(57)【要約】【課題】ＡＢＣＧ２遺伝子のＱ１４Ｋ変異体の発現後に、タンパク質として正常にフォールディングさせ、糖鎖修飾させるための薬理シャペロンを提供する。【解決手段】トコトリエノール及び／又はトコフェロールを有効成分とする、ＡＢＣＧ２遺伝子の変異体であるＱ１４１Ｋの発現産物であるトランスポータータンパク質の正常フォールディングの機能を有する薬理シャペロン組成物。【選択図】図５
2018024644.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トコトリエノール及び／又はトコフェロールを有効成分とする、ＡＢＣＧ２遺伝子の変異体であるＱ１４１Ｋの発現産物であるトランスポータータンパク質の正常フォールディングの機能を有する薬理シャペロン組成物。
【請求項２】
腸管への生体内代謝物の排泄が阻害されている疾患治療のための請求項１に記載の薬理シャペロン組成物。
【請求項３】
腸管からの薬剤吸収を正常化するための請求項１に記載の薬理シャペロン組成物。
【請求項４】
経口投与の形態である請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
トコトリエノール及び／又はトコフェロールを有効成分とする、ＡＢＣＧ２遺伝子のＱ１４１Ｋ変異体の発現産物であるトランスポータータンパク質の正常フォールディングに作用する薬理シャペロンとしての飲食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物トランスポーターＡＢＣＧ２の機能改善に作用する薬理シャペロンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＢＣＧ２は、ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｇ２の略称であり、抗がん剤耐性を示したヒト乳がん細胞から発見された。抗がん剤などの化学物質のトランスポーターとして良く知られている（特許文献１、２）。ＡＢＣＧ２は、広範な組織分布と広い基質認識性を有することが次第に明らかとなってきた。現在では多様な視点から研究が進められている。ＡＢＣＧ２の生理的役割と遺伝子多型（ＳＮＰ等）に伴う薬物動態変動に加え、ＡＢＣＧ２の遺伝子多型によるポルフィリン蓄積と皮膚の光線過敏症の発症や、更に、ＡＢＣＧ２による尿酸輸送と痛風発症に係る事が注目されている（非特許文献１、２、３）。
ＡＢＣＧ２は、ＡＴＰ結合部位を一つしか持たないハーフトランスポーターであり、分子間ジスルフィド結合により形成されるホモ二量体として機能している。そして肝臓、腎臓、小腸、脳など多くの組織に発現しており、基質化合物の胆汁中・尿中への排泄促進、消化管吸収の抑制、血液脳関門・胎盤・精巣におけるバリア機能などを担っていることが非特許文献１に記載されている。
またＡＢＣＧ２の輸送基質は、ゲフィチニブなどの抗がん剤、ロスバスタチンなどのＨＭＧＣｏＡ還元酵素阻害薬、シプロフロキサシンなどのニューキノロン系抗菌薬をはじめとする薬物、ステロイドホルモン・薬物の硫酸抱合体や植物エストロゲン、２−ａｍｉｎｏ−１−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｐｈｅｎｙｌｉｍｉｄａｚｏ［４，５−ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ（ＰｈＩＰ）に代表されるがん原性物質、クロロフィルの分解物であるポルフィリン類（例えばフェオフォルビド）、尿酸などを輸送することが知られている（非特許文献１、２、３）。
【０００３】
特許文献３にはＡＢＣＧ２遺伝子の多型に基づく薬物輸送能の予測方法が記載されている。
ＡＢＣＧ２遺伝子多型の日本人におけるアレル頻度は高く、発現量および機能変化を伴わない３４Ｇ＞Ａ（Ｖ１２Ｍ）は１９．２％、タンパク質発現量が約半分に低下する４２１Ｃ＞Ａ（Ｑ１４１Ｋ）は３１．９％、終止コドンが生じ機能欠損となる３７６Ｃ＞Ｔ（Ｑ１２６Ｘ）は２．８％である（非特許文献１、特許文献４参照）。この変異体の構造について図１に示す。
これらの遺伝子多型のうち、機能低下を伴い頻度も高い４２１Ｃ＞Ａ（Ｑ１４１Ｋ）については臨床的によく研究されている。薬物動態の変動としてはスルファサラジンの消化管吸収の上昇、ロスバスタチンやフルバスタチンの経口投与時の血中濃度の上昇などが知られている（非特許文献２、特許文献４参照）。
また、ゲフィチニブ投与に伴う下痢発症リスクの上昇や、ロスバスタチン服用時のＬＤＬコレステロール低下作用の有意な亢進（４２１Ｃを二つ持つヒトでは−５０．２％、４２１Ａを二つ持つヒトでは−５７．０％であり、この違いは一般にスタチン系薬物の服用量を倍量にした際のＬＤＬコレステロールの低下率６％と比較しても大きい）などの薬理作用や毒性に関する知見も増え始めており、ＡＢＣＧ２の薬物移送能と遺伝子多型の関係、及び機能低下について研究が進んでいる。
