(57)【要約】【課題】内耳疾患のメカニズムに基づく新たな治療剤を提供する。【解決手段】ネクロトーシス阻害剤を有効成分として含有する、内耳疾患の予防又は治療剤を提供する。ネクロトーシス阻害剤は、ネクロスタチン（Necrostatin）-1、ネクロスタチン-2、ネクロスタチン-3、ネクロスタチン-4、ネクロスタチン-5、ネクロスタチン-7、ポナティニブ(Ponatinib）、及びこれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物又はプロドラッグから選択される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネクロトーシス阻害剤を有効成分として含有する、内耳疾患の予防又は治療剤。
【請求項２】
ネクロトーシス阻害剤が、RIPキナーゼ1（RIPK1: receptor interacting serine/threonine kinase 1）の選択的阻害剤である、請求項１記載の予防又は治療剤。
【請求項３】
内耳における感覚毛の脱落及び／又は有毛細胞死を抑制することを特徴とする、請求項１又は２記載の予防又は治療剤。
【請求項４】
ネクロトーシス阻害剤が、ネクロスタチン（Necrostatin）-1、ネクロスタチン-2、ネクロスタチン-3、ネクロスタチン-4、ネクロスタチン-5、ネクロスタチン-7、ポナティニブ(Ponatinib）、及びこれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物又はプロドラッグから選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の予防又は治療剤。
【請求項５】
内耳疾患が感音性難聴又は混合性難聴である、請求項１〜４のいずれか１項記載の予防又は治療剤。
【請求項６】
内耳疾患が内耳性難聴である、請求項１〜４のいずれか１項記載の予防又は治療剤。
【請求項７】
単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて投与される、請求項１〜６のいずれか１項記載の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内耳疾患に対する新規治療剤に関し、より具体的には、突発性難聴等の難聴、めまい、耳鳴り等の内耳障害に起因する疾患及び症状の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
突発性難聴は、片方の耳に突然激しい耳鳴りと難聴が起こるものであり、発症要因として血流障害など様々な要因が考えられているが、現時点ではウイルス感染説が有力である。厚生労働省の急性高度難聴調査研究班が10年毎に行っている疫学調査によると、全国の受療患者数は1993年には年間24,000人、2001年では年間35,000人であり、2012年に厚生労働省の研究班によって愛媛県、愛知県、岩手県において実施された疫学研究による推定では、発症数は人口10万人あたり60.9人であると発表されている（急性高度難聴に関する調査研究（平成25(2013)年度））。
【０００３】
音は空気の振動として外耳道から入り、鼓膜から耳小骨に伝えられ、さらに内耳に満たされたリンパ液の振動となり、蝸牛の基底板の上にある有毛細胞で電気信号に変えられ、聴神経を経て脳の聴覚中枢に伝わる。この有毛細胞が障害を受けると音を感じることができなくなるが、ヒト側頭骨病理を用いた検討により突発性難聴では有毛細胞にある感覚毛が脱落し、有毛細胞死を起こしてしまうことが知られている。
【０００４】
突発性難聴の薬剤治療のためには、現在、副腎皮質ステロイド薬、利尿薬、ビタミン薬、血流改善薬等が用いられており、更に、突発性難聴を含む難聴疾患の治療剤として、インターフェロン等のタンパク質や小分子化合物が提案されている（特許文献１〜５）。
【０００５】
一方、細胞死は従来、あらかじめプログラムされたアポトーシスと細胞周囲の環境の変化に伴う偶発的なネクローシスに区別されてきたが、近年の研究から、従来ネクローシスとされてきた細胞死の中にもアポトーシスと同様に高度に制御されたものがあることが明らかとなり、ネクロトーシスと呼ばれるようになっている。ネクロトーシスのメカニズムは完全には解明されていないが、小分子化合物のネクロトーシス阻害剤が報告され、ネクロスタチン-1と命名された化合物が含まれている（非特許文献１〜３）。
【０００６】
