(57)【要約】      （修正有）【課題】間質性膀胱炎及び／又は有痛性膀胱症候群及び／又は膀胱痛症候群の疼痛及び／又は下部尿路症状を治療医するための医薬品組成物の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び、他の特定のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体とヒトＮＧＦとの結合について競合する抗体であって、ＮＧＦ依存性ニューロンの生存を阻害する抗体を含む医薬品組成物、及び有効量の抗ＮＧＦ拮抗抗体と対象に有効量の抗体を投与するための指示書とを含むキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する下部尿路症状の治療または予防のための医薬組成物であって、以下の（ｂ）の抗ＮＧＦ拮抗抗体を含む、医薬組成物。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体とヒトＮＧＦとの結合について競合する抗体であって、ＮＧＦ依存性ニューロンの生存を阻害する抗体。
【請求項２】
間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する下部尿路症状が、貯蔵（刺激性）、排尿（閉塞性）または排尿後症状を含む群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
貯蔵症状が切迫、頻発、夜間多尿、切迫尿失禁および緊張性尿失禁を含み、過活動膀胱（ＯＡＢ）および良性前立腺肥大（ＢＰＨ）と関連している場合がある、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
排尿症状が、躊躇、流れの不良、間欠性、いきみおよび排尿障害を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
排尿後症状が、終末時滴下、排尿後滴下および残尿感を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する下部尿路症状の治療または予防に使用するための、有効量の抗ＮＧＦ拮抗抗体と対象に有効量の抗体を投与するための指示書とを含むキットであって、抗ＮＧＦ拮抗抗体が以下の（ｂ）である、キット。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体とヒトＮＧＦとの結合について競合する抗体であって、ＮＧＦ依存性ニューロンの生存を阻害する抗体。
【請求項７】
対象において間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する下部尿路症状を治療または予防するための医薬品の製造における抗ＮＧＦ拮抗抗体の使用であって、抗ＮＧＦ拮抗抗体が以下の（ｂ）である、使用。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を含
む軽鎖可変領域を含む抗体とヒトＮＧＦとの結合について競合する抗体であって、ＮＧＦ
依存性ニューロンの生存を阻害する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状（ＬＵＴＳ）の治療または予防における抗ＮＧＦ抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
間質性膀胱炎（ＩＣ）とは、骨盤痛などの疼痛、および尿意の回数／切迫の増加などの下部尿路症状（ＬＵＴＳ）の症状によって特徴づけられている、原因不明の慢性膀胱疾患である。より最近では、この用語は、ＩＣと共に有痛性膀胱症候群（ＰＢＳ）（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ  ＳＡら、Ｒｅｖ  Ｕｒｏｌ  ２００７、９（１）：９〜１６）または膀胱痛症候群（ＢＰＳ）（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｒｖｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  ５３（２００８）６０〜６７が含まれるように、すなわち、この症状の複合を総称するためにＩＣ／ＰＢＳ／ＢＰＳと発展している。
【０００３】
ＩＣ／ＰＢＳ／ＢＰＳの有病率は、６７〜２３０人／１００，０００人の女性が臨床的に確認された疾患に罹患しているとして変動するが、数値は、一般的には子宮内膜症、再発性尿路感染症、過活動膀胱または外陰部痛としての過小診断または誤診断が原因で、これよりも高い可能性がある（Ｆｏｒｒｅｓｔ  Ｊ  Ｂら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｕｒｉｅｒ  ２００６、２４（３）：１〜８）。ＩＣは生活の質に顕著な影響を与え、旅行、家族関係、および雇用に影響を与え（Ｓｌａｄｅ  Ｄら、Ｕｒｏｌ  １９９７、４９（５Ａ補遺）：１０〜３）、また、鬱症状に関連している（Ｒｏｔｈｒｏｃｋ  Ｎ  Ｅら、Ｊ  Ｕｒｏｌ  ２００２、１６７：１７６３〜１７６７）。
【０００４】
ＩＣに向けられた治療の、良好に行われたプラセボ比較のランダム化された治験がいくつか存在し、治療は多くの場合、多様式の試行錯誤手法からなり、これは、１８３種の異なる種類の治療を報告している間質性膀胱炎データベース研究における患者の１つの総説から明白である（Ｒｏｖｎｅｒ  Ｅら、Ｊ  Ｕｒｏｌ  ２０００、５６：９４０〜５）。
【０００５】
単一の病因学は同定されておらず、これは、上皮細胞機能不全、Ｃ−神経線維の活性化、および肥満細胞の増殖の自己永続性のプロセスを引き起こし、組織の損傷、瘢痕および線維症の悪化をもたらす、いくつかの泌尿器傷害を有する多因子のプロセスである可能性が高い。炎症からのＣ線維の反復刺激、および膀胱中の感覚神経のアップレギュレーションは、最終的には永久の変更（集中化）をもたらし、その結果、痛覚異常過敏、慢性膀胱痛および排尿機能不全がもたらされる（Ｆｏｒｒｅｓｔ  Ｊ  Ｂら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｕｒｉｅｒ  ２００６、２４（３）：１〜８）。
【０００６】
ＩＣの根本的な原因について意見の一致には達していないが、既存のデータから、３つの病態生理学的な機構が示唆されている可能性があるという推測がもたらされている：上皮機能不全、肥満細胞活性化、および神経因性炎症（Ｎａｚｉｆ  Ｏら、Ｕｒｏｌ  ２００７、６９（補遺４Ａ）：２４〜３３）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在利用可能な治療の有害作用または限定された有効性がない、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群の疼痛および／または下部尿路症状の新規の有効な治療を提供する必要性が持続して存在する。
【０００８】
組換えヒト抗ＮＧＦ（神経成長因子）抗体を間質性膀胱炎に罹患している患者で試験したことが報告されている（Ｄｉｍｉｔｒａｋｏｖら、Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ．第１７１（４）巻、補遺、３６３（２００４））。研究の目的は、「顕著な神経損傷および神経因性疼痛の構成要素を有し、数々の以前の治療が成功しなかったＩＣ患者群における」有効性および安全性を評価することであったが、尿中神経損傷マーカーレベルを用いて、神経損傷に対する効果しか報告されていない。状態の疼痛および／または下部尿路症状の治療における有効性は報告されていないことに注意することが重要である。
【０００９】
抗ＮＧＦ抗体Ｅ３は、関節リウマチ痛、骨関節炎疼痛および手術後疼痛を含めた疼痛の治療において有用であることが、以前に報告されている（たとえばＷＯ２００４／０５８１８４を参照）。しかし、間質性膀胱炎の病因学および状態の機構の理解が乏しいことを考慮すると、抗体Ｅ３などの抗ＮＧＦ抗体を、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状（ＬＵＴＳ）の治療に使用できるとは容易に予測できない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様では、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状（ＬＵＴＳ）を治療または予防する方法であって、有効量の抗ＮＧＦ拮抗抗体を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体は、
（ａ）約２ｎＭ以下のＫＤでＮＧＦと結合し、
（ｂ）約１００ｐＭ以下のＩＣ５０でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を阻害し（ただし、ＩＣ５０は約１５ｐＭのヒトＮＧＦの存在下で測定する）、および／または
（ｃ）約１０ｐＭ以下のＩＣ５０でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を阻害する（ただし、ＩＣ５０は約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下で測定する）。
【００１１】
間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛は、下腹部（骨盤）痛、膀胱痛、恥骨上痛、膣痛、陰茎、精巣、陰嚢および会陰の疼痛、尿道痛、性交疼痛、膀胱が満たされるにつれて増加し得る疼痛、圧力または不快感を含む。
【００１２】
下部尿路症状は３つの群の泌尿器症状を含み、これらは、貯蔵（刺激性）、排尿（閉塞性）および排尿後の症状として定義し得る。貯蔵症状は、切迫、頻発、夜間多尿、切迫尿失禁および緊張性尿失禁を含み、これは、過活動膀胱（ＯＡＢ）および良性前立腺肥大（ＢＰＨ）と関連している場合がある。排尿症状は、躊躇、流れの不良、間欠性、いきみおよび排尿障害を含む。排尿後症状は、終末時滴下、排尿後滴下および残尿感を含む。
【００１３】
過活動膀胱（ＯＡＢ）とは、緊迫性尿失禁を伴ったまたは伴わない、通常は頻発および夜間多尿を伴った切迫として定義される［Ａｂｒａｍｓら、Ｎｅｕｒｏｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｕｒｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ２１：１６７〜１７８（２００２）］。男性および女性のＯＡＢの有病率は同様であり、米国の集団の約１６％がこの状態を患っている［Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｏｖｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｂｌａｄｄｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ：Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＮＯＢＬＥ  Ｐｒｏｇｒａｍ、第２回国際失禁会議（ｔｈｅ  ２ｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｃｏｎｔｉｎｅｎｃｅ）に提出されたアブストラクト、２００１年７月、フランスＰａｒｉｓ］。
【００１４】
用語ウェットＯＡＢおよびドライＯＡＢとは、それぞれ尿失禁を伴ったまたは伴わないＯＡＢ患者を説明している。以前は、ＯＡＢの主症状は尿失禁であると考えられていた。しかし、新しい用語の出現に伴って、これは、失禁者ではない多数の罹患者（すなわちドライＯＡＢ患者）にとって明らかに無意味である。したがって、Ｌｉｂｅｒｍａｎら［Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ａｍｏｎｇ  Ａｄｕｌｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｏｆ  Ｏｖｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｂｌａｄｄｅｒ：Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｆｒｏｍ  Ａ  ＵＳ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｕｒｖｅｙ、Ｕｒｏｌｏｇｙ  ５７（６）、１０４４〜１０５０、２００１］の２００１年の研究は、米国集団の団体に基づいたサンプルの生活の質に対する、すべてのＯＡＢ症状の影響を調査した。この研究は、実証可能な尿損失を全く伴わないＯＡＢを患っている個体は、対照と比較して生活の質が損なわれていることを実証している。
【００１５】
ＢＰＨとは、急性尿貯留、再発性尿路感染症、膀胱結石および腎臓機能不全などの合併症をもたらす可能性がある、慢性的な進行性疾患である。男性におけるＢＰＨに関連するＬＵＴＳの有病率および平均重篤度は、年齢に伴って増加する。
【００１６】
ＢＰＨは前立腺の体積の増加をもたらし、それにより尿道および膀胱の流出閉塞ならびに膀胱機能の二次的変化がもたらされる。この効果は、貯蔵（刺激性）および排尿（閉塞性）の症状のどちらによっても顕在化される。
【００１７】
本発明によれば、抗ＮＧＦ拮抗抗体は、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状（ＬＵＴＳ）を阻害または遮断することができることが示されている。一部の実施形態では、疼痛および／または下部尿路症状は、抗ＮＧＦ拮抗抗体を投与した後の約２４時間以内に緩和される。一部の実施形態では、疼痛および／または下部尿路症状は、抗ＮＧＦ拮抗抗体を投与した後の約４日間以内に緩和される。一部の実施形態では、疼痛および／または下部尿路症状は、個体における状態の改善の指標が観察される前、またはその非存在下で緩和される。
【００１８】
本発明のさらなる態様では、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状（ＬＵＴＳ）を治療または予防する方法であって、
（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲ１領域、
（ｂ）配列番号４に示されるＣＤＲ２領域、および
（ｃ）配列番号５に示されるＣＤＲ３領域
を含む重鎖可変領域を含む、有効量の抗ＮＧＦ拮抗抗体を投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
本発明のさらなる態様では、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状（ＬＵＴＳ）を治療または予防する方法であって、
（ａ）配列番号６に示されるＣＤＲ１領域、
（ｂ）配列番号７に示されるＣＤＲ２領域、および
（ｃ）配列番号８に示されるＣＤＲ３領域
を含む軽鎖可変領域を含む、有効量の抗ＮＧＦ拮抗抗体を投与することを含む方法を提供する。
【００２０】
抗ＮＧＦ拮抗抗体は、
（ａ）配列番号３に示されるＣＤＲ１領域、
（ｂ）配列番号４に示されるＣＤＲ２領域、および
（ｃ）配列番号５に示されるＣＤＲ３領域
を含む重鎖可変領域をさらに含み得る。
【００２１】
抗ＮＧＦ拮抗抗体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含んでいてよく、抗体は、ＮＧＦと特異的に結合する。
【００２２】
抗ＮＧＦ抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域は、１つまたは複数の対応するフレームワーク突然変異を含み得る。一態様では、フレームワーク突然変異は、ヒトフレームワーク残基を相補的なネズミフレームワーク残基で置き換え得る。突然変異は、重鎖可変領域中に置換Ｖ７１Ｋを含み得る。
【００２３】
抗ＮＧＦ拮抗抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み得る、および／または配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。
【００２４】
抗ＮＧＦ拮抗抗体は、配列番号１および２に示されるアミノ酸配列を含む抗体であり得る。抗ＮＧＦ拮抗抗体は、配列番号１６および１７に示されるアミノ酸配列を含む抗体であり得る。
【００２５】
抗ＮＧＦ拮抗抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含んでいてよく、抗体は、ＮＧＦと特異的に結合する。
【００２６】
抗ＮＧＦ拮抗抗体は、本明細書中に定義するように、ＮＧＦが抗ＮＧＦ拮抗抗体と結合することについて競合してもよい。抗ＮＧＦ拮抗抗体は、ＮＧＦが抗体と結合することについて競合してもよく、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２７】
抗ＮＧＦ拮抗抗体は、ヒト化されたものであり得る。抗体は、ヒトおよびげっ歯類のＮＧＦと特異的に結合する抗体Ｅ３であり得る。抗体Ｅ３は、その内容の全体が参考として本明細書中に組み込まれているＷＯ２００４／０５８１８４に記載されている。Ｅ３の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および２に示されている（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂ）。抗体Ｅ３のＣＤＲ部分（コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）およびカバット（Ｋａｂａｔ）ＣＤＲが含まれる）は、ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂに図式的に示されている。Ｅ３重鎖および軽鎖、ならびに個々の拡張したＣＤＲのアミノ酸配列も以下に示す（以下の「抗体配列」を参照）。抗体Ｅ３は、ＮＧＦを隔絶し、その受容体との相互作用を防止することにおいて非常に強力である。Ｅ３およびそのネズミ前駆抗体９１１は、関節炎、癌性疼痛および手術後疼痛を含めた病理学的疼痛の非臨床的動物モデルにおいて、有効な鎮痛剤であることが示されている。
【００２８】
別の態様では、抗体は、抗体Ｅ３の断片または領域（本明細書中で「Ｅ３」と互換性があるように呼ばれる）を含む。一実施形態では、断片は、ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ｂおよび本明細書中の配列番号１７に示される抗体Ｅ３の軽鎖である。別の実施形態では、断片は、ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび本明細書中の配列番号１６に示される抗体Ｅ３の重鎖である。さらに別の実施形態では、断片は、抗体Ｅ３の軽鎖および／または重鎖からの１つまたは複数の可変領域を含有する。さらに別の実施形態では、断片は、ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂならびに本明細書中のそれぞれ配列番号１７および１６に示される、抗体Ｅ３の軽鎖および／または重鎖からの１つまたは複数のＣＤＲを含有する。
【００２９】
別の態様では、抗体は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４の寄託番号を有する宿主細胞によって産生されるポリヌクレオチドによってコードされている軽鎖を含む。別の態様では、抗体は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有する宿主細胞によって産生されるポリヌクレオチドによってコードされている重鎖を含む。別の態様では、抗体は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３の寄託番号を有する宿主細胞によって産生されるポリヌクレオチドによってコードされている軽鎖、および（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有する宿主細胞によって産生されるポリヌクレオチドによってコードされている重鎖を含む（本明細書中では、利便上、寄託した宿主細胞によって産生されるポリヌクレオチドは、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４、ＰＴＡ−４８９３およびＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有すると呼ぶ）。別の態様では、抗体は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３の寄託番号を有する宿主細胞によって産生されるポリヌクレオチドによってコードされている軽鎖の軽鎖可変領域を含む。別の態様では、抗体は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有する宿主細胞によって産生されるポリヌクレオチドによってコードされている重鎖の重鎖可変領域を含む。別の態様では、抗体は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３の寄託番号を有する宿主細胞によって産生されるポリヌクレオチドによってコードされている軽鎖の軽鎖可変領域、および（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有する宿主細胞によって産生されるポリヌクレオチドによってコードされている重鎖の重鎖可変領域を含む。さらに別の態様では、抗体は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４の寄託番号を有する宿主細胞によって産生されるポリヌクレオチド、および／または（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有する宿主細胞によって産生されるポリヌクレオチドによってコードされている重鎖によってコードされている１つまたは複数のＣＤＲを含む。
【００３０】
一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２サブクラスのものであり得る、完全長の抗体であり得る。抗体は、ヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域を含み得る。一部の実施形態では、抗体は、ヒト軽鎖κ定常領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、免疫学的に不活性である、たとえば、補体媒介性の溶解を始動しない、または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しない定常領域などの、改変された定常領域を含む。他の実施形態では、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３〜２６２４、ＰＣＴ  ＷＯ９９５８５７２に記載のように改変する。抗体は、以下の突然変異：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１を含むヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域を含み得る（アミノ酸の番号づけは野生型ＩｇＧ２ａ配列を参考とする）。
【００３１】
一部の実施形態では、抗体は、ＦａｂもしくはＦａｂ’２断片などの抗体断片、または単鎖抗体であり得る。
【００３２】
別の態様では、抗体は、ａ）配列番号１〜８（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂ）に示される抗体Ｅ３の１つまたは複数のＣＤＲ、ｂ）配列番号１および５（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａ）に示される抗体Ｅ３の重鎖からのＣＤＲ  Ｈ３、ｃ）配列番号２および８（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ｂ）に示される抗体Ｅ３の軽鎖からのＣＤＲ  Ｌ３、ｄ）配列番号２、６〜８（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ｂ）に示される抗体Ｅ３の軽鎖からの３個のＣＤＲ、ｅ）配列番号１、３〜５（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａ）に示される抗体Ｅ３の重鎖からの３個のＣＤＲ、ならびにｆ）配列番号１〜８（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂ）に示される抗体Ｅ３の、軽鎖からの３個のＣＤＲおよび重鎖からの３個のＣＤＲのうちの、任意の１つまたは複数を含む。別の態様では、抗体は、ａ）配列番号１〜８（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂ）に示される抗体Ｅ３に由来する１つもしくは複数（１、２、３、４、５、もしくは６）個のＣＤＲ、ｂ）配列番号１および５（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａ）に示される抗体Ｅ３の重鎖からのＣＤＲ  Ｈ３に由来するＣＤＲ、ならびに／またはｃ）配列番号２および８（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ｂ）に示される抗体Ｅ３の軽鎖からのＣＤＲ  Ｌ３に由来するＣＤＲのうちの、任意の１つまたは複数を含み得る。一部の実施形態では、ＣＤＲは、カバットＣＤＲ、コチアＣＤＲ、またはカバットおよびコチアＣＤＲの組合せであり得る（本明細書中で「拡張」または「組合せ」ＣＤＲと呼ぶ）。一部の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書中に記載のＣＤＲ立体配置（組合せ、変異体などが含まれる）のうちの任意のものを含む。
【００３３】
一態様では、抗体は、Ｉ３４がＳ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＩであり、Ｎ３５がＮ、ＴまたはＳで置換されている、配列番号９を含む重鎖可変領域を含む。本明細書中では、利便上、このコンテキストまたはアミノ酸に言及した「置換されている」または「である」とは、所定の位置におけるアミノ酸の選択肢をいう。明らかなように、置換または選択肢は、本明細書中の配列番号に記載したアミノ酸であり得る。
【００３４】
別の態様では、抗体は、Ｍ５０がＭ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、ＳまたはＬであり、Ａ６２がＡまたはＳであり、Ｌ６３がＬまたはＶである、配列番号１０を含む重鎖可変領域を含む。
【００３５】
別の態様では、抗体は、Ｙ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＤ、ＮまたはＧであり、Ｙ１１０がＹ、Ｋ、Ｓ、ＲまたはＴである、配列番号１１を含む重鎖可変領域を含む。
【００３６】
別の態様では、抗体は、Ｙ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり、Ｙ１１０が任意のアミノ酸である、配列番号１１を含む重鎖可変領域を含む。
【００３７】
別の態様では、抗体は、Ｇ９８がＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり、Ｇ９９がＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり、Ｙ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり、Ｙ１１０が任意のアミノ酸である、配列番号１１を含む重鎖可変領域を含む。
【００３８】
別の態様では、抗体は、Ｓ２６がＳまたはＦであり、Ｄ２８がＤ、Ｓ、ＡまたはＹであり、Ｈ３２がＨ、ＮまたはＱである、配列番号１２を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３９】
別の態様では、抗体は、Ｉ５１がＩ、Ｔ、ＶまたはＡであり、Ｓ５６がＳまたはＴである、配列番号１３を含む軽鎖可変領域を含む。
【００４０】
別の態様では、抗体は、Ｓ９１がＳまたはＥであり、Ｋ９２がＫ、Ｈ、ＲまたはＳであり、Ｙ９６がＹまたはＲである、配列番号１４を含む軽鎖可変領域を含む。
【００４１】
別の態様では、抗体は、Ｓ９１がＳまたはＥであり、Ｋ９２が任意のアミノ酸であり、Ｔ９３が任意のアミノ酸であり、Ｙ９６がＹまたはＲである、配列番号１４を含む軽鎖可変領域を含む。
【００４２】
一態様では、抗体は、Ｉ３４がＳ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＩであり、Ｎ３５がＮ、ＴまたはＳである、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。
【００４３】
別の態様では、抗体は、Ｍ５０がＭ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、ＳまたはＬであり、Ａ６２がＡまたはＳであり、Ｌ６３がＬまたはＶである、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む。
【００４４】
別の態様では、抗体は、Ｙ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＤ、ＮまたはＧであり、Ｙ１１０がＹ、Ｋ、Ｓ、ＲまたはＴである、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む。
【００４５】
別の態様では、抗体は、Ｙ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり、Ｙ１１０が任意のアミノ酸である、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む。
【００４６】
別の態様では、抗体は、Ｇ９８がＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり、Ｇ９９がＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり、Ｙ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり、Ｙ１１０が任意のアミノ酸である、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む。
【００４７】
別の態様では、抗体は、Ｓ２６がＳまたはＦであり、Ｄ２８がＤ、Ｓ、ＡまたはＹであり、Ｈ３２がＨ、ＮまたはＱである、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む。
【００４８】
別の態様では、抗体は、Ｉ５１がＩ、Ｔ、ＶまたはＡであり、Ｓ５６がＳまたはＴである、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む。
【００４９】
別の態様では、抗体は、Ｓ９１がＳまたはＥであり、Ｋ９２がＫ、Ｈ、ＲまたはＳであり、Ｙ９６がＹまたはＲである、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。
【００５０】
別の態様では、抗体は、Ｓ９１がＳまたはＥであり、Ｋ９２が任意のアミノ酸であり、Ｔ９３が任意のアミノ酸であり、Ｙ９６がＹまたはＲである、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。
【００５１】
別の態様では、抗体は、Ｉ３４がＳ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＩであり、Ｎ３５がＮ、ＴまたはＳである、配列番号９のＣＤＲ１領域、Ｍ５０がＭ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、ＳまたはＬであり、Ａ６２がＡまたはＳであり、Ｌ６３がＬまたはＶである、配列番号１０のＣＤＲ２領域、およびＹ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＤ、ＮまたはＧであり、Ｙ１１０がＹ、Ｋ、Ｓ、ＲまたはＴである、配列番号１１のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、重鎖可変領域は、Ｙ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり、Ｙ１１０が任意のアミノ酸である、配列番号１１のＣＤＲ３領域を含む。他の実施形態では、重鎖可変領域は、Ｇ９８がＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり、Ｇ９９がＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり、Ｙ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり、Ｙ１１０が任意のアミノ酸である、配列番号１１のＣＤＲ３領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、抗体軽鎖可変領域をさらに含む。
【００５２】
別の態様では、抗体は、Ｓ２６がＳまたはＦであり、Ｄ２８がＤ、Ｓ、ＡまたはＹであり、Ｈ３２がＨ、ＮまたはＱである、配列番号１２のＣＤＲ１領域、Ｉ５１がＩ、Ｔ、ＶまたはＡであり、Ｓ５６がＳまたはＴである、配列番号１３のＣＤＲ２領域、およびＳ９１がＳまたはＥであり、Ｋ９２がＫ、Ｈ、ＲまたはＳであり、Ｙ９６がＹまたはＲである、配列番号１４のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、Ｓ９１がＳまたはＥであり、Ｋ９２が任意のアミノ酸であり、Ｔ９３が任意のアミノ酸であり、Ｙ９６がＹまたはＲである、配列番号１４のＣＤＲ３領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、抗体重鎖をさらに含む。
【００５３】
別の態様では、抗体は、（ａ）Ｉ３４がＳ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＩであり、Ｎ３５がＮ、ＴまたはＳである、配列番号９のＣＤＲ１領域、Ｍ５０がＭ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、ＳまたはＬであり、Ａ６２がＡまたはＳであり、Ｌ６３がＬまたはＶである、配列番号１０のＣＤＲ２領域、およびＹ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＤ、ＮまたはＧであり、Ｙ１１０がＹ、Ｋ、Ｓ、ＲまたはＴである、配列番号１１のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域、ならびに（ｂ）Ｓ２６がＳまたはＦであり、Ｄ２８がＤ、Ｓ、ＡまたはＹであり、Ｈ３２がＨ、ＮまたはＱである、配列番号１２のＣＤＲ１領域、Ｉ５１がＩ、Ｔ、ＶまたはＡであり、Ｓ５６がＳまたはＴである、配列番号１３のＣＤＲ２領域、およびＳ９１がＳまたはＥであり、Ｋ９２がＫ、Ｈ、ＲまたはＳであり、Ｙ９６がＹまたはＲである、配列番号１４のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、Ｓ９１がＳまたはＥであり、Ｋ９２が任意のアミノ酸であり、Ｔ９３が任意のアミノ酸であり、Ｙ９６がＹまたはＲである、配列番号１４のＣＤＲ３領域を含む。一部の実施形態では、重鎖可変領域は、Ｙ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり、Ｙ１１０が任意のアミノ酸である、配列番号１１のＣＤＲ３領域を含む。他の実施形態では、重鎖可変領域は、Ｇ９８がＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり、Ｇ９９がＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり、Ｙ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり、Ｙ１１０が任意のアミノ酸である、配列番号１１のＣＤＲ３領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、抗体軽鎖をさらに含む。
【００５４】
別の態様では、抗体は、Ｉ３４がＳ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＩであり、Ｎ３５がＮ、ＴまたはＳである、配列番号９に示されるアミノ酸配列、Ｍ５０がＭ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、ＳまたはＬであり、Ａ６２がＡまたはＳであり、Ｌ６３がＬまたはＶである、配列番号１０に示されるアミノ酸配列、およびＹ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＤ、ＮまたはＧであり、Ｙ１１０がＹ、Ｋ、Ｓ、ＲまたはＴである、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｙ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり、Ｙ１１０が任意のアミノ酸である、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ポリペプチドは、Ｇ９８がＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり、Ｇ９９がＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり、Ｙ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり、Ｙ１１０が任意のアミノ酸である、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、抗体軽鎖可変領域をさらに含む。
【００５５】
別の態様では、抗体は、Ｓ２６がＳまたはＦであり、Ｄ２８がＤ、Ｓ、ＡまたはＹであり、Ｈ３２がＨ、ＮまたはＱである、配列番号１２に示されるアミノ酸配列、Ｉ５１がＩ、Ｔ、ＶまたはＡであり、Ｓ５６がＳまたはＴである、配列番号１３に示されるアミノ酸配列、およびＳ９１がＳまたはＥであり、Ｋ９２がＫ、Ｈ、ＲまたはＳであり、Ｙ９６がＹまたはＲである、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｓ９１がＳまたはＥであり、Ｋ９２が任意のアミノ酸であり、Ｔ９３が任意のアミノ酸であり、Ｙ９６がＹまたはＲである、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、抗体重鎖可変領域をさらに含む。
【００５６】
別の態様では、抗体は、（ａ）Ｉ３４がＳ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＩであり、Ｎ３５がＮ、ＴまたはＳである、配列番号９に示されるアミノ酸配列、Ｍ５０がＭ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、ＳまたはＬであり、Ａ６２がＡまたはＳであり、Ｌ６３がＬまたはＶである、配列番号１０に示されるアミノ酸配列、およびＹ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＤ、ＮまたはＧであり、Ｙ１１０がＹ、Ｋ、Ｓ、ＲまたはＴである、配列番号１１に示されるアミノ酸配列、ならびに（ｂ）Ｓ２６がＳまたはＦであり、Ｄ２８がＤ、Ｓ、ＡまたはＹであり、Ｈ３２がＨ、ＮまたはＱである、配列番号１２に示されるアミノ酸配列、Ｉ５１がＩ、Ｔ、ＶまたはＡであり、Ｓ５６がＳまたはＴである、配列番号１３に示されるアミノ酸配列、およびＳ９１がＳまたはＥであり、Ｋ９２がＫ、Ｈ、ＲまたはＳであり、Ｙ９６がＹまたはＲである、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｓ９１がＳまたはＥであり、Ｋ９２が任意のアミノ酸であり、Ｔ９３が任意のアミノ酸であり、Ｙ９６がＹまたはＲである、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｙ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり、Ｙ１１０が任意のアミノ酸である、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ポリペプチドは、Ｇ９８がＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり、Ｇ９９がＧ、Ｓ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｎ、ＤまたはＴであり、Ｙ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＳ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、ＴまたはＧであり、Ｙ１１０が任意のアミノ酸である、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、抗体軽鎖可変領域をさらに含む。
