(57)【要約】【課題】高流速域での吸着及び分離性能と、目詰まりしにくい性能と、を両立し、高い吸着容量を有する、治療用タンパク質精製用のイオン交換クロマトグラフィー担体を提供する。【解決手段】実質的に非多孔質の合成ポリマーからなる基材と、基材に共有結合している、イオン交換基を有するグラフト鎖と、を備えるタンパク質精製用のイオン交換クロマトグラフィー担体であって、放射線照射によって活性化された基材と、貧溶媒中でエマルジョン化された１種類以上の反応性モノマーと、を、接触させて、基材上にグラフト鎖を形成させて製造されるイオン交換クロマトグラフィー担体であり、反応性モノマーの少なくとも１種類は、イオン交換基又はイオン交換基導入前駆体を有し、グラフト鎖の形成と同時に、又はグラフト鎖形成の後に、イオン交換基を基材上に導入することにより製造される、イオン交換クロマトグラフィー担体。【選択図】図２
2018040772.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に非多孔質の合成ポリマーからなる基材と、
前記基材に共有結合している、イオン交換基を有するグラフト鎖と、
を備えるタンパク質精製用のイオン交換クロマトグラフィー担体であって、
放射線照射によって活性化された前記基材と、貧溶媒中でエマルジョン化された１種類以上の反応性モノマーと、を、接触させて、前記基材上に前記グラフト鎖を形成させて製造されるイオン交換クロマトグラフィー担体であり、
前記反応性モノマーの少なくとも１種類は、前記イオン交換基又は前記イオン交換基導入前駆体を有し、前記グラフト鎖の形成と同時に、又は前記グラフト鎖形成の後に、前記イオン交換基を前記基材上に導入することにより製造される、イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項２】
実質的に非多孔質の合成ポリマーからなる基材と、
前記基材に共有結合している、イオン交換基を有するグラフト鎖と、
を備えるタンパク質精製用のイオン交換クロマトグラフィー担体であって、
以下に示すＡとＢの関係が、Ａ／√Ｂ≧１．０５である、イオン交換クロマトグラフィー担体。
Ａ：イオン交換クロマトグラフィー担体の断面の外周／基材の断面の外周
Ｂ：イオン交換クロマトグラフィー担体の断面積／基材の断面積
【請求項３】
放射線照射によって活性化された前記基材と、貧溶媒中でエマルジョン化された１種類以上の反応性モノマーと、を、接触させて、前記基材上に前記グラフト鎖を形成させて製造されるイオン交換クロマトグラフィー担体であり、
前記反応性モノマーの少なくとも１種類は、前記イオン交換基又は前記イオン交換基導入前駆体を有し、前記グラフト鎖の形成と同時に、又は前記グラフト鎖形成の後に、前記イオン交換基を前記基材上に導入することにより製造される、請求項２に記載のイオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項４】
前記基材に導入されたグラフト鎖のうち、前記表面グラフト鎖の割合が７０％以上であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載のイオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項５】
前記基材内部に、前記グラフト鎖が実質的に形成されていない、請求項１から４のいずれか１項に記載のイオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項６】
グラフト率が２０％以上３００％以下である、請求項１から５のいずれか１項に記載のイオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項７】
前記基材の形状が、繊維又は不織布である、請求項１から６のいずれか１項に記載のイオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項８】
前記合成ポリマーが、ポリオレフィン、ポリアミド、及びポリエステルからなる群から選ばれる、請求項１から７のいずれか１項に記載のイオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項９】
前記ポリオレフィンがポリエチレンである、請求項８に記載のイオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１０】
前記ポリアミドがナイロンである、請求項８に記載のイオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１１】
前記反応性モノマーがグリシジルメタクリレートであり、前記グラフト鎖形成の後に、前記イオン交換基を前記基材上に導入することにより製造される、請求項１から１０のいずれか１項に記載のイオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１２】
前記イオン交換基がアニオン交換基である、請求項１から１１のいずれか１項に記載のイオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１３】
前記イオン交換基がカチオン交換基である、請求項１から１１のいずれか１項に記載のイオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１４】
請求項７に記載のイオン交換クロマトグラフィー担体を、裁断し、又は成型することによって、クロマトグラフィーカラムに充填した、タンパク質精製用イオン交換クロマトグラフィーカラム。
【請求項１５】
請求項７に記載のイオン交換クロマトグラフィー担体を、裁断し、又は成型することによって、フィルターカートリッジに充填した、タンパク質精製用イオン交換クロマトグラフィーフィルターモジュール。
【請求項１６】
請求項７に記載のイオン交換クロマトグラフィー担体のモノフィラメント又はマルチフィラメントを、円筒状コアに巻きつけた、タンパク質精製用イオン交換クロマトグラフィーワインドフィルターモジュール。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか１項に記載のタンパク質精製用のイオン交換クロマトグラフィー担体を用いてタンパク質を精製する工程を少なくとも含む、タンパク質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノクローナル抗体等のタンパク質を精製するために適したイオン交換クロマトグラフィー担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体等の各種治療用タンパク質は、細胞培養液等の生物由来材料から、複数のクロマトグラフィー精製工程を経て製造されている。これらのクロマトグラフィー工程には、例えば、多孔質ビーズを基材としたイオン交換クロマトグラフィー樹脂を充填したカラムが用いられている。多孔質ビーズは比表面積が大きく、高いイオン交換基密度を達成出来るため、目的の治療用タンパク質の高い吸着容量を実現できる反面、多孔質ビーズ細孔内部への治療用タンパク質の拡散速度が吸着特性に大きく影響するため、高流速域では吸着容量が著しく低下する。さらに、多孔質ビーズを充填したカラムは、ビーズが圧縮されて変形し圧力が上昇するため、高流速域で使用することができない。これらの事情から、治療用タンパク質を商業的に製造する際には、直径１ｍを超える大型カラムと１００Ｌを超える大量のクロマトグラフィー樹脂が使用されている。そのため、多孔質ビーズを用いるクロマトグラフィー精製工程は、高コストで処理時間もかかる工程となっている。
