(57)【要約】      （修正有）【課題】３−メチルチオプロパナールおよび二酸化炭素から２−ヒドロキシ−４−メチルメルカプト酪酸を酵素により製造する方法の提供。【解決手段】Ｄ−またはＬ−２−ヒドロキシ−４−メチルメルカプト酪酸（ＭＨＡ）の製造方法であって、３−メチルチオプロパナール（３−メチルメルカプトプロパナール（ＭＭＰ、メチオナール））と、二酸化炭素と、デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１）と、その相応する補因子と、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１）と、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨとを含む混合物を反応させて、ＭＨＡまたはその塩を形成させるステップを含む方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−またはＬ−２−ヒドロキシ−４−メチルメルカプト酪酸（ＭＨＡ）の製造方法であって、３−（メチルチオ）−プロパナール（メチオナール）と、二酸化炭素と、デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１）と、その相応する補因子と、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１）と、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨとを含む混合物を反応させて、Ｄ−もしくはＬ−２−ヒドロキシ−４−メチルメルカプト酪酸（ＭＨＡ）またはその塩を形成させるステップを含む方法。
【請求項２】
前記補因子は、チアミンピロリン酸を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記デカルボキシラーゼは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のピルビン酸デカルボキシラーゼＰｄｃ１、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼＡｒｏ１０、およびラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）由来の分岐鎖デカルボキシラーゼＫｄｃＡ、ならびにデカルボキシラーゼ活性を示す前記デカルボキシラーゼの変異体および多様体からなる群から選択される、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
Ｄ−２−ヒドロキシ−４−メチルメルカプト酪酸（Ｄ−ＭＨＡ）を製造するための請求項１から３までのいずれか１項記載の方法であって、前記アルコールデヒドロゲナーゼは、Ｄ−ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼである方法。
【請求項５】
前記Ｄ−ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼは、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）由来のＤ−ＨｉｃＤＨであるか、またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すその変異体および多様体のいずれかである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
Ｌ−２−ヒドロキシ−４−メチルメルカプト酪酸（Ｌ−ＭＨＡ）を製造するための請求項１から３までのいずれか１項記載の方法であって、前記アルコールデヒドロゲナーゼは、Ｌ−ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼである方法。
【請求項７】
前記Ｌ−ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼは、ラクトバチルス・コンフューサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｎｆｕｓｕｓ）由来のＬ−ＨｉｃＤＨであるか、またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すその変異体および多様体のいずれかである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記二酸化炭素を、１０〜７４００ｋＰａの圧力で前記混合物に加える、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記混合物は、ギ酸またはその塩と、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１７．１．９）とをさらに含む、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記ギ酸デヒドロゲナーゼは、シュードモナス属菌種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）由来のギ酸デヒドロゲナーゼ、およびカンジダ属菌種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）由来のギ酸デヒドロゲナーゼ、ならびにギ酸デヒドロゲナーゼ活性を示す前記ギ酸デヒドロゲナーゼの変異体および多様体からなる群から選択される、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−メチルチオプロパナール（３−メチルメルカプトプロパナール（ＭＭＰ）、すなわち「メチオナール」）からの２−ヒドロキシ−４−メチルメルカプト酪酸の酵素的製造方法に関する。
【０００２】
