(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質のナノポアの通過を反映した電子信号により前記タンパク質に関する情報を得ることを可能にするための、前記ナノポアを通して個々の前記タンパク質をトランスロケートするシステムの提案。【解決手段】前記ナノポアを通して前記タンパク質をトランスロケートするためのデバイスであって、前記ナノポアを中に有する膜であって、前記膜が、チャンバーをシス側及びトランス側に隔て、前記タンパク質が、前記シス側に添加されて前記ナノポアを通って前記トランス側にトランスロケートされる膜、及び順番に前記ナノポアを通じて前記タンパク質に結合してこれをトランスロケートする、前記チャンバーの少なくとも一方の側にあるタンパク質トランスロカーゼを含む前記デバイス。【選択図】図１−１
2018075021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノポアを通してタンパク質をトランスロケートするためのデバイスであって、
（ａ）ナノポアを中に有する膜であって、前記膜が、チャンバーをシス側及びトランス側に隔て、前記タンパク質が、前記シス側に添加されて前記ナノポアを通って前記トランス側にトランスロケートされる、膜；及び
（ｂ）順番に前記ナノポアを通じてタンパク質に結合してこれをトランスロケートする、前記チャンバーの少なくとも一方の側にあるタンパク質トランスロカーゼ
を含むデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｎｉｖａｌａにより２０１２年２月１６日付で提出された「Ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｓｅｎｓｏｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ」というタイトルの米国仮特許出願第６１／５９９，７５４号及びＪｅｆｆｒｅｙ  Ｎｉｖａｌａ  ｅｔ  ａｌ．により２０１２年１０月１２日付で提出された「Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ」というタイトルの米国仮特許出願第６１／７１３，１６３号の利益を主張する。これら両方の全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
政府支援の記述
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた契約Ｒ０１ＨＧ００６３２１及び米国国立ヒトゲノム研究所により与えられた契約２４０３３−４４４０７１に基づく政府支援を受けてなされた。米国政府は本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
配列表、コンピュータープログラム、又はコンパクトディスクの参照
「ＥＦＳ−Ｗｅｂの法的枠組み（Ｌｅｇａｌ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ＥＦＳ−Ｗｅｂ）」（２０１１年４月６日）に従い、出願人らは本明細書と共に配列表をＡＳＣＩＩテキストファイルで提出する。テキストファイルは、３７ＣＦＲ１．８２１（ｃ）により要求されるハードコピー及び３７ＣＦＲ  １．８２１（ｅ）により要求されるコンピューターにより読取可能な形態（ＣＲＦ）の両方の役割を果たす。ファイル作製日は２０１３年２月１３日であり、ＡＳＣＩＩテキストファイルのサイズは２４，５７６バイトである。出願人らは、配列表の内容全体を参照により援用する。
【０００４】
技術分野
本発明は、単一分子タンパク質分析の分野及びナノポア分析の分野に関する。
【背景技術】
【０００５】
本発明の特定の態様ついての背景情報を、詳細な説明で言及される技術的特徴に関連し得るものとして以下に記載するが、必ずしも詳細に説明してはいない。すなわち、本発明で使用される個々の組成物又は方法は、以下に記載される公開物及び特許中により詳細に記載され得、それらは、請求されている本発明の特定の態様を当業者が製造又は使用するための更なる指針となり得る。以下の説明は、記載されている特許又は公開物の関連性又は先行技術の効果を認めるものとして解釈されるべきではない。
【０００６】
ナノポアは、種々のバイオセンシング用途に用いられており、その中でもＤＮＡ分析（例えばシークエンシング）が最も一般的である。同様に、タンパク質のナノポアシークエンシングも考えられてきた。しかし、核酸と異なり、タンパク質は、通常均一に帯電しておらず（これが印加電圧によるトランスロケーションの駆動を困難にしている）、更にナノポアの開口部を横断できない複雑で大きな安定構造に折り畳まれる。より具体的には、タンパク質シークエンシングがＤＮＡシークエンシングよりも技術的に難しい理由としては、（ｉ）ＤＮＡシークエンシングではヌクレオチドが４種類である（翻訳後及びエピジェネティックな修飾は含まない）のに対し、タンパク質中には２０種類の異なる天然アミノ酸が見出されること、（ｉｉ）変性タンパク質が一列になってナノポアセンサーに通されるように３次構造及び２次構造の両方がほどかれなくてはならないこと、及び（ｉｉｉ）ポリペプチド骨格に沿った不均一な電荷にも関わらず、ナノポア電場を通じた変性ポリペプチドの一方向前進的トランスロケーションを実現する必要があることが含まれる。
【０００７】
生体高分子をシークエンシングするためのナノポアの使用は１０年以上前に提唱されている（Ｐｅｎｎｉｓｉ，Ｅ．Ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｐｏｒｅ−ｆｅｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３６，５３４−５３７（２０１２）；Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．，Ｄｅａｍｅｒ，Ｄ．Ｗ．，Ｂｒａｎｔｏｎ，Ｄ．，Ｂａｌｄａｒｅｌｌｉ，Ｒ．＆Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｏｎｏｍｅｒ−ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）。
【０００８】
酵素に基づくＤＮＡトランスロケーションの制御（Ｃｈｅｒｆ，Ｇ．Ｍ．，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｋ．Ｒ．，Ｒａｓｈｉｄ，Ｈｙｔｈａｍ，Ｒ．，Ｌａｍ，Ｃ．Ｅ．，Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｋ．＆Ａｋｅｓｏｎ，Ｍ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ“Ｆｏｒｗａｒｄ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｒａｔｃｈｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  ａ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ａｔ  ５−Å  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０，３４４−３４８（２０１２））及び改変された生物学的ポアを用いたＤＮＡヌクレオチド分離（Ｍａｎｒａｏ，ｅｔ  ａｌ．“ＤＮＡ  ａｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  ＭｓｐＡ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ａｎｄ  ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０，３４９−３５３（２０１２））における近年の進展により、商業的発表が２０１２年後半に予想されるナノポアＤＮＡシークエンシング機器の準備が整えられた（Ｈａｌｌａｍ，Ｋ．“Ｏｘｆｏｒｄ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｔｏ  ｓｅｌｌ  ｔｉｎｙ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ，”Ｂｌｏｏｍｂｅｒｇ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １７  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１２；Ｈａｙｄｅｎ，Ｅ．Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｍａｋｅｓ  ｉｔｓ  ｄｅｂｕｔ．Ｎａｔｕｒｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １７  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１２）。
【０００９】
ナノポアを通じたタンパク質の移動が確立されたが（Ｍｏｈａｍｍａｄｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ａ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｔｒａｐｓ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０，４０８１−４０８８（２００８）；Ｔａｌａｇａ，Ｄ．Ｓ．＆Ｌｉ，Ｊ．“Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｓｔａｔｅ  ｎａｎｏｐｏｒｅｓ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３１，９２８７−９２９７（２００９）；Ｍｅｒｓｔｏｒｆ，ｅｔ  ａｌ．“Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ，ｍｕｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｈａｓｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ，”ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７，６５２−６５８（２０１２））、制御された順番な（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）トランスロケーションのためにタンパク質をほどく技術は現在までまだ実証されていない。
【発明の概要】
【００１０】
以下の概要は、本発明の全ての特徴及び態様を含むことを意図しておらず、本発明がこの概要中に説明される全ての特徴及び態様を含まなければならないことを意味するものでもない。
【００１１】
本発明は、ナノポアを通してタンパク質をトランスロケートするためのデバイスであって、ナノポアを中に有する膜であって、前記膜がチャンバーをシス側及びトランス側に隔て、タンパク質がシス側に添加されてナノポアを通ってトランス側にトランスロケートされる、膜；及びナノポアを通じてタンパク質に結合してこれをトランスロケートする、前記チャンバーの一方の側にあるタンパク質トランスロカーゼ酵素、を含むデバイスを提供する。トランスロケーションは順番に起こり、すなわち、決まった順番でアミノ酸残基がナノポア中に通過し、これは通常、タンパク質の一次アミノ酸配列に従う。複数のタンパク質が一度にトランスロケートされてもよい。
【００１２】
本発明は更に、ナノポアを通してタンパク質をトランスロケートするデバイスであって、膜中のナノポアであって、前記膜が流体チャンバーをシス側及びトランス側に隔て、トランスロケートされるタンパク質がシス側に添加されてナノポアを通ってトランス側にトランスロケートされる、ナノポア；シス側とトランス側との間に電圧勾配を加えるため及びナノポアを通るイオン電流を測定するための回路；並びに例えばシス側で前記ナノポアへの結合を許すことにより又はトランス側に溶液中で加えることにより流体チャンバーに添加される特異的酵素、例えばタンパク質トランスロカーゼ及び／又はＮＴＰ駆動アンフォールダーゼ、を含むデバイスを提供する。
【００１３】
本発明の一実施形態では、ナノポアはポアタンパク質によって規定（ｄｅｆｉｎｅ）される。好ましい一実施形態では、ポアタンパク質はα溶血素である。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、タンパク質トランスロカーゼは、トランスロケートされるタンパク質分子に作用するＮＴＰ駆動アンフォールダーゼである。好ましい一実施形態では、ＮＴＰ駆動アンフォールダーゼはＡＡＡ＋酵素である。別の好ましい実施形態では、ＡＡＡ＋酵素は大腸菌ＣｌｐＸのサブユニットの組合せである。
【００１５】
本発明の別の実施形態では、タンパク質トランスロケーションを検出するための回路は、トランス側に正電圧を印加するパッチクランプ増幅器を含む。パッチクランプ増幅器は、定電圧を維持し、電流の変化を測定する。好ましい実施形態では、デバイスは、ナノポアを通るイオン電流の変化を素早く記録するための、パッチクランプ増幅器に接続されたコンピューターを含む。タンパク質がナノポアを通過する際、１秒当たり１〜１００，０００の変動のオーダーで検出できるイオン電流のシグネチャーが得られ、ポアを通ってトランスロケートしている個々のアミノ酸に関する情報が得られる。例えば、１００ｋＨｚでの記録を用いて、１０μ秒毎に１個のデータポイントを生成することができる。データは、トランスロケートされているタンパク質の構造的特徴に関連付けることができる。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、ナノポアを通してタンパク質をトランスロケートするためのシステムであって、流体チャンバーをシス側及びトランス側に隔てる膜中のナノポアであって、トランスロケートされるタンパク質がシス側に添加されてナノポアを通ってトランス側にトランスロケートされ、前記流体チャンバーが、トランスロケートされる非変性タンパク質及びＮＴＰ（ヌクレオシド５’−三リン酸、例えばＡＴＰ及び／又はＧＴＰ）等の酵素補因子を含むイオン性バッファーをシス側に含む、ナノポア；シス側とトランス側との間に電圧を加えるため及びナノポアを流れるイオン電流を測定するための回路；及びチャンバー中のシス側の溶液中のＮＴＰ駆動アンフォールダーゼ等のタンパク質トランスロカーゼ、を含むシステムが提供される。
【００１７】
本発明の別の実施形態では、ナノポアは多量体ポアタンパク質等のポアタンパク質によって規定され、ＮＴＰ駆動アンフォールダーゼ等のタンパク質トランスロカーゼが多量体ポアタンパク質に結合する。タンパク質トランスロカーゼは、共有結合的又は非共有結合的にポアタンパク質に結合してよく、膜及びポアタンパク質のシス側、トランス側、又は両側にあってよい。
【００１８】
本発明の別の実施形態では、トランスロケートされるタンパク質は、非変性タンパク質（すなわち、その天然の状態）であり、更に、標的化対象タンパク質にナノポアを通過させてＮＴＰ駆動アンフォールダーゼに接触させるための標的化ドメインを含む外来配列を含む。好ましい実施形態では、ＮＴＰ駆動アンフォールダーゼはＣｌｐＸであり、ナノポアタンパク質はα溶血素である。外来配列中の標的化ドメインは、タンパク質をナノポアに導くのに役立つ。標的化ドメインは、ナノポアにかかる電圧の影響を受けるように形成され得る。好ましい一実施形態では、標的化ドメインは、約５個の負に帯電したアミノ酸又は少なくとも約５〜３０個の負に帯電したアミノ酸を含み、シス側とトランス側との間に印加された電圧勾配によりチャンバーの正の側に引っ張られる。
【００１９】
本発明は更に、ナノポアを通して非変性タンパク質をトランスロケートする方法であって、ナノポアを通してタンパク質をトランスロケートするためのデバイスであって、前記デバイスが、流体チャンバーをシス側及びトランス側に隔てる膜中にナノポアを含み、トランスロケートされるタンパク質がシス側に添加されてナノポアを通ってトランス側にトランスロケートされる、デバイスと、シス側とトランス側との間に電圧を加えるため及びナノポアを通るイオン電流を測定するための回路と、トランス側の溶液中のタンパク質トランスロカーゼと、を準備するステップ；前記流体チャンバーに、ＮＴＰを含むバッファー（トランスロカーゼがＮＴＰ駆動型である場合）を加えるステップ；必要に応じて行う、シス側に非変性タンパク質を加えるステップ；非変性タンパク質がナノポアにタンパク質トランスロカーゼに接触できるように、（例えば電荷により）非変性タンパク質を捕捉させるか非変性タンパク質にナノポアを通らせるステップ；及びナノポアを通した非変性タンパク質のトランスロケーションによって生じるイオン電流変化を測定するステップ、を含む方法を提供する。