【０００３】
これに対し、多孔質膜を基材としたクロマトグラフィー膜は、その細孔部を直接工程液が流れていくため、高流速域でも高吸着容量を維持するという特性がある。特にアニオン交換膜は、治療用タンパク質よりも不純物を選択的にアニオン交換膜に吸着させるフロースルーモードによる精製工程の処理速度を著しく効率化できるため、モノクローナル抗体の製造等に普及しつつある。しかし、多孔質膜を基材としたクロマトグラフィー膜は、膜詰まりを起こしやすいという欠点もある。
【０００４】
特許文献１及び非特許文献１には、天然繊維であるセルロース系繊維の基材に放射線グラフト重合によってイオン交換基を導入したクロマトグラフィー担体が開示されている。繊維基材の担体をカラムに充填することによって、多孔質ビーズよりも高流速域での吸着及び分離特性に優れ、また濁質存在下でも詰まりにくいカラムを作成することができるとされている。しかし、一般的にセルロース系繊維は、吸水性が高く緩衝液中では著しく膨潤し、湿潤強度も著しく低下するため、安定してカラムに充填することが困難である。
【０００５】
特許文献２には、断面形状を星型にすることによって表面積を大きくした特殊な形状のナイロン繊維を基材とし、当該基材にグラフト重合によってイオン交換基を導入したクロマトグラフィー担体が開示されている。一般的にナイロン等の合成繊維は、セルロース系繊維に比べて吸水性に乏しく膨潤しないので、湿潤強度に優れている。しかし、このような特殊な形状の繊維は、基材としての供給安定性やコスト面で最良ではない。また、高い吸着容量を得るために大表面積を有する特殊な形状のナイロン繊維を採用したにもかかわらず、その吸着容量は、多孔質ビーズ基材の担体と比べて、十分高いとはいえない。
【０００６】
特許文献３及び特許文献４には、ナイロン、ポリエチレン、あるいはポリプロピレン繊維からなる不織布に、エマルジョングラフト重合法を用いて、イオン交換基を導入した不織布フィルタが開示されている。しかし、特許文献３及び特許文献４においては、不織布フィルタによる治療用タンパク質の吸着分離性能については検証されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／００６５４９９号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１２／０１５９０８号
【特許文献３】特許第５０８２０３８号公報
【特許文献４】特許第５０１３３３３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ２０１５、３、２０４−２２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、高流速域での吸着及び分離性能と、目詰まりしにくい性能と、を両立し、高い吸着容量を有し、湿潤強度に優れた、タンパク質精製用のイオン交換クロマトグラフィー担体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、実質的に非多孔質の合成ポリマーからなる基材に、放射線グラフト重合によってイオン交換基を導入する際に、貧溶媒中で反応性モノマーをエマルジョン化することによって、効率的にイオン交換基が基材に導入され、タンパク質精製に適したイオン交換クロマトグラフィー担体を作製できることを見出した。
【００１１】
本発明の態様によれば、実質的に非多孔質の合成ポリマーからなる基材と、基材に共有結合している、イオン交換基を有するグラフト鎖と、を備えるタンパク質精製用のイオン交換クロマトグラフィー担体であって、放射線照射によって活性化された基材と、貧溶媒中でエマルジョン化された１種類以上の反応性モノマーと、を、接触させて、基材上にグラフト鎖を形成させて製造されるイオン交換クロマトグラフィー担体であり、反応性モノマーの少なくとも１種類は、イオン交換基又はイオン交換基導入前駆体を有し、グラフト鎖の形成と同時に、又はグラフト鎖形成の後に、イオン交換基を基材上に導入することにより製造される、イオン交換クロマトグラフィー担体が提供される。
【００１２】
また、本発明の態様によれば、実質的に非多孔質の合成ポリマーからなる基材と、基材に共有結合している、イオン交換基を有するグラフト鎖と、を備えるタンパク質精製用のイオン交換クロマトグラフィー担体であって、以下に示すＡとＢの関係が、Ａ／√Ｂ≧１．０５である、イオン交換クロマトグラフィー担体が提供される。
Ａ：イオン交換クロマトグラフィー担体の断面の外周／基材の断面の外周
Ｂ：イオン交換クロマトグラフィー担体の断面積／基材の断面積
【００１３】
上記のイオン交換クロマトグラフィー担体が、放射線照射によって活性化された基材と、貧溶媒中でエマルジョン化された１種類以上の反応性モノマーと、を、接触させて、基材上にグラフト鎖を形成させて製造されるイオン交換クロマトグラフィー担体であり、反応性モノマーの少なくとも１種類は、イオン交換基又はイオン交換基導入前駆体を有し、グラフト鎖の形成と同時に、又はグラフト鎖形成の後に、イオン交換基を基材上に導入することにより製造されてもよい。
【００１４】
上記のイオン交換クロマトグラフィー担体において、基材に導入されたグラフト鎖のうち、表面グラフト鎖の割合が７０％以上であってもよい。基材の内部に存在するグラフト鎖の割合が３０％未満であってもよい。
【００１５】
上記のイオン交換クロマトグラフィー担体において、基材内部に、グラフト鎖が実質的に形成されていなくともよい。
【００１６】
上記のイオン交換クロマトグラフィー担体において、グラフト率が２０％以上３００％以下であってもよい。
【００１７】
上記のイオン交換クロマトグラフィー担体において、基材の形状が、繊維又は不織布であってもよい。
【００１８】
上記のイオン交換クロマトグラフィー担体において、合成ポリマーが、ポリオレフィン、ポリアミド、及びポリエステルからなる群から選ばれてもよい。ポリオレフィンがポリエチレンであってもよい。ポリアミドがナイロンであってもよい。
【００１９】
上記のイオン交換クロマトグラフィー担体において、反応性モノマーがグリシジルメタクリレートであり、グラフト鎖形成の後に、イオン交換基を基材上に導入することにより製造されてもよい。
【００２０】
上記のイオン交換クロマトグラフィー担体において、イオン交換基がアニオン交換基であってもよいし、カチオン交換基であってもよい。
【００２１】
また、本発明の態様によれば、上記のイオン交換クロマトグラフィー担体を、裁断し、又は成型することによって、クロマトグラフィーカラムに充填した、タンパク質精製用イオン交換クロマトグラフィーカラムが提供される。
【００２２】
本発明の態様によれば、上記のイオン交換クロマトグラフィー担体を、裁断し、又は成型することによって、フィルターカートリッジに充填した、タンパク質精製用イオン交換クロマトグラフィーフィルターモジュールが提供される。
