(57)【要約】【課題】エネルギー代謝を調節するための組成物、方法およびキットを提供すること。【解決手段】一態様では、本発明は、（ａ）ロイシンなどの分枝鎖アミノ酸、および（ｂ）ビタミンＢ６、または（ａ）もしくは（ｂ）の任意の前駆体もしくは代謝産物の組合せを含む組成物を提供する。これらの組合せは、体重または脂肪体積を減少させるために相乗的および／または有効であり得る。別の態様では、本発明は、分枝鎖アミノ酸およびビタミンＢ６を含む１つまたは複数の組成物を投与することによってエネルギー代謝を調節する方法を提供する。本発明は、経口用投薬形態に包装された分枝鎖アミノ酸およびビタミンＢ６の組成物を使用説明書と一緒に含むキットも提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
引用
本願は、２０１２年３月８日に出願された米国仮出願第６１／６０８，５９５号および２０１２年６月６日に出願された米国仮出願第６１／６５６，４０７号および２０１２年１０月２６日に出願された米国仮出願第１３／６６２，３４５号に対する優先権の利益を主張する。これらの各々は、その全体がすべての目的のために参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
エネルギー代謝とは、体内の生化学的反応に伴うエネルギーの変換である。エネルギー代謝は、多くの場合、動物、特に老齢動物、閉経後の動物、またはエネルギー代謝の低下を引き起こす健康問題または他の問題が生じている動物において低下しているまたは損なわれている。Robertsら、Nutrition  and  Aging:  Changes  in  the  Regulation  of  Energy  Metabolism  With  Aging、Physiol.  Rev.  ８６巻：６５１〜６６７頁、２００６年を参照されたい。そのような動物では、身体活動に伴うエネルギー消費量および基礎代謝率は一般に減少する。そのような低下したまたは損なわれたエネルギー代謝により、多くの場合、脂肪沈着が増加し、筋肉量が減少する。これは、食物およびエネルギーの摂取量が同じままであるにもかかわらず起こる。この結果、２型糖尿病、高脂血症、動脈硬化症、および高血圧症などの多くの慢性疾患のリスクが増加し、動物の生活の質が低減し、また、動物の寿命が減少する。
【０００３】
エネルギー代謝の調節に取り組むために、イソフラボン（米国特許出願第２０１１０１６５１２５号）、医薬様テトラヒドロリプスタチン（米国特許第６，００４，９９６号）、およびＳＩＲＴ１経路およびＡＭＰＫ経路を調整する組成物（米国特許出願第２０１００２１０６９２号、同第２０１００００９９９２号、同第２００７０２４４２０２号および同第２００８０１７６８２２号）を含めたいくつもの組成物が提唱されてきた。また、エネルギーの調節を容易にする種々の公知の薬剤を含むショットガン組成物が記載されている（米国特許出願第２００８０２２００９２号）。これにもかかわらず、エネルギー代謝を安全に調節するための有効な組成物および方法が未だに必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Robertsら、Nutrition  and  Aging:  Changes  in  the  Regulation  of  Energy  Metabolism  With  Aging、Physiol.  Rev.  ８６巻：６５１〜６６７頁、２００６年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、一般に、エネルギー代謝の調節の分野に関する。一部の実施形態では、本発明は、分枝鎖アミノ酸およびビタミンＢ６を使用してエネルギー代謝を調節するための組成物、方法、およびキットを提供する。
【０００６】
本発明は、エネルギー代謝を調節するための改善された組成物および補助剤の必要性に対処する。エネルギー代謝を調節することにより、体重または脂肪組織を減少させること、脂肪酸化またはインスリン感受性を増加させること、および／または炎症または酸化ストレスを減少させることが可能になり得る。これらの効果は、細胞代謝およびミトコンドリア生合成を含めたエネルギー代謝の増加または調節によるものであってよい。
【０００７】
一態様では、本発明は、（ａ）１種または複数種の分枝鎖アミノ酸および／またはその代謝産物、ならびに（ｂ）ビタミンＢ６を含む組成物であって、構成成分（ａ）の（ｂ）に対する質量比が約５０超、約６５超、約７０超、約７５超、約８５超、約９０超、約１００超、約２００超またはそれ以上であり、それを必要とする対象に投与した場合に、対象の体重増加の減少、対象の脂肪体積の減少、対象の脂肪酸化の増加、対象のインスリン感受性の増加、対象の酸化ストレスマーカーの減少、および／または対象の炎症マーカーの減少によって測定して、細胞代謝およびミトコンドリア生合成を含めたエネルギー代謝を増強する組成物を提供する。一部の実施形態では、前記組成物中の構成成分（ａ）の構成成分（ｂ）に対する質量比は約６５超である。一部の実施形態では、前記組成物中の構成成分（ａ）の構成成分（ｂ）に対する質量比は約６５超であり、構成成分（ａ）はロイシンである。
【０００８】
一部の実施形態では、組成物は、非分枝鎖アミノ酸を実質的に含まなくてよい。一部の実施形態では、組成物は食品組成物である。他の実施形態では、組成物は、飲料、固形食または半固形食として包装された栄養補助食品である。組成物は、経口剤形として製剤化されていてよい。組成物は、食品担体をさらに含んでもよい。組成物は栄養補助食品であってよい。組成物は、単位投与量として包装されていてよい。単位投与量は、約１，１２５ｍｇのロイシンおよび約１５ｍｇのビタミンＢ６を含んでよい。あるいは、単位投与量は、約７５０ｍｇのロイシンおよび約１０ｍｇのビタミンＢ６を含んでよい。一部の実施形態では、ロイシンの投与用量は、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１９００ｍｇ、約２１００ｍｇ、または約２３００ｍｇであってよい。ビタミンＢ６の投与用量は、約０．１ｍｇ、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約４ｍｇ、約６ｍｇ、約８ｍｇ、約１０ｍｇ、約１２ｍｇ、約１５ｍｇ、約１８ｍｇ、約２１ｍｇ、約２４ｍｇ、約２７ｍｇ、約３０ｍｇ、または約３３ｍｇであってよい。単位投与量は、錠剤、徐放錠剤、カプセル剤、またはゲルカプセル剤として製剤化されていてよい。組成物は、薬学的に活性な薬剤または他の治療的に活性な薬剤も含んでよい。組成物は、抗糖尿病剤も含んでよい。
【０００９】
一部の実施形態では、対象の組成物に含めることができる分枝鎖アミノ酸は、ロイシン、バリン、イソロイシン、および４−ヒドロキシイソロイシンからなる群から選択される。他の実施形態では、分枝鎖アミノ酸はロイシンである。明確にするために、これらの分枝鎖アミノ酸は、インタクトな（すなわち、遊離した）形態の個々のアミノ酸またはその塩、遊離した形態、個々の形態、インタクトな形態、または塩の形態である。
【００１０】
本発明の別の態様は、（ａ）１種または複数種の分枝鎖アミノ酸および／またはその代謝産物、ならびに（ｂ）ビタミンＢ６を相乗的有効量で含む組成物であって、この組合せにより、それを必要とする対象に投与した場合に、細胞代謝およびミトコンドリア生合成を含めたエネルギー代謝が、対象に構成成分（ａ）または構成成分（ｂ）を単独で投与することと比較してより大きな程度まで相乗的に増強される組成物を提供する。前記組成物は、それを必要とする対象に投与した場合に、対象の体重増加の減少、対象の脂肪体積の減少、対象の脂肪酸化の増加、対象のインスリン感受性の増加、対象の酸化ストレスマーカーの減少、および／または対象の炎症マーカーの減少によって測定して、細胞代謝およびミトコンドリア生合成を含めたエネルギー代謝を相乗的に増強することができる。一部の実施形態では、組成物は、遊離したまたは個々の非分枝鎖アミノ酸を実質的に含まない。
【００１１】
エネルギー代謝の増強は、（ｉ）組成物を用いて処理した筋管もしくは脂肪細胞由来の培地を筋管もしくは脂肪細胞の他方に投与した場合、または（ｉｉ）組成物を筋管もしくは脂肪細胞に投与した場合に、筋管の脂肪酸の酸化が少なくとも約１４０％増加すること、脂肪細胞の脂肪酸の酸化が少なくとも約４５０％増加すること、脂肪細胞のグルコース利用が少なくとも１５０％増加すること、脂肪細胞のグルコース利用が少なくとも２００％増加すること、筋管におけるＳｉｒｔ１発現が少なくとも約２倍増加すること、筋管におけるＡＭＰＫ活性化が少なくとも約２倍増加すること、および／または筋管におけるミトコンドリアバイオマスが少なくとも約５０％増加することによって数量化することができる。さらに、エネルギー代謝の増強は、組成物を対象に投与した場合に、対象の体重減少が少なくとも４０％増加すること、対象の脂肪減少が少なくとも約５０％増加すること、対象の脂肪減少が少なくとも約５０％増加すること、またはインスリン感受性が少なくとも約１５％増加すること、脂肪酸化が少なくとも約６０％増加すること、または酸化ストレスマーカーが少なくとも約１５％減少することによって測定することができる。
【００１２】
一部の実施形態では、組合せにより、エネルギー代謝が、構成成分（ａ）および（ｂ）のそれぞれの効果が独立に発揮されるとした場合の、構成成分（ａ）を単独で投与することおよび構成成分（ｂ）を単独で投与することの効果の合計と比較して、より大きな程度まで増強される。組成物は、各構成成分の効果が独立に発揮される場合の各構成成分単独の投与で予測される相加効果よりも少なくとも約５０％大きく筋管の脂肪酸の酸化を増強することができる。組成物は、各構成成分の効果が独立に発揮される場合の各構成成分単独の投与で予測される相加効果よりも少なくとも約１５０％大きく筋管のグルコース利用を増強することができる。
【００１３】
本発明の別の態様は、（ａ）ある量の１種または複数種の分枝鎖アミノ酸および／またはその代謝産物；ならびに（ｂ）ある量のビタミンＢ６を含む組成物であって、対象の体重増加の減少、対象の脂肪体積の減少、対象の脂肪酸化の増加、対象のインスリン感受性の増加、対象の酸化ストレスマーカーの減少、および／または対象の炎症マーカーの減少によって測定して、１種または複数種の分枝鎖アミノ酸および／またはその代謝産物の量およびビタミンＢ６の量が、細胞代謝およびミトコンドリア生合成を含めたエネルギー代謝を増強するために有効な量である組成物を提供する。一部の実施形態では、１種または複数種の分枝鎖アミノ酸および／またはその代謝産物の量は、対象に投与した場合に、対象における脂肪細胞におけるエネルギー貯蔵を減少させるため、および／または脂肪酸の酸化を増加させるために有効である。ビタミンＢ６の量は、対象に投与した場合に、対象における脂肪酸シンターゼの活性を低下させるため、および／または細胞内のカルシウム濃度を低下させるために有効であってよい。他の実施形態では、組成物は、食品担体をさらに含んでよい。
【００１４】
本発明は、経口摂取用に製剤化された単位投与量を含む組成物であって、単位投与量が（ａ）ロイシンおよび／またはその代謝産物；ならびに（ｂ）ビタミンＢ６を含み、単位投与量が、前記単位投与量を前記対象に投与した場合に、体重減少が少なくとも４０％増加すること、脂肪減少が少なくとも約５０％増加すること、インスリン感受性が少なくとも約１０％増加すること、脂肪酸化が少なくとも約６０％増加すること、または酸化ストレスマーカーが少なくとも約１５％減少することによって測定して、構成成分（ａ）および構成成分（ｂ）を欠く別の単位投与量を投与した対象におけるベースラインレベルと比較して、エネルギー代謝を増強するために有効である組成物を提供する。一部の実施形態では、構成成分（ａ）は少なくとも約５００ｍｇの量で存在し、構成成分（ｂ）は少なくとも約５ｍｇの量で存在する。他の実施形態では、構成成分（ａ）は少なくとも約１１３０ｍｇの量で存在し、構成成分（ｂ）は少なくとも約１２ｍｇの量で存在する。
【００１５】
一部の実施形態では、組成物は、単位投与量として包装されていてよい。単位投与量として包装されていてよい組成物は、（ａ）少なくとも約５００ｍｇの１種または複数種の分枝鎖アミノ酸および／またはその代謝産物、ならびに（ｂ）少なくとも約５ｍｇのビタミンＢ６を含んでよい。分枝鎖アミノ酸および／またはその代謝産物は、ロイシンを含んでよい。単位投与量は、約１，１２５ｍｇのロイシンおよび約１５ｍｇのビタミンＢ６を含んでよい。一部の実施形態では、組成物の貯蔵寿命は７ヶ月を超える。一部の実施形態では、組成物は容器に入っており、開封後少なくとも１時間にわたって室温で腐敗しにくい。一部の実施形態では、構成成分（ａ）は少なくとも５５０ｍｇまたは少なくとも１１３０ｍｇの量で存在する。一部の実施形態では、構成成分（ｂ）は少なくとも７．５ｍｇまたは１２ｍｇの量で存在する。一部の実施形態では、構成成分（ａ）は少なくとも約５５０ｍｇの量で存在し、構成成分（ｂ）は少なくとも約７．５ｍｇの量で存在する。一部の実施形態では、構成成分（ａ）は少なくとも約１１３０ｍｇの量で存在し、構成成分（ｂ）は少なくとも約１２ｍｇの量で存在する。一部の実施形態では、組成物は、飲料、固形食、または半固形食として包装された栄養補助食品である。一部の実施形態では、組成物は、錠剤、カプセル剤、またはゲルカプセル剤として製剤化されている。一部の実施形態では、組成物は、甘味剤、増量剤、安定剤、酸味剤、および防腐剤の１つまたは複数を含む。
【００１６】
別の態様では、本明細書に記載の組成物、例えば、ロイシンおよびＢ６を含む組成物などは、薬学的に活性な薬剤または抗糖尿病剤をさらに含んでよい。薬学的に活性な薬剤または抗糖尿病剤はメトホルミンであってよい。記載されている組成物、例えば、医薬組成物などは、薬学的に許容される添加剤をさらに含んでよい。
【００１７】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の組合せ組成物を含むキットを提供する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の組成物の単位投与量の複数日供給物、および前記複数日供給物の複数日にわたる投与を指示する説明書を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、組成物の単位投与量を少なくとも４つ含む。一部の実施形態では、キットは、前記組成物を投薬するための説明書、例えば、１日当たり少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたはそれ以上の単位投与量の投与を指示する説明書などを含む。
【００１８】
別の態様では、本発明は、対象にロイシンおよびビタミンＢ６の補助をもたらすための方法であって、対象に本明細書に記載の組成物のいずれかを投与することを含む方法を提供する。組成物は、分枝鎖アミノ酸のビタミンＢ６に対する指定された質量比を有する組成物、相乗効果を有する組成物、またはエネルギー代謝を調節するために有効な組成物であってよい。
【００１９】
一部の実施形態では、本発明は、対象におけるエネルギー代謝を維持し、および／または調節するための方法であって、対象に本明細書に記載の組成物のいずれかを投与することを含み、その期間にわたって対象のエネルギー代謝が維持され、および／または調節される方法を提供する。組成物は、分枝鎖アミノ酸のビタミンＢ６に対する指定された質量比を有する組成物、相乗効果を有する組成物、またはエネルギー代謝を調節するために有効な組成物であってよい。
【００２０】
他の実施形態では、本発明は、対象における脂肪体積および／または体重を減少させるための方法であって、対象に本明細書に記載の組成物のいずれかを、対象における脂肪体積および／または体重を少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％減少させるために有効な期間投与することを含む方法を提供する。組成物は、分枝鎖アミノ酸のビタミンＢ６に対する指定された質量比を有する組成物、相乗効果を有する組成物、またはエネルギー代謝を調節するために有効な組成物であってよい。
【００２１】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の組合せ組成物を投与するための方法を提供する。一部の実施形態では、前記方法は、組成物を、それを必要とする対象に、対象が１５分以上の中程度の運動（例えば、対象の心拍数が安静時心拍数よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、またはそれ以上、上昇する活動など）を終了して１時間以内に投与することを含む。一部の実施形態では、前記方法は、組成物を、それを必要とする対象に１日当たり少なくとも２回投与することを含む。
【００２２】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の組成物、例えば、ロイシンおよびＢ６を含む組成物などを、対象にある期間投与することを含み、前記期間における前記対象のエネルギー代謝が、前記期間より前の前記対象におけるエネルギー代謝と比較して増加する、それを必要とする対象におけるエネルギー代謝を増加させるための方法を提供する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の組成物、例えば、ロイシンおよび／またはその代謝産物ならびにＢ６を含む組成物などを、ある期間にわたって１日当たり少なくとも２回投与することを含み、前記期間にわたる対象における脂肪酸化が、前記期間より前の前記対象における脂肪酸化と比較して増加する、それを必要とする対象における脂肪酸化を増強するための方法を提供する。
【００２４】
本発明は、本明細書に記載の組成物、例えば、ロイシンおよび／またはその代謝産物ならびにＢ６を含む組成物などを、選択された投薬レベルで投与することを含み、選択された投薬レベルにより、対象において約０．５ｍＭのロイシンおよび約１００ｎＭのＢ６の循環レベルが誘導される、対象におけるエネルギー代謝を増加させるための方法も提供する。
【００２５】
参照による組み込み
本明細書において言及されているすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的におよび個別に参照により組み込まれることが示されたのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【００２６】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に記載されている。本発明の原理が利用される例示的な実施形態が記載されている以下の発明の詳細な説明、および付随する図（複数可）を参照することにより、本発明の特徴および利点のよりよい理解が得られる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
（ａ）ロイシンおよび／またはその代謝産物、ならびに
（ｂ）ビタミンＢ６
を含む組成物であって、
