(57)【要約】【課題】正確に希釈倍率を求めて成分の定量分析をする血液分析方法及び血液検査キットを提供すること。【解決手段】採取された血液検体を希釈液で希釈する工程と、血液中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定する工程と、血液検体中の対象成分の濃度を分析する工程とを含む、血液分析方法であり、血液分析方法が、希釈液が収納された第１の収容器具と、希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具と、分離器具を保持するための保持器具と、回収した血漿を収容するための第２の収容器具と、収容した血漿を第２の収容器具内に維持するための封止器具とからなる群により選択される部材を用いる血液分析方法であって、希釈液が、希釈液及び／又は部材に由来する、希釈液中に含まれうる標準成分の量を規定した希釈液であり、血液検体の容量が５０μＬ以下であり、血液検体中の血漿成分の希釈倍率が１４倍以上である、血液分析方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
採取された血液検体を希釈液で希釈する工程と、
血液中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定する工程と、
血液検体中の対象成分の濃度を分析する工程と、
を含む、血液分析方法であり、
前記血液分析方法が、前記希釈液が収納された第１の収容器具と、前記希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具と、前記分離器具を保持するための保持器具と、回収した血漿を収容するための第２の収容器具と、収容した血漿を第２の収容器具内に維持するための封止器具とからなる群により選択される部材を用いる血液分析方法であって、
前記希釈液が、前記希釈液及び／又は前記部材に由来する、前記希釈液中に含まれうる前記標準成分の量を規定した希釈液であり、
前記血液検体の容量が５０μＬ以下であり、前記血液検体中の血漿成分の希釈倍率が１４倍以上である、血液分析方法。
【請求項２】
前記希釈液に含まれうる前記血液検査キットの部材に由来する前記標準成分の量が、希釈液に対し、０．３５ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１に記載の血液分析方法。
【請求項３】
血液中に恒常的に存在する前記標準成分が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンである、請求項１又は２に記載の血液分析方法。
【請求項４】
血液中に恒常的に存在する前記標準成分が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンと、さらに少なくとも１種の標準成分とである、請求項１から３のいずれか一項に記載の血液分析方法。
【請求項５】
前記さらに少なくとも１種の標準成分が、総タンパク又はアルブミンから選択される標準成分である、請求項４に記載の血液分析方法。
【請求項６】
前記さらに少なくとも１種の標準成分の標準値を用いて求めた希釈倍率から前記対象成分の濃度の分析を検証する工程、を更に含む、請求項４又は５に記載の血液分析方法。
【請求項７】
前記希釈液が、血液中に恒常的に存在する標準成分を含まない、請求項１から６のいずれか一項に記載の血液分析方法。
【請求項８】
前記希釈液が、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０のｐＨ域で緩衝作用を有する緩衝液である、請求項１から７の何れか一項に記載の血液分析方法。
【請求項９】
前記希釈液が、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、２−エチルアミノエタノール、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミンからなる群から選択されるアミノアルコール化合物、並びにＨＥＰＥＳとも称する２−［４−（２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジニル］  エタンスルホン酸）、ＴＥＳとも称するＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、ＭＯＰＳとも称する３−モルホリノプロパンスルホン酸、及びＢＥＳとも称する（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸からなる群から選択される緩衝剤を含む希釈液である、請求項１から８の何れか一項に記載の血液分析方法。
【請求項１０】
希釈液が収納された第１の収容器具と、前記希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具と、前記分離器具を保持するための保持器具と、回収した血漿を収容するための第２の収容器具と、収容した血漿を第２の収容器具内に維持するための封止器具とを含む、請求項１から９の何れか一項に記載の血液分析方法において使用するための血液検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量の血液検体中の対象成分を分析するための、血液分析方法及び血液検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、採血には、医師等一定の有資格者が注射器を用いて静脈から血液を採取する一般採血と、検査対象者が、自分の手の指等に採血針を刺して血液を採取する自己採血とがある。
【０００３】
一般採血により採取された血液は、採取容器に密閉された状態で医療機関又は検査機関に輸送され、そこで検査が行われている。血液を血球と血漿とに分離せずに輸送する場合には、医療機関又は検査機関にて遠心分離機により血液を血球と血漿とに分離した後に検査が行われる。また、検査対象者が行う自己採血では、採血後の血液は分離膜により血球と血漿とに分離され、この分離された状態で検査場所に輸送され、そこで検査が行われる。
【０００４】
特許文献１には、自己採血により採取された血液検体の検査方法が記載されている。具体的には、１）容量を定量することなしに採取した定量すべき成分を含有する未知容量の生体試料と一定量の指示物質を含有する一定量の水性溶液とからなる定量用試料を調製する工程、２）一定量の指示物質を含有する一定量の水性溶液中の指示物質の濃度（Ｃ1）と定量用試料中の指示物質の濃度（Ｃ2）とから生体試料の希釈倍率（ａ）を求める工程、３）定量用試料中の定量すべき成分の濃度（Ｙ）を求める工程、４）上記２）で求めた生体試料希釈倍率（ａ）と上記３）で求めた定量用試料中の定量すべき物質の濃度（Ｙ）とから生体試料中の定量すべき成分を決定する工程を含む生体試料中の定量すべき成分の定量方法が記載されている。
【０００５】
特許文献２には、検体中の分析対象成分量を測定し、さらに、これ以外の恒常的に検体中に元来存在する標準成分の量を測定し、この標準成分の量と、検体中での標準成分の既知濃度とから検体の量を決定し、この検体量と、分析対象成分量とから、検体中の分析対象成分の濃度を決定する定量分析法が記載されている。
【０００６】
また、特許文献３には、血液希釈定量器具を用いてヒトや動物から微量血液を採取しそのまま又は希釈したのち一定量を他の機器や容器又は直接試薬に供給することが記載されている。さらに特許文献４には、希釈用水溶液中の指示物質の吸光度を利用して、生物学的試料中の定量すべき成分の濃度を定量する方法が記載されている。
【０００７】
一方、血液検体を検査対象者が採取する際には、小型ナイフが具備されたランセットにて採取し、血液中の任意成分の濃度の定量に使用されているが、通常１００μＬ以上の血液検体を採取することが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−１６１７２９号公報
【特許文献２】特開２００１−３３０６０３号公報
【特許文献３】特開２００９−１２２０８２号公報
【特許文献４】特開２００９−１０９１９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１に記載の方法においては、血液検体が微量である場合には、血液検体量に対する希釈液の割合を高くすることが必要になる。しかし、この場合、血液検体を希釈する前後での希釈液の体積変化率が非常に小さくなるため、内部標準物質の濃度の変化率が小さくなり、測定値の繰り返し再現性が低下するという問題がある。