【００２３】
本発明の態様によれば、上記のイオン交換クロマトグラフィー担体のモノフィラメント又はマルチフィラメントを、円筒状コアに巻きつけた、タンパク質精製用イオン交換クロマトグラフィーワインドフィルターモジュールが提供される。
【００２４】
本発明の態様によれば、上記のタンパク質精製用のイオン交換クロマトグラフィー担体を用いてタンパク質を精製する工程を少なくとも含む、タンパク質の精製方法が提供される。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、高流速域での吸着及び分離性能と、目詰まりしにくい性能と、を両立し、高い吸着容量を有し、湿潤強度に優れた、タンパク質精製用のイオン交換クロマトグラフィー担体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の実施の形態に係る基材の電子顕微鏡写真の一例である。
【図２】本発明の実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体の電子顕微鏡写真の一例である。
【図３】実施例１に係るアニオン交換クロマトグラフィー担体のウシ血清アルブミンの静的結合容量を示す表である。
【図４】実施例２に係るアニオン交換クロマトグラフィー担体のウシ血清アルブミンの動的結合容量を示すグラフである。
【図５】実施例３に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体のリゾチームの動的結合容量を示す表である。
【図６】実施例３に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体の電子顕微鏡写真である。
【図７】実施例４に係るアニオン交換クロマトグラフィー担体のモル転化率とウシ血清アルブミンの飽和結合用量との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の好適な実施の形態（以下において、「実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお以下の示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
【００２８】
実施の形態に係るタンパク質精製用のイオン交換クロマトグラフィー担体は、実質的に非多孔質の合成ポリマーからなる基材と、基材に共有結合している、イオン交換基を有するグラフト鎖と、を備える。当該イオン交換クロマトグラフィー担体は、放射線照射によって活性化された基材と、貧溶媒中でエマルジョン化された１種類以上の反応性モノマーと、を、接触させて、基材上にグラフト鎖を形成させて製造される。反応性モノマーの少なくとも１種類は、イオン交換基又はイオン交換基導入前駆体を有する。イオン交換クロマトグラフィー担体は、グラフト鎖の形成と同時に、又はグラフト鎖形成の後に、イオン交換基を基材上に導入することにより製造される。
【００２９】
実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体は、例えば、不純物を含むタンパク質の精製に用いられる。精製対象のタンパク質は、例えば、抗体タンパク質の単量体である。不純物とは、例えば抗体タンパク質の２量体以上の凝集体、その他のタンパク質の夾雑物、ＤＮＡ、及びエンドトキシン等である。
【００３０】
生理活性物質の一例である抗体タンパク質は、生化学における一般的な定義のとおり、脊椎動物の感染防禦機構としてＢリンパ球が産生する糖タンパク質分子（ガンマグロブリン又は免疫グロブリンともいう）である。例えば、実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体で精製される抗体タンパク質は、ヒトの医薬品として使用され、投与対象であるヒトの体内にある抗体タンパク質と実質的に同一の構造を有する。
【００３１】
抗体タンパク質は、ヒト抗体タンパク質であってもよく、ヒト以外のウシ及びマウス等の哺乳動物由来抗体タンパク質であってもよい。あるいは、抗体タンパク質は、ヒトＩｇＧとのキメラ抗体タンパク質、及びヒト化抗体タンパク質であってもよい。ヒトＩｇＧとのキメラ抗体タンパク質とは、可変領域がマウス等のヒト以外の生物由来であるが、その他の定常領域がヒト由来の免疫グロブリンに置換された抗体タンパク質である。また、ヒト化抗体タンパク質とは、可変領域のうち、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：  ＣＤＲ）がヒト以外の生物由来であるが、その他のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ：  ＦＲ）がヒト由来である抗体タンパク質である。ヒト化抗体タンパク質は、キメラ抗体タンパク質よりも免疫原性がさらに低減される。
【００３２】
実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体の精製対象の一例である抗体タンパク質のクラス（アイソタイプ）及びサブクラスは特に限定されない。例えば、抗体タンパク質は、定常領域の構造の違いにより、ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，及びＩｇＥの５種類のクラスに分類される。しかし、実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体が精製対象とする抗体タンパク質は、５種類のクラスのいずれであってもよい。また、ヒト抗体タンパク質においては、ＩｇＧにはＩｇＧ１〜ＩｇＧ４の４つのサブクラスがあり、ＩｇＡにはＩｇＡ１とＩｇＡ２の２つのサブクラスがある。しかし、実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体が精製対象とする抗体タンパク質のサブクラスは、いずれであってもよい。なお、Ｆｃ領域にタンパク質を結合したＦｃ融合タンパク質等の抗体関連タンパク質も、実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体が精製対象とする抗体タンパク質に含まれ得る。
【００３３】
さらに、抗体タンパク質は、由来によっても分類することができる。しかし、実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体が精製対象とする抗体タンパク質は、天然のヒト抗体タンパク質、遺伝子組換え技術により製造された組換えヒト抗体タンパク質、モノクローナル抗体タンパク質、及びポリクローナル抗体タンパク質のいずれであってもよい。これらの抗体タンパク質の中でも、実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体が精製対象とする抗体タンパク質としては、抗体医薬としての需要や重要性の観点から、ヒトＩｇＧが好適であるが、これに限定されない。
【００３４】
