(57)【要約】【課題】皮膚老化症状に対する新たなアプローチによる皮膚老化改善剤として有効な成分を探索することを目的とし、そのための新たなスクリーニング方法を確立する。【解決手段】皮下脂肪細胞中の老化制御因子の活性を指標として、皮膚老化改善剤をスクリーニングする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮下脂肪細胞中の老化制御因子の活性を指標として、皮膚老化改善剤をスクリーニングする方法。
【請求項２】
前記老化制御因子が、皮膚老化症状の発生に関与する物理量のいずれかを変動させるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記皮膚老化症状の発生に関与する物理量が、コラーゲン量、エラスチン量、ヒアルロン酸量、バーシカン量、オートファジー活性、及び皮膚支持構造からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記老化制御因子が、皮下脂肪細胞への刺激によってその発現量が変動するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記老化制御因子の活性が、前記因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子又は前記タンパク質の発現量であり、刺激及び被験物質を添加した皮下脂肪細胞における前記発現量が、刺激を添加し被験物質を添加しなかった細胞における発現量と比較して大きい又は小さい場合に、前記被験物質は皮膚老化改善作用を有すると判定する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記刺激が、生活習慣及又は加齢によって量が変動する物質から選択される、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記生活習慣及又は加齢によって量が変動する物質が、酸化ＬＤＬ、グルコース、過酸化水素、エストラジオール、カフェイン、アセトアルデヒド、ビタミン類、オレキシン、プロゲステロン、テストステロン、ＤＨＥＡ、及びメチルグリオキサールからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記刺激が酸化ＬＤＬであって、
前記老化制御因子が、４−１ＢＢ、ＦａｓＬ、ＩＧＦＢＰ２、ＭＳＰα、ＩＦＮγ、及びＰＡＩ−１からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記刺激がグルコースであって、
前記老化制御因子が、４−１ＢＢ、ＣＲＰ、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＡＡ、ＳＤＦ−１、ｓＴＮＦＲＩ、ｓＴＮＦＲＩＩ、ＶＥＧＦ、及びＩＬ−６ｓＲからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記刺激が過酸化水素であって、
前記老化制御因子が、ＩＬ−８、Ｌｅｐｔｉｎ、ＧＨ１、及びＯＰＧからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記刺激がエストラジオールであって、
前記老化制御因子が、ＡＣＥ２、ＡｇＲＰ、ＣＲＰ、ＩＧＦＢＰ３、ＬｅｐｔｉｎＲ、ｓＴＮＦＲＩ、ＳＴ２、ＭＣＰ３、ＰＤＧＦＡＢ、及びＶＥＧＦからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚老化改善剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シワやタルミ等の皮膚老化症状は、見た目の印象に大きな影響を与えるものであるため、その改善への関心は高い。近年、皮膚老化症状の改善を目的とする、抗老化剤、抗シワ剤、保湿剤等の開発が盛んに行われている。それらは主に、コラーゲンやエラスチンといった肌の張りや弾力を保つ働きをする物質を産生する真皮の線維芽細胞をターゲットとするものや（特許文献１〜２等）、表皮基底細胞をターゲットとするものであった（例えば特許文献３等）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１５−１３１７９７号公報
【特許文献２】特開２０１５−１７４８５７号公報
【特許文献３】特開２００３−１７１２２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来の抗老化剤では、ある程度の抗老化効果は認められるものの、十分に満足のいく効果が得られているとは言い難い。また、皮膚老化症状の生じるメカニズムのさらなる解明も求められている。
