(57)【要約】【課題】  汚染を防止し、標的配列を効率よく増幅し、試料に含まれる核酸が微量であっても検出することができる核酸調製器具を提供することにある。【解決手段】  核酸調製器具は、核酸を含むサンプルが供給され、この核酸中の標的核酸を第１の増幅試薬で核酸増幅する反応場を提供する反応容器部４２を具備し、また、反応容器部４２に連通され、反応容器部４２に供給される第２の増幅試薬であって、前記第１の増幅試薬で処理されたサンプル中の前記標的核酸及び/又は増幅生成物を核酸増幅するための第２の増幅試薬を収納するための増幅試薬収容部を具備している。核酸調製器具は、第１及び第２の核酸試薬での核酸増幅工程において、反応容器部４２及び増幅試薬収容部４８を外部に対して気密に維持する容器構造を備えている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含むサンプルが供給され、この核酸中の標的核酸を第１の増幅試薬で核酸増幅する反応場を提供する反応容器部と、
前記反応容器部に連通され、前記反応容器部に供給される第２の増幅試薬であって、前記第１の増幅試薬で処理されたサンプル中の前記標的核酸及び／又は増幅生成物を核酸増幅するための第２の増幅試薬を収納するための増幅試薬収容部と、
を具備し、前記第１及び第２の核酸試薬での核酸増幅工程において、前記反応容器部及び前記増幅試薬収容部を外部に対して気密に維持する容器構造を備えている核酸調製器具。
【請求項２】
可撓性容器部とこの可撓性容器部に液密に固定されている振動チップとを備える、生物試料を収納するための破砕容器と、
前記破砕容器と前記反応容器部との間に配置され、前記破砕容器を前記反応容器部に連通させるカラムであって、前記破砕容器で生成された破砕物から核酸を抽出し、抽出された核酸を前記反応容器部に供給するカラムと、
を更に具備し、前記容器構造が前記破砕容器及び前記カラムに対して前記反応容器部及び前記増幅試薬収容部とともに外部に対して気密に維持している請求項１の核酸調製器具。
【請求項３】
投入された生物試料を溶解する溶解液が収納されている溶解容器と、
前記溶解容器と前記反応容器部との間に配置され、前記溶解容器を前記反応容器部に連通させる濾過室部であって、前記溶解容器で生成された溶解物から核酸を抽出し、抽出された核酸を前記反応容器部に供給する濾過室部と、
を更に具備し、前記容器構造が前記溶解容器及び前記濾過室部に対して前記反応容器部及び前記増幅試薬収容部とともに外部に対して気密に維持する請求項１の核酸調製器具。
【請求項４】
前記溶解容器と前記反応容器部との間に配置され、処理液を保存する処理液保存部と、
前記濾過室部に格納され、前記処理液保存部から供給された前記処理液で活性化される前記溶解物中の不純物を吸着する濾過部材と、
を更に具備し、前記容器構造が前記処理液保存部に対して前記反応容器部及び前記増幅試薬収容部とともに外部に対して気密に維持する請求項３の核酸調製器具。
【請求項５】
前記第１の増幅試薬及び前記第２の増幅試薬は、互いに同一の組成を有し、前記増幅試薬収容部から異なるタイミングで前記反応容器部に輸送される請求項１又は請求項３の核酸調製器具。
【請求項６】
前記第１の増幅試薬及び前記第２の増幅試薬は、互いに異なる組成を有し、前記第１の増幅試薬は、前記反応容器部或いは前記反応容器部への輸送路に格納され、前記第２の増幅試薬に先だって前記反応容器部に輸送される請求項１又は請求項３の核酸調製器具。
【請求項７】
前記破砕容器、前記カラム、前記反応容器部及び前記試薬収容部は、気密を維持する輸送路で連結されるように、一体的に形成されている請求項２に記載の核酸調製器具。
【請求項８】
前記溶解容器、前記濾過室部、前記反応容器部及び前記試薬収容部は、気密を維持する輸送路で連結されるように、一体的に形成されている請求項３に記載の核酸調製器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、動植物、微生物、細菌、菌類或いはウイルス等から抽出された核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を多段階増幅する核酸調製器具に関する。
