(57)【要約】【課題】卵巣がんの中でも予後が悪いとされる卵巣明細胞腺がんの有効な治療薬の提供。【解決手段】ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤とを組み合わせてなる卵巣明細胞腺がん治療薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤とを組み合わせてなる卵巣明細胞腺がん治療薬。
【請求項２】
ＭＤＭ２阻害剤が、ＡＰＲ−２４６、ＮＳＣ２０７８９５、ＭＩ−７７３、Ｎｕｔｌｉｎ−３、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ、Ｎｕｔｌｉｎ−３ｂ、ＹＨ２３９−ＥＥ、ＲＧ７１１２及びＤＳ３１３２ｂから選ばれる薬物である請求項１記載の卵巣明細胞腺がん治療薬。
【請求項３】
ｍＴＯＲ経路阻害剤が、ラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス、ＤＳ７４２３、ＧＤＣ０９８０、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＦ−０５２１２３８４、ＳＦ１１２６、ＸＬ７６５、ＳＡＲ２４５４０９、ＧＳＫ２１２６４５８、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＮＶＰ−ＢＫＭ１２０及びイデラリシブから選ばれる薬物である請求項１又は２記載の卵巣明細胞腺がん治療薬。
【請求項４】
卵巣がん患者に由来するがん細胞のＭＤＭ２発現量及びｐ５３変異の有無を測定し、ＭＤＭ２発現量が高く、かつｐ５３変異が陰性であるがん細胞を卵巣明細胞腺がんと判定することを特徴とする卵巣明細胞腺がんの判定方法。
【請求項５】
卵巣明細胞腺がんにおけるＭＤＭ２発現量を対比することを特徴とする卵巣明細胞腺がんの予後の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵巣明細胞腺がん治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
卵巣がんは、近年増加傾向にあり、その中でも卵巣明細胞腺がんは４０歳代から急に増え、発生頻度も上昇傾向にある。卵巣がんは、組織型で、漿液性、粘液性、類内膜、明細胞、未分化型、混合型に分類されるが、組織型に着目した治療法は行われておらず、化学療法のレジメンも共通である。分子標的薬で現在卵巣がんで適応拡大されているベバシズマブにおいても、組織型による使い分けは行われていない。また、欧米では約６０％が漿液性腺がんで、明細胞腺がんは５％前後であることから、臨床試験や前臨床試験のいずれにおいても、卵巣がん研究の圧倒的多数を漿液性腺がんが占めているのが現状である。明細胞腺がんは、日本人に特に多いという特徴があり、臨床試験においても日本が中心で行われてきたものが多い。しかしながら、卵巣明細胞腺がんの治療戦略を変えるだけの治療法は未だに確立されていないのが現状である。がん抑制遺伝子ｐ５３がほぼ全例で変異を来たしている卵巣漿液性腺がんと子宮内膜症由来とされている卵巣明細胞腺がんでは、発がん機序が全く異なると考えられており、事実、これまでのゲノム解析結果や遺伝子変異プロファイルを比較してみても、共通性は極めて低い。以上の背景より、卵巣明細胞腺がんについては、臨床検体を入手し、その生物学的特性を調べるうえで、日本に大きなアドバンテージがあり、臨床検体から得られた生物学的特性に裏打ちされた新規の分子標的治療法を開発していくことは、個別化治療に直結するところであり、日本の製薬企業の関心も高くなっている。
【０００３】