前記組成物中の構成成分（ａ）の（ｂ）に対する質量比が約６５超であり、前記組成物により、エネルギー代謝が、対象に構成成分（ａ）または構成成分（ｂ）を単独で投与することと比較してより大きな程度まで相乗的に増強される組成物。
（項目２）
アラニン、グルタミン酸、グリシン、およびプロリンの個々のアミノ酸を実質的に含まない、項目１に記載の組成物。
（項目３）
約１％未満のアラニン、グルタミン酸、グリシン、およびプロリンの個々のアミノ酸を含む、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記エネルギー代謝の増強が、（ｉ）前記組成物を用いて処理した筋管もしくは脂肪細胞由来の培地を筋管もしくは脂肪細胞の他方に投与した場合、または（ｉｉ）前記組成物を筋管もしくは脂肪細胞に投与した場合に、前記筋管の脂肪酸の酸化が少なくとも約１４０％増加すること、前記脂肪細胞の脂肪酸の酸化が少なくとも約４５０％増加すること、前記脂肪細胞のグルコース利用が少なくとも１５０％増加すること、前記脂肪細胞のグルコース利用が少なくとも２００％増加すること、前記筋管におけるＳｉｒｔ１発現が少なくとも約２倍増加すること、前記筋管におけるＡＭＰＫ活性化が少なくとも約２倍増加すること、および／または前記筋管におけるミトコンドリアバイオマスが少なくとも約５０％増加することによって測定される、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記エネルギー代謝の増強が、前記組成物を対象に投与した場合に、前記対象の体重減少が少なくとも４０％増加すること、前記対象の脂肪減少が少なくとも約５０％増加すること、前記対象の脂肪減少が少なくとも約５０％増加すること、またはインスリン感受性が少なくとも約１５％増加すること、脂肪酸化が少なくとも約６０％増加すること、または酸化ストレスマーカーが少なくとも約１５％減少することによって測定される、項目１に記載の組成物。
（項目６）
アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、およびチロシンからなる群から選択される個々の非分枝鎖アミノ酸を実質的に含まない、項目１に記載の組成物。
（項目７）
構成成分（ａ）および（ｂ）のそれぞれの効果が独立に発揮されるとした場合の、構成成分（ａ）を単独で投与することおよび構成成分（ｂ）を単独で投与することの効果の合計と比較して、より大きな程度までエネルギー代謝を増強する、項目１に記載の組成物。（項目８）
少なくとも約２５０ｍｇのロイシンおよび少なくとも約５ｍｇのビタミンＢ６を含む、項目１に記載の組成物。
（項目９）
各構成成分の効果が独立に発揮される場合の各構成成分単独での投与で予測される相加効果よりも少なくとも約５０％大きく筋管の脂肪酸の酸化を増強する、項目１に記載の組成物。
（項目１０）
各構成成分の効果が独立に発揮される場合の各構成成分単独での投与で予測される相加効果よりも少なくとも約１５０％大きく筋管のグルコース利用を増強する、項目１に記載の組成物。
（項目１１）
飲料、固形食または半固形食として包装された栄養補助食品である、項目１に記載の組成物。
（項目１２）
経口剤形として製剤化された、項目１に記載の組成物。
（項目１３）
食品担体をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目１４）
単位投与量として包装されており、
（ａ）前記ロイシンおよび／またはその代謝産物が少なくとも約２５０ｍｇの量で存在し、
（ｂ）前記ビタミンＢ６が少なくとも約０．１ｍｇの量で存在する、
項目１に記載の組成物。
（項目１５）
単位投与量として包装されており、
前記単位投与量が、約５００ｍｇのロイシンおよび約５ｍｇのビタミンＢ６を含む、
項目１に記載の組成物。
（項目１６）
単位投与量として包装されており、
前記単位投与量が錠剤、カプセル剤、またはゲルカプセル剤として製剤化されている、
項目１に記載の組成物。
（項目１７）
薬学的に活性な薬剤または抗糖尿病剤をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目１８）
メトホルミンをさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目１９）
薬学的に許容される添加剤をさらに含む医薬組成物である、項目１に記載の組成物。
（項目２０）
前記組成物中の構成成分（ａ）の（ｂ）に対する質量比が約７０超、約７５超、約８０超、約８５超、約９０超、または約１００超である、項目１に記載の組成物。
（項目２１）
経口摂取用に製剤化された単位投与量を含む組成物であって、前記単位投与量が、
（ａ）ロイシンおよび／またはその代謝産物；ならびに
（ｂ）ビタミンＢ６
を含み、前記単位投与量が、前記単位投与量を対象に投与した場合に、体重減少が少なくとも４０％増加すること、脂肪減少が少なくとも約５０％増加すること、インスリン感受性が少なくとも約１０％増加すること、脂肪酸化が少なくとも約６０％増加すること、または酸化ストレスマーカーが少なくとも約１５％減少することによって測定して、構成成分（ａ）および構成成分（ｂ）を欠く別の単位投与量を投与した前記対象におけるベースラインレベルと比較してエネルギー代謝を増強するために有効である組成物。
（項目２２）
食品担体をさらに含む、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）
構成成分（ａ）が少なくとも約２５０ｍｇの量で存在し、構成成分（ｂ）が少なくとも約０．１ｍｇの量で存在する、項目２１に記載の組成物。
（項目２４）
構成成分（ａ）が少なくとも約１１３０ｍｇの量で存在し、構成成分（ｂ）が少なくとも約１２ｍｇの量で存在する、項目２１に記載の組成物。
（項目２５）
飲料、固形食または半固形食として包装された栄養補助食品である、項目２１に記載の組成物。
（項目２６）
錠剤、カプセル剤、またはゲルカプセル剤として製剤化されている、項目２１に記載の組成物。
（項目２７）
甘味剤、増量剤、安定剤、酸味剤、および防腐剤のうちの１つまたは複数をさらに含む、項目２１に記載の組成物。
（項目２８）
貯蔵寿命が７ヶ月を超える、項目２１に記載の組成物。
（項目２９）
容器に入っており、開封後少なくとも１時間にわたって室温で腐敗しにくい、項目２１に記載の組成物。
（項目３０）
項目２１に記載の組成物の単位投与量の複数日供給物、および前記複数日供給物の複数日にわたる投与を指示する説明書を含むキット。
（項目３１）
エネルギー代謝の増加を必要とする対象におけるエネルギー代謝を増加させるための方法であって、項目１に記載の組成物を、前記対象にある期間投与することを含み、前記期間における前記対象のエネルギー代謝が、前記期間より前の前記対象におけるエネルギー代謝と比較して増加する方法。
（項目３２）
前記対象が家畜動物である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
脂肪酸化の増強を必要とする対象における脂肪酸化を増強するための方法であって、項目２１に記載の組成物を、ある期間にわたって１日当たり少なくとも２回投与することを含み、前記期間にわたる前記対象における脂肪酸化が、前記期間より前の前記対象における脂肪酸化と比較して増加する方法。
（項目３４）
対象におけるエネルギー代謝を増加させるための方法であって、項目１に記載の組成物を選択された投薬レベルで投与することを含み、前記選択された投薬レベルにより、前記対象において約０．５ｍＭのロイシンおよび約１００ｎＭのＢ６の循環レベルが誘導される方法。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、プラセボ組成物を投与した対象およびロイシンを含有する組成物を投与した対象についての呼吸商を示す。
【図２】図２は、プラセボ組成物を投与した対象およびロイシンを含有する組成物を投与した対象における脂肪酸化を示す。
【図３】図３は、プラセボ組成物を投与した対象およびロイシンを含有する組成物を投与した対象におけるインスリン抵抗性の恒常性モデル評価を示す。
【図４】図４は、Ｃ２Ｃ１２筋管における脂肪酸の酸化に対するロイシンとビタミンＢ６（ピリドキサールリン酸）の効果を示す。脂肪酸の酸化をパルミチン酸注入に対するＯ２消費応答として測定し、それが注入前のベースラインからの％変化で表されている。縦線は、パルミチン酸注入の時間を示し、この線の左側のデータ点はベースライン測定値であり、この線の右側のデータ点はＯ２消費応答を示す。ロイシンとＢ６の組合せにより、Ｃ２Ｃ１２筋管などの筋肉細胞における脂肪酸の酸化が増強された。
【図５】図５は、Ｃ２Ｃ１２筋管における脂肪酸の酸化に対するロイシン、バリンまたはイソロイシンとビタミンＢ６（ピリドキサールリン酸）の相互作用効果を示す。データは対照値からの％変化として表されている。＊対照に対してｐ＝０．０１；＊＊対照またはロイシンに対してｐ＝０．０１５。図に示されている通り、ロイシンおよびＢ６を用いて処理することにより、ロイシン単独、Ｂ６単独、または対照よりも大きな、筋管における脂肪酸の酸化の増加がもたらされた。
【図６】図６は、Ｃ２Ｃ１２筋管における脂肪酸の酸化に対するロイシンとビタミンＢ６（ピリドキサールリン酸）およびメトホルミンの相互作用効果を示す。脂肪酸の酸化をパルミチン酸注入に対するＯ２消費応答として測定し、それが注入前のベースラインからの％変化で表されている。縦線は、パルミチン酸注入の時間を示し、この線の左側のデータ点はベースライン測定値であり、この線の右側のデータ点はＯ２消費応答を示す。ロイシン＋Ｂ６＋メトホルミンの組合せにより、Ｃ２Ｃ１２筋管などの筋肉細胞における脂肪酸の酸化がロイシン＋Ｂ６を用いた処理、メトホルミンを用いた処理、または対照と比較して増強された。
【図７】図７は、Ｃ２Ｃ１２筋管における脂肪酸の酸化に対するロイシンとビタミンＢ６（ピリドキサールリン酸）およびメトホルミンの相互作用効果を示す。データは対照値からの％変化として表されている。＊ｐ＜０．０４。図に示されている通り、ロイシン＋Ｂ６＋メトホルミンを用いた処理により、ロイシン＋Ｂ６を単独で用いた処理、メトホルミンを単独で用いた処理、または対照よりも大きいが、作用が独立していると仮定したロイシン＋Ｂ６およびメトホルミンを用いた処理の単純な相加効果よりは大きくない筋管における脂肪酸の酸化の増加がもたらされた。
【図８】図８は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における脂肪酸の酸化に対するロイシンまたはバリンとビタミンＢ６（ピリドキサールリン酸）の相互作用効果を示す。データは対照からの％変化として表されている。データにより、ロイシン＋Ｂ６の組合せが、３Ｔ３−Ｌ１細胞などの脂肪細胞における脂肪酸の酸化を増強することにおいて、ロイシンまたはＢ６を単独で、同等の投与量で用いた処理と比較してより有効であることが示されている。さらに、ロイシンとＢ６の組合せにより、ロイシンおよびＢ６の作用が独立していると仮定した、ロイシンまたはＢ６の単独投与で予測される単純な相加効果よりも大きな程度まで脂肪酸の酸化が増強される。
【図９】図９は、Ｃ２Ｃ１２筋管におけるグルコース利用に対するロイシンとビタミンＢ６（ピリドキサールリン酸）およびメトホルミンの相互作用効果を示す。グルコース利用をグルコース注入に対する細胞外酸性化応答として測定した。＊対照に対するｐ＝０．０５；＊＊対照またはロイシンに対してｐ＝０．０４。図に示されている通り、Ｃ２Ｃ１２筋管などの筋肉細胞をロイシン＋Ｂ６＋メトホルミンを用いて処理することにより、ロイシン＋Ｂ６を用いた処理と比較してグルコース利用が増加した。ロイシン＋Ｂ６を用いた処理により、作用が独立していると仮定した、ロイシンまたはＢ６を単独で用いた処理の単純な相加効果を超えるグルコース利用の増加がもたらされた。
【図１０】図１０は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるグルコース利用に対するロイシンとビタミンＢ６（ピリドキサールリン酸）およびメトホルミンの相互作用効果を示す。グルコース利用をルコース注入に対する細胞外酸性化応答として測定した。＊ｐ＝０．０３。データにより、３Ｔ３−Ｌ１細胞などの脂肪細胞をロイシン＋Ｂ６を用いて処理することにより、ロイシンおよびＢ６を単独で用いた処理の予測される単純な相加効果よりも大きな程度までグルコース利用が増加することが示されている。
【図１１】図１１は、ウエスタンブロットによって測定された、Ｃ２Ｃ１２細胞溶解物におけるＰｈｏｓｐｈｏ−ＡＭＰＫα（Ｔｈｒ１７２）タンパク質の発現に対するロイシンまたはバリンとビタミンＢ６（ピリドキサールリン酸）の相互作用効果を示す。値は正規化されたバンド強度単位である。＊ｐ＝０．０００３。データにより示されている通り、ロイシン＋Ｂ６の処理により、Ｐ−ＡＭＰＫ発現が、対照またはロイシン、バリン、またはＢ６を単独で用いた処理よりも高い程度まで増加した。
【図１２】図１２は、ウエスタンブロットによって測定された、Ｃ２Ｃ１２細胞溶解物におけるＳｉｒｔ１タンパク質の発現に対するロイシンとビタミンＢ６（ピリドキサールリン酸）およびメトホルミンの相互作用効果を示す。値は正規化されたバンド強度単位である。＊ｐ＝０．００２。データにより示されている通り、ロイシンまたはＢ６を単独で用いた処理ではＳｉｒｔ１タンパク質の発現に影響はなかったが、ロイシンとＢ６の組合せを用いた処理により、Ｓｉｒｔ１タンパク質レベルの増加がもたらされた。
【図１３】図１３は、Ｃ２Ｃ１２細胞における、ミトコンドリアの質量として測定されるミトコンドリア生合成に対するロイシンとビタミンＢ６（ピリドキサールリン酸）およびメトホルミンの相互作用効果を示す。＊対照に対してｐ＝０．０４；＊＊ロイシンに対してｐ＜０．０３；＊＊＊他の処理すべてに対してｐ＜０．０１。図に示されている通り、筋管をロイシンで用いて処理することにより、ミトコンドリアバイオマスが対照と比較して増加し、ロイシン＋Ｂ６の組み合わせ処理により、ミトコンドリアバイオマスがさらに大きな程度まで増加した。
【図１４】図１４は、脂肪細胞トリグリセリド含量に対するＢ６（ピリドキサールリン酸、ＰＬＰ）とロイシン（Ｌｅｕ）の相互作用効果を示す。培養した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、ロイシン（０．２５ｍＭまたは０．５０ｍＭ）、ＰＬＰ（５０ｎＭまたは１００ｎＭ）またはそれらの組合せを用いて処理した。０．５ｍＭのロイシンを用いた処理は、約１，１２５ｍｇの食事性ロイシンをヒト対象に投与することによって実現される同じ容量モル濃度の循環レベルに対応する。０．２５ｍＭのロイシンを用いた処理は、約３００ｍｇの食事性ロイシンをヒト対象に投与することによって実現される同じ容量モル濃度の循環レベルに対応する。１００ｎＭのＰＬＰを用いた処理は、約１５ｍｇの食事性ビタミンＢ６をヒト対象に投与することによって実現される同じ容量モル濃度の循環レベルに対応する。５０ｎＭのＰＬＰを用いた処理は、約７．５ｍｇの食事性ビタミンＢ６をヒト対象に投与することによって実現される同じ容量モル濃度の循環レベルに対応する。トリグリセリド蓄積の減少は０．５ｍＭのロイシン＋１００ｎＭのＰＬＰによって実現され、これは、ロイシンのＢ６に対する質量比が約７５である、約１，１２５ｍｇのロイシン＋１５ｍｇのＢ６の用量を投与することに対応する。データは平均±ＳＥとして表されており、棒の上の一致していない文字は、処理間の有意差を示す（ｐ＜０．０１）。データにより、脂肪細胞トリグリセリド含量を減少させることに対するロイシンの用量依存的効果および脂肪細胞トリグリセリド含量を減少させることに対するＢ６の用量依存的効果が示されている。さらに、ロイシンとＢ６の組合せが、脂肪細胞トリグリセリド含量を減少させることにおいて、ロイシンまたはＢ６を単独で、同等の投与量で用いて処理することと比較してより有効である。ロイシンとＢ６の組合せは、ロイシンまたはＢ６の効果が独立に発揮されるとした場合の、ロイシンまたはＢ６の単純な相加効果を超える効果を有し得る。この実験により、投薬質量比が少なくとも約７５以上、およびＢ６の用量が約１５ｍｇ以上であるロイシンとＢ６の組合せが脂肪細胞トリグリセリド含量を減少させることにおいて相乗的であることが例証されている。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明のいくつかの態様が、例示するための実施例の適用を参照して下に記載されている。多数の特定の詳細、関係、および方法が、本発明の完全な理解をもたらすために記載されていることが理解されるべきである。しかし、本発明は、特定の詳細の１つまたは複数を用いずに、または他の方法を用いて実施することができることが当業者には容易に理解されよう。別段の指定のない限り、いくつかの作用は他の作用または事象と異なる順序で、および／またはそれと同時に起こり得るので、本発明は例示されている作用または事象の順序により限定されない。さらに、例示されている作用または事象のすべてが本発明による方法体系を実行するために必要であるとは限らない。
【００２９】
「対象」とは、哺乳動物などの動物を指す。本明細書に記載の方法は、ヒト治療薬、前臨床的適用、および獣医的適用のいずれにおいても有用であり得る。一部の実施形態では、対象は哺乳動物であり、一部の実施形態では、対象はヒトである。他の哺乳動物としては、類人猿、チンパンジー、オランウータン、サル；家畜動物（愛玩動物）、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、ウサギ、およびフェレットなど；家畜化農場動物、例えば、ウシ、スイギュウ、バイソン、ウマ、ロバ、ブタ、ヒツジ、およびヤギなど；または、一般には動物園において見いだされるエキゾチック動物、例えば、クマ、ライオン、トラ、ヒョウ、ゾウ、カバ、サイ、キリン、レイヨウ、ナマケモノ、ガゼル、シマウマ、ウィルドビースト、プレーリードッグ、コアラ、カンガルー、パンダ、ジャイアントパンダ、ハイエナ、アザラシ・アシカ類、シーライオン、およびゾウアザラシなどが挙げられ、これらに限定されない。
【００３０】
「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」、「投与した（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」、「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｓ）」および「投与すること（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」という用語は、組成物を対象に、静脈内投与経路、動脈内投与経路、経口投与経路、非経投与経路、頬側投与経路、局所投与経路、経皮投与経路、直腸投与経路、筋肉内投与経路、皮下投与経路、骨内投与経路、経粘膜投与経路、または腹腔内投与経路によって提供することと定義される。本出願のある特定の実施形態では、組成物を投与する経口経路が好ましい場合がある。
【００３１】
