(57)【要約】【課題】本発明は、Carbopol（登録商標）等の従来のポリマーアジュバントよりも、免疫惹起能が高く、低い粘性を有するアジュバントを提供することを目的とする。【解決手段】アクリル酸系ポリマーを含むアジュバント、このアジュバントと免疫化のために投与すべき免疫原とを含有するワクチン組成物、及びこのワクチン組成物を非ヒト哺乳動物に投与する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクリル酸系ポリマーを含む、アジュバント。
【請求項２】
アクリル系ポリマーがポリアクリル酸又はその塩である、請求項1に記載のアジュバント。
【請求項３】
前記アクリル酸系ポリマーの重量平均分子量が100,000〜15,000,000ダルトンである、請求項1又は2に記載のアジュバント。
【請求項４】
0.2質量％粘度が90 mP・s以上であり、そして780 mP・sより小さい、請求項1又は2に記載のアジュバント。
【請求項５】
請求項1〜4のいずれか１項に記載のアジュバントと、免疫化のために投与すべき免疫原と、を含有するワクチン組成物。
【請求項６】
前記免疫原が、細菌、ウイルス又は原虫の由来である、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記免疫原が、黄色ブドウ球菌抗原、エロモナス菌抗原、結核菌抗原、豚丹毒菌抗原、アクチノバシラス・プルロニューモニエ抗原、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原、ボルデテラ・ブロンキセプチカ抗原、パスツレラ・ムルトシダ抗原、ヘモフィルス・パラスイス抗原、マイコプラズマ・ハイオライニス抗原、大腸菌抗原、サルモネラ・コレラスイス抗原、連鎖球菌抗原、インフルエンザウイルス抗原、SARSウイルス抗原、AIDSウイルス抗原、豚流行性下痢症ウイルス抗原、伝染性胃腸炎ウイルス抗原、豚繁殖呼吸障害症候群ウイルス抗原、日本脳炎ウイルス抗原、豚パルボウイルス抗原、豚サーコウイルス抗原、豚インフルエンザウイルス抗原、オーエスキー病ウイルス抗原、ApxI、ApxII、ApxIII、ApxIV、Stx、SpaA、SpaB、SpaC、パスツレラ・ムルトシダ毒素、トリパノソーマ抗原、コクシジウム抗原、マラリア抗原、タイレリア抗原から選択される、請求項6に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
請求項5〜7のいずれか1項に記載のワクチン組成物を非ヒト哺乳動物に投与する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アジュバント及びワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌、ウイルス又は寄生虫を弱毒化させたものを抗原として含む生ワクチン、不活性化させた微生物から得た抗原を含む不活化ワクチン、又は微生物の特定の抗原を含むサブユニットワクチンを投与された動物は、これらの抗原を記憶する。このため、投与された抗原と同じ又は類似の抗原を有する病原体に対して速やかな免疫応答を示し、病原体を排除する。
【０００３】
しかしながら、細菌、ウイルス又は寄生虫のみを免疫原とする不活化ワクチンおよびサブユニットワクチンを動物に投与しても、病原体の感染に対して有効な防御を得る程の高い免疫応答を生じさせることは難しい。このため、一般的に、ワクチンには免疫応答を賦活化させるためにアジュバントを添加する。
【０００４】
古くは、フロイント完全アジュバント（流動パラフィン、界面活性剤および結核菌死菌を含む）、これの結核死菌を含まないフロイント不完全アジュバントがあり、これらは一般的にオイルアジュバントと呼ばれる。このアジュバントは免疫原と共に動物に投与された後、投与局所に長期間留まることによって、免疫原に対する免疫を誘導する。一方、投与局所での長期間の残留によって、肉芽腫形成などの副反応が認められることも知られている。
【０００５】
上記のアジュバントと比較して副反応がでにくいアジュバントとしてアルミニウム塩アジュバントが知られている。それらアルミニウム塩には水酸化アルミニウムあるいはリン酸アルミニウムが用いられている。ヒト用のワクチンでは、例えばジフテリア、破傷風トキソイドワクチン等に用いられており、副反応が出にくい特徴から現在までヒト用ワクチンのアジュバントとして広く用いられている。しかしながら、アジュバントとして免疫惹起能が不十分な免疫原も存在する。
【０００６】
動物用ワクチンのアジュバントは多種多様なものが存在し、製品として利用されている。それらは、例えば、上記に挙げたアルミニウム塩やフロイント不完全アジュバントであり、アクリル酸あるいはその塩類からなるポリマーアジュバント（例えばCarbopol（登録商標）としても公知であるポリアクリル酸系の水溶性ポリマー）等も存在する。また、これらのアジュバントの組み合わせも利用されている。
【０００７】