本発明は、かかる状況に鑑み、皮膚老化症状に対する新たなアプローチによる皮膚老化改善剤として有効な成分を探索することを目的とし、そのための新たなスクリーニング方法を確立することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、真皮の下に存在する皮下組織に着目し、皮下脂肪細胞が血液から受ける刺激も、皮膚老化症状の原因となり得ると考え、皮下脂肪細胞が血中刺激を受けたときのアディポサイトカイン活性への影響、及びアディポサイトカインの活性の真皮線維芽細胞等への影響を検討した。そして、ある種のアディポサイトカインを活性化又は不活性化することにより皮膚老化症状を改善することができるという知見を得て、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］皮下脂肪細胞中の老化制御因子の活性を指標として、皮膚老化改善剤をスクリーニングする方法。
［２］前記老化制御因子が、皮膚老化症状の発生に関与する物理量のいずれかを変動させるものである、［１］に記載の方法。
［３］前記皮膚老化症状の発生に関与する物理量が、コラーゲン量、エラスチン量、ヒアルロン酸量、バーシカン量、オートファジー活性、及び皮膚支持構造からなる群から選択される、［２］に記載の方法。
［４］前記老化制御因子が、皮下脂肪細胞への刺激によってその発現量が変動するものである、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記老化制御因子の活性が、前記因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子又は前記タンパク質の発現量であり、刺激及び被験物質を添加した皮下脂肪細胞における前記発現量が、刺激を添加し被験物質を添加しなかった細胞における発現量と比較して大き
い又は小さい場合に、前記被験物質は皮膚老化改善作用を有すると判定する、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記刺激が、生活習慣及又は加齢によって量が変動する物質から選択される、［４］又は［５］に記載の方法。
［７］前記生活習慣及又は加齢によって量が変動する物質が、酸化ＬＤＬ、グルコース、過酸化水素、エストラジオール、カフェイン、アセトアルデヒド、ビタミン類、オレキシン、プロゲステロン、テストステロン、ＤＨＥＡ、及びメチルグリオキサールからなる群から選択される、［６］に記載の方法。
［８］前記刺激が酸化ＬＤＬであって、前記老化制御因子が、４−１ＢＢ、ＦａｓＬ、ＩＧＦＢＰ２、ＭＳＰα、ＩＦＮγ、及びＰＡＩ−１からなる群から選択される、［７］に記載の方法。
［９］前記刺激がグルコースであって、前記老化制御因子が、４−１ＢＢ、ＣＲＰ、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＡＡ、ＳＤＦ−１、ｓＴＮＦＲＩ、ｓＴＮＦＲＩＩ、ＶＥＧＦ、及びＩＬ−６ｓＲからなる群から選択される、［７］に記載の方法。
［１０］前記刺激が過酸化水素であって、前記老化制御因子が、ＩＬ−８、Ｌｅｐｔｉｎ、ＧＨ１、及びＯＰＧからなる群から選択される、［７］に記載の方法。
［１１］前記刺激がエストラジオールであって、前記老化制御因子が、ＡＣＥ２、ＡｇＲＰ、ＣＲＰ、ＩＧＦＢＰ３、ＬｅｐｔｉｎＲ、ｓＴＮＦＲＩ、ＳＴ２、ＭＣＰ３、ＰＤＧＦＡＢ、及びＶＥＧＦからなる群から選択される［７］に記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、皮膚外用剤や飲食品に含有させるのに好適な、皮膚老化改善剤として有効な成分を探索できるスクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】刺激を受けた皮下脂肪細胞の皮膚老化症状への影響を表す概念図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明者らが見出した皮膚老化の新たなメカニズムについて、図１を参照して説明する。
加齢や生活習慣、又は環境等の要因による刺激を受けた皮下脂肪細胞においては、ある種のアディポサイトカインの発現が変動（増加又は減少）する。該アディポサイトカインは、皮膚の老化症状に関与する「老化制御因子」である。例えば、アディポサイトカインの発現の変動によりその活性が増強又は減弱化して、皮膚老化症状の発生に関与する物理量、例えば、コラーゲン量、エラスチン量、ヒアルロン酸量、バーシカン量、オートファジー活性、皮膚支持構造等の変動が引き起こされる。より具体的にはコラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸、又はバーシカンを分解する酵素が増加してコラーゲン量、エラスチン量、ヒアルロン酸量、又はバーシカン量を減少させたり、オートファジー悪化タンパク質（monodansylcadaverine；ＭＤＣ）が増加してオートファジー活性を減弱したり、皮下組織下部の皮下支持帯の網目構造を構成するタンパク質の発現量が減少して該網目構造が疎になったりする。それらによって、真皮においてシワやタルミ等の皮膚老化症状が発現する。かかる皮膚老化フローにおいて、皮下脂肪細胞における老化制御因子の活性を、前記刺激による変動と逆方向に増強又は減弱化することによって、皮膚老化症状が引き起こされるのを抑制し改善することができる。言い換えると、刺激を受けた皮下脂肪細胞における老化制御因子の変動を抑制させるような物質は、皮膚老化改善剤となり得る。
