(57)【要約】      （修正有）【課題】従来より高い蛍光上昇を示す、新規な近赤外蛍光Ｃａ２＋プローブの提供。【解決手段】下式１１で例示される、カルシウムイオン捕捉基を有するＰローダミン化合物又はその塩。2018090535.tif 000050［ＡＭはＨ又は−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ３］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）：
2018090535.tif 000047
（式中、
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する一価の置換基を示し、Ｒ１は、同一であっても異なっていてもよく；
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、水素又は一価の置換基を示し、
但し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が水素ではなく；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ７は、炭素数１〜６のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基を示し；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ８及びＲ９は一緒になってＲ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ８又はＲ９、或いは、Ｒ８及びＲ９の両方は、夫々、Ｒ３、Ｒ５と一緒になって、Ｒ８、Ｒ９が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ１０及びＲ１１は一緒になってＲ１０及びＲ１１が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ１０又はＲ１１、或いは、Ｒ１０及びＲ１１の両方は、夫々、Ｒ４、Ｒ６と一緒になって、Ｒ１０、Ｒ１１が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｘは、存在する場合は、Ｌとベンゼン環とを結合するスペーサーを示し：
Ｌは、カルシウムイオンの捕捉基を示し：
ｍは、０〜２の整数であり、ｎは１〜３の整数であり、但し、ｍ＋ｎ＝３である）
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基又はハロゲン原子である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、炭素数１〜６個のアルキル基である、請求項２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
Ｘは、アミド又はエステルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項６】
Ｌが以下の一般式（１）で表される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
2018090535.tif 000048
（式中、Ｒ２０１、Ｒ２０２、Ｒ２０３及びＲ２０４は、それぞれ独立に、カルボキシ基、カルボキシ基を有するアルキル基、エステル基、置換されていてもよいアルキルエステル基、又はこれらの塩を示し；
Ｒ２０５、Ｒ２０６及びＲ２０７は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、メトキシ基又はニトロ基を示し；
Ｒ２０８は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す。）
【請求項７】
Ｌが以下の式（２）： 
2018090535.tif 000049
（式中、Ｒは、水素又は−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ３であり、各Ｒは同一あっても異なっていてもよく：
Ｒ’は、水素原子、メチル基、メトキシ基又はフッ素原子である）
で表される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項８】
ｎが１であり、−Ｘ−Ｌがベンゼン環の３位又は４位に結合している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項９】
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項１０】
Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
【請求項１２】
測定対象物質の測定方法であって、下記の工程：
（ａ）請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物又はその塩と測定対象物質とを接触させる工程、及び
（ｂ）上記工程（ａ）で生成した測定対象物質の捕捉後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な近赤外蛍光カルシウムプローブに関る。
【背景技術】
【０００２】
Ｃａ２＋は細胞内のセカンドメッセンジャーとして、脳機能、細胞運動、細胞増殖、代謝など様々な生体機能に関与している。そのため、可視光領域のＣａ２＋プローブが数多く開発されており、Ｆｕｒａ−２やＦｌｕｏ−４、Ｒｈｏｄ−２などのＣａ２＋プローブはＣａ２＋イメージングで大きな力を発揮している。（非特許文献１）
【０００３】
一方、近赤外領域のＣａ２＋プローブは報告が少なく、Ｃａ２＋の有無における蛍光強度の変化が２〜３倍と小さい（非特許文献２）、脂溶性が高くアグリゲーションを起こしてしまう、といった問題を抱えており実用的な蛍光プローブが開発されていないのが現状である。
【０００４】
波長７００ｎｍを超える領域の光はヘモグロビンの吸収が少ないため生体内透過性に優れ、生体深部の観察を可能とする。また、生体内分子由来の自家蛍光が少ないため、ノイズが少なく精密な測定が可能である。
【０００５】
キサンテン系蛍光色素はその高い水溶性、高い蛍光量子収率等から、バイオイメージングに広く利用されている。近年、キサンテン環の１０位酸素原子をＰ原子に置換した化合物Ｐローダミン（ＰＲ）は７００ｎｍを超え近赤外領域に吸収・蛍光波長を有する蛍光色素となることが報告されている（非特許文献３）。しかしながら、近赤外蛍光色素ＰＲの機能化は行われておらず、Ｐローダミンがバイオイメージングにおける有用な機能性色素として機能するかは明らかでなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Stosiek, C.; Garaschuk, O.; Holthoff, K.; Konnerth, A., In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. 2003, 100 (12), 7319-7324.
【非特許文献２】Akkaya, B. O. a. E. U., Infrared fluorescence sensing of submicromolar calcium: pushing the limits of photoinduced electron transfer. Tet. Lett. 2000, 41, 9185-9188.
