(57)【要約】【課題】１種または複数の生物学的に活性な薬剤にコンジュゲートされたＰＡＭＡＭデンドリマーを含む組成物、ならびに網膜／脈絡膜および一般に、眼の炎症性疾患および／または血管形成疾患における活性化されたミクログリア／マクロファージを標的化するためのそれらの全身的な使用を提供すること。【解決手段】一局面において、デンドリマーナノ粒子を含む組成物が提供され、このデンドリマーナノ粒子は、眼における炎症性疾患を抑制または阻害するのに有効な量の同じまたは異なり得る少なくとも１種または複数の生物学的に活性な薬剤に共有結合した、大部分がヒドロキシル終端したポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への参照
本出願は、本明細書で十分に示されているように、すべての目的のために参照によって本明細書に組み込まれる、２０１４年４月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／９８６，４９５号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ミクログリアは、脳および網膜の常在性マクロファージである。これらは、細胞が死ぬ糖尿病および網膜変性などの疾患において活性化され、ミクログリアは、細胞デブリを貪食するようになる。網膜ミクログリアの活性化は、緑内障、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症および静脈分枝閉塞症を含む眼の炎症性疾患において生じるのと同様、虚血／再灌流傷害（Ｉ／Ｒ）のマウスモデルにおいて生じる。Ｉ／Ｒモデルにおける高い眼内圧またはＢＶＯにおける血栓による網膜血管閉塞は、眼内の血流の減少を引き起こし、網膜虚血を生じる。これは、ミクログリアのさらなる活性化を開始させるニューロンの死を引き起こす。
【０００３】
滲出型（ウェット型）ＡＭＤは、網膜色素上皮または神経感覚層の漿液性または出血性の分離を特徴とする。患者は、流体貯留、出血および／または脂質滲出として症状発現する脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を発生させ得る。
【０００４】
より早期段階の糖尿病性網膜症（ＤＲ）は、小血管瘤（毛細血管壁からの嚢状の膨出（ｏｕｔ−ｐｏｕｃｈｉｎｇ））、網膜内出血および綿花状白斑（神経線維層梗塞）を含む網膜血管異常を特徴とする。疾患が進行するにつれて、網膜血管の漸進的閉鎖は、網膜虚血を生じ、静脈異常（ビーズ形成（ｂｅａｄｉｎｇ）、ループ）、網膜内微小血管異常、ならびに増加する網膜出血および滲出を含む徴候を生じる。非増殖性糖尿病性網膜症は、上記病変の存在および程度に従って、軽度、中程度、重症および非常に重症と段階分けされる。
【０００５】
より進行した段階のＤＲには、乳頭（乳頭の血管新生、ＮＶＤ）または網膜中の他の場所（他所の血管新生、ＮＶＥ）のいずれかから広がる、網膜虚血によって誘導される新たな血管の形成が関与する。硝子体中に伸びる新たな血管は、硝子体出血、および付随する収縮性線維組織と関連する牽引性網膜剥離を引き起こし得る（新たな図１）。
【０００６】
デンドリマーは、それらの多数の官能基に起因して薬物および小分子治療を細胞内領域へ送達する潜在力を有する、一群のナノ構造化ポリマーである。Ｋａｎｎａｎらは、ウサギモデル脳性麻痺（ＣＰ）を処置することにおける、デンドリマーベースの治療の治療的有用性を示している。このウサギモデルは、ＣＰの間に成体脳において見られる神経炎症を再現する。
【０００７】
今日まで、ＤＲに対して長期的に利益になると決定的に実証された唯一の処置は、限局性レーザー凝固である。
【０００８】
ＡＭＤを有する患者のための標準的な処置は、眼中への抗ＶＥＧＦの硝子体内注射であり、抗ＶＥＧＦ治療が糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）において有用であり得ることを示した研究が存在している。しかし、虚血性網膜症またはＡＭＤに対して利用可能な全身処置は現時点では存在しないので、全身送達は、現行の処置を超える多くの利点を有する。これらの利点には、ミクログリア中での保持に起因する低頻度の注射、および現行の抗ＶＥＧＦ治療における、または腐食性もしくは非腐食性徐放性デバイスからの薬物または薬物放出インプラントの頻繁な眼内注射を回避する、全身送達する能力が含まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
現在、ＡＭＤまたはＤＲに対する標的化治療は存在しない。活性化されたミクログリア／マクロファージを全身投与から標的化することは、薬物の効力を増加させ得、副作用を低減させ得る。
【００１０】
一実施形態によれば、本発明者らは、虚血性網膜における網膜中の活性化されたミクログリアを標的化する、全身送達されたデンドリマーの能力を調査した。ミクログリア活性化は、虚血／再灌流傷害によって誘導した。正常網膜と虚血性網膜との間のデンドリマーの示差的取込みを比較した。
【００１１】
本発明者らは、驚くべきことに、ＰＡＭＡＭデンドリマーが、網膜神経炎症における１つの重要な細胞型、活性化されたミクログリア／マクロファージ（ｍｉ／ｍａ）を標的化できることを見出した。デンドリマーが静脈内送達されても硝子体内送達されても、活性化されたミクログリア／マクロファージ（ｍｉ／ｍａ）による保持が生じた。さらに、ミクログリアおよび網膜色素上皮細胞は、デンドリマーを保持したが、眼および他の臓器中の他の細胞型は、デンドリマーを取り込まなかった。デンドリマーは、長期間、この研究において評価した最も長い時点である２１日間にわたって、ｍｉ／ｍａ中に残存した。
【００１２】
この実施形態に従って、本発明者らはまた、デンドリマーを、網膜血管新生（ＲＮＶ）および脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）が網膜下脂質注射によって誘導された動物中に全身（静脈内）投与した。正常な網膜および脈絡膜と脂質注射した網膜および脈絡膜との間での、デンドリマーの示差的取込みを比較した。
【００１３】
本発明者らは、全身投与されたデンドリマーが、ＲＮＶのエリア中の活性化されたミクログリア／マクロファージ中に、およびＣＮＶのエリア中のマクロファージ中に選択的に局在したが、片割れの未傷害の眼中には存在しなかったことを見出した。
【００１４】
一実施形態によれば、本発明は、眼における炎症性疾患および／または血管形成疾患を抑制または阻害するのに有効な量で、デンドリマーナノ粒子を含む組成物を被験体に全身投与するステップを含む、被験体の眼における炎症性疾患および／または血管形成疾患を処置するための方法を提供し、このデンドリマーナノ粒子は、少なくとも１つの生物学的に活性な薬剤に共有結合した、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）のヒドロキシル終端したデンドリマーを含む。
【００１５】
本発明は、活性な生物学的薬剤を保有するデンドリマーの全身投与による、網膜および脈絡膜の血管新生を処置するための方法を提供する。
【００１６】
別の実施形態によれば、本発明は、眼における炎症性疾患および／または血管形成疾患を抑制または阻害するのに有効な量で、デンドリマーナノ粒子を含む組成物を被験体に周期的に静脈内投与するステップを含む、被験体の眼における炎症性疾患および／または血管形成疾患を処置するための方法を提供し、このデンドリマーナノ粒子は、生物学的に活性な薬剤に共有結合した、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）のヒドロキシル終端したデンドリマーを含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
デンドリマーナノ粒子を含む組成物であって、前記デンドリマーナノ粒子は、眼における炎症性疾患を抑制または阻害するのに有効な量の同じまたは異なり得る少なくとも１種または複数の生物学的に活性な薬剤に共有結合した、大部分がヒドロキシル終端したポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーを含む、組成物。
（項目２）
前記少なくとも１種または複数の生物学的に活性な薬剤が、酵素、受容体アンタゴニストまたはアゴニスト、ホルモン、増殖因子、抗体、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータ−カロテン、検出可能な部分および小分子からなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記小分子が、抗炎症剤、例えば、トリアムシノロンアセトニド（ＴＡ）、メチルプレドニゾン、デキサメタゾンを含むステロイド、ＣＯＸ−２阻害剤を含む非ステロイド性抗炎症剤、コルチコステロイド抗炎症剤、金化合物抗炎症剤、免疫抑制性抗炎症剤、サリチレート抗炎症剤、例えば、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、ＴＡ、ミノサイクリン、アフリベルセプト、およびラパマイシン、ならびにラニビズマブ、ベバシズマブを含む抗ＶＥＧＦ剤からなる群より選択される、項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記眼の炎症性疾患が、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜色素変性、視神経炎、感染症、ぶどう膜炎、サルコイド、鎌状赤血球症、網膜剥離、側頭動脈炎、網膜虚血、動脈硬化性網膜症、高血圧性網膜症、網膜動脈遮断、網膜静脈遮断、低血圧、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫および脈絡膜血管新生からなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記デンドリマーナノ粒子が、リポソーム、マイクロカプセル、ナノ粒子およびナノカプセルのうち１種または複数を含む製剤中に含まれる、項目１に記載の組成物。
（項目６）
前記ＰＡＭＡＭデンドリマーが、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７、ＧＢ、Ｇ９またはＧ１０  ＰＡＭＡＭデンドリマーである、項目１に記載の組成物。
（項目７）
被験体の眼における炎症性疾患を抑制または阻害するのに有効な量で、前記被験体に全身投与するステップを含む、前記被験体の眼における炎症性疾患および／または血管形成疾患を処置するための、項目１から６のいずれかに記載の組成物の使用。
（項目８）
前記眼の炎症性疾患が、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜色素変性、視神経炎、感染症、ぶどう膜炎、サルコイド、鎌状赤血球症、網膜剥離、側頭動脈炎、網膜虚血、動脈硬化性網膜症、高血圧性網膜症、網膜動脈遮断、網膜静脈遮断、低血圧、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫および脈絡膜血管新生からなる群より選択される、項目７に記載の使用。
（項目９）
前記組成物が、１日１回、１週間に１回、２週間に１回、１カ月に１回および２カ月に１回からなる群より選択される時間周期で前記被験体に投与される、項目８に記載の使用。
（項目１０）
項目１から６のいずれかに記載の組成物が、少なくとも１種または複数のさらなる生物学的に活性な薬剤と併せて投与される、項目７に記載の使用。
（項目１１）
前記少なくとも１種または複数のさらなる生物学的に活性な薬剤が、酵素、受容体アンタゴニストまたはアゴニスト、ホルモン、増殖因子、抗体、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータ−カロテン、検出可能な部分および小分子からなる群より選択される、項目１０に記載の使用。
（項目１２）
前記小分子が、抗炎症剤、例えば、メチルプレドニゾン、デキサメタゾンを含むステロイド、ＣＯＸ−２阻害剤を含む非ステロイド性抗炎症剤、コルチコステロイド抗炎症剤、金化合物抗炎症剤、免疫抑制性抗炎症剤、サリチレート抗炎症剤、例えば、ＮＡＣ、ＴＡ、ミノサイクリン、アフリベルセプト、およびラパマイシン、ならびにラニビズマブ、ベバシズマブを含む抗ＶＥＧＦ剤からなる群より選択される、項目１１に記載の使用。
（項目１３）
前記抗体が、ダクリズマブ、バシリキシマブ、ラニビズマブおよびペガプタニブナトリウムからなる群より選択される、項目１１に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＡＭＤの病因、およびＮ−アセチル−システイン（ＮＡＣ）が、どのようにして複数の経路を減弱できるマルチモーダル薬物であるかを示す模式図である。
