(57)【要約】【解決課題】  新規な近赤外蛍光ｐＨプローブを提供すること。【解決手段】  以下の一般式（Ｉ）：2018090536.tif 000050で表される化合物又はその塩。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）：
2018090536.tif 000045
（式中、
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示し、Ｒ１は、同一であっても異なっていてもよく；
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、一価の置換基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ７は、置換されていてもよいフェニル基を示し；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ８及びＲ９は一緒になってＲ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ８又はＲ９、或いは、Ｒ８及びＲ９の両方は、夫々、Ｒ３、Ｒ５と一緒になって、Ｒ８、Ｒ９が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ１０は、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又は炭素数１〜６個のフッ素化アルキル基を示す。）
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基又はハロゲン原子である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、炭素数１〜６個のアルキル基である、請求項２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
Ｒ１０は、水素原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、トリフルオロメチル基又はトリフルオロエチル基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項６】
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子、メチル基又はエチル基である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項７】
Ｒ１は、いずれも水素原子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項８】
Ｒ１の少なくとも１つは、カルボキシ基、カルボキシ基を有するアルキル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アミド基、アルキルアミノ基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、又はアルキニル基から選ばれる請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項９】
Ｒ１の少なくとも１つは、カルボキシ基、カルボキシル基を有するアルキル基、アミノ基、アミド基である、請求項８に記載の化合物又はその塩。
【請求項１０】
以下の一般式（ＩＩ）：
2018090536.tif 000046
（式中、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、一価の置換基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ７は、置換されていてもよいフェニル基を示し； 
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ８及びＲ９は一緒になってＲ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ８又はＲ９、或いは、Ｒ８及びＲ９の両方は、夫々、Ｒ３、Ｒ５と一緒になって、Ｒ８、Ｒ９が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ１０は、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又は炭素数１〜６個のフッ素化アルキル基を示し；
Ｘは、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基がＴと結合した後の構造を示し；
Ｔは、架橋基を示し、該架橋基は、その片方または両方の端部に、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基、ラベル部位又は標的集積部位と結合することができる官能基を有してもよく；
Ｒ１’は、水素、又は同一又は異なる一価の置換基であり；
ｍは１〜２の整数であり、ｎは１〜２の整数であり、但し、ｍ＋ｎ＝３である；
で表される化合物又はその塩。
【請求項１１】
以下の一般式（ＩＩＩ）：
2018090536.tif 000047
（式中、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、一価の置換基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ７は、置換されていてもよいフェニル基を示し； 
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ８及びＲ９は一緒になってＲ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ８又はＲ９、或いは、Ｒ８及びＲ９の両方は、夫々、Ｒ３、Ｒ５と一緒になって、Ｒ８、Ｒ９が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ１０は、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又は炭素数１〜６個のフッ素化アルキル基を示し；
Ｘは、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基がＴと結合した後の構造を示し；
Ｔ’は、存在する場合は、架橋基がＳと結合した後の構造であり；
Ｓは。ラベル部位又は標的集積部位を示し；
Ｒ１’は、水素、又は同一又は異なる一価の置換基であり；
ｍは１〜２の整数であり、ｎは１〜２の整数であり、但し、ｍ＋ｎ＝３である；
で表される化合物又はその塩。
【請求項１２】
−Ｘ−（Ｔ’）−Ｓは、以下の構造を有する、請求項１１に記載の化合物又はその塩。
2018090536.tif 000048
【請求項１３】
以下の一般式（ＩＶ）：
2018090536.tif 000049
（式中、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、一価の置換基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ７は、置換されていてもよいフェニル基を示し； 
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ８及びＲ９は一緒になってＲ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ８又はＲ９、或いは、Ｒ８及びＲ９の両方は、夫々、Ｒ３、Ｒ５と一緒になって、Ｒ８、Ｒ９が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ１０は、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又は炭素数１〜６個のフッ素化アルキル基を示し；
Ｘは、生体高分子標識部位を導入することが可能な官能基がＴと結合した後の構造を示し；
Ｔ’は、存在する場合は、架橋基がＤｘと結合した後の構造であり；
Ｄｘは、デキストランを示し；
Ｒ１’は、水素、又は同一又は異なる一価の置換基であり；
ｍは１〜２の整数であり、ｎは１〜２の整数であり、但し、ｍ＋ｎ＝３であり；
ｐは、デキストランとの結合当量を示す；
で表される化合物又はその塩。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
【請求項１５】
細胞内の酸性領域の測定方法であって、
（ａ）請求項１〜１４に記載の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び
（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内で発する蛍光を測定する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な近赤外蛍光レシオ型プローブ及びこれを用いた細胞内の酸性領域の測定方法に関る。
【背景技術】
【０００２】
生体内のｐＨは厳密に制御されており、骨代謝、がん細胞の浸潤など様々な生命現象に関わっている。そのため、生きた動物個体でのｐＨを測定する技術が求められている。
【０００３】
現在、ｉｎ  ｖｉｖｏのｐＨ測定技術として２つ挙げられる。１つはｐＨ電極を直接挿入する手法であり、簡便であるが、電極を挿入した部分のｐＨしか得られず、空間的な情報を得ることは難しい。２つ目はＭＲＩを用いた手法であり、空間的な情報は得られる一方で、感度の悪さから長い測定時間や造影剤の大量投与が必要とされる。蛍光イメージング法は優れた空間分解能を有し、検出感度の高さから簡便性や時間分解能にも優れている。
【０００４】
しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングに適した近赤外領域に吸収・蛍光波長を有する優れたｐＨプローブは開発されておらず、ｐＨの変化を観察した例はあるものの（非特許文献１）、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてｐＨを正確に定量する手法は確立されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Li, Y.; Wang, Y.; Yang, S.; Zhao, Y.; Yuan, L.; Zheng, J.; Yang, R., Hemicyanine-based high resolution ratiometric near-infrared fluorescent probe for monitoring pH changes in vivo. Anal. Chem. 2015, 87 (4), 2495-503.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規な近赤外蛍光ｐＨプローブを提供することを目的とする。特に、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで弱酸性環境を蛍光イメージングすることが可能な近赤外蛍光ｐＨプローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングにおいては、蛍光プローブの体内分布により濃度差を生じるため、ｏｆｆ／ｏｎ型蛍光プローブを用いた場合、ｐＨの変化とプローブの分布の変化を見分けることは困難である。そこで、本発明者等は、有用な技術としてレシオイメージング法に着目した。
レシオイメージング法とは、吸収あるいは蛍光が標的分子との相互作用によって波長変化を示す蛍光プローブを用いて、２波長のシグナルの比（レシオ）として画像を得る方法であり、プローブの濃度差を補正することができる。
【０００８】
近年、Ｓｉローダミンの１０位Ｓｉ元素をリン元素に置換したＰローダミン（ＰＲ）が吸収・蛍光波長ともに５０〜７０ｎｍ長波長化することが報告されている。しかしながら、近赤外蛍光色素ＰＲの機能化は行われておらず、Ｐローダミンがレシオイメージングにおける有用な機能性色素として機能するかは明らかにされていなかった。
本発明者等は、これまで、ピペラジンを有するＳｉローダミンがｐＨプローブとして機能することを見出した。そこで、Ｐローダミン骨格とピペラジンを有する蛍光プローブが近赤外領域のｐＨプローブとして有効に機能するかを検討したところ、Ｓｉローダミンの１０位Ｓｉ元素をＰ元素に置換すると、蛍光量子収率とｐＫａが蛍光色素骨格によって変化することが分かった。更に、鋭意検討したところ、特定の構造を有するＰローダミンにより近赤外レシオ型蛍光プローブを提供できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、
［１］以下の一般式（Ｉ）：
2018090536.tif 000002
（式中、
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示し、Ｒ１は、同一であっても異なっていてもよく；
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、一価の置換基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ７は、置換されていてもよいフェニル基を示し；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ８及びＲ９は一緒になってＲ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ８又はＲ９、或いは、Ｒ８及びＲ９の両方は、夫々、Ｒ３、Ｒ５と一緒になって、Ｒ８、Ｒ９が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ１０は、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又は炭素数１〜６個のフッ素化アルキル基を示す。）
で表される化合物又はその塩。
［２］Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基又はハロゲン原子である、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、炭素数１〜６個のアルキル基である、［２］に記載の化合物又はその塩。
［４］Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［５］Ｒ１０は、水素原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、トリフルオロメチル基又はトリフルオロエチル基である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［６］Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子、メチル基又はエチル基である、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［７］Ｒ１は、いずれも水素原子である、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［８］Ｒ１の少なくとも１つは、カルボキシ基、カルボキシ基を有するアルキル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アミド基、アルキルアミノ基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、又はアルキニル基から選ばれる［１］〜［６］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［９］Ｒ１の少なくとも１つは、カルボキシ基、カルボキシル基を有するアルキル基、アミノ基、アミド基である、［８］に記載の化合物又はその塩。
