度に塩基性のパッチ、ヌクレアーゼドメイン、およびポリメラーゼドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含み、および核酸ターゲティング核酸を含む工程と、標的核酸を改変する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、接触させる工程は、複合体を、標的核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフに接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、接触させる工程は、複合体を、未改変の部位特異的ポリペプチドと比較して、長い標的核酸配列に接触させ
る工程を含む。いくつかの実施形態では、改変する工程は、標的核酸を切断する工程を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸はＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、改変する工程は、ハイブリダイズしたＲＮＡおよびＤＮＡのＲＮＡ鎖を切断する工程を含む。いくつかの実施形態では、改変する工程は、ハイブリダイズしたＲＮＡおよびＤＮＡのＤＮＡ鎖を切断する工程を含む。いくつかの実施形態では、改変する工程は、標的核酸中に、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部、またはそれらの任意の組み合わせを挿入する工程を含む。いくつかの実施形態では、改変する工程は、標的核酸の転写活性を改変する工程を含む。いくつかの実施形態では、改変する工程は、標的核酸の１つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失を含む。
【００５６】
一態様では、本開示は、配列番号８と比較して改変されたヌクレアーゼドメインを含む改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、標的核酸を切断するように構成されている。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレアーゼドメインは、ＲｕｖＣドメインヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレアーゼドメインは、ＨＮＨヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレアーゼドメインは、ＨＮＨヌクレアーゼドメインの複製を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレアーゼドメインは、未改変の部位特異的ポリペプチドと比較して標的核酸についてアミノ酸配列の特異性を増大するように適合されている。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレアーゼドメインは、未改変の部位特異的ポリペプチドと比較して核酸ターゲティング核酸についてアミノ酸配列の特異性を増大するように適合されている。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレアーゼドメインは、アミノ酸追加、アミノ酸置換、アミノ酸交換、およびアミノ酸欠失、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される改変を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレアーゼドメインは、挿入された非天然配列を含む。いくつかの実施形態では、非天然配列は、改変された部位特異的ポリペプチドに対して酵素活性を付与する。いくつかの実施形態では、酵素活性は、ヌクレアーゼ活性、メチラーゼ活性、アセチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポーゼース活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性またはグリコシラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、リモデリング活性、プロテアーゼ活性、酸化還元酵素活性、トランスフェラーゼ活性、加水分解酵素活性、リアーゼ活性、イソメラーゼ活性、シンターゼ活性、シンテターゼ活性、および脱ミリストイル化活性、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、酵素活性は、標的核酸の転写を調整するように適合されている。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレアーゼドメインは、プロトスペーサー隣接モチーフ配列（ここへ未改変の部位特異的ポリペプチドが結合するように適合されている）とは異なるプロトスペーサー隣接モチーフ配列に対してアミノ酸配列の結合を可能にするように適合されている。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレアーゼドメインは、核酸ターゲティング核酸（ここへ未改変の部位特異的ポリペプチドが結合するように適合されている）とは異なる核酸ターゲティング核酸に対してアミノ酸配列の結合を可能にするように適合されている。いくつかの実施形態では、改変された部位特異的ポリペプチドは、未改変の部位特異的ポリペプチドよりも長い標的核酸配列に対して結合するように適合されている。いくつかの実施形態では、改変された部位特異的ポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡを切断するように適合されている。いくつかの実施形態では、改変された部位特異的ポリペプチドは、ハイブリダイズしたＲＮＡおよびＤＮＡのＲＮＡ鎖を切断するように適合
されている。いくつかの実施形態では、改変された部位特異的ポリペプチドは、ハイブリダイズしたＲＮＡおよびＤＮＡのＤＮＡ鎖を切断するように適合されている。いくつかの実施形態では、組成物は、改変された核酸ターゲティング核酸をさらに含み、ここで部位特異的ポリペプチドの改変は、改変された核酸ターゲティング核酸に対して部位特異的ポリペプチドが結合することを可能にするように適合されている。いくつかの実施形態では、改変された核酸ターゲティング核酸および改変された部位特異的ポリペプチドは、代償性の変異を含む。
【００５７】
一態様では、本開示は、配列決定するための標的核酸を濃縮するための方法であって、標的核酸と、核酸ターゲティング核酸および部位特異的ポリペプチドを含む複合体とを接触させる工程、複合体を用いて標的核酸を濃縮させる工程、ならびに標的核酸の配列を決定する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、増幅工程を含まない。いくつかの実施形態では、方法は、標的核酸の配列を解析する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、濃縮の前に標的核酸を断片化する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は、ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、方法は、核酸ターゲティング核酸が２つのＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、方法は、２つのＲＮＡ分子各々の一部は一緒にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、方法は、２つのＲＮＡ分子のうちの１つがＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して相同である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、２つのＲＮＡ分子のうちの１つは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃＲＮＡ配列は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して相同である。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃＲＮＡ配列は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は、ダブルガイド核酸である。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は、１つの連続のＲＮＡ分子を含み、ここで連続のＲＮＡ分子は、２つのドメインおよびリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、連続のＲＮＡ分子の各々の２つのドメインの一部は、一緒にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、連続のＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して相同である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、連続のＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃＲＮＡ配列は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して相同である。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃＲＮＡ配列は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は、シングルガイド核酸である。いくつかの実施形態では、接触させる工程は、核酸ターゲティング核酸の一部と標的核酸の一部とをハイブリダイズする工程を含む。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は、６〜２０ヌクレオチドを含む領域にまたがって標的核酸とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも２０％の相同性を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９に対して少なくとも６０％の相同性を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、操作されたヌクレアーゼドメインを含み、ここでヌクレアーゼドメインは、操作されていないヌクレアーゼドメインを含む部位特異的ポリペプチドと比較して低下したヌクレアーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、標的核酸中に一本鎖の破壊を導入する。いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼドメインは、保存されているアスパラギン酸の変異を含む。いくつかの
実施形態では、操作されたヌクレアーゼドメインは、Ｄ１０Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼドメインは、保存されたヒスチジンの変異を含む。いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼドメインは、Ｈ８４０Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、親和性タグを含む。いくつかの実施形態では、親和性タグは、部位特異的ポリペプチドのＮ末端、部位特異的ポリペプチドのＣ末端、表面アクセス可能領域、またはそれらの任意の組み合わせに位置する。いくつかの実施形態では、親和性タグは、ビオチン、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ６ｘ、Ｈｉｓ９ｘ、および蛍光タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は、核酸親和性タグを含む。いくつかの実施形態では、核酸親和性タグは、核酸ターゲティング核酸の５’末端、核酸ターゲティング核酸の３’末端、表面アクセス可能領域、またはそれらの任意の組み合わせに位置する。いくつかの実施形態では、核酸親和性タグは、低分子、蛍光標識、放射性標識、またはそれらの任意の組み合わせを含む群より選択される。いくつかの実施形態では、核酸親和性タグは、Ｃｓｙ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、またはそれらの任意の組み合わせに結合するように構成されている配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸親和性タグは、５’−ＧＵＵＣＡＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧＣＵＡＡＧＡＡＡ−３’に対して５０％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、方法は、疾患を診断する工程、および患者特異的な処置決定を行う工程、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、決定する工程は、遺伝子型を決定する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、記憶メモリシステムから遠隔のコンピュータへ配列を連絡する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、濃縮は、複合体の親和性タグを捕捉剤と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、捕捉剤は、抗体を含む。いくつかの実施形態では、捕捉剤は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、捕捉剤は、Ｃｓｙ４、Ｃａｓ５、およびＣａｓ６からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、捕捉剤は、イミダゾールの非存在下で酵素活性の低下を含む。いくつかの実施形態では、捕捉剤は、活性化可能な酵素学的ドメインを含み、ここで活性化可能な酵素学的ドメインは、イミダゾールと接触することによって活性化される。いくつかの実施形態では、捕捉剤は、Ｃａｓ６ファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、捕捉剤は親和性タグを含む。いくつかの実施形態では、捕捉剤は、ヌクレアーゼドメイン中に変異を含む、条件付きで酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、保存されたヒスチジンの変異。いくつかの実施形態では、変異は、Ｈ２９Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、複合体に対して結合される。いくつかの実施形態では、標的核酸は、複合体に結合されない切り出された核酸である。いくつかの実施形態では、複数の複合体は、複数の標的核酸に接触される。いくつかの実施形態では、複数の標的核酸は、少なくとも１ヌクレオチドずつ異なる。いくつかの実施形態では、複数の複合体は、少なくとも１ヌクレオチドずつ異なる複数の核酸ターゲティング核酸を含む。
【００５８】
一態様では、本開示は、核酸を切り出すための方法であって、標的核酸を、２つまたはそれ以上の複合体と接触させる工程であって、各々の複合体は部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む、工程、および標的核酸を切断する工程であって、切り出された標的核酸を生成する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、切断する工程は、部位特異的ポリペプチドのヌクレアーゼドメインによって行われる。いくつかの実施形態では、方法は、増幅を含まない。いくつかの実施形態では、方法は、切り出された標的核酸を濃縮する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、切り出された標的核酸を配列決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は２つのＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、各々の２つのＲＮＡ分子の一部は一緒にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、２つのＲＮＡ分子の１つは、ＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して相同である配列を含む。いくつかの実施形
態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、２つのＲＮＡ分子の１つは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃＲＮＡ配列は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して相同である。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃＲＮＡ配列は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸はダブルガイド核酸である。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は１つの連続のＲＮＡ分子を含み、ここで連続のＲＮＡ分子は、２つのドメインおよびリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、連続のＲＮＡ分子の各々の２つのドメインの一部は一緒にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、連続のＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して相同である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、連続のＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃＲＮＡ配列は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して相同である。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃＲＮＡ配列は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は、シングルガイド核酸である。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は、標的核酸とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は、ある領域（領域は、少なくとも６ヌクレオチドおよび多くとも２０ヌクレオチド含む）にまたがって標的核酸とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドはＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも２０％の相同性を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９に対して少なくとも６０％の相同性を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは親和性タグを含む。いくつかの実施形態では、親和性タグは、部位特異的ポリペプチドのＮ末端、部位特異的ポリペプチドのＣ末端、表面アクセス可能領域、またはそれらの任意の組み合わせに位置する。いくつかの実施形態では、親和性タグは、ビオチン、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ６ｘ、Ｈｉｓ９ｘ、および蛍光タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は、核酸親和性タグを含む。いくつかの実施形態では、核酸親和性タグは、核酸ターゲティング核酸の５’末端、核酸ターゲティング核酸の３’末端、表面アクセス可能領域、またはそれらの任意の組み合わせに位置する。いくつかの実施形態では、核酸親和性タグは、低分子、蛍光標識、放射性標識、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸親和性タグは、Ｃｓｙ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、またはそれらの任意の組み合わせに結合し得る配列である。いくつかの実施形態では、核酸親和性タグは、ＧＵＵＣＡＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧＣＵＡＡＧＡＡＡに対する５０％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２つまたはそれ以上の複合体に結合されない切り出された核酸である。いくつかの実施形態では、２つまたはそれ以上の複合体は、複数の標的核酸に接触させられる。いくつかの実施形態では、複数の標的核酸は、少なくとも１つのヌクレオチドずつ異なる。いくつかの実施形態では、２つまたはそれ以上の複合体は、少なくとも１つのヌクレオチドずつ異なる核酸ターゲティング核酸を含む。
【００５９】
一態様では、本開示は、標的核酸のライブラリーを生成するための方法であって、複数の標的核酸を、部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む複合体と接触させる工程と、複数の標的核酸を切断する工程と、複数の標的核酸を精製して、標的核酸のライブラリーを作成する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、標的核酸のライブラリーをスクリーニングする工程をさらに含む。
【００６０】
一態様では、本開示は、第１の複合体（第１の部位特異的ポリペプチドおよび第１の核酸ターゲティング核酸を含む）、第２の複合体（第２の部位特異的ポリペプチドおよび第２の核酸ターゲティング核酸を含む）を含み、ここで第１のおよび第２の核酸ターゲティング核酸が異なる組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、第１のまたは第２の複合体によって結合される標的核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の部位特異的ポリペプチドおよび第２の部位特異的ポリペプチドは同じである。いくつかの実施形態では、第１の部位特異的ポリペプチドおよび第２の部位特異的ポリペプチドは異なる。
【００６１】
一態様では、本開示は、少なくとも１ヌクレオチド異なる２つまたはそれ以上の核酸ターゲティング核酸、および部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
【００６２】
一態様では、本開示は、少なくとも１ヌクレオチド異なる２つまたはそれ以上の核酸ターゲティング核酸、および部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター含む遺伝的に改変された宿主細胞を提供する。
【００６３】
一態様では、本開示は、少なくとも１ヌクレオチド異なる２つまたはそれ以上の核酸ターゲティング核酸、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター、および適切な緩衝液を備えるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、捕捉剤、固体支持体、配列決定アダプター、および陽性対照、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは使用説明書をさらに備える。
【００６４】
一態様では、本開示は、野性型部位特異的ポリペプチドと比較して低下した酵素活性を含む部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸、および捕捉剤を備えるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは使用説明書をさらに備える。いくつかの実施形態では、キットは、洗浄緩衝液、安定化緩衝液、再構成緩衝液、または希釈緩衝液を含む群から選択される緩衝液をさらに備える。
【００６５】
一態様では、本開示は、２つまたはそれ以上のニッカーゼを用いて標的核酸を切断するための方法であって、標的核酸を、第１の複合体および第２の複合体と接触させる工程であって、ここで第１の複合体は、第１のニッカーゼおよび第１の核酸ターゲティング核酸を含み、かつここで第２の複合体は、第２のニッカーゼおよび第２の核酸ターゲティング核酸を含み、ここで標的核酸は、第１の鎖の上に第１のプロトスペーサー隣接モチーフおよび第２の鎖の上に第２のプロトスペーサー隣接モチーフを含み、ここで第１の核酸ターゲティング核酸は、第１のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズするように適合されており、かつここで第２の核酸ターゲティング核酸は、第２のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズするように適合されている工程と、標的核酸の第１のおよび第２の鎖にニッキングする工程であって、ニッキングする工程が、切断された標的核酸を生成する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、第１のおよび第２のニッカーゼは同じである。いくつかの実施形態では、第１のおよび第２のニッカーゼは異なる。いくつかの実施形態では、第１のおよび第２の核酸ターゲティング核酸は異なる。いくつかの実施形態では、第１のプロトスペーサー隣接モチーフと第２のプロトスペーサー隣接モチーフの間に１２５未満のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態では、第１のおよび第２のプロトスペーサー隣接モチーフは、配列ＮＧＧを含み、ここでＮは任意のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第１のまたは第２のニッカーゼは、少なくとも１つの実質的に不活性なヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のまたは第２のニッカーゼは、保存されたアスパラギン酸の変異を含む。いくつか
の実施形態では、変異はＤ１０Ａ変異である。いくつかの実施形態では、第１のまたは第２のニッカーゼは、保存されたヒスチジンの変異を含む。いくつかの実施形態では、変異はＨ８４０Ａ変異である。いくつかの実施形態では、第１のプロトスペーサー隣接モチーフと第２のプロトスペーサー隣接モチーフの間に１５未満のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態では、第１のプロトスペーサー隣接モチーフと第２のプロトスペーサー隣接モチーフの間に１０未満のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態では、第１のプロトスペーサー隣接モチーフと第２のプロトスペーサー隣接モチーフの間に５未満のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態では、第１のおよび第２のプロトスペーサー隣接モチーフは互いに隣接する。いくつかの実施形態では、ニッキングする工程は、第１のニッカーゼが第１の鎖をニッキングする工程、および第２のニッカーゼが第２の鎖をニッキングする工程を含む。いくつかの実施形態では、ニッキングする工程は、スティッキィエンド切断を生じる。いくつかの実施形態では、ニッキングする工程はブラントエンド切断を生じる。いくつかの実施形態では、方法は、切断された標的核酸にドナーポリヌクレオチドを挿入する工程をさらに含む。
【００６６】
一態様では、本開示は、各々の核酸分子が核酸結合タンパク質結合部位を含む複数の核酸分子であって、複数の核酸分子のうちの少なくとも１つは核酸ターゲティング核酸をコードし、複数の核酸分子のうちの１つは部位特異的ポリペプチドをコードする核酸分子、および複数の核酸結合タンパク質を含む融合ポリペプチドであって、複数の核酸結合タンパク質は、それらの同族の核酸結合タンパク質結合部位に結合するように適合されている融合ポリペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上の複数の核酸結合タンパク質は、非天然配列を含む。いくつかの実施形態では、非天然配列は、Ｎ末端、Ｃ末端、表面アクセス可能領域、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置に位置する。いくつかの実施形態では、非天然配列は、核局在シグナルをコードする。いくつかの実施形態では、複数の核酸結合タンパク質は、リンカーによって隔てられる。いくつかの実施形態では、複数の核酸結合タンパク質のうちのいくつかは、同じ核酸結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、複数の核酸結合タンパク質の全てが、同じ核酸結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、複数の核酸結合タンパク質は、異なる核酸結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、複数の核酸結合タンパク質は、ＲＮＡ結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、Ｉ型のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートシステム（Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ  ｓｙｓｔｅｍ）のエンドリボヌクレアーゼ、ＩＩ型のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートシステム（Ｔｙｐｅ  ＩＩ  Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ
Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ  ｓｙｓｔｅｍ）のエンドリボヌクレアーゼ、またはＩＩＩ型のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートシステム（Ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ  ｓｙｓｔｅｍ）のエンドリボヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、およびＣｓｙ４、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、複数の核酸結合タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、核酸結合タンパク質結合部位は、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートシステム（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ  ｓｙｓｔｅｍ）の核酸結合タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸結合タンパク質に結合するように構成されている。いくつかの実施形態では、核酸結合タンパク質結合部位は、Ｃａｓ６、Ｃａｓ５、およびＣｓｙ４、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸結合タンパク質に結合するように構成されて
いる。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子のいくつかは、同じ核酸結合タンパク質結合部位を含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、同じ核酸結合タンパク質結合部位を含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子のうち同じ核酸結合タンパク質結合部位を含むものはない。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも２０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドはＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸分子は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）のエンドリボヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートのエンドリボヌクレアーゼは、Ｃｓｙ４に対して少なくとも２０％の配列類似性を含む。いくつかの実施形態では、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートのエンドリボヌクレアーゼは、Ｃｓｙ４に対して少なくとも６０％の配列類似性を含む。いくつかの実施形態では、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートのエンドリボヌクレアーゼはＣｓｙ４である。いくつかの実施形態では、複数の核酸結合タンパク質は、低下した酵素活性を含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸結合タンパク質は、核酸結合タンパク質結合部位に結合するように適合されているが、核酸結合タンパク質結合部位は切断できない。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は、２つのＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、各々の２つのＲＮＡ分子の一部は、一緒にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、２つのＲＮＡ分子のうち第１の分子が、８つの連続するヌクレオチドにおいて、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートのＲＮＡ配列に対して少なくとも６０％の同一性を含む配列を含み、かつここで２つのＲＮＡ分子のうち第２の分子は、６つの連続するヌクレオチドにおいて、トランス活性化のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ−Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）のＲＮＡ配列に対して少なくとも６０％の同一性を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は、１つの連続のＲＮＡ分子を含み、ここで連続のＲＮＡ分子は、２つのドメインおよびリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、連続のＲＮＡ分子の２つのドメインの一部は、一緒にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、連続のＲＮＡ分子の第１の部分は、８つの連続するヌクレオチドにおいて、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートのＲＮＡ配列に対して少なくとも６０％の同一性を含む配列を含み、かつここで連続のＲＮＡ分子の第２の部分は、６つの連続するヌクレオチドにおいて、トランス活性化のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートのＲＮＡ配列に対して少なくとも６０％の同一性を含む配列を含���。いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は、６〜２０ヌクレオチドにおいて標的核酸とハイブリダイズするように適合されている。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞に送達されるように構成されている。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞に対して等しい量の複数の核酸分子を送達するように構成されている。いくつかの実施形態では、組成物は、ドナーポリヌクレオチド分子をさらに含み、ここでドナーポリヌクレオチド分子は、核酸結合タンパク質結合部位を含み、ここで結合部位は、融合ポリペプチドの核酸結合タンパク質によって結合される。
【００６７】
一態様では、本開示は、細胞中の細胞レベルより下の位置への核酸の送達のための方法であって、細胞に、各々の核酸分子が核酸結合タンパク質結合部位を含む複数の核酸分子であって、複数の核酸分子のうちの少なくとも１つは核酸ターゲティング核酸をコードし、複数の核酸分子のうちの１つは部位特異的ポリペプチドをコードする核酸分子、および複数の核酸結合タンパク質を含む融合ポリペプチドであって、複数の核酸結合タンパク質は、それらの同族の核酸結合タンパク質結合部位に結合して、細胞より下の位置へ組成物を化学量論的に送達するように適合されている融合ポリペプチドを含む組成物を導入する工程と、部位特異的ポリペプチドをコードする核酸分子から翻訳された部位特異的ポリペ
プチドおよび核酸ターゲティング核酸を含むユニットを形成する工程と、標的核酸を切断する工程であって、ここでユニットの部位特異的ポリペプチドが標的核酸を切断する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、複数の核酸結合タンパク質は、それらの同族の核酸結合タンパク質結合部位に結合する。いくつかの実施形態では、エンドリボヌクレアーゼは、１つまたはそれ以上の核酸結合タンパク質結合部位のうちの１つを切断する。いくつかの実施形態では、エンドリボヌクレアーゼは、核酸ターゲティング核酸をコードする核酸の核酸結合タンパク質結合部位を切断し、それによって核酸ターゲティング核酸を解放する。いくつかの実施形態では、細胞内の位置は、ヌクレアーゼ、ＥＲ、ゴルジ、ミトコンドリア、細胞壁、リソソーム、および核からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞内の位置とは核である。
【００６８】
一態様では、本開示は、ある組成物をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、組成物が、複数の核酸分子（ここで各々の核酸分子が核酸結合タンパク質結合部位を含み、ここで複数の核酸分子の少なくとも１つが核酸ターゲティング核酸をコードしており、複数の核酸分子のうちの１つが部位特異的ポリペプチドをコードする）；および融合ポリペプチド（ここで融合ポリペプチドが複数の核酸結合タンパク質を含み、ここで複数の核酸結合タンパク質が、それらの同族の核酸結合タンパク質結合部位に結合して、組成物を細胞内の位置へ化学量論的に送達するように適合されている）を含む、ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、プロモーターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ポリヌクレオチドに対して作動可能に結合される。いくつかの実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターである。
【００６９】
一態様では、本開示は、あるベクターを含む遺伝的に改変された生物体であって、ベクターが、複数の核酸分子をコードするポリヌクレオチド配列（ここで各々の核酸分子は、核酸結合タンパク質結合部位を含み、ここで複数の核酸分子の少なくとも１つが、核酸ターゲティング核酸をコードし、複数の核酸分子のうちの１つが部位特異的ポリペプチドをコードする）、および融合ポリペプチド（ここで融合ポリペプチドが、複数の核酸結合タンパク質を含み、ここで複数の核酸結合タンパク質が、それらの同族の核酸結合タンパク質結合部位に結合して、組成物を細胞内の位置へ化学量論的に送達するように適合されている）を含む生物体を提供する。
【００７０】
一態様では、本開示は、ある組成物を含む遺伝的に改変された生物体であって、組成物が、複数の核酸分子（ここで各々の核酸分子は、核酸結合タンパク質結合部位を含み、ここで複数の核酸分子の少なくとも１つが、核酸ターゲティング核酸をコードし、複数の核酸分子のうちの１つが部位特異的ポリペプチドをコードする）；および融合ポリペプチド（ここで融合ポリペプチドが、複数の核酸結合タンパク質を含み、ここで複数の核酸結合タンパク質が、それらの同族の核酸結合タンパク質結合部位に結合するように適合されている）を含む生物体を提供する。
【００７１】
一態様では、本開示は、ある組成物を備えるキットであって、組成物が、複数の核酸分子（ここで各々の核酸分子は、核酸結合タンパク質結合部位を含み、ここで複数の核酸分子の少なくとも１つが、核酸ターゲティング核酸をコードし、複数の核酸分子のうちの１つが部位特異的ポリペプチドをコードする）、および融合ポリペプチド（ここで融合ポリペプチドが、複数の核酸結合タンパク質を含み、ここで複数の核酸結合タンパク質が、それらの同族の核酸結合タンパク質結合部位に結合するように適合されている）を含む組成物、ならびに緩衝液を備えるキットを提供する。
【００７２】
一態様では、本開示は、ベクターが、複数の核酸分子をコードするポリヌクレオチド配列（ここで各々の核酸分子は、核酸結合タンパク質結合部位を含み、ここで複数の核酸分
子の少なくとも１つが、核酸ターゲティング核酸をコードし、複数の核酸分子のうちの１つが部位特異的ポリペプチドをコードする）ベクター；および融合ポリペプチド（ここで融合ポリペプチドが、複数の核酸結合タンパク質を含み、ここで複数の核酸結合タンパク質が、それらの同族の核酸結合タンパク質結合部位に結合して、組成物を細胞内の位置へ化学量論的に送達するように適合されている）、および緩衝液を備えるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは使用説明書をさらに備える。いくつかの実施形態では、緩衝液は、希釈緩衝液、再構成緩衝液、および安定化緩衝液、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される。
【００７３】
一態様では、本開示は、対象とする遺伝子エレメント、およびレポーターエレメントを含み、ここでレポーターエレメントが、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および１つまたはそれ以上の核酸を含み、ここで１つまたはそれ以上の核酸が、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列および６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列を含む、ドナーポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、対象とする遺伝子エレメントは、ある遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、対象とする遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、および長い非コードＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される非コード核酸を含む。いくつかの実施形態では、対象とする遺伝子エレメントは、非コード遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、対象とする遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、および長い非コードＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される非コード核酸を含む。いくつかの実施形態では、レポーターエレメントは、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、化学発光タンパク質をコードする遺伝子、および抗生物質耐性遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、レポーターエレメントは、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、レポーターエレメントはプロモーターに対して作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは組織特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１５％のアミノ酸配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９に対して１０アミノ酸にまたがって少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＨＮＨドメイン、ＨＮＨ様ドメイン、ＲｕｖＣドメイン、およびＲｕｖＣ様ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００７４】
一態様では、本開示は、発現ベクターであって、対象とする遺伝子エレメントをコードするポリヌクレオチド配列；およびレポーターエレメントを含み、ここでレポーターエレメントは、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および１つまたはそれ以上の核酸を含み、ここで１つまたはそれ以上の核酸は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列、および６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列を含む、発現ベクターを提供する。
【００７５】
一態様では、本開示は、ドナーポリヌクレオチドを含む遺伝的に改変された細胞であって、ドナーポリヌクレオチドが、対象とする遺伝子エレメント；およびレポーターエレメントを含み、ここでレポーターエレメントが部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および１つまたはそれ以上の核酸を含み、ここで１つまたはそれ以上の核酸が、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列、および６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対
して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列を含む細胞を提供する。
【００７６】
一態様では、本開示は、対象とする遺伝子エレメント；およびレポーターエレメントを含み、ここでレポーターエレメントが部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および１つまたはそれ以上の核酸を含み、ここで１つまたはそれ以上の核酸が、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列、および６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列を含むドナーポリヌクレオチドと；緩衝液とを備えるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、Ｃａｓ９に対して少なくとも１０％のアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドと；ポリペプチドに対して結合し、標的核酸にハイブリダイズする核酸をさらに備える。いくつかの実施形態では、キットは使用説明書をさらに備える。いくつかの実施形態では、キットは、Ｃａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに備える。いくつかの実施形態では、キットは、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列と、６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列とを含む核酸をコードするポリヌクレオチドをさらに備える。
【００７７】
一態様では、本開示は、レポーターエレメントを用いて細胞を選択し、レポーターエレメントを細胞から切り出すための方法であって、標的核酸を、部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む複合体と接触させる工程と；標的核酸を部位特異的ポリペプチドで切断して、切断された標的核酸を生成する工程と；対象とする遺伝子エレメントを含むドナーポリヌクレオチド；およびレポーターエレメント（ここでレポーターエレメントが、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および１つまたはそれ以上の核酸を含み、ここで１つまたはそれ以上の核酸が、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列および６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列を含む、切断された標的核酸中に挿入する工程と；ドナーポリヌクレオチドに基づいて細胞を選択して、選択された細胞を生成する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、選択する工程は、疾患について処置されている対象から細胞を選択する工程を含む。いくつかの実施形態では、選択する工程は、疾患について診断されている対象から細胞を選択する工程を含む。いくつかの実施形態では、選択する工程の後、その細胞は、ドナーポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、レポーターエレメントの全て、いくつかを切り出すか、または切り出さない工程であって、これによって第２の選択された細胞を生成する工程を含む。いくつかの実施形態では、切り出す工程は、レポーターエレメントの５’末端を、部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む複合体と接触させる工程であって、ここで複合体が５’末端を切断する工程を含む。いくつかの実施形態では、切り出す工程は、レポーターエレメントの３’末端を、部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む複合体と接触させる工程であって、ここで複合体が３’末端を切断する工程を含む。いくつかの実施形態では、切り出す工程は、レポーターエレメントの５’および３’末端を、部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む１つまたはそれ以上の複合体と接触させる工程であって、ここで複合体が５’および３’末端を切断する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、第２の選択された細胞をスクリーニングする工程を含む。いくつかの実施形態では、スクリーニングする工程は、レポーターエレメントの全てまたはいくつかが存在しないことを観察する工程を含む。
【００７８】
一態様では、本開示は、核酸を含む組成物であって、核酸は、１２〜３０ヌクレオチド（両端を含む）であり、ＰＡＭに対して５’である配列に対してハイブリダイズするように適合されているスペーサーと；スペーサーに対して３’である第１の二重鎖と；第１の
二重鎖の第１の鎖の上に少なくとも３つの不対のヌクレオチド、および第１の二重鎖の第２の鎖の上に少なくとも１つの不対のヌクレオチドを含むバルジと；二重鎖の第１の鎖および第２の鎖を連結し、少なくとも３ヌクレオチド長であるリンカーと；Ｐ−ドメインと；Ｐ−ドメインの３’であり、部位特異的ポリペプチドに結合するように適合されている第２の二重鎖とを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＡＭに対して５’である配列は、少なくとも１８ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＰＡＭに対して５’である配列は、ＰＡＭに対して隣接する。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは５’−ＮＧＧ−３’を含む。いくつかの実施形態では、第１の二重鎖は、スペーサーに隣接する。いくつかの実施形態では、Ｐ−ドメインは、二重鎖の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、少なくとも４ヌクレオチドを含み、かつ、５’−ＮＧＧ−３’プロトスペーサー隣接モチーフ配列、化膿レンサ球菌（Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９のアミノ酸１０９６〜１２５５に対して少なくとも５０％の同一性を含む配列、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列に対してハイブリダイズするように適合されている。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１５％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸はＡ型のＲＮＡである。いくつかの実施形態では、第１の二重鎖は、少なくとも６ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、バルジの３つの不対のヌクレオチドは、５’−ＡＡＧ−３’を含む。いくつかの実施形態では、３つの不対のヌクレオチドに対する隣接は、第１の二重鎖の第２の鎖上のヌクレオチドと不安定な対を形成するヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、第１の二重鎖、第２の二重鎖、およびＰ−ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸のある領域に結合する。
【００７９】
一態様では、本開示は、標的核酸を改変する方法であって、標的核酸を、核酸を含む組成物と接触させる工程であって、核酸は、１２〜３０ヌクレオチド（両端を含む）であるスペーサーであって、ＰＡＭに対して５’である配列にハイブリダイズするように適合されているスペーサーと；スペーサーに対して３’である第１の二重鎖と；第１の二重鎖の第１の鎖の上に少なくとも３つの不対のヌクレオチド、および第１の二重鎖の第２の鎖の上に少なくとも１つの不対のヌクレオチドを含むバルジと；二重鎖の第１の鎖および第２の鎖を連結し、少なくとも３ヌクレオチド長であるリンカーと；Ｐ−ドメインと；Ｐ−ドメインの３’であり、部位特異的ポリペプチドに結合するように適合されている第２の二重鎖とを含む、工程と；標的核酸を改変する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、部位特異的ポリペプチドと接触させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、接触させる工程は、スペーサーを標的核酸に接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、改変する工程は、標的核酸を切断して、切断された標的核酸を生成する工程を含む。いくつかの実施形態では、切断する工程は、部位特異的ポリペプチドによって行われる。いくつかの実施形態では、方法はさらに、ドナーポリヌクレオチドを、切断された標的核酸に挿入する工程を含む。いくつかの実施形態では、改変する工程は、標的核酸の転写を改変する工程を含む。
【００８０】
一態様では、本開示は、１２〜３０ヌクレオチド（両端を含む）であり、ＰＡＭに対して５’である配列にハイブリダイズするように適合されているスペーサーと；スペーサーに対して３’である第１の二重鎖と；第１の二重鎖の第１の鎖の上に少なくとも３つの不対のヌクレオチド、および第１の二重鎖の第２の鎖の上に少なくとも１つの不対のヌクレオチドを含むバルジと；二重鎖の第１の鎖および第２の鎖を連結し、かつ少なくとも３ヌクレオチド長であるリンカーと；Ｐ−ドメインと；Ｐ−ドメインの３’であり、かつ部位特異的ポリペプチドに結合するように適合されている第２の二重鎖と含む核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
【００８１】
一態様では、本開示は、１２〜３０ヌクレオチド（両端を含む）であり、ＰＡＭに対し
て５’である配列にハイブリダイズするように適合されているスペーサーと；スペーサーに対して３’である第１の二重鎖と；第１の二重鎖の第１の鎖の上に少なくとも３つの不対のヌクレオチド、および第１の二重鎖の第２の鎖の上に少なくとも１つの不対のヌクレオチドを含むバルジと；二重鎖の第１の鎖および第２の鎖を連結し、少なくとも３ヌクレオチド長であるリンカーと；Ｐ−ドメイン；およびＰ−ドメインの３’であり、部位特異的ポリペプチドに結合するように適合されている第２の二重鎖と含む核酸を含む組成物；ならびに緩衝液を備えるキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、部位特異的ポリペプチドをさらに備える。いくつかの実施形態では、キットは、ドナーポリヌクレオチドをさらに備える。いくつかの実施形態では、キットは、使用説明書をさらに備える。
【００８２】
一態様では、本開示は、合成的に設計された核酸ターゲティング核酸を作成する方法であって、１２〜３０ヌクレオチド（両端を含む）であり、ＰＡＭに対して５’である配列にハイブリダイズするように適合されているスペーサーと；スペーサーに対して３’である第１の二重鎖と；第１の二重鎖の第１の鎖の上に少なくとも３つの不対のヌクレオチド、および第１の二重鎖の第２の鎖の上に少なくとも１つの不対のヌクレオチドを含むバルジと；二重鎖の第１の鎖および第２の鎖を連結し、少なくとも３ヌクレオチド長であるリンカーと；Ｐ−ドメインと；Ｐ−ドメインの３’であり、部位特異的ポリペプチドに結合するように適合されている第２の二重鎖とを含む核酸を含む組成物を設計する工程を含む方法を提供する。
【００８３】
一態様では、本開示は、核酸ターゲティング核酸のＰドメインに変異を含む操作された核酸ターゲティング核酸；核酸ターゲティング核酸のバルジ領域に変異を含む操作された核酸ターゲティング核酸からなる群から選択される操作された核酸ターゲティング核酸を含む医薬組成物を提供する。
【００８４】
一態様では、本開示は、３’ハイブリダイズ伸長を含む操作された核酸ターゲティング核酸と、前記３’ハイブリダイズ伸長に対してハイブリダイズされるドナーポリヌクレオチドを含む組成物；エフェクタータンパク質と、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性、６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性、および非天然配列を含み、前記エフェクタータンパク質に対して結合するように適合されている核酸と含む組成物；多重化遺伝子ターゲティング剤を含む組成物であって、前記多重化遺伝子ターゲティング剤は１つまたはそれ以上の核酸モジュールを含み、ここで前記核酸モジュールは非天然配列を含み、ここで前記核酸モジュールはＣａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１０％のアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドに結合するように構成されており、ここで前記核酸モジュールは標的核酸に対してハイブリダイズするように構成されている、組成物；改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドは、野性型部位特異的ポリペプチドと比較して第２のプロトスペーサー隣接モチーフを標的とするように適合するように改変されている、組成物；改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドは、野性型部位特異的ポリペプチドと比較して第２の核酸ターゲティング核酸を標的とするように適合されているように改変されている、組成物；配列番号８と比較して架橋らせん中に改変を含む改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物；配列番号８と比較して、高度に塩基性のパッチ中に改変を含む改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物；配列番号８と比較してポリメラーゼ様ドメイン中に改変を含む改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物；配列番号８と比較して、架橋らせん中の改変、高度に塩基性のパッチ、ヌクレアーゼドメイン、およびポリメラーゼドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物；配列番号８と比較して、改変されたヌクレアーゼドメインを含む改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物；第１の部位特異的ポリペプチドおよび
第１の核酸ターゲティング核酸を含む第１の複合体、第２の部位特異的ポリペプチドおよび第２の核酸ターゲティング核酸を含む第２の複合体を含む組成物であって、前記第１および第２の核酸ターゲティング核酸が異なる、組成物；各々の核酸分子が核酸結合タンパク質結合部位を含む複数の核酸分子であって、前記複数の核酸分子のうちの少なくとも１つは核酸ターゲティング核酸をコードし、前記複数の核酸分子の１つが部位特異的ポリペプチドをコードする核酸分子と、複数の前記核酸結合タンパク質を含む融合ポリペプチドであって、前記複数の核酸結合タンパク質はそれらの同族の核酸結合タンパク質結合部位に結合するように適合されている、融合ポリペプチドとを含む組成物；ならびに１２〜３０ヌクレオチド（両端を含む）であり、ＰＡＭに対して５’である配列にハイブリダイズするように適合されているスペーサーと；前記第１の二重鎖は、前記スペーサーに対して３’である第１の二重鎖と；前記第１の二重鎖の第１の鎖の上に少なくとも３つの不対のヌクレオチド、および前記第１の二重鎖の第２の鎖の上に少なくとも１つの不対のヌクレオチドを含むバルジと；前記二重鎖の前記第１の鎖および前記第２の鎖を連結し、少なくとも３ヌクレオチド長であるリンカーと；Ｐ−ドメインと；前記Ｐ−ドメインの３’であり、部位特異的ポリペプチドに結合するように適合されている第２の二重鎖とを含む核酸を含む組成物；またはそれらの任意の組み合わせ；からなる群から選択される組成物を含む医薬組成物を提供する。
【００８５】
一態様では、本開示は、改変された部位特異的ポリペプチドを含む医薬組成物であって、ポリペプチドが、第１のヌクレアーゼドメイン、第２のヌクレアーゼドメイン、および挿入されたヌクレアーゼドメインを含む、医薬組成物を提供する。
【００８６】
一態様では、本開示は、ドナーポリヌクレオチドを含む医薬組成物であって、ポリヌクレオチドが、対象とする遺伝子エレメント、およびレポーターエレメントを含み、ここで前記レポーターエレメントが、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および１つまたはそれ以上の核酸を含み、ここで前記１つまたはそれ以上の核酸が、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列および６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列を含む、医薬組成物を提供する。
【００８７】
一態様では、本開示は、核酸ターゲティング核酸のＰドメインに変異を含む操作された核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター；核酸ターゲティング核酸のバルジ領域に変異を含む操作された核酸ターゲティング核酸をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクター；ならびに標的核酸を改変する工程；改変された核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、改変された核酸ターゲティング核酸は非天然配列を含む、ベクター；ベクター（改変された核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、改変された核酸ターゲティング核酸は、エフェクタータンパク質、および部位特異的ポリペプチドに結合するように構成された配列を含む、ベクター；改変された核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、改変された核酸ターゲティング核酸は、非天然配列、部位特異的ポリペプチド、およびエフェクタータンパク質を含む、ベクター；多重化遺伝子ターゲティング剤をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、多重化遺伝子ターゲティング剤は１つまたはそれ以上の核酸モジュールを含み、ここで核酸モジュールは非天然配列を含み、ここで核酸モジュールはＣａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１０％のアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドに結合するように構成されており、ここで核酸モジュールは標的核酸に対してハイブリダイズするように構成されている、ベクター；配列番号８と比較して架橋らせん中の改変、高度に塩基性のパッチ、ヌクレアーゼドメイン、およびポリメラーゼドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む改変された部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター；少なくとも１つのヌクレオチドずつ異な
る２つまたはそれ以上の核酸ターゲティング核酸；および部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター；各々の核酸分子が核酸結合タンパク質結合部位を含む複数の核酸分子であって、複数の核酸分子の少なくとも１つは核酸ターゲティング核酸をコードし、複数の核酸分子のうちの１つが部位特異的ポリペプチドをコードする核酸分子と；複数の核酸結合タンパク質を含む融合ポリペプチドであって、複数の核酸結合タンパク質はそれらの同族の核酸結合タンパク質結合部位に結合して、組成物を化学量論的に細胞内の位置に送達するように適合されている融合ポリペプチドとを含む組成物コードしているポリヌクレオチド配列を含むベクター；対象とする遺伝子エレメントをコードするヌクレオチド配列と；レポーターエレメントとを含む発現ベクターであって、レポーターエレメントは、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および１つまたはそれ以上の核酸を含み、ここで１つまたはそれ以上の核酸は６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列、および６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列を含む、発現ベクター；ならびに１２〜３０ヌクレオチド（両端を含む）であり、ＰＡＭに対して５’である配列にハイブリダイズするように適合されているスペーサーと；スペーサーに対して３’である第１の二重鎖と；第１の二重鎖の第１の鎖の上に少なくとも３つの不対のヌクレオチド、および第１の二重鎖の第２の鎖の上に少なくとも１つの不対のヌクレオチドを含むバルジと；二重鎖の第１の鎖および第２の鎖を連結し、かつ少なくとも３ヌクレオチド長であるリンカーと；Ｐ−ドメインと；Ｐ−ドメインの３’であり、かつ部位特異的ポリペプチドに結合するように適合されている第２の二重鎖とを含む核酸コードするポリヌクレオチド配列を含むベクター；またはそれらの任意の組み合わせ；からなる群から選択されるベクターを含む医薬組成物を提供する。
【００８８】
一態様では、本開示は、疾患を処置する方法であって、対象に、核酸ターゲティング核酸のＰ−ドメインに変異を含む操作された核酸ターゲティング；核酸ターゲティング核酸のバルジ領域に変異を含む操作された核酸ターゲティング核酸；３’ハイブリダイズ伸長を含む操作された核酸ターゲティング核酸と、前記３’ハイブリダイズ伸長に対してハイブリダイズされるドナーポリヌクレオチドとを含む組成物；エフェクタータンパク質および核酸を含む組成物であって、前記核酸は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性、６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性、および非天然配列を含み、ここで前記核酸は前記エフェクタータンパク質に結合するように適合されている、組成物；多重化遺伝子ターゲティング剤を含む組成物であって、前記多重化遺伝子ターゲティング剤は１つまたはそれ以上の核酸モジュールを含み、ここで前記核酸モジュールは非天然配列を含み、ここで前記核酸モジュールはＣａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１０％のアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドに対して結合するように構成されており、ここで前記核酸モジュールは標的核酸に対してハイブリダイズするように構成されている、組成物；改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドは、野性型部位特異的ポリペプチドと比較して第２のプロトスペーサー隣接モチーフを標的とするように適合されるように改変されている、組成物；改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドは、野性型部位特異的ポリペプチドと比較して第２の核酸ターゲティング核酸を標的とするように適合されるように改変されている、組成物；配列番号８と比較して架橋らせん中の改変を含む改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物；配列番号８と比較して高度に塩基性のパッチ中の改変を含む改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物；配列番号８と比較して、ポリメラーゼ様ドメイン中に改変を含む改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物；配列番号８と比較して、架橋らせん中の改変、高度に塩基性のパッチ、ヌクレアーゼドメイン、およびポリメラーゼドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物；配列番号８と比較して改変されたヌクレアーゼドメインを含む改変された部位特異的ポリペプチドを含む組成物；第１の部位特異的ポリペプチドおよび
第１の核酸ターゲティング核酸を含む第１の複合体、第２の部位特異的ポリペプチドおよび第２の核酸ターゲティング核酸を含む第２の複合体を含む組成物であって、前記第１および第２の核酸ターゲティング核酸が異なる、組成物；各々の核酸分子が核酸結合タンパク質結合部位を含む複数の核酸分子であって、前記複数の核酸分子のうちの少なくとも１つが核酸ターゲティング核酸をコードし、前記複数の核酸分子のうちの１つが部位特異的ポリペプチドをコードする核酸分子と、複数の前記核酸結合タンパク質を含む融合ポリペプチドであって、前記複数の核酸結合タンパク質はそれらの同族の核酸結合タンパク質結合部位に結合するように適合されている、融合ポリペプチドとを含む組成物；１２〜３０ヌクレオチド（両端を含む）であり、ＰＡＭに対して５’である配列にハイブリダイズするように適合されているスペーサーと、前記スペーサーに対して３’である第１の二重鎖と、前記第１の二重鎖の第１の鎖の上に少なくとも３つの不対のヌクレオチドおよび前記第１の二重鎖の第２の鎖の上に少なくとも１つの不対のヌクレオチドを含むバルジと、前記二重鎖の前記第１の鎖および前記第２の鎖を連結し、少なくとも３ヌクレオチド長であるリンカーと、Ｐ−ドメインと、前記Ｐ−ドメインの３’であり、部位特異的ポリペプチドに結合するように適合されている第２の二重鎖とを含む核酸を含む組成物；第１のヌクレアーゼドメイン、第２のヌクレアーゼドメイン、および挿入されたヌクレアーゼドメインを含む改変された部位特異的ポリペプチド；対象とする遺伝子エレメントおよびレポーターエレメントを含むドナーポリヌクレオチドであって、前記レポーターエレメントは、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および１つまたはそれ以上の核酸を含み、ここで前記１つまたはそれ以上の核酸は、６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列および６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列を含む、ドナーポリヌクレオチド；核酸ターゲティング核酸のＰ−ドメインに変異を含む操作された核酸ターゲティング核酸を含むポリヌクレオチド配列を含むベクター；核酸ターゲティング核酸のバルジ領域に変異を含む操作された核酸ターゲティング核酸をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクター；および標的核酸を改変する工程；改変された核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、改変された核酸ターゲティング核酸は非天然配列を含む、ベクター；改変された核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、改変された核酸ターゲティング核酸はエフェクタータンパク質、および部位特異的ポリペプチドに結合するように構成されている配列を含む、ベクター；改変された核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、改変された核酸ターゲティング核酸は、非天然配列、部位特異的ポリペプチド、およびエフェクタータンパク質を含む、ベクター；多重化遺伝子ターゲティング剤をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、多重化遺伝子ターゲティング剤は１つまたはそれ以上の核酸モジュールを含み、ここで核酸モジュールは非天然配列を含み、ここで核酸モジュールは、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１０％のアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドに結合するように構成されており、ここで核酸モジュールは標的核酸に対してハイブリダイズするように構成されているベクター；配列番号８と比較して、架橋らせん中の改変、高度に塩基性のパッチ、ヌクレアーゼドメイン、およびポリメラーゼドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む改変された部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター；少なくとも１ヌクレオチドずつ異なる２つまたはそれ以上の核酸ターゲティング核酸；および部位特異的ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクター；各々の核酸分子が核酸結合タンパク質結合部位を含む複数の核酸分子であって、複数の核酸分子の少なくとも１つは核酸ターゲティング核酸をコードし、複数の核酸分子のうちの１つは部位特異的ポリペプチドをコードする核酸分子と；複数の核酸結合タンパク質を含む融合ポリペプチドであって、複数の核酸結合タンパク質が、それらの同族の核酸結合タンパク質結合部位に対して結合して、化学量論的に組成物を細胞内の位置に送達するように適合されている融合ポリペプチドとを含む組成物コードしているポリヌクレオチド配列を含むベクター；対象とする遺伝子エレメ
ントをコードするポリヌクレオチド配列と；レポーターエレメントとを含む発現ベクターであって、レポーターエレメントは、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および１つまたはそれ以上の核酸を含み、ここで１つまたはそれ以上の核酸は６つの連続するヌクレオチドにおいてｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列および６つの連続するヌクレオチドにおいてｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも５０％の配列同一性を含む配列を含む、発現ベクター；ならびに１２〜３０ヌクレオチド（両端を含む）であり、ＰＡＭに対して５’である配列にハイブリダイズするように適合されているスペーサーと；スペーサーに対して３’である第１の二重鎖と；第１の二重鎖の第１の鎖の上に少なくとも３つの不対のヌクレオチド、および第１の二重鎖の第２の鎖の上に少なくとも１つの不対のヌクレオチドを含むバルジと；二重鎖の第１の鎖および第２の鎖を連結し、少なくとも３ヌクレオチド長であるリンカーと；Ｐ−ドメインと；Ｐ−ドメインの３’であり、部位特異的ポリペプチドに結合するように適合されている第２の二重鎖とを含む核酸コードするポリヌクレオチド配列を含むベクター；またはそれらの任意の組み合わせを投与する工程とを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、投与する工程は、ウイルス送達によって投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、投与する工程は、エレクトロポレーションによって投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、投与する工程は、ナノ粒子送達によって投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、投与する工程は、リポソーム送達によって投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、投与する工程は、静脈内に、皮下に、筋肉内に、経口的に、経腸的に、エアロゾルによって、非経口的に、眼科的に、肺に、経皮的に、経膣的に、光学的に、経鼻的に、および局所投与による、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される方法による投与工程を含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、植物細胞、微生物細胞、および真菌細胞、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞中で行われる。
【００８９】
参照による組み込み
本明細書に言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各々の個々の刊行物、特許または特許出願を参照によって組み入れたと詳細にかつ個々に示されるのと同じ程度まで、参照によって本明細書に組み入れる。
【００９０】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲で詳細に述べられる。本発明の特徴および利点のより優れた理解は、説明的な実施形態を述べる次の詳細な記述への参照によって得られ、そこには、本発明の原理が利用され、添付の図面は以下の通りである：
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１Ａ】本開示のシングルガイド核酸ターゲティング核酸の典型的な実施形態を示す図である。
【図１Ｂ】本開示のシングルガイド核酸ターゲティング核酸の典型的な実施形態を示す図である。
【図２】本開示のダブルガイド核酸ターゲティング核酸の典型的な実施形態を示す図である。
【図３】標的核酸切断を利用する本開示の配列濃縮法の典型的な実施形態を示す図である。
【図４】標的核酸濃縮を利用する本開示の配列濃縮法の典型的な実施形態を示す図である。
【図５】部位特異的ポリペプチドの精製を利用する部位特異的ポリペプチドのオフ標的結合部位を決定するための本開示の方法の典型的な実施形態を示す図である。
【図６】核酸ターゲティング核酸の精製を利用する部位特異的ポリペプチドのオフ標的結合部位を決定するための本開示の方法の典型的な実施形態を示す図である。
【図７】本開示の部位特異的ポリペプチドを用いた配列に基づく配列決定法のための典型的な実施形態を例示する図である。
【図８】本開示の部位特異的ポリペプチドを用いた配列に基づく配列決定法のための典型的な実施形態を例示し、切断された生成物が配列決定される図である。
【図９】本開示の部位特異的ポリペプチドを用いた次世代シーケンスに基づく方法のための典型的な実施形態を例示する図である。
【図１０】典型的なタグ付きシングルガイド核酸ターゲティング核酸を示す図である。
【図１１】典型的なタグ付きダブルガイド核酸ターゲティング核酸を示す図である。
【図１２】分割システム（例えば、分割蛍光システム）でタグ付き核酸ターゲティング核酸を用いる方法の典型的な実施形態を例示する図である。
【図１３】５’タグ付き核酸ターゲティング核酸の、標的核酸切断へ及ぼす影響に関するいくつかの典型的なデータを示す図である。
【図１４】核酸ターゲティング核酸とタグとの間にタグリンカー配列を含む、典型的な５’タグ付き核酸ターゲティング核酸を例示する図である。
【図１５】多重化した標的核酸切断方法の典型的な実施形態を示す図である。
【図１６】ＲＮＡ核酸の化学量論的送達方法の典型的な実施形態を示す図である。
【図１７】核酸の化学量論的送達方法の典型的な実施形態を示す図である。
【図１８】本開示の部位特異的ポリペプチドを用いた標的核酸へのレポーター要素の継ぎ目のない挿入の典型的な実施形態を示す図である。
【図１９】標的核酸からレポーター要素を除去するための典型的な実施形態を示す図である。
【図２０】化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０由来のプレＣＲＩＳＰＲ核酸配列およびｔｒａｃｒ核酸配列の核酸配列の相補的な部分を示す図である。
【図２１】合成シングルガイド核酸ターゲティング核酸の典型的な二次構造を示す図である。
【図２２Ａ−１】典型的なシングルガイド核酸ターゲティング核酸骨格の変種を示す図である。囲み線内のヌクレオチドは、ＦＬ−ｔｒａｃｒ−ｃｒＲＮＡ配列であると標識されたＣＲＩＳＰＲ配列と比較して変更されたヌクレオチドに相当する。
【図２２Ａ−２】図２２Ａ−１の続き。
【図２２Ｂ−１】典型的なシングルガイド核酸ターゲティング核酸骨格の変種を示す図である。囲み線内のヌクレオチドは、ＦＬ−ｔｒａｃｒ−ｃｒＲＮＡ配列であると標識されたＣＲＩＳＰＲ配列と比較して変更されたヌクレオチドに相当する。
【図２２Ｂ−２】図２２Ｂ−１の続き。
【図２３Ａ】試験管内切断検定の典型的なデータを示す図である。結果は、複数の合成核酸ターゲティング核酸骨格配列は、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）によって切断を支持できることを示す。
【図２３Ｂ】試験管内切断検定の典型的なデータを示す図である。結果は、複数の合成核酸ターゲティング核酸骨格配列は、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）によって切断を支持できることを示す。
【図２３Ｃ】試験管内切断検定の典型的なデータを示す図である。結果は、複数の合成核酸ターゲティング核酸骨格配列は、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）によって切断を支持できることを示す。
【図２４−１】相補的領域／二本鎖に変種を含む典型的な合成シングルガイド核酸ターゲティング核酸配列を示す図である。囲み線内のヌクレオチドは、ＦＬ−ｔｒａｃｒ−ｃｒＲＮＡ配列であると分類されたＣＲＩＳＰＲ配列と比較して変更されたヌクレオチドに相当する。
【図２４−２】図２４−１の続き。
【図２５】相補的領域／二本鎖の３’側の領域内で、シングルガイド核酸ターゲティング核酸構造に対する典型的な変種を示す図である。囲み線内のヌクレオチドは、天然の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０のＣＲＩＳＰＲ核酸およびｔｒａｃｒ核酸配列の組合せと比較して変更されたヌクレオチドに相当する。
【図２５Ｂ】図２５の続き。
【図２６Ａ−１】相補的領域／二本鎖の３’側の領域内で、シングルガイド核酸ターゲティング核酸構造に対する典型的な変種を示す図である。囲み線内のヌクレオチドは、天然の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０のＣＲＩＳＰＲ核酸およびｔｒａｃｒ核酸配列の組合せと比較して変更されたヌクレオチドに相当する。
【図２６Ａ−２】図２６Ａ−１の続き。
【図２６Ｂ−１】相補的領域／二本鎖の３’側の領域内で、シングルガイド核酸ターゲティング核酸構造に対する典型的な変種を示す図である。囲み線内のヌクレオチドは、天然の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０のＣＲＩＳＰＲ核酸およびｔｒａｃｒ核酸配列の組合せと比較して変更されたヌクレオチドに相当する。
【図２６Ｂ−２】図２６Ａ−１の続き。
【図２７Ａ】緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ１４）のＣＲＩＳＰＲ反復に由来する追加のヘアピン配列を含む典型的な変種核酸ターゲティング核酸構造を示す図である。囲み線内の配列は、ＰＡ１４由来のリボヌクレアーゼＣｓｙ４と結合することができる。
【図２７Ｂ】緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ１４）のＣＲＩＳＰＲ反復に由来する追加のヘアピン配列を含む典型的な変種核酸ターゲティング核酸構造を示す図である。囲み線内の配列は、ＰＡ１４由来のリボヌクレアーゼＣｓｙ４と結合することができる。
【図２８】複数の合成核酸ターゲティング核酸骨格配列がＣａｓ９切断を支持することを示す、試験管内切断検定の典型的なデータを示す図である。上段および下段のゲルの画像は、２回の独立した反復で検定が行われたことを表す。
【図２９】複数の合成核酸ターゲティング核酸骨格配列がＣａｓ９切断を支持することを示す、試験管内切断検定の典型的なデータを示す図である。上段および下段のゲルの画像は、２回の独立した反復で検定が行われたことを表す。
【図３０】標的核酸内の改変部位にドナーポリヌクレオチドを持ってくる本開示の典型的な方法を示す図である。
【図３１】電子情報を保存して、共有するためのシステムを示す図である。
【図３２】標的核酸内で平滑末端切断を生成する２種類のニッカーゼの典型的な実施形態を示す図である。核酸ターゲティング核酸と複合型の部位特異的改変ポリペプチドは示していない。
【図３３】２種類のニッカーゼを使用し粘着末端を生成する、標的核酸のジグザグ切断の典型的な実施形態を示す図である。核酸ターゲティング核酸と複合型の部位特異的改変ポリペプチドは示していない。
【図３４】２種類のニッカーゼを使用し中型の粘着末端を生成する、標的核酸のジグザグ切断の典型的な実施形態を示す図である。核酸ターゲティング核酸と複合型の部位特異的改変ポリペプチドは示していない。
【図３５−１】Ｃａｓ９オーソログの配列アライメントを例示する図である。下方に「Ｘ」と記したアミノ酸は、類似していると考えてもよい。下方に「Ｙ」と記したアミノ酸は、高度に保存されるか、または全配列で同一であると考えることができる。「Ｘ」または「Ｙ」のないアミノ酸残基は、保存されていなくてもよい。
【図３５−２】図３５−１の続き。
【図３５−３】図３５−２の続き。
【図３５−４】図３５−３の続き。
【図３５−５】図３５−４の続き。
【図３５−６】図３５−５の続き。
【図３５−７】図３５−６の続き。
【図３５−８】図３５−７の続き。
【図３６】標的核酸切断上で核酸ターゲティング核酸変種の機能性を示す図である。図３６中でテストされる変種は、図２２、図２４、および図２５に示される変種に対応する。
【図３７Ａ】変種核酸ターゲティング核酸を用いた試験管内切断検定を示す図である。
【図３７Ｂ】変種核酸ターゲティング核酸を用いた試験管内切断検定を示す図である。
【図３７Ｃ】変種核酸ターゲティング核酸を用いた試験管内切断検定を示す図である。
【図３７Ｄ】変種核酸ターゲティング核酸を用いた試験管内切断検定を示す図である。
【図３８】野生型緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のＣｓｙ４の典型的なアミノ酸配列を示す図である。
【図３９】酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ（例えば、Ｃｓｙ４）の典型的なアミノ酸配列を示す図である。
【図４０】緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のＣｓｙ４の典型的なアミノ酸配列を示す図である。
【図４１Ａ】典型的なＣａｓ６アミノ酸配列を示す図である。
【図４１Ｂ】典型的なＣａｓ６アミノ酸配列を示す図である。
【図４１Ｃ】典型的なＣａｓ６アミノ酸配列を示す図である。
【図４１Ｄ】典型的なＣａｓ６アミノ酸配列を示す図である。
【図４１Ｅ】典型的なＣａｓ６アミノ酸配列を示す図である。
【図４１Ｆ】典型的なＣａｓ６アミノ酸配列を示す図である。
【図４１Ｇ】典型的なＣａｓ６アミノ酸配列を示す図である。
【図４１Ｈ】典型的なＣａｓ６アミノ酸配列を示す図である。
【図４１Ｉ】典型的なＣａｓ６アミノ酸配列を示す図である。
【図４１Ｊ】典型的なＣａｓ６アミノ酸配列を示す図である。
【図４２Ａ】典型的なＣａｓ６アミノ酸配列を示す図である。
【図４２Ｂ】典型的なＣａｓ６アミノ酸配列を示す図である。
【図４２Ｃ】典型的なＣａｓ６アミノ酸配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
本明細書において用いる場合、「親和性タグ」とは、ペプチド親和性タグまたは核酸親和性タグのいずれを指してもよい。親和性タグとは一般には、分子に結合し得る（例えば、低分子、タンパク質、共有結合によって結合）タンパク質または核酸配列を指す。親和性タグは、非天然配列であってもよい。ペプチド親和性タグは、ペプチドを含んでもよい。ペプチド親和性タグは、分割システムの一部であり得るものであってもよい（例えば、２つの不活性なペプチドフラグメントは、トランスで一緒に組み合わさって、活性な親和性タグを形成し得る）。核酸親和性タグは、核酸を含んでもよい。核酸親和性タグは、公知の核酸配列に対して選択的に結合し得る（例えば、ハイブリダイゼーションを通じて）配列であってもよい。核酸親和性タグは、タンパク質に対して選択的に結合し得る配列であってもよい。親和性タグは、天然のタンパク質に融合し得る。親和性タグは、ヌクレオチド配列に融合し得る。時には、１つ、２つまたは複数の親和性タグが天然のタンパク質またはヌクレオチド配列に融合してもよい。親和性タグは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ
ｖｉｖｏの転写の方法を用いて、核酸ターゲティング核酸に導入されてもよい。核酸親和性タグとしては、例えば、化学タグ、ＲＮＡ結合タンパク質結合配列、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列、親和性タグ付きポリヌクレオチドに対してハイブリダイズ可能な配列、合成のＲＮＡアプタマー、または合成のＤＮＡアプタマーを挙げることができる。化学的核酸親和性タグの例としては、限定するものではないが、リボ−ヌクレオ三リン酸であって、ビオチン、蛍光色素、およびジゴキシゲニンを含むものを挙げることができる。タン
パク質結合核酸親和性タグの例としては、限定するものではないが、ＭＳ２結合配列、Ｕ１Ａ結合配列、ステムループ結合タンパク質配列、ボックスＢ配列、ｅＩＦ４Ａ配列、またはＲＮＡ結合タンパク質によって認識される任意の配列を挙げることができる。核酸親和性タグ付きオリゴヌクレオチドの例としては、限定するものではないが，ビオチン化オリゴヌクレオチド、２，４−ジニトロフェニルオリゴヌクレオチド、フルオレセインオリゴヌクレオチド、および第一級アミンコンジュゲートオリゴヌクレオチドが挙げることができる。
【００９３】
核酸親和性タグは、ＲＮＡアプタマーであってもよい。アプタマーとしては、テオフィリン、ストレプトアビジン、デキストランＢ５１２、アデノシン、グアノシン、グアニン／キサンチン、７−メチル−ＧＴＰ、アミノ酸アプタマー、例えば、アルギニン、シトルリン、バリン、トリプトファンに結合するアプタマー、シアノコバラミン、Ｎ−メチルメソポリフィリンＩＸ、フラビン、ＮＡＤ、および抗生物質アプタマー、例えば、トブラマイシン、ネオマイシン、リビドマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ビオマイシンおよびクロラムフェニコールに結合するアプタマーを挙げることができる。
【００９４】
核酸親和性タグは、部位特異的ポリペプチドによって結合され得るＲＮＡ配列を含んでもよい。部位特異的ポリペプチドは、条件付きで酵素学的に不活性であってもよい。ＲＮＡ配列は、Ｉ型、ＩＩ型、および／またはＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲシステムのメンバーによって結合され得る配列を含んでもよい。ＲＮＡ配列は、ＲＡＭＰファミリーのメンバータンパク質によって結合され得る。ＲＮＡ配列は、Ｃａｓ６ファミリーのメンバーのタンパク質（例えば、Ｃｓｙ４、Ｃａｓ６）によって結合され得る。ＲＮＡ配列は、Ｃａｓ５ファミリーのメンバータンパク質（例えば、Ｃａｓ５）によって結合されてもよい。例えば、Ｃｓｙ４は、高い親和性（Ｋｄ約５０ｐＭ）で特定のＲＮＡヘアピン配列に結合してもよく、３’部位でヘアピンに対してＲＮＡを切断し得る。Ｃａｓ５またはＣａｓ６ファミリーのメンバータンパク質は、以下のヌクレオチド配列に対して少なくとも約、または多くとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を含むＲＮＡ配列に結合し得る：５’−ＧＵＵＣＡＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧＣＵＡＡＧＡＡＡ−３’；５’−ＧＵＵＣＡＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧＣＵＡＡＧＡＡＡ−３’
５’−ＧＵＵＧＣＡＡＧＧＧＡＵＵＧＡＧＣＣＣＣＧＵＡＡＧＧＧＧＡＵＵＧＣＧＡＣ−３’；
５’−ＧＵＵＧＣＡＡＡＣＣＵＣＧＵＵＡＧＣＣＵＣＧＵＡＧＡＧＧＡＵＵＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＧＡＵＣＧＡＵＡＣＣＣＡＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＡＣＧＡＧＡＡＣ−３’；
５’−ＧＵＣＧＵＣＡＧＡＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＡＵＡＵＡＡＡＣＣＵＡＡＵＵＡＣＣＵＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＣＣＣＣＡＧＵＣＡＣＣＵＣＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＵＵＣＣＡＡＵＵＡＡＵＣＵＵＡＡＡＣＣＣＵＡＵＵＡＧＧＧＡＵＵＧＡＡＡＣ−３’。
５’−ＧＵＵＧＣＡＡＧＧＧＡＵＵＧＡＧＣＣＣＣＧＵＡＡＧＧＧＧＡＵＵＧＣＧＡＣ−３’；
５’−ＧＵＵＧＣＡＡＡＣＣＵＣＧＵＵＡＧＣＣＵＣＧＵＡＧＡＧＧＡＵＵＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＧＡＵＣＧＡＵＡＣＣＣＡＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＡＣＧＡＧＡＡＣ−３’；
５’−ＧＵＣＧＵＣＡＧＡＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣ−
３’；
５’−ＧＡＵＡＵＡＡＡＣＣＵＡＡＵＵＡＣＣＵＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＣＣＣＣＡＧＵＣＡＣＣＵＣＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＵＵＣＣＡＡＵＵＡＡＵＣＵＵＡＡＡＣＣＣＵＡＵＵＡＧＧＧＡＵＵＧＡＡＡＣ−３’，
５’−ＧＵＣＧＣＣＣＣＣＣＡＣＧＣＧＧＧＧＧＣＧＵＧＧＡＵＵＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＣＣＡＧＣＣＧＣＣＵＵＣＧＧＧＣＧＧＣＵＧＵＧＵＧＵＵＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＵＣＧＣＡＣＵＣＵＡＣＡＵＧＡＧＵＧＣＧＵＧＧＡＵＵＧＡＡＡＵ−３’；
５’−ＵＧＵＣＧＣＡＣＣＵＵＡＵＡＵＡＧＧＵＧＣＧＵＧＧＡＵＵＧＡＡＡＵ−３’；および
５’−ＧＵＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＡＵＧＧＧＧＣＧＣＧＵＧＧＡＵＵＧＡＡＡ−３’。
【００９５】
核酸親和性タグは、部位特異的ポリペプチドによって結合され得るＤＮＡ配列を含んでもよい。部位特異的ポリペプチドは、条件付きで酵素学的に不活性であってもよい。ＤＮＡ配列は、Ｉ型、ＩＩ型、および／またはＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲシステムのメンバーによって結合され得る配列を含んでもよい。ＤＮＡ配列は、アオイガイ（Ａｒｇｏｎａｕｔ）タンパク質によって結合されてもよい。ＤＮＡ配列は、ジンクフィンガードメイン、ＴＡＬＥドメイン、または任意の他のＤＮＡ結合ドメインを含むタンパク質によって結合されてもよい。
【００９６】
核酸親和性タグは、リボザイム配列を含んでもよい。適切なリボザイムとしては、ペプチジルトランスフェラーゼ２３Ｓ  ｒＲＮＡ、ＲｎａｓｅＰ、Ｉ群イントロン、ＩＩ群イントロン、ＧＩＲ１分岐リボザイム、リードザイム（Ｌｅａｄｚｙｍｅ）、ヘアピンリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ＨＤＶリボザイム、ＣＰＥＢ３リボザイム、ＶＳリボザイム、ｇｌｍＳリボザイム、ＣｏＴＣリボザイム、および合成のリボザイムを挙げることができる。
【００９７】
ペプチド親和性タグは、トラッキングまたは精製のために用いられ得るタグを含んでもよい（例えば、蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｈｉｓタグ、（例えば、６ＸＨｉｓタグ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、およびキチン結合タンパク質タグ、カルモジュリンタグ、Ｖ５タグ、ストレプトアビジン結合タグ、など）。
【００９８】
核酸およびペプチド親和性タグの両方とも、低分子タグ、例えば、ビオチン、またはジギトキシン、蛍光標識タグ、例えば、フルオロセイン、ローダミン、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ色素、シアニン３色素、シアニン５色素などを含んでもよい。
【００９９】
核酸親和性タグは、核酸（例えば、核酸ターゲティング核酸）に対して５’側に配置されてもよい。核酸親和性タグは、核酸に対して３’側に配置されてもよい。核酸親和性タグは、核酸に対して５’および３’側に配置されてもよい。核酸親和性タグは、核酸内に配置されてもよい。ペプチド親和性タグは、ポリペプチド配列に対してＮ末端に配置されてもよい。ポリペプチド親和性タグは、ポリペプチド配列に対してＣ末端に配置されてもよい。ペプチド親和性タグは、ポリペプチド配列に対してＮ末端およびＣ末端に配置されてもよい。複数の親和性タグは、核酸および／またはポリペプチド配列に対して融合されてもよい。
【０１００】
本明細書において用いる場合、「捕捉剤」は一般的にはポリペプチドおよび／または核酸を精製し得る剤を指してもよい。捕捉剤は、生物学的に活性な分子または材料（例えば
、天然または合成で見出される任意の生物学的物質であってもよく、これには限定するものではないが、細胞、ウイルス、細胞下粒子、タンパク質、例としては、さらに詳細には、抗体、免疫グロブリン、抗原、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質複合体、（ストレプト）アビジン−ビオチン複合体、リガンド、受容体または低分子、アプタマー、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、オリゴ糖類、多糖類、リポ多糖類、細胞代謝物、ハプテン、薬理学的に活性な物質、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、および糖類）が挙げられる。いくつかの実施形態では、捕捉剤は、親和性タグを含んでもよい。いくつかの実施形態では、捕捉剤は優先的に、標的ポリペプチドまたは対象とする核酸に結合し得る。捕捉剤は、混合物中で浮遊性であってもよい。捕捉剤は、粒子（例えば、ビーズ、マイクロビーズ、ナノ粒子）に結合され得る。捕捉剤は、固体または半固体表面に結合されてもよい。いくつかの場合には、捕捉剤は、標的に対して不可逆的に結合される。他の場合には、捕捉剤は、標的に可逆的に結合される（例えば、標的が溶出され得る場合、またはイミダゾールのような化学薬品の使用によって）。
【０１０１】
本明細書において用いる場合、「Ｃａｓ５」は、一般的には、野性型の例示的なＣａｓ５ポリペプチド（例えば、デスルホビブリオ・ブルガリス（Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のＣａｓ５および／または図４２に示される任意の配列）に対して少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指してもよい。Ｃａｓ５は一般的には、野性型の例示的なＣａｓ５ポリペプチド（例えば、デスルホビブリオ・ブルガリス由来のＣａｓ５）に対して多くとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指してもよい。Ｃａｓ５とは、アミノ酸変化、例えば、欠失、挿入、置換、変種、変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得るＣａｓ５タンパク質の野性型または改変された型を指してもよい。
【０１０２】
本明細書において用いる場合、「Ｃａｓ６」とは一般的には、野性型の例示的なＣａｓ６ポリペプチド（例えば、サーマス・サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ６、および／または図４１に示される配列）に対して少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指してもよい。Ｃａｓ６は一般的には、野性型の例示的なＣａｓ６ポリペプチド（例えば、サーマス・サーモフィルス由来）に対して、多くとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指してもよい。Ｃａｓ６とは、アミノ酸変化、例えば、欠失、挿入、置換、変種、変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得るＣａｓ６タンパク質の野性型または改変された型を指してもよい。
【０１０３】
本明細書において用いる場合、「Ｃａｓ９」とは一般的には、野性型の例示的なＣａｓ６ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９（配列番号８、配列番号１〜２５６、配列番号７９５〜１３４６）に対して少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指してもよい。Ｃａｓ９とは、野性型の例示的なＣａｓ９ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌由来）に対して、多くとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指してもよい。Ｃａｓ９とは、アミノ酸変化、例えば、欠失、挿入、置換、変種、変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得るＣａｓ９タンパク質の野性型または改変された型を指してもよい。
