(57)【要約】【課題】ＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患、特に、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症（ＨＡＭ）又はＨＴＬＶ−１関連ぶどう膜炎（ＨＵ）を治療するための医薬組成物の提供。【解決手段】ヒトトランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ: ＴｆＲ）に特異的に結合する抗ＴｆＲ抗体を有効成分として含む、ＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患を治療するための医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトトランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ: ＴｆＲ）に特異的に結合する抗ＴｆＲ抗体又はその断片を有効成分として含む、ＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
抗ＴｆＲ抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）の第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号１、２５及び３で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１、２５及び３で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域（ＶＬ）の第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号４、５及び６で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４、５及び６で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
抗ＴｆＲ抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）の第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号７、８及び９で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７、８及び９で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域（ＶＬ）の第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号１０、１１及び１２で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０、１１及び１２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
抗ＴｆＲ抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）の第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号１３、１４および１５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１３、１４及び１５で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域（ＶＬ）の第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号１６、１７及び１８で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１６、１７及び１８で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
抗ＴｆＲ抗体がヒト抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
抗ＴｆＲ抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化V領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化V領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患がＨＴＬＶ−１関連脊髄症である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患がＨＴＬＶ−１関連ぶどう膜炎である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患、特に、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症（ＨＡＭ）又はＨＴＬＶ−１関連ぶどう膜炎（ＨＵ）を治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（Ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ−１；以下「ＨＴＬＶ−１」と略記する）は、ヒトのＴリンパ球に感染するウイルスである。ＨＴＬＶ−１の感染者は、平成２０年度の厚生労働省の調査によると、国内に１０８万人前後いる。多くのＨＴＬＶ−１感染者は一生無症状のキャリアになるが、約４〜５％の感染者は成人Ｔ細胞白血病（Ａｄｕｌｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ；以下「ＡＴＬ」と略記する）を発症する。その他、一部の感染者は、ＨＴＬＶ−１関連炎症性疾患、たとえばＨＴＬＶ−１関連脊髄症（ＨＴＬＶ−１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ；以下「ＨＡＭ」と略記する）又はＨＴＬＶ−１関連ぶどう膜炎（ＨＴＬＶ−１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｕｖｅｉｔｉｓ；以下「ＨＵ」と略記する）を発症する (非特許文献１、２)。
【０００３】
ＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患は、発症者の数が大変少ないため、病因解明および治療薬開発のための研究が進みにくい。現在、ＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患に対する有効な治療法は確立されていない。
【０００４】
ＨＡＭの病態の特徴として、末梢血および脳脊髄液中においてＨＴＬＶ−１感染細胞の数が非常に多くなり、その量に比例して過剰な免疫応答が誘発されて、ＨＴＬＶ−１特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）が異常に増加することが挙げられる。ＨＡＭの脊髄病変では、神経組織へのウイルス感染は観察されないが、ＨＴＬＶ−１感染ＣＤ４＋Ｔ細胞およびそれを取り囲むＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞浸潤、ならびに炎症性サイトカインの過剰産生が観察される。これらのことから、ＨＡＭの病態は、感染細胞に起因した過剰な免疫応答による神経組織障害であると考えられている（非特許文献２）。ＨＵでは、ＨＴＬＶ−１の感染により炎症がおこると考えられている。
【０００５】
これらの病態をふまえたＨＡＭの治療戦略として、（１）ＨＴＬＶ−１感染細胞の排除、（２）過剰免疫応答の抑制、つまり脊髄炎症の抑制、（３）損傷した脊髄の再生、が挙げられる。ＨＡＭを根治するためには、最終的には脊髄の再生治療が必要である。しかしながら、現在のところ脊髄再生治療法は開発されていない。現在、ＨＡＭの治療法として使われているのは、脊髄炎症を抑える効果のあるステロイド及びインターフェロンの投与である。しかしながら、これらの治療は、一時的症状の改善や症状の進行を抑制するものの、ＨＴＬＶ−１感染細胞の減少効果が乏しいため、効果は持続しない。また、ステロイドやインターフェロンには、感染症の誘発、骨粗鬆症、肝障害などいろいろな副作用があり、症状改善のための長期投与は難しい。これらの問題点を解決する治療法として、ＨＴＬＶ−１感染細胞の排除が一番効果的だと考えられる。ＨＵの治療については、現在ステロイド薬投与による治療法が行われているが、再発しやすいため、やはり感染細胞の除去がもっとも有効な治療法と考えられる。感染細胞を特異的に攻撃し、死滅させる方法の一つは、分子標的療法である。
【０００６】
