(57)【要約】【課題】アミノ基を有するグルコースをプライマーとして用いることで新規な特性を有するセルロース構造体を合成することを課題とする。【解決手段】  本発明によると、式（Ｉ）：2018174871.tif 000017［式中、ｍは、４〜１４である］で示される化合物を構成成分として含有するセルロース構造体が提供される。【選択図】図１
2018174871.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）：
【化１】
2018174871.tif 000014
［式中、ｍは、４〜１４である］
で示される化合物を構成成分として含有するセルロース構造体。
【請求項２】
ナノリボン構造体を有する、請求項１に記載のセルロース構造体。
【請求項３】
沈殿物である、請求項１または２に記載のセルロース構造体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のセルロース構造体を含むタンパク質の吸着剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載のセルロース構造体を含むタンパク質の固定化担体。
【請求項６】
前記タンパク質が酵素である、請求項５に記載の固定化担体。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項記載のセルロース構造体を含む細胞の足場材。
【請求項８】
α−Ｄ−グルコース一リン酸と、プライマーとして次式（ＩＩＩ）：
【化２】
2018174871.tif 000015
で示されるグルコース誘導体を、セロデキストリンホスホリラーゼと反応させる工程を含む、次式（Ｉ）：
【化３】
2018174871.tif 000016
［式中、ｍは、４〜１４である］
で示される化合物を構成成分として含有するセルロース構造体の製造方法。
【請求項９】
前記反応が６０℃で３日間実施される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記セロデキストリンホスホリラーゼの反応液中での濃度が０．２Ｕ／ｍＬ以上である、請求項８または９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば人工的に合成したセルロース構造体並びにその製造方法及び利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは、地球上で最も豊富に存在する有機高分子である。セルロースは、その資源性に加え、高いサステイナビリティをもつことから、注目されているマテリアル素材である。機械的処理や化学的処理によって天然物から得られるセルロースは、繊維状の形態であることが知られており、その構造や物性に応じた利用が展開されている。また、天然資源を酸処理することによって得られるセルロースナノ結晶（ＣＮＣ）は、新たなセルロース素材としての利用が期待されている。ＣＮＣは、セルロース鎖が平行に配列したＩ型結晶構造を有し、高いアスペクト比や優れた機械的強度、熱的安定性等から複合材料のフィラーとして注目されている。
【０００３】
一方、結晶性のセルロースが人工的にも合成できることが知られている（人工合成で得られるセルロースは一般にオリゴマーであることから、このようなセルロースはセロデキストリンと呼ばれる。ここでは、区別せずにすべてセルロースと呼ぶ）。下記の反応は、加リン酸分解酵素であるセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）の逆反応を利用したセルロースの酵素合成であり、プライマー（出発物質）として働くＤ−（＋）−グルコースに対して、α−グルコース−１−リン酸（αＧ１Ｐ）がモノマーとして逐次的に重合される。
【０００４】
【化１】
2018174871.tif 000003
（図中、ｎはセルロースの重合度を示す。）
【０００５】
上述の反応により、長さ数μｍ、幅数百ｎｍ、厚さ４．５ｎｍのナノシート構造を有するセルロース結晶（セルロースナノシート；ＣＮＳ）が得られる（非特許文献１）。さらに、本発明者の一部は、上記ＣＤＰを利用したセルロースの酵素合成において、プライマーとしてＣ２−５−直鎖状アルキル基又はＣ２−５を主鎖とする分岐状アルキル基を有するグルコース誘導体を用いることで、スポンジ状の構造等の溶媒を含む三次元網目構造を有するセルロースナノ構造体を作製できること（特許文献１）、また水溶性高分子存在下で同様にセルロースを合成すると、その二次元結晶がさらに成長し、ナノリボン状のネットワーク構造を形成することを見出した（特許文献２）。本発明者の一部は、上記ＣＤＰを利用したセルロースの酵素合成において、プライマーとして繰り返し単位を有する親水性置換基を有するグルコース誘導体を用いることでもナノリボン状のネットワーク構造を形成することをさらに見出した（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１５／０７１０４７
【特許文献２】国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０５７２５３
【特許文献３】特願２０１６−１１８２２７
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍ．Ｈｉｒａｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００９年，Ｖｏｌ．３４４，ｐｐ．２４６８−２４７３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、アミノ基を有するグルコースをプライマーとして用いることで新規な特性を有するセルロース構造体を合成することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
プライマーに対してα−グルコース−１−リン酸（αＧ１Ｐ）を脱リン酸化しながら結合させるＣＤＰを用いたセルロースの合成において、アミノ基を有するグルコースをプライマーに用いると、セルロース誘導体からなるセルロース構造体が一段階で酵素合成できることを見出した。また、得られたセルロース構造体は酵素であるタンパク質を、活性を維持したまま吸着させることができるものであった。
【００１０】
本発明は、次式（Ｉ）：
【化２】
2018174871.tif 000004
［式中、ｍは、４〜１４である］
で示される化合物を構成成分とするセルロース構造体を包含する。
【００１１】
本発明はさらに、α−グルコース−１−リン酸と、プライマーとしての
次式（ＩＩ）：
【化３】
2018174871.tif 000005
の化合物とを反応させる工程を含む、次式（Ｉ）：
【化４】
2018174871.tif 000006
［式中、ｍは、４〜１４である］
で示される化合物を構成成分とするセルロース構造体の製造方法を包含する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、足場材などの医療分野、およびフィルムなどの環境・エネルギー分野において有用なセルロースのみからなる構造体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明によるアミノ基をもつセルロース構造体（図１左）の反転倒立試験の結果を示す（図１右）。
【図２】本発明によるアミノ基をもつセルロース構造体の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。図中、ｎはアミノ基をもつセルロース構造体の重合度を示す。
【図３】本発明によるアミノ基をもつセルロース構造体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。
【図４】本発明によるアミノ基をもつセルロース構造体のＷＡＸＤチャートを示す。
【図５】本発明によるアミノ基をもつセルロース構造体のＡＴＲ／ＦＴＩＲスペクトルを示す。
【図６】本発明によるアミノ基をもつセルロース構造体のＡＦＭ像を示す。スケールバーは１μｍを示す。
【図７】本発明によるアミノ基をもつセルロース構造体のＴＥＭ像を示す。
【図８】本発明によるアミノ基をもつセルロース構造体（第一級アミノ基（＋））及びアミノ基を持たないセルロース構造体（−）に対する血清アルブミン（ＢＳＡ）の吸着特性を評価した結果を示す。（ａ）のグラフは、横軸にＢＳＡの初期濃度（μＭ）を示し、縦軸に吸着平衡に達した後の上清中のＢＳＡの濃度（μＭ）を示す。（ｂ）のグラフは、横軸にＢＳＡの初期濃度（μＭ）を示し、縦軸に吸着平衡に達した後のセルロース構造体の単位面積あたりのＢＳＡの吸着量（ｎｇｃｍ−２）を示す。
【図９】本発明によるアミノ基をもつセルロース構造体と５μＭの初期濃度のＢＳＡとを混合してインキュベーションした後の構造体のＡＦＭ像を示す。
【図１０】本発明によるアミノ基をもつセルロース構造体に対する、３つのタンパク質（フィブリノーゲン、トランスフェリン、ＩｇＧ）の吸着特性を評価した結果を示す。（ａ）のグラフは、横軸にフィブリノーゲン（上）、トランスフェリン（中）またはＩｇＧ（下）の初期濃度（μＭ）を示し、縦軸に吸着平衡に達した後の上清中のそれぞれのタンパク質の濃度（μＭ）を示す。（ｂ）のグラフは、フィブリノーゲン（上）、トランスフェリン（中）またはＩｇＧ（下）のアミノ基をもつセルロース構造体に対する単位面積あたりのタンパク質の吸着量（縦軸、ｎｇｃｍ−２）を、平衡濃度に対してプロットし、Ｌａｎｇｍｕｉｒ型の吸着等温式によりフィッティングしたグラフである。
【図１１】本発明によるアミノ基をもつセルロース構造体に対する、３つのタンパク質（シトクロムＣ、リゾチーム、トリプシン）の吸着特性を評価した結果を示す。横軸にシトクロムＣ（左）、リゾチーム（中）またはトリプシン（右）の初期濃度（μＭ）を示し、縦軸に吸着平衡に達した後の上清中のそれぞれのタンパク質の濃度（μＭ）を示す。
【図１２】ＢＳＡ吸着による、本発明によるアミノ基をもつセルロース構造体のゼータ電位の変化を示す。０、１、２、３、５、１０、２０μＭの初期濃度のＢＳＡと本発明によるアミノ基をもつセルロース構造体を混合してインキュベーションし、吸着平衡に達した後に未吸着のＢＳＡを除去した後にゼータ電位を測定している。横軸はゼータ電位（ｍＶ）を示し、縦軸は強度を示す。
【図１３】塩濃度の変化による、本発明によるアミノ基をもつセルロース構造体へのＢＳＡ吸着量の変化を示す。グラフ中横軸で示す塩濃度（ｍＭ）において本発明によるアミノ基をもつセルロース構造体と初期濃度５μＭのＢＳＡとを混合してインキュベーションし、吸着平衡に達した後に算出したアミノ基をもつセルロース構造体の単位面積あたりのＢＳＡの吸着量（ｎｇｃｍ−２）を縦軸に示している。
【図１４】本発明によるアミノ基をもつセルロース構造体に吸着したβ−Ｇａｌの活性の評価を示す。終濃度０．０５％のアミノ基をもつセルロース混合物と終濃度５ｎＭのβ−Ｇａｌとを混合し、２５℃で１時間静置した後に上清と沈殿に分離し、それぞれのβ−Ｇａｌの活性を示している。遊離したβ−Ｇａｌ（ナノリボン（−））の活性を１００％としたときの相対活性を縦軸に示している。
【図１５】本発明によるアミノ基をもつセルロース構造体の細胞毒性を評価した結果を示す。０％（ｗ／ｖ）、０．００１％（ｗ／ｖ）、０．０１％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）のセルロース構造体の存在下でＨｅＬａ細胞を７２時間培養し、生細胞（緑）および死細胞（赤）をそれぞれ染色して蛍光顕微鏡で撮像した。スケールバーは１００μｍを示す。
【図１６】本発明によるアミノ基をもつセルロース構造体の細胞毒性を評価した結果を示す。０％（ｗ／ｖ）、０．００１％（ｗ／ｖ）、０．０１％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）のセルロース構造体の存在下でＨｅＬａ細胞を１日間もしくは３日間培養した後の生存率（％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．本発明に係るセルロース構造体は、
次式（ＩＩ）：
【化５】
2018174871.tif 000007
［式中、ｍは、４〜１４である］
で示される化合物を構成成分として含有するものである。
【００１５】
上述の式（Ｉ）で表される化合物の平均重合度は１０であり、Ｄ−グルコースをプライマーとして酵素合成した場合のセルロースオリゴマーの平均重合度（Ａｖｅｒａｇｅ  ＤＰ  〜１０）（Ｔ．Ｓｅｒｉｚａｗａら，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２０１６年，４８，５３９−５４４）と同程度である。また、当該化合物の平均重合度は１０と算出され、上述のＤ−グルコースをプライマーとした場合と同程度である。
【００１６】
式（Ｉ）の化合物の重合度は、例えば６以上、好ましくは７以上（すなわち、式（Ｉ）の化合物において、ｎが４以上、好ましくは５以上）であり、且つ１６以下、好ましくは１５以下（すなわち、式（Ｉ）の化合物において、ｎが１４以下、好ましくは１３以下）である。
【００１７】
天然由来のセルロース鎖が平行に配列したＩ型セルロース構造とは異なり本発明に係るセルロース構造体は、熱力学的に安定であるセルロースＩＩ型結晶形を形成する。これは、Ｄ−グルコースをプライマーとした場合にセルロースオリゴマーが形成する結晶形と同様であり、セルロース鎖末端の２−アミノエチル基は結晶形に影響を与えない。２−アミノエチル基をもつセルロース誘導体はナノリボンの膜厚方向に配列してラメラ結晶を形成しており、セルロース鎖末端のアミノ基をナノリボンの表面に露出している。
【００１８】
本発明に係るセルロース構造体は、リボン状の構造体（ナノリボン）を有する。このナノリボンは、ハイドロゲルを形成せず、沈殿物として得られる。
【００１９】
本間明細書中で「ハイドロゲル」は、液体に対して不溶性であり、水を内部に含み、三次元構造をもつ高分子物質およびその膨潤体を示す。一方で、本明細書中で「沈殿物」は、液体に対して不溶性である、内部に液体を含まない構造体を示す。沈殿物の例はＴ．Ｓｅｒｉｚａｗａら，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２０１６年，４８，５３９−５４４などを参照できる。
【００２０】
本発明に係るセルロース構造体は、タンパク質を吸着する。吸着されるタンパク質は単層吸着し、構造体の両面にサンドイッチ様に単層吸着する。この吸着には静電相互作用が寄与する。
【００２１】
本発明に係るセルロース構造体は、タンパク質酵素をその活性を維持したまま吸着することができる。
【００２２】
本発明に係るセルロース構造体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養環境では顕著な細胞毒性を示さない。
【００２３】