【００２０】
本発明の一実施形態では、電流変化を測定するステップは、（ｉ）ナノポア中の開口チャネル、（ｉｉ）ナノポアによる非変性タンパク質の捕捉、及び（ｉｉｉ）（ｉｉ）からのタンパク質のナノポアの通過、の状態の電流変化を測定することを含む。好ましい実施形態では、測定は、状態（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）間の差を検出することを含む。別の好ましい実施形態では、測定は、ナノポアを通過しているタンパク質のアミノ酸構造によって生じる状態（ｉｉｉ）中の差を測定することを含む。方法は、状態（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の間の状態として起こる、非変性タンパク質へのＮＴＰ駆動アンフォールダーゼの結合及びナノポアへのアンフォールダーゼのトランスロケーションの状態を測定するステップを更に含み得る。これにより４つの状態が測定される。例えば図２に説明又は図解されているように、トランスロケーションが完了してナノポアが初期状態に戻った時に測定される最終状態（ｖ）があり得る。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、ナノポアはポアタンパク質によって規定される。別の好ましい実施形態では、ポアタンパク質はα溶血素である。別の好ましい実施形態では、ＮＴＰ駆動アンフォールダーゼがポアタンパク質に結合する。別の好ましい実施形態では、ＮＴＰ駆動アンフォールダーゼはＡＡＡ＋酵素である。別の好ましい実施形態では、ＡＡＡ＋酵素はＣｌｐＸである。別の実施形態では、回路は、シスチャンバーとトランスチャンバーとの間に定電圧を印加するパッチクランプ増幅器を含む。
【００２２】
本発明の特定の態様では、ナノポアはα溶血素又は他の多量体ポアタンパク質によって規定される。ポアタンパク質は機能化されている必要はなく、すなわち、その天然環境中に出るタンパク質として用いられてもよく、トランスロケートされるタンパク質に結合（ａｔｔａｃｈ）又は結合（ｂｉｎｄ）するために如何なる分子構造も付加される必要はない。すなわち、ポアタンパク質は、あらゆるタンパク質配列のトランスロケーションに一般的であってよく、トランスロケートされるタンパク質に特異的な結合又は認識をしない。トランスロケートされるタンパク質は更に、好ましくは天然の形態である。本発明の特定の実施形態では、タンパク質のナノポアの「通し（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」を改善するための分子構造をこれに付けてもよい。本発明の特定の態様では、トランスロケートされるタンパク質は、タンパク質トランスロカーゼの標的化ドメインを含む外来配列を含む。標的化ドメインは少なくとも約５〜３０個のアミノ酸又は１０〜３０個のアミノ酸を含み得る。アミノ酸は、トランスロケートされるタンパク質のアミノ末端又はカルボキシ末端に配置された負に帯電したアミノ酸、例えば３０〜１００個のグルタミン酸若しくはアスパラギン酸残基、又は他の負に帯電した合成モノマー、例えば硫酸デキストランであり得る。アミノ酸は更に、電圧の極性を以下の例示と逆にした場合、正に帯電していてもよい（例えば、アルギニン又はリジン）。
【００２３】
本発明の特定の態様では、トランスロケートされるタンパク質は、その天然の状態、すなわち、変性又はその他のアンフォールディングがされていない状態でトランスロケートされ、トランスロカーゼは、ナノポアにかかる電圧勾配をタンパク質が横切る際にタンパク質をほどく役割をする。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１Ａは、脂質二重層中に単一のＡＨＬ（α−溶血素）ポアが埋め込まれたナノポアセンサーの模式図（カーツーン）である。図１Ｂは、ナノポア中に捕捉されたタンパク質を示す模式図である。図１Ｃは、本発明の実施例中でトランスロケーションに用いられる設計されたタンパク質を示す模式図である。
【図２】図２Ａは、ＣｌｐＸ仲介タンパク質トランスロケーション中のイオン電流トレースを示すプロットである。図２Ｂは、ＣｌｐＸ仲介タンパク質トランスロケーション中の模式図である。図２Ｃは、タンパク質Ｓ２−３５トランスロケーション中のイオン電流トレースを示すトレースである。図２Ｄは、タンパク質Ｓ２−１４８トランスロケーション中のイオン電流トレースを示すトレースである。
【図３】図３は、３つのモデルタンパク質におけるイオン電流状態の滞留時間の比較を示す一連の棒グラフである。
【図４】図４は、トランス溶液中にＣｌｐＸが存在しない、電圧仲介タンパク質トランスロケーション中のイオン電流トレースを示す電流トレースを示す図である。ばらつきの大きい捕捉期間（＜５秒〜＞２分）後、試験した全ての基質が最終的に印加電圧のためにほどかれてトランスロケートされた。ランプ状態（ｒａｍｐｉｎｇ  ｓｔａｔｅ）は観察されず、Ｓ２−３５及びＳ２−１４８リンカー状態に由来する詳細な信号の特徴は失われており、全ての状態の持続時間がＣｌｐＸ仲介イベントと比べてより広く分布している。
【図４】図４Ａは、電圧仲介Ｓ１トランスロケーション中のイオン電流トレースを示す図である。図２Ａと比べて、状態ｉｉｉがなく、状態ｉｖの持続時間は平均的に、より長く、よりばらつきがある。図４Ｂは、トランス溶液中にＣｌｐＸが存在しない電圧仲介タンパク質トランスロケーション中の模式図である。電圧仲介タンパク質トランスロケーションのモデルを示す図である。４つのカーツーン構造（ｉ〜ｉｖ）を示している。カーツーンｉ〜ｉｖは図４Ａのイオン電流状態ｉ〜ｉｖに対応する。図４Ｃは、電圧仲介Ｓ２−３５トランスロケーション中のイオン電流トレースを示す図である。状態ｉｉｉ及びｖｉのランプがなく、状態ｖの分離（図２Ｃ）が減少している。図４Ｄは、電圧仲介Ｓ２−１４８中のイオン電流トレースが、対応する状態が省略されたＳ２−３５（図２Ｄ）と同様な挙動を示すことを示す図である。
【図５】図５は、３つのモデルタンパク質のＣｌｐＸ依存的（トランス側にＣｌｐＸが存在する）ランプ状態ｉｉｉのイオン電流状態滞留時間の比較を示す度数棒グラフである。Ｓ１、ｎ＝４５；Ｓ２−３５、ｎ＝６２；Ｓ２−１４８、ｎ＝６６。
【図６】図６は、ＣｌｐＸ依存的ランプ状態ｉｉｉ及びｖｉを含んだイベントにおけるＳ２−３５（ｎ＝４２）及びＳ２−１４８（ｎ＝４１）タンパク質の推定第２Ｓｍｔ３ドメイントランスロケーション状態ｖｉｉのイオン電流状態滞留時間の比較を示す度数棒グラフである。
【図７】図７は、タンパク質Ｓ２−３５（ｎ＝４４）及びＳ２−１４８（ｎ＝４４）のＣｌｐＸ依存的ランプ状態ｖｉのイオン電流滞留時間の比較を示す度数棒グラフである。
【図８】図８は、３つのモデルタンパク質の推定Ｓｍｔ３ドメイントランスロケーション状態ｉｖ及びｖｉｉのイオン電流滞留時間の比較を示す度数棒グラフである。黒色の棒は、ランプ状態ｉｉｉを含んだイベント（ＣｌｐＸ駆動）の滞留時間を表す。灰色の棒は、ランプ状態を含まなかったイベント（ＣｌｐＸ駆動でない）を表す。ランプあり、ｎ＝２５４；ランプなし、ｎ＝１８３。
【図９】図９は、Ｓ２−３５トランスロケーションイベントの状態ｖの滞留時間を示す度数棒グラフである。黒色の棒は、ランプ状態ｉｉｉを含んだイベント（ＣｌｐＸ駆動）の滞留時間を表す。灰色の棒は、ランプ状態を含まなかったイベント（ＣｌｐＸ駆動でない）を表す。ランプあり、ｎ＝５０；ランプなし、ｎ＝４５。
【図１０】図１０は、脂質膜内に埋められたＣｌｐＰ／α−ＨＬの融合タンパク質を図解する模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
概要
タンパク質のナノポアの通過を反映した電子信号によりタンパク質に関する情報、例えばタンパク質のアミノ酸の内容、を得ることを可能にするための、ナノポアを通して個々のタンパク質をトランスロケートするシステムを本明細書に記載する。膜中のナノポア、膜のシス側とトランス側との間の電圧、及びタンパク質トランスロカーゼを準備することにより、本デバイスは、シス側とトランス側との間の回路網がタンパク質のアミノ酸の内容（例えばアミノ酸配列）を示す信号をモニタリング及び記録できるように、タンパク質トランスロカーゼを用いてナノポアセンサーを通して、酵素により制御された天然タンパク質のアンフォールディング及びトランスロケーションを実現する。実用的な目的のために、回路及びナノポアのアレイを設けることができる。それらは、１つのチャンバー中にあってもよく、複数のチャンバー中にあってもよい。
【００２６】
ここで、図１Ａに関して、本デバイスは、基質タンパク質１０１をトランスロケートするように作動し、流体コンパートメントをタンパク質１０１を含むシス側とタンパク質１０１がポア１０２を通ってトランスロケートされてゆくトランス側とに分離する膜１０６の約２５μｍの開口部中に含まれる脂質二重層１０４に埋められたポアタンパク質１０２（α溶血素、すなわち「ＡＨＬ」）を含む。デバイスは、トランス側の正極１１０とシス側の負極との間に一定の電圧を印加するための制御可能な増幅器１０８を含む。以降ＣｌｐＸで例示されるタンパク質トランスロカーゼ１０９がチャンバーのトランス側に存在する。増幅器１０８は更に、タンパク質１０１がトランスロケートする時に非常に急速に起こるイオン電流（すなわち、図示されているＣｌ-及びＫ+等のイオンの流れ）の変化を検出及び好ましくは記録するための回路網を提供する。例中、データは１００ｋＨｚで収集したが、高速データサンプリングデバイスが知られており、用いてもよい（例えば、ペンテック社（Ｐｅｎｔｅｋ，Ｉｎｃ．）の２００ＭＨｚ  Ｍｏｄｅｌ  ７１５０）。図１Ｂは、脂質二重層１０４中のＡＨＬポアタンパク質１０２の詳細図であり、更に、トランス側にあって、カーツーン中でポア１０２に通され且つポア１０２の両側にあるタンパク質１０１に作用する、タンパク質トランスロカーゼ１０９を示している。図１Ｃに示されているように、アミノ末端にＳｍｔ３ドメインを有するモデル基質タンパク質が、荷電した可動性リンカーによりカルボキシ末端でｓｓｒＡタグに結合されている。荷電した可動性タグは、ナノポアをトランス側の溶液中へと通され、一方、この時点で、折り畳まれたＳｍｔ３ドメインが、捕捉されたタンパク質の完全なトランスロケーションを妨げる。トランス溶液側に存在するＣｌｐＸが基質タンパク質のＣ末端ｓｓｒＡ配列に結合する。ＡＴＰ加水分解をエネルギー源として、ＣｌｐＸが、タンパク質テイルに沿ってチャネルに向かってトランスロケートさせ、その後、ポアを通じてＳｍｔ３ドメインのアンフォールディング及びトランスロケーションを触媒する。Ｓｍｔ３ドメインは折り畳まれているが、リンカーは折り畳まれていない。Ｓｍｔ３については米国特許出願公開第２００９／０２８０５３５号、「ＳＵＭＯ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」に更に説明されている。α溶血素ナノポアを通じたタンパク質のアンフォールディング及びトランスロケーションの酵素的制御を以下の例中に示す。各基質タンパク質のセグメントが、長さ約５０Åの膜貫通ポア内腔（ナノポア）を通過した際にアミノ酸組成に基づいて識別された。使用されるトランスロカーゼ酵素は、デバイスがタンパク質配列情報を提供することができるように選択及び制御される。酵素は、基質に関して物理的移動を生じさせる酵素の能力を指して本明細書中で一般的に「タンパク質トランスロカーゼ」と呼ばれる酵素のクラスから選択される。本明細書中で使用されるように、この用語には、タンパク質の一次構造、すなわち一時配列に影響せずに天然タンパク質のアンフォールディングを触媒することから「アンフ��ールダーゼ（ｕｎｆｏｌｄａｓｅ）」としばしば呼ばれる酵素のクラスが含まれる。
【００２７】
特定の実施形態では、基質タンパク質はトランスロカーゼによって認識されるようにタグ化されている。そのための方法の１つはｓｓｒＡタグの使用である。ｓｓｒＡタグは、ＣｌｐＸプロテアーゼシステムによって分解されるタンパク質をマーキングするために複数の細菌種で用いられているメカニズムであるので、種々のｓｓｒＡタグが知られている。例中、ｓｓｒＡタグは、Ｃ末端１１残基のアミノ酸配列（配列番号５の末端に示されている）であり、この配列のサブセットはＣｌｐＡ又はＣｌｐＸによって固有に認識される。記載されているように、別の配列を用いてもよい。特定の実施形態では、図１０に示されるようなタンパク質ナノポアタンパク質又はキメラナノポアを、電圧の差異がある２つの導電性水溶液を隔てる薄い絶縁性膜（例えば、脂質二重層又はグラフェンシート）に埋め込んでよい。ナノポアを流れるイオン電流の流れによりセンシングが伝えられる。タンパク質がトランスロケートされるかポアとその他の相互作用をすると、イオン流が遮断され、その後の分析のための電子信号が生じる。このタンパク質ナノポア又はキメラナノポアは、標的タンパク質をひとまとめに並行して分離及び／又は精製するためのアレイ又はラボオンチップデバイスに利用することもできる。
【００２８】
本発明は、アレイ又はチップ等のナノポア分析のための種々の装置を用いて実施することができる。装置は、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｙｅｒｓ  ｏｆ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」のタイトルで国際公開第２００９／０７７７３４号として公開）、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９（「Ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒ  ｓｅｎｓｏｒ  ａｒｒａｙ」のタイトルで国際公開第２０１０／１２２２９３号として公開）、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２２０６号（「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ」のタイトルで国際公開第００／２８１３２号として公開）、又は国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９号（「Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ」のタイトルで国際公開第２０００／２８３１２号として公開）に記載されているもののいずれかであり得る。以下の説明から明らかになるように、タンパク質は単一ポリペプチド配列としてトランスロケートされ、個々のアミノ酸がポアを順番に通過する。複数のタンパク質が続けてトランスロケートされてもよい。
【００２９】
定義
特に断りのない限り、本明細書中で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する分野の熟練者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されているものと同様又は同等な任意の方法及び材料が本発明の実施及び試験に用いられ得るが、好ましい方法及び材料を記載する。一般的に、細胞及び分子生物学並びに化学の技術及び関連して用いられる命名法は当該技術分野で周知且つ一般的に使用されているものである。特に断りのない限り、特定の実験技術は一般的に、当該技術分野で周知の従来の方法に従って並びに本明細書中に引用及び記載されている種々の一般的及びより具体的な参照文献に記載されているように行われる。明確にするために、以下の用語を定義する。
【００３０】
範囲：簡潔にするのため、記載されている全ての範囲は、特に断りのない限り、記載されている範囲内の全ての部分範囲を含むことが意図される。非限定的な例として、１２０〜１５０の範囲は、１２０〜１２１、１２０〜１３０、２００〜２２５、１２１〜２５０等の範囲を含むことが意図される。「約」という用語は、およそという通常の意味であり、実験の変動性により状況から決定され得る。はっきりしない場合には、「約」は記載の数値のプラス又はマイナス５％を意味する。
【００３１】