「有効量」または「治療有効量」という用語は、これだけに限定されないが、下で定義されている疾患の処置を含めた、意図された適用をもたらすために十分な本明細書に記載の阻害剤の量を指す。治療有効量は、意図された適用（ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ）、または処置されている対象および疾患状態、例えば、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などに応じて変動し得、これは、当業者が容易に決定することができる。この用語は、標的細胞における特定の応答、例えば、増殖の減少または標的タンパク質の活性の下方制御を誘導する用量にも適用される。特定の用量は、選択する特定の化合物、従う投薬レジメン、他の化合物と組み合わせて投与するかどうか、投与のタイミング、その投与を受ける組織、およびそれを運ぶ物理的送達系に応じて変動する。
【００３２】
「エネルギー代謝」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞代謝およびミトコンドリア生合成を含めた、体内の生化学的反応に伴うエネルギーの変換を指す。エネルギー代謝は、本明細書に記載の種々の測定値、例えば、体重減少、脂肪減少、インスリン感受性、脂肪酸の酸化、グルコース利用、トリグリセリド含量、Ｓｉｒｔ１  発現レベル、ＡＭＰＫ  発現レベル、酸化ストレス、およびミトコンドリアバイオマスを使用して数量化することができる。
【００３３】
「実質的に含まない」という用語は、本明細書で使用される場合、指定の構成成分が約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．５％未満、０．１％未満である、またはさらに少ない組成物を指す。例えば、非分枝鎖アミノ酸を実質的に含まない組成物は、約１％未満の非分枝鎖アミノ酸リジンを有してよい。
【００３４】
薬剤または療法の「治療量未満の量」とは、その薬剤または療法の有効量よりも少ないが、有効量または治療量未満の別の薬剤または療法と組み合わせると、例えば、生じる有効な効果の相乗作用、または副作用の減少に起因して、医師により所望される結果が生じる量である。
【００３５】
組成物
【００３６】
本発明は、分枝鎖アミノ酸とビタミンＢ６の組合せを含む組成物を提供する。任意の特定の理論に限定されることなく、本明細書に記載のこれらの組合せにより、共培養系において脂肪細胞から骨格筋管へのエネルギー分配を促進し、脂肪細胞におけるエネルギー貯蔵の減少および筋肉における脂肪酸利用の増加をもたらすことができる。一部の実施形態では、本発明の組成物により、脂肪細胞の脂質生成遺伝子発現を阻害し、筋肉の脂肪酸の酸化を刺激することできる。これらは、一部において、ミトコンドリア生合成および酸素消費のＳｉｒｔ１依存性刺激によって媒介され得る。さらに、脂肪細胞により分泌される因子（複数可）によりこれらの効果が抑制される可能性があり、本明細書に記載のロイシン投与により、この抑制を部分的に免れることが可能になり得る。本明細書において詳述されている特定の分枝鎖アミノ酸またはその代謝産物とビタミンＢ６の組合せにより、栄養上の利益および治療上の利益をもたらすことができる。
【００３７】
本発明の一部の実施形態では、組合せ組成物は、分枝鎖アミノ酸のビタミンＢ６に対する指定の比を有してよい。指定の比により、有効なエネルギー代謝の調節をもたらすことができる。例えば、指定の比により、対象の体重増加の減少、対象の脂肪体積の減少、対象の脂肪酸化の増加、対象のインスリン感受性の増加、対象の酸化ストレスマーカーの減少、および／または対象の炎症マーカーの減少を引き起こすことができる。そのような有益な効果は、一部において、ミトコンドリア生合成の増加、または細胞代謝またはエネルギー代謝経路における種々の他の変化によって生じ得る。分枝鎖アミノ酸のビタミンＢ６に対する比は、質量比、モル比、または体積比であってよい。一部の実施形態では、分枝鎖アミノ酸のビタミンＢ６に対する質量比は、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約５００、約７５０、約１０００、または約４５超、約５０超、約５５超、約６０超、約６５超、約７０超、約７５超、約８０超、約８５超、約９０超、約１００超、約１１０超、約１２０超、約１３０超、約１４０超、約１５０超、約１７５超、約２００超、約２５０超、約５００超、約７５０超、約１０００超、または約４５未満、約５０未満、約５５未満、約６０未満、約６５未満、約７０未満、約７５未満、約８０未満、約８５未満、約９０未満、約１００未満、約１１０未満、約１２０未満、約１３０未満、約１４０未満、約１５０未満、約１７５未満、約２００未満、約２５０未満、約５００未満、約７５０未満、約１０００未満、またはそれ以上である。他の実施形態では、対象の組成物に含有される１つまたは複数の分枝鎖アミノ酸のビタミンＢ６に対するモル比は、約９０、約９５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、または約９０超、約９５超、約９０超、約９５超、約１００超、約１０５超、約１１０超、約１２０超、約１３０超、約１４０超、約１５０超、約１６０超、約１７０超、約１８０超、約１９０超、約２００超、または約９０未満、約９５未満、約９０未満、約９５未満、約１００未満、約１０５未満、約１１０未満、約１２０未満、約１３０未満、約１４０未満、約１５０未満、約１６０未満、約１７０未満、約１８０未満、約１９０未満、約２００未満、またはそれ以上である。
【００３８】
一部の実施形態では、単位用量中のロイシンのビタミンＢ６に対する質量比は約６５超、約７５超、約８５超、または約９５超であり、単位用量中のロイシンの量は少なくとも約５００ｍｇ、少なくとも約７５０ｍｇ、少なくとも約１０００ｍｇ、少なくとも約１１２５ｍｇ、または少なくとも約１５００ｍｇである。実施例５に示されているように、ロイシンとＢ６の組合せ組成物の効果は、ロイシンのＢ６に対する比と、ロイシンおよびＢ６の絶対的なレベルの両方に左右され得る。実施例５に記載の通り、質量比が約６５超または約７５超であり、ロイシン投薬量が少なくとも５００ｍｇまたは少なくとも１１２５ｍｇであり、Ｂ６投薬量が少なくとも５ｍｇまたは少なくとも１５ｍｇである組成物により、相乗効果が実現され得る。
【００３９】
一部の実施形態では、組合せ組成物は、対象の体重増加の減少、対象の脂肪体積の減少、対象の脂肪酸化の増加、対象のインスリン感受性の増加、対象の酸化ストレスマーカーの減少、および／または対象の炎症マーカーの減少によって測定して、エネルギー代謝を調節するために有効である。組合せ組成物を投与することには、対照の対象または対照群に対して約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約５０％、約７５％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１５０％、約２００％、約２５０％、約３５０％、約５００％、約７００％、または約１０００％、または約５％超、約１０％超、約１５％超、約２０％超、約３０％超、約５０％超、約７５％超、約１００％超、約１１０％超、約１２０％超、約１５０％超、約２００％超、約２５０％超、約３５０％超、約５００％超、約７００％超、または約１０００％超の改善である、測定される効果があり得る。例えば、対照群における体重減少は最初の平均体重の１％であり得るが、一方、組合せ組成物を投与した群における体重減少はその群の最初の平均体重の約６％であり得る。改善は、対照群における体重減少の５％、または５００％であり得る。体重減少は、約１週間以内、約２週間以内、約３週間以内、約４週間以内、約８週間以内、約１２週間以内、約１６週間以内、約２４週間以内、約３６週間以内、約５２週間以内に、またはそれ以下で観察され得る。一部の実施形態では、体重減少は、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約２ヶ月、約４ヶ月、約６ヶ月、約１年、またはそれよりも長い期間にわたって持続可能である（すなわち、体重減少が元に戻らない）。一部の実施形態では、本発明の組成物を服用している対象は、投与している間、少なくとも０．０５ｋｇ、少なくとも０．１ｋｇ、少なくとも０．５ｋｇ、少なくとも０．７ｋｇ、少なくとも１ｋｇ、少なくとも２ｋｇ、少なくとも５ｋｇ、少なくとも１０ｋｇ、少なくとも２０ｋｇ、またはそれ以上の体重減少を示す。
【００４０】
本発明の他の実施形態では、本明細書に記載の組成物を投与した対象では、呼吸商が低下し得る。呼吸商の低下は、処置前の対象の呼吸商と比較して約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、または約４０％、または約１％超、約５％超、約１０％超、約１５％超、約２０％超、約２５％超、約３０％超、約３５％超、または約４０％超の低下であり得る。あるいは、呼吸商の測定値は、対照群と比較した試験群についてのものであってよい。
【００４１】
本明細書に記載の対象に対する効果は、対象から取得した試料を利用する、または対象における効果を示すパラメータを直接アッセイする種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける方法によって決定することができる。例えば、体重は、較正したスケールで測定することができ、呼吸商は、間接的な熱量測定法を使用して測定することができ、インスリン感受性は、インスリン抵抗性の評価の恒常性モデルを使用して測定することができ、酸化ストレスは、対象から抜き取った血液試料を使用して測定することができ、炎症マーカーは、ＥＬＩＳＡを使用して測定することができ、脂肪量または脂肪組織は、Ｘ線吸光光度法を使用して測定することができる。
【００４２】
あるいは、効果は、筋管または脂肪細胞を本明細書に記載の組成物で処理した際に決定することができる。例えば、筋管または脂肪細胞を組成物で処理することができ、筋管または脂肪細胞に対する１つまたは複数の効果を測定することができる。これらの測定値は、脂肪酸の酸化、グルコース利用、Ｓｉｒｔ１発現、ＡＭＰＫ活性化、およびミトコンドリアバイオマスを含んでよい。本明細書に記載の組成物には、脂肪酸の酸化を、処理していない筋管または脂肪細胞と比較して少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、または少なくとも約４５０％増加させる効果があり得る。本明細書に記載の組成物には、グルコース利用を、処理していない筋管または脂肪細胞と比較して少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％増加させる効果があり得る。本明細書に記載の組成物には、グルコース利用を、処理していない筋管または脂肪細胞と比較して少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％増加させる効果があり得る。本明細書に記載の組成物には、Ｓｉｒｔ１発現またはＡＭＰＫ活性化を、処理していない筋管または脂肪細胞と比較して少なくとも０．２倍、少なくとも０．５倍、少なくとも０．７５倍、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍または少なくとも３倍増加させる効果があり得る。
【００４３】
一部の実施形態では、筋管または脂肪細胞を、組成物で処理した他の筋管または脂肪細胞から得た培地を用いて処理することができる。例えば、筋管を、組成物で処理した脂肪細胞由来の培地を用いて処理することができる。あるいは、脂肪細胞を、組成物で処理した筋管由来の培地を用いて処理することができる。
【００４４】
組合せ組成物、例えば、分枝鎖アミノ酸のビタミンＢ６に対する特定の比を有する組成物などによっても、相乗効果が引き起こされ得る。これらの相乗効果は、組合せ組成物の１つまたは複数の効果が、各構成成分が独立に作用すると仮定して、同等の投薬レベルでの各構成成分単独の１つまたは複数の効果よりも大きくなるようなものであってよい、または同等の投薬レベルでのすべての構成成分の予測される効果の合計よりも大きくてよい。相乗効果は、構成成分のうちの１つを単独で用いて対象を処置することの効果、または構成成分のそれぞれを個別に投与した場合の相加効果よりも約１０％、約２０％、約３０％、約５０％、約７５％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１５０％、約２００％、約２５０％、約３５０％、もしくは約５００％、または約１０％超、約２０％超、約３０％超、約５０％超、約７５％超、約１００％超、約１１０％超、約１２０％超、約１５０％超、約２００％超、約２５０％超、約３５０％超、もしくは約５００％超優れている。効果は、本明細書に記載の測定可能な効果のいずれであってもよい。複数の構成成分を含む組成物は、相乗効果が細胞代謝の増強であるようなもの、および細胞代謝が、本明細書では予測される相加効果とも称される、各構成成分の効果が独立に発揮されるものとして決定された各構成成分を投与することの効果の合計と比較してより大きな程度まで増加するようなものであってよい。例えば、構成成分（ａ）を含む組成物により、細胞代謝が２０％改善されるという効果がもたらされ、構成成分（ｂ）を含む組成物により、細胞組成が５０％改善されるという効果がもたらされる場合、構成成分（ａ）および構成成分（ｂ）の両方を含む組成物は、細胞代謝に対する組合せ組成物の効果が７０％を超えれば、相乗効果を有するということになる。
【００４５】
相乗的な組合せ組成物には、各構成成分の効果が独立に発揮されるとした場合の、組合せ組成物の各構成成分の単独投与で予測される相加効果を超える効果があり得る。例えば、予測される相加効果が７０％である場合、実際の効果である１４０％は予測される相加効果よりも７０％大きい、または予測される相加効果よりも１倍大きい。相乗効果は、予測される相加効果よりも少なくとも約２０％、約５０％、約７５％、約９０％、約１００％、約１５０％、約２００％または約３００％大きい可能性がある。あるいは、相乗効果は、予測される相加効果よりも少なくとも約０．２倍、少なくとも約０．５倍、少なくとも約０．９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍大きい可能性がある。
【００４６】
一部の実施形態では、組合せ組成物の相乗効果により、投薬量を減少させ、それにより対象に対する副作用および処置の費用の縮小をもたらすことも可能になり得る。さらに、相乗効果により、任意の他の処置によっては実現不可能な結果が可能になり得る。したがって、組合せ組成物の適切な同定、規格、および使用により、エネルギー代謝の調節を有意に改善することが可能になり得る。
【００４７】
組合せ組成物は、１種または複数種の薬学的に活性な薬剤をさらに含んでよい。治療的に活性な薬剤の例としては、イブプロフェン、アルドリル（aldoril）、およびゲムフィブロジル（gemfebrozil）、ベラパミル、マックスザイド、ジクロフェナクおよびメトロロール（metrolol）、マプロチリン（maproltiline）、トリアゾラムおよびミノキシジルが挙げられる。例えば、組合せ組成物は、薬学的に活性な抗糖尿病剤、体重減少剤、またはカルシウム調節剤を含んでよい。米国特許第７，１０９，１９８号および米国特許出願第２００９０１４２３３６号には、本明細書に記載の組合せ組成物に含めるために適した種々の薬学的に活性な薬剤または治療的に活性な薬剤が記載されている。抗糖尿病剤の例としては、ビグアナイド（例えば、メトホルミンなど）、チアゾリジンジオン（thiazoladinedione）およびメグリチニド（例えば、レパグリニド、ピオグリタゾン、およびロシグリタゾンなど）、アルファグルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボースなど）、スルホニル尿素（例えば、トルブタミド、アセトヘキサミド、トラザミド、クロルプロパミド、グリピジド、グリブリド、グリメピリド、グリクラジドなど）、インクレチン、麦角アルカロイド（例えば、ブロモクリプチンなど）、ならびにＤＰＰ阻害剤（例えば、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン（lingliptin）、デュトグリプチン（dutogliptin）、ジェミグリプチン（gemigliptin）、アログリプチン、およびベルベリンなど）が挙げられる。抗糖尿病剤は、経口用抗糖尿病剤であってよい。抗糖尿病剤は、インスリン、アミリン類似体（例えば、プラムリンチドなど）、およびインクレチン模倣体（例えば、エクセナチドおよびリラグルチドなど）を含めた注射用抗糖尿病薬であってもよい。抗肥満治療剤の例としては、リパーゼ阻害剤（例えば、オルリスタットなど）、ドーパミン作動性化合物、ノルアドレナリン作動性化合物、およびセロトニン作動性化合物、カンナビノイド受容体アンタゴニスト（例えば、リモナバンなど）、エクセナチド、プラムリンチド、ならびにＣＮＳ薬（例えば、トピメレート（topimerate）など）が挙げられる。これらの例は、考察するためにのみ提供され、本発明の多種多様な薬物への広範囲の適用性を実証することが意図されている。これは、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００４８】
医薬、または本明細書に記載の組合せ組成物に使用される任意の他の構成要素の量は、治療量未満の量で使用することができる。治療量未満の量の薬剤または構成成分を使用することにより、薬剤の副作用を減少させることができる。治療量未満の量を使用することは、特に、他の薬剤または構成成分と相乗させて使用する場合に有効であり得る。
【００４９】
治療量未満の薬剤または構成成分は、治療的であると考えられるよりも少ない量であってよい。例えば、ＦＤＡガイドラインにより特定の状態を治療するための投薬の指定のレベルが提唱され得、治療量未満の量は、ＦＤＡにより提唱された投薬レベルを下まわる任意のレベルであってよい。治療量未満の量は、治療量であると考えられる量よりも約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約５０％、約７５％、約９０％、または約９５％少なくてよい。治療量は、個々の対象、または対象の群について評価することができる。対象の群は、潜在的な対象のすべて、または年齢、体重、人種、性別、または身体活動レベルなどの特定の特性を有する対象であってよい。
【００５０】
メトホルミン塩酸塩の場合では、出発用量は毎日１０００ｍｇであり、毎日５００ｍｇ〜最大２５００ｍｇの範囲の対象特異的な投薬を伴う（メトホルミン塩酸塩徐放錠剤ラベル、http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2008/021574s010lbl.pdf）。対象に対する特定の投薬は、用量を設定すること、および治療反応を測定することにより、臨床医が決定することができる。治療的な投薬レベルは、空腹時血漿中グルコースレベルを測定することおよびグリコシル化されたヘモグロビンを測定することによって決定することができる。治療量未満の量は、推奨されるメトホルミンの投薬量を下まわる任意のレベルであってよい。例えば、対象の治療的な投薬レベルが毎日７００ｍｇであると決定された場合、６００ｍｇの用量は治療量未満の量である。あるいは、治療量未満の量は、個々の対象ではなく対象の一群に対して決定することができる。例えば、体重が３００ｌｂを超える対象に対するメトホルミンの平均治療量が２０００ｍｇである場合、治療量未満とは、２０００ｍｇを下まわるいかなる量であってもよい。一部の実施形態では、投薬は、これだけに限定されないが、患者の医師、看護師、および薬剤師を含めた健康管理提供者によって推奨され得る。