２−ヒドロキシ−４−メチルメルカプト酪酸は、メチオニンと同様に飼料添加剤として使用されており、かつ、構造が類似していることからメチオニンヒドロキシ類似体（ＭＨＡ）として知られている。現在に至るまで、ＭＨＡは、通常はメチオナールから得られており、メチオナールは、メチルメルカプタン（メタンチオール）をアクロレインに付加させ、次いでシアン化水素と反応させて４−メチルメルカプト−２−ヒドロキシブタンニトリルを形成させ、次いでこの４−メチルメルカプト−２−ヒドロキシブタンニトリルを加水分解させることによって得ることができる。この方法の欠点の一つとして、シアン化水素使用の必要性が挙げられる。シアン化水素は毒性が高いため、この反応には、安全性を保持するために高いコストをかけなければならない。もう１つの重大な欠点は、窒素の導入によってアンモニウム塩が形成され、このアンモニウム塩がその後に加水分解により分解されるという点にある。このアンモニウム塩は化学量論的な量で形成されるため、それに応じて高度に汚染された廃水が生じる。したがって、ＨＣＮを用いずにＭＨＡを製造する方法が求められている。
【０００３】
Ｂｕｒｒｉｎｇｔｏｎら（米国特許第４，７８２，１７３号明細書（ＵＳ  ４，７８２，１７３））は、Ｃ１構成単位として一酸化炭素を使用した、触媒作用による３段階でのメチオナールからＭＨＡへの転化を提案している。Ｌｅｈｍａｎｎら（国際公開第０２／１６６７１号（ＷＯ  ０２／１６６７１  Ａ１））は、Ｃ１構成単位として二酸化炭素を使用して、犠牲陽極と非プロトン性溶媒と支持電解質とを含む隔膜のない電解槽内でメチオナールを電気化学的にカルボキシル化することによるＭＨＡの製造方法を開示している。
【０００４】
Ｆｉｇｇｅら（国際公開第２０１２／０９００２２号（ＷＯ  ２０１２／０９００２２  Ａ１））は、窒素制限下での微生物の培養によりＭＨＡを発酵によって製造する方法を提案している。しかしこの場合には、微生物によってメチオニンが生成され、このメチオニンが窒素制限下で窒素源として使用されることによって、その脱アミノ反応生成物である４−メチルチオ−２−オキソ酪酸（ＭＴＯＢ）が生成され、このＭＴＯＢの還元によってＭＨＡが生成される（Ｉｎｃｅ  ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｓ（１９８６）Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４６，１５１−１５８）。
【０００５】
Ｍｉｙａｚａｋｉら（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００１）１８００−１８０１）は、エタナール（アセトアルデヒド）からピルビン酸（２−オキソプロパン酸）を合成するための、Ｃ１構成単位として二酸化炭素を使用したピルビン酸デカルボキシラーゼの逆反応を提案している。この反応には、脱カルボキシル化とは逆の方向に平衡をシフトさせるための二酸化炭素源として、大過剰の重炭酸塩が必要とされる。Ｔｏｎｇら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２０１１）１０８，４６５−４６９）は、アセトアルデヒドおよびピルビン酸を経由してＬ−乳酸を生成させるための、炭酸−重炭酸緩衝剤およびエタノールを使用する補因子再生サイクルを含む多酵素触媒系を提案している。
【０００６】
Ｓｃｈｕｅｔｔｅら（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９８４）１９，１６７−１７６）は、α−ケト酸からα−ヒドロキシ酸へのＮＡＤＨ依存的還元を触媒するラクトバチルス・コンフューサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｎｆｕｓｕｓ）由来のＬ−２−ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼを開示している。
【０００７】
Ｗｉｃｈｍａｎｎら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９８１）２３，２７８９−２８０２）は、ギ酸塩およびギ酸デヒドロゲナーゼを使用する生体触媒によるＮＡＤＨ再生系を併用して２−オキソ−４−メチルペンタン酸（α−ケトイソカプロン酸）からＬ−ロイシンへの還元的アミノ化を行うためのＮＡＤＨ依存性酵素であるＬ−ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＤＨ）を提案している。
【０００８】
本発明の目的は、出発成分としてメチオナールを使用しつつ、ＨＣＮに代えて二酸化炭素をＣ１構成単位として使用してＤ−ＭＨＡまたはＬ−ＭＨＡを生成させる、新規なＭＨＡ製造方法を提供することである。
【０００９】
前記目的は、Ｄ−またはＬ−２−ヒドロキシ−４−メチルメルカプト酪酸（ＭＨＡ）の製造方法であって、３−（メチルチオ）−プロパナール（メチオナール）と、二酸化炭素と、デカルボキシラーゼと、その相応する補因子と、アルコールデヒドロゲナーゼと、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨとを含む混合物を反応させて、Ｄ−もしくはＬ−２−ヒドロキシ−４−メチルメルカプト酪酸（ＭＨＡ）またはその塩を形成させるステップを含む方法により達成される。
【００１０】
理論に束縛されることを望むものではないが、まず前述の混合物中のデカルボキシラーゼが、その逆反応、つまり二酸化炭素（ＣＯ２）によるメチオナールのカルボキシル化を触媒し、これによって、中間生成物である４−メチルチオ−２−オキソ酪酸（ＭＴＯＢ）、つまりα−ケト酸（２−オキソ酸）が生成されるものと考えられる。次いで、アルコールデヒドロゲナーゼにより触媒される立体特異的でかつＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）依存的反応において、ＭＴＯＢのα−カルボニル基を還元させてヒドロキシル基を生成させることによって、ＭＨＡが得られる。図１に、この生体触媒を用いた２段階でのメチオナールからのＭＨＡの合成のスキームを示す。デカルボキシラーゼの相応する補因子は、好ましくはチアミンピロリン酸（ＴｈＤＰ）を含む。