【００１０】
特許文献２には、健常者全血約１００μＬを多孔質膜に滴下し、血球を分離して血清を展開した後に、１５０μＬの生食等張ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：  ｐＨ７．４）を添加して得た液を遠心分離して得られた上清を分析試料として分析しているが、１００μＬ未満の採血については記載されていない。
【００１１】
特許文献３の方法では、１０μＬの血液量をマイクロピペットで正確に採取して分析しているが、採血に不慣れな患者が採取する場合には一定量を正確に採取することは難しく、誤差を含む採血で検査をした場合には測定値に誤差が含まれる結果となる。
【００１２】
特許文献４に記載の測定方法は希釈倍率が１０倍程度の測定であり、希釈倍率をさらに高めて希釈血液量を十分に確保する場合には、特許文献１と同様に、測定値の繰り返し再現性が低下するという問題がある。
【００１３】
上記の通り、微量の血液検体を使用する場合について測定値の繰り返し再現性が高い血液分析方法が望まれている。本発明者らは、５０μＬ以下の血液検体において測定値の繰り返し再現性が高い血液分析方法を精度高く行う為には、従来から提案されている内部標準物質を用いることでは充分ではないと考え、外部標準物質を用いる方法を検討した。
【００１４】
本発明は、５０μＬ以下の微量血液を緩衝液で希釈して成分を定量分析する方法として、血液中に恒常的に存在する標準成分を用いて血液検体中の対象成分の濃度を分析する方法において、血液検査キットの部材から、緩衝液中に溶出する血液に恒常的に存在する標準成分濃度を規定することで、例えば、特許文献１及び、特許文献２の従来技術にはない精度で、正確に希釈倍率を求めて成分の定量分析をする血液分析方法及び血液検査キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、採取された血液検体を希釈液で希釈し、血液中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定し、血液検体中の対象成分の濃度を分析する血液検査キットにおいて、血液検体の容量が５０μＬ以下であり、血液検体中の血漿成分の希釈倍率が１４倍以上であり、希釈液として、希釈液及び／又は血液検査キットの部材に由来する、希釈液中に含まれうる標準成分の量を規定した希釈液を使用するという構成によって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
【００１６】
（１）  採取された血液検体を希釈液で希釈する工程と、
血液中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定する工程と、
血液検体中の対象成分の濃度を分析する工程と、
を含む、血液分析方法であり、
上記血液分析方法が、上記希釈液が収納された第１の収容器具と、上記希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具と、上記分離器具を保持するための保持器具と、回収した血漿を収容するための第２の収容器具と、収容した血漿を第２の収容器具内に維持するための封止器具とからなる群により選択される部材を用いる血液分析方法であって、
上記希釈液が、上記希釈液及び／又は上記部材に由来する、上記希釈液中に含まれうる上記標準成分の量を規定した希釈液であり、
上記血液検体の容量が５０μＬ以下であり、上記血液検体中の血漿成分の希釈倍率が１４倍以上である、血液分析方法。
（２）  上記希釈液に含まれうる上記血液検査キットの部材に由来する上記標準成分の量が、希釈液に対し、０．３５ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、（１）に記載の血液分析方法。
（３）  血液中に恒常的に存在する上記標準成分が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンである、（１）又は（２）に記載の血液分析方法。
（４）  血液中に恒常的に存在する上記標準成分が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンと、さらに少なくとも１種の標準成分とである、（１）から（３）のいずれか一に記載の血液分析方法。
（５）  上記さらに少なくとも１種の標準成分が、総タンパク又はアルブミンから選択される標準成分である、（４）に記載の血液分析方法。
（６）  上記さらに少なくとも１種の標準成分の標準値を用いて求めた希釈倍率から上記対象成分の濃度の分析を検証する工程、を更に含む、（４）又は（５）に記載の血液分析方法。
（７）  上記希釈液が、血液中に恒常的に存在する標準成分を含まない、（１）から（６）のいずれか一に記載の血液分析方法。
（８）  上記希釈液が、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０のｐＨ域で緩衝作用を有する緩衝液である、（１）から（７）の何れか一に記載の血液分析方法。
（９）  上記希釈液が、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、２−エチルアミノエタノール、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミンからなる群から選択されるアミノアルコール化合物、並びにＨＥＰＥＳとも称する２−［４−（２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）、ＴＥＳとも称するＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、ＭＯＰＳとも称する３−モルホリノプロパンスルホン酸、及びＢＥＳとも称する（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸からなる群から選択される緩衝剤を含む希釈液である、（１）から（８）の何れか一に記載の血液分析方法。
（１０）  希釈液が収納された第１の収容器具と、上記希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具と、上記分離器具を保持するための保持器具と、回収した血漿を収容するための第２の収容器具と、収容した血漿を第２の収容器具内に維持するための封止器具とを含む、（１）から（９）の何れか一に記載の血液分析方法において使用するための血液検査キット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の血液分析方法及び血液検査キットによれば、血液中に恒常的に存在する標準成分を用いて血液検体中の対象成分の濃度の分析を精度よく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明の実施の態様に係る血液検査キットの断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。なお、Ｘ〜Ｙで示される範囲は、上限Ｘと下限Ｙの値を含む。血液中に恒常的に存在する標準成分のことを、外部標準物質又は外部標準ということがある。また、血液中に存在しない標準成分のことを、内部標準物質又は内部標準ということがある。
【００２０】
血液検査を行う場合、採血針を被検者の静脈に挿入して血液を採取するか、指先などの皮膚に傷をつけて、皮膚外に流出した血液を採取する方法で血液を入手している。いずれの方法も皮膚に傷をつける侵襲的な行為であるため、患者の痛みを伴うものとなる。そのため、皮膚につける傷を小さくして侵襲性を極力抑え、患者の痛みを和らげる方法で採血して分析を行う方法が多くの患者から望まれている。その場合、傷を小さくすることで痛みは小さくなるが、採血量が微量となるため、検査可能な対象成分の種類が限られてしまうという弊害がある。特許文献１の検査方法にこのような態様を当てはめて、上記弊害を解決しようとする場合、採血量に対する希釈液量の割合を高くすることによって、血液を希釈した希釈液について、検査が必要な分析対象成分の全てを検査することを可能とするのに十分な量を確保することになる。しかし、採血量が少ない場合には血液を希釈する前後での希釈液の体積変化率が非常に小さくなり、内部標準物質として使用する物質の変化率も非常に小さくなるため、計量時の計量誤差や、測定時の測定誤差が相対的に大きくなり、測定精度の悪化や、繰り返し再現性の低下などにより検査の信頼性が損なわれる可能性がある。従って、測定値の再現性の高い検査のためには、血液検体の量をある程度確保する必要があり、被検者にある程度の痛みを伴う採血方法を行う必要があった。
