(57)【要約】      （修正有）【課題】電極の形成が容易であり、センサとして安定的に機能するセンサ用電極を提供する。【解決手段】絶縁性を有する基材１の一方の面に第１電極層４を有し、上記第１電極層が、作用極２１および標準電極２２を含み、上記第１電極層は、上記基材の一方の面にパラジウムを含む第１層２を有し、さらに、上記第１層の上記基材が形成された面とは反対側の面に、上記標準電極が標準電極としての機能を奏するように形成された金を含む第２層３を有することを特徴とするセンサ用電極。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性を有する基材の一方の面に第１電極層を有し、
前記第１電極層が、作用極および標準電極を含み、
前記第１電極層は、前記基材の一方の面にパラジウムを含む第１層を有し、さらに、前記第１層の前記基材が形成された面とは反対側の面に、前記標準電極が標準電極としての機能を奏するように形成された金を含む第２層を有することを特徴とするセンサ用電極。
【請求項２】
前記第２層の厚みが、５ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載のセンサ用電極。
【請求項３】
前記第１層の厚みが、前記第２層の厚みより厚いことを特徴とする請求項１または請求項２に記載のセンサ用電極。
【請求項４】
前記基材の一方の面に前記第１層を含む電極層を有し、
前記電極層は、全て前記第１電極層であることを特徴とする請求項１から請求項３までのいずれかの請求項に記載のセンサ用電極。
【請求項５】
前記基材の一方の面に、
測定対象物を収容し得るものであり、その内部に前記作用極および前記標準電極が配置される収容部と、
一端が前記収容部に接続され、他端が導入口に接続された流路と、
を有することを特徴とする請求項１から請求項４までのいずれかの請求項に記載のセンサ用電極。
【請求項６】
前記作用極の平面視形状が櫛形形状であることを特徴とする請求項１から請求項５までのいずれかの請求項に記載のセンサ用電極。
【請求項７】
前記センサ用電極が、エンドトキシンセンサとして用いられることを特徴とする請求項１から請求項６までのいずれかの請求項に記載のセンサ用電極。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電極の形成が容易であり、センサとして安定的に機能するセンサ用電極に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血液等の生体試料中の特定成分について迅速かつ簡便に濃度等を測定する方法として、電気化学的検出手段によるバイオセンサが実用化されている。
酵素をセンシング素子に用いる電気化学バイオセンサでは、一般に、電極として作用極および対極を含む電極系と、酵素および電子伝達体（メディエータ）を含む反応部とを基本構成として備えている。このようなバイオセンサの一例として、電気化学的に血液中のグルコースを定量化するグルコースセンサがある。
【０００３】
例えば、グルコースセンサにおいては、当該反応部において、酵素が血液中のグルコースを選択的に酸化してグルコン酸を生成し、また同時に電子伝達体を還元して還元体を生じる。この還元体が電極系に伝達され、一定の電圧が印加されることにより還元体が再び酸化され、その際に電流が発生する。
このとき発生する電流の大きさは、血液中のグルコース濃度に依存することから、バイオセンサと接続する測定装置において測定された電流値から、血液中のグルコースを定量化することができる。
【０００４】
グルコースセンサ等に代表されるバイオセンサは、少量の試料から短時間で測定を可能とするため、高い感度および測定精度を有することが必要とされる。一方で、バイオセンサは検査毎に交換して使用される消耗品であるため、低コストであることも求められる。
高感度で安価なバイオセンサとするために、電極系および配線部等の材料として、従来、銀、ニッケル等の導電性が高く、安価な金属材料が用いられていた（特許文献１参照）。
しかしながら、このような金属材料からなる電極は、大気中の水分、試料中の水分、試料および酵素の酵素反応により発生した過酸化水素等との接触による腐食によりバイオセンサの電気特性が低下し、センサとしての精度が低下するという問題がある。
【０００５】
また、電極の材料として、例えば、カーボンを用いる方法が知られている(特許文献２)。カーボンは上述の金属材料よりも腐食しにくく、金属材料よりも安価である。しかしながら、カーボンは、平坦かつ精密なパターン形状に加工する安価な技術がなく、高精度なセンサとして使用可能な電極を量産すること困難であるといった問題がある。
【０００６】
このようなことから、バイオセンサに用いられる電極の材料としては、一般的に、金等の非腐食性の貴金属材料を用いたものが使用される。
また、電極の形成方法としては、特許文献３に記載されるように、金等の非腐食性の貴金属材料膜を蒸着法により形成した後、フォトリソグラフィ法等により、電極以外の貴金属材料膜を除去する方法が用いられる。
なお、このような電極は、バイオセンサのみならず、ガスセンサ、生体物質検出用センサ等の様々な測定用センサや、ＳＡＷ（弾性表面波）フィルタ、バイオ燃料電池の電極等にも用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−０２３２９１号公報
【特許文献２】特開２００４−２９４２３１号公報
【特許文献３】特開２０１０−２２９１３５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、金電極を用いて作用極等を形成した場合、材料自体が高価であり、センサ用電極が高コストになるといった問題がある。
また、金電極を用いて作用極等を形成した場合、標準電極として銀／酸化銀電極等を別途形成する必要があり、製造工程が煩雑になると共に、高コストになるといった問題がある。
このような問題に対して、本発明者等は、パラジウムを用いて電極を形成することを検討している。パラジウムは金と比較して安価であると共に、それを用いた電極が標準電極として使用可能な数少ない材料である。このため、パラジウム電極を用いて作用極等を形成した場合、金電極を用いた場合のように別途標準電極を別材料を用いて形成することが不要となる。つまり、パラジウム電極であれば、標準電極および作用極を同時に形成でき、別の材料を用いて別途標準電極を形成する手間を省くことができる。このため、パラジウム電極を用いて電極を形成することで、大幅な低コス化を図ることが可能となる。
しかしながら、標準電極および作用極の両者をパラジウム電極により形成した場合には、センサとして機能しない場合があるといった問題がある。
【０００９】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、電極の形成が容易であり、センサとして安定的に機能するセンサ用電極を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、パラジウム電極を用いて作用極を形成した際に、測定対象物を含む試料中のタンパク質等の成分（以下、吸着性成分と称する場合がある。）が作用極表面に吸着し、作用極表面での電気化学反応を阻害することで、センサ用電極がセンサとして機能しなくなる場合があることを新たに発見した。
また、パラジウム電極表面に薄く金電極膜を形成した電極層は、これを用いて作用極および標準電極を形成した場合に、作用極表面への吸着性成分の吸着を抑制でき、作用極として安定的に機能すると共に、標準電極としても機能することを新たに見出し、本発明を完成させるに至ったのである。
【００１１】
すなわち、本発明は、絶縁性を有する基材の一方の面に第１電極層を有し、上記第１電極層が、作用極および標準電極を含み、上記第１電極層は、上記基材の一方の面にパラジウムを含む第１層（以下、パラジウム層と称する場合がある。）を有し、さらに、上記第１層の上記基材が形成された面とは反対側の面に、上記標準電極が標準電極としての機能を奏するように形成された金を含む第２層（以下、金層と称する場合がある。）を有することを特徴とするセンサ用電極を提供する。
つまり、本発明は、絶縁性を有する基材と、上記基材の一方の面に形成された第１電極層と、を有し、上記第１電極層が、作用極および標準電極を含み、上記第１電極層は、上記基材の一方の面に形成されたパラジウム層と、上記パラジウム層の上記基材が形成された面とは反対側の面に、上記標準電極が標準電極としての機能を奏するように形成された金層と、を有することを特徴とするセンサ用電極を提供する。
【００１２】
本発明によれば、上記第１電極層が、パラジウム層と、上記パラジウム層の上記基材が形成された面とは反対側の面に、金層と、を有することにより、この第１電極層を用いて形成された作用極は、使用時の吸着性成分の吸着を抑制できる。このため、本発明のセンサ用電極は、センサとして安定的に機能するものとなる。