【００５１】
分枝鎖アミノ酸
【００５２】
本発明は、分枝鎖アミノ酸を含む組成物を提供する。分枝鎖アミノ酸は、２つ以上の他の原子に結合した分枝炭素原子を有する脂肪族側鎖を有してよい。他の原子は炭素原子であってよい。分枝鎖アミノ酸の例としては、ロイシン、イソロイシン、およびバリンが挙げられる。分枝鎖アミノ酸は、４−ヒドロキシイソロイシンなどの他の化合物も包含し得る。一部の実施形態では、組成物は、非分枝鎖アミノ酸の１つまたは複数、またはすべてを実質的に含まなくてよい。例えば、組成物は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、および／またはチロシンなどの個々のアミノ酸を実質的に含まなくてよい。組成物は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、および／またはバリンなどの遊離アミノ酸を実質的に含まなくてよい。対象の組成物は、アラニン、グリシン、グルタミン酸、およびプロリンの個々のアミノ酸を実質的に含まなくてよい。対象の組成物は、アラニン、グリシン、グルタミン酸、およびプロリンの個々のアミノ酸のうちの１つまたは複数を実質的に含まなくてよい。対象の組成物は、アラニンを実質的に含まなくてよい。対象の組成物は、グリシンを実質的に含まなくてよい。対象の組成物は、バリンを実質的に含まなくてよい。対象の組成物は、アラニン、グリシン、グルタミン酸、およびプロリンの個々のアミノ酸を１０％未満、５％未満、１％未満、または０．１％未満含んでよい。明確にするために、本明細書に記載されている非分枝アミノ酸は、遊離形態またはその塩の形態で存在するインタクトなアミノ酸である。例えば、対象の組成物は、アラニン、グリシン、グルタミン酸、およびプロリンなどの遊離アミノ酸を実質的に含まなくてよい。
【００５３】
理論に限定されることなく、ロイシンなどの分枝鎖アミノ酸を摂取することにより、ｍＴＯＲ依存性経路のおよびｍＴＯＲ非依存性経路の両方によって組織タンパク質合成を刺激すること、ならびに抗タンパク質分解性効果を発揮させることができる。これらの効果は、筋肉において優性であるが、脂肪組織を含めた他の組織においても顕在化し得る。タンパク質合成およびターンオーバーのエネルギー費用を考慮すると、ロイシンにより、脂肪酸の酸化および正味のエネルギー利用を増加させること、ならびに脂肪蓄積を弱めることができる。実際に、ロイシンは、エネルギー制限の間に熱発生効果を発揮することおよび体重減少および脂肪組織減少を増大させることが報告されている。また、ロイシンおよびロイシンが豊富な食事により脂肪細胞およびマウスにおける炎症性サイトカインパターンが好都合に調整される。
【００５４】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物はいずれも、任意の分枝鎖アミノ酸の塩、誘導体、代謝産物、異化産物、同化産物、前駆体、および類似体、例えば、ロイシン塩などを含んでよい。例えば、分枝鎖アミノ酸の代謝産物としては、ヒドロキシメチルブチレート（ＨＭＢ）、α−ヒドロキシイソカプロン酸、およびケト−イソカプロン酸（ＫＩＣ）、ケトイソ吉草酸、およびケトアンテルイソカプロン酸を挙げることができる。非限定的な例示的な分枝鎖アミノ酸の同化産物としては、グルタミン酸、グルタミン、トレオニン、α−ケト酪酸、α−アセト−α−ヒドロキシ酪酸、α，β−ジヒドロキシ−β−メチル吉草酸、α−ケト−β−メチル吉草酸、α，β−ジヒドロキシイソ吉草酸、およびα−ケトイソ吉草酸を挙げることができる。明確にするために、分枝鎖アミノ酸、その代謝産物、および他の関連する組成物は、遊離した形態／個々の形態であってよい。
【００５５】
ビタミンＢ６
【００５６】
いかなる特定の理論または作用様式にも限定されることなく、活性なＢ６代謝産物（ピリドキサールリン酸）を上昇させることにより、脂肪細胞カルシウムチャネルの緊張度および活性を低下させることができる。細胞内の遊離Ｃａ２＋は、脂肪細胞の脂肪酸シンターゼの発現および活性の一次調節因子であるので、これにより、脂肪細胞における中性脂質合成の速度限定ステップの１つである脂肪酸シンターゼの発現および活性の両方が抑制される。
【００５７】
本明細書で使用される場合、ビタミンＢ６とは、ピリドキシン、ピリドキシン５’−リン酸、ピリドキサール、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール５’−リン酸、ピリドキサミン、ピリドキサミン５’−リン酸を含めたその種々の形態を包含する。他の実施形態では、ビタミンＢ６は、排出されるビタミンＢ６の上記の形態の異化産物である４−ピリドキシン酸も包含し得る。本明細書に記載の組成物は、ビタミンＢ６のこれらの形態の任意の１つまたは複数を含んでよい。
【００５８】
体内のビタミンＢ６の活性型はピリドキサール５−リン酸であり、これは、すべてのアミノ基転移およびいくつかの脱カルボキシル化および脱アミノ化反応のための補酵素である。さらに、ピリドキサール５−リン酸は、体内で生じるすべてのアミノ基転移反応のための補酵素として必要である（Peterson  D  L、Martinez-Carrion  M.  The  mechanism  of  transamination.  Function  of  the  histidyl  residue  at  the  active  site  of  supernatant  aspartate  transaminase.  J  Biol  Chem.  １９７０年２月２５日；２４５巻（４号）：８０６〜１３頁）。
【００５９】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物はいずれも、任意の形態のビタミンＢ６の塩、誘導体、代謝産物、異化産物、同化産物、前駆体、および類似体を含んでよい。例示的なビタミンＢ６の異化産物としては、２−メチル−３−ヒドロキシ−５−ホルミルピリジン−４−カルボキシレートおよび３−ヒドロキシ−２−メチルピリジン−４，５−ジカルボキシレートが挙げられる。例示的なビタミンＢ６の類似体は、米国特許第７，２３０，００９号、および同第６，３６９，０４２号に記載されている。例示的なビタミンＢ６の前駆体は、米国特許第７，４９５，１０１号に記載されている。
【００６０】
投薬形態
【００６１】
本明細書に記載の組成物は、種々の異なる剤形に配合することができる。本明細書に記載の組成物は、錠剤、咀嚼錠、カプレット、カプセル剤、軟ゼラチンカプセル剤、ロゼンジまたは溶液として経口的に使用することができる。本明細書に記載の組成物は、溶液の形態にある場合には経鼻スプレーとしてまたは注射用にも使用することができる。一部の実施形態では、組成物は、経口的消費のために適した液体組成物であってよい。経口投与するために適した本発明の組成物は、液体剤形（例えば、懸濁剤またはスラリー）、および経口用固体剤形（例えば、錠剤または混合散剤）を含めた、カプセル剤、カシェ剤、もしくは錠剤などなどの別個の剤形で、またはそれぞれが所定量の活性成分を粉末として含有する液体またはエアロゾル噴霧剤で、または顆粒剤、溶液、または水性液もしくは非水性液中の懸濁剤、水中油エマルション、または油中水液体エマルションで存在してよい。経口用剤形は、治療される個体または患者が経口摂取するための錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル剤、乳剤、親油性懸濁剤および親水性懸濁剤、液体、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化することができる。そのような剤形は、任意の製剤の方法によって調製することができる。例えば、活性成分を担体と会合させることができ、それが１つまたは複数の必要な成分を構成する。経口投与するために適したカプセル剤は、ゼラチン製の押し込み型（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル剤、ならびにゼラチン製の軟密閉カプセル剤およびグリセロールまたはソルビトールなどなどの可塑剤を含む。押し込み型カプセル剤は、活性成分を、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および場合によって安定剤と混和して含有してよい。場合によって、経口的に使用するための本発明の組成物は、組成物を固形添加剤と混合し、場合によって、生じた混合物を粉砕し、所望であれば適切な助剤を加えた後、顆粒剤の混合物を加工して錠剤または糖剤コアを得ることによって得ることができる。適切な添加剤は、具体的には、充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含めた糖；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、イネデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などである。一般に、組成物は、活性成分を液体担体または細かく分割された固体担体またはその両方と均一および密接に混和し、次いで、必要であれば、産物を所望の体裁に形づくることによって調製される。例えば、錠剤は、場合によって１つまたは複数のアクセサリー成分を用い、圧縮または成形によって調製することができる。圧縮錠剤は、適切な機械で活性成分を粉末または顆粒などのさらさらした形態に圧縮し、場合によって、例えば、これだけに限定されないが、結合剤、滑沢剤、不活性な賦形剤、および／または表面活性剤または分散剤などの添加剤と混合することによって調製することができる。成形錠剤は、適切な機械で、不活性な液体賦形剤で湿らせた粉末化合物の混合物を成形することによって作製することができる。
【００６２】
本発明の医薬組成物の調製は、医薬調製物を調製するために一般に認められている手順に従って行う。例えば、Remington's  Pharmaceutical  Sciences  第１８版（１９９０年）、E.  W.  Martin編、Mack  Publishing  Co.、PAを参照されたい。意図された使用および投与形式に応じて、マグネシウム−対イオン化合物をさらに医薬組成物の調製物に加工することが望ましい。適切な加工は、適切な無毒性および非干渉性の構成成分と混合すること、滅菌すること、用量単位に分割すること、および送達デバイスに封入することを含んでよい。
【００６３】
本発明は、水により、いくつかの化合物の分解が容易になり得るので、活性成分を含む無水組成物および剤形をさらに包含する。例えば、当技術分野では、製剤の長期にわたる貯蔵寿命または安定性などの特性を決定するために長期保管をシミュレートする手段として水を加えることができる（例えば、５％）。本発明の無水組成物および剤形は、無水または低水分の成分および低水分または低湿度条件を使用して調製することができる。ラクトースを含有する本発明の組成物および剤形は、製造、包装、および／または保管の間に水分および／または湿度と実質的に接触することが予測される場合、無水にすることができる。無水組成物は、その無水性が維持されるように調製し、保管することができる。したがって、無水組成物は、適切な製剤キットに含めることができるように、水への曝露を防止することが分かっている材料に包装することができる。適切な包装の例としては、これだけに限定されないが、密封ホイル、プラスチックなど、単位用量容器、ブリスター包装、およびストリップパックが挙げられる。
【００６４】
組合せ組成物は、分枝鎖アミノ酸、ビタミンＢ６、および１つまたは複数の追加的な成分を含んでよい。追加的な成分は、１つまたは複数の機能を果たし得る。一部の実施形態では、追加的な成分は、組合せ組成物の質量または体積の約０．１％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約０．１％未満、約０．５％未満、約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、約５％未満、約６％未満、約７％未満、約８％未満、約９％未満、約１０％未満、約１５％未満、約２０％未満、約２５％未満、約３０％未満、約４０％未満、約５０％未満、約６０％未満、約７０％未満、約８０％未満、約９０％未満、約９５％未満、または約０．１％超、約０．５％超、約１％超、約２％超、約３％超、約４％超、約５％超、約６％超、約７％超、約８％超、約９％超、約１０％超、約１５％超、約２０％超、約２５％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超、またはそれ以上を占める。追加的な成分の非限定的な例としては、甘味剤、増量剤、安定剤、酸味剤、防腐剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、充填剤、可溶化剤、着色剤（例えば、果実ジュースおよび野菜ジュースなど）、ならびに当技術分野で公知の他の添加物および添加剤が挙げられる。一部の実施形態では、組合せ組成物は、１種または複数種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、またはそれ以上）の甘味剤を含む。甘味剤の例としては、これだけに限定されないが、スクロース、フルクトース、ブドウ糖、マルトース、ラクトース、高フルクトーストウモロコシシロップ固形物、転化糖、糖アルコール、ソルビトール、サッカリン、シクラメート、ステビアに由来する甘味剤、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉに由来する甘味剤、モグロシドに由来する甘味剤、アセスルファムＫ、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン低級アルキルエステル甘味剤、Ｌ−アスパルチル−Ｄ−アラニンアミド甘味剤、Ｌ−アスパルチル−Ｄ−セリンアミド甘味剤、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−１−ヒドロキシメチルアルカンアミド甘味剤、Ｌ−アスパルチル−１−ヒドロキシエチルアルカンアミド甘味剤、Ｌ−アスパルチル−Ｄ−フェニルグリシンエステルおよびアミド甘味剤、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、ズルコシドＡ、ズルコシドＢ、ルブソシド、ステビア、ステビア抽出物、ステビオシド、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、シアメノシド、モナチンおよびそれらの塩（モナチンＳＳ、モナチンＲＲ、モナチンＲＳ、モナチンＳＲ）、クルクリン、グリチルリジン酸およびその塩、タウマチン、モネリン、マビンリン、ブラゼイン、ヘルナンズルシン（hemandulcin）、フィロズルチン、グリシフィリン、フロリジン、トリロバチン、バイユノシド、オスラジン、ポロポドシドＡ、プテロカリオシドＡ、プテロカリオシドＢ、ムクロジオシド、フロミソシドＩ、ペ��アンドリンＩ、アブルソシドＡ、シクロカリオシドＩ、スクラロース、アセスルファムカリウム、アスパルテーム、アリターム、サッカリン、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、シクラメート、ネオテーム、Ｎ−［Ｎ−［３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）プロピル］−Ｌ−α−アスパルチル］−Ｌ−フェニルアラニン−１−メチルエステル、Ｎ−［Ｎ−［３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−３−メチルブチル］−Ｌ−α−アスパルチル］−Ｌ−フェニルアラニン−１−メチルエステル、Ｎ−［Ｎ−［３−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）プロピル］−Ｌ−α−アスパルチル］−Ｌ−フェニルアラニン−１−メチルエステル、その塩、またはそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、甘味剤は、ポリオール添加物、例えば、糖アルコール、エリスリトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、ラクチトール、キシリトール、イノシトール、イソマルト、プロピレングリコール、グリセロール（グリセリン）、トレイトール、ガラクチトール、パラチノーゼ、還元イソマルトオリゴ糖、還元キシロオリゴ糖、還元ゲンチオオリゴ糖、還元マルトースシロップ、または還元グルコースシロップなどである。
【００６５】
一部の実施形態では、組合せ組成物は、１種または複数種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、またはそれ以上）の増量剤を含む。増量剤の非限定的な例としては、グアーガム、イナゴマメゴム、カッシアゴム、植物学的供給源由来のペクチン、高分子量カルボキシメチルセルロース、カラギーナン、アルギン酸塩、およびキサンタンが挙げられる。一部の実施形態では、液体製剤の粘度を増強するために１種または複数種の増量剤を加えることができる。
【００６６】