【００１８】
【図２】図２Ａ〜２Ｌは、硝子体内注射の２４時間後の対照非Ｉ／Ｒ眼由来の切片を示す図である。２Ａ〜Ｄ：Ｄ−Ｃｙ５の注射の２４時間後、網膜中に保持されたデンドリマーは存在しない。２Ｅ〜Ｈ：遊離Ｃｙ５は、網膜内層（ｉｎｎｅｒ  ｒｅｔｉｎａ）の至る所に、および内網状層（ＩＰＬ）中に存在した。矢頭は、内境界膜（ＩＬＭ）を示す。２Ｉ〜Ｌ：ＰＢＳの注射は、Ｃｙ５波長における蛍光を生じなかった。［ＤＡＰＩ核マーカー（青色）。デンドリマー−Ｃｙ５およびＣｙ５（赤色）。Ｉｂａ−１ミクログリア細胞マーカー（緑色）。バー＝４０μｍ］。
【００１９】
【図３】図３Ａ〜３Ｌは、硝子体内注射の２４時間後の虚血／再灌流眼由来の切片を示す図である。３Ａ〜Ｄ。デンドリマー−Ｃｙ５（赤色）は、Ｉｂａ−１＋ミクログリア／マクロファージ（矢印）中に存在する。アスタリスク付きの矢印は、挿入図中に示されるデンドリマーを有する網膜Ｉｂａ１＋細胞を示す。３Ｅ〜Ｈ。より高い拡大率の、Ｉｂａ−１＋ミクログリアにおけるＤ−Ｃｙ５（赤色）。アスタリスク付きの矢印は、挿入図中に示されるデンドリマーを有する網膜下Ｉｂａ１＋細胞を示す。３Ｉ〜Ｌ。Ｃｙ５または遊離色素は、網膜内層の至る所にあり、Ｉｂａ−１＋ミクログリア（矢頭）とは関連しない。［ＤＡＰＩ（青色）、Ｉｂａ−１（緑色）、Ｄ−Ｃｙ５およびＣｙ５（赤色）；ＮＦＬ＝神経線維層、ＩＮＬ＝内顆粒層、ＯＮＬ＝外顆粒層；３Ａ〜Ｄおよび３Ｉ〜Ｌ  バー＝４０μｍ、３Ｅ〜Ｈ  バー＝２０μｍ］。
【００２０】
【図４】図４Ａ〜４Ｌは、硝子体内注射の７２時間後を示す図である。４Ａ〜Ｄ。Ｄ−Ｃｙ５は、Ｉ／Ｒ眼においてミクログリア（矢印）およびＲＰＥ細胞（左側、線状の蛍光）中になおも存在する。アスタリスク付きの矢印は、挿入図中に示されるデンドリマーを有する網膜内層中のＩｂａ１＋細胞を示す。４Ｅ〜Ｈ。より高い拡大率の、ミクログリア／マクロファージ（矢印）におけるＤ−Ｃｙ５。アスタリスク付きの矢印は、挿入図中に示されるデンドリマーを有する網膜下Ｉｂａ１＋細胞を示す。４Ｉ〜Ｌ。Ｄ−Ｃｙ５は、非Ｉ／Ｒ対照眼中には存在しなかった。［ＤＡＰＩ（青色）、Ｄ−Ｃｙ５（赤色）、ＮＦＬ＝神経線維層、ＩＮＬ＝内顆粒層、ＯＮＬ＝外顆粒層；４Ａ〜Ｄおよび３Ｉ〜Ｌ  バー＝４０μｍ、４Ｅ〜Ｈ  バー＝２０μｍ］。
【００２１】
【図５】図５Ａ〜５Ｌは、硝子体内注射の２１日後を示す図である。５Ａ〜Ｄ。Ｄ−Ｃｙ５は、Ｉ／Ｒ眼においてＩｂａ−１＋細胞中に残存する（矢印）。一部は網膜下マクロファージのようである（左矢印）。アスタリスク付きの矢印は、挿入図中に示されるデンドリマーを有する網膜下Ｉｂａ１＋細胞を示す。５Ｅ〜Ｈ。より高い拡大率での、Ｉ／Ｒ後のＤ−Ｃｙ５注射した眼の網膜。アスタリスク付きの矢印は、挿入図中に示されるデンドリマーを有する網膜内層中のＩｂａ１＋細胞を示す。５Ｉ〜Ｌ、Ｄ−Ｃｙ５波長の蛍光は、ＰＢＳを受けている非Ｉ／Ｒ眼には存在しない（蛍光対照）。［ＤＡＰＩ（青色）、Ｄ−Ｃｙ５およびＣｙ５（赤色）、Ｉｂａ−１（緑色）；５Ａ〜Ｄおよび５Ｉ〜Ｌ  バー＝４０μｍ、５Ｅ〜Ｈ  バー＝２０μｍ］。
【００２２】
【図６】図６Ａ〜６Ｐは、静脈内注射の２４時間後のＩ／Ｒ眼由来の網膜の切片を示す図である。６Ａ〜Ｈ。Ｄ−Ｃｙ５は、網膜中の標識された細胞中のＩｂａ−１（緑色）と共局在し、ＲＰＥ細胞中にも存在するようである（左下）。アスタリスク付きの矢印は、挿入図中に示されるデンドリマーを有する網膜下Ｉｂａ１＋細胞を示す。６Ｅ〜Ｈ。より高い拡大率の、６Ａ〜Ｄと同じエリア。５Ｉ〜Ｌ。遊離Ｃｙ５色素は、２４時間後に脈絡膜中になおも存在する。６Ｍ〜Ｐ。ＰＢＳを静脈内で受けている眼には、Ｃｙ５波長における蛍光は存在しない。［ＤＡＰＩ（青色）、Ｄ−Ｃｙ５およびＣｙ５（赤色）、Ｉｂａ−１（緑色）；６Ａ〜Ｄおよび６Ｉ〜Ｌ  バー＝４０μｍ、６Ｅ〜Ｈ  バー＝２０μｍ］。
【００２３】
【図７】図７Ａ〜７Ｌは、静脈内Ｄ−Ｃｙ５投与の７２時間後の網膜の切片を示す図である。７Ａ〜Ｄ。Ｉ／Ｒ網膜中には多くのＩｂａ−１＋細胞が存在し、この視野中のいくつかは、共局在したＤ−Ｃｙ５を有する。７Ｅ〜Ｈ。共局在（黄色）は、より高い拡大率で示される。７Ｉ〜Ｌ、非Ｉ／Ｒ対照眼中には、Ｄ−Ｃｙ５を有する細胞は存在しない。［ＤＡＰＩ（青色）。Ｄ−Ｃｙ５およびＣｙ５（赤色）。Ｉｂａ−１（緑色）；７Ａ〜Ｄおよび７Ｉ〜Ｌ  バー＝４０μｍ、７Ｅ〜Ｈ  バー＝２０μｍ］。
【００２４】
【図８】図８Ａ〜８Ｌは、Ｄ−Ｃｙ５注射の２１日後の網膜および脈絡膜の切片を示す図である。８Ａ〜Ｄ。Ｉ／Ｒ網膜は、Ｉｂａ−１＋細胞と共局在したＣｙ−５をなおも有する（矢印）。８Ｅ〜Ｈ。分枝型Ｉｂａ−１＋細胞中の、より高い拡大率で示された、Ｉｂａ−１とのＤ−Ｃｙ５の共局在。８Ｉ〜Ｌ。非Ｉ／Ｒ対照眼へのＤ−Ｃｙ５投与。８Ａ〜Ｈの矢印は、Ｄ−Ｃｙ５（赤色）およびＩｂａ−１標識された細胞（緑色）の共局在を示す。［ＤＡＰＩ（青色）、Ｄ−Ｃｙ５およびＣｙ５（赤色）；８Ａ〜Ｄおよび８Ｉ〜Ｌ  バー＝４０μｍ、８Ｅ〜Ｈ  バー＝１５μｍ］。
【００２５】
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、網膜中のＩｂａ−１＋細胞の定量化を示す図である。Ｉｍａｒｉｓソフトウェアを、鋸状縁から鋸状縁までの網膜の切片中のＩｂａ−１＋細胞を計数するように訓練した。９Ａ。Ｉ／Ｒ網膜では、Ｉｂａ−１＋細胞の数における有意な増加が存在した（ｐ＜０．０１）。９Ｂ。このソフトウェアを、この３−Ｄ表面体積中にＩｂａ−１標識のみ（黄色矢印）またはＩｂａ−１およびＤ−Ｃｙ５（白色矢印）の両方を有した、突起ではなく細胞の細胞体のみを選択するように訓練した。ミクログリア／マクロファージ（緑色）の総数およびＤ−Ｃｙ５を有するものが、Ｉ／Ｒ眼への硝子体内（９Ｃ）および静脈内（９Ｄ）投与後の３つ全ての時点で示される。これらの値は、網膜中の細胞がＤ−Ｃｙ５を有さなかった非Ｉ／Ｒ網膜中よりも、有意に大きい。
【００２６】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、組織からのＤ−Ｃｙ５の抽出後の、蛍光分光法による後眼杯（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｅｙｅ  ｃｕｐ）におけるＤ−Ｃｙ５レベルの定量化を示す図である。１０Ａ）２０μｇのＤ−Ｃｙ５の単回硝子体内注射の際のデンドリマーレベルは、非Ｉ／Ｒ眼とＩ／Ｒ眼との間で有意差を示す。１０Ｂ）６００μｇの単回静脈内注射の際のＤ−Ｃｙ５レベル；１０Ｃ）硝子体内経路および静脈内（３０×高い用量）経路の両方におけるＩ／Ｒ眼におけるデンドリマーレベルの比較は、比較可能である（ｎ＝８、スチューデントｔ検定）。定量化のために、後眼杯を、ホモジナイズし凍結乾燥させ、デンドリマーを、小体積のメタノール中に抽出した。蛍光を、以前に確立されたプロトコールを、適切なＤ−Ｃｙ５較正および対照と共に使用して測定した。Ｄ−Ｃｙ５は、健康な眼では検出限界近傍（ＮＤＬ）であった（３日および２１日）（＊は、Ｉ／Ｒを非Ｉ／Ｒと比較したときの、ｐ＜０．０１を示す）。
【００２７】
【図１１】図１１は、Ｄ−ＴＡコンジュゲートおよびＣｙ５−Ｄ−ＴＡコンジュゲートの合成を示す図である。
【００２８】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃ（新）は、１２Ａ）Ｄ−ＴＡコンジュゲートおよび１２Ｂ）Ｃｙ５−Ｄ−ＴＡコンジュゲートの純度を示すクロマトグラムを示す図である。１２Ｃ）は、コンジュゲートのサイズ、ゼータ電位および分子量を示す図である。
【００２９】
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂ（新）は、１３Ａ）Ｄ−ＴＡコンジュゲートおよび１３Ｂ）Ｃｙ５−Ｄ−ＴＡコンジュゲートのＮＭＲ特徴付けを示す図である。
【００３０】
【図１４】図１４は、シミュレートされた硝子体液モデルにおけるＤ−ＴＡからのＴＡのｉｎ−ｖｉｔｒｏ放出を示す図である。
【００３１】
【図１５】図１５は、種々の臓器におけるＤ−Ｃｙ５の生体内分布および経時的クリアランスを示す図である。臓器取込みを、Ｄ−Ｃｙ５蛍光測定値を使用して、適切な較正曲線に対して定量化した（ｎ＝８）（＊は、２４時間を７２時間と比較したときの、ｐ＜０．０１を示す；＃は、ｐ＜０．０５を示す）。
【００３２】
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｂは、合成された二官能性デンドリマーのゲル浸透クロマトグラフを示す図である。１６Ａは、Ｇ４−ＯＨデンドリマーの溶出時間（溶出時間１４．４２分）とは異なる、カラムからの１４．８４分の溶出時間を示す。これは、新たな化合物の形成を示し、溶出時間における軽微なシフトのみが存在することを示し、これは、Ｇ４−ＯＨデンドリマーの構造的特性が顕著には変化していないことを示している。Ｃｙ５ピーク（２０．３９分）１６Ｂとは異なる、６４７ｎｍ（Ｃｙ５についてのＵＶ  λｍａｘ）および６４５ｎｍ（Ｃｙ５の蛍光発光）における、１６．６９分の同時の新たなピークの出現は、デンドリマーへの色素の首尾よいコンジュゲーションを確認する。
【００３３】
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｌは、静脈内注射の２４時間後の非虚血／再灌流眼由来の切片を示す図である。１７Ａ〜Ｄ。デンドリマー−Ｃｙ５（赤色）は、脈絡膜中のＩｂａ−１＋ミクログリア（矢印）中に存在する。挿入図：より高い拡大率の、Ｉｂａ−１＋ミクログリアにおけるＤ−Ｃｙ５（赤色）。１７Ｅ〜Ｈ。遊離Ｃｙ５は、脈絡膜（アスタリスク）の至る所に存在し、Ｉｂａ−１＋ミクログリア（矢印）とは関連しない。１７Ｉ〜Ｌ。ＰＢＳを静脈内投与する場合、眼中にはＣｙ５波長の蛍光は存在しない（陰性対照）。［ＤＡＰＩ（青色）、Ｉｂａ−１（緑色）、Ｄ−Ｃｙ５およびＣｙ５（赤色）；ＮＦＬ＝神経線維層、ＩＮＬ＝内顆粒層、ＯＮＬ＝外顆粒層；１７Ａ〜Ｄおよび１７Ｉ〜Ｌ  バー＝４０μｍ、１７Ｅ〜Ｈ  バー＝２０μｍ］。
【００３４】
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｉは、共焦点顕微鏡法を使用した、時間の関数としての腎臓におけるＤ−Ｃｙ５レベルの定性的評価を示す図である。１８Ａ〜Ｃ。（上パネル）それぞれ静脈内Ｄ−Ｃｙ５注射の２４時間後、７２時間後および２１日後における腎臓の断面。静脈内注射の際のＤ−Ｃｙ５（赤色）は、体循環から迅速に除去され、腎皮質の近位尿細管（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｔｕｂｕｌｅ）中に大部分が蓄積されることが見出され、後の時点（７２時間および２１日）において排泄された。下は、腎皮質からの蛍光シグナルがインタクトなＤ−Ｃｙ５からのものであることを証明する、腎臓抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムであり（保持時間１４．９２分に基づく）、時間が増加するほどピークシグナルは減少し、これは尿を介したＤ−Ｃｙ５排泄を示し、共焦点画像と良好に一致している。
【００３５】
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｂは、後眼杯におけるデンドリマーの半定量化を示すグラフを示す図である。Ｄ−Ｃｙ５を、静脈内（１９Ａ）または硝子体内（１９Ｂ）のいずれかで投与し、２４時間、７２時間、２１日における傷害された（Ｉ／Ｒ）眼および健康な（非Ｉ／Ｒ）眼の両方において定量化した。傷害された眼と傷害されていない眼との間で、取込みにおいて有意差が見られる。
【００３６】
【図２０】図２０は、ＣＮＶのラットモデルおよび処置プロトコールの実例を示す図である。
【００３７】
【図２１】図２１は、ＣＮＶが、異常な血管の発生（血管新生）を引き起こす脂質注射に起因して発生した（イソレクチン、青色パネル）、脈絡膜フラットマウントを示す図である。ミクログリア／マクロファージ（Ｉｂａ−１、緑色パネル）の蓄積、およびＣＮＶエリア中のミクログリア／マクロファージ中に局在したデンドリマー（Ｄ−Ｃｙ５、赤色パネル）。全てのチャネルが、共局在を示すためにオーバーレイされる（マージ）。
【００３８】
【図２２】図２２は、脂質注射されたラットモデルにおける非処置脈絡膜およびＤ−ＮＡＣ処置脈絡膜における平均ＣＮＶ面積を示すグラフを示す図である。非処置動物群と比較して、Ｄ−ＮＡＣ処置動物において、ＣＮＶ面積における約８０％の有意な低減が存在する。このデータを、両側スチューデントｔ検定を使用して統計的に分析し、Ｗｅｌｃｈ補正は、試料サイズｎ＝６についてｐ＝０．０００３で有意な結果を生じた。
【００３９】
