(57)【要約】【課題】膵管腺癌（PDAC)のサブタイプの同定及び層別化のための新規手法の提供。【解決手段】腫瘍試料におけるＰＤＡＣ細胞のサブタイプ特異的検出のためのインビトロの方法であって、サブタイプ特異的マーカーの発現を、タンパク質又はかかるタンパク質をコードするオリゴヌクレオチドのいずれかとして検出するステップによって特徴づけられ、ここで、ケラチン８１は、間葉系様サブタイプのＰＤＡＣ細胞のためのマーカーであり、ＨＮＦ−１Ａは、外分泌様サブタイプの細胞のためのマーカーであり、そして古典的サブタイプのＰＤＡＣ細胞は、ケラチン８１及びＨＮＦ−１Ａの欠如によって特徴づけられる、前記方法。【選択図】図１
2018105876.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍試料におけるＰＤＡＣ細胞のサブタイプ特異的検出のためのインビトロの方法であって、サブタイプ特異的マーカーの発現を、タンパク質又はかかるタンパク質をコードするオリゴヌクレオチドのいずれかとして検出するステップによって特徴づけられ、
ここで、ケラチン８１及びビメンチンは、間葉系様サブタイプのＰＤＡＣ細胞のためのマーカーとして検出され、
(i）ＨＮＦ−１Ａ、ＨＮＦ−１Ｂ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）、ＦＯＸＡ３（ＨＮＦ３Ｇ）、ＨＮＦ４Ｇ、及びＯＮＥＣＵＴ１（ＨＮＦ６）から選択される１又は２以上の転写因子、(ii) ＨＮＦ−１Ａによって制御される１又は２以上の標的遺伝子、特に表２に列挙されている１又は２以上のＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、及び(iii) カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）は、外分泌様サブタイプの細胞のためのマーカーとして検出され、そして
古典的サブタイプのＰＤＡＣ細胞は、(i) ケラチン８１及び／又はビメンチン、並びに(ii) ＨＮＦ−１Ａ及び／又はＨＮＦ−１Ｂの欠如によって特徴づけられる、前記方法。
【請求項２】
腫瘍試料におけるＰＤＡＣ細胞のサブタイプ特異的検出のためのインビトロの方法であって、サブタイプ特異的マーカーの発現を、タンパク質又はかかるタンパク質をコードするオリゴヌクレオチドのいずれかとして検出するステップによって特徴づけられ、
ここで、ケラチン８１は、間葉系様サブタイプのＰＤＡＣ細胞のためのマーカーであり、
(i) ＨＮＦ−１Ａは、外分泌様サブタイプの細胞のためのマーカーであり、そして
古典的サブタイプのＰＤＡＣ細胞は、ケラチン８１及びＨＮＦ−１Ａの欠如によって特徴づけられる、前記方法。
【請求項３】
古典的サブタイプのＰＤＡＣが、(i）ＨＮＦ−１Ａ、ＨＮＦ−１Ｂ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）、ＦＯＸＡ３（ＨＮＦ３Ｇ）、ＨＮＦ４Ｇ、及びＯＮＥＣＵＴ１（ＨＮＦ６）から選択される転写因子、(ii) ＨＮＦ−１Ａによって制御される１又は２以上の標的遺伝子、特に表２に列挙されている１又は２以上のＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、及び(iii) カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）から選択される１又は２以上の追加のバイオマーカーの特異的発現の欠如を決定することによって同定される、請求項１又は２に記載のインビトロの方法。
【請求項４】
前記検出が、前記サブタイプ特異的マーカーの１つのエピトープへの検出抗体の結合に基づく、請求項１〜３のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項５】
以下のステップ：
(a) 前記サブタイプ特異的マーカーの１つに特異的な検出抗体が前記エピトープと結合できる条件下にて、前記試料を前記検出抗体と接触させ；
(b) 過剰の検出抗体分子を除去し；そして
(c) 前記試料中で結合した検出抗体を検出すること
を含む、請求項４に記載のインビトロの方法。
【請求項６】
前記検出抗体は、モノクローナル抗体；ポリクローナル抗体；組み換えによって産生されたキメラ抗体又はヒト化抗体を含む、組み換えによって産生された抗体；完全合成抗体；又は、前記抗体の１つの機能的断片である、請求項４又は５に記載のインビトロの方法。
【請求項７】
検出抗体の結合は、第二抗体との、特に標識化された第二抗体とのインキュベーションによって検出される、請求項４〜６のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項８】
前記第二抗体は、マーカー分子で標識化される、請求項４〜６のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項９】
前記第二抗体は、蛍光染料、生物学的に活性な酵素標識、放射活性標識、核磁気共鳴に活性な標識、発光性標識又は発色団による標識を用いて標識化される、請求項８に記載のインビトロの方法。
【請求項１０】
前記放射活性標識が、32Ｐ、125Ｉ、3Ｈ、14Ｃ、188Ｒｈ、131Ｉ、99mＴｃ及び111Ｉｎからなる群から選択される、請求項９に記載のインビトロの方法。
【請求項１１】
抗体の結合が、免疫組織化学染色によって検出される、請求項１０に記載のインビトロの方法。
【請求項１２】
前記検出が、前記サブタイプ特異的マーカーの１つをコードするｍＲＮＡを測定することに基づき、特に定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって前記ｍＲＮＡを測定することに基づく、請求項１〜３のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項１３】
腫瘍試料におけるＰＤＡＣ細胞のサブタイプ特異的検出のためのインビトロの方法であって、遺伝子発現プロファイルにおけるＳｒｃ阻害剤感受性特性を分析するステップによって特徴づけられ、特に、前記遺伝子発現プロファイルは、表１に示された３０個の遺伝子セットに基づく、前記方法。
【請求項１４】
前記試料は膵臓組織を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項１５】
前記試料は、哺乳類から得られ、特にヒトから得られる、請求項１４に記載のインビトロの方法。
【請求項１６】
ＰＤＡＣ細胞のサブタイプ特異的検出のためのキットであって、
(i) ケラチン８１、
(ii) ビメンチン、
(iii) ＨＮＦ−１Ａ、ＨＮＦ−１Ｂ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）、ＦＯＸＡ３（ＨＮＦ３Ｇ）、ＨＮＦ４Ｇ、及びＯＮＥＣＵＴ１（ＨＮＦ６）から選択される１又は２以上の転写因子、
(iv) ＨＮＦ−１Ａによって制御される１又は２以上の標的遺伝子、特に表２に列挙されている１又は２以上のＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、及び
(v) カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）
のリストから選択される、ＰＤＡＣサブタイプ特異的マーカーに特異的な、少なくとも２つの試薬を含み、ここで前記試薬は、検出抗体及びオリゴヌクレオチドプローブのリストから選択され、
そして場合により、前記試薬の少なくとも１つの検出のための、少なくとも１つの試薬をさらに含む、前記キット。
【請求項１７】
(i) ケラチン８１及びビメンチンのリストから選択される間葉系様に特異的な、特にケラチン８１である間葉系様に特異的な、少なくとも１つの試薬、
並びに
(ii) ＨＮＦ−１Ａ及びＨＮＦ−１Ｂのリストから選択される外分泌様ＰＤＡＣサブタイプに特異的な、特にＨＮＦ−１Ａである外分泌様ＰＤＡＣサブタイプに特異的な、少なくとも１つの試薬
を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
Ｓｒｃ阻害剤感受性のＰＤＡＣ細胞をサブタイプ特異的に検出するためのキットであって、Ｓｒｃ阻害剤感受性特性の同定のためのオリゴヌクレオチドプローブを含み、特に、表１に示された３０個の遺伝子を示すオリゴヌクレオチドプローブを含む、前記キット。
【請求項１９】
ＰＤＡＣを患う患者を治療コホートへと層別化する方法であって、以下のステップ：