動物に利用する場合、上記に示したアルミニウム塩アジュバントでは免疫応答や免疫の持続期間が不十分な場合があり、オイルアジュバントでは投与局所に長期間残存することによって投与部位に肉芽腫、硬結等の副反応が認められ、産業上問題となっている。上記に加えて、オイルアジュバントに水（免疫原を含有する）が加えられることによって、粘性が増し、オイルアジュバントを含むワクチンの取扱いは煩雑となる。例えばワクチンの注射器への吸引に時間がかかる。
【０００８】
ポリマーアジュバントも同様に投与局所に残留し、ポリマーの粒子に取り込まれた免疫原は粒子が分解されるまで投与部位に残留して、長期間免疫原を提示し続ける。従って高い免疫応答を誘導する事が可能となる。しかしながら、粘性の高さから、上記オイルアジュバントを含むワクチン同様、その取扱いは煩雑である。
【０００９】
従って、高い免疫反応を誘導し、粘性が低く取扱いも容易である新規アジュバントが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表2011-500772
【特許文献２】特開2006-25659
【特許文献３】特開2004-242608
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】動物用生物学的製剤基準（公益社団法人日本動物用医薬品協会、平成20年3月p311〜p315）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従来技術に認められるワクチンに含まれるアジュバントの免疫惹起能は、動物への病原体の侵入を防御するには不十分なものがある。免疫惹起能の高いオイルアジュバント及びポリマーアジュバントは投与局所に長時間残留することから明らかな様に、高い粘性を有し、取扱いは煩雑である。
【００１３】
本発明は、免疫惹起能が高く、低い粘性を有するアジュバントを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、架橋させないアクリル酸系ポリマーを用いることにより、免疫惹起能の高く、低い粘性を有するアジュバントを提供できることを見出し、本発明に至った。ポリマーアジュバントとしてはポリアクリルスクロースで架橋されたアクリル酸水溶性ポリマーが従来より知られていたが、それとは異なり本発明では架橋されていない直鎖状のアクリル酸水溶性ポリマーをアジュバントとして提供する。この直鎖状のアクリル酸ポリマーをアジュバントとして含有したワクチン組成物は従来技術のポリマーアジュバントを含むワクチン組成物と比較して免疫惹起能が強く、これは予想外の効果であった。
【００１５】
すなわち、本発明はその一実施態様において、アクリル酸系ポリマーを含む、アジュバントを提供する。アクリル系ポリマーがポリアクリル酸又はその塩であってもよい。前記アクリル酸系ポリマーの重量平均分子量が100,000〜15,000,000ダルトンであってもよい。0.2質量％粘度が64 mP・sより大きく、780 mP・sより小さくてもよい。
【００１６】
本発明の他の実施態様は、上記アジュバントと、免疫化のために投与すべき免疫原と、を含有するワクチン組成物である。前記免疫原が、細菌、ウイルス又は原虫の由来であってもよい。前記免疫原が、黄色ブドウ球菌抗原、エロモナス菌抗原、結核菌抗原、豚丹毒菌抗原、アクチノバシラス・プルロニューモニエ抗原、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原、ボルデテラ・ブロンキセプチカ抗原、パスツレラ・ムルトシダ抗原、ヘモフィルス・パラスイス抗原、マイコプラズマ・ハイオライニス抗原、大腸菌抗原、サルモネラ・コレラスイス抗原、連鎖球菌抗原、インフルエンザウイルス抗原、SARSウイルス抗原、AIDSウイルス抗原、豚流行性下痢症ウイルス抗原、伝染性胃腸炎ウイルス抗原、豚繁殖呼吸障害症候群ウイルス抗原、日本脳炎ウイルス抗原、豚パルボウイルス抗原、豚サーコウイルス抗原、豚インフルエンザウイルス抗原、オーエスキー病ウイルス抗原、ApxI、ApxII、ApxIII、ApxIV、Stx、SpaA、SpaB、SpaC、パスツレラ・ムルトシダ毒素、トリパノソーマ抗原、コクシジウム抗原、マラリア抗原、タイレリア抗原から選択されてもよい。
【００１７】
本発明の他の実施態様は、ワクチン組成物を非ヒト哺乳動物に投与する方法である。
以上より、本発明は、以下の態様として示される：
[1]  アクリル酸系ポリマーを含む、アジュバント。
[2]  アクリル系ポリマーがポリアクリル酸又はその塩である、[1]に記載のアジュバント。
[3]  前記アクリル酸系ポリマーの重量平均分子量が100,000〜15,000,000ダルトンである、[1]又は[2]に記載のアジュバント。
[4]  0.2質量％粘度が90 mP・s以上であり、そして780 mP・sより小さい、[1]又は[2]に記載のアジュバント。
[5]  [1]〜[4]のいずれか1項に記載のアジュバントと、免疫化のために投与すべき免疫原と、を含有するワクチン組成物。
[6]  前記免疫原が、細菌、ウイルス又は原虫の由来である、[5]に記載のワクチン組成物。
