(57)【要約】【課題】本発明は、モロコシ属又はサトウキビ属の植物について、高効率で脱分化、再分化及び形質転換を可能とする方法を提供すること等を課題とする。【解決手段】本発明は、モロコシ（Sorghum）属又はサトウキビ（Saccharum）属の植物の種子から未熟胚を回収する工程、及び未熟胚を暗所でカルス誘導培地で培養することにより、カルスを形成させる工程を含む、カルスの生産方法、再分化カルスの生産方法、及び再生植物体又は形質転換植物体を生産する方法等に関する。【選択図】図１
2018174718.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）モロコシ（Sorghum）属又はサトウキビ（Saccharum）属の植物の種子から未熟胚を回収する工程、及び
（b）未熟胚を暗所でカルス誘導培地で培養することにより、カルスを形成させる工程、
を含む、カルスの生産方法。
【請求項２】
（a）モロコシ（Sorghum）属又はサトウキビ（Saccharum）属の植物の種子から未熟胚を回収する工程、
（b）未熟胚を暗所でカルス誘導培地で培養することにより、カルスを形成させる工程、及び
（c）カルスを暗所で再分化培地で培養することによりカルスを再分化させる工程、
を含む、再分化カルスの生産方法。
【請求項３】
（a）モロコシ（Sorghum）属又はサトウキビ（Saccharum）属の植物の種子から未熟胚を回収する工程、
（b）未熟胚を暗所でカルス誘導培地で培養することにより、カルスを形成させる工程、
（c）カルスを暗所で再分化培地で培養することによりカルスを再分化させる工程、及び
（d）再分化したカルスを明暗サイクル下で発根培地で培養することにより発根させる工程、
を含む、再生植物体の生産方法。
【請求項４】
（a）モロコシ（Sorghum）属又はサトウキビ（Saccharum）属の植物の種子から未熟胚を回収する工程、
（b）未熟胚を形質転換処理して目的の遺伝子を導入する工程、
（c）未熟胚を暗所でカルス誘導培地で培養することにより、カルスを形成させる工程、及び
（d）形質転換された細胞からなるカルスを選抜する工程、
を含む、形質転換されたカルスの生産方法。
【請求項５】
（a）モロコシ（Sorghum）属又はサトウキビ（Saccharum）属の植物の種子から未熟胚を回収する工程、
（b）未熟胚を形質転換処理して目的の遺伝子を導入する工程、
（c）未熟胚を暗所でカルス誘導培地で培養することにより、カルスを形成させる工程、及び
（d）形質転換された細胞からなるカルスを選抜する工程、及び
（e）選抜されたカルスを暗所で再分化培地で培養することによりカルスを再分化させる工程、
を含む、形質転換された再分化カルスの生産方法。
【請求項６】
（a）モロコシ（Sorghum）属又はサトウキビ（Saccharum）属の植物の種子から未熟胚を回収する工程、
（b）未熟胚を形質転換処理して目的の遺伝子を導入する工程、
（c）未熟胚を暗所でカルス誘導培地で培養することにより、カルスを形成させる工程、
（d）形質転換された細胞からなるカルスを選抜する工程、
（e）選抜されたカルスを暗所で再分化培地で培養することによりカルスを再分化させる工程、及び
（f）再分化したカルスを明暗サイクル下で発根培地で培養することにより発根させ、形質転換された再生植物体を得る工程、
を含む、形質転換植物の生産方法。
【請求項７】
前記（d）に記載の工程を、アグロバクテリウム又はパーティクルガン法を介して行う、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記発根培地が、多孔質媒体を含む、請求項３及び６〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記多孔質媒体が、バーミキュライト、珪藻土、木粉、ゼオライト、多孔質ガラスビーズ、及び多孔質ポリマーからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