「ナノポア（ｎａｎｏｐｏｒｅ）」という用語は本明細書中で、内径が０．５〜１０ナノメートルのオーダーの任意の小さな孔又はチャネルを指してその従来の意味で使用される。「ナノポア」という用語は、生物学的ナノポア（例えば、α溶血素）又は人工ナノポアの両方を含む。本発明のナノポアの寸法は様々であり得、例えば、直径サイズが約０．５〜１０ｎｍであり得る。例えば、直径は約０．５ｎｍ、１ｎｍ、１．２５ｎｍ、１．５ｎｍ、１．７５ｎｍ、２ｎｍ、２．２５ｎｍ、２．５ｎｍ、２．７５ｎｍ、３ｎｍ、３．５ｎｍ、４ｎｍ、４．５ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、又はその間の任意の寸法であり得る。生物学的ナノポアはポアタンパク質によって作ることができる。人工ナノポアはマイクロモールディング又は穴あけ（ｄｒｉｌｌｉｎｇ）により作製することができる。これらは、一片のシリコン中に幾分より大きな孔（数十ナノメートル）をエッチングし、次いでこれを徐々に、はるかに小さな直径の孔が得られるようにイオンビーム彫刻（ｉｏｎ−ｂｅａｍ  ｓｃｕｌｐｔｉｎｇ）法を用いて埋めることにより作製することもできる。
【００３２】
「ポアタンパク質」という用語は本明細書中において、自然発生的な二重層への挿入を駆動するのに充分な疎水性を示す環様構造へと標的膜の近傍で構築されるポア形成タンパク質（ＰＦＰ）を指してその従来の意味で使用されている。ポアタンパク質は通常（しかし必ずではない）Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ及び黄色ブドウ球菌等の細菌により生産される。ＰＦＰは、大腸菌の溶血素Ａ等のα孔形成毒素；α溶血素及び白血球溶解毒素（Ｐａｎｔｏｎ−Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ  ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ：ＰＶＬ）等のβ孔形成毒素；炭疽毒素等の二元毒素（ｂｉｎａｒｙ  ｔｏｘｉｎ）；ニューモリシン等のコレステロール依存性細胞溶解毒素（ＣＤＣ）；又はグラミシジンＡ等の小孔形成毒素であり得る。好ましいポアタンパク質はα溶血素（ＡＨＬ）である。
【００３３】
「α溶血素（α−ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）」という用語は本明細書中、細菌の黄色ブドウ球菌に由来する孔形成毒素（ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｔｏｘｉｎ）を指してその従来の意味で使用される。α溶血素は、主にβシートからなり（６８％）、αへリックスは約１０％だけである。黄色ブドウ球菌の染色体上のｈｌａ遺伝子は、細胞膜上で７量体ユニットを形成して完全なβバレルポアを形成する２９３残基のタンパク質モノマーをコードしている。この構造により、毒素は、細胞膜中でポアを形成するという主な機能を発揮することができる。
【００３４】
「膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）」という用語は本明細書中において、薄いフィルム様の構造を指してその従来の意味で使用される。シス及びトランスチャンバーを隔てる膜は、少なくとも１つのポア又はチャネルを含む。膜は合成膜及び生物学的膜に一般的に分類することができる。任意の膜が本発明に従って使用され得る。好適な膜は当該技術分野で周知である。膜は、好ましくは両親媒性層である。両親媒性層とは、少なくとも１つの親水性部分及び少なくとも１つの親油性又は疎水性部分の両方を有するリン脂質等の両親媒性分子から形成される層である。両親媒性層は単層であってもよく、二重層であってもよい。両親媒性分子は合成であってもよく、天然であってもよい。単層を形成する非天然両親媒性物質が当該技術分野で公知であり、例えば、ブロックコポリマー（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００９，２５，１０４４７−１０４５０）が含まれる。
【００３５】
「脂質二重層」という用語は本明細書中で、親水性のリン酸基ヘッドが二重層のいずれかの側の水に突「出し」、疎水性のテイルが二重層のコア「中に」突き刺さっているように配置された、２層の脂質分子でできた薄い極性の膜を指してその従来の意味で使用される。脂質二重層は通常、幅が数ナノメートルであり、ほとんどの荷電水溶性分子を通さない。脂質二重層は、液体又は固体の機械的特性のいくつかを有するのに充分大きな構造である。これらの記述に面積圧縮係数（ａｒｅａ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｕｓ）Ｋａ、曲げ係数Ｋｂ、及びエッジエネルギー（ｅｄｇｅ  ｅｎｅｒｇｙ）を用いることができる。固体の脂質二重層は更にある剛性率を有するが、あらゆる液体と同様に、流体二重層では剛性率はゼロである。脂質二重層は、熱収縮チューブ、融解石英、ホウケイ酸ガラス、雲母、及び酸化シリコン等の開口部を有する固体支持体によって支持することもできる。脂質は、例えばラングミュア−ブロジェット法、小胞融合プロセス、又は２つの組合せによりアプライされ得る。
【００３６】
「ＮＴＰ」という用語は本明細書中で、ヌクレオシドをヌクレオチドにする３つのリン酸に結合したヌクレオシドを含む分子であるヌクレオシド三リン酸を指してその従来の意味で使用される。ＮＴＰは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルウリジン三リン酸（ｍ５ＵＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、又はデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）であり得る。「ＮＴＰ」は、他のさほど豊富でないＮＴＰ、例えば、さほど一般的でない天然を含むヌクレオチド代謝の中間体も指す。
【００３７】
「ＮＴＰ駆動アンフォールダーゼ（ＮＴＰ  ｄｒｉｖｅｎ  ｕｎｆｏｌｄａｓｅ）」という用語は本明細書中で、タンパク質のアンフォールディングを触媒するＮＴＰ依存性酵素を指してその従来の意味で使用される。非常に一般的なＮＴＰ駆動アンフォールダーゼは、ＡＴＰ依存性プロテアーゼ、例えばプロテアソームＡＴＰアーゼ、ＡＡＡプロテアーゼ、又はＡＡＡ＋酵素（以下に定義）；膜融合タンパク質、例えばＮＳＦ（Ｎ−エチルマレイミド感受性融合タンパク質）／Ｓａｃ１８ｐ（酵母のＮ−エチルマレイミド感受性融合タンパク質ホモログ）又はｐ９７／ＶＣＰ／Ｃｄｃ４８ｐ（９７−ｋＤａバロシン含有タンパク質）；Ｐｅｘ１ｐ及びＰｅｘ６ｐ（ペルオキシソームＡＴＰアーゼ）；カタニン及びＳＫＤ１（マウスのＶｐｓ４ｐホモログ）／Ｖｐｓ４ｐ（酵母の液胞型タンパク質ソーティング４（Ｖａｃｕｏｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ４）ホモログ）；ダイニン（モータータンパク質）；ＤＮＡ複製タンパク質、例えばＯＲＣ（複製開始点認識複合体）、Ｃｄｃ６（細胞分裂制御タンパク質６）、ＭＣＭ（ミニ染色体維持タンパク質（ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ））、ＤｎａＡ、又はＲＦＣ（複製因子Ｃ）／クランプローダー；ＲｕｖＢ（ホリデイジャンクションＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＢ、ＥＣ＝３．６．４．１２）；ＴＩＰ４９ａ／ＴＩＰ４９及びＴＩＰ４９ｂ／ＴＩＰ４８（真核生物ＲｕｖＢ様タンパク質）である。
【００３８】
「ＡＡＡ＋酵素」という用語は本明細書中で、酵素のＡＡＡ＋スーパーファミリーを指してその従来の意味で使用される。ＡＡＡ＋は、多様な細胞活性に関連するＡＴＰアーゼの略語である。これらは、およそ２３０アミノ酸残基の共通する保存モジュールを有する。これは、巨大分子のエネルギー依存的リモデリング又はトランスロケーションを介して活性を発揮する環状ＰループＮＴＰアーゼのＡＡＡ＋スーパーファミリーに属する大きな機能的に多様なタンパク質ファミリーである。例としては、細菌のＣｌｐＡＰ、ＣｌｐＸＰ、ＣｌｐＣＰ、ＨｓｌＶＵ、及びＬｏｎ並びにミトコンドリア及び葉緑体におけるそれらのホモログが含まれる。Ｌｏｎを例外として、ＡＡＡ＋酵素（アンフォールダーゼ又はプロテアーゼと呼ばれることもある）は、制御サブユニット（ＡＴＰアーゼ）及びタンパク分解性サブユニットからなり、Ｌｏｎは、制御ドメイン及びタンパク分解性ドメインの両方を含む単一ポリペプチドである。ＣｌｐＸ及びＣｌｐＡはＣｌｐＰとドッキングしてＣｌｐＸＰ及びＣｌｐＡＰプロテアーゼを形成し、ＨｓｌＵはＨｓｌＶとドッキングして別のプロテアーゼＨｓｌＶＵを形成する。ＣｌｐＰが五量体を形成するのに対し、ＣｌｐＡ及びＣｌｐＸは六量体を形成する。ＨｓｌＵ及びＨｓｌＶはそれぞれ六量体を形成する。但し、ＨｓｌＵ七量体も報告されている。制御サブユニットＣｌｐＡ、ＣｌｐＸ、及びＨｓｌＵはシャペロンとして機能する。ＣｌｐＸに関する更なる詳細はＭａｉｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，“ＣｌｐＸ（Ｐ）ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｆｏｒｃｅ  ｔｏ  ｕｎｆｏｌｄ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅ  ｉｔｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，”Ｃｅｌｌ  １４５：４５９−４６６９（Ａｐｒｉｌ  ２９，２０１１）に記載されている。そこに報告されているように、ＣｌｐＸモーターは、原核生物ＣｌｐＡ、ＣｌｐＢ、ＨｓＩｕ、ＦｔｓＨ、又はＬｏｎを含む他のＡＡＡ＋酵素と基本的デザインを共有している。ＡＡＡ＋酵素は「ＡＡＡ＋分子モーター」ともいう。ＡＡＡ＋スーパーファミリーの更なる説明はＯｇｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．“ＡＡＡ＋ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ＡＴＰａｓｅｓ”ｃｏｍｍｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｄｉｖｅｒｓｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ，６：５７５−５９７（２００１）に記載されている。そこに説明されているように、ミトコンドリアに関連するＡＡＡ＋ファミリーのメンバーはＢｃｓ１ｐ、Ｌｏｎ／Ｐｉｍ１ｐ、ＣｌｐＸ、及びＨｓｐ７８である。
【００３９】
「ＨｓＩＵ」という用語は本明細書中で、ＡＴＰ依存性プロテアーゼであるＡＴＰアーゼサブユニットＨｓＩＵを指してその従来の意味で使用され、アンフォールダーゼＨｓＩＵとも呼ばれる。ＨｓＩＵはＡＴＰアーゼのＨｓｐ１００及びＣｌｐファミリーのメンバーである。これは、ＨｓＩＶと複合体を形成してアンフォールダーゼとして作用することもできる（Ｂｏｃｈｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ＨｓＩＵ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＨｓＩＵ−ＨｓＩＶ，”Ｎａｔｕｒｅ  ４０３（６７７１）：８００−８０５（２０００）参照）。
【００４０】
「Ｌｏｎプロテアーゼ」という用語は本明細書中で、古細菌、細菌、及び真核生物に見出されるプロテアーゼのファミリーを指してその通常の意味で使用される。Ｌｏｎプロテアーゼは、ＭＥＲＯＰＳペプチダーゼファミリーＳ１６（ｌｏｎプロテアーゼファミリー、ＳＦ族）に属するＡＴＰ依存性セリンペプチダーゼである。真核生物では、Ｌｏｎプロテアーゼの大部分はミトコンドリアマトリックス中に位置する。酵母では、ＬｏｎプロテアーゼＰＩＭ１はミトコンドリアマトリックス中に位置する。これはミトコンドリアの機能に必要であり、構成的に発現されているが、熱ストレスの後に増加し、このことは、ＰＩＭ１が熱ショック反応において役割を果たし得ることを示唆している。
【００４１】
「タンパク質トランスロカーゼ」という用語は本明細書中で、タンパク質基質の移動を制御できるポリペプチド等のタンパク質結合性ポリペプチド、例えば、タンパク質基質に作用してこれを酵素に相対的に前進的に、すなわち酵素活性に応じて移動させる酵素、酵素複合体、又は酵素複合体の一部を意味してその通常の意味で使用される。「前進的（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）」という用語は当該技術分野で、酵素が複数のステップで基質を「処理する（ｐｒｏｃｅｓｓ）」段階的活性を指すと理解される。本発明の場合、タンパク質トランスロカーゼは通常、タンパク質が順番にトランスロケートされるように、すなわち一次アミノ酸配列に沿って移動するように処理する。便宜上、「アンフォールダーゼ」とまとめて呼ばれる複数の酵素、特にＮＴＰ駆動アンフォールダーゼもこの定義に含まれる。この定義には特にＡＡＡ＋酵素スーパーファミリー及びこのスーパーファミリーのＣｌｐＸメンバーも含まれる。
【００４２】
一般的な用語である「タンパク質トランスロカーゼ」の例としては更に、Ｌｏｎプロテアーゼ及びＨｓＩＵ等のプロテアーゼも含まれ、これらの酵素は、酵素の酵素的切断活性が除去されるように改変されているか、配列がナノポアを通ってトランスロケートされた後に切断が起こるように配列されている。
【００４３】
タンパク質トランスロカーゼのその他の例は、ＣｌｐＸ（アンフォールダーゼでもある）、例えばＣｌｐＡ、ミトコンドリアタンパク質トランスロカーゼＴＯＭ（外膜のトランスロカーゼ）又は他のＴＯＭ、及びＴＩＭタンパク質に関連する。選択されるタンパク質トランスロカーゼは、シャペロン、ＴＯＭ移入受容体、ＴＯＭチャネル複合体、及び「モーター」タンパク質等、ミトコンドリアタンパク質トランスロカーゼ複合体の任意の一部であってもよい。
【００４４】
「ＣｌｐＸ」の「ＣｌｐＸ酵素」という用語は本明細書中で、Ｕｎｉｐｒｏｔでの名称がｃｌｐＸであり、そこで４２４アミノ酸配列が与えられており、サブユニットとして成熟型へと処理されるＨＳＰ（熱ショックタンパク質）１００ファミリーのメンバーを指してその従来の意味で使用される。ＣｌｐＸサブユニットは会合して、ＡＴＰ又はＡＴＰの非加水分解性アナログの結合により安定化される６員（ホモ六量体）の環を形成する。ＣｌｐＸのＮ末端ドメインは、基質認識に関与するＣ４型亜鉛結合ドメイン（ＺＢＤ）である。ＺＢＤは、ｌＯ及びＭｕＡ等のいくつかの典型的なＣｌｐＸＰ基質の分解促進に必須である非常に安定な二量体を形成する。Ｗａｗｒｚｙｎｏｗ  ｅｔ  ａｌ，“Ｔｈｅ  ＣｌｐＸ  ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，ｔｈｅ  ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣｌｐＰ−ＣｌｐＸ  ｐｒｏｔｅａｓｅ，ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ，”ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９５  Ｍａｙ  １；１４（９）：１８６７−１８７７に更に説明されている。アミノ酸配列はｅｃｌｏｗｉｋｉ．ｎｅｔで「ｃｌｐＸ：ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ」としても提供されている。
【００４５】
同様に、ＣｌｐＡは、ＣｌｐＡサブユニットに７５８アミノ酸配列が与えられているＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔのエントリーｃｌｐＡを指す。これは、ＡＴＰの存在下で六量体の環へと構築された６個のＣｌｐＡサブユニットの複合体を形成する。これは、ＡＴＰの存在下で六量体環へと構築される６個のＣｌｐＡサブユニットと２つの七量体環を構成する１４個のＣｌｐＰサブユニットとで構成されるＣｌｐＡＰ複合体の構成要素である。ＣｌｐＳに結合。
【００４６】
「非変性タンパク質」という用語は本明細書中で、その従来の意味、すなわち、全ての天然のシステイン結合、水素結合、及び多量体形態が本質的に損なわれていない天然の二次構造及び三次構造に少なくとも部分的に折り畳まれているタンパク質を指して使用される。これは、通常不溶性であり且つ凝集している変性タンパク質と対照的である。
【００４７】
