(57)【要約】【課題】簡易的な構成で焦点変調を実現する顕微鏡を提供すること。【解決手段】顕微鏡、好ましくはレーザ走査顕微鏡は、少なくとも１つの照明光線と、該照明光線を試料に集束する顕微鏡対物レンズと、検出光線路と、少なくとも１つの復調手段とを備える。該照明光線は、部分領域では部分領域の断面に沿って変調周波数によって位相変調され、パルス制御された照明光線が存在し、照明光線路には該顕微鏡対物レンズの前方に第１の偏光ビームスプリッタが設けられ、該偏光ビームスプリッタは少なくとも１つの第１と第２の部分光線路を形成し、該第１と第２の部分光線路は、好ましくは、調整可能であり、かつ異なる光経路を有し、統合素子、好ましくは第２のポールスプリッタが、該部分光線を再び統合するように設けられ、１つの部分光線路に位相素子が設けられ、該位相素子は、位相の影響の異なる少なくとも２つの領域を有する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
部分領域において該部分領域の断面に応じて変調周波数で位相変調された少なくとも１つの照明光線と、該照明光線を試料に集束する顕微鏡対物レンズと、検出光線路と、少なくとも１つの復調手段とを備える顕微鏡であって、
パルス制御された照明光線が存在し、
照明光線路には、該顕微鏡対物レンズの前方に第１の偏光ビームスプリッタが設けられ、
該第１の偏光ビームスプリッタは、異なる偏光の少なくとも第１および第２の非干渉部分光線を生成し、
該第１および第２の非干渉部分光線は、異なる光経路を有し、
統合素子が、前記第１および第２の非干渉部分光線を非コヒーレントに重畳するように設けられ、
前記第１および第２の非干渉部分光線のうちの一方の光線路には、位相素子が設けられ、
該位相素子は、同時に異なる位相制御を有する少なくとも２つの領域を有し、
前記少なくとも２つの領域は、前記第１および第２の非干渉部分光線のうちの一方の光線路にあり、前記少なくとも２つの領域のうちの１つは、前記部分領域に対応する、顕微鏡。
【請求項２】
前記照明光線は、パルス制御されるレーザによって形成される、請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記照明光線は、高周波でスイッチオン・オフされるＣＷレーザによって形成される、請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記位相素子は、位相プレートである、請求項１から３のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項５】
位相プレートは、位相が実質的に影響を受けない領域（単数または複数）と、位相が影響を受ける領域（単数または複数）とを有する、請求項４に記載の顕微鏡。
【請求項６】
位相が影響を受ける前記領域（単数または複数）は、少なくとも１つのλ／ハーフプレートである、請求項５に記載の顕微鏡。
【請求項７】
復調のために、ロック・イン増幅部のような電子的手段が設けられるか、または復調のために検出器の動作モードが変化される、請求項１から６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項８】
位相プレートが、偏光変化のための第１のポールスプリッタの光方向の前方で、部分光線間の光分布を変化させるために回転可能に構成されている、請求項４に記載の顕微鏡。
【請求項９】
位相プレートは、空間的な光変調器（ＳＬＭ，空間光変調器）である、請求項４に記載の顕微鏡。
【請求項１０】
少なくとも１つの照明光線が、部分領域において部分領域の断面に応じて変調周波数で位相変調され、該照明光線を集束するための顕微鏡対物レンズを介して試料に集束される顕微鏡観察方法であって、
検出光線路と、少なくとも１つの復調手段とによって検出が行われ、
パルス制御された照明光線が照明に用いられ、
照明光線路には該顕微鏡対物レンズの前方に第１の偏光ビームスプリッタが設けられ、
該第１の偏光ビームスプリッタは、異なる偏光の少なくとも第１および第２の非干渉部分光線を生成し、
該第１および第２の非干渉部分光線は、異なる光経路を有し、
前記異なる光経路を非コヒーレントで重畳し、
