(57)【要約】【課題】食品中の微生物の増殖を抑えることができる、安全性が高い細菌増殖抑制剤の提供。さらに、芽胞形成バチルス属における芽胞発芽阻害剤の提供。【解決手段】黒麹菌培養物の加熱処理物又はその抽出物を有効成分とする細菌増殖抑制剤および芽胞発芽阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
黒麹菌培養物の加熱処理物又はその抽出物を有効成分とする細菌増殖抑制剤。
【請求項２】
黒麹菌培養物の加熱処理物又はその抽出物を有効成分とする食品用日持ち向上剤。
【請求項３】
加熱処理物が、６０〜９０℃で１〜１２時間、又は１００〜１２０℃で２０〜６０分間の加熱処理物である請求項１の細菌増殖抑制剤又は請求項２の食品用日持ち向上剤。
【請求項４】
請求項１の細菌増殖抑制剤又は請求項２の食品用日持ち向上剤を用いて食品を処理することを特徴とする食品の日持ち向上方法。
【請求項５】
穀類を含む液体培地で黒麹菌を培養し、得られた培養物を６０〜９０℃で１〜１２時間、又は１００〜１２０℃で２０〜６０分間加熱処理することを特徴とする黒麹菌培養物の加熱処理物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黒麹菌由来の細菌増殖抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、惣菜類、おにぎり類、弁当類、生菓子類、パン類、飲料等様々な種類の加工食品が多数販売されている。斯かる加工食品や飲料にとって、酵母、細菌、カビ等の微生物による腐敗を防止し、長期保存可能にすることは重要である。代表的な殺菌又は保存方法として、保存料や日持ち向上剤と称される添加物を添加し、食品中の微生物の増殖を抑えることが挙げられ、一般に、安息香酸、ソルビン酸、デヒドロ酢酸、サリチル酸などの合成化合物が使用される場合が多い。しかしながら、これらは、微生物の生育阻止効果は優れているものの、食品衛生上の安全性が懸念されるため、その使用量や使用範囲などが厳しく制限されている。
【０００３】
そこで、近年、より安全性の高い天然由来の食品用日持ち保存料や抗菌性物質の探索が行われ、例えば、茶又は茶抽出物（特許文献１）や柑橘類抽出物（特許文献２）等が使用可能であることが報告されている。しかしながら、当該食品へ添加した際の風味や嗜好性、抗菌スペクトルや抗菌力の点で、必ずしも十分とは云えない。
【０００４】
一方、麹菌の培養物に抗菌性物質が含まれることが報告され、例えばアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来の抗菌性物質が、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）等に抗菌性を有すること（特許文献３）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）および、近年、学名がアスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)からアスペルギルス・ルチュエンシス（Aspergillus luchuenshis ）へと変更された黒麹菌が、歯周病菌の増殖を阻害すること（特許文献４）等が報告されている。
【０００５】
しかしながら、黒麹菌アスペルギルス・ルチェエンシスの培養物を加熱処理することにより、新たに細菌、特に胞子形成細菌に対する抗菌物質が生ずることは全く報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平８−３８１３３号公報
【特許文献２】特開平１１−３３２５３４号公報
【特許文献３】特開２００３−２６６９３号公報
【特許文献４】国際公開第２０１２／０４３７４３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、食品中の微生物の増殖を抑えることができ、かつ、安全性の高い細菌増殖抑制剤、特に胞子形成細菌に極めて有効な増殖抑制剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明らは、麹菌について検討したところ、加熱処理した黒麹菌培養物を、食中毒や食品腐の原因となる、黄色ブドウ球菌や胞子形成細菌であるバチルス・セレウス(Bacillus cereus) 等の培養液に添加すると、それら細菌に対する生育阻止効果が発現することを発見し、当該加熱処理物が細菌増殖抑制剤、或いは食品用日持ち向上剤となり得ることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の１）〜５）に係るものである。