２．  本発明に係るセルロース構造体の製造方法。
上述の本発明に係るセルロース構造体は、以下に示される反応に準じて製造することができる。
【００２４】
【化６】
2018174871.tif 000008
（図中、ｎはアミノ基をもつセルロース誘導体の重合度を示す。）
【００２５】
これはＣＤＰの逆反応を利用した酵素合成によるものであり、プライマーとしての２−アミノエチル−β−Ｄ−グルコシドと、基質としてのαＧ１ＰをＣＤＰと反応させることによって、本発明に係るセルロース構造体を製造することができる。プライマーとしての２−アミノエチル−β−Ｄ−グルコシドに対してαＧ１Ｐがモノマーとして逐次的に重合される。
【００２６】
この反応に用いるＣＤＰの濃度は、０．１Ｕ／ｍｌ以上であってよく、０．２Ｕ／ｍｌ以上または０．４Ｕ／ｍｌであってもよい。
【００２７】
αＧ１Ｐは、市販品として入手できるものであってよい。
【００２８】
２−アミノエチル−β−Ｄ−グルコシドは、例えばＢ．Ｒａｏら，Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１３年，４９，１０８０８−１０８１０．に記載の方法を参考にして合成できるがこれには限定されない。具体的には、Ｏ−ペンタアセチル−β−Ｄ−グルコシドと２−ブロモエタノールとからＯ−テトラアセチル−２−ブロモエチル−β−Ｄ−グルコシドを合成し、Ｏ−ペンタアセチル−２−ブロモエチル−β−Ｄ−グルコシドとアジ化ナトリウムとからＯ−ペンタアセチル−２−アジドエチル−β−Ｄ−グルコシドを合成し、ナトリウムメトキシドによって脱アセチル化し、その後アジド基を還元することにより２−アミノエチル−β−Ｄ−グルコシドを得ることが出来るがこれには限定されない。
【００２９】
一方、ＣＤＰは、例えばＭ．Ｋｒｉｓｈｎａｒｅｄｄｙら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００２年，４９，１−８に記載の方法に準じて調製することができるがこれには限定されない。具体的には、Ｍ．Ｋｒｉｓｈｎａｒｅｄｄｙら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００２年，４９，１−８によれば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ＹＭ４株由来のＣＤＰを調製することができるがこれには限定されない。
【００３０】
ＣＤＰの酵素量は、例えば、酵素活性をもとに決定することができる。この場合、例えば、αＧ１ＰとＤ−（＋）−セロビオースおよびＣＤＰをインキュベーションし、ＣＤＰにより生成されるリン酸を定量し、１分間あたり１μｍｏｌのリン酸を遊離する酵素量を１Ｕとすることができる。
【００３１】
例えば、１０〜１０００ｍＭ（好ましくは１００〜３００ｍＭ）のαＧ１Ｐ、１０〜２００ｍＭ（好ましくは５０〜６０ｍＭ）の式（ＩＩ）の２−アミノエチル−β−Ｄ−グルコシド、及び０．１Ｕ／ｍＬ以上（または０．２Ｕ／ｍＬ以上、好ましくは０．４Ｕ／ｍＬ以上）のＣＤＰを、１００〜１０００ｍＭ（好ましくは２５０〜７５０ｍＭ）の２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０（好ましくはｐＨ７．５））中で混合し、１０〜８０℃（好ましくは、２０〜６０℃）で３０分間〜３０日間（好ましくは、１時間〜１４日間）インキュベートし、反応させることで、本発明に係るセルロース構造体を製造することができる。
【００３２】
３．本発明に係るセルロース構造体の用途
３−１．医療分野
３−１−１．細胞培養足場材
本発明に係るセルロース構造体は、その表面に動物細胞を生育させる足場材として使用することができる。本発明に係るセルロース構造体は顕著な細胞毒性を示さないため、この用途に特に有用である。
【００３３】
生育させる細胞としては、動物由来であれば良く、例えば哺乳類、爬虫類、両生類、又は昆虫由来の細胞が挙げられる。また、心臓、肝臓、脾臓、表皮等の臓器や組織から分離した初代培養細胞でも、継代培養した株化細胞、腫瘍細胞でも良い。さらに、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）等の体性幹細胞、人工多能性幹細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞等の細胞株（Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ）等でも良い。
【００３４】
細胞培養に用いる培地としては、平衡塩類溶液にアミノ酸やビタミン等の低分子化合物を加えた基礎培地が挙げられる。さらに、血清或いは血清・組織抽出物、加水分解物、成長因子、ホルモン、搬送体タンパク質、脂質、ポリアミン酸、微量元素、ビタミン、増粘剤、界面活性剤、細胞接着因子等を添加した培地を使用することもできる。
【００３５】
本発明に係るセルロース構造体は、酵素をその活性を維持したまま吸着させることができるため、当該添加物をセルロース構造体に吸着させて使用することもできる。
【００３６】
当該セルロース構造体を、薄膜状に成形して、薄膜の表面で細胞を培養できる。栄養成分を薄膜底面からも供給することで培養効率を高めることができる。
【００３７】
当該セルロース構造体上に単層状に生育した細胞は、細胞剥離剤にて剥離し回収することができる。細胞剥離剤には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の２価カチオン除去のためのキレート剤、細胞・基質間、細胞・細胞間接着タンパク質のためのトリプシン等のプロテアーゼを用いることもできるし、セルラーゼにより当該セルロース構造体の一部又は全部を分解し、可溶化することで細胞を剥離することもできる。プロテアーゼを用いない後者の方法では、細胞・細胞間の接着は剥離することなく、また細胞への影響も無いことから、活性の高い懸濁細胞又は細胞シートを得ることができる。
【００３８】
得られた細胞シートは、同様に得られた細胞シートと積層するか、或いは細胞シートの表面を細胞間接着タンパク質等でコートし、さらに細胞を培養することで、三次元的に厚みを持った細胞塊を得ることができる。
【００３９】
３−１−２．高濃度細胞培養用足場材
本発明に係るセルロース構造体は、その内部に動物細胞を生育させる足場材として使用することができる。当該セルロース構造体を、細胞が入ることができる大きさ程度又はそれ以上の空隙を持つ構造体に成形し、構造体の中で細胞を培養することができる。本発明に係るセルロース構造体は顕著な細胞毒性を示さないため、この用途に特に有用である。
【００４０】
生育させる細胞は、上記の第３−１−１節に記載するように、動物由来であればどのような細胞でも良い。また、培養に用いる培地は、上記の第３−１−１節に記載するように、基礎培地、血清添加培地又はその他成分を添加した培地でも良い。さらにそれらの添加物は、上記の第３−１−１節に記載するように、セルロース構造体に吸着させて使用しても良い。
【００４１】
当該セルロース構造体中で細胞を培養することで、浮遊懸濁培養の際に起こる撹拌のせん断応力による細胞の傷害が起こらず、培養液当たりの細胞の高濃度化が可能となる。
【００４２】
また、抗体やタンパク質等のバイオ医薬品の生成能を付与したｒＣＨＯ細胞等を当該セルロース構造体で高濃度に培養すれば、バッチ当たりの抗体やタンパク質等の生産量が増大し、バイオ医薬品の製造コスト低減が可能である。さらに、目的生産物を回収後、新しい培地を添加し、再度培養を行うか、或いは連続的に目的生産物を含む培地を回収し、新しい培地を追加添加することで、バッチ連続式又は連続式に生産物を得ることができる。
【００４３】
さらに、高濃度培養した細胞は、足場材として利用したセルロース構造体をセルラーゼ処理に供することで、プロテアーゼ処理の際に起こるような細胞への傷害を起こさずに細胞を遊離させ、回収することができる。ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の全能性幹細胞を当該手法で大量に培養し、再生医療や創薬産業のために必要な細胞を供給することができる。
【００４４】
３−１−３．三次元構造体足場材
本発明に係るセルロース構造体は、その内部に動物細胞を生育させる足場材として使用することができる。当該セルロース構造体を、細胞が入ることができる大きさ程度又はそれ以上の空隙を持つ構造体に成形し、構造体の中で細胞を培養することができる。本発明に係るセルロース構造体は顕著な細胞毒性を示さないため、この用途に特に有用である。
【００４５】
生育させる細胞は、上記の第３−１−１節に記載するように、動物由来であればどのような細胞でも良い。培養に用いる培地は、上記の第３−１−１節に記載するように、基礎培地、血清添加培地又はその他成分を添加した培地でも良い。さらにそれらの添加物は、上記の第３−１−１節に記載するように、セルロース構造体に吸着させて使用しても良い。
【００４６】
当該セルロース構造体を、細胞培養の前、途中又は後に、目的組織に合わせた形状に成形し、生体組織又は臓器の再生のために用いることができる。細胞培養の前に成形する場合、当該セルロース構造体の重合反応時に目的の形状の型枠で反応させることもできるし、成形後に切断、積層、編み込み等で目的の形状にすることができる。
【００４７】
当該セルロース構造体は、セルラーゼ処理により、細胞へ影響することなく分解可溶化することができる。臓器への移植する前に、セルラーゼ処理に供し、部分的に、又は全部を分解可溶化しても良いし、セルラーゼ処理に供することなく足場材と共に移植しても良い。
【００４８】
さらに、細胞を生育させた三次元構造体は、組織又は臓器の形状や機能を生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で再現したものとして、癌転移の機構解明、制癌剤の薬効評価等の基礎医学研究用、或いは、近年動物試験が禁止された化粧品の皮膚等の生体組織への影響を検討するための素材として利用することができる。
【００４９】
３−１−４．骨欠損部位への移植材料
本発明に係るセルロース構造体は、動物の骨欠損部位への移植材料、歯周組織の再生誘導材料としても使用することができる。当該セルロース構造体は、容易に望む形に成形加工することができ、高圧蒸気による滅菌も可能である。当該セルロース構造体は、移植する前に細胞を生着させても良いし、そのまま移植しても良い。
【００５０】
３−２．環境・エネルギー分野
下記に説明するように、本発明に係るセルロース構造体は、フィルム（例えば、微多孔性のフィルム（用途例：セパレータ、吸着材、バイオセンサー等）、緻密なフィルム（用途例：バリアフィルム等））として環境・エネルギー分野において使用することができる。本願に係るセルロース構造体は、タンパク質を吸着することができるため、タンパク質の吸着材として特に有用である。また、タンパク質を、活性を維持しながら吸着させることができるため、吸着させるタンパク質の機能を持つ高機能性のフィルムとしても使用できる。
【００５１】
３−２−１．電池セパレータ用途
本発明に係るセルロース構造体は、例えばリチウムイオン電池等の二次電池向けのセパレータとしても用いることができる。セパレータとして用いることにより、従来のポリオレフィン製のセパレータに比べ、高い耐熱性を有するため、例えば、過充電等により、電池が異常発熱した場合に、セパレータが融解し、内部短絡することを防ぐことができ、安全性を向上させることができる。また、親水性置換基の存在により、一般的に電池に用いられる極性溶媒等をより保持しやすく、安定したイオン伝導性、すなわち電池の入出力特性の維持が期待でき、寿命を向上させることが可能である。
【００５２】
３−２−２．吸着材、濃縮（生分解性）
本発明に係るセルロース構造体は、シリカ、アルミナ、ゼオライト、プルシアンブルー等の吸着材微粒子を分散、担持させることにより、アンモニア、アルデヒド等の有毒ガス、放射性廃棄物等の有害物質、海水中の有価金属等を吸着回収することが可能である。
【００５３】
また、当該セルロース構造体は、分解酵素を用いて簡単に分解可能であることから、吸着回収した物質を必要に応じて簡単に濃縮することができるといった特長も有する。
【００５４】
３−２−３．バイオセンサー
本発明に係るセルロース構造体は、酵素や抗体を担持することによってバイオセンサーとして使用することができる。例えば、グルコースオキシダーゼ等の酵素を担持すればグルコースセンサーとして使用することが可能であり、親水性置換基を活用し、例えば、ナトリウムイオン等のイオン伝導特性を観測すれば、血中のナトリウムイオン濃度等を計測するセンサーとして使用することが可能である。本発明に係るセルロース構造体はタンパク質を、活性を維持しつつ吸着させることができるためこの用途に特に有用である。
【００５５】
３−２−４．ガスバリアシート（構造体も含む）
本発明に係るセルロース構造体に無機ナノ材料を緻密に担持させることにより、例えば水蒸気等のガスを遮断するガスバリアシートとすることができる。無機ナノ材料としては、シリカ等のナノ粒子、又はモンモリロナイト等のクレイが挙げられる。これら無機ナノ材料と親水性置換基とは親和性が高く、強く相互作用するため、無機ナノ材料を強固に取り込んだ複合材料を形成し、バリア性を向上させることが可能である。
【００５６】
３−２−５．放熱シート
本発明に係るセルロース構造体に高熱伝導率を持つ材料を緻密に担持させることにより、放熱材料として使用することが可能である。高熱伝導率を持つ材料としては、ダイヤモンド、グラフェン、カーボンナノチューブ等の炭素系材料、銀、銅、金、アルミニウム等の金属材料、アルミナ、マグネシア、六方晶窒化ホウ素等の無機材料等が挙げられる。また、親水性置換基により、シート表面を柔らかくすることが可能であり、発熱体との密着性を改善させ、熱界面抵抗を低減することにより、放熱性を改善することが可能である。
【００５７】
３−２−６．蓄熱シート
本発明に係るセルロース構造体に蓄熱性を有する材料を分散、担持させることにより、蓄熱材として使用することが可能である。蓄熱材としては、エリスリトール、酢酸ナトリウム３水塩、硫酸ナトリウム１０水塩、パラフィン、Ｆｅ−Ｃｏ合金等の潜熱蓄熱材、その他、顕熱蓄熱材、化学蓄熱材等が挙げられる。潜熱蓄熱材は物質の相転移を利用するものであり、固液相転移を利用する蓄熱材の場合は、液状となった場合に漏洩が生じないように工夫する必要があり、例えば石油樹脂等のカプセル内に包含させる方法がある。
【００５８】
３−２−７．分離精製の基材（カラムの充填剤、電気泳動）
本発明に係るセルロース構造体は、ナノサイズの空間を有しているため、当該空間を利用して分離精製カラムや電気泳動の充填剤として用いることが可能である。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６０】
【化７】
2018174871.tif 000009
（図中、ｎはアミノ基をもつセルロース誘導体の重合度を示す。）