実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体の基材は、実質的に非多孔質の合成ポリマーからなる。基材の形状は、例えば、繊維又は不織布である。繊維は、通常の円柱形状を有していればよく、断面が星型の特殊な繊維である必要はない。また、繊維は、モノフィラメントであってもよいし、マルチフィラメントであってもよい。なお、モノフィラメントとは、単繊維からなる構造をいう。また、マルチフィラメントとは、多数の繊維を撚り合せた構造をいう。合成ポリマーは、例えば、ポリオレフィン、ポリアミド、又はポリエステル等である。
【００３５】
ポリオレフィンの例としては、エチレン、プロピレン、ブチレン、及びフッ化ビニリデン等のオレフィン単独重合体、該オレフィンの２種以上の共重合体、又は１種もしくは２種以上のオレフィンと、パーハロゲン化オレフィンと、の共重合体等が挙げられる。パーハロゲン化オレフィンの例としては、テトラフルオロエチレン及び／又はクロロトリフルオロエチレン等が挙げられる。これらの中でも、機械的強度に優れ、かつタンパク質等の夾雑物の高い吸着容量が得られる点で、ポリエチレン又はポリフッ化ビニリデンが好ましい。
【００３６】
ポリアミドの例としては、ナイロン６（ε−カプロラクタムの重縮合体）、ナイロン１１（ウンデカンラクタムの重縮合体）、ナイロン１２（ラウリルラクタムの重縮合体）、ナイロン６６（ヘキサメチレンジアミンとアジピン酸の共縮重合体）、ナイロン６１０（ヘキサメチレンジアミンとアジピン酸の共縮重合体）、ナイロン６Ｔ（ヘキサメチレンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロン９Ｔ（ノナンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロンＭ５Ｔ（メチルペンタンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロン６２１（カプロラクタムとラウリルラクタムの共縮重合体）、ｐ−フェニレンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体、並びにｍ−フェニレンジアミンとイソフタル酸の共縮重合体等が挙げられる。
【００３７】
ポリエステルの例としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリトリメチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、及びポリブチレンナフタレート等が挙げられる。
【００３８】
基材に共有結合しているグラフト鎖は、モノマー単位により構成されている。モノマー単位が、イオン交換基を有する。イオン交換基は、精製対象や精製条件に応じて、カチオン交換基であってもよいし、アニオン交換基であってもよい。カチオン交換基は、不純物が除去できれば、強カチオン交換基であってもよく、弱カチオン交換基であってもよい。
【００３９】
強カチオン交換基の例としては、スルホン酸基等が挙げられる。ほぼ全ての強カチオン交換基は、抗体タンパク質を精製する際における実用的な抗体溶液のｐＨ領域で荷電しているため、荷電量が一定である。したがって、基材上に強カチオン交換基が存在することで、常に一定以上の荷電量が保証される。また、ｐＨ微変化によってカチオン交換クロマトグラフィー担体の性能が大きく左右されることを抑制することができる。
【００４０】
弱カチオン交換基の例としては、カルボン酸基、ホスホン酸基、及びリン酸基等が挙げられる。弱カチオン交換基は、移動相のｐＨにより、荷電量を変化させることが可能である。そのため、移動相のｐＨを変化させることにより、カチオン交換クロマトグラフィー担体の電荷密度の調整が可能となる。したがって、除去すべき不純物の特性に合わせて、ｐＨを調整することにより、任意の不純物の除去が可能となる。
【００４１】
アニオン交換基は、液中で負に帯電したタンパク質等を吸着することができればよく、例えば、特に限定されないが、アニオン交換基の例としては、３級アミノ基であるジエチルアミノ基（ＤＥＡ、Ｅｔ2Ｎ−）、４級アンモニウム基（Ｑ、Ｒ3Ｎ+−）、４級アミノエチル基（ＱＡＥ、Ｒ3Ｎ+−（ＣＨ2）2−）、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ、Ｅｔ2Ｎ−（ＣＨ2）2−）、及びジエチルアミノプロピル基（ＤＥＡＰ、Ｅｔ2Ｎ−（ＣＨ2）3−）等が挙げられる。ここで、Ｒは、特に限定されず、同一のＮに結合するＲが同一又は異なっていてもよく、好適には、アルキル基、フェニル基、アラルキル基等の炭化水素基を表す。４級アンモニウム基としては、例えば、トリメチルアミノ基（トリメチルアンモニウム基、Ｍｅ3Ｎ+−）等が挙げられる。なお、３級アミノ基及び４級アミノ基は、それぞれ、ジアルキル置換アミノ基及びトリアルキル置換アミノ基ともいう。基材への化学的な固定が容易であり、高い吸着容量が得られるという観点からは、アニオン交換基としてはＤＥＡ及びＱが好ましく、ＤＥＡがより好ましい。
【００４２】
基材にグラフト鎖を導入する際、基材は、放射線照射により活性化される。基材にラジカルを生成させるためにはいかなる手段も採用しうるが、基材に電離性放射線を照射すると、基材全体に均一なラジカルが生成するため、好適である。電離性放射線の種類としては、γ線、電子線、β線、及び中性子線等が利用できるが、工業規模での実施には電子線又はγ線が好ましい。電離性放射線は、コバルト６０、ストロンチウム９０、及びセシウム１３７等の放射性同位体から、又はＸ線撮影装置、電子線加速器及び紫外線照射装置等により得られる。
【００４３】
電離性放射線の照射線量は、１ｋＧｙ以上１０００ｋＧｙ以下が好ましく、より好ましくは２ｋＧｙ以上５００ｋＧｙ以下、さらに好ましくは５ｋＧｙ以上２００ｋＧｙ以下である。照射線量が１ｋＧｙ以上の場合、ラジカルが均一に生成しやすい傾向にある。また、基材の物理的強度の観点から、照射線量が１０００ｋＧｙ以下であるとよい。
【００４４】
電離性放射線の照射によるグラフト重合法には、一般に基材にラジカルを生成した後、次いでラジカルを反応性モノマーと接触させる前照射法と、基材を反応性モノマーと接触させた状態で基材にラジカルを生成させる同時照射法と、に大別される。実施の形態においては、いかなる方法も適用しうるが、オリゴマーの生成が少ない前照射法が好ましい。ここでいうオリゴマーとは、遊離オリゴマーのことを指す。遊離オリゴマーはグラフト鎖中には取り込まれないため、生成されないことが好ましい。
【００４５】
基材上にグラフト重合される反応性モノマーは、イオン交換基を有する反応性モノマーであってもよいし、「イオン交換基導入前駆体」を有する反応性モノマーであってもよい。「イオン交換基導入前駆体」を有する反応性モノマーを使用する場合、反応性モノマーを共重合した後、イオン交換基導入前駆体をイオン交換基に変換する。
【００４６】
ここでいう、「イオン交換基導入前駆体」とは、イオン交換基を付与しうる官能基のことをいい、例えばエポキシ基等が挙げられるが、これに限定されるものではない。「イオン交換基導入前駆体」を有する反応性モノマーとは、イオン交換基を付与しうる官能基を有する反応性モノマーのことをいう。また、「イオン交換基導入前駆体」は「イオン交換基の前駆体」を含みうる。「イオン交換基の前駆体」とは、例えばイオン交換基に保護基が付いたものである。「イオン交換基の前駆体」を有する反応性モノマーとしては、フェニルビニルスルホネート等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