［１０］以下の一般式（ＩＩ）：
2018090536.tif 000003
（式中、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、一価の置換基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ７は、置換されていてもよいフェニル基を示し； 
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ８及びＲ９は一緒になってＲ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ８又はＲ９、或いは、Ｒ８及びＲ９の両方は、夫々、Ｒ３、Ｒ５と一緒になって、Ｒ８、Ｒ９が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ１０は、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又は炭素数１〜６個のフッ素化アルキル基を示し；
Ｘは、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基がＴと結合した後の構造を示し；
Ｔは、架橋基を示し、該架橋基は、その片方または両方の端部に、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基、ラベル部位又は標的集積部位と結合することができる官能基を有してもよく；
Ｒ１’は、水素、又は同一又は異なる一価の置換基であり；
ｍは１〜２の整数であり、ｎは１〜２の整数であり、但し、ｍ＋ｎ＝３である；
で表される化合物又はその塩。
［１１］以下の一般式（ＩＩＩ）：
2018090536.tif 000004
（式中、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、一価の置換基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ７は、置換されていてもよいフェニル基を示し； 
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ８及びＲ９は一緒になってＲ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ８又はＲ９、或いは、Ｒ８及びＲ９の両方は、夫々、Ｒ３、Ｒ５と一緒になって、Ｒ８、Ｒ９が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ１０は、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又は炭素数１〜６個のフッ素化アルキル基を示し；
Ｘは、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基がＴと結合した後の構造を示し；
Ｔ’は、存在する場合は、架橋基がＳと結合した後の構造であり；
Ｓは。ラベル部位又は標的集積部位を示し；
Ｒ１’は、水素、又は同一又は異なる一価の置換基であり；
ｍは１〜２の整数であり、ｎは１〜２の整数であり、但し、ｍ＋ｎ＝３である；
で表される化合物又はその塩。
［１２］−Ｘ−（Ｔ’）−Ｓは、以下の構造を有する、［１１］に記載の化合物又はその塩。
2018090536.tif 000005
［１３］以下の一般式（ＩＶ）：
2018090536.tif 000006
（式中、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、一価の置換基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ７は、置換されていてもよいフェニル基を示し； 
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ８及びＲ９は一緒になってＲ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ８又はＲ９、或いは、Ｒ８及びＲ９の両方は、夫々、Ｒ３、Ｒ５と一緒になって、Ｒ８、Ｒ９が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ１０は、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又は炭素数１〜６個のフッ素化アルキル基を示し；
Ｘは、生体高分子標識部位を導入することが可能な官能基がＴと結合した後の構造を示し；
Ｔ’は、存在する場合は、架橋基がＤｘと結合した後の構造であり；
Ｄｘは、デキストランを示し；
Ｒ１’は、水素、又は同一又は異なる一価の置換基であり；
ｍは１〜２の整数であり、ｎは１〜２の整数であり、但し、ｍ＋ｎ＝３であり；
ｐは、デキストランとの結合当量を示す；
で表される化合物又はその塩。
［１４］［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
［１５］細胞内の酸性領域の測定方法であって、
（ａ）［１］〜［１４］に記載の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び
（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内で発する蛍光を測定する工程
を含む方法。
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、高い蛍光量子収率を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｐＨである６．０−７．４程度の弱酸性環境を蛍光イメージングすることが可能なｐＨプローブを提供することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１ａ】ｐｉｐｅｉｎｄｏ−ＰＰｈＲの化学構造と光物理的特性
【図１ｂ】ｐｉｐｅｉｎｄｏ−ＰＰｈＲのｐＨの異なる０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（含０．１％ＤＭＳＯ）中における吸収スペクトル
【図１ｃ】ｐｉｐｅｉｎｄｏ−ＰＰｈＲのｐＨに対する吸収強度比のプロット
【図１ｄ】ｐｉｐｅｉｎｄｏ−ＰＰｈＲのｐＨの異なる０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（含０．１％ＤＭＳＯ）中における蛍光スペクトル
【図１ｅ】ｐｉｐｅｉｎｄｏ−ＰＰｈＲのｐＨの異なる０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（含０．１％ＤＭＳＯ）中における励起スペクトル
【図１ｆ】ｐｉｐｅｉｎｄｏ−ＰＰｈＲのｐＨ対する蛍光強度比のプロット
【図２ａ】ｐＥＰＰＲの化学構造と光物理的特性
【図２ｂ】ｐＥＰＰＲのｐＨの異なる０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（含０．１％ＤＭＳＯ）中における吸収スペクトル
【図２ｃ】ｐＥＰＰＲのｐＨに対する吸収強度比のプロット
【図２ｄ】ｐＥＰＰＲのｐＨの異なる０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（含０．１％ＤＭＳＯ）中における蛍光スペクトル
【図２ｅ】ｐＥＰＰＲのｐＨの異なる０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（含０．１％ＤＭＳＯ）中における励起スペクトル
【図２ｆ】ｐＥＰＰＲのｐＨ対する蛍光強度比のプロット
【図３ａ】Ｍｅ−ｐＥＰＰＲの化学構造と光物理的特性
【図３ｂ】Ｍｅ−ｐＥＰＰＲのｐＨの異なる０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（含０．１％ＤＭＳＯ）中における吸収スペクトル
【図３ｃ】Ｍｅ−ｐＥＰＰＲのｐＨに対する吸収強度比のプロット
【図３ｄ】Ｍｅ−ｐＥＰＰＲのｐＨの異なる０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（含０．１％ＤＭＳＯ）中における蛍光スペクトル
【図３ｅ】Ｍｅ−ｐＥＰＰＲのｐＨの異なる０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（含０．１％ＤＭＳＯ）中における励起スペクトル
【図３ｆ】Ｍｅ−ｐＥＰＰＲのｐＨ対する蛍光強度比のプロット
【図４ａ】Ｅｔ−ｐＥＰＰＲの化学構造と光物理的特性
【図４ｂ】Ｅｔ−ｐＥＰＰＲのｐＨの異なる０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（含０．１％ＤＭＳＯ）中における吸収スペクトル
【図４ｃ】Ｅｔ−ｐＥＰＰＲのｐＨに対する吸収強度比のプロット
【図４ｄ】Ｅｔ−ｐＥＰＰＲのｐＨの異なる０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（含０．１％ＤＭＳＯ）中における蛍光スペクトル
【図４ｅ】Ｅｔ−ｐＥＰＰＲのｐＨの異なる０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（含０．１％ＤＭＳＯ）中における励起スペクトル
【図４ｆ】Ｅｔ−ｐＥＰＰＲのｐＨ対する蛍光強度比のプロット
【図５ａ】ｉＰｒ−ｐＥＰＰＲの化学構造と光物理的特性
【図５ｂ】ｉＰｒ−ｐＥＰＰＲのｐＨの異なる０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（含０．１％ＤＭＳＯ）中における吸収スペクトル
【図５ｃ】ｉＰｒ−ｐＥＰＰＲのｐＨに対する吸収強度比のプロット
【図５ｄ】ｉＰｒ−ｐＥＰＰＲのｐＨの異なる０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（含０．１％ＤＭＳＯ）中における蛍光スペクトル
【図５ｅ】ｉＰｒ−ｐＥＰＰＲのｐＨの異なる０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（含０．１％ＤＭＳＯ）中における励起スペクトル
【図５ｆ】ｉＰｒ−ｐＥＰＰＲのｐＨ対する蛍光強度比のプロット
【図６ａ】０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー中２μＭのＭｅ−ｐＥＰＰＲの蛍光レシオイメージを示す。
【図６ｂ】ｐＨに対する蛍光強度比のプロット及びｐＫａを表す。
【図６ｃ】０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー中２μＭのＭｅ−ｐＥＰＰＲの蛍光レシオイメージを示す。
【図６ｄ】ｐＨに対する蛍光強度比のプロット及びｐＫａを表す。
【図７ａ】デキストランに様々な当量のＭｅ−ｐＥＰＰＲを標識したプローブ（Ｄｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ）の光物理的特性を示す。
【図７ｂ】Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ又はＤｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ（ＤＯＬ５．７）を担持させたＡ５４９細胞の共焦点蛍光顕微鏡イメージ
【図８】２０μＭのＤｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ（ＤＯＬ＝５．７）（２０μＬ）を経口投与後２時間でのマウスの胃腸のｐＨの蛍光イメージを示す。
【図９】２０μＭのＤｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ（ＤＯＬ＝５．７）（２０μＬ×２）を経口投与後（上段）、及びその後、ＮａＨＣＯ３水溶液（胃の制酸薬）投与後（下段）のマウスの胃腸のｐＨの蛍光イメージを示す。
【図１０ａ】Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍モデルマウスにＤｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ（ＤＯＬ＝１．４）（１４０μＭ、１００μＬ）を静脈内投与後１時間における蛍光レシオイメージ（マウスに水を与えた場合）
【図１０ｂ】Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍モデルマウスにＤｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ（ＤＯＬ＝１．４）（１４０μＭ、１００μＬ）を静脈内投与後１時間における蛍光レシオイメージ（マウスに２００ｍＭのＮａＨＣＯ３水溶液を与えた場合）
【図１０ｃ】水を与えたマウス（ｍｏｃｋ）及び２００ｍＭのＮａＨＣＯ３を与えたマウス（ＮａＨＣＯ３）のｐＨヒストグラム
【図１０ｄ】水を与えたマウス（ｍｏｃｋ）及び２００ｍＭのＮａＨＣＯ３を与えたマウス（ＮａＨＣＯ３）の平均ｐＨ
【図１１ａ】マウスにＤｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ（ＤＯＬ＝１．４）（１４０μＭ、１００μＬ）を静脈内投与後１時間における蛍光レシオイメージ（マウスに生理食塩水を１週間経口投与した場合）
【図１１ｂ】マウスにＤｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ（ＤＯＬ＝１．４）（１４０μＭ、１００μＬ）を静脈内投与後１時間における蛍光レシオイメージ（マウスにアセタゾラミドを１週間経口投与した場合）
【図１１ｃ】生理食塩水を１週間経口投与したマウス（ｍｏｃｋ）及びアセタゾラミドを１週間経口投与したマウス（ＡＺＭ）の平均ｐＨ
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１〜６個、好ましくは炭素数１〜４個、更に好ましくは炭素数１〜３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。
【００１３】
本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
【００１４】
本発明の１つの実施態様は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である（以下「実施態様１」とも言う。）
2018090536.tif 000007
【００１５】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す。Ｒ１は、同一であっても異なっていてもよい。