【００６１】
１．実験方法
１−１．試薬
ＬＢ−ＢＲＯＴＨ  ＬＥＮＮＯＸ及びＬＢ−ＡＧＡＲ  ＬＥＮＮＯＸはフナコシより購入した。
【００６２】
グリセロール、カナマイシン硫酸塩、イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：ＩＰＴＧ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチルエチレンジアミン（Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ：ＴＥＭＥＤ）、ジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ：ＤＴＴ）、１−ブタノール、αＧ１Ｐ二ナトリウム水和物、４０％重水酸化ナトリウム重水溶液、モレキュラーシーブス４Ａ、ダウエクスＴＭ５０ＷＸ４  １００−２００メッシュ強酸性陽イオン交換樹脂、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，９８％，プロテアーゼ不含）、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ウシ由来、ＩｇＧ、免疫化学用）、トランスフェリン（ヒト由来、細胞培養用）、ストレプトマイシン硫酸塩、１０×Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（Ｄ−ＰＢＳ（−）、細胞培養用）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドは和光純薬より購入した。
【００６３】
ジクロロメタン、酢酸エチル、シリカゲル６０Ｎ（４０−１００μｍ，球状、中性）は関東化学より購入した。
【００６４】
Ｏ−ペンタアセチル−β−Ｄ−グルコシド、２−ブロモエタノール、無水ヒドラジン、三ふっ化ホウ素ジエチルエーテル、ｐ−アニスアルデヒドは東京化成より購入した。
【００６５】
ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）アガロースゲルはＱＩＡＧＥＮより購入した。
【００６６】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）はタカラバイオより購入した。
【００６７】
アクリルアミド、Ｎ−Ｎ´−メチレンビスアクリルアミド、ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ：ＳＤＳ）、過硫酸アンモニウム（Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ：ＡＰＳ）、重水、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（２，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ：ＤＨＢＡ）、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ  Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  １−７  ＭＡＬＤＩ−ＭＳスタンダード（Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ  Ｐ１４Ｒ  ＭＡＬＤＩ−ＭＳスタンダード（Ｐ１４Ｒ）、ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ  ＡＣＴＨ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  １８−３９  ＭＡＬＤＩ−ＭＳスタンダード（ＡＣＴＨ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、アセトニトリル、リゾチーム（ニワトリ卵由来、＞９０％）、トリプシン（ブタ膵臓由来、ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔグレード）、シトクロム  Ｃ（ウマ心臓由来、＞９９％）、フィブリノーゲン（ウシ血漿由来、Ｔｙｐｅ  Ｉ−Ｓ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ，  Ｔｒｙｐｓｉｎ  ＥＤＴＡ（１０×）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより購入した。
【００６８】
日新ＥＭステイナーは、日新ＥＭ株式会社より購入した。
【００６９】
細胞培養用ウシ胎児血清（ＦＢＳ）はＢｉｏＷｅｓｔより取得した。
【００７０】
ＣａｌｌｓｔａｉｎＲ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ＫＩＴ−８は同仁化学研究所より取得した。
【００７１】
その他の試薬は、特に表記しない限りナカライテスクより購入し、特級以上の試薬を使用した。
【００７２】
超純水はＭｉｌｌｉ−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ａ−１０，Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により供給され、純水はＴＡＮＫ  ６０  Ｌｉｔｅ  ＰＥ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により供給された。
【００７３】
乾燥ジクロロメタンはＧｌａｓｓ  Ｃｏｎｔｏｕｒ有機溶剤精製装置（Ｎｉｋｋｏ  Ｈａｎｓｅｎ）で精製されたジクロロメタンを使用した。
【００７４】
１−２．ＣＤＰの調製及び酵素活性評価
ＣＤＰは、Ｍ．Ｋｒｉｓｈｎａｒｅｄｄｙら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００２年，４９，１−８．に記載の方法と同様の方法により調製した。
【００７５】
１−２−１．試薬の調製
（１）  滅菌精製水
５００ｍＬ広口メディウム瓶に超純水５００ｍＬを採取してオートクレーブ（１２１℃、２０分間、ＢＳ−２４５、ＴＯＭＹ）して室温で保存した。
【００７６】
（２）  ５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液
カナマイシン硫酸塩１．５ｇを滅菌精製水に溶解させ、３０ｍＬにメスアップした。調製した溶液をクリーンベンチ内でポリフッ化ビニリデン（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ：ＰＶＤＦ）製０．２２μｍフィルターで濾過滅菌し、１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して−２０℃で保存した。
【００７７】
（３）  １０ｍＭ  ＩＰＴＧストック溶液
ＩＰＴＧ  ７１．５ｍｇを滅菌精製水に溶解させ、３０ｍＬにメスアップした。調製した溶液をクリーンベンチ内でＰＶＤＦ製０．２２μｍフィルターで濾過滅菌した。１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して−２０℃で保存した。
【００７８】
（４）  ＬＢ−ＡＧＡＲ／カナマイシンプレート
２５０ｍＬ広口メディウム瓶にＬＢ−ＡＧＡＲ  ＬＥＮＮＯＸ２．８ｇを採取し、超純水８０ｍＬを添加して溶解させてオートクレーブした。６０℃以下まで室温で冷却した後、クリーンベンチ内で５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液８０μＬを加えて混合した。滅菌済みシャーレに分注して室温で固化させた後、４℃で保存した。調製後１ヶ月以内に使用した。
【００７９】
（５）  ５０％グリセロール溶液
２５０ｍＬ広口メディウム瓶にグリセロール５０ｍＬ、超純水５０ｍＬを加えて混合した後、オートクレーブして室温で保存した。
【００８０】
（６）  ＬＢ培地
５００ｍＬ広口メディウム瓶にＬＢ−ＢＲＯＴＨ  ＬＥＮＮＯＸ  １０ｇを純水５００ｍＬに溶解させ、オートクレーブして室温で保存した。
【００８１】
（７）  ＭＯＰＳ−Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）
３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）４．１８ｇを約６００ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、１Ｌにメスアップした。ＰＶＤＦ製０．１０μｍフィルターで濾過滅菌して４℃で保存した。
【００８２】
（８）  ７０％エタノール（バイオテクノロジーグレード）
エタノール（バイオテクノロジーグレード）１４０ｍＬ及び超純水６０ｍＬを２５０ｍＬ広口メディウム瓶に採取して混合した後、室温で保存した。
【００８３】
（９）  洗浄バッファー（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）
ＭＯＰＳ２．０９ｇ、塩化ナトリウム８．７７ｇ、イミダゾール３４０ｍｇを約３５０ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、５００ｍＬにメスアップした。ＰＶＤＦ製０．１０μｍフィルターで濾過滅菌して４℃で保存した。
【００８４】
（１０）  溶出バッファー（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）
ＭＯＰＳ２．０９ｇ、塩化ナトリウム８．７７ｇ、イミダゾール８．５１ｇを約３５０ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、５００ｍＬにメスアップした。ＰＶＤＦ製０．１０μｍフィルターで濾過滅菌して４℃で保存した。
【００８５】
（１１）  ５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムストック溶液
アジ化ナトリウム５００ｍｇをプラスチック製スパチュラにより秤量してＭＯＰＳ−Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）を添加して全量が１０ｍＬとなるよう溶解させて４℃で遮光保存した。
【００８６】
（１２）  ３０％アクリルアミド／ビス混合溶液
アクリルアミドは劇物であるため、調製には細心の注意を払った。アクリルアミド２９．２ｇ、Ｎ−Ｎ´−メチレンビスアクリルアミド０．８ｇを約７０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。全量が１００ｍＬになるようにメスアップして４℃で遮光保存した。
【００８７】
（１３）  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１．５Ｍ、ｐＨ８．８）
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）１８．１７ｇを約８０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。６Ｎ塩酸によりｐＨ８．８に調整後、全量が１００ｍＬになるようにメスアップして４℃で保存した。
【００８８】
（１４）  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ６．８）
Ｔｒｉｓ  ６．０６ｇを約８０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。６Ｎ塩酸によりｐＨ６．８に調整後、全量が１００ｍＬになるようにメスアップして４℃で保存した。
【００８９】
（１５）  １０％ＳＤＳ水溶液
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１０ｇを約９０ｍＬの超純水に撹拌しながら溶解させた。全量が１００ｍＬになるようにメスアップして室温で保存した。
【００９０】
（１６）  １０％ＡＰＳ水溶液
過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）０．１ｇを約１ｍＬの超純水に溶解させて４℃で保存した。
【００９１】
（１７）  飽和１−ブタノール
１−ブタノールと超純水を２：１の割合で混合して室温で保存した。
【００９２】
（１８）  ５×泳動バッファー（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、９６０ｍＭグリシン、０．５％ＳＤＳ）
Ｔｒｉｓ１５．１ｇ、グリシン７２．１ｇ、ＳＤＳ５．０ｇを全量が１Ｌとなるように超純水に溶解させて４℃で保存した。使用の際は超純水で５倍に希釈した。一度使用した泳動バッファーは回収して再度使用し、使用回数は最大で２回とした。
【００９３】
（１９）  ５×Ｌｏａｄｉｎｇバッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．０５％ブロモフェノールブルー、１０％ＳＤＳ、５０％グリセロール）
Ｔｒｉｓ２．４２ｇ、ＳＤＳ１０．０ｇ、ブロモフェノールブルー５０ｍｇを５０ｍＬのグリセロールと約４０ｍＬの超純水を添加して溶解させた。６Ｎ塩酸を用いてｐＨ６．８に調整後、１００ｍＬにメスアップした。１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して４℃で保存した。
【００９４】
（２０）  １ＭＤＴＴ溶液
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）約１５０ｍｇを１Ｍとなるように約１ｍＬの超純水を添加して溶解させ、−２０℃で保存した。
【００９５】
（２１）  固定液
酢酸５０ｍＬ、エタノール２００ｍＬを混合した後、超純水で５００ｍＬにメスアップして室温で保存した。
【００９６】
（２２）  脱色液
酢酸４０ｍＬ、エタノール１２５ｍＬを混合した後、超純水で５００ｍＬにメスアップして室温で保存した。
【００９７】
（２３）  染色液
クマシーブリリアントブルーＲ−２５０  ０．２５ｇを脱色液１００ｍＬに加え、撹拌して溶解させて室温で遮光保存した。
【００９８】
１−２−２．大腸菌の培養及びＣＤＰの発現
（１）  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰグリセロールストックの調製