【図２３】図２３は、脂質の網膜下注射によって引き起こされた網膜炎症および血管新生を示す図である。白色の丸で示されるイソレクチンによって染色された蛇行状の異常な血管を示す、網膜において形成された網膜血管新生（ＲＮＶ）（青色パネル）。Ｉｂａ−１によって染色された炎症性ミクログリア細胞の遊走および蓄積（緑色パネル）、ならびにミクログリア細胞におけるＤ−Ｃｙ５の共局在（Ｄ−Ｃｙ５、赤色パネル）。マージされたパネルは、炎症および血管新生、ならびに白色矢印によって示される炎症細胞中の特異的なデンドリマーの共局在の組み合わされた効果を示す（マージ）。
【００４０】
【図２４】図２４は、デンドリマー（赤色）が炎症エリアにおいて蓄積され、ミクログリア細胞によって取り込まれることを示す、網膜フラットマウントにおけるＲＮＶエリアを示す図である。本発明者らは、白色矢印によって示される、傷害された（炎症）エリアに向かう網膜ミクログリアの遊走もまた観察した。（青色−イソレクチン）血管、（緑色、Ｉｂａ−１）ミクログリア／マクロファージおよび（赤色または桃色）Ｄ−ｃｙ５。
【００４１】
【図２５】図２５Ａ〜２５Ｂは、確立された脈絡膜フラットマウントプロトコールを使用して盲検様式で評価した、ＣＮＶに対する全身性遊離ＮＡＣ、Ｄ−ＮＡＣ（ＮＡＣ基準で２０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳの効果を示す図である。Ｄ−ＮＡＣ処置した動物は、ＰＢＳと比較した場合、ＣＮＶ面積における有意な減少を示した。遊離ＮＡＣは、有意ではないいくらかの減少を示した。ＣＮＶ面積を、Ｉｍａｇｅ−Ｊソフトウェアにおいて形態計測分析を使用して評価した（黄色の描写）。パネルＡは、小疱（ｂｌｅｂ）エリアにおけるより大きいＣＮＶおよびマクロファージの増加した集団（緑色）を有するＰＢＳ脈絡膜を示し、パネルＢは、ＣＮＶおよびマクロファージ蓄積が低減された、Ｄ−ＮＡＣの効力を示す。脈管構造を、ＧＳＡレクチンで染色し（青色）、マクロファージをＩＢＡ−１で染色する（緑色）。値は、ｎ＝１２およびＰ＜０．００１で、マン・ホイットニーのｔ検定を使用して分析した。
【００４２】
【図２６】図２６は、ＣＮＶを取り囲む小疱エリアにおけるマクロファージ蓄積についての、脈絡膜の（２０×の拡大率）のフラットマウント画像分析を示す図である。マクロファージを、ＩＢＡ−１で染色し（緑色）、Ｄ−Ｃｙ５は赤色である。マクロファージ細胞計数分析は、ＰＢＳ処置と比較した、Ｄ−ＮＡＣ処置の際の、マクロファージ細胞の数における約６３％の低減、および活性化されたマクロファージにおける約６０％の低減を示し、活性化されたマクロファージとデンドリマーとのほぼ９０％＋の共局在を示した。細胞計数分析を、スプリット機能と共に、平滑化因数および８〜１２μｍ直径の細胞サイズ閾値を用いて、サーフェス機能を使用してＩｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）ソフトウェアを使用して実施した。活性化されたマクロファージおよび休止マクロファージを、閾値として０．７５８の球形度に楕円率関数０．２９８を加えて、細胞表面対体積比を使用して、細胞形状（アメーバ様対分枝型）に基づいて計数した。Ｄ−Ｃｙ５の共局在を、スポット機能を使用して評価した。各群についてＮ＝６の眼、３エリア／脈絡膜を分析し、平均した。
【００４３】
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｃは、異なる群由来の脈絡膜をＥＬＩＳＡを使用して分析したことを示す図である（ｎ＝８脈絡膜／群）。遊離ＮＡＣは、対照と比較して有効でなかったが、Ｄ−ＮＡＣは、炎症促進性サイトカインの有意な減弱を示した（２７ＡおよびＢ）。＊＊＊は、ｐ＜０．００１を示す。Ｄ−ＮＡＣは、抗炎症性ＩＬ−１０もまた増強した（２７Ｃ）。＊は、ｐ＜０．０１を示す。
【００４４】
【図２８】図２８Ａ〜２８Ｃは、ＧＳＡ染色された血管、ｍｉ／ｍａについてのＩＢＡ−１、およびデンドリマー（Ｄ−Ｃｙ５）を用いた、フラットマウント網膜（４０×の拡大率）を示す図である。２８Ａ）通常の血管構造および休止ｍｉ／ｍａ（分枝型）（白色矢印）を有し、Ｄ−Ｃｙ５なしの、同じ網膜の「健康な」非病理的エリア；２８Ｂ）異常な血管、活性化されたｍｉ／ｍａ（「円形」およびアメーバ様）および活性化されたｍｉ／ｍａ中に共局在した「スパイク型」デンドリマー（白色矢印）を示す、小疱近傍の同じ網膜の病理学的エリア；２８Ｃ）ミクログリア活性化を静めることにおけるＤ−ＮＡＣの治療効果を示唆する、両方の集団（ｉ）休止ミクログリア（分枝型）（黄色矢印）および（ｉｉ）デンドリマーを有する活性化されたｍｉ／ｍａ（アメーバ様）（白色矢印）を示す、Ｄ−ＮＡＣ処置した網膜。
【００４５】
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｂ。２９Ａ）は、ＰＢＳおよびＤ−ＮＡＣ処置についての、網膜における網膜ミクログリア計数を示す棒グラフを示す図である。Ｄ−ＮＡＣ処置は、活性化されたミクログリア表現型を逆転させる。２９Ｂ）は、ＰＢＳおよびＤ−ＮＡＣ処置したミクログリアの３−Ｄの代表的画像を示す図である。
【００４６】
【図３０】図３０Ａ〜３０Ｃは、ＥＬＩＳＡによって分析した、異なる群由来の網膜からの結果を示す図である（ｎ＝８／群）。遊離ＮＡＣは、ＰＢＳと比較して有効でなかったが、Ｄ−ＮＡＣは、炎症促進性サイトカインの有意な減弱を示した。Ｄ−ＮＡＣは、抗炎症性（ＩＬ−１０）もまた増強した。＊＊＊は、ｐ＜０．００１を示す。
【００４７】
【図３１】図３１Ａ〜３１Ｂは、ＣＮＶ抑制に対するＴＡの効果を示す図である。３１Ａは、ＣＮＶが、異常な血管の発生を引き起こす脂質注射（ＨｐＯＤＥ）に起因して発生し（３１Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）、次いで、Ｄ−ＴＡで処置された（３１Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）、脈絡膜フラットマウントを示す。３１Ｂは、ＨｐＯＤＥ、Ｄ−ＴＡまたは遊離ＴＡ（Ｆ−ＴＡ）のＣＮＶ面積（ｍｍ２）の測定値を示す棒グラフである。ＣＮＶの低減の約９５％は、二重の抗炎症および抗血管形成効果に帰せられ得る。
【００４８】
【図３２】図３２は、Ｄ−ＮＡＣ＋Ｄ−ＴＡ処置した脈絡膜の予備的ＣＮＶ面積分析を示す図である。２１日目に、ＰＢＳ処置した脈絡膜は、１１日目に処置したＤ−ＮＡＣ脈絡膜と比較して、完全に形成された変則的な血管を有する、有意により大きいＣＮＶ面積を示し、これは、後期ＡＭＤに対する有効性を示唆している。２１日目に、（１１日目に）Ｄ−ＮＡＣ処置した脈絡膜は、１０日目のＰＢＳ脈絡膜と比較して、より低いＣＮＶ面積を示し、これは退縮を示唆している。
【００４９】
【図３３】図３３Ａ〜３３Ｃは、ＰＢＳ−２１日目（３３Ａ）およびＰＢＳ−１０日目（３３Ｂ）およびＤ−ＮＡＣ＋Ｄ−ＴＡ−２１日目（３３Ｃ）のＣＮＶを示す代表的画像（右）を示す図である。＊＊は、ｐ＜０．０１を示す。１００μｍにおけるスケールバー。
【００５０】
【図３４】図３４Ａ〜３４Ｃは、デンドリマーが、全身経路、および３０倍高い全身用量において匹敵する硝子体内経路の両方の際に、網膜ミクログリア／マクロファージを標的化することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
１または複数の実施形態に従って、本発明は、網膜神経炎症における１つの重要な細胞型、活性化されたミクログリアを、静脈内の全身注射を介して標的化する、ＰＡＭＡＭデンドリマーの能力を開示する。驚くべきことに、活性化されたミクログリアによる保持は、硝子体内注射と比較した場合、このデンドリマーを静脈内送達しても生じた。さらに、ミクログリアはデンドリマーを保持したが、他の細胞型はデンドリマーを取り込まなかった。デンドリマーは、長期間、この研究において評価した最も長い時点である２１日間にわたって、ミクログリア中に残存した。活性化されたミクログリア／マクロファージは、炎症性網膜疾患および／または血管形成網膜疾患、例えば、黄斑変性、糖尿病性網膜症、緑内障、および未熟児網膜症と関連付けられている。虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害は、慢性緑内障、糖尿病性網膜症および静脈分枝閉塞症（ＢＶＯ）の特定の態様をモデル化するために使用されてきた。Ｉ／Ｒ傷害は、網膜血管および脈絡膜血管の両方の閉塞を引き起こし、低減された血流および組織低酸素を生じる。上記状態は、血液網膜関門（ＢＲＢ）の破壊、常在性ミクログリア／マクロファージの活性化、脈絡膜および体循環からのミクログリアおよびマクロファージの浸潤、サイトカイン（ＴＮＦ−α、Ｉｎｆ−α、ＴＧＦ−β．ＩＬ−１βおよびＩＬ−６）の上昇した産生、ならびに網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の死を引き起こすと報告されている。
【００５２】
本発明の方法の重要な一態様は、Ｄ−Ｃｙ５が、静脈内送達されても硝子体内送達されても、活性化されたミクログリアにおいてほぼ排他的に保持されたという事実である。静脈内投与は、硝子体内よりも安全であるが、硝子体内は、現在、滲出型加齢黄斑変性（ウェットＡＭＤ）および糖尿病性黄斑浮腫を処置する際に使用される抗ＶＥＧＦ治療のための標準治療である。大腿注射の２１日後におけるミクログリア中でのＤ−Ｃｙ５保持もまた、現行の抗ＶＥＧＦ治療などの反復注射が硝子体内注射を必要としないという点で、非常に有意義である。
【００５３】
この方法は、ラット脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）モデルにおいて、Ｎ−アセチル−システイン（Ｎ−ａｃｅｔａｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）にコンジュゲートされた本発明のデンドリマー化合物の全身静脈内注射が、対照と比較して、処置した動物においてＣＮＶの面積を有意に低減させたという驚くべき知見によってさらに支持された。
【００５４】
一部の実施形態によれば、本発明は、デンドリマーナノ粒子を含む組成物を提供し、このデンドリマーナノ粒子は、眼における炎症性疾患を抑制または阻害するのに有効な量の同じまたは異なり得る少なくとも１種または複数の生物学的に活性な薬剤に共有結合した、大部分がヒドロキシル終端したポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーを含む。本明細書で使用する場合、用語「大部分がヒドロキシル終端した」とは、デンドリマーの表面官能基の大部分がＯＨ基であることを意味する。一部の実施形態では、このデンドリマーは、異なる官能基の混合物を有し得る。
【００５５】
したがって、別の一実施形態によれば、本発明は、デンドリマーナノ粒子を含む組成物を静脈内投与することによって、被験体の眼における炎症性疾患および／または血管形成疾患を処置するための方法を提供する；このデンドリマーナノ粒子は、眼における炎症性疾患および／または血管形成疾患を抑制または阻害するのに有効な量の同じまたは異なり得る少なくとも１種または複数の生物学的に活性な薬剤に共有結合した、１つまたは複数のエチレンジアミン−コアポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）のヒドロキシル終端したデンドリマーを含む。
【００５６】
本明細書で使用する場合、用語「ＰＡＭＡＭデンドリマー」とは、アミドアミン構成要素を有し、異なるコアを含有し得る、ポリ（アミドアミン）デンドリマーを意味する。それらを作製する方法は、当業者に公知であり、一般に、中心イニシエーターコア周囲の樹状β−アラニン単位の同心性シェル（世代）を生成する２段階反復反応シーケンスが関与する。このＰＡＭＡＭコア−シェル構造は、付加されたシェル（世代）の関数として、直径が線形に成長する。一方、表面基は、樹状分枝数学（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ−ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ）に従って、各世代において指数関数的に増幅する。これらは、５つの異なるコア型および１０個の表面官能基で、世代Ｇ０〜１０において入手可能である。デンドリマー分枝したポリマーは、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリエステル、ポリエーテル、ポリリシン、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリペプチドデンドリマーからなり得る。本明細書に記載され特許請求されるデンドリマー組成物は、Ｇ３〜Ｇ１０の範囲の、典型的にはＧ４またはＧ５の範囲のデンドリマーであり得、異なるＧレベルの混合物もまた可能であることが、当業者に理解される。
