(57)【要約】【課題】優れた安定性を有する化学発光分析用組成物を得、該組成物を用いて安定に化学発光分析を行うこと。【解決手段】免疫学的測定方法に用いるための組成物であって、（１）発光基質及び／又はエンハンサーを含み、かつ、該組成物の銅イオン濃度が０．０１ｍｇ／Ｌ以下である、免疫学的測定用組成物、または、（２）発光基質添加前のＢ／Ｆ分離用の洗浄液を含み、かつ、該組成物の銅イオン濃度が０．０１ｍｇ／Ｌ以下である、免疫学的測定用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫学的測定方法に用いるための組成物であって、発光基質及び／又はエンハンサーを含み、かつ、該組成物の銅イオン濃度が０．０１ｍｇ／Ｌ以下である、免疫学的測定用組成物。
【請求項２】
発光基質を利用する免疫学的測定方法に用いるための組成物であって、発光基質添加前のＢ／Ｆ分離用の洗浄液を含み、かつ、該組成物の銅イオン濃度が０．０１ｍｇ／Ｌ以下である、免疫学的測定用組成物。
【請求項３】
銅イオン濃度が０．００１ｍｇ／Ｌ以下である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
発光基質が、２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５−クロロトリシクロ［３．３．１．１（３，７）］デカン）］−４−イル）−１−フェニルリン酸二ナトリウム（商標名：ＣＤＰ−Ｓｔａｒ）、３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１（３，７）］デカン−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム（商標名：ＣＳＰＤ）、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（商標名：ＡＭＰＰＤ）、３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ［３．３．１．１（３，７）］デカン−４−イル）フェノール二水素リン酸二ナトリウム塩（商標名：ＬｕｍｉｇｅｎＰＰＤ、商標名：Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ５３０）、及び［（４−クロロフェニル）スルファニル］（１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニリデン）メチルホスフェート二ナトリウム；［（４−クロロフェニル）チオ］（１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニリデン）−メタノール１−（二水素リン酸）二ナトリウム塩（１：２）（商標名：Ｌｕｍｉｇｅｎ  ＡＰＳ−５）からなる群の中から選択される少なくとも一種の発光基質である、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
ホスファターゼを用いる免疫学的測定方法で使用される、請求項１〜４のいずれかに記載の免疫学的測定用組成物。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の組成物を含む、免疫学的測定用キット。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載の組成物、または、請求項６に記載のキットを用いる、免疫学的測定方法。
【請求項８】
免疫学的測定方法において、発光基質及び／又はエンハンサーが含まれる組成物の銅イオン濃度を０．０１ｍｇ／Ｌ以下にする、免疫学的測定用組成物の安定性を向上させる方法。
【請求項９】
発光基質を利用する免疫学的測定方法において、発光基質添加前のＢ／Ｆ分離用の洗浄液用組成物の銅イオン濃度を０．０１ｍｇ／Ｌ以下にする、免疫学的測定用組成物の安定性を向上させる方法。
【請求項１０】
キレート剤を用いて、前記組成物の銅イオン濃度を０．０１ｍｇ／Ｌ以下にすることを特徴とする、請求項８又は９に記載の免疫学的測定用組成物の安定性を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学的測定用組成物および免疫学的測定方法に関する。更に詳しくはホスファターゼを用いる化学発光分析において優れた安定性を有する化学発光分析用組成物、および、該組成物を用いて化学発光分析を行う方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスファターゼは、リン酸モノエステルを加水分解し、アルコールと無機リン酸を生じる反応を触媒する酵素である。
ホスファターゼとしては種々のものが知られているが、例えばアルカリホスファターゼ（ＥＣ  ３．１．３．１、以下ＡＬＰとも称する）（たとえば特許文献１、２）は、遺伝子工学用酵素として利用されるほか、酵素免疫測定法における標識酵素として広く利用されており、化学発光基質と組み合わせて様々な分析方法に利用されている（たとえば特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／１１５０２３