[7]  前記免疫原が、黄色ブドウ球菌抗原、エロモナス菌抗原、結核菌抗原、豚丹毒菌抗原、アクチノバシラス・プルロニューモニエ抗原、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原、ボルデテラ・ブロンキセプチカ抗原、パスツレラ・ムルトシダ抗原、ヘモフィルス・パラスイス抗原、マイコプラズマ・ハイオライニス抗原、大腸菌抗原、サルモネラ・コレラスイス抗原、連鎖球菌抗原、インフルエンザウイルス抗原、SARSウイルス抗原、AIDSウイルス抗原、豚流行性下痢症ウイルス抗原、伝染性胃腸炎ウイルス抗原、豚繁殖呼吸障害症候群ウイルス抗原、日本脳炎ウイルス抗原、豚パルボウイルス抗原、豚サーコウイルス抗原、豚インフルエンザウイルス抗原、オーエスキー病ウイルス抗原、ApxI、ApxII、ApxIII、ApxIV、Stx、SpaA、SpaB、SpaC、パスツレラ・ムルトシダ毒素、トリパノソーマ抗原、コクシジウム抗原、マラリア抗原、タイレリア抗原から選択される、[6]に記載のワクチン組成物。
[8]  [5]〜[7]のいずれか1項に記載のワクチン組成物を非ヒト哺乳動物に投与する方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、免疫惹起能の高く、低い粘性を有するアジュバントを提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
アクリル酸系ポリマーを含有するアジュバント
本発明はその一実施態様として、水溶性アクリル酸系ポリマー、及び、ならびに少なくとも1種の免疫原を含有することを特徴とするアジュバントを提供する。本明細書において、アジュバントとは、免疫原と混合又は組み合わせることで、抗体産生を増大させ、免疫応答の増強を起こす物質をいう。
【００２０】
本明細書において、アクリル酸系ポリマーとは、ポリアクリル酸及びその塩を意味する。本発明において用いるアクリル酸系ポリマーは、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、イタコン酸から選択されるモノマーを構成単位とするポリマー、若しくはこれらのモノマーの少なくとも1種を構成単位として含む共重合体、又は、これらの塩が好ましい。
【００２１】
本発明の一実施形態に係るアジュバントは、単量体としてはアクリル酸又はその塩を使用して製造することができる。アクリル酸、イオン交換水、水酸化ナトリウム、水と非混和性の少なくとも一種の炭化水素からなる油状物質、油中水型エマルジョンを形成するに有効な量の少なくとも一種類の界面活性剤を混合し、強攪拌し油中水型エマルジョンを形成させた後、重合開始させることにより合成できる。
【００２２】
分散媒として使用する炭化水素からなる油状物質の例としては、パラフィン類あるいは灯油、軽油、中油などの鉱油、あるいはこれらと実質的に同じ範囲の沸点や粘度などの特性を有する炭化水素系合成油、あるいはこれらの混合物があげられる。
【００２３】
界面活性剤の例としては、Hydrophile-Lipophile Balance（HLB）値が、3〜12の界面活性剤であり、好ましくはノニオン性界面活性剤である。その具体例としては、ソルビタンモノオレ−ト、ソルビタンモノステアレ−ト、ソルビタンモノパルミテ−ト、ポリオキシエチレンソルビタントリオレート、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルなどがあげられる。これら界面活性剤の添加率としては、油中水型エマルジョン全量に対して0.5〜10重量％であり、好ましくは1〜5質量％である。
【００２４】
重合濃度としては、15〜50質量％であり、好ましくは20〜40質量％である。重合温度としては、0〜80℃であり、好ましくは20〜55℃であり、重合法、開始剤によって適宜重合温度を設定する。
【００２５】
重合開始にはラジカル重合開始剤を添加してもよい。これら開始剤は油溶性あるいは水溶性のどちらでも良く、アゾ系、過酸化物系、レドックス系いずれでも重合することが可能である。油溶性アゾ系開始剤の例としては、2,2’-アゾビスイソブチロニトリル、1,1’-アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、2,2’-アゾビス（2-メチルブチロニトリル）、4,4-アゾビス（4-メトキシ-2、4ジメチル）バレロニトリル、ジメチル-2,2′-アゾビスイソブチレートなどがあげられ、これらは水混溶性溶剤に溶解し添加することができる。
【００２６】
水溶性アゾ系開始剤の例としては、2,2’-アゾビス（アミジノプロパン）二塩化水素化物、2,2’-アゾビス〔2-（5-メチル-2-イミダゾリン-2-イル）プロパン〕二塩化水素化物、4,4’-アゾビス（4-シアノ吉草酸）などがあげられる。またレドックス系の例としては、ペルオキソ二硫酸アンモニウムと亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、トリメチルアミン、テトラメチルエチレンジアミンなどとの組み合わせがあげられる。さらに過酸化物の例としては、ペルオキソ二硫酸アンモニウムあるいはカリウム、過酸化水素、ベンゾイルペルオキサイド、ラウロイルペルオキサイド、オクタノイルペルオキサイド、サクシニックペルオキサイド、t-ブチルペルオキシ2-エチルヘキサノエ−トなどをあげることができる。