【００５７】
別の態様では、抗体は、（ａ）Ｉ３４がＳ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＩであり、Ｎ３５がＮ、ＴまたはＳで置換されている、配列番号９のＣＤＲ１領域、（ｂ）Ｍ５０がＩ、Ｇ、Ｑ、ＳまたはＬであり、Ａ６２がＡまたはＳであり、Ｌ６３がＬまたはＶである、配列番号１０のＣＤＲ２領域、および（ｃ）Ｙ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＤ、ＮまたはＧであり、Ｙ１１０がＹ、Ｋ、Ｓ、ＲまたはＴである、配列番号１１のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含み、抗体はＮＧＦと結合する。
【００５８】
別の態様では、抗体は、（ａ）Ｓ２６がＳまたはＦであり、Ｄ２８がＤ、Ｓ、ＡまたはＹであり、Ｈ３２がＨ、ＮまたはＱである、配列番号１２のＣＤＲ１領域、（ｂ）Ｉ５１がＩ、Ｔ、ＶまたはＡであり、Ｓ５６がＳまたはＴである、配列番号１３のＣＤＲ２領域、および（ｃ）Ｋ９２がＫ、Ｈ、ＲまたはＳであり、Ｙ９６がＹまたはＲである、配列番号１４のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を含み、抗体はＮＧＦと結合する。
【００５９】
別の態様では、抗体は、（ａ）（ｉ）Ｉ３４がＳ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＩで置換されており、Ｎ３５がＮ、ＴまたはＳで置換されている、配列番号９のＣＤＲ１領域、（ｉｉ）Ｍ５０がＩ、Ｇ、Ｑ、ＳまたはＬであり、Ａ６２がＡまたはＳであり、Ｌ６３がＬまたはＶである、配列番号１０のＣＤＲ２領域、および（ｉｉｉ）Ｙ１００がＹ、ＬまたはＲであり、Ｙ１０１がＹまたはＷであり、Ｇ１０３がＧ、ＡまたはＳであり、Ｔ１０４がＴまたはＳであり、Ｓ１０５がＳ、ＡまたはＴであり、Ｙ１０６がＹ、Ｒ、ＴまたはＭであり、Ｙ１０７がＹまたはＦであり、Ｆ１０８がＦまたはＷであり、Ｄ１０９がＤ、ＮまたはＧであり、Ｙ１１０がＹ、Ｋ、Ｓ、ＲまたはＴである、配列番号１１のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域、ならびに（ｂ）（ｉ）Ｓ２６がＳまたはＦであり、Ｄ２８がＤ、Ｓ、ＡまたはＹであり、Ｈ３２がＨ、ＮまたはＱである、配列番号１２のＣＤＲ１領域、（ｉｉ）Ｉ５１がＩ、Ｔ、ＶまたはＡであり、Ｓ５６がＳまたはＴである、配列番号１３のＣＤＲ２領域、および（ｉｉｉ）Ｓ９１がＳまたはＥであり、Ｋ９２がＫ、Ｈ、ＲまたはＳであり、Ｙ９６がＹまたはＲである、配列番号１４のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を含み、抗体はＮＧＦと結合する。
【００６０】
別段に注記しない限りは、１つの位置でのアミノ酸の選択肢（たとえば置換）は、任意の他の位置でのアミノ酸の選択とは独立して選択される。
【００６１】
一部の実施形態では、抗体は、本明細書中に記載のＣＤＲ立体配置（組合せ、変形などが含まれる）のうちの任意のものを含む。
【００６２】
本明細書中の説明から明らかなように、本明細書中で使用する可変領域の番号づけは、連続的な番号づけである。当業者は、いくつかの抗体番号づけ系が存在すること（カバットおよびコチアの番号づけなど）、ならびに、どのようにして連続的な番号づけをカバット番号づけまたはコチア番号づけなどの別の番号づけ系へと変換するかを、容易に理解するであろう。
【００６３】
別の態様では、抗体は、配列番号４６または５０から選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲ３配列など）を含む。さらに他の実施形態では、抗体は、配列番号３、４、５、６、７および８に示されるアミノ酸配列のうちの１つまたは複数をさらに含む。さらに他の実施形態では、抗体は、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４および１５に示されるアミノ酸配列のうちの１つまたは複数をさらに含む。
【００６４】
別の態様では、抗体は、（ａ）配列番号２８および／または２９、（ｂ）配列番号３０および／または３１、（ｃ）配列番号３２および／または３３、（ｄ）配列番号３４および／または３５、（ｅ）配列番号３６および／または３７、（ｆ）配列番号３８および／または３９、ならびに（ｇ）配列番号４０および４１から選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲＨ１および／またはＣＤＲ  Ｈ２領域などのＣＤＲ領域など）を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２８、３０、３２、３４、３６、３８および４０から選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲ  Ｈ１領域など）を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２９、３１、３３、３５、３７、３９および４１から選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲ  Ｈ２領域など）を含む。さらに他の実施形態では、抗体は、配列番号３、４、５、６、７および８に示されるアミノ酸配列のうちの１つまたは複数をさらに含む。さらに他の実施形態では、抗体は、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４および１５に示されるアミノ酸配列のうちの１つまたは複数をさらに含む。
【００６５】
別の態様では、抗体は、（ａ）配列番号１８および／または１９、（ｂ）配列番号２０および／または２１、ならびに（ｃ）配列番号２２および／または２３から選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲＬ１および／またはＣＤＲ  Ｌ２領域などのＣＤＲ領域など）を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１８、２０および２２から選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲ  Ｌ１領域など）を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号１９、２１および２３から選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲ  Ｌ２領域など）を含む。さらに他の実施形態では、抗体は、配列番号３、４、５、６、７、８に示されるアミノ酸配列のうちの１つまたは複数をさらに含む。さらに他の実施形態では、抗体は、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４および１５に示されるアミノ酸配列のうちの１つまたは複数をさらに含む。
【００６６】
別の態様では、抗体は、（ａ）配列番号５１および／または５２、（ｂ）配列番号５５および／または５６、（ｃ）配列番号５７および／または５８、（ｃ）配列番号５９および／または６０、（ｄ）配列番号６１および／または６２、（ｅ）配列番号６３および／または６４から選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲＬ３および／またはＣＤＲ  Ｈ３領域などのＣＤＲ領域など）を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号５１、５５、５７、５９、６１および６３から選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲ  Ｌ３領域など）を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号５２、５６、５８、６０、６２および６４から選択されるアミノ酸配列（ＣＤＲ  Ｈ３領域など）を含む。さらに他の実施形態では、抗体は、配列番号１８、１９、３０および３１のうちの１つまたは複数に示されるアミノ酸配列をさらに含む。さらに他の実施形態では、抗体は、配列番号３、４、５、６、７および８に示されるアミノ酸配列のうちの１つまたは複数をさらに含む。さらに他の実施形態では、抗体は、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４および１５に示されるアミノ酸配列のうちの１つまたは複数をさらに含む。
【００６７】
別の態様では、抗体は、
（ａ）
（ｉ）配列番号３０のＣＤＲ１領域、
（ｉｉ）配列番号３１の配列を含むＣＤＲ２領域、
（ｉｉｉ）配列番号１１、５６、５８、６０、６２および６４からなる群から選択されるＣＤＲ３領域
を含む重鎖可変領域、ならびに
（ｂ）
（ｉ）配列番号１８のＣＤＲ１領域、
（ｉｉ）配列番号１９のＣＤＲ２領域、
（ｉｉｉ）配列番号１４、５５、５７、５９、６１および６３からなる群から選択されるＣＤＲ３領域
を含む軽鎖可変領域
を含み得る。
【００６８】
別の態様では、抗体は、配列番号６１、６３、１８、１９、３０および３１に示されるアミノ酸配列（ＣＤＲ領域など）のうちの１つまたは複数を含む。
【００６９】
別の態様では、抗体は、ＷＯ２００５０１９２６６（抗体４Ｄ４、１４Ｄ１０、６Ｇ９、７Ｈ２、１４Ｆ１１および４Ｇ６が含まれる）またはＷＯ２００６１３１９５１（抗体Ｈｕ−αＤ１１が含まれる）に記載されている抗体などの、当分野で知られている抗ＮＧＦ抗体から選択され得る。抗体は、ＮＧＦ、特にヒトＮＧＦ上の、ＷＯ２００５０１９２６６（抗体４Ｄ４、１４Ｄ１０、６Ｇ９、７Ｈ２、１４Ｆ１１および４Ｇ６が含まれる）もしくはＷＯ２００６１３１９５１（抗体Ｈｕ−αＤ１１が含まれる）に記載されている抗体、または本明細書中に定義した抗体などの、当分野で知られている抗ＮＧＦ抗体と同じエピトープと結合し得る、および／または、ＮＧＦとの結合についてそのような抗体と競合し得る。
【００７０】
一部の実施形態では、本明細書中に記載の抗ＮＧＦ抗体のうちの任意のものの重鎖のＣ末端リシンが切断される。様々な事例で、抗ＮＧＦ抗体の重鎖および軽鎖には、シグナル配列が含まれていてもよい。
【００７１】
一態様では、抗体は、高い親和性でＮＧＦ（ヒトＮＧＦなど）と結合する抗ＮＧＦ拮抗抗体である。一部の実施形態では、高い親和性とは、（ａ）約２ｎＭ以下のＫＤ（約１ｎＭ、８００ｐＭ、６００ｐＭ、４００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、９０ｐＭ、８０ｐＭ、７０ｐＭ、６０ｐＭ、５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭもしくはそれより低いもののうちの任意のものなど）、および／もしくは約６×１０−５ｓ−１よりも遅いｋｏｆｆ）でＮＧＦと結合すること、および／または（ｂ）およそ２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、８０ｐＭ、６０ｐＭ、４０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、もしくはそれより低いもののうちの任意のＩＣ５０（約１５ｐＭのＮＧＦの存在下）でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を阻害する（減少および／もしくは遮断する）こと、および／または（ｃ）およそ５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、１０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、２ｐＭ、１ｐＭ、もしくはそれより低いもののうちの任意のＩＣ５０（約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下）でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を阻害する（減少および／もしくは遮断する）こと、および／または（ｄ）およそ１５０ｐＭ、１２５ｐＭ、１００ｐＭ、８０ｐＭ、６０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、もしくはそれより低いもののうちの任意のＩＣ５０（約１５ｐＭのＮＧＦの存在下）でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのラットＮＧＦ依存性の生存を阻害する（減少および／もしくは遮断する）こと、および／または（ｅ）およそ３０ｐＭ、２５ｐＭ、２０ｐＭ、１５ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、４ｐＭ、３ｐＭ、２ｐＭ、１ｐＭ、もしくはそれより低いもののうちの任意のＩＣ５０（約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下）でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのラットＮＧＦ依存性の生存を阻害する（減少および／もしくは遮断する）こと、および／または（ｆ）および／またはｔｒｋＡ受容体よりも高い親和性でＮＧＦと結合することである。
【００７２】
別の態様では、抗体は、（ａ）約２ｎＭ以下のＫＤ（約１ｎＭ、８００ｐＭ、６００ｐＭ、４００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、９０ｐＭ、８０ｐＭ、７０ｐＭ、６０ｐＭ、５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭもしくはそれより低いもののうちの任意のものなど）、および／もしくは約６×１０−５ｓ−１よりも遅いｋｏｆｆ）でＮＧＦ（ヒトＮＧＦなど）と結合し、および／または（ｂ）およそ２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、８０ｐＭ、６０ｐＭ、４０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、もしくはそれより低いもののうちの任意のＩＣ５０（約１５ｐＭのＮＧＦの存在下）でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を阻害し、および／または（ｃ）およそ５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、１０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、２ｐＭ、１ｐＭ、もしくはそれより低いもののうちの任意のＩＣ５０（約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下）でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を阻害し、および／またはｔｒｋＡ受容体よりも高い親和性でＮＧＦと結合する。一部の実施形態では、抗体は、（ａ）約２ｎＭ以下のＫＤでＮＧＦと結合し、および／または（ｂ）約１００ｐＭ以下のＩＣ５０でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を阻害し（ただし、ＩＣ５０は約１５ｐＭのＮＧＦの存在下で測定する）、および／または（ｃ）約１０ｐＭ以下のＩＣ５０でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を阻害する（ただし、ＩＣ５０は約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下で測定する）（ただし、ＩＣ５０は約１５ｐＭのＮＧＦの存在下で測定する）。一部の実施形態では、抗体は、（ａ）約１００ｐＭ以下のＫＤでＮＧＦと結合し、および／または（ｂ）約２０ｐＭ以下のＩＣ５０でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を阻害し（ただし、ＩＣ５０は約１５ｐＭのＮＧＦの存在下で測定する）、および／または（ｃ）約２ｐＭ以下のＩＣ５０でマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を阻害する（ただし、ＩＣ５０は約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下で測定する）。
【００７３】
一部の実施形態では、上記抗体は単離されている。一部の実施形態では、抗体は実質的に精製されている。さらに他の実施形態では、抗体は親和性成熟している。一部の実施形態では、抗体は、ヒトフレームワーク配列を含む。さらに他の実施形態では、抗体は、１つまたは複数の非ヒトフレームワーク残基を含む。一部の実施形態では、抗体は、２ｎＭ以下のＫＤでＮＧＦ（ヒトＮＧＦなど）と結合する。一部の実施形態では、抗体は、非ヒトアミノ酸配列（たとえば可変領域配列、たとえばＣＤＲ配列、たとえばフレームワーク配列）と比較して、１つまたは複数（２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、またはそれより多くなど）のヒトアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、抗体は、親ポリペプチドアミノ酸配列（たとえば抗体９１１のアミノ酸配列、たとえば配列番号９〜１４のうちの任意の１つまたは複数）と比較して、少なくとも１個、少なくとも２個、またはそれより多く、たとえば、少なくとも３個、４個、５個、６個、またはそれより多くのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、抗体の結合親和性は、親抗体（Ｍａｂ９１１など）の親和性と比較して変更されている（一部の実施形態では増加している）。さらに他の実施形態では、抗体の結合親和性は、ＮＧＦ（ヒトＮＧＦなど）に対するｔｒｋＡ受容体の結合親和性よりも低い。一部の実施形態では、抗体はヒト抗体である。他の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。さらに他の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は親和性成熟した抗体である。
【００７４】
本発明は、上記実施形態の抗体のうちの任意のものをコードしているポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド（単離したポリヌクレオチドが含まれる）を利用する。
【００７５】
別の態様では、本発明は、抗体Ｅ３の断片または領域（本明細書中で「Ｅ３」と互換性があるように呼ばれる）をコードしているポリヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、断片は、ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ｂに示される抗体Ｅ３の軽鎖である。別の実施形態では、断片は、ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａに示される抗体Ｅ３の重鎖である。さらに別の実施形態では、断片は、抗体Ｅ３の軽鎖および／または重鎖からの１つまたは複数の可変領域を含有する。さらに別の実施形態では、断片は、ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂに示される抗体Ｅ３の軽鎖および／または重鎖からの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。
【００７６】
別の態様では、本発明は、抗体Ｅ３をコードしているポリヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＷＯ２００４／０５８１８４の図２および３に示されるポリヌクレオチドの一方または双方を含む。
【００７７】
別の態様では、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４の寄託番号を有するＥ３軽鎖をコードしている単離したポリヌクレオチドを利用する。別の態様では、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有するＥ３重鎖をコードしている単離したポリヌクレオチドである。さらに別の態様では、単離したポリヌクレオチドは、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３またはＰＴＡ−４８９４の寄託番号を有するポリヌクレオチド中にコードされている可変領域および（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有するポリヌクレオチド中にコードされている可変領域を含む。別の態様では、単離したポリヌクレオチドは、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３もしくはＰＴＡ−４８９４の寄託番号を有するポリヌクレオチド中にコードされている１つもしくは複数のＣＤＲ、および／または（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有するポリヌクレオチド中にコードされている１つもしくは複数のＣＤＲを含む。
【００７８】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載の抗体（抗体断片が含まれる）またはポリペプチドのうちの任意のものをコードしているポリヌクレオチドを利用する。
【００７９】
別の態様では、本発明は、本明細書中に開示したポリヌクレオチドのうちの任意のものを含むベクター（発現およびクローニングベクターが含まれる）ならびに宿主細胞を利用する。
【００８０】
別の態様では、本発明は、Ｅ３軽鎖をコードしているポリヌクレオチドおよびＥ３重鎖をコードしているポリヌクレオチドを含む宿主細胞を利用し、Ｅ３軽鎖をコードしているポリヌクレオチドはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３および／またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４の寄託番号を有し、Ｅ３重鎖をコードしているポリヌクレオチドはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有する。一部の実施形態では、宿主細胞は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３もしくはＰＴＡ−４８９４の寄託番号を有するポリヌクレオチド中にコードされている可変領域および／または（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有するポリヌクレオチド中にコードされている可変領域を含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３もしくはＰＴＡ−４８９４の寄託番号を有するポリヌクレオチド中にコードされている１つもしくは複数のＣＤＲ、および／または（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有するポリヌクレオチド中にコードされている１つもしくは複数のＣＤＲをコードしているポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。
【００８１】
別の態様では、本発明は、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状（ＬＵＴＳ）の治療または予防において使用するための抗ＮＧＦ拮抗抗体を提供する。抗ＮＧＦ拮抗抗体は、本明細書中に記載したとおりであり得る。
【００８２】
本発明の別の態様は、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状（ＬＵＴＳ）を治療または予防するための医薬品の製造における抗ＮＧＦ拮抗抗体の使用を提供する。抗ＮＧＦ拮抗抗体は、本明細書中に記載したとおりであり得る。
【００８３】
別の態様では、本発明は、抗体Ｅ３または抗体Ｅ３の断片と、薬学的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物などの、本明細書中に記載のポリペプチド（抗体Ｅ３などの抗体が含まれる）、ポリヌクレオチドまたはベクターのうちの任意のものを含む、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状（ＬＵＴＳ）の治療または予防において使用するための医薬組成物である。
【００８４】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載の組成物のうちの任意の１つまたは複数を含むキットおよび組成物を提供する。これらのキットは、一般に適切なパッケージング中にあり、適切な指示と共に提供し、本明細書中に記載の方法のうちの任意のものに有用である。
【００８５】
また、本発明は、医薬品としての使用および／または医薬品の製造における使用のコンテキストにかかわらず、本明細書中に記載の任意の使用について記載した組成物およびキットのうちの任意のものも提供する。
【００８６】
本発明のそれぞれの態様の好ましい特長は、必要な変更を加えて、それぞれの他の態様に同様に適用される。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
本明細書中に開示した本発明は、治療上有効な量の抗ＮＧＦ拮抗抗体を投与することによる、個体において間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状（ＬＵＴＳ）を治療または予防する方法を提供する。
【００８８】
また、本明細書中に開示した本発明は、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状（ＬＵＴＳ）の治療または予防において使用するための抗ＮＧＦ拮抗抗体も提供する。さらに、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状（ＬＵＴＳ）を治療または予防するための医薬品の製造における抗ＮＧＦ拮抗抗体の使用を提供する。
【００８９】
本明細書中に開示した本発明は、高い親和性でＮＧＦ（ヒトＮＧＦなど）と結合する抗ＮＧＦ拮抗抗体の使用を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＮＧＦと結合するヒト化抗体Ｅ３を利用する。また、本発明は、ＮＧＦと結合するＥ３ポリペプチド（抗体が含まれる）、ならびにＥ３抗体および／またはポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドも利用する。さらに、本発明は、ＮＧＦと結合するＥ３に由来する抗体およびポリペプチドの使用を提供する。
【００９０】
一般技術
本発明の実施では、別段に指定しない限りは、当分野の技術範囲内にある、分子生物学（組換え技術が含まれる）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の慣用技術を用いる。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３〜１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）；ならびにＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９３）などの文献中に完全に記載されている。
【００９１】
定義
「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的と特異的結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書中で使用する場合、この用語には、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂなど）、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、キメラ抗体、ダイアボディ、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された立体配置も包含される。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＭなどの任意のクラス（またはそのサブクラス）の抗体が含まれ、抗体は、いずれかの特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを様々なクラスに割り当てることができる。５つの主要な免疫グロブリンのクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２へとさらに分類し得る。様々な免疫グロブリンのクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。様々な免疫グロブリンのクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
【００９２】
抗体の「可変領域」とは、単独または組み合わせた、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域をいう。重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても知られる３個相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４個のフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。それぞれの鎖中のＣＤＲは、ＦＲによって近接して一緒に保たれ、他方の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するための技術は少なくとも２つ存在する：（１）種間配列可変性に基づいた手法（すなわち、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、（第５版、１９９１、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ））、および（２）抗原−抗体の複合体の結晶学的研究に基づいた手法（Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７；Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７〜９４８））。本明細書中で使用するＣＤＲとは、どちらかの手法または両方の手法の組合せによって定義されたＣＤＲをいい得る。
【００９３】
抗体の「定常領域」とは、単独または組み合わせた、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域をいう。
【００９４】
「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含有する抗体断片である。２本鎖Ｆｖ種では、この領域は、密に非共有的会合した１つの重鎖および１つの軽鎖の可変ドメインの二量体からなる。単鎖Ｆｖ種では、１つの重鎖および１つの軽鎖の可変ドメインは、軽鎖および重鎖が２本鎖Ｆｖ種に類似の二量体構造で会合することができるように、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合されることができる。それぞれの可変ドメインの３個のＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合特異性が定義されるのは、この立体配置においてである。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３個のＣＤＲのみを含むＦｖの半分）さえも、一般に結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
【００９５】
また、Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含めた、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆ（ａｂ）２断片とは、ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である。
【００９６】
単鎖抗体（ｓｃＦｃ）とは、ＶＬおよびＶＨ領域が対合し、それらが単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーを介して一価分子を形成する抗体である（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６（１９８８）およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３（１９８８））。
【００９７】
ダイアボディとは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同一鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインが別の鎖の相補的ドメインと対合することを強いて、２つの抗原結合部位が作製される、二価の二重特異性抗体である。
【００９８】
抗体は１つまたは複数の結合部位を有することができる。複数の結合部位が存在する場合、結合部位は、互いに同一であり得るか、または異なり得る。たとえば、天然に存在する免疫グロブリンは２つの同一の結合部位を有し、単鎖抗体またはＦａｂ断片は１つの結合部位を有する一方で、「二重特異性」または「二官能性」抗体（ダイアボディ）は２つの異なる結合部位を有する。
【００９９】
「単離した抗体」とは、（１）そのネイティブ状態でそれに付随する、他の天然で会合している抗体を含めた、天然で会合している構成要素と会合していない、（２）同じ種由来の他のタンパク質を含まない、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、または（４）天然に存在しない抗体である。
【０１００】
「モノクローナル抗体」とは同種抗体集団をいい、モノクローナル抗体は、抗原の選択的結合に関与する（天然に存在するおよび天然に存在しない）アミノ酸からなる。モノクローナル抗体の集団は特異性が高く、単一の抗原部位に向けられている。用語「モノクローナル抗体」には、インタクトなモノクローナル抗体および完全長モノクローナル抗体だけでなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ならびに所要の特異性の抗原認識部位および抗原と結合する能力を含む、免疫グロブリン分子の任意の他の改変された立体配置も包含される。抗体の供給源またはそれを作製する様式（たとえば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物などによる）に関して、限定的であることを意図しない。
【０１０１】
本明細書中で使用する「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生される抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有する抗体、および／または当分野で知られているもしくは本明細書中に開示した、ヒト抗体を作製する技術のうちの任意のものを用いて作製した抗体を意味する。このヒト抗体の定義には、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。そのような例の１つは、ネズミ軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体である。ヒト抗体は、当分野で知られている様々な技術を用いて産生することができる。一実施形態では、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリから選択される（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３０９〜３１４；Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８、ＰＮＡＳ，（ＵＳＡ）９５：６１５７〜６１６２；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１）。また、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座位を、トランスジェニック動物、たとえば、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に失活させられたマウス内に導入することによっても作製することができる。この手法は、米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、および第５，６６１，０１６号に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に向けられた抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化することによって調製し得る（そのようなＢリンパ球は、個体から回収するか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化し得る）。たとえば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７ページ（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５、および米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい。
【０１０２】
「キメラ抗体」とは、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの一部分が、特定の種に由来するまたは特定のクラスに属する抗体中の対応する配列に相同的である一方で、鎖の残りのセグメントが、別の種中の対応する配列に相同的である抗体をいう。典型的には、これらのキメラ抗体中では、軽鎖および重鎖の両方の可変領域が１つの哺乳動物種に由来する抗体の可変領域を模倣する一方で、定常部分は別の種に由来する抗体中の配列に相同的である。そのようなキメラ形態の１つの明らかな利点は、たとえば、容易に入手可能な非ヒト宿主生物由来のハイブリドーマまたはＢ細胞をたとえばヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせて用いて、可変領域を現在知られている供給源から好都合に誘導できることである。可変領域は、調製の容易性という利点を有し、特異性がその供給源によって影響を受けない一方で、定常領域はヒトであるため、抗体を注射した場合に、ヒト対象から免疫応答を誘発する可能性が非ヒト源由来の定常領域よりも低い。しかし、この定義はこの具体的な例に限定されない。
【０１０３】