【０１０４】
本明細書において用いる場合、「細胞」とは一般的には生物学的細胞を指してもよい。細胞とは、生きている生物体の基本的な構造の、機能的および／または生物学的な単位であり得る。細胞は、１つまたはそれ以上の細胞を有する任意の生物体由来であってもよい。いくつかの非限定的な例としては、原核生物細胞、真核生物細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物生物体の細胞、原生動物細胞、植物由来の細胞（例えば、植物の作物由来の細胞、果実、野菜、穀物、ダイズ、コーン（ｃｏｒｎ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、コムギ、種子、トマト、コメ、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、干し草（ｈａｙ）、ジャガイモ、ワタ、大麻、タバコ、顕花植物、針葉樹、裸子植物、シダ類、ヒカゲノカズラ（ｃｌｕｂｍｏｓｓｅｓ）、ツノゴケ類（ｈｏｒｎｗｏｒｔｓ）、コケ類（ｌｉｖｅｒｗｏｒｔｓ）、コケ（ｍｏｓｓｅｓ））、藻細胞、（例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ）、クラミドモナス・レインハルドッテイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ナンノクロロプシス・ガンジタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ）、クロレラ・ピレノイドーサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、サルガッサム・パテンス（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｐａｔｅｎｓ）カール・アガード（Ｃ．Ａｇａｒｄｈ）、など）、海草（例えば、ケルプ）真菌細胞（例えば、酵母細胞、キノコ由来の細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）由来の細胞、哺乳動物（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど）由来の細胞、および種々のものが挙げられる。時には、細胞は、天然の生物体由来ではない（例えば、細胞は、合成的に作製されたものでもよく、時には、人工細胞と呼ばれる）。
【０１０５】
細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏであってもよい。細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏであってもよい。細胞は単離された細胞であってもよい。細胞は、生物体の内部の細胞であってもよい。細胞は、生物体であってもよい。細胞は、細胞培養物中の細胞であってもよい。細胞は、細胞の収集のうちの１つであってもよい。細胞は、原核生物細胞であっても、または原核生物細胞由来であってもよい。細胞は、細菌細胞であってもよいし、または細菌細胞由来であってもよい。細胞は、古細菌細胞であってもよいし、または古細菌細胞由来であってもよい。細胞は、真核生物細胞であってもよいし、または真核生物細胞由来であってもよい。細胞は、植物細胞であってもよいし、または植物細胞由来であってもよい。細胞は、動物細胞であってもよいし、または動物細胞由来であってもよい。細胞は、無脊椎動物細胞であってもよいし、または無脊椎動物細胞由来であってもよい。細胞は、脊椎動物細胞であってもよいし、または脊椎動物細胞由来であってもよい。細胞は、哺乳動物細胞であってもよいし、または哺乳動物細胞由来であってもよい。細胞は、げっ歯類細胞であってもよいし、またはげっ歯類細胞由来であってもよい。細胞は、ヒト細胞であってもよいし、またはヒト細胞由来であってもよい。細胞は、微生物細胞であってもよいし、または微生物細胞由来であってもよい。細胞は、真菌細胞であってもよいし、または真菌細胞由来であってもよい。
【０１０６】
細胞は、幹細胞であっても、または前駆細胞であってもよい。細胞としては、幹細胞（例えば、成体幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞）および前駆細胞（例えば、心臓前駆細胞、神経前駆細胞など）が挙げられる。細胞としては、哺乳動物の幹細胞および前駆細胞が挙げられ、これには、げっ歯類幹細胞、げっ歯類前駆細胞、ヒト幹細胞、ヒト前駆細胞などが挙げられる。クローン細胞は、細胞の子孫を含んでもよい。細胞は、標的核酸を含んでもよい。細胞は生きている生物体中であってもよい。細胞は、遺伝的に改変された細胞であってもよい。細胞は宿主細胞であってもよい。
【０１０７】
細胞は、全能性幹細胞であってもよいが、本開示のいくつかの実施形態では、「細胞」
という用語を用いてもよく、ただし全能性幹細胞を指さない場合がある。細胞は、植物細胞であってもよいが、本開示のいくつかの実施形態では、「細胞」という用語が用いられてもよく、ただし植物細胞を指さない場合もある。細胞は、多能性細胞であってもよい。例えば、細胞は、造血性の細胞系列中の他の細胞へ分化し得る多能性造血細胞であってもよいが、任意の他の非造血性細胞へ分化できなくてもよい。細胞は、全生物体へ発達できる場合がある。細胞は、全生物体へ発達できてもできなくてもよい。細胞は全生物体であってもよい。
【０１０８】
細胞は、初代細胞であってもよい。例えば、初代細胞の培養物が、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、１５回以上継代されてもよい。細胞は、単細胞生物体であってもよい。細胞は、培養物中で増殖されてもよい。
【０１０９】
細胞は、病的な細胞であってもよい。病的な細胞は、変更された代謝、遺伝子発現および／または形態学的特徴を有してもよい。病的細胞は、癌細胞、糖尿病性細胞、およびアポトーシス細胞であってもよい。病的な細胞は、疾患に罹患した対象由来の細胞であってもよい。例示的な疾患としては、血液障害、癌、代謝障害、眼の障害、臓器障害、筋骨格障害、心疾患などが挙げられる。
【０１１０】
細胞が初代細胞である場合、それらは、任意の方法で個体から回収されてもよい。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、密度勾配分離などによって回収されてもよい。皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃などのような組織由来の細胞を、生検によって回収してもよい。収集された細胞の分散または懸濁のために適切な溶液を用いてもよい。このような溶液は、一般的には、低濃度で許容可能な緩衝液と組み合わせて、ウシ胎仔血清または他の天然に存在する因子を従来のように補充された、平衡塩溶液、（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩溶液など）であってもよい。緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩緩衝液、乳酸塩緩衝液などが挙げられる。細胞は、直ちに用いられてもよいし、または保管されてもよい（例えば、凍結による）。凍結細胞は、解凍されてもよく、かつ再使用されてもよい。細胞は、ＤＭＳＯ、血清、媒体緩衝液（例えば、１０％のＤＭＳＯ、５０％の血清、４０％の緩衝化媒体）中で凍結されてもよく、および／またはいくつかの他のこのような一般的な溶液を用いて、細胞を凍結温度で保存してもよい。
【０１１１】
本明細書において用いる場合、「条件付きで酵素学的に不活性な部位特異的ポリペプチド」とは、一般的には、配列特異的な方式でポリヌクレオチド中の核酸配列に結合し得るが、酵素的ドメインを活性にさせる１つまたはそれ以上の条件下を除いて標的ポリヌクレオチドを切断し得ないポリペプチドを指してもよい。条件付きで酵素学的に不活性な部位特異的ポリペプチドは、条件付きで活性化され得る酵素学的に不活性なドメインを含んでもよい。条件付きで酵素学的に不活性な部位特異的ポリペプチドは、イミダゾールの存在下で、条件付きで活性化され得る。条件付きで酵素学的に不活性な部位特異的ポリペプチドは、その同族のリガンドに結合できない変異した活性部位を含んでもよく、それによって酵素学的に不活性な部位特異的ポリペプチドが生じる。この変異した活性部位は、リガンド類似体が、変異した活性部位に結合し得、かつ部位特異的ポリペプチドに反応性であるように、リガンド類似体に結合するように設計され得る。例えば、ＡＴＰ結合タンパク質は、タンパク質の活性を阻害し得、さらにＡＴＰ類似体に特異的に結合するように設計されている、変異した活性部位を含んでもよい。ＡＴＰ類似体の結合は、タンパク質を再活性化し得るが、ＡＴＰは活性化し得ない。条件付きで酵素学的に不活性な部位特異的ポリペプチドは、１つまたはそれ以上の非天然配列（例えば、融合、親和性タグ）を含んでもよい。
【０１１２】
本明細書において用いる場合、「ｃｒＲＮＡ」は一般的には、野性型の例示的なｃｒＲ
ＮＡ（例えば、化膿レンサ球菌由来のｃｒＲＮＡ（例えば、配列番号５６９、配列番号５６３〜６７９））に対して少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／または配列類似性を有する核酸を指してもよい。ｃｒＲＮＡは一般的には、野性型の例示的なｃｒＲＮＡ（例えば、化膿レンサ球菌由来のｃｒＲＮＡ）に対して多くとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／または配列類似性を有する核酸を指してもよい。ｃｒＲＮＡとは、欠失、挿入、または置換、変種、変異、またはキメラのようなヌクレオチド変化を含み得る、ｃｒＲＮＡの改変型を指してもよい。ｃｒＲＮＡは、少なくとも６つの連続するヌクレオチドのストレッチにまたがって、野性型の例示的なｃｒＲＮＡ（例えば、化膿レンサ球菌由来のｃｒＲＮＡ）配列に対して少なくとも約６０％の同一性を有している核酸であってもよい。例えば、ｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６つの連続するヌクレオチドのストレッチにまたがって、野性型の例示的なｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌由来のｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約６０％同一、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一であってもよい。
【０１１３】
本明細書において用いる場合、「ＣＲＩＳＰＲ反復」または「ＣＲＩＳＰＲ反復配列」とは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を指してもよい。
【０１１４】
本明細書において用いる場合、「Ｃｓｙ４」とは一般的には、野性型の例示的なＣｓｙ４ポリペプチド（例えば、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のＣｓｙ４、図４０を参照のこと）に対して、多くとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指してもよい。Ｃｓｙ４とは、一般的には野性型の例示的なＣｓｙ４ポリペプチド（例えば、緑膿菌由来のＣｓｙ４）に対して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指してもよい。Ｃｓｙ４とは、欠失、挿入、置換、変種、変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組み合わせのようなアミノ酸変化を含み得る、Ｃｓｙ４タンパク質の野性型または改変された型を指してもよい。
【０１１５】
本明細書において用いる場合、「エンドリボヌクレアーゼ」は一般的には、ＲＮＡを切断し得る、ポリペプチドを指してもよい。いくつかの実施形態では、エンドリボヌクレアーゼは、部位特異的ポリペプチドであってもよい。エンドリボヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲシステムのメンバーであってもよい（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）。エンドリボヌクレアーゼは、反復関連ミステリアスプロテイン（Ｒｅｐｅａｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍｙｓｔｅｒｉｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＲＡＭＰ）スーパーファミリーのタンパク質（例えば、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６、Ｃａｓ５ファミリー）を指してもよい。エンドリボヌクレアーゼとしてはまた、ＲＮａｓｅ  Ａ、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＲＮａｓｅ  Ｉ、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩファミリーのメンバー（例えば、Ｄｒｏｓｈａ、Ｄｉｃｅｒ、ＲＮａｓｅ
Ｎ）、ＲＮａｓｅ  Ｌ、ＲＮａｓｅ  Ｐ、ＲＮａｓｅ  ＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅ  Ｔ１、ＲＮａｓｅ  Ｔ２、ＲＮａｓｅ  Ｕ２、ＲＮａｓｅ  Ｖ１、ＲＮａｓｅ  Ｖが挙げられる。エンドリボヌクレアーゼとは、条件付きで酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼを指してもよい。エンドリボヌクレアーゼとは、触媒的に不活性なエンドリボヌクレアーゼを指してもよい。
【０１１６】
本明細書において用いる場合、「ドナーポリヌクレオチド」とは、ゲノム操作または標的核酸操作の間にある部位に組み込まれ得る核酸を指してもよい。
【０１１７】
本明細書において用いる場合、「固定剤」または「架橋剤（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）」とは一般的には、細胞を固定または架橋し得る剤を指してもよい。固定された細胞または架橋細胞は、細胞中でタンパク質−核酸複合体を安定化し得る。適切な固定剤および架橋剤としては、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、エタノールベースの固定剤、メタノールベースの固定剤、アセトン、酢酸、四酸化オスミウム、重クロム酸カリウム、クロム酸、過マンガン酸カリウム、水銀剤、ピクリン酸塩、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、アミン反応性ＮＨＳ−エステル架橋、例えば、ビス［スルホスクシンイミジル］スベラート（ＢＳ３）、３，３’−ジチオビス［スルホスクシンイミジルプロピオネート］（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス［スルホスクシンイミジルスクシネート（スルホ−ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジチオビス［スクシンイミジルプロピオネート］（ＤＳＰ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、エチレングリコールビス［スクシンイミジルスクシネート］（ＥＧＳ）、ＮＨＳ−エステル／ジアジリン架橋、例えば、ＮＨＳ−ジアジリン、ＮＨＳ−ＬＣ−ジアジリン、ＮＨＳ−ＳＳ−ジアジリン、スルホ−ＮＨＳ−ジアジリン、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ジアジリン、およびスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ジアジリンが挙げられる。
【０１１８】
本明細書において用いる場合、「融合」とは、１つまたはそれ以上の非天然配列（例えば、部分）を含むタンパク質および／または核酸を指してもよい。融合は、１つまたはそれ以上の同じ非天然配列を含んでもよい。融合は、１つまたはそれ以上の異なる非天然配列を含んでもよい。融合は、キメラであってもよい。融合は、核酸親和性タグを含んでもよい。融合は、バーコードを含んでもよい。融合は、ペプチド親和性タグを含んでもよい。融合は、部位特異的ポリペプチドの細胞下局在化を提供し得る（例えば、核を標的とするための、核局在シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル、クロロプラストを標的するためのクロロプラスト局在化シグナル、小胞体（ＥＲ）保持シグナルなど）。融合は、トラッキングまたは精製するために用いられ得る非天然配列（例えば、親和性タグ）を提供し得る。融合は、低分子、例えば、ビオチンまたは色素、例えば、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ色素、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）３色素、シアニン５色素であってもよい。融合は、安定性の増大または減少を提供し得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、融合は、検出可能なシグナルを提供し得る部分を含む、検出可能標識を含んでもよい。検出可能なシグナルを提供し得る、適切な検出可能標識および／または部分としては、限定するものではないが、酵素、放射性同位体、特異的結合対のメンバー；フルオロフォア；蛍光タンパク質；量子ドット；などが挙げられる。
【０１２０】
融合は、ＦＲＥＴ対のメンバーを含んでもよい。使用に適したＦＲＥＴ対（ドナー／アクセプター）としては、限定するものではないが、ＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、フルオレセイン／Ｃｙ５、ＩＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／ＱＳＹ−７、フルオレセイン／ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０、フルオレセイン／Ｃｙ  ５．５およびフルオレセイン／ＬＣ  Ｒｅｄ  ７０５が挙げられる。
【０１２１】
フルオロフォア／量子ドットドナー／アクセプター対は、融合として用いられ得る。適切なフルオロフォア（「蛍光標識」）としては、その固有の蛍光特性を介して検出され得る任意の分子が挙げられ、これには励起の際に検出可能な蛍光が挙げられる。適切な蛍光標識としては、限定するものではないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリトロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラサイトグリーン（Ｍａｌａｃｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ）、スチルベン、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（商標）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０、Ｃｙ  ５、Ｃｙ
５．５、ＬＣ  Ｒｅｄ  ７０５およびオレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  ｇｒｅｅｎ）が挙げられる。
【０１２２】
融合は、酵素を含んでもよい。適切な酵素としては、限定するものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼなどが挙げられる。
【０１２３】
融合は、蛍光タンパク質を含んでもよい。適切な蛍光タンパク質としては、限定するものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、（例えば、Ａｅｑｕｏｒｉａ  ｖｉｃｔｏｒｉａのＧＦＰ、Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａの蛍光タンパク質、またはそれらの変異体もしくは誘導体）、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、任意の種々の蛍光および有色のタンパク質が挙げられる。
【０１２４】
融合は、ナノ粒子を含んでもよい。適切なナノ粒子としては、蛍光ナノ粒子または発光性ナノ粒子、および磁性ナノ粒子が挙げられる。ナノ粒子（単数または複数）の任意の光学的または磁性の特性または特徴が検出され得る。
【０１２５】
融合は、量子ドット（ＱＤ）を含んでもよい。ＱＤは、種々の異なる物質を含むコーティング層を塗布することによって水溶性にされ得る。例えば、ＱＤは、両親媒性ポリマーを用いて溶解され得る。使用された例示的なポリマーとしては、オクチルアミン改変の低分子量ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−誘導体化リン脂質、ポリ無水物、ブロックコポリマーなどが挙げられる。ＱＤは、コーティング層に直接または間接的に連結され得る任意の多数の異なる官能基または連結剤を介してポリペプチドに対してコンジュゲートされ得る。広範な種々の吸収スペクトルおよび発光スペクトルを有するＱＤは、例えば、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐ．（Ｈａｙｗａｒｄ  Ｃａｌｉｆ．；現在Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎが所有）から、またはＥｖｉｄｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｔｒｏｙ，Ｎ．Ｙ．）から市販されている。例えば、およそ５２５、５３５、５４５、５６５、５８５、６０５、６５５、７０５、および８００ｎｍのピーク発光波長を有するＱＤが利用可能である。従って、ＱＤは、スペクトルの可視部分にまたがって、およびある場合には超えてさえ、ある範囲の異なる色を有してもよい。
【０１２６】
適切な放射性同位体としては、限定するものではないが１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、および１２５Ｉが挙げられる。
【０１２７】
本明細書において用いる場合、「遺伝的に改変された細胞」とは、一般的には、遺伝的に改変された細胞を指してもよい。遺伝的な改変のいくつかの非限定的な例としては、挿入、欠失、逆位、転座、遺伝子融合、または１つまたはそれ以上のヌクレオチドの変化が挙げられる。遺伝的に改変された細胞は、二重鎖破壊（例えば、ＤＮＡ破壊）を導入されている標的核酸を含んでもよい。遺伝的に改変された細胞は、外因的に導入された核酸（例えば、ベクター）を含んでもよい。遺伝的に改変された細胞は、本開示の外因的に導入されたポリペプチドおよび／または本開示の核酸を含んでもよい。遺伝的に改変された細胞は、ドナーポリヌクレオチドを含んでもよい。遺伝的に改変された細胞は、その遺伝的に改変された細胞のゲノム中に統合された外因性の核酸を含んでもよい。遺伝的に改変された細胞は、ＤＮＡの欠失を含んでもよい。遺伝的に改変された細胞とはまた、改変されたミトコンドリアのＤＮＡまたはクロロプラストＤＮＡを有する細胞を指してもよい。
【０１２８】
本明細書において用いる場合、「ゲノム操作」とは、標的核酸を改変する方法を指してもよい。ゲノム操作とは、天然の核酸への非天然核酸の組み込みを指してもよい。ゲノム操作とは、標的核酸の組み込みも欠失もない、標的核酸への部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸の標的化を指してもよい。ゲノム操作とは、標的核酸の切断、および標的核酸中の外因性配列の組み込みのない標的核酸の再結合、または標的核酸の欠
失を指してもよい。天然の核酸は遺伝子を含んでもよい。非天然核酸は、ドナーポリヌクレオチドを含んでもよい。本開示の方法では、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）は、核酸（例えば、ゲノムのＤＮＡ）中に二本鎖の破壊を導入し得る。二本鎖の破壊は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同組換え（ＨＲ）および／または非相同末端結合（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ）（ＮＨＥＪ）、またはＡ−ＮＨＥＪ（選択的非相同末端結合））を刺激し得る。変異、欠失、変更、ならびに外来、外因性および／または別の核酸の組み込みは、二本鎖ＤＮＡ破壊の部位に導入され得る。
【０１２９】
本明細書において用いる場合、「単離された」という用語は、ヒトの手によって、その天然の環境とは離れて存在し、従って天然の生成物ではない核酸またはポリペプチドを指してもよい。単離されたとは、実質的に純粋を意味し得る。単離された核酸またはポリペプチドは、精製型で存在してもよいし、および／または天然ではない環境で、例えば、トランスジェニック細胞中などに存在してもよい。
【０１３０】
本明細書において用いる場合、「非天然」とは、天然の核酸またはタンパク質中には見出されない核酸またはポリペプチドの配列を指してもよい。非天然とは、親和性タグを指してもよい。非天然とは、融合を指してもよい。非天然とは、変異、挿入および／または欠失を含む天然に存在する核酸またはポリペプチド配列を指してもよい。非天然配列は、非天然配列が融合されている核酸および／またはポリペプチド配列によっても呈示され得る活性（例えば、酵素活性、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）を呈してもよいし、および／またはコードしてもよい。非天然の核酸またはポリペプチドの配列は、遺伝子操作によって、天然に存在する核酸またはポリペプチド配列（またはその変種）に連結されて、キメラの核酸および／またはポリペプチドをコードしているキメラの核酸および／またはポリペプチドの配列を生成し得る。非天然配列とは、３’ハイブリダイズ伸長を指してもよい。
【０１３１】
本明細書において用いる場合、「核酸」とは一般的には、ポリヌクレオチド配列、またはそのフラグメントを指す。核酸は、ヌクレオチドを含んでもよい。核酸は、細胞に対して外因性であっても、または内因性であってもよい。核酸は、無細胞環境中に存在してもよい。核酸は、遺伝子であっても、またはそのフラグメントであってもよい。核酸はＤＮＡであってもよい。核酸はＲＮＡであってもよい。核酸は、１つまたはそれ以上の類似体（例えば、変更された骨格、糖または核酸塩基）を含んでもよい。アナログのいくつかの非限定的な例としては、５−ブロモウラシル、ペプチド核酸、異種核酸、モルホリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コルジセピン、７−デアザ−ＧＴＰ、フルオロフォア（例えば、糖に結合したローダミンまたはフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン連結ヌクレオチド、蛍光塩基類似体、ＣｐＧ島、メチル−７−グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、キューオシン、およびワイオシンが挙げられる。
【０１３２】
本明細書において用いる場合、「核酸サンプル」とは、一般的には生物学的実体由来のサンプルを指してもよい。核酸サンプルは、核酸を含んでもよい。核酸サンプル由来の核酸は、精製されるか、および／または濃縮されてもよい。核酸サンプルは、全体の性質を示し得る。核酸サンプルは、種々の供給源に由来してもよい。核酸サンプルは、１つまたはそれ以上の個体に由来してもよい。１つまたはそれ以上の核酸サンプルは、同じ個体由来であってもよい。１つの非限定的な例は、１つのサンプルが個体の血液由来であって、第二のサンプルが個体の腫瘍生検由来である場合である。核酸サンプルの例としては限定するものではないが、血液、血清、血漿、鼻スワブまたは鼻咽頭洗浄液、唾液、尿、胃液、脊髄液、涙、糞便、粘液、汗、耳垢、オイル、腺分泌物、脳脊髄液、組織、精液、膣液、間質液を挙げることができ、例としては腫瘍組織由来の間質液、眼液、脊髄液、咽頭ス
ワブ、口腔粘膜検体採取、呼気、毛髪、指の爪、皮膚、生検、胎盤液、羊水、臍帯血、強調液（ｅｍｐｈａｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ）、空洞液、痰、膿汁、微生物相、胎便、母乳、口腔サンプル、鼻咽頭洗浄液、他の排泄物、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。核酸サンプルは、組織由来であってもよい。組織サンプルの例としては、限定するものではないが、結合組織、筋組織、神経組織、上皮性組織、軟骨、癌性または腫瘍のサンプル、骨髄、または骨が挙げられる。核酸サンプルは、ヒトまたは動物から提供され得る。核酸サンプルは、哺乳動物、脊椎動物、例えば、マウス、サル、ヒト、家畜、スポーツ動物またはペットから提供されてもよい。核酸サンプルは、生きている対象から収集しても、または死んだ対象から収集してもよい。核酸サンプルは、対象から新鮮に収集してもよいし、または事前処理、貯蔵または輸送のいくつかの形態を受けていてもよい。
【０１３３】
核酸サンプルは、標的核酸を含んでもよい。核酸サンプルは、細胞溶解液に由来してもよい。その細胞溶解液は、細胞に由来してもよい。
【０１３４】
本明細書において用いる場合、「核酸ターゲティング核酸」とは、別の核酸にハイブリダイズできる核酸を指してもよい。核酸ターゲティング核酸は、ＲＮＡであってもよい。核酸ターゲティング核酸は、ＤＮＡであってもよい。核酸ターゲティング核酸は、核酸の配列に対して部位特異的に結合するようにプログラミングされてもよい。標的化される核酸または標的核酸は、ヌクレオチドを含んでもよい。核酸ターゲティング核酸は、ヌクレオチドを含んでもよい。標的核酸の一部は、核酸ターゲティング核酸の一部に相補的であり得る。核酸ターゲティング核酸は、ポリヌクレオチド鎖を含んでもよく、「シングルガイド核酸」（すなわち、「シングルガイド核酸ターゲティング核酸」）と呼ばれてもよい。核酸ターゲティング核酸は、２つのポリヌクレオチド鎖を含んでもよく、「ダブルガイド核酸」（すなわち、「ダブルガイド核酸ターゲティング核酸」）と呼ばれてもよい。別段特定しない場合、「核酸ターゲティング核酸」という用語は、包括的であってもよく、シングルガイド核酸およびダブルガイド核酸の両方を指す。
【０１３５】
核酸ターゲティング核酸は、「核酸ターゲティングセグメント」または「核酸ターゲティング配列」とも呼ばれ得るセグメントを含んでもよい。核酸ターゲティング核酸は、「タンパク質結合セグメント」または「タンパク質結合配列」と呼ばれ得るセグメントを含んでもよい。
【０１３６】
核酸ターゲティング核酸は、１つまたはそれ以上の改変（例えば、塩基改変、骨格改変）を含み、これによって新規なまたは強化された特徴（例えば、安定性の改善）を有する核酸を提供し得る。核酸ターゲティング核酸は、核酸親和性タグを含んでもよい。ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせであり得る。ヌクレオシドの塩基部分は、複素環塩基であってもよい。このような複素環塩基のうち２つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドであってもよい。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドについて、リン酸基は、糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分に連結されてもよい。核酸ターゲティング核酸を形成するには、リン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合して、直鎖のポリマー化合物を形成し得る。次に、直鎖のポリマー化合物のそれぞれの末端は、さらに結合されて、環状の化合物を形成し得る；しかし、直鎖の化合物が一般には適切である。さらに、直鎖の化合物は、内部ヌクレオチド塩基相補性を有してもよく、従って、完全にまたは部分的に二重鎖の化合物を生じるような方式でフォールディングし得る。核酸ターゲティング核酸内では、リン酸基は共通して、核酸ターゲティング核酸のヌクレオシド間骨格を形成するといってもよい。核酸ターゲティング核酸の連結または骨格は、３’〜５’ホスホジエステル結合であってもよい。
【０１３７】
核酸ターゲティング核酸は、改変された骨格および／または改変されたヌクレオシド間
連結を含んでもよい。改変された骨格としては、骨格中にリン原子を保持するもの、および骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。
【０１３８】
適切な改変された核酸ターゲティング核酸骨格（その中にリン原子を含む）としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート、例えば、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホラミデートを挙げることができ、例としては、３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、およびボラノホスフェート（正常な３’−５’連結、２’−５’連結の類似体、ならびに逆位の極性を有するもの）が挙げられ、ここで１つまたはそれ以上のヌクレオチド間連結は、３’−３’、５’−５’または２’−２’連結である。逆位の極性を有している適切な核酸ターゲティング核酸は、最も３’側のヌクレオチド間連結で単一の３’−３’連結を含んでもよい（すなわち、核酸塩基が失われているか、またはヒドロキシル基をその位置に有する、単一の逆位ヌクレオシド残基）。種々の塩（例えば、塩化カリウムまたは塩化ナトリウム）、混合塩、および遊離の塩型もまた含まれてもよい。
【０１３９】
核酸ターゲティング核酸は、１つまたはそれ以上のホスホロチオエートおよび／またはヘテロ原子ヌクレオシド間連結、具体的には、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（すなわち、メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（ここで天然のホスホジエステルヌクレオチド間連結は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−として示される）を含んでもよい。
【０１４０】
核酸ターゲティング核酸は、モルホリノ骨格構造を含んでもよい。例えば、核酸は、リボース環の位置に６員のモルホリノ環を含んでもよい。これらの実施形態のいくつかでは、ホスホロジアミデートまたは他の非ホスホジエステルヌクレオシド間連結が、ホスホジエステル連結を置き換えてもよい。
【０１４１】
核酸ターゲティング核酸は、短鎖のアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子、およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、あるいは１つまたはそれ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環ヌクレオシド間連結によって形成されるポリヌクレオチド骨格を含んでもよい。これらとしては、モルホリノ連結を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルキレン含有骨格；スルファミン酸塩骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸塩およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合のＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分の部分を有しているものが挙げられる。
【０１４２】
核酸ターゲティング核酸は、核酸模倣物を含んでもよい。「模倣物」という用語は、ポリヌクレオチドを含むことを意図し得、ここでフラノース環のみ、またはフラノース環およびヌクレオチド間連結の両方が、非フラノース基で置き換えられ、フラノース環のみの置換はまた、糖代用であると言うこともできる。複素環塩基部分または改変された複素環塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションについて維持され得る。１つのこのような核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であってもよい。ＰＮＡでは、ポリヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、具体的にはアミノエチルグリシン骨格で置換されても
よい。ヌクレオチドは、保持されてもよく、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に対して直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物中の骨格は、２つまたはそれ以上の連結されたアミノエチルグリシン単位を含んでもよく、これがＰＮＡをアミド含有骨格に与える。複素環塩基部分は、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に対して直接または間接的に結合され得る。
【０１４３】
核酸ターゲティング核酸は、連結されたモルホリノ単位（すなわち、モルホリノ核酸）を含んでもよく、モルホリノ環に複素環塩基が結合されている。連結基は、モルホリノ核酸中のモルホリノ単量体単位を連結し得る。非イオン性のモルホリノ塩基のオリゴマーの化合物は、細胞のタンパク質との望ましくない相互作用が少ない場合がある。モルホリノベースのポリヌクレオチドは、核酸ターゲティング核酸の非イオン性模倣物であってもよい。モルホリノの分類内の種々の化合物は、異なる連結基を用いて連結され得る。ポリヌクレオチド模倣物のさらなる分類は、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と呼ばれてもよい。核酸分子中に正常に存在するフラノース環は、シクロヘキセニル環で置き換えられ得る。ＣｅＮＡ  ＤＭＴ保護ホスホラミダイト単量体を調製して、ホスホラミダイト化学を用いるオリゴマー化合物合成に用いてもよい。核酸鎖へのＣｅＮＡモノマーの組み込みは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの安定性を増大し得る。ＣｅＮＡオリゴアデニレートは、天然の複合体と同様の安定性を有する核酸相補体との複合体を形成し得る。さらなる改変は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでもよく、ここで２’−ヒドロキシル基が糖の環の４’炭素原子に連結されて、それによって２’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシメチレン連結が形成され、これによって二環式の糖部分が形成される。連結は、メチレン（−ＣＨ２−）であって、２’酸素原子および４’炭素原子を架橋する基であって、ここでｎが１または２である。ＬＮＡおよびＬＮＡ類似体は、相補性の核酸との極めて高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０℃）、３’−エキソ核酸分解に向かう安定性、および良好な溶解特性を提示し得る。
【０１４４】
核酸ターゲティング核酸は、１つまたはそれ以上の置換されている糖部分を含んでもよい。適切なポリヌクレオチドは、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルから選択される糖置換基を含んでもよく、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換されている、または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。特に適切なのは、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２であり、ここでｎおよびｍは、１〜約１０である。糖置換基は、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換されている低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されているシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、核酸ターゲティング核酸の薬物動態学的特性を改善するための基、または核酸ターゲティング核酸の薬力学的特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基から選択され得る。適切な改変としては、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても公知、すなわち、アルコキシアルコキシ基）を挙げることができる。さらに適切な改変としては、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、（すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、２’−ＤＭＡＯＥとしても公知）、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を挙げることができる。
【０１４５】
他の適切な糖置換基としては、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、−Ｏ−アリル（−−Ｏ−−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）およびフルオロ（Ｆ）を挙げることができる。２’−糖置換基は、アラビノ（上）位置またはリボ（下）位置であってもよい。適切な２’−アラビノ改変は、２’−Ｆである。同様の改変がまた、オリゴマーの化合物上の他の位置で、特に３’末端ヌクレオシド上の糖の３’位置、または２’−５’連結ヌクレオチド中、および５’末端ヌクレオチドの５’位置でも行われる。オリゴマー化合物はまた、ペントフラノシル糖の位置にシクロブチル部分のような糖模倣物を有してもよい。
【０１４６】
核酸ターゲティング核酸は、核酸塩基（単に「塩基」と呼ばれる場合が多い）の改変または置換を含んでもよい。本明細書において用いる場合、「未改変の」または「天然の」核酸塩基としては、プリン塩基、（例えば、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））、およびピリミジン塩基、（例えば、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ））を挙げることができる。改変された核酸塩基としては、他の合成のおよび天然の核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換のアデニンおよびグアニン、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換のウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを挙げることができる。改変された核酸塩基としては、三環系ピリミジン類、例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば、置換されているフェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−（ｂ）（１，４）ベンンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３−ｄ）ピリミジン−２−オン）を挙げることができる。
【０１４７】
複素環塩基部分としては、プリンまたはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンで置換されるものを挙げることができる。核酸塩基は、ポリヌクレオチド化合物の結合親和性を増大するために有用であり得る。これらとしては、５−置換のピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換のプリン、例としては、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを挙げることができる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃まで増大し得、かつ適切な塩基置換であり得る（例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル糖改変と組み合わせた場合）。
【０１４８】
核酸ターゲティング核酸の改変は、核酸ターゲティング核酸に対して、１つまたはそれ以上の部分またはコンジュゲート（核酸ターゲティング核酸の活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強し得る）に対して化学的に連結する工程を含み得る。これらの部分またはコンジュゲートは、第一級または第二級のヒドロキシル基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基を含んでもよい。コンジュゲート基としては、限定するものではないが
、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態学的特性を増強する基を挙げることができる。コンジュゲート基としては、限定するものではないが、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素を挙げることができる。薬力学的特性を向上する基としては、標的核酸の取り込みを改善する基、標的核酸の分解に対する耐性を向上する基、および／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。薬物動態学的特性を向上し得る基としては、核酸の取り込み、分布、代謝または排出を改善する基が挙げられる。コンジュゲート部分としては、限定するものではないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基）、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミトイル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を挙げることができる。
【０１４９】
改変としては、「タンパク質形質導入ドメイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ）」またはＰＴＤ（すなわち、細胞貫通性ペプチド（ＣＰＰ））が挙げられ得る。ＰＴＤとは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜または小胞膜を横切ることを容易にする、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または有機もしくは無機の化合物を指してもよい。ＰＴＤは、小さい極性の分子から大きい高分子および／またはナノ粒子にまでおよんでもよく、かつ分子が膜を横切ること、例えば、細胞外空間から細胞内空間、または細胞質からオルガネラ内へ移動することを容易にし得る、別の分子に結合されてもよい。ＰＴＤは、ポリペプチドのアミノ末端に共有結合され得る。ＰＴＤは、ポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合され得る。ＰＴＤは、核酸に共有結合されてもよい。例示的なＰＴＤとしては、限定するものではないが、最小ペプチドタンパク質形質導入ドメイン；ポリアルギニン配列（細胞へ直接侵入するために十分なアルギニンの数（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０アルギニン）を含む）、ＶＰ２２ドメイン、ドロソフィリア・アンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）タンパク質形質導入ドメイン、短縮ヒトカルシトニンペプチド、ポリリジン、およびトランスポータン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）、アルギニンホモポリマー（３アルギニン残基から５０アルギニン残基まで）を挙げることができる。ＰＴＤは、活性化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）であってもよい。ＡＣＰＰは、マッチングするポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９または「Ｅ９」）に対して切断可能なリンカーを介して接続される、ポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９または「Ｒ９」）を含んでもよく、これは、正味の電荷をほぼゼロまで低下し得、それによって細胞への接着および取り込みを阻害する。リンカーの切断の際、ポリアニオンは、遊離され得、局所的にポリアルギニンおよび、そのもともとの接着性をアンマスキングし、それによってＡＣＰＰを「活性化」して膜を横切らせる。
【０１５０】
「ヌクレオチド」とは一般的には、塩基−糖−リン酸塩の組み合わせを指してもよい。ヌクレオチドは、合成のヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチドは合成のヌクレオチド類似体を含んでもよい。ヌクレオチドは、核酸配列の単量体単位であってもよい（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ））。ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオシド三リン酸アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはその誘導体を含み得る。このような誘導体としては、例えば、［αＳ］
ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄＡＴＰ、およびヌクレオチド誘導体（それらを含有する核酸分子に対してヌクレアーゼ耐性を付与する）を挙げることができる。ヌクレオチドという用語は、本明細書で用いられる場合、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびそれらの誘導体を指してもよい。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例示的な例としては、限定するものではないが、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰを挙げることができる。ヌクレオチドは、未標識であってもよいし、または周知の技術によって検出可能に標識されてもよい。標識はまた、量子ドットで行われてもよい。検出可能な標識としては、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識を挙げることができる。ヌクレオチドの蛍光標識としては、限定するものではないが、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ）、オレゴングリーン、テキサスレッド、シアニンおよび５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）が挙げられ得る。蛍光標識されたヌクレオチドの特定の例としては、［Ｒ６Ｇ］ｄＵＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＵＴＰ、［Ｒ１１０］ｄＣＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＣＴＰ、［ＪＯＥ］ｄｄＡＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ＦＡＭ］ｄｄＣＴＰ、［Ｒ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、［ＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ、［ｄＲ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ｄＲ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ｄＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、および［ｄＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．から入手可能）、フルオロリンクデオキシヌクレオチド（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  ＤｅｏｘｙＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、フルオロリンクＣｙ３−ｄＣＴＰ、フルオロリンクＣｙ５−ｄＣＴＰ、フルオロリンクフルオロ（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ
Ｆｌｕｏｒ）Ｘ−ｄＣＴＰ、フルオロリンクＣｙ３−ｄＵＴＰ、およびフルオロリンクＣｙ５−ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉｌｌ．から入手可能）；フルオレセイン−１５−ｄＡＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、テトラメチル−ローダミン−６−ｄＵＴＰ、ＩＲ７７０−９−ｄＡＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、およびフルオレセイン−１５−２’−ｄＡＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．から入手可能）；ならびに染色体標識ヌクレオチド（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−１４−ｄＵＴＰ、カスケードブルー−７−ＵＴＰ、カスケードブルー−７−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、オレゴングリーン４８８−５−ｄＵＴＰ、ローダミングリーン−５−ＵＴＰ、ローダミングリーン−５−ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＵＴＰ、テキサスレッド−５−ＵＴＰ、テキサスレッド−５−ｄＵＴＰ、およびテキサスレッド−１２−ｄＵＴＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇから入手可能）を挙げることができる。ヌクレオチドはまた化学的改変によって標識されても、またはマークされてもよい。化学的に改変された単一のヌクレオチドは、ビオチン−ｄＮＴＰであってもよい。ビオチン化ｄＮＴＰのいくつかの非限定的な例としては、ビオチン−ｄＡＴＰ（例えば、ビオ−Ｎ６−ｄｄＡＴＰ、ビオチン−１４−ｄＡＴＰ）、ビオチン−ｄＣＴＰ（例えば、ビオチン−１１−ｄＣＴＰ、ビオチン−１４−ｄＣＴＰ）、およびビオチン−ｄＵＴＰ（例えば、ビオチン−１１−ｄＵＴＰ、ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、ビオチン−２０−ｄＵＴＰ）を挙げることができる。
【０１５１】
本明細書において用いる場合、「Ｐ−ドメイン」とは、核酸ターゲティング核酸中のあ
る領域を指してもよい。Ｐ−ドメインは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、部位特異的ポリペプチド、および／または核酸ターゲティング核酸と相互作用し得る。Ｐ−ドメインは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、部位特異的ポリペプチド、および／または核酸ターゲティング核酸と直接または間接的に相互作用し得る。本明細書において用いる場合、「ＰＡＭ相互作用領域」「抗反復隣接領域」および「Ｐ−ドメイン」という用語は交換可能に用いられてもよい。
【０１５２】
本明細書において用いる場合、「精製された」とは、組成物のうち少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％を含む分子（例えば、部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸）を指してもよい。例えば、部位特異的ポリペプチドの１０％を含むが、精製ステップの後は、部位特異的ポリペプチドの６０％を含むサンプルならば、このサンプルは精製されているということができる。精製されたサンプルとは、濃縮されたサンプル、または対象とする粒子以外の粒子を除去するための方法を受けたサンプルを指してもよい。
【０１５３】
本明細書において用いる場合、「再活性化剤」とは一般的には、酵素学的に不活性なポリペプチドを酵素学的に活性なポリペプチドに変化し得る任意の剤を指してもよい。イミダゾールは、再活性化剤であってもよい。リガンド類似体は、再活性化剤であってもよい。
【０１５４】
本明細書において用いる場合、「組換え」とは、特定の宿主（例えば、細胞）に対して外来の供給源に由来する配列、または同じ供給源由来の場合は、そのもとの形態から改変されている配列を指してもよい。細胞中の組換えの核酸としては、特定の細胞に対して内因性であるが、例えば、部位特異的変異生成の使用を通じて改変されている核酸を挙げることができる。この用語は、天然に存在するＤＮＡ配列の天然には存在しない複数のコピーを含んでもよい。従って、この用語は、細胞に対して外来であるかもしくは異種であるか、またはその核酸がもともと見出されない細胞内の位置もしくは形態では細胞に対して相同である、核酸を指してもよい。同様に、ポリペプチドまたはアミノ酸配列の状況で用いる場合、外因性ポリペプチドまたはアミノ酸配列とは、その特定の細胞に対して外来の供給源に由来するか、または同じ供給源由来の場合、そのもとの形態から改変されているポリペプチドもしくはアミノ酸の配列であってもよい。
【０１５５】
本明細書において用いる場合、「部位特異的ポリペプチド」とは、一般的には、ヌクレアーゼ、部位特異的ヌクレアーゼ、エンドリボヌクレアーゼ、条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ、アルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔ）、および核酸結合タンパク質を指してもよい。部位特異的ポリペプチドまたはタンパク質としては、ヌクレアーゼ、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ、例えば、ＰＩ−ＴｌｉＩＩ、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＤｍｏＩおよびＩ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリーヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリーヌクレアーゼ、Ｖｓｒ様ヌクレアーゼ、エンドリボヌクレアーゼ、エクソリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、およびエクソヌクレアーゼを挙げることができる。部位特異的ポリペプチドとは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、および／またはＵ型のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓ遺伝子のメンバーを指してもよい。部位特異的ポリペプチドは、反復関連ミステリアスプロテイン（ＲＡＭＰ）スーパーファミリー（例えば、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６サブファミリー）のメンバーを指してもよい。部位特異的ポリペプチドは、アルゴノートタンパク質を指してもよい。
【０１５６】
部位特異的ポリペプチドとは、ある種のタンパク質であってもよい。部位特異的ポリペプチドとは、ヌクレアーゼを指してもよい。部位特異的ポリペプチドとは、エンドリボヌクレアーゼを指してもよい。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドの任意
の改変された（例えば、短縮された、変異された、長くされた）ポリペプチド配列または相同体を指してもよい。部位特異的ポリペプチドは、コドン最適化されてもよい。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのコドン最適化相同体であってもよい。部位特異的ポリペプチドは、酵素学的に不活性であっても、部分的に活性であっても、構成的に活性であっても、完全に活性であっても、誘導性に活性であっても、および／またはさらに活性であってもよい（例えば、タンパク質またはポリペプチドの野性型相同体よりも）。部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９であってもよい。部位特異的ポリペプチドは、Ｃｓｙ４であってもよい。部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ５またはＣａｓ５ファミリーのメンバーであってもよい。部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ６またはＣａｓ６ファミリーのメンバーであってもよい。
【０１５７】
いくつかの場合には、部位特異的ポリペプチド（例えば、変種、変異した、酵素学的に不活性なおよび／または条件的に酵素学的に不活性な部位特異的ポリペプチド）は、核酸を標的とし得る。部位特異的ポリペプチド（例えば、変種、変異した、酵素学的に不活性なおよび／または条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ）は、ＲＮＡを標的とし得る。ＲＮＡを標的とし得るエンドリボヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ６およびＣａｓ５のような他のＣＲＩＳＰＲサブファミリーのメンバーを挙げることができる。
【０１５８】
本明細書において用いる場合、「特異的、特定の」という用語は、２つの分子の相互作用であって、その分子のうちの１つが、例えば、化学的方法または物理的方法を通じて、第２の分子に特異的に結合する相互作用を指してもよい。例示的な特異的な結合相互作用とは、抗原−抗体結合、アビジン−ビオチン結合、炭水化物およびレクチン、相補的な核酸配列（例えば、ハイブリダイズする）、相補的なペプチド配列、例としては組換え方法によって形成される配列を含む、エフェクターおよび受容体分子、酵素補因子および酵素、酵素阻害剤および酵素などを指してもよい。「非特異的」とは、特異的ではない２つの分子の間の相互作用を指してもよい。
【０１５９】
本明細書において用いる場合、「固体支持体」とは、一般的には、任意の不溶性または部分的に可溶性の物質を指してもよい。固体支持体とは、試験紙、マルチウェルディッシュなどを指してもよい。固体支持体は、種々の物質（例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然のおよび改変されたセルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および磁鉄鉱）を含んでもよく、かつアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁性ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび／またはシリコンチップおよび表面、ニトロセルロースストリップ、ナイロン膜、シート、反応トレイのウェル（例えば、マルチウェルプレート）、プラスチックチューブなどを含む種々の形態で提供されてもよい。固体支持体は、固体であっても、半固体であっても、ビーズであっても、または表面であってもよい。支持体は、溶液中で移動性であっても、または固定されていてもよい。固体支持体は、ポリペプチドを捕捉するために用いられてもよい。固体支持体は捕捉剤を含んでもよい。
【０１６０】
本明細書において用いる場合、「標的核酸」とは、一般的には、本開示の方法で用いられるべき核酸を指してもよい。標的核酸とは、染色体の配列または染色体外の配列（例えば、エピソーム配列、小円配列、ミトコンドリアの配列、クロロプラスト配列など）を指してもよい。標的核酸はＤＮＡであってもよい。標的核酸はＲＮＡであってもよい。標的核酸は、本明細書においては、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、および／または「標的ポリヌクレオチド」と交換可能に用いられ得る。標的核酸とは、単一のヌクレオチド置換によって核酸サンプル中の任意の他の配列と関連し得ない核酸配列であってもよい。標的核酸とは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド置換によって、核酸サンプル中で任意の他の配列に関連し得ない核酸配列を指してもよい。い
くつかの実施形態では、置換は、標的核酸の５’末端の５、１０、１５、２０、２５、３０、または３５ヌクレオチド内には存在し得ない。いくつかの実施形態では、置換は、標的核酸の３’末端の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５ヌクレオチド内には存在し得ない。
【０１６１】
本明細書において用いる場合、「ｔｒａｃｒＲＮＡ」とは一般的には、野性型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌由来のｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号４３３）、配列番号４３１〜５６２）に対して少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／または配列類似性を有する核酸を指してもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡとは、野性型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して多くとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／または配列類似性を有する核酸を指してもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡとは、欠失、挿入、または置換、変種、変異、またはキメラのようなヌクレオチド変化を含み得るｔｒａｃｒＲＮＡの改変型を指してもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡとは、少なくとも６つの連続するヌクレオチドのストレッチにおいて、野性型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、化膿レンサ球菌由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に対して少なくとも約６０％同一であり得る核酸を指してもよい。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６つの連続するヌクレオチドのストレッチにおいて、野性型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、化膿レンサ球菌由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に対して、少なくとも約６０％同一、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一であり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡとは、中央−ｔｒａｃｒＲＮＡを指してもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を指してもよい。
【０１６２】
ＣＲＩＳＰＲシステム
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートは、多くの原核生物（例えば、細菌および古細菌）のゲノムで見出されるゲノム遺伝子座であってもよい。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、原核生物の外来の侵入物（例えば、ウイルス、ファージ）に対する耐性を提供し得る。この方法では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、外来の侵入物に対する原核生物防御を補助するためのある種の免疫系として機能することが考えられ得る。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の機能には３つの段階があり得る：この遺伝子座への新しい配列の組み込み、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の生物発生、および外来の侵入物核酸のサイレンシング。ＣＲＩＳＰＲシステムには４つの種類があり得る（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｕ型）。
【０１６３】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、「反復、リピート」と呼ばれる多数の短い反復性の配列を含んでもよい。反復は、ヘアピン構造を形成してもよく、および／または反復は、非構造化一本鎖配列であってもよい。反復は、クラスター中に存在してもよい。反復配列は、種の間で高頻度に分岐し得る。反復は、「スペーサー」と呼ばれる固有の介在性配列で規則的に空間を空けられてもよく、それによって反復−スペーサー−反復遺伝子座の構造が生じる。スペーサーは、公知の外来の侵入物配列と同一であってもよいし、または高い相同性を有してもよい。スペーサー−反復単位は、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードし得る。ｃｒＲＮＡは、スペーサー−反復単位の成熟型を指してもよい。ｃｒＲＮＡは、標的核酸を標的とすること（例えば、可能性としては、外来核酸に対する監視機構として）に関与し得る「シード」配列を含んでもよい。シード配列は、ｃｒＲＮＡの５’末端に位置しても、または３’末端に位置してもよい。
【０１６４】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ｃｒｉｓｐｒ関連遺伝子（Ｃｒｉｓｐｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔ
ｅｄ  Ｇｅｎｅｓ）（Ｃａｓ）遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよい。Ｃａｓ遺伝子は、ｃｒＲＮＡ機能の生物発生および／または干渉段階に関与し得る。Ｃａｓ遺伝子は、種と相同体との間の極度の配列（例えば、一次配列）分岐を示し得る。例えば、Ｃａｓ１相同体は、相同体の間で１０％未満の初代配列同一性を含んでもよい。いくつかのＣａｓ遺伝子は、相同な二次的構造および／または三次的構造を含んでもよい。例えば、極度の配列分岐にかかわらず、ＣＲＩＳＰＲタンパク質のＣａｓ６ファミリーの多くのメンバーは、Ｎ末端フェレドキシン様フォールディングを含む。Ｃａｓ遺伝子は、それが由来する生物体に応じて命名され得る。例えば、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）のＣａｓ遺伝子は、Ｃｓｍ−型と呼ばれ、高温性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ遺伝子は、Ｃｓｎ−型と呼ばれ、およびパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＣａｓ遺伝子は、Ｃｍｒ−型と呼ばれ得る。
【０１６５】
組み込み
ＣＲＩＳＰＲシステムの組み込み段階とは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が、外来の侵入物によって感染される際に、新しいスペーサーをｃｒＲＮＡアレイに組み込む能力を指してもよい。外来の侵入物スペーサーの獲得によって、同じ外来侵入物によるその後の攻撃に対して免疫付与が補助され得る。組み込みは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のリーダー末端で生じ得る。Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１およびＣａｓ２）は、新規なスペーサー配列の組み込みに関与し得る。組み込みは、同種のＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｉ型〜ＩＩＩ型）に関して同様に進行し得る。
【０１６６】
生物発生
成熟ｃｒＲＮＡは、より長い多シストロン性ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座転写物（すなわち、前ｃｒＲＮＡアレイ）からプロセシングされ得る。プレ−ｃｒＲＮＡアレイは、複数のｃｒＲＮＡを含んでもよい。プレ−ｃｒＲＮＡアレイ中の反復は、Ｃａｓ遺伝子によって認識され得る。Ｃａｓ遺伝子は、反復に結合して、反復を切断し得る。作用は、複数のｃｒＲＮＡを遊離し得る。ｃｒＲＮＡを、トリミング（例えば、エクソヌクレアーゼによる）などの、成熟型ｃｒＲＮＡを生じるためのさらなる事象に供してもよい。ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ反復配列を全て含んでも、そのうちいくつかを含んでも、または含まなくてもよい。
【０１６７】
干渉
干渉とは、外来侵入物による感染と戦うことを機能的に担うＣＲＩＳＰＲシステムの中の段階を指してもよい。ＣＲＩＳＰＲ干渉はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ（例えば、ここでは標的ＲＮＡが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって標的される（例えば、ハイブリダイズされる））と同様の機構に従ってもよく、これによって、標的ＲＮＡの分解および／または不安定化が生じ得る。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｃｒＲＮＡおよびＣａｓ遺伝子をカップリングすることによって標的核酸の干渉を行い、これによってＣＲＩＳＰＲリボヌクレオタンパク質（ｃｒＲＮＰ）を形成し得る。ｃｒＲＮＰのｃｒＲＮＡは、外来の侵入物核酸へｃｒＲＮＰをガイドし得る（例えば、ハイブリダイゼーションを通じて外来の侵入物核酸を認識することによって）。ハイブリダイズされた標的の外来の侵入物核酸−ｃｒＲＮＡ単位を、Ｃａｓタンパク質による切断に供してもよい。標的核酸干渉は、標的核酸中にスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とし得る。
【０１６８】
ＣＲＩＳＰＲシステムの種類
４種のＣＲＩＳＰＲシステムが存在し得る：Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、およびＵ型。２つ以上のＣＲＩＳＰＲ型システムは、生物体で見出され得る。ＣＲＩＳＰＲシステムは、互いに相補的であってもよく、および／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のプロセシングを容易にするために機能的ユニットをトランスに与えてもよい。
【０１６９】
Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステム
Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステムのｃｒＲＮＡ生物発生は、複数のｃｒＲＮＡを生じ得る、プレ−ｃｒＲＮＡアレイにおける反復のエンドリボヌクレアーゼ切断を含んでもよい。Ｉ型システムのｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡトリミングに供されなくてもよい。ｃｒＲＮＡは、カスケードと呼ばれる多重タンパク質複合体によりプレ−ｃｒＲＮＡアレイからプロセシングされ得る（抗ウイルス防御のためのＣＲＩＳＰＲ関連複合体に由来）。カスケードは、タンパク質サブユニット（例えば、ＣａｓＡ−ＣａｓＥ）を含んでもよい。いくつかのサブユニットは、反復関連ミステリアスプロテイン（ＲＡＭＰ）スーパーファミリー（例えば、Ｃａｓ５およびＣａｓ６ファミリー）のメンバーであってもよい。カスケード−ｃｒＲＮＡ複合体（すなわち、干渉複合体）は、標的核酸とのｃｒＲＮＡのハイブリダイゼーションを通じて標的核酸を認識し得る。カスケード干渉複合体は、Ｃａｓ３ヘリカーゼ／ヌクレアーゼを補充し得、これがトランスで作用して、標的核酸の切断を容易にし得る。Ｃａｓ３ヌクレアーゼは、標的核酸を切断し得る（例えば、そのＨＤヌクレアーゼドメインで）。Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステム中の標的核酸は、ＰＡＭを含んでもよい。Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステム中の標的核酸はＤＮＡであってもよい。
【０１７０】
Ｉ型システムはさらに、もともとのそれらの種によって小分割されてもよい。Ｉ型システムは、ＩＡ型（アエロピュルム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）またはＣＡＳＳ５）；ＩＢ（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）−ハロアーキュラ・マリスモルツイ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ  ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ）またはＣＡＳＳ７）；ＩＣ（デスルホビブリオ・ブルガリス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）またはＣＡＳＳ１）；ＩＤ；ＩＥ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはＣＡＳＳ２）；およびＩＦ（エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）またはＣＡＳＳ３）サブファミリーを含んでもよい。
【０１７１】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中のｃｒＲＮＡ生物発生は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、内因性のＲＮａｓｅＩＩＩによって改変され得る。複合体のｔｒａｃｒＲＮＡは、プレ−ｃｒＲＮＡアレイ中のｃｒＲＮＡ反復に対してハイブリダイズし得る。内因性のＲｎａｓｅＩＩＩは、プレ−ｃｒＲＮＡを切断するために補充され得る。切断されたｃｒＲＮＡは、エクソリボヌクレアーゼトリミングに供されて、成熟型ｃｒＲＮＡ（例えば、５’トリミング）を生じ得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡにハイブリダイズされたまま残存し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）と会合し得る。ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体のｃｒＲＮＡは、複合体を標的核酸にガイドし得る（標的核酸へｃｒＲＮＡがハイブリダイズし得る）。標的核酸に対するｃｒＲＮＡのハイブリダイゼーションは、標的核酸切断に関してＣａｓ９を活性化し得る。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中の標的核酸は、ＰＡＭを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、標的核酸に対する部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）の結合を容易にするために必須である。ＩＩ型システムは、さらにＩＩ−Ａ（ＮｍｅｎｉまたはＣＡＳＳ４）およびＩＩ−Ｂ（ＮｍｅｎｉまたはＣＡＳＳ４）に小分割されてもよい。
【０１７２】
ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム
ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中のｃｒＲＮＡ生物発生は、プレ−ｃｒＲＮＡアレイ中の反復のエンドリボヌクレアーゼ切断のステップを含んでもよく、これによって複数のｃｒＲＮＡが生じ得る。ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおける反復は、非構造化一本鎖領域であってもよい。反復は、エンドリボヌクレアーゼのＲＡＭＰスーパーファミリーのメンバー（例えば、Ｃａｓ６）によって認識されて切断されてもよい。ＩＩＩ型（例えば、
ＩＩＩ−Ｂ型）システムのｃｒＲＮＡを、ｃｒＲＮＡトリミング（例えば、３’トリミング）に供してもよい。ＩＩＩ型システムは、ポリメラーゼ様タンパク質（例えば、Ｃａｓ１０）を含んでもよい。Ｃａｓ１０は、パームドメインに対して相同なドメインを含んでもよい。
【０１７３】
ＩＩＩ型システムは、複数のＲＡＭＰスーパーファミリーメンバータンパク質および１つまたはそれ以上のＣＲＩＳＰＲポリメラーゼ様タンパク質を含む複合体でプレ−ｃｒＲＮＡをプロセシングし得る。ＩＩＩ型システムは、ＩＩＩ−ＡおよびＩＩＩ−Ｂに分割されてもよい。ＩＩＩ−Ａ型システムの干渉複合体（すなわち、Ｃｓｍ複合体）は、プラスミド核酸を標的とし得る。プラスミド核酸の切断は、複合体中のポリメラーゼ様タンパク質のＨＤヌクレアーゼドメインで生じ得る。ＩＩＩ−Ｂ型システムの干渉複合体（すなわち、Ｃｍｒ複合体）は、ＲＮＡを標的とし得る。
【０１７４】
Ｕ型ＣＲＩＳＰＲシステム
Ｕ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｉ〜ＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲシステムのいずれかの特徴的な遺伝子（例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ９、Ｃａｓ６、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２）を含まなくてもよい。Ｕ型ＣＲＩＳＰＲのＣａｓ遺伝子の例としては、限定するものではないが、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４を挙げることができる。Ｕ型のＣａｓ遺伝子は、Ｉ〜ＩＩＩ型のＣａｓ遺伝子とは極めて隔たった相同体であり得る。例えば、Ｃｓｆ３は、Ｃａｓ５ファミリーのメンバーに対して高度に分岐しているが、機能的には類似であり得る。Ｕ型システムは、Ｉ〜ＩＩＩ型のシステムにおいてトランスで補完的に機能し得る。いくつかの場合には、Ｕ型システムは、ＣＲＩＳＰＲアレイのプロセシングと関連されなくてもよい。Ｕ型システムは、別の外来の侵入物防御システムに相当し得る。
【０１７５】
ＲＡＭＰスーパーファミリー
反復関連ミステリアスプロテイン（ＲＡＭＰプロテイン）は、β−鎖（β）およびα−らせん（α）のβαββαβ［β−α−β−β−α−β］モチーフを含む、タンパク質フォールディングによって特徴付けられ得る。ＲＡＭＰタンパク質は、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）（これは、フェレドキシンまたはフェレドキシン様フォールディングを含み得る）を含んでもよい。ＲＡＭＰタンパク質は、Ｎ末端ＲＲＭを含んでもよい。ＲＡＭＰタンパク質のＣ末端ドメインは、変化し得るが、またＲＲＭを含んでもよい。ＲＡＭＰファミリーのメンバーは、構造化および／または非構造化核酸を認識し得る。ＲＡＭＰファミリーのメンバーは、一本鎖および／または二本鎖核酸を認識し得る。ＲＡＭＰタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲのＩ型およびＩＩＩ型のシステムの生物発生および／または干渉段階に関与し得る。ＲＡＭＰスーパーファミリーのメンバーは、Ｃａｓ７、Ｃａｓ６、およびＣａｓ５のファミリーのメンバーを含んでもよい。ＲＡＭＰスーパーファミリーのメンバーは、エンドリボヌクレアーゼであってもよい。
【０１７６】
ＲＡＭＰスーパーファミリー中のＲＲＭドメインは、過度に分岐され得る。ＲＲＭドメインは、野性型の例示的なＲＲＭドメイン（例えば、Ｃａｓ７由来のＲＲＭドメイン）に対して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％の配列または構造的な相同性を含んでもよい。ＲＲＭドメインは、野性型の例示的なＲＲＭドメイン（例えば、Ｃａｓ７由来のＲＲＭドメイン）に対して、多くとも約５％、多くとも約１０％、多くとも約１５％、多くとも約２０％、多くとも約２５％、多くとも約３０％、多くとも約３５％、多くとも約４０％、多くとも約４５％、多くとも約５０％、多くとも約５５％、多くとも約６０％、多くとも約６５％、多くとも約７０％、多くとも約
７５％、多くとも約８０％、多くとも約８５％、多くとも約９０％、多くとも約９５％、または１００％の配列または構造的な相同性を含んでもよい。
【０１７７】
Ｃａｓ７ファミリー
Ｃａｓ７ファミリーのメンバーは、ＲＡＭＰファミリータンパク質のサブクラスであってもよい。Ｃａｓ７ファミリーのタンパク質は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステムで分類され得る。Ｃａｓ７ファミリーのメンバーは、いくつかのＲＡＭＰファミリーのメンバーにはよく知られているグルシンリッチのループを含まない場合がある。Ｃａｓ７ファミリーのメンバーは、１つのＲＲＭドメインを含んでもよい。Ｃａｓ７ファミリーのメンバーとしては、限定するものではないが、Ｃａｓ７（ＣＯＧ１８５７）、Ｃａｓ７（ＣＯＧ３６４９）、Ｃａｓ７（ＣＴ１９７５）、Ｃｓｙ３、Ｃｓｍ３、Ｃｍｒ６、Ｃｓｍ５、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ１、Ｃｓｆ２、およびＣｓｃ２を挙げることができる。
【０１７８】
Ｃａｓ６ファミリー
Ｃａｓ６ファミリーは、ＲＡＭＰサブファミリーであってもよい。Ｃａｓ６ファミリーのメンバーは、２つのＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）様ドメインを含んでもよい。Ｃａｓ６ファミリーのメンバー（例えば、Ｃａｓ６ｆ）は、Ｎ末端ＲＲＭドメインおよび別個のＣ末端ドメインを含んでもよく、これは、ＲＲＭドメインに対して弱い配列類似性または構造的な相同性を示し得る。Ｃａｓ６ファミリーのメンバーは、エンドリボヌクレアーゼ活性に関与し得る触媒性ヒスチジンを含み得る。匹敵するモチーフは、Ｃａｓ５およびＣａｓ７のＲＡＭＰファミリーで見出され得る。Ｃａｓ６ファミリーのメンバーとしては、限定するものではないが、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ（例えば、Ｃｓｙ４）を挙げることができる。
【０１７９】
Ｃａｓ５ファミリー
Ｃａｓ５ファミリーは、ＲＡＭＰサブファミリーであってもよい。Ｃａｓ５ファミリーは、２つのサブグループに分割されてもよい：２つのＲＲＭドメインを含み得る１つのサブグループ、および１つのＲＲＭドメインを含み得る１つのサブグループ。Ｃａｓ５ファミリーのメンバーとしては、限定するものではないが、Ｃｓｍ４、Ｃｓｘ１０、Ｃｍｒ３、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５（ＢＨ０３３７）、Ｃｓｙ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｆ３を挙げることができる。
【０１８０】
Ｃａｓ遺伝子
例示的なＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ遺伝子としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３’（Ｃａｓ３−プライム）、Ｃａｓ３’’（Ｃａｓ３−二重プライム）、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ（以前はＣａｓＥ、Ｃｓｅ３と呼ばれた）、Ｃａｓ６ｆ（すなわち、Ｃｓｙ４）、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４を挙げることができる。表１は、ＣＲＩＳＰＲシステムのタイプによるＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ遺伝子の例示的な分類を示す。
【０１８１】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子の命名システムは、Ｃａｓ遺伝子が発見されて以来広範に書き換えを受けてきた。本出願の目的に関しては、本明細書で用いられるＣａｓ遺伝子名は、Ｍａｋａｒｏｖａら、「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの発展および分類（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ）」Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．
２０１１  Ｊｕｎｅ；９（６）：４６７〜４７７．Ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍｉｃｒｏ２５７７に概説される命名システムに基づく。
【０１８２】
【表１】
2018075026.tif 000002
【０１８３】
部位特異的ポリペプチド
部位特異的ポリペプチドは、標的核酸に結合し得るポリペプチドであってもよい。部位特異的ポリペプチドは、ヌクレアーゼであってもよい。
【０１８４】
部位特異的ポリペプチドは、核酸結合ドメインを含んでもよい。核酸結合ドメインは、核酸に接触する領域を含んでもよい。核酸結合ドメインは、核酸を含んでもよい。核酸結合ドメインは、タンパク質性の物質を含んでもよい。核酸結合ドメインは、核酸およびタンパク質性の物質を含んでもよい。核酸結合ドメインはＲＮＡを含んでもよい。単一の核酸結合ドメインが存在し得る。核酸結合ドメインの例としては、限定するものではないが、らせん・ターン・らせんドメイン、ジンクフィンガードメイン、ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）ドメイン、翼状らせん（ｗｉｎｇｅｄ  ｈｅｌｉｘ）ドメイン、翼状らせんターンらせん（ｗｉｎｇｅｄ  ｈｅｌｉｘ  ｔｕｒｎ  ｈｅｌｉｘ）ドメイン、らせん・ループ・らせん（ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ）ドメイン、ＨＭＧ−ｂｏｘドメイン、Ｗｏｒ３ドメイン、免疫グロブリンドメイン、Ｂ３ドメイン、ＴＡＬＥドメイン、ＲＮＡ−認識モチーフドメイン、二本鎖ＲＮＡ結合モチーフドメイン、二本鎖核酸結合ドメイン、一本鎖核酸結合ドメイン、ＫＨドメイン、ＰＵＦドメイン、ＲＧＧボックスドメイン、
ＤＥＡＤ／ＤＥＡＨボックスドメイン、ＰＡＺドメイン、Ｐｉｗｉドメイン、および低温ショックドメインを挙げることができる。
【０１８５】
核酸結合ドメインは、アルゴノートタンパク質のドメインであってもよい。アルゴノートタンパク質は、真核生物のアルゴノートであっても、または原核生物のアルゴノートであってもよい。アルゴノートタンパク質は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方に結合し得る。アルゴノートタンパク質は、ＲＮＡ、またはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を切断し得る。いくつかの場合には、アルゴノートタンパク質は、ＤＮＡに結合して、標的ＤＮＡを切断する。
【０１８６】
いくつかの場合には、２つまたはそれ以上の核酸結合ドメインは、一緒に連結されてもよい。複数の核酸結合ドメインを一緒に連結することは、ポリヌクレオチドターゲティング特異性の増大を提供し得る。２つまたはそれ以上の核酸結合ドメインは、１つまたはそれ以上のリンカーを介して連結され得る。リンカーは、可塑性リンカーであってもよい。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０またはそれ以上のアミノ酸長を含んでもよい。リンカーは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のグリシン含量を含んでもよい。リンカーは、多くとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のグリシン含量を含んでもよい。リンカーは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のセリン含量を含んでもよい。リンカーは、多くとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のセリン含量を含んでもよい。
【０１８７】
核酸結合ドメインは、核酸配列に結合し得る。核酸結合ドメインは、ハイブリダイゼーションを通じて核酸に結合し得る。核酸結合ドメインは、操作されてもよい（例えば、ゲノム中の配列に対してハイブリダイズするように操作されてもよい）。核酸結合ドメインは、分子クローニング技術（例えば、定方向進化、部位特異的変異、および論理的変異生成）によって操作されてもよい。
【０１８８】
部位特異的ポリペプチドは、核酸切断ドメインを含んでもよい。核酸切断ドメインは、任意の核酸切断タンパク質由来の核酸切断ドメインであってもよい。核酸切断ドメインは、ヌクレアーゼに由来し得る。適切な核酸切断ドメインとしては、エンドヌクレアーゼの核酸切断ドメイン（例えば、ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＲｅｃＢＣＤエンドヌクレアーゼ、Ｔ７エンドヌクレアーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＩＶ、Ｂａｌ３１エンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼＩ（エンドＩ）、ミクロコッカスヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼＩＩ（エンドＶＩ、エクソＩＩＩ））、エクソヌクレアーゼ、制限ヌクレアーゼ、エンドリボヌクレアーゼ、エクソリボヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮＡｓｅＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ）が挙げられる。いくつかの場合には、核酸切断ドメインは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼに由来し得る。部位特異的ポリペプチドは、複数の核酸切断ドメインを含んでもよい。核酸切断ドメインは、一緒に連結されてもよい。２つまたはそれ以上の核酸切断ドメインは、リンカーを介して連結されてもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは可塑性のリンカーであってもよい。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０またはそれ以上のアミノ酸長を含んでもよ
い。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、複数の核酸切断ドメインを含んでもよい。
【０１８９】
部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９、アルゴノート）は、２つまたはそれ以上のヌクレアーゼドメインを含んでもよい。Ｃａｓ９は、ＨＮＨもしくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインおよび／またはＲｕｖＣもしくはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含んでもよい。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、ＭｃｒＡ様フォールディングを含んでもよい。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、２つの逆平行のβ−鎖およびα−らせんを含んでもよい。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、二価陽イオン結合部位）を含んでもよい。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、標的核酸の１つの鎖（例えば、ｃｒＲＮＡ標的鎖の相補的な鎖）を切断し得る。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインを含むタンパク質は、エンドヌクレアーゼ、クリシン（ｃｌｉｃｉｎ）、制限エンドヌクレアーゼ、トランスポーゼース、およびＤＮＡパッケージング因子を含んでもよい。
【０１９０】
ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、ＲＮａｓｅＨまたはＲＮａｓｅＨ様フォールディングを含んでもよい。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨドメインは、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方に作用することを含む核酸ベースの機能の多様なセットに関与し得る。ＲＮａｓｅＨドメインは、複数のα−らせんに囲まれる５つのβ−鎖を含んでもよい。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、二価陽イオン結合部位）を含んでもよい。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨ様ドメインは、標的核酸の１つの鎖（例えば、ｃｒＲＮＡ標的鎖の非相補的な鎖）を切断し得る。ＲｕｖＣ、ＲｕｖＣ様、またはＲＮａｓｅＨ様ドメインを含むタンパク質としては、ＲＮａｓｅＨ、ＲｕｖＣ、ＤＮＡトランスポーゼース、レトロウイルスインテグラーゼ、およびアルゴノートタンパク質）を挙げることができる。
【０１９１】
部位特異的ポリペプチドはエンドリボヌクレアーゼであってもよい。部位特異的ポリペプチドは、酵素学的に不活性な部位特異的ポリペプチドであってもよい。部位特異的ポリペプチドは、条件的に酵素学的に不活性な部位特異的ポリペプチドであってもよい。部位特異的ポリペプチドは、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）中に二本鎖破壊または一本鎖破壊を導入し得る。二本鎖破壊は、細胞の内因性のＤＮＡ修復経路（例えば、相同組換えおよび非相同末端結合（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ）（ＮＨＥＪ）または選択的非相同体末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ））を刺激し得る。ＮＨＥＪは、相同な鋳型を必要とせずに、切断された標的核酸を修復し得る。これは、標的核酸の欠失を生じ得る。相同組換え（ＨＲ）は、相同な鋳型で生じ得る。相同な鋳型は、標的核酸切断部位に隣接する配列に対して相同である配列を含んでもよい。標的核酸が部位特異的ポリペプチドによって切断された後、切断部位は、破壊され得る（例えば、部位は、もとの核酸ターゲティング核酸および部位特異的ポリペプチドでの別の回の切断にはアクセス可能ではない場合がある）。
【０１９２】
いくつかの場合には、相同組換えは、外因性のポリヌクレオチド配列を標的核酸切断部位に挿入し得る。外因性のポリヌクレオチド配列は、ドナーポリヌクレオチドと呼ばれてもよい。本開示の方法のいくつかの場合には、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が、標的核酸切断部位に挿入され得る。ドナーポリヌクレオチドは、外因性のポリヌクレオチド配列であってもよい。ドナーポリヌクレオチドは、標的核酸切断部位で天然に存在しない配列であってもよい。ベクターは、ドナーポリヌクレオチドを含んでもよい。ＮＨＥＪおよび／またはＨＲに起因する標的ＤＮＡの改変は、例えば、変異、欠失、変更、組み込み、遺伝子補正、遺伝子置換、遺伝子タグ化、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破損、および／または遺伝子変異をもたらし得る。ゲノムＤＮＡ中に非天然核酸を組み込む方法は、ゲノム操作と呼ばれてもよい。
【０１９３】
いくつかの場合には、部位特異的ポリペプチドは、野性型の例示的な部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９、配列番号８）に対して多くとも１０％、多くとも１５％、多くとも２０％、多くとも３０％、多くとも４０％、多くとも５０％、多くとも６０％、多くとも７０％、多くとも７５％、多くとも８０％、多くとも８５％、多くとも９０％、多くとも９５％、多くとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【０１９４】
いくつかの場合には、部位特異的ポリペプチドは、野性型の例示的な部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９、配列番号８）に対して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【０１９５】
いくつかの場合には、部位特異的ポリペプチドは、野性型の例示的な部位特異的ポリペプチドのヌクレアーゼドメイン（例えば、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９、配列番号８）に対して、多くとも１０％、多くとも１５％、多くとも２０％、多くとも３０％、多くとも４０％、多くとも５０％、多くとも６０％、多くとも７０％、多くとも７５％、多くとも８０％、多くとも８５％、多くとも９０％、多くとも９５％、多くとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【０１９６】
部位特異的ポリペプチドは、１０の連続するアミノ酸において、野性型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９、配列番号８）に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、１０の連続するアミノ酸において、野性型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９、配列番号８）に対して多くとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含んでもよい。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン中の１０の連続するアミノ酸において、野性型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９、配列番号８）に対して、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン中の１０の連続するアミノ酸において、野性型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９、配列番号８）に対して、多くとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン中の１０の連続するアミノ酸において、野性型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９、配列番号８）に対して、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン中の１０の連続するアミノ酸において、野性型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９、配列番号８）に対して、多くとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含んでもよい。
【０１９７】