前記第１および第２の非干渉部分光線のうちの一方の光線路では、位相素子が、少なくとも２つの領域において位相に対して同時に異なって影響し、
前記少なくとも２つの領域は、前記第１および第２の非干渉部分光線のうちの一方の光線路にあり、前記少なくとも２つの領域のうちの１つは、前記部分領域に対応する、顕微鏡観察方法。
【請求項１１】
前記照明光線は、パルス制御されるレーザによって形成される、請求項１０に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項１２】
前記照明光線は、高周波でスイッチオン・オフされるＣＷレーザによって形成される、請求項１０に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項１３】
位相素子として位相プレートが使用される、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項１４】
位相プレートは、位相が実質的に影響を受けない領域（単数または複数）と、位相が影響を受ける領域（単数または複数）とを有する、請求項１３に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項１５】
位相が影響を受ける領域（単数または複数）は、少なくとも１つのλ／ハーフプレートである、請求項１４に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項１６】
復調は、ロック・イン増幅部のような電子的手段によって行われるか、または復調のための検出器の動作モードの変化によって行われる、請求項１０から１５のいずれか１項に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項１７】
位相プレートが、偏光変化のための第１のポールスプリッタの光方向の前方で、部分光線間の光分布を変化させるために回転される、請求項１３に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項１８】
位相プレートは、空間的な光変調器（ＳＬＭ，空間光変調器）である、請求項１３に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項１９】
部分領域において該部分領域の断面に応じて変調周波数で位相変調された少なくとも１つの照明光線と、該照明光線を試料に集束する顕微鏡対物レンズと、検出光線路と、少なくとも１つの復調手段とを備える顕微鏡であって、
該照明光線は、連続的に照射するＣＷレーザによって形成され、
照明光線路には、該顕微鏡対物レンズの前方に偏光ビームスプリッタが設けられ、
該偏光ビームスプリッタは、異なる偏光の第１および第２の非干渉部分光線を生成し、
前記第１および第２の非干渉部分光線を非コヒーレントで重畳する統合素子が設けられ、
前記第１および第２の非干渉部分光線の一方の光線路には、位相素子が設けられ、
該位相素子は、同時に異なる位相制御を有する少なくとも２つの領域を有し、
前記少なくとも２つの領域は、前記第１および第２の非干渉部分光線のうちの一方の光線路にあり、前記少なくとも２つの領域のうちの１つは、前記部分領域に対応し、
前記第１および第２の非干渉部分光線の両方の光線路には、該両方の部分光線を交互にスイッチオン・オフする音響光学的素子（ＡＯＭ）が設けられている、顕微鏡。
【請求項２０】
少なくとも１つの照明光線が、部分領域では部分領域の断面に応じて変調周波数で位相変調され、該照明光線を集束する顕微鏡対物レンズを介して試料に集束される顕微鏡観察方法であって、
検出光線路と、少なくとも１つの復調手段とによって検出が行われ、
該照明光線は、連続的に照射するＣＷレーザによって形成され、
照明光線路では該顕微鏡対物レンズの前方で、偏光ビームスプリッタによって第１および第２の非干渉部分光線が生成され、統合素子が前記第１および第２の非干渉部分光線を非コヒーレントで重畳し、
前記第１および第２の非干渉部分光線の一方の光線路では、位相素子が、少なくとも２つの領域で位相に同時に異なる影響を与え、
前記少なくとも２つの領域は、前記第１および第２の非干渉部分光線のうちの一方の光線路にあり、前記少なくとも２つの領域のうちの１つは、前記部分領域に対応する、