【非特許文献３】Chai, X.; Cui, X.; Wang, B.; Yang, F.; Cai, Y.; Wu, Q.; Wang, T., Near-Infrared Phosphorus-Substituted Rhodamine with Emission Wavelength above 700 nm for Bioimaging. Chem. A Eur. J. 2015, 21 (47), 16754-8.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規の近赤外蛍光Ｃａ２＋プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
通常、蛍光団の近傍に高い電子密度を持つ構造が存在すると、励起状態において電子が蛍光団に移動する光誘起電子移動（ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ，  ＰｅＴ）が起こり、蛍光が消光を受ける。しかしながら、一般的な近赤外蛍光色素はＰｅＴが起こりづらいため、Ｃａ２＋プローブのようなＰｅＴで蛍光を制御した蛍光プローブの開発が困難であった。
そこで、本発明者等は、新たなＰｅＴ制御による蛍光プローブの母核として、７００ｎｍ付近に吸収・蛍光波長を有する近赤外蛍光色素として知られるＰＲに着目し、そのＰｅＴによる蛍光の消光の受けやすさについて検討した。その結果、Ｐローダミンは電子密度の高い（ＨＯＭＯエネルギーレベルの高い）ベンゼン環を導入するほど蛍光の消光を示したことからＰｅＴによる消光が起きていることが示唆された。そこで、更に鋭意検討した結果、特定のＰローダミン骨格に特定のＣａ２＋キレーターを導入することで、従来ではＣａ２＋の有無における蛍光上昇が２〜３倍であったのに対して、より高い蛍光上昇を示す近赤外蛍光Ｃａ２＋プローブを提供できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、
［１］以下の一般式（Ｉ）：
2018090535.tif 000002
（式中、
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する一価の置換基を示し、Ｒ１は、同一であっても異なっていてもよく；
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、水素又は一価の置換基を示し、
但し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が水素ではなく；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ７は、炭素数１〜６のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基を示し；
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ８及びＲ９は一緒になってＲ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ８又はＲ９、或いは、Ｒ８及びＲ９の両方は、夫々、Ｒ３、Ｒ５と一緒になって、Ｒ８、Ｒ９が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ１０及びＲ１１は一緒になってＲ１０及びＲ１１が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ１０又はＲ１１、或いは、Ｒ１０及びＲ１１の両方は、夫々、Ｒ４、Ｒ６と一緒になって、Ｒ１０、Ｒ１１が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｘは、存在する場合は、Ｌとベンゼン環とを結合するスペーサーを示し：
Ｌは、カルシウムイオンの捕捉基を示し：
ｍは、０〜２の整数であり、ｎは１〜３の整数であり、但し、ｍ＋ｎ＝３である）
で表される化合物又はその塩。
［２］Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基又はハロゲン原子である、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、炭素数１〜６個のアルキル基である、［２］に記載の化合物又はその塩。
［４］Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［５］Ｘは、アミド又はエステルである、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［６］Ｌが以下の一般式（１）で表される、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
2018090535.tif 000003
（式中、Ｒ２０１、Ｒ２０２、Ｒ２０３及びＲ２０４は、それぞれ独立に、カルボキシ基、カルボキシ基を有するアルキル基、エステル基、置換されていてもよいアルキルエステル基、又はこれらの塩を示し；
Ｒ２０５、Ｒ２０６及びＲ２０７は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、メトキシ基又はニトロ基を示し；
Ｒ２０８は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す。）
［７］Ｌが以下の式（２）： 
2018090535.tif 000004
（式中、Ｒは、水素又は−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ３であり、各Ｒは同一あっても異なっていてもよく：
Ｒ’は、水素原子、メチル基、メトキシ基又はフッ素原子である）
で表される、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［８］ｎが１であり、−Ｘ−Ｌがベンゼン環の３位又は４位に結合している、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［９］Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基から選択される、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［１０］Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基から選択される、［１］〜［９］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［１１］［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
［１２］測定対象物質の測定方法であって、下記の工程：
（ａ）［１］〜［１１］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩と測定対象物質とを接触させる工程、及び
（ｂ）上記工程（ａ）で生成した測定対象物質の捕捉後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法。
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、生体内の光の透過性の高い近赤外領域（７００ｎｍ程度以上）に吸収・蛍光波長を有する蛍光Ｃａ２＋プローブを提供することができる。また、本発明の近赤外蛍光Ｃａ２＋プローブは、従来の近赤外蛍光プローブに比較してＣａ２＋の有無による蛍光上昇が大きいため、より高い感度によるＣａ２＋の検出が可能になる。そのため、生体深部組織におけるＣａ２＋のイメージングが期待される。特に脳神経科学において、神経の活動をモニターするＣａ２＋イメージングにおいて深部からのＣａ２＋シグナルを検出することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＨＯＭＯエネルギーレベルに対するＰローダミン誘導体の規格化蛍光量子効率を示す。
【図２ａ】ＣａＰＲ−１の化学構造と光物理的特性を示す。
【図２ｂ】１μＭのＣａＰＲ−１に０〜３９μＭのＣａ２＋を添加した場合の吸収スペクトルを示す。
【図２ｃ】１μＭのＣａＰＲ−１に０〜３９μＭのＣａ２＋を添加した場合の蛍光スペクトルを示す。
【図２ｄ】Ｃａ２＋濃度に対する７１２ｎｍでの蛍光強度のプロットとＫｄ値を示す。
