(57)【要約】【課題】抗体を用いた希少細胞の検出方法において、生体試料から希少細胞を検出する検出率を向上させること。【解決手段】希少細胞と希少細胞以外の夾雑細胞とを含む生体試料から希少細胞を検出する検出方法であって、希少細胞に存在するタンパク質に対する抗体が第一の標識物質で標識された第一の標識抗体を、生体試料に接触させて、第一の標識抗体で細胞をマーキングする工程と、希少細胞に存在せず夾雑細胞に存在するタンパク質に対する抗体が第二の標識物質で標識された第二の標識抗体を、生体試料に接触させて、第二の標識抗体で細胞をマーキングする工程と、生体試料から、第一の標識抗体でマーキングされ且つ第二の標識抗体でマーキングされていない細胞を検出する工程と、を有し、希少細胞に存在するタンパク質に対する抗体が、Ｆａｂ抗体及びＦａｂ’抗体から選ばれる少なくとも１種である、希少細胞の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
希少細胞と前記希少細胞以外の夾雑細胞とを含む生体試料から前記希少細胞を検出する検出方法であって、
前記希少細胞に存在するタンパク質に対する抗体が第一の標識物質で標識された第一の標識抗体を、前記生体試料に接触させて、前記第一の標識抗体で細胞をマーキングする工程と、
前記希少細胞に存在せず前記夾雑細胞に存在するタンパク質に対する抗体が第二の標識物質で標識された第二の標識抗体を、前記生体試料に接触させて、前記第二の標識抗体で細胞をマーキングする工程と、
前記生体試料から、前記第一の標識抗体でマーキングされ且つ前記第二の標識抗体でマーキングされていない細胞を検出する工程と、
を有し、
前記希少細胞に存在するタンパク質に対する抗体が、Ｆａｂ抗体及びＦａｂ’抗体から選ばれる少なくとも１種である、希少細胞の検出方法。
【請求項２】
前記希少細胞に存在するタンパク質に対する抗体がＦａｂ’抗体である、請求項１に記載の希少細胞の検出方法。
【請求項３】
前記第一の標識抗体が、前記希少細胞に存在するタンパク質に対する抗体のチオール基に前記第一の標識物質が共有結合した標識抗体である、請求項１又は請求項２に記載の希少細胞の検出方法。
【請求項４】
前記希少細胞が有核細胞であり、さらに、
核染色色素を前記生体試料に接触させて細胞核を染色する工程と、
前記生体試料から、前記核染色色素によって核が染色された細胞を検出する工程と、
を有する、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の希少細胞の検出方法。
【請求項５】
前記生体試料が、血液を密度勾配遠心分離に供して得た、前記希少細胞を含む画分である、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の希少細胞の検出方法。
【請求項６】
前記生体試料が妊娠母体末梢血に由来する生体試料であり、前記希少細胞が胎児有核赤血球である、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の希少細胞の検出方法。
【請求項７】
前記生体試料ががん患者末梢血に由来する生体試料であり、前記希少細胞が血中循環腫瘍細胞である、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の希少細胞の検出方法。
【請求項８】
前記第一の標識物質及び前記第二の標識物質がそれぞれ、蛍光色素、蛍光タンパク質、酵素、ビオチン及び磁気ビーズから選ばれる化学物質である、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の希少細胞の検出方法。
【請求項９】
前記生体試料から細胞を検出することがフローサイトメトリーによって行われる、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の希少細胞の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、希少細胞の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料に存在する希少細胞を検出すること及び単離することは、病気の診断、遺伝学的検査、希少細胞の臨床研究などに有用である。希少細胞を検出する方法として、希少細胞に発現しているタンパク質に対する抗体を用いて、希少細胞を免疫学的に識別し検出する方法が、例えば特許文献１〜４に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００８−５０７２８６号公報
【特許文献２】特表２００８−５００５５８号公報
【特許文献３】特表２００２−５０４９９２号公報
【特許文献４】特許第２６４４０２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
抗体を用いた免疫学的検出方法は、細胞特異性の比較的高い検出方法であるが、検出対象となる希少細胞が生体試料中に非常に少ない細胞である場合、希少細胞に対する抗体が夾雑細胞に非特異的に結合する確率が無視できず、夾雑細胞が希少細胞として誤検出されることがある。この誤検出を回避するために、夾雑細胞に対する抗体で夾雑細胞を識別し夾雑細胞を除外することを組み合せる技術が知られている。ただし、この技術を用いると、以下に説明する理由から、希少細胞が検出されなくなってしまうことがある。
【０００５】
免疫グロブリン分子はＦｃ領域を１個有するところ、希少細胞に対する抗体のＦｃ領域が夾雑細胞に結合することがある。特に、検出対象となる希少細胞が血液中の細胞である場合は、血液中に多数存在する好中球がＦｃ受容体を発現しているので、希少細胞に対する抗体のＦｃ領域が好中球に結合しやすい。
また、免疫グロブリン分子は抗原結合部位を含むＦａｂ領域を２個有するところ、検出対象となる希少細胞が試料中に非常に少ない細胞である場合は、希少細胞に対する抗体の一方のＦａｂ領域が希少細胞に結合し、他方のＦａｂ領域が夾雑細胞に非特異的に結合することがある。
【０００６】
上記のように、希少細胞に対する抗体１個を介して希少細胞と夾雑細胞とが繋がった場合、夾雑細胞を除外することによって、希少細胞が夾雑細胞と共に除外されてしまい、希少細胞が検出されないこととなってしまう。
【０００７】
本開示の実施形態は、上記状況のもとになされた。
本開示の課題は、抗体を用いた希少細胞の検出方法において、生体試料から希少細胞を検出する検出率を向上させることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題を解決するための具体的手段には、以下の態様が含まれる。
【０００９】
［１］  希少細胞と希少細胞以外の夾雑細胞とを含む生体試料から希少細胞を検出する検出方法であって、希少細胞に存在するタンパク質に対する抗体が第一の標識物質で標識された第一の標識抗体を、生体試料に接触させて、第一の標識抗体で細胞をマーキングする工程と、希少細胞に存在せず夾雑細胞に存在するタンパク質に対する抗体が第二の標識物質で標識された第二の標識抗体を、生体試料に接触させて、第二の標識抗体で細胞をマーキングする工程と、生体試料から、第一の標識抗体でマーキングされ且つ第二の標識抗体でマーキングされていない細胞を検出する工程と、を有し、希少細胞に存在するタンパク質に対する抗体が、Ｆａｂ抗体及びＦａｂ’抗体から選ばれる少なくとも１種である、希少細胞の検出方法。
［２］  希少細胞に存在するタンパク質に対する抗体がＦａｂ’抗体である、［１］に記載の希少細胞の検出方法。
［３］  第一の標識抗体が、希少細胞に存在するタンパク質に対する抗体のチオール基に第一の標識物質が共有結合した標識抗体である、［１］又は［２］に記載の希少細胞の検出方法。