【００２７】
重合後は、転相剤と呼ばれる親水性界面活性剤を添加する。これにより形成される、油の膜で被われたエマルジョン粒子は水になじみ易く、水溶性ポリマーが溶解しやすくなるため、水で希釈して使用することができる。使用する親水性界面活性剤の例としては、カチオン性界面活性剤やＨＬＢ値が9〜15のノニオン性界面活性剤が挙げられ、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル、ポリオキシエチレンアルコールエ−テル、アルコールアルコキシレートなどが好ましい。
【００２８】
本発明に使用するアクリル酸系ポリマーは、脱塩水にポリマーを溶解して調製した0.2質量％ポリマー溶液について、B型粘度計により測定される25℃における粘度が、回転数30 rpmで測定した場合に、90 mPa・s以上であり、780 mPa・sより小さい範囲のいずれの値の粘度であってもよい。この粘度の下限値は、90 mPa・s以上のものであり、95 mPa・s以上であることがより好ましく、98 mPa・s以上であることがさらに好ましく、また、上限値は、780 mPa・sより小さいものであり、750 mPa・s以下、700 mPa・s以下、650 mPa・s以下、600 mPa・s以下、550 mPa・s以下、500 mPa・s以下、450 mPa・s以下であることがより好ましく、413 mPa・s以下であることがさらに好ましい。
【００２９】
本発明に用いるアクリル酸系ポリマーの重量平均分子量は、100,000〜15,000,000ダルトンであることが好ましく、1,000,000〜10,000,000ダルトンであることがより好ましい。本発明における重量平均分子量とは、光散乱法により測定した重量平均分子量を指す。
【００３０】
アクリル酸系ポリマーをアジュバントとして含有するワクチン組成物
本発明は他の実施態様として、上記アジュバント組成物及び少なくとも1種の免疫原を含有するワクチン組成物を提供する。その免疫原には、特に制限はなく、ヒトまたは動物（哺乳動物、魚類など）においてワクチン接種が望まれる免疫原のいずれを含ませてもよい。免疫原としては、細菌由来の免疫原、ウィルス由来の免疫原、原虫由来の免疫原などが含まれる。
【００３１】
例えば、細菌由来の免疫原として、黄色ブドウ球菌抗原、エロモナス菌抗原、結核菌抗原、豚由来の病原性細菌抗原が挙げられる。具体的な豚由来の病原性細菌抗原としては、例えば、豚丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）抗原、アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）抗原、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Mycoplasma hyopeumoniae）抗原、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）抗原、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）抗原、ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）抗原、マイコプラズマ・ハイオライニス（Mycoplasma hyorhinis）抗原、大腸菌（Escherichia coli）抗原、サルモネラ・コレラスイス（Salmonella choleraesuis）抗原、連鎖球菌（Streptococcus suis）抗原等が挙げられる。これら病原性細菌を不活性化あるいは弱毒化して免疫原とすることが好ましく、特に不活性化した免疫原が好ましい。
【００３２】
ウイルス由来の免疫原としては、その具体的な例として、インフルエンザウィルス抗原、SARSウイルス抗原、AIDSウイルス抗原、豚由来の病原性ウイルス抗原が挙げられる。具体的な豚由来の病原性ウイルス抗原としては、例えば、豚流行性下痢症ウイルス（Porcine Epidemic Diarrhea virus）抗原、伝染性胃腸炎ウイルス（Transmissible gastroenteritis virus）抗原、豚繁殖呼吸障害症候群ウイルス（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）抗原、日本脳炎ウイルス（Japanese encephalitis virus）抗原、豚パルボウイルス（porcine parvo virus）抗原、豚サーコウイルス（porcine circo virus）抗原、豚インフルエンザウイルス（swine influenza virus）抗原、オーエスキー病ウイルス（Aujesky’s disease virus）抗原等が挙げられる。病原性ウイルスを不活性化あるいは弱毒化して免疫原とすることが好ましく、特に不活性化した免疫原が好ましい。