強カチオン基を有する反応性モノマーの例としては、スルホン酸を有するポリマーの構成単位である（メタ）アクリルアミドアルキルスルホン酸、ビニルスルホン酸、アクリルアミドｔ−ブチルスルホン酸、スチレンスルホン酸、及びそれらの金属塩等が挙げられる。
【００４８】
弱カチオン基を有する反応性モノマーの例としては、アクリル酸、２−アクリロキシエチルコハク酸、２−アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、２−アクリロイロキシエチルフタル酸、メタクリル酸、２−メタクリロキシエチルコハク酸、２−メタクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、２−メタクリロイロキシエチルフタル酸、２−ビニル安息香酸、３−ビニル安息香酸、４−ビニル安息香酸、及びそれらの金属塩等が挙げられる。
【００４９】
アニオン基を有する反応性モノマーの例としては、２−（ジメチルアミノ）エチルアクリレート、２−（ジエチルアミノ）エチルアクリレート、２−（ジメチルアミノ）エチルアクリレート、及び２−（ジエチルアミノ）エチルアクリレート等が挙げられる。
【００５０】
イオン交換基導入前駆体を有する反応性モノマーの例としては、グリシジルメタクリレート、グリシジルエーテル、スチレン、クロロメチルスチレン、アクリロニトリル、アクロレイン、及びビニルベンジル等が挙げられる。
【００５１】
イオン交換基導入前駆体を有する反応性モノマーがグリシジルメタクリレートの場合、基材上でグリシジルメタクリレートを重合してグラフト鎖を形成した後、亜硫酸ナトリウムと反応させることにより、グリシジルメタクリレートのエポキシ基の一部又は全部をスルホン酸基に変換することができる。また、基材上でグリシジルメタクリレートを重合してグラフト鎖を形成した後、ジエチルアミンと反応させることにより、グリシジルメタクリレートのエポキシ基の一部又は全部をアミノ基に変換することができる。
【００５２】
共重合する際、反応性モノマーは、エマルジョン化されている。「エマルジョン」とは、貧溶媒に対して不溶性である反応性モノマー液の小滴が貧溶媒中に分散した系をいう。反応性モノマー液の小滴の大きさは、特に限定されない。実施の形態に係るエマルジョンは、数ｎｍ以上数十ｎｍ以下程度のマイクロエマルジョン、及び１ｎｍ程度のナノエマルジョンも含む。実施の形態に係るエマルジョンは、界面活性剤の添加により、貧溶媒と、反応性モノマー液と、の界面張力を低下させて、見かけ上一様に混ざり合った状態の系も含む。例えば、大気下、窒素雰囲気下、あるいは減圧下で、基材をエマルジョン中に浸漬することにより、基材上で反応性モノマーが共重合する。
【００５３】
反応性モノマーの貧溶媒は、反応性モノマーをエマルジョン化できるものであれば特に限定されない。貧溶媒の例としては、イオン交換水、純水、及び超純水等の水系溶媒が挙げられる。
【００５４】
反応性モノマーをエマルジョン化する際に用いられる界面活性剤の例としては、陰イオン系界面活性剤、陽イオン系界面活性剤、両性イオン系界面活性剤、及び非イオン系界面活性剤、並びにこれらの混合物等が挙げられる。
【００５５】
陰イオン系界面活性剤の例としては、アルキルベンゼン系界面活性剤、アルコール系界面活性剤、オレフィン系界面活性剤、リン酸系界面活性剤、及びアミド系界面活性剤等が挙げられ、より具体的には、ドデシル硫酸ナトリウムが挙げられる。陽イオン系界面活性剤の例としては、オクタデシルアミン酢酸塩、及びトリメチルアンモニウムクロライド等が挙げられる。両性イオン系界面活性剤の例としては、アンヒトール（登録商標、花王株式会社）等が挙げられる。非イオン系界面活性剤の例としては、エトキシル化脂肪アルコール、及び脂肪酸エステル等が挙げられ、より具体的には、Ｔｗｅｅｎ  ２０、及びＴｗｅｅｎ  ８０等が挙げられる。
【００５６】
界面活性剤の濃度は、例えば、溶媒の全容積を基準として、０．１％以上１０％以下である。ただし、界面活性剤の濃度は、特に限定はなく、反応性モノマーの種類、濃度に依存して、適宜決定することができる。
【００５７】
界面活性剤を使用することにより、貧溶媒に対して不溶性の反応性モノマーの分散を促進することができる。エマルジョンの外観は、分散相の液滴の大きさに依存して種々変化するが、一般的には、乳濁状態であり、マイクロエマルジョンからナノエマルジョンへと液滴の大きさが小さくなるにつれ、透明を呈するようになる。
【００５８】
エマルジョン化した反応性モノマーのグラフト重合条件については、反応性モノマーの反応性にもよるが、温度は、例えば１０℃以上６０℃以下、好ましくは２０℃以上６０℃以下である。反応時間は、例えば１分以上２時間以下、好ましくは５分以上６０分以下である。エマルジョンにおける反応性モノマーの容積濃度は、例えば１％以上３０％以下、好ましくは２％以上２０％以下である。
【００５９】
実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体のグラフト鎖の結合率（グラフト率）は、吸着容量等の観点から２０％以上が好ましく、より好ましくは２５％以上、さらに好ましくは３０％以上である。また、力学的に安定な強度を確保するという観点から、好ましくは３００％以下、より好ましくは２００％以下、さらに好ましくは１５０％以下、特に好ましくは１２０％以下である。しかし、好適なグラフト率は用いる基材や導入するモノマー単位に依存するため、適宜最適化を行う必要があり、上記範囲に限定されない。グラフト率は下記（１）式によって算出される。
ｄg（％）＝（ｗ1−ｗ0）／ｗ0×１００      （１）
ここで、ｗ0はグラフト鎖が導入される前の基材の質量、ｗ1はグラフト鎖が導入された後の基材の質量である。
【００６０】
エマルジョン化していない反応性モノマーは、基材内部の非晶部に入り込んでグラフト重合され、基材内部にもグラフト鎖が形成されると考えられる。しかし、グラフト鎖で吸着する吸着対象分子は、基材内部の非晶部に入れる大きさではない。そのため、基材内部に形成されたグラフト鎖は、吸着対象分子の吸着に利用できない。これに対し、エマルジョン化された反応性モノマーは、ミセルであるため、基材内部の非晶部に入り込まず、基材内部にはほとんどグラフト鎖が形成されないと考えられる。そのため、基材上に多くのグラフト鎖が形成され、グラフト鎖を吸着対象分子の吸着に有効に利用することが可能である。また、基材が繊維である場合、繊維の表面積は小さい。しかし、繊維にエマルジョン化した反応性モノマーをグラフト重合して作製されるイオン交換クロマトグラフィー担体の表面積は大きくなる。そのため、多数の吸着対象分子を吸着することが可能である。
【００６１】