【００２１】
特許文献２では、約１００μＬの血液量を採取しているが、１００μＬの血液を患者が自分で採血をする場合、指先などの皮膚につける傷は大きくする必要があり、患者は痛みを伴い、人によっては強い痛みとして感じる場合もある。また、傷も深いので止血が遅くなる懸念もある。さらに特許文献２では、恒常性成分量として血液中の恒常性の中心値が０．９ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオン、４．６５ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオン、７．５ｇ／１００ｍＬの総タンパクを用いて希釈倍率を測定している。しかし、患者が採血をする血液量が少なくなると、希釈液中の恒常性成分の濃度が低くなり、恒常性成分を測定する際に無視できない測定誤差を含む結果となってしまう。その結果、希釈倍率の測定値にも誤差を含むことになり、測定の信頼性が損なわれる。
【００２２】
特許文献３の方法では、１０μＬと少ない血液量をマイクロピペットで一定量を正確に採取して分析しているが、患者が採取する場合には、採血に不慣れな患者も多いため一定量を正確に常に採取することは難しい。患者が採取する場合には、繰り返し採血するため、多くの血液量が皮膚外に流出されることになるか、誤差を含む採血で検査をした場合に測定値に誤差が含まれる結果となってしまう。
【００２３】
特許文献４には、２波長の光を利用して、乳ビの影響を補正して測定精度をあげる技術が開示されているが、希釈倍率が１０倍程度の測定である。特許文献４の方法は、希釈した血液量が１００μＬ以下の分析には有効であるが、分析対象成分が少なく、さまざまな多くの分析対象成分の情報を入手して、臓器の状態、生活習慣の予測などに使用する目的の検査には対応できない。この場合、希釈倍率をさらに高めて希釈血液量を十分に確保する場合には、特許文献１と同様の課題に直面する。
【００２４】
本発明は、上記した問題点を考慮して検討されたものであり、採血時の侵襲性を低減して患者の負担を和らげるために採取する血液量を微量とした場合であっても、希釈倍率を高くして分析すべき希釈液量を十分に確保した時の再現性良い希釈倍率を実現でき、対象成分の高い分析精度を実現するために、微量な血液中に高い濃度で存在する標準成分を測定することが好ましい。本発明では、血液検体中に恒常的に存在する成分の中でも高濃度に存在する、ナトリウムイオン（Ｎａ+）又は塩化物イオン（Ｃｌ-）を用いることが好ましく、更には、上述の血液中に恒常的に存在する標準成分の中でも血液中に存在する量が最も多いナトリウムイオンを測定することが最も好ましい。ナトリウムイオンは、平均値が標準値（基準範囲の中央値）を表し、その値は、１４２ｍｍｏｌ／Ｌであり、血漿中の総陽イオンの９０モル％以上を占める。
【００２５】
これら先行技術の実施例では、抽出する緩衝液にはリン酸緩衝生理食塩水が生体成分の安定保持に優れているので利用されているが、リン酸緩衝生理食塩水にはナトリウムイオンや塩化物イオンが含まれている。そのためナトリウムイオンや塩化物イオンは外部標準として利用できず、カルシウムイオン、蛋白等が利用されている。従って、微量血液での血液検査を精度高く行う為には、従来技術にあるように希釈率を補正する外部標準物質の使用や、従来提案されている内部標準物質を含有する緩衝液の使用では検査精度の確保が充分ではなかった。
【００２６】
また、血液中の恒常性物質とはいえ、例えば、ナトリウムイオンにおいては、正常値１３４〜１４６ｍｍｏｌ／Ｌの分布の幅を有するため、より正確な希釈倍率を算出することが必要となる。希釈倍率の精度が低下すると検査精度に悪影響を与えて、検査の信頼性を損なうリスクが高まってしまう。特に、キットを構成する部材から緩衝液中に溶出する外部標準物質による汚染（いわゆるコンタミ）が多少なりともあった場合に、血液採取量が変化すると、コンタミの希釈倍率算出に与える影響度が異なることになる。特許文献２では、このようなキットを構成する部材から緩衝液中に溶出する外部標準物質のコンタミの希釈倍率算出に与える影響度を抑えることに関しては、一切言及していない。
【００２７】
本発明は、患者に負担の少ない微量血液採取量による検体を緩衝液で希釈して対象成分の濃度を分析する血液分析方法であって、血液中に恒常的に存在する外部標準を用いて対象成分の分析を行うに際して、従来技術にはない精度で希釈倍率を求めることが可能な血液分析方法を提供することに関するものであり、そのための解決手段として、希釈液中に含まれうる、希釈液成分及び／又は血液検査キットの部材に由来する上記標準成分の量を規定したものである。
【００２８】
希釈液中に含まれうる標準成分は、希釈液に溶解した化学物質由来の成分と、血液検査キットを校正する部材から溶出する成分の２種類が存在する。前者の希釈液に溶解した化学物質由来の成分とは、例えば、ナトリウムを標準成分として用いる場合には、抗凝固剤や、緩衝液などの、カウンターイオンにナトリウムを使用した場合の成分などが考えられる。後者の場合には、緩衝液を収容する容器や、血球を分離する分離膜やフィルターなどにもともと含有される成分、これら部材の調製段階で表面に付着して残った成分などがある。本発明では、採取する血液量を微量とした場合、希釈液に持ち込まれる血液由来の標準成分の量は非常に微量であり、希釈液中に含まれうる上記標準成分が有る程度存在する場合に生じる誤差が相対的に大きくなる。従って、規定する希釈液中に含まれうる上記部材に由来する上記標準成分の量を規定するものであり、上記の量は、極力低い値に規定することが好ましい。この場合、希釈液を構成する化学物質及び溶媒由来の標準物質は無視できる程に微量とし、緩衝液を収容する容器、及び血球を分離する分離膜等の部材由来の標準物質の量を血液分析の精度を保証できる程度の量に規定することが必要である。このような構成とすることで、採取した血液が微量であり、希釈液による血漿の希釈倍率が高い場合であっても、血漿の希釈倍率を正確に求めることが可能であり、しかも測定値の繰り返し再現性が高い血液分析を行うことが可能となる。このことは、先行技術文献の記載からは予想できない効果である。
【００２９】
血液中に恒常的に存在するナトリウムを標準成分として用いる場合、後述するように、血漿と希釈液の混合液中のナトリウムイオン濃度を測定することで、血漿中のナトリウムイオン濃度の恒常的な平均値である１４２ｍｍｏｌ／Ｌを用いて希釈倍率を算出し、分離回収した血漿中に存在する対象成分の濃度が算出できる。この場合、血液検査キットの部材に由来する希釈液中のナトリウムイオン量（血液由来でないナトリウムイオン量、即ち、コンタミ成分）が、血漿中のナトリウムイオン量の５％程度かそれ以下に抑えることで、希釈倍率の算出において５％程度の誤差精度を維持可能となる。例えば、希釈液の量を３５０μＬとし、血液採血量を３０μＬ、血漿成分の占める割合を５５％とした場合、希釈液に含まれうるキットの部材に由来するナトリウム成分の量が、希釈液に対し、０．３５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるとすると、血漿由来のナトリウムイオンに対して、５質量％程度にとどまるため、検査精度を５％程度の誤差精度の範囲内に維持できることがわかる。また、希釈液に対し、０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるとすると、検査精度を２％程度の誤差精度の範囲内に維持できることがわかる。希釈液に含まれうるキットの部材に由来するナトリウム成分の量は、少ないことが好ましく、０．３５ｍｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下がより好ましく、０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下が更に好ましい。
【００３０】
（血液検体）
