(57)【要約】【課題】生体サンプルがラボ・オン・ア・チップの上に適用された際に、時間の経過に伴うインピーダンスの変化を定量化することにより病原体、感染症、および生理的条件を検出する方法を開示する。【解決手段】当該ラボ・オン・ア・チップは、予め定められた大きさおよび周波数の電気信号がラボ・オン・ア・チップの電極アレイに印加されることにより発生した電界内に、分子が移動し、または運び込まれるように、交流動電学的な現象（ＡＣＥＫ）を利用する。【選択図】図２Ｂ
2018141775.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の電極を備える電極アレイをコーティング材料でコーティングすることにより当該電極アレイを機能化する工程と、
前記電極アレイの上にサンプルを適用する工程と、
前記サンプルが最初に適用された際に、前記電極アレイのインピーダンスの初期値を計測するために、コントローラを用いてインピーダンス読み出し回路を制御する工程と、
前記インピーダンスの初期値が計測された後に、電気信号を発生させ、かつ、固定された大きさおよび固定された周波数を有する当該電気信号を前記電極アレイに印加するために、前記電極アレイに連結された信号発生器を、コントローラを用いて制御する工程と、
前記インピーダンスの初期値が計測された後、所定期間に亘って、前記電極アレイの、時間に対する前記インピーダンスを測定するために、コントローラを用いてインピーダンス読み出し回路を制御する工程と、
前記インピーダンスの初期値に関して、前記電極アレイの、時間に対する前記インピーダンスの変化を計算する工程と、
を含むサンプル内の生物マーカの検出方法。
【請求項２】
前記電極アレイの前記インピーダンスの変化が予め定められた閾値を超えた際に、特定の疾患または特定の状態の存在を示す工程を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電極アレイの前記インピーダンスの前記変化が予め定められた閾値を超えた際に、ヨーネ病、乳腺炎、妊娠、結核、凝固、心臓発作、インフルエンザおよび糖尿病のうちの一つの存在を示す工程を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記コーティング材料は、前記生物マーカと結合する分子を備える請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記コーティング材料は、前記生物マーカと反応する分子を備える請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記コーティング材料は、抗原、抗体、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質および酵素のうちの一つ以上を備える請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記生物マーカは、抗原、抗体、タンパク質、ペプチド、核酸、ホルモン、脂質、糖およびプローブ分子のうちの一つ以上を備える請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記電極アレイの上に前記サンプルを適用する前に、当該サンプルを、予め定められた濃度の標識粒子と混ぜ合わせる工程を備え、当該標識粒子は、前記生物マーカに特有のリンカー分子によって機能化されたものであり、
前記サンプルと前記標識粒子の混合物を培養する工程を更に備える請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記標識粒子は、ラテックスビーズ、磁気ビーズおよび微生物のうちの一つである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記電極アレイを機能化する前に、当該電極アレイをプレコーティング材料でコーティングする工程を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記プレコーティング材料は、３アミノプロピルトリエトキシシランまたはポリピロールである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記電気信号は、１０Ｖｒｍｓ未満の大きさおよび１０ＭＨｚ未満の周波数を有する電圧信号である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記電極アレイは集積回路において提供される請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記所定期間は１０分未満である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルは前記電極アレイに一度だけ適用される請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記電極アレイは同一平面上の電極アレイである請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記電極アレイが有する複数の電極は平行プレート電極である請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、多くの病原体、疾患および生理的条件、或いはそれらの指標をインフィールド（すなわち、研究室から離れた現場、臨床）で検出するための交流動電学（ＡＣＥＫ）を用いた、例えば、生体試料における生物マーカを検出するための方法および関連装置に関し、より詳細には、動物におけるヨーネ病および乳腺炎のような細菌性疾患の診断のための抗体、動物および人間における結核診断のための抗体、動物および人間における肺動脈塞栓症の診断のためのＤダイマー、妊娠診断のための小分子（例えば、プロゲステロン）、糖尿病の診断のための糖（例えば、ブドウ糖）および酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ）、および心発作の指標としての他の酵素の、このような方法と装置によるフィールド検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
集合的に交流（ＡＣ）動電学（ＡＣＥＫ）と呼ばれる誘電泳動、交流（ＡＣ）電熱効果およびＡＣ電気浸透の現象は、現在、細胞スケール上の粒子を操作して切り離すために用いられている。誘電泳動（ＤＥＰ）は、不平等電界における誘電体粒子の浮遊に関わる。本願明細書において後述されるように、静電容量およびインピーダンス変化は、被検査物質のための分子プローブ（例えば細菌抗原）で被覆された、例えば２つの（或いはより多くの）電極アレイから認識される場合がある。分極化された粒子がこのようなフィールド中に浮遊された場合、誘導双極子が粒子の全体に亘って形成され、そのフィールドと同調して回転または移動する。更にまた、本願明細書において描写されかつ述べられるように、ＡＣ電熱およびＡＣ電気浸透の現象または効果は、電極周辺にマイクロスケール電流を誘発し、検出用の電極に向けて粒子／コロイド／巨大分子を対流によって移動させる。
【０００３】
互いに嵌合された微小電極または２枚の密接な間隔で置かれた平行プレートが知られており、例えば、Capacitive Microsystems for Biological Sensing, V. Tsoutiその他著, Biosensors and Boilelectoronics, 27, (2011年)、第１−１１頁に記載されている。簡略形において、静電容量タイプセンサの電極は、特定の間隔と厚みを有する２枚の密接な間隔で置かれた平行プレートを備える場合がある。２つの電極を有するコンデンサの並列接続が形成されてもよい。並列に配置された個々のコンデンサの合計が並列コンデンサの静電容量を有することはよく知られている。コンデンサとして扱われる一方で、インピーダンスを生み出す抵抗的および誘導的な成分を伴わない完璧な静電容量を呈するコンデンサは存在しない。それでも、このような静電容量マイクロシステムの抵抗的および誘導的な成分は、静電容量成分と比較すれば僅かな表層結合しか表さない。このようなバイオセンサは、例えば大腸菌およびサルモネラ菌の検出において特に開発され、かつ利用されてきた。他の電極アレイが、前立腺癌のための前立腺特異度抗原（ＰＳＡ）検査で知られている。さらにもう一つのプロトタイプ検査集積回路が、特定のタンパク質検出のために開発されている。
【０００４】
ヨーネ病は、鳥型結核菌亜種副結核症として公知の細菌によって引き起こされる。ヨーネ病は野生生物および家畜に影響を与える。牛または乳牛のような家畜において、上記疾患は牛乳生産量の減少（乳牛）、重量の減少、および臨床的な影響を受けた動物の早まった間引きの原因となる。米国単独で、ヨーネ病は、酪農群の６８％で見つかり、米国乳業産業単独で２憶２千万ドルの年間損失を引き起こすと推定される。ヨーネ病は現在、免疫学的測定法、または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、または病原体検出方法（細菌培養または感染または汚染を表すＰＣＲ）を用いて診断研究室において診断される。
【０００５】
ウシ型結核菌は、動物および人間の双方においてウシ結核を引き起こす。米国の家畜からのウシ結核の根絶に向けた進歩にかかわらず、ミシガンおよびミネソタのような州では、それらの野生生物および牛オペレーションにおいてウシ結核との戦いが続けられている。義務化された牛のテストには、ミネソタ単独で年間３２５万ドルを要している。米国において、ウシ結核の発生には、検査および治療のため２００８〜２００９年において４千万ドル以上を要している。野生動物のウシ結核は、現在、肉眼的病変の死体解剖の、細菌培養および皮膚試験によって検査されている。
【０００６】
ヒト結核菌によって生じる人間の結核は、１千万人以上に発症し、世界的には、それにより毎年２百万人が死亡していると推定される。１０憶ドル以上が世界的に毎年人間の結核の診断および評価に使われていると推定される。人間の結核は現在、Ｘ線撮影イメージング（従来の胸部Ｘ線）、塗抹標本鏡検、細菌培養、またはツベルクリン皮膚試験によって診断される。
【０００７】
乳腺炎は、主に細菌感染症によって生じる乳腺の炎症にを引き起こす疾患である。この疾患は、成体の乳牛における最も一般的な死因である。実際、すべてのウシの３８％が乳腺炎によって影響を受けていると推定される。乳腺炎は、米国酪農産業に年間１７憶〜２０憶ＵＳドルの経済的損失を生じさせると推定されている。それは、世界的には、５００憶ドル／年（３１０憶ポンド／年）の経済的損失を招くと推定される、酪農産業に最も高コストの影響を及ぼす疾患である。大腸菌およびレンサ球菌ウベリス（ｕｂｅｒｉｓ）は、ウシ乳房炎の一般的な原因物質であり、それぞれ、その疾患の約１８％および５％に対して責任を負う。乳腺炎のウシの牛乳における細菌の数は、１０７［細菌／ｍＬ］に達し得る。授乳中の動物の乳腺炎の更なる徴候は体細胞の白血球数である。これは、感染した牛乳と試薬を混ぜ合わせることによって決定することができ、形成されたゲルの量は、体細胞のセルの数を示し、従って乳腺炎の徴候を示す。新鮮な牛乳において細菌を検出し識別することは、酪農場において上記疾患を治療し制御するうえできわめて重要である。
【０００８】
テネシー大学研究財団に譲渡された米国特許番号７，５１７，９５５および７，８１２，１４７によれば、「レンサ球菌ウベリス接着分子」またはＳＵＡＭと指定されたポリペプチドが、スティーブンＰ．オリバーその他から成るチームによって開発された。ＳＵＡＭは、診断的に、また治療的に用いることができる。この特許は更に、免疫蛍光牛乳カード試験、および結果を得るために研究室での長い時間を要することのある周知のＥＬＩＳＡテストと同様に診断のために「乳牛側」で用いられることのある凝集反応／沈降テストを記述している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許番号７，５１７，９５５
【特許文献２】米国特許番号７，８１２，１４７
【非特許文献】
【００１０】
Capacitive Microsystems for Biological Sensing, V. Tsoutiその他著, Biosensors and Boilelectoronics, 27, (2011年)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
家庭においても、フィールドにおいても、他の疾患のために開発されたような集積回路（チップ）上の研究室および関連した方法論が、他の診断の中で、野生生物、家畜、および人間の疾患、並びに、結核、ヨーネ病、乳腺炎、および心発作の事例を含む細菌性疾患のような生理的条件のための迅速な検査に適用できるとすれば有益である。
【００１２】
Ｄダイマーは、凝血塊の分解の指標であり、そのため肺動脈塞栓症、深部静脈血栓症などの予測値または指標である。凝血塊は、例えば静脈において発生して心臓に戻ることがあり、凝血塊はしばしば致命的である。Ｄダイマーを検出するためにはラボ・オン・ア・チップ検査を有することが望ましい。
【００１３】
血液および他の体液中の糖分、例えばグルコース、の含有量の高／低は、糖分に関連する疾患の他の予測因子の中で高または低糖血の一つの指標である。糖分含有量のラボ・オン・ア・チップ検査は、患者および医師が直ちにこのような糖関連の疾患を判断し、既存の方法論と戦うのに役立つ場合がある。さらに、産業的または商用的応用としては、例えば、ビール中の糖分含有量を検査することが考えられる。
【００１４】
小分子検出は、条件の疾患の予測因子となり得るいかなる小分子にも一般に関係する。具体的には、それは、例えば、妊娠のような条件の例として、プロゲステロンに対する検査に望ましい場合がある。