１）黒麹菌培養物の加熱処理物又はその抽出物を有効成分とする細菌増殖抑制剤。
２）黒麹菌培養物の加熱処理物又はその抽出物を有効成分とする食品用日持ち向上剤。
３）加熱処理物が、６０〜９０℃で１〜１２時間、又は１００〜１２０℃で２０〜６０分間の加熱処理物である上記１）の細菌増殖抑制剤又は上記２）の食品用日持ち向上剤。
４）上記１の細菌増殖抑制剤又は上記２）の食品用日持ち向上剤を用いて食品を処理することを特徴とする食品の日持ち向上方法。
５）穀類を含む液体培地で黒麹菌を培養し、得られた培養物を６０〜９０℃で１〜１２時間又は１００〜１２０℃で２０〜６０分間加熱処理することを特徴とする黒麹菌培養物の加熱処理物の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の細菌増殖抑制剤及び食品用日持ち向上剤によれば、食品の安全性や品質を害することなく、食品を汚染する細菌（バチルス・ズブチリス、バチルス・セレウス、バチルス・コアギュランス、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、リステリア・モノサイトゲネス等）の増殖を抑制できることから、食品を長期間の保存を可能とし、かつ、食中毒の発症を防止または抑制することができる。中でも、好気性の耐熱性芽胞形成桿菌であるバチルス・セレウスは、下痢や嘔吐を誘発する毒素を産生する場合、食中毒の原因菌であり、また院内感染症細菌としても懸念されていることから、バチルス・セレウスに対して栄養細胞増殖阻害作用のみならず芽胞発芽阻害作用を有する本発明の細菌増殖抑制剤及び食品用日持ち向上剤は、有用性が極めて高い。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分画物の抗菌活性（阻止円）。
【図２】精製活性画分のＨＰＬＣの溶出ピーク。
【図３】精製活性画分の飛行時間型質量分析による解析結果。
【図４】精製活性画分のＢ．ｃｅｒｅｕｓに対する栄養増殖阻害活性。
【図５】精製活性画分のＢ．ｃｅｒｅｕｓに対する芽胞発芽阻害活性。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の黒麹菌培養物の加熱処理物は、穀類を含む液体培地で黒麹菌を培養し、得られた培養物を加熱処理してなるものである。
本発明において用いられる「黒麹菌」としては、アスペルギルス・ルチュエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｓａｍｉｉ）、アスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ）、アスペルギルス・ニーガ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・グラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｇｌａｕｃｕｓ）等が挙げられ、このうち、アスペルギルス・ルチュエンシスが好ましい。アスペルギルス・ルチュエンシスは、旧分類では、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）とされていたもので、一般にアワモリコウジカビ（焼酎用コウジカビ）として広く知られているものである。
また、アスペルギルス・ルチュエンシスとしては、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ  ＳＨ―４１株（株式会社樋口松之助商店）を好適に用いることができる。
【００１３】
本発明において、黒麹菌の培養は、抗菌活性の点から、炭素源として少なくとも穀類が用いられる。例えば、可溶性でんぷんのみを炭素源として用いた場合には抗菌活性が認められない。
ここで、「穀類」としては、米、大麦、小麦、そば、ヒエ、アワ、キビ、コウリャン、トウモロコシ等を挙げられ、このうち米が好ましい。