【００１０】
したがって、本発明の皮膚老化改善剤をスクリーニングする方法は、皮下脂肪細胞中の老化制御因子の活性を指標とすることを特徴とする。
【００１１】
本発明において、老化制御因子は通常、シワやタルミ等の皮膚老化症状の発生に関与す
る物理量を変動させるものをいう。具体的には、コラーゲン量、エラスチン量、ヒアルロン酸量、バーシカン量、オートファジー活性、及び皮膚支持構造（ＲＣ構造）等の変動に関与するアディポサイトカインが好ましく挙げられる。
表１に、皮膚老化の指標と、前記指標の変動に関与するアディポサイトカインの例を示すが、これらに限定されない。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
コラーゲンやエラスチンは、皮膚構造の支持体としての機能と力学的役割を担っている真皮の９０％以上を構成する線維タンパク質であり、束化した線維会合体として存在し、真皮のほぼ全層に絡み合って網目のような線維状構造を形成している。一般に、加齢や紫外線によって上記線維タンパク質の分解酵素が増加したりして、コラーゲン量やエラスチン量の減少が引き起こされ、真皮層が薄くなったり緩んだりする。また、ヒアルロン酸は、皮膚内部で貯水の役割を担っており、一般に加齢によってその現象が引き起こされる。
バーシカンは、真皮が作られるときに線維芽細胞が働くための足場となるプロテオグリカンで、加齢に伴い減少し、皮膚老化や弾性力低下を招くことが知られている（フレグランスジャーナル 44(1): 88 -88, 2016参照）。後述の実施例に示されるように、特定の老化制御因子が活性化すると、バーシカン分解酵素が増加し、バーシカン量の減少が引き起こされる。
オートファジーは、細胞内のタンパク質及び細胞小器官を分解するための仕組みの一つであり、オートファジー活性が亢進すると抗老化作用が働くことが知られている（N. Engl. J. Med., 2013 Feb 14;368(7):651-62.参照）。後述の実施例に示されるように、特定の老化制御因子が活性化すると、オートファジー悪化タンパク質（ＭＤＣ）が増加し、オートファジー活性が抑制される。
皮膚支持構造（ＲＣ構造）は、皮下組織下部の皮下支持帯（retinacula cutis；ＲＣ）と呼ばれる網目構造をいい、該構造が疎になると皮膚深部の弾力性が低下し、タルミが引き起こされる（フレグランスジャーナル 44(2), 23-27, 2016参照）。後述の実施例に示
されるように、特定の老化制御因子が活性化すると、ＲＣ構造を構成するタンパク質の発現量が減少し、ＲＣ構造の弱化（網目構造の疎化）が生じる。
【００１４】
また、本発明において、老化制御因子は、皮下脂肪細胞への刺激によってその発現量が変動するものが好ましい。
一般に、生活習慣や加齢等により血中の諸成分の存在量は変動するところ、本発明者らは皮下脂肪細胞が血中濃度の増加又は減少する成分による刺激（血中刺激）を受けると、ある種のアディポサイトカインの発現量が変動することを見出した。具体的には、血中刺激によって、アディポサイトカインのタンパク質をコードする遺伝子又は前記タンパク質の発現量が、増加又は減少する。
【００１５】
前記血中刺激としては、生活習慣又は老化によって量が変動する物質が好ましく、具体的には、特に限定されないが、過酸化水素、グルコース、酸化ＬＤＬ、エストラジオール、カフェイン、アセトアルデヒド、ビタミン類、オレキシン、プロゲステロン、テストステロン、ＤＨＥＡ、メチルグリオキサール等が好ましく挙げられる。
過酸化水素、グルコース、及び酸化ＬＤＬは、加齢により血中濃度が増加し、エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、ＤＨＥＡは、加齢により血中濃度が減少することが知られている。また、カフェイン、アセトアルデヒド、ビタミン類、オレキシン、メチルグリオキサールは、摂食行動により血中濃度が変動し得る成分である。
【００１６】
本発明において、特定の刺激によって発現量が変動する老化制御因子の組み合わせは、例えば表２に示されるものが挙げられる。
皮下脂肪細胞に刺激として過酸化水素を添加すると、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、レプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）の発現は増加し、成長ホルモン１（ＧＨ１）、オステオプロテグリン（ＯＰＧ）の発現は減少する。