本発明者らは、これまでＨＴＬＶ−１感染細胞に着目して研究を進めてきた。その結果、ＨＡＭ患者において、ＨＴＬＶ−１はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞に選択的に感染しており、さらにこの感染細胞が免疫応答を過剰に刺激していることがわかった（非特許文献３、４）。また、ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ解析により、ＨＴＬＶ−１に感染したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＨＴＬＶ−１非感染細胞と比べ、ＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）を高発現していることを見出し、抗ＣＣＲ４抗体を用いるＨＡＭの治療法を開発し、特許出願した（特許文献１、２）。しかしながら、抗ＣＣＲ４抗体の臨床使用では、重度の皮膚障害、感染症、肝機能障害など副作用がたびたび発生しており、抗ＣＣＲ４抗体を用いるＨＡＭの治療にも注意が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第５５５２６３０号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４/００７３０３号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Percher F, Jeannin P, Martin-Latil S, Gessain A, Afonso PV, Vidy-Roche A, Ceccaldi PE., “Mother-to-Child Transmission of HTLV-1 Epidemiological Aspects, Mechanisms and Determinants of Mother-to-Child Transmission”Viruses. 2016 Feb 3; 8(2)
【非特許文献２】Matsuura E, Yamano Y, Jacobson S., “Neuroimmunity of HTLV-1 Infection” J Neuroimmune Pharmacol. 2010 Sep; 5(3):310-25
【非特許文献３】Yamano Y., Cohen C. J., Takenouchi N., Yao K., Tomaru U., Li H. C., Reiter Y., Jacobson S., "Increased Expression of Human T Lymphocyte Virus Type I (HTLV-1) Tax11-19 Peptide-Human Histocompatibility Leukocyte Antigen A*201 Complexes on CD4+ CD25+ T Cells Detected by Peptide-specific, Major Histocompatibility Complex-restricted Antibodies in Patients with HTLV-1-associated Neurologic Disease", J Exp Med., 199(10), 1367-1377, 2004
【非特許文献４】Yamano Y., Takenouchi N., Li H. C., Tomaru U., YaoK., Grant C. W., Maric D. A., Jacobson S., "Virus-induced dysfunction of CD4+CD25+ T cells in patients with HTLV-1-associated neuroimmunological disease", J Clin Invest., 115(5), 1361-1368, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述のとおり、ＨＴＬＶ−１感染によるＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患、たとえば、ＨＡＭ又はＨＵの効果的な治療法は現在開発されていない。本発明は、ＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患、特にＨＡＭ又はＨＵに対する有効な抗体療法に用いられうる医薬組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行ったところ、驚くべきことに、ＨＡＭ又はＨＵ患者のＨＴＬＶ−１感染細胞（病因細胞）がトランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴｆＲ）を高発現することを見出し、ＴｆＲに対する抗体を用いて、ＨＡＭ又はＨＵ患者のＨＴＬＶ−１感染細胞に対する効果を検討した。その結果、抗ＴｆＲ抗体は、ＨＡＭ又はＨＵ患者由来のＨＴＬＶ−１感染細胞（病因細胞）の増殖を著しく抑制し、病態と関連するサイトカインの分泌も抑制した。この結果より、抗ＴｆＲ抗体を含む医薬組成物はＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患、特にＨＡＭ又はＨＵの治療に有用であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１１］を提供するものである。
［１］ヒトトランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ： ＴｆＲ）に特異的に結合する抗ＴｆＲ抗体又はその断片を有効成分として含む、ＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患を治療するための医薬組成物。
［２］抗ＴｆＲ抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）の第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号１、２５及び３で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１、２５及び３で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域（ＶＬ）の第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号４、５及び６で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４、５及び６で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列である、［１］に記載の医薬組成物。
［３］抗ＴｆＲ抗体の、重鎖可変領域（ＶＨ）の第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号７、８及び９で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７、８及び９で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域（ＶＬ）の第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、軽鎖第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び軽鎖第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号１０、１１及び１２で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０、１１及び１２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列である、［１］に記載の医薬組成物。
［４］抗ＴｆＲ抗体の、重鎖可変領域（ＶＨ）の第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号１３、１４及び１５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１３、１４及び１５で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域（ＶＬ）の第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、軽鎖第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び軽鎖第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号１６、１７及び１８で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１６、１７及び１８で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列でである、［１］に記載の医薬組成物。
［５］抗ＴｆＲ抗体がヒト抗体である、［１］〜［４］のいずれかに記載の医薬組成物。