いくつかの場合には、部位特異的ポリペプチドは、野性型の例示的な部位特異的ポリペプチドのヌクレアーゼドメイン（例えば、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９）に対して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【０１９８】
部位特異的ポリペプチドは、野性型の例示的な部位特異的ポリペプチドの改変型を含んでもよい。野性型の例示的な部位特異的ポリペプチドの改変型は、部位特異的ポリペプチドの核酸切断活性を低下するアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含んでもよい。例えば、野性型の例示的な部位特異的ポリペプチドの改変型は、野性型の例示的な部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９）の核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有し得る。部位特異的ポリペプチドの改変型は、実質的な核酸切断活性を有さない場合がある。部位特異的ポリペプチドが、実質的な核酸切断活性を有さない改変型である場合、これは、「酵素学的に不活性な」と呼ばれてもよい。
【０１９９】
野性型の例示的な部位特異的ポリペプチドの改変型は、野性型の例示的な部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９）の核酸切断活性の９０％超、８０％超、７０％超、６０％超、５０％超、４０％超、３０％超、２０％超、１０％超、５％超、または１％超を有してもよい。
【０２００】
部位特異的ポリペプチドの改変型は、変異を含んでもよい。部位特異的ポリペプチドの改変型は、標的核酸上に一本鎖の破壊（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｂｒｅａｋ）（ＳＳＢ）（例えば、標的核酸の糖−リン酸塩骨格のうちの一方のみを切断することによる）を誘導し得るような変異を含んでもよい。変異は、野性型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９）の複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたはそれ以上で、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満の核酸切断活性を生じ得る。変異は、標的核酸の相補鎖を切断する能力を保持しているが、その標的核酸の非相補鎖を切断する能力が低下している、複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたはそれ以上を生じ得る。変異は、標的核酸の非相補鎖を切断する能力を保持しているが、その標的核酸の相補鎖を切断する能力が低下している、複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたはそれ以上を生じ得る。例えば、Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４およびＡｓｎ８５６のような、野性型の例示的な化膿レンサ球菌Ｃａｓ９ポリペプチドの中の残基は、複数の核酸切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）のうちの１つまたはそれ以上を不活性化するように変異されてもよい。変異されるべき残基は、野性型の例示的な化膿レンサ球菌のＣａｓ９ポリペプチド中の残基Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４およびＡｓｎ８５６に相当し得る（例えば、配列および／または構造的アラインメントによって決定される）。変異の非限定的な例としては、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４ＡまたはＮ８５６Ａを挙げることができる。当業者は、アラニン置換以外の変異が適切であることを認識する。
【０２０１】
Ｄ１０Ａ変異は、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つまたはそれ以上と組み合わされて、実質的にＤＮＡ切断活性を欠いている部位特異的ポリペプチドを生じ得る。Ｈ８４０Ａ変異は、Ｄ１０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つまたはそれ以上と組み合わされて、実質的にＤＮＡ切断活性を欠いている部位特異的ポリペプチドを生じ得る。Ｎ８５４Ａ変異は、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つまたはそれ以上と組み合わされて、実質的にＤＮＡ切断活性を欠いている部位特異的ポリペプチドを生じ得る。Ｎ８５６Ａ変異は、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＤ１０Ａ変異のうちの１つまたはそれ以上と組み合わされて、実質的にＤＮＡ切断活性を欠いている部位特異的ポリペプチドを生じ得る。１つの実質的に不活性なヌクレアーゼドメインを含む部位特異的ポリペプチドは、ニッカーゼと呼ばれてもよい。
【０２０２】
本開示の変異は、部位特異的変異によって生成され得る。変異としては、置換、付加、
および欠失、またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。いくつかの場合には、変異は、変異したアミノ酸をアラニンに変換する。いくつかの場合には、変異は、変異したアミノ酸を別のアミノ酸（例えば、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、またはアルギニン）に変換する。変異は、変異したアミノ酸を非天然のアミノ酸（例えば、セレノメチオニン）に変換し得る。変異は、変異したアミノ酸をアミノ酸模倣物（例えば、リン模倣物（ｐｈｏｓｐｈｏｍｉｍｉｃ））に変換し得る。変異は、保存的変異であってもよい。例えば、変異は、変異したアミノ酸を、変異したアミノ酸のサイズ、形状、電荷、極性、構造および／または回転異性体と似ているアミノ酸に変換し得る（例えば、システイン／セリン変異、リジン／アスパラギン変異、ヒスチジン／フェニルアラニン変異）。
【０２０３】
いくつかの場合には、部位特異的ポリペプチド（例えば、変種、変異した、酵素学的に不活性および／または条件的に酵素学的に不活性な部位特異的ポリペプチド）は、核酸を標的とし得る。部位特異的ポリペプチド（例えば、変種、変異した、酵素学的に不活性および／または条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ）は、ＲＮＡを標的とし得る。ＲＮＡを標的とし得る部位特異的ポリペプチドとしては、Ｃａｓ６およびＣａｓ５のような他のＣＲＩＳＰＲサブファミリーのメンバーを挙げることができる。
【０２０４】
部位特異的ポリペプチドは、１つまたはそれ以上の非天然配列（例えば、融合）を含んでもよい。
【０２０５】
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のＣａｓ９に対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、核酸結合ドメイン、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含んでもよい。
【０２０６】
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含んでもよい。
【０２０７】
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメインを含んでもよく、ここで核酸切断ドメインのうち一方または両方は、細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のＣａｓ９由来のヌクレアーゼドメインに対して、少なくとも５０％のアミノ酸同一性を含む。
【０２０８】
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）、および部位特異的ポリペプチドを非天然配列に連結するリンカーを含んでもよい。
【０２０９】
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）（ここで部位特異的ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％まで低下する核酸切断ドメインの一方または両方に変異を含む）を含んでもよい。
【０２１０】
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のＣａｓ９に対して
少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）（ここでヌクレアーゼドメインのうち１つは、アスパラギン酸１０の変異を含み、および／またはヌクレアーゼドメインのうちの１つは、ヒスチジン８４０の変異を含み、ここで変異は、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％まで低下する）を含んでもよい。
【０２１１】
エンドリボヌクレアーゼ。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、エンドリボヌクレアーゼであってもよい。
【０２１２】
いくつかの場合には、エンドリボヌクレアーゼは、野性型参照エンドリボヌクレアーゼに対して、多くとも約２０％、多くとも約３０％、多くとも約４０％、多くとも約５０％、多くとも約６０％、多くとも約７０％、多くとも約７５％、多くとも約８０％、多くとも約８５％、多くとも約９０％、多くとも約９５％、多くとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性および／または相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。エンドリボヌクレアーゼは、野性型参照エンドリボヌクレアーゼ（例えば、緑膿菌由来のＣｓｙ４）に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性および／または相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。参照エンドリボヌクレアーゼは、Ｃａｓ６ファミリーのメンバー（例えば、Ｃｓｙ４、Ｃａｓ６）であってもよい。参照エンドリボヌクレアーゼは、Ｃａｓ５ファミリーのメンバー（例えば、デスルホビブリオ・ブルガリス由来のＣａｓ５）であってもよい。参照エンドリボヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲファミリーのメンバー（例えば、Ｃａｓ３）であってもよい。参照エンドリボヌクレアーゼは、ＩＩ型ファミリーのメンバーであってもよい。参照エンドリボヌクレアーゼは、ＩＩＩ型ファミリーのメンバー（例えば、Ｃａｓ６）であってもよい。参照エンドリボヌクレアーゼは、反復関連ミステリアスプロテイン（ＲＡＭＰ）スーパーファミリーのメンバー（例えば、Ｃａｓ７）であってもよい。
【０２１３】
エンドリボヌクレアーゼは、アミノ酸改変（例えば、置換、欠失、付加など）を含んでもよい。エンドリボヌクレアーゼは、１つまたはそれ以上の非天然配列（例えば、融合、親和性タグ）を含んでもよい。アミノ酸改変は、エンドリボヌクレアーゼの活性を実質的に変更しなくてもよい。アミノ酸改変および／または融合を含むエンドリボヌクレアーゼは、野性型エンドリボヌクレアーゼの少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％または１００％の活性を保持し得る。
【０２１４】
改変は、エンドリボヌクレアーゼの酵素活性の変更を生じ得る。改変は、エンドリボヌクレアーゼの９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を生じ得る。いくつかの場合には、改変は、エンドリボヌクレアーゼのヌクレアーゼドメイン中で生じる。このような改変は、野性型エンドリボヌクレアーゼの複数の核酸切断ドメインのうち１つまたはそれ以上における核酸切断能力の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を生じ得る。
【０２１５】
条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、エンドリボヌクレアーゼは、条件的に酵素学的に不活性であってもよい。条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、配列特異的な方式
でポリヌクレオチドに結合し得る。条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、配列特異的な方式でポリヌクレオチドに結合し得るが、標的ポリリボヌクレオチドは切断できない。
【０２１６】
いくつかの場合には、条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、参照の条件的に酵素学的エンドリボヌクレアーゼ（例えば、緑膿菌由来のＣｓｙ４）に対して、最大で約２０％まで、最大で約３０％まで、最大で約４０％まで、最大で約５０％まで、最大で約６０％まで、最大で約７０％まで、最大で約７５％まで、最大で約８０％まで、最大で約８５％まで、最大で約９０％まで、最大で約９５％まで、最大で約９９％まで、または１００％のアミノ酸配列同一性および／または相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの場合には、条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、参照の条件的に酵素学的にエンドリボヌクレアーゼ（例えば、緑膿菌由来のＣｓｙ４）に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性および／または相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【０２１７】
条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、改変型のエンドリボヌクレアーゼを含んでもよい。改変型のエンドリボヌクレアーゼは、エンドリボヌクレアーゼの核酸切断活性を低下するアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含んでもよい。例えば、改変型の条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、参照（例えば、野生型）の条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ（例えば、緑膿菌由来のＣｓｙ４）の核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有してもよい。改変型の条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、実質的な核酸切断活性を有さない場合がある。条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼが、実質的な核酸切断活性を有さない改変型である場合、これは、「酵素学的に不活性な」と呼んでもよい。
【０２１８】
改変型の条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、核酸切断能力の低下を生じ得る変異を含んでもよい（すなわち、結果として、条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼが、核酸切断ドメインのうちの１つまたはそれ以上で酵素学的に不活性であり得る）。変異は、野性型エンドリボヌクレアーゼ（例えば、緑膿菌由来のＣｓｙ４）の複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたはそれ以上における核酸切断能力の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を生じ得る。変異は、エンドリボヌクレアーゼのヌクレアーゼドメイン中で生じてもよい。変異は、フェレドキシン様フォールディング中で生じてもよい。変異は、保存された芳香族アミノ酸の変異を含んでもよい。変異は、触媒性アミノ酸の変異を含んでもよい。変異は、ヒスチジンの変異を含んでもよい。例えば、変異は、配列および／または構造的アラインメントによって決定して、Ｃｓｙ４（例えば、緑膿菌由来のＣｓｙ４）中のＨ２９Ａ変異、またはＨ２９Ａに対する任意の対応する残基を含んでもよい。他の残基を変異させて、同じ効果（すなわち、複数のヌクレアーゼドメインのうちの１つまたはそれ以上を不活性化すること）を達成してもよい。
【０２１９】
本発明の変異は、部位特異的変異によって生成され得る。変異としては、置換、付加、および欠失、またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。いくつかの場合には、変異は、変異したアミノ酸をアラニンに変換する。いくつかの場合には、変異は、変異したアミノ酸を別のアミノ酸（例えば、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、
バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、またはアルギニン）に変換する。変異は、変異したアミノ酸を非天然のアミノ酸（例えば、セレノメチオニン）に変換し得る。変異は、変異したアミノ酸をアミノ酸模倣物（例えば、リン模倣物）に変換し得る。変異は、保存的変異であってもよい。例えば、変異は、変異したアミノ酸を、その変異したアミノ酸のサイズ、形状、電荷、極性、構造および／または回転異性体と似ているアミノ酸に変換し得る（例えば、システイン／セリン変異、リジン／アスパラギン変異、ヒスチジン／フェニルアラニン変異）。
【０２２０】
条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、再活性化剤（例えば、イミダゾール）の非存在下で酵素学的に不活性であってもよい。再活性化剤は、ヒスチジン残基を模倣する剤であってもよい（例えば、イミダゾール環を有してもよい）。条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、再活性化剤との接触によって活性化され得る。再活性化剤は、イミダゾールを含んでもよい。例えば、条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼと、イミダゾールとを、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度で接触させることによって酵素学的に活性化され得る。イミダゾールは、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約５５０ｍＭ、または約６００ｍＭの濃度であってもよい。イミダゾールの（例えば、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度範囲での）存在は、条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼを活性化し得、その結果、条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、酵素学的に活性になり、例えば、条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、参照の条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ（例えば、Ｈ２９Ａ変異を含む緑膿菌由来のＣｓｙ４）の核酸切断能力の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または９５％超を示す。
【０２２１】
条件的に酵素学的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、緑膿菌由来のＣｓｙ４（ヒスチジン２９の変異）に対して少なくとも２０％アミノ酸同一性を含んでもよく、ここで変異は、エンドリボヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性の少なくとも５０％低下を生じ、かつここでヌクレアーゼ活性の少なくとも５０％の消失は、エンドリボヌクレアーゼと少なくとも１００ｍＭのイミダゾールとのインキュベーションによって修復され得る。
【０２２２】
コドン最適化
部位特異的ポリペプチドおよび／またはエンドリボヌクレアーゼをコードしているポリヌクレオチドは、コドン最適化され得る。この種の最適化は、同じタンパク質をコードしたままで、意図する宿主生物体または細胞のコドン優先度を模倣するために外来の（例えば、組換えの）ＤＮＡの変異を必要とし得る。従って、コドンは変化されてもよいが、コードされたタンパク質は、未変化のままである。例えば、意図される標的細胞がヒト細胞である場合、ヒトのコドン最適化ポリヌクレオチドＣａｓ９は、適切な部位特異的ポリペプチドを生成するために用いられ得る。別の非限定的な例として、意図される宿主細胞がマウス細胞である場合、Ｃａｓ９をコードするマウスコドン最適化ポリヌクレオチドは、適切な部位特異的ポリペプチドであり得る。部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、対象とする多くの宿主細胞についてコドン最適化され得る。宿主細胞は、任意の生物体由来の細胞（例えば、細菌細胞、古細菌の細胞、単一細胞の真核生物生物体の細胞、植物細胞、藻細胞、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー、クラミドモナス・レインハルドッテイ、ナンノクロロプシス・ガジタナ、クロレラ・ピレノイドーサ、サルガッサム・パテンス、カール・アガードなど、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）由来の細胞、哺乳動物（例
えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど）由来の細胞などであってもよい。コドン最適化は必要でない場合もある。いくつかの場合には、コドン最適化が好ましい場合がある。
【０２２３】
核酸ターゲティング核酸
本開示は、標的核酸内の特異的標的配列に対して、関連したポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の活性を指向し得る核酸ターゲティング核酸を提供する。核酸ターゲティング核酸は、ヌクレオチドを含んでもよい。核酸ターゲティング核酸はＲＮＡであってもよい。核酸ターゲティング核酸は、シングルガイドの核酸ターゲティング核酸を含んでもよい。例示的なシングルガイド核酸は、図１Ａに示される。スペーサー伸長１０５およびｔｒａｃｒＲＮＡ伸長１３５は、核酸ターゲティング核酸に対する追加の機能（例えば、安定性）に寄与し得るエレメントを含んでもよい。いくつかの実施形態ではスペーサー伸長１０５およびｔｒａｃｒＲＮＡ伸長１３５は場合による。スペーサー配列１１０は、標的核酸配列に対してハイブリダイズし得る配列を含んでもよい。スペーサー配列１１０は、核酸ターゲティング核酸の可変部分であってもよい。スペーサー配列１１０の配列は、標的核酸配列に対してハイブリダイズするように操作され得る。ＣＲＩＳＰＲ反復１１５（すなわち、この例示的な実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復と呼ばれる）は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列１２５に対してハイブリダイズし得るヌクレオチドを含んでもよい（すなわち、この例示的な実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる）。最小ＣＲＩＳＰＲ反復１１５および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列１２５は、相互作用し得、相互作用する分子は、塩基対の、二本鎖構造を含む。まとめると、最小ＣＲＩＳＰＲ反復１１５および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列１２５は、部位特異的ポリペプチドに対する結合を容易にし得る。最小ＣＲＩＳＰＲ反復１１５および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列１２５は、一緒に連結されて、シングルガイドコネクター１２０を通じてヘアピン構造を形成し得る。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列１３０は、プロトスペーサー隣接モチーフ認識配列を含んでもよい。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列１３０は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部に対して同一であっても、または類似であってもよい。いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列１３０は、１つまたはそれ以上のヘアピンを含んでもよい。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は、図１Ｂに示されるようなシングルガイドの核酸ターゲティング核酸を含んでもよい。核酸ターゲティング核酸は、スペーサー配列１４０を含んでもよい。スペーサー配列１４０は、標的核酸配列に対してハイブリダイズ可能な配列を含んでもよい。スペーサー配列１４０は、核酸ターゲティング核酸の可変部分であってもよい。スペーサー配列１４０は、第１の二重鎖１４５の５’側であってもよい。第１の二重鎖１４５は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復１４６と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列１４７との間にハイブリダイゼーションの領域を含む。第１の二重鎖１４５は、バルジ１５０によって中断され得る。バルジ１５０は、不対のヌクレオチドを含んでもよい。バルジ１５０は、核酸ターゲティング核酸への部位特異的ポリペプチドの補充を容易にし得る。バルジ１５０には、第１のステム１５５が続く場合がある。第１のステム１５５は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復１４６および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列１４７を連結するリンカー配列を含む。第１の二重鎖１４５の３’末端の最終の対のヌクレオチドは、第２のリンカー配列１６０に接続されてもよい。第２のリンカー１６０は、Ｐ−ドメインを含んでもよい。第２のリンカー１６０は、第１の二重鎖１４５を中央−ｔｒａｃｒＲＮＡ１６５に連結し得る。中央−ｔｒａｃｒＲＮＡ１６５は、いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上のヘアピン領域を含む。例えば中央−ｔｒａｃｒＲＮＡ１６５は、第２のステム１７０および第３のステム１７５を含んでもよい。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は、ダブルガイド核酸構造を含んでもよい。図２は、例示的なダブルガイド核酸ターゲティング核酸構造を示す。図１のシングルガイド核酸構造と同様に、ダブルガイド核酸構造は、スペーサー伸長２０５、スペー
サー２１０、最小ＣＲＩＳＰＲ反復２１５、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列２３０、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列２３５、およびｔｒａｃｒＲＮＡ伸長２４０を含んでもよい。しかし、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸は、シングルガイドコネクター１２０を含まなくてもよい。代わりに、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列２１５は、ＣＲＩＳＰＲ反復の一部と類似または同一であり得る、３’ＣＲＩＳＰＲ反復配列２２０を含んでもよい。同様に、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列２３０は、ｔｒａｃｒＲＮＡの一部と類似または同一であり得る５’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列２２５を含んでもよい。ダブルガイドＲＮＡは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復２１５および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列２３０を介して一緒にハイブリダイズし得る。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、第１のセグメント（すなわち、核酸ターゲティングセグメント）は、スペーサー伸長（例えば、１０５／２０５）およびスペーサー（例えば、１１０／２１０）を含んでもよい。核酸ターゲティング核酸は、上述の核酸ターゲティングセグメントを介して標的核酸内の特異的なヌクレオチド配列に対して、結合したポリペプチドをガイドし得る。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、第２のセグメント（すなわち、タンパク質結合セグメント）は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復（例えば、１１５／２１５）、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、１２５／２３０）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、１３０／２３５）、および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列（例えば、１３５／２４０）を含んでもよい。核酸ターゲティング核酸のタンパク質結合セグメントは、部位特異的ポリペプチドと相互作用し得る。核酸ターゲティング核酸のタンパク質結合セグメントは、互いにハイブリダイズし得るヌクレオチドの２つのストレッチを含んでもよい。タンパク質結合セグメントのヌクレオチドはハイブリダイズして、二本鎖核酸二重鎖を形成し得る。二本鎖核酸二重鎖はＲＮＡであってもよい。二本鎖核酸二重鎖はＤＮＡであってもよい。
【０２２８】
いくつかの場合には、核酸ターゲティング核酸は、５’〜３’の順序で、スペーサー伸長、スペーサー、最小ＣＲＩＳＰＲ反復、シングルガイドコネクター、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、およびｔｒａｃｒＲＮＡ伸長を含んでもよい。いくつかの場合には、核酸ターゲティング核酸は、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ、シングルガイドコネクター、最小ＣＲＩＳＰＲ反復、スペーサー、およびスペーサー伸長を任意の順序で含んでもよい。
【０２２９】
核酸ターゲティング核酸および部位特異的ポリペプチドは、複合体を形成し得る。核酸ターゲティング核酸は、標的核酸の配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含むことによって、複合体に対する標的特異性を提供し得る。言い換えれば、部位特異的ポリペプチドは、核酸ターゲティング核酸の少なくともタンパク質結合セグメントとのその会合のおかげで核酸配列にガイドされ得る。核酸ターゲティング核酸は、Ｃａｓ９タンパク質の活性を指向し得る。核酸ターゲティング核酸は、酵素学的に不活性なＣａｓ９タンパク質の活性を指向し得る。
【０２３０】
本開示の方法は、遺伝的に改変された細胞を提供し得る。遺伝的に改変された細胞は、外因性の核酸ターゲティング核酸および／または核酸ターゲティング核酸をコードするヌクレオチド配列を含む外因性の核酸を含んでもよい。
【０２３１】
スペーサー伸長配列
スペーサー伸長配列は、安定性を提供し得、および／または核酸ターゲティング核酸の改変のための位置を提供し得る。スペーサー伸長配列は、約１ヌクレオチド〜約４００ヌクレオチドの長さを有してもよい。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４
０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、もしくは７０００またはそれ以上のヌクレオチドを超える長さを有してもよい。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００またはそれ以上のヌクレオチド未満の長さを有してもよい。スペーサー伸長配列は、１０ヌクレオチド長未満であってもよい。スペーサー伸長配列は、１０〜３０ヌクレオチド長であってもよい。スペーサー伸長配列は、３０〜７０ヌクレオチド長であってもよい。
【０２３２】
スペーサー伸長配列は、ある部分（例えば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）を含んでもよい。部分は、核酸ターゲティングＲＮＡの安定性に影響し得る。部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終止配列）であってもよい。核酸ターゲティング核酸の一部は、約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔまたは約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの総長を有してもよい。この部分は、真核生物細胞中で機能し得るものであってもよい。いくつかの場合には、この部分は、原核生物細胞中で機能し得るものであってもよい。この部分は、真核生物細胞および原核生物細胞の両方の中で機能し得るものであってもよい。
【０２３３】
適切な部分の非限定的な例としては、以下を挙げることができる：５’キャップ（例えば、７−メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質およびタンパク質複合体によって調節された安定性および／または調節された接近性を可能にするため）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、クロロプラストなど）に標的とする配列、トラッキングを提供する改変もしくは配列（例えば、蛍光分子に対する直接のコンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分に対するコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列、など）、タンパク質（例えば、ＤＮＡに作用するタンパク質、例としては、転写活性化因子、転写レプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなど）に結合部位を提供する改変もしくは配列、増大した、低下したおよび／もしくは制御可能な安定性を提供する改変もしくは配列、またはそれらの任意の組み合わせ。スペーサー伸長配列は、プライマー結合部位、分子指標（例えば、バーコード配列）を含んでもよい。スペーサー伸長配列は、核酸親和性タグを含んでもよい。
【０２３４】
スペーサー
核酸ターゲティング核酸の核酸ターゲティングセグメントは、標的核酸中の配列に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列（例えば、スペーサー）を含んでもよい。核酸ターゲティング核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して標的核酸と、配列特異的な方式で相互作用し得る。従って、スペーサーのヌクレオチド配列は、変化し得、かつ核酸ターゲティング核酸および標的核酸が相互作用し得る標的核酸内の位置を決定し得る。
【０２３５】
スペーサー配列は、スペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側に位置する標的核酸に対してハイブリダイズし得る。異なる生物体は、異なるＰＡＭ配列を含んでもよい。例えば、化膿レンサ球菌では、ＰＡＭは、配列５’−ＸＲＲ−３’を含む標的核酸中の配列で
あってもよく、ここでＲは、ＡまたはＧのいずれであってもよく、ここでＸは、任意のヌクレオチドであり、かつＸは、スペーサー配列によって標的される標的核酸配列のすぐ３’側である。
【０２３６】
標的核酸配列は、２０ヌクレオチドであってもよい。標的核酸は、２０ヌクレオチド未満であってもよい。標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。標的核酸は、多くとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。標的核酸配列は、ＰＡＭの第１のヌクレオチドのすぐ５’側の２０塩基であってもよい。例えば、５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＲＲ−３’を含む配列では、標的核酸は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＮに相当する配列であってもよい。
【０２３７】
標的核酸にハイブリダイズし得るスペーサーの核酸ターゲティング配列は、少なくとも約６ｎｔ長を有してもよい。例えば、標的核酸にハイブリダイズし得るスペーサー配列は、少なくとも約６ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔまたは少なくとも約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約８０ｎｔ、約６ｎｔ〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４５ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３５ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ〜約６０ｎｔの長さを有してもよい。いくつかの場合には、標的核酸にハイブリダイズし得るスペーサー配列は、２０ヌクレオチド長であってもよい。標的核酸にハイブリダイズし得るスペーサーは、１９ヌクレオチド長であってもよい。
【０２３８】
スペーサー配列と標的核酸との間の相補性のパーセントは、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％であってもよい。スペーサー配列と標的核酸との間の相補性のパーセントは、多くとも約３０％、多くとも約４０％、多くとも約５０％、多くとも約６０％、多くとも約６５％、多くとも約７０％、多くとも約７５％、多くとも約８０％、多くとも約８５％、多くとも約９０％、多くとも約９５％、多くとも約９７％、多くとも約９８％、多くとも約９９％、または１００％であってもよい。いくつかの場合には、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性のパーセントは、標的核酸の相補性鎖の標的配列の６つの連続する最も５’側のヌクレオチドにおいて１００％であってもよい。いくつかの場合には、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性のパーセントは、約２０の連続するヌクレオチドにおいて少なくとも６０％であってもよい。いくつかの場合には、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性のパーセントは、標的核酸の相補性鎖の標的配列の１４の連続する最も５’側のヌクレオチドにおいて１００％であってもよく、かつ残りの部分においては０％程度低い。このような場合、スペーサー配列は、１４ヌクレオチド長であるとみなされ得る。いくつかの場合には、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性のパーセントは、標的核酸の相補性鎖の標的配列の６の連続する最も５’側のヌクレオチドにおいて１００％であってもよく、かつ残りの部分においては０％程度低い。このよ
うな場合、スペーサー配列は、６ヌクレオチド長であるとみなされ得る。標的核酸は、ｃｒＲＮＡのシード領域に対して、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を超えて相補的であってもよい。標的核酸は、ｃｒＲＮＡのシード領域に対して約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％未満で相補的であってもよい。
【０２３９】
核酸ターゲティング核酸のスペーサーセグメントは、標的核酸内の任意の所望の配列に対してハイブリダイズするように改変されてもよい（例えば、遺伝子操作によって）。例えば、スペーサーは、癌、細胞増殖、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復、ＨＬＡ遺伝子、細胞表面タンパク質、Ｔ細胞受容体、免疫グロブリンスーパーファミリー遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、マイクロＲＮＡ遺伝子、長非コードＲＮＡ遺伝子、転写因子、グロブリン、ウイルスタンパク質、ミトコンドリア遺伝子などに関与する標的核酸中の配列にハイブリダイズするように操作され（例えば、設計され、プログラミングされ）てもよい。
【０２４０】
スペーサー配列は、コンピュータプログラム（例えば、機械読み取り可能なコード）を用いて特定され得る。コンピュータプログラムは、予測融点、二次構造形成、および予測アニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテクスト、クロマチン接近性、ＧＣ％、ゲノム出現の頻度、メチル化状況、ＳＮＰの存在などのような変数を用い得る。
【０２４１】
最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列
最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、参照のＣＲＩＳＰＲ反復配列（例えば、化膿レンサ球菌由来のｃｒＲＮＡ）と、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性および／または配列相同性である配列であってもよい。最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、参照のＣＲＩＳＰＲ反復配列（例えば、化膿レンサ球菌由来のｃｒＲＮＡ）と、多くとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性および／または配列相同性を有する配列であってもよい。最小ＣＲＩＳＰＲ反復は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズし得るヌクレオチドを含んでもよい。最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、塩基対の二本鎖構造を形成してもよい。まとめると、最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、部位特異的ポリペプチドに対する結合を容易にし得る。最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対してハイブリダイズし得る。最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％相補的であり得る。最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して多くとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％相補的であり得る。
【０２４２】
最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、約６ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有してもよい。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔまたは約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔまたは約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、およそ１２ヌクレオチドの長さを有する。
【０２４３】
最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、少なくとも６、７または８つの連続するヌクレオチドのストレッチにおいて、参照の最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列（例えば、化膿レンサ球菌由来の
野性型ｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約６０％同一であってもよい。最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、少なくとも６、７または８つの連続するヌクレオチドのストレッチにおいて、参照の最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列（例えば、化膿レンサ球菌由来の野性型ｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約６０％同一であってもよい。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、少なくとも６、７または８つの連続するヌクレオチドのストレッチにおいて、参照の最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に対して少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一または１００％同一であってもよい。
【０２４４】
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照のｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌由来の野性型ｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性および／または配列相同性を有する配列であってもよい。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照のｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌由来の野性型ｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して多くとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性および／または配列相同性を有する配列であってもよい。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に対してハイブリダイズし得るヌクレオチドを含んでもよい。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列および最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、塩基対の、二本鎖構造を形成し得る。まとめると、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列および最小ＣＲＩＳＰＲ反復は、部位特異的ポリペプチドに対する結合を容易にし得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズし得る。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に対して３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％相補的であってもよい。
【０２４５】
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔまたは約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔまたは約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有してもよい。いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１４ヌクレオチドの長さを有する。
【０２４６】
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７または８つの連続するヌクレオチドのストレッチにおいて、参照の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、野性型、化膿レンサ球菌由来のｃｒＲＮＡ）配列に対して少なくとも約６０％同一であってもよい。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７または８つの連続するヌクレオチドのストレッチにおいて、参照の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、野性型、化膿レンサ球菌由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に対して少なくとも約６０％同一であってもよい。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７または８つの連続するヌクレオチドのストレッチにおいて、参照の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一または１００％同一であってもよい。
【０２４７】
最小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖（すなわち、図１Ｂ
の第１の二重鎖）は、二重らせんを含んでもよい。二重鎖の第１の鎖の第１の塩基（例えば、図１Ｂの最小ＣＲＩＳＰＲ反復）は、グアニンであってもよい。二重鎖の第１の鎖の第１の塩基（例えば、図１Ｂの最小ＣＲＩＳＰＲ反復）はアデニンであってもよい。最小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖（すなわち、図１Ｂの第１の二重鎖）は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、または１０超のヌクレオチドを含んでもよい。最小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖（すなわち、図１Ｂの第１の二重鎖）は、多くとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、または１０超のヌクレオチドを含んでもよい。
【０２４８】
二重鎖は、ミスマッチを含んでもよい。二重鎖は、少なくとも約１、２、３、４、または５またはそれ以上のミスマッチを含んでもよい。二重鎖は、多くとも約１、２、３、４、または５またはそれ以上のミスマッチを含んでもよい。いくつかの場合には、二重鎖は、２つ以下のミスマッチを含んでもよい。
【０２４９】
バルジ
バルジとは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列からできている二重鎖内のヌクレオチドの不対の領域を指してもよい。バルジは、部位特異的ポリペプチドに対する結合に重要であり得る。バルジは、二重鎖の片側に、不対の５’−ＸＸＸＹ−３’を含んでもよく、ここでＸは、任意のプリンであり、かつＹは、反対の鎖の上のヌクレオチドと不安定な対を形成し得るヌクレオチド、および二重鎖の他の側の上の不対のヌクレオチド領域であってもよい。
【０２５０】
例えば、バルジは、バルジの最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖上に不対のプリン（例えば、アデニン）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、バルジは、そのバルジの最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖の不対の５’−ＡＡＧＹ−３’を含んでもよく、ここでＹは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖上のヌクレオチドと不安定な対を形成し得るヌクレオチドであってもよい。
【０２５１】
二重鎖の第１の側（例えば、最小ＣＲＩＳＰＲ反復側）の上のバルジは、少なくとも１、２、３、４、もしくは５つ、またはそれ以上の不対のヌクレオチドを含んでもよい。二重鎖の第１の側（例えば、最小ＣＲＩＳＰＲ反復側）の上のバルジは、多くとも１、２、３、４、もしくは５つ、またはそれ以上の不対のヌクレオチドを含んでもよい。二重鎖の第１の側（例えば、最小ＣＲＩＳＰＲ反復側）の上のバルジは、１つの不対のヌクレオチドを含んでもよい。
【０２５２】
二重鎖の第２の側（例えば、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側）の上のバルジは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、またはそれ以上の不対のヌクレオチドを含んでもよい。二重鎖の第２の側（例えば、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側）の上のバルジは、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、またはそれ以上の不対のヌクレオチドを含んでもよい。二重鎖の第２の側（例えば、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側）の上のバルジは、４つの不対のヌクレオチドを含んでもよい。
【０２５３】
二重鎖の各々の鎖の上の異なる数の不対のヌクレオチドの領域は一緒に対になってもよい。例えば、バルジは、第１の鎖由来の５つの不対のヌクレオチドおよび第２の鎖由来の１つの不対のヌクレオチドを含んでもよい。バルジは、第１の鎖由来の４つの不対のヌクレオチドおよび第２の鎖由来の１つの不対のヌクレオチドを含んでもよい。バルジは、第１の鎖由来の３つの不対のヌクレオチドおよび第２の鎖由来の１つの不対のヌクレオチドを含んでもよい。バルジは、第１の鎖由来の２つの不対のヌクレオチドおよび第２の鎖由来の１つの不対のヌクレオチドを含んでもよい。バルジは、第１の鎖由来の１つの不対のヌクレオチドおよび第２の鎖由来の１つの不対のヌクレオチドを含んでもよい。バルジは
、第１の鎖由来の１つの不対のヌクレオチドおよび第２の鎖由来の２つの不対のヌクレオチドを含んでもよい。バルジは、第１の鎖由来の１つの不対のヌクレオチドおよび第２の鎖由来の３つの不対のヌクレオチドを含んでもよい。バルジは、第１の鎖由来の１つの不対のヌクレオチドおよび第２の鎖由来の４つの不対のヌクレオチドを含んでもよい。バルジは、第１の鎖由来の１つの不対のヌクレオチドおよび第２の鎖由来の５つの不対のヌクレオチドを含んでもよい。
【０２５４】
いくつかの場合には、バルジは、少なくとも１つの不安定な対合を含んでもよい。いくつかの場合には、バルジは、多くとも１つの不安定な対合を含んでもよい。バルジ配列は、少なくとも１つのプリンヌクレオチドを含んでもよい。バルジ配列は、少なくとも３つのプリンヌクレオチドを含んでもよい。バルジ配列は、少なくとも５つのプリンヌクレオチドを含んでもよい。バルジ配列は、少なくとも１つのグアニンヌクレオチドを含んでもよい。バルジ配列は、少なくとも１つのアデニンヌクレオチドを含んでもよい。
【０２５５】
Ｐ−ドメイン（Ｐ−ＤＯＭＡＩＮ）
Ｐ−ドメインは、標的核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し得る核酸ターゲティング核酸のある領域を指してもよい。Ｐ−ドメインは、標的核酸中のＰＡＭにハイブリダイズし得る。従って、Ｐ−ドメインは、ＰＡＭに相補性である配列を含んでもよい。Ｐ−ドメインは、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して３’側に位置してもよい。Ｐ−ドメインは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（すなわち、中央−ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）内に位置してもよい。
【０２５６】
ｐは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の二重鎖中の最後の対のヌクレオチドの少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０、またはそれ以上のヌクレオチドで開始する。Ｐ−ドメインは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の二重鎖中の最後の対のヌクレオチドの多くとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、またはそれ以上のヌクレオチドで開始し得る。
【０２５７】
Ｐ−ドメインは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０、またはそれ以上の連続のヌクレオチドを含んでもよい。Ｐ−ドメインは、多くとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０、またはそれ以上の連続のヌクレオチドを含んでもよい。
【０２５８】
いくつかの場合には、Ｐ−ドメインは、ＣＣジヌクレオチド（すなわち、２つの連続のシトシンヌクレオチド）を含んでもよい。ＣＣジヌクレオチドは、ＰＡＭのＧＧジヌクレオチドと相互作用し得、ここでＰＡＭは、５’−ＸＧＧ−３’配列を含む。
【０２５９】
Ｐ−ドメインは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列中に位置するヌクレオチド配列であってもよい（すなわち、中央−ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）。Ｐ−ドメインは、二重鎖のヌクレオチド（例えば、一緒にハイブリダイズした、ヘアピンのヌクレオチド）を含んでもよい。例えば、Ｐ−ドメインは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のヘアピン二重鎖中のＧＧジヌクレオチドにハイブリダイズするＣＣジヌクレオチドを含んでもよい（すなわち、中央−ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）。Ｐ−ドメインの活性（例えば、核酸ターゲティング核酸が標的核酸を標的とする能力）は、Ｐ−ＤＯＭＡＩＮのハイブリダイゼーション状態によって調節され得る。例えば、Ｐ−ドメインがハイブリダイズされる場合、核酸ターゲティング核酸は、その標的を認識しなくてもよい。Ｐ−ドメインがハイブリダイズしない場合、核酸ターゲティング核酸は、その標的を認識し得る。
【０２６０】
Ｐ−ドメインは、部位特異的ポリペプチド内のＰ−ドメイン相互作用領域と相互作用し
得る。Ｐ−ドメインは、部位特異的ポリペプチド中のアルギニンリッチな塩基性パッチと相互作用し得る。Ｐ−ドメイン相互作用領域は、ＰＡＭ配列と相互作用し得る。Ｐ−ドメインは、ステムループを含み得る。Ｐ−ドメインはバルジを含んでもよい。
【０２６１】
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照のｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）と、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性および／または配列相同性を有する配列であってもよい。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照のｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）と、多くとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性および／または配列相同性を有する配列であってもよい。
【０２６２】
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有してもよい。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔまたは約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔまたは約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有してもよい。いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１４ヌクレオチドの長さを有する。
【０２６３】
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８つの連続するヌクレオチドのストレッチにおいて、参照の３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌由来の野性型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対して少なくとも約６０％同一であってもよい。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８つの連続するヌクレオチドのストレッチにおいて、参照の３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌由来の野性型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対して、少なくとも約６０％同一、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一であってもよい。
【０２６４】
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つ以上の二重鎖の領域（例えば、ヘアピン、ハイブリダイズした領域）を含んでもよい。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つの二重鎖の領域を含んでもよい。
【０２６５】
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列はまた、中央−ｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれてもよい（図１Ｂを参照のこと）。中央−ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ステムループ構造を含んでもよい。言い換えれば、中央−ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、図１Ｂに示されるとおり、第２のまたは第３のステムとは異なるヘアピンを含んでもよい。中央−ｔｒａｃｒＲＮＡのステムループ構造（すなわち、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５もしくは２０、またはそれ以上のヌクレオチドを含んでもよい。中央−ｔｒａｃｒＲＮＡのステムループ構造（すなわち、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、またはそれ以上のヌクレオチドを含んでもよい。ステムループ構造は、機能的な部分を含んでもよい。例えば、ステムループ構造は、アプタマー、リボザイム、タンパク質−相互作用ヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、およびエクソンを含んでもよい。ステムループ構造は、少なくとも約１
、２、３、４、もしくは５つ、またはそれ以上の機能的な部分を含んでもよい。ステムループ構造は、多くとも約１、２、３、４、もしくは５つ、またはそれ以上の機能的部分を含んでもよい。
【０２６６】
中央−ｔｒａｃｒＲＮＡ配列中のヘアピンは、Ｐ−ドメインを含んでもよい。Ｐ−ドメインは、そのヘアピン中に二本鎖の領域を含んでもよい。
【０２６７】
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、核酸ターゲティング核酸の改変について安定性を提供するか、および／または位置を提供し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約１ヌクレオチド〜約４００ヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００またはそれ以上のヌクレオチドを超える長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約２０〜約５０００、またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有してもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００を超えるヌクレオチドの長さを有してもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００ヌクレオチド未満の長さを有してもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００ヌクレオチド未満の長さを有してもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０ヌクレオチド長未満であってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０〜３０ヌクレオチド長であってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、３０〜７０ヌクレオチド長であってもよい。
【０２６８】
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、ある部分（例えば、安定性制御配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を含んでもよい。部分は、核酸ターゲティングＲＮＡの安定性に影響し得る。部分は、転写終結セグメント（すなわち、転写終止配列）であってもよい。核酸ターゲティング核酸の一部は、約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔまたは約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの総長を有してもよい。この部分は、真核生物細胞中で機能し得るものであってもよい。いくつかの場合には、この部分は、原核生物細胞中で機能し得るものであってもよい。この部分は、真核生物細胞および原核生物細胞の両方の中で機能し得るものであってもよい。
【０２６９】
適切なｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部分の非限定的な例としては、３’ポリ−アデニル化テール、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質およびタンパク質複合体により調節された安定性および／もしくは調節された接近性を可能にするため）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、クロロプラストなど）に標的とする配列、トラッキング（蛍光分子に対する直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列、など）を提供する改変もしくは配列、タンパク質（例えば、ＤＮＡに作用するタンパク質、例としては、転写活性化因子、転写レプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなど）に関する結合部位を提供する改変もしくは配列、安定性の増大、低下および／もしくは制御可能な安定性を提供する改変もしくは配列、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、プライマー結合部位、分子指標（例えば
、バーコード配列）を含んでもよい。本開示のいくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１つまたはそれ以上の親和性タグを含んでもよい。
【０２７０】
シングルガイド核酸
核酸ターゲティング核酸は、シングルガイド核酸であってもよい。シングルガイド核酸はＲＮＡであってもよい。シングルガイド核酸は、シングルガイドコネクター配列と呼ばれ得る最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列との間のリンカー（すなわち、図１Ａの項目１２０）を含んでもよい。
【０２７１】
シングルガイド核酸のシングルガイドコネクターは、約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有してもよい。例えば、リンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約９０ｎｔ、約３ｎｔ〜約８０ｎｔ、約３ｎｔ〜約７０ｎｔ、約３ｎｔ〜約６０ｎｔ、約３ｎｔ〜約５０ｎｔ、約３ｎｔ〜約４０ｎｔ、約３ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３ｎｔ〜約２０ｎｔまたは約３ｎｔ〜約１０ｎｔの長さを有してもよい。例えば、リンカーは、約３ｎｔ〜約５ｎｔ、約５ｎｔ〜約１０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約３５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有してもよい。いくつかの実施形態では、シングルガイド核酸のリンカーは、４〜４０ヌクレオチドである。リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、もしくは７０００、またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有してもよい。リンカーは、多くとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、もしくは７０００、またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有してもよい。
【０２７２】
リンカー配列は、機能的部分を含んでもよい。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用性ヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、およびエクソンを含んでもよい。リンカー配列は、少なくとも約１、２、３、４、もしくは５つ、またはそれ以上の機能的部分を含んでもよい。リンカー配列は、多くとも約１、２、３、４、もしくは５つ、またはそれ以上の機能的部分を含んでもよい。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、シングルガイドコネクターは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復の３’末端を最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の５’末端に接続し得る。あるいは、シングルガイドコネクターは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の３’末端を、最小ＣＲＩＳＰＲ反復の５’末端に接続し得る。すなわち、シングルガイド核酸は、３’タンパク質結合セグメントに連結された５’ＤＮＡ結合セグメントを含んでもよい。シングルガイド核酸は、３’ＤＮＡ結合セグメントに連結された５’タンパク質結合セグメントを含んでもよい。
【０２７４】
核酸ターゲティング核酸は、１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは、標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；６、７、または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、５〜３０ヌクレオチドを有する最小ＣＲＩＳＰＲ反復；最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６、７、または８つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）；リンカー配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを連結し、かつ３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６、７、または８つの連続するヌ
クレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；ならびに／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。核酸ターゲティング核酸は、シングルガイド核酸ターゲティング核酸と呼ばれてもよい。
【０２７５】
核酸ターゲティング核酸は、１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは、標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；１）６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する、最小ＣＲＩＳＰＲ反復、２）６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３）バルジ（ここでバルジが、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖上に少なくとも３つの不対のヌクレオチド、および二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖上に少なくとも１つの不対のヌクレオチドを含む）を含む二重鎖；リンカー配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを連結し、かつ３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；Ｐ−ドメイン（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖の１〜５ヌクレオチド下流で開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、標的核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズし得る配列を含み、ヘアピンを形成し得、かつ３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域に位置している）；ならびに／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０２７６】
ダブルガイド核酸
核酸ターゲティング核酸は、ダブルガイド核酸であってもよい。ダブルガイド核酸はＲＮＡであってもよい。ダブルガイド核酸は、２つの別々の核酸分子（すなわち、ポリヌクレオチド）を含んでもよい。ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の２つの核酸分子の各々は、２つの核酸分子の相補的なヌクレオチドがハイブリダイズして、タンパク質結合セグメントの二重鎖の二重鎖を形成するように互いに対してハイブリダイズし得るヌクレオチドのストレッチを含んでもよい。別段特定しない場合、「核酸ターゲティング核酸」という用語は、包括的であってもよく、単一分子の核酸ターゲティング核酸および二重分子の核酸ターゲティング核酸の両方を指す。
【０２７７】
ダブルガイド核酸ターゲティング核酸は、１）１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは、標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；および最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復は５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）を含む、第１の核酸分子；ならびに２）ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子であって、６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列であって、かつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が、５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来
のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチド長を含み、かつ二重鎖の領域を含む）；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）を含んでもよい第２の核酸分子、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０２７８】
いくつかの場合には、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸は、１）スペーサー伸長配列（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは、標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復が５〜３０ヌクレオチドの長さ、およびバルジの少なくとも３つの不対のヌクレオチドを有する）を含む第１の核酸分子；ならびに２）ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子であって、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が５〜３０ヌクレオチドの長さ、およびバルジの少なくとも１つの不対のヌクレオチドを有し、ここでバルジの１つの不対のヌクレオチドが、最小ＣＲＩＳＰＲ反復の３つの不対のヌクレオチドと同じバルジに位置する）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；Ｐ−ドメイン（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、標的核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズし得る配列を含み、ヘアピンを形成し得、かつ３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域に位置する）；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）を含み得る、第２核酸分子、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０２７９】
核酸ターゲティング核酸および部位特異的ポリペプチドの複合体
核酸ターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチド（例えば、核酸−ガイドのヌクレアーゼ、Ｃａｓ９）と相互作用し得、これによって複合体を形成し得る。核酸ターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドを標的核酸へガイドし得る。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は、複合体（例えば、部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む）が、部位特異的ポリペプチドの切断部位の外側に結合し得るように操作され得る。この場合、標的核酸は、複合体と相互作用しない場合があり、標的核酸は切り出され得る（例えば、複合体から自由に）。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、核酸ターゲティング核酸は、この複合体が、部位特異的ポリペプチドの切断部位の内側に結合し得るように操作され得る。この場合、標的核酸は、複合体と相互作用し得、標的核酸が結合され得る（例えば、複合体に結合して）。
【０２８２】
いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチド（ここで部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含んでもよい）；およびダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これは、１）１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは、標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；および最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なく
とも６０％の同一性を含み、かつここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）を含む第１の核酸分子；ならびに２）ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子であって、これは、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が、５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；および／もしくはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０２８３】
いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチド（ここで部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含んでもよい）；ならびにダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これは、１）１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは、標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復が５〜３０ヌクレオチドの長さ、およびバルジの少なくとも３つの不対のヌクレオチドを有する）を含む第１の核酸分子；ならびに２）ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子であって、これは、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が５〜３０ヌクレオチドの長さ、およびバルジの少なくとも１つの不対のヌクレオチドを有し、ここでバルジの１つの不対のヌクレオチドが、最小ＣＲＩＳＰＲ反復の３つの不対のヌクレオチドと同じバルジ内に位置している）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；Ｐ−ドメイン（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、標的核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズし得る配列を含み、ヘアピンを形成し得、かつ３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域に位置する）；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０２８４】
いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチド（ここで部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含んでもよい）；ならびに、核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これは、１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列を含み；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６、７、または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）；最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６、７、または８つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が５〜３０ヌクレオチドの
長さを有する）；リンカー配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを連結し、かつ３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６、７、または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。核酸ターゲティング核酸は、シングルガイド核酸ターゲティング核酸と呼ばれてもよい。
【０２８５】
いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチド（ここで部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含んでもよい）；ならびに核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これは、１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列を含み；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；１）最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）、２）最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）、ならびに３）バルジ（ここでバルジが、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖上の少なくとも３つの不対のヌクレオチド、および二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖上の少なくとも１つの不対のヌクレオチドを含む）を含む二重鎖；リンカー配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを連結しかつ３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；Ｐ−ドメイン（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、標的核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズし得る配列を含み、ヘアピンを形成し得、かつ３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域に位置する）；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ（伸長１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせ、を含んでもよい。いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチド（ここで部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）、およびリンカー（部位特異的ポリペプチドを非天然配列に連結する）を含む）；ならびにダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これは１）第１の核酸分子（１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列を含む）；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；および最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）を含む第１の核酸分子；２）ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子を含み、これが、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含
み、かつ二重鎖の領域を含む）；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）を含み得る第２の核酸分子、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０２８６】
いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチドを含んでもよく、ここで部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）、および非天然配列に対して部位特異的ポリペプチドを連結するリンカー；ならびにダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これは１）１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは、標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む）を含み、かつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復は、反復５〜３０ヌクレオチドの長さ、およびバルジの少なくとも３つの不対のヌクレオチドを有する、第１の核酸分子；ならびに２）ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子を含み、これは、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が５〜３０ヌクレオチドの長さ、およびバルジの少なくとも１つの不対のヌクレオチドを有し、ここでバルジの１つの不対のヌクレオチドが最小ＣＲＩＳＰＲ反復の３つの不対のヌクレオチドと同じバルジ内に位置している）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；Ｐ−ドメイン（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、標的核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズし得る配列を含み、ヘアピンを形成し得、かつ３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域に位置する）；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０２８７】
いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチド（ここで部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）、および非天然配列に対して部位特異的ポリペプチドを連結するリンカーを含む）；ならびに核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これは、１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列を含み；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６、７、または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含みかつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復は５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）；最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６、７、または８つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）；リンカー配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを連結しかつ３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６、７、または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせ
を含む。核酸ターゲティング核酸は、シングルガイド核酸ターゲティング核酸と呼ばれてもよい。
【０２８８】
いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチドであって、ここで部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）、および非天然配列に対して部位特異的ポリペプチドを連結するリンカーを含む、部位特異的ポリヌクレオチド；ならびに核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これは、１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列を含み；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）を含み；１）最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）、２）最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）、および３）バルジ（ここでバルジが、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖上の少なくとも３つの不対のヌクレオチドおよび二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖上の少なくとも１つの不対のヌクレオチドを含む）を含む二重鎖；リンカー配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを連結しかつ３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；Ｐ−ドメイン（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、標的核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズし得る配列を含み、ヘアピンを形成し得、かつ３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域に位置する）；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０２８９】
いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチドであって、ここで部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み、ここで部位特異的ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％まで低下する核酸切断ドメインの一方または両方に変異を含む、部位特異的ポリペプチド；ならびにダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これは、１）１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；および最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）を含む、第１の核酸分子；ならびに２）ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子を含み、これは、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含み；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０２９０】
いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチドであって、ここで部位特異的ポリペプチドは化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み、ここで部位特異的ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％まで低下する核酸切断ドメインの一方または両方に変異を含む、部位特異的ポリペプチド；ならびにダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これは、１）１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復は５〜３０ヌクレオチドの長さ、およびバルジの少なくとも３つの不対のヌクレオチドを有する）を含む第一の核酸分子；ならびに２）ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子を含んでもよく、これは、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は５〜３０ヌクレオチドの長さ、およびバルジの少なくとも１つの不対のヌクレオチドを有し、ここでバルジの１つの不対のヌクレオチドが最小ＣＲＩＳＰＲ反復の３つの不対のヌクレオチドと同じバルジ内に位置している）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；Ｐ−ドメイン（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、標的核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズし得る配列を含み、ヘアピンを形成し得、かつ３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域に位置する）；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０２９１】
いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチド（ここで部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含む）、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含んでもよく、ここで部位特異的ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％まで低下する核酸切断ドメインの一方または両方に変異を含む）；ならびに核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これは、１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列を含み；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６、７、または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）；最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６、７、または８つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）；リンカー配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを連結しかつ３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６、７、または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。核酸ターゲティング核酸は、シングルガイド核酸ターゲティング核酸と呼ばれてもよい。
【０２９２】
いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチド（部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み、ここで部位特異的ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％まで低下する核酸切断ドメインの一方または両方に変異を含む）；ならびに核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これは、１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列を含み；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；１）最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）、２）最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）、および３）バルジ（ここでバルジが、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖上の少なくとも３つの不対のヌクレオチド、および二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖上の少なくとも１つの不対のヌクレオチドを含む）を含む二重鎖；リンカー配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを連結しかつ３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；Ｐ−ドメイン（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、標的核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズし得る配列を含み、ヘアピンを形成し得、かつ３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域に位置する）；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０２９３】
いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチド（ここで部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み、ここで部位特異的ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％まで低下する核酸切断ドメインの一方または両方に変異を含む；ならびにダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これは１）第１の核酸分子（１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列を含む）；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；および最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）；および２）ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子を含み、これは最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含みかつ、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０２９４】
いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチド（ここで部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性、２
つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み、ここで部位特異的ポリペプチドが、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％まで低下する核酸切断ドメインの一方または両方に変異を含む）；ならびにダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これは１）第１の核酸分子（１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列を含む）；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復は５〜３０ヌクレオチドの長さ、およびバルジの少なくとも３つの不対のヌクレオチドを有する）；ならびに２）ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子を含み、これは最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（これは、６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は５〜３０ヌクレオチドの長さ、およびバルジの少なくとも１つの不対のヌクレオチドを有し、ここでバルジの１つの不対のヌクレオチドが最小ＣＲＩＳＰＲ反復の３つの不対のヌクレオチドと同じバルジ内に位置している）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；Ｐ−ドメイン（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、標的核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズし得る配列を含み、ヘアピンを形成し得、かつ３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域に位置する）；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせ、を含んでもよい。
【０２９５】
いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチド（ここで部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み、ここで部位特異的ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％まで低下する核酸切断ドメインの一方または両方に変異を含む）；ならびに核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これは１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列を含み；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６、７、または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）；最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６、７、または８つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）；リンカー配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを連結しかつ３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６、７、または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。核酸ターゲティング核酸は、シングルガイド核酸ターゲティング核酸と呼ばれてもよい。
【０２９６】
いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチド（ここで部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み、こ
こで部位特異的ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％まで低下する核酸切断ドメインの一方または両方に変異を含む）；ならびに核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これは１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列を含み；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；１）最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）、２）最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）、および３）バルジ（ここでバルジが、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖上の少なくとも３つの不対のヌクレオチド、および二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖上の少なくとも１つの不対のヌクレオチドを含む）二重鎖；リンカー配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを連結しかつ３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含みかつ二重鎖の領域を含む）；Ｐ−ドメイン（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、標的核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズし得る配列を含み、ヘアピンを形成し得、かつ３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域に位置し；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０２９７】
いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチド（ここで部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み、ここで部位特異的ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％まで低下する核酸切断ドメインの一方または両方に変異を含む）；ならびにダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これは１）第１の核酸分子（１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列を含む）；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；および最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）を含む、第一の核酸分子；および２）ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子を含み、これが最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０２９８】
いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチド（ここで部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性、および２つの核酸切断ドメインを含み、ここで核酸切断ドメインの一方または両方は、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９由来のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも５０％アミノ酸同一性を含む）；ならびにダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これ
は１）第１の核酸分子（１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列を含む）；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復は５〜３０ヌクレオチドの長さ、およびバルジの少なくとも３つの不対のヌクレオチドを有する）；ならびに２）ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子を含み、これがて最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６つの連続するヌクレオチドにおい原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は５〜３０ヌクレオチドの長さ、およびバルジの少なくとも１つの不対のヌクレオチドを有し、ここでバルジの１つの不対のヌクレオチドが最小ＣＲＩＳＰＲ反復の３つの不対のヌクレオチドと同じバルジ内に位置している）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；Ｐ−ドメイン（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、標的核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズし得る配列を含み、ヘアピンを形成し得、かつ３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域に位置し；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０２９９】
いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチド（ここで部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性、および２つの核酸切断ドメインを含み、ここで核酸切断ドメインの一方または両方は、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９由来のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも５０％アミノ酸同一性を含む）；ならびに核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これは、１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列を含み；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；最小ＣＲＩＳＰＲ反復（６、７、または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含みかつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）；最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６、７、または８つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含みかつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）；リンカー配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを連結しかつ３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６、７、または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。核酸ターゲティング核酸は、シングルガイド核酸ターゲティング核酸と呼ばれてもよい。
【０３００】
いくつかの場合には、複合体は、部位特異的ポリペプチド（ここで部位特異的ポリペプチドは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性、および２つの核酸切断ドメインを含み、ここで核酸切断ドメインの一方または両方が化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９由来のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも５０％アミノ酸同一性を含む）；ならびに核酸ターゲティング核酸を含んでもよく、これは１０〜５０００ヌクレオチド長のスペーサー伸長配列を含み；１２〜３０ヌクレオチド長のスペーサー配列（ここでスペーサーは標的核酸に対して少なくとも５０％相補的である）；１）最小
ＣＲＩＳＰＲ反復（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、かつ、ここで最小ＣＲＩＳＰＲ反復が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）２）最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、化膿レンサ球菌）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含みかつ、ここで最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が５〜３０ヌクレオチドの長さを有する）、および３）バルジ（ここでバルジが、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖上の少なくとも３つの不対のヌクレオチドおよび二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖上の少なくとも１つの不対のヌクレオチドを含む）を含む、二重鎖；リンカー配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを連結しかつ３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む）；３’ｔｒａｃｒＲＮＡ（６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、化膿レンサ球菌）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含み、ここで３’ｔｒａｃｒＲＮＡが１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、かつ二重鎖の領域を含む）；Ｐ−ドメイン（最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、標的核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズし得る配列を含み、ヘアピンを形成し得、かつ３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域に位置する）；および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（１０〜５０００ヌクレオチド長を含む）、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【０３０１】
本開示の任意の核酸ターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、本開示の方法の実施形態を行うために必須のエフェクタータンパク質、多重化遺伝子ターゲティング剤、ドナーポリヌクレオチド、タンデム融合タンパク質、レポーターエレメント、対象とする遺伝子エレメント、分割システムの構成要素および／または任意の核酸またはタンパク質性の分子は、組換えられても、精製されても、単離されてもよい。
【０３０２】
核酸ターゲティング核酸および／または部位特異的ポリペプチドをコードする核酸
本開示は、本開示の核酸ターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、本開示の方法の実施形態を行うために必須のエフェクタータンパク質、多重化遺伝子ターゲティング剤、ドナーポリヌクレオチド、タンデム融合タンパク質、レポーターエレメント、対象とする遺伝子エレメント、分割システムの構成要素および／または任意の核酸またはタンパク質性の分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。いくつかの実施形態では、本開示の核酸ターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、本開示の方法の実施形態を行うために必須のエフェクタータンパク質、多重化遺伝子ターゲティング剤、ドナーポリヌクレオチド、タンデム融合タンパク質、レポーターエレメント、対象とする遺伝子エレメント、分割システムの構成要素および／または任意の核酸またはタンパク質性の分子をコードする核酸はベクター（例えば、組換え発現ベクター）であってもよい。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、組換えの発現ベクターは、ウイルスの構築物（例えば、組換えのアデノ随伴ウイルス構築物）、組換えのアデノウイルスの構築物、組換えのレンチウイルスの構築物、組換えのレトロウイルスの構築物などであってもよい。
【０３０４】
適切な発現ベクターとしては、限定するものではないが、ウイルスのベクター（例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルスのベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにレトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルス）由来のウイルスのベクター）、植物ベクター（例えば、Ｔ−ＤＮＡベクター）、などを挙げることができる。以下のベクターが、例えば、真核生物宿主細胞について提供され得る：ｐＸＴ１、ｐＳＧ
５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。他のベクターを、それらが宿主細胞と適合する限り、用いてもよい。
【０３０５】
いくつかの場合には、ベクターは、直線化されたベクターであってもよい。直線化されたベクターは、部位特異的ポリペプチドおよび／または核酸ターゲティング核酸を含んでもよい。直線化されたベクターは、環状プラスミドでなくてもよい。直線化されたベクターは、二本鎖破壊を含んでもよい。直線化されたベクターは、蛍光タンパク質（例えば、オレンジ蛍光タンパク質（ＯＦＰ））をコードする配列を含んでもよい。直線化されたベクターは、抗原（例えば、ＣＤ４）をコードする配列を含んでもよい。直線化されたベクターは、核酸ターゲティング核酸の一部をコードするベクターの領域中で直線化され（例えば、切断され）てもよい。例えば直線化されたベクターは、核酸ターゲティング核酸５’の領域から核酸ターゲティング核酸のｃｒＲＮＡ部分まで直線化され（例えば、切断され）てもよい。直線化されたベクターは、核酸ターゲティング核酸３’の領域から核酸ターゲティング核酸のスペーサー伸長配列まで直線化され（例えば、切断され）てもよい。直線化されたベクターは、核酸ターゲティング核酸のｃｒＲＮＡ配列をコードする核酸ターゲティング核酸の領域で直線化され（例えば、切断され）てもよい。いくつかの場合には、直線化されたベクターまたは閉じたスーパーコイルのベクターは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）をコードする配列、部位特異的ポリペプチドをコードする配列の発現を駆動するプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）、リンカー（例えば、２Ａ）をコードする配列、マーカー（例えば、ＣＤ４またはＯＦＰ）をコードする配列、核酸ターゲティング核酸の一部をコードする配列、核酸ターゲティング核酸の一部をコードする配列の発現を駆動するプロモーター、および選択マーカー（例えば、アンピシリン）をコードする配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０３０６】
ベクターは、転写および／または翻訳制御エレメントを含んでもよい。利用される宿主／ベクターシステム次第で、任意の多数の適切な転写および翻訳制御エレメント、例としては、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを、発現ベクター中で用いてもよい。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸ターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、本開示の方法の実施形態を行うために必須のエフェクタータンパク質、多重化遺伝子ターゲティング剤、ドナーポリヌクレオチド、タンデム融合タンパク質、レポーターエレメント、対象とする遺伝子エレメント、分割システムの構成要素および／または任意の核酸またはタンパク質性の分子をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターのような制御要素（例えば、転写制御要素）に作動可能に連結され得る。転写制御要素は、真核生物細胞、（例えば、哺乳動物細胞）、原核生物細胞（例えば、細菌または古細菌細胞）中で機能的であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の核酸ターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、本開示の方法の実施形態を行うために必須のエフェクタータンパク質、多重化遺伝子ターゲティング剤、ドナーポリヌクレオチド、タンデム融合タンパク質、レポーターエレメント、対象とする遺伝子エレメント、分割システムの構成要素および／または任意の核酸またはタンパク質性の分子をコードするヌクレオチド配列は、多重の制御要素に対して作動可能に連結され得る。多重の制御要素に対する作動可能な連結は、本開示の核酸ターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、本開示の方法の実施形態を行うために必須のエフェクタータンパク質、多重化遺伝子ターゲティング剤、ドナーポリヌクレオチド、タンデム融合タンパク質、レポーターエレメント、対象とする遺伝子エレメント、分割システムの構成要素および／または任意の核酸またはタンパク質性の分子をコードするヌクレオチド配列の発現を、原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかの中で、可能にし得る。
【０３０８】
適切な真核生物プロモーター（すなわち、真核生物細胞中で機能的なプロモーター）の
非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長末端反復（ＬＴＲ）、ヒト伸長因子−１プロモーター（ＥＦ１）、ハイブリッド構築物（ニワトリβ活性化プロモーター（ＣＡＧ）に融合されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを含む）、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１遺伝子座プロモーター（ＰＧＫ）およびマウス金属ロチオネイン−Ｉを挙げることができる。プロモーターは、真菌プロモーターであってもよい。プロモーターは植物プロモーターであってもよい。植物プロモーターのデータベースは見出すことができる（例えば、ＰｌａｎｔＰｒｏｍ）。発現ベクターはまた、翻訳開始および転写終止のためのリボソーム結合部位を含んでもよい。発現ベクターはまた、発現を増幅するために適切な配列を含んでもよい。発現ベクターはまた、部位特異的ポリペプチドに融合されており、これによって融合タンパク質を生じる、非天然タグ（例えば、６ｘＨｉｓタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸ターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、本開示の方法の実施形態を行うために必須のエフェクタータンパク質、多重化遺伝子ターゲティング剤、ドナーポリヌクレオチド、タンデム融合タンパク質、レポーターエレメント、対象とする遺伝子エレメント、分割システムの構成要素および／または任意の核酸またはタンパク質性の分子をコードするヌクレオチド配列（単数または複数）は、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、エストロゲン受容体−調節性プロモーターなど）に対して作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、本開示の核酸ターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、本開示の方法の実施形態を行うために必須のエフェクタータンパク質、多重化遺伝子ターゲティング剤、ドナーポリヌクレオチド、タンデム融合タンパク質、レポーターエレメント、対象とする遺伝子エレメント、分割システムの構成要素および／または任意の核酸もしくはタンパク質性の分子をコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）に対して作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、空間的に制限されたプロモーター、および／または時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）に対して作動可能に連結され得る。
【０３１０】
本開示の核酸ターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、本開示の方法の実施形態を行うために必須のエフェクタータンパク質、多重化遺伝子ターゲティング剤、ドナーポリヌクレオチド、タンデム融合タンパク質、レポーターエレメント、対象とする遺伝子エレメント、分割システムの構成要素および／または任意の核酸またはタンパク質性の分子をコードするヌクレオチド配列（単数または複数）は、細胞への送達のために生物学的区画の中にまたはその表面上にパッケージングされてもよい。生物学的区画としては、限定するものではないが、ウイルス（レンチウイルス、アデノウイルス）、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、およびミセルが挙げられる。
【０３１１】
細胞への本開示の複合体、ポリペプチド、および核酸の導入は、ウイルスのまたはバクテリオファージの感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介性核酸送達などによって生じ得る。
【０３１２】
トランスジェニック細胞および生物体
本開示は、トランスジェニック細胞および生物体を提供する。遺伝的に改変された宿主細胞および／またはトランスジェニック生物体の核酸が、ゲノム操作について標的され得る。
【０３１３】
本開示の方法によるトランスジェニック細胞を生成するために用いられ得る例示的な細胞としては、限定するものではないが、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、２９３−Ｔ細胞、褐色細胞腫、神経芽細胞腫線維芽細胞、横紋筋肉腫、後根神経節細胞、ＮＳＯ細胞、タバコ（Ｔｏｂａｃｃｏ）ＢＹ−２、ＣＶ−Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋｌ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、Ｃ１２７１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１７１）、Ｌ細胞、ＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬｌ５７３）およびＰＣ１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７２１）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８）、ＲＢＬ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１３７８）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２６６）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４）、ＳＪ−ＲＨ３０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０６１）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６５）、ＮＤ７／２３（ＥＣＡＣＣ９２０９０９０３）、ＣＨＯ（ＥＣＡＣＣ８５０５０３０２）、Ｖｅｒａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８１）、Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ３７）、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２４３）、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２）、Ｐｅｒ．Ｃｏ，Ｈｕｖｅｃ（ＡＴＣＣヒト初代ＰＣＳ１００−０１０、マウスＣＲＬ２５１４、ＣＲＬ２５１５、ＣＲＬ２５１６）、ＨｕＨ−７Ｄ１２（ＥＣＡＣＣ０１０４２７１２）、２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０８５２）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１８５）、ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１８６）、ＭＣＦ−７（ＡＴＣ  ＨＴＢ−２２）、Ｕ−２  ＯＳ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−９６）、およびＴ８４（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２４８）、またはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）から入手可能な任意の細胞、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０３１４】
トランスジェニックであり得る生物体としては、細菌、古細菌、単一細胞真核生物、植物、藻類、真菌（例えば、酵母）、無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）、脊椎動物（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）、哺乳動物（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど）などを挙げることができる。
【０３１５】
トランスジェニック生物体は、遺伝的に改変された細胞を含んでもよい。トランスジェニック生物体および／または遺伝的に改変された細胞は、本開示の核酸ターゲティング核酸、エフェクタータンパク質、および／または部位特異的ポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせをコードするヌクレオチド配列を含む外因性の核酸で遺伝的に改変された生物体および／または細胞を含んでもよい。
【０３１６】
遺伝的に改変された細胞は、外因性の部位特異的ポリペプチドおよび／または外因性の核酸（部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む）を含んでもよい。細胞中の部位特異的ポリペプチドの発現は、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上の日数がかかる場合がある。部位特異的ポリペプチドを導入された細胞は、細胞が細胞培養物および／または宿主生物体から取り出され得る前に、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の日数、増殖されてもよい。
【０３１７】
対象
本開示は、対象において本開示の方法を実施することを提供する。対象はヒトであることができる。対象は哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ）であることができる。対象は、脊椎動物または無脊椎動物であることができる。対象は、実験動物であることができる。対象は、患者であることができる。対象は疾患に罹っていることができる。対象は、疾患の症状を呈することができる。対象は、疾患の症状を呈さないが、なお疾患を有する可能性がある。対象は、介護者の医療を受けていることができる（例えば、対象は、入院し、医師により治療されている）。対象は、植物または穀物であることができる。
【０３１８】
キット
本開示は、本開示の方法を実施するためのキットを提供する。キットは、本開示の核酸ターゲティング核酸、核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド、本開示の部位特異的ポリペプチド、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エフェクタータンパク質、エフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド、多重化遺伝子ターゲティング剤、多重化遺伝子ターゲティング剤をコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、タンデム融合タンパク質、タンデム融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、レポーターエレメント、対象とする遺伝子エレメント、分割システムの構成要素および／または本開示の方法の実施態様を実施するために必要な任意の核酸もしくはタンパク質性分子、あるいはそれらの任意の組合せのうちの１つまたはそれ以上を含むことができる。
【０３１９】
本開示の核酸ターゲティング核酸、核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド、本開示の部位特異的ポリペプチド、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エフェクタータンパク質、エフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド、多重化遺伝子ターゲティング剤、多重化遺伝子ターゲティング剤をコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、タンデム融合タンパク質、タンデム融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、レポーターエレメント、対象とする遺伝子エレメント、分割システムの構成要素および／または本開示の方法の実施態様を実施するために必要な任意の核酸もしくはタンパク質性分子が、上で詳述される。
【０３２０】
キットは、（１）核酸ターゲティング核酸をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、および（２）部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターおよび（２）ベクターの再構成および／または希釈のための試薬を含むことができる。
【０３２１】
キットは、（１）（ｉ）核酸ターゲティング核酸をコードするヌクレオチド配列および（ｉｉ）部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターならびに（２）ベクターの再構成および／または希釈のための試薬を含むことができる。
【０３２２】
キットは、（１）核酸ターゲティング核酸をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、（２）部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、（３）エフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、多重化遺伝子ターゲティング剤、ドナーポリヌクレオチド、タンデム融合タンパク質、レポーターエレメント、対象とする遺伝子エレメント、分割システムの構成要素および／または本開示の方法の実施態様を実施するために必要な任意の核酸もしくはタンパク質性分子を含むベクターならびに（４）ベクターの再構成および／または希釈のための試薬を含むことができる。
【０３２３】
キットは、（１）（ｉ）核酸ターゲティング核酸をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、（２）エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列、多重化遺伝子ターゲティング剤、ド
ナーポリヌクレオチド、タンデム融合タンパク質、レポーターエレメント、対象とする遺伝子エレメント、分割システムの構成要素および／または本開示の方法の実施態様を実施するために必要な任意の核酸もしくはタンパク質性分子を含むベクターならびに（３）組換え発現ベクターの再構成および／または希釈のための試薬を含むことができる。
【０３２４】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含むことができ；ならびにダブルガイド核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）であって、１）１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；および６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有する、を含む、第１の核酸分子；および２）６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、Ｓ．ピオゲネス）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを有し、二重鎖領域を含むことができ；および／または１０〜５０００ヌクレオチドの長さを含む、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長物、あるいはそれらの任意の組合せを含むことのできる、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子を含む、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含むことができる。
【０３２５】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含むことができ；ならびにダブルガイド核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）であって、１）１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し、バルジの少なくとも３つの不対ヌクレオチドを含む、を含む、第１の核酸分子；および２）６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜３０ヌクレオチドの長さおよびバルジの少なくとも１つの不対ヌクレオチドを有し、ここで、バルジの１つの不対ヌクレオチドが、最小のＣＲＩＳＰＲ反復の３つの不対ヌクレオチドと同じバルジ中に位置し；６つの連続するヌクレオチドにおいて６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、二重鎖領域を含み；最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖領域の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、ターゲット核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズすることのできる配列を含み、ヘアピンを形成することができ、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域中に位置する、Ｐ−ドメイン；および／または１０〜５０００ヌクレオ
チドの長さを含むｔｒａｃｒＲＮＡ伸長物、あるいは、それらの任意の組合せを含むことのできる、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子を含む、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含むことができる。
【０３２６】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含むことができ；ならびに１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；６、７または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；６、７または８つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、Ｓ．ピオゲネス）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列であって、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；最小のＣＲＩＳＰＲ反復と最小のｔｒａｃｒＲＮＡを連結し、３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む、リンカー配列；６、７または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡであって、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、二重鎖領域を含み；および／または１０〜５０００ヌクレオチドの長さを含む、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部、あるいはそれらの任意の組合せを含む、核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）を含むことができる。
【０３２７】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含むことができ；ならびに核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）であって、１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；二重鎖であって、１）６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し、２）６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、Ｓ．ピオゲネス）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜５０ヌクレオチドの長さを有し、および３）バルジ、ここでバルジは、二重鎖の最小のＣＲＩＳＰＲ反復鎖上の少なくとも３つの不対ヌクレオチドおよび二重鎖の最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖上の少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含む、を含む、二重鎖；最小のＣＲＩＳＰＲ反復と最小のｔｒａｃｒＲＮＡを連結し、３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む、リンカー配列；６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、二重鎖領域を含み；最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、ターゲット核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズすることのできる配列を含み、ヘアピンを形成することができ、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域中に位置する、Ｐ−ドメイン；および／または１０〜５０００ヌクレオチドの長さを含む、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部、あるいはそれら
の任意の組合せを含む、核酸ターゲティング核酸を含むことができる。
【０３２８】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）および部位特異的ポリペプチドを非天然配列に連結するリンカーを含み；ならびにダブルガイド核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）であって、１）１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；および６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、ＣＲＩＳＰＲ反復は５〜３０ヌクレオチドの長さを有する、を含む、第１の核酸分子；および２）６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えばＳ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（Ｓ．ピオゲネス）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、二重鎖領域を含み；および／または１０〜５０００ヌクレオチドの長さを含むｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部、あるいはそれらの任意の組合せを含むことのできる、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子を含む、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含むことができる。
【０３２９】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）および部位特異的ペプチドを非天然配列に連結するリンカーを含み；ならびにダブルガイド核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）であって、１）１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さおよびバルジの少なくとも３つの不対ヌクレオチドを有する、を含む、第１の核酸分子；および２）６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜３０ヌクレオチドの長さおよびバルジの少なくとも１つの不対ヌクレオチドを有し、ここで、バルジの１つの不対ヌクレオチドは、最小のＣＲＩＳＰＲ反復の３つの不対ヌクレオチドと同じバルジ中に位置し；６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、二重鎖領域を含み；最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、ターゲット核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズすることのできる配列を含み、ヘアピンを形成することができ、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域中に位置する、Ｐ−ドメイン；および／または１０〜５０００ヌクレオチドの長さを含むｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部、あるいはそれらの任意の組合せを含むことのできる、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の分子を含む、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含むことができる。
【０３３０】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）および部位特異的ペプチドを非天然配列に連結するリンカーを含み；ならびに１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；６、７または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；６、７または８つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（Ｓ．ピオゲネス）由来の連続したｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；最小のＣＲＩＳＰＲ反復と最小のｔｒａｃｒＲＮＡを連結し、３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む、リンカー配列；６、７または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、二重鎖領域を含み；および／または１０〜５０００ヌクレオチドの長さを含むｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部、あるいはそれらの任意の組合せを含む、核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）を含むことができる。この核酸ターゲティング核酸は、シングルガイド核酸ターゲティング核酸と呼ばれることができる。
【０３３１】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）および部位特異的ペプチドを非天然配列に連結するリンカーを含み；ならびに核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）であって、１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；二重鎖であって、１）６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；２）６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、Ｓ．ピオゲネス）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し、および３）バルジ、ここで、バルジは、二重鎖の最小のＣＲＩＳＰＲ反復鎖上の少なくとも３つの不対ヌクレオチドおよび二重鎖の最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖上の少なくとも１つの不対ヌクレオチド含む、を含む、二重鎖；最小のＣＲＩＳＰＲ反復と最小のｔｒａｃｒＲＮＡを連結し、３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む、リンカー配列；６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、二重鎖領域を含み；最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、ターゲット核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズすることのできる配列を含み、ヘアピンを形成することができ、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域中に位置する、Ｐ−ドメイン；および／または１０〜５０００ヌクレオチドの長さを含むｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部、あるいはそれらの任意の組合せを含む、核酸ターゲティング核酸を含むことができる。
【０３３２】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み、ここで、部位特異的ポリペプチドは、一方または両方の核酸切断ドメイン中に、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低減する変異を含み；ならびにダブルガイド核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）であって、１）１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；および６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有する、を含む、第１の核酸分子；および２）６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、Ｓ．ピオゲネス）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、二重鎖領域を含み；および／または１０〜５０００ヌクレオチドの長さを含むｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部、あるいはそれらの任意の組合せを含むことのできる、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子を含む、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含むことができる。
【０３３３】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み、ここで、部位特異的ポリペプチドは、一方または両方の核酸切断ドメイン中に、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低減する変異を含み；ならびにダブルガイド核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）であって、１）１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さおよびバルジの少なくとも３つの不対ヌクレオチドを有する、を含む、第１の核酸分子；および２）６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜３０ヌクレオチドの長さおよびバルジの少なくとも１つの不対ヌクレオチドを有し、ここで、バルジの１つの不対ヌクレオチドは、最小のＣＲＩＳＰＲ反復の３つの不対ヌクレオチドと同じバルジ中に位置し；６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、二重鎖領域を含み；最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖領域の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、ターゲット核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズすることのできる配列を含み、ヘアピンを形成することができ、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域中に位置する、Ｐ−ドメイン；および／または１０〜５０００ヌクレオチドの長さを含むｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部、あるいはそれらの任意の組合せを含むことのできる、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子を含む、ダブルガイド核酸ター
ゲティング核酸を含むことができる。
【０３３４】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み、ここで、部位特異的ポリペプチドは、一方または両方の核酸切断ドメイン中に、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低減する変異を含み；ならびに１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；６、７または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；６、７または８つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、Ｓ．ピオゲネス）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；最小のＣＲＩＳＰＲ反復と最小のｔｒａｃｒＲＮＡを連結し、３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む、リンカー配列；６、７または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、二重鎖領域を含み；および／または１０〜５０００ヌクレオチドの長さを含むｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部、あるいはそれらの任意の組合せを含む、核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）を含むことができる。この核酸ターゲティング核酸は、シングルガイド核酸ターゲティング核酸を呼ばれることができる。
【０３３５】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み、ここで、部位特異的ポリペプチドは、一方または両方の核酸切断ドメイン中に、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低減する変異を含み；ならびに核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）であって、１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；二重鎖であって、１）６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；２）６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、Ｓ．ピオゲネス）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し、および３）バルジ、ここで、バルジは、二重鎖の最小のＣＲＩＳＰＲ反復鎖上の少なくとも３つの不対ヌクレオチドおよび二重鎖の最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖上の少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含む、を含む、二重鎖；最小のＣＲＩＳＰＲ反復と最小のｔｒａｃｒＲＮＡを連結し、３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む、リンカー配列；６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、二重鎖領域を含み；最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、ターゲット核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズすることのできる配列を含み、ヘアピンを形成することができ、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域中に位置す
る、Ｐ−ドメイン；および／または１０〜５０００ヌクレオチドの長さを含む、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部、あるいはそれらの任意の組合せを含む、核酸ターゲティング核酸を含むことができる。
【０３３６】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み、ここで、部位特異的ポリペプチドは、一方または両方の核酸切断ドメイン中に、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低減する変異を含み；ならびにダブルガイド核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）であって、１）１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；および６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さを含む、を含む、第１の核酸分子；および２）６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、二重鎖領域を含み；および／または１０〜５０００ヌクレオチドの長さを含む、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部、あるいはそれらの任意の組合せを含むことのできる、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子を含む、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含むことができる。
【０３３７】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み、ここで、部位特異的ポリペプチドは、一方または両方の核酸切断ドメイン中に、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低減する変異を含み；ならびにダブルガイド核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）であって、１）１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さおよびバルジの少なくとも３つの不対ヌクレオチドを有する、を含む、第１の核酸分子；および２）６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜３０ヌクレオチドの長さおよびバルジの少なくとも１つの不対ヌクレオチドを有し、ここで、バルジの１つの不対ヌクレオチドは、最小のＣＲＩＳＰＲ反復の３つの不対ヌクレオチドと同じバルジ中に位置し；６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、二重鎖領域を含み；最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖領域の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、ターゲット核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブ
リダイズすることのできる配列を含み、ヘアピンを形成することができ、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域中に位置する、Ｐ−ドメイン；および／または１０〜５０００ヌクレオチドの長さを含むｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部、あるいはそれらの任意の組合せを含むことのできる、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子を含む、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含むことができる。
【０３３８】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み、ここで、部位特異的ポリペプチドは、一方または両方の核酸切断ドメイン中に、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低減する変異を含み；ならびに１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；６、７または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；６、７または８つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、Ｓ．ピオゲネス）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；最小のＣＲＩＳＰＲ反復と最小のｔｒａｃｒＲＮＡを連結し、３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む、リンカー配列；６、７または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、二重鎖領域を含み；および／または１０〜５０００ヌクレオチドの長さを含むｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部、あるいはそれらの任意の組合せを含む、核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）を含むことができる。この核酸ターゲティング核酸は、シングルガイド核酸ターゲティング核酸と呼ばれることができる。
【０３３９】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み、ここで、部位特異的ポリペプチドは、一方または両方の核酸切断ドメイン中に、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低減する変異を含み；ならびに核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）であって、１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；二重鎖であって、１）６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；２）６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、Ｓ．ピオゲネス）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し、および３）バルジ、ここで、バルジは、二重鎖の最小のＣＲＩＳＰＲ反復鎖上の少なくとも３つの不対ヌクレオチドおよび二重鎖の最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖上の少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含む、を含む、二重鎖；最小のＣＲＩＳＰＲ反復と最小のｔｒａｃｒＲＮＡを連結し、３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む、リンカー配列；６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌク
レオチドの長さを含み、二重鎖領域を含み；最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、ターゲット核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズすることのできる配列を含み、ヘアピンを形成することができ、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域中に位置する、Ｐ−ドメイン；および／または１０〜５０００ヌクレオチドの長さを含むｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部、あるいはそれらの任意の組合せを含む、核酸ターゲティング核酸を含むことができる。
【０３４０】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を含み、ここで、部位特異的ポリペプチドは、一方または両方の核酸切断ドメイン中に、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低減する変異を含み；ならびにダブルガイド核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）であって、１）１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；および６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有する、を含む、第１の核酸分子；および２）６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、Ｓ．ピオゲネス）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、二重鎖領域を含み；および／または１０〜５０００ヌクレオチドの長さを含むｔｒａｃｒＲＮＡ伸長物、あるいは、それらの任意の組合せを含むことのできる、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子を含む、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含むことができる。
【０３４１】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性および２つの核酸切断ドメインを含み、ここで、核酸切断ドメインの一方または両方は、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９由来のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも５０％のアミノ酸同一性を含み；ならびにダブルガイド核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）であって、１）１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し、バルジの少なくとも３つの不対ヌクレオチドを含む、を含む、第１の核酸分子；および２）６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜３０ヌクレオチドの長さおよびバルジの少なくとも１つの不対ヌクレオチドを有し、ここで、バルジの１つの不対ヌクレオチドが、最小のＣＲＩＳＰＲ反復の３つの不対ヌクレオチドと同じバルジ中に位置し；６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、二
重鎖領域を含み；最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖領域の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、ターゲット核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズすることのできる配列を含み、ヘアピンを形成することができ、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域中に位置する、Ｐ−ドメイン；および／または１０〜５０００ヌクレオチドの長さを含むｔｒａｃｒＲＮＡ伸長物、あるいは、それらの任意の組合せを含むことのできる、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸の第２の核酸分子を含む、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含むことができる。
【０３４２】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性および２つの核酸切断ドメインを含み、ここで、核酸切断ドメインの一方または両方は、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９由来のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも５０％のアミノ酸同一性を含み；ならびに１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；６、７または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；６、７または８つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、Ｓ．ピオゲネス）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；最小のＣＲＩＳＰＲ反復と最小のｔｒａｃｒＲＮＡを連結し、３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む、リンカー配列；６、７または８つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、二重鎖領域を含み；および／または１０〜５０００ヌクレオチドの長さを含むｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部、あるいはそれらの任意の組合せを含む、核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）を含むことができる。この核酸ターゲティング核酸は、シングルガイド核酸ターゲティング核酸と呼ばれることができる。
【０３４３】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチド（および／またはそれをコードする核酸）、ここで、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性および２つの核酸切断ドメインを含み、ここで、核酸切断ドメインの一方または両方は、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９由来のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも５０％のアミノ酸同一性を含み；ならびに１０〜５０００ヌクレオチドの長さのスペーサー伸長配列；１２〜３０ヌクレオチドの長さのスペーサー配列、ここで、スペーサーは、ターゲット核酸に対して少なくとも５０％相補的であり；二重鎖であって、１）６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のＣＲＩＳＰＲ反復、ここで、最小のＣＲＩＳＰＲ反復は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し；２）６つの連続するヌクレオチドにおいて細菌（例えば、Ｓ．ピオゲネス）由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ここで、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５〜３０ヌクレオチドの長さを有し、および３）バルジ、ここで、バルジは、二重鎖の最小のＣＲＩＳＰＲ反復鎖上の少なくとも３つの不対ヌクレオチドおよび二重鎖の最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖上の少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含む、を含む、二重鎖；最小のＣＲＩＳＰＲ反復と最小のｔｒａｃｒＲＮＡを連結し、３〜５０００ヌクレオチドの長さを含む、リンカー配列；６つの連続するヌクレオチドにおいて原核生物（例えば、Ｓ．ピオゲネス）またはファージ由来のｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも６０％の同一性を含む、３’ｔｒａｃｒＲＮ
Ａ、ここで、３’ｔｒａｃｒＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチドの長さを含み、二重鎖領域を含み；最小のＣＲＩＳＰＲ反復および最小のｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重鎖の１〜５ヌクレオチド下流から開始し、１〜１０ヌクレオチドを含み、ターゲット核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフにハイブリダイズすることのできる配列を含み、ヘアピンを形成することができ、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ領域中に位置する、Ｐ−ドメイン；および／または１０〜５０００ヌクレオチドの長さを含むｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部、あるいはそれらの任意の組合せを含む、核酸ターゲティング核酸（および／またはそれをコードする核酸）を含むことができる。
【０３４４】
任意の上記キットのいくつかの実施態様において、キットは、シングルガイド核酸ターゲティング核酸を含むことができる。任意の上記キットのいくつかの実施態様において、キットは、ダブルガイド核酸ターゲティング核酸を含むことができる。任意の上記キットのいくつかの実施態様において、キットは、２つまたはそれ以上のダブルガイドまたはシングルガイド核酸ターゲティング核酸ができる。いくつかの実施態様において、ベクターは、核酸ターゲティング核酸をコードし得る。
【０３４５】
任意の上記キットのいくつかの実施態様において、キットは、所望の遺伝子改変を行うために、ドナーポリヌクレオチドまたはドナーポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含むことができる。キットの構成要素は、別個の容器中にあることができるか；または単一の容器中に併合されることができる。
【０３４６】
上記キットは、１つまたはそれ以上の追加の試薬をさらに含み、ここで、そのような追加の試薬は、バッファー、キットのポリペプチドまたはポリヌクレオチド物品を細胞中に導入するためのバッファー、洗浄バッファー、対照試薬、対照ベクター、対照ＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからのポリペプチドのインビトロでの産生のための試薬、配列決定のためのアダプターなどから選択されることができる。バッファーは、安定化バッファー、再構成バッファーまたは希釈バッファーであることができる。
【０３４７】
いくつかの場合において、キットは、植物および／または真菌に特異的な１つまたはそれ以上の追加の試薬を含むことができる。植物および／または真菌のための１つまたはそれ以上の追加の試薬は、例えば、土壌、栄養素、植物、種子、胞子、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｔ−ＤＮＡベクターおよびｐＢＩＮＡＲベクターを含むことができる。
【０３４８】
上記構成要素に加えて、キットは、方法を実行するためにキットの構成要素を使用するための指示をさらに含むことができる。方法の実行のための指示は、一般に、好適な記録媒体に記録される。例えば、指示は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷され得る。指示は、包装挿入物としてキットの中に、キットの容器もしくはその構成要素のラベル中に（すなわち、包装または分包に伴って）存在し得る。指示は、好適なコンピュータ読み取り可能な記憶媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなどに存在する電子記憶データファイルとして存在することができる。いくつかの場合において、実際の指示は、キット中に存在しないが、遠隔供給源から指示を得るための手段が（例えば、インターネットを介して）提供されることができる。この実施態様の例は、指示が見られることができおよび／またはそこから指示がダウンロードされることのできるウエブアドレスを含むキットである。指示と同様に、指示を入手するためのこの手段は、好適な基材に記録可能である。
【０３４９】
いくつかの実施態様において、キットは、線状化されたベクターを含むことができる。線状化されたベクターは、部位特異的ポリペプチドおよび／または核酸ターゲティング核酸を含む、線状化された（例えば環状でない）プラスミドを含むことができる。線状化さ
れたベクターは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０および１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を含むバッファー中に貯蔵されることができる。キットは、約２０マイクロリッターの線状化されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼベクターを含むことができる。いくつかの実施態様において、キットは、１つまたはそれ以上の環状ベクターを含むことができる。
【０３５０】
いくつかの実施態様において、キットは、オリゴヌクレオチドアニーリングバッファーを含むことができる。オリゴヌクレオチドアニーリングバッファーは、ＤＮＡオリゴを一緒にしてアニーリングして、核酸ターゲティング核酸をコードする二本鎖ＤＮＡを作り出すために使用されるバッファーであることができる。オリゴヌクレオチドアニーリングバッファーは、使用濃度よりも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍またはそれ以上濃縮されることができる。オリゴヌクレオチドアニーリングバッファーは、使用時の濃度よりも１０倍濃縮されることができる。オリゴヌクレオチドアニーリングバッファーは、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０および１Ｍ  ＮａＣｌを含むことができる。キットは、２５０マイクロリッターのオリゴヌクレオチドアニーリングバッファーを含むことができる。
【０３５１】
キットは、ＤＮａｓｅを含まない水を含むことができる。キットは、ＲＮＡｓｅを含まない水を含むことができる。キットは、少なくとも１．５ミリリッターのＲＮａｓｅを含まないおよび／またはＤＮＡｓｅを含まない水を含むことができる。
【０３５２】
キットは、ライゲーションバッファーを含むことができる。ライゲーションバッファーは、線状化されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼベクターにオリゴヌクレオチドを連結するために使用されることができる。ライゲーションバッファーは、使用濃度よりも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍またはそれ以上濃縮されることができる。ライゲーションバッファーは、使用時の濃度よりも５倍濃縮されることができる。５倍ライゲーションバッファーは、２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ＤＴＴおよび２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール−８０００を含むことができる。キットは、約８０マイクロリッターのライゲーションバッファーを含むことができる。
【０３５３】
キットは、ＤＮＡリガーゼを含むことができる。ＤＮＡリガーゼは、線状化されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼベクターにオリゴヌクレオチドを連結するために使用されることができる。ＤＮＡリガーゼは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび５０％（ｗ／ｖ）グリセロールを含むことができる。キットは、２０マイクロリッターのＤＮＡリガーゼを含むことができる。
【０３５４】
キットは、配列決定プライマーを含むことができる。配列決定プライマーは、一旦オリゴヌクレオチドが線状化されたベクター中に連結されているベクターを配列決定するために使用されることができる。配列決定プライマーは、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーｐＨ８．０で希釈されることができる。キットは、２０マイクロリッターの配列決定プライマーを含むことができる。
【０３５５】
キットは、対照オリゴヌクレオチドを含むことができる。対照オリゴヌクレオチドは、線状化されたベクター中に連結されるオリゴヌクレオチドであるが、核酸ターゲティング核酸をコードしない、オリゴヌクレオチドであることができる。対照オリゴヌクレオチドは、１倍濃度のオリゴヌクレオチドアニーリングバッファーで希釈されることができる。キットは、１０マイクロリッターの対照オリゴヌクレオチドを含むことができる。
【０３５６】
いくつかの場合において、キットは、部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む線状化されたベクター、オリゴヌクレオチドアニーリングバッファー、ＤＮ
Ａｓｅ／ＲＮＡｓｅを含まないバッファー、ライゲーションバッファー、リガーゼ酵素、配列決定プライマーおよび対照オリゴヌクレオチドまたはそれらの任意の組合せを含むことができる。
【０３５７】
医薬組成物
本明細書に記載された本開示の核酸ターゲティング核酸、核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド、本開示の部位特異的ポリペプチド、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エフェクタータンパク質、エフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド、多重化遺伝子ターゲティング剤、多重化遺伝子ターゲティング剤をコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、タンデム融合タンパク質、タンデム融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、レポーターエレメント、対象とする遺伝子エレメント、分割システムの構成要素および／または本開示の方法の実施態様を実施するために必要な任意の核酸もしくはタンパク質性分子のような分子が、医薬組成物に製剤化されることができる。
【０３５８】
医薬組成物は、本明細書に記載の任意の分子と、担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤および／または賦形剤のような他の化学成分の組合せを含むことができる。医薬組成物は生物への分子の投与を容易化することができる。医薬組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋内、経口、直腸内、エアロゾル、腸管外、点眼、肺内、経皮、膣内、耳内、鼻腔内および局所投与を含む、多様な形態および経路により、医薬組成物としての治療的有効量で投与されることができる。
【０３５９】
医薬組成物は、例えば、場合により、デポーまたは持続放出製剤で、器官中への分子の直接的な注入を介して、局所的または全身的な方法で投与されることができる。医薬組成物は、速放性製剤（ｒａｐｉｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の形態で、持続放出性製剤の形態で、または中間型放出性製剤（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の形態で提供されることができる。速放性形態は、即時放出を提供することができる。持続放出性製剤は、制御放出または持続性遅延放出を提供することができる。
【０３６０】
経口投与のために、医薬組成物は、分子と薬学的に許容される担体または賦形剤を併合することによって容易に製剤化されることができる。そのような担体は、対象による経口摂取のための錠剤、散剤、ピル、ドラジェ、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、エリキシル、スラリー、懸濁液などを製剤するために使用されることができる。
【０３６１】
経口使用のための医薬製剤は、１つまたはそれ以上の固体賦形剤を１つまたはそれ以上の本明細書に記載の分子と混合し、場合により、得られた混合物を粉砕し、所望により、好適な佐剤を添加した後に顆粒の混合物を加工処理して、錠剤またはドラジェコアを得ることによって、得られることができる。コアは、好適なコーティングとともに提供されることができる。この目的のために、濃縮糖液が使用されることができ、これは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液のような賦形剤、ならびに好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有することができる。染料または顔料が、例えば、活性化合物用量の様々な組合せの同定のためまたは特徴づけるために、錠剤またはドラジェコーティングに添加されることができる。
【０３６２】
経口で使用可能な医薬製剤は、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ  ｃａｐｓｕｌｅ）並びにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤でできた軟質密封カプセルを含むことができる。いくつかの実施態様において、カプセルは、医薬品、ウシゼラチンおよび植物性ゼラチンの１つまたはそれ以上を含む硬質
ゼラチンカプセルを含む。ゼラチンは、アルカリ処理されることができる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースのような充填剤、デンプンのような結合剤および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤および安定化剤との混合物として活性成分を含むことができる。軟質カプセル中で、分子は、脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールのような好適な液体中に溶解または懸濁されることができる。安定化剤が添加されることができる。経口投与のためのすべての製剤は、そのような投与に好適な用量で提供される。
【０３６３】
頬側または舌下投与のために、組成物は錠剤、ロゼンジまたはゲルであることができる。
【０３６４】
腸管外注射剤は、ボーラス注射または持続的輸注のために製剤化されることができる。医薬組成物は、油性または水性ビヒクル中の滅菌懸濁液、溶液またはエマルジョンとして、腸管外注射に好適な形態であることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような調合剤を含有することができる。腸管外投与のための医薬製剤は、水溶性形態の活性化合物の水溶液を含むことができる。
【０３６５】
分子の懸濁液は、油性注射用懸濁液として調製されることができる。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪油またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステルまたはリポソームを含む。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁液の粘度を増加させる物質を含有することができる。懸濁液は、分子の溶解度を増大させて、高濃縮溶液の調製を可能とする好適な安定化剤または作用物質も含有することができる。或いは、活性成分は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌パイロジェンフリー水による構成のための粉末形態であることができる。
【０３６６】
活性化合物は、局所に投与されることができ、溶液、懸濁液、ローション、ゲル、ペースト、薬用スティック、バーム、クリームおよび軟膏のような多様な局所投与可能な組成物に製剤化されることができる。そのような医薬組成物は、可溶化剤、安定化剤、浸透圧増進剤、バッファーおよび防腐剤を含むことができる。
【０３６７】
分子の経皮投与に好適な製剤は、経皮送達デバイスおよび経皮送達パッチを使用することができ、ポリマーまたは接着剤中に溶解および／または分散された、親油性エマルジョンまたは緩衝化水溶液であることができる。そのようなパッチは、分子の持続的な、パルス状のまたはオンデマンドの送達のために構築されることができる。経皮送達は、イオン導入パッチなどにより達成されることができる。さらに、経皮パッチは、制御された送達を提供することができる。吸収速度は、律速膜を使用することによりまたは化合物をポリマーマトリックスもしくはゲル内に捕捉することによって遅くされることができる。逆に、吸収を増加させるために吸収促進剤が使用されることができる。吸収促進剤または担体は、皮膚を通る移行を支援するために、吸収性の薬学的に許容される溶媒を含むことができる。例えば、経皮デバイスは、裏打ち部材、化合物および担体を入れたリザーバー、長時間にわたって制御された所定の速度で対象の皮膚に化合物を送達するための律速障壁および皮膚にデバイスを固定するための接着剤を含む包帯の形態であることができる。
【０３６８】
吸入による投与のために、分子は、エアロゾル、ミストまたは散剤の形態であることができる。好適な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適な気体の使用により、医薬組成物は、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレー表現の形態で送達されることができる。加圧エアロゾルの場合、単位用量は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定されることができる。例えば、吸入器または注入器に
おける使用のためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物の粉末混合物およびラクトースまたはデンプンのような好適な粉末基剤を含有して製剤化されることができる。
【０３６９】
分子は、浣腸剤、直腸ゲル、直腸フォーム、直腸エアロゾル、坐剤、ゼリー坐剤またココアバターまたは他のグリセリド並びにポリビニルピロリドンおよびＰＥＧのような合成ポリマーのような従来の坐剤基材を含有する、停留浣腸剤のような直腸用組成物に製剤化されることもできる。組成物の坐剤形態において、脂肪酸グリセリドまたはココアバターの混合物のような低融点ワックスが使用されることができる。
【０３７０】
本開示の方法の実行において、本明細書に記載の化合物の治療的有効量が、処置される疾患または状態を有する対象に医薬組成物中で投与されることができる。治療的有効量は、疾患の重症度、対象の年齢および相対的な健康、使用される化合物の有効性および他の因子に依存して大きく変化しうる。化合物は、単独でまたは１つまたは複数の治療剤と組み合わせて混合物の構成要素として使用されることができる。
【０３７１】
医薬組成物は、賦形剤および佐剤を含み、医薬として使用可能な製剤への分子の加工処理を容易化する、１つまたはそれ以上の生理学的に許容可能な担体を用いて製剤化されることができる。製剤は、選択された投与経路に依存して改変されることができる。本明細書に記載の分子を含む医薬組成物は、例えば、混合、溶解、顆粒化、ドラジェ作製、水簸、乳化、封入、捕捉または圧縮方法によって製造されることができる。
【０３７２】
医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および遊離塩基もしくは薬学的に許容される塩形態としての本明細書に記載の分子を含むことができる。本明細書に記載の方法および医薬組成物は、（多形としても知られる）結晶形態および同じタイプの活性を有するこれらの化合物の活性代謝物の使用を含む。
【０３７３】
本明細書に記載の化合物を含む組成物の調製方法は、分子を１つまたはそれ以上の不活性な薬学的に許容される賦形剤または担体とともに製剤化して、固体、半固体または液体組成物を形成する工程を含むことができる。固体組成物は、例えば、散剤、錠剤、分散性顆粒剤、カプセル、カシェ剤および坐剤を含むことができる。液体組成物は、例えば、その中に化合物が溶解している溶液、化合物を含むエマルジョンまたは本明細書に開示された化合物を含むリポソーム、ミセルもしくはナノ粒子を含有する溶液を含むことができる。半固体組成物は、例えば、ゲル、懸濁液およびクリームを含むことができる。組成物は、溶液もしくは懸濁液であるか、使用前には、液体中の溶液もしくは懸濁液に好適な固形であるか、またはエマルジョンあることができる。これらの組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤のような、微量の無毒性の補助剤および他の薬学的に許容される添加剤も含有することができる。
【０３７４】
剤形の非限定例としては、飼料、食品、ペレット、ロゼンジ、液体、エリキシル、エアロゾル、吸入剤、スプレー、散剤、錠剤、ピル、カプセル、ゲル、ジェルタブ、ナノ懸濁液、ナノ粒子、マイクロゲル、坐剤トローチ、水性または油性懸濁液、軟膏、パッチ、ローション、歯磨き剤、エマルジョン、クリーム、滴剤、分散性散剤もしくは顆粒剤、硬質もしくは軟質ゲルカプセル中のエマルジョン、シロップ、フィトシューティカル（ｐｈｙｔｏｃｅｕｔｉｃａｌ）および栄養補助食品（ｎｅｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）またはそれらの任意の組合せが挙げられ得る。
【０３７５】
薬学的に許容される賦形剤の非限定例としては、顆粒化剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、甘味料、流動促進剤、固結防止剤（ａｎｔｉ−ａｄｈｅｒｅｎｔ）、帯電防止剤、界面活性剤、抗酸化剤、ゴム、被覆剤、着色剤、香味料、被覆剤、可塑剤、防腐剤、懸濁剤、乳
化剤、植物セルロース性材料および球状化剤（ｓｐｈｅｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）またはそれらの任意の組合せが挙げられ得る。
【０３７６】
組成物は、例えば、即時放出型または制御放出製剤であることができる。即時放出製剤は、分子が迅速に作用することを可能とするために製剤化されることができる。即時放出製剤の非限定例としては、容易に溶解する製剤が挙げられ得る。制御放出製剤は、薬物放出速度および薬物放出プロフィールが生理学的および時間治療学的要求にマッチしうるように適合させられているか、或いはプログラムされた速度で薬物の放出を達成するように製剤化されている医薬製剤であることができる。制御放出製剤の非限定例としては、顆粒剤、遅延放出顆粒剤、（例えば、合成または天然起源の）ハイドロゲル、他のゲル化剤（例えば、ゲル形成性食物繊維）、マトリックスベースの製剤（例えば、全体に分散した少なくとも１つの活性成分を含むポリマー材料を含む製剤）、マトリックス内の顆粒、ポリマー混合物、顆粒塊などが挙げられ得る。
【０３７７】
制御放出製剤は、遅延放出型であることができる。遅延放出型は、分子の作用を長時間遅らせるために製剤化されることができる。遅延放出型は、１つまたはそれ以上の分子の有効量の放出を、例えば、約４時間、約８時間、約１２時間、約１６時間または約２４時間遅らせるために製剤化されることができる。
【０３７８】
制御放出製剤は、持続放出型であることができる。持続放出型は、例えば、分子の作用を長時間にわたって維持するために製剤化されることができる。持続放出型は、本明細書に記載の任意の分子の（例えば、生理学的に有効な血液プロフィールを提供する）有効量を、約４時間、約８時間、約１２時間、約１６時間または約２４時間にわたって提供するために製剤化されることができる。
【０３７９】
投与方法および処置方法
本明細書に記載の分子を含有する医薬組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与されることができる。治療適用において、組成物は、既に疾患または状態に罹っている対象に、疾患または状態の症状を治癒させるかもしくは少なくとも部分的に停止させるために、または状態を治癒させ、癒し、改善しもしくは寛解させるために十分な量で投与されることができる。この用途のために有効な量は、疾患または状態の重症度および経過、先の治療、対象の健康状態、体重および薬物に対する反応ならびに処置する医師の判断に基づいて変化しうる。
【０３８０】
複数の治療剤が任意の順番でまたは同時に投与されることができる。同時の場合、複数の治療剤は、単一の、統合されたまたは複数の形態で、例えば、複数の別個のピルとして提供されることができる。分子は、一緒にまたは別個に、単一の包装にまたは複数の包装に詰められることができる。１つまたはすべての治療剤は、複数用量で与えられることができる。同時でない場合、複数用量の間のタイミングは、約１ヶ月も変化しうる。
【０３８１】
本明細書に記載の分子は、疾患または状態の発生の前、その間または後に投与されることができ、化合物を含有する組成物の投与のタイミングは変化することができる。例えば、医薬組成物は、予防薬として使用されることができ、疾患または状態の発生を防止するために、状態または疾患の傾向を有する対象に持続的に投与されることができる。分子および医薬組成物は、症状の発症の間または発症後にできるだけ早く対象に投与されることができる。分子の投与は、症状の発症の最初の４８時間以内、症状の発症の最初の２４時間以内、症状の発症の最初の６時間以内、または症状の発症の最初の３時間以内に開始されることができる。初回投与は、本明細書に記載の任意の製剤を用いて、本明細書に記載の任意の経路によるなどの実用的な任意の経路を介することができる。分子は、疾患または状態の発症が検出または疑われた後、実行可能であればできるだけ早く、疾患の治療に
必要な長さの時間、例えば、約１ヶ月から約３か月まで投与されることができる。処置の長さは、各対象について変化し得る。
【０３８２】
分子は、生体コンパートメントに詰められることができる。分子を含む生体コンパートメントは、対象に投与されることができる。生体コンパートメントは、ウイルス（レンチウイルス、アデノウイルス）、ナノスフィア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノカプセル、ベシクル、ポリエチレングリコール粒子、ハイドロゲルおよびミセルを含むことができるが、これらに限定されない。
【０３８３】
例えば、生体コンパートメントはリポソームを含むことができる。リポソームは、それぞれが反対向きの両親媒性脂質分子を含有する２つの単層を含むことのできる脂質二重層を１つまたはそれ以上含む自己集合構造であることができる。両親媒性脂質は、１つまたは２つまたはそれ以上の非極性（疎水性）アシルまたはアルキル鎖に共有結合した極性（親水性）先頭基を含むことができる。疎水性のアシル鎖と周囲の水性媒体との間のエネルギー的に好ましくない接触が、極性先頭基が二重層表面に向き、アシル鎖が二重層内部に向くように両親媒性脂質分子がそれら自身を配置するように誘導し、アシル鎖を水性環境との接触から効果的に保護する。