【００１５】
酵素は、例えば、人間の器官または骨格構造の生きた細胞において生じる複合体である。従って、ＥＬＩＳＡ検査が利用可能である一方で、臓器疾患の標識となり得ると共に、結果を得るためにＥＬＩＳＡが整式な研究室と数日の時間とを必要とすることのある事項を数分で達成する酵素レベル用の単純なラボ・オン・ア・チップ検査の必要性が存在する。
【００１６】
他の可能性のあるラボ・オン・ア・チップの応用は、周知の検査のための他の遅遅とした研究室手段による培養を待つのではなくむしろ、水中の大腸菌または病原性大腸菌を見つけるために井戸水を検査することである。スワビングおよび検査を必要とする他の細菌は、例えば敗血性咽頭炎の指標であるレンサ球菌である。
【００１７】
前述の仮定によれば、必要とされるのは、細菌性および他の感染症の疾患の検出、生物マーカーを介した条件、または例えばＡＣＥＫ現象を用いた商業的適用でさえをも提供する場合がある方法および関連するラボ・オン・ア・チップ装置である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
この課題を解決するための手段は、概念の選択を紹介するために提供されるものである。これらの概念は、詳細な説明で更に後述する。この課題を解決するための手段は、特許請求の範囲に記載された主題の主な特長または不可欠な特徴の特定を意図したものではなく、また、この課題を解決するための手段は、特許請求の範囲に記載された主題の技術的範囲を決定する助けとなることを意図したものでもない。
【００１９】
本発明は、電極アレイまたは特別に製造された電極アレイを有する既製の弾性表面波共振子のような装置を提供することによって、上記の特定されたニーズを充足する。各々の電極アレイは、病原体、疾患および生理的条件を検出するためのラボ・オン・ア・チップを備えることがある。調査のために組み上げられた前記電極アレイと関連するパラメータは、病原体、疾患または物理的状態の検出限界を改良する。図１９Ａ〜図１９Ｄの議論と関連して本願明細書において更に定義されるように、乳腺炎のための白い体細胞の数のために、更に特別な配列が、開口部の大きさが異なる第１および第２のオーバーレイ電極メッシュ（第１および第２のネットワークグリッド）を備えて設計された。さらに、ヨーネ病、結核、病原体検出（乳腺炎）、体細胞検出（乳腺炎）、タンパク質検出（妊娠）、小分子、およびＤダイマーの各検出のための一般的な方法が記載されている。ここに記載されている電極アレイプラットホームは、異種起源反応に基づくいかなる検出／分析をも助けるプラットホーム技術である。インピーダンス検知が免疫診断、ＤＮＡ分析および酵素の検知のために用い得ることは、文献により十分に裏付けられていた。ここに開示されたプラットホームは、全体として、異種起源ベースのインピーダンス検知において改善される。ここに開示されたプラットホームに適用できるインピーダンスバイオセンサは、上に紹介された３つのタイプ（すなわち、抗原／抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ（核酸）、及び酵素を検出するためのバイオセンサ）を含み、更に、糖の１例としてのグルコース、タンパク質生物マーカの１例としてのＤダイマー、小分子の１例としてのプロゲステロン、および細菌およびセルを含む微生物の１例としてのＳウベリスを含む。
【００２０】
一の実施形態において、本発明は、大凡２μｍの間隔を空けて置かれるインタレース電極、すなわち、各電極フィンガの幅が１〜３ミクロンであり互いに１〜３ミクロン分離している電極を有し、ＡＶＸ社から入手可能な４３３．９２ＭＨｚの従来の表面弾性波（ＳＡＷ）共振子の電極アレイ、ＰＡＲＳ４３３．９２のような互いに嵌合された電極アレイを備えている。関連するラボ・オン・ア・チップの準備方法は、集積回路の電極アレイ部分の表面を細菌抗原で被覆する工程を備える。今までに実行されてきた試験によれば、細菌抗原は、ヨーネ病または結核の原因物質の抽出物である場合がある。乳腺炎のための病原体検出、および妊娠のための生物マーカ（妊娠関連糖蛋白（ＰＡＧ））検出のために、病原体またはＰＡＧに対する抗体は、病原体またはタンパク質を捕獲するために電極表面に直接または（例えばタンパク質Ｇを介して）間接的にコーティングされることがある。コーティングされていない如何なる表面も、遮断試薬によってブロックされる。検出のために、血清サンプルまたは病原体の懸濁液は、コーティングされて遮断されたラボ・オン・ア・チップにロードされる。抗体、一般に生物マーカ、または病原体は、所定の強度および周波数を持つ電気信号が電極に印加された際に、細菌抗原に、または反病原体抗体に、または反生物マーカ抗体に結合する。このような抗体／病原体、一般に生物マーカの結合は、無影響のサンプルと比較して、それらの抗体／病原体／生物マーカによって検出が求められている状態に応じて、１分〜６分のオーダーで時間が経過するに連れて、静電容量又はインピーダンス値の変化に変換される。
【００２１】
どのような物質が電極アレイに適用されるかという一般的な説明として本明細書で用いられているのと同様に、生物マーカ、または生物学的マーカは、一般に、感染症、または妊娠または凝固（塞栓の発症）のような物理的状態を示すことのある生物学的状態の指標として用いられる物質である。プロゲステロンは、小分子検出の例として検出される場合がある。それは、通常の生物学的プロセス、病原性的な方法、異常な生物学的プロセス、または治療的な介入に対する薬理学的応答の指標として客観的に測定され、かつ評価される特性である。それは、その検出が特定の疾患状態を示す物質であることも可能であり、例えば、抗体の存在は感染を示すことがある。より詳しくは、生物マーカの集中は、疾患のリスクまたは進行を、或いは施された治療に対するその疾患の罹病性と共に、示す場合がある。例えば、妊娠関連する糖蛋白、Ｄダイマーおよびグルコースはそれぞれ、例えば、妊娠、塞栓および糖尿病（または他の糖関連の疾患）の指標である。図３Ｂおよび図１０の描写において見ることができるように、本明細書で用いられるバインディングアッセイは、１つの分子のもう一つの分子への結合性、親和性、誘引性または現実の付着に関連しており、例えば、バインディングアッセイは、２つの分子の間の結合性または親和性の量を計量する特定の分析である。
【００２２】
他の実施形態では、電極に結合する生物マーカの結果時間の経過に伴って生ずる静電容量またはインピーダンス値の変化を検出するよりはむしろ、ラボ・オン・ア・チップは、電極の表面の近くに酵素のレドックス（還元−酸化）反応から生ずる試料溶液の誘電率の変化に起因する界面静電容量の変化を検出する場合がある。電極アレイは、機能化され／診断レドックス酵素またはレドックス酵素自体に特有のいずれのリンカー分子で被覆されている。低ＡＣ電圧信号は、電極アレイの表面に向かうターゲット分子（例えば、酵素、基質および／またはプローブ）の対流をつくるためにＡＣＥＫ効果を誘導する電極アレイに適用されて、リンカー分子または固定化酵素によって捕獲される酵素によって触媒作用が及ぼされるレドックス反応を促進する。酵素−基質対に特有のレドックス反応は、電極アレイの表面で界面静電容量の変化を測定することにより検出される場合がある。
【００２３】
他の実施形態において、電極の配列は、シリコン基板またはウェハ上に大凡５μｍの接点を有し、２５μｍの幅と間隔をあけた電極の構成に組み立てられている。この実施形態において、平行したインタレースの指は、シリコン基板上の２つの電極アレイのためのインタレースパターンを形成するために、大凡２５ミクロンの指と、大凡５ミクロンのスペースと、大凡５ミクロンの指と、大凡２５ミクロンのスペースと、を備えていてもよい。この組み立てられたアレイは、周知のＳＡＷ共振器から商業的に提供可能なアレイを越える改良された結果をもたらした。生物マーカのさらに低い濃度を検出するために、組み立てられた異なるアレイが、この種のアレイ、例えば、対称および非対称の互いに嵌合する電極の組み合わせの検出限界を決定するために、調査されてきた。さらにまた、Ｄダイマーを検出するための本発明の使用において、ポリピロール（ＰＰｙ）被覆の電極の使用がテストされ、かつ、このアレイのコーティングを用いていないものとの結果の比較がなされている。また、本発明の小分子検出（例えば、プロゲステロン検出）への適用の間に、３−アミノプロピル−トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）コーティングの適用の衝撃がテストされ、ＡＰＴＥＳが用いられない場合のテスト検出と比較して、ＡＰＴＥＳが用いられる場合に、時間の経過に伴う静電容量変化率が上昇するという結果が得られた。最後に、特別なメッシュ（グリッド）電極が、乳腺炎の指標として生体試料内の体細胞を検出するために開発されており、図１９Ａ〜図１９Ｄを参照して本願明細書において更に詳述されるように、他の検出のために同様に用いられる場合がある。
【００２４】
本願明細書において述べられる１つの実施形態において、複数の電極アレイは、複数のサンプルが多重送信され、全ての蓄積サンプルについて時間の経過に伴う静電容量／インピーダンスのデジタルデータが同時に収集されることがあるように、同じチップの表面上に配布される場合がある。直径４インチ（１０センチメートル）の基板、または（電極対が収容可能である限りにおいて）５ミリメートル程度以下の好適なサイズが用いられる場合がある。同じ基板上に形成された２０以上の電極アレイを介して、２０以上もの生体試料が同時にテストされる場合がある。
【００２５】
更なる実施形態において、電極網（グリッドネットワーク）は、基板上に覆いかぶせられる（例えば、図１９Ａ−１９Ｄを参照して詳述されるようなコンデンサとして構成される）、または本願明細書において更に述べられるように狭い電極と共に用いられる広い嵌め合い電極上に覆いかぶせられる場合がある。上記の覆われた電極網／グリッド（図１９Ａ〜図１９Ｄ）は、乳腺炎に襲われた授乳中動物の体細胞の数をカウントするために用いられる場合がある。
【００２６】
他の電極構成は、ピン-ライン共面電極および対面パターン電極を含む場合がある。不平等電界を生じさせるいかなる微小電極の設計も、ＡＣＥＫベースのインピーダンス測定に関する（impedimetric)ラボ・オン・ア・チップとして実現される場合がある。ポリピロール（ＰＰｙ）が例証として用いられる一方で、幾つかの実施形態における検出を改善するために、いかなる一様な導電性ポリマーも、コーティングとして用いられる場合がある。他の実施形態において、ナノ構造材料を備えるコーティングが、検出を改善するために適用される場合がある。ナノ構造材料の例には、周知の他のナノ構造材料コーティングの中で、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、ナノチューブおよびグラフェンが含まれる。さらにもう一つの実施形態において、サンプル分析物をナノ〜マイクロ・サイズの標識粒子と接合させ、接合されたサンプルを電極上にロードすることにより、検出が増幅される場合がある。標識粒子は、例えば、ラテックスビード、磁気ビーズ、またはウイルスや細菌のような微生物である場合がある。
【００２７】
商業的な提供が可能であってもなくても、カスタマイズされた微細組み立て物またはそのような電極アレイの他の実施形態は製造される場合があり、それは、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）テストまたは他の検査室試験のためにサンプルを研究室に発信することと関連して、フィールドでの使用、時間および支出の削減のためのラボ・オン・ア・チップを備えるために、目標とされた病原体またはタンパク質に対して細菌抗原または抗体でプレコートされてブロックされる場合がある。細菌検出において、例えば、唾液の連鎖球菌または井戸水中の大腸菌（coliformまたはE. ColiＥ）、または食品中のサルモネラ菌サンプリングでさえ、従来のテストが夜を徹した培養物成長などを必要とすることがあるのに対して、試験が５分で実行できてしまうことがあり、すなわち、検出は、より早く、より効率的に、かつ、より少ない費用で実行可能なのである。ミルクが人間または動物の試験溶媒と言われる一方で、汗、唾液、血液および尿のような他の体液が、価値ある目的のために検査される場合がある。応用は、連鎖球菌のための唾液、糖分含有量のためのビール、または、Ｄダイマーおよび血液凝固の所見のための血液または汗または他の体液の5分間テストを含む場合がある。
【００２８】
原則として、このシステムは、抗体、病原体（例えば、病原体の抗原、疾患にかかわるバイオマーカータンパク質、感染、汚染または生理的条件）、タンパク質、小分子、グルコースのような糖質のタイプ、および酵素レベル以外の分析物を検出することができ、したがって、本願明細書において記載されているように、各種の疾患、タンパク質、および妊娠、血液凝固、最近の心発作および動物および人間の他の条件といった生理的条件、または動物または人間に対する脅威（例えば井戸水テストへの応用）の診断に用いられる場合がある。本願明細書において述べられるラボ・オン・ア・チップの実施形態およびコーティング／ブロッキング試験は、国土安全保障的な応用、およびビールの糖分レベル検査のような商用的な応用における使用と同様に、食品の安全において、例えば、食肉、ミルクおよび酪農製品、水などの検査において応用を見出す場合がある。ラボ・オン・ア・チップおよび関連した方法のこのような応用は、港または空港での、人間および動物における、また、輸入食品の受領における感染症のための国境通過における迅速なテストおよび診断を含む場合がある。
【００２９】