「負に帯電したアミノ酸」という用語は本明細書中で、その従来の意味で、すなわち、グルタミン酸及びアスパラギン酸のような負に帯電したアミノ酸が多い表面を有するタンパク質を意味して使用される。
【００４８】
一般的方法及び装置
ナノポアセンサーデバイスを通じたタンパク質のトランスロケーションは、シークエンシング、構造／折り畳み分析、精製／分離、細胞内タンパク質運搬、及びトランスロケーション中のポリペプチドを駆動する酵素のメカニズムへの洞察を含む複数の可能な応用を提供する。核酸と異なり、タンパク質は通常、均一に荷電されておらず（そのため、印加電圧によりトランスロケーションを駆動するのが困難である）、ナノポア開口部を横切れない複雑で大きな安定構造へと折り畳まれている。これらの問題に取り組むために、タンパク質ナノポアを通じた天然の折り畳まれた状態のタンパク質のアンフォールディング及びトランスロケーションが、大腸菌ＣｌｐＸ等の種々の酵素（又は他の種類のタンパク質トランスロカーゼ／アンフォールダーゼ）により実現され得る。
【００４９】
本発明の方法及びデバイスはトランスロケートされているタンパク質の１又は複数の特徴を測定するために用いることができる。
【００５０】
様々な異なる種類の測定がなされ得る。これは時に限定されないが、例えば電気的測定及び光学的測定を含む。可能な電気的測定としては、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果の測定（Ｉｖａｎｏｖ  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１１  Ｊａｎ  １２；１１（１）：２７９−８５）、及びＦＥＴ測定（国際公開第２００５／１２４８８８号）が含まれる。光学的測定を電気的測定を組み合わせることもできる（Ｓｏｎｉ  ＧＶ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍ．２０１０  Ｊａｎ；８１（１）：０１４３０１）。測定は、ポアを流れるイオン電流の測定等の膜電流測定であり得る。
【００５１】
電気的測定は、Ｓｔｏｄｄａｒｔ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１２；１０６（１９）：７７０２−７，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ＫＲ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２０１０；１３２（５０）：１７９６１−７２，及び国際公開第２０００／２８３１２号に記載されているように標準的な単一チャネル記録機器を用いてなされ得る。あるいは、電気的測定は、例えば国際公開第２００９／０７７７３４号及び同第２０１１／０６７５５９号に記載されているようにマルチチャネルシステムを用いてなされ得る。
【００５２】
信号測定は通常、タンパク質又はタンパク質中のアミノ酸の同定の指標となる。したがって、信号は前述したようにタンパク質の特徴解析（例えば配列）に用いることができる。
【００５３】
１．トランスロケーションに用いられる酵素
大腸菌ＣｌｐＸを本発明のデバイスの実施例に用いた。これは、安定なタンパク質の折り畳みを変性させるのに充分な機械的力（＞２０ｐＮ）を生成すること及びナノポアセンサーによる一次配列分析に適した速度（最大で１秒当たり８０アミノ酸）でタンパク質に沿ってトランスロケートさせることから、最初の研究に選択された。ＣｌｐＸはＣｌｐＸＰプロテアソーム様複合体の一部である。ＣｌｐＰは、制御的な六量体ＡＴＰ依存性アンフォールダーゼ／トランスロカーゼ複合体（例えばＣｌｐＸ）の一方又は両方の末端に結合する２つの七量体（ｄｉｈｅｐｔａｍｅｒｉｃ）シリンダー様プロテアーゼで構成される。ＣｌｐＸは、タグ化されたタンパク質がその後分解されるためにＣｌｐＰプロテアーゼ複合体の内腔に入ることを可能にするゲートとして働く。六量体タンパク質複合体ＣｌｐＸのＡＴＰ依存性アンフォールダーゼ／トランスロカーゼ活性を利用して、ナノポアを通じてタンパク質をほどいて通す。
【００５４】
ＣｌｐＸはＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｒｅｂｕｉｌｔ  ＡＡＡ＋  Ｍｏｔｏｒｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  ＡＴＰ−ｆｕｅｌｌｅｄ  ｍａｃｈｉｎｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  ４３７：１１１５−１１２０（２００５）に記載されているように作製することができる（作製した）。種々の代替的酵素が本発明の方法及びデバイスにおいてタンパク質トランスロカーゼの機能を果たし得る。そこに記載されているように、Ｎ末端アミノ酸１〜６０を欠き、長さ２０アミノ酸のリンカーで連結された２、３、又は６個のＣｌｐＸ−ΔＮサブユニットの組合せを単一ポリペプチド鎖として作製した。
【００５５】
ＡＡＡ＋ＡＴＰアーゼが関わる細胞機能のレパートリーは多様である。ＡＡＡ＋タンパク質のあるサブセットはＡＴＰアーゼとして活性でなく、一部はＡＴＰへの結合すらしない。しかし、これらのタンパク質は、ＡＴＰアーゼとして働く他のファミリーのメンバーと複合体を形成するようである。しかし、全ての公知のＡＴＰ依存性プロテアーゼのＡＴＰアーゼサブユニット又はドメインはＡＡＡ＋ファミリーに属する。
【００５６】
好適なＡＡＡ＋酵素の一例としてＣｌｐ／Ｈｓｐ１００  ＡＴＰアーゼが挙げられる。Ｃｌｐ／Ｈｓｐ１００  ＡＴＰアーゼはタンパク質標的の選択を担う。例えば、２つの異なる細菌ＡＴＰアーゼ、ＣｌｐＸ及びＣｌｐＡは、ＣｌｐＰペプチダーゼに別個の基質選択性を付与する。リボソーム上に止められたポリペプチドに付加される１１残基ペプチドであるｓｓｒＡ分解配列はＣｌｐＸ及びＣｌｐＡの両方に認識される。ｓｓｒＡ配列の変異分析により、この同じタグが異なる残基により２つのアンフォールディング酵素に認識されることが明らかになり、これにより各ＡＴＰアーゼの別個の結合選択性が更に確認された。
【００５７】
ＡＴＰ加水分解に由来するエネルギーを用いて、Ｃｌｐ／Ｈｓｐ１００酵素は基質の構造変化を能動的に方向付ける。これらのＡＴＰ駆動構造変化は、タンパク質基質に２つの別個の生物学的結果、すなわち変性又はリモデリングをもたらす。ＣｌｐＡは、カゼインを分解するその能力に基づき、機能的に同定された最初の原核生物Ｃｌｐ／Ｈｓｐ１００タンパク質である。したがって、Ｃｌｐ／Ｈｓｐ１００タンパク質の分解経路は２つのプロセスの内でもよりよく特徴解析されている。Ｃｌｐ／Ｈｓｐ１００により促進されるタンパク質分解中、最初にＣｌｐ／Ｈｓｐ１００構成要素が標的タンパク質を認識及び選択する。酵素は、基質のＣ又はＮ末端のいずれかの近くに通常位置する短いペプチド配列（例えば、ｓｓｒＡ分解タグ）に結合する。その後、複数サイクルのＡＴＰ加水分解を要求する反応において、酵素は、標的基質をほどいて、それが分解されるペプチダーゼチャンバーへ指向的にトランスロケートさせる。
【００５８】
ミトコンドリアタンパク質トランスロカーゼを用いることもできる。これらは、ヒト又は真核生物細胞に由来するトランスロカーゼＴＯＭ又はＴＩＭ、例えばＴＯＭＭ２０（ミトコンドリア外膜トランスロカーゼ２０ホモログ）、ＴＯＭＭ２２（ミトコンドリア移入受容体サブユニット２２ホモログ）、ＴＯＭＭ４０（ミトコンドリア外膜トランスロカーゼ４０ホモログ）、ＴＯＭ７（ミトコンドリア外膜トランスロカーゼ７）、ＴＯＭＭ７（ミトコンドリア外膜トランスロカーゼ７ホモログ）、ＴＩＭＭ８Ａ（ミトコンドリア内膜トランスロカーゼ８ホモログＡ）、ＴＩＭＭ５０（ミトコンドリア内膜トランスロカーゼ５０ホモログ）であり得る。例えば、ＴＯＭＭ４０は、ミトコンドリアの外膜に埋め込まれ、ミトコンドリア内へのタンパク質の移動に必要である。より具体的には、ＴＯＭＭ４０は、ミトコンドリア内へのタンパク質輸送に必須であるミトコンドリア外膜のトランスロカーゼ（ＴＯＭ）のチャネル形成サブユニットである。
【００５９】
別の代替的タンパク質トランスロカーゼがトランスロカーゼのＳｅｃファミリーから作製され得る。これらには、ＳｅｃＢ（シャペロンタンパク質）、ＳｅｃＡ（ＡＴＰアーゼ）、ＳｅｃＹ（原核生物の内膜複合体）、ＳｅｃＥ（原核生物の内膜複合体）、ＳｅｃＧ（原核生物の内膜複合体）、又はＳｅｃ６１（真核生物の内膜複合体）、ＳｅｃＤ（膜タンパク質）、及びＳｅｃＦ（膜タンパク質）が含まれる。
【００６０】
別の代替的タンパク質トランスロカーゼとしては、３型分泌装置（ＴＴＳ）トランスロカーゼ、例えばＨｒｃＮ、及びＴＴＳトランスロカーゼの２０個のサブユニットのいずれか、又はＳｅｃ非依存性ペリプラズムタンパク質トランスロカーゼＴａｔＣが挙げられる。
【００６１】
他の代替的タンパク質トランスロカーゼはシャペロンである。これらは、他の巨大分子構造体の非共有結合的フォールディング又はアンフォールディング及び構築又は解体を支援するが、フォールディング及び／又は構築のプロセスが完了した構造体がその通常の生物学的機能を行っている時にはこれらの構造体中にはないタンパク質である。多くのシャペロンは熱ショックタンパク質、すなわち、高温又は他の細胞ストレスに応答して発現されるタンパク質である。Ｈｓｐ７０とは、知られているように、７０ｋ-Ｄａの熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ７０）、例えば原核生物のＤｎａＫ、ＨｓｃＡ（Ｈｓｃ６６）、及びＨｓｃＣ（Ｈｓｃ６２）並びに真核生物のＨｓｃ７０、Ｈｓｐ７０、ＢｉＰ、又はＧｒｐ７８（免疫グロブリンタンパク質に結合）、ｍｔＨｓｐ７０、又はＧｒｐ７５、並びにヒトＨｓｐ７０タンパク質、例えばＨｓｐ７０、Ｈｓｐ７０−２、Ｈｓｐ７０−４、Ｈｓｐ７０−４Ｌ、Ｈｓｐ７０−５、Ｈｓｐ７０−６、Ｈｓｐ７０−７、Ｈｓｐ７０−８、Ｈｓｐ７０−９、Ｈｓｐ７０−１２ａ、Ｈｓｐ７０−１４を指す。Ｈｓｐ７０タンパク質は、分子シャペロン及びフォールディング触媒の細胞ネットワークの中心的構成要素である。Ｈｓｐ７０は、新たに合成されたタンパク質のフォールディング及び構築、ミスフォールド及び凝集したタンパク質のリフォールディング、オルガネラ及び分泌型のタンパク質の膜トランスロケーション並びに制御タンパク質の活性の調節を含む幅広いフォールディングプロセスを支援する。Ｈｓｐ７０タンパク質のシャペロン活性にインビトロ及びインビボでＡＴＰ結合及び加水分解が必須である。
【００６２】
Ｈｓｐ７０シャペロンファミリーは、Ｈｓｐ６０シャペロンファミリーと共に最も一般的なリモデリング酵素として認識されている。Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ６０は、フォールディングしているタンパク質に孤立した環境を与えることにより、タンパク質フォールディング中の経路外（ｏｆｆ−ｐａｔｈｗａｙ）相互作用を防止する。対照的に、Ｃｌｐ／Ｈｓｐ１００アンフォールディング酵素はその基質の構造変化を能動的に方向付ける。Ｃｌｐ／Ｈｓｐ１００は、フォールディング及び構築された複合体並びに不適切にフォールディング及び凝集したタンパク質に作用する。
【００６３】
ＨＳＰ９０は、ＡＴＰ依存的プロセスでＴＯＭ複合体へのミトコンドリアプレタンパク質の運搬を助ける。
【００６４】
Ｈｓｐ１００（大腸菌のＣｌｐファミリー）タンパク質が、タグ化及びミスフォールドされたタンパク質を標的化してほどく能力についてインビボ及びインビトロで研究されてきた。Ｈｓｐ１００／Ｃｌｐファミリーのタンパク質は、ＡＴＰの存在下でアンフォールダーゼ活性を有する大きな六量体構造を形成する。これらのタンパク質は、小さな２０Å（２ｎｍ）のポアにクライアントタンパク質を前進的に通すことで各クライアントタンパク質に２回目の折り畳みの機会を与えることによりシャペロンとして機能すると考えられる。これらのＨｓｐ１００シャペロンのいくつか、例えばＣｌｐＡ及びＣｌｐＸは、二環十四量体セリンプロテアーゼＣｌｐＰと会合し、クライアントタンパク質のリフォールディングを触媒する代わりに、これらの複合体はタグ化及びミスフォールドされたタンパク質の標的化された破壊を担う。
【００６５】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨｓｐ１００であるＨｓｐ１０４は多くの酵母のプリオンの増殖に必須である。ＨＳＰ１０４遺伝子が欠失すると特定のプリオンを増殖できない細胞になる。
【００６６】
実施例で用いられる酵素は以下の配列を有する：
2018075021.tif 000003
【００６７】
これは、合成により設計された単鎖として発現されるＣｌｐＸサブユニットの三量体である。前述したように、種々のトランスロカーゼコンストラクトが本システムで用いられ得る。
【００６８】
２．酵素はナノポアと結合して一方の側の溶液中で自由であってもよく且つ／又はナノポアの両側に存在してもよい。
シス側（基質タンパク質と同じ側）のトランスロカーゼ
特定の実施形態では、例えば図１０に示されているように、ＣｌｐＡ又はＣｌｐＸがナノポアに結合してよい。設計されたα溶血素／ＣｌｐＰ融合タンパク質ポアが、Ｎ末端キャップドメインでＣｌｐＰ七量体複合体のＣｌｐＸ結合ドメインに共有結合により融合した活性七量体タンパク質ナノポアを形成するように構築され得る。ナノポアの上にＣｌｐＰのＣｌｐＸ結合ドメインを融合させることにより、溶液中でＣｌｐＸを集めてＣｌｐＰドメインに結合させ、ナノポア上で機能させることが可能になる。
【００６９】
図１０は、ＣｌｐＰタンパク質のサブユニットに融合させたα溶血素ポアタンパク質サブユニットを含む融合タンパク質を示す図である。ＣｌｐＸタンパク質トランスロカーゼはその後、ＣｌｐＰサブユニット上に非共有結合的に「ドッキング」することができる。この実施形態では、タンパク質トランスロカーゼはナノポアのシス側にあって、ナノポアに融合している。
【００７０】
図１０の実施形態では、トランスロカーゼ及びナノポアの軸方向ポアは正確な方向に配列されなくてはならない。すなわち、ＣｌｐＸは、タンパク質基質が溶液から捕捉されてＣｌｐＸ中央の空洞を通じて駆動され、その後これがＡＨＬ（α溶血素）上側内腔に直接移入して最終的にナノポア全体を通らされるように、ナノポアに結合しなければならない（図１０参照）。この目的を達成するために、ＣｌｐＸ結合ドメインをＡＨＬのヘッドに融合させてもよい。天然には、ＣｌｐＸ六量体は自然に十四量体（２つの七量体環）プロテアーゼＣｌｐＰの各開口部のヘッドドメインに結合し、タグ化されたタンパク質だけをタンパク質分解チャンバーに入れるゲートとして作用する。ＣｌｐＰのＣｌｐＸ結合ドメインをＡＨＬのヘッドに融合させることにより、天然のタンパク質間相互作用を介してＣｌｐＸをナノポアの上に高い親和性で直接結合させることが可能になる。幸運にも、ＡＨＬ及びＣｌｐＰはどちらも、ほぼ同じ直径のホモ七量体環へと構築される。したがって、各ＡＨＬモノマーのヘッドにＣｌｐＰモノマーのＣｌｐＸ結合ドメインを融合させることで、これらＣｌｐＰ／ＡＨＬ融合モノマーで構成される七量体ナノポア複合体が作られる。過去の実験で、ＡＨＬモノマーの融合が調べられており、ＡＨＬは実際Ｎ末端及びＣ末端の両方での融合に耐えられることが示されている。更に、ＣｌｐＰのＣ末端における欠失が実験により調べられており、ここは七量体形成又はＣｌｐＸ結合にとって重要な領域でないことが示されている。このデータは、ＣｌｐＰがＣ末端へのＡＨＬの融合に耐えられることを示唆しており、一方、ＣｌｐＰのＮ末端への融合は、Ｎ末端ループがＣｌｐＸの結合活性に重要であることが示されているので、ほぼ確実にＣｌｐＸの結合を阻害するであろう。これらの過去の研究に基づき、（各タンパク質モノマーが適切に折り畳まれるように可動性の５〜１５個のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーにより隔てられている）切断型ＣｌｐＰモノマーのＣ末端に単一ＡＨＬモノマーが融合したＡＨＬ／ＣｌｐＰ融合モノマーをデザインする。これらのＣｌｐＰ−ペプチドリンカー−ＡＨＬ融合タンパク質ＤＮＡ配列は、ＰＣＲアセンブリーにより構築され、Ｈｉｓタグ化され、ｐＴ７−ＳＣ１発現ベクター中に挿入され得る。融合タンパク質の発現は、以前にＡＨＬ融合体の発現に用いられたＴ７−Ｓ３０発現系を用いた連動したインビトロの転写及び翻訳により行われ得、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。
【００７１】