【０３８４】
リポソーム中で使用される好ましい両親媒性化合物の例としては、ホスグリセリドおよびスフィンゴリピドが挙げられ、その代表例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンおよび卵スフィンゴミエリン、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【０３８５】
生体コンパートメントは、ナノ粒子を含むことができる。ナノ粒子は、約４０ナノメーターから約１．５マイクロメーターまで、約５０ナノメーターから約１．２マイクロメーターまで、約６０ナノメーターから約１マイクロメーターまで、約７０ナノメーターから約８００ナノメーターまで、約８０ナノメーターから約６００ナノメーターまで、約９０ナノメーターから約４００ナノメーターまで、約１００ナノメーターから約２００ナノメーターまでの直径を含むことができる。
【０３８６】
いくつかの場合において、ナノ粒子のサイズが増大するにつれて放出速度は遅くなるかまたは延長されることができ、ナノ粒子のサイズが減少するにつれて放出速度は増大することができる。
【０３８７】
ナノ粒子中のアルブミンの量は、約５％から約８５％アルブミン（ｖ／ｖ）まで、約１０％から約８０％まで、約１５％から約８０％まで、約２０％から約７０％アルブミン（ｖ／ｖ）まで、約２５％から約６０％まで、約３０％から約５０％まで、約３５％から約４０％までにわたることができる。医薬組成物は、３０、４０、５０、６０、７０もしくは８０％以下またはそれ以上のナノ粒子を含むことができる。いくつかの場合において、本開示の核酸分子は、ナノ粒子の表面に結合することができる。
【０３８８】
生体コンパートメントは、ウイルスを含むことができる。ウイルスは、本開示の医薬組成物のための送達系であることができる。代表的なウイルスは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスもしくＩ型はＩＩ型、パルボウイルス、細網内皮症ウイルスおよびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）を含むことができる。本開示
の医薬組成物は、ウイルスを用いて細胞に送達されることができる。ウイルスは、インビボ、エクスビボまたはインビトロで、細胞に感染し、形質導入することができる。エクスビボよびインビトロ送達において、形質導入された細胞が、治療を必要とする対象に投与されることができる。
【０３８９】
医薬組成物は、ウイルス送達系中にパッケージングされることができる。例えば、組成物は、ＨＳＶ−１ヘルパーウイルスを含まないパッケージング系によってビリオン中にパッケージングされることができる。
【０３９０】
ウイルス送達系（例えば、本開示の医薬組成物を含むウイルス）は、直接注入、定位的注入、脳室内に、ミニポンプ輸注系により、対流、カテーテル、静脈内、腸管外、腹腔内および／または皮下注入によって、必要とする対象の細胞、組織または器官に投与されることができる。いくつかの場合において、細胞は、インビトロまたはエクスビボで、ウイルス送達系により、形質導入されることができる。形質導入細胞は、疾患を有する対象に投与されることができる。例えば、医薬組成物を含むウイルス送達系によって幹細胞が形質導入されることができ、該肝細胞が疾患を処置するために患者に移植されることができる。いくつかの場合において、対象に与えられる形質導入細胞の用量は、単一用量中、約１×１０５細胞／ｋｇ、約５×１０５細胞／ｋｇ、約１×１０６細胞／ｋｇ、約２×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ、約６×１０６細胞／ｋｇ、約７×１０６細胞／ｋｇ、約８×１０６細胞／ｋｇ、約９×１０６細胞／ｋｇ、約１×１０７細胞／ｋｇ、約５×１０７細胞／ｋｇ、約１×１０８細胞／ｋｇまたはそれ以上であることができる。
【０３９１】
生体コンパートメント中の医薬組成物は、関節炎のような炎症性疾患、骨癌、乳癌、皮膚癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、咽頭癌および腎臓癌のような癌、細菌感染症を処置するため、神経損傷、肺、肝臓および腎臓疾患、目の処置、脊髄損傷、心臓疾患、動脈疾患を処置するために使用されることができる。
【０３９２】
細胞中への生体コンパートメントの導入は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、形質移入、コンジュゲーション、原形質融合、リポフェクション、エレクトロポーレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、微粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達などにより起こることができる。
【０３９３】
用量
本明細書に記載の医薬組成物は、正確な用量の単回投与に好適な単位剤形であることができる。単位剤形において、製剤は適切な量の１つまたはそれ以上の化合物を含有する単位用量に分割されることができる。単位用量は、個別の量の製剤を含有する包装の形態であることができる。非限定例としては、包装された錠剤またはカプセルおよびバイアルまたはアンプル入りの散剤が挙げられ得る。水性懸濁液組成物は、再度密封できない単回投与容器に包装されることができる。再度密封できる多数回投与容器は、例えば、防腐剤とともに使用されることができる。腸管外注射のための製剤は、単位剤形、例えば、アンプル中または防腐剤とともに多数回投与容器中で提示されることができる。
【０３９４】
本明細書に記載の分子は、約１ｍｇから約２０００ｍｇまで；約５ｍｇから約１０００ｍｇまで、約１０ｍｇから又は約２５ｍｇから５００ｍｇまで、約５０ｍｇから約２５０ｍｇまで、約１００ｍｇから約２００ｍｇまで、約１ｍｇから約５０ｍｇまで、約５０ｍｇから約１００ｍｇまで、約１００ｍｇから約１５０ｍｇまで、約１５０ｍｇから約２００ｍｇまで、約２００ｍｇから約２５０ｍｇまで、約２５０ｍｇから約３００ｍｇまで、
約３００ｍｇから約３５０ｍｇまで、約３５０ｍｇから約４００ｍｇまで、約４００ｍｇから約４５０ｍｇまで、約４５０ｍｇから約５００ｍｇまで、約５００ｍｇから約５５０ｍｇまで、約５５０ｍｇから約６００ｍｇまで、約６００ｍｇから約６５０ｍｇまで、約６５０ｍｇから約７００ｍｇまで、約７００ｍｇから約７５０ｍｇまで、約７５０ｍｇから約８００ｍｇまで、約８００ｍｇから約８５０ｍｇまで、約８５０ｍｇから約９００ｍｇまで、約９００ｍｇから約９５０ｍｇまで、または約９５０ｍｇから約１０００ｍｇまでの範囲内の組成物中に存在することができる。
【０３９５】
本明細書中に記載の分子は、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６５０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１０５０ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１１５０ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１２５０ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１３５０ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１４５０ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１５５０ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１６５０ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１７５０ｍｇ、約１８００ｍｇ、約１８５０ｍｇ、約１９００ｍｇ、約１９５０ｍｇまたは約２０００ｍｇの量で組成物中に存在することができる。
【０３９６】
本明細書に記載の分子（例えば、部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸および／または部位特異的ポリペプチドと核酸ターゲティング核酸の複合体）は、少なくとも０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、１０単位またはそれ以上の活性／ｍｇ分子を提供する組成物中に存在することができる。いくつかの実施態様において、対象に送達される分子の活性の総単位数は、少なくとも２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１１０，０００、１２０，０００、１３０，０００、１４０，０００、１５０，０００、１６０，０００、１７０，０００、１８０，０００、１９０，０００、２００，０００、２１０，０００、２２０，０００、２３０，０００または２５０，０００単位またはそれ以上である。いくつかの実施態様において、対象に送達される分子の活性の総単位数は、最大で２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１１０，０００、１２０，０００、１３０，０００、１４０，０００、１５０，０００、１６０，０００、１７０，０００、１８０，０００、１９０，０００、２００，０００、２１０，０００、２２０，０００、２３０，０００または２５０，０００単位またはそれ以上である。
【０３９７】
いくつかの実施態様において、少なくとも約１０，０００単位の活性が対象に送達され、体重５０ｋｇあたりに基準化される。いくつかの実施態様において、少なくとも約１０，０００、１５，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１１０，０００、１２０，０００、１３０，０００、１４０，０００、１５０，０００、１６０，０００、１７０，０００、１８０，０００、１９０，０００、２００，０００、２１０，０００、２２０，０００、２３０，０００または２５０，０００単位またはそれ以上の分子の活性が対象に送達され、体重５０ｋｇあたりに基準化される。いくつかの実施態様において、治療的有効量は、少なくとも５×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、１．１×１０７、１．２×１０７、１．５×１０７、１．６×１０７、１．７×１０７、１．８×１０７、１．９×１０７、２×１０７、２．１×１０７また
は３×１０７単位またはそれ以上の分子の活性である。いくつかの実施態様において、治療的有効量は、最大で５×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、１．１×１０７、１．２×１０７、１．５×１０７、１．６×１０７、１．７×１０７、１．８×１０７、１．９×１０７、２×１０７、２．１×１０７または３×１０７単位またはそれ以上の分子の活性である。
【０３９８】
いくつかの実施態様において、治療的有効量は、少なくとも約１０，０００、１５，０００、２０，０００、２２，０００、２４，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１２５，０００、１５０，０００、２００，０００または５００，０００単位／ｋｇ体重である。いくつかの実施態様において、治療的有効量は、最大で約１０，０００、１５，０００、２０，０００、２２，０００、２４，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１２５，０００、１５０，０００、２００，０００または５００，０００単位／ｋｇ体重である。
【０３９９】
いくつかの実施態様において、対象に送達される分子の活性は、少なくとも１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００、２５，０００、２６，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、３２，０００、３４，０００、３５，０００、３６，０００、３７，０００、４０，０００、４５，０００または５０，０００Ｕ／ｍｇ分子またはそれ以上である。いくつかの実施態様において、対象に送達される分子の活性は、最大で１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００、２５，０００、２６，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、３２，０００、３４，０００、３５，０００、３６，０００、３７，０００、４０，０００、４５，０００または５０，０００Ｕ／ｍｇ分子またはそれ以上である。
【０４００】
薬力学および薬物動態測定
薬力学および薬物動態データは、様々な実験技術によって得られることができる。特別な組成物を説明する適切な薬力学および薬物動態プロフィールの構成要素は、ヒト対象における薬物代謝の変動によって変化することができる。薬力学および薬物動態プロフィールは、一群の対象の平均パラメータの決定に基づくことができる。該対照群は、代表的な平均を決定するのに好適な任意の合理的な数の対象、例えば、５人の対象、１０人の対象、１５人の対象、２０人の対象、２５人の対象、３０人の対象、３５人またはそれ以上の対象を含む。平均は、測定した各パラメータのすべての対象の測定値の平均を計算することによって決定されることができる。用量は、本明細書に記載の所望のまたは有効な血液プロフィールのような所望の薬力学または薬物動態プロフィールを達成するために調節されることができる。
【０４０１】
薬力学パラメータは、分子を説明するのに好適な任意のパラメータであることができる。例えば、Ｃｍａｘは、約２５ｎｇ／ｍＬ未満でない；約５０ｎｇ／ｍＬ未満でない；約７５ｎｇ／ｍＬ未満でない；約１００ｎｇ／ｍＬ未満でない；約２００ｎｇ／ｍＬ未満でない；約３００ｎｇ／ｍＬ未満でない；約４００ｎｇ／ｍＬ未満でない；約５００ｎｇ／ｍＬ未満でない；約６００ｎｇ／ｍＬ未満でない；約７００ｎｇ／ｍＬ未満でない；約８００ｎｇ／ｍＬ未満でない；約９００ｎｇ／ｍＬ未満でない；約１０００ｎｇ／ｍＬ未満でない；約１２５０ｎｇ／ｍＬ未満でない；約１５００ｎｇ／ｍＬ未満でない；約１７５０ｎｇ／ｍＬ未満でない；約２０００ｎｇ／ｍＬ未満でない；または本明細書に記載の分子の薬力学プロフィールを説明するのに適切な任意の他のＣｍａｘであることができる。
【０４０２】
本明細書に記載の分子のＴｍａｘは、例えば、約０．５時間超でない、約１時間超でない、約１．５時間超でない、約２時間超でない、約２．５時間超でない、約３時間超でない、約３．５時間超でない、約４時間超でない、約４．５時間超でない、約５時間超でない、または本明細書に記載の分子の薬力学プロフィールを説明するのに適切な任意の他のＴｍａｘであることができる。
【０４０３】
本明細書に記載の分子のＡＵＣ（０−ｉｎｆ）は、例えば、約５０ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約１００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約１５０ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約２００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約２５０ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約３００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約３５０ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約４００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約４５０ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約５００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約６００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約７００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約８００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約９００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約１０００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約１２５０ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約１５００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約１７５０ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約２０００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約２５００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約３０００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約３５００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約４０００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約５０００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約６０００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約７０００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約８０００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約９０００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、約１０，０００ｎｇ／時間／ｍＬ未満でない、または本明細書に記載の分子の薬力学プロフィールを説明するのに適切な任意の他のＡＵＣ（０−ｉｎｆ）であることができる。
【０４０４】
投与の約１時間後の本明細書に記載の分子の血漿濃度は、例えば、約２５ｎｇ／ｍＬ未満でない、約５０ｎｇ／ｍＬ未満でない、約７５ｎｇ／ｍＬ未満でない、約１００ｎｇ／ｍＬ未満でない、約１５０ｎｇ／ｍＬ未満でない、約２００ｎｇ／ｍＬ未満でない、約３００ｎｇ／ｍＬ未満でない、約４００ｎｇ／ｍＬ未満でない、約５００ｎｇ／ｍＬ未満でない、約６００ｎｇ／ｍＬ未満でない、約７００ｎｇ／ｍＬ未満でない、約８００ｎｇ／ｍＬ未満でない、約９００ｎｇ／ｍＬ未満でない、約１０００ｎｇ／ｍＬ未満でない、約１２００ｎｇ／ｍＬ未満でない、または本明細書に記載の分子の任意の他の血漿濃度であることができる。
【０４０５】
薬物動態パラメータは、本開示の医薬組成物を説明するのに好適な任意のパラメータであることができる。例えば、薬物動態プロフィールは、例えば、約２時間、約４時間、約８時間、約１２時間または約２４時間後の炎症に関連した因子の減少を示すことができる。
【０４０６】
薬学的に許容される塩
本開示は、本明細書に記載の任意の分子の薬学的に許容される塩の使用を提供する。薬学的に許容される塩は、例えば、酸付加塩および塩基付加塩を含むことができる。化合物に付加されて酸付加塩を形成する酸は、有機酸または無機酸であることができる。化合物に付加されて塩基付加塩を形成する塩基は、有機塩基または無機塩基であることができる。いくつかの実施態様において、薬学的に許容される塩は、金属塩である。いくつかの実施態様において、薬学的に許容される塩は、アンモニウム塩である。
【０４０７】
金属塩は、本発明の化合物への無機塩基の付加から生じることができる。無機塩基は、水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩またはリン酸塩などの、塩基性対イオンと対になった金属カチオンから成る。金属は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、遷移金属または典型金属であることができる。いくつかの実施態様において、金属は、リチウム、ナトリウム、カリ
ウム、セシウム、セリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、カルシウム、ストロンチウム、コバルト、チタン、アルミニウム、銅、カドミウムまたは亜鉛である。
【０４０８】
いくつかの実施態様において、金属塩は、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、セシウム塩、セリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩、カルシウム塩、ストロンチウム塩、コバルト塩、チタン塩、アルミニウム塩、銅塩、カドミウム塩、亜鉛塩またはそれらの任意の組合せである。
【０４０９】
アンモニウム塩は、本発明の化合物へのアンモニアまたは有機アミンの付加から生じることができる。いくつかの実施態様において、有機アミンは、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モルホリン、Ｎ−メチルモルホリン、ピペリジン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ジベンジルアミン、ピペラジン、ピリジン、ピラゾール、ピピラゾール（ｐｉｐｙｒｒａｚｏｌｅ）、イミダゾール、ピラジンまたはピピラジン（ｐｉｐｙｒａｚｉｎｅ）またはそれらの任意の組合せである。
【０４１０】
いくつかの実施態様において、アンモニウム塩は、トリエチルアミン塩、ジイソプロピルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、モルホリン塩、Ｎ−メチルモルホリン塩、ピペリジン塩、Ｎ−メチルピペリジン塩、Ｎ−エチルピペリジン塩、ジベンジルアミン塩、ピペラジン塩、ピリジン塩、ピラゾール塩、ピピラゾール塩、イミダゾール塩、ピラジン塩またはピピラジン塩またはそれらの任意の組合せである。
【０４１１】
酸付加塩は、本開示の分子への酸の付加から生じることができる。いくつかの実施態様において、酸は有機的である。いくつかの実施態様において、酸は無機的である。いくつかの実施態様において、酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、亜硝酸、硫酸、亜硫酸、リン酸、イソニコチン酸、乳酸、サリチル酸、酒石酸、アスコルビン酸、ゲンチシン酸、グルコン酸、グルカロン酸、サッカリン酸、ギ酸、安息香酸、グルタミン酸、パントテン酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、フマル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、クエン酸、シュウ酸またはマレイン酸またはそれらの任意の組合せである。
【０４１２】
いくつかの実施態様において、塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩、ゲンチシン酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、パントテン酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩またはマレイン酸塩またはそれらの任意の組合せである。
【０４１３】
操作された部位特異的ポリペプチド
総括
本開示は、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｓｙ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ａｒｇｏｎａｕｔなど）および／または関連酵素を改変するための方法、組成物、系および／またはキットを記載する。改変は、部位特異的ポリペプチドに対する任意の共有結合または非共有結合による改変を含み得る。いくつかの場合において、これは、部位特異的ポリペプチドの１つまたはそれ以上の領域への化学改変を含み得る。いくつかの場合において、改変は、部位特異的ポリペプチドの保存的または非保存的アミノ酸置換を含み得る。いくつかの場合において、改変は、天然の部位特異的ポリペプチド中に見出されないアミノ酸、ペプチドまたはドメインによる、部位特異的ポリペプチドの任意の部分の付
加、欠失または置換を含み得る。いくつかの場合において、１つまたはそれ以上の非天然のドメインが、部位特異的ポリペプチド中で付加、欠失または置換され得る。いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドは、融合タンパク質として存在し得る。
【０４１４】
いくつかの場合において、本開示は、所望の酵素特異性および／または活性を有する所望の標的核酸配列を認識するための部位特異的ポリペプチドの操作を提供する。部位特異的ポリペプチドに対する改変は、タンパク質工学によって実施されることができる。タンパク質工学は、部位特異的ポリペプチド全体の機能状態または内在性の細胞遺伝子座の実際の標的核酸配列を改変するために使用可能な、そのような操作された部位特異的ポリペプチドに機能ドメインを融合させることを含むことができる。本開示の部位特異的ポリペプチドは、内在性遺伝子の転写の活性化および抑制の両方を通じて、内在性遺伝子の発現を調節するために使用されることができる。
【０４１５】
部位特異的ポリペプチド融合物は、内在性の染色体配列を改変するために、他の調節または機能ドメイン、例えば、ヌクレアーゼ、トランスポゼースまたはメチラーゼ、に連結されることもできる。いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドは、本明細書に記載の少なくとも１つまたはそれ以上の調節ドメインに連結され得る。調節または機能ドメインの非限定例としては、ＫＲＡＢおよびＶＰ１６のような転写因子リプレッサーまたはアクチベータードメイン、コリプレッサーおよびコアクチベータードメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼならびにエンドヌクレアーゼＦｏｋＩ由来の切断ドメインのようなＤＮＡ切断ドメインが挙げられる。
【０４１６】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドの１つまたはそれ以上の特異的ドメイン、領域または構造要素は、一緒に改変されることができる。部位特異的ポリペプチドの改変は起こり得るが、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）および／または核酸ターゲティング核酸に結合もしくは認識する領域のような部位特異的ポリペプチドの要素に限定されない。そのような結合または認識要素は、保存された架橋性へリックス、強塩基性領域、Ｎ末端領域、Ｃ末端領域、ＲｕｖＣモチーフ（例えば、ＲｕｖＣおよび／またはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン）ならびにＨＮＨおよび／またはＨＮＨ様ドメインのような１つまたはそれ以上のヌクレアーゼドメインを含み得る。改変は、部位特異的ポリペプチド内のさらなるドメイン、構造要素、配列またはアミノ酸に対しても行われ得る。
【０４１７】
部位特異的ポリペプチドの１つまたはそれ以上の領域に対する改変は、部位特異的ポリペプチドの様々な性質を変更するために実施されうる。いくつかの場合において、改変は、一定の核酸標的配列に関する結合認識を変更し得る。これは、一定の配列に対する結合親和性および／または特異性を増大させることあるいは一定の標的核酸配列／認識要素を優先的にターゲティングすることを含み得るが、これらに限定されない。いくつかの場合において、改変は、天然のヌクレアーゼ機能を変更するために使用され得る。いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドに対する改変は、ＰＡＭ特異性、ｔｒａｃｒＲＮＡ特異性、ｃｒＲＮＡ特異性または核酸ターゲティング核酸のようなさらなる核酸エレメントに対する特異性を変更し得る。
【０４１８】
本明細書には、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）とゲノム編集（例えば、遺伝子の切断；例えば、切断とそれに続く外来配列の挿入（物理的挿入または相同組換え修復を介する挿入）および／または切断とそれに続くＮＨＥＪによる遺伝子の変更；１つまたはそれ以上の遺伝子の部分的または完全な不活性化；内在性遺伝子の機能状態の変更、調節エレメントの挿入によるアレルの生成；など）のために操作された１つまたはそれ以上のドメインもしくは領域の融合タンパク質および生殖細胞系に運び入れられるゲノムの変更を含む、組成物および方法が記載される。例えば、標的細胞中の１つまたはそれ以
上の遺伝子を編集（すなわち、変更）するためのこれらの組成物（すなわち、試薬）を作成および使用する方法も開示される。したがって、本明細書に記載の方法および組成物は、ターゲティングされる遺伝子の変更（例えば、ノックイン）および／または１つまたはそれ以上の遺伝子の（部分的または完全な）ノックアウトのため、および／または任意の標的アレルの配列の無作為化変異のための高効率の方法を提供し、したがって、ヒト疾患の動物モデルの作成を可能とする。当業者は、用語「ゲノム操作」または「ゲノム編集」が本明細書中の方法を記述するためにしばしば使用されるが、本明細書に記載の方法および組成物は、細胞のゲノムにおいて厳密に言及されない可能性のある任意の標的核酸を変更するためにも使用されることができることを理解する（例えば、合成核酸、プラスミド、ベクター、ウイルス核酸、組換え核酸などに対して使用可能である）。
【０４１９】
本明細書に記載の方法および組成物は、新規治療適用（例えば、遺伝疾患、癌、真菌、原虫、細菌およびウイルス感染症、虚血、血管病、関節炎、免疫不全などの予防および／または治療）、新規診断法（例えば、状態の予知および／または診断）並びに研究ツール（例えば、キット、機能的ゲノミクスアッセイならびに研究および薬物スクリーニングのための操作された細胞系および動物モデルを作成すること）ならびに増大した疾患抵抗性を含むがそれに限定されない、変更された表現型を有する植物を開発するためならびに果実の熟成特性、糖および油脂組成、収量および色の変更を提供するための手段を提供することを可能とする。本明細書に記載の方法および組成物は、新規なエピジェネティック研究を可能とする。
【０４２０】
タンパク質の改変および操作
アミノ酸変更
本明細書に記載のとおり、部位特異的ポリペプチドは改変されることができる。改変は、部位特異的ポリペプチドのアミノ酸に対する改変を含むことができる。改変は、一次アミノ酸配列および／または二次、三次および四次アミノ酸構造を変更することができる。いくつかの場合において、本発明の部位特異的ポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列が、該タンパク質の構造または機能に対する顕著な影響なしに変化させられることができる。変更がいくつかの領域（例えば、該タンパク質の重要でない領域）において起こる場合、変異の種類は全く重要でない可能性がある。いくつかの場合において、置換の位置によって、変異は結果としての変種の生物学的性質に対して大きな効果を有さない可能性がある。例えば、Ｃａｓ９変種の性質および機能は、野生型Ｃａｓ９と同じ種類であることができる。いくつかの場合において、変異は、部位特異的ポリペプチドの構造および／または機能に決定的に影響を及ぼすことができる。
【０４２１】
部位特異的ポリペプチドを改変する位置（例えば、Ｃａｓ９変種）は、配列および／または構造アラインメントを用いて決定されることができる。配列アラインメントは、ポリペプチドの類似および／または非類似の領域（例えば、保存された、保存されない、疎水性、親水性など）を同定することができる。いくつかの場合において、他の配列に類似する、対象とする配列中の領域が改変に好適である。いくつかの場合において、他の配列に非類似の、対象とする配列中の領域が改変に好適である。例えば、配列アラインメントが、データベース探索、ペアワイズアラインメント、多重配列アラインメント、ゲノム解析、モチーフ探索、ベンチマーキングおよび／またはＢＬＡＳＴ、ＣＳ−ＢＬＡＳＴ，ＨＨＰＲＥＤ、ｐｓｉ−ＢＬＡＳＴ、ＬＡＬＩＧＮ、ＰｙＭＯＬおよびＳＥＱＡＬＮのようなプログラムによって実行されることができる。構造アラインメントは、Ｄａｌｉ、ＰＨＹＲＥ、Ｃｈｉｍｅｒａ、ＣＯＯＴ、ＯおよびＰｙＭＯＬのようなプログラムによって実行されることができる。アラインメントは、データベース探索、ペアワイズアラインメント、多重配列アラインメント、ゲノム解析、モチーフ探索、ベンチマーキングまたはそれらの任意の組合せによって実行されることができる。
【０４２２】
部位特異的ポリペプチドは、核酸ターゲティング核酸および／または標的核酸に対する結合特異性を増大させるために改変されることができる。部位特異的ポリペプチドは、核酸ターゲティング核酸の特定の領域（例えば、スペーサー伸長部、スペーサー、最小のＣＲＩＳＰＲ反復（ＣＲＩＳＰＲ  ｒｅｐｅａｔ）、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部）および／または標的核酸への結合を増大させるために改変されることができる。
【０４２３】
いくつかの場合において、改変は、保存的改変を含むことができる。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖（例えば、システイン／セリン）において関連するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を含むことができる。
【０４２４】
いくつかの場合において、本明細書に開示されたＣａｓ９タンパク質におけるアミノ酸変化は、非保存的アミノ酸変化（すなわち、非類似の荷電または非荷電アミノ酸の置換）である。非保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖において関連しなくてもよいアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換または部位特異的ポリペプチドの生理活性を変更する置換を含むことができる。
【０４２５】
アミノ酸の変異は、標的核酸への結合の選択性も変化させることができる。変異は、変異した部位特異的ポリペプチドと標的核酸の間の結合の解離定数（Ｋｄ）における変化を含み得る変化をもたらし得る。変異した部位特異的ポリペプチドと標的核酸の間の結合のＫｄの変化は、非変異部位特異的ポリペプチドと標的核酸の間の結合のＫｄよりも１０００倍超、５００倍超、１００倍超、５０倍超、２５倍超、１０倍超、５倍超、４倍超、３倍超、２倍超高いかまたは低くてもよい。変異した部位特異的ポリペプチドと標的核酸の間の結合のＫｄの変化は、非変異部位特異的ポリペプチドと標的核酸の間の結合のＫｄよりも１０００倍未満、５００倍未満、１００倍未満、５０倍未満、２５倍未満、１０倍未満、５倍未満、４倍未満、３倍未満、２倍未満高いかまたは低くてもよい。
【０４２６】
変異は、変異した部位特異的ポリペプチドとＰＡＭモチーフの間の結合のＫｄにおける変化を含み得る変化をもたらし得る。変異した部位特異的ポリペプチドとＰＡＭモチーフの間の結合のＫｄにおける変化は、非変異部位特異的ポリペプチドとＰＡＭモチーフの間の結合のＫｄよりも１０００倍超、５００倍超、１００倍超、５０倍超、２５倍超、１０倍超、５倍超、４倍超、３倍超、２倍超高いかまたは低くてもよい。変異した部位特異的ポリペプチドとＰＡＭモチーフの間の結合のＫｄの変化は、非変異部位特異的ポリペプチドとＰＡＭモチーフの間の結合のＫｄよりも１０００倍未満、５００倍未満、１００倍未満、５０倍未満、２５倍未満、１０倍未満、５倍未満、４倍未満、３倍未満、２倍未満高いかまたは低くてもよい。
【０４２７】
変異は、変異した部位特異的ポリペプチドと核酸ターゲティング核酸の間の結合のＫｄにおける変化を含み得る変化をもたらし得る。変異した部位特異的ポリペプチドと核酸ターゲティング核酸の間の結合のＫｄにおける変化は、非変異部位特異的ポリペプチドと核酸ターゲティング核酸の間の結合のＫｄよりも１０００倍超、５００倍超、１００倍超、５０倍超、２５倍超、１０倍超、５倍超、４倍超、３倍超、２倍超高いかまたは低くてもよい。変異した部位特異的ポリペプチドと核酸ターゲティング核酸の間の結合のＫｄにおける変化は、非変異部位特異的ポリペプチドと核酸ターゲティング核酸の間の結合のＫｄよりも１０００倍未満、５００倍未満、１００倍未満、５０倍未満、２５倍未満、１０倍未満、５倍未満、４倍未満、３倍未満、２倍未満高いかまたは低くてもよい。
【０４２８】
部位特異的ポリペプチドの変異は、部位特異的ポリペプチドの酵素作用の反応速度論を変化させることもできる。変異は、変異した部位特異的ポリペプチドのＫｍにおける変化を含み得る変化をもたらし得る。変異した部位特異的ポリペプチドのＫｍにおける変化は
、非変異部位特異的ポリペプチドのＫｍよりも１０００倍超、５００倍超、１００倍超、５０倍超、２５倍超、１０倍超、５倍超、４倍超、３倍超、２倍超高いかまたは低くてもよい。変異した部位特異的ポリペプチドのＫｍにおける変化は、非変異部位特異的ポリペプチドのＫｍよりも１０００倍未満、５００倍未満、１００倍未満、５０倍未満、２５倍未満、１０倍未満、５倍未満、４倍未満、３倍未満、２倍未満高いかまたは低くてもよい。
【０４２９】
部位特異的ポリペプチドの変異は、部位特異的ポリペプチドのターンオーバーにおける変化を含み得る変化をもたらし得る。変異した部位特異的ポリペプチドのターンオーバーにおける変化は、非変異部位特異的ポリペプチドのターンオーバーよりも１０００倍超、５００倍超、１００倍超、５０倍超、２５倍超、１０倍超、５倍超、４倍超、３倍超、２倍超高いかまたは低くてもよい。変異した部位特異的ポリペプチドのターンオーバーにおける変化は、非変異部位特異的ポリペプチドのターンオーバーよりも１０００倍未満、５００倍未満、１００倍未満、５０倍未満、２５倍未満、１０倍未満、５倍未満、４倍未満、３倍未満、２倍未満高いかまたは低くてもよい。
【０４３０】
変異は、部位特異的ポリペプチドの酵素作用のΔＧにおける変化を含み得る変化をもたらし得る。変異した部位特異的ポリペプチドのΔＧにおける変化は、非変異部位特異的ポリペプチドのΔＧよりも１０００倍超、５００倍超、１００倍超、５０倍超、２５倍超、１０倍超、５倍超、４倍超、３倍超、２倍超高いかまたは低くてもよい。変異した部位特異的ポリペプチドのターンオーバーにおける変化は、非変異部位特異的ポリペプチドのΔＧよりも１０００倍未満、５００倍未満、１００倍未満、５０倍未満、２５倍未満、１０倍未満、５倍未満、４倍未満、３倍未満、２倍未満高いかまたは低くてもよい。
【０４３１】
変異は、部位特異的ポリペプチドの酵素作用のＶｍａｘにおける変化を含み得る変化をもたらし得る。変異した部位特異的ポリペプチドのＶｍａｘにおける変化は、非変異部位特異的ポリペプチドのＶｍａｘよりも１０００倍超、５００倍超、１００倍超、５０倍超、２５倍超、１０倍超、５倍超、４倍超、３倍超、２倍超高いかまたは低くてもよい。変異した部位特異的ポリペプチドのターンオーバーにおける変化は、非変異部位特異的ポリペプチドのＶｍａｘよりも１０００倍未満、５００倍未満、１００倍未満、５０倍未満、２５倍未満、１０倍未満、５倍未満、４倍未満、３倍未満、２倍未満高いかまたは低くてもよい。
【０４３２】
変異は、部位特異的ポリペプチドの任意の反応速度パラメータにおける変化を含み得る変化をもたらし得る。変異は、部位特異的ポリペプチドの任意の熱力学的パラメータにおける変化を含み得る変化をもたらし得る。変異は、部位特異的ポリペプチドの表面電荷、埋没した表面積および／または折りたたみ速度論および／または部位特異的ポリペプチドの酵素作用における変化を含み得る変化をもたらし得る。
【０４３３】
機能に必須の本発明の部位特異的ポリペプチド中のアミノ酸は、部位特異的変異誘発、アラニン−スキャニング変異誘発、タンパク質構造解析、核磁気共鳴、光親和性標識および電子断層撮影、ハイスループットスクリーニング、ＥＬＩＳＡ、生化学アッセイ、結合アッセイ、切断アッセイ（例えば、サーベイヤーアッセイ）、レポーターアッセイなどの方法により同定されることができる。
【０４３４】
他のアミノ酸変更は、グリコシル化形態のアミノ酸、他の分子との凝集性コンジュゲートおよび関連しない化学部分（例えば、ペグ化分子）との共有結合によるコンジュゲートも含み得る。共有結合性の変異体は、アミノ酸鎖中またはＮ末端またはＣ末端残基において見出される基に官能基を連結することによって調製されることができる。いくつかの場合において、変異した部位特異的ポリペプチドは、対立遺伝子変異型および変異種も含み
得る。
【０４３５】
Ｃａｓ９タンパク質の機能活性に影響しない領域のトランケーションが操作され得る。Ｃａｓ９タンパク質の機能活性に影響する領域のトランケーションが操作され得る。トランケーションは、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満、３５個未満、４０個未満、４５個未満、５０個未満、６０個未満、７０個未満、８０個未満、９０個未満、１００個またはそれ以上よりも少ないアミノ酸のトランケーションを含み得る。トランケーションは、５個超、１０個超、１５個超、２０個超、２５個超、３０個超、３５個超、４０個超、４５個超、５０個超、６０個超、７０個超、８０個超、９０個超、１００個超またはそれ以上よりも多いアミノ酸のトランケーションを含み得る。トランケーションは、部位特異的ポリペプチドの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％，８５％，９０％，９５％または１００％のトランケーションを含み得る。
【０４３６】
Ｃａｓ９タンパク質の機能活性に影響しない領域の欠失が改変され得る。Ｃａｓ９タンパク質の機能活性に影響する領域の欠失が操作され得る。欠失は、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、２５個未満、３０個未満、３５個未満、４０個未満、４５個未満、５０個未満、６０個未満、７０個未満、８０個未満、９０個未満、１００個またはそれ以上よりも少ないアミノ酸の欠失を含み得る。欠失は、５個超、１０個超、１５個超、２０個超、２５個超、３０個超、３５個超、４０個超、４５個超、５０個超、６０個超、７０個超、８０個超、９０個超、１００個超またはそれ以上よりも多いアミノ酸の欠失を含み得る。欠失は、部位特異的ポリペプチドの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％，８５％，９０％，９５％または１００％の欠失を含み得る。欠失は、Ｎ末端、Ｃ末端またはポリペプチド鎖中の任意の領域において起こることができる。
【０４３７】
スクリーニング
本開示は、部位特異的ポリペプチドを操作するための方法を提供する。スクリーニングは、部位特異的ポリペプチドを操作するために使用されることができる。例えば、スクリーニングは、部位特異的ポリペプチドの領域中の変異の効果をスクリーニングするために設定されることができる。例えば、スクリーニングは、ＲＮＡ構造（例えば、核酸ターゲティング核酸構造）への親和性またはプロセシング能力（例えば、標的核酸の切断）に対する強塩基性パッチの改変をテストするために設定されることができる。代表的なスクリーニング方法は、細胞ソーティング法、ｍＲＮＡディスプレイ、ファージディスプレイおよび定方向進化を含むが、これらに限定されない。
【０４３８】
融合物
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドは、非天然配列（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（すなわち、該ポリペプチドが、対立遺伝子またはそれが由来する配列から変化した改変を有する）（例えば、該ポリペプチドは融合物と呼ばれることができる）を含むように改変される。非天然配列は、１つまたはそれ以上の追加のタンパク質、タンパク質ドメイン、サブドメインまたはポリペプチドを含むこともできる。例えば、Ｃａｓ９は、転写因子ドメイン、ヌクレアーゼドメイン、核酸ポリメライジングドメインを含むがこれらに限定されない、任意の好適な追加の非天然核酸結合タンパク質（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）および／またはドメインと融合され得る。非天然配列は、Ｃａｓ９および／またはＣａｓ９ホモログの配列を含むことができる。
【０４３９】
非天然配列は、融合タンパク質に新しい機能を付与することができる。これらの機能は
、例えばＤＮＡ切断、ＤＮＡメチル化、ＤＮＡ損傷、ＤＮＡ修復、標的ＤＮＡに関連した標的ポリペプチド（例えば、ヒストン、ＤＮＡ結合タンパク質）の改変を含むことができ、例えば、ヒストンのメチル化、ヒストンのアセチル化、ヒストンのユビキチン化などをもたらす。融合タンパク質により付与される他の機能は、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、脱アミノ活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポゼース活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、リモデリング活性、プロテアーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、トランスフェラーゼ活性、ヒドロラーゼ活性、リアーゼ活性、イソメラーゼ活性、シンターゼ活性、シンセターゼ活性および脱ミリストイル化活性またはそれらの任意の組合せを含むことができる。
【０４４０】
ブリッジヘリックスに対する改変
いくつかの場合において、（ＰＡＭ特異性を変更するなどのために）Ｃａｓ９のブリッジヘリックス領域が改変され得る。いくつかの場合において、ブリッジヘリックスは、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９タンパク質中に同定されるブリッジヘリックス（残基５５１〜５６６）と相同性を共有する。いくつかの場合において、ブリッジヘリックスは、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９ブリッジヘリックスの残基５５１〜５５６と、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の相同性を共有し得る。いくつかの場合において、ブリッジヘリックスは、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９ブリッジヘリックスの残基５５１〜５５６と、最大で５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の相同性を共有し得る。
【０４４１】
いくつかの場合において、ブリッジヘリックスに対する改変は、本明細書に記載の個々のアミノ酸改変を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの場合において、ブリッジヘリックスに対する改変は、個々のアミノ酸または（ドメイン、構造モチーフ、タンパク質などの）他のタンパク質要素のようなポリペプチドの挿入、欠失または置換を含み得るが、これらに限定されない。
【０４４２】
改変は、ブリッジへリックスの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸に対する改変を含み得る。改変は、ブリッジへリックスの最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸に対する改変を含み得る。改変は、ブリッジヘリックスの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％も含み得る。改変は、ブリッジヘリックスの最大で５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％も含み得る。
【０４４３】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのブリッジヘリックス配列に対する改変は、アルファへリックス、ベータストランド、ベータシート、３１０−へリックス、ｐｉ−へリックス、ポリプロリンＩモチーフ、ポリプロリンＩＩモチーフ、ポリプロリン
ＩＩＩモチーフ、ベータターン、アルファ−ターン−アルファまたはへリックスのよじれまたはヒンジを含むがこれらに限定されない、特別のポリペプチド構造モチーフを含み得る。例えば、部位特異的ポリペプチドのブリッジヘリックスに対する置換は、１つまたはそれ以上のプロリンアミノ酸残基による置換または付加を含み得る。プロリン残基の挿入は、ＰＡＭに対するブリッジヘリックスの結合特異性を変更し得る、ブリッジヘリックス中のねじれを導入し得る。別の例において、置換または付加は、１つまたはそれ以上のグリシンアミノ酸残基を含み得る。グリシン残基の挿入または置換は、ブリッジヘリックスのフレキシビリティの増大またはＰＡＭに対するブリッジヘリックスの結合特異性も変更し得る「ヒンジ」を導入し得る。結合特異性の変更は、Ｃａｓ９タンパク質の酵素活性に影響する可能性があるかまたはない。
【０４４４】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのブリッジヘリックス配列に対する改変は、ブリッジヘリックスの少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の欠失を含み得る。いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのブリッジヘリックス配列に対する改変は、ブリッジヘリックスの最大で１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の欠失を含み得る。
【０４４５】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのブリッジヘリックス配列に対する改変は、相同な部位特異的ブリッジヘリックスの少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の付加または置換を含み得る。いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのブリッジヘリックス配列に対する改変は、相同な部位特異的ブリッジヘリックスの最大で１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の付加または置換を含み得る。
【０４４６】
例えば、非天然のＣａｓ９ブリッジヘリックスは、任意の好適な生物に由来し得る。いくつかの場合において、Ｃａｓ９タンパク質およびブリッジヘリックスは、古細菌、細菌、原生生物（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｐ．フリオスス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）など）を含むが、これらに限定されない原核生物に由来し得る。
【０４４７】
例えば、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９酵素のブリッジヘリックスは、異なる種からの別のＣａｓ９酵素由来のブリッジヘリックスまたはその断片により置換または挿入され得る。
【０４４８】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネスからのＣａｓ９に対する少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）および改変されたブリッジヘリックスを含む。
【０４４９】
強塩基性パッチに対する改変
ＰＡＭ結合および特異性は、Ｃａｓ９タンパク質内のさらなる領域によっても影響されうる。いくつかの場合において、ＰＡＭ結合部位に隣接する塩基性アミノ酸残基を含む強塩基性パッチまたは領域は、ＰＡＭ特異性を変更するためにも改変され得る。いくつかの場合において、強塩基性パッチまたは領域は、Ｎ末端領域内に含有されるＳ．ピオゲネスのＣａｓ９において同定される強塩基性パッチまたはＳ．ピオゲネスＣａｓ９のアミノ酸
残基１〜２７０との相同性を共有し得る。いくつかの場合において、強塩基性パッチは、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９の強塩基性パッチと、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の相同性を共有し得る。いくつかの場合において、強塩基性パッチは、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９の強塩基性パッチと、最大で５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の相同性を共有し得る。
【０４５０】
いくつかの場合において、強塩基性パッチに対する改変は、本明細書に記載の個々のアミノ酸改変を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの場合において、強塩基性パッチに対する改変は、個々のアミノ酸または（ドメイン、構造モチーフ、タンパク質などの）他のタンパク質要素のようなポリペプチドの挿入、欠失または置換を含み得るが、これらに限定されない。
【０４５１】
改変は、強塩基性パッチの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはそれ以上のアミノ酸に対する改変を含み得る。改変は、強塩基性パッチの最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはそれ以上のアミノ酸に対する改変を含み得る。改変は、強塩基性パッチの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％も含み得る。改変は、強塩基性パッチの最大で５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％も含み得る。
【０４５２】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドの強塩基性パッチ配列に対する改変は、アルファへリックス、ベータストランド、ベータシート、３１０−へリックス、ｐｉ−へリックス、ポリプロリンＩモチーフ、ポリプロリンＩＩモチーフ、ポリプロリンＩＩＩモチーフ、ベータターン、アルファ−ターン−アルファまたはへリックスのねじれもしくはヒンジを含むがこれらに限定されない、特別のポリペプチド構造モチーフを含み得る。
【０４５３】
部位特異的ポリペプチドの強塩基性パッチに対する置換は、１つまたはそれ以上の酸性アミノ酸残基による置換または付加を含み得る。酸性残基の挿入は、部位特異的ポリペプチドのこの領域の全体的塩基性電荷を低減することができ、ＰＡＭに対する強塩基性パッチの結合特異性を変更し得る。別の例において、置換または付加は、１つまたはそれ以上の塩基性アミノ酸残基を含み得る。塩基性残基の挿入または置換は、荷電領域または該ポリペプチドと核酸の間の相互作用のイオン強度を増大することができ、ＰＡＭに対する強塩基性パッチの結合特異性も変更し得る。結合特異性の変更は、部位特異的ポリペプチドの酵素活性に影響する可能性があるかまたはない。
【０４５４】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドの強塩基性パッチ配列に対する改変は、強塩基性パッチの少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％
、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の欠失を含み得る。いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドの強塩基性パッチ配列に対する改変は、強塩基性パッチの最大で１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の欠失を含み得る。
【０４５５】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドの強塩基性パッチ配列に対する改変は、相同なＣａｓ９強塩基性パッチの少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の付加または置換を含み得る。いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドの強塩基性パッチ配列に対する改変は、相同なＣａｓ９強塩基性パッチの最大で１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の付加または置換を含み得る。
【０４５６】
相同なＣａｓ９強塩基性パッチ配列は、任意の好適な生物に由来し得る。いくつかの場合において、Ｃａｓ９タンパク質は、古細菌、細菌、原生生物（例えば、Ｅ．コリ、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｐ．フリオススなど）を含む原核生物に由来し得る。例えば、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９酵素の強塩基性パッチは、別の種のＣａｓ９由来の強塩基性パッチまたはその断片により置換または挿入され得る。
【０４５７】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネスからのＣａｓ９に対する少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）および改変された強塩基性パッチを含む。
【０４５８】
ＨＮＨドメインに対する改変
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチド中のＨＮＨドメインは、ＰＡＭ特異性を変更するために改変され得る。いくつかの場合において、ＨＮＨドメインは、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９タンパク質のＣ末端ドメインにおいて同定されるＨＮＨドメイン（残基８６０〜１１００）との相同性を共有し得る。いくつかの場合において、ＨＮＨドメインは、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９のＨＮＨドメインの残基５５１〜５５６と、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の相同性を共有し得る。いくつかの場合において、ＨＮＨドメインは、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９のＨＮＨドメインの残基８６０〜１１００と、最大で５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の相同性を共有し得る。
【０４５９】
いくつかの場合において、ＨＮＨドメインに対する改変は、本明細書に記載の個々のアミノ酸改変を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの場合において、ＨＮＨドメインに対する改変は、個々のアミノ酸または（ドメイン、構造モチーフ、タンパク質などの）他のタンパク質要素のようなポリペプチドの挿入、欠失または置換を含み得るが、これらに限定されない。
【０４６０】
改変は、ＨＮＨドメインの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸に対する改変を含み得る。改変は、ＨＮＨドメインの最大で１、２、３、４、５、６、７
、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸に対する改変を含み得る。改変は、ＨＮＨドメインの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％も含み得る。改変は、ＨＮＨドメインの最大で５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％も含み得る。
【０４６１】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨドメイン配列に対する改変は、アルファへリックス、ベータストランド、ベータシート、３１０−へリックス、ｐｉ−へリックス、ポリプロリンＩモチーフ、ポリプロリンＩＩモチーフ、ポリプロリンＩＩＩモチーフ、ベータターン、アルファ−ターン−アルファまたはへリックスのねじれもしくはヒンジを含むがこれらに限定されない、特別のポリペプチド構造モチーフを含み得る。
【０４６２】
部位特異的ポリペプチドのＨＮＨドメインに対する置換は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基による置換または付加を含み得る。いくつかの場合において、ＨＮＨドメインは、他の好適な核酸結合ドメインと置換または融合され得る。核酸結合ドメインは、ＲＮＡを含むことができる。単一の核酸結合ドメインが存在することができる。核酸結合ドメインの例としては、へリックス−ターン−へリックスドメイン、ジンクフィンガードメイン、ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）ドメイン、翼状へリックスドメイン、翼状へリックスターンへリックスドメイン、へリックス−ループ−へリックスドメイン、ＨＭＧ−ボックスドメイン、Ｗｏｒ３ドメイン、イムノグロブリンドメイン、Ｂ３ドメイン、ＴＡＬＥドメイン、ジンクフィンガードメイン、ＲＮＡ認識モチーフドメイン、二本鎖ＲＮＡ結合モチーフドメイン、二本鎖核酸結合ドメイン、一本鎖核酸結合ドメイン、ＫＨドメイン、ＰＵＦドメイン、ＲＧＧボックスドメイン、ＤＥＡＤ／ＤＥＡＨボックスドメイン、ＰＡＺドメイン、Ｐｉｗｉドメインおよび低温ショックドメイン、ＲＮＡｓｅＨドメイン、ＨＮＨドメイン、ＲｕｖＣ様ドメイン、ＲＡＭＰドメイン、Ｃａｓ５ドメイン、Ｃａｓ６ドメインが挙げられることができるが、これらに限定されない。
【０４６３】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨドメイン配列に対する改変は、ＨＮＨドメインの少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の欠失を含み得る。いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨドメイン配列に対する改変は、ＨＮＨドメインの最大で１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の欠失を含み得る。
【０４６４】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨドメイン配列に対する改変は、相同なＣａｓ９ＨＮＨドメインの少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の付加または置換を含み得る。いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨドメイン配列に対する改変は、相同なＣａｓ９ＨＮＨドメインの最大で１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の付加または置換を含み得る。
【０４６５】
相同なＣａｓ９ＨＮＨドメインは、任意の好適な生物に由来し得る。いくつかの場合において、Ｃａｓ９タンパク質は、古細菌、細菌、原生生物（例えば、Ｅ．コリ、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｐ．フリオススなど）を含む原核生物に由来し得る。例えば、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９酵素のＨＮＨドメインは、別の種のＣａｓ９酵素由来のＨＮＨドメインまたはその断片により置換または挿入され得る。いくつかの場合において、少なくとも１つの相同なＣａｓ９ＨＮＨドメインがＨＮＨドメイン中に挿入され得る。いくつかの場合において、該少なくとも１つの相同なＣａｓ９ＨＮＨドメインは、少なくとも２つのＨＮＨドメインを含むＨＮＨドメインアレイを形成し得る。いくつかの場合において、ＨＮＨドメインアレイは、少なくとも１つのＣａｓ９ＨＮＨドメインおよび少なくとも１つの第２のＨＮＨドメインを含むことができる。
【０４６６】
いくつかの場合において、ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインに対する改変は、Ｃａｓ９のＨＮＨドメインに直列した（例えば、隣接した）同じまたは類似のＨＮＨまたはＮＨ様ドメインの挿入を含むことができる。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、Ｃａｓ９中のＨＮＨドメインのＮ末端および／またはＣ末端に挿入されることができる。Ｃａｓ９における１つまたはそれ以上のＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインの挿入は、標的核酸における特異性を拡張することにおいて有用であることができる。Ｃａｓ９における１つまたはそれ以上のＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインの挿入は、標的核酸における特異性を２倍にすることにおいて有用であることができる。例えば、１つまたはそれ以上のＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインの挿入は、より長い標的核酸を認識し、異なるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを認識し、および／またはより結合親和性の高い標的核酸を認識するようにＣａｓ９を設計することができる。
【０４６７】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネスからのＣａｓ９に対する少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）および改変されたＨＮＨドメインを含む。
【０４６８】
ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインに対する改変
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチド中のＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、ＰＡＭ特異性を変更するために改変され得る。いくつかの場合において、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９タンパク質において同定されるＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメイン（残基１〜２７０）との相同性を共有し得る。いくつかの場合において、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９のＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインの残基５５１〜５５６と、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の相同性を共有し得る。いくつかの場合において、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９のＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインの残基１〜２７０と、最大で５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の相同性を共有し得る。
【０４６９】
いくつかの場合において、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインに対する改変は、本明細書に記載の個々のアミノ酸改変を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの場合において、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインに対する改変は、個々のアミノ酸または（ドメイン、構造モチーフ、タンパク質などの）他のタンパク質要素のようなポリペプチドの挿入、欠失または置換を含み得るが、これらに限定されない。
【０４７０】
改変は、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインの少なくとも１、２、３、４、５、６、７
、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸に対する改変を含み得る。改変は、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインの最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸に対する改変を含み得る。改変は、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％も含み得る。改変は、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインの最大で５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％も含み得る。
【０４７１】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメイン配列に対する改変は、アルファへリックス、ベータストランド、ベータシート、３１０−へリックス、ｐｉ−へリックス、ポリプロリンＩモチーフ、ポリプロリンＩＩモチーフ、ポリプロリンＩＩＩモチーフ、ベータターン、アルファ−ターン−アルファまたはへリックスのねじれもしくはヒンジを含むがこれらに限定されない、特別のポリペプチド構造モチーフを含み得る。
【０４７２】
部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインに対する置換は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基による置換または付加を含み得る。いくつかの場合において、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、他の好適な核酸結合ドメインと置換または融合され得る。核酸結合ドメインは、ＲＮＡを含むことができる。単一の核酸結合ドメインが存在することができる。核酸結合ドメインの例としては、へリックス−ターン−へリックスドメイン、ジンクフィンガードメイン、ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）ドメイン、翼状へリックスドメイン、翼状へリックスターンへリックスドメイン、へリックス−ループ−へリックスドメイン、ＨＭＧ−ボックスドメイン、Ｗｏｒ３ドメイン、イムノグロブリンドメイン、Ｂ３ドメイン、ＴＡＬＥドメイン、ジンクフィンガードメイン、ＲＮＡ認識モチーフドメイン、二本鎖ＲＮＡ結合モチーフドメイン、二本鎖核酸結合ドメイン、一本鎖核酸結合ドメイン、ＫＨドメイン、ＰＵＦドメイン、ＲＧＧボックスドメイン、ＤＥＡＤ／ＤＥＡＨボックスドメイン、ＰＡＺドメイン、Ｐｉｗｉドメイン、低温ショックドメイン、ＲＮＡｓｅＨドメイン、ＨＮＨドメイン、ＲｕｖＣ様ドメイン、ＲＡＭＰドメイン、Ｃａｓ５ドメインおよびＣａｓ６ドメインが挙げられることができるが、これらに限定されない。
【０４７３】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメイン配列に対する改変は、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインの少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の欠失を含み得る。いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメイン配列に対する改変は、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインの最大で１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の欠失を含み得る。
【０４７４】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメイン配列に対する改変は、相同なＣａｓ９ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインの少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の付加または置換を含み得る。いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメイン配列に対する改変は、相同なＣ
ａｓ９ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインの最大で１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の付加または置換を含み得る。
【０４７５】
相同なＣａｓ９ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、任意の好適な生物に由来し得る。いくつかの場合において、Ｃａｓ９タンパク質は、古細菌、細菌、原生生物（例えば、Ｅ．コリ、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｐ．フリオススなど）を含む原核生物に由来し得る。例えば、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９酵素のＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、別の種からのもののような、別のＣａｓ９酵素由来のＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインまたはその断片により置換または挿入され得る。
【０４７６】
いくつかの場合において、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインに対する改変は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインに直列した（例えば、隣接した）同じまたは類似のＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインの挿入を含むことができる。ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、Ｃａｓ９中のＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインのＮ末端および／またはＣ末端に挿入されることができる。Ｃａｓ９における１つまたはそれ以上のＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインの挿入は、標的核酸における特異性を拡張することにおいて有用であることができる。Ｃａｓ９における１つまたはそれ以上のＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインの挿入は、標的核酸における特異性を２倍にすることにおいて有用であることができる。例えば、１つまたはそれ以上のＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインの挿入は、より長い標的核酸を認識し、異なるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを認識し、および／またはより結合親和性の高い標的核酸を認識するようにＣａｓ９を設計することができる。
【０４７７】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネスからのＣａｓ９に対する少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）および改変されたＲｕｖＣドメインを含む。
【０４７８】
ＲＮＡポリメラーゼ相同領域を含有するＣａｓ９ドメインに対する改変
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドは、ＲＮＡポリメラーゼとの相同性を共有しうる。両タンパク質は、結合の触媒および核酸の操作に関与する類似の機能的に相同なドメインを共有し得る。例えば、ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の結合に関与するポリペプチド配列の領域を含むことができる。いくつかの場合において、これらの領域は、二本鎖の融解を支援しうる。
【０４７９】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドは、核酸に関する酵素の結合特異性に影響する一定の領域も含み得る。いくつかの場合において、これらの領域は、ＲＮＡポリメラーゼにおいて見出されるドメインまたは領域との配列または機能的相同性のいずれかを共有し得る。いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのＮ末端の塩基性領域は、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡまたは一本鎖ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に結合し得る。Ｓ．ピオゲネスにおいて、これは、残基５０〜１００の領域に相当する。
【０４８０】
一般に、本開示は、この領域または隣接領域に対する任意の好適な改変を提供する。いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチド中のｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域（例えば、核酸ターゲティング核酸結合領域）は、核酸に関する特異性を変更するために改変され得る。いくつかの場合において、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域は、Ｓ．ピオゲネスのＣａｓ９タンパク質において同定されるｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域（残基５０〜１００）との相同性を共有し得る。いくつかの場合において、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域は、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９のｔｒａｃｒＲＮＡ／
ｃｒＲＮＡ結合領域の残基５０〜１００と、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の相同性を共有し得る。いくつかの場合において、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域は、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９のｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域の残基５０〜１００と、最大で５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の相同性を共有し得る。
【０４８１】
いくつかの場合において、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域に対する改変は、本明細書に記載の個々のアミノ酸改変を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの場合において、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域に対する改変は、個々のアミノ酸または（ドメイン、構造モチーフ、タンパク質などの）他のタンパク質要素のようなポリペプチドの挿入、欠失または置換を含み得るが、これらに限定されない。
【０４８２】
改変は、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸に対する改変を含み得る。改変は、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域の最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸に対する改変を含み得る。改変は、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％も含み得る。改変は、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域の最大で５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％も含み得る。
【０４８３】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域配列に対する改変は、アルファへリックス、ベータストランド、ベータシート、３１０−へリックス、ｐｉ−へリックス、ポリプロリンＩモチーフ、ポリプロリンＩＩモチーフ、ポリプロリンＩＩＩモチーフ、ベータターン、アルファ−ターン−アルファまたはへリックスのねじれもしくはヒンジを含むがこれらに限定されない、特別のポリペプチド構造モチーフを含み得る。
【０４８４】
例えば、部位特異的ポリペプチドのｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域に対する置換は、１つまたはそれ以上のタンパク質またはその断片による置換または付加を含み得る。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域は、任意の知られたＲＮＡ結合性タイプＩ、タイプＩＩまたはタイプＩＩＩＣＲＩＳＰＲシステムのメンバーからのＲＮＡ結合ドメインにより置換され得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域は、ＲＡＭＰスーパーファミリーの任意の知られたＲＮＡ結合メンバーからのＲＮＡ結合ドメインにより置換され得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域は、Ｃａｓ７、Ｃａｓ６、Ｃａｓ５ファミリーの任意の知られたＲＮＡ結合メンバーからのＲＮＡ結合ドメインにより置換され得る。一例において、ｔｒａｃｒＲＮＡの必要条件は、ＤＮＡ認識のためのペアピンの下流に位置するスペーサー配列を有する５’ヘアピン配列の必要条件で置き換えられ得る。
【０４８５】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域配列に対する改変は、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域の少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５
５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の欠失を含み得る。いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域配列に対する改変は、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域の最大で１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の欠失を含み得る。
【０４８６】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域配列に対する改変は、相同なＣａｓ９ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域の少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の付加または置換を含み得る。いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドのｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域配列に対する改変は、相同なＣａｓ９ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域の最大で１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の付加または置換を含み得る。
【０４８７】
相同な部位特異的ポリペプチドのｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域は、任意の好適な生物に由来し得る。いくつかの場合において、ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域は、古細菌、細菌、原生生物（例えば、Ｅ．コリ、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．サーモフィルス、Ｐ．フリオススなど）を含むが、これらに限定されない原核生物に由来し得る。例えば、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９のｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域は、別の種由来のもののような、別のＣａｓ９由来のｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ結合領域またはその断片により置換または挿入され得る。
【０４８８】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネスからのＣａｓ９に対する少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）および改変されたポリメラーゼ様ドメインを含む。
【０４８９】
ＰＡＭ特異性を変更するための改変
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ）（ＰＡＭ）を認識することができる。ＰＡＭは、部位特異的ポリペプチドにより認識される標的核酸中の任意の配列であることができ、核酸ターゲティング核酸のスペーサーによってターゲティングされる標的核酸配列の３’に隣接する。例えば、ＰＡＭは、５’−ＮＧＧ−３’または５’−ＮＧＧＮＧ−３’、５’−ＮＮＡＡＡＡＷ−３’、５’−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３’、５’−ＧＮＮＮＣＮＮＡ−３’、５’−ＮＮＮＡＣＡ−３’を含むことができ、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列によってターゲティングされる標的核酸配列の３’に隣接する。
【０４９０】
部位特異的ポリペプチドは、ＰＡＭ特異性を変更するために改変されることができる。例えば、部位特異的ポリペプチドは、改変前には該ポリペプチドが第１のプロトスペーサー隣接モチーフをターゲティングし、改変後には該部位特異的ポリペプチドが第２のプロトスペーサー隣接モチーフをターゲティングするように、改変されることができる。いくつかの場合において、変更されたＰＡＭ特異性は、結合特異性の変化（例えば、増大した結合、減少した結合）および／または結合定数の変化（例えば、増大したＫｄ、減少したＫｄ）を含むことができる。
【０４９１】
部位特異的ポリペプチドは、該部位特異的ポリペプチドが、野生型部位特異的ポリペプチドが認識するタイプとは異なる新しいタイプのＰＡＭを認識することができるように、改変されることができる。例えば、５’−ＮＧＧ−３’ＰＡＭを認識する部位特異的ポリペプチドは、５’−ＮＧＧＮＧ−３’ＰＡＭ、５’−ＮＮＡＡＡＡＷ−３’、５’−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３’、５’−ＧＮＮＮＣＮＮＡ−３’または５’−ＮＮＮＡＣＡ−３’を認識することができるように改変されることができる。
【０４９２】
部位特異的ポリペプチドの任意の領域（例えば、ブリッジヘリックス、ＨＮＨおよび／またはＨＮＨ様ドメイン、ＲｕｖＣおよび／またはＲｕｖＣ様ドメイン、塩基性パッチ）が、本開示の方法によってＰＡＭ特異性を変更するために操作されることができる。
【０４９３】
野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ピオゲネスからのＣａｓ９、配列番号８）の残基４４５〜５０７、４４６〜４９７、１０９６〜１２２５、１１０５〜１１３８に相当する領域は、ＰＡＭ認識を改変するために、操作されることができる。これらの領域の操作は、変異を導入すること、他のＣａｓ９オルソログからの対応する領域で置換すること、欠失、挿入などを含むことができる。残基７１８〜７５７、２２〜４９、６５〜９５、４４５〜５０７、４４６〜４９７、１０９６〜１２２５、１１０５〜１１３８に相当する領域は、核酸ターゲッティング核酸の認識を改変するために操作されることができる。残基４４５〜５０７および１１０５〜１１３８に相当する領域は、Ｐ−ドメイン認識を改変するために操作されることができる。
【０４９４】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネスからのＣａｓ９に対する少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）および改変を含み、ここで、改変の導入前には、該部位特異的ポリペプチドは、第１のＰＡＭに結合するのに適合しており、改変の導入後には、該部位特異的ポリペプチドは、異なるＰＡＭに結合するのに適合している。
【０４９５】
核酸ターゲティング核酸特異性を変更するための改変
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドは、核酸ターゲティング核酸を認識することができる。部位特異的ポリペプチドは、核酸ターゲティング核酸特異性を変更するために改変されることができる。例えば、部位特異的ポリペプチドは、改変前には、該ポリペプチドが第１の核酸ターゲティング核酸をターゲティングし、改変後には、部位特異的ポリペプチドが第２の核酸ターゲティング核酸をターゲティングするように改変されることができる。いくつかの場合において、変更された核酸ターゲティング核酸特異性は、結合特異性の変化（例えば、増大した結合、減少した結合）および／または結合定数の変化（例えば、Ｋｄを増加させる、Ｋｄを減少させる）を含むことができる。
【０４９６】
部位特異的ポリペプチドは、該部位特異的ポリペプチドが、野生型部位特異的ポリペプチドが認識するタイプとは異なる新しいタイプの核酸ターゲティング核酸を認識することができるように、改変されることができる。部位特異的ポリペプチドの任意の領域（例えば、ブリッジヘリックス、ＨＮＨおよび／またはＨＮＨ様ドメイン、ＲｕｖＣおよび／またはＲｕｖＣ様ドメイン、塩基性パッチ）が、本開示の方法によってＰＡＭ特異性を変更するために操作されることができる。
【０４９７】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネスからのＣａｓ９に対する少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）および改変を含み、ここで、改変の導入前には、部位特異的ポリペプチドは、第１の核酸ターゲティング核酸に結合するのに適合しており、改変の導入後には、部位特異的ポリペプチドは、異なる核酸ターゲテ
ィング核酸に結合するのに適合している。
【０４９８】
ハイブリダイゼーション必要条件を変更するための改変
挿入
部位特異的ポリペプチドは、標的核酸への結合特異性を増大させるために改変されることができる。配列が部位特異的ポリペプチド中に挿入され得る。いくつかの場合において、ＨＮＨおよび／またはＨＮＨ様ドメインが部位特異的ポリペプチド中に挿入され得る。非天然配列（例えば、ＨＮＨおよび／またはＨＮＨ様ドメイン）は、任意の種に起源を有し得る。挿入は、部位特異的ポリペプチド中の任意の位置において起こり得る。挿入は、部位特異的ポリペプチドの天然のＨＮＨおよび／またはＨＮＨ様ドメインに直列に（例えば、隣接して）起こり得る。挿入されたＨＮＨおよび／またはＨＮＨ様ドメインは、変異を含み得る。挿入されたＨＮＨおよび／またはＨＮＨ様ドメインは、該ドメインのヌクレアーゼ活性を低減する変異を含み得る。いくつかの場合において、ＲｕｖＣおよび／またはＲｕｖＣ様ドメインが、部位特異的ポリペプチド中に挿入され得る。挿入は、部位特異的ポリペプチド中に任意の位置において起こり得る。挿入は、部位特異的ポリペプチドの天然のＲｕｖＣおよび／またはＲｕｖＣ様ドメインに直列に（例えば、隣接して）起こり得る。挿入されたＲｕｖＣおよび／またはＲｕｖＣ様ドメインは、変異を含み得る。挿入されたＲｕｖＣおよび／またはＲｕｖＣ様ドメインは、該ドメインのヌクレアーゼ活性を低減する変異を含み得る。
【０４９９】
部位特異的ポリペプチドは、核酸ターゲティング核酸への結合特異性を増大させるために改変されることができる。配列が部位特異的ポリペプチド中に挿入され得る。ＨＮＨおよび／またはＨＮＨ様ドメインが部位特異的ポリペプチド中に挿入され得る。非天然配列（例えば、ＨＮＨおよび／またはＨＮＨ様ドメイン）は、任意の種に起源を有し得る。挿入は、部位特異的ポリペプチド中の任意の位置において起こり得る。挿入は、部位特異的ポリペプチドの天然のＨＮＨおよび／またはＨＮＨ様ドメインに直列に（例えば、隣接して）起こり得る。挿入されたＨＮＨおよび／またはＨＮＨ様ドメインは、変異を含み得る。挿入されたＨＮＨおよび／またはＨＮＨ様ドメインは、該ドメインのヌクレアーゼ活性を低減する変異を含み得る。ＲｕｖＣおよび／またはＲｕｖＣ様ドメインが、部位特異的ポリペプチド中に挿入され得る。挿入は、部位特異的ポリペプチド中に任意の位置において起こり得る。挿入は、部位特異的ポリペプチドの天然のＲｕｖＣおよび／またはＲｕｖＣ様ドメインに直列に（例えば、隣接して）起こり得る。挿入されたＲｕｖＣおよび／またはＲｕｖＣ様ドメインは、変異を含み得る。挿入されたＲｕｖＣおよび／またはＲｕｖＣ様ドメインは、該ドメインのヌクレアーゼ活性を低減する変異を含み得る。
【０５００】
部位特異的ポリペプチドはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド（例えば、ＲＮａｓｅドメイン、ジンクフィンガードメイン）に結合することのできるポリペプチドドメインを含むように操作されることができる。例えば、部位特異的ポリペプチドは、ＲＮａｓｅＨドメインを含むように操作されることができる。挿入されたＲＮａｓｅＨドメインは、変異を含み得る。挿入されたＲＮａｓｅＨドメインは、該ドメインのヌクレアーゼ活性を低減する変異を含み得る。
【０５０１】
部位特異的ポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ（例えば、へリックス−ターン−へリックスモチーフを含むドメイン、ロイシンジッパーモチーフを含むドメイン、へリックス−ループ−へリックスモチーフを含むドメイン、ジンクフィンガードメインを含むドメイン）に結合することのできるポリペプチドドメインを含むように操作されることができる。たとえば、部位特異的ポリペプチドは、へリックス−ターン−へリックスモチーフを含むように操作されることができる。へリックス−ターン−へリックスモチーフの非限定例としては、ｄｎａＢ、ＴｅｔＲ、ＭｕＢ、Ｐ２Ｒ、ＣｙｓＢ、ＢｉｒＡ、バクテリオファージラムダリプレッサー、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ、Ｍｙｂ、ＬｕｘＲ、ＭａｒＲ、ＥＴＳ、ＺＮＦ
１０ａ、Ｋｏｘ−１からのものが挙げられる。へリックス−ループ−へリックスモチーフは、２重らせん、３重らせん、４重らせん、翼状へリックス−ターン−へリックスまたは他の改変されたへリックス−ループ−へリックスであることができる。挿入されたドメインは、変異を含み得る。挿入されたドメインは、該ドメインのヌクレアーゼ活性を低減する変異を含み得る。
【０５０２】
補償変異（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）
部位特異的ポリペプチドは、変異したおよび／または操作された核酸ターゲティング核酸に優先的に結合し得るように、変異を含むおよび／または操作されることができる。部位特異的ポリペプチドと核酸ターゲティング核酸の対のそのような変異は、補償変異と呼ばれることができる。例えば、部位特異的ポリペプチドは、そのヌクレアーゼドメイン（例えば、ＨＮＨおよび／またはＨＮＨ様、ＲｕｖＣおよび／またはＲｕｖＣ様）が、核酸結合ドメイン（例えば、Ｃｙｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６核酸結合ドメイン）により置換されるように操作されることができる。部位特異的ポリペプチドは、核酸結合ドメイン（例えば、Ｃｙｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６核酸結合ドメイン）が部位特異的ポリペプチド中に挿入されるように、操作されることができる。得られた部位特異的ポリペプチドは、核酸結合ドメイン結合部位（例えば、Ｃｓｙ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６核酸結合ドメイン）を含むように変異および／または操作された核酸ターゲティング核酸に結合することができる。核酸ターゲティング核酸は、最小のｔｒａｃｒＲＮＡ配列中に核酸結合ドメイン結合部位を含むように変異および／または操作されることができる。核酸ターゲティング核酸は、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列中の核酸結合ドメイン結合部位を含むように変異および／または操作されることができる。核酸ターゲティング核酸は、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部中の核酸結合ドメイン結合部位を含むように変異および／または操作されることができる。
【０５０３】
いくつかの場合において、部位特異的ポリペプチドは、Ｓ．ピオゲネスからのＣａｓ９に対する少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）および該部位特異的ポリペプチドが操作された核酸ターゲティング核酸に結合できるが、未改変の核酸ターゲティング核酸には結合できない、補償変異を含む。
【０５０４】
粘着末端および平滑末端を作成する方法
いくつかの場合において、１つまたはそれ以上のニッカーゼ（すなわち、１つの実質的に不活性なヌクレアーゼドメインを含む部位特異的ポリペプチド）が、標的核酸中にターゲティングされた二本鎖切断を作成するために使用されることができる。１つまたはそれ以上のニッカーゼのそれぞれは、二本鎖標的核酸うちの１つの鎖をターゲティングすることができる。いくつかの場合において、２つのニッカーゼが、ターゲティングされた二本鎖切断を作成するために使用されることができる。
【０５０５】
２つのニッカーゼは、標的核酸を切断して、（標的核酸の切断部位が各鎖上の同じ位置にある）平滑末端切断を作成することができる。２つのニッカーゼは、いくつかの一本鎖ヌクレオチドが残るように各鎖内の異なる位置で標的核酸を切断し、それによって粘着末端を作成することができる。
【０５０６】
ニッカーゼ活性を有する２つの改変された部位特異的ポリペプチドによる標的核酸の切断は、標的核酸を切断し、外来的に提供されるドナーポリヌクレオチドの非存在下で細胞が配列を修復するのを可能とすることによって、標的核酸からの核酸材料の欠失または挿入をもたらすために使用され得る。いくつかの場合において、本開示の方法は、遺伝子をノックアウトするために使用されることができる。核酸ターゲティング核酸およびニッカーゼ活性を有する２つの改変された部位特異的ポリペプチドが、標的核酸に対する相同性を有するセグメントを少なくとも含むドナーポリヌクレオチド配列とともに細胞に同時投
与される場合、新たな核酸材料が該部位に挿入／複製され得る。そのような方法は、（例えば、タンパク質をコードする核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを「ノックイン」するために）核酸材料を標的核酸に付加（すなわち、挿入または置換）するため、タグ（例えば、６ｘＨｉｓ、蛍光たんぱく質（例えば、緑色蛍光たんぱく質；黄色蛍光たんぱく質など）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＦＬＡＧなど）を付加するため、遺伝子に調節配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド、開始コドン、停止コドン、スプライスシグナル、局在化シグナルなど）を付加するため、核酸配列を改変する（例えば、変異を導入する）ためなどに使用され得る。
【０５０７】
図３２は、ニッカーゼにより平滑末端を作成するための方法を示す。標的核酸二本鎖３２１０は、複数のＰＡＭ配列３２１５（枠で囲んだ）を含むことができ、ここで、１つのＰＡＭが標的核酸３２１０の一方の鎖上にあり、１つのＰＡＭは標的核酸３２１０の他方の鎖上にある。ニッカーゼとの複合体（ニッカーゼは示されない）の一部としての核酸ターゲティング核酸３２０５は、標的核酸３２１０の各鎖上のＰＡＭ３２１５に隣接するスペーサー配列にハイブリダイズすることができる。ニッカーゼは、標的核酸３２１０の一方の鎖を切断することができる。切断は、三角により示される。ＰＡＭが適切な間隔にあれば、ニッカーゼは各鎖の実質的に同じ場所で標的核酸を切断することができ、それによって平滑末端が生じる。ＰＡＭ配列は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０または５０またはそれ以上のヌクレオチドで隔てられ得る。ＰＡＭ配列は、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０または５０またはそれ以上のヌクレオチドで隔てられ得る。いくつかの場合において、ＰＡＭは、６ヌクレオチドで隔てられ得る（すなわち、各ＰＡＭの間に６ヌクレオチドがある）。いくつかの場合において、核酸ターゲティング核酸は、ＰＡＭの５’の約３ヌクレオチドを切断する。
【０５０８】
いくつかの実施態様において、粘着末端を作成するために、２つまたはそれ以上のニッカーゼが使用されることができる。図３３は、標的核酸のオーバーラップ領域をターゲティングする２つのニッカーゼが、どのように粘着末端を生じる二本鎖のずれた裂け目をもたらすことができるかを図解する。標的核酸二本鎖３３１０は、複数のＰＡＭ配列３３１５（枠で囲んだ）を含むことができる。ニッカーゼとの複合体（ニッカーゼは示されない）の一部としての核酸ターゲティング核酸３３０５は、標的核酸３３１０の各鎖上のＰＡＭ３３１５に隣接するスペーサー配列にハイブリダイズすることができる。ニッカーゼは、標的核酸３３１０の一方の鎖を切断することができる。切断は、三角により示される。ＰＡＭが適切な間隔にあれば、ニッカーゼはずれた位置で標的核酸を切断することができ、それによって粘着末端が生じる。ＰＡＭ配列は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０またはそれ以上のヌクレオチドで隔てられ得る。ＰＡＭ配列は、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０またはそれ以上のヌクレオチドで隔てられ得る。ＰＡＭ配列の距離は、作成された粘着末端の長さに関連することができる。例えば、ＰＡＭが互いに遠いほど、粘着末端は長くなる。
【０５０９】
２つまたはそれ以上のニッカーゼを使用して粘着末端を作成するための方法は、（反対の鎖上であるが）相互に実質的に隣接したＰＡＭ配列を含むことができる。いくつかの場合において、ＰＡＭ配列は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０またはそれ以上のヌクレオチドで隔てられ得る。いくつかの場合において、ＰＡＭ配列は、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０またはそれ以上のヌクレオチドで隔てられ得る。いくつかの場合において、ＰＡＭ配列は１つのヌクレオチドで隔てられる。いくつかの場合において、ＰＡＭ配列は、ヌクレオチドなしで隔てられる。
