(57)【要約】【課題】  疥癬を効率的に検査しうる方法、並びにそれに用いる薬剤及びデバイスを提供すること。【解決手段】  ヒトの疥癬の原因であるヒトヒゼンダニに由来するビテロジェニン様たん白質を抗原とする抗体を作製した。そして、該抗体を用いた、イムノクロマトグラフィー等の免疫学的手法により、ヒトに寄生するヒトヒゼンダニのみならず、他の動物に寄生するヒゼンダニをも精度高く検出できることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体から分離された試料に、ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質を認識する抗体を接触させ、該試料における該ビテロジェニン様たん白質を免疫学的に検出することを特徴とする、疥癬の検査方法。
【請求項２】
前記免疫学な検出をイムノクロマトグラフィーにより行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質を認識する抗体を含む、疥癬を検査するための薬剤。
【請求項４】
前記抗体に標識物質が付加されている、請求項３に記載の薬剤。
【請求項５】
ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質を認識する抗体が固定化されている担体を含む、疥癬を検査するためのデバイス。
【請求項６】
イムノクロマトグラフィーにより疥癬を検査するためのデバイスであって、前記担体がクロマト展開用膜担体であり、前記抗体が該担体に固定化されて検出部を構成する、請求項５に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疥癬の検査方法、並びにそれに用いる薬剤及びデバイスに関し、より詳しくは、ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質を認識する抗体を用いた疥癬の検査方法、並びに前記抗体を含む疥癬を検査するための薬剤及びデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
疥癬は、ヒゼンダニ（疥癬虫、Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ）という小さなダニが人の皮膚の角質層に寄生しておこる皮膚疾患である。その感染・発症は、老若男女問わず幅広い年齢層で見られるが、発症者の殆どは、免疫力が低下した高齢者である。そのため、最近は、老人病院や養護老人ホーム等の急増に伴い、老人とその介護者に発症が増える傾向にある。特に、高齢者や免疫不全者等に見られるノルウエー疥癬（角化型疥癬）では寄生するヒゼンダニ数が通常疥癬の１０００倍以上となり、治療が困難になることも多い。また、疥癬は、湿疹等の他の皮膚疾患と誤って診断されるケースが多い。そして、このような場合、ステロイド剤が疥癬患者に誤って処方され、該薬剤投与による免疫抑制によって症状の悪化を引き起こすことが多々あり、ひいては重篤型の前記ノルウエー疥癬に移行してしまうこともある。このような疥癬における誤診による症状の悪化は、養護老人ホームといった閉鎖環境と相俟って集団感染を引き起こす例も報告されており、今後の超高齢化社会における大きな問題として懸念されている。
【０００３】
この背景には、疥癬の診断が、ダーマスコープによる疥癬トンネル（ヒゼンダニの通り道）の確認といった皮膚表面の目視と、皮膚組織の顕微鏡診断という旧態依然の方法にのみ依拠していることが考えられる。また、現実には皮膚科医が現場で運よく診察する機会は限られるため、他科の医師に見過ごされたり他の皮膚疾患と誤診されたりすることが原因にあると考えられる。さらに、疥癬の検出確率は、５０％以下であるとの報告もある（非特許文献１）。そのため、疥癬の精度の高い検査法の確立が希求されている。
【０００４】
また、養護老人ホーム等の介護現場では、疥癬の診断を現場で迅速にできず皮膚科医のいる病院に搬送することが必要である。入居老人が皮膚科医を受診する場合、家族側もその都度、対応が必要な場合もあり負担となる。スタッフ側は搬送する手間や時間的拘束もあり、いったん施設で蔓延すると収拾対策コストも経営を圧迫する場合もある。そのため、インフルエンザの検査並みの迅速な検査を待望する家族や養護老人ホーム等からの切実なる意見もある。
【０００５】
このような状況下、医師の指示のもと看護職や介護職のスタッフでも簡便かつ容易に取り扱うことができる感染の検査方法が構築できれば、医療現場において、疥癬の診断を極めて効率的に行うことが可能となる。このことは、ひいては、患者のみならず介護関係者の現場の負担軽減や経営コストの低減、患者家族の負担軽減にもつながり、社会的意義が大きい。しかしながら、そのような疥癬の検査方法が確立されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｈｅｌｌｅｙ  Ｆ．Ｗａｌｔｏｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００７年、２０巻、２号、２６８〜２７９ページ
【非特許文献２】Ｋａｔｊａ  Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．、２００３年、６８巻、１号、６１〜６４ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、疥癬を効率的に検査しうる方法、並びにそれに用いる薬剤及びデバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、感染部位に残存するヒゼンダニ由来の物質を抗原・抗体反応によって検出する方法につき鋭意検討を行った。
【０００９】
ヒゼンダニは、１匹の雌から約１０個の卵が表皮の疥癬トンネル内に産卵される。そのため、成虫がいなくとも卵の抜け殻だけが表皮中に残存していることが想定される。そこで、検出対象として、卵の構成成分として推定されるたん白質の中でもビテロジェニン様たん白質に着目し、これを抗原とする抗体の作製を試みた。
【００１０】
ヒトに感染するヒゼンダニ（ヒトヒゼンダニ）由来のビテロジェニン様たん白質をコードする遺伝子の部分ヌクレオチド配列については、非特許文献２において報告されている。本発明者らは、この配列がコードするアミノ酸配列（１７４アミノ酸）から、疎水性、親水性、表面露出度等を考慮した独自のアルゴリズムに基づき、２９アミノ酸からなるペプチドを抗原として選抜し、該ペプチドをウサギに免疫してポリクローナル抗体を作製した。
【００１１】
そして、得られた抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体を用い、ウエスタンブロッティングを行ったところ、驚くべきことに、ヒトヒゼンダニのみならず、タヌキに寄生するヒゼンダニ（タヌキヒゼンダニ）も検出できることが明らかになった。
【００１２】
さらに、ウエスタンブロッティングのみならず、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体を用いたイムノクロマトグラフィーによっても、ヒトヒゼンダニ及びタヌキヒゼンダニを検出できることを見出した。イムノクロマトグラフィーは、短時間で一連の抗原・抗体反応を同時に行うことができることから、前記抗体を用いたイムノクロマトグラフィーによって、効率的にヒゼンダニの存在を検出できることも明らかになった。
【００１３】
また、前記イムノクロマトグラフィーにおいて、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体は、家屋内等のヒトの身近に生息するチリダニについては認識しなかった。このことから、当該抗体はヒゼンダニを極めて特異性高く検出できることも見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質を認識する抗体を用いた疥癬の検査方法、並びに前記抗体を含む疥癬を検査するための薬剤及びデバイスに関するものであり、より詳しくは、以下を提供するものである。
＜１＞  被検体から分離された試料に、ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質を認識する抗体を接触させ、該試料における該ビテロジェニン様たん白質を免疫学的に検出することを特徴とする、疥癬の検査方法。
＜２＞  前記免疫学な検出をイムノクロマトグラフィーにより行う、＜１＞に記載の方法。
＜３＞  ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質を認識する抗体を含む、疥癬を検査するための薬剤。
