(57)【要約】【課題】  脳とコミュニケーションするＧＩ管の筋肉組織と神経に関連した明確な方法論部分を用いて、様々な腸運動障害を治療するための薬剤を評価する方法が提供される、また本発明の方法によって選択される細菌の菌株と、腸運動障害の治療における前記細菌の菌株の使用も提供される。【解決手段】  受託番号ＤＳＭ２７１２３でＤＳＭＺに寄託されているラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）３４５Ａ（ＬＧ３４５Ａ）菌株、又は受託番号ＤＳＭ２７１２６でＤＳＭＺに寄託されているラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）６２１Ａ（ＬＧ６２１Ａ）菌株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸運動障害の治療に有効な薬剤の選択方法であって、前記方法は、
ａ）胃腸運動に対する前記薬剤の効果を分析するために、胃腸部において行われる時空間（ＳＴ）マッピングの段階；及び
ｂ）腸間膜求心性神経発火に対する該薬剤の効果を分析するために、胃腸部において行われるエクスビボでの神経束記録の段階
を含む上記選択方法。
【請求項２】
段階ａ）におけるＳＴマッピングがビデオ画像によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階ａ）が、前記胃腸部における伝播性運動群（ＭＭＣ）周波数及び／又は伝播性運動群（ＭＭＣ）速度を測定するためにＳＴマップを用いることを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
段階ａ）が管腔内圧の測定をさらに含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記管腔内圧の測定が管腔内ピーク圧（ＰＰｒ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
段階ｂ）が、腸間膜求心性神経束の自然発火頻度を測定することを含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記胃腸部が、空腸又は結腸のエクスビボ部である、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記胃腸部がマウス由来である、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
段階ａ）及びｂ）が、薬剤の管腔内適用の前後で行われる、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記薬剤が、全細胞、微生物、タンパク質、ペプチド、酵素、又は他の生物学的若しくは化学的物質である、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬剤が、微生物、より好ましくは細菌の菌株である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法によって選択される細菌の菌株。
【請求項１３】
腸運動障害が、胃腸管を通る物質の通過時間を低減させることが望まれるものであり、段階ａ）において、前記細菌の菌株が胃腸運動を増加させる能力を示し、段階ｂ）において、前記細菌の菌株が腸間膜求心性神経発火を減少させる能力を示す、請求項１２に記載の細菌の菌株。
【請求項１４】
段階ａ）において、前記細菌の菌株がＭＭＣ周波数を増加させ、又はＭＭＣ速度を増加させ、又は管腔内圧を増加させる能力を示し、段階ｂ）において、前記細菌の菌株が疼痛シグナル伝達を減少させる能力を示す、請求項１３に記載の細菌の菌株。
【請求項１５】
前記菌株がＬＧ３４５Ａ（ＤＳＭ２７１２３）である、請求項１３又は１４に記載の細菌の菌株。
【請求項１６】
腸運動障害が、胃腸管を通る物質の通過時間を増加させることが望まれるものであり、段階ａ）において、前記細菌の菌株が胃腸運動を減少させる能力を示し、段階ｂ）において、前記細菌の菌株が腸間膜求心性神経発火を減少させる能力を示す、請求項１２に記載の細菌の菌株。
【請求項１７】
段階ａ）において、前記細菌の菌株がＭＭＣ周波数を減少させ、又はＭＭＣ速度を減少させ、又は管腔内圧を減少させる能力を示し、段階ｂ）において、前記細菌の菌株が疼痛シグナル伝達を減少させる能力を示す、請求項１６に記載の細菌の菌株。
【請求項１８】
前記菌株がＬＧ６２１Ａ（ＤＳＭ２７１２６）である、請求項１６又は１７に記載の細菌の菌株。
【請求項１９】
前記菌株がＬＧ３４５Ａ（ＤＳＭ２７１２３）又はＬＧ６２１Ａ（ＤＳＭ２７１２６）である細菌の菌株。
【請求項２０】
治療に使用するための、請求項１９に記載の細菌の菌株。
【請求項２１】
腸運動障害の治療に使用するための、請求項１２から１９までのいずれか一項に記載の細菌の菌株。
【請求項２２】
便秘又は疝痛の治療に使用するための、請求項１３から１５までのいずれか一項に記載の細菌の菌株又はＬＧ３４５Ａ株（ＤＳＭ２７１２３）。
【請求項２３】
前記便秘が高齢患者若しくは妊娠中の女性における便秘であり、又は前記疝痛が乳児疝痛である、請求項２２に記載の使用のための細菌の菌株。
【請求項２４】
過敏性腸症候群の治療に使用するための、請求項１６から１８までのいずれか一項に記載の細菌の菌株又はＬＧ６２１Ａ株（ＤＳＭ２７１２６）。
【請求項２５】
請求項１２から１９までのいずれか一項に記載の細菌の菌株を、前記腸運動障害を治療するのに有効な量で対象に投与することを含む、腸運動障害を患っている前記対象を治療するための方法。
【請求項２６】
前記胃腸運動障害及び菌株が、請求項２２から２４までのいずれか一項に定義されている通りである、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
腸運動障害なる用語は、多くの場合、疼痛、便秘又は下痢に関連した異常な腸収縮に適用される。この語句は、胃腸が正常に発達しておらず、又は様々な原因により筋活動を協調させる能力を喪失している多種多様な障害を説明するために使用される。このような障害は様々な面で現れてもよく、限定されないが、以下を含む：
・腹部膨満
・再発閉塞
・腹部疝痛
・便秘
・胃食道逆流症
・難治性、再発性嘔吐
・下痢
・過敏性腸症候群（ＩＢＳ）
・炎症性腸疾患
・便失禁
・乳児疝痛
・頻繁な再発性腹痛（ＦＲＡＰ）
・逆流
・食物不耐症
【０００２】
広義には、食物の通過及び消化管への分泌におけるいずれかの顕著な変化は、腸運動性障害とみなすことができる。
【０００３】
胃及び腸の適切な協調運動は、腸内容物を消化し、消化管に沿って前進させるために必要である。胃腸（ＧＩ）管の適切な運動のために必要とされる収縮と弛緩のパターンは複雑であり、ＧＩ壁内の神経と筋肉を用いる。毎日、いつでも、多数の要因が、ＧＩ運動（例えば、物理的な運動、精神的苦悩）に影響を与え得る。新生児は、ＧＩ管における運動の複雑なシステムを発達させる必要がある。腸運動障害の病因は、ほとんどの場合、多因子的である。
【０００４】
神経及び筋肉組織の全体的な構造組織が小腸及び大腸全体で類似しているが、それぞれの部分は特徴的な運動活性を有する。不定期の長い蠕動と逆蠕動の複合と共に定常的な又は短い伝播性収縮が食事中と食後に起こり、これにより、食物塊が分割され、適切な吸収のために消化液と混合することができる。消化後、運動プログラムは、肛門方向に消化物を移動させる長い伝播性収縮を有するものに変わる。他の運動活性が起こり、これはより規則的であり、腸全体で未消化の食物の前進を可能にする蠕動波（すなわち、小腸の輪走筋肉組織の収縮）を生む。
【０００５】
老化、認知症、脳卒中、パーキンソン病、脊髄損傷、出産中の直腸裂傷、糖尿病、外科合併症、及び神経筋障害（例えば、重症筋無力症）は、運動障害を引き起こす可能性がある。
【０００６】
腸運動の一般的に診断される障害であるＩＢＳは、数十年間、結腸の疾患と考えられてきたが、ＧＩ運動に関する研究は、根本的な運動阻害が小腸にも発生し得ることを実証している。ＩＢＳは腹痛を伴うことがある。
【０００７】
過敏性腸症候群（ＩＢＳ）の原因は不明のままである。いくつかの報告によれば、ＩＢＳを患っている患者の小腸及び結腸は、通常よりも軽度の刺激に対して、より感受性であり、反応性である。
【０００８】
時折、便失禁が、ある種の食品の摂取後に起こる場合がある。糖、不溶性繊維、及びデンプン（コメを除く）は、通常、腸内で破壊され、排出されなければならない可変量のガスを形成する。ラクターゼ欠損症を患っているほとんどの人々は、いくつかの食品（例えば、ミルク、ケーキ）に共通して含まれる糖である乳糖を消化することができない。乳糖欠損症を患っている人々は、乳糖摂取後に、制御されない液状の下痢を経験する場合がある。
【０００９】
便秘は、米国において最も一般的な消化に関する愁訴であるが、その頻度にかかわらず、患者は、肛門直腸障害又は憩室疾患などの二次障害を発症するまで、多くの場合、認識されないままである。
【００１０】
便秘の幅広く受け入れられた臨床的に有用な定義は存在しない。医療従事者は、通常、便秘を定義するために、排便の頻度（すなわち、週３回未満の排便）を用いる。しかしながら、ローマ基準は、当初、１９８８年に導入され、その後、２回修正があり、ローマＩＩＩ基準となったが、便秘の研究−標準の定義になっている。
【００１１】
便秘に関するローマＩＩＩ基準によれば、患者は、先の３カ月間、以下の症状のうち少なくとも２つを経験している必要がある：
・週に３回より少ない排便
・いきみ
・ゴツゴツした又は硬い便
・肛門直腸に障害があるという感覚
・不完全な排便の感覚
・排便に必要とされる手動操作
【００１２】
便秘は、多くの場合、慢性的であり、個々の生活の質に顕著に影響を与える可能性があり、顕著な医療費と関連付けることができる。便秘は、前年中に少なくとも１２週間（総じて、必ずしも連続していなくてもよい）生じた場合に慢性的であると考えられている。
【００１３】
便秘は、一般的に、一次的に又は二次的にいくつかの原因がある。これらのうちで最も頻繁なものは、次の通りである：
・繊維が非常に乏しい食料