【００１１】
メチオナールのカルボキシル化に適したデカルボキシラーゼは、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のピルビン酸デカルボキシラーゼＰｄｃ１、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼＡｒｏ１０、およびラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）由来の分岐鎖デカルボキシラーゼＫｄｃＡ、ならびにデカルボキシラーゼ活性を示すこれらのデカルボキシラーゼの変異体（Ｍｕｔａｎｔｓ）および多様体（Ｖａｒｉａｎｔｓ）である。
【００１２】
本発明による方法は、Ｄ−２−ヒドロキシ−４−メチルメルカプト酪酸（Ｄ−ＭＨＡ）の製造にもＬ−２−ヒドロキシ−４−メチルメルカプト酪酸（Ｌ−ＭＨＡ）の製造にも適している。Ｄ−ＭＨＡを製造する場合には、適したアルコールデヒドロゲナーゼは、例えばＤ−ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼであり、好ましくはラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）由来のＤ−ＨｉｃＤＨ、またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すその変異体および多様体であり、一方でＬ−ＭＨＡの製造が望ましい場合には、アルコールデヒドロゲナーゼとして、例えばＬ−ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼ、好ましくはラクトバチルス・コンフューサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｎｆｕｓｕｓ）由来のＬ−ＨｉｃＤＨ、またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すその変異体および多様体を選択することができる。
【００１３】
本発明による方法において、好ましくは、二酸化炭素を１０〜７４００ｋＰａ（０．１〜７４バール）の圧力で、好ましくは１００〜１０００ｋＰａ（１〜１０バール）の圧力で、より好ましくは２００〜８００ｋＰａ（２〜８バール）の圧力で、反応混合物に加える。
【００１４】
必要に応じて、本発明による方法において、前述の混合物は、ギ酸またはその塩およびギ酸デヒドロゲナーゼをさらに含むことができる。その場合、本発明による方法において消費されるＮＡＤＨの再生を、ギ酸塩の消費および二酸化炭素の形成下に達成することができる（図１）。二酸化炭素は、上記の脱カルボキシル化反応の逆反応の基質としての役割を果たすことができる。
【００１５】
適したギ酸デヒドロゲナーゼは、例えばシュードモナス属菌種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）由来のギ酸デヒドロゲナーゼであり、例えばシュードモナス属１０１種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１０１）由来のギ酸デヒドロゲナーゼＰｓｅＦＤＨ、およびカンジダ属菌種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）由来のギ酸デヒドロゲナーゼ、例えばカンジダ・ボイジニイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）由来のギ酸デヒドロゲナーゼ（これは、場合によりアミノ酸置換体Ｃ２３ＡおよびＦ２８５Ｓを有する）、ならびにギ酸デヒドロゲナーゼ活性を示すこれらのギ酸デヒドロゲナーゼの変異体および多様体である。
【００１６】
本発明による方法に適した酵素の例を表１にまとめた。酵素は、主にそれらが触媒する反応により分類および命名される。触媒される化学反応は、ある酵素を別の酵素と区別する特定の性質であり、したがってこれは、国際生化学・分子生物学連合の命名法委員会により推奨される酵素命名法による酵素の分類および命名の基礎として用いられる［Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＩＳＢＮ  ０−１２−２２７１６４−５（ハードカバー版），０−１２−２２７１６５−３（ペーパーバック版）］。したがって、２−オキソカルボン酸の脱カルボキシル化を触媒する、ＥＣ  ４．１．１と分類されるデカルボキシラーゼと、α−ケト酸からα−ヒドロキシ酸へのＮＡＤＨ依存的還元を触媒する、ＥＣ  １．１．１と分類されるアルコールデヒドロゲナーゼとはいずれも、本発明による方法における使用に適している。さらに、ＮＡＤＨ再生下でのギ酸塩から二酸化炭素への反応を触媒する、ＥＣ  １．１７．１．９と分類されるギ酸デヒドロゲナーゼはいずれも、本発明による方法の特定の一実施形態に適している。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１に、デカルボキシラーゼとアルコールデヒドロゲナーゼとを存在させるとともに、必要に応じて、生体触媒によるＮＡＤＨ再生系としてのギ酸デヒドロゲナーゼを存在させた状態での、生体触媒を用いた２段階での３−メチルチオプロパナール（メチオナール）からのメチオニンヒドロキシ類似体（ＭＨＡ）の合成に関するスキームを示す。  まず、ＣＯ２雰囲気下にデカルボキシラーゼ（例えばＫｄｃＡ、Ｐｄｃ１、Ａｒｏ１０）を用いて、逆反応、つまりメチオナールのカルボキシル化を触媒して、中間生成物である４−メチルチオ−２−オキソ酪酸（ＭＴＯＢ）を生成させる。次いで、アルコールデヒドロゲナーゼ（例えばＤ／Ｌ−ＨｉｃＤＨ）により触媒される立体特異的でかつＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）依存的反応において、ＭＴＯＢのα−カルボニル基を還元させてヒドロキシル基を生成させることによって、Ｄ−ＭＨＡまたはＬ−ＭＨＡを得る。必要に応じて、例えば、ギ酸塩の消費およびＣＯ２の生成下にギ酸デヒドロゲナーゼ（例えばＣｂｏＦＤＨ（Ｃ２３Ａ／Ｆ２８５Ｓ）／ＰｓｅＦＤＨ）によりＮＡＤＨの再生を達成することができる。