［４］  希少細胞が有核細胞であり、さらに、核染色色素を生体試料に接触させて細胞核を染色する工程と、生体試料から、核染色色素によって核が染色された細胞を検出する工程と、を有する、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の希少細胞の検出方法。
［５］  生体試料が、血液を密度勾配遠心分離に供して得た、希少細胞を含む画分である、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の希少細胞の検出方法。
［６］  生体試料が妊娠母体末梢血に由来する生体試料であり、希少細胞が胎児有核赤血球である、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の希少細胞の検出方法。
［７］  生体試料ががん患者末梢血に由来する生体試料であり、希少細胞が血中循環腫瘍細胞である、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の希少細胞の検出方法。
［８］  第一の標識物質及び第二の標識物質がそれぞれ、蛍光色素、蛍光タンパク質、酵素、ビオチン及び磁気ビーズから選ばれる化学物質である、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の希少細胞の検出方法。
［９］  生体試料から細胞を検出することがフローサイトメトリーによって行われる、［１］〜［８］のいずれか１つに記載の希少細胞の検出方法。
【発明の効果】
【００１０】
本開示によれば、抗体を用いた希少細胞の検出方法において、生体試料から希少細胞を検出する検出率を向上させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、実施形態について説明する。これらの説明及び実施例は実施形態を例示するものであり、実施形態の範囲を制限するものではない。
【００１２】
本開示において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
【００１３】
本開示において組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中の各成分に該当する物質が複数種存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する複数種の物質の合計量を意味する。
【００１４】
本開示において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
【００１５】
＜希少細胞の検出方法＞
本開示の検出方法は、希少細胞と希少細胞以外の夾雑細胞とを含む生体試料から希少細胞を検出する方法である。
【００１６】
本開示において生体試料には、生体からの抽出物そのもの（生試料、raw sample）及び、生試料を生理食塩水等で希釈した希釈試料；生試料に添加剤を加えた保存試料；これらの分画物、乾燥物又は凍結物；これら試料に含まれる細胞を固定剤（例えば、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒド）で固定した試料；などが含まれる。
【００１７】
本開示の検出方法の対象となる希少細胞は、生体試料における存在割合が低い細胞を指す。夾雑細胞とは、本開示の検出方法の対象となる希少細胞が含まれている生体試料を構成する、希少細胞以外の細胞を意味する。生試料（raw sample、例えば末梢血）において、希少細胞と夾雑細胞の存在比（個数基準）は、例えば、希少細胞：夾雑細胞＝１：１×１０５〜１：１×１０９である。
【００１８】
本開示の検出方法の対象となる希少細胞としては、妊娠母体末梢血に含まれる胎児有核赤血球、がん患者末梢血に含まれる血中循環腫瘍細胞などが挙げられる。
【００１９】
胎児有核赤血球（fetal nucleated red blood cell：ｆＮＲＢＣ）は、胎盤を通過して妊娠母体末梢血中に存在する赤血球前駆体である。ｆＮＲＢＣは、妊娠母体末梢血数ｍＬに約１個の割合で存在するといわれている。ｆＮＲＢＣには染色体が存在するため、ｆＮＲＢＣを単離することにより、胎児染色体および胎児遺伝子の入手が可能となる。したがって、ｆＮＲＢＣを単離することにより、妊娠母体に対する侵襲度が低い出生前遺伝学的検査が可能となる。
【００２０】
ｆＮＲＢＣは、妊娠後６週程度から妊娠母体末梢血中に存在するといわれている。また、母体が妊娠中には、胎児の赤血球は有核であり得る。したがって、本開示の検出方法の対象がｆＮＲＢＣである場合、本開示の検出方法に供する生体試料は、妊娠後６週程度以降の妊娠母体から採取した末梢血、又は、この末梢血から調製した血液試料であることが好ましい。
【００２１】
妊娠母体末梢血には、ｆＮＲＢＣのほかに、母親の白血球（好酸球、好中球、好塩基球、単球、リンパ球）；母親の、核のない成熟した赤血球；母親の有核赤血球；等の細胞が含まれる。これらｆＮＲＢＣ以外の細胞が、本開示における夾雑細胞に当たる。
【００２２】
血中循環腫瘍細胞（circulating tumor cell：ＣＴＣ）は、がん患者の血液中を循環する腫瘍細胞である。ＣＴＣは、がん患者末梢血数ｍＬに約１個の割合で存在するといわれている。末梢血中のＣＴＣ数を測定することで、治療効果の判定、転移がんの早期診断、治療の必要性の判断、患者の予後予測などができると期待されている。また、ＣＴＣを単離することにより、腫瘍細胞の染色体を入手して遺伝子の変異を調べることが可能となる。
【００２３】
がん患者末梢血には、ＣＴＣのほかに、白血球（好酸球、好中球、好塩基球、単球、リンパ球）；赤血球；等の細胞が含まれる。これらＣＴＣ以外の細胞が、本開示における夾雑細胞に当たる。
【００２４】
本開示の検出方法は、
希少細胞に存在するタンパク質に対する抗体が第一の標識物質で標識された第一の標識抗体を、生体試料に接触させて、第一の標識抗体で細胞をマーキングする工程（「第一標識工程」という。）と、
希少細胞に存在せず夾雑細胞に存在するタンパク質に対する抗体が第二の標識物質で標識された第二の標識抗体を、生体試料に接触させて、第二の標識抗体で細胞をマーキングする工程（「第二標識工程」という。）と、
生体試料から、第一の標識抗体でマーキングされ且つ第二の標識抗体でマーキングされていない細胞を検出する工程（「希少細胞検出工程」という。）と、
を有する。そして、本開示の検出方法は、第一の標識抗体が、Ｆａｂ抗体及びＦａｂ’抗体から選ばれる少なくとも１種が第一の標識物質で標識された標識抗体である。
【００２５】
本開示の検出方法の対象が有核細胞である場合、本開示の検出方法は、さらに、
核染色色素を生体試料に接触させて細胞核を染色する工程（「細胞核染色工程」という。）と、
生体試料から、核染色色素によって核が染色された細胞を検出する工程（「有核細胞検出工程」という。）と、
を有することが好ましい。
【００２６】
以下、本開示の検出方法について、抗体、標識物質、及び工程を詳細に説明する。
【００２７】
［第一の標識抗体、第二の標識抗体］
第一の標識抗体を構成する抗体と、第二の標識抗体を構成する抗体とは、別の抗体である。第一の標識抗体を構成する抗体は、希少細胞に存在するタンパク質に対する抗体であり、第二の標識抗体を構成する抗体は、希少細胞に存在せず夾雑細胞に存在するタンパク質に対する抗体である。
【００２８】
第一の標識抗体は、１種類のタンパク質に対する抗体を１種類の化学物質で標識した抗体；複数種類のタンパク質それぞれに対する抗体の集合を１種類の化学物質で標識した抗体；のいずれでもよいが、前者が好ましい。抗体は、モノクローナル抗体でもよくポリクローナル抗体でもよい。第一の標識抗体のターゲットとなるタンパク質は、希少細胞の細胞膜表面に発現しているタンパク質であることが好ましい。