【特許文献２】ＷＯ２０１４／００７２２９
【特許文献３】特開２００９−０８５７５３
【特許文献４】ＷＯ２０１０／０４１５９５
【特許文献５】特許３９９４３３７
【特許文献６】特開２０１３−８７０６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、免疫学的測定において、より精度の高い結果が得られるような免疫学的測定用組成物を得ることである。より詳しくは、ホスファターゼを用いた化学発光測定において、より精度の高い結果が得られるような化学発光測定用組成物を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、発光基質の１種であるＣＤＰ−Ｓｔａｒ（商標）（２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５−クロロトリシクロ［３．３．１．１３．７］デカン］）−４−イル］−１−フェニルリン酸二ナトリウム、ＣＡＳ番号  １６００８１−６２−９）とＡＬＰとを用いた化学発光免疫測定法において、原因不明の測定値低下を経験した。そこで本発明者は、試薬組成について検討した。その結果、意外なことに、試薬組成物中に銅イオンが存在するとその濃度に比例して測定感度が低下することを見出した。そして、試薬組成物中の銅イオン濃度を一定以下にすることで、種々の発光基質を用いてホスファターゼ系で安定的に良好な測定ができることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［項１］  免疫学的測定方法に用いるための組成物であって、発光基質及び／又はエンハンサーを含み、かつ、該組成物の銅イオン濃度が０．０１ｍｇ／Ｌ以下である、免疫学的測定用組成物。
［項２］  発光基質を利用する免疫学的測定方法に用いるための組成物であって、発光基質添加前のＢ／Ｆ分離用の洗浄液を含み、かつ、該組成物の銅イオン濃度が０．０１ｍｇ／Ｌ以下である、免疫学的測定用組成物。
［項３］  銅イオン濃度が０．００１ｍｇ／Ｌ以下である、項１または２に記載の組成物。
［項４］  発光基質が、２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５−クロロトリシクロ［３．３．１．１（３，７）］デカン）］−４−イル）−１−フェニルリン酸二ナトリウム（商標名：ＣＤＰ−Ｓｔａｒ）、３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１（３，７）］デカン−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム（商標名：ＣＳＰＤ）、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（商標名：ＡＭＰＰＤ）、３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ［３．３．１．１（３，７）］デカン−４−イル）フェノール二水素リン酸二ナトリウム塩（商標名：ＬｕｍｉｇｅｎＰＰＤ、商標名：Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ５３０）、及び［（４−クロロフェニル）スルファニル］（１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニリデン）メチルホスフェート二ナトリウム；［（４−クロロフェニル）チオ］（１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニリデン）−メタノール１−（二水素リン酸）二ナトリウム塩（１：２）（商標名：Ｌｕｍｉｇｅｎ  ＡＰＳ−５）からなる群の中から選択される少なくとも一種の発光基質である、項１から３のいずれかに記載の組成物。
［項５］  ホスファターゼを用いる免疫学的測定方法で使用される、項１〜４のいずれかに記載の免疫学的測定用組成物。
［項６］  項１から５のいずれかに記載の組成物を含む、免疫学的測定用キット。
［項７］  項１から５のいずれかに記載の組成物、または、項６に記載のキットを用いる、免疫学的測定方法。
［項８］  免疫学的測定方法において、発光基質及び／又はエンハンサーが含まれる組成物の銅イオン濃度を０．０１ｍｇ／Ｌ以下にする、免疫学的測定用組成物の安定性を向上させる方法。
［項９］  発光基質を利用する免疫学的測定方法において、発光基質添加前のＢ／Ｆ分離用の洗浄液用組成物の銅イオン濃度を０．０１ｍｇ／Ｌ以下にする、免疫学的測定用組成物の安定性を向上させる方法。