【背景技術】
【０００２】
動植物、微生物、細菌、菌類或いはウイルス（以下、単に生物組織と称する。）を破壊してその内から核酸を抽出し、その核酸を検出するには、抽出された核酸を増幅することが必要とされる。この核酸検出のために核酸を増幅する方法には、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法などがあるが、何れの方法も、核酸がある量まで増幅されると増幅効率が低下し、それ以降増幅産物がほとんど増えなくなってしまう。また、プライマーが非特異的な配列に結合し、非特異的な核酸配列が増幅されてしまう可能性もある。
【０００３】
さらに、多段階の増幅を行う場合、各段階の増幅反応を行うたびに増幅反応混合物に新しい増幅試薬を添加する必要性があるため、増幅試薬の添加の都度コンタミネーションが起こる可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５８９４６１０号公報
【特許文献２】特許第５０５７２２８号公報
【特許文献３】特許第５０２２２２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１から３には、種々の核酸処理方法或いは装置が開示されている。しかし、これらの文献には、外部環境を汚染（コンタミネーション）させることなく、また、核酸の漏出による別の試料への当該核酸の混入（クロスコンタミネーション）させることなく、核酸増幅における増幅率の低下並びに多段階増幅に対処するに好適する核酸調製器具について考慮されていない。
【０００６】
このような背景から、外部環境の汚染（コンタミネーション）及び核酸の漏出による別の試料への当該核酸の混入（クロスコンタミネーション）を防止し、標的配列を効率よく増幅し、試料に含まれる核酸が微量であっても検出することができるように増幅産物を調製することができる核酸調製器具の開発が望まれている。特に、この核酸調製器具には、組織の破砕、核酸の抽出、核酸の増幅及び核酸の検出を密閉状態で行うことも要請されている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
実施形態によれば、
核酸を含むサンプルが供給され、この核酸中の標的核酸を第１の増幅試薬で核酸増幅する反応場を提供する反応容器部と、
前記反応容器部に連通され、前記反応容器部に供給される第２の増幅試薬であって、前記第１の増幅試薬で処理されたサンプル中の前記標的核酸及び/又は増幅生成物を核酸増幅するための第２の増幅試薬を収納するための増幅試薬収容部と、
を具備し、前記第１及び第２の核酸試薬での核酸増幅工程において、前記反応容器部及び前記増幅試薬収容部を外部に対して気密に維持する容器構造を備えている核酸調製器具が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】第１の実施形態に係る生物組織の試料を振動で破砕し、破砕処理された生物組織の試料から核酸を抽出し、核酸に対して２段階の増幅反応を実施する核酸調製器具の配置構成を概略的に示す模式図である。
【図２】第２の実施形態に係る生物組織の試料を振動で破砕し、破砕処理された生物組織の試料から核酸を抽出し、核酸に対して２段階の増幅反応を実施する核酸調製器具の配置構成を概略的に示す模式図である。
【図３】第３の実施形態に係る生物組織の試料を溶解溶液で溶解し、溶解された生物組織の試料から核酸を抽出し、核酸に対して２段階増幅反応を実施する核酸調製器具の配置構成を概略的に示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、実施の形態に係る核酸調製器具ついて、図面を参照して説明する。