皮下脂肪細胞に刺激としてがグルコースを添加すると４−１ＢＢ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、活性化調節された発現および分泌正常Ｔ細胞（ＲＡＮＴＥＳ）、血清アミロイドＡタンパク質（ＳＡＡ）、ストローマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、ＴＮＦスーパーファミリー１型受容体（ｓＴＮＦＲＩ）、ＴＮＦスーパーファミリー２型受容体（ｓＴＮＦＲＩＩ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、の発現は増加し、インターロイキン−６ｓＲ（ＩＬ−６ｓＲ）の発現は減少する。
皮下脂肪細胞に刺激として酸化ＬＤＬを添加すると、４−１ＢＢ、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＩＧＦＢＰ２、ＭＳＰαの発現は増加し、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、及びプラスミノーゲン活性化抑制因子（ＰＡＩ−１）の発現は減少する。
皮下脂肪細胞に刺激としてエストラジオールを添加すると、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）、アグーチ関連ペプチド（ＡｇＲＰ）、ＣＲＰ、インスリン様増殖因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、レプチン受容体（ＬｅｐｔｉｎＲ）、ｓＴＮＦＲＩ、ＳＴ２、単球走化性タンパク質３（ＭＣＰ３）、血小板由来成長因子ＡＢ（ＰＤＧＦＡＢ）、ＶＥＧＦの発現は減少する。
【００１７】
【表２】
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【００１８】
本発明のスクリーニング方法において指標となる老化制御因子の活性とは、通常は老化制御因子の発現量である。ここで、発現量とは、該遺伝子のｍＲＮＡの転写量と、該遺伝子がコードするタンパク質の翻訳量との何れかを指すものとする。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様においては、刺激及び被験物質を添加した皮下脂肪細胞における老化制御因子の発現量が、刺激を添加し被験物質を添加しなかった細胞における発現量（コントロール）と比較して大きい又は小さい場合に、前記被験物質は皮膚老化改善作用を有すると判定される。
【００２０】
ここで、加齢により血中で増加する刺激の添加により発現量が増加する老化制御因子の場合は、被験物質を添加したときの発現量がコントロールより小さい場合に、前記被験物質は皮膚老化改善作用を有すると判定される。反対に、加齢により血中で増加する刺激の添加により発現量が減少する老化制御因子の場合は、被験物質を添加したときの発現量がコントロールより大きい場合に、前記被験物質は皮膚老化改善作用を有すると判定される。
また、加齢により血中で減少する刺激の添加により発現量が増加する老化制御因子の場合は、被験物質を添加したときの発現量がコントロールより大きい場合に、前記被験物質は皮膚老化改善作用を有すると判定される。反対に、加齢により血中で減少する刺激の添加により発現量が減少する老化制御因子の場合は、被験物質を添加したときの発現量がコントロールより小さい場合に、前記被験物質は皮膚老化改善作用を有すると判定される。
【００２１】
老化制御因子であるタンパク質をコードする遺伝子の発現量は、任意の方法を用いて測定することができる。例えば、当該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、定量的な検出を行う。なお、上述したアディポサイトカインをコードするヒトの遺伝子配列はそれぞれ公開されており、当業者は適宜プライマーを設計してＰＣＲに供することができる。
また、例えば、当該タンパク質の細胞膜上の量を、常法で、例えば抗体を用いる免疫学的手法等で測定して、遺伝子の発現量としてもよい。
【００２２】
本発明のスクリーニング方法に用いる細胞としては、皮下脂肪細胞を用いる。
細胞の培養の条件としては、通常の培養条件の他、本発明のスクリーニング方法の実行を妨げない、具体的に老化制御因子の発現量の測定を妨げない培養条件であれば、特段の限定なく適用することができる。
【００２３】
本発明のスクリーニング方法が対象とする被験物質は、純物質、動植物由来の抽出物、またはそれらの混合物等のいずれであってもよい。