［６］抗ＴｆＲ抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化V領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化V領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、［１］〜［５］のいずれかに記載の医薬組成物。
［７］ＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患がＨＴＬＶ−１関連脊髄症である、［１］〜［６］のいずれかに記載の医薬組成物。
［８］ＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患がＨＴＬＶ−１関連ぶどう膜炎である、［１］〜［６］のいずれかに記載の医薬組成物。
［９］ＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患治療用医薬組成物を製造するためのＴｆＲに特異的に結合する抗ＴｆＲ抗体の使用。
［１０］ＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患治療用のＴｆＲに特異的に結合する抗ＴｆＲ抗体。
［１１］ＴｆＲに特異的に結合する抗ＴｆＲ抗体の有効量を投与することを特徴とするＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患の治療方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の医薬組成物によれば、ＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患患者、特にＨＡＭ又はＨＵ患者のＨＴＬＶ−１感染細胞（病因細胞）を効率的に排除することができ、病態とかかわるサイトカインの産生を低減できるため、ＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患、特にＨＡＭ又はＨＵを効果的に治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】抗ＴｆＲ抗体の抗原反応性を示す図である。
【図２】ＨＡＭ患者由来ＰＢＭＣに対する抗ＴｆＲ抗体ＴＳＰ−Ａ７４のＨＴＬＶ−１プロウイルス量（感染細胞率）抑制効果を示す図である。
【図３】ＨＡＭ患者由来ＰＢＭＣに対する抗ＴｆＲ抗体ＴＳＰ−Ａ７４の増殖抑制効果を示す図である。
【図４】ＨＡＭ患者由来ＰＢＭＣ対する抗ＴｆＲ抗体ＴＳＰ−Ａ７４のサイトカイン産生抑制効果を示す図である。
【図５】ＨＡＭ患者由来ＰＢＭＣに対する抗ＴｆＲ抗体ＴＳＰ−Ａ０２及びＴＳＰ−Ａ１７のＨＴＬＶ−１プロウイルス量（感染細胞率）抑制効果を示す図である。
【図６】ＨＡＭ患者由来ＰＢＭＣに対する抗ＴｆＲ抗体ＴＳＰ−Ａ０２及びＴＳＰ−Ａ１７の増殖抑制効果を示す図である。
【図７】ＨＡＭ患者由来ＰＢＭＣ対する抗ＴｆＲ抗体ＴＳＰ−Ａ０２及びＴＳＰ−Ａ１７のサイトカイン産生抑制効果を示す図である。
【図８】ＨＵ患者由来ＰＢＭＣに対する抗ＴｆＲ抗体ＴＳＰ−Ａ７４のＨＴＬＶ−１プロウイルス量（感染細胞率）抑制効果を示す図である。
【図９】ＨＵ患者由来ＰＢＭＣに対する抗ＴｆＲ抗体ＴＳＰ−Ａ７４の増殖抑制効果を示す図である。
【図１０】ＨＵ患者由来ＰＢＭＣに対する抗ＴｆＲ抗体ＴＳＰ−Ａ７４のサイトカイン産生抑制効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
定義および一般的技術
本明細書において別段定義しない限り、本発明に関して使用した科学技術用語は、当業者に通常理解されている意味を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質及び核酸化学並びにハイブリダイゼーションに関して使用した命名法及びその技術は、当技術分野で周知のものであり、通常使用されているものである。
【００１５】
本発明の方法および技術は一般に、別段示さない限り、当技術分野で周知である従来の方法に従って、本明細書全体にわたって引用し論じた種々の一般的参照文献およびより具体的な参照文献に記載されているように実施する。
【００１６】
ＴｆＲ
ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）はヒト３番染色体にコードされ、配列番号２７に示される７６０アミノ酸から構成される一回膜貫通型タンパク質である。このタンパク質は、ＣＤ７１抗原としても知られ、細胞の鉄の取り込みに関与し、細胞の増殖に関与すると考えられている。本発明において、ヒトＴｆＲは、構造上特に限定されず、単量体、多量体、細胞膜に発現しているｉｎｔａｃｔ  ｆｏｒｍ、細胞外領域に構成された可溶化ｆｏｒｍ、ｔｒｕｎｃｔｅｄ  ｆｏｒｍ、遺伝子の変異や欠損などにより生じたｍｕｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒｍ、リン酸化などにより翻訳後修飾を受けたｆｏｒｍなども含む。
【００１７】
抗体
本明細書では必要に応じて、慣習に従い以下の略号（括弧内）を使用する。
重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）、第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）、重鎖の第１相補性決定領域（ＶＨ  ＣＤＲ１）、重鎖の第２相補性決定領域（ＶＨ  ＣＤＲ２）、重鎖の第３相補性決定領域（ＶＨ  ＣＤＲ３）、軽鎖の第１相補性決定領域（ＶＬ  ＣＤＲ１）、軽鎖の第２相補性決定領域（ＶＬ  ＣＤＲ２）、軽鎖の第３相補性決定領域（ＶＬ  ＣＤＲ３）。
【００１８】
本明細書において、「抗体」という用語は、イムノグロブリンと同義であり、当技術分野で通常知られている通りに理解されるべきである。具体的には、抗体は、抗体を作製する任意の方法により限定されるものではない。抗体には、例えば、組換え抗体、モノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体を含む。
【００１９】
本明細書において、「ヒト抗体」という用語は、可変領域および定常領域の配列がヒト配列である任意の抗体を意味する。ヒト抗体は、ヒト遺伝子に由来する配列を有するが、例えば、考えられる免疫原性の低下、親和性の増大、望ましくない折りたたみを引き起こす可能性があるシステインの除去などを行うように変化させている抗体を包含する。また、ヒト抗体には、ヒト細胞に特有でないグリコシル化を施すことができ、非ヒト細胞中で組換えにより作製されたそのような抗体をも包含する。これらの抗体は、公知の手段により、様々な形で調製することができる。
【００２０】
本発明の医薬組成物を構成する抗体の可変領域において、フレームワーク領域（ＦＲ）の配列は、対応する抗原に対する特異的結合性に実質的な影響のない限り、特に限定されない。ヒト抗体のＦＲ領域を用いることが好ましいが、ヒト以外の動物種（例えばマウスやラット）のＦＲ領域を用いることもできる。
【００２１】
本発明の医薬組成物を構成する抗体の一態様においては、可変領域に加えて定常領域を含む（例えばＩｇＧ型抗体）。定常領域の配列は特に限定されず、例えば、公知のヒト抗体の定常領域を用いることができる。ヒト抗体の重鎖定常領域（ＣＨ）としては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更に具体的にはｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのものを用いることができる。また、軽鎖定常領域（ＣＬ）としては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。また、ヒト以外の動物種（例えばマウスやラット）の定常領域を用いることもできる。
【００２２】
本発明の医薬組成物を構成する抗体に用いられるＣＤＲ、ＦＲ又は定常領域のアミノ酸配列は、由来となる元のＣＤＲ、ＦＲ又は定常領域のアミノ酸配列をそのまま用いてもよいし、１又は数個（例えば、１から８個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から３個、特に好ましくは１又は２個）のアミノ酸を欠失、付加、置換及び／又は挿入して異なるアミノ酸配列にして用いてもよい。ここで、「１又は数個のアミノ酸を欠失、付加、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列」とは、前記アミノ酸配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を意味する。
【００２３】
本発明の医薬組成物を構成する抗体は、後述する抗体を産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。得られた抗体が、本発明の抗体と同等の活性を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明で記載されているアミノ酸配列に翻訳後に修飾を受けた抗体も本発明に含まれる。更に、既知の翻訳後修飾以外の部位に対する翻訳後修飾を受けた抗体も、本発明の抗体と同等の活性を有している限り、本発明に含まれる。また、本発明の抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加される。本発明の抗体はこのような抗体も包含する。