【図３】ＨｅＬａ細胞に１０μＭのＣａＰＲ−１−ＡＭを１時間担持させ、１００μＭのＡＴＰ又は１μＭのヒスタミンで刺激し、その後５μＭのイオノマイシンで刺激した場合の共焦点蛍光顕微鏡像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１〜６個、好ましくは炭素数１〜４個、更に好ましくは炭素数１〜３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。
【００１３】
本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
【００１４】
本発明の１つの実施態様は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
2018090535.tif 000005
【００１５】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する一価の置換基を示す。Ｒ１は、同一であっても異なっていてもよい。
【００１６】
Ｒ１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲ１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。更に、Ｒ１が示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４−カルボキシブトキシ基又は４−アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。
【００１７】
本発明の好ましい側面においては、Ｒ１は何れも水素原子である。
【００１８】
一般式（Ｉ）において、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、水素又は一価の置換基を示す。但し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が水素ではない。
Ｒ２ａ及びＲ２ｂが示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、Ｒ１と同様に、例えば、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれる。
【００１９】
本発明の１つの好ましい態様においては、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基又はハロゲン原子である。
【００２０】
また、本発明の１つのより好ましい態様においては、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が炭素数１〜６個のアルキル基である。
また、本発明の１つの更に好ましい態様においては、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基である。
理論に拘束されることを意図するものではないが、Ｐローダミン骨格においてはベンゼン環が結合している炭素原子は求核攻撃を非常に受け易く、水によっても求核攻撃を受ける可能性があるが、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が炭素数１〜６個のアルキル基であるとかかる求核攻撃を防止することができ、プローブの溶液中における安定性を向上させることができる。
【００２１】
一般式（Ｉ）において、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。
Ｒ３又はＲ４がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ３又はＲ４が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ３及びＲ４がともに水素原子である場合、又はＲ３及びＲ４がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
【００２２】
一般式（Ｉ）において、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示すが、Ｒ３及びＲ４について説明したものと同様である。Ｒ５及びＲ６が共に水素原子であるか、共に塩素原子であるか、又は共にフッ素原子であることが好ましい。
【００２３】
一般式（Ｉ）において、Ｒ７は、炭素数１〜６のアルキル基又は置換されていてもよいフェニル基を示す。
フェニル基の置換基としては、メチル基、ヒドロキシ基、メトキシ基などが挙げられる。
合成上の導入のし易さの点から、Ｒ７は、好ましくはメチル基又はフェニル基である。また、Ｒ７がメチル基である方が水溶性は高いため、より好ましい。
【００２４】
一般式（Ｉ）において、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示す。
【００２５】
また、Ｒ８及びＲ９は一緒になってＲ８及びＲ９が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよい。ヘテロシクリルとしては、アゼチジン、ピロリジン等があげられ、これらヘテロシクリルは炭素数１〜６個のアルキル等の置換基で置換されていてもよい。
【００２６】
また、Ｒ８又はＲ９、或いは、Ｒ８及びＲ９の両方は、夫々、Ｒ３、Ｒ５と一緒になって、Ｒ８、Ｒ９が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基（ベンジル基、フェネチル基等）、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基から選択される。
【００２８】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示す。
【００２９】
また、Ｒ１０及びＲ１１は一緒になってＲ１０及びＲ１１が結合している窒素原子を含む４〜７員のヘテロシクリルを形成していてもよい。ヘテロシクリルとしては、アゼチジン、ピロリジン等があげられ、これらヘテロシクリルは炭素数１〜６個のアルキル等の置換基で置換されていてもよい。
【００３０】
また、Ｒ１０又はＲ１１、或いは、Ｒ１０及びＲ１１の両方は、夫々、Ｒ４、Ｒ６と一緒になって、Ｒ１０、Ｒ１１が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基（ベンジル基、フェネチル基等）、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基から選択される。
【００３２】
本発明の好ましい側面においては、Ｒ８〜Ｒ１１は、それぞれ独立に、メチル基又はエチル基から選択される。水溶性の観点から、アルキル基の短いメチル基、エチル基が好ましい。また、電子供与能の高い長鎖アルキル基はＰｅＴによる蛍光の消光効率を下げると考えられる点からも、メチル基、エチル基が好ましい。
【００３３】
一般式（Ｉ）において、Ｘは、存在する場合は、Ｌとベンゼン環とを結合するスペーサーを示す。スペーサーとしては、アミド（−ＣＯ−ＮＨ−）、エステル（−ＣＯＯ−）等を用いることができるが、アミド又はエステルが好ましく、アミドがより好ましい。
【００３４】
一般式（Ｉ）において、Ｌは、カルシウムイオンの捕捉基を示す。
【００３５】
カルシウムイオンの捕捉基のＬとしては、以下の一般式（１）で表される補足基を好適に用いることができる。
2018090535.tif 000006
【００３６】
式（１）において、Ｒ２０１、Ｒ２０２、Ｒ２０３及びＲ２０４は、それぞれ独立に、カルボキシ基、カルボキシ基を有するアルキル基、エステル基、置換されていてもよいアルキルエステル基、又はこれらの塩を示す。
Ｒ２０５、Ｒ２０６及びＲ２０７は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、メトキシ基又はニトロ基を示す。
Ｒ２０８は水素原子であるか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す。
【００３７】
カルシウムイオンの捕捉基のＬとしては、ＢＡＰＴＡ（１，２−ｂｉｓ（ｏ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｘｙ）ｅｔｈａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）の構造を有することが好ましい。
また、
また、カルシウムイオンの捕捉基のＬとしては、以下の式（２）で表される補足基が好ましい。
2018090535.tif 000007
【００３８】