(a) (i) ケラチン８１、(ii) ビメンチン、(iii) ＨＮＦ−１Ａ、ＨＮＦ−１Ｂ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）、ＦＯＸＡ３（ＨＮＦ３Ｇ）、ＨＮＦ４Ｇ、及びＯＮＥＣＵＴ１（ＨＮＦ６）から選択される１又は２以上の転写因子、(iv) １又は２以上のＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、特に表２に列挙されている１又は２以上のＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、及び／又は、(v) カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）の発現及び／又は存在をインビトロで決定し；
(b) 前記選択されたタンパク質の発現及び／又は存在に基づいて、ＰＤＡＣサブタイプを同定し；
(c) ＰＤＡＣ患者が患うＰＤＡＣサブタイプに基づいて、前記患者を薬剤治療コホートへと層別化すること
を含む、前記方法。
【請求項２０】
ＰＤＡＣを患う患者を治療コホートへと層別化する方法であって、以下のステップ：
(a)膵臓組織を含む患者試料の細胞中におけるＳｒｃ阻害剤感受性特性の決定のために、インビトロでの遺伝子発現プロファイルを確立し；
(b) 前記遺伝子発現プロファイルに基づいて、ＰＤＡＣサブタイプを同定し；
(c) ＰＤＡＣ患者が患うＰＤＡＣサブタイプに基づいて、前記患者を薬剤治療コホートへと層別化すること
を含む、前記方法。
【請求項２１】
ＰＤＡＣを患う患者の予後を評価する方法であって、以下のステップ：
(a) (i) ケラチン８１、(ii) ビメンチン、(iii) ＨＮＦ−１Ａ、ＨＮＦ−１Ｂ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）、ＦＯＸＡ３（ＨＮＦ３Ｇ）、ＨＮＦ４Ｇ、及びＯＮＥＣＵＴ１（ＨＮＦ６）から選択される１又は２以上の転写因子、(iv)１又は２以上のＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、特に表２に列挙されている１又は２以上のＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、及び／又は、(v) カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）の発現及び／又は存在をインビトロで決定し；
(b) 前記選択されたタンパク質の発現及び／又は存在に基づいて、ＰＤＡＣサブタイプを同定し；
(c) ＰＤＡＣ患者が患うＰＤＡＣサブタイプに基づいて、前記患者を予後コホートへと層別化すること
を含む、前記方法。
【請求項２２】
ＰＤＡＣを患う患者の予後を評価する方法であって、以下のステップ：
(a)膵臓組織を含む患者試料の細胞中におけるＳｒｃ阻害剤感受性特性の決定のために、インビトロでの遺伝子発現プロファイルを確立し；
(b) 前記遺伝子発現プロファイルに基づいて、ＰＤＡＣサブタイプを同定し；
(c) ＰＤＡＣ患者が患うＰＤＡＣサブタイプに基づいて、前記患者を予後コホートへと層別化すること
を含む、前記方法。
【請求項２３】
前記発現レベルが、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって、ｍＲＮＡレベルで決定される、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記発現レベルが、前記選択されたタンパク質への抗体の結合の検出に基づいて、タンパク質レベルで決定される、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、前記患者試料から癌細胞を精製することによって得られ、特に前記精製ステップは、流動選別又はレーザー捕獲顕微解剖を含む、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記患者試料は、腫瘍生検である、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記腫瘍生検は、微細針吸引によって得られる、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、膵管腺癌 (pancreatic ductal adenocarcinoma)（ＰＤＡＣ）のサブタイプの同定及び層別化のための新規手法に関する。本発明は特に、新規のＰＤＡＣサブタイプ特異的マーカーに関し、そして前記マーカーを検出するための試薬を含む診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
個別化腫瘍学は、将来癌患者が治療される方法に革命をもたらす可能性を秘めている。実体の異なる癌は、治療応答と臨床的転帰をしばしば決定するシグナル伝達の特異的活性化を含む分子的差異に基づいて、サブクラスに分割することができる。乳癌、肺癌および結腸癌を含む種々の癌について、そのようなサブタイプの同定やコホートへの患者の層別化は、既にサブタイプ特異的な方法で患者を治療するために臨床診療に応用されている。
【０００３】
ＰＤＡＣは最も頻度の高い膵臓癌であり、米国および欧州における癌による死亡の第４の原因である。ほとんどの患者は１２ヶ月以内に死亡し、予後後５年間の生存はわずか２％である。２０００年のゲムシタビンと２００５年のエルロチニブの承認以来、ＰＤＡＣの治療においてほとんど進展がなかった。さらに、標的化療法を用いる最近の治験は、ほとんど又は全く利益を示していない。
【０００４】
ＰＤＡＣはいまだに単一の癌として分類され、臨床的にそのように扱われる。しかし、最近３つのＰＤＡＣサブタイプ（古典的（classical）サブタイプ、間葉系様（quasi-mesenchymal）サブタイプ、外分泌様(exocrine-like)サブタイプ）の存在が示唆された（Collisson, E. A., Sadanandam, A., Olson, P., Gibb, W. J., Truitt, M., Gu, S. D., Cooc, J., Weinkle, J., Kim, G. E., Jakkula, L., et al. (2011). Subtypes of pancreatic ductal adenocarcinoma and their differing responses to therapy. Nat Med 17, 500-U140）。これらのサブタイプの同定は、患者の検体からの微小解剖された上皮細胞中の比較遺伝子発現分析に基づいていた。
【０００５】
ＰＤＡＣのサブタイプの存在は、治療剤に対する感受性に関するサブタイプ間の特異的な差異の可能性を提起する。ＰＤＡＣの個別化治療手法の確立の成功は、ＰＤＡＣ標品の特異的ＰＤＡＣサブタイプへの信頼性ある且つ正確な帰属を可能とする新規バイオマーカーに依存する。かかる新規サブタイプ特異的バイオマーカーは、ＰＤＡＣの個別化治療のための迅速且つ信頼性のある患者の層別化のために有用である。患者の層別化に基づく改善されたＰＤＡＣ治療手法に対する大きな必要性は、いまだに満たされていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の課題
したがって、本発明の課題は、ＰＤＡＣの、具体的には古典的サブタイプ、間葉系様サブタイプ及び外分泌様サブタイプの新規バイオマーカーを提供することである。それは、ＰＤＡＣ標品の特異的ＰＤＡＣサブタイプへの信頼性ある且つ正確な帰属を可能とする。かかる新規ＰＤＡＣサブタイプ特異的バイオマーカーは、迅速且つ信頼性のある患者の層別化に関する大きな必要性を満たし得る。その結果、サブタイプ特異的な薬剤脆弱性を利用する新規ＰＤＡＣ治療手法の導入及び予後評価を大きく改善する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
驚くべきことに、ＰＤＡＣのサブタイプに特異的な新規バイオマーカーが同定され得ることが明らかとなった。さらに、驚くべきことに、本発明の新規ＰＤＡＣサブタイプ特異的バイオマーカーは、ＰＤＡＣ標品の特異的ＰＤＡＣサブタイプへの信頼性ある且つ正確な帰属を可能とすることが明らかとなった。本発明の新規サブタイプ特異的バイオマーカーは、患者の予後評価を大きく改善するために、及び、サブタイプ特異的な薬剤脆弱性の利用によるＰＤＡＣ治療手法を大きく改善するために有用であり得る。迅速且つ信頼性のあるＰＤＡＣ患者層別化は、本発明の新規バイオマーカーを利用することによって初めて可能となった。
【０００８】