【００２４】
本発明の医薬組成物を構成する抗体は、ヒトＴｆＲに特異的に結合する抗ＴｆＲ抗体又はその断片である。このうち、重鎖可変領域（ＶＨ）の第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号１、２５及び３で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１、２５及び３で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域（ＶＬ）の第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号４、５及び６で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４、５及び６で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列である抗ＴｆＲ抗体；重鎖可変領域（ＶＨ）第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号７、８及び９で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７、８及び９で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域（ＶＬ）第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号１０、１１及び１２で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０、１１及び１２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列である抗ＴｆＲ抗体；並びに重鎖可変領域（ＶＨ）第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号１３、１４及び１５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１３、１４及び１５で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域（ＶＬ）第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）がそれぞれ配列番号１６、１７及び１８で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１６、１７及び１８で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列である抗ＴｆＲ抗体が好ましい。ここで、「配列番号１〜１８で示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を欠失、付加、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列」とは、配列番号１〜１８に示すＣＤＲの配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するＣＤＲ配列を意味する。
【００２５】
抗体の作製
（１）ファージディスプレイライブラリーを用いた抗原と反応するｓｃＦｖの取得
本発明の医薬組成物を構成する抗体の取得は、当技術分野で知られているいくつかの方法に従って調製することができる。例えば、ファージディスプレイ技術を使用して、ＴｆＲに対する親和性が様々である抗体のレパートリーを含むライブラリーを提供することができる。次いで、これらのライブラリーをスクリーニングして、ＴｆＲに対する抗体を同定し単離することができる。好ましくは、ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬおよびＶＨｃＤＮＡを使用して生成されるｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。そのようなライブラリーを調製しスクリーニングする方法は、当技術分野で知られている。ヒトＴｆＲを抗原としてスクリーニングした反応性を示すファージクローンから遺伝物質を回収する。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＶＨ及びＶＬのＤＮＡ配列を決定することができる。このｓｃＦｖの配列を用いて、ｓｃＦｖをＩｇＧ化すれば、ヒト抗体を取得することができる。
【００２６】
（２）ｓｃＦｖのＩｇＧ化（ヒト抗体の作製）
Ｈ鎖またＬ鎖の発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、上清を回収・精製することにより、ヒト抗体を取得できる。また、ＶＨ及びＶＬを同一ベクターで発現させること（タンデム型）によっても、ヒト抗体を取得できる。これらの方法は周知であり、例えば、国際公開第９２/０１０４７号、国際公開第９２/２０７９１号、国際公開第９３/０６２１３号、国際公開第９３/１１２３６号、国際公開第９３/１９１７２号、国際公開第９５/０１４３８号、国際公開第９５/１５３８８号、国際公開第９７/１０３５４号などを参考にすることができる。
【００２７】
具体的には、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする他のＤＮＡ分子と連結することによって、完全長重鎖遺伝子を取得することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤの定常領域でよいが、最も好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ２の定常領域である。ＩｇＧ１定常領域配列は、Ｇｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）、Ｇｍ（１７）など、異なる個人間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子またはアロタイプの配列であってもよい。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域中の天然に存在するアミノ酸が置換したものに相当する。
【００２８】
ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域（ＣＬ）をコードする他のＤＮＡ分子と連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（及びＦａｂ軽鎖遺伝子）を取得することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλの定常領域でよい。κ定常領域は、Ｉｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）、Ｉｎｖ（３）など、異なる個人間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子であってもよい。λ定常領域は、３つのλ遺伝子のいずれかに由来するものでよい。
【００２９】
上記のように得られたＨ鎖またＬ鎖コードするＤＮＡを発現ベクター中に挿入することにより、発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、上清を回収・精製することにより、ヒト抗体を取得できる。発現ベクターとしては、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、カリフラワーモザイクウイルスベクターやタバコモザイクウイルスベクターなどの植物ウイルスベクター、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。発現ベクター及び発現調節配列は、使用する発現用宿主細胞と適合するように適宜選択すればよい。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別々のベクター中に挿入することができるし、また両方の遺伝子を同じ発現ベクター中に挿入することもできる。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片上の制限部位とベクター上の相補的な制限部位との連結、または制限部位が存在しない場合には抗体遺伝子断片とベクターの平滑末端連結）によって発現ベクター中に挿入できる。
【００３０】