【図２ａ】図２ａに、反応生成物であるＤ−メチオニンヒドロキシ類似体（Ｄ−ＭＨＡ）の、ＨＰＬＣ分析による検出を示す。Ｄ−ＭＨＡの製造を、例４および例５の５μＬの試料において、Ｃ１８カラム（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８、４．６×１５ｍｍ、３μｍ、１１０Å）を用いた、１体積％（％（ｖ／ｖ））のリン酸を加えた４体積％（％（ｖ／ｖ））のアセトニトリル水溶液中でのイソクラティック溶離によるＨＰＬＣ分析によって確認した。メチオナールおよびＭＨＡを、これらの２１０ｎｍでの吸収により検出した。１０μＭのＫｄｃＡ、１μＭのＤ−ＨｉｃＤＨ、４ｍＭのメチオナールおよび２ｍＭのＮＡＤＨの存在下で、２バールのＣＯ２下で１時間かけてＤ−ＭＨＡ合成を行う。点線のトレースは、所定の濃度のＭＨＡ標準物質に相当する。
【図２ｂ】図２ｂに、（ａ）と同一の条件下であるが、ただしそれぞれＫｄｃＡ、Ｄ−ＨｉｃＤＨ、メチオナールまたはＮＡＤＨを含まない対照反応を示す。
【図２ｃ】図２ｃに、ＫｄｃＡ濃度を２倍にし、反応時間を８倍にし、かつＣＯ２圧力を４倍にするという反応条件の最適化を行った後に、Ｄ−ＭＨＡの収率が、（ａ）に示す３％から２３％へと増加したことを示す：２０μＭのＫｄｃＡ、１μＭのＤ−ＨｉｃＤＨ、４ｍＭのメチオナール、４ｍＭのＮＡＤＨ；触媒反応を、８バールのＣＯ２下で８時間行う。
【図２ｄ】図２ｄに、ＮＡＤＨ濃度が制限された状態で、生体触媒を用いたＮＡＤＨ再生系の存在によってＤ−ＭＨＡの最終濃度が増加することを示す：１０μＭのＫｄｃＡ、０．５μＭのＤ−ＨｉｃＤＨ、１０μＭのＣｂｏＦＤＨ（Ｃ２３Ａ／Ｆ２８５Ｓ）、４ｍＭのメチオナール、８０μＭのＮＡＤＨ、２５ｍＭのギ酸塩；触媒反応を、８バールのＣＯ２下で１．５時間行う。ＭＨＡピークを拡大したものを、挿入図に示す。
【図３ａ】図３ａに、反応生成物であるＬ−メチオニンヒドロキシ類似体（Ｌ−ＭＨＡ）の、ＨＰＬＣ分析による検出を示す。Ｌ−ＭＨＡの製造を、例６の５μＬの試料において、Ｃ１８カラム（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８、４．６×１５ｍｍ、３μｍ、１１０Å）を用いた、１体積％（％（ｖ／ｖ））のリン酸を加えた４体積％（％（ｖ／ｖ））のアセトニトリル水溶液中でのイソクラティック溶離によるＨＰＬＣ分析によって確認した。メチオナールおよびＭＨＡを、これらの２１０ｎｍでの吸収により検出した。２０μＭのＫｄｃＡ、０．５μＭのＬ−ＨｉｃＤＨ、４ｍＭのメチオナールおよび４ｍＭのＮＡＤＨの存在下で、８バールのＣＯ２下で４５分間かけてＬ−ＭＨＡ合成を行う。点線のトレースは、所定の濃度のＭＨＡ標準物質に相当する。
【図３ｂ】図３ｂに、（ａ）と同一の条件下であるが、ただし、それぞれＫｄｃＡ、Ｌ−ＨｉｃＤＨ、メチオナールまたはＮＡＤＨを用いない対照反応を示す。
【００２０】
例
例１：大腸菌におけるデカルボキシラーゼの製造
ピルビン酸デカルボキシラーゼの遺伝子（Ｐｄｃ１；配列番号１；Ｐ０６１６９；Ｋｉｌｌｅｎｂｅｒｇ−Ｊａｂｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，１９００−１９０５）およびフェニルピルビン酸デカルボキシラーゼの遺伝子（Ａｒｏ１０；配列番号３；Ｑ０６４０８；Ｋｎｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＦＥＢＳ  Ｊ．２７８，１８４２−１８５３）（いずれもサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来）、ならびにラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）由来の分岐鎖デカルボキシラーゼ（ＫｄｃＡ）の遺伝子（配列番号５；Ｑ６ＱＢＳ４；Ｙｅｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３４，３２５−３３６）を、大腸菌（Ｇｅｎｅａｒｔ、ドイツ連邦共和国、レーゲンスブルク）での発現に最適なコドン使用頻度で合成し、次いで制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いて発現ベクターｐＥＴ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州、マディソン）にクローニングした。得られた３つの発現プラスミドｐＥＴ２１−Ｐｄｃ１、ｐＥＴ２１−Ａｒｏ１０およびｐＥＴ２１−ＫｄｃＡはそれぞれ、各酵素に対するカルボキシ末端Ｈｉｓ６タグもコードしており、これらを、クローニングした構造遺伝子のＤＮＡシーケンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ドイツ連邦共和国、エーバースベルク）により確認した。
【００２１】