【００１０】
（実施形態１）
図１を参照すると、生物組織の試料を振動で破砕する破砕部２を備え、破砕処理された生物組織の試料から核酸を抽出し、核酸に対して２段階増幅反応を行う反応部４を備える核酸調製器具が示されている。
【００１１】
破砕部２は、外部から変形可能な可撓性の破砕容器２０及びこの破砕容器２０に液密に固定され、破砕容器２０の一部を成す振動チップ２２を備えている。破砕容器２１は、外部から試料を入れるための開口部（開口ポート）及び試料が収納される収容部を備え、この開口部（開口ポート）は、破砕容器２１を気密に密閉する蓋部２４で塞がれて外部に対して密閉されている。
【００１２】
検査対象の試料としての動植物、微生物等の生物組織、細菌、菌類或いはウイルス（以下、この明細書では、単に生物組織と称する。）は、蓋部２４が除去された破砕容器２０の開口部を介して液体とともに収納部に収容され、その後、蓋部２４が取り付けられて外部環境から遮断される。ここで、破砕容器２０においては、蓋部２４で収納部が密閉されることから、振動チップ２２の振動によってその内容物である試料が外部に飛散することが防止され、外部環境が汚染されることが阻止される。
【００１３】
破砕容器２０は、例えば、剛性を有する平板プレート２５上に透明な可撓性材料、例えば、樹脂のシート（ポリプロピレン等のシート）で膨出部が形成されて作られ、その膨出部が収納部とされる。また、可撓性シートは、プレート２５に密着固定されることによって外部から気密に遮断された収納部が形成される。ここで、破砕容器２０は、透明な可撓性シート及びプレート２５で密閉構造に形成されることが好ましい。
【００１４】
振動チップ２２は、破砕容器２０とは異なる材料で平板状に形成されている。より詳細には、振動チップ２２は、被振動部として破砕容器２０よりも十分に高い剛性を有する金属或いはセラミックで形成される。振動チップ２２の内面は、生物組織に直接接触して生物組織を破砕するように破砕容器２０内に露出され、その外面は、振動装置（図示せず）からの振動を伝達するように振動装置に設けられた振動発生部２６に取り外し可能に連結されている。ここで、振動チップ２２に振動が与えられて破砕容器２０が変形しても、破砕容器２０から分離されることがないように振動チップ２２は、破砕容器２０に嵌め込み固定される。より詳細には、振動チップ２２は、振動チップ２２の振動によって微小範囲で可動可能に破砕容器２０に固定される。破砕容器２０への振動チップ２２の固定に関しては、振動チップ２２を気密に維持したまま振動チップ２２が振動されることを許す材料或いは支持構造が採用されれば良い。また、振動チップ２２は、振動発生部２６に高分子樹脂膜を介して接触固定されても良い。
【００１５】
振動発生部２６は、破砕容器２０が破砕装置に装着された際に、振動チップ２２の外面側に密着固定される。また、振動発生部２６は、例えば、超音波振動を発生する超音波振動子及びこの超音波振動子で発生された超音波振動を最適周波数に増幅する超音波ホーンで構成され、超音波ホーンの振動端が振動チップ２２の外面側に連結されている。
【００１６】
上述した破砕容器２０は、破砕装置（図示せず）に装着されて破砕容器２０が密閉されている状態で振動発生部２６から振動が与えられる。振動は、振動発生部２６が装着された剛性を有する振動チップ２２に伝達され、この振動チップ２２から検体溶液内の生物組織に直接的に伝播されて生物組織が破砕される。また、振動によるキャビテーションによって生物組織の試料が破砕される。ここで、振動チップが剛性を有することから、振動が、ほとんど減衰すること無く、効率的に生物組織の試料に伝達される。その結果、効果的に生物組織の試料が効果的に破砕される。すでに述べたように、破砕容器２０が密閉されていることから、振動によって生物組織の試料が外部に飛散することがなく、周囲の環境を汚染する事態を避け、また、核酸の漏出による別の試料への当該核酸の混入（クロスコンタミネーション）を防止することができる。
