(57)【要約】【課題】高機能肝細胞を用いた人工肝臓を提供する。【解決手段】［１］以下を含む、少なくとも一個のモジュールを備える、体外型の人工肝臓を提供する：・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポート；・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポートを備える、血漿成分循環室；及び・血漿成分循環室に隣接して配置され、血漿成分循環室とはアンモニアは透過するが肝細胞は透過しない分離膜で隔てられおり、アンモニア代謝能を有する肝細胞が培養されている肝細胞培養室。［２］肝細胞培養室の上に血漿成分循環室が配置されている、１に記載の人工肝臓。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、少なくとも一個のモジュールを備える、体外型の人工肝臓：
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポート；
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポートを備える、血漿成分循環室；及び
・血漿成分循環室に隣接して配置され、血漿成分循環室とはアンモニアは透過するが肝細胞は透過しない分離膜で隔てられており、アンモニア代謝能を有する肝細胞が培養されている肝細胞培養室。
【請求項２】
肝細胞培養室の上に血漿成分循環室が配置されている、請求項１に記載の人工肝臓。
【請求項３】
肝細胞が、１００μｇ／ｄｌ／２４ｈ以上のアンモニア代謝機能を有し、かつ網状構造体を構成可能な、人工肝細胞である、請求項１又は２に記載の人工肝臓。
【請求項４】
肝細胞が、無血清かつ無フィーダー環境下で培養されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の人工肝臓。
【請求項５】
モジュール１個あたり少なくとも１．０×１０6個の肝細胞が培養されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の人工肝臓。
【請求項６】
複数個のモジュールを備え、５．０×１０9〜５．０×１０11個の肝細胞が培養されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の人工肝臓。
【請求項７】
１×１０4〜１×１０6ｃｍ2の有効培養面積を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の人工肝臓。
【請求項８】
少なくとも以下を備える、体外型の人工肝臓用又は肝細胞培養用の器具：
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポート；
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポートを備える、血漿成分循環室；及び
・血漿成分循環室に隣接して配置され、血漿成分循環室とはアンモニアは透過するが肝細胞は透過しない分離膜で隔てられた、肝細胞を培養するための肝細胞培養室。
【請求項９】
肝細胞培養室が、肝細胞を導入するための細胞導入ポートを備える、請求項８に記載の器具。
【請求項１０】
肝細胞培養室が、空気を排出するためのエア抜きポートを備える、請求項９に記載の器具。
【請求項１１】
肝細胞培養室内に、分離膜の変形を抑制する手段を備える、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンモニア代謝能を有する肝細胞を用いた体外型の人工肝臓、及び体外型の人工肝臓用又は肝細胞培養用器具に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性期の管理を含む医療技術が向上してきた現在もなお、日本において肝不全による死亡者は後を絶たない。中でも劇症肝炎は死亡率が７０〜９０％と非常に高く、予後不良の疾患である。肝不全治療においては、肝移植術がもっとも治療効果が高いが、ドナー不足や急性肝不全の劇的な経過のために肝移植術を施行できない症例が多い。
【０００３】
一方、人工構造物中で培養した肝細胞に肝機能補助を行わせる、ハイブリッド型人工肝臓(Hybrid-artificial livers support system; HALSS)が肝移植術までの、又は自己肝の再生までの期間、肝臓の機能を補助するために用いられるものとして期待されている。
【０００４】
ハイブリッド型人工肝臓としては、従来、中空糸型、多層平版型等の細胞を高密度に維持できる培養器を用いることが検討されてきた。また、このような高密度の培養器内の肝細胞に十分な酸素を供給するためには、酸素付加機を用いることが検討されてきた。例えば、特許文献１は、肝細胞を中空糸内腔に封入した中空糸モジュールと、酸素付加装置と、送液ポンプと、液溜めと、それらを連結する導管とからなる灌流回路であって、灌流液が送液ポンプにより液溜めから中空糸モジュールの外部を流れて、再び液溜めに戻る循環回路を形成している中空糸型人工肝臓の灌流及び培養システムを提案する。また、特許文献２は、血液導入部と血液導出部との間に、血漿分離装置と血球−血漿混合部とをこの順で含む血液流通経路と、前記血漿分離装置で分離された血漿を肝細胞を含む血漿処理装置を経て前記血球−血漿混合部に流入させる血漿循環経路とからなるハイブリッド型人工肝臓であって、前記血漿処理装置又はそれよりも上流側に、血漿処理装置の導出側血漿中の溶存酸素濃度を０．５ｐｐｍ以上に維持するための酸素付加器が設けられていることを特徴とするハイブリッド型人工肝臓を提案する。
【０００５】
ハイブリッド型人工肝臓に関しては、用いる細胞やそれを用いる場合の装置構成についても検討されてきた。例えば、特許文献３はハイブリッド型人工肝臓等の肝機能補助装置への使用に適するものとして、ヒト肝臓由来の細胞株であって、Ｐ４５０ ３Ａ４等の薬物代謝酵素遺伝子及びグルタミン合成酵素遺伝子等のアンモニア代謝酵素遺伝子によって形質転換された細胞株を提案する。また、引用文献４は、体外循環血液量を減らすことができ、かつ浄化効率を高めることができる血液浄化装置として、血液を血球と血漿とに分離するための血漿分離器を備えた生体側血液循環回路と、血漿分離器で分離された血漿を浄化する人工臓器モジュールを備えた人工臓器モジュール側血漿循環回路とを有する血液浄化装置において、人工臓器モジュール側血漿循環回路が、生体側血液循環回路とは独立の閉回路を形成していることを特徴とする血液浄化装置を提案する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−３３６７１号公報
【特許文献２】特開平１０−２３４８５０号公報
【特許文献３】特開２００３−２７４９６３号公報
【特許文献４】特開２００４−４９３０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、ハイブリッド型人工肝臓に用いる人工肝細胞について検討し、理論的に無限増殖可能であって、高いアンモニア代謝能を有する肝細胞を得た（特願２０１６−０３７５１８。本願の出願時には未公開。）。そして、この肝細胞の培養物がシート状の網目構造を形成することから、そのようなシート状の網目構造を保持したまま体外型の人工肝臓を構成することができるモジュール形状について鋭意検討した。その結果、患者からの血漿成分が循環する部分と、それとは分離膜で隔てられた肝細胞を培養するための部分との２室で構成される培養容器に想到し、またこのような培養容器が種々の肝細胞の培養に適することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、以下を提供する。
［１］以下を含む、少なくとも一個のモジュールを備える、体外型の人工肝臓：
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポート；
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポートを備える、血漿成分循環室；及び
・血漿成分循環室に隣接して配置され、血漿成分循環室とはアンモニアは透過するが肝細胞は透過しない分離膜で隔てられており、アンモニア代謝能を有する肝細胞が培養されている肝細胞培養室。