ガスバーナーで加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、ＣＤＰの遺伝子を含むプラスミドをもつＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰ）のグリセロールストックからＬＢ−ＡＧＡＲ／カナマイシンプレートに植菌し、３７℃で８−１２時間培養した。加熱した白金耳を用いてシングルコロニーから、予め乾熱滅菌した試験管に加えた５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液５μＬとＬＢ培地５ｍＬの混合溶液に植菌した。ＯＤ６６０が０．６−０．８に達するまで振盪培養機（ＢＲ−２３ＦＰ、ＴＡＩＴＥＣ）で３７℃で振盪培養（往復、２００ｒｐｍ）した。その後、培養液８００μＬを１．７ｍＬチューブに採取し、５０％グリセロール溶液１００μＬを添加して混合した。液体窒素で凍結して−８０℃で保存した。
【００９９】
（２）  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰマスタープレートの調製
ガスバーナーで加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰのグリセロールストックもしくは作製後１ヶ月以内のマスタープレートからＬＢ−ＡＧＡＲ／カナマイシンプレートに植菌して３７℃で８−１２時間培養した。マスタープレートから植菌した場合はそのまま４℃で保存した。グリセロールストックから植菌した場合は、さらにＬＢ−ＡＧＡＲ／カナマイシンプレートに植菌して３７℃で８−１２時間培養して４℃で保存した。
【０１００】
（３）  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰ前培養液の調製
乾熱滅菌した試験管にＬＢ培地３ｍＬを採取して５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液３μＬを加えた。加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰマスタープレートのシングルコロニーから植菌した。振盪培養機を用いて３７℃で１０−１２時間振盪培養（往復、２００ｒｐｍ）した。
【０１０１】
（４）  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰの培養とＣＤＰの発現
２本の１Ｌバッフル付きフラスコにＬＢ−ＢＲＯＴＨ  ＬＥＮＮＯＸ６ｇをそれぞれ秤量して純水３００ｍＬを加えてオートクレーブして放冷した。５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンストック溶液３００μＬをそれぞれに添加して混合した後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰ前培養液３００μＬを加えた。振盪培養機を用いて３０℃で振盪培養（回転、６００ｒｐｍ）してＯＤ６６０が０．５５−０．６０に達したことを確認後、１０ｍＭ  ＩＰＴＧストック溶液３ｍＬをそれぞれ加えて２５℃で２０時間振盪培養（回転、２００ｒｐｍ）してＣＤＰを発現させた。
【０１０２】
１−２−３．Ｈｉｓタグ精製及び緩衝液置換
（１）  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰの破砕によるＣＤＰの抽出
１−２−２項（２）で調製したＣＤＰを発現させたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰ懸濁液を５０ｍＬチューブ１２本に約５０ｍＬずつ均等に分注し、遠心機（遠心機：ＥＸ−１２６、ＴＯＭＹ、ローター：３８５０−０４Ｐ、ＴＯＭＹ）を用いて遠心（３５００ｒｐｍ、２０分間、４℃）した。上清をデカンテーションにより除去し、沈澱したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰペレットにＭＯＰＳ−Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）を加えてそれぞれ約１５ｍＬにメスアップし、手で激しく振盪して懸濁させた。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰ懸濁液を４本の１００ｍＬ自立式チューブに約４５ｍＬずつ分注し、氷浴しながらプローブ式超音波照射器（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０、ＢＲＡＮＳＯＮ）を用いて超音波照射してＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰを破砕した。超音波照射は、ｐｏｗｅｒ：２００Ｗ（ダイヤル１０）、ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ：３０％の条件で２サイクル（５秒間超音波照射と２５秒間インターバルの４回繰り返しを１サイクル）行った。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰ破砕液にはＣＤＰの他にプロテアーゼ等が含まれていることから、それらによるＣＤＰの分解を防ぐために、以降はＥ．ｃｏｌｉ破砕液は常に氷浴した。４本の１００ｍＬチューブ中のＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰ破砕液をそれぞれ５０ｍＬチューブに移して遠心（３５００ｒｐｍ、＞２０分間、４℃）した。沈澱したＥ．ｃｏｌｉペレットが舞わないよう注意を払いながら、デカンテーションにより上清を５０ｍＬチューブに回収した。
【０１０３】
（２）  Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティーカラムによるＣＤＰの精製
コンタミネーションを避けるため、以後の精製操作で用いるマイクロピペットのチップ及び１．７ｍＬチューブはオートクレーブ後乾燥して用いた。
予め７０％エタノールで滅菌し、超純水で置換した直径１．８ｃｍ、長さ１０ｃｍのプラスチック製カラムに、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースゲル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）分散液９．８ｍＬを充填した。カラム内を１−２−１項（８）で調製した７０％エタノールで満たして流すことでＮＩ−ＮＴＡアガロースゲルを殺菌・洗浄した。この操作を２回繰り返した。ＭＯＰＳ−Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）３ｍＬをアプライして流し、さらに３ｍＬアプライした。スパチュラで撹拌もしくはマイクロピペットでピペッティングしてＮｉ−ＮＴＡアガロースゲルを再分散させて気泡を取り除いた。その後、ＭＯＰＳ−Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）５ｍＬで４回置換した。
【０１０４】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣＤＰ破砕液の上清をカラムにアプライし、カラムより流出した溶液を回収してフロースルー溶液とした。洗浄バッファー３−５ｍＬをアプライして置換し、さらに３−５ｍＬアプライした。ピペッティングによりＮｉ−ＮＴＡアガロースゲルを再分散させてゲル層の表面を均一にした後アプライした洗浄バッファーを流した。さらに洗浄バッファー５ｍＬをアプライして置換する操作を繰り返し、合計で３０ｍＬ以上をアプライした。洗浄バッファーをアプライした際に通過した溶液は全て回収し、洗浄液とした。その後、溶出バッファー３−５ｍＬをアプライし、１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつフラクションに分けて回収し、溶出液とした。この操作を繰り返し、合計で溶出バッファー２５ｍＬをアプライした。それぞれのフラクションの吸光度を微量紫外可視分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定し、２８０ｎｍの吸光度を指標にタンパク質の溶出を確認した。この際、バックグラウンド測定には超純水を用いた。タンパク質の溶出が完了していない場合は、２８０ｎｍの吸収が無くなるまでカラムに溶出バッファーをアプライした。回収した溶出液のうち、吸光度が高いフラクションを回収し、ＣＤＰ溶液とした。
【０１０５】
（３）  ＣＤＰ溶液の緩衝液置換
ＣＤＰ溶液の緩衝液置換はＰＤ１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、付属の説明書に従って行った。ＣＤＰ溶液の容量に応じて、必要な数のＰＤ１０カラムを用いた。付属のアダプターを用いてＰＤ１０カラムを５０ｍＬチューブに固定した。７０％エタノール（バイオテクノロジーグレード）で満たし、遠心機（ＭＸ−３０５、ＴＯＭＹ）を用いて遠心（１０００ｇ、２分間、４℃）した。この操作を２回繰り返すことでカラムを殺菌及び洗浄した。５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムストック溶液をＭＯＰＳ−Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）で２５０倍希釈して調製した０．０２％アジ化ナトリウム／２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｎａ緩衝液で満たし、静置して溶液を流す操作を４回繰り返すことでＰＤ１０カラムを緩衝液で置換した。さらに０．０２％アジ化ナトリウム／２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｎａ緩衝液を加え、遠心した。
【０１０６】
ＰＤ１０カラムを新たな５０ｍＬチューブに移し、遠心によるＳｅｐｈａｄｅｘの斜面を崩さないようにＣＤＰ溶液をＰＤ１０カラム１本につき１．７５−２．５ｍＬアプライした。前述の遠心時と同じ角度で遠心機に固定し、遠心した。溶出した溶液を回収してＣＤＰストック溶液とし、ＣＤＰストック溶液の２８０ｎｍの吸光度をＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃにより測定し、１．７ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して４℃で保存した。なおＣＤＰストック溶液を使用する際は、必要量を適宜クリーンベンチ内で分注した。
【０１０７】
カラム１本につき３０ｍＬのＭＯＰＳ−Ｎａ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）を加えて静置してカラムを洗浄した。次いで超純水で満たし、遠心する操作を２回繰り返した。同様に５０％エタノール水溶液で２回洗浄した。ＰＤ−１０カラムを５０％エタノール水溶液で満たして４℃で保存した。
【０１０８】
１−２−４．ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によるＣＤＰの精製の確認
（１）  １０％アクリルアミドゲルの調製
５０ｍＬチューブに３０％アクリルアミド／ビス混合溶液３．３３ｍＬ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１．５Ｍ、ｐＨ８．８）２．５ｍＬ、超純水４．０１ｍＬを加え、超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。１０％ＳＤＳ水溶液１００μＬ、１０％ＡＰＳ水溶液５０μＬ、ＴＥＭＥＤ１０μＬを加え、泡立たないようピペッティングして混合した。混合した溶液３．５ｍＬを２枚のガラスプレートの間隙（０．７５ｍｍ）に加え、飽和１−ブタノール９００μＬを静かに重層し、室温で１時間静置して重合した。マイクロピペットを用いて飽和１−ブタノールを除去し、次いで超純水で洗浄し、分離ゲルとした。
【０１０９】
５０ｍＬチューブに３０％アクリルアミド／ビス混合溶液０．４４ｍＬ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ６．８）０．４４ｍＬ、超純水２．０３ｍＬを加え、超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。１０％ＳＤＳ水溶液３３μＬ、１０％ＡＰＳ水溶液１６．７μＬ、ＴＥＭＥＤ１．６５μＬを加え、泡立たないようピペッティングして混合した。溶液を分離ゲルの上に十分に加え、１０ウェルのコームを空気が入らないように注意しながらセットし、室温で１時間静置して重合した。生成したゲルはガラスプレートごと十分に湿らせたキムワイプで挟み、さらにラップで包み４℃で保存した。ゲルは調製後１ヶ月以内に使用した。
【０１１０】
（２）  電気泳動による評価
１．７ｍＬチューブにＰｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）５μＬ、１Ｍ  ＤＴＴ溶液２μＬ、５×Ｌｏａｄｉｎｇバッファー２０μＬ、滅菌精製水１７３μＬを加えて混合し、これをマーカーとし、−２０℃で保存した。ＣＤＰストック溶液及びＣＤＰの精製において回収したフロースルー液、洗浄液それぞれ１μＬを５×Ｌｏａｄｉｎｇバッファー２μＬ、１Ｍ  ＤＴＴ１μＬ、超純水６μＬと混合した。これらと室温で解凍したマーカー１０μＬを１０５℃で熱処理し、卓上小型遠心機（Ｒ５−ＡＱＢＤ０２、Ｒｅｃｅｎｔｔｅｃ）によりスピンダウンした。本項（１）で調製したポリアクリルアミドゲルを電気泳動用容器（ミニプロティアンＴｅｔｒａセル、ＢＩＯ  ＲＡＤ）にセットし、超純水で５倍希釈した５×泳動バッファーを５００ｍＬ注ぎ、コームを外した。１ウェルずつに電気泳動サンプルをロードし、電気泳動装置（ミニプロティアンＴｅｔｒａシステム、ＢＩＯ  ＲＡＤ）を用いて電圧１５０Ｖで約４０分間泳動した。バンドがゲルの下端より約１ｃｍ上に達したところで泳動を止め、ゲルをガラスプレートから取り出して固定液に浸漬させ、遮光してシェイカー（Ｗａｖｅ−ＰＲ、ＴＡＩＴＥＣＨ）で３０分間振盪した。固定液を除去し、染色液を加えてゲルを浸漬させ、遮光して６０分間振盪した。染色液を回収し、脱色液を加えてゲルを浸漬させ、遮光して３０分間振盪した。脱色液を除去して新たに脱色液を加えて振盪する操作を、マーカーに含まれるタンパク質のバンドが明確に見えるまで繰り返した。超純水でゲルを洗浄し、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  ＥＺ  Ｉｍａｇｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）により撮影して付属のソフトウェアで解析した。
【０１１１】
１−２−５．ＣＤＰの酵素活性測定
ＣＤＰの活性は以下のように測定した。αＧ１Ｐ５０ｍＭとＤ−（＋）−セロビオース５０ｍＭ、及び所定倍率希釈されたＣＤＰを含む３−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）を３７℃でインキュベーションした。ＣＤＰにより生成されるリン酸を定量し、１分間あたり１μｍｏｌのリン酸を遊離する酵素量を１Ｕと定義した際のＵ／ｍＬを求め、酵素活性とした。ＣＤＰの希釈率は、反応時間が１００分の際におけるαＧ１Ｐの転化率が１０％以下になるように決定した。