＜４＞  前記抗体に標識物質が付加されている、＜３＞に記載の薬剤。
＜５＞  ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質を認識する抗体が固定化されている担体を含む、疥癬を検査するためのデバイス。
＜６＞  イムノクロマトグラフィーにより疥癬を検査するためのデバイスであって、前記担体がクロマト展開用膜担体であり、前記抗体が該担体に固定化されて検出部を構成する、＜５＞に記載のデバイス。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ヒトヒゼンダニに由来するビテロジェニン様たん白質に対する抗体を利用した免疫学的手法によって、疥癬を効率的に検査することが可能となる。また、本発明によれば、異なる動物に寄生するヒゼンダニをも検出することができるため、汎用性が高い。さらに、本発明において、イムノクロマトグラフィーを用いることにより、精度のみならず、簡便、容易かつ迅速に疥癬を検査することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の疥癬をイムノクロマトグラフィーにより検査するためのデバイスの好適な一実施形態を示す、概略平面図である。
【図２】図１で示されたデバイスを図１のＩ−II線に沿って切断した場合の切断面を示す、概略縦断部端面図である。
【図３】図１で示されたデバイスを収納するためのケースの好適な一実施形態を示す、概略平面図である。
【図４】図３で示されたケースを図３のＩ−II線に沿って切断した場合の切断面を示す、概略縦断部端面図である。
【図５】ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質の部分ペプチド（リコンビナントヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質）を発現させた大腸菌を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した結果を示す、写真である。図中、レーン１は、前記たん白質を発現させていない大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ）のライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果を示し、レーン２は、前記たん白質を発現させた大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＥＴ−ｅＸ−ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ  Ｃ）のライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果を示し、レーンＭは分子量を示すマーカーレーンである（図中の表記については、図６においても同様）。
【図６】抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体を用いたウエスタンブロッティングによって、リコンビナントヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質を検出した結果を示す、写真である。
【図７】抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体を用いたウエスタンブロッティングによって、タヌキヒゼンダニ成虫と卵のライセート中のビテロジェニン様たん白質を検出した結果を示す、写真である。図中、レーン１は、タヌキヒゼンダニ成虫のライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果を示し、レーン２は、タヌキヒゼンダニ卵のライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果を示し、レーンＭは分子量を示すマーカーレーンである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
＜疥癬の検査方法＞
本発明は、被検体から分離された試料に、ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質を認識する抗体（以下、「抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体」とも称する）を接触させ、該試料における該ビテロジェニン様たん白質を免疫学的に検出することを特徴とする、疥癬の検査方法を提供する。
【００１８】
本発明において「ヒゼンダニ」とは、無気門亜目ヒゼンダニ科に属するダニ（学名：Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ）を意味し、「ヒトヒゼンダニ」とはヒトに寄生するヒゼンダニを意味する。また「疥癬」とは、ヒゼンダニが寄生して生じる皮膚疾患を意味し、一般的な疥癬（通常疥癬）のみならず、より重篤な疥癬（ノルウェー疥癬、角化型疥癬、痂皮型疥癬）も含む意である。
【００１９】
本発明における「ビテロジェニン様たん白質」は、ヒゼンダニの卵を構成すると推定されるたん白質の一つである。ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質（以下「ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質」とも称する）は、典型的に、配列番号：１に記載のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＡＯ１５６１１にて特定されるアミノ酸配列）を含むたん白質である。また、自然界においてヌクレオチド配列が変異することにより、たん白質のアミノ酸配列の変化が生じ得ることは理解されたい。
【００２０】
本発明の検査に供される「被検体」は、疥癬に罹患している動物のみならず、疥癬に罹患している疑いのある動物を含む意である。ここで「動物」とは、ヒゼンダニが寄生し得る動物であればよく、例えば、哺乳類、鳥類が挙げられ、より具体的には、ヒト、タヌキ、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、インコ、ニワトリが挙げられる。「試料」としては、ヒゼンダニが存在し得る試料である限り特に制限はなく、例えば、前記動物由来の皮膚組織（皮膚擦過、皮膚落屑等）、該組織から抽出されたヒゼンダニ含有画分が挙げられる。皮膚組織からのヒゼンダニ含有画分抽出方法としては特に制限はなく、例えば、後述の実施例に記載のように、皮膚組織をたん白質分解酵素（パパイン等）及び界面活性剤（ＳＤＳ）にて処理した後に、濾過処理を施す工程を含む方法が挙げられる。
【００２１】
本発明の疥癬を検査する方法としては、公知の抗体を用いて検出する方法（免疫学的手法）を用いることができる。免疫学的手法としては、イムノクロマトグラフィー、ウエスタンブロッティング、ラテックス凝集法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー、イメージングサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学的染色法、免疫沈降法、抗体アレイを用いた解析法が挙げられる。本発明に用いる免疫学的手法としては、簡便、容易かつ迅速に抗原を検出できるという観点から、イムノクロマトグラフィーが好適である。
【００２２】
本発明において用いられる「抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体」は、ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質を認識する限り、特に制限はないが、好ましくは、ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質において配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体であり、より好ましくは、ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質において配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体である。ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質を認識するか否かは、例えば、後述の実施例に記載の通り、当業者であれば、免疫学的手法（ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング、イムノクロマトグラフィー等）を用いて評価することが可能である。