植物が、ソルガム（Sorghum bicolor）である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ソルガムの品種が、Btx623又はKellerである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モロコシ属又はサトウキビ属植物におけるカルスの生産方法、再分化カルスの生産方法、再生植物体の生産方法、及び形質転換体の生産方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ソルガム（Sorghum bicolor）は、コムギ、イネ、トウモロコシ、及びオオムギと共に五大穀物の一つに数えられており、世界中で広く栽培されている。ソルガムは、食物のみならずバイオエタノール等の原料となるエネルギー作物としても利用され、また近年ではプラスチック及び線維等の原料として利用することについても研究されている。これらの用途のそれぞれに適合する形質を有するソルガムを作製するためには、従来の育種技術だけではなく、形質転換による遺伝子改変技術が必要とされている。
【０００３】
ソルガムの形質転換技術については、例えば、非特許文献1に、硫酸銅及び6-ベンジルアミノプリンを用いてTx430品種の形質転換効率を向上させる方法が記載されている。しかしながら、従来の方法におけるソルガムにおける脱分化、再分化、及び形質転換の効率は必ずしも十分とは言えるものではなかった。また、ソルガムの培養特性は品種間差が大きいことが知られており（非特許文献2）、従来技術の方法がTx430以外の品種のソルガムに対しても適用可能であるかは不明であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Wu et al., In Vitro Cell Dev. Biol. Plant., 2014, 50(1), pp. 9-18
【非特許文献２】形質転換プロトコール［植物編］、化学同人（2012年）、田部井豊編
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、モロコシ属又はサトウキビ属の植物について、高効率で脱分化、再分化、及び形質転換を可能とする方法を提供すること等を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため鋭意検討した結果、本発明者は、カルスが白色光に暴露されることにより色素が生産され、これが再分化、及び形質転換に悪影響を与え得ることを見出し、本願発明を完成させた。したがって、本願発明は以下の態様を包含する。
【０００７】
（１）（a）モロコシ（Sorghum）属又はサトウキビ（Saccharum）属の植物の種子から未熟胚を回収する工程、及び
（b）未熟胚を暗所でカルス誘導培地で培養することにより、カルスを形成させる工程、
を含む、カルスの生産方法。
（２）（a）モロコシ（Sorghum）属又はサトウキビ（Saccharum）属の植物の種子から未熟胚を回収する工程、
（b）未熟胚を暗所でカルス誘導培地で培養することにより、カルスを形成させる工程、及び
（c）カルスを暗所で再分化培地で培養することによりカルスを再分化させる工程、
を含む、再分化カルスの生産方法。
（３）（a）モロコシ（Sorghum）属又はサトウキビ（Saccharum）属の植物の種子から未熟胚を回収する工程、
（b）未熟胚を暗所でカルス誘導培地で培養することにより、カルスを形成させる工程、
（c）カルスを暗所で再分化培地で培養することによりカルスを再分化させる工程、及び
（d）再分化したカルスを明暗サイクル下で発根培地で培養することにより発根させる工程、
を含む、再生植物体の生産方法。
（４）（a）モロコシ（Sorghum）属又はサトウキビ（Saccharum）属の植物の種子から未熟胚を回収する工程、
（b）未熟胚を形質転換処理して目的の遺伝子を導入する工程、
（c）未熟胚を暗所でカルス誘導培地で培養することにより、カルスを形成させる工程、及び
（d）形質転換された細胞からなるカルスを選抜する工程、
を含む、形質転換されたカルスの生産方法。
（５）（a）モロコシ（Sorghum）属又はサトウキビ（Saccharum）属の植物の種子から未熟胚を回収する工程、
（b）未熟胚を形質転換処理して目的の遺伝子を導入する工程、
（c）未熟胚を暗所でカルス誘導培地で培養することにより、カルスを形成させる工程、及び
（d）形質転換された細胞からなるカルスを選抜する工程、及び
（e）選抜されたカルスを暗所で再分化培地で培養することによりカルスを再分化させる工程、
を含む、形質転換された再分化カルスの生産方法。
（６）（a）モロコシ（Sorghum）属又はサトウキビ（Saccharum）属の植物の種子から未熟胚を回収する工程、
（b）未熟胚を形質転換処理して目的の遺伝子を導入する工程、
（c）未熟胚を暗所でカルス誘導培地で培養することにより、カルスを形成させる工程、
（d）形質転換された細胞からなるカルスを選抜する工程、