【００５７】
一部の実施形態によれば、使用されるＰＡＭＡＭデンドリマーは、それらの表面官能基に結合したヒドロキシル基を有する、世代４のデンドリマーであり得る。
【００５８】
一部の実施形態では、このデンドリマーは、ナノ粒子形態であり、本明細書で参照によって組み込まれる国際特許出願公開ＷＯ２００９／０４６４４６号に詳細に記載されている。
【００５９】
本明細書で使用する場合、用語「眼の炎症性疾患」とは、例えば、加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）、網膜色素変性、視神経炎、感染症、サルコイド、鎌状赤血球症、網膜剥離、側頭動脈炎、網膜虚血、動脈硬化性網膜症、高血圧性網膜症、網膜動脈遮断（ｒｅｔｉｎａｌ
ａｒｔｅｒｙ  ｂｌｏｃｋａｇｅ）、網膜静脈遮断（ｒｅｔｉｎａｌ  ｖｅｉｎ  ｂｌｏｃｋａｇｅ）、低血圧、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫を含む、眼の組織の炎症に関連する眼の疾患を意味し、例えば脈絡膜血管新生を含む血管形成疾患もまた含む。
【００６０】
一実施形態によれば、本発明は、被験体の眼における炎症性疾患を抑制または阻害するのに有効な量で、この被験体に全身投与するステップを含む、被験体の眼における炎症性疾患および／または血管形成疾患を処置するための、本明細書に開示される組成物の使用を提供する。
【００６１】
別の実施形態によれば、本発明は、生物学的に活性な薬剤を含むデンドリマー組成物の有効量を被験体に投与するステップを含む、被験体の角膜における酸化ストレスおよびＥＲストレスによって引き起こされる、被験体の眼の障害を減弱または処置するための方法を提供する。
【００６２】
活性な薬剤および生物学的に活性な薬剤は、本明細書で相互交換可能に使用されて、所望の薬理学的および／または生理学的効果を誘導する化学的または生物学的化合物を指し、その効果は、予防的または治療的であり得る。これらの用語は、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性な代謝物、アナログなどが含まれるがこれらに限定されない、本明細書で具体的に言及される活性な薬剤の薬学的に許容される薬理学的に活性な誘導体もまた包含する。用語「活性な薬剤」、「薬理学的に活性な薬剤」および「薬物」が使用される場合、本発明は、活性な薬剤自体、および薬学的に許容される薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝物、アナログなどを含むと理解すべきである。この活性な薬剤は、天然に存在するものであれ、形質転換されたものなどの操作されたものであれ、ウイルスまたは細胞などの生物学的実体であり得る。
【００６３】
一部の実施形態では、生物学的に活性な薬剤は、検出可能な部分を含み得る。本明細書で使用する場合、用語「検出可能な部分」とは、分子のこの特定の部分が、デンドリマー分子に結合した少なくとも１種または複数の画像化剤を含むことを意味する。これらの画像化剤のうち少なくとも１つは、蛍光色素である。この色素は、可視または近赤外（ＮＩＲ）スペクトルにおけるエミッターであり得る。本発明において有用な公知の色素には、カルボシアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン（ｔｈｕｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）およびメロシアニン、ポリメチン、クマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎｅ）、ローダミン、キサンテン、フルオレセイン、ホウ素ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＶｉｖｏＴａｇ−６８０、ＶｉｖｏＴａｇ−Ｓ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ−Ｓ７５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７９０、Ｄｙ６７７、Ｄｙ６７６、Ｄｙ６８２、Ｄｙ７５２、Ｄｙ７８０、ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４７、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ  ８００ＲＳ、ＩＲＤｙｅ  ７００ＤＸ、ＡＤＳ７８０ＷＳ、ＡＤＳ８３０ＷＳならびにＡＤＳ８３２ＷＳが含まれる。
【００６４】
ＮＩＲ領域において活性な有機色素は、生物医学的適用において公知である。しかし、従来の色素の制限、例えば、乏しい親水性および光安定性、低い量子収量、不十分な安定性ならびに生物学的系における低い検出感度などに起因して、容易に利用可能なＮＩＲ色素は数種しか存在しない。かなり改善された化学的および光安定性、高い蛍光強度ならびに長い蛍光寿命を有する、ＮＩＲ色素（シアニン色素、スクアライン、フタロシアニン、ポルフィリン誘導体およびＢＯＤＩＰＹ（ホウ素ジピロメタン）アナログを含む）の近年の開発には、顕著な進展があった。ＮＩＲ色素の例には、シアニン色素（ポリメチンシアニン色素とも呼ばれる）が含まれ、これらは、ポリメチン架橋によって連結された２つの芳香族窒素含有複素環を有する小さい有機分子であり、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７およびそれらの誘導体が含まれる。スクアライン（スクアリリウム色素と呼ばれる場合が多い）は、分子の両方の末端において芳香族または複素環式成分を有する、オキソシクロブテノレートコアからなり、一例はＫＳＱ−４−Ｈである。フタロシアニンは、窒素原子を介して一緒に連結された４つの架橋ピロールサブユニットからなる、２次元１８π電子芳香族ポルフィリン誘導体である。ＢＯＤＩＰＹ（ホウ素ジピロメタン）色素は、４，４’−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン）の一般構造を有し、高い量子収量ならびに優れた熱的および光化学的安定性と共に、鋭い蛍光を有する。
【００６５】
一実施形態によれば、この生物学的に活性な薬剤は、酵素、受容体アンタゴニストまたはアゴニスト、ホルモン、増殖因子、抗体、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータ−カロテンおよび小分子からなる群より選択される。
【００６６】
別の実施形態によれば、この小分子は、抗炎症剤、例えば、メチルプレドニゾン、デキサメタゾンを含むステロイド、ＣＯＸ−２阻害剤を含む非ステロイド性抗炎症剤、コルチコステロイド抗炎症剤、金化合物抗炎症剤、免疫抑制性抗炎症剤および抗血管形成剤、サリチレート抗炎症剤、ラニビズマブ、ミノサイクリン、アフリベルセプトおよびラパマイシンを含む抗ＶＥＧＦ剤からなる群より選択される。これらには、抗酸化剤、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、オメガ−３脂肪酸誘導体、例えば、レゾルビン（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ）およびニューロプロテクチン（ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｎ）−Ｄ１（ＮＰＤ１）もまた含まれ得る。
【００６７】
一部の他の実施形態によれば、この分子には、例えば、ダクリズマブ、ベバシズマブ（ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、バシリキシマブ、ラニビズマブおよびペガプタニブナトリウムを含む抗体、またはＳＮ５０などのペプチド、ならびにＮＦκβのアンタゴニストが含まれ得る。
【００６８】
一部の実施形態によれば、この生物学的に活性な薬剤は、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）および／またはトリアムシノロンアセトニド（ＴＡ）であり得る。
【００６９】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用されるデンドリマー組成物は、１種または複数の生物学的に活性な薬剤にコンジュゲートされた世代４のヒドロキシル終端したＰＡＭＡＭデンドリマー（Ｇ４−ＯＨ）である。例えば、ＮＡＣおよび／またはＴＡにコンジュゲートされたＧ４−ＯＨデンドリマーが、本発明の方法において使用され得る。
【００７０】
一部の実施形態では、少なくとも１種の生物学的に活性な薬剤および少なくとも１つの検出可能な部分を含むセラノスティック（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ）組成物が企図される。例えば、セラノスティック組成物は、身体における治療剤または生物学的に活性な薬剤の可視化を補助するために、ＮＡＣにコンジュゲートされたＧ４−ＯＨまたはアミン−Ｇ４−ＮＨ２デンドリマー、およびＤ−Ｃｙ５を含み得る。
【００７１】
トリアムシノロンアセトニド（４ａＳ，４ｂＲ，５Ｓ，６ａＳ，６ｂＳ，９ａＲ，１０ａＳ，１０ｂＳ）−４ｂ−フルオロ−６ｂ−グリコロイル−５−ヒドロキシ−４ａ，６ａ，８，８−テトラメチル−４ａ，４ｂ，５，６，６ａ，６ｂ，９ａ，１０，１０ａ，１０ｂ，１１，１２−ドデカヒドロ−２Ｈ−ナフト［２’，１’：４，５］インデノ［１，２−ｄ］［１，３］ジオキソール−２−オン）は、種々の皮膚状態を処置するため、口のびらんの不快感を軽減するため、および鼻スプレー形態でアレルギー性鼻炎を処置するために使用される、合成コルチコステロイドである。これは、トリアムシノロンのより強力な誘導体であり、プレドニゾンの約８倍強力である。硝子体内注射として、トリアムシノロンアセトニドは、種々の眼疾患を処置するために使用されており、黄斑浮腫を低減させるのに有用であることが見出されている。薬物試験により、これは、２年間の期間にわたって、人工水晶体を有する眼において、抗ＶＥＧＦ薬物と同様に効率的であることが見出されている。
【００７２】
本発明の方法で使用されるデンドリマー組成物は、任意の適切な製剤中にあり得ることが理解される。かかる製剤の例には、リポソーム、マイクロカプセルおよびナノカプセルのうち１種または複数が含まれる。
【００７３】
本発明の実施形態は、これらの化合物を含む医薬製品を調製するためのプロセスもまた含む。用語「医薬製品」とは、本明細書に定義されるように、医薬的使用に適切な組成物（医薬組成物）を意味する。本発明の化合物を含む、特定の適用のために製剤化された医薬組成物もまた、本発明の一部であり、本発明の一実施形態であるとみなすべきである。
【００７４】
本明細書で使用する場合、用語「処置する」およびそれから派生した単語は、予防的処置および障害緩解（ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｒｅｍｉｔａｔｉｖｅ）処置を含む。用語「低減させる」、「抑制する」、「予防する」および「阻害する」、ならびにそれらから派生した単語は、減らすまたは減少させるという、それらの一般に理解される意味を有する。これらの単語は、１００％または完全な処置、低減、抑制または阻害を必ずしも意味しない。
【００７５】
本明細書に記載される医薬組成物に関して、薬学的に許容される担体は、従来から使用されているもののいずれかであり得、物理−化学的考慮事項、例えば、溶解度および活性な化合物（複数可）との反応性の欠如によって、ならびに投与の経路によってのみ、限定される。本明細書に記載される薬学的に許容される担体、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤および希釈剤は、当業者に周知であり、公に容易に入手可能である。薬学的に許容される担体の例には、可溶性担体、例えば、生理学的に許容され得る公知の緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）および固体組成物、例えば、固体状態の担体またはラテックスビーズが含まれる。薬学的に許容される担体は、活性な薬剤（複数可）にとって化学的に不活性なもの、および使用の条件下で有害な副作用または毒性をほとんどまたは全く有さないものであることが好ましい。
【００７６】
本明細書で使用される担体または希釈剤は、固体製剤のための固体担体もしくは希釈剤、液体製剤のための液体担体もしくは希釈剤、またはそれらの混合物であり得る。
【００７７】