好適なベクターは、上記のように任意のＶＨまたはＶＬ配列を容易に挿入し発現させることができるように工学的に作製された適当な制限部位を有する、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬイムノグロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターでは、通常、挿入されたＪ領域中のスプライス供与部位とヒトＣドメインに先行するスプライス受容部位の間で、またヒトＣＨエキソン内に存在するスプライス領域でもスプライシングが起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流にある天然の染色体部位で起こる。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞由来の抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることもできる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドがインフレームでイムノグロブリン鎖のアミノ末端と連結するようにベクター中にクローン化することができる。シグナルペプチドは、イムノグロブリンシグナルペプチドでもよく、あるいは異種性シグナルペプチド（すなわち非イムノグロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）でもよい。
【００３１】
本発明の医薬組成物を構成する抗体の発現ベクターは、抗体遺伝子および制御配列に加えて、宿主細胞中でのベクターの複製を制御する配列（例えば複製起点）や選択マーカー遺伝子などのさらなる配列を有してよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンやメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞でメトトレキセート選択／増幅とともに使用する）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｇ４１８選択用）、およびグルタミン酸合成酵素遺伝子がある。
【００３２】
以上の方法で作製された抗体遺伝子発現ベクターにより宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、本発明の抗体を産生させることが可能な細胞であればいかなる細胞でもよいが、動物細胞が好ましい。動物細胞としては、ｄｈｆｒ遺伝子欠失チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ/ＤＧ４４細胞、サル由来細胞ＣＯＳ細胞（A.Wright & S.L.Morrison, J. Immunol., 160, 3393-3402, 1998)、マウスミエローマＳｐ２／０細胞 （K.Motmans et al., Eur. J. Cancer Prev., 5, 512-519, 1996; R.P.Junghans et al., Cancer Res., 50, 1495-1502, 1990)  などが挙げられる。また、形質転換には、リポフェクチン法（R.W.Malone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6077-6081, 1989; P.L.Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417, 1987)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（F.L.Graham & A.J. van der Eb, Virology, 52, 456-467, 1973)、ＤＥＡＥ-Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。
【００３３】
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト抗体を分離することができる。抗体の分離・精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて利用することができる。
【００３４】
抗体断片
本発明の抗体を基にして又は本発明の抗体をコードする遺伝子の配列情報を基にして、抗体断片を作製することができる。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ抗体などが挙げられる。
【００３５】
Ｆａｂは、ＩｇＧをシステイン存在下パパイン消化することにより得られる、Ｌ鎖と、Ｈ鎖可変領域並びにＣＨ１ドメイン及びヒンジ部の一部からなるＨ鎖フラグメントとから構成される分子量約５万の断片である。本発明では、上記抗体をパパイン消化することにより得ることができる。また、上記抗体のＨ鎖の一部及びＬ鎖をコードするＤＮＡを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりＦａｂを調製することもできる。
【００３６】
Ｆａｂ’は、後述のＦ（ａｂ’）２のＨ鎖間のジスルフィド結合を切断することにより得られる分子量が約５万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化し、還元剤を用いてジスルフィド結合を切断することにより得られる。また、Ｆａｂ同様に、Ｆａｂ’をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
【００３７】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをペプシン消化することにより得られる、Ｌ鎖と、Ｈ鎖可変領域並びにＣＨ１ドメイン及びヒンジ部の一部からなるＨ鎖フラグメントとから構成される断片（Ｆａｂ’）がジスルフィド結合で結合した分子量約１０万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化することにより得られる。また、Ｆａｂ同様に、Ｆ（ａｂ’）２をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
【００３８】
ｓｃＦｖは、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域とからなるＦｖを、片方の鎖のＣ末端と他方の鎖のＮ末端とを適当なペプチドリンカーで連結し一本鎖化した抗体断片である。ペプチドリンカーとしては、例えば、柔軟性の高い（ＧＧＧＧＳ）３などを用いることができる。例えば、上記抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡとペプチドリンカーをコードするＤＮＡを用いてｓｃＦｖ抗体をコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりｓｃＦｖを調製することができる。
【００３９】
ｄｓＦｖは、Ｈ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域の適切な位置にＣｙｓ残基を導入し、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域とをジスルフィド結合により安定化させたＦｖ断片である。各鎖におけるＣｙｓ残基の導入位置は、分子モデリングにより予測される立体構造に基づき決定することができる。本発明では、例えば、上記抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域のアミノ酸配列から立体構造を予測し、かかる予測に基づき変異を導入したＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をそれぞれコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、そして当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりｄｓＦｖを調製することができる。
【００４０】
尚、適当なリンカーを用いてｓｃＦｖ抗体、ｄｃＦｖ抗体などを連結させたり、ストレプトアビジンを融合させたりして抗体断片を多量体化することもできる。
【００４１】
ＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患
ＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患は、ＨＴＬＶ−１の感染により起こる炎症性疾患を意味する。当該炎症性疾患としては、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症（ＨＡＭ）、ＨＴＬＶ−１関連ぶどう膜炎（ＨＵ）、ＨＴＬＶ−１に関連する関節炎、皮膚炎、筋炎などが挙げられる。
【００４２】
医薬組成物
本発明によれば、本発明の抗ＴｆＲ抗体を含有する医薬組成物が提供される。本発明の一つの実施形態では、抗ＴｆＲ抗体を含有する医薬組成物はＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患の治療に用いられる。更に好ましい実施形態では、抗ＴｆＲ抗体を含有する医薬組成物はＨＡＭ又はＨＵの治療に用いられる。
【００４３】