【００１７】
尚、振動発生部２６は、振動チップ２２に接触結合に限らず、機械的な嵌合連結、電磁力を利用した物理的な結合或いは接合部を介して連結されても良い。
【００１８】
破砕容器２０は、図示せぬ弁機構或いは連通遮断開放機構を介して核酸フィルターとして破砕対象物に含まれる不純物成分（タンパク質及び破砕片等）の吸着並びに核酸の分離機能を有するカラム６に連通されている。弁機構の解放或いは連通遮断開閉機構が開かれて破砕容器２０がカラム６に連通されると、破砕処理された破砕対象物を含む試料は、破砕容器２０と連通するカラム６に送られ、破砕物の破片或いはタンパク質等の不純物がカラム６でその通過が阻止される。その結果、核酸を含むサンプルがカラム６を通過されて次に説明するように反応容器部４２に輸送される。
【００１９】
このような試料の輸送に際しては、カラム６に負圧を与えて破砕容器２０から試料を吸引しても良い。また、破砕容器２０を圧縮して破砕容器２０から試料を押し出しても良く、或いは、図示しないシリンジから空気又は他の液体を破砕容器２０に注入して試料を押し出すようにしても良い。このような輸送を行うために生じた排液及び／又は空気などを送り込むための、減圧された袋（図示せず）などが核酸調製器具に設けられていても良い。破砕容器２０とカラム６とは、外部に対して密閉された構造を維持するように、例えば、流路、チューブ又はノズルなどの通路によって連通され、その通路内に弁機構、或いは、連通遮断開放機構が形成されても良い。
【００２０】
カラム６においては、上述したように破砕容器２０で生成された破砕物から核酸が抽出される。ここで、破砕物は、例えば、カラム６内に存在するフィルター及び／又はメッシュ等で通過が阻止され、また、抽出溶液中の不純物は、フィルター及び／又はメッシュ等の表面に吸着される。そして、核酸を含む抽出溶液は、フィルター及び／又はメッシュ等の通過を許されて核酸が抽出される。このカラム６には、表面に特殊なポリマーコーティングが施された微粒子材料が充填され、破砕物に含まれる核酸以外のタンパク質等の不純物を効率よく吸着させることができる。核酸は吸着することなく通過するため、短時間で核酸を効率的に精製することができる。このカラム６に充填される材料には、例えば、特表２００７−５３０７６０に示される材料を使用することができる。
【００２１】
カラム６は、密閉を維持したまま反応器部４２に連通され、カラム６を通過した核酸抽出物は、反応容器部４２に送られる。反応器部４２とカラム６とは、上述したと同様に、例えば、流路、チューブ又はノズルなどの通路によって連通され、その通路内に弁機構、或いは、連通遮断開放機構が形成されても良い。また、カラム６からの反応容器部４２の核酸抽出物の輸送は、吸引、シリンジによる空気又は他の液体の注入などによって行われる。反応容器部４２は、破砕容器２０と同様に、例えば、剛性を有するプレート２５上に透明な可撓性材料、例えば、樹脂（ポリプロピレン等）のシートで容器状に形成された密閉構造に作られても良い。或いは、反応容器部４２は、金属等で作られても良い。反応容器部４２の背面には、核酸増幅反応時にこの反応容器部４２を加熱し、一定温度に維持する為に外部から熱を伝達し易い平板状の熱伝達領域４４が形成されている。この熱伝達領域４４は、平板プレート２５の一部を簿肉化して熱を伝達し易くした領域に形成しても良く、或いは、良好な熱伝導率を有する金属が平板プレート２５に埋め込み固定された領域として形成されても良い。
【００２２】
この実施の形態に係る核酸調製器具においては、第１の増幅試薬が用いられて核酸抽出物中の標的核酸に対して第１の核酸増幅反応が行われ、標的核酸が増幅され、第１の核酸増幅反応に続いて、第２の増幅試薬が用いられて核酸抽出物中の標的核酸及び／又は、増幅核酸産物に対して第２の核酸増幅反応が行われて標的核酸が増幅される。ここで、第１の増幅試薬と第２の増幅試薬とは、同一組成の増幅試薬であっても良く、異なる組成の増幅試薬であっても良い。第１の増幅試薬と第２の増幅試薬とは、核酸抽出物に対して時間的に異なる第１及び第２のタイミングで第１及び第２の核酸増幅反応に寄与している。ここで、第１の増幅試薬は、反応容器部４２に予め収納され、或いは、核酸抽出物の輸送通路に予め固定されていても良い。