これらの発現プラスミドを用いてＣａＣｌ２法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）により大腸菌ＢＬ２１株の化学的形質転換を行った後に（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｆｆａｔｔ（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９，１１３−１３０）、Ｔ７プロモーターの制御下にＰｄｃ１（配列番号２）、Ａｒｏ１０（配列番号４）およびＫｄｃＡ（配列番号６）を個々に生成させた（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｆｆａｔｔ（１９８６）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １８９，１１３−１３０）。この目的を達成するために、ＯＤ５５０が０．３〜０．４に達するまで振とうしながら、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地内の２リットルの培養物中で、３０℃で細菌を増殖させた。４５〜６０分間かけて温度を２２℃に下げた後、０．０１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えることによって、組換え遺伝子の発現を、ＯＤ５５０＝０．６〜０．８で２２℃で５時間かけて誘導した。最後に、遠心分離（１０分間、６０００ｒｐｍ、固定角ロータ、４℃）により集菌し、細胞ペーストを−２０℃で凍結させた。
【００２２】
固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）と、後続のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）とを含む２段階の戦略によって、すべてのデカルボキシラーゼを精製した。したがって、これらの細胞を、湿重量１ｇあたり３ｍｌ（３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１ｍＭのチアミンピロリン酸（ＴｈＤＰ）、２０ｍＭのＰＩＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．０））に再懸濁させ、次いで、これらをフレンチ・プレッシャー・セル（ＳＬＭ  Ａｍｉｎｃｏ、ニューヨーク州、ロチェスター）で機械的に破砕した。このホモジネートを遠心分離（３０分間、１８０００ｒｐｍ、固定角ロータ、４℃）し、ランニングバッファとして３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１ｍＭのＴｈＤＰ、２０ｍＭのＰＩＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）を用いて、Ｎｉ（ＩＩ）イオンにより荷電させた総容積５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ドイツ連邦共和国、ミュンヘン）に上清全体を加えた。ランニングバッファ中の０〜５００ｍＭのイミダゾール／ＨＣｌの直線的な濃度勾配によって、結合したデカルボキシラーゼを溶離させた。このデカルボキシラーゼを含む主要な画分を、クマシー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、この画分を、公称分画分子量（ＮＭＷＬ）が３０ｋＤａである遠心ろ過装置（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ連邦共和国、ダルムシュタット）を用いて最終容量が２〜２．５ｍｌとなるまで濃縮した。濃縮したこの試料を、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、０．５ｍＭのＴｈＤＰおよび２０ｍＭのＰＩＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）の存在下で、総容積１２０ｍｌのＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＳＥＣによりさらに精製した。
【００２３】
その結果、クマシー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認した通り、３つすべてのデカルボキシラーゼが純度９０％超で得られた。Ｐｄｃ１、Ａｒｏ１０およびＫｄｃＡについて、培養物体積１リットルあたりの収量は、それぞれ約５０ｍｇ、約１０ｍｇおよび約３０ｍｇであった。
【００２４】
例２：大腸菌におけるアルコールデヒドロゲナーゼの製造
ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）由来のＤ−ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼ（Ｄ−ＨｉｃＤＨ）の遺伝子（配列番号７；Ｐ１７５８４；Ｈｕｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１，７−１５）を、大腸菌（Ｇｅｎｅａｒｔ）での発現に最適なコドン使用頻度で合成し、制限酵素ＫａｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて発現ベクターｐＡＳＫ−ＩＢＡ３５（＋）（ＩＢＡ、ドイツ連邦共和国、ゲッティンゲン）にクローニングした。得られた発現プラスミドｐＡＳＫ−ＩＢＡ３５（＋）−Ｄ−ＨｉｃＤＨは、Ｄ−ＨｉｃＤＨに対するアミノ末端Ｈｉｓ６タグもコードしており、これを、クローニングした構造遺伝子のＤＮＡシーケンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）により確認した。
【００２５】