【０５１０】
標的核酸の濃縮および配列決定のための方法
総括
配列決定は、変異および／または他の配列変種（例えば、多型）を同定することによって疾患を診断するために有用であることができる。本開示の方法は、増幅方法を使用することなく、標的核酸配列を濃縮するための方法、キットおよび組成物を提供する。標的核酸は、部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸の使用によって濃縮されることができる。
【０５１１】
図３は、本開示の方法の代表的な実施態様を示す。部位特異的ポリペプチド３０５は、核酸ターゲティング核酸３１０を結合し、それによって、複合体３０６を形成することができる。核酸ターゲティング核酸３１０は、核酸親和性タグ（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇ）３１１を含むことができる。部位特異的ポリペプチド３０５は、ヌクレアーゼドメインを含むことができる。部位特異的ポリペプチド３０５は、酵素的に活性であることができる。部位特異的ポリペプチド３０５は、親和性タグ３１５を含むことができる。核酸ターゲティング核酸３１０は、標的核酸３２０にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施態様において、複数の複合体３０６が、標的核酸３２０内の複数の位置にハイブリダイズすることができる。切断工程３２５において、部位特異的ポリペプチド３０５のヌクレアーゼドメインが、標的核酸３２０を切断または切り取る３３０。切り出された標的核酸３４０は、精製工程３３５において精製されることができる。アダプター３４５が切り出された標的核酸に連結されることができる。アダプターは、切り出された標的核酸の配列決定を容易化することができる。
【０５１２】
図４は、本開示の方法の代表的な実施態様を示す。部位特異的ポリペプチド４０５は、核酸ターゲティング核酸４１０と相互作用し、それによって、複合体４０６を形成することができる。部位特異的ポリペプチド４０５は、ヌクレアーゼドメインを含むことができる。いくつかの実施態様において、部位特異的ポリペプチド４０５のヌクレアーゼドメインは、酵素的に不活性であることができる。部位特異的ポリペプチド４０５は、親和性タグ４１５を含むことができる。核酸ターゲティング核酸４１０は、標的核酸４２０にハイブリダイズすることができる。核酸ターゲティング核酸４１０は、核酸親和性タグ４１１を含むことができる。核酸ターゲティング核酸の親和性タグ４１１は、ヘアピン構造を含むことができる。複数の複合体４０６が、標的核酸４２０内の複数の位置にハイブリダイズすることができる。断片化工程２２５において、標的核酸４２０は、（本明細書中で「標的核酸」とも呼ばれる）標的核酸断片４４５に断片化されることができる。部位特異的ポリペプチド４０５は、部位特異的ポリペプチド４０５の親和性タグ４１５に結合することができる捕捉剤４４０によって精製されることができる。断片化された標的核酸４４５は、精製工程４５０において複合体４０６から溶離されることができる。同工程において、または場合により異なる工程において、アダプター４５５は、標的核酸に連結されることができる。アダプターは、標的核酸の配列決定を容易化することができる。
【０５１３】
核酸ターゲティング核酸および部位特異的ポリペプチドの複合体
核酸ターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９などの核酸誘導ヌクレアーゼ）と相互作用し、それによって、複合体を形成することができる。核酸ターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドを標的核酸に誘導することができる。
【０５１４】
いくつかの実施態様において、核酸ターゲティング核酸は、（例えば、部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む）複合体が部位特異的ポリペプチドの切断部位の外側に結合することができるように、操作されることができる。この場合、標的核酸は、複合体と相互作用することができず、標的核酸は（例えば、複合体から遊離して）切り出されることができる。
【０５１５】
いくつかの実施態様において、核酸ターゲティング核酸は、複合体が部位特異的ポリペ
プチドの切断部位の内側に結合することができるように、操作されることができる。この場合、標的核酸は、複合体と相互作用することができ、標的核酸は（例えば、複合体に結合されて）結合されることができる。
【０５１６】
核酸ターゲティング核酸は、（例えば、部位特異的ポリペプチドおよび／または核酸ターゲティング核酸を含む）複合体が核酸サンプル内の複数の位置にハイブリダイズできるように、操作されることができる。
【０５１７】
複数の複合体が核酸サンプルに接触させられることができる。複数の複合体は、同じ配列にハイブリダイズするように操作された核酸ターゲティング核酸を含むことができる。複数の複合体は、異なる配列にハイブリダイズするように操作された核酸ターゲティング核酸を含むことができる。
【０５１８】
配列は、標的核酸内の異なる位置にあることができる。位置は、同じ、または同様の標的核酸配列を含むことができる。位置は、異なる標的核酸配列を含むことができる。位置は、互いに定義された距離にあることができる。位置は、１０キロ塩基（Ｋｂ）未満離れている、８Ｋｂ未満離れている、６Ｋｂ未満離れている、４Ｋｂ未満離れている、２Ｋｂ未満離れている、１Ｋｂ未満離れている、９００ヌクレオチド未満離れている、８００ヌクレオチド未満離れている、７００ヌクレオチド未満離れている、６００ヌクレオチド未満離れている、５００ヌクレオチド未満離れている、４００ヌクレオチド未満離れている、３００ヌクレオチド未満離れている、２００ヌクレオチド未満離れている、１００未満ヌクレオチド離れていることができる。
【０５１９】
複合体は、標的核酸を切断することができ、１０キロ塩基（Ｋｂ）未満の長さ、８Ｋｂ未満の長さ、６Ｋｂ未満の長さ、４Ｋｂ未満の長さ、２Ｋｂ未満の長さ、１Ｋｂ未満の長さ、９００ヌクレオチド未満の長さ、８００ヌクレオチド未満の長さ、７００ヌクレオチド未満の長さ、６００ヌクレオチド未満の長さ、５００ヌクレオチド未満の長さ、４００ヌクレオチド未満の長さ、３００ヌクレオチド未満の長さ、２００ヌクレオチド未満の長さ、１００ヌクレオチド未満の長さの切り出された標的核酸を生じることができる。
【０５２０】
複合体は、１０キロ塩基（Ｋｂ）未満の長さ、８Ｋｂ未満の長さ、６Ｋｂ未満の長さ、４Ｋｂ未満の長さ、２Ｋｂ未満の長さ、１Ｋｂ未満の長さ、９００ヌクレオチド未満の長さ、８００ヌクレオチド未満の長さ、７００ヌクレオチド未満の長さ、６００ヌクレオチド未満の長さ、５００ヌクレオチド未満の長さ、４００ヌクレオチド未満の長さ、３００ヌクレオチド未満の長さ、２００ヌクレオチド未満の長さ、１００ヌクレオチド未満の長さであることができる断片化された標的核酸に結合することができる。
【０５２１】
部位特異的ポリペプチドのオフターゲットの結合部位を検出するための方法
総括
本開示は、部位特異的ポリペプチドのオフターゲットの結合部位を決定するための方法、組成物、系および／またはキットを記載する。本開示のいくつかの実施態様において、部位特異的ポリペプチドは、核酸ターゲティング核酸を含み、それによって複合体を形成することができる。複合体は、標的核酸と接触させられることができる。標的核酸は、複合体の親和性タグに結合することができる捕捉剤により捕捉されることができる。標的核酸の同一性は、配列決定によって決定されることができる。配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔなどのハイスループット配列決定）は、特別な結合部位が読み取られる回数を計数することによって、部位特異的ポリペプチドおよび／または複合体のオフターゲットの結合部位の頻度を同定することができる。本開示の方法、組成物、系および／またはキットは、より正確かつ特異的にターゲティングされた部位特異的ポリペプチドの開発を容易化することができる。
【０５２２】
図５は、本開示の方法の代表的な実施態様を示す。部位特異的ポリペプチド５０５は、親和性タグ５１０を含むことができる。部位特異的ポリペプチドは、核酸結合ドメイン５１５を含むことができる。核酸結合ドメイン５１５は、核酸であることができる。いくつかの実施態様において、核酸結合ドメイン５１５および部位特異的ポリペプチド５０５は、複合体５３１を形成することができる。複合体５３１は、標的核酸５３０と接触させられることができる（５２５）。好ましい実施態様において、標的核酸５３０は、ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡまたはｇＤＮＡ）である。複合体は、捕捉剤５４０によってアフィニティー精製されることができる（５３５）。捕捉剤５４０は、部位特異的ポリペプチド５０５からの親和性タグ５１０に結合することができる。捕捉剤５４０は、第２の親和性タグ５４５を含むことができる。捕捉剤５４０は、固体支持体５５５に結合することによってアフィニティー精製されることができる（５５０）。いくつかの実施態様において、固体支持体５５５は、捕捉剤の親和性タグ５４５に結合することのできるアフィニティー試薬でコーティングされたビーズである。場合により、固体支持体５５５は、精製を容易化するために、部位特異的ポリペプチド５０５の親和性タグ５１０に結合することができる。いくつかの実施態様において、１回またはそれ以上の精製が行われることができる。各回は、固体支持体５５５を部位特異的ポリペプチド５１０および／または捕捉剤５４５の親和性タグと接触させることを含むことができる。アフィニティー精製された複合体が、標的核酸５３０から溶離されることができる。続いて、標的核酸はさらなる加工処理のために調製されることができる。加工処理は、下流の分析方法、例えば、配列決定を含むことができる。
【０５２３】
図６は、本開示の方法の代表的な実施態様を示す。部位特異的ポリペプチド６０５は、親和性タグ６１０を含むことができる。部位特異的ポリペプチド６０５は、核酸結合ドメイン６１５を含むことができる。核酸結合ドメイン６１５は、核酸であることができる。いくつかの実施態様において、核酸結合ドメイン６１５は、親和性タグ６２０を含むことができる。いくつかの実施態様において、核酸結合ドメイン６１５および部位特異的ポリペプチド６０５は、複合体６３１を形成することができる。複合体６３１は、標的核酸６３０と接触させられることができる６２５。好ましい実施態様において、標的核酸６３０はＤＮＡである。複合体６３１は、捕捉剤６４０によってアフィニティー精製されることができる６３５。捕捉剤６４０は、条件的に、酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチドであることができる。捕捉剤６４０は、条件的に、Ｃｓｙ４の酵素的に不活性な変種であることができる。捕捉剤６４０は、親和性タグ６２０に結合することができる。捕捉剤６４０は、親和性タグ６４５を含むことができる。捕捉剤６４０は、固体支持体６５５に結合することによって、アフィニティー精製されることができる６５０。いくつかの実施態様において、固体支持体は、捕捉剤６４０の親和性タグ６４５に結合することのできるアフィニティー試薬でコーティングされたビーズである。場合により、固体支持体６５５は、精製を容易化するために、部位特異的ポリペプチド６０５の親和性タグ６１０に結合することができる。いくつかの実施態様において、２回の精製が行われることができ、各回は、固体支持体６５５を部位特異的ポリペプチド６１０および／または捕捉剤６４０の親和性タグと接触させることを含むことができる。親和性タグ６２０の切断は、標的核酸６３０の固体支持体６５５からの溶離６６０を容易化することができる。続いて、標的核酸６３０は、配列決定のような、さらなる下流の分析方法のために調製されることができる。
【０５２４】
方法
本開示は、ヌクレアーゼの免疫沈降および配列決定（ＮＩＰ−Ｓｅｑ）のための方法を提供する。いくつかの実施態様において、方法は、ａ）核酸サンプルを、酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチド、部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む複合体と接触させる工程を含むことができる。複合体は、標的核酸にハイブリダイズす
ることができる。複合体は、捕捉剤によって捕捉されることができ、複合体に結合した標的核酸は、配列決定されることができる。いくつかの実施態様において、方法は、オフターゲットの結合部位の同一性を決定する工程をさらに含むことができる。方法は、本明細書に記載の、部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸および部位特異的ポリペプチドと核酸ターゲティング核酸の複合体のいずれかを使用して実施されることができる。
【０５２５】
方法は、細胞の外側で実施されることができる。例えば、サンプルは、精製されたゲノムＤＮＡ、細胞ライセート、均質化された組織、血漿などを含むことができる。方法は、細胞中で実施されることができる。
【０５２６】
部位特異的ポリペプチド−標的核酸複合体は、複合体を形成するために、固定化されるかまたは架橋されることができる。細胞は、溶解される前に架橋されることができる。固定化されたまたは架橋した細胞は、細胞中のタンパク質−ＤＮＡ複合体を安定化することができる。好適な固定化剤および架橋剤は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、エタノールに基づく固定化剤、メタノールに基づく固定化剤、アセトン、酢酸、四酸化オスミウム、重クロム酸カリウム、クロム酸、過マンガン酸カリウム、水銀製剤、ピクリン酸塩、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、ビス［スルホスクシニミジル］スベレート（ＢＳ３）、３，３’−ジチオビス［スルホスクシニミジルプロピオネート］（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス［スルホスクシジミジルスクシネート（スルホ−ＥＧＳ）、ジスクシニミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジチオビス［スクシニミジルプロピオネート］（ＤＳＰ）、ジスクシニミジルスベレート（ＤＳＳ）、エチレングリコールビス［スクシニミジルスクシネート］（ＥＧＳ）のようなアミン反応性ＮＨＳ−エステル架橋剤、ＮＨＳ−ジアジリン、ＮＨＳ−ＬＣ−ジアジリン、ＮＨＳ−ＳＳ−ジアジリン、スルホ−ＮＨＳ−ジアジリン、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ジアジリンおよびスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ジアジリンのようなＮＨＳ−エステル／ジアジリン架橋剤を含むことができる。
【０５２７】
核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）は、アフィニティー精製の前にＤＮＡを断片化するために処理されることができる。断片化は、物理的、機械的または酵素的方法によって実施されることができる。物理的断片化は、標的ポリヌクレオチドを熱または紫外（ＵＶ）光に曝露することを含む。機械的破壊は、標的ポリヌクレオチドを所望の範囲の断片に機械的にせん断するために使用され得る。機械的せん断は、標的ポリヌクレオチドの繰り返しのピペッティング、超音波処理および噴霧化を含む、本分野で知られた多くの方法によって達成され得る。標的ポリヌクレオチドは、酵素的方法によっても断片化され得る。いくつかの場合において、制限酵素の使用などの酵素を使用して酵素消化が実施され得る。制限酵素は、標的ポリヌクレオチドの特異的または非特異的断片化を実施するために使用され得る。方法は、一般にＩ型酵素、ＩＩ型酵素および／またはＩＩＩ型酵素と記述される１つまたはそれ以上の型の制限酵素を使用し得る。ＩＩ型およびＩＩＩ型酵素は、一般に市販され、本分野で周知である。ＩＩ型およびＩＩＩ型酵素は、二本鎖ポリヌクレオチド配列内のヌクレオチドの特定の配列（「認識配列」または「認識部位」）を認識する。これらの配列の結合および認識に際して、ＩＩ型およびＩＩＩ形酵素は、ポリヌクレオチド配列を切断する。いくつかの場合において、切断は、「粘着末端」と呼ばれるオーバーハングした一本鎖ＤＮＡの部分を有するポリヌクレオチド断片を生じる。他の場合において、切断は、オーバーハングを有する断片を生じず、「平滑末端」を作り出す。方法は、粘着末端または平滑末端のいずれかを作成する制限酵素の使用を含み得る。核酸の断片は、増幅技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、長距離ポリメラーゼ連鎖反応、線形（ｌｉｎｅａｒ）ポリメラーゼ連鎖反応など）を介しても作成されることができる。
【０５２８】
断片化されると、部位特異的ポリペプチドを含む複合体は、固体支持体とのインキュベーションにより精製されることができる。例えば、部位特異的ポリペプチドがビオチンタ
グを含む場合、固体支持体は、ビオチンタグに結合するためにアビジンまたはストレプトアビジンによりコーティングされることができる。
【０５２９】
いくつかの実施態様において、断片化されると、部位特異的ポリペプチド、標的核酸および／または核酸ターゲティング核酸を含む複合体は、捕捉剤とのインキュベーションによって精製される。捕捉剤は、部位特異的ポリペプチドに融合された親和性タグに結合することのできる任意の作用物質を意味することができる。代表的な捕捉剤は、ビオチン、ストレプトアビジンおよび抗体を含むことができる。例えば、部位特異的ポリペプチドに融合された親和性タグがＦＬＡＧタグである場合、捕捉剤は抗ＦＬＡＧタグ抗体である。いくつかの実施態様において、捕捉剤は、親和性タグ（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン）を含むことができる。
【０５３０】
いくつかの場合において、捕捉剤は、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼである。例えば、捕捉剤は、酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチド、酵素的に不活性なＣｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６であることができる。
【０５３１】
捕捉剤は、固体支持体によって精製されることができる。例えば捕捉剤がビオチンタグを含む場合、ビオチン化された捕捉剤を結合するために、ビーズがアビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされることができる。
【０５３２】
方法のいくつかの実施態様において、２回またはそれ以上の精製が実施されることができる。少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回またはそれ以上の精製が実施されることができる。最大で１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回またはそれ以上の精製が実施されることができる。初回の精製は、捕捉剤の親和性タグに結合することのできる固体支持体による精製を含むことができ、２回目の精製は、部位特異的ポリペプチドの親和性タグに結合することのできる固体支持体による精製を含むことができる。初回の精製は、部位特異的ポリペプチドの親和性タグに結合することのできる固体支持体による精製を含むことができ、２回目の精製は、捕捉剤の親和性タグに結合することのできる固体支持体による精製を含むことができる。方法は、該方法を２回以上実施することによって、部位特異的ポリペプチドの結合特異性を最適化するために使用されることができる。
【０５３３】
捕捉された複合体は、部位特異的ポリペプチドおよび標的核酸を含むことができる。標的核酸は、高塩濃度洗浄（ｈｉｇｈ  ｓａｌｔ  ｗａｓｈｉｎｇ）、エタノール沈殿、沸騰およびゲル精製のような方法によって部位特異的ポリヌクレオチド複合体から溶離されることができる。
【０５３４】
溶離されたＤＮＡは、配列決定解析（例えば、せん断、アダプターの連結）のために調製されることができる。配列決定解析のための調製は、溶離された標的核酸の配列決定ライブラリーの作成を含むことができる。配列決定解析は、部位特異的ポリペプチドのオフターゲットの結合部位の同一性および頻度を決定することができる。配列決定は、好ましくは、ハイスループットな連続的方法を使用して並行して多くの配列が読み取られる、本質的に並行したやり方で、多くの（典型的に、何千から何十億の）核酸配列を決定する方法を使用して実施されることもできる。そのような方法は、（例えば、４５４  Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｒａｎｆｏｒｄ，  Ｃｏｎｎ．により市販される）ピロシーケンシング；（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）技術、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  Ｃａｌｉｆ．において市販される）連結による配列決定；（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．によるＴｒｕＳｅｑ（商標）およびＨｉＳｅｑ（商標）技術、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｍａｓｓ．によ
るＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）ならびにＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  Ｉｎｃ．，  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，  Ｃａｌｉｆ．によるＰａｃＢｉｏ  ＲＳにおいて市販されるような）改変されたヌクレオチドを使用する合成による配列決定、イオン検出技術による配列決定（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  Ｃａｌｉｆ．）、ＤＮＡナノボールの配列決定（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  Ｃａｌｉｆ．）；（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＬＴＤ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＵＫにより開発された）ナノポアに基づく配列決定技術および他の知られた高並列化配列決定法を含むが、これらに限定されない。
【０５３５】
いくつかの実施態様において、方法は、データを収集する工程およびデータを保存する工程をさらに含む。データは、機械により読み取り可能であることができ、コンピュータサーバーに保存および／または収集可能である（例えば、図３１および実施例２７）。
【０５３６】
核酸中の配列変種を検出するための方法
総括
いくつかの実施態様において、本開示の方法は、核酸中の配列変種を検出することを提供する。該方法は、本明細書に記載の部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸および部位特異的ポリペプチドと核酸ターゲティング核酸の複合体のいずれかを使用して実施されることができる。図７に示されるように、核酸サンプル７０５は核酸タグ７１０と連結されることができる７２０。核酸タグは、シングルガイド（ｓｉｎｇｌｅ  ｇｕｉｄｅ）ＲＮＡであることができる。核酸タグは、ｃｒＲＮＡを含むことができる。核酸タグは、検出可能な標識７１５を含むことができる。核酸タグ７１０に連結された核酸サンプル７０５は、全体として、タグ付き試験サンプル７２１と呼ばれることができる。タグ付き試験サンプル７２１は、固定化されたオリゴヌクレオチド７３５を含むアレイ７４０に接触させられることができる７２５。固定化されたオリゴヌクレオチド７３５は、核酸ライブラリー（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）と呼ばれることができる。オリゴヌクレオチド７３５は、二本鎖ＤＮＡであることができる。オリゴヌクレオチド７３５は、検出可能な標識７３０を含むことができる。タグ付き試験サンプル７２１の個々の構成要素は、ハイブリダイゼーションを容易化するための十分な相補性をそれらが共有するオリゴヌクレオチド７３５にハイブリダイズすることができる７４５。ハイブリダイゼーションの量は、２つの検出可能な標識７１５および７３０の強度を比較することによって定量化されることができる。例えば、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、２つの検出可能な標識を表示することができる。ハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドは、１つの検出可能な標識７３０を表示することができる。ハイブリダイズしたサンプルは、部位特異的ポリペプチド７５０と接触させられることができる。部位特異的ポリペプチドは、タグ付き試験サンプル７２１の構成要素とハイブリダイズした、アレイ７４０中のオリゴヌクレオチド７３５を切断することができる７５５。部位特異的ポリペプチドによる切断は、タグ付き試験サンプル７２１のハイブリダイズした構成要素が除去されることを可能とすることができる。部位特異的ポリペプチド７５０による切断後、ハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドの検出可能な標識７６０のみが、アレイ上に残る。残った検出可能な標識７６０は定量化されることができる。残った検出可能な標識７６０の定量化は、核酸サンプル７０５中にどの配列が表されたかおよびどれが表されなかったかに関係付けられることができる。残った検出可能な標識７６０を表示しないオリゴヌクレオチドは、核酸サンプル７０５中に表された配列に対応する。残った検出可能な標識７６０を表示するオリゴヌクレオチドは、核酸サンプル７０５中に表されなかった配列に対応する。
【０５３７】
いくつかの実施態様において、核酸サンプル８０５は、核酸タグ８１０と連結されることができる８２０。核酸タグは、シングルガイドＲＮＡであることができる。核酸タグは
、ｃｒＲＮＡを含むことができる。核酸タグは、検出可能な標識８１５を含むことができる。核酸タグに連結された核酸サンプルは、全体として、タグ付き試験サンプル８２１と呼ばれることができる。タグ付き試験サンプル８２１は、固定化されたオリゴヌクレオチド８３５を含むアレイ８４０に接触させられることができる８２５。固定化されたオリゴヌクレオチドは、核酸ライブラリーと呼ばれることができる。オリゴヌクレオチド８３５は、二本鎖ＤＮＡであることができる。タグ付き試験サンプル８２１の個々の構成要素は、ハイブリダイゼーションを容易化するための十分な相補性をそれらが共有するオリゴヌクレオチド８３５にハイブリダイズすることができる８４５。ハイブリダイズしたサンプルは、部位特異的ポリペプチド８５０と接触させられることができる。部位特異的ポリペプチドは、タグ付き試験サンプル８２１の構成要素とハイブリダイズした、アレイ８４０中のオリゴヌクレオチド８３５を切断することができる８５５。部位特異的ポリペプチド８５０による切断は、タグ付き試験サンプル８２１のハイブリダイズした構成要素が除去されることを可能とすることができる。部位特異的ポリペプチド８５０による切断は、固定化されたオリゴヌクレオチドの一部が切断され、アレイ８６０から分離されることを可能とすることができる。分離された切断オリゴヌクレオチド８６０は、配列決定のために適切なアダプター８７０に連結されることができる８６５。切断されたオリゴヌクレオチド８６０の配列決定は、核酸サンプル８０５中に表される配列を決定することができる。
【０５３８】
いくつかの実施態様において、市販のハイスループット配列決定プラットフォームを使用して、核酸ライブラリーが配列決定解析のために作成されることができる。該ライブラリーは、１つまたはそれ以上の配列決定タグ９３０および標的配列９４５を含むことのできる核酸を含むことができる。標的配列９４５は、核酸サンプル９０５中に表され得る配列であることができる。標的配列９４５は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含むことができる。場合により、核酸ライブラリー中の核酸は、１つまたはそれ以上の同定用ポリヌクレオチド配列（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）９３５、および１つまたはそれ以上の伸長配列９４０を含むことができる。この実施態様において、核酸サンプル９０５が、核酸タグ９１０と連結されることができる９２０。核酸タグはシングルガイドＲＮＡであることができる。核酸タグは、ｃｒＲＮＡを含むことができる。場合により、核酸タグは、親和性タグ９１５を含むことができる。核酸タグに連結された核酸サンプルは、全体として、タグ付き試験サンプル９２１と呼ばれることができる。タグ付き試験サンプル９２１は、核酸ライブラリーに接触させられることができる９２５。タグ付き試験サンプル９２１は、核酸ライブラリー中の核酸にハイブリダイズし、複合体９４６を形成することができる。ハイブリダイズしたタグ付き試験サンプルおよび核酸ライブラリーは、部位特異的ポリペプチド９５０と接触させられることができる。部位特異的ポリペプチド９５０は、ハイブリダイズした核酸ライブラリーの構成要素を切断することができる。切断された核酸ライブラリーの構成要素９６５は、未切断の構成要素から分離されることができる。未切断の構成要素は、配列決定解析に供されることができる。配列決定解析は、どの配列が核酸サンプル９０５中で表されたかを決定することができる。例えば、未切断の構成要素の配列は、核酸サンプル９０５中で表されなかった配列に相当することができる。これらの配列は、核酸ライブラリー中の既知の配列から除去されることができる。結果として生じる配列は、核酸ライブラリーの切断された構成要素９６５の配列であることができ、核酸サンプル９０５中で表された配列に相当することができる。
【０５３９】
部位特異的ポリペプチド９５０は、親和性タグ９５５を含むことができる。場合により、部位特異的ポリペプチド９５０は、部位特異的ポリペプチドの酵素的に不活性な変種であることができる。いくつかの実施態様において、酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチドは、ハイブリダイズした核酸ライブラリー（例えば、複合体９４６）と接触させられることができる。部位特異的ポリペプチドは、ハイブリダイズした核酸ライブラリーの構成要素を結合することができるが、切断することはできない。部位特異的ポリペプチドは
、親和性タグ９５５に結合することのできる捕捉剤９７５によってアフィニティー精製されることができる９７０。場合により、複合体９４６は、親和性タグ９１５に結合することができる捕捉剤によってアフィニティー精製されることができる。アフィニティー精製された核酸ライブラリーの構成要素は、配列決定解析に供されることができる。この実施態様において、配列決定された核酸ライブラリーの構成要素は、核酸サンプル９０５中で表される配列に対応することができる。
【０５４０】
配列決定
配列変種を検出するための方法は、変種を配列決定することを含むことができる。配列決定は、好ましくは、ハイスループットな連続的方法を使用して、並行して多くの配列が読み取られる、本質的に並行したやり方で、多くの（典型的に、何千から何十億の）核酸配列を決定する方法を使用して実施されることができる。そのような方法は、（例えば、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｒａｎｄｆｏｒｄ，  Ｃｏｎｎ．により市販される）ピロシーケンシング；（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）技術、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  Ｃａｌｉｆ．において市販される）連結による配列決定；（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．によるＴｒｕＳｅｑ（商標）およびＨｉＳｅｑ（商標）技術、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｍａｓｓ．によるＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）およびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  Ｉｎｃ．  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，  Ｃａｌｉｆ．によるＰａｃＢｉｏ  ＲＳにおいて市販されるような）改変されたヌクレオチドを使用する合成による配列決定、イオン検出技術による配列決定（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  Ｃａｌｉｆ．）；ＤＮＡナノボールの配列決定（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  Ｃａｌｉｆ．）；（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＬＴＤ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＵＫにより開発された）ナノポアに基づく配列決定技術、（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｙｎａｍｉｃｓによるＭｅｇａＢＡＣＥにおいて市販されるような）キャピラリー配列決定、電子的配列決定（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  Ｃａｌｉｆ．によるＳＭＲＴ（商標）技術において市販されるような）単一分子配列決定（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｅｌｅｃｕｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、液滴マイクロ流体配列決定、（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  Ｃａｌｉｆ．により市販されるような）ハイブリダイゼーションによる配列決定、バイサルフェイトシーケンシング（ｂｉｓｕｌｆａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）および他の知られた高並列化配列決定法を含むが、これらに限定されない。
【０５４１】
リアルタイムＰＣＲ
配列変種を検出するための方法は、リアルタイムＰＣＲを使用して変種を検出することを含むことができる。配列決定は、サンプル中に存在する増幅可能な核酸の量を検出することのできるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）とも呼ばれる、ＲＴ−ＰＣＲ）によって実施されることができる。ＱＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく技術であり、標的核酸を増幅し、同時に定量化するために使用されることができる。ＱＰＣＲは、標的核酸サンプル中の特定の配列の検出および定量化の両方を可能とすることができる。手順は、ポリメラーゼ連鎖反応の一般的原理に従うことができ、増幅された標的核酸が各増幅サイクルの後でリアルタイムに反応中に蓄積するため、増幅された標的核酸が定量化されうる、という追加の特徴を有する。定量化の２つの方法は、（１）二本鎖標的核酸にインターカレートする蛍光色素の使用および（２）相補的標的核酸とハイブリダイズしたときに蛍光を発する改変ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブ、であることができる。第一の方法において、標的核酸結合色素は、ＰＣＲにおけるすべての二本鎖（ｄｓ）核酸に結合し、色素の蛍光を生じることができる。ＰＣＲの間の核酸産物の増
加は、したがって、蛍光強度の増大をもたらすことができ、各サイクルにおいて測定されることができ、こうして、核酸濃度が定量化されることを可能とする。反応は、蛍光（ｄｓ）核酸色素の添加により、標準的なＰＣＲ反応と同様に準備されることができる。反応は、サーモサイクラーにおいて行われることができ、各サイクルの後に、検出器によって、蛍光のレベルが測定されることができ；色素は、（ｄｓ）核酸（すなわち、ＰＣＲ産物）に結合した時にのみ、蛍光を発することができる。標準希釈液を参照して、ＰＣＲにおける（ｄｓ）核酸濃度が決定されることができる。得られた値は、それに関連した絶対単位を有することができない。測定されたＤＮＡ／ＲＮＡサンプルの標準希釈液に対する比較は、標準液に対するサンプルの比率または割合を与えることができ、異なる組織または実験条件の間の相対的比較を可能とする。定量化における精度を確実にするために、標的遺伝子の発現は、安定して発現される遺伝子に対して正規化されることができる。これは、サンプル間の核酸の量または質における可能性のある相違の補正を可能とすることができる。第２の方法は、プローブ配列を含有する核酸のみを定量化するために、配列特異的なＲＮＡまたはＤＮＡに基づくプローブの使用することができ；したがって、レポータープローブの使用は、特異性を増大させることができ、何等かの非特異的核酸増幅の存在下でさえ、定量化を可能とすることができる。これは、すべての遺伝子が同様の効率で増幅されるという条件で、多重化（すなわち、異なる色の標識を伴う特異的プローブを使用することによって、同じ反応で数種の遺伝子をアッセイすること）を可能とすることができる。この方法は、プローブの一方の末端に蛍光レポーター（例えば、６−カルボキシフルオレセイン）を、反対の末端に蛍光のクエンチャー（例えば、６−カルボキシ−テトラメチルローダミン）を有する核酸に基づくプローブによって実施されることができる。クエンチャーにレポーターがごく接近していることは、その蛍光の検出を妨げ得る。ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によるプローブの分解は、レポーター−クエンチャーの近接性を解決することができ、したがって、蛍光のクエンチングされない発光を可能とすることができ、これが検出されることができる。各ＰＣＲサイクルにおいてレポータープローブによりターゲティングされる産物の増加は、プローブの分解およびレポーターの放出による蛍光の比例した増加をもたらすことができる。
【０５４２】
反応は、標準的なＰＣＲ反応と同様に準備されることができ、レポータープローブが添加されることができる。反応が開始すると、ＰＣＲのアニーリング段階の間、プローブとプライマーの両方が標的核酸にアニールすることができる。新しいＤＮＡ鎖の多量体化は、プライマーから開始されることができ、ポリメラーゼがプローブに到達すると、その５’−３’エキソヌクレアーゼがプローブを分解し、クエンチャーから蛍光レポーターを物理的に分離して蛍光の増加をもたらす。リアルタイムＰＣＲサーモサイクラーにおいて蛍光が検出され、測定されることができ、蛍光の幾何学的増加は産物の指数関数的増加に対応することができ、各反応における閾値サイクルを決定するために使用される。反応の指数関数相の間に存在するＤＮＡの相対濃度は、対数スケールにおいて、サイクル数に対して蛍光をプロットすることによって決定されることができる（したがって、指数関数的増量は、直線を与えることができる）。バックグラウンドより高い蛍光の検出のための閾値が決定されることができる。サンプルからの蛍光が閾値を超えるサイクルは、サイクル閾値、Ｃｔと呼ばれることができる。ＤＮＡの量が指数相の間はサイクルごとに２倍になることができるため、ＤＮＡの相対量が計算されることができる（例えば、別のものよりもＣｔが３サイクル早いサンプルは、２３＝８倍多いテンプレートを有する）。核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）の量は、既知量の核酸の連続的希釈液（例えば、未希釈、１：４、１：１６、１：６４）のリアルタイムＰＣＲにより作られた標準曲線に対して結果を比較することによって決定されることができる。ＱＰＣＲ反応は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）よりも有利な二元フルオロフォアアプローチを含むことができる（例えば、２つのオリゴヌクレオチドプローブがアンプリコンにアニールすることができる、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＦＲハイブリダイゼーションプローブ）。オリゴヌクレオチドは、効率
的なエネルギー移動に適合した距離に分離されたフルオロフォアと、頭尾方向にハイブリダイズするように設計されることができる。伸長産物に組み込まれたか、核酸に結合した時にシグナルを放射するように構造化された標識オリゴヌクレオチドの他の例としては：ＳＣＯＲＰＩＯＮＳプローブ、Ｓｕｎｒｉｓｅ（またはＡＭＰＬＩＦＬＯＵＲ）プライマー、およびＬＵＸプライマーおよびＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＥＡＣＯＮＳプローブが挙げられる。ＱＰＣＲ反応は、蛍光Ｔａｑｍａｎ方法論およびリアルタイムで蛍光を測定することのできる装置（例えば、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を使用することができる。Ｔａｑｍａｎ反応は、２つの異なる蛍光色素で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用することができる。一方の色素は、レポーター色素（６−カルボキシフルオレセイン）であることができ、他方は、クエンチング色素（６−カルボキシ−テトラメチルローダミン）であることができる。プローブが未変化であるとき、蛍光エネルギー移動が起こり、レポーター色素の蛍光発光がクエンチング色素により吸収されることができる。ＰＣＲサイクルの伸長相の間、蛍光ハイブリダイゼーションプローブが、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’核酸分解活性によって切断されることができる。プローブが切断されると、レポーター色素発光はもはや効率的にクエンチング色素に移動することはできず、レポーター色素蛍光発光スペクトルの増大をもたらす。リアルタイム法または一点検出法（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｉｎｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を含む任意の核酸定量法が、サンプル中の核酸の量を定量化するために使用されることができる。検出は、数種の異なる方法論（例えば、染色、標識プローブによるハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの取り込みとそれに続くアビジン−酵素コンジュゲート検出；ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰのような３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の増幅されたセグメントへの取り込み）により実施されることができる。定量化は、増幅工程を含むことができるかまたは含むことができない。定量は、実験的であることはできない。
【０５４３】
マイクロアレイ
配列変種を検出するための方法は、マイクロアレイを使用して変種を配列決定および／または検出することを含むことができる。マイクロアレイは、核酸サンプル中の複数の遺伝子の発現レベルを決定するために使用されることができる。マイクロアレイは、核酸サンプル中の複数の配列の配列同一性を決定するために使用されることができる。
【０５４４】
マイクロアレイは、基板を含むことができる。基板は、ガラスおよび改変または官能化ガラス、（アクリル系、ポリスチレンおよびスチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）などを含む）プラスチック、多糖、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカまたはシリコンおよび改変シリコンを含むシリカに基づく材料、炭素、金属、無機ガラスおよびプラスチックを含むことができるが、これらに限定されない。
【０５４５】
マイクロアレイは、複数のポリヌクレオチドプローブを含むことができる。マイクロアレイは、約１、１０、１００、１０００、５０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、１１００００、１２００００またはそれ以上のプローブを含むことができる。
【０５４６】
プローブは、長さが少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０ヌクレオチドまたはそれ以上であることができる。
【０５４７】
いくつかの実施態様において、プローブは、遺伝子および／または種の特定の組に関する配列情報を含むことができる。プローブは、宿主タンパク質をコードする核酸配列に相補的であることができる。プローブは、非コーディング核酸配列に相補的であることがで
きる。プローブは、ＤＮＡ配列に相補的であることができる。プローブは、ＲＮＡ配列に相補的であることができる。
【０５４８】
プローブは、マイクロアレイ上に固定化されることができる。固体基板上へのポリヌクレオチドの固定化は、固体基板上へのポリヌクレオチドの直接合成（例えば、光リソグラフィー合成）によりまたは固体基板の所定の領域上への先に合成されたポリヌクレオチドの固定化（スポッティング）により達成されることができる。ポリヌクレオチドは、固体基板の表面を求核性官能基（例えば、アミノ基）により活性化すること、優れた脱離基によって活性化された生体分子（例えば、ポリヌクレオチド）を表面が活性化された固体基板にカップリングすることおよび未反応の反応物質を除去することによってマイクロアレイ基板上に固定化されることができる。プローブは、固体基板へ共有結合またはイオン結合によってさらにコンジュゲーションされたビーズに固定化されることができる。プローブは、低い伝導率および低い融点を有する特定の膜、すなわち金膜を使用して基板上に固定化されることができる。印加された電磁放射線は、入射部位において膜を融解することができ、切断することができる。膜は、コロイド状の分散体と接触させられ、融解に際して、反応部位で対流を生じさせ、それによって、特異的に融解した部位への分散体中の不溶性粒子の接着をもたらすことができる。
【０５４９】
マイクロアレイは、素性の不明な核酸サンプルを参照サンプルと比較することによって、素性の不明な核酸を含む核酸サンプル（例えば、試験サンプル）を分析することができる。核酸サンプルは、ＤＮＡ（例えば、単離されたＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ，染色体外ＤＮＡ）から調製されることができる。核酸サンプルは、ＲＮＡから調製されることができる。ＲＮＡは、遺伝子特異的なプライマーまたはユニバーサルプライマーによってＤＮＡに逆転写されることができる。逆転写されたＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）は、ＲＮＡを加水分解するためにＲｎａｓｅまたは塩基（例えば、ＮａＯＨ）で処理されることができる。ｃＤＮＡは、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド化学または同様のラベリングケミストリーによって色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５）で標識されることができる。好適な蛍光色素は、多様な市販の色素およびＡｌｅｘａ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、Ｊｏｅ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＢＯＤＩＰＹ、ＦＩＴＣ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅなどと表示される色素誘導体を含むことができる。参照サンプルは、試験サンプルとは異なる色素で標識化されることができる。
【０５５０】
試験サンプルおよび参照サンプルは、同時に複数のスポットに接触させるために、マイクロアレイに塗布されることができる。試験サンプルおよび参照サンプルは、核酸サンプル中の核酸がマイクロアレイ上の相補的プローブに結合することを可能としうるハイブリダイズ条件下でマイクロアレイに塗布されることができる。マイクロアレイ中の結合した分子によって、結合した反応物質分子の洗浄工程への曝露を含む多様な反応工程が実施されることができる。チップ上に固定化された核酸サンプルを特徴づけするために、反応の進行または結果が、マイクロアレイ中の各スポット（例えば、プローブ）においてモニターされることができる。マイクロアレイ分析は、通常、数分から数時間にわたる可能性のあるインキュベーション期間を必要とし得る。インキュベーション期間の持続時間は、アッセイに依存することができ、反応物質の種類、混合の程度、サンプル体積、標的のコピー数およびアレイの密度などの多様な因子によって決定されることができる。インキュベーション期間の間、核酸サンプル中の核酸は、マイクロアレイプローブに密着していることができる。
【０５５１】
検出は、ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ（Ｂｅｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）により提供されるＳｃａｎＡｒｒａｙ  ３０００のような、レーザー励起および光電子増幅管検出を備えた共焦点走査型装置を使用して実施されることができる。方法を実行するために、Ａｘｏｎ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｉ
ｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）およびＶｉｒｔｅｋ（Ｗｏｂｕｒｎ，  ＭＡ）により提供されるような共焦点および非共焦点蛍光検出システムが使用されることができる。代替の検出システムは、気体、ダイオードおよび固体レーザーを使用する走査システム並びにキセノンおよびハロゲンバルブのような多様な他の種類の光源を使用する走査システムを含むことができる。光増幅管に加えて、検出器は、電荷結合素子（ＣＣＤ）および相補型金属酸化物シリコン（ＣＭＯＳ）チップを使用するカメラを含むことができる。
【０５５２】
試験サンプルおよび参照サンプルからの２つの色素の強度の比が、各プローブに関して比較されることができる。所与のマイクロアレイスポットから検出されたシグナルの強度は、所与のスポット（例えば、スポットがプローブを含む）におけるプローブへのサンプル中の核酸のハイブリダイゼーションの程度に直接比例することができる。ハイブリダイズしたマイクロアレイの蛍光強度の分析は、スポットセグメンテーション、背景判定（および可能性のある背景除去）、バッドスポットの除去、それに続く、任意の残ったノイズを補正するための正規化の方法を含むことができる。正規化技術は、すべてのスポットまたはハウスキーピング遺伝子のようなスポットのサブセットにおける全体的正規化、より良いベースラインマッチを得るためのプレローグシフト、あるいは２つ（またはそれ以上）のチャネルハイブリダイゼーションの場合には、Ｍ＝０に中心を合わせたＭ対Ａプロットを与えるのを助けるおよび／または分布が最小となる対角線に中心を合わせたログ（Ｒｅｄ）対ログ（Ｇｒｅｅｎ）プロットを与えるのを助けるベストフィットを見出すことを含むことができる。Ｍ対Ａプロットは、Ｒ対Ｉプロットとも呼ばれることができ、ここで、Ｒは、Ｒ＝ｌｏｇ２（Ｒｅｄ／Ｇｒｅｅｎ）のような比であり、Ｉは、Ｉ＝ｌｏｇＶＲｅｄ＊Ｇｒｅｅｎのような強度である。スケーリング、シフティング、ベストフィットから散布図までは、マイクロアレイデータセットを正規化するためおよびその後の分析のためのより良い足がかりを与えるために利用される技術であることができる。これらの正規化法のほとんどは、その背景に、（「試験内のほとんどの遺伝子はあまり変化しない」などの）基礎となる同じ仮説を有することができる。
【０５５３】
タグ付けした核酸および使用方法
総括
本開示は、本明細書で記載したようなタグ付けした核酸ターゲティング核酸のためのキット、方法および組成物を提供する。図１０は、開示の核酸ターゲティング核酸１００５の実施形態例を示す。核酸ターゲティング核酸は、１つまたはそれ以上の非天然配列（例えば、タグ）１０１０／１０１５を含むことができる。核酸ターゲティング核酸は、核酸ターゲティング核酸の３’末端、５’末端のいずれかまたは３’および５’末端の両方に非天然配列１０１０／１０１５を含むことができる。
【０５５４】
場合によって、核酸ターゲティング核酸は本明細書で記載したような核酸ターゲティング核酸であってもよく、核酸ターゲティング核酸の３’末端、５’末端のいずれかまたは３’および５’末端の両方などに１つまたはそれ以上の非天然配列を含む。
【０５５５】
場合によって、核酸ターゲティング核酸は、本明細書で記載し、図１１に示したようなダブルガイド核酸ターゲティング核酸である。ダブルガイド核酸ターゲティング核酸は、２つの核酸分子１１０５／１１１０を含むことができる。ダブルガイド核酸ターゲティング核酸は、複数の非天然配列１１１５／１１２０／１１２５／１１３０を含むことができる。非天然配列は核酸ターゲティング核酸の各分子の３’末端、５’末端または３’および５’末端の両方に位置することができる。例えば、非天然配列は第１の核酸分子１１０５の３’末端、５’末端または３’および５’末端の両方に位置することができる。非天然配列は第２の分子１１１０の３’末端、５’末端または３’および５’末端の両方に位
置することができる。核酸ターゲティング核酸は、図１１において列挙した構成のいずれかにおいて１つまたはそれ以上の非天然配列を含むことができる。
【０５５６】
本開示は、タグ付けした核酸ターゲティング核酸の使用方法を提供する。この方法は、本明細書で記載したような部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸ならびに部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸の複合体のいずれかを使用して実施することができる。場合によって、複数のタグ付けした核酸ターゲティング核酸を複数の標的核酸と接触させることができる。図１２は、タグ付けした核酸ターゲティング核酸の使用方法例を示す。タグ付けした核酸ターゲティング核酸は、標的核酸１２０５とハイブリダイズすることができるスペーサー１２１０を含むことができる。核酸ターゲティング核酸は、非天然配列（例えば、タグ）１２２０を含むことができる。非天然配列１２２０は、ＲＮＡ結合タンパク質結合配列であることができる。場合によって、非天然配列１２２０は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ結合タンパク質結合配列であることができる。非天然配列１２２０にはＲＮＡ結合タンパク質１２１５が結合することができる。ＲＮＡ結合タンパク質１２１５は、非天然配列１２２５を含むことができる（例えば、融合体、すなわち、ＲＮＡ結合タンパク質１２１５は融合ポリペプチドであってもよい）。非天然配列（例えば、融合体）１２２５は、標的核酸および／または外来性核酸の転写を変更することができる。非天然配列（例えば、融合体）１２２５は、分割システムの第１の部分を含むことができる。
【０５５７】
いくつかの実施形態では、第２の核酸ターゲティング核酸は、第２の標的核酸１２４５にハイブリダイズすることができる第２のスペーサー１２４０を含み、第２の非天然配列（例えば、タグ）１２５０を含むことができる。第２の非天然配列（例えば、タグ）１２５０は、ＲＮＡ結合タンパク質結合配列であることができる。第２の非天然配列（例えば、タグ）１２５０は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ結合タンパク質結合配列であることができる。第２の非天然配列１２５０にはＲＮＡ結合タンパク質１２３５が結合することができる。ＲＮＡ結合タンパク質は、非天然配列１２３０を含むことができる（例えば、融合体、すなわち、ＲＮＡ結合タンパク質１２３５は融合体であってもよい）。非天然配列１２３０（例えば、融合体）は、分割システムの第２の部分であることができる。
【０５５８】
場合によって、分割システム１２２５の第１の部分および分割システム１２３０の第２の部分は空間的に接近することができ、したがって分割システム１２２５の第１の部分および分割システム１２３０の第２の部分は相互作用して１２５５、活性のある分割システム１２６０を形成する。活性のある分割システム１２６０とは、第１の部分および第２の部分が分割システム全体を形成する分割されていないシステムを意味することができる。分割システムの活性化は、２つの標的核酸１２０５／１２４５が空間的に接近したことを示すことができる。
【０５５９】
方法
本開示は、標的核酸を、部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む複合体と接触させ、１つまたはそれ以上のエフェクタータンパク質を導入するための方法であって、１つまたはそれ以上のエフェクタータンパク質が非天然配列を含み、改変された核酸ターゲティング核酸に結合することができる方法を提供する。エフェクタータンパク質とは、機能的効果を備えた任意のタンパク質を意味することができる。例えば、エフェクタータンパク質は酵素活性、リモデリング生体分子（例えば、フォールディングシャペロン）を含んでいてもよく、足場タンパク質であってもよく、および／または低分子または代謝物に結合していてもよい。エフェクタータンパク質は、標的核酸を改変（例えば、切断、酵素的に改変、転写によって改変）することができる。開示の方法は、バイオセンサーのような開示の組成物の使用を提供する。例えば、複合体（例えば、改変された核酸ターゲティング核酸、部位特異的ポリペプチドおよび／またはエフェクタータンパク質
を含む）は、遺伝子移動事象をモニターして、配列が３次元空間的に接近するときを検知し、転写を条件的に変更するために使用することができる。
【０５６０】
遺伝子移動事象
本開示は、遺伝子移動事象の発生を決定するための方法を提供する。この方法は、本明細書で記載したような部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸ならびに部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸の複合体のいずれかを使用して実施することができる。遺伝子移動事象は、例えば、転座、組換え、組込み、遺伝子転移、遺伝子水平導入事象、形質転換、形質導入、接合、遺伝子変換事象、重複、転座、反転、欠失、置換、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【０５６１】
遺伝子移動事象は、遺伝子間の組換えを含むことができる。組換えは、有害な遺伝子生成物を導くおそれがある（例えば、乳癌の原因となり得るＢＣＲ−ＡＢＬ組換え）。組換えは、例えば、相同組換え、非相同組換え（例えば、非相同末端結合）およびＶ（Ｄ）Ｊ組換えを含むことができる。組換えは、染色体交差を意味することができる。組換えは、減数分裂の分裂前期Ｉ（例えば、対合）中に起こり得る。組換えは、ＤＮＡの核酸鎖の２本鎖切断、その後のＤＮＡ鎖の交換を触媒することができるリコンビナーゼによるホリディジャンクションの形成を含むことができる。
【０５６２】
遺伝子移動事象は疾患の原因となり得る。例えば、慢性骨髄性白血病は遺伝子移動事象から生じ得る。染色体９と２２の間の転座は、融合体ＢＣＲ−Ａｂｌ１遺伝子を生じ、１染色体の伸長（例えば、９）および別の染色体の短縮（例えば、２２、すなわち、フィラデルフィア染色体）を引き起こすおそれがある。ＢＣＲ−Ａｂｌ１転座は、受容体（例えば、インターロイキン−３受容体）と相互作用して細胞分裂を促進することができるＢＣＲ−Ａｂｌ融合タンパク質の生成をまねき、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を引き起こすおそれがある。遺伝子移動事象のその他の非限定的例には、ＢＲＤ３−ＮＵＴ、ＢＲＤ４−ＮＵＴ、ＫＩＡＡ１５４９−ＢＲＡＦ、ＦＩＧ／ＧＯＰＣ−ＲＯＳ１、ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３、ＢＣＡＳ４−ＢＣＡＳ３、ＴＢＬ１ＸＲ１−ＲＧＳ１７、ＯＤＺ４−ＮＲＧ１、ＭＡＬＡＴ１−ＴＦＥＢ、ＡＰＳＣＲ１−ＴＦＥ３、ＰＲＣＣ−ＴＦＥ３、ＣＬＴＣ−ＴＦＥ３、ＮＯＮＯ−ＴＦＥ３、ＳＦＰＱ−ＴＦＥ３、ＥＴＶ６−ＮＲＴＫ３、ＥＭＬ４−ＡＬＫ、ＥＷＳＲ１−ＡＴＦ１、ＭＮ１−ＥＴＶ６、ＣＴＮＮＢ１−ＰＬＡＧ１、ＬＩＦＲ−ＰＬＡＧ１、ＴＣＥＡ１−ＰＬＡＧ１、ＦＧＦｒ１−ＰＬＡＧ１、ＣＨＣＨＤ７−ＰＬＡＧ１、ＨＭＧＡ２−ＦＨＩＴ、ＨＭＧＡ−ＮＦＩＢ、ＣＲＴＣ１−ＭＡＭｌ２、ＣＲＣＴ３−ＭＡＭＬ２、ＥＷＳＲ１−ＰＯＵＦ５Ｆ１、ＴＭＰＲＳＳ１−ＥＲＧ、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＴＶ４、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＴＶ５、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１−ＥＴＶ１、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＥＴＶ１、Ｃ１５ＯＲＦ２１−ＥＴＶ１、ＳＬＣ４５Ａ３−ＥＴＶ１、ＳＬＣ４５Ａ３−ＥＴＶ５、ＳＬＣ４５Ａ３−ＥＬＫ４、ＫＬＫ２−ＥＴＶ４、ＣＡＮＴ１−ＥＴＶ４、ＲＥＴ−ＰＴＣ１／ＣＣＤＣ６、ＲＥＴ−ＰＴＣ２／ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＲＥＴ−ＰＴＣ３，４／ＮＣＯＡ４、ＲＥＴ−ＰＴＣ５／ＧＯＬＧＡ５、ＲＥＴ−ＰＴＣ６／ＴＲＩＭ２４、ＲＥＴ−ＰＴＣ７／ＴＲＩＭ３３、ＲＥＴ−ＰＴＣ８／ＫＴＮ１、ＲＥＴ−ＰＴＣ９／ＲＦＧ９、ＲＥＴ−ＰＴＣＭ１、ＴＦＧ−ＮＴＲＫ１、ＴＰＭ３−ＮＲＴＫ１、ＴＰＲ−ＮＲＴＫ１、ＲＥＴ−Ｄ１０Ｓ１７０、ＥＬＫＳ−ＲＥＴ、ＨＯＯＫＳ３−ＲＥＴ、ＲＦＰ−ＲＥＴ、ＡＫＡＰ９−ＢＲＡＦ、およびＰＡＸ８−ＰＰＡＲＧが含まれる。
【０５６３】
遺伝子移動事象が原因となり得る疾患には、シャルコーマリートゥース病１Ａ型（ＣＭＴ１Ａ）、若年性ネフロン癆（ＮＰＨ）、Ｘ連鎖性魚鱗癬、家族性成長ホルモン欠乏症１Ａ型、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、α−サラセミア、血友病Ａ、ハンター症候群（すなわち、ムコ多糖症ＩＩ）、エメリドレフュス型筋ジストロフィー、ヘモグロビンレポア、ステロイド２１−ヒドロキシラーゼ欠乏症、糖質コルチコイド抑制性高アルドステロン症（ＧＳＨ）、色覚異常（例えば、２色型色覚）、常染色体劣性脊髄性筋
萎縮症（ＳＭＡ）、癌、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、悪性上皮細胞癌（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｉｄｌｉｎｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、星状細胞腫、分泌性乳癌、乳癌、腎臓癌、中胚葉性腎腫、肺腺癌、黒色腫、髄膜腫、多形性腺腫、粘液性類表皮癌、前立腺癌、甲状腺癌および急性前骨髄球性白血病を含むことができる。
【０５６４】
開示の方法は、標的核酸が２つの複合体と接触することができる遺伝子移動事象の発生の決定であって、各複合体が部位特異的ポリペプチドおよび改変された核酸ターゲティング核酸を含み、２つ以上のエフェクタータンパク質を導入することができ、２つ以上のエフェクタータンパク質が改変された核酸ターゲティング核酸に結合することができ、２つ以上のエフェクタータンパク質のうちの１つが分割システムの第１の部分である非天然配列を含み、２つ以上のエフェクタータンパク質のうちの１つが分割システムの第２の部分である非天然配列を含む遺伝子移動事象の発生の決定を提供する。分割システムとは、それぞれ蛍光性ではないが、複合体を形成したとき機能的（すなわち、蛍光を発する）蛍光タンパク質複合体を生じる２つ以上のタンパク質断片から構成されるタンパク質複合体を意味することができる。分割システム（例えば、分割蛍光タンパク質）の個々のタンパク質断片は、「相補的断片（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）」または「相補的断片（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）」と称することができる。自発的に機能的蛍光タンパク質複合体に組み込まれることができる相補的断片は、自己相補的な、自己組織化した、または自発的に関連する相補的断片として知られている。例えば、分割システムはＧＦＰを含むことができる。ＧＦＰ分割システムにおいて、相補的断片はＧＦＰの３次元構造から得られ、１１個の外側の逆平行ベータ鎖および１個の内側のアルファ鎖を含む。第１の断片は、ＧＦＰ分子の１１個のベータ鎖の１つ（例えば、ＧＦＰ  Ｓ１１）を含むことができ、第２の断片は残りの鎖（例えば、ＧＦＰ  Ｓ１〜１０）を含むことができる。
【０５６５】
遺伝子移動事象の前に、１つの複合体の標的となり得る標的核酸配列は、別の配列の標的となり得る標的核酸配列から離れていてもよい。２つの標的核酸配列の間の距離は、少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０Ｋｂまたはそれ以上を含むことができる。２つの標的核酸配列の間の距離は、多くても約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０Ｋｂまたはそれ以上を含むことができる。２つの標的核酸配列は、異なる染色体に位置していてもよい。２つの標的核酸配列は、同じ染色体に位置していてもよい。
【０５６６】
遺伝子移動事象の前に、分割システムの部分を構成するエフェクタータンパク質は、互いに相互作用することができなくてもよい（例えば、分割システムは不活性であってもよい）。遺伝子移動事象の後に、１つの複合体の標的となり得る標的核酸配列はその他の複合体の標的となり得る標的核酸配列に極めて近くに位置することができる。遺伝子移動事象の後で、分割システムの部分を構成するエフェクタータンパク質は、互いに相互作用して、それによって分割システムを活性化することができる。
【０５６７】
活性化した分割システムは、遺伝子移動事象の発生を示すことができる。例えば、活性化した分割システムが蛍光タンパク質分割システムである場合、遺伝子移動事象の前に、サンプル中で蛍光を検出することはできない。場合によって、不活性の分割システムの蛍光レベル（例えば、バックグラウンドレベル）は、分割システムを含まない対照試料（例えば、細胞）と比較して０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５倍またはそれ以上少ない蛍光であってもよい。場合によって、不活性の分割システムの蛍光レベル（例えば、バックグラウンドレベル）は、分割システムを含まない対照試料（例えば、細胞）よりも０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５倍またはそれ以上多い蛍光であってもよい。
【０５６８】
遺伝子移動事象の後に、２つの分割部分は合体して活性のある蛍光タンパク質を形成することができ、試料中で蛍光を検出することができる。活性のある分割システムは、蛍光の少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍またはそれ以上の増加を引き起こすことができる。活性のある分割システムは、蛍光の多くても約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍またはそれ以上の増加を引き起こすことができる。
【０５６９】
遺伝子移動の検出は、対象（例えば、患者）の遺伝子型同定に使用することができる。遺伝子型は疾患の指標となり得る。遺伝子移動事象の検出は、対照の診断に使用することができる。本明細書で記載した方法から得られた遺伝子診断情報は、対照に連絡することができる。本明細書で記載した方法から得られた遺伝子診断情報は、対象専用の処置計画を立てるために使用することができる。例えば、本開示の方法から得られたデータが、患者が特定の処置計画に対して抵抗性にする遺伝子型を有することを示す場合、対象のために新たな処置計画を立てることができる。
【０５７０】
転写の変更
開示の方法は、核酸の転写の変更を提供することができる。この方法は、本明細書で記載したような部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸ならびに部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸の複合体のいずれかを使用して実施することができる。この方法は、標的核酸を２つの複合体と接触させることであって、各複合体が部位特異的ポリペプチドおよび改変された核酸ターゲティング核酸を含むこと、ならびに２つ以上のエフェクタータンパク質を導入することであって、２つ以上のエフェクタータンパク質が改変された核酸ターゲティング核酸に結合することができ、２つ以上のエフェクタータンパク質のうちの１つが分割転写因子システムの第１の部分である非天然配列を含み、２つ以上のエフェクタータンパク質のうちの１つが分割転写因子システムの第２の部分である非天然配列を含み、分割システムの第１の部分と第２の部分の相互作用が核酸の転写を変更する転写因子を形成することを提供する。
【０５７１】
転写因子は、核酸および／または標的核酸の転写レベルを変更することができる。変更した転写は、転写レベルの増加および／または転写レベルの減少を含むことができる。転写因子は、転写レベルを変更していない転写レベルよりも２倍、３倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍またはそれ以上、高くまたは低く変更することができる。転写因子は、転写レベルを変更していない転写レベルよりも２倍、３倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍またはそれ以下、高くまたは低く変更することができる。
【０５７２】
転写因子は、標的核酸および／または外来性核酸の転写を変更することができる。標的核酸は、部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む複合体が接触する核酸であってもよい。外来性核酸は、ドナーポリヌクレオチド、プラスミドおよび／または標的核酸を含むことができる。
【０５７３】
外来性核酸は、アポトーシスに関与する遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。アポトーシスに関与する適切な遺伝子には、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−Ｒ２、ＴＮＦ受容体関連死ドメイン（ＴＲＡＤＤ）、Ｆａｓ受容体およびＦａｓリガンド、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ３、カスパーゼ８、カスパーゼ１０）、ＡＰＡＦ−１、ＦＡＤＤおよびアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）を含めることができる。外来性核酸には、細胞溶解を生じる遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含めることができる。適切な遺伝子には、アデノウイルス死タンパク質（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ
ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＤＰ）、ディフェンシン、ｃ−ＦＬＩＰから得られた膜透過性溶解性ペプチド、プロカスパーゼ、細胞貫通ペプチド、例えば、ＨＩＶ  ＴＡＴを含めることができる。外来性核酸には、細胞部位（例えば、ＭＨＣクラスペプチド）
に免疫細胞の動員を引き起こすことができる抗原をコードするポリヌクレオチドを含めることができる。外来性核酸には、ゲノム内に何回も生じ、大規模なゲノム断片化および細胞死を引き起こす配列（例えば、マイクロサテライト、縦列反復）を標的とする核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチドを含めることができる。
【０５７４】
標的核酸の改変
本開示は、開示の核酸ターゲティング核酸を使用して標的核酸を改変するための方法を提供する。この方法は、本明細書で記載したような部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸ならびに部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸の複合体のいずれかを使用して実施することができる。例えば、標的核酸は、部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸および１つまたはそれ以上のエフェクタータンパク質を含む複合体と接触させることができ、１つまたはそれ以上のエフェクタータンパク質は非天然配列を含み、改変された核酸ターゲティング核酸に結合することができる。非天然配列は酵素活性を与えることができ、および／またはエフェクタータンパク質の転写活性は標的核酸を改変することができる。例えば、エフェクタータンパク質がメチルトランスフェラーゼに対応する非天然配列を含むならば、メチルトランスフェラーゼは標的核酸をメチル化することができ得る。標的核酸の改変は、標的核酸の５’または３’末端のいずれかからヌクレオチドが少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個またはそれ以上離れたところに起こすことができる。標的核酸の改変は、標的核酸の５’または３’末端のいずれかからヌクレオチドが多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個以上離れたところに起こすことができる。改変は、標的核酸を含まない別個の核酸（例えば、別の染色体）に起こすことができる。
【０５７５】
改変例には、メチル化、脱メチル化、アセチル化、脱アセチル化、ユビキチン化、脱ユビキチン化、脱アミノ化、アルキル化、脱プリン化、酸化、ピリミジン二量体形成、遺伝子転移、組換え、鎖伸長、連結、グリコシル化を含めることができる。リン酸化、脱リン酸化、アデニル化、脱アデニル化、ＳＵＭＯ化、脱ＳＵＭＯ化、リボシル化、脱リボシル化、ミリストイル化、リモデリング、切断、酸化還元、水和・加水分解および異性化。
【０５７６】
遺伝子型の決定および処置
本開示は、開示の核酸ターゲティング核酸を使用して疾患を処置するための方法を提供する。この方法は、本明細書で記載したような部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸ならびに部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸の複合体のいずれかを使用して実施することができる。例えば、本明細書で記載した分割システムを使用して、（例えば、遺伝子移動事象において、染色体構造において、または線状核酸において）空間的に接近した２つ以上の標的核酸の存在は、（例えば、対象の）遺伝子型の指標となり得る。遺伝子型は、核酸の特定の配列、ヌクレオチド多型（すなわち、一塩基遺伝子多型または多塩基遺伝子多型のいずれか）、対立遺伝子変種または核酸の配列の任意のその他の指標の有無を意味することができる。遺伝子型は、患者が疾患を罹患しているかどうか、および／または疾患に罹患しやすいかどうかを示すことができる。
【０５７７】
遺伝子型の決定には、例えば、対象が変異配列（例えば、変異を含む核酸配列）を含むかどうかを決定することを含めることができる。場合によって、分割システムの第１の部分を含むために本明細書で記載したような適切な成分を含む第１の核酸ターゲティング核酸は、予測された変異配列の近くの領域を標的とするように設計することができる。場合によって、分割システムの第２の部分を含むために本明細書で記載したような適切な成分を含む第２の核酸ターゲティング核酸は、予測された変異配列を含む領域を標的とするように設計することができる。変異配列が存在するならば、第２の核酸ターゲティング核酸はその配列に結合することができ、分割システムの２つの部分は相互作用することができ
る。相互作用は、変異配列の存在を指示することができる信号を生成することができる。
【０５７８】
遺伝子型はバイオマーカーによって同定することができる。バイオマーカーは任意の生理学的プロセスを指示することができる。バイオマーカーは、処置（例えば、薬剤処置）の効能の指標として役立つことができる。バイオマーカーは、核酸、ポリペプチド、分析物、溶質、低分子、イオン、元素、核酸および／またはポリペプチドの改変、ならびに／または分解生成物であってもよい。バイオマーカーは、核酸および／またはポリペプチドの相対的発現レベルを意味することができる。
【０５７９】
対象専用の処置計画は、開示の方法を使用した対象の遺伝子型の測定から策定することができる。例えば、特定の療法に反応しないことが知られているある種の遺伝子型を対象が含む場合、対象は異なる療法で処置することができる。遺伝子型の決定は、臨床試験のために対象を選択するか、または選択しないことを可能にすることができる。
【０５８０】
遺伝子型の決定は、介護者から対象に（例えば、医師から患者に、または遺伝子型分析の実施者から顧客に）連絡することができる。連絡は、対面で（例えば、診療所において）、電話で、書面でまたは電子的に行うことができる。連絡はさらに、対象の遺伝子型から決定された対象専用の処置計画を対象に通知することができる。
【０５８１】
方法は対象に２回以上（例えば、反復して）実施することができる。例えば、対象の遺伝子型を測定し、処置行程を対象に指示し、対象の遺伝子型を再度測定することができる。２つの遺伝子型を比較して、処置行程の有効性を測定することができる。処置計画は、遺伝子型の比較に基づいて変更することができる。
【０５８２】
３次元空間における配列の位置
場合によって、本開示は、細胞の３次元空間において配列の位置を測定するための方法を提供する。この方法は、本明細書で記載したような部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸ならびに部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸の複合体のいずれかを使用して実施することができる。クロマチンおよび核酸の３次元構造の測定は、遺伝子の転写活性化および／または抑制などの遺伝子調節を理解するために重要であろう。場合によって、この方法は、標的核酸と２つの複合体を接触させることを含み、各複合体はそのコグネイト標的核酸に結合する。この複合体は、本開示の部位特異的ポリペプチドおよび核酸標的核酸を含むことができる。２つ以上のエフェクタータンパク質を導入することができ、２つ以上のエフェクタータンパク質はそれぞれ複合体に結合する。エフェクタータンパク質は、前述の分割システムに類似していてもよく、各エフェクタータンパク質は全ポリペプチドの不活性断片を含んでいてもよい。エフェクタータンパク質が空間的に離れている場合、エフェクタータンパク質は不活性である（例えば、信号が検出されない）。エフェクタータンパク質が相互作用するために空間的に十分に近いと、検出可能な活性化ポリペプチドを形成することができる。
【０５８３】
エフェクタータンパク質は、分割親和性タグシステムの一部であってもよい。分割親和性タグシステムにおいて、システムの２つの不活性ポリペプチド断片は、親和性タグの２つの不活性断片に対応することができる。２つの断片が一緒に結合すると、完全な親和性タグが回復し、したがって親和性タグは結合剤によって検出することができる。結合剤は、親和性タグに結合し精製することができる分子を意味することができる。結合剤の例には、抗体、抗体結合ビーズおよび低分子結合ビーズを含めることができる。
【０５８４】
開示の複合体およびポリペプチドの導入は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクシ
ョン、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸輸送などによって行うことができる。
【０５８５】
細胞は、複合体と共に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日またはそれ以上培養することができる。細胞は、複合体と共に多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日またはそれ以上培養することができる。適切な期間の後（例えば、複合体を標的核酸に結合させるための期間）、細胞を溶解することができる。
【０５８６】
細胞は溶解する前に架橋結合させることができる。固定または架橋結合した細胞は、細胞内でタンパク質−ＤＮＡ複合体を安定化することができる。適切な固定剤および架橋結合剤には、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、エタノールに基づく固定剤、メタノールに基づく固定剤、アセトン、酢酸、四酸化オスミウム、重クロム酸カリウム、クロム酸、過マンガン酸カリウム、水銀剤、ピクリン酸塩、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、アミン反応性ＮＨＳ−エステル架橋結合剤、例えばビス［スルホスクシンイミジル］スベレート（ＢＳ３）、３，３’−ジチオビス［スルホスクシンイミジルプロピオネート］（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス［スルホスクシンイミジルスクシネート（スルホ−ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジチオビス［スクシンイミジルプロピオネート］（ＤＳＰ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、エチレングリコールビス［スクシンイミジルスクシネート］（ＥＧＳ）、ＮＨＳ−エステル／ジアジリン架橋結合剤、例えば、ＮＨＳ−ジアジリン、ＮＨＳ−ＬＣ−ジアジリン、ＮＨＳ−ＳＳ−ジアジリン、スルホ−ＮＨＳ−ジアジリン、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ジアジリンおよびスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ジアジリンを含めることができる。
【０５８７】
溶解した細胞は、親和性タグへの結合を目的とする結合剤（例えば、抗体）と接触させることができる。接触は試験管内で行うことができる。接触はクロマトグラフィー装置（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）内で行うことができる。結合剤との接触は少なくとも１分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、４５時間またはそれ以上行うことができる。結合剤との接触は多くても１分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、４５時間またはそれ以上行うことができる。場合によって、結合剤との接触は細胞溶解前に行う。
【０５８８】
複合体は結合剤によって精製することができる。精製した複合体に核酸精製技術を実施し、複合体から標的核酸を分離することができる。核酸精製技術にはスピンカラム分離、沈殿および電気泳動を含めることができる。
【０５８９】
核酸（例えば、標的核酸を含む核酸）に配列決定法を実施することができる。核酸は、１つまたはそれ以上のアダプターを連結することによって配列分析用に調製することができる。配列決定した核酸を分析して、遺伝子多型を同定し、疾患を診断し、疾患の処置行程を決定し、および／またはゲノムの３次元構造を決定することができる。
【０５９０】
リンカーを含むタグ付けした核酸ターゲティング核酸
本開示は、タグ付けした核酸ターゲティング核酸の組成物ならびに作製方法および使用方法を提供する。図１３Ａは、タグ付けしていない核酸ターゲティング核酸の例を示す。タグ付けしていない核酸ターゲティング核酸は、プロトスペーサー（ＰＳ）、最小ＣＲＩＳＰＲ反復（ＭＣＲ）、シングルガイドコネクター（ＳＧＣ）、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（ＭｔＳ）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（３ＴＳ）およびｔｒａｃｒＲＮＡ伸長（ＴＥ
）を含むことができる。リンカーを含むタグ付けした核酸ターゲティング核酸は、本明細書で記載したような核酸ターゲティング核酸のいずれかを意味することができ、核酸標的核酸の５’末端、３’末端のいずれかまたは５’および３’末端の両方にリンカーを含む。
【０５９１】
核酸ターゲティング核酸は、図１３Ｂで示したような非天然配列を含むことができる。非天然配列は、タグと称することができる。タグは、核酸ターゲティング核酸の５’末端、３’末端のいずれかまたは５’および３’末端の両方に融合させることができる。非天然配列は、ＲＮＡ結合タンパク質のための結合配列を含むことができる。ＲＮＡ結合タンパク質はＣｓｙ４であってもよい。非天然配列は核酸ターゲティング核酸のプロトスペーサー配列に融合することができる。
【０５９２】
非天然融合体は、リンカーによって核酸ターゲティング核酸から分離することができる。図１４は、核酸ターゲティング核酸のプロトスペーサーから非天然配列（例えば、Ｃｓｙ４ヘアピン）を分離するリンカーの例（例えば、Ｔａｇリンカー）を示す。リンカー配列は、標的核酸と相補的であってもよい。リンカー配列は、標的核酸と少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のミスマッチを含むことができる。リンカー配列は、標的核酸と多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のミスマッチを含むことができる。場合によって、リンカーと標的核酸との間のミスマッチが少なければ少ないほど、Ｃａｓ９：核酸ターゲティング核酸複合体の切断効率が良好である。
【０５９３】
リンカー配列の長さはヌクレオチドが少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個またはそれ以上であってもよい。リンカー配列の長さはヌクレオチド長が多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個またはそれ以上であってもよい。
【０５９４】
多重化遺伝子ターゲティング剤
総括
本開示は、多重化ゲノム操作のための方法、組成物、システムおよび／またはキットについて記載する。本開示のいくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは核酸ターゲティング核酸を含み、それによって複合体を形成することができる。複合体は標的核酸と接触させることができる。標的核酸は複合体によって切断および／または改変することができる。本開示の方法、組成物、システムおよび／またはキットは、多数の標的核酸を迅速に、効率よく、および／または同時に改変するために有用であり得る。この方法は、本明細書で記載したような部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸ならびに部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸の複合体のいずれかを使用して実施することができる。
【０５９５】
図１５は、本開示の方法の実施形態例を示す。核酸（例えば、核酸ターゲティング核酸）１５０５は、非天然配列（例えば、部分、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）１５１０に融合させて、それによって核酸モジュール１５１２を形成することができる。核酸モジュール１５１２（例えば、非天然配列に融合した核酸を含む）を直列に結合させて、それによって多重化遺伝子ターゲティング剤（例えば、ポリモジュール、例えば、配列）１５１１を形成することができる。多重化遺伝子ターゲティング剤１５１１はＲＮＡを含むことができる。多重化遺伝子ターゲティング剤は、１つまたはそれ以上のエンドリボヌクレアーゼ１５２０と接触させることができる１５１５。エンドリボヌクレアーゼは、非天然配列１５１０に結合することができる。結合したエンドリボヌクレアーゼは
、多重化遺伝子ターゲティング剤１５１１の核酸モジュール１５１２を非天然配列１５１０によって限定された指定の位置で切断することができる。切断１５２５は、個々の核酸モジュール１５１２を処理（例えば、遊離）することができる。いくつかの実施形態では、処理された核酸モジュール１５１２は、非天然配列１５１０の全部、一部を含んでいてもよく、または全く含まなくてもよい。処理された核酸モジュール１５１２には部位特異的ポリペプチド１５３０が結合し、それによって複合体１５３１を形成することができる。複合体１５３１は、標的核酸１５４０を標的とすることができる１５３５。標的核酸１５４０は複合体１５３１によって切断および／または改変することができる。
【０５９６】
多重化遺伝子ターゲティング剤
多重化遺伝子ターゲティング剤は、多数の標的核酸を同時に、および／または化学量論的量で改変するのに使用することができる。多重化遺伝子ターゲティング剤は、直列に並んだ本明細書で記載したような任意の核酸ターゲティング核酸であってもよい。多重化遺伝子ターゲティング剤は、１つまたはそれ以上の核酸モジュールを含む連続的な核酸分子を意味することができる。核酸モジュールは、核酸および非天然配列（例えば、部分、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）を含むことができる。核酸は、ノンコーディングＲＮＡ、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡまたはｌｉｎｃＲＮＡ）、内在性ｓｉＲＮＡ（エンド−ｓｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランス作用性低分子干渉ＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、リピート関連低分子干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。核酸は、コーディングＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であってもよい。核酸は、いかなる種類のＲＮＡであってもよい。いくつかの実施形態では、核酸は、核酸ターゲティング核酸であってもよい。
【０５９７】
非天然配列は、核酸モジュールの３’末端に位置することができる。非天然配列は、核酸モジュールの５’末端に位置することができる。非天然配列は、核酸モジュールの３’末端および５’末端の両方に位置することができる。非天然配列は、エンドリボヌクレアーゼに結合することができる配列（例えば、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を含むことができる。非天然配列は、エンドリボヌクレアーゼによって配列特異的に認識される配列であることができる（例えば、ＲＮアーゼＴ１は不対Ｇ塩基を切断し、ＲＮアーゼＴ２はＡｓの３’末端を切断し、ＲＮアーゼＵ２は不対Ａ塩基の３’末端を切断する）。非天然配列は、エンドリボヌクレアーゼによって構造的に認識される配列であることができる（例えば、ヘアピン構造、１本鎖−２本鎖接合部、例えば、ドローシャはヘアピン内の１本鎖−２本鎖接合部を認識する）。非天然配列は、ＣＲＩＳＰＲシステムエンドリボヌクレアーゼ（例えば、Ｃｓｙ４、Ｃａｓ５、および／またはＣａｓ６タンパク質）に結合することができる配列を含むことができる。非天然配列は、以下の配列の１つと少なくとも、または多くても約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％のヌクレオチド配列同一性および／または配列類似性を有するヌクレオチド配列を含むことができる：
５’−ＧＵＵＣＡＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧＣＵＡＡＧＡＡＡ−３’；
５’−ＧＵＵＧＣＡＡＧＧＧＡＵＵＧＡＧＣＣＣＣＧＵＡＡＧＧＧＧＡＵＵＧＣＧＡＣ−３’；
５’−ＧＵＵＧＣＡＡＡＣＣＵＣＧＵＵＡＧＣＣＵＣＧＵＡＧＡＧＧＡＵＵＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＧＡＵＣＧＡＵＡＣＣＣＡＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＡＣＧＡＧＡＡＣ−３’；
５’−ＧＵＣＧＵＣＡＧＡＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＡＵＡＵＡＡＡＣＣＵＡＡＵＵＡＣＣＵＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＣＣＣＣＡＧＵＣＡＣＣＵＣＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＵＵＣＣＡＡＵＵＡＡＵＣＵＵＡＡＡＣＣＣＵＡＵＵＡＧＧＧＡＵＵＧＡＡＡＣ−３’。
５’−ＧＵＵＧＣＡＡＧＧＧＡＵＵＧＡＧＣＣＣＣＧＵＡＡＧＧＧＧＡＵＵＧＣＧＡＣ−３’；
５’−ＧＵＵＧＣＡＡＡＣＣＵＣＧＵＵＡＧＣＣＵＣＧＵＡＧＡＧＧＡＵＵＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＧＡＵＣＧＡＵＡＣＣＣＡＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＡＣＧＡＧＡＡＣ−３’；
５’−ＧＵＣＧＵＣＡＧＡＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＡＵＡＵＡＡＡＣＣＵＡＡＵＵＡＣＣＵＣＧＡＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＣＣＣＣＡＧＵＣＡＣＣＵＣＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＵＵＣＣＡＡＵＵＡＡＵＣＵＵＡＡＡＣＣＣＵＡＵＵＡＧＧＧＡＵＵＧＡＡＡＣ−３’，
５’−ＧＵＣＧＣＣＣＣＣＣＡＣＧＣＧＧＧＧＧＣＧＵＧＧＡＵＵＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＣＣＡＧＣＣＧＣＣＵＵＣＧＧＧＣＧＧＣＵＧＵＧＵＧＵＵＧＡＡＡＣ−３’；
５’−ＧＵＣＧＣＡＣＵＣＵＡＣＡＵＧＡＧＵＧＣＧＵＧＧＡＵＵＧＡＡＡＵ−３’；
５’−ＵＧＵＣＧＣＡＣＣＵＵＡＵＡＵＡＧＧＵＧＣＧＵＧＧＡＵＵＧＡＡＡＵ−３’；および
５’−ＧＵＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＡＵＧＧＧＧＣＧＣＧＵＧＧＡＵＵＧＡＡＡ−３’。
【０５９８】
いくつかの実施形態では、非天然配列はエンドリボヌクレアーゼ結合配列を含み、核酸モジュールには同じエンドリボヌクレアーゼが結合することができる。核酸モジュールは、同じエンドリボヌクレアーゼ結合配列を含んでいなくてもよい。核酸モジュールは、異なるエンドリボヌクレアーゼ結合配列を含んでいてもよい。異なるエンドリボヌクレアーゼ結合配列には、同じエンドリボヌクレアーゼが結合することができる。いくつかの実施形態では、核酸モジュールは、異なるエンドリボヌクレアーゼが結合することができる。
【０５９９】
部分はリボザイムを含むことができる。リボザイムは自己切断して、それによって多重化遺伝子ターゲティング剤の各モジュールを遊離することができる。適切なリボザイムには、ペプチジルトランスフェラーゼ２３Ｓ  ｒＲＮＡ、ＲＮアーゼＰ、グループＩイントロン、グループＩＩイントロン、ＧＩＲ１枝分かれリボザイム、Ｌｅａｄｚｙｍｅ、ヘアピンリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ＨＤＶリボザイム、ＣＰＥＢ３リボザイム、ＶＳリボザイム、ｇｌｍＳリボザイム、ＣｏＴＣリボザイム、合成リボザイムを含めることができる。
【０６００】
多重化遺伝子ターゲティング剤の核酸モジュールの核酸は同一であってもよい。核酸モジュールは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個またはそれ以上のヌクレオチドが異なっていてもよい。例えば、異なる核酸モジュールは、核酸モジュールのスペーサー領域が異なっていて、それによって核酸モジュールは異なる標的核酸を標的とすることができる。場合によって、異なる核酸モジュールは、核酸モジュールのスペーサー領域が異なっていても、同じ標的核酸を標的とすることができる。核酸モジュールは、同じ標的核酸を標的とすることができる。核酸モジュールは、１つまたはそれ以上の標的核酸を標的とすることができる。
【０６０１】
核酸モジュールは、核酸モジュールの適切な翻訳または増幅を可能にすることができる
調節配列を含むことができる。例えば、核酸モジュールは、プロモーター、ＴＡＴＡボックス、エンハンサー配列、転写終結因子、リボソーム結合部位、３’非翻訳領域、５’非翻訳領域、５’キャップ配列、３’ポリアデニル化配列、ＲＮＡ安定性因子などを含むことができる。
【０６０２】
方法
本開示は、多重化遺伝子ターゲティング剤を使用することによって多数の標的核酸を同時に改変するための方法を提供する。部位特異的ポリペプチド、エンドリボヌクレアーゼおよび多重化遺伝子ターゲティング剤を宿主細胞に導入することができる。開示のベクター（例えば、多重化遺伝子ターゲティング剤、エンドリボヌクレアーゼおよび／または部位特異的ポリペプチドを含む）を宿主細胞に導入することができる。場合によって、２つ以上のエンドリボヌクレアーゼおよび／または多重化遺伝子ターゲティング剤を細胞に導入することができる。多重化遺伝子ターゲティング剤が様々な種類の部分を含み、その部分が様々なエンドリボヌクレアーゼ結合配列である場合、多重化遺伝子ターゲティング剤における結合配列の種類に対応する１つまたはそれ以上のエンドリボヌクレアーゼを細胞に導入することができる。
【０６０３】
導入は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合体、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）−媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸輸送などの核酸を細胞に導入するための任意の手段によって行うことができる。ベクターは、宿主細胞内で一過性に発現することができる。ベクターは、宿主細胞内で安定して発現させることができる（例えば、宿主細胞のゲノムに安定して組み込むことによって）。
【０６０４】
部分がエンドリボヌクレアーゼ結合配列を含む場合、エンドリボヌクレアーゼは発現して、多重化遺伝子ターゲティング剤のエンドリボヌクレアーゼ結合部位に結合することができる。エンドリボヌクレアーゼは、多重化遺伝子ターゲティング剤を個々の核酸モジュールに切断することができる。
【０６０５】
部分がリボザイムを含む場合、エンドリボヌクレアーゼは宿主細胞内で発現するために必要でなくてもよい。リボザイムは自己切断して、それによって多重化遺伝子ターゲティング剤の個々の核酸モジュールへの切断を引き起こすことができる。
【０６０６】
個々の（例えば、切断した）核酸モジュールは、部分（例えば、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）の全部、一部を含んでいてもよく、または全く含まなくてもよい。例えば、遊離した（例えば、処理した）核酸モジュールは、核酸モジュールの５’および／または３’末端の除去を引き起こすことができるエキソヌクレアーゼトリミングおよび／または分解を受けることができる。このような場合、エキソヌクレアーゼトリミングおよび／または分解は、部分（例えば、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）の全部、一部の除去を引き起こしてもよく、または全く引き起こさなくてもよい。
【０６０７】
遊離した（例えば、処理した）核酸モジュールは、部位特異的ポリペプチドに結合し、それによって複合体を形成することができる。この複合体は、配列特異的な方法で標的核酸とハイブリダイズすることができる核酸ターゲティング核酸によって標的核酸にガイドすることができる。一旦ハイブリダイズすると、複合体の部位特異的ポリペプチドは標的核酸を改変する（例えば、標的核酸を切断する）ことができる。場合によって、この改変には、標的核酸への２本鎖分断の導入が含まれる。場合によって、この改変には、標的核酸への１本鎖分断の導入が含まれる。
【０６０８】
いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上のドナーポリヌクレオチドおよび／またはこれをコードするベクターを細胞に導入することができる。１つまたはそれ以上のドナーポリヌクレオチドは、改変された（例えば、切断された）標的核酸に組み込まれ、それによって挿入を引き起こすことができる。同じドナーポリヌクレオチドを標的核酸の多数の切断部位に組み込むことができる。１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを標的核酸の１つまたはそれ以上の切断部位に組み込むことができる。これは、多重ゲノム操作と称することができる。場合によって、ドナーポリヌクレオチドおよび／またはこれをコードするベクターを細胞に導入しなくてもよい。これらの場合、改変された標的核酸は欠失を含むことができる。
【０６０９】
核酸の化学量論的輸送
総括
本開示は、核酸を細胞および／または細胞内の限定された部位に化学量論的に輸送するための組成物、方法およびキットを提供する。化学量論的輸送は複合体によって媒介することができる。図１６は、複数の核酸を細胞および／または細胞内の位置に化学量論的に輸送するための複合体の例を示す。複合体は、複数の核酸１６０５を含むことができる。各核酸は、核酸結合タンパク質結合部位１６１０を含むことができる。核酸結合タンパク質結合部位１６１０は全て同じ配列、異なる配列であってもよく、または一部が同じ配列であってもよく、一部が異なる配列であってもよい。いくつかの実施形態では、核酸結合タンパク質結合部位はＣａｓ６、Ｃａｓ５またはＣｓｙ４ファミリーメンバーに結合することができる。複合体は、直列型融合ポリペプチド１６３０を含むことができる。直列型融合ポリペプチドは、直列に一緒に融合した核酸結合タンパク質１６２５を含むことができる。核酸結合タンパク質は、リンカー１６２０によって分離することができる。核酸結合タンパク質１６２５は同じタンパク質であってもよく、異なるタンパク質であってもよく、または一部が同じタンパク質であってもよく、一部が異なるタンパク質であってもよい。核酸結合タンパク質１６２５は、Ｃｓｙ４タンパク質であってもよい。核酸結合タンパク質１６２５は、核酸１６０５の核酸結合タンパク質結合部位１６１０に結合することができる。直列型融合ポリペプチド１６３０は、非天然配列１６１５を含むことができる。場合によって、非天然配列は細胞内（例えば、核）に局在する配列である。いくつかの実施形態では、核酸１６０５は非天然配列（例えば、細胞内（例えば、核）に局在する配列）をコードすることができる。複合体は、細胞内に導入することができ１６３５、１つまたはそれ以上の核酸１０５はポリペプチド１６４０に翻訳することができる。翻訳されたポリペプチド１６４０は、核酸１６０５の核酸結合タンパク質結合部位１６１０に結合し、切断することができる。切断１６４５は、核酸ターゲティング核酸であることができる核酸１６５０を遊離することができる。遊離した核酸１６５０は、翻訳したポリペプチド１６４５（例えば、部位特異的ポリペプチド）に結合し、それによって単位を形成することができる。翻訳したポリペプチド１６４５は、核内移行シグナルを含むことができる。単位は核に転座することができ、単位は遊離した核酸１６５０のスペーサーとハイブリダイズすることができる標的核酸にガイドすることができる。単位は、標的核酸にハイブリダイズすることができる。単位の部位特異的ポリペプチドは、標的核酸を切断することができる。標的核酸の切断は、ゲノム操作と称することができる。この方法は、本明細書で記載したような部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸ならびに部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸の複合体のいずれかを使用して実施することができる。