また、上記第１電極層は、金層が、上記標準電極が標準電極としての機能を奏するように形成されていることにより、上記第１電極層を用いて形成された標準電極は、標準電極としての機能を奏するものとなる。
したがって、上記第１電極層は、作用極および標準電極の両者として使用可能となり、このような第１電極層により作用極および標準電極の両者が形成されていることで、本発明のセンサ用電極は、電極の形成が容易なものとなる。
【００１３】
本発明においては、上記第２層の厚みが、５ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることが好ましい。つまり、本発明においては、上記金層の厚みが、５ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることが好ましい。標準電極としての機能を奏する第１電極層の形成が容易となるからである。
【００１４】
本発明においては、上記第１層の厚みが、上記第２層の厚みより厚いことが好ましい。つまり、本発明においては、上記パラジウム層の厚みが、上記金層の厚みより厚いことが好ましい。金層の使用量、すなわち、金の使用量を低減することができ、本発明のセンサ用電極は、低コストなものとなるからである。
【００１５】
本発明においては、上記基材の一方の面に上記第１層を含む電極層を有し、上記電極層は、全て上記第１電極層であることが好ましい。つまり、本発明においては、上記基材の一方の面に形成され、上記パラジウム層を含む電極層が、全て上記第１電極層であることが好ましい。上記電極層により形成された電極の全てが、第１電極層により形成されたものとすることで、本発明のセンサ用電極は、電極の形成が容易なものとなるからである。
【００１６】
本発明においては、上記基材の一方の面に、測定対象物を収容し得るものであり、その内部に上記作用極および上記標準電極が配置される収容部と、一端が上記収容部に接続され、他端が導入口に接続された流路と、を有することが好ましい。つまり、本発明においては、上記基材の一方の面に形成され、測定対象物を収容し得るものであり、その内部に上記作用極および上記標準電極が配置される収容部と、一端が上記収容部に接続され、他端が導入口に接続された流路と、を有することが好ましい。
上記収容部および流路を有することにより、本発明のセンサ用電極は、センサとして使用容易なものとなるからである。
【００１７】
本発明においては、上記作用極の平面視形状が櫛形形状であることが好ましい。上記作用極の平面視形状が櫛形形状であることにより、本発明のセンサ用電極は、高感度なセンサとなるからである。
【００１８】
本発明においては、上記センサ用電極が、エンドトキシンセンサとして用いられることが好ましい。本発明のセンサ用電極は低コストなものとなるため、例えば、様々な場面で測定されるエンドトキシン濃度の測定を低コストで実施可能となるからである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、電極の形成が容易であり、センサとして安定的に機能するセンサ用電極を提供できるといった効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明のセンサ用電極の一例を示す概略平面図である。
【図２】図１のＡ−Ａ線断面図である。
【図３】本発明における電極層を説明する説明図である。
【図４】本発明における電極層を説明する説明図である。
【図５】本発明のセンサ用電極の他の例を示す概略平面図および断面図である。
【図６】本発明のセンサ用電極の他の例を示す概略平面図および断面図である。
【図７】実施例１におけるサイクリックボルタモグラムである。
【図８】実施例２におけるサイクリックボルタモグラムである。
【図９】実施例３におけるサイクリックボルタモグラムである。
【図１０】実施例４におけるサイクリックボルタモグラムである。
【図１１】実施例５におけるサイクリックボルタモグラムである。
【図１２】実施例６におけるサイクリックボルタモグラムである。
【図１３】比較例１におけるサイクリックボルタモグラムである。
【図１４】比較例２におけるサイクリックボルタモグラムである。
【図１５】比較例３におけるサイクリックボルタモグラムである。
【図１６】比較例４におけるサイクリックボルタモグラムである。
【図１７】比較例５におけるサイクリックボルタモグラムである。
【図１８】比較例６におけるサイクリックボルタモグラムである。
【図１９】参考例１におけるサイクリックボルタモグラムである。
【図２０】実施例１におけるアンペログラムである。
【図２１】実施例７におけるアンペログラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、センサ用電極に関するものである。
以下、本発明のセンサ用電極について詳細に説明する。
【００２２】
本発明のセンサ用電極は、絶縁性を有する基材と、上記基材の一方の面に形成された第１電極層と、を有し、上記第１電極層が、作用極および標準電極を含み、上記第１電極層は、上記基材の一方の面に形成されたパラジウム層と、上記パラジウム層の上記基材が形成された面とは反対側の面に、上記標準電極が標準電極としての機能を奏するように形成された金層と、を有することを特徴とするものである。
【００２３】
このような本発明のセンサ用電極について図を参照して説明する。図１は、本発明のセンサ用電極の一例を示す概略平面図であり、図２は図１のＡ−Ａ線断面図である。
図１および図２に例示するように、本発明のセンサ用電極１０は、絶縁性を有する基材１と、上記基材１の一方の面に形成された第１電極層４と、を有し、上記第１電極層４が、作用極２１および標準電極２２を含み、上記第１電極層４は、上記基材１の一方の面に形成されたパラジウム層２と、上記パラジウム層２の上記基材１が形成された面とは反対側の面に、上記標準電極２２が標準電極としての機能を奏するように形成された金層３と、を有するものである。
なお、図１および図２は、上記基材１の一方の面に形成された上記パラジウム層２を含む電極層６が、２つの作用極２１、標準電極２２および対極２３を含む電極部１１と、電極部１１に接続され、測定装置との接続に用いられる端子部１３と、電極部１１および端子部１３を接続する配線部１２と、を有する電極を含み、これらの電極の全てが第１電極層４により形成される例を示すもの、すなわち、パラジウム層２を含む電極層６が全て上記第１電極層４である例を示すものである。
【００２４】
本発明によれば、上記第１電極層が、パラジウム層と、上記パラジウム層の上記基材が形成された面とは反対側の面に、金層と、を有することにより、この第１電極層を用いて形成された作用極は、金層の存在により使用時の吸着性成分の吸着を抑制でき、吸着性成分による電気化学反応の阻害を抑制できる。このため、本発明のセンサ用電極は、センサとして安定的に機能するものとなる。
また、上記第１電極層は、金層が、上記標準電極が標準電極としての機能を奏するように形成されていること、例えば、測定対象物を含む試料がパラジウム層に接触可能に形成されていることにより、パラジウム層としての機能も発揮可能となる。その結果、上記第１電極層を用いて形成された標準電極は、標準電極としての機能を奏するものとなる。
したがって、上記第１電極層は、作用極および標準電極の両者として使用可能となり、このような第１電極層により作用極および標準電極の両者が形成されていることで、本発明のセンサ用電極は、電極の形成が容易なものとなる。
さらに、第１電極層は、パラジウム層を含むものであることから、金層のみによって電極を形成する場合と比較して低コスト化を図ることができる。
【００２５】
本発明のセンサ用電極は、基材および電極層を有するものである。
以下、本発明のセンサ用電極の各構成について詳細に説明する。
【００２６】
１．電極層
上記電極層は、上記基材の一方の面に形成されたパラジウム層を含むものである。
上記電極層は、少なくとも第１電極層を含むものである。
【００２７】
（１）第１電極層
上記第１電極層は、作用極および標準電極を少なくとも含むものである。
上記第１電極層は、上記基材の一方の面に形成されたパラジウム層と、上記パラジウム層の上記基材が形成された面とは反対側の面に、上記標準電極が標準電極としての機能を奏するように形成された金層と、を有するものである。
【００２８】
ここで、上記標準電極が標準電極としての機能を奏するように形成されるとは、パラジウム層の上記基材が形成された面とは反対側の面（以下、パラジウム層表面と称する場合がある。）に金層が形成された場合でも、本発明のセンサ用電極において第１電極層を用いて形成された標準電極が、標準電極としての機能を発揮可能なものであればよい。