【００２９】
第二の標識抗体は、１種類のタンパク質に対する抗体を１種類の化学物質で標識した抗体；複数種類のタンパク質それぞれに対する抗体の集合を１種類の化学物質で標識した抗体；のいずれでもよいが、前者が好ましい。試料中に夾雑細胞が複数種類含まれる場合、第二の標識抗体は下記の形態（ａ）及び（ｂ）のいずれでもよく、形態（ａ）が好ましい。抗体は、モノクローナル抗体でもよくポリクローナル抗体でもよい。第二の標識抗体のターゲットとなるタンパク質は、夾雑細胞の細胞膜表面に発現しているタンパク質であることが好ましい。
【００３０】
形態（ａ）：複数種類の夾雑細胞に共通に発現している１種類のタンパク質に対する抗体を１種類の化学物質で標識した抗体。
形態（ｂ）：複数種類の夾雑細胞の少なくとも１種類に発現している複数種類のタンパク質それぞれに対する抗体の集合を１種類の化学物質で標識した抗体。
【００３１】
第一の標識抗体を構成する第一の標識物質と、第二の標識抗体を構成する第二の標識物質とは、光学的方法、化学的方法、電気的方法、又は磁気的方法によって区別される、別の化学物質である。
【００３２】
第一の標識物質としては、抗体を標識する公知の、蛍光色素、蛍光タンパク質、酵素、ビオチン、磁気ビーズ等が挙げられる。第二の標識物質としては、抗体を標識する公知の、蛍光色素、蛍光タンパク質、酵素、ビオチン、磁気ビーズ等が挙げられる。
【００３３】
抗体を標識する蛍光色素としては、例えば、Alexa Fluorシリーズ（Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647等）、Brilliant Violetシリーズ（BV421、BV570等）、BODIPYシリーズ（BODIPY FL、BODIPY TR等）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）、クマリン系蛍光色素などが挙げられる。これらの中で、バックグラウンドの低さ、蛍光強度の強さ、及び退色のしにくさの観点から、Alexa Fluorシリーズ又はBrilliant Violetシリーズが好ましい。抗体を標識する蛍光タンパク質としては、例えば、フィコシアニン、アロフィコシアニン、フィコエリスリン、フィコエリスロシアニン等が挙げられる。抗体を標識する酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等が挙げられる。
【００３４】
第一の標識抗体を構成する抗体は、免疫グロブリン分子の断片である、Ｆａｂ抗体及びＦａｂ’抗体から選ばれる少なくとも１種である。第一の標識抗体を構成する抗体は、希少細胞と夾雑細胞との架橋を形成しない観点から、抗原結合部位が１個で且つＦｃ領域のない抗体である、Ｆａｂ抗体又はＦａｂ’抗体である。第一の標識抗体を構成する抗体が細胞間に架橋を形成する可能性はほとんどないので、第一の標識抗体を構成する抗体のターゲットは、希少細胞に存在するのみならず夾雑細胞にも存在しているタンパク質でもよい。ただし、希少細胞の検出率を向上させる観点からは、第一の標識抗体を構成する抗体のターゲットは、夾雑細胞に存在せず希少細胞に存在するタンパク質が好ましい。
【００３５】
第一の標識抗体は、例えば、Ｆａｂ抗体又はＦａｂ’抗体が有するチオール基又はアミノ基に標識物質を共有結合させることによって製造できる。抗体にチオール基又はアミノ基を介して標識物質を共有結合させる方法は公知である。アミノ基は一般的に免疫グロブリン分子内にランダムに存在するので、アミノ基を介して抗体を標識すると、抗体の抗原結合部位乃至はその近傍に標識物質が結合し抗体活性を失活させる可能性がある。一方、チオール基は一般的に免疫グロブリン分子のヒンジ部のジスルフィド結合が還元されて形成される基であるので、チオール基を介して抗体を標識するとヒンジ部に標識物質が結合することになり抗体活性は失活しにくい。したがって、第一の標識抗体としては、抗体が有するチオール基に標識物質が共有結合した標識抗体が好ましい。
【００３６】
上記の理由から、第一の標識抗体を構成する抗体としては、ヒンジ部を有する抗体であるＦａｂ’抗体が、ヒンジ部を有しない抗体であるＦａｂ抗体よりも好ましい。
【００３７】
Ｆａｂ抗体は、免疫グロブリン分子がパパインによって切断されてなる、抗原結合部位を含む断片である。免疫グロブリン分子からＦａｂ抗体を調製する方法は公知である。Ｆａｂ抗体は市販品でもよい。
【００３８】
Ｆａｂ’抗体は、免疫グロブリン分子がペプシンによって切断され、さらにヒンジ領域のジスルフィド結合が還元されてなる、抗原結合部位を含む断片である。免疫グロブリン分子からＦａｂ’抗体を調製する方法は公知である。Ｆａｂ’抗体は市販品でもよい。
【００３９】
Ｆａｂ抗体又はＦａｂ’抗体の調製に供する免疫グロブリン分子は、抗原を免疫された非ヒト動物の血液から精製する方法；抗原を免疫された非ヒト動物のＢ細胞とミエローマ細胞との融合細胞であるハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマからモノクローナル抗体を得る方法；等の方法で製造可能である。免疫グロブリン分子は、市販品でもよい。
【００４０】
第二の標識抗体を構成する抗体（希少細胞に存在せず夾雑細胞に存在するタンパク質に対する抗体）は、免疫グロブリン分子そのもの（intact immunoglobulin）、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆ(ａｂ’)２抗体のいずれでもよい。希少細胞と夾雑細胞の存在割合からして、第二の標識抗体を構成する抗体が、希少細胞のみに非特異的に結合したり、希少細胞に非特異的に結合し且つ夾雑細胞にも結合し両者間に架橋を形成したりする確率は低い。したがって、第二の標識抗体を構成する抗体は、Ｆｃ領域を有する抗体又はＦａｂ領域を２個有する抗体であってもよい。
【００４１】
第二の標識抗体を構成する抗体および第二の標識抗体は、第一の標識抗体について述べた上記の製造方法で製造してもよく、市販品でもよい。
【００４２】
本開示の検出方法の対象が妊娠母体末梢血に含まれるｆＮＲＢＣである場合、第一の標識抗体のターゲットとなるタンパク質としては、例えば、ＣＤ７１、ＣＤ２３５ａ、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）が挙げられ、第二の標識抗体のターゲットとなるタンパク質としては、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ６１が挙げられる。
【００４３】
本開示の検出方法の対象ががん患者末梢血に含まれるＣＴＣである場合、第一の標識抗体のターゲットとなるタンパク質としては、例えば、ＥｐＣＡＭ、サイトケラチン、ビメンチンが挙げられ、第二の標識抗体のターゲットとなるタンパク質としては、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６６、ＣＤ７１、ＣＤ２３５ａが挙げられる。
【００４４】
［第一標識工程、第二標識工程］
第一標識工程は、第一の標識抗体を生体試料に接触させて、第一の標識抗体で細胞をマーキングする工程である。本工程は、例えば、生体試料に第一の標識抗体を添加し、又は、第一の標識抗体を含有するリン酸緩衝液若しくは生理食塩水に生体試料を添加し、４℃〜室温で３０分間〜１２０分間インキュベートすることによって行われる。
【００４５】
