(57)【要約】【課題】分子の医学的な使用、特定にはアンドロゲン受容体(AR)の活性および/またはエストラジオール受容体(ER)が寄与因子である状態を治療するための分子の使用を提供する。【解決手段】本発明は、対象におけるARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態の予防または治療で使用するための、あるいは生殖能力の維持を望む対象におけるARおよび/またはERの活性が寄与因子である癌性状態の予防または治療で使用するための、あるいは対象におけるARおよび/またはERの活性が寄与因子である婦人科系の状態の予防または治療で使用するための、Srcファミリーキナーゼとアンドロゲンまたはエストラジオール受容体との相互作用を阻害または予防する分子を提供する。好ましくは、本分子は、構造:Bj[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp、もしくはBj[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rp、またはその誘導体もしくは断片を含むかまたはそれからなり、式中Bは、第一の化学成分であり、jは、0または1であり、nは、1〜10の整数であり、Xは、任意のアミノ酸であり、rは、0〜2の整数であり、mは、1〜3の整数であり、Rは、第二の化学成分であり、pは、0または1であり、[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]は、[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]のレトロインベルソペプチドである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるアンドロゲン受容体(AR)および/またはエストラジオール受容体(ER)の活性が対象における寄与因子である非癌性状態の予防または治療で使用するための、あるいは生殖能力の維持を望むARおよび/またはERの活性が寄与因子である癌性状態の予防または治療で使用するための、あるいは対象におけるARおよび/またはERの活性が寄与因子である婦人科系の状態の予防または治療で使用するための、SrcファミリーキナーゼとARまたはERとの相互作用を阻害または予防する分子。
【請求項２】
対象においてアンドロゲン受容体(AR)および/またはエストラジオール受容体(ER)の活性が寄与因子である非癌性状態を予防または治療するための、あるいは生殖能力の維持を望む対象においてARおよび/またはERの活性が寄与因子である癌性状態を予防または治療するための、あるいは対象においてARおよび/またはERの活性が寄与因子である婦人科系の状態を予防または治療するための医薬の製造における、SrcファミリーキナーゼとARまたはERとの相互作用を阻害または予防する分子の使用。
【請求項３】
対象においてアンドロゲン受容体(AR)および/またはエストラジオール受容体(ER)の活性が寄与因子である非癌性状態を予防または治療する、あるいは生殖能力の維持を望む対象においてARおよび/またはERの活性が寄与因子である癌性状態を予防または治療するための、あるいは対象においてARおよび/またはERの活性が寄与因子である婦人科系の状態を予防または治療するための方法であって、SrcファミリーキナーゼとARまたはERとの相互作用を阻害または予防する有効量の分子を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項４】
Srcファミリーキナーゼが、Src、Yes、Fyn、Fgr、Lck、Hck、Blk、Lyn、およびFrkのいずれかである、請求項1に記載の分子、請求項2に記載の使用または請求項3に記載の方法。
【請求項５】
分子が、構造:
Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp、もしくはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rp、またはその誘導体もしくは断片
を含み、
式中Bは、第一の化学成分であり、jは、0または1であり、nは、1〜10の整数であり、Xは、任意のアミノ酸であり、rは、0〜2の整数であり、mは、1〜3の整数であり、Rは、第二の化学成分であり、pは、0または1であり、[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]は、[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]のレトロインベルソペプチドである、請求項1もしくは4に記載の分子、請求項2もしくは4に記載の使用、または請求項3もしくは4に記載の方法。
【請求項６】
分子が、SrcファミリーキナーゼのSH3またはSH2ドメインに対する抗体であるか、あるいは分子が、ペプチド(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lysに対する抗体であり、式中nは、1〜10の整数であり、Xは、任意のアミノ酸であり、rは、0〜2の整数である、請求項1もしくは4に記載の分子、請求項2もしくは4に記載の使用、または請求項3もしくは4に記載の方法。
【請求項７】
分子が、対象において生殖能力を低下もさせず、妨げもしない、請求項1および4から6のいずれか一項に記載の分子、または請求項2および4から6のいずれか一項に記載の使用、または請求項3から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
nが、3であり、mが、1である、請求項5または7に記載の分子、使用または方法。
【請求項９】
分子が、ペプチドである、請求項1および4から8のいずれか一項に記載の分子、または請求項2および4から8のいずれか一項に記載の使用、または請求項3から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドが、3〜57アミノ酸の長さである、請求項9に記載の分子、使用または方法。
【請求項１１】
Bが、H、またはアセチル基、または遊離のもしくはアセチル誘導体化されたNH2基を有するアミノ酸の1つもしくは配列のいずれかである、請求項5および7から10のいずれか一項に記載の分子、使用または方法。
【請求項１２】
Rが、OH基、またはNH2基、またはC末端のカルボキシ-アミド基を有するアミノ酸の1つもしくは配列のいずれかである、請求項5および7から11のいずれか一項に記載の分子、使用または方法。
【請求項１３】
第一および第二の化学成分BおよびRが、独立して、または両方とも、脂質、脂肪酸、ポリエチレングリコール、トリグリセリド、グリセロール、プレニルもしくはイソプレニル成分、炭水化物、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドもしくは核酸、またはその組合せのいずれかを含む、請求項5および7から12のいずれか一項に記載の分子、使用または方法。
【請求項１４】
rが、0である、請求項5から13のいずれか一項に記載の分子、使用または方法。
【請求項１５】
分子が、構造Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-LysまたはAc-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2を含み、式中Acは、アセチル基である、請求項5および7から13のいずれか一項に記載の分子、使用または方法。
【請求項１６】
Xが、スレオニンであり、rが、1である、請求項5および7から13のいずれか一項に記載の分子、使用または方法。
【請求項１７】
分子が、構造Pro-Pro-Thr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys、またはAc-Pro-Pro-Thr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2を含み、式中Acは、アセチル基である、請求項16に記載の分子、使用または方法。
【請求項１８】
分子が、HPHARIK、HPHAR、PHPHAR、HPH、PHPH、PPHPH、PPPHPH、PHP、PPHP、PPPHP、PPPH、PPH、およびPPPからなる群から選択される構造を含み、例えば、Ac-HPHARIK-NH2、Ac-HPHAR-NH2、Ac-PHPHAR-NH2、Ac-HPH-NH2、Ac-PHPH-NH2、Ac-PPHPH-NH2、Ac-PPPHPH-NH2、Ac-PHP--NH2、Ac-PPHP-NH2、Ac-PPPHP-NH2P、Ac-PPPH-NH2、Ac-PPH-NH2、およびAc-PPP-NH2からなる群から選択される構造を含む分子であり、式中Acは、アセチル基である、請求項5および7から13のいずれか一項に記載の分子、使用または方法。
【請求項１９】
分子が、抗体を生成するためにワクチンとして投与される、請求項1および4から18のいずれか一項に記載の分子、または請求項2および4から18のいずれか一項に記載の使用、または請求項3から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
分子が、ウシ血清アルブミン(BSA)またはキーホールリンペットヘモシニアン(KLH)などの担体分子に連結されている、請求項1および4から19のいずれか一項に記載の分子、または請求項2および4から19のいずれか一項に記載の使用、または請求項3から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
分子が、脂質組成物、例えば脂質粒子、ナノカプセル、リポソームまたは脂質小胞中に含まれる、請求項1および4から20のいずれか一項に記載の分子、または請求項2および4から20のいずれか一項に記載の使用、または請求項3から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
非癌性状態が、婦人科系の状態などの生殖系の状態である、請求項1および4から21のいずれか一項に記載の分子、または請求項2および4から21のいずれか一項に記載の使用、または請求項3から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
非癌性状態が、子宮内膜症、卵巣嚢胞、線維性ポリープの過形成、新形成、無排卵性出血、および陰嚢、膀胱または前立腺における子宮内膜の増殖のいずれかである、請求項1および4から22のいずれか一項に記載の分子、または請求項2および4から22のいずれか一項に記載の使用、または請求項3から22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
癌性状態が、婦人科系の状態などの生殖系の状態である、請求項1および4から21のいずれか一項に記載の分子、または請求項2および4から21のいずれか一項に記載の使用、または請求項3から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
癌性状態が、子宮類線維症、線維性ポリープの過形成、卵巣癌、膀胱癌、子宮頚癌、子宮癌、精巣癌、および前立腺癌のいずれかである、請求項1、4から21および24のいずれか一項に記載の分子、または請求項2、4から21および24のいずれか一項に記載の使用、または請求項3から21および24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
対象に、追加の治療剤が投与される、請求項1および4から25のいずれか一項に記載の分子、または請求項2および4から25のいずれか一項に記載の使用、または請求項3から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
(i)Srcファミリーキナーゼとアンドロゲン受容体(AR)またはエストラジオール受容体(ER)との相互作用を阻害または予防する分子と、(ii)ARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態を予防または治療するのに適した治療剤とを含む組成物。
【請求項２８】
薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤と共に、(i)Srcファミリーキナーゼとアンドロゲン受容体(AR)またはエストラジオール受容体(ER)との相互作用を阻害または予防する分子と、(ii)ARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態を予防または治療するのに適した治療剤とを含む医薬組成物。
【請求項２９】
分子が、構造:
Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp、もしくはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rp、またはその誘導体もしくは断片
を含み、
式中Bは、第一の化学成分であり、jは、0または1であり、nは、1〜10の整数であり、mは、1〜3の整数であり、Rは、第二の化学成分であり、pは、0または1であり、[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]は、[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]のレトロインベルソペプチドである、請求項27または28に記載の組成物。
【請求項３０】
分子が、請求項1から18のいずれか一項で定義された通りである、請求項27または28に記載の組成物。
【請求項３１】
対象におけるARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態の予防または治療で使用するための、請求項27から30のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
対象においてARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態を予防または治療するための医薬の製造における、請求項27から30のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３３】
対象におけるARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態の予防または治療で使用するための、あるいは生殖能力の維持を望む対象におけるARおよび/またはERの活性が寄与因子である癌性状態の予防または治療で使用するための、あるいは対象におけるARおよび/またはERの活性が寄与因子である婦人科系の状態の予防または治療で使用するための、Srcファミリーキナーゼとアンドロゲンまたはエストラジオール受容体との相互作用を阻害または予防する分子であって、対象がさらに、前記状態を予防または治療するのに適した治療剤も投与される、分子。
【請求項３４】