［２］肝細胞培養室の上に血漿成分循環室が配置されている、１に記載の人工肝臓。
［３］肝細胞が、１００μｇ／ｄｌ／２４ｈ以上のアンモニア代謝機能を有し、かつ網状構造体を構成可能な、人工肝細胞である、１又は２に記載の人工肝臓。
［４］肝細胞が、無血清かつ無フィーダー環境下で培養されている、１〜３のいずれかに記載の人工肝臓。
［５］モジュール１個あたり少なくとも１．０×１０6個の肝細胞が培養されている、１〜４のいずれかに記載の人工肝臓。
［６］複数個のモジュールを備え、５．０×１０9〜５．０×１０11個 の肝細胞が培養されている、１〜５のいずれかに記載の人工肝臓。
［７］１×１０4〜１×１０6ｃｍ2 の有効培養面積を有する、１〜６のいずれかに記載の人工肝臓。
［８］少なくとも以下を備える、体外型の人工肝臓用又は肝細胞培養用の器具：
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポート；
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポートを備える、血漿成分循環室；及び
・血漿成分循環室に隣接して配置され、血漿成分循環室とはアンモニアは透過するが肝細胞は透過しない分離膜で隔てられた、肝細胞を培養するための肝細胞培養室。
［９］肝細胞培養室が、肝細胞を導入するための細胞導入ポートを備える、８に記載の器具。
［１０］肝細胞培養室が、空気を排出するためのエア抜きポートを備える、９に記載の器具。
［１１］肝細胞培養室内に、分離膜の変形を抑制する手段を備える、８〜１０のいずれかに記載の器具。
【０００９】
本発明はまた、以下を提供する。
［１］100μg/dl/24h以上のアンモニア代謝機能を有し、かつ網状構造体を構成可能な、人工肝細胞。
［２］無血清かつ無フィーダー環境下で培養できる、１に記載の人工肝細胞。
［３］人工多能性幹（iPS）細胞から誘導されたものである、１又は２に記載の人工肝細胞。
［４］iPS細胞が、センダイウイルスベクターを用いて製造されたものである、３に記載の人工肝細胞。
［５］以下の工程を含む、人工肝細胞の製造方法：
iPS細胞を、Activin Aを含む分化誘導メディウムIで培養する、分化誘導工程１；
分化誘導工程１から得た細胞を、骨形成タンパク質4（BMP4）及び線維芽細胞増殖因子2（FGF2）を含む分化誘導メディウムIIで培養する、分化誘導工程２；及び
分化誘導工程２から得た細胞を、肝細胞成長因子（HGF）、Oncostatin M、Dexamethasone、並びにN,N'-(methylenebis(4,1-phenylene))diacetamide（FH1）及び／又は2-(N-(5-chloro-2-methylphenyl)(methylsulfonamido)-N-(2,6-difluorophenyl)-acetamide（FPH1）を含む分化誘導メディウムIIIで培養して人工肝細胞を得る、分化誘導工程３。
［６］iPS細胞が、センダイウイルスベクターを用いて製造されたものである、５に記載の製造方法。
［７］分化誘導メディウムIII が、FH1及びFPH1を含む、５又は６に記載の製造方法。
［８］分化誘導工程１〜３が、無血清かつ無フィーダー環境下で実施される、５〜７のいずれかに記載の人工肝細胞。
［９］分化誘導工程１及び分化誘導工程２が合計２〜１４日間行われ、
分化誘導工程３が２〜１４日間行われる、５〜８のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、シート状に肝細胞を維持した少なくとも一個のモジュールを備える、ハイブリッド型人工肝臓が提供される。
本発明により、シート状の組織として肝細胞を維持することができ、また循環流が直接肝細胞に伝わらない、ハイブリッド型人工肝臓用の器具、及び肝細胞培養用の器具が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、人工肝臓を構成するモジュールの実施態様の一例の断面図である。
【図２】図２は、人工肝臓を用いたシステムの実施態様の一例の模式図である。図中の矢印は回路内を血液等が流れる方向を表す。
【図３】Cord blood CD34陽性細胞由来iPS細胞（CiPS）
【図４】Cord blood CD34陽性細胞由来iPS細胞（CiPS）
【図５】CiPSからのrSeVベクター脱落確認
【図６】最適化されたiPS細胞から誘導された、高機能肝細胞
【図７】アンモニア代謝量の確認。フィーダー細胞（HUVECs, MSCs）を用いるより、化合物（FH1、FPH1）を用いた方が、代謝機能増強効果が高いことが分かった。
【図８】アンモニア代謝量の確認。得られたiPS-HEP細胞は、培養条件によっては、初代肝細胞の代謝能（160〜200μg/dl/24h）と同程度のアンモニア代謝機能を保持することが分かった。
【図９】肝細胞マーカーの確認（RT-PCR）
【図１０】肝細胞マーカーの確認（RT-PCR）
【図１１】肝細胞マーカーの確認（RT-PCR）
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、以下を含む、少なくとも一個のモジュールを備える、体外型の人工肝臓を提供する：
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポート ；
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポートを備える、血漿成分循環室；及び
・血漿成分循環室に隣接して配置され、血漿成分循環室とはアンモニアは透過するが肝細胞は透過しない分離膜で隔てられており、アンモニア代謝能を有する肝細胞が培養されている肝細胞培養室。
【００１３】
＜モジュール、人工肝臓、肝細胞培養器＞
図１は、人工肝臓を構成するモジュールの実施態様の一例の断面図である。モジュールの内部は、分離膜５により、血漿成分循環室３と肝細胞培養室４とに分割されている。モジュールは、モジュール蓋７とモジュール本体８とを、分離膜５を挟むように付設して形成することができる。血漿成分循環室３と肝細胞培養室４とは、どのように配置してもよいが、図１に示したように、肝細胞培養室４の上に血漿成分循環室３を配置することが好ましい。血漿成分循環室３は、血漿成分入口ポート１及び血漿成分出口ポート２を備える。肝細胞培養室４では、肝細胞９が培養されている。肝細胞は、無血清かつ無フィーダー環境下で培養されていてもよい。用いることのできる肝細胞の例については、後に詳述する。モジュールには、分離膜５が変形しないように、分離膜５の変形を抑制する手段、例えば分離膜サポート６を設けてもよい。また、肝細胞培養室４は、肝細胞を導入するための細胞導入ポートや、肝細胞を導入する際に空気を排出するためのエア抜きポートを備えていてもよい。
【００１４】
使用時、モジュール内部は、血漿成分でほぼ満たされており、血漿成分入口ポート１及び血漿成分出口ポート２を介して、血漿成分が循環される。血漿成分循環室３から肝細胞培養室４内へは、分離膜５を通過できる比較的低分子の成分が拡散する。
【００１５】
なお、モジュール内を循環する血漿成分としては、血漿のみならず、血漿を含む全血であってもよい。また、後述するようにモジュールを毒性試験等のための肝細胞の培養器として用いる場合は、血漿成分として、細胞の培養に適した培地がモジュール内に循環される。またモジュール内は、肝細胞を導入する前、人工肝臓その他の用途で使用する前、又は使用後等においては、洗浄、環境調整、順化等の目的で、等張液等を循環させることができる。本発明に関連して血漿成分というときは、特に記載した場合を除き、血漿、全血、培地、及び等張液を含む。
【００１６】
分離膜５により、血漿成分循環室３と肝細胞培養室４とを隔てる構成とすることにより、血漿成分循環室へは肝細胞が入り込むことがない。また、肝細胞培養室内へは、循環流からの比較的低分子の成分が分離膜を通過して拡散するだけであり、循環流が直接肝細胞培養室内に流入しない。肝細胞培養室内の液体が大きく動くことはないので、肝細胞培養室内で培養されている肝細胞自体の損傷や、肝細胞により形成された構造体の損傷を防ぎうる。そのため、肝細胞の機能を高く維持することができると考えられる。また、このような構造を採ることによりモジュールを薄型にし、積層するのに適した形状とすることができる。そのため多くの肝細胞を要する場合には、複数のモジュールを用いることとして分離膜の面積を一定以上に確保することができる。そして、多くの細胞に対する十分な量の酸素等の補給を行うことができ、また、肝細胞によるアンモニア等の老廃物の代謝を十分に行うことができる。