【０１１２】
１−３．２−アミノエチル−β−Ｄ−グルコシドの合成
２−アミノエチル−β−Ｄ−グルコシドは、Ｂ．Ｒａｏら，Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１３年，４９，１０８０８−１０８１０．に記載の方法を参考にして合成した。
以下の全ての反応は、ｐ−アニスアルデヒドＴＬＣ呈色試薬、又は１Ｈ  ＮＭＲ測定（ＪＥＯＬ  Ｍｏｄｅｌ−ＥＣＰ  ４００（ＪＥＯＬ、磁場強度：４００ＭＨｚ））により反応の進行を確認しながら進めた。ｐ−アニスアルデヒドＴＬＣ呈色試薬は、ｐ−アニスアルデヒド１３ｍＬ、酢酸５ｍＬ、エタノール４７８ｍＬを氷冷しながら混合し、マグネチックスターラーを用いて撹拌しながら濃硫酸１８ｍＬを滴下し、使用するまで４℃で保存した。
【０１１３】
１−３−１．Ｏ−テトラアセチル−２−ブロモエチル−β−Ｄ−グルコシドの合成
Ｏ−ペンタアセチル−β−Ｄ−グルコシド（１．０等量）と２−ブロモエタノール（１．２等量）を乾燥ジクロロメタンに溶解させた。脱水剤として３５０℃のヒーターで予め活性化させた粉状モレキュラーシーブ４Ａを加え、アルゴン雰囲気下にてマグネチックスターラーを用いて室温で１時間撹拌した。氷冷した反応溶液に三ふっ化ホウ素ジエチルエーテル（５．０等量）を滴下し、反応溶液を室温に戻して一晩撹拌し、Ｏ−グリコシル化反応させた。氷冷した飽和炭酸水素ナトリウム水溶液／酢酸エチル（５０％（ｖ／ｖ））に反応溶液を滴下し、反応を停止させた。原料であるＯ−ペンタアセチル−β−Ｄ−グルコシドの消失をｐ−アニスアルデヒド呈色試薬を用いてＴＬＣにより確認した後、氷冷した飽和炭酸水素ナトリウム水溶液／酢酸エチル（５０％（ｖ／ｖ））に反応溶液を滴下し、反応を停止させた。反応溶液を分液漏斗に移し、激しく振盪した後、溶液が二層に分離するまで静置し、上層の油層を回収した。下層の水層を新たな分液漏斗に移し、酢酸エチルによって抽出し、油層を回収する操作を２回繰り返した。回収した油層を再度分液漏斗に移し、飽和食塩水を加え、激しく振盪し、油層に溶解した水を除去した。水層を流去し、乾燥剤として無水硫酸マグネシウムを油層に加えた。ガラスフィルターを用いて硫酸マグネシウムを除去し、ロータリーエバポレーターにより有機溶媒を留去した。ここで、ＴＬＣ試験において原料であるＯ−ペンタアセチル−β−Ｄ−グルコシドと目的物のスポットが重なり、シリカゲルカラムカラムクロマトグラフィーによる原料の除去が困難であることがわかった。目的物の精製を可能にするため、残渣の原料を選択的に加水分解することとした。得られた粗生成物をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、無水ヒドラジン（０．１５等量）および酢酸（０．１５等量）を加え、室温で一晩撹拌した。撹拌後、氷冷した塩酸（３Ｎ）／酢酸エチル（５０％（ｖ／ｖ））に反応溶液を滴下し、反応を停止させた。溶媒として用いたＤＭＦを抽出操作により水層に除去するため、塩酸（３Ｎ）を水層として用いた。以降、上述した操作と同様に、酢酸エチルを用いて抽出操作し、飽和食塩水及び無水硫酸マグネウムにより油層を脱水した。硫酸マグネシウムを除去し、ロータリーエバポレーターにより有機溶媒を留去することで、白色の粉末を得た。このとき、得られた粗生成物がオイル状である場合、分液操作によりＤＭＦを十分に除去できていないことを示唆している。ＤＭＦが残留している場合は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製に用いることができないため、再度塩酸（３Ｎ）／酢酸エチル（５０％（ｖ／ｖ））を加え、一連の抽出、脱水、濃縮の操作を行った。得られた白色の粉末を少量のジクロロメタンに溶解させてカラムクロマトグラフィーにアプライし、展開溶媒をアセトン／ヘキサン（２５％（ｖ／ｖ））として、５１％の収率で白色粉末のＯ−ペンタアセチル−２−ブロモエチル−β−Ｄ−グルコシドを得た。
【０１１４】
１−３−２．Ｏ−テトラアセチル−２−アジドエチル−β−Ｄ−グルコシドの合成
Ｏ−ペンタアセチル−２−ブロモエチル−β−Ｄ−グルコシド（１等量）をＤＭＦに溶解させて氷冷し、アジ化ナトリウム（３等量）を加えて室温で３時間撹拌した。撹拌後、氷冷した水／酢酸エチル（５０％（ｖ／ｖ））に反応溶液を滴下し、反応を停止させた。酸性条件では爆発性をもつアジ化ナトリウムを抽出操作により水層に除去するため、水層として水を用いた。１−３−１項の操作と同様に、酢酸エチルを用いて抽出操作し、油層を回収した。ここで、溶媒として用いたＤＭＦを抽出操作により水層に除去するため、氷冷した塩酸（３Ｎ，油層の体積のおよそ１／３量）に油層を滴下して混和した。１−３−１項の操作と同様に、酢酸エチルを用いて抽出操作し、飽和食塩水及び無水硫酸マグネウムにより油層を脱水した。硫酸マグネシウムを除去し、ロータリーエバポレーターにより有機溶媒を留去することで、白色の粉末を得た。得られた白色の粉末を少量のジクロロメタンに溶解させてカラムクロマトグラフィーにアプライし、展開溶媒をアセトン／ヘキサン（２５％（ｖ／ｖ））として、８１％の収率で白色粉末のＯ−ペンタアセチル−２−アジドエチル−β−Ｄ−グルコシドを得た。
【０１１５】
１−３−３．  ２−アミノエチル−β−Ｄ−グルコシドの合成
Ｏ−ペンタアセチル−２−アジドエチル−β−Ｄ−グルコシドをメタノール／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１／１）に溶解させ、反応溶液を氷冷し、触媒量のナトリウムメトキシド（０．１等量）を添加した。反応溶液を室温に戻し、マグネチックスターラーを用いて４時間撹拌した後、Ｄｏｗｅｘ陽イオン交換樹脂を加え、反応を停止させた。セライトを載せた濾紙を用いて反応溶液を濾過し、ロータリーエバポレーターにより有機溶媒を留去した。１０％パラジウム／炭素を充填した触媒カートリッジをフロー式水素化反応システム（Ｈ−Ｃｕｂｅ，ＴｈａｌｅｓＮａｎｏ）に設置し、メタノールに溶解させた粗生成物をＨ−Ｃｕｂにフロー（水素圧：５０ｂａｒ、５５℃、１ｍＬ／ｍｉｎ）することで、アジド基を還元した。フローした溶液を氷冷し、４Ｍ塩酸／ジオキサン（１．５等量）を滴下し、ロータリーエバポレーターにより有機溶媒を留去した。得られた生成物をメタノールに溶解させ、２−プロパノールを滴下することで、白色の塩酸塩として２−アミノエチル−β−Ｄ−グルコシドを得た。
【０１１６】
１−４．アミノ基をもつセルロースオリゴマーからなるナノリボンの酵素合成
１−４−１．ＣＤＰによる酵素合成
２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）２３．８ｇを約６０ｍＬの超純水に溶解させた。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．５に調整後、１００ｍＬにメスアップしてＰＶＤＦ製０．２２μｍフィルターで濾過滅菌した。これをＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ７．５）とし、４℃で保存した。
αＧ１Ｐ二ナトリウム水和物および２−アミノエチル−β−Ｄ−グルコシドを所定量秤量し、１Ｍとなるよう超純水に溶解させた。
【０１１７】
ＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ７．５）、１Ｍ  αＧ１Ｐ水溶液、１Ｍ  ２−アミノエチル−β−Ｄ−グルコシド水溶液を反応時の濃度がそれぞれ５００ｍＭ、２００ｍＭ、５０ｍＭとなるよう４ｍＬチューブに加え、使用するＣＤＰストック溶液の量を考慮し、超純水でメスアップした。超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。終濃度が０．２Ｕ／ｍＬになるようＣＤＰストック溶液を適量加え、気泡が発生しないようピペッティングにより混合した。１．７ｍＬチューブあるいは１ｍＬマイティーバイアルに所定量分取し、６０℃で３日間インキュベーションした。
【０１１８】
１−４−２．酵素合成された生成物の精製
１−４−１項において調製された生成物を各種分析に用いるため、超純水で精製した。反応溶液に超純水を加えてピペッティングにより分散させ、遠心（１５０００ｒｐｍ、＞１０分間、４℃）し、上清を除去した。超純水を加えて沈澱物を再分散させ、遠心する操作を繰り返し、溶液の置換率が９９．９９９％以上となるまで精製した。精製した分散液を１００℃のヒートブロックにより１０分間加熱することで、残存するＣＤＰを失活させた。
【０１１９】
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ）法、全反射型赤外分光（ＡＴＲ／ＦＴＩＲ）法、広角Ｘ線回折（ＷＡＸＤ）法による測定に用いる場合は、精製後の水分散液を１．７ｍＬチューブに分注し、２４時間凍結乾燥した。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）法による測定、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）観察、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察、タンパク質の吸着特性の評価に用いる場合は凍結乾燥することなく、精製後の分散液を超純水により希釈して用いた。
【０１２０】
１−５．生成されたアミノ基をもつセルロースの特性評価
１−５−１．生成物の反転倒立試験
１ｍＬマイティーバイアル中で調製した生成物を用いて、反転倒立試験によりハイドロゲル化を評価した。バイアルを上下反転して静置し、生成物の流動がみられなかった場合にハイドロゲルが生成されたと判断した。
【０１２１】
１−５−２．生成物の収量測定
予め１０５℃で２４時間乾燥させ、デシケーター内で放冷したサンプル管を秤量し、精製後の水分散液を加えて１０５℃で２４時間乾燥させ、その後デシケーター内で放冷して秤量した。乾燥前後の重量の差から生成物の収量を算出した。この操作は同時に２回行い、それらの平均値より生成物の収量を算出した。
【０１２２】
１−５−３．  生成物の化学構造及び結晶構造の評価
（１）  生成物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル測定
４０％重水酸化ナトリウム重水溶液５０μＬ及び重水４５０μＬを混合して４％重水酸化ナトリウム重水溶液を調製した。凍結乾燥した生成物１５ｍｇ以上を４％重水酸化ナトリウム重水溶液５００μＬに溶解させた。溶液をＮＭＲチューブに移し、ＪＥＯＬ  Ｍｏｄｅｌ−ＥＣＰ  ４００（ＪＥＯＬ、磁場強度：４００ＭＨｚ）により測定した。積算回数は１２８回とした。水のケミカルシフトをリファレンス（４．７９ｐｐｍ）として校正した。
【０１２３】
（２）  生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定
質量電荷比の校正に用いる標準サンプルはＢｒａｄｙｋｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  １−７水溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ  Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  １−７、０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５０％アセトニトリル）、Ｐ１４Ｒ水溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ  Ｐ１４Ｒ、０．１％ＴＦＡ）、ＡＣＴＨ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  １８−３９水溶液（１０ｎｍｏｌ／ｍＬ  ＡＣＴＨ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  １８−３９、０．１％ＴＦＡ）それぞれ５μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＤＨＢＡ水溶液５μＬ、１．０％ＴＦＡ水溶液１μＬ、アセトニトリル４μＬを１．７ｍＬチューブ中で混合して調製した。
【０１２４】
生成物の測定サンプルは、０．０５％（ｗ／ｖ）とした生成物の水分散液６μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ  ＤＨＢＡ水溶液６μＬ、アセトニトリル１５μＬ、１％トリフルオロ酢酸水溶液３μＬをＫＯＨ／メタノール（３．３％（ｗ／ｖ））により洗浄した１ｍＬマイティーバイアル中で混合して調製した。
【０１２５】
標準サンプル及び生成物の測定サンプルそれぞれ１μＬをサンプルプレートにマウントし、風乾させる操作を５回繰り返した。１時間以上真空乾燥し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＡＸＩＭＡ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、島津製作所）で測定した。測定条件はＭｏｄｅ：Ｌｉｎｅｒ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、Ｍａｓｓ  Ｒａｎｇｅ：１．０−３０００．０、Ｍａｘ  Ｌｅａｓｅｒ  Ｒａｐ  Ｒａｔｅ：  １０、ｐｏｗｅｒ：１００  −  １１５、ｐｒｏｆｉｌｅｓ：１００、ｓｈｏｔｓ：２、Ｉｏｎ  Ｇａｔｅ（Ｄａ）：Ｂｌａｎｋ  ５００、Ｐｕｌｓｅｄ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ａｔ（Ｄａ）：１５００．０とした。
測定により得られたＭＳスペクトルは、Ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ：Ｇａｕｓｓｉａｎ，  Ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ  ｆｉｌｔｅｒ  ｗｉｄｔｈ：１９，  Ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｆｉｌｔｅｒ  ｗｉｄｔｈ：１０００の条件で処理した。
【０１２６】
平均重合度は、生成物のプロトン、ナトリウム、又はカリウムイオン付加体の中で強度が最も強いピークの面積比を用いて算出した。
【０１２７】
（３）  生成物のＷＡＸＤ測定