対象においてARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態を予防または治療するための、あるいは生殖能力の維持を望む対象においてARおよび/またはERの活性が寄与因子である癌性状態を予防または治療するための、あるいは対象においてARおよび/またはERの活性が寄与因子である婦人科系の状態を予防または治療するための医薬の製造における、Srcファミリーキナーゼとアンドロゲンまたはエストラジオール受容体との相互作用を阻害または予防する分子の使用であって、対象がさらに、前記状態を予防または治療するのに適した治療剤も投与される、使用。
【請求項３５】
分子が、構造:
Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp、もしくはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rp、またはその誘導体もしくは断片
を含み、
式中Bは、第一の化学成分であり、jは、0または1であり、nは、1〜10の整数であり、Xは、任意のアミノ酸であり、rは、0〜2の整数であり、mは、1〜3の整数であり、Rは、第二の化学成分であり、pは、0または1であり、[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]は、[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]のレトロインベルソペプチドである、請求項33に記載の分子または請求項34に記載の使用。
【請求項３６】
分子が、請求項1から18のいずれか一項で定義された通りである、請求項33に記載の分子または請求項34に記載の使用。
【請求項３７】
追加の治療剤が、増殖抑制剤、例えば細胞増殖抑制剤、細胞殺傷剤または抗癌剤のいずれかである、請求項26、33、35および36のいずれか一項に記載の分子、請求項26および34から36のいずれか一項に記載の使用、または請求項26に記載の方法。
【請求項３８】
対象がヒトである、請求項1から37のいずれか一項に記載の分子、使用、方法または組成物。
【請求項３９】
膣坐剤もしくは肛門坐剤;膣内用タンポン;膣内リング;膣内ペッサリー;膣内スポンジ;薬剤付加子宮内避妊具(IUD);または持続放出製剤のいずれかに製剤化された、Srcファミリーキナーゼとアンドロゲンまたはエストラジオール受容体との相互作用を阻害または予防する分子。
【請求項４０】
分子が、構造Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp、もしくはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rp、またはその誘導体もしくは断片を有し、式中Bは、第一の化学成分であり、jは、0または1であり、nは、1〜10の整数であり、Xは、任意のアミノ酸であり、rは、0〜2の整数であり、mは、1〜3の整数であり、Rは、第二の化学成分であり、pは、0または1であり、[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]は、[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]のレトロインベルソペプチドである、請求項39に記載の分子。
【請求項４１】
分子が、請求項1から18のいずれか一項で定義された通りである、請求項39に記載の分子。
【請求項４２】
ARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態を予防または治療する物質の選択方法であって、試験物質が、(a)ARもしくはER、またはSrcファミリーキナーゼに結合することができるその部分と(b)Srcファミリーキナーゼ、またはARもしくはERに結合することができるその部分との相互作用を低減させるかどうかを決定する工程を含む、方法。
【請求項４３】
試験物質が、ポリペプチド、抗体、小分子、天然産物、ペプチドミメティック、または核酸のいずれかである、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
試験物質を、ARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態を予防または治療することができる物質であると同定する工程をさらに含む、請求項42または43に記載の方法。
【請求項４５】
実質的に本明細書で説明されている通りの、あらゆる分子、使用、方法または組成物。
【請求項４６】
前記非癌性状態が、生殖能力の維持を望む対象におけるものである、請求項1、4から26、33、35、36、37、38、41および45のいずれか一項に記載の分子、請求項2、4から26、32、34から38および45のいずれか一項に記載の使用、または、請求項3、4から26、37、38、42、43、44および45のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記婦人科系の状態が、生殖能力の維持を望む対象におけるものである、請求項1、4から26、33、35、36、37、38、41および45のいずれか一項に記載の分子、請求項2、4から26、34から38および45のいずれか一項に記載の使用、または、請求項3、4から26、37、38および45のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子の医学的な使用、特定にはアンドロゲン受容体(AR)の活性および/またはエストラジオール受容体(ER)が寄与因子である状態を治療するための分子の使用に関する。
【０００２】
本明細書における明らかに先に公開された文書の列挙または考察は、必ずしもその文書が最先端の知見の一部であるか、または共通の一般的な知見であるとの承認とみなされるものではない。
【背景技術】
【０００３】
子宮内膜症は、生殖可能年齢の女性に広く蔓延している疾患であり、これは、子宮内膜由来の細胞が子宮腔の外側に、最も一般的には卵巣上に出現して増殖するものである。この疾患は、治療後に慢性および再発性の経過を辿る性質があり、それにより消耗性の慢性骨盤疼痛や不妊症を引き起こす。この疾患は、腹痛による入院や不妊症の主な原因であり、女性の5〜10%において発生すると考えられている。
【０００４】
現行の子宮内膜症の治療方法には多数の欠点がある。
【０００５】
イブプロフェンおよびナプロキセンなどの非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)は、子宮内膜症によって引き起こされる炎症を治療し、加えて疼痛と不快感を緩和する。しかしながらこれらは、吐き気、嘔吐、および下痢を引き起こす可能性がある。さらに長期の使用も、胃腸刺激、腎臓へのダメージ、および心臓発作および卒中リスクの上昇をもたらす可能性があり、さらに有害心血管イベント低減におけるアスピリンの有効性を減少させる可能性がある。キノロン系抗生物質を摂取している場合、NSAIDは、発作を誘導する可能性がある。
【０００６】
子宮内膜症患者にはパラセタモールおよびコデイン(いずれか単独で、またはパラセタモールと併用して)が処方される場合があるが、それによりしばしば便秘が起こる可能性があり、便秘が症状を悪化させることもある。
【０００７】
子宮内膜症の症状を管理する頼みの綱は、1950年代後期から経口避妊薬である。経口避妊薬は、疾患は治癒しないが、一般的に忍容性が高く、月経周期を止めることにより疼痛の主な症状を緩和する。治療計画は、避妊の場合に一般的に使用される3週間のオン/1週間のオフサイクルから、重度の疾患の場合での3〜4か月のオン/1週間のオフサイクルまで様々である。一般的な副作用としては、不規則な膣からの出血、体液貯留、腹部膨満、体重増加、食欲の増加、吐き気、頭痛、乳房圧痛、およびうつ病が挙げられる。深刻な不利益は避妊効果であり、従って避妊薬は、生殖能力の維持を望む女性にとって不適切である。
【０００８】
合成プロゲステロン(例えばプロゲスチン/プロゲストゲン)は、排卵を妨げ、1950年代の中頃から例えば子宮内器具(例えばミレーナ(Mirena)IUD)として子宮内膜症を治療するのにうまく使用されてきた。しかしながら明らかな避妊効果に加えて、気分の変調、膨満、不規則な出血、および体重増加などの他の副作用がある。
【０００９】
自然のエストロゲンおよびプロゲステロンレベルを低減させて閉経期のような状態を誘発するために、合成テストステロン誘導体(例えばダンゾール(Danzol)およびゲストリノン)などの抗プロゲストゲンが使用されてきたが、これらは、体重増加、座瘡、発毛、および声の低音化を誘発する可能性がある。
【００１０】
またゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)類似体(例えばゴセレリン、ナファレリン、リュープロレリン/ロイプロン(Leupron)、およびトリプトレリン)も、エストロゲン産生をブロックすることにより人工的な閉経期の状態を誘発する。しかしながら、ホットフラッシュ、膣の乾燥、および低いリビドーなどの共通の副作用がある。長期的使用、例えば6か月よりも長い使用は骨量減少を伴い、それにより骨粗しょう症を引き起こす。
【００１１】
つい最近になって、テストステロンからエストロゲンへの変換をブロックするアロマターゼ阻害剤(例えばレトロゾールおよびアナストロゾール)と、閉経前の女性における卵巣の過剰刺激と卵巣嚢胞の発達を予防するのに必要なGnRHアゴニストとの併用が調査されてきた。しかしながら、長期治療に伴う骨量減少を緩和するためにはカルシウム、ビタミンD、およびビスホスホネートが必要である。
【００１２】
子宮内膜症と闘うためには、3つの主要なタイプの外科的介入を利用することができる。第一に、キーホール腹腔鏡検査法を使用することができ、この検査法では、しばしば診断手順中に熱、レーザーまたは電気的切除(electro-ablation)により病変が除去される。腹腔鏡による試験までの典型的な期間は、8年を超える可能性があり、さらに病変の不完全な除去および/または隠れた病変の確認の失敗のために症状が繰り返し再発する。第二に、開腹術を行って、腹腔にアクセスすることもできる;しかしながら、これは、それに関連するリスクと長期入院を伴う大きな外科的介入である。第三かつ最後の選択肢は子宮摘出であるが、それをもってしても治癒的とはいえず、特に卵巣がその場に残されている場合は病変が再発する可能性がある。
【００１３】
NgOら(J Pathol 2010;222:148〜157)は、in vitroおよびin vivoで子宮内膜症の進行をコントロールして、子宮内膜症を治療するための新しい標的としてERK経路を同定する可能性について論じている。しかしながら、著者らは、ヒトにおける効果および忍容性を評価するためにはさらなる臨床研究が必要であることを強調しており、生殖能力の維持については何も述べていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】WO2008/113770
【特許文献２】US5,552,534
【特許文献３】US5,550,251
【特許文献４】US5,288,707
【特許文献５】GB 0715635.9
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】NgOら(J Pathol 2010;222:148〜157)
【非特許文献２】Migliaccioら(Oncogene 2007、26:6619)
【非特許文献３】Migliaccioら(Cancer Research 2005、65(22):10585〜93)
【非特許文献４】Venterら(Science 2001、291(5507):1304〜51)
【非特許文献５】Plantら(1995)Analyt Biochem、226(2)、342〜348
【非特許文献６】Sambrookら(2001) Molecular Cloning A Laboratory Manual.第3版. Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York
【非特許文献７】O'Sullivanら、Anal. Biochem. (1979)100、100〜108
【非特許文献８】Julianら(1983)Anal.Biochem.132、68
【非特許文献９】Sambrookら(2001)「Molecular Cloning, a Laboratory Manual」、第3版、Sambrookら(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、USA
【非特許文献１０】Janewayら(2001)Immunobiology.、第5版、Garland Publishing
【非特許文献１１】KohlerおよびMilstein(1975)「Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity」.Nature 256:495〜497
【非特許文献１２】Winterら(1994)「Making antibodies by phage display technology」.Annu.Rev.Immunol.12:433〜455
【非特許文献１３】Schaffitzelら(1999)「Ribosome display:an in vitro method for selection and evolution of antibodies from libraries」.J.Immunol.Methods 231:119〜135
【非特許文献１４】Giovannoniら(2001)「Isolation of anti-angiogenesis antibodies from a large combinatorial repertoire by colony filter screening」.Nucleic Acids Res.29:E27
【非特許文献１５】「Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Application」、Hurrell(CRC Press、1982)
【非特許文献１６】「Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques」、H.Zola、CRC Press、1987、ISBN:0-84936-476-0
【非特許文献１７】「Antibodies:A Laboratory Manual」第1版、HarlowおよびLane編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1988.ISBN 0-87969-314-2
【非特許文献１８】「Using Antibodies:A Laboratory Manual」第2版、HarlowおよびLane編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1999.ISBN 0-87969-543-9
【非特許文献１９】「Handbook of Therapeutic Antibodies」Stefan Dubel編、第1版、-Wiley-VCH、Weinheim、2007.ISBN:3-527-31453-9