したがって、一の態様において、本発明は、腫瘍試料におけるＰＤＡＣ細胞のサブタイプ特異的検出のためのインビトロの方法であって、サブタイプ特異的マーカーの発現を、タンパク質又はかかるタンパク質をコードするオリゴヌクレオチドのいずれかとして検出するステップによって特徴づけられ、ここで、ケラチン８１及びビメンチンは、間葉系様サブタイプのＰＤＡＣ細胞のためのマーカーとして検出され、(i）ＨＮＦ−１Ａ、ＨＮＦ−１Ｂ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）、ＦＯＸＡ３（ＨＮＦ３Ｇ）、ＨＮＦ４Ｇ、及びＯＮＥＣＵＴ１（ＨＮＦ６）から選択される１又は２以上の転写因子、(ii) ＨＮＦ−１Ａによって制御される１又は２以上の標的遺伝子、特に表２に列挙されている１又は２以上のＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、及び(iii) カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）は、外分泌様サブタイプの細胞のためのマーカーとして検出され、そして、古典的サブタイプのＰＤＡＣ細胞は、(i) ケラチン８１及び／又はビメンチン、並びに(ii) ＨＮＦ−１Ａ及び／又はＨＮＦ−１Ｂの欠如によって特徴づけられる、前記方法に関する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、腫瘍試料におけるＰＤＡＣ細胞のサブタイプ特異的検出のためのインビトロの方法であって、遺伝子発現プロファイルにおけるＳｒｃ阻害剤感受性特性 (Src inhibitor sensitivity signature)を分析するステップによって特徴づけられ、前記方法に関する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、ＰＤＡＣ細胞のサブタイプ特異的検出のためのキットであって、(i) ケラチン８１、(ii) ビメンチン、(iii) ＨＮＦ−１Ａ、ＨＮＦ−１Ｂ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）、ＦＯＸＡ３（ＨＮＦ３Ｇ）、ＨＮＦ４Ｇ、及びＯＮＥＣＵＴ１（ＨＮＦ６）から選択される１又は２以上の転写因子、(iv) ＨＮＦ−１Ａによって制御される１又は２以上の標的遺伝子、特に表２に列挙されている１又は２以上のＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、及び(v) カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）、のリストから選択される、ＰＤＡＣサブタイプ特異的マーカーに特異的な、少なくとも２つの試薬を含み、ここで前記試薬は、検出抗体及びオリゴヌクレオチドプローブのリストから選択され、そして場合により、前記試薬の少なくとも１つの検出のための、少なくとも１つの試薬をさらに含む、前記キットに関する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、Ｓｒｃ阻害剤感受性のＰＤＡＣ細胞をサブタイプ特異的に検出するためのキットであって、Ｓｒｃ阻害剤感受性特性の同定のためのオリゴヌクレオチドプローブを含む、前記キットに関する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、ＰＤＡＣを患う患者をコホートへと層別化する方法であって、以下のステップ：(a) (i) ケラチン８１、(ii) ビメンチン、(iii) ＨＮＦ−１Ａ、ＨＮＦ−１Ｂ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）、ＦＯＸＡ３（ＨＮＦ３Ｇ）、ＨＮＦ４Ｇ、及びＯＮＥＣＵＴ１（ＨＮＦ６）から選択される１又は２以上の転写因子、(iv) １又は２以上のＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、特に表２に列挙されている１又は２以上のＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、及び／又は、(v) カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）の発現及び／又は存在をインビトロで決定し；(b) 前記選択されたタンパク質の発現及び／又は存在に基づいて、ＰＤＡＣサブタイプを同定し；(c) ＰＤＡＣ患者が患うＰＤＡＣサブタイプに基づいて、前記患者を予後コホート及び／又は薬剤治療コホートへと層別化すること、を含む、前記方法に関する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、ＰＤＡＣを患う患者をコホートへと層別化する方法であって、以下のステップ：(a)膵臓組織を含む患者試料の細胞中におけるＳｒｃ阻害剤感受性特性の決定のために、インビトロで遺伝子発現を分析し；(b) 前記遺伝子発現分析に基づいて、ＰＤＡＣサブタイプを同定し；(c) ＰＤＡＣ患者が患うＰＤＡＣサブタイプに基づいて、前記患者を予後コホート及び／又は薬剤治療コホートへと層別化すること、を含む、前記方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＰＤＡＣサブタイプ特異的マーカーの同定を示す。ケラチン８１（上列）及びＨＮＦ−１Ａ（下列）に関する、異なるサブタイプの代表的腫瘍（QM-PDAC - PACO 7 DT、外分泌様- PACO 3 DT、古典的- PACO 2 DT）の免疫組織化学染色（スケールバー、２００μｍ）。
【図２】図２は、新たに同定されたマーカーによる患者の層別化を実証する。患者は、本発明の方法にしたがって層別化され、それらのサブタイプは、平均生存（mean survival）と相関した。各々のサブタイプと患者の生存との間における有意に高い相関が明らかとなった。
【図３】図３は、調査されたケースの総数、それらのサブタイプの割り当て、及び３つのグループの平均生存の概略を示す。
【図４】図４は、組織マイクロアレイに含まれる、患者の特性の詳細を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、本明細書中の以下の発明の詳細な説明及び実施例を参照することによってより容易に理解され得る。
【００１６】
一の態様において、本発明は、腫瘍試料におけるＰＤＡＣ細胞のサブタイプ特異的検出のためのインビトロの方法であって、サブタイプ特異的マーカーの発現を、タンパク質又はかかるタンパク質をコードするオリゴヌクレオチドのいずれかとして検出するステップによって特徴づけられ、ここで、ケラチン８１及びビメンチンは、間葉系様サブタイプのＰＤＡＣ細胞のためのマーカーとして検出され、(i）ＨＮＦ−１Ａ、ＨＮＦ−１Ｂ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）、ＦＯＸＡ３（ＨＮＦ３Ｇ）、ＨＮＦ４Ｇ、及びＯＮＥＣＵＴ１（ＨＮＦ６）から選択される１又は２以上の転写因子、(ii) ＨＮＦ−１Ａによって制御される１又は２以上の標的遺伝子、特に表２に列挙されている１又は２以上のＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、及び(iii) カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）は、外分泌様サブタイプの細胞のためのマーカーとして検出され、そして、古典的サブタイプのＰＤＡＣ細胞は、(i) ケラチン８１及び／又はビメンチン、並びに(ii) ＨＮＦ−１Ａ及び／又はＨＮＦ−１Ｂの欠如によって特徴づけられる、前記方法に関する。
【００１７】
本明細書において、「ＰＤＡＣ」は、最も一般的なタイプの膵臓癌である膵管腺癌を指し、これは、これらの腫瘍の９５％を占め、膵臓の外分泌成分内で発生する。これは典型的には、顕微鏡検査で適度に分化しているかあまり分化していない腺構造を特徴とする。
【００１８】
本発明において、「膵臓癌」は、形質転換細胞に由来し、膵臓を形成する組織で発生する癌を指す。
【００１９】
本発明において、用語「古典的 (classical)」、「間葉系様 (quasi-mesenchymal)」及び「外分泌様 (exocrine-like)サブタイプのＰＤＡＣ」は、それらの遺伝子発現プロファイルに基づいて、Collisson et al. (上記引用)により同定されたＰＤＡＣサブタイプを指す。この研究において、腫瘍試料を３つのサブタイプの１つへと分類することを可能にする６２個の遺伝子パネルが考案された。
【００２０】
間葉系様ＰＤＡＣサブタイプの腫瘍は、異常な紡錘体形成を伴う豊富な有糸分裂と、大細胞質及び異形性（すなわち異常形態の）から多形性（すなわち種々の形の）の核を有する細胞とを特徴とする、あまり分化していない腫瘍を生じさせる。