【００１７】
モジュール全体の形状は、特に限定されず、丸型、角型等、適宜とすることができる。モジュールのサイズもまた、特に限定されず、適宜とすることができる。特に好ましい態様においては、モジュールは、モジュール１個あたり少なくとも１．０×１０6個の肝細胞を培養することができるサイズである。このようなモジュールは、容積を１〜１０ｍｌとすることができ、また肝細胞が培養の際に付着することができる面の面積（有効培養面積）を、１〜２０ｃｍ2とすることができる。
【００１８】
モジュールを構成する素材は、肝細胞の培養に適したものから選択するとよい。特に、肝細胞培養室４の内側の面は、通常、肝細胞が付着して培養されるので、肝細胞に適合性があるものから選択することが好ましい。また、モジュール素材は、滅菌できるものであることが好ましく、透明であることが好ましい。さらに、医療用具として許容されるものであることが好ましい。モジュール素材の具体例として、ポリスルホン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリメチルペンテン、又はポリスチレン等のブロック共重合体が挙げられる。
【００１９】
分離膜は、アンモニアを透過可能な多孔膜、例えば分子分画能が３００ｋＤａ以上の膜を用いる。分離膜は、肝細胞が透過できない孔径、例えば０．６５μｍ以下の孔径の孔を有することが好ましい。分離膜の素材としては、医療用具として許容されるものであることが好ましい。また、滅菌できるものであることが好ましい。分離膜素材の具体例として、セルロース系膜、又は合成高分子系膜を挙げることができ、より詳細には、再生セルロース（ＲＣ）、キュプラアンモニウムレーヨン（ＣＲ）、鹸化セルロース（ＳＣＡ）、表面改質再生セルロース、セルロースアセテート（ＣＡ）、セルロースジアセテート（ＣＤＡ）、セルローストリアセテート（ＣＴＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、エチレンビニルアルコール共重合体（ＥＶＡＬ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリエステル系ポリマーアロイ（ＰＥＰＡ）が挙げられる。
【００２０】
モジュールは、分離膜の変形を抑制する手段（分離膜サポート６）を有していてもよい。分離膜の変形を抑制する手段は、分離膜の下側に設けることができ、肝細胞や生体に対して毒性のない素材を用いた、格子状、網状等の構造物とすることができる。
【００２１】
このようなモジュールの少なくとも一個により、人工肝臓が構成される。モジュールの個数は、モジュール一個の大きさと、人工肝臓として用いるべき肝細胞の数に応じて、決定することができる。例えば、上述したような１個あたり１０6個オーダーの肝細胞を培養することができるサイズ（容積１〜１０ｍｌ、有効培養面積１〜２０ｃｍ2）のモジュールを用いる場合は、体重約２０ｇのマウス一匹に対しては１〜５個、体重約２００ｇのラット一匹に対しては１０〜５０個、使用することが想定される。
【００２２】
ヒト（成人）に用いる場合、５．０×１０9〜５．０×１０11個、より特定すると１×１０10〜１×１０11個の肝細胞が必要であることが想定される。このような人工肝臓の有効膜培養面積は、１×１０4〜１×１０6ｃｍ2であり得、より特定すると、１．９×１０4〜１．９×１０5ｃｍ2であり得る。複数個のモジュールを用いる場合は、モジュール同士を並列に連結することができ、また直列に連結することもできる。
【００２３】
一般に、ハイブリッド型人工肝臓は、体外に装着して血管に接続するもの、体内に留置して血管に接続するもの、又は血管に接続せずに腹腔内に留置するものの三つの形態がある。本発明の人工肝臓は、体外型である。体外型であることは、後述するようなiPS細胞由来の肝細胞を用いる場合に、細胞移入などに伴うリスクを回避するという点からも好ましい。
【００２４】
本発明によって提供される上述のモジュールからなる器具は、人工肝臓のためのみならず、肝細胞の培養のためにも用いることができる。器具内で培養された肝細胞又は肝細胞から構成された肝臓組織は、様々な用途に用いうる。例えば、安全性試験；毒性試験；吸収、分布、代謝および排出試験（ＡＤＭＥ）；薬物代謝と薬物動態学試験（ＤＭＰＫ）；薬物相互作用試験；及び抗ウイルス活性試験等の、各種試験のために用いうる。また、医薬品のスクリーニング（例えば、高脂血症薬、高血圧治療薬、低分子化合物医薬、又は抗体医薬のスクリーニング）、及び創薬標的スクリーニングのために用いうる。さらに、疾患モデル；感染症モデル；動物モデルの代替として、用いうる。また、大量培養、高密度培養、高次元培養等の生物学的研究のためにも用いうる。
【００２５】
肝細胞の培養のために用いる場合、血漿成分に代えて、細胞培養用の培地をモジュールに循環させることができる。
【００２６】
＜システム、回路＞
図２は、人工肝臓を用いたシステムの実施態様の一例の模式図である。人工肝臓を用いた体外循環システムは、血漿分離器１１を用いる場合は、患者１０側の第一の循環回路２０（患者側回路）と、人工肝臓１２が配された第二の循環回路２１（人工肝臓側回路）とにより構成することができる。必要に応じ送液ポンプ等を利用して、循環回路２０に患者１０から採取した血液を循環させる。血液が血漿分離器１１に導入されると、患者の血液から血漿が分離され、分離された血漿は、循環回路２１に流れる。循環回路２１に血漿を流すために、送液ポンプを利用してもよい。血漿が人工肝臓１２に導入されると、人工肝臓を構成するモジュール内部に培養されている肝細胞により、アンモニア等の有害物質の代謝が行われる。人工肝臓１２に導入される血漿はまた、人工肝臓内部の肝細胞に、酸素等の必要物質を供給する役割も有している。肝細胞により有害物質が減じられ、人工肝臓１２から導出された血漿は循環回路２０に入って循環回路２０を流れる血液と一緒になり、患者１０へ返血される。
【００２７】
本発明の人工肝臓を用いた体外循環システムの構成は、血漿分離器を用いる態様に限られず、血漿分離器を用いずに従来の血液透析システムに倣った構成とすることもできる。具体的には、既存の血液透析の回路において、透析器の代わりに本発明の人工肝臓を接続した構成とすることができる。
【００２８】
＜肝細胞＞
次に、本発明の人工肝臓に用いられる肝細胞について説明する。本発明には、従来のハイブリッド型人工肝臓への適用が検討されてきた種々の肝細胞を用いることができる。
【００２９】
肝細胞は、株化された細胞であっても、成人や胎児等の肝臓の細胞の初代培養細胞であってもよく、また幹細胞から誘導された細胞であってもよい。株化細胞の例として、次のものが挙げられる：BRL-3A（ラット肝由来細胞株, MSA (somatomedin様)蛋白産生, (Buffalo rat)）、LMH（ニワトリ肝細胞がん, diethylnitrosamine誘発）、RL-34（ラット正常肝より樹立された細胞株, コラーゲンによる増殖の停止, (Wistar rat)）、ARLJ301-3（ラット肝上皮細胞株, (F344/DuCrj rat)）、FAA-HTC1（ラット肝細胞がん, 2-acetylaminofluorene誘発, (F344/DuCrj rat)）、RLN-B2（ラット正常肝より樹立された細胞株, (Donryu rat)）、RLN-J-5-2（ラット正常肝より樹立された細胞株, (Donryu rat)）、Ac2F（ラット正常肝より樹立された細胞株, 核型は二倍体, (Donryu rat)）、dRLa-74 Clone 2（ラット肝臓, 腺腫, (Donryu rat)）、dRLh-84（ラット肝細胞がん, (Donryu rat)）、AH66tc（ラット腹水肝がん, (Donryu rat)）、AH70Btc（ラット腹水肝がん, (Donryu rat)）、RLN-8（ラット正常肝より樹立された細胞株, (Donryu