(57)【要約】      （修正有）【課題】日本山ニンジンから抽出される抽出物を有効に活用する、ヘアケア製品の生産方法、毛母細胞増殖促進剤等の提供。【解決手段】構造式が（１２）式で表されるヒュウガニンＥの単離化合物を有効成分として含有する毛母細胞増殖促進剤。2018024687.tif 000014【選択図】図１
2018024687.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式が（１２）式で表されるヒュウガニンＥの単離化合物を有効成分として含有する毛母細胞増殖促進剤。
【化１】
2018024687.tif 000009
【請求項２】
構造式が（３）式で表される５-ヒドロキシメチル-２-フラルデヒド又は（１３）式で表されるβ―アミリンの単離化合物を有効成分としてさらに含有する、請求項１記載の毛母細胞増殖促進剤。
【化２】
2018024687.tif 000010
【請求項３】
構造式が(１７）式で表されるイソプテリキシンの単離化合物を有効成分として含有する毛乳頭細胞増殖促進剤。
【化３】
2018024687.tif 000011
【請求項４】
構造式が（３）式で表される５-ヒドロキシメチル-２-フラルデヒド又は（１３）式で表されるβ―アミリンの単離化合物を有効成分としてさらに含有する、請求項３記載の毛乳頭細胞増殖促進剤。
【化４】
2018024687.tif 000012
【請求項５】
未精製の山ニンジン抽出物を有効成分として含有するのではなく、構造式が(１７）式で表されるイソプテリキシンを有効成分として含有する毛乳頭細胞増殖促進剤。
【化５】
2018024687.tif 000013
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘアケア製品の生産方法、毛母細胞増殖促進剤、毛乳頭細胞増殖促進剤及びメラニン生成促進剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
いわゆる日本山ニンジンと言われるセリ科植物には、イヌトウキ（犬当帰：Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｓｈｉｋｏｋｉａｎａ）とヒュウガトウキ（日向当帰：Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｔｅｎｕｉｓｅｃｔａ  ｖａｒ  ｆｕｒｃｉｊｕｇａ）という２種類の学名のシシウド属に属する植物がある。日本山ニンジンは、イヌトウキ及びヒュウガトウキとこれらの近似植物の総称と言われることもある。総称と捉えれば、イヌトウキとヒュウガトウキの他にも、トウキ、ホッカイトウキ、セイヨウトウキ、カラトウキ、シシウド、アシタバという同属の学名のものが含まれる。
【０００３】
イヌトウキは、一般的には、肝障害、アレルギー、炎症、糖尿病や高血圧の治療に有効であるといわれている（例えば、非特許文献１参照）が、本格的には研究されていない。他方、ヒュウガトウキについては、種々の研究により、抽出物の生理活性が明らかにされてきている（例えば、非特許文献２及び３参照。）。なお、ヒュウガトウキは、平成１４年１１月に厚生労働省から医薬品（生薬）の認定を受けている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Taniguchi  M、外４名著，The  115th  Annuaｌ  Meeting  of  the  Pharmaceuticaｌ  Society  of  Japan，Sendai，March  1995，Abstract  of  Papers  II，p.194．
【非特許文献２】松下洋一、外３名著，ヒュウガトウキ（Angeｌica  furcijuga  Kitagawa）葉および茎の分離・分析，Memoirs  of  the  Facuｌty  of  Engineering，Miyazaki  University，38:87-90，2009-09-30．