【００２１】
古典的または外分泌様ＰＤＡＣサブタイプは、核の大きさとクロマチン構造の唯一の適度な変化を有する中程度のサイズの新生物管構造の、より分化した増殖パターンを有する腫瘍を生じさせる。
【００２２】
本発明者らは、驚くべきことに、間葉系様サブタイプのＰＤＡＣ細胞が、II 型ケラチン８１及び／又はビメンチンの特異的発現を示すことを同定した。ケラチン８１の発現は通常、正常な毛包に限定されるが、ケラチン８１の発現と、(a) 乳癌における肺転移、及び(b) 肺癌の再発リスクとの間の相関が報告されている。ビメンチンの発現は、ストローマ細胞において見られ、その結果、本発明の任意のマーカー分析は、試験される細胞が腫瘍細胞であり、ストローマ細胞を含まないことを確保する。
【００２３】
本発明において、用語「特異的発現」は、１つまたはそれ以上の比較試料と比較した、試料中のンパク質又は転写体の検出を指す。５００個の分析された腫瘍細胞のうちで、少なくとも１つの腫瘍細胞が非特異的対照抗体で観察されたシグナルより高いシグナルを示し、比較試料中に、試験されたマーカーの陽性シグナルが検出されない場合は、試験されたマーカーの発現は試料に対して特異的であると見なされる。
【００２４】
本発明において、分析のための用語「特異的発現」はまた、全試料中の特定のＲＮＡ転写体の量の検出を指すことができる。ｍＲＮＡの相対量は、これを１つ又はそれ以上の適した標準物質（例えば、ハウスキーピング遺伝子ベータ−アクチンまたはＧＡＰＤＨ）と比較することによって、定量的（例えば定量ＲＴ−ＰＣＲによって）に行うことができる。あるいは、発現は、他の腫瘍試料または正常な非癌性組織と比較することによって決定することができる。転写体の相対発現が、すでに決定されたカットオフより大きい（例えば、１．５倍、２倍、５倍または１０倍）場合、発現は、その試料に対して特異的であると見なされる。
【００２５】
本発明において、用語「欠如 (absence)」は、（前々段落に記載のように測定される）試料中のマーカー陽性腫瘍細胞の割合を指す。試料の５００個の分析された腫瘍細胞において、試験したマーカーのシグナルを有する細胞が検出されない場合、マーカーはその試料中で「欠如」していると見なされる。あるいは、（前段落に記載のように測定される）転写体のレベルがあらかじめ決定されたカットオフより小さい場合、その転写体は試料から「欠如」していると見なされる。
【００２６】
さらに、本発明者らは驚くべきことに、（i）ＨＮＦ−１Ａ、ＨＮＦ−１Ｂ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）、ＦＯＸＡ３（ＨＮＦ３Ｇ）、ＨＮＦ４Ｇ、及びＯＮＥＣＵＴ１（ＨＮＦ６）から選択される転写因子、(ii) ＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、特に表２に列挙されているＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、及び(iii) カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）が、外分泌様サブタイプのＰＤＡＣ細胞において特異的に発現していることを突き止めた。ＨＮＦ−１ＡとＨＮＦ−１Ｂは転写因子であり、肝臓で発現していて、増殖している膵臓の内分泌細胞と外分泌細胞の両方で以前に報告されているが、成人の正常な膵臓では発現していない。さらに、カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）の発現も外分泌様サブタイプに特異的であることが見いだされている。
【００２７】
最後に、本発明者らは、驚くべきことに、古典的なＰＤＡＣサブタイプの細胞が、（i）ケラチン８１及び／又はビメンチンと(ii) ＨＮＦ−１Ａ及び／又はＨＮＦ−１Ｂの欠如と、場合により、ＨＮＦ−１Ａ、ＨＮＦ−１Ｂ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）、ＦＯＸＡ３（ＨＮＦ３Ｇ）、ＨＮＦ４Ｇ、及びＯＮＥＣＵＴ１（ＨＮＦ６）という転写因子、ＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、特に表２に列挙されているＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、及びカドヘリン１７（ＣＤＨ１７）のうちの１又は２以上のさらなる欠如を特徴とすることを突き止めた。
【００２８】
特別な一実施態様では、古典的サブタイプのＰＤＡＣは、バイオマーカーであるケラチン８１とＨＮＦ−１Ａの特異的発現の欠如を測定することによって同定される。
【００２９】
特別な一実施態様では、古典的サブタイプのＰＤＡＣは、（i）ＨＮＦ−１Ａ、ＨＮＦ−１Ｂ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）、ＦＯＸＡ３（ＨＮＦ３Ｇ）、ＨＮＦ４Ｇ、及びＯＮＥＣＵＴ１（ＨＮＦ６）から選択される転写因子、（ii）ＨＮＦ−１Ａによって制御される１又は２以上の標的遺伝子、特に表２に列挙されているＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、及び(iii) カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）から選択される１又は２以上の追加のバイオマーカーの特異的発現の不在を測定することによって同定される。
【００３０】
特別な一の態様では、本発明は、腫瘍試料におけるＰＤＡＣ細胞のサブタイプ特異的検出のためのインビトロの方法であって、サブタイプ特異的マーカーの発現を、タンパク質又はかかるタンパク質をコードするオリゴヌクレオチドのいずれかとして検出するステップによって特徴づけられ、ここで、ケラチン８１は、間葉系様サブタイプのＰＤＡＣ細胞のためのマーカーであり、(i) ＨＮＦ−１Ａは、外分泌様サブタイプの細胞のためのマーカーであり、そして古典的サブタイプのＰＤＡＣ細胞は、ケラチン８１及びＨＮＦ−１Ａの欠如によって特徴づけられる、前記方法に関する。
【００３１】
特別な実施態様では、前記検出は、前記サブタイプ特異的マーカーの１つのエピトープへの検出抗体の結合に基づいている。
【００３２】
本発明の文脈では、用語「エピトープ」は、抗原のうちで抗体によって認識される部分を意味する。
【００３３】
特別な実施態様では、ＰＤＡＣ細胞をサブタイプ特異的に検出するインビトロの方法は、以下のステップ：(a) 前記サブタイプ特異的マーカーの１つに特異的な検出抗体が前記エピトープと結合できる条件下にて、前記試料を前記検出抗体と接触させ；(b) 過剰の検出抗体分子を除去し；そして(c) 前記試料中で結合した検出抗体を検出することを含んでいる。
【００３４】
本発明の文脈では、用語「含む (comprises)」 又は「含んでいる (comprising)」は、「含有するが、それに限定されない (including, but not limited to)」ことを意味する。この用語は、含むものを限定するのではなく、記載した何らかの特徴、要素、整数、ステップ、又は成分の存在を示すことを目的としており、他の特徴、要素、整数、ステップ、成分や、これらの群の１又は２以上がさらに存在することを排除することは意図していない。したがって用語「含んでいる」は、より限定的な用語である「からなる (consisting of)」と「主に…からなる (consisting essentially of)」を含有する。
【００３５】
特別な実施態様では、検出抗体は、モノクローナル抗体；ポリクローナル抗体；組み換えによって産生されたキメラ抗体又はヒト化抗体を含む、組み換えによって産生された抗体；又は、完全合成抗体である。特別な実施態様では、抗体は、完全な免疫グロブリンであり、その中にはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、特にＩｇＡ又はＩｇＧが含まれる。特別な実施態様では、抗体は、抗体の機能的断片であり、その中にはＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆｖフラグメント、及び単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）が含まれる。
【００３６】
本発明の文脈では、用語「モノクローナル抗体」は、不死化された唯一の親免疫細胞によって産生される単一特異性抗体を意味する。
【００３７】