固体担体または希釈剤には、ガム、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン、アルファ化デンプン）、糖（例えば、ラクトース、マンニトール、スクロース、デキストロース）、セルロース材料（例えば、微結晶セルロース）、アクリレート（例えば、ポリメチルアクリレート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、またはそれらの混合物が含まれるがこれらに限定されない。
【００７８】
液体製剤について、薬学的に許容される担体は、例えば、水性もしくは非水性の溶液、懸濁物、乳剤または油であり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体には、例えば、生理食塩水および緩衝化媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、シクロデキストリン、乳剤または懸濁物が含まれる。
【００７９】
油の例は、石油、動物、植物または合成起源の油、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ、ワセリン、およびミネラルである。非経口製剤における使用のために適切な脂肪酸には、例えば、オレイン酸、ステアリン酸およびイソステアリン酸が含まれる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、適切な脂肪酸エステルの例である。
【００８０】
非経口ビヒクル（皮下、静脈内、動脈内または筋内注射のため）には、例えば、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルならびに不揮発油が含まれる。非経口投与に適切な製剤には、例えば、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を意図したレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る、水性および非水性の等張無菌注射溶液、ならびに懸濁剤、溶解剤、増粘剤、安定剤および防腐剤を含み得る、水性および非水性の無菌懸濁物が含まれる。
【００８１】
静脈内ビヒクルには、例えば、流体および栄養補給剤、電解質補給剤、例えば、リンゲルデキストロースに基づくものなどが含まれる。例は、界面活性剤および他の薬学的に許容されるアジュバントの添加ありまたはなしの、水および油などの無菌液体である。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連の糖溶液、ならびにグリコール、例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールは、特に注射可能な溶液のための、好ましい液体担体である。
【００８２】
さらに、一実施形態では、本発明の化合物は、例えば、結合剤（例えば、アラビアゴム、トウモロコシデンプン、ゼラチン、カルボマー、エチルセルロース、グアーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン）、崩壊剤（例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸、二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム（ｃｒｏｓｃａｒｍｅｌｏｓｅ  ｓｏｄｉｕｍ）、クロスポビドン、グアーガム、デンプングリコール酸ナトリウム）、種々のｐＨおよびイオン強度の緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、添加剤、例えば、表面への吸収を防止するためのアルブミンもしくはゼラチン、洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、胆汁酸塩）、プロテアーゼ阻害剤、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、浸透増強剤、可溶化剤（例えば、クレモフォール、グリセロール、ポリエチレングリセロール、塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚｌｋｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、安息香酸ベンジル、シクロデキストリン、ソルビタンエステル、ステアリン酸）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチルヒドロキシアニソール）、安定剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ｈｙｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ））、粘度増加剤（例えば、カルボマー、コロイド性二酸化ケイ素、エチルセルロース、グアーガム）、甘味料（例えば、アスパルテーム、クエン酸）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、流動助剤（ｆｌｏｗ−ａｉｄ）（例えば、コロイド性二酸化ケイ素）、可塑剤（例えば、フタル酸ジエチル、クエン酸トリエチル）、乳化剤（例えば、カルボマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム）、ポリマーコーティング（例えば、ポロクサマーまたはポロキサミン）、コーティングおよびフィルム形成剤（例えば、エチルセルロース、アクリレート、ポリメタクリレート）、ならびに／またはアジュバントをさらに含み得る。
【００８３】
担体の選択は、特定の化合物によって、ならびに化合物を投与するために使用される特定の方法によって、一部決定される。したがって、本発明の医薬組成物の種々の適切な製剤が存在する。非経口、皮下、静脈内、筋内、動脈内、くも膜下腔内および腹腔内投与のための以下の製剤は、例示であり、決して限定ではない。１よりも多い経路が、化合物を投与するために使用され得、ある特定の場合には、特定の経路が、別の経路よりもより即座かつより有効な応答を提供できる。
【００８４】
非経口製剤における使用に適切なセッケンには、例えば、脂肪性アルカリ金属、アンモニウムおよびトリエタノールアミン塩が含まれ、適切な洗剤には、例えば、（ａ）カチオン性洗剤、例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライドおよびアルキルピリジニウムハライドなど、（ｂ）アニオン性洗剤、例えば、スルホン酸アルキル、スルホン酸アリールおよびスルホン酸オレフィン、硫酸アルキル、硫酸オレフィン、硫酸エーテルおよび硫酸モノグリセリド、ならびにスルホサクシネートなど、（ｃ）非イオン性洗剤、例えば、脂肪性アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミドおよびポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマーなど、（ｄ）両性洗剤、例えば、アルキル−β−アミノプロピオネートおよび２−アルキル−イミダゾリン四級アンモニウム塩など、ならびに（ｅ）それらの混合物が含まれる。
【００８５】
注射可能な製剤は、本発明に従う。注射可能な組成物のための有効な医薬担体の必要条件は、当業者に周知である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｊ．Ｂ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、ＢａｎｋｅｒおよびＣｈａｌｍｅｒｓ編、２３８〜２５０頁（１９８２年）、ならびにＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ、Ｔｒｉｓｓｅｌ、第１５版、６２２〜６３０頁（２００９年）を参照のこと）。
【００８６】
一実施形態では、用語「投与する」とは、本発明の化合物が、被験体、好ましくは、眼の炎症関連疾患に対する処置を受けている被験体中に導入され、これらの化合物が、ｉｎ
ｖｉｖｏで、１つまたは複数の疾患関連細胞または細胞の集団と接触するようにされることを意味する。
【００８７】
本明細書で使用する場合、用語「被験体」とは、Ｒｏｄｅｎｔｉａ目の哺乳動物、例えば、マウスおよびハムスター、ならびにＬａｇｏｍｏｒｐｈａ目の哺乳動物、例えばウサギが含まれるがこれらに限定されない、任意の哺乳動物を指す。哺乳動物は、ネコ（Ｆｅｌｉｎｅ（ｃａｔ））およびイヌ（Ｃａｎｉｎｅ（ｄｏｇ））を含むＣａｒｎｉｖｏｒａ目由来であることが好ましい。哺乳動物は、ウシ（Ｂｏｖｉｎｅ（ｃｏｗ））およびブタ（Ｓｗｉｎｅ（ｐｉｇ））を含むＡｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ目、またはウマ（Ｅｑｕｉｎｅ（ｈｏｒｓｅ））を含むＰｅｒｉｓｓｏｄａｃｔｙｌａ目のものであることが、より好ましい。哺乳動物は、Ｐｒｉｍａｔｅ目、Ｃｅｂｏｉｄ目もしくはＳｉｍｏｉｄ目（サル）のもの、またはＡｎｔｈｒｏｐｏｉｄ目（ヒトおよび類人猿）のものであることが、最も好ましい。特に好ましい哺乳動物は、ヒトである。
【００８８】
本発明の方法において使用される投薬レジメンは、被験体の眼における炎症性疾患および／または酸化ストレスの低減を提供するのに十分な任意の長さの時間であり得ることが、当業者によって理解される。用語「慢性」とは、本明細書で使用する場合、投薬レジメンの時間の長さが、数時間、数日間、数週間、数カ月間またはおそらくは数年間であり得ることを意味する。
【００８９】
さらなる一実施形態では、本発明の組成物および方法は、上に議論した状態または疾患を処置することが可能であることが公知の１種または複数のさらなる治療的に活性な薬剤と組み合わせて使用され得る。例えば、本発明の組成物は、炎症性疾患および／もしくは血管形成疾患、または酸化ストレス関連疾患を処置するために、１種または複数の公知の治療的に活性な薬剤と組み合わせて使用され得る。本発明の組成物および方法と共に、医薬組成物中で容易に組み合わされ得る他の治療的に活性な薬剤の非限定的な例には、非ステロイド性抗炎症薬物のクラス（ＮＳＡＩＤ）中の薬物が含まれる。
【００９０】
一実施形態によれば、本発明は、非ステロイド性抗炎症薬物にコンジュゲートされたデンドリマー組成物を含む組成物の有効量を被験体に投与するステップを含む、被験体の眼における炎症性疾患、酸化ストレスおよび／または新脈管形成によって引き起こされる、被験体の眼における障害を減弱または処置するための方法を提供する。
【００９１】
本発明の方法において使用されるＮＳＡＩＤの例には、メフェナム酸、アスピリン、ジフルニサル、サルサラート、イブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、デクスケトプロフェン（Ｄｅａｃｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ）、フルルビプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、インドメタシン、スリンダク、エトドラク、ケトロラク、ジクロフェナク、ナブメトン、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム（Ｉｓｏｘｉｃａｍ）、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、セレコキシブ（ｅｌｅｃｏｘｉｂ）、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、ルミラコキシブ、エトリコキシブ、フィロコキシブ（Ｆｉｒｏｃｏｘｉｂ）、スルホンアニリド（Ｓｕｌｐｈｏｎａｎｉｌｉｄｅ）、ニメスリド、ニフルミン酸およびリコフェロン（Ｌｉｃｏｆｅｌｏｎｅ）が含まれる。
【００９２】
典型的には、主治医は、種々の因子、例えば、年齢、体重、全体的な健康、食事、性別、投与される化合物、投与の経路、および処置されている状態の重症度を考慮して、各個々の被験体を処置するための組成物の投薬量を決定する。本発明の限定を意図せずに、例として、本発明の組成物の全身用量は、処置されている被験体の体重１ｋｇ当たり約０．０００１〜約１０００ｍｇ、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇおよび約０．５ｍｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。本発明の一実施形態では、患者は、投薬レジメンに従って、デンドリマー−薬物組成物で周期的に処置される。
【００９３】