卵巣明細胞腺がんの治療手段としては、まず手術で除去することが重要であるが、抗がん剤が効きにくいため予後が悪いという特徴がある。一般に卵巣がんの治療には、シスプラチンやカルボプラチンが標準的に用いられるが、卵巣明細胞腺がんの多くはプラチナ製剤に抵抗性があり、再発しやすい要因となっている。上述の通り、化学療法に低感受性の卵巣明細胞腺がんにおいては、既存の化学療法のみでは再発例の予後は極めて不良であり、新規の治療法の開発が喫緊の課題である。
【０００４】
がん抑制遺伝子として知られるｐ５３は、ユビキチン−プロテアソーム誘発分解によるＭＤＭ２との結合を介して不活性化される。またｐ５３は、ｐ５３がＭＤＭ２から遊離されると活性化する（非特許文献１）。従って、ｐ５３−ＭＤＭ２結合の阻害は、抗がん剤のターゲットとして注目されている。しかし、卵巣がんについてみると、漿液性卵巣がんはｐ５３の変異が９６％に見られるものの、明細胞腺がんではｐ５３の変異は１０％未満であることが知られている（非特許文献２、３）。変異によって失われた機能を回復させることは困難であり、多くの他のがん腫と同様に、漿液性卵巣がんにおいて、ｐ５３機能を活用した遺伝子治療法は行われていない。しかしながら、ｐ５３の変異率が低いことと、ｐ５３ががん抑制遺伝子としての機能を保持していることとは別に考える必要がある。すなわち、上記の通り、ｐ５３はＭＤＭ２との結合により不活化されているため、ＭＤＭ２が発現上昇などにより活性化している場合、ｐ５３の分解が進み、ｐ５３に変異がないにもかかわらず、機能できるｐ５３タンパクが存在しない（不活化している）という状態が生じうる。ｐ５３に変異はないものの、ＭＤＭ２による分解によって失活しているがんにおいては、ＭＤＭ２−ｐ５３結合が分子標的治療のターゲットとなりうる。
【０００５】
一方、卵巣明細胞腺がんでは、ＰＩ３Ｋ経路の遺伝子であるＰＩＫ３ＣＡの遺伝子変異率が高く、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴとその下流にあるｍＴＯＲが分子標的治療のターゲットとして注目されている（非特許文献４、５）。実際にｍＴＯＲ経路の阻害剤は、卵巣明細胞腺がんで抗腫瘍効果を示している（非特許文献４）。ｍＴＯＲ阻害剤は腎細胞がんをはじめとしていくつかの癌腫で臨床応用されているものの、単剤での使用にとどまっており、増殖抑制効果は示すものの、細胞死の誘導効果は低く、腫瘍を縮小させる効果は乏しい。従って、卵巣明細胞腺がんを含めて、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路は活性化している頻度は高いが、実際にどのようにがん細胞を死に至らしめるのか、腫瘍を縮小させるのかについての治療ストラテジーは未解明の状況が続いてきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Wade M, Li YC, Wahl GM.MDM2, MDMX and p53 in oncogenesis and cancer therapy. PMID 23303139 or [21] Pei D, Zhang Y, Zheng J. Regulation of p53: a collaboration between Mdm2 and Mdmx. Oncotarget 2012; 3: 228-235.
【非特許文献２】Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature 2011; 474: 609-615.
【非特許文献３】Kuo KT, Mao TL, Jones S, Veras E, Ayhan A, Wang TL, Glas R, Slamon D, Velculescu VE, Kuman RJ, Shih IeM. Frequent activating mutations of PIK3CA in ovarian clear cell carcinoma. Am J Pathol 2009; 174: 1597-160.