【非特許文献２０】Meziereら(1997)J.Immunol.159 3230〜3237
【非特許文献２１】Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro編、1985
【非特許文献２２】Beckerら、AM J Pathol 178(4):1782〜91
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従って、生殖能力を維持するような方法で、かつ好ましくは上述した難儀な欠点が少ない、子宮内膜症ならびに/またはARおよび/もしくはERの活性が寄与因子である他の状態を治療する必要が未だある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
驚くべきことに、かつ意外なことに、本発明者らはここで、チロシンキナーゼSrcとARまたはERのいずれかとの相互作用を低減させることにより、子宮内膜症患者に関する症候を軽減することができ、同時に避妊効果をもたらさないことを示した。
【００１８】
ARおよびERはいずれもチロシンキナーゼSrcと相互作用することが知られているが、他のSrc-ファミリーキナーゼとも相互作用する可能性がある。AR受容体は、SrcのSH3ドメインに結合する(Migliaccioら(Oncogene 2007、26:6619))。SH3ドメインは、50〜70アミノ酸長であり、真核生物のシグナル伝達および細胞骨格タンパク質に特徴的であることが多い。このドメインは、プロリンリッチペプチドに結合することにより、キナーゼの活性調節、加えて局在化および基質認識において主要な役割を果たす。ER受容体は、SrcのSH2ドメインに結合する(Migliaccioら(Cancer Research 2005、65(22):10585〜93))。SH2ドメインは、一般的におよそ100アミノ酸長であり、典型的には、標的タンパク質中の比較的長いペプチドモチーフの状態でリン酸化されたチロシン残基に結合する。
【００１９】
いかなる理論にも縛られることは望まないが、本発明者らは、SrcファミリーキナーゼとARまたはERのいずれかとの相互作用を低減させることによって、ステロイドホルモンによる非遺伝子性のシグナル伝達調節(例えばSrcファミリーキナーゼシグナル伝達の活性化、サイクリンD1の発現、およびDNA合成)を選択的に阻害することができ、それと同時にステロイドホルモンによる遺伝子性のシグナル転写調節が保持されると考えている。この方法で、従来のステロイドホルモン遮断または切除(これらは、遺伝子性および非遺伝子性作用の両方を無効にする)に関連する多くの副作用を回避し、治療をより持続的なものにすることができる。さらに本発明者らは、SrcファミリーキナーゼとARまたはERのいずれかとの相互作用を低減させることは、驚くべきことに避妊効果がないことを見出した。これは、既存の治療とは対照的である。現行の抗アンドロゲンおよび/または抗エストロゲンによる治療は、受胎を可能にするために中断しなければならず、その中断により疾患が再発する可能性があることから、生殖能力の維持は、子宮内膜症治療における顕著な改善点の1つである。従って、本発明者らは、子宮内膜症ならびに/またはARおよび/もしくはERの活性が役割を果たす他の状態と闘うことにおいて、この相互作用を標的化することは有用であると考えている。
【００２０】
従って、本発明の第一の態様において、対象におけるARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態の予防または治療で使用するための、あるいは生殖能力の維持を望む対象におけるARおよび/またはERの活性が寄与因子である癌性状態の予防または治療で使用するための、あるいは対象におけるARおよび/またはERの活性が寄与因子である婦人科系の状態の予防または治療で使用するための、SrcファミリーキナーゼとARまたはERとの相互作用を阻害または予防する分子が提供される。
【００２１】
同様に、本発明は、対象においてARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態を予防または治療するための、あるいは生殖能力の維持を望む対象においてARおよび/またはERの活性が寄与因子である癌性状態を予防または治療するための、あるいは対象においてARおよび/またはERの活性が寄与因子である婦人科系の状態を予防または治療するための医薬の製造における、SrcファミリーキナーゼとARまたはERとの相互作用を阻害または予防する分子の使用も提供する。
【００２２】
同様に、本発明は、対象においてARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態を予防または治療するための、あるいは生殖能力の維持を望む対象においてARおよび/またはERの活性が寄与因子である癌性状態を予防または治療するための、あるいは対象においてARおよび/またはERの活性が寄与因子である婦人科系の状態を予防または治療するための方法であって、それを必要とする対象に、有効量のSrcファミリーキナーゼとARまたはERとの相互作用を阻害または予防する分子を投与する工程を含む、方法を提供する。
【００２３】
ARおよび/またはERの活性が寄与因子である状態を「予防または治療すること」とは、本発明を使用して、障害の症状を緩和すること(すなわち、待機的な使用)、あるいは障害を治療すること(例えば原因物質の阻害または除去によって)、あるいは障害を予防すること(すなわち、予防的な使用であり、症状の悪化もしくは進行を予防すること、または障害の進行を抑制することのいずれか)が可能であることを意味するものとする。
【００２４】
好ましくは、ARおよび/またはERの活性が寄与因子である状態は、例えばヒトなどの哺乳動物の対象において予防または治療される。あるいは対象は、動物、例えば飼育動物(例えばイヌまたはネコ)、実験用動物(例えば実験用げっ歯類、マウス、ラットまたはウサギ)、または農業において重要な動物(すなわち、家畜)、例えばウシ、ヒツジ、ウマまたはヤギであってもよい。対象は、雌でもよいし、または雄でもよい。
【００２５】
Srcファミリーキナーゼには、Srcファミリーのあらゆるキナーゼが含まれる。例えば、このようなキナーゼは、Src、Yes、Fyn、およびFgr(すなわち、SrcAサブファミリーのキナーゼ)、Lck、Hck、Blk、およびLyn(すなわち、SrcBサブファミリーのキナーゼ)、ならびにFrk(Amanchyら、Proteome Res 2008、7(8):3447)から選択されるチロシンキナーゼ以外のあらゆるキナーゼであってもよい。最も好ましくは、Srcファミリーキナーゼは、Srcキナーゼである。
【００２６】
Srcファミリーキナーゼとは、ヒトSrcファミリーキナーゼ、例えばヒトSrcキナーゼを意味するものとし、アンドロゲン受容体(AR)とは、ヒトARを意味するものとし、エストラジオール受容体(ER)とは、ヒトERを意味するものとし、これらの配列はいずれも、Migliaccioら(Cancer Research 2005、65(22):10585〜93)、Migliaccioら(Oncogene 2007、26:6619)、Venterら(Science 2001、291(5507):1304〜51)、およびWO2008/113770で示されている。当然のことながら、遺伝子およびmRNA配列に関して天然の変異型があるが、このような変異型も、本明細書で定義されたようなそれぞれのSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)、ARおよびERの意味に含まれることが理解されるであろう。
【００２７】
またヒトSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)、ARおよび/またはERの変異体が、親のSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)、ARまたはERの活性のうち1つまたは複数を共有していれば、それらも含まれる。言い換えれば、変異体は、機能性変異体である。例えば、変異体は、それに対応するヒト配列に対して、少なくとも60%の配列同一性を共有していてもよいし、例えば少なくとも65%、70%、75%、80%、および85%の配列同一性を共有していてもよいし、より好ましくは90%、95%または99%の配列同一性を共有していてもよい。変異は、挿入、欠失、および置換を含み、これらは保存的または非保存的のいずれかである。「保存的置換」は、Gly、Ala;Val、Ile、Leu;Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、Thr;Lys、Arg;およびPhe、Tyrのような組合せを意味するものとする。
【００２８】
またそれぞれのSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)、ARおよびERには、ヒトSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)、ARおよびERのオルソログも含まれる。適切な同種のSrcファミリーキナーゼ、ARおよびERの例としては、マウス由来のもの、およびラット由来のものが挙げられる。他のオルソログとしては、図3に列挙した種由来のものが挙げられる。当然のことながら、それぞれのヒトSrcファミリーキナーゼ、ARおよびERのオルソログをコードする遺伝子およびmRNA配列に関して天然の変異型があるが、このような変異型も、定義されたような同種のSrcファミリーキナーゼ、ARおよびERの意味に含まれることが理解されるであろう。
【００２９】
一実施形態において、本分子は、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインとアンドロゲン受容体との相互作用を阻害または予防する分子である。この相互作用の詳細は、Migliaccioら(Oncogene 2007、26:6619)に示されている。
【００３０】
Srcファミリーキナーゼの「SH3ドメイン」とは、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のN末端Src相同性3ドメインを意味するものとする。SH3ドメインは、典型的には50〜70アミノ酸長であり、プロリンリッチペプチドと結合する。Migliaccioら(EMBO J 2000、19:5406〜5417)の研究によれば、SrcキナーゼのSH3ドメインとARとの相互作用における該SH3ドメインの重要性が示されている。
【００３１】
別の実施形態において、本分子は、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH2ドメインとエストラジオール受容体との相互作用を阻害または予防する分子である。この相互作用の詳細は、Migliaccioら(Cancer Research 2005、65(22):10585〜93)に示されている。
【００３２】
Srcファミリーキナーゼの「SH2ドメイン」とは、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSrc相同性2ドメインを意味するものとする。SH2ドメインは、一般的にはおよそ100アミノ酸の長さであり、典型的にはリン酸化されたチロシン残基に結合する。
【００３３】
治療される哺乳動物の対象に関して、当然のことながら本分子は、その哺乳動物種のSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とアンドロゲンまたはエストラジオール受容体との相互作用を阻害または予防することができる分子であることが理解される。例えば哺乳動物の対象がヒトである場合、本分子は、ヒトSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とヒトARまたはヒトERのいずれかとの相互作用を阻害または予防することができ、他も同様である。
【００３４】
分子がSrcファミリーキナーゼとARまたはERとの相互作用を予防または阻害するとは、最初の段階で相互作用が形成されることを防ぐという意味と、相互作用が形成された後に相互作用を低減させるという意味の両方が含まれる。好ましくは、本分子は、相互作用を防ぐか、または検出できないレベルまで低減させる。
【００３５】
好ましい実施形態において、本分子は、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とARまたはERとの相互作用を選択的に予防または阻害する。例えば、本分子がSrcファミリーキナーゼとARまたはERとの相互作用を予防または阻害する程度が、本分子がSrcファミリーキナーゼと他の何らかの分子との相互作用を予防する程度よりも高い程度(例えば少なくとも5倍、10倍、20倍、50倍、100倍または1000倍)であることが好ましい。同様に、本分子がARまたはERとSrcファミリーキナーゼとの相互作用を予防または阻害する程度が、本分子がARまたはERと他の何らかの分子との相互作用を予防する程度よりも高い程度(例えば少なくとも5倍、10倍、20倍、50倍、100倍または1000倍)であることが好ましい。
【００３６】
分子が、SrcファミリーキナーゼとARまたはERとの相互作用を予防または阻害するかどうかは、特定の分子の存在および非存在下でSrcファミリーキナーゼとARまたはERのいずれかとの相互作用を評価することによってうまく決定される。上述したように、SrcキナーゼのSH3ドメインは、SrcキナーゼとARとの相互作用を仲介すると考えられているため、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインとARとの相互作用は、特定の分子の存在および非存在下で評価してもよい。同様に、SrcキナーゼのSH2ドメインは、SrcキナーゼとERとの相互作用を仲介すると考えられているため、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH2ドメインとERとの相互作用は、特定の分子の存在および非存在下で評価してもよい。2種のタンパク質間の相互作用の評価方法は当技術分野で公知であり、任意の適切な方法を使用することができる。その例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、表面プラズモン共鳴アッセイ、競合アッセイ、チップベースのアッセイ、免疫細胞蛍光法(immunocytofluorescence)、酵母2ハイブリッド技術、およびファージディスプレイが挙げられ、これらはいずれも当技術分野では慣例的な方法であり、例えば、Plantら(1995)Analyt Biochem、226(2)、342〜348、およびSambrookら(2001) Molecular Cloning A Laboratory Manual.第3版. Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New Yorkで説明されている。タンパク質相互作用を評価する他の方法としては、限外ろ過とイオンスプレー質量分析/HPLC法との併用、または他の物理的および分析的方法が挙げられる。例えば、当業者に周知の蛍光エネルギー共鳴移動(FRET)法を使用することができ、この方法では、2種の蛍光標識された実体の結合は、互いに接近した際の蛍光標識の相互作用を測定することによって測定することができる。特に好ましい実施形態において、免疫沈降アッセイ、例えばMigliaccioら(Oncogene 2007、26:6619)で説明されているアッセイを使用して、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインとARとの相互作用、および/またはSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH2ドメインとERとの相互作用を評価することができる。