ここで、Ｒ１は、Ｒ２ａ及びＲ２ｂで置換されている位置以外のベンゼン環上の３つの位置に導入される。Ｒ１がベンゼン環上に存在する一価の置換基を示す場合には、ベンゼン環上に同一又は異なる置換基が１ないし２個程度存在していることが好ましい。Ｒ１が１個又は２個以上の一価の置換基を示す場合には、該置換基はベンゼン環上の任意の位置に置換することができる。好ましくは、Ｒ１は水素原子を示す（即ち、Ｒ１の全てが水素原子）か、１個の置換基が存在する場合（即ち、Ｒ１の１つが一価の置換基であり、それ以外は水素原子）である。
【００１６】
Ｒ１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲ１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。更に、Ｒ１が示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４−カルボキシブトキシ基又は４−アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。
【００１７】
一つの好ましい側面において、Ｒ１が炭素数１〜６個のアルキル基などの一価の置換基であり、該置換基はベンゼン環上の３位から５位に存在する。
【００１８】
本発明の１つの態様においては、Ｒ１の少なくとも１つは、ラベル部位又は標的集積部位（「生体高分子標識部位」とも言う。）を導入することが可能な官能基である。ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基とは、ラベル部位又は標的集積部位と反応することが可能な官能基を意味し、その例は、カルボキシル基、カルボキシル基を有するアルキル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アミド基、アルキルアミノ基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基などが挙げられ、特にカルボキシル基、カルボキシル基を有するアルキル基、アミノ基、アミド基が好ましい。
Ｒ１の少なくとも１つは、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基である場合においては、その他のＲ１は水素であっても、上記の一価の置換基（炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基）であってもよい。
【００１９】
一つの好ましい側面において、Ｒ１の少なくとも１つは、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基であり、該官能基はベンゼン環上の３位から５位に存在する。
【００２０】
本発明の好ましい側面において、Ｒ１の少なくとも１つは、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基（特に好ましくは、カルボキシル基、カルボキシル基を有するアルキル基、アミノ基、アミド基）であり、その他のＲ１は水素である。
【００２１】
また、一つの好ましい側面において、Ｒ１の少なくとも１つはカルボキシル基であり、その他のＲ１は水素であり、カルボキシル基はベンゼン環上の４位に存在する。
【００２２】
一般式（Ｉ）において、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、一価の置換基を示す。
Ｒ２ａ及びＲ２ｂが示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、Ｒ１と同様に、例えば、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれる。
本発明の１つの好ましい態様においては、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基又はハロゲン原子である。
また、本発明の１つのより好ましい態様においては、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が炭素数１〜６個のアルキル基である。
また、本発明の１つの更に好ましい態様においては、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基である。
理論に拘束されることを意図するものではないが、Ｐローダミン骨格においてはベンゼン環が結合している炭素原子は求核攻撃を非常に受け易く、水によっても求核攻撃を受ける可能性があるが、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が炭素数１〜６個のアルキル基であるとかかる求核攻撃を防止することができ、プローブの溶液中における安定性を向上させることができる。
【００２３】
一般式（Ｉ）において、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。
Ｒ３又はＲ４がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ３又はＲ４が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ３及びＲ４がともに水素原子である場合、又はＲ３及びＲ４がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
【００２４】
一般式（Ｉ）において、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示すが、Ｒ３及びＲ４について説明したものと同様である。Ｒ５及びＲ６が共に水素原子であるか、共に塩素原子であるか、又は共にフッ素原子であることが好ましい。
【００２５】
一般式（Ｉ）において、Ｒ７は、置換されていてもよいフェニル基を示す。Ｒ７が置換されていてもよいフェニル基であると、求核種に対する化学的な安定性が高まり好ましい。
置換基としては、フェニル基、メチル基、エチル基、プロピル基などが挙げられ、好ましくは、フェニル基である。
【００２６】
一般式（Ｉ）において、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示す。
【００２７】
また、Ｒ８及びＲ９は一緒になってＲ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよい。ヘテロシクリルとしては、アゼチジン、ピロリジン等があげられ、これらヘテロシクリルは炭素数１〜６個のアルキル等の置換基で置換されていてもよい。
【００２８】
また、Ｒ８又はＲ９、或いは、Ｒ８及びＲ９の両方は、夫々、Ｒ３、Ｒ５と一緒になって、Ｒ８、Ｒ９が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基（ベンジル基、フェネチル基等）、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子、メチル基又はエチル基である。
理論に拘束されることを意図するものではないが、優れたレシオ型ｐＨプローブを得る観点からはＰローダミン骨格の３位及び６位のアミノ基を非対称な構造にするのが好ましく、一方、Ｐローダミン骨格が左右対称な構造であるほど蛍光量子収率が向上する傾向にある。本発明の化合物のＰローダミン骨格はピペラジン環を有するものであるが、もう一方のアミノ基に水素原子、メチル基又はエチル基を導入することにより、優れたレシオ型ｐＨプローブとしての特性を有すると共に、蛍光量子収率を向上させることが可能である。
【００３０】
一般式（Ｉ）においてＲ１０は、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又は炭素数１〜６個のフッ素化アルキル基を示す。Ｒ１０は、好ましくは、水素原子、メチル基、エチル基、イソプロピル基、トリフルオロメチル基又はトリフルオロエチル基であり、より好ましくは、メチル基、エチル基、イソプロピル基である。Ｒ１０としてこれらの置換基を導入することにより、弱酸性のｐＫａを有するｐＨプローブを提供することが可能である。
【００３１】
本発明のもう一つの実施態様は、一般式（Ｉ）におけるＲ１の少なくとも１つが、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基であって、当該官能基が架橋基と結合した化合物又はその塩である（以下「実施態様２」とも言う）。
ここで、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基としては、カルボニル基、アルキルカルボニル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アミド基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基などが挙げられ、特にカルボニル基、アルキルカルボニル基が好ましい。
【００３２】
また、架橋基としては、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基とラベル部位又は標的集積部位とを連結させるスペーサーとして働くものであればいずれの架橋基であってもよい。例えば、置換又は無置換の炭化水素基（アルカン、アルケン、アルキン、シクロアルカン、芳香族炭化水素など）、エチレングリコール基、ジエチレングリコール基、トリエチレングリコール基、ポリエチレングリコール基など、システイン酸アルキル及び複素環基（例えば、ピペリジニル基など）などが挙げられるが、これらに限定されない。また、上記架橋基は、その片方または両方の端部に、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基、ラベル部位又は標的集積部位と結合することができる官能基を有してもよい。このような官能基として、例えば、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、アミド基、プロパギル基などが挙げられる。
【００３３】
実施態様２の１つの側面は、以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩である。
2018090536.tif 000008
【００３４】
一般式（ＩＩ）において、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ３〜Ｒ１０は、一般式（Ｉ）について記載した通りである。
【００３５】
Ｘは、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基がＴと結合した後の構造を示し、Ｔは、前記した架橋基である。
該架橋基は、その片方または両方の端部に、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基、ラベル部位又は標的集積部位と結合することができる官能基を有してもよい。このような官能基として、例えば、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、アミド基、プロパギル基などが挙げられる。
また、Ｒ１’は、水素、又は一般式（Ｉ）のＲ１として定義した同一又は異なる一価の置換基であり、その詳細は一般式（Ｉ）の化合物について説明した通りである。
Ｒ１’は、好ましくは、水素である。
【００３６】
一般式（ＩＩ）において、ｍは１〜２の整数であり、ｎは１〜２の整数であり、但し、ｍ＋ｎ＝３である。
【００３７】
一般式（ＩＩ）において、−（Ｘ−Ｔ）は、ベンゼン環の３〜５位のいずれの位置に導入することができる。
一般式（ＩＩ）で表される化合物の好ましい側面において、ｍは１であり、ｎは２であり、この場合、Ｒ１’は同一であっても異なっていてもよい。
【００３８】
本発明のもう一つの実施態様は、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）におけるＲ１の少なくとも１つが、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基であって、当該官能基は架橋基と結合し、更に架橋基がラベル部位又は標的集積部位と結合した化合物又はその塩である。
また、本発明のもう一つの実施態様は、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）におけるＲ１の少なくとも１つが、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基であって、当該官能基は、架橋基を介さずに、ラベル部位又は標的集積部位と結合した化合物又はその塩である。
上記２種類の実施態様を総称して以下「実施態様３」とも言う。
ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基、架橋基については、実施態様２で説明した通りである。
【００３９】
ラベル部位又は標的集積部位の例として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｈａｌｏタグリガンド（例えば、２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタンアミノ基）、弱塩基性アミン、マレイミド、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基、ベンジルグアニン誘導体又はベンジルシトシン誘導体などが挙げられる。また、ラベル部位又は標的集積部位には、片末端又は両末端に修飾基を有してもよいポリエチレングリコール基も含まれ、修飾基としてはアミノ基、カルボニル基、カルボキシル基などが挙げられる。修飾基を有するポリエチレングリコール基の非限定的例として、３−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）プロパン酸が挙げられる。
【００４０】
また、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基の一部にラベル部位又は標的集積部位が導入された化合物、即ち、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基と、ラベル部位又は標的集積部位を導入した置換基の両方を有する化合物も、実施態様３に含まれる。
【００４１】
実施態様３の１つの側面は、以下の一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又は
その塩である。
2018090536.tif 000009
【００４２】
一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ３〜Ｒ１０は、一般式（Ｉ）について記載した通りである。また、Ｘ、Ｒ１’、ｍ、ｎは、一般式（ＩＩ）について記載した通りである。
【００４３】
一般式（ＩＩ）において、Ｔ’は、存在する場合は、架橋基がＳと結合した後の構造である。また、Ｓは。ラベル部位又は標的集積部位を示し；
Ｒ１’は、水素、又は同一又は異なる一価の置換基である。
【００４４】
一般式（ＩＩＩ）において、−（Ｘ−（Ｔ’）−Ｓ）は、ベンゼン環の３〜５位のいずれの位置に導入することができる。
一般式（ＩＩＩ）で表される好ましい側面において、ｍは１であり、ｎは２であり、この場合、Ｒ１’は同一であっても異なっていてもよい。
【００４５】
実施態様３の１つの好ましい側面においては、一般式（ＩＩＩ）における−Ｓは、スクシンイミジルエステル体である。