【００２３】
反応容器部４２は、反応容器部４２に供給される増幅試薬（第２増幅試薬或いは第１及び第２増幅試薬）を収納する試薬収納部４８に連通されている。試薬収納部４８は、破砕容器２０及び反応容器部４２と同様に、例えば、剛性を有するプレート２５上に透明な可撓性材料、例えば、樹脂（ポリプロピレン等）のシートで容器状に形成された密閉構造に作られても良い。また、反応器部４２と試薬収納部４８とは、上述したと同様に、例えば、流路、チューブ又はノズルなどの通路によって連通され、その通路内に弁機構、或いは、連通遮断開放機構が形成されても良い。また、試薬収納部４８からの増幅試薬の輸送は、吸引或いは試薬収納部４８の押し潰し等によって行われる。
【００２４】
反応容器部４２は、抽出された核酸中の標的核酸に対して行われる第１の増幅反応と、第１の増幅反応の増幅産物に対して行われる第２の増幅反応とが行われる反応場を提供する。ここで、既に述べたように、第１の増幅反応に寄与する第１の増幅試薬は、予め反応容器部４２に収納され、或いは、輸送路に固定されていても良い。また、反応容器部４２には、第１の増幅試薬が収納されず、或いは、輸送路に固定されず、核酸抽出物が反応容器部４２に収納された後、第１のタイミングで試薬収納部４８から第１の核酸増幅反応のための第１の増幅試薬が供給され、第１の核酸増幅反応の後の第２のタイミングで試薬収納部４８から第２の核酸増幅反応のための第２の増幅試薬が供給されても良い。ここで、第１の増幅試薬は、酵素、プライマー、ポリメラーゼ、塩及び逆転写酵素など第１の増幅反応に必要な試薬であれば良い。第１の増幅試薬は、例えば、試薬収容部４８の底部又は壁部などに固定されていて輸送の際に固定が開放されて押し出されて輸送されても良く、供給の際に試薬収容部４８内の液体と混合されて輸送されても良い。また、第１の増幅試薬は、液体に含まれて試料収容部４４内に収容されていても良く、粉末状であっても良い。第１の増幅試薬は、反応容器部４２内に収納されていても良い、反応容器部４２と連通する連通路内に用意されていても良い。
【００２５】
試薬収容部４８には、第１の増幅反応で生成した増幅産物に対して行われる第２の核酸増幅反応に用いられる第２の増幅試薬が収容される。第２の増幅試薬は、第１の増幅試薬と同様に酵素、プライマー、ポリメラーゼ、塩及び逆転写酵素など第２の増幅反応に必要な試薬であれば良い。第２の増幅試薬の組成は、第１の増幅試薬と同じであっても良く、或いは、異なっていても良い。プライマーは、第１の増幅反応に用いられるものと同じであっても良く、或いは、異なっていても良い。しかしながら、第２の増幅試薬に含まれるプライマーの結合する配列は、第１の増幅試薬に含まれるプライマーが結合する配列よりも内側の配列であるように設計されていることが好ましい。第２の増幅反応に用いられる増幅試薬には、核酸の二重鎖に結合する蛍光色素が含まれていてもよい。それによって、第２の増幅反応を行う際に増幅反応混合物の蛍光強度を測定することによって核酸の検出を行うことが可能となる。蛍光強度を測定する場合には、反応容器部４２は、外部から蛍光を観察できる光透過性の部材で作られることが好ましい。光透過性の部材で作られることによって、増幅産物を容器から取り出すことなく核酸を検出することができる。反応容器部４２が光透過性の部材で作られることによって、増幅産物の取り出し伴うコンタミネーションを防止することができる。第２の増幅試薬は、液体に含まれて第２の試料収容部内に収容されていても良く、或いは、粉末状であっても良い。第２の増幅試薬は、第１の増幅反応中の第２のタイミング、又は、第１の増幅反応が完了した後の第２のタイミングで反応容器部４２に送られる。このような輸送は、吸引、試薬収容部の圧縮、シリンジによる空気又は他の液体の注入などによって実施される。