本発明の医薬組成物の一態様として、本発明の抗ＴｆＲ抗体が有効成分として利用される。本発明の医薬組成物は、抗体の細胞増殖抑制活性、細胞死誘導活性、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性などを利用し、ＨＴＬＶ−１に関連する炎症性疾患の治療効果を発揮する。抗体は、上記の活性を一つだけ持っていてもよいし、また複数の活性を同時に持っていてもよい。
【００４４】
本発明の抗ヒトＴｆＲ抗体を含有する医薬組成物による製剤も、本発明の範囲内に含まれる。このような製剤は、好ましくは、抗ＴｆＲ抗体を含有する医薬組成物に加え、生理学的に許容され得る希釈剤又はキャリアを含んでおり、他の抗体又は抗がん剤のような他の薬剤との混合物であってもよい。適切なキャリアとして、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されるものではない。或いは、抗ＴｆＲ抗体は凍結乾燥（フリーズドライ）し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用してもよい。
投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、懸濁剤、シロップ剤等による経口投与、注射剤による皮下注、静注、筋注、腹腔内注、経皮、経粘膜、経鼻、経肺、坐薬等による非経口投与を挙げることができる。本発明の医薬組成物による製剤単独の投与でもよいし、他の薬剤と併用して投与してもよい。
【００４５】
本発明の医薬組成物の投与量は、対象の症状、年齢、体重、投与形態などによって異なるが、通常、経口投与では、抗体の量として、成人に対して、１日約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜５００ｍｇ、さらに好ましくは１ｍｇ〜１００ｍｇであり、これらを１回、又は数回に分けて投与することができる。また、非経口投与では、１回約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜５００ｍｇ、さらに好ましくは１ｍｇ〜１００ｍｇを好ましくは皮下注射、筋肉注射又は静脈注射によって投与することができる。
【００４６】
細胞の増殖活性を測定する方法は、特に限定されず、３Ｈ−チミジン取り込み法などの当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。ＨＴＬＶ−１感染細胞（病因細胞）では、培養開始後６〜７日目に増殖活性が最も高くなる。したがって、培養開始後６〜７日目における細胞の増殖活性を測定することが好ましい。細胞の培養方法は、当業者に公知の方法から適宜選択すればよい。
【実施例】
【００４７】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００４８】
ＨＴＬＶ−１関連炎症性疾患であるＨＡＭ又はＨＵの患者の末梢血より分離した末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）を用いて、抗ヒトＴｆＲ抗体の治療効果を検討した。抗ＴｆＲ抗体の作用は、（１）ＰＢＭＣのＨＴＬＶ−１感染細胞率、（２）自発増殖活性、（３）各種サイトカイン産生量の変化により評価した。
【００４９】
参考例１  癌細胞株を使用したファージ抗体スクリーニング
（１）癌細胞に結合するファージ抗体のスクリーニング（肝癌細胞株ＨｅｐＧ２）
ＨｅｐＧ２細胞を１５ｃｍデイッシュで培養し、２ｍｇ/ｍＬ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩ/ ｃｅｌｌ  ｓｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）によりデイッシュから剥離した。細胞を回収し、冷却したＰＢＳで洗浄した後、１×１０１３ｃｆｕのヒト抗体ファージライブラリーを混ぜ、最終容積１．６ｍＬになるように反応液（１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、ＭＥＭ）を添加し、４℃にて４時間ゆっくり回転させて反応させた。反応終了後、反応液を二つに分け、それぞれに事前に用意した０．６ｍＬの有機溶液（ｄｉｂｕｔｙｌ  ｐｈｔａｌａｔｅ  ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ９：１）を重層し、マイクロ遠心機により２分間遠心（３０００ｒｐｍ）した。上清を捨て、チューブの底に沈降した細胞を０．７ｍＬの１％ＢＳＡ/ＭＥＭで懸濁し、更に０．７ｍＬの有機溶媒を重層した。同じように遠心により上清を捨て、細胞を０．３ｍＬのＰＢＳで懸濁し、液体窒素で凍結した。
【００５０】
凍結した細胞を３７℃で解凍し、２０ｍＬの大腸菌ＤＨ１２Ｓ（ＯＤ０．５）に１時間で感染させた。ファージに感染した大腸菌を６００ｍＬの２×ＹＴＧＡ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬ ａｍｐｉｃｉｓｕｌｆａｔｅ、１％  Ｇｌｕｃｏｓｅ）に入れ、３０℃で一晩培養した。その後１０ｍＬを取り、２００ｍＬ  ２×ＹＴＡ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬ  ａｍｐｉｃｉｓｕｌｆａｔｅ）に入れ、３７℃で１．５時間培養した。１×１０１１ヘルパーファージＫＯ７を入れ、更に３７℃で１時間培養した。８００ｍＬの２×ＹＴＧＡＫ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬ  ａｍｐｉｃｉｓｕｌｆａｔｅ、０．０５％  Ｇｌｕｃｏｓｅ、５０μｇ/ｍＬ  ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を添加し、３０℃で一晩培養した。１０分間の遠心（８０００ｒｐｍ）により上清を回収した。回収した上清に２００ｍＬのＰＥＧ液（２０％  ｐｏｌｙｅｔｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ６０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）を入れよく攪拌した後、１０分間の遠心（８０００ｒｐｍ）によりファージを沈殿させた。これを１０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、１ｓｔスクリーニングのファージとした。
【００５１】
次に、２ｎｄスクリーニングを行った。２×１０７培養細胞と１×１０１０１ｓｔスクリーニングのファージを混合し、最終容積０．８ｍＬになるように反応液（１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、ＭＥＭ）を入れた。その後は上記１ｓｔスクリーニングと同様の手法を行い、２ｎｄスクリーニングのファージを取得した。
【００５２】
３ｒｄスクリーニングは１×１０９の２ｎｄスクリーニングのファージを使用し、上記と同じように行った。
【００５３】
（２）ファージ抗体の解析
３ｒｄスクリーニングしたファージを回収し、既存法によりＤＮＡ配列を解析し、欠損領域を保持する不完全な抗体や配列が重複する抗体を排除し、独立した抗体配列を持つファージ抗体を取得した。
【００５４】
同様の手法により、下記の表１に示す２１種類のがん細胞を用いて、がん抗原に反応するファージ抗体のスクリーニングを行った。その結果、表１に示したように、独立配列を有するファージ抗体１８６３個を取得した。
【００５５】
【表１】
2018024615.tif 000002
【００５６】
参考例２  可溶性ヒトＴｆＲと反応するファージのスクリーニング
（１）可溶性ＴｆＲ抗原産生細胞の作製
癌細胞株ＭＩＡＰａＣａ２、ＳＫＯＶ−３を用いて、ＴｆＲのｃＤＮＡをＰＣＲ法により作製した。常法によりＴｆＲ細胞外ドメインのｃＤＮＡを調製し、ｐＣＭＶ-Ｓｃｒｉｐｔ（クロンテック社製）に挿入することにより、可溶性ＴｆＲ抗原発現ベクターを作製した。この発現ベクターを細胞株２９３Ｔへ導入し、可溶性ＴｆＲ抗原を産生する発現細胞を作製した。
【００５７】
（２）ＥＬＩＳＡによる陽性ファージのスクリーニング