動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物又は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花、花蕾、果実等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される一種又は二種以上が好適なものとして例示することができる。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位又はその乾燥物１質量部に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却した後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。
【００２４】
本発明のスクリーニング方法における手順の一例を以下に挙げるが、本発明の趣旨を逸
脱しない限り以下の内容に限定されるものではなく、適宜変更して実施することができる。
まず、皮下脂肪細胞に刺激物質を添加し、１〜２時間インキュベーションする。その後、被検物質を添加し、２４時間インキュベーションする。その後、該細胞からｍＲＮＡを抽出し、指標とする老化制御因子をコードする遺伝子の発現量を、該遺伝子を特異的に検出するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、定量的に測定する。コントロールとして同刺激物質を添加し被検物質を添加しなかった細胞においても該遺伝子の発現量を測定する。被検物質を添加した細胞における該遺伝子の発現量が、被検物質を添加しなかった細胞における該遺伝子の発現量（コントロール）に対して変動した場合、前記被検物質は皮膚老化改善作用を有すると判定する。該判定された物質は、マッサージ用皮膚外用剤に好適に含有し得る皮膚老化改善剤となり得る。
なお、発現量の変動の程度としては、発現量増加の場合は、コントロールに対して１２０％以上が好ましく、１３５％以上がより好ましく、１５０％以上がさらに好ましい。発現量減少の場合は、コントロールに対して８０％以下が好ましく、６５％以下がより好ましく、５０％以下がさらに好ましい。
【００２５】
皮膚老化症状が改善されたことは、例えば、皮膚老化改善剤を適用した被験者の自覚による評価、画像解析によるシワやタルミの評価、皮膚の粘弾物性の評価、皮膚の水分保持量の評価など、周知の方法によって確認することができる。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法により皮膚老化症状を改善する作用を有すると判定された物質（皮膚老化改善剤）は、任意の調製方法により組成物に含有させることができ、かかる組成物としては、例えば皮膚外用組成物や、飲食品組成物等を好適に挙げられる。かかる組成物は、抗老化用途に好ましく適用できる。
本発明のスクリーニングにより皮膚老化症状を改善する作用を有すると判定された物質（皮膚老化改善剤）は、皮下脂肪細胞が受ける血中刺激に起因する皮膚老化の発生をターゲットとする新たな機序で皮膚老化症状を改善する点で、新たなアプローチによる有効な抗老化用組成物の配合成分となり得る。
【００２７】
本発明に係る抗老化用組成物における、皮膚老化改善剤の含有量（配合量）は、通常、０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上であり、通常１５質量％以下、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％である。皮膚老化改善剤の含有量（配合量）が少なすぎると所望の効果が得られにくい場合があり、多すぎると効果が頭打ちになるばかりか組成物の処方の自由度を損なう場合があるからである。また、組成物に含有させる皮膚老化改善剤の種類は、１種類のみでなく２種類以上であってもよい。
【００２８】
本発明に係る抗老化用組成物の製造に際しては、化粧料、医薬部外品、医薬品などの製剤化や、飲食品等の経口組成物の製造で通常使用される任意成分を配合することができる。
例えば、皮膚外用組成物であれば、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシルなどのエステル類、オリーブ油、牛脂、椰子油などのトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸などの脂肪酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、オクチルドデカノール等の高級アルコール、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤類、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブタンジオール等の多価アルコール類、増
粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を任意に配合することができる。