上記標準電極が標準電極としての機能を奏するように形成されるとは、より具体的には、後述する実施例の評価１に記載する条件でサイクリックボルタモグラムを作成し、そのサイクリックボルタモグラムより酸化ピークおよび還元ピークの両者が観察されるものとすることができる。
具体的には、酸化ピーク位置が０．３Ｖ以下で観察された場合に、酸化ピークを観察できたと判断することができる。
また、サイクリックボルタモグラムで観察される還元ピークを通過し、Ｘ軸に並行な直線を引いた時、その線より還元ピーク後の特性が上にあるもの、すなわち、電位を０．６Ｖから−０．４Ｖに走査する際に、還元ピークが観察された電位より低電位側で、還元ピークにおける電流値以上の電流値が観察された場合に、還元ピークを観察できたと判断することができる。
このような第１電極層としては、例えば、測定対象物を含む試料（以下、単に試料と称する場合がある。）がパラジウム層まで到達可能な状態でパラジウム層表面に形成された金層を有するものとすることができ、より具体的には、厚みが５０ｎｍ以下である金層を有する態様（第１実施態様）と、平面視形状が部分的にパラジウム層が露出するパターン形状である金層を有する態様（第２実施態様）と、を挙げることができる。
本発明においては、なかでも、上記第１電極層が、第１実施態様であることが好ましい。金層の形成が容易だからである。
なお、図３（ａ）は、厚みが５０ｎｍ以下である金層３を有する第１電極層４の一例を示す概略平面図であり、図３（ｂ）は図３（ａ）のＢ−Ｂ線断面図である。
また、図４（ａ）、（ｃ）および（ｅ）は、平面視形状が、部分的にパラジウム層２が露出するパターン形状である金層３を有する第１電極層４の一例を示す概略平面図であり、図４（ｂ）、（ｄ）および（ｆ）は、図４（ａ）、（ｃ）および（ｅ）のそれぞれのＣ−Ｃ線断面図である。
以下、このような各実施態様の第１電極層について分けて説明する。
【００２９】
（ａ）第１実施態様
本態様の第１電極層は、厚みが５０ｎｍ以下である金層を有するものである。
【００３０】
ここで、厚みが５０ｎｍ以下の金層を有するものであることにより、第１電極層を用いて形成された標準電極が標準電極としての機能を奏するものとなる理由については明確ではないが、以下のように推察される。
すなわち、金層は、一般的にピンホール等を有し易く、薄膜である程ピンホール等の数が多いものとなる。このため、金層の厚みが所定の範囲以下であることで、試料がパラジウム層まで到達可能となる結果、第１電極層は標準電極としての機能を奏するものとなるのである。
また、パラジウム層が金層に覆われることで、吸着性成分の吸着を抑制できる結果、第１電極層は作用極としても安定的に機能を奏するものとなるのである。
さらに、厚みが５０ｎｍ以下であることで、低コスト化を図ることができる。
【００３１】
上記金層の厚みは、５０ｎｍ以下であればよく、本発明のセンサ用電極の用途等によって異なるものであるが、例えば、５ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることが好ましく、５ｎｍ以上３０ｎｍ以下であることが好ましく、特に、５ｎｍ以上２０ｎｍ以下であることが好ましく、なかでも特に、５ｎｍ以上１５ｎｍ以下であることが好ましい。
上記金層の厚みが上述の範囲内であることにより、安定的に試料がパラジウム層まで到達可能であり、さらに、吸着性成分がパラジウム層に吸着することを安定的に抑制できるからである。
なお、上記金層の厚みは、上記パラジウム層の上記基材が形成された面とは反対側の面から金層のパラジウム層が形成された面とは反対側の面までの距離をいうものであり、具体的には、既に説明した図３（ｂ）中のｈ１で示されるものである。
【００３２】
以下、本態様の第１電極層に含まれる金層およびパラジウム層について説明する。
【００３３】
（ｉ）金層
上記金層は、上記パラジウム層の上記基材が形成された面とは反対側の面に、上記第１電極層が上記標準電極としての機能を奏するものとなるように形成されるものであり、本態様においては、厚みが５０ｎｍ以下のものである。
また、上記金層は、金を主成分として含む層である。
【００３４】
ここで、金を主成分として含むとは、第１電極層が作用極および標準電極としての機能を安定的に奏するものであればよく、例えば、金層中の金の含有量が、９５質量％以上であるものとすることができ、なかでも、９８質量％以上であることが好ましく、特に、１００質量％、すなわち、金のみを含むものであることが好ましい。上記含有量が上述の範囲内であることにより、第１電極層は作用極および標準電極としての機能を安定的に奏するものとなるからである。
なお、上記含有量が１００質量％未満である場合、上記金層が含有可能な材料としては、例えば、白金等を挙げることができる。
【００３５】
上記金層の、パラジウム層表面の形成箇所としては、パラジウム層が露出するパターン状であってもよいが、通常、パラジウム層表面の全面である。上記形成箇所であることで、第１電極層は形成容易となるからである。
【００３６】
上記金層は、上記パラジウム層の上記基材が形成された面とは反対側の面に形成されるものであればよいが、必要に応じて、パラジウム層の側面にも形成されていてもよい。
【００３７】
上記金層は、他の層を介してパラジウム層の上記基材が形成された面とは反対側の面に形成されるものであってもよいが、通常、パラジウム層と直接接するように形成されるものである。
【００３８】
（ｉｉ）パラジウム層
上記パラジウム層は、上記基材の一方の面に形成されるものである。
上記パラジウム層は、パラジウムを主成分として含む層である。
【００３９】
ここで、パラジウムを主成分として含むとは、第１電極層が作用極および標準電極としての機能を安定的に奏するものであればよく、例えば、パラジウム層中のパラジウムの含有量が、９５質量％以上であるものとすることができ、なかでも、９８質量％以上であることが好ましく、特に、１００質量％、すなわち、パラジウムのみを含むものであることが好ましい。上記含有量が上述の範囲内であることにより、第１電極層が作用極および標準電極としての機能を安定的に奏するものとなるからである。
なお、上記含有量が１００質量％未満である場合、上記パラジウム層が含有可能な材料としては、例えば、金、ニッケル、クロム、カーボン等を挙げることができる。
【００４０】
上記パラジウム層の厚みは、第１電極層が作用極および標準電極としての機能を安定的に奏するものであればよく、例えば、５ｎｍ以上５００ｎｍ以下とすることができ、なかでも１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることが好ましく、特に３０ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることが好ましい。上記厚みが上述の範囲内であることにより、第１電極層が作用極および標準電極としての機能を安定的に奏するものとなるからである。
また、上記パラジウム層の厚みは、上記金層の厚みより厚いことが好ましい。本発明のセンサ用電極は、低コストなものとなるからである。
なお、上記パラジウム層の厚みは、パラジウム層の基材側の面から金層が形成された面までの距離をいうものであり、具体的には、既に説明した図３（ｂ）中のｈ２で示されるものである。
【００４１】
（ｉｉｉ）第１電極層の形成方法
上記第１電極層は、作用極および標準電極を少なくとも含むものであり、その平面視形状は、通常、パターン形状である。
このような第１電極層の形成方法としては、所望のパターン形状の第１電極層を形成可能な方法であればよく、例えば、パターン状のパラジウム層を形成した後、パラジウム層上に金層を積層する方法（第１方法）、パラジウム層を形成可能なパラジウム層形成膜および金層を形成可能な金層形成膜の両者を積層した後、パラジウム層形成膜および金層形成膜の積層体をパターニングする方法(第２方法)等を挙げることができる。
本発明においては、なかでも、上記形成方法が、上記第１方法であることが好ましい。金層を形成するために用いる金の使用量を低減できるからである。
【００４２】
パターン状のパラジウム層を形成する方法としては、パラジウム層形成膜を形成した後、パターン状のレジストを形成し、次いでレジストから露出するパラジウム層形成膜をエッチングする方法を用いることができる。また、上記形成方法としては、第１電極層の形成箇所に開口部を有するマスク層を形成した後、パラジウム層形成膜を製膜する方法や、第１電極層の形成箇所に形成されパラジウム層と密着可能な密着層を形成した後、上記パラジウム層の構成材料を用いて形成されたパラジウム層形成膜を製膜する方法を用いることができる。
上記マスク層としては、フォトレジスト、印刷層、メタルマスク、水性インク層等を挙げることができる。また、上記密着層としてはめっき下地等を挙げることができる。