「機能的Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保有する。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食、細胞表面受容体（たとえばＢ細胞受容体、ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが含まれる。そのようなエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（たとえば抗体可変ドメイン）と組み合わさることが必要であり、そのような抗体エフェクター機能を評価するための当分野で知られている様々なアッセイを用いて評価することができる。
【０１０４】
「ネイティブ配列Ｆｃ領域」は、天然に見つかるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によってネイティブ配列Ｆｃ領域のそれとは異なるアミノ酸配列を含むが、それでもネイティブ配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保持する。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、たとえば、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域中に約１〜約１０個のアミノ酸置換、好ましくは約１〜約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、ネイティブ配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性、最も好ましくはそれと少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくはそれと少なくとも約９５％の配列同一性を保有する。
【０１０５】
本明細書中で使用する「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞毒性細胞（たとえば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上の結合された抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応をいう。目的分子のＡＤＣＣ活性は、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載のものなどの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイを用いて評価することができる。そのようなアッセイの有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびＮＫ細胞が含まれる。あるいは、またはそれに加えて、目的分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、たとえば、Ｃｌｙｎｅｓら、１９９８、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、９５：６５２〜６５６に開示されているものなどの動物モデルにおいて評価し得る。
【０１０６】
本明細書中で使用する「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」とは、抗体のＦｃ領域と結合する受容体を説明している。好ましいＦｃＲは、ネイティブ配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）と結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が含まれ、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシングされた形態が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれ、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる同様のアミノ酸配列を有する。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２；Ｃａｐｅｌら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４、ならびにｄｅ  Ｈａａｓら、１９９５、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１に総説されている。また、「ＦｃＲ」には、母性ＩｇＧを胎児に移行することを担っている新生児受容体ＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒら、１９７６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７、およびＫｉｍら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９）。
【０１０７】
「補体依存性細胞傷害」および「ＣＤＣ」とは、補体の存在下における標的の溶解をいう。補体の活性化経路は、補体系の第１の構成要素（Ｃ１ｑ）と同族抗原と複合体形成した分子（たとえば抗体）との結合によって開始される。補体の活性化を評価するために、たとえば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２：１６３（１９９６）に記載されているＣＤＣアッセイを行い得る。
【０１０８】
本明細書中で使用する場合、用語「Ｅ３」、「３Ｅ」、および「抗体Ｅ３」とは互換性があるように使用し、それぞれ配列番号１および配列番号２（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂ）に示される重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体をいう。抗体Ｅ３のＣＤＲ部分（コチアおよびカバットＣＤＲが含まれる）は、ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂに図式的に示されている。ＷＯ２００４／０５８１８４の図２および３は、それぞれ、それぞれ図１Ａおよび１Ｂに示される重鎖および軽鎖可変領域を含む重鎖および軽鎖をコードしているポリヌクレオチドを示す。Ｅ３の作製および特徴づけは、その内容の全体が本明細書中に参考として組み込まれているＷＯ２００４／０５８１８４の実施例中に記載されている。それだけには限定されないが、ＮＧＦと結合してＮＧＦ生物活性および／またはＮＧＦシグナル伝達によって媒介される下流経路（複数可）を阻害する能力、ならびにマウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存性の生存を阻害する能力を含めた、様々な生物学的機能がＥ３に関連づけられている。本明細書中で記載するように、本発明で使用する抗体は、これらの特徴のうちの任意の１つまたは複数を有し得る。一部の実施形態では、用語「Ｅ３」とは、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４の寄託番号を有する、Ｅ３軽鎖をコードしているポリヌクレオチド、および（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有する、Ｅ３重鎖をコードしているポリヌクレオチドによってコードされている免疫グロブリンをいう。
【０１０９】
本明細書中で使用する、抗体の「免疫特異的」結合とは、抗体の抗原を合わせる部位とその抗体によって認識される特異的抗原との間に起こる抗原特異的結合の相互作用をいう（すなわち、抗体は、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイにおいてタンパク質と反応し、非関連のタンパク質とは検出可能に反応しない）。
【０１１０】
抗体またはポリペプチドと「特異的に結合する」、または「優先的に結合する」（本明細書中で互換性があるように使用する）エピトープとは、当分野で十分に理解されている用語であり、そのような特異的または優先的な結合を決定するための方法も当分野で周知である。分子は、それが別の細胞または物質よりも特定の細胞または物質と、より頻繁に、より迅速に、より長く持続しておよび／またはより高い親和性で反応または会合する場合に、「特異的結合」または「優先的結合」を示すといわれる。抗体は、それが他の物質よりも高い親和性で、結合力で、より容易に、および／またはより長く持続して結合する場合に、標的と「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。たとえば、ＮＧＦエピトープと特異的または優先的に結合する抗体とは、それが他のＮＧＦエピトープまたは非ＮＧＦエピトープと結合するよりも、より高い親和性で、結合力で、より容易に、および／またはより長く持続して、このエピトープと結合する抗体である。また、この定義を読むことによって、たとえば、第１の標的と特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第２の標的と特異的または優先的に結合しても、しなくてもよいことも理解されよう。したがって、「特異的結合」または「優先的結合」とは、必ずしも排他的な結合を必要としない（ただし、含まれることができる）。一般に、必ずではないが、結合への言及は、優先的な結合を意味する。
【０１１１】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」とは、本明細書中で互換性があるように使用し、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。ポリマーは、直鎖状または分枝状であってよく、修飾されたアミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。また、この用語には、自然に、または中断、たとえば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、たとえば標識構成要素とのコンジュゲーションによって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含される。また、この定義には、たとえば、アミノ酸の１つまたは複数の類似体（たとえば非天然アミノ酸などが含まれる）、および当分野で知られている他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。本発明のポリペプチドは抗体に基づいているため、ポリペプチドは、単鎖または会合した鎖として存在できることを理解されたい。
【０１１２】
「ポリヌクレオチド」、または「核酸」とは、本明細書中で互換性があるように使用し、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいい、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはその類似体、またはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによってポリマー内に取り込まれることができる任意の物質であることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびその類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合は、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーのアセンブリの前または後に与え得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識構成要素とのコンジュゲーションなどによってさらに修飾し得る。他の種類の修飾には、たとえば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つまたは複数の類似体での置換、ヌクレオチド間修飾、たとえば、非荷電連結（たとえば、ホスホン酸メチル、リン酸トリエステル、ホスホアミデート、カバメートなど）および荷電連結（たとえば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有するものなど、たとえばタンパク質（たとえば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リシンなど）などのペンダント部分を含有するもの、介入物（たとえば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレート剤（たとえば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された連結（たとえばαアノマー核酸など）を含有するもの、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態が含まれる。さらに、糖内に通常存在するヒドロキシル基のうちの任意のものを、たとえば、ホスホン酸基、リン酸基によって置き換える、標準の保護基によって保護する、もしくは活性化してさらなるヌクレオチドとの追加の連結を調製する、または固体支持体とコンジュゲートし得る。５’および３’末端のＯＨは、リン酸化するか、またはアミンもしくは１〜２０個の炭素原子の有機キャップ基部分で置換することができる。また、他のヒドロキシルも標準の保護基へと誘導体化することができる。また、ポリヌクレオチドは、たとえば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環糖類似体、α−アノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環状類似体およびメチルリボシドなどの脱塩基ヌクレオシド類似体を含めた、一般に当分野で知られているリボースまたはデオキシリボース糖の類似体形態も含有することができる。１つまたは複数のリン酸ジエステル連結を、代替の連結基によって置き換え得る。これらの代替の連結基には、それだけには限定されないが、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、’’（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）［式中、それぞれのＲまたはＲ’は、独立して、Ｈ、またはエーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアル��ル、シクロアルケニルもしくはアラルジルを含有していてもよい、置換もしくは未置換のアルキル（１〜２０個のＣ）である］によって置き換えられている実施形態が含まれる。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含めた本明細書中で言及するすべてのポリヌクレオチドに適用される。
【０１１３】
用語「同一性」とは、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の％「同一性」をいう。％同一性は、一般に、配列を最適な比較目的のためにアラインメントし（たとえば、第２の配列との最良アラインメントのために第１の配列中にギャップを導入することができる）、アミノ酸残基またはヌクレオチドを対応する位置で比較することによって決定する。「最良アラインメント」とは、最も高い％同一性をもたらす、２つの配列のアラインメントである。％同一性は、配列内の同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドの数を比較することによって決定する（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の合計数×１００）。
【０１１４】
２つの配列間の％同一性の決定は、当業者に知られている数学アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列を比較するための数学アルゴリズムの例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５８７７に記載のように改変した、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４〜２２６８のアルゴリズムである。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムがそのようなアルゴリズムを組み込んでいる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行って、本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行って、本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ付きアラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｉｅｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２に記載のようにギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子間の遠い関係性を検出する反復検索を行うことができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（たとえば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。配列の比較に利用される数学アルゴリズムの別の例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）が、そのようなアルゴリズムを組み込んでいる。当分野で知られている配列解析の他のアルゴリズムには、ＴｏｒｅｌｌｉｓおよびＲｏｂｏｔｔｉ（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、１０：３〜５に記載されているＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ、ならびにＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４〜８に記載されているＦＡＳＴＡが含まれる。ＦＡＳＴＡ内で、ｋｔｕｐとは、検索の感度および速度を設定する制御オプションである。
【０１１５】
本明細書中で使用する場合、用語「神経成長因子」および「ＮＧＦ」とは、神経成長因子およびＮＧＦの生物活性の少なくとも一部を保持するその変異体をいう。本明細書中で使用するＮＧＦには、ネイティブ配列ＮＧＦの、ヒト、イヌ科動物、ネコ科動物、ウマ科動物、またはウシ亜科動物を含めたすべての哺乳動物種が含まれる。
【０１１６】
「ＮＧＦ受容体」とは、ＮＧＦによって結合または活性化されるポリペプチドをいう。ＮＧＦ受容体には、それだけには限定されないが、ヒト、イヌ科動物、ネコ科動物、ウマ科動物、霊長類、またはウシ亜科動物を含めた、任意の哺乳動物種のＴｒｋＡ受容体およびｐ７５受容体が含まれる。
【０１１７】
本明細書中で使用する「抗ＮＧＦ拮抗抗体」（「抗ＮＧＦ抗体」と互換性があるように呼ばれる）とは、ＮＧＦと結合して、ＮＧＦシグナル伝達によって媒介されるＮＧＦ生物活性および／または下流経路を阻害することができる抗体をいう。抗ＮＧＦ拮抗抗体には、受容体結合および／またはＮＧＦに対する細胞応答の誘発などのＮＧＦシグナル伝達によって媒介される下流経路を含めた、ＮＧＦ生物活性を遮断、拮抗、抑制または減少する（顕著なものが含まれる）抗体が包含される。本発明の目的のために、用語「抗ＮＧＦ拮抗抗体」には、既に同定した用語、主題、ならびに機能状態および特徴のすべてが包含され、ＮＧＦ自体、ＮＧＦ生物活性（それだけには限定されないが、手術後疼痛の任意の側面を媒介するその能力が含まれる）、または生物活性の結果が、任意の有意な度合で実質的に無効化、減少、または中和されることが明確に理解される。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体は、ＮＧＦと結合して、ＮＧＦの二量体化および／またはＮＧＦ受容体（ｐ７５および／またはｔｒｋＡなど）との結合を防止する。他の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体は、ＮＧＦと結合して、ｔｒｋＡ受容体の二量体化および／またはｔｒｋＡの自己リン酸化を防止する。抗ＮＧＦ拮抗抗体の例を本明細書中に提供する。
【０１１８】
ＮＧＦの「生物活性」とは、一般に、ＮＧＦ受容体と結合するおよび／またはＮＧＦ受容体シグナル伝達経路を活性化する能力をいう。それだけには限定されないが、生物活性には、以下のうちの任意の１つまたは複数が含まれる：ＮＧＦ受容体（ｐ７５および／またはｔｒｋＡなど）と結合する能力、ｔｒｋＡ受容体の二量体化および／または自己リン酸化を促進する能力、ＮＧＦ受容体シグナル伝達経路を活性化する能力、細胞の分化、増殖、生存、成長および細胞の生理学の他の変化［（末梢および中枢ニューロンを含めたニューロンの場合は）神経形態学の変化、シナプス形成、シナプス機能、神経伝達物質および／または神経ペプチドの放出ならびに損傷後の再生が含まれる］を促進する能力、マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンの生存を促進する能力、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状を媒介する能力。
【０１１９】
本明細書中で使用する「実質的に純粋」とは、少なくとも５０％純粋（すなわち、汚染物質を含まない）、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、より好ましくは少なくとも９８％純粋、より好ましくは少なくとも９９％純粋な物質をいう。
【０１２０】
「宿主細胞」には、ポリヌクレオチド挿入物を取り込ませるためのベクターのレシピエントとなることができる、またはそうであった、個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には単一の宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、天然、偶発的、または意図的な突然変異が原因で必ずしも元の親細胞と（形態学またはゲノムＤＮＡ補体性において）完全に同一でない場合がある。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチドを用いてｉｎ  ｖｉｖｏで形質移入した細胞が含まれる。
【０１２１】
本明細書中で使用する「治療」とは、有益または所望の臨床的結果を得るための手法である。本発明の目的のために、有益または所望の臨床的結果には、それだけには限定されないが、以下のうちの１つまたは複数が含まれる：間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状の任意の側面の改善または軽減。本発明の目的のために、有益または所望の臨床的結果には、それだけには限定されないが、以下のうちの１つまたは複数が含まれる：重篤度の軽減、疼痛の任意の側面を含めた、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状の軽減（疼痛の持続期間の短縮、疼痛感受性または感覚の減少など）。
【０１２２】
薬物、化合物、または医薬組成物の「有効量」とは、疼痛感覚の軽減または減少などの臨床的結果を含めた、有益または所望の結果をもたらすために十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与で投与することができる。本発明の目的のために、有効量の薬物、化合物、または医薬組成物とは、強度を治療、寛解、減少させる、ならびに／または間質性膀胱炎および／もしくは有痛性膀胱症候群および／もしくは膀胱痛症候群に関連する疼痛もしくは下部尿路症状を予防するために十分な量である。一部の実施形態では、「有効量」は、静止時の疼痛（静止時疼痛）もしくは力学的に誘発される疼痛（動作後の疼痛が含まれる）、または両方を減少する場合があり、有痛性刺激の前、その間またはその後に投与し得る。臨床的コンテキストで理解されるように、有効量の薬物、化合物、または医薬組成物は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と併せて達成される場合もされない場合もあり得る。したがって、「有効量」は、１つまたは複数の治療剤を投与するコンテキストにおいて検討される場合があり、１つまたは複数の他の薬剤と併せて望ましい結果が達成され得るまたは達成される場合は、単一の薬剤を有効量で与えることを検討し得る。
【０１２３】
間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状の「発生率の減少」とは、重篤度（たとえばオピエートを含めた、この状態に一般に使用される他の薬物および／もしくは治療の必要性および／もしくは量（たとえば曝露）の減少が含まれることができる）、持続期間、ならびに／または頻度（たとえば、個体における時間疼痛（ｔｉｍｅ  ｐａｉｎ）の遅延もしくは増加が含まれる）の減少のうちの、任意のものを意味する。当業者には理解されるように、個体は、治療に対するその応答に関して異なる場合があり、したがって、たとえば、「個体において間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状の発生率を減少させる方法」とは、そのような投与が、その特定の個体においてそのような発生率の減少を引き起こし得る合理的な予測に基づいて、抗ＮＧＦ拮抗抗体を投与することを反映する。
【０１２４】
間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状を「寛解させること」とは、抗ＮＧＦ拮抗抗体を投与しないことと比較した、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状の１つまたは複数の症状の軽減または改善を意味する。また、「寛解させること」には、症状の持続期間の短縮または減少も含まれる。
【０１２５】
間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状を「緩和させること」とは、個体または個体集団において疼痛および／または下部尿路症状の１つまたは複数の望ましくない臨床徴候の程度の軽減を意味する。
【０１２６】
本明細書中で使用する、疼痛の発生を「遅延させること」とは、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状の進行を延期させる、妨害する、減速する、遅らせる、安定化させる、および／または後回しにすることを意味する。この遅延は、疾患の経歴および／または治療する個体に応じて、様々な長さの時間であることができる。当業者には明らかであるように、十分または顕著な遅延は、事実上、個体が疼痛を発生しないという点で、予防を包含することができる。症状の発生を「遅延する」方法とは、方法を使用しない場合と比較して、所定のタイムフレーム内で症状を発生する確率を減少させる、および／または所定のタイムフレーム内での症状の程度を減少させる方法である。そのような比較は、典型的には、統計的に有意な数の対象を用いた臨床研究に基づく。
【０１２７】
本明細書中で使用する「疼痛」とは、急性および慢性の疼痛を含めた任意の病因学の疼痛、ならびに炎症性の構成要素を有する任意の疼痛をいう。本明細書中で使用する「疼痛」には、痛覚および疼痛の感覚が含まれ、疼痛は、疼痛スコアおよび当分野で周知の他の方法を用いて客観的および主観的に評価することができる。疼痛は、当分野で周知のように、一次または二次疼痛であることができる。
【０１２８】
本明細書中で使用する「間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛」とは、下腹部（骨盤）痛、膀胱痛、恥骨上痛、膣痛、陰茎、精巣、陰嚢および会陰の疼痛、尿道痛、性交疼痛、膀胱が満たされるにつれて増加し得る疼痛、圧力または不快感をいう。
【０１２９】
本明細書中で使用する「間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する下部尿路症状」とは、３つの群の泌尿器症状をいい、これらは、貯蔵（刺激性）、排尿（閉塞性）および排尿後の症状として定義し得る。貯蔵症状は、切迫、頻発、夜間多尿、切迫尿失禁および緊張性尿失禁を含み、これは、過活動膀胱（ＯＡＢ）および良性前立腺肥大（ＢＰＨ）と関連している場合がある。排尿症状は、躊躇、流れの不良、間欠性、いきみおよび排尿障害を含む。排尿後症状は、終末時滴下、排尿後滴下および残尿感を含む。
【０１３０】
「過活動膀胱（ＯＡＢ）」とは、緊迫性尿失禁を伴ったまたは伴わない、通常は頻発および夜間多尿を伴った切迫として定義される［Ａｂｒａｍｓら、Ｎｅｕｒｏｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｕｒｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ２１：１６７〜１７８（２００２）］。男性および女性のＯＡＢの有病率は同様であり、米国の集団の約１６％がこの状態を患っている［Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｏｖｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｂｌａｄｄｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ：Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＮＯＢＬＥ  Ｐｒｏｇｒａｍ、第２回国際失禁会議（ｔｈｅ  ２ｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｃｏｎｔｉｎｅｎｃｅ）に提出されたアブストラクト、２００１年７月、フランスＰａｒｉｓ］。
【０１３１】
用語ウェットＯＡＢおよびドライＯＡＢとは、それぞれ尿失禁を伴ったまたは伴わないＯＡＢ患者を説明している。以前は、ＯＡＢの主症状は尿失禁であると考えられていた。しかし、新しい用語の出現に伴って、これは、失禁者ではない多数の罹患者（すなわちドライＯＡＢ患者）にとって明らかに無意味である。したがって、Ｌｉｂｅｒｍａｎら［Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ａｍｏｎｇ  Ａｄｕｌｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｏｆ  Ｏｖｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｂｌａｄｄｅｒ：Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｆｒｏｍ  Ａ  ＵＳ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｕｒｖｅｙ、Ｕｒｏｌｏｇｙ  ５７（６）、１０４４〜１０５０、２００１］の２００１年の研究は、米国集団の団体に基づいたサンプルの生活の質に対する、すべてのＯＡＢ症状の影響を調査した。この研究は、実証可能な尿損失を全く伴わないＯＡＢを患っている個体は、対照と比較して生活の質が損なわれていることを実証している。
【０１３２】
「ＢＰＨ」とは、急性尿貯留、再発性尿路感染症、膀胱結石および腎臓機能不全などの合併症をもたらす可能性がある、慢性的な進行性疾患である。男性におけるＢＰＨに関連するＬＵＴＳの有病率および平均重篤度は、年齢に伴って増加する。ＢＰＨは前立腺の体積の増加をもたらし、それにより尿道および膀胱の流出閉塞ならびに膀胱機能の二次的変化がもたらされる。この効果は、貯蔵（刺激性）および排尿（閉塞性）の症状のどちらによっても顕在化される。
【０１３３】
「生体試料」には、個体から得られた様々な試料種が包含され、診断または監視アッセイで使用することができる。この定義には、血液および生物学的起源の他の液体試料、生検標本またはそれに由来する組織培養物もしくは細胞、およびその子孫などの、固体組織試料が包含される。また、この定義には、その獲得後に、試薬を用いた処理、可溶化、またはタンパク質もしくはポリヌクレオチドなどの特定の構成要素の濃縮、または、切片作製目的のための半固体または固体のマトリックス中への包埋などによる、任意の方法で操作した試料が含まれる。用語「生体試料」には臨床的試料が包含され、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解液、血清、血漿、生体液、および組織試料も含まれる。
【０１３４】
「個体」または「対象」とは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、それだけには限定されないが、家畜（ウシなど）、スポーツ動物、ペット（ネコ、イヌおよびウマなど）、霊長類、マウスならびにラットが含まれる。
【０１３５】
本明細書中で使用する「ベクター」とは、１つまたは複数の目的の遺伝子または配列を宿主細胞内に送達し、好ましくは発現させることができる構築体を意味する。ベクターの例には、それだけには限定されないが、ウイルスベクター、裸ＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、陽イオン性凝縮剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム内にカプセル封入したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および産生細胞などの特定の真核細胞が含まれる。
【０１３６】
本明細書中で使用する「発現制御配列」とは、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成的もしくは誘導性プロモーターなどのプロモーター、またはエンハンサーであることができる。発現制御配列は、転写する核酸配列と作動可能に連結している。
【０１３７】
本明細書中で使用する「薬学的に許容できる担体」には、活性成分と組み合わせた場合に、成分が生物活性を保持することを可能にし、対象の免疫系と非反応性である、任意の物質が含まれる。例には、それだけには限定されないが、リン酸緩衝溶液などの標準の医薬担体、水、油／水乳濁液などの乳濁液、および様々な種類の湿潤剤のうちの任意のものが含まれる。エアロゾルまたは非経口投与用の好ましい希釈剤は、リン酸緩衝溶液または正常（０．９％）生理食塩水である。そのような担体を含む組成物は、周知の慣用方法によって配合する（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ペンシルベニア州Ｅａｓｔｏｎ、１９９０、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第２０版Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００を参照）。
【０１３８】
本明細書中で使用する用語「Ｋｏｆｆ」とは、抗体−抗原の相互作用から抗体が解離するオフ速度定数をいうことを意図する。本明細書中で使用する用語「Ｋｏｎ」とは、特定の抗体−抗原の相互作用のオン速度または会合速度をいうことを意図する。本明細書中で使用する用語「ＫＤ」とは、Ｋｏｆｆ対Ｋｏｎの比から得られ、モル濃度（Ｍ）として表現する、抗体−抗原の相互作用の解離定数をいうことを意図する。抗体のＫＤ値は、当分野で十分に確立された方法を用いて決定することができる。抗体のＫＤを決定するための一方法は、表面プラズモン共鳴を用いることによる、典型的にはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いることによる。
【０１３９】
間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状を治療または予防するために抗ＮＧＦ拮抗抗体を使用する方法
本発明は、ヒトおよび非ヒトの両方の哺乳動物を含めた、個体において間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状を治療または予防する方法を提供する。したがって、一態様では、本発明は、有効量の抗ＮＧＦ拮抗抗体を投与することを含む、個体において間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状を治療または予防する方法を提供する。適切な抗ＮＧＦ拮抗抗体は本明細書中に記載されている。
【０１４０】
別の態様では、本発明は、個体において間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状の発症、発生または進行の発生率を減少する、寛解させる、抑制する、緩和させる、および／または遅延させる方法を提供する。したがって、一部の実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体は、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に罹患している個体において、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状が発生する前に投与する。
【０１４１】
抗ＮＧＦ拮抗抗体は、任意の適切な経路によって個体に投与し得る。様々な投与経路の例は、本明細書中に記載されている。
【０１４２】
一部の実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体は、週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、１０週間に１回、１５週間に１回、２０週間に１回、２５週間に１回、または２６週間に１回投与する。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体は、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、４カ月に１回、５カ月に１回、または６カ月に１回投与する。
【０１４３】
下部尿路症状からの鎮痛または緩和は、緩和の経時変化によって特徴づけられ得る。したがって、一部の実施形態では、緩和は、抗ＮＧＦ拮抗抗体を投与した後の約２４時間以内に観察される。他の実施形態では、緩和は、抗ＮＧＦ拮抗抗体を投与した後の約３６、４８、６０、７２時間または４日間以内に観察される。一部の実施形態では、疼痛および／もしくは下部尿路症状の頻度および／もしくは強度が減弱する、ならびに／または疾患に罹患している者の生活の質が増加する。一部の実施形態では、鎮痛は、抗ＮＧＦ拮抗抗体の単一の用量の後に、少なくとも約７日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２８日間、少なくとも約３５日間、少なくとも約４２日間、少なくとも約４９日間、少なくとも約５６日間、少なくとも約６３日間、少なくとも約７０日間、少なくとも約７７日間、少なくとも約８４日間、少なくとも約１８０日間、またはそれよりも長い期間の間もたらされる。
【０１４４】
下部尿路症状からの鎮痛または緩和は、疼痛数値化スケール（ＮＲＳ）の変化、オリアリー−サント間質性膀胱炎症状指標（ＩＣＳＩ）の変化、オリアリー−サント間質性膀胱炎問題指数（ＩＣＰＩ）の変化、骨盤痛および切迫／頻発（ＰＵＦ）症状のスコアの変化ならびに／または排尿頻度、夜間頻度、失禁発症頻度、１回の排尿あたり排尿される平均体積、平均の間質性膀胱炎疼痛重篤度、尿意切迫発症、平均睡眠障害スコア、平均の性行為痛に関連する疼痛のスコア、全体応答評価、開存性報告治療（ｐａｔｅｎｔ  ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）影響評価、治療失敗、バイオマーカー、安全性エンドポイントおよび／もしくは薬物動態学測度を含めた排尿変数の変化によって特徴づけられ得る。バイオマーカーには、とりわけ、ＮＧＦ、糖タンパク質−５１（ＧＰ−５１）、抗増殖因子（ＡＰＦ）およびＨＢ−表皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）が含まれ得る。
【０１４５】