【００３３】
原虫由来の免疫原としては、その具体的な例として、トリパノソーマ抗原、コクシジウム抗原、マラリア抗原、タイレリア抗原が挙げられる。
【００３４】
本発明に含まれ得る免疫原として、細菌が菌体外に分泌するタンパク質、あるいは細菌またはウイルスより抽出・精製したもの、あるいはその遺伝子を由来とし大腸菌やバキュロウイルス等の他の生物で発現させた組換えタンパク質等もまた、使用することができる。具体例として、アクチノバシラス・プルロニューモニエが産生・分泌する4種のApx毒素（ApxI、ApxII、ApxIII、ApxIV）、あるいはこれらを組換え体で発現させた毒素、大腸菌が産生する志賀毒素（Stx）、あるいはこれの組換え毒素を大腸菌で発現させたもの、豚丹毒菌の菌体表層に存在する表層防御抗原ポリペプチド（SpaA、SpaBまたはSpaC）を大腸菌で発現させたもの、あるいは当該ポリペプチドを変異させて大腸菌で発現させたもの等が挙げられ、前記ポリペプチドの利用については特許文献2を参照してもよい。またはパスツレラ・ムルトシダが産生するパスツレラ・ムルトシダ毒素、あるいはこれらを組換え体で発現させたもの等が挙げられ、前記組換え毒素の利用については特許文献3を参照してもよい。好ましくはこれらの細菌由来のタンパク質あるいは組換えタンパク質を不活性化したものを免疫原とすることができる。
【００３５】
特定の実施形態において、上記免疫原は豚丹毒菌（例として不活性化した豚丹毒菌）である。
【００３６】
上記記載のワクチン組成物は哺乳類動物に投与され得る。その投与される動物の具体的例としては、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモットが挙げられるが、これらの動物には限定されない。さらに具体的にはブタに投与されることが好ましい。
【００３７】
上記動物に本発明が投与される場合、その投与経路として、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、腹腔内投与、経皮投与、経粘膜投与、静脈内投与が挙げられるが、これらに限定されない。免疫原に対してどの様な免疫反応を生じさせたいかに基づいて、投与経路を変更することもでき、例えば、抗体を産生させて体液性免疫を生じさせたい場合には、筋肉内注射や皮下注射を利用することができ、粘膜面での免疫反応を生じさせたい場合には、IgAを中心とする粘膜免疫を誘導するために経口投与や経粘膜投与を利用することができる。
【００３８】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す。下記に示す実施例はいかなる方法によっても本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３９】
実施例1：ポリマーアジュバントの作製法（1）
攪拌機および温度制御装置を備えた反応槽に、平均分子量300の流動パラフィン119.6 g、ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート（HLB11）11.2 g、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（HLB11.7）11.2 gを仕込み均一にした。脱イオン水106.6 gおよび80質量％水溶液アクリル酸（AAC）76.6 gを添加した後、48%質量水酸化ナトリウム67.0 gを液温が30℃以上にならないよう冷却しながら加え中和した。
【００４０】
これにより得られたアクリル酸ナトリウム水溶液を1000 rpmで60分間攪拌乳化した。得られた乳化液を52℃に保ち、窒素置換を30分行った後、ジメチル-2,2′-アゾビスイソブチレート0.4 gを加え、重合反応を開始させた。反応温度を52±2℃で5時間重合させ、更に70℃で反応を完結させた。
【００４１】
重合後、生成した油中水型エマルジョンに転相剤としてアルコールアルコキシレート8.0 gを添加混合した。得られたエマルジョン40 gをアセトン200 mlに添加し、ポリアクリル酸ナトリウムを沈殿させた。沈殿物を回収し、アセトンに溶解した水、オイル、界面活性剤を除去した。この作業を2回繰り返した後、回収した沈殿物を乾燥させ、精製ポリマーを得た。精製ポリマーをポリマー濃度が1質量％になるように生理食塩水に溶解し試料とした。なお、B型粘度計により測定される25℃における、脱塩水にポリマーを溶解して調製した0.2質量％粘度は98 mPa・sであった。このポリマーアジュバントの本明細書中での表記はHySとした。
【００４２】
実施例2：ポリマーアジュバントの作製法（2）