トランスロカーゼがデバイスのシス側にある別の実施形態ではアクセサリータンパク質を用いる。この場合、基質タンパク質に結合するタンパク質を用いて、ナノポアへの又はナノポアを通した基質タンパク質の移動の制御を容易にする。例えば、（図１のように）トランス側に存在するタンパク質は活性トランスロカーゼ／アンフォールダーゼである必要はないが、ポリペプチドのほどかれた部分に非特異的に結合する別のタンパク質（例えば、トリガー因子）である必要がある。トリガー因子とは、リボソーム関連分子シャペロンであり、新生ポリペプチドと相互作用する最初のシャペロンである。これは、新たに合成されたタンパク質をオープン構造中に維持することにより、シャペロンとして働く。その他のシャペロニン又は熱ショックタンパク質を用いることもできる。
【００７２】
このトランス側タンパク質（例えば、トリガー因子）は、これにより、ほどかれた基質タンパク質がシス側トランスロカーゼ／アンフォールダーゼによりトランス溶液中にトランスロケートされる際にこれを順次捕捉し、基質タンパク質がシス側に戻ることを防ぐ。
【００７３】
別の実施形態では、基質タンパク質は、所定の状態に達するまでアンフォールダーゼによるアンフォールディングをブロックする因子を備える。この実施形態では、基質タンパク質及びアンフォールダーゼの両方がシス側に加えられる。基質タンパク質は、一方の末端においてアンフォールダーゼ結合モチーフ（例えばＣｌｐＸに対するｓｓｒＡタグ）、ポア標的化ドメイン（例えば、印加電圧下でポア中に引っ張られる荷電ポリペプチドテイル）、及びアンフォールダーゼ抵抗性タンパク質（例えば、安定化リガンド存在下のジヒドロ葉酸還元酵素又はバルナーゼはＣｌｐＸによるアンフォールディングに抵抗性である；Ｈｏｓｋｉｎｓ，ＪＲ  ｅｔ  ａｌ．ＣｌｐＡＰ  ａｎｄ  ＣｌｐＸＰ  ｄｅｇｒａｄｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｔａｇｓ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｉｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ＰＮＡＳ  Ａｕｇｕｓｔ  ２０，２００２  ｖｏｌ．９９  ｎｏ．１７  １１０３７−１１０４２参照）でタグ化される。したがって、基質タンパク質は、その折り畳まれたドメインとポア標的化ドメイン及びアンフォールダーゼ結合モチーフドメインとの間のこの「ブロッキングドメイン」によってアンフォールダーゼから保護される。
【００７４】
ブロッキングドメインタンパク質（ポア標的化ドメイン及びアンフォールダーゼ標的化モチーフドメインと融合）は、翻訳後に化学的又は酵素的に基質タンパク質に結合し得る。
【００７５】
大量のシス溶液中、アンフォールダーゼは、アンフォールダーゼ結合モチーフに結合し、ポア標的化ドメインに沿ってトランスロケートさせる。タグ化基質に沿ったアンフォールダーゼによるトランスロケーションは、酵素がアンフォールダーゼ抵抗性タンパク質（「ブロッキングドメイン」）に接近すると止まる。このタグ化基質タンパク質／アンフォールダーゼ複合体がナノポアに捕捉された時、ブロッキングドメインのアンフォールディング及びトランスロケーションが開始される。これは、ポアに基質テイルが捕捉されて通された後に、ポアの電圧及び／又はタグ化基質タンパク質テイルと相互作用するトランス溶液中に存在する別のタンパク質トランスロカーゼ／アンフォールダーゼによって付与される特別な不安定化力によって触媒される。その後、ポアによって活性化されるブロッキングドメインのアンフォールディングが触媒された後、ナノポアを通じたシス結合アンフォールダーゼによる基質タンパク質全体のアンフォールディング及びトランスロケーションが可能になる。
【００７６】
ブロッキングドメイン配列の戦略的配列の例は以下の通りである：
Ｎ末端−基質タンパク質−ブロッキングドメイン−荷電テイル−アンフォールダーゼ結合モチーフ−Ｃ末端
【００７７】
トランス側のトランスロカーゼ
ＣｌｐＸ複合体をナノポアのトランス側の溶液中に配置し、ナノポアのシス側に溶解させた基質タンパク質を、Ｎ又はＣ末端から始めてナノポアに通す（例えば、５〜１０個のＡｓｐ、Ｌｙｓ、又はＡｒｇ残基等の数個の荷電アミノ酸をタンパク質末端中に設計することにより電圧で駆動される）、ＣｌｐＸ複合体がこのタグ化ポリペプチドテイルを捕捉し、ナノポアを通して下へ機械的に基質を牽引／トランスロケートし始める。タグ化タンパク質の天然ＣｌｐＸ結合、アンフォールディング、及びトランスロケーション活性を用いて、その後の分析のためのナノポアセンサーを通したタンパク質の移動を制御する。ＣｌｐＸ又はＣｌｐＡ等の別のトランスロカーゼがデバイスのトランス側の溶液中に配置される場合、野生型タンパク質ナノポア又は他の固体ナノポアが用いられ得、そこで、ナノポアを通してシス側からトランス側の溶液に通されたタグ化タンパク質テイルを捕捉することができる（すなわち、ＣｌｐＸへの「フィッシング」）。このタグ化テイルの捕捉後、ＣｌｐＸ複合体は、最終的にポアを通じてポリペプチド全体をほどいてトランス側溶液に通すことができるまで、ポアの向こう側からタンパク質を機械的に引っ張り始めることができる。タグ化テイルの最初の通しは、標的タンパク質のＮ又はＣ末端上のタグ配列の近くに複数の荷電残基を付加することにより達成することができ、電圧差によりナノポアを通して荷電テイルが駆動され、ＣｌｐＸへの「フィッシング」が可能になる。
【００７８】
例えば以下の実施例１及び２に示されているように、タンパク質トランスロカーゼはチャンバーのトランス側に溶液で添加され、折り畳まれたタンパク質が通過するには狭すぎるナノポアを通じて引っ張ることにより、トランスロケートされるタンパク質をほどく役割をする。同じ又は異なるタンパク質トランスロカーゼが、タンパク質をほどくためにナノポアのシス側に配置され得る。
【００７９】
３．ナノポアセンシング
本発明の方法及びデバイスにおける検知方法は、タンパク質の１、２、３、４、又は５以上の特徴を測定することを含み得る。１又は複数の特徴は、好ましくは（ｉ）タンパク質の長さ、（ｉｉ）タンパク質のアイデンティティー、（ｉｉｉ）タンパク質の配列、（ｉｖ）タンパク質の二次又は三次構造、及び（ｖ）タンパク質が修飾されているかいないか、から選択される。（ｉ）〜（ｖ）の任意の組合せが本発明に従って測定され得る。
【００８０】
特徴的な（ｉ）では、タンパク質とポアとの相互作用の数及び／又はタンパク質がポアを通ってトランスロケートする際のタンパク質の滞留時間を用いて、タンパク質の長さが測定され得る。
【００８１】
特徴的な（ｉｉ）では、複数の方法でタンパク質のアイデンティティーが測定され得る。タンパク質のアイデンティティーは、タンパク質の配列の測定と組み合せて測定されてもよく、タンパク質の配列の測定なしで測定されてもよい。前者は明白であり、タンパク質がシークエンシングされることにより同定される。後者は複数の方法でなされ得る。例えば、タンパク質中の特定のモチーフの存在が測定され得る（タンパク質の残りの配列を測定することなく）。あるいは、方法における特定の電気的及び／又は光学的信号の測定により、タンパク質が特定のソースに由来することが同定され得る。
【００８２】
特徴的な（ｉｉｉ）では、本明細書に記載されているようにタンパク質の配列が決定され得る。配列は、個々のアミノ酸残基毎に決定されてもよく、アミノ酸のブロックで読まれて、ＤＮＡのリシークエンシングと同様な方法で既知のタンパク質配列へとマッピングされてもよい。したがって、方法は、個々のアミノ酸それぞれを分離（ｒｅｓｏｌｖｅ）する必要はなく、タンパク質／ポリペプチド配列の同定がまだ可能なアミノ酸の「単語」又はブロック／チャンク（例えば、２〜１０ａａ）を分離するだけでよい。
【００８３】
特徴的な（ｉｖ）では、種々の方法で二次及び三次構造が測定され得る。例えば、方法が電気的測定を含む場合、二次構造（例えば、αへリックス領域対ループ領域又はβシート領域の検出）が、滞留時間の変化又はポアを流れる電流の変化を用いて測定され得る。
【００８４】
特徴的な（ｖ）では、任意の修飾の有無が測定され得る。方法は、好ましくは、メチル化リン酸化、酸化、損傷（例えば、ミスフォールディング又はアミノ酸の共有結合的修飾）、グリコシル化、又は１若しくは複数の標識、タグ、若しくはスペーサーによりタンパク質が修飾されているかどうか決定することを含む。特異的な修飾はナノポアとの特異的相互作用を生じさせ、これを以下に記載する方法を用いて測定することができる。
【００８５】
以下に記載するように、本発明の方法及びデバイスは、ナノポアを通じて測定されるイオン電流の分析により、トランスロケートされているタンパク質からタンパク質配列情報を抽出することができる。これは、以下に全て記載のあるパッチクランプ増幅器等の高感度電子機器、有限状態機械、及び加重平均等の信号処理の利用に一部依存する。更に、本発明の方法は、ナノポアを通したタンパク質の移行に関連することが今回見出された種々の電流状態、及び付随する電流の遮断、遮断解除（ｕｎｂｌｏｃｋａｇｅ）、調節の分析を含む。以下に記載されているように、酵素仲介タンパク質横断により検出される信号は、酵素と基質タンパク質との結合に特徴的であるいわゆる「ランプ状態（ｒａｍｐｉｎｇ  ｓｔａｔｅ）」に入り、次いでタンパク質がナノポアを通ってトランスロケートする際の一連の別個の振幅遷移（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）、次いでトランスロケーション前のポアの電流に等しい開口状態に入る。要約すると、例示されている実験構成を用いて、以下の別個の状態を観察することができる（図２参照）：
（ｉ）トランスロケーション前の開口チャネル電流：約３０〜３５ｐＡ又は３２〜３６ｐＡ；
（ｉｉ）トランスロケートされるタンパク質の捕捉後の約１１〜１５（例えば、約１３〜１５）ｐＡへの低下（すなわち、タンパク質がナノポアの開口部をブロックする）；
（ｉｉｉ）酵素がタンパク質に結合し、ナノポアに向かってタンパク質テイルに沿ってトランスロケートさせる（すなわち、酵素がナノポア開口部を更にブロックする）ことによる、１０ｐＡ以下への低下及び種々の振幅変化（後述する「ランプ」効果を含む）；
（ｉｖ）タンパク質のアンフォールディング後、タンパク質全体がナノポアを通ってトランスロケートされ、固有の電流パターンが生成する；
（ｖ）開口チャネル状態に戻る。
【００８６】
重要なことに、状態（ｉｖ）（図２Ａ及び２Ｂ）は、タンパク質構造に関連付けることができる電流パターンを表す。後述する通り、実施例中で用いた人工リンカーは、異なる電流の振幅及び期間を示した。配列等の未知の特徴を決定するためにタンパク質を分析する場合、観察されたＲＭＳノイズ及び振幅の変化を、トランスロケートされたタンパク質のアミノ酸依存的特徴と関連付けることができる。これには、三次及び二次構造、アミノ酸配列、並びに翻訳後修飾が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８７】
ナノポアバイオセンシング技術は、印加電圧下で分子がポアを通ってトランスロケートする及び／又はポアと相互作用する時に生じるイオン電流の遮断に基づく。したがって、電流遮断は印加電圧及び相互作用分子の特性（例えば、電荷、サイズ）に依存する。
【００８８】
任意の好適な技術でナノポア開口部の時間依存的輸送特性を測定することができる。輸送特性は、ポリペプチドの輸送に用いられる媒体、液体中の溶質（例えばイオン）、ポリペプチド（例えば、モノマーの化学構造）、又はポリペプチド上の標識によって異なり得る。輸送特性の例としては、電流、コンダクタンス、抵抗、静電容量、電荷、濃度、光学的特性（例えば、蛍光及びラマン散乱）、及び化学構造が含まれる。望ましくは、輸送特性は電流である。
【００８９】
シスチャンバーとトランスチャンバーとの間の電流を検出するための手段の例は、国際公開第００／７９２５７号、米国特許第６，４６，５９４号、同第６，６７３号、同第６，６７３，６１５号、同第６，６２７，０６７号、同第６，４６４，８４２号、同第６，３６２，００２号、同第６，２６７，８７２号、同第６，０１５，７１４号、同第６，４２８，９５９号、同第６，６１７，１１３号、及び同第５，７９５，７８２号、並びに米国特許出願公開第２００４／０１２１５２５号、同第２００３／０１０４４２８号、及び同第２００３／０１０４４２８号に記載されており、特に限定されないが、ポア開口部の又はその近くのチャネル又はポアに直接連結された電極、シス及びトランスチャンバー内に配置された電極、並びに絶縁ガラス微小電極を含み得る。電極は、特に限定されないが、２つのチャンバー間のイオン電流の差又はポア開口部若しくはチャネル開口部を横切る電子トンネル電流を検出でき得る。別の実施形態では、輸送特性は、開口部の直径を横切る電子流であり、これは、ナノポア外周に近接又は隣接して配置された電極によりモニタリングすることができ得る。そのような電極は、信号を増幅するためのＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器に連結され得る。
【００９０】
一実施形態では、媒体は電気伝導性である。別の好ましい実施形態では、媒体は水溶液である。別の好ましい実施形態では、方法は、２つのプール間の電流を測定するステップ；最初の極性が誘導された時に最初に得られた電流値（Ｉ１）を、最初の極性が２回目に誘導された時点で得られた電流値（Ｉ２）と比較するステップ；及びＩ１とＩ２の差を求めることにより差値δＩを得るステップを更に含む。別の好ましい実施形態では、方法は、２つのプール間の電流を測定するステップ；最初の極性が誘導された時に最初に得られた電流値（Ｉ１）を後の時点で得られた電流値（Ｉ２）と比較するステップ；及びＩ１とＩ２の差を求めることにより差値δ１を得るステップを更に含む。
【００９１】
別の実施形態では、方法は、酵素活性を開始させる試薬を準備するステップ；ポリペプチド複合体を含むプールに試薬を導入するステップ；及び好適な温度でプールをインキュベートするステップを更に含む。別の好ましい実施形態では、試薬は、活性化因子及び補因子からなる群から選択される。
【００９２】
４．ナノポア薄膜デバイスの製造
単一チャネル（ナノポア）薄膜デバイス及びその使用方法を提供する。対象デバイスは通常、混合信号半導体ウェーハ、少なくとも１つの電気化学的層を含み、電気化学的層は、二酸化シリコン等の半導体材料を含み、半導体材料は、炭化水素等の表面改質剤を更に含み、電気化学的層は複数のオリフィスを規定し、オリフィスは、チャンバー及びネックを含み、オリフィスのチャンバーは、混合信号半導体ウェーハの第１の金属組成物と一緒に局在し、オリフィスの一部は、第２の金属、例えば銀で塞がれており、第２の金属は、第１の金属と電子的に連絡しており、オリフィスは、リン脂質二重層等の薄膜を更に含み、薄膜は、オリフィスのネックで溶媒不透過性シールを形成し、薄膜はポアを更に含み、オリフィスは水相及びガス相を封入する。
【００９３】
別の好ましい実施形態では、半導体材料は、二酸化シリコン（ＳｉＯ２）、酸窒化シリコン（ＳｉＯＮ）、窒化シリコン（ＳｉＮ）、金属酸化物、及び金属ケイ酸塩からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、半導体材料は二酸化シリコンである。別の好ましい実施形態では、表面改質剤は炭化水素である。別の好ましい実施形態では、金属化組成物は、ニッケル、金、銅、及びアルミニウムからなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、金属は銀である。好ましい実施形態では、薄膜は二分子層である。別の好ましい実施形態では、薄膜はリン脂質二重層である。別の一実施形態では、オリフィスのサイズは０．５〜３μｍである。好ましい実施形態では、オリフィスのサイズは１〜２μｍである。最も好ましい実施形態では、オリフィスのサイズは１．２５〜１．５μｍである。別の好ましい実施形態では、ポアは生物学的分子である。別の好ましい実施形態では、生物学的分子は、イオンチャネル、ヌクレオシドチャネル、ペプチドチャネル、糖輸送体、シナプスチャネル、膜貫通受容体、及び核孔からなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、生物学的分子はα溶血素である。好ましい実施形態では、ポア開口部のサイズは約１〜１０ｎｍである。別の好ましい実施形態では、ポア開口部のサイズは約１〜４ｎｍである。最も好ましい実施形態では、ポア開口部のサイズは約１〜２ｎｍである。別の最も好ましい実施形態では、ポア開口部のサイズは約２〜４ｎｍである。
【００９４】