【００２３】
本発明において用いられる抗体は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ等のいずれのアイソタイプであってもよい。このような抗体はまた、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体（例、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体）、それらの抗体断片であってもよい。抗体断片は、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディー等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
ポリクローナル抗体の作製においては、後述の実施例に記載のように、抗原（ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質、その部分ペプチド、またはこれらを発現する細胞等）で免疫動物（ウサギ、ラット、マウス、ニワトリ、ハムスター、サル、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ラクダ、アルパカ等）に抗原として精製したヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質やその部分ペプチドを免疫（繰り返し注入等）することにより、免疫反応によって、ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質を認識する抗体を産生させる。次いで、動物から血液（抗血清）を採取すればよい。またその抗血清から、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離、透析等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより、抗体を精製してもよい。
【００２５】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法等、公知の方法によって作製することができる。
【００２６】
ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原（ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質、その部分ペプチド、またはこれらを発現する細胞等）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ラクダ、アルパカ、ニワトリ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球等である。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球等に対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質を認識するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
【００２７】
組換えＤＮＡ法は、上記抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば、哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ  Ａ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７−７７５（１９９０））。抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（ＷＯ９４／１１５２３号公報  参照）。組換え抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内または培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
【００２８】
本発明において用いられる抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体としては、標識物質を付加させた抗体を使用することができる。標識物質としては、抗体に付加させて検出できるものであれば特に制限はないが、例えば、後述の呈色標識物質、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、βガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）等の酵素、１２５Ｉ等の放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）等の蛍光色素、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）やフィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）等の蛍光蛋白質、アビジン、ビオチンが挙げられる。なお、標識物質として酵素を用いた場合には、基質として、発色基質、蛍光基質、あるいは化学発光基質等を添加することにより、基質に応じて種々の検出を行うことができる。
【００２９】
標識物質を付加させた抗体を用いて直接的にヒゼンダニビテロジェニン様たん白質を検出する方法以外に、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体には標識物質を結合せず、標識物質が結合した二次抗体等を利用して間接的に検出する方法を利用することもできる。ここで「二次抗体」とは、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体に対して反応性を示す抗体である。例えば、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体をウサギ抗体として調製した場合には、二次抗体として抗ウサギＩｇＧ抗体を使用することができる。ヤギ、マウス、ラット等の様々な生物種に由来する抗体に対して、使用可能な標識二次抗体が市販されており、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体の由来する生物種に応じて、適切な二次抗体を選択して使用することができる。二次抗体に代えて、標識物質を結合させたプロテインＧやプロテインＡ等を用いることも可能である。
【００３０】
抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体と標識物質との付加には、ビオチン−アビジン系を利用することもできる。この方法においては、例えば、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体をビオチン化し、これに、アビジン化した標識物質を作用させ、ビオチンとアビジンの相互作用を利用して、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体に標識物質を付加させる。
【００３１】
本発明において用いられる抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体としては、担体に固定化されている抗体も使用することができる。担体としては、例えば、磁性粒子やラテックス粒子等の粒子、プラスチックプレート等のプレート、ニトロセルロース等の繊維状物質を用いることができる。
【００３２】
抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体は担体に直接固定してもよいが、間接的に固定してもよい。例えば、当該抗体に結合する物質を担体に固定し、当該物質に前記抗体を結合させることにより、前記抗体を担体に間接的に固定することができる。前記抗体に結合する物質としては、例えば、上記の二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡ等が挙げられるが、これらに制限されない。また、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体がビオチン化されている場合には、アビジン化した担体を利用することができる。