攪拌機および温度制御装置を備えた反応槽に、平均分子量300の流動パラフィン149.7 g、ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート（HLB11）14.0 g、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（HLB11.7）14.0 gを仕込み均一にした。脱イオン水133.2 gおよび80質量％水溶液アクリル酸（AAC）95.9 gを添加した後、48質量％水酸化ナトリウム83.6 gを液温が30℃以上にならないよう冷却しながら加え中和した。
【００４３】
これにより得られたアクリル酸ナトリウム水溶液を1000 rpmで60分間攪拌乳化した。得られた乳化液を52℃に保ち、窒素置換を30分行った後、ジメチル-2,2′-アゾビスイソブチレート0.25 ｇを加え、重合反応を開始させた。反応温度を52±2℃で５時間重合させ、更に70℃で反応を完結させた。
【００４４】
重合後、生成した油中水型エマルジョンに転相剤としてアルコールアルコキシレート10.0 gを添加混合した。得られたエマルジョン40 gをアセトン200 mlに添加し、ポリアクリル酸ナトリウムを沈殿させた。沈殿物を回収し、アセトンに溶解した水、オイル、界面活性剤を除去した。この作業を2回繰り返した後、回収した沈殿物を乾燥させ、精製ポリマーを得た。精製ポリマーをポリマー濃度が1質量％になるように生理食塩水に溶解し試料とした。なお、B型粘度計により測定される25℃における、脱塩水にポリマーを溶解して調製した0.2質量％粘度は224 mPa・sであった。このポリマーアジュバントの本明細書中での表記はHyMとした。
【００４５】
実施例3：ポリマーアジュバントの作製法（3）
攪拌機および温度制御装置を備えた反応槽に、平均分子量300の流動パラフィン149.5 g、ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート（HLB11）14.0 g、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（HLB11.7）14.0 gを仕込み均一にした。脱イオン水87.0 gおよび80％水溶液アクリル酸（AAC）119.7 gを添加した後、48％水酸化ナトリウム102.3 gを液温が30℃以上にならないよう冷却しながら加え中和した。
【００４６】
これにより得られたアクリル酸ナトリウム水溶液を1000 rpmで60分間攪拌乳化した。得られた乳化液を52℃に保ち、窒素置換を30分行った後、ジメチル-2,2′-アゾビスイソブチレート0.25 gを加え、重合反応を開始させた。反応温度を52±2℃で5時間重合させ、更に70℃で反応を完結させた。
【００４７】
重合後、生成した油中水型エマルジョンに転相剤としてアルコールアルコキシレート10.0 gを添加混合した。得られたエマルジョン40 gをアセトン200 mlに添加し、ポリアクリル酸ナトリウムを沈殿させた。沈殿物を回収し、アセトンに溶解した水、オイル、界面活性剤を除去した。この作業を2回繰り返した後、回収した沈殿物を乾燥させ、精製ポリマーを得た。精製ポリマーをポリマー濃度が1％になるように生理食塩水に溶解し試料とした。なお、B型粘度計により測定される25℃における、脱塩水にポリマーを溶解して調製した0.2質量％粘度は413 mPa・sであった。このポリマーアジュバントの本明細書中での表記はHyLとした。
【００４８】
実施例４：ポリマーアジュバントの作製法（4）
攪拌機および温度制御装置を備えた反応槽に、平均分子量300の流動パラフィン299.0 g、ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート（HLB11）28.0 g、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（HLB11.7）28.0 gを仕込み均一にした。脱イオン水266.2 gおよび80％水溶液アクリル酸（AAC）191.5 gを添加した後、48％水酸化ナトリウム177.3 gを液温が30℃以上にならないよう冷却しながら加え中和した。
【００４９】
これにより得られたアクリル酸ナトリウム水溶液を1000 rpmで60分間攪拌乳化した。得られた乳化液を52℃に保ち、窒素置換を30分行った後、ジメチル-2,2′-アゾビスイソブチレート0.50 gを加え、重合反応を開始させた。反応温度を52±2℃で5時間重合させ、更に70℃で反応を完結させた。
【００５０】
重合後、生成した油中水型エマルジョンに転相剤としてアルコールアルコキシレート20.0 gを添加混合した。ポリマー濃度1％になるように脱塩水に希釈し、試料とした。なお、B型粘度計により測定される25℃における、脱塩水にポリマーを溶解して調製した0.2質量％粘度は292 mPa・sであった。このポリマーアジュバントの本明細書中での表記はEM-1とした。
【００５１】
実施例5：ポリマーアジュバントの作製法（5）
