(57)【要約】【課題】染色試薬を用いることなく、かつ、細胞の自家蛍光に依らずに細胞の生存率を判定可能な細胞生存率判定装置を提供する。【解決手段】  培養細胞を含む粒子を含む溶液における粒子の大きさの分布を得る分布取得部３０１と、分布において、所定の閾値を用いて、粒子を、小粒子群と、大粒子群と、に分類する分類部３０２と、小粒子群に属する粒子の数と、大粒子群に属する粒子の数と、の比の値を算出する比算出部３０３と、予め取得した、比と、細胞の生存率と、の関係を用いて、比の値から、培養細胞の生存率を判定する生存率判定部３０４と、を備える、細胞生存率判定装置。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養細胞を含む粒子を含む溶液における前記粒子の大きさの分布を得る分布取得部と、
前記分布において、所定の閾値を用いて、前記粒子を、小粒子群と、大粒子群と、に分類する分類部と、
前記小粒子群に属する粒子の数と、前記大粒子群に属する粒子の数と、の比の値を算出する比算出部と、
予め取得した、前記比と、細胞の生存率と、の関係を用いて、前記比の値から、前記培養細胞の生存率を判定する生存率判定部と、
を備える、細胞生存率判定装置。
【請求項２】
前記分布取得部が、前記溶液の画像に基づき、前記粒子の大きさの分布を得る、請求項１に記載の細胞生存率判定装置。
【請求項３】
前記分布取得部が、前記粒子のそれぞれで生じた散乱光の強度に基づき、前記粒子の大きさの分布を得る、請求項１に記載の細胞生存率判定装置。
【請求項４】
前記溶液が流れる取り外し可能な流路と、
前記流路に接続された、取り外し可能な測定セルと、
前記測定セル内に測定光を照射する照射器と、
前記測定光を照射された前記測定セル内で生じた散乱光の強度を測定する散乱光測定器と、
をさらに備える、請求項３に記載の細胞生存率判定装置。
【請求項５】
前記培養細胞が浮遊培養されている、請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞生存率判定装置。
【請求項６】
前記培養細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１から５のいずれか１項に記載の細胞生存率判定装置。
【請求項７】
培養細胞を含む粒子を含む溶液における前記粒子の大きさの分布を得ることと、
前記分布において、所定の閾値を用いて、前記粒子を、小粒子群と、大粒子群と、に分類することと、
前記小粒子群に属する粒子の数と、前記大粒子群に属する粒子の数と、の比の値を算出することと、
予め取得した、前記比と、細胞の生存率と、の関係を用いて、前記比の値から、前記培養細胞の生存率を判定することと、
を含む、細胞生存率判定方法。
【請求項８】
前記溶液の画像に基づき、前記粒子の大きさの分布を得る、請求項７に記載の細胞生存率判定方法。
【請求項９】
前記粒子のそれぞれで生じた散乱光の強度に基づき、前記粒子の大きさの分布を得る、請求項７に記載の細胞生存率判定方法。
【請求項１０】
前記培養細胞が浮遊培養されている、請求項７から９のいずれか１項に記載の細胞生存率判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞培養技術に関し、細胞生存率判定装置及び細胞生存率判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオプロセスや細胞培養の分野において、細胞培養の条件を制御するため、及び細胞培養の停止時期を判断するため等に、培養細胞の生死を判定して、生存率が測定される。細胞の生死を判定する方法としては、細胞内の核酸に蛍光色素を結合させ、励起された蛍光の強度により細胞の生死を判定する方法（例えば、特許文献１参照。）が提案されている。また、死細胞の細胞膜を透過し、死細胞の細胞質を青く染色するトリパンブルー染色により、細胞の生死を判定する方法も知られている。
【０００３】
しかし、染色試薬は高価であり、かつ、細胞を染色する工程は煩雑である。また、染色試薬は、人体にとって有害であることが多い。そのため、染色試薬は、管理されて保管される必要がある。また、染色試薬で染色された細胞を、引き続き培養することは困難であり、廃液の処理にも注意する必要がある。これに対し、染色試薬を用いることなく、細胞が発する自家蛍光に基づいて、細胞の生死を判定する方法が提案されている（例えば、特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第２５９２１１４号公報