【００３７】
好ましい実施形態において、本分子は、構造:
Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp、もしくはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rp、またはその誘導体もしくは断片
を含む分子かまたはそれからなる分子であり、
式中Bは、第一の化学成分であり、jは、0または1であり、nは、1〜10の整数であり、Xは、任意のアミノ酸であり、rは、0〜2の整数であり、mは、1〜3の整数であり、Rは、第二の化学成分であり、pは、0または1であり、[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]は、[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]のレトロインベルソペプチド(retro-inverso peptide)である。
【００３８】
構造Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp、またはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rpを含むかまたはそれからなる分子は、一般的に、ペプチド部分[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]mまたは[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mを有し、任意選択でさらに、一方または両方の末端(すなわち、BjおよびRp)に化学成分を有することが理解されるであろう。言い換えれば、j=0およびp=0;またはj=1およびp=0;またはj=0およびp=1;またはj=1およびp=1である。一実施形態において、j=0およびp=0であり、その結果、本分子は、構造[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]mまたは[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mを有するペプチドである。
【００３９】
BおよびRは、独立して、どのような化学成分であってもよく、このような成分としては、例えば脂質(例えばグリコリピド、リン脂質、スフィンゴ脂質)、脂肪酸、トリグリセリド、グリセロール、プレニルもしくはイソプレニル成分(例えばファルネシルまたはゲラニルゲラニル成分)、炭水化物(例えば単糖および多糖)、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドもしくは核酸、またはその組合せのいずれかがある。従って、上記成分は、グリコペプチドまたはリポペプチドであってもよい。上記成分は、低分子量または高分子量ポリエチレングリコールであってもよく、例えば200〜70000の範囲の分子量を有するポリエチレングリコールであってもよい。追加の適切な成分は、当業者によって決定することができる。
【００４０】
一実施形態において、Bは、H、またはアセチル基、または遊離のもしくはアセチル誘導体化されたNH2基を有するアミノ酸の1つもしくは配列のいずれかである。
【００４１】
さらなる実施形態において、Rは、OH基、またはNH2基、またはC末端のカルボキシ-アミド基を有するアミノ酸の1つもしくは配列のいずれかである。
【００４２】
化学成分BおよびRは、分子が対象に投与されたときに、化学成分BおよびRはペプチド部分から切断されて放出され得るように、分子のペプチド部分に任意選択で付着されていてもよい。例えば、成分BおよびRのいずれかに、分子が体に投与されるときに切断が可能な切断部位が含まれていてもよい。一般的に、切断部位は、対象中に存在するプロテアーゼによって切断することができるプロテアーゼ切断部位である。
【００４３】
化学成分Bおよび/またはRは、当技術分野で公知の任意の適切な方法でペプチド部分に結合されていてもよい。例えば、成分Bおよび/またはRは、従来のポリペプチド架橋方法のいずれかによりペプチド部分に結合されていてもよく、このような方法としては、例えば、O'Sullivanら、Anal. Biochem. (1979)100、100〜108で概説されている方法がある。例えば、第一の部分にチオール基を多く含ませて、第二の部分を、そのチオール基と反応することができる二官能性物質と反応させてもよく、このような二官能性物質としては、例えばヨード酢酸のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHIA)またはN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、コンジュゲートした化学種間にジスルフィド架橋を組み入れるヘテロ二官能性架橋剤などがある。一般的に、アミドおよびチオエーテル結合、例えばm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて達成されるような結合は、in vivoではジスルフィド結合よりも安定である。
【００４４】
さらなる有用な架橋剤としては、穏やかな条件下でスルフヒドリル基を脱保護させる第一級アミン用のチオール化試薬であるS-アセチルチオグリコール酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(SATA)(Julianら(1983)Anal.Biochem.132、68)、ジメチルスベリミデートジヒドロクロリド、およびN,N'-o-フェニレンジマレイミドが挙げられる。
【００４５】
化学成分Bおよび/またはRをペプチド部分に結合するさらなる方法としては、化学的ライゲーションプロトコール、クリックケミストリーを使用するカップリングプロトコール、またはシュタウディンガーライゲーションを使用するカップリングプロトコールを使用することが挙げられ、これらは当技術分野で周知である。当業者により他の適切な方法に決めてもよい。
【００４６】
化学成分Bおよび/またはRがペプチドまたはポリペプチドである場合、分子のペプチド部分ならびに化学成分Bおよび/またはRは、核酸分子によってコードされていてもよい融合ポリペプチドの一部であってもよいことが理解される。例えば、化学成分Bおよび/またはRは、当技術分野において十分に確立されている遺伝子操作技術を使用して、分子のペプチド部分が含まれるように遺伝操作されていてもよい。
【００４７】
好都合には、本分子のペプチド部分[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]mまたは[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mは、57アミノ酸残基未満の長さであり、例えば55、50、45、40、35、30、25、20または15アミノ酸未満の長さである。従って、ペプチド部分は、8から60アミノ酸残基の長さ、または10から15アミノ酸残基の長さ、または15から20アミノ酸残基の長さ、または20から25アミノ酸残基の長さ、または25から30アミノ酸残基の長さ、または30から35アミノ酸残基の長さ、または35から40アミノ酸残基の長さ、または40から45のアミノ酸残基の長さ、または45から50アミノ酸残基の長さ、または50から55アミノ酸残基の長さを有していてもよい。好ましくは、ペプチド部分は、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25アミノ酸の長さであり、最も好ましくは10アミノ酸の長さである。
【００４８】
Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とARおよび/またはERとの相互作用を予防または阻害することができるのであれば、構造Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp、またはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rpを含むかまたはそれからなる本分子の断片を使用することができることが理解される。従って、本分子に含まれる上述のアミノ酸は8個未満であってもよい。典型的には、このような断片は、本分子のペプチド部分[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]mまたは[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mの断片であり、一般的には、少なくとも3アミノ酸の長さであり、例えば少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15アミノ酸の長さである。従って、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とARおよび/またはERとの相互作用を予防または阻害することができるのであれば、本分子は、ペプチド[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]mまたは[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mの断片を含むかまたはそれからなっていてもよい。
【００４９】
このような断片の誘導体または塩は、以下でさらに説明されているようにして使用することができる。例えば、安定性を改善するために、このような断片の一方または両方の末端にキャッピング成分が付加されてもよい。
【００５０】
適切な断片の例は、HPHARIK、HPHAR、PHPHAR、HPH、PHPH、PPHPH、PPPHPH、PHP、PPHP、PPPHP、PPPH、PPH、およびPPPからなる群から選択することができる。断片の特定の誘導体または塩は、Ac-HPHARIK-NH2、Ac-HPHAR-NH2、Ac-PHPHAR-NH2、Ac-HPH-NH2、Ac-PHPH-NH2、Ac-PPHPH-NH2、Ac-PPPHPH-NH2、Ac-PHP--NH2、Ac-PPHP-NH2、Ac-PPPHP-NH2P、Ac-PPPH-NH2、Ac-PPH-NH2、およびAc-PPP-NH2からなる群から選択することができる。
【００５１】
好都合には、成分Bおよび/またはRがペプチドである場合、分子全体がペプチドであってもよく、このようなペプチドは、57アミノ酸を超える長さであってもよいことが理解される。しかしながら、分子全体がペプチドである場合、150アミノ酸未満の長さ、例えば140、130、120、110、100、90、80、70または60アミノ酸未満の長さであることが好ましい。
【００５２】
一般的に、本分子は、50kDa未満の分子量を有し、例えば40、30、20、10または5kDa未満の分子量を有する。典型的には、本分子は、1000〜5000Daの分子量を有する。従って、本分子は、約4500、4000、3500、3000または2500Daの分子量を有していてもよく、あるいは1000〜2500Daの分子量を有していてもよい。
【００５３】
一実施形態において、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10のいずれかであり、最も好ましくはn=3である。別の実施形態において、mは、1、2または3のいずれかであり、最も好ましくはm=1である。従って、特に好ましい実施形態において、nは、3であり、mは、1である。
【００５４】
Xrは、1または2個のアミノ酸残基の伸長部を表し、これらのアミノ酸残基は、独立して、または両方とも、任意のアミノ酸残基であってよい。従って、Xrで表されるアミノ酸残基は、DNAによってコードされる天然に存在する任意のアミノ酸残基であってよく、このようなアミノ酸残基は、アラニン(Ala、A)、アルギニン(Arg、R)、アスパラギン(Asn、N)、アスパラギン酸(Asp、D)、システイン(Cys、C)、グルタミン(Gln、Q)、グルタミン酸(Glu、E)、グリシン(Gly、G)、ヒスチジン(His、H)、イソロイシン(Ile、I)、ロイシン(Leu、L)、リシン(Lys、K)、メチオニン(Met、M)、フェニルアラニン(Phe、F)、プロリン(Pro、P)、セリン(Ser、S)、スレオニン(Thr、T)、トリプトファン(Trp、W)、チロシン(Tyr、Y)、およびバリン(Val、V)から選択される。しかしながら、ペプチド部分がポリヌクレオチドからの発現によって形成されるもの以外に、Xrで表されるアミノ酸残基は、例えば以下で説明されるもののようなDNAによってコードされない1つまたは複数のアミノ酸残基を含んでもよい。一実施形態において、rは、0であり、代替の実施形態において、rは、1であり、Xは、スレオニン残基である。
【００５５】
誤解を避けるために言えば、本分子は、ARでもERでもない。
【００５６】
いかなる理論にも縛られることは望まないが、本発明者は、ペプチドPPPHPHARIKは、SrcファミリーキナーゼのSH3ドメインとの相互作用を仲介するヒトARの一部であると考えている。従って、特に好ましい実施形態において、本分子のペプチド部分[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]mまたは[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mは、PPPHPHARIKまたはそのレトロインベルソペプチド、kirahphpppである。
【００５７】
ペプチドPPPHPHARIKは、ヒトARのアミノ酸残基377〜386に相当し、いかなる理論にも縛られることは望まないが、本発明者は、それに相当する他の種由来のARの一部は同じ活性を共有すると考えている。「それに相当する部分」とは、例えばMacVectorまたはCLUSTALWなどのアライメントツールを使用してヒトARと他のARとを比較する際に、ヒトARの所定のアミノ酸配列に合わせてアライメントされた別のARのアミノ酸残基配列を意味するものとする。従って、別の好ましい実施形態において、ペプチド部分は、ヒトARの377〜386位のアミノ酸配列(PPPHPHARIK)に相当するペプチドである。例えば、マウスおよびラットARのそれに相当するペプチドは、PPTHPHARIKであり、従ってペプチド部分は、PPTHPHARIKまたはそのレトロインベルソペプチド、kirahphtppであってもよい。図3に選択された他の種のそれに相当するペプチドを示すが、ペプチド部分は、図3に列挙したペプチドのいずれかであってもよいし、またはそのレトロインベルソペプチドであってもよい。好ましくは、ペプチドPPPHPHARIKは、ヒト対象に投与され、ペプチドPPTHPHARIKは、マウスまたはラット対象に投与され、他も同様である。