【００３３】
＜疥癬を検査するための薬剤、デバイス等＞
本発明は、疥癬を検査するための薬剤であって、上述の抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体を含む薬剤を提供する。本発明の薬剤に含まれる抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体は、上述の通り、標識物質が結合したものであってもよい。
【００３４】
また、本発明は、疥癬を検査するためのデバイスであって、上述の抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体を含むデバイスを提供する。本発明のデバイスに含まれる抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体は、上述の通り、担体に固定化しているものであってもよい。
【００３５】
また、本発明の薬剤及びデバイスにおいては、抗体の他、必要に応じて、滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、保存剤等、他の成分を含むことができる。
【００３６】
また、本発明は、疥癬を検査するためのキットを提供する。本発明のキットは、少なくとも上述の抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体を抗体標品として含むが、さらに、ビテロジェニン様たん白質等の対照試薬、試料の調製液、試料の希釈液、洗浄液等を組み合わせることができる。酵素標識を利用した場合には、標識の検出に必要な基質や反応停止液等を含めることができる。また、抗体を標識しない場合には、例えば、当該抗体に付加する物質を標識したものをキットに含めることができる。また、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体がビオチン化されている場合には、例えば、アビジン化された標識物質をキットに含めることができる。本発明のキットには、さらに、当該キットの使用説明書を含めることができる。
【００３７】
本発明の薬剤、デバイス、キットは、例えば、体外診断用医薬品として、疥癬の検査に利用することができる。
【００３８】
＜イムノクロマトグラフィー用デバイス＞
本発明の疥癬を検査するためのデバイスの好適な一態様として、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体が固定化されているクロマト展開用膜担体を含み、前記抗体が該担体に固定化されて検出部を構成する、イムノクロマトグラフィー用デバイス（以下「イムノクロマトグラフィー用デバイス」とも称する）が挙げられる。
【００３９】
本発明において、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体が固定化されている「クロマト展開用膜担体」としては、抗体を固定化することができ、かつイムノクロマトグラフィーに供される試料を毛細管現象により展開できる材質からなる膜であればよい。かかる材質としては、例えば、ニトロセルロース等のセルロース類、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン類、ガラスファイバーが挙げられる。また、本発明の膜担体の孔径は、特に制限されることなく、試料の展開速度等を考慮して適宜調節すればよく、例えば、０．１〜１０μｍである。
【００４０】
膜担体における「検出部」とは、当該膜担体において展開された試料中のヒゼンダニビテロジェニン様たん白質又はその部分ペプチドを捕捉し、検出するための部位である。したがって、「検出部」は、膜担体において下流側に配置されている必要がある。なお、本発明において、上流側及び下流側とは、試料が膜担体を展開していく流れの上流側（後述の図１及び２においては、左側）及び下流側（後述の図１及び２においては、右側）を各々意味する。また、検出部の形状としては特に制限はなく、例えば、円状であってもよく、膜担体を横断するライン状であってもよい。
【００４１】
また「検出部」は、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体が固定化されて構成される部位であるが、固定化の方法としては特に制限はなく、例えば、物理吸着、静電的相互作用、疎水的相互作用又は架橋剤を利用する方法が挙げられる。また、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体の固定化量は、膜担体の材質、該抗体との結合性、後述の標識物質の種類等に合わせて適宜調整すればよく、例えば、１ｎｇ〜１μｇである。
【００４２】
本発明のイムノクロマトグラフィーにおいては、前述の抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体（以下「捕捉用抗体」とも称する）が固定化されているクロマト展開用膜担体において、上述の試料を、標識物質が付加されている抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体（以下「標識抗体」とも称する）に接触させた後、当該試料を前記検出部に向けて展開させ、当該検出部において前記標識物質を検出する。
【００４３】
本発明のイムノクロマトグラフィーにおいて、捕捉用抗体と標識抗体とは共にヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質を認識する限り、同一の抗体であってもよく、異なる抗体であってもよいが、ヒゼンダニビテロジェニン様たん白質を非競合的に捕捉、検出することができるという観点から、異なる抗体であることが好ましい。異なる抗体としては、例えば、捕捉用抗体が抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質モノクローナル抗体であり、標識抗体が当該捕捉用抗体の認識する部位（エピトープ）とは異なる部位を認識する抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質モノクローナル抗体であるという組み合わせが挙げられる。
【００４４】
抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体に付加される「標識物質」としては、上述の通りであるが、好ましくは、呈色標識物質である。呈色標識物質としては、例えば、金コロイド、白金コロイド、銀コロイド、セレンコロイド、テルルコロイド等のコロイド状金属、赤色及び青色等のそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックス等の合成ラテックス及び天然ゴムラテックス（着色ラテックス）が挙げられる。
【００４５】
試料と標識抗体との「接触」については、膜担体に導入された試料が前記検出部に達するまでに行われていればよく、例えば、試料をイムノクロマトグラフィー用デバイスに導入する前に、標識抗体を添加することで接触させてもよく、試料を後述の標識抗体含有部材中を通過させることによって接触させてもよい。
【００４６】
本発明において、試料と標識抗体とを毛細管現象により効率良く展開させるために、展開液を用いてもよい。展開液としては、例えば、たん白質、多糖類、界面活性剤、有機溶媒及びポリマー等の中から少なくとも1種を含む緩衝液が挙げられる。展開液は、試料と混合した上でイムノクロマトグラフィー用デバイスに導入してもよく、また試料等をイムノクロマトグラフィー用デバイスに導入した後に、当該デバイスの上流側から導入してもよい。
【００４７】
そして、試料中にヒゼンダニビテロジェニン様たん白質及びその部分ペプチドが含まれていれば、前記接触により形成される当該ヒゼンダニビテロジェニン様たん白質等と標識抗体との複合体が、前記検出部の捕捉用抗体に捕捉されることにより、当該標識物質が当該検出部に集積することになる。
【００４８】
したがって、本発明のイムノクロマトグラフィー用デバイスによれば、検出部における標識物質を検出することにより、試料中のヒゼンダニビテロジェニン様たん白質の有無、ひいてはヒゼンダニの有無を判断することができる。「標識物質の検出」は、標識物質が前記呈色標識物質であれば、当該検出部における当該標識物質の集積により生じる着色を目視にて確認することにより行うことができる。また、酵素標識物質であれば、当該酵素の発色基質を検出ラインに添加することにより生じる発色を目視にて確認することにより行うことができる。かかる発色基質としては、酵素標識物質としてＨＲＰを用いる場合には、例えば、４−クロロ−１−ナフトール、ＡＢＴＳ、Ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）が挙げられる。