【特許文献２】特許第４８６８８７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞が発する自家蛍光は微弱であるため、長い露光時間が必要となったり、高感度な蛍光検出装置が必要となったりする場合がある。そこで、本発明は、染色試薬を用いることなく、かつ、細胞の自家蛍光に依らずに細胞の生存率を判定可能な細胞生存率判定装置及び細胞生存率判定方法を提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の態様によれば、培養細胞を含む粒子を含む溶液における粒子の大きさの分布を得る分布取得部と、分布において、所定の閾値を用いて、粒子を、小粒子群と、大粒子群と、に分類する分類部と、小粒子群に属する粒子の数と、大粒子群に属する粒子の数と、の比の値を算出する比算出部と、予め取得した、比と、細胞の生存率と、の関係を用いて、比の値から、培養細胞の生存率を判定する生存率判定部と、を備える、細胞生存率判定装置が提供される。
【０００７】
上記の細胞生存率判定装置において、分布取得部が、溶液の画像に基づき、粒子の大きさの分布を得てもよい。
【０００８】
上記の細胞生存率判定装置において、分布取得部が、粒子のそれぞれで生じた散乱光の強度に基づき、粒子の大きさの分布を得てもよい。
【０００９】
上記の細胞生存率判定装置が、溶液が流れる取り外し可能な流路と、流路に接続された、取り外し可能な測定セルと、測定セル内に測定光を照射する照射器と、測定光を照射された測定セル内で生じた散乱光の強度を測定する散乱光測定器と、をさらに備えていてもよい。
【００１０】
上記の細胞生存率判定装置において、培養細胞が浮遊培養されていてもよい。
【００１１】
上記の細胞生存率判定装置において、培養細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であってもよい。
【００１２】
また、本発明の態様によれば、培養細胞を含む粒子を含む溶液における粒子の大きさの分布を得ることと、分布において、所定の閾値を用いて、粒子を、小粒子群と、大粒子群と、に分類することと、小粒子群に属する粒子の数と、大粒子群に属する粒子の数と、の比の値を算出することと、予め取得した、比と、細胞の生存率と、の関係を用いて、比の値から、培養細胞の生存率を判定することと、を含む、細胞生存率判定方法が提供される。
【００１３】
上記の細胞生存率判定方法において、溶液の画像に基づき、粒子の大きさの分布を得てもよい。
【００１４】
上記の細胞生存率判定方法において、粒子のそれぞれで生じた散乱光の強度に基づき、粒子の大きさの分布を得てもよい。
【００１５】
上記の細胞生存率判定方法が、取り外し可能な流路、及び流路に接続された、取り外し可能な測定セルに溶液を流すことと、測定セル内に測定光を照射することと、測定光を照射された測定セル内で生じた散乱光の強度を測定することと、をさらに含んでいてもよい。
【００１６】
上記の細胞生存率判定方法において、培養細胞が浮遊培養されていてもよい。
【００１７】
上記の細胞生存率判定方法において、培養細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であってもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、染色試薬を用いることなく、かつ、細胞の自家蛍光に依らずに細胞の生存率を判定可能な細胞生存率判定装置及び細胞生存率判定方法を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】第１実施形態に係る細胞生存率判定装置の模式図である。
【図２】第１実施形態に係る細胞生存率判定装置の模式図である。
【図３】第１実施形態に係る粒子の度数分布を示す模式的なグラフである。
【図４】第１実施形態に係る細胞の培養時間と、大粒子群に属する粒子の数に対する小粒子群に属する粒子の数の比と、の関係を示す模式的なグラフである。
【図５】第１実施形態に係る死細胞の割合と、大粒子群に属する粒子の数に対する小粒子群に属する粒子の数の比と、の関係を示す模式的なグラフである。
【図６】第２実施形態に係る細胞生存率判定装置の模式図である。
【図７】第２実施形態に係る細胞生存率判定装置の模式図である。
【図８】培養開始後０日目から３日目における実施例に係る粒子の度数分布を示すグラフである。
【図９】培養開始後４日目から７日目における実施例に係る粒子の度数分布を示すグラフである。
【図１０】培養開始後８日目から１１日目における実施例に係る粒子の度数分布を示すグラフである。
【図１１】培養開始後１２日目及び１３日目における実施例に係る粒子の度数分布を示すグラフである。
【図１２】実施例に係る浮遊培養された細胞を含む培地の写真である。