攪拌機および温度制御装置を備えた反応槽に、平均分子量300の流動パラフィン299.0 g、ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート（HLB11）28.0 g、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（HLB11.7）28.0 gを仕込み均一にした。脱イオン水266.2 gおよび80％水溶液アクリル酸（AAC）191.5 gを添加した後、48％水酸化ナトリウム177.3 gを液温が30℃以上にならないよう冷却しながら加え中和した。
【００５２】
これにより得られたアクリル酸ナトリウム水溶液を1000 rpmで60分間攪拌乳化した。得られた乳化液を52℃に保ち、窒素置換を30分行った後、ジメチル-2,2′-アゾビスイソブチレート0.50 gを加え、重合反応を開始させた。反応温度を52±2℃で5時間重合させ、更に70℃で反応を完結させた。
【００５３】
重合後、生成した油中水型エマルジョンに転相剤としてアルコールアルコキシレート20.0 gを添加混合した。得られたエマルジョン40 gをアセトン200 mlに添加し、ポリアクリル酸ナトリウムを沈殿させた。沈殿物を回収し、アセトンに溶解した水、オイル、界面活性剤を除去した。この作業を2回繰り返した後、回収した沈殿物を乾燥させ、精製ポリマーを得た。精製ポリマーをポリマー濃度が1％になるように生理食塩水に溶解し試料とした。なお、B型粘度計により測定される25℃における、脱塩水にポリマーを溶解して調製した0.2質量％粘度は292 mPa・sであった。このポリマーアジュバントの本明細書中での表記は精製EM-1とした。
【００５４】
上記の粘度の異なるポリマーアジュバントを用いて豚の病原体として代表的な豚丹毒菌の不活化ワクチンを作製し、マウスを用いて有効性を確認する試験を実施した。実施した試験系は、現行の豚用ワクチンの検定方法である非特許文献１を参照して試験を実施した。
【００５５】
実験例1：ポリマーアジュバント加豚丹毒不活化ワクチンの有効性確認試験
代表的なワクチン株である豚丹毒菌（多摩96株）の不活化菌液とポリマーアジュバントを含有する実験ワクチンを調製した。多摩96株豚丹毒菌を37℃で約18時間培養したものに、ホルマリンを0.2 vol％になるように加え、37℃で16時間以上感作して不活化したものを不活化菌液とした。不活化菌液0.2 mLを寒天平板に播種し、生育しないことにより不活化を確認した。不活化前生菌数は3.3×109 cfu/mLであった。不活化菌液とポリマーアジュバント(ポリマーの含有率5%(w/v))EM-1、精製EM-1をそれぞれ10:1量で混合し、分散した。陽性対照のアジュバントとしてCarbopol（登録商標）934（ポリマーの含有率5%(w/v)）を前記と同じ割合で不活化菌液と混合し分散した。陰性対照としてアジュバントを含有しない不活化菌液のみを用いた。4週齢のSPFマウス（雌）の内股部皮下に実験ワクチンを0.1 mLずつ免疫した。免疫3週後に、約103個の生きた豚丹毒菌藤沢株（強毒）をTPB培地1 mLに浮遊させて内股部皮下へ注射し攻撃した。攻撃の成立を確認するためにワクチン投与を行っていない攻撃対照群を設定した。各試験群でそれぞれ10匹ずつ攻撃した。攻撃後1週間観察し、生死数を記録した。攻撃後1週後のマウス生残数を表1に示す。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
ポリマーアジュバントEM-1、精製EM-1からなる本発明を加えて調製したワクチンを投与した2群ではアジュバントを加えない群(不活化菌液のみ)より、攻撃後、有意に生存数が高かった。得られた結果は、明らかに全てのポリマーアジュバントが豚丹毒抗原に対する免疫応答を高めることを示している。
【００５８】
実験例2：ポリマーアジュバント加豚丹毒不活化ワクチン5倍希釈後の有効性確認試験
実験例1で用いた実験ワクチンを、PBSで5倍に希釈したものを実験ワクチン2とした。4週齢のSPFマウス（雌）の内股部皮下に実験ワクチン2を0.1 mLずつ免疫した。免疫3週後に、約103個の生きた豚丹毒菌藤沢株（強毒）をTPB培地1 mLに浮遊させて内股部皮下へ注射し攻撃した。各試験群でそれぞれ10匹ずつ攻撃した。1週間観察し、生死数を記録した。攻撃後1週後のマウス生残数を表2に示す。
【００５９】
【表２】
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【００６０】
本発明のポリマーアジュバントEM-1、EM-1(精製)を加えて調製したワクチンを投与した2群では本発明を加えない群(不活化菌液のみ)より、攻撃後、有意に生存数が高かった。また、Carbopol（登録商標）934をアジュバントとして含むワクチンを投与された群では、十分な免疫応答が得られなかった。従って、本発明は豚丹毒抗原に対する免疫応答を高めることを示し、架橋されたアクリル酸ポリマーであるCarbopol（登録商標）934より高い免疫惹起能を有するという予想以上の結果を得た。また、全てのマウスにおいて投与局所での反応は認められなかった。
【００６１】
実験例3：希釈されたポリマーアジュバントを加えた豚丹毒不活化ワクチン有効性確認試験