パターン状のパラジウム層上に金層を積層する方法としては、めっき法等を用いることができ、なかでも、無電解めっき法を好ましく用いることができる。また、無電解金めっき液としては、例えば、ノンシアン系の無電解金めっき液を用いることができる。
また、パラジウム層形成膜および金層形成膜の形成方法としては、所望の厚みのパラジウム層形成膜および金層形成膜を形成可能な方法であればよく、一般的な製膜方法を用いることができ、例えば、真空蒸着法、スパッタリング、イオンプレーティング等の物理気相成長法等の気相法、めっき法等の公知の製膜方法を挙げることができ、なかでも、気相法であることが好ましく、特に、物理気相成長法であることが好ましい。
上記積層体のパターニング方法としては、上記パターン状のパラジウム層を形成する方法と同様の方法を用いることができる。
なお、上記形成方法がマスク層等を形成した後製膜する方法である場合には、必要に応じて、マスク層と共に不要なパラジウム層形成膜を除去する処理を行ってもよい。
【００４３】
（ｂ）第２実施態様
上記第１電極層の第２実施態様は、平面視形状が部分的にパラジウム層が露出するパターン形状の金層を有するものである。
【００４４】
本態様においては、金層の平面視形状が部分的にパラジウム層が露出するパターン形状であることにより、試料がパラジウム層まで到達可能となる結果、第１電極層は標準電極としての機能を奏するものとなる。
また、パラジウム層が部分的に金層に覆われることで、吸着性成分の吸着を抑制できる結果、第１電極層は作用極としての機能も安定的に奏することができるのである。
【００４５】
上記金層の平面視形状は、部分的にパラジウム層が露出するパターン形状であればよく、ドット形状（網点形状）、ライン形状、複数の開口部が配列した形状等とすることができる。
上記ドット形状の金層の平面視形状としては、第１電極層が標準電極としての機能を奏することができるものであればよく、例えば、三角形状、四角形状、五角形状等の多角形状、円形状、楕円形状等とすることができる。
上記開口部の形状としては、上記ドット形状の金層の平面視形状と同様とすることができる。
なお、既に説明した図４（ａ）、（ｃ）および（ｅ）は、上記平面視形状が、それぞれ、ライン形状、ドット形状、および複数の開口部が配列した形状である例を示すものである。
また、図４（ｃ）および図４（ｅ）は、それぞれドット形状および開口部の平面視形状が、正方形状である例を示すものである。
【００４６】
上記金層の被覆割合、すなわち、パラジウム層の上記基材が形成された面とは反対側の面の面積（パラジウム層面積）に対する、金層により覆われる面積（金層面積）の割合（金層面積／パラジウム層面積）としては、１未満であればよく、本発明のセンサ用電極の用途等によって異なるものであるが、例えば、０．５０以上０．９９以下とすることができ、なかでも０．６０以上０．９５以下であることが好まく、特に、０．８０以上０．９５以下であることが好しい。上記被覆割合が上述の範囲内であることにより、第１電極層が作用極および標準電極としての機能を安定的に奏するものとなるからである。
なお、上記被覆割合は、例えば、第１電極層により形成された電極について、平面視上の重なりが最大となるように少なくとも１辺が１０μｍ以上の正方形領域を配置し、その正方形領域と平面視上重なる部位での被覆割合を求めることができる。
【００４７】
以下、本態様の第１電極層に含まれる金層およびパラジウム層について説明する。
なお、パラジウム層については、上記「（ａ）第１実施態様」の項に記載の内容と同様とすることができるので、ここでの説明は省略する。
【００４８】
（ｉ）金層
上記金層は、上記パラジウム層の上記基材が形成された面とは反対側の面に、上記第１電極層が上記標準電極としての機能を奏するように形成されるものであり、本態様においては、平面視形状が部分的にパラジウム層が露出するパターン形状であるものである。
【００４９】
上記金層の厚みとしては、第１電極層が作用極および標準電極としての機能を安定的に奏するものであればよく、例えば、５ｎｍ以上５０ｎｍ以下とすることができ、なかでも、１０ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることが好ましく、特に、１０ｎｍ以上３０ｎｍ以下であることが好ましい。上記厚みが上述の範囲内であることにより、所定のパターン形状の金層を安定的に形成できるからである。また、低コスト化を図ることができるからである。
【００５０】
上記金層のその他の内容については、上記「（ａ）第１実施態様」の項に記載の内容と同様とすることができるので、ここでの説明は省略する。
【００５１】
（ｉｉ）第１電極層の形成方法
上記第１電極層は、作用極および標準電極を少なくとも含むものであり、その平面視形状は、通常、パターン形状である。
また、本態様の第１電極層は、パラジウム層が露出するパターン状に金層が形成されるものである。
このような第１電極層の形成方法としては、所望のパターン形状の第１電極層を形成可能な方法であればよく、例えば、パターン状のパラジウム層を形成した後、パラジウム層上にパターン状の金層を形成する方法等を挙げることができる。
パターン状に金層を形成する方法およびパターン状にパラジウム層を形成する方法等については、上記「（ａ）第１実施態様」の項に記載のパターン状にパラジウム層を形成する方法と同様とすることができる。
【００５２】
（ｃ）その他の層
上記第１電極層は、パラジウム層および金層が基材側からこの順で積層した構造を有するものであり、パラジウム層および金層以外のその他の層を有するものであってもよいが、上記第１電極層が、パラジウム層および金層のみを含み、パラジウム層が基材に直接接するように形成されるものであることが好ましい。上記層構造の第１電極層であることにより、本発明のセンサ用電極は、低コストなものとなるからである。
上記その他の層としては、導電性を有するものであればよく、Ｔｉ層、Ｃｒ層、Ｎｉ層等のパラジウム層および基材の間に形成され、第１電極層の基材への密着性を向上する密着性向上層等を挙げることができる。
なお、パラジウム層をめっき法により形成する際に用いるめっき下地層については、上記密着性向上層に含まれないものである。
【００５３】
（２）第１電極層の形成対象
上記第１電極層は、作用極および標準電極を少なくとも含むものである。
ここで、第１電極層が作用極および標準電極を含むとは、作用極および標準電極が第１電極層により形成されていることをいうものである。
本発明において、第１電極層は、作用極および標準電極のそれぞれ試料と接触可能な部位を含むものであればよく、例えば、それぞれの一部のみを含むものであってもよいが、作用極および標準電極の試料と接触可能な部位の全てを含むことが好ましく、なかでも、作用極および標準電極の両者の全てを含むもの、すなわち、作用極および標準電極は全て第１電極層であることが好ましい。
なお、既に説明した図１および図２は、第１電極層が作用極および標準電極の全てを含む例を示すものである。
また、図５は、第１電極層が、作用極および標準電極のそれぞれの一部のみを含む例を示すものであり、それぞれの試料と接触可能な部位のみを含む例を示すものであり、図５（ａ）は、本発明のセンサ用電極１０の他の例を示す概略平面図であり、図５（ｂ）および（ｃ）はそれぞれ図５（ａ）のＤ−Ｄ線断面図およびＥ−Ｅ線断面図である。
なお、図５は、第１電極層が、作用極および標準電極の試料と接触可能な部位の全てを含む例を示すものである。
【００５４】
（ａ）作用極
上記作用極は、試料に含まれる酸化還元物質と電気化学反応を生じ、酸化還元物質の還元体の酸化および酸化還元物質の酸化体の還元が行われる結果流れる電流により測定対象物を検出するものである。
【００５５】
上記作用極の平面視形状としては、酸化還元物質と電気化学反応を生じることができるものであればよく、一般的なセンサ用電極と同様とすることができる。
本発明においては、上記平面視形状が、少なくとも２以上の櫛歯部と、これらの櫛歯部を連結する連結部と、を有する櫛形形状であることが好ましい。上記平面視形状が櫛形形状であることにより、上記作用極は、試料との接触面積の広いものとすることが容易である。したがって本発明のセンサ用電極は高精度なセンサとして使用可能となるからである。
また、上記櫛形形状であることで、例えば２つの櫛形形状の作用極を櫛歯部が幅方向に隣接するように、すなわち、上記櫛歯部同士が噛み合うように配置することで、上記センサ用電極は、検出される電流値を効率的に増幅可能となる。このため、本発明のセンサ用電極は高精度なセンサとして使用可能となるからである。
なお、既に説明した図１は、作用極２１が、少なくとも２以上の櫛歯部１４ａと、これらの櫛歯部１４ａを連結する連結部１４ｂと、を有する櫛形形状である例を示すものである。