【非特許文献４】Kashiyama T, Oda K, Ikeda Y, Shiose Y, Hirota Y, Inaba K, , Makii C, Kurikawa R, Miyasaka A, Koso T, Fukuda T, Tanikawa M, Shoji K, et al. Antitumor activity and induction of TP53-dependent apoptosis toward ovarian clear cell adenocarcinoma by the dual PI3K/mTOR inhibitor DS-7423. PLoS One 2014; 9:e87220
【非特許文献５】Okamoto A, Glasspool RM, Mabuchi S, Matsumura N, Nomura H, Itamochi H, Takano M, Takano T, Susumu N, Aoki D, Konishi I, Covens A, Ledermann J, et al. Gynecologic Cancer InterGroup (GCIG) consensus review for clear cell carcinoma of the ovary. Int J Gynecol Cancer 2014; 24: S20-25.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、卵巣明細胞腺がんはｐ５３の異常が少ないなど卵巣がんの中でも特殊であり、シスプラチン抵抗性でもあり、また欧米で頻度が低いことから、治療標的分子の解明が未だに十分解明されておらず、どのような阻害剤をどのように組み合わせればよいのかは未だ明らかにされていない。
従って、本発明の課題は、卵巣がんの中でも予後が悪いとされる卵巣明細胞腺がんにおいて、新規の治療標的分子を明らかとし、有効な治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、卵巣明細胞腺がんにおける臨床検体を用いた発現解析により、卵巣明細胞腺がんでは、他の組織型や正常組織に比べて有意にＭＤＭ２高発現例が多いこと、さらにはＭＤＭ２高発現例では有意に予後不良であること、および多変量解析により、卵巣明細胞腺がんでＭＤＭ２高発現が独立予後不良因子であることを見出した。しかも、ＭＤＭ２高発現例ではいずれもｐ５３変異は陰性であり、卵巣明細胞腺がんにおいて、ｐ５３に変異は認めないものの、ｐ５３機能がＭＤＭ２高発現によって抑制されている機序が存在することを見出した。すなわち、一つ目の知見として、ＭＤＭ２高発現かつｐ５３変異陰性が卵巣明細胞腺がんのコンパニオン診断に応用できることを見出した。これにより、ＭＤＭ２−ｐ５３結合を阻害するストラテジー（ＭＤＭ２阻害剤）が卵巣明細胞腺がんにおいて、合理的な治療戦略であることが明らかとなった。
卵巣明細胞腺がんにおけるｍＴＯＲ経路阻害剤の抗腫瘍効果は上述の通りであるが、細胞死の比率が低いという課題があった。そこで、卵巣明細胞腺がんに対する治療薬を開発すべく種々検討した。ｐ５３変異率が低いことから、これまで卵巣明細胞腺がんにおいてｐ５３が関わる経路は治療標的として注目されてこなかったが、本研究の一つ目の上記発見により、ＭＤＭ２発現上昇とｐ５３変異陰性というコンパニオン診断を活用した治療戦略を候補に考えることが可能となった。ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤とを併用したところ、驚くべきことに、各阻害剤の作用が相乗的に増強され、アポトーシスシグナルの活性化とともに、卵巣明細胞腺がん細胞が次々にアポトーシスを起こすという、既存薬では見られなかった現象を、ヌードマウスモデルで証明し、ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤の併用が卵巣明細胞腺がんの治療に有効であることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤とを組み合わせてなる卵巣明細胞腺がん治療薬を提供するものである。
また、本発明は、卵巣がん患者に由来するがん細胞のＭＤＭ２発現量及びｐ５３変異の有無を測定し、ＭＤＭ２発現量が高く、かつｐ５３変異が陰性であるがん細胞を卵巣明細胞腺がんと判定することを特徴とする卵巣明細胞腺がんの判定方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の判定方法によれば、卵巣がんのうちＭＤＭ２によってｐ５３が失活している卵巣明細胞腺がんが明確に診断できる。
ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤とを併用すれば、卵巣がんの中でも予後が悪く、抗がん剤抵抗性の高い卵巣明細胞腺がんの増殖が相乗的に抑制される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】卵巣明細胞腺がん（ＣＣＣ）、卵巣漿液性腺がん（ＣＳ）及び正常組織（Ｎｏｒｍａｌ）のＭＤＭ２発現量の比較を示す。
【図２】卵巣明細胞腺がんにおけるＭＤＭ２発現量が高い群とＭＤＭ２発現量が低い群の予後（生存率）の比較を示す。
【図３】ヒト卵巣明細胞腺がん細胞株に対する増殖抑制作用を示す。図４〜図１１中、ＲＧ又はＲＧ７１１２は、ＲＧ７１１２（ＭＤＭ２阻害剤）を示す。ＤＳ７４２３又はＤＳはＤＳ７４２３（ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ同時阻害剤）を示す。
【図４】ヒト卵巣明細胞腺がん細胞株におけるＲＧ７１１２とＤＳ７４２３によるｐ５３及びアポトーシスレベルに対する作用を示す。
【図５】ヒト卵巣明細胞腺がん細胞株におけるＲＧ７１１２とＤＳ７４２３によるｓｕｂ−Ｇ１に対する作用を示す。
【図６】ヒト卵巣明細胞腺がん細胞株におけるＲＧ７１１２とＤＳ７４２３によるアネキシンＶに対する作用を示す。
【図７】ヒト卵巣明細胞腺がん（ＲＭＡ１株）に対するＲＧ７１１２とＤＳ７４２３による増殖抑制作用を示す（ｉｎ  ｖｉｖｏ）。
【図８】ヒト卵巣明細胞腺がん（ＯＶＩＳＥ株）に対するＲＧ７１１２とＤＳ７４２３による増殖抑制作用を示す（ｉｎ  ｖｉｖｏ）。
【図９】ヒト卵巣明細胞腺がんにおけるＲＧ７１１２とＤＳ７４２３によるアポトーシス誘導作用を示す（ｉｎ  ｖｉｖｏ）。
【図１０】ヒト卵巣明細胞腺がんにおけるＲＧ７１１２とＤＳ７４２３によるＤＮＡ合成に対する作用を示す（ｉｎ  ｖｉｖｏ）。
【図１１】ヒト卵巣明細胞腺がんにおけるＲＧ７１１２とＤＳ７４２３による血管新生に対する作用を示す（ｉｎ  ｖｉｖｏ）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の卵巣明細胞腺がんの判定方法は、卵巣がん患者に由来するがん細胞のＭＤＭ２発現量及びｐ５３変異の有無を測定し、ＭＤＭ２発現量が高く、かつｐ５３変異が陰性であるがん細胞を卵巣明細胞腺がんと判定することを特徴とする。
【００１３】
判定の対象となる細胞は、卵巣がん患者に由来するがん細胞である。卵巣がん細胞は、患者の卵巣から手術による摘出や生検法により採取することができる。がん細胞が存在すると考えられる卵巣の一部の組織を採取して用いることができる。原発の卵巣腫瘍が摘出困難な場合には、転移・播種巣のみであっても、その生検組織を用いることで評価が可能である。
【００１４】
対象組織のＭＤＭ２発現量の測定は、例えば免疫組織染色法、ＲＮＡ定量法、マイクロアレイ法、染色体コピー数判定法等により行うことができる。例えば、免疫組織染色法は、手術・生検検体等より得られたパラフィン切片を用いて市販の抗ＭＤＭ２抗体により発現強度を判定できる。一般にスコア化することが可能であり（ＨＥＲ２の過剰発現のように）、定量化が可能である。
【００１５】
対象組織のｐ５３変異の測定は、例えば免疫組織染色法、腫瘍からのゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ＋Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法、等により行うことができる。例えば、免疫組織染色法は、手術・生検検体等より得られたパラフィン切片を用いて市販の抗ｐ５３抗体により発現強度を判定できる。ｐ５３の免疫組織染色は一般病理診断でも卵巣がんを含めて広く行われており、ｐ５３変異の有無を予測することができる。例えば、ｐ５３に変異があると、ＭＤＭ２による分解も行われないため、ｐ５３タンパクが核に蓄積し（過剰発現）、変異陽性と判定できる。
【００１６】
ＭＤＭ２の発現量は、正常組織中のＭＤＭ２発現量や卵巣漿液性腺がん組織中のＭＤＭ２発現量と対比して高い場合に、ＭＤＭ２の発現量が高いと判断すればよい。すなわち、予め正常組織や卵巣漿液性腺がん組織中のＭＤＭ２発現量を測定しておき、その値と対比すればよい。摘出腫瘍検体では、正常組織を通常含んでいるため、同一症例において検討することができる。