一部の実施形態では、組合せ組成物は、１種または複数種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、またはそれ以上）の安定剤を含む。安定剤の非限定的な例としては、ペクチン、デキストリンを含む多糖加水分解産物、寒天、カラギーナン（can-ageenan）、タマリンド種子多糖、アンゼリカゴム、カラヤゴム、キサンタンガム、アルギン酸ナトリウム、トラガントゴム、グアーガム、イナゴマメゴム、プルラン、ジェランガム、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、およびアルギン酸プロピレングリコールが挙げられる。一部の実施形態では、組合せ組成物の貯蔵寿命を増強するために１種または複数種の安定剤を組合せ組成物に加える。一般に、貯蔵寿命とは、容器およびその中の組成物を外界の条件（およそ室温、例えば、約１８〜２８℃）以下で、組成物を意図された目的のために意図された様式で使用することができない程度にまで組成物および／または容器の分解が起こることなく保持することができる時間の量を指す。一部の実施形態では、組合せ組成物の貯蔵寿命は、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１４日、約３０日、約６０日、約９０日、または約１日未満、約２日未満、約３日未満、約４日未満、約５日未満、約６日未満、約７日未満、約８日未満、約９日未満、約１０日未満、約１１日未満、約１２日未満、約１４日未満、約３０日未満、約６０日未満、約９０日未満、または約１日超、約２日超、約３日超、約４日超、約５日超、約６日超、約７日超、約８日超、約９日超、約１０日超、約１１日超、約１２日超、約１４日超、約３０日超、約６０日超、約９０日超、またはそれ以上；または、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１２ヶ月、または約１ヶ月未満、約２ヶ月未満、約３ヶ月未満、約４ヶ月未満、約５ヶ月未満、約６ヶ月未満、約７ヶ月未満、約８ヶ月未満、約９ヶ月未満、約１０ヶ月未満、約１１ヶ月未満、約１２ヶ月未満、または約１ヶ月超、約２ヶ月超、約３ヶ月超、約４ヶ月超、約５ヶ月超、約６ヶ月超、約７ヶ月超、約８ヶ月超、約９ヶ月超、約１０ヶ月超、約１１ヶ月超、約１２ヶ月超、またはそれ以上、または約１年、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約７年、約８年、約９年、約１０年、約１１年、約１２年、または約１年未満、約２年未満、約３年未満、約４年未満、約５年未満、約６年未満、約７年未満、約８年未満、約９年未満、約１０年未満、約１１年未満、約１２年未満、または約１年超、約２年超、約３年超、約４年超、約５年超、約６年超、約７年超、約８年超、約９年超、約１０年超、約１１年超、約１２年超、またはそれ以上である。一部の実施形態では、組合せ組成物は、組成物を含有する容器の開封後ある期間にわたって腐敗しやすくないままである。一般に、腐敗しやすさとは、組成物が、設計された目的のために設計された様式で使用することができない程度まで分解することを指す。一部の実施形態では、組合せ組成物は、開封後約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間���約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、約７２時間、約９０時間、または約１時間未満、約２時間未満、約３時間未満、約４時間未満、約５時間未満、約６時間未満、約７時間未満、約８時間未満、約９時間未満、約１０時間未満、約１１時間未満、約１２時間未満、約１８時間未満、約２４時間未満、約３０時間未満、約３６時間未満、約４８時間未満、約６０時間未満、約７２時間未満、約９０時間未満、または約１時間超、約２時間超、約３時間超、約４時間超、約５時間超、約６時間超、約７時間超、約８時間超、約９時間超、約１０時間超、約１１時間超、約１２時間超、約１８時間超、約２４時間超、約３０時間超、約３６時間超、約４８時間超、約６０時間超、約７２時間超、約９０時間超、またはそれ以上、または、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１８日、約２４日、約３０日、約３６日、約４８日、約６０日、約７２日、約９０日、または約１日未満、約２日未満、約３日未満、約４日未満、約５日未満、約６日未満、約７日未満、約８日未満、約９日未満、約１０日未満、約１１日未満、約１２日未満、約１８日未満、約２４日未満、約３０日未満、約３６日未満、約４８日未満、約６０日未満、約７２日未満、約９０日未満、または約１日超、約２日超、約３日超、約４日超、約５日超、約６日超、約７日超、約８日超、約９日超、約１０日超、約１１日超、約１２日超、約１８日超、約２４日超、約３０日超、約３６日超、約４８日超、約６０日超、約７２日超、約９０日超、またはそれ以上；または、開封後約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約８ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１２ヶ月、または約１ヶ月未満、約２ヶ月未満、約３ヶ月未満、約４ヶ月未満、約５ヶ月未満、約６ヶ月未満、約８ヶ月未満、約１０ヶ月未満、約１１ヶ月未満、約１２ヶ月未満、または約１ヶ月超、約２ヶ月超、約３ヶ月超、約４ヶ月超、約５ヶ月超、約６ヶ月超、約８ヶ月超、約１０ヶ月超、約１１ヶ月超、約１２ヶ月超、またはそれ以上、または約１年、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約８年、約１０年、約１１年、約１２年、または約１年未満、約２年未満、約３年未満、約４年未満、約５年未満、約６年未満、約８年未満、約１０年未満、約１１年未満、約１２年未満、または約１年超、約２年超、約３年超、約４年超、約５年超、約６年超、約８年超、約１０年超、約１１年超、約１２年超、またはそれ以上にわたって腐敗しやすくないままである。一部の実施形態では、組合せ組成物は、室温（例えば、約１８〜２８℃）で、ある期間にわたって腐敗しにくいままである。一部の実施形態では、組合せ組成物は、約２０℃未満、約１５℃未満、約１０℃未満、約５℃未満、約４℃未満、約３℃未満、約２℃未満、約１℃未満、約０℃未満、約−１℃未満、約−２℃未満、約−３℃未満、約−４℃未満、約−５℃未満、約−１０℃未満、約−２０℃未満、またはそれ以下での保管などの冷蔵状態で、ある期間にわたって腐敗しやすくないままである。
【００６７】
一部の実施形態では、組合せ組成物は、１種または複数種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、またはそれ以上）の酸味剤を含む。酸味剤の非限定的な例としては、Ｃ２〜Ｃ３０カルボン酸、置換ヒドロキシルＣ１〜Ｃ３０カルボン酸、安息香酸、置換安息香酸（例えば、２，４−ジヒドロキシ安息香酸）、置換ケイ皮酸、ヒドロキシ酸、置換ヒドロキシ安息香酸、置換シクロヘキシルカルボン酸、タンニン酸、乳酸、酒石酸、クエン酸、グルコン酸、グルコヘプトン酸、アジピン酸、ヒドロキシクエン酸、リンゴ酸、果実酸（fruitaric  acid）（リンゴ酸、フマル酸、および酒石酸のブレンド）、フマル酸（fimaric  acid）、マレイン酸、コハク酸、クロロゲン酸、サリチル酸、クレアチン、グルコサミン塩酸塩、グルコノデルタラクトン、コーヒー酸、胆汁酸、酢酸、アスコルビン酸、アルギン酸、エリソルビン酸、ポリグルタミン酸、およびそれらのアルカリ金属塩誘導体またはアルカリ土類金属塩誘導体が挙げられる。
【００６８】
一部の実施形態では、組合せ組成物は、１種または複数種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、またはそれ以上）の防腐剤を含む。防腐剤の非限定的な例としては、ソルビン酸、安息香酸、および、これらに限定されないが、ソルビン酸カルシウム、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸カルシウム、安息香酸ナトリウム、安息香酸カリウムを含めたその塩、ならびにそれらの混合物が挙げられる。
【００６９】
本明細書に記載の成分は、従来の医薬配合技法に従って医薬担体と組み合わせて均質混和物にすることができる。担体は、投与するために望ましい調製物の形態に応じて多種多様な形態を取ってよい。経口剤形用の組成物の調製では、経口用液体調製物（例えば、懸濁剤、溶液、およびエリキシル剤など）の場合では、例えば、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、防腐剤、着色剤などまたはエアロゾルなどの任意の通常の医薬媒体を担体として使用することができ、経口用固形調製物の場合では、一部の実施形態では、ラクトースを使用せずに、デンプン、糖、微結晶セルロース、賦形剤、増粒剤、滑沢剤、結合剤、および崩壊剤などの担体を使用することができる。例えば、適切な担体としては、固形経口用調製物を伴う散剤、カプセル剤、および錠剤が挙げられる。所望であれば、錠剤を標準の水系技法または非水系技法によってコーティングすることができる。
【００７０】
剤形に使用するために適した結合剤としては、これだけに限定されないが、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、または他のデンプン、ゼラチン、アラビアゴムなどの天然ゴムおよび合成ゴム、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸、他のアルギン酸塩、粉末化トラガント、グアーガム、セルロースおよびその誘導体（例えば、エチルセルロース、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、アルファ化デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶セルロース、ならびにそれらの混合物が挙げられる。
【００７１】
本発明の組成物および剤形を形成するために使用することができる滑沢剤としては、これだけに限定されないが、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、軽鉱油、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール、他のグリコール、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、硬化植物油（例えば、ピーナッツ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油）、ステアリン酸亜鉛、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル（ethylaureate）、寒天、またはそれらの混合物が挙げられる。追加的な滑沢剤としては、例えば、ｓｙｌｏｉｄシリカゲル、合成シリカの凝固エアロゾル、またはそれらの混合物が挙げられる。滑沢剤は、場合によって、組成物の約１重量パーセント未満の量で添加することができる。
【００７２】
滑沢剤は、これらに限定されないが、多糖、ポリグリカン、セプラフィルム、インターシードおよびヒアルロン酸を含めた組織壁と併せて使用することもできる。
【００７３】
水性の環境に曝露されると崩壊する錠剤をもたらすために、本発明の組成物に崩壊剤を使用することができる。崩壊剤が多すぎると、瓶内で崩壊する可能性がある錠剤が生じ得る。少なすぎると、崩壊を起こすために不十分である可能性があり、したがって、活性成分（複数可）が剤形から放出される速度および程度が変更され得る。したがって、本明細書に開示されている化合物の剤形を形成するために、活性成分（複数可）の放出が不利益に変更されるほど少なすぎもせず多すぎもしない十分な量の崩壊剤を使用することができる。使用する崩壊剤の量は、製剤の種類および投与形式に基づいて変動し得、当業者には容易に識別可能であり得る。約０．５〜約１５重量パーセントの崩壊剤、または約１〜約５重量パーセントの崩壊剤を医薬組成物に使用することができる。本発明の組成物および剤形を形成するために使用することができる崩壊剤としては、これだけに限定されないが、寒天、アルギン酸、炭酸カルシウム、微結晶セルロース、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポラクリリンカリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、他のデンプン、アルファ化デンプン、他のデンプン、粘土、他のアルギン、他のセルロース、ゴムまたはそれらの混合物が挙げられる。
【００７４】
本明細書に開示されている組成物および剤形において使用するための適切な充填剤の例としては、これだけに限定されないが、タルク、炭酸カルシウム（例えば、顆粒剤または散剤）、微結晶セルロース、粉末セルロース、デキストレート、カオリン、マンニトール、ケイ酸、ソルビトール、デンプン、アルファ化デンプン、ならびにそれらの混合物が挙げられる。
【００７５】
経口投与するために水性懸濁剤および／またはエリキシル剤が望ましい場合には、その活性成分を、種々の甘味剤または香味剤、着色剤または色素、および、それが所望であれば、乳化剤および／または懸濁化剤と、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンおよびそれらのさまざまな組み合わせなどの賦形剤と一緒に組み合わせることができる。
【００７６】
錠剤は、胃腸管内での崩壊および吸収を遅延させ、それにより、より長い期間にわたって持続する作用をもたらすために公知の技法によってコーティングしてもコーティングしなくてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を使用することができる。経口的に使用するための製剤は、活性成分が不活性な固形賦形剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンと混合された硬ゼラチンカプセルとして、または、活性成分が水媒体または油媒体、例えば、ピーナッツ油、流動パラフィンまたはオリーブ油と混合された軟ゼラチンカプセルとして提供されてもよい。
【００７７】
一実施形態では、組成物は、本発明の化合物の良好な可溶化および／または溶解を確実にするため、本発明の化合物の沈殿を最小限にするために可溶化剤を含んでよい。これは、非経口的に使用するための組成物、例えば、注射用組成物に対して特に重要であり得る。可溶化剤は、親水性薬物および／または界面活性物質などの他の構成成分の溶解性を増大させるため、または組成物を安定または均一な溶液または分散剤として維持するために添加することもできる。
【００７８】
組成物は、１種または複数種の薬学的に許容される添加物および添加剤をさらに含んでよい。そのような添加物および添加剤としては、限定することなく、粘着性低下剤（detackifier）、消泡剤、緩衝剤、ポリマー、抗酸化剤、防腐剤、キレート化剤、粘弾性調整剤（viscomodulator）、等張化剤（tonicifier）、風味剤、着色剤、着臭剤、乳白剤、懸濁化剤、結合剤、充填剤、可塑剤、滑沢剤、ならびにそれらの混合物が挙げられる。添加剤の例の包括的ではない一覧としては、モノグリセリド、ステアリン酸マグネシウム、食品用加工デンプン、ゼラチン、微結晶セルロース、グリセリン、ステアリン酸、シリカ、黄蝋、レシチン、ヒドロキシプロピルセルロース、クロスカルメロースナトリウム、およびクロスポビドンが挙げられる。
【００７９】
本明細書に記載の組成物は、１つまたは複数の構成成分が徐々に放出されるように徐放、持続放出または持効性放出として製剤化することもできる。遅延放出は、１つまたは複数の構成成分を種々の材料のマトリックス中に製剤化することによって、またはマイクロカプセル封入によって実現することができる。組成物は、１つまたは複数の構成成分が、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、または２４時間にわたって放出されるように製剤化することができる。１つまたは複数の構成成分の放出は、速度が一定であっても速度が変化してもよい。
【００８０】
一部の実施形態では、組成物は、食品組成物に製剤化することができる。例えば、組成物は、食品担体を伴うまたは伴わない飲料または他の液体、固形食、半固形食であってよい。例えば、組成物は、本発明に従ってロイシンおよびビタミンＢ６を補充した紅茶を含んでよい。組成物は、本発明に従ってロイシンおよびビタミンＢ６を補充した乳製品であってよい。一部の実施形態では、組成物は、食品組成物に製剤化することができる。例えば、組成物は、飲料、固形食、半固形食、または食品担体を含んでよい。例えば、組成物は、ロイシンおよびビタミンＢ６を補充した紅茶を含んでよい。一部の実施形態では、組合せ組成物は、経口的に消費するための液体懸濁剤、例えば、飲料などとして容器（例えば、瓶）内に包装される。一部の実施形態では、各容器が単位用量を構成する。一部の実施形態では、液体懸濁剤の体積は、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、約１５ｍＬ、約３０ｍＬ、約６０ｍＬ、約９０ｍＬ、約１２０ｍＬ、約２４０ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１０００ｍＬ、または約５ｍＬ未満、約１０ｍＬ未満、約１５ｍＬ未満、約２０ｍＬ未満、約１５ｍＬ未満、約３０ｍＬ未満、約６０ｍＬ未満、約９０ｍＬ未満、約１２０ｍＬ未満、約２４０ｍＬ未満、約５００ｍＬ未満、約６００ｍＬ未満、約７００ｍＬ未満、約８００ｍＬ未満、約９００ｍＬ未満、約１０００ｍＬ未満、または約５ｍＬ超、約１０ｍＬ超、約１５ｍＬ超、約２０ｍＬ超、約１５ｍＬ超、約３０ｍＬ超、約６０ｍＬ超、約９０ｍＬ超、約１２０ｍＬ超、約２４０ｍＬ超、約５００ｍＬ超、約６００ｍＬ超、約７００ｍＬ超、約８００ｍＬ超、約９００ｍＬ超、約１０００ｍＬ超、またはそれ以上である。一部の実施形態では、液体懸濁剤の体積は、約０．５ｏｚ、約１ｏｚ、約２ｏｚ、約３ｏｚ、約４ｏｚ、約５ｏｚ、約６ｏｚ、約７ｏｚ、約８ｏｚ、約９ｏｚ、約１０ｏｚ、約１１ｏｚ、約１２ｏｚ、約１６ｏｚ、約１８ｏｚ、約２０ｏｚ、約２４ｏｚ、約３０ｏｚ、約３６ｏｚ、約４８ｏｚ、または約０．５ｏｚ未満、約１ｏｚ未満、約２ｏｚ未満、約３ｏｚ未満、約４ｏｚ未満、約５ｏｚ未満、約６ｏｚ未満、約７ｏｚ未満、約８ｏｚ未満、約９ｏｚ未満、約１０ｏｚ未満、約１１ｏｚ未満、約１２ｏｚ未満、約１６ｏｚ未満、約１８ｏｚ未満、約２０ｏｚ未満、約２４ｏｚ未満、約３０ｏｚ未満、約３６ｏｚ未満、約４８ｏｚ未満、または約０．５ｏｚ超、約１ｏｚ超、約２ｏｚ超、約３ｏｚ超、約４ｏｚ超、約５ｏｚ超、約６ｏｚ超、約７ｏｚ超、約８ｏｚ超、約９ｏｚ超、約１０ｏｚ超、約１１ｏｚ超、約１２ｏｚ超、約１６ｏｚ超、約１８ｏｚ超、約２０ｏｚ超、約２４ｏｚ超、約３０ｏｚ超、約３６ｏｚ超、約４８ｏｚ超、またはそれ以上である。一部の実施形態では、組合せ組成物は、表１に列挙されている特性を含む。
【表１】
2018012722.tif 000002
【００８１】
あるいは、組成物は、ロイシンおよびビタミンＢ６を補充したスナックバーであってよい。例えば、スナックバーはチョコレートバー、グラノーラバー、またはトレイルミックスバーであってよい。さらに別の実施形態では、本栄養補助食品または食物組成物は、消費するために適切および望ましい味、テクスチャー、および粘度を有するように製剤化することができる。任意の適切な食品担体を本食物組成物に使用することができる。本発明の食品担体は事実上いかなる食品も包含する。そのような食品担体の例としては、これだけに限定されないが、食品バー（グラノーラバー、プロテインバー、キャンディバーなど）、穀物製品（オートミール、朝食用シリアル、グラノーラなど）、ベーカリー製品（パン、ドーナツ、クラッカー、ベーグル、ペストリー、ケーキなど）、飲料（乳ベースの飲料、スポーツドリンク、果実ジュース、アルコール飲料、瓶詰め飲料水）、パスタ、穀粒（イネ、トウモロコシ、エンバク、ライムギ、コムギ、穀粉など）、卵製品、スナック（キャンディ、チップ、ゴム、チョコレートなど）、肉、果実、および野菜が挙げられる。ある実施形態では、本発明で使用される食品担体は、望ましくない味（例えば、苦味）を遮蔽することができる。所望の場合、本明細書で提示されている食品組成物は、本明細書に記載の構成成分のいずれのものよりも望ましいテクスチャーおよび芳香を示す。例えば、本発明による液体食品担体を使用して、本食物組成物を飲料、例えば、補充されたジュース、コーヒー、茶などの形態で得ることができる。他の実施形態では、固形食品担体を本発明に従って使用して、本食物組成物をミールリプレイスメント、例えば、補充されたスナックバー、パスタ、パンなどの形態で得ることができる。さらに他の実施形態では、半固形食品担体を本発明に従って使用して、本食物組成物をガム、チューインキャンディまたはスナックなどの形態で得ることができる。