非特許文献２では、ＡＢＣＧ２の機能を欠失させた遺伝子改変動物（ＡＢＣＧ２  ノッ
クアウトマウス）を用いて尿酸排泄について検討を行い、ノックアウトマウスでは、ＡＢ
ＣＧ２の機能が低下した高尿酸血症のヒトと同様、血清尿酸値と腎臓からの尿酸排泄が増
加していたことに加えて、腸管からの尿酸排泄が低下していることを記載している。そし
てＡＢＣＧ２の尿酸排泄の機能が低下すると、腸管からの尿酸排泄量が低下し、血清尿酸
値が上昇し、腎臓からの尿酸排泄量が増加することが記載されている。
非特許文献３では、ＡＢＣＧ２  ノックアウトマウスがポルフィリン症に酷似した光線
過敏症を発症したこと、更に野生型ＡＢＣＧ２およびアミノ酸置換を伴う１６種のＳＮＰ
についてポルフィリン輸送能を検討し、ＡＢＣＧ２がＡＴＰ依存的なポルフィリン輸送活
性を示すこと、野生型と比べ著しくポルフィリン輸送活性が低下するＳＮＰが存在することが記載されている。
【０００４】
また、特許文献５には、ＡＢＣＧ２の１２６番目のグルタミン酸残基コドンが翻訳終止コドンとなりＡＢＣＧ２の活性が欠失する異常を検出する技術が開示されており、薬物吸収の異常を予め診断する方法が記載されている。
特許文献６には、ポリオキシエチレングリセロールトリリシノレアート３５、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、ラウリルポリエチレングリコールエーテル、エチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマー（ＰＥＯ）などによってＡＢＣＧ２の機能を阻害することで胃腸管での薬剤の吸収を増大させる技術が開示されている。
このようにＡＢＣＧ２の異常を検出することや、ＡＢＣＧ２のトランスポーター機能を制御することで薬剤の吸収を制御し、生体内に産生される代謝産物の排出を制御しようとする技術が多数提案されている。
【０００５】
また、前記したＡＢＣＧ２遺伝子のＱ１４１Ｋ変異は、遺伝子の発現産物であるトランスポータータンパク質のフォールディングに影響していることがわかっている。
タンパク質のフォールディングは分子シャペロンによってなされるが、近年分子シャペロンに加えて、タンパク質のフォールディングに係る低分子化合物のケミカルシャペロン又は薬理シャペロンと呼ばれる低分子物質が見いだされている。特許文献７にはチオシアロオリゴ糖結合デンドリマーのヒトノイラミニダーゼのケミカルシャペロンとする技術が記載されている。特許文献８には、２−アセトアミド−１，２−ジデオキシノジリマイシンおよびＮ−アセチルグルコサミン−チアゾリンをガングリオシダーゼの薬理シャペロンとする技術が記載されている。しかしＡＢＣＧ２遺伝子のＱ１４１Ｋ変異遺伝子の発現産物であるＡＢＣＧ２トランスポータータンパク質の発現後のフォールディングと糖鎖修飾に係る薬理シャペロンは、現在のところ見出されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００９／０７２２６７号
【特許文献２】国際公開第２０１０／１５０５２５号
【特許文献３】特表２００５−５２９６１８号公報
【特許文献４】特開２０１５−２３１９９３号公報
【特許文献５】特開２００４−１６０４２号公報
【特許文献６】特表２００９−５１４７９３号公報
【特許文献７】特開２０１３−６３９３３号公報
【特許文献８】特開２０１６−４１７４１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】高田龍平、松尾洋孝、生化学  第８３巻  第１２号、１１３１〜１１３５、２０１１年
【非特許文献２】東京薬科大学・防衛医科大学・東京大学の連名による２０１２年４月２付  プレスリリース
【非特許文献３】田村藍、安然、大西裕子、石川智久、日薬理誌  第１３０巻、２７０〜２７４、２００７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、ＡＢＣＧ２遺伝子の多型性を研究する過程で、前記した機能低下を伴い多型性頻度も高い変異体である４２１Ｃ＞Ａ（Ｑ１４１Ｋ）に着目した。この変異遺伝子をトランスポーターとして細胞表面で正常機能を有するように発現させる薬理シャペロンについて探索を進め、トコトリエノールとトコフェロールに薬理シャペロン作用を見いだし、本発明をなした。
【０００９】
すなわち本発明は、ＡＢＣＧ２遺伝子のＱ１４１Ｋ変異体の発現後に、タンパク質として正常にフォールディングさせ、糖鎖修飾させるための薬理シャペロンを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）トコトリエノール及び／又はトコフェロールを有効成分とする、ＡＢＣＧ２遺伝子の変異体であるＱ１４１Ｋの発現産物であるトランスポータータンパク質の正常フォールディングの機能を有する薬理シャペロン組成物。