【００２６】
上述した第１及び第２の増幅反応は、例えば、ＰＣＲ増幅、ＬＡＭＰ増幅、ＲＴ−ＬＡＭＰ増幅、ＳＭＡＰ増幅及びＩＣＡＮ増幅等のいずれであっても良い。また、第１及び第２の増幅反応は、例えば、ネステッド増幅反応であっても良い。更に、第１及び第２の増幅反応は、同じ条件で行われてもよく、異なる条件で行われてもよい。
【００２７】
上述した説明においては、反応容器部４２において、第１のタイミングで第１の核酸増幅反応が実施され、第２のタイミングで第１の核酸増幅反応が実施される旨を説明しているが、第１及び第２のタイミングに限らず複数のタイミング（ｎ回のタイミング）でｎ回の核酸増幅反応が実施されても良い。ここで、ｎ回の核酸増幅反応のための増幅試薬は、第２の試料収容部から供給され、或いは、輸送路或いは他の収容部等の他の試薬収容箇所から供給されれば良い。
【００２８】
図１に示される核酸調製器具においては、閉じられた系内で生物試料を破砕し、破砕物から核酸を取り出し、核酸を複数回に亘って増幅している。従って、第１の実施形態に係る核酸調製器具によれば、標的配列を効率よく増幅し、試料に含まれる核酸が微量であっても検出することができる。また、この核酸調製器具では、組織の破砕、核酸の抽出、核酸の増幅及び核酸の検出を密閉状態で行っていることから、外部環境の汚染（コンタミネーション）及び核酸の漏出による別の試料への当該核酸の混入（クロスコンタミネーション）を防止することができる。
【００２９】
（実施形態２）
図２には、第２の実施形態に係る核酸調製器具が示されている。図２において、図１に付した符号と同一符号を付した部分或いは箇所は、同一部分或いは箇所を示し、その説明は、省略する。
【００３０】
図２に示される核酸調製器具においては、反応容器部（第１の反応容器）４２には、直列に他の反応容器部（第２の反応容器）５２が輸送路で連結され、第２の反応容器５２には、第２の反応容器部５２に供給される増幅試薬（第２増幅試薬或いは第３増幅試薬）を収納する第２の試薬収納部５８に連通されている。第２の試薬収納部５８は、試薬収納部（第１の試薬収納部）４８と同様に、熱伝達領域４４と同様の平板状の熱伝達領域５４上に配置されている。
【００３１】
また、第２の反応容器部５２と第２の試薬収容部５８とは、密閉構造を維持するように、流路、チューブ又はノズルなどの通路によって連通されている。反応容器部５２から第２の試薬収容部５８までの通路内に弁機構、或いは、連通遮断開放機構が形成されても良い。また、第２の試薬収納部５８からの増幅試薬の輸送は、吸引或いは第２の試薬収納部５８の押し潰し等によって行われる。
【００３２】
第２の試薬収容部５８には、第１の反応容器部４２内における増幅反応で生成した増幅産物に対する第２或いは第３の核酸増幅反応に用いられる第２或いは第３の増幅試薬が収容されている。第２或いは第３の増幅試薬は、酵素、プライマー、ポリメラーゼ、塩及び逆転写酵素など第２或いは第３の増幅反応に必要な試薬であれば良い。第２或いは第３の増幅試薬の組成は、第１の増幅試薬と同じであっても良く、或いは、異なっていても良い。プライマーは、第１の増幅反応に用いられるものと同じであっても良く、或いは、異なっていても良い。しかしながら、第２或いは第３の増幅試薬に含まれるプライマーが結合する配列は、第１の増幅試薬に含まれるプライマーが結合する配列よりも内側の配列であるように設計されていることが好ましい。第２或いは第３の増幅反応に用いられる増幅試薬には、核酸の二重鎖に結合する蛍光色素が含まれていても良い。蛍光色素が含まれることによって、第２或いは第３の増幅反応を行う際に増幅反応混合物の蛍光強度を測定することによって核酸の検出を行うことが可能である。蛍光強度を測定する場合には、反応容器部５２は、外部から蛍光を観察できる光透過性の部材で形成される。反応容器部５２が透明であることによって、増幅産物を容器から取り出すことなく核酸を検出できる。それによってコンタミネーションが防止される。反応容器部５２への輸送は、吸引、試薬収容部の圧縮、シリンジによる空気又は他の液体の注入などによって行われる。