【００５８】
2種のタンパク質のアライメント作製は、クラスタルWプログラム(Clustal W program)(Thompsonら、1994)を使用して行ってもよい。使用されるパラメーターは、以下に示す通りであってもよい:Fastのペアワイズアライメントパラメーター:K-tuple(ワード)サイズ;1、ウィンドウサイズ;5、ギャップペナルティー;3、トップダイアゴナルの数;5。スコア付けの方法:xパーセント。マルチプルアライメントパラメーター:ギャップオープンペナルティー;10、ギャップ伸長ペナルティー;0.05。スコア行列:BLOSUM。
【００５９】
特に好ましい実施形態において、本分子は、ペプチドPPPHPHARIKまたはPPTHPHARIKを含むかまたはそれからなる。
【００６０】
上記で定義された本分子のペプチド部分[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]mもしくは[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mまたはその断片は、典型的にはタンパク質化学的な技術を使用して作製され、例えば部分的なタンパク質分解を(エキソ型分解またはエンド型分解のいずれかで)使用して、またはデノボ合成によって作製される。あるいはこのようなペプチドは、組換えDNA技術によって作製してもよい。核酸のクローニング、操作、改変、および発現、ならびに発現されたタンパク質の精製に適した技術は当技術分野で周知であり、例えば、Sambrookら(2001)「Molecular Cloning, a Laboratory Manual」、第3版、Sambrookら(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、USAで説明されている。
【００６１】
上記で定義された本分子のペプチド部分[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]mもしくは[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mまたはその断片はまた、化学的に合成することもでき、例えばMerrifieldら(1964)の固相ペプチド合成によって合成することもできる。あるいは、このようなペプチド部分は、標準的な溶液法を使用して合成することもできる(例えばBodanszky、1984およびDugasら、1981を参照)。新たに合成されたペプチドは、例えば高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製することもでき、さらに、例えば質量分析またはアミノ酸配列解析を使用して特徴付けることもできる。
【００６２】
他の適切な分子としては、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とARまたはERとの相互作用を予防または阻害することができる、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のいずれか、またはARおよびERのいずれかに対する任意の抗体も挙げられることが理解される。上述したように、本発明者は、SrcキナーゼのSH3ドメインとARのアミノ酸残基377〜386とは、SrcキナーゼとARとの相互作用を仲介すると考えている。従って、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とARまたはERのいずれかとの相互作用を阻害または予防する適切な分子としては、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインに対する抗体、またはヒトARのアミノ酸377〜386に相当する位置でARに結合する抗体(例えば構造(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lysを有するペプチド(式中nは、1〜10の整数であり、Xは、任意のアミノ酸であり、rは、0〜2の整数である)に対する抗体であって、例えばPPPHPHARIKまたはPPTHPHARIKに対する抗体)が挙げられることが理解される。同様に、SrcキナーゼのSH2ドメインは、SrcキナーゼとERとの相互作用を仲介すると考えられている。従って、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とARまたはERのいずれかとの相互作用を阻害または予防する適切な分子としては、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH2ドメインに対する抗体が挙げられることが理解される。好ましくは、このような抗体は、上記で考察したように、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とARまたはERとの相互作用を選択的に予防または阻害する。
【００６３】
用語「抗体」は、本明細書で用いられる場合、これらに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Fab断片、およびFab発現ライブラリーによって生産された断片を含む。このような断片としては、標的物質との結合活性を保持する全抗体、Fv、F(ab')、およびF(ab')2断片、加えて単鎖抗体(scFv)、融合タンパク質、ならびに抗体の抗原-結合部位を含む他の合成タンパク質の断片が挙げられる。さらに、ドメイン抗体(dAb)、二重特異性抗体、ラクダ抗体、および遺伝子操作されたラクダ抗体も挙げられる。さらに、ヒトに投与する場合、抗体およびその断片は、ヒト化抗体であってもよく、このような抗体は現在当技術分野で周知である(Janewayら(2001)Immunobiology.、第5版、Garland Publishing)。
【００６４】
Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)またはARおよびERの特定の領域に結合する上述された適切な抗体は、当技術分野で長年かけて確立した技術を使用して当業者により作製することができる。モノクローナル抗体および抗体断片の調製方法は当技術分野で周知であり、このような方法としては、ハイブリドーマ技術(KohlerおよびMilstein(1975)「Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity」.Nature 256:495〜497);抗体ファージディスプレイ(Winterら(1994)「Making antibodies by phage display technology」.Annu.Rev.Immunol.12:433〜455);リボソームディスプレイ(Schaffitzelら(1999)「Ribosome display:an in vitro method for selection and evolution of antibodies from libraries」.J.Immunol.Methods 231:119〜135);および反復コロニーフィルタースクリーニング(iterative colony filter screening)(Giovannoniら(2001)「Isolation of anti-angiogenesis antibodies from a large combinatorial repertoire by colony filter screening」.Nucleic Acids Res.29:E27)が挙げられる。さらに、本発明で使用するのに適した抗体および抗体断片は、例えば以下の出版物でも説明されている:「Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Application」、Hurrell(CRC Press、1982);「Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques」、H.Zola、CRC Press、1987、ISBN:0-84936-476-0;「Antibodies:A Laboratory Man
ual」第1版、HarlowおよびLane編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1988.ISBN 0-87969-314-2;「Using Antibodies:A Laboratory Manual」第2版、HarlowおよびLane編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1999.ISBN 0-87969-543-9;および「Handbook of Therapeutic Antibodies」Stefan Dubel編、第1版、-Wiley-VCH、Weinheim、2007.ISBN:3-527-31453-9。
【００６５】
本発明の分子は、細胞への侵入を容易にする細胞貫通ペプチド(また、タンパク質導入ドメインとしても知られている)の配列を含んでもよいことが理解される。当技術分野でよく知られているように、細胞貫通ペプチドは、一般的には、正味の正電荷を有する最大30残基の短いペプチドであり、受容体非依存的およびエネルギー非依存的に作用する(Lindgrenら、2000;Deshayesら、2005aおよび2005b;Takeuchiら、2006、これらの細胞貫通ペプチドに関する全開示は、参照により本明細書に組み込まれる)。従って、上述の化学成分BおよびRのいずれかが細胞貫通ペプチドであってもよい。そのような場合、細胞貫通ペプチドは、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とARまたはERとの相互作用の阻害または予防に関する本分子の一部から切断可能であることが好ましい。例えば、細胞貫通ペプチドは、細胞内で切断可能である。
【００６６】
また本分子は、より容易に検出できるように改変してもよく、例えば、本分子をビオチン化することによって、または放射標識、蛍光標識または酵素標識などの当技術分野で公知の任意の検出可能な標識を取り込ませることによって改変してもよい。
【００６７】
本明細書において説明される分子のアミノ酸残基は、「L」型異性体であってもよい。しかしながら、本分子が、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とARまたはERとの相互作用を阻害または予防することが可能な限りは、「D」型異性体の残基をあらゆるL型アミノ酸残基で置換してもよい。この定義は、特に他の指定がない限り、化学修飾されたアミノ酸、例えば、アミノ酸類似体(例えばペニシラミン、3-メルカプト-D-バリン)、天然に存在するタンパク質を構成しないアミノ酸(例えばノルロイシン)、および当技術分野でアミノ酸に特徴的であることが知られている特性を有する化学的に合成された化合物を含む。用語「タンパク質を構成する」とは、アミノ酸がよく知られた代謝経路により細胞内に取り込まれてタンパク質になることを示す。
【００６８】
従って、一実施形態において、上記分子のペプチド部分は、ペプチド[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]mのレトロインベルソペプチドまたはその断片(好ましくは上記で定義されたものが挙げられる)である。レトロインベルソペプチド(また、全D型レトロまたはレトロエナンチオペプチド(retro-enantio peptide)としても知られている)とは、全てのL型アミノ酸がD型アミノ酸で置換されており、ペプチド結合が逆になったペプチドを意味するものとする。従って、このようなペプチドは、親のL型配列の順番とは逆の順番で組み立てられたD型アミノ酸で構成される。[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]mのレトロインベルソペプチドは、[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mである(式中、小文字は、それに相当するD型アミノ酸を表す)。レトロインベルソペプチドは、例えばMeziereら(1997)J.Immunol.159 3230〜3237で説明されている方法などの当技術分野で公知の方法で合成することができる。このアプローチは、主鎖には変化を含むが、側鎖の配置には変化を含まず、親のペプチドとの高い類似性を保持したプソイドペプチドの作製を含む。レトロインベルソペプチドは、タンパク質分解に対してかなり高い耐性を有する。
【００６９】
誤解を避けるために言えば、上記でXrについて示した好ましい選択肢はいずれも、それに相当するD型アミノ酸xrにも適用される。
【００７０】
上述した分子のペプチド部分は、ペプチド「ミメティック」、すなわち上述のようなアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるペプチドの構造的特徴を模倣したペプチドミメティックであってもよい。
【００７１】
非ペプチドの性質を有するペプチドミメティックは、標準的な有機化学的方法により設計し合成することができる。非ペプチドの性質を有するペプチドミメティックはさらに、治療用途、分解に対する耐性、透過性、および経口投与の可能性においても有利である。
【００７２】
ペプチドミメティックは、ペプチドやタンパク質の特定の構造的態様を模倣することによりタンパク質に結合することができる小分子である。これらは、科学および医学において、タンパク質や細胞受容体および他の受容体のペプチドリガンドのアゴニストおよびアンタゴニストとして、さらに酵素の基質および基質類似体として広範囲にわたり使用される。いくつかの例は、モルヒネアルカロイド(天然に存在するエンドルフィン類似体)、ペニシリン(半合成)、およびHIVプロテアーゼ阻害剤(合成)である。このような化合物は、ペプチドまたはタンパク質を模倣する構造的特徴を有しており、そのようなものとして他のタンパク質により認識されてそれと結合する。ペプチドミメティックの結合は、結合したタンパク質に、このような結合によって引き起こされる通常の機能を実行させること(アゴニスト)か、あるいはこのような機能を中断させること(アンタゴニスト、阻害剤)のいずれかを誘導する。
【００７３】