本発明の方法で使用するための例示的な抗ＮＧＦ抗体（間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状に関連して）は抗ＮＧＦ拮抗抗体であり、これは受容体結合および／またはＮＧＦに対する細胞応答の誘発などのＮＧＦシグナル伝達によって媒介される下流経路を含めたＮＧＦ生物活性を遮断、抑制または減少する（顕著なものが含まれる）、任意の抗体をいう。用語「拮抗剤」は、生物学的作用のいかなる特定の機構も暗示するものではなく、異なる様々かつ化学的に多様な組成物によって達成することができる、ＮＧＦとのすべての可能な薬理学的、生理的、および生化学的な相互作用ならびにその結果が明確に含まれかつ包含されるとみなされる。本発明の目的のために、用語「拮抗剤」には、既に同定した用語、主題、ならびに機能状態および特徴のすべてが包含され、ＮＧＦ自体、ＮＧＦ生物活性（それだけには限定されないが、疼痛の任意の側面を媒介するその能力が含まれる）、または生物活性の結果が、任意の有意な度合で実質的に無効化、減少、または中和されることが明確に理解される。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体はＮＧＦと結合する（物理的に相互作用する）、ＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡ受容体および／もしくはｐ７５受容体など）と結合する、ならびに／または下流のＮＧＦ受容体シグナル伝達を減少させる（妨げるおよび／もしくは遮断する）。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体はＮＧＦ（ｈＮＧＦなど）と結合し、関連ニューロトロフィン、たとえばＮＴ−３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦなどと顕著に結合しない。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体は、有害な免疫応答に関連していない。さらに他の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体はヒト化されている（本明細書中に記載の抗体Ｅ３など）。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体は抗体Ｅ３である（本明細書中に記載）。他の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体は、抗体Ｅ３の１つまたは複数のＣＤＲを含む（Ｅ３からの１個、２個、３個、４個、５個、または一部の実施形態では、６個すべてのＣＤＲなど）。他の実施形態では、抗体はヒトである。さらに他の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体は、配列番号１（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａ）に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列および／または配列番号２（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ｂ）に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、抗体は、免疫学的に不活性である、たとえば、補体媒介性の溶解を始動しない、または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しない定常領域などの、改変された定常領域を含む。他の実施形態では、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３〜２６２４、ＰＣＴ  ＷＯ９９５８７５２に記載のように改変する。
【０１４６】
本発明の方法で使用するための抗体は、以下の特徴のうちの任意のもの（１つまたは複数）によって特徴づけられる：（ａ）ＮＧＦと結合する能力、（ｂ）ＮＧＦシグナル伝達によって媒介されるＮＧＦ生物活性および／または下流経路を減少および／または阻害する能力、（ｃ）マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存性の生存を減少および／または阻害する能力、（ｄ）ＮＴ３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦに対するすべての顕著な交差反応性の非存在、（ｅ）間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状を治療および／または予防する能力、（ｆ）ＮＧＦのクリアランスを増加する能力、（ｇ）たとえば、キナーゼ受容体活性化アッセイ（ＫＩＲＡ）（米国特許第６，０２７，９２７号を参照）を用いて検出される、ｔｒｋＡ受容体の活性化を減少または阻害する能力。
【０１４７】
本発明の目的のために、抗体は、ＮＧＦシグナル伝達機能によって媒介されるＮＧＦおよび／または下流経路を阻害する様式で、ＮＧＦと反応する。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体はヒトＮＧＦを認識する。さらに他の実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体はヒトＮＧＦと特異的に結合する。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体は、ＮＴ−３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦなどの関連ニューロトロフィンと特異的に結合しない。さらに他の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体は、ＮＧＦと結合して、ＮＧＦとそのＴｒｋＡおよび／もしくはｐ７５受容体との結合をｉｎ  ｖｉｖｏで有効に阻害することができる、ならびに／またはＮＧＦがそのＴｒｋＡおよび／またはｐ７５受容体を活性化することを有効に阻害することができる。さらに他の実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体はモノクローナル抗体である。さらに他の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体はヒト化されている（本明細書中に記載の抗体Ｅ３など）。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体はヒトである。たとえば、抗体４Ｄ４、１４Ｄ１０、６Ｇ９、７Ｈ２、１４Ｆ１１および４Ｇ６を記載しているＷＯ２００５／０１９２６６を参照されたい。一実施形態では、抗体は、ヒトＮＧＦ上の１つまたは複数のエピトープを認識するヒト抗体である。別の実施形態では、抗体は、ヒトＮＧＦ上の１つまたは複数のエピトープを認識するマウスまたはラット抗体である。別の実施形態では、抗体は、霊長類、イヌ科動物、ネコ科動物、ウマ科動物、およびウシ亜科動物からなる群から選択されるＮＧＦ上の１つまたは複数のエピトープを認識する。さらなる実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体は、以下のうちの任意の１つまたは複数から選択される抗体と本質的に同じＮＧＦエピトープと結合する：ＭＡｂ９１１、ＭＡｂ９１２およびＭＡｂ９３８（Ｈｏｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９：２１５〜２２７（２０００）参照）、本明細書中に定義した抗体（抗体Ｅ３など）、ならびに／またはＷＯ２００５００１９２６６（抗体４Ｄ４、１４Ｄ１０、６Ｇ９、７Ｈ２、１４Ｆ１１および４Ｇ６が含まれる）もしくはＷＯ２００６１３１９５１（抗体Ｈｕ−αＤ１１が含まれる）に記載の抗体。他の実施形態では、抗体は、Ｍａｂ９１１と同じエピトープと結合する。別の実施形態では、抗体は、免疫学的に不活性な（たとえば、補体媒介性の溶解または抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を始動しない）定常領域を含む。ＡＤＣＣ活性は、米国特許第５，５００，３６２号に開示されている方法を用いて評価することができる。一部の実施形態では、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３〜２６２４、ＰＣＴ  ＷＯ９９５８７５２に記載のように改変する。
【０１４８】
一部の実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体は、抗体「Ｅ３」と呼ばれるヒト化マウス抗ＮＧＦモノクローナル抗体、本明細書中に記載のＥ３関連抗体のうちの任意のもの、または任意のその断片である。
【０１４９】
親ネズミ抗ＮＧＦモノクローナル抗体９１１と比較して高い親和性および遅い解離速度でヒトＮＧＦと結合する抗体Ｅ３の結合特性を、以下に要約する。Ｅ３は、親マウス抗体９１１よりも約５０倍高い結合親和性でヒトＮＧＦと結合する。
【０１５０】
【表１】
2018012692.tif 000002
【０１５１】
また、Ｅ３抗体および関連抗体は、その内容が本明細書中に参考として組み込まれているＷＯ２００４／０５８１８４の実施例２および３に記載されているｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって評価して、ヒトＮＧＦを拮抗する強力な能力も示す。たとえば、抗体Ｅ３は、マウスＥ１３三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存性の生存を、１５ｐＭのヒトＮＧＦの存在下では約２１ｐＭのＩＣ５０、および１．５ｐＭのヒトＮＧＦの存在下では約１．２ｐＭで拮抗する。
【０１５２】
したがって、別の態様では、本発明の抗体およびポリペプチドは、（ｈ）低い解離速度でヒトＮＧＦとの高い親和性結合（一部の実施形態では、約２ｎＭ以下のＫＤ、および／または約６×１０−５ｓ−１よりも遅いｋｏｆｆ）および／または（ｉ）マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存性の生存を、約１５ｐＭのＮＧＦ（一部の実施形態ではヒトＮＧＦ）では約１００ｐＭ以下のＩＣ５０、および／もしくは約１．５ｐＭのＮＧＦでは約２０ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害（遮断）する能力によって、さらに同定および特徴づけられ得る。
【０１５３】
本発明に有用な抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、ヒト抗体、ならびに、抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体、および共有的に修飾された抗体を含めた、所要の特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された立体配置が包含される場合がある。抗体は、ネズミ、ラット、ヒト、または任意の他の起源（キメラもしくはヒト化抗体が含まれる）であり得る。
【０１５４】
一部の実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４の寄託番号を有する宿主細胞によって産生されるポリヌクレオチドによってコードされている軽鎖を含む抗体を利用する。別の態様では、抗体は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有する宿主細胞によって産生されるポリヌクレオチドによってコードされている重鎖を含む。また、本発明は、Ｅ３および均等な抗体断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、単鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ならびに所要の特異性の抗原（ＮＧＦ）認識部位を含むＥ３の任意の他の改変された立体配置の、様々な配合物も利用する。Ｅ３の抗体およびポリペプチド断片（抗体であってもなくてもよい）、ならびにＥ３のポリペプチド断片を含むポリペプチドを含めた、Ｅ３の均等な抗体は、上述の基準のうちの任意のもの（１つまたは複数）によって同定および特徴づけられる。
【０１５５】
したがって、本発明は、以下のうちの任意のもの、または以下のうちの任意のものを含む組成物（医薬組成物が含まれる）を利用する：（ａ）抗体Ｅ３、（ｂ）抗体Ｅ３の断片もしくは領域、（ｃ）配列番号１７（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ｂ）に示される抗体Ｅ３の軽鎖、（ｃ）配列番号１６（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａ）に示される抗体Ｅ３の重鎖、（ｄ）抗体Ｅ３の軽鎖および／もしくは重鎖からの１つもしくは複数の可変領域、（ｅ）配列番号３〜８（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂ）に示される抗体Ｅ３の１つもしくは複数のＣＤＲ（１個、２個、３個、４個、５個もしくは６個のＣＤＲ）、（ｆ）配列番号５（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａ）に示される抗体Ｅ３の重鎖からのＣＤＲ  Ｈ３、（ｇ）配列番号８（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ｂ）に示される抗体Ｅ３の軽鎖からのＣＤＲ  Ｌ３、（ｈ）配列番号６〜８（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ｂ）に示される抗体Ｅ３の軽鎖からの３個のＣＤＲ、（ｉ）配列番号３〜５（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａ）に示される抗体Ｅ３の重鎖からの３個のＣＤＲ、（ｊ）配列番号３〜８（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂ）に示される抗体Ｅ３の、軽鎖からの３個のＣＤＲおよび重鎖からの３個のＣＤＲ、ならびに（ｋ）（ｂ）〜（ｊ）のうちの任意の１つを含む抗体。
【０１５６】
抗体Ｅ３のＣＤＲ部分（コチアおよびカバットＣＤＲが含まれる）は、ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂに図式的に示されており）、以下のアミノ酸配列からなる：
（ａ）重鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲ  Ｈ１」）ＧＦＳＬＩＧＹＤＬＮ（配列番号３）、
（ｂ）重鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲ  Ｈ２」）ＩＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＶＫＳ（配列番号４）、
（ｃ）重鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲ  Ｈ３」）ＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号５）、
（ｄ）軽鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲ  Ｌ１」）ＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＮ（配列番号６）、
（ｅ）軽鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲ  Ｌ２」）ＹＴＳＲＦＨＳ（配列番号７）、および
（ｆ）軽鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲ  Ｌ３」）ＱＱＥＨＴＬＰＹＴ（配列番号８）。
【０１５７】
ＣＤＲ領域の決定は、十分に当分野の技術範囲内にある。一部の実施形態では、ＣＤＲは、カバットおよびコチアＣＤＲの組合せであることができる（「組合せＣＤＲ」または「拡張ＣＤＲ」とも呼ばれる）ことを理解されたい。一部の実施形態では、ＣＤＲはカバットＣＤＲを含む。他の実施形態では、ＣＤＲはコチアＣＤＲである。
【０１５８】
一部の実施形態では、抗体は、Ｅ３の少なくとも１個のＣＤＲ、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個のＣＤＲに実質的に相同的な少なくとも１つのＣＤＲを含む（または、一部の実施形態では、Ｅ３の６個すべてのＣＤＲに実質的に相同的、もしくはＥ３に由来する）。他の実施形態には、Ｅ３の少なくとも２個、３個、４個、５個もしくは６個のＣＤＲに実質的に相同的な、少なくとも２個、３個、４個、５個、もしくは６個のＣＤＲを有する抗体、またはＥ３に由来する抗体が含まれる。本発明の目的のために、結合特異性および／または全体的な活性（疼痛またはＥ１３．５マウス三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存性の生存の阻害の治療および／または予防に関する場合がある）は一般に保持されるが、活性の程度はＥ３と比較して変動し得る（より高いまたは低い場合がある）ことを理解されたい。
【０１５９】
一部の実施形態では、抗体は、以下のうちの任意のものを有するＥ３のアミノ酸配列を含み得る：Ｅ３の配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸、少なくとも８個の連続したアミノ酸、少なくとも約１０個の連続したアミノ酸、少なくとも約１５個の連続したアミノ酸、少なくとも約２０個の連続したアミノ酸、少なくとも約２５個の連続したアミノ酸、少なくとも約３０個の連続したアミノ酸であり、アミノ酸のうちの少なくとも３個がＥ３からの可変領域であるもの。Ｍａｂ９１１の拡張ＣＤＲ配列は、ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂ、ならびに本明細書中の配列番号９〜１４に示されている。一実施形態では、可変領域は、Ｅ３の軽鎖からのものである。別の実施形態では、可変領域は、Ｅ３の重鎖からのものである。別の実施形態では、５個（以上）の連続したアミノ酸は、配列番号３〜８（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂ）に示されるＥ３の相補性決定領域（ＣＤＲ）からのものである。
【０１６０】
別の実施形態では、抗体は、以下のうちの任意のものを有するＥ３のアミノ酸配列を含む：Ｅ３の配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸、少なくとも８個の連続したアミノ酸、少なくとも約１０個の連続したアミノ酸、少なくとも約１５個の連続したアミノ酸、少なくとも約２０個の連続したアミノ酸、少なくとも約２５個の連続したアミノ酸、少なくとも約３０個の連続したアミノ酸であり、Ｅ３配列は、アミノ酸残基ＣＤＲＨ１のＬ２９、ＣＤＲＨ２のＩ５０、ＣＤＲＨ３のＷ１０１、および／もしくはＣＤＲＨ３のＡ１０３、ならびに／またはアミノ酸残基ＣＤＲＬ１のＳ２８、ＣＤＲＬ１のＮ３２、ＣＤＲＬ２のＴ５１、ＣＤＲＬ３の９１Ｅおよび／もしくはＣＤＲＬ３のＨ９２のうちの、任意の１つまたは複数を含む。
【０１６１】
明らかなように、本開示全体にわたって、可変領域中のアミノ酸残基を指すために連続的なアミノ酸の番号づけスキームを使用する（すなわち、それぞれの可変領域中のアミノ酸残基は順々に番号づけされている）。当分野で周知のように、カバットおよび／またはコチア番号づけ系は、Ｅ３抗体とＥ３変異体（またはＥ３変異体であると疑われるポリペプチド）などの２つの抗体またはポリペプチドを比較する場合に有用である。たとえば、Ｅ３と別のポリペプチドとの間の比較を行う際に使用するために、所望する場合は、連続的な番号づけをコチアおよび／またはカバットの番号づけにどのように変換するかは、当分野で周知である。ＷＯ２００４／０５８１８４の図２３は、連続的なコチアおよびカバットの番号づけを用いて番号づけしたＥ３の可変領域を示す。さらに、比較を容易にするために、一般に、フレームワーク残基は、一般に、必ずではないがほぼ同数の残基を有することを理解されたい。しかし、ＣＤＲの大きさは変動し得る（すなわち、１つまたは複数のアミノ酸残基の挿入および／または欠失を有することが可能である）。Ｅ３抗体と候補Ｅ３変異体とを比較する場合（たとえば、それをアラインメントする抗体Ｅ３よりも、配列が長い候補配列からのＣＤＲ領域の場合）は、以下のステップに従い得る（ただし他の方法も当分野で知られている）。候補抗体配列をＥ３抗体重鎖および軽鎖可変領域とアラインメントする。アラインメントは手動で、または一般的に認められているコンピュータプログラムを用いたコンピュータによって行い得る。アラインメントは、ほとんどのＦａｂ配列に共通の一部のアミノ酸残基を用いて容易になり得る。たとえば、軽鎖および重鎖は、それぞれ、典型的には２つのシステインを有し、これらは、しばしば保存された位置に見つかる。候補の変異抗体のアミノ酸配列は、より長い（すなわち、挿入されたアミノ酸残基を有する）またはより短い（欠失したアミノ酸残基を有する）場合があることを理解されたい。追加の残基の挿入を示すために、接尾記号を残基数に付け加えてもよく、たとえば、残基３４ａｂｃである。たとえば、たとえば残基３３および３５についてＥ３配列とアラインメントするが、残基３５とアラインメントするためにその間に残基が存在しない候補配列では、残基３５は、単純に、残基に割り当てられない。別の手法では、異なる長さのＣＤＲを比較する場合は、比較を、構造的に均等な（たとえば、抗原−抗体の複合体中の同じ位置の）アミノ酸の間で行い得ることが一般に周知である。たとえば、コチア番号づけ（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、上記）は、一般に（すべての事例ではないが）、挿入および欠失を構造的に正しい位置に配置する。また、構造的均等性は、Ｘ線結晶構造解析または二重突然変異体サイクル分析を用いて推定または実証してもよい（Ｐｏｎｓら、（１９９９）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．８：９５８〜９６８を参照）。
【０１６２】
ＮＧＦ（ｈＮＧＦなど）に対する抗ＮＧＦ抗体の結合親和性は、ＫＤとして、約０．１０〜約０．８０ｎＭ、約０．１５〜約０．７５ｎＭおよび約０．１８〜約０．７２ｎＭであることができる。一部の実施形態では、ＫＤは、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約４０ｐＭ、または約４０ｐＭよりも高い。一実施形態では、ＫＤは、約２ｐＭ〜２２ｐＭである。他の実施形態では、ＫＤは、約１０ｎＭ以下、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭである。一部の実施形態では、ＫＤは約１０ｎＭである。他の実施形態では、ＫＤは約１０ｎＭ以下である。他の実施形態では、ＫＤは約０．１ｎＭまたは約０．０７ｎＭである。他の実施形態では、ＫＤは、約０．１ｎＭ以下または約０．０７ｎＭ以下である。他の実施形態では、ＫＤは、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約１０ｐＭから約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、または約４０ｐＭのうちの任意のもののうちの、任意のものである。一部の実施形態では、ＫＤは、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約１０ｐＭのうちの任意のものである。さらに他の実施形態では、ＫＤは、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約４０ｐＭ、または約４０ｐＭよりも高い。
【０１６３】
ＮＧＦに対する抗体の結合親和性は、当分野で周知の方法を用いて決定することができる。ＮＧＦに対する抗体の結合親和性を決定する一方法は、抗体の単官能性Ｆａｂ断片の結合親和性を測定することによる。単官能性Ｆａｂ断片を得るために、抗体（たとえばＩｇＧ）をパパインで切断するか、または組換えによって発現させることができる。抗体の抗ＮＧＦ  Ｆａｂ断片の親和性は、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、ＢＩＡｃｏｒｅ，ＩＮＣ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｗａｙ）によって決定することができる。ＣＭ５チップは、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイニドヒドロクロリド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて、供給者の指示に従って活性化させることができる。ヒトＮＧＦ（または任意の他のＮＧＦ）を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中で希釈することができ、活性化したチップ上に０．００５ｍｇ／ｍＬの濃度で注入した。個々のチップチャネルにわたって可変の流時間を用いて、２つの範囲の抗原密度を達成することができる：詳細な動力学的研究用には１００〜２００応答単位（ＲＵ）およびスクリーニングアッセイ用には５００〜６００ＲＵ。チップをエタノールアミンでブロッキングすることができる。再生研究により、Ｐｉｅｒｃｅ溶出緩衝液（製品番号２１００４、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）および４ＭのＮａＣｌの混合物（２：１）が、結合したＦａｂを有効に除去する一方で、チップ上のｈＮＧＦの活性が２００回の注射にわたって保持されることが示されている。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５のＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２９）をＢＩＡｃｏｒｅアッセイのランニング緩衝液として使用する。精製したＦａｂ試料の段階希釈（０．１〜１０×推定ＫＤ）を１分間、１００μＬ／分で注入し、２時間までの解離時間を許容する。Ｆａｂタンパク質の濃度を、標準として既知の濃度のＦａｂ（アミノ酸分析によって決定）を用いたＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって決定する。動力学的会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）が、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを用いて、データを１：１のラングミュア結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．Ｒｏｏｓ，Ｈ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．（１９９４）．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６．９９〜１１０）に当てはめることによって同時に得られる。平衡解離定数（ＫＤ）値をｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。このプロトコルは、ヒトＮＧＦ、別の脊椎動物（一部の実施形態では哺乳動物）のＮＧＦ（マウスＮＧＦ、ラットＮＧＦ、霊長類ＮＧＦなど）を含めた任意のＮＧＦに対する抗体の結合親和性の決定に使用するため、関連ニューロトロフィンＮＴ３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦなどの他のニューロトロフィンで使用するために適している。
【０１６４】
一部の実施形態では、抗体はヒトＮＧＦと結合し、別の脊椎動物種（一部の実施形態では哺乳動物）からのＮＧＦとは顕著に結合しない。一部の実施形態では、抗体は、ヒトＮＧＦおよび別の脊椎動物種（一部の実施形態では哺乳動物）からの１つまたは複数のＮＧＦと結合する。さらに他の実施形態では、抗体は、ＮＧＦと結合し、他のニューロトロフィン（関連ニューロトロフィン、ＮＴ３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦなど）と顕著に交差反応しない。一部の実施形態では、抗体は、ＮＧＦおよび少なくとも１つの他のニューロトロフィンと結合する。一部の実施形態では、抗体は、ウマまたはイヌなどのＮＧＦの哺乳動物種と結合するが、別の哺乳動物種からのＮＧＦと顕著に結合しない。
【０１６５】
エピトープは連続的または非連続的であることができる。一実施形態では、抗体は、その内容の全体が本明細書中に参考として組み込まれている、Ｈｏｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９：２１５〜２２７（２０００）に記載のＭＡｂ９１１、ＭＡｂ９１２、およびＭＡｂ９３８、本明細書中に定義した抗体（抗体Ｅ３など）および／またはＷＯ２００５０１９２６６（抗体４Ｄ４、１４Ｄ１０、６Ｇ９、７Ｈ２、１４Ｆ１１および４Ｇ６が含まれる）もしくはＷＯ２００６１３１９５１（抗体Ｈｕ−αＤ１１が含まれる）に記載の抗体からなる群から選択される抗体と本質的に同じヒトＮＧＦエピトープと結合する。別の実施形態では、抗体は、ＭＡｂ９１１と本質的に同じｈＮＧＦエピトープと結合する。さらに別の実施形態では、抗体は、ＭＡｂ９０９と本質的に同じエピトープと結合する。Ｈｏｎｇｏら、上記。たとえば、エピトープは、ｈＮＧＦの可変領域１（アミノ酸２３〜３５）内の残基Ｋ３２、Ｋ３４およびＥ３５、ｈＮＧＦの可変領域４（アミノ酸８１〜８８）内の残基Ｆ７９およびＴ８１、可変領域４内の残基Ｈ８４およびＫ８８、ｈＮＧＦの可変領域５（アミノ酸９４〜９８）とｈＮＧＦのＣ末端（アミノ酸１１１〜１１８）との間の残基Ｒ１０３、ｈＮＧＦのプレ可変領域１（アミノ酸１０〜２３）内の残基Ｅ１１、ｈＮＧＦの可変領域２（アミノ酸４０〜４９）とｈＮＧＦの可変領域３（アミノ酸５９〜６６）との間のＹ５２、ｈＮＧＦのＣ末端内の残基Ｌ１１２およびＳ１１３、ｈＮＧＦの可変領域３内の残基Ｒ５９およびＲ６９、またはｈＮＧＦのプレ可変領域１内の残基Ｖ１８、Ｖ２０、およびＧ２３のうちの、１つまたは複数を含み得る。さらに、エピトープは、ｈＮＧＦの可変領域１、可変領域３、可変領域４、可変領域５、Ｎ末端領域、および／またはＣ末端のうちの１つまたは複数を含むことができる。さらに別の実施形態では、抗体は、ｈＮＧＦの残基Ｒ１０３の溶媒接近性を顕著に減少させる。上述のエピトープはヒトＮＧＦに関するが、当業者は、ヒトＮＧＦの構造を他の種のＮＧＦとアラインメントして、これらのエピトープの可能性のある対応物を同定できることを理解されたい。
【０１６６】
一部の実施形態では、本発明で使用するための抗体は、マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を、およそ２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、８０ｐＭ、６０ｐＭ、４０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、もしくはそれより低いもののうちの任意のＩＣ５０（約１５ｐＭのＮＧＦの存在下）で阻害（減少および／または遮断）し得る。一部の実施形態では、本発明の抗体またはペプチドは、マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのヒトＮＧＦ依存性の生存を、およそ５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、１０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、２ｐＭ、１ｐＭ、もしくはそれより低いもののうちの任意のＩＣ５０（約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下）で阻害（減少および／または遮断）し得る。一部の実施形態では、本発明の抗体またはペプチドは、マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのラットＮＧＦ依存性の生存を、およそ１５０ｐＭ、１２５ｐＭ、１００ｐＭ、８０ｐＭ、６０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、もしくはそれより低いもののうちの任意のＩＣ５０（約１５ｐＭのＮＧＦの存在下）で阻害（減少および／または遮断）し得る。一部の実施形態では、抗体は、マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのラットＮＧＦ依存性の生存を、およそ３０ｐＭ、２５ｐＭ、２０ｐＭ、１５ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、４ｐＭ、３ｐＭ、２ｐＭ、１ｐＭ、もしくはそれより低いもののうちの任意のＩＣ５０（約１．５ｐＭのＮＧＦの存在下）で阻害（減少および／または遮断）し得る。マウスＥ１３三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存性の生存を測定する方法は当分野で知られており、たとえば、ＷＯ２００４／０５８１８４の実施例２に記載されている）。
【０１６７】
抗ＮＧＦ拮抗抗体の同定
本発明で使用するための抗ＮＧＦ拮抗抗体は、ＮＧＦ生物活性の減少、寛解、または中和が検出および／または測定される、当分野で知られている方法を用いて同定または特徴づけることができる。ＰＣＴ  ＷＯ０４／０６５５６０に記載されている方法を使用することができる。別の方法、たとえば、米国特許第５，７６６，８６３号および第５，８９１，６５０号に記載のキナーゼ受容体活性化（ＫＩＲＡ）アッセイを用いて、抗ＮＧＦ剤を同定することができる。このＥＬＩＳＡ型アッセイは、受容体タンパク質チロシンキナーゼ（本明細書中で以降「ｒＰＴＫ」）、たとえばＴｒｋＡ受容体のキナーゼドメインの自己リン酸化を測定することによる、キナーゼ活性化の定性的または定量的な測定、ならびに選択したｒＰＴＫ、たとえばＴｒｋＡの潜在的な拮抗剤の同定および特徴づけに適している。アッセイの第１の段階は、キナーゼ受容体、たとえばＴｒｋＡ受容体のキナーゼドメインのリン酸化を含み、受容体は、真核細胞の細胞膜中に存在する。
【０１６８】
受容体は、内在性受容体もしくは受容体をコードしている核酸であってよいか、または受容体構築体を細胞内に形質転換させてもよい。典型的には、細胞が固相に接着するように、第１の固相（たとえば第１のアッセイプレートのウェル）を、そのような細胞（通常は哺乳動物細胞系）の実質的に同種の集団でコーティングする。多くの場合、細胞は接着性であり、したがって第１の固相に自然に接着する。「受容体構築体」を用いる場合、これは、通常、キナーゼ受容体とフラグポリペプチドとの融合体を含む。フラグポリペプチドは、アッセイのＥＬＩＳＡ部分において捕捉剤、多くの場合は捕捉抗体によって認識される。その後、チロシンキナーゼ受容体（たとえばＴｒｋＡ受容体）がＮＧＦおよび分析物に曝露されるように（またはそれと接触するように）、候補ＮＧＦ拮抗剤（抗ＮＧＦ拮抗抗体が含まれる）などの分析物を、ＮＧＦと一緒に、接着性細胞を有するウェルに加える。このアッセイにより、そのリガンドＮＧＦによるＴｒｋＡの活性化を阻害する拮抗剤（抗体が含まれる）の同定が可能となる。ＮＧＦおよび分析物への曝露に続いて、溶解緩衝液（その中に可溶化洗剤を有する）および穏やかな動揺を用いて接着性細胞を可溶化して、細胞溶解液を放出させ、これは、細胞溶解液の濃縮または清澄の必要性なしにアッセイのＥＬＩＳＡ部分に直接供することができる。
【０１６９】
その後、このようにして調製した細胞溶解液は、アッセイのＥＬＩＳＡ段階に供する準備ができている。ＥＬＩＳＡ段階の第１のステップとして、第２の固相（通常はＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウェル）を、チロシンキナーゼ受容体と、または受容体構築体の場合はフラグポリペプチドと特異的に結合する、捕捉剤（多くの場合は捕捉抗体）でコーティングする。第２の固相のコーティングは、捕捉剤が第２の固相に接着するように実施する。捕捉剤は一般にモノクローナル抗体であるが、本明細書中の実施例に記載するように、ポリクローナル抗体も使用し得る。その後、受容体または受容体構築体が第２の固相に接着する（またはその中に捕捉される）ように、得られた細胞溶解液を接着性捕捉剤に曝露するまたはそれと接触させる。その後、結合していない細胞溶解液を除去し、捕捉された受容体または受容体構築体を残すために、洗浄ステップを実施する。その後、接着性または捕捉された受容体または受容体構築体を、チロシンキナーゼ受容体中のリン酸化されたチロシン残基を同定する抗ホスホチロシン抗体に曝露するまたはそれと接触させる。一実施形態では、抗ホスホチロシン抗体を、非放射性有色試薬の色変化を触媒する酵素とコンジュゲートさせる（直接または間接的に）。したがって、受容体のリン酸化は、続く試薬の色変化によって測定することができる。酵素は、抗ホスホチロシン抗体と直接結合することができるか、またはコンジュゲート分子（たとえばビオチン）を抗ホスホチロシン抗体とコンジュゲートさせ、続いて、酵素を、コンジュゲート分子を介して抗ホスホチロシン抗体と結合させることができる。最後に、抗ホスホチロシン抗体と捕捉された受容体または受容体構築体との結合を、たとえば有色試薬の色変化によって測定する。
【０１７０】
また、抗ＮＧＦ拮抗抗体は、候補剤をＮＧＦと共にインキュベートし、以下のうちの任意の１つまたは複数の特徴を監視することによっても同定することができる：（ａ）ＮＧＦと結合して、ＮＧＦシグナル伝達機能によって媒介されるＮＧＦ生物活性または下流経路を阻害すること、（ｂ）ＮＧＦ受容体活性化（ＴｒｋＡの二量体化および／または自己リン酸化が含まれる）を阻害、遮断または減少すること、（ｃ）ＮＧＦのクリアランスを増加すること、（ｄ）間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状の任意の側面を治療または予防すること、（ｅ）ＮＧＦの合成、産生または放出を阻害（減少）すること。一部の実施形態では、ＮＧＦ拮抗剤（たとえば抗ＮＧＦ拮抗抗体）は、候補剤をＮＧＦと共にインキュベートし、結合および／または付随するＮＧＦの生物活性の減少もしくは中和を監視することによって同定する。結合アッセイは、精製したＮＧＦポリペプチドを用いて行うか、またはＮＧＦポリペプチドを自然に発現する、もしくは発現するように形質移入した細胞を用いて行い得る。一実施形態では、結合アッセイは、ＮＧＦ結合について既知の抗ＮＧＦ拮抗抗体と競合する候補剤（抗体など）の能力を評価する、競合的結合アッセイである。アッセイは、ＥＬＩＳＡ様式を含めた様々な様式で行い得る。他の実施形態では、ＮＧＦ拮抗剤（抗ＮＧＦ拮抗抗体など）は、候補剤をＮＧＦと共にインキュベートし、結合ならびに付随するｔｒｋＡ受容体の二量体化および／または自己リン酸化の阻害を監視することによって同定する。
【０１７１】
初期の同定の後、候補抗ＮＧＦ拮抗抗体の活性は、標的の生物活性を試験することが知られているバイオアッセイによってさらに確認および洗練することができる。あるいは、バイオアッセイは、候補を直接スクリーニングするために使用することができる。たとえば、ＮＧＦは、応答性細胞のいくつかの形態学的に認識可能な変化を促進する。これらには、それだけには限定されないが、ＰＣ１２細胞の分化の促進およびこれらの細胞からの神経突起の成長の増強（Ｇｒｅｅｎｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．７３（７）：２４２４〜８、１９７６）、応答性の感覚および交感神経節の外植片からの神経突起の成長の促進（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ，Ｒ．およびＡｎｇｅｌｅｔｔｉ，Ｐ．Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．４８：５３４〜５６９、１９６８）ならびに胚性後根神経節、三叉神経節、または交感神経節ニューロンなどのＮＧＦ依存性ニューロンの生存の促進（たとえば、ＣｈｕｎおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．７５：７０５〜７１１、（１９７７）；ＢｕｃｈｍａｎおよびＤａｖｉｅｓ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８：９８９〜１００１（１９９３）が含まれる。したがって、ＮＧＦ生物活性の阻害のアッセイは、ＮＧＦ応答性細胞をＮＧＦおよび候補ＮＧＦ拮抗剤（抗ＮＧＦ拮抗抗体が含まれる）などの分析物と共に培養することを伴う。適切な時間後、細胞応答をアッセイする（細胞分化、神経突起の成長または細胞生存）。