第二標識工程は、第二の標識抗体を生体試料に接触させて、第二の標識抗体で細胞をマーキングする工程である。本工程は、例えば、生体試料に第二の標識抗体を添加し、又は、第二の標識抗体を含有するリン酸緩衝液若しくは生理食塩水に生体試料を添加し、４℃〜室温で３０分間〜１２０分間インキュベートすることによって行われる。
【００４６】
第一標識工程と第二標識工程とは、同時に行ってもよく、順次行ってもよい。第一標識工程と第二標識工程との同時実施は、例えば、生体試料に第一の標識抗体及び第二の標識抗体を添加する、又は、第一の標識抗体及び第二の標識抗体を含有するリン酸緩衝液若しくは生理食塩水に生体試料を添加することによって行われる。第一標識工程と第二標識工程とを順次実施する場合、いずれを先に行ってもよい。
【００４７】
第一標識工程及び第二標識工程において抗体と接触させる生体試料は、全細胞の濃度が、例えば１×１０２〜１×１０１０個／ｍＬであり、好ましくは１×１０３〜１×１０９個／ｍＬであり、より好ましくは１×１０４〜１×１０８個／ｍＬである。
【００４８】
第一標識工程及び第二標識工程において抗体と接触させる生体試料の量は、希少細胞検出工程に要する時間を低減する観点から、通常１０００μＬ以下であり、好ましくは５００μＬ以下であり、より好ましくは３００μＬ以下である。
【００４９】
［希少細胞検出工程］
希少細胞検出工程は、第一の標識物質及び第二の標識物質に応じた光学的方法、化学的方法、電気的方法、又は磁気的方法によって行われる。
【００５０】
希少細胞検出工程は、細胞の検出のみならず単離もできる観点から、フローサイトメトリーによって行うことが好ましい。フローサイトメトリーとは、細胞が一列に並ぶように細胞懸濁液を流し、分光学的手法により細胞を計測する技術である。フローサイトメトリーによれば、細胞を含む液滴を荷電して流れる方向を制御し、特定の細胞を分取することもできる。希少細胞検出工程をフローサイトメトリーによって行う観点からは、第一の標識物質及び第二の標識物質は、蛍光色素、蛍光タンパク質又はビオチンで標識された抗体であることが好ましい。希少細胞検出工程をフローサイトメトリーによって行う際に、希少細胞に特異的な形態に対応する散乱光を検出し、希少細胞の検出率をより向上させることもできる。
【００５１】
希少細胞検出工程は、マイクロキャピラリーに生体試料を流通させ、細胞を光学的方法、化学的方法、電気的方法、又は磁気的方法によって分離する工程としてもよい。希少細胞検出工程を、マイクロキャピラリー内を流通している細胞を電気的方法又は磁気的方法によって捕捉する工程とすれば、希少細胞の検出のみならず単離も可能である。
【００５２】
［細胞核染色工程、有核細胞検出工程］
細胞核染色工程は、核染色色素を生体試料に接触させて細胞核を染色する工程である。細胞核染色工程は、本開示の検出方法の対象が有核細胞である場合、設けることが好ましい。
【００５３】
核染色色素としては、クロマチン、核タンパク質、ＤＮＡ等を染色する色素のいずれでもよく、具体的には、ＤＲＡＱ５（Deep Red Anthraquinone 5）、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）、ヨウ化プロピジウム、７−ＡＡＤ（7-amino-actinomycin D）、ヘキスト３３３４２、メチレンブルー、ヘマトキシリン、チオニン等が挙げられる。
【００５４】
細胞核染色工程は、例えば、生体試料に核染色色素を添加し、又は、核染色色素を含有するリン酸緩衝液若しくは生理食塩水に生体試料を添加し、４℃〜室温で３０分間〜１２０分間インキュベートすることによって行われる。
【００５５】
細胞核染色工程と第一標識工程と第二標識工程とは、同時に行ってもよく、順次行ってもよい。３工程の同時実施は、例えば、生体試料に第一の標識抗体及び第二の標識抗体及び核染色色素を添加する、又は、第一の標識抗体及び第二の標識抗体及び核染色色素を含有するリン酸緩衝液若しくは生理食塩水に生体試料を添加することによって行われる。３工程を順次実施する場合、その順番は制限されない。
【００５６】
核染色色素が蛍光色素の場合、有核細胞検出工程は、例えば、フローサイトメトリーにより行われる。核染色色素が非蛍光色素の場合、有核細胞検出工程は、例えば、生体試料を光学顕微鏡で観察し、核が染色された細胞を検出することにより行われる。
【００５７】
希少細胞検出工程と有核細胞検出工程とは、同時に行ってもよく、順次行ってもよい。両工程をフローサイトメトリーによって行う場合、両工程の同時実施が可能である。
【００５８】
本開示の検出方法の実施形態例としては、第一標識工程、第二標識工程、細胞核染色工程、希少細胞検出工程、及び有核細胞検出工程を有し、
第一標識工程、第二標識工程及び細胞核染色工程を行い（３工程の順番は制限されず、３工程を同時に行ってもよい。）、次いで、希少細胞検出工程及び有核細胞検出工程をフローサイトメトリーによって行う（２工程の順番は制限されず、２工程を同時に行ってもよい。）実施形態が挙げられる。
【００５９】
本開示の検出方法に用いる標識抗体が細胞内に存在するタンパク質をターゲットとする場合、又は、本開示の検出方法に用いる核染色色素が細胞膜透過性に乏しい場合は、一連の標識工程に供する生体試料は、細胞膜透過処理を施された試料であることが好ましい。細胞膜透過処理は、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ１００等の界面活性剤を含有するリン酸緩衝液又は生理食塩水と、生体試料とを混合し、４℃〜室温で１分間〜３０分間インキュベートすることによって行われる。生体試料に細胞膜透過処理を施す場合、生体試料は、細胞内からタンパク質が失われることを抑制する目的で、細胞膜透過処理の前に固定化処理を施された生体試料であることが好ましい。生体試料の固定化処理は、例えば、グルタルアルデヒド又はパラホルムアルデヒドを含有するリン酸緩衝液又は生理食塩水と、生体試料とを混合し、４℃〜室温で１分間〜３０分間インキュベートすることによって行われる。
【００６０】
［密度勾配遠心分離による生体試料の調製］
本開示の検出方法の対象が血液に含まれる希少細胞（例えば、ｆＮＲＢＣ、ＣＴＣ）である場合、一連の標識工程に供する生体試料は、血液を密度勾配遠心分離に供して得た、希少細胞を含む画分であることが好ましい。密度勾配遠心分離によって希少細胞が濃縮された生体試料を得ることができ、これによって、希少細胞の検出率をより向上させることができる。
【００６１】
ｆＮＲＢＣ又はＣＴＣは、密度勾配遠心分離により、血液中に存在する血漿成分やその他の血液細胞と分離され得る。ｆＮＲＢＣ又はＣＴＣを分離するための密度勾配遠心分離は、公知の方法を適用してよい。例えば、密度の異なる少なくとも２種類の媒体を遠沈管に重層した不連続密度勾配の上に、生理食塩水で希釈した血液を重層して遠心を行うことにより、ｆＮＲＢＣ又はＣＴＣを分画し濃縮できる。
【００６２】
以下、ｆＮＲＢＣを密度勾配遠心分離によって濃縮する方法の実施形態例を説明する。
【００６３】
国際公開第２０１２／０２３２９８号に、ｆＮＲＢＣを含めた母体の血球の密度が記載されている。その記載によると、想定されるｆＮＲＢＣの密度は、1.065ｇ／ｍＬ〜1.095ｇ／ｍＬ程度、母親の血球の密度は、赤血球が1.070ｇ／ｍＬ〜1.120ｇ／ｍＬ程度、好酸球が1.090ｇ／ｍＬ〜1.110ｇ／ｍＬ程度、好中球が1.075ｇ／ｍＬ〜1.100ｇ／ｍＬ程度、好塩基球が1.070ｇ／ｍＬ〜1.080ｇ／ｍＬ程度、リンパ球が1.060ｇ／ｍＬ〜1.080ｇ／ｍＬ程度、単球が1.060ｇ／ｍＬ〜1.070ｇ／ｍＬ程度である。
【００６４】