本発明の文脈では、用語「ポリクローナル抗体」は、さまざまなＢ細胞供給源から得られる抗体を意味する。ポリクローナル抗体は、特定の抗原に対して分泌される免疫グロブリン分子の組み合わせであり、異なるエピトープを同定する。
【００３８】
本発明の文脈では、用語「キメラ抗体」は、非ヒト供給源からの遺伝子材料をヒト遺伝子材料と組み合わせることによって作られる抗体、特に非ヒト種の標的特異的抗体からの非ヒト可変領域をヒト抗体定常領域と組み合わせることによって作られる抗体を意味する。かかるキメラ抗体は、一般に約２／３がヒトであり、治療で用いるときに非ヒト動物からの外来抗体と反応するリスクを低下させる。
【００３９】
本発明の文脈では、用語「ヒト化抗体」は、キメラ抗体の１つの特別な形態を意味し、ヒト化抗体では、非ヒト種の標的特異的抗体からのＣＤＲ領域がヒト抗体可変領域フレームワークに挿入されており、特に、ヒトフレームワークのいくつかの残基が復帰突然変異して非ヒト種に似た残基になり、結合しているＣＤＲループの三次元配列のための適切な構造支持体を提供している。したがってかかるＣＤＲ接合抗体又はヒト化抗体は、上述のキメラ抗体よりもはるかに広い範囲がヒト配列で構成されている。
【００４０】
本発明の文脈では、用語「抗体の機能的断片」は、抗体に基づくタンパク質で抗原に特異的に結合することのできる特性を保持しているものを意味する。いくつかの実施態様では、かかる断片は、可変重鎖（ＶＨ鎖）の少なくともＣＤＲ１領域とＣＤＲ２領域とＣＤＲ３領域を含んでいる。いくつかの実施態様では、かかる断片は、完全ＶＨ鎖（ＣＤＲ１領域とＣＤＲ２領域とＣＤＲ３領域に加えてフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含んでいる。いくつかの実施態様では、かかる断片は、可変軽鎖（ＶＬ鎖）の少なくともＣＤＲ１領域とＣＤＲ２領域とＣＤＲ３領域を含んでいる。いくつかの実施態様では、かかる断片は、完全ＶＬ鎖（ＣＤＲ１領域とＣＤＲ２領域とＣＤＲ３領域に加えてフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含んでいる。いくつかの実施態様では、かかる断片は、ＶＨ鎖とＶＬ鎖両方（ＶＨ鎖）の少なくともＣＤＲ１領域とＣＤＲ２領域とＣＤＲ３領域を含んでいる。いくつかの実施態様では、かかる断片は、完全ＶＨ鎖と完全ＶＬ鎖の両方を含んでいる。
【００４１】
本発明の文脈では、用語Ｆａｂフラグメントは、抗体の機能的断片で、重鎖と軽鎖それぞれの１つの定常領域と１つの可変領域からなるものに関する。これら２つの可変領域は、特異的抗原上の表面にあるエピトープに結合する。
【００４２】
本発明の文脈では、用語Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、ヒンジ領域を通じて結合された２つの同じＦａｂフラグメントに関する。
【００４３】
本発明の文脈では、用語「単鎖抗体」 又は「単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）」は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ鎖）と軽鎖（ＶＬ鎖）の可変領域が１０個〜約２５個のアミノ酸からなる短いリンカーペプチドで結合された融合タンパク質を意味する。リンカーは、通常は、可撓性を持たせるためのグリシンと、可溶性にするためのセリン又はトレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続するか、その逆が可能である。このタンパク質は、定常領域の除去とリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。
【００４４】
特別な実施態様では、検出抗体の結合は、二次抗体、特に標識化された二次抗体とのインキュベーションによって検出される。
【００４５】
特別な実施態様では、二次抗体は、マーカー分子で標識化される。
【００４６】
特別な実施態様では、二次抗体は、蛍光染料、生物学的に活性な酵素標識、放射活性標識、核磁気共鳴に活性な標識、発光性標識又は発色団による標識を用いて標識化される。
【００４７】
特別な実施態様では、放射活性標識は、32Ｐ、125Ｉ、3Ｈ、14Ｃ、188Ｒｈ、131Ｉ、99mＴｃ及び111Ｉｎからなる群から選択される。
【００４８】
特別な一実施態様では、抗体の結合は、免疫組織化学染色によって検出される。
【００４９】
特別な実施態様では、前記検出は、前記サブタイプ特異的マーカーの１つをコードするｍＲＮＡを測定することに基づき、特に定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって前記ｍＲＮＡを測定することに基づく。
【００５０】
特別な一実施態様では、試験すべき試料は膵臓組織を含有している。
【００５１】
特別な実施態様では、前記試料は、哺乳類、特にヒトから得られる。
【００５２】
別の態様では、本発明は、腫瘍試料におけるＰＤＡＣ細胞のサブタイプ特異的検出のためのインビトロの方法であって、遺伝子発現プロファイルにおけるＳｒｃ阻害剤感受性特性を分析するステップによって特徴づけられる、前記方法に関する。
【００５３】
本発明の文脈では、“Ｓｒｃ”は、癌原遺伝子ＳＲＣによってコードされるチロシンキナーゼという１つのタンパク質（“細胞性 (cellular) Ｓｒｃ”に関してはｃ-Ｓｒｃとも呼ばれる）であり、悪性腫瘍では過剰発現して高度に活性化されていることがしばしばある。Ｓｒｃはキナーゼファミリー（いわゆる“Ｓｒｃファミリー”）の一員である。このファミリーの追加のメンバーは、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｈｃｋ、Ｆｇｒ、Ｂｌｋ、Ｙｒｋ、及びｃ-Ｙｅｓである。
【００５４】
驚くべきことに、本発明者らは、ＰＤＡＣ細胞をＳｒｃ阻害剤感受性予測因子陽性ＰＤＡＣサブタイプとＳｒｃ阻害剤感受性予測因子陰性ＰＤＡＣサブタイプに分離できることを見いだした。
【００５５】
本発明の文脈では、用語「Ｓｒｃ阻害剤感受性特性」は、Ｓｒｃ阻害剤に対して感受性のある細胞に特徴的な遺伝子発現特性を意味し、それは実施例２に従って確立される。
【００５６】
本発明の文脈では、用語「Ｓｒｃ阻害剤感受性予測因子陽性ＰＤＡＣサブタイプ」は、ＧＳＥＡアルゴリズム（Subramanian, A., Tamayo, P., Mootha, V. K., Mukherjee, S., Ebert, B. L., Gillette, M. A., Paulovich, A., Pomeroy, S. L., Golub, T. R., Lander, E. S., and Mesirov, J. P. (2005). Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 15545-15550）のための入力として遺伝子発現値のリストを用いた遺伝子発現分析における腫瘍細胞スコア陽性を特徴とするサブタイプを意味する。本発明の文脈では、用語「スコア陽性」は、偽発見率（“ＦＤＲ”）が０．２００未満であることを意味する。逆に、用語「Ｓｒｃ阻害剤感受性予測因子陰性ＰＤＡＣサブタイプ」は、かかる遺伝子発現分析においてＦＤＲが０．２００以上である腫瘍細胞スコア陰性を特徴とするサブタイプを意味する。
【００５７】
特別な一実施態様では、遺伝子発現プロファイルは、表１に示した３０個の遺伝子のセットに基づいており、特にその遺伝子発現プロファイルは、実施例２に記載したようにして確立される。
【００５８】
本発明者らは、古典的なＰＤＡＣサブタイプの細胞と、間葉系様ＰＤＡＣサブタイプのいくつかの細胞が、Ｓｒｃ阻害剤感受性予測因子陽性ＰＤＡＣサブタイプに属することと、かかる細胞がＳｒｃ阻害剤に対して感受性があることを見いだす一方で、間葉系様ＰＤＡＣサブタイプの残りの細胞と外分泌様サブタイプの細胞は、Ｓｒｃ阻害剤感受性予測因子陰性ＰＤＡＣサブタイプに属していて、かかる細胞はＳｒｃ阻害剤に抵抗性であることを見いだした。
【００５９】
別の一の態様では、本発明は、ＰＤＡＣ細胞のサブタイプ特異的検出のためのキットであって、(i) ケラチン８１、(ii) ビメンチン、(iii) ＨＮＦ−１Ａ、ＨＮＦ−１Ｂ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）、ＦＯＸＡ３（ＨＮＦ３Ｇ）、ＨＮＦ４Ｇ、及びＯＮＥＣＵＴ１（ＨＮＦ６）から選択される１又は２以上の転写因子、(iv) ＨＮＦ−１Ａによって制御される１又は２以上の標的遺伝子、特に表２に列挙されている１又は２以上のＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、及び(v) カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）のリストから選択される、ＰＤＡＣサブタイプ特異的マーカーに特異的な、少なくとも２つの試薬を含み、ここで前記試薬は、検出抗体及びオリゴヌクレオチドプローブのリストから選択され、そして場合により、前記試薬の少なくとも１つの検出のための、少なくとも１つの試薬をさらに含む、前記キットに関する。