（２）腸管への生体内代謝物の排泄が阻害されている疾患治療のための（１）に記載の薬理シャペロン組成物。
（３）腸管からの薬剤吸収を正常化するための（１）に記載の薬理シャペロン組成物。
（４）経口投与の形態である（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）トコトリエノール及び／又はトコフェロールを有効成分とする、ＡＢＣＧ２遺伝子のＱ１４１Ｋ変異体の発現産物であるトランスポータータンパク質の正常フォールディングに作用する薬理シャペロンとしての飲食品組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、ＡＢＣＧ２遺伝子のＱ１４１Ｋ変異体の発現産物であるトランスポータータンパク質の正常フォールディングのための薬理シャペロンが提供される。また、トコトリエノール及び／又はトコフェロールを含むＡＢＣＧ２遺伝子のＱ１４１Ｋ変異体の発現産物であるトランスポータータンパク質のフォールディング作用を有する組成物が提供される。この組成物は、ＡＢＣＧ２遺伝子のＱ１４１Ｋ変異に由来する腸管排泄の抑制のある尿酸等生体内代謝産物の、腸管内への排泄を促進できる。このため高尿酸血症などの種々の病態の治療・予防、あるいは抗がん剤の吸収正常化に役立つことが期待される。また、薬物治療時に発生するスルファサラジンの消化管における吸収量の上昇、ロスバスタチンやフルバスタチンの経口投与時の血中濃度の上昇などの薬剤副作用の低減に有効である。更にＱ１４１Ｋ変異を含めたＡＢＣＧ２遺伝子多型によるポルフィリン症と皮膚光線過敏症の治療や予防に有効であることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】高尿酸血症患者において確認されたヒトＡＢＣＧ２のトポロジーモデル及び非同義的変異部位示す模式図である。なお本図面は非特許文献１及び特許文献４の記載に基づく図面である。
【図２】一過的に発現させたＡＢＣＧ２  野性型（ＷＴ）及びＱ１４１Ｋ変異体の共焦点レーザー顕微鏡を用いた局在解析の結果を示す画像である。図中の白抜き部分がＡＢＣＧ２の局在を示している。左はＷＴ、右はＱ１４１Ｋを導入した細胞である。
【図３】一過的に発現させたＡＢＣＧ２  ＷＴ及びＱ１４１Ｋ変異体導入細胞のフェオフォルビドＡＢＣＧ２をマーカーとしたＦＡＣＳ解析の結果を示す。左はＷＴ、右はＱ１４１Ｋを導入した細胞である。
【図４】上段は、一過的に発現させたＡＢＣＧ２  ＷＴ及びＱ１４１Ｋ変異体導入細胞のフェオフォルビド（ＰＰＢ）排泄をマーカーとしたＦＡＣＳ解析の結果を示す。左はＷＴ、右はＱ１４１Ｋを導入した細胞である。下段は、同じく一過的に発現させたＡＢＣＧ２  ＷＴ及びＱ１４１Ｋ変異体導入細胞の機能をＦＴＣで阻害し、フェオフォルビド排泄をマーカーとしたＦＡＣＳ解析の結果を示す。左はＷＴ、右はＱ１４１Ｋを導入した細胞である。
【図５】トランスフェクション後トコフェロールを４８時間処理した細胞のウエスタンブロッティング画像である。
【図６】トランスフェクション後トコトリエノールを４８時間処理した細胞のウエスタンブロッティング画像である。
【図７】δ−トコトリエノール（δＴ３）の薬理シャペロン作用の確認試験において、δＴ３がＫＰ−１の排泄を促進する薬理シャペロンとして作用していることを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、トコトリエノール及び／又はトコフェロールを有効成分とする、ＡＢＣＧ２遺伝子のＱ１４１Ｋ変異体の発現産物であるトランスポータータンパク質のフォールディングを是正する薬理シャペロンに係る。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明でいう薬理シャペロンとは、遺伝子の発現産物であるタンパク質が正しく折りたたまれるように作用する分子シャペロンに、補助的に作用する低分子の化合物をいう。
本発明に係るＡＢＣＧ２遺伝子の変異体Ｑ１４１Ｋの発現産物であるトランスポータータンパク質は、図１に示す模式図で表される。ＡＢＣＧ２遺伝子の全コーディング領域の塩基配列を解析し、アミノ酸に変化がみられた５種類の変異（Ｖ１２Ｍ、Ｑ１２６Ｘ、Ｑ１４１Ｋ、Ｓ４４１Ｎ、Ｆ５０６ＳｆｓＸ４）が記載されている。なお、＃はＮ結合糖鎖部位（Ｎ５９６）を示し、＊はジスルフィド結合のシステイン残基（Ｃ５９２、Ｃ６０３、Ｃ６０８）を示す。Ｖ１２Ｍ、Ｑ１２６Ｘ、Ｑ１４１Ｋは、細胞内のＮ末端領域に存在するＳＮＰである。このようなＳＮＰの対立遺伝子頻度は日本人において非常に多く、従来技術で説明の通り、Ｑ１４１Ｋ  ３１．９％、Ｖ１２Ｍ  １９．２％、Ｑ１２６Ｘ  ２．８％であるとの報告がある（非特許文献１参照）。