（e）選抜されたカルスを暗所で再分化培地で培養することによりカルスを再分化させる工程、及び
（f）再分化したカルスを明暗サイクル下で発根培地で培養することにより発根させ、形質転換された再生植物体を得る工程、
を含む、形質転換植物の生産方法。
（７）前記（d）に記載の工程を、アグロバクテリウム又はパーティクルガン法を介して行う、（４）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記発根培地が、多孔質媒体を含む、（３）及び（６）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記多孔質媒体が、バーミキュライト、珪藻土、木粉、ゼオライト、多孔質ガラスビーズ、及び多孔質ポリマーからなる群から選択される、（８）に記載の方法。
（１０）植物が、ソルガム（Sorghum bicolor）である、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）ソルガムの品種が、Btx623又はKellerである、（１０）に記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、モロコシ属又はサトウキビ属の植物について、高効率で再分化及び形質転換を可能とする方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図1Aは、アグロバクテリウム感染2週間後のカルスを示す写真である。図1Bは、図1Aに示した培地を白色光下に3時間曝露した際の写真である。図1Cは、これらのサンプルについて、ImageJ-Scaleにより（白黒反転図写真の）輝度の評価を行った結果を示す。
【図２】図2は、ハイグロマイシンを含むカルス誘導培地で選抜を行った後のカルスを示す。図2Aはハイグロマイシン耐性のカルスを、図2Bはハイグロマイシン感受性のカルスを、図2Cはハイグロマイシン耐性カルスのGFP蛍光を示す。
【図３】図3Aは、本願発明の再生植物体の生産方法に従って再生させたソルガムを、土を入れたポットに移し、成体まで増殖させた植物体の写真を示す。図3Bは、この植物体の葉から全ゲノムDNAを抽出し、GFP遺伝子の挿入をPCRにより確かめた結果を示す。図3B中、矢印はGFP遺伝子の挿入を示すPCRバンドを指す。
【図４】図4は、本願発明に従って再分化及び発根させたKeller種の写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
一態様において、本発明は、カルスの生産方法に関する。本発明のカルスの生産方法は、モロコシ（Sorghum）属又はサトウキビ（Saccharum）属の植物の種子から未熟胚を回収する工程（以下、「回収工程」とする）、及び未熟胚を暗所でカルス誘導培地で培養することにより、カルスを形成させる工程（以下、「カルス形成工程」とする）を含む。
【００１１】
本発明の方法の対象となる植物は、モロコシ属植物又はサトウキビ属植物である。本明細書において、モロコシ属植物の種類は限定しないが、例えば、ソルガム（Sorghum bicolor）、ソルガム・アルマム（Sorghum almum）、ソルガム・ドルモンディイ（Sorghum drummondii）、ソルガム・ハレペンセ（Sorghum halepense）、ソルガム・チモレンセ（Sorghum timorense）であってよく、好ましくはソルガムである。
【００１２】
本明細書において、サトウキビ属植物の種類は限定しないが、例えば、サトウキビ（Saccharum officinarum）、サッカラム・アルンジナセウム（Saccharum arundinaceum）、サッカラム・ベンガレンス（Saccharum bengalense）、サッカラム・ラヴェナエ（Saccharum ravennae）、又はサッカラム・スポンタネウム（Saccharum spontaneum）であってよく、好ましくはサトウキビである。
【００１３】
本発明の方法の対象となる植物は、好ましくはソルガム（Sorghum bicolor）である。ソルガムの品種は限定しないが、例えば、Btx623、Keller、Tx430、PE932 025、combine kafir、P898012、296B、C401及びM81Eからなる群から選択されるものであってよく、好ましくはBtx623又はKellerである。
【００１４】
本明細書において「カルス」とは、多分化能と細胞分裂能を再獲得した植物細胞の脱分化細胞をいう。ここで、植物細胞の「分化」とは、一つの単純な系又は細胞集団が二つ以上の互いに異質な系又は細胞集団に分かれることをいう。