上記可溶性ＴｆＲ産生細胞の上清を回収し、精製により可溶性ＴｆＲ抗原を取得した。この可溶性ＴｆＲ抗原を用いてＥＬＩＳＡによる抗原抗体の反応性を検討した。すなわち、可溶性ＴｆＲ抗原をＰＢＳで１０μｇ／ｍＬになるように調製し、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｍｏｄｕｌｅ／Ｓｔｒｉｐ  Ｐｌａｔｅｓ（ＮＵＮＫ）に５０μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で２時間静置した。その後、可溶性ＴｆＲ抗原を捨て、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ液（５％スキムミルク／０．０５％  ＮａＮ３／ＰＢＳ)を２００μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で２時間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除き、ＰＢＳにより洗浄し、上記表１のファージの培養上清を１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＰＢＳ/０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で希釈した１μｇ/ｍＬ  Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｃｐ３を１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、更にＰＢＳ/０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で２０００倍希釈したａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰを１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＯＰＤ  ｉｎ  ０．１Ｍクエン酸リン酸バーファー（ｐＨ５．１）＋０．０１％Ｈ２Ｏ２を１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し室温で５分間反応させた。２Ｎ  Ｈ２ＳＯ２を１００μＬ/ｗｅｌｌ加え、発色反応を停止した。その後、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ３４０ＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果、１８６３株のファージのうち、可溶性ＴｆＲ抗原と顕著な陽性反応を示すものは２０株であった。この２０株のファージのＤＮＡ配列を解析したところ、それぞれのＣＤＲ配列が新規であることが確認された。そのうち、ＴＳＰ−Ａ０１、ＴＳＰ−Ａ０２、ＴＳＰ−Ａ１７抗体のＣＤＲ配列並びにＶＨ及びＶＬの配列を表２〜７に示す。
【００５８】
【表２】
2018024615.tif 000003
【００５９】
【表３】
2018024615.tif 000004
【００６０】
【表４】
2018024615.tif 000005
【００６１】
【表５】
2018024615.tif 000006
【００６２】
【表６】
2018024615.tif 000007
【００６３】
【表７】
2018024615.tif 000008
【００６４】
参考例３  ＴＳＰ−Ａ７４抗体の取得
ＴＳＰ−Ａ０１抗体の生産性の向上及び機能の向上を目的として、ＴＳＰ−Ａ０１抗体の可変領域のＣＤＲ２の２個アミノ酸を改変し、臨床応用のため最適化したＴＳＰ-Ａ７４抗体を作製した。ＴＳＰ−Ａ７４抗体のＣＤＲ配列並びにＶＨ及びＶＬの配列を表８及び９に示す。
【００６５】
【表８】
2018024615.tif 000009
【００６６】
【表９】
2018024615.tif 000010
【００６７】
実施例１  抗ＴｆＲ抗体の抗原反応性検討
ＴｆＲ発現細胞Ｋ５６２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４３：ＣＭＬ）を用いて、ＴＳＰ−Ａ０１、ＴＳＰ−Ａ０２、ＴＳＰ−Ａ１７、ＴＳＰ−Ａ７４の各抗ＴｆＲ抗体の抗原反応性を検討した。Ｋ５６２細胞を遠心により回収し、ＰＢＳで１回洗浄した。その後、ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（１％ＢＳＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＮａＮ３入りＰＢＳ）で細胞を１×１０６／ｍＬになるように懸濁した。この細胞懸濁液１００μＬを９６−ｗｅｌｌ  Ｖ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３８９７）に分注し、さらにそれぞれの抗体をＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒで０．２〜２μｇ／ｍＬに調製し、細胞に添加し、４℃で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒにより２回洗浄した後、ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒで７５０倍に希釈したＡｌｅｘａ４８８−ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）溶液１００μＬを添加し、攪拌した後更に４℃で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒで遠心により２回洗浄し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）のＨＴＳにセットして各ｗｅｌｌのＦＬ１蛍光強度を測定した。図１に示すように、各抗体はＫ５６２細胞に対し強い反応性を示した。
【００６８】
実施例２  ＨＡＭ患者に対する抗ＴｆＲ抗体ＴＳＰ−Ａ７４の治療効果の検討
（１）ＴＳＰ−Ａ７４抗体によるＨＡＭ患者のＰＢＭＣ中のＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡ量の抑制効果
液体窒素中に凍結保存していた６例のＨＡＭ患者のＰＢＭＣ（ＨＡＭ−ＰＢＭＣ）を、３７℃のウォーターバスにて溶解し、１０％  Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ (ＦＢＳ) （ＧＩＢＣＯ：１０４３７−０２８）を含有するＲＰＭＩ−１６４０（ＷＡＫＯ：１８９−０２０２５）培地で洗浄後、同培地を用いて細胞を１×１０６個/ｍＬに調製した。その後、各ＨＡＭ−ＰＢＭＣを、Ｕ底（ｒｏｕｎｄ ｂｏｔｔｏｍ）９６−Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ（ＦＡＬＣＯＮ）に、１０５ｃｅｌｌｓ/１００μＬ/ｗｅｌｌで播種した。ＴＳＰ−Ａ７４又はアイソタイプコントロール抗体Ｐａｂ１４００を、培地で０．０２、０．２、２、２０μｇ/ｍＬとなるよう調製し、各ウェルに１００μＬずつ加え、終濃度０、０．００１、０．０１、０．１、１（１０−３、１０−２、１０−１、１）μｇ/ｍＬとした。コントロールとして、１μｇ/ｍＬのステロイド系抗炎症薬Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰＳＬ）（フナコシ：Ｐ７０１２）を使用した。その後、３７℃ ＣＯ２インキュベーターで培養を行った。
培養開始から７日後、各培養条件につき１０ウェル分の細胞懸濁液（１×１０６個）を集め、遠心し上清を除き、細胞ペレットを回収し、ゲノムＤＮＡ抽出を行った。抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型にリアルタイムＰＣＲによりＨＴＬＶ−１プロウイルス量（感染細胞率）の測定を行った（Ｙａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ. Ｂｌｏｏｄ. ２００２, ９９（１）：８８−９４）。
抗体又は試薬を添加せず、培地のみで培養を行った各ＨＡＭ患者ＰＢＭＣにおけるＨＴＬＶ−１プロウイルス量を１００％として、ＴＳＰ−Ａ７４、Ｐａｂ１４００、ＰＳＬを添加し培養した細胞のＨＴＬＶ−１プロウイルス量の相対値を算出し、ＨＡＭ患者６例の平均値を求めた。有意差検定は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６（ＭＤＦ）のＯｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを用いて行った。
【００６９】
ＨＡＭ−ＰＢＭＣ中のＨＴＬＶ−１プロウイルス量は、ＴＳＰ−Ａ７４の添加によって有意に減少した。その際、アイソタイプコントロールであるＰａｂ１４００添加条件下では、ＨＡＭ-ＰＢＭＣ中のＨＴＬＶ−１プロウイルス量の減少作用は観察されなかった（図２）。従って、抗ＴｆＲ抗体は、ＨＡＭ-ＰＢＭＣ中のＨＴＬＶ−１感染細胞排除の効果を有することが示唆された。
【００７０】
（２）ＨＡＭ−ＰＢＭＣの自発的増殖活性に対するＴＳＰ−Ａ７４抗体の作用検討
ＨＡＭ−ＰＢＭＣは、無刺激条件下での培養において自発的に増殖し、ＨＴＬＶ−１の感染拡大を示す特徴を有する。このようなＨＡＭ−ＰＢＭＣの自発増殖活性は、ＨＡＭに特徴的な過剰免疫応答を反映するものである。そこで、ＴＳＰ−Ａ７４がＨＡＭ−ＰＢＭＣの自発増殖活性を抑制するかどうかを検討した。