式（２）中、Ｒは、水素又は−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ３であり、各Ｒは同一あっても異なっていてもよい。Ｒ’は、水素原子、メチル基、メトキシ基又はフッ素原子である。
【００３９】
一般式（Ｉ）において、ｍは、０〜２の整数であり、ｎは１〜３の整数であり、但し、ｍ＋ｎ＝３である。
好ましくは、ｍは２であり、ｎは１である。
【００４０】
本発明において、−Ｘ−Ｌは、好ましくはベンゼン環の３位又は４位に結合している。−Ｘ−Ｌが３位または４位に結合することは、合成上の導入の簡便性から好ましい。
また、より好ましくは、−Ｘ−Ｌはベンゼン環の３位に結合している。プローブにＣａ２＋が結合していないｏｆｆ状態での蛍光はＰｅＴ（光誘起電子移動）により消光されていると考えられており、ＰｅＴによる消光は、電子供与部位（ＢＡＰＴＡ等のカルシウムイオン補足基）と電子受容部位（蛍光団）の距離が近い程効率が高いため、ベンゼン環３位に結合することがより好ましい。
【００４１】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物の非限定的な例としては以下の化合物が挙げられる。
2018090535.tif 000008
式（３）において、Ｒは、水素又は−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ３であり、各Ｒは同一あっても異なっていてもよい。また、Ｒ’は、水素原子、メチル基、メトキシ基又はフッ素原子である。
【００４２】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質も本発明の範囲内である。
【００４３】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。
【００４４】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物を製造することができる。
【００４５】
本発明のもう１つの態様は、一般式（Ｉ）のいずれかの化合物又はその塩を含む蛍光プローブである。
【００４６】
また、本発明のもう１つの態様は、測定対象物質の測定方法であって、下記の工程：（ａ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と測定対象物質とを接触させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成した測定対象物質の捕捉後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法である。
本発明の方法において、測定対象物質は好ましくはカルシウムイオンである。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４８】
［参考例１］
本発明の予備検討として、以下のスキームにより様々なＰＲ誘導体を合成した。
【００４９】
スキーム１：ＰＲ誘導体の合成スキーム
2018090535.tif 000009
【００５０】
ＰＲ誘導体（１３−２２）の合成の一般的手順
ブロモベンゼン誘導体（０．２９又は０．５８ｍｍｏｌ、１０又は２０ｅｑ）をＡｒ置換下、ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解し、−７８ｏＣでｓ−ＢｕＬｉ（１．０Ｍヘキサン溶液）（０．２９又は０．５８ｍＬ、０．２９又は０．５８ｍｍｏｌ、１０又は２０ｅｑ）を加え、１０分間攪拌した。これにＰキサントン（９．５ｍｇ、２９μｍｏｌ、１ｅｑ）をＴＨＦ（４ｍＬ）に溶解したものを加え、−７８ｏＣで５−６０分間攪拌した。これに２Ｎ塩酸（５ｍＬ）を加え、有機溶媒を減圧除去した。残った溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、水／ＭｅＣＮ、０．１％ＴＦＡ）で精製し、ＰＲ誘導体を得た。
【００５１】
２−Ｍｅ−５−ＮＭｅ２−ＰＲ（１３）
2018090535.tif 000010
収率：４６％
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.76 (2H, dd, J = 2.7 Hz, JH-P = 15.9 Hz, d), 7.42 (1H, d, J = 8.8 Hz, f), 7.26 (1H, dd, J = 8.8, 2.9 Hz, g), 7.18 (2H, dd, J = 9.5 Hz, JH-P = 6.1 Hz, b), 6.97-6.93 (3H, m, c, h), 3.44 (12H, s, e), 3.09 (6H, s, i), 2.04 (3H, s, j), 1.99 (3H, d, J = 13.7 Hz, a).
HPLC (A/B=70/30→0/100, 35 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【００５２】
2018090535.tif 000011
【００５３】
２−Ｍｅ−４−ＮＭｅ２−ＰＲ（１４）
2018090535.tif 000012
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 7.71 (2H, dd, J = 2.6 Hz, JH-P = 15.8 Hz, d), 7.34-7.23 (2H, m, b), 7.04-6.93 (3H, m, c, h), 6.83-6.76 (2H, m, f, g), 3.42 (12H, s, e), 3.06 (6H, s, i), 2.04-1.94 (6H, m, a, j).
HPLC (A/B=70/30→0/100, 35 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【００５４】
2018090535.tif 000013
【００５５】
２，５−ｄｉＯＭｅ−ＰＲ（１５）
収率：１３％
2018090535.tif 000014
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.72 (2H, dd, J = 2.7 Hz, JH-P = 15.9 Hz, d), 7.30-7.21 (2H, m, b), 7.17-7.15 (2H, m, f, h), 6.97-6.92 (2H, m, c), 6.83-6.77 (1H, m, g), 3.79 (3H, s, i), 3.66-3.64 (3H, m, j), 3.43 (12H, s, e), 2.01-1.94 (3H, m, a).
HPLC (A/B=60/40→0/100, 30 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【００５６】
2018090535.tif 000015
【００５７】
２，４−ｄｉＯＭｅ−ＰＲ（１６）
収率：３．８％
2018090535.tif 000016
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.61 (2H, dd, J = 2.7 Hz, JH-P = 15.9 Hz, d), 7.26-7.16 (2H, m, b), 6.98 (1H, dd, J = 8.5 Hz, JH-P = 12.4 Hz, h), 6.88-6.83 (2H, m, c), 6.70-6.64 (2H, m, f, g), 3.82 (3H, s, i), 3.61-3.59 (3H, m, j), 3.33 (12H, s, e), 1.90-1.84 (3H, m, a).
HPLC (A/B=50/50→0/100, 25 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【００５８】
2018090535.tif 000017
【００５９】
２−ＯＭｅ５−Ｍｅ−ＰＲ（１７）
収率：３．８％
2018090535.tif 000018
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 7.71 (2H, dd, J = 2.9 Hz, JH-P = 16.1 Hz, d), 7.40 (1H, dd, J = 8.8, 1.8 Hz, h), 7.29-7.17 (2H, m, b), 7.11 (1H, d, J = 8.8 Hz, f), 7.01-6.92 (3H, m, c, g), 3.68-3.66 (3H, m, j), 3.42 (12H, s, e), 2.36-2.34 (3H, s, i), 2.01-1.93 (3H, m, a).