rat)）、RLN-10（ラット正常肝より樹立された細胞株, (Donryu rat)）、Ac2F(DT)（ラットAc2F由来, 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzeneによる形質発現株, (Donryu rat)）、Ac2F(ST)（ラットAc2F由来, 自然形質転換株, (Donryu rat)）、dRLN-4（ラット肝由来細胞株, 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene誘発, (Donryu rat)）、dRLN-9（ラット肝由来細胞株, 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene誘発, (Donryu rat)）、dRLN-6（ラット肝由来細胞株, 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene誘発, (Donryu rat)）、3'-mRLN-30（ラット肝由来細胞株, 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene誘発, (Donryu rat)）、3'-mRLN-31（ラット肝由来細胞株, 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene誘発, (Donryu rat)）、3'-mRLh-2（ラット肝細胞がん, (Donryu rat)）、IAR-20（ラット非トランスフォーム肝細胞株, (BD-IV rat)）、JTC-16 P3（ラット腹水肝がん, JTC-16由来, 無血清順化株, (Donryu rat)）、RLC-10.P3（ラットRLC-10細胞由来, 無血清順化株, (JAR-1 rat)）、NCTC Clone 1469（マウス正常肝より樹立された細胞株, (C3H/An mouse)）、BRL-3A（ラット肝由来細胞株, MSA (somatomedin様)蛋白産生, (Buffalo rat)）、AH601.P3(JTC27)（ラット可移植腹水肝がん, 無血清順化株, (Donryu rat)）、AH601(JTC27)（ラット可移植腹水肝がん, (Donryu rat)）、M（ラット肝由来, DABによる株化, (JAR rat)）、M.P3（ラット肝由来, DABにより株化したM細胞の無血清・無脂質培地順化株, (JAR rat)）、NCTC clone 1469（マウス正常肝より樹立された細胞株, (C3H/An mouse)）、FLS3（マウス肝ストロマ細胞株）、FLS5（マウス肝ストロマ細胞株）、TLR2（マウス肝細胞株, 温度感受性SV40 large T遺伝子による不死化, 培養温度33℃(C57BL/6 transgenic mouse)）、TLR3（マウス肝細胞株, 温度感受性SV40 large T遺伝子による不死化, 培養温度33℃(C57BL/6 transgenic mouse)）、WB-F344（ラット肝上皮細胞株, oval cellの表現型に類似と報告されている, (Fischer F344 rat)）、FF101（ラット肝細胞がん, 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene誘発, 無血清培養, (Donryu rat)）、AH601.P3(JTC27)（ラット可移植腹水肝がん, 無血清順化株）、AH-7974.P3（ラット腹水肝がん, JTC-16由来, 無血清順化株）、RLC-10.P3（ラットRLC-10細胞由来, 無血清順化株）、M.P3（ラット肝由来, DABにより株化したM細胞の無血清・無脂質培地順化株）、RI-T（ラット肝星細胞(イトウ細胞)株, SV40 T抗原による不死化(Wistar rat)）、TMNK-1（ヒト不死化肝内皮細胞 ）、HUH-6 Clone 5（ヒト肝芽腫, 高分化型）、HuH-7（ヒト肝細胞がん, 分化型）、HLE（ヒト肝細胞がん, 未分化型）、HLF（ヒト肝細胞がん, 未分化型）、PLC/PRF/5（ヒト肝細胞がん, HBs抗原陽性）、HuCCT1（ヒト胆管がん）、HuH28（ヒト胆管がん）、JHH-4（ヒト肝細胞がん）、LI90（ヒト肝 Ito細胞, 有限増殖）、Alexander cells（ヒト肝細胞がん, HBs抗原陽性, PLC/PRF/5株の別名）、OCUG-1（ヒト胆嚢がん, 悪性）、huH-1（ヒト肝細胞がん, HBs抗原陽性）、JHH-2（ヒト肝細胞がん）、JHH-5（ヒト肝細胞がん）、JHH-6（ヒト肝細胞がん）、JHH-7（ヒト肝細胞がん, HBV遺伝子の組込がある）、OZ（ヒト胆管がん）、NOZ（ヒト胆嚢がん, 中分化型管状腺がん）、Hep G2（ヒト肝細胞がん）、JHH-1（ヒト肝細胞がん）、GS-3A4-HepG2（ヒト肝細胞がん, ヒトグルタミン合成酵素、CYP3A4強制発現細胞）、TYGBK-1（ヒト胆嚢がん）、TYBDC-1（ヒト胆管腺がん（胆管がんの肝転移巣より樹立））、KKU-055（ヒト胆管がん細胞）、MMNK-1（ヒト不死化胆管由来細胞株）、KKU-213（ヒト胆管がん細胞）、KKU-100（ヒト胆管がん細胞）、TWNT-1（ヒト肝 Ito細胞, LI90の不死化細胞株）、TYGBK-8（ヒト胆嚢がん（中分化管状がん））、DR-EcoScreen（マウスaryl hydrocarbon受容体のインビトロ転写活性化アッセイに用いる細胞株）。
【００３０】
特に好ましい態様においては、１００μｇ／ｄｌ／２４ｈ以上のアンモニア代謝機能を有し、かつ網状構造体を構成可能な人工肝細胞が用いられる。次に、この高機能人工肝細胞について詳述する。
【００３１】
＜人口肝細胞＞
［網状構造体］
細胞の特徴に関し、「網状構造体を構成可能である」とは、対象となる細胞を適切な条件で培養した場合に、所定の網状構造体が構成されることをいう。網状構造体は、細胞を適切な密度で、必要に応じ細胞外マトリクス（ＥＣＭ）、例えばｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ヒアルロン酸、ヘパリン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、又は他のＥＣＭでコートした培養器に播種し、適切な培地を用いて数日間培養することにより、構成される。網状構造体は、少なくとも細胞１個分の幅〜1000μm（より特定すると数個分の幅〜500μm、さらに特定すると20〜250μm）の紐状の部分と、円形、楕円形等の空隙の部分とを含む。空隙の直径は典型的には、100〜2000μmであり、より特定すると200〜1000μmであり、さらに特定すると300〜1000μmである。網状構造体はまた、細胞1〜3個分の、厚み10〜60μmを有しうる。
【００３２】
［アンモニア代謝能］
本発明でアンモニア代謝機能をいうときは、特に記載した場合を除き、対象となる細胞を適切な条件で培養した場合のアンモニア代謝機能をいう。アンモニア代謝機能の測定方法は、当業者にはよく知られているが、フィーダー細胞（HUVECs、MSCs等）を用いず、後述する化合物（FH1）を用いて、必要に応じＥＭＣでコート下培養器を用い、付着培養することが好ましい。より詳細な条件は、本書の実施例の項に記載の方法を参照することができる。
【００３３】
好ましい態様において、人工肝細胞は、高いアンモニア代謝機能を有する。具体的には、人工肝細胞は100μg/dl/24h以上、好ましくは120μg/dl/24h以上、より好ましくは初代肝細胞の代謝能（160〜200μg/dl/24h）と同程度、すなわち160μg/dl/24h、さらに好ましくは180μg/dl/24hのアンモニア代謝機能を有しうる。
【００３４】
［培養上の特徴］
無血清及び／又は無フィーダー環境下での培養：
【００３５】
人工肝細胞を培養するための培地としては、肝細胞を培養するために開発された種々の既存の培地が利用できる。利用可能な培地の例として、後述する分化誘導メディウムIII若しくはHCMTM BulletKitTM Medium (Lonza Walkersville, Inc)又はHBMTM Basal Medium (Lonza Walkersville, Inc）が挙げられる。