基材内部に形成されるグラフト鎖は、内部グラフト鎖、あるいはポリマールーツと呼ばれる。基材上に形成されるグラフト鎖は、表面グラフト鎖、あるいはポリマーブラシと呼ばれる。実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体において、グラフト鎖全体に占める表面グラフト鎖の割合は、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上である。表面グラフト鎖の割合は、エポキシ基等のイオン交換基導入前駆体のイオン交換基へのモル転化率と、イオン交換基の吸着対象分子の飽和吸着量と、の関係を示すグラフを作成して現れる変曲点におけるモル転化率と一致する。好ましくは、実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体において、基材内部に、グラフト鎖が実質的に形成されない。
【００６２】
図１は、エマルジョン化した反応性ポリマーをグラフト重合する前のポリエチレン基材の電子顕微鏡写真を示しており、図２は、エマルジョン化した反応性ポリマーをグラフト重合した後の基材（イオン交換クロマトグラフィー担体）の電子顕微鏡写真を示している。図１及び図２に示すように、エマルジョン化した反応性ポリマーをグラフト重合したことにより、実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体の断面の外周は、グラフト重合する前の基材の断面の外周より大きくなり、かつ、実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体の断面積は、グラフト重合する前の基材の断面積より大きくなる。
【００６３】
そのため、実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体においては、下記（２）式で与えられるＣの値が、１．０５以上、好ましくは１．０８以上、より好ましくは１．１以上、さらに好ましくは１．１２以上である。
Ｃ＝Ａ／√Ｂ      （２）
ここで、Ａは、イオン交換クロマトグラフィー担体の断面の外周／基材の断面の外周を表している。また、Ｂは、イオン交換クロマトグラフィー担体の断面積／基材の断面積を表している。
【００６４】
実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体を、裁断し、又は成型することによって、クロマトグラフィーカラムに充填することにより、タンパク質精製用イオン交換クロマトグラフィーカラムを作製してもよい。
【００６５】
実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体を、裁断し、又は成型することによって、フィルターカートリッジに充填することにより、タンパク質精製用イオン交換クロマトグラフィーフィルターモジュールを作製してもよい。
【００６６】
実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体のモノフィラメント又はマルチフィラメントを、円筒状コアに巻きつけることにより、タンパク質精製用イオン交換クロマトグラフィーワインドフィルターモジュールを作製してもよい。円筒状コアは、多孔質であってもよい。また、担体を円筒状コアに巻きつけた後、円筒状コアを抜いてもよい。
【００６７】
実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体によれば、高流速域でのタンパク質の吸着及び分離性能と、目詰まりしにくい性能と、を両立することが可能である。また、実施の形態に係るイオン交換クロマトグラフィー担体は、タンパク質の高吸着容量を有し、湿潤強度に優れる。
【実施例】
【００６８】
以下に、実施の形態を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、これらは実施の形態を何ら限定するものではない。
【００６９】
（実施例１）
実質的に非多孔質の合成ポリマーからなる基材として、繊維径１２ｕｍの高密度ポリエチレン繊維（以下において、「ポリエチレン繊維基材」という。）を用意した。
【００７０】
１ｇのポリエチレン繊維基材を、溶液導入口を取り付けた密閉容器に入れ、密閉容器内の空気を窒素で置換した。その後、ドライアイスで冷却しながら、１００ｋＧｙの電子線をポリエチレン繊維基材に照射し、ラジカルを発生させた。
【００７１】
上記の密閉容器とは別の容器中において、貧溶媒としての純水に窒素を３０分間バブリングし、脱酸素を行った。さらに、純粋にＴｗｅｅｎ２０を加え５分間撹拌し、その後、反応性モノマーとしてグリシジルメタクリレートを加えて撹拌し、エマルジョンを形成させた。グリシジルメタクリレートは、アニオン交換基導入前駆体としてのエポキシ基を有する。純水と、Ｔｗｅｅｎ２０と、グリシジルメタクリレートと、は、容積比で、９４．５：０．５：５になるように混合した。調製したエマルジョン溶液を４０℃の温浴中で撹拌しながら３０分間バブリングした。
【００７２】
ポリエチレン繊維基材の入った密閉容器の溶液導入口からエマルジョン溶液を１００ｍＬ導入し、４０℃で、ポリエチレン繊維基材と、エマルジョンと、を反応させ、ポリエチレン繊維基材に共有結合しているグラフト鎖を形成させた。反応時間は、目的のグラフト率により、適宜調整した。その後、グラフト鎖が導入されたポリエチレン繊維基材をメタノールにより洗浄し、真空乾燥して、グラフト鎖が導入されたポリエチレン繊維基材の質量を測定し、上記（１）式を用いてグラフト率を算出した。その結果、図３に示すように、それぞれグラフト率が６％、８％、１６％、２２％、４３％、６２％、６９％、１０９％、及び１６１％のグラフト鎖が導入されたポリエチレン繊維基材が得られた。
【００７３】
次に、グリシジルメタクリレートをグラフト重合したポリエチレン繊維基材を、５０ｖ／ｖ％のジエチルアミン水溶液に４０℃で１５時間浸漬し、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基にアニオン交換基としてのジエチルアミノ基を導入して、実施例１に係るアニオン交換クロマトグラフィー担体を得た。その後、実施例１に係るアニオン交換クロマトグラフィー担体をメタノールで洗浄した。
【００７４】
下記（３）式を用いて、ポリエチレン繊維基材の質量変化から、ジエチルアミノ基を導入した際のモル転化率Ｃ1を算出したところ、全て９０％以上であった。
Ｃ1（％）＝１００［（Ｗ2−Ｗ1）／７３］／［（Ｗ1−Ｗ0）／１４２］      （３）
ここで、Ｗ0、Ｗ1、及びＷ2は、それぞれ、グラフト重合前のポリエチレン繊維基材の質量、グラフト重合後のポリエチレン繊維基材の質量、ジエチルアミノ基導入後のポリエチレン繊維基材の質量を表す。７３及び１４２は、それぞれ、ジエチルアミン、及びグリシジルメタクリレートの分子量である。（Ｗ2−Ｗ1）／７３は、ジエチルアミノ基のモル数を表す。
【００７５】
次に、実施例１に係るアニオン交換クロマトグラフィー担体を大過剰量の２．０ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液、ｐＨ８．０）に浸漬し、室温で２０時間振とうした。振とう浸漬後、ＢＳＡ溶液の吸光度（２８０ｎｍ）から、実施例１に係るアニオン交換クロマトグラフィー担体の質量あたりのＢＳＡの静的結合容量（ＳＢＣ）を、グラフト率毎に測定した。静的結合容量とは、担体が分子を吸着できる上限の量を表す。結果を、図３に示す。実施例１に係るアニオン交換クロマトグラフィー担体は、高い静的結合容量を示した。