本発明の血液分析方法の対象となる生体試料は血液であり、血液とは、血清又は血漿を含む概念である。血液の起源はヒトに限定されず、ヒト以外の動物（非ヒト動物）である哺乳類、鳥類、魚類等であっても良い。ヒト以外の動物としては、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、クマ、パンダ等が挙げられる。好ましくは、生体試料の起源はヒトである。
本発明では、血液検体を採取して、血液検体中の対象成分を分析する。本発明の血液分析方法は、対象者自身が血液を採取する自己採血で実施してもよいし、医師等の有資格者が注射器を使用して血液を採取する一般採血において実施してもよい。
【００３１】
好ましい態様としては、患者本人が、ランセットなどのナイフ付の器具を用いて指先などを傷つけて皮膚外にでた血液を採取する方法がある。患者の負担を減らすために、侵襲性低く血液を採取することが好ましく、血液を採取するときに無痛、あるいは、痛みが非常に少ない状態で採血できることがより好ましい。その場合、傷の深さ、大きさは小さいことが望ましく、結果として採取できる血液も非常に少なくなる。従って、本発明の血液分析方法で用いる血液検体の容量（即ち、採血量）は５０μＬ以下であり、４０μＬ以下が好ましく、３０μＬ以下がより好ましく、２０μＬ以下がさらに好ましく、下限は特に限定されないが一般的には血液分析を行うための必要な血液量として５μＬ以上であることが好ましい。本発明においては、血液検体が微量の場合でも、測定精度よく対象成分の分析を行うことが可能である。
【００３２】
採取する血液には、血漿成分と血球成分が含まれるが、血漿成分中の対象成分の濃度を測定するために、血液から血球成分を除いた血漿成分を希釈液で希釈する。あらかじめ血液から血球成分を分離した後に希釈液で希釈してもよいし、採取した血液を希釈液で希釈してから、分離膜などを用いて血球成分を分離してもよいが、採取した血液検体を希釈液で希釈した後に、血漿成分含有試料を分離して回収することが好ましい。
【００３３】
血液が希釈された状態で長時間放置される場合には、例えば、赤血球の溶血が起こり、血球内の濃度が高い物質や酵素などが血漿あるいは血清中に溶出し、検査結果に影響を与えたり、赤血球から溶出するヘモグロビン成分が検査に影響を与える可能性があるため、血漿成分含有試料を血球から分離したのちに、血漿成分含有試料と血球とを隔離することが好ましい。この場合、血球から隔離した血漿成分含有試料を、例えば検査場所まで輸送することができる。
【００３４】
血液から血球を分離して血漿を回収する方法、並びに希釈した血液から血球を分離して血漿成分含有試料を回収する方法は、特に制限はない。抗凝固剤入り採血管で採血した後に遠心分離を行って血液を血球成分と血漿成分に分離してもよいし、血液成分に圧力を加えて濾過膜などの分離膜を通過させて、血球成分を分離膜に捕捉させて血液から血球成分を分離してもよい。この場合、抗凝固剤を用いてもよい。血漿成分を回収する工程は、上記の中でも好ましくは、分離膜を用いる工程である。また、測定の精度を確保するために、血球成分を除いた血液の溶液部分と物理的に隔離することが好ましく、この場合、具体的には、特開２００３−２７０２３９号公報に記載の逆流防止手段を有する生体試料分離器具等を用いることができる。
【００３５】
（血液検体の希釈）
本発明では、採取された血液検体を希釈液で希釈する。
血液検査として、肝機能、腎機能、メタボリズムなど、特定の臓器、特定の疾患を検査する場合には、臓器や疾患に特有の複数の測定対象成分の情報を入手して、臓器の状態、生活習慣の予測などを行うために、一般的には、複数の対象成分の分析が同時に行われる。たとえば、肝臓の状態を検査するためには、一般的には、ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、γ−ＧＴＰ（γグルタミルトランスペプチダーゼ）、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）、総ビリルビン、総タンパク、アルブミン等の数種類以上の成分の血液中の濃度が測定される。このように、複数の対象成分を一つの血液検体から測定するためには、再測定の可能性も考慮すると、希釈された血液の量がある程度必要となる。従って、採取した血液を希釈する希釈液としては、ある程度の量の希釈液を使用することが必要になる。採取した血液量にかかわらず、使用する希釈液の量は、複数の対象成分を測定するためには、２５０μＬ以上が好ましく、３００μＬ以上がより好ましく、３５０μＬ以上がさらに好ましく、４００μＬ以上であることが最も好ましく、希釈液の量の上限は特に限定されないが、測定に有効な希釈率を実現するため、一般的には１０００μＬ以下が好ましい。
【００３６】
（希釈倍率）
患者である被検者の血液中における血漿成分の占有率は、容積の比率で約５５％であるが、被検者の塩分摂取量の変化などで変動し、また被検者ごとにも異なる。そのため、本発明においては、血液中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定し、決定された希釈倍率を用いて血液検体中の対象成分の濃度を分析する。希釈倍率を決定する方法としては、血漿の希釈液中の標準物質の測定値（濃度Ｘ）と、血漿中に恒常的に存在する標準物質の既知濃度値（濃度Ｙ）とから、血液検体中の血漿成分の希釈倍率（Ｙ／Ｘ）を算出することができる。この希釈倍率を用いて、血漿の希釈液中の対象成分の測定値（濃度Ｚ）を測定し、この測定値に希釈倍率を掛け合わせることにより、実際に血液検体中に含まれる分析対象成分の濃度［Ｚ×（Ｙ／Ｘ）］を測定することができる。
【００３７】
血液の採取は、侵襲性低く行うことが患者などの被検者にとって好ましく、微量の血液検体から血液の希釈液を調製することになる。一方で、上述したように、複数の測定対象成分の分析を可能とするためにある程度の量の希釈液が必要となることから、血液検体中の血漿成分の希釈倍率が高くなる。本発明においては、低侵襲性の採血を可能とするため、採取した血液の血漿成分の希釈倍率は、１４倍以上であり、１７倍以上が好ましく、２１倍以上がより好ましく、２５倍以上が更に好ましく、３０倍以上が特に好ましく、４０倍以上が最も好ましい。上限は特に限定されないが、高い精度の測定を可能にするために、１００倍以下が好ましい。血球を含む血液を希釈液で希釈する、血液自体の希釈倍率とした場合、８倍以上が好ましく、１０倍以上がより好ましく、１３倍以上が更に好ましく、１８倍以上が最も好ましく、上限は特に限定されないが、高い精度の測定を可能にするために、５０倍以下が好ましい。
【００３８】
（標準物質）
上記のように、血漿成分の希釈倍率の高い希釈血漿中の対象成分の分析に用いる標準物質として、希釈液中にあらかじめ存在する物質を用いる場合には、希釈前後の標準物質の濃度変化が非常に小さいために希釈倍率の測定誤差が大きくなり、測定の再現性が悪化する弊害がある。一方で、血液中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定する本発明の方法では、希釈前後の標準物質の濃度変化が大きいため、測定誤差が小さく、測定の再現性も良好に保つことが可能となるので、常に測定精度の高い血液分析が可能となる。なお、血液中に恒常的に存在する標準成分のことは、外部標準物質とも称する。
【００３９】
血液中に恒常的に存在する標準成分は、たとえば、ナトリウムイオン、塩化物イオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、総タンパク、及びアルブミン等が挙げられる。血液検体の血清及び血漿中に含まれるこれらの標準成分の濃度は、ナトリウムイオン濃度は、１３４〜１４６ｍｍｏｌ／Ｌ（平均値：１４２ｍｍｏｌ／Ｌ）、塩化物イオン濃度は、９７〜１０７ｍｍｏｌ／Ｌ（平均値：１０２ｍｍｏｌ／Ｌ）、カリウムイオン濃度は、３．２〜４．８ｍｍｏｌ／Ｌ（平均値：４．０ｍｍｏｌ／Ｌ）、マグネシウムイオン濃度は、０．７５〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌ（平均値：０．９ｍｍｏｌ／Ｌ）、カルシウムイオン濃度は、４．２〜５．１ｍｍｏｌ／Ｌ（平均値：４．６５ｍｍｏｌ／Ｌ）、総タンパク濃度は、６．７〜８．３ｇ／１００ｍＬ（平均値：７．５ｇ／１００ｍＬ）、アルブミン濃度は、４．１〜５．１ｇ／１００ｍＬ（平均値：４．６ｇ／１００ｍＬ）である。患者、あるいは被検者の低侵襲性の採血を可能とするためには微量の採血量でも対象成分の測定を精度よく行うため、血液中に高い濃度で存在する標準成分を用いることが好ましい。本発明では、血液検体中に恒常的に存在する成分の中でも高濃度に存在する、ナトリウムイオン（Ｎａ+）又は塩化物イオン（Ｃｌ-）を用いることが好ましく、更に、標準成分の中でも血液中に存在する量が一番高いナトリウムイオンを測定することが最も好ましい。ナトリウムイオンは、血漿中の総陽イオンの９０％以上を占める。