【００３６】
人工肝細胞は、無血清及び／又は無フィーダー環境下で、好ましくは無血清かつ無フィーダー環境下で培養することができる。無血清かつ無フィーダー環境下で培養するとは、動物血清及びヒト血清を含まない培地を用いて、目的の人工肝細胞以外の細胞、例えばマウス胎児線維芽細胞やフィーダー細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs）、間葉系肝細胞（mesenchymal stem cells, MSCs）が共存しない環境下で培養することである。
【００３７】
ＥＭＣコート：
人工肝細胞の培養に際しては、各種の既存の培養器を利用できる。培養器素材は、当業者であれば適宜選択できるが、増殖が良好であり、かつ高い機能を維持するとの観点からは、ＥＭＣをコートした培養器を用いることが好ましい。好ましいＥＣＭの例は、ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ヒアルロン酸、ヘパリン、フィブロネクチン、ラミニン、及びビトロネクチン、プロテオグリカン（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン）、各種コラーゲン、ゼラチン、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、及びフィブリリン等である。
【００３８】
維持・継代：
人工肝細胞は、後述する分化誘導メディウムIIIを用い、10日程度の継続培養が可能であることが確認されている。適切な密度で播種することにより、継代し、増殖させることができると考えられる。適切な密度とは、例えば人工肝細胞が互いに丁度接する密度である。これよりも低密度の場合は、増殖が悪く、またこれよりも高密度の場合は、三次元的構築を示す領域から顕著な細胞死が誘導されうる。
【００３９】
＜人工肝細胞の製造方法＞
好ましい態様において用いられる人工肝細胞は、以下の工程を含む方法により製造することができる：
iPS細胞を、Activin Aを含む分化誘導メディウムIで培養する、分化誘導工程１；
分化誘導工程１から得た細胞を、骨形成タンパク質4（BMP4）及び線維芽細胞増殖因子2（FGF2）を含む分化誘導メディウムIIで培養する、分化誘導工程２；及び
分化誘導工程２から得た細胞を、肝細胞成長因子（HGF）、Oncostatin M、Dexamethasone及びN-phenyl-2-(N-phenylmethylsulfonamido) acetamide骨格を有する化合物を含む分化誘導メディウムIIIで培養して人工肝細胞を得る、分化誘導工程３。
【００４０】
分化誘導工程１：
分化誘導工程１では、iPS細胞を、少なくともActivin Aを含む分化誘導メディウムIで培養する。
【００４１】
iPS細胞：
好ましい態様において用いられる肝細胞を得るためには、出発細胞として、ヒト又は非ヒト動物由来のiPS細胞を用いる。iPS細胞の入手方法及び樹立方法は当業者にはよく知られている。ヒトiPS細胞は、理化学研究所バイオリソースセンターからの購入や、京都大学や国立成育医療研究センターからの分与が可能である。入手可能であり、かつ好ましいiPS細胞の例は、例えば、臍帯由来線維芽細胞（RCB0436 HUC-F2）にレトロウイルスベクターにより4因子（Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc）を導入することにより樹立された、ヒト人工多能性幹（iPS）細胞株HiPS-RIKEN-1A（理化学研究所、HPS0003）、臍帯由来線維芽細胞（RCB0197 HUC-Fm）にレトロウイルスベクターにより4因子（Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc）を導入することにより樹立されたヒトiPS細胞株HiPS-RIKEN-2A（理化学研究所、HPS0009）、臍帯由来線維芽細胞にレトロウイルスベクターにより3因子（Oct3/4, Sox2, Klf4）を導入することにより得られるヒトiPS細胞株HiPS-RIKEN-12A（理化学研究所、HPS0029）、センダイウイルスベクターを用いて4因子（Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc）を導入することにより樹立されたヒトiPS細胞株Nips-B2（理化学研究所、HPS0223）等である。
【００４２】
センダイウイルスベクターの使用：
iPS細胞を樹立する際、因子を導入するためのベクターとして、センダイウイルスベクターを用いることが好ましい。レトロウイルスベクターは細胞の核に入り込んでDNAとして遺伝子発現を行うものであるため、得られたiPS細胞を患者に用いた際に、極めて稀ではあるが、ベクターが患者の染色体に積極的に入り込んだり、あるいは染色体DNAと遺伝的組換えを起こす恐れが懸念されている。一方、センダイウイルスベクターは、細胞核の中に入らず、細胞質内で自らのゲノムを複製して大量のタンパク質を作り出すものである。このゲノムはRNAからできており、患者の染色体のDNAとは物質的に異なるため、センダイウイルスベクターが核内の患者の染色体を改変するリスクは原理上ないと考えられている。
【００４３】
iPS細胞をセンダイウイルス（SeV）ベクターを用いて樹立する方法は、当業者にはよく知られており、例えば市販のヒト線維芽細胞等を、リプログラム因子発現ユニットを搭載したセンダイウイルスベクターが添加された培地で培養することで樹立される。リプログラム因子発現ユニットを搭載したセンダイウイルスベクターとしては、例えばCytoTune-iPS（ディナベック株式会社製）等が挙げられる。
【００４４】
分化誘導メディウムI：
この工程で用いられる分化誘導メディウムIは、Wnt3AやActivinA等のサイトカインを含む。少なくともActivinAを含むことが好ましい。サイトカインの量は、例えば、Wnt3Aは10〜50ng/mL程度、好ましくは25ng/ml程度、ActivinAは10〜100ng/ml程度、好ましくは100ng/ml程度である。
【００４５】
分化誘導メディウムIは、無血清であり、例えばRPMI1640等の基本的な組成に、上述のサイトカインと血清代替品を添加して用いることができる。血清代替品としては、B27（登録商標）（Life Technologies社製）、KnockOut(登録商標）Serum Replacement(Life  Technologies社製）等が挙げられる。分化誘導メディウムIの具体的な構成例は、本願明細書の実施例の項に記載された組成のものである。B27 の組成は、G.J. Brewer et al. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented NeurobasalTM, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research 35567476 (1993)を参照することができる。
【００４６】
本工程は、iPS細胞を、分化誘導メディウムIを用いて、37℃、5% CO2インキュベータにて数日間培養することにより行われる。分化誘導工程１の培養期間は、具体的には4〜10日間であり、好ましくは6〜8日間であり、より好ましくは7日間である。分化誘導工程１は、形態的には内胚葉細胞の特徴を有するようになるまで行うことができる。
【００４７】
分化誘導工程２：
分化誘導工程２では、分化誘導工程１から得た細胞を、分化誘導メディウムIIで培養する。
【００４８】
分化誘導メディウムII：
この工程で用いられる分化誘導メディウムIIは、種々のサイトカイン、例えば、線維芽細胞増殖因子2（FGF2）、骨形成因子4（BMP4）、肝細胞増殖因子（HGF）を含む。サイトカインの量は、例えば、FGF2は5〜50ng/ml、BMP4は5〜50ng/ml、HGFは5〜50ng/mlであり、好ましくはFGF2は10ng/ml程度、BMP4は20ng/ml程度、HGFは20ng/ml程度である。分化誘導メディウムIIは、少なくとも骨形成タンパク質4（BMP4）及び線維芽細胞増殖因子2（FGF2）を含む。分化誘導メディウムIIも無血清とすることができ、例えばRPMI1640等の基本的な組成に、上述のサイトカインと血清代替品を添加して用いることができる。分化誘導メディウムIIの具体的な構成例は、本願明細書の実施例の項に記載された組成のものである。