凍結乾燥した生成物をシリコン無反射試料板の凹部にマウントし、表面を均して卓上粉末Ｘ線回折計（ＭｉｎｉＦｌｅｘ  ６００、リガク）に設置して測定した。測定条件は、検出器：Ｄ／ｔｅＸ  Ｕｌｔｒａ、Ｘ線出力：４０ｋＶ及び１５ｍＡ、フィルター：Ｋβ、スキャンスピード：２．００００ｄｅｇ／ｍｉｎ、ステップ幅：０．０２００ｄｅｇ、スキャン軸：２θ／θ、スキャン範囲：５．００００−７０．００００ｄｅｇ、入射スリット：１．２５０  ｄｅｇとした。
【０１２８】
（４）  生成物のＡＴＲ／ＦＴＩＲスペクトル測定
凍結乾燥した生成物を全反射赤外分光光度計（ＦＴ／ＩＲ−４１００ｔｙｐｅＡ、日本分光）のステージのダイヤモンドセルにスパチュラを用いて生成物を載せ、付属のプレッシャーチップによりサンプルをダイヤモンドセルに押さえ付けて測定した。測定条件は、測定波長：３５０−７８００ｃｍ−１、分解能：２ｃｍ−１、積算回数：１００とした。
【０１２９】
１−５−４．生成物の顕微鏡観察
（１）  生成物のＡＦＭ観察
生成物の濃度が０．００１％（ｗ／ｖ）となるよう希釈し、セロハンテープで表面を５回剥がしたマイカ基板に１５μＬマウントして６００ｒｐｍで３０分間スピンコートした。デシケーター内で１２時間以上乾燥し、走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ−９６００、島津製作所）を用いてＡＦＭにより観察した。測定条件はタッピングモード、操作速度：０．５−１Ｈｚ、画素数：５１２×５１２、Ｚレンジ：×１、操作モード：力一定とした。それぞれの試料から１０個の構造体を観察し、観察された構造体ひとつにつき９点の高さを算出し、それら全てを平均して構造体の高さを算出した。
【０１３０】
（２）  生成物のＴＥＭ観察
プラスチック製シャーレに消毒用エタノールを少量滴下し、パラフィルムを密着させた。ナノリボン濃度が０．００１％（ｗ／ｖ）となるよう超純水で希釈したサンプル１５μＬをパラフィルム上にマウントした。液滴にコロジオン支持膜を載せ、１時間相互作用させた。ろ紙に対してグリッドを垂直に当て、水分を除去した。超純水１５μＬをパラフィルムにマウントし、コロジオン支持膜を１０秒間載せて洗浄した。再度、ろ紙に対してグリッドを垂直に当て、水分を除去した。日新ＥＭステイナー（原液）１５μＬをパラフィルムに滴下し、コロジオン支持膜のマイクログリッドの表面が染色液と接するよう３０分間載せて染色し、デシケーターで一晩乾燥させた。日新ＥＭステイナーは、試薬瓶からガラス製シリンジを用いて、窒素置換しながら適量を１．７ｍＬチューブに採取し、１週間以内に使用した。調製したサンプルをＴＥＭ（日立製作所製Ｈ７５６０  Ｚｅｒｏ．Ａ）により観察した。観察条件は、電子銃：熱電子放出型Ｗ−ヘアピンフィラメント、加速電圧：１００ｋＶ、ホルダー：サイドエントリー式１軸傾斜、分解能：０．２０４ｎｍ（格子像）、スポットサイズ：０．８〜４μｍ（ＨＣモード）、０．６〜２μｍ（ＨＲモード）、ＣＣＤ画像数：１０２４×１０２４ｐｉｘｅｌとした。
【０１３１】
１−６  アミノ基をもつセルロースナノリボンに対する各種タンパク質の吸着特性の評価
１−６−１  試薬の調製
（１）  １０ｍＭＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．４）
２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）１１９ｍｇを所定量の超純水に溶解させた。４Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ７．４に調整して５０ｍＬにメスアップし、４℃で保存した。
【０１３２】
（２）  １０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ１．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．４）
ＨＥＰＥＳ１４３ｍｇ、ＮａＣｌ５．２６ｇを所定量の超純水に溶解させた。４Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ７．４に調整して６０ｍＬにメスアップし、４℃で保存した。
【０１３３】
（３）  各種タンパク質ストック溶液の調製
種々のタンパク質（ＢＳＡ、フィブリノーゲン、トランスフェリン、シトクロムＣ、リゾチーム、トリプシン）を秤量し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．４）に溶解させることでタンパク質ストック溶液を調製した。各種タンパク質ストック溶液濃度は、それぞれＢＳＡ：５０μＭ、フィブリノーゲン：７μＭ、トランスフェリン：５０μＭ、シトクロムＣ：２５０μＭ、リゾチーム：２５０μＭ、トリプシン：２５０μＭとし、調製から１日以内に使用した。
【０１３４】
ＩｇＧは溶液状態（９４μＭ  ＩｇＧ、１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２））で購入したため、透析により１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．４）に溶液置換して使用した。１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．４）１．５ｍＬおよびマイクロマグネチックスターラーチップを２ｍＬチューブに加え、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−ＬｙｚｅｒＴＭ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＭＷＣＯ：１０ｋＤａ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を設置した。購入時のＩｇＧ溶液３００μＬをＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒのカセットに入れて４℃でマグネチックスターラーにより撹拌した。１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．４）を１−２時間ごとに計７回交換し、溶液の置換率を９９．９９９％以上とした。なお、ＩｇＧは購入時の溶液を希釈して検量線を作製し、透析後の濃度は検量線から算出したモル吸光係数を用いて決定した。
【０１３５】
（４）  アミノ基をもつセルロースナノリボン分散液（０．５％（ｗ／ｖ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）の調製
１−４−２項で超純水により精製したアミノ基をもつセルロースナノリボン分散液（絶乾法により濃度を決定）を１．７ｍＬチューブに所定量分取し、１５０００ｒｐｍ、４℃で５分間以上遠心した。上清を除去し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を加えて沈殿物を再分散させ、遠心する操作を５回以上繰り返し、溶液の置換率が９９．９９９％となるようにした。ナノリボン濃度が０．５％（ｗ／ｖ）となるよう１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を加えて、再分散させ、４℃で保存した。
【０１３６】
（５）  二次元ナノ結晶分散液（０．５％（ｗ／ｖ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）の調製
Ｄ−グルコースをプライマーとして、１−４−１項と同条件で酵素合成することで調製した二次元ナノ結晶分散液（Ｔ．Ｓｅｒｉｚａｗａら，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２０１６年，４８，５３９−５４４）を１−６−１項（４）と同様に遠心・再分散により１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）に置換し、４℃で保存した。
【０１３７】
（６）  Ｄ−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有）
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００００Ｕ／ｍＬペニシリン、１０ｎｇ／ｍＬストレプトマイシンの終濃度がそれぞれ１０％、１００Ｕ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬとなるようＤ−ＭＥＭ５００ｍＬと混合し、４℃で保存した。
【０１３８】
（７）  各種タンパク質の検量線の作製
種々のタンパク質ストック溶液を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．４）により系列希釈し、光路長１０ｍｍのマイクロ石英セルに８０μＬ分取して紫外可視（ＵＶ−Ｖｉｓ）分光光度計（Ｖ−５５０もしくはＶ−６７０、ＪＡＳＣＯ）により測定した。測定条件は、走査速度：４００ｎｍ／ｍｉｎ、バンド幅：０−５ｎｍ、データ取込間隔：０．５ｎｍ、レスポンス：Ｆａｓｔとした。測定波長は、ＢＳＡ、フィブリノーゲン、トランスフェリン、ＩｇＧ、リゾチーム、トリプシンを用いる場合は２００−４００ｎｍとし、シトクロムＣを用いる場合は２００−６００ｎｍとした。サンプルは独立して３回調製し、２８０ｎｍの吸光度をプロットすることで、検量線を作製した。重量から算出されるモル吸光係数はそれぞれ、ＢＳＡ：ε２８０＝３．９６×１０４、フィブリノーゲン：ε２８０＝３．０７×１０５、トランスフェリン：ε２８０＝８．１６×１０４、ＩｇＧ：ε２８０＝２．０４×１０５、シトクロームＣ：ε２８０＝１．５６×１０４、リゾチームε２８０＝３．３８×１０４、トリプシンε２８０＝２．８４×１０４であった。
【０１３９】
（８）  アミノ基をもつセルロースナノリボンに対する各種タンパク質の吸着実験
アミノ基をもつセルロースナノリボン分散液（０．５％（ｗ／ｖ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）あるいは二次元ナノ結晶分散液（０．５％（ｗ／ｖ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）１２μＬをＰＣＲチューブに加え、タンパク質ストック溶液を添加する量を考慮して１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．４）あるいは１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ１．５ＭＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．４）によりメスアップした。タンパク質ストック溶液を所定量添加し、ピペッティングにより混合した後、２５℃で１時間静置した。１５０００ｒｐｍ、２５℃で１０分間遠心し、上清９０μＬを新たなＰＣＲチューブに分取した。ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計により、上清の２８０ｎｍの吸光度を測定し、１−６−１項（７）で作製した検量線を用いて上清のタンパク質濃度を算出した。なお、サンプルは独立して３回調製し、同様に測定した。初期のタンパク質濃度から、上清のタンパク質濃度を減じることでナノリボンに対するタンパク質の吸着量を算出した。
【０１４０】
セルロースＩＩ型の格子定数から算出したナノリボンの上下面の面積（６５Å２／ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｃｈａｉｎ、Ｍ．  Ｈｉｒａｉｓｈｉら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００９年，３４４，２４６８−２４７３）を用いて、ナノリボンに対する単位面積あたりのタンパク質の着量（Ａ／ｎｇｃｍ−２）を算出した。単位面積あたりのタンパク質の吸着量（Ａ／ｎｇｃｍ−２）を上清のタンパク質濃度（［ｐｒｏｔｅｉｎ］／μＭ）に対してプロットした。上清のタンパク質濃度を吸着が平衡に達した濃度（Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）とし、Ｌａｎｇｍｕｉｒ型の吸着を仮定して以下の式からナノリボンに対するタンパク質の見かけの吸着定数（Ｋａｐｐ／Ｍ−１）および、飽和吸着量（Ａｍａｘ／ｎｇｃｍ−２）を算出した。
【０１４１】
【数１】
2018174871.tif 000010
【０１４２】
（９）  ＡＦＭ観察
１−６−１項（８）と同様にナノリボンとタンパク質を混合して１時間静置した後、ナノリボン濃度が０．００１％（ｗ／ｖ）となるよう超純水で希釈した。以降は、１−５−４項（１）と同様に、マイカ基板上でスピンキャストし、ＡＦＭ観察した。
【０１４３】
（１０）  ゼータ電位測定
１−６−１項（８）と同様にナノリボンとタンパク質を混合して１時間静置した後、１５０００ｒｐｍ、２５℃で１０分間遠心した。上清を９０μＬ除去し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を９０μＬ加えて沈殿物を再分散させた。同様に遠心し、上清を９０μＬ除去した後、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）によりナノリボン濃度が０．０１％（ｗ／ｖ）となるよう１．７ｍＬチューブ中で分散させることで上清に残存するタンパク質が１％以下となるようにした。ナノリボン分散液７５０μＬを専用セルに分取し、ゼータサイザー（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳＰ，  Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）により測定した。測定条件は、温度：２５℃、平衡時間：３００秒間、Ｒｕｎ：１０−１００ｔｉｍｅｓとした。
【０１４４】
１−７  アミノ基をもつセルロースナノリボンの酵素の固定化担体としての利用
１−７−１  試薬の調製
（１）  ２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）
リン酸水素ニナトリウム七水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ）２．６８ｇならびにリン酸ニ水素ナトリウム二水和物（ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）１．５６ｇを超純水５０ｍＬにそれぞれ溶解させた。Ｎａ２ＨＰＯ４溶液３８．５ｍＬとＮａＨ２ＰＯ４溶液１１．５ｍＬを混合し、４℃で保存した。
【０１４５】
（２）  ３０ｍＭ塩化マグネシウム水溶液
塩化マグネシウム六水和物を６１ｍｇ秤量し、超純水１０ｍＬに溶解させ、４℃で保存した。
【０１４６】
（３）  ３．３６Ｍ２−メルカプトエタノール水溶液
超純水に２−メルカプトエタノール２．７１ｇを１０ｍＬとなるように溶解させ、４℃で保存した。
【０１４７】