本発明の更なる特徴および効果は、本発明の様々な態様の構造およびオペレーションと同様に、添付の図面を参照して以下に詳細に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本発明の特徴および効果は、同様の参照符号が同一または機能的に同等の要素を示している図面を参照しながら把握することで、以下に述べる詳細な説明からより明らかになる。
【００３１】
【図１Ａ】部分的に、電極アレイの実施形態として用いられ、ヨーネ病および結核の発見を提供するために被覆されている関連するインタレース電極部を有する従来のＳＡＷ共振器チップの写真であり、そして更に、典型的な電極アレイ部の引き伸ばし線図を示す。
【００３２】
【図１Ｂ】従来のＳＡＷチップの電極の構造が鳥瞰的に見て取れる３ミクロンスケールを示す顕微鏡写真である。
【００３３】
【図２Ａ】本発明による検出方法の典型的なフローチャート線図である。
【００３４】
【図２Ｂ】信号発生器、生理的条件、および細菌性疾患、ヨーネ病および結核のような感染症のフィールド検出のためのコントローラおよびディスプレイと組み合わされた多重電極アレイの典型的な回路ブロック図である。
【００３５】
【図２Ｃ】プロトタイプのポータブル疾患診断キット、サンプルを落とすためのピペット、インテリジェント通信装置に接続するためのコネクタ、及び、複数の電極アレイ（８つの場合を示す）に適合するプラグインコネクタを示す。
【００３６】
【図２Ｄ】現場での検出／診断を得て伝送し、また、結果をインテリジェントデバイス／パーソナルコンピュータを介して疾病管理センター／研究室などに潜在的に送信し、または結果をプラグインメモリにローカルに格納するための典型的な現場での方法を示す。
【００３７】
【図３Ａ】一つの分子のためのミニチュア電極アレイ上の電界内に捕らえられた分子に適用される誘電泳動（ＤＥＰ）の現象を示す。
【００３８】
【図３Ｂ】図１に示す電極アレイの典型的な従来の電極アレイによって引き起こされるものと同様に適用される誇張された回転及び方向力を示す典型的な電極アレイの拡大図を提供する。
【００３９】
【図４】２０の血清サンプルを対象としたヨーネ病についてのブラインドテストの結果を提供しており、図１の典型的な電極アレイを用いた場合、１０のテストが陰性、１０のテストが陽性であった。
【００４０】
【図５Ａ】対照試料（１：１０の抗原および１：２０の血清）としてのバッファ液Ｂと共に、ヨーネ病の診断のための陽性、陰性の血清の正規化された静電容量の変化を変更のグラフを提供する。
【００４１】
【図５Ｂ】ヨーネ病１：８０抗原についての血清濃度対静電容量の変化率のグラフである。
【００４２】
【図５Ｃ】ヨーネ病について秒単位で時間の経過に対する正規化静電容量を示すグラフであり、１：８０の抗原と１：２０〜１：８０の濃度範囲で異なる線形結果を示す希釈抗体とについて示している。
【００４３】
【図５Ｄ】陰性試験結果対陽性試験検出、ヨーネ病血清のための１分当たりの静電容量変化率（％）対そのヨーネ病検出結果を示す１０の陰性および陽性結果、を示す線形棒グラフを提供する。
【００４４】
【図６】インピーダンスの変化のための本発明の方法と人間の結核の発見のための広く使われているＥＬＩＳＡ検査方法との間の比較を提供し、この比較は陰性および陽性のテストにおいて類似の結果を示す。
【００４５】
【図７Ａ】１００ｋＨｚ、１００ｍＶｒｍｓ及び２分の時間長に対する、制御下対ミリリットル当たりマイクログラムの各種濃度についての１分当たりの変化率（％）についての検出限界のグラフ結果である。
【００４６】
【図７Ｂ】時間の経過に伴う静電容量の変化対印加信号の周波数によるアナグマ結核検出を示すグラフである。
【００４７】
【図８Ａ】図１の回路のための、印加信号の周波数範囲の研究のグラフィック結果であり、図１の回路を用いたヨーネ病診断について時間の経過に伴う静電容量変化対周波数を表している（その１）。
【図８Ｂ】図１の回路のための、印加信号の周波数範囲の研究のグラフィック結果であり、図１の回路を用いたヨーネ病診断について時間の経過に伴う静電容量変化対周波数を表している。（その２）
【００４８】
【図８Ｃ】時間の経過に伴うインピーダンスの変化対印加信号の周波数についての図８Ｂに対する類似のグラフである。
【００４９】
【図８Ｄ】図１の回路のための、時間の経過に伴う静電容量およびインピーダンスのそれぞれの変化対周波数のグラフ（その１）である。
【図８Ｅ】図１の回路のための、時間の経過に伴う静電容量およびインピーダンスのそれぞれの変化対周波数のグラフ（その２）である。
【００５０】
【図９Ａ】図１の従来の電極アレイを超える改良された結果を提供する基板上に構成された電極アレイの顕微鏡写真表示を提供する。
【００５１】
【図９Ｂ】図９Ａに表される電極アレイにおいて繰り返される２５、５、５、２５ミクロンパターンを示しかつ分散させる顕微鏡写を提供する。
【００５２】
【図１０】長期ＡＣ電熱流による対流を利用することで、電極アレイが、抗原コーティング層と遮断層との間にどのように改良された結合性結果を提供することができるのかを開示している、図３Ｂと類似の図面を提供する。
【００５３】
【図１１】１０の陰性および陽性サンプルの間における１分当たり静電容量変化率（％）の改良された陰性／陽性区別のグラフィック例を提供する。
【００５４】
【図１２】１分当たりの静電容量変化率（％）対ミリリットル当たりマイクログラムでの濃度のグラフを提供する。
【００５５】
【図１３】１分当たりの静電容量変化率（％）対ミリリットル当たりナノグラムの濃度についてのグラフを提供する。
【００５６】
【図１４】時間の経過に伴う静電容量変化対印加信号の周波数を示す図９に示すウェハ配列のための検出限界テストのグラフィック表現を提供する。
【００５７】
【図１５】２つの制御群および１つの実験群に関わり、その実験群がレンサ球菌ウベリス（乳腺炎の原因物質）細菌を含むような病原体検出のための表を提供し、かつ、１００ｍＶにおける印加信号周波数範囲およびテストのための短い期間を分析するための方法を記載する。
【００５８】
【図１６Ａ】細菌を除外した陰性制御群（「細菌なし」と表示）のグラフを提供する。グラフの各バーは、時間の経過に伴う静電容量の変化率対５ｋＨｚと１ＭＨｚの間における印加信号の周波数を表している。
【図１６Ｂ】血清を除去した陰性制御群（「血清なし」と表示）のグラフを提供する。グラフの各バーは、時間の経過に伴う静電容量の変化率対５ｋＨｚと１ＭＨｚの間における印加信号の周波数を表している。
【図１６Ｃ】血清および細菌を有する実験郡（「結合」と表示）のグラフを提供する。グラフの各バーは、時間の経過に伴う静電容量の変化率対５ｋＨｚと１ＭＨｚの間における印加信号の周波数を表している。
【００５９】
【図１６Ｄ】図１６Ａ、図１６Ｂおよび図１６Ｃの結果を示す複合グラフを提供しており、これによれば、レンサ球菌ウベリス細菌の検出における使用には３００ｋＨｚが適しているように見える。
【００６０】
【図１６Ｅ】細菌なし、血清なしおよび結合のそれぞれにおける、測定周波数、静電容量の変化率および標準偏差のそれぞれについてのデータ表を提供する。
【００６１】
【図１７】４０Ｈｚと６ＭＨｚの間の周波数プロットにおける時間の経過に伴う静電容量の変化率のグラフを提供しており、これによれば、静電容量の変化を読み取るには４０Ｈｚから１ｋＨｚが感度のよい周波数である（ｄＣ／Ｃｏの変化率に重複がない）との結論を導き出すことができる。
【００６２】
【図１８Ａ】５０ｋＨｚを要約したグラフである。
【図１８Ｂ】１５０ｋＨｚを要約したグラフである。
【図１８Ｃ】３００ｋＨｚを要約したグラフである。好適な３００ｋＨｚの印加信号は、インピーダンス／静電容量測定で、より顕著な区別を得るための３００ｋＨｚの印加信号における感度の高い周波数が、レンサ球菌ウベリス細菌検出（乳腺炎）のための図１７に示唆されているように、４０Ｈｚと１ｋＨｚの間にある場合があることを示している。
【００６３】
【図１９Ａ】基板と、例えば、牛の乳腺炎の検出のための白血球をカウントするために開口サイズが異なるサイズに設定されたオーバーレイ電極メッシュとの線図である。
【００６４】
【図１９Ｂ】図１９Ａに示す上部及び底部電極メッシュに関するスペーシングを示す線図である。
【００６５】
【図１９Ｃ】どのようにして、サンプルがオーバーレイ電極メッシュ上に滴下されるか、および、特定の交流信号が図１９Ａに示すメッシュに印加されるかを示す線図である。
【００６６】
【図１９Ｄ】図１９Ａの基板上のオーバーレイメッシュ電極の写真の白黒線画である。
【００６７】
【図２０Ａ】時間の経過に伴う（１分テスト）正規化された静電容量の結果のグラフを提供し、図２０Ａの曲線は細胞固定、サンプル番号３８５３およびサンプル番号４１１８の特異性の実証を示している。
【図２０Ｂ】時間の経過に伴う（１分テスト）正規化された静電容量の結果のグラフを提供し、体細胞なし、に対するサンプル４１１８の濃度のレベルを調査しており、細胞なし、に対して１００希釈のサンプル４１１８が乳腺炎を検出する場合があることを示している。
【図２０Ｃ】５分テストの期間にわたる体細胞のカウント（体細胞数またはＳＣＣ）対静電容量の変化対実験結果の精度を示すための時間比例の変化を示す。
【００６８】
【図２１】妊娠検出のためにα-ＰＡＧ（反ＰＡＧ抗体）のコーティングを利用した妊娠試験のために、図１のＳＡＷ電極アレイを準備する方法のステップを例示する。
【００６９】
【図２２Ａ】時間の経過に伴う静電容量の変化対印加信号の周波数のグラフを提供しており、これによれば、５０ｋＨｚ以上の範囲の信号は、陽性対陰性またはバッファ液が妊娠検出を可能とすることを示しており、妊娠の検出に用い得るという結論が導かれることがある。
【図２２Ｂ】時間の経過に伴う静電容量の変化対印加信号の周波数のグラフを提供しており、これによれば、妊娠に対する５つの検査の概要は、陽性対陰性またはバッファ液が妊娠検出を可能とすることを示しており、妊娠の検出に用い得るという結論が導かれることがある。
【００７０】
【図２３Ａ】複数の広い間隔で置かれた電極を先ず始めに提供し、次いで、広い電極ごとに複数の極近接電極を提供することで構成された、このように構成された電極アレイの検出限界を研究するための、互いに嵌合された電極アレイを例示する。
【００７１】
【図２３Ｂ】シミュレーションされた引力と、その動電学的な影響下で広く間隔を置かれた電極に引きつけられ、次いで図２３Ａの極近接電極に結合される粒子の流れを示す線図である。
【００７２】
【図２３Ｃ】図２３Ａの互いに嵌合された電極アレイを用いた、例えば、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬおよび５ｎｇ／ｍＬの生物マーカ濃度での改良された検出を示す線図である。
【００７３】
【図２４Ａ】１ｋＨｚから１１０ＭＨｚの周波数範囲でのテストに伴う、インピーダンスの虚部対抵抗またはインピーダンスの実部のナイキストプロットによる、本発明の使用からの試験結果（その１）を示す。
【図２４Ｂ】１ｋＨｚから１１０ＭＨｚの周波数範囲でのテストに伴う、インピーダンスの虚部対抵抗またはインピーダンスの実部のナイキストプロットによる、本発明の使用からの試験結果（その２）を示す。
【００７４】
【図２５Ａ】ＡＣ容量性検出によるレドックス酵素の検出を例示する概念図である。
【００７５】
【図２５Ｂ】図２５Ａの「電解液-電極」システムの代表的な等価回路である。
【００７６】
【図２５Ｃ】濃度の異なる基質について、酵素によって機能化された電極を用いて行われた基質検出のための実験の結果を示す。
【００７７】
【図２６Ａ】サンプル分析物を表す。
【図２６Ｂ】標識粒子を表す。
【図２６Ｃ】抱合型試料を表す。
【００７８】
【図２６Ｄ】被覆された／機能化された電極表面を例示する概念的概略図である。
【図２６Ｅ】被覆された電極表面の分析物検出を例示する概念的概略図である。
【図２６Ｆ】被覆された電極表面の共役化されたサンプル検出を例示する概念的概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
本発明は、病原体、疾患および生理的条件の検出のため、特に、プロゲステロン検出によって例証されるように、これらに限定されるものではないが、井戸水の細菌、グルコースの検出、酵素レベルの検出、Ｄダイマー検出および小分子検出のテストを含む他の条件の中で妊娠、結核、ヨーネ病および乳腺炎の検出のための配列と関連する、典型的な電極アレイおよび方法を提供するシステム、方法、およびコンピュータプログラム製品に関する。商業的な配列が図１Ａ、１Ｂに従って用いられる場合があると共に、電極アレイのための好適なトポロジの例は図９Ａ及び図９Ｂに提供される。いずれの場合にも、図２Ａに従って開示される方法によれば、他の細菌性疾患の中で結核、ヨーネ病および乳腺炎の発生が、図１及び図９の電極アレイを利用することで区別される場合がある。
【００８０】
先ず始めに、市販のＳＡＷ共振器集積回路、すなわち、ＡＶＸ社から入手可能なＳＡＷ共振器、ＰＡＲＳ４３３．９２からの電極アレイを用いて実行されてきた検出試験について説明するが、これによれば、信号発生器、マイクロコントローラおよび容量／インピーダンス読み出しディスプレイを含む検出キットを形成するために、その電極アレイは、図２Ａの方法に従って被覆され、かつ処理されていた。様々な試験はヨーネ病血清サンプルを用いて実行され、また、様々な試験が牛、人間および野生生物（アナグマ）の結核血清サンプルを用いて実行された。試験はまた、２つのタイプの乳腺炎の原因である病原体（レンサ球菌ウベリス）の検出、病原体検出および異常な白血球検出のためにも実行された。検出限界は、抗体の濃度を変化させることによってテストされた。更に試験は、反芻動物における妊娠の生物マーカー（ＰＡＧ）を検出するために実行された。その全内容が本願明細書に組み込まれるＬｉ，Ｓ．ら（発明者ジー（ジェーン）ウーを含む）による、バイオセンサおよびバイオエレクトロニクス（２０１２）"Dielectrophoretic responses of DNA and fluorophore in physiological solution of impedimetric characterization,"において報告されているように、この同じＳＡＷ共振器チップは、ＤＮＡを分化させるために成功裏に用いられている。さらに、検出テストの優れた再現性が以下に説明されている。