【００４９】
本工程は、工程１で得られた細胞を、分化誘導メディウムIIを用いて、37℃、5% CO2インキュベータにて培養することにより実施できる。分化誘導工程２の培養期間は、具体的には1〜6日であり、好ましくは2〜5日であり、より好ましくは3〜4日である。
【００５０】
分化誘導工程３
本工程は、分化誘導工程２から得た細胞を、分化誘導メディウムIIIで培養して人工肝細胞を得る工程である。
【００５１】
分化誘導メディウムIII：
ここで用いるサイトカイン及びホルモンの例は、オンコスタチンM（OSM）やDexamethasone等である。用いる量は、例えば、OSMは10〜50ng/ml、Dexamethasoneは0.05〜0.5μMであり、好ましくはOSMは25ng/ml程度、Dexamethasoneは0.1μM程度である。分化誘導メディウムIIIは、少なくとも、肝細胞成長因子（HGF）、Oncostatin M、Dexamethasone、並びにN,N'-(methylenebis(4,1-phenylene))diacetamide（FH1）及び／又は2-(N-(5-chloro-2-methylphenyl)(methylsulfonamido)-N-(2,6-difluorophenyl)-acetamide（FPH1）を含む。分化誘導メディウムIIIの具体的な構成例は、本願明細書の実施例の項に記載された組成のものである。
【００５２】
FH1及びFPH1：
分化誘導メディウムIIIは、下式で表される、N,N'-(methylenebis(4,1-phenylene))diacetamide（FH1）及び／又は2-(N-(5-chloro-2-methylphenyl)(methylsulfonamido)-N-(2,6-difluorophenyl)-acetamide（FPH1）を含む。
【００５３】
【化１】
2018186932.tif 000003
【００５４】
【化２】
2018186932.tif 000004
【００５５】
好ましい態様においては、分化誘導メディウムIIIは、FH1及びFPH1を含む。
【００５６】
本工程は、分化誘導工程２で得られた細胞を、分化誘導メディウムIIIで、数日〜数週間程度培養することにより実施することができる。この培養期間においては、少なくとも３日に１回、好ましくは毎日の頻度で培地交換を行うことが好ましい。
【００５７】
その他の条件：
分化誘導工程１〜３はいずれも、血清及び／又は無フィーダー環境下で、好ましくは無血清かつ無フィーダー環境下で実施することができる。また必要に応じ、ＥＣＭをコートした培養器を用いて実施することができる。
【００５８】
肝細胞の確認：
肝実質細胞は、発生学的に、胚様体における心筋細胞の出現に続いて出現することが知られている。実験的に肝実質細胞は、胚様体から分化した心筋細胞近傍に発現が観察されることが知られている。
【００５９】
分化誘導工程１〜３を経た細胞の肝細胞への分化を確認する方法としては、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）胎児肝細胞、ａ１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）、トリプトファンオキシゲナーゼ（ＴＯ）、チロシンアミノトランスフェラーゼ、アシアログリコプロテインレセプター（ＡＳＧＲ）、アルブミンなどの肝細胞（胎児肝細胞）特異的マーカー遺伝子発現、若しくは肝細胞特異的マーカータンパク質の発現、又は抗アルブミン抗体による免疫染色などにより確認することができる。また、マウスの肝細胞においては、２核を有する細胞が多く確認されることから、細胞核を形態学的に確認することにより確認することができる。
好ましくは、上記の人工肝細胞の項で述べたように、網状構造体を構成可能であること、高いアンモニア代謝能を有することを指標とする。
【実施例】
【００６０】
<iPS細胞の作製>
［iPS細胞の作製］
下記の方法でiPS細胞を作製した。
1． POIETICS（登録商標） CORD BLOOD CD34+ Cells (Cat. No. 2C-101A)、POIETICS（登録商標） Mobilized CD34+ Cells (Cat. No. 2G-101B) を解凍する．
2． CytoTune（登録商標）-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kitを用い、キットに付属のプロトコールに従い、iPS細胞を作製する．
【００６１】
［iPS細胞の確認］
下記を行い、iPS細胞が得られたことを確認した。
【００６２】
免疫染色：
1． 253G1（理研より入手）及びCiPSをCytoSpin（登録商標）でスライドガラスに貼り付ける（800rpm, 5min）
2． 4%パラフォルムアルデヒド（ナカライテスク）で固定（15min, 室温）
3． PBSで3回洗浄
4． ブロッキング（0.3% TritonX-100, 1% BSA, 10% AB serum 又はBlockingOne-Histo（ナカライテスク））10〜20min, 室温
5． 0.1% Tween PBS処理 5min, 室温
6． R&D, Human Pluripotent stem cell 3 color Immunocytochemistry kit 各10倍希釈、3hr, 室温又はo/n, 4℃
7． PBSで洗浄
8． VECTA SHIELD（登録商標） Hard Set with DAPIで封入
9． オールインワン蛍光顕微鏡BZ-9000（KEYENCE）で観察
【００６３】
フローサイトメトリー：
1.  253G1（理研より）及びCiPSをAccutase処理37℃, 5minで剥離させ、回収
2.  SSEA-4 FITC, SSEA-3 PE, TRA-1-81 PE（各終濃度1μg/ml）抗体で染色（4℃, 30min）
3.  FACSCaliburで測定
4.  CellQuest或いはFlowJoで解析
【００６４】
形態観察：
後述の培養法において、定期的にオールインワン蛍光顕微鏡BZ-9000（KEYENCE）で観察
【００６５】
SeVベクター（CytoTune_iPS2.0）の脱落確認：
1.  12-well plateでiPS細胞を培養
2.  PBSで洗浄
3.  10% 中性ホルマリン 1ml/wellで固定（5min, 室温）
4.  PBSで洗浄
5.  Anti-Sev抗体（0.1% TritonX-100/PBSで1/500希釈）500μl添加
6.  37℃, 1h反応
7.  PBSで洗浄
8.  Dyelight550標識anti-rabbit IgG抗体（0.1% TritonX-100/PBSで1/500希釈）500μl添加
9.  37℃, 1h反応
10. PBSで洗浄
11. オールインワン蛍光顕微鏡BZ-9000（KEYENCE）で観察
【００６６】
結果：
免疫染色及びフローサイトメトリーの結果を図３に、定期的に細胞の形態を観察した結果を図４に、CiPS細胞からのrSeVベクターの脱落を確認した結果を図５に示した。CiPS細胞は、作製から拡大培養の全工程において、フィーダーレスであった。また、感染からおよそ３か月の継代で、sReVが脱落したCiPSを取得できた。
【００６７】
<CiPS-Hepを誘導するためのiPS細胞の準備>
下記の方法で、iPS由来高機能肝細胞（CiPS-Hep）を誘導するためのiPS細胞を準備した。なお、iPS細胞コロニー観察等、上記の作製されたiPS細胞の確認においては、本項に示した方法を実施した。
【００６８】
［ラミニンコートディッシュ作製］
1.  Laminin-51) (-80℃)を4℃で融解しておく．手で温めないように注意．
2.  6ウェルプレート2)にPBS3)を1ml/well入れ，全体に行き渡らせる．
3.  PBSの入った6ウェルプレートと200μlチップを4℃で冷やしておく．