また、一般式（ＩＩＩ）の化合物の１つの好ましい側面においては、−（Ｘ−（Ｔ’）−Ｓ）は以下の構造を有する。
2018090536.tif 000010
【００４６】
一般式（ＩＩＩ）の化合物は、特定のタンパク質、糖、抗体などをラベルすることができ、また、細胞内に局在させることができることから、細胞内のｐＨをｉｎ  ｖｉｖｏで測定することが可能である。
ラベル部位としてスクシンイミジルエステル体や末端をカルボキシル基等で修飾したポリエチレングリコールを分子内に導入した場合には、これを糖ポリマーである水溶性高分子担体であるデキストランにラベル化することで本発明の蛍光プローブをｉｎ  ｖｉｖｏイメージングへ応答することが可能になる。
【００４７】
本発明の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物の非限定的な例としては以下の化合物が挙げられる。
2018090536.tif 000011
2018090536.tif 000012
上記の（１）〜（６）において、Ｒ１、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は以下の通りである。
Ｒ１＝Ｈ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＳｕ（Ｓｕ：Ｎ−スクシンイミド）、ＣＯＮＨＲ（Ｒ：炭素数１〜６のアルキル基）
Ｒ８＝Ｅｔ、Ｍｅ、Ｈ
Ｒ９＝Ｅｔ、Ｍｅ、Ｈ
Ｒ１０＝Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉＰｒ、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＦ３
【００４８】
本発明のもう１つの実施態様は、一般式（ＩＶ）で表される化合物又はその塩である。
2018090536.tif 000013
【００４９】
一般式（ＩＶ）において、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ３〜Ｒ１０は、一般式（Ｉ）について記載した通りである。また、Ｒ１’、ｍ、ｎは、一般式（ＩＩ）について記載した通りである。
【００５０】
一般式（ＩＶ）において、Ｘは、生体高分子標識部位を導入することが可能な官能基がＴと結合した後の構造を示し、Ｔ’は、存在する場合は、架橋基がＤｘと結合した後の構造である。
また、Ｄｘは、デキストランを示す。
ｐは、デキストランとの結合当量を示し、通常、ｐは６以下であり、好ましくは、０．９５〜５．７である。
【００５１】
一般に、水溶性の高分子担体は細胞に取り込まれないため、血中滞留性を上昇させ、様々な組織に分布することが知られていることから、本発明の化合物を水溶性高分子担体であるデキストランにラベル化することで、特定の組織や細胞内に取り込まれることにより目的の組織にプローブを到達させることが容易になり、優れたＩｎ  ｖｉｖｏイメージングを提供することが可能である。
【００５２】
本発明の一般式（Ｉ）〜（ＶＩ）の化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質も本発明の範囲内である。
【００５３】
本発明の一般式（Ｉ）〜（ＶＩ）の化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。
【００５４】
本発明の一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）で表される化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）で表される本発明の化合物を製造することができる。
【００５５】
本発明のもう１つの態様は、一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかの化合物又はその塩を含む蛍光プローブである。
【００５６】
また、本発明のもう１つの態様は、細胞内の酸性領域の測定方法であって、
（ａ）一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかの化合物又はその塩を含む蛍光プローブを細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内で発する蛍光を測定する工程を含む方法である。
【００５７】
本発明の更に１つの態様は、（ａ）細胞を一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかの化合物又はその塩と接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、（ｂ）前記接触させた細胞を、前記化合物が前記細胞に侵入するためにインキュベーションし、標識された細胞を形成する段階と、（ｃ）前記標識された細胞を、蛍光が測定される適切な波長を用いて照射し、それによって前記細胞内部のｐＨをモニターする段階とを含む、生細胞内部のｐＨをモニターするための方法である。ここで、細胞としては、正常細胞、癌細胞、神経細胞等が挙げられる。
【００５８】
本発明の更に１つの態様は、（ａ）一般式（ＩＶ）の化合物又はその塩を被検体に投与する工程、（ｂ）被検体の細胞、組織又は臓器を、蛍光が測定される適切な波長を用いて照射し、それによって前記細胞、組織又は臓器内部のｐＨをモニターする段階とを含む、生体内部のｐＨをｉｎ  ｖｉｖｏでモニターするための方法である。
投与方法としては、経口投与、静脈内投与等が挙げられる。
また、細胞としては、正常細胞、癌細胞、神経細胞等が挙げられる。組織としては、正常筋肉組織、腫瘍組織、脂肪組織等が挙げられ、臓器としては、胃、消化管、膵臓、肝臓、腎臓等が挙げられる。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６０】
［合成実施例１］
以下のスキーム１により化合物１（５−（２，６−ジメチルフェニル）−１−メチル−１０−フェニル−８−（ピペラジン−１−イル）−３，１０−ジヒドロ−２Ｈ−ホスフィノリノ［３，２−ｆ］インドール−１−イウム  １０−オキシド（ｐｉｐｅｉｎｄｏ−ＰＰｈＲ））を合成した。
【００６１】
スキーム１：ｐｉｐｅｉｎｄｏ−ＰＰｈＲの合成スキーム
2018090536.tif 000014
【００６２】
（１）１−Ｂｏｃ−４−（３−ブロモ−４−ホルミルフェニル）ピペラジン（１）の合成
2018090536.tif 000015
【００６３】
２−ブロモ−４−フルオロベンズアルデヒド（４．７６ｇ、２３ｍｍｏｌ）、１−Ｂｏｃ−ピペラジン（４．２８ｇ、２３ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（４．０４ｇ、２９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解し、１００ｏＣで３１時間攪拌した。溶液を室温に冷やし、水を加え、ＤＣＭで抽出して有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、溶媒を減圧除去した。残渣を中圧分取（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、８０／２０ヘキサン／ＤＣＭ→５０／５０ヘキサン／ＤＣＭ）で精製し、１−Ｂｏｃ−４−（３−ブロモ−４−ホルミルフェニル）ピペラジン（４．４１  ｇ、５２％収率）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 10.11 (1H, s, f), 7.81 (1H, d, J = 8.8 Hz, a), 6.98 (1H, d, J = 2.2 Hz, c), 6.82 (1H, dd, J = 8.8, 2.2 Hz, b), 3.59 (4H, t, J = 5.5 Hz, d), 3.39 (4H, t, J = 5.5 Hz, e), 1.49 (9H, s, g).
【００６４】
（２）１−Ｂｏｃ−４−（３−ブロモ−４−ヒドロキシメチルフェニル）ピペラジン（２）の合成
2018090536.tif 000016
【００６５】
１−Ｂｏｃ−４−（３−ブロモ−４−ホルミルフェニル）ピペラジン（２．５７ｇ、７．０ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５０ｍＬ）に溶解し、ＮａＢＨ４（２９０ｍｇ、７．７ｍｍｏｌ）を加え室温で１．５時間攪拌した。これに水を加え、ＤＣＭで抽出して有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、１−Ｂｏｃ−４−（３−ブロモ−４−ヒドロキシメチルフェニル）ピペラジン（２．５６ｇ、９９％収率）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.32 (1H, d, J = 8.1 Hz, a), 7.08 (1H, d, J = 2.1 Hz, c), 6.85 (1H, dd, J = 8.1, 2.2 Hz, b), 4.66 (2H, d, J = 6.6 Hz, f), 3.56 (4H, t, J = 5.1 Hz, d), 3.13 (4H, t, J = 5.1 Hz, e), 2.02 (1H, t, J = 6.6 Hz, h), 1.48 (9H, s, g).
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 154.6, 151.8, 130.9, 130.0, 123.9, 120.1, 115.4, 80.1, 64.8, 48.9, 28.4.
HRMS: Calcd for [M+H]+, 371.0970, Found, 371.0922 (-4.8 mmu).
【００６６】
（３）Ｎ−メチルインドリン（３）の合成
文献（Koide, Y.; Urano, Y.; Hanaoka, K.; Piao, W.; Kusakabe, M.; Saito, N.; Terai, T.; Okabe, T.; Nagano, T., Development of NIR fluorescent dyes based on Si-rhodamine for in vivo imaging. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134 (11), 5029-5031.）に従って、Ｎ−メチルインドリンを合成した。
【００６７】
（４）ｔｅｒｔ−ブチル  ４−（３−ブロモ−４−（（６−ブロモ−１−メチルインドリン−５−イル）メチル）フェニル）ピペラジン−１−カルボキシレート（４）の合成
2018090536.tif 000017
【００６８】
１−Ｂｏｃ−４−（３−ブロモ−４−ヒドロキシメチルフェニル）ピペラジン（１．９４ｇ、５．２ｍｍｏｌ）とＮ−メチルインドリン（１．１１ｇ、５．２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解し、ＢＦ３・ＯＥｔ２（１．１４ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を加え室温で３時間攪拌した。これに水を加え、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、溶媒を減圧除去した。残渣を中圧分取（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、ＤＣＭ→９８／２ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、ｔｅｒｔ−ブチル  ４−（３−ブロモ−４−（（６−ブロモ−１−メチルインドリン−５−イル）メチル）フェニル）ピペラジン−１−カルボキシレート（１．５６ｇ、５３％収率）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.13 (1H, d, J = 2.1 Hz, e), 6.88 (1H, d, J = 8.7 Hz, c), 6.77 (1H, dd, J = 8.7, 2.1 Hz, d), 6.70 (1H, s, b), 6.65 (1H, s, a), 4.00 (2H, s, l), 3.56 (4H, t, J = 5.1 Hz, i), 3.30 (2H, t, J = 8.1 Hz, g), 3.10 (4H, t, J = 5.1 Hz, j), 2.82 (2H, t, J = 8.1 Hz, f), 1.48 (9H, s, k).
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 154.7, 153.1, 150.5, 131.2, 130.8, 130.2, 127.5, 126.1, 125.4, 123.1, 102.3, 115.6, 110.8, 80.0, 56.2, 49.1, 40.4, 36.0, 28.4, 28.3.
HRMS: Calcd for [M+H]+, 566.0841, Found, 566.0850 (+0.9 mmu).
【００６９】
（５）ｌｅｕｃｏ  Ｂｏｃｐｉｐｅ−ｉｎｄｏ−ＰＰｈＲ（５）の合成
2018090536.tif 000018
【００７０】
ｔｅｒｔ−ブチル−４−（３−ブロモ−４−（（６−ブロモ−１−メチルインドリン−５−イル）メチル）フェニル）ピペラジン−１−カルボキシレート（１．５３ｇ、２．７ｍｍｏｌ）をＡｒ置換下、ＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解し、−７８ｏＣでｓ−ＢｕＬｉ（１Ｍ  ヘキサン溶液）（５．７ｍＬ、５．７ｍｍｏｌ）を徐々に加え、３０分間攪拌した。ジクロロフェニルホスフィン（４４１μＬ、３．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解したものを加え、２時間半攪拌した。０ｏＣに温め、３０％過酸化水素水（５ｍＬ、４４ｍｍｏｌ）を加え、１時間攪拌した後、溶媒を減圧除去し、残渣を中圧分取  （ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、９７／３ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、その後、ＮＨ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、１／１ヘキサン／ＤＣＭ→ＤＣＭ）で精製し、ｌｅｕｃｏ  Ｂｏｃｐｉｐｅ−ｉｎｄｏ−ＰＰｈＲ（２２８ｍｇ、１６％収率）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.69 (1H, dd, J = 2.2 Hz, JH-P = 13.2 Hz, h),7.50-7.42 (2H, m, c), 7.37-7.22 (4H, m, a, b, f), 7.19 (1H, d, JH-P = 12.5 Hz, e), 7.06-6.97 (2H, m, d, g), 3.90-3.64 (2H, m, o), 3.58-3.55 (4H, m, m), 3.34-3.23 (2H, m, j), 3.19-3.16 (2H, m, l), 2.93 (2H, t, J = 8.1 Hz, i), 2.75 (3H, s, k), 1.48 (9H, s, n).