【００４０】
（検証）
血液中の分析対象成分の濃度分析が正常に行われているか確認をするために、血液中に恒常的に存在する異なる２つ以上の成分を標準成分として用いて、それぞれ独立に血液検体中の血漿成分の希釈倍率を求めて、その値がほぼ一致することを確認することが好ましい。好ましい一態様としては、ナトリウムイオン以外の血漿中に恒常的に存在する標準成分から求めた希釈倍率が、ナトリウムイオン濃度から求めた希釈倍率と比較してほぼ同じ値であることを確認することによって、血漿の希釈液中のナトリウムイオン濃度の測定値から求めた希釈倍率を用いて行った血液中の分析対象成分の濃度分析が正常に行われていることの確証が可能となる。塩化物イオンの測定法は、イオン選択電極を用いた電極法（Ｉｏｎ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ：ＩＳＥ）や、アミラーゼなどの酵素を用いる酵素法、硝酸銀滴定法などがあり、測定試料の特性や感度、試料量などに応じて適宜使用する方法を選択することができる。本発明の好ましい態様としては、血液中に恒常的に存在する標準成分が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンと、さらに、別の血液中に恒常的に存在する標準成分である場合である。この場合、ナトリウムイオン及び塩化物イオン以外の血漿中に恒常的に存在する検証のために使用する標準成分の例としては、総タンパク又はアルブミンから選択されることが好ましく、総タンパクから選択されることがより好ましい。総タンパクの測定法としては、ビューレット法や、紫外吸収法、ブレッドフォード法、ローリー法、ビシンコニン酸（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ：ＢＣＡ）法、蛍光法など公知の方法があり、測定試料の特性や感度、試料量などに応じて適宜使用する方法を選択することができる。
【００４１】
ナトリウムイオン濃度及び塩化物イオン濃度は、例えば、炎光光度法、ガラス電極法、滴定法、イオン選択電極法、酵素活性法等により測定することができる。
【００４２】
本発明において、血液検体中の対象成分の濃度を分析するとは、対象成分の濃度を決定すること（即ち、対象成分を定量すること）、又は対象成分の濃度が所定の基準値以上であるか所定の基準値以下であるかを決定すること、ある程度の濃度を含むことを検出する定性測定を行うこと、などを包含し、分析の形態は特に限定されない。
【００４３】
（希釈液）
本発明においては、血液中に恒常的に存在する標準成分（以下、恒常性物質とも言う）を希釈液で希釈後に測定し、上記した通り希釈倍率を決定して、血液検体中の対象成分の濃度を分析することができる。血液検体を希釈するための希釈液として用いる化学物質又は溶媒については、希釈倍率を求めるために使用する「血液中に恒常的に存在する標準成分」を含有しない（含まない）ことが好ましい。本明細書において「含有しない」とは、「実質的に含有しない」ことを意味する。ここで、「実質的に含有しない」とは、希釈倍率を求める時に使用する恒常性物質をまったく含まないか、あるいは含まれていたとしても、血液検体を希釈した後の希釈液の恒常性物質の測定に影響を及ぼさない程度の極微量の濃度で含まれる場合を意味する。恒常性物質として、ナトリウムイオン又は塩化物イオンを用いる場合には、希釈液に用いる化学物質又は溶媒に、ナトリウムイオン又は塩化物イオンを実質的に含有しないことが好ましい。
【００４４】
本発明においては、患者又は被検者が採血した血液検体を希釈した後、医療機関又は検査機関に輸送して対象成分の濃度を分析することが可能である。この場合、採血から分析までには長時間を要することがあることから、その間に、血漿の希釈液中での対象成分の分解や変性を防止することが好ましい。血液のｐＨは、健常者では通常ｐＨ７．３０〜７．４０程度で一定に保たれている。従って、対象成分が分解や変性するのを防止するために、希釈液は、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０、好ましくはｐＨ７．０〜ｐＨ７．５、更に好ましくはｐＨ７．３〜ｐＨ７．４のｐＨ域で緩衝作用を有する緩衝成分を含有する緩衝液であることが好ましい。
【００４５】
緩衝液の種類としては、酢酸緩衝液（Ｎａ）、リン酸緩衝液（Ｎａ）、クエン酸緩衝液（Ｎａ）、ホウ酸緩衝液（Ｎａ）、酒石酸緩衝液（Ｎａ）、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン）緩衝液（Ｃｌ）、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（Ｎａ）等が知られている。これらの中でｐＨ７．０〜ｐＨ８．０付近の緩衝液としては、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液が代表的なものである。しかしながら、リン酸緩衝液はリン酸のナトリウム塩が含まれていること、Ｔｒｉｓ緩衝液は、解離ｐＫａ（Ｋａは酸解離定数）は８．０８であるため、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０付近で緩衝能を持たせるためには通常は塩酸と組み合わせて使用されること、ＨＥＰＥＳのスルホン酸の解離のｐＫａは７．５５であるが、イオン強度一定での緩衝溶液を調整するため、通常は水酸化ナトリウムと塩化ナトリウムとＨＥＰＥＳの混合物が用いられることから、ナトリウムイオンや、塩化物イオンを標準物質として用いる場合には、本発明への適用は好ましくない。
【００４６】
本発明で用いる希釈液としては、ナトリウムイオン又は塩化物イオンを含有しない緩衝液を用いることが好ましく、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、２−エチルアミノエタノール、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミンからなる群から選択される少なくとも１種のアミノアルコール化合物、並びにＧｏｏｄ’ｓ緩衝液（グッドバッファー）でｐＫａが７．４付近の緩衝剤であるＨＥＰＥＳとも称する２−［４−（２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）（ｐＫａ＝７．５５）、ＴＥＳとも称するＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ｐＫａ＝７．５０）、ＭＯＰＳとも称する３−モルホリノプロパンスルホン酸（ｐＫａ＝７．２０）、及びＢＥＳとも称する（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ｐＫａ＝７．１５）からなる群から選択される緩衝剤を用いることが好ましい。上記の中でも、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）とＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ又はＢＥＳとの組み合わせが好ましく、さらに、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）とＨＥＰＥＳとの組み合わせが最も好ましい。
【００４７】
上記緩衝液を調製するためには、アミノアルコールとＧｏｏｄ’ｓ緩衝液を１：２〜２：１、好ましくは１：１．５〜１．５：１、更に好ましくは１：１の濃度比で混合すればよい。緩衝液の濃度は限定されないが、アミノアルコール又はＧｏｏｄ’ｓ緩衝液の濃度は、０．１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは、１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００４８】