【非特許文献３】藤原博士、外６名著，ヒュウガトウキ（Angeｌica furcijuga）のメラニン色素産生能への影響，Jpn  Phaimacok  Ther(薬理と治療)，voｌ.38，no.12，2010．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、日本山ニンジンからの抽出物の生理活性は研究の余地が残されており、薬理効果等について、氷山の一角を明らかにしたにすぎない。そのため、日本山ニンジンからの抽出物を用いた製品において、バリエーションの拡大や有効成分の特定といったさらなる研究開発が期待されている。
【０００６】
ゆえに、本発明は、日本山ニンジンから抽出される抽出物を有効に活用する、ヘアケア製品の生産方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の観点は、植物由来の成分を有効成分として含有するヘアケア製品の生産方法であって、日本山ニンジンから前記有効成分を抽出する抽出ステップを含み、前記有効成分は、毛母細胞増殖促進作用及び/又は毛乳頭細胞増殖促進作用による発毛作用の有効成分である、ヘアケア製品の生産方法である。
【０００８】
本発明の第２の観点は、第１の観点のヘアケア製品の生産方法であって、前記有効成分として、メラニン生成促進作用による抗白毛の有効成分をさらに含む、ヘアケア製品の生産方法である。なお、本願では「抗白毛」を「白毛化の抑制及び防止」という意味で用いている。
【０００９】
本発明の第３の観点は、第１の観点のヘアケア製品の生産方法であって、前記抽出ステップにおいて、水を抽出溶媒として用いる、ヘアケア製品の生産方法である。
【００１０】
本発明の第４の観点は、第１から第３の観点のいずれかのヘアケア製品の生産方法であって、前記有効成分は、毛母細胞増殖促進作用の有効成分であり、構造式が（１）式で表されるオレイン酸、（２）式で表されるフマル酸、（３）式で表される５-ヒドロキシメチル-２-フラルデヒド、（４）式で表されるアデノシン、（５）式で表されるクロロゲン酸メチルエステル、（６）式で表されるクロロゲン酸、（７）式で表されるケンフェロール、（８）式で表されるルテオリン、（９）式で表されるケルセチン、（１０）式で表されるベルガプテン、（１１）式で表されるイソエポキシプテリキシン、（１２）式で表されるヒュウガニンＥ又は（１３）式で表されるβ―アミリンである、ヘアケア製品の生産方法である。
【化１】
2018024687.tif 000003
【００１１】
本発明の第５の観点は、第１から第３の観点のいずれかのヘアケア製品の生産方法であって、前記有効成分は、毛乳頭細胞増殖促進作用の有効成分であり、構造式が（１）式で表されるオレイン酸、（２）式で表されるフマル酸、（３）式で表される５-ヒドロキシメチル-２-フラルデヒド、（４）式で表されるアデノシン、（５）式で表されるクロロゲン酸メチルエステル、（６）式で表されるクロロゲン酸、（７）式で表されるケンフェロール、（８）式で表されるルテオリン、（９）式で表されるケルセチン、（１０）式で表されるベルガプテン、（１１）式で表されるイソエポキシプテリキシン、（１２）式で表されるヒュウガニンＥ、（１３）式で表されるβ―アミリン、（１４）式で表されるケンフェロールルテノシド、（１５）式で表されるケンフェロールグルコシド、（１６）式で表されるソラレン又は（１７）式で表されるイソプテリキシンである、ヘアケア製品の生産方法である。
【化２】
2018024687.tif 000004
【００１２】
本発明の第６の観点は、第２の観点のヘアケア製品の生産方法であって、メラニン生成促進作用による抗白毛の前記有効成分は、構造式が（５）式で表されるクロロゲン酸メチルエステル、（６）式で表されるクロロゲン酸又は（１６）式で表されるソラレンである、ヘアケア製品の生産方法である。
【化３】
2018024687.tif 000005
【００１３】