【００８１】
市販の電極アレイを利用した後に、微細に作成された第１および第２の好適な電極アレイが設計され、製造され、かつ改良された結果を伴って同様にテストされた。市販のＳＡＷ共振器から取り出した電極アレイの使用に関する説明に続けて、改良された電極アレイ（図９および図２３）と改良された結果の説明を行う。図１９Ａ〜図１９Ｄを参照して後に説明するように、第１及び第２のオーバーレイ電極メッシュ／グリッドネットワークが構成されている。
【００８２】
ここで図１Ａを参照すると、図２Ａに従って用いられる電極アレイ部１３０を示すために平面図において露出した状態で、従来の市販のＰＡＲＳ４３３．９２表面弾性波（ＳＡＷ）共振子集積回路が示されている。引き伸ばし線図の形式において、上記の電極アレイは、第１および第２の平行電極導体からの、一様に間隔を置かれて配置された複数の指を備える電極アレイ１２０として表されている。電極アレイの構造は図１Ｂの顕微鏡写真においてよりよく理解することができる場合があり、ここでは、（アルミニウムの）各導体が水晶／ガラス基板上に設けられている。本願明細書において更に述べられるように、周知の他の導電性金属および基板は、適切な電極アレイを構築するために用いられる場合がある。各指は、０．５〜１００ミクロンの間（例えば、１〜３ミクロン）の、または特に１．７ミクロンの、同じ幅を有するように見え、かつ、０．５〜１００ミクロンの範囲において、好ましくは、１．０と３ミクロンの間或いは約１．６ミクロンの間隔で、互いに同じ間隔または分離を有している。例えば、大凡５ｍＶｒｍｓと１０Ｖｒｍｓの間の（好ましくは１０ｍＶｒｍｓおよび１Ｖｒｍｓ間の）範囲における、または例えば１００〜５００ｍＶｒｍｓの所定電圧が、例えば、下限の２０Ｈｚ（好ましくは、１ｋＨｚ）と５ＭＨｚとの間、特に１ｋＨｚ〜２００ｋＨｚの範囲における所定周波数で、大凡１〜１０分間、例えば、２〜３分間、例えばＡＣＥＫ効果を誘導するために印加される。
【００８３】
完全なシステムを組み立てるためには、基板レベル信号発生器に、（例えば、血清サンプルが寄託されるならば１００ｍｖ、１００ｋＨｚの信号を生成するために）電極アレイ、インピーダンスまたは静電容量読み出し装置、インピーダンス／静電容量読出しに対する知的インタフェースとしてのマイクロコントローラ、および読み出しディスプレイを組み込む場合がある。後に説明するテストによって決定されるように、印加される信号の予定値は、５ｍＶｒｍｓ〜１０Ｖｒｍｓ（好ましくは１０ｍＶｒｍｓ〜１Ｖｒｍｓ）の範囲、および２０Ｈｚ（好ましくは１ｋＨｚ）と５ＭＨｚとの間の周波数となる場合がある。
【００８４】
検出テストキットの構造、およびこれに対する血清の適用は、図２Ａのフローチャートによって提供される。第１のステップ２１０では、例示的な電極アレイまたは集積回路アレイ部の表面を細菌抗原（例えば、ヨーネ病のための鳥型結核菌亜種副結核症の抽出物、または人結核のためのＭ結核、妊娠のためのＰＡＧに対する抗体、または乳腺炎のための病原体に対する抗体）で被覆する。ステップ２２０では、遮断バッファ試薬でその表面を遮断する。使用が可能である場合のあるそのような遮断薬の一つは、イリノイ州、ロックフォードのサーモ・フィッシャー・サイエンティフィックから入手可能な０.０５％のＴｗｅｅｎ２０および１０％のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ遮断バッファを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．０）を含む。ｐＨレベルは、好ましくは７．０であるが、例えば２．０〜１１．０であってもよい。周知の他の遮断薬を用いることとしてもよい。コーティングされていない表面を、リン酸緩衝食塩水Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）のような洗浄液または他の適切な洗浄液により洗浄してもよい。この電極アレイ装置は、例えば、横断面である図１０に示されるように、シリコン（Ｓｉ）基板またはウェハに、金／チタン、金／クロミウム、アルミニウム、銅、銀または他の伝導材質を従来の蒸着／スパッタリングによって堆積して電極アレイを設け、最上部に遮断層を有し、かつ、間に抗原コーティング層を有する形をとる場合もある。一の実施形態において、電極アレイチップは、試料の装填前に信号発生器チップ、マイクロコントローラおよび読み出しディスプレイに接続される。顕著なＤＥＰ反応を伴う生体粒子（すなわち、細胞のＤＥＰ反応のような、選択電気信号による電極に対する明らかな引力または反発）については、電気信号の周波数と大きさの選択により、選択的な捕獲／検出、および改良された選択性が実現される場合がある。場合によっては、表面の機能化が必要でない場合があり、そして、電極は洗浄などを行うことなく再利用することができる。
【００８５】
次に、ステップ２３０において、血清サンプル（生物マーカー）が、例えば、後述するように所与のミリボルトレベルおよび周波数の信号で作動している電極のコーティング表面にピペットから滴下されることによりロードされる。テストにおいて、疾患陽性または疾患陰性の結果が導かれる遮断および他の試験が行われた。本願明細書において述べられるように、ステップ２４０では、所与の信号でのテスト下で血清の抗体が被覆抗原層と結合するのに連れて、静電容量の変化（またはインピーダンスの変化）が時間とともに起こる。血清は、インピーダンス測定に関するセンサ（ラボ・オン・ア・チップ）の適用に応じて、例えば選択された体液から、すなわち、例えば授乳中の雌の動物のミルク、血液、唾液、汗および尿から作られる場合がある。
【００８６】
電極アレイチップは、一旦用いられると、洗浄されてから同じ信号発生器、マイクロコントローラおよびディスプレイによって再利用される場合がある。この洗浄は、電極アレイの再利用が可能となるように抗原／コーティングを落とすために、例えばアビジン（糖蛋白）-ビオチン相互作用、または水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液と関連してビオチン／ストレプトアビジン相互作用、またはカリウム塩酸塩／水酸化ナトリウム（ＫＯＨ／ＮａＯＨ）溶液、または公知の他の洗浄液の使用を含むことができる。
【００８７】
商業的な生産において、集積回路は、オンチップ信号発生器、およびすでに塗布された抗原層によって露出し、試薬によってブロックされた電極アレイと共に配布される場合があると予想される。あるいは、抗原およびコーティングは、現場で適用され、ブロックされ、ラボ・オン・ア・チップが一度用いられ、洗浄され、その後効果がなくなるまで再利用される場合がある。一の実施形態において、この電極アレイは、例えば、その効果が繰り返しの使用および洗浄の後に衰えた場合に再利用および交換が容易であることのある別々のチップから成る場合がある。図２Ｂと関連して更に本願明細書において詳細に説明されているように、システムは、マイクロコントローラ、複数のサンプルアレイ、マルチプレクサ、信号発生器および、遠隔研究室または疾患センターまたは他の遠隔施設に結果を通信するためのパーソナルコンピュータまたは通信装置に対するコネクタを含む場合がある。この例では、集積回路は、同時にテストされる場合がある複数のサンプルのロードに対して準備がなされている。例えば２０程度のサンプルは同じ基板上に堆積された同等数の電極アレイにより同時にテストされる場合がある。全システムは、携帯が可能であり、例えば酪農または牛飼育の農場または家庭のようなフィールドでの（研究室ではなく）使用が可能なものとして造られる場合がある。テストの結果は、研究室におけるＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）テストの場合のような時間単位ではなく、数分で利用することができる。また、これまでに行われたテストから、満足な検出を得るために必要とされる血清サンプルは、本願明細書において更に述べられるように、所与の濃度で大凡２マイクロリットルだけである。従って、同じラボ・オン・ア・チップ上で多くのサンプルが同時にテストされる場合がある。このような量の血清は、遠心器を用いることなく、人間または動物の体液（牛乳、血液、尿、唾液、…）サンプルから容易に得ることができる。
【００８８】
図２Ｂは、生理的条件、および細菌性疾患、ヨーネ病および結核のような感染症のフィールド検出のために、信号発生器、コントローラ（コンピュータプロセッサおよびメモリ）、およびディスプレイと組み合わされた複合電極アレイの典型的な回路ブロック図である。特に、図２Ｂの装置は、図１Ａの複数の電極アレイまたは図９に従うラボ・オン・ア・チップを備えることのあるマルチサンプルホルダ５６５を備え、そこには、同時にテストを行うための複数の電極アレイ（図示は３つ）が設けられることがある。信号発生器５７０は、制御装置、好ましくは、マルチサンプルホルダ５６５に対するオンボードデータメモリ（図示せず）を含む公知のマイクロコントローラ５５４に接続するように図示されている。コントローラ５５４から信号発生器５７０へのラインは、所定の信号または電圧レベルおよび所定周波数を示す制御信号ラインを表しており、その結果、信号発生器５７０は、それらに応えてユーザの信号選択に従う信号を出力する。ユーザにより選択された信号値の電圧および周波数はパーソナルコンピュータ（キーボードを含む）、またはパッドコンピュータまたはインテリジェント電話のような他のインテリジェントデバイスから入力され、かつ、マイクロコントローラメモリまたは図示されない外部メモリに格納されることがある。マイクロコントローラ５５４は、バッファ回路５５８を介してインピーダンス読み出し回路５５６とマルチサンプルホルダ５６５の間に接続されるマルチプレクサ５６２にも接続される。
【００８９】
図２Ｂの左側には、パーソナルコンピュータに対する接続、例えばＵＳＢポート、または、ストレージメモリカードに対する接続が示されている。パーソナルコンピュータは、マイクロコントローラ５５４からデータを受け取り、かつ、疾患の管理機関、外部研究室、またはユーザがデータの送信を望むことのあるあらゆる場所に通信ポートおよびネットワークを介してデータを再送信するために用いられる場合がある。起動ボタンは、テストを始めるため、またはテストの多数同時サンプリング、例えば、マルチサンプルホルダ５６５に生体サンプルを一旦ロードするために用いられる。検出／診断は、３つのステップで実行される場合がある。
ステップ１：スタートが押されると、サンプルホルダ５６５からインピーダンスチップ５５６までのインピーダンス読出し線を介して多重読出しを得るためにマルチプレクサ５６２およびインピーダンス読出しチップ５５６を起動させるべく、制御信号がコントローラ５５４に送られる。インピーダンスチップ５５６は、一つのサンプルにつき一つの単一信号または複数信号としてコントローラ５５４に静電容量／インピーダンス値を報告し、電極アレイについての初期の静電容量／インピーダンス値を設定する。
ステップ２：コントローラ５５４は、所定の期間に亘って（例えば、１０分未満）、選択された大きさおよび周波数の信号をサンプルホルダ５６５に印加するため信号発生器５７０を起動させ、これは、電極表面上へ巨大分子／生体粒子の堆積を強めるＡＣＥＫ効果を誘導することを意味する。
ステップ３：コントローラ５５４は、サンプルホルダ５６５からインピーダンスチップ５５６に至るインピーダンス読出し線を介して多重の読み出しを得るためにマルチプレクサ５６２およびインピーダンス読出しチップ５５６を再び作動させ、これにより、所定の期間が経過した後の静電容量／インピーダンス値のエンド状態が提供される。インピーダンスチップ５５６は、一つのサンプルにつき一つの単一信号または複数信号として、コントローラ５５４に静電容量／インピーダンス値を報告する。ＬＣＤまたは他のディスプレイ５５２は、ラボ・オン・ア・チップの特殊用途のために、所定期間にわたって、予め選択された時間間隔で、例えば、静電容量またはインピーダンス値のサンプルデータの読み出しを提供する場合がある。これらの周期的値は、制御と一緒に、マイクロコントローラ５５４のメモリ（図示せず）内に一時的に格納される場合がある。パーソナルコンピュータは、本願明細書において提供される幾つかの図面に従うように、制御下の対象または他の濃度の対象との比較において、時間の経過に伴う静電容量またはインピーダンスの変化のグラフ表示を提供するために用いられる場合がある。
【００９０】
図２Ｃを次に参照すると、例えば、血液／牛乳／唾液／尿または他の生体試料を例えば、連絡管５２５を介してキット５１５のスロットに接続される場合がある８つのアレイのうちの１つである場合があるアレイ５３０に落とすためのピペット５１０を備えるラボ・オン・ア・チップ実施形態のための完全なキットが示されている。キット５１５は、データの遠隔伝送のためにインテリジェント電話５２０のポートに、標準コネクタケーブルを介して接続する場合がある。
【００９１】
図２Ｄには、典型的な農場での適用が示されており、ここでは、診断医が牛舎に図２Ｃのキットを持ち込み、若干の血液／ミルク／唾液／尿または他の生体試料を図１Ａ、９のアレイの予めコーティングされている表面に滴下し、次いで典型的にはプラグインメモリにデータをローカル的な処理で格納し、またはデータ解析のため、または研究室または疾病管理センターまたは他の遠隔地に対する遠隔伝送のために、インテリジェントデバイス５２０またはパーソナルコンピュータを用いる場合がある。
【００９２】