【００５６】
上記櫛歯部の幅としては、所望の精度のセンサとすることができるものであれば特に限定されるものではないが、０．１μｍ以上２０μｍ以下であることが好ましく、なかでも、０．１μｍ以上１０μｍ以下であることが好ましい。
上記櫛歯部の長さとしては、本発明のセンサ用電極の用途等に応じて異なるものであるが、５００μｍ以上１００００μｍ以下とすることができる。
上記櫛歯部の本数としては、本発明のセンサ用電極の用途等に応じて異なるものであるが、５０本以上５００本以下とすることができる。
隣接する上記櫛歯部間の幅としては、本発明のセンサ用電極の用途等に応じて異なるものであるが、０．１μｍ以上６０μｍ以下とすることができる。
上記連結部の幅としては、本発明のセンサ用電極の用途等に応じて異なるものであるが、０．１μｍ以上１００００μｍ以下とすることができる。
なお、上記櫛歯部の幅、長さ、隣接する上記櫛歯部間の幅、および上記連結部の幅は、具体的には、図１中のａ，ｂ、ｃ、ｄで示されるものである。また、既に説明した図１では、１つの櫛形電極当たりの櫛歯部の本数が４本である例を示すものである。
【００５７】
上記作用極の数としては、１個以上であればよく、本発明のセンサ用電極の用途等に応じて適宜設定されるものである。
上記作用極の数が２個である場合、すなわち、作用極として第１作用極および第２作用極を有する場合には、第１作用極および第２作用極は、それぞれ酸化還元物質の還元体を酸化するための電極と、酸化還元物質の酸化体を還元するための電極として用いることが可能となる。
そして、第１作用極および第２作用極が近接配置されることで、酸化還元物質の酸化および還元を高頻度で繰り返すことができ、本発明のセンサ用電極は高精度なセンサとして使用可能となる。
【００５８】
（ｂ）標準電極
上記標準電極は、作用極の電位を決定する際の基準となる電極である。
【００５９】
上記標準電極の平面視形状としては、電気化学センサに一般的に用いられるものと同様とすることができる。
【００６０】
上記標準電極の作用極との間の距離は、ショートを起こさない距離であればよい。
このような各電極間の距離は、本発明のセンサ用電極の大きさに応じて適宜設定することができる。
【００６１】
（ｃ）その他
上記第１電極層は、電極層により形成される電極のうち、作用極および標準電極を少なくとも含むものである。
本発明においては、電極層により形成される電極のうちの一部が第１電極層により形成されるもの、すなわち、電極層に含まれるパラジウム層の一部のみが金層により覆われるものであってもよいが、電極層により形成される電極の全てが第１電極層により形成されるもの、すなわち、電極層に含まれるパラジウム層の全てが金層により覆われ、上記基材の一方の面に形成された上記パラジウム層を含む電極層が全て第１電極層であることが好ましい。上記電極層により形成される電極の全てが、第１電極層により形成されるものとすることで、本発明のセンサ用電極は、電極の形成が容易なものとなるからである。
なお、既に説明した図１および図２は、電極層６が全て第１電極層４である例、すなわち、電極層６により形成される電極の全てが第１電極層４により形成される例を示すものである。
また、既に説明した図５は、電極層６の一部が第１電極層４である例、すなわち、電極層６により形成される電極の一部が第１電極層４により形成される例を示すものである。
【００６２】
本発明において、電極層により形成される電極のうち、作用極および標準電極以外のその他の電極としては、作用極および標準電極以外の電極部、電極部に接続され、測定装置との接続に用いられる端子部、電極部および端子部を接続する配線部等を挙げることができる。
【００６３】
（ｉ）電極部
上記電極部は、試料と接して電気化学反応を生じる電極である。このような電極部としては、既に説明した作用極および標準電極以外に、例えば、対極を有するものであってもよい。
ここで、対極は、作用極における電気化学反応が，電気的中性の原理の影響のために滞ることを防ぐために用いられる電極である。
なお、対極は、標準電極がその機能を兼ねるものであってもよい。また、標準電極が対極としての機能も兼ねる共通電極である場合、共通電極と測定装置との接続方法としては、上記共通電極を測定装置の標準電極用端子および対極用端子の両方と接続する方法を用いることができる。
【００６４】
上記対極の平面視形状としては、電気化学センサに一般的に用いられるものと同様とすることができる。
【００６５】
上記対極の作用極との間の距離は、ショートを起こさない距離であればよい。
このような各電極間の距離は、本発明のセンサ用電極の大きさに応じて適宜設定することができる。
【００６６】
（ｉｉ）端子部および配線部
上記端子部は、上記電極部に接続され、測定装置との接続に用いられるものである。
また、上記配線部は、電極部および端子部を接続するものである。
上記端子部が接続される測定装置については、本発明のセンサ用電極の用途等により異なるものであるが、一般に電気化学測定に使用される装置を用いることができ、例えばポテンショスタット、電流増幅器、これらと同等の機能を持つ装置を挙げることができる。これらの装置は、例えば、上記センサ用電極で生じた電気信号を受信するための接続電極、演算部、電源、表示部および操作部等を備えるものを挙げることができる。
上記端子部および上記配線部の平面視形状については、一般的な配線基板に用いられるものと同様とすることができる。
例えば、上記端子部の平面視形状としては円形状、長方形状、正方形状等の多角形状、円形状等とすることができる。また、配線部については、ライン形状等とすることができる。
【００６７】
（３）その他
上記電極層は、第１電極層を少なくとも有するものであるが、必要に応じて、第２電極層を有するものであってもよい。このような第２電極層としては、上記基材の一方の面に形成された上記パラジウム層を含むものであればよい。例えば、図５に例示するように、第２電極層５として、パラジウム層２を有し、金層を有しないもの、すなわち、パラジウム層２のうち、その基材１が形成された面とは反対側の面に金層３が形成されていないものを第２電極層５として使用することができる。
本発明における第２電極層に含まれるパラジウム層については、上記「(１)第１電極層」の項に記載の内容と同様とすることができる。
なお、図５（ａ）は、電極層６が、第１電極層４および第２電極層５を有する例を示すものである。また、第２電極層５は、その基材１が形成された面とは反対側の面が絶縁層２４により覆われるものである例を示すものである。
また、図５では、櫛形形状の作用極２１、標準電極２２および対極２３を含む電極部１１のうち、絶縁層２４により覆われていない部位のみが第１電極層４により形成され、絶縁層２４に覆われる部分が第２電極層５により形成されるものである。また、図５では、配線部１２のうち、絶縁層２４により覆われていない部位のみが第１電極層４により形成され、絶縁層２４に覆われる部分が第２電極層５により形成されるものである。なお、図５では、端子部１３はその全てが第１電極層４により形成されるものである。
なお、図５は、電極部１１のうち、作用極２１、標準電極２２および対極２３の試料と接触可能な部位の全てが第１電極層４により形成される例を示すものである。
【００６８】
電極層が第１電極層および第２電極層を有する場合、電極層の形成方法としては、まず、パラジウム層をパターン状に形成した後、第１電極層として使用するパラジウム層表面にのみ金層をパターン状に形成する方法、例えば、パラジウム層を用いてパターン状に電極層を形成した後、第２電極層を形成する箇所をレジスト層により被覆し、レジスト層から露出するパラジウム層表面上に金層を形成することで、電極層の一部を第１電極層とし、残りを第２電極層とする方法を挙げることができる。
また、金層形成後のレジスト層については、金層形成後に剥離するものであってもよく、除去せずに絶縁層として本発明のセンサ用電極の構成として使用してもよい。
【００６９】
２．基材
上記基材は、絶縁性を有するものであり、電極層を支持するものである。
【００７０】
ここで、絶縁性を有するとは、上記基材表面に離間して設けられた作用極および標準電極同士の短絡を防ぐことが可能なものであればよい。上記基材の体積抵抗値としては、例えば、１×１０１２Ω・ｍ以上とすることができる。なお、上記体積抵抗値は、ＪＩＳＫ９６１１に準じた測定方法により求めることができる。
このような基材としては、例えば、樹脂基材、紙、セラミック基材、ガラス基材、少なくとも表面が絶縁された半導体基材や金属基材等を用いることができる。上記基材は、剛性を有していてもよく、弾性を有していてもよい。中でも、上記基材は、弾性を有することが好ましく、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリスチレン（ＰＳ）樹脂、ポリプロピレン（ＰＰ）樹脂、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリフェニレンサルファイド樹脂（ＰＰＳ）等のフィルムを好適に用いることができる。