生物学的ナノポアはポリペプチドの検出に有用であるが、使用される電流が低い（およそ数十ピコアンペア）ため、ハイスループットの単一ナノポアシークエンシングデバイスを用いた検出は１秒当たりおよそ１０００アミノ酸残基に限定され得る。非常に大きな集積回路のアレイの製造で用いられるような、互いに独立して作動可能な生物学的ナノポアのアレイを製造することにより、非常に大規模なナノポアのアレイで１秒に数百万の生化学反応及び分析を行うことが可能になる。
【００９５】
種々のナノポアが本発明のシステムで使用され得る。一実施形態では、ポア又はチャネルは、ポリマーの通過に適した寸法の形状及びサイズにされ得る。別の実施形態では、ポア又はチャネルはポリマーの実質的部分を収容する。好ましい実施形態では、ポリマーはポリペプチドである。ポア又はチャネルは、ポア分子又はチャネル分子であり得、生物学的分子、合成改変分子、改変された生物学的分子、又はこれらの組合せを含み得る。そのような生物学的分子は、例えば、限定されるものではないが、イオンチャネル、例えばα溶血素、ＭｓｐＡ、ヌクレオシドチャネル、ペプチドチャネル、糖輸送体、シナプスチャネル、膜貫通受容体、例えばＧＰＣＲ等、受容体型チロシンキナーゼ等、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣ受容体、核受容体、例えばステロイドホルモン受容体、核孔、合成バリアント、キメラバリアント、又は同様のものである。
【００９６】
好ましい一実施形態では、生物学的分子はα溶血素である。別の好ましい実施形態では、生物学的分子はＭｓｐＡ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのポーリンＡ）である。更に別の好ましい実施形態では、ポアは固体ポアである。
【００９７】
あるいは、ポア又はチャネルは非酵素的生物学的活性を含む。非酵素的生物学的活性を有するポア又はチャネルは、例えば、限定されるものではないが、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ、糖、脂質、グリコシルホスファチジルイノシトール、グリコホスホイノシトール、リポ多糖、又は同様のものであり得る。化合物は抗原活性を有し得る。化合物は、選択的結合特性を有し得、これにより、ポリマーは特定の制御された環境条件下で化合物に結合するが、環境条件が変えられた時には結合しない。そのような条件は、例えば、限定されるものではないが、［Ｈ＋］の変化、環境温度の変化、ストリンジェンシーの変化、疎水性の変化、親水性の変化、又は同様のものであり得る。
【００９８】
別の実施形態では、ポア又はチャネルは、チオール基、スルフィド基、リン酸基、硫酸基、シアノ基、ピペリジン基、Ｆｍｏｃ基、及びＢｏｃ基からなる群から選択されるリンカー分子を更に含む。別の実施形態では、化合物は、二官能性硫化アルキル及び金からなる群から選択される。
【００９９】
一実施形態では、ポアは、活性化因子の通過が可能なサイズ及び形状であり、活性化因子は、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ジアシルグリセロール、ホスファチジルセリン、エイコシノイド、レチノイン酸、カルシフェロール、アスコルビン酸、ニューロペプチド、エンケファリン、エンドルフィン、４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、カテコールアミン、アセチルＣｏＡ、Ｓ−アデノシルメチオニン、及び任意の他の生物学的活性化因子からなる群から選択される。別の実施形態では、ポアは補因子の通過が可能なサイズ及び形状であり、補因子は、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、及び任意の他の生物学的補因子からなる群から選択される。
【０１００】
アレイ要素は、集積回路上のトランジスタの製造と同様に、段階的に並行して製造され得る。各アレイ要素の同様な層の全て又はほとんどが、アレイ要素の全て又はほとんどに同時に起こる一連の単一プロセスステップで作製される。
【０１０１】
生物学的試薬の別個の分子の活性を同期させる簡便な方法はないようであるので、アレイの各要素は他の要素から独立して作用可能であるべきである。これは、生物学的ナノポアに関連する単一（又は複数）分子から離れた複合体の生化学的状態を制御及び検知する有限状態機械を実行するデジタル論理回路を各単一生物学的ナノポアに含めることにより実現され得る。有限状態機械は、生物学的ナノポアに関連する分子の複合体の短待ち時間制御を可能にし、同時に、別の時点での検索のために収集された情報を保存することができる。
【０１０２】
最低限の数の有線接続を用いてアレイ中の生物学的ナノポア要素のそれぞれが互いに連絡できるように、シリアルインターフェース及びアドレス指定可能なロジックを用いて、アレイを出入りする大量のデータを多重送信することができる。
【０１０３】
アレイ要素の全てがそれぞれのオリフィスを横切る薄膜又は二重層を有さなくてもよい。有限状態機械により測定されるナノポア中に存在する膜の静電容量を用いて、非機能性アレイ要素の存在を検出することができる。その後、薄膜又は二重層のないアレイ要素の割合が、好ましい割合より大きいと判定された場合、テフロンフィルム及び脂質コート等の膜を被せるステップを繰り返してよい。
【０１０４】
電極、例えば接地された巨視的ＡｇＣｌ電極が第２溶液に接触して配置され得る。機能可能なオリフィスの全てにわたって二重層等の膜が配置されている場合、第２溶液から第１溶液へイオン電流は流れない。所定の量のポア分子又はチャネル分子、例えばα溶血素毒素又はＭｓｐＡが、第２溶液に加えられる。ポア分子又はチャネル分子の濃度は、例えばおよそ１５分で薄膜又は二重層のいずれかに単一チャネルを形成するのに充分な濃度である。そのようなチャネルを形成するための時間は、例えば、０．５分〜１時間、例えば約０．５分、１分、２分、３分、４分、５分、７分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、又はこれらの間の任意の時間であり得る。形成の時間は、複数の因子又はパラメーター、例えば周囲若しくはインキュベーション温度の増減、第２溶液若しくは第１溶液中の塩濃度の増減、第１溶液と第２溶液との間に電位差を設けること、又は当業者に公知のその他の方法により、オペレーターによって変更可能である。有限状態機械は、回路を流れる電（イオン）流に反応して、その対応する二重層中における単一チャネルの形成を検出及び／又は検知することができ、回路は、巨視的電極と、第２溶液と、単一のナノポア又はチャネル分子と、第１溶液と、任意の所与のアレイ要素に対する金属電極とを含む。
【０１０５】
生物学的チャネルの形成は確率過程である。所与のアレイ要素二重層中に単一チャネルが形成されたら、第２チャネルが同じように二重層中に形成される確率が低減するか、好ましくは確立がゼロになることが好ましい。第２のチャネルが挿入される確率は、二重層に印加される電位、すなわち電位差によって調節することができる。単一チャネルの検知後、有限状態機械は、同じ二重層に第２のチャネルが挿入される確率が下がるように金属電極上の電位を調節することができる。
【０１０６】
前のステップで注意しても、所与の二重層に第２チャネルが形成されることがある。有限状態機械は第２チャネルの形成を検出することができる。正確に制御された低圧パルスにより２つのチャネルの１つを追い出して、二重層中に単一チャネルを埋められたまま残すことができる。
【０１０７】
生化学的始動及び検出のために生物学的ナノポアを用いている間に、ポアが永久的に塞がれることがある。有限状態機械はこの塞がれた状態を検出及び検知することができ、加熱要素を不活性化することで二重層に吸入力（圧力低下）を加えることにより、ブロックされたチャネルを二重層から除去することができる。
【０１０８】
別の実施形態では、各アレイ要素は、オリフィス周囲に金電極を含み得る。この金電極は、還元又は酸化反応を用いて化学試薬を活性化する役目を果たし得、特定のオリフィスの位置で特異的に作用することができる。
【０１０９】
有限状態機械は、例えば台湾セミコンダクター・マニュファクチャリング・カンパニー台湾）から市販されている最新の６５ｎｍプロセス技術等を用いて作製することができる。ナノポアの６００×６００アレイは３６０，０００の生化学反応及び１０００Ｈｚの速度での検出／検知ステップを行うことができる。これは、例えば、半導体ウェーハから切り出した１ｃｍ×１ｃｍのダイ当たり１秒間に３億６千万塩基の速度でポリヌクレオチドのシークエンシングを進めることを可能にし得る。
【０１１０】
シスチャンバーとトランスチャンバーとの間に電場を印加する手段の例としては、例えば、電圧源に接続された浸漬されたアノード及び浸漬されたカソードを含む電極が挙げられる。そのような電極は、例えば塩化銀、又は同様な物理的及び／又は化学的特性を有する任意の他の化合物からできていてよい。
【０１１１】
５．機器
実施例中、パッチクランプ増幅器（モデキュラーデバイス社製ＡｘｏＰａｔｃｈ  ２００Ｂ）を用いて印加電圧の制御及びチャネルを通るイオン電流の測定を行った。データはモレキュラーデバイス社製Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａデジタイザーを用いて記録され、５０ｋＨｚでサンプリングされ、四極Ｂｅｓｓｅｌフィルターで５ｋＨｚの低域フィルターに通した。ステーションの１つは異なるパッチクランプ（Ａ−Ｍシステムズ社（Ａ−Ｍ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）製、Ｍｏｄｅｌ  ２４００）を用いる。
【０１１２】
以下のように他の機器を用いてもよい：
【０１１３】
制御論理：ハードウェア及びソフトウェア
電圧制御論理は、ＬａｂＶＩＥＷ８ソフトウェア内の有限状態機械（ＦＳＭ）を用いてプログラムされる。ＦＳＭ論理は、書替え可能ゲートアレイ（ｆｉｅｌｄ−ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｇａｔｅ  ａｒｒａｙ：ＦＰＧＡ）ハードウェアシステムであるナショナルインスツルメンツ社（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製ＰＣＩ−７８３１Ｒ上で実行される。ＦＰＧＡとは、速い測定及び電圧応答時間（１μ秒のアウトプットサンプル時間）を可能にする再構成可能なハードウェアプラットフォームである。ＦＳＭは、プログラムの実行が一連の個々の状態に分割された論理構成である。各状態はそれに関連するコマンドを有し、状態間の遷移がシステム測定値の関数である。ポア電流の測定値が処理され、インプットとしてＦＳＭへ渡される。ＦＰＧＡ上で走らせるためにデザインをリコンパイル及びリルーティングする必要なく、ＦＳＭ制御論理は必要に応じて変更される。これにより、システムがマイクロ秒のオーダーでイベントに反応できるようにしつつ、実験間で必要に応じて制御論理を再構成できるようにすることで、速度と柔軟性のバランスがとられる。
【０１１４】
有限状態機械は、ポリマーへの分子の結合を検出及び制御するために用いることができる。分子はタンパク質であり、好ましくはタンパク質は酵素である。有限状態機械は更に、ナノポアを通したポリマー化合物の転位を阻害する構造的要素を有するポリマー化合物を検出することができる。一実施形態では、ポリマー化合物はペプチド核酸を含む。
【０１１５】
有限状態機械は、ポリマーへの分子の結合を約５〜２０００Ｈｚの速度に制御することができる。有限状態機械は、ポリマーへの分子の結合を例えば約５Ｈｚ、約１０Ｈｚ、約１５Ｈｚ、約２０Ｈｚ、約２５Ｈｚ、約３０Ｈｚ、約３５Ｈｚ、約４０Ｈｚ、約４５Ｈｚ、約５０Ｈｚ、約５５Ｈｚ、約６０Ｈｚ、約６５Ｈｚ、約７０Ｈｚ、約７５Ｈｚ、約８０Ｈｚ、約８５Ｈｚ、約９０Ｈｚ、約９５Ｈｚ、約１００Ｈｚ、約１１０Ｈｚ、約１２０Ｈｚ、約１２５Ｈｚ、約１３０Ｈｚ、約１４０Ｈｚ、約１５０Ｈｚ、約１６０Ｈｚ、約１７０Ｈｚ、約１７５Ｈｚ、約１８０Ｈｚ、約１９０Ｈｚ、約２００Ｈｚ、約２５０Ｈｚ、約３００Ｈｚ、約３５０Ｈｚ、約４００Ｈｚ、約４５０Ｈｚ、約５００Ｈｚ、約５５０Ｈｚ、約６００Ｈｚ、約７００Ｈｚ、約７５０Ｈｚ、約８００Ｈｚ、約８５０Ｈｚ、約９００Ｈｚ、約９５０Ｈｚ、約１０００Ｈｚ、約１１２５Ｈｚ、約１１５０Ｈｚ、約１１７５Ｈｚ、約１２００Ｈｚ、約１２５０Ｈｚ、約１３００Ｈｚ、約１３５０Ｈｚ、約１４００Ｈｚ、約１４５０Ｈｚ、約１５００Ｈｚ、約１５５０Ｈｚ、約１６００Ｈｚ、約１７００Ｈｚ、約１７５０Ｈｚ、約１８００Ｈｚ、約１８５０Ｈｚ、約１９００Ｈｚ、約９５０Ｈｚ、及び約２０００Ｈｚに制御することができる。好ましい実施形態では、有限状態機械は、ポリマーへの分子の結合を約２５〜約２５０Ｈｚの速度に制御することができる。より好ましい実施形態では、有限状態機械は、ポリマーへの分子の結合を約４５〜約１２０Ｈｚの速度に制御することができる。最も好ましい実施形態では、有限状態機械はポリマーへの分子の結合を約５０Ｈｚの速度に制御することができる。
【０１１６】
移動平均フィルター
５．３μ秒毎にＦＰＧＡはイオン電流をサンプリングし、０．７５ｍ秒のウィンドウサイズを用いてウィンドウ平均振幅（ｗｉｎｄｏｗｅｄ  ｍｅａｎ  ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）を計算する。選択された閾値範囲に平均値が入る場合、ＦＰＧＡは、エントリーを検出し、モニタリングし続けて、０．２ｍ秒毎に閾値を再チェックする。平均値が連続４回のチェックで閾値範囲内に留まる場合、ＦＳＭ論理は、選択された閾値と一致することが分かっているイベントタイプとして遮断を診断する。
【０１１７】
電圧変化がない場合、イベントの開始とイベントの診断との間の予想される時間遅延は１．３５ｍ秒であり、ウィンドウ平均（ｗｉｎｄｏｗｅｄ  ｍｅａｎ）が最初に閾値に入るのに０．７５ｍ秒、更に３つのテストが確認されるのに０．６ｍ秒である。実際、診断時間は１．１〜２．５ｍ秒である。本発明者らの最初の実証には平均フィルターを実装した。
【０１１８】
指数加重移動平均フィルター
最終ステップの誤検出に対するＦＳＭのロバストネスを向上させるために、平均フィルターの代わりに指数加重移動平均（ＥＷＭＡ）フィルターを用いてもよい。ＥＷＭＡフィルターは、電気工学的応用において信号平滑化に一般的に用いられるアナログＲＣフィルターのデジタル実装を意味する。フィルターは、過去のサンプルにさほど指数関数的に有意性を置かない移動平均を計算し、フィルタリングされた信号が実際の信号をよりよく追跡できるようにする。ＥＷＭＡフィルタリングは更に、その再帰的実行のため、単純移動平均より効率的に信号平滑化を行う：
2018075021.tif 000004
（式中、ｉ及びｉｂａｒは、それぞれフィルタリングされていない及びフィルタリングされた電流信号であり、ｔはサンプル数である）。オフラインで最終ステップの検出実験からのデータをフィルタリング（α＝０．９）することで、平均フィルターと比べて偽陽性に対するロバストネスの実質的な改善が示された。平均フィルターの場合同様、閾値テスト間に０．２ｍ秒待つ４回連続閾値テストをイベントの診断に用いる。
【０１１９】
電圧変化がない場合、イベント開始とイベントの診断との間の予想される時間遅延は０．７ｍ秒であり、ＥＷＭＡが最初に閾値に入るのに０．１ｍ秒、更に３回テストが確認されるのに０．６ｍ秒である。ＥＷＭＡ検出時間のより厳密な評価は本発明者らが現在進めている仕事の一部である。
【０１２０】
ＦＳＭ／ＦＰＧＡを用いた電圧制御
ナノポアシステムは０．３ｍＭ  ＫＣｌ溶液中に設定される。パッチクランプ増幅器（モレキュラーデバイス社製ＡｘｏＰａｔｃｈ  ２００Ｂ）で印加電圧の制御及びチャネルを通るイオン電流の測定を行う。データはモレキュラーデバイス社製Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａデジタイザーを用いて記録され、５０ｋＨｚでサンプリングされ、四極Ｂｅｓｓｅｌフィルターを用いて５ｋＨｚで低域フィルタリングする。
【０１２１】
電圧制御論理はＬａｂＶＩＥＷ８ソフトウェア内のＦＳＭを用いてプログラムされる。ＦＳＭ論理は、書替え可能ゲートアレイ（ＦＰＧＡ）ハードウェアシステムであるナショナルインスツルメンツ社製ＰＣＩ−７８３１Ｒ上で実行される。ＦＰＧＡは、速い測定及び電圧応答時間（１μ秒のアウトプットサンプル時間）を可能にする再構成可能なハードウェアプラットフォームである。ＦＳＭは、プログラムの実行が一連の個々の状態に分割された論理構成である。各状態はそれに関連するコマンドを有し、状態間の遷移がシステム測定値の関数である。ポア電流の測定値が処理され、インプットとしてＦＳＭへ渡される。ＦＰＧＡ上で走らせるためにデザインをリコンパイル及びリルーティングする必要なく、ＦＳＭ制御論理は必要に応じて変更される。これにより、システムがマイクロ秒のオーダーでイベントに反応できるようにしつつ、実験間で必要に応じて制御論理を再構成できるようにすることで、速度と柔軟性のバランスがとられる。