図３Ａを簡潔に参照すると、選択された電圧および選択周波数で印加された電気信号によって生じる電界内で活動する分子に作用する例として陰性および陽性の誘電泳動が示されている。図３Ｂを次に参照すると、より大きなスケールでの交流動電学が示されており、また、矢印およびストリームラインは、その現象からの速度フィールドを示しており、所与の幾何学的配列の被覆された電極アレイに関して、メートル／秒における表面速度フィールドで分子が示されている。
【００９３】
第１例−ヨーネ病 
【００９４】
図４を次に参照すると、２０のサンプルを備えるヨーネ病のためのブラインドテストの結果が示されており、具体的には、１分当たりの静電容量の変化率が１０の陰性および１０の陽性について示されている。１分当たりの静電容量の変化において、最も小さい陰性の結果は−８．４５３９の値を有し、８．２３２１％が最大の結果である。陽性の試験結果では、１分当たりの静電容量の変化について、最小が−１５．０８４３で負の最大が−６５．００３５％であり、有意な差が示されている。大凡−１１％のあたりに、陽性と陰性テストの間の明確な境界設定が存在する。平均値は、−３６．１４９７１と比較して、陰性については−１．２８９５３であり、ここでも、陽性テストと陰性テストの間に明確な境界線が示されている。ヨーネ病のためのブラインドテストは、異なる学生によっても実行され、２０のサンプルのテストの実行により、陰性が毎分−５〜＋５％であるのに対して陽性検出が毎分−２０〜−３０％という類似の結果が得られた。
【００９５】
図５Ａを次に参照すると、ヨーネ病の診断のための陽性、陰性血清の正規化された静電容量変化のグラフが、制御サンプル（１：１０の抗原および１：２０の抗体血清の濃度）としてのバッファ液と共に示されている。データは、５００ｍＶｒｍｓの選択強度および１００ｋＨｚの選択周波数で電極アレイに電気信号を印加した状態で取得した。試験期間は、２００秒間またはちょうど３分超の実行として示されている。制御対象と比較した試験結果（陰性／陽性）は、研究室でのテストと比較して、約１分以下で見える場合がある。図５Ｃは類似の結果を示している。図５Ｃに示されているのは、制御レベルに入り込んでいるグラフィックフォームにおいて示されているように、血清濃度は、時間の経過に伴って測定される静電容量／インピーダンスなしで、１：１から１：８０まで変化する場合があることである。１：１２０〜１：２００の濃度は、制御から区別するには弱すぎる。図５Ｂは、血清濃度対、１：８０でのヨーネ病および図１のラボ・オン・ア・チップを用いた所定のテスト期間、本出願においては大凡１２０秒または２分の間、に渡る周波数１００ｋＨｚでの１００ｍＶの印加信号についての静電容量の百分率変化のグラフである。後に詳細に説明する通り、図８のラボ・オン・ア・チップからは改良された結果が得られる。図５Ｄは、陰性試験結果対陽性試験検出、ヨーネ病血清のための１分当たりの静電容量変化率（％）対そのヨーネ病検出結果をはっきりとした閾値分析と共に示す１０の陰性および陽性結果、を示す線形棒グラフを提供する。
【００９６】
チップ毎の再現性は、被覆された５本の異なる電極上で同じテストサンプルを用いることによりテストされた。５つの被覆チップサンプルの全ては、１分当たり−２０％と１分当たり−２８％との間で、同じ血清サンプルについて同程度の静電容量変化率でテストされた。ヨーネ病のための異なる血清サンプルを用いて血清毎の再現性もテストされた。１０の陽性サンプルが１０のチップ上でテストされた結果、１分当たりの静電容量の変化の範囲は−２０と−２８％の間であった。
【００９７】
第２例−結核 
【００９８】
図２の方法を通じて、１１の人結核サンプル、具体的には６つの陽性及び５つの陰性をテストした。各サンプルは二回テストした。サンプル１は、１回目の試験において、時間の経過に伴って３９．０６７９％の静電容量変化を示し、同じサンプルの２回目の試験は１４．３６１５％であり、平均値の２６．７１４７％は疾患に対する陽性検査の結論を導く。値２５が適切な閾値であると決定された。他の陽性結果の平均は、４２．８９９３５、４５．７８３４、７１．０２３１５および９２．９０８１を含んでいた。これらは、上記の閾値２５より小さな２１．９５３０５、２１．１２９３５、１１．１０２１、９．３７８９５および８．４９２９５といった陰性結果の平均と対比される。
【００９９】
図６を参照すると、人結核の試験結果がＥＬＩＳＡを用いた結果と比較されており、陰性および陽性の結果が示されている。これにより、本実施形態のテスト工程とＥＬＩＳＡが類似の結果を提供することが理解できると思われる。また、人結核試験の結果は、インピーダンスＺの時間の経過に伴う百分率変化の読み出しが取り込まれる場合と、等価な結果で静電容量Ｃの読み出しが取り込まれる場合との対比で比較されている。換言すれば、時間の経過に伴うインピーダンスは、時間の経過に伴って静電容量と等価なものとして測定される場合がある。
【０１００】
図７Ａを参照すると、この結核の適用における１００ｋＨｚ、１００ｍＶｒｍｓ及び２分の所定時間長に対する、制御下対ミリリットル当たりマイクログラムの各種濃度についての１分当たりの変化率（％）についての検出限界グラフ結果が示されている。この目的は、血清濃度の限界を決定することである。ここに見られるように、１から１０μｇ／ｍＬの範囲の濃度の抗体は、制御されたものと比較して明らかな違いを生じさせている。０.１μｇ／ｍＬの濃度は、場合によっては受け入れ可能な値として考慮される場合があると思われる。
【０１０１】
次に、ウシ結核テストの結果について説明する。ここでは、１０の陰性および１０の陽性（総数２０）のアナグマ結核サンプルがテストされ、時間の経過に伴う静電容量の変化率が計測された。
【０１０２】
【表１】
2018141775.tif 000003
【０１０３】
上記の表から、ＥＬＩＳＡの結果と比較すると、トータル２０のサンプル中、陰性と判断されるべき３つのサンプルが陽性と判断されていることが分かる。しかし、アナグマ結核サンプルに対するウシ結核検査は８５％の精度を示した。図９の改良された電極アレイが改良された結果を提供すると考えられる。
【０１０４】
図７Ｂを次に参照すると、１２０秒間印加され１ｋＨｚから５ＭＨｚまで周波数が変化する１．１μｍ当たり１００ｍＶの電圧降下信号に対して抗原１：１０濃度および血清１：２０濃度での、図１のＳＡＷ共振器電極アレイ上のアナグマ結核診断についてのグラフが示されている。グラフの分析から、時間データに渡る静電容量の変化を読み取るためには１０ｋＨｚ〜３０ｋＨｚが好適な周波数範囲であると結論付けてもよい。ヨーネ病の発見のために実行した類似のテストについて、以下図８を参照して説明する。
【０１０５】
最初に図８Ａを参照すると、予め定められた持続時間、本出願においては１２０秒または２分に渡る、１．１μｍ当たり１００ｍＶの印加電圧での、Ｍ副結核症（ＭＡＰ）抗原１：１０濃度および血清１：２０濃度による図１のＳＡＷ共振器電極アレイ上のヨーネ病診断のグラフが示されている。グラフの分析から、時間データに渡る静電容量の変化を読み取るためには１０ｋＨｚ〜１００ｋＨｚが感度の高い周波数範囲であると結論付けてもよい。図８Ｂおよび図８Ｃにおいて、印加信号および濃度は変更されていない。図８Ｂおよび図８Ｃは、５つの生物マーカーサンプルおよびそれらの平均のグラフを表しており、図８Ｂは、印加信号の周波数に対する時間の経過に伴う静電容量データの変化を、一方図８Ｃは、周波数に対する時間の経過に伴うインピーダンスデータ変化についての類似の結果を提供している。図８Ｂおよび図８Ｃにおいて、テストは、大凡４０Ｈｚから６ＭＨｚに至るまで実行されている。図８Ｂから、静電容量を読み取るためには１ｋＨｚ〜１０ｋＨｚが感度の高い周波数範囲である結論付けることができ、一方図８Ｃからは、時間の経過に伴うインピーダンス変化のデータを読み取るためには１ｋＨｚ〜５０ｋＨｚが感度の高い周波数範囲であると結論付けることができる。従って、静電容量またはインピーダンスデータを読み取るにあたり、図８Ｂおよび図８Ｃから、印加信号を１ｋＨｚ〜５０ｋＨｚの範囲に収めることが結論付けられる。
【０１０６】
図の８Ｄおよび８Ｅも、図１の示す回路と、同じ抗原および血清濃度とを用いた、ヨーネ病検出のための印加信号の周波数に対する、時間に伴う静電容量の変化および時間データに伴うインピーダンスの変化のグラフを表す。テストされる周波数範囲は、ここでも約４０Ｈｚから６ＭＨｚまである。図８Ｄの分析は、静電容量データを読み取るためには１０〜１００ｋＨｚが印加信号にとって感度の高い周波数範囲であることを示しており、一方、図８Ｅは、インピーダンスデータを読み取るための印加信号については、より低い１ｋＨｚ〜１０ｋＨｚの周波数範囲が感度の高い周波数範囲であることを示している。
【０１０７】
ウシ結核およびヨーネ病についての、また、ウシ結核についての上記の結果は、テネシー大学の発明者Ｓ．エダおよびＣ．Ａ．シュペーアに対する、２００８年９月９日発行の米国特許番号７，４２２，８６９及び２０１０年５月１１日発行の７，７１３，７１５に記載の方法を用いて、ウシ型結核菌およびＭ副結核症のエタノール抽出を用いた。
【０１０８】
改良された性能を有する電極アレイの代替例
【０１０９】
図９Ａは、それは、図１の従来の電極アレイを超える改良された結果を提供する基板上に構成される電極アレイの顕微鏡写真の表示を提供する。基板は直径１０センチメートル程度の大きさでもよく、生物学的なテストサンプルを受けるための２０の電極アレイを備えていてもよい。上記により簡潔に説明したように、図９Ａの電極アレイは、シリコンの基板を提供し、また、指の反復可能なパターン、およびその指の間のスペース、および１〜２ミリリットルのサンプルデポジット（濃度レベルによってはマイクロリットルデポジット）を考慮に入れた所望の数のサンプル受け入れ場所を提供するために、周知のフォトリソグラフィープロセスを用いて造られる。図９Ｂは、図９Ａに描かれた電極アレイにおいて繰り返される分散型の５、５、２５、２５ミクロンパターンを示す顕微鏡写真を提供する。第１の電極は２５．１８７６μｍの幅を有するものとして示されている。次いで、スペースは幅５．１４０９６０μｍで提供される。次の導体は５．４９７２２５μｍの幅を有する。パターンが繰り返される前の最後の分離は２５．０９２７３μｍである。図９Ａから、同時に複数のサンプルを受け付けてテストするために、複数の電極アレイが同じチップの表面上に配分される場合があることが判る。他の電極構成は、ピン-ライン共面電極および対面パターン電極を含む場合がある。不平等電界を生成する微小電極デザインは、チップ上の研究室（ラボラトリ・オン・ア・チップ）として実現される場合がある。以下、図１９Ａ〜図１９Ｄを参照して、コンデンサとして形成される電極メッシュについて説明し、また、図２３を参照して更なる電極アレイを説明する。
【０１１０】
図１０は、図３Ｂと類似の図面を提供し、電極アレイが、ロングレンジの交流動電学的な微小流を呼び起こして、どのようにして病原体コーティング層に対する抗原／抗体の間に改良された結合の結果を提供する場合があるかを示している。電極アレイは、シリコンＳｉ９０５の基板を備える場合がある。５、５、２５、２５、５、５、２５、２５の指／スペースのパターンは基板全体に亘って繰り返され、それにより、所与の大きさおよび周波数の印加電気信号によって＋Ｖｃｏｓωｔ、−Ｖｃｏｓωｔ、＋Ｖｃｏｓωｔおよび−Ｖｃｏｓωｔが発生する。病原体コーティング層９２０に対する抗原／抗体は、交流動電学による結合性または非結合性分子についてのＹ形状のレセプタとして現れる病原体に対する抗原／抗体と共に、上に示されている。病原体コーティング層に対する抗原／抗体の分子は、５ミクロンの指と２５ミクロンの指の間の５ミクロンのスペースの方へ進み、２５のミクロンスペースから遠ざかるように移動した後再び戻ってくるように示されている。図９の設計、および図１の設計との比較から、指の値の範囲は、１と大凡１００ミクロンとの間で、細菌性疾患の検査において成功する場合があると結論付けることができる。同様に、指の間のスペースの範囲は、１から大凡１００ミクロンの間で成功したテスト結果を与える場合がある。金／クロミウムが電極の組成として用いられる一方、金／チタン、金、銀、アルミニウムおよび銅のような他の導電性金属が有効に用いられる場合がある。本願明細書中以下においても説明されるのは、コーティングが施されていない電極に対する、コーティングの適用による効果である。
【０１１１】
実際には、図１の電極アレイを用いて２０のヨーネ病テスト、すなわち、前述と同様１０の陰性および１０の陽性テストを実行し、以下の結果が得られた。陰性テストについては、範囲は−２．６３５６と＋０.７５３７％変化の間である。陰性テストについては、範囲は−５２．３１５２と−８３．８０３２％変化の間である。これらの範囲は、微小に製造された５−５−２５−２５チップと、ヨーネ病のための市販の電極アレイとの間の静電容量の変化率間に非常に改良された区別を示す。これらの試験の印加信号は５００ｍＶおよび１００ｋＨｚであった。
【０１１２】
図１１は、ヨーネ病のための１０の陰性および１０の陽性サンプルについての１分当たりの％における静電容量変化率の間の改良された陰性／陽性区別のグラフィック例を提供し、結果間に劇的な区別を示している。
【０１１３】
図１２は、ミリリットル当たりのマイクログラムでの濃度に対する、１分当たりの静電容量変化率％のグラフを提供し、図９のチップを用いた検出限界を示している。グラフに示されるように、1ｍＬ当たり０.０１μｇ程度の低さの濃度は、５００ｍＶの信号および１００ｋＨｚの信号周波数について受け入れ可能な結果を示す。
【０１１４】
図１３は、ミリリットル当たりのナノグラムにおける濃度に対する、１分当たりの静電容量変化率％のグラフを提供する。信号強度が１Ｖｒｍｓまで上げられ、検出の受け入れ可能レベルが濃度０.５ｎｇ／ｍＬであることがグラフから見て取れる。
【０１１５】