本発明においては、Ｑ１４１Ｋの変異に伴うＡＢＣＧ２タンパク質のフォールディング異常を発生させないために適用される。Ｑ１４１Ｋの変異に伴うＡＢＣＧ２タンパク質のフォールディング異常は、尿酸輸送能の不全、或いはそれに起因する高尿酸血症、更にポルフィリン輸送能の不全、或いはそれに起因する皮膚光線過敏症として発症する場合がある。また、スルファサラジンの消化管吸収の上昇、ロスバスタチンやフルバスタチンの経口投与時の血中濃度の上昇などを引き起こす可能性がある。またこのような副作用は、遺伝子の多型性から考えると高頻度で発生する可能性がある。
この遺伝子異常（多型性）を検出するためには、ダイレクトシークエンス法、ＢＡＣアレイＣＧＨ法、ＦＩＳＨ法、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、インベーダー法、ＨＲＭ法、ＳｍａｒｔＡｍｐ法、Ｑ−ｐｒｏｂｅ法（ＱＰ法）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、モレキュラービーコン法、ＲＣＡ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法などの公知のいずれかの方法が使用可能である。
【００１４】
遺伝子検査の結果Ｑ１４１Ｋの変異が検出された患者は、ＡＢＣＧ２遺伝子の発現産物であるＡＢＣＧ２タンパク質（トランスポータータンパク質）のフォールディングが正常に進行しないため、トランスポーター機能を正常に発揮できない。これを正常化するためには、ＡＢＣＧ２遺伝子の発現に当たり、薬理シャペロンを共存させると、遺伝子発現後の正常なフォールディングが進行し、さらに糖鎖が結合し、ＡＢＣＧ２トランスポーターの正常な機能が復活する。
【００１５】
本発明の、ＡＢＣＧ２遺伝子の変異体Ｑ１４１Ｋの発現産物であるトランスポータータンパク質のフォールディングに働く薬理シャペロンの有効成分であるトコフェロールは、植物油等に含まれる脂溶性ビタミンで、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロールの４種が挙げられる。トコトリエノールは、トコフェロールの関連化合物で、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、δ−トコトリエノールの４種が挙げられる。これらは天然物由来であっても合成品であってもよい。
トコトリエノールまたはトコフェロールを薬理シャペロンの有効成分として用いる場合、これらの誘導体としてもよい。具体的には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、よって生じる塩類、アルコールや脂肪酸、アルキルハロゲナイド類などとの反応によって得られるアルキルエステルなどのエステル類およびそれらの塩類、また、リン酸基を導入したリン酸化化合物、硫酸基を導入した硫酸化化合物、さらに、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコールのようなＣ２〜Ｃ４の程度の炭素鎖を有するアルキレンオキサイド類との反応によって得られるアルキルエーテル誘導体、グリシジルトリアルキルアンモニウムハロゲナイドの如く第４級アミンを分子内に有する基質との反応に生じる第４級アルキルアミン誘導体およびその塩類といった形で利用できる。
【００１６】
本発明の薬理シャペロンは、トコトリエノールもしくはトコフェロールの精製物、または、トコトリエノールやトコフェロールを高濃度に含む大豆抽出物、米油抽出物、ナタネ油抽出物やアナトー油抽出物をそのまま公知の方法で経口投与製剤の形態にしてもよい。
【００１７】
また、精製トコトリエノールやトコフェロール、トコトリエノールやトコフェロールを高濃度に含む大豆抽出物、米油抽出物、ナタネ油抽出物やアナトー油抽出物等を、本発明の薬理シャペロンとして用いる場合は、例えば、油脂、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンあるいはこれらの混合物に溶解して液状にし、これを希釈して飲用するか、あるいは飲料に添加するか、固形食品に添加することも可能である。さらに、必要に応じてデキストリン等の粉末又は粒状バインダーと混合して粉末状あるいは顆粒状にし、固形食品に添加することも可能である。
【００１８】
薬理シャペロンとしてトコトリエノール及び／又はトコフェロールを投与する場合の投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常成人一人あたり、１回につき１ｍｇ〜５０００ｍｇの範囲で、１日１回から数回経口投与することが好ましい。経口投与することで、消化管を構成する細胞に対して、トコトリエノール及び／又はトコフェロールが薬理シャペロンとして作用する。その結果、消化管内の細胞で発現するＡＢＣＧ２トランスポーターのフォールディングと糖鎖結合を正常に進行させる。
【実施例】
【００１９】
試験１