【０１２２】
６．応用例
本明細書に開示されている発明の応用及び／又は使用は、特に限定されないが、以下を含み得る：（１）ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及びＤＮＡ中のタンパク質−核酸複合体のアッセイ、（２）ペプチド分析による食品及び環境サンプル中の微生物の存在又はウイルス含有量のアッセイ、（３）ペプチド分析による食品及び環境サンプル中の微生物又はウイルス含有量の同定、（４）植物、ヒト、微生物、及び動物中のペプチド分析による病態の同定、（５）医学的診断におけるペプチドのアッセイ、及び（６）法医学的アッセイ。
【０１２３】
本発明のナノポアデバイスは、細胞増殖における応用に重要なプロテアーゼ、キナーゼ、及びホスファターゼ等の酵素のターンオーバーのモニタリングに用いることができる。
【０１２４】
本発明のナノポアデバイスは、酵素基質又はシグナル伝達分子等の可溶性物質間の相互作用をモニタリングするためのバイオセンサーとして機能し得る。例としては、受容体分子に結合することによりその機能を発揮する、グルコース等の血液成分、尿酸及び尿素、ステロイド及びサイトカイン等のホルモン、及び医薬品が含まれる。
【０１２５】
本発明のナノポアデバイスは、リボソーム等の重要な生物学的構造の機能をリアルタイムでモニタリングすることができ、単一機能単位でこの動作を行うことができる。
【０１２６】
本発明の方法及びデバイスは、治療的介入中のタンパク質レベルをモニタリングするため並びにタンパク質発現の変化、有無対過剰、タンパク質発現を検出及び定量するために用いることもできる。本発明に係るナノポアデバイスのアレイを用いて、所与のサンプル中のタンパク質の量を推定することができる。トランスロケートされるポリペプチド又はタンパク質を、数日〜数ヶ月にわたり前述の疾患並びに他の脳障害、状態、及び疾患に対する処置の有効性のマーカーとして用いることもできる。この比較のための定性的又は定量的方法は当該技術分野で周知である。
【０１２７】
診断学
本発明のシステムによってトランスロケートされ得るポリペプチド、断片、オリゴペプチド、及びＰＮＡを、治療的介入中のタンパク質レベルをモニタリングするため又はタンパク質発現の変化、有無対過剰、タンパク質発現を検出及び定量するために用いることができる。発現変化に関連する状態、疾患、又は障害には、特発性肺動脈高血圧症、続発性肺高血圧症、細胞増殖障害、特に退形成性乏突起膠腫、星状細胞腫、乏突起星細胞腫、膠芽腫、髄膜腫、神経節性神経腫、神経細胞腫瘍、多発性硬化症、ハンチントン病、乳腺癌、前立腺腺癌、胃腺癌、転移性神経内分泌癌、非増殖性及び増殖性の線維嚢胞性乳腺疾患、胆嚢の胆嚢炎及び胆石症、変形性関節症、及び関節リウマチ；後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイドーシス、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、良性前立腺肥大症、気管支炎、チェディアック・東症候群、胆嚢炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、気腫、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、慢性肉芽腫性疾患、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節症、骨粗しょう症、膵炎、多嚢胞性卵巣症候群、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、血液透析、体外循環、ウイルス、細菌、真菌、寄生中、原生動物、及び蠕虫の感染；プロラクチン生産障害、不妊症、例えば卵管の疾患、排卵異常、及び子宮内膜症、性周期の乱れ、月経周期の乱れ、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜又は卵巣の腫瘍、子宮筋腫、自己免疫障害、子宮外妊娠、及び奇形発生；乳癌、線維嚢胞性乳腺疾患、及び乳汁漏出；精子形成の乱れ、精子生理機能の異常、良性前立腺肥大症、前立腺炎、ペイロニー病、インポテンス、女性化乳房；光線角化症、動脈硬化、滑液包炎、肝硬変、肝炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間血色素尿症、真性多血症、原発性血小板血症、癌の合併症、癌、例えば腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、特に、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頸部、胆嚢、神経節、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。別の態様では、本発明のポリヌクレオチド。
【０１２８】
ポリペプチド、断片、オリゴペプチド、及びＰＮＡ、又はその断片を、治療的介入中のタンパク質レベルをモニタリングするため又はタンパク質発現の変化、有無対過剰、タンパク質発現を検出及び定量するために用いることができる。発現変化に関連する障害としては、静座不能（ａｋａｔｈｅｓｉａ）、アルツハイマー病、健忘症、筋萎縮性側索硬化症、運動失調、双極性障害、緊張病、脳性麻痺、脳血管疾患  クロイツフェルト・ヤコブ病、認知症、うつ病、ダウン症候群、遅発性ジスキネジー、ジストニー、てんかん、ハンチントン病、多発性硬化症、筋ジストロフィー、神経痛、神経線維腫症、ニューロパチー、パーキンソン病、ピック病、色素性網膜炎、統合失調症、季節性情動障害、老年認知症、脳卒中、トゥレット症候群、並びに腺癌、黒色腫、及び奇形癌を初めとする癌、特に脳の癌が含まれる。これらのポリペプチド又はタンパク質は、数日から数ヶ月にわたる上記疾患並びに他の脳の障害、状態、及び疾患に対する処置の有効性のマーカーとしても用いることができる。この比較のための定性的又は定量的方法は当該技術分野で周知である。
【０１２９】
例えば、ポリペプチド又はペプチドを標準的方法で標識して、ハイブリダイゼーション複合体形成の条件下で患者由来の生物学的サンプルに添加してよい。インキュベーション期間後、サンプルを洗浄し、標識（又は信号）の量を定量化し、標準値と比較する。患者サンプル中の標識の量が標準値と比べて有意に変化している場合、関連する状態、疾患、又は障害の存在を示している。
【０１３０】
タンパク質発現に関連する状態、疾患、又は障害の診断の基礎を提供するために、正常又は標準的な発現プロファイルを確立する。これは、正常対象（動物又はヒト）から取った生物学的サンプルをハイブリダイゼーション又は増幅の条件下でペプチドタグと併用することにより実現され得る。標準的ハイブリダイゼーションは、正常対象を用いて得られた値と既知の量の実質的に精製された標的配列を用いた実験で得られた値とを比較することにより定量化することができる。このようにして得られた標準値は、特定の状態、疾患、又は障害について症候性である患者由来サンプルから得られた値と比較することができる。特定の状態に関連する値の方への標準値からの逸脱を用いてその状態を診断する。
【０１３１】
そのようなアッセイは、動物実験及び臨床試験における特定の治療処置レジメンの有効性を評価するため又は個々の患者の処置をモニタリングするために用いることもできる。状態の存在が確認され、処置プロトコールが開始された後、患者の発現レベルが正常対象で観察されるレベルに近づき始めているかどうかを判定するために診断アッセイを定期的に繰り返してよい。連続的アッセイから得られた結果を、数日から数ヶ月にわたる処置の有効性を示すために用いることができる。
【実施例】
【０１３２】
実施例１：タンパク質トランスロケーションをモニタリングするためのナノポアデバイスの構築
本実施例のナノポアデバイスが図１Ａに示されており、この図は使用した構成を表している。１００μｌの０．２Ｍ  ＫＣｌ溶液（３０℃）をそれぞれ含む２つのテフロン（登録商標）ＰＴＦＥポリマーウェルを隔てる脂質二重層中に単一ＡＨＬポアが埋められたナノポアセンサーを準備した。ウェル間に電圧を印加し（トランス側＋１８０ｍＶ）、チャネルにイオン電流を生成した。電流は捕捉されたタンパク質分子の存在下で減少する。
【０１３３】
簡潔に述べると、各実験で、それぞれが１００μｌのＰＤバッファー（ｐＨ７．６）を含む２つのウェル（シス及びトランスと呼ぶ）を隔てる直径３０μｍの脂質二重層に単一ＡＨＬナノポアを挿入した。Ｎ末端切断型ＣｌｐＸバリアントの共有結合三量体（ＣｌｐＸ−ΔＮ３）を全てのＣｌｐＸナノポア実験に用いた。ＣｌｐＸ−ΔＮ３  ＢＬＲ発現株をＡｎｄｒｅａｓ  Ｍａｒｔｉｎ（カリフォルニア大学バークレー校）から入手した。ＯＤ６００が約１の時に０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを加えてＣｌｐＸタンパク質発現を誘導し、２３℃で３〜４時間振盪しながらインキュベートした。培養物をペレット化し、溶解バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ８、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール、１０ｍＭ  ＢＭＥ）に再懸濁し、ガラスビーズと一緒にボルテックスすることで溶解した。ライセートを遠心及びろ過した後、Ｎｉ２＋−ＮＴＡアフィニティーカラム（サーモ社（Ｔｈｅｒｍｏ）製）及びＵｎｏ−Ｑ陰イオン交換カラム（バイオ・ラッド社製）を用いてタンパク質を精製した。
【０１３４】
シスコンパートメント及びトランスコンパートメントの両方に、ＣｌｐＸ機能に最適化した１００μｌの２００ｍＭ  ＫＣｌバッファーを充填する。このバッファーに、示されているように、５ｍＭ  ＡＴＰを補充した。パッチクランプ増幅器（Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ、モレキュラーデバイス社製）で、２つのＡｇ／ＡｇＣｌ電極間に一定の１８０ｍＶの電位を印加し（トランス側＋）、ナノポアを流れるイオン電流を時間の関数として記録した。シス溶液に終濃度約１μＭで基質タンパク質を加え、一方、トランス溶液には約１００ｎＭ  ＣｌｐＸが存在した。
【０１３５】
二重層間に一定１８０ｍＶ電位を印加し、電圧クランプモードの統合パッチクランプ増幅器（Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ、モレキュラーデバイス社製）に直列の状態のＡｇ／ＡｇＣｌ電極間でナノポアを通るイオン電流を測定した。アナログデジタル変換器（Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａ、モレキュラーデバイス社製）を１００ｋＨｚの帯域幅、ホールセルコンフィギュレーション（β＝１）で用いてデータを記録し、次いで、アナログ低域Ｂｅｓｓｅｌフィルターを用いて５ｋＨｚでフィルタリングした。ＰＤ／ＡＴＰ（５ｍＭ）及びＰＤ／ＡＴＰ（４ｍＭ）を毎日調製することにより実験条件を準備した。ＣｌｐＸをＰＤ／ＡＴＰ（５ｍＭ）で１：１０希釈して、終濃度４．５ｍＭのＡＴＰ中のＣｌｐＸの終濃度を３０〜１００ｎＭにした。単一ＡＨＬナノポアの単離前にＣｌｐＸ溶液でシステム全体を満たした。挿入後、シスウェルに約６ｍＬのＰＤ／ＡＴＰ（４ｍＭ）を灌流した。１〜２μＭの基質をシスウェルに加えて３０℃で実験を行った。ポアの詰まりにより極性が保存されるか所定の時間が経過した後、タンパク質基質捕捉イベントをイジェクトした。詰まりを防止するため及びデータ収集の効率を上げるために、電圧誘導トランスロケーションはしばしばイジェクトされた。二重層破裂、チャネルのコンダクタンスの消失、又は予め設定した数のトランスロケーションイベントの完了による終了前に無傷の二重層中の１つのＡＨＬナノポアからイオン電流を取得した期間として単一ナノポア実験を定義する。
【０１３６】
実施例２：トランスロケーションのためのタンパク質Ｓ１、Ｓ２−３５、及びＳ２−１４８の設計
トランスロケーションに用いる基質タンパク質を図１Ｃに模式的に示す。この図は、（ｉ）１１アミノ酸のＣｌｐＸ標的化ドメイン（ｓｓｒＡタグ）でカルボキシ末端がキャッピングされた６５アミノ酸長の荷電可動性セグメントにカップリングした単一のＮ末端Ｓｍｔ３ドメインを有するタンパク質であるＳ１、（ｉｉ）Ｎ末端に３５アミノ酸リンカー及び第２のＳｍｔ３ドメインが付加されていること以外はＳ１と同様のＳ２−３５、（ｉｉｉ）Ｓｍｔ３ドメイン間の延長された１４８アミノ酸リンカー以外はＳ２−３５と同一であるＳ２−１４８を示している。
【０１３７】
本発明者らの最初の実験には、改変型のユビキチン様タンパク質Ｓｍｔ３を用いた。Ｓｍｔ３は、４個のβストランド及び１個のαへリックスへと配置された約１００アミノ酸で構成されている。本発明者らは更にＳ１中にＳｍｔ３を設計している。基質タンパク質Ｓ１を構築するために、７６アミノ酸テイル
2018075021.tif 000005
をコードするＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって構築し、ｐＥＴ−ＳＵＭＯベクター（インビトロジェン社製）にＴ／Ａクローニング部位でクローニングしてテイル配列をＳｍｔ３配列３’末端に融合した。
【０１３８】
７６アミノ酸テイルは、約１０個の負に帯電した残基及び１１アミノ酸Ｃｌｐｘ結合ドメインｓｓｒＡを含む。
【０１３９】
ナノポア分析を容易化ために、設計したＳｍｔ３タンパク質Ｓ１を２通りに改変した。（１）１３個の散在する負に帯電したアスパラギン酸残基を含む６５アミノ酸長のグリシン／セリンテイルを付加した（配列番号６）。この非構造化ポリアニオンは、ナノポアの電場中でのＳ１の捕捉及び保持を促進するためにデザインされた。その結晶構造１３に基づき、Ｓｍｔ３折り畳みドメインは、ＡＨＬ入口の上に座ると予想される（図１Ｂ）。（２）付加されたポリアニオンのＣ末端を、１１アミノ酸のＣｌｐＸ標的化モチーフ１４であるｓｓｒＡタグでキャッピングした。このｓｓｒＡペプチドタグは、タンパク質がトランスコンパートメントへとポアを通る時に、ＣｌｐＸがタンパク質のＣ末端に特異的に結合することを可能にした。
【０１４０】
Ｓ１  Ｓｍｔ−３配列の５’末端に、３５アミノ酸リンカー
2018075021.tif 000006
をコードするＤＮＡをＰＣＲで付加することによりＳ２−３５（配列番号５）を構築した。次いで、このリンカー改変Ｓ１遺伝子をｐＥ−ＳＵＭＯ（ライフセンサーズ社（ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ）製）にＢｓａＩ部位でクローニングして、付加されたリンカー及びＳ１配列をｐＥ−ＳＵＭＯ  Ｓｍｔ３配列の３’末端に融合した。
【０１４１】
Ｓ２−１４８（配列番号６）リンカー付加
2018075021.tif 000007
のためのＤＮＡをＰＣＲにより構築し、ギブソン・アセンブリ法によりＳ２−３５ベクターの３５アミノ酸リンカー領域内にクローニングした。これらの設計されたタンパク質を大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）＊中で発現させた。ＯＤ６００が約０．６の時に０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを加えることにより発現を誘導し、振盪しながら３７℃で４〜６時間インキュベートした。培養物をペレット化し、溶解バッファーに再懸濁し、ガラスビーズと一緒にボルテックスすることにより溶解した。ライセートを遠心及びろ過した後、Ｎｉ２＋−ＮＴＡアフィニティーカラム（サーモ社製）を用いてタンパク質を精製した。
【０１４２】
実施例３：タンパク質Ｓ１のトランスロケーションの検出