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 154.1, 152.0 (d, JC-P = 13.7 Hz), 149.5 (d, JC-P = 12.4 Hz), 134.5 (d, JC-P = 2.5 Hz), 134.0 (d, JC-P = 105 Hz), 132.4 (d, JC-P = 8.7 Hz), 130.8 (d, JC-P = 2.5 Hz), 130.5 (d, JC-P = 9.3 Hz), 130.1 (d, JC-P = 10.6 Hz), 129.6 (d, JC-P = 100 Hz), 128.7 (d, JC-P = 11.2 Hz), 128.0 (d, JC-P = 11.8 Hz), 126.6 (d, JC-P = 101 Hz), 124.1 (d, JC-P = 12.4 Hz), 119.1 (d, JC-P = 1.9 Hz), 117.1 (d, JC-P = 7.5 Hz), 107.1 (d, JC-P = 8.1 Hz), 79.3, 55.3, 48.7, 35.6, 35.5, 28.9, 28.3, 27.9.
HRMS: Calcd for [M+H]+, 530.2573, Found, 530.2576 (+0.3 mmu).
【００７１】
（６）Ｂｏｃｐｉｐｅ−ｉｎｄｏ−ＰＰｈＸ（６）の合成
2018090536.tif 000019
【００７２】
Ｌｅｕｃｏ  Ｂｏｃｐｉｐｅ−ｉｎｄｏ−ＰＰｈＲ（２２１ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）とクロラニル（６１４ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解し、室温で７時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣を中圧分取（ＮＨ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、ＤＣＭ）で精製し、Ｂｏｃｐｉｐｅ−ｉｎｄｏ−ＰＰｈＸ（４７ｍｇ、２０％収率）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.32 (1H, dd, J = 8.8 Hz, JH-P = 5.9 Hz, f), 8.08 (1H, d, JH-P = 4.9 Hz, d), 7.61 (2H, dd, J = 7.3 Hz, JH-P = 12.7 Hz, c), 7.42-7.28 (4H, m, a, b, h), 7.05 (1H, dd, J = 9.0, 2.2 Hz, g), 6.79 (1H, d, JH-P = 13.7 Hz, e), 3.57-3.51 (6H, m, j, m), 3.40-3.35 (4H, m, l), 3.12-3.03 (2H, m, i), 2.86 (3H, s, k), 1.47 (9H, s, n).
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 180.0 (d, JC-P = 9.1 Hz), 156.0 (d, JC-P = 14.1 Hz), 154.5, 152.9 (d, JC-P = 12.4 Hz), 134.5 (d, JC-P = 96.8 Hz), 134.4 (d, JC-P = 98.5 Hz), 134.3, 131.4, 131.1 (d, JC-P = 9.9 Hz), 130.4 (d, JC-P = 9.9 Hz), 128.6 (d, JC-P = 12.4 Hz), 126.7 (d, JC-P = 6.6 Hz), 125.8 (d, JC-P = 6.6 Hz), 125.2 (d, JC-P = 10.8 Hz), 117.1, 114.7 (d, JC-P = 7.4 Hz), 104.8 (d, JC-P = 7.4 Hz), 80.1, 54.3, 46.8, 42.9, 33.8, 28.3, 27.7.
HRMS: Calcd for [M+H]+, 544.2365, Found, 544.2367 (+0.2 mmu).
【００７３】
（７）ｐｉｐｅｉｎｄｏ−ＰＰｈＲ（７）の合成
2018090536.tif 000020
【００７４】
Ｂｏｃｐｉｐｅ−ｉｎｄｏ−ＰＰｈＸ（１１ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）をＡｒ置換下、ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解し、（２，６−ジメチルフェニル）マグネシウムブロミド（１．０Ｍ  ＴＨＦ溶液）（２．０  ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）を５回に分けて加え、５時間攪拌した。これに２Ｎ塩酸（２ｍＬ）を加え有機溶媒を減圧除去した。残った溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、水／ＭｅＣＮ、０．１％ＴＦＡ）で精製し、ｐｉｐｅｉｎｄｏ−ＰＰｈＲ（２．２ｍｇ、１４％収率）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.70 (1H, d, JH-P = 15.1 Hz, e), 7.66-7.51 (4H, m, a, c, h), 7.43 (1H, ddd, J = 7.6, 7.6 Hz, JH-P = 3.4 Hz, b), 7.32 (1H, t, J = 7.6 Hz, n), 7.22-7.16 (2H, m, o), 7.03 (1H, dd, J = 9.0, 2.2 Hz, g), 6.97 (1H, dd, J = 9.3 Hz, JH-P = 6.3 Hz, f), 6.70 (1H, d, JH-P = 4.4 Hz, d), 4.04 (2H, t, J = 6.8 Hz, j), 3.77 (4H, t, J = 5.1 Hz, l), 3.40 (3H, s, k), 3.28 (4H, t, J = 5.1 Hz, m), 3.00-2.93 (2H, m, i), 1.92 (3H, s, p), 1.90 (3H, s, q).
HPLC (A/B=60/40→0/100, 30 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【００７５】
2018090536.tif 000021
【００７６】
［合成実施例２］
以下のスキーム２により化合物２（Ｎ−（１０−（２，６−ジメチルフェニル）−５−オキシド−５−フェニル−７−（ピペラジン−１−イル）アクリドホスフィン−３（５Ｈ）−イリデン）−Ｎ−エチルエタナミニウム（ｐＥＰＰＲ））を合成した。
【００７７】
スキーム２：ｐＥＰＰＲの合成スキーム
2018090536.tif 000022
【００７８】
（１）３−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン(８)の合成
文献（Lei, Z.; Li, X.; Li, Y.; Luo, X.; Zhou, M.; Yang, Y., Synthesis of Sterically Protected Xanthene Dyes with Bulky Groups at C-3′ and C-7′. J. Org. Chem. 2015, 80 (22), 11538-11543.）に従って、３−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンを合成した。
【００７９】
（２）ｔｅｒｔ−ブチル  ４−（３−ブロモ−４−（２−ブロモ−４−（ジエチルアミノ）ベンジル）フェニル）ピペラジン−１−カルボキシレート（９）の合成
2018090536.tif 000023
【００８０】
１−Ｂｏｃ−４−（３−ブロモ−４−ヒドロキシメチルフェニル）ピペラジン（３．６０ｇ、９．７ｍｍｏｌ）、３−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン（２．２１ｇ、９．７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（８０ｍＬ）に溶解し、ＢＦ３・ＯＥｔ２（２．１０ｍＬ、１９ｍｍｏｌ）を加え室温で８時間攪拌した。これに水を加え、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、溶媒を減圧除去した。残渣を中圧分取（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、１／１ヘキサン／ＤＣＭ→ＤＣＭ）で精製し、ｔｅｒｔ−ブチル４  （３−ブロモ−４−（２−ブロモ−４−（ジエチルアミノ）ベンジル）フェニル）ピペラジン−１−カルボキシレート（４．２８ｇ、５９％収率）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.10 (1H, dd, J = 2.2 Hz, f), 6.88-6.84 (2H, m, c, d), 6.80 (1H, d, J = 8.8 Hz, a), 6.70 (1H, dd, J = 8.8, 2.2 Hz, e), 6.48 (1H, dd, J = 8.8, 2.2 Hz, b), 3.96 (2H, s, l), 3.52 (4H, t, J = 4.4 Hz, j), 3.26 (4H, q, J = 7.0 Hz, g), 3.04 (4H, t, J = 4.4 Hz, i), 1.49 (9H, s, k), 1.11 (6H, t, J = 7.0 Hz, h).
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 154.3, 150.2, 147.1, 130.8, 130.6, 125.6, 125.1, 124.9, 119.9, 115.4, 115.0, 110.8, 79.5, 48.8, 44.0, 43.3, 39.7, 28.2, 12.3.
HRMS: Calcd for [M+H]+, 580.1174, Found, 580.1163 (-1.1 mmu).
【００８１】
（３）ｌｅｕｃｏ  Ｂｏｃｐｉｐｅ−ｄｉＥｔ−ＰＰｈＲ（１０）の合成
2018090536.tif 000024
ｔｅｒｔ−ブチル４  （３−ブロモ−４−（２−ブロモ−４−（ジエチルアミノ）ベンジル）フェニル）ピペラジン−１−カルボキシレート（５８０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をＡｒ置換下、ＴＨＦ（１５ｍＬ）に溶解し、−７８ｏＣでｓ−ＢｕＬｉ（１Ｍヘキサン溶液）（２．０ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）を徐々に加え、１時間間攪拌した。ジクロロホスフィン（１６２μＬ、１．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解したものを加え、２時間半攪拌した。０ｏＣに温め、３０％過酸化水素水（２ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）を加え、２時間攪拌した。これに水を加え、ＡｃＯＥｔで抽出して有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、溶媒を減圧除去し、残渣を中圧分取（ＮＨ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、１／２ヘキサン／ＤＣＭ→ＤＣＭ）で精製し、ｌｅｕｃｏ  Ｂｏｃｐｉｐｅ−ｄｉＥｔ−ＰＰｈＲ（１６３ｍｇ、３０％収率）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.71 (1H, dd, J = 2.4 Hz, JH-P = 13.2 Hz, i), 7.49-7.41 (3H, m, c, f), 7.35 (1H, t, J = 6.8 Hz, a), 7.29 (2H, ddd, J = 7.3, 7.3 Hz, JH-P = 2.1 Hz, b), 7.23 (1H, dd, J = 8.3 Hz, JH-P = 5.9 Hz, g), 7.18 (1H, dd, J = 8.3 Hz, JH-P = 6.3 Hz, d), 7.00 (1H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz, h), 7.20 (1H, dd, J = 8.3, 2.7 Hz, e), 3.91-3.65 (2H, m, o), 3.57 (4H, t, J = 5.1 Hz, m), 3.41-3.33 (4H, m, j), 3.20-3.15 (4H, m, l), 1.48 (9H, s, n), 1.13 (6H, t, J = 7.1 Hz, k).
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 154.4, 149.7 (d, JC-P = 12.4 Hz), 146.5 (d, JC-P = 12.4 Hz), 134.3 (d, JC-P = 104 Hz), 132.9 (d, JC-P = 8.3 Hz), 130.9, 130.4 (d, JC-P = 10.8 Hz), 129.5 (d, JC-P = 16.6 Hz), 129.0 (d, JC-P = 12.4 Hz), 128.8 (d, JC-P = 11.6 Hz), 128.6, 127.3 (d, JC-P = 8.3 Hz), 119.3, 117.6 (d, JC-P = 7.4 Hz), 114.9, 113.0 (d, JC-P = 8.3 Hz), 79.6, 48.9, 44.1, 43.2, 35.1, 28.2, 12.2.
HRMS: Calcd for [M+H]+, 546.2886, Found, 546.2889 (+0.3 mmu).