【００１５】
本明細書において植物細胞の「脱分化」とは、分化した組織や器官の細胞が再び未分化性の高い状態に戻り、多分化能を再獲得することをいう。つまり、脱分化とは、分化とは逆のプロセスであって、器官、組織等の機能分化又は形態分化が完了した細胞が様々な細胞種に再分化できる状態になる現象をいう。脱分化した細胞は多くの場合、細胞分裂能を再獲得することが知られている。
【００１６】
本明細書において、「未熟胚」とは、受粉後の登熟過程にある未熟種子の胚をいう。本発明の方法に供される未熟胚のステージ（熟期）は特に限定されるものではなく、未熟である限り、出穂後いかなる時期に採取されたものであってもよいが、出穂後7〜21日、例えば10日〜18日、13日〜15日又は14日のものが好ましい。未熟胚の大きさは限定しないが、例えば直径0.3〜2.0mm、直径0.4〜1.8mm、又は直径0.5〜1.5mmであってよい。未熟胚は取り出した当日使用してもよいし、適当な期間、例えば2日間以内培養した後に使用してもよい。
【００１７】
未熟胚の回収工程は、限定するものではないが、例えばピンセット等の器具を用いて行うことができる。
【００１８】
本明細書において、「暗所」とは、原則として光（自然光及び人工光を問わない）の非照射状態又は遮光状態にある環境を意味するが、培養中の植物が後述する色素を生産しない限り、光を完全に遮蔽した状態に限られず、多少の光が存在する弱光環境下であってもよい。その場合の照度は、限定するものではないが、例えば500ルクス以下、100ルクス以下、50ルクス以下、10ルクス以下、1ルクス以下、又は0.1ルクス以下であってよい。
【００１９】
本明細書において、植物が生産する色素は、限定しないが、アントシアニン又はタンニン等のフェノール類であってよい。植物による色素の産生は、光への曝露によって促され、これによってカルスの生育が阻害され得る。
【００２０】
本明細書において、「カルス誘導培地」とは、未熟胚をカルスに誘導可能なように調製された培地を意味する。カルス誘導培地は、当業者であれば、例えば「形質転換プロトコール［植物編］、化学同人（2012年）」等の教科書に記載の方法に従って容易に調製することができる。カルス誘導培地は、基礎培地に加えて、植物ホルモンを含む。
【００２１】
カルス誘導培地の基礎培地としては、MS培地、LS培地、N6培地、B5培地、R2培地、及びCC培地等の任意の培地、好ましくはMS培地を用いることができる。培地は、例えばこれらの培地の塩類を含む組成物、例えば市販のMS Salt（Duchefa Biochemie）と、塩以外の成分、例えばミオイノシトール又はチアミンHCl等のビタミン、及び／又はCuSO4等の追加の塩を混合することにより調製することができる。MS培地を構成する各成分の量は当業者であれば容易に定めることができる。さらに、カルス誘導培地は、追加の成分、例えば50〜300g/L、100〜200g/L、20〜80g/L、又は30〜60g/Lのマルトース又はスクロース等の糖、及び／又は例えば600〜800mg/L、650〜750mg/L、680〜700mg/L、又は約690mg/LのL-プロリン等のストレス耐性を増加させ得る因子を含んでもよい。
【００２２】
植物ホルモンとしては、例えば、オーキシン（例えば、2，4−ジクロロフェノキシ酢酸（2，4−D）、インドール酢酸（IAA）、ジカンバ、ピクロラム、2,4,5-トリクロロフェノキシ酢酸（2,4,5-T））、及び／又はサイトカイニン（例えば、カイネチン、ベンジルアミノプリン（BAP）、及びゼアチン）等が挙げられる。本明細書中に記載の方法で使用するカルス誘導培地は、好ましくは2,4-D等のオーキシン、を、例えば0.5〜4.0mg/L、1.0〜3.0mg/L、1.5〜2.5mg/L、1.8〜2.2mg/L、1.9〜2.1mg/L、又は2.0mg/L含む。カルス誘導培地は、2,4-Dに加えて、任意にカイネチンを、例えば0.2〜2.0mg/L、0.3〜1.0mg/L、0.4〜0.6mg/L、又は0.5mg/L含んでいてもよい。
【００２３】
カルス誘導培地のpHは、例えば5.0〜7.0、5.5〜6.5、又は5.6〜6.0、5.7〜5.9又は約5.8であってよい。培地は、寒天、ゲランガム、アガロース等のゲル化剤を加えることにより、固体培地としてもよい。
【００２４】