・妊娠
・患者が排便する衝動を無視する、ライフスタイルの変化（例えば、旅行、新しい仕事、又は離婚）に関連した心理的な便秘と臨床的鬱病
・甲状腺機能低下症
・電解質不均衡、特に、Ｃａ＋＋又はＫ＋を伴う場合
・内的又は外的に腸管に機械的圧縮を生じさせる腫瘍
・神経系損傷
・老化
・パーキンソン病
・鉛、水銀、リン又はヒ素による中毒
【００１４】
便秘は、妊娠中に非常に一般的なものである。高レベルのプロゲステロンホルモンとおそらくは妊婦用ビタミン剤として摂取された余分な鉄分のために、腸を通る食物を通常移動させる筋収縮が減速する。これはまた、時々、下腹部痛を伴う。
【００１５】
便秘はまた、加齢に関係し、いわゆる「腸の老化」は、一般的に、特に７０歳を超える人々と慢性疾患医療機関において見出される。この条件は、以下を伴う：
・筋層間機能不全をもたらす、直接刺激に対する筋層間神経叢の応答低下におけるニューロン数の減少
・結腸と直腸コンプライアンスの異常と運動障害をもたらす、左結腸のコラーゲン沈着の増加
・部分的な運動協調性の欠如をもたらす、結腸の円形筋層への抑制性神経入力の振幅の減少
・６０歳以上の人々における腸受容体への血漿エンドルフィン結合の増加
【００１６】
老齢スペクトル腸運動障害の他の終端で、乳児疝痛による持続的な又は過度の号泣は、乳児期の最も悲惨な問題の一つである。それは、乳児、両親及び関係する医療従事者を悩ましている。過敏性乳児の両親は、彼らの介護能力の訴えとして、又は彼らの子供における病気の証しとして号泣を観察することができる。乳児疝痛は、時間とともに解決する状態である。
【００１７】
疝痛に関して最も広く受け入れられている定義は、Ｗｅｓｓｅｌ基準又は「３のルール」：１日に３時間を超えて継続し、週に３日を超えて発生し、３週を超えて持続する号泣である。また、この定義は、乳児が「そうでなければ健康でよく食べる」ことが必要である。
【００１８】
推測される自律神経失調に続発する腸管運動亢進はまた、疝痛のための一病因として提唱されている。運動活性を制御するメカニズムの多くは、乳児においては未熟である。これらのメカニズムの未熟さは、摂食過敏症に対する脆弱性を増大させることになる場合がある。したがって、疝痛は、運動性規制の側面の１つ以上において、成熟機能不全を有する乳児の亜集団における一般的な臨床症状であり得る。
【００１９】
いくつかの疫学の報告によれば、３０００万人程度の米国人は、腸運動障害を患っている。医学文献から入手可能なデータは、世界的に、全ＧＩ状態の３０〜４５％が腸運動障害に帰することを示している。
【００２０】
現在の治療及び提案は、運動障害の種類により異なり、便秘に関しては、以下の通り、いくつかの例がある：
・ファイバー又は膨張性薬剤（通過遅延型便秘には有用でない） 
・便軟化剤
・刺激性下剤
・浸透圧性下剤（例えば、ポリエチレングリコール）
・クロライドチャネル活性化剤（例えば、ルビプロストン）
・セロトニン作動薬（５−ＨＴ４受容体アゴニスト）
【００２１】
さらに、無作為化臨床試験において、乳酸菌（ＬＡＢ）の使用が試験されている：「機能性便秘を患っている患者の治療におけるラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）に富化したアーティチョークの有効性」（Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  Ａｒｔｉｃｈｏｋｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｓｔｉｐａｔｉｏｎ）（Ｒｉｅｚｚｏら；Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１２年２月；３５（４）：４４１−５０）。
【００２２】
また、９０人の母乳で育てられた疝痛乳児を無作為に、試験におけるＬ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）又はシメチコンによる治療に割り当てた。ベースラインとして、毎日号泣する時間の中央値は、両群において１９７分であった。試験を完了した８３人の乳児のうち、毎日号泣する時間の中央値は、第７日目（１５９分対１７７分）と第２８日目（５１分対１４５分）で、シメチコン群よりもＬ．ロイテリにおいて低かった（Ｓａｖｉｎｏ  Ｆら，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２００７年；１１９（１）：ｅｌ２４）。
【００２３】
腸運動障害は、多くの場合、疼痛を伴う異常な腸収縮にあてはまり、様々な障害について多種多様な治療及び提案があり、そのいくつかは、他の多くよりも良好に作用する。
【００２４】
そのため、全体的な必要性、さらに、様々な運動障害について解決すべき特定の課題、すなわち、腸運動障害及び胃腸痛／腸痛を正常化し又は治療するための薬剤をどのように最適に選択するかといった課題が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
発明者らは、本明細書において、ＧＩ管の筋肉組織と神経、脳とそれらのコミュニケーションに関連した特徴的な方法論的部分を用いて、様々な腸運動障害を治療するための薬剤を評価する新規な方法を開発した。
【００２６】
すなわち、本発明は、腸運動障害の治療に有効な薬剤の選択方法に関し、該方法は、
ａ）胃腸運動に対する薬剤の効果を分析するために、胃腸部において行われる時空間（ＳＴ）マッピングの段階；及び
ｂ）腸間膜求心性神経発火に対する薬剤の効果を分析するために、胃腸部において行われるエクスビボでの神経束記録の段階
を含む。
【００２７】
好ましい実施形態において、段階ａ）におけるＳＴマッピングはビデオ画像又はビデオ録画によって行われる。本発明の方法において、段階ａ）は、好ましくは、胃腸部における伝播性運動群（ＭＭＣ）周波数及び／又は伝播性運動群（ＭＭＣ）速度を測定するための、段階ａ）において作製したＳＴマップを用いることを含む。
【００２８】
本発明の方法において、段階ａ）は、好ましくは、管腔内圧の測定、例えば管腔内ピーク圧（ＰＰｒ）の測定をさらに含む。
【００２９】
本発明の方法において、好ましくは、段階ｂ）は、腸間膜求心性神経束の自然発火頻度を測定することを含む。
【００３０】
好ましい態様において、本発明は、運動障害に有効な薬剤を選択するための二段階法を開示する。第一段階において、本発明者らは、運動における様々な薬剤の効果を分析するために、時空間マップを用いて管腔内圧記録を組み合わせた。この段階において、管腔内ピーク圧（ＰＰｒ）が、好ましくは、測定され、ビデオ録画が、薬剤の管腔内適用の前後に、マウスのエクスビボでの空腸部及び結腸部で行われた。伝播性運動群の周波数と速度はまた、本方法の第一段階において計算される。第二段階において、腸神経シグナル伝達を分析し、腸間膜求心性神経束の自然発火頻度を測定する。したがって、本発明は、運動障害に有効な薬剤の選択方法を開示し、該方法は、ビデオ録画と時空間マップに加えて、管腔内圧変化の同時記録を用いる第一段階と、例えば、腸間膜、例えば細胞外腸間膜、神経記録をとることによって、神経シグナル伝達の分析である第二段階を含む。
【００３１】
このように、さらなる実施形態において、本発明は、腸運動障害の治療に有効な薬剤の選択方法を提供し、該方法は：
（ａ）管腔内圧を記録し、胃腸運動に対する様々な薬剤の効果の分析を可能にするための時空間（ＳＴ）マップを作製すること、ここで、該時空間マップは、試験薬剤の存在及び非存在下で腸試料において、伝播性運動群の周波数及び速度を測定するために使用され；及び
（ｂ）試験薬剤の存在及び非存在下で腸試料における腸間膜求心性神経束の自然発火頻度を測定することによって、腸神経シグナル伝達を分析すること
を含む。
【００３２】
段階（ａ）における本方法の好ましい実施形態において、管腔内ピーク圧（ＰＰｒ）が測定される。
【００３３】
本発明は、記載される二段階法に関し、さらに、新規な細菌の菌株に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】臓器運動記録を示す図である。
【図２】運動記録からの図及びデータ出力を示す図である。
【図３】運動記録からの図及びデータ出力を示す図である。
【図４】腸間膜神経記録；腸の神経支配を示す図である。
【図５】細胞外記録を示す図である。
【図６】ＳｔＭＡＰプラグインソフトウェアの詳細を示す図である。
【図７】段階ａ）の結果を示すグラフである。試験された薬剤は、（Ａ）Ｌ．ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）３４５Ａ（ＤＳＭ２７１２３）、（Ｂ）Ｌ．ガセリ６２１Ａ（ＤＳＭ２７１２６）、（Ｃ）Ｌ．ガセリＴ１、（Ｄ）Ｌ．ガセリＴ２、（Ｅ）Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ６４７５、（Ｆ）Ｌ．ロイテリＤＳＭ１７９３８及び（Ｇ）Ｌ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）（ＪＢ−１）である。
【図８】段階ｂ）の結果を示すグラフである。試験された薬剤は、Ｌ．ラムノサス（ＪＢ−１）、Ｌ．ロイテリＤＳＭ１７９３８、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ６４７５、Ｌ．ガセリ３４５Ａ（ＤＳＭ２７１２３）、Ｌ．ガセリ６２１Ａ（ＤＳＭ２７１２６）、Ｌ．ガセリＴ１及びＬ．ガセリＴ２である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の理解を促進するために、多数の用語を以下に定義する。
【００３６】
本明細書で使用するとき、用語「管腔内ピーク圧」（ＰＰｒ）は、管腔内圧記録に基づくものであって、この場合、管腔内圧変化は、胃腸部の長手方向軸の中間で測定される。圧力シグナルを分析し、管腔内ピーク圧力（ＰＰｒ）を同定し、測定する。
【００３７】
本明細書で使用するとき、用語「伝播性運動群周波数」（ＭＭＣ周波数）は、時空間マップにおける暗いＭＣバンドの数をカウントすることによって計算される。
【００３８】