以下にＡＢＣＧ２遺伝子の発現産物の細胞膜局在性試験例及びトコトリエノール及び／又はトコフェロールによるシャペロン作用による変異ＡＢＣＧ２遺伝子の発現産物であるトランスポーターのフォールディングの正常化例を示し、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
＜ＡＢＣＧ２遺伝子の正常型と変異型の細胞膜局在性相違の確認試験＞
１．ＡＢＣＧ２遺伝子変異体（Ｑ１４１Ｋ）とＡＢＣＧ２遺伝子野性型（ＷＴ）の発現産物の細胞内分布の相違確認試験
（１）ＤＮＡコンストラクトの作製  
（１−１）ヒトＡＢＣＧ２野性型（ＷＴ型）
ヒトＡＢＣＧ２（ＷＴ型）ｃＤＮＡ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）及び哺乳類発現用ベクターのｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をそれぞれｉＰｒｏｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いたＰＣＲ法により増幅し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてｐＥＧＦＰベクターにヒトＡＢＣＧ２遺伝子を組み込んだ（ｐＥＧＦＰ−ＡＢＣＧ２）。このコンストラクトを細胞に導入するとＮ末端に強化緑色蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＥＧＦＰ）を融合したＡＢＣＧ２を発現する。
なお、ヒトＡＢＣＧ２全長は特許文献３等に開示されている。また、ｐＥＧＦＰベクター増幅に使用したプライマー及びＰＣＲ条件は次のとおりである。
ABCG2 sense primer: 5’-gagctgtacaagtccatgtcttccagtaatgtcgaag-3’     配列番号１
ABCG2 antisense primer: 5’-taccgtcgactgcagttatcaagaatattttttaagaaataac-3’
配列番号２
pEGFP sense primer: 5’-aaatattcttgataactgcagtcgacggtaccgcg-3’       配列番号３
pEGFP antisense primer: 5’-gacattactggaagacatggacttgtacagctcgtccatgcc-3’
配列番号４
ＰＣＲ条件
１．９８℃  ３０秒
２．９８℃  １０秒
３．６８℃  ３０秒
４．７２℃    ２分
５．２〜４を３０サイクル実施する。
６．７２℃  １０分
【００２１】
（１−２）ヒトＡＢＣＧ２変異体（Ｑ１４１Ｋ）
上記（１−１）にて作製したｐＥＧＦＰ−ＡＢＣＧ２を鋳型にＰＣＲ法により増幅した配列と変異導入箇所のＤＮＡを合成した配列をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてＡＢＣＧ２に導入し、４２１番目の塩基がシトシンからアデニンに変換したＡＢＣＧ２変異体のコンストラクトを作製した（ｐＥＧＦＰ−ＡＢＣＧ２（Ｑ１４１Ｋ））。このコンストラクトより発現したＡＢＣＧ２は、１４１番目のグルタミン（Ｑ）がリジン（Ｋ）に変換された変異体となる。
ｐＥＧＦＰ−ＡＢＣＧ２増幅に使用したプライマー、合成したオリゴＤＮＡ及びＰＣＲ条件は次のとおりである。
ABCG2_Q141K sense primer: 5’-agcagctcttcggcttgcaacaactatgacgaatcatg-3’
配列番号５
ABCG2_Q141K antisense primer: 5’-acgtcagagtgcccatcacaacatcatcttgtaccac-3’  
配列番号６
Q141K oligo sense primer: 5’-gggcactctgacggtgagagaaaacttaaagttctcagcagctcttcggc
t-3’                                   配列番号７
Q141K oligo antisense primer: 5’-agccgaagagctgctgagaactttaagttttctctcaccgtcagag
tgccc-3’                           配列番号８
ＰＣＲ条件
１．９８℃  ３０秒
２．９８℃  １０秒
３．６８℃  ３０秒
４．７２℃    ２分
５．２〜４を３０サイクル実施する。
６．７２℃  １０分
【００２２】
上記（１−１）及び（１−２）にて作製した野性型と変異型ＡＢＣＧ２の配列はプレミックスシーケンス解析サービス（タカラバイオ）を利用して確認を行った。シーケンス用ｐｒｉｍｅｒは下記の通りである。
sense: 5’-aatgtcgtaacaactccgcc-3’                                 配列番号９
sense: 5’-agctcgccgaccactaccagc-3’                                配列番号１０