【００６０】
特別な一実施態様では、前記キットは、(i) ケラチン８１及びビメンチンのリストから選択される間葉系様に特異的な、特にケラチン８１である間葉系様に特異的な、少なくとも１つの試薬と、(ii) ＨＮＦ−１Ａ及びＨＮＦ−１Ｂのリストから選択される外分泌様ＰＤＡＣサブタイプに特異的な、特にＨＮＦ−１Ａである外分泌様ＰＤＡＣサブタイプに特異的な、少なくとも１つの試薬を含んでいる。
【００６１】
別の一の態様では、本発明は、Ｓｒｃ阻害剤感受性ＰＤＡＣ細胞をサブタイプ特異的に検出するためのキットであって、Ｓｒｃ阻害剤感受性特性の同定のためのオリゴヌクレオチドプローブを含む、前記キットに関する。
【００６２】
特別な一実施態様では、このキットは、表１に示された３０個の遺伝子を表わすオリゴヌクレオチドプローブを含んでいる。
【００６３】
特別な一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドアレイの中に、特に遺伝子チップ上のアレイの中に存在している。
【００６４】
別の一の態様では、本発明は、ＰＤＡＣを患う患者を治療コホートへと層別化する方法であって、以下のステップ：(a) (i) ケラチン８１、(ii) ビメンチン、(iii) ＨＮＦ−１Ａ、ＨＮＦ−１Ｂ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）、ＦＯＸＡ３（ＨＮＦ３Ｇ）、ＨＮＦ４Ｇ、及びＯＮＥＣＵＴ１（ＨＮＦ６）から選択される１又は２以上の転写因子、(iv) １又は２以上のＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、特に表２に列挙されている１又は２以上のＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、及び(v) カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）の発現及び／又は存在をインビトロで決定し；(b) 前記選択されたタンパク質の発現及び／又は存在に基づいて、ＰＤＡＣサブタイプを同定し；(c) ＰＤＡＣ患者が患うＰＤＡＣサブタイプに基づいて、前記患者を薬剤治療コホートへと層別化することを含む、前記方法に関する。
【００６５】
特別な実施態様では、この方法は、（i）ケラチン８１又はビメンチン、特にケラチン８１と、（ii）ＨＮＦ−１Ａ又はＨＮＦ−１Ｂ、特にＨＮＦ−１Ａの発現及び／又は存在をインビトロで決定するステップを含んでいる。
【００６６】
別の一の態様では、本発明は、ＰＤＡＣを患う患者をコホートへと層別化する方法であって、以下のステップ：(a)膵臓組織を含む患者試料の細胞中におけるＳｒｃ阻害剤感受性特性の決定のために、インビトロでの遺伝子発現プロファイルを確立し；(b) 前記遺伝子発現プロファイルに基づいて、ＰＤＡＣサブタイプを同定し；(c) ＰＤＡＣ患者が患うＰＤＡＣサブタイプに基づいて、前記患者を薬剤治療コホートへと層別化することを含む、前記方法に関する。
【００６７】
別の一の態様では、本発明は、ＰＤＡＣを患う患者の予後を評価する方法であって、以下のステップ：(a)（i）ケラチン８１、（ii）ビメンチン、（iii）ＨＮＦ−１Ａ、ＨＮＦ−１Ｂ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）、ＦＯＸＡ３（ＨＮＦ３Ｇ）、ＨＮＦ４Ｇ、及びＯＮＥＣＵＴ１（ＨＮＦ６）から選択される１又は２以上の転写因子、（iv）１又は２以上のＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、特に表２に列挙されている１又は２以上のＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子、及び(v) カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）の発現及び／又は存在をインビトロで決定し；(b) 前記選択されたタンパク質の発現及び／又は存在に基づいて、ＰＤＡＣサブタイプを同定し；(c) ＰＤＡＣ患者が患うＰＤＡＣサブタイプに基づいて、前記患者を予後コホートへと層別化することを含む、前記方法に関する。
【００６８】
特別な実施態様では、この方法は、（i）ケラチン８１又はビメンチン、特にケラチン８１と、（ii）ＨＮＦ−１Ａ又はＨＮＦ−１Ｂ、特にＨＮＦ−１Ａの発現及び／又は存在をインビトロで決定するステップを含んでいる。
【００６９】
別の一の態様では、本発明は、ＰＤＡＣを患う患者の予後を評価する方法であって、以下のステップ：(a)膵臓組織を含む患者試料の細胞中におけるＳｒｃ阻害剤感受性特性の決定のために、インビトロでの遺伝子発現プロファイルを確立し；(b) 前記遺伝子発現プロファイルに基づいて、ＰＤＡＣサブタイプを同定し；(c) ＰＤＡＣ患者が患うＰＤＡＣサブタイプに基づいて、前記患者を予後コホートへと層別化することを含む、前記方法に関する。
【００７０】
本発明の文脈では、用語「層別化する」 又は「層別化」は、患者の最適な管理法を選択するため分子診断試験と生化学的診断試験を利用して「生物学的」特徴を共有する患者の群を同定することに関する。
【００７１】
特別な一実施態様では、発現レベルは、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって、ｍＲＮＡレベルで決定される。
【００７２】
別の一実施態様では、発現レベルは、前記選択されたタンパク質への抗体の結合の検出に基づいて、タンパク質レベルで決定される。
【００７３】
特別な実施態様では、前記細胞は、前記患者試料から癌細胞を精製することによって得られ、特に前記精製ステップは、流動選別 (flow sorting)又はレーザー捕獲顕微解剖 (laser capture microdissection)を含んでいる。
【００７４】
特別な一実施態様では、前記患者試料は腫瘍生検である。
【００７５】
特別な一実施態様では、前記腫瘍生検は、微細針吸引 (fine needle aspiration)によって得られる。
【００７６】
特別な一実施態様では、患者試料は、血液、血清、及び血漿から選択される。特別な一実施態様では、患者試料は、特に患者の血液から単離された循環している腫瘍細胞（ＣＴＣ）を集めたものである。特別な実施態様では、ＣＴＣは血漿交換によって単離される。
【００７７】
特別な実施態様では、患者試料は、切除可能なＰＤＡＣに由来する。
【実施例】
【００７８】
実施例１：ＰＤＡＣサブタイプ特異的マーカーの同定
一次異種移植片として、原初の腫瘍サブタイプに関連する遺伝子発現パターンを保持しているためサブタイプ特異的バイオマーカーの同定を目的として古典的ＰＤＡＣサブタイプと間葉系様ＰＤＡＣサブタイプと外分泌様ＰＤＡＣサブタイプの分子的特徴づけが可能な商品名付きの安定なＰＤＡＣ細胞系と、細胞系由来の腫瘍を使用し、サブタイプ特異的遺伝子発現分析を実施した。この遺伝子発現分析においてサブタイプ特異的発現の大きな違い（５倍超）を示す遺伝子が、サブタイプ特異的バイオマーカータンパク質のためのスクリーンに含まれていた。臨床設定では免疫組織化学的マーカーが最も有用であるため、タンパク質地図データベースを使用してこの最初の候補リストを改良した。それに加え、ＧＳＥＡモチーフモジュールを使用して転写因子のサブタイプ特異的発現の検索も実施した。これにより、外分泌様サブタイプにおいてだけ、転写因子ＨＮＦ−１のための結合部位を含む遺伝子が豊富であることが明らかになった。したがって外分泌様サブタイプが最終候補リストに含まれた。細胞系由来異種移植片のパネル全体の切片について、あらゆる候補の発現を免疫組織化学法で試験した。腫瘍試料は１０％ホルマリンの中で一晩固定し、パラフィンに包埋した。免疫組織化学法のため、スライドを脱パラフィン化し、再水和した。ｐＨ６（Dako標的回収溶液、Dako、Glostrup）の蒸気釜中で１５分間沸騰させて抗原を回収し、３０分間放冷し、蒸留水で洗浄した。Linarisアビジン／ビオチンブロッキングキット（Vector Labs、Burlingame）を製造業者の説明書に従って使用して、非特異的結合をブロックした。スライドを一次抗体と３０分間インキュベートし、ＰＢＳ-Ｔ（０．５％トゥイーン-２０を含むＰＢＳ）で洗浄し、Dako REAL Detection Systemを使用して適切な二次抗体と２０分間インキュベートし、ＰＢＳ-Ｔで洗浄した。内因性ペルオキシダーゼをブロックし、ストレプトアビジンＨＲＰとインキュベーション（室温で２０分間）した後、スライドをＡＥＣ（Dako）で発色させ、ヘマトキシリンで対染色した。個々の抗体がＰＤＡＣ試料の特定のサブセットを染色し、したがって３種類のＰＤＡＣサブタイプの識別と分類に役立つことがわかった場合には、候補マーカータンパク質だけを選択した。ＨＮＦ−１Ａに対する抗体は、外分泌様サブタイプの腫瘍細胞の核を特異的に染色した。それに対してケラチン８１の発現は、間葉系様サブタイプの腫瘍においてだけ検出できた。古典的タイプでは、患者試料を分析するときに予測性があることが後に示される可能性のある特異的マーカーを同定することができなかった。したがって古典的サブタイプのＰＤＡＣは、ケラチン８１とＨＮＦ−１Ａの発現不在を特徴とすることができる。