【図１３】実施例に係る細胞の培養時間と、大粒子群に属する粒子の数に対する小粒子群に属する粒子の数の比と、の関係を示すグラフである。
【図１４】実施例に係る細胞の生存率と、大粒子群に属する粒子の数に対する小粒子群に属する粒子の数の比と、の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に本発明の実施形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。ただし、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることはもちろんである。
【００２１】
なお、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。したがって、本発明はここでは記載していない様々な実施形態等も包含するということを理解すべきである。
【００２２】
（第１実施形態）
第１実施形態に係る細胞生存率判定装置は、図１及び図２に示すように、培養細胞を含む粒子を含む溶液における粒子の大きさの分布を得る分布取得部３０１と、分布において、所定の閾値を用いて、粒子を、小粒子群と、大粒子群と、に分類する分類部３０２と、小粒子群に属する粒子の数と、大粒子群に属する粒子の数と、の比の値を算出する比算出部３０３と、予め取得した、比と、細胞の生存率と、の関係を用いて、比の値から、培養細胞の生存率を判定する生存率判定部３０４と、を備える。分布取得部３０１、分類部３０２、比算出部３０３、及び生存率判定部３０４は、例えば、演算処理装置３００に含まれる。
【００２３】
培養細胞は、例えば浮遊培養されている細胞である。浮遊培養においては、細胞を培養器の底面に接着させず、球状の細胞を培養液の中に浮遊させた状態で増殖させる。培養細胞は、接着培養された細胞であってもよい。培養細胞は、あらゆる種類の細胞を含む。培養細胞の一例としては、抗体産生細胞が挙げられる。抗体産生細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞は、株化したＣＨＯ細胞を含む。また、ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞や、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞等の亜種を含む。
【００２４】
分布取得部３０１は、例えば、培養細胞を含む粒子を含む溶液の画像に基づき、単位体積あたりの粒子の大きさの度数分布を得る。培養細胞を含む粒子を含む溶液の画像に写っている個々の粒子の大きさを計測することにより、粒子の大きさの度数分布が得られる。培養細胞を含む粒子を含む溶液の画像は、浮遊培養されている細胞を含む溶液の画像である。あるいは、培養細胞を含む粒子を含む溶液の画像は、接着培養されていた細胞であって、培養器から剥がされ溶液中に懸濁された細胞を含む溶液の画像である。粒子の大きさの度数分布は、例えば、ヒストグラムで表される。ただし、粒子の大きさの度数分布は、必ずしも視覚的に表現される必要はない。
【００２５】
培養細胞を含む粒子の大きさとは、粒子の直径であってもよいし、粒子の半径であってもよい。また、粒子の大きさを反映する数値を、粒子の大きさを表す指標として利用してもよい。例えば、粒子に光を照射すると、粒子において、ミー散乱光が生じる。ミー散乱光の強度は、粒子の大きさを反映している。したがって、ミー散乱光の強度を、粒子の大きさを表す指標として用いてもよい。この場合、分布取得部３０１は、粒子のそれぞれで生じた散乱光の強度に基づき、粒子の大きさの分布を得る。
【００２６】
本発明者が見出した知見によれば、培養細胞を含む粒子を含む溶液において粒子の大きさを測定すると、図３（ａ）に示すように、大きさが所定の閾値より大きい大粒子群と、大きさが所定の閾値より小さい小粒子群と、が観察される。細胞の培養日数が経過し、培養液中の死細胞が増加すると、図３（ｂ）に示すように、培養初期と比較して、大粒子群に属する粒子の数が減少し、小粒子群に属する粒子の数が増加する傾向にある。細胞の培養日数がさらに経過し、培養液中の死細胞がさらに増加すると、図３（ｃ）に示すように、大粒子群に属する粒子の数がさらに減少し、小粒子群に属する粒子の数がさらに増加する傾向にある。
【００２７】
したがって、例えば、図４に示すように、培養時間が経過するにつれて、大粒子群に属する粒子の数に対する小粒子群に属する粒子の数の比が、増加する傾向にある。また、図５に示すように、溶液における死細胞の割合が増加するにつれて、大粒子群に属する粒子の数に対する小粒子群に属する粒子の数の比が、増加する傾向にある。