【００８２】
（４）Ｂｏｃｐｉｐｅ−ｄｉＥｔ−ＰＰｈＸ（１１）の合成
2018090536.tif 000025
【００８３】
Ｌｅｕｃｏ  Ｂｏｃｐｉｐｅ−ｄｉＥｔ−ＰＰｈＲ（１６３ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）とクロラニル（２２０ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解し、室温で９時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣を中圧分取（ＮＨ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、ＤＣＭ→９９／１ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、Ｂｏｃｐｉｐｅ−ｄｉＥｔ−ＰＰｈＸ（７０ｍｇ、４９％収率）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.33 (1H, dd, J = 8.8 Hz, JH-P = 5.9 Hz, g), 8.29 (1H, dd, J = 8.8 Hz, JH-P = 5.9 Hz, d), 7.61 (1H, d, JH-P = 12.5 Hz, i), 7.59 (1H, dd, J = 1.5 Hz, JH-P = 12.5 Hz, f), 7.40-7.30 (4H, m, b, c), 7.13-7.02 (2H, m, a, h), 6.83 (1H, dd, J = 9.2 Hz, JH-P = 2.6 Hz, e), 3.56 (4H, t, J = 5.1 Hz, m), 3.47-3.36 (8H, m, j, l), 1.47 (9H, s, n), 1.15 (6H, t, J = 7.0 Hz, k).
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 179.9 (d, JC-P = 8.1 Hz), 154.4, 152.8 (d, JC-P = 12.4 Hz), 150.5 (d, JC-P = 12.4 Hz), 134.8 (d, JC-P = 97.0 Hz), 134.5 (d, JC-P = 106 Hz), 134.4 (d, JC-P = 97.0 Hz), 131.6 (d, JC-P = 10.6 Hz), 131.4 (d, JC-P = 2.5 Hz), 131.0 (d, JC-P = 9.9 Hz), 130.2 (d, JC-P = 9.9 Hz), 128.5 (d, JC-P = 12.4 Hz), 126.8 (d, JC-P = 6.8 Hz), 123.2 (d, JC-P = 6.8 Hz), 117.1 (d, JC-P = 2.5 Hz), 114.4 (d, JC-P = 7.5 Hz), 114.1 (d, JC-P = 1.9 Hz), 111.3 (d, JC-P = 7.5 Hz), 80.1, 46.7, 44.4, 42.8, 28.3, 12.3.
HRMS: Calcd for [M+H]+, 582.2498, Found, 582.2496 (-0.2 mmu).
【００８４】
（５）ｐＥＰＰＲ（１２）の合成．
2018090536.tif 000026
【００８５】
Ｂｏｃｐｉｐｅ−ｄｉＥｔ−ＰＰｈＸ（２０ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）をＡｒ置換下、ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解し、（２，６−ジメチルフェニル）マグネシウムブロミド（１．０Ｍ  ＴＨＦ溶液）（２．１ｍＬ、２．１ｍｍｏｌ）を３回に分けて加え、８時間攪拌した。これに２Ｎ塩酸（２ｍＬ）を加え有機溶媒を減圧除去した。残った溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、水／ＭｅＣＮ、０．１％ＴＦＡ）で精製し、ｐＥＰＰＲ（６．２ｍｇ、２３％収率）を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 7.74-7.68 (2H, m, i, f), 7.63-7.52 (3H, m, a, c), 7.45 (2H, ddd, J = 7.6, 7.6 Hz, JH-P = 3.3 Hz, b), 7.33 (1H, t, J = 7.6 Hz, n), 7.23-7.17 (2H, m, o), 7.13-7.06 (3H, m, d, g, h), 6.98 (1H, dd, J = 9.8, 2.4 Hz, e), 3.89 (4H, t, J = 5.4 Hz, j), 3.86-3.69 (4H, m, l), 3.31 (4H, t, J = 5.1 Hz, m), 1.92 (3H, s, p), 1.91 (3H, s, q), 1.29-1.21 (6H, m, k).
HPLC (A/B=70/30→0/100, 35 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【００８６】
2018090536.tif 000027
【００８７】
［合成実施例３〜５］
以下のスキーム３により化合物３（Ｎ−（１０−（２，６−ジメチルフェニル）−７−（４−メチルピペラジン−１−イル）−５−オキシド−５−フェニルアクリドホスフィン−３（５Ｈ）−イリデン）−Ｎ−エチルエタナミニウム（Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ））、化合物４（Ｎ−（１０−（２，６−ジメチルフェニル）−７−（４−エチルピペラジン−１−イル）−５−オキシド−５−フェニルアクリドホスフィン−３（５Ｈ）−イリデン）−Ｎ−エチルエタナミニウム（Ｅｔ−ｐＥＰＰＲ））、及び化合物５（Ｎ−（１０−（２，６−ジメチルフェニル）−７−（４−イソプロピルピペラジン−１−イル）−５−オキシド−５−フェニルアクリドホスフィン−３（５Ｈ）−イリデン）−Ｎ−エチルエタナミニウム（ｉＰｒ−ｐＥＰＰＲ））を合成した。
【００８８】
スキーム３：Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ（１３）、Ｅｔ−ｐＥＰＰＲ（１４）、及びｉＰｒ−ｐＥＰＰＲ（１５）の合成スキーム
2018090536.tif 000028
【００８９】
（１）Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ（１３）の合成
2018090536.tif 000029
【００９０】
ｐＥＰＰＲ（３．１ｍｇ、４．０μｍｏｌ）と３７％ＨＣＨＯ水溶液（３０μＬ、４００μｍｏｌ）とＮａＢＨ３ＣＮ（２．２ｍｇ、３６μｍｏｌ）とＡｃＯＨ（２０μＬ）をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）に溶解し、室温で１時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ＯＤＳ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、水／ＭｅＣＮ、０．１％ＴＦＡ）で精製し、Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ（２．１ｍｇ、６７％収率）を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 7.85-7.75 (2H, m, f, i), 7.72-7.60 (3H, m, a, b), 7.58-7.51 (2H, m, c), 7.42 (1H, t, J = 7.3 Hz, n), 7.32-7.25 (2H, m, o), 7.21-7.15 (3H, m, d, g, h), 7.08 (1H, dd, J = 10.3, 2.2 Hz, e), 4.18-3.79 (8H, m, l, m), 3.45 (4H, s, j), 2.95 (3H, s, r), 2.01 (3H, s, p), 2.00 (3H, s, q), 1.36-1.30 (6H, m, k).
HPLC (A/B=70/30→0/100, 35 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【００９１】
2018090536.tif 000030
【００９２】
（２）Ｅｔ−ｐＥＰＰＲ（１４）の合成
2018090536.tif 000031
【００９３】
ｐＥＰＰＲ（２．８ｍｇ、３．６μｍｏｌ）とＣＨ３ＣＨＯ（２２．４μＬ、３６１μｍｏｌ）とＮａＢＨ３ＣＮ（１．０ｍｇ、１６μｍｏｌ）とＡｃＯＨ（２０μＬ）をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）に溶解し、室温で３０分間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ＯＤＳ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、水／ＭｅＣＮ、０．１％ＴＦＡ）で精製し、Ｅｔ−ｐＥＰＰＲ（１．７ｍｇ、５９％収率）を得た。
1H NMR (300 MHz, CD2Cl2): δ 7.72-7.52 (7H, m, a, b, c, f, i), 7.41 (1H, t, J = 7.7 Hz, n), 7.32-7.17 (4H, m, d, g, o), 6.90 (1H, d, J = 8.8 Hz, h), 6.76 (1H, d, J = 9.5 Hz, e), 3.90-3.43 (12H, m, l, m, j), 3.32 (2H, t, J = 7.3 Hz, r), 2.02 (3H, s, p), 2.00 (3H, s, q), 1.42-1.30 (9H, m, k, s).
HPLC (A/B=70/30→0/100, 35 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【００９４】
2018090536.tif 000032
【００９５】
（３）ｉＰｒ−ｐＥＰＰＲ（１５）の合成
2018090536.tif 000033
【００９６】
ｐＥＰＰＲ（３．７ｍｇ、４．８μｍｏｌ）とアセトン（３５μＬ、４８０μｍｏｌ）とＮａＢＨ３ＣＮ（１．３ｍｇ、２．１μｍｏｌ）とＡｃＯＨ（２０μＬ）をＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶解し、室温で４時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ＯＤＳ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、水／ＭｅＣＮ、０．１％ＴＦＡ）で精製し、ｉＰｒ−ｐＥＰＰＲ（１．５ｍｇ、３８％収率）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.82 (1H, d, JH-P = 16.1 Hz, i), 7.76 (1H, d, JH-P = 16.2 Hz, f), 7.71-7.62 (3H, m, a, c), 7.54 (1H, ddd, J = 7.7, 7.7 Hz, JH-P = 3.1 Hz, b), 7.42 (1H, t, J = 7.6 Hz, n), 7.31-7.26 (2H, m, o), 7.20-7.14 (3H, m, d, g, h), 7.05 (1H, d, J = 8.8 Hz, e), 3.96-3.76 (5H, m, m, r), 3.21 (4H, q, J = 7.3 Hz, j), 2.90-2.56 (4H, m, l), 2.02 (3H, s, p), 2.01 (3H, s, q), 1.37-1.27 (12H, m, k, s).
HPLC (A/B=70/30→0/100, 35 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【００９７】
2018090536.tif 000034
【００９８】
［合成実施例６］
以下のスキーム４により化合物６（Ｎ−（１０−（４−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）−２，６−ジメチルフェニル）−７−（４−メチルピペラジン−１−イル）−５−オキシド−５−フェニルアクリドホスフィン−３（５Ｈ）−イリデン）−Ｎ−エチルエタナミニウム（Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ−ＳＥ）を合成した。
【００９９】
スキーム４：Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ−ＳＥ（２０）の合成
2018090536.tif 000035
【０１００】
（１）２，５−ジブロモ−ｍ−キシレン（１６）の合成．
2018090536.tif 000036
【０１０１】
４−ブロモ−２，６−ジメチルアニリン（６．００ｇ、３０ｍｍｏｌ）を４８％ＨＢｒ水溶液（２０ｍＬ）に懸濁し、−１０ｏＣで水に溶解したＮａＮＯ２（２．２８ｇ、３３ｍｍｏｌ）を加え、１時間攪拌し、スルファミン酸（０．５８ｇ、６ｍｍｏｌ）を加えた。これを、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（４．１７ｇ、１５ｍｍｏｌ）を４８％ＨＢｒ水溶液（２０ｍＬ）に溶解し８０ｏＣに加熱したものに徐々に加え、８０ｏＣで１時間攪拌した。これに水を加え、ヘキサンで抽出して有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、溶媒を減圧除去した。中圧分取（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、ヘキサン）で精製し、２，５−ジブロモ−ｍ−キシレン（６．１９ｇ、７２％収率）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.19 (2H, s, a), 2.37 (6H, s, b).