本発明の第７の観点は、構造式が（１）式で表されるオレイン酸、（２）式で表されるフマル酸、（３）式で表される５-ヒドロキシメチル-２-フラルデヒド、（４）式で表されるアデノシン、（５）式で表されるクロロゲン酸メチルエステル、（６）式で表されるクロロゲン酸、（７）式で表されるケンフェロール、（８）式で表されるルテオリン、（９）式で表されるケルセチン、（１０）式で表されるベルガプテン、（１１）式で表されるイソエポキシプテリキシン、（１２）式で表されるヒュウガニンＥ又は（１３）式で表されるβ―アミリンを有効成分として含有する毛母細胞増殖促進剤である。
【化４】
2018024687.tif 000006
【００１４】
本発明の第８の観点は、構造式が（１）式で表されるオレイン酸、（２）式で表されるフマル酸、（３）式で表される５-ヒドロキシメチル-２-フラルデヒド、（４）式で表されるアデノシン、（５）式で表されるクロロゲン酸メチルエステル、（６）式で表されるクロロゲン酸、（７）式で表されるケンフェロール、（８）式で表されるルテオリン、（９）式で表されるケルセチン、（１０）式で表されるベルガプテン、（１１）式で表されるイソエポキシプテリキシン、（１２）式で表されるヒュウガニンＥ、（１３）式で表されるβ―アミリン、（１４）式で表されるケンフェロールルテノシド、（１５）式で表されるケンフェロールグルコシド、（１６）式で表されるソラレン又は（１７）式で表されるイソプテリキシンを有効成分として含有する毛乳頭細胞増殖促進剤である。
【化５】
2018024687.tif 000007
【００１５】
本発明の第９の観点は、構造式が（５）式で表されるクロロゲン酸メチルエステル、（６）式で表されるクロロゲン酸又は（１６）式で表されるソラレンを有効成分として含有するメラニン生成促進剤である。
【化６】
2018024687.tif 000008
【発明の効果】
【００１６】
本発明の各観点によれば、日本山ニンジンから、毛母細胞増殖促進作用及び/又は毛乳頭細胞増殖促進作用による発毛作用を有する成分を抽出し、それらを有効成分として含有するヘアケア製品等を提供可能となる。
【００１７】
日本山ニンジンに、毛母細胞増殖促進作用及び/又は毛乳頭細胞増殖促進作用を有する成分が含有されていることは、本発明の発明者によって初めて明らかにされたことである。
【００１８】
本発明の第２の観点によれば、メラニン生成促進作用による抗白毛の有効成分をさらに含むヘアケア製品等を提供可能となる。
【００１９】
本発明の第３の観点によれば、日本山ニンジンから毛母細胞増殖促進作用及び/又は毛乳頭細胞増殖促進作用を有する成分を効率よく抽出することが可能となる。なお、水抽出物中の全ての有効成分の構造等を直接的に特定するためには、多くの時間を要する見通しである。
【００２０】
本発明の第４の観点によれば、日本山ニンジンから抽出した、オレイン酸、フマル酸、５-ヒドロキシメチル-２-フラルデヒド、アデノシン、クロロゲン酸メチルエステル、クロロゲン酸、ケンフェロール、ルテオリン、ケルセチン、ベルガプテン、イソエポキシプテリキシン、ヒュウガニンＥ又はβ―アミリンを毛母細胞増殖促進作用の有効成分として含有するヘアケア製品を提供することが可能となる。
【００２１】
ここで、オレイン酸、フマル酸、５-ヒドロキシメチル-２-フラルデヒド、アデノシン、クロロゲン酸メチルエステル、クロロゲン酸、ケンフェロール、ルテオリン、ケルセチン、ベルガプテン、イソエポキシプテリキシン、ヒュウガニンＥ及びβ―アミリンが毛母細胞増殖促進作用を有することは、本発明の発明者によって初めて明らかにされたことである。
【００２２】
特に、フマル酸、クロロゲン酸メチルエステル、クロロゲン酸、ルテオリン、ケルセチン、ベルガプテン、イソエポキシプテリキシン及びヒュウガニンＥを有効成分として用いた場合には、一般に脱毛症の外用薬に主成分として配合されているミノキシジルと同程度、又は、それ以上に強力な毛母細胞増殖促進作用を有するヘアケア製品を提供することが可能となる。
【００２３】