HPLC (A/B=50/50→0/100, 25 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【００６０】
2018090535.tif 000019
【００６１】
２−Ｍｅ−４−ＯＭｅ−ＰＲ（１８）
収率：５１％
2018090535.tif 000020
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δd 7.74 (2H, dd, J = 2.7 Hz, JH-P = 15.9 Hz, d), 7.24-7.15 (2H, m, b), 7.11 (1H, d, J = 8.3 Hz, g), 7.06 (1H, d, J = 8.3 Hz, h), 7.02-6.94 (3H, m, c, f), 3.88 (3H, s, i), 3.43 (12H, s, e), 2.08-1.95 (6H, m, a, j).
HPLC (A/B=60/40→0/100, 30 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【００６２】
2018090535.tif 000021
【００６３】
２−ＯＭｅ−ＰＲ（１９）
収率：５．２％
2018090535.tif 000022
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 7.72 (2H, dd, J = 2.6 Hz, JH-P = 15.8 Hz, d), 7.64-7.58 (1H, m, i), 7.25-7.17 (5H, m, b, f, g, h), 6.93 (2H, dd, J = 9.9, 2.6 Hz, c), 3.72-3.70 (3H, m, j), 3.43 (12H, s, e), 2.03-1.94 (3H, m, a).
HPLC (A/B=60/40→0/100, 30 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【００６４】
2018090535.tif 000023
【００６５】
２，５−ｄｉＭｅ−ＰＲ（２０）
収率：２６％
2018090535.tif 000024
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 7.75 (2H, dd, J = 2.6 Hz, JH-P = 15.8 Hz, d), 7.32 (2H, s, f, g), 7.15 (2H, dd, J = 9.5 Hz, JH-P = 5.9 Hz, b), 6.98 (1H, s, h), 6.94 (2H, dd, J = 9.5, 2.6 Hz, c), 3.43 (12H, s, e), 2.38 (3H, s, i), 2.04 (3H, s, j), 1.98 (3H, d, J = 13.2 Hz, a).
HPLC (A/B=60/40→0/100, 30 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【００６６】
2018090535.tif 000025
【００６７】
２，４−ｄｉＭｅ−ＰＲ（２１）
収率：６３％
2018090535.tif 000026
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.74 (2H, dd, J = 2.9 Hz, JH-P = 15.9 Hz, d), 7.27 (1H, s, f), 7.23 (1H, d, J = 7.3 Hz, g), 7.17 (2H, dd, J = 9.8 Hz, JH-P = 5.9 Hz, b), 7.03 (1H, d, J = 7.3 Hz, h), 6.94 (2H, dd, J = 9.8, 2.9 Hz, c), 3.43 (12H, s, e), 2.44 (3H, s, i), 2.05 (3H, s, j), 1.98 (3H, d, J = 13.2 Hz, a).
HPLC (A/B=70/30→0/100, 35 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【００６８】
2018090535.tif 000027
【００６９】
２−Ｍｅ−ＰＲ（２２）
収率：１１％
2018090535.tif 000028
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 7.76 (2H, dd, J = 2.2 Hz, JH-P = 16.1 Hz, d), 7.55-7.38 (3H, m, f, g, h), 7.21-7.09 (3H, m, b, i), 6.94 (2H, dd, J = 9.5, 2.2 Hz, c), 3.44 (12H, s, e), 2.10 (s, 3H, j), 1.99 (3H, d, J = 13.2 Hz, a).
HPLC (A/B=70/30→0/100, 35 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【００７０】
2018090535.tif 000029
【００７１】
［参考例２］
近赤外蛍光色素の蛍光の消光に関する検討
ＰローダミンのＰｅＴによる蛍光の消光の受けやすさを調べるため、参考例１で合成したＰＲ誘導体の蛍光特性を島津ＵＶ−１６５０ＰＣ吸光光度計、日立Ｆ−４５００蛍光光度計を使用して調べた。
図１は、ＨＯＭＯエネルギーレベルに対するＰＲ誘導体の規格化蛍光量子ごへい効率を示す。様々な置換基を有するベンゼン環を導入したＰＲ誘導体の蛍光特性を比較した結果、図１で示すように、ＰＲは電子密度の高い（ＨＯＭＯエネルギーレベルの高い）ベンゼン環を導入するほど蛍光の消光を示したことからＰｅＴによる消光が起きていることが示唆された（図１）。
また、６５０ｎｍ付近に吸収・蛍光波長を有するＳｉローダミン（ＳｉＲ）よりも長波長の蛍光色素であるにも関わらず、ＰｅＴによる蛍光の消光を受け易いことが明らかになった（図１）。その消光の受けやすさは同じく可視光領域でＣａ２＋プローブの母核として用いられているＴＧと同程度であり、より蛍光変化の大きいＣａ２＋プローブの母核となりうることが分かった。
【００７２】
［合成実施例１］
次に、Ｃａ２+キレーターを有する本発明の化合物について、以下のスキーム２により化合物１（Ｎ−（１０−（４−（（４−（ビス（カルボキシメチル）アミノ）−３−（２−（２−（ビス（カルボキシメチル）アミノ）−５−メチルフェノキシ）エトキシ）フェニル）カルバモイル）−２，６−ジメチルフェニル）−７−（ジメチルアミノ）−５−メチル−５−オキシドアクリドホスフィン−３（５Ｈ）−イリデン）−Ｎ−メチルメタナミニウム（ＣａＰＲ−１））を合成した。
【００７３】
スキーム２：ＣａＰＲ−１の合成スキーム
2018090535.tif 000030
2018090535.tif 000031
【００７４】
（１）ＭｅＢＡＰＴＡ−ＮＯ２Ｍｅエステル（２）の合成
2018090535.tif 000032
【００７５】
ＭｅＢＡＰＴＡ  Ｍｅエステル（１）（５４．５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）をＡｃＯＨ２ｍＬに溶解し、濃硝酸（６５％）（７．７μＬ、０．０８０ｍｍｏｌ）と濃硫酸（５．３１μＬ、０．１０ｍｍｏｌ）を加え、１００ｏＣで３分間攪拌した後、素早く氷冷し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で中和した。ＡｃＯＥｔで抽出して有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、溶媒を減圧除去した。中圧分取（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、７８／２２ヘキサン／ＡｃＯＥｔ→５６／４４ヘキサン／ＡｃＯＥｔ）で精製し、ＭｅＢＡＰＴＡ−ＮＯ２Ｍｅエステル（３２ｍｇ、５４％収率）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.83 (1H, dd, J = 8.8, 2.2 Hz, b), 7.73 (1H, d, J = 2.9 Hz, c), 6.78-6.66 (4H, m, a, d, e, f), 4.35-4.27 (4H, m, g, h), 4.24 (4H, s, j), 4.12 (4H, s, k), 3.60 (12H, s, l, m), 2.27 (3H, s, i).