カルス形成工程の条件は、カルス形成及び植物の生育が可能である限り特に限定しないが、例えば温度は15〜35℃、20〜30℃、23〜27℃、24〜26℃、又は25℃であってよく、期間は、1日以上、2日以上、3日以上、5日以上、又は1週間以上であってよく、1か月以下、3週間以下、又は2週間以下であってよい。
【００２５】
一態様において、本発明は、再分化カルスの生産方法に関する。本発明の再分化カルスの生産方法は、上記カルスの生産方法に記載の回収工程及びカルス形成工程に加えて、カルス形成工程後、カルスを暗所で再分化培地で培養することによりカルスを再分化させる工程（以下、「再分化工程」とする）を含む。
【００２６】
本明細書において、「再分化培地」とは、カルスをシュート等に再分化誘導できるように調製された培地を意味し、当業者であれば、例えば「形質転換プロトコール［植物編］、上掲」等の教科書に記載の方法に従って容易に調製することができる。再分化培地は、上記の基礎培地、好ましくはMS培地に、任意に、プロリン等のストレス耐性を増加させ得る因子及び／又はPVP（ポリビニルピロリドン）等のカルスの壊死を阻害する因子を含むものであってもよい（形質転換プロトコール［植物編］、上掲）。あるいは、再分化培地は、上記の基礎培地、好ましくはMS培地に、植物ホルモンを含むものであってよい。再分化培地の基礎培地、追加の成分、及びpHについては、上記「カルス誘導培地」に準ずる。
【００２７】
本明細書中に記載の方法で使用する再分化培地は、例えば、オーキシン及び／又はサイトカイニンを含むものであってよい。植物ホルモンについては上記の通りであるから記載を省略する。再分化培地は、好ましくは、ゼアチン、インドール酢酸、チジアズロン、アブシジン酸の少なくとも一つ、好ましくはこれらの2つ、3つ、又は全てを含む。再分化培地中の植物ホルモンの濃度は、当業者であれば適宜定めることができるが、例えば、ゼアチンであれば0.1〜2.0mg/L、0.2〜1.0mg/L、0.4〜0.6mg/L又は約0.5mg/Lであってよく、インドール酢酸であれば1.0〜3.0mg/L、1.5〜2.5mg/L、0.9〜1.1mg/L、又は約1.0mg/Lであってよく、アブシジン酸であれば5〜50μg/L、10〜40μg/L、20〜30μg/L、又は約26.4μg/L（0.1μM）であってよく、チジアズロンであれば、0.02〜0.4mg/L、0.05〜0.2mg/L、0.09〜0.11mg/L、又は約0.1mg/Lであってよい。
【００２８】
再分化工程の条件は、再分化が可能である限り特に限定しないが、例えば温度は15〜35℃、20〜30℃、23〜27℃、24〜26℃、又は25℃であってよく、期間は、1日以上、2日以上、3日以上、5日以上、又は1週間以上、2週間以上、3週間以上、又は4週間以上、であってよく、3か月以下、2か月以下、1か月以下、3週間以下、又は2週間以下であってよい。
【００２９】
一態様において、本発明は、再生植物体の生産方法に関する。本発明の再生植物体の生産方法は、上記カルスの生産方法に記載の回収工程及びカルス形成工程、並びに上記再分化カルスの生産方法に記載の再分化工程に加えて、再分化したカルスを明暗サイクル下で発根培地で培養することにより発根を誘導する工程（以下、「発根工程」とする）を含む。
【００３０】
本明細書において、「明暗サイクル下」とは、明期（明所）及び暗期（暗所）が特定の周期で繰り返される環境下を意味する。一周期の時間は、原則24時間である。植物を明暗サイクル下で培養することにより、発根を促すことができる。明期における照度は、発根を誘導可能な限り限定しないが、例えば200ルクス〜30000ルクス、500ルクス〜10000ルクス、1000ルクス〜5000ルクス、又は2000ルクス〜4000ルクスであってよい。
【００３１】
明期及び暗期の時間は、植物の発根が可能な限り特に限定されないが、例えば明期の時間は20時間以下、18時間以下、17時間以下、また5時間以上、10時間以上、14時間以上、15時間以上であってよい。明暗サイクルの条件は、例えば、10時間〜20時間明期／14時間〜4時間暗期、14時間〜18時間明期／10時間〜6時間暗期、15時間〜17時間明期／9時間〜7時間暗期、又は約16時間明期／8時間暗期であってよい。
【００３２】