密度1.065ｇ／ｍＬ〜1.095ｇ／ｍＬ程度のｆＮＲＢＣを、ほかの血液細胞と分離するために、積層する媒体の密度が設定される。ｆＮＲＢＣの中心の密度は1.080ｇ／ｍＬ程度であるため、この密度をはさむ２つの異なる密度の媒体を隣接して重層することで、その界面にｆＮＲＢＣを有する画分を集めることが可能となる。好ましくは、下層の媒体の密度を1.08ｇ／ｍＬ〜1.10ｇ／ｍＬ（より好ましくは1.080ｇ／ｍＬ〜1.095ｇ／ｍＬ）、上層の媒体の密度を1.06ｇ／ｍＬ〜1.08ｇ／ｍＬ（より好ましくは1.065ｇ／ｍＬ〜1.080ｇ／ｍＬ）とする。下層の媒体と上層の媒体は同じ種類でも異なる種類でもよく、同じ種類の媒体を用いることが好ましい。
【００６５】
媒体としては、ポリビニルピロリドンでコートされた直径１５ｎｍ〜３０ｎｍのケイ酸コロイド粒子分散液であるPercoll（登録商標）、ショ糖から作られた側鎖に富んだ中性の親水性ポリマーであるFicoll-Paque（登録商標）、ポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムを含むHistopaque（登録商標）等が挙げられる。中でも、Percoll及び／又はHistopaqueが好ましい。Percollは、密度1.130ｇ／ｍＬの製品が市販されており、水で希釈することで密度勾配を調製することが可能である。Histopaqueは、市販されている密度1.077ｇ／ｍＬの媒体及び密度1.119ｇ／ｍＬの媒体と水とを用いて密度勾配を調製することが可能である。
【００６６】
２層の不連続密度勾配は、例えば以下のようにして遠沈管に形成する。まず、凝固点以上かつ１４℃以下（好ましくは８℃以下）の温度状態にある下層の媒体を遠沈管の底部に収容する、又は、下層の媒体を遠沈管の底部に収容したのち１４℃以下（好ましくは８℃以下）の温度下で保存して冷却する。次に、下層の媒体の上に上層の媒体を重層する。
【００６７】
そして、上層の媒体の上に、生理食塩水で例えば２倍に希釈した血液を重層し、遠心分離を行い、下層の媒体と上層の媒体との間に沈積した画分を採取し、採取した画分をリン酸緩衝液で洗浄する。こうして得た有核赤血球を含む画分には、ｆＮＲＢＣが濃縮して含まれているので、この有核赤血球を含む画分を一連の標識工程に供することが好ましい。
【００６８】
本開示の検出方法は、例えば、胎児の出生前遺伝学的検査に応用できる。つまり、本開示の検出方法によって、妊娠母体末梢血に由来する生体試料からｆＮＲＢＣを検出し、検出されたｆＮＲＢＣから染色体ＤＮＡを入手して胎児の出生前遺伝学的検査を行うことができる。以下に、胎児の出生前遺伝学的検査の実施形態例を説明する。
【００６９】
＜胎児の出生前遺伝学的検査＞
本開示の検査方法は、妊娠母体末梢血に由来する生体試料からｆＮＲＢＣを検出し、検出されたｆＮＲＢＣから染色体ＤＮＡを入手して行う、胎児の出生前遺伝学的検査の方法である。本開示の検査方法は、ヒト個体が生来的に保有する遺伝情報を明らかにする検査であり、例えば、染色体の異数性の有無の検出、遺伝子多型の検出、及び、遺伝子変異の検出の少なくともいずれかを行う検査である。本開示の検査方法は、例えば、１３番染色体、１８番染色体、及び２１番染色体のトリソミー；性染色体の過剰；等の染色体の異数性の有無の検出に適用される。
【００７０】
本開示の検査方法は、公知の遺伝子検査の方法、及び公知の遺伝子解析技術を適用して実施してよい。本開示の検査方法は、簡便に効率よく染色体ＤＮＡの解析を行うため、染色体上の目的領域をポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）により増幅する増幅工程と、増幅した目的領域の塩基配列及び量を決定する配列解析工程と、を有することが好ましい。また、染色体ＤＮＡの解析を容易にする目的で、まずは、ｆＮＲＢＣから全ゲノム増幅（whole genome amplification：ＷＧＡ）を行い、全ゲノム増幅の増幅産物を鋳型にして、染色体上の目的領域をＰＣＲにより増幅する増幅工程と、増幅した目的領域の塩基配列及び量を決定する配列解析工程と、を行ってもよい。以下、上記の工程を説明することによって、本開示の検査方法の実施形態例を詳細に説明する。
【００７１】
［ＰＣＲによる目的領域の増幅工程］
本増幅工程は、目的領域をＰＣＲにより増幅する工程である。目的領域（増幅される領域）は、遺伝学的検査の目的に応じて選択される、染色体上の領域である。ＰＣＲに使用するプライマー対の塩基配列は、目的領域の塩基配列とシークエンサーの解析原理とに従って設計される。増幅工程は、染色体上の複数の領域を解析する目的で、複数のプライマー対を用いて複数の目的領域の多重増幅を行う多重ＰＣＲ（マルチプレックスＰＣＲ）としてもよい。増幅工程は、シークエンサーの解析原理に従って、ＰＣＲを１回行ってもよく２回以上行ってもよい。
【００７２】
ＰＣＲ試薬としては、例えば、Multiplex PCR Assay Kit（タカラバイオ社）、Multiplex PCR Assay Kit ver2（タカラバイオ社）、KAPA Library Amplification Kit（日本ジェネティクス社）、Platinum Multiplex PCR Master Mix Kit（ライフテクノロジーズ社、Platinumは登録商標）が挙げられる。マルチプレックスＰＣＲを行う場合には、プライマー対ごとにアニーリングの至適温度が異なることがあるため、反応条件の検討をすることが好ましい。ＰＣＲのサイクル数は、リアルタイムＰＣＲによる検討を予め行って、その結果に基づき設定してよい。ＰＣＲは、その途中で、反応温度及び／又は反応時間を変更してもよい。
【００７３】
増幅工程で得た増幅産物は、精製することが好ましく、精製は、例えば、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社）、AMPure XP Kit（BECKMAN COULTER社）を用いて行う。増幅産物の量は、例えば、NanoDrop（Thermo Fisher Scientific社）、BioAnalyzer（Agilent社）、Quantus Fluorometer（Promega社）、KAPA Library Quantification Kits（日本ジェネティクス社）を用いて濃度を測定することで確認し得る。
【００７４】
［全ゲノム増幅］
全ゲノム増幅の方法は、特に制限されず、公知の方法で行ってよい。全ゲノム増幅は、例えば、界面活性剤とタンパク質分解酵素とを用いて細胞を溶解させる工程と、細胞から溶出したゲノムＤＮＡを鋳型にしてＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡを増幅する工程と、を有する。
【００７５】
全ゲノム増幅は、市販の試薬を適用して行ってよい。ＰＣＲに基づく試薬としては、例えば、PicoPLEX WGA Kit（New England Biolabs社）、GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit（Sigma-Aldrich社）、国際公開第２０１２／１６６４２５号に開示のＭＡＬＢＡＣ法（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles）に係る試薬が挙げられる。鎖置換型ＤＮＡ合成反応に基づく試薬としては、例えば、GenomiPhi DNA Amplification Kit（ＧＥヘルスケア社、GenomiPhiは登録商標）、REPLI-g Single Cell Kit（QIAGEN社、REPLI-gは登録商標）が挙げられる。
【００７６】