当該穀類は、未精白の穀類から、穀皮が穀粒の表面にある程度残されているのが好ましく、精白歩合（穀類を精白して残った穀類の割合）が、３〜３０％であるのが好ましい。穀類として米を用いる場合、精米歩合は、３〜３０％が好ましく、約３０％であることがより好ましい。尚、３０％精米歩合とは、玄米の周囲を３０％削り落とした米粒のことである。
【００１４】
穀類を含む液体培地は、水に穀類を加えて調製される。例えば、水に対して穀類を１〜２０％（ｗ／ｖｏｌ）、好ましくは、１〜５％（ｗ／ｖｏｌ）、より好ましくは、１．５〜３（ｗ／ｖｏｌ）添加して調製される。
斯かる液体培地には、無機塩、有機物等の麹菌の培養に一般に使用されている栄養源を添加することができ、無機塩としてはアンモニウム塩、硝酸塩、カリウム塩、酸性リン酸塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の水溶性の化合物の１種又は２種以上を挙げることができる。ここで、無機塩としては０．１〜１％（ｗ／ｖｏｌ）添加するのが好ましい。
なお、有機物としては米糠、小麦麩、コーンスティープリカー、大豆粕、脱脂大豆等が挙げられる。
好適な培地としては、例えば、２（ｗ／ｖ）％炭素源（精米歩合３〜３０％の米粒）を添加したミネラル添加培地（ＮａＮＯ３  ０．３（ｗ／ｖ）％，Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１（ｗ／ｖ）％，ＭｇＳＯ４  ０．０５（ｗ／ｖ）％，ＫＣｌ  ０．０５％（ｗ／ｖ）％，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．００１（ｗ／ｖ）％）が挙げられる。
【００１５】
黒麹菌は、分生子（胞子）又は前培養により得られる菌糸のどちらの形態のものを用いてもよいが、分生子を用いるのが好ましい。
黒麹菌の液体培地への接種量には特に制限はないが、液体培地１ｍｌ当り、胞子であれば１×１０４〜１×１０６個程度、菌糸であれば前培養液を０．１〜１０％程度接種することが好ましい。
【００１６】
培養温度は、生育に影響を及ぼさない限り特に限定されないが、好ましくは２５〜４０℃、より好ましくは３７℃で行なうのがよい。培養時間は、好ましくは４８〜１６８時間、より好ましくは７２〜１４４時間、より好ましくは９６〜１２０時間である。
【００１７】
培養装置は液体培養を行なうことができるものであればよいが、酸素や空気を培地中に供給できる好気的条件下で行われ、培養中は培地中の原料、酸素、及び麹菌が装置内に均一に分布するように、撹拌をするのが好ましい。撹拌条件や通気量については、培養環境を好気的に保つことができる条件であればいかなる条件でもよく、培養装置、培地の粘度等により適宜選択すればよい。
【００１８】
培養終了後、培養物が加熱処理に付されるが、この場合、培養物そのものを加熱処理に付してもよいが、培養物を濾過又は遠心分離等することにより得られる培養上清物又は培養濾液を加熱処理に付すのが好ましい。
加熱処理条件としては、６０〜１２０℃で行うことができ、例えば６０〜９０℃で１〜１２時間、好ましくは６〜１２時間、１００〜１２０℃で２０〜６０分間、好ましくは１００℃で２０〜６０分間、１２０℃で２０〜３０分間である。
【００１９】
黒麹菌培養物の加熱処理物の抽出法としては、当該加熱処理物を有機又は無機溶媒で抽出し得られる抽出物、好ましくは有機溶媒による抽出物、さらに当該抽出物をクロマトグラフィー等で分画した分画物、さらにはその精製物が包含される。
抽出に用いる溶媒は、黒麹菌培養物の加熱処理物に含有される抗菌物質を抽出できる溶媒である限り、特に限定されるものではなく、例えば、水、メタノール、エタノール、エーテル、酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサン、又はこれらの混合物（例えば、クロロホルムとメタノールとの混合液）等を挙げることができるが、酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサン等の非プロトン性溶媒であるのが好ましく、低極性溶媒であるのがより好ましい。
好適な抽出法としては、Bligh-Dyer法又はこれに準ずる方法が採用できる。すなわち、加熱処理物に対し、適量のＮａＣｌを加え、クロロホルム−メタノール溶液を加えて撹拌した後、さらにクロロホルムを加えて撹拌し、クロロホルム層を回収することにより黒麹菌培養物の加熱処理物の抽出物を得ることができる。