［項１０］  キレート剤を用いて、前記組成物の銅イオン濃度を０．０１ｍｇ／Ｌ以下にすることを特徴とする、項８又は９に記載の免疫学的測定用組成物の安定性を向上させる方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、ホスファターゼを用いた化学発光測定において、より精度の高い結果を得ることができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の免疫学的測定方法で用いうる試薬カートリッジの例を示す図である。
【図２】本発明の免疫学的測定方法で用いうる反応容器の例を示す図である。
【図３】洗浄液における阻害物質の検討結果を示す図である。
【図４】洗浄液に含まれる銅イオンの濃度検討結果を示す図である。
【図５】洗浄液に含まれる銅イオンの濃度検討（発光基質をＬｕｍｉｇｅｎ  ＡＰＳ−５（商標）に変更した場合）の結果を示す図である。
【図６】［Ａ］ブロック液、［Ｃ］Ｒ１試薬（ビオチン標識抗測定対象抗体）、［Ｄ］Ｒ２試薬（アルカリホスファターゼ標識抗測定対象抗体）および［Ｅ］Ｒ３試薬（発光基質及び／又はエンハンサー）への銅添加による影響を評価した結果を示す図である。
【図７】Ｒ３試薬（発光基質及び／又はエンハンサーを含む）に含まれる銅イオンの濃度検討結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の実施形態の一つは、免疫学的測定方法に用いるための組成物であって、発光基質及び／又はエンハンサー含み、かつ、該組成物の銅イオン濃度が０．０１ｍｇ／Ｌ以下である、免疫学的測定用組成物である。さらに、本発明の別の実施形態の一つは、発光基質を利用する免疫学的測定方法に用いるための組成物であって、発光基質添加前のＢ／Ｆ分離用の洗浄液を含み、かつ、該組成物の銅イオン濃度が０．０１ｍｇ／Ｌ以下である、免疫学的測定用組成物である。なお、本明細書では銅のことをＣｕと表記することがある。
【００１０】
本発明の対象となる免疫学的測定方法は、ガラスフィルター担体または磁性粒子等を固相に用い、該固相上で、測定対象物質と種々の試薬成分とが、結合（可逆的または非可逆的）、解離、洗浄、反応（発色、発光など）等を行い、そこで生じた種々の物理化学的変化を検出するものであれば特に限定されるものではなく、種々の公知の方法が利用できる。
また、これらの方法を適用できる自動分析機が種々知られている。たとえば、ガラスフィルター担体を固相に用いる方法が適用できる自動分析機として、特許文献４に記載の測定システムが例示できる。また、市販のものではＰＯＣｕｂｅ（登録商標、東洋紡製）などが例示できる。
【００１１】
前記の免疫学的測定方法の一態様（第一の態様）として、以下の組成物［Ａ］〜［Ｆ］を含む測定キットを用いる方法が挙げられる。
［Ａ］ブロック液
［Ｂ］洗浄液
［Ｃ］Ｒ１試薬（ビオチン標識抗測定対象抗体を含む）
［Ｄ］Ｒ２試薬（アルカリホスファターゼ標識抗測定対象抗体を含む）
［Ｅ］Ｒ３試薬（発光基質及び／又はエンハンサーを含む）
［Ｆ］抗ビオチン抗体が固定化された固相。
【００１２】
本発明の免疫学的測定方法の別の態様（第二の態様）としては、前記［Ｃ］と［Ｆ］とをビオチンを介して結合させず、［Ｆ］の固相に直接、［Ｃ］に相当する抗測定対象抗体を結合させてもよい。この第二の態様としては、以下のような測定キットを例示することができる。
［Ａ］ブロック液
［Ｂ］洗浄液
［Ｄ］Ｒ２試薬（アルカリホスファターゼ標識抗測定対象抗体を含む）
［Ｅ］Ｒ３試薬（発光基質及び／又はエンハンサーを含む）
［Ｆ］抗測定対象抗体が固定化された固相。
【００１３】
前記の第一及び第二の態様のいずれにおいても、前記［Ｅ］Ｒ３試薬は、一つの試薬中に発光基質及びエンハンサーの両方を含んでいてもよいし、発光基質のみを含む試薬であってもよいし、発光基質とエンハンサーとを別々に含有する試薬の形態（例えば、発光基質を含むＲ３（Ｉ）試薬とエンハンサーを含むＲ３（ＩＩ）試薬のいずれか一方）であってもよい。エンハンサーは通常、発光基質の発光強度の増強及び／又は発光時間の延長等を目的として添加される。従って、発光基質とエンハンサーを別々に含有する試薬の形態であっても、各試薬は相前後して実質的に同じタイミングで添加されることが多い。
【００１４】
前記［Ｆ］の固相としてはビーズ、磁性粒子、マイクロタイタープレート、チューブ、膜など種々のものが使用できる。
固相化担体としてマイクロタイタープレートやチューブを用いる場合は、固相化担体自体を反応容器とすることができるが、固相化担体とは別途に各種の反応容器を用いることもできる。
例えば、固相化担体としてガラスフィルターを用いる場合は、図２のような形態からなる反応容器（特許文献５や特許文献６などに記載の反応容器）を用いることができる。図２において、（ａ）はこの容器の斜視図であり、（ｂ）はこの容器の断面図である。図２において、１：反応容器（全体）、２：開口部、３：多孔性担体、４：吸水層、５：液体不透過性容器、をそれぞれ示す。
この反応容器は、例えば前記の特許文献４に記載の測定システムに適用することができる。
【００１５】
この反応容器を用いる免疫学的測定方法としては、上記第一の態様の測定キットを例として説明すると、以下のような工程を含む方法が例示できる。これらの工程は、例えば前記の特許文献４に記載の測定システムに適用することができる。