HRMS: Calcd for [M+Na]+ 614.1962, Found, 614.1920 (-4.2 mmu).
【００７６】
（２）ＭｅＢＡＰＴＡ−ＮＯ２（３）の合成
2018090535.tif 000033
【００７７】
ＭｅＢＡＰＴＡ−ＮＯ２Ｍｅエステル（２）（５２ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ９ｍＬに溶解し、２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（５ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１４時間攪拌した。これに２Ｎ塩酸（６ｍＬ）を加え、有機溶媒を減圧除去した。残った溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、水／ＭｅＣＮ、０．１％ＴＦＡ）で精製し、ＭｅＢＡＰＴＡ−ＮＯ２（３４ｍｇ、７２％収率）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.86-7.81 (2H, m, b, c), 6.89-6.68 (4H, m, a, d, e, f), 4.44-4.33 (4H, m, g, h), 4.24 (4H, s, j), 4.04 (4H, s, k), 2.28 (3H, s, i).
【００７８】
（３）ＭｅＢＡＰＴＡ−ＮＯ２ＡＭエステル（４）の合成
2018090535.tif 000034
【００７９】
ＭｅＢＡＰＴＡ−ＮＯ２（３）（３４ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ５ｍＬに溶解し、メチルブロモアセテート（６０μＬ、０．６４ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（２２０μＬ、１．３ｍｍｏｌ）を３回に分けて加え、Ａｒ置換下、室温で３時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ＯＤＳ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、水／ＭｅＣＮ、０．１％ＡｃＯＨ）で精製し、ＭｅＢＡＰＴＡ−ＮＯ２ＡＭエステル（１９ｍｇ、３５％収率）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.87-7.81 (1H, m, b), 7.77 (1d, J = 2.2 Hz, c), 6.83 (1H, d, J = 8.1 Hz, a), 6.74-6.64 (3H, m, d, e, f), 5.66 (4H, s, l), 5.62 (4H, s, m), 4.44-4.36 (4H, m, g, h), 4.29 (4H, s, j), 4.16 (4H, s, k), 2.28 (3H, s, i), 2.09 (6H, s, n), 2.07 (6H, s, o).
HRMS: Calcd for [M+Na]+ 846.2181, Found, 846.2214 (+3.3 mmu).
【００８０】
（４）ＭｅＢＡＰＴＡ−ＮＨ２ＡＭエステル（５）の合成
2018090535.tif 000035
【００８１】
ＭｅＢＡＰＴＡ−ＮＯ２ＡＭエステル（４）（１９ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ／ＥｔＯＨ＝５ｍＬ／５ｍＬに溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（小スパーテル２杯）を加え、Ｈ２置換下、室温で１時間攪拌した。Ｐｄ／Ｃをセライトろ過で除去し、溶媒を減圧除去し、ＭｅＢＡＰＴＡ−ＮＨ２ＡＭエステル（１５ｍｇ、８２％収率）を得た。精製は行わず次の反応に使用した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 6.84-6.66 (4H, m, a, d, e, f), 6.40-6.21 (2H, m, b. c), 5.66 (8H, s, l, m), 4.33-4.09 (12H, m, g, h, j, k), 2.28 (3H, s, i), 2.07 (12H, s, n, o).
【００８２】
（５）２，５−ジブロモ−ｍ−キシレン（６）の合成
2018090535.tif 000036
【００８３】
４−ブロモ−２，６−ジメチルアニリン（６．００ｇ、３０ｍｍｏｌ）を４８％ＨＢｒ水溶液（２０ｍＬ）に懸濁し、−１０ｏＣで水に溶解したＮａＮＯ２（２．２８ｇ、３３ｍｍｏｌ）を加え、１時間攪拌し、スルファミン酸（０．５８ｇ、６ｍｍｏｌ）を加えた。これを、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（４．１７ｇ、１５ｍｍｏｌ）を４８％ＨＢｒ水溶液（２０ｍＬ）に溶解し８０ｏＣに加熱したものに徐々に加え、８０ｏＣで１時間攪拌した。これに水を加え、ヘキサンで抽出して有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、溶媒を減圧除去した。中圧分取（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、ヘキサン）で精製し、２，５−ジブロモ−ｍ−キシレン（６．１９ｇ、７２％収率）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.19 (2H, s, a), 2.37 (6H, s, b).