【００７９】
選択されたマーカータンパク質に対する一次抗体を以下の希釈で使用した：ＨＮＦ−１Ａ（Ｈ-２０５、Santa Cruz）１：５０、ケラチン８１（３６-Ｚ、Santa Cruz）１：１００、及びビメンチン（Clone V9、ＤＡＫＯ）。すべての抗体をDako抗体希釈液の中に希釈した。
【００８０】
実施例２：ｍＲＮＡの発現を利用したＳｒｃ阻害剤感受性の予測
ｍｉＲＮＡｅａｓｙキット（Qiagen、Hilden）を使用してＰＤＡＣ細胞系又は腫瘍異種移植片から全ＲＮＡを単離した。Ｉｌｌｍｉｎａ  ＢｅａｄＣｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（HumanHT-12）を利用して遺伝子発現分析を実施した。各試料について得られた規格化された遺伝子リストを検出されたシグナルに従って分類した。シグナルが最も強い遺伝子を最上位にし、残りは降順で分類した。ランク付けしたこの遺伝子リストをＧＳＥＡ-アルゴリズム（Subramanian et al.上記引用）のための入力として用いた。ランク付けした各リストを表１に記載した感度予測因子（ＳＲＣ-ＳＰ）と別々に比較し、ＦＤＲを計算した。０．２００というＦＤＲカットオフ値が、試料をＳｒｃ阻害剤感受性であるかＳｒｃ阻害剤抵抗性であるかに正確に分類するのに最適であると判断した。ＦＤＲが０．２００未満になった試料は感受性であることが予測されるのに対し、ＦＤＲが０．２００よりも大きいと抵抗性であることが予測される。
【００８１】
実施例３：外分泌様サブタイプで過剰発現しているＨＮＦ−１標的遺伝子の同定
我々は、外分泌様サブタイプで過剰発現している転写因子ＨＮＦ−１の標的遺伝子を同定した。これら遺伝子は、外分泌様サブタイプのためのさらなるマーカーとして用いることができよう。
【００８２】
ｍｉＲＮＡｅａｓｙキット（Qiagen、Hilden）を使用し、継代の初期と後期（８０％集密）の異なるＰＡＣＯ系から、又は腫瘍組織（３０mｇ）から、全ＲＮＡを単離した。Ｉｌｌｍｉｎａ  ＢｅａｄＣｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（HumanHT-12v4）を利用して遺伝子発現分析を実施した。遺伝子発現差分析とクラスター化には、ＴＭ４マイクロアレイ・ソフトウエア・スイート（Saeed, A.I., Sharov, V., White, J., Li, J., Liang, W., Bhagabati, N., Braisted, J., Klapa, M., Currier, T., Thiagarajan, M. et al. (2003). TM4: a free, open-source system for microarray data management ad analysis. BioTechniques 34, 374-378）を使用した。以前に報告されているようにして（Subramanian et al.上記引用）、規格化されたデータで遺伝子セット豊富化分析を実施した。ＨＮＦ−１Ａのための仮想的結合部位を含む遺伝子のセットに対して試料を試験した。試験した遺伝子セットはＭＳｉｇＤａｔａｂａｓｅ（http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp）に含まれており、受け入れ番号Ｍ１２６７５、Ｍ１１４４２、Ｍ１４５９３、Ｍ１５４２９で入手できる。ＧＳＥＡアルゴリズム（Saeed et al. 上記引用）によって求めたようにコアに豊富に含有されていた遺伝子は、外分泌様サブタイプで発現したＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子の特性に含まれており、表２に列挙されている。
【００８３】
実施例４：免疫組織化学法による腫瘍サブタイプの測定
ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料（３μｍ〜５μｍの切片）を脱パラフィン化し、そして再水和した。ｐＨ６（Dako標的回収溶液、Dako, Glostrup）の蒸気釜中で１５分間沸騰させて抗原を回収し、３０分間放冷し、蒸留水で洗浄した。Linaris アビジン／ビオチンブロッキングキット (Vector Labs, Burlingame) を製造業者の説明書に従って使用して、非特異結合をブロックした。スライドを一次抗体と３０分間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔ（０．５％ツイーン２０を有するＰＢＳ）で洗浄し、Dako REAL Detection Systemを使用して適切な二次抗体と２０分間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。内因性ペルオキシダーゼをブロックし、ストレプトアビジンＨＲＰとインキュベーション（室温で２０分間）した後、スライドをＡＥＣ（Dako）で発色させ、ヘマトキシリンで対染色した。染色は、２つの別々の切片に、又は１つの切片上の２つの別々の領域に、それぞれＨＮＦ−１Ａおよびケラチン８１について行った。
【００８４】
染色の評価：サブタイプの割り当てのための染色の評価では、腫瘍細胞のみが考慮される。各試料について５００個の腫瘍細胞が評価される。観察されたシグナルが、比較可能な試料上でのアイソタイプ対照抗体で観察されるバックグランド染色と明確に区別できる場合には、シグナルは陽性と見なされる。少なくとも１つの腫瘍細胞が明らかに検出可能な細胞内シグナルを示す場合、試料はケラチン８１について陽性と見なされる。腫瘍細胞の少なくとも１つが明らかに検出可能な核染色を示す場合、試料はＨＮＦ−１Ａについて陽性と見なされる。サブタイプは以下のように測定される：
ケラチン８１陽性／ＨＮＦ−１Ａ陰性：間葉系様サブタイプ
ケラチン８１陰性／ＨＮＦ−１Ａ陽性：外分泌様サブタイプ
ケラチン８１陰性／ＨＮＦ−１Ａ陰性：古典的サブタイプ
ケラチン８１陽性／ＨＮＦ−１Ａ陽性：未定
【００８５】
実施例５：組織マイクロアレイにおける、マーカー発現と患者生存の相関
サブタイプ特異的な治療手法と組合せた患者の層別化はますます重要になってきており、すでにいくつかのタイプの癌で治療の有効性を改善することが証明されている。しかしこれまで、ＰＤＡＣ患者を臨床的に意味のある群に層別化する試みは、まちまちの結果を与えている（Stathis, A., and Moore, M. J. (2010). Advanced pancreatic carcinoma: current treatment and future challenges. Nat Rev Clin Oncol 7, 163-172）。これは、単一のマーカーによる手法を複雑にする、少なくとも３つのサブタイプの存在に一部起因しているかも知れない。２つのマーカーのセットでは、ＰＡＣＯモデルですべての３つのＰＤＡＣサブタイプを明確に特定することができる。２５８人のＰＤＡＣ患者のコホートへのこれらのマーカーの適用は、非重複染色を確認しており、患者群に適用された時の我々の２つのマーカーセットの頑強性を示唆している。これは、我々が患者の大きなコホートを３つの群［ＨＮＦ１Ａ陽性（外分泌様）、ケラチン８１（ＫＲＴ８１）陽性（ＱＭ−ＰＤＡ）、及び２重陰性（古典的）］に層別化することを可能にした。我々は、３群間で全体的生存率の有意差を見いだした。ＫＲＴ８１陽性患者は最悪の予後（平均ＯＳ＝１６．５ヶ月）を有し、ＨＮＦ−１Ａ陽性患者は最良の結果（平均ＯＳ＝４３．５ヶ月）を有し、２重陰性患者は中間の結果（平均ＯＳ＝２６．３ヶ月）を有していた。従って我々のマーカーは、ＰＤＡＣ患者の臨床的に意味のある層別化を初めて可能にし、容易に日常的な診断に取り込むことができ、ＰＤＡＣ患者の層別化が、現在の及び新規治療法の指針となる可能性を提供することができる。