本発明の第５の観点によれば、日本山ニンジンから抽出した、オレイン酸、フマル酸、５-ヒドロキシメチル-２-フラルデヒド、アデノシン、クロロゲン酸メチルエステル、クロロゲン酸、ケンフェロール、ルテオリン、ケルセチン、ベルガプテン、イソエポキシプテリキシン、ヒュウガニンＥ、β―アミリン、ケンフェロールルテノシド、ケンフェロールグルコシド、ソラレン又はイソプテリキシンを毛乳頭細胞増殖促進作用の有効成分として含有するヘアケア製品を提供することが可能となる。
【００２４】
ここで、オレイン酸、フマル酸、５-ヒドロキシメチル-２-フラルデヒド、アデノシン、クロロゲン酸メチルエステル、クロロゲン酸、ケンフェロール、ルテオリン、ケルセチン、ベルガプテン、イソエポキシプテリキシン、ヒュウガニンＥ、β―アミリン、ケンフェロールルテノシド、ケンフェロールグルコシド、ソラレン及びイソプテリキシンが毛母細胞増殖促進作用を有することは、本発明の発明者によって初めて明らかにされたことである。
【００２５】
本発明の第６の観点によれば、毛母細胞増殖促進作用及び/又は毛乳頭細胞増殖促進作用による発毛作用の有効成分に加え、日本山ニンジンから抽出した、クロロゲン酸メチルエステル、クロロゲン酸又はソラレンをメラニン生成促進作用の有効成分として含有するヘアケア製品を提供することが可能となる。
【００２６】
ここで、クロロゲン酸メチルエステル、クロロゲン酸及びソラレンがメラニン生成促進作用を有することは、本発明の発明者によって初めて明らかにされたことである。
【００２７】
本発明の第７の観点によれば、日本山ニンジンから抽出した成分に限らず、オレイン酸、フマル酸、５-ヒドロキシメチル-２-フラルデヒド、アデノシン、クロロゲン酸メチルエステル、クロロゲン酸、ケンフェロール、ルテオリン、ケルセチン、ベルガプテン、イソエポキシプテリキシン、ヒュウガニンＥ又はβ―アミリンを有効成分として含有する毛母細胞増殖促進剤を提供することが可能となる。
【００２８】
本発明の第８の観点によれば、日本山ニンジンから抽出した成分に限らず、オレイン酸、フマル酸、５-ヒドロキシメチル-２-フラルデヒド、アデノシン、クロロゲン酸メチルエステル、クロロゲン酸、ケンフェロール、ルテオリン、ケルセチン、ベルガプテン、イソエポキシプテリキシン、ヒュウガニンＥ、β―アミリン、ケンフェロールルテノシド、ケンフェロールグルコシド、ソラレン又はイソプテリキシンを有効成分として含有する毛乳頭細胞増殖促進剤を提供することが可能となる。
【００２９】
本発明の第９の観点によれば、日本山ニンジンから抽出した成分に限らず、クロロゲン酸メチルエステル、クロロゲン酸又はソラレンを有効成分として含有するメラニン生成促進剤を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】日本山ニンジンからの抽出物及び単離物質による、ヒト皮膚角化細胞（ＨａＣａＴ細胞）の増殖促進作用を示す図である。
【図２】日本山ニンジンから抽出した単離物質の構造式を示す図である。
【図３】日本山ニンジンからの抽出物及び単離物質による、ヒト頭髪毛乳頭細胞（ＨＦＤＰＣ細胞）の増殖促進作用を示す図である。
【図４】イヌトウキからの単離物質（クマリン類）のメラニン産生促進／阻害作用を示す図である。
【図５】イヌトウキからの単離物質（フェノール類）のメラニン産生促進／阻害作用を示す図である。
【図６】イヌトウキからの単離物質（その化合物）のメラニン産生促進／阻害作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
毛根の下部には、毛の成長に関わる「毛球部」という部位がある。毛球部の底は凹んでおり、そこに「毛乳頭」と呼ばれる組織が入り込んでいる。この中には「毛乳頭細胞」が密に詰まり、毛の成長に使われる栄養分や酸素を運ぶ毛細血管が張り巡らされている。また、毛球部の内部には、毛乳頭を取り囲むように「毛母細胞」が存在しており、毛乳頭細胞から毛の成長や休止に関わる指令を受ける。毛母細胞が毛乳頭細胞から増殖・分化を促され、毛乳頭の毛細血管から栄養分を吸収しながら角化することで、毛は成長していく。
【００３２】