前記第１および第２の非干渉部分光線の両方の光線路において、音響光学的素子（ＡＯＭ）が、部分光線の交互のスイッチオン・オフを形成する、顕微鏡観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
顕微鏡および顕微鏡観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
時間的焦点変調技術（ＦＭＭ：zeitliche Fokusmodulationstechnik）は、蛍光顕微鏡法において種々異なる焦点野を高速に切り替えることを可能にする方法である。これはとりわけ、対物レンズの焦点にある光だけに影響を及ぼしたい場合に重要である。ここでは既に文献において、光学的に厚い試料の３次元結像を、背景光を同時に弁別しながら可能にする方法が示されている（非特許文献１〜３、特許文献１）。
【０００３】
ここでの基礎は、実質的に焦点内に生成される特性（例えば蛍光）に対して、これらの特性（蛍光）が焦点外では変調されないように時間的に影響を及ぼすことである。これまでこの方法は、対物レンズの瞳内で光学的位相を高速に切り替えることに基づいている。とりわけこれまでは、この位相を２つの半瞳（Ｈａｌｂｐｕｐｉｌｌｅｎ）内で切り替えることが示されている。
【０００４】
上記半瞳切り替えと同じように、別の部分光線の光学的位相を瞳内で切り替えることも有利に利用することができる。さらに、焦点容積からの放射の時間的変調を生成するために、位相だけでなく一般的にフィールドモード切り替え（Ｆｅｌｄｍｏｄｅｎｓｃｈａｌｔｕｎｇ）を利用することも有利に可能であり、ここで焦点容積外の光線は時間的に変調されない。
【０００５】
図１は、焦点内だけの蛍光の変調に作用する２つの焦点状態の間の時間的切り替えを示す。図１は、切り替えることのできる２つの焦点状態に対する１例を断面に示す。状態の一方が光軸上にゼロ位置を有することが良く分かる。焦点の外ではゼロ位置が消失する。
【０００６】
瞳内における純粋な位相切り替えの他に、さらに、焦点容積から発する光線を変調するために位相プレートと組み合わせた偏光の切り替えが、さらなる可能性として提案される（特許文献２、特許文献３）。
【０００７】
図２は、電子光学的偏光回転器に基づく焦点変調の前記形式の１実施形態を示し、図３は、焦点変調を引き起こす位相プレートのこれに所属する可能な変形例を示す。これに関しては、先行の特許文献２および特許文献３を参照されたい。
【０００８】
問題となる全ての焦点変調技術は、数ＭＨｚの変調周波数から恩恵を受ける。したがってこの技術は基本的に、スキャン速度を低下させることなく到達深度を高めるためにレーザ走査顕微鏡（ＬＳＭ）で有利に使用するのに適する。速度のさらなる上昇は、マルチスポット顕微鏡による並列化によって得られる。しかしながら緩慢な変調も相変わらず可能であり、対応して調整することができる。
【０００９】
有利には変調周波数が高いので、実質的に高速にスイッチングする光電子エレメント、例えばＡＯＭおよびＥＯＭが考えられる。これらの構成素子は、偏光を時間的に非常に高速に切り替えることができ、これにより偏光に依存する位相偏移が種々の空間的領域に、好ましくは対物レンズ瞳に導入される（図２）。
【００１０】
偏光状態の切り替えにより、位相の切り替えを達成することも可能である。この解決策により、最終的には実質的に焦点内のフィールドに作用する特性を切り替えることができ、その結果、焦点フィールドが変調される。一方、焦点外の基本的な成分は有意には変調されない。
【００１１】
図２は、照明光線路に配置された電子光学的変調器ＥＯＭと受動型位相素子ＰＰに基づく、この種の高速の光学的モードスイッチを示す。素子ＰＰはＥＯＭと作用接続しており、ＥＯＭは相応の制御によって、入射する光線Ｌ、すなわち通常は線形偏光されたレーザ光線の偏光方向を高速に回転する。ＰＰを通過した後、光線は、以下に示す構成の場合と同じように、顕微鏡Ｍの方向へ、図示しないスキャンユニットを介し試料へさらに経過する。これは従来技術から公知のものと同様である。プレートＰＰによる片側の位相変化により、光線はＦＭＭ型のフィード変調を受ける。
【００１２】