（４）  ５０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム緩衝液（ｐＨ７．３）
２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）７．５ｍＬ、３０ｍＭ塩化マグネシウム水溶液１ｍＬ、超純水２１．５ｍＬを混合し、４℃で保存した。
【０１４８】
（５）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）ストック溶液の調製
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）を所定量の５０ｍＭリン酸ナトリウム１ｍＭ塩化マグネシウム緩衝液（ｐＨ７．３）に溶解させ、４℃で保存した。
【０１４９】
（６）５０ｍＭリン酸ナトリウム、１１６ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ塩化マグネシウム水溶液
２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）７．５ｍＬ、３０ｍＭ塩化マグネシウム水溶液１ｍＬ、３．３６Ｍ  ２−メルカプトエタノール水溶液１ｍＬ、超純水１９．５ｍＬを混合し、４℃で保存した。
【０１５０】
（７）  １ｍＭ  ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰＧ）溶液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１１６ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ塩化マグネシウム）
ＰＮＰＧを所定量の５０ｍＭリン酸ナトリウム、１１６ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ塩化マグネシウム水溶液に溶解させ、調製から１日以内に使用した。
【０１５１】
（８）  アミノ基をもつセルロースナノリボン分散液（０．５％（ｗ／ｖ）、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム緩衝液、ｐＨ７．３）の調製
１−４−２項で超純水により精製したアミノ基をもつセルロースナノリボン分散液（絶乾法により濃度を決定）を１．７ｍＬチューブに所定量分取し、１５０００ｒｐｍ、４℃で５分間以上遠心した。上清を除去し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム緩衝液（ｐＨ７．３）を加えて沈殿物を再分散させ、遠心する操作を５回以上繰り返し、溶液の置換率が９９．９９９％となるようにした。ナノリボン濃度が０．５％（ｗ／ｖ）となるよう５０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム緩衝液（ｐＨ７．３）を加えて、再分散させ、４℃で保存した。
【０１５２】
１−７−２  アミノ基をもつセルロースナノリボンに吸着したβ−Ｇａｌの活性評価
アミノ基をもつセルロースナノリボン分散液（０．５％（ｗ／ｖ））１８μＬならびにリン酸ナトリウム１ｍＭ塩化マグネシウム緩衝液（ｐＨ７．３）１４４μＬをＰＣＲチューブ中で混合し、５０ｎＭ  β−Ｇａｌ水溶液１８μＬを添加した（終濃度  アミノ基をもつセルロースナノリボン：０．０５％（ｗ／ｖ）、β−Ｇａｌ：５ｎＭ）。２５℃で１時間静置した後、１５０００ｒｐｍ、２５℃で１０分間遠心した。上清１６２μＬを採取し、５０ｍＭリン酸ナトリウム１ｍＭ塩化マグネシウム緩衝液（ｐＨ７．３）を１６２μＬ加えて沈殿物を再分散させた。同様に遠心し、上清を除去する操作を２回繰り返した後、５０ｍＭリン酸ナトリウム１ｍＭ塩化マグネシウム緩衝液（ｐＨ７．３）によりナノリボン濃度が０．０５％（ｗ／ｖ）となるよう再分散させることで上清に残存するβ−Ｇａｌが０．１％以下となるようにした。ポリスチレン製９６穴プレート（Ｔｈｅｒｍｏ）に遠心・再分散を繰り返したアミノ基をもつセルロースナノリボン溶液あるいは分取した上清５０μＬを加え、１ｍＭＰＮＰＧ溶液５０μＬを加えて３７℃で３０分間インキュベーションした。プレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ６８０、Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いて４０５ｎｍの吸光度を測定することで、ＰＮＰＧの加水分解により生成されるｐ−ニトロフェノールを定量した。ナノリボンを添加しなかった場合のｐ−ニトロフェノールの生成量と比較することで、ナノリボンに吸着したβ−Ｇａｌが示す活性を評価した。なお、サンプルは独立して６回調製し、同様に測定した。
【０１５３】
１−８  アミノ基をもつセルロースナノリボン存在下での細胞培養
ＨｅＬａ細胞はＤ−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有）中で３７℃、５％ＣＯ２条件下で１０ｃｍディッシュで培養し、約８０％コンフルエントまで培養して継代した。継代は以下の操作により実施した：培地を除去し、１０ｍＬ  Ｄ−ＰＢＳをディッシュに加えて軽く撹拌した。Ｄ−ＰＢＳを除去し、トリプシン溶液１ｍＬを加えて前面に広げて３７℃、５％ＣＯ２条件下で３〜５分間インキュベーションした。Ｄ−ＭＥＭを９ｍＬ程度加えて１５ｍＬチューブに移し、５００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を除去してＤ−ＭＥＭを加えて懸濁し、１／８〜１／１０を次のディッシュに加えて往復するよう軽く撹拌し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
【０１５４】
継代の際に用いなかった細胞数をカウントし、細胞が５０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬに、アミノ基をもつセルロースナノリボン（オートクレーブ処理済（１２１℃、２０分間、ＢＳ−２４５  ＴＯＭＹ））が０、０．００１、０．０１、０．０５％（ｗ／ｖ）になるよう混合した。細胞培養用ポリスチレン（ＴＣＰＳ）製９６穴プレート（ＴＰＰ）に２００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１日間もしくは３日間インキュベーションした。上清を除去することで接着していない細胞を除去し、蛍光顕微鏡観察に供する場合はＤ−ＰＢＳにより洗浄した。ＣａｌｌｓｔａｉｎＲ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔのマニュアルに従いＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭおよびＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅにより生細胞および死細胞をそれぞれ染色し、蛍光顕微鏡（ＺＯＥ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｍａｇｅｒ、Ｂｉｏ−ｒａｄ）により観察した。生細胞数を定量する場合にはＤ−ＰＢＳではなくＤ−ＭＥＭで洗浄し、Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（ＣＣＫ）のマニュアルに従ってＤ−ＭＥＭと混合したＣＣＫを添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で６０分間インキュベーションした。プレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ６８０、Ｂｉｏ−ｒａｄ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。ナノリボンを添加しなかった場合の生細胞数と比較することで、ナノリボンが示す細胞毒性を評価した。
【０１５５】
２．結果及び考察
２−１．アミノ基をもつセルロースの酵素合成
２−１−１．生成物の反転倒立試験
エチル基を介してアミノ基が導入されたグルコース誘導体（２−アミノエチル−β−Ｄ−グルコシド）をプライマーとして用い、ＣＤＰによる酵素合成系に適用した。その結果、反応後の溶液が白濁したことから、酵素反応が進行しており、２−アミノエチル−β−Ｄ−グルコシドがＣＤＰにより認識されることが示唆された。反転倒立試験により、生成物のハイドロゲル化を評価した結果、溶液が流れ落ち、Ｄ−グルコースをプライマーとした場合（Ｔ．Ｓｅｒｉｚａｗａら，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２０１６年，４８，５３９−５４４）と同様に生成物はハイドロゲルを形成せず、沈殿物として得られることがわかった（図１）。
【０１５６】
２−１−２．生成物の化学構造の評価
（１）  １Ｈ  ＮＭＲスペクトル
セルロースは重合度１５以下の低分子量であれば水酸化ナトリウム水溶液に溶解するため、重水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させることで１Ｈ  ＮＭＲ測定できることが知られている（Ａ．Ｉｓｏｇａｉ，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，１９９７年，４，９９−１０７）。そこで、４％重水酸化ナトリウム／重水溶液に生成物を溶解させて１Ｈ  ＮＭＲ測定した結果、いずれの鎖長においても既報のセルロースオリゴマー（Ｍ．Ｈｉｒａｉｓｈｉら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００９年，３４４，２４６８−２４７３、Ｌ．Ａ．Ｆｌｕｇｇｅら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９９年，１２１，７２２８−７２３８、Ｈ．Ｓｕｇｉｙａｍａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，２０００年，５５６，１７３−１７７、Ｂ．Ｘｉｏｎｇら，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，２０１３年，２０，６１３−６２１、Ｍ．Ｕ．Ｒｏｓｌｕｎｄら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００８年，３４３，１０１−１１２）及びエチル基（δ〜２．６，３．４〜３．５）に帰属されるピークを示し、末端に２−アミノエチル基をもつセルロース誘導体が酵素合成できていることが明らかとなった（図２）。次いで２−アミノエチル基をもつセルロース誘導体の還元末端のアノマー位（δ〜４．２）およびそれ以外のアノマー位（δ〜４．３）の水素の積分値を次式に適用して、平均重合度を算出した。
【０１５７】
【数２】
2018174871.tif 000011
【０１５８】
その結果、平均重合度は１０と算出され、同条件でＤ−グルコースをプライマーとした場合のセルロースオリゴマーの平均重合度（〜１０）と同程度であることがわかった（Ｔ．  Ｓｅｒｉｚａｗａら，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２０１６年，４８，５３９−５４４）。
【０１５９】
（２）  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトル
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定により、生成物の化学構造を同定した結果、グルコ&#8722;スユニットの質量数である１６２の間隔をもつ３つのピーク群が見られた（図３）。３つのピーク群はそれぞれアミノ基をもつセルロース誘導体のプロトン、ナトリウム又はカリウムイオン付加体の質量電荷比と一致し、２−アミノエチル基をもつセルロース誘導体が合成できていることが支持された。また、重合度の分布は６から１６であり、Ｄ−グルコ−スをプライマーとした場合と同様に分子量分布をもつことがわかった。ＭＳスペクトルのピークの積分比から平均重合度を算出した結果、８．７と算出され、１Ｈ  ＮＭＲ測定から算出した平均重合度よりも１程度低い値を示した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定ではイオン化された分子のみが検出されるため、測定した条件では高重合度の２−アミノエチル基をもつセルロース誘導体が十分にイオン化していないことが示唆された。本発明者は酵素合成により調製されるセルロースオリゴマーの平均重合度の算出にはこれまで１Ｈ  ＮＭＲ測定を用いてきたことから、本実施例でも１Ｈ  ＮＭＲ測定により算出した平均重合度を用いることとした。
【０１６０】
（３）  αＧ１Ｐの転化率
絶乾法により算出した生成物の収量と１Ｈ  ＮＭＲ測定から算出した平均重合度を用いて、モノマーであるαＧ１Ｐの転化率を算出した結果、２−アミノエチル−β−Ｄ−グルコシドをプライマーとした場合は約２０％であった。同条件下でＤ−グルコースをプライマーとした場合の転化率は約３５％（Ｔ．Ｓｅｒｉｚａｗａら，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２０１６年，４８，５３９−５４４）であり、２−アミノエチル−β−Ｄ−グルコシドをプライマーとした場合は低く、末端の２−アミノエチル基がＣＤＰによる認識性を低下させることが示唆された。
【０１６１】
２−１−３．生成物の結晶構造の評価
（１）  ＷＡＸＤチャート
２−アミノエチル基をもつセルロース誘導体が形成する結晶形を明らかにするため、ＷＡＸＤにより測定した結果、２θ＝１２．３、２０．０、２２．１°において鋭い回折ピークを示した（図４）。これらの回折ピークは、それぞれセルロースＩＩ型結晶の１−１０、１１０、０２０面（Ｍ．Ｈｉｒａｉｓｈｉら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００９年，３４４，２４６８−２４７３）に帰属された。これは、Ｄ−グルコースをプライマーとした場合にセルロースオリゴマーが形成する結晶形と同様であり、セルロース鎖末端の２−アミノエチル基は結晶形に影響を与えないことがわかった。
【０１６２】
（２）  ＡＴＲ／ＦＴＩＲスペクトル
２−アミノエチル基をもつセルロース誘導体が形成する結晶形をＡＴＲ／ＦＴＩＲ法により解析した結果、セルロースＩＩ型結晶に特徴的なＯＨ伸縮振動に由来する２本の鋭いピーク（Ｑ．Ｗｕら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．，２０１５年，１３３，４３８−４４７）を３４４２、３４９０ｃｍ−１付近に示した（図５）。Ｄ−グルコースをプライマーとした場合（Ｔ．Ｓｅｒｉｚａｗａら，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２０１６年，４８，５３９−５４４）と同様に、２−アミノエチル−β−Ｄ−グルコシドをプライマーとした場合もセルロースＩＩ型結晶を形成することが支持された。