【００４９】
本発明のイムノクロマトグラフィー用デバイスは、前述の抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体が固定化されているクロマト展開用膜担体の他、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１の構成要素とを備えるデバイスであってもよい。
（ａ）  試料添加用部材
（ｂ）  標識抗体含有部材
（ｃ）  吸収用部材
（ｄ）  支持体。
【００５０】
このような本発明のデバイスの好適な一例を図１及び２に示す。図１は、かかるデバイスの概略平面図であり、図２は、図１に示すデバイスを図１のＩ−II線に沿って切断した場合の切断面を示す概略縦断部端面図である。以下、これら図面を参照しながら本発明のデバイスについて説明する。
【００５１】
クロマト展開用膜担体３については上述の通りであるが、図１及び２に示す通り、上述の検出部３１の他、コントロールライン３２を備えていてもよい。
【００５２】
コントロールライン３２は、前述の標識抗体を捕捉するための部分であるため、前記標識物質が検出部３１では検出されず、コントロールライン３２のみにて検出された場合には、試料中にヒゼンダニビテロジェニン様たん白質は存在していないと判定することができる。また、コントロールライン３２には、前述の標識抗体を捕捉するために、当該抗体と特異的に結合する分子（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体、レクチン、アプタマー）が固定化される。
【００５３】
試料添加用部材５は、本発明のイムノクロマトグラフィー用デバイスに導入された試料や展開液等を保持、通過させるための部分である。したがって、当該デバイスにおいて、試料添加用部材５は、直接又は間接的にクロマト展開用膜担体３に接し、かつクロマト展開用膜担体３の上流側に配置されている必要がある。
【００５４】
標識抗体含有部材２は、上述の標識抗体を含有しており、当該標識抗体と試料とを接触させるための部分である。したがって、本発明のイムノクロマトグラフィー用デバイスにおいて、標識抗体含有部材２は、直接又は間接的に試料添加用部材５及びクロマト展開用膜担体３に接し、かつ試料添加用部材５の下流側及びクロマト展開用膜担体３の上流側に配置されている必要がある。
【００５５】
吸収用部材４は、膜担体を通過してきた余剰の試料や展開液等を吸収することにより、膜担体における試料の展開を促進しつつ、逆流を抑制するための部分である。したがって、本発明のイムノクロマトグラフィー用デバイスにおいて、吸収用部材４は、直接又は間接的にクロマト展開用膜担体３に接し、かつクロマト展開用膜担体３の下流側に配置されている必要がある。
【００５６】
標識抗体含有部材２、吸収用部材４、試料添加用部材５の材質としては、特に限定されず、ニトロセルロース等のセルロース類、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン類、グラスファイバーが挙げられる。
【００５７】
本発明のイムノクロマトグラフィー用デバイスにおいては、図１及び２に示す通り、上述の標識抗体含有部材２、クロマト展開用膜担体３、吸収用部材４又は試料添加用部材５を保持するために、支持体１を備えてもよい。支持体１の材質は、成形の容易さ、コスト、軽量性の点でプラスチックであることが好ましい。プラスチックの材質としては、種々のプラスチック材料を選択することが可能であり、使用する用途、処理、使用する溶媒、生理活性物質、検出方法の特性に合わせて、成形性、耐熱性、耐薬品性、吸着性等を考慮し適宜に選択される。例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアセテート、ビニル−アセテート共重合体、スチレン−メチルメタアクリレート共重合体、アクリルニトリル−スチレン共重合体、アクリルニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、ナイロン、ポリメチルペンテン、シリコン樹脂、アミノ樹脂、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ポリエーテルイミド、フッ素樹脂、ポリイミド等が挙げられる。また、これらのプラスチック材料に、顔料、染料、酸化防止剤、難燃剤等の添加物を適宜混合してもよい。
【００５８】
さらに、本発明のイムノクロマトグラフィー用デバイスにおいては、図３及び４に示す通り、上述のクロマト展開用膜担体３等を固定、保存するためのケース６（容器本体６１及び蓋体６２）を備えていてもよい。
【００５９】
容器本体６１及び蓋体６２の母材には、成形の容易さ、コスト、軽量性の点でプラスチックであることが好ましい。プラスチックの材質としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアセテート、ビニル−アセテート共重合体、スチレン−メチルメタアクリレート共重合体、アクリルニトリル−スチレン共重合体、アクリルニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、ナイロン、ポリメチルペンテン、シリコン樹脂、アミノ樹脂、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ポリエーテルイミド、フッ素樹脂、ポリイミド等が挙げられる。また、これらのプラスチック材料に、顔料、染料、酸化防止剤、難燃剤等の添加物を適宜混合してもよい。
【００６０】
また、容器本体６１及び蓋体６２には、支持体１、標識抗体含有部材２、クロマト展開用膜担体３、吸収用部材４、試料添加用部材５等の内容物を固定するための構造物を適宜形成することができる。
【００６１】
また、本発明のイムノクロマトグラフィー用デバイスにおいては、図３及び４に示す通り、蓋体６２には、試料注入口６２１又は判定窓６２２が形成されていてもよい。
【００６２】
試料注入口６２１は、イムノクロマトグラフィーに供するための試料が導入されるための部分であり、その形状について特に制限はない。
【００６３】
判定窓６２２は、クロマト展開用膜担体３における検出部３１及びコントロールライン３２を視認し、試料中のヒゼンダニビテロジェニン様たん白質の有無の判定等を行うための部分である。判定窓６２２は、例えば、蓋体６２がその厚さ方向に貫通されることによって形成されるものであってもよく、その形状については特に制限はない。さらに、この貫通孔に透明のプラスチック板やフィルムが付加されていてもよい。
【００６４】
さらに、本発明のイムノクロマトグラフィー用デバイスにおいては、図には示さないが、空気穴を備えていてもよい。空気穴は、前記ケース内の空気を排出するための部分であり、これにより、試料添加用部材５による試料の吸収効率を向上させ、ひいてはクロマト展開用膜担体３における試料の迅速な展開を可能とする。空気穴は、蓋体６２がその厚さ方向に貫通されることによって形成されるものであればよく、その形状、個数、場所については特に制限はない。
【００６５】
本発明のイムノクロマトグラフィー用デバイスの大きさについて、特に制限はないが、例えば、図３及び４において示されるデバイス（ケース）の大きさとしては、長さ５〜１１ｃｍ、幅１〜３ｃｍ、高さ０．２〜１．５ｃｍが挙げられる。
【００６６】
以上、本発明のイムノクロマトグラフィー用デバイスの好適な実施形態について説明したが、本発明のデバイスは上記実施形態に限定されるものではない。当業者であれば、上記を参酌しながら、デバイスの構成、材質、構造等について、適宜応用、変形、追加等を加えることができる。
【００６７】
また、本発明はイムノクロマトグラフィー用のキットも提供する。本発明のイムノクロマトグラフィー用キットは、少なくとも上述のイムノクロマトグラフィー用デバイスを含むが、その他にビテロジェニン様たん白質等の対照試薬、試料の調製液、展開液等を組み合わせることができ、酵素標識を利用した場合には、標識の検出に必要な基質や反応停止液等を含めることができる。また、本発明のイムノクロマトグラフィー用デバイスが標識抗体含有部材を備えないデバイスである場合には、標識物質が付加されている抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体をキットに含めてもよい。さらに、本発明のキットには、当該キットの使用説明書を含めることができる。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６９】