【０１０２】
（２）ｔｅｒｔ−ブチル  ４−ブロモ−３，５−ジメチルベンゾエート（１７）の合成．
2018090536.tif 000037
【０１０３】
２，５−ジブロモ−ｍ−キシレン（４．６９ｇ、１８ｍｍｏｌ）をＡｒ置換下、ＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解し、−７８ｏＣでｎ−ＢｕＬｉ（１．６Ｍヘキサン溶液）（１１．１ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）を加え、２時間攪拌した。これにＢｏｃ２Ｏ（４．０８ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解したものを加え、室温で２時間攪拌した。これに水を加え、ＤＣＭで抽出して有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、溶媒を減圧除去した。残渣を中圧分取（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、ヘキサン）で精製し、ｔｅｒｔ−ブチル  ４−ブロモ−３，５−ジメチルベンゾエート（３．５３ｇ、６９％収率）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.65 (2H, s, a), 2.43 (6H, s, b), 1.58 (9H, s, c).
【０１０４】
（３）ｐＥＰＰＲ−ＣＯＯＨ（１８）の合成
2018090536.tif 000038
【０１０５】
ｔｅｒｔ−ブチル  ４−ブロモ−３，５−ジメチルベンゾエート（９０３ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）をＡｒ置換下、ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解し、−７８ｏＣでｓ−ＢｕＬｉ（１．０Ｍヘキサン溶液）（３．２ｍＬ、３．２ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪拌した。これにＢｏｃｐｉｐｅ−ｄｉＥｔ−ＰＰｈＸ（１７３ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解したものを加え、−７８ｏＣで１．５時間攪拌した。これに２Ｎ塩酸（５ｍＬ）を加え有機溶媒を減圧除去した。残った溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、水／ＭｅＣＮ、０．１％ＴＦＡ）で精製し、ｐＥＰＰＲ−ＣＯＯＨ（２２．４ｍｇ、８．８％収率）を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 7.95-7.92 (2H, m, n), 7.84-7.78 (2H, m, i, f), 7.71-7.62 (3H, m, a, c), 7.54 (2H, ddd, J = 7.6, 7.6 Hz, JH-P = 3.3 Hz, b), 7.21-7.05 (4H, m, d, e, g, h), 4.05-3.78 (8H, m, l, m), 3.41 (4H, t, J = 5.4 Hz, j), 2.08 (3H, s, o), 2.06 (3H, s, p), 1.38-1.30 (6H, m, k).
HPLC (A/B=70/30→0/100, 35 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【０１０６】
2018090536.tif 000039
【０１０７】
（４）Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ−ＣＯＯＨ（１９）の合成
2018090536.tif 000040
【０１０８】
ｐＥＰＰＲ−ＣＯＯＨ（４．７ｍｇ、５．７μｍｏｌ）と３７％ＨＣＨＯ水溶液（４２．６μＬ、５７３μｍｏｌ）とＮａＢＨ３ＣＮ（１．６ｍｇ、２６μｍｏｌ）とＡｃＯＨ（２０μＬ）をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）に溶解し、室温で１時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ＯＤＳ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、水／ＭｅＣＮ、０．１％ＴＦＡ）で精製し、Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ−ＣＯＯＨ（４．９ｍｇ、ｑｕａｎｔ．  ｙｉｅｌｄ）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.87-7.83 (2H, m, n), 7.76-7.69 (2H, m, i, f), 7.62-7.54 (3H, m, a, c), 7.45 (2H, ddd, J = 7.4, 7.4 Hz, JH-P = 3.4 Hz, b), 7.18-6.95 (4H, m, d, e, g, h), 4.07-3.69 (8H, m, l, m), 3.38-3.35 (4H, m, j), 1.99 (3H, s, o), 1.97 (3H, s, p), 1.26-1.23 (6H, m, k).
HPLC (A/B=70/30→0/100, 35 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【０１０９】
2018090536.tif 000041
【０１１０】
（５）Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ−ＳＥ（２０）の合成
2018090536.tif 000042
【０１１１】
Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ−ＣＯＯＨ（４．３ｍｇ、５．１μｍｏｌ）とＷＳＣＤ・ＨＣｌ（３．０ｍｇ、１５μｍｏｌ）とＮＨＳ（１．８ｍｇ、１５μｍｏｌ）とＤＩＥＡ（９．０μＬ、５１μｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解し、室温で８時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ＯＤＳ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、水／ＭｅＣＮ、０．１％  ＴＦＡ）で精製し、Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ−ＳＥ（１．６ｍｇ、３４％収率）を得た。
HPLC (A/B=70/30→0/100, 35 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
2018090536.tif 000043
【０１１２】
［実施例１］
本発明の化合物１（ｐｉｐｅｉｎｄｏ−ＰＰｈＲ）の光学特性を評価した。吸収スペクトル、蛍光スペクトル及び励起スペクトルを島津ＵＶ−１６５０ＰＣ吸光光度計、日立Ｆ−４５００蛍光光度計を用いて測定した。結果を図１ｂ、１ｄ〜ｅに示す。
【０１１３】
図１ａは、ｐｉｐｅｉｎｄｏ−ＰＰｈＲの化学構造と光物理的特性を示す。図１ｂ、図１ｄ、図１ｅは、夫々、ｐｉｐｅｉｎｄｏ−ＰＰｈＲのｐＨの異なる０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（含０．１％ＤＭＳＯ）中における吸収、蛍光、励起スペクトルを表す。図１ｃは、ｐＨに対する吸収強度比のプロットと、これにより算出したプロトン化反応のｐＫａ値を表す。図１ｆは、ｐＨに対する蛍光強度比のプロットと、これにより算出したプロトン化反応のｐＫａ値を表す。
【０１１４】
ｐｉｐｅｉｎｄｏ−ＰＰｈＲはＳｉローダミン（ＳｉＲ）のｐＨプローブと同様に、酸性でプロトン化されることで吸収波長が７３４ｎｍから６４５ｎｍに大きく短波長シフトした（図１ａ、ｂ）。一方、吸収波長はＳｉＲよりも６０−７０ｎｍ長波長化し、酸性型、塩基性型いずれにおいても近赤外領域に吸収を有していた。
ｐＫａは吸収スペクトルの変化から７．４と算出され、ＳｉＲよりも約１酸性側にシフトした（図１ｃ）。これは、Ｐ＝Ｏ基が電子求引基であるためピペラジンの電子密度を低下させ、塩基性を減弱させているためだと考えられる。また、いずれの型においても微弱蛍光を示し、蛍光波長を７００ｎｍ台に有していた（図１ｄ）。６４０ｎｍと７３０ｎｍで励起した際の蛍光強度の比を取ることで蛍光のレシオ測定も可能で、蛍光のレシオ値の変化からはｐＫａ７．６と算出された（図１ｅ，ｆ）。ただし、蛍光量子収率が最大で１％程度と小さい値であった。
【０１１５】
［実施例２］
化合物１（ｐｉｐｅｉｎｄｏ−ＰＰｈＲ）の蛍光量子収率が低い原因は、キサンテン環左右の電子密度の偏りが大きいためだと考え、電子供与能の高いインドリンを電子供与能の低いジエチルアニリンに置換した化合物２（ｐｉｐｅｄｉＥｔ−ＰＰｈＲ（ｐＥＰＰＲ））を合成し、その光学特性を評価した。
その結果、蛍光量子収率は酸性から中性にかけて９．４％から６．７％を示し、ｐｉｐｅｉｎｄｏ−ＰＰｈＲの蛍光量子収率１％以下から大幅に改善されることが明らかになった（図２ａ）。また、ｐＥＰＰＲの吸収・蛍光波長は依然として近赤外領域に吸収・蛍光波長を有していた（図２ｂ、ｄ）。６５０ｎｍ、７１０ｎｍで励起した際の７３０ｎｍの蛍光強度の比をプロットすると、蛍光レシオ値の変化が観察され、ｐＨプローブとして機能することが分かった（図２ｅ，ｆ）。ただ、ｐＫａ７．４及び７．９と算出され、弱酸性から中性のイメージングを行うためにはｐＫａを７程度まで低下させるのが望ましいと考えられる（図２ｃ、ｆ）。
【０１１６】
［実施例３〜５］
ｐＫａの最適化を目的として合成した３つの誘導体Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ、Ｅｔ−ｐＥＰＰＲ、ｉＰｒ−ｐＥＰＰＲ（化合物３〜５）について光学特性を調べた。いずれも、ｐＥＰＰＲと比較して吸収・蛍光スペクトル、蛍光量子収率に大きな変化は与えない一方、ｐＫａには変化が見られた（図３、４、５）。特に、Ｅｔ−ｐＥＰＰＲ、Ｍｅ−ｐＥＰＰＲのｐＫａは生体内の酸性環境を観察するのに適した７．０付近の値を示した。そこで、Ｍｅ−ｐＥＰＰＲを以降のｐＨイメージングの検討に用いることとした。
【０１１７】
［実施例６］
Ｍｅ−ｐＥＰＰＲを用いたレシオイメージング
Ｍｅ−ｐＥＰＰＲを用いて実際にｐＨのレシオイメージングが可能かどうかを検討した。Ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング装置Ｍａｅｓｔｒｏ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で６６１ｎｍ、７０４ｎｍの２波長で励起し、それぞれの蛍光像のレシオ画像を構築することによりｐＨの蛍光レシオイメージングに適用可能かを調べた。
【０１１８】
図６ａ及び６ｃは、０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー中２μＭのＭｅ−ｐＥＰＰＲの蛍光レシオイメージを示す。図６ｂ及び６ｄは、ｐＨに対する蛍光強度比とｐＫａを表す。エラーバーは標準誤差を示す（ｎ＝３）。