図１４は、１ミリリットル当たり１００ナノグラムの濃度、および５ミクロンの電極フィンガ当たり５００ｍＶの印加信号について、図９のウェハにおける更なる検出限界テストを提供しており、１０ｋＨｚから１０ＭＨｚまでの印加信号の周波数に対する時間に伴う静電容量の変化がグラフで示されている。このテストは、約４０Ｈｚから約６ＭＨｚまでの周波数範囲にわたり、３００秒（５分）にわたって行われた。図１４のグラフの分析から、図９のウェハについて時間に伴う静電容量の変化を読み取るためには１０から１００ｋＨｚまでの周波数範囲が感度の高い周波数範囲であると結論付けることができ、これは、図１のＳＡＷ電極アレイについての感度の高い周波数範囲と好ましく匹敵する。
【０１１６】
第３Ａ例− 病原体検出（乳腺炎） 
【０１１７】
次に図１５乃至図１９を参照して、授乳中の動物からミルクのサンプルを取り出す場合のある、乳腺炎のための病原体検出について説明する。レンサ球菌ウベリスはレンサ球菌の種である。タンパク質Ｇは、グループＣにおいて表される免疫グロブリン結合性タンパク質であり、また、タンパク質Ａに非常に似ているが異なる特異性を有しているストレプトコッカル（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）細菌である。それは、Ｆｃ領域への結合性による抗体の精製に応用が見出された６５ｋＤａ（Ｇ１４８タンパク質Ｇ）および５８ｋＤａ（Ｃ４０タンパク質Ｇ）細胞表面タンパク質である。タンパク質Ｇは、図１５に示すラボ・オン・ア・チップの遮断および細菌において用いられる実験群および制御群の夫々の標本の準備のために用いられる。
【０１１８】
図１５を参照すると、２つの陰性の制御群および１つの実験群が病原体検出に関わっている。タンパク質Ｇは、図１５の通り、1ミリリットルにつき１０マイクログラムの濃度および２ミリリットルの量だけ、加湿設備において一晩、上記の通り電極アレイをコーティングする使用のために、培養される場合がある。「遮断」として識別された領域には、制御（血清でない）バッファＢが、０．１倍の濃度、２マイクロリットルの量で１時間、として示されている。実験的な遮断溶液は、バッファＢにおける血清希釈１：１０を含む場合がある。当該アレイは０．１倍濃度のＰＢＳＴを２マイクロリットル用いて２回洗浄された。図１５の「細菌」部分は、実験群として、０．１倍のＰＢＳ溶液において２マイクロリットルを用いて１×１０７の細胞数で（ミルクの細菌をカウントすると到達するミリリットル当たりの細菌の細胞密度と同じ）Ｓウベリス細菌を備える。制御（細菌なし）は、０．１倍濃度のＰＢＳおよび２マイクロリットルである場合がある。
【０１１９】
図１５に従って、病原体検出のために３つの周波数スイープが実行された。スイープ１は、５ｍＶの単一強度で１秒間に亘り４０Ｈｚと６ＭＨｚの間で行われた。スイープ２は、１００ｍＶの単一強度で、２０１の測定点をとったスイープ周波数は５ｋＨｚ、１０ｋＨｚ、２０ｋＨｚ、５０ｋＨｚ、１００ｋＨｚ、３００ｋＨｚ、５００ｋＨｚ、８００ｋＨｚおよび１ＭＨｚであった。第３の周波数スイープ（スイープ３）は、５ｍＶｒｍｓで１秒間に亘り４０Ｈｚから６ＭＨｚ（スイープ１と同様）であった。スイープ２は、適切な周波数をテストし、また、制御群に対する異なる周波数で病原体検出コーティングの細菌性溶液結合性を比較することにより静電容量における制御的な変化に対して細菌性疾患（乳腺炎）の診断を示す、時間に伴う静電容量の変化を維持するための実験的なスイープである。これらの結果は図１６に示される。
【０１２０】
図１６Ａを次に参照すると、細菌なし、０．１倍濃度ＰＢＳの血清の制御郡について、スイープ２の結果だけ、時間に伴う静電容量の百分率変化のグラフが示されている。細菌なしの陰性の制御群では、信号が４００ｋＨｚであるときに、時間に伴う静電容量が最大の百分率変化を示す。８００ｋＨｚおよび３００ｋＨｚでは、その時間に伴う静電容量の変化率が僅かに減少する。５０ｋＨｚでは、その時間に伴う静電容量の百分率変化がより大きく減少する。
【０１２１】
図１６Ｂを次に参照すると、特定の血清抗体なしの陰性制御郡について、スイープ２の結果だけ、時間に伴う静電容量の百分率変化のグラフが示されている。陰性の制御群は、信号が８００ｋＨｚであるときに、時間に伴う静電容量において最大の百分率変化を示す。このスイープにおける他の全ての周波数で、静電容量の百分率変化は著しくより小さな値であった（より良好であった）。
【０１２２】
図１６Ｃを次に参照すると、抗体血清と結合している細菌溶液（Ｓウベリス／乳腺炎）について、スイープ２の結果だけ、時間に伴う静電容量の百分率変化のグラフが示されている。細菌溶液の群は、信号が３００ｋＨｚであるとき、また５０ｋＨｚであるときに再び、時間に伴う静電容量の最大の百分率変化を示す。１００および２００ｋＨｚでは、その静電容量の百分率変化はより小さなものであった。
【０１２３】
上記の結果は図１６Ｄにまとめられており、これは、図１６Ａ、図１６Ｂおよび図１６Ｃの結果が互いに重ねあわされた複合グラフであり、そこに描かれたグレイスケールは、周波数ごとに、左から右に向かって、血清なし、細菌なし、および結合の順で、時間に伴う静電容量の百分率変化を示している。図１６Ｄのすべての周波数位置で、８００ｋＨｚについての周波数結果を除いて、結合の結果は、血清および細菌を制御した結果を超えている。このグラフから、６０秒間の１００ｍＶでの５０ｋＨｚと４０００ｋＨｚの間の印加信号（スイープ２の信号パラメータ）は、Ｓウベリス結合と陰性制御を適切に区別すると結論付けてもよい。図１６Ｅは、取得された全てのデータ、および全ての点で計算された標準偏差についてのチャートを提供する。
【０１２４】
図１７を次に参照すると、６０秒当たりのスイープ３、すなわちスイープ１によって算出されたグラフが示されており、ここでは、９つの異なる周波数における、時間に伴う静電容量の百分率変化の曲線が、反応からの平均的な変化を示している。このグラフからは、４０Ｈｚと１ｋＨｚの間は、上記の範囲に渡る陰性制御群（血清なしまたは細菌なし）のどちらかに対する実験群（結合性）の区別により、時間に伴う静電容量の百分率変化を読み取るうえで感度の高い周波数範囲であると結論つけることができる場合がある。
【０１２５】
図１８Ａ、図１８Ｂおよび図１８Ｃにおいて、６０秒当たりのスイープ３、すなわちスイープ１によって算出されたグラフが示されており、ここでは、時間に伴う静電容量の百分率変化の曲線は、図１６Ｄから算出した好適な信号周波数である５０ｋＨｚ、１５０ｋＨｚおよび３００ｋＨｚの信号について研究された。このグラフからは、４０Ｈｚと２ｋＨｚの間のような低い周波数では、容量またはインピーダンスの百分率変化が取得される際に、より顕著な差異が認められると結論付けることができる場合がある。なお、これらの周波数の間では、３００ｋＨｚにおいて最も低い曲線を示す（図１８Ｃ）実験群（結合）は、３００ｋＨｚにおける細菌なしまたは血清なしの陰性制御郡よりも著しく大きな静電容量の百分率変化を提供する。１０ｋＨｚを超えると、実験群（結合）と、細菌なしおよび血清なしは一緒に近接した状態となるため、結合を区別することが容易でなくなる場合がある。更にまた、これらの周波数の間では、５０ｋＨｚの印加周波数では下から２番目の曲線となる結合は、周波数範囲の直ぐ上の１００Ｈｚと１ＫＨｚの間で細菌曲線から区別され、その区別は顕著なものではないが、次いで、例えば１０ｋＨｚで、再び離れる方向に移動する。図１８Ｂの１５０ｋＨｚのセットは、周波数スペクトルの全域にわたって、結合の明白な検出を示すように見える。要約すると、このグラフからは、乳腺炎／Ｓウベリスの区別は、１５０ｋＨｚまたは３００ｋＨｚの信号周波数、および４０Ｈｚと１０ｋＨｚの間が好ましいように見える。記載されているように、細菌は、被覆された電極アレイに１００ｍＶの信号を印加した６０秒または１分のテストで区別される場合がある。
【０１２６】
第３Ｂ例−体細胞数（乳腺炎）
【０１２７】
図１９Ａは、基板と、例えば、牛の乳腺炎の検出のための白血球をカウントするために開口サイズが異なるサイズに設定されたオーバーレイ電極メッシュとの線図である。体細胞のカウントは、ミルクのサンプルにおいて体細胞（好中球のような免疫細胞）の数を計量する。図１９Ａによれば、例えば１００μｍの開口を有する最上層の電極メッシュを備える電極アレイは、例えばより小さな５０μｍの開口を有する底部の電極メッシュから間隔を置いて覆いかぶされるように配置される場合があり、その目的は、本来の生物マーカーサンプルが最上部および底部の電極メッシュを通過し、例えばサンプルリザーバまたは図示しない開口部に到達するのを可能にして、図１９Ａの実施形態が、上記の通り静電容量の変化を経た体細胞のカウントを経て乳腺炎を検出する機会を促進するように、サンプルの収集および／または当該配列からのクリーニング除去を可能とすることである。実際には、最上層の電極は１０と５００ミクロンの間の開口（好ましくは５０と１５０ミクロンの間の開口）を有する場合があり、また、底部の電極は被験対象である授乳中の動物、牛、ヤギ、ヒツジなどに応じて５と１５０ミクロンの間の間隔（好ましくは２０と８０ミクロンの間の間隔）を有する場合がある。図１９Ｂは、最上層と底部の電極メッシュ（コンデンサの２つのプレート）の間の間隔を示し、これら２枚のメッシュまたはグリッドネットワークはコンデンサを形成している。本明細書における使用および請求項において、第１の「メッシュ」は、ネットワークパターン化された、例えば、開口を備えるまたは備えていない第１の電極アレイを備える矩形のネットワーク電極を備えている。下方のメッシュも、同様に、開口を含んでいてもよく、また、含んでいなくても良い。換言すれば、メッシュは固いものであってもよい。第２のメッシュは、第１のメッシュの下に示されており、それらのメッシュの間に、コンデンサを形成するための間隔を提供している。図１９Ａの実施形態において、サンプルは、メッシュを通過してリザーバに到達する。代替の実施形態において、パターン化されたネットワークメッシュは、開口を備えずに表面が固い場合があり、サンプルは、コンデンサを形成している２枚のメッシュの最上部で静止し、または最上層を通過して固い底部メッシュに達する場合がある。図１９Ｃは、覆いかぶされた電極メッシュ上にサンプルがどのように滴下されるか、およびそのメッシュにどのように特定の交流信号が印加されるかを示す線図を提供する。図１９Ｄは、基板上の、覆い被されたメッシュ電極の写真の白黒線画と、一の実施形態の、覆い被された電極網を示す拡大図とを提供する。
【０１２８】
サンプル３８５３は、例えば、1ミリリットルにつき１．９２×１０６粒子の粒子密度を有し、また、サンプル４１１８は、1ミリリットルにつき３．５×１０６粒子の粒子密度を有する場合がある。これらのサンプルは、授乳中動物からとられる体細胞（ミルク）サンプルを備える。図２０Ａは、時間に伴う正規化された静電容量（１分テスト）の結果のグラフを提供し、図２０Ａ中に、細胞固定（細胞なし）、サンプル番号３８５３およびサンプル番号４１１８についての曲線を示している。実験的方法は、上記のデバイスのために用いられたものと正確に同一である。ボックスにおいて示されるセル固定（細胞なし）溶液およびサンプル３８５３の静電容量は、図１９Ａ〜図１９Ｄの覆い被された電極メッシュアレイに対して１００ｋＨｚの印加周波数および５００ｍＶの電圧の印加信号を与えた１分（６０秒）テストにおいて５．４６９％および１．１３０６５％の増加を示した。図２０Ｂは、１００希釈のサンプル４１１８が、細胞なしに対して乳腺炎を検出する場合があることを示すために、体細胞なしに対するサンプル４１１８の濃度レベルを調査したものである。上記と同様の５００ｍＶのスキャン電圧および１００ｋＨｚの周波数が適用された。純粋な４１１８は、静電容量において、図２０Ａにおいて−０．９％と示されているように、−１．５４％の負の変化を示した。一方では、１００希釈の４１１８は、静電容量において２．１５％の正の変化を示し、また１０希釈の４１１８は静電容量において１．２７％の正の変化を示した。図２０Ｃは、時間の変化に伴う静電容量の変化に対する５分間テストにおける体細胞カウントのグラフを示す。静電容量の変化率とミルクにおける体細胞カウントとの間には強い相関が観察され、この方法が乳腺炎の診断に役立つことが示されている。グラフにおいて、ｙ＝−１．８７４ｌｎ（ｘ）＋１４．５１７であり、Ｒ２＝０．８７６３である。２００Ｋ［体細胞／ｍＬ］の良好なカットオフ値で、テストの感度および特異度は、それぞれ、９４．７％および１００％であると算出される。上記の結果は５分で得ることができ、この時間は、インラインシステムで用いるうえで十分短く、かつ高い精度を達成する。類似の結果が、別々に行われた他の２つの実験においても得られた。テストのパラメータを変えることにより、或いはある程度の精度を犠牲にすることによりテスト期間はより短くすることが可能である。ヨーロッパにおいては、ミルクが販売に適したものであるかどうか決定するために４００ｋの体細胞カウントが用いられる。米国では、ミルクが販売に適したものであるかを決定するための体細胞カウント値は７５０ｋである。これらの特徴は、体細胞カウントについてのカットオフのためにそれぞれの地域において利用される場合があり、同様の感度および特異度を達成する場合がある。
【０１２９】
第４Ａ例−反ＰＡＧ抗体を介した経た妊娠
【０１３０】
図２１は、妊娠検出のために、ＩＤＥＸＸから入手可能なα−ＰＡＧ（反ＰＡＧ抗体）のコーティングを利用した妊娠テストのために、図１のＳＡＷ電極アレイを準備する方法のステップを例示する。第一ステップでは、室温の加湿設備において一晩、１倍のＰＢＳの中で1ミリリットルにつき１０μｇでＳＡＷアレイをタンパク質Ｇで処理する。次に、このアレイは、０．１倍のＰＢＳＴで一度洗浄してもよい。それから、ＩＤＥＸＸから入手可能なα−ＰＡＧがロードされ、室温でほぼ１時間保持される。ロードされたアレイは、再び０．１倍のＰＢＳＴで洗浄され、次いで室温で３０分から１時間、０．１倍のバッファＢによりブロックされる。