ラクトバチルス・コンフューサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｎｆｕｓｕｓ）由来のＬ−ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ−ＨｉｃＤＨ）の遺伝子（配列番号９；Ｐ１４２９５；Ｓｃｈｕｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９，１６７−１７６）を、大腸菌（Ｇｅｎｅａｒｔ）での発現に最適なコドン使用頻度で合成した。アミノ末端Ｈｉｓ６タグは、Ｌ−ＨｉｃＤＨ４量体の形成の妨げとなると考えられるため、合成した遺伝子（配列番号９）を、制限酵素ＮｄｅＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩを用いて発現ベクターｐＡＳＫ７５（Ｔ７ＲＢＳ）ｈｉｓにクローニングした。得られた発現プラスミドｐＡＳＫ７５（Ｔ７ＲＢＳ）Ｌ−ＨｉｃＤＨ−ｈｉｓは、カルボキシ末端Ｈｉｓ６タグが付与されたＬ−ＨｉｃＤＨをコードし、これを、クローニングした構造遺伝子のＤＮＡシーケンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）により確認した。
【００２６】
Ｄ−ＨｉｃＤＨ（配列番号８）およびＬ−ＨｉｃＤＨ（配列番号１０）のどちらの酵素も、ｔｅｔプロモーターの制御下に大腸菌ＢＬ２１において製造された（Ｓｋｅｒｒａ（１９９４）Ｇｅｎｅ  １５１，１３１−１３５）。したがって、相応する発現プラスミドを用いてＣａＣｌ２法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｂｉｄ．）により大腸菌ＢＬ２１株を形質転換させ、次いで、これを、ＯＤ５５０が０．３〜０．４に達するまで振とうしながら、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた２リットルのＬＢ培地内で３０℃で増殖させた。その後、Ｄ−ＨｉｃＤＨの製造については４５〜６０分間かけて温度を２２℃に下げ、一方でＬ−ＨｉｃＤＨの製造については温度を３０℃に保持した。いずれの場合にも、ＯＤ５５０＝０．６〜０．８で、０．２ｍｇ／ｌのアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ；Ａｃｒｏｓ、ベルギー国、ヘール）を用いてこの組換え遺伝子の発現を誘導した。２２℃／３０℃で５時間経過した後、遠心分離（１０分間、６０００ｒｐｍ、固定角ロータ、４℃）により集菌し、これらの細菌を−２０℃で凍結させた。
【００２７】
これら２つのデヒドロゲナーゼを精製するために、Ｄ−ＨｉｃＤＨを含む細胞については、湿重量１ｇあたり３ｍｌ（１５０ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０））に再懸濁させ、Ｌ−ＨｉｃＤＨを含む細胞については、湿重量１ｇあたり３ｍｌ（３００ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＫＰｉ（ｐＨ７．０））に再懸濁させた。次いで、これらの細菌をフレンチ・プレッシャー・セルで機械的に破砕した。このホモジネートを遠心分離（３０分間、１８０００ｒｐｍ、固定角ロータ、４℃）し、ランニングバッファとして、Ｄ−ＨｉｃＤＨについては１５０ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）を、またＬ−ＨｉｃＤＨについては３００ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＫＰｉ（ｐＨ７．０）をそれぞれ使用して、Ｎｉ（ＩＩ）イオンにより荷電させた総容積５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐＨＰカラムに上清全体を加えた。ランニングバッファ中の０〜５００ｍＭのイミダゾール／ＨＣｌの直線的な濃度勾配によって、結合したデヒドロナーゼを溶離させた。このデヒドロナーゼを含む主要な画分を、クマシー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、この画分を、ＮＭＷＬが３０ｋＤａである遠心ろ過装置を用いて最終容量が４〜５ｍｌとなるまで濃縮した。第２のステップにおいて、濃縮したこの試料を、Ｄ−ＨｉｃＤＨについては１５０ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）が、またＬ−ＨｉｃＤＨについては３００ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのＫＰｉ（ｐＨ６．５）がそれぞれ存在した状態で、総容積３２０ｍｌのＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０カラムを用いたＳＥＣにより精製した。
【００２８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認した通り、どちらのアルコールデヒドロゲナーゼも９０％超の純度で得られた。Ｄ−ＨｉｃＤＨについては７ｍｇ／ｌで得られ、Ｌ−ＨｉｃＤＨについては４７ｍｇ／ｌ以上で得られた。
【００２９】
例３：大腸菌におけるギ酸デヒドロゲナーゼの製造
シュードモナス属１０１種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１０１）由来のギ酸デヒドロゲナーゼの遺伝子（ＰｓｅＦＤＨ；配列番号１１；Ｐ３３１６０；Ｅｇｏｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９，５６９−５７６）を、大腸菌（Ｇｅｎｅａｒｔ）での発現に最適なコドン使用頻度で合成し、制限酵素ＫａｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて発現ベクターｐＡＳＫ−ＩＢＡ３５（＋）にクローニングした。