全ゲノム増幅は、その終了後にアガロースゲル電気泳動を行って、増幅の有無を確認することが好ましい。全ゲノム増幅の増幅産物は、精製することが好ましい。精製は、例えば、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社、QIAquickは登録商標）を用いて行う。増幅産物の量は、例えば、NanoDrop（登録商標、Thermo Fisher Scientific社）、BioAnalyzer（Agilent社）、Quantus Fluorometer（Promega社）を用いて濃度を測定することで確認し得る。
【００７７】
［配列解析工程］
配列解析工程は、増幅された目的領域の塩基配列と量とを決定する工程である。配列解析工程は、各種のシークエンサーによって行われる。ＰＣＲによる増幅工程で得た増幅産物の全部又は一部が、配列解析工程でシークエンサーにかけられる物質であり、ＰＣＲによる増幅工程で得た増幅産物が、いわばシークエンス用ライブラリーである。
【００７８】
配列解析工程は、解析の精度及び速さ、１度に処理可能な試料数の多さ等の点で、次世代シークエンサーによって行われることが好ましい。次世代シークエンサー（Next Generation Sequencer：ＮＧＳ）とは、サンガー法を利用したキャピラリーシークエンサー（第一世代シークエンサーと呼ばれる）に対比して分類されるシークエンサーを意味する。次世代シークエンサーは、第二世代、第三世代、第四世代、及び今後開発されるシークエンサーを含む。現時点で最も普及している次世代シークエンサーは、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成又はＤＮＡリガーゼによる相補鎖結合に連動した蛍光又は発光をとらえ塩基配列を決定する原理のシークエンサーである。具体的には、MiSeq（Illumina社）、HiSeq2000（Illumina社、HiSeqは登録商標）、Roche454（Roche社）等が挙げられる。
【００７９】
シークエンサーで得られた配列データをアライメントする手段としては、Burrows-Wheeler Aligner（ＢＷＡ）が挙げられ、ＢＷＡによって既知のヒトゲノム配列へ配列データをマッピングすることが好ましい。遺伝子を解析する手段としては、SAMtools及びBEDtoolsが挙げられ、これらの解析手段により遺伝子多型、遺伝子変異、及び／又は染色体数を解析することが好ましい。
【００８０】
配列解析工程で解析した、増幅された目的領域の塩基配列と量とから、染色体の異数性の有無、遺伝子多型、及び／又は遺伝子変異が検出される。染色体の異数性の検出方法の一例を、以下に説明する。
【００８１】
ｆＮＲＢＣから得た染色体について、増幅産物の量をシークエンサーで解析する。基準（あるいは参照）として、母親の細胞から得た染色体について、増幅産物の量をシークエンサーで解析する。胎児が染色体の異数性を有しなければ、母親由来の増幅産物の量と胎児由来の増幅産物の量とは、ほぼ１：１の量比になると予想される。増幅領域が位置する染色体が胎児においてトリソミーである場合には、母親由来の増幅産物の量と胎児由来の増幅産物の量とは、ほぼ１．０：１．５（あるいは２：３）の量比になると予想される。
【実施例】
【００８２】
以下に、実施例により本開示の実施形態を詳細に説明するが、本開示の実施形態は、これら実施例により限定されるものではない。
【００８３】
下記において、物質濃度に関し「Ｍ」はモル濃度を表し、１Ｍ＝１ｍｏｌ／Ｌである。また、物質濃度に関し、特に断りのない限り「％」は質量基準である。
【００８４】
以下の参考例又は実施例で使用される水は、特に断りのない限り、メルク社のＭｉｌｌｉ−Ｑ装置で精製した水である。（Ｍｉｌｌｉ−Ｑは登録商標）
【００８５】
以下の参考例又は実施例で使用される化学物質等の略称は以下のとおりである。
ＢＳＡ：bovine serum albumin
ＢＶ４２１：Brilliant Violet 421
ＤＲＡＱ５：Deep Red Anthraquinone 5
ＥＤＴＡ：ethylenediaminetetraacetic acid
ＦＩＴＣ：fluorescein isothiocyanate
ｆＮＲＢＣ：fetal nucleated red blood cell、胎児有核赤血球
ＰＢＳ：phosphate buffered saline
ＰＢＭＣ：peripheral blood mononuclear cell、末梢血単核細胞
ＰＣＲ：polymerase chain reaction
ＳＤＳ：sodium dodecyl sulfate
ＴＣＥＰ−ＨＣＬ：tris-(2-Carboxyethyl)phosphine hydrochloride
【００８６】
［参考例１］
（１）断片化抗体の作製
ｆＮＲＢＣを認識して結合する抗体として、抗ＣＤ７１抗体（BD biosciences社、商品番号５５５５３４）を用意した。
【００８７】
抗ＣＤ７１抗体を、F(ab')2 Micro Preparation Kit（Pierce社）を用いて断片化した。すなわち、固定化されたペプシンによって抗ＣＤ７１抗体を３７℃で３時間消化し、消化物をプロテインＡセファロースカラムに通し、未結合物を精製し、Ｆ(ａｂ’)２を得た。
【００８８】
次いで、濃度０．１〜５ｍｇ／ｍＬのＦ(ａｂ’)２溶液２０μＬに、１０ｍＭのＴＣＥＰ−ＨＣＬ（Thermo Fisher Scientific社）溶液を２μＬ添加し、２５℃下に３０分間放置した。次いで、Antibody conjugate purification Kit for 50-100μg（Thermo Fisher Scientific社）でＴＣＥＰ−ＨＣＬを除去し、Ｆａｂ’を精製した。
【００８９】
（２）断片化抗体の蛍光標識
濃度０．１〜５ｍｇ／ｍＬのＦａｂ’溶液５０μＬに、２５ｍＭのAlexa Fluor 488 C5 maleimide（Thermo Fisher Scientific社）（ジメチルスルホキシド溶液）を４μＬ添加し、２５℃下に６時間放置した。次いで、Antibody conjugate purification Kit for 50-100μg（Thermo Fisher Scientific社）で未反応のAlexa Fluor 488 C5 maleimideを除去し、蛍光色素で標識されたＦａｂ’を精製した。以下、本抗体を、蛍光標識断片化抗体（１）という。
【００９０】
（３）希少細胞を含むモデルサンプルの調製
希少細胞を含む生体試料として、ヒト臍帯血（ＶＥＲＩＴＡＳ社、商品番号Ｃ−ＣＢ１０１）を用意し、本臍帯血から以下の工程によってｆＮＲＢＣを回収した。
【００９１】
Percoll液（登録商標、シグマアルドリッチ社）と水を使用して、密度1.070ｇ／ｍＬの液と、密度1.095ｇ／ｍＬの液を調製した。遠沈管に密度1.095ｇ／ｍＬの液２ｍＬを入れ、４℃下に３０分間置き冷却した。次いで、密度1.095ｇ／ｍＬの液の上に、密度1.070ｇ／ｍＬの液２ｍＬを、界面が乱れないようにゆっくり重層した。次いで、密度1.070ｇ／ｍＬの液の上に、生理食塩水で２倍に希釈した血液１１ｍＬをゆっくり重層し、遠心分離を２０００ｒｐｍで２０分間行った。次いで、密度1.070ｇ／ｍＬの液と密度1.095ｇ／ｍＬの液の間に沈積した画分を、ピペットを用いて採取した。採取した画分を、洗浄液（２ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ）にて２回洗浄し、有核赤血球を含む画分を得た。
【００９２】