【００３３】
図２に示される核酸調製器具においては、閉じられた系内で生物試料を破砕し、破砕物から核酸を取り出し、核酸を複数回に亘って増幅している。従って、この第２の実施形態に係る核酸調製器具によれば、標的配列を効率よく増幅し、試料に含まれる核酸が微量であっても検出することができる。また、この核酸調製器具では、組織の破砕、核酸の抽出、核酸の増幅及び核酸の検出を密閉状態で行っていることから、外部環境の汚染（コンタミネーション）及び核酸の漏出による別の試料への当該核酸の混入（クロスコンタミネーション）を防止することができる。
【００３４】
（実施形態３）
図３には、第３の実施形態に係る核酸調製器具が示されている。図３において、図１及び図２に付した符号と同一符号を付した部分或いは箇所は、同一部分或いは箇所を示し、その説明は、省略する。
【００３５】
図３に示される核酸調製器具においては、破砕容器部２０に代えて生物組織の試料を溶解する溶液が収納されている溶解溶液部３０が設けられている。溶解溶液部３０は、上述したと同様に、密閉構造に形成され、例えば、流路、チューブ又はノズル等の輸送通路を介して処理液保存部３２に連通されている。この輸送通路には、上述したと同様に弁機構、或いは、連通遮断開放機構が設けられ、任意のタイミングで溶解溶液を溶解溶液部３０から処理液保存部３２に輸送することができる。
【００３６】
処理液保存部３２は、密閉を維持したまま、例えば、流路、チューブ又はノズル等の輸送通路を介して濾過室部３６に連通され、その通路内に弁機構、或いは、連通遮断開放機構が形成されている。濾過室部３６には、溶解された試料溶液からタンパク質等の不純物を取り除く濾過部材、濾過ビーズ等が収納されている。この濾過部材は、処理液保存部３２からの処理液で活性化される材料であって、弁機構、或いは、連通遮断開放機構が開放されて処理液保存部３２から処理液が供給されて活性化され、その後、処理液保存部３２を介して溶解溶液部３０から濾過室部３６に溶解溶液が輸送されて溶解溶液が濾過の為に処理される。
【００３７】
濾過室部３６には、フィルター３８が設けられ、このフィルター３８が設けられた輸送路を介して密閉状態を維持したまま回収部３４に連通されている。濾過室部３６内にて処理された溶解溶液からは、組織片、タンパク質等の不純物がフィルター３８で濾過されて核酸を含む溶液がこのフィルター３８を介して回収部３４に輸送される。回収部３４は、増幅反応場を提供する反応容器部４６内空間に輸送路を介して連通されている。
【００３８】
回収部３４には、第１の増幅試薬が収納され、核酸を含む溶液と混合されて外部から閉塞された反応容器部４６内の増幅反応場に供給される。反応容器部４６は、外部から熱を加えることが可能に、例えば、恒温槽で加熱可能に構成され、外部から加熱された状態の第１タイミングで、第１の増幅試薬を利用する第１の核酸増幅反応で核酸が増幅される。
【００３９】
尚、回収部３４は、必ずしも設けられなくとも良く、濾過室部３６がフィルター３８及び輸送路を介して直接に反応容器部４６に連結されていても良い。回収部３４が設けられない場合には、第１の増幅試薬は、輸送路中、或いは、反応容器中に予め設けられれば良い。
【００４０】
この反応容器部４６は、試薬収容部４８に輸送路を介して連通され、その通路内に弁機構、或いは、連通遮断開放機構が形成されている。第１の増幅試薬を利用する第１の核酸増幅反応後の第２タイミングで弁機構、或いは、連通遮断開放機構が開放されて試薬収容部４８から第２の増幅試薬が反応容器部４６に供給される。従って、反応容器部４６が外部から加熱され状態の第２タイミングで、第２の増幅試薬を利用する第２の核酸増幅反応で増幅反応場内の核酸及び／又は増幅産物が更に増幅される。