ポリマーアジュバント（ポリマーの含有率5%（w/v））（EM-1、精製EM-1）をPBSでそれぞれ5倍（ポリマーの含有率1%（w/v））、10倍（ポリマーの含有率0.5%（w/v））に希釈したものを調整した。Carbopol（登録商標）934（ポリマーの含有率5%(w/v)）は10倍（ポリマーの含有率0.5%(w/v)）に希釈したものを調整した。実験例1で用いた不活化菌液と希釈したポリマーアジュバントをそれぞれ10:1量で混合し、分散した。これらを実験ワクチン3とした。4週齢のSPFマウス（雌）の内股部皮下に実験ワクチン3を0.1 mLずつ免疫した。免疫3週後に、約103個の生きた豚丹毒菌藤沢株（強毒）をTPB培地1 mLに浮遊させて内股部皮下へ注射し攻撃した。各実験条件でそれぞれ10匹ずつ攻撃した。1週間観察し、生死数を記録した。攻撃後1週後のマウス生残数を表3に示す。
【００６２】
【表３】
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【００６３】
この結果から、ポリマーアジュバントは5倍に希釈しても豚丹毒抗原に対する免疫応答を高めることを示している。また、全てのマウスにおいて投与局所での反応は認められなかった。
【００６４】
Carbopol（登録商標）934は、粘度が高いため5倍の希釈濃度には調製できなかった。これに対し、本発明のEM-1及び精製EM-1は、粘度が低いために調製することができた。このように、本発明のアジュバントは従来のアジュバントよりも粘度が低いため、本発明のアジュバントの操作性は高い。
【００６５】
実験例4：ポリマーアジュバントを加えた豚丹毒不活化ワクチン有効性確認試験
次に、豚丹毒菌を37℃で14〜20時間培養したものに、ホルマリンを0.2 vol%になるように加え、37℃で16時間以上感作して不活化したものを不活化菌液とした。不活化前生菌数は3.9×109cfu/mLであった。不活化菌液と0.2質量％粘度の異なるポリマーアジュバント（Carbopol（登録商標）934（780 mPa・s）、HyS（粘度98 mPa・s）、HyM（224 mPa・s）、HyL（413 mPa・s））（ポリマーの含有率1%）をそれぞれ9:1量で混合し、分散した。対照としてアジュバントを含有しない菌液のみを用いた。4週齢のSPFマウス（雌）の内股部皮下に実験ワクチンを0.1 mLずつ免疫した。免疫3週後に、約103個の生きた豚丹毒菌藤沢株（強毒）をTPB培地 1 mLに浮遊させて内股部皮下へ注射し攻撃した。各試験群でそれぞれ10匹ずつ攻撃した。1週間観察し、生死数を記録した。攻撃1週後のマウス生残数を表4に示す。
【００６６】
【表４】
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【００６７】
ポリマーアジュバントを加えて調製したワクチンを投与したHyS、HyM、HyL群ではアジュバントを加えない群より、攻撃後、有意に生存数が高かった。この結果から、全てのポリマーアジュバントが豚丹毒抗原に対する免疫応答を高めることを示している。Carbopol（登録商標）934をアジュバントとして添加したワクチンでは、10匹中5匹しか生存せず、豚丹毒菌に対する免疫は不十分であった。ポリマーアジュバントHyS、HyMおよびHyLからなる本発明をアジュバントとして含むワクチンで免疫された群では、10匹中10匹生存し、Carbopol（登録商標）934による免疫より高い免疫応答を示す予想以上の結果を得た。また、全てのマウスにおいて投与局所での反応は認められなかった。
【００６８】
次に、表4の実験で使用した実験ワクチンを、PBSで5倍に希釈したものを実験ワクチン5とした。4週齢のSPFマウス（雌）の内股部皮下に実験ワクチン5を0.1 mLずつ免疫した。免疫3週後に、約103個の生きた豚丹毒菌藤沢株（強毒）をTPB培地1 mLに浮遊させて内股部皮下へ注射し攻撃した。1週間観察し、生死数を記録した。（表5）
【００６９】
【表５】
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【００７０】
ポリマーアジュバント（HyS、HyMおよびHyL）を加えて調製したワクチンを投与した3群ではアジュバントを加えない群より、攻撃後、有意に生存数が高かった。また、Carbopol（登録商標）934をアジュバントとして添加した群ではアジュバント効果は認められなかった。しかしながら、ポリマーアジュバントHyS、HyMおよびHyLからなる本発明をアジュバントとして含むワクチンで免疫された群では、攻撃対照、Carbopol（登録商標）934および培養菌液のみの群と比べて有意に攻撃後の生存数が高かった。この結果から、ポリマーアジュバント、HyS、HyMおよびHyLが豚丹毒抗原に対する免疫応答を高めることを示し、架橋されたアクリル酸ポリマーであるCarbopol（登録商標）934より高い免疫応答を示す予想以上の結果を得た。また、全てのマウスにおいて投与局所での反応は認められなかった。