【００８４】
（６）ｔｅｒｔ−ブチル４−ブロモ−３，５−ジメチルベンゾエート（７）の合成
2018090535.tif 000037
【００８５】
２，５−ジブロモ−ｍ−キシレン（４．６９ｇ、１８ｍｍｏｌ）をＡｒ置換下、ＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解し、−７８ｏＣでｎ−ＢｕＬｉ（１．６Ｍヘキサン溶液）（１１．１ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）を加え、２時間攪拌した。これにＢｏｃ２Ｏ（４．０８ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解したものを加え、室温で２時間攪拌した。これに水を加え、ＤＣＭで抽出して有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、溶媒を減圧除去した。残渣を中圧分取（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、ヘキサン）で精製し、ｔｅｒｔ−ブチル４−ブロモ−３，５−ジメチルベンゾエート（３．５３ｇ、６９％収率）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.65 (2H, s, a), 2.43 (6H, s, b), 1.58 (9H, s, c).
【００８６】
（７）４−ブロモ−３，５−ジメチル安息香酸（８）の合成
2018090535.tif 000038
【００８７】
ｔｅｒｔ−ブチル４−ブロモ−３，５−ジメチルベンゾエート（１．２４ｇ、４．４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解し、ＴＦＡ（５ｍＬ）を加え、室温で９時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液に溶解い、ＤＣＭで洗浄した。水相を２Ｎ塩酸で酸性（ｐＨ１）にし、ＡｃＯＥｔで抽出して有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後溶媒を減圧除去し、４−ブロモ−３，５−ジメチル安息香酸（７２６ｍｇ、７２％収率）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 13.05 (1H, s, c), 7.71 (2H, s, a), 2.39 (6H, s, b).
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 166.8, 138.2, 131.9, 129.4, 128.9, 23.4.
HRMS: Calcd for [M-H]- 226.9708, Found, 226.9715 (+0.7 mmu).
【００８８】
（８）Ｐキサントン（９）の合成
2018090535.tif 000039
【００８９】
非特許文献３（Chai, X.; Cui, X.; Wang, B.; Yang, F.; Cai, Y.; Wu, Q.; Wang, T., Near-Infrared Phosphorus-Substituted Rhodamine with Emission Wavelength above 700 nm for Bioimaging. Chem. A Eur. J. 2015, 21 (47), 16754-8.）に従ってＰキサントンを合成した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.15 (2H, dd, J = 8.4 Hz, JH-P = 6.2 Hz, b), 7.14 (2H, d, JH-P = 14.7 Hz, d), 6.75 (2H, d, J = 8.4 Hz, c), 3.00 (12H, s, e), 1.66 (3H, d, JH-P = 13.2 Hz, a).
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 179.6, 152.8, 136.0 (d, JC-P = 99 Hz), 131.3, 123.7, 114.6, 111.1, 40.1, 22.4 (d, JC-P = 91 Hz).
HRMS: Calcd for [M+H]+, 329.1419, Found, 329.1379 (-4.0 mmu).
【００９０】
（９）ＴＭＰＲ−ｐＣＯＯＨ（１０）の合成
2018090535.tif 000040
【００９１】
４−ブロモ−３，５−ジメチル安息香酸（１９５ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）をＡｒ置換下、ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解し、−７８ｏＣでｓ−ＢｕＬｉ（１．０Ｍヘキサン）（１．７ｍＬ、１．７ｍｍｏｌ）を加え、２０分間攪拌した。これにＰキサントン（３８ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４ｍＬ）に溶解したものを加え、１５分間攪拌した。これに２Ｎ塩酸（５ｍＬ）を加え有機溶媒を減圧除去した。残った溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、水／ＭｅＣＮ、０．１％ＴＦＡ）で精製し、ＴＭＰＲ−ｐＣＯＯＨ（６．２ｍｇ、９．３％収率）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.74 (2H, dd, J = 2.4 Hz, JH-P = 16.1 Hz, d), 7.24 (2H, dd, J = 9.5 Hz, JH-P = 6.1 Hz, b), 7.10 (1H, s, f), 7.06 (1H, s, g), 6.95 (2H, dd, J = 9.5, 2.4 Hz, c), 3.44 (12H, s, e), 2.43 (6H, s, h), 2.00 (3H, d, J = 13.7 Hz, a).
HPLC (A/B=70/30→0/100, 35 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【００９２】
2018090535.tif 000041
【００９３】
（１０）ＣａＰＲ−１−ＡＭ（１１）の合成
2018090535.tif 000042
【００９４】
ＴＭＰＲ−ｐＣＯＯＨ（２．６ｍｇ、４．５μｍｏｌ）、ＭｅＢＡＰＴＡ−ＮＨ２ＡＭエステル（１４．３ｍｇ、１８μｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（５．２ｍｇ、１３．６μｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（１６μＬ、９０μｍｏｌ）を加え、Ａｒ置換化、室温で８時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ＯＤＳ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、水／ＭｅＣＮ、０．１％ＴＦＡ、その後、ＯＤＳ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、水／ＭｅＣＮ、０．１％ＡｃＯＨ）で精製し、ＣａＰＲ−１−ＡＭ（１．３ｍｇ、２２％収率）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD2Cl2): δ 9.73 (1H, s, k), 7.90-7.86 (2H, m, d), 7.77-7.61 (2H, m, f, g), 7.43 (1H, d, J = 7.3 Hz, j), 7.16 (2H, d, J = 9.5 Hz, c), 6.91 (1H, d, J = 8.8 Hz, i), 6.88-6.83 (5H, m, b, l, m, n), 5.63 (4H, s, t or u), 5.61 (4H, s, u or t), 4.42-4.31 (4H, m, p, q), 4.18 (4H, s, r or s), 4.15 (4H, s, s or r), 3.41 (12H, s, e), 2.29 (3H, s, o), 2.11 (3H, s, h), 2.06 (6H, s, v or w), 2.03 (6H, s, w or v), 2.01 (3H, s, h), 1.32-1.24 (3H, m, a).