図３に示した位相プレートは単なる例である。原理的にここでは種々の幾何形状が考えられる。例として図示した受動型位相素子は、ここではそれぞれ複屈折結晶と、位相に関して偏光方向に依存しないコンポーネントとの組合せから成り、複屈折結晶として図示されている位相プレートＰＰは分割されたλ／２プレートの形態にあり、前記偏光方向に依存しないコンポーネントは例えばガラスとして構成されている（図３）。ここで位相プレートは、結晶の高速方向が、入射されるレーザ偏光に対して有利には平行ないし直角に配向されるか、またはさらなる最適の角度に配向されるように配向されている。
【００１３】
図３には、位相プレートＰＰの種々の変形例が示されている。ＰＰ＿１では片側の部分がλ／２の半分とガラスの半分であり、ＰＰ＿２では４分の１が対向するλ／２の４分の１とガラスの４分の１であり、ＰＰ＿３では外側にあるλ／２リングと内側のガラスコアであり、ＰＰ＿４では反対に外側にあるガラスリングと内側にあるλ／２コアである。
【００１４】
ガラスはここでは例としてだけ挙げられている。アモルファス石英（スプラシル（登録商標））または他の複屈折しない材料を使用することもできる。図３のＰＰ＿１では、例として矢印により、それぞれのλ／２部分の異常軸の向きが示されている。この矢印方向に対して平行に偏光された光線がこの素子を通過すると、ガラス部分に対して半波長だけの位相シフトが、λ／２部分において形成される。これに対し、光線の偏光が矢印方向に対して垂直に配向されている場合には、相対的な位相遅延は形成されない。
【００１５】
例えばネマチックであるが緩慢に反応する結晶、または経路分割を介して異なる偏光を形成する構造であって、この経路が例えばＡＯＭ／ＡＯＴＦを介して高速に切り替わる構造も、偏光の所望の変化のために使用できることを付記しておく。一般的に偏光状態は、例えば正弦波状、矩形状、または他の有利な波形で時間的に変化することができる。これにより、顕微鏡の焦点における空間的なフィールド分布間の移行が、時間的に異なって影響される。
【００１６】
ＦＭＭの利点は、以下のようにまとめられる：
・焦点外の散乱光の低減による到達深度の向上
・光学的な切断−蛍光容積の低減
・光学的分解能の向上。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第２００９／００８８３８号パンフレット
【特許文献２】独国特許出願公開第１０２０１１０１３６１３号明細書
【特許文献３】独国特許出願公開第１０２０１００１３８２９号明細書
【特許文献４】欧州特許第５００７１７号明細書
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】コーエンら（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ  １６，１８７６４（２００８）
【非特許文献２】ウォンら（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．），Ａｐｐｌ．Ｏｐｔ．  ４８，３２３７（２００９）
【非特許文献３】エー・レライとジェー・メルツ（Ａ．ＬｅｒａｙとＪ．Ｍｅｒｔｚ），Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ１４，１０５６５（２００６）
【非特許文献４】スエダら（Ｓｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ），Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ１２，３５４８（２００４）
【非特許文献５】チョンら（Ｃｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．），Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓ  Ｖｏｌ．１ナンバー３