励起フィルター；６６１ｎｍ：６４１−６８１ｎｍ、７０４ｎｍ：６８４−７２９ｎｍ、発光；７４０−８５０ｎｍ  ｗｉｔｈ  ７４０ｎｍ  ＬＰフィルター
【０１１９】
図６ａ及び６ｂから、Ｍｅ−ｐＥＰＰＲは、ｐＨの蛍光レシオイメージングに適用可能であることが示される。特に、生体内に多い弱酸性から中性のｐＨ６．０−７．４においてはｐＨ０．２の違いを検出することができる感度の高さを示し、検量線を直線近似することができた（図６ｃ、６ｄ）。
以下のイメージングにおいてもこの条件で蛍光レシオイメージングを行った。
【０１２０】
［実施例７］
高分子担体へのラベル化
プローブを水溶性高分子担体であるデキストランにラベル化することでｉｎ  ｖｉｖｏイメージングへの応用を検討した。そこで、デキストランへのラベル化によるプローブ特性の変化について調べた。Ｍｅ−ｐＥＰＰＲの活性エステル体を合成し、以下のプロトコルでラベル化を行った。
【０１２１】
2018090536.tif 000044
【０１２２】
ラベル化のプロトコル
（１）４０ｋＤａ  Ｄｅｘｔｒａｎ、Ａｍｉｎｏ（登録商標）を０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３水溶液に溶解した（０．２５ｍＭ）。−（ａ）
（２）Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ−ＳＥを０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３水溶液／４０％ＤＭＳＯに溶解した。−（ｂ）
（３）（ａ）と（ｂ）を１：１で素早く混合し、室温で１時間ボルテックスした。
（４）デキストランラベル化体をＰＤ−１０でＰＢＳ（ｐＨ７．４）を溶出溶媒に用い、分離した。−（ｃ）
（５）（ｃ）をＰＤ−１０でｍｉｌｉＱを溶出溶媒に用い、脱塩した。
（６）凍結乾燥し、ｍｉｌｉＱに再び溶解し、１ｍＭの溶液を調製し、測定・イメージングに使用した。
【０１２３】
図７ａは、デキストランに様々な当量のＭｅ−ｐＥＰＰＲを標識したプローブ（Ｄｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ）の光物理的特性を示す。同図から、Ｄｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲはそのラベル化数（ＤＯＬ）に関わらずデキストラン標識前とｐＫａ、蛍光量子収率に大きな変化は示さず、ｐＨプローブとして機能することが分かった（図７ａ）。
また、図７ｂは、Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ又はＤｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ（ＤＯＬ５．７）を担持させたＡ５４９細胞の共焦点蛍光顕微鏡イメージを示す。細胞表面を白の点線で示した。図７ｂから、デキストランに結合させることで、プローブを細胞外に滞留させることができることが示される（図７ｂ）。
以下のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングでは、ＤＯＬ５．７もしくは１．４のＤｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲを用いた。
【０１２４】
［実施例８］
消化管のｉｎ  ｖｉｖｏイメージング
消化管のｐＨは胃の酸性に始まり、小腸上部で膵液によって中和される。また、小腸下部から大腸にかけては腸内細菌の産生する乳酸によりｐＨ５−６程度の弱酸性になることが知られている。腸のｐＨを定量することができれば、腸内細菌の働きに関しての研究に大きな進歩を与える。そこで、腸のｐＨを観察できるか以下のプロトコルにより検討を行った。
【０１２５】
プロトコル
マウスに蛍光プローブＤｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ（ＤＯＬ＝５．７）を経口投与し、２時間後に開腹し、蛍光レシオイメージングを行った。
【０１２６】
図８は、２０μＭのＤｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ（ＤＯＬ＝５．７）（２０μＬ）を経口投与後２時間でのマウスの胃腸のｐＨの蛍光イメージを示す。図８のａは、白色光イメージで、消化管を白の点線で示した。図８のｂは、Ｅｘ／Ｅｍ＝６６１（６４１−６８１）ｎｍでの蛍光イメージであり、図８のｃは、Ｅｘ／Ｅｍ＝７０４（６８４−７２９）ｎｍでの蛍光イメージである（７４０−８３０ｎｍ  ｗｉｔｈ  ７４０ｎｍ  ＬＰ  ｆｉｌｔｅｒ）。図８のｄは、ｂとｃとのレシオイメージである（Ｅｘ６６１／Ｅｘ７０４）。
図８のｄで示されるように、小腸（Ｓ．Ｉ．）の中性に始まり、大腸（Ｌ．Ｉ．）に近づくにつれ酸性化している様子を観察することに成功した。
【０１２７】
［実施例９］
胃のｉｎ  ｖｉｖｏイメージング
胃のｐＨは酸性に保たれているが、酸の酸性過剰により逆流性食道炎を来たすことがある。そのため、胃のｐＨを中性まで上げる制酸薬の投与が必要となるが、制酸薬の開発において胃のｐＨをモニターすることのできる技術が重要となる。そこで、既存の制酸薬投与による胃のｐＨ変化を観察できるか以下のプロトコルにより検討を行った。
プロトコル
蛍光観察の２時間前、５分前の２回、マウスに蛍光プローブＤｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ（ＤＯＬ＝５．７）を経口投与し、開腹後に蛍光レシオイメージングを行った。
【０１２８】
図９は、２０μＭのＤｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ（ＤＯＬ＝５．７）（２０μＬ×２）を経口投与後（上段）、及び、ＮａＨＣＯ３水溶液（胃の制酸薬）投与後（下段）のマウスの胃腸のｐＨの蛍光イメージを示す。図９のａ、ｅは、白色光イメージで、消化管を白の点線で示した。図８のｂ、ｆは、Ｅｘ／Ｅｍ＝６６１（６４１−６８１）ｎｍでの蛍光イメージであり、図８のｃ、ｇは、Ｅｘ／Ｅｍ＝７０４（６８４−７２９）ｎｍでの蛍光イメージである（７４０−８３０ｎｍ  ｗｉｔｈ  ７４０ｎｍ  ＬＰ  ｆｉｌｔｅｒ）。図８のｄ、ｈは、夫々、ｂとｃ、ｆとｇとのレシオイメージである（Ｅｘ６６１／Ｅｘ７０４）。
その結果、図９のｈに示されるように、制酸約投与による胃のｐＨの中性化をすることに成功した（図９）。
【０１２９】
［実施例１０］
血中投与による腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐＨイメージング
がん細胞においては解糖系が亢進し、その生成物である乳酸由来のＨ＋が細胞内で過剰に産生される。そのため、細胞内を中性に保つためこのＨ＋を細胞外に排出するためのＨ＋トランスポーターや酸としてのＣＯ２を代謝するためのＣＡ９などが過剰に発現しており、がん細胞周辺の細胞外ｐＨは６．５−７．０程度に低下していることが報告されている。また、がん細胞周辺のｐＨの低下により、がん細胞の浸潤能が上昇することがこれまでの研究で示唆されており、がんの転移の原因の１つと考えられている。このように、がん細胞周辺の酸性環境のイメージングが達成されれば、がんに関する基礎研究や、抗がん剤の薬効評価などに貢献できる。そこで、以下のプロトコルを用いて、血中投与による腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐＨイメージングを行った。
プロトコル
蛍光観察の１時間前にマウスに蛍光プローブＤｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ  （ＤＯＬ＝１．４）を静脈内投与し、皮膚を切開後に蛍光レシオイメージングを行った。
【０１３０】
図１０ａ及び図１０ｂは、Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍モデルマウスにＤｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ（ＤＯＬ＝１．４）（１４０μＭ、１００μＬ）を静脈内投与後１時間における蛍光レシオイメージを示す。図１０ａは、水を与えたマウスでの蛍光イメージを、図１０ｂは、２００ｍＭのＮａＨＣＯ３水溶液を与えたマウスでの蛍光イメージを示す。図中、Ｋは腎臓を、Ｔは腫瘍を表す。（Ｅｘ／Ｅｍ＝６６１（６４１−６８１）ｎｍ又は７０４（６８４−７２９）ｎｍである。（７４０−８３０ｎｍ  ｗｉｔｈ  ７４０ｎｍ  ＬＰ  ｆｉｌｔｅｒ））
図１０ｃは、水を与えたマウス（ｍｏｃｋ）及び２００ｍＭのＮａＨＣＯ３を与えたマウス（ＮａＨＣＯ３）のｐＨヒストグラムを示す。図１０ｄは、水を与えたマウス（ｍｏｃｋ）及び２００ｍＭのＮａＨＣＯ３を与えたマウス（ＮａＨＣＯ３）の平均ｐＨを表す（エラーバー：Ｓ．Ｅ．（ｎ＝２））。
正常部位はｐＨ７．３と中性を示したが、腫瘍付近はｐＨ６．９を示し、これまでの報告にあるｐＨ６．５−７．０付近に酸性化している様子がイメージングすることに成功した（図１０ａ、１０ｃ及び１０ｄ）。また、薬物（ＮａＨＣＯ３水溶液）投与により中和され、中性化する様子も観察できた（図１０ｂ、１０ｃ、１０ｄ）。
【０１３１】
［実施例１１］
腎臓のｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐＨイメージング
腎尿細管におけるトランスポーター機能の障害は、腎臓ｐＨそして全身性のｐＨの変化を引き起こし、アシドーシスやアルカローシスに陥る。このような腎機能障害に対しては薬物治療が有効な治療の１つとなるが、薬剤開発において薬物投与による腎機能の評価を行うことが重要である。そこで、以下のプロ所を用いて、薬剤投与による腎臓のｐＨ変化を検出できるか検討を行った。
プロトコル
蛍光観察の１時間前にマウスに蛍光プローブＤｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ（ＤＯＬ＝１．４）を静脈内投与し、皮膚を切開後に蛍光レシオイメージングを行った。
【０１３２】
図１１ａ及び１１ｂは、マウスにＤｅｘ−Ｍｅ−ｐＥＰＰＲ（ＤＯＬ＝１．４）（１４０μＭ、１００μＬ）を静脈内投与後１時間における蛍光レシオイメージを示す。図１１ａは、生理食塩水を１週間経口投与したマウスでの蛍光イメージを、図１１ｂは、アセタゾラミドを１週間経口投与したマウスでの蛍光イメージを示す。図中、腎臓を白矢印で示す。（Ｅｘ／Ｅｍ＝６６１（６４１−６８１）ｎｍ又は７０４（６８４−７２９）ｎｍである。（７４０−８３０ｎｍ  ｗｉｔｈ  ７４０ｎｍ  ＬＰ  ｆｉｌｔｅｒ））
図１１ｃは、生理食塩水を１週間経口投与したマウス（ｍｏｃｋ）及びアセタゾラミドを１週間経口投与したマウス（ＡＺＭ）の平均ｐＨを表す（エラーバー：Ｓ．Ｅ．（ｎ＝３））。
図１１ｃで示すように、薬物アセタゾラミド投与により腎臓（尿）のｐＨ上昇が観察された（図１１ｃ）。
ADDIN EN.REFLIST 
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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