【０１７２】
また、ＮＧＦの生物活性を遮断または中和する候補ＮＧＦ拮抗抗体の能力は、Ｈｏｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９：２１５〜２２７（２０００）に記載されているように、候補剤が胚性ラット後根神経節生存バイオアッセイにおいて、ＮＧＦに媒介される生存を阻害する能力を監視することによって、評価することができる。
【０１７３】
本発明で使用するための抗体は、当分野で知られている手順によって作製することができ、その一部はＷＯ２００４／０５８１８４の実施例に例示されている。抗体は、抗体のタンパク質分解もしくは他の分解によって、ＷＯ２００４／０５８１８４に記載のように組換え方法によって（すなわち、単一もしくは融合ポリペプチド）または化学合成によって産生することができる。抗体のポリペプチド、特に約５０個までのアミノ酸のより短いポリペプチドは、化学合成によって好都合に作製される。化学合成の方法は当分野で知られており、市販されている。たとえば、Ｅ３抗体は、固相方法を用いた自動ポリペプチド合成器によって産生することができる。米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、および第６，３３１，４１５号も参照されたい。また、キメラまたはハイブリッド抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、架橋結合剤を含むものを含めた既知の合成タンパク質化学の方法を用いて調製し得る。たとえば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって構築し得る。この目的のための適切な試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが含まれる。
【０１７４】
別の代替方法では、抗体は、当分野で周知の手順を用いて、組換えによって作製することができる。一実施形態では、抗体Ｅ３の可変および軽鎖領域をコードしている配列を含むポリヌクレオチドを、宿主細胞（たとえばＣＨＯ細胞）中での発現または増殖のためのベクター内にクローニングする。別の実施形態では、ＷＯ２００４／０５８１８４の図２および３に示されるポリヌクレオチド配列を、発現または増殖のための１つまたは複数のベクター内にクローニングする。目的抗体をコードしている配列を、宿主細胞中のベクター中に維持してよく、その後、宿主細胞を拡大して将来使用するために凍結することができる。ベクター（発現ベクターが含まれる）および宿主細胞は、本明細書中にさらに記載されている。抗体を植物または乳中で組換え発現させる方法が開示されている。たとえば、Ｐｅｅｔｅｒｓら、（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２７５６；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＤ．Ｈｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５、ならびにＰｏｌｌｏｃｋら、（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１４７を参照されたい。抗体誘導体、たとえば、ヒト化、単鎖などを作製する方法は、当分野で知られている。
【０１７５】
また、本発明には、Ｅ３などの本発明の抗体の単鎖可変領域断片（「ｓｃＦｖ」）も包含される。単鎖可変領域断片は、短い連結ペプチドを用いることによって軽鎖および／または重鎖の可変領域を連結させることによって作製する。Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６。連結ペプチドの例は、一方の可変領域のカルボキシ末端と他方の可変領域のアミノ末端との間の約３．５ｎｍを架橋する、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１５）である。他の配列のリンカーが設計および使用されている（Ｂｉｒｄら、（１９８８））。立ち返って、リンカーは、薬物の付着または固体支持体への付着などの、追加の機能のために修飾することができる。単鎖変異体は、組換えまたは合成によって産生することができる。ｓｃＦｖの合成産生には、自動合成器を使用することができる。ｓｃＦｖの組換え産生には、ｓｃＦｖをコードしているポリヌクレオチドを含有する適切なプラスミドを、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物細胞などの真核、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核のどちらかである、適切な宿主細胞内に導入することができる。目的のｓｃＦｖをコードしているポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどのルーチン操作によって作製することができる。生じるｓｃＦｖは、当分野で知られている標準のタンパク質精製技術を用いて単離することができる。
【０１７６】
また、ダイアボディなどの、単鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディとは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同一鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインが別の鎖の相補的ドメインと対合することを強いて、２つの抗原結合部位が作製される、二価の二重特異性抗体である（たとえば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら、（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１〜１１２３を参照）。
【０１７７】
抗体は、二重特異性抗体、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体であり得る。二重特異性抗体は、本明細書中に開示した抗体を用いて調製することができる。二重特異性抗体を作製する方法は当分野で知られている（たとえば、Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０を参照）。従来より、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの重鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいていた（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５、５３７〜５３９）。
【０１７８】
二重特異性抗体を作製する一手法によれば、所望の結合特異性（抗体−抗原の組合せ部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとである。融合体の少なくとも１つ中に存在する軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、および所望する場合は免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別々の発現ベクター内に挿入し、適切な宿主生物内に同時形質移入する。これにより、構築体中で使用する３つのポリペプチド鎖の不等な比が最適な収率をもたらす実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互割合の調節において高い柔軟性がもたらされる。しかし、等しい比の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらす場合、または比が特に有意でない場合は、２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクター内に挿入することが可能である。
【０１７９】
一手法では、二重特異性抗体は、一方のアーム中の第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアーム中のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性をもたらす）からなる。免疫グロブリン軽鎖が二重特異性分子の半分にしか存在しないこの不斉構造は、所望の二重特異性化合物を所望しない免疫グロブリン鎖の組合せから分離することを容易にする。この手法は、１９９４年３月３日に公開のＰＣＴ公開ＷＯ９４／０４６９０に記載されている。
【０１８０】
２つの共有結合された抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体も、本発明の範囲内にある。そのような抗体は、免疫系細胞を所望しない細胞に標的化するため（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染症を治療するため（ＰＣＴ公開出願ＷＯ９１／００３６０およびＷＯ９２／２００３７３、ＥＰ０３０８９）に使用されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋結合方法を用いて作製し得る。適切な架橋結合剤および技術は当分野で周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されている。
【０１８１】
抗体は、たとえば、当分野で知られている、および本明細書中に記載のヒト化抗体であり得る。
【０１８２】
本発明には、その特性に顕著な影響が与えられない機能的に均等な抗体および増強または減少した活性を有する変異体を含めた、抗体Ｅ３への修飾が包含される。ポリペプチドの修飾は当分野でルーチン的な実施であり、実施例中にさらに例示されている。修飾されたポリペプチドの例には、アミノ酸残基の置換（保存的置換が含まれる）、機能的活性を顕著に有害変化させないアミノ酸の１つもしくは複数の欠失もしくは付加、または化学類似体の使用を有するポリペプチドが含まれる。
【０１８３】
本明細書中で使用するポリペプチド「変異体」とは、ポリペプチドの免疫反応性が実質的に減弱しないように、ネイティブタンパク質から１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入により異なるポリペプチドである。言い換えれば、抗原と特異的に結合する変異体の能力は、ネイティブタンパク質と比較して増強されているもしくは変化していないか、またはネイティブタンパク質と比較して５０％以下、好ましくは２０％以下が減弱していてもよい。ポリペプチド変異体は、好ましくは、同定したポリペプチドに対して少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性を示す（本明細書中に記載のように決定）。
【０１８４】
抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を抗体ＤＮＡ内に導入することによって、またはペプチド合成によって調製し得る。そのような変異体には、たとえば、本明細書中に記載の配列番号１または２のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはそれ内への挿入、および／またはその置換が含まれる。欠失、挿入、および置換の任意の組合せを行って最終構築体に達するが、ただし、最終構築体は所望の特徴を保有する。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数または位置の変更などの、抗体の翻訳後プロセスも変更し得る。
【０１８５】
突然変異誘発または修飾の好ましい位置である、抗体の特定の残基または領域を同定するための有用な方法は、「アラニンスキャン突然変異誘発」と呼ばれ、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１〜１０８５によって記載されている。残基または標的残基群を同定し（たとえば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）、中性または負荷電のアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えて、アミノ酸と抗原との相互作用をもたらす。その後、さらなるまたは他の変異体を置換部位に、またはその代わりに導入することによって、置換に対して機能感受性を実証するこれらのアミノ酸位置を洗練する。したがって、アミノ酸配列の変異を導入する部位は事前に決定されているが、突然変異自体の性質は事前に決定される必要はない。たとえば、所定の部位での突然変異の性能を分析するために、ａｌａスキャンまたはランダム突然変異誘発を標的コドンまたは領域において実施し、発現された抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。また、本明細書中に記載のライブラリスキャン突然変異誘発を、突然変異誘発または修飾に適した抗体中の位置を同定するために使用し得る。
【０１８６】
アミノ酸配列挿入には、１個の残基から数百個以上の残基を含有するポリペプチドの範囲の長さのアミノおよび／またはカルボキシル末端の融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグと融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させる酵素またはポリペプチドの抗体のＮまたはＣ末端との融合体が含まれる。
【０１８７】
置換変異体は、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が取り除かれ、様々な残基がその代わりに挿入されている。置換突然変異誘発の最も興味深い部位には超可変領域が含まれるが、ＦＲの変更も企図される。保存的置換は、表１に「保存的置換」の見出しの下に示す。そのような置換が生物活性の変化をもたらす場合は、表１中に「例示的な置換」と示す、またはアミノ酸クラスに関して以下に詳述する、より多大な変化を導入して、その産物をスクリーニングし得る。
【０１８８】
【表２】
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【０１８９】
抗体の生物学的特性の相当な改変は、（ａ）置換領域中のポリペプチド主鎖の構造、たとえば、シートもしくはヘリックスコンホメーションとして、（ｂ）標的部位での分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさの維持に対するその効果が顕著に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられている：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１９０】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスで交換することによって行われる。
【０１９１】
また、抗体の正しいコンホメーションの保持に関与していない任意のシステイン残基も、分子の酸化安定性を改善させ、異常な架橋結合を防止するために、一般にセリンで置換し得る。逆に、システイン結合（複数可）を、特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合に、その安定性を改善させるために、抗体に付加し得る。
【０１９２】
アミノ酸修飾は、１つまたは複数のアミノ酸の変更または修飾から、可変領域などの領域の完全な再設計の範囲であることができる。可変領域の変化は、結合親和性および／または特異性を変更する場合がある。一部の実施形態では、１〜５個以下の保存的アミノ酸置換をＣＤＲドメイン内に行う。他の実施形態では、１〜３以下の保存的アミノ酸置換をＣＤＲ３ドメイン内に行う。さらに他の実施形態では、ＣＤＲドメインはＣＤＲＨ３および／またはＣＤＲ  Ｌ３である。
【０１９３】
また、修飾には、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチド、ならびに、たとえば、様々な糖を用いたグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などの他の翻訳後修飾を有するポリペプチドも含まれる。抗体は、その定常領域中の保存された位置でグリコシル化される（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、１９９７、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：１１１〜１２８；ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７、ＴｉｂＴＥＣＨ  １５：２６〜３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１〜１３１８；ＷｉｔｔｗｅおよびＨｏｗａｒｄ、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：４１７５〜４１８０）、ならびに、糖タンパク質のコンホメーションおよび提示された三次元表面に影響を与える場合がある、糖タンパク質の部分間の分子内相互作用（ＨｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、上記、ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４０９〜４１６）に影響を与える。また、オリゴ糖は、所定の糖タンパク質を特定の認識構造に基づいて特定の分子に標的化させる役割を果たし得る。また、抗体のグリコシル化は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を与えることも報告されている。特に、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）、二分ＧｌｃＮＡｃのグリコシルトランスフェラーゼ触媒形態テトラサイクリン制御性の発現を有するＣＨＯ細胞は、改善したＡＤＣＣ活性を有することが報告されている（Ｕｍａｎａら、１９９９、Ｍａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６〜１８０）。
【０１９４】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ−連結またはＯ−連結のどちらかである。Ｎ−連結とは、炭水化物部分とアスパラギン残基側鎖との付着をいう。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン［式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である］が、炭水化物部分とアスパラギン側鎖との酵素的付着の認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のどちらかが存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が生じる。Ｏ−連結グリコシル化とは、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つとヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンとの付着をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用し得る。
【０１９５】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、上述のトリペプチド配列のうちの１つまたは複数が含有されるようにアミノ酸配列を変更することによって、好都合に達成される（Ｎ−連結グリコシル化部位）。また、変更は、１つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基を元の抗体の配列に付加することによって、またはそれで置換することによっても行い得る（Ｏ−連結グリコシル化部位）。
【０１９６】
また、抗体のグリコシル化パターンは、基底にあるヌクレオチド配列を変更せずに変更し得る。グリコシル化は、抗体を発現させるために使用する宿主細胞に大きく依存する。潜在的な治療剤として組換え糖タンパク質、たとえば抗体を発現させるために使用する細胞種は、ネイティブ細胞であることが稀であるため、抗体のグリコシル化パターンの変動が予測できる（たとえばＨｓｅら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９０６２〜９０７０を参照）。
【０１９７】
宿主細胞の選択肢に加えて、抗体の組換え産生中にグリコシル化に影響を与える要素には、成長様式、培地配合、培養密度、酸素化、ｐＨ、精製スキームなどが含まれる。特定の宿主生物で達成されるグリコシル化パターンを変更するために、オリゴ糖の産生に関与する特定の酵素の導入または過剰発現を含めた、様々な方法が提案されている（米国特許第５，０４７，３３５号、第５，５１０，２６１号および第５，２７８，２９９号）。グリコシル化、または特定の種類のグリコシル化は、糖タンパク質から、たとえばエンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）を用いて、酵素的に除去することができる。さらに、特定の種類の多糖類のプロセッシングが欠損しているように、組換え宿主細胞を遺伝子操作することができる。これらおよび類似の技術が当分野で周知である。
【０１９８】
他の修飾方法には、それだけには限定されないが、酵素的手段、酸化的置換およびキレート化を含めた、当分野で知られているカップリング技術の使用が含まれる。修飾は、たとえば、免疫アッセイ用の標識の付着に使用することができる。Ｅ３ポリペプチドの修飾は、当分野で確立された手順を用いて行い、その一部が以下および実施例中に記載されている、当分野で知られている標準アッセイを用いてスクリーニングすることができる。
【０１９９】
他の抗体修飾には、１９９９年１１月１８日に公開のＰＣＴ公開ＷＯ９９／５８５７２に記載のように改変された抗体が含まれる。これらの抗体は、標的分子に向けられた結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの全部または一部に実質的に相同的なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、顕著な補体依存性の溶解、または標的の細胞媒介性破壊を始動させずに、標的分子と結合することができる。一部の実施形態では、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂと特異的に結合することができる。これらは、典型的には、２つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインに基づく。この様式で改変された抗体は、慣用の抗体治療に対する炎症性および他の有害な反応を回避するために、慢性抗体治療での使用に特に適している。
【０２００】
また、本発明は、本発明の抗体またはポリペプチドからの１つまたは複数の断片または領域を含む融合タンパク質も利用する。一実施形態では、配列番号２（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ｂ）に示される可変軽鎖領域の少なくとも１０個の連続したアミノ酸および／または配列番号１（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａ）に示される可変重鎖領域の少なくとも１０個のアミノ酸を含む融合ポリペプチドを提供する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号１および２（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂ）に示されるＥ３の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｅ３の１つまたは複数のＣＤＲを含む。さらに他の実施形態では、融合ポリペプチドは、抗体Ｅ３のＣＤＲ  Ｈ３および／またはＣＤＲ  Ｌ３を含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、アミノ酸残基ＣＤＲＨ１のＬ２９、ＣＤＲＨ２のＩ５０、ＣＤＲＨ３のＷ１０１、および／もしくはＣＤＲＨ３のＡ１０３、ならびに／またはアミノ酸残基ＣＤＲＬ１のＳ２８、ＣＤＲＬ１のＮ３２、ＣＤＲＬ２のＴ５１、ＣＤＲＬ３の９１Ｅおよび／もしくはＣＤＲＬ３のＨ９２のうちの、任意の１つまたは複数を含む。本発明の目的のために、Ｅ３融合タンパク質は、１つまたは複数のＥ３抗体およびネイティブ分子中では付着していない別のアミノ酸配列、たとえば、異種配列または別の領域からの相同配列を含有する。例示的な異種配列には、それだけには限定されないが、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグなどの「タグ」が含まれる。タグは当分野で周知である。
【０２０１】
Ｅ３融合ポリペプチドは、当分野で知られている方法、たとえば、合成または組換えによって作製することができる。典型的には、Ｅ３融合タンパク質は、本明細書中に記載の組換え方法を用いてそれらをコードしているポリヌクレオチドを調製および発現させることによって作製するが、たとえば化学合成を含めた当分野で知られている他の手段によって調製してもよい。
【０２０２】
ＮＧＦとの結合、ＮＧＦ生物活性の減少または阻害、Ｅ１３．５マウス三叉神経ニューロンのＮＧＦ誘発性の生存の減少および／または遮断などの、本発明の抗体およびポリペプチドの能力は、当分野で知られている方法を用いて試験してもよい、その一部は、ＷＯ２００４／０５８１８４の実施例、特にＷＯ２００４／０５８１８４の実施例２および３に記載されている。
【０２０３】
また、本発明は、抗体Ｅ３を含む組成物（医薬組成物が含まれる）およびキット、ならびに、本開示によって明らかとなるように、本明細書中に記載の抗体および／またはポリペプチドのうちの任意のものまたはすべても利用する。そのような組成物およびキットは、個体における間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する１つまたは複数の疼痛および／または下部尿路症状の治療および／または予防で使用するためであり得る。
【０２０４】
ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
また、本発明は、本発明の抗体およびポリペプチド（ＷＯ２００４０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂに示される軽鎖および重鎖可変領域のポリペプチド配列を含む抗体が含まれる）をコードしている単離したポリヌクレオチド、ならびに本発明の方法で使用するためのポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も提供する。
【０２０５】
したがって、ポリヌクレオチド（または医薬組成物を含めた組成物）は、以下のうちの任意のものをコードしているポリヌクレオチドを含み得る：（ａ）抗体Ｅ３、（ｂ）抗体Ｅ３の断片もしくは領域、（ｃ）配列番号１７（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ｂ）に示される抗体Ｅ３の軽鎖、（ｄ）配列番号１６（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａ）に示される抗体Ｅ３の重鎖、（ｅ）抗体Ｅ３の軽鎖および／もしくは重鎖からの１つもしくは複数の可変領域、（ｆ）配列番号３〜８（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂ）に示される抗体Ｅ３の１つもしくは複数のＣＤＲ（１個、２個、３個、４個、５個もしくは６個のＣＤＲ）、（ｇ）配列番号５（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａに示される抗体Ｅ３の重鎖からのＣＤＲ  Ｈ３、（ｈ）配列番号８（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ｂ）に示される抗体Ｅ３の軽鎖からのＣＤＲ  Ｌ３、（ｉ）配列番号６〜８（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ｂ）に示される抗体Ｅ３の軽鎖からの３個のＣＤＲ、（ｊ）配列番号３〜５（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａ）に示される抗体Ｅ３の重鎖からの３個のＣＤＲ、（ｋ）配列番号３〜８（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂに示される抗体Ｅ３の軽鎖からの３個のＣＤＲおよび重鎖からの３個のＣＤＲ、または（ｌ）（ｂ）〜（ｋ）のうちの任意のものを含む抗体。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号７６および７７（ＷＯ２００４／０５８１８４の図２および３）に示されるポリヌクレオチドの一方または両方を含む。
【０２０６】
別の態様では、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９３またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４の寄託番号を有するＥ３軽鎖をコードしている単離したポリヌクレオチドを利用する。別の態様では、本発明は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有するＥ３重鎖をコードしている単離したポリヌクレオチドを利用する。さらに別の態様では、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４の寄託番号を有するポリヌクレオチド中にコードされている可変領域、および（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有するポリヌクレオチド中にコードされている可変領域を含む、単離したポリヌクレオチドを利用する。別の態様では、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９４の寄託番号を有するポリヌクレオチド中にコードされている１つもしくは複数のＣＤＲ、および／または（ｂ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４８９５の寄託番号を有するポリヌクレオチド中にコードされている１つもしくは複数のＣＤＲを含む、単離したポリヌクレオチドを利用する。ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４８９３、ＰＴＡ−４８９４およびＰＴＡ−４８９５の下の寄託は、その内容の全体が本明細書中に組み込まれているＷＯ２００４／０５８１８４に記載されている。
【０２０７】
本明細書中に記載の抗体（抗体断片が含まれる）およびポリペプチドのうちの任意のものをコードしているポリヌクレオチドは、当分野で知られている手順によって作製することができる。
【０２０８】
別の態様では、本発明は、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状の治療または予防に使用するための、本発明のポリヌクレオチドのうちの任意のものを含む、組成物（医薬組成物など）を提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書中に記載のＥ３抗体をコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。他の実施形態では、組成物は、本明細書中に記載の抗体またはポリペプチドのうちの任意のものをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。さらに他の実施形態では、組成物は、ＷＯ２００４／０５８１８４の図２および３に示されるポリヌクレオチドの一方または両方を含む。発現ベクター、およびポリヌクレオチド組成物の投与を、本明細書中にさらに記載する。
【０２０９】
別の態様では、本発明は、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状を治療または予防する方法で使用するための、本明細書中に記載のポリヌクレオチドのうちの任意のものを作製する方法を提供する。
【０２１０】
任意のそのような配列に相補的なポリヌクレオチドも、本発明によって包含されている。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であってよく、また、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であってよい。ＲＮＡ分子には、イントロンを含有し、１対１の様式でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子が含まれる。必要ではないが、追加のコードまたは非コード配列が本発明のポリヌクレオチド内に存在していてもよく、また、必要ではないが、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持物質と連結していてもよい。
【０２１１】
ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、抗体もしくはその一部分をコードしている内在性配列）を含んでいてもよく、またはそのような配列の変異体を含んでいてもよい。ポリヌクレオチド変異体は、ネイティブ免疫反応性分子と比較してコードされているポリペプチドの免疫反応性が減弱しないように、１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。コードされているポリペプチド免疫反応性に対する効果は、一般に、本明細書中に記載のように評価し得る。変異体は、好ましくは、ネイティブ抗体またはその一部分をコードしているポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を示す。
【０２１２】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載のように最大一致についてアラインメントした場合に同じである場合に、「同一」であるといわれる。２つの配列間の比較は、典型的には、比較ウィンドウにわたって配列を比較して、配列類似度の局所的な領域を同定および比較することによって行う。本明細書中で使用する「比較ウィンドウ」とは、少なくとも約２０個の連続した位置、通常は３０〜約７５個、４０〜約５０個のセグメントをいい、２つの配列を最適にアラインメントした後に、配列を同じ数の連続した位置の参照配列と比較し得る。
【０２１３】
比較のための配列の最適なアラインメントは、生物情報学ソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて、初期設定パラメータを使用して実施し得る。このプログラムは、以下の参考文献中に記載されているいくつかのアラインメントスキームを具体化している：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ワシントンＤＣ  第５巻、補遺３、３４５〜３５８ページ；Ｈｅｉｎ  Ｊ．、１９９０、Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｈｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ６２６〜６４５ページ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１〜１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．、１９７１、Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．、Ｎｅｓ，Ｍ．、１９８７、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６〜４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．、１９７３、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６〜７３０。
【０２１４】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントした配列を、少なくとも２０個の位置の比較ウィンドウにわたって比較することによって決定し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２０％以下、通常は５〜１５％、または１０〜１２％の付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定することで、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を参照配列中の位置の合計数（すなわち、ウィンドウの大きさ）で除算し、結果に１００を乗算して、配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算する。
【０２１５】
また、またはそれに代わって、変異体は、ネイティブ遺伝子、またはその一部分もしくは補体に実質的に相同的であり得る。そのようなポリヌクレオチド変異体は、中等度にストリンジェントな条件下で、ネイティブ抗体（または相補的配列）をコードしている天然に存在するＤＮＡ配列とハイブリダイズすることができる。
【０２１６】
適切な「中等度にストリンジェントな条件」には、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液で事前に洗浄すること、５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣで終夜ハイブリダイズさせること、続いて、０．１％のＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いて、６５℃で２０分間、２回洗浄することが含まれる。
【０２１７】
本明細書中で使用する「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」とは、（１）洗浄に低イオン強度および高温、たとえば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、５０℃を用いること、（２）ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミド、たとえば５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドなどの変性剤を、０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のフィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、および７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムと共に、４２℃で用いること、または（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％の硫酸デキストランを４２℃で用い、４２℃、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％のホルムアミド、５５℃で洗浄し、続いて、ＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣ、５５℃からなる高ストリンジェンシーの洗浄を行うことである。当業者には、プローブの長さなどの要素に適合するために、必要に応じて温度、イオン強度などを調節する方法が理解されよう。