本明細書で使用するとき、用語「伝播性運動群速度」（ＭＭＣ速度）は、伝播性運動群によって作製される時空間マップにおけるそれぞれのバンドの傾き（単数又は複数）から測定される。
【００３９】
本明細書で使用するとき、用語「発火頻度」は、脳への感覚スパイク列を測定するために使用される。
【００４０】
本明細書で使用するとき、用語「薬剤」は、任意の物体又は物質を意味するために使用され、例えば、細胞全体、微生物、タンパク質、ペプチド、酵素、分子或いは哺乳動物の胃腸系における運動及び／若しくは疼痛に影響を与えるために使用することができる他の生物学的物質又は化学的物質が挙げられる。好ましい薬剤は、細菌の菌株であり、例えばプロバイオティクス細菌株である。
【００４１】
本発明の方法は、本明細書において、エクスビボでの神経束記録に対して改善された技術（段階２）と併せた時空間（ＳＴ）マッピング法（段階１）に基づく二段階法であり、この方法では、胃腸部は、脊椎と迷走神経繊維の両方で較正された部分を供給する神経束を含有する腸間膜アーケードの有無で切除される。
【００４２】
提示された好ましい方法の第一段階において、管腔内圧記録は、運動における異なる薬剤の効果を分析するために時空間（ＳＴ）マップと組み合わせられる。
【００４３】
ＳＴマップは、健常と運動障害における行動を含む胃腸運動の分析に使用することができる、時間的に発達し、空間的に変化する場を可視化するためのツールを提供する。時空間ビデオ画像を使用して、本発明者らは、本明細書において、胃腸径の変化の時空間マップのコンピュータ分析を用いた新たな方法の一部を開発した。これは、任意の他の技術では検出することが非常に困難である運動パターンを明らかにする。これらのパターンのパラメータは、ヒト胃腸薬理学を用いたマウスのエクスビボでの腸部分により得られた結果と直接相関する。蠕動性の伝播する運動群（ＭＣ）又は混合運動（定常ＭＣ）は、リアルタイムでデジタル的に記録され、画像が保存される。分析ソフトウェアは、下記にさらに記載されるように、腸のエッジを検出し、経時的に該部分の長さに沿って径を自動的に計算することができる。このデータはプログラムによって使用され、運動パターン；例えば、伝播性運動群（ＭＭＣ）周波数（神経依存性ＭＭＣ周波数）、ＭＭＣ速度及び収縮の筋原（関連する徐波）収縮率について非常に特異的な情報を抽出することができる時空間マップを構築する。
【００４４】
さらに、腸内微生物は、いわゆる微生物叢−腸−脳軸の一部として脳にシグナルを送ることが受け入れられ始めている。しかしながら、非常に少ないが、神経系の発達又は機能において胃腸微生物叢の役割について知られている。現在、中枢神経系への胃腸から中継された神経シグナルの定量的性質については知られていない。
【００４５】
単一感覚ニューロンは、迷走神経繊維間のものを含めて、刺激の性質と強度をコードするスパイク列をパターン化するような連続的な物理的刺激を表す。これに加えて、刺激は、束における活性な繊維の数によって決定される集団コードで表すことができる。一次求心性神経を介して脳に到達するすべての情報は、ニューロンのスパイク列の言語でコードされなければならない。したがって、感覚スパイク列がどのようにして共生、プロバイオティクス株及び様々な物体によって影響されるかを知ることにより、本発明者らは、一次求心性発火に対する新規な有益な胃腸微生物の効果によって、該微生物及びそれらの活性分子を同定し、さらに、様々な様式で、このシグナル伝達系に介入することができる新規な薬剤及び他の化合物を同定することができる。
【００４６】
本明細書において、様々な腸運動障害を治療する薬剤を評価するための本発明の新規な方法は、筋肉と神経の両方において、薬剤、例えば、プロバイオティクス菌株又は別の生物学的若しくは化学的薬剤の具体的な効果を区別することができる。実験データは、腸内系及び／又は中枢神経系に関連する疼痛の調節において最も効果的でもある、ＧＩ管の特定の部分において、例えば混合パターン又は前進パターンを調節することができる同一薬剤であるとは限らないことを確認にする。
【００４７】
さらに、様々な疾患における特定の分子の効果を調べるために、本発明者らの方法は、上皮バリアに対して及び上皮バイアを横切って管腔灌流及び拡散の様々な研究を可能にする。
【００４８】
運動の２つの基本的パターンは消化管で行われる。
前進：食物は、分解及び吸収に関与する連続的な一連の処理に供されるために、消化管の全長に沿って前進されなければならない。前進運動の主要なタイプは、特に食道及び小腸で見られ、蠕動性である−筋収縮の輪は、食物塊の口側から肛門に向かって移動し、その方向で管腔の内容物を前進させる；輪が移動するにつれて、膨張した領域の他の側にある筋肉は弛緩し、塊の滑らかな通過を促進する。
【００４９】
混合：摂取された物質が、消化管を通って単に前進した場合、消化及び吸収は非常に乏しいと考える。これは、消化酵素が、摂取物と十分に混合されておらず、大部分の摂取物が、水を含む栄養素を吸収する上皮細胞と接触するに至っていないためである。分節収縮は、特に小腸で見られる混合運動−収縮チョップ（ｃｈｏｐ）の分節輪の一般的なタイプであり、摂取物を混合する。また、腸の壁における縦筋の、交互に起こる収縮と弛緩は、その内容物の効果的な混合を与える。
【００５０】
本明細書における新規な方法を用いて、変化した胃腸運動は、混合パターン（摂取後）又は前進パターンのいずれかとして見られ、様々な運動障害によって引き起こされる疼痛における変化と組み合わせて、ＳＴマップ法を用いて明確に見られ、及び中心又は末梢に出現され、検出及び記録することができる。
【００５１】
疼痛の一種は、腹部内臓（臓器）の侵害受容器の活性化に起因する内臓疼痛である。内臓構造は、膨満（伸縮）、虚血及び炎症に非常に感受性であるが、通常、疼痛を誘発する他の刺激には相対的に非感受性である。内臓疼痛は、拡散的であり、局在化することが困難であり、多くの場合、遠位の、通常は表面的な構造と呼ばれる。悪心、嘔吐、バイタルサインの変化、並びに感情的な症状などの症候を伴うことがある。疼痛は、吐き気、深刻、圧迫、及び鈍痛として説明することができる。明らかな構造病変又は生化学的異常により、患者の一部だけにこの種の疼痛が説明される。これらの疾患は、時々、胃腸神経筋疾患（ＧＩＮＭＤ）下でグループ化される。また、人々は、このような症候に対して構造的、生化学的又は組織病理学的な理由のいずれの証拠がなく、内臓疼痛を経験し得て、多くの場合、実際に非常に強いものである。
【００５２】
侵害受容器は、脊髄の前外側路（さらに、小さい迷走神経突起）に伝送し、次に、視床、並びに島状及び帯状皮質を含む前脳に伝送する特異的な侵害受容ニューロン（Ａδ又はＣ）に活動電位を送ることによって、潜在的に有害な刺激に応答する感覚受容器である。胃腸病理学に起因する疼痛知覚にとって重要なことは、腸間膜求心性神経束に移動する外因性の一次求心性繊維を介した中枢神経系への胃腸からの疼痛メッセージの活性化である。
【００５３】
本明細書における本発明のシステムにおいて、運動及び疼痛の変化は、運動パターン（例えば、ＰＰｒ、ＭＭＣ速度及び／又はＭＭＣ周波数）若しくは収縮幅の変更、又は胃腸の特定の選択された部分に対する求心性神経腸間膜神経脊髄転送量の増加として読み出される。様々な薬剤が、ある部分のＧＩ管における混合と別の部分における前進を促進し、又は全く影響がなく、さらに、ＧＩ管のある部分において疼痛シグナル伝達系に影響を及ぼすが、別の部分では、迷走神経などの異なる神経経路を介して、又は後根神経節を通じた内臓疼痛について影響を及ぼさない。このような正確な領域特異性は、試験分子の効果を評価する上で本発明者らのアプローチの力と特異性を強調する。
【００５４】
したがって、本明細書におけるモデルを用いることによって、具体的な運動障害の治療、予防、又は調節に適切な薬剤を見出すことが本発明の目的である。
【００５５】
提示されている方法における２つの段階は、胃腸運動及び腸間膜求心性神経発火に関するデータを提供する。これらのパラメータの分析は、胃腸運動障害の治療に有効な薬剤を選択する方法をもたらす。したがって、提供される方法の段階ａ）と段階ｂ）における薬剤の効果の分析を用いて、薬剤が腸運動障害の治療に有効であるかどうかを決定する。
【００５６】
段階ａ）で測定される好ましいパラメータは、ＭＭＣ周波数及び／又はＭＭＣ速度であり、これは、好都合には、好ましくは、ビデオ画像によって、例えばビデオ録画を用いることによって生じさせるＳＴマップの方法により行われ、好ましくは、３セットの情報（胃腸（縦軸）、時間（横軸）及び胃腸径（高さ軸（ａｐｐｌｉｃａｔｅ）又はｚ軸）に従った位置）を含有する明るい色相と暗い色相との交互のバンドパターンを含む。これらの変数を用いると、時空間マップは、運動「フィンガープリント」となり得て、その感度は、特定のプロバイオティクス株及び他の薬剤が、運動において有する詳細な効果と微妙な効果、及びそれらの間を区別する能力の定義に重要である。
【００５７】
段階ａ）で測定される他の好ましいパラメータは、管腔内圧であり、特に管腔内ピーク圧（ＰＰｒ）である。他のパラメータは、例えば、実施例に記載されるように、場合により、ＳＴマップから及び方法の段階ａ）で測定され得る。
【００５８】
段階ｂ）において測定される好ましいパラメータは、腸間膜求心性神経束の自然発火頻度である。この技術は、異なる治療によって誘導される腸間膜神経繊維の興奮性の変化を決定するために使用することができる。
【００５９】
これらのパラメータの１つ以上を分析することは、運動障害において有効な薬剤を選択する方法をもたらす。ＳＴマップを作製し、これらのパラメータを測定するための適切な方法及び装置は、実験の実施例及び図面に記載されている。
【００６０】
したがって、好ましい方法では、提示される方法における２つの段階は、管腔内ピーク圧（ＰＰｒ）、ＭＭＣ周波数、ＭＭＣ速度及び腸間膜求心性神経束の自然発火頻度に関するデータを与える。これらのパラメータのすべてを分析することは、運動障害において有効な薬剤を選択する好適な方法をもたらす。
【００６１】
本発明の方法は、異なる運動障害に適切な薬剤を見出すために使用することができる。薬剤は、運動障害に影響を与え、それを予防又は治療するために有益な方法で患者のＭＭＣ速度及び／又はＭＭＣ周波数及び／又はＰＰｒ、並びに神経発火頻度に影響を及ぼすように選択される。