（１）測定対象を［Ｃ］Ｒ１試薬（ビオチン標識抗測定対象抗体）と［Ｄ］Ｒ２試薬（アルカリホスファターゼ標識抗測定対象抗体）とで挟んだ複合体を作製する。
（２）工程（１）で得られた複合体を、反応容器の開口部から固相に滴下し、そのビオチン標識部分と［Ｆ］の固相に標識された抗ビオチン抗体との相互作用により固相に結合させる。なお、工程（２）が開始される前に、固相には、予め［Ａ］ブロック液を反応容器の開口部から固相に滴下して非特異反応のブロッキングをしておくことが好ましい。
（３）［Ｂ］洗浄液を反応容器の開口部から固相に滴下して、工程（１）で複合体を形成しなかった［Ｃ］Ｒ１試薬と［Ｄ］Ｒ２試薬などを反応系外である固相の下の吸水層に移動させる。（発光基質添加前のＢ／Ｆ分離）
（４）［Ｅ］Ｒ３試薬（発光基質及び／又はエンハンサー）を反応容器の開口部から固相に滴下して、固相に結合した前記複合体のアルカリホスファターゼ標識部分と反応させ、発光強度を測定する。
ここで、Ｂ／Ｆ分離とは、抗原と抗体とが結合している結合型分画（Ｂｏｕｎｄ、Ｂ）と、結合していない遊離型分画（Ｆｒｅｅ、Ｆ）とを分離することをいう。
【００１６】
本発明の免疫学的測定方法において自動分析機を用いる場合、前記［Ａ］〜［Ｅ］の各試薬はボトル等に分注され、直接分析装置にセットして用いることができる。
または、本発明のキットの構成として、例えば、図１のような形態からなるカートリッジ（特許文献４に記載の試薬カートリッジ）を用い、その各ウェルに前記［Ａ］〜［Ｅ］の溶液が別々に保持されていてもよい。
【００１７】
本発明の免疫学的測定方法の測定対象物質を成分として含有する検体としては、血清、血漿、血液、髄液等の各種体液や尿等の排泄物、便等の希釈物から固形分を除去したもの、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、咽頭ぬぐい液、唾液、鼻汁などから採取した各種組織の抽出液等が挙げられ、特に限定されない。これらに希釈や前処理等の操作を行って得たものも、検体となりうる。なお、検体には必ずしも測定対象物質が成分として含有されている必要はなく、測定対象物質を成分として含有する可能性があることを前提とした検体であってもよい。
【００１８】
本発明の免疫学的測定用組成物の一態様は、発光基質及び／又はエンハンサーを含み、かつ、銅イオン濃度が０．０１ｍｇ／Ｌ以下であることを特徴とする。銅イオン濃度は、さらに好ましくは０．００１ｍｇ／Ｌ以下である。すなわち、本発明の免疫学的測定用組成物は遊離の銅イオンを実質的に含まないことが好ましく、なかでも遊離の銅イオンを含まないことが好ましい。発光基質とエンハンサーを別々に含有する試薬の形態とする場合、両方の試薬中における銅イオン濃度が上記範囲内になることが好ましい。
このような組成物は、前記の組成物［Ａ］〜［Ｆ］を含む測定キットのうち、［Ｅ］Ｒ３試薬（発光基質及び／又はエンハンサー）に該当する。前記キットの構成において［Ｅ］Ｒ３試薬の銅イオン濃度が０．０１ｍｇ／Ｌ以下であれば、［Ｅ］Ｒ３試薬単独で本発明の免疫学的測定用組成物に該当するし、また、組成物［Ａ］〜［Ｆ］を含む測定キットも本発明の免疫学的測定用キットに該当する。
【００１９】
本発明で用いる発光基質は特に限定されない。例えば、２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５−クロロトリシクロ［３．３．１．１（３，７）］デカン）］−４−イル）−１−フェニルリン酸二ナトリウム（英名；Ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ２−ｃｈｌｏｒｏ−５−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ｛１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ−３，２’−（５−ｃｈｌｏｒｏ）−ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１（３，７）］ｄｅｃａｎ｝−４−ｙｌ）−１−ｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、商標名；ＣＤＰ−Ｓｔａｒ）、３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１（３，７）］デカン−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム（英名；Ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ３−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ｛１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ−３，２’−（５