上記の通り、毛母細胞及び毛乳頭細胞は毛の成長に深く関与している。そのため、これらの細胞の増殖を促進することができれば、毛の成長が促進され、薄毛及び脱毛の改善、並びに、発毛促進が期待できる。
【００３３】
１．１  エタノール抽出物及び水抽出物の抽出（本願請求項における「抽出ステップの」一例）
日本山ニンジンの地上部２０ｇを１５０ｍｌのエタノールに浸漬し、常温で時々攪拌しながら一昼夜置いた後にろ過した。ロータリーエバポレーターを用いて、ろ液（エタノール抽出液）から溶媒を除去し、エタノール抽出物を得た。エタノール抽出物はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で任意の濃度に調製し、以下の実験に用いた。
【００３４】
また、日本山ニンジンの地上部２０ｇを１００ｍＬの水に浸漬し、先のエタノールと同様に抽出を行った。水抽出液は、凍結乾燥器ＴＡＩＴＥＣ（Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｅｒ）ＶＤ−２５０Ｒを用いて溶媒を除去した。
【００３５】
１．２  単離・同定方法
上記抽出方法で得られたエタノール抽出物溶液及び水抽出物溶液を、シリカゲルカラムを用いて、ヘキサン、酢酸エチル、メタノールでグラジエントをかけて複数に分画した。画分ごとにＮＭＲ測定を行い、既報の文献にて報告されているデータを比較することで、単離物質を同定した。
【００３６】
上記方法により日本山ニンジンから得られた抽出物又は単離物質について、毛母細胞及び頭髪毛乳頭細胞の増殖促進作用を検討した。
【００３７】
２  日本山ニンジン抽出物及び単離物質による毛母細胞増殖促進作用の検討
毛母細胞のモデル細胞として、ヒト皮膚角化細胞（ＨaＣaＴ細胞）を用いた。ＨaＣaＴ細胞は、成人男性の皮膚から樹立された不死化角化細胞（ケラチノサイト）株である。角化研究や皮膚がんの発がん機序の解明、紫外線等の外的因子の皮膚に対する影響解明等の皮膚研究等のモデル細胞として一般に用いられている。
【００３８】
９６ウェルプレートに、ＨaＣaＴ細胞を５×１０３cell/wellの濃度となるよう播種した。２４時間培養した後、それぞれのウェルに異なる濃度の日本山ニンジン抽出物又は単離物質を添加した。さらに２４時間培養した後、下記のＭＴＴ法で細胞生存率を測定した。
【００３９】
ＭＴＴ法（細胞生存率の測定法）
日本山ニンジン単離物質又は抽出物の存在下で培養した後に、残った培地を洗い流して基礎培地を加え、さらに１時間培養した後、各ウェルにＭＴＴ染色液（５ｍｇ／ｍｌ  リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））を１０μｌ添加した。５％ＣＯ２、３７℃で４時間静置培養した後、培地を除去し、各ウェルに塩酸−イソプロパノール溶液を１００μｌずつ加え、遮光し、４時間室温で放置した。マイクロプレートリーダーで５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、細胞生存率の指標とした。
【００４０】
図１は、横軸に細胞生存率、縦軸に日本山ニンジンからの各単離物質及び抽出物を示す横棒グラフであり、日本山ニンジンによるＨaＣaＴ細胞の細胞生存率への影響を表している。また、各抽出物及び単離物質の濃度をそれぞれ変化させて、ＨaＣaＴ細胞の増殖促進に適した濃度についても検討した。全ての単離物質及び抽出物において、横棒をそれぞれ３本ずつ示しているが、単離物質及びミノキシジルでは上から１００μＭ、５０μＭ、２５μＭの結果であり、抽出物では上から４００μＭ、２００μＭ、１００μＭの結果である。なお、横軸はコントロールを１００％とした場合の相対値である。ポジティブコントロールとしては、脱毛症の外用薬に主成分として配合されているミノキシジルを用いた。５０μＭ及び１００μＭのミノキシジルでは、細胞生存率は１２８％であり、顕著な細胞増殖が観測された。
【００４１】