【０２１８】
当業者には、遺伝暗号の縮重の結果、本明細書中に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が多く存在することが理解されよう。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意のネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の相同性しか保有しない。それでも、コドン使用頻度の差異によって変動するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に企図される。さらに、本明細書中に提供するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子が、本発明の範囲内にある。対立遺伝子とは、１つまたは複数の突然変異、たとえば、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換の結果として変更されている内在性遺伝子である。生じるｍＲＮＡおよびタンパク質は、必ずではないが、変更された構造または機能を有し得る。対立遺伝子は、標準技術（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータ塩基配列の比較など）を用いて同定し得る。
【０２１９】
本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、化学合成、組換え方法、またはＰＣＲを用いて得ることができる。化学的ポリヌクレオチド合成方法は当分野で周知であり、本明細書中で詳述する必要はない。当業者は、本明細書中に提供する配列および市販のＤＮＡ合成器を使用して、所望のＤＮＡ配列を産生することができる。
【０２２０】
組換え方法を用いてポリヌクレオチドを調製するためには、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクター内に挿入することができ、立ち代って、ベクターは、本明細書中でさらに記載するように、複製および増幅のために、適切な宿主細胞内に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当分野で知られている任意の手段によって宿主細胞内に挿入し得る。細胞は、直接の取り込み、エンドサイトーシス、形質移入、Ｆ−接合または電気穿孔によって外因性ポリヌクレオチドを導入することによって、形質転換させる。導入された後、外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター（プラスミドなど）として、または宿主細胞ゲノム内に組み込まれて、細胞内に維持されることができる。そのようにして増幅したポリヌクレオチドは、当分野で周知の方法によって宿主細胞から単離することができる。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）を参照。
【０２２１】
あるいは、ＰＣＲは、ＤＮＡ配列の再現を可能にする。ＰＣＲ技術は当分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号、第４，７５４，０６５号および第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ（１９９４）に記載されている。
【０２２２】
ＲＮＡは、単離したＤＮＡを適切なベクター中で使用して、それを適切な宿主細胞内に挿入することによって得ることができる。細胞が複製されてＤＮＡがＲＮＡへと転写される際、ＲＮＡを、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）に記載されているように、当業者に周知の方法を用いて単離することができる。
【０２２３】
適切なクローニングベクターは、標準技術に従って構築するか、または当分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択し得る。選択されるクローニングベクターは、使用を意図する宿主細胞に応じて変化し得るが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼの単一の標的を保有する場合があり、および／またはベクターを含有するクローンの選択に使用することができるマーカーの遺伝子を保有する場合がある。適切な例には、プラスミドおよび細菌ウイルス、たとえば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（たとえばｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのシャトルベクターが含まれる。これらおよび多くの他のクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの販売業者から入手可能である。
【０２２４】
発現ベクターは、一般に、本発明によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築体である。発現ベクターは、宿主細胞中で、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの組み込まれた部分として複製可能でなければならないことが暗示される。適切な発現ベクターには、それだけには限定されないが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスを含めたウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２に開示されている発現ベクターが含まれる。ベクター構成要素には、一般に、それだけには限定されないが、以下のうちの１つまたは複数が含まれ得る：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、適切な転写性制御要素（プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターなど）。発現（すなわち翻訳）には、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、およびストップコドンなどの、１つまたは複数の翻訳制御要素も通常は必要である。
【０２２５】
目的のポリヌクレオチドを含有するベクターは、電気穿孔、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を用いた形質移入、微粒子銃、リポフェクション、および感染（たとえば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染性因子である場合）を含めた、いくつかの適切な手段のうちの任意のものによって、宿主細胞内に導入することができる。ベクターまたはポリヌクレオチドの導入の選択肢は、多くの場合宿主細胞の特長に依存する。
【０２２６】
また、本発明は、本明細書中に記載のポリヌクレオチドのうちの任意のものを含む宿主細胞も利用する。異種ＤＮＡを過剰発現することができる任意の宿主細胞を、目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝子を単離する目的に使用することができる。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例には、それだけには限定されないが、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が含まれる。ＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２も参照されたい。適切な非哺乳動物宿主細胞には、原核生物（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）など）および酵母（出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）またはケー・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ））が含まれる。好ましくは、宿主細胞は、存在する場合は、宿主細胞中の対応する目的の内在性抗体またはタンパク質よりも約５倍高い、より好ましくは１０倍高い、さらにより好ましくは２０倍高いレベルで、ｃＤＮＡを発現する。ＮＧＦに対する特異的結合について宿主細胞をスクリーニングすることは、免疫アッセイまたはＦＡＣＳによって達成される。目的の抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞を同定することができる。
【０２２７】
本発明の方法で使用するための組成物
本発明の方法で使用するための組成物（間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状に関連して）は、有効量の抗ＮＧＦ拮抗抗体を含み、一部の実施形態では、薬学的に許容できる賦形剤をさらに含む。そのような組成物、およびどのように配合するかの例も、本明細書中に記載されている。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体はＮＧＦと結合し、関連ニューロトロフィン（ＮＴ３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦなど）と顕著に交差反応しない。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体は、有害な免疫応答に関連していない。他の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体はヒトＮＧＦを認識する。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体はヒトである。さらに他の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体はヒト化されている（本明細書中に記載の抗体Ｅ３など）。さらに他の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体は、抗体媒介性溶解またはＡＤＣＣなどの、所望しないまたは望ましくない免疫応答を始動しない定常領域を含む。他の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体は、抗体Ｅ３の１つまたは複数のＣＤＲ（Ｅ３の１個、２個、３個、４個、５個、または一部の実施形態では６個すべてのＣＤＲなど）を含む。
【０２２８】
組成物は複数のＮＧＦ拮抗剤を含むことができることを理解されたい。たとえば、組成物は、ＮＧＦ拮抗剤のクラスの複数のメンバー（たとえば、ＮＧＦの様々なエピトープを認識する抗ＮＧＦ抗体の混合物）、ならびに様々なＮＧＦ拮抗剤のクラスのメンバー（たとえば、抗ＮＧＦ抗体およびＮＧＦ阻害化合物）を含むことができる。他の例示的な組成物は、同じエピトープ（複数可）、ＮＧＦの様々なエピトープと結合する抗ＮＧＦ抗体の様々な種、または様々なＮＧＦ阻害化合物を認識する、複数の抗ＮＧＦ抗体を含む。
【０２２９】
本発明中で使用する組成物は、薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第２０版（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ編．）を、凍結乾燥配合物または水溶液の形態で、さらに含むことができる。薬学的に許容できる賦形剤は、本明細書中にさらに記載されている。
【０２３０】
また、抗ＮＧＦ拮抗抗体およびその組成物は、薬剤の有効性を増強および／または補完する役割を果たす他の薬剤、たとえば、疼痛および／または下部尿路症状の治療または予防に使用する薬剤と併せて使用することもできる。抗ＮＧＦ拮抗抗体は、そのような薬剤のうちの１つまたは複数と、同時に、逐次的にまたは別々に組み合わせて投与し得る。
【０２３１】
抗ＮＧＦ抗体は、１つもしくは複数の他の薬物と組み合わせて（またはその任意の組合せとして）投与し得る。抗ＮＧＦ抗体は、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状（ＬＵＴＳ）を治療するために、別の薬理学的に活性のある化合物、または２つ以上の他の薬理学的に活性のある化合物と、有用に組み合わせ得る。たとえば、上記定義した抗ＮＧＦ抗体は、以下から選択される１つまたは複数の薬剤と組み合わせて、同時に、逐次的にまたは別々に投与し得る：
・オピオイド鎮痛剤、たとえば、モルヒネ、ヘロイン、ヒドロモルホン、オキシモルホン、レボルファノール、レバロルファン、メサドン、メペリジン、フェンタニル、コカイン、コデイン、ジヒドロコデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、プロポキシフェン、ナルメフェン、ナロルフィン、ナロキソン、ナルトレキソン、ブプレノルフィン、ブトルファノール、ナルブフィンまたはペンタゾシン、
・非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、たとえば、アスピリン、ジクロフェナク、ジフルシナル、エトドラク、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルフェニサル、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラック、メクロフェナム酸、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、ニメスリド、ニトロフルルビプロフェン、オルサラジン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スルファサラジン、スリンダク、トルメチンまたはゾメピラック、
・バルビツレート鎮痛剤、たとえば、アモバルビタール、アプロバルビタール、ブタバルビタール、ブタビタール、メホバルビタール、メタルビタール、メトヘキシタール、ペントバルビタール、フェノバルチタール、セコバルビタール、タルブタール、テアミラールまたはチオペンタール、
・鎮痛作用を有するベンゾジアゼピン、たとえば、クロルジアゼポキシド、クロラゼプ酸、ジアゼパム、フルラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、テマゼパムまたはトリアゾラム、
・鎮痛作用を有するＨ１拮抗剤、たとえば、ジフェンヒドラミン、ピリラミン、プロメタジン、クロルフェニルアミンまたはクロルシクリジン、
・鎮痛剤、たとえば、グルテチミド、メプロバメート、メタカロンまたはジクロラルフェナゾン、
・骨格筋弛緩剤、たとえば、バクロフェン、カリソプロドール、クロルゾキサゾン、シクロベンザプリン、メトカルバモールまたはオルフレナジン、
・ＮＭＤＡ受容体拮抗剤、たとえば、デキストロメトルファン（（＋）−３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルモルフィナン）またはその代謝物デキストロルファン（（＋）−３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルモルフィナン）、ケタミン、メマンチン、ピロロキノリンキニーネ、シス−４−（ホスホノメチル）−２−ピペリジンカルボン酸、ブジピン、ＥＮ−３２３１（ＭｏｒｐｈｉＤｅｘ（登録商標）、モルヒネおよびデキストロメトルファンの組合せ配合物）、トピラメート、ネラメキサンまたはペルジンフォテル［ＮＲ２Ｂ拮抗剤、たとえば、イフェンプロジル、トラキソプロジルもしくは（−）−（Ｒ）−６−｛２−［４−（３−フルオロフェニル）−４−ヒドロキシ−１−ピペリジニル］−１−ヒドロキシエチル−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−キノリノンが含まれる］、
・α−アドレナリン作動剤、たとえば、ドキサゾシン、タムスロシン、クロニジン、グアンファシン、デクスメタトミジン、モダフィニル、テラゾシン、インドラミン、アルフゾシン、シロドシンまたは４−アミノ−６，７−ジメトキシ−２−（５−メタン−スルホンアミド−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノール−２−イル）−５−（２−ピリジル）キナゾリン、プラゾシン
・三環系抗鬱剤、たとえば、デシプラミン、イミプラミン、アミトリプチリンまたはノルトリプチリン、
・抗痙攣剤、たとえば、カルバマゼピン、ラモトリギン、トピラトメートまたはバルプロエート、
・タキキニン（ＮＫ）拮抗剤、特にＮＫ−３、ＮＫ−２またはＮＫ−１拮抗剤、たとえば、（αＲ，９Ｒ）−７−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）ベンジル］−８，９，１０，１１−テトラヒドロ−９−メチル−５−（４−メチルフェニル）−７Ｈ−［１，４］ジアゾシノ［２，１−ｇ］［１，７］−ナフチリジン−６−１３−ジオン（ＴＡＫ−６３７）、５−［［（２Ｒ，３Ｓ）−２−［（１Ｒ）−１−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］エトキシ−３−（４−フルオロフェニル）−４−モルホリニル］−メチル］−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−オン（ＭＫ−８６９）、アプレピタント、ラネピタント、ダピタントまたは３−［［２−メトキシ−５−（トリフルオロメトキシ）フェニル］−メチルアミノ］−２−フェニルピペリジン（２Ｓ，３Ｓ）、
・ムスカリン性拮抗剤、たとえば、オキシブチニン、トルテロジン、フェソテロジン、５−ヒドロキシメチルトルテロジン、プロピベリン、塩化トロスピウム、ダリフェナシン、ソリフェナシン、テミベリンおよびイプラトロピウム、
・ＣＯＸ−２選択的阻害剤、たとえば、セレコキシブ、ロフェコキシブ、パレコキシブ、バルデコキシブ、デラコキシブ、エトリコキシブ、またはルミラコキシブ、
・コールタール鎮痛剤、特にアセトアミノフェン／パラセタモール、
・神経遮断剤、たとえば、ドロペリドール、クロルプロマジン、ハロペリドール、ペルフェナジン、チオリダジン、メソリダジン、トリフルオペラジン、フルフェナジン、クロザピン、オランザピン、リスペリドン、ジプラシドン、クエチアピン、セルチンドール、アリピプラゾール、ソネピプラゾール、ブロナンセリン、イロペリドン、ペロスピロン、ラクロプリド、ゾテピン、ビフェプルノックス、アセナピン、ルラシドン、アミスルプリド、バラペリドン、パリンドール、エプリバンセリン、オサネタント、リモナバント、メクリネルタント、Ｍｉｒａｘｉｏｎ（登録商標）またはサリゾタン、
・バニロイド受容体作用剤（たとえばレシンフェラトキシン）または拮抗剤（たとえばカプサゼピン）、
・β−アドレナリン作動性、たとえばプロプラノロール、
・局所麻酔剤、たとえばメキシレチン、
・コルチコステロイド、たとえばデキサメタゾン、
・５−ＨＴ受容体作用剤または拮抗剤（たとえばピゾチフェン）、特に５−ＨＴ１Ｂ／１Ｄ作用剤、たとえば、エレトリプタン、スマトリプタン、ナラトリプタン、ゾルミトリプタンまたはリザトリプタン、
・５−ＨＴ２Ａ受容体拮抗剤、たとえば、Ｒ（＋）−α−（２，３−ジメトキシ−フェニル）−１−［２−（４−フルオロフェニルエチル）］−４−ピペリジンメタノール（ＭＤＬ−１００９０７）、
・コリン作動性（ニコチン性）鎮痛剤、たとえば、イスプロニクリン（ＴＣ−１７３４）、（Ｅ）−Ｎ−メチル−４−（３−ピリジニル）−３−ブテン−１−アミン（ＲＪＲ−２４０３）、（Ｒ）−５−（２−アゼチジニルメトキシ）−２−クロロピリジン（ＡＢＴ−５９４）またはニコチン、
・Ｔｒａｍａｄｏｌ（商標）、
・ＰＤＥ−５阻害剤、たとえば、５−［２−エトキシ−５−（４−メチル−１−ピペラジニル−スルホニル）フェニル］−１−メチル−３−ｎ−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（シルデナフィル）、（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−ピラジノ［２’，１’：６，１］−ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン（ＩＣ−３５１またはタダラフィル）、２−［２−エトキシ−５−（４−エチル−ピペラジン−１−イル−１−スルホニル）−フェニル］−５−メチル−７−プロピル−３Ｈ−イミダゾ［５，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−４−オン（バルデナフィル）、５−（５−アセチル−２−ブトキシ−３−ピリジニル）−３−エチル−２−（１−エチル−３−アゼチジニル）−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン、５−（５−アセチル−２−プロポキシ−３−ピリジニル）−３−エチル−２−（１−イソプロピル−３−アゼチジニル）−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン、５−［２−エトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）ピリジン−３−イル］−３−エチル−２−［２−メトキシエチル］−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン、４−［（３−クロロ−４−メトキシベンジル）アミノ］−２−［（２Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−イル］−Ｎ−（ピリミジン−２−イルメチル）ピリミジン−５−カルボキサミド、３−（１−メチル−７−オキソ−３−プロピル−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−Ｎ−［２−（１−メチルピロリジン−２−イル）エチル］−４−プロポキシベンゼンスルホンアミド；
・α−２−δリガンド、たとえば、ガバペンチン、プレガバリン、３−メチルガバペンチン、（１α，３α，５α）（３−アミノ−メチル−ビシクロ［３．２．０］ヘプト−３−イル）−酢酸、（３Ｓ，５Ｒ）−３−アミノメチル−５−メチル−ヘプタン酸、（３Ｓ，５Ｒ）−３−アミノ−５−メチル−ヘプタン酸、（３Ｓ，５Ｒ）−３−アミノ−５−メチル−オクタン酸、（２Ｓ，４Ｓ）−４−（３−クロロフェノキシ）プロリン、（２Ｓ，４Ｓ）−４−（３−フルオロベンジル）−プロリン、［（１Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）−６−（アミノメチル）ビシクロ［３．２．０］ヘプト−６−イル］酢酸、３−（１−アミノメチル−シクロヘキシルメチル）−４Ｈ−［１，２，４］オキサジアゾール−５−オン、Ｃ−［１−（１Ｈ−テトラゾール−５−イルメチル）−シクロヘプチル］−メチルアミン、（３Ｓ，４Ｓ）−（１−アミノメチル−３，４−ジメチル−シクロペンチル）−酢酸、（３Ｓ，５Ｒ）−３−アミノ−５−メチル−ノナン酸、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３−アミノ−４，５−ジメチル−ヘプタン酸および（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−３−アミノ−４，５−ジメチル−オクタン酸、（３Ｓ，５Ｒ）−３−アミノメチル−５−メチルオクタン酸、
・カンナビノイド、
・代謝型グルタミン酸サブタイプ１受容体（ｍＧｌｕＲ１）拮抗剤、
・セロトニン再取り込み阻害剤、たとえば、セルトラリン、セルトラリン代謝物デスメチルセルトラリン、フルオキセチン、ノルフルオキセチン（フルオキセチンデスメチル代謝物）、フルボキサミン、パロキセチン、シタロプラム、シタロプラム代謝物デスメチルシタロプラム、エシタロプラム、ｄ，ｌ−フェンフルラミン、フェモキセチン、イホキセチン、シアノドチエピン、リトキセチン、ダポキセチン、ネファゾドン、セリクラミンおよびトラゾドン、
・ノルアドレナリン（ノルエピネフリン）再取り込み阻害剤、たとえば、マプロチリン、ロフェプラミン、ミルタゼピン、オキサプロチリン、フェゾラミン、トモキセチン、ミアンセリン、ブプロプリオン、ブプロプリオン代謝物ヒドロキシブプロプリオン、ノミフェンシンおよびビロキサジン（Ｖｉｖａｌａｎ（登録商標））、特に選択的ノルアドレナリン再取り込み阻害剤、たとえばレボキセチン、特に（Ｓ，Ｓ）−レボキセチン、
・二重セロトニン−ノルアドレナリン再取り込み阻害剤、たとえば、ベンラファクシン、ベンラファクシン代謝物Ｏ−デスメチルベンラファクシン、クロミプラミン、クロミプラミン代謝物デスメチルクロミプラミン、デュロキセチン、ミルナシプランおよびイミプラミン、
・誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）阻害剤、たとえば、Ｓ−［２−［（１−イミノエチル）アミノ］エチル］−Ｌ−ホモシステイン、Ｓ−［２−［（１−イミノエチル）−アミノ］エチル］−４，４−ジオキソ−Ｌ−システイン、Ｓ−［２−［（１−イミノエチル）アミノ］エチル］−２−メチル−Ｌ−システイン、（２Ｓ，５Ｚ）−２−アミノ−２−メチル−７−［（１−イミノエチル）アミノ］−５−ヘプテン酸、２−［［（１Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−（５−チアゾリル）−ブチル］チオ］−５−クロロ−３−ピリジンカルボニトリル、２−［［（１Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−（５−チアゾリル）ブチル］チオ］−４−クロロベンゾニトリル、（２Ｓ，４Ｒ）−２−アミノ−４−［［２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］チオ］−５−チアゾールブタノール、２−［［（１Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−（５−チアゾリル）ブチル］チオ］−６−（トリフルオロメチル）−３ピリジンカルボニトリル、２−［［（１Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−（５−チアゾリル）ブチル］チオ］−５−クロロベンゾニトリル、Ｎ−［４−［２−（３−クロロベンジルアミノ）エチル］フェニル］チオフェン−２−カルボキサミジン、またはグアニジノエチルジスルフィド、
・アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、たとえばドネペジル、
・プロスタグランジンＥ２サブタイプ４（ＥＰ４）拮抗剤、たとえば、Ｎ−［（｛２−［４−（２−エチル−４，６−ジメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）フェニル］エチル｝アミノ）−カルボニル］−４−メチルベンゼンスルホンアミドまたは４−［（１Ｓ）−１−（｛［５−クロロ−２−（３−フルオロフェノキシ）ピリジン−３−イル］カルボニル｝アミノ）エチル］安息香酸、
・ロイコトリエンＢ４拮抗剤、たとえば、１−（３−ビフェニル−４−イルメチル−４−ヒドロキシ−クロマン−７−イル）−シクロペンタンカルボン酸（ＣＰ−１０５６９６）、５−［２−（２−カルボキシエチル）−３−［６−（４−メトキシフェニル）−５Ｅ−ヘキセニル］オキシフェノキシ］−吉草酸（ＯＮＯ−４０５７）またはＤＰＣ−１１８７０、
・５−リポキシゲナーゼ阻害剤、たとえば、ジロートン、６−［（３−フルオロ−５−［４−メトキシ−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル］）フェノキシ−メチル］−１−メチル−２−キノロン（ＺＤ−２１３８）、または２，３，５−トリメチル−６−（３−ピリジルメチル），１，４−ベンゾキノン（ＣＶ−６５０４）、
・ナトリウムチャネル遮断剤、たとえば、リドカイン、またはブピビカイン
・５−ＨＴ３拮抗剤、たとえばオンダンセトロン、
・グリコサミノグリカン層置き換え剤および抗炎症剤、たとえばペントサンポリ硫酸（Ｅｌｍｉｒｏｎ（商標））、
・β−３作用剤、たとえば、ＹＭ−１７８（ミラベグロンもしくは２−アミノ−Ｎ−［４−［２−［［（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−フェニルエチル］アミノ］エチル］フェニル］−４−チアゾールアセトアミド）、ソラベグロン、ＫＵＣ−７４８３（リトベグロンもしくは２−［４−［２−［［（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−１−メチルエチル］アミノ］エチル］−２，５−ジメチルフェノキシ］−酢酸）またはＡＫ−１３４、
・抗ヒスタミン剤、たとえばヒドロキシジン、
・Ｈ２−拮抗剤、たとえば、シメチジン、またはラニチジン
・硝酸銀、
・ステロイド、
・ドキソルビシン、
・コンドロイチン硫酸、
・クロモグリク酸二ナトリウム、
・オキシクロロセン（Ｃｌｏｒｐａｃｔｉｎ−（商標））、および
・免疫抑制剤、たとえばシクロスポリン
ならびにその薬学的に許容できる塩および溶媒和物。
【０２３２】
抗ＮＧＦ拮抗抗体の投与
抗ＮＧＦ拮抗抗体は、任意の適切な経路によって個体に投与することができる（間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状のため）。当業者には、本明細書中に記載の例は、限定することを意図するものではなく、利用可能な技術の例示であることが明らかであろう。したがって、一部の実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体は、静脈内投与、たとえば、ボーラスとしてもしくは一定期間をかけた持続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、舌下、滑液内、ガス注入によって、くも膜下腔内、経口、吸入経皮または局所的経路によってなどの、既知の方法に従って個体に投与する。投与は、全身性、たとえば静脈内投与、または局所であることができる。ジェット噴霧器および超音波噴霧器を含めた液体配合物用の市販の噴霧器が投与に有用である。液体配合物は直接噴霧することができ、凍結乾燥粉末は再構成後に噴霧することができる。あるいは、抗ＮＧＦ拮抗抗体は、炭化フッ素配合物および定量吸入器を用いてエアロゾル化するか、または凍結乾燥および粉砕した散剤として吸入することができる。
【０２３３】
一実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体は、部位特異的または標的化した局所送達技術によって投与する。部位特異的または標的化した局所送達技術の例には、抗ＮＧＦ拮抗抗体の様々な移植可能なデポー源またはインフュージョンカテーテル、留置カテーテル、もしくは針カテーテルなどの局所送達カテーテル、合成移植片、外膜ラップ、シャントおよびステントまたは他の移植可能な装置、部位特異的担体、直接注射、または直接塗布が含まれる。たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ００／５３２１１および米国特許第５，９８１，５６８号を参照されたい。
【０２３４】
Ｅ３などの抗体またはその断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、たとえば、単鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および所要の特異性の抗原ＮＧＦ認識部位を含む任意の他の改変された立体配置の様々な配合物を、投与に使用し得る。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体はニートで投与し得る。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体および薬学的に許容できる賦形剤は、様々な配合物中にあり得る。薬学的に許容できる賦形剤は、当分野で知られており、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質である。たとえば、賦形剤は、形もしくは稠度を与えるか、または希釈剤として作用することができる。適切な賦形剤には、それだけには限定されないが、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、カプセル封入剤、緩衝液、および皮膚浸透賦活剤が含まれる。非経口および非経口でない薬物送達のための賦形剤ならびに配合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第２０版Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に記載されている。
【０２３５】
一部の実施形態では、これらの薬剤は、注射による投与（たとえば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）のために配合する。したがって、これらの薬剤は、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液などの薬学的に許容できるビヒクルと組み合わせることができる。具体的な投薬レジメン、すなわち、用量、タイミングおよび反復は、具体的な個体およびその個体の病歴に依存する。
【０２３６】
抗ＮＧＦ抗体は、注射（たとえば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）によるものを含めた、任意の適切な方法を用いて投与することができる。また、抗ＮＧＦ抗体は、本明細書中に記載のように、吸入または他の投与形態（たとえば、経口、粘膜、舌下）によって投与することもできる。一般に、抗ＮＧＦ抗体の投与には、初期の候補用量は約２ｍｇ／ｋｇであることができる。
【０２３７】
好ましい実施形態では、投与する抗体の濃度は、約０．１〜約２００ｍｇ／ｍｌの範囲であることができる。好ましくは、抗体の濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約７ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約９ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１１ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１３ｍｇ／ｍｌ、約１４ｍｇ／ｍｌ、約１５ｍｇ／ｍｌ、約１６ｍｇ／ｍｌ、約１７ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約１９ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１ｍｇ／ｍｌ、約２２ｍｇ／ｍｌ、約２３ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ、約２６ｍｇ／ｍｌ、約２７ｍｇ／ｍｌ、約２８ｍｇ／ｍｌ、約２９ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ、約３１ｍｇ／ｍｌ、約３２ｍｇ／ｍｌ、約３３ｍｇ／ｍｌ、約３４ｍｇ／ｍｌ、約３５ｍｇ／ｍｌ、約３６ｍｇ／ｍｌ、約３７ｍｇ／ｍｌ、約３８ｍｇ／ｍｌ、約３９ｍｇ／ｍｌ、約４０ｍｇ／ｍｌ、約４１ｍｇ／ｍｌ、約４２ｍｇ／ｍｌ、約４３ｍｇ／ｍｌ、約４４ｍｇ／ｍｌ、約４５ｍｇ／ｍｌ、約４６ｍｇ／ｍｌ、約４７ｍｇ／ｍｌ、約４８ｍｇ／ｍｌ、約４９ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約５１ｍｇ／ｍｌ、約５２ｍｇ／ｍｌ、約５３ｍｇ／ｍｌ、約５４ｍｇ／ｍｌ、約５５ｍｇ／ｍｌ、約５６ｍｇ／ｍｌ、約５７ｍｇ／ｍｌ、約５８ｍｇ／ｍｌ、約５９ｍｇ／ｍｌ、約６０ｍｇ／ｍｌ、約７０ｍｇ／ｍｌ、約８０ｍｇ／ｍｌ、約９０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌまたは約１１０ｍｇ／ｍｌである。最も好ましくは、抗体の濃度は、約２ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２２ｍｇ／ｍｌおよび約５０ｍｇ／ｍｌを含む群から選択される。
【０２３８】
一部の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体の投与パターンは、１週間に１回、２週間、３週間毎、４週間毎、５週間毎、６週間毎、７週間毎、８週間毎、９週間毎、１０週間毎、１５週間毎、２０週間毎、２５週間毎、またはそれよりも長い間に１回の用量の投与を含む。一部の実施形態では、抗体は、１カ月毎、２カ月毎、３カ月毎、４カ月毎、５カ月毎、６カ月毎、またはそれよりも長い間に１回投与する。最も好ましくは、抗ＮＧＦ抗体は、８週間に１回投与する。この治療の進行は、慣用技術およびアッセイによって監視し得る。投薬レジメン（使用するＮＧＦ拮抗剤（複数可）が含まれる）は経時的に変動する場合がある。
【０２３９】
一部の実施形態では、用量の体積は、約２０ｍｌ、約１５ｍｌ、約１０ｍｌ、約５ｍｌ、約２．５ｍｌ、約１．５ｍｌ、約１．０ｍｌ、約０．７５ｍｌ、約０．５ｍｌ、約０．２５ｍｌまたは約０．０１ｍｌ以下である。一部の実施形態では、用量の体積は、約２０ｍｌ、約１９ｍｌ、約１８ｍｌ、約１７ｍｌ、約１６ｍｌ、約１５ｍｌ、約１４ｍｌ、約１３ｍｌ、約１２ｍｌ、約１１ｍｌ、約１０ｍｌ、約９ｍｌ、約８ｍｌ、約７ｍｌ、約６ｍｌ、約５ｍｌ、約４ｍｌ、約３ｍｌ、約２ｍｌまたは約１ｍｌである。あるいは、約２０．５ｍｌ、約１９．５ｍｌ、約１８．５ｍｌ、約１７．５ｍｌ、約１６．５ｍｌ、約１５．５ｍｌ、約１４．５ｍｌ、約１３．５ｍｌ、約１２．５ｍｌ、約１１．５ｍｌ、約１０．５ｍｌ、約９．５ｍｌ、約８．５ｍｌ、約７．５ｍｌ、約６．５ｍｌ、約５．５ｍｌ、約４．５ｍｌ、約３．５ｍｌ、約２．５ｍｌ、約１．５ｍｌ、または約０．５である。あるいは、約９００μｌ、約８００μｌ、約７００μｌ、約６００μｌ、約５００μｌ、約４００μｌ、約３００μｌ、約２００μｌ、または約１００μｌ、あるいは、約９５０μｌ、約８５０μｌ、約７５０μｌ、約６５０μｌ、約５５０μｌ、約４５０μｌ、約３５０μｌ、約２５０μｌ、約１５０μｌ、または約５０μｌである。最も好ましくは、用量の体積は約２．５ｍｌ以下である。
【０２４０】
好ましい実施形態によれば、用量は、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１１ｍｇ、約１２ｍｇ、約１３ｍｇ、約１４ｍｇ、約１５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１７ｍｇ、約１８ｍｇ、約１９ｍｇ、約２０ｍｇ、約２１ｍｇ、約２２ｍｇ、約２３ｍｇ、約２４ｍｇ、約２５ｍｇ、約２６ｍｇ、約２７ｍｇ、約２８ｍｇ、約２９ｍｇ、約３０ｍｇ、約３１ｍｇ、約３２ｍｇ、約３３ｍｇ、約３４ｍｇ、約３５ｍｇ、約３６ｍｇ、約３７ｍｇ、約３８ｍｇ、約３９ｍｇ、約４０ｍｇ、約４１ｍｇ、約４２ｍｇ、約４３ｍｇ、約４４ｍｇ、約４５ｍｇ、約４６ｍｇ、約４７ｍｇ、約４８ｍｇ、約４９ｍｇ、約５０ｍｇ、約５１ｍｇ、約５２ｍｇ、約５３ｍｇ、約５４ｍｇ、約５５ｍｇ、約５６ｍｇ、約５７ｍｇ、約５８ｍｇ、約５９ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、または約１１０ｍｇ以下の抗体を含有する。最も好ましくは、用量は、約５０ｍｇ以下の抗体を含有する。
【０２４１】
好ましい実施形態によれば、用量は、約１μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約２０μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１１ｍｇ／ｋｇ（用量を投与する哺乳動物の体重）である抗体の量を含有する。
【０２４２】
数日間以上にわたる繰り返し投与には、状態に応じて、症状の所望の抑制が起こるまで、または疼痛を減少させる十分な治療レベルが達成されるまで、治療を持続する。一実施形態では、投薬レジメンは、約２ｍｇ／ｋｇの初期用量、続いて、約１ｍｇ／ｋｇの抗ＮＧＦ抗体の週１回の維持量、または続いて約１ｍｇ／ｋｇの隔週の維持量を投与することを含み得る。しかし、従事者が達成することを望む薬物動態学的崩壊のパターンに応じて、他の投薬レジメンが有用であり得る。たとえば、一部の実施形態では、１週間に１〜４回の投薬が企図される。さらに低頻度の投薬を使用し得る。