【００２８】
大粒子群に属する粒子の数に対する小粒子群に属する粒子の数の比と、溶液における死細胞又は生細胞の割合と、の関係は、予め取得することが可能である。例えば、細胞の培養を開始してから、毎日、細胞を含む溶液における、大粒子群に属する粒子の数に対する小粒子群に属する粒子の数の比を測定し、かつ、細胞を含む溶液における死細胞又は生細胞の割合を、トリパンブルー染色等の既知の方法で測定する。これにより、大粒子群に属する粒子の数に対する小粒子群に属する粒子の数の比と、溶液における死細胞又は生細胞の割合と、の関係が取得される。当該関係の取得に際しては、最小二乗法等の近似法を適宜採用してもよい。例えば、当該関係は、比を独立変数とし、割合を従属変数とする一次関数で表されてもよい。
【００２９】
図１に示す演算処理装置３００には、例えば、データ記憶装置４０１が接続されている。データ記憶装置４０１は、上記のように予め取得された大粒子群に属する粒子の数に対する小粒子群に属する粒子の数の比と、溶液における死細胞又は生細胞の割合と、の関係を保存する。
【００３０】
分類部３０２は、分布取得部３０１が取得した粒子の大きさの度数分布において、図３に示すように、所定の閾値を用いて、粒子を、小粒子群と、大粒子群と、に分類する。所定の閾値には、例えば、度数の極小値を与える粒子の大きさが設定される。所定の閾値より大きさが小さい粒子が、小粒子群に分類され、所定の閾値より大きさが大きい粒子が、大粒子群に分類される。
【００３１】
図１に示す比算出部３０３は、小粒子群に属する粒子の数と、大粒子群に属する粒子の数と、の比の値を算出する。比の値は、小粒子群に属する粒子の数に対する、大粒子群に属する粒子の数の比の値でもよいし、大粒子群に属する粒子の数に対する、小粒子群に属する粒子の数の比の値でもよい。以下においては、大粒子群に属する粒子の数に対する小粒子群に属する粒子の数の比を用いる例を説明する。
【００３２】
生存率判定部３０４は、データ記憶装置４０１から、予め取得された大粒子群に属する粒子の数に対する小粒子群に属する粒子の数の比と、溶液における死細胞又は生細胞の割合と、の関係を読み出す。生存率判定部３０４は、読み出した関係と、比算出部３０３が算出した比の値に基づいて、溶液における死細胞又は生細胞の割合を算出し、培養細胞の生存率を判定する。ここで、培養細胞の生存率とは、例えば、死細胞と生細胞の合計に対する、生細胞の割合である。もっとも、死細胞の割合から、培養細胞の生存率を判定してもよい。
【００３３】
演算処理装置３００には、例えば、一時記憶装置４０２、信号出力装置４０３、信号入力装置４０４、信号送受信装置４０５、及び表示装置４０６等が接続されていてもよい。一時記憶装置４０２は、演算処理装置３００の演算過程における情報を一時的に記憶する。信号出力装置４０３は、演算処理装置３００が演算した信号を出力する。信号入力装置４０４は、演算処理装置が演算する信号を入力する。信号送受信装置４０５は、外部の装置と信号の送受信をする。表示装置４０６は、演算処理装置３００の処理過程における情報、及び処理結果の情報を表示する。
【００３４】
以上説明した第１実施形態に係る細胞生存率判定装置によれば、染色試薬を用いることなく、かつ、細胞の自家蛍光に依らずに細胞の生存率を判定可能である。
【００３５】
（第２実施形態）
第２実施形態に係る細胞生存率判定装置は、図６及び図７に示すように、光学式粒子検出装置５００をさらに備える。光学式粒子検出装置５００は、例えば、培養細胞を含む粒子を含む溶液が流れる取り外し可能な流路５０１と、流路５０１に接続された、取り外し可能な測定セル５０２と、測定セル５０２内に測定光を照射する照射器５０３と、測定光を照射された測定セル５０２内で生じた散乱光の強度を測定する散乱光測定器５０４と、を備える。
【００３６】
送液装置５０５によって、流路５０１に、培養細胞を含む粒子を含む溶液が流される。送液装置５０５は、送液制御部５０６によって制御され、溶液の流量等を設定する。流路５０１は、光学式粒子検出装置５００から取り外し可能である。取り外された流路５０１は、洗浄されてもよいし、新しい清浄な流路５０１と交換されてもよい。測定セル５０２は、測定光及び散乱光が透過可能な透明部材からなる。測定セル５０２の材料としては、石英ガラスが挙げられるが、これに限定されない。測定セル５０２は、光学式粒子検出装置５００から取り外し可能である。取り外された測定セル５０２は、洗浄されてもよいし、新しい清浄な測定セル５０２と交換されてもよい。
【００３７】