本発明者らは、精度の高い疥癬検査を可能にすべく、以下に示す通り、免疫学的手法によって、感染部位に残存するヒゼンダニ由来の物質を検出することを試みた。
１．ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗原の調製
疥癬の感染部位である表皮中には、ヒゼンダニが産んだ卵及びその抜け殻が残存していることが想定される。そこで先ず、この卵を構成するたん白質として推定されるビテロジェニン様たん白質を検出対象として選択し、それを抗原とする抗体の作製を試みた。
【００７０】
ヒトに感染するヒゼンダニ（ヒトヒゼンダニ）由来のビテロジェニン様たん白質（部分ペプチド）をコードするヌクレオチド配列は、非特許文献２において、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ４６２１９４にて規定される配列として報告されている。そこで、本発明者らは、この配列がコードするアミノ酸配列情報（１７４アミノ酸、配列番号：１）から、疎水性、親水性、表面露出度等を考慮した独自のアルゴリズムに基づき、２９アミノ酸（ＫＷＳＡＥＴＲＴＮＮＬＲＱＩＡＲＱＡＡＱＥＥＡＡＲＱＱＱＭ（配列番号：３））からなる、分子量３５１７. ８７のペプチドを抗原として選択した。そして、常法通り、前記ペプチドのＮ末端側にシステインを付加した３０アミノ酸のペプチドを化学合成し、さらにキャリアたん白質としてＫＬＨたん白質と架橋反応によって化学結合させることにより、抗原として調製した。
【００７１】
２．抗ビテロジェニン様たん白質ウサギ抗体の作製
前記ＫＬＨ−ペプチド抗原をウサギ（日本白色種）に免疫して抗血清を取得した。取得した抗血清については、前記抗原を固相化したプレートを用いたＥＬＩＳＡ法により抗体価を測定した。そして、抗体価の上昇が認められた抗血清（以下「抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体含有抗血清」とも称する）については、後述のウエスタンブロッティング及びイムノクロマトグラフィー等に供するまで、凍結保存した。
【００７２】
３．リコンビナントビテロジェニン様たん白質の調製
前記にて調製したポリクローナル抗体によってビテロジェニン様たん白質を検出できるかを試験するために、後述の通り、ウエスタンブロッティング及びイムノクロマトグラフィーを行った。そのために先ず、それら方法における検出対象として、以下の通りにリコンビナントたん白質を調製した。
【００７３】
具体的には、前記検出対象のリコンビナントたん白質として、ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質のうち以下の９７アミノ酸配列（配列番号：２）を選択した。
ＰＳＴＴＴＲＮＧＫＹＳＶＰＩＹＥＰＦＳＲＬＭＤＫＷＳＡＥＴＲＴＮＮＬＲＱＩＡＲＱＡＡＱＥＥＡＡＲＱＱＱＭＮＬＥＲＩＭＡＲＱＨＫＩＶＱＱＱＥＱＥＱＥＱＱＫＱＥＱＫＭＥＨＹＲＬＲＴＭＡＶＱＱＴＤＫＩ。
【００７４】
そして、この配列のＮ末端側にＰｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ  ｔａｇ（バイオラッド社）を融合した１７３アミノ酸からなるたん白質を設計し、さらに該たん白質をコードし、大腸菌のコドン使用頻度に最適化されたヌクレオチド配列からなる人工遺伝子を化学的に合成した（人工遺伝子の合成は、ＭＢＬ社に委託した）。５’末端と３’末端には、制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩサイトを付加し、このサイトを利用してｐＥＴ３ｂ（４．６Ｋｂ）（Ｍｅｒｃｋ社製）のマルチクローニングサイトに連結し発現ベクター（このベクターを「ｐＥＴ−ｅＸ−ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ  Ｃ」とも称する）を構築した。
【００７５】
次いで、ｐＥＴ−ｅＸ−ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ  Ｃを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、２％グルコースを含むＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン，２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含む）寒天プレートに播種し、コロニーを形成させた。得られた複数のコロニーを２％グルコースを含む２ｘＹＴ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン，２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含む液体培地）に植菌し、３７℃で培養し、液体培地の濁度（ＯＤ６００ｎｍ）が０．５付近になったところで、０．１Ｍ  イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を終濃度１ｍＭになるように添加して、２５℃にて３時間インキュベーションすることにより、前記リコンビナントビテロジェニン様たん白質の発現誘導をおこなった。
【００７６】
遠心集菌した培養菌体に破砕液（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、製品名：Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（登録商標）−５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７））を添加してハンディソニックにて超音波破砕した後、菌体ライセートとした。このうち１０μＬを３ｘＳＤＳサンプルバッファー（ＤＴＴを含む）５μＬと混合し、９８℃、５分間の熱処理後、１０−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（製品名：ＳｕｐｅｒＳｅｐ、和光純薬社製）にロードし、電気泳動した後、染色液ＣＢＢ−Ｒ３５０（ＧＥ社製）にて検出した。なお、陰性対照として、形質転換していない大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳについても、前記同様に菌体ライセートを調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。
【００７７】
その結果、リコンビナントヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質は、発現誘導により理論分子量２０ｋＤａ付近に明瞭なバンドとして検出された（図５参照のほど）。
【００７８】
（実施例１）  抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体を用いたウエスタンブロッティングによる、リコンビナントヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質の検出
抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体を用いたウエスタンブロッティングによって、ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質を検出できるかについて、以下の通りに検証した。
【００７９】
前記の通りにして調製したＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルを、転写装置トラスブロットｔｕｒｂｏ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いてＰＶＤＦ膜（製品名：Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写した。そのＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴ（５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝（ｐＨ７．６），１５０ｍＭ  塩化ナトリウム，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）にて洗浄した後、ブロッキング用試薬（製品名：ブロックエース、ＤＳファーマバイオメディカル社製）に室温にて１時間インキュベーションすることにより、ブロッキング処理を施し、さらにＴＢＳＴにて５分３回洗浄した。