【０６１０】
いくつかの実施形態では、多数の核酸ターゲティング核酸は、細胞および／または細胞内の位置に化学量論的に輸送することができる。図１７は、複数の核酸を化学量論的に輸送するための複合体の例を示す。複合体は、複数の核酸１７０５を含むことができる。各核酸は、複数の核酸結合タンパク質結合部位１７１０／１７１１を含むことができる。核
酸結合タンパク質結合部位１７１０／１７１１は全て同じ配列、異なる配列であってもよく、または一部が同じ配列であってもよく、また一部が異なる配列であってもよい。いくつかの実施形態では、核酸結合タンパク質結合部位１７１０／１７１１はＣａｓ６、Ｃａｓ５またはＣｓｙ４ファミリーメンバーに結合することができる。複合体は、直列型融合ポリペプチド１７３０を含むことができる。直列型融合ポリペプチドは、直列に一緒に融合した核酸結合タンパク質１７２５を含むことができる。核酸結合タンパク質は、リンカー１７２０によって分離することができる。核酸結合タンパク質１７２５は同じタンパク質であってもよく、異なるタンパク質であってもよく、または一部が同じタンパク質であってもよく、一部が異なるタンパク質であってもよい。ＲＮＡ結合タンパク質１７２５は、Ｃｓｙ４、Ｃａｓ５およびＣａｓ６ポリペプチドの組み合わせであってもよい。核酸結合タンパク質１７２５は、核酸１７０５の核酸結合タンパク質結合部位１７１０に結合することができる。直列型融合ポリペプチド１７３０は、非天然配列１７１５を含むことができる。場合によって、非天然配列は細胞内（例えば、核）に局在する配列である。いくつかの実施形態では、核酸１７０５は非天然配列（例えば、細胞内（例えば、核）に局在する配列）をコードすることができる。複合体は、細胞内に導入することができ１７３５、１つまたはそれ以上の核酸はポリペプチド１７４０／１７５０に翻訳することができる。翻訳されたポリペプチド１７４０は、核酸１７０５の核酸結合タンパク質結合部位１７１１に結合し、切断することができる。切断１７４５は、核酸ターゲティング核酸および／またはドナーポリヌクレオチドであることができる核酸１７５５を遊離することができる。遊離した核酸１７５５は、翻訳したポリペプチド１７５０（例えば、部位特異的ポリペプチド）に結合し、それによって単位を形成することができる。場合によって、翻訳したポリペプチド１７５０は、核内移行シグナルを含む。単位は核に転座することができ、単位は遊離したＲＮＡ１７５５のスペーサーとハイブリダイズすることができる標的核酸にガイドすることができる。単位は、標的核酸にハイブリダイズすることができる。単位の部位特異的ポリペプチドは、標的核酸を切断することができる。
【０６１１】
方法
本開示は、核酸を細胞に化学量論的に輸送するための方法を提供する（例えば、化学量論的に輸送できる核酸）。この方法は、直列型融合ポリペプチドを複数の化学量論的に輸送できる核酸に結合し、それによって複合体を形成することを含むことができる。複合体は、化学量論的量の核酸を含むことができる（例えば、複合体は複数の核酸を指定した比および／または量で含むことができる）。１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の核酸を化学量論的に輸送することができる。場合によって、３個の化学量論的に輸送できる核酸を化学量論的に輸送することができる。場合によって、４個の化学量論的に輸送できる核酸を化学量論的に輸送することができる。
【０６１２】
化学量論的に輸送できる核酸は、ポリペプチドまたはノンコーディングＲＮＡをコードすることができる。ポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲシステムポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド、エンドリボヌクレアーゼ）であってもよい。化学量論的に輸送できる核酸は、２つ以上のポリペプチドをコードすることができる。化学量論的に輸送できる核酸は、複数の化学量論的に輸送できる核酸（例えば、配列で）含むことができる。化学量論的に輸送できる核酸は、ノンコーディングＲＮＡをコードすることができる。ノンコーディングＲＮＡの例には、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡまたはｌｉｎｃＲＮＡ）、内在性ｓｉＲＮＡ（エンド−ｓｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、トランス作用性低分子干渉ＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、リピート関連低分子干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含めることができる。化学量論的に輸送できる核酸は、ＲＮＡであってもよい。
【０６１３】
化学量論的に輸送できる核酸は、非天然配列をコードすることができる。場合によって、化学量論的に輸送できる核酸は非天然配列をコードし、したがって、ポリペプチドがポリペプチドをコードする化学量論的に輸送できる核酸から翻訳されるとき、ポリペプチドは非天然配列に融合する（例えば、それによって融合体タンパク質を生成する）。非天然配列は、ペプチド親和性タグであってもよい。非天然配列（例えば、ペプチド親和性タグ）は、ポリペプチドのＮ末端、ポリペプチドのＣ末端、またはポリペプチド内の任意の位置（例えば、表面から到達できるループ）に位置することができる。いくつかの実施形態では、非天然配列は核内移行シグナル（ＮＬＳ）である。ＮＬＳは、モノパータイトまたはバイパータイト配列であってもよい。ＮＬＳは、核移行機構（例えば、インポーチン）によって認識され得る。ＮＬＳは、小さいペプチド（例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原のＰＫＫＫＲＫＶ）であってもよい。ＮＬＳは、ポリペプチドドメイン（例えば、ｈｎＲＮＰ
Ａ１の酸性Ｍ９ドメイン）であってもよい。
【０６１４】
非天然配列は、核酸親和性タグ（例えば、核酸局在シグナル）であってもよい。例えば、化学量論的に輸送できる核酸をコードするＤＮＡ（例えば、ドナーポリヌクレオチド）は、ＤＮＡを核に局在させることができる核酸局在シグナルを含むことができる。このような核酸局在シグナルは、例えば、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）配列を含むことができる。
【０６１５】
化学量論的に輸送できる核酸は、核酸の適切な翻訳または増幅を可能にできる調節配列を含むことができる。例えば、核酸は、プロモーター、ＴＡＴＡボックス、エンハンサー配列、転写終結因子、ＤＮＡ安定化因子、リボソーム結合部位、３’非翻訳領域、５’非翻訳領域、５’キャップ配列、３’ポリアデニル化配列、ＲＮＡ安定性因子などを含むことができる。
【０６１６】
核酸は、核酸結合タンパク質結合部位を含むことができる。核酸結合タンパク質結合部位には、核酸結合タンパク質が結合することができる。核酸結合タンパク質結合部位は、ＣＲＩＳＰＲポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド、エンドリボヌクレアーゼ）が結合することができる。核酸結合タンパク質結合部位には、Ｃａｓ５またはＣａｓ６ファミリーポリペプチドが結合することができる。核酸結合タンパク質結合部位には、Ｃｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６ポリペプチドが結合することができる。核酸結合タンパク質結合部位のいくつかの例には、例えば、ＲＮＡ結合タンパク質が結合することができる配列、例えば、ＭＳ２結合配列、Ｕ１Ａ結合配列、ｂｏｘＢ配列、ｅＩＦ４Ａ配列、ヘアピン、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）ドメイン（例えば、Ｕ１Ａ）が結合することができる配列、２本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）例えば、（シュタウフェン）が結合することができる配列、ＰＡＺドメイン（例えば、ＰＡＺ、アルゴノート）が結合することができる配列、ＰＩＷＩドメイン（例えば、ＰＩＷＩ、ＭＩＬＩ、ＭＩＷＩ、アルゴノート）が結合することができる配列などが含めることができる。核酸結合タンパク質結合部位のいくつかの例には、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質、例えば、亜鉛フィンガー、ヘリックス−ターン−ヘリックスドメイン、亜鉛フィンガードメイン、ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）ドメイン、ウイングドヘリックスドメイン、ウイングドヘリックスターンヘリックスドメイン、ヘリックス−ループ−ヘリックスドメイン、ＨＭＧ−ボックスドメイン、Ｗｏｒ３ドメイン、イムノグロブリンドメイン、Ｂ３ドメイン、ＴＡＬＥドメインなどが結合する配列を含めることができる。
【０６１７】
核酸は、１つまたはそれ以上の核酸結合タンパク質結合部位を含むことができる。核酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の核酸結合タンパク質結合部位を含むことができる。１つまたはそれ以上の核酸結合タンパク質結合部位は同じであってもよい。１つまたはそれ以上の核酸結合タンパク質結合部位は異なっていてもよい。例えば、核酸はＣｓｙ４結合部位およびＭＳ２結合部位を含むことができる。１つまたはそれ以上の核酸結合タンパク質結合部位は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、
１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００個またはそれ以上のヌクレオチドによって分離することができる。いくつかの実施形態では、３’のほとんどの核酸結合タンパク質結合部位には、本開示の直列型融合ポリペプチドが結合することができる。
【０６１８】
直列型融合ポリペプチド
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、複数の核酸の直列型融合ポリペプチドへの結合を提供する。直列型融合ポリペプチドは、１つのポリペプチド鎖に一緒に融合した複数の核酸結合タンパク質を含むことができる。直列型融合ポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の核酸結合タンパク質を含むことができる。直列型融合ポリペプチドの核酸結合タンパク質は、本開示の核酸の核酸結合タンパク質結合部位に結合することができる。核酸結合タンパク質の例には、ＭＳ２、Ｕ１Ａ、ｂｏｘＢ配列結合タンパク質（例えば、亜鉛フィンガー）、ｅＩＦ４Ａ、シュタウフェン、ＰＡＺ、アルゴノート、ＰＩＷＩ、ＭＩＬＩ、ＭＩＷＩ、亜鉛フィンガー、ヘリックス−ターン−ヘリックスドメイン、亜鉛フィンガードメイン、ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）ドメイン、ウイングドヘリックスドメイン、ウイングドヘリックスターンヘリックスドメイン、ヘリックス−ループ−ヘリックスドメイン、ＨＭＧ−ボックスドメイン、Ｗｏｒ３ドメイン、イムノグロブリンドメイン、Ｂ３ドメイン、ＴＡＬＥドメインなどを含めることができる。いくつかの実施形態では、核酸結合タンパク質はＲＮＡ結合タンパク質である。ＲＮＡ結合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素であってもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ５またはＣａｓ６ファミリーのタンパク質の構成要素であってもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、Ｃｓｙ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、核酸結合タンパク質はＤＮＡ結合タンパク質（例えば、亜鉛フィンガー）である。
【０６１９】
場合によって、核酸結合タンパク質はリンカーによって分離される。リンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個またはそれ以上のアミノ酸を含んでいてもよい。
【０６２０】
直列型融合ポリペプチドは、非天然配列（例えば、ペプチド親和性タグ）を含むことができる。非天然配列は、直列型融合ポリペプチドを細胞内の位置（例えば、核）に向かわせることができる核内移行シグナル（ＮＬＳ）を含むことができる。
【０６２１】
直列型融合ポリペプチドの各核酸結合タンパク質は、それ自身の非天然配列を含むことができる。各核酸結合タンパク質の非天然配列は同じであってもよい。各核酸結合タンパク質の非天然配列は異なっていてもよい。直列型融合ポリペプチドの核酸結合タンパク質のいくつかの非天然配列は同じであってもよく、直列型融合ポリペプチドの核酸結合タンパク質のいくつかの非天然配列は異なっていてもよい。
【０６２２】
場合によって、本開示の方法は、本開示の直列型融合ポリペプチドおよび複数の核酸を含む複合体の形成を提供することができる。複合体の形成は、本開示の核酸内のコグネイト核酸結合タンパク質結合配列に結合する直列型融合ポリペプチドの核酸結合タンパク質を含むことができる。例えば、Ｃｓｙ４結合部位を含む化学量論的に輸送できる核酸は、直列型融合体タンパク質におけるＣｓｙ４タンパク質サブユニットに結合することができる。複合体は、細胞の外側で形成することができる（例えば、インビトロにおいて）。複合体は、細胞内で形成することができる（例えば、インビボにおいて）。複合体がインビトロにおいて形成する場合、例えば、トランスフェクション、形質転換、ウイルス形質導入、エレクトロポレーション、注射などによって細胞に導入することができる。
【０６２３】
本開示の方法は、インビボ、インビトロおよびエキソビボの両方における多数の核酸の治療的輸送を提供する。輸送した核酸は、疾患を処置するために使用することができる。例えば、輸送した核酸は、遺伝子治療で使用することができ、および／または細胞のゲノムに組み込むことによって治療成績をもたらすことができる。治療成績とは、タンパク質、核酸または疾患に関連した任意の生体分子、例えば、分解生成物、低分子および／またはイオンのレベルの増加または減少を意味することができる。例えば、治療成績は、抗炎症遺伝子のレベルの増加、または疾患に関連する経路におけるタンパク質レベルの減少を含むことができる。治療成績とは、生理学的効果を意味することができる。生理学的効果には、形態学的変化、代謝変化および／または細胞における構造変化を含めることができる。治療成績とは、タンパク質および／または核酸の改変、例えば、グリコシル化、アセチル化、メチル化、脱メチル化、脱プリン化、ユビキチン化などの変化を意味することができる。
【０６２４】
治療成績は、細胞の遺伝子構造の変化、細胞内の対象とする生体分子のレベルおよび／または細胞における生理学的変化によって測定することができる。測定は、分光測定法、スペクトル測定法、配列決定、ＥＬＩＳＡ、顕微鏡検査および／またはｘ線結晶学などの分子生物学的技術を使用して行うことができる。測定は、マウス、ラット、イヌおよび霊長類などの動物モデルを使用して行うことができる。例えば、本開示の遺伝的に改変された細胞をマウスに導入して、例えば、転移および／または分化させる能力などの生物学的および生理学的変化を評価することができる。
【０６２５】
血液疾患のためのスペーサー
本開示は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の遺伝子操作のための組成物、方法およびキットを提供する。
【０６２６】
組成物
ＨＳＣは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）を含むことができる。
【０６２７】
ＨＳＣは、核酸ターゲティング核酸を含むことができる。本開示の核酸ターゲティング核酸は、遺伝子疾患に関与する遺伝子を標的とすることができる。表１に障害に関与する遺伝子の例を挙げる。表１に挙げた遺伝子は、核酸ターゲティング核酸の標的となることができる遺伝子であることができる。本開示の核酸ターゲティング核酸は、表１に挙げた遺伝子を標的とすることができるスペーサーを含むことができる。
【０６２８】
表２は、本開示の核酸ターゲティング核酸のスペーサーの例を示す。表２の各スペーサーは、核酸ターゲティング核酸に挿入することができるスペーサーであることができる。スペーサーの例と共に、疾患の名称およびスペーサーの標的となる疾患に関与する遺伝子を示す。
【０６２９】
【表２】
2018075026.tif 000003
【０６３０】
方法
本開示は、核酸ターゲティング核酸および部位特異的ポリペプチドをＨＳＣに導入する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは導入前に患者から抽出する。抽出したＨＳＣは精製することができる（例えば、アフェレーシスによって）。部位特異的ポリペプチドおよび／または核酸ターゲティング核酸は、精製したＨＳＣに導入することができる。部位特異的ポリペプチドおよび／または核酸ターゲティング核酸は、精製していないＨＳＣに導入することができる。導入はインビトロにおいて（例えば、患者の外部で、取り出した細胞で）ＨＳＣ内に行うことができる。場合によって、導入はインビボにおいて（例えば、患者の内部で、取り出していない細胞で）ＨＳＣ内に行うことができる。
【０６３１】
本開示の部位特異的ポリペプチドおよび／または核酸ターゲティング核酸の導入は、例えば、ウイルス形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーション、光学的トランスフェクションおよび／または化学的トランスフェクションによって行うことができる。
【０６３２】
一旦ＨＳＣに導入されると、本開示の核酸ターゲティング核酸および部位特異的ポリペプチドは複合体を形成することができる。複合体は核酸ターゲティング核酸によって標的核酸（例えば、表３に挙げた遺伝子）にガイドすることができる。核酸ターゲティング核酸は、標的核酸とハイブリダイズすることができる。部位特異的ポリペプチドは、標的核酸を改変することができる（例えば、標的核酸を切断することによって）。
【０６３３】
場合によって、改変された標的核酸は欠失を含む。場合によって、改変された標的核酸
はドナーポリヌクレオチドの挿入を含む。ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピーまたはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部を標的核酸に挿入することができる。この方法は、本明細書で記載したような部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸ならびに部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸の複合体のいずれかを使用して実施することができる。
【０６３４】
【表３】
2018075026.tif 000004
【０６３５】
計算法
本開示は、核酸ターゲティング核酸のためのスペーサーを同定するための計算法を提供する。計算法は、プロトスペーサー隣接モチーフのためのゲノムの核酸配列の走査を含むことができる。プロトスペーサー隣接モチーフを見いだすと、プログラムはプロトスペーサー隣接モチーフの上流のヌクレオチド１０〜３０個を自動的に計数することができる。プロトスペーサー隣接モチーフの上流のヌクレオチド１０〜３０個は、推定上のスペーサー配列となり得る。言い換えると、ゲノムにおいてプロトスペーサー隣接モチーフの上流のヌクレオチド１０〜３０個は標的核酸に対応することができ、標的核酸に相補的な配列はスペーサーと称することができる。
【０６３６】
このプログラムは、配列が核酸ターゲティング核酸においてスペーサーとしてどの程度効果的であるかを確認するために、推定スペーサー配列の全配列反復を試験することができる。例えば、このプログラムは、推定スペーサー配列の各反復を取り上げ、配列につい
てインシリコ２次構造予測を実施することができる。２次構造予測は、推定スペーサー配列を核酸ターゲティング核酸主鎖（例えば、スペーサーを含まない核酸ターゲティング核酸）に付加することを含むことができる。２次構造予測は、核酸ターゲティング核酸主鎖において合体した推定スペーサー配列の２次構造予測分析を実施することができる。２次構造予測分析は、例えば、どのヌクレオチドが２本鎖、ヘアピンを形成することができ、どのヌクレオチドが構造不定で、および／またはどのヌクレオチドが不対であり得るかを予測することを含むことができる。
【０６３７】
計算化学法は、２次構造予測分析を行った各推定スペーサー配列について折りたたみ試験を実行することを含むことができる。折りたたみ試験は、推定スペーサー配列を含む核酸ターゲティング核酸のインシリコ折りたたみを含むことができる。核酸ターゲティング核酸および推定スペーサー配列は、折りたたみ試験を合格することができるか、または不合格であってもよい。
【０６３８】
折りたたみ試験を合格するために、主鎖核酸ターゲティング核酸の２次構造は保存されていることが必要であり、スペーサーにおける５、４、３、２または１個未満のヌクレオチドがスペーサーの外のヌクレオチドとハイブリダイズしていてもよく、スペーサー内のその他の２次構造はスペーサー内に含有される。
【０６３９】
切れ目のないレポーター選択
総括
本開示は、細胞を遺伝的に改変し、レポーターエレメントの切れ目のない組込み、検出および切除によってこのように遺伝的に改変された細胞を選択するための方法、組成物、システムおよびキットについて記載する。本開示のいくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、細胞ゲノムに導入する核酸（本明細書では対象とする遺伝子エレメントと呼ぶ）ならびにレポーターエレメント（例えば、ＧＦＰ）をコードする核酸配列、部位特異的ポリペプチドおよび２つの核酸ターゲティング核酸を含むことができる。部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸のいずれかおよび／または３つ全てを誘導性プロモーターによって制御することができる。部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸は、核酸ターゲティング核酸がゲノム内の標的核酸にハイブリダイズすることによって細胞ゲノムの１部位を標的とすることができる複合体を形成することができる。複合体の部位特異的ポリペプチドは、標的核酸を切断することができる。ドナーポリヌクレオチドは切断された標的核酸に挿入することができる。ドナーポリヌクレオチドの存在下で標的部位に２本鎖分断（または１本鎖分断）を導入した後で、受容体細胞の集団は、対象とする遺伝子エレメントの存在の代理としてレポーター分子の存在をスクリーニングすることができる。レポーター分子含有細胞を単離した後で、レポーターエレメントは部位特異的ポリペプチドおよび／または核酸ターゲティング核酸発現を誘導することによって切除することができる。核酸ターゲティング核酸は、レポーターエレメントの５’および３’末端を標的とすることができ、レポーターエレメントの切除を引き起こすことができる。この方法は、本明細書で記載したような部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸ならびに部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸の複合体のいずれかを使用して実施することができる。
【０６４０】
図１８は、本開示の方法の実施形態例を示す。核酸は、複数の遺伝子エレメント１８０５／１８１０を含むことができる。遺伝子エレメント１８０５および１８１０は、例えば、遺伝子、ノンコーディング核酸、イントロン、エキソン、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡであってもよい。遺伝子エレメント１８０５および１８１０は、同じ遺伝子の一部であることができる。遺伝子エレメントの間に、遺伝子操作に適した標的核酸１８０６があってもよい。本開示の部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸は、標的核酸１８０６を標的とすることができる１８１５複合体を形成することができる。複合体の部位
特異的ポリペプチドは、標的核酸１８０６を切断１８２０することができる。ドナーポリヌクレオチドは切断された標的核酸１８０６に挿入１８２５することができる。ドナーポリヌクレオチドは、対象とする遺伝子エレメント１８３０を含むことができる。対象とする遺伝子エレメント１８３０は遺伝子であってもよい。ドナーポリヌクレオチドはまた、レポーターエレメント１８３５を含むことができる。ドナーポリヌクレオチドはまた、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および１つまたはそれ以上の核酸ターゲティング核酸を含むことができる。場合によって、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび１つまたはそれ以上の核酸ターゲティング核酸は、２つの核酸ターゲティング核酸をコードする。部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および核酸ターゲティング核酸は、作動可能に誘導性プロモーターに結合することができる。ドナーポリヌクレオチドの標的核酸１８０６への挿入は、レポーターエレメント１８３５の発現を引き起こすことができる。レポーターエレメント１８３５は、ドナーポリヌクレオチドを含む細胞を選択する手段として使用することができる。
【０６４１】
図１９は、標的核酸からレポーターエレメント１９１５を除去するための実施形態例を示す。標的核酸は、複数の遺伝子エレメント１９０５／１９２０を含むことができる。レポーターエレメント１９１５は、対象とする遺伝子エレメント１９１０に融合させることができる。部位特異的ポリペプチドおよび１つまたはそれ以上の核酸ターゲティング核酸の生成を引き起こすことができるレポーター遺伝子１９１５の発現を誘導することができる。部位特異的ポリペプチドは、核酸ターゲティング核酸と複合体を形成することができる。この複合体は、複合体の核酸ターゲティング核酸によってレポーターエレメント１９１５にガイドすることができる。２つの核酸ターゲティング核酸の１つは、レポーターエレメント１９１５の５’末端を標的とすることができる１９２５。２つの核酸ターゲティング核酸の１つは、レポーターエレメント１９１５の３’末端を標的とすることができる１９３０。レポーターエレメント１９１５の標的末端は、複合体の部位特異的ポリペプチドによって切断され、それによってレポーターエレメント１９１５を切除１９３５することができる。標的核酸は、ドナーポリヌクレオチドの対象とする遺伝子エレメント１９１０部分を含むことができる。核酸ターゲティング核酸は、ドナーポリヌクレオチドが（対象とする遺伝子エレメントを含んで）切除されるように設計することができる。
【０６４２】
方法
本発明の開示は、レポーターエレメントおよびレポーターエレメントの切除を使用した細胞の選択方法を提供する。部位特異的ポリペプチド、エンドリボヌクレアーゼ、核酸ターゲティング核酸、ドナーポリヌクレオチドおよび／または核酸ターゲティング核酸は、細胞に導入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、１つまたはそれ以上の対象とする遺伝子エレメントを含むことができる。ドナーポリヌクレオチドは、１つまたはそれ以上のレポーターエレメントを含むことができる。ドナーポリヌクレオチドは、対象とする１つまたはそれ以上の遺伝子エレメントおよび１つまたはそれ以上のレポーターエレメントを含む。２つ以上の部位特異的ポリペプチド、エンドリボヌクレアーゼ、ドナーポリヌクレオチドおよび／または核酸ターゲティング核酸は、細胞に導入することができる。場合によって、細胞は既に部位特異的ポリペプチドおよび／または核酸ターゲティング核酸を発現している。場合によって、部位特異的ポリペプチドおよび／または核酸ターゲティング核酸はプラスミドにコードされる。場合によって、部位特異的ポリペプチドおよび／または核酸ターゲティング核酸は２つ以上のプラスミドにコードされる。場合によって、２つ以上の部位特異的ポリペプチドまたは部位特異的ポリペプチドをコードする核酸を細胞に導入する。場合によって、細胞は細胞溶解物である。
【０６４３】
導入は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−
デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸輸送などの核酸を細胞に導入するための任意の手段によって行うことができる。ベクターは、宿主細胞内で一過性に発現することができる。ベクターは、宿主細胞内で安定して発現することができる（例えば、宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれることによって）。
【０６４４】
核酸ターゲティング核酸は、特定の標的配列および／または特定の配列に相同な任意の配列によって特徴づけられる核酸に結合することができる。標的配列は、遺伝子の一部または全部、その他の核酸実体の中でも遺伝子の５’末端、遺伝子の３’末端、調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、擬遺伝子、ノンコーディングＤＮＡ、マイクロサテライト、イントロン、エキソン、染色体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、センスＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、核様体ＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡまたはＲＮＡであることができる。
【０６４５】
部位特異的ポリペプチドは、核酸ターゲティング核酸が結合した標的核酸を切断することができる。部位特異的ポリペプチドは、標的核酸を切断しなくてもよい。場合によって、エンドリボヌクレアーゼは標的核酸を切断する。エンドリボヌクレアーゼは、ベクターによってコードされていてもよい。エンドリボヌクレアーゼはドナーポリヌクレオチドによってコードされていてもよい。エンドリボヌクレアーゼは、細胞内に存在していてもよい。エンドリボヌクレアーゼおよび／または部位特異的ポリペプチドの発現は、条件的プロモーターによって誘導することができる。ドナーポリヌクレオチドは、切断された部位の標的核酸に組み込むことができる。
【０６４６】
切除
本明細書で開示した方法はさらに、レポーターエレメントの全部、一部の切除を含んでいてもよく、または全く含まなくてもよい。レポーターエレメントの第１の核酸ターゲティング核酸は、レポーターエレメントの５’末端を標的とすることができる。レポーターエレメントの第２の核酸ターゲティング核酸は、レポーターエレメントの３’末端を標的とすることができる。核酸ターゲティング核酸は、レポーターエレメントの５’および３’末端両方を標的とすることができる。核酸ターゲティング核酸は、レポーターエレメントおよび／またはドナーポリヌクレオチドの２つの配列を標的とすることができる。２つの標的配列は、少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一であることができる。２つの標的配列は、多くても約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一であることができる。レポーターエレメントの核酸ターゲティング核酸が発現すると、それらは部位特異的ポリペプチドと複合体を形成し、レポーターエレメントの５’および３’末端の相補的領域にハイブリダイズすることによってレポーターエレメントの５’および３’末端を標的とすることができる。複合体とレポーターエレメントのハイブリダイゼーションは、レポーターエレメントの全部、一部の切断を引き起こすことができるか、または全く引き起こすことができない。切断した核酸は、例えば、非相同末端結合によって再結合することができる。再結合した核酸は、欠失または挿入を導入しなくてもよい。再結合した核酸は、欠失または挿入を導入してもよい。切断した核酸は、例えば、相同組換えによって再結合することができる。相同組換えは、標的核酸部位が実質的に同一のとき、切断した核酸を再結合するために使用することができる。
【０６４７】
スクリーニング
本明細書で開示した方法はさらに、選択した細胞からレポーターエレメントを切除すること、それによって第２の細胞を形成すること、および第２の細胞をスクリーニングする
ことを含むことができる。スクリーニングには、レポーターエレメントの全部または一部の欠如のスクリーニングを含めることができる。スクリーニングには、レポーターエレメントによってコードされた蛍光タンパク質を発現する細胞を、蛍光タンパク質を発現しない細胞から分離する蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を含めることができる。細胞は、レポーターエレメントもしくは遺伝子エレメントによってコードされたタンパク質に結合する蛍光タンパク質、蛍光プローブまたは蛍光色素を結合した抗体と接触させ、その後ＦＡＣＳによって選択することができる。蛍光色素には、限定はしないが、カスケードブルー、パシフィックブルー、パシフィックオレンジ、ルシファーイエロー、ＮＢＤ、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、ＰＥ−Ｃｙ５結合体、ＰＥ−Ｃｙ７結合体、Ｒｅｄ６１３、ＰｅｒＣＰ、ＴｒｕＲｅｄ、ＦｌｕｏｒＸ、フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＴＲＩＴＣ、テキサスレッド、アロフィコシアニン、ＡＰＣ−Ｃｙ７結合体（ＰｈａｒＲｅｄ）、様々なアレクサフルオロ色素、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、様々なダイライト、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｆ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アズライト、ＧＦＰｕｖ、Ｔ−サファイア、ＴａｇＢＦＰ、セルリアン、ｍＣＦＰ、ＥＣＦＰ、ＣｙＰｅｔ、Ｙ６６Ｗ、ｄケイマ−レッド、ｍケイマ−レッド、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ｍＴＦＰ１、Ｓ６５Ａ、ミドリイシ−シアン、ＧＦＰ、Ｔｕｒｂｏ  ＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ２、ＡｃＧＦＰ１、Ｓ６５Ｌ、エメラルド、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ｃ、ＥＧＦＰ、アザミ−グリーン、ザグリーン１、ドロンパ−グリーン、ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、トパーズ、ヴィーナス、ｍシチリン（ｍＣｉｔｉｒｉｎｅ）、ＹＰｅｔ、Ｔｕｒｂｏ  ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰｍ、ザイエロー１、ｍバナナ、クサビラ−オレンジ、ｍオレンジ、ｍＯｒａｎｅ２、ｍＫＯ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄモノマー、ＤｓＲｅｄ２、ｍストロベリー、Ｔｕｒｂｏ  ＦＰ６０２、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、Ｊ−Ｒｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＫａｔｅ２、Ｋａｔｕｓｈｋａ、ｍＫａｔｅ、ＴｕｒｂｏＦＰ６３５、ｍＰｌｕｍ、ｍラズベリー、ｍネプチューン（ｍＮｅｐｔｕｎｅ）、Ｅ２−クリムゾンを含めることができる。
【０６４８】
細胞は、レポーターエレメントまたは遺伝子エレメントによってコードされるペプチド親和性タグに結合する抗体と接触させて、その後この抗体を認識する免疫磁気ビーズによって選択することができる。スクリーニングは、レポーターエレメントまたは遺伝子エレメントがｂ−ガラクトシダーゼをコードする場合は、Ｘ−ｇａｌを添加することによって細胞を染色することを含むことができる。スクリーニングは、手動の選別（例えば、細胞懸濁液の希釈）および顕微鏡（例えば、蛍光顕微鏡）を含むことができる。スクリーニングはハイコンテンツスクリーニングを含むことができる。
【０６４９】
レポーターエレメントは、薬剤耐性遺伝子をコードし、それによって、レポーターエレメントを発現しない細胞を殺滅する薬剤を添加することによってレポーターエレメントを含有する細胞の選択を可能にすることができる。このような薬剤には、限定はしないが、エリスロマイシン、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、キヌプリスチン−ダルホプリスチンの組み合わせ、エンロフロキサシン、バンコマイシン、オキサシリン、ペニシリン、スルホンアミドスルフイソキサゾール、トリメトプリム、メチオニンスルホキシミン、メトトレキセート、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ヒスチジノール、ハイグロマイシン、ゼオシン、ブレオマイシンおよびネオマイシンを含めることができる。
【０６５０】
ライブラリー
本発明の開示は、ドナーポリヌクレオチドを含む発現ベクターのライブラリーを提供する。いくつかの実施形態では、このライブラリーは、対象とする遺伝子エレメントは異なるが、同じレポーターエレメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含むことができる。いくつかの実施形態では、このライブラリーは異なる対象とする異
なる遺伝子エレメントおよび異なるレポーターエレメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含むことができる。レポーターエレメントは、核酸ターゲティング配列（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）が異なっていてもよい。レポーターエレメントは、レポーター遺伝子（例えば、蛍光タンパク質をコードする遺伝子）が異なっていてもよい。本開示は、遺伝的に改変された複数の細胞を生成するためのライブラリーの使用方法を提供する。本開示は、ハイスループット遺伝子スクリーニングのためのライブラリーの使用方法を提供する。これらのライブラリーは、遺伝子機能を推測するために多数の個々の遺伝子の分析を可能にすることができる。ライブラリーは約１０個の構成要素から約１０１２個の構成要素を含むことができ、例えば、ライブラリーは約１０個の構成要素から約１０２個の構成要素、約１０２個の構成要素から約１０３個の構成要素、約１０３個の構成要素から約１０５個の構成要素、約１０５個の構成要素から約１０７個の構成要素、約１０７個の構成要素から約１０９個の構成要素、または約１０９個の構成要素から約１０１２個の構成要素を含むことができる。
【０６５１】
細胞の改変（トランスフェクション／感染）
開示の方法は、ドナーポリヌクレオチドを含む細胞の選択を提供する。いくつかの実施形態では、方法には、標的核酸と接触させること、または細胞（若しくは細胞の集団）に本開示の核酸ターゲティング核酸、部位特異的ポリペプチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つまたはそれ以上の核酸を導入することが関与することができる。核酸の細胞への導入方法は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合体、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸輸送などを含むことができる。いくつかの実施形態では、標的核酸の接触または細胞（もしくは細胞の集団）への１つまたはそれ以上の核酸の導入は、ウイルス感染を含んでいなくてもよい。いくつかの実施形態では、標的核酸の接触または細胞（もしくは細胞の集団）への１つまたはそれ以上の核酸の導入は、バクテリオファージ感染を含んでいなくてもよい。いくつかの実施形態では、標的核酸の接触または細胞（もしくは細胞の集団）への１つまたはそれ以上の核酸の導入は、トランスフェクションを含んでいなくてもよい。
【０６５２】
操作された核酸ターゲティング核酸
操作されたＰ−ドメイン
核酸ターゲティング核酸は操作されていてもよい（例えば、改変を含む）。操作された核酸ターゲティング核酸とは、本明細書で記載したような操作された核酸ターゲティング核酸のいずれかを意味することができる。例えば、操作された核酸ターゲティング核酸は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復、最小ｔｒａｃｒＲＮＡおよび３’ｔｒａｃｒＲＮＡを含むことができる。核酸ターゲティング核酸のＰ−ドメインは、部位特異的ポリペプチドの領域と相互作用することができる。Ｐ−ドメインは、部位特異的ポリペプチドの複数の領域と相互作用することができる。Ｐ−ドメインは、部位特異的ポリペプチドの複数の領域と相互作用することができ、少なくとも１個の領域はプロトスペーサー隣接モチーフのＰＡＭと相互作用する。これらの領域の例には、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９のアミノ酸１０９６〜１２２５および１１０５〜１１３８を含めることができる。
【０６５３】
改変は、Ｐ−ドメインに導入することができる。Ｐ−ドメインは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０個またはそれ以上の隣接ヌクレオチドを含むことができる。Ｐ−ドメインは、多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０個またはそれ以上の隣接ヌクレオチドを含むことができる。Ｐ−ドメインは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒ
ＲＮＡ配列を含む２本鎖における最後のヌクレオチド対の３’の１個のヌクレオチドから開始することができる。Ｐ−ドメインは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む２本鎖における最後のヌクレオチド対の少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個または３０個またはそれ以上のヌクレオチド３’から開始することができる。Ｐ−ドメインは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む２本鎖における最後のヌクレオチド対の多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個または３０個またはそれ以上のヌクレオチド３’から開始することができる。
【０６５４】
操作されたＰ−ドメインは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上の変異を含むことができる。操作されたＰ−ドメインは、多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上の変異を含むことができる。変異は、互いに隣接（例えば、連続）していてもよい。変異は、互いに分離していてもよい。変異は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のヌクレオチドによって分離していてもよい。変異は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のヌクレオチドによって分離していてもよい。核酸ターゲティング核酸への変異は、核酸ターゲティング核酸におけるヌクレオチドの挿入、欠失および置換を含むことができる。
【０６５５】
場合によって、操作された核酸ターゲティング核酸は、野生型核酸ターゲティング核酸に対して多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０％またはそれ以上のヌクレオチド同一性および／または類似性を含む。場合によって、操作された核酸ターゲティング核酸は、野生型核酸ターゲティング核酸に対して少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０％またはそれ以上のヌクレオチド同一性および／または類似性を含む。
【０６５６】
場合によって、操作された核酸ターゲティング核酸のＣＲＩＳＰＲ核酸部分は、野生型ＣＲＩＳＰＲ核酸に対して多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０％またはそれ以上のヌクレオチド同一性および／または類似性を含む。場合によって、操作された核酸ターゲティング核酸のＣＲＩＳＰＲ核酸部分は、野生型ＣＲＩＳＰＲ核酸に対して少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０％またはそれ以上のヌクレオチド同一性および／または類似性を含む。
【０６５７】
操作された核酸ターゲティング核酸のｔｒａｃｒＲＮＡ核酸部分は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ核酸に対して多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０％またはそれ以上のヌクレオチド同一性および／または類似性を含むことができる。操作された核酸ターゲティング核酸のｔｒａｃｒＲＮＡ核酸部分は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ核酸に対して少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０％またはそれ以上のヌクレオチド同一性および／または類似性を含むことができる。
【０６５８】
Ｐ−ドメインにおける改変は、操作された核酸ターゲティング核酸が標的核酸における
新規ＰＡＭ配列にハイブリダイズするように新たに構成されていてもよい。Ｐ−ドメインへの改変は、標的核酸におけるＰＡＭと相補的にすることができる。Ｐ−ドメインの改変は、標的核酸におけるＰＡＭと逆向き相補性を含むことができる。新規ＰＡＭは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。新規ＰＡＭは、多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。Ｐドメインの改変は、Ｐ−ドメイン結合および部位特異的ポリペプチドのＰＡＭ結合領域の改変と共に起こすことができる。これらの改変は代償的であってもよく、改変されたＰ−ドメインは改変された部位特異的ポリペプチドに結合するように特異的に改変され、改変によって部位特異的ポリペプチドはより高い特異性で操作されたＰ−ドメインに結合することが可能である。
【０６５９】
操作されたＰ−ドメインは、新規ＰＡＭに結合するように操作することができる（例えば、操作されたＰ−ドメインは新規ＰＡＭにハイブリダイズすることができる）。新規ＰＡＭ（例えば、異なるＰＡＭ）は、２峰性であってもよい（すなわち、２峰性ＰＡＭは、ＰＡＭの２つの別々の領域を含むことができる）。２峰性ＰＡＭの２つの別々の領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のヌクレオチドによって分離していてもよい。２峰性ＰＡＭの２つの別々の領域は、多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のヌクレオチドによって分離していてもよい。
【０６６０】
操作されたＰ−ドメインは、新規ＰＡＭ（例えば、異なるＰＡＭ）に結合するように操作されていてもよく、この新規ＰＡＭは３峰性である。３峰性ＰＡＭは、ＰＡＭ配列の３つの別々の領域を含むことができる（例えば、核酸ターゲティング核酸が標的核酸を標的とするのに使用することができる３つの別々の領域）。３峰性ＰＡＭの３つの別々の領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のヌクレオチドによって分離していてもよい。３峰性ＰＡＭの３つの別々の領域は、多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のヌクレオチドによって分離していてもよい。
【０６６１】
操作された核酸ターゲティング核酸は少なくとも２個のヘアピンを含むことができる。第１のヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の間に２本鎖を含むことができる。第２のヘアピンは、第１のヘアピンの下流にあることができる。第２のヘアピンは、第１の２本鎖の最後のヌクレオチド対の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のヌクレオチドの下流から開始することができる。第２のヘアピンは、第１の２本鎖の最後のヌクレオチド対の多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のヌクレオチドの下流から開始することができる。第２のヘアピンは、操作されたＰ−ドメインを含むことができる。
【０６６２】
第２のヘアピンの操作されたＰ−ドメインは、２本鎖ヘアピンの片側に位置することができる。第２のヘアピンの操作されたＰ−ドメインは、２本鎖ヘアピンの両側に位置することができる。第２のヘアピンの操作されたＰ−ドメインは、第２のヘアピンのヌクレオチドの少なくとも約１、２、３、４、５、１０または２０％を含むことができる。第２のヘアピンの操作されたＰ−ドメインは、第２のヘアピンのヌクレオチドの多くても約１、２、３、４、５、１０または２０％を含むことができる。
【０６６３】
第２のヘアピンは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、核酸ターゲティング核酸のｍｉｄ−ｔｒａｃｒＲＮＡまたは３’ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むことができる。第２のヘアピンは、ｔｒａｃｒＲＮＡと少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％またはそれ以上の同一性を含むことができる。第２のヘアピンは、ｔｒａｃｒＲＮＡと多くても約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５ま
たは５０％またはそれ以上の同一性を含むことができる。
【０６６４】
操作されたＰ−ドメインを含む第２のヘアピンは、２本鎖を解く（例えば、融解する、ほどく）ように構成されていてもよい。第２のヘアピンは、標的核酸と接触したとき、２本鎖を解くことができる。第２のヘアピンは、標的核酸のプロトスペーサー隣接モチーフと接触したとき、２本鎖を解くことができる。
【０６６５】
場合によって、操作されたＰ−ドメインは、核酸ターゲティング核酸（例えば、操作されたＰ−ドメインを含む同じ核酸ターゲティング核酸）における領域にハイブリダイズするように構成されていてもよく、操作されたＰ−ドメインは、標的核酸にハイブリダイズするように構成されていてもよい。言い換えると、操作されたＰ−ドメインは切り替え可能な配列を含むことができ、場合によって、Ｐ−ドメインは核酸ターゲティング核酸にハイブリダイズし、それによってヘアピンを形成し、場合によって、Ｐ−ドメインに標的核酸内のＰＡＭがハイブリダイズする。
【０６６６】
改変されたＰ−ドメインを含む操作された核酸ターゲティング核酸は、改変されたＰ−ドメインを含まない核酸ターゲティング核酸（例えば、野生型核酸ターゲティング核酸）よりも低い解離定数でＰＡＭに結合するように操作することができる。改変されたＰ−ドメインを含む操作された核酸ターゲティング核酸は、改変されたＰ−ドメインを含まない核酸ターゲティング核酸よりも少なくとも約１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００％またはそれ以上低い、または高い解離定数でＰＡＭに結合するように操作することができる。
【０６６７】
改変されたＰ−ドメインを含む操作された核酸ターゲティング核酸は、改変されたＰ−ドメインを含まない核酸ターゲティング核酸よりも多くても約１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００％またはそれ以上低い、または高い解離定数でＰＡＭに結合するように操作することができる。改変されたＰ−ドメインを含む操作された核酸ターゲティング核酸は、改変されたＰ−ドメインを含まない核酸ターゲティング核酸よりも少なくとも約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍または５０倍またはそれ以上低い、または高い解離定数でＰＡＭに結合するように操作することができる。改変されたＰ−ドメインを含む操作された核酸ターゲティング核酸は、改変されたＰ−ドメインを含まない核酸ターゲティング核酸よりも多くても約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍または５０倍またはそれ以上低い、または高い解離定数でＰＡＭに結合するように操作することができる。
【０６６８】
改変されたＰ−ドメインを含む操作された核酸ターゲティング核酸は、改変されたＰ−ドメインを含まない核酸ターゲティング核酸（例えば、野生型核酸ターゲティング核酸）よりも高い特異性でＰＡＭに結合するように操作することができる。より高い特異性とは、オフターゲット結合（例えば、核酸ターゲティング核酸の間違ったＰＡＭまたはＰＡＭ関連配列への結合）の低下を意味することができる。例えば、改変されたＰ−ドメインを含む操作された核酸ターゲティング核酸は、改変されたＰ−ドメインを含まない核酸ターゲティング核酸よりも少なくとも約１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００％またはそれ以上非特異的結合を低下させるように操作することができる。改変されたＰ−ドメインを含む操作された核酸ターゲティング核酸は、改変されたＰ−ドメインを含まない核酸ターゲティング核酸よりも多くても約１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００％またはそれ以上非特異的結合を低下させるように操作することができる。改変されたＰ−ドメインを含む操作された核酸ターゲティング核酸は、改変されたＰ−ドメインを含まない核酸ターゲティング核酸よりも少なくとも
約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍または５０倍またはそれ以上非特異的結合を低下させるように操作することができる。改変されたＰ−ドメインを含む操作された核酸ターゲティング核酸は、改変されたＰ−ドメインを含まない核酸ターゲティング核酸よりも多くても約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍または５０倍またはそれ以上非特異的結合を低下させるように操作することができる。
【０６６９】
操作されたバルジ
操作された核酸ターゲティング核酸は、改変を核酸ターゲティング核酸のバルジ領域に導入することができるように操作することができる。バルジは、不対ヌクレオチドを含む特徴的な核酸部分である。バルジは、バルジを含む２本鎖のそれぞれの鎖に不対ヌクレオチドを含むことができる。言い換えると、バルジは、２本鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖に不対ヌクレオチドを、２本鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖にも不対ヌクレオチドを含むことができる。
【０６７０】
バルジは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上の不対ヌクレオチドを核酸ターゲティング核酸の２本鎖の第１の鎖（すなわち、最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む２本鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖）に含むことができる。バルジは、多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上の不対ヌクレオチドを核酸ターゲティング核酸の２本鎖の第１の鎖（すなわち、最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む２本鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖）に含むことができる。バルジは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上の不対ヌクレオチドを核酸ターゲティング核酸の２本鎖の第２の鎖（すなわち、最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む２本鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖）に含むことができる。バルジは、多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９は１０個またはそれ以上の不対ヌクレオチドを核酸ターゲティング核酸の２本鎖の第２の鎖（すなわち、最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む２本鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖）に含むことができる。バルジは、最小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ配列に１個の不対ヌクレオチドを、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖に３個の不対ヌクレオチドを含むことができる。
【０６７１】
不対ヌクレオチドに隣接したヌクレオチドは、ゆらぎ塩基対相互作用を形成するヌクレオチドであることができる。ゆらぎ塩基対相互作用には、グアニン−ウラシル、ヒポキサンチン−ウラシル、ヒポキサンチン−アデニンおよびヒポキサンチン−シトシンを含めることができる。不対ヌクレオチドに隣接した少なくとも１、２、３、４または５個またはそれ以上のヌクレオチドは揺らぎ対を形成することができる。不対ヌクレオチドに隣接した多くても１、２、３、４または５個またはそれ以上のヌクレオチドは揺らぎ対を形成することができる。
【０６７２】
操作されたバルジは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上の変異を含むことができる。操作されたバルジは、多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上の変異を含むことができる。変異は、互いに隣接（例えば、連続）していてもよい。変異は、互いに分離していてもよい。変異は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のヌクレオチドによって分離していてもよい。変異は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のヌクレオチドによって分離していてもよい。核酸ターゲティング核酸への変異には、核酸ターゲティング核酸におけるヌクレオチドの挿入、欠失および置換を含めることができる。
【０６７３】
操作された核酸ターゲティング核酸のバルジは、野生型核酸ターゲティング核酸に対し
て多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０％またはそれ以上のヌクレオチド同一性および／または類似性を含むことができる。操作された核酸ターゲティング核酸のバルジは、野生型核酸ターゲティング核酸に対して少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０％またはそれ以上のヌクレオチド同一性および／または類似性を含むことができる。
【０６７４】
バルジの１本の鎖は変異していてもよいが、もう１本の鎖は変異していない。言い換えると、場合によって、最小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ鎖のバルジの配列は、野生型核酸ターゲティング核酸と同じであり、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のバルジの配列は変異している。言い換えると、最小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ鎖のバルジの配列は変異しており、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のバルジの配列は野生型核酸ターゲティング核酸と同じである。
【０６７５】
バルジにおける改変は、操作された核酸ターゲティング核酸が新規部位特異的ポリペプチドに結合するように新たに構成されていてもよい。新規部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチドに対して少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を含むことができる。新規部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチドに対して多くても約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を含むことができる。新規部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９の相同体であってもよい。新規部位特異的ポリペプチドは、Ｃａｓ９の相同分子種であってもよい。新規部位特異的ポリペプチドは、２つの異なる部位特異的ポリペプチドのキメラであってもよい。新規部位特異的ポリペプチドは、本明細書で開示したような変異を含んでいてもよい。
【０６７６】
改変されたバルジを含む操作された核酸ターゲティング核酸は、改変されたバルジを含まない核酸ターゲティング核酸（例えば、野生型核酸ターゲティング核酸）よりも低いまたは高い解離定数で部位特異的ポリペプチドに結合するように操作することができる。改変されたバルジを含む操作された核酸ターゲティング核酸は、改変されたバルジを含まない核酸ターゲティング核酸よりも少なくとも約１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００％またはそれ以上低い、または高い解離定数で部位特異的ポリペプチドに結合するように操作することができる。改変されたバルジを含む操作された核酸ターゲティング核酸は、改変されたバルジを含まない核酸ターゲティング核酸よりも多くても約１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００％またはそれ以上低い、または高い解離定数で部位特異的ポリペプチドに結合するように操作することができる。改変されたバルジを含む操作された核酸ターゲティング核酸は、改変されたバルジを含まない核酸ターゲティング核酸よりも少なくとも約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍または５０倍またはそれ以上低い、または高い解離定数で部位特異的ポリペプチドに結合するように操作することができる。改変されたバルジを含む操作された核酸ターゲティング核酸は、改変されたバルジを含まない核酸ターゲティング核酸よりも多くても約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍または５０倍またはそれ以上低い、または高い解離定数で部位特異的ポリペプチドに結合するように操作することができる。
【０６７７】
方法
本開示は、核酸ターゲティング核酸の操作方法を提供する。この方法は、核酸ターゲティング核酸の改変を含むことができる。この改変は、核酸ターゲティング核酸におけるヌ
クレオチドの挿入、欠失、置換および変異を含むことができる。この改変には、核酸ターゲティング核酸が野生型核酸ターゲティング核酸よりも新規プロトスペーサー隣接モチーフおよび／または新規部位特異的ポリペプチドに結合するように核酸ターゲティング核酸を改変することを含めることができる。この方法は、本明細書で記載したような部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸ならびに部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸の複合体のいずれかを使用して実施することができる。
【０６７８】
操作された核酸ターゲティング核酸は、標的核酸を切断するために使用することができる。操作された核酸ターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドを有する細胞に導入し、それによって複合体を形成することができる。複合体は標的核酸にハイブリダイズすることができ、この標的核酸はプロトスペーサー隣接モチーフを含む。複合体の部位特異的ポリペプチドは、標的核酸を切断することができる。
【０６７９】
化膿性連鎖球菌ＳＦ３７０のｐｒｅ−ＣＲＩＳＰＲ核酸およびｔｒａｃｒ核酸配列の核酸配列の相補的部分を図２０に示す。
【０６８０】
図２１は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列および３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部を含む２本鎖（例えば、ヘアピン）の構造例を示す。２本鎖はバルジ領域を含む。
【０６８１】
表４は、開示の１個のガイド核酸ターゲティング核酸を合成するために使用したＤＮＡ鋳型の配列を含む。
【０６８２】
【表４】
2018075026.tif 000005
【０６８３】
【表５】
2018075026.tif 000006
【０６８４】
【表６】
2018075026.tif 000007
【０６８５】
表２は、表１のＤＮＡ鋳型のＲＮＡ配列を示す。
【０６８６】
【表７】
2018075026.tif 000008
【０６８７】
【表８】
2018075026.tif 000009
【０６８８】
【表９】
2018075026.tif 000010
【０６８９】
【表１０】
2018075026.tif 000011
【０６９０】
【表１１】
2018075026.tif 000012
【０６９１】
表５は、さらなる核酸ターゲティング核酸変種の活性および目的を示す。＋は活性を意味し、−は不活性を意味する。これらの変種の実験データを図３７に示す。
【０６９２】
【表１２】
2018075026.tif 000013
【０６９３】
【表１３】
2018075026.tif 000014
【０６９４】
【表１４】
2018075026.tif 000015
【０６９５】
【表１５】
2018075026.tif 000016
【０６９６】
【表１６】
2018075026.tif 000017
【０６９７】
核酸ターゲティング核酸を使用するタグ付き細胞株の生成方法
本開示の方法は、細胞をドナーポリヌクレオチドでタグ付けすることであって、このドナーポリヌクレオチドは分裂および／または分化することができ、このドナーポリヌクレオチドは細胞分裂中に娘細胞それぞれに伝達することができることを提供する。この方法は、本明細書で記載したような部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸ならびに部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸の複合体のいずれかを使用して実施することができる。
【０６９８】
タグ付けした細胞は、細胞をドナーポリヌクレオチドならびに部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む複合体と接触させることによって生成することができる。ドナーポリヌクレオチドは切断された標的核酸に挿入され、それによってタグ付けした細胞を生成することができる。タグ付けした細胞は細胞系などにおいて増殖させるか、または細胞の増殖集団を生成するために増殖させることができる。
【０６９９】
ドナーポリヌクレオチドは、２本鎖分断の両側に配列に相同な末端を含む相同組換えのためのドナーカセットを使用することによって切断部位に導入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、２つの末端の間に他の配列を含むことができる。他の配列は核酸配列であってもよい。他の配列は遺伝子をコードしていてもよい。他の配列はノンコーディング核酸エレメントをコードしていてもよい。
【０７００】
ドナーポリヌクレオチド（例えば、２つの相同末端の間にあるドナーポリヌクレオチドの他の配列）はマーカーを含んでいてもよい。マーカーは、視覚化マーカー（例えば、ＧＦＰなどの蛍光マーカー）を含むことができる。マーカーは、ランダムポリヌクレオチド配列（例えば、ランダムヘキサマー配列）を含むことができる。マーカーはバーコードであってもよい。
【０７０１】
ＮＨＥＪは、各切断部位に特有の配列特性を導入することができる。修復機構は、挿入（例えば、ドナーポリヌクレオチドの挿入）、欠失または変異の切断部位への導入を引き起こすことができる。２本鎖分断を修復するためにＮＨＥＪを受けた細胞は、修復が起こった後、特有の配列を含むことができる（例えば、特有の配列は２本鎖分断に挿入され得る）。２つ以上の部位が細胞内で切断される場合、修復によって各部位にドナーポリヌクレオチドが導入され、それによってその細胞に配列多様性を付加することができる。修復部位は、細胞分裂中保持され、改変された細胞の後代全てに受け継がれることが可能な特有のバードコード配列を細胞にもたらすことができる。ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上の部位に挿入することができる（例えば、切断された標的核酸）。ドナーポリヌクレオチドは、多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上の部位に挿入することができる（例えば、切断された標的核酸）。
【０７０２】
相同組換え（ＨＲ）は、細胞および／または細胞集団（例えば、ヒト細胞、ほ乳類細胞、酵母、真菌、原生動物、古細菌）にバーコード配列を導入するために使用することができる。ドナープラスミドのライブラリー（例えば、ドナーポリヌクレオチドを含む）は、ドナーカセット内のランダム配列を用いて作製することができる。このライブラリーは、オリゴヌクレオチド、１本の２本鎖ＤＮＡ断片、プラスミドおよび／またはミニサークルから形成することができる。
【０７０３】
ドナーポリヌクレオチド配列は、細胞系列を追跡する目的のために個々の細胞のゲノムに導入することができる。細胞機能に有害な影響を及ぼす可能性を最小限に抑えるために、遺伝子および調節エレメントから離れたゲノムのサイレントまたは「セーフハーバー」領域において改変するように、部位を選択することができる。機能を果たす遺伝子エレメント内の部位はまた、細胞の運命を追跡するために使用することができる。
【０７０４】
例えば、ドナーポリヌクレオチドは、幹細胞および／または幹細胞集団に導入することができる。本開示の方法は、動物モデルにおける細胞系列の発達を追跡するために使用することができる。例えば、造血における細胞の運命の発達および／または分化は、本開示の方法を使用して追跡することができる。本開示の方法は、細胞操作に基づく治療的療法のために使用することができる。例えば、細胞は、治療用タンパク質をコードするドナーポリヌクレオチドでタグ付けすることができる。この細胞を増殖させることができる。増殖した細胞は、対象に導入することができる。別の例として、分化した細胞を対象から除去することができる。分化した細胞は、１つは細胞が分化したときに発現し、１つは細胞が脱分化したときに発現する２つのマーカーでタグ付けすることができる。マーカーの同定は、分化事象の決定において有用であり得る。別の例として、分化した細胞を対象から獲得することができる。分化した細胞は、多能性細胞に脱分化させることができる。多能性細胞は、治療用タンパク質をコードするドナーポリヌクレオチドでタグ付けすることができる。細胞は、治療用タンパク質を発現する間に新たな細胞型に再分化させ、それによって患者専用の治療用細胞を生成することができる。タグ付けした細胞は分裂および分化することができ、ゲノムの改変は、細胞分裂中に各娘細胞に伝達することができる。
【０７０５】
場合によって、２種類の細胞を２種類の異なるドナーポリヌクレオチドマーカーでタグ付けすることができる。この２種類の細胞を一緒にすることができる。一緒にした混合物は同時にアッセイすることができる。ドナーポリヌクレオチドは２種類の細胞を区別するために使用することができるので、ドナーポリヌクレオチドは２種類の細胞の多重化分析を可能にすることができる。
【０７０６】
細胞集団は、２本鎖分断を導入し、または細胞特性を生成するために選択することがで
きる。細胞は精製するか、または選択することができる。例えば、造血幹細胞（ＣＤ４５陽性）の集団は、ＦＡＣＳまたは磁気ビーズ精製によって選択することができる。骨髄は、エキソビボにおいてヌクレアーゼで処理することができる。細胞は、特定の指向性を備えたウイルスを使用することによってインビボにおいて標的とすることができる。細胞は、特定の受容体を有する細胞を標的とするために操作されたウイルスを使用することによって選択することができる。
【０７０７】
タグ付けした細胞は、集団レベルまたは単一細胞レベルのいずれかでハイスループット配列決定によって分析することができる。集団レベルでは、細胞の収集物を溶解することができる。ゲノムＤＮＡを抽出することができる。ＰＣＲプライマーは、ヌクレアーゼによって改変されたゲノム領域を増幅するために設計することができる。配列は、ハイブリダイゼーションによって濃縮することができる。配列ライブラリーは、ゲノムＤＮＡから調製し、濃縮することができる。対象とする領域を濃縮して、配列ライブラリーを調製することができる。配列ライブラリーは、核酸配列決定技術で使用するために適切な配列タグを含むプライマーを使用して、濃縮中に同時に調製することができる。２本鎖分断が転写可能な領域内に形成される場合、ＲＮＡを使用して配列ライブラリーを調製することができる。
【０７０８】
一旦核酸配列データを獲得したら、配列を分析してクローン構造を決定することができる。これは、共通配列を一緒に集め、これらの配列を計数することによって実施することができる。
【０７０９】
細胞は、フローサイトメトリーまたはアフィニティー精製方法を使用して細胞表面マーカーに基づく選別方法によって予備選択してもよい。細胞表面マーカーは、細胞状態を明確にするために使用することができ、細胞状態とクローン構造を比較することによって改変された細胞集団の運命を測定することができる。
【０７１０】
単一細胞レベルでは、細胞は単離してもよい。ＰＣＲ生成物は、個々の細胞それぞれから生成することができる。これは、マイクロウェルアレイ、マイクロ流体装置および／またはエマルジョンにおいて実現することができる。細胞当たり２つ以上のゲノム改変を行う場合、ＰＣＲ生成物は、親細胞に対する関連性を確認するために物理的に、または化学的に一緒に結合することができる。
【０７１１】
ゲノム編集事象の定量方法
Ｃａｓ９などのＲＮＡ依存性ヌクレアーゼのために、核酸認識機能とヌクレアーゼ活性を関連づけることができる。場合によって、核酸認識機能とヌクレアーゼ活性を関連づけなくてもよい。ヌクレアーゼ部位は、ヌクレアーゼによって認識される特定の配列内に位置していてもよい。
【０７１２】
非相同性末端結合は、２本鎖分断の部位に複数の塩基の挿入を引き起こすことができる不完全な修復プロセスであってもよい。ＮＨＥＪは、切断部位への挿入、欠失および／または変異の導入を引き起こすことができる。ＮＨＥＪは、元の配列を著しく破壊することができる。修復機構の結果としての元の配列の破壊は、ゲノム編集アプローチの有効性を評価するために使用することができる。
【０７１３】
相同組換えは、類似した、または同一の核酸分子の間でヌクレオチド配列を交換することによって、標的核酸分断のより完全な修復を可能にすることができる。２本鎖分断の両側の配列に相同な末端および２つの末端の間に他の配列を含むドナーカセット（例えば、ドナーポリヌクレオチド）を使用することによって、他の配列を標的核酸の切断部位に導入することができる。
【０７１４】
本開示は、２本鎖分断活性およびＣａｓ９などの核酸依存性ヌクレアーゼによって導入されたＮＨＥＪ媒介挿入／欠失を評価するアプローチについて記載する。この方法は、最初のヌクレアーゼ認識および核酸切断活性中にＣａｓ９によって認識される標的核酸内の部位が、ＮＨＥＪプロセス中に挿入または欠失が導入されることによって破壊され得るという事実を利用する。
【０７１５】
場合によって、この方法は、標的核酸（例えば、ゲノム）における対象とする部位を標的とする核酸ターゲティング核酸の設計を提供する。核酸ターゲティング核酸をコードする核酸鋳型は、核酸ターゲティング核酸のインビトロ合成を可能にするために、核酸ターゲティング核酸の５’末端にプロモーター配列を付加するように設計することができる。
【０７１６】
プライマーは、切断部位に隣接した場所に設計することができる。切断部位（および／または切断部位周辺の核酸領域）は（例えば、ゲノム核酸から）増幅して、それによって生成物（例えば、増幅したＰＣＲ生成物）を生成することができる。生成物（例えば、増幅したＰＣＲ生成物）は、塩基の長さが少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００またはそれ以上であってもよい。生成物（例えば、増幅したＰＣＲ生成物）は、塩基の長さが多くても約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００またはそれ以上であってもよい。生成物（例えば、増幅したＰＣＲ生成物）の塩基対の長さは約２００〜６００であってもよい。
【０７１７】
生成物は精製することができる。生成物は、ＲＮＡ依存性ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）および核酸ターゲティング核酸とインキュベートすることができる。ＮＨＥＪによって改変されていないゲノム核酸から増幅された分子は、Ｃａｓ９によって認識され、切断され得る正確な配列を含むことができる。ＮＨＥＪによって改変されたゲノム核酸から増幅された分子は、Ｃａｓ９によって認識および／または切断され得る部位を含まなくてもよい。
【０７１８】
消化した生成物は、次にゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、ハイスループット配列決定および／または定量的ＰＣＲ（例えば、ｑＰＣＲ）などの方法によって分析することができる。ゲル電気泳動の場合、ゲルを画像処理することができる。一旦ゲルが画像処理されたら、ＮＨＥＪによって改変された細胞の割合は消化した生成物に対応するバンドの強度を測定し、消化していない生成物に対応するバンドの強度と比較することによって推定することができる。
【０７１９】
ドナーポリヌクレオチドを２本鎖分断に挿入するために２本鎖分断に輸送するための方法
本開示は、ドナーポリヌクレオチドの２本鎖分断部位への挿入（例えば、相同組換え）を促進するために、ドナーポリヌクレオチドを部位特異的標的核酸分断に極めて接近させる方法について記載する。この方法は、本明細書で記載したような部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸ならびに部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸の複合体のいずれかを使用して実施することができる。
【０７２０】
場合によって、本開示の方法は２本鎖分断を生成するヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）にドナーポリヌクレオチドを結合させることによって、ドナーポリヌクレオチドを標的核酸内の２本鎖分断部位に極めて接近させることを提供する。
【０７２１】
部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸およびドナーポリヌクレオチドを含む複合体を標的核酸に輸送することができる。図３０は、ドナーポリヌクレオチドを標的
核酸内の２本鎖分断部位に接近させる方法例を例示している。例えば、核酸ターゲティング核酸は、３’にハイブリダイズする伸長配列を含むことができ、これはｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列（核酸ターゲティング核酸に付着した細い点線で示した）の一部となることができる。３’にハイブリダイズする伸長配列は、非天然配列であってもよい。図３０Ａは、核酸ターゲティング核酸の３’末端のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列がドナーポリヌクレオチドの末端（例えば、３’末端）にハイブリダイズできる配列を含むことができることを例示している（ドナーポリヌクレオチドは太い破線で示す）。３’のハイブリダイズする伸長配列の長さは、ヌクレオチドが少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上であってもよい。３’のハイブリダイズする伸長配列の長さは、ヌクレオチドが多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上であってもよい。３’のハイブリダイズする配列は、ドナーポリヌクレオチドの少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。３’のハイブリダイズする配列は、ドナーポリヌクレオチドの多くても約１、２、３、４、５、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。３’のハイブリダイズする配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のミスマッチを有するドナーポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。３’のハイブリダイズする配列は、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のミスマッチを有するドナーポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。
【０７２２】
３’のハイブリダイズする伸長は、ドナーポリヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズすることができる。３’のハイブリダイズする伸長は、ドナーポリヌクレオチドの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上の３’のほとんどのヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。３’のハイブリダイズする伸長は、ドナーポリヌクレオチドの多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上の３’のほとんどのヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。
【０７２３】
図３０Ｂに示したように、核酸ターゲティング核酸の３’末端のｔｒａｃｒ核酸伸長は、ドナーＤＮＡの５’末端にハイブリダイズすることができる配列を含むことができる。３’のハイブリダイズする伸長は、ドナーポリヌクレオチドの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上の５’のほとんどのヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。３’のハイブリダイズする伸長は、ドナーポリヌクレオチドの多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上の５’のほとんどのヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。
【０７２４】
図３０Ｃに示したように、核酸ターゲティング核酸の３’末端のｔｒａｃｒ核酸伸長は、ドナーポリヌクレオチドの３’末端と５’末端の間の領域にハイブリダイズすることができる配列を含むことができる。３’のハイブリダイズする伸長は、ドナーポリヌクレオチドの３’末端と５’末端の間の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。３’のハイブリダイズする伸長は、ドナーポリヌクレオチドの３’末端と５’末端の間の多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。
【０７２５】
図３０Ｄに示したように、核酸ターゲティング核酸の３’末端のｔｒａｃｒ核酸伸長は、ドナーポリヌクレオチドの完全長に沿ってハイブリダイズすることができる配列を含むことができる。核酸ターゲティング核酸は、ドナーポリヌクレオチドの少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％に沿ってハイブリダイズすることができる。核酸ターゲティング核酸は、ドナーポリヌクレオチドの多くても約２０
、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％に沿ってハイブリダイズすることができる。３’のハイブリダイズする伸長配列は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のミスマッチを有するドナーポリヌクレオチドの完全長に沿ってハイブリダイズすることができる。３’のハイブリダイズする伸長配列は、多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上のミスマッチを有するドナーポリヌクレオチドの完全長に沿ってハイブリダイズすることができる。
【０７２６】
図３０Ｅに示したように、核酸ターゲティング核酸の３’末端のｔｒａｃｒ核酸伸長（例えば、３’のハイブリダイズする伸長）は、鋳型として使用できる配列を含むことができ、例えば、逆転写酵素によって変換されてハイブリッド核酸を生成することができる（例えば、得られた核酸は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドであり、新たに転写された核酸はＤＮＡであってもよい）。逆転写酵素の例には、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ、ＨＩＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素が含まれる。逆転写酵素は、３’のハイブリダイズする伸長鋳型からドナーポリヌクレオチド配列を伸長することができる。
【０７２７】
核酸ターゲティング核酸の３’末端のｔｒａｃｒ核酸伸長は、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）に結合することができる核酸配列を組み込むことができる。ＲＮＡ結合タンパク質は図３０Ｆに示したようにＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）に融合することができる。ＤＮＡ結合タンパク質は、ドナーポリヌクレオチドに結合することができる。
【０７２８】
ドナーポリヌクレオチドを２本鎖分断に極めて接近させるために使用した配列は、核酸ターゲティング核酸の５’末端（例えば、スペーサー伸長）に付加することができる。ドナーポリヌクレオチドを２本鎖分断の極めて接近させるために使用した配列は、核酸ターゲティング核酸の５’末端および３’末端の両方に付加することができる。
【０７２９】
本開示の方法で使用したヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、ヌクレアーゼが標的核酸に１本鎖分断を導入することができるニッカーゼ活性を含むことができる。ヌクレアーゼとニッカーゼ活性の対は、互いに極めて接近した領域を標的とすることができる。第１のヌクレアーゼは、第１のドナーポリヌクレオチドと相互作用することができる第１の核酸ターゲティング核酸に結合することができる。第２のヌクレアーゼは、第２のドナーポリヌクレオチドと相互作用することができる第２の核酸ターゲティング核酸に結合することができる。第１および第２のドナーポリヌクレオチドは、２本鎖ドナーポリヌクレオチドを形成するために互いにハイブリダイズするように設計することができる。２つの別々のドナーポリヌクレオチドをヌクレアーゼ部位にもたらすことができる。
【０７３０】
いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは１本鎖であってもよい。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは２本鎖であってもよい。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡはミニサークルであってもよい。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドはプラスミドであってもよい。いくつかの実施形態では、プラスミドは高次コイルであってもよい。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドはメチル化されていてもよい。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドはメチル化されていなくてもよい。ドナーポリヌクレオチドは改変を含んでいてもよい。改変には、限定はしないが、ビオチン化、化学結合および合成ヌクレオチドを含む本明細書で記載したものを含めることができる。
【０７３１】
部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含むベクターをクローニングし発現する方法
本開示は、操作された核酸ターゲティング核酸をベクター（例えば、直線化したベクタ
ー）にクローニングする方法を提供する。この方法は、本明細書で記載したような部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸ならびに部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸の複合体のいずれかを使用して実施することができる。
【０７３２】
使用者（例えば、科学者）は、１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計することができる。１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、一緒にハイブリダイズすると標的核酸を標的とするスペーサー配列をコードすることができる。１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの長さは、ヌクレオチドが少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０個またはそれ以上であってもよい。１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの長さは、ヌクレオチドが多くても約５、１０、１５、２０、２５、３０個またはそれ以上であってもよい。１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの長さは、ヌクレオチド１９〜２０個であってもよい。
【０７３３】
１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、標的核酸（例えば、プロトスペーサー隣接モチーフの３’または５’末端などのプロトスペーサー隣接モチーフに隣接した配列）にハイブリダイズするように設計することができる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列のセンスまたはアンチセンス鎖に対応する配列をコードすることができる。
【０７３４】
１本鎖オリゴヌクレオチドは、標的核酸にハイブリダイズすることができ、および／または相補的である第１の部分を含むことができる。１本鎖オリゴヌクレオチドは、別の１本鎖オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、および／または相補的である第１の部分を含むことができる。１本鎖オリゴヌクレオチドは、直線化したベクター内の配列にハイブリダイズすることができる第２の部分を含むことができる。言い換えると１対の１本鎖オリゴヌクレオチドは、互いにハイブリダイズする第１の部分および１本鎖オーバーハングを含む第２の部分を含むことができ、このオーバーハングは直線化したベクターにおける付着末端にハイブリダイズすることができる。場合によって、オーバーハングは５’−ＧＴＴＴＴ−３’を含む。場合によって、オーバーハングは５’−ＣＧＧＴＧ−３’を含む。
【０７３５】
１本鎖ＤＮＡヌクレオチドは、一緒にアニーリングして２本鎖オリゴヌクレオチドを生成することができる。１本鎖ＤＮＡヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドアニーリング緩衝液（例えば、トリス−ＨＣｌ、ＥＤＴＡおよびＮａＣｌを含む）中で一緒にアニーリングすることができる。２本鎖オリゴヌクレオチドは、作用濃度（例えば、直線化したプラスミドへの連結に適した濃度）に希釈することができる。希釈した２本鎖オリゴヌクレオチドは、直線化したベクターに連結することができる。連結は、ライゲーション緩衝液（例えば、トリス−ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＡＴＰを含む）中でリガーゼ（例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）によって実施することができる。２本鎖オリゴヌクレオチドは、直線化したベクターの核酸ターゲティング核酸をコードする配列内の領域に連結することができる。言い換えると、直線化したベクターは核酸ターゲティング核酸をコードする領域内の一点において直線化していてもよく、直線化によって２本鎖オリゴヌクレオチドの付着末端に相補的な付着末端が生成する。２本鎖オリゴヌクレオチドをベクターに連結すると、２本鎖オリゴヌクレオチド配列に対応するスペーサー配列を含む操作された核酸ターゲティング核酸をコードする配列を生成することができる。
【０７３６】
連結したベクターは、化学的にコンピテントな細胞（例えば、ＤＨ５−アルファ、Ｔｏｐ１０）を形質転換し、正確に連結したベクターの発現を（例えば、抗体スクリーニングによって）選択することができる。選択した形質転換体は、配列決定によって挿入の存在を分析することができる。配列決定は、ベクターの一部にハイブリダイズすることができる配列決定プライマーを使用して実施することができる。
【０７３７】
正確に連結したベクターは（例えば、大規模なＤＮＡ調製、ｍａｘｉｐｒｅｐ）によっ
て調製し、精製することができる。部位特異的ポリペプチド、２本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む核酸ターゲティング核酸を含むベクターは、選択した細胞系（例えば、ほ乳類細胞系）に導入（例えば、遺伝子導入）することができる。
【０７３８】
本明細書では本発明の好ましい実施形態について示し述べたが、このような実施形態が例としてのみ示されていることは当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明を逸脱することのない数多くの変種、変化および置換に気づくであろう。本明細書で記載した本発明の実施形態の様々な代替法が本発明の実施で使用できることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、これらの特許請求の範囲内の方法および構造物ならびにそれらの同等物が特許請求の範囲の対象となるものとする。
【実施例】
【０７３９】
〔実施例１〕
変更されたＰＡＭ特異性のための部位特異的ポリペプチドの改変
いくつかの実施形態において、本開示はＰＡＭ特異性を変更するために改変される改変部位特異的ポリペプチドを提供する。改変部位特異的ポリペプチドをコードする核酸は、トランスフェクションによって細胞に導入される。改変部位特異的ポリペプチドは、挿入されたＨＮＨまたはＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含む。改変部位特異的ポリペプチドは、改変された高塩基性断片を含む。標的核酸とハイブリダイズすることができるスペーサーを含む核酸ターゲティング核酸も、トランスフェクションによって細胞に導入される。改変部位特異的ポリペプチドと核酸ターゲティング核酸は、複合体を形成する。複合体は、核酸ターゲティング核酸によって標的核酸へ導かれる。一度、核酸ターゲティング核酸とハイブリダイズされると、標的核酸は部位特異的ポリペプチドのヌクレアーゼドメインによって切断される。いくつかの実施形態において、改変部位特異的ポリペプチドは、より低いＫｄで標的核酸と結合する。
【０７４０】
いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドも、細胞に導入される。いくつかの例では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部は、切断された標的核酸に挿入される。
【０７４１】
〔実施例２〕
変更された標的核酸特異性のための部位特異的ポリペプチドの改変
いくつかの実施形態において、本開示は標的核酸特異性を変更するために改変される改変部位特異的ポリペプチドを提供する。改変部位特異的ポリペプチドは、細胞に導入される。改変部位特異的ポリペプチドは、高塩基性断片および／またはＨＮＨ様ドメインの改変を含む。標的核酸とハイブリダイズすることができるスペーサーを含む核酸ターゲティング核酸も、細胞に導入される。改変部位特異的ポリペプチドと核酸ターゲティング核酸は、複合体を形成する。複合体は、核酸ターゲティング核酸によって標的核酸へ導かれる。一度、核酸ターゲティング核酸とハイブリダイズされると、標的核酸は部位特異的ポリペプチドによって切断される。いくつかの実施形態において、改変部位特異的ポリペプチドは、より低いＫｄで標的核酸と結合する。
【０７４２】
いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドも、細胞に導入される。いくつかの例では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部は、切断された標的核酸に挿入される。
【０７４３】
〔実施例３〕
部位特異的ポリペプチドの組換え発現
改変部位特異的ポリペプチドをコードし、宿主生物で改変部位特異的ポリペプチドの発現を可能にするように、組換えＤＮＡ配列を組み立てることができる。組換えＤＮＡ配列はプロモーター配列を含み、さらに精製のための親和性タグまたはエピトープタグを含んでもよい。非限定的な実施例では、プラスミドは改変部位特異的ポリペプチドの発現のための組換えＤＮＡ配列を含む。
【０７４４】
組換えタンパク質の産生。
部位特異的改変ポリペプチドをコードしているプラスミドは、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））へ導入される。ポリペプチドは細菌細胞内で発現されて、次いで、クロマトグラフ法を用いて細胞溶解物から精製される。改変部位特異的ポリペプチドの活性は、改変ポリペプチドの特異性、ＰＡＭ配列、部位特異的ポリペプチドの特異性プロフィールおよびポリペプチドの核酸選択（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または改変核酸。）の特異性を定量するために設計された検定方法を用いて測定される。
【０７４５】
ソフトウェアは、改変部位特異的ポリペプチドを用いて切断することができる部位を選択するように設計されている。ガイドＲＮＡ配列は、部位特異的ポリペプチドの活性を管理するように設計されている。一度設計されたならば、部位特異的ポリペプチドを使用して核酸を切断する。
【０７４６】
改変部位特異的ポリペプチドの細胞への導入
改変ペプチドは核酸部位を標的とするために細胞に導入される。ヌクレアーゼ活性を保持するポリペプチドを使って、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの切れ目を標的ＤＮＡに導入する。ＤＮＡ結合活性を持つがＤＮＡ切断活性は持たないポリペプチドを使って二本鎖ＤＮＡを細胞に結合させる。このことは、転写の活性化または抑制をもたらすのに用いることができる。
【０７４７】
〔実施例４〕
ＣＡＳ９配列内での改変部位の選択
先に述べたように、Ｃａｓ９オーソログを含むタイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムは、それらのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ座位の分析に基づいて３つのグループ（タイプＩＩ−Ａ、タイプＩＩ−ＢおよびタイプＩＩ−Ｃ）に分類できる。これらのグループ内のＣａｓ９オーソログは、概して、より短い（Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１−タイプ）およびより長い（Ｃａｓ９／Ｃｓｘ１２−タイプ）配列を含む２つの分岐によって定義することができる。これらのより大きいグループに加えて、Ｃａｓ９に類似したトポロジーではあるが保存配列要素間の挿入の長さおよび配列の有意差を伴って配置されるＨＮＨおよびＲｕｖＣドメインを含むホモログの２つの追加のファミリーが存在しうる。二次構造予測と配列アラインメントを使って、改変のためのポリペプチドの領域を定める。二次構造要素の間に、または、高い配列保存の領域の間に分類される領域は、挿入または欠失の候補として選択される。既知構造のドメインと類似性がある領域は、配列を挿入または欠失させるための特異的な領域を同定するために分析される。
【０７４８】
図３５は、少数の多様なＣａｓ９オーソログのための、ＣＤＤ配列アラインメントＴＩＧＲ０１８５を表す。下方に「Ｘ」と記したアミノ酸は、類似していると考えてられる。下方に「Ｙ」と記したアミノ酸は、高度に保存されるか、または全配列で同一であると考えることができる。「Ｘ」または「Ｙ」のないアミノ酸残基は、保存されていない。このアラインメントは、より長いＣａｓ９オーソログのＣ−末端領域（アミノ酸残基１１００〜１３５０とほぼ一致する）を含まない。図３５に記載された配列を表６に記載する。
【０７４９】
【表１７】
2018075026.tif 000018
【０７５０】
新しい機能性ドメインの位置、代替配列の挿入または、Ｃａｓ９活性を改変する領域サイズの欠失または減少のための領域は、表７でハイライトされる領域を含むことができるが、これに限定されるものではない。数字は、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｍ１  ＧＡＳ由来のＣａｓ９配列に基づくアミノ酸配列番号を表す。
【０７５１】
【表１８】
2018075026.tif 000019
【０７５２】
一度、ある領域が新しいポリペプチド配列をタンパク質に挿入するか、またはタンパク質の領域を欠失させる可能性のある位置であると同定されたならば、タンパク質をコードするＤＮＡ配列は改変を取り入れるために改変される。
【０７５３】
〔実施例５〕
部位特異的ポリペプチド結合性標的核酸の配列濃縮
本開示は、部位特異的ポリペプチドを用いた、増幅のない配列濃縮の方法を提供する。
【０７５４】
いくつかの実施形態において、方法は、ａ）標的核酸を、核酸ターゲティング核酸および部位特異的ポリペプチドを含む複合体と接触させる工程と、ｂ）標的核酸を切断する工程と、ｃ）標的核酸を精製する工程と、ｄ）濃縮される標的核酸の配列決定する工程とを含む。
【０７５５】
いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは酵素的に不活性である。酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチドの使用は、標的核酸が部位特異的ポリペプチド複合体に結合するのを容易にする。いくつかの実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、酵素的に活性である。
【０７５６】
いくつかの実施形態において、配列濃縮は、細胞外（例えば、無細胞試料）で実行される。例えば、試料は精製されたゲノムＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、配列濃縮は、細胞試料（例えば、細胞、細胞溶解物）で実行される。
【０７５７】
いくつかの例では、部位特異的ポリペプチド−標的核酸複合体は、固定されるか、複合体を形成するために架橋される。方法が細胞上で実行されているならば、細胞は溶解される。溶解条件は、無傷のタンパク質−ＤＮＡ複合体を維持するために選択される。