ネクローシス阻害薬を用いてCNSニューロン内の軸索再生を促進する方法（特許文献６）、あるいはネクロトーシス抑制物質を用いるネクロトーシス関連疾患の予防用又は治療用医薬組成物（特許文献７）が開示されているが、内耳疾患との関連については開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第2759050号
【特許文献２】特開2004-99537号
【特許文献３】特開2004-123713号
【特許文献４】特開2007-99675号
【特許文献５】特開2012-148995号
【特許文献６】特表2014-530881号
【特許文献７】国際公開WO 2014/126127号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nature Chemical Biology 1, 112-119 (2005)
【非特許文献２】Cell Death and Differentiation 20, 185-187 (2013)
【非特許文献３】Cell Death and Differentiation 20, 366 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の通り、突発性難聴の治療には、副腎皮質ステロイド薬、利尿薬、ビタミン薬、血流改善薬などが用いられているが、エビデンスのある治療法は確立していない。突発性難聴を含む内耳疾患のメカニズムの解明と、そのメカニズムに基づく新たな治療法の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（TEMV：Theiler's murine encephalomyelitis virus）に感染させたマウス蝸牛組織において、有毛細胞に傷害が生じ、感覚毛の脱落及び有毛細胞死が生じていること、そして、この有毛細胞死がネクロトーシスによるものであることを初めて見出した。この現象は、これまでにない内耳疾患モデル系として、疾患のメカニズムの解明、及び治療剤のスクリーニング等に利用することができる。
【００１１】
本発明者等は更に、上記の内耳疾患モデルを用いて種々の化合物がもたらす影響を検討した結果、驚くべきことに、ネクロトーシスの鍵を握ると言われるシグナル伝達分子RIPキナーゼ1（RIPK1: receptor interacting serine/threonine kinase 1）の選択的な阻害作用を有する化合物によって、有毛細胞死が抑制されることを見出した。
【００１２】
本発明は、これらの知見に基づいて、本発明を完成させるに到った。すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．  ネクロトーシス阻害剤を有効成分として含有する、内耳疾患の予防又は治療剤。
２．  ネクロトーシス阻害剤が、RIPキナーゼ1（RIPK1: receptor interacting serine/threonine kinase 1）の選択的阻害剤である、上記１記載の予防又は治療剤。
３．  内耳における感覚毛の脱落及び／又は有毛細胞死を抑制することを特徴とする、上記１又は２記載の予防又は治療剤。
４．  ネクロトーシス阻害剤が、ネクロスタチン（Necrostatin）-1、ネクロスタチン-2、ネクロスタチン-3、ネクロスタチン-4、ネクロスタチン-5、ネクロスタチン-7、ポナティニブ(Ponatinib）、及びこれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物又はプロドラッグから選択される、上記１〜３のいずれか記載の予防又は治療剤。
５．  内耳疾患が感音性難聴又は混合性難聴である、上記１〜４のいずれか記載の予防又は治療剤。
６．  内耳疾患が内耳性難聴である、上記１〜４のいずれか記載の予防又は治療剤。
７．  単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて投与される、上記１〜６のいずれか記載の予防又は治療剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、従来使用され、又は提案されてきた難聴疾患治療剤とは異なるメカニズムに基づく新たな治療剤が提供される。従って、本発明の治療剤は、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（TEMV）を感染させたマウス蝸牛組織の有毛細胞の感覚毛をファロイジン（phalloidin、Invitrogen）で染色し、同時に、有毛細胞のマーカーとしてミオシン7a（myosin7a）を染色した。OHC：外有毛細胞、IHC：内有毛細胞。Ａ：ウイルス感染の24時間後に、ほとんどの有毛細胞でファロイジン染色で染まる感覚毛の脱落と有毛細胞死が観察された。Ｂ：ウイルス感染時にネクロスタチン-1 20μMを添加した結果を示す。Ｃ：ウイルス感染時にネクロスタチン-1 200μMを添加した結果を示す。Ｄ：ウイルス感染時にネクロスタチン-1 400μMを添加した結果を示す。ネクロスタチン-1の添加量に依存して、有毛細胞死と感覚毛の脱落が軽減され、黄色（赤と緑が同時に染まっている＝感覚毛+有毛細胞）が多く見られる。