【０１３１】
テストは、陽性または陰性の実験群としての希釈を最適化するために、１：５〜１：２０で血清をロードする工程を備えてもよい。また、０．１倍のバッファＢが制御群としてロードされてもよい。
【０１３２】
スイープおよびデータ収集プロセスは、周波数に渡る静電容量の値を初期化するために、１秒間、４０Ｈｚ〜６ＭＨｚの間で、約５ｍＶを印加する工程を含んでもよい。次に、制御および本物のサンプルについて、印加信号は、時間に伴う静電容量を記録するほぼ１分間のテストのために、１００ｋＨｚで１００ｍＶであってもよい。プロセッサは、次いで、初期静電容量スイープの関数として、時間に伴う静電容量の変化を算出してもよい。
【０１３３】
図２２Ａおよび２２Ｂは、それぞれ、印加信号の周波数に対する時間に伴う静電容量の変化のそれぞれのグラフを提供しており、そこにおいては、５０ｋＨｚ以上の範囲の信号が妊娠を検出するために用いられる場合があり、また、妊娠に対する５件の検査の概要は、陽性対陰性またはバッファ液が、妊娠を検出する場合があることを要約した形で表している、と結論付けることができる場合がある。
【０１３４】
電極アレイ設計の検出限界の研究
【０１３５】
図２３Ａは、広く間隔を開けて置かれた複数の電極を先ず提供し、次いで広い電極毎に複数の近接電極を提供することで、このように構成された電極アレイの検出限界を研究するために構成された、互いに嵌合する電極アレイの図面を提供する。この設計およびテストの目的は広く間隔を開けて置かれた非対称電極と、生物マーカを狭い複数の平行した対称電極に引きつける広い電極とから成るアレイ構造の検出限界を明らかにすることである。以下、非対称電極の広い間隔の特定の寸法を上から下に読み上げる。
第1の非対称電極の幅であるＤ１は２２．８９９４６μｍ（ほぼ２０ミクロン）である。互いに嵌合する広い非対称電極間の第1の間隔であるＤ２は９．１５９７８２μｍである（ほぼ１０ミクロン）。非対称の互いに嵌合する電極間の広い間隔であるＤ３は２９．３１１３０（ほぼ３０ミクロン）である。そして、最も広い非対称電極の幅であるＤ４は
５９．５３３５９μｍ（ほぼ６０ミクロン）である。次に、狭い間隔で置かれ、図２３Ａ底部の引き出し図に詳細が示されている複数の対称の幅の狭い電極について説明する。引き出し図は、以下の間隔および対称電極の幅を示している。複数の対称電極の全幅であるＤ３は、ほぼ３０μｍである。Ｄ４は、ほぼ１．５のμｍの対称電極間の間隔である。そしてＤ２は、対称電極の１つの幅またはほぼ２μｍである。新規な電極上の検出限界テストは、対称および非対称の互いに嵌合する電極の組み合わせとして電極パターンを形成する工程を含み、それにより、非対称電極は、より多くの粒子が、それらが結合する場合のある対称電極に引きつけられるような流れを起こすのを助ける場合がある。この非対称パターンは、およそ１０／２０／３０／６０であり、そして、対称パターンは、およそ１．５／１．５／１．５／１．５（または２／２／２／２または互いに嵌合する１．５／２パターン）である。
【０１３６】
図２３Ｂは、電気運動現象の影響を受けて広く間隔を開けて置かれた電極に引きつけられ、次いで、近接して置かれた電極と結合する粒子のシミュレーションされた引力および流れを示している線図である。矢印は流れを表し、線は、広く間隔を開けて置かれた電極により決定され、狭い間隔で置かれた電極が位置するところの指定領域に向かう粒子の対流を示す。図２３Ｃは、例えば、1ｍＬにつき１ｎｇ、1ｍＬにつき２ｎｇ、１ｍＬにつき５ｎｇ／ｍＬなどにおける生物マーカの粒子濃度の改良された検出を示す線図である。５７．５ｋＨｚの印加信号周波数でテストが行われたところ、静電容量の変化は、１ｎｇ／ｍＬの濃度から２ｎｇ／ｍＬの濃度の変化に対して２倍になり、次いで５ｎｇ／ｍＬの濃度となることで更に２倍になるのが見て取れる。制御の１および２も、０．５ｎｇ／ｍＬという低濃度がそうであるように、静電容量に正の変化を与えるものとして示されている。繰り返すが、検出限界の実験は、結合のために対称電極に向かう粒子の引力を提供するためには、互いに嵌合する細い電極と広い電極の組み合わせが好ましいことを示しているように見える。
【０１３７】
上記の結果が示唆するように、説明の通り被覆され、かつ、所与の大きさ、周波数および例えば１０分未満といった短い期間にわたる信号を受けるように準備されたラボ・オン・ア・チップのいくつかの実施形態は、フィールドまたは多くの感染症の臨床診断（抗原、病原体、異常な白血球数を介する）、および、例えば妊娠のような物理的状態のためのタンパク質検出に、迅速性のために多分に用いられる場合がある。
【０１３８】
第４Ｂ例−小分子検出 
【０１３９】
プロゲステロンが唯一の例であるが、小分子検出のためのラボ・オン・ア・チップ構造およびテストのための処理は、上記に記載したものと非常に類似している。プロゲステロン値は、妊娠検査の手段である場合がある。ウェハ上の５／５／２５／２５μｍ電極が利用される。しかしながら、このような治療が時間に伴う静電容量の変化率に若干の影響を及ぼすか否かを判断するために、３-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を有する治療の影響が分析された。
【０１４０】
特に、小分子検出（例えば、プロゲステロン）のために、反プロゲステロンポリクローナル抗体が、電極表面に０．１倍のＰＢＳにおいて追加され、例えば、加湿設備において一晩（例えば、４〜８時間、好ましくは６時間）培養を許容した。一旦培養した後、例えばＰＢＳ-Ｔにより、例えば３回、電極を洗浄することとしても良い。次いで、０．１倍のバッファＢを用いて、遮断を確実なものとするため例えば３０分を超過する期間にわたって、ブロッキングが実行される。次に、反プロゲステロンポリクローナル抗体を有する遮断された電極は、ＰＢＳ-Ｔで、例えば３回洗浄される。
【０１４１】
テストは、制御としてプレーンな０．１倍のバッファＢを用いて、１ｎｇ／ｍｌで開始し、０．１倍バッファＢにおいて１０，０００ｎｇ／ｍｌに至るまでプロゲステロンの濃度を上昇させて、プロゲステロンを異なる濃度で追加することによって実行された。手元の試験において３つのチップがテストされた。濃度レベルは、時間に伴う静電容量に変化のない制御から約４．２ｄＣ／ｄｔ（％／分）へ、次いで、１０ｎｇ／ｍｌのプロゲステロンにおける約１０．１ｄＣ／ｄｔ（％／分）まで増加する結果となった。１０ｎｇ／ｍＬについてＣＶは１．７％であった。ついで、例えば、１００ｎｇ／ミリリットルまたは１０００ｎｇ／ミリリットルで、プロゲステロンのより高い濃度レベルがテストされた際には、テストのｄＣ／ｄｔ％／分はまだ提示されたが、そのレベルは約２．５ｄＣ／ｄｔに減少し、プロゲステロンのより高レベルのための飽和が示唆された。
【０１４２】
上記のようにＡＰＴＥＳ処置も試みられ、その結果は興味深いものであった。詳しくは、エタノールアルコールにおける約２ｖ／ｖ％のＡＰＴＥＳが追加され、６３°Ｃで約４時間培養することができ、次いで２倍の蒸留水で３回洗浄され、更に乾燥を施すことができる。乾燥を速めるためには、エアガンを用いてもよい。ＡＰＴＥＳ処置をうけた表面は、エアガンにより非常に迅速に乾燥し、顕微鏡の下で点検された際にクラスタの形成は認められなかった。
【０１４３】
次に、２．５％のグルタルアルデヒド溶液が追加され、室温で約２時間培養することができた。電極は、その後二重蒸留水で３回洗浄された。電極は、上記の通りにプロゲステロン抗体を追加する前に乾燥することは許されなかった。最後に、１００ｍＭのエタノールアミン溶液が追加されて、１時間室温で培養することができた。プロゲステロンをロードする準備の残りは上記と同一であり、３０分より長い間０．１倍のバッファＢで遮断され、ＰＢＳ-Ｔで洗浄される。
【０１４４】
プロゲステロンは、０（制御）と、０．１倍のバッファＢにおける１ｎｇ、０．５ｎｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇおよび１００ｎｇ／ｍｌの濃度との間のレベルにおいてＡＰＴＥＳ処理チップに追加された。測定は下表にまとめられており、ｄＣ／ｄｔ（％／分）が１００ｋＨｚの周波数で実行され、電圧レベルは５００ｍＶであった。
【表２】
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【０１４５】
ＡＰＴＥＳ処置あり対処置なしのテスト結果は、時間に伴う静電容量の変化がＡＰＴＥＳなしに対してＡＰＴＥＳありで上昇し、また、例えば、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬの間では、例えば９から６から５のようにより緩やかな飽和を示すようになり、対するＡＰＴＥＳなしでは、１０ｎｇ／ｍＬの結果である１．２９０９は、１．２０１９である「制御」に対してほとんど識別ができないといった傾向を示す。上記のようなＡＰＴＥＳ処置が小分子検出の助けになるということは、公正に結論付けることが可能である場合がある。
【０１４６】
第５例−凝固の指標としてのＤダイマー
【０１４７】
緊急条件は、手術の後、またはアクティブな生活の間に発生する場合がある。Ｄダイマーは凝固の指標である。以下の一連の試験では、ＰＰｙで被覆された電極が、コーティングなしの電極と比較されている。被覆チップの準備にはいくつかの工程が含まれる。チップは、０．１Ｍの輝緑石硫酸ナトリウムによって３回掃除される。次に、９３０μＬの硫酸ナトリウムにピロール７０μＬを追加して、０．１Ｍピロール／０．１Ｍ硫酸ナトリウムを作ることにより、ポリマーコーティング溶液が準備される。次いで、５／５／２５／２５μｍウェハ上に０．ｌＭピロール／０．１Ｍ硫酸ナトリウムをロードすることによりポリマーが電気化学的に堆積される。コーティングを堆積させるために室温で約５秒間、大凡１．５Ｖが印加され、ウェハがＰＢＳで２回洗浄される。ポリピロール被覆チップの表面に抗原をロードし、またはその表面を機能化するために、反Ｄダイマー抗体が０．１倍ＰＢＳにおける１０μｇ／ｍＬとしてロードされ、室温で、加湿設備内で３０分間培養される（加湿設備は任意または必要に応じて）。その後、チップはＰＢＳＴで３回洗浄される。
【０１４８】
テスト結果は、Ｄダイマーなしの制御、０．１倍バッファにおける異なる濃度でＤダイマー溶液をロードすることにより生成した。テスト溶液には０．１倍ＰＢＳが用いられた。テストされた周波数範囲は、４０Ｈｚと６ＭＨｚの間である。
【０１４９】
下表は、３つのテストについての濃度（／ｍＬ）における詳細な結果を示す。テスト条件は、５００ｍｖ（電圧）、１００ｋＨｚ（周波数）および１分（期間）である。結果の単位はｄＣ／ｄｔ（％／分）である。
【表３】
2018141775.tif 000005
【０１５０】
Ｄダイマー検出においては、ほぼ１００ｐｇで飽和に到達するかのような様子が表れている。テストを成功させるテスト範囲は、１０ｐｇと１００ｐｇの間にあるように見え、飽和に達した後の制御と比較すると、１０００ｐｇは、まだ満足な結果を生み出している。
【０１５１】
制御のテスト結果は以下に示されているが、ここでは、表面の機能化および遮断なしに、サンプルが直接ＰＰｙ被覆電極に滴下されている。変化率が非常に小さく、多量の非特異的結合の可能性を除外する傾向があることが判明した。
【表４】
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【０１５２】
図２４Ａおよび図２４Ｂは、インピーダンス（虚部）対抵抗(実部）のナイキストプロットによるテスト結果を示す。テストされた周波数範囲は１ｋＨｚから１１０ＭＨｚである。それらの曲線は、例えば、これもまた我々のテスト結果によって示される１ｍＬにつき１０ｐｇの濃度とよく相関しており、それは、今のところ、１０〜１００ｐｇが我々の検出限界である場合があり、１００ｐｇを超える結果は飽和を示していることを示唆している。
【０１５３】
第６例−糖（グルコース検出）
【０１５４】
５／５／２５／２５の電極の実施形態は、糖、特にグルコースのテストのためにも用いられる。糖をテストするためのチップをロードし、ブロックするためには、類似の方法が追従される。グルコースのために、チップにロードされブロックされる分子プローブとして、我々はグルコースオキシダーゼ（酵素）を用いた。以下の表は、周波数をテストするための最適化を示すために用いられる。下の表から分かるように、５０ｋＨｚと１００ｋＨｚの間の周波数は良好である。
【表５】
2018141775.tif 000007
【０１５５】
下記にも表が示される。この表からは、テストにおい電圧レベルが重要な要因ではないということが判断できる場合がある。テストは１０ｍＶと５００ｍＶの間の電圧値について実行されており、電圧レベルは結果に大きな影響を与えていない。
【表６】
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【０１５６】
以下のテーブルは、グルコース検出のためのテスト結果を提供している。ここで用いられた周波数は１００ｋＨｚであり、電圧は５００ｍＶである。また、選択された測定周波数で電圧を印加するためにアジレント装置を用いた。
【表７】
2018141775.tif 000009
【０１５７】
この結果はｄＲ／ｄｔ（％／分）、但しＲは抵抗、で示されており、１０００μｇで飽和に達しているように見える。以上に示されているように、グルコースが同様にテストされる場合のある糖の唯一の例である。糖検出の１つの示唆された適用、例えば、蔗糖は、医療用途（例えば、グルコース）に加えて、ビール内の糖の検出である。
【０１５８】
第７例−酵素のレドックス反応検出 
【０１５９】