【０７５８】
核酸試料は、親和性精製の前に標的核酸を断片化するために処理される。断片化は、物理的、機械的、または酵素的方法によって実行することができる。物理的な断片化は、標的ポリヌクレオチドを熱、または、紫外（ＵＶ）光にさらすことを含む。機械的な破壊を使って、標的ポリヌクレオチドを、所望の範囲の断片に機械的に剪断する。機械的剪断は、標的ポリヌクレオチドの反復的なピペット操作、音波処理および噴霧を含むいくつかの方法によって達成される。標的核酸も、酵素的な方法を用いて断片化される。場合によっては、酵素消化は制限酵素などの酵素を使って実行される。制限酵素を使って、標的ポリヌクレオチドの特異的または非特異的断片化を行う。方法は、一般に、タイプＩ酵素、タイプＩＩ酵素および／またはタイプＩＩＩ酵素と言われる１つまたはそれ以上の種類の制限酵素を使用する。タイプＩＩおよびタイプＩＩＩ酵素は、二本鎖ポリヌクレオチド配列内の、ヌクレオチドの特異的な配列を認識する（「認識配列」または「認識部位」）。これらの配列を結合および認識すると同時に、タイプＩＩおよびタイプＩＩＩ酵素は、ポリヌクレオチド配列を切断する。場合によっては、切断の結果、一本鎖核酸が一部突出した、「付着末端」と呼ばれるポリヌクレオチド断片になる。その他の場合、切断の結果、突出した断片にならずに「平滑末端」を生じる。方法は、付着末端または平滑末端を生成する制限酵素の使用を含んでもよい。
【０７５９】
断片化されると、部位特異的ポリペプチドを含む複合体は、固体担体とインキュベートすることによって精製される。例えば、部位特異的ポリペプチドがビオチンタグを含むならば、固体担体はビオチンタグと結合するためにアビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされる。
【０７６０】
代替的な実施形態において、断片化されると、部位特異的ポリペプチド、標的核酸およ
び／または核酸ターゲティング核酸を含む複合体は捕捉剤とインキュベートすることによって精製される。捕捉剤は、部位特異的ポリペプチドと融合する親和性タグと結合する。捕捉剤は、抗体を含む。例えば、部位特異的ポリペプチドと融合する親和性タグがＦＬＡＧタグであるならば、捕捉剤は抗−ＦＬＡＧ−タグ抗体になる。
【０７６１】
いくつかの実施形態において、捕捉剤は、固体担体で精製される。例えば、捕捉剤がビオチンタグを含むならば、固体担体はビオチン化された捕捉剤を結合するためにアビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされる。
【０７６２】
いくつかの実施形態において、核酸ターゲティング核酸は、親和性タグを含む。親和性タグは、エンドリボヌクレアーゼと結合可能な配列を含む。いくつかの例では、親和性タグは、条件つきで酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼと結合可能な配列を含む。条件つきで酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、親和性タグを結合するが、切断しない。
【０７６３】
いくつかの実施形態において、エンドリボヌクレアーゼおよび／または条件つきで酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、親和性タグを含む。
【０７６４】
条件つきで酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、固体担体で精製される。固体担体は、条件つきで酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼの親和性タグと結合する。例えば、条件つきで酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼがビオチンタグを含むならば、固体担体はビオチン化された捕捉剤を結合するためにアビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされる。
【０７６５】
いくつかの実施形態において、条件つきで酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、様々な不溶性担体のいずれかの上に固定される。
【０７６６】
方法のいくつかの実施形態において、２ラウンドの精製が実行される。いくつかの例では、第１ラウンドは捕捉剤の親和性タグと結合する固体担体を用いた精製を含み、第２ラウンドは部位特異的ポリペプチドの親和性タグと結合する固体担体を用いた精製を含む。いくつかの例では、第１ラウンドは部位特異的ポリペプチドの親和性タグと結合する固体担体を用いた精製を含み、第２ラウンドは捕捉剤の親和性タグと結合する固体担体を用いた精製を含む。
【０７６７】
いくつかの実施形態において、本開示の方法が、多重の配列濃縮のために使われる。本実施形態において、複数の核酸ターゲティング核酸は、核酸試料と接触可能であり、各々の核酸ターゲティング核酸は、核酸試料中で異なる標的核酸（例えば、ゲノムの配列）を標的とするように操作されている。
【０７６８】
捕捉された複合体は、標的核酸を含む。標的核酸は、高塩濃度洗浄、エタノール沈殿、煮沸、ゲル精製などを含む標準的な方法によって、部位特異的ポリペプチド複合体から溶出される。
【０７６９】
溶出されたＤＮＡは、１つまたはそれ以上のアダプターのライゲーションによって、配列解析のために調製される。
【０７７０】
本明細書に記載されるように、配列ライブラリーは配列決定される。配列決定されたライブラリーは、多型性を同定するため、疾患を診断するため、疾患の治療方針を決定するため、および／または、抗体ライブラリーを生成するために分析される。
【０７７１】
〔実施例６〕
部位特異的ポリペプチドを含む複合体非結合性標的核酸の配列濃縮
いくつかの実施形態において、配列濃縮は、酵素的に活性な部位特異的ポリペプチドで実行される。いくつかの例では、部位特異的ポリペプチドは、酵素的に活性である。この例では、標的核酸は部位特異的ポリペプチドに結合されず、切除される。
【０７７２】
標的核酸は同定され、核酸ターゲティング核酸は標的核酸の側面に位置する配列に部位特異的ポリペプチドを向けるように設計される。部位特異的ポリペプチドが標的核酸の両端でＤＮＡを切断するような、設計された核酸ターゲティング核酸および部位特異的ポリペプチドを含む複合体と共に試料をインキュベートする。標的核酸の切断と同時に、標的核酸は元の核酸から切断される。切断された標的核酸は精製される（例えば、ゲル電気泳動、ビーズもしくは他のカルボン酸塩誘導体化ビーズからのサイズ選択溶出によって、または、適切な濃度の塩およびＰＥＧを用いて、より大きいもしくはより小さなＤＮＡを優先して沈殿させることによって）。
【０７７３】
いくつかの実施形態において、配列濃縮は、細胞外（例えば、無細胞試料）で実行される。例えば、試料は精製されたゲノムＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、配列濃縮は、細胞試料（例えば、細胞、細胞溶解物）で実行される。
【０７７４】
方法が細胞上で実行されているならば、細胞は溶解される。溶解条件は、無傷のタンパク質−ＤＮＡ複合体を維持するために選択される。
【０７７５】
いくつかの実施形態において、配列決定される標的核酸は、核酸ターゲティング核酸および／または部位特異的ポリペプチドに結合されない。本実施形態では、部位特異的ポリペプチドおよび／または核酸ターゲティングと結合した核酸は精製される。部位特異的ポリペプチドの精製は、本明細書で前に記載したように進行する。手短に言うと、部位特異的ポリペプチドを含む複合体は、固体担体とインキュベートすることによって精製される。例えば、部位特異的ポリペプチドがビオチンタグを含むならば、固体担体はビオチンタグと結合するためにアビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされる。
【０７７６】
代替的な実施形態において、断片化されると、部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸、および非標的核酸を含む複合体は捕捉剤とインキュベートすることによって精製される。捕捉剤は、部位特異的ポリペプチドと融合する親和性タグと結合する。捕捉剤は、抗体を含む。例えば、部位特異的ポリペプチドと融合する親和性タグがＦＬＡＧタグであるならば、捕捉剤は抗−ＦＬＡＧ−タグ抗体になる。
【０７７７】
捕捉剤は、固体担体で精製される。例えば、捕捉剤がビオチンタグを含むならば、固体担体はビオチン化された捕捉剤を結合するためにアビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされる。
【０７７８】
いくつかの実施形態において、本開示の方法が、多重の配列濃縮のために使われる。本実施形態において、複数の核酸ターゲティング核酸は、細胞へ導入可能であり、各々の核酸ターゲティング核酸は、異なる標的核酸（例えば、ゲノムの配列）を標的とするように操作されている。
【０７７９】
捕捉された複合体は、標的核酸を含まない。
【０７８０】
標的核酸は、部位特異的ポリペプチドを含む複合体に結合しない核酸を含む。標的核酸は、標準的な核酸精製法（例えば、市販のＰＣＲ精製キット、アガロースゲル）によって回収することができる。
【０７８１】
回収した標的核酸は、本明細書に記載されたたように、１つまたはそれ以上のアダプターのライゲーションによって、配列分析（例えば、ディープシーケンス）用に調製される。
【０７８２】
配列決定された標的核酸は、多型性を同定するため、疾患を診断するため、疾患の治療方針を決定するため、および／または、抗体ライブラリーを生成するために分析される。
【０７８３】
〔実施例７〕
配列決定
溶出された標的核酸は、配列解析のために調製される。配列解析のための調製は、溶出された標的核酸の配列ライブラリーの生成を含む。配列解析は、部位特異的ポリペプチドのオフ標的結合部位の同一性および頻度を決定する。
【０７８４】
配列決定は、本質的に平行した方法で多くの（一般的に数千から数十億）核酸配列を決定する方法を用いて実行され、多くの配列は、高スループット連続的方法を用いて平行して好ましく読み出される。このような方法は、パイロシーケンス法（例えば、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．によって商品化されたように）；ライゲーションによる配列決定（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）技術、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．に商品化されたように）；改変ヌクレオチドを用いた合成による配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．によるＴｒｕＳｅｑ（商標）およびＨｉＳｅｑ（商標）技術、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．によるＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）、およびＰａｃｉｆｉｃ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．によるＰａｃＢｉｏ  ＲＳなどに商品化されたように）、イオン検出技術による配列決定（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）；ＤＮＡナノボールの配列決定（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）；ナノ細孔ベースの配列決定技術（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＴＤ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫによって開発されたように）、キャピラリー配列決定（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｙｎａｍｉｃｓによってＭｅｇａＢＡＣＥに商品化されたように）、電子配列決定、単一分子配列決定（例えばＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．によるＳＭＲＴ（商標）技術に商品化されたように）、液滴マイクロ流体配列決定（ｄｒｏｐｌｅｔ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ハイブリダイゼーションによる配列決定（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆによって商品化されたような）、重硫酸塩配列決定およびその他の既知の高度に並行化された配列決定法を含むことができるが、限定されるものではない。
【０７８５】
いくつかの実施形態において、配列決定はマイクロアレイ分析によって実行される。
【０７８６】
〔実施例８〕
抗体ライブラリーの生成
本明細書で開示された方法を使用して、タンパク質ライブラリー（例えば、抗体ライブラリー）を生成する。タンパク質ライブラリーは、発現ライブラリーを調製するために有用であり、それは治療、試薬および／または診断法で使用するためのスクリーニングタンパク質（例えば抗体）のために使用される。タンパク質ライブラリーは、追加の抗体の合成および／またはクローニングのためにも有用である。
【０７８７】
タンパク質ライブラリーは、免疫グロブリンをコードする標的核酸配列とハイブリダイズするために核酸ターゲティング核酸を操作することによって生成される。部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む複合体は、本明細書に記載された方法を用いて精製される。いくつかの実施形態において、核酸ターゲティング核酸とハイブリダイズしている核酸は標的核酸であり、本明細書に記載された方法を用いて溶出され、配列決定される。いくつかの実施形態において、核酸ターゲティング核酸とハイブリダイズしている核酸は、標的核酸ではない。標的核酸は、複数の複合体（例えば、部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む複合体）の切断部位の間で切除される核酸である。切除された標的核酸は、本明細書に記載された方法を用いて精製され、配列決定される。
【０７８８】
〔実施例９〕
遺伝子型決定
本明細書で開示された方法を使用して、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タイピングを実行する。ＨＬＡ遺伝子は、ヒトで最も多型の遺伝子のいくつかである。これらの領域の遺伝子型を理解することは、組織および臓器移植のための優れた適合性を得る上で重要である。
【０７８９】
ＨＬＡタイピングを実行するために、核酸ターゲティング核酸は、ＨＬＡ遺伝子における標的核酸配列とハイブリダイズするように操作されている。部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む複合体は、本明細書に記載された方法を用いて精製される。いくつかの実施形態において、核酸ターゲティング核酸とハイブリダイズしている核酸は標的核酸であり、本明細書に記載された方法を用いて溶出され、配列決定される。いくつかの実施形態において、核酸ターゲティング核酸とハイブリダイズしている核酸は、標的核酸ではない。標的核酸は、複数の複合体（例えば、部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸を含む複合体）の切断部位の間で切除される核酸である。切除された標的核酸は、本明細書に記載された方法を用いて精製され、配列決定される。
【０７９０】
〔実施例１０〕
部位特異的ポリペプチドの免疫沈降反応
本開示は、ヌクレアーゼ免疫沈降反応および配列決定（ＮＩＰ−Ｓｅｑ）方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、ａ）核酸試料を酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチドと接触させ、そこで、酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチドは標的核酸と結合し、それによって複合体を形成すること、ｂ）捕捉剤で複合体を捕捉すること、および、ｃ）標的核酸の配列決定をすることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ｄ）オフ標的結合部位の同一性を決定することをさらに含む。
【０７９１】
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、細胞外で実行される。例えば、試料は精製されたゲノムＤＮＡを含む。
【０７９２】
部位特異的ポリペプチド−標的核酸複合体は、固定されるか、複合体を形成するために架橋される。
【０７９３】
核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）は、親和性精製の前にＤＮＡを断片化するために処理される。断片化は、物理的、機械的、または酵素的方法によって実行することができる。物理的な断片化は、標的ポリヌクレオチドを熱、または、紫外（ＵＶ）光にさらすことを含むことができる。機械的な破壊を使って、標的ポリヌクレオチドを、所望の範囲の断片に機械的に剪断してもよい。機械的剪断は、標的ポリヌクレオチドの反復的なピペット操作、音波処理および噴霧を含む当技術分野で知られているいくつかの方法によって達成してもよい。標的ポリヌクレオチドも、酵素的な方法を用いて断片化されてもよい。場合によっては、酵素消化は制限酵素などの酵素を使って実行されてもよい。制限酵素を使って、
標的ポリヌクレオチドの特異的または非特異的断片化を行ってもよい。方法は、一般に、タイプＩ酵素、タイプＩＩ酵素および／またはタイプＩＩＩ酵素と言われる１つまたはそれ以上の種類の制限酵素を使用してもよい。タイプＩＩおよびタイプＩＩＩ酵素は、通常、市販され、当技術分野で既知である。タイプＩＩおよびタイプＩＩＩ酵素は、二本鎖ポリヌクレオチド配列内の、ヌクレオチドの特異的な配列を認識する（「認識配列」または「認識部位」）。これらの配列を結合および認識すると同時に、タイプＩＩおよびタイプＩＩＩ酵素は、ポリヌクレオチド配列を切断する。場合によっては、切断の結果、一本鎖核酸が一部突出した、「付着末端」と呼ばれるポリヌクレオチド断片になる。その他の場合、切断の結果、突出した断片にならずに「平滑末端」を生じる。方法は、付着末端または平滑末端を生成する制限酵素の使用を含んでもよい。
【０７９４】
断片化されると、部位特異的ポリペプチドを含む複合体は、固体担体とインキュベートすることによって精製される。例えば、部位特異的ポリペプチドがビオチンタグを含むならば、固体担体はビオチンタグと結合するためにアビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされる。
【０７９５】
代替的な実施形態において、断片化されると、部位特異的ポリペプチド、標的核酸および／または核酸ターゲティング核酸を含む複合体は捕捉剤とインキュベートすることによって精製される。捕捉剤は、部位特異的ポリペプチドと融合する親和性タグと結合する。捕捉剤は、抗体を含む。例えば、部位特異的ポリペプチドと融合する親和性タグがＦＬＡＧタグであるならば、捕捉剤は抗−ＦＬＡＧ−タグ抗体になる。
【０７９６】
捕捉剤は、固体担体で精製される。例えば、捕捉剤がビオチンタグを含むならば、ビーズはビオチン化された捕捉剤を結合するためにアビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされる。
【０７９７】
方法のいくつかの実施形態において、２ラウンドまたはそれ以上の精製が実行される。第１ラウンドは捕捉剤の親和性タグと結合可能な固体担体を用いた精製を含み、第２ラウンドは部位特異的ポリペプチドの親和性タグと結合可能な固体担体を用いた精製を含む。第１ラウンドは部位特異的ポリペプチドの親和性タグと結合する固体担体を用いた精製を含み、第２ラウンドは捕捉剤の親和性タグと結合する固体担体を用いた精製を含む。
【０７９８】
いくつかの実施形態において、２回以上方法を実行することによって、方法を使って部位特異的ポリペプチドの結合特異性を最適化する。
【０７９９】
捕捉された複合体は、部位特異的ポリペプチドおよび標的核酸を含む。標的核酸は、高塩濃度洗浄、エタノール沈殿、煮沸、ゲル精製、などを含む標準的な方法によって、部位特異的ポリペプチド複合体から溶出される。
【０８００】
溶出されたＤＮＡは、標準的な方法を用いて、配列解析のために調製される。配列ライブラリーは配列決定され、配列およびヌクレアーゼ結合部位の頻度を同定するために分析される。
【０８０１】
いくつかの実施形態において、方法は何回も実行される。いくつかの実施形態において、方法はデータの収集およびデータの保存をさらに含む。データを収集し、コンピュータサーバに保存することができる。
【０８０２】
〔実施例１１〕
生体内における部位特異的ポリペプチドの免疫沈降反応
いくつかの実施形態において、方法は、ａ）酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチド
を細胞内に導入する工程であって、酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチドは標的核酸と結合し、それによって複合体を形成する工程と、ｂ）捕捉剤で複合体を捕捉する工程と、ｃ）標的核酸の配列決定をする工程とを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ｄ）オフ標的結合部位の同一性を決定する工程をさらに含む。
【０８０３】
いくつかの例では、部位特異的ポリペプチドは、親和性タグを含む。親和性タグを含むポリペプチドは、本明細書に記載された。
【０８０４】
細胞は固定されるか、または架橋される。固定されたおよび／または架橋された細胞は、溶解される。溶解条件は、無傷のタンパク質−ＤＮＡ複合体を維持するために選択される。溶解物は、親和性精製の前にＤＮＡを断片化するために処理される。適切な断片化技術は、本明細書に記載されている。
【０８０５】
断片化されると、部位特異的ポリペプチド、標的核酸および／または核酸ターゲティング核酸を含む複合体は、固体担体とインキュベートすることによって溶解物から精製される。例えば、部位特異的ポリペプチドがビオチンタグを含むならば、固体担体はビオチンタグと結合するためにアビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされる。
【０８０６】
代替的な実施形態において、断片化されると、部位特異的ポリペプチドを含む複合体は捕捉剤とインキュベートすることによって溶解物から精製される。捕捉剤は、部位特異的ポリペプチドに融合する親和性タグと結合する。捕捉剤は、抗体を含む。例えば、部位特異的ポリペプチドに融合する親和性タグがＦＬＡＧタグであるならば、捕捉剤はＦＬＡＧ−タグ抗体になる。
【０８０７】
いくつかの実施形態において、捕捉剤は、親和性タグを含む。捕捉剤は、固体担体で精製される。固体担体は、捕捉剤の親和性タグと結合する。例えば、捕捉剤がビオチンタグを含むならば、ビーズはビオチン化された捕捉剤を結合するためにアビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされる。
【０８０８】
方法のいくつかの実施形態において、２ラウンドの精製が実行される。いくつかの例では、第１ラウンドは捕捉剤の親和性タグと結合する固体担体を用いた精製を含み、第２ラウンドは部位特異的ポリペプチドの親和性タグと結合する固体担体を用いた精製を含む。いくつかの例では、第１ラウンドは部位特異的ポリペプチドの親和性タグと結合する固体担体を用いた精製を含み、第２ラウンドは捕捉剤の親和性タグと結合する固体担体を用いた精製を含む。
【０８０９】
いくつかの実施形態において、２回以上方法を実行することによって、方法を使って部位特異的ポリペプチドの結合特異性を最適化する。
【０８１０】
捕捉された複合体は、部位特異的ポリペプチドおよび標的核酸を含む。標的核酸は、高塩濃度洗浄、エタノール沈殿、煮沸、ゲル精製、などを含む標準的な方法によって、部位特異的ポリペプチド複合体から溶出される。
【０８１１】
溶出されたＤＮＡは、配列解析のために調製される。配列ライブラリーは、溶出された標的核酸から作製される。配列ライブラリーは配列決定され、配列およびヌクレアーゼ結合部位の頻度を同定するために分析される。
【０８１２】
〔実施例１２〕
酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ捕捉剤を用いた免疫沈降反応
ヌクレアーゼのオフ標的結合部位の同一性を決定する方法は、ａ）核酸試料を酵素的に
不活性な部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸と接触させる工程であって、酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸は標的核酸と結合し、それによって複合体を形成する工程と、ｂ）捕捉剤で複合体を捕捉する工程であって、捕捉剤は条件つきで酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチドを含む、工程と、ｃ）標的核酸の配列決定をする工程と、およびｄ）オフ標的結合部位の同一性を決定する工程とを含む。この方法は、無細胞核酸試料、および／または細胞に由来する核酸試料で実行されるように設計されている。
【０８１３】
部位特異的ポリペプチド−標的核酸複合体は、固定されるか、複合体を形成するために架橋される。
【０８１４】
核酸試料が細胞に由来するならば、固定されたおよび／または架橋された複合体は溶解される。溶解条件は、無傷のタンパク質−ＤＮＡ複合体を維持するために選択することができる。溶解物は、親和性精製の前にＤＮＡを断片化するために処理される。核酸試料が無細胞試料に由来するならば、無細胞核酸はＤＮＡを断片化するために処理される。適切な断片化技術は、本明細書に記載されている。
【０８１５】
いくつかの実施形態において、核酸ターゲティング核酸は、親和性タグを含む。親和性タグは、条件つきで酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチドと結合可能な配列を含む。いくつかの例では、親和性タグは、条件つきで酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼと結合可能な配列を含む。いくつかの例では、親和性タグは、条件つきで酵素的に不活性なＣｓｙ４タンパク質と結合可能な配列を含む。条件つきで酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチドは、親和性タグを結合するが、切断しない。親和性タグは、核酸配列５’−ＧＵＵＣＡＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧＣＵＡＡＧＡＡＡ−３’を含む。親和性タグは、標準的な組換え法を用いて核酸に導入される。
【０８１６】
断片化されると、部位特異的ポリペプチド、標的核酸および／または核酸ターゲティング核酸を含む複合体は、条件つきで酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチド（例えば、変種Ｃｓｙ４）とインキュベートすることによって精製される。
【０８１７】
いくつかの実施形態において、条件つきで酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチドは、親和性タグを含む。
【０８１８】
条件つきで酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチドは、固体担体で精製される。固体担体は、条件つきで酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチドの親和性タグと結合する。例えば、条件つきで酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチドがビオチンタグを含むならば、ビーズはビオチン化された捕捉剤を結合するためにアビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされる。
【０８１９】
いくつかの実施形態において、酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチドは、様々な不溶性担体のいずれかの上に固定される。
【０８２０】
方法のいくつかの実施形態において、２ラウンドの精製が実行される。いくつかの例では、第１ラウンドは条件つきで酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチド（例えば、変種Ｃｓｙ４）の親和性タグと結合する固体担体を用いた精製を含み、第２ラウンドは部位特異的ポリペプチドの親和性タグと結合する固体担体を用いた精製を含む。いくつかの例では、第１ラウンドは部位特異的ポリペプチドの親和性タグと結合する固体担体を用いた精製を含み、第２ラウンドは条件つきで酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチド（例えば、変種Ｃｓｙ４）の親和性タグと結合する固体担体を用いた精製を含む。
【０８２１】
いくつかの実施形態において、２回以上方法を実行することによって、方法を使って部位特異的ポリペプチドの結合特異性を最適化する。
【０８２２】
捕捉された複合体は、部位特異的ポリペプチドおよび標的核酸を含む。標的核酸は、高塩濃度洗浄、エタノール沈殿、煮沸、ゲル精製、などを含む標準的な方法によって、部位特異的ポリペプチド複合体から溶出される。
【０８２３】
溶出されたＤＮＡは、配列解析のために調製される。配列ライブラリーは配列決定され、配列およびヌクレアーゼ結合部位の頻度を同定するために分析される。
【０８２４】
〔実施例１３〕
配列決定
溶出された標的核酸は、配列解析のために調製される。配列解析のための調製は、溶出された標的核酸の配列ライブラリーの生成を含む。配列解析は、部位特異的ポリペプチドのオフ標的結合部位の同一性および頻度を決定する。
【０８２５】
配列決定も、本質的に平行した方法で多くの（一般的に数千から数十億）核酸配列を決定する方法を用いて実行され、多くの配列は、高スループット連続的方法を用いて平行して好ましく読み出される。このような方法は、パイロシーケンス法（例えば、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．によって商品化されたように）；ライゲーションによる配列決定（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）技術、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．に商品化されたように）；改変ヌクレオチドを用いた合成による配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．によるＴｒｕＳｅｑ（商標）およびＨｉＳｅｑ（商標）技術  、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．によるＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）、およびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．によるＰａｃＢｉｏ  ＲＳなどに商品化されたように）、イオン検出技術による配列決定（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）；ＤＮＡナノボールの配列決定（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）；ナノ細孔ベースの配列決定技術（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＴＤ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫによって開発されたように）、およびその他の既知の高度に並行化された配列決定法を含むことができるが、限定されるものではない。
【０８２６】
〔実施例１４〕
エフェクタータンパク質による標的核酸の改変
部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸および／またはエフェクタータンパク質を含むベクターは、細胞に導入される。一度細胞内に、ベクターにコードされる要素を含む複合体が形成される。核酸ターゲティング核酸は、Ｃｓｙ４タンパク質結合配列で改変される。エフェクタータンパク質、Ｃｓｙ４は、改変核酸ターゲティング核酸と結合する。Ｃｓｙ４は、標的核酸を改変する非天然配列（例えば、融合）を含む。非天然配列は、標的核酸の転写を改変する配列である。非天然配列は、転写因子である。転写因子は、標的核酸の転写レベルを上昇させる。場合によっては、非天然配列は、メチラーゼである。メチラーゼは、結果として標的核酸のメチル化を増加させる。場合によっては、非天然配列は、デメチラーゼである。デメチラーゼは、結果として標的核酸のメチル化を減少させる。場合によっては、非天然配列は、Ｒａｄ５１動員ペプチド（ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）である。Ｒａｄ５１動員ペプチドは、標的部位で相同組換えのレベルを上昇させる。場合によっては、非天然配列は、ＢＣＲＡ−２動員ペプチドである。ＢＲＣＡ−２動員ペプチドは、標的部位で相同組換えのレベルを上昇させる。
【０８２７】
〔実施例１５〕
遺伝子移動事象のためのバイオセンサーとしての部位特異的ポリペプチドの使用
部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸および／またはエフェクタータンパク質を含むベクターは、細胞に導入される。部位特異的ポリペプチドおよびエフェクタータンパク質は、細胞局在配列（例えば核局在化シグナル）に融合される。一度細胞内に、ベクターにコードされる要素を含む複合体が形成される。いくつかの例では、２つのベクターが、細胞に導入される。ベクターは、分割された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の第１の不活性な部分を含み、第１の核酸ターゲティング核酸と結合する第１のエフェクタータンパク質（Ｃｓｙ４）、および分割されたＧＦＰの第２の不活性な部分を含み、第２の核酸ターゲティング核酸と結合する第２のエフェクタータンパク質（Ｃｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６）をコードする。第１の核酸ターゲティング核酸は、第１のＣｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６タンパク質が結合可能な、第１のＣｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６タンパク質結合配列で改変される。第２の核酸ターゲティング核酸は、第２のＣｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６タンパク質が結合可能な第２のＣｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６タンパク質結合配列で改変される。いくつかの実施形態において、第１のＣｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６タンパク質は第１のＣｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６タンパク質結合配列と相互作用し、第２のＣｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６タンパク質は第２のＣｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６タンパク質結合配列と相互作用する。第１および第２の核酸ターゲティング核酸が、ごく接近した２つの配列と結合するように部位特異的ポリペプチドを導く時、第１のエフェクタータンパク質および第２のエフェクタータンパク質は、分割されたＧＦＰの第１の不活性な部分を分割されたＧＦＰの第２の不活性な部分と接触させて、活性なＧＦＰを生成する。例えば、１つの核酸ターゲティング核酸が、Ｂｃｒ遺伝子領域またはその近くに複合体を導くように、および、例えば、別の核酸ターゲティング核酸が、Ａｂｌ遺伝子領域またはその近くに複合体を導くように、複合体の核酸ターゲティング核酸は設計される。転位事象が起こらなかったならば、Ｂｃｒ遺伝子は２２番染色体上にあり、Ａｂｌ遺伝子は９番染色体上にあり、分割されたＧＦＰシステムの２つの不活性な部分が相互作用することができないように、標的核酸配列は十分に遠く離れているので、シグナルは生成しない。転位事象が起こったならば、遺伝子が共に近くなるように、Ｂｃｒ遺伝子およびＡｂｌ遺伝子は転位する。この例では、分割されたＧＦＰシステムの２つの不活発性な部分が活性なＧＦＰを形成するために一体となるように、標的核酸配列は共に十分に接近している。ＧＦＰシグナルは、蛍光光度計によって検出可能である。シグナルは、遺伝子移動事象に由来する特定の遺伝子型を示す。
【０８２８】
〔実施例１６〕
遺伝子変異のためのバイオセンサーとしての部位特異的ポリペプチドの使用
実施例２に記載されたシステムを使用して、細胞内の特異的な変異の存在を検出することもできる。この実施例では、第１の核酸ターゲティング核酸は、部位特異的ポリヌクレオチドを変異部位の近くに位置する天然の配列に導くために選択される。第２の核酸ターゲティング核酸は、変異配列（例えば、ＤＮＡ配列決定によって同定された変異配列）を認識するために選択される。部位のＰＡＭ配列のすぐ５’側の最初の１２個の核酸内に、変異配列が生じるように、核酸ターゲティング核酸は選択される。この例では、分割されたＧＦＰシステムの２つの不活発性な部分が活性なＧＦＰを形成するために一体となるように、標的核酸配列は共に十分に接近している。ＧＦＰシグナルは、蛍光光度計によって検出可能である。シグナルは、特定の遺伝子型を示す。
【０８２９】
〔実施例１７〕
遺伝子移動事象を含む疾患治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｆｏｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）としての部位特異的ポリペプチドの使用
部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸および／またはエフェクタータンパ
ク質を含むベクター、操作可能なように第１のプロモーターにリンクした細胞溶解誘導性ペプチド（例えばアデノウイルス死タンパク質）を含む核酸もまた、細胞に導入される。一度細胞内に、ベクターにコードされる要素を含む複合体が形成される。いくつかの例では、２つのベクターが、細胞に導入される。ベクターは、第１の核酸ターゲティング核酸と結合し、第１のプロモーターと結合する第１の転写因子の活性化因子ドメインを含む第１のエフェクタータンパク質（第１のＣｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６タンパク質配列を含む）、および第２の核酸ターゲティング核酸と結合し、第１の転写因子のＤＮＡ結合ドメインを含む第２のエフェクタータンパク質（第２のＣｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６タンパク質配列を含む）をコードする。第１の核酸ターゲティング核酸は、第１のＣｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６タンパク質が結合可能な、第１のＣｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６タンパク質結合配列で改変される。第２の核酸ターゲティング核酸は、第２のＣｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６タンパク質が結合可能な第２のＣｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６タンパク質結合配列で改変される。いくつかの実施形態において、第１のＣｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６タンパク質は第１のＣｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６タンパク質結合配列と優先的に相互作用し、第２のＣｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６タンパク質は第２のＣｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６タンパク質結合配列と優先的に相互作用する。罹患細胞が遺伝子移動事象を含むゲノムを含むならば、第１および第２の核酸ターゲティング核酸が、ごく接近した２つの配列と結合するように部位特異的ポリペプチドを導く時、第１のエフェクタータンパク質および第２のエフェクタータンパク質は、活性化因子ドメインおよび第１の転写因子のＤＮＡ結合ドメインを接近させる。第１の転写因子のＤＮＡ結合ドメインは、操作可能なように細胞溶解誘導性ペプチドにリンクした第１のプロモーターと結合可能であり、近位の活性化因子ドメインは、細胞溶解誘導性ペプチドをコードするＲＮＡの転写を誘発する。遺伝子移動事象を含まない非罹患細胞において、ＤＮＡ結合ドメインおよび第１の転写因子の活性化因子ドメインは接近させられず、細胞溶解誘導性ペプチドの転写は行われない。
【０８３０】
例えば、１つの核酸ターゲティング核酸が、Ｂｃｒ遺伝子領域またはその近くに複合体を導くように、および、例えば、別の核酸ターゲティング核酸が、Ａｂｌ遺伝子領域またはその近くに複合体を導くように、複合体の核酸ターゲティング核酸は設計される。非罹患細胞において、転位事象は起こらず、Ｂｃｒ遺伝子は２２番染色体上にあり、Ａｂｌ遺伝子は９番染色体上にあり、転写因子システムの２つの不活性な部分が相互作用することができず、細胞溶解誘導ペプチドの転写が誘導されないように、標的核酸配列は十分に遠く離れている。転位事象が起きた罹患細胞において、遺伝子が共に近くなるように、Ｂｃｒ遺伝子およびＡｂｌ遺伝子は転位する。この例では、転写因子システムの２つの不活性な部分が細胞死誘導ペプチドの転写を誘導するために一体となるように、標的核酸配列は共に十分に接近している。細胞溶解は、遺伝子移動事象に由来する特定の遺伝子型に依存している。
【０８３１】
〔実施例１８〕
遺伝子変異を含む疾患治療としての部位特異的ポリペプチドの使用
実施例４に記載されたシステムを使用して、細胞内の特異的な変異の存在を検出することもできる。この実施例では、第１の核酸ターゲティング核酸は、部位特異的ポリヌクレオチドを変異部位の近くに位置する天然の配列に導くために選択される。第２の核酸ターゲティング核酸は、変異配列（例えば、ＤＮＡ配列決定によって同定された変異配列）を認識するために選択される。部位のＰＡＭ配列のすぐ５’側の最初の１２個の核酸内に、変異配列が生じるように、核酸ターゲティング核酸は選択される。この例では、転写因子の２つの不活性な部分が細胞溶解誘導ペプチドの転写を可能にするために一体となるように、標的核酸配列は共に十分に接近している。
【０８３２】
〔実施例１９〕
遺伝子移動事象または遺伝子変異を含む患部組織を攻撃するための免疫系の動員。
実施例４および／または５に記載されたシステムを使用して、結果として細胞表面上の抗原を表示する分割された転写因子システムによる転写を導くこともできる。いくつかの例では、抗原はＭＨＣクラスＩＩ分子によって示されるペプチドである。いくつかの例では、抗原は、免疫エフェクター細胞を部位に動員する細胞表面タンパク質である。
【０８３３】
〔実施例２０〕
核酸の３次元位置の検出
部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸および／またはエフェクタータンパク質を含むベクターは細胞に導入される。一度細胞内に、ベクターにコードされる要素を含む複合体が形成される。２つのベクターが、細胞に導入される。１つのベクターは、分割された親和性タグシステムの第１の不活性な部分を含むエフェクタータンパク質（Ｃｓｙ４）をコードする。第２のベクターは、分割された親和性タグの第２の不活性な部分を含むエフェクタータンパク質（Ｃｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６）をコードする。複合体の核酸ターゲティング核酸は、Ｃｓｙ４、Ｃａｓ５またはＣａｓ６タンパク質結合配列で改変される。エフェクタータンパク質は、改変核酸ターゲティング核酸と結合する。核酸ターゲティング核酸は、複合体を３次元核酸構造（例えば、クロマチン）中の関心領域へ導くように設計されている。標的配列が空間的に共に近くないならば、分割された親和性タグの２つの不活性な部分は相互作用することができない。標的配列が空間的に共に近いならば、分割された親和性タグの２つの不活性な部分は、親和性タグ全体を形成するために一体とすることができる。
【０８３４】
細胞は溶解され、細胞溶解は親和性タグと結合する抗体と共にインキュベートされる。抗体は精製され、それによって、親和性タグおよび複合体が結合している核酸を精製する。精製された核酸は、高塩濃度洗浄を用いて複合体から解離される。解離され精製された核酸は配列解析用に調製され、配列決定される。配列決定の結果は、３次元空間で共に近いクロマチン領域と一致する。配列決定の結果を用いて、遺伝子発現をさらに理解し、疾患を治療することができる。
【０８３５】
〔実施例２１〕
多重ゲノム工学
核酸ターゲティング核酸およびエンドリボヌクレアーゼ結合配列を含む核酸モジュールを含む多重化遺伝子標的剤を含むベクターは、細胞に導入される。いくつかの実施形態において、細胞は部位特異的ポリペプチドおよびエンドリボヌクレアーゼをすでに含む。いくつかの例では、細胞は、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターおよびエンドリボヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターと接触する。いくつかの例では、細胞は、部位特異的ポリペプチドおよびエンドリボヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターと接触する。いくつかの実施形態において、ベクターは１つまたはそれ以上のエンドリボヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、多重化遺伝子標的剤、部位特異的ポリペプチドおよび１つまたはそれ以上のエンドリボヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む。配列はＲＮＡに転写される。１つまたはそれ以上のエンドリボヌクレアーゼは、多重化遺伝子標的剤の１つまたはそれ以上のエンドリボヌクレアーゼ結合配列へ結合する。１つまたはそれ以上のエンドリボヌクレアーゼは、多重化遺伝子標的剤の１つまたはそれ以上のエンドリボヌクレアーゼ結合配列を切断し、このように、個々の核酸モジュールを解放する。いくつかの実施形態において、核酸モジュールは、エンドリボヌクレアーゼ結合配列の、すべて、いくつかを含むか、または何も含まない。
【０８３６】
解放された核酸モジュールは、部位特異的ポリペプチドと結合し、それによって複合体
を形成する。複合体は、１つまたはそれ以上の標的核酸に標的とされる。１つまたはそれ以上の核酸モジュールは、１つまたはそれ以上の標的核酸とハイブリダイズする。１つまたはそれ以上の部位特異的ポリペプチドは、核酸モジュールによって定義される切断部位で１つまたはそれ以上の標的核酸を切断し、このように、結果として１つまたはそれ以上の改変標的核酸になる。
【０８３７】
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のドナーポリヌクレオチドおよび／または同じものをコードするベクターは、細胞に導入される。１つまたはそれ以上のドナーポリヌクレオチドは１つまたはそれ以上の切断された標的核酸に組み入れられ、それによって結果として１つまたはそれ以上の改変標的核酸（例えば、付加）になる。いくつかの例では、同一のドナーポリヌクレオチドは、複数の切断部位に組み入れられる。いくつかの例では、１つまたはそれ以上のドナーポリヌクレオチドは、複数の切断部位に組み入れられる。いくつかの例では、ドナーポリヌクレオチドおよび／または同じものをコードするベクターは、細胞に導入されない。これらの場合に、改変標的核酸は、欠失を含むことができる。
【０８３８】
〔実施例２２〕
ＲＮＡの細胞への化学量論的送達方法
いくつかの実施形態において、本開示は、核酸の細胞核への化学量論的送達方法を提供する。いくつかの実施形態において、３つの化学量論的に送達可能な核酸が用いられる：Ｃａｓ９をコードするもの、核酸ターゲティング核酸をコードするもの、およびＣｓｙ４をコードするものである。３つの核酸の各々は、Ｃｓｙ４結合部位を含む。
【０８３９】
いくつかの実施形態において、方法はタンデム融合ポリペプチドを提供する。融合ポリペプチドは、３つのＣｓｙ４ポリペプチドを含む。３つのＣｓｙ４ポリペプチドは、リンカーによって分離される。３つのＣｓｙ４ポリペプチドは、３つの核酸分子の各々の上でＣｓｙ４結合部位と結合し、それによって複合体を形成する。
【０８４０】
いくつかの実施形態において、複合体は細胞外で形成され、細胞に導入される。複合体は、３つの化学量論的に送達可能な核酸と融合タンパク質とを混合し、タンデム融合ポリペプチドと３つのＣｓｙ４結合部位との間で結合を可能にする反応を生じさせることによって形成される。複合体は、インジェクション、エレクトロポレーション、トランスフェクション、形質転換、ウイルス導入、などによって導入される。細胞内で、複合体の核酸のいくつかは翻訳される。いくつかの実施形態において、結果として生じる翻訳産物は、Ｃｓｙ４およびＮＬＳ−Ｃａｓ９である（例えば、ＮＬＳを含むＣａｓ９。ＮＬＳは、Ｎ末端である必要はない場合がある）。Ｃｓｙ４は、核酸ターゲティング核酸をコードする核酸上でＣｓｙ４結合部位を切断し、それによって核酸ターゲティング核酸をタンデム融合ポリペプチドから解放する。ＮＬＳ−Ｃａｓ９は解放された核酸ターゲティング核酸を結合し、それによってユニットを形成する。このユニットは、核へ移行する。核内で、ユニットは核酸ターゲティング核酸のスペーサーとハイブリダイズする標的核酸へ導かれる。ユニットのＣａｓ９は、標的核酸を切断する。Ｃａｓ９による標的核酸の切断は、ゲノム工学と呼ばれる。
【０８４１】
いくつかの実施形態において、複合体は細胞内で形成される。３つの化学量論的に送達可能な核酸をコードするベクターは、細胞に導入される。３つの化学量論的に送達可能な核酸の各々のうちの１つをコードする３つの異なるベクターは、細胞に導入される。２つのベクターが細胞に導入され、２つのベクターのうちの１つは２つの化学量論的に送達可能な核酸をコードし、２つのベクターのうちの１つは、１つの化学量論的に送達可能な核酸をコードする。ベクターのどれでも、タンデム融合ポリペプチドをコードすることができる。
【０８４２】
細胞内で、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするベクターの核酸は、ＲＮＡに転写される。３つの核酸およびタンデム融合ポリペプチドを含む複合体が形成され、それによってＣｓｙ４結合タンパク質の各々は、３つの核酸の各々の上のＣｓｙ４結合部位へ結合する。複合体の核酸は、翻訳される。いくつかの実施形態において、結果として生じる翻訳産物は、Ｃｓｙ４とＮＬＳ−Ｃａｓ９である（例えば、ＮＬＳを含むＣａｓ９。ＮＬＳは、Ｎ末端である必要はない場合がある）。Ｃｓｙ４は、核酸ターゲティング核酸をコードする核酸上でＣｓｙ４結合部位を切断し、それによって核酸ターゲティング核酸をタンデム融合ポリペプチドから解放する。ＮＬＳ−Ｃａｓ９は解放された核酸ターゲティング核酸を結合し、それによってユニットを形成する。このユニットは、核へ移行する。核内で、ユニットは核酸ターゲティング核酸のスペーサーとハイブリダイズする標的核酸へ導かれる。ユニットのＣａｓ９は、標的核酸を切断する。
【０８４３】
〔実施例２３〕
複数の核酸ターゲティング核酸の細胞への化学量論的送達方法
いくつかの実施形態において、本開示は、複数の核酸の細胞への化学量論的送達方法を提供し、複数の核酸のいくつかは、核酸ターゲティング核酸である。いくつかの実施形態において、複数の核酸は、４つの核酸を含む：Ｃａｓ９をコードするもの、核酸ターゲティング核酸をコードするものが２つ、およびＣｓｙ４をコードするものである。
【０８４４】
核酸は、２つ以上の核酸結合タンパク質結合部位を含む。いくつかの例では、第１の核酸結合タンパク質結合部位（例えば、より５’部位）は、Ｃｓｙ４結合部位を含む。いくつかの例では、第２の核酸結合タンパク質結合部位（例えば、より３’部位）は、異なる核酸結合タンパク質結合部位（例えば、ＭＳ２結合部位）を含む。いくつかの例では、第２の核酸結合タンパク質結合部位は、化学量論的に送達可能な核酸の各々とは異なる。例えば、第２の核酸結合タンパク質結合部位は、ＣＲＩＳＰＲポリペプチド（例えば、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６）のうちの１つを結合する部位である可能性がある。いくつかの例では、Ｃａｓ９をコードする核酸も、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。
【０８４５】
いくつかの実施形態において、タンデム融合ポリペプチドは、３つの核酸結合タンパク質を含む。３つの核酸結合タンパク質は、Ｃｓｙ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６である。タンデム融合ポリペプチドは、核局在化シグナルを含む。タンデム融合ポリペプチドは、複数の核酸結合タンパク質のコピーを含む（例えば、Ｃｓｙ４を２コピー、Ｃａｓ５を１コピー、Ｃａｓ６を１コピー）。
【０８４６】
いくつかの実施形態において、タンデム融合タンパク質および４つの核酸を含む複合体は、細胞外で形成される。複合体は、４つの核酸とタンデム融合タンパク質とを混合し、タンデム融合ポリペプチドと４つの核酸結合タンパク質結合部位との間で結合を可能にする反応を生じさせることによって形成される。複合体は、細胞に導入される。導入は、形質転換、トランスフェクション、ウイルス導入、マイクロインジェクションもしくはエレクトロポレーション、または、細胞膜を横断して生体分子を導入することができるいかなる技術のいずれかによって生じる。複合体は、細胞内で形成される（例えば、核酸およびタンデム融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターの導入後）。
【０８４７】
細胞内で、Ｃｓｙ４およびＣａｓ９をコードする核酸は翻訳され、結果としてＣｓｙ４およびＮＬＳ−Ｃａｓ９を生じる（例えば、ＮＬＳを含むＣａｓ９。ＮＬＳは、Ｎ末端である必要はない場合がある）。Ｃｓｙ４は、核酸ターゲティング核酸をコードする核酸上でＣｓｙ４結合部位を切断し、それによってそれらをタンデム融合ポリペプチドから解放する。
【０８４８】
ＮＬＳ−Ｃａｓ９は解放された核酸ターゲティング核酸を結合し、それによって複数のユニットを形成する。これらのユニットは、核へ移行する。核内で、ユニットは、ユニットの核酸ターゲティング核酸のスペーサーとハイブリダイズする標的核酸へ導かれる。ユニットのＣａｓ９は、標的核酸を切断する。
【０８４９】
〔実施例２４〕
ＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチドの化学量論的送達方法
本開示は、ゲノム工学で使用可能なＲＮＡ成分の化学量論的送達方法を提供する。方法は、ゲノム工学の部位に挿入可能なドナーポリヌクレオチドの送達を含むこともできる。
【０８５０】
本開示は、複数のＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチドの細胞への化学量論的送達方法を提供する。いくつかの実施形態において、複数のＲＮＡは、３つのＲＮＡおよび１つのＤＮＡを含む。いくつかの例では、３つのＲＮＡは以下の通りである：Ｃａｓ９をコードするもの、Ｃｓｙ４をコードするもの、および核酸ターゲティング核酸をコードするものである。ＤＮＡは、ドナーポリヌクレオチドをコードするＤＮＡである。
【０８５１】
いくつかの例では、ＲＮＡは複数の核酸結合タンパク質結合部位（例えば、２つの核酸結合タンパク質結合部位）を含む。第１の核酸結合タンパク質結合部位（例えば、より５’部位）は、Ｃｓｙ４結合部位を含む。第２の核酸結合タンパク質結合部位（例えば、より３’部位）は、異なる核酸結合タンパク質結合部位を含む。本開示の核酸の各々における第２の核酸結合タンパク質結合部位は異なる。例えば、第２の核酸結合タンパク質結合部位は、ＣＲＩＳＰＲポリペプチド（例えば、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６）および／またはＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ジンクフィンガータンパク質）を結合する。方法の核酸も、核局在化シグナル（例えば、Ｃａｓ９をコードするＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ）をコードする配列を含む。
【０８５２】
いくつかの実施形態において、タンデム融合ポリペプチドは、４つの核酸結合タンパク質（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質およびＤＮＡ結合タンパク質）を含む。いくつかの例では、３つの核酸結合タンパク質はＣｓｙ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６であり、第４の核酸結合タンパク質はＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ジンクフィンガータンパク質）である。いくつかの例では、タンデム融合ポリペプチドは、核局在化シグナルを含む。
【０８５３】
いくつかの実施形態において、タンデム融合タンパク質および核酸（例えば、３つのＲＮＡおよび１つのＤＮＡ）を含む複合体は、細胞外で形成される。複合体は、核酸（例えば、３つのＲＮＡおよび１つのＤＮＡ）とタンデム融合タンパク質とを混合し、タンデム融合ポリペプチドと４つのＲＮＡ結合タンパク質結合部位との間で結合を可能にする反応を生じさせることによって形成される。複合体を、細胞に導入することができる。複合体は、細胞内で形成される（例えば、核酸およびタンデム融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターの導入後）。
【０８５４】
細胞内で、Ｃｓｙ４およびＣａｓ９をコードするＲＮＡは翻訳され、結果としてＣｓｙ４およびＮＬＳ−Ｃａｓ９を生じる（例えば、ＮＬＳを含むＣａｓ９。ここに記載するように、ＮＬＳは、Ｎ末端である必要はない場合がある）。Ｃｓｙ４は、核酸ターゲティング核酸およびＤＮＡをコードするＲＮＡ上でＣｓｙ４結合部位を切断し、それによってそれらをタンデム融合ポリペプチドから解放する。いくつかの例では、解放されたドナーポリヌクレオチドは、その核局在化シグナルによって核へ移行する。
【０８５５】
ＮＬＳ−Ｃａｓ９は解放された核酸ターゲティング核酸を結合し、それによってユニットを形成する。ユニットは、核へ移行する。核内で、ユニットは、ユニットの核酸ターゲティング核酸のスペーサーとハイブリダイズする標的核酸へ導かれる。ユニットのＣａｓ
９は、標的核酸を切断する。ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部は、切断された標的核酸に挿入されることができる。
【０８５６】
〔実施例２５〕
遺伝的に改変した細胞の継ぎ目のない選抜
複数の細胞は、Ｃａｓ９と相同なポリペプチド、核酸ターゲティング核酸およびドナーポリヌクレオチドをコードする配列を含むベクターと接触させられる。場合によっては、Ｃａｓ９と相同なポリペプチド、核酸ターゲティング核酸およびドナーポリヌクレオチドをコードする配列の１つまたはそれ以上は、異なるベクター上に配置される。細胞は、ベクターでトランスフェクションされる。いくつかの例では、細胞はベクターを運ぶウイルスに感染される。いくつかの例では、細胞はＣａｓ９に相同なタンパク質をすでに含み、ベクターはこのポリペプチドをコードしない。いくつかの例では、細胞はＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｃａｓタンパク質、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）をすでに含み、ベクターはドナーポリヌクレオチドをコードするだけである。ドナーポリヌクレオチドは、関心の遺伝要素およびレポーター要素をコードする配列を含む。レポーター要素は、核酸ターゲティング核酸配列、Ｃａｓ９と相同なタンパク質、および蛍光タンパク質を含む。核酸ターゲティング核酸は、Ｃａｓ９を標的核酸（例えば宿主細胞ゲノムの部位）へ導き、結果として標的核酸の二本鎖ＤＮＡに亀裂を入れ、ドナーポリヌクレオチドを挿入する。ドナーポリヌクレオチドの挿入は、レポーターのスクリーニングによって検査される。場合によっては、スクリーニングは蛍光活性化細胞分類を含む。スクリーニングは、複数の選抜方法を含む。Ｃａｓ９および／または核酸ターゲティング核酸は、誘導性プロモーターによって制御される。レポーターシグナルを含む細胞集団を選抜した後に、レポーター要素は、誘導性プロモーターを活性化することによって除去され、このことは核酸ターゲティング核酸およびドナーポリヌクレオチドの部位特異的ポリペプチドを転写する。転写された核酸ターゲティング核酸および転写された部位特異的ポリペプチドは、複合体を形成することができる。ある複合体は、ドナーポリヌクレオチドのレポーター要素の３’末端を標的とすることができる。ある複合体は、ドナーポリヌクレオチドのレポーター要素の５’末端を標的とすることができる。レポーター要素の３’および５’末端は、切断可能である。切断された標的核酸は細胞メカニズムで再結合されることが可能であり、それによって、結果として、ドナーポリヌクレオチドの挿入前と同一の核酸配列をコードするインフレーム核酸配列になる。このように、レポーター要素は継ぎ目なく挿入されて、細胞から除去される。
【０８５７】
〔実施例２６〕
操作された核酸ターゲティング核酸を用いたＣａｓ９の切断方法
試薬
ｔｅｍｐ３標的ＤＮＡ配列を含むｐＣＢ００２プラスミドは、ＤＮＡ  １μｇにつき、ＡｓｃＩ  １Ｕで消化してベクターを線状にした。反応混合物を８０℃で２０分間インキュベートすることによって反応を停止した。次いでＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットを用いて反応物を精製した。
【０８５８】
シングルガイド核酸は、Ｔ７  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（カタログ番号Ｅ２０４０Ｓ）を用いて、３００ヌクレオチドを超えるＲＮＡの場合に製造業者によって推奨される試薬の半分の量を用いて生成した。通常、２０μＬ反応で２００〜３５０ｎｇの間のテンプレートを用い、１６時間インキュベートした。試料をＤＮａｓｅで処理し、Ｔｈｅｒｍｏ  ＧｅｎｅＪｅｔ  ＲＮＡ精製キット（カタログ番号Ｋ０７３２）を用いて精製し、２０μＬに溶出した。典型的な収量は、１．４〜２μｇ／μＬの範囲であった。
【０８５９】
切断検定のセットアップの初めに、すべてのｓｇＲＮＡを３５００ｎＭの濃度に希釈し、８０℃で１５分間、熱ショックを与えた。試料を加熱素子から除去し、室温に平衡化させた。シングルガイド核酸ターゲティング核酸の４μＬアリコートを、アガロースゲル上に流してＲＮＡ完全性を確かめることができる。
【０８６０】
２〜２．５ｍｇ／ｍＬのＣａｓ９のアリコートをフリーザーから取り出し、可及的速やかに解凍し、次いで１倍切断緩衝液で希釈して適切なストック濃度にした。
【０８６１】
切断検定
マスターミックスの水、５倍切断緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴおよび２５％グリセリン、ｐＨ７．４）、および２５０ｎＭまでのＣａｓ９を薄肉のＰＣＲ試験管に等分した。ｓｇＲＮＡを、２５０ｎＭの最終濃度で適切な試験管に添加した。
【０８６２】
反応を３７℃で１０分間インキュベートし、１０ｎＭの線状プラスミドを添加し、反応物（最終的な反応体積は２０μＬ）を３７℃で１時間インキュベートした。反応を６０℃で２０分間加熱することによって反応を停止した。アリコート１０μＬを６倍ＤＮＡローディングダイ２μＬと混合し、ＳＹＢＲ  ｓａｆｅで染色した１．５％アガロースゲル上で、電気泳動によって分析した。約２８００ｂｐおよび約１３００ｂｐ断片が出現することは、Ｃａｓ９が媒介して切断されたことを示した。実験の結果を、図６、１０および１１に示す。図５に示した、設計されたすべての合成ガイドＲＮＡ配列は、ＳＧＲｖ８を除いて、ｓｇＲＮＡ切断を支持し、全ての補完的な領域は逆転した。これらの結果は、ｓｇＲＮＡの異なる領域が操作に従うことが可能であり、まだ機能を保持することを示す。
【０８６３】
操作された核酸ターゲティング核酸は、上述の検定でテストされた。図２２Ａおよび２２Ｂは、ターゲティングおよび切断活性をテストするために用いられるシングルガイド核酸ターゲティング核酸骨格変種における二本鎖変種の初期設定の設計を示す。
【０８６４】
図２３Ａおよび２３Ｂは、二本鎖におけるより小さな改変の二本鎖変種の第２セットを例示する。Ｖ２８は、相補的な領域の３’側に２塩基の挿入を含む；Ｖ２９は、相補的な領域の３’側に３塩基の欠失を含む。
【０８６５】
図２４Ａおよび２４Ｂは、核酸ターゲティング核酸（すなわち、最小限のｔｒａｃｒＲＮＡ配列および３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）のｔｒａｃｒＲＮＡ部分に変異を含むｔｒａｃｒ変種を例示する。Ｖ３８〜Ｖ４１は、マイコプラズマ・モバイル（Ｍ．ｍｏｂｉｌｅ）１６３Ｋ（ｖ３８）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９（Ｖ３９）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）（Ｖ４０）、および髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の相補的領域／二本鎖とｔｒａｃｒ核酸配列の３’末端との間での融合を含む。
【０８６６】
図２５Ａおよび２５Ｂは、核酸ターゲティング核酸へのＣｓｙ４結合を可能にする改変を含む変種を表す。追加のヘアピン配列は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡ１４のＣＲＩＳＰＲ反復に由来する。
【０８６７】
図２６Ａ〜Ｃは、Ｃａｓ９切断に関する核酸ターゲティング核酸変種の活性を示している、試験管内切断検定のデータを示す。変種ＳＧＲｖ８は、標的核酸切断（図２６Ｂレーン９）を支持することができなかった。
【０８６８】
図２７および図２８は、図２３〜２５の中に図示される変種をテストする、Ｃａｓ９切断検定の２回の独立した反復を表す。
【０８６９】
追加の操作された核酸ターゲティング核酸は、表２にリストされたように作製され、同じ検定によってテストされた。検定の結果は図３７に示され、表２の活性欄にリストされる。
【０８７０】
これらの実験結果は、標的核酸切断を達成する場合に膨らみおよびＰドメイン領域が重要であることを示す。変種４２〜４５の機能性は、核酸ターゲティング核酸へのＣｓｙ４結合配列の付加が標的核酸切断を阻害しないことを示す。
【０８７１】
〔実施例２７〕
配列解析システム
図３０は、本開示の方法を実装するために構成されたシステムを示す。システムは、本明細書に記載される方法を実装するためにプログラムされたコンピュータサーバ（「サーバ」）を含むことができる。図３０は、利用者が、例えば、ヌクレアーゼを標的とした濃縮核酸、配列決定された標的核酸、本開示の方法に関するデータ、疾患の診断、患者の遺伝子型、患者に特異的な治療の決定、またはその任意の組合せの配列決定の結果を検出し、分析し、伝達することができるように適用されたシステム３０００を表す。システム３０００は、本明細書に記載される典型的な方法を実装するようにプログラムされた中央コンピュータサーバ３００１を含む。サーバ３００１は、シングルコアプロセッサ、マルチコアプロセッサ、または並列処理のための複数個のプロセッサであり得る中央処理装置（ＣＰＵ、また、「プロセッサ」）３００５を含む。サーバ３００１も、メモリ３０１０（例えばランダムアクセスメモリ、読出し専用メモリ、フラッシュメモリ）；電子記憶装置３０１５（例えばハードディスク）；１つまたはそれ以上の他のシステムと通信するための通信用インターフェース３０２０（例えばネットワークアダプタ）；および、キャッシュ、他のメモリ、データ記憶および／または電子表示アダプターを含んでもよい周辺デバイス３０２５を含む。メモリ３０１０、記憶装置３０１５、インターフェース３０２０および周辺デバイス３０２５は、マザーボードのような通信バス（実線）で、プロセッサ３００５と通信する。記憶装置３０１５は、データを保存するためのデータ記憶装置であり得る。サーバ３００１は、通信用インターフェース３０２０を用いてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）３０３０に作動可能に接続される。ネットワーク３０３０は、インターネット、イントラネットおよび／またはエクストラネット、イントラネットおよび／またはインターネット、テレコミュニケーションまたはデータネットワークと通信するエクストラネットであり得る。ネットワーク３０３０は、場合によっては、サーバ３００１を用いて、ピアツーピアネットワークを実装することができ、それはサーバ３００１に接続したデバイスがクライアントまたはサーバとして動くのを可能にしてもよい。顕微鏡およびマイクロマニピュレーターは、周辺デバイス３０２５または遠隔コンピュータシステム３０４０であり得る。
【０８７２】
記憶装置３０１５は、例えば配列決定の結果、標的結合部位、個人的な遺伝子のデータ、遺伝子型、イメージ、イメージおよび／または配列決定の結果のデータ解析、または、本開示と関連したデータの任意の態様のファイルを保存することができる。
【０８７３】
サーバは、ネットワーク３０３０によって１つまたはそれ以上の遠隔コンピュータシステムと通信することができる。１つまたはそれ以上の遠隔コンピュータシステムは、例えば、パーソナルコンピュータ、ラップトップ、タブレット、電話、スマートフォン、または個人情報機器であってもよい。
【０８７４】
いくつかの状況では、システム３０００はシングルサーバ３００１を含む。他の状況では、システムは、イントラネット、エクストラネットおよび／またはインターネットで互いに通信する複数のサーバを含む。
【０８７５】
サーバ３００１は、配列決定の結果、標的結合部位、個人的な遺伝子のデータ、および／または潜在的関連のその他の情報を保存するために適用されることができる。そのような情報を、記憶装置３０１５またはサーバ３００１に保存することができ、そのようなデータを、ネットワークを通じて送信することができる。
【０８７６】
本明細書に記載された方法は、例えばメモリ３０１０または電子記憶装置３０１５上などのサーバ３００１の電子記憶場所に保存される機械（またはコンピュータプロセッサ）実行コード（またはソフトウェア）として実装可能である。使用中に、コードはプロセッサ３００５によって実行されることができる。場合によっては、コードは記憶装置３０１５から検索されることができ、プロセッサ３００５による手早いアクセスのためにメモリ３０１０に保存されることができる。いくつかの状況では、電子記憶装置３０１５を除外することができ、機械実行可能命令がメモリ３０１０に保存される。あるいは、コードを第２のコンピュータシステム３０４０上で実行することができる。
【０８７７】
本明細書により提供されるシステムおよび方法の態様、例えばサーバ３００１は、プログラミングに具体化されることができる。技術のさまざまな態様は、一般的に、機械（またはプロセッサ）実行コードおよび／または一種の機械可読媒体で送られる、または具体化される関連データの形の「生成物」または「製品」とみなしてもよい。機械実行可能コードを、電子記憶装置、同様のメモリ（例えば、読出し専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクに保存することができる。「記憶」タイプ媒体は、コンピュータ、プロセッサなどの具体的なメモリのいずれかもしくはすべて、または、さまざまな半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどの、その関連モジュールを含むことができ、いつでも一時的ではない保存をソフトウェアプログラミングに提供してもよい。ソフトウェアのすべてまたは部分は、インターネットまたはさまざまな他のテレコミュニケーションネットワークを通して時々やりとりされてもよい。そのような通信は、例えば、１台のコンピュータまたはプロセッサから他へ、例えば、管理サーバまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットホームへ、ソフトウェアの装填を可能にするかもしれない。したがって、ソフトウェアエレメントを担ってもよい別のタイプの媒体は、例えばローカルデバイス間の物理的インターフェースを横断して、有線で光学的な地上通信線ネットワークを介して、さまざまなエアーリンク（ａｉｒ−ｌｉｎｋｓ）で使用される光学的、電気的、電磁気的な波を含む。そのような波を運ぶ物理的要素、例えば有線または無線リンク、光リンクなども、ソフトウェアを載せる媒体と考えてもよい。本明細書で用いられるように、非一時的な、具体的な「記憶」媒体に制限されない限り、コンピュータまたは機械「読み込み可能な媒体」などの用語は、実行のために命令をプロセッサに提供することに関与するいかなる媒体をも指す。
【０８７８】
したがって、コンピュータ実行可能コードのような、機械可読媒体は、具体的な記憶媒体、搬送波媒体または物理的伝送媒体を含むが、これに限定されない多くの形式をとってもよい。不揮発性記憶媒体は、例えば、いかなるコンピュータのいかなる記憶デバイスなどの、光学または磁気ディスクを含むことができ、上述のものはシステムを実装するのに用いられてもよい。具体的な伝送媒体は、以下を含むことができる：同軸ケーブル、銅線、および光ファイバ（コンピュータシステム内のバスを構成するワイヤを含む）。搬送波伝送媒体は、電気的もしくは電磁気的シグナルまたは、無線周波数（ＲＦ）および赤外線の（ＩＲ）データ通信の間に発生するような音波もしくは光波の形式をとってもよい。コンピュータで読取り可能な媒体の一般的な形式は、したがって、例えば、以下を含む：フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、その他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、その他の光学的媒体、パンチカード、紙テープ、穴のパターンによるその他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、Ｐ
ＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、その他のメモリチップまたはカートリッジ、搬送波輸送データまたは命令、ケーブル、または前述の搬送波を輸送しているリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／またはデータを読み込む可能性のあるその他の媒体。コンピュータで読取り可能な媒体のこれらの形式の多くは、実行のために１つまたはそれ以上の命令の１つまたはそれ以上の配列をプロセッサへ運ぶことに関係している可能性がある。
【０８７９】
〔実施例２８〕
部位特異的ポリペプチドを用いた配列に基づく配列決定
核酸試料は、シングルガイドＲＮＡおよび検出可能なラベルを含む核酸タグと結合する。同時に、核酸タグが結合した核酸試料は、タグ付き測定用試料と呼ばれる。タグ付き測定用試料は、固定化オリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイに接触される。固定化オリゴヌクレオチドは、二本鎖核酸ライブラリーである。オリゴヌクレオチドは、検出可能なラベル（例えば、蛍光ラベル）を含む。タグ付き測定用試料の個々の部材は、それらがハイブリダイゼーションを容易にするのに十分な相補性を共有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの量は、試料ライブラリーおよび固定化オリゴヌクレオチドから２つの検出可能なラベルの強度を比較することによって定量化されることができる。例えば、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、２つの検出可能なラベル（試料ライブラリーおよびオリゴヌクレオチドから）を示すことができる。ハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドは、１つの検出可能なラベル（オリゴヌクレオチドから）を示すことができる。ハイブリダイズしたプローブは、Ｃａｓ９と接触する。Ｃａｓ９は、タグ付き測定用試料の部材とハイブリダイズしたマイクロアレイで、オリゴヌクレオチドを切断する。部位特異的ポリペプチドによる切断は、タグ付き測定用試料のハイブリダイズされた部材が除去されることを可能にする。部位特異的ポリペプチドによる切断の後、ハイブリダイズしないオリゴヌクレオチド検出可能なラベルのみが、マイクロアレイ上に残る。残された検出可能なラベルを定量化する。残された検出可能なラベルの定量化は、どの配列が核酸試料において示されたか、およびどれがそうではなかったか（例えば、位置マッピングによって）に相関している。残された検出可能なラベルを示さないオリゴヌクレオチドは、核酸試料において示された配列と一致する。残りの検出可能なラベルを示すオリゴヌクレオチドは、核酸試料において示されなかった配列と一致する。
【０８８０】
〔実施例２９〕
タグ付き核酸ターゲティング核酸を用いた標的核酸の切断
本実施例は、核酸ターゲティング核酸の５’末端の上でＣｓｙ４結合配列を含む核酸ターゲティング核酸で、標的核酸を切断した結果を記載する。直鎖状二本鎖ＤＮＡ配列の単一部位を標的とするガイドＲＮＡの有りまたは無しで、Ｃａｓ９をインキュベートした。１時間後に、切断産物をアガロースゲル上で分離し、視覚化した。図１３Ｄは、タグ付き核酸ターゲティング核酸を介したＣａｓ９切断（レーン３）が、タグなし核酸ターゲティング核酸を介したＣａｓ９切断（レーン１）より効率的でなかったことを示す。１時間後、標的の約１００％は、タグなし核酸ターゲティング核酸に導かれたＣａｓ９によって切断され、ごくわずかな標的だけが、タグ付き核酸ターゲティング核酸に導かれたＣａｓ９によって同時に切断された。これらの実験は、非天然配列の位置を使ってＣａｓ９：核酸ターゲティング核酸複合体の切断の切断効率を調整できることを示す。例えば、図２７および図２９は、活性を保持する核酸ターゲティング核酸内のさまざまな位置へのＣｓｙ４結合配列の付加の機能性を表す。
【０８８１】
〔実施例３０〕
血液疾患におけるゲノム工学遺伝子
図ＸＸ中に記載されたスペーサー配列を含む核酸ターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドと共に細胞に導入され、それによって複合体が形成される。複合体は、核酸タ
ーゲティング核酸のスペーサー配列に相当する相補性を持つ血液疾患に関する遺伝子を標的とする。核酸ターゲティング核酸が標的核酸とハイブリダイズされると、部位特異的ポリペプチドは標的核酸を切断する。切断された標的核酸は、ドナーポリヌクレオチドと共に操作されることができる。
【０８８２】
〔実施例３１〕
標的核酸切断および改変を定量するためのプロトコール
本プロトコールを用いて、標的核酸が切断されたかどうか、または、標的核酸が、例えば挿入または欠失で改変されたかどうか定量することができる。２５μＬ反応、ｇＤＮＡからの５００〜６００ｎｔ生成物において、標的部位を囲むプライマーが、ＰＣＲ増幅に使われる。プライマーは、切断部位の両側に少なくとも１００ｎｔを含む。切断検定から結果として生じる生成物は、約１００ｎｔを超える。
【０８８３】
増幅が純粋かどうか確認するために、約５μＬのＰＣＲ産物、をアガロースゲル上で泳動する。残りのＰＣＲ産物についての、融解およびアニーリングのプロトコールは、以下の通りである：
・９５℃  １０分
・９５℃〜８５℃  （−２．０℃／秒）
・８５℃  １分
・８５℃〜７５℃  （−０．３℃／秒）
・７５℃  １分
・７５℃〜６５℃  （−０．３℃／秒）
・６５℃  １分
・６５℃〜５５℃  （−０．３℃／秒）
・５５℃  １分
・５５℃〜４５℃  （−０．３℃／秒）
・４５℃  １分
・４５℃〜３５℃  （−０．３℃／秒）
・３５℃  １分
・３５℃〜２５℃  （−０．３℃／秒）
・２５℃  １分
・４℃  保持
【０８８４】
Ｔ７Ｅ１マスターミックスの水、ＮＥＢ２緩衝液、およびＴ７Ｅ１酵素を調製する。各反応を乗じて、余分を追加する。表８は、Ｔ７Ｅ１マスターミックスの構成要素を示す。
【０８８５】
【表１９】
2018075026.tif 000020
【０８８６】
２００μＬストリップキャップ試験管中の、各々の反応に、次の試薬を添加する：Ｔ７Ｅ１マスターミックス（１０μＬ）およびＰＣＲ試料（１０μＬ）。反応を、３７℃で２５分間インキュベートする。
【０８８７】
ローディングバッファーを試料に加え、すべての試料を３％のゲル上で１２０Ｖ、２０分間泳動する。より分離が必要ならば、ゲルをもっと長く泳動してもよい。画像化して、ゲル画像を保存する。
【０８８８】
標的核酸の切断量を定量するために、画像を定量化する。
【０８８９】
〔実施例３１〕
核酸ターゲティング核酸変種の細胞検定
本実施例は、実施例２６で定量した試験管内の機能性が、生体内の機能性と適合するかどうか確認するために、図２２、２４および２５、ならびに実施例２６に示される核酸ターゲティング核酸変種が、細胞に基づく検定でテストされたことを示す。ＨＥＫ２９３細胞を、１０ｃｍのシャーレで６０〜７０％の集密まで生育させた。細胞をトリプシン処理によって切り離し、血球計数器を用いて計数し、次いでトランスフェクションするために、各ウエルに７×１０４細胞のアリコートに分けた。各ウエルについて、哺乳動物のコドンを最適化したＣａｓ９を発現しているｐＣＢ０４５プラスミド２５０ｎｇを、最終体積が５０μＬのＤＭＥＭ中にガイドＲＮＡ  ３０ｎｇおよびｃｏｐＧＦＰ  ＤＮＡ  ４０ｎｇおよびリポフェクタミン２０００  ０．５μＬと混合した。ＤＮＡおよび脂質は、トランスフェクションの前に１５分間インキュベートした。トランスフェクションはプレーティング時に、脂質を加えることによって行った：７×１０４細胞を含む４５０μＬ  ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清へＤＮＡを混合。トランスフェクション／細胞混合物を、ラットテールコラーゲンＩでコートされた９６穴組織培養プレートに添加した。細胞は、３７℃で、５％ＣＯ２を含むインキュベーターで４０時間インキュベートした。
【０８９０】
各ウエルから培地を除去し、製造業者の使用説明書に従ってＱｕｉｃｋｅｘｔｒａｃｔ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて細胞を溶解した。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶解から集められたＤＮＡを、１：１０に希釈し、実施例３０に記載したようにＴ７Ｅ１検定のためのＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。
【０８９１】
図３６は、ｖ８およびｖ９以外の全変種が標的核酸を切断することができたことを示す。図２３Ｂに示されるように、核酸ターゲティング核酸変種ｖ８は試験管内の検定においてもかなり不活性であった。核酸ターゲティング核酸変種ｖ９は、図２３Ｂに示される試験管内の検定で、非常にわずかに活性であった。
【０８９２】
〔実施例３２〕
タグ付き細胞を用いた細胞運命の決定
本実施例は、細胞系統から発達している細胞を追う方法を記載する。造血幹細胞（例えば、血球芽細胞）は、部位特異的ポリペプチド、核酸ターゲティング核酸およびドナーポリヌクレオチドと接触する。部位特異的ポリペプチドおよび核酸ターゲティング核酸は、複合体を形成し、切断のために造血ゲノムの領域を標的とする。一度切断されたならば、ドナーポリヌクレオチドは造血細胞のゲノム中の切断部位に挿入される。造血幹細胞は、通常の分化プロセスによって分化するよう誘導される。分化の異なるステージで、分化した造血細胞を含む試料は、ドナーポリヌクレオチドが存在するために分析可能である。このように、細胞の分化過程を追跡することができる。
【０８９３】
〔実施例３３〕
核酸ターゲティング核酸をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを線状化ベクターへクローニングする
本実施例は、核酸ターゲティング核酸（例えば、スペーサー）の一部をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを生成し、それを線状化ベクターに挿入する方法を記載する。線状
化ベクターまたは閉鎖スーパーコイルベクターは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）をコードする配列、部位特異的ポリペプチド（例えば、ＣＭＶプロモーター）をコードする配列の発現を駆動するプロモーター、リンカー（例えば、２Ａ）をコードする配列、マーカー（例えば、ＣＤ４またはＯＦＰ）をコードする配列、核酸ターゲティング核酸の一部をコードする配列、核酸ターゲティング核酸の一部をコードする配列の発現を駆動するプロモーターおよび選択可能なマーカー（例えば、アンピシリン）をコードする配列、またはその任意の組合せを含む。
【０８９４】
等量の２つの一本鎖オリゴヌクレオチドは、一緒にアニールされる（例えば、５０マイクロモル）。２つの一本鎖オリゴヌクレオチドは、一緒にハイブリダイズすることができる。２つの一本鎖オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、標的核酸（例えば、標的のプロトスペーサー隣接モチーフに隣接した１０〜３０のヌクレオチド領域）と相補的である。２つの一本鎖ヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、配列５’−ＧＴＴＴ−３’を含む３’突出配列を含む。２つの一本鎖オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、配列５’−ＣＧＧＴＧ−３’を含む３’突出配列を含む。いくつかの例では、２つの一本鎖オリゴヌクレオチドのうちの１つは、５’−ＧＴＴＴ−３’突出を含み、２つの一本鎖オリゴヌクレオチドのもう一方は５’−ＣＧＧＴＧ−３’を含む。アニーリングは、少なくとも１０ｍＭ  ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０および１００ｍＭ  ＮａＣｌを含むアニーリング緩衝液中で行う。アニーリングは、オリゴヌクレオチド混合物を９５℃で３〜５分間加熱し、オリゴヌクレオチド混合物を熱源から取り除き、混合物を５〜１０分間室温まで冷却させることによって行う。二本鎖オリゴヌクレオチド混合物は、穏やかに遠心分離する。アニーリングの後、混合物を４℃または−２０℃で保存してもよい。混合物、今では二本鎖オリゴヌクレオチドを、５００ナノモルおよび５ナノモルの２つの原液を調製するために希釈する。原液は、オリゴヌクレオチド混合物を水で希釈することによって調製する。
【０８９５】
二本鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓオリゴヌクレオチド）を、線状化ベクターに結合する。線状化ベクターは、部位特異的ポリペプチドをコードする配列（例えば、Ｃａｓ９）、マーカータンパク質（例えば、オレンジ蛍光タンパク質）、および／または核酸ターゲティング核酸をコードする配列を含み、生成する付着末端がｄｓオリゴヌクレオチドの突出端に適合するように、線状化ベクターは核酸ターゲティング核酸をコードする配列の領域で線状化される。ライゲーション反応は、１倍ライゲーション緩衝液（例えば、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ、および／または５％ＰＥＧ８０００）、３０ナノグラムの線状化ベクター、５ｎＭ  ｄｓオリゴヌクレオチド、およびＤＮＡリガーゼ（例えば、４マイクロリットルの５倍ライゲーション緩衝液、１５ナノグラム／マイクロリットルの線状化ベクターを２マイクロリットル、５ナノモルのｄｓオリゴヌクレオチドを２マイクロリットル、１１マイクロリットルの水、１マイクロリットルのＴ４ＤＮＡリガーゼ）を含むことができる。反応を混合する。反応は、１０分〜２時間、室温でインキュベートする。反応を氷上に置き、コンピテント細胞に変換させる。
【０８９６】
コンピテント細胞への形質転換は、化学的にコンピテントなＴＯＰ１０  大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞へのトランスフォーミングを含む。コンピテント細胞を、氷上で解凍する。反応混合物の３マイクロリットルを、コンピテント細胞に添加し、穏やかに混合する。細胞を１０〜３０分間、氷上でインキュベートする。細胞に４２℃で３０秒間、熱ショックを与える。細胞を２分間、氷へ移す。２５０マイクロリットルの培地（ＳＯＣまたはＬＢ）を、細胞に添加する。細胞を２００ｒｐｍで１時間、３７℃で振盪する。細胞を、次いで１００マイクログラム／ミリリットルのアンピシリンを含む寒天平板に広げ、３７℃で一晩保存する。
【０８９７】
形質転換体を分析する。例えば、形質転換体は、ベクターに結合されたｄｓオリゴヌクレオチドの同一性を判定し、および／またはライゲーションが偽陽性でないことを確認するために分析される。形質転換体を分析するために、コロニーをつまみ、３７℃で１００マイクログラム／ミリリットルのアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養する。部位特異的ポリペプチドおよびｄｓオリゴヌクレオチドを含むプラスミドを単離する（例えば、ミニプレップキットによって）。配列決定反応は、単離したプラスミドで実行する。配列決定反応は、ｄｓオリゴヌクレオチドを配列決定するように設計されている配列決定プライマーを利用する（例えば、配列決定プライマーは、ｄｓオリゴヌクレオチドをコードする配列のすぐ上流にあるＵ６プロモーターと結合するＵ６配列決定プライマーである）。
【０８９８】
一度所望のｄｓオリゴヌクレオチドの挿入が確認されたならば、プラスミドを−２０℃、または、−８０℃のグリセリンストックで保存することができる。グリセリンストックを作製するために、所望のプラスミドを含む元のコロニーを、１００マイクログラム／ミリリットルのアンピシリンを含む寒天平板上にストリークし、３７℃で一晩インキュベートする。シングルコロニーを単離し、１００マイクログラム／ミリリットルのアンピシリンを含むＬＢで、培養が定常期になるまで生育させる。培養物をグリセリンと混合し、液体窒素で急速冷凍する（例えば、０．８５ｍＬの培養物を、０．１５ｍＬのグリセリンと混合する）。
【０８９９】
所望のｄｓオリゴヌクレオチドを含む精製されたプラスミドを、トランスフェクションによって細胞系統（例えば、哺乳動物の細胞系統、ＨｅＬａ）に挿入する。プラスミドをトランスフェクションさせるために、プラスミドを、例えば、マキシプレップキットを用いて高濃度に精製する。プラスミドを、脂質ベースの緩衝液（例えば、リポフェクタミン２０００）で７０％の集密度で塗布した細胞にトランスフェクションする。３マイクログラムのベクターを細胞にトランスフェクションする。
【０９００】
〔実施例３４〕
操作された核酸ターゲティング核酸のナノ粒子送達
操作された核酸ターゲティング核酸および部位特異的ポリペプチドをコードする核酸をカプセルに入れたナノ粒子を調製する。ナノ粒子を、９０％エタノール１０ｍＬ中に、ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ：Ｃ１６ｍＰＥＧ−セラミドを１８：６０：２０：１：１のモル比で混合することによって調製する（総脂質３０μｍｏｌｅ）。核酸を、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４〜７．６）１０ｍＬに溶解する。３７℃まで加熱後、２つの溶液を複式シリンジポンプを通して混合し、その後、混合溶液を２０ｍＭトリス緩衝液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４〜７．６）２０ｍＬで希釈する。混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液（１３８ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ  ７．４）で透析する。透析によって混合物からエタノールを除去した後、安定粒子が得られる。ナノ粒子液剤を、３，０００ｒｐｍ、４℃の温度で遠心分離することによって濃縮する。濃縮懸濁液を所与の時間以後に回収し、０．２２μｍシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）でろ過することによって滅菌する。操作された核酸ターゲティング核酸および部位特異的ポリペプチドをコードする核酸を含むナノ粒子の均一な懸濁液が得られる。
【０９０１】
ナノ粒子を細胞に接触させる。ナノ粒子が細胞に入る。細胞内で、ナノ粒子は操作された核酸ターゲティング核酸および部位特異的ポリペプチドをコードする核酸を解放する。核酸は転写および／または翻訳されて部位特異的ポリペプチドタンパク質と結合する操作された核酸ターゲティング核酸を生産し、それによって複合体が形成される。複合体は、操作された核酸ターゲティング核酸とハイブリダイズする標的核酸を標的とする。複合体は標的核酸を切断する。
【０９０２】
いくつかの例では、ナノ粒子はドナーポリヌクレオチドをコードする核酸をさらに含む。標的核酸が部位特異的ポリペプチドによって切断される時、ドナーポリヌクレオチドは切断された標的核酸の部位に挿入される。
【図１Ａ】
2018075026.tif 000021
【図１Ｂ】
2018075026.tif 000022
【図２】
2018075026.tif 000023
【図３】
2018075026.tif 000024
【図４】
2018075026.tif 000025
【図５】
2018075026.tif 000026
【図６】
2018075026.tif 000027
【図７】
2018075026.tif 000028
【図８】
2018075026.tif 000029
【図９】
2018075026.tif 000030
【図１０】
2018075026.tif 000031
【図１１】
2018075026.tif 000032
【図１２】
2018075026.tif 000033
【図１３】
2018075026.tif 000034
【図１４】
2018075026.tif 000035
【図１５】
2018075026.tif 000036
【図１６】
2018075026.tif 000037
【図１７】
2018075026.tif 000038
【図１８】
2018075026.tif 000039
【図１９】
2018075026.tif 000040
【図２０】
2018075026.tif 000041
【図２１】
2018075026.tif 000042
【図２２Ａ−１】
2018075026.tif 000043
【図２２Ａ−２】
2018075026.tif 000044
【図２２Ｂ−１】
2018075026.tif 000045
【図２２Ｂ−２】
2018075026.tif 000046
【図２３Ａ】
2018075026.tif 000047
【図２３Ｂ】
2018075026.tif 000048
【図２３Ｃ】
2018075026.tif 000049
【図２４−１】
2018075026.tif 000050
【図２４−２】
2018075026.tif 000051
【図２５】
2018075026.tif 000052
【図２５Ｂ】
2018075026.tif 000053
【図２６Ａ−１】
2018075026.tif 000054
【図２６Ａ−２】
2018075026.tif 000055
【図２６Ｂ−１】
2018075026.tif 000056
【図２６Ｂ−２】
2018075026.tif 000057
【図２７Ａ】
2018075026.tif 000058
【図２７Ｂ】
2018075026.tif 000059
【図２８】
2018075026.tif 000060
【図２９】
2018075026.tif 000061
【図３０】
2018075026.tif 000062
【図３１】
2018075026.tif 000063
【図３２】
2018075026.tif 000064
【図３３】
2018075026.tif 000065
【図３４】
2018075026.tif 000066
【図３５−１】
2018075026.tif 000067
【図３５−２】
2018075026.tif 000068
【図３５−３】
2018075026.tif 000069
【図３５−４】
2018075026.tif 000070
【図３５−５】
2018075026.tif 000071
【図３５−６】
2018075026.tif 000072
【図３５−７】
2018075026.tif 000073
【図３５−８】
2018075026.tif 000074
【図３６】
2018075026.tif 000075
【図３７Ａ】
2018075026.tif 000076
【図３７Ｂ】
2018075026.tif 000077
【図３７Ｃ】
2018075026.tif 000078
【図３７Ｄ】
2018075026.tif 000079
【図３８】
2018075026.tif 000080
【図３９】
2018075026.tif 000081
【図４０】
2018075026.tif 000082
【図４１Ａ】
2018075026.tif 000083
【図４１Ｂ】
2018075026.tif 000084
【図４１Ｃ】
2018075026.tif 000085
【図４１Ｄ】
2018075026.tif 000086
【図４１Ｅ】
2018075026.tif 000087
【図４１Ｆ】
2018075026.tif 000088
【図４１Ｇ】
2018075026.tif 000089
【図４１Ｈ】
2018075026.tif 000090
【図４１Ｉ】
2018075026.tif 000091
【図４１Ｊ】
2018075026.tif 000092
【図４２Ａ】
2018075026.tif 000093
【図４２Ｂ】
2018075026.tif 000094
【図４２Ｃ】
2018075026.tif 000095
【配列表】
2018075026000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年1月9日(2018.1.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９タンパク質と複合体を形成することができる、操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸であって、
・標的核酸配列とハイブリダイズすることができる配列を含むスペーサー配列；
・以下を含む二重鎖、
最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列と最小ｔｒａｃｒ配列の間のハイブリダイズ領域、ここで当該ハイブリダイズ領域は第一の二重鎖を形成し、前記スペーサー配列が当該第一の二重鎖の５’である、及び、
その後に第一のステムが続いていないバルジ領域、ここで当該バルジ領域は不対のヌクレオチドの領域を含む；
・前記二重鎖の末端を接続し、ヘアピン構造を形成する、シングルガイドコネクター配列；及び
・３’のｔｒａｃｒ配列、
を含む、操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸。
【請求項２】
前記最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列と最小ｔｒａｃｒ配列の間のハイブリダイズ領域が２つ以下のミスマッチしか含まない、請求項１に記載の操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸。
【請求項３】
前記最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列が６〜１５ヌクレオチドの長さを有する、請求項１または２に記載の操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸。
【請求項４】
前記最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列が１２ヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸。
【請求項５】
前記最小ｔｒａｃｒ配列が１４ヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸。
【請求項６】
前記バルジ領域が当該バルジ領域の最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列側に不対のプリンを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核
酸。
【請求項７】
前記バルジ領域が、前記二重鎖の片側に、不対の５’−ＸＸＸＹ−３’を含み、ここでＸは任意のプリンであり、かつＹは反対の鎖の上のヌクレオチドと不安定な対を形成し得るヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸。
【請求項８】
前記バルジ配列が１つの不対のヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸。
【請求項９】
前記バルジ配列が４つの不対のヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸。
【請求項１０】
前記シングルガイドコネクター配列が４〜４０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸。
【請求項１１】
前記シングルガイドコネクター配列が３〜約１０のヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸。
【請求項１２】
ＤＮＡを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸。
【請求項１３】
ＲＮＡを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを更に含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
・請求項１〜１３のいずれか一項に記載の操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸；及び、
・Ｃａｓ９タンパク質、
を含む、組成物。
【請求項１７】
前記操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸と前記Ｃａｓ９タンパク質が複合体を形成する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記Ｃａｓ９タンパク質がStreptococcus pyogenesのＣａｓ９タンパク質である、請求項１６または１７に記載の組成物。
【請求項１９】
・標的核酸を含む核酸を請求項１７に記載の組成物と接触させ、これにより、前記複合体の当該標的核酸への結合を容易にし、当該標的核酸の切断を生じさせる、
ことを含む、標的核酸を切断する方法。
【請求項２０】
・標的核酸を含む核酸を請求項１７に記載の組成物と接触させ、これにより、前記複合体の当該標的核酸への結合を容易にする、
ことを含む、標的核酸を結合する方法。
【請求項２１】
・請求項１〜１３のいずれか一項に記載の操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸、または、当該操作されたシングルガイド核酸ターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド；及び、
・バッファー、
を含む、キット。
【請求項２２】
Ｃａｓ９タンパク質、または、当該Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを更に含む、請求項２１に記載のキット。