【００８２】
組合せ組成物の投薬は、毎日約１回、約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回、約１０回、または約１回未満、約２回未満、約３回未満、約４回未満、約５回未満、約６回未満、約７回未満、約８回未満、約９回未満、約１０回未満、または約１回超、約２回超、約３回超、約４回超、約５回超、約６回超、約７回超、約８回超、約９回超、約１０回超、またはそれ以上であってよい。対象は、投薬を約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、または約１日未満、約２日未満、約３日未満、約４日未満、約５日未満、約６日未満、約７日未満、約８日未満、約９日未満、約１０日未満、約１１日未満、約１２日未満、約１３日未満、約１４日未満、または約１日超、約２日超、約３日超、約４日超、約５日超、約６日超、約７日超、約８日超、約９日超、約１０日超、約１１日超、約１２日超、約１３日超、約１４日超、またはそれ以上、または約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１３週間、約１４週間、または約１週間未満、約２週間未満、約３週間未満、約４週間未満、約５週間未満、約６週間未満、約７週間未満、約８週間未満、約９週間未満、約１０週間未満、約１１週間未満、約１２週間未満、約１３週間未満、約１４週間未満、または約１週間超、約２週間超、約３週間超、約４週間超、約５週間超、約６週間超、約７週間超、約８週間超、約９週間超、約１０週間超、約１１週間超、約１２週間超、約１３週間超、約１４週間超、またはそれ以上、または約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１２ヶ月、約１３ヶ月、約１４ヶ月、または約１ヶ月未満、約２ヶ月未満、約３ヶ月未満、約４ヶ月未満、約５ヶ月未満、約６ヶ月未満、約７ヶ月未満、約８ヶ月未満、約９ヶ月未満、約１０ヶ月未満、約１１ヶ月未満、約１２ヶ月未満、約１３ヶ月未満、約１４ヶ月未満、または約１ヶ月超、約２ヶ月超、約３ヶ月超、約４ヶ月超、約５ヶ月超、約６ヶ月超、約７ヶ月超、約８ヶ月超、約９ヶ月超、約１０ヶ月超、約１１ヶ月超、約１２ヶ月超、約１３ヶ月超、約１４ヶ月超、またはそれ以上の期間にわたって受けてよい。単位用量は、対象に、毎日約１０００ｍｇまたは約１０００ｍｇ超の分枝鎖アミノ酸（例えば、約１１００ｍｇ、約１１３０ｍｇ、約２０００ｍｇ、約２１００ｍｇ、約２２００ｍｇ、約２２５０ｍｇ、約２２６０ｍｇ、約３３００ｍｇ、約３３９０ｍｇ、約４４００ｍｇ、約４５２０ｍｇ、または約１１００ｍｇ超、約１１３０ｍｇ超、約２０００ｍｇ超、約２１００ｍｇ超、約２２００ｍｇ超、約２２５０ｍｇ超、約２２６０ｍｇ超、約３３００ｍｇ超、約３３９０ｍｇ超、約４４００ｍｇ超、約４５２０ｍｇ超、またはそれ以上）および約１０ｍｇまたは約１０ｍｇ超のビタミンＢ６（例えば、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、２４ｍｇ、３０ｍｇ、３６ｍｇ、４５ｍｇ、４８ｍｇ、６０ｍｇ、またはそれ以上）が投与されるように選択することができる。分枝鎖アミノ酸は、ロイシンを含んでよい。単位用量は、１日用量の画分、例えば、１日用量を１日当たりに投与される単位用量の数で割ったものなどであってよい。単位用量は、１日用量を１日当たりに投与される単位用量の数で割り、さらに投与当たりの単位用量（例えば、錠剤）の数で割ったものである１日用量の画分であってよい。投与当たりの単位用量の数は、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、または約１個未満、約２個未満、約３個未満、約４個未満、約５個未満、約６個未満、約７個未満、約８個未満、約９個未満、約１０個未満、または約１個超、約２個超、約３個超、約４個超、約５個超、約６個超、約７個超、約８個超、約９個超、約１０個超、またはそれ以上であってよい。１日当たりの用量の数は、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、または約１個未満、約２個未満、約３個未満、約４個未満、約５個未満、約６個未満、約７個未満、約８個未満、約９個未満、約１０個未満、または約１個超、約２個超、約３個超、約４個超、約５個超、約６個超、約７個超、約８個超、約９個超、約１０個超、またはそれ以上であってよい。１日当たりの単位用量の数は、１日用量を単位用量で割ることによって決定することができ、１日当たり約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、または約１個未満、約２個未満、約３個未満、約４個未満、約５個未満、約６個未満、約７個未満、約８個未満、約９個未満、約１０個未満、約１１個未満、約１２個未満、約１３個未満、約１４個未満、約１５個未満、約６個未満、約１７個未満、約１８個未満、約１９個未満、約２０個未満、または約１個超、約２個超、約３個超、約４個超、約５個超、約６個超、約７個超、約８個超、約９個超、約１０個超、約１１個超、約１２個超、約１３個超、約１４個超、約１５個超、約６個超、約１７個超、約１８個超、約１９個超、約２０個超、またはそれ以上の単位用量であってよい。例えば、単位用量は、約１／２、約１／３、約１／４、約１／５、約１／６、約１／７、約１／８、約１／９、約１／１０であってよい。単位用量は、毎日の量の約３分の１であってよく、対象に毎日３回投与することができる。単位用量は、毎日の量の約２分の１であってよく、対象に１日２回投与することができる。単位用量は、毎日の量の約４分の１であってよく、１日２回、２つの単位用量を対象に投与することができる。例えば、単位用量は、約２５０ｍｇ、約２７５ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８２５ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１１２５ｍｇ、約１１３０ｍｇ、約１６５０ｍｇ、約２２００ｍｇ、または約２５０ｍｇ未満、約２７５ｍｇ未満、約５００ｍｇ未満、約５５０ｍｇ未満、約７５０ｍｇ未満、約８２５ｍｇ未満、約１１００ｍｇ未満、約１１２５ｍｇ未満、約１１３０ｍｇ未満、約１６５０ｍｇ未満、約２２００ｍｇ未満、または約２５０ｍｇ超、約２７５ｍｇ超、約５００ｍｇ超、約５５０ｍｇ超、約７５０ｍｇ超、約８２５ｍｇ超、約１１００ｍｇ超、約１１２５ｍｇ超、約１１３０ｍｇ超、約１６５０ｍｇ超、約２２００ｍｇ超、またはそれ以上のロイシンおよび約３．７５ｍｇ、約７．５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１１．２５ｍｇ、約１５ｍｇ、または約３．７５ｍｇ未満、約７．５ｍｇ未満、約１０ｍｇ未満、約１１．２５ｍｇ未満、約１５ｍｇ未満、または約３．７５ｍｇ超、約７．５ｍｇ超、約１０ｍｇ超、約１１．２５ｍｇ超、約１５ｍｇ超、またはそれ以上のビタミンＢ６を有してよい。
【００８３】
一部の実施形態では、ロイシン、ロイシンの任意の代謝産物、および／またはビタミンＢ６の投与用量は、ロイシン、ロイシンの代謝産物および／またはビタミンＢ６の指定された生理的濃度または循環レベルが実現されるように設計することができる。生理的濃度は、対象の血流において測定される循環レベルであってよい。対象はヒトであっても動物であってもよい。選択された投薬は、体重、エネルギー代謝の速度、遺伝的性質、民族性、身長、または任意の他の特性などの対象の特性に基づいて変更することができる。単位用量中のロイシンの量は、対象におけるロイシンの循環レベルが約０．２５ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．７５ｍＭ、もしくは約１ｍＭ、または約０．２５ｍＭ超、約０．５ｍＭ超、約０．７５ｍＭ超、もしくは約１ｍＭ超になるような量であってよい。約１，１２５ｍｇのロイシンを投薬することにより、対象におけるロイシンの循環レベル約０．５ｍＭを実現することができる。約３００ｍｇのロイシンを投薬することにより、対象におけるロイシンの循環レベル約０．２５ｍＭを実現することができる。約１５ｍｇのビタミンＢ６を投薬することにより、ビタミンＢ６の循環レベル約１００ｎＭを実現することができる。約７．５ｍｇのビタミンＢ６を投薬することにより、ビタミンＢ６の循環レベル約５０ｎＭを実現することができる。単位用量中のビタミンＢ６の量は、対象におけるビタミンＢ６の循環レベルが約１０ｎＭ、約２５ｎＭ、約５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１５０ｎＭ、もしくは約２００ｎＭ、または約１０ｎＭ超、約２５ｎＭ超、約５０ｎＭ超、約１００ｎＭ超、約１５０ｎＭ超、もしくは約２００ｎＭ超になるような量であってよい。単位用量中のロイシンおよびビタミンＢ６の量は、対象におけるロイシンの循環レベルが約０．５ｍＭになり、対象におけるビタミンＢ６の循環レベルが約１００ｎＭになるような量であってよい。
【００８４】
方法
【００８５】
本発明は、１つまたは複数の組成物を投与することによってエネルギー代謝を調節する方法を提供する。これらの組成物としては、本明細書に記載の組合せ組成物、例えば、分枝鎖アミノ酸およびビタミンＢ６を含む組合せ組成物などが挙げられる。組合せ組成物は、錠剤、カプセル剤の形態で、または本明細書に記載の任意の他の形態で経口投与するために製剤化することができる。
【００８６】
組成物は、対象に経口的にまたは任意の他の方法によって投与することができる。経口投与の方法としては、組成物を、栄養補助食品または食料品の形態で取ることができる液体、固形物、または半固形物として投与することが挙げられる。
【００８７】
組成物は、定期的に投与することができる。例えば、組成物は、１日に１回、２回、３回、４回、またはそれよりも頻繁に投与することができる。対象は、１日ごと、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごとまたは７日ごとに投与を受けることができる。一部の実施形態では、組成物を毎日３回投与する。投与は、対象の食事時間と同時であってよい。処置または食事補充の期間は、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、または約９日、約２週間、約１〜１１ヶ月、または約１年、約２年、約５年またはさらに長い期間であってよい。本発明の一部の実施形態では、対象に投与する投与量は、処置の期間にわたって変化させてもよく、一定であってもよい。例えば、毎日の投薬量を投与の期間にわたって増加または減少させることができる。
【００８８】
組成物は、対象に組成物の選択された総１日用量が投与されるように、対象に投与することができる。総１日用量は、２４時間にわたって投与する用量の合計によって決定することができる。組成物の総１日用量は、少なくとも約２５０ｍｇ、少なくとも約５００ｍｇ、少なくとも約７５０ｍｇ、少なくとも約１０００ｍｇ、少なくとも約１１２５ｍｇ、少なくとも約２０００ｍｇ、少なくとも約２２５０ｍｇまたはそれ以上の分枝鎖アミノ酸またはその代謝産物を含んでよい。分枝鎖アミノ酸は、ロイシン、ＨＭＢ、または本明細書に記載の任意の他の分枝鎖アミノ酸であってよい。組成物の総１日用量は、少なくとも約３ｍｇ、少なくとも７．５ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも３０ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも９０ｍｇまたはそれ以上のＢ６を含んでよい。組成物の総１日用量の分枝鎖アミノ酸またはその代謝産物のビタミンＢ６に対する質量比は約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約５００、約７５０、約１０００、または約４５超、約５０超、約５５超、約６０超、約６５超、約７０超、約７５超、約８０超、約８５超、約９０超、約１００超、約１１０超、約１２０超、約１３０超、約１４０超、約１５０超、約１７５超、約２００超、約２５０超、約５００超、約７５０超、約１０００超、または約４５未満、約５０未満、約５５未満、約６０未満、約６５未満、約７０未満、約７５未満、約８０未満、約８５未満、約９０未満、約１００未満、約１１０未満、約１２０未満、約１３０未満、約１４０未満、約１５０未満、約１７５未満、約２００未満、約２５０未満、約５００未満、約７５０未満、約１０００未満、またはそれ以上であってよい。
【００８９】
一部の実施形態では、対象で組成物の所望の循環レベルが実現されるように組成物の選択された用量を対象に投与することができる。組成物の所望の循環レベルは、少なくとも約０．２５ｍＭ、少なくとも約０．５ｍＭ、少なくとも約０．７５ｍＭ、少なくとも約１ｍＭまたはそれ以上のロイシンであってよい。組成物の所望の循環レベルは、少なくとも約１０ｎＭ、少なくとも約２５ｎＭ、少なくとも約５０ｎＭ、少なくとも約１００ｎＭ、少なくとも約１５０ｎＭ、または少なくとも約２００ｎＭまたはそれ以上のＢ６であってよい。選択された用量は、体重、身長、民族性、または遺伝的性質などの対象の特性に基づいて選択することができる。
【００９０】
別の態様では、本発明は、対象におけるエネルギー代謝を増加させるための方法であって、本明細書に記載の組成物、例えば、ロイシンおよびＢ６を含む組成物などを、それを必要とする対象に、対象のエネルギー代謝が増加する期間にわたって投与することを含む方法を提供する。本発明は、本明細書に記載の組成物を、ある期間にわたって１日当たり少なくとも２回投与することを含み、前記期間にわたる対象における脂肪酸化が、前記期間より前の対象における脂肪酸化と比較して増加する、それを必要とする対象における脂肪酸化を増強するための方法も提供する。処置前および処置後に対象のエネルギー代謝を測定して、対象のエネルギー代謝が増加したかどうかを決定することができる。あるいは、対象を試験群と対照群にプールし、エネルギー代謝の増加を群間で測定することができる。
【００９１】
投与の期間の長さおよび／または投薬量は、医師、栄養士、または任意の他の種類の臨床医が決定することができる。期間は、１週間、２週間、３週間、４週間またはそれ以上であってよい。あるいは、期間は、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月またはそれ以上であってよい。
【００９２】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の組成物を選択された投薬レベルで投与することを含み、選択された投薬レベルにより、対象において約０．５ｍＭのロイシンおよび約１００ｎＭのＢ６の循環レベルが誘導される、対象におけるエネルギー代謝を増加させるための方法を提供する。投薬レベルは、体重、身長、民族性、遺伝的性質、またはベースラインのエネルギー代謝レベルなどの対象の特性に基づいて調整することができる。
【００９３】
医師、栄養士、または臨床医は、投与した組成物に対する対象の反応を観察し、対象の動作または測定されたロイシン、Ｂ６、または組成物の任意の他の構成要素の循環レベルに基づいて投薬を調整することができる。例えば、エネルギー調節の効果またはＢ６またはロイシンの循環レベルが所望の標的レベル未満に低下している対象に対して投薬レベルを上昇させることができる。
【００９４】
一部の実施形態では、対象に投与する組成物を所与の対象に対して最適化することができる。例えば、組合せ組成物中の分枝鎖アミノ酸のビタミンＢ６または特定の構成成分に対する比を調整することができる。比および／または特定の構成成分は、１つまたは複数の組成物を、分枝鎖アミノ酸のビタミンＢ６に対する比を変動させて、または組合せ組成物の構成成分を変動させて投与した後に対象を評価した後に選択することができる。
【００９５】
本明細書に記載の組成物、例えば、組合せ組成物などを対象に投与することにより、対象のエネルギー代謝を調節または維持することが可能になり得る。エネルギー代謝を調節または維持することにより、対象にいくつもの有益な効果を生じることが可能になり得る。これらの有益な効果としては、体重の減少、脂肪組織の減少、脂肪酸の酸化の増加、インスリン感受性の増大、酸化ストレスの減少、および／または炎症の減少が挙げられる。処置前のベースラインと比較して、これらの効果により、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約７５％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約２００％、約２５０％、約３００％、約４００％、もしくは約５００％、または約５％超、約１０％超、約１５％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約７５％超、約１００％超、約１２５％超、約１５０％超、約２００％超、約２５０％超、約３００％超、約４００％超、もしくは約５００％超の改善がもたらされ得る。あるいは、本明細書に記載の組成物を投与することにより、対象の体重、脂肪組織の量、脂肪酸の酸化の量、インスリン感受性のレベル、酸化ストレスレベル、および／または炎症のレベルを維持することが可能になり得る。これらの量および／またはレベルを、投与開始時の量および／またはレベルの０％以内、１％以内、５％以内、または１０％以内に維持することができる。
【００９６】
キット
【００９７】