sense: 5’-agtgtttcagccgtggaactc-3’                                配列番号１１
sense: 5’-agaaaaaggactagtatagg-3’                                 配列番号１２
sense: 5’-agtgtttcagccgtggaactc-3’                                配列番号１３
【００２３】
（２）ＡＢＣＧ２  ＷＴ及びＱ１４１Ｋ発現細胞の作製
１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）にて培養したヒト腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣより購入）に、上記（１−１）及び（１−２）にて作製したプラスミドをＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてトランスフェクションし、これを、一過的発現系を用いた実験に供した。
【００２４】
（３）共焦点レーザー顕微鏡を用いたＡＢＣＧ２発現産物の細胞内分布の相違確認試験（細胞内局在性解析）
上記（１−１）及び（１−２）にて作製したプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、２４時間後、ポリＬ−リジンコートされたガラスボトムディッシュ（ＩＷＡＫＩ）に細胞を播種し直し、更に２４時間培養した。その後、培養液をＨａｎｋ’ｓ液（Ｇｉｂｃｏ）に交換した。細胞は、ＥＧＦＰの蛍光を指標に共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス）による局在解析に供した。
【００２５】
（４）結果及び考察
一過的に発現させたＡＢＣＧ２  ＷＴ及びＱ１４１Ｋ変異体の共焦点レーザー顕微鏡を用いた局在解析の結果を図２に示す。ＷＴは細胞膜に強く発現しているのに対して、Ｑ１４１Ｋ変異体は細胞膜には局在していなかった。おそらく小胞体の品質管理機構を抜け出せず、プロテオソーム系の分解経路に進んでいることが予想された。すなわち変異型ＡＢＣＧ２はトランスポーターの機能を果たしていないことが予想された。
【００２６】
２．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）を用いた細胞内局在性解析
・一時発現した細胞のＦＡＣＳによる解析試験
（１）試験方法
上記試験で作製したプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、４８時間後、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅとなるよう１．５ｍｌ用マイクロチューブに細胞を回収した。その後、細胞は抗ＡＢＣＧ２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１００倍希釈）、Ａｌｅｘａ６３３標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）（５００倍希釈）及び２％牛胎児血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有したＨａｎｋ’ｓ液に室温３０分反応させ、Ｈａｎｋ’ｓ液にて洗浄・再懸濁後、ＦＡＣＳに供した。ＦＬ−１にてＥＧＦＰを、ＦＬ−４にてＡｌｅｘａ６３３の蛍光強度を測定した。
【００２７】
（２）結果及び考察
結果を図３に示す。ＨＥＫ２９３細胞に一過的に発現させたＡＢＣＧ２  ＷＴの発現産物が細胞膜に局在する細胞比率は全体の４１．７％であったのに対し、Ｑ１４１Ｋ変異体を発現させた細胞では、その比率が２１．３％まで低下した。
以上の結果よりＱ１４１Ｋ変異体の発現産物はＷＴと比べ細胞膜に局在していないことが明らかとなった。またウエスタンブロッティングにより、糖鎖修飾の違いも認められた（変異体は成熟バンドが薄い）。
【００２８】
３．ＡＢＣＧ２機能に及ぼす影響確認試験
・フェオフォルビド（Ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ：ＰＰＢ）輸送活性測定
ＡＢＣＧ２の基質であり蛍光物質のＰｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ（ＰＰＢ）を用いた解析を行った。
（１）試験方法