したがって、別の実施形態によれば、本発明は、眼における炎症性疾患を抑制または阻害するのに有効な量で、デンドリマーナノ粒子を含む組成物を被験体に周期的に全身投与するステップを含む、被験体の眼における炎症性疾患および血管形成疾患を処置するための方法を提供し、このデンドリマーナノ粒子は、生物学的に活性な薬剤に共有結合した、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）のヒドロキシル終端したデンドリマーを含む。
【００９４】
本発明の一実施形態では、患者が、例えば、２週間に１回、１カ月に１回、２カ月に１回または３カ月に１回のスケジュールで、抗炎症性デンドリマー組成物で処置されることが企図される。
【実施例】
【００９５】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析。デンドリマー−Ｃｙ５コンジュゲート（Ｄ−Ｃｙ５）の純度を、Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェアと連結した、Ｗａｔｅｒｓインライン脱気器、バイナリーポンプ、光ダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器、マルチ蛍光λ検出器およびオートサンプラー（４℃に維持）を備えたＷａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣ機器（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して分析した。ＨＰＬＣクロマトグラムを、Ｗａｔｅｒｓ  ２９９８  ＰＤＡ検出器を使用して、デンドリマーについて２１０ｎｍでの吸光度およびＣｙ５について６５０ｎｍでの吸光度、ならびにＷａｔｅｒｓ  ２４７５蛍光検出器を使用して、６４５ｎｍでの励起および６６２ｎｍでの発光を有する蛍光に関して、同時にモニタリングした。水／アセトニトリル（０．１％  ｗ／ｗ  ＴＦＡ）を新たに調製し、濾過し、脱気し、移動相として使用した。ＴＳＫ−Ｇｅｌガードカラムに接続されたＴＳＫ−Ｇｅｌ  ＯＤＳ−８０
Ｔｓ（２５０×４．６ｍｍ、２５ｃｍの長さ、５μｍの粒子サイズ）を使用した。勾配流を、１ｍｌ／分の流量で、９０：１０（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ）の初期条件で使用し、次いで、アセトニトリル濃度を３０分間で１０：９０（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ）に漸進的に増加させ、６０分間で元の初期条件９０：１０（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ）に戻した。
【００９６】
動的光散乱およびゼータ電位分析。Ｇ４−ＯＨおよびＤ−Ｃｙ５コンジュゲートの粒子サイズおよびζ電位を、５０ｍＷ  Ｈｅ−Ｎｅレーザー（６３３ｎｍ）を備えたＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｌｔｄ．Ｗｏｒｃｈｅｓｔｅｒ、Ｕ．Ｋ）を使用する動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定した。サイズ分類のために、試料を、脱イオン水（１８．２Ω）中に溶解させて、５０μｇ／ｍＬの最終濃度にした。この溶液を、酢酸セルロースメンブレン（０．４５ミクロン、ＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を通して濾過し、ＤＬＳ測定を、１７３°の散乱角で２５℃で実施した。ゼータ電位を、Ｓｍｏｌｏｋｏｗｓｋｙモデルを使用して計算し、測定を３連で実施した。
【００９７】
動物および虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害。動物が関与する全ての手順は、眼科および視覚研究における動物の使用のためのＡＲＶＯ声明（ＡＲＶＯ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ
ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従った。Ｊｏｈｎｓ  ＨｏｐｋｉｎｓのＷｉｌｍｅｒ動物施設に収容した各々体重約２５グラムのＢＡＬＢ／ｃアルビノマウスを、輸送およびＩ／Ｒ研究に使用した。全ての手術を、ケタミン（１００ｍｇ／Ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）腹腔麻酔下で実施した。６匹のマウスを、各時点において各群において使用した。Ｉ／Ｒ傷害を、別の場所に記載した手順に従うことによって、左眼において実施した。簡潔に述べると、前房に、生理食塩水を注入するラインに取り付けた３０ゲージ（ｇａｕｚｅ）の針を用いてカニューレ挿入した。生理食塩水システムを、カスタムメードの生理食塩水レザバ上に取り付け、特定の高さに上昇させた（９０ｍｍ  Ｈｇに調整した）。ＩＯＰを、９０分間かけて９０ｍｍ  Ｈｇに上昇させ、Ｉ／Ｒ傷害および脈絡膜循環の遮断を、手術用顕微鏡による眼底試験を介して、後眼部の脱色によって証明した。虚血後、針を、即時の血液再灌流のために即座に引き出した。右眼は、Ｉ／Ｒ傷害を有さず、対照として機能した。
【００９８】
デンドリマー注射および動物の屠殺。Ｉ／Ｒ傷害の６日後、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、硝子体内または静脈内のいずれかでデンドリマーを注射した。硝子体内注射のために、２０μｇのＤ−Ｃｙ５を含有する２μＬを、硝子体腔中に、圧縮注射器（Ｈａｒｖａｒｄ  ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）で補助されたガラス針を使用して注射した。静脈内注射のために、１００μＬの無菌ＰＢＳ中に溶解させた６００μｇのＤ−Ｃｙ５を、大腿領域中に小さい切開を作製した後に、大腿静脈中に３０ｇ針を介して注射した。遊離Ｃｙ５およびＰＢＳを注射した動物は、この研究のための陽性対照または陰性対照として機能した。デンドリマー注射後の適切な時点（２４時間、７２時間および２１日）において、動物を、ケタミン／キシラジンを使用して麻酔し、致死用量のナトリウムペントバルビタールを使用して安楽死させた。それらの眼を、即座に摘出し、免疫組織化学分析のために処理した。
【００９９】
免疫組織化学および共焦点顕微鏡法。眼を摘出し、ＰＢＳ中２％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定した。眼の前房を除去し、眼杯を、以前に確立されたプロトコール（Ｌｕｔｔｙら、ＩＯＶＳ、１９９３年）を使用して凍結保存した。眼を、イソペンタン中のドライアイスを丁寧に使用して、１：２の比の、最適な切削温度化合物（ＯＣＴ）（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）を有する２０％スクロース中で凍結させた。クリオブロックを、切片化するまで−８０℃で貯蔵する。８μｍ切片を、クリオスタットを使用して凍結ブロックから切削した。切片を、ミクログリア細胞マーカーであるウサギ抗イオン化カルシウム結合アダプター１分子（Ｉｂａ−１）（Ｗａｋｏ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＵＳＡ）中でインキュベートし、ヤギ抗ウサギ−Ｃｙ３二次抗体を適用した。切片を、Ｚｅｉｓｓ  ５１０共焦点顕微鏡上で分析した。励起波長および発光波長ならびにレーザー設定は、硝子体内およびＩＶ注射した動物中の全ての組織を分析するために、同一であった。切片のＺスタックを取り、折り畳んで、切片全体の奥行を通じて画像を得た。
【０１００】
デンドリマーコンジュゲートのコンジュゲーション。デンドリマートリアムシノロンアセトニドコンジュゲート（Ｄ−ＴＡ）およびＣｙ５−Ｄ−ＴＡの合成を、図１１〜１３に示す。Ｃｙ５へのデンドリマーのコンジュゲーションを、以前に報告された方法を使用して実施した（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２０１２年；３３巻：９７９〜８８頁）。これは、合成の収束的方法であり、代表的クロマトグラムが図１６Ａ〜１６Ｂに示される。
【０１０１】
重要臓器におけるＤ−Ｃｙ５の生体内分布分析。約２５ｇｒ  ＢＷの重さの１２匹のＢＡＬＢ−Ｃマウスを、この研究に使用した。４匹の動物を、各時点において屠殺した：２４時間、７２時間および２１日。各マウスに、１００μＬの無菌ＰＢＳ中の６００μｇのＤ−Ｃｙ５を、大腿静脈を介して注射した。それぞれの時点において、動物を安楽死させ、重要臓器（心臓、肺、脾臓、腎臓、肝臓および眼）を即座に回収し、臓器湿重量を記録した。臓器を、ドライアイス上で瞬間凍結させ、分析まで−８０℃で貯蔵した。分析の際に、組織を解凍し、およそ１００〜１５０ｍｇの組織を測定し、ステンレス鋼ビーズおよび組織ホモジナイザー（Ｔｉｓｓｕｅｌｙｚｅｒ  ＬＴ、ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、低ＤＮＡ結合性チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で１ｍｌのＭｅＯＨと共にホモジナイズして、髄質様組織懸濁物を得た。この懸濁物を、３０分間超音波処理し、１００ｍｇの組織を含有する適切な体積を、異なる低ＤＮＡ結合性バイアル中に配置し、メタノールで１ｍｌに希釈して、同じ量の組織および同じ体積が、各試料について分析されるようにした。これらの試料を、１０，０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離して上清を得、これを蛍光分光法（ＦＬＳ）に供した。
【０１０２】
ＣＮＶラットモデル。各々約３００グラムの雄性ＳＤラットを、この研究のために選択した。脂質３（Ｓ）−ヒドロペルオキシ−９Ｚ，１１Ｅ−オクタデカジエン酸（ＨｐＯＤＥ）（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡ．）を、５００μｇ／３３μＬの濃度で冷ホウ酸緩衝液中に溶解させた。２μＬの脂質を、１日目に網膜下注射して、網膜中に小疱を形成させた。３日目までに、この脂質小疱は消失し、網膜変性が始まった。脂質注射の７日後に、脈絡膜からの血管新生（ＣＮＶ）が形成し始め、網膜および脈絡膜における炎症ならびに網膜における血管新生（ＲＮＶ）が生じる。このモデルは、脈絡膜および網膜の両方に対する損傷を引き起こし、ドライおよびウェットの両方のＡＭＤ形態の特徴を有する（図２０）。
【０１０３】
統計分析。データを、スチューデントｔ検定を使用して再現性について分析して、２つの群間の有意性を決定した。０．０５またはそれ未満のｐ値を、有意とみなした。
【０１０４】
（実施例１）
Ｄ−Ｃｙ５コンジュゲートの特徴付け。エチレンジアミン−コアポリ−（アミドアミン）［ＰＡＭＡＭ］のヒドロキシル終端した世代４（Ｇ４−ＯＨ）を、本発明者らが以前に報告した通りに（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．  ２０１３年；１０巻：４５６０〜７１頁；Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２０１２年；３３巻：９７９〜８８頁）、近ＩＲ蛍光色素Ｃｙ５を用いて標識した。簡潔に述べると、Ｇ４−ＯＨを、ＦＭＯＣ保護／脱保護化学を使用して６−アミノカプロン酸によって部分的に官能化して、それらの表面上に約５〜６個のＮＨ２基を有する二官能性デンドリマーを得た。反応性アミン基を有する得られた二官能性デンドリマーを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドモノエステルＣｙ５色素と反応させて、Ｄ−Ｃｙ５コンジュゲートを得た。得られたコンジュゲートを、透析およびＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）を使用して精製し、１Ｈ  ＮＭＲを使用して特徴付けた（図１１〜１３）。
【０１０５】
二官能性デンドリマーのＨＰＬＣクロマトグラムは、Ｇ４−ＯＨデンドリマーの溶出時間（溶出時間１４．４２分）とは異なる、カラムからの１４．８４分の溶出時間を示した（図１６Ａ〜１６Ｂ）。これは、新たな化合物の形成を示し、溶出時間における軽微なシフトのみが存在することを示し、これは、Ｇ４−ＯＨデンドリマーの構造的特性が顕著には変化していないことを示している。これは、Ｇ４−ＯＨデンドリマーの適切なサイズおよびゼータ電位（それぞれ、４．３６±０．１８ｎｍおよび＋４．５９±０．１１ｍＶ）が観察されたＤＬＳ結果とも一致する。また、二官能性デンドリマーのサイズおよびゼータ電位値は、それぞれ４．８７±０．２０ｎｍおよび６．６３±０．２４ｍＶであり、これは、デンドリマーのサイズおよび表面特性において有意な変化がないことを示す。Ｃｙ５ピーク（２０．３９分）とは異なる、６４７ｎｍ（Ｃｙ５についてのＵＶ  λｍａｘ）および６４５ｎｍ（Ｃｙ５の蛍光発光）における、１６．６９分の同時の新たなピークの出現は、デンドリマーへの色素の首尾よいコンジュゲーションを確認する。