本発明は、キットも提供する。キットは、適切に包装された本明細書に記載の１つまたは複数の組成物を含み、使用説明書、臨床試験の考察、副作用の一覧表などを含んでよい書面材料をさらに含んでよい。そのようなキットは、健康管理提供者にとって有用な、組成物の活性および／または利点が示されるまたは確立され、および／または投薬、投与、副作用、薬物相互作用、または他の情報が記載されている参照科学文献、添付文書材料、臨床試験結果、および／またはこれらの概要などの情報も含んでよい。そのような情報は、種々の試験、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルを伴う実験動物を使用した試験、およびヒト臨床試験に基づく試験の結果に基づいてよい。キットは、本明細書に記載の１つまたは複数の単位用量を含んでよい。一部の実施形態では、キットは、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約３０個、約３１個、約６０個、約９０個、約１２０個、約１５０個、約１８０個、約２１０個、または約１個未満、約２個未満、約３個未満、約４個未満、約５個未満、約６個未満、約７個未満、約８個未満、約９個未満、約１０個未満、約１１個未満、約１２個未満、約１３個未満、約１４個未満、約１５個未満、約１６個未満、約１７個未満、約１８個未満、約１９個未満、約２０個未満、約３０個未満、約３１個未満、約６０個未満、約９０個未満、約１２０個未満、約１５０個未満、約１８０個未満、約２１０個未満、または約１個超、約２個超、約３個超、約４個超、約５個超、約６個超、約７個超、約８個超、約９個超、約１０個超、約１１個超、約１２個超、約１３個超、約１４個超、約１５個超、約１６個超、約１７個超、約１８個超、約１９個超、約２０個超、約３０個超、約３１個超、約６０個超、約９０個超、約１２０個超、約１５０個超、約１８０個超、約２１０個超、またはそれ以上の単位用量を含む。使用説明書は、投薬説明書、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上の単位用量を１日当たり１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ以上服用するための説明書などを含んでよい。例えば、キットは、錠剤として供給され、各錠剤が別々に包装されているか、多数の錠剤が投与当たりの単位用量の数に応じて別々に包装されているか（例えば、錠剤の対）、またはすべての錠剤が一緒に包装されている（例えば、瓶内に）単位用量を含んでよい。別の例として、キットは、瓶詰めされた飲料として供給される単位用量を含んでよく、キットは、１本、２本、３本、４本、５本、６本、７本、８本、９本、１０本、１１本、１２本、１３本、１４本、２４本、２８本、３６本、４８本、７２本、またはそれ以上の瓶を含む。
【００９８】
キットは、別の薬剤をさらに含有してよい。一部の実施形態では、本発明の化合物および薬剤は、キット内の別々の容器に入った別々の組成物として提供される。一部の実施形態では、本発明の化合物および薬剤は、キット内の容器に入った単一の組成物として提供される。適切な包装および追加的な使用品（例えば、液体調製物用の測定カップ、空気への曝露を最小限にするためのホイルなど）は、当技術分野で公知であり、キットに含めることができる。本明細書に記載のキットは、医師、看護師、薬剤師、処方担当職員（formulary  offcial）などを含めた健康に関する提供者に提供、販売および／または販売促進することができる。キットは、また、一部の実施形態では、直接消費者に販売することができる。
【００９９】
一部の実施形態では、キットは、単位投与量の複数日供給物を含んでよい。単位投与量は、本明細書に記載の任意の単位投与量であってよい。キットは、単位投与量の複数日供給物の複数日にわたる投与を指示する説明書を含んでよい。複数日供給物は、１ヶ月供給物、３０日供給物、または複数週供給物であってよい。複数日供給物は、９０日供給物、１８０日供給物、３ヶ月供給物または６ヶ月供給物であってよい。キットは、包装された毎日の単位投与量、例えば、１個、２個、３個、４個、または５個の単位投与量が包装されたものなどを含んでよい。キットは、他の栄養補助食品、ビタミン、およびミールリプレイスメントバー、ミックス、および飲料と一緒に包装されていてよい。
【実施例】
【０１００】
（実施例１）
過体重および肥満の対象における脂肪酸化、ならびに酸化ストレスおよび炎症性ストレスに対する効果
【０１０１】
過体重および肥満の対象２０人（男性１１人、女性９人、２９±４．５歳、ＢＭＩ３１．２±２．４）を無作為化し、通常の食事、活動およびタバコ使用のパターンの下で、ロイシンおよびピリドキサールリン酸を含有するブレンド（総計７６０ｍｇ、７５０ｍｇのロイシン、１０ｍｇのピリドキサールリン酸（pyrodixal  phosphate））またはプラセボを１日当たり３回、４週間にわたって受けさせた。すべての対象が、試験開始前の４週間にわたって体重が安定しており、以下の除外基準に適合した：著しい内分泌疾患、代謝疾患または胃腸疾患；前の４週間以内に肥満の薬物療法（処方薬またはＯＴＣ）；妊娠または授乳；最近（過去４週間）の食事プログラムまたは運動プログラムの開始または変化；最近（過去４週間）のタバコ使用のパターンの変化；最近（過去１２週間）の向精神薬の使用。
【０１０２】
ブレンドを紅茶に添加し、補充していない紅茶がプラセボとしての機能を果たした。すべての対象に、試験スタッフから通常の食事、活動およびタバコ使用のパターンを維持することに関して個別の説明、カウンセリングおよび評価が提供された。歩数計による計数を使用して身体活動を評価し、試験全体を通しておよそ試験前のレベルに維持した。対象は一定のレベルの活動（１日当たりプラスマイナス５００歩）を維持するように指示され、自己評価するために歩数計を使用した。歩数計による計数を記録し、週に１回の頻度で、提供された日誌に維持した食事、身体活動およびタバコの記録と一緒に試験スタッフに提供した。試験エントリー時に、肥満度指数を算出するために体重および身長を測定した。
【０１０３】
測定：
【０１０４】
人体計測：体重を較正したスケールで測定し、身長を壁付けのスタジオメーターで測定し、肥満度指数を標準の方程式（ｋｇ／ｍ２）によって算出した。
【０１０５】
安静時代謝率（ＲＭＲ）／基質酸化：ＲＭＲおよび呼吸商（ＲＱ）をベースラインおよび７日目および２８日目に評価した。１２時間の絶食および４８時間の運動節制後、午前６時から午前１０時の間に、開放回路技法を使用した間接的な熱量測定法によって呼吸器ガス交換を測定した；すべての測定にＳｅｎｓｏｒＭｅｄｉｃｓ  Ｖｍａｘ  ２９ｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃａｒｔ（Ｓｅｎｓｏｒ  Ｍｅｄｉｃｓ、Ａｎａｈｅｉｍ、ＣＡ）を使用した。排尿後、参加者は隔離された部屋の中、温度制御（２１〜２４℃）環境で３０分静かに休息した。次いで、対象を、定常状態が実現されるまで最低でも３０分の間、換気されたフード内に入れた。有効測定の基準は、最低１５分の定常状態であり、定常状態は、毎分換気量および酸素消費の変動が１０％未満であり、呼吸商の変動が５％未満であると決定した。Ｗｅｉｒ方程式を使用して代謝率を算出し、ＲＱをＣＯ２産生／Ｏ２消費として算出し、尿中窒素損失について補正した後にＲＱから基質酸化を算出した。
【０１０６】
ＨＯＭＡＩＲ：インスリン抵抗性の恒常性モデル評価（ＨＯＭＡＩＲ）をインスリン感受性の変化のスクリーニング指標として使用した。ＨＯＭＡＩＲは、空腹時血漿中インスリンおよびグルコースから標準の式によって以下の通り算出される：ＨＯＭＡＩＲ＝［インスリン（ｕＵ／ｍＬ）×グルコース（ｍＭ）］／２２．５。
【０１０７】
ＲＯＳ／酸化ストレス：ＥＤＴＡ処理したチューブ中に血液を抜き取り、遠心分離して血漿を分離し、試料を個々のアッセイのために分取した；血漿を窒素下−８０℃で維持して、測定する前に酸化的変化することを予防した。蛍光定量アッセイを使用して血漿マロンアルデヒド（ＭＤＡ）を測定し、血漿中８−イソプラスタンＦ２αをＥＬＩＳＡによって測定した（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）。
【０１０８】
炎症マーカーおよびサイトカイン：血漿中のＩＬ−６、アディポネクチン、ＴＮＦ−αおよびＣＲＰのレベルをＥＬＩＳＡによって決定した（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉ；Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ、ＭＯ；およびＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。
【０１０９】
統計分析：あらゆる結果変数についてベースラインからの変化値を計算した。これらのデータを、多変量分散分析（ＭＡＮＯＶＡ）を使用して分析し、同時に、各結果変数についての平均が処置にわたって同等であるという帰無仮説を検定した。ＭＡＮＯＶＡを行って、処置の主要な効果（ＮｕＦｉｔ対プラセボ）、ならびにこれらの主要な効果の中で性別および可能性のある相互作用について検定した。ベースラインＢＭＩについての潜在的な調整をモデルにおいて評価したが、有意でなかった。すべての分析にＳＡＳ−ＰＣを使用した。
【０１１０】
結果
【０１１１】
図１に示されている通り、本発明によるロイシンおよびビタミンＢ６のブレンド補助剤により、ＲＱに有意な減少がもたらされ、７日目までに対応する脂肪酸化の増加が伴い、これは７日目から２８日目まででさらに増加した。本発明で試験した１つの例示的な組成物は、７５０ｍｇのロイシンおよび１０ｍｇのピリドキサールリン酸を含む（すなわちＮｕＦｉｔ）（毎日３回投与する）。図２に示されている通り、ＲＱは０．０１９単位減少し（ｐ＜０．０４）、脂肪酸化は１時間当たり１．４＋０．４ｇ、または１日当たり３３．６ｇ増加したが、プラセボ群では有意な効果は見いだされなかった。これは、ＮｕＦｉｔを投与した対象について、脂肪酸化を最初の脂肪酸化速度に対して約６０％増加させることができることを示す。
【０１１２】
血漿中グルコースまたは脂質に対する有意な処置効果はなかったが、図３に示されている通り、ＨＯＭＡＩＲによって測定されたインスリン感受性は、ブレンドを補充した群では有意に改善されたが、プラセボ群では有意に変化しなかった。
【０１１３】
ブレンド補助剤により、血漿ＭＤＡが２０％低下したこと（４．０＋０．２ｎｍｏｌ／Ｌから３．２＋０．３ｎｍｏｌ／Ｌまで、ｐ＜０．０１）および血漿８−イソプラスタン−Ｆ２αが１７％減少したこと（４４．１＋３ｐｇ／ｍＬから３６．６＋３ｐｇ／ｍＬまで、ｐ＜０．００５）によって実証される通り、有意な酸化ストレスの減少がもたらされた。炎症性ストレスバイオマーカーについて、ブレンドによる処置では同様の改善が示されたが、プラセボ群では有意な効果は見いだされなかった。ＴＮＦ−αは、３９３＋２９ｐｇ／ｍＬから３３４＋３８ｐｇ／ｍＬまで１５％減少し、Ｃ反応性タンパク質は３６．８＋７．４μｇ／ｍＬから２２．８＋８．３μｇ／ｍＬまで３８％減少した、ｐ＜０．０１）。これらの所見と一致して、脂肪細胞由来の抗炎症性バイオマーカーであるアディポネクチンは、６７％増加した（９．６＋１．４ｎｇ／ｍＬから１５．６＋２．３ｎｇ／ｍＬまで、ｐ＜０．００１）。アディポネクチンは、肝臓および骨格筋における脂肪酸化を刺激し、脂肪組織および骨格筋におけるインスリンシグナル伝達を増大させることができるので、この所見はインスリン感受性および脂肪酸化において観察された改善と一致する。
【０１１４】
ロイシン処置により脂肪組織と骨格筋の間のエネルギー分配を変更し、脂肪組織における正味の脂質貯蔵の減少および筋肉における脂肪酸化の増加をもたらすことができる。ロイシンとピリドキシンのブレンドは、エネルギー代謝の調節において、ロイシン単独よりも有意に有効である。これらのブレンドは、インスリン感受性の指標（ＨＯＭＡＩＲ）を使用して測定された通り、インスリン感受性の改善においても有効である。本発明では、インスリン抵抗性の１０％〜約１５％の低下が観察された。ミトコンドリア生合成の増加の別の正味の効果は、一般には、酸化ストレスおよび炎症性ストレスの低下である。さらに、ロイシンおよびピリドキシン（例えば、ビタミンＢ６）を含む組成物により、炎症性サイトカインパターンを好都合に調整することができる。
【０１１５】
ロイシン（１日当たり２．２５ｇ）およびピリドキシン（１日当たり３０ｍｇ）を含有するブレンドにより、過体重および肥満の対象における脂肪酸化が有効に増加し、インスリン感受性が改善される。さらに、ブレンドにより、他の点では肥満およびインスリン抵抗性に関連し、主要な肥満に関連する共存症と密接に関連する酸化ストレスおよび炎症性ストレスが有意に減弱する。したがって、この補助剤により、肥満および関連する共存症の管理の有用な補助がもたらされ、また、この補助剤は、脂肪酸化に対するその効果により、健康的な体重管理／肥満予防における有用な化合物になり得る。
【０１１６】
（実施例２）
体重および体組成に対する効果
【０１１７】
設計
【０１１８】
プラセボ対照、並行群、二重盲検式無作為化試験
【０１１９】
処置：ＮｕＳｈａｐｅ（１，１２５ｍｇのロイシン＋１５ｍｇのビタミンＢ６）を１日２回服用（毎日の投与量の総計＝２２５０ｍｇのロイシン＋３０ｍｇのＢ６）対プラセボ。
【０１２０】
２４週間
【０１２１】
実験１：バランスのとれた欠損食：通常の食事、および算出された必要維持エネルギーから１日当たり−５００ｋｃａｌ。ＵＳに適合した主要栄養素分布（カロリーの約３５％を脂肪から、１５％をタンパク質から、５０％を炭水化物から）
【０１２２】
実験２：ユーカロリー食（Eucaloric）：実験１と同様に、ＵＳに適合した主要栄養素
分布（カロリーの約３５％を脂肪から、１５％をタンパク質から、５０％を炭水化物から）
【０１２３】
外来患者、週に１回のモニタリングおよび来診。
【０１２４】
対象
【０１２５】
Ｎ＝２０（実験１）、Ｎ＝２４（実験２）。測定されたベースラインの特性に群間で差異なし
【０１２６】
ＢＭＩ＝３４．７６±２．５７（実験１）、３５．９２±２．８５（実験２）
【０１２７】
２６．８２歳±４．２４（実験１）、２５．７３±４．８９年（実験２）
【０１２８】
性別：女性１４人、男性６人（実験１）、女性１２人、男性１２人（実験２）
【０１２９】
測定：
【０１３０】
ベースライン、１２週および２４週における体重および脂肪（二重エネルギーＸ線吸光光度法（ＤＥＸＡ；Ｌｕｎａｒ  Ｐｒｏｄｉｇｙ  ＤＸＡ、ＧＥ  Ｌｕｎａｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。
【０１３１】
体重を較正したスケールで測定し、身長を壁付けのスタジオメーターで測定し、肥満度指数を標準の方程式（ｋｇ／ｍ２）によって算出した。
【０１３２】
脂肪量を、ベースライン、および１２週および２４週において二重エネルギーＸ線吸光光度法によって評価した。毎年ＬＵＮＡＲのスタッフにより維持され較正されているＬＵＮＡＲ  Ｐｒｏｄｉｇｙ二重エネルギーＸ線吸光光度システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用した。脊椎ファントムを毎日評価して機械に任意のドリフトが起こっていないかを決定し、その後に毎日の較正ブロックを続けた；脊椎ファントムの変動は試験全体を通して＜３％であった。
【０１３３】
結果
【０１３４】
実験１：
【表２】
2018012722.tif 000003
【０１３５】
実験２（設計により体重は維持された）：
【表３】
2018012722.tif 000004
【０１３６】
実験１において示されているように、ＮｕＳｈａｐｅを投与した対象では、プラセボを投与した対象と比較して、１２週において約８０％多く体重が減少し、２４週において５５％多く体重が減少した。さらに、ＮｕＳｈａｐｅを投与した対象では、プラセボを投与した対象と比較して１２週において約１１４％多く脂肪が減少し、２４週において６５％多く脂肪が減少した。
【０１３７】
（実施例３）
ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）とロイシンの脂肪細胞代謝に対する相互作用効果
【０１３８】
これらの実験において使用したロイシン投薬量０．５ｍＭは、本明細書に記載のブレンド配合物を摂取した後に循環中で実現されるレベルである。同様に、これらの実験において使用したピリドキサールリン酸の用量（ＰＬＰ、Ｂ６の活性な代謝産物；１００ｎＭ）は、本明細書に記載のブレンド配合物を摂取した後に循環中で実現されるレベルである。
【０１３９】
方法
【０１４０】
細胞培養物：３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞を１ｃｍ２当たり細胞８０００個の密度（１０ｃｍ２のディッシュ）でインキュベートし、１０％ＦＢＳおよび抗生物質（１％ペニシリン−ストレプトマイシン）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（脂肪細胞培地）中、インスリンの不在下、３７℃、空気中５％ＣＯ２で成長させた。集密的な前脂肪細胞を、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２５０ｎＭのデキサメタゾン（ＤＥＸＡ）、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）（０．５ｍＭ）および抗生物質を補充したＤＭＥＭ−Ｆ１０（１：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）培地からなる標準の分化培地を用いて分化するように誘導した。前脂肪細胞をこの分化培地で３日間維持し（特に示されていなければ）、その後、脂肪細胞培地で培養した。２〜３日ごとに培養液を再供給して、９０％の細胞を十分に分化させた後に処理した。
【０１４１】
脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）ｍＲＮＡの発現：脂肪細胞ＦＡＳおよび１８ｓを、スマートサイクラーリアルタイムＰＣＲシステム（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用し、ＴａｑＭａｎ１０００  Ｃｏｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ）を用いて定量的に測定した。プライマーおよびプローブセットをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎプライマーおよびプローブセットコレクションから入手し、製造者の説明書に従って利用した。プールされている脂肪細胞の全ＲＮＡを１．５６２５〜２５ｎｇの範囲で段階希釈し、標準曲線を確立するために使用し、未知の試料の全ＲＮＡもこの範囲で希釈した。標準物質および未知の試料についての定量的ＲＴ−ＰＣＲの反応もＳｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）およびＴａｑＭａｎ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ）の説明書に従って実施した。各試料についてのｍＲＮＡ定量化を対応する１８ｓ定量化を使用して正規化した。
【０１４２】
ＦＡＳ活性：脂肪細胞質抽出物においてＦＡＳ活性を分光光度法によって決定した。脂肪細胞を１ｍｍｏｌ／Ｌのエチレンジアミン四酢酸（ethylenediamine-tetraacticacid）（ＥＤＴＡ）、１ｍｍｏｌ／Ｌのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および１００μｍｏｌ／Ｌのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）（ｐＨ７．４）を含有する２５０ｍｍｏｌ／Ｌのスクロース溶液中にホモジナイズした。ホモジネートを１８，５００×ｇで１時間遠心分離し、下澄液をＮＡＤＰＨの酸化速度を測定するために使用した。
【０１４３】