’−ｃｈｌｏｒｏ）ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１（３，７）］ｄｅｃａｎ｝−４−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、商標名；ＣＳＰＤ）、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（英名；３−（２’−ｓｐｉｒｏａｄａｍａｎｔａｎｅ）４−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−（３”−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ−１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ、商標名；ＡＭＰＰＤ）、３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ［３．３．１．１（３，７）］デカン−４−イル）フェノール二水素リン酸二ナトリウム塩（英名；３−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ［１，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ−３，２’−ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１（３，７）］ｄｅｃａｎ］−４−ｙｌ）ｐｈｅｎｏｌ  ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ、商標名；ＬｕｍｉｇｅｎＰＰＤ又は商標名；Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ５３０）、［（４−クロロフェニル）スルファニル］（１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニリデン）メチルホスフェート二ナトリウム；［（４−クロロフェニル）チオ］（１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニリデン）−メタノール１−（二水素リン酸）二ナトリウム塩（１：２）（英名；Ｄｉｓｏｄｉｕｍ［（４−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｓｕｌｆａｎｙｌ］（１０−ｍｅｔｈｙｌ−９（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｉｎｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；［（４−Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏ］（１０−ｍｅｔｈｙｌ−９（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｉｎｙｌｉｄｅｎｅ）−ｍｅｔｈａｎｏｌ  １−（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）  ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ  （１：２）、商標名；Ｌｕｍｉｇｅｎ  ＡＰＳ−５）からなる群の中から選択される１以上が挙げられる。好ましくはＣＤＰ−Ｓｔａｒ（商標）またはＡＰＳ−５（商標）である。さらに好ましくはＣＤＰ−Ｓｔａｒ（商標）である。
【００２０】
本発明の免疫学的測定用組成物の別の態様は、発光基質添加前のＢ／Ｆ分離用の洗浄液を含み、かつ、該組成物の銅イオン濃度が０．０１ｍｇ／Ｌ以下であることを特徴とする。銅イオン濃度は、さらに好ましくは０．００１ｍｇ／Ｌ以下である。すなわち、本発明の免疫学的測定用組成物は遊離の銅イオンを実質的に含まないことが好ましく、なかでも遊離の銅イオンを含まないことが好ましい。
このような組成物は、前記の組成物［Ａ］〜［Ｆ］を含む測定キットのうち、［Ｂ］洗浄液に該当する。前記キットの構成において［Ｂ］洗浄液の銅イオン濃度が０．０１ｍｇ／Ｌ以下であれば、［Ｂ］洗浄液単独で本発明の免疫学的測定用組成物に該当するし、また、組成物［Ａ］〜［Ｆ］を含む測定キットも本発明の免疫学的測定用キットに該当する。
【００２１】