なお、基材は、可撓性を有していてもよく有さなくてもよい。また、基材の透明性の有無は問わない。
【００７１】
上記基材の形状、大きさ、厚さ等は、本発明のセンサ用電極を使用する測定機器の接続部の形状等により、適宜設定することができる。
【００７２】
３．その他
本発明のセンサ用電極は、基材および電極層を有するものであるが、必要に応じてその他の構成を有するものであってもよい。
このようなその他の構成としては、例えば、図６に例示するように、上記基材１の一方の面に形成され、測定対象物を収容し得るものであり、その内部に上記作用極２１および上記標準電極２２が配置される収容部２８、上記基材の一方の面に形成され、一端が上記収容部２８に接続され、他端が導入口３０に接続された流路２９、導入口３０から収容部２８までの間に配置され、酵素を含む反応部２７、上記基材１上に配置されるカバー層２６、配線部１２を覆うように形成される絶縁層２４等を挙げることができる。
なお、図６（ａ）は、本発明のセンサ用電極の他の例を示す概略平面図であり、図６（ｂ）は、図６（ａ）からカバー層の記載を省略したものであり、図６（ｃ）は、図６（ａ）のＦ−Ｆ線断面図である。
【００７３】
（１）収容部
本発明における収容部は、基板上に形成され、測定対象物を収容し得るものであり、その内部に上記作用極および上記標準電極が配置されるものであり、通常、これらの電極を含む全ての電極部が配置されるものである。
収容部の形状としては特に限定されるものではなく、収容部の平面視形状としては、例えば円形状、楕円形状、四角形状等を挙げることができる。
本発明のセンサ用電極においては、試料を数μＬ〜数十μＬ程度導入して測定を行うことができることから、収容部の容量としては、１ｍｍ３以上２００ｍｍ３以下であることが好ましく、中でも１ｍｍ３以上１００ｍｍ３以下、特に１ｍｍ３以上５０ｍｍ３以下であることが好ましい。収容部の大きさとしては、例えば収容部の平面視形状が円形の場合には、直径が１ｍｍ以上５ｍｍ以下程度、深さが１ｍｍ以上１０ｍｍ以下程度とすることができる。
【００７４】
収容部の配置としては、測定対象物を収容することができ、その内部に上記電極部を配置することができれば特に限定されるものではない。例えば図５に示すように上部が導入口３０となるように収容部２８が配置されていてもよく、図６に示すように流路２９に接続して収容部２８が配置されていてもよい。
収容部の数は、１つでもよく複数でもよい。
【００７５】
収容部は、基材の溝によって形成されていてもよく、また、既に説明した図５に示すように、基材１上に収容部２８の形状の開口部を有するカバー層２６や、既に説明した図６に示すように、基材１上に収容部２８の形状の開口部を有するスペーサ２５を配置することによって形成されていてもよい。
【００７６】
（２）流路
本発明のセンサ用電極は、一端が上記収容部に接続され、他端が導入口に接続された流路を有していてもよい。
流路は、基材の溝によって形成されていてもよく、また、既に説明した図６に示すように、基材１上に流路２９の形状の開口部を有するスペーサ２５を配置することによって形成されていてもよい。
流路の幅や高さとしては、被検体を収容部に導くことができれば特に限定されるものではなく、例えば０．５ｍｍ〜５ｍｍ程度とすることができる。
【００７７】
（３）反応部
本発明のセンサ用電極は、導入口から収容部までの間に配置され、酵素を含む反応部を有していてもよい。
上記反応部は、基質特異的な物質の変化移動に伴う、化学ポテンシャル、熱あるいは光学的な変化を電気信号へ変換する部分である。
【００７８】
本発明のセンサ用電極を、グルコース濃度を測定するグルコースセンサとして用いる場合には、上記酵素としては、例えば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を用いることができる。
本発明のセンサ用電極を、コレステロールセンサ、アルコールセンサ、スクロールセンサ、乳酸センサ、フルクトースセンサに用いる場合には、上記酵素としては、例えば、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ等の反応系に合ったものを適宜用いることができる。
上記反応部は、これらの酵素と共に、酸化還元物質として、例えば、フェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体、オスミューム誘導体等を含むものであってもよい。
【００７９】
本発明のセンサ用電極を、エンドトキシン濃度を測定するエンドトキシンセンサとして用いる場合には、上記酵素として、少なくともＣ因子を含むものを用いることができ、なかでも、さらにＢ因子および凝固酵素前駆体を含むものを好ましく用いることができる。
上記反応部は、上記酵素と共に、酸化還元物質が結合したペプチド化合物を含むものとすることができる。
また、上記酸化還元物質としては、例えば、パラメトキシアニリン（以下、単にｐＭＡと称する場合がある。）等を含む下記一般式（１）で示す化合物、色素、パラアミノフェノール（ｐＡＰ）等を挙げることができる。
上記色素としては、具体的には、例えば、２、４−ジニトロアニリン（ＤＮＰ）、ｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）、７−メトキシクマリン−４−酢酸（ＭＣＡ）、Ｄａｎｓｙｌ色素等を挙げることができる。
【００８０】
【化１】
2018105805.tif 000003
【００８１】
（式（１）中、Ｒは、−Ｏ−ＣｎＨ２ｎ＋１または−Ｓ−ＣｎＨ２ｎ＋１であり、ｎは１から４までの整数である。）
【００８２】
本発明においては、上記一般式（１）で示した化合物がｐＭＡであることが好ましい。上記一般式（１）で示した化合物のアルキル鎖が短い程、水溶性が高くなり、かつ、活性化したＣ因子または上記活性型凝固酵素が、上記ペプチド化合物に含まれるオリゴペプチドのペプチド配列を認識しやすくなる。このため、酸化還元物質としてオリゴペプチドに結合している上記一般式（１）で示す化合物がｐＭＡであることにより、上記ペプチド化合物は、上記活性化したＣ因子等との反応性が高まるからである。
【００８３】
本発明においては、上記酸化還元物質が、ｐＭＡまたはｐＡＰであることが好ましい。ペプチド化合物から遊離したｐＭＡおよびｐＡＰと、ペプチド化合物に結合したｐＭＡおよびｐＡＰとは、酸化還元電位が異なっており、その差が比較的大きい。このため、ペプチド化合物から遊離したｐＭＡまたはｐＡＰの濃度が極微量であっても、エンドトキシンの濃度を高い精度で検出することができるからである。
【００８４】
上記酸化還元物質が結合したペプチド化合物としては、酸化還元物資と、酸化還元物質が結合しているオリゴペプチドと、を有するものであればよく、オリゴペプチドの一端に酸化還元物質が結合し、他端にペプチドの保護基が結合したものを用いることができる。
上記オリゴペプチドとしては、Ｃ因子または凝固酵素前駆体の作用によって酸化還元物質を遊離することができるものであれば特に限定されるものではない。凝固酵素前駆体の作用によって上記酸化還元物質を遊離可能なオリゴペプチドとしては、例えば、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ等のトリペプチド等を挙げることができる。
【００８５】
上記反応部の配置箇所は、導入口から収容部までの間に配置されるものである。
本発明においては、なかでも、上記配置箇所が、収容部内であることが好ましく、特に、上記電極部と平面視上重なる箇所であることが好ましく、なかでも特に、上記電極部と接する箇所であることが好ましい。上記配置箇所は、上記反応部と試料との混合、測定が容易だからである。
なお、既に説明した図６は、反応部２７の形成箇所が電極部１１に含まれる作用極２１および対極２３の一部と平面視上重なる箇所であり、さらに、これらの電極と接するように配置される例を示すものである。
【００８６】
反応部の形成方法としては、所望の位置に反応部を配置できる方法であれば特に限定されない。例えば、収容部において露出される上記電極部上に上記酵素を含む溶液を塗布した後、乾燥させ溶媒成分を除去して形成することができる。
酵素を含む溶液の塗布方法としては、例えばディスペンサー法を用いることができる。
反応部を形成する場合、酵素は４０℃以上で長時間放置すると活性を失うため、溶媒の乾燥は４０℃以下で行い、乾燥後は速やかに室温に戻すことが好ましい。
【００８７】
（４）カバー層
本発明においては、基板上にカバー層が配置されていてもよい。