【０１０６】
（実施例２）
虚血−再灌流：ミクログリア／マクロファージ集団、形態学および網膜の構造的変化における差異。正常な網膜中のＩｂａ−１＋常在性ミクログリア／マクロファージは、数がより少なく、特徴的樹状突起を有する分枝型形態学を有した。ミクログリア細胞の不均一集団は、脈絡膜および内顆粒層（ＩＮＬ）において大部分が見出され、そのうち非常に僅かが、外網状層（ＯＰＬ）において観察された（図２Ａ〜Ｄ；２Ｉ〜Ｌ）。これらの網膜は、硝子体内注射後に正常な積層を有した（図２）。Ｉ／Ｒ傷害は、構造的に損傷した網膜、ならびに樹状から円形または紡錘状の形態学への変化に基づいた、網膜および脈絡膜におけるミクログリアの顕著な活性化をもたらした。ＩＲの６日後に、網膜ミクログリア／マクロファージは活性化され、数が増加し、全ての網膜層に分布した：内網状層（ＩＰＬ）、ＩＮＬ、外顆粒層（ＯＮＬ）および網膜下空間（図３Ａ〜Ｄ）。興味深いことに、本発明者らは、脈絡膜ミクログリア／マクロファージの数の減少を見出した。ＩＲ傷害は、網膜内層の崩壊ならびに脈絡膜およびＲＰＥ層からの網膜剥離を引き起こし、網膜におけるヒダを生じた。本発明者らは、正常な網膜と比較した場合に、ＩＲ傷害された網膜において、特に顆粒層（ｎｕｃｌｅａｒ  ｌａｙｅｒ）の網膜厚さ値の菲薄化もまた観察し、これは、神経細胞および神経節細胞の死を示唆する（図３）。
【０１０７】
（実施例３）
硝子体内および静脈内投与の際のＤ−Ｃｙ５の網膜生体内分布：硝子体内投与。Ｄ−Ｃｙ５の硝子体内投与は、正常網膜とＩ／Ｒ網膜との間で示差的な生体内分布を示した。Ｄ−Ｃｙ５の硝子体内注射の２４時間後の正常網膜では、網膜および脈絡膜においてごく最小の蛍光が存在した（図２Ａ〜Ｄ）。２４時間後にはＤ−Ｃｙ５からの蛍光シグナルは存在せず、これは、デンドリマーが網膜から完全に除去されたことを示唆している。対照的に、遊離Ｃｙ５は、注射の２４時間後に網膜内層中に残存した（図２Ｄ〜Ｆ）。これは、Ｄ−Ｃｙ５がインタクトな網膜から迅速に除去されることを示唆している。Ｉ／Ｒ傷害された網膜では、本発明者らは、注射の２４時間後に、網膜切片においてＤ−Ｃｙ５からの有意な蛍光シグナルを観察した（図３Ａ〜Ｈ）。デンドリマー（Ｄ−Ｃｙ５）は、網膜下空間、ＯＮＬ、ＩＮＬ中、および網膜の内境界膜（ＩＬＭ）近傍の、Ｉｂａ−１＋ミクログリア／マクロファージにおいて観察された。本発明者らは、硝子体中の、ならびに網膜内層および脈絡膜中の他の細胞中に局在した、デンドリマーもまた観察している。硝子体内注射の７２時間後に、Ｄ−Ｃｙ５は、Ｉ／Ｒ眼中の他の細胞および硝子体から除去された（図４Ａ〜Ｈ）。Ｄ−Ｃｙ５は、Ｉｂａ−１標識された細胞内で見出され、ＩＬＭの近傍、網膜内層中および網膜下空間中のミクログリア／マクロファージ中に保持された（図４Ａ〜Ｈ  矢印）。興味深いことに、注射の２１日後には、Ｄ−Ｃｙ５は、光受容体層中、ＩＰＬ中およびＩＬＭ近傍のミクログリア細胞中に特異的に保持された（図５）。しかし、遊離Ｃｙ５注射した動物のＩ／Ｒ眼および正常眼の両方の場合、Ｃｙ−５は、網膜内層中で見られ得、ＩＬＭ近傍の血管中に濃縮されているようであるが（図２Ｉ〜Ｌ  矢印）、注射の７２時間後までに完全に除去された（データ示さず）。
【０１０８】
（実施例４）
静脈内投与。Ｄ−Ｃｙ５、遊離Ｃｙ５またはＰＢＳを、１つの眼において、Ｉ／Ｒ傷害の６日後に、大腿静脈を介して静脈内注射した。注射後のそれぞれの時点（２４時間、７２時間および２１日）において、これらの眼を、ＩＨＣを使用して、Ｉ／Ｒ傷害された網膜と正常網膜との間での、デンドリマーの網膜生体内分布における差異の定性的評価のために摘出した。硝子体内Ｄ−Ｃｙ５投与の２４時間後のＩ／Ｒ眼では、Ｄ−Ｃｙ５は、循環から網膜中に進入し、網膜の至る所および網膜下空間中のミクログリア／マクロファージ内に見出された。しかし、遊離Ｃｙ５色素投与の２４時間後の正常眼およびＩ／Ｒ眼の両方において、Ｃｙ−５は、網膜血管および脈絡毛細管板中に存在するようであった（図６Ｉ〜Ｌ  矢印）。遊離Ｃｙ５は、後の時点において除去された。Ｄ−Ｃｙ５は脈絡膜マクロファージ中に存在したので（図１７）、デンドリマーは、正常な脈絡毛細管板を逃れ得るようである。興味深いことに、本発明者らは、非Ｉ／Ｒ網膜においてＤ−Ｃｙ５からのいかなる蛍光シグナルも見出さず、これは、インタクトな血液網膜関門がデンドリマーの進入を防止したことを示している。静脈内Ｄ−Ｃｙ５注射の７２時間後、Ｄ−Ｃｙ５は、Ｉ／Ｒ中のミクログリア／マクロファージ中に選択的に局在および保持され、網膜下空間中に保持された（図７Ａ〜Ｈ  矢印）。活性化されたミクログリア細胞は、全ての網膜層中に散在および分布していたが、デンドリマーは、脈絡膜中のミクログリア細胞中に、および網膜下空間中にのみ保持されて見出された（図７Ｅ〜Ｈ）。注射の２１日後に、Ｄ−Ｃｙ５は、網膜および脈絡膜のミクログリア細胞中に少数が散在して保持された。２１日目に、２４時間および７２時間の時点の網膜と比較して、Ｄ−Ｃｙ５を有するＩｂａ−１＋ミクログリア細胞は比較的少なかった。Ｄ−Ｃｙ５を有するミクログリア細胞は、それらの分枝型形態学に戻っているように思われたが、なおもＤ−Ｃｙ５を保持した（図８Ｅ〜Ｈ）。
【０１０９】
（実施例５）
Ｄ−Ｃｙ５の眼生体内分布：硝子体内  対  ＩＶ。Ｄ−Ｃｙ５のＩＶ用量は、硝子体内用量よりも３０倍高かった。興味深いことに、網膜における定性的取込みおよび保持パターンは、両方の様式の投与の後に類似した（図１０）。これは、健康な対照眼における比較的低い取り込みとその後の迅速なクリアランス、ならびに片割れのＩ／Ｒ眼におけるはるかに高い取り込みおよび次のＩ／Ｒ眼における持続性の保持を実証している。実際、２つの投与様式間で、定量的取込み／保持パターンにおける有意差は存在しなかった。ＩＶ
Ｄ−Ｃｙ５後に正常な眼においていくらかの脈絡膜存在があるが、これは、７２時間以内にほとんどが除去されるようである（図７Ｉ〜Ｌ）。ＩＶ投与後のＩ／Ｒ眼では、２４時間後に観察されたＤ−Ｃｙ５取込みの約４０％が、最大２１日間保持される。硝子体内投与については、２４時間からのＤ−Ｃｙ５レベルの約１６％が、最大２１日間保持される。
【０１１０】
（実施例６）
Ｉｂａ−１＋細胞およびＤ−Ｃｙ５の定量化。Ｉｍａｒｉｓソフトウェアを使用して、鋸状縁から鋸状縁までの８ｍｍ凍結切片中のＩｂａ−１＋細胞の数を計数した。各群からの４つの切片を計数した。非Ｉ／Ｒ眼よりもＩ／Ｒ眼において、有意により多くのＩｂａ−１＋細胞が存在した（図９Ａ）。このソフトウェアは、単一の標識だけでなく、２つの標識が共局在した細胞も計数する。図９Ｂは、繊細な突起ではなく細胞の細胞体のみが計数されるパラメーターを設定した後に、両方の標識を有する（矢頭）、ソフトウェアによって選択された細胞を実証している。非Ｉ／Ｒ網膜中には二重標識された細胞は存在しなかったので、本発明者らは、Ｉｂａ−１＋細胞の有意な数が、両方の様式のＤ−Ｃｙ５送達によって、全ての時点においてＤ−Ｃｙ５を有したことを決定した（図９Ｃ〜Ｄ）。
【０１１１】
（実施例７）
重要臓器におけるＤ−Ｃｙ５の定量的生体内分布。重要臓器（肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺および血清）における定量的生体内分布、およびＩ／Ｒ傷害を有する動物中に静脈内注射されたＤ−Ｃｙ５の動態を、ＦＬＳ（蛍光分光法）法を使用して評価した。分析のために、組織の重量を、ホモジナイズする前に測定し、Ｄ−Ｃｙ５を、Ｌｅｓｎｉａｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  １０巻（１２号）、４５６０〜４５７１頁）によって以前に記載されたように、メタノールを使用して抽出した。Ｄ−Ｃｙコンジュゲートは、３７℃のヒト血漿およびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてインタクトで安定であり、また、適用されたメタノール抽出プロトコールは、９６％の最良の回収を生じた。メタノール抽出物を、蛍光分光光度計を使用して、発光値についての蛍光測定に供した。各臓器中に蓄積したＤ−Ｃｙ５の量を、発光値（ＰＢＳを注射したそれぞれの臓器の発光値からバックグラウンドを差し引いた）を較正グラフ中に取り込むことによって計算し、次いで、これらの値を、全臓器湿重量を使用して、注射した用量（ＩＤ）／臓器の％へと逆算した。
【０１１２】
静脈内注射のとき、Ｄ−Ｃｙ５の百分率は、尿を介して循環から即座に除去された。本発明者らは、Ｄ−Ｃｙ５または遊離Ｃｙ５を注射した動物が、約５〜７分以内に深い青色の尿を排尿したことを観察した。注射の２４時間後、Ｄ−Ｃｙ５の大部分は、血漿から除去されたが、重要臓器では様々な量で保持された（図１５）。２４時間の時点で、ＦＬＳ分析によれば、注射した用量の約０．１８％が、なおも血液中に存在した。ＢＡＬＢ／Ｃマウスについての総血液体積は、組織１ｇ当たり１０．３５±０．１６ｍｌである。
【０１１３】
腎臓切片の共焦点顕微鏡法分析（図１８）により、２４時間の時点において腎皮質の近位尿細管における高いＤ−Ｃｙ５シグナルが明らかになり（図１８Ａ）、このシグナルは７２時間の時点までに減少し（図１８Ｂ）、これは、生体内分布データと良好に一致している。２４時間の時点での腎臓抽出物のＨＰＬＣは、遊離Ｃｙ５からの小さいピークを示したが、このピークの主要な部分は、Ｄ−Ｃｙ５であった（図１８Ｄ）。ＨＰＬＣ較正に基づいて、本発明者らは、コンジュゲートされたＣｙ５の１２％が、この時間までに放出されたと推定したが、これは、これらのコンジュゲートが、ｉｎ−ｖｉｖｏでほぼインタクトであることを示唆している。Ｄ−Ｃｙ５を注射した動物由来の腎臓切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色は、好中球または単球の浸潤も、構造的損傷も、毒性のいかなる徴候も示さなかった（図１８Ｇ〜Ｉ）。
【０１１４】
注射されたＤ−Ｃｙ５コンジュゲートは除去されたが、一部は腎臓中に蓄積された（図１８）。これは、上記のような蛍光測定、および放射標識に基づく以前の結果と良好に一致している（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ．  ２０１３年６月１日；３巻（３号）：２６０〜２７１頁）。Ｄ−Ｃｙ５の生体内分布および蓄積は、以下のとおりである：腎臓（２９．９８±２．５％）、肝臓（１１．１９±２．２）および脾臓（３．３３±１．２６）（図１５）。心臓および肺は、Ｄ−Ｃｙ５の最小の蓄積を有した（それぞれ、０．００４９％および０．０１％）。他方、遊離Ｃｙ５は、血液から迅速に除去されることが見出され、２４時間で、腎臓における注射された用量の０．８２±２．９３％の、有意により低い蓄積を有した。さらに、本発明者らは、他の臓器においていかなる蛍光シグナルも検出できず、これは、遊離Ｃｙ５が迅速なクリアランスを有することを示している。注射の７２時間後に、Ｄ−Ｃｙ５は、心臓、肺および脾臓から除去されたが、腎臓においては優勢かつ持続的に見出され（５．５３±１．５％）、肝臓においては非常に僅かな程度まで見出された（０．７３±０．０２６％）。遊離Ｃｙ５は、臓器のいずれにおいても検出不能であり、これは、遊離Ｃｙ５が身体から除去されたか、またはその量が検出限界（ＬＯＤ）を下回ったかのいずれかであることを示している。注射の２１日後、デンドリマーは、試験した全ての臓器から完全に除去された。
【０１１５】
腎臓中にＤ−Ｃｙ５の優勢な蓄積が存在したので、定性的顕微鏡分析を、共焦点顕微鏡法を使用して実施した。２４時間の時点で、Ｄ−Ｃｙ５チャネルのシグナル強度は、腎皮質の近位尿細管において高かったが（図１７）、このシグナル強度は、７２時間の腎臓では減少され、これは、生体内分布データと良好に一致している。腎臓抽出物もまた、ＨＰＬＣを使用して分析して、蛍光発光がＤ−Ｃｙ５または遊離Ｃｙ５種由来であることを確認した。２４時間の時点での腎臓抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムは、遊離Ｃｙ５からの小さいピークを示したが、このピークの主要な部分は、Ｄ−Ｃｙ５であった。遊離Ｃｙ５の較正グラフに基づいて、コンジュゲートされたＣｙ５の１２％が放出されたが、これは、これらのコンジュゲートが、ｉｎ−ｖｉｖｏで最大７２時間まで幾分インタクトであることを示唆している。これらの腎臓切片に対するヘマトキシリンおよびエオシン分析（データ示さず）は、好中球または単球の浸潤も、構造的損傷も、毒性のいかなる徴候も示さず、これは、注射されたＤ−Ｃｙ５用量が、臓器に対するいかなる毒性効果も与えなかったことを示唆している。