【００８０】
次いで、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体含有抗血清を、免疫反応促進試薬（東洋紡社製、製品名：Ｃａｎｇｅｔ  ｓｉｇｎａｌ（登録商標）  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １）にて４０００倍希釈した上で、前記ＰＶＤＦ膜と室温にて１時間反応した後、ＴＢＳＴにて洗浄した。その後、ＨＲＰ−ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（ＣＳＴ社製、Ｃａｎ  ｇｅｔ  ｓｉｎｇａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２（東洋紡社製）で４０００倍希釈）と室温にて１時間反応し、ＴＢＳＴにて洗浄した。そして、ウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥヘルスジャパン社製、製品名：ＥＣＬ−Ｓｅｌｅｃｔ）にて５分反応した後、ルミノ・イメージアナライザー（ＧＥヘルスジャパン社製、製品名：ＬＡＳ５００）にて化学発光を検出した。
【００８１】
その結果、上述の通りにて調製した抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体は、大腸菌ライセートのみには殆ど反応せず、ヒトヒゼンダニ由来のビテロジェニン様たん白質特異的に反応することが明らかになった（図６参照のほど）。
【００８２】
（実施例２）  抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体を用いたウエスタンブロッティングによる、タヌキヒゼンダニの検出
ヒトのみならず、疥癬は他の動物でも生じる。例えば、日本国内に棲息するホンドタヌキにおいて疥癬が蔓延していることが複数の論文及び各種マスメディアにて報告されている。特に、日本の横浜市においては、年間約１００頭のホンドタヌキが捕獲、保護されるが、すべての個体が疥癬であり、多くが重症化している。また、疥癬罹患のホンドタヌキ皮膚断片には、数ｃｍ３あたり数万匹のヒゼンダニ成虫とヒゼンダニの卵が検出される。
【００８３】
そこで、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体が、ヒトヒゼンダニのみならず、タヌキに寄生するヒゼンダニ（タヌキヒゼンダニ）を検出できるかについて、以下の通りに検証した。
【００８４】
先ず横浜市で保護された疥癬罹患ホンドタヌキの新鮮なはがれおちた肥厚した皮膚３ｃｍ３を１０％ＳＤＳ溶液に一晩、十分に浸漬させた。なお、該溶液には、雑菌の増殖を抑制するために２種類の抗菌薬（２５μｇ／ｍＬ  硫酸カナマイシン、３４μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール）を添加した。翌日、Ｐｒｏｎａｓｅ／ＥＤＴＡ  ｆｏｒ  Ｓｔｅｍ（極東製薬工製）、パパイン粉末（和光純薬工業）を少量添加して１時間以上室温から３７℃で処理し、皮膚組織を溶解させた。この処理によって、ホンドタヌキの皮膚組織は溶解するが、ダニ成虫及び卵は、溶解せずに残存するため、ヒゼンダニのみを回収することが可能となる。
【００８５】
続いて、このようにして調製したホンドタヌキ皮膚溶解物を、１００μｍフィルター（製品名：ＥＡＳＹｓｔｒａｉｎｅｒ、１００μｍ  ｍｅｓｈ、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社製）を用いた自然落下による濾過処理に供した。この濾過処理と１０％ＳＤＳによる洗浄とを３回以上繰り返すことによって、殆どの皮膚組織は溶解し、前記フィルターにはダニの成虫が残ることになる。一方、１００μｍフィルターを通り抜けた卵は、７０μｍフィルター（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社製）を用いた濾過処理にて回収した。その後、遠心（２，３００
×g、1分間、２５℃）にて、ダニの成虫と卵をペレットとして回収し、１０％ＳＤＳ溶液を除去した。
【００８６】
このようにして単離したタヌキヒゼンダニ成虫を含む遠心ペレットと卵を含むそれとを、各々ＴＢＳに懸濁してホモジナイザー（キアゲン社製、製品名：Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｕｐｔｏｒ）にて破砕し、たん白質サンプルを調製した。そして、実施例１と同様な方法にて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、そのゲルをＰＶＤＦ膜に転写した。
【００８７】
次いで、該ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴにて洗浄した後、ブロックエースに室温にて１時間インキュベーションすることにより、ブロッキング処理を施し、さらにＴＢＳＴにて５分３回洗浄した後、Ｃａｎ  ｇｅｔ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １にて１００倍に希釈した抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体含有抗血清と、室温で１時間反応させた。その後、ＴＢＳＴにて洗浄し、ＨＲＰ−ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔＩｇＧ（ＣＳＴ社製、Ｃａｎ  ｇｅｔ  ｓｉｎｇａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２で２０００倍に希釈したもの）と室温で１時間反応させ、ＴＢＳＴにて洗浄した後、ＨＲＰ化学発光検出試薬（製品名：Ｌｕｍｉｎａｔａ  Ｆｏｒｔｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）と５分反応させた後、高感度発光・蛍光イメージングシステム（製品名：Ｅｚ−Ｃａｐｔｕｒｅ、ＡＴＴＯ社製）にて化学発光を検出した。
【００８８】
その結果、図７に示す通り、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体によって、タヌキヒゼンダニの成虫及び卵のライセートにおいて、主として４０ｋＤａ及び１２０ｋＤａにバンドが認められた。
【００８９】
ビテロジェニンの研究成果から、多くの昆虫等において、翻訳後のビテロジェニンは、様々なプロテアーゼによりプロセシングされ、さらに様々な分子量のサブユニットたん白質がアセンブリーされ、多様な生理機能を発揮すると考えられている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ５４  （２００８）  １４４７−１４５８）。ヒゼンダニのビテロジェニン様たん白質のプロセシングについては未解明であるが、様々な分子量サイズのビテロジェニン様たん白質の部分ペプチドが生じることは十分に考えられ、上記２つのバンドが検出されたことは、かかるプロセシングを反映したものと想定される。
【００９０】
したがって、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体は、ヒトに寄生するもののみならず、タヌキに寄生するヒゼンダニをも検出できることが明らかになった。
【００９１】
４．イムノクロマトグラフィー用試験片の作製
免疫学的手法の一つであるイムノクロマトグラフィーは、短時間で一連の抗原・抗体反応を同時に行うことができる方法であるため、精度の点のみならず、抗原を、簡便、容易かつ迅速に検出できるという利点を有する。
【００９２】
そこで、ウエスタンブロッティングのみならず、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体を用いたイムノクロマトグラフィーによっても、疥癬の検査をできることを確認すべく、先ず以下の通りにして、その試験片を作製した。
【００９３】
１）抗体の精製