4.  融解したLaminin-5をPBSの入ったウェルに回し入れ，素早く10回程度ゆらし，全体に行き渡らせる．Laminin-5は吸着性が非常に強いため，ピペッティングは絶対にしない．
5.  4℃で一晩，又は37℃で2時間以上インキュベートしてコーティングする．37℃で放置しないこと．
6.  すぐに使用しない場合はパラフィルムで2重にシールし，4℃で保存できる．（1週間）
【００６９】
［凍結細胞の解凍と培養］
1.  P２の遠心分離機を20℃に設定する．
2.  各種阻害剤（以下の工程9で使用の4種）を-30℃のフリーザーから出しておく．
3.  培養メディウムを調製する（以下ReproFF2と記載）．
【００７０】
【表１】
2018186932.tif 000005
【００７１】
4.  ReproFF2を15mlチューブ7)に，9ml及び4mlずつ分注し，37℃で温める．
5.  ラミニンコートディッシュをPBS(-)で2回すすぎ，1mlのPBS(-)をウェルに入れておく．
6.  凍結細胞を液体窒素から取り出し，37℃のウォーターバスに2min漬けて溶解する．凍結細胞の容量が少ない場合は，温めた培地を適量加え，優しくピペッティングすることにより素早く解凍させる．
7.  解凍した細胞を回収し培養メディウム9mlを入れた15mlチューブに移し，優しく転倒混和し混ぜる．
8.  遠心分離  条件：160g, 5min, R.T. アクセル有，ブレーキ有
9.  遠心中に培養メディウム＋各種阻害剤を4ml調製する．
【００７２】
【表２】
2018186932.tif 000006
【００７３】
10. 遠心後の15mlチューブを回収し,上清を慎重に除去する．
11. 阻害剤培養メディウムを1ml加え細胞ペレットをピペッティングにより優しくほぐす．
12. ラミニンコートディッシュのPBS(-)を除去し，細胞懸濁培養液をウェルに移す．残りの阻害剤培養メディウムで15mlチューブを洗い，ウェルへ移す．
13. ディッシュを揺らし，細胞を均一に広げ，37℃，5%CO2でインキュベートする．
14. 翌日，優しくウェル中の培地を混ぜた後，上清を除去する．
15. 再び培養メディウム＋各種阻害剤4mlを加え37℃，5％CO2で培養する．
【００７４】
［培地交換］
1.  培養上清を除去する
2.  新鮮な培養メディウムReproFF2を4ml/wellで加える．
3.  上記の操作を2〜3日おき（月，水，金）に行う．
【００７５】
［細胞の継代］
1.  ラミニンコートディッシュを作製する．
2.  培養上清を除去する．
3.  PBS(-) 1mlを加え細胞表面を洗浄する．
4.  PBS(-)を除去し，ESGRO Complete Accutase12)を1ml/wellで加え，37℃，5%CO2，5minインキュベートする．
5.  ウェル中の剥がれきれていない細胞をピペッティングによりはがし，細胞溶液を15mlチューブへ回収する．
6.  ウェルにReproFF2を1ml加え，ウェル内を洗浄し15mlチューブへ溶液を回収し，さらに15mlチューブへReproFF2をもう1ml加え，Total volumeを3mlにする．
7.  調整した細胞懸濁液をよく混和後，トリパンブルー染色液13)で2倍希釈しセルカウントを行う．
8.  継代するウェル数に応じて5x105cells/wellになるように細胞懸濁液を新たな15mlチューブへ分注する．必要に応じて残りの細胞は凍結保存する．
9.  遠心分離する．条件：160g, 5min, R.T. アクセル有，ブレーキ有
10. 遠心中に培養メディウム＋阻害剤を4ml/wellになるように調整する．
【００７６】
【表３】
2018186932.tif 000007
【００７７】
11. 遠心後上清を除去し，培養メディウム＋阻害剤を用いて細胞ペレットをピペッティングによりほぐし,各ラミニンコーティングウェルに播種する.
12. 培養プレートに日付，iPS細胞の名前，継代数を記載し37℃，5%CO2で培養する．
月→金→水→月の間隔で継代を続ける．
【００７８】
［細胞の凍結保存］
1.  細胞継代時と同様に細胞をはがし，カウントする．
2.  細胞懸濁液を遠心分離する．条件：160g, 5min, R.T. アクセル有，ブレーキ有
3.  凍結に用いるセラムチューブ14)に日付，細胞名，継代数をラベルする．
4.  遠心後，上清をしっかり除き，1x106 cells/500μlになるようにSTEM-CELLBANKER15)に細胞を懸濁させる．
5.  細胞懸濁液をラベリングしたセラムチューブに500μl/本ずつ分注していく．
6.  分注後，セラムチューブを-80℃のディープフリーザーに入れる．
7.  1〜3日後以内に凍結した細胞を-80℃から液体窒素細胞保存システムへ移動させ保管する．
【００７９】
<CiPS-Hepの誘導>
下記の方法で、CiPS細胞から高機能肝細胞（CiPS-Hep）を分化誘導した。
【００８０】
［Day1：iPS由来高機能肝細胞分化誘導step1；iPS由来高機能肝細胞分化誘導メディウムＩ（以下メディウムＩ）へメディウムチェンジ］
1.  メディウムＩを必要量（4ml/well）調製する．
【００８１】
【表４】
2018186932.tif 000008
【００８２】
2.  上清を除去し，無血清RPMI1640を1ml加え細胞表面を洗浄する．
3.  メディウムＩを4ml/wellになるように加える．
4.  Day6まで毎日上清を除去し，新鮮なメディウムＩを加える作業を行う．
【００８３】
［Day7：iPS由来高機能肝細胞分化誘導step2；iPS由来高機能肝細胞分化誘導メディウムII（以下メディウムII）へメディウムチェンジ］
1.  メディウムIIを必要量（4ml/well）調製する．
【００８４】
【表５】
2018186932.tif 000009
【００８５】
2.  優しく培養上清をピペッティングした後,上清を除去し，メディウムIIを4ml/wellになるように加える．
3.  Day9まで毎日上清を除去し，新鮮なメディウムIIを加える作業を行う．
【００８６】
［Day10：iPS由来高機能肝細胞分化誘導step3］
1.  培養プレートのマトリゲルコーティング
1.1. BD matrigel growth factor reduced20) 300μlを4℃で解凍する．
1.2. 24 well-plate dish21)，KnockOut-DMEM22)を4℃で冷やしておく．
1.3. マトリゲルが融解されたら，KnockOut-DMEMを等量加え，ピペッティングによりよく混和する．
1.4. マトリゲル希釈液を24 well-plate dishへ１wellあたり200μlずつ入れwell全体に行き渡らせる．
1.5. 24 well-plate dishを常温で3時間以上静置しコーティングする．
【００８７】
2.  iPS細胞由来高機能肝細胞の継代
2.1. iPS由来高機能肝細胞分化誘導メディウムIII（以下メディウムIII）を1ml/wellになるように調製する．
【００８８】
【表６】
2018186932.tif 000010
【００８９】
2.2. 培養上清を除去し，PBS(-)1mlで細胞表面を洗浄する．
2.3. ESGRO Complete Accutaseを1ml加え，37℃で5minインキュベートする．
2.4. 念入りにピペッティングして細胞をはがし，細胞溶液を15mlチューブへ回収する．
2.5. HCM 1mlでウェル内を洗浄し15mlチューブへ溶液を回収し，さらに15mlチューブへHCMをもう1ml加え，Total volumeを3mlにする．
2.6. 細胞懸濁液をよく混和し，トリパンブルー2倍希釈でセルカウントする．
2.7. 継代するウェル数に応じて1.0x106cells/wellになるように新たな１５mlチューブへ必要量を分注する．
2.8. 160g, 5min, R.T.で遠心分離する．
2.9. 遠心中にマトリゲルコーティングウェルにPBS(-)を1ml加え，洗浄し上清を除去する．この洗浄作業を2回繰り返し，ウェルにPBS(-)を1ml加える．
2.10.遠心後上清を除去し，Adhesion cultivationを行う場合にはマトリゲルコーティングウェルの上清も除去後，メディウムIIIを用いて細胞ペレットをピペッティングによりほぐし，マトリゲルコーティングウェルに播種する．