【００８６】
Charite大学病院ベルリンで１９９１年〜２００６年の間にＰＤＡＣのための部分的な膵頭十二指腸切除術を受けた患者から、組織マイクロアレイを構築した。バイオマーカー解析のためのこの腫瘍コホートの使用は、Charite大学倫理委員会（ＥＡ１／０６／２００４）によって承認されている。患者の特徴は、図４に要約されている。
【００８７】
既に記載されている（Weichert, W., Roske, A., Gekeler, V., Beckers, T., Ebert, M. P., Pross, M., Dietel, M., Denkert, C., and Rocken, C. (2008). Association of patterns of class I histone deacetylase expression with patient prognosis in gastric cancer: a retrospective analysis. The Lancet Oncology 9, 139-148）ように、ホルマリン固定及びパラフィン包埋組織試料を使用して、組織マイクロアレイを作成した。簡単に説明すると、パラフィンの「ドナー」ブロックの３つの形態学的に代表的な領域が選択された。各組織から、これらの領域を代表する直径０．６ｍｍの３つの組織円柱を打ち抜き、特注の機器（Beecher Instruments, Silver Spring, MD, USA）を使用して、新しい「受容者」パラフィンブロックに正確に配列した。
【００８８】
【表１】
2018105876.tif 000003
【表２】
2018105876.tif 000004
【表３】
2018105876.tif 000005
【図１】
2018105876.tif 000006
【図２】
2018105876.tif 000007
【図３】
2018105876.tif 000008
【図４】
2018105876.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月8日(2018.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍試料におけるＰＤＡＣ細胞のサブタイプ特異的検出のためのインビトロの方法であって、サブタイプ特異的マーカーの発現を、タンパク質又はかかるタンパク質をコードするオリゴヌクレオチドのいずれかとして検出するステップによって特徴づけられ、
ここで、ケラチン８１は、間葉系様サブタイプのＰＤＡＣ細胞のためのマーカーであり、
ＨＮＦ−１Ａは、外分泌様サブタイプの細胞のためのマーカーであり、そして
古典的サブタイプのＰＤＡＣ細胞は、ケラチン８１及びＨＮＦ−１Ａの欠如によって特徴づけられる、前記方法。
【請求項２】
古典的サブタイプのＰＤＡＣが、(i）ＨＮＦ−１Ａ、ＨＮＦ−１Ｂ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）、ＦＯＸＡ３（ＨＮＦ３Ｇ）、ＨＮＦ４Ｇ、及びＯＮＥＣＵＴ１（ＨＮＦ６）から選択される転写因子、(ii) ＨＮＦ−１Ａによって制御される１又は２以上の標的遺伝子、及び(iii) カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）から選択される１又は２以上の追加のバイオマーカーの特異的発現の欠如を決定することによって同定される、請求項１に記載のインビトロの方法。
【請求項３】
ＨＮＦ−１Ａによって制御される１又は２以上の標的遺伝子が、ＳＬＣ５Ａ１、ＦＧＦＲ４、ＡＮＸＡ１３、Ｃ１１０ＲＦ９、ＴＭ４ＳＦ４、ＫＩＦ１２、ＲＮＡＳＥ４、ＵＧＴ１Ａ１、ＴＣＥＡ３、ＣＤＨ１７、ＳＬＣ４Ａ４、ＮＲ５Ａ２、ＬＧＡＬＳ２、ＮＲ１Ｈ４、ＵＧＴ１Ａ６、ＧＡＴＡ６、ＮＰＡＳ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＦＡＭ２０Ｃ、ＴＢＸＡＳ１、ＩＧＦＢＰ１、ＣＤＡＮ１、ＧＵＣＡ２Ｂ、ＳＬＣ３Ａ１、ＦＯＸＡ２、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＭＳＨ５、ＡＰＯＭ、ＦＸＹＤ２、ＨＰＮ、ＳＥＭＡ４Ｇ、ＲＯＢＯ３、ＳＬＣ３９Ａ１４、ＳＬＣ７Ａ９、ＮＦＩＸ、ＰＤＧＦＲＡ、ＲＡＢ３ＩＰ、ＧＣ、ＡＮＰＥＰ、ＣＲＢ３、ＭＳＸ２、ＭＭＰ１１、ＴＬＥ４、ＳＦＲＳ７、ＳＧＫ２、ＧＵＣＡ２Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ４、ＡＬＢ、ＧＪＢ１、ＳＬＣ３７Ａ４、ＳＰＩＮＫ１、ＳＬＣ１２Ａ２、ＴＢＬ１Ｘ、ＳＬＣ１Ａ１、ＲＢＰ４、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＮＤＳＴ２、ＥＭＬ４、ＮＥＯ１、ＴＨＲＡ、ＰＲＤＭ１、ＬＰＰ、ＰＬＳ３、ＹＥＳ１、ＡＦＭ、Ｃ１４ＯＲＦ１３８、ＢＡＣＥ２、ＵＢＥ３Ａ、ＬＲＲＣ１９、ＡＱＰ４、ＬＲＲＦＩＰ２、ＢＰＨＬ、Ｃ５、ＣＹＦＩＰ２、ＳＬＣ３９Ａ５、ＡＸＩＮ２、ＴＭＥＭ２７、ＳＵＬＦ２、ＭＩＡ２、ＳＴＡＧ２、ＴＩＮＡＧ、ＵＳＰ３、ＨＡＢＰ２、ＣＲＥＢ５、ＣＬＤＮ１０、ＰＵＲＡ、ＰＲＯＤＨ２、ＧＲＢ７、ＡＧＴ、ＴＴＲ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＭＬＬ、及びＴＨＡＰ１１から選択される、１又は２以上のＨＮＦ−１Ａ標的遺伝子である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出が、前記サブタイプ特異的マーカーの１つのエピトープへの検出抗体の結合に基づく、請求項１〜３のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項５】
以下のステップ：
(a) 前記サブタイプ特異的マーカーの１つに特異的な検出抗体が前記エピトープと結合できる条件下にて、前記試料を前記検出抗体と接触させ；
(b) 過剰の検出抗体分子を除去し；そして
(c) 前記試料中で結合した検出抗体を検出すること
を含む、請求項４に記載のインビトロの方法。
【請求項６】
前記検出抗体は、モノクローナル抗体；ポリクローナル抗体；組み換えによって産生されたキメラ抗体又はヒト化抗体を含む、組み換えによって産生された抗体；完全合成抗体；又は、前記抗体の１つの機能的断片である、請求項４又は５に記載のインビトロの方法。
【請求項７】
検出抗体の結合は、第二抗体とのインキュベーションによって検出される、請求項４〜６のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項８】
前記第二抗体は標識化された第二抗体である、請求項７に記載のインビトロの方法。
【請求項９】
前記第二抗体は、マーカー分子で標識化される、請求項４〜６のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項１０】
前記第二抗体は、蛍光染料、生物学的に活性な酵素標識、放射活性標識、核磁気共鳴に活性な標識、発光性標識又は発色団による標識を用いて標識化される、請求項９に記載のインビトロの方法。
【請求項１１】
前記放射活性標識が、32Ｐ、125Ｉ、3Ｈ、14Ｃ、188Ｒｈ、131Ｉ、99mＴｃ及び111Ｉｎからなる群から選択される、請求項１０に記載のインビトロの方法。
【請求項１２】
抗体の結合が、免疫組織化学染色によって検出される、請求項１１に記載のインビトロの方法。
【請求項１３】
前記検出が、前記サブタイプ特異的マーカーの１つをコードするｍＲＮＡを測定することに基づく、請求項１〜３のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項１４】
前記検出が、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって前記サブタイプ特異的マーカーの１つをコードするｍＲＮＡを測定することに基づく、請求項１３に記載のインビトロの方法。
【請求項１５】
前記試料は膵臓組織を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項１６】
前記試料は、哺乳類から得られる、請求項１５に記載のインビトロの方法。
【請求項１７】
前記哺乳類がヒトである、請求項１６に記載のインビトロの方法。
【外国語明細書】
2018105876000001.pdf