抽出条件は、使用する溶剤によっても異なるが、例えば、加熱処理物１質量部に対して1〜１０質量部の溶剤を用い、０〜５０℃、好ましくは２５〜３７℃の温度で、１０〜１２０分抽出するのが好ましい。
【００２０】
分画物としては、カラムクロマトグラフィーを用いて、溶出・分離して得られる分画物、さらにはその精製物が挙げられる。
クロマトグラフィーに用いる担体としては、特に限定されないが、充填剤としてシリカゲルが好ましく、シリカゲル６０がより好ましい。カラムのサイズは、特に限定されない。
【００２１】
以下に、活性画分の取得法について、その一例を示す。
上記で得られた加熱処理物の溶媒抽出物をシリカゲルカラムに吸着後、溶媒としてｎ−ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝４０：６０：１で、ベッドボリームごとに溶出させ、画分１から画分６までを得、さらにアセトニトリルを用いてシリカゲルカラムを洗浄したものを画分７とする。このうち、画分３と４を合わせたものを、抗菌活性を示す画分（「活性画分」と称する）として回収し、濃縮することにより純度の高い黒麹菌培養物の加熱処理物の抽出物を得ることができる。
【００２２】
上記で得られた活性画分は、限外濾過膜（例えば、１０Ｋ又は３Ｋのメンブランフィルター（Amicon Ultracel-10, Millipore））、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製することができる。後記実施例で示すように、活性画分を１０Ｋフィルターで濾過した際の濾液をＹＭＣ  Ｈｙｄｒｏｓｈｅｒｅ  Ｃ１８カラムを用いたＨＰＬＣで精製した精製活性画分には、１．６７分付近に溶出されるピークに抗菌活性が認められ、また、飛行時間型質量分析計「AutoFlex-T2」を用いて当該精製画分の分子量を測定すると、６００Ｄａ〜１３００Ｄａ付近に主ピークが確認される（図１）。その際の ｍ／ｚは、１２７９．８５２、１０７０．５３２、８６０．８５８、６５１．２３５の規則的な等間隔のピークが観測される。
【００２３】
斯くして得られる黒麹菌培養物の加熱処理物又はその抽出物は、そのまま、或いは濃縮若しくは希釈、乾燥等の処理を適宜施し、固形状、懸濁液状、ペースト状等の任意の形態とし、本発明の細菌増殖抑制剤或いは食品用日持ち向上剤として用いることができる。
【００２４】
後記実施例に示すとおり、黒麹菌培養物の加熱処理物又はその抽出物は、食品腐敗、食中毒或いは感染症の原因となる有害菌であるバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、に対して抗菌活性を有する。
また、黒麹菌培養物の加熱処理物又はその抽出物は、バチルス・セレウスに対する栄養細胞増殖阻害作用のほか、芽胞発芽阻害作用を有する。バチルス・セレウスは芽胞形成細菌であり、物理化学的抵抗性が非常に強く、加熱調理食品においても保存や取扱いに欠陥があると発芽・増殖し、食中毒発症菌量に達することがあることから、発芽阻害作用有することは、食中毒発症抑制に有用である。
【００２５】
したがって、黒麹菌培養物の加熱処理物又はその抽出物は、細菌増殖抑制剤（細菌増殖阻害剤を包含する）或いは食品用日持ち向上剤として、主として食品中の微生物の増殖を抑制するため、食中毒の発症を抑制するために使用することすることができる。特に、食品工場ではバチルス・セリウスによる汚染が多数報告されていることから、食品工場における食品汚染の抑制に有用である。
本発明において、「食品用日持向上剤」とは、微生物の増殖を抑制するためのものであって、食品に添加されて使用され、該食品の日持ちを、即ち該食品を安全に食することができる期間を数日間程度延長可能とする食品添加剤（日持ち保存料）を意味する。
【００２６】
本発明の細菌増殖抑制剤又は食品用日持ち向上剤には、本発明の効果を阻害しない範囲で、酸化防止剤、香料、無機酸類、無機酸塩類、無機塩類、色素類、乳化剤、保存料、調味料、甘味料、酸味料、ｐＨ調整剤、品質安定剤、多糖増粘剤、かん水や結着剤等の製造用剤等を含有してもよい。その形態としては、粉末、顆粒、錠剤、氷等の固体、ペースト状等の半固体、調味料や浸漬液等の液体であってもよい。