本発明の免疫学的測定用組成物は、銅イオン濃度を一定以下にすることで安定に化学発光分析を行うことができる。従って、本発明の免疫学的測定用組成物は、遊離の銅イオンを発生させる成分を含まないか、又は、遊離の銅イオン濃度が一定以下になるになるようにその配合量の調整を行うことが好ましい。銅イオンを発生させる成分としては、例えば、塩化銅、酸化銅、シアン化銅、硝酸銅、硫酸銅、アズリン、ステラシアニン、プラストシアニン、ラスティシアニン、シュードアズリン、ラッカーゼ、アスコルビン酸酸化酵素、銅含有亜硝酸還元酵素、スーパーオキシドディスムターゼ、ガラクトース酸化酵素、ドーパミン-β-ヒドロキシラーゼ、銅アミン酸化酵素、ヘモシアニン、チロシナーゼ、カテコール酸化酵素、セルロプラスミン、シトクロムc酸化酵素等を挙げることができる。本発明の免疫学的測定用組成物に、前記のような銅イオンを発生させる成分を配合する場合には、組成物中の銅イオン濃度が０．０１ｍｇ／Ｌ以下となるように、好ましくは０．００１ｍｇ／Ｌ以下となるように添加量を調整すればよい。特定の態様では、本発明の免疫学的測定用組成物は、前記のような銅イオンを発生させる成分を実質的に含まないことが好ましく、全く含まないことがより好ましい。
【００２２】
本発明の免疫学的測定用組成物における銅イオン濃度を一定以下にする方法としては、上記のように銅イオン発生成分の添加量を調整する以外に、銅イオンをキレート作用等によって不活化してもよい。このように銅イオンを不活化するために用いられるキレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，３−プロパンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン四酢酸（ＤＴＰＡ−ＯＨ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジカルボキシメチルグルタミン酸（ＣＭＧＡ）、（Ｓ、Ｓ）−エチレンジアミン二コハク酸（ＥＤＤＳ）、ヒドロキシエチリデンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）（ＮＴＭＰ）、ホスホノブタントリカルボン酸（ＰＢＴＣ）、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰ）、グルコン酸、Ｏ、Ｏ’−ビス（２−アミノフェニル）エチレングリコール−Ｎ、Ｎ、Ｎ’−四酢酸、テトラカリウムシオ、水和物（ＢＡＰＴＡ）、Ｎ、Ｎ−ビス（2-ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’-四酢酸、一水和物（ＣｙＤＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラキス（２-ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＰＥＮ）、又はそれらの塩（例えば、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム）等を挙げることができる。好ましくは、エチレンジアミン四酢酸又はその塩が用いられる。本発明の免疫学的測定用組成物における、このようなキレート剤を添加する場合の配合量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、発光基質及び／又はエンハンサーを含むＲ３試薬中に、０．０１〜１０ｍＭ程度、好ましくは０．１〜１０ｍＭ程度、より好ましくは０．１〜５ｍＭ程度とすることができる。洗浄液中の銅イオン濃度を一定以下にする場合にも、上記と同様の配合量でキレート剤を添加すればよい。
【００２３】
本発明の免疫学的測定用組成物の調製に用いる溶媒は、本発明の効果を阻害しない限り特に限定されないが、例えば、水を用いることができる。溶媒として水を用いる場合には、重金属イオンを実質的に又は全く含まない水であることが好ましく、蒸留水、精製水、脱イオン水、イオン交換水、純水、超純水、ＭｉｌｌｉＱ水、バイオメディカル用水等を用いることがより好ましい。
【００２４】
本発明で用いる［Ａ］ブロック液の組成は、特に限定されない。ブロック液には、酵素抗体反応および酵素反応に無関係なタンパク質で固相表面を覆い、後のステップで作用させるタンパク質が固相表面に吸着されるのを防ぐためのブロッキング剤を含む。
本発明で用いるブロッキング剤は、特に限定されない。例えば、カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチンなどのほか、血液タンパク質または植物タンパク質を有効成分とするもの、兎血液成分などを用いることができる。なかでもカゼインが好ましい。
【００２５】
本発明において、［Ｂ］洗浄液はＢ／Ｆ分離等の目的で用いられる。洗浄液の組成は、測定対象物質に未結合の標識物を洗浄する機能を実用上保持するものであれば、特に限定されない。例えば、非イオン界面活性剤（例えば０．５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０やＴｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００）を含有する緩衝化生理食塩水が挙げられる。
【００２６】
本発明において、測定対象物質の検出用に用いる抗体としてはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用可能であり、産生動物種も限定されない。前記の第一の態様である組成物［Ａ］〜［Ｆ］を含む測定キットの態様では、［Ｃ］Ｒ１試薬（ビオチン標識抗測定対象抗体）、および、［Ｄ］Ｒ２試薬（アルカリホスファターゼ標識抗測定対象抗体）が該当する。