ペプチドミメティック設計における主要な目的は、ペプチダーゼによる切断および不活性化の影響を受けやすいミメティックの特徴を低減することであった。例えばShermanら(1990)で開示されているような1つのアプローチは、1つまたは複数のアミド結合を、様々な化学的官能基で実質的に比体積が等しくなるように置き換えることである。この段階的なアプローチは、活性な類似体が得られるという点である程度の成功を収めている。いくつかの例では、これらの類似体は、その天然に存在する等価物よりも長い生物学的半減期を有することが示されている。別のアプローチでは、D型アミノ酸およびN-メチルアミノ酸などの様々な非コードアミノ酸または改変アミノ酸を使用して、哺乳動物ペプチドを改変している。あるいは、推定の生物活性コンフォメーションは、環化などの共有結合の改変によって、あるいはγ-ラクタムの取り込みまたは他のタイプの架橋(Veberら、1978およびThorsettら、1983)によって安定化させている。Rich(1986)によって開示された別のアプローチは、酵素阻害剤の設計に遷移状態アナログの概念を適用することによりペプチドミミックを設計することである。例えば、スタチンの第二級アルコールは、ペプシン基質の不動のアミド結合の四面体遷移状態(tetrahedral transition state)を模倣することが知られている。
【００７４】
US5,552,534では、様々なペプチドの化学および/または生物活性を模倣または阻害する非ペプチド化合物が開示されている。このような化合物は、テトラヒドロピラニル環などのある種のコア種に、化合物を少なくとも部分的にペプチドと交差反応するようにする化学官能基を付加することによって生産することができる。他のペプチドミメティック調製技術は、US5,550,251およびUS5,288,707に開示されている。
【００７５】
市販のソフトウェアパッケージを使用して、低分子量のペプチドおよび/またはペプチドミメティック、好ましくは非加水分解性の類似体を特異的なアンタゴニスト/阻害剤として設計することができる。低分子量のペプチドおよびペプチドミメティックの結晶構造、設計、および最適化に適した市販のソフトウェアとしては、これらに限定されないが、高分子X線結晶学利用のクアンタエンバイロメント(Macromolecular X-ray Crystallography QUANTA Environment)(Molecular Simulations,Inc.);TeXsan、BioteX、およびSQUASH(Molecular Structure Corporation);ならびにCrystallographica(Oxford Cryostsystems)が挙げられる。
【００７６】
本明細書において説明される分子の塩または誘導体が、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とARまたはERとの相互作用を予防または阻害することができるのであれば、その塩または誘導体は、ARおよび/またはERの活性が寄与因子である状態を予防または治療するのに有用である可能性があることが理解される。「誘導体」とは、官能性を有する側基の反応により化学的に誘導体化された1つまたは複数の残基を有するペプチド(例えば上述した分子のペプチド部分[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]mは、[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mである)を意味するものとする。このような誘導体化された分子としては、例えば、遊離のアミノ基を誘導体化することにより、アミン塩酸塩、p-トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基が形成された分子が挙げられる。遊離カルボキシル基を誘導体化して、塩、メチルおよびエチルエステルもしくは他のタイプのエステルまたはヒドラジドが形成されてもよい。遊離ヒドロキシル基を誘導体化して、O-アシルまたはO-アルキル誘導体が形成されてもよい。また誘導体としては、20種の標準的なアミノ酸の1つまたは複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むペプチド部分も挙げられる。例えば、プロリンが4-ヒドロキシプロリンで置換されていてもよく、リシンが5-ヒドロキシリシンで置換されていてもよく、ヒスチジンが3-メチルヒスチジンで置換されていてもよく、セリンがホモセリンで置換されていてもよく、リシンがオルニチンで置換されていてもよい。誘導体化には、あるアミノ酸を別のアミノ酸に変える官能基の変化は含まれない。
【００７７】
いくつかの有用な改変は、血液中のタンパク質分解活性をブロックすることにより、溶液中、特に血液、血漿または血清などの生体液中での分子(例えばペプチド)の安定性を高め、結果的に半減期を高めるように設計される。従って、ペプチドは、一方または両方の末端に安定化基を有していてもよい。典型的な安定化基としては、アミド、アセチル、ベンジル、フェニル、トシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ベンジルオキシカルボニルが挙げられ、加えて類似の末端基改変も挙げられる。追加の改変としては、エキソペプチダーゼ活性を阻害するために、末端に「L型」アミノ酸の代わりに「D型」アミノ酸を使用し、アミノまたはカルボキシ末端ではなくアミドを使用することが挙げられる。従って、ペプチド部分[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]mは、上記で定義された分子の[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mであり、一方または両方の末端に、キャッピング成分、好ましくは分子量が200Da未満の成分を有していてもよいことが理解される。さらにキャッピング成分としては、ナフチル基またはポリエチレングリコール基が挙げられる。レトロインベルソペプチドはすでに比較的安定であるため、追加のキャッピング成分を必要としない場合もあることが理解される。
【００７８】
従って、特に好ましい実施形態において、本分子は、構造Ac-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2またはAc-Pro-Pro-Thr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2を含むかまたはそれからなり、式中Acは、アセチル基である。
【００７９】
本発明の分子は、対象の生殖能力を低下もさせず、妨げもしない分子である。実施例で説明されているように、本発明者は、マウスへのペプチドAc-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2の投与はマウスの生殖能力に影響を及ぼさないことを実証し、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とARまたはERとの相互作用を予防または阻害する他の分子も同じ活性を有することが期待される。対象における生殖能力の評価方法は当技術分野で周知であり、例えば実施例で説明されるアッセイがある。
【００８０】
一実施形態において、本分子は、抗体を生成するためにワクチンとして投与される。例えば、上記で定義された構造を有する分子は、ARに特異的に結合する抗体の調製に使用することができ、従ってワクチンとして調製されてもよい。
【００８１】
本分子を免疫促進性の分子などの担体分子に連結させることが望ましい場合もある。適切な例としては、ウシ血清アルブミン(BSA)またはキーホールリンペットヘモシニアン(KLH)が挙げられる。加えて、または代替として、本分子は、脂質組成物、例えば脂質粒子、ナノカプセル、リポソームまたは脂質小胞中に含まれていてもよい。また本分子は、以下でさらに説明されているような遅延放出用のコーティングカプセルに取り込まれていてもよい。
【００８２】
ARおよび/またはERの活性が寄与因子である状態には、少なくとも病理の一部にARおよび/またはERの活性が介在するあらゆる生物学的または医学的な状態もしくは障害が含まれる。このような病理は、高いまたは低いARおよび/またはERの活性に起因する可能性がある。このような状態は、ARおよび/またはERの活性によって引き起こされる場合もあり、あるいは単にARおよび/またはERの活性を特徴とする場合もある。ARおよび/またはERの活性がこのような状態に直接的に寄与する場合もあるし、あるいはこのような状態に間接的に寄与する場合もある。一般的に、ARおよび/またはERの活性が寄与因子である状態とは、病因が、ARおよび/またはERを介する異常なシグナル伝達に関与する状態(例えばARおよび/またはERにより細胞増殖が調節される状態)である。例えば、このような状態は、Srcファミリーキナーゼ経路を介する異常なシグナル伝達に関与する可能性がある。このような状態は、当技術分野で利用可能な従来の方法を使用して容易に診断することができる。
【００８３】
このような状態は、非癌性であってもよいし(例えば非癌性の増殖性障害)、あるいは癌性であってもよい(例えば良性または悪性癌)。このような状態は、生殖系の状態(reproductive condition)であってもよく、この生殖系の状態とは、生殖系の臓器または組織の一部または全部に影響を及ぼす状態を意味するものとする。生殖系の状態は、婦人科系の状態、すなわち女性生殖系に影響を及ぼす状態であってもよい。
【００８４】
第一の好ましい実施形態において、このような状態は、ARおよび/またはERが寄与因子であるあらゆる増殖性障害を含む非癌性状態である。その例としては、子宮内膜症、卵巣嚢胞、線維性ポリープの過形成、新形成、無排卵性出血、陰嚢、膀胱または前立腺における子宮内膜の増殖、および乳房組織における非癌性の増殖性の状態が挙げられる。好ましくは、このような状態は、子宮内膜症である。
【００８５】
第二の好ましい実施形態において、このような状態は、癌性状態であり、対象は、生殖能力の維持を望むものである。「生殖能力の維持を望む」とは、対象の生殖能力を低下させないことが望ましいということを意味するものとする。例えば、対象は、妊娠を望んでいてもよい。それゆえに、癌患者が癌を有すると同時に生殖能力の維持を望むような場合、このような対象の一例は、癌患者の部分集団である。このような癌性状態の例としては、子宮類線維症、線維性ポリープの過形成、卵巣癌、膀胱癌、子宮頚癌、子宮癌、精巣癌、および前立腺癌が挙げられる。
【００８６】
第三の好ましい実施形態において、このような状態(例えば非癌性または癌性状態)は、婦人科系の状態である。好ましくは、このような状態は、子宮内膜症である。
【００８７】
第一および第三の好ましい実施形態において、生殖能力の維持を望む対象に本分子を使用することが特に望ましい可能性があることが理解される。従って、これらの実施形態では、対象が生殖能力の維持を望む対象である場合においても好ましい。最も好ましくは、このような状態は、子宮内膜症であり、対象は、生殖能力の維持を望む対象である。
【００８８】
本明細書において説明される分子またはその誘導体もしくは断片は、薬学的に許容される賦形剤、溶媒、希釈剤または担体(それらの組合せも含む)と共に製剤化されてもよいことが理解される。担体、希釈剤、溶媒または賦形剤は、本分子または誘導体と適合性がありそのレシピエントに対して有害ではないという意味で「許容される」ものでなければならない。典型的には、担体は、滅菌済みでパイロジェンフリーの水または塩類溶液(例えば生理食塩水)と予想される。適切な賦形剤としては、マンニトールおよびデキストロースが挙げられる。治療用途に応じた許容される担体、溶媒、希釈剤、および賦形剤は製薬分野でよく知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro編、1985)で説明されている。医薬担体、溶媒、賦形剤または希釈剤は、目的とする投与経路および標準的な製薬上の実施を考慮して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤、溶媒または希釈剤として、またはそれらに加えて、任意の適切な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、または可溶化剤を含んでもよい。保存剤、安定剤、色素、さらには着香剤が医薬組成物に添加されていてもよい。
【００８９】
製剤は、単位剤形で提供されることが便利な場合があり、当技術分野で周知の任意の薬学的方法により調製することができる。このような方法は、本分子を、1つまたは複数の補助的な成分を構成する担体と混合する工程を含む。一般的に、製剤は、活性成分を、液体担体もしくは微粉化した固体担体またはその両方に均一かつ密接に混合し、次に必要に応じて生成物を成形することにより調製される。
【００９０】
本発明に係る経口投与に適した製剤は、それぞれ予め決められた量の活性成分を含むカプセル剤、カシェ剤または錠剤などの個別の単位として;散剤または顆粒剤として;水性液体または非水性液体中の液剤または懸濁剤として;または水中油型液体乳剤または油中水型液体乳剤として提供されてもよい。また活性成分は、ボーラス剤、舐剤またはペースト剤として提供されてもよい。
【００９１】
錠剤は、任意選択で1つまたは複数の補助的な成分と共に、圧縮または成型することにより作製されてもよい。圧縮錠剤は、任意選択で結合剤(例えばポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤(例えばデンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム)、表面活性剤または分散剤と混合して、粉末または顆粒などの自由流動性の形態で活性成分を適切な装置で圧縮することにより調製してもよい。成型錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿潤させた粉末状化合物の混合物を適切な装置で成型することにより作製してもよい。錠剤は、任意選択でコーティングしたり、または刻み目を入れたりしてもよく、さらに、例えば所望の放出プロファイルが達成されるように様々な比率でヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて、内部の活性成分を持続放出または制御放出させるように製剤化してもよい。
【００９２】
口内への局所投与に適した製剤としては、風味付された基剤中に、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に活性成分を含むロゼンジ剤;不活性な基剤中に、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア中に活性成分を含む香錠;および適切な液体担体中に活性成分を含むうがい薬が挙げられる。
【００９３】
非経口投与に適した製剤としては、水性および非水性の滅菌注射液剤(これは、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、および製剤を対象のレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでいてもよい);および水性および非水性の滅菌懸濁剤(これは、懸濁化剤や増粘剤を含んでいてもよい)が挙げられる。このような製剤は、単位用量で、またはマルチドーズコンテナー、例えば密封されたアンプルやバイアル中に提供されてもよく、さらに、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水を添加するだけでよいフリーズドライ(凍結乾燥)した状態で保存されてもよい。即時調製用の注射液剤および懸濁剤は、これまでに述べられたような滅菌散剤、顆粒剤、および錠剤からも調製することができる。