【非特許文献６】イスラエル  ロチャ−メンドウザ，ウォルフガング  ラングバイン，ペーター  ワトソン，およびパオラ  ボリ（Ｉｓｒａｅｌ  Ｒｏｃｈａ−Ｍｅｎｄｏｚａ，  Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｌａｎｇｂｅｉｎ，  Ｐｅｔｅｒ  Ｗａｔｓｏｎ，およびＰａｏｌａ  Ｂｏｒｒｉ），「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｔ  ａｎｔｉ−Ｓｔｏｋｅｓ  Ｒａｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｗｉｔｈ  ｌｉｎｅａｒｌｙ  ｃｈｉｒｐｅｄ  ｆｅｍｔｏｓｅｃｏｎｄ  ｌａｓｅｒ  ｐｕｌｓｅｓ」Ｏｐｔ．  Ｌｅｔｔ．  ３４，２２５８−２２６０  （２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
特に図２と３に基づき、焦点変調を実現するためには、比較的に大きな技術的出費が必要であることが分かる。したがって本発明の関心事は、焦点変調のための簡単で安価な解決提案を実現することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明によれば、驚くことには、パルス制御される光源の内的なレーザ変調周波数を、焦点変調の形成のために使用することができ、しかも安価であり大きな技術的出費の掛からないことが認識された。パルス制御される照明源を使用すれば、有利には光源自体が既に変調周波数を備えており、有利には上記の高速スイッチを省略することができる。
【００２１】
したがって本発明により位相変調のために受動素子だけを使用すれば、技術的出費を格段に低減することができる。確かに、他の光学的目的のための類似の方法が既に記載されている。非特許文献６には、例えばＣＡＲＳ顕微鏡分光法における変調のための受動型構成体が記載されている。しかしながらそこでは光学的位相が変調されるのではなく、それぞれ２つのレーザパルスの間に、時間的に変化する時間間隔が導入される。この時間間隔は変化によって、生じるＣＡＲＳ信号に種々の貢献をする。本発明によれば、受動素子により単独で光学的位相の変調が可能であることが認識された。ここで変調は、レーザが相応に高い繰り返し率を有していればＭＨｚ領域に置くことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】焦点内だけの蛍光の変調に作用する２つの焦点状態の間の時間的切り替えを示す。
【図２】電子光学的偏光回転器に基づく焦点変調の構成を示す。
【図３】焦点変調を引き起こす位相プレートの変形例を示す。
【図４】内的なレーザ変調周波数ないし繰り返し率を利用した焦点変調の有利な実施形態を示す。
【図５】図４の焦点変調の有利な実施形態に基づく変形例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明を以下、概略的図面に基づいて詳細に説明する。
図４は、内的なレーザ変調周波数ないし繰り返し率を利用した焦点変調の有利な実施形態を示す。図４ではパルス制御されるレーザＬが、ここでは偏向ミラーＵｓを介して顕微鏡の光学的照明光線路に偏向される。顕微鏡はここでは、顕微鏡対物レンズＯと試料面ＰＲに基づいて概略的にだけ図示されている。試料から発する試料光を備える光線路には、ここに図示しない手段（例えば主ビームスプリッタ）が検出方向で対物レンズの後方に設けられており、これにより試料光を図示しない検出部の方向に偏向する。さらに図示されていないが、照明側で対物レンズに前置されたスキャン手段が、Ｏにより集束された照明光線、光線分布または照明ラインを、１つまたは２つの方向で試料の上に案内する。スキャン手段には、試料光が検出部の方向と逆方向で、デスキャン検出のための検出部の方向でフェードアウトの前に再び通過する。短いパルスＰｕを送出するレーザＬには、λ／２プレートＷｐが後置されている。照明光Ｌは第１の偏光ビームスプリッタＰｓｔ１に達し、パルス制御される２つの成分Ｐｕ１とＰｕ２に分割される。伝送された成分の一方であるＰｕ１は、好ましくは対物レンズ瞳またはこれに共役の平面に配置された、連鎖パルスＰｕ１の位相プレートＰＰと、第２のポールスプリッタＰｓｔ２とを介して到達し、試料の方向に対物レンズＯを介して偏向される。第２の連鎖パルスＰｕ２は、Ｓ１で反射され、偏向ミラーＳ１とＳ２によりＰｕ１に対して時間的に遅延されて第２のポールスプリッタＰｓｔ２に達し、ここで同様に試料の方向に対物レンズＯを介して偏向される。