【００６２】
方法の段階ａ）は、胃腸運動に対する薬剤の効果を分析するために、胃腸部分のＳＴマッピング（ＳＴ分析）を使用する。これを行うために、好ましくは、ＭＭＣ周波数及び／又はＭＭＣ速度がＳＴマップを用いて測定される。好都合には、ＳＴマップは、例えば、実験の実施例に記載されるように、周波数及び速度を測定し得るＭＣバンドの画像を示す。さらに、好ましくは、管腔内圧力、及びより好ましくは、管腔内ピーク圧（ＰＰｒ）は胃腸部分内で測定される。
【００６３】
本発明の方法において使用するための胃腸部分は、胃腸管の任意の適切な部分に由来し得て、例えば、小腸部分（例えば、空腸）由来、又は大腸（例えば、結腸）由来の部分であってもよい。本方法の段階ｂ）に適切な部分は、腸間膜求心性神経発火の測定を可能にする適切な神経束の存在を必要とする。これは、好都合には、例えば、実験の実施例に記載されるように、接続された腸間膜組織を含む胃腸部分を有することによって提供することができる。したがって、本発明の方法は、好都合には、適切な実験動物由来のエクスビボ部分において、例えば、マウス胃腸部分（例えば、マウス結腸又は空腸部分）において実施される。驚くべきことに、本発明の方法は、腸部分の両タイプに対して同じ薬剤の作用の違いを検出することができる。小腸対大腸における薬剤の効果の比較を行う能力は、特に、治療される腸運動障害及びその臨床段階と症候に依存して有利であり得、領域特異的であり、例えば、小腸又は大腸のいずれかに特異的である治療が有益である。
【００６４】
薬剤によって誘導される胃腸運動の変化は、本方法の段階ａ）における読み出しとして、例えば、運動パターン又は収縮幅の変化として検出することができる。いくつかの薬剤は全く効果がない。例えば、ＭＭＣ周波数及び／又はＭＭＣ速度及び／又はＰＰｒなどの管腔内圧を増加させることによって、胃腸運動を増加させ得る薬剤は、おそらく、便秘と疝痛などの消化管に沿った前進運動を増加させるのに有利である障害を治療するのに有用である。薬剤は、例えば、ＭＭＣ周波数及び／又はＭＭＣ速度及び／又はＰＰｒなどの管腔内圧を減少させることによって、又は有意に変化させないことによって、胃腸運動を減少させ又は有意に変化させないことを示す場合、このような薬剤は、このような障害を治療するのに有用でない可能性があり、特に、測定されるパラメータのすべてにおいて減少があり又は有意な変化がない場合には選択されない。しかしながら、例えば、ＭＭＣ周波数及び／又はＭＭＣ速度及び／又はＰＰｒなどの管腔内圧を減少させることによって、胃腸運動の減少をもたらし得る薬剤は、おそらく、ＩＢＳ又は下痢などの消化管に沿った前進運動の減少に有利である障害を治療するのに有用である。
【００６５】
本発明の方法における薬剤による胃腸運動の増加、例えば、大腸の部分におけるＭＭＣ周波数及び／又はＭＭＣ速度及び／又はＰＰｒなどの管腔内圧の増加は、特に、便秘又は疝痛を治療するのに使用する薬剤を選択するために特に好ましい。
【００６６】
本発明の方法の段階ｂ）は、腸間膜求心性神経発火（疼痛シグナル伝達）における薬剤の効果を分析し、したがって、薬剤が、疼痛に対する読み出しとして、すなわち、疼痛、例えば内臓疼痛における効果を有する可能性があるかどうかの読み出しとして使用され得る。求心性神経発火の増加又はそれにおける有意な効果がないことは、それぞれ、疼痛の増加、又は疼痛における有意な効果がないことをもたらす可能性がある薬剤を示し、一方、求心性神経発火の減少は、疼痛を低減する薬剤を示す。したがって、好ましい薬剤は、求心性神経発火の減少、例えば、求心性神経束の自発発火頻度の減少をもたらすものである。或いは、神経発火に有意な変化をもたらさない薬剤は、菌株が本方法の段階ａ）によって測定される有利な特性を示す場合に選択され得る。
【００６７】
試験される薬剤は、任意の適切な方法で選ばれた胃腸部分に添加される。好都合には、薬剤は、部分の管腔内空間に添加され、すなわち、管腔内に適用される。運動（段階ａにおける）又は疼痛シグナル伝達（段階ｂにおける）の効果を分析するために、これらの段階は、好都合には、薬剤の存在及び非存在下で行われる。例えば、段階ａ）及びｂ）は、薬剤が適用される前後で行われる。したがって、このような方法において、薬剤の効果は、適切な対照と比較され、例えば、試験薬剤の存在下での結果は、試験薬剤の非存在下での結果、例えば、緩衝剤＋薬剤（例えば、緩衝剤＋細菌の菌株）と対比した緩衝剤だけの結果と比較される。
【００６８】
したがって、本発明のさらなる態様は、本発明の方法によって選択される薬剤を提供する。好ましい薬剤は、微生物、より好ましくは細菌の菌株、好ましくはプロバイオティクス菌株である。本発明の方法によって選択される薬剤は、医薬化合物若しくは組成物又は栄養化合物若しくは組成物の形態をとることができる。
【００６９】
上述したように、治療されることが望まれる運動障害に応じて、選択基準は変化する。例えば、腸運動障害が、腸を通る物質の通過時間を減少させること（又は消化管に沿った前進運動を増加させること）が望まれるもの、例えば、便秘、逆流又は疝痛である場合、方法の段階ａ）において、目的とする薬剤は、ＭＭＣ周波数又はＭＭＣ速度又は管腔内圧（例えば、ＰＰｒ）を増加させることによって、胃腸運動を増大させるように作用する。好ましい薬剤は、これらのパラメータの２つ以上を増加させ、例えば、ＭＭＣ周波数とＭＭＣ速度を増加させ、又はＭＭＣ周波数と管腔内圧（例えば、ＰＰｒ）を増加させ、又はＭＭＣ速度と管腔内圧（例えば、ＰＰｒ）を増加させる。最も好ましい薬剤は、これらのパラメータのすべてを増加させ、例えば、ＭＭＣ周波数、ＭＭＣ速度及び管腔内圧（例えば、ＰＰｒ）を増加させる。本方法の段階ａ）は、小腸又は大腸由来の適切な胃腸部分、例えば、小腸については空腸部分又は大腸については結腸部分について評価され得る。いくつかの実施形態において、大腸、例えば結腸部分の使用が好ましい。
【００７０】
このような障害の治療について、疼痛シグナル伝達に影響を与えず若しくはそれを増加させず、又は好ましくは疼痛シグナル伝達を減少させるように作用する薬剤が選択される。本方法の段階ｂ）において、このような薬剤は、効果を与えない、又は好ましくは腸間膜求心性神経発火を低減し若しくは減少させるように作用する。好ましくは、前記薬剤は、影響を与えない、又は好ましくは腸間膜求心性神経束の自発発火頻度を減少させるように作用する。本方法の段階ｂ）は、小腸又は大腸由来の任意の適切な胃腸部分、例えば、小腸については空腸部分又は大腸については結腸部分について評価され得る。いくつかの実施形態において、小腸、例えば空腸部分の使用が好ましい。
【００７１】
本発明の方法を用いて、本発明者らは、ＭＭＣ周波数、ＭＭＣ速度及び管腔内ピーク圧を増加させることが示されることによって、胃腸運動を増加することが示されている新規な細菌の菌株であるラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）３４５Ａ（ＬＧ３４５Ａ）を選択している。この菌株はまた、腸間膜求心性神経発火を減少させることによって（腸間膜求心性神経束の発火頻度を減少させることによって）、疼痛シグナル伝達を減少させることが示されている。この単離された細菌の菌株（及び、この寄託された菌株の特徴、例えば、胃腸運動及び疼痛シグナル伝達において上記で言及した効果を増加させる能力を有する他の菌株、例えば、Ｌ．ガセリ株）は、本発明の好ましい態様を形成し、腸運動障害、特に、腸を通る物質の通過時間を減少させることが望まれるものを治療するために使用され得る。したがって、この菌株を用いて治療される好ましい状態は便秘又は疝痛である。ＭＭＣ周波数、ＭＭＣ速度及び管腔内ピーク圧のそれぞれを増加させる能力を持たせることによって胃腸運動を増加させることができ、例えば、腸間膜求心性神経の発火を減少させる能力を持たせることによって（例えば、腸間膜求心性神経束の発火頻度を減少させることによって）疼痛シグナル伝達を減少させることができる菌株、例えば、Ｌ．ガセリ株は、本発明の好ましい態様を形成する。
【００７２】
或いは、例えば、治療のために腸運動障害が、腸を通る物質の通過時間を増加させることが望まれるもの（例えば、迅速な移動通過を伴う障害）、例えば、ＩＢＳ又は下痢である場合、本方法の段階ａ）において、目的とする薬剤は、例えば、ＭＭＣ周波数又はＭＭＣ速度又は管腔内圧、例えばＰＰｒを減少させることによって、胃腸運動を減少させるように作用する。好ましい薬剤は、少なくともＭＭＣ速度を減少させる。好ましい薬剤は、これらのパラメータの２つ以上を減少させ、例えば、ＭＭＣ速度とＭＭＣ周波数を減少させ、又はＭＭＣ周波数及び管腔内圧（例えば、ＰＰｒ）を減少させ、又はＭＭＣ速度と管腔内圧（例えば、ＰＰｒ）を減少させる。最も好ましい薬剤は、これらのパラメータのすべてを減少させ、例えば、ＭＭＣ周波数、ＭＭＣ速度及び管腔内圧（例えば、ＰＰｒ）を減少させる。本方法の段階ａ）は、小腸又は大腸由来の適切な胃腸部分、例えば、小腸については空腸部分又は大腸については結腸部分について評価され得る。いくつかの実施形態において、大腸、例えば結腸部分の使用が好ましい。
【００７３】
このような障害の治療について、疼痛シグナル伝達に影響を与えず若しくはそれを増加させず、又は好ましくは疼痛シグナル伝達を減少させるように作用する薬剤が選択される。本方法の段階ｂ）において、このような薬剤は、効果を与えない、又は好ましくは腸間膜求心性神経発火を低減し若しくは減少させるように作用する。好ましくは、上記薬剤は、効果を与えない、又は好ましくは腸間膜求心性神経束の自発発火頻度を減少させるように作用する。本方法の段階ｂ）は、小腸又は大腸由来の適切な胃腸部分、例えば、小腸については空腸部分又は大腸については結腸部分について評価され得る。いくつかの実施形態において、小腸、例えば空腸部分の使用が好ましい。
【００７４】