ＣｌｐＸ及びＡＴＰ存在下でのタンパク質Ｓ１の捕捉及びトランスロケーションの代表的イオン電流トレースを図２Ａに示す。図２Ａは、Ｓ１トランスロケーション中のイオン電流トレースを示している。（ｉ）標準条件下でＡＨＬナノポアを通る開口チャネル電流（約３４±２ｐＡ、ＲＭＳノイズ１．２±０．１ｐＡ）。（ｉｉ）Ｓ１基質の捕捉。タンパク質捕捉後、イオン電流は約１４ｐＡに低下する（ＲＭＳノイズ約０．７ｐＡ）。（ｉｉｉ）ＣｌｐＸ媒介ランプ状態。イオン電流は１０ｐＡ未満に下がり、１又は複数の徐々な振幅遷移を特徴とする。このパターンはＣｌｐＸ及びＡＴＰの存在下（トランスコンポーネント）でのみ観察される。（ｉｖ）ナノポアを通じたＳｍｔ３ドメインのアンフォールディング及びトランスロケーション（約３．８ｐＡ、ＲＭＳノイズ１．７ｐＡ）。（ｖ）トランスコンパートメントへの基質トランスロケーションが完了した後の開口チャネル電流への復帰。約３４±２ｐＡの開口チャネル電流（図２Ａ、ｉ）から、Ｓ１捕捉により約１４ｐＡ（図２Ａ、ｉｉ）へと電流が低下した。この安定な電流は数十秒間持続し、トランスコンパートメントに添加されたＣｌｐＸ及びＡＴＰの存在下及び非存在下で観察された（図４）。これは、ポア電場中で荷電ポリペプチドテイルに作用する電気力によりポア入口の上に静止したままのＳｍｔ３構造と一致する。ＣｌｐＸ及びＡＴＰの存在下では、この最初の電流状態にしばしば、平均約１０ｐＡに達し且つ持続時間の中央値が４．３秒である漸進的な下向き電流ランプが続く（図２Ａ、ｉｉｉ及び図５）。この電流ランプは、ＣｌｐＸ及びＡＴＰが存在した時、５．５時間の実験中に合計４５回、タンパク質Ｓ１で観察された。対照的に、トランス溶液にＣｌｐＸ及びＡＴＰが存在しない場合、約２．３時間の実験中、状態ｉｉの後にランプは観察されなかった。イベントの大部分で、ＣｌｐＸ依存的なランプ状態は、イオン電流が突然約３ｐＡに低下して終結した（図２Ａ、ｉｖ）。状態ｉｖの持続時間の中央値は約７００ｍｓ（図３Ａ）であり、その後、開口チャネル電流へと急上昇して終わった（図２Ａ、ｖ）。
【０１４３】
これらのデータに基づき、本発明者らは、ＡＴＰ加水分解に由来する化学エネルギーを用いてナノポアを通してＳ１タンパク質を引っ張る分子機械としてＣｌｐＸが機能したという仮説を立てた。このプロセスは、荷電アミノ酸がポア電場に入る際の電気力により断続的に補助された。
【０１４４】
図２Ｂは、Ｓ１のＣｌｐＸ仲介トランスロケーションの動作モデルを示す図である。カーツーンｉ〜ｖは、パネルａのイオン電流状態ｉ〜ｖに対応する。このプロセス中で提唱されるステップを図２Ｂに示す。（ｉ）開口チャネル；（ｉｉ）Ｓｔｍ３セグメントが入口の上に止まり、細長い荷電ポリペプチドテイルセグメントがポア内腔に延び、ｓｓｒＡタグがトランスコンパートメント中にある、ポアによるタンパク質Ｓ１の捕捉。このイオン電流状態では、ＣｌｐＸはＳ１に結合していないか、結合しているがポアからまだ遠い。（ｉｉｉ）ＣｌｐＸがＳ１鎖に沿ってＡＨＬポアのトランス側オリフィスへと、接触するまで進む。ＣｌｐＸがポアに近くにあるためイオン電流が低下する。（ｉｖ）ＣｌｐＸ及びポア電場によって発揮される合わせた力の下、ポアの上のＳｔｍ３構造が順次変性し、これによりポリペプチドがナノポアと相対的に進むことができる。この状態では、より大きなアミノ酸（又はＳｍｔ３二次構造）がポア内腔に入ったため、イオン電流は低下した。このイオン電流状態は、Ｓ１タンパク質がトランスコンパートメント中に完全に引っ張られるまで持続し、開口チャネル電流ｖに戻った。
【０１４５】
実施例４：タンパク質Ｓ２−３５及びＳ２−１４８のトランスロケーションの検出
このモデルは試験可能な予測を行う。観察された電流状態が、部分的にＣｌｐＸによって駆動されるポア内腔へのポリペプチドセグメントの前進的移動によるものである場合、タンパク質の一次構造の変化は、ＣｌｐＸ／ＡＴＰ依存的なイオン電流パターンを連続的に変化させるはずである。特に、第２のＳｍｔ３ドメインの付加は、第２のランプ状態（図２Ａ、ｉｉｉ）、次いで３ｐＡを中心とする第２状態（図２Ａ、ｉｖ）を生じさせるはずである。試験として、本発明者らは、可動性グリシン／セリンリッチ３５アミノ酸リンカーをＳ１タンパク質のＮ末端に融合し、第２のＳｍｔ３ドメインでこれをキャッピングした（タンパク質Ｓ２−３５、表１Ｃ、ｉｉ及び配列表、Ｓ２−３５）。こうして、Ｓ１の単一折り畳み構成要素配列（Ｃ末端＞荷電可動性テイル＞Ｓｍｔ３＞Ｎ末端）がＳ２−３５中に２回繰り返される（Ｃ末端＞荷電可動性テイル＞Ｓｍｔ３＞可動性リンカー＞Ｓｍｔ３＞Ｎ末端）。
【０１４６】
トランスコンパートメントにＣｌｐＸ／ＡＴＰが存在してナノポア中にタンパク質Ｓ２−３５が捕捉された時、８つの再現可能な状態を有するイオン電流パターンが観察された（図２Ｃ）。
【０１４７】
図２Ｃは、タンパク質Ｓ２−３５トランスロケーション中のイオン電流トレースを示す図である。開口チャネル電流（状態ｉ）は示されていない。状態ｉｉ〜ｉｖはパネルａの状態ｉｉ〜ｉｖと同じである。（ｖ）約１０ｐＡへのイオン電流の徐々な増加。本発明者らの動作モデルでは、これはＳｍｔ３ドメイントランスロケーションからリンカー領域トランスロケーションへの遷移に対応する。（ｖｉ）ランプ状態ｉｉｉに非常に似ている第２の推定ランプ状態。（ｖｉｉ）イオン電流特性が状態ｉｖに非常に近い、第２の推定Ｓｍｔ３トランスロケーション状態。（ｖｉｉｉ）開口チャネル電流への復帰。最初の４つの状態（図２Ｃ、ｉ〜ｉｖ）は、Ｓ１トランスロケーションで生じた状態ｉ〜ｉｖと同じであった（図２Ａと２Ｃを比較）。この類似は、ＣｌｐＸの結合に特徴的なランプ状態ｉｉｉ及びＳｍｔ３依存的状態ｉｖを含む。しかし、状態ｖ以降、Ｓ２−３５のパターンはＳ１のパターンから逸脱した（図２Ａ及び２Ｃを比較）。すなわち、Ｓｍｔ３状態ｉｖの後、典型的なＳ２−３５イオン電流トレースは開口チャネル電流へと進まず、その代わり、持続時間中央値１．５秒で約６ｐＡの状態へと遷移した（図２Ｃ、ｖ及び図３Ｂ）。この後に、ランプ状態ｉｉｉに非常に似た約８．５ｐＡ状態（図２Ｃ、ｖｉ）、その後、推定上のＳｍｔ３トランスロケーション状態ｉｖに非常に似たイオン電流状態（図２Ｃ、ｖｉｉ）が続いた。換言すると、本発明者らのモデルと一致し、Ｓ１イベント中に１回観察された推定ＣｌｐＸ結合且つＳｍｔ３依存的状態（図２Ａ）が、Ｓ２−３５イベント中に２回観察された（図２Ｃ）。２つのコンストラクトのこれらの類似した状態は、ほぼ同じ振幅、ＲＭＳノイズ値、及び持続時間を共有していた（図３Ａ、図５、及び図６）。
【０１４８】
このタンパク質構造へのイオン電流の依存は、ナノポアを通したＣｌｐＸ駆動タンパク質トランスロケーションと合致する。更なる試験として、本発明者らは、Ｓ２−３５トランスロケーション中に観察されるイオン電流状態ｖを再試験した。この状態は、以下の２つの観察結果に基づき、ナノポアを通る３５アミノ酸リンカーの移動と合致する：（１）かさ高い側鎖がほとんどないアミノ酸配列で予測されるように、平均イオン電流が周囲の状態より測定可能なほど高いこと（図２Ｃ）及び（２）時間領域で、イオン電流状態ｖが、Ｓ２−３５一次配列に沿ったその位置から予想されるように、Ｓｍｔ３依存的イオン電流状態ｉｖとｖｉとの間に生じていること（図１Ｃ、ｉｉ及び関連する配列）。
【０１４９】
状態ｖが、ＣｌｐＸ制御下のポリペプチドリンカーのトランスロケーションに対応する場合、このリンカーの長さ及び組成を変更すると持続時間及び電流振幅が変化するはずである。この試験のために、本発明者らは、Ｓ２−３５リンカー領域に更に１１３アミノ酸が付加された第３のタンパク質をデザインし、これにより、最終コンストラクトは、延長された１４８アミノ酸可動性リンカーによって隔てられた２個のＳｍｔ３ドメインからなる（タンパク質Ｓ２−１４８、図１Ｃ、ｉｉｉ、及び配列Ｓ２−１４８）。
【０１５０】
図２Ｄは、タンパク質Ｓ２−１４８トランスロケーション中のイオン電流トレースを示す図である。イオン電流状態ｉ〜ｖ及びｖｉ〜ｖｉｉｉは、Ｓ２−３５トランスロケーションでの状態（パネルｃ）とほぼ同じであった。（ｖ）本発明者らの動作モデルでは、このイオン電流状態は１４８アミノ酸リンカーのトランスロケーションに相当する。その振幅は、Ｓ２−３５リンカーの振幅（約９ｐＡ）より約３ｐＡ高く、持続時間の中央値は、比較対象となるＳ２−３５の状態ｖより約２．５倍長い。ＣｌｐＸ及びＡＴＰが存在した場合、ランプ状態ｉｉｉを含んだトランスロケーションイベントは、タンパク質Ｓ２−３５で６２回（７．３時間の実験）、タンパク質Ｓ２−１４８で６６回（４．３時間の実験）観察された。ＣｌｐＸ／ＡＴＰ非存在下では、これらのランプ状態はＳ２−３５（１．７時間の実験）、Ｓ２−１４８（１．２時間の実験）のどちらでも観察されなかった。
【０１５１】
図３Ａは、状態ｉｖ（推定上のＳｍｔ３トランスロケーション状態）を示す図である。これらのイベントには、ＣｌｐＸ依存的ランプ状態ｉｉｉを示すものだけが含まれた（Ｓ１、ｎ＝４５；Ｓ２−３５、ｎ＝６０；Ｓ２−１４８、ｎ＝６５）。図３Ｂは、Ｓ２−３５及びＳ２−１４８タンパク質のリンカー領域状態ｖの滞留時間の比較を示している。これらのヒストグラムに含まれるイベントはランプ状態ｉｉｉを示す（Ｓ２−３５、ｎ＝５０；Ｓ２−１４８、ｎ＝５０）。図３Ｃは、Ｓ２−１４８トランスロケーションイベントの状態ｖトランスロケーション滞留時間を示す図である。黒い棒は、ランプ状態ｉｉｉを含んだイベント（ＣｌｐＸ駆動）の滞留時間を示す。灰色の棒は、ランプ状態を含まなかったイベント（ＣｌｐＸ駆動でない）を表す。ランプあり、ｎ＝５０；ランプなし、ｎ＝２０。
【０１５２】
予想通り、ＣｌｐＸ／ＡＴＰ存在下の標準条件下でこのタンパク質がナノポアに捕捉された場合、Ｓ２−３５のイベントと同様な８つの再現可能な状態が観察された（図２ｄ、図３Ａ、図５、６、及び７）。
【０１５３】
しかし、重要なことに、Ｓ２−３５及びＳ２−１４８のイベントは状態ｖで有意に異なっていた（図２ｃ及び２ｄを比較）。すなわち、Ｓ２−１４８の状態ｖはＳ２−３５より平均残留電流が高く（それぞれ約９対約６ｐＡ）、持続時間の中央値はＳ２−３５の状態ｖより約２．５倍長かった（図３Ｂ）。Ｓ２−１４８の追加的アミノ酸を処理するためにＣｌｐＸはより長い時間がかかるはずなので、Ｓ２−３５と比べたＳ２−１４８状態ｖの持続時間の延長が予想され、一方、電流レベルの上昇は、２つのタンパク質間のリンカーアミノ酸組成の違いによるものであると考えられる（Ｓ２−３５リンカー：５１％Ｇｌｙ、３４％Ｓｅｒ、１５％その他；Ｓ２−１４８リンカー：３４％Ｇｌｙ、３２％Ｓｅｒ、１９％Ａｌａ、１５％その他）。しかし、本発明者らは、リンカーの長さのため必ず異なる、ナノポアオリフィスへのタンパク質のＳｍｔ３ドメインの相対的近さを排除できていない。
【０１５４】
３つのモデルタンパク質全ての電圧駆動トランスロケーションがＣｌｐＸ／ＡＴＰ非存在下で観察されたことに言及しておく（図４）。しかし、これらのＣｌｐＸ（−）トランスロケーションイベントには、図２に示されている特徴的ランプ状態がなく、これらは、ＣｌｐＸ仲介トランスロケーションイベントより有意に長く、持続時間の変動がより大きかった（図３Ｃ、図８、及び図９）。これは、捕捉されたタンパク質分子のランダムな構造的変動と不定の電荷密度でポリマーに作用する断続的電気力とに依存する未制御のトランスロケーションプロセスと合致する。これは、比較的一定のＡＴＰ加水分解速度及びＣｌｐＸモーターにより付与される機械的力とは対照的である。
【０１５５】
2018075021.tif 000008
2018075021.tif 000009
2018075021.tif 000010
【０１５６】
結言
上記の具体的記述は本発明を例示及び例証することを意図したものであり、添付の特許請求の範囲の文字通りの範囲及び同等な範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。本明細書中で言及された全ての特許又は公開物は、明示的に記載されていなくても当業者に理解されるであろう本発明の特定の態様を実施するのに有用な方法及び材料の詳細を伝えることを意図している。そのような特許又は公開物を、言及されている方法又は材料を説明し可能にする目的で必要に応じてそれぞれを個々に具体的に参照により本明細書に組み込んだ場合と同じ程度に参照により援用する。
【図１−１】
2018075021.tif 000011
【図１−２】
2018075021.tif 000012
【図２−１】
2018075021.tif 000013
【図２−２】
2018075021.tif 000014
【図３】
2018075021.tif 000015
【図４−１】
2018075021.tif 000016
【図４−２】
2018075021.tif 000017
【図５】
2018075021.tif 000018
【図６】
2018075021.tif 000019
【図７】
2018075021.tif 000020
【図８】
2018075021.tif 000021
【図９】
2018075021.tif 000022
【図１０】
2018075021.tif 000023
【配列表】
2018075021000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月13日(2018.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
【図１】図１Ａは、脂質二重層中に単一のＡＨＬ（α−溶血素）ポアが埋め込まれたナノポアセンサーの模式図（カーツーン）である。図１Ｂは、ナノポア中に捕捉されたタンパク質を示す模式図である。図１Ｃは、本発明の実施例中でトランスロケーションに用いられる設計されたタンパク質を示す模式図である。
【図２】図２Ａは、ＣｌｐＸ仲介タンパク質トランスロケーション中のイオン電流トレースを示すプロットである。図２Ｂは、ＣｌｐＸ仲介タンパク質トランスロケーション中の模式図である。図２Ｃは、タンパク質Ｓ２−３５トランスロケーション中のイオン電流トレースを示すトレースである。図２Ｄは、タンパク質Ｓ２−１４８トランスロケーション中のイオン電流トレースを示すトレースである。
【図３】図３は、３つのモデルタンパク質におけるイオン電流状態の滞留時間の比較を示す一連の棒グラフである。
【図４】図４は、トランス溶液中にＣｌｐＸが存在しない、電圧仲介タンパク質トランスロケーション中のイオン電流トレースを示す電流トレースを示す図である。ばらつきの大きい捕捉期間（＜５秒〜＞２分）後、試験した全ての基質が最終的に印加電圧のためにほどかれてトランスロケートされた。ランプ状態（ｒａｍｐｉｎｇ  ｓｔａｔｅ）は観察されず、Ｓ２−３５及びＳ２−１４８リンカー状態に由来する詳細な信号の特徴は失われており、全ての状態の持続時間がＣｌｐＸ仲介イベントと比べてより広く分布している。図４Ａは、電圧仲介Ｓ１トランスロケーション中のイオン電流トレースを示す図である。図２Ａと比べて、状態ｉｉｉがなく、状態ｉｖの持続時間は平均的に、より長く、よりばらつきがある。図４Ｂは、トランス溶液中にＣｌｐＸが存在しない電圧仲介タンパク質トランスロケーション中の模式図である。電圧仲介タンパク質トランスロケーションのモデルを示す図である。４つのカーツーン構造（ｉ〜ｉｖ）を示している。カーツーンｉ〜ｉｖは図４Ａのイオン電流状態ｉ〜ｉｖに対応する。図４Ｃは、電圧仲介Ｓ２−３５トランスロケーション中のイオン電流トレースを示す図である。状態ｉｉｉ及びｖｉのランプがなく、状態ｖの分離（図２Ｃ）が減少している。図４Ｄは、電圧仲介Ｓ２−１４８中のイオン電流トレースが、対応する状態が省略されたＳ２−３５（図２Ｄ）と同様な挙動を示すことを示す図である。
【図５】図５は、３つのモデルタンパク質のＣｌｐＸ依存的（トランス側にＣｌｐＸが存在する）ランプ状態ｉｉｉのイオン電流状態滞留時間の比較を示す度数棒グラフである。Ｓ１、ｎ＝４５；Ｓ２−３５、ｎ＝６２；Ｓ２−１４８、ｎ＝６６。
【図６】図６は、ＣｌｐＸ依存的ランプ状態ｉｉｉ及びｖｉを含んだイベントにおけるＳ２−３５（ｎ＝４２）及びＳ２−１４８（ｎ＝４１）タンパク質の推定第２Ｓｍｔ３ドメイントランスロケーション状態ｖｉｉのイオン電流状態滞留時間の比較を示す度数棒グラフである。
【図７】図７は、タンパク質Ｓ２−３５（ｎ＝４４）及びＳ２−１４８（ｎ＝４４）のＣｌｐＸ依存的ランプ状態ｖｉのイオン電流滞留時間の比較を示す度数棒グラフである。
【図８】図８は、３つのモデルタンパク質の推定Ｓｍｔ３ドメイントランスロケーション状態ｉｖ及びｖｉｉのイオン電流滞留時間の比較を示す度数棒グラフである。黒色の棒は、ランプ状態ｉｉｉを含んだイベント（ＣｌｐＸ駆動）の滞留時間を表す。灰色の棒は、ランプ状態を含まなかったイベント（ＣｌｐＸ駆動でない）を表す。ランプあり、ｎ＝２５４；ランプなし、ｎ＝１８３。
【図９】図９は、Ｓ２−３５トランスロケーションイベントの状態ｖの滞留時間を示す度数棒グラフである。黒色の棒は、ランプ状態ｉｉｉを含んだイベント（ＣｌｐＸ駆動）の滞留時間を表す。灰色の棒は、ランプ状態を含まなかったイベント（ＣｌｐＸ駆動でない）を表す。ランプあり、ｎ＝５０；ランプなし、ｎ＝４５。
【図１０】図１０は、脂質膜内に埋められたＣｌｐＰ／α−ＨＬの融合タンパク質を図解する模式図である。