【０１１６】
（実施例８）
後眼杯におけるデンドリマー取込み。デンドリマー取込みを、Ｄ−Ｃｙ５の組織単離および蛍光定量化を使用して、全身性（図１９、パネルＡ）および硝子体内（図１９、パネルＢ、３０分の１の用量）の際の、傷害された眼および傷害されていない眼において評価した。興味深いことに、本発明者らの研究は、全身投与の最大２１日後でさえ、傷害されたＩ／Ｒ眼におけるデンドリマーの有意により高い取り込みおよび保持を示している。驚くべきことに、２４時間と２１日との間に、傷害された眼におけるデンドリマーレベルには、５０％の低下だけが存在するようである。対照的に、デンドリマーは、７２時間以内に健康な眼から大部分が除去されるようである。デンドリマーが炎症細胞中に選択的に存在するという事実は、デンドリマーを用いた全身治療が、実行可能であり、何週間にもわたって持続可能であることを示唆している。対照的に、静脈内および硝子体内のいずれかで投与された小型の薬物は、短い期間で、眼から容易に除去される。
【０１１７】
（実施例９）
ＣＮＶモデルに対するＮ−アセチル−システイン（ＮＡＣ）の効果。Ｄ−ＮＡＣ（デンドリマー−ＮＡＣ；ＮＡＣ規準で１０ｍｇ／ｋｇ）および６ｍｇのＤ−Ｃｙ５の組み合わせを、脂質注射の３日後に、陰茎静脈を介して静脈内注射し、動物を、注射の７日後に屠殺した。Ｄ−Ｃｙ５およびＰＢＳを注射した動物は、対照として機能した。それらの眼を、屠殺後即座に摘出し、固定し、網膜および脈絡膜をミクログリア／マクロファージ特異的抗体Ｉｂａ−１で染色し、血管をＧＳＡレクチンで染色し、核をＤＡＰＩで染色し、次いで、最初にＺｅｉｓｓ  Ｍｅｔａ７１０共焦点顕微鏡を用いて、別々のフラットマウントとして見た。フラットマウント分析後、組織を別々に凍結保存し、ＯＣＴ／２０％スクロース中で凍結させた。Ｄ−ＮＡＣ処置群および対照群の脈絡膜の共焦点画像を、Ｉｍａｇｅ−Ｊソフトウェアを使用して、ＣＮＶ面積測定値について分析した。
【０１１８】
画像分析により、脂質注射が、ＣＮＶエリア（イソ−レクチン血管標識、青色）におけるミクログリア／マクロファージ（Ｉｂａ−１緑色）の活性化、遊走および蓄積を生じる、脈絡膜における強い炎症応答を引き起こしたことが確認された（図２１）。これらの結果は、全身投与されたデンドリマーが、ＣＮＶエリア中のＩｂａ−１陽性細胞中に特異的に局在したことを示唆している（Ｃｙ５−赤色）。Ｄ−ＮＡＣ＋Ｄ−Ｃｙ５群は、Ｄ−Ｃｙ５注射群と比較した場合、ＣＮＶ面積を低減させることにおいて治療効力を示した。Ｄ−ＮＡＣ（２０ｍｇ／ｋｇ）を、脂質投与の３日後、３日目および６日目に全身投与し、動物を１０日目に屠殺した。Ｄ−ＮＡＣ処置動物は、ＣＮＶにおける有意な予期しなかった低減を示した（約８０％）（図２２）。
【０１１９】
デンドリマーは、炎症を引き起こす細胞にＮＡＣを特異的に送達でき、それによってそれらを減弱し、これが次にＶＥＧＦ産生を減少させ、そうして血管新生を制御する。網膜フラットマウント画像は、Ｄ−Ｃｙ５が、炎症エリアにおいて網膜ミクログリアによって取り込まれることを示している（図２３）。ミクログリア細胞が、脂質によって引き起こされる炎症に起因して活性化され（ドライＡＭＤと類似）、脂質およびミクログリアが新たな血管の成長を誘導する（ウェットＡＭＤと類似）ことも明らかである。本発明者らは、網膜中の炎症エリアに向かうミクログリア細胞の遊走もまた観察している（図２４）。
【０１２０】
（実施例１０）
全身投与されたＤ−ＮＡＣコンジュゲートは、早期に投与した場合、ＣＮＶを抑制する。Ｄ−ＮＡＣを、ＮＡＣ基準で２０ｍｇ／ｋｇで、３日目（脂質投与の２日後）ならびに５日目および７日目に投与した。Ｄ−ＮＡＣは、等価な用量の遊離ＮＡＣ、および未処置の対照と比較して、１０日目に評価したとき、ＣＮＶの有意な抑制を引き起こした（ＰＢＳと比較して約７８％の抑制、ｎ＝１２の眼、ｐ＜０．００１）。図２５に示されるように、ＣＮＶに対する全身性遊離ＮＡＣ、Ｄ−ＮＡＣ（ＮＡＣ基準で２０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳの効果を、確立された脈絡膜フラットマウントプロトコールを使用して、盲検様式で評価した。Ｄ−ＮＡＣ処置した動物は、ＰＢＳと比較した場合、ＣＮＶ面積における有意な減少を示した。遊離ＮＡＣは、有意ではないいくらかの減少を示した。ＣＮＶ面積を、Ｉｍａｇｅ−Ｊソフトウェアにおいて形態計測分析を使用して評価した（黄色の描写）。図２５のパネルＡは、小疱エリアにおけるより大きいＣＮＶおよびマクロファージの増加した集団（緑色）を有するＰＢＳ脈絡膜を示し、図２５のパネルＢは、ＣＮＶおよびマクロファージ蓄積が低減された、Ｄ−ＮＡＣの効力を示す。脈管構造を、ＧＳＡレクチンで染色し（青色）、マクロファージをＩＢＡ−１で染色する（緑色）。値は、ｎ＝１２およびＰ＜０．００１でマン・ホイットニーのｔ検定を使用して分析した。
【０１２１】
（実施例１１）
全身性Ｄ−ＮＡＣは、ＣＮＶエリアへのマクロファージ遊走を低減させ、脈絡膜炎症を減弱する。２０ｍｇ／ｋｇ  ＮＡＣでの全身性Ｄ−ＮＡＣ治療の際の、ＣＮＶ領域におけるマクロファージ枯渇の程度を、ＩＢＡ−１染色を使用して、１０日目に評価した。総マクロファージ蓄積における有意な低減（約６３％）が、Ｄ−ＮＡＣ治療の際に見られた。Ａｍｂａｔｉおよび共同研究者による以前の研究は、マクロファージ枯渇がＣＮＶ低減と相関することを示している。興味深いことに、Ｉｍａｒｉｓ７１を使用する形態学的分析により、活性化されたマクロファージにおける８０％の低減が存在したこと、およびこれらの活性化されたマクロファージの約９０％が（ＰＢＳ処置動物およびＤ−ＮＡＣ処置動物の両方において）Ｄ−Ｃｙ５を含有したことが示唆され、これは選択性を示している（図２６）。
【０１２２】
（実施例１２）
Ｄ−ＮＡＣ脈絡膜炎症の効果を、炎症促進性（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１−単球化学誘引物質およびＴＮＦα）サイトカインレベルおよび抗炎症性（ＩＬ−１０）サイトカインレベルを測定することによって、盲検様式で評価した。１０、２３、７２。全ての炎症促進性サイトカインにおいて、健康な対照において見られるレベルに戻った有意な低減が存在したが、遊離ＮＡＣは有効ではなかった（図２７ＡおよびＢ）。興味深いことに、Ｄ−ＮＡＣは、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０を増強するようであった（図２７Ｃ）。これは、炎症促進性応答の選択的減弱が、Ｄ−ＮＡＣによって達成できることを示唆している。
【０１２３】
（実施例１３）
全身性デンドリマーは、網膜ｍｉ／ｍａを標的化し、Ｄ−ＮＡＣは、網膜炎症を減弱する。ＣＮＶエリアにおいて見られる生体内分布パターンと類似して、Ｄ−Ｃｙ５は、小疱エリア中の活性化されたｍｉ／ｍａ中に選択的に局在したが（図２８Ｂ）、同じ網膜の罹患していないエリア中には局在しなかった（図２８Ａ）。Ｄ−ＮＡＣ処置網膜では、小疱エリア中のｍｉ／ｍａの数における低減が存在し、これらは、より少ないＤ−Ｃｙ５取込みを有し、より分枝型であった。
【０１２４】
網膜炎症に対するＤ−ＮＡＣの効果を、炎症促進性（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１およびＴＮＦα）サイトカインレベルおよび抗炎症性（ＩＬ−１０）サイトカインレベルを測定することによって、盲検様式で評価した。全ての炎症促進性サイトカインにおいて、健康な対照において見られるレベルに戻った有意な低減が存在したが、遊離ＮＡＣは有効ではなかった（図３０ＡおよびＢ）。興味深いことに、Ｄ−ＮＡＣは、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０を増強するようであった（図３０Ｃ）。これは、炎症促進性応答の選択的減弱が、Ｄ−ＮＡＣによって達成できることを示唆している。
【０１２５】
（実施例１４）
Ｄ−ＮＡＣおよびＤ−ＴＡを用いた全身組み合わせ治療は、ＣＮＶ退縮を生じる。Ｄ−ＮＡＣ（ＮＡＣ規準で２０ｍｇ／ｋｇ）およびＤ−ＴＡ（ＴＡ基準で１０ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせを、後の段階（１１日目、１３日目および１５日目）で全身投与して、有意なＣＮＶが既に生じている場合の効力を評価した：（１）２１日目に、ＰＢＳ対照と比較して、デンドリマー処置動物においてＣＮＶにおける７２％の低減が存在したが、これは、後期の処置が有効であることを示唆している；（２）１０日目のＣＮＶ面積の程度と比較して、２１日目に、デンドリマー処置動物において約４５％の低減が存在したが、これは、ＣＮＶ退縮の強い示唆を示している（図３１〜３３）。これらのパイロット結果（ｎ＝３）は、有意なＣＮＶ抑制が、デンドリマーと共に送達された全身治療を用いて可能であり得ることを示唆している。全身組み合わせ治療は、ＩＯＰにおける何らかの増加も、組織学から評価された何らかの全身毒性ももたらさなかった。さらに、図３４に示されるように、本発明の組成物の硝子体内投与および全身投与の両方が、傷害された網膜において類似の網膜生体内分布および効果を有するが、これは、全身投与が、硝子体内注射に対する実行可能な代替法であることを意味している。
【０１２６】
本明細書で引用される刊行物、特許出願および特許を含む全ての引用文献は、あたかも各参考文献が個々にかつ具体的に参照によって組み込まれると示され、本明細書中にその全体が示されるのと同程度まで、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１２７】
（特に以下の特許請求の範囲に関して）本発明を説明する文脈における用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」ならびに類似の指示対象の使用は、本明細書に他のように示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を網羅すると解釈すべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むがこれらに限定されない」）と解釈すべきである。本明細書での値の範囲の列挙は、本明細書に他のように示されない限り、その範囲内に入る各別々の値を個々に参照する省略方法として機能することが意図されるにすぎず、各別々の値は、それが本明細書で個々に列挙されるかのように、本明細書中に取り込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に他のように示されない限り、または文脈と明らかに他のように矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書に提供される任意および全ての例または例示的語句（例えば、「例えば（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、本発明をより良く説明することを意図しているにすぎず、他のように特許請求されない限り、本発明の範囲に対する限定にはならない。本明細書中の語句は、任意の特許請求されていない要素を本発明の実施のために必須であるとして示していると解釈すべきではない。
【０１２８】
発明を実施するための本発明者らに公知の最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が、本明細書に記載される。好ましい実施形態のバリエーションは、上述の説明を読めば、当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がかかるバリエーションを必要に応じて使用することを予期しており、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されるものとは異なって実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用法によって許容されるような、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙される主題の全ての改変および等価物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組み合わせは、本明細書に他のように示されない限り、または文脈と明らかに他のように矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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