緩衝液中には、分析対象成分を安定に保つことを目的にキレート剤、界面活性剤、抗菌剤、防腐剤、補酵素、糖類等が含有されていてもよい。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、クエン酸塩、シュウ酸塩等が挙げられる。界面活性剤としては、例えば、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性界面活性剤又は非イオン界面活性剤が挙げられる。防腐剤としては、たとえば、アジ化ナトリウムや抗生物質等が挙げられる。補酵素としては、ピリドキサールリン酸、マグネシウム、亜鉛等が挙げられる。赤血球安定化剤の糖類としては、マンニトール、デキストロース、オリゴ糖等が挙げられる。特に、抗生物質の添加により、手指採血時に手指表面から一部混入する細菌の増殖を抑えることができ、生体成分の細菌による分解の安定化を図ることができる。
【００４９】
血液検体に全血を使用する場合には、希釈した血液中の血球成分をフィルター濾過する必要から、緩衝液の浸透圧を血液と同等か（２８５ｍＯｓｍ／ｋｇ（ｍＯｓｍ／ｋｇは、溶液の水１ｋｇが持つ浸透圧で、イオンのミリモル数をあらわす））、又はそれ以上とすることにより血球の溶血を防止することができる。浸透圧は、対象成分の測定、及び血液中に恒常的に存在する標準成分の測定に影響しない塩類、糖類又は緩衝剤等により、等張に調整することができる。
【００５０】
（対象成分）
血液検体中の分析の対象成分は特に限定されず、血液中に含まれるあらゆる物質が対象となる。例えば臨床診断に用いられる血液中の生化学検査項目、腫瘍マーカーや肝炎のマーカー等各種疾患のマーカー等が挙げられ、タンパク質、糖、脂質、低分子化合物等が挙げられる。また、測定は物質濃度だけでなく、酵素等の活性を有する物質の活性も対象となる。各対象成分の測定は、公知の方法で行うことができる。さらに、肝機能、腎機能、メタボリズムなど、特定の臓器、特定の疾患を検査する場合には、臓器や疾患に特有の複数の測定対象成分の情報を入手して、臓器の状態、生活習慣の予測などを行うため、複数の対象成分の分析が同時に行われる。たとえば、肝臓の状態を検査するためには、ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、γ―ＧＴＰ（γグルタミルトランスペプチダーゼ）、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）、総ビリルビン、総タンパク、アルブミン等の数種類以上の成分の血液中の濃度が測定される。
【００５１】
（血液検査キット）
本発明の血液検査キットは、希釈液が収納された第１の収容器具と、希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具と、分離器具を保持するための保持器具と、回収した血漿を収容するための第２の収容器具と、収容した血漿を第２の収容器具内に維持するための封止器具とを含む。本発明の血液検査キットの一例としては、血液検体の成分を希釈するための希釈液、希釈液が収容された第一の収容器具、希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具、分離器具を保持するための保持器具、回収した血漿を収容するための第二の収容器具、収容した血漿を第二の収容器具内に維持するための封止器具、皮膚に傷をつけて血液を皮膚外に染み出させる針又はランセット、傷に貼る絆創膏又は消毒部材（例えば、イソプロパノール（７０％イソプロパノールなど）又はエタノールなどを含浸させた不織布）、及び取扱説明書、等を備えることができる。希釈された血液検体から血漿成分を回収するための分離器具としては、分離膜である態様が好ましく、血球成分を分離可能な細孔を有するフィルタがより好ましい。
【００５２】
第一の収容器具、及び第二の収容器具は、１つの器具を第一の収容器具及び第二の収容器具として兼用してもよいし、別々の器具を備える態様であってもよい。収容器具内にある血液を希釈した希釈液を、患者、あるいは、希釈倍率の測定や分析対象成分の分析を行う測定者に確認可能とするために、第一の収容器具、及び第二の収容器具は、透明な素材でできていることが好ましい。
【００５３】
分離器具を保持する保持器具は、ガスケットである態様が好ましい。また、封止器具としては、収容器具が筒状の形状をした器具などの場合には、開口に蓋をすることが可能なキャップや、螺旋状の溝を有する蓋、あるいはゴム栓などを使用することができる。
【００５４】
上記の構成により、希釈液により血液を希釈した後に、直ちに血漿と血球を分離する機能を血液と希釈液の混合容器に付与することにより、血液成分の安定性と血球細胞からの溶血による成分の変動の影響を排除し、血液採取後の試料の安定性を付与できる。
【００５５】
本発明の血液分析方法は、５０μＬ以下の採血量であっても、測定精度よく分析対象成分を分析できる方法を実現可能とするものであり、血液分析用の血液検査キットには、５０μＬ以下の少ない採血量でも精度よく測定することが可能であること等の患者への情報が記載された取り扱い説明書を含むキットであることが好ましい。
【００５６】
（血液検査キットの具体例）
好ましい態様の一つにおいて、血液分析用の血液検査キットは、希釈液、希釈液が収容された第一の収容器具（血液検体の希釈物を収容するための収容器具でもある。）、希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具、分離器具を保持するための保持器具、回収した血漿を収容するための第二の収容器具、及び収容した血漿を第二の収容器具内に維持するための封止器具を含む。具体的な器具としては、例えば、特許第３５９７８２７号公報の図１から図１３に記載された器具を使用することができる。特許第３５９７８２７号公報の図１を、本願の図１として援用する。
【００５７】
血液分離器具１は採血容器２（希釈液が収容された収容器具、第一の収容器具ということもある。血液検体の希釈物を収容するための収容器具でもある。）と、採血容器２に嵌挿可能な筒体３（回収した血漿を収容するための第二の収容器具）と、筒体３に冠着可能なキャップピストン４と、キャップピストン４の下端に設けられた密閉蓋５（封止器具）とを備え、使用前は、図１に示すように、採血容器２の上端開口部はキャップ６によりパッキン７を介して密閉されている。本発明における希釈された血液検体を収容するための収容器具は、図１の構成においては、採血容器２と筒体３の組み合わせに対応する。すなわち、希釈された血液検体を収容するための収容器具は１個でも２個以上の組み合わせでもよい。
【００５８】
採血容器２は透明な材質製で円筒状を成し、その上端部には、外面に螺子部８が形成され、内面に係止部９が突設されている。また、採血容器２の下端部には、逆円錐状の底部１０が形成され、底部１０の周囲に円筒状の脚部１１が形成されている。脚部１１は、血液の分析検査時に使用するサンプルカップと同一外径を有しており、好ましくは、その下端の対向する位置にそれぞれ鉛直方向にスリット溝１２が形成されている。さらに、採血容器２内には、図１に示されているように、所要量、例えば、５００ｍｍ3の希釈液１３が予め入れられていてもよい。
【００５９】
筒体３は透明な材質製で円筒状を成し、その上端部には拡径部１４が形成されている。拡径部１４は薄肉部１５を介して本体部１６と接続されている。筒体３の下端部には、縮径部１８が形成され、縮径部１８の内面には係止突起部１９が形成されている。さらに、縮径部１８の下端部には外鍔部２０（保持器具）が形成され、外鍔部２０の下端開口部は濾過膜２１（分離器具）により覆われ、濾過膜２１は血液中の血漿の通過を許容し、血球の通過を阻止するようになっている。
【００６０】
縮径部１８の外周にはシリコンゴム製のカバー２２が装着されている（図１）。
【００６１】
キャップピストン４は、略円筒状の摘み部２６と、摘み部２６と同心で下方に延びる心棒部２７とで構成されている。摘み部２６の内側上端部には筒体３の拡径部１４が嵌合可能な円筒状の空間２８が形成され、また、その下方は螺刻され、螺子に螺合可能となっている。心棒部２７はその下端部２９がピン状に形成され、下端部２９に密閉蓋５が着脱可能に設けられている（図１参照）。密閉蓋５はシリコンゴム製である。
【００６２】