【図２】ネクロスタチン-1添加濃度に依存して外有毛細胞（Ａ）及び内有毛細胞（Ｂ）の減少がいずれも抑制されることを示す。
【図３】TEMVを感染させたマウス蝸牛組織をDAPI蛍光色素で染色し、MLKLのリン酸化を調べた結果を示す。
【図４】ウイルス感染時にクロドロン酸を含むリポソーム（Clophosome）を添加して感覚毛の脱落と有毛細胞死が抑制されることを示す。
【図５】クロドロン酸を含むリポソーム（Clophosome）の存在下で外有毛細胞（Ａ）及び内有毛細胞（Ｂ）の減少がいずれも抑制されることを示す。
【図６】ポナティニブ添加濃度に依存して感覚毛の脱落と有毛細胞死がいずれも抑制されることを示す。Ａ：ポナティニブ5.0μM、Ｂ：ポナティニブ0.5μM。
【図７】ポナティニブ添加濃度に依存して外有毛細胞（Ａ）及び内有毛細胞（Ｂ）の減少がいずれも抑制されることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、ネクロトーシス阻害剤を有効成分として含有する、内耳疾患の予防又は治療剤を提供する。本明細書において、ネクロトーシス阻害剤は、具体的には、RIPキナーゼ1（RIPK1: receptor interacting serine/threonine kinase 1）の選択的阻害剤である。
【００１６】
本発明者等は、上記の予防又は治療剤が、内耳における感覚毛の脱落及び／又は有毛細胞死を抑制することを見出した。
【００１７】
本発明において好適に使用されるネクロトーシス阻害剤は、ネクロスタチン-1、ネクロスタチン-2、ネクロスタチン-3、ネクロスタチン-4、ネクロスタチン-5、ネクロスタチン-7、ポナティニブ、及びこれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物又はプロドラッグから選択される。
【００１８】
これらの化合物は、例えばNature Chemical Biology 1, 112-119 (2005)；Cell Death and Differentiation 20, 185-187 (2013)；Cell Death and Differentiation 20, 366 (2013)等の記載に基づいて合成することができ、また、市販品を入手することも可能である。
【００１９】
例えば、ネクロトーシス阻害剤の一例であるネクロスタチン-1は、下記式で示される化合物である。5-((1H-インドール-3-イル)メチル)-3-メチル-2-チオキソイミダゾリジン-4-オンのIUPAC名を有し、またメチルヒダントイン-(DL-)トリプトファンとも称される。ネクロスタチン-1は、合成することもでき、また、フナコシ株式会社、Abcam社等から入手することもできる。
【００２０】
【化１】
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【００２１】
ネクロスタチン-1はネクロトーシスの特異的阻害物質として報告されている。ネクロトーシスについては、RIPK（RIPキナーゼ）1→RIPK3→MLKL（Mixed lineage kinase domain-like、シュードキナーゼドメインを持つアダプター分子）へと連続的にリン酸化が誘導され、リン酸化されたMLKLが細胞膜で孔（ポア）を形成することによりネクロトーシスが実行されるというモデルが提唱されている (Vanden Berghe et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 15(2), 135-147, 2014; Pasparakis and Vandenabeele, Nature 517, 311-320, 2015)。ネクロスタチン-2、ネクロスタチン-3、ネクロスタチン-4、ネクロスタチン-5、及びネクロスタチン-7も、ネクロスタチン-1と同様のRIPキナーゼ1（RIPK1: receptor interacting serine/threonine kinase 1）の選択的阻害メカニズムによってネクロトーシスを阻害するとされている。
【００２２】