本発明の方法を用いて、本発明者らは、ＭＭＣ速度を減少させ、ＭＭＣ周波数及び管腔内ピーク圧に影響を与えないことによって、胃腸運動を減少することが示されている新規な菌株であるラクトバチルス・ガセリ６２１Ａ（ＬＧ６２１Ａ）を選択している。この菌株はまた、腸間膜求心性神経発火を減少させることによって（腸間膜求心性神経束の発火頻度を減少させることによって）、疼痛シグナル伝達を減少させることが示されている。この単離された細菌株（及び、この寄託された菌株の特徴、例えば、胃腸運動及び疼痛シグナル伝達に対する上記で言及した効果を増加させる能力を有する他の菌株、例えば、Ｌ．ガセリ株）は、本発明の好ましい態様を形成し、腸運動障害、特に、腸を通る物質の通過時間を増加させることが望まれるもの（例えば、迅速な移動通過を伴う障害）を治療するために使用され得る。したがって、この菌株を用いて治療される好ましい状態はＩＢＳ又は下痢である。例えば、ＭＭＣ周波数、ＭＭＣ速度及び管腔内ピーク圧（好ましくはＭＭＣ速度）の１つ以上を減少させる能力を持たせることによって胃腸運動を減少させることができ、例えば、腸間膜求心性神経の発火を減少させる能力を持たせることによって（例えば、腸間膜求心性神経束の発火頻度を減少させることによって）疼痛シグナル伝達を減少させることができる菌株、例えば、Ｌ．ガセリ株は、本発明の好ましい態様を形成する。
【００７５】
上記から、本発明の方法はまた、胃腸運動障害の治療に適切でない薬剤を選択又は同定するために使用され得て、例えば、ＭＭＣ速度又はＭＭＣ周波数又は管腔内圧の１つ以上、又は２つ以上、又は３つすべてに何ら影響を示さない薬剤は、特に、このような薬剤が疼痛シグナル伝達の低減において有益な効果を有さない場合、腸運動障害の治療における使用に適さない場合がある。特に、これらのパラメータのいずれにも影響を示さないこれらの薬剤は、腸運動障害の治療に適している可能性はない。さらに、本方法の段階ｂ）において、腸間膜求心性神経発火の増加によって測定される疼痛シグナル伝達を増加させる効果を有するこれらの薬剤は、腸運動障害の治療に適している可能性はない。
【００７６】
したがって、本発明のさらなる好ましい態様は、治療における使用のために、より具体的には、本明細書に記載されているものなどの腸運動障害の治療における使用のために本発明の方法によって選択される薬剤、好ましくは細菌の菌株を提供する。治療される適切な腸運動障害は、本明細書中の他の場所に記載されている。本発明の薬剤又は細菌株によって治療される好ましい腸運動障害は、腸を通る物質の通過時間を低減させることが望まれるもの、例えば、疝痛、逆流又は便秘である。他の好ましい腸運動障害は、腸を通る物質の通過時間を増加させることが望まれるもの、例えばＩＢＳ又は下痢である。
【００７７】
また、腸運動障害を患っている対象を治療する方法は、本発明によって提供され、該方法は、該腸運動障害を治療するのに有効な量で該対象に、本発明の方法によって選択される薬剤、好ましくは細菌の菌株を投与することを含む。
【００７８】
また、腸運動障害を患っている対象を治療する方法は、本発明によって提供され、該方法は、該腸運動障害を治療するのに有効な量で該対象に、本発明の細菌の菌株を投与することを含む。好ましい菌株は、本明細書の他の場所に記載されるように、腸運動障害を治療するためのＬＧ３４５Ａ又はＬＧ６２１Ａである。
【００７９】
好ましい腸運動障害及び他の好ましい特徴は、本発明の他の態様について本明細書の他の場所に記載されている。
【００８０】
また、腸運動障害の治療に使用するための組成物又は医薬の製造における、本発明の方法によって選択される薬剤、好ましくは細菌の菌株の使用が本発明によって提供される。
【００８１】
また、腸運動障害の治療に使用するための組成物又は医薬の製造における、本発明の細菌の菌株の使用は、本発明によって提供される。好ましい菌株は、本明細書の他の場所で説明されている腸運動障害を治療するためのＬＧ３４５Ａ又はＬＧ６２１Ａである。
【００８２】
好ましい腸運動障害及び他の好ましい特徴は、本発明の他の態様について本明細書の他の場所に記載されている。
【００８３】
本明細書に記載されている本発明の方法及び使用において、用語「増加する」、「減少する」、「低減する」などは、レベルの測定可能な変化、好ましくはレベルの有意な変化、より好ましくは統計学的に有意な変化、好ましくは≦０．０５の確率値を意味する。
【００８４】
本発明の方法を用いて治療するための好ましい対象は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。治療される腸運動障害が便秘である場合、好ましい対象は、高齢患者又は妊娠中の女性である。高齢患者は、一般的に、７０歳以上の患者であると理解される。治療される腸運動障害が疝痛である場合、好ましくは、これは乳児疝痛である。
【００８５】
本発明のさらなる態様は、本明細書の他の場所で定義されている治療的使用について、本発明の薬剤又は菌株（例えば、本発明の方法によって選択された薬剤又は菌株）を含む製造物を提供し、ここで、上記使用は、少なくとも１つのさらなる治療剤又は栄養剤の投与をさらに含む。このような実施形態において、さらなる治療剤は、対象とする腸運動障害の治療に有用な任意のさらなる薬剤であってもよい。さらなる栄養剤は、任意の適切な栄養成分、例えば、食品又は食品サプリメントであってもよい。
【００８６】
上記のさらなる薬剤は、本発明の薬剤若しくは菌株（例えば、組成物として）と一緒に投与することができ、又は別々に投与することができる。加えて、上記のさらなる薬剤は、本発明の薬剤若しくは菌株と同時に、又は異なる時点で投与されてもよい。適切な投与計画及び時期は、対象とするさらなる薬剤に応じて、当業者によって容易に決定することができる。
【００８７】
本発明はまた、以下：
（ｉ）本発明の選択方法によって得ることができる薬剤、好ましくは細菌の菌株、又は本明細書の他の場所で定義される本発明の細菌の菌株；及び
（ｉｉ）医薬として許容される担体、希釈剤若しくは賦形剤、食品又は食品サプリメント、又はさらなる治療剤若しくは栄養剤からなる群から選択される少なくとも１つの追加の成分
を含む組成物を提供する。したがって、上記組成物は、医薬組成物又は栄養組成物として、例えば食品製造物として製剤化することができる。
【００８８】
本明細書中で定義される本発明の薬剤、菌株及び組成物の治療的使用は、関連する障害又は障害の症候の低減、予防又は軽減を含む（例えば、疾患症候の変調をもたらすことができる）。障害又はその症候のこのような低減、予防又は軽減は、任意の適切なアッセイによって測定することができる。好ましくは、障害又は症候の低減又は軽減は、統計学的に有意であり、好ましくは確率値は＜０．０５である。障害又は症候のこのような低減又は軽減は、一般的に、適切な対照個体又は集団、例えば、健康な対象又は未処置若しくはプラセボ処置の対象と比較して決定される。
【００８９】
薬剤、菌株、組成物などの投与及び製剤化の適切な様式は、疾患部位に依存して選ばれる。しかしながら、好ましい投与様式は経口であり、いくつかの治療に対しても同様に、静脈内又は筋肉内注射は適切である。
【００９０】
本明細書に定義されている本発明の薬剤、菌株及び組成物の適切な投薬量は、治療される障害、投与様式及び関連した製剤化に応じて、当業者によって容易に選ばれ又は決定され得る。
【００９１】
上述されるように、本明細書における本発明を用いて、発明者らは、２つの新規な菌株であるラクトバチルス・ガセリ３４５Ａ及びラクトバチルス・ガセリ６２１Ａを得ている。これらの菌株は、２０１３年４月１８日にＤＳＭＺ（Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託され、それぞれ、ＤＳＭ２７１２３及びＤＳＭ２７１２６の番号が割りあてられている。
【００９２】
運動障害に影響を与える薬剤の効果は、ほとんどの場合、多因子性であり、ＧＩ管の様々な部分で異なり、結果として、特定の障害について最良の薬剤を見出す方法で研究されなければならないという、本明細書における本発明者らによる発見が本発明の方法に導いた。
【００９３】
したがって、本明細書におけるモデルを用いることによって、特定の運動障害の治療、予防又は調節に適した薬剤を見出すことが本発明の目的である。
【００９４】
本発明の一実施形態において、目的は、ヒト、特に高齢者における便秘の予防又は治療に有効である、栄養化合物又は医薬のいずれかとしての潜在的な用途を有する化合物又は他の薬剤を選択することである。
【００９５】
本発明の一実施形態において、目的は、ヒト、特に高齢の対象又は妊娠中の女性における便秘の予防又は治療に有効であり得るプロバイオティクス菌株を選択することである。
【００９６】
別の実施形態において、本発明の目的は、乳児疝痛の予防又は治療に有効であり得る薬剤、例えば、プロバイオティクス株を選択することである。
【００９７】
別の実施形態において、本発明の目的は、例えば、下痢若しくは他の運動障害の予防又は治療に有効であり得る薬剤、例えばプロバイオティクス株を選択することであり、ここで、速度を減少させ、それによって通過時間を増加させることは有益である。
【００９８】
本発明の一実施形態において、目的は、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）を治療し又はその症候を調節するのに有効であり得る薬剤、例えば、プロバイオティクス株を選択することである。このような薬剤は、好ましくは何ら疼痛を引き起こさずに、好ましくは疼痛を低減させるために、通過時間を増加させるように選択される。
【００９９】
さらに別の実施形態において、本発明の目的は、便失禁の予防に有効であり得る薬剤、例えば、プロバイオティクス株を選択することである。
【０１００】
さらに別の実施形態において、本発明の目的は、対象、特に高齢者において良好な栄養摂取を促進し又はもたらすように、何ら疼痛を引き起こさずに、好ましくは疼痛を低減させて、小腸及び大腸における混合を増加させるのに有効であり得る薬剤、例えばプロバイオティクス株を選択することである。
【０１０１】
以下は、本明細書における本発明の使用の制限であることを意味しないが、本発明がどのように使用し得るかについての実例を詳細に示す、本発明のいくつかの例である。例１は、時空間マッピング（ＳｔＭａｐ）ソフトウェアプラグインの説明に関し、例２は、有効な薬剤の選択の段階に関し、例３は、特定の運動障害のための薬剤の選択に関する。