図１の通り、オレイン酸、フマル酸、クロロゲン酸メチルエステル、クロロゲン酸、及び、水抽出物では、全ての濃度において１００％を超える顕著な細胞生存率を示した。また、濃度増加に伴って細胞生存率が増加する傾向を示した。
【００４２】
５-ヒドロキシメチル-２-フラルデヒド、アデノシン、ケンフェロール、ルテオリン、ケルセチン、ベルガプテン、イソエポキシプテリキシン、ヒュウガニンＥ、及び、β−アミリンでは、細胞生存率が１００％を超えない濃度もあったが、濃度によっては１１０％以上の高い細胞生存率を示した。
【００４３】
なお、クマリン類であるアンゲリシン、ソラレン、ベルガプテン、イソプテリキシン、イソエポキシプテリキシン及びヒュウガニンＥでは、１００μＭにおいて細胞毒性があるが、５０μＭでは細胞増殖作用が強く、２５μＭでは細胞増殖作用は弱まるという傾向がみられた。ベルガプテン、イソエポキシプテリキシン、ヒュウガニンＥの５０μＭにおける細胞生存率は、それぞれ１６９％、１３３％、１２６％である。
【００４４】
また、全体として、特に、１００μＭのフマル酸、１００μＭ及び５０μＭのクロロゲン酸メチルエステル、１００μＭのクロロゲン酸、５０μＭのルテオリン、５０μＭ及び２５μＭのケルセチン、５０μＭベルガプテン、５０μＭイソエポキシプテリキシン、５０μＭヒュウガニンＥ、及び、４００μＭの水抽出物では、ポジティブコントロールのミノキシジルと同程度又はそれを超える高い細胞生存率が観測された。
【００４５】
したがって、日本山ニンジンからの水抽出物、及び、図２の構造式（１）から（１３）で表される日本山ニンジンからの単離物質については、毛母細胞の増殖促進作用が期待される。
【００４６】
一方、βシステロールグルコシド、α−グルチノール、及びエタノール抽出物では、実験を行った全濃度範囲において細胞生存が低く、強い細胞毒性があることが示唆された。
【００４７】
３  日本山ニンジン抽出物及び単離物質による毛乳頭細胞増殖促進作用の検討
ヒト頭部毛髪由来の毛乳頭から分離培養したヒト頭髪毛乳頭細胞（ＨＦＤＰＣ細胞）を用いて、下記の方法で日本山ニンジンによる毛乳頭細胞増殖促進作用を検討した。
【００４８】
９６ウェルプレートに、ＨＦＤＰＣ細胞を１×１０４cell/wellの濃度となるよう播種した。２４時間培養した後、それぞれのウェルに異なる濃度の日本山ニンジン抽出物又は単離物質を添加した。さらに２４時間培養した後、毛母細胞実験と同様にＭＴＴ法で細胞生存率を測定した。
【００４９】
図３は、横軸に細胞生存率、縦軸に日本山ニンジンからの各単離物質及び抽出物を示す横棒グラフであり、日本山ニンジンによるＨＦＤＰＣ細胞の細胞生存率への影響を表している。また、各抽出物及び単離物質の濃度をそれぞれ変化させて、ＨＦＤＰＣ細胞の増殖促進に適した濃度についても検討した。全ての単離物質及び抽出物において、横棒をそれぞれ３本ずつ示しているが、単離物質及びミノキシジルでは上から１００μＭ、５０μＭ、２５μＭの結果であり、抽出物では上から４００μＭ、２００μＭ、１００μＭの結果である。なお、横軸はコントロールを１００％とした場合の相対値である。ポジティブコントロールとしては、脱毛症の外用薬に主成分として配合されているミノキシジルを用いた。５０μＭ及び１００μＭのミノキシジルでは、細胞生存率はそれぞれ１７３％、１７７％であり、顕著な細胞増殖が観測された。
【００５０】
図３の通り、オレイン酸、フマル酸、５-ヒドロキシメチル-２-フラルデヒド、アデノシン、クロロゲン酸メチルエステル、クロロゲン酸、ケンフェロールルテノシド、ケンフェロールグルコシド、ケルセチン、イソプテリキシン、及び、水抽出物では、全ての濃度において１００％近い、または１００％以上の細胞生存率を示した。４００μＭ及び２００μＭの水抽出物では、細胞生存率はそれぞれ１３９％、１３１％であった。
【００５１】
ケンフェロール、ルテオリン、ソラレン、ベルガプテン、イソエポキシプテリキシン、ヒュウガニンＥ、及び、β−アミリンでは、細胞生存率が１００％を超えない濃度もあったが、濃度によっては１１０％以上の高い細胞生存率を示した。
【００５２】