【００１７】
またｐ５３変異率は、卵巣明細胞腺がんでは、他の卵巣がんに比べて有意に低い。すなわち、対象組織が卵巣明細胞腺がんの場合には、ｐ５３変異は通常陰性になる。陽性か陰性かは、p５３の過剰発現により変異を判定できる。まれに、変異および／あるいは染色体欠失により、p５３発現が完全に消失することがあるが、その場合のp５３変異判定もすでに病理診断上確立されている。他の卵巣がん、例えば卵巣漿液性腺がんのｐ５３変異と判定されたものをポジティブコントロールとして用いることができる。
【００１８】
対象組織のＭＤＭ２発現量が正常組織や漿液性腺がんのＭＤＭ２発現量よりも高く、かつｐ５３変異性が陰性であれば、その対象組織は卵巣明細胞腺がんであると判定できる。
【００１９】
また、卵巣明細胞腺がん組織のＭＤＭ２発現量をさらに検討した結果、ＭＤＭ２発現量が高い群はＭＤＭ２発現量が低い群に比べて、生存率が有意に低く、予後が悪いことも判明した。従って、卵巣明細胞腺がん組織のＭＤＭ２発現量を測定し、予め測定しておいて卵巣明細胞腺がん組織におけるＭＤＭ２発現量と対比し、ＭＤＭ２発現量が高ければ予後が悪い、ＭＤＭ２発現量が低ければ予後が良好であると判定できる。
【００２０】
本発明の卵巣明細胞腺がん治療薬の有効成分は、ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤である。
【００２１】
ＭＤＭ２は、ｐ５３を制御する主要なユビキチンリガーゼであり、ｐ５３をプロテアソーム依存性の分解へ導くタンパクである。がん細胞でみられるＭＤＭ２の発現増加の異常は、ｐ５３発現を著しく低下させ、持続的ながん細胞の増殖を可能にすることが知られている。従って、ＭＤＭ２阻害剤は、抗がん剤として有用であると考えられている。しかし、ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤との併用が、卵巣明細胞腺がんに対してどのような作用を示すかは知られていない。また、卵巣がんの中で、ＭＤＭ２が高発現を示す組織型が卵巣明細胞腺がんであることも知られていない。
【００２２】
ＭＤＭ２阻害剤としては、以下に示す化合物が挙げられる。
【００２３】
【化１】
2018012666.tif 000002
【００２４】
これらの化合物は、既知であり、市販品を入手できる。
【００２５】
がん細胞では、細胞死シグナルの機能喪失とともに生存シグナルの亢進が認められ、その中心的なシグナル伝達経路としてＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路が知られており、このｍＴＯＲ経路はがんの生存、分化、増殖に重要な役割を担っている。従って、ｍＴＯＲ経路阻害剤は、抗がん剤として有用であると考えられている。しかし、ｍＴＯＲ経路阻害剤とＭＤＭ２阻害剤との併用が卵巣明細胞腺がんに対してどのような作用を示すかは知られていない。
【００２６】
ｍＴＯＲ経路阻害剤としては、ＡＫＴ阻害剤、ｍＴＯＲＣ１／ｍＴＯＲＣ２阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ同時阻害剤から選ばれる阻害剤が挙げられ、具体的には、以下に示す化合物が挙げられる。
【００２７】
【化２】
2018012666.tif 000003
【００２８】
【化３】
2018012666.tif 000004
【００２９】
【化４】
2018012666.tif 000005
【００３０】
【化５】
2018012666.tif 000006
【００３１】
これらの化合物は、既知であり、容易に入手できる。
【００３２】
後記実施例に示すように、ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤とを併用すれば、ＭＤＭ２を高発現し、ｐ５３の異常が少ない等特殊ながんである卵巣明細胞腺がんの増殖を相乗的に抑制する。また、ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤の併用は、ｐ５３及び前駆アポトーシス蛋白を顕著に誘導し、アポトーシスを顕著に誘導する。従って、ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤との組み合わせは、卵巣明細胞腺がん治療薬として有用である。