【実施例】
【０１０２】
（例１）
ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェアに関するＳｔＭａｐプラグインの説明；
ＩｍａｇｅＪは、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ用のＮＩＨ  Ｉｍａｇｅから開始されたパブリックドメインＪａｖａ（登録商標）画像処理プログラムである。それは、オンラインのアプレットとして又はダウンロード可能なアプリケーションとして、Ｊａｖａ（登録商標）１．４以降の仮想マシンを有する任意のコンピュータ上で実行される。ダウンロード可能な販売は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ｍａｃ  ＯＳ、Ｍａｃ  ＯＳ  Ｘ及びＬｉｎｕｘ（登録商標）で利用できる。
【０１０３】
ＩｍａｇｅＪは、Ｊａｖａ（登録商標）プラグインを経由して拡張性を提供するオープンアーキテクチャを用いて設計された。カスタム取得、分析及び処理のプラグインは、エディター及びＪａｖａ（登録商標）コンパイラに組み込まれたＩｍａｇｅＪを用いて開発することができる。ユーザーが作成したプラグインにより、ほぼいずれもの画像処理又は分析問題を解決することを可能にする。
【０１０４】
本発明者らは、図６の詳細に従って、（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で利用可能なソフトウェアの説明（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ），９０００  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）によるプラグインを開発した。ＲＯＩは「関心領域（Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」の略である。
【０１０５】
（例２）
運動障害に有効な薬剤の選択。
この選択は二段階法を含む。第一段階は、ビデオ録画及び時空間マップに加えた管腔内圧変化の同時記録を使用する。第二段階は神経のシグナル伝達の分析である。
【０１０６】
すべての薬剤を対照と比較し、薬剤は互いには比較されず、これは試験される薬剤ごとに１つのグラフをもたらす。
【０１０７】
第一段階、時空間分析
本発明者らは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した成熟雄性Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（２０〜３０ｇ）を用いた。マウスは、動物の使用及びケアに関するＭｃＭａｓｔｅｒガイドラインに沿って、頚椎脱臼により屠殺した。すべてのその後の手順はエクスビボであった。
【０１０８】
浴運動記録
４ｃｍ長の空腸又は遠位結腸部分を摘出し、内容物は、２ｈＰａの重力圧ヘッド下でクレブス生理食塩水を用いて該部分を洗浄することによって空にすることができた。それぞれの部分は、２０ｍｌの浴チャンバー内に載置され、酸素化されたクレブスに浸漬された（図１Ａ）。口と肛門の端にカニューレを挿入し、管腔は、いくつかのマリオットボトルを使用して、（９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２）−−ガスが供給されたクレブスで重力灌流した。管腔内コンパートメントを室温の緩衝液（１９〜２２℃）を用いて０．５ｍｌ／分で灌流した。器官チャンバー（漿膜コンパートメント）を予め温められた（３４℃）、カルボゲンでガス供給されたクレブス溶液を５ｍｌ／分の速度で灌流した。酸素化されたクレブス緩衝液は、以下の組成であった（ｍＭ）：カルボゲンガス（９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２）で泡立てられた１１８  ＮａＣｌ、４．８  ＫＣｌ、２５  ＮａＨＣＯ３、１．０  ＮａＨ２ＰＯ４、１．２  ＭｇＳＯ４、１１．１  グルコース、及び２．５  ＣａＣｌ２。実験の開始時、管腔内圧を３ｈＰａに調整し、この充填圧力で記録した。細菌は、図１Ａに示されるように、適切な栓を開閉して、クレブスを含有するマリオットボトルからの口腔管腔流入を、クレブス＋細菌を含有するものにスイッチすることによって適用された。管腔内圧変化は、胃腸部分の長手方向軸の中間点で測定された。圧力シグナルを増幅し、デジタル化し、パーソナルコンピュータに保存し、ＰＣｌａｍｐ  ９ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙ  Ｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてオフラインで分析した。
【０１０９】
画像は、胃腸部分の１０ｃｍ上部に配置されたビデオカムコーダー（ＪＶＣ  Ｅｖｅｒｉｏ  Ｈａｒｄ  Ｄｉｓｋ  Ｃａｍｃｏｒｄｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ＧＺ−ＭＧ１５５Ｕ）を用いて記録された（図１Ａ）。記録は、実験期間中、８〜１２ｃｍの視界を用いて圧力記録と同期して開始された。カメラ出力は、１秒あたり３０フレーム（ｆｐｓ）で生ビデオフォーマット（ＭＯＤ）であった。１０分長のビデオクリップは、ビデオ編集ソフトウェア（Ａｖｉｄｅｍｕｘ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．５．０、ｗｗｗ．ａｖｉｄｅｍｕｘ．ｏｒｇで利用可能なオープンソースソフトウェア）を用いてＭＯＤファイルから切り出された。次に、クリップは、ビデオコンバーター（Ｚｕｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１、ｈｔｔｐ：／／ｆｆｍｐｅｇ．ｍｐｌａｙｅｒｈｑ．ｈｕで入手可能なオープンソースソフトウェア）を用いて、ＭＯＶフォーマットに変換された。最終的なビデオクリップは、３８４×２５６ピクセルの解像度及び２５ｆｐｓにリサンプリングされた。ビデオ録画は、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪ（バージョン１．４３ｃ、ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／で利用可能なオープンソースソフトウェア）として開発された社内の画像処理ソフトウェア（ＳｔＭａｐ、例１参照）を用いて分析された。ソフトウェアは、白黒シルエット（１Ｃ）にビデオの各フレームで画像（ＩＢ）に変換し、エッジ検出ルーチンを使用して時空間マップを作製する。ルーチンは、最初に、胃腸に沿った各位置で径を測定し、次に、色相値（０〜２５５の範囲、黒から白）として各位置での物理的な径を表す。胃腸径が収縮中に減少すると、色相値は０に向かって低減し、より暗い値に向かうように表示される。ソフトウェアが各１０分間のクリップを通して読み込むと、時空間マップ−３セットの情報：胃腸に沿った位置（縦軸）、時間（横軸）及び胃腸径（高さ軸又はｚ軸）を含む明るい色素と暗い色相との交互のバンドパターンを作製する（図１Ｄ）。これらの変数を用いると、時空間マップは、運動「フィンガープリント」となり、その感度は、特定のプロバイオティクス株及び他の薬剤が、運動において有する詳細な効果と微妙な効果及びそれらの間を区別する能力の定義に極めて重要である。
【０１１０】
ＳｔＭａｐは、各位置で径の変化を測定するため、ＳｔＭａｐは、多数の２Ｄ径対時間グラフの積み重ねとして解釈され得る。実際に、マップに関して、圧力変換器の位置が同定され（図２Ａの点線）、グレースケール対時間グラフ（図２Ｂ）として示される場合、このグラフは、その地点で記録する同時に記録された圧力対時間と一致する（図２Ｃ）。
【０１１１】
運動パラメータは、ＳｔＭａｐプラグインを用いて時空間マップから直接測定された。このシステムでは、本発明者らは、収縮が腸神経系に依存し、又は（リズミカルな筋収縮によって駆動されるが、ニューロンに依存しない）筋原性であるかどうかについて（テトロドトキシンニューロンサイレンシングを使用した）試験することができる。神経系によって生じ、肛門に伝播し、伝播性運動群ＭＣは、左から右に対角線上に傾斜する厚い暗いバンドを生じさせた；伝播速度（ｍｍ  ｓ−１）は、各バンドの傾き（単数又は複数）から測定される（図３）。それぞれの処置について、３〜５個の連続したＭＣの傾きが伝播速度を計算するために平均化された。ＭＣ周波数（ｍＨｚ）は、１０分間のセグメント中に暗いＭＣバンドの数をカウントすることによって計測された。ＭＣ振幅は、直接、ベースライン径（図２Ｂ）又は圧力（図２Ｃ）から次のピークに測定され、それぞれの処置について３つの値が平均化された。径の変化率（ｃｍ／ｓ）は、径が基準から最大限に収縮するのにかかる時間から計算された（（図２Ｂ）におけるＭＣの下降）。
【０１１２】
試験される薬剤
ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）（ＪＢ−１）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）（ＤＳＭ１７９３８）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）  ＡＴＣＣ  ＰＴＡ６４７５、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）３４５Ａ（ＤＳＭ２７１２３）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）６２１Ａ（ＤＳＭ２７１２６）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）Ｔ１及びラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）Ｔ２はすべて、本発明の方法の第一段階で試験された。
【０１１３】