「発根培地」とは、「再分化培地」において分化させたシュート等から発根を誘導できるよう調製された培地を意味し、当業者であれば、例えば「形質転換プロトコール［植物編］、上掲」等の教科書に記載の方法に従って容易に調製することができる。発根培地は、上記の基礎培地、好ましくはMS培地を必要に応じて、例えば1.2倍〜4倍、1.5倍〜3倍又は約2倍希釈したものに、任意に、PVP（ポリビニルピロリドン）等のカルスの壊死を阻害する因子を含むものであってもよい（形質転換プロトコール［植物編］、上掲）。発根培地は、明暗サイクル化において植物に産生され得る前述の色素を分散させ、発根率を向上させるため、多孔質媒体を含むことが好ましい。発根培地は、例えば、バーミキュライト、珪藻土、木粉、ゼオライト等であってもよいし、（例えば、上記基礎培地を含む）多孔質ガラスビーズ及び多孔質ポリマー等を含むものであってもよい。
【００３３】
発根工程の条件は、発根が可能である限り特に限定しないが、例えば温度は15〜35℃、20〜30℃、23〜27℃、24〜26℃、又は25℃であってよく、期間は、1日以上、2日以上、3日以上、5日以上、又は1週間以上、2週間以上、3週間以上、又は4週間以上、であってよく、3か月以下、2か月以下、1か月以下、3週間以下、又は2週間以下であってよい。
【００３４】
一態様において、本発明は、形質転換されたカルスの生産方法に関する。本発明の形質転換されたカルスの生産方法は、上記のカルスの生産方法に記載の回収工程及びカルス形成工程に加えて、未熟胚を形質転換処理して目的の遺伝子を導入する工程（形質転換工程）、及び形質転換された細胞からなるカルスを選抜する工程（選抜工程）を含む。形質転換工程は、回収工程の後、カルス形成工程の前に行われ、選抜工程は、カルス形成工程の後に行われる。
【００３５】
一態様において、本発明は、形質転換された再分化カルスの生産方法に関する。本発明の形質転換されたカルスの生産方法は、上記の形質転換されたカルスの生産方法に記載の回収工程、形質転換工程、カルス形成工程、及び選抜工程に加えて、選抜工程後、カルスを暗所で再分化培地で培養することによりカルスを再分化させる工程（再分化工程）を含む。再分化工程については、上記再分化カルスの生産方法において記載したのと同様であるから記載を省略する。
【００３６】
一態様において、本発明は、形質転換植物の生産方法に関する。本発明の形質転換植物の生産方法は、上記形質転換された再分化カルスの生産方法に記載の回収工程、形質転換工程、カルス形成工程、選抜工程、及び再分化工程に加えて、再分化工程後に再分化したカルスを明暗サイクル下で発根培地で培養することにより発根を誘導する工程（発根工程）を含む。発根工程については、上記再生植物体の生産方法において記載したのと同様であるから記載を省略する。したがって、本発明の形質転換植物の生産方法は、回収工程、形質転換工程、カルス形成工程、選抜工程、再分化工程、及び発根工程をこの順で含む。
【００３７】
形質転換工程は、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、又はプロトプラスト法等を用いて行うことができ、好ましくはアグロバクテリウム法を用いて行う。
【００３８】
アグロバクテリウム法は、形質転換因子としてアグロバクテリウム属の菌（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(A． tumefaciens)、アグロバクテリウム・リゾゲネス（A． rhizogenes））及びそれに由来するTiプラスミドを用いて目的のポリヌクレオチドを対象とする植物細胞のゲノムDNA中に導入することができる。
【００３９】
パーティクルガン法は、金又はタングステン等の微粒子を含む溶液と脱分化誘導剤を混合し、金属微粒子に目的のポリヌクレオチドを付着させて、それを高圧ガスにより植物組織細胞内に打ち込み、ポリヌクレオチドを細胞内に導入する方法である。この方法は、対象とする植物細胞のゲノムDNA中に目的のポリヌクレオチドが取り込まれた形質転換細胞を得ることができる。
【００４０】
上記の方法は、いずれも当該分野においては公知の方法であり、詳細については植物代謝工学ハンドブック（2002年、NTS社）又は新版モデル植物の実験プロトコル：遺伝学的手法からゲノム解析まで（2001年秀潤社）等の適当なプロトコルを参照すればよい。本発明の方法においては、形質転換工程を暗所で行うことが好ましい。
【００４１】