HPLC (A/B=50/50→0/100, 25 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【００９５】
2018090535.tif 000043
【００９６】
（１１）ＣａＰＲ−１（１２）の合成
2018090535.tif 000044
【００９７】
ＣａＰＲ−１−ＡＭ（０．５０μｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１５０μＬ）溶液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）（９５０μＬ）に溶解し、エステラーゼ（２０μＬ、１２３ｕｎｉｔ）を加え、３７ｏＣで２３時間静置した。この溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、水／ＭｅＣＮ、０．１％ＴＦＡ、その後、ＯＤＳ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ、水／ＭｅＣＮ、０．１％ＡｃＯＨ）で精製し、ＣａＰＲ−１（０．３５ｍｇ、６９％収率）を得た。
1H NMR (400 MHz, D2O): δ 7.64 (2H, s, f, g), 7.51 (2H, d, J = 16.1 Hz, d), 7.34 (1H, s, k), 7.20-7.13 (1H, m, j), 7.07-6.94 (4H, m, c, i, l), 6.85-6.75 (2H, m, m, n), 6.68 (2H, d, J = 8.3 Hz, b), 4.43-4.31 (4H, m, p, q), 3.63-3.40 (8H, m, r, s), 3.22 (12H, s, e), 2.00-1.83 (9H, m, a, h)..
HPLC (A/B=50/50→0/100, 25 min; A: H2O, 0.1 M TFA, B: MeCN/H2O=80/20, 0.1 M TFA)
【００９８】
2018090535.tif 000045
【００９９】
［実施例１］
ＣａプローブＣａＰＲ−１の光学特性
本発明の化合物１（ＣａＰＲ−１）の光学特性を評価した。吸収スペクトル、蛍光スペクトル及び励起スペクトルを島津ＵＶ−１６５０ＰＣ吸光光度計、日立Ｆ−４５００蛍光光度計を用いて測定した。結果を図１ｂ、１ｄ〜ｅに示す。
【０１００】
図２ａは、ＣａＰＲ−１の化学構造と光物理的特性を示す。図２ｂは、１μＭのＣａＰＲ−１に０〜３９μＭのＣａ２＋を添加した場合の吸収スペクトルを示す。図２ｃは、１μＭのＣａＰＲ−１に０〜３９μＭのＣａ２＋を添加した場合の蛍光スペクトルを示す。図２ｄは、Ｃａ２＋濃度に対する７１２ｎｍでの蛍光強度のプロットとＫｄ値を示す。
【０１０１】
図２ｃから、ＣａＰＲ−１はＣａ２＋濃度依存的に５．８倍の蛍光上昇を示したことが分かる（図２ｃ）。これまで報告されている７００ｎｍ以上の近赤外領域に吸収・蛍光波長を有するＣａ２＋プローブは２〜３倍の蛍光上昇しか示さず（非特許文献２）、ＣａＰＲ−１の方が優れた近赤外Ｃａ２＋プローブである。そのＫｄ値は一般的なＢＡＰＴＡベースのＣａ２＋プローブと同程度の０．２９μＭを示し（図２ｄ）、Ｃａ２＋プローブとして機能することが明らかとなった。
【０１０２】
［実施例２］
細胞内Ｃａ２＋イメージングへの応用
実際の細胞内のＣａ２＋濃度変動を捉えることができるかを検討するため、以下のＣａＰＲ−１−ＡＭを用いてＨｅＬａ細胞でヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）またはＡＴＰ添加によって起こるＣａ２＋オシレーションの観察への適用を試みた。
2018090535.tif 000046
【０１０３】
図３の下段は、ＨｅＬａ細胞に１０μＭのＣａＰＲ−１−ＡＭを１時間担持させ、１００μＭのＡＴＰ又は１μＭのヒスタミンで刺激し、その後５μＭのイオノマイシン（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）で刺激した場合の共焦点蛍光顕微鏡像を示す。図３の上段は、ＡＴＰ又はヒスタミン添加後、イオノマイシン添加する操作を繰り返した蛍光強度の変化を示す。
【０１０４】
図３から、ＡＴＰ、ヒスタミンいずれの刺激を行った際にもＣａ２＋オシレーションが観察され、細胞内の生理的なＣａ２＋濃度変動を捉えられることが明らかとなった（図３）。イオノマイシンは細胞外のＣａ２＋を強制的に細胞内に流入させるイオノフォアであり、イオノマイシンの添加によっても蛍光上昇が観察された。
また、ＣａＰＲ−１は主に細胞質、核に均一に分布し、一部がゴルジ体と見られる小器官に集積している様子が観察されている。同じローダミン骨格を持つＲｈｏｄ−２がミトコンドリアに、ＣａＳｉＲ−１がリソソームに局在しやすいのと比較して異なる局在を示すことは興味深く、色素の水溶性の高さ故、脂溶性環境の強い細胞内小器官に局在しづらい性質をもつものと考えている。
【図１】
2018090535.tif 000051
【図２ａ】
2018090535.tif 000052
【図２ｂ】
2018090535.tif 000053
【図２ｃ】
2018090535.tif 000054
【図２ｄ】
2018090535.tif 000055
【図３】
2018090535.tif 000056