【００２４】
したがって図４は、本発明の原理を示す：
１．レーザからの光パルスの線形偏光は、λ／２プレートまたはλ／４プレートによって、偏光ビームスプリッタＰｓｔ１が到来するパルス列をエネルギー的には同じ２つの部分光線ないし２つのパルス列に分割するように偏光される。これら２つの部分光線は、偏光のみが異なっている。
２．しかしこれらパルス列の一方は瞳（図３）にある位相プレートＰＰを付加的に通過し、これにより空間的に変調された照明パターンを対物レンズ焦点内（軸上のゼロ位置を備える）に形成することができる。
３．さらに２つのパルス列は、時間的に互いに、例えば繰り返し時間の半分だけシフトされる。そして可能であれば、繰り返し時間の半分は、蛍光持続時間を下回るべきではない。すなわち繰り返し率＜１００ＭＨｚが推奨値である。
【００２５】
時間遅延は、部分光線路における異なる光経路によって行われる。この光経路は、ミラーＳ１、Ｓ２を光軸に対して垂直に移動することにより好ましくは調整することもできる。
ポールスプリッタＰｓｔ２の後方で、図示のように時間的順序で、パルスＰｕ２と、ＰＰによって影響されて部分的に位相状態の遅延されたパルス列とがＦＭＭ原理にしたがい切り替えられる。（試料中の）対物レンズ焦点にはこれらのパルス列が交互に発生する。
図４に示した原理により、対物レンズの焦点における蛍光信号の時間的変調が行われる。変調周波数は、レーザの繰り返し率によって規定される。時間的に変調された焦点信号は、位相検知性のロック・イン技術によって、または２つの極値点の差分信号をボックスカー積分することによって復元することができる。位相プレートＰＰとして、図３に示した実施形態を使用することができる。
【００２６】
パルス制御されるレーザとしてＣＷレーザも用いることができる。このＣＷレーザは、対応の高速スイッチング手段によってスイッチオン・オフされる。図４の構造に基づき同様に安価な構造を、ＣＷレーザ源Ｌと２つのＡＯＭ１，２を使用して創成できることを付け加えておく。この原理に関する１例が図５に示されている。偏光ブームスプリッタＰｓｔ１によるビーム分割の後、光はそれぞれ（伝送および反射され）、音響光学的変調器（ＡＯＭ１ないしＡＯＭ２）ならびにそれぞれ光線適合光学系Ｂｏ１，２を通過する。ここでそれぞれ有利に使用される第１の回折構成体が試料ＰＲの方向に達し、２つのＡＯＭが光を、周波数＞１０ＭＨｚでそれぞれスイッチオン・オフし、振幅がＤ／２だけ互いに位相シフトされるように切り替えられる。非特許文献５とは異なり、ここではＡＯＭが、２つの光経路においてレーザ光をパルス状にスイッチオン・オフするために用いられる。このようにしてビームスプリッタＰｓｔ２の後方には、図４のように時間的にずれたパルスシーケンスが同様に発生する。２つの光経路における振幅変調は、時間の経過が例えば正弦波状または矩形状であるように構成することができる。
【００２７】
図４と５に示された方法は、線形顕微鏡でも非線形顕微鏡でも機能することを述べておく。すなわち、単一光子過程でも多光子過程（第２高調波生成−ＳＨＧ、第３高調波生成−ＴＨＧ、２光子吸収−ＴＰＡ（特許文献４）、コヒーレント反ストークスラマン散乱−ＣＡＲＳ）でも適用することができる。ここで図４の方法（パルス制御されるレーザ光源）では、多光子交互作用の場合は、対物レンズ焦点におけるピーク強度が比較的高いため、利用可能な信号がより簡単に得られる。
【００２８】
さらなる方法を、本方法と有利に組み合わせることができる：
・ポイントスキャン高解像法：誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡法、可逆的飽和性光学（蛍光）遷移（ＲＥＳＯＬＦＴ）顕微鏡法、飽和パターン励起顕微鏡法（ＳＰＥＭ）および構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）
・ＦＩＬＭ−蛍光寿命イメージング顕微鏡法
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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