さらに、カンジダ・ボイジニイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）由来のギ酸デヒドロゲナーゼの遺伝子（ＣｂｏＦＤＨ；Ｏ１３４３７；Ｓｃｈｕｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２，１５１−１６０）を、大腸菌（Ｇｅｎｅａｒｔ）での発現に最適なコドン使用頻度で合成したが、ここで、この遺伝子は、安定性および活性を高めうるＣ２３ＡおよびＦ２８５Ｓなる２つのアミノ酸置換を有していた。Ｃｙｓ２３の反応性チオール側鎖をＡｌａで置換することで、前述の変異体Ｃ２３Ｓと同様に酵素が酸化に対して安定化されると考えられる（Ｓｌｕｓａｒｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２６７，１２８０−１２８７）。Ｐｈｅ２８５をＳｅｒで置換することによって酵素活性が高められることがすでに分かっている（Ｆｅｌｂｅｒ（２００１）Ｄｏｃｔｏｒａｌ  Ｔｈｅｓｉｓ，Ｈｅｉｎｒｉｃｈ−Ｈｅｉｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ；米国特許出願公開第２００３０１５７６６４号明細書（ＵＳ  ２００３０１５７６６４  Ａ１））。得られたＣｂｏＦＤＨ（Ｃ２３Ａ／Ｆ２８５Ｓ）をコードする遺伝子（配列番号１３）を、ＰｓｅＦＤＨについて上記で述べたｐＡＳＫ−ＩＢＡ３５（＋）にクローニングした。得られた発現プラスミドｐＡＳＫ−ＩＢＡ３５（＋）−ＣｂｏＦＤＨおよびｐＡＳＫ−ＩＢＡ３５（＋）−ＰｓｅＦＤＨは、それぞれアミノ末端Ｈｉｓ６タグをもコードしており、これらを、クローニングした構造遺伝子のＤＮＡシーケンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）により確認した。
【００３０】
ＰｓｅＦＤＨ（配列番号１２）およびＣｂｏＦＤＨ（Ｃ２３Ａ／Ｆ２８５Ｓ）（配列番号１４）を、本明細書において上記で例２において述べたアルコールデヒドロゲナーゼＤ−ＨｉｃＤＨと同一の条件下で大腸菌ＢＬ２１において製造した。
【００３１】
これら２つのＦＤＨを精製するために、細菌ペーストを、３００ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＫＰｉ（ｐＨ７．５）において湿潤細胞重量１ｇあたり３ｍｌに再懸濁させ、これをフレンチ・プレッシャー・セルで機械的に破砕した。遠心分離（３０分間、１８０００ｒｐｍ、固定角ロータ、４℃）後、ランニングバッファとして３００ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＫＰｉ（ｐＨ７．５）を使用して、Ｎｉ（ＩＩ）イオンにより荷電させた総容積５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐＨＰカラムに上清全体を加えた。ランニングバッファ中の０〜５００ｍＭのイミダゾール／ＨＣｌの直線的な濃度勾配によって、結合したＦＤＨを溶離させた。溶離したタンパク質を、ＮＭＷＬが３０ｋＤａである遠心ろ過装置を用いて濃縮した。ＰｓｅＦＤＨを約５０ｍｇ含有するタンパク質溶液４ｍｌ、またはＣｂｏＦＤＨ（Ｃ２３Ａ／Ｆ２８５Ｓ）を約１３０ｍｇ含有するタンパク質溶液６ｍｌを、３００ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのＫＰｉ（ｐＨ７．５）の存在下で総容積３２０ｍｌのＳＥＣ用ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０カラムに装入した。
【００３２】
ギ酸デヒドロゲナーゼＰｓｅＦＤＨおよびＣｂｏＦＤＨ（Ｃ２３Ａ／Ｆ２８５Ｓ）が、それぞれ１９ｍｇ／ｌおよび４５ｍｇ／ｌの収量で得られた。クマシー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、９５％超の高純度であることを確認した。
【００３３】
例４：デカルボキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを含む、生体触媒を用いた２段階の反応による、３−（メチルチオ）プロパナール（メチオナール）からのＤ−メチオニンヒドロキシ類似体（Ｄ−ＭＨＡ）の合成
ここで提案する生体触媒を用いた２段階の反応（図１）でＤ−ＭＨＡを合成するために、精製したデカルボキシラーゼＫｄｃＡおよびアルコールデヒドロゲナーゼＤ−ＨｉｃＤＨを、１０ｍｌの圧力反応器（Ｔｉｎｙｃｌａｖｅ  ｓｔｅｅｌ；Ｂｕｅｃｈｉ、スイス国、ウスター）内で以下の試薬と混合して、最終体積を１ｍｌとした：
【表３】
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【００３４】
基質であるメチオナールを加え、さらに２００ｋＰａ（２バール）のＣＯ２を加えることによって、デカルボキシラーゼＫｄｃＡの触媒作用下でのカルボキシル化反応を開始させた。この混合物の初期ｐＨは８であったが、ＣＯ２を加えたところ、（試料中で固定呈色式ｐＨ指示用スティック（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、ドイツ連邦共和国、カールスルーエ）で測定した通り）このｐＨは約６．５へとシフトした。１時間のインキュベーション後、この混合物を反応器から回収し、ベンチトップ型遠心分離器で１３４００ｒｐｍで５分間遠心分離して、沈殿したタンパク質を除去した。透明な上清において、Ｃ１８カラム（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８、４．６×１５ｍｍ、３μｍ、１１０Å；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ドイツ連邦共和国、アシャッフェンブルク）を用いた、１体積％（％（ｖ／ｖ））のリン酸を加えた４体積％（％（ｖ／ｖ））のアセトニトリル水溶液中でのイソクラティック溶離によるＨＰＬＣによって、生成物の形成を分析した。
【００３５】