６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＢＤ）に５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようＨＥＫ２９３細胞を播種し、翌日、上記（１−１）及び（１−２）にて作製したプラスミドをトランスフェクションした。その４８時間後、ＡＢＣＧ２の輸送基質であり蛍光を発するＰＰＢ（フナコシ）を最終濃度５μＭとなるよう添加し１時間処理した。またＡＢＣＧ２の機能を確認するため阻害剤のｆｕｍｉｔｒｅｍｏｒｇｉｎ  Ｃ（ＦＴＣ）（フナコシ）を５μＭ添加した。細胞は１．５ｍｌ用マイクロチューブに回収後、Ｈａｎｋ’ｓ液にて洗浄・再懸濁しＦＡＣＳに供した。ＦＬ−１にてＥＧＦＰを、ＦＬ−４にてＰＰＢの蛍光強度を測定した。
【００２９】
（２）結果
試験結果を図４上段及び下段に示す。ＷＴが導入された細胞（ＥＧＦＰポジティブ）では未導入の細胞（ＥＧＦＰネガティブ）に比べ細胞内ＰＰＢ蓄積量が低値となった（図４上段）。
さらにＦＴＣ処理によりＡＢＣＧ２機能が阻害されるとＰＰＢ蓄積が認められた（図４下段）。この結果は、ＡＢＣＧ２によるＰＰＢの細胞外排泄活性を示している。すなわち、ＡＢＣＧ２は細胞外へのトランスポーターとして機能していることが明らかとなった。
【００３０】
以上の試験からＡＢＣＧ２のトランスポーターとしての機能を評価できることが示された。
続いて、Ｑ１４１Ｋ変異体の機能を評価するため、Ｑ１４１Ｋ変異体発現細胞を試験した。その結果、ＷＴに比べ細胞内ＰＰＢ蓄積が増大することが認められ、ＡＢＣＧ２機能が低下していることが観察された。これら結果はＱ１４１Ｋ変異体が細胞膜に局在していないためと考えられた。
【００３１】
＜トコトリエノール及び／又はトコフェロールのシャペロン作用による変異ＡＢＣＧ２遺伝子の発現産物であるトランスポーターのフォールディング正常化確認試験＞
トコトリエノールとトコフェロールがＡＢＣＧ２変異体（Ｑ１４１Ｋ）の遺伝子発現においてシャペロンとして作用することを確認した。
１．試験方法
（１）ＡＢＣＧ２変異体（Ｑ１４１Ｋ）の遺伝子発現細胞の処理
上記の一過性発現細胞を安定発現細胞とするため、トランスフェクション後４８時間から最終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるようＧ４１８−ｓｕｌｆａｔｅ（和光純薬工業）を加えて継代培養を続け、薬剤耐性を獲得した細胞を安定発現細胞として本試験に用いた。
１２ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＢＤ）に５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようＡＢＣＧ２変異体（Ｑ１４１Ｋ）安定発現細胞を播種し、翌日、被験物質を添加し２４時間処理した。被験物質はα、γ、δ体のトコフェロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びトコトリエノール（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の計６種類をそれぞれ３段階の濃度となるよう添加した。また、陽性対照として、Ｃｏｒｒｅｃｔｏｒ  ４ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いた。Ｃｏｒｒｅｃｔｏｒ  ４ａは元来ＡＢＣトランスポーターの一つであり、嚢胞性線維症の原因となるＣＦＴＲ変異体（ΔＦ５０８）に対して薬理シャペロンを示す化合物であるが、ＡＢＣＧ２変異体（Ｑ１４１Ｋ）に対しても同様の作用を示す
ことが報告されている（ＰＮＡＳ．２０１３．１１０（１３）：ｐ．５２２３-５２２８．）。被験物質処理後の細胞は、ＰＢＳにて洗浄後、界面活性剤の入ったＲＩＰＡ液にて細胞を溶解させ回収した。回収したＲＩＰＡ液は１４０００ｒｐｍ、４℃、１０分の条件にて遠心分離し、得られた上清をタンパク定量後（ＢＣＡ法）、解析試料として用いた。
【００３２】
（２）ウエスタンブロッティングによる発現解析
得られた解析試料は、ＳＤＳ化後、７．５％プレキャストポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた電気泳動にてタンパク質を分離し、トランスブロットＴｕｒｂｏシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によりＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写した。その後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（ナカライテスク）を用いてブロッキングし、一次抗体に抗ＧＦＰ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、二次抗体に抗マウスＩｇＧ−ＨＰＲ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、発光剤にＥＣＬ−Ｐｒｉｍｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて化学発光させた。検出はＬＡＳ−４０００  ｍｉｎｉ（富士フィルム）を用いて行い、得られたデジタル画像はＭｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ（富士フィルム）を用いて解析した。