【００８８】
カバー層は貫通孔を有していてもよい。貫通孔を導入口とすることができる。また、図５に例示するようにカバー層２６に設けられた貫通孔によって収容部２８を形成することもできる。
貫通孔の大きさとしては、図５に例示するように貫通孔によって収容部２８を形成する場合には、収容部の大きさと同様とすることができる。また、図示しないが貫通孔が導入口であり流路に接続されている場合には、試料を導入可能な大きさであればよい。
貫通孔の形状としては特に限定されないが、貫通孔の形成し易さから、貫通孔の平面視形状は円形、楕円形が好ましい。
【００８９】
また、カバー層の基材との対向面には、流路および収容部を形成するための溝が形成されていてもよい。流路や収容部を形成するための溝の大きさとしては、流路や収容部の大きさと同様とすることができる。
【００９０】
カバー層としては、表面が絶縁性を有するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、ガラス基板、樹脂基板等が挙げられる。
カバー層の形状としては、特に限定されるものではなく、例えば、正方形状等の四角形状、円形状、楕円形状等、任意の形状とすることができる。
【００９１】
カバー層は、少なくとも端子が露出するように基材上に配置される。また、カバー層の貫通孔によって収容部を形成する場合には、貫通孔が上記電極部上に位置するように、カバー層が配置される。また、カバー層の溝によって流路および収容部を形成する場合には、溝の一部が電極部上に位置するように、カバー層が配置される。
カバー層は、例えば、接着剤や粘着剤を介して基材に貼付することができる。
【００９２】
（５）スペーサ
本発明においては、基材とカバー層との間にスペーサが配置されていてもよい。スペーサは収容部および流路等を形成するために設けられるものである。
スペーサは収容部および流路に相当する開口部を有することができる。開口部の大きさおよび形状としては、収容部および流路の大きさおよび形状と同様とすることができる。
【００９３】
スペーサとしては、絶縁性を有するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、光硬化性樹脂、熱硬化性樹脂等を用いることができる。光硬化性樹脂、熱硬化性樹脂を用いる場合には、安価にスペーサを形成することができる。また、スペーサとして樹脂基材を用いることもでき、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリスチレン（ＰＳ）樹脂、ポリプロピレン（ＰＰ）樹脂、ポリエステル樹脂等の樹脂基材を用いることが可能である。
スペーサの形状としては、特に限定されるものではなく、例えば、正方形状等の四角形状、円形状、楕円形状等、任意の形状とすることができる。
【００９４】
スペーサは、少なくとも端子が露出し、スペーサの開口部が電極部上に位置するように基材上に配置される。
スペーサは、例えば、接着剤や粘着剤を介して基材に貼付することができる。
【００９５】
（６）絶縁層
本発明においては、配線部を覆うように絶縁層を形成することができる。絶縁層により、配線部の酸化を抑制するとともに、ショートを防ぐことができる。
絶縁層の材料としては、例えば、熱硬化性樹脂、光硬化性樹脂等を用いることができる。
絶縁層の形成方法としては、配線部を覆い、電極部および端子部を覆わないように絶縁層をパターン状に形成する方法とすることができ、例えば、フォトリソグラフィ法、スクリーン印刷法、グラビア印刷法、フレキソ印刷法、インクジェット法等が挙げられる。
【００９６】
４．用途
本発明のセンサ用電極の用途としては、様々な測定に用いることができ、具体的には、湿度センサ等の用途の電極；においセンサ、ＮＯ２センサ等のガスセンサ用途の電極；グルコースセンサ、コレステロールセンサ、アルコールセンサ、スクロールセンサ、乳酸センサ、フルクトースセンサ、エンドトキシンセンサ、免疫センサ等のバイオセンサ用途の電極等を挙げることができる。
本発明においては、なかでも、上記センサ用電極が、バイオセンサ用途に用いられることが好ましく、特に、エンドトキシンセンサとして用いられることが好ましい。本発明のセンサ用電極は低コストなものとなるため、様々な場面で測定されるエンドトキシン濃度の測定を低コストで実施可能となるからである。
例えば、上記センサ用電極をエンドトキシンセンサとして使用する方法としては、電極層として、第１作用極および第２作用極の２つの作用極、標準電極、および必要に応じて対極を有するものを使用し、エンドトキシンの濃度を測定する方法を挙げることができる。
また、上記センサ用電極の用途としては、例えば、誘電分析の電極用途、バイオ燃料電池の電極用途も挙げることができる。
【００９７】
また、上記センサ用電極を用いて測定される試料としては、例えば血液、唾液、汗、尿等の生体試料や、環境検査の対象物、食品、化粧品、廃液、樹脂等を挙げることができる。
なお、上記試料については、液体試料に限定されず、気体試料も含むことができる。
本発明においては、作用極および標準電極の両者を有するとの観点からは、上記試料が、液体試料であることが好ましい。
【００９８】
なお、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。上記実施形態は、例示であり、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するものは、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含される。
【実施例】
【００９９】
以下、本発明について実施例および比較例を用いて具体的に説明する。
【０１００】
本実施例で使用した試薬は以下の通りである。
【０１０１】
（１）標準エンドトキシン溶液
エンドトキシン標準品は、生化学工業社製のＥ．Ｃｏｌｉ  Ｏ１１３：Ｈ１０株由来ＵＳＰ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎを用いた。標準エンドトキシン溶液は、生化学工業社製のエンドスペシーＥＳ２４Ｍに添付されているエンドトキシンフリー水を用いて調製し、使用の直前に３０分間ボルテックスミキサーで激しく攪拌した。なお、エンドトキシン濃度は測定溶液中の最終濃度で示した。
【０１０２】
（２）ライセート試薬
ライセート試薬としては、ライセート試薬が凍結乾燥状態で１テスト分ずつ専用の試験管に封入されている、生化学工業社製のエンドスペシーＥＳ２４Ｍを用いた。
【０１０３】
（３）ＬＧＲ−ｐＡＰ
特開２０１５−１８７６０７号公報に記載のＬＧＲ−ｐＭＡの合成と同様の方法を用いて、ＬＧＲ−ｐＡＰを合成し、１０ｍＭのストック溶液として−２０℃で保管した。
ＬＧＲ−ｐＡＰの希釈には生化学工業社製のエンドスペシーＥＳ２４Ｍに添付されている緩衝液を用いた。
【０１０４】
［実施例１］
上記ＰＥＴ基材（基板）上にスパッタにて５０ｎｍのパラジウム（Ｐｄ）膜を形成した後、フォトリソグラフィ法によりエッチングを行い、既に説明した図１に示すような２つの作用極、１つの対極および１つの標準電極を含む電極部、端子部および配線部を有するパターン形状のパラジウム層を形成した。
次いで、パターン形状のパラジウム層上に、無電解めっき法により厚さ１０ｎｍの金層を形成し、基材と第１電極層とを有するセンサ用電極を形成した。なお、金層の無電解めっきは、ノンシアンタイプの無電解金めっきを液を用いた。
なお、２つの作用極は、櫛形形状とし、櫛歯部の幅および櫛歯部間の幅をそれぞれ９μｍおよび９μｍとした。また、それぞれの作用極の隣接する櫛歯部間の幅（図１中のｃ）は、櫛歯部の幅と櫛歯部間の幅の２倍との合計とし、２つの櫛形形状の作用極は、櫛歯部間の幅が等間隔となるように配置した。なお、実施例１においては、隣接する櫛歯部間の幅（図１中のｃ）は、２７μｍとした。
また、櫛歯部間の幅は、２つの櫛形形状の作用極の櫛歯部間の距離であり、具体的には、図１中のｅで示されるものである。
【０１０５】
［実施例２］
金層の厚みを、３０ｎｍとした以外は実施例１と同様にしてセンサ用電極を形成した。
【０１０６】
［実施例３］
金層の厚みを、５０ｎｍとした以外は実施例１と同様にしてセンサ用電極を形成した。
【０１０７】
［実施例４］
金層の厚みを、５ｎｍとし、櫛歯部の幅および櫛歯部間の幅をそれぞれ５μｍおよび５μｍとした以外は実施例１と同様にしてセンサ用電極を形成した。
【０１０８】
［実施例５］
金層の厚みを、１０ｎｍとし、櫛歯部の幅および櫛歯部間の幅をそれぞれ５μｍおよび５μｍとした以外は実施例１と同様にしてセンサ用電極を形成した。
【０１０９】
［実施例６］
金層の厚みを、５ｎｍとし、櫛歯部の幅および櫛歯部間の幅をそれぞれ７μｍおよび７μｍとした以外は実施例１と同様にしてセンサ用電極を形成した。