ポナティニブは、下記式で示される化合物である。3-(2-{イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-3-イル}エチニル)-4-メチル-N-{4-[(4-メチルピペラジン-1-イル)メチル]-3-(トリフルオロメチル)フェニル}-ベンズアミドのIUPAC名を有し、AP24534と称される場合もある。ポナティニブは、合成することもでき、また、Selleckchem社等から入手することもできる。ポナティニブは、慢性骨髄性白血病治療剤としての効果が報告されているが、ネクロトーシス阻害作用によって内耳疾患の予防または治療剤として使用できることは知られていなかった。
【００２３】
【化２】
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【００２４】
また、ネクロスタチン-1、ネクロスタチン-2、ネクロスタチン-3、ネクロスタチン-4、ネクロスタチン-5、ネクロスタチン-7、及びポナティニブの薬学的に許容される塩、溶媒和物、及びプロドラッグも、投与後に生体内でこれらの化合物に変換される限りにおいて、同様に使用することができる。薬学的に許容される塩としては、特に限定するものではないが、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、メシル酸塩、トシル酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩等を好適に使用することができる。溶媒和物としては、限定するものではないが、例えば水和物が挙げられる。プロドラッグとしては、例えば体内の酵素によって分解されて上記化合物が生じるようなエステルが挙げられる。
【００２５】
本発明者等は、哺乳動物の蝸牛組織における有毛細胞の感覚毛の脱落及び細胞死をネクロトーシス阻害剤が濃度依存的に抑制することを見出した。この効果は、外有毛細胞（outer hair cells：OHC）及び内有毛細胞（inner hair cells）の双方で観察された。また、この有毛細胞の感覚毛の脱落及び細胞死は、上記のリン酸化経路の下流分子であるMLKLのリン酸化によるものであり、更に有毛細胞周囲に存在する支持細胞がマクロファージに変化して分泌するTrail（TNF-related apoptosis-inducing factor：細胞死誘導分子）による有毛細胞の傷害作用も示唆された。
【００２６】
従って、本発明の知見に基づけば、ネクロトーシス阻害剤は、内耳疾患の予防又は治療剤として使用し得る。そのような化合物としては、例えばネクロスタチン-1、ネクロスタチン-2、ネクロスタチン-3、ネクロスタチン-4、ネクロスタチン-5、ネクロスタチン-7、及びポナティニブ等が挙げられる。
【００２７】
内耳は、聴覚と平衡機能を司る臓器であるが、いずれの機能においても有毛細胞が物理的刺激を神経刺激に変換し、ラセン神経節細胞に伝えている。有毛細胞は一旦傷害されるとその再生が極めて困難であり、有毛細胞が失われると神経節細胞も徐々に失われ、内耳障害は不可逆的に進行する。内耳に障害が生じると、難聴の他にめまい、耳鳴り等の症状を起こす。
【００２８】
従って、本発明における内耳疾患としては、突発性難聴、騒音性難聴、老人性難聴、遺伝性難聴、両側性感音難聴、一側性感音難聴、両側性混合難聴、片側性混合難聴、薬剤性難聴等の難聴、並びに耳の血管障害、メニエール病、良性発作性頭位めまい症、前庭神経炎若しくはその他の末梢性めまい、その他の前庭機能障害、耳鳴、又は聴神経障害が含まれる。
【００２９】
あるいは、難聴は、障害器官の相違によって、外耳から中耳まで（伝音器）に障害がある伝音性難聴、内耳又は聴神経、中枢（感音器）に障害がある感音性難聴、伝音器と感音器の双方に障害のある混合性難聴に分類される。従って、本発明の予防又は治療剤の対象疾患は、感音性難聴又は混合性難聴であり、特に内耳性難聴を対象とする。
【００３０】
ネクロトーシス阻害剤、より具体的には、ネクロスタチン-1、ネクロスタチン-2、ネクロスタチン-3、ネクロスタチン-4、ネクロスタチン-5、ネクロスタチン-7、及びポナティニブ、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物又はプロドラッグは、上記の内耳疾患の予防又は治療のために使用される。本明細書において、「治療」とは、既に症状を有する患者における疾患の完全な若しくは部分的な治癒、症状の軽減、症状の進行の防止をいい、「予防」とは、疾患の可能性を有する患者における発症の抑制をいう。
【００３１】