【００３３】
本発明の治療薬においては、ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤とを組み合わせて使用すればよく、例えば次の形態が挙げられる。
（Ａ）ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤とを含有する医薬組成物。
（Ｂ）ＭＤＭ２阻害剤を含有する医薬組成物と、ｍＴＯＲ経路阻害剤を含有する医薬組成物を、別々に投与するための形態。
ここで、（Ｂ）の形態の場合、各医薬組成物を同時に投与するか、又は適宜別々に投与してもよい。また、（Ｂ）の形態の場合、各医薬組成物を単一包装中に含むキット製剤として提供することもできる。
【００３４】
ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤とは、それぞれの薬剤を単独で投与する形態と同じ形態で投与するのが好ましい。また、ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤との投与量は、特に限定されるものではないが、１回あたりの投与量の質量比で１：５００〜５００：１が好ましく、１：４００〜４００：１がより好ましく、１：３００〜３００：１がさらに好ましい。
【００３５】
本発明の医薬の投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与のいずれであってもよい。前記（Ｂ）に係る形態においては、一方を経口投与製剤とし、他方を非経口投与製剤とすることもできる。経口投与製剤としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等が挙げられる。非経口投与製剤としては、例えば、注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、皮膚外用剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。
経口投与製剤、非経口投与製剤は、公知の製剤添加物を用いて、例えば、第１５改正日本薬局方  製剤総則等に記載の公知の方法に基づいて製造することができる。
【００３６】
本発明の医薬の投与量は特に限定されず、患者の年齢、体重、症状、投与形態、投与回数等の種々の条件に応じて適宜投与量を増減することができるが、ＭＤＭ２阻害剤は１回あたり０．１ｍｇ／ｂｏｄｙ〜２，０００ｍｇ／ｂｏｄｙまたは０．１ｍｇ／ｍ2〜２，０００ｍｇ／ｍ2を１日〜２８日間に１〜７回投与することができる。一方、ｍＴＯＲ経路阻害剤は１回あたり０．１ｍｇ／ｂｏｄｙ〜２，０００ｍｇ／ｂｏｄｙまたは０．１ｍｇ／ｍ2〜２，０００ｍｇ／ｍ2を１日〜２８日間に１〜７回投与することができる。
【実施例】
【００３７】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００３８】
実施例１
卵巣明細胞腺がん（ＣＣＣ）の臨床検体７５例、卵巣漿液性腺がんの臨床検体１６例（ＳＣ）と１３種類の正常組織（Ｎｏｒｍａｌ）からＲＮＡを抽出し、マイクロアレイにて発現を調べた。その結果、図１に示すように、卵巣明細胞腺がんでＭＤＭ２高発現例が多く、卵巣漿液性腺がんや正常組織と比較して有意に上昇していることが明らかとなった。さらに、卵巣明細胞腺がんの中でＭＤＭ２の発現を検討したところ、ＭＤＭ２高発現は有意に無増悪生存期間が短く、有意に予後不良であった（図２）。
【００３９】
卵巣明細胞腺がんの臨床検体における単変量、多変量解析結果を表１に示す。ＭＤＭ２高発現は単変量解析に加えて、多変量解析でも独立した予後不良因子であることが明らかとなった。
【００４０】
【表１】
2018012666.tif 000007
【００４１】
実施例２
ヒト卵巣明細胞腺がん由来細胞株（ＯＶＩＳＥ、ＲＭＧＩ、ＯＶＴＯＫＯ及びＪＨＯＣ７）を用いて、ＭＤＭ２阻害剤であるＲＧ７１１２とＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤であるＤＳ７４２３の細胞増殖抑制作用を検討した。