それぞれＫｄｃＡ、Ｄ−ＨｉｃＤＨ、メチオナールまたはＮＡＤＨを用いない対照反応（図２ｂ）と比較して、デカルボキシラーゼ（例えばＫｄｃＡ）およびデヒドロゲナーゼ（例えばＤ−ＨｉｃＤＨ）の存在下での生体触媒を用いた２段階での合成のクロマトグラムから、選択された反応条件下でメチオナールからＤ−ＭＨＡが製造されることが明らかに実証された（図２ａ）。反応時間を延長して８時間とし、ＣＯ２圧力を８００ｋＰａ（８バール）に高め、かつＫｄｃＡ濃度を２倍にして２０μＭとすることによって、Ｄ−ＭＨＡの収率が、３％から２３％へと向上した（図２ｃ）。
【００３６】
例５：生体触媒を用いたＮＡＤＨ再生系の存在下でデカルボキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを含む、生体触媒を用いた２段階での反応によるメチオナールからのＤ−ＭＨＡの合成
デカルボキシラーゼ（例えばＫｄｃＡ）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（例えばＤ−ＨｉｃＤＨ）の触媒作用を用いて酵素により２段階でメチオナールからＤ−ＭＨＡを合成する際に、デヒドロナーゼによりＭＴＯＢのα−カルボニル基が還元されることによって、補助基質であるＮＡＤＨが消費される。ＮＡＤＨをその酸化型であるＮＡＤ＋からイン・サイチュで循環させるために、ギ酸デヒドロゲナーゼ（例えばＣｂｏＦＤＨ（Ｃ２３Ａ／Ｆ２８５Ｓ））を使用することができる。この酵素と補助基質としてのＮＡＤ＋とが協働してギ酸塩を酸化させることによってＣＯ２およびＮＡＤＨが得られるが、このＣＯ２は、メチオナールのカルボキシル化反応の基質としての役割も果たしうる（Ｓｃｈｕｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２，１５１−１６０；Ｗｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２３，２７８９−２８０２）。
【００３７】
３種の酵素を組み合わせたこの反応を、ＮＡＤＨ濃度が制限された状態（８０μＭ）で行い、これを、以下の試薬の入った１０ｍｌの圧力反応器（Ｔｉｎｙｃｌａｖｅ  ｓｔｅｅｌ）内の反応混合物に加えて、最終体積を１ｍｌとした：
【表４】
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【００３８】
例４と同様に、メチオナールを加え、さらに８００ｋＰａ（８バール）のＣＯ２を加えることによって反応を開始させた。この混合物の初期ｐＨは８であったが、ＣＯ２を加えたところ、（試料中で固定呈色式ｐＨ指示用スティックで測定した通り）このｐＨは約６．５へとシフトした。１．５時間のインキュベーション後、この混合物を反応器から回収し、例４に記載したＨＰＬＣを用いて分析した。得られたクロマトグラムから、Ｄ−ＭＨＡのピークが、ギ酸デヒドロゲナーゼの基質であるギ酸塩を用いなかった対照反応でのピーク（約３８μＭ）と比較して明らかに増加した（約１１４μＭ）ことが判明した（図２ｄ）。
【００３９】
したがって、デカルボキシラーゼ（例えばＫｄｃＡ）およびＮＡＤＨ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（例えばＤ−ＨｉｃＤＨ）を用いたＤ−ＭＨＡ形成反応に、ギ酸デヒドロゲナーゼをその基質と一緒に加えることによって、ＮＡＤＨ濃度の制限を補償することができるとともに、この補助基質を再生させることができる。
【００４０】
例６：デカルボキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを使用した、生体触媒を用いた２段階での反応による、メチオナールからのＬ−メチオニンヒドロキシ類似体（Ｌ−ＭＨＡ）の合成
ここに提案する生体触媒を用いた２段階での反応（図１）でＬ−ＭＨＡを合成するために、精製したデカルボキシラーゼ（例えばＫｄｃＡ）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（例えばＬ−ＨｉｃＤＨ）を、１０ｍｌの圧力反応器（Ｔｉｎｙｃｌａｖｅ  ｓｔｅｅｌ）内で以下の試薬と混合して、最終体積を１ｍｌとした：
【表５】
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【００４１】
本明細書において上記で例４および例５において記載した通り、メチオナールを加え、さらに８００ｋＰａ（８バール）のＣＯ２を加えることによって反応を開始させた。初期ｐＨは８であったが、ＣＯ２を加えたところ、試料中で固定呈色式ｐＨ指示用スティックで測定した通り、このｐＨは６．５へとシフトした。
【００４２】
８００ｋＰａ（８バール）で４５分間が経過した後、この混合物をオートクレーブから回収し、ベンチトップ型遠心分離器で１３４００ｒｐｍで５分間遠心分離して、沈殿したタンパク質を除去した。透明な上清において、生成物の形成を、例４に記載したＣ１８カラムを用いたＨＰＬＣにより分析した。
【００４３】
デカルボキシラーゼ（例えばＫｄｃＡ）とデヒドロゲナーゼ（例えばＬ−ＨｉｃＤＨ）との組合せの作用による、生体触媒を用いた２段階でのメチオナールからのＬ−ＭＨＡの合成についてのクロマトグラム（図３ａ）と、それぞれＫｄｃＡ、Ｌ−ＨｉｃＤＨ、メチオナールまたはＮＡＤＨを用いない対照反応についてのクロマトグラム（図３ｂ）から、補因子であるＮＡＤＨに加えて、例えばＫｄｃＡなどのデカルボキシラーゼと、例えばＬ−ＨｉｃＤＨなどのアルコールデヒドロゲナーゼとの双方の酵素が存在する場合にのみ、選択された反応条件下でメチオナールからＬ−ＭＨＡが特異的に合成されることが明らかに実証された。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【配列表】
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