【００２７】
本発明において、食品とは、食用肉、魚介、野菜、果物、卵、穀物、乳等の何れでもよく、そのまま又はそれをカッティングした未加工品の他、これらを混和した加工品や予め加熱処理した加工品でもよい。加工品としては、例えば、食肉惣菜、中華惣菜、煮物、菓子、パン類、弁当、水産食品、発酵食品、飲料が挙げられる。
【００２８】
本発明の食品の日持ち向上方法による食品の処理としては、例えば、本発明の細菌増殖抑制剤又は食品用日持ち向上剤を、食品表面に直接塗布すること、食品内部に浸透させること、又は食品と混合すること等が挙げられる。
【実施例】
【００２９】
実施例１  黒麹菌培養加熱処理物及びその抽出物の調製
（１）３０％精米２ｇ（１００粒）に１００ｍLの純水を添加し、さらに、ＮａＮＯ３（０．３ｗ／ｖ％）、Ｋ２ＨＰＯ４（０．１ｗ／ｖ％）、ＭｇＳＯ４（０．０５ｗ／ｖ％）、ＫＣｌ（０．０５ｗ／ｖ％）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．０１ｗ／ｖ％）を所定の濃度となるように添加して液体培地を作製した。
作製した液体培地に対し、１白金耳（２ｍｇ）の黒麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ  ＳＨ-４１株）の分生子を接種後、往復振機培養装置を用いて１００ｒｐｍ、３７℃で、１２０時間培養した。
培養終了後、ｐＨを７．０に調整し、０．２μｍポアサイズのメンブランフィルターにて濾過し、その濾液を１２０℃、２０分の高圧滅菌（オートクレーブ）処理に供し、黒麹菌培養物の加熱処理物を得た。
（２）（１）で得られた加熱処理物１６０ｍＬに対し、最終濃度が５ＭになるようにＮａＣｌを加えた。その混合液にクロロホルム：メタノール（１：２）溶液を７５０ｍＬ加え、分液ロートを用いて１０分間撹拌した。さらにクロロホルム２５０ｍＬを加えた後、分液ロートを用いて１分間撹拌を行ない、クロロホルム層を回収した。溶媒を留去し、黒麹菌培養物の加熱処理物の抽出物を得た。
【００３０】
試験例１  抗菌活性の測定（１）
供試菌として、Staphylococcus aureus IFO 12732、Staphylococcus epidermidis NBRC 12993、Listeria monocytogenes ATCC 7644、Bacillus cereus ATCC 11778、Bacillus cereus HK 51-16-1838、Bacillus coagulans IFO 12583、Bacillus subtilis ATCC 6633を用い、実施例１（２）で得られた加熱処理物の抽出物を１０％ＤＭＳＯに溶解後、５０μＬを寒天ウェルに入れ、寒天拡散法により、供試菌に対する抗菌活性を評価した。結果を表１に示す。尚、加熱処理を行わない黒麹菌培養物の抽出物には、抗菌作用は認められなかった。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
実施例２  黒麹菌培養物の加熱処理物抽出物の分画
（１）シリカゲルカラムに対して、実施例１で得られた抽出物を吸着させた後、溶媒としてｎ−ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝４０：６０：１で、ベッドボリームごとに溶出させ、画分１から６を得た。さらに、アセトニトリルを用いてシリカゲルカラムを洗浄したものを画分７とした。その際、抗菌活性は画分３と４に認められた。この両画分を合わせて抗菌活性を示す画分（活性画分）として算出したところ、培養液１リットルから３５．８ｍｇの活性物質を得ることができた。
【００３３】
（２）抗菌活性の測定
供試菌として、Bacillus coagulans IFO12583を用い、試験例１と同様の方法により、（１）で得られた画分１〜７について、それぞれの抗菌活性を測定した。結果を図１に示す。
その結果、画分４に最も強い抗菌活性があり、次が画分３であった。それ以外の画分には抗菌活性が認められなかった。
【００３４】
（３）活性画分の精製
（１）で得られた活性画分について、限外濾過膜及び高速液体クロマトグラフィー法を用いて精製を行った。すなわち、１０Ｋフィルターで限外濾過した際の濾液を、ＹＭＣ  Ｈｙｄｒｏｓｈｅｒｅ  Ｃ１８を用いたＨＰＬＣに適用し、以下の条件で溶出させた。