形質転換された細胞からなるカルスを選抜する工程も、特に限定しない。例えば、形質転換工程において目的のポリヌクレオチドと共に選択マーカーを植物細胞に導入しておき、この選択マーカーに基づいて選抜を行うことができる。選択マーカーは、例えば、薬剤耐性遺伝子（ハイグロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、又はネオマイシン耐性遺伝子）、蛍光又は発光レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ（GUS）、又はグリーンフルオレッセンスプロテイン（GFP））、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（NPT II）、及びジヒドロ葉酸還元酵素等の酵素遺伝子が挙げられる。選抜工程におけるマーカー遺伝子及び選抜期間等の条件は、植物に応じて当業者であれば適宜選択することができる。本発明の方法においては、選抜工程を暗所で行うことが好ましい。
【実施例】
【００４２】
＜材料＞
植物
植物としては、ソルガム（Sorghum bicolor）の品種BTx623又はKellerを用いた。BTx623及びKellerの種子は、農業生物資源研究所の遺伝子資源センターから得た。
アグロバクテリウム及びプラスミド
全ての実施例において、EHA105をアグロバクテリウムとして用いた。また、緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子を含むpMDC32を、アグロバクテリウム媒介形質転換に用いた。
【００４３】
培地
カルス誘導培地
カルス誘導培地の成分は、4.3g/LのMS Salt（Duchefa Biochemie）、50mg/Lのミオイノシトール、1mg/LのチアミンHCl、2mg/Lの2,4-D、30g/Lのマルトース、690mg/LのL-プロリン、1.22mg/LのCuSO4、2g/Lのゲランガムで、最終pHは5.8であった。共培養後にアグロバクテリウムを除くために、以下の通り、カルス誘導培地にメロペネムを25mg/Lの終濃度で添加した。
選抜培地1
カルス誘導培地に、2mg/Lのハイグロマイシン（和光）、及びメロペネム三水和物（和光）を終濃度25mg/Lで加えたものを用いた。
選抜培地2
カルス誘導培地に、5mg/Lのハイグロマイシン（和光）、及びメロペネム三水和物（和光）を終濃度25mg/Lで加えたものを用いた。
再生培地
再生に用いた培地の成分は、4.3g/LのMS Salt、MSビタミン、60g/Lのスクロース、0.5mg/Lのゼアチン、1mg/LのIAA、0.1μMのABA、0.1mg/Lのチジアズロン、1.25mg/LのCuSO4、8g/Lのアガロースで、pHは5.6であった。
【００４４】
実験器具
ピンセットは、胚の処理において最も重要な器具である。ピンセットの先端は、平らな面でソルガムの胚を採取するように扱うものとする。
【００４５】
＜方法＞
未熟胚の調製
１．出穂の約2週間後の未熟な種子を集めた。
２．種子をHAITER（花王）で10分間処理した。
３．直後に、滅菌水を用いて3回洗浄した。
４．ピンセットを用いて、長さ0.5〜1.5mmの未熟胚を回収した。
５．未熟胚を1mLの液体培地を含む試験管に移した。
６．液体培地を除き、43℃で3分間、その後25℃で2分間インキュベートした。
【００４６】
アグロバクテリウムによる形質転換
緑色蛍光タンパク質を含むT-DNAプラスミドと共に、EHA105を形質転換に用いた。
１．液体培地でOD550=0.7に調整したアグロバクテリウムを調製し、アセトシリンゴンを終濃度40mg/Lで添加した。
２．胚のみを温める熱処理（上記「未熟胚の調製」の工程6）の直後に、胚に上記の通り調製したアグロバクテリウムの懸濁液を加えた。
３．5分間静置した。
４．アグロバクテリウムを処理した胚を、背軸面を上側に向けて共培養培地に配置した。
５．1週間、暗所で25℃でインキュベートした。この間、アグロバクテリウムが胚を覆うように増殖した。
６．アグロバクテリウムが増殖したカルスを、抗生物質を含むカルス誘導培地（上記選択培地1）に移し、さらに1週間暗所で28℃でインキュベートすることで、アグロバクテリウムの増殖を阻害し、取り除いた。
７．カルスを、2mg/Lのハイグロマイシンを含むカルス誘導培地（上記選択培地1）で、培地を1週間ごとに交換しながら3週間暗所で28℃で増殖させた。
８．カルスを、5mg/Lのハイグロマイシンを含むカルス誘導培地（上記選択培地2）で、培地を1週間ごとに交換しながら3週間暗所で28℃で増殖させた。
９．カルスを、5mg/Lのハイグロマイシンを含むシュート誘導培地（上記再生培地）で、培地を1週間ごとに交換しながら4週間暗所で25℃で培養した。
１０．シュートを、滅菌したバーミキュライトに移し、ガラス製の容器内で、16時間点灯／8時間暗所のサイクルで、根を再生させた。培養一週間ほどで葉の伸長が認められたものについて、発根がなされたと判断した。
１１．植物体をポットに移し、成体まで成長させた。