【００２９】
また、本発明に係る抗老化用組成物には、本発明のスクリーニングにより皮膚老化症状を改善する作用を有すると判定された物質（皮膚老化改善剤）以外の皮膚老化改善用成分も配合してもよい。
本発明に係る抗老化用組成物は、常法に従って前述の成分を処理・配合することにより製造することができる。その形態は、例えば、皮膚外用組成物であれば、ローション剤型、乳化剤型、オイル剤型等任意の剤型とすることができ、経口組成物であれば、錠剤、顆粒、散剤、液剤等の剤型の他、食品や飲料なども任意に採用できる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００３１】
＜試験例１＞刺激によるアディポサイトカイン発現への影響の確認
以下の手順により、刺激を与えたときの皮下脂肪細胞から分泌されるタンパク質の変動を評価した。
増殖培地（CELL製）を用い、正常ヒト皮下脂肪細胞を２４ウェルプレートに１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種し、３７℃・５％ＣＯ2環境下で２日間培養した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳにて細胞を洗浄後、分化培地（CELL社製）に交換し、３７℃・５％ＣＯ2環境下にて、１０日間培養した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳにて細胞を洗浄後
、維持培地（CELL社製）に交換し、６時間培養後、表３に示す刺激のいずれか又は溶媒対照を含む維持培地を加え、３７℃・５％ＣＯ2環境下にて、表３に示す時間培養した。培
養後、培地を除去し、ＰＢＳにて細胞を洗浄後、維持培地（CELL社製）に交換し、４８時間培養後、培養上清を回収し、Human Adipocytokine(Adipokine) Antibody Array kit（RayBiotech製）を用いて、抗原抗体反応により検出した。溶媒対照群を１とした場合の、
相対発現量を表４に示す。
【００３２】
【表３】
2018141642.tif 000005
【００３３】
【表４】
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【００３４】
＜試験例２＞アディポサイトカインの皮膚老化への影響の確認１
以下の手順により、アディポサイトカインが皮膚老化に影響を及ぼすのか評価した。
ＤＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）又はTenocyte Culture Medium（Ｄｓファーマバイオ
メディカル社製）を用い、正常ヒト真皮線維芽細胞又は正常ヒト腱細胞を２４ウェルプレ−トに３．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェル又は２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種し、３７℃・５％ＣＯ2環境下で１日間培養した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳにて細胞
を洗浄後、アディポサイトカイン（表５に示すリコンビナントタンパク質）又は溶媒対照を含む、ＤＭＥＭ培地又はTenocyte Culture Mediumを加え、３７℃・５％ＣＯ2環境下にて、２４時間又は４８時間培養した。
RNeasy Mini Kit（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて上記正常ヒト真皮線維芽細胞又は正常ヒ
ト腱細胞のｍＲＮＡを抽出し、Superscript VILO DNA synthesis Kit（Lifetechnologies製）を用いてｃＤＮＡを合成後、バーシカン・バーシカン分解酵素又はＲＣ構造タンパク質の発現量をリアルタイムｑＰＣＲ法にて測定した。また、内在性コントロール遺伝子であるＡＣＴＢのｍＲＮＡ発現量を同様に測定した。測定には、QuantiFact SYBR GREEN PCR kit（ＱＩＡＧＥＮ製）及び表６のプライマーを用いた。
変動したタンパク質のリコンビナントタンパク質添加群及び溶媒対照群における各ｍＲＮＡ発現量について、ＡＣＴＢの発現量による補正を行い、溶媒対照群の各ｍＲＮＡ発現量を１とした場合の、変動したタンパク質のリコンビナントタンパク質添加群の各ｍＲＮＡ発現量を算出した。結果の一部を、次の試験例３の結果と共に表７に示す。
【００３５】
【表５】
2018141642.tif 000007
【００３６】
【表６】
2018141642.tif 000008
【００３７】
＜試験例３＞アディポサイトカインの皮膚老化への影響の確認２