【０１１０】
［実施例７］
金層の厚みを、１０ｎｍとし、櫛歯部の幅および櫛歯部間の幅をそれぞれ７μｍおよび７μｍとした以外は実施例１と同様にしてセンサ用電極を形成した。
【０１１１】
［比較例１］
金層を形成しなかった以外は、実施例１と同様にしてセンサ用電極を形成した。
【０１１２】
［比較例２］
金層の厚みを、１００ｎｍとした以外は実施例１と同様にしてセンサ用電極を形成した。
【０１１３】
［比較例３］
金層の厚みを、１ｎｍとし、櫛歯部の幅および櫛歯部間の幅をそれぞれ８μｍおよび８μｍとした以外は実施例１と同様にしてセンサ用電極を形成した。
【０１１４】
［比較例４］
金層の厚みを、１ｎｍとした以外は実施例１と同様にしてセンサ用電極を形成した。
【０１１５】
［比較例５］
金層の厚みを、０．５ｎｍとした以外は実施例１と同様にしてセンサ用電極を形成した。
【０１１６】
［比較例６］
金層の厚みを、１ｎｍとし、櫛歯部の幅および櫛歯部間の幅をそれぞれ６μｍおよび６μｍとした以外は実施例１と同様にしてセンサ用電極を形成した。
【０１１７】
［参考例１］
上記ＰＥＴ基材（基板）上にスパッタにて５０ｎｍのパラジウム（Ｐｄ）膜を形成した後、フォトリソグラフィ法によりエッチングを行い、既に説明した図１に示すような１つの対極および１つの標準電極を含む電極部、ならびに対極および標準電極に接続された端子部および配線部を有するパターン形状のパラジウム層を形成した。
次いで、パラジウム層を覆うマスクを配置した状態で、上記ＰＥＴ基材（基板）上にスパッタにて５０ｎｍの金（Ａｕ）膜を形成した後、フォトリソグラフィ法によりエッチングを行い、既に説明した図１に示すような２つの作用極、ならびに２つの作用極に接続された端子部および配線部を有するパターン形状の金層を形成し、金作用極と、パラジウム標準電極およびパラジウム対極と、を有するセンサ用電極を形成した。
なお、２つの作用極は、櫛形形状とし、櫛歯部の幅および櫛歯部間の幅をそれぞれ９μｍおよび９μｍとした。
【０１１８】
［評価１］
ＬＡＬカスケード反応を用いてエンドトキシンの濃度検出を行った。
ライセート試薬および緩衝液は、生化学工業社製のエンドスペシー添付の試薬を用いた。凍結乾燥状態のライセート試薬（エンドスペシーＥＳ２４Ｍ）が入った試験管へ、ＬＧＲ−ｐＡＰ２０μＬ、緩衝液１８０μＬおよびエンドトキシン標準溶液２００μＬを添加して撹拌し、混合液４００μＬを調製した。
３７℃で６０分間反応を行った後、混合液２００μＬを、実施例、比較例および参考例で作製したセンサ用電極の電極部上に滴下した後、ＬＧＲ−ｐＡＰから遊離したｐＡＰをサイクリックボルタンメトリ法（ＣＶ法）を用いて検出した。結果を、図７（実施例１）、図８（実施例２）、図９（実施例３）、図１０（実施例４）、図１１（実施例５）、図１２（実施例６）、図１３（比較例１）、図１４（比較例２）、図１５（比較例３）、図１６（比較例４）、図１７（比較例５）、図１８（比較例６）および図１９（参考例１）に示す。
また、実施例、比較例および参考例について得られたサイクリックボルタモグラムより、酸化ピークおよび還元ピークの観察可否、およびピーク電流値の評価を行った。結果を下記表１に示す。なお、表１中のＬ/Ｓは、Ｌが櫛歯部の幅を示し、Ｓが櫛歯部間の幅を示すものである。
なお、ＣＶ法は、走査速度を２０ｍＶ／ｓとし、範囲を０Ｖ→０．６Ｖ→−０．４Ｖ→０Ｖとした。
また、上記混合液中のＬＧＲ−ｐＡＰの濃度は０．５ｍＭであり、エンドトキシン標準溶液の濃度は１０００ＥＵ／Ｌとした。
【０１１９】
なお、酸化ピークおよび還元ピークの観察は、サイクリックボルタモグラムを目視にて確認し、酸化ピークおよび還元ピークの両者を観察できた場合は○とし、酸化ピークおよび還元ピークの両者を観察できなかった場合は×とした。
具体的には、酸化ピーク位置（例えば、図７〜図１９中の縦軸に平行なＧ−Ｇ線の位置）が０．３Ｖ以下で観察された場合に、酸化ピークを観察できたと判断した。
また、サイクリックボルタモグラムで観察される還元ピークを通過し、横軸に並行な直線（例えば、図７〜図１９中のＨ−Ｈ線）を引いた時、その線より還元ピーク後の特性が上にあるもの、すなわち、電位を０．６Ｖから−０．４Ｖに走査する際に、還元ピークが観察された電位より低電位側で、還元ピークにおける電流値以上の電流値が観察された場合に、還元ピークを観察できたと判断した。
なお、実施例４および実施例６では、酸化ピーク位置が０．３Ｖ以下であり、かつ、サイクリックボルタモグラムとして、−０．２Ｖ以上０Ｖの間に、少なくとも０．０５Ｖ以上平行な部分が観察された。そして、平行な部分の高電圧側端部を還元ピークと認識し、それより低電圧側の電流値が一定の部位が観察されたことで、還元ピークにおける電流値以上の電流値が観察されたと判断した。
また、実施例１〜６では、還元ピークが−０．２Ｖ以上０Ｖ以下の電位で観察された。
また、上記ピーク電流値は、サイクリックボルタモグラムにおいて、−０．２Ｖ以上０Ｖ以下の電位において検出される下に凸の変極点（還元ピーク）と、その還元ピークに隣接して上記還元ピークを挟持する２つの上に凸の変極点（隣接ピーク）と、を認定し、２つの隣接ピークを直線で結ぶ補助線を作成し、還元ピークと補助線との電流値の差(図７〜図１２および図１９中のｐ）を測定することで得た。
なお、図１１（実施例５）のように、隣接ピークのうち高電位側の変極点が不明確な場合には、０．１Ｖにおける曲線上の値を隣接ピークとして認定した。
【０１２０】
【表１】
2018105805.tif 000004
【０１２１】
［評価２］
エンドトキシン標準溶液として濃度が１ＥＵ／Ｌのエンドトキシン標準溶液２００μＬを用いた以外は、評価１と同様にして混合液を４００μＬ調製した。次いで、混合液２００μＬを、実施例１および実施例７で作製したセンサ用電極の電極部上に滴下した後、ＬＧＲ−ｐＡＰから遊離したｐＡＰをアンペロメトリ法を用いた検出を行った。アンペロメトリ法では−０．２Ｖの初期電位を１０秒間印加した後、０．４Ｖに電位をステップして３０秒間印加し、ｐＡＰの酸化反応に由来する電流を記録し、次いで、−０．１５Ｖに電位をステップして３０秒間印加し、ｐＡＰの還元反応に由来する電流を記録した。結果を、図２０（実施例１）および図２１（実施例７）に示す。
【０１２２】
［評価３］
エンドトキシン標準溶液を添加しなかった以外は、評価２と同様にして、ｐＡＰをアンペロメトリ法を用いた検出を行った。結果を、図２０（実施例１）および図２１（実施例７）に示す。
【０１２３】
［まとめ］
評価１より、金層が形成されていない場合（比較例１）、金層の厚みが１ｎｍ以下の場合（比較例３〜６）や５０ｎｍより大きい場合（比較例２）では、酸化ピークおよび還元ピークの両者を明確に検出できない場合があったのに対して、金層の厚みが５ｎｍ以上５０ｎｍ以下である実施例では、酸化ピークおよび還元ピークの両者を明確に検出できた。
このように、金層が所定の厚みの範囲内である場合、例えば、５０ｎｍ以下である場合、特に、５ｎｍ以上５０ｎｍ以下である場合、パラジウム層および金層が積層した第１電極層は、安定的に標準電極としても機能することが確認できた。
また、評価２および評価３より、実施例では、エンドトキシンの濃度が０ＥＵ／Ｌの場合と１ＥＵ／Ｌの場合とで、明確に区別できることが確認できた。したがって、実施例では、測定対象物であるエンドトキシンの濃度が１ＥＵ／Ｌのような低濃度である場合でも、安定的に検出できることが確認できた。
【符号の説明】
【０１２４】
１  …  基材
２  …  パラジウム層
３  …  金層
４  …  第１電極層
５  …  第２電極層
６  …  電極層
１０  …  センサ用電極
１１  …  電極部
１２  …  配線部
１３  …  端子部
２１  …  作用極
２２  …  標準電極
２３  …  対極
２４  …  絶縁層
２５  …  スペーサ
２６  …  カバー層
２７  …  反応部
２８  …  収容部
２９  …  流路
３０  …  導入口
【図１】
2018105805.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2018105805.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2018105805.tif 000017
【図１４】
2018105805.tif 000018
【図１５】
2018105805.tif 000019
【図１６】
2018105805.tif 000020
【図１７】
2018105805.tif 000021
【図１８】
2018105805.tif 000022
【図１９】
2018105805.tif 000023
【図２０】
2018105805.tif 000024
【図２１】
2018105805.tif 000025