【００７６】
（実施例２）
実施例１に係るグラフト率が６２％のアニオン交換クロマトグラフィー担体を、体積が０．４ｍＬ、密度が０．３０ｇ／ｍＬになるようにカラムに充填し、２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化して、実施例２に係るタンパク質精製用アニオン交換クロマトグラフィーカラムを作製した。その後、１．０ｇ／ＬのＢＳＡ溶液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液、ｐＨ８．０）を複数に設定された流速のそれぞれでカラムに通液し、１０％動的結合容量（ＤＢＣ）を測定した。なお、動的結合容量とは、カラムに分子を含む溶液を流して、カラム中の担体で分子を回収できる程度を表す。動的結合容量が大きいカラムでは、分子を効率よく担体に吸着することが可能である。
【００７７】
また、ジエチルアミン（ＤＥＡＥ）で修飾されたセファロースビーズ（製品名ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を内径５．５．ｍＬのカラムに０．４０ｍＬ充填し、実施例２の比較例に係るアニオン交換クロマトグラフィーカラムを作製した。その後、実施例２と同条件でＢＳＡ溶液をカラムに通液し、１０％動的結合容量を測定した。
【００７８】
結果を、図４に結果を示す。流速は、アニオン交換クロマトグラフィー担体の何倍のタンパク質溶液量を１分間に流したかで示されている。比較例と比較して、実施例２に係るタンパク質精製用アニオン交換クロマトグラフィーカラムは、高流速領域において高い動的結合容量を示した。
【００７９】
（実施例３）
実質的に非多孔質の合成ポリマーからなる基材として、繊維径２５ｕｍのナイロン６繊維（以下において、「ナイロン繊維基材」という。）を用意した。ナイロン繊維基材を用いた以外は実施例１と同様にグリシジルメタクリレートをグラフト重合したナイロン繊維基材を、質量比で、亜硫酸ナトリウム／イソプロピルアルコール／水＝１０／１５／７５の反応溶液に浸漬して、８０℃で３０時間から１２０時間反応させ、エポキシ基にカチオン交換基としてのスルホン酸基を導入し、実施例３に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体を得た。その後、実施例３に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体を水及びメタノールで洗浄した。
【００８０】
実施例３に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体を０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液に浸漬し、全てのスルホン酸基をナトリウム塩に変換した。その後、下記（４）式を用いて、ナイロン繊維基材の質量変化から、スルホン酸基を導入した際のモル転化率Ｃ2を算出したところ、６５％から７９％であった。
Ｃ2（％）＝１００［（Ｗ2−Ｗ1）／１０４］／［（Ｗ1−Ｗ0）／１４２］      （４）
ここで、Ｗ0、Ｗ1、及びＷ2は、それぞれ、グラフト重合前のナイロン繊維基材の質量、グラフト重合後のナイロン繊維基材の質量、スルホン酸基導入及びナトリウム塩化後のナイロン繊維基材の質量を表す。１０４は、スルホン化、及びスルホン酸基のナトリウム塩化に伴う分子量変化である。１４２は、グリシジルメタクリレートの分子量である。（Ｗ2−Ｗ1）／１０４は、スルホン酸基のモル数を表す。
【００８１】
実施例３に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体を、体積が０．３３ｍＬ、密度が０．３０ｇ／ｍＬになるようにカラムに充填し、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＨＣＯ3−ＮａＯＨ（ｐＨ９．０）溶液で平衡化して、実施例３に係るタンパク質精製用カチオン交換クロマトグラフィーカラムを作製した。
【００８２】
また、実施例３の比較例に係るタンパク質精製用カチオン交換クロマトグラフィーカラムを以下の手順で作製した。
【００８３】
１ｇのナイロン繊維基材を、溶液導入口を取り付けた密閉容器に入れ、密閉容器内の空気を窒素で置換した。その後、ドライアイスで冷却しながら、１００ｋＧｙの電子線を繊維基材に照射し、ラジカルを発生させた。
【００８４】
上記の密閉容器とは別の容器中において、グリシジルメタクリレートと、良溶媒としてのメタノールと、を、５：９５の容積比で混合した。調製したエマルジョン化していない溶液を４０℃の温浴中で３０分間バブリングした。
【００８５】
ナイロン繊維基材の入った密閉容器の溶液導入口から調製した溶液を１００ｍＬ導入し、４０℃で、ナイロン繊維基材と、溶液と、を反応させ、グラフト重合により、ナイロン繊維基材に共有結合しているグラフト鎖を形成させた。反応時間は、目的のグラフト率により、適宜調整した。その後、上記と同様に、エポキシ基にカチオン交換基としてのスルホン酸基を導入して、実施例３の比較例に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体を得た。実施例３と同様に、実施例３の比較例に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体をカラムに充填し、実施例３の比較例に係るタンパク質精製用カチオン交換クロマトグラフィーカラムを作製した。
【００８６】
その後、１．０ｇ／Ｌのリゾチーム溶液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３−ＮａＯＨ溶液、ｐＨ９．０）を複数に設定された流速のそれぞれで、実施例及び比較例に係るカラムのそれぞれに通液し、１０％動的結合容量を測定した。結果を、図５に結果を示す。なお、図５に示す結果は、スルホン酸基導入時に３０時間反応させたものである。比較例と比較して、実施例３に係るタンパク質精製用カチオン交換クロマトグラフィーカラムは、高い動的結合容量を示した。
【００８７】
さらに、スルホン酸基導入反応の反応時間を１２０時間に延ばしたものでは、１０％ＤＢＣが向上した。実施例３に係る、グラフト率２５８％カチオン交換クロマトグラフィー担体では、６２ｍｇ／ｍＬであった。スルホン酸基導入の反応時間を延ばしても、スルホン酸基へのモル転化率は向上しないが、高温で長時間保持することにより、タンパク質の吸着に適したグラフト鎖の状態になったためであると考えられる。一方、実施例３の比較例に係る（均一グラフト重合による）カチオン交換クロマトグラフィー担体（グラフト率２５８％）についても、スルホン酸基導入時間を１２０時間に延ばすことにより、１０％ＤＢＣは４３ｍｇ／ｍＬと向上したが、実施例３に係るカチオン交換体には及ばなかった。
【００８８】