【００９４】
上記で具体的に述べられた成分に加えて、製剤は、対象の製剤のタイプを考慮して当技術分野において一般的な他の物質を含んでいてもよく、例えば経口投与に適した製剤は、着香剤を含んでいてもよい。
【００９５】
本分子またはその誘導体もしくは断片、またはその製剤は、経口、鼻腔内、および非経口(例えば皮下または筋肉内)注射などのあらゆる従来の方法によって投与することができる。好ましい経路としては、経口、静脈内または皮下注射が挙げられる。治療は、単回投与、または所定時間にわたる複数回の投与からなっていてもよい。本分子またはその誘導体は、長期間にわたり、例えば少なくとも2または4または6または8週間にわたり持続放出されるように持続放出製剤に製剤化されてもよい。好ましくは、持続放出は、少なくとも4週間にわたりなされる。
【００９６】
特定の実施形態において、本分子またはその誘導体もしくは断片は、生殖系に直接投与されるように製剤化される。従って、本分子またはその誘導体もしくは断片は、膣坐剤もしくは肛門坐剤、膣内用タンポン、膣内リング、膣内ペッサリー、膣内スポンジ、または薬剤付加子宮内避妊具(IUD)に製剤化されてもよい。
【００９７】
当然のことながら、本発明は、生殖系に直接投与されるように製剤化された、あるいは持続放出を可能にする、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とアンドロゲンまたはエストラジオール受容体との相互作用を阻害または予防する分子、例えば上記で定義された構造Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-RpまたはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rpを含むかまたはそれからなる分子を含む。従って、本発明は、膣坐剤もしくは肛門坐剤;膣内用タンポン;膣内リング;膣内ペッサリー;膣内スポンジ;薬剤付加子宮内避妊具(IUD);または持続放出製剤のいずれかに製剤化された、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とアンドロゲンまたはエストラジオール受容体との相互作用を阻害または予防する分子、例えば構造Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-RpまたはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rpを含むかまたはそれからなる分子またはその誘導体または断片を含む。言い換えれば、本発明は、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とアンドロゲンまたはエストラジオール受容体との相互作用を阻害または予防する分子を含む医薬組成物であって、本分子は、膣坐剤もしくは肛門坐剤;膣内用タンポン;膣内リング;膣内ペッサリー;膣内スポンジ;薬剤付加子宮内避妊具(IUD);または持続放出製剤のいずれかに製剤化するのに適しており、さらに本組成物は、任意選択で、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含んでいてもよい医薬組成物を提供する。
【００９８】
対象に投与される本分子またはその誘導体もしくは断片の量は、特定の対象の状態と闘うのに有効な量である。この量は、医師が決めることができる。
【００９９】
一実施形態において、本分子、例えば上記で定義された構造Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-RpまたはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rpを含むかまたはそれからなる分子は、1〜1000ngの1日用量で、例えば1〜900ng、1〜800ng、1〜700ng、1〜600ng、1〜500ng、1〜400ng、1〜300ng、1〜200ngまたは1〜100ngの1日用量で対象に投与される。従って、本分子、例えば上記で定義された構造Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-RpまたはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rpを含むかまたはそれからなる分子は、少なくとも1ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ngまたは100ngの1日用量で、あるいは少なくとも150ngまたは200ngの1日用量で対象に投与されてもよい。
【０１００】
別の実施形態において、本分子、例えば上記で定義された構造Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-RpまたはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rpを含むかまたはそれからなる分子は、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55または60日間の期間にわたり、さらには少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または18か月もの期間にわたり、あるいは少なくとも2、3、4または5年の期間にわたり、間隔をおいて(例えば1日1回、1日2回または週1回)投与される。本分子または誘導体が間隔をおいて投与される場合、異なる間隔で異なる投与経路を使用することが望ましい場合があることが理解される。例えば、本分子または誘導体をまず注射投与して、それに続く用量を皮下埋め込みにより投与してもよい。最適な投与間隔および治療の持続時間は、一般的に、状態の重症度によって決まると予想される。
【０１０１】
一実施形態において、対象に、本明細書において説明される本分子または誘導体に加えて追加の治療剤が投与される。例えば、特定の状態を予防または治療するために本分子またはその誘導体を投与する場合、その状態を予防または治療するのに有用であることがわかっている追加の治療剤が投与されてもよい。従って、子宮内膜症を予防または治療する場合、追加の治療剤は、子宮内膜症を予防または治療することがわかっている物質であってもよく、子宮類線維症を予防または治療する場合、追加の治療剤は、子宮類線維症を予防または治療することがわかっている物質であってもよく、他も同様である。
【０１０２】
典型的には、ARおよび/またはERの活性が寄与因子である状態は、増殖性障害であり、従って追加の治療剤は、増殖を抑制する任意の物質、例えば細胞増殖抑制剤または細胞殺傷剤または抗癌剤のいずれかであってもよい。
【０１０３】
追加の治療剤は、本明細書において説明される分子またはその誘導体と同時に投与されてもよいし(すなわち、同時投与であり、任意選択で共に製剤化された形態であってもよい)、あるいは本明細書において説明される分子またはその誘導体とは異なる時期に投与されてもよい(すなわち、連続投与であり、この場合、追加の治療剤は、本分子またはその誘導体が投与される前またはその後に投与される)ことが理解される。追加の治療剤は、本明細書において説明される本発明の分子と同じ方法で投与されてもよいし、あるいはその追加の治療剤にとって通常の投与経路を使用して投与されてもよい。
【０１０４】
本発明の第二の態様は、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤と共に、(i)Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とアンドロゲンまたはエストラジオール受容体との相互作用を阻害または予防する分子と、(ii)ARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態を予防または治療するのに適した治療剤とを含む組成物を提供する。本組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤をさらに含む医薬組成物であってもよい。
【０１０５】
本分子、誘導体、追加の治療剤、状態、および治療される対象に関して好ましいものとしては、上記で本発明の第一の態様に関して述べたものが挙げられる。例えば、本分子は、構造:
Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp、もしくはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rp、またはその誘導体もしくは断片
を含むかまたはそれからなっていてもよく、
式中Bは、第一の化学成分であり、jは、0または1であり、nは、1〜10の整数であり、mは、1〜3の整数であり、Rは、第二の化学成分であり、pは、0または1であり、[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]は、[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]のレトロインベルソペプチドである。最も好ましくは、本分子は、構造Ac-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2またはAc-Pro-Pro-Thr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2を有し、式中Acは、アセチル基である。好ましくは、対象はヒトである。好ましくは、追加の治療剤は、子宮内膜症を予防または治療するのに適したものである。
【０１０６】
従って、本発明は、ARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態の予防または治療に使用するための、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤と共に、(i)Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とアンドロゲンまたはエストラジオール受容体との相互作用を阻害または予防する分子と、(ii)ARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態を予防または治療するのに適した治療剤とを含む組成物を含む。本組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤をさらに含む医薬組成物であってもよい。
【０１０７】
同様に、本発明は、ARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態を予防または治療するための医薬の製造における、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤と共に、(i)Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とアンドロゲンまたはエストラジオール受容体との相互作用を阻害または予防する分子と、(ii)ARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態を予防または治療するのに適した治療剤とを含む組成物の使用を含む。本組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤をさらに含む医薬組成物であってもよい。
【０１０８】
本発明は、対象におけるARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態の予防または治療に使用するための、あるいは生殖能力の維持を望む対象におけるARおよび/またはERの活性が寄与因子である癌性状態の予防または治療に使用するための、あるいは対象におけるARおよび/またはERの活性が寄与因子である婦人科系の状態の予防または治療に使用するための、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とアンドロゲンまたはエストラジオール受容体との相互作用を阻害または予防する分子であって、対象がさらに、前記状態を予防または治療するのに適した治療剤も投与される、分子を含むことが理解される。
【０１０９】
同様に、本発明は、対象におけるARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態を予防または治療するための医薬の製造における、あるいは生殖能力の維持を望む対象におけるARおよび/またはERの活性が寄与因子である癌性状態を予防または治療するための、あるいは対象においてARおよび/またはERの活性が寄与因子である婦人科系の状態を予防または治療するための、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とアンドロゲンまたはエストラジオール受容体との相互作用を阻害または予防する分子の使用であって、対象がさらに、ARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態を予防または治療するのに適した治療剤も投与される、使用を含むことが理解される。
【０１１０】
好ましくは、本分子は、構造:
Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp、もしくはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rp、またはその誘導体もしくは断片
を含むかまたはそれからなっていてもよく、
式中Bは、第一の化学成分であり、jは、0または1であり、nは、1〜10の整数であり、mは、1〜3の整数であり、Rは、第二の化学成分であり、pは、0または1であり、[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]は、[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]のレトロインベルソペプチドである。最も好ましくは、本分子は、構造Ac-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2またはAc-Pro-Pro-Thr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2を有し、式中Acは、アセチル基である。
【０１１１】