流路５０１及び測定セル５０２が清浄でない場合、前回測定した粒子が流路５０１及び測定セル５０２に残存し、その後の測定に影響を及ぼす可能性がある。これに対し、第２実施形態に係る流路５０１及び測定セル５０２は、光学式粒子検出装置５００から取り外し可能であるため、流路５０１及び測定セル５０２を清浄にすることが容易である。
【００３８】
照射器５０３は、例えば、レーザー光源と、レーザー光源の制御装置と、を備える。照射器５０３は、測定セル５０２内に、例えばレーザー光である測定光を照射する。測定セル５０２内に焦点を結ぶよう、レンズを配置してもよい。測定セル５０２内の粒子に測定光が照射されると、粒子においてミー散乱光が生じる。散乱光測定器５０４は、粒子で生じた散乱光の強度を測定する。
【００３９】
散乱光測定器５０４で測定された散乱光の強度は、信号送受信装置４０５等を介して、分布取得部３０１に送られる。上述したように、ミー散乱光の強度は、粒子の大きさを反映しているため、分布取得部３０１は、粒子のそれぞれで生じた散乱光の強度に基づき、粒子の大きさの分布を得る。
【００４０】
第２実施形態に係る細胞生存率判定装置の他の構成要素は、第１実施形態と同様であるため、説明は省略する。
【００４１】
［実施例］
Ｌ−グルタミン（終濃度６ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ａｎｔｉ−Ｃｌｕｍｐｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ（終濃度１％）を添加した培地（ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ、登録商標、タンパク質不含有、動物由来成分不含有、インビトロジェン製）を用意した。当該培地で、トラスツズマブを産生するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、３７℃、５％ＣＯ2で浮遊培養した。浮遊培養開始後、定期的に細胞を含む培地をサンプリングした。
【００４２】
サンプリングした培地を、所定の倍率で希釈し、粒子検出装置（ＩＭＤ−Ｗ、アズビル製）を用いて、培地に含まれる粒子のそれぞれにレーザー光を照射し、粒子のそれぞれで生じるミー散乱光の強度を測定した。粒子で生じるミー散乱光の強度は、粒子の粒径を表している。また、サンプリングし希釈した培地に含まれる細胞をトリパンブルーで染色し、セルカウンターを用いて、総細胞数と、染色細胞数と、を計数した。染色された細胞は、死細胞と判定した。判定結果より、細胞の生存率を算出した。さらに、サンプリングし希釈した培地の写真を撮影し、培地中の粒子の観察をした。
【００４３】
培養開始後、１日ごとに測定した、粒子の粒径の度数分布を表すヒストグラムを図８から図１１に示す。ヒストグラムにおいて、度数の極小値を与える粒径を境に、小粒子群の分布と、大粒子群の分布と、が現れた。図１２に示すサンプリングされた細胞を含む培地の画像から、大粒子群に分類された粒子は、生細胞を含むものと考えられた。
【００４４】
培養時間に対して、大粒子群に属する粒子の数に対する、小粒子群に属する粒子の数の比の値をプロットしたグラフを図１３に示す。図１３に示すように、比の値は、培養日数が進むにつれて、大きくなる傾向にあった。なお、培養初期にやや比の値が大きいのは、粒子検出装置に、以前測定した小粒子が残存していたことが考えられる。また、その後、比の値が一旦小さくなったのは、生細胞が増殖し、大粒子群に分類された粒子が増加したためと考えられる。
【００４５】
また、細胞の生存率に対し、大粒子群に属する粒子の数に対する、小粒子群に属する粒子の数の比の値をプロットしたグラフを図１４に示す。比と、細胞の生存率と、の間には、相関が認められた。したがって、細胞を培養すると、培養日数が進むにつれて、培地中に小粒子群に分類される粒子が増加すること、小粒子群に属する粒子の数と、大粒子群に属する粒子の数と、比から、細胞の生存率を推測することができることが示された。
【符号の説明】
【００４６】
３００・・・演算処理装置、３０１・・・分布取得部、３０２・・・分類部、３０３・・・比算出部、３０４・・・生存率判定部、４０１・・・データ記憶装置、４０２・・・一時記憶装置、４０３・・・信号出力装置、４０４・・・信号入力装置、４０５・・・信号送受信装置、４０６・・・表示装置、５００・・・光学式粒子検出装置、５０１・・・流路、５０２・・・測定セル、５０３・・・照射器、５０４・・・散乱光測定器、５０５・・・送液装置、５０６・・・送液制御部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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