特に、１００μＭのクロロゲン酸、５０μＭのケンフェロール、１００μＭのルテオリン、１００μＭのケルセチンにおいて、顕著な細胞生存率が観測された。
【００５３】
したがって、日本山ニンジンからの水抽出物、及び、図２の構造式（１）から（１７）で表される日本山ニンジンからの単離物質については、毛乳頭細胞の増殖促進作用が期待される。
【００５４】
一方、βシステロールグルコシド及びエタノール抽出物では、実験を行った全濃度範囲において細胞生存率が低く、強い細胞毒性があることが示唆された。
【００５５】
４  日本山ニンジン抽出物及び単離物質のメラニン産生促進作用の検討
続いて、日本山ニンジンからの単離物質が、Ｂ１６メラノーマ細胞のメラニン産生量に与える影響を評価した。毛球部には、毛母細胞と隣り合うようにメラノサイトが存在しており、そこで生成されたメラニン色素が毛母細胞に受け渡される。毛母細胞に取り込まれたメラニン色素の種類や量によって毛の色は決まり、メラニン総量が多いほど黒くなる。毛母細胞に取り込まれるメラニン色素の量の減少によって、白毛化が引き起こされる。よって、メラノサイトでのメラニン産生促進により、白毛化の抑制及び防止が期待できる。
【００５６】
シャーレ上に培養したＢ１６メラノーマ細胞培養液（Ｅａｇｌｅ‘ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ａｌｐｈａ（ＥＭＥＭ））を血球計測板に１０μｌ添加し、顕微鏡を用いて細胞数を測定した。その後、細胞培養液にＥＭＥＭ培地を加え、細胞濃度を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう調製した。これを２４ウェルプレートの各ウェルに１ｍｌずつ播種し、５モル％ＣＯ２、３７℃で２４時間静置培養した。培養後、２４ウェルプレートの培地を除去し、新たにＥＭＥＭ培地９９８μｌとサンプル溶液２μｌを添加した。これを５モル％ＣＯ２、３７℃で４８時間静置培養した。培養後、再び培地を除去し、ＥＭＥＭ培地９９８μｌとサンプル溶液２μｌを添加し、５モル％ＣＯ２、３７℃で２４時間静置培養した。培養後、下記の方法でメラニン生合成量を測定した。また、毛球細胞の増殖促進作用の検討と同様に、ＭＴＴ法により細胞生存率も測定した。
【００５７】
培地を除去し、各ウェルに３００μｌのＰＢＳ（−）（すなわち、カルシウムが含まれないもの）を加えて洗浄した。ＰＢＳ（−）を除去し、各ウェルに１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液を１ｍｌずつ添加し、細胞を溶解させた。室温で遮光し、４時間放置した。マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、メラニン生合成量の指標とした。
【００５８】
図４から図６に、日本山ニンジンの各単離物質を加えた場合の、メラニン産生量及び細胞生存率を示している。ポジティブコントロールとしては、アルブチンを用いた。アルブチンは、メラニン産生を阻害する効能があり、美白有効成分として化粧品によく配合されている。なお、縦軸の値は、コントロールであるＤＭＳＯを加えたサンプルの値を１００とした時の相対値である。
【００５９】
図４はクマリン類、図５はフェノール類、図６はその他の化合物の結果を示している。この結果から、イソプテリキシン、ヒュウガニンＥ、ケルセチン、ルテオリン、ケンフェロール、フラルデヒドは、メラニン産生阻害作用が観測された。逆にメラニン産生促進作用が観測されたものは、ソラレン、クロロゲン酸、クロロゲン酸メチルエステル等である。これらの単離物質は、結果のグラフに示すような濃度範囲では、細胞生存率を高く保ちながら、メラニン産生促進／阻害作用を発揮することが期待される。なお、β―アミリン及びα―グルチノールでも、メラニン産生促進作用が観測された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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