本発明者らは、SrcファミリーキナーゼとARおよび/またはERとの相互作用を阻害または予防する分子を使用することにより、ARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態を予防または治療することができることを見出した。従って、この相互作用に対する試験物質の効果を評価することにより、非癌性状態を予防または治療する物質を同定することができることが理解される。
【０１１２】
従って、本発明のさらなる態様は、ARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態を予防または治療する物質の選択方法を提供し、本方法は、試験物質が、(a)ARもしくはER、またはSrcファミリーキナーゼに結合することができるその部分と(b)Srcファミリーキナーゼ、またはARもしくはERに結合することができるその部分との相互作用を低減させるかどうかを決定する工程を含む。
【０１１３】
AR、ER、およびSrcファミリーキナーゼ、ならびに非癌性状態に関して好ましいものとしては、上記で本発明の第一の態様に関して定義されたものが挙げられる。
【０１１４】
スクリーニング方法の目的のために、ARもしくはER、またはSrcファミリーキナーゼの全体を用意しなくてもよいことが理解される。Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)に結合することができるARまたはERの部分を使用してもよいし、ARまたはERに結合することができるSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)の部分を使用してもよい。例えば、上述したように、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3およびSH2ドメインはそれぞれ、SrcファミリーキナーゼとARおよびERそれぞれとの相互作用を仲介すると考えられている。従って、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインに相当する部分もしくはARに結合することができるその一部、またはSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH2ドメインに相当する部分もしくはERに結合することができるその一部を使用することができる。同様に、ARのアミノ酸残基377〜386に相当するARの部分は、ARとSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインとの相互作用を仲介すると考えられており、使用が可能である。他の適切な部分は当業者により決定することができ、例えば、Migliaccioら(Oncogene 2007、26:6619)およびMigliaccioら(Cancer Research 2005、65(22):10585〜93)で説明されている。
【０１１５】
試験物質は、ポリペプチド、抗体、小分子、天然産物、ペプチドミメティックまたは核酸などの任意の適切な試験物質であってもよい。当然のことながら、ハイスループットスクリーニングの一環として試験物質のライブラリーをスクリーニングしてもよい。
【０１１６】
様々な技術を使用して、ARまたはERとSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)またはその部分との相互作用に対する試験物質の効果を決定することができ、このような技術は例えば上述したようなものであり、当技術分野で周知である(例えばMigliaccioら(Oncogene 2007、26:6619)およびMigliaccioら(Cancer Research 2005、65(22):10585〜93による)。
【０１１７】
一実施形態において、本方法は、(a)ARもしくはER、またはSrcファミリーキナーゼに結合することができるその部分と(b)Srcファミリーキナーゼ、またはARもしくはERに結合することができるその部分との相互作用を低減させる試験物質を単離する工程を含む。
【０１１８】
好ましくは、選択される試験物質は、(a)ARもしくはER、またはSrcファミリーキナーゼに結合することができるその部分と(b)Srcファミリーキナーゼ、またはARもしくはERに結合することができるその部分との相互作用を、試験物質の非存在下における元の結合の少なくとも10%、20%、30%、40%または50%の割合で、より好ましくは少なくとも60%、70%、80%、90%または95%の割合で低減させる試験物質である。
【０１１９】
一実施形態において、本方法は、試験物質を、ARおよび/またはERの活性が寄与因子である非癌性状態を予防または治療する物質であると同定する工程をさらに含む。例えば、本方法は、対象の特定の状態に適したアッセイ(例えばその状態の動物モデル)で試験物質の有効性を評価する工程をさらに含んでいてもよい。例えば、子宮内膜症モデルでその物質の効果を評価する工程を含む方法を使用して、子宮内膜症を予防または治療する物質を選択することができる。このような状態の適切なモデルは当技術分野で周知である。
【０１２０】
選択される試験物質は、本発明の第一の態様の意味の範囲内でSrcファミリーキナーゼとARまたはERとの相互作用を阻害または予防する物質であり、従ってそのようなものとして使用することができることが理解される。
【０１２１】
本明細書において説明される方法は、薬物のスクリーニング方法(これは当業者に周知の用語である)であってもよく、このような方法において、試験物質は、薬らしい化合物または薬らしい化合物の開発のためのリード化合物であってもよいことが理解される。
【０１２２】
用語「薬らしい化合物」は当業者に周知であり、医薬で使用するのに適したようになる、例えば医薬中の活性成分として使用するのに適したようになる可能性があるという特徴を有する化合物の意味を含んでいてもよい。従って、例えば、薬らしい化合物は、有機化学の技術によって合成することができる分子であってもよいし、あまり好ましくないが分子生物学または生化学の技術によって合成することができる分子であってもよく、好ましくは小分子であり、5000ダルトン未満の小分子であってもよく、さらに水溶性であってもよい。薬らしい化合物は、加えて特定の1種または複数のタンパク質と選択的に相互作用する特徴を示すものでもよいし、さらに生物的に利用可能であり、および/または標的の細胞膜または血液脳関門を通過することができるものでもよいが、これらの特徴は必須ではないことが理解される。
【０１２３】
用語「リード化合物」も同様に当業者に周知であり、このような化合物は、それ自身は薬物として使用するのに適してないが(例えば、その目的とする標的に対して弱い効力しかない、その作用において非選択的である、不安定である、溶解性が低い、合成が難しい、あるいは生物学的利用率が低いという理由で)より望ましい特徴を有する可能性がある他の化合物を設計するための開始点になり得るという意味を含んでいてもよい。
【０１２４】
一実施形態において、本方法は、in vitroで行われる。in vitroは、細胞非含有アッセイと細胞ベースのアッセイの両方を含む。例えば、本方法は、単離されたヒト細胞系で、または実験室で容易に取り扱うことができる細胞系(例えば大腸菌(Escherichia coli)およびサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae))で行ってもよい。
【０１２５】
代替の実施形態において、本方法は、in vivoで行われ、例えば特定の状態(例えば子宮内膜症)の動物モデルで行われる。
【０１２６】
本発明は、実質的に本明細書で説明された通りのあらゆる分子、使用、方法または組成物を提供する。
【０１２７】
ここで以下の図面および実施例を参照しながら本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】投与量決定試験におけるマウスの体重(g)を示す図である。
【図２】投与量決定試験における処置後の病変の増殖(mm2)を示す図である。
【図３−１】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【図３−２】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【図３−３】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【図３−４】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【図３−５】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【図３−６】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【図３−７】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【図３−８】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【図３−９】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【図３−１０】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１２９】
実施例１
ペプチドAc-PPPHPHARIK-NH2は、生殖能力に影響を与えることなく子宮内膜症に対して治療効果を示す
要約
子宮内膜症の治療において、ペプチドAc-PPPHPHARIK-NH2(Table 1〜4(表1〜4)ではValiRx1とも表記される)が生殖能力を低下させることなく有効であることを実証する2つの研究が行われた。
【０１３０】
結果
第一の研究において、新規のin vivo子宮内膜症モデルにおいて、5匹の対照動物で合計4回の処置を行った(Research Horizons、University of Cambridge、2009年版8、GB 0715635.9)。K-rasV12/Ah-CreトランスジェニックマウスをRosa26Rマウスと交雑しKrasV12+/-/Ah-Cre+/-/ROSA26R-LacZ+/-トランスジェニックマウスを作製した。F1世代を同系交配して、F2のK-rasV12+/-/Ah-Cre+/+/ROSA26R-LacZ+/+トランスジェニックマウスを作製した。導入遺伝子の存在を、K-ras、Cre、およびRosa26R-LacZの遺伝子特異的なプライマーを使用したPCRによって決定した。前もってホルモン等で処置したドナー動物から組織を回収し、野生型動物に分配し、次いで薬物またはビヒクルを21日間注射した。
【０１３１】
合計4匹の処置済みの動物のうち3匹は処置後に病変が完全になくなり、1匹は応答しなかったことが示された。合計5匹の動物の対照群のうち1匹において病変が発達しなかった。
【０１３２】
健康なマウスの繁殖に対するペプチドの効果と、同じ動物に再移植された子宮から得られた自家移植病変に対する有効性とを評価するために、第二の研究を設計した(Beckerら、AM J Pathol 178(4):1782〜91)。
【０１３３】
発情周期
8〜10週齢の未経産の雌C57BL6マウスを1週間順化させた。動物10匹の群は、実験前の3日間、10ngのペプチドを皮下注射することにより処置され、対照10匹の群は、ビヒクルのみが投与された。膣塗抹標本を10日間毎日採取した。全ての場合で正常塗抹標本を得た。
【０１３４】
交配(雌の処置群)
8〜10週齢の未経産の雌C57BL6マウスを1週間順化させた。雌動物10匹の群は、実験前の3日間、10ngのペプチドを皮下注射することにより処置され、動物10匹の対照群は、ビヒクルのみで処置された。
【０１３５】
5匹の雄C57BL6動物を導入し、雌を粘液栓について毎日チェックした(午前9時前に)。粘液栓が記録されたら、雌を以下について評価した:
a)妊娠可能な期間の長さ(日)
b)子孫の数
c)子孫の奇形。
【０１３６】
全ての動物が正常な同腹子を出産した(ただし投薬を受けた群のうち1つを除く)
【０１３７】
交配(雄の処置群)
8〜10週齢の未経産のC57BL6マウスを1週間順化させた。雄動物5匹の群は、実験前の3日間、10ngのペプチドを皮下注射することにより処置され、動物5匹の対照群は、ビヒクルのみが投与された(10ngを1日1回皮下投与)。
【０１３８】
各群に10匹の未処置の雌C57BL6動物を導入し、雌を粘液栓について毎日チェックした(午前9時前に)。粘液栓が記録されたら、雌を以下について評価した:
a)妊娠可能な期間の長さ(日)
b)子孫の数
c)子孫の奇形。
【０１３９】
上述したように全ての動物が正常な同腹子を出産した。
【０１４０】
交配(処置済みの雌から2世代)
投薬を受けた雌からの子孫を交配し、生殖能力についてチェックし、遺伝する可能性のある効果を決定した。上述したように栓形成について動物を評価したところ、異常は認められなかった。
【０１４１】
投与量決定のための予防的研究
順化1週間後に、8〜10週齢の未経産の雌C57BL6マウスにそれぞれドナー動物からの子宮組織栓(6×)を移植した。動物5匹の3つの群は、ARPペプチドを1ng、10ngまたは100ngのペプチド量で皮下注射することによる1日1回の投与がすぐに開始され、動物5匹の対照群は、ビヒクルのみで処置された。投薬を受けた群における処置後の病変の増殖は、対照群と比較して有意に抑制された(図2を参照)。
【０１４２】
このモデルは、優れた病変を構築した(97.67%〜100%、Table 4(表4))。病変量の減少(7.18mm2に対して、6.02mm2、5.53mm2、および4.52mm2、Table 2(表2))、および増殖の減少(7.18mm2に対して、6.23mm2、5.72mm2、および4.52、Table 3(表3))。
【０１４３】
用量に関しては、外科手術前の2〜3日間エストロゲンを1回注射することにより発情周期を同調させるという選択肢もある。
【０１４４】
図1および図2ならびにTable 1〜4(表1〜4)に上述の実験から得られたデータを記載する。
【０１４５】
【表１】
2018012723.tif 000002
【０１４６】
【表２】
2018012723.tif 000003
【０１４７】
【表３】
2018012723.tif 000004
【０１４８】
【表４】
2018012723.tif 000005
【図１】
2018012723.tif 000006
【図２】
2018012723.tif 000007
【図３−１】
2018012723.tif 000008
【図３−２】
2018012723.tif 000009
【図３−３】
2018012723.tif 000010
【図３−４】
2018012723.tif 000011
【図３−５】
2018012723.tif 000012
【図３−６】
2018012723.tif 000013
【図３−７】
2018012723.tif 000014
【図３−８】
2018012723.tif 000015
【図３−９】
2018012723.tif 000016
【図３−１０】
2018012723.tif 000017
【配列表】
2018012723000001.app
【外国語明細書】
2018012723000001.pdf