【００４１】
図３に示される核酸調製器具も図１及び図２に示される核酸調製器具と同様に、各部が剛性を有する平板プレート２５上に透明な可撓性材料、例えば、樹脂のシート（ポリプロピレン等のシート）で閉塞された空間収納部が形成されても良い。ここで、濾過室部３６は、フィルター３８を介して回収部３４に連通されることから、輸送路は、平板プレート２５に設けた流通孔を介して平板にプレート２４の背面側の輸送路を介して連通されても良い。
【００４２】
上述した実施形態においては、破砕容器２０、カラム６、反応容器部４２、５２、第１の試薬収容部４８と、第２の試薬収容部５８は、一体構造に限らず、閉塞した系を保つ限り互いに連通した別体の密閉構造に構成されても良い。より詳細には、破砕容器２０の内部、カラム６の内部、反応容器部４２、５２の内部、第１の試薬収容部４８の内部、第２の試薬収容部５８の内部、これらを連通する部材の内部からなる空間が流体的に閉鎖系で構成される。流体的に閉鎖系とは、密閉、密封又は液密等であることを意味している。生物組織の試料の破砕、核酸の抽出及び核酸の増幅が閉鎖系で行われることから、外部環境のコンタミネーション及び核酸の漏出による別の試料への当該核酸の混入（クロスコンタミネーション）を防ぐことができる。
【００４３】
以上の構成によって、コンタミネーションを引き起こすことなく、破砕対象に含まれ得る核酸を調製することができる。また、２段階以上の増幅を行うことによって、抽出物に含まれる微量な核酸を効率よく増幅し、精度のよい検出を可能としている。
【００４４】
尚、増幅産物の検出は、例えば、濁度又は蛍光を指標に行い得る。濁度を指標にする増幅産物の検出は、例えば、濁度計、吸光度計、及び目視などで行えばよい。蛍光を指標にする増幅産物の検出は、例えば、カルセインを含む蛍光試薬やインターカレーター又は蛍光標識したプローブ核酸などの、増幅産物に結合して蛍光を生ずる試薬或いは増幅産物又は増幅反応の存在に応じて蛍光を生ずる試薬などを用い、生じた蛍光を検出することにより行われればよい。
【００４５】
更に他の実施形態として、反応容器部４２、５２は、複数あっても良い。このような実施形態にあっては、一つのカラム６に対して複数の反応容器部４２が連通され、複数の反応容器部４２のそれぞれに第１の試薬収容部及び／又は第２の試薬収容部が連通されても良い。各複数の第１又は第２の試料収容部に収容されている第１又は第２の試薬それぞれには、互いに異なる配列を増幅するためのプライマーがそれぞれ含まれていても良い。
【００４６】
更にまた他の実施形態において、複数の核酸調製器具を含むキットが提供されても良い。そのような複数の核酸調製器具には、互いに異なる又は同じ組成の第１の増幅試薬及び／又は第２の増幅試薬がそれぞれ含まれていても良い。
【００４７】
この実施の形態の核酸調製器具によれば、核酸を効率よくまた精度よく検出し、コンタミネーションを防止することが可能である。
【００４８】
尚、上述した種々の実施例において、破砕対象が硬い生物組織である場合には、ビーズが破砕容器２０に組織とともに収容され、ビーズの振動に伴う接触によっても生物組織が破砕されるようにしても良い。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
【符号の説明】
【００５０】
２…破砕部、４…反応部、６…カラム、２０…破砕容器、２２…振動チップ、２４…蓋部、２５…平板プレート、２６…振動発生部、３０…溶解溶液部、３２…処理液保存部、３４…回収部、３６…濾過室部、３８…フィルター、５２…反応容器部、４８、５８…試薬収納部、４６…キャップ部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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