【０２４３】
本発明の目的のために、抗ＮＧＦ拮抗抗体の適切な用量は、用いた抗体（またはその組成物）、治療する疼痛または下部尿路症状の種類および重篤度、薬剤を予防または治療目的のどちらで投与するか、以前の治療、患者の病歴および薬剤に対する応答、ならびに担当医の裁量に依存する。典型的には、臨床家は、所望の結果がもたらされる用量に達するまで、抗ＮＧＦ拮抗抗体を投与する。用量および／または頻度は、治療の経過中に変動する場合がある。
【０２４４】
半減期などの経験的な検討事項が、一般に用量の決定に寄与する。たとえば、ヒト化抗体または完全にヒトの抗体などのヒト免疫系と適合性のある抗体を、抗体の半減期を延長するため、および宿主の免疫系によって攻撃されることを防止するために使用し得る。投与の頻度は、治療の経過中に決定および調節してよく、必ずではないが、一般に、疼痛の治療および／または抑制および／または寛解および／または遅延に基づく。あるいは、抗ＮＧＦ拮抗抗体の持続的な連続放出配合物が適切であり得る。持続放出を達成するための様々な配合物および装置が当分野で知られている。
【０２４５】
一部の個体では、複数の用量が必要であり得る。投与の頻度は、治療の経過中に決定および調節し得る。たとえば、投与の頻度は、治療する疼痛および／または下部尿路症状の種類および重篤度、薬剤を予防または治療目的のどちらで投与するか、以前の治療、患者の病歴および薬剤に対する応答、ならびに担当医の裁量に基づいて、決定または調節し得る。典型的には、臨床家は、所望の結果がもたらされる用量に達するまで、抗ＮＧＦ拮抗抗体（Ｅ３など）を投与する。一部の例では、Ｅ３抗体の持続的な連続放出配合物が適切であり得る。持続放出を達成するための様々な配合物および装置が当分野で知られている。
【０２４６】
一実施形態では、抗ＮＧＦ拮抗抗体の用量は、ＮＧＦ拮抗剤の１回または複数回の投与を与えた個体において、経験的に決定し得る。個体に漸増する用量の抗ＮＧＦ拮抗抗体を与える。抗ＮＧＦ拮抗抗体の有効性を評価するために、疼痛数値化スケール（ＮＲＳ）の変化、オリアリー−サント間質性膀胱炎症状指標（ＩＣＳＩ）の変化、オリアリー−サント間質性膀胱炎問題指数（ＩＣＰＩ）の変化、骨盤痛および切迫／頻発（ＰＵＦ）症状のスコアの変化ならびに／または排尿頻度、夜間頻度、失禁発症頻度、１回の排尿あたり排尿される平均体積、平均の間質性膀胱炎疼痛重篤度、尿意切迫発症、平均睡眠障害スコア、平均の性行為痛に関連する疼痛のスコア、全体応答評価、開存性報告治療影響評価、治療失敗、バイオマーカー、安全性エンドポイントおよび／もしくは薬物動態学測度を含めた排尿変数の変化などの、疼痛または下部尿路症状の指標に従い得る。バイオマーカーには、とりわけ、ＮＧＦ、糖タンパク質−５１（ＧＰ−５１）、抗増殖因子（ＡＰＦ）およびＨＢ−表皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）が含まれ得る。
【０２４７】
本発明の方法による抗ＮＧＦ拮抗抗体の投与は、たとえば、レシピエントの生理的条件、投与の目的が治療的または予防的のどちらであるか、および当業者に知られている他の要素に応じて、連続的または断続的であることができる。抗ＮＧＦ拮抗抗体の投与は、事前に選択した期間にわたって本質的に連続的であってよく、または、一連の間隔を空けた用量、たとえば、間質性膀胱炎および／もしくは有痛性膀胱症候群および／もしくは膀胱痛症候群に関連する疼痛および／もしくは下部尿路症状が発生する前、その間、もしくはその後、間質性膀胱炎および／もしくは有痛性膀胱症候群および／もしくは膀胱痛症候群に関連する疼痛および／もしくは下部尿路症状を発生する前、その間、その前および後、その間および後、その前およびその間、またはその前、その間、および後のいずれかであってよい。
【０２４８】
本発明に従って使用する抗ＮＧＦ拮抗抗体の治療用配合物は、所望の度合の純度を有する抗体を、任意選択の薬学的に許容できる担体、賦形剤または安定化剤と（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第２０版Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００））、凍結乾燥配合物または水溶液の形態で混合することによって、貯蔵用に調製する。一部の実施形態では、複数の抗ＮＧＦ拮抗抗体が存在し得る。少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの異なる、またはそれより多くの抗ＮＧＦ拮抗抗体が存在することができる。一般に、これらの抗ＮＧＦ拮抗抗体は、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有する。また、ＮＧＦ拮抗剤は、薬剤の有効性を増強および／または補完する役割を果たす他の薬剤と併せて使用することもできる。
【０２４９】
薬学的に許容できる担体には、生理的に適合性のある任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。典型的には、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（たとえば、注射またはインフュージョンによる）に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、その抗原結合部分、免疫コンジュゲート、または二重特異性分子を、物質中にコーティングして、化合物を失活させ得る酸の作用および他の天然の条件から化合物を保護する。
【０２５０】
許容できる担体、賦形剤、または安定化剤は、用いる用量および濃度でレシピエントに対して無毒性であり、アミノ酸緩衝液を含めたリン酸、クエン酸、酢酸および他の有機酸などの緩衝液、塩化ナトリウムなどの塩、アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤、保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾールなど）、低分子量（約１０個以下の残基）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた、単糖、二糖、および他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート化剤、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（たとえばＺｎ−タンパク質複合体）、ならびに／またはポリソルベート、Ｔｗｅｅｎ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含み得る。
【０２５１】
特定の実施形態では、本開示の抗体は、中性形態（双性イオン性形態が含まれる）または正もしくは負に荷電した種として存在し得る。一部の例では、抗体は、対イオンと複合体形成して、薬学的に許容できる塩を形成し得る。したがって、本開示の医薬化合物には、１つまたは複数の薬学的に許容できる塩が含まれ得る。
【０２５２】
「薬学的に許容できる塩」とは、親化合物（たとえば抗体）の所望の生物活性を保持しており、望ましくない毒性効果を与えない塩をいう（たとえば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら、（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１〜１９を参照）。たとえば、用語「薬学的に許容できる塩」には、１つまたは複数の抗体および１つまたは複数の対イオンを含む複合体が含まれ、対イオンは、薬学的に許容できる無機および有機の酸および塩基に由来する。
【０２５３】
そのような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リンなどの無毒性の無機酸に由来するもの、ならびに脂肪族のモノおよびジカルボン酸、フェニル置換のアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族、芳香族スルホン酸などの無毒性の有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属に由来するもの、ならびにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒性の有機アミンに由来するものが含まれる。
【０２５４】
さらに、薬学的に許容できる無機塩基には金属イオンが含まれる。金属イオンには、それだけには限定されないが、適切なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩および他の生理的に許容できる金属イオンが含まれる。無機塩基に由来する塩には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、コバルト、ニッケル、モリブデン、バナジウム、マンガン、クロム、セレン、スズ、銅、三価鉄、二価鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン塩、第一マンガン、カリウム、ルビジウム、ナトリウム、および亜鉛、ならびにそれらの通常の原子価のものが含まれる。
【０２５５】
本開示の抗体の薬学的に許容できる酸付加塩は、それだけには限定されないが、ギ酸、酢酸、アセトアミド安息香酸、アジピン酸、アスコルビン酸、ホウ酸、プロピオン酸、安息香酸、ショウノウ酸、炭酸、シクラミン酸、デヒドロコール酸、マロン酸、エデト酸、エチル硫酸、フェンジゾ酸、メタリン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、タンニン酸、クエン酸、硝酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、葉酸、フマル酸、プロピオン酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リシン、イソクエン酸、トリフルオロ酢酸、パモン酸、プロピオン酸、アントラニル酸、メシル酸、オロト酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、オレイン酸、ステアリン酸、サリチル酸、アミノサリチル酸、ケイ酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ニコチン酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボニン酸、スルホン酸、メタンスルホン酸、リン酸、ホスホン酸、エタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、アンモニウム、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、ナフタレンスルホン酸、トルエンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、硫酸、硝酸、亜硝酸、硫酸モノメチルエステル、シクロヘキシルアミノスルホン酸、β−ヒドロキシ酪酸、グリシン、グリシルグリシン、グルタミン酸、カコジル酸、ジアミノヘキサン酸、ショウノウスルホン酸、グルコン酸、チオシアン酸、オキソグルタル酸、ピリドキサル５−リン酸、クロロフェノキシ酢酸、ウンデカン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸、ガラクタル酸およびガラクツロン酸を含めた酸から調製することができる。
【０２５６】
薬学的に許容できる有機塩基には、トリメチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ、Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジベンジルアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、プロカイン、環状アミン、第四級アンモニウム陽イオン、アルギニン、ベタイン、カフェイン、クレミゾール、２−エチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタンジアミン、ブチルアミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、エチルグルカミン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イミダゾール、イソプロピルアミン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピリジン、ピリドキシン、ネオジム、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、メチルアミン、タウリン、コラート、６−アミノ−２−メチル−２−ヘプタノール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、脂肪族のモノおよびジカルボン酸、フェニル置換のアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸、ストロンチウム、トリシン、ヒドラジン、フェニルシクロヘキシルアミン、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン、４−モルホリンプロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸、２−［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］エタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸、３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）二水和物、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、およびトロメタモールが含まれる。
【０２５７】
他の配合物には、それだけには限定されないが、リポソームなどの担体を含めた、当分野で知られている適切な送達形態が含まれる。たとえば、Ｍａｈａｔｏら、（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：８５３〜８５９を参照されたい。リポソーム調製物には、それだけには限定されないが、サイトフェクチン、多重膜小胞および単層ベシクルが含まれる。
【０２５８】
抗ＮＧＦ拮抗抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８（１９８５）、Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０（１９８０）、ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号に記載されているものなどの、当分野で知られている方法によって調製する。増強した循環時間を有するリポソームが米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発方法によって作製することができる。リポソームは、定義された孔径のフィルターを通して押し出して、所望の直径を有するリポソームが得られる。
【０２５９】
また、活性成分を、たとえば、コアセルベーション技術または界面重合、たとえば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタシレート）マイクロカプセルによって、コロイド状薬物送達系（たとえば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロ乳濁液中で調製した、マイクロカプセル中に捕捉させてもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第２０版Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に開示されている。
【０２６０】
持続放出調製物を調製し得る。持続放出調製物の適切な例には、拮抗剤（抗体など）を含有する固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、マトリックスは、成形した物品の形態、たとえば、フィルム、またはマイクロカプセルである。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（たとえば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、または’ポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸と７エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、たとえばＬＵＰＲＯＮＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸のコポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフェア）、酢酸スクロースイソブチレート、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【０２６１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与で使用する配合物は、無菌的でなければならない。これは、たとえば、無菌的な濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
【０２６２】
治療用抗ＮＧＦ拮抗抗体の組成物は、一般に、無菌的なアクセス口を有する容器、たとえば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針で穿孔可能なストッパーを有するバイアル内に入れる。
【０２６３】
治療用組成物は、当分野で知られている医療装置を用いて投与することができる。たとえば、本開示の治療用組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号、または第４，５９６，５５６号に開示されている装置などの、無針皮下注射装置を用いて投与することができる。本開示において有用な周知の移植片およびモジュールの例には、医薬品を制御された速度で分注するための移植可能な微小注入ポンプを開示している米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚を介して医薬品を投与するための治療用装置を開示している米国特許第４，４８６，１９４号、正確なインフュージョン速度で医薬品を送達するための医薬品注入ポンプを開示している米国特許第４，４４７，２３３号、連続的な薬物送達のための可変流の移植可能なインフュージョン装置を開示している米国特許第４，４４７，２２４号、複数チャンバ区画を有する浸透圧薬物送達系を開示している米国特許第４，４３９，１９６号、および浸透圧薬物送達系を開示している米国特許第４，４７５，１９６号が含まれる。多くの他のそのような移植片、送達系、およびモジュールが当業者に知られている。
【０２６４】
本発明による組成物は、経口、非経口もしくは直腸投与用、または吸入もしくはガス注入による投与用の、錠剤、丸薬、カプセル、散剤、顆粒、溶液もしくは懸濁液、または坐薬などの単位剤形であり得る。
【０２６５】
錠剤などの固体組成物の調製には、主要な活性成分を、医薬担体、たとえば、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガムなどの慣用の錠剤形成成分、および他の医薬希釈剤、たとえば水と混合して、本発明の化合物、または無毒性の薬学的に許容できるその塩の同種混合物を含有する、固体の予備処方組成物を形成する。これらの予備処方組成物を同種と言及する場合、組成物が、錠剤、丸薬およびカプセルなどの均等に有効な単位剤形へと容易に分割され得るように、活性成分が組成物全体にわたって均一に分散されていることを意味する。その後、この固体の予備処方組成物を、０．１〜約５００ｍｇの本発明の活性成分を含有する上述の種類の単位剤形へと分割する。新規組成物の錠剤または丸薬を、コーティングまたは他の様式で配合して、持続的な作用の利点を与える剤形を提供することができる。たとえば、錠剤または丸薬は、内部投薬構成要素および外部投薬構成要素を含むことができ、後者は前者上のエンベロープの形である。２つの構成要素は、胃内での崩壊に耐え、内部構成要素が未変化で十二指腸内に通されるまたはその放出が遅延されることを可能にする役割を果たす、腸溶層によって隔てることができる。様々な物質をそのような腸溶層またはコーティングに使用することができ、そのような物質には、いくつかのポリマー酸ならびにポリマー酸とシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースなどの物質との混合物が含まれる。
【０２６６】
適切な界面活性剤には、特に、ポリオキシエチレンソルビタン（たとえば、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン（たとえば、Ｓｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）などの非イオン性剤が含まれる。界面活性剤を有する組成物は、０．０５〜５％の界面活性剤を好都合に含み、０．１〜２．５％であることができる。必要な場合は、他の成分、たとえば、マンニトールまたは他の薬学的に許容できるビヒクルを加え得ることが理解されよう。
【０２６７】
適切な乳濁液は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）などの市販の脂肪乳濁液を用いて調製し得る。活性成分は、事前に混合した乳濁組成物中に溶解するか、または油（たとえば、ダイズ油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油もしくはアーモンド油）ならびにリン脂質（たとえば、卵リン脂質、ダイズリン脂質もしくはダイズレシチン）および水と混合した際に形成される乳濁液に溶解してよい。乳濁液の等張性を調節するために、他の成分、たとえば、グリセロールまたはグルコースを加え得ることが理解されよう。適切な乳濁液は、典型的には２０％までの油、たとえば５〜２０％を含有する。脂肪乳濁液は、０．１〜１．０．ｌｍ、特に０．１〜０．５．ｌｍの脂肪の液滴を含み、５．５〜８．０の範囲のｐＨを有することができる。
【０２６８】
乳濁組成物は、抗ＮＧＦ抗体）をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）またはその構成要素（ダイズ油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）と混合することによって調製したものであることができる。
【０２６９】
吸入またはガス注入用の組成物には、薬学的に許容できる水性もしくは有機の溶媒、またはその混合物中の溶液および懸濁液、ならびに散剤が含まれる。液体または固体の組成物は、上述の適切な薬学的に許容できる賦形剤を含有し得る。一部の実施形態では、組成物は、局所または全身性の効果のために、経口または経鼻の呼吸器経路によって投与される。好ましくは無菌的な薬学的に許容できる溶媒中にある組成物は、気体を使用することによって噴霧し得る。噴霧した溶液は、噴霧装置から直接呼吸するか、または噴霧装置をフェイスマスク、テントもしくは間欠的陽圧呼吸器に接続し得る。溶液、懸濁液または散剤の組成物は、好ましくは経口または経鼻で、配合物を適切な様式で送達する装置から投与し得る。
【０２７０】
治療の有効性は、当分野で周知の方法によって評価することができる。
【０２７１】
また、本発明の抗体またはポリペプチド（抗体Ｅ３など）のうちの任意のものをコードしているポリヌクレオチドを、所望の細胞における本発明の抗体またはポリペプチド（抗体Ｅ３など）のうちの任意のものの送達および発現に使用し得る。発現ベクターを用いてＥ３抗体またはポリペプチドの発現を指示できることが明らかであろう。発現ベクターは、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、くも膜下腔内、脳室内、経口、経腸、非経口、鼻腔内、経皮、舌下、または吸入によってなどの、当分野で知られている任意の手段によって投与することができる。たとえば、発現ベクターの投与には、注射、経口投与、粒子銃またはカテーテル投与、および外用投与を含めた、局所または全身の投与が含まれる。当業者は、外因性タンパク質の発現をｉｎ  ｖｉｖｏで得るための発現ベクターの投与に精通している。たとえば、米国特許第６，４３６，９０８号、第６，４１３，９４２号、および第６，３７６，４７１号を参照されたい。
【０２７２】
本発明の抗体またはポリペプチド（抗体Ｅ３など）のうちの任意のものをコードしているポリヌクレオチドを含む治療用組成物の標的送達も使用することができる。受容体媒介性ＤＮＡ送達技術は、たとえば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：２０２；Ｃｈｉｏｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編）（１９９４）；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：６２１；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９９０）８７：３６５５；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：３３８に記載されている。ポリヌクレオチドを含有する治療用組成物は、遺伝子治療プロトコルにおける局所投与では、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与する。また、約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲も、遺伝子治療プロトコル中に使用することができる。本発明の治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを用いて送達することができる。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルスまたは非ウイルス起源であることができる（一般に、Ｊｏｌｌｙ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１；Ｋｉｍｕｒａ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９５）１：１８５、およびＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）６：１４８を参照）。そのようなコード配列の発現は、内在性哺乳動物または異種のプロモーターを用いて誘導することができる。コード配列の発現は、構成的であるか、または制御されていることができる。
【０２７３】
所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞中の発現のためのウイルス系ベクターは、当分野で周知である。例示的なウイルス系ビヒクルには、それだけには限定されないが、組換えレトロウイルス（たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／１１２３０、ＷＯ９３／１０２１８、ＷＯ９１／０２８０５、米国特許第５，２１９，７４０号、第４，７７７，１２７号、英国特許第２，２００，６５１号、および欧州特許第０３４５２４２号を参照）、アルファウイルス（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）系ベクター（たとえば、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）ベクター、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｅ  ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ  ＶＲ１２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、ならびにアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５を参照）が含まれる。Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７に記載の、死滅させたアデノウイルスと連結したＤＮＡの投与も用いることができる。
【０２７４】
また、それだけには限定されないが、死滅させたアデノウイルス単独と連結したまたは連結していないポリカチオン凝縮ＤＮＡ（たとえば、Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７を参照）、リガンドと連結したＤＮＡ（たとえば、Ｗｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１６９８５を参照）、真核細胞送達ビヒクル細胞（たとえば、米国特許第５，８１４，４８２号、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７９９４、ＷＯ９６／１７０７２、ＷＯ９５／３０７６３、およびＷＯ９７／４２３３８を参照）および核荷電中和または細胞膜との融合を含めた、非ウイルス送達ビヒクルおよび方法を用いることもできる。裸ＤＮＡも用いることができる。例示的な裸ＤＮＡ導入方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用することができるリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、ＷＯ９１／１４４４５、および欧州特許第０５２４９６８号に記載されている。さらなる手法は、Ｐｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９４）１４：２４１１およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４）９１：１５８１に記載されている。
【０２７５】
診断方法および使用
また、本明細書中に記載の抗体は、変更されたまたは異常なＮＧＦ発現（一部の実施形態では、増加または減少したＮＧＦ発現（正常の試料と比較して）、および／または、通常はＮＧＦ発現を欠く組織および／もしくは細胞における発現の存在、または通常はＮＧＦ発現を保有する組織もしくは細胞におけるＮＧＦ発現の非存在などの、不適切な発現）に関連する、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状の検出、診断および監視にも使用し得る。一部の実施形態では、ＮＧＦ発現は、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状に罹患していると疑われる個体からの試料中で検出される。
【０２７６】
したがって、一部の実施形態では、本発明は、変更されたまたは異常なＮＧＦ発現に罹患していると疑われる個体の検体（試料）を本発明の抗体またはポリペプチドと接触させること、およびＮＧＦのレベルが対照または比較検体のそれと異なるかどうかを決定することを含む方法を提供する。
【０２７７】
他の実施形態では、本発明は、個体の検体（試料）を接触させること、およびＮＧＦ発現のレベルを決定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、個体は、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状に罹患していると疑われる。
【０２７８】
診断用途のためには、抗体は、典型的には、それだけには限定されないが、放射性同位体、蛍光標識、および様々な酵素−基質の標識を含めた検出可能な部分で標識する。標識を抗体とコンジュゲートさせる方法は当分野で知られている。本発明の他の実施形態では、本発明の抗体は標識されている必要はなく、その存在は、本発明の抗体と結合する標識した抗体を用いて検出することができる。
【０２７９】
本発明の抗体は、競合的結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなどの、任意の既知のアッセイ方法で用い得る。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７〜１５８ページ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）。
【０２８０】
また、抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングなどのｉｎ  ｖｉｖｏ診断アッセイでも使用し得る。一般に、免疫シンチオグラフィーを用いて目的の細胞または組織の位置決定ができるように、抗体を放射性核種（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、または３Ｈなど）で標識する。
【０２８１】
また、抗体は、当分野で周知の技術に従って、病態における染色試薬としても使用し得る。
【０２８２】
本明細書中に記載のすべての方法に関して、抗ＮＧＦ拮抗抗体への言及には、これらの薬剤のうちの１つまたは複数を含む組成物も含まれる。これらの組成物は、当分野で周知の、緩衝液を含めた薬学的に許容できる賦形剤などの適切な賦形剤をさらに含み得る。本発明は、単独で、または他の慣用の治療方法と組み合わせて使用することができる。
【０２８３】
検出および／または治療で使用するための抗ＮＧＦ拮抗抗体を含むキット
また、本発明は、検出および／または治療で使用するための抗体を含むキットも提供する。したがって、一部の実施形態では、キットは抗体Ｅ３を含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書中に記載の任意の抗体またはポリペプチドを含む。他の態様では、キットは、たとえば、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状に罹患している個体を治療するためを含めた、本明細書中に記載の方法のうちの任意のものに使用し得る。本発明のキットは適切なパッケージング中にあり、緩衝液および本明細書中に記載の方法のうちの任意のものにおける抗体の使用説明書などの、追加の構成要素を任意選択で提供し得る。一部の実施形態では、キットには、疼痛または下部尿路症状を治療するための指示書が含まれる。一部の実施形態では、キットは、本明細書中に記載の抗ＮＧＦ拮抗抗体ならびに個体において間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および／または下部尿路症状を治療および／または予防するための指示書を含む。実施形態の一部では、抗ＮＧＦ拮抗抗体は抗体Ｅ３である。
【０２８４】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載のＥ３ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、本明細書中に記載の方法のうちの任意のものにおけるポリヌクレオチドの使用説明書をさらに含む。
【０２８５】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供するが、限定するものではない。ＷＯ２００４／０５８１８４中の実施例を、本発明で使用するための抗体を例示するために参照する。ＷＯ２００４／０５８１８４の内容全体が参考として本明細書中に組み込まれている。
【実施例】
【０２８６】
（実施例１）
マウス拮抗抗ＮＧＦ抗体９１１のヒト化および親和性成熟
Ａ．一般方法
以下の一般方法を本実施例中で使用した。
【０２８７】
ライブラリの作製
ライブラリは、Ｋａｙら、（１９９６）、Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２７７〜２９１ページを参照）に記載のように、変性オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲカセット突然変異誘発によって作製した。ドーピングコドンＮＮＫを用い、１つのアミノ酸位置をランダム化して２０個の可能なアミノ酸を含めた。特定の特性を有するアミノ酸のサブセットのみが含まれるように１つのアミノ酸位置をランダム化するために、Ｂａｌｉｎｔら、（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３７（１）：１０９〜１８）に記載のようにドーピングコドンを用いた。Ｉｎｎｉｓら、（１９９０）ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１７７〜１８３ページを参照）に記載のように、組換えＰＣＲを用いて部位特異的突然変異誘発を行った。
【０２８８】
スモールスケールのＦａｂ調製
９６ウェルプレート中でのスモールスケールの発現を、Ｆａｂライブラリをスクリーニングするために最適化した。Ｆａｂライブラリで形質転換させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から開始して、コロニーを選択して、マスタープレート（寒天ＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋２％のグルコース）および作業プレート（２ｍｌ／ウェル、９６ウェル／プレート、１．５ｍＬのＬＢを含有＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋２％のグルコース）の両方に接種した。どちらのプレートも３０℃で８〜１２時間成長させた。マスタープレートを４℃で保管し、作業プレートからの細胞を５０００ｒｐｍでペレット化し、１ｍＬのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋１ｍＭのＩＰＴＧに再懸濁させて、Ｆａｂの発現を誘発した。細胞を、３０℃で５時間の発現時間の後に遠心分離によって収集し、その後、５００μＬの緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＰ２０、３ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁させた。ＨＢＳ−ＥＰに再懸濁させた細胞の溶解は、凍結（−８０℃）、その後、３７℃で解凍の１回のサイクルによって達成した。細胞溶解液を５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、細胞細片を、Ｆａｂを含有する上清から分離した。その後、上清をＢＩＡｃｏｒｅプラズモン共鳴装置内に注入して、それぞれのＦａｂの親和性の情報が得られた。Ｆａｂを発現するクローンをマスタープレートから救出して、ＤＮＡの配列決定ならびに以下に記載のラージスケールのＦａｂ産生および詳細な特徴づけを行った。
【０２８９】
ラージスケールのＦａｂ調製
詳細な動力学的パラメータを得るために、Ｆａｂを大培養物から発現および精製した。２００ｍＬのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋２％のグルコースを含有するエルレンマイヤーフラスコに、選択したＦａｂ発現大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローンからの５ｍＬの終夜培養物を接種した。１．０のＯＤ５５０ｎｍが得られるまでクローンを３０℃でインキュベーションし、その後、培地を２００ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）＋１ｍＭのＩＰＴＧで置き換えることによって誘発させた。３０℃で５時間の発現時間の後、細胞を遠心分離によってペレット化し、その後、１０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ８）に再懸濁させた。細胞の溶解液は、凍結／解凍（それぞれ−８０℃および３７℃）の２回のサイクルによって得られた。細胞溶解液の上清を、ＰＢＳ、ｐＨ８で平衡化したＮｉ−ＮＴＡスーパーフローセファロース（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）カラム上に載せ、その後、５倍カラム体積のＰＢＳ、ｐＨ８で洗浄した。個々のＦａｂが、ＰＢＳ（ｐＨ８）＋３００ｍＭのイミダゾールを含む異なる画分中で溶出された。Ｆａｂを含有する画分をプールし、ＰＢＳ中で透析し、その後、ＥＬＩＳＡによって定量した後に親和性の特徴づけを行った。