上記のようにリゾチーム溶液をカラムに通液した後、さらにリゾチーム溶液を実施例３及び比較例に係るカラムのそれぞれに通液し、リゾチームを担体に飽和吸着させた。その後、カラムを、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＨＣＯ3−ＮａＯＨ（ｐＨ９．０）溶液で洗浄した。洗浄後、１ｍｏｌ／Ｌの濃度でＮａＣｌを含む、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＨＣＯ3−ＮａＯＨ（ｐＨ９．０）溶液でリゾチームを溶出し、溶出率を求めた。
【００８９】
その結果、比較例に係るカチオン交換クロマトグラフィーカラムは、吸着したリゾチームを９０％以上溶出するのに繊維質量の５００倍以上、９５％以上溶出するのに繊維質量の６０６倍の溶液が必要であった。これに対し、実施例３に係るカチオン交換クロマトグラフィーカラムは、吸着したリゾチームを９０％以上溶出するのに繊維質量の４８倍、９５％以上溶出するのに繊維質量の２００倍の溶液のみ必要であった。したがって、実施例３に係るカチオン交換クロマトグラフィーカラムは、吸着した分子の溶出が容易であることが示された。
【００９０】
また、実施例３に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体（グラフト率８１％）、実施例３の比較例に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体（グラフト率８７％）、及びそれらの基材について、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）により観察した。さらに、スルホン酸基に含まれる硫黄と、スルホン酸基に吸着させた銅と、を、走査型電子顕微鏡／エネルギー分散型Ｘ線分光法（ＳＥＭ−ＥＤＸ）で観察した。なお、銅は、４０ｍｍｏｌ／ＬのＣｕＳＯ4溶液（５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．７））を用いて、スルホン酸基に吸着させた。
【００９１】
結果を図６に示す。実施例３に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体においては、基材上にグラフト鎖が分布し、基材内部にはグラフト鎖が存在していないことが確認された。これに対し、実施例３の比較例に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体においては、基材の内部にも多くグラフト鎖が形成されていることが確認された。
【００９２】
実施例３に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体（グラフト率８１％）において、上記（２）式で与えられるＣの値は１．１３であった。なお、イオン交換クロマトグラフィー担体及び基材の外周及び断面積は、ＩｍａｇｅＪを用い、フリーハンドで縁を外部から描くことにより算出した。
【００９３】
実施例３の比較例に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体（グラフト率８７％）においては、図６に示すように、基材とカチオン交換クロマトグラフィー担体がほぼ相似であり、上記（２）式で与えられるＣの値はほぼ１．０５未満であった。
【００９４】
（実施例４）
ナイロン繊維基材を用いた以外は実施例１と同様にグリシジルメタクリレートをグラフト重合したナイロン繊維基材を、水酸化ナトリウムでｐＨ１０に調整した０．５ｍｏｌ／Ｌのトリメチルアミン水溶液に浸漬し、４０℃で１０分から１２０分反応させ、エポキシ基にアニオン交換基としてのトリメチルアミンを導入して、実施例４に係るアニオン交換クロマトグラフィー担体を得た。反応時間は、目的の反応率に合わせて適宜調節した。その後、残存エポキシ基を開環させるために、担体を０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸に浸漬し、８０℃で３時間反応させた。反応後、水及びメタノールで担体を洗浄した。
【００９５】
また、実施例３の比較例と同様に、エマルジョン化していない反応性モノマーを用いてグリシジルメタクリレートをグラフト重合したナイロン繊維基材に、上記と同様にトリメチルアミンを導入して、実施例４の比較例に係るアニオン交換クロマトグラフィー担体を得た。
【００９６】
導入されたトリメチルアミンのモル数を、以下のように算出した。実施例４及び比較例に係るアニオン交換クロマトグラフィー担体のそれぞれを１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液に３０分間振とう浸漬し、トリメチルアミンのカウンターアニオンを水酸化物イオンにした。次に、洗浄液が中性になるまで水で洗浄した後、実施例４及び比較例に係るアニオン交換クロマトグラフィー担体のそれぞれを１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液に３０分間振とう浸漬し、カウンターアニオンを塩素アニオンに変換し、水酸化物イオンを遊離させた。
【００９７】
さらに、実施例４及び比較例に係るアニオン交換クロマトグラフィー担体のそれぞれを１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液で４回洗浄した。その後、振とう浸漬及び洗浄に用いた塩化ナトリウム水溶液を全て回収し、０．０１ｍｏｌ／Ｌ塩酸で滴定して、水酸化物イオンのモル数を定量した。定量した水酸化物イオンのモル数は、トリメチルアミンのモル数に相当する。定量されたトリメチルアミンのモル数と、下記（５）式と、を用いて、トリメチルアミンを導入した際のモル転化率Ｃ3を担体ごとに算出した。
Ｃ3（％）＝１００＊Ｍ1／Ｍ2      （５）
ここで、Ｍ1は、導入されたトリメチルアミンのモル数を表し、Ｍ2は、トリメチルアミン導入前のエポキシ基のモル数を表す。
【００９８】
次に、担体のそれぞれを０．５ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液に３０分振とう浸漬し、さらに２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に３０分振とう浸漬して平衡化した。その後、担体のそれぞれを１ｇ／Ｌの濃度でＢＳＡを含むＢＳＡ溶液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）に６０ｒｐｍ、２５℃で１２時間振とう浸漬して、担体それぞれのＢＳＡの飽和結合用量を求めた。
【００９９】
担体のモル転化率と、ＢＳＡの飽和結合用量と、の関係を図７に示す。上述したように、図７に示すグラフにおいて、変曲点におけるモル転化率は、表面グラフト鎖の割合に一致する。比較例に係るアニオン交換クロマトグラフィー担体における表面グラフト鎖の割合は、約５％であった。これに対し、実施例４に係るアニオン交換クロマトグラフィー担体においては、明確な変曲点が現れなかったことから、表面グラフト鎖の割合は、少なくとも８１％であった。以上の結果は、反応性モノマーをエマルジョン化することにより、表面グラフト鎖の割合が増えることを示していた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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