前記［Ｃ］Ｒ１試薬としては、アミノ基またはスルフヒドリル基にビオチンを標識した抗体を用いることが好適であり、前記Ｒ１試薬中の成分としては防腐剤や蛋白成分等を含んでよい。 
前記［Ｄ］Ｒ２試薬としては、検出に利用する酵素標識の態様は特に限定されないが、アミノ基またはスルフヒドリル基にアルカリホスファターゼを標識した抗体を用いることが好適であり、前記Ｒ２試薬中の成分としては防腐剤や蛋白成分等を含んでよい。
また、前記の第二の態様である測定キットで用いられる抗体も、上記と同様のものを使用することができる。 
【００２７】
本発明において、検出に利用する酵素標識に対応する基質についても特に限定されない。
例えば、アルカリホスファターゼを用いる系の場合は、前記［Ｅ］Ｒ３試薬に含まれる発光基質として、Ｌｕｍｉｇｅｎ  ＡＰＳ−５（商標）、ＬｕｍｉｇｅｎＰＰＤ（商標）、Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ５３０（商標）（以上Ｌｕｍｉｇｅｎ社）、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（商標）、ＣＳＰＤ（商標）、ＡＭＰＰＤ（商標）（以上Ｔｒｏｐｉｘ社）等を使用することができるが、これらに限定されない。
前記で示した基質は、市販品を用いることができる。基質を含む基質液の組成は、その機能を損ねない範囲で、特に限定されない。
【００２８】
銅イオン濃度はＩＣＰ発光分光分析法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）やＩＣＰ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）で求めることができる。
本明細書においては、銅イオン濃度は、ＩＣＰ−ＡＥＳ（アメテック社のＳＰＥＣＴＲＯＢＬＵＥ（登録商標）を使用）で測定した値で定義される。ただし、ＩＣＰ−ＡＥＳで検出限界を下回ったため検出できなかったと判断される場合は、さらに、ＩＣＰ−ＭＳ（アジレント・テクノロジー社のＡｇｉｌｅｎｔ７７００ｓＩＣＰ−ＭＳを使用）で測定した値を採用する。
【実施例】
【００２９】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３０】
［実施例１］洗浄液における阻害物質の検討
本発明者は、発光基質の１種であるＣＤＰ−ＳｔａｒとＡＬＰとを用いた化学発光免疫測定法において、原因不明の測定値低下を経験した。本発明者は、試薬組成について検討を行い、洗浄液中に含まれる重金属イオンの影響について評価を行った。
以下の実験では、蒸留水を用いて重金属イオンを含まない洗浄液を作成し、検討のベース組成とした。このベース組成の洗浄液に、各金属を表１のように添加して影響を及ぼす金属を特定した。金属はチタンおよびモリブデン以外は塩化物塩で添加した。チタンは酸化チタン硫酸塩、モリブデンはモリブデン酸ナトリウムを用いた。表１に示す金属濃度（ｍｇ／Ｌ）は、塩としての添加濃度ではなく金属としての添加濃度である。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
小型化学発光免疫自動分析装置ＰＯＣｕｂｅ（登録商標、東洋紡製）を用いて以下の様に検討した。
［試薬］
［Ａ］ブロック液（１重量％カゼイン）
［Ｂ］洗浄液（水に、表１に記載の濃度の各金属を添加）
［Ｃ］Ｒ１試薬（５．０μｇ／ｍｌビオチン標識抗ＣＲＰ抗体液）
［Ｄ］Ｒ２試薬（５．０ｎｇ／ｍｌ アルカリホスファターゼ標識抗ＣＲＰ抗体液）
［Ｅ］Ｒ３試薬（ロシュ社ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ  Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｕｓｅ  Ｗｉｔｈ  Ｅｍｅｒａｌｄ−ＩＩ；発光基質共にエンハンサーを含む混合物）
［Ｆ］ＰＯＣｕｂｅ（登録商標）専用反応容器（第一抗体に結合したリガンドを特異的に認識するリガンド捕捉剤が結合された多孔性フィルタ（抗ビオチン抗体を結合させたガラスフィルター固相）を含む容器）
【００３３】
［操作］
（１）Ｒ１試薬３０μＬとＲ２試薬２０μＬおよび試料として予め生理食塩水で２０倍希釈した血清１０μＬを別のウェルに自動分注・混合し、４０℃で２分３０秒インキュベートし抗原−抗体のサンドイッチ複合体を形成した。
（２）ＰＯＣｕｂｅ（登録商標）専用反応容器に、ブロック液を５０μＬ添加した後、（１）でインキュベート後の液４０μＬを反応容器に滴下し、４０℃で２０秒インキュベートし抗原−抗体のサンドイッチ複合体を反応容器に結合させた。
（３）インキュベート後、反応容器に表１に記載の各洗浄液８０μＬを２回分注し、Ｂ／Ｆ分離を行った後、Ｒ３試薬３０μＬを添加し、発光強度を測定した。
【００３４】