上記で得た有核赤血球画分の細胞数をセルカウンター（Bio-Rad Laboratories社、ＴＣ２０全自動セルカウンター）で計測し、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈し、細胞濃度１．０×１０７個／ｍＬの有核赤血球懸濁液を得た。有核赤血球懸濁液１００μＬに、白血球等の細胞表面に発現しているＦｃ受容体をブロッキングする目的で、Fc Block Reagent for Human（BD biosciences社）を３μＬ添加し、２５℃下に１０分間放置した。次いで、白血球マーカーとしてＢＶ４２１標識抗ＣＤ４５抗体（BD biosciences社、商品番号５６３８７９、抗体部分はインタクトな免疫グロブリン分子である。）を１μＬ、ｆＮＲＢＣマーカーとして蛍光標識断片化抗体（１）を４μＬ、核染色色素として０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで０．１％に希釈したＤＲＡＱ５（Cell Signaling社）を１００μＬ添加し、４℃下に３０分間以上放置した。
【００９３】
別途、夾雑細胞のモデルとしてＰＢＭＣ（Precision Bioservices社、商品番号９３０００−１０Ｍ）を用意し、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈して、細胞濃度１．０×１０７個／ｍＬのＰＢＭＣ懸濁液を調製した。
【００９４】
抗体及び核染色色素と反応させた後の有核赤血球懸濁液をフローサイトメーター（ソニー（株）、ＳＨ８００ＺＰ）に供し、シングルセルモードにて、ＣＤ４５陰性且つＣＤ７１陽性且つＤＲＡＱ５陽性の細胞を分取し、分取した細胞を１００個、１００μＬのＰＢＭＣ懸濁液（ＰＢＭＣ濃度１．０×１０７個／ｍＬ、１００μＬにＰＢＭＣが１．０×１０６個含まれる。）に回収した。
【００９５】
一連の操作によって回収された、ＣＤ４５陰性且つＣＤ７１陽性且つＤＲＡＱ５陽性の細胞を、ｆＮＲＢＣとみなすことができる。こうして、細胞の存在比がｆＮＲＢＣ：ＰＢＭＣ＝１：１００００であるモデルサンプルを得た。
【００９６】
（４）細胞集団の標識
モデルサンプル１００μＬに、Fc Block Reagent for Human（BD biosciences社）を３μＬ添加し、２５℃下に１０分間放置した。次いで、ＢＶ４２１標識抗ＣＤ４５抗体（BD biosciences、商品番号５６３８７９）を１μＬ、蛍光標識断片化抗体（１）を４μＬ、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで０．１％に希釈したＤＲＡＱ５（Cell Signaling社）を１００μＬ添加し、４℃下に３０分間以上放置した。
【００９７】
（５）希少細胞の検出
抗体及び核染色色素と反応させた後のモデルサンプルをフローサイトメーター（ソニー（株）、ＳＨ８００ＺＰ）に供し、セミイールドモードにて、ＣＤ４５陰性且つＣＤ７１陽性且つＤＲＡＱ５陽性の細胞を分取し、４μＬの０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中に１細胞ずつ回収した。
【００９８】
モデルサンプルを全量フローサイトメーターに供した後、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで０．１％に希釈したＤＲＡＱ５を２００μＬ用いてサンプルチューブを洗浄し、洗浄液を再度フローサイトメーターに供し、セミイールドモードにて、ＣＤ４５陰性且つＣＤ７１陽性且つＤＲＡＱ５陽性の細胞を分取し、４μＬの０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中に１細胞ずつ回収した。全量フローサイトメーターに供した後、再度同様の操作を行い、４μＬの０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中に１細胞ずつ回収した。
【００９９】
モデルサンプルに含まれていたｆＮＲＢＣの個数（ＣＤ４５陰性且つＣＤ７１陽性且つＤＲＡＱ５陽性の細胞の個数）と、回収したｆＮＲＢＣの個数（ＣＤ４５陰性且つＣＤ７１陽性且つＤＲＡＱ５陽性の細胞の個数）とから、検出率（％）を算出した。結果を表１に示す。
【０１００】
［参考例２］
参考例１の「（３）希少細胞を含むモデルサンプルの調製」及び「（４）細胞集団の標識」において、蛍光標識断片化抗体（１）を蛍光標識断片化抗体（２）に変更した以外は、参考例１と同様にして希少細胞の検出を行った。結果を表１に示す。
蛍光標識断片化抗体（２）は、参考例１の「（２）断片化抗体の蛍光標識」を下記に変更して調製した。
【０１０１】
（２）断片化抗体の蛍光標識
濃度０．１〜５ｍｇ／ｍＬのＦａｂ’溶液１００μＬに、１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液を１０μＬ添加した。この溶液１００μＬを、Alexa fluor 488 labeling kit（Thermo Fisher Scientific社）のreactive dyeに添加し、２５℃下に１時間放置した。次いで、Antibody conjugate purification Kit for 50-100μg（Thermo Fisher Scientific社）で未反応のreactive dyeを除去し、蛍光色素で標識されたＦａｂ’を精製し、蛍光標識断片化抗体（２）とした。
【０１０２】
［参考例３］
参考例１の「（３）希少細胞を含むモデルサンプルの調製」及び「（４）細胞集団の標識」において、蛍光標識断片化抗体（１）を蛍光標識断片化抗体（３）に変更した以外は、参考例１と同様にして希少細胞の検出を行った。結果を表１に示す。
蛍光標識断片化抗体（３）は、参考例１の「（１）断片化抗体の作製」及び「（２）断片化抗体の蛍光標識」を下記に変更して調製した。
【０１０３】
（１）断片化抗体の作製
抗ＣＤ７１抗体（BD biosciences社、商品番号５５５５３４）を、Fab Micro Preparation Kit（Pierce社）を用いて断片化した。すなわち、固定化されたパパインによって抗ＣＤ７１抗体を３７℃で６時間消化し、消化物をプロテインＡセファロースカラムに通し、未結合物を精製し、Ｆａｂを得た。
【０１０４】
（２）断片化抗体の蛍光標識
濃度０．１〜５ｍｇ／ｍＬのＦａｂ溶液１００μＬに、１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液を１０μＬ添加した。この溶液１００μＬを、Alexa fluor 488 labeling kit（Thermo Fisher Scientific社）のreactive dyeに添加し、２５℃下に１時間放置した。次いで、Antibody conjugate purification Kit for 50-100μg（Thermo Fisher Scientific社）で未反応のreactive dyeを除去し、蛍光色素で標識されたＦａｂを精製し、蛍光標識断片化抗体（３）とした。
【０１０５】
［参考例４］
参考例１の「（３）希少細胞を含むモデルサンプルの調製」及び「（４）細胞集団の標識」において、蛍光標識断片化抗体（１）をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ７１抗体（BD biosciences社、商品番号５５５５３６、抗体部分はインタクトな免疫グロブリン分子である。）に変更し、この抗体の添加量を細胞懸濁液１００μＬに対して１５μＬにした以外は、参考例１と同様にして希少細胞の検出を行った。結果を表１に示す。
【０１０６】
［参考例５］
参考例１の「（３）希少細胞を含むモデルサンプルの調製」において、ＣＤ４５陰性且つＣＤ７１陽性且つＤＲＡＱ５陽性の細胞を回収するＰＢＭＣ懸濁液の濃度をＰＢＭＣ濃度１．０×１０５個／ｍＬに変更し、モデルサンプル中の細胞の存在比をｆＮＲＢＣ：ＰＢＭＣ＝１：１００に変更した以外は、参考例１と同様にして希少細胞の検出を行った。結果を表１に示す。