上述の抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体含有抗血清１ｍＬに対し、１Ｍ  トリス塩酸緩衝（ｐＨ８）を１０μＬ添加し、５００μＬずつ分けた。チューブ１本に対して０．２％硫酸デキストラン溶液５００μＬと１Ｍ  塩化カルシウム溶液２０μＬを添加し、室温で１０分間撹拌した。遠心（２０，０００ｘｇ、５分間、４℃）にて上清１ｍＬに８０％硫安溶液を終濃度が４０％になるように添加し、４℃で１時間回転混和した。遠心（５，０００ｘｇ、５分間、４℃）にて上清を除去し、４０％硫安溶液を添加し、４℃で一晩回転混和した。遠心（２０，０００ｘｇ、５分間、４℃）にて上清を十分に除去し、ペレットにＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）、１０ｍＭ  塩化ナトリウム及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を５００μＬ添加し、４℃で一晩溶解させた。硫安沈殿後の溶解サンプル約１．１ｍＬをＰＤ−１０脱塩カラムを用いて、１０ｍＭ  ＮａＣｌ含有ＴＮ緩衝液（１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）及び１０ｍＭ  塩化ナトリウム）へと置換した。
【００９４】
これを、１０ｍＭ  ＮａＣｌ含有ＴＮ緩衝液で平衡化された陰イオン交換担体（バイオラッドラボラトリーズ株式会社製、製品名：Ｎｕｖｉａ  Ｑ）カラムにチャージした。次いで、カラムを１０ｍＭ  ＮａＣｌ含有ＴＮ緩衝液で洗浄した後、１Ｍ  ＮａＣｌ含有ＴＮ緩衝液（１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）及び１Ｍ  塩化ナトリウム）にて、抗体をグラジエント溶出せしめた。その結果、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有ＴＮ緩衝液の溶出画分に殆どすべての抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体が回収された。そして、限外濾過スピンカラム（製品名：Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）  Ｔｕｒｂｏ  ４，１０ｋＤａ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）を用いて、回収した抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体含有画分６ｍＬを２．５ｍＬに濃縮し、抗体濃度が２．３３ｍｇ／ｍＬ（分子吸光係数：Ａ２８０値とＥ  ０．１％＝１．３７より換算）になるよう調整した。
【００９５】
２）クロマトグラフィー用膜担体への判定部の作製
クロマトグラフィー用膜担体としてニトロセルロースからなるシートを用いた。０．１質量％のアジ化ナトリウムを含む１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体（捕捉用抗体）を調製し、その希釈された溶液１５μＬを１５ｃｍのメンブレン上に抗体塗布機により塗布し、検出ラインを作製した。コントロールラインは、抗ウサギＩｇＧ抗体を該検出ラインと５ｍｍの間隔をあけ前記同様に塗布することにより、作製した。５５℃で３０分間乾燥させ、続いてブロッキング試薬にて２５℃で２時間緩やかに振とうさせブロッキングをおこない、１質量%スクロースと０．０１質量％ＳＤＳを含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に浸漬させ、２５℃で３０分間緩やかに浸とうをおこなった。その後、５５℃で４０分間乾燥させ、クロマトグラフィー用膜担体に、検出ラインとコントロールラインとを備えた判定部を作製した
３）標識抗体溶液の作製
ＡλＭａｘ＝１．０になるよう精製水にて希釈した金コロイド懸濁液４．５ｍＬにｐＨ調整液（２０ｍＭ  Ｂｏｒａｘ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を０．５ｍＬ添加し、ｐＨを調整した。その金コロイド懸濁液に、０．１質量％アジ化ナトリウムを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．７ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈した後、精製水にて７０μｇ／ｍＬの濃度になるように調整した抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体０．５ｍＬを加え、室温で一晩静置した。次いで、１０質量％の牛血清アルブミン溶液（ｐＨ８．５）を終濃度１％となるように添加した。その後、十分撹拌した後、９８００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、ＡλＭａｘ＝１．２となるように、１質量％の牛血清アルブミンと１質量％濃度のスクロースを含む５ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）を加え、標識抗体溶液を作製した。
【００９６】
４）イムノクロマトグラフィー用試験片の組み立て
前記にて作製した標識抗体溶液７５０μＬを８ｍｍ×１５０ｍｍのグラスファイバーパッドに均一になるように添加した後、真空凍結乾燥機にて乾燥させ、標識抗体含有部材を作製した。次に、バッキングシートからなる支持体に、上記にて作製した判定部を有するクロマトグラフィー用膜担体及び標識抗体含有部材、試料を添加する部分に用いるサンプルパッド（試料添加用部材）、展開した試料や標識抗体を吸収するための吸収パッド（吸収用部材）を貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、イムノクロマトグラフィー用試験片とした。
【００９７】
（実施例３）  抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体を用いたイムノクロマトグラフィーによる疥癬の検査
前記にて作製したイムノクロマトグラフィー用試験片の試料添加用部材に、下記表１に記載の各試料（溶媒はＴＢＳＴであり、それを用いてたん白質濃度が１０ｎｇ〜１ｍｇ／ｍＬになるよう調整してある）１００μＬ（たん白質量：ｎｇ〜μｇ）を添加し、展開させ、該試験片における検出ラインにおいて呈色（金の集積）が生じるか否かを観察した。得られた結果を下記表１に示す。なお、表１における「ヤケヒョウダニ・コナヒョウダニ抽出成分」は、鳥居薬品株式会社製、製品名：ダニアレルゲンエキス皮下注「トリイ」１００，０００ＪＡＵ／ｍＬを示す。
【００９８】
【表１】
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【００９９】
その結果、表１に示す通り、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体を用いたイムノクロマトグラフィーによって、ヒゼンダニであれば特異的に検出できること、すなわち、疥癬の検査ができることが明らかになった。特に、家屋内等のヒトの身近に生息するチリダニ（ヤケヒョウダニ、コナヒョウダニ）は、抗ヒトヒゼンダニビテロジェニン様たん白質抗体によって検出されないことからも、精度の高い疥癬検査において、当該抗体が極めて有効であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
以上説明したように、本発明によれば、ヒゼンダニに由来するビテロジェニン様たん白質を抗体によって特異的に検出することにより、疥癬を精度高く検査することが可能となる。また、本発明によれば、寄生する動物の種類を問わずヒゼンダニを検出することができるため、ヒトのみならずタヌキ等の様々な動物における疥癬を精度高く検査することができる。さらに、本発明において、イムノクロマトグラフィーを用いることにより、精度の点のみならず、簡便、容易かつ迅速に疥癬を検査することも可能となる。
【０１０１】
したがって、本発明の検査方法、並びにそれに用いる薬剤及びデバイスは、疥癬の診断、特にそれを必要とする老人医療現場において有用である。
【符号の説明】
【０１０２】
１…支持体、２…標識抗体含有部材、３…クロマト展開用膜担体、３１…検出部、３２…コントロールライン、４…吸収用部材、５…試料添加用部材、６…ケース、６１…容器本体、６２…蓋体、６２１…試料注入口、６２２…判定窓。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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