【００４７】
カルスの白色光への曝露後の色素産生の定量的評価
上記「アグロバクテリウムによる形質転換」の工程６で得られたカルスを白色光下に3時間曝露し、ImageJ-Scaleを用いて、以下の通り白色光曝露前のサンプルとの色調変化を評価した。
最初に、曝露前と曝露後の寒天培地を撮像し、ImageJ-Scaleを用いて画像同士のピクセル数を合わせた。続いて、ImageJ-Process-Subtract Backgroudにより画像の背景輝度を引き算した。つづいて、白黒反転を行い、ROI（Region of interest）を8箇所選択し、面積を4356ピクセルに統一して輝度を計測し、平均値を求めた。
【００４８】
PCRによる遺伝子導入の確認
ソルガムの葉からCTAB法によりDNAを抽出した。続いて、94℃で2分間加熱した後、94℃30秒、60℃30秒、68℃１分間のサイクルを30サイクル行った。PCRによる増幅産物を、電気泳動により評価した。
【００４９】
＜結果＞
品種Btx623について、61〜254の未熟胚をカルス誘導に用いた。カルス誘導の成功率は、49〜100％であった。1週間アグロバクテリウムとソルガムの胚を共培養した後の写真を図1Aに示す。この共培養物を白色光下に3時間曝露した場合の培地の写真を図1Bに示す（明所に移したソルガムでは、高量の色素（茶褐色）が認められる）。このサンプルについてImageJ-Scaleにより輝度の評価を行ったところ、曝露前のサンプルよりも曝露後のサンプルにおいて、白黒反転後の輝度が上昇していた（表1、図1C）。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
これらの結果は、カルスが白色光に暴露されることにより高量の色素を産生することを示唆している。
【００５２】
アグロバクテリウムによる感染及びハイグロマイシン含有培地による選抜後、ハイグロマイシン耐性カルスの割合は1.8〜13.85%（平均6.07%）であった。2mg/Lのハイグロマイシンを含むカルス誘導培地で3週間28℃でインキュベーションした後のカルスの写真を図2に示す。この濃度では感受性のあるカルスは増殖が遅い。図2のAはハイグロマイシン耐性のカルスを、Bはハイグロマイシン感受性のカルスを、Cはハイグロマイシン耐性カルスのGFP蛍光を示す。
【００５３】
これらのハイグロマイシン耐性カルスからの根の再生割合は、0〜3.28%（平均0.97%）であった。特に興味深いことに、長日条件（16h明所/8h暗所）でカルスを根に再分化、及び発根させた場合には培地中に黒褐色の色素が生じ、試験した382個体について健常なシュート及び根が1つも生じなかったのに対し、暗所でカルスを根に再分化、及び発根させた場合には、92個体の薬剤耐性カルスから14個体のシュートが得られた。暗所で再生させたソルガムの種子を、土を入れたポットに移し、成体まで増殖させた植物体の写真を図3のAに示す。図3のBは、この植物体の葉から全ゲノムDNAを抽出し、GFP遺伝子の挿入をPCRにより確かめた結果を示す。WTはアグロバクテリウム形質転換をしなかった野生型の結果を、GFPは、再生したソルガム植物体から得られたPCR断片を示す。
【００５４】
根の再分化に続いて、胚を滅菌したバーミキュライトに移したところ、発根率は0〜1.54%（平均0.84%）であった。この工程において、バーミキュライトを用いた場合、14個体のシュートから11個体が発根したのに対し、培地を用いた場合、約40個体のシュートから発根した個体は一つも得られなかった。
【００５５】
また、品種Kellerについては再分化を25℃で行い、アグロバクテリウムによる感染を行なわず、抗生物質による選抜を行わない以外、BTx623と同様の条件でカルス誘導を行った。その結果、Keller種についても再分化によって発根させることができた。発根が生じた胚の写真を図4に示す。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により、産業上有用なモロコシ属又はサトウキビ属の植物について、高効率で再分化及び形質転換を可能とする方法が提供される。特に、ソルガムは食物及びエネルギー作物、並びにプラスチック及び線維等の原料としても利用され得ることから、形質転換が可能になったことによる産業への影響は大きい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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