【０１０７】
［参考例６］
参考例２の「（３）希少細胞を含むモデルサンプルの調製」において、ＣＤ４５陰性且つＣＤ７１陽性且つＤＲＡＱ５陽性の細胞を回収するＰＢＭＣ懸濁液の濃度をＰＢＭＣ濃度１．０×１０５個／ｍＬに変更し、モデルサンプル中の細胞の存在比をｆＮＲＢＣ：ＰＢＭＣ＝１：１００に変更した以外は、参考例２と同様にして希少細胞の検出を行った。結果を表１に示す。
【０１０８】
［参考例７］
参考例３の「（３）希少細胞を含むモデルサンプルの調製」において、ＣＤ４５陰性且つＣＤ７１陽性且つＤＲＡＱ５陽性の細胞を回収するＰＢＭＣ懸濁液の濃度をＰＢＭＣ濃度１．０×１０５個／ｍＬに変更し、モデルサンプル中の細胞の存在比をｆＮＲＢＣ：ＰＢＭＣ＝１：１００に変更した以外は、参考例３と同様にして希少細胞の検出を行った。結果を表１に示す。
【０１０９】
［参考例８］
参考例４の「（３）希少細胞を含むモデルサンプルの調製」において、ＣＤ４５陰性且つＣＤ７１陽性且つＤＲＡＱ５陽性の細胞を回収するＰＢＭＣ懸濁液の濃度をＰＢＭＣ濃度１．０×１０５個／ｍＬに変更し、モデルサンプル中の細胞の存在比をｆＮＲＢＣ：ＰＢＭＣ＝１：１００に変更した以外は、参考例４と同様にして希少細胞の検出を行った。結果を表１に示す。
【０１１０】
【表１】
2018105645.tif 000002
【０１１１】
［実施例１］
妊娠１２週目の妊婦ボランティアから末梢血を得て、妊娠母体末梢血からのｆＮＲＢＣ検出を試みた。妊婦ボランティアからの採血は、インフォームドコンセントを得た上で行った。胎児は男児と判明している。
【０１１２】
抗凝固剤としてＥＤＴＡジナトリウム塩１０．５ｍｇ入りの７ｍＬ採血管に、妊婦ボランティア１名から末梢血７．０ｍＬを採取し、生理食塩水で２倍に希釈し、以下の工程に供した。
【０１１３】
（１）有核赤血球の密度勾配遠心分離
Percoll液（登録商標、シグマアルドリッチ社）と水を使用して、密度1.070ｇ／ｍＬの液と、密度1.095ｇ／ｍＬの液を調製した。遠沈管に密度1.095ｇ／ｍＬの液２ｍＬを入れ、４℃下に３０分間置き冷却した。次いで、密度1.095ｇ／ｍＬの液の上に、密度1.070ｇ／ｍＬの液２ｍＬを、界面が乱れないようにゆっくり重層した。次いで、密度1.070ｇ／ｍＬの液の上に、希釈した血液１１ｍＬをゆっくり重層し、遠心分離を２０００ｒｐｍで２０分間行った。次いで、密度1.070ｇ／ｍＬの液と密度1.095ｇ／ｍＬの液の間に沈積した画分を、ピペットを用いて採取した。採取した画分を、洗浄液（２ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ）にて２回洗浄し、有核赤血球を含む画分を得た。
【０１１４】
（２）細胞集団の標識
上記で得た有核赤血球画分の細胞数をセルカウンター（Bio-Rad Laboratories社、ＴＣ２０全自動セルカウンター）で計測し、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈し、細胞濃度１．０×１０７個／ｍＬの有核赤血球懸濁液を得た。有核赤血球懸濁液１００μＬに、白血球等の細胞表面に発現しているＦｃ受容体をブロッキングする目的で、Fc Block Reagent for Human（BD biosciences社）を３μＬ添加し、２５℃下に１０分間放置した。次いで、白血球マーカーとしてＢＶ４２１標識抗ＣＤ４５抗体（BD biosciences社、商品番号５６３８８０）を１μＬ、ｆＮＲＢＣマーカーとして蛍光標識断片化抗体（１）を４μＬ、核染色色素として０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳで０．１％に希釈したＤＲＡＱ５（Cell Signaling社）を１００μＬ添加し、４℃下に３０分間以上放置した。
【０１１５】
（３）希少細胞の検出
抗体及び核染色色素と反応させた後の有核赤血球懸濁液をフローサイトメーター（ソニー（株）、ＳＨ８００ＺＰ）に供し、セミイールドモードにて、ＣＤ４５陰性且つＣＤ７１陽性且つＤＲＡＱ５陽性の細胞を分取し、４μＬの０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳを分注したＰＣＲプレートに、１ウェルに１細胞ずつ回収した。回収した細胞から任意に選択した１０個（１０ウェル）に、以下のＤＮＡ分析を行った。
【０１１６】
（４）ＤＮＡ分析
ＰＣＲプレートの各ウェルに、Cell lysis buffer（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＫＣｌ、０．００７％ＳＤＳ、１３．３μｇ／ｍＬ Proteinase Kの混合物）を５μＬ添加し、５０℃で６０分間インキュベートし、次いで、９５℃で５分間インキュベートし、ＰＣＲプレート内で細胞を溶解させた。
【０１１７】
細胞溶解物からＤＮＡ増幅を行う目的で、Multiplex PCR Assay kit（タカラバイオ社）を用いてマルチプレックスＰＣＲ反応を行った。細胞溶解物を９μＬ、６４７種類の混合プライマーを４μＬ、Multiplex PCR Mix1を０．１２５μＬ、Multiplex PCR Mix2を１２．５μＬ、及び水を９．３７５μＬ混合し反応液を調製した。ＰＣＲ反応は、９４℃／６０秒で変性した後、９４℃／３０秒、５６．７℃／６００秒、７２℃／３０秒を３２サイクル行った。
【０１１８】
得られたＰＣＲ産物を、磁気ビーズ（AMPure XP Kit、BECMAN COULTER社）を用いて精製した。ＰＣＲ反応液２５μＬに磁気ビーズ分散液（AMPure XP）を４５μＬ添加し、磁気ビーズにＰＣＲ反応産物を結合させた。磁気ビーズをMagnaStand（日本ジェネティクス社）の磁力で分離し、夾雑物を除いた。７０ｖ／ｖ％エタノールで洗浄後、磁気ビーズに結合した核酸をＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーで溶出した。
【０１１９】
得られた溶出物を鋳型にして、Multiplex PCR Assay kit（タカラバイオ社）を用いて、再度ＰＣＲ反応を行った。溶出物を２μＬ、Ｙ染色体部分領域のフォワードプライマー（１．２５μＭ）を２μＬ、Ｙ染色体部分領域のリバースプライマー（１．２５μＭ）を２μＬ、Multiplex PCR Mix1を０．１２５μＬ、Multiplex PCR Mix2を１２．５μＬ、及び水を６．３７５μＬ混合し反応液を調製した。ＰＣＲ反応は、９４℃／３分で変性した後、９４℃／４５秒、５０℃／６０秒、７２℃／３０秒を５サイクル行い、次いで、９４℃／４５秒、５５℃／６０秒、７２℃／３０秒を１１サイクル行った。
【０１２０】
ＰＣＲ反応後、アガロースゲル電気泳動を行ってＤＮＡ増幅の有無を確認した。細胞１０個中３個において増幅のバンドが見られたことから、蛍光標識断片化抗体（１）とＢＶ４２１標識抗ＣＤ４５抗体とを標識抗体として用いて、妊娠母体末梢血からｆＮＲＢＣを検出できることが確認された。
【０１２１】
［比較例１］
実施例１の「（２）細胞集団の標識」において、蛍光標識断片化抗体（１）をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ７１抗体（BD biosciences社、商品番号５５５５３６）に変更し、この抗体の添加量を細胞懸濁液１００μＬに対して１５μＬにした以外は、実施例１と同様にしてｆＮＲＢＣの検出を試みた。細胞１０個すべてにおいて増幅のバンドが見られなかったことから、妊娠母体末梢血からｆＮＲＢＣを検出できなかったと判断した。