カラム：YMC hydrosphere C18（株式会社ワイエムシー）
溶出：水＋０．１％トリフルオロ酢酸、およびアセトニトリル＋０．１％トリフルオロ酢酸を用いたリニアグラジエント（０−３０％）、
流量：1.0 mL／min
その結果、図２に示すように、１．６７分後に溶出されるピークが認められ、そのピーク画分のみに抗菌活性が認められた。
尚、限外濾過を３Kのメンブランフィルターを用いて行った場合には、濾液とフィルター上の両者に抗菌活性が認められた。
【００３５】
（４）分子量の測定
（３）で得られた精製活性画分について、飛行時間型質量分析計（(MALDI-TOF MS)）「AutoFlex-T2」(BRUKER DALTONICS)を用いて分子量を測定したところ、６００Ｄａ〜１３００Ｄａ付近に主ピークが確認された。また、その際のｍ／ｚは、１２７９．８５２、１０７０．５３２、８６０．８５８、６５１．２３５の規則的な等間隔のピークが観測された（図３）。
【００３６】
試験例２  抗菌活性の測定（２）
供試菌として、Staphylococcus aureus IFO 12732、Staphylococcus epidermidis NBRC 12993、Listeria monocytogenes ATCC 7644、Bacillus cereus ATCC 11778、Bacillus cereus HK 51-16-1838、Bacillus coagulans IFO 12583、Bacillus subtilis ATCC 6633を用い、実施例２（３）で得られた精製活性画分を、１０％ＤＭＳＯに溶解後、５０μＬを寒天ウェルに入れ、寒天ウェル拡散法により、供試菌に対する抗菌活性を評価した。
【００３７】
【表２】
2018012675.tif 000003
【００３８】
その結果、バチルス属細菌に広い抗菌スペクトルを示した。とくに、バチルス・コアグランスIFO12583に対し強い抗菌作用を示した。
【００３９】
試験例３  栄養細胞増殖阻害活性の測定
抗菌効果を評価するために、タイム−キリング−アッセイ（time-killing-assay）法を用いて栄養細胞の増殖に与える影響を評価した。
得られた実施例２（３）で得られた精製活性画分を、１０％ＤＭＳＯを含むＰＢＳ（−）緩衝液に溶解して培地とした。
３７℃で一晩培養したＢ．ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ１１７７８をＰＢＳ（−）緩衝液で２回洗浄後、ＯＤ６００  ｍｍ＝０．７５になるように調整して菌液とした。上記培養液にその菌液を１０μＬ添加し３７℃でインキュベートした。それを、一定時間ごとに一定量を採取し、ＬＢ寒天平板培地上に塗布し、３７℃、２４時間培養後、観察されるコロニー数から生菌数を測定した。図４より、活性画分の濃度依存的に栄養増殖阻害活性が認められた。
【００４０】
試験例４  Ｂ．  ｃｅｒｅｕｓ芽胞発芽に対する活性の測定
Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ１１７７８株を芽胞形成培地（ＤＳＭ：Ｄｉｆｃｏ  ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ用培地）にて４日間振盪培養し、最終的に成熟芽胞を抽出した。実施例２（３）で得られた精製活性画分及び発芽誘発物質（Ｌ−Ａｌａｎｉｎｅ）を添加したリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、６５℃で３０分間加温した芽胞を懸濁し、吸光度６００ｎｍにて細胞数の変動を経時的に測定した（図５）。なお、芽胞を分離できたか否かはウイルツ法に従って芽胞染色し確認した。
その結果，無添加培地では２時間後に濁度が２０％程度低下するが、精製活性画分を添加した場合、その低下率が減少した。このことから、当該画分が芽胞の発芽過程に何らかの影響を与え、芽胞の発芽を阻害することが推測された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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