細胞内Ｃａ２＋（［Ｃａ２＋］ｉ）：［Ｃａ２＋］ｉを、ｆｕｒａ−２二波長蛍光イメージングシステムを使用して測定した。脂肪細胞をプレーティングし、カバーガラスを伴う３５ｍｍのディッシュ（Ｐ３５Ｇ−０−１４−Ｃ、ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中で分化させた。［Ｃａ２＋］ｉ測定の前に、細胞を無血清培地で一晩プレインキュベートし、以下の構成成分（ｍＭ単位）：ＮａＣｌ  １３８、ＣａＣｌ２  １．８、ＭｇＳＯ４  ０．８、ＮａＨ２ＰＯ４  ０．９、ＮａＨＣＯ３  ４、グルコース  ５、グルタミン  ６、Ｈｅｐｅｓ  ２０、およびウシ血清アルブミン１％を含有するＨｅｐｅｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）ですすいだ。細胞をｆｕｒａ−２アセトキシメチルエステル（ＡＭ）（１０μＭ）と一緒に同じ緩衝液にローディングし、５％ＣＯ２を伴う暗いインキュベーター内、３７℃で２時間置いた。細胞外色素を除去するために、細胞をＨＢＳＳで３回すすぎ、次いで、細胞質のｆｕｒａ−２  ＡＭを完全に加水分解させるために室温でさらに１時間ポストインキュベートした。色素ローディング細胞を伴うディッシュを、Ｃｏｈｕ  ４９１５  ＣＣＤカメラを伴うＮｉｋｏｎ  ＴＭＳ−Ｆ蛍光倒立顕微鏡のステージに載せた。蛍光画像を、交互に、励起波長３４０ｎＭおよび３８０ｎＭ、放出波長５２０ｎＭで取得した。［Ｃａ２＋］ｉを、標準の比方程式を使用して算出した。各分析により、８〜１０の代表的な全細胞の応答を評価した。ＩｎＣｙｔＩｍ２バージョン４．６２イメージングソフトウェア（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）を用いて画像を分析した。ｆｕｒａ−２カルシウムイメージング較正キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を使用して画像を較正して溶液における較正曲線を作成し、細胞の較正をジギトニン（２５μＭ）およびｐＨ８．７のトリス−ＥＧＴＡ（１００ｍＭ）を使用して実現して、最大および最小の［Ｃａ２＋］ｉレベルを測定した。
【表４】
2018012722.tif 000005
【０１４４】
各列の一致していない上付き文字は有意差を示す（ｐ＜０．０１）
【０１４５】
１ＦＡＳ：脂肪酸シンターゼ
【０１４６】
２１８Ｓ発現に対して正規化されたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる発現
【０１４７】
（実施例４）
脂肪細胞および筋管の代謝に対するロイシン、ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）、メトホルミン、バリン、およびイソロイシンの相互作用効果
【０１４８】
測定
【０１４９】
細胞培養：Ｃ２Ｃ１２前脂肪細胞および３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、１ｃｍ２当たり細胞８０００個の密度でプレーティングし（１０ｃｍ２のディッシュ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および抗生物質を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（成長培地）中、５％ＣＯ２、３７℃で成長させた。集密の３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞を、１０％ＦＢＳ、２５０ｎＭのデキサメタゾン、０．５ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地からなる標準の分化培地を用いて分化するように誘導した。前脂肪細胞をこの分化培地で３日間維持し、その後、成長培地で培養した。２〜３日ごとに培養液を再供給して、＞９０％の細胞を十分に分化させた後に化学的処理を行った。Ｃ２Ｃ１２細胞を分化させるために、細胞を１００％集密まで成長させ、分化培地（２％ウマ血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを伴うＤＭＥＭ）に移し、筋管が十分に形成されるまで（３日間）新鮮な分化培地を毎日供給した。
【０１５０】
脂肪酸の酸化：細胞の酸素消費を、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＸＦ２４アナライザー（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用し、２４ウェルプレート中、３７℃で、わずかな改変を伴ってＦｅｉｇｅら（１）に記載されている通り測定した。細胞を１ウェル当たり細胞４０，０００個で播種し、上記の通り分化させ、示されている処理を用いて２４時間にわたって処理し、カルニチン（０．５ｍＭ）を含有する非緩衝無炭酸ｐＨ７．４低グルコース（２．５ｍＭ）ＤＭＥＭで２回洗浄し、同じ培地５５０μＬを用いて非ＣＯ２インキュベーター中で４５分平衡化し、次いで、計器に挿入して１５分さらに平衡化し、その後、Ｏ２消費を測定した。３つの連続的な５分間隔のベースライン測定値を取得した後にパルミチン酸を注入した（最終濃度２００μＭ）。次いで、４つの連続的なＯ２消費の５分測定を行い、その後、１０分の再平衡化および別の３〜４回の５分測定を行った。次いで、この測定パターンを４〜６時間にわたって繰り返した。各試料についてのデータを、その試料についてのパルミチン酸注入前のベースラインに対して正規化し、そのベースラインからの％変化として表した。パルミチン酸注入前の値は筋管については１分当たり３７１±１４ｐｍｏｌのＯ２であり、脂肪細胞については１分当たり１９３±１１ｐｍｏｌのＯ２であった。次いで、各試料についてＯ２消費のベースラインからの変化の曲線下面積を算出し、その後の分析のために使用した。
【０１５１】
グルコース利用：脂肪酸供給源および酸化的代謝の不在下で、解糖およびその後の乳酸産生により細胞外酸性化が生じ、これも、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＸＦ２４アナライザーを使用して測定した。脂肪酸の酸化についての上記の方法と同様に、培地からカルニチンを除いて、細胞を調製し、平衡化した。計器平衡化および３つのベースライン測定の後、グルコースを各ウェルに最終濃度１０ｍＭまで注入した。Ｏ２消費ではなく細胞外酸性化についてセンサーを利用して、上記の通り測定値を取得した。インスリン（最終濃度５ｎＭ）を陽性対照としていくつかのウェルに加えた。各試料についてのデータを、その試料についてのグルコース注入前のベースラインに対して正規化し、そのベースラインからの％変化として表した。各試料について細胞外酸性化のベースラインからの変化の曲線下面積を算出し、その後の分析のために使用した。
【０１５２】
ウエスタンブロット：Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＭＰＫα（Ｔｈｒ１７２）抗体およびＳｉｒｔ１（マウス特異的）抗体を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）から入手した。Ｃ２Ｃ１２筋管を結果に示されている通り処理し、標準の方法を使用して細胞画分を調製した。タンパク質をＢＣＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定した。ウエスタンブロットのために、細胞溶解物由来のタンパク質３０μｇ（Ｐ−ＡＭＰＫについて）または３５μｇ（Ｓｉｒｔ１について）を１０％トリス／ＨＣＬポリアクリルアミドゲル（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ｐｒｅｃａｓｔ  ｇｅｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、ブロッキング緩衝液（ＴＢＳ中３％ＢＳＡ）中でインキュベートし、次いで、一次抗体（Ｐ−ＡＭＰＫ）と一緒にインキュベートし、洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした二次抗体と一緒にインキュベートした。可視化および化学発光検出を、ＢｉｏＲａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して行い、バンド強度を、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ  ４．０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用し、バックグラウンドおよびローディングコントロールについての補正を伴って評価した。６１〜６６ｋＤＡにおいてＰ−ＡＭＰＫが検出され、１０４〜１１５ｋＤＡにおいてＳｉｒｔ１が検出された。
【０１５３】
ミトコンドリア生合成：ミトコンドリア生合成を、以前に記載されている通り（２）ミトコンドリアの質量の変化として評価した。ミトコンドリアプローブＮＡＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してミトコンドリアの質量を蛍光（励起４８５ｎｍおよび放出５２０ｎｍ）によって分析し、蛍光マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ、ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を用いて定量的データを得た。蛍光の強さをタンパク質１μｇ当たりの任意の単位で表し、各アッセイ内の対照値に対して正規化した。
【０１５４】
統計値：データを一元配置分散分析によって分析し、最小有意差検定を使用して有意に異なる群の平均を分離した。
【０１５５】
結果
【０１５６】
脂肪酸の酸化：図４は、ロイシンとビタミンＢ６のＣ２Ｃ１２筋管における脂肪酸の酸化に対する相互作用効果を示し、有意な定量的データが図５に要約されている。ロイシン（０．５ｍＭ）により、脂肪酸の酸化の７３％の増加が誘導されたが（ｐ＝０．０１）、Ｂ６（ピリドキサールリン酸として１００ｎＭ）では有意な独立した効果は発揮されなかった。しかし、ロイシンとＢ６を組み合わせることにより、さらに１４６％の増加がもたらされた（対照またはロイシンに対してｐ＝０．０１５）。予測される相加効果は７３％であったが、脂肪酸の酸化が１４６％に増加したことにより、予測される相加効果に対して１００％増加する相乗効果がもたらされた。対照的に、ロイシンを他の２つの分枝鎖アミノ酸、バリン（０．５ｍＭ）またはイソロイシン（０．５ｍＭ）で置換することによっては、独立で、またはＢ６と組み合わせてのいずれでも、対照と比較した脂肪酸の酸化の変化は小さかった（図５）。バリンまたはイソロイシンとＢ６を組み合わせることの効果により、バリンまたはイソロイシン単独と比較して脂肪酸の酸化が増加したが、Ｂ６単独よりも大きなレベルではなかった。図６は、ロイシン、Ｂ６およびメトホルミン（１００μＭ）の相互作用効果を示し、定量的データが図７に要約されている。図４および図５に示されているのと同様に、ロイシン＋Ｂ６により、脂肪酸の酸化が１２５％増加し（ｐ＜０．０４）、メトホルミンは同等の効果を発揮した。しかし、ロイシン＋Ｂ６とメトホルミンを組み合わせることの効果は、メトホルミンおよびロイシン＋Ｂ６の作用が独立していると仮定して、メトホルミンを用いて処理することおよびロイシン＋Ｂ６を用いて処理することの単純な相加効果を超えなかった。図８は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における脂肪酸の酸化に対するロイシンおよびＢ６の定量的効果を示す。ロイシン処理により、脂肪酸の酸化が１８１％増加したが（ｐ＝０．０４）、ロイシンとＢ６の組合せでは、脂肪酸の酸化が４７７％増加した（ｐ＝０．００８）。バリンを単独でまたはＢ６を単独で用いた処理の効果はおよそ８０〜９０％であり、バリン＋Ｂ６を用いた処理により、約１２５％の効果がもたらされた。イソロイシンを用いた処理ではベースラインからの小さな変化がもたらされ、イソロイシン＋Ｂ６を用いた処理ではベースラインから約３０％までの小さな増加がもたらされた。Ｂ６とバリンまたはイソロイシンのいずれかを組み合わせることの効果では、作用が独立していると仮定した、Ｂ６を単独で用いて処理することおよびバリンまたはイソロイシンを単独で用いて処理することの効果の合計よりも大きなベースラインからの変化はもたらされなかった。
【０１５７】
グルコース利用：脂肪酸の酸化に対する効果とは対照的に、ロイシンは、筋管（図９）または脂肪細胞（図１０）のいずれにおいてもグルコース利用に対して独立した有意な効果を発揮しなかった。同様に、Ｂ６もいずれの細胞型においてもグルコース利用に対する独立した効果を発揮しなかった。しかし、この２つの組合せにより、グルコース利用が筋管において１６８％増加し（ｐ＝０．０５、図９）、脂肪細胞において２２１％増加した（ｐ＝０．０３、図１０）。したがって、Ｂ６とロイシンの組合せ組成物により、筋管において予測される相加効果よりも１６８％大きく、脂肪細胞において予測される相加効果よりも２２１％大きな相乗効果が生じた。ロイシン／Ｂ６の効果は、メトホルミンにより筋管（図９）では有意に増強されたが、脂肪細胞（図１０）では有意に増強されなかった。
【０１５８】
ＡＭＰＫ：リン酸化ＡＭＰＫ（Ｔｈｒ１７２）を使用して、筋管におけるＡＭＰＫ活性化を評価した。ロイシン、バリン、またはＢ６を単独で用いた処理のいずれでも、ＡＭＰＫ活性化に対していかなる有意な効果も発揮されなかった。しかし、ロイシンとＢ６の組合せにより、ＡＭＰＫ活性化のこの評価基準に約２倍の増加が誘導された（ｐ＝０．０００３、図１１）。対照的に、脂肪細胞においてはＡＭＰＫに対して処理による効果はなかった。
【０１５９】
Ｓｉｒｔ１：ＡＭＰＫデータと同様に、Ｓｉｒｔ１タンパク質の発現は、ロイシンまたはＢ６のいずれによっても影響を受けなかったが、この２つの組合せにより、Ｓｉｒｔ１タンパク質レベルに約２倍の増加がもたらされた（ｐ＝０．００２、図１２）。しかし、脂肪細胞においては組合せの処理による効果はなかった。
【０１６０】
ミトコンドリアバイオマス：ロイシンにより、筋管において有意なミトコンドリア生合成の増加が刺激され（ミトコンドリアバイオマスによって評価される）（ｐ＝０．０４）（約１５％）、これは、Ｂ６を添加することによって増大した（ｐ＝０．００６；図１３）（約５０％）。メトホルミンではロイシンと同様の効果が発揮されたが、この効果はロイシン、Ｂ６またはロイシン＋Ｂ６を添加することによって増大しなかった（図１３）。他の分枝鎖アミノ酸（イソロイシン、バリン）では、ミトコンドリアバイオマスの測定によって評価されるミトコンドリア生合成に対する有意な効果は発揮されなかった。
【０１６１】
これらのデータにより、ＡＭＰＫ、Ｓｉｒｔ１および下流の転帰（脂肪酸の酸化、グルコース利用、ミトコンドリアバイオマス）を刺激することにおけるロイシンとビタミンＢ６の間の有意および実質的な相乗作用が実証される。これらの効果は、他の分枝鎖アミノ酸によっては同じ程度まで再現されないので、ロイシンに特異的である。特に、ロイシンでは脂肪酸化に対して独立した効果が発揮されるが、この効果は、独立した効果が発揮されない化合物であるピリドキサールリン酸を添加することによって著しく増強される。さらに、グルコース利用を刺激することにおいてロイシンとＢ６の間には、いずれの化合物でも有意な独立した効果が発揮されないので、明らかな相乗作用がある。ロイシン＋Ｂ６とメトホルミンを組み合わせることの効果により、メトホルミン単独またはロイシン＋Ｂ６単独のいずれをも上回る脂肪酸の酸化の増加がもたらされるが、それぞれが独立に作用すると仮定してロイシン＋Ｂ６およびメトホルミンの予測される相加効果よりも大きなレベルまでではないことにも同様に注目すべきである。
【０１６２】
（実施例５）
脂肪細胞トリグリセリド含量に対するピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）とロイシン（Ｌｅｕ）の相互作用効果
【０１６３】
培養した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、ロイシン（０．２５ｍＭまたは０．５０ｍＭ）、ＰＬＰ（５０ｎＭまたは１００ｎＭ）または組合せで処理した。０．５ｍＭのロイシンを用いた処置は、約１，１２５ｍｇの食事性ロイシンをヒト対象に投与することによって実現される同じ容量モル濃度の循環レベルに対応する。０．２５ｍＭのロイシンを用いた処置は、約３００ｍｇの食事性ロイシンをヒト対象に投与することによって実現される同じ容量モル濃度の循環レベルに対応する。１００ｎＭのＰＬＰを用いた処理は、約１５ｍｇの食事性ビタミンＢ６をヒト対象に投与することによって実現される同じ容量モル濃度の循環レベルに対応する。５０ｎＭのＰＬＰを用いた処理は、約７．５ｍｇの食事性ビタミンＢ６をヒト対象に投与することによって実現される同じ容量モル濃度の循環レベルに対応する。図１４に示されている通り、トリグリセリド含量の低下は、０．５ｍＭのロイシン＋１００ｎＭのＰＬＰによって実現され、これは約１，１２５ｍｇのロイシン＋１５ｍｇのＢ６の用量を投与することに対応し、同様に、これは、ロイシンのＢ６に対する質量比が約７５である。比較として、トリグリセリド含量の低下は、細胞を、０．５ｍＭのロイシンおよび５０ｎＭのＰＬＰを用いて処理した場合ほど著しくなく、これは３００ｍｇのロイシンおよび７．５ｍｇのＢ６を投与することに対応し、同様に、これはより低いロイシンのＢ６に対する質量比（約４０）に対応する。
【０１６４】
トリグリセリド含量は、細胞を、０．２５ｍＭのロイシンおよび５０ｎＭのＰＬＰを用いて処理した場合よりも少ない程度まで低下し、これは、所望の場合、質量比を維持しながら（例えば、７５以上）、ロイシンおよびＢ６のそれぞれのモル濃度を増加させることによってトリグリセリドの低下を増強することができることを示している。
【０１６５】
データは平均±ＳＥとして表されており、棒の上の一致していない文字は、処理間の有意差を示す（ｐ＜０．０１）。図１４に示されている通り、トリグリセリドの低下は、ビタミンＢ６の投薬レベルによって限定することができる。
【０１６６】
前述のことから、特定の実行について例示され、記載されているが、本発明において、それらに種々の改変を行うことができ、それが意図されていることが理解されるべきである。同様に、本発明は、本明細書の中で提供される特定の実施例によって限定されるものではない。本発明は上記の明細書に関連して記載されているが、本明細書における好ましい実施形態の説明および例示は、限定の意味で解釈されることを意図していない。さらに、本発明のすべての態様は、種々の条件および変数に左右される本明細書に記載されている特定の描写、構成または相対的な割合に限定されないことが理解されるべきである。本発明の実施形態の形態および詳細における種々の改変は当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、そのような改変、変形および等価物をいかなるものも包含することが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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