Floating cultivateonを行う場合には、メディウムIIIを用いて細胞ペレットをピペッティングによりほぐし，MPC treatment plate（MD6 with Lid Low-Cell Binding; Nalge Nunc International, Japan）に播種する．
HUVEC及びMSCをフィーダー細胞として用いる場合には、Adhesion cultivationとして適宜共培養を行う（後掲非特許文献１参照）．
2.11.培養プレートに日付，細胞の名前等記載し，37℃，5%CO2インキュベータ内で培養する．
2.12.Day17まで隔日で上清を除去し，新鮮なメディウムIIIを加える作業を行う．
【００９０】
［Day17：CiPS-Hep完成 → アンモニア代謝テスト］
1.  HBM（カクテル−）＋ アンモニア水（以下アンモニア培地）を1ml/well×2になるように調製する．
【００９１】
【表７】
2018186932.tif 000011
【００９２】
2.  培養上清を除去し，HBM 1mlで１回，アンモニアHBMで１回，細胞表面を洗浄する．
3.  上清を除去し，アンモニア培地を1ml/wellで加える．
4.  空きのウェルにアンモニア培地及びHBMを1mlずつ入れ，ポジコン及びネガコンとする．
5.  37℃，5%CO2で24hr培養する．
【００９３】
［Day18：アンモニア代謝テストサンプル回収］
1.  上清をエッペンチューブに回収し，500g，5min遠心分離する．
2.  上清を新しいエッペンチューブ3本に300μlずつ回収し，-80℃で凍結する．
3.  ウェルをPBSで洗浄し，トリプシンEDTA30) 1mlを加え，37℃で5minインキュベートする．
4.  念入りにピペッティングして細胞をはがし，細胞溶液をFACSチューブ31)に通す．
5.  HBM 1mlで洗浄し，Total volumeを2mlにする．
6.  トリパンブルーでカウントする．
【００９４】
<iPS−HEP細胞の確認>
下記を行い、iPS細胞が得られたことを確認した。
【００９５】
アンモニアテストワコー32)：
1.  上清を溶解させる．
2.  遠心 8000rpm 5min 4℃
3.  アンモニア希釈液を作製する．キット内の標準液及び標準希釈液は使用しない．HBM（無添加）960μlにアンモニウムイオン標準液 (1000mg/L) 40μlを添加し，ボルテックスし，標準液とする．
【００９６】
【表８】
2018186932.tif 000012
【００９７】
4.  サンプルの上清及びアンモニア希釈液それぞれ200μlを新しいエッペンに移す
5.  800μlの除タンパク液を加え，ボルテックスする．
6.  遠心 8000rpm 5min 4℃
7.  遠心中にマイクロプレートリーダー及びパソコンの電源を入れ，Tecan i-controlを選択しておく．
8.  上清を60μlずつ96well 平底プレートへ分注していく．Duplicate
9.  発色試液Aを60μlずつ各ウェルに加えていく．
10. 蓋を外してマイクロプレートリーダーにセットし，プレートを撹拌する．（Shakingをダブルクリック，10sec，Normalにセットし，Statをクリック）
11. 発色試液Bを30μlずつ各ウェルに加えていく．
12. マイクロプレートリーダーにセットし，プレートを撹拌する．
13. 発色試液Cを60μlずつ各ウェルに加えていく．なるべく速く．
14. マイクロプレートリーダーにセットし，プレートを撹拌する．
15. 37℃，CO2 5％インキュベータで20minインキュベートする.
16. 4℃で10min以上冷やし反応を止める．
17. プレートの底面をきれいに拭き，左上を合わせて，マイクロプレートリーダーにセットする．
18. 吸光度（620 or 630nm）を測定する．（MeasureのAbsorbanceをダブルクリック．620nm．Detailsで測定するwellを選択．Startをクリック）
【００９８】
RT-PCR：
1.  ISOGEN II（ニッポンジーン）を用い、付属のプロトコールに従い、RNA抽出
2.  ナノドロップ（登録商標）でRNA濃度測定
3.  PrimeScript High Fidelity RT-PCR kitでcDNAを合成
4.  Veriti 96-well Thermal Cycler（Applied Biosystems）でPCR実施
5.  プライマーセットは以下の通り
【００９９】
【表９】
2018186932.tif 000013
【０１００】
7.  RT-PCR産物を1% アガロースゲルで電気泳動
8.  Gel Redで染色し、観察
【０１０１】
結果：
得られたiPS-HEP細胞の写真を、図６に示した。得られた細胞は、特徴的な網状構造体を構成するものであった。空隙の直径は約300〜1000μmであり、網部分の幅は約20〜200μmであった。細胞1〜3個分の厚み約10〜60μmを有していた。
【０１０２】
得られたアンモニア代謝テスト及びRT-PCRの結果を図７〜１１に示した。iPS-HEP細胞は、培養条件によっては、初代肝細胞の代謝能（160〜200μg/dl/24h）と同程度のアンモニア代謝機能を有することが分かった。また、フィーダー細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)）、間葉系肝細胞（mesenchymal stem cells, MSCs））を用いるよりも化合物（FH1、FPH1）を用いたほうが、アンモニア代謝機能の増強効果が高かった。
【０１０３】
<実施例で用いた資材の一覧>
【０１０４】
【表１０】
2018186932.tif 000014
【０１０５】
＜実施例で引用した文献＞
非特許文献１：T. Takebe et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature 499, 481-484 (2013), doi:10.1038/nature12271, Published online  03 July 2013
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明により得られる体外型の人工肝臓は、肝移植術までの、又は自己肝の再生までの期間、肝臓の機能を補助するために用いられることが期待される。
【符号の説明】
【０１０７】
１  血漿成分入口ポート
２  血漿成分出口ポート
３  血漿成分循環室
４  肝細胞培養室
５  分離膜
６  分離膜サポート（分離膜の変形を抑制する手段）
７  モジュール蓋
８  モジュール本体
９  肝細胞
１０  患者
１１  血漿分離器
１２  人工肝臓
２０  循環回路１（患者側回路）
２１  循環回路２（人工肝臓側回路）
【配列表フリーテキスト】
【０１０８】
SEQ ID NO.:1 hALB For
SEQ ID NO.:2 hALB Rev
SEQ ID NO.:3 hHNF4a For
SEQ ID NO.:4 hHNF4a Rev
SEQ ID NO.:5 hOCT4 For
SEQ ID NO.:6 hOCT4 Rev
SEQ ID NO.:7 hCYP3A4 For
SEQ ID NO.:8 hCYP3A4 Rev
SEQ ID NO.:9 hβ-actin For
SEQ ID NO.:10 hβ-actin Rev
【図１】
2018186932.tif 000015
【図２】
2018186932.tif 000016
【図３】
2018186932.tif 000017
【図４】
2018186932.tif 000018
【図５】
2018186932.tif 000019
【図６】
2018186932.tif 000020
【図７】
2018186932.tif 000021
【図８】
2018186932.tif 000022
【図９】
2018186932.tif 000023
【図１０】
2018186932.tif 000024
【図１１】
2018186932.tif 000025
【配列表】
2018186932000001.app