血液検体の希釈物からの血漿の分離回収操作は、具体的には、次のように行う。希釈液を収容する採血容器２に、採取した血液を投入した後、採血容器２の上部を持って泡立てないように注意しながら血液と希釈液とを十分に振り混ぜる。次に、濾過膜２１を保持する筒体３（血漿、血球分離時のシリンダ側面への回りこみによる液漏れを防止）を濾過膜が下になるように採血容器２に差し込み、ゆっくりと一定のスピードで採血容器２の底面まで濾過膜を押し下げる。このとき、筒体３の濾過膜を通って血漿が上部に上がり、血球は採血容器２の下部に残る。その後、キャップピストン４を筒体３にゆっくりと差し込んで、密閉栓５により逆流による血漿と血球の混合を防止する。
【００６３】
上記した器具による血液分離方法の詳細は、特許第３５９７８２７号公報の段落番号００２３〜００２６並びに図１２及び図１３に記載されており、その内容は本明細書に引用される。
【００６４】
（キットの部材からの溶出）
本発明のキットにおいては、希釈液中に含まれうる血液キットの部材に由来する血液中に恒常的に存在する標準成分の量が規定される。希釈液中に含まれうる量は、対象となる部材を実際に適切な量の標準成分を含まない希釈液に一定時間曝し、部材に由来して希釈液に含まれることとなった標準成分の量を測定することにより求めることができる。希釈液中に含まれうる血液キットの部材に由来する血液に恒常的に存在する標準成分の量は少ないことが好ましく、下限値は特に限定されない。
【００６５】
血液検査キットにおいては、通常、血液を採取する吸引器にはファイバーロットが使用されており、このファイバーロットには抗凝固剤としてＥＤＴＡのナトリウム塩が使用されている。また、血漿を分離回収するための器具としてガラスフィルターが使用されており、これにはソーダガラス、炭酸ナトリウム等の微量のナトリウムイオンが含まれている。ソーダガラスは、ケイ砂（ＳｉＯ2）、炭酸ナトリウム（Ｎａ2ＣＯ3）、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ3）を混合して融解することにより得られる。ガラスフィルターを保持するためのガスケットの素材、及び収容した血漿を第二の収容器具内に維持するための封止器具がゴム製であれば、除タンパクのためのＮａＯＨ洗浄、及び成形の際に使用される離型剤（硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム等の混合物）等の残渣分として微量のナトリウムイオンが含まれる場合がある。プラスチック（樹脂）成形品である部材は、表面に微量Ｎａが含まれる場合がある。樹脂成形に使用する離型剤中に金属元素としてスズ、亜鉛、カルシウムなどとともに、ナトリウムが含まれるからである。
【００６６】
これらがキットの部材に由来するナトリウムイオンとして、希釈液中に混入することが想定される。本発明者らの検討によると、希釈液に実際に含まれうるキット由来の血液に恒常的に存在する標準成分（好ましくはナトリウムイオン又は塩化物イオン）の量を十分に少なくすることにより、具体的には、希釈液と混合した血漿由来のナトリウムイオン量の３％程度かそれ以下に抑えることで、希釈倍率の算出において３％程度の誤差精度を維持可能となる。上述したように、例えば、希釈液の量を３５０μＬとし、血液採血量を３０μＬ、血漿成分の占める割合を５５％とした場合、希釈液に含まれうるキットの部材に由来するナトリウム成分の量が、希釈液に対し、０．３５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるとすると、血漿由来のナトリウムイオンに対して、５質量％程度にとどまるため、検査精度を５％程度の誤差精度の範囲内に維持できることがわかる。このように、キットの部材に由来するナトリウム成分の量は、少ないことが好ましく、０．３５ｍｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下がより好ましく、０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下が更に好ましい。
【００６７】
キットの部材に由来する、希釈液に混入するナトリウムイオンの量を十分に少ない量に規定する手段としては、ナトリウムイオンを含まない純水等の水で、予め、好ましくは複数回、キットの部材を洗浄することで可能となる。この場合、それぞれ純水等で同じ方法で洗浄した部材を複数準備し、実際の最終血液を希釈し、最終的に血液中の対象成分を分析するまでに希釈液を保持した場合に、準備した複数の部材全てにおいて、ナトリウムイオンが十分に洗い流されて、希釈液中に溶出するナトリウムイオン濃度が測定精度を維持できるまで低下していることを確認しておくことが好ましい。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明の参考例、実施例及び比較例について説明する。
（参考例１）
１．部材の洗浄と希釈液の調製
デメカル血液検査キット（株式会社リージャー社）を用いた。その際、血液検査キットの部材であるボトル（希釈液を収容するための第一の収容器具）、フィルター（希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具）、ガスケット（分離器具を保持するための保持器具）に対して、洗浄なし、蒸留水洗浄１回、純水洗浄（電気伝導度１μＳ／ｃｍ）３回、を施した血液検査キットを準備した。そして、下記のように調製した希釈液−１の３５０μＬをボトルに入れ、ガスケットで保持されたフィルターをボトルに押し込んで希釈液をろ過し、フィルターを通過した液のナトリウムイオン量を測定した。なお洗浄は、水を部材にシャワー状に当てることにより行った。
【００６９】
（希釈液組成）
希釈液−１を以下の組成で調製した。浸透圧は、ＯＳＭＯＡＴＡＴ  ＯＭ−６０４０（アークレイ（株）社製）を用いて測定した値を表示した。浸透圧の単位は、溶液の水１ｋｇが持つ浸透圧で、イオンのミリモル数をあらわす。
ＨＥＰＥＳ  ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）  ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｄ−マンニトール  ２８４ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化リチウム    １ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＤＴＡ−２Ｋ  ０．８ｍｍｏｌ／Ｌ
ＰＡＬＰ（ピリドキサールリン酸）  ０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ
チアベンダゾール  ０．０００１質量％
アミカシン硫酸塩  ０．０００３質量％
硫酸カナマイシン  ０．０００５質量％
メロペネム三水和物  ０．０００５質量％
浸透圧    ３５５ｍＯｓｍ／ｋｇ
ｐＨ    ７．４
【００７０】
２．ナトリウム濃度の測定
１．で調製した希釈液のナトリウム濃度の測定には、β−ガラクトシダーゼがナトリウムで活性化することを利用し、それぞれの希釈液中のナトリウム濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性が比例関係にあることを利用した酵素活性法により行った。具体的には、ナトリウムイオンを含まない精製水で上記のように濾過した希釈液−１を５倍希釈した後、３μＬを秤量し下記のように調製した第一試薬５２μＬを加えて、３７℃で５分間加温し、下記のように調製した第二試薬を２６μＬ加え、１分間の吸光度の変化をＪＣＡ−ＢＭ６０５０型生化学自動分析装置（日本電子（株）社製）を用いて主波長４１０ｎｍ、副波長６５８ｎｍで吸光度を測定することにより求めた。あらかじめ作成した検量線から、ナトリウムの濃度を測定した。
【００７１】
（ナトリウム測定試薬の調製）
以下の組成のナトリウム測定試薬を調製した。
第一試薬
ＨＰＥＰＳ・ＬｉＯＨ（ｐＨ８．０）  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｄ−マンニトール  ６０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ−アセチルシステイン  ３０ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸マグネシウム    １．５２ｍｍｏｌ／Ｌ
β−ガラクトシダーゼ    １．１ｋＵ／Ｌ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ０．０５質量％