Ｕ底（ｒｏｕｎｄ ｂｏｔｔｏｍ）９６−Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅに、ＨＡＭ−ＰＢＭＣ細胞を１×１０５個/ｗｅｌｌで播種した。ＴＳＰ−Ａ７４又はアイソタイプコントロール抗体Ｐａｂ１４００を、培地で０．０２、０．２、２、２０μｇ/ｍＬとなるよう調製し、各ウェルに１００μＬずつ加え、終濃度０、０．００１、０．０１、０．１、１（１０−３、１０−２、１０−１、１）μｇ/ｍＬとした。コントロールとして、１μｇ/ｍＬのＰＳＬを使用した。その後、３７℃ のＣＯ２インキュベーターで培養を行い、６日後、Ｈ３−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを１μＣｉ/ｗｅｌｌになるように加え、更に１６時間インキュベートした。その後、培養細胞をセルハーべスター（Ｔｏｍｔｅｃ ＭＨ３、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてガラスフィルター（Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ  Ａ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に吸着させ、十分乾燥させた後に、固体シンチレータＭｅｌｔｉＬｅｘ−Ａ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を染み込ませ、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（ＷＡＬＬＡＣ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ ＴｒｉＬｕｘ １４５０−０２１）を用いて細胞に取り込まれた３Ｈ−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ量の測定を行った（Ｙａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ. ＰＬｏＳ Ｏｎｅ. ２００９, ４（８）：ｅ６５１７）。抗体又は試薬を添加せず、培地のみで培養を行った各ＨＡＭ患者ＰＢＭＣにおける３Ｈ−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅのカウントの平均を１００％として、ＴＳＰ−Ａ７４、Ｐａｂ１４００、ＰＳＬを添加し培養した細胞のカウントの相対値を算出し、ＨＡＭ患者６例の平均値を求めた。有意差検定は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６（ＭＤＦ）のＯｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを用いて行った。
【００７１】
その結果、ＨＡＭ-ＰＢＭＣの自発増殖は、０．１μｇ/ｍＬあるいはそれ以上の濃度のＴＳＰ−Ａ７４の添加により著しく抑制された。その際、アイソタイプコントロールであるＰａｂ１４００添加条件下では、自発増殖活性に対する有意な作用は見られなかった（図３）。従って、抗ＴｆＲ抗体がＨＡＭ患者由来ＰＢＭＣの過剰免疫応答を正常化する効果を有することが示唆された。
【００７２】
（３）ＨＡＭ-ＰＢＭＣ のサイトカイン産生に対するＴＳＰ−Ａ７４ の作用検討
液体窒素中に凍結保存していた６例のＨＡＭ患者のＰＢＭＣを、３７℃のウォーターバスにて溶解し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄後、同培地を用いて細胞を１×１０６個/ｍＬに調製した。その後、各ＨＡＭ−ＰＢＭＣを、Ｕ底（ｒｏｕｎｄ ｂｏｔｔｏｍ）９６−Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅに、１０５ｃｅｌｌｓ/１００μＬ/ｗｅｌｌで播種した。ＴＳＰ−Ａ７４又はアイソタイプコントロール抗体Ｐａｂ１４００を、培地で０．０２、０．２、２、２０μｇ/ｍＬとなるよう調製し、各ウェルに１００μＬずつ加え、終濃度０、０．００１、０．０１、０．１、１（１０−３、１０−２、１０−１、１）μｇ/ｍＬとした。コントロールとして、１μｇ/ｍＬのＰＳＬを使用した。その後、３７℃ ＣＯ２インキュベーターで培養を行った。７日後、培養細胞を回収し、遠心し培養上清を回収した。
培養上清中のサイトカイン量は、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、フローサイトメーターＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により測定した（ＩＦＮ−γ：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５６０１１１、ＩＬ−６：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５８２７６）（Ｙａｍａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ. Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ. ２０１５, ２１１(２):２３８−４８)。
ＴＳＰ−Ａ７４又はＰａｂ１４００のどちらも加えず培地のみで培養を行った細胞の培養液中のサイトカイン濃度を対照として、各濃度のＴＳＰ−Ａ７４又はＰａｂ１４００を添加し培養した際の培養液中のサイトカイン濃度変化を比較解析した。有意差検定は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６（ＭＤＦ）のＯｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを用いて行った。
【００７３】
その結果、ＴＳＰ−Ａ７４存在下においてＩＦＮ−γ及びＩＬ−６の産生量は有意に減少した（図４）。 抗ＴｆＲ抗体は、ＨＡＭ-ＰＢＭＣより産生される炎症性サイトカインＩＦＮ−γ及びＩＬ−６の産生を抑制する作用を有することが示唆された。
【００７４】
実施例３  ＨＡＭ患者に対する抗ＴｆＲ抗体ＴＳＰ−Ａ０２又はＴＳＰ−Ａ１７の治療効果の検討
ＨＡＭの治療における抗ＴｆＲ抗体の有用性を確認するため、他の抗ＴｆＲ抗体（ＴＳＰ−Ａ０２、ＴＳＰ−Ａ１７）を用いて、ＨＡＭ患者由来細胞に対する効果を検討した。
【００７５】
上述の実施例２（１）〜（３）の方法と同様にして、５例のＨＡＭ患者末梢血から分離したＰＢＭＣを、９６ウェルプレートに播種し、１μｇ／ｍＬ ＴＳＰ−Ａ０２又はＴＳＰ−Ａ１７を添加したウェル、１μｇ/ｍＬ Ｐａｂ１４００を添加したウェル、１μｇ／ｍＬ  ＰＳＬを添加したウェルを調製し、培養を行った。培養後、ＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡ量（図５）、自発増殖活性（図６）及び培養上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−６の産生量（図７）を測定した。
【００７６】
その結果、図５に示すように、Ｐａｂ１４００添加時に比べＴＳＰ−Ａ０２、ＴＳＰ−Ａ１７の両抗ＴｆＲ抗体の添加時において、ＨＡＭ患者ＰＢＭＣ中のＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡ量は有意に減少した。
また、図６に示すように、Ｐａｂ１４００に比べＴＳＰ−Ａ０２、ＴＳＰ−Ａ１７の両抗ＴｆＲ抗体は、ＨＡＭ患者ＰＢＭＣの自発的増殖活性を顕著に抑制した。
さらに、図７に示すように、ＨＡＭ患者ＰＢＭＣより産生されるＩＦＮ−γおよびＩＬ−６の培養上清中濃度は、Ｐａｂ１４００に比べＴＳＰ−Ａ０２およびＴＳＰ−Ａ１７の両抗ＴｆＲ抗体添加時に有意に減少した。よって、抗ＴｆＲ抗体は、ＨＡＭ患者ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γおよびＩＬ−６産生を阻害することが明らかとなった。
【００７７】
実施例４  ＨＵ患者に対する抗ＴｆＲ抗体の治療効果の検討
更に、抗ＴｆＲ抗体によるＨＴＬＶ−１関連炎症性疾患であるＨＵの治療可能性を検討した。実施例２に記載した条件と同じように、ＨＵ患者由来ＰＢＭＣ（２例）を培養し、ＴＳＰ−Ａ７４、アイソタイプコントロール抗体Ｐａｂ１４００又はＰＳＬを最終濃度１μｇ/ｍＬになるようにＰＢＭＣ細胞に添加し、３７℃ ＣＯ２インキュベーターで培養を行った。培養後、実施例２（１）〜（３）と同様に細胞のＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡ量、細胞の自発増殖活性及び培養上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−６濃度の変化を解析した。
【００７８】
その結果、図８〜１０に示すように、ＴＳＰ−Ａ７４は、ＨＵ患者のＰＢＭＣ中のＨＴＬＶ−１プロウイルス量、細胞の増殖並びにＩＦＮ−γ及びＩＬ−６の産生を著しく抑制した。従って、抗ＴｆＲ抗体のＨＴＬＶ−１関連炎症性疾患であるＨＵの治療可能性も示唆された。
【図１】
2018024615.tif 000011
【図２】
2018024615.tif 000012
【図３】
2018024615.tif 000013
【図４】
2018024615.tif 000014
【図５】
2018024615.tif 000015
【図６】
2018024615.tif 000016
【図７】
2018024615.tif 000017
【図８】
2018024615.tif 000018
【図９】
2018024615.tif 000019
【図１０】
2018024615.tif 000020
【配列表】
2018024615000001.app