以下の手順により、変動したタンパク質が皮膚老化に影響を及ぼすのか評価した。
ＤＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用い、正常ヒト真皮線維芽細胞を９６ウェルプレ−トに５．０×１０3ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種し、３７℃・５％ＣＯ2環境下で１日間培養した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳにて細胞を洗浄後、アディポサイトカイン（表５に示すリコンビナントタンパク質）又は溶媒対照を含むＤＭＥＭ培地を加え、３７℃・５％ＣＯ2環境下にて、２４時間又は４８時間培養した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳにて
細胞を洗浄後、Autophagy/Cytotoxicity Dual Staining Kit（Cayman Chemical製）を用
いて、アディポサイトカイン添加群又は溶媒対照群のＭＤＣ量を測定した。変動したタンパク質のリコンビナントタンパク質添加群及び溶媒対照群における各ＭＤＣ量について、溶媒対照群の各ＭＤＣ量で補正を行い、溶媒対照群の各ＭＤＣ量を１とした場合の、変動したタンパク質のリコンビナントタンパク質添加群の各ＭＤＣ量を算出した。結果の一部を、試験例２の結果と共に表７に示す。
【００３８】
【表７】
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【００３９】
＜実施例１＞皮膚老化改善剤のスクリーニング
以下の手順で、老化制御因子（アディポサイトカイン）の遺伝子発現を指標に、皮膚老化改善剤のスクリーニングを行った。
増殖培地（CELL社製）を用い、正常ヒト皮下脂肪細胞を２４ウェルプレートに１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種し、３７℃・５％ＣＯ2環境下で２日間培養した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳにて細胞を洗浄後、分化培地（CELL社製）に交換し、３７℃・５％ＣＯ2環境下にて、１０日間培養した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳにて細胞を洗浄
後、表３に示す刺激物質又は溶媒対照を含む維持培地（CELL社製）を加え、３７℃・５％ＣＯ2環境下にて、表３に示す時間培養した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳにて細胞を
洗浄後、エキス又は溶媒対照を含む維持培地を加え、３７℃・５％ＣＯ2環境下にて、２
４時間培養した。培養後、培地を除去し、ＰＢＳにて細胞を洗浄後、QIAzol Lysis Reagent（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて上記正常ヒト皮下脂肪細胞のｍＲＮＡを抽出し、Superscript VILO DNA synthesis Kit（Lifetechnologies社製）を用いてｃＤＮＡを合成後、皮膚老化に影響するタンパク質の発現量をリアルタイムｑＰＣＲ法にて測定した。また、内在性コントロール遺伝子であるＡＣＴＢのｍＲＮＡ発現量を同様に測定した。測定には、QuantiFact SYBR GREEN PCR kit（ＱＩＡＧＥＮ社製）及び表８のプライマーを用いた。
エキス添加群及び溶媒対照群における各ｍＲＮＡ発現量について、ＡＣＴＢの発現量による補正を行い、溶媒対照群の各ｍＲＮＡ発現量を１とした場合の、エキス添加群の各ｍＲＮＡ発現量を算出した。結果の一部を実施例１の結果と共に表９〜１１に示す。
【００４０】
【表８】
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【００４１】
【表９】
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【００４２】
【表１０】
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【００４３】
【表１１】
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【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明のスクリーニング方法により、皮膚老化改善剤として有効な成分を探索することができる。かかる皮膚老化改善剤は、抗老化用途の皮膚外用剤や飲食品に好適に含有させることができるため、産業上非常に有用である。
【図１】
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