上記式の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物又はプロドラッグは、そのまま予防剤又は治療剤として投与することも可能であるが、医薬組成物において通常使用される担体、賦形剤、防腐剤、酸化安定剤等を適宜添加して、医薬組成物として投与することもできる。
【００３２】
本発明の予防又は治療剤、あるいは上記医薬組成物は、経口投与及び非経口投与が可能であり、例えば経口；静脈内、筋肉内、経皮、皮下、皮内、腹腔内への注射もしくは注入による投与等が挙げられるが、特に限定するものではない。当業者であれば、本発明の予防又は治療剤、あるいは上記医薬組成物の投与のための好適な投与経路を適宜決定することができる。
【００３３】
一実施形態において、本発明の予防又は治療剤、あるいは上記医薬組成物は、全身投与される。一実施形態において、本発明の予防又は治療剤、あるいは上記医薬組成物は、局所投与される。特に、内耳疾患の予防又は治療の目的のために、また安全性の面からも、内耳への局所投与とすることが好ましい。
【００３４】
内耳への局所投与の場合、例えば少量の薬剤をスポンゼルとして既に医療現場で販売・使用されているスポンジ状のものに含ませ、内耳の入り口である正円窓（round window）に留置する方法等を用いることができる。
【００３５】
本発明の予防又は治療剤のヒトへの投与量は、投与対象の患者の年齢、体重、症状等に依存し、特に限定されないが、例えば1日当たり100μg/kg体重〜100mg/kg体重、好適には500μg/kg体重〜50mg/kg体重、より好適には1mg/kg〜30mg/kg体重の範囲とすることができる。１日１回〜数回、２日毎、３日毎、１週間毎、２週間毎、毎月、２カ月毎、３カ月毎等の頻度で、例えば症状が軽快するまで投与することが可能である。
【００３６】
本発明の予防又は治療剤、あるいは上記医薬組成物は、単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて投与することができる。他の薬剤は、内耳疾患に対して異なるメカニズムによって有効と思われる薬剤、限定するものではないが、例えばステロイド薬、利尿薬、ビタミン薬、及び血流改善薬から選択される1種以上の薬剤であり得る。ステロイド薬としては、例えばベタメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン等が挙げられる。利尿薬としては、例えばイソバイド、メニレット等が挙げられる。ビタミン薬としては、例えばビタミンB12、ATP製剤としてアデホス等が挙げられる。血流改善薬としては、例えばカリクレイン、プロスタグランジン、低分子デキストラン、血液凝固阻止剤等が挙げられる。
【００３７】
あるいはまた、他の薬剤は、対象患者の他の症状に対して投与される薬剤であっても良い。本発明の予防又は治療剤と他の薬剤は、同じ投与経路で投与しても、異なる投与経路で投与しても良い。例えば本発明の予防又は治療剤を局所投与とし、他の薬剤を全身投与、例えば経口投与とすることができる。
【００３８】
従って、本発明の予防又は治療剤は、上記の他の薬剤と同時に投与しても、連続して投与しても、別個に投与しても良い。同時に投与する場合には、本発明の予防又は治療剤と、上記の他の薬剤とを、別個の組成物として投与しても良く、また同じ組成物として投与しても良い。
【実施例】
【００３９】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
［実施例１］
タイラーマウス脳脊髄炎ウイルスは、ピコルナウイルス科カルデオウイルス属に属し、マウスに脳脊髄炎や免疫性脱髄を引き起こし、多発性硬化症のモデル動物となり得ることが報告されている（例えば信州医誌, 43(5): 405-415, 1995）。
【００４１】
本発明者等は、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルスに感染したマウスでは、感覚毛の脱落と有毛細胞死が観察され、従って突発性難聴等の内耳疾患のモデル動物となり得ることを見出し、以下の検討を行った。
【００４２】
生後２日齢のマウス蝸牛組織を顕微鏡下に摘出し、一晩培養した後、突発性難聴の病態を再現すべく、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（TEMV：Theiler's murine encephalomyelitis virus）3.0 x 107 pfu/mlを感染させた。
【００４３】