細胞増殖はテトラゾリウム塩ＷＳＴ−８（同仁堂、日本国東京都港区）をベースにした細胞数測定キットを用いて測定した（ＭＴＴアッセイとして知られる）。簡潔に言うと、細胞を９６穴プレートに２，０００細胞／ｗｅｌｌで撒き、２４時間後、ＲＧ７１１２(ＯＶＩＳＥおよびＲＭＧ１に対しては０．６２５μＭ、ＯＶＴＯＫＯおよびＪＨＯＣ７に対しては１．２５μＭ)の存在下または非存在下でＤＳ７４２３を０〜３，０００ｎＭで添加し、細胞を７２時間インキュベートした。細胞増殖数はマイクロプレートリーダー（バイオテック：米国バーモント州ウィノースキー）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定することにより数えた。細胞増殖はＤＭＳＯ処理した細胞培養と比較して正規化した。相乗効果はＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ法の併用係数（ＣＩ）を計算することによって評価した。全数値は０．７２５以下であったので、相乗効果があったことを示す（ＣＩ＜１であれば、相乗効果、ＣＩ＝１は相加効果、ＣＩ＞１は拮抗作用を表す。）。
【００４２】
その結果を図３に示す。図３から明らかなように、ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤を併用すると、それぞれ単独の場合に比べて細胞増殖抑制作用を示すＩＣ５０が顕著に低下し、相乗的に強力な細胞増殖抑制作用を示すことが明らかになった。
【００４３】
実施例３
ヒト卵巣明細胞腺がん細胞株（ＯＶＴＯＫＯ、ＯＶＩＳＥ）を用いて、ＭＤＭ２阻害剤であるＲＧ７１１２とＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ同時阻害剤であるＤＳ７４２３のｐ５３とアポトーシスに及ぼす作用を検討した。
ウェスタンブロット法：細胞をＲＧ７１１２（２．５〜５μＭ）および／またはＤＳ７４２３（１５６ｎＭ）で処理し、その後細胞よりタンパクを抽出した。抽出タンパクを用いて、ｐ５３、ホスホ−ｐ５３（ｓｅｒ４６）、ホスホ−ｐ５３（ｓｅｒ１５）、ｐ２１、ＰＵＭＡ、Ｃｌｅａｖｅｄ−ＰＡＲＰ（ＰＡＲＰタンパクが断片化された状態）（セルシグナリングテクノロジー、米国マサチューセッツ州ダンバース）およびアクチン（シグマ・アルドリッチ、米国ミズーリ州セントルイス）に特異的な抗体で解析を行った。
細胞周期はフローサイトメトリ法によって分析した。細胞（５×１０５）を６０ｍｍの培養皿に撒き、ＲＧ７１１２（２．５μＭ）および／またはＤＳ７４２３（１５６ｎＭ）で４８時間処理した。浮遊・付着した細胞をトリプシン処理によって集め、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、冷７０％エタノール中に再懸濁し、４℃で終夜インキュベートした。次に細胞をＰＢＳでさらに２回洗浄し、０．２５ｍｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ  Ａ（シグマ・アルドリッチ）で３０分間３７℃で処理し、５０μｇ／ｍＬ  ヨウ化プロピジウム（シグマ・アルドリッチ）で染色し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ  ＨＧ（ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー）で分析した。データをＣＥＬＬ  Ｑｕｅｓｔ  ｐｒｏ  ｖｅｒ．３．１．（ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー）により分析した。
アポトーシスの検出は、アネキシンＶアッセイによって行った：細胞（５×１０５）を６０ｍｍプレートに２４時間播種し、ＤＭＳＯまたはＲＧ７１１２のいずれかに７２時間曝露した。細胞はその後トリプシン処理し、二回洗浄し、製造者の指示書に従ってアネキシンＶ−フルオレシンイソチオシアネートおよびヨウ化プロピジウムで二倍染色した。実験は３回繰り返した。
【００４４】
その結果を図４〜６に示す。図４からＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤の併用により、ｐ５３レベル及びアポトーシス蛋白であるＰＵＭＡやＰＡＲＰ切断（Ｃｌｅａｖｅｄ  ＰＡＲＰ）のレベルが、それら単独使用の場合に比べて顕著に増加した。図５から、ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤の併用により、ｓｕｂ−Ｇ１が顕著に増加し、アポトーシス誘導が促進された。また、図６から、ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤の併用により、アネキシンＶが相乗的に増加しており、アポトーシス誘導が相乗的に増強されたことがわかる。