細胞数は光学的に測定され、生存率は、常に、増殖培地寒天プレート上に播種後、増殖する能力によって確認した。凍結ストックからの細胞を解凍し、２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ペレットを同容量のクレブス緩衝液に懸濁させた。次に、懸濁液を再度遠心分離し、細胞を除去し、元の濃度でクレブスに再懸濁させた。使用直前に、細菌は、新鮮なクレブス緩衝液で作業濃度に希釈された。
【０１１４】
細菌を含むクレブスは、管腔内コンパートメントに供給され、一方、イオンチャネル調節薬は漿膜コンパートメントを灌流するクレブス緩衝液に添加された。薬剤溶液がタップから記録チャンバーに流れるのに必要とされる時間は３０秒であった。ＩＫＣａイオンチャネルブロッカーである１−［（２−クロロフェニル）ジフェニルメチル］−１Ｈ−ピラゾール（ＴＲＡＭ−３４）（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ，ＭＯ，ＵＳＡ）は、純粋なジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解され、１０ｍＭのストック溶液を作製した。これらは、使用の３０分前に作業濃度を作るために、酸素化されたクレブスに希釈された。ＩＫＣａチャネルオープナーである５，６−ジクロロ−１−エチル−２−ベンゾイミダゾリノン（ＤＣＥＢＩＯ）（Ｔｏｃｒｉｓ）は、ＤＭＳＯに溶解され、１０ｍＭのストック溶液を作製した；クレブス緩衝液中で最終的な作業濃度は、０．１又は１μΜであった。
【０１１５】
薬剤は、上記の提示された第一段階に従って分析され、結果を図７に示す。
【０１１６】
統計
統計は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて計算された。記述統計は、平均±ＳＤとして示されているが、濃度−反応プロットにおいて、サンプリング誤差はＳＥＭを用いて表示される；試料サイズはｎで示される。有意性の試験に関する統計的に識別可能な差をＰ＝０．０５に設定した；すべての試験は２検定であった。
【０１１７】
第二段階、神経シグナル伝達の分析
すべての手順は、動物ケアガイドラインにおけるカナダ評議会に順守し、Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって承認された（許可番号０８−０８−３５）。
【０１１８】
細胞外記録
成熟雄性Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（２０〜３０ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。マウスを頚椎脱臼により屠殺した。すべてのその後の手順はエクスビボであった。接着した腸間膜組織を含む切り出された遠位空腸の部分（約２．５ｃｍ）を安楽死させた動物から取り出し（図４）、即座に、以下の組成（ｍＭ）：カルボゲン（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）で泡立てられた１１８  ＮａＣｌ、４．８  ＫＣｌ、２５  ＮａＨＣＯ３、１．０  ＮａＨ２ＰＯ４、１．２  ＭｇＳＯ４、１１．１  グルコース、及び２．５  ＣａＣｌ２のクレブス緩衝液で満たされたシルガード被覆された記録用ペトリディッシュに配置させた。消化管部分の口と肛門端は、プラスチックチューブでカニューレを挿入し、酸素化されたクレブス緩衝液で満たされた装着シリンジを用いて、穏やかに空にされた；次に、部分及び腸間膜組織をピンで留め、Ｂａｒｂａｒａら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １３２，Ｉｓｓｕｅ  １，Ｐａｇｅｓ  ２６−３７，Ｊａｎｕａｒｙ  ２００７年）によって記載されるように、腸間膜神経束は実体顕微鏡下での注意深い解剖によって単離された（図５）。調製物は、倒立顕微鏡に移され、管腔は、いくつかのマリオットボトルを用いて、室温（約２２℃）の酸素化されたクレブス及び／又は添加物より、０．５〜１ｍｌ／分で重力灌流された。漿膜コンパートメントは、別々に、３〜５ｍｌ／分で予め温めた（３４℃）クレブス溶液で灌流させた。神経束は、パッチクランプ電極ホルダ（ＣＶ−７Ｂ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）に接続させたガラスピペットに吸引によって穏やかに引き込まれ、細胞外神経記録は、マルチクランプ７００Ｂ増幅器及びＤｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａシグナルコンバータ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて行われた。電気シグナルは、０．１〜２ｋＨｚでバンドパスフィルターをかけられ、２０ｋＨｚでサンプリングされ、事後分析のためにｐＣｌａｍｐ  １０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を実行するパーソナルコンピュータに保存された。
【０１１９】
迷走神経切断術
いくつかの実験について、横隔膜下迷走神経切断術は、以前記載されたように行われた（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｌｅｉｊ  Ｈ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９５：１１３１−１１３７，２００８年）。動物は、電気生理学的実験のために、空腸及び腸間膜組織を採取する前の１０〜１４日間回復させた。疑似迷走神経切断術を３匹の動物において実施した。術後、マウスの体重及び一般的な健康状態を毎日測定した。本発明者らは、迷走神経切断術を施された動物又は疑似処置を施された動物のいずれかにおいて、術後１週間で体重増加における有意差の証拠を見出さなかった。迷走神経切断術を施されたすべてのマウスは、各実験後、コレシストキニン（ＣＣＫ）の漿膜適用への反応を記録することによって、手順の完全性について試験された。
【０１２０】
本発明者らがＣＣＫは腸間膜神経発火率を増加させなかったことを見出したときに、迷走神経切断術は有効であったとみなした。
【０１２１】
空腸部分の完全性
実験中に上皮を通過する細菌の転座に関して、空腸部分の完全性を試験するために、本発明者らは、ＪＢ−１を５−（６）−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、１０９／ｍｌクレブスの濃度でこれらを管内腔に配置し、７５分間のインキュベート後、パラホルムアルデヒド中に組織を固定し、共焦点顕微鏡（デュアルレーザー顕微鏡，ＬＳＭ  ５１０，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において上皮下におけるそれらの存在について切片を調べた。ＪＢ−１をＰＢＳ中で２回洗浄し、５％ウシ胎仔血清が補足されたＰＢＳ中で５μＭのＣＦＳＥの最終濃度に懸濁させ、２５分間３７℃にてインキュベートした。組織（ｎ＝３）を４％パラホルムアルデヒド中に４℃にて一晩固定し、次に、ＰＢＳ中で３回、各１０分間洗浄し、１０μｍと３０μｍの切片を作製し、横断面を顕微鏡スライドに移し、載置した。次に、これらは、Ｚ−スタッキング方法論によって光学スライスにおいて観察された。
【０１２２】
試験される薬剤
ラクトバチルス・ラムノサス（ＪＢ−１）、ラクトバチルス・ロイテリ（ＤＳＭ１７９３８）、ラクトバチルス・ロイテリ  ＡＴＣＣ  ＰＴＡ６４７５、ラクトバチルス・ガセリ３４５Ａ（ＤＳＭ２７１２３）、ラクトバチルス・ガセリ６２１Ａ（ＤＳＭ２７１２６）、ラクトバチルス・ガセリＴ１及びラクトバチルス・ガセリＴ２はすべて、本発明の方法の第二段階で試験された。
【０１２３】
細胞数は光学的に測定され、生存率は、増殖培地寒天プレート上に播種後、増殖する能力によって確認した。生きたＬ．ラムノサスは、凍結された（−８０℃）１ｍｌ分注液から増殖させ、これは、Ｍａｎ−Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅブロス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）中の５×１０９細胞からなっていた。凍結ストックからの細胞を解凍し、２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ペレットを同容量のクレブス緩衝液に懸濁させた。懸濁液を再度遠心分離し、細胞を除去し、元の濃度でクレブスに再懸濁させた。使用直前に、細菌は、クレブス緩衝液で作業濃度に希釈された。いくつかの実験について、細菌は、（ブロス中で）解凍後、直接、作業濃度に希釈された；細菌は、常に、空腸部分の管腔に適用された。硫酸化されたコレシストキニン（２５−３３）（ＣＣＫ；ＡｎａＳｐｅｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）をＤＭＳＯに溶解し、１ｍＭのストック溶液を作製した。分注液は、実験の当日、クレブス緩衝液で作業濃度に希釈され、最終のＤＭＳＯ濃度は≦０．０００１％であった。
【０１２４】
オフラインデータ分析
腸間膜求心性神経束の複合ユニット及び単一ユニットの自然発火頻度は、Ｃｌａｍｐｆｉｔ１０．２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定された。測定の両方法（複合ユニットスパイク放電及び波形分析）は、日常的に使用し、異なる処置によって誘導された腸間膜神経繊維の興奮性の変化を決定した。複合ユニットスパイクの時期は、Ｃｌａｍｐｆｉｔのピーク検出モジュールを用いて決定され、平均周波数をスパイク間隔から計算した。単一ユニット活性は、Ｃｌａｍｐｆｉｔのスパイク形状自動テンプレート検出ツール（コンピュータ化された波形分析）を用いて複合ユニット活性から単離された。テンプレート検出後、差は、常に目視で確認し、視覚的に非スパイク形態事象を破棄した（＜０．２％）。結果を図８に示す。
【０１２５】
統計