【００３３】
２．結果
ＡＢＣＧ２変異体（Ｑ１４１Ｋ）に対する薬理シャペロン作用が報告されている陽性対照のＣｏｒｒｅｃｔｏｒ  ４ａ（５μＭ；これ以上の濃度では毒性が認められる）をＱ１４１Ｋ安定発現細胞に２４時間処理し、ウエスタンブロッティングにより評価した。
（１）陽性対照の結果
Ｑ１４１Ｋ変異体のウエスタンブロット像は、糖鎖修飾の違いによるダブルバンドを示した。そしてＣｏｒｒｅｃｔｏｒ  ４ａは、下記表１に示すように、コントロールと比較して１．４倍、高分子側の成熟ＡＢＣＧ２の発現を高めることが示された（表１）。すなわち、Ｃｏｒｒｅｃｔｏｒ  ４ａは、薬理シャペロンとして作用し、正常なフォールディングと糖鎖修飾をＱ１４１Ｋ変異体にもたらすことが確認された。
【００３４】
【表１】
2018024644.tif 000003
【００３５】
（２）トコフェロール及びトコトリエノールの薬理シャペロン作用
同様にトコフェロール及びトコトリエノールの試験結果を表２、表３、図５、図６に示す。
【００３６】
【表２】
2018024644.tif 000004
【００３７】
【表３】
2018024644.tif 000005
【００３８】
表２、表３、図５、図６から、トコフェロール、トコトリエノールは濃度依存性で成熟ＡＢＣＧ２バンド量を増加させていたことが明らかとなった。また糖鎖修飾を促進してい
ることが明らかである。この結果から、トコフェロールとトコトリエノールは、濃度依存的にＡＢＣＧ２遺伝子の発現産物に対して薬理シャペロンとして作用することが確認された。
【００３９】
試験２
次いでδ−トコトリエノール（δＴ３）によるシャペロン作用によって変異ＡＢＣＧ２遺伝子の発現産物であるトランスポーターが正常に作用して、細胞外への排泄を促進するようになることを確認した試験を示す。
（１）試験方法
ＫＰ−１排泄活性の測定
δＴ３の薬理シャペロンによるＡＢＣＧ２（Ｑ１４１Ｋ）発現量の増加がＡＢＣＧ２機能亢進と連動しているのかを明らかにするため、ＡＢＣＧ２の基質となる蛍光物質ＫＰ−１を用いて、その排泄活性を測定した。
ポリ−Ｌ−リジンコートされた２４  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ）に２．５×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようＡＢＣＧ２変異体（Ｑ１４１Ｋ）安定発現細胞を播種し４８時間培養した。その後、被験物質としてδＴ３を最終濃度３０μＭ、２４時間処理した（ｃｏｎｔｒｏｌにはエタノールを添加）。次にＡＢＣＧ２の輸送基質であり蛍光物質のＫＰ−１（五稜化学）とＡＢＣＧ２阻害剤であるＦＴＣをそれぞれ最終濃度１μＭ及び２μＭとなるよう同時に１時間処理し、ＫＰ−１を細胞に取込ませた。その後、細胞を洗浄し、１０％ＦＢＳ含有フェノールレッドフリーのＤＭＥＭ（ｇｉｂｃｏ）に培地交換し、３７℃、５％ＣＯ２下、１時間、ＫＰ−１を排泄させた。回収した培地は１４，０００ｒｐｍ、４℃、５分の条件にて遠心分離し、得られた上清の蛍光強度（励起波長４８０ｎｍ、検出波長５２９ｎｍ）を測定し、細胞外ＫＰ−１量とした。また、細胞はＰＢＳにて洗浄後、ＲＩＰＡ液にて溶解させ回収した。回収したＲＩＰＡ液は１４，０００ｒｐｍ、４℃、１０分の条件にて遠心分離し、得られた上清の蛍光強度（励起波長４８０ｎｍ、検出波長５２９ｎｍ）を測定し、細胞内ＫＰ−１量とした。ＫＰ−１排泄活性は、下記式より算出した。
ＫＰ−１排泄活性（％）＝細胞外ＫＰ−１量／（細胞外ＫＰ−１量＋細胞内ＫＰ−１量）×１００
【００４０】
（２）結果及び考察
ＫＰ−１排泄活性
図７にδＴ３添加細胞と無添加細胞のＫＰ−１排泄活性を測定した結果を示す。
ＡＢＣＧ２変異体（Ｑ１４１Ｋ）安定発現細胞のδＴ３無添加（ｃｏｎｔｒｏｌ）におけるＫＰ−１排泄活性は２７．１±０．３６％であったのに対して、δＴ３（３０μＭ）添加処理によりその排泄活性は３８．７±１．２３％と明らかな増加が認められた。
したがって、δＴ３はＱ１４１Ｋ変異体のＫＰ−１排泄活性を亢進させるが、その作用は薬理シャペロン作用によることが明らかとなった。
【図１】
2018024644.tif 000006
【図２】
2018024644.tif 000007
【図３】
2018024644.tif 000008
【図４】
2018024644.tif 000009
【図５】
2018024644.tif 000010
【図６】
2018024644.tif 000011
【図７】
2018024644.tif 000012
【配列表】
2018024644000001.app