第二試薬
ＨＰＥＰＳ・ＬｉＯＨ（ｐＨ８．０）  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ｏ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ  １５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００７２】
下記の表１に示した洗浄方法により洗浄した血液検査キットを１０セット準備し、それぞれ濾過した希釈液−１中に溶出するＮａイオン量の平均値とばらつきの尺度である変動係数であるＣＶ（coefficient of variation）（％）を求めた。結果を表１に示した。
【００７３】
【表１】
2018105830.tif 000002
【００７４】
（参考例２）
１．微量血液検体を希釈した希釈液の調製
ボランティアの患者から、インフォームドコンセントを行った後に静脈から注射器で採取した１０ｍＬの血液を採血管に得た。この採血した血液から、８０μＬ、６０μＬ、４０μＬ、３０μＬ、２０μＬをそれぞれ２０回ずつマイクロピペットで正確に秤量し、参考例１で調製した希釈液と同じ希釈液−１の３５０μＬにそれぞれ混合した。注射器とマイクロピペットからは、ナトリウム溶出がほとんどないことを事前に確認した。希釈液−１を入れた血液検査キットは、参考例１と同様に、下記の表２に示したように、蒸留水洗浄、純水洗浄したものを用いた。得られた血液と希釈液の混合液をフィルターを通過させることにより血球成分を分離して、希釈血漿を得た。得られた希釈血漿を試料として、参考例１と同様にして、ナトリウムイオン濃度の測定を行った。
【００７５】
上記のように求めた希釈液中のナトリウムイオン濃度（Ｘ）と、血液の血漿中のナトリウムイオン濃度の標準値（Ｙ：１４２ｍｍｏｌ／Ｌ）とからそれぞれの希釈液の希釈倍率（Ｙ／Ｘ）を求め、採血した血液（８０μＬ、６０μＬ、４０μＬ、３０μＬ、２０μＬ）のそれぞれについて１０本ずつ作製した試料の希釈倍率の平均値と希釈倍率の変動係数であるＣＶ（coefficient of variation）（％）を求めた。結果を表２に示した。
【００７６】
【表２】
2018105830.tif 000003
【００７７】
（希釈液中のリチウムイオンの測定）
次に、希釈液、及び、純水洗浄を行った血液検査キット中の希釈液と血液の混合液をフィルターを通過させて得た血漿の希釈液中のリチウムイオンを、キレート比色法（ハロゲン化ポリフィリンキレート法：パーフルオロ−５，１０，１５，２０−テトラフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ，−ポリフィリン）により測定した。具体的には、希釈血漿を、リチウムイオンを含まない精製水で４．５倍に希釈した後、５μＬを秤量し下記のように調製した第三試薬５５μＬを加えて、３７℃で１０分間加温した。この混合物について、１分間の吸光度の変化を、ＪＣＡ−ＢＭ６０５０型生化学自動分析装置（日本電子（株）社製）を用いて、主波長５４５nm、副波長５９６nmで吸光度を測定することにより求めた。あらかじめ作成した検量線から、リチウムイオンの濃度を測定した。
【００７８】
（リチウムイオン用測定試薬の調製）
以下の組成のリチウムイオン用測定試薬を調製した。
第三試薬
パーフルオロ−５，１０，１５，２０−テトラフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ，−ポリフィリン  ０．０５質量％
ジメチルスルホキシド    ５質量％
トリエタノールアミン    ２質量％
ポリエチレングリコール−ｔ−オクチルフェニルエーテル    ２質量％
ドデシル硫酸ナトリウム    ２質量％
【００７９】
上記のように求めた血液検体を希釈した希釈後の希釈液中のリチウムイオン濃度（Ａ）と、血液を希釈する前の希釈液中のリチウムイオン濃度（Ｂ）とからそれぞれの希釈液の希釈倍率［Ｂ／（Ｂ−Ａ）］を求め、採血した血液（８０μＬ、６０μＬ、４０μＬ、３０μＬ、２０μＬ）のそれぞれについて１０本ずつ作製した試料の希釈倍率の平均値と希釈倍率の変動係数であるＣＶ（％）を求めた。結果を表３に示した。
【００８０】
【表３】
2018105830.tif 000004
【００８１】
表２の結果から、洗浄が不十分である比較水準１、３、５、６、７の希釈倍率の平均値は、リチウムイオンから求めた表３に示す希釈倍率の結果とズレが生じることがわかる。また、希釈倍率の測定結果のばらつきがわずかであるが大きくなっていることがわかる。一方で、洗浄を強化した比較水準２、４、参考水準１，２，３の希釈倍率の平均値は、リチウムイオンから求めた表３に示す希釈倍率の結果と非常に良く一致している。更に、採血量が５０μＬ以下で、希釈倍率が１４倍以上の水準では、希釈倍率の繰り返し再現性について、表３に示したリチウムイオンから求めた希釈倍率の繰り返し再現性が悪化する結果に対して、表２に示したように血液中のナトリウムイオン濃度から求めた、参考水準１、２、３の希釈倍率の繰り返し再現性が非常に良好であることがわかる。
【００８２】
（実施例１）
１．ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）及びＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）の測定
参考例２で注射器を用いて静脈から採血した直後に、採血した同じ患者の指先からランセットを用いて血液を指先の皮膚外ににじませた後に、２０μＬ〜４０μＬ程度の液体を吸収できるスポンジを、参考例２と同様に純水で３回洗浄し、乾燥させた後に使用して血液を患者に吸い取ってもらい、参考例２で使用した希釈液と同じ組成の希釈液３５０μＬ中に血液を吸収したスポンジを浸し、十分にスポンジから血液を希釈液中に抽出し、フィルターで濾過して血球成分を分離し、血液検体の血漿成分の希釈液を得た。この時使用した血液検査キットは、参考例２と同様に純水洗浄を３回行ったキットを用いた。その後、希釈液を密閉して、検査が可能な別の施設へと輸送し、その後、希釈液を取り出して、参考例２の血液中のナトリウムイオンを用いた希釈倍率の測定方法と同様にして、希釈倍率を測定したところ、１９．８倍の希釈倍率であった。このことから、採血量は３０μＬ強であることがわかった。この希釈検体中のＡＬＴ、ＡＳＴの濃度を、市販の測定キット（トランスアミナーゼＣII−テストワコー：和光純薬工業（株）社製）を用いて測定したところ、参考例２の採血量３０μＬでのサンプルでナトリウムイオン濃度を用いて測定した希釈倍率を基にして分析した、ＡＬＴ値は１８Ｕ／Ｌ、ＡＳＴ値は３６Ｕ／Ｌとの結果に対して、上記のようにスポンジを用いて採取した血液を希釈した希釈液から分析した、ＡＬＴ値は１８Ｕ／Ｌ、ＡＳＴ値は、３６Ｕ／Ｌであり、一致した結果が得られ、本発明の効果を確認した。
【００８３】
（実施例２）
実施例１において、ナトリウムイオンを用いた血液検体中の血漿成分の希釈倍率の測定を行った希釈液を用いて、下記に示す方法により、塩化物イオンの濃度を測定した。
【００８４】
（希釈液中の塩化物イオン濃度の測定）
イオン選択電極（ＩＳＥ）を用いて塩化物イオンの測定を行った。塩化物イオンに選択的に応答するイオン選択電極と参照電極間に生体試料を流し、両電極間に生じた起電圧より塩化物イオン濃度を算出した。
【００８５】
血漿の希釈液中のナトリウムイオン濃度の測定から求めた血液検体中の血漿成分の希釈倍率に対して、希釈液中の塩化物イオン濃度の測定値と、血液中に恒常的に存在する塩化物イオン濃度の平均値１０２ｍｍｏｌ／Ｌとから求めた希釈倍率が、同じ値であるとの結果が得られた。これにより、実施例１のナトリウムイオン濃度から求めた希釈倍率の測定が正常に行われていることがわかり、測定の検証が可能であることが分かった。
【符号の説明】
【００８６】
１  血液分離器具
２  採血容器
３  筒体
４  キャップピストン
５  密閉蓋
６  キャップ
７  パッキン
８  螺子部
９  係止部
１０  底部
１１  脚部
１２  スリット溝
１３  希釈液
１４  拡径部
１５  薄肉部
１６  本体部
１８  縮径部
１９  係止突起部
２０  外鍔部
２１  濾過膜
２２  カバー
２６  摘み部
２７  心棒部
２８  空間
２９  下端部
３１  段差部
３３  上端部
３４  頂部
【図１】
2018105830.tif 000005