感染後、複数の時点で4%パラホルムアルデヒド溶液にて固定し、免疫染色にて組織評価を行った。具体的には、有毛細胞を、感覚毛を染色するファロイジン（phalloidin、Invitrogen）で赤く染色した。同時に、有毛細胞のマーカーとしてミオシン7a（myosin7a）を、ミオシン7a抗体（Proteus Biosciences）及び蛍光標識二次抗体（488-conjugated anti-rabbit goat IgG、Invitrogen）を用いて染色した。その結果、ウイルス感染を開始して24時間後では、ほとんどの感覚細胞（有毛細胞）の感覚毛の脱落と有毛細胞死が観察された（図１Ａ）。
【００４４】
一方、同様にマウス蝸牛組織をTEMV 3.0 x 107 pfu/mlに感染させる際に、同時にネクロトーシス抑制剤であるネクロスタチン-1（20μM／200μM／400μM、Abcam）を培地に添加した。投与24時間後に組織を4%パラホルムアルデヒド溶液にて固定し、免疫染色にて組織評価を行った結果、ネクロスタチン-1の濃度依存性に感覚毛の脱落と有毛細胞死の抑制が観察された（図１Ｂ〜１Ｄ）。
【００４５】
上記の実験にて、ネクロスタチン-1の添加によって保護された有毛細胞の数を測定したところ、外有毛細胞：OHC（図２Ａ）、内有毛細胞：IHC（図２Ｂ）共に、ネクロスタチン-1の濃度依存性にウイルス感染による細胞数の減少が抑制されることが確認された。
【００４６】
［実施例２］
実施例１と同様にして生後２日齢のマウス蝸牛組織をTEMV 3.0 x 107 pfu/mlに感染させ、19時間後に組織を4%パラホルムアルデヒド溶液にて固定した。感覚毛の脱落と有毛細胞死にネクロトーシスが重要であることを確認するため、ネクロトーシスを誘導するタンパク質であるリン酸化酵素RIPK1、RIPK3の下流の制御分子MLKLのリン酸化の有無について、ウサギモノクローナル抗-p-Mlkl抗体（phospho S345、Abcam）及び蛍光標識二次抗体（488-conjugated anti-rabbit goat IgG、Invitrogen）を用いて免疫染色による組織評価を行った。
【００４７】
その結果、蝸牛有毛細胞においてMLKLのリン酸化が確認され、ウイルス感染時に起こる有毛細胞死はネクロトーシスによるものであることが明らかになった（図３）。
【００４８】
［実施例３］
実施例１と同様にして生後２日齢のマウス蝸牛組織をTEMV 3.0 x 107 pfu/mlに感染させ、同時に貪食能のあるマクロファージを殺傷するクロドロン酸を含むリポソーム（Clophosome、フナコシ株式会社） 91μg/mlを加えた。Clophosomeを投与して24時間後に組織を4%パラホルムアルデヒド溶液にて固定し、免疫染色にて組織評価を行ったところ、感覚毛の脱落と有毛細胞死の抑制が観察された（図４)。
【００４９】
上記の実験にて、Clophosomeの投与によって保護された有毛細胞の数を測定したところ、内有毛細胞：IHC（図５Ａ）、外有毛細胞：OHC（図５Ｂ）共にマクロファージへと分化転換した支持細胞による障害の程度が軽減されていた。
【００５０】
上記の結果から、支持細胞、すなわち有毛細胞周囲に存在する細胞群がマクロファージに変化して、Trailを分泌して有毛細胞を傷害することが確認された。
【００５１】
［実施例４］
実施例１と同様にして、マウス蝸牛組織をTEMV 3.0 x 107 pfu/mlに感染させる際に、同時にネクロトーシス抑制剤であるポナティニブ（0.5μM/5μM, Selleckchem）を培地に添加した。投与24時間後に組織を4%パラホルムアルデヒド溶液にて固定し、免疫染色にて組織評価を行った結果、ポナティニブの濃度依存性に感覚毛の脱落と有毛細胞死の抑制が観察された（図６Ａ及びＢ）。
【００５２】
上記の実験にて、ポナティニブの添加によって保護された有毛細胞の数を測定したところ、外有毛細胞：OHC（図７Ａ）、内有毛細胞：IHC（図７Ｂ）共に、ポナティニブの濃度依存性にウイルス感染による細胞数の減少が抑制されることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
難聴を含む内耳疾患に罹患している患者は世界的に非常に多く、また高齢化社会になるにつれて内耳疾患の発症が増えている。特に21世紀は『感覚器の時代』と称される程、クオリティ・オブ・ライフ（Quality of Life）の向上が求められる時代であり、難治性である難聴等の内耳疾患に対する有効な治療剤が望まれてきた。本発明は、有毛細胞における感覚毛の脱落及び細胞死を効果的に抑制し、内耳疾患の治療及び予防に非常に有効な新規治療法を提供するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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