【０１６３】
２−１−４．セルロースの集合構造
（１）  ＡＦＭ像
２−アミノエチル基をもつセルロース誘導体が形成する集合構造を明らかにするため、生成物をマイカ基板上でスピンキャストしてＡＦＭ観察した。その結果、よく分散したリボン状の構造体（ナノリボン）が観察された（図６）。ナノリボンの厚さを評価した結果、５．３±０．３ｎｍと算出され、セルロースＩＩ型結晶を形成するセロデカオースの分子鎖長５．２ｎｍ（Ｍ．Ｈｉｒａｉｓｈｉら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００９年，３４４，２４６８−２４７３）とよく一致した。従って、Ｄ−グルコースをプライマーとした場合の二次元ナノ結晶と同様に、２−アミノエチル基をもつセルロース誘導体はナノリボンの膜厚方向に配列してラメラ結晶を形成しており、セルロース鎖末端のアミノ基をナノリボンの表面に露出していると考えられる。
【０１６４】
生成されたナノリボンのアスペクト比に着目すると、Ｄ−グルコースをプライマーとした場合（Ｍ．Ｈｉｒａｉｓｈｉら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００９年，３４４，２４６８−２４７３、Ｔ．Ｓｅｒｉｚａｗａら，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２０１６年，４８，５３９−５４４）と比較して明らかに高く、末端の２−アミノエチル基の寄与により、結晶がより異方的に成長することが示唆された。エチル基をもつグルコース誘導体をプライマーとした場合もナノリボンが形成されることから（Ｙ．Ｙａｔａｋａら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２０１６年，３２，１０１２０−１０１２５）、末端のエチル基が異方的な結晶成長に寄与しているものと考えられる。また、２−アミノエチル基をもつグルコース誘導体をプライマーとした場合は、ナノリボンは沈殿物として生成されるのに対し、エチル基をもつグルコース誘導体をプライマーとした場合は、ナノリボンからなるハイドロゲルが生成された（Ｙ．Ｙａｔａｋａら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２０１６年，３２，１０１２０−１０１２５）。よって、末端のアミノ基の寄与により、生成物の集合構造がマクロなスケールで大きく変化することがわかった。
【０１６５】
（２）  ＴＥＭ像
２−アミノエチル基をもつセルロース誘導体が形成する集合構造を明らかにするため、生成物をコロジオン支持膜に吸着させてＴＥＭ観察した結果、リボン状の構造体（ナノリボン）が観察され（図７）、ＴＥＭ観察からもナノリボンが生成されることが支持された。
【０１６６】
２−２．アミノ基をもつセルロースナノリボンに対する各種タンパク質の吸着特性
アミノ基をもつセルロースナノリボンのバイオマテリアルへの利用可能性を明らかにするため、ナノリボンに対する各種タンパク質（表１）の吸着特性を系統的に評価した。
【０１６７】
【表１】
2018174871.tif 000012
【０１６８】
血漿中で最も豊富に存在するタンパク質である血清アルブミン（ＢＳＡ）を１−２０μＭの濃度でナノリボンと混合してインキュベーションした。その後、ナノリボンとＢＳＡの混合溶液を遠心し、上清のＢＳＡ濃度を定量した。ＢＳＡの初期濃度（Ｉｎｉｔｉａｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）に対して、吸着平衡に達した上清のＢＳＡ濃度（Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）をプロットした結果、上清のＢＳＡ濃度が明らかに減少した（図８ａ，第一級アミノ基 (＋））。よって、ナノリボンに対してＢＳＡが吸着することがわかった。一方、アミノ基をもたない二次元ナノ結晶とＢＳＡを混合した場合は上清のＢＳＡ濃度がほとんど変化せず（図８ａ，（−））、二次元ナノ結晶に対してＢＳＡはほとんど吸着しないことがわかった。よって、ナノリボン表面のアミノ基がＢＳＡの吸着に寄与していることが示唆された。ＢＳＡの等電点は４．６（Ｓ．Ｂｒｅｗｅｒら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００５年，２１，９３０３−９３０７）であることが知られており（表１）、実験条件（ｐＨ７．４）においてＢＳＡの実効電荷は負であると考えられる。一方、第一級アルキルアミンのｐＫａはおよそ１０（Ｍ．Ｊｏｈｎ，マクマリー有機化学（下）第８版，東京化学同人，２０１３年）であり、ナノリボン表面のアミノ基は実験条件（ｐＨ７．４）においてプロトン化していると考えられる。よって、ナノリボン表面のアミノ基とＢＳＡとの静電相互作用が主に吸着に寄与していると考えられる。ＢＳＡの初期濃度が３μＭまでは、上清においてＢＳＡは検出されず（よって、Ｌａｎｇｍｕｉｒ型吸着等温式でのフィッティングはできない）、ナノリボンに対してＢＳＡが強く吸着することが示唆された。セルロースＩＩ型の格子定数から算出したナノリボンの上下面の面積（６５Å２／ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｃｈａｉｎ、Ｍ．Ｈｉｒａｉｓｈｉら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００９年，３４４，２４６８−２４７３．）を用いて、単位面積あたりのＢＳＡの吸着量を算出し、ＢＳＡの初期濃度に対してプロットした（図８ｂ）。その結果、ＢＳＡの初期濃度の増大に伴い単位面積あたりのＢＳＡの吸着量が増大し、初期濃度が５μＭ程度でＢＳＡの吸着量が飽和（２５０−３００ｎｇｃｍ−２）に達することが示唆された。ここで、ＢＳＡの飽和吸着量を評価するため、ＢＳＡの形状モデルとして用いられている正三角形プリズム（一辺：８．４ｎｍ、高さ：３．１５ｎｍ、Ｃ．Ｒｏｃｋｅｒら，Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００９，４，５７７−５８０．）を用い、正三角形面あるいは側面を向けて単層吸着すると仮定して単位面積あたりの理想的な吸着量を算出した（表２）。その結果、３６０±４１０ｎｇｃｍ−２と算出され、実験により得られたナノリボンに対する単位面積あたりのＢＳＡの飽和吸着量（２５０−３００ｎｇｃｍ−２）とよく一致した。よって、ＢＳＡはナノリボンに単層吸着していると推察された。
【０１６９】
【表２】
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【０１７０】
ナノリボンに対するＢＳＡの吸着の様子を直接確認するため、ＢＳＡの初期濃度を５μＭとしてナノリボンと混合し、インキュベーション後にマイカ基板上でスピンキャストしてＡＦＭ観察した（図９）。その結果、ＢＳＡと混合する前（図６）と同様に、リボン状の構造体（ナノリボン）が観察されたが、その表面は明らかに荒くなっていた。観察されたナノリボンの厚さは１２．６±１．６ｎｍであり、２−１−４項（１）で算出したＢＳＡ吸着前のナノリボンの厚さ（５．３±０．３ｎｍ）と上述したＢＳＡの正三角形プリズムモデルの二層分の厚さ（３．１５×２ｎｍ）の和とよく一致した。従って、ＡＦＭ観察からナノリボンの両面にサンドイッチ様にＢＳＡが単層吸着していることが示唆された。
【０１７１】
さらにナノリボンに対する他の代表的な血清タンパク質（フィブリノーゲン、トランスフェリン、ＩｇＧ）の吸着特性を評価した。ＢＳＡの場合と同様に、各種血清タンパク質をナノリボンと混合し、初期濃度に対して上清の濃度をプロットした（図１０ａ）。その結果、いずれも上清のタンパク質濃度が減少し、ナノリボンに吸着することがわかった。フィブリノーゲン、トランスフェリン、ＩｇＧの等電点はそれぞれ５．６（Ｍ．Ｄｅら，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．，２００９，１，４６１−４６５．）、５．６（Ｍ．Ｄｅら，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．，２００９，１，４６１−４６５．）、６．８−７．４（Ｈ．Ｏｒｅｌｍａら，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１１，１２，４３１１−４３１８．）であり（表１）、ＢＳＡの場合と同様に、負に帯電したタンパク質とナノリボン表面のアミノ基との静電相互作用が吸着に寄与していることが示唆された。そこで、ナノリボンに対する各種タンパク質の見かけの吸着定数（Ｋａｐｐ／Ｍ−１）および、飽和吸着量（Ａｍａｘ／ｎｇｃｍ−２）を算出するため、単位面積あたりのタンパク質の吸着量を吸着平衡に達した上清の濃度に対してプロットし、Ｌａｎｇｍｕｉｒ型の吸着等温式によりフィッティングした（数１、図１０ｂ）。その結果、見かけの吸着定数はいずれも１０５−１０７Ｍ−１オーダーであり（表２）、静電相互作用に基づく血清タンパク質の吸着定数の過去の報告（Ｓ．Ｂｒｅｗｅｒら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００５年，２１，９３０３−９３０７．、Ｄ．Ｌｉら，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，２００６年，１８，６４０３−６４１３）と同程度であった。見かけの吸着定数がタンパク質の種類に応じてそれぞれ異なっていたのは、静電相互作用のみならず、等電点、タンパク質のサイズや形状などがそれぞれ吸着に寄与しているためと考えられる。また、フィブリノーゲン、トランスフェリン、ＩｇＧの飽和吸着量はそれぞれ、８３２ｎｇｃｍ−２、１７８ｎｇｃｍ−２、５１５ｎｇｃｍ−２と算出された。ここで、各種タンパク質の形状モデルとして直方体（フィブリノーゲン：５×５×４７（Ａ．Ｓｅｔｈｕｒａｍａｎら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４年，２０，７７７９−７７８８．）、トランスフェリン：４．２×５×７（Ｘ．Ｊｉａｎｇら，Ｊ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，２０１０年，７，Ｓ５−Ｓ１３）、ＩｇＧ：６．５×７．７×１０（Ｌ．Ｈａｒｒｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７年，３６，１５８１−１５９７．））を用い、それぞれが狭い面積（ｅｎｄ−ｏｎ）あるいは広い面積（ｓｉｄｅ  ｏｎ）で単層吸着した際の単位面積あたりの理想的な吸着量を算出した（表２）。その結果、単層吸着を仮定した理想的な飽和吸着量と実験により得られた飽和吸着量は同程度であった。よって、ＢＳＡの場合と同様に、いずれの血清タンパク質もナノリボンに対して単層吸着していることが示唆された。
【０１７２】
そこでナノリボンに対するタンパク質の吸着に静電相互作用が寄与していることを明らかにするため、実験条件（ｐＨ７．４）で正に帯電していると考えられる等電点が１０以上のタンパク質（シトクロムＣ、リゾチーム、トリプシン（表１））の吸着特性を評価した（図１１）。その結果、シトクロムＣ、リゾチーム、トリプシンは初期濃度をいずれも２００μＭと高い条件で吸着させてもナノリボンに吸着しないことがわかった。よって、静電相互作用が吸着に寄与することが支持された。
【０１７３】
ナノリボンのゼータ電位をタンパク質吸着前後で評価した（図１２）。上述した手法と同様にＢＳＡとナノリボンを混合し、ナノリボンに吸着していないＢＳＡを遠心、再分散の操作で除去してゼータ電位測定した。その結果、ＢＳＡ吸着前のナノリボンのゼータ電位（＋２４ｍＶ）はＢＳＡ濃度の増大とともに負にシフトすることがわかった。よって、ゼータ電位測定からも静電相互作用が吸着に寄与することが支持された。また、ゼータ電位の負へのシフトはＢＳＡ濃度が５μＭで飽和に達し（−１５ｍＶ）、上述した吸着データの濃度依存性とも矛盾しなかった。さらに、ＢＳＡのナノリボンに対する吸着量は塩濃度（ＮａＣｌ）の増大とともに低下することがわかり（図１３）、静電相互作用が吸着に確かに寄与していることが支持された。
【０１７４】
２−３  アミノ基をもつセルロースナノリボンに吸着した酵素の活性
アミノ基をもつセルロースナノリボンの酵素の固定化担体としての利用可能性を明らかにするため、ナノリボンに吸着したβ−Ｇａｌの酵素活性を評価した。ナノリボンとβ−Ｇａｌの混合溶液を遠心し、上清の酵素活性（ナノリボン（＋），上清）を測定した結果、ナノリボンを添加していない場合のフリーのβ−Ｇａｌ（ナノリボン（−））の酵素活性の１０％以下であり、２−２節の結果と同様に負に帯電したβ−Ｇａｌ（等電点：４．１、Ｍ．  Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ．  Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００３年，１９，１８６１−１８７２．）がナノリボンに吸着していることがわかった。ナノリボンに吸着したβ−Ｇａｌ（ナノリボン（＋），沈殿物）の酵素活性は、フリーのβ−Ｇａｌ（ナノリボン（−））と誤差範囲内で同程度であることがわかった（図１４）。すなわち、β−Ｇａｌはその活性を維持したままナノリボンに吸着し、ナノリボンを酵素の固定化担体として利用できることが明らかとなった。
【０１７５】
２−４．  アミノ基をもつセルロースナノリボンが示す細胞毒性
アミノ基をもつセルロースナノリボンが示す細胞毒性を評価するため、ナノリボン存在下で細胞培養した。ナノリボン濃度を０−０．０５％（ｗ／ｖ）としてＨｅＬａ細胞を３日間培養し、生細胞および死細胞をそれぞれ異なる蛍光色素で染色して蛍光顕微鏡観察した（図１５）。その結果、いずれのナノリボン濃度においても、多くの細胞が生存しており、またナノリボン濃度によらず生細胞と死細胞の割合は大きく変化しなかった。さらに、ナノリボン存在下で細胞培養した。ナノリボン濃度を０−０．０５％（ｗ／ｖ）としてＨｅＬａ細胞を１日間もしくは３日間培養し、次いで細胞定量キットを用いて生細胞数を定量した結果、同様にナノリボン濃度を変化させてもナノリボン非存在下と比較した細胞生存率は大きく変化しなかった（図１６）。よって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養環境では、アミノ基をもつセルロースナノリボンは顕著な細胞毒性を示さないことが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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