酵素のレドックス反応は、疾患の診断または溶液内の分子検出のために用いられてきた。酵素のレドックス反応は、一般に酵素と基質の間の反応を含み、溶液の誘電率を変えるイオンを生成する。誘電率の変化は、電気化学的に、例えば、溶液を通って流れる電流の変化を測定することによって検出される場合がある。
【０１６０】
電気化学的な検出により酵素のレドックス反応が疾患の診断のために用いられる場合には、少なくとも３つの異なる方法、すなわち基質の検出、酵素の検出、およびプローブの検出がある。
【０１６１】
基質検出の例は、過酸化水素を生成しながらグルコース（基質）がグルコノーラクトンに変換される際に触媒作用を及ぼす診断レドックス酵素であるグルコースオキシダーゼを用いている。過酸化水素のレベルは、サンプル内のグルコースレベルの代用物として電気化学的に測定することができる。この反応は、糖尿病患者において上昇するグルコース（基質）レベルの測定の根拠である。血液中のグルコースの正常レベルは５ｍＭであり、この原理に基づくグルコースの検出限界は、１ｎＭから２５μＭの範囲であることが報告されている。
【０１６２】
酵素検出の例は、一般の組織の損傷マーカである乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）が、アスパラギン酸がグルタミン酸塩に変換する際に触媒作用を及ぼすときである。グルタミン酸塩がグルタミン酸塩オキシダーゼによってケトグルタル酸に変わるときに、過酸化水素が副産物として生成され、上述した通り電気化学的に検出され得る。ＬＤＨの正常レベルは３ｎＭであり、商用的なテストの検出限界は３０ｐＭである。
【０１６３】
プローブ検出に関しては、アプタマのような標的分析物のプローブがレドックス酵素阻害剤に接合される際に、このような接合は、分析物がない場合にだけレドックス酵素の反応を阻害し、従って、溶液内の分析物のレベル測定に用いることができる。この手法は、疾患診断のためにだけでなく、環境サンプルの化学汚染物質のような他の目的のためにも用いることができる。
【０１６４】
これらの３つの概念は、感度が高く迅速な診断のためにラボ・オン・ア・チップに適用される場合がある。ラボ・オン・ア・チップは、電極の表面付近での酵素のレドックス反応から生じるサンプル溶液の誘電率の変化に与えられるべきものである境界面静電容量の変化を検出する場合がある。電極アレイは、診断レドックス酵素に特有のリンカー分子（酵素検出のため）およびレドックス酵素自体（基質またはプローブ検出のため）の何れか一方で機能化／被覆化される場合がある。低い交流電圧信号は、電極アレイの表面に向かうターゲット分子（例えば、酵素、基質、および／またはプローブ）の対流を生み出すＡＣＥＫ効果を誘導するために電極アレイに印加される場合があり、リンカー分子（酵素検出）または固定化酵素（基質またはプローブ検出）によって捕えられる酵素によって触媒作用を及ぼされるレドックス反応を促進する。酵素-基質対に特有なレドックス反応は、電極アレイの表面で境界面静電容量の変化を測定することによって検出される場合がある。
【０１６５】
図２５Ａは、交流容量性検出によるレドックス酵素の検出を例示する概念図である。Ｙ型レセプタ（すなわち、リンカー分子）として現れており電極に固定されている抗体は、特定の酵素（●として示される）を捕獲し、この酵素は、次に、サンプル溶液／電解液中の基質（＊として示される）と共にレドックス反応に触媒作用を及ぼす。反応は、電解液／電極の界面で起こり、境界面静電容量の変化によって検出されることができる。
【０１６６】
図２５Ｂは、図２５Ａの「電解液-電極」システムの代表的な等価回路である。電荷移動抵抗Ｒｃｔおよび境界面静電容量Ｃｉｎｔは、電極／電解液の界面での電荷転送に対して責任がある場合がある。図２５Ｂにおいて、電解液抵抗はＲｆｌｕｉｄと、また電解液静電容量はＣｆｌｕｉｄと表されている。酵素の反応は、電極上のバイオポリマー層に亘って電荷移動を生じさせる。電気的には、この現象は、Ｒｃｔの下降およびＣｉｎｔの上昇として現れる場合がある。Ｃｉｎｔをモニタすることによって、ラボ・オン・ア・チップは、電極表面の近くで起こっているプロセスに注目する。酵素の反応が続くに連れ、Ｃｉｎｔは連続的に増加する。この方法によれば、酵素による増幅と境界面静電容量測定のためにより高い感度が期待される。
【０１６７】
境界面静電容量Ｃｉｎｔは、酵素のレドックス反応の指標である。図２５Ｂの等価回路が示すように、Ｃｉｎｔはセンサ表面の変化だけを表す。このように、検出は、酵素反応が起こる界面の周辺に強く局所化される。この反応は、従来の電気化学検出方式の場合と同様に、電極間のイオン環境の平均ではない。従って、ラボ・オン・ア・チップを用いて酵素のレドックス反応を検出することでより高い感度が得られる。加えて、合成流体内の干渉の効果は、主として流体抵抗Ｒｆｌｕｉｄを通して現れる。このような干渉は、Ｃｉｎｔだけを測定することで容易に排除することができる。従って、酵素のレドックス反応を検出するためにラボ・オン・ア・チップを用いれば、高い感度と特異度を期待することができる。
【０１６８】
検出は、分子（基質および製品を含む）のＡＣＥＫ対流と境界面静電容量測定の同時誘発を可能とする固定周波数で実行される。ＡＣＥＫで一般に用いられる周波数では、インピーダンスがＣｉｎｔとＲｆｌｕｉｄの直列接続として近似される場合があり、複雑なデータ処理または測定器に頼ることなくＣｉｎｔの直接抽出が可能である。
【０１６９】
そのうえ、正規化されたＣｉｎｔの変化率を用いる検出測定基準によって、ベースラインのドリフトまたは基準センサ／基準サンプルの必要性が回避される場合があり、検出処理および測定器が非常に単純化される。測定器の精度上の要件が緩和される場合もあり、センサの違いの影響が最小化され、システムを手頃な価格で構築することが可能となる。
【０１７０】
図２５Ｃは、異なる基質濃度について、酵素によって機能化された電極を用いた基質検出のための実験の結果を示す。溶液の基質は、テトラメチルベンジジン二塩化水素化物ジ水和物（ＴＭＢ）（Ｍ．Ｗ．＝３４９．３、ＭＰバイオメディカル有限責任会社、カタログ番号：１５２１１６）である。電極に固定される酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（サーモサイエンティフィック、番号：３１４９０）である。電極表面は、０．０１％のトリトンで３０分間ブロックされた。実験は、２０ｋＨｚ、１００ｍＶの交流信号によって行われた。図２５Ｃは、ＴＭＢサンプルの１ｆＭ、１０ｆＭ、１００ｆＭおよび１０００ｆＭ（１ｐＭ）で記録された正規化されたｄＣ／ｄｔを示す。図に見られるように、正規化されたｄＣ／ｄｔは、基質濃度の増加に従って比例して増加する。
【０１７１】
標識粒子を有する検出増幅
【０１７２】
ラボ・オン・ア・チップの検出限界（ＬＯＤ）は、ターゲット分子または分析物の寸法に依存していることが判明している。具体的には、分析物の寸法が増加するにつれてＬＯＤは低下する。例えば、大きさが約１０ nmの特定のタンパク質をテストする際のＬＯＤは約１ｎｇ／ｍＬであり、大きさが約１００ nmのウイルス粒子を検出する際にはＬＯＤが約１ｐｇ／ｍＬである。
【０１７３】
これにより、小さいサンプル分析物の検出には、ナノ〜マイクロ・サイズの標識粒子を有する小さいサンプル分析物が接合し、ラボ・オン・ア・チップの電極上に接合されたサンプルがロードされることにより、増幅が生ずる場合がある（すなわち、ＬＯＤが減少する場合がある）。標識粒子は、分析前に、対象分析物に特有なリンカー分子によって機能化される。標識粒子の既知濃度は、サンプル溶液と混合される。その混合物は、対象分析物と接合する標識粒子のために培養される。接合されたサンプルは、テストのために電極上へロードされる。標識粒子は、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、またはウイルスや細菌のような微生物である場合がある。図２６Ａ、図２６Ｂおよび図２６Ｃは、夫々、サンプル分析物、標識粒子および接合されたサンプルの描写である。
【０１７４】
図２６Ｄは、被覆された／機能化されたラボ・オン・ア・チップの電極を示す。図２６Ｅは、標識粒子を伴わずに被覆された電極と結合した分析物を例示する。ここでは、電極のインピーダンスまたは静電容量の変化は、分析物の追加に起因する。静電容量におけるこのような変化は、分析物の濃度希釈のために小さなものとなる場合がある。一方、図２６Ｆは、被覆された電極と結合した接合サンプルを例示する。この場合は、分析物と標識粒子の双方がインピーダンスまたは静電容量の変化に関与し、このため、ラボ・オン・ア・チップの検出が増幅される。
【０１７５】
本実施形態のラボ・オン・ア・チップは、ＥＬＩＳＡまたは他の検査方法より迅速に酵素レベルを検出するためにも用いられる場合がある。上記では、酵素であるグルコースオキシダーゼは、糖尿病の診断のために説明した。特定の組織細胞（例えば器官組織細胞）は、自らが閉じ込められるセルが損傷するか破壊された場合にのみ血液に入り込む特徴的な酵素を含んでいる。動物の血液において試験されることのある酵素の１例は、血液中の高い血清レベルで骨格筋損傷を示し、また進行性筋ジストロフィ症である場合があるアルドラーゼである。また、アルドラーゼレベルは、ウイルス性肝炎および進行前立腺癌（男性）の初期に、わずかに増加する場合がある。クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）は、ラボ・オン・ア・チップで血液サンプルから測定される場合があり、かつ、心臓発作に関連した診断情報を差別化するために貴重であり、また骨格筋の損傷を表す場合のある他の酵素である。ＧＧＴは、胆管および肝の癌の閉塞性疾患を表す酵素である。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、５つのコンポーネントまたはアイソザイムＬＤＨ−１、ＬＤＨ−２、ＬＤＨ−３、ＬＤＨ−４およびＬＤＨ−５に更に分けられることができる。これらのアイソザイムの差動レベルは、肝臓または筋肉疾患を表す場合がある。ＬＤＨ−２のレベルより高いＬＤＨ−１のレベルは、最近の心臓発作または心臓の損傷を表す場合がある。トータルのＬＤＨレベルは心臓発作の後２４〜４８時間以内に上昇するので、ＬＤＨレベルのテストは心臓発作の遅延診断に役立つ道具である。ラボ・オン・ア・チップを介してテストされる場合がある他の酵素レベルは、膵臓炎のためのリパーゼ、心臓アンギナまたは肝損傷（肝硬変を含む）および胆管閉塞のためのＧＯＴを含む。
【０１７６】
井戸水のテストは、概して細菌の内容物、特に、大腸菌型および大腸菌のテストを含んでいる。本実施形態のラボ・オン・ア・チップの発明は、細菌のための井戸水テストにおいて商業的な応用を見出すことができる。
【０１７７】
同様に診断される場合がある感染症のリストは、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎、ＳＡＲＳ、ヘリコバクターピロリ感染症、ハンセン病、ライム病、トキソプラズマ症、ニューカッスル病、口蹄病、豚のパルボウイルス、仮性狂犬病、鳥のインフルエンザ、豚繁殖・呼吸障害症候群、ブルセラ症およびクローン病をも含む。Ｍ副結核症（ＭＡＰ）が人間のクローン病の原因となる生物体でもあるという有力な証拠が存在している。そして、２００２年９月発行のイラ・シャフランその他によるＤｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０７９−２０８１頁）によって報告されている通り、幾つかのＭＡＰ抗原、ｐ３５および特にｐ３６は、クローン病患者の血液サンプルの大多数（９５％）において反応することが判明している。また、サッカロミセスセレビシエ（出芽酵母）に対する抗体（ＡＳＣＡ／好球中細胞質（ＡＮＣＡ））は、クローン病の指標であることが公知であり、ＯｒｇｅｎｔｅｃおよびＴｈｅ  Ｄｏｃｔｏｒｓ  Ｄｏｃｔｏｒから入手可能な市販の免疫学的測定法のキットで用いられている。ＡＳＣＡ／ＡＮＣＡ免疫学的測定法は、類似の症状を有する潰瘍性大腸炎とクローン病の鑑別診断のために用いられる。従って、当該ラボ・オン・ア・チップの実施形態は、人間のクローン病の診断に適用することができる。
【０１７８】
本発明の様々な態様が上述されているが、それらは限定的なものではなく例示の手法で提供されていることは理解されるべきである。本発明の精神と技術的範囲から逸脱することなく、それらの形式および細部において様々な変更が可能であることは、関連分野の当業者にとって明らかである。従つて、本発明は、上記の例示的な態様のいずれかによって限定されるべきではなく、以下の請求項およびそれらの均等物に従ってのみ定められるべきである。
【０１７９】
加えて、本発明の構造、方法論、機能および利点を強調する添付の図面は、例示的な目的だけを提供すると理解されるべきである。本発明は、添付の図面に示されている以外の方法で実現される場合があるように、十分にフレキシブルかつ変更可変である。本願明細書において参照される全ての特許出願、特許または記事の参照物は、本願明細書に記載された実施形態および方法の理解のために必要であると考えられる全ての材料に関して、参照により引用されたものと考えられる。
【０１８０】
更に、前述のアブストラクトの目的は、米国特許商標局、および一般公衆、および特に特許または法律の用語または語法に精通していない関連分野の科学者、エンジニアおよび実務家が本技術的開示の性質および本質を大まかに検討することで迅速な判断を下せるようにすることである。このアブストラクトは、いかなる形であれ本発明の技術的範囲を制限することを意図するものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２６Ｆ】
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【外国語明細書】
2018141775000001.pdf