測定結果を図３および表２に示す。実施例１で作製したベース組成の洗浄液（金属添加なし）を対象として、各金属を添加した場合の測定結果（発光値）を相対％で示す。上記の結果より、銅を添加した場合のみ測定値が著しく低下することを確認した。
【００３５】
【表２】
2018105866.tif 000003
【００３６】
［実施例２］洗浄液に含まれる銅イオンの濃度検討
実施例１と同様の方法で、ベース組成の洗浄液に添加する銅の濃度を０ｍｇ／Ｌ、０．００１ｍｇ／Ｌ、０．０１ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌとして、測定値を確認した。
【００３７】
測定結果を図４および表３に示す。銅の添加濃度０ｍｇ／Ｌを対象として、銅を各濃度添加した場合の測定結果（発光値）を相対％で示す。上記の結果より、０．１ｍｇ／Ｌ以上の銅を添加した場合、測定値が著しく低下することを確認した。
【００３８】
【表３】
2018105866.tif 000004
【００３９】
［実施例３］洗浄液に含まれる銅イオンの濃度検討（発光基質を変更した場合）
実施例１と同様の方法で、用いる発光基質をＬｕｍｉｇｅｎ  ＡＰＳ−５（商標）に変更し、洗浄液に添加する銅の濃度を０ｍｇ／Ｌ、０．００１ｍｇ／Ｌ、０．０１ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌとして測定値を確認した。
【００４０】
測定結果を図５および表４に示す。添加濃度０ｍｇ／Ｌを対象として、各濃度添加した場合の測定結果（発光値）を相対％で示す。上記の結果より、０．１ｍｇ／Ｌ以上の銅を添加した場合、測定値が著しく低下することを確認した。
【００４１】
【表４】
2018105866.tif 000005
【００４２】
［実施例４］各試薬への銅添加による影響
実施例１と同様の方法で、［Ｂ］洗浄液には銅などの金属を添加せず、そのかわりに、以下の［Ａ］［Ｃ］［Ｄ］および［Ｅ］の各試薬にそれぞれ１ｍｇ／Ｌの銅を添加して、測定値を確認した。
［Ａ］ブロック液
［Ｃ］Ｒ１試薬（ビオチン標識抗測定対象抗体）
［Ｄ］Ｒ２試薬（アルカリホスファターゼ標識抗測定対象抗体）
［Ｅ］Ｒ３試薬（発光基質と共にエンハンサーを含む混合物）
【００４３】
測定結果を図６および表５に示す。Ｃｕ無添加を対象として、各濃度添加した場合の測定結果（発光値）を相対％で示す。上記の結果より、［Ｅ］Ｒ３試薬に１ｍｇ／Ｌの銅を添加した場合、著しく感度低下することを確認した。
【００４４】
【表５】
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【００４５】
［実施例５］Ｒ３試薬（発光基質を含む）に含まれる銅イオンの濃度検討
実施例１と同様の方法で、［Ｂ］洗浄液には銅などの金属を添加せず、そのかわりに、Ｒ３試薬に添加する銅の濃度を０ｍｇ／Ｌ、０．００１ｍｇ／Ｌ、０．０１ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌとして測定値を確認した。
【００４６】
測定結果を図７および表６に示す。添加濃度０ｍｇ／Ｌを対象として、各濃度添加した場合の測定結果（発光値）を相対％で示す。上記の結果より、［Ｅ］Ｒ３試薬に０．１ｍｇ／Ｌ以上の銅を添加した場合、著しく感度低下することを確認した。
【００４７】
【表６】
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【００４８】
［実施例６］キレート剤添加による銅イオンの影響低減検討
実施例１と同様の方法で、［Ｂ］洗浄液に銅を１ｍｇ／Ｌとなるように添加した。さらに、［Ｅ］Ｒ３試薬にエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を０ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭとなるように添加し、測定値を確認した。
【００４９】
測定結果を表７に示す。銅を添加しなかった洗浄液を対象として、銅を１ｍｇ／Ｌ加えた洗浄液を用い、かつＲ３試薬中のＥＤＴＡ・２Ｎａを各濃度添加した場合の測定結果（発光値）を相対％で示す。本結果より、［Ｅ］Ｒ３試薬に０．０１ｍＭ以上のＥＤＴＡ・２Ｎａを添加した場合、銅イオンによる感度低下を抑制できることを確認した。
【００５０】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【００５１】
アルカリホスファターゼを用いる化学発光分析において、発光基質及び／又はエンハンサーを含む組成物中、或いはＢ／Ｆ分離用の洗浄液中の銅イオン濃度を低減することで、優れた安定性を有する化学発光分析用組成物を得ることができる。また、該組成物を用いて安定に化学発光分析を行うことが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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