【００４５】
実施例４
ヒト卵巣明細胞腺がんに対するＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤の併用による効果をｉｎ  ｖｉｖｏで検討した。
【００４６】
ヌードマウス中の腫瘍キセノグラフト： クレア・ジャパン社（日本国東京都目黒区）から病原菌のないメスヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃ１−ｎｕ／ｎｕ）を購入した。５〜６週齢において、マウス脇腹に２００μＬＰＢＳ中の１０７ＲＭＧ−ＩまたはＯＶＩＳＥ細胞の皮下注射を行った。腫瘍が非常に大きくなった後に収穫し、３ｍｍ大にすりつぶし、他のマウスの右脇腹に皮下移植を行った。腫瘍が直径５ｍｍに成長した後、マウスを無作為に５〜６匹の群二つに分けた。一方の群は一日経口注射０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース４００（和光純薬工業、日本国大阪府大阪市）に懸濁したＲＧ７１１２および／またはＤＳ７４２３（３ｍｇ／ｋｇ）を（５０ｍｇ／ｋｇ）行った。他方はメチルセルロースの同用量を投与した。腫瘍サイズはデジタル測定器を用いて毎週３回測定し、腫瘍体積を式（長軸×短軸）／２に従って予測した。マウスは２０日間の処置の後人道的に殺処分し、腫瘍は免疫ブロット分析のために４％パラホルムアルデヒド内で保存した。
【００４７】
ＴＵＮＥＬアッセイ：腫瘍部は４％パラホルムアルデヒド中で４℃で１０分間固定し、１％過酸化水素水に室温で３０分間浸漬して内因性ペルオキシダーゼを不活化し、ブロッキングワン（ナカライテスク、日本国京都府）で３０分間室温でブロッキング処理した。ＴＵＮＥＬアッセイはＰｒｏｍｅｇａ  ＤｅａｄＥＮＤＴＭ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ＴＵＮＥＬ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造者の指示書に従って行った。
【００４８】
免疫組織化学：ＣＤ３１を免疫染色するために、腫瘍部を４％パラホルムアルデヒド水に４℃で１０分間固定し、１％過酸化水素水に室温で３０分間浸漬して内因性のペルオキシダーゼを不活化し、ブロッキングワン（ナカライテスク、日本国京都府）で３０分間室温でブロッキング処理した。腫瘍部は次に４℃で終夜１：５００抗ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１;ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー州フランクリンレイク）で調査し、トリス緩衝生理食塩水中で洗浄し、１：４００ビオチニル化ウサギ抗ラット（ＤＡＫＯ）で、そして室温でＬＳＡＢ（ＤＡＫＯ）でラベル化した。最後に、腫瘍部は３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＫＯ）およびヘマトキシリン（和光）で染色した。
【００４９】
微小血管新生の定量化：収穫した皮下腫瘍をアンチマウスＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１;ＢＤバイオサイエンス）で免疫染色した。染色された微小血管の数をそれぞれの腫瘍で４つの無作為な領域において４００倍で計測した。
【００５０】
その結果を図７〜図１１に示す。図７及び図８から、ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤との併用は、それぞれ単独投与の場合に比べて相乗的にヒト卵巣明細胞腺がんの増殖を抑制した。また、図９〜１１から、ＭＤＭ２阻害剤とｍＴＯＲ経路阻害剤の併用は、それぞれ単独投与の場合に比べて、相乗的にアポトーシスを誘導（ＴＵＮＥＬ細胞増加）し、ＤＮＡ合成を抑制（ＢｒｄＵの低下）し、血管新生を抑制（ＣＤ３１の低下）した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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