データは、平均±ＳＥＭとして表され、ｎは、記録された空腸部分の総数を意味する；同一動物から記録された部分の最大数は２であった。ウィルコクソン検定は、対になったデータ比較のために使用され、分散の反復測定分析のためのダン事後検定を伴うフリードマン検定は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて行われた。自発活動の大きな変化は、複合ユニットの神経活動における１つの調製物と他の調製物の間で発生する可能性があるため、処置が記録される前後で、すべての比較が互いに対となり、それぞれの神経束がそれ自身の対照として機能した。差異は、Ｐ≦０．０５である場合、有意とみなされた。
【０１２６】
（例３）
Ａ．本発明の定義された段階を用いて、運動障害（例えば、高齢者における便秘）の治療を助けるための最適なプロバイオティクス細菌剤の選択；
ラクトバチルス・ラムノサス（ＪＢ−１）、ラクトバチルス・ロイテリ（ＤＳＭ１７９３８）、ラクトバチルス・ロイテリ  ＡＴＣＣ  ＰＴＡ６４７５、ラクトバチルス・ガセリ３４５Ａ（ＤＳＭ２７１２３）、ラクトバチルス・ガセリ６２１Ａ（ＤＳＭ２７１２６）、ラクトバチルス・ガセリＴ１及びラクトバチルス・ガセリＴ２が、例２に従って分析される。結果を表１にまとめる。
【表１】
2018090616.tif 000002
【０１２７】
Ｌ．ロイテリＤＳＭ１７９３８及びＬ．ガセリ３４５Ａは、結腸においてＭＭＣ速度を増加させ、さらに、結腸においてパラメータＰＰｒ又はＭＭＣ周波数の少なくとも１つを増加させる（Ｌ．ロイテリＤＳＭ１７９３８はＭＭＣ周波数を増加させ、Ｌ．ガセリ３４５ＡはＰＰｒを増加させる）。これらの菌株の両方は、腸間膜求心性神経束の自然発火の周波数を減少させる。したがって、これらの株は、疝痛、例えば乳児疝痛などの疝痛を治療するために選択され、これは、これらの菌株が、ＭＣ伝播の流れの速さを増加させ、同時に、腸間膜求心性神経束の発火頻度を減少させる。
【０１２８】
ＭＭＣ速度の増加、及びＬ．ロイテリＤＳＭ１７９３８とＬ．ガセリ３４５Ａによって引き起こされる腸間膜求心性神経束の自然発火の頻度の減少が、特に低減が望まれる妊娠中の女性、又は高齢者において、便秘の治療に適したものとさせる。
【０１２９】
Ｌ．ラムノサスＪＢ−１とＬ．ガセリ６２１Ａは、ＭＭＣ速度を減少させる。Ｌ．ガセリ６２１Ａはまた、腸間膜求心性神経束の発火の頻度を減少させ、したがって、迅速な移動経過を伴う障害、例えば、ＩＢＳの治療に使用され得る。Ｌ．ラムノサスＪＢ−１は、腸間膜求心性神経束の発火の頻度に影響を与えず、したがって、運動障害の治療に適さない。
【０１３０】
Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ６４７５、Ｌ．ガセリＴ１及びＬ．ガセリＴ２は、ＭＭＣ速度及び腸間膜求心性神経束の発火の自発的頻度のいずれにも何ら影響を示さず、したがって、運動障害における使用に推奨されない。
【図１】
2018090616.tif 000003
【図２】
2018090616.tif 000004
【図３】
2018090616.tif 000005
【図４】
2018090616.tif 000006
【図５】
2018090616.tif 000007
【図６】
2018090616.tif 000008
【図７−１】
2018090616.tif 000009
【図７−２】
2018090616.tif 000010
【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年2月22日(2018.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
伝播性運動群（ＭＭＣ）周波数、ＭＭＣ速度を増加させ、及び腸間膜求心性神経発火を減少させる菌株であって、該菌株が受託番号ＤＳＭ１７９３８でＤＳＭＺに寄託されているラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）である、上記菌株。
【請求項２】
対象に投与した際に疼痛シグナル伝達を減少させる、請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
対象に投与した際に胃腸運動を増加させ、それによって該対象の腸を通る物質の通過時間を減少させる、請求項１に記載の菌株。
【請求項４】
該対象の腸を通る物質の通過時間を減少させることにより、該対象において便秘又は疝痛を発症するリスクを治療又は減少させる、請求項３に記載の菌株。
【請求項５】
請求項１に記載の菌株、及び医薬として許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の菌株、及び食品又は食品サプリメントを含む組成物。
【請求項７】
受託番号ＤＳＭ１７９３８でＤＳＭＺに寄託されているラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株、及び更なる治療剤又は栄養剤を含む組成物。
【請求項８】
便秘又は疝痛を治療し、或いは便秘又は疝痛を発症するリスクを減少させるための、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
便秘又は疝痛を治療し、或いは便秘又は疝痛を発症するリスクを減少させるための、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
便秘又は疝痛を治療し、或いは便秘又は疝痛を発症するリスクを減少させるための、請求項７に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ６４７５、Ｌ．ガセリＴ１及びＬ．ガセリＴ２は、ＭＭＣ速度及び腸間膜求心性神経束の発火の自発的頻度のいずれにも何ら影響を示さず、したがって、運動障害における使用に推奨されない。
本発明の好ましい態様には以下が含まれる。
（１）腸運動障害の治療に有効な薬剤の選択方法であって、前記方法は、
ａ）胃腸運動に対する前記薬剤の効果を分析するために、胃腸部において行われる時空間（ＳＴ）マッピングの段階；及び
ｂ）腸間膜求心性神経発火に対する該薬剤の効果を分析するために、胃腸部において行われるエクスビボでの神経束記録の段階
を含む上記選択方法。
（２）段階ａ）におけるＳＴマッピングがビデオ画像によって行われる、（１）に記載の方法。
（３）段階ａ）が、前記胃腸部における伝播性運動群（ＭＭＣ）周波数及び／又は伝播性運動群（ＭＭＣ）速度を測定するためにＳＴマップを用いることを含む、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）段階ａ）が管腔内圧の測定をさらに含む、（１）から（３）までのいずれか一項に記載の方法。
（５）前記管腔内圧の測定が管腔内ピーク圧（ＰＰｒ）である、（４）に記載の方法。
（６）段階ｂ）が、腸間膜求心性神経束の自然発火頻度を測定することを含む、（１）から（５）までのいずれかに記載の方法。
（７）前記胃腸部が、空腸又は結腸のエクスビボ部である、（１）から（６）までのいずれかに記載の方法。
（８）前記胃腸部がマウス由来である、（１）から（７）までのいずれかに記載の方法。
（９）段階ａ）及びｂ）が、薬剤の管腔内適用の前後で行われる、（１）から（８）までのいずれかに記載の方法。
（１０）前記薬剤が、全細胞、微生物、タンパク質、ペプチド、酵素、又は他の生物学的若しくは化学的物質である、（１）から（９）までのいずれかに記載の方法。
（１１）前記薬剤が、微生物、より好ましくは細菌の菌株である、（１０）に記載の方法。
（１２）（１）から（１１）までのいずれかに記載の方法によって選択される細菌の菌株。
（１３）腸運動障害が、胃腸管を通る物質の通過時間を低減させることが望まれるものであり、段階ａ）において、前記細菌の菌株が胃腸運動を増加させる能力を示し、段階ｂ）において、前記細菌の菌株が腸間膜求心性神経発火を減少させる能力を示す、（１２）に記載の細菌の菌株。
（１４）段階ａ）において、前記細菌の菌株がＭＭＣ周波数を増加させ、又はＭＭＣ速度を増加させ、又は管腔内圧を増加させる能力を示し、段階ｂ）において、前記細菌の菌株が疼痛シグナル伝達を減少させる能力を示す、（１３）に記載の細菌の菌株。
（１５）前記菌株がＬＧ３４５Ａ（ＤＳＭ２７１２３）である、（１３）又は（１４）に記載の細菌の菌株。
（１６）腸運動障害が、胃腸管を通る物質の通過時間を増加させることが望まれるものであり、段階ａ）において、前記細菌の菌株が胃腸運動を減少させる能力を示し、段階ｂ）において、前記細菌の菌株が腸間膜求心性神経発火を減少させる能力を示す、（１２）に記載の細菌の菌株。
（１７）段階ａ）において、前記細菌の菌株がＭＭＣ周波数を減少させ、又はＭＭＣ速度を減少させ、又は管腔内圧を減少させる能力を示し、段階ｂ）において、前記細菌の菌株が疼痛シグナル伝達を減少させる能力を示す、（１６）に記載の細菌の菌株。
（１８）前記菌株がＬＧ６２１Ａ（ＤＳＭ２７１２６）である、（１６）又は（１７）に記載の細菌の菌株。
（１９）前記菌株がＬＧ３４５Ａ（ＤＳＭ２７１２３）又はＬＧ６２１Ａ（ＤＳＭ２７１２６）である細菌の菌株。
（２０）治療に使用するための、（１９）に記載の細菌の菌株。
（２１）腸運動障害の治療に使用するための、（１２）から（１９）までのいずれかに記載の細菌の菌株。
（２２）便秘又は疝痛の治療に使用するための、（１３）から（１５）までのいずれかに記載の細菌の菌株又はＬＧ３４５Ａ株（ＤＳＭ２７１２３）。
（２３）前記便秘が高齢患者若しくは妊娠中の女性における便秘であり、又は前記疝痛が乳児疝痛である、（２２）に記載の使用のための細菌の菌株。
（２４）過敏性腸症候群の治療に使用するための、（１６）から（１８）までのいずれかに記載の細菌の菌株又はＬＧ６２１Ａ株（ＤＳＭ２７１２６）。
（２５）（１２）から（１９）までのいずれかに記載の細菌の菌株を、前記腸運動障害を治療するのに有効な量で対象に投与することを含む、腸運動障害を患っている前記対象を治療するための方法。
（２６）前記胃腸運動障害及び菌株が、（２２）から（２４）までのいずれか一項に定義されている通りである、（２５）に記載の方法。
【外国語明細書】
2018090616000001.pdf