【０２９０】
完全抗体の調製
完全抗体の発現には、重鎖および軽鎖可変領域を２つの哺乳動物発現ベクター（軽鎖にはＥｂ．９１１．Ｅ３またはＥｂ．ｐｕｒ．９１１．３Ｅ、重鎖にはＤｂ．９１１．３Ｅ、本明細書中に記載されている）中でクローニングし、一過性発現のためにリポフェクテミンを用いてＨＥＫ２９３細胞内に形質移入した。抗体は、タンパク質Ａを使用して、標準方法を用いて精製した。
【０２９１】
Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ
抗ＮＧＦ  Ｆａｂおよびモノクローナル抗体の親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ，ＩＮＣ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｗａｙ）を用いて決定した。ＣＭ５チップを、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイニドヒドロクロリド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて、供給者の指示に従って活性化させた。ヒトＮＧＦを１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中で希釈し、活性化したチップ上に０．００５ｍｇ／ｍＬの濃度で注入した。個々のチップチャネルにわたって可変の流時間を用いて、２つの範囲の抗原密度が達成された：詳細な動力学的研究用には１００〜２００応答単位（ＲＵ）およびスクリーニングアッセイ用には５００〜６００ＲＵ。チップをエタノールアミンでブロッキングした。再生研究により、Ｐｉｅｒｃｅ溶出緩衝液（製品番号２１００４、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）および４ＭのＮａＣｌの混合物（２：１）が、結合したＦａｂを有効に除去した一方で、チップ上のｈＮＧＦの活性が２００回の注射にわたって保持されることが示された。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５のＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２９）をすべてのＢＩＡｃｏｒｅアッセイのランニング緩衝液として使用した。
【０２９２】
スクリーニングアッセイ
スクリーニングＢＩＡｃｏｒｅアッセイを最適化して、ライブラリからのＦａｂクローンの親和性を決定した。小培養物の溶解液の上清を５０μｌ／分で２分間注入した。１０〜１５分間の解離時間を用いて、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して単一指数の解離速度（ｋｏｆｆ）を決定した。ライブラリの作製に使用した鋳型（クローン８Ｌ２−６Ｄ５、ｋｏｆｆ  １×１０−３ｓ−１）と同じ範囲のｋｏｆｆ速度を示した試料を確認のために注入し、４５分間までの解離時間を許容して、より良好なｋｏｆｆ値が得られた。改善した（より遅い）ｋｏｆｆ値を示すクローンをラージスケールで発現させ、完全な動力学的パラメータ、ｋｏｎおよびｋｏｆｆを精製したタンパク質で決定した。このアッセイは、約２倍以上の親和性の差異を検出することができた。
【０２９３】
親和性決定アッセイ
精製したＦａｂ試料の段階希釈（０．１〜１０×推定ＫＤ）を１分間、１００μＬ／分で注入し、２時間までの解離時間を許容した。Ｆａｂタンパク質の濃度を、標準として既知の濃度のＦａｂ（アミノ酸分析によって決定）を用いたＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって決定した。動力学的会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）が、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを用いて、データを１：１のラングミュア結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．Ｒｏｏｓ，Ｈ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．（１９９４）．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６．９９〜１１０）に当てはめることによって同時に得られた。平衡解離定数（ＫＤ）値はｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。
【０２９４】
Ｂ．マウス拮抗抗ＮＧＦ抗体９１１のヒト化および親和性成熟
マウス拮抗抗ＮＧＦ抗体、９１１（Ｈｏｎｇｏら、（２０００）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９（３）：２１５〜２２７を参照）をヒト化および親和性成熟のために選択した。Ｍａｂ９１１は、ヒトおよびラットのＮＧＦと高い親和性で結合し、ニューロトロフィンＮＴ３、ＮＴ４／５またはＢＤＮＦと顕著な交差反応性を示さない。Ｈｏｎｇｏ、同上を参照されたい。パパインで切断したマウスＭａｂ９１１のＦａｂ断片の親和性は、上述のようにＢＩＡｃｏｒｅ分析を用いて決定した。マウスＭａｂ９１１のパパインで切断したＦａｂ断片は、約１０ｎＭのＫＤでヒトＮＧＦと結合した。
【０２９５】
ヒト化および親和性成熟は、以下のようにいくつかのステップで実施した。
【０２９６】
（１）ＣＤＲ移植した鋳型の調製。抗体９１１の軽鎖拡張ＣＤＲ（すなわち、カバットおよびコチアＣＤＲ領域の両方が含まれる）を、ＪＫ２を有するヒト生殖系列アクセプター配列Ｏ８内に移植し、抗体９１１の重鎖拡張ＣＤＲを、ＪＨ４を有するヒト生殖系列アクセプター配列ＶＨ４−５９内に移植した。ヒト生殖系列アクセプター配列のアミノ酸配列は、ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂに示されている。アミノ酸の番号づけは連続的である。上述のタンパク質フレームワークを用いて、ネズミＣＤＲを有するヒトフレームワークをコードしている合成遺伝子のＤＮＡ配列を設計した。これらのヒト化した重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれｈＶＨおよびｈＶＬと呼ぶ。コドンを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびハムスターでの使用について最適化した。それぞれの鎖について２つの短いフランキングプライマーでｈＶＬおよびｈＶＨの完全長を延長するいくつかの重複するオリゴヌクレオチド（６９〜９０個の塩基の長さ）を用いて、Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕら、（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ５（８）：８２７〜９に本質的に記載されているように、繰り返しＰＣＲによって２つの遺伝子を別々に合成した。正しい長さの生じるＤＮＡ断片をゲル精製し、その後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）バイシストロン性発現プラスミド（アンピシリン耐性）内にクローニングした。抗体の発現は、Ｂａｒｂａｓ（２００１）Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（ベクターｐＣｏｍｂ３Ｘ、２．１０ページを参照）に記載のものに類似のＩＰＴＧ誘導性ｌａｃＺプロモーターの制御下であったが、しかし、改変には、以下の追加のドメインの付加および発現が含まれていた：ヒトκ軽鎖定常ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ０９１８１を参照）およびＩｇＧ２ａヒト免疫グロブリンのＣＨＩ定常ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１８５９）。
【０２９７】
８Ｌ２−４Ｄ５と呼ばれる、ＣＤＲ移植した抗体の可変領域のアミノ酸配列（「鋳型」とも呼ばれる）は、ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂにも示されている。８Ｌ２−４Ｄ５の親和性は上述のようにＢＩＡｃｏｒｅ分析を用いて決定した。８Ｌ２−４Ｄ５は、約３８ｎＭのＭＫＤでヒトＮＧＦと結合した。
【０２９８】
（２）フレームワーク配列内への点突然変異の導入。Ｉｎｎｉｓら、（１９９５）ＰＣＲ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載のように、組換えＰＣＲ部位特異的突然変異誘発を用いてＶ７１Ｋ置換をＣＤＲ移植した重鎖内に導入した。この置換により、ヒトフレームワーク残基が対応するマウスフレームワーク残基で置き換えられた。生じる抗体は８Ｌ２−６Ｄ５と呼ばれ、８Ｌ２−６Ｄ５の重鎖可変領域のアミノ酸配列はＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａに示されている。８Ｌ２−６Ｄ５の親和性は、上述のようにＢＩＡｃｏｒｅ分析を用いて決定した。８Ｌ２−６Ｄ５のＦａｂ断片は、約１５ｎＭのＫｄでヒトＮＧＦと結合した。８Ｌ２−６Ｄ５を親和性成熟の鋳型として選択した。
【０２９９】
（３）ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、Ｈ１およびＨ２のヒト化および親和性成熟。ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、Ｈ１およびＨ２を、ヒト化および親和性成熟に供した。コチアカノニカル構造に基づいてＣＤＲの構造に必須でないＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、Ｈ１、およびＨ２中のアミノ酸位置を同定し（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３（４）：９２７〜４８を参照）、以下のようにランダム化に供した。Ｂａｌｉｎｔら、（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３７（１）：１０９〜１８）に記載のドーピングコドンを用いて、Ｋａｙら、（１９９６）、Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載のように、変性オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲカセット突然変異誘発を使用して、表２に示す軽鎖突然変異または重鎖突然変異、ならびに移植した（マウス）ＣＤＲ  Ｌ３またはＣＤＲ  Ｈ３をそれぞれ含有する２つのライブラリを調製した。一般に、アミノ酸残基は、抗体９１１の軽鎖および重鎖アミノ酸配列とヒト生殖系列抗体配列とのアラインメントに基づいて、ヒト抗体中でより一般的な残基へと変更した。野生型（未置換の）アミノ酸残基もライブラリ中で提示したが、ただし、ＣＤＲ  Ｈ２の残基５０であるメチオニンは例外とした（野生型メチオニンはライブラリ中に提示させなかった）。メチオニン残基は酸化を受けやすく、したがって、その残基と置き換えることで、生じる抗体の安定性が改善されることが予測された。上述のように、ＦａｂのライブラリをベクターｐＣｏｍｂ３Ｘ＋ヒトＣＨ１およびＣκ領域内にクローニングした。
【０３００】
表２：
１．重鎖Ｈ１／Ｈ２ライブラリ：
ＣＤＲ−Ｈ１
Ｉ３４をＦ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、Ｐ、Ｔ、Ａ、またはＩに変化させた
Ｎ３５をＮ、Ｔ、Ｓ、またはＹに変化させた
ＣＤＲ−Ｈ２
Ｍ５０を２０個の天然のアミノ酸すべてに変化させた
Ａ６２をＡまたはＳに変化させた
Ｌ６３をＬまたはＶに変化させた
２．軽鎖Ｌ１／Ｌ２ライブラリ
ＣＤＲ−Ｌ１
Ｓ２６をＳ、Ａ、Ｖ、またはＦに変化させた
Ｄ２８をＤ、Ａ、Ｓ、またはＹに変化させた
Ｈ３２をＨ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、またはＹに変化させた
ＣＤＲ−Ｌ２
Ｙ５０をＹ、Ｄ、Ａ、またはＳに変化させた
Ｉ５１をＩ、Ｔ、Ａ、またはＶに変化させた
Ｆ５４をＦまたはＬに変化させた
Ｓ５６をＳおよびＴに変化させた
【０３０１】
親和性スクリーニング実験には、それぞれのライブラリを、対応するＣＤＲ移植した軽鎖または重鎖とさらに対合させ（たとえば、Ｈ１／Ｈ２ライブラリをＣＤＲ移植した軽鎖と対合させた）、抗体を発現させ、個々のクローンのヒトＮＧＦに対する親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥ  表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を用いて、製造者の指示に従い、かつ上述のようにスクリーニングした。ｋｏｆｆ、ｋｏｎおよびＫＤを決定した。一般に親和性の最大の変動はｋｏｆｆ速度に見られるため、また、さらに、ｋｏｆｆ速度は抗体濃度とは独立しているため、ｋｏｆｆ速度に基づいて抗体クローンをランクづけした。
【０３０２】
結合したクローンの配列を決定し、結合したクローンの配列を表３に示す。
【０３０３】
【表３−１】
2018012692.tif 000004
【０３０４】
【表３−２】
2018012692.tif 000005
【０３０５】
以下の置換を含有するＣＤＲが結合を保持していた：
ＣＤＲ−Ｈ１
Ｉ３４：Ｓ、Ｌ、Ｖ、ＩおよびＡが結合した。
Ｎ３５：Ｎ、ＴおよびＳが結合した。
ＣＤＲ−Ｈ２
Ｍ５０：Ｍ、Ｉ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、Ｌが結合した。
Ａ６２：ＡおよびＳが結合した。
Ｌ６３：ＬおよびＶが結合した。
ＣＤＲ−Ｌ１
Ｓ２６：Ｓ、およびＦが結合した。
Ｄ２８：Ｄ、Ｓ、Ａ、Ｙが結合した。
Ｈ３２：Ｈ、Ｎ、Ｑが結合した。
ＣＤＲ−Ｌ２
Ｙ５０：Ｙが結合した。
Ｉ５１：Ｉ、Ｔ、Ｖ、Ａが結合した。
Ｆ５４：Ｆが結合した
Ｓ５６：ＳおよびＴが結合した
【０３０６】
以下の置換を含有するＣＤＲを一般に結合親和性に基づいて選択し、Ｈ１９−Ｌ１２９と呼ぶ単一のクローンへと組み合わせた：
ＣＤＲ−Ｈ１：Ｉ３４Ｌ、Ｎ３５Ｎ（変化なし）
ＣＤＲ−Ｈ２：Ｍ５０Ｉ、Ａ６２Ａ（変化なし）、Ｌ６３Ｖ
ＣＤＲ−Ｌ１：Ｓ２６Ｓ（変化なし）、Ｄ２８Ｓ、Ｈ３２Ｎ
ＣＤＲ−Ｌ２：Ｙ５０Ｙ（変化なし）、Ｉ５１Ｔ、Ｆ５４Ｆ（変化なし）、Ｓ５６Ｓ（変化なし）
【０３０７】
これらの突然変異を、移植したＨ３およびＬ３  ＣＤＲも含まれるＨ１９−Ｌ１２９と呼ばれる単一のクローン内に一緒に合わせた（ＨおよびＬ鎖をＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ産物およびベクター（ｐＲＮ８）を制限酵素で切断し、３つの断片のライゲーションを行うことによる）。Ｈ１９−Ｌ１２９の重鎖および軽鎖可変領域の配列はＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂに示されており、表４はＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、Ｈ１およびＨ２のアミノ酸配列を示す。Ｈ１９−Ｌ１２９は、本明細書中に記載のようにＢＩＡｃｏｒｅ分析を用いて決定して、約１ｎＭのＫＤでＮＧＦと結合した。
【０３０８】
【表４】
2018012692.tif 000006
【０３０９】
（４）Ｈ３およびＬ３  ＣＤＲの親和性成熟。Ｈ３およびＬ３  ＣＤＲの親和性成熟は、２つのステップで実施した。第１に、「ライブラリスキャン突然変異誘発」と呼ばれるプロセスで、突然変異がヒトＮＧＦに対する結合親和性の増加をもたらすアミノ酸位置を同定するために、Ｈ３およびＬ３中のそれぞれのアミノ酸残基を個々にプレスクリーニングした。ライブラリスキャン突然変異誘発（「小ライブラリランダム化分析」とも呼ばれる）の結果に基づいて、Ｈ３およびＬ３中のアミノ酸位置のサブセットを親和性成熟ライブラリの調製用に選択し、本明細書中に記載のようにＢＩＡｃｏｒｅ分析を用いて、親和性成熟ライブラリをヒトＮＧＦに対する親和性についてスクリーニングした。これらの技術を一般に適用できることが理解されよう。
【０３１０】
（ａ）ライブラリスキャン突然変異誘発
Ｈ３およびＬ３  ＣＤＲ中のそれぞれのアミノ酸位置を、ヒトＮＧＦに対する結合親和性の増加をもたらした置換について個々にプレスクリーニングした。改善した結合、同じ結合、悪化した結合または結合なしをもたらした、任意の所定の位置におけるアミノ酸置換の頻度により、多くの異なるアミノ酸（２０個のアミノ酸すべてが含まれる）へと変化させることができるＣＤＲ中の位置、および変化させることができない、またはいくつかのアミノ酸へとしか変化させることができないＣＤＲ中の位置に関する情報が提供された。増加した結合親和性をもたらしたアミノ酸置換も同定した。このスクリーニングの結果に基づいて、ＣＤＲ  Ｈ３およびＬ３中のアミノ酸位置のサブセットが親和性成熟ライブラリの調製用に選択された。
【０３１１】
Ｌ３およびＨ３  ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸を１つずつ２０個のアミノ酸すべてへとランダム化された個々のＦａｂライブラリを調製し、それぞれが、それぞれのアミノ酸位置で２０個のアミノ酸の可能性の複雑度を有する、いくつかの（軽鎖に５個のライブラリおよび重鎖に１３個のライブラリ）小さなライブラリがもたらされた。すべての場合で、ネイティブ（すなわち未変化の）アミノ酸をライブラリ中に提示させた。ライブラリは、Ｋａｙら、（１９９６）、Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載のように、２０個の可能なアミノ酸が含まれるように１つのアミノ酸位置をランダム化するためにドーピングコドンＮＮＫを用いて、変性オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲカセット突然変異誘発によって調製した。ＣＤＲ移植した抗体の親和性がより低い場合に、スクリーニング中にＨ３およびＬ３突然変異体の親和性の差異のより容易な検出が可能となるため、８Ｌ２−６Ｄ５（フレームワーク突然変異Ｖ７１Ｋを有するＣＤＲ移植した抗体）がライブラリ構築の鋳型として役割を果たした。したがって、ライブラリのそれぞれのメンバーが、１つのアミノ酸置換、および５個の移植したＣＤＲを有するＣＤＲ３（Ｈ３またはＬ３）を含有していた。
【０３１２】
それぞれの小ライブラリからの２０〜８０個のクローンを、本明細書中に記載のようにＢＩＡｃｏｒｅ分析を用いてスクリーニングした。試料を、ＢＩＡｃｏｒｅチップの１つのチャネルにおいてＮＧＦに対する結合親和性について、および重鎖のＣ末端でのｈｉｓタグを検出するために、センサーチップの別のチャネルにおいてペンタｈｉｓタグ抗体との結合によってＦａｂの存在について、ＢＩＡｃｏｒｅによって同時に分析した。分類にｋｏｆｆを用いて、タンパク質を発現したクローンを、同じ親和性、悪化した親和性、より良好な親和性または結合なしを有するとして分類した。この分析の結果を表５に示す。
【０３１３】
【表５】
2018012692.tif 000007
【０３１４】
改善した親和性を有するすべてのクローンの配列を決定し、増加した親和性がもたらされたアミノ酸置換の頻度および同一性が明らかとなった。さらに、置換が必ずしも結合親和性を増加しなかったにもかかわらず、所定の位置で許容されたアミノ酸配列の置換を確認するために、８ｌ２−６Ｄ５クローンに類似の親和性を保持していたいくつかのクローンをそれぞれのライブラリから選択した。この分析の結果を表６に要約する。
【０３１５】
【表６】
2018012692.tif 000008
【０３１６】
いくつかの突然変異が増加した結合親和性をもたらした。少なくとも以下の突然変異が、８Ｌ２−６Ｄ５鋳型と比較して顕著に増加した結合親和性をもたらした：（Ｈ＿Ｙ１０１Ｗ（ＣＤＲ配列ＧＧＹＷＹＧＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号４６））、Ｈ＿Ｓ１０５Ａ（ＣＤＲ配列ＧＧＹＹＹＧＴＡＹＹＦＤＹ（配列番号４７））、Ｈ＿Ｓ１０５Ｔ（ＣＤＲ配列ＧＧＹＹＹＧＴＴＹＹＦＤＹ（配列番号４８））、Ｈ＿Ｇ１０３Ａ（ＣＤＲ配列ＧＧＹＹＹＡＴＳＹＹＦＤＹ（配列番号４９）、およびＬ＿Ｓ９１Ｅ（ＣＤＲ配列ＱＱＥＫＴＬＰＹＴ（配列番号５０））。
【０３１７】
この実験の結果を用いて、親和性成熟ライブラリを作製するためのアミノ酸位置の選択を導いた。
【０３１８】
また、この実験により、表５に示すように、改善した結合、同じ結合、悪化した結合または結合なしをもたらした任意の所定の位置でのアミノ酸置換の頻度に関する情報も提供された。この情報により、多くの異なるアミノ酸（２０個のアミノ酸すべてが含まれる）へと変化させることができるＣＤＲ中のアミノ酸位置、およびいくつかのアミノ酸または非常にわずかなアミノ酸へと変化させることができる（一部の実施形態では、変化させることができるアミノ酸がない）ＣＤＲ中の位置の同定が可能となった。また、これらの結果により、結合親和性を増加させたアミノ酸置換も実証された。
【０３１９】
（ｂ）親和性成熟
次に、小ライブラリランダム化分析（上記）の結果を用いて、Ｈ３およびＬ３  ＣＤＲの親和性成熟のためのＨ３およびＬ３ライブラリを作製するための残基を選択した。ＣＤＲ  Ｈ３の残基Ｙ１０１およびＧ１０３ならびにＣＤＲ  Ｌ３の残基Ｓ９１およびＫ９２を、Ｈ３およびＬ３  ＣＤＲの親和性成熟のためのＨ３およびＬ３ライブラリを作製するために選択した。
【０３２０】
このライブラリでは、Ｈ３およびＬ３中の突然変異を、ＣＤＲ移植したクローン８Ｌ２−６Ｄ５中で同時に、ならびにＨ１９−Ｌ１２９の背景で別々に組み合わせ、８０個の異なるクローンの多様性を有していた。表７は、置換用に選択されたアミノ酸残基およびそれぞれの位置で置換されたアミノ酸を示す。
【０３２１】
表７．置換用に選択されたＨ３およびＬ３中のアミノ酸残基およびそれぞれの位置で置換されたアミノ酸
ＣＤＲ−Ｈ３：
Ｙ１０１をＹおよびＷに変化させた、Ｃ．（１つの変性オリゴヌクレオチド中でのコドンＴＲＳの使用は、コドンＣも生じたため、Ｃは含めなかったことに注記されたい）。
Ｇ１０３をＡ、Ｐ、Ｓに変化させた
ＣＤＲ−Ｌ３：
Ｓ９１をＥに変化させた。
Ｋ９２を２０個のアミノ酸すべてに変化させた。Ａ、Ｒ、Ｋ、およびＨが結合した。
【０３２２】
それぞれのポリペプチドをＦａｂとして発現させ、９６個の個々のクローンのヒトＮＧＦに対する親和性を、それぞれのライブラリについて、ＢＩＡＣＯＲＥ分析を用いて、製造者の指示に従い、かつ上述のようにスクリーニングした。この分析の結果を表８に示す。
【０３２３】
【表７−１】
2018012692.tif 000009
【０３２４】
【表７−２】
2018012692.tif 000010
【０３２５】
結合親和性に基づいて、最良のクローンＥ３（「３Ｅ」と互換性があるように呼ばれる）および３Ｃを、さらなる特徴づけのために選択した。Ｅ３は、以下のＣＤＲ置換、すなわち、ＣＤＲ−Ｈ３：Ｙ１０１Ｗ、Ｇ１０３Ａ、およびＣＤＲ−Ｌ３：Ｓ９１Ｅ、Ｋ９２Ｈを含んでおり、これらを、以下のＬ１、Ｌ２、Ｈ１およびＨ２突然変異も含まれる単一のクローン内へと合わせた：
ＣＤＲ−Ｈ１：Ｉ３４Ｌ、
ＣＤＲ−Ｈ２：Ｍ５０Ｉ、Ｌ６３Ｖ、
ＣＤＲ−Ｌ１：Ｄ２８Ｓ、Ｈ３２Ｎ、
ＣＤＲ−Ｌ２：Ｉ５１Ｔ。
【０３２６】
Ｅ３の重鎖および軽鎖可変領域の配列は、配列番号１および２に示されている（ＷＯ２００４／０５８１８４の図１Ａおよび１Ｂも参照）。３Ｃは、以下のＣＤＲ置換、すなわち、ＣＤＲ−Ｌ３：Ｓ９１Ｅ、Ｋ９２Ｒ、ＣＤＲＨ３：Ｙ１０１Ｗ、Ｇ１０３Ａを含んでおり、これらを、クローン３Ｅについて記載したＬ１、Ｌ２、Ｈ１およびＨ２突然変異も含まれる単一のクローン内へと合わせた。
【０３２７】
３Ｅおよび３Ｃの配列をＦａｂおよび完全抗体を産生させるための哺乳動物発現ベクター内にクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞中で発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡまたはタンパク質Ａクロマトグラフィーを用いて精製した。純粋なタンパク質をアミノ酸分析によって正確に定量した。
【０３２８】
ヒトＮＧＦに対するＦａｂ  Ｅ３および３Ｃの結合親和性を、製造者の指示に従い、かつ上述のように、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を用いて測定したが、ただし、再結合効果を防止するために１００ＲＵ  ＮＧＦをチップ上で用いた。手短に述べると、抗体（Ｆａｂ）のいくつかの濃度を、２分間、それ上に１００ＲＵの固定したヒトＮＧＦを有するＣＭ５チップ上に注入し、１８００秒間解離させた。マウス抗体９１１（Ｆａｂ）を対照として分析した。データは、製造者の指示に従って、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて分析した。抗体Ｅ３および９１１の分析の結果は、ＷＯ２００４／０５８１８４の図９および１０に示されている。Ｅ３は、約０．０７ｎＭのＫＤ（ならびに約６．０ｅ５Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ、および約４．２ｅ−５ｓ−１のｋｏｆｆ）でヒトＮＧＦと結合した。３Ｃは、約０．３５ｎＭのＫＤ（約１．４Ｅ−５のｋｏｆｆ）でヒトＮＧＦと結合した。対照的に、マウス抗体９１１は、３．７ｎＭのＫＤ、８．４×１０−５ｓ−１のｋｏｆｆおよび２．２×１０４Ｍｓ−１のｋｏｎでＮＧＦと結合した。
【０３２９】
抗体Ｅ３（３Ｅと互換性があるように呼ばれる）を、高い結合親和性に基づいたさらなる分析のために選択した。ＮＧＦとＮＧＦ受容体ｔｒｋＡおよびｐ７５との相互作用を防止するＥ３の能力を試験するために、２．５ｎＭのヒトＮＧＦを事前に混合し、１時間、０〜５０ｎＭの抗体Ｅ３（Ｆａｂ）と共にインキュベーションした。インキュベーション後、試料を１０ｕｌ／分で、２６０ＲＵのｐ７５（チャネル２）および６００ＲＵのｔｒｋＡ（チャネル３）を含有するＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５チップ上に注入し、％結合を決定した。この分析の結果は、ＷＯ２００４／０５８１８４の図１１に示されている。Ｆａｂ  Ｅ３の増加した濃度が、減少したシグナル（ＲＵで測定した）によって示されるように、ＮＧＦとｐ７５およびｔｒｋＡのどちらとの相互作用も遮断し、Ｆａｂ  Ｅ３が、ヒトＮＧＦとｔｒｋＡおよびｐ７５のどちらとの相互作用も遮断することが示される。抗体Ｅ３（Ｆａｂ）の濃度がＮＧＦの濃度に等しい場合（約２．５ｎＭのＮＧＦ濃度）、ＮＧＦ結合は観察されなかった（０のシグナルによって示される）。ＮＧＦの濃度が抗体３Ｅの濃度に等しい場合に０％のＮＧＦ−受容体結合が起こったことにより、２．５ｎＭのＮＧＦが、ＮＧＦに対するＥ３のｋＤよりも少なくとも１０倍高く、平衡状態であることが示唆された。
【０３３０】
（実施例２）
マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンの生存アッセイを用いた、抗ＮＧＦ抗体のＮＧＦ遮断能力の評価
ＮＧＦ活性を遮断するＦａｂ  Ｅ３または完全抗体Ｅ３の能力を、マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンのＮＧＦ依存性の生存をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害する抗体の能力を測定することによって評価した。三叉神経節は、顔面領域を神経支配する皮膚感覚ニューロンからなる。マウスＥ１３．５三叉神経ニューロンの生存は、これらのニューロンの生存を支持するためにＮＧＦが必要であるため、抗ＮＧＦ拮抗抗体のＮＧＦ遮断活性を評価するための高感度のアッセイである。たとえば、飽和濃度のＮＧＦでは、生存は４８時間の培養中に１００％に近い。対照的に、ＮＧＦが存在しない場合は、５％以下のニューロンしか４８時間で生存しない。
【０３３１】
生存アッセイは以下のように実施した：交配期を合わせた（ｔｉｍｅ−ｍａｔｅｄ）妊娠したＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ雌マウスをＣＯ２吸入によって安楽死させた。子宮角を取り出し、胚期Ｅ１３．５の胚を抽出し、断頭した。電解により鋭利にしたタングステン針を用いて三叉神経節を解剖した。その後、神経節をトリプシン処理し、物理的に分離し、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニンでコーティングした９６ウェルプレート中の定義された無血清培地に、２００〜３００個の細胞／ウェルの密度で植えた。
【０３３２】
抗ＮＧＦ  Ｆａｂまたは抗体の遮断活性は、三叉神経ニューロンに、様々な用量の抗ＮＧＦ抗体Ｍａｂ９１１（Ｆａｂ）、８Ｌ２−６Ｄ５、Ｈ１９−Ｌ１２９、Ｅ３および３Ｃ、ならびに０．４ｎｇ／ｍｌ（約１５ｐＭ、この濃度は生存のためのＮＧＦの飽和濃度を表す）および０．０４ｎｇ／ｍｌ（約１．５ｐＭまで、この濃度はＩＣ５０近い）の濃度のヒトまたはラットＮＧＦを加えることによって評価した。４８時間培養した後、細胞を、以下のようにＢｉｏｍｅｋ  ＦＸ液体処理（ｌｉｑｕｉｄ  ｈａｎｄｌｉｎｇ）ワークステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）上で行う自動免疫細胞化学プロトコルに供した：４％のホルムアルデヒド、５％のスクロース、およびＰＢＳを用いた固定、０．３％のＰＢＳ中のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いた透過処理）、５％の正常ヤギ血清、０．１１％のＰＢＳ中のＢＳＡを用いた非特異的結合部位の遮断、ならびにニューロンを検出するための一次および二次抗体との逐次的なインキュベーション。一次抗体は、確立された神経の表現型マーカーであるタンパク質遺伝子産物８９．５（ＰＧＰ９．５、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対する、ウサギポリクローナル抗体であった。二次抗体は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、および培養物中に存在するすべての細胞の核を標識するための核色素Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）であった。画像収集および画像分析はＤｉｓｃｏｖｅｒｙ−Ｉ／ＧｅｎＩＩ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上で行った。画像はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の２つの波長で自動的に取得し、核染色はウェルのすべてに存在するため、核染色を、Ｉｍａｇｅｒの画像に基づいた自動フォーカスシステムの参照点として使用した。１個のウェルあたり画像処理された適切な対象および部位数を選択して、それぞれのウェルの全表面をカバーした。自動画像分析は、抗ＰＧＰ９．５抗体を用いたその特異的染色に基づいて、４８時間の培養の後にそれぞれのウェル中に存在するニューロンの数を計数するように設定した。画像の注意深い閾値化ならびに形態学および蛍光強度に基づいた選択性フィルターの適用により、１個のウェルあたりのニューロンの正確な計数がもたらされた。
【０３３３】
この実験の結果により、Ｆａｂ  Ｅ３がＮＧＦ活性を高い親和性で遮断したことが実証された。結果は、ＷＯ２００４／０５８１８４の図４〜６および表９に示されている。
【０３３４】
ＷＯ２００４／０５８１８４の図４は、様々な濃度のヒトおよびラットＮＧＦの存在下における、Ｅ１３．５ニューロンのＮＧＦ依存性の生存を示すグラフである。
【０３３５】
ＷＯ２００４／０５８１８４の図５は、０．０４ｎｇ／ｍｌのヒトＮＧＦ（約１．５ｐＭ、下部パネルに示される）または０．４ｎｇ／ｍｌのヒトＮＧＦ（約１５ｐＭ、上部パネルに示される）のどちらかの存在下における、様々なＦａｂのＮＧＦ遮断効果を比較するグラフである。１．５ｐＭのＮＧＦは、ＮＧＦのＥＣ５０に近く、生存を促進した一方で、１５ｐＭは、飽和濃度のＮＧＦを表した。様々な濃度のＦａｂ  Ｅ３、ネズミ９１１  Ｆａｂ、ならびにＦａｂ  Ｈ１９−Ｌ１２９およびＦａｂ  ８Ｌ２−６Ｄ５におけるＥ１３．５マウス三叉神経ニューロンの生存を、上述のように評価した。ＩＣ５０（ｐＭ）をそれぞれのＮＧＦ濃度でそれぞれのＦａｂについて計算し、表９に示す。Ｆａｂ  Ｅ３はヒトＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロンの生存を強力に遮断し、１５ｐＭのヒトＮＧＦの存在下では約２１ｐＭのＩＣ５０であり、１．５ｐＭのヒトＮＧＦの存在下では約１．２ｐＭのＩＣ５０であった。Ｆａｂ  ３ＣおよびＨ１９−Ｌ１２９も、ヒトＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロンの生存を強力に遮断した。図６は、０．０４ｎｇ／ｍｌのラットＮＧＦ（約１．５ｐＭ、下部パネルに示す）または０．４ｎｇ／ｍｌのラットＮＧＦ（約１５ｐＭ、上部パネルに示す）のどちらかの存在下における、様々なＦａｂのＮＧＦ遮断効果を比較するグラフである。１．５ｐＭのＮＧＦはＥＣ５０に近い一方で、１５ｐＭは飽和濃度のＮＧＦを表した。様々な濃度のＦａｂ  Ｅ３、ネズミＦａｂ９１１、ならびにＦａｂ  Ｈ１９−Ｌ１２９および８Ｌ２−６Ｄ５におけるＥ１３．５マウス三叉神経ニューロンの生存を、上述のように評価した。ＥＣ５０（ｐＭ）をそれぞれのＮＧＦ濃度でそれぞれのＦａｂについて計算し、表９に示す。Ｆａｂ  Ｅ３はヒトＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロンの生存を強力に遮断し、１５ｐＭのラットＮＧＦの存在下では約３１．６ｐＭのＩＣ５０であり、１．５ｐＭのラットＮＧＦの存在下では約１．３ｐＭのＩＣ５０であった。Ｆａｂ  ３ＣおよびＨ１９−Ｌ１２９も、ラットＮＧＦ依存性の三叉神経ニューロンの生存を強力に遮断した。
【０３３６】
【表８】
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【０３３７】
異なる実験で、本発明者らは、ヒトＮＧＦの０．４ｎｇ／ｍｌの飽和濃度の存在における）、完全抗体Ｅ３およびＦａｂ  ３Ｅの、Ｅ１３．５ニューロンのＮＧＦ依存性の生存を阻害する能力を比較した。分析の結果は、ＷＯ２００４／０５８１８４の図１０に示されている。完全抗体Ｅ３およびＦａｂ  ３Ｅは、全抗体およびＦａｂの濃度をＮＧＦ結合部位の数に正規化した場合に（Ｆａｂは１つの結合部位を有し、全抗体は２つの結合部位を有する）、同様のレベルのＮＧＦ依存性の生存の阻害を示した。これらの結果により、完全抗体とＮＧＦ二量体との結合による結合力効果が存在しないことが実証された。
【０３３８】
別の実験で、本発明者らは、様々な濃度（２０、４、０．８、０．１６、０．０３２、０．００６４、０．００１２８、および０．０ｎＭ）の抗体Ｅ３、抗体９１１、およびｔｒｋＡ受容体イムノアドヒーシン（免疫グロブリンＦｃドメイン、ＣＨ２−ＣＨ３と融合したＮＧＦ受容体ｔｒｋＡの細胞外ドメインからなる）の、０．４ｎｇ／ｍｌ（飽和条件）の存在下における、Ｅ１３．５ニューロンのＮＧＦ依存性の生存を阻害する能力を比較した。これらの結果は、ＷＯ２００４／０５８１８４の図１１に示されている。これらの結果により、抗体Ｅ３が、抗体９１１またはｔｒｋＡイムノアドヒーシンのどちらかよりも良好にＮＧＦを遮断したことが実証された。
【０３３９】
（実施例３）
マウス三叉神経および節状神経ニューロンの生存アッセイを用いた、抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の特異性の評価
ＮＧＦ活性を特異的に遮断する抗体Ｅ３の能力は、飽和濃度のＮＧＦ、ＮＧＦ関連ニューロトロフィンＮＴ３、またはＮＧＦ非関連の神経栄養因子、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）の存在下において、マウスＥ１７／１８三叉神経ニューロンの生存をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害する抗体の能力を測定することによって評価した。マウスＥ１７／１８三叉神経ニューロンの生存は、Ｅ１３．５ＴＧニューロンの生存を支持するために必要なＮＧＦのレベルよりも、これらのニューロンの生存を支持するために高濃度のＮＧＦが必要であるため、抗ＮＧＦ拮抗抗体のＮＧＦ遮断活性を評価するための高感度のアッセイである。また、これらのニューロンの生存はＮＴ３またはＭＳＰによっても支持され、したがって、これらのニューロンの生存も、抗ＮＧＦ拮抗抗体がＮＴ３またはＭＳＰも遮断したかどうかを評価するための高感度なアッセイである。
【０３４０】
また、ＮＧＦ活性を特異的に遮断する抗体Ｅ３の能力は、飽和濃度のＢＤＮＦまたはＮＴ４／５の存在下における、マウス節状神経Ｅ１７ニューロンの生存を阻害する抗体の能力を測定することによっても評価した。節状神経ニューロンの生存はＢＤＮＦまたはＮＴ４／５によって支持され、したがって、これらのニューロンの生存も、抗ＮＧＦ拮抗抗体のＢＤＮＦまたはＮＴ４／５遮断能力を評価するための高感度なアッセイである。
【０３４１】
生存アッセイは以下のように実施した：交配期を合わせた妊娠したＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ雌マウスをＣＯ２吸入によって安楽死させた。子宮角を取り出し、胚（胚性日１７または１８）を抽出し、断頭した。三叉神経および節状神経節を解剖し、清浄にした。その後、神経節をトリプシン処理し、物理的に分離し、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニンでコーティングした４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中の定義された無血清培地に、１００〜３００個の細胞／ウェルの密度で植えた。
【０３４２】
Ｅ１７／１８三叉神経ニューロンを、加えた神経栄養因子なしに（陰性対照）または飽和濃度のヒトＮＧＦ（４００ｐＭおよび１５ｐＭ）（陽性対照）、ＮＴ３（４００ｐＭ）、もしくはＭＳＰ（６００ｐＭ）の存在下で成長させた。様々な濃度のＥ３および９１１  Ｆａｂならびに完全抗体が含まれる２つ組の培養物を設定した。Ｆａｂおよび完全抗体の濃度を、結合部位１個あたりで示した（たとえば、完全抗体は２つの結合部位を含有する一方で、Ｆａｂは１つの結合部位を含有する）。
【０３４３】
Ｅ１７節状神経ニューロンを、加えた神経栄養因子を存在させずに（陰性対照）、または飽和濃度のＢＤＮＦ（４００ｐＭ）（陽性対照）もしくはＮＴ４／５（４００ｐＭ）もしくはＮＧＦ非関連の成長因子ＩＬＦ（インターロイキン阻害因子）と共に成長させた。この実験の目的は抗体の特異性を試験することであったため、高濃度のニューロトロフィンを使用した。様々な、ここでも抗体Ｅ３および９１１を加えたおよび加えないものが含まれる、２つ組の培養物を設定した。４８時間の培養の後、それぞれの条件下でそれぞれのウェル中に生存するニューロンの合計数を、位相差顕微鏡を用いた手動の計数によって確認した。
【０３４４】
これらの実験の結果により、Ｅ３および９１１抗体が、Ｅ１８三叉神経ニューロンに対するＮＧＦの生存促進効果を完全に遮断したことが実証された。対照的に、Ｅ３および９１１抗体は、ＮＴ３もしくはＭＳＰによって促進された三叉神経ニューロンの生存、またはＢＤＮＦもしくはＮＴ４／５もしくはＬＩＦによって促進された節状神経ニューロンの生存に影響を与えなかった。これらの結果により、ＮＧＦ遮断の有効濃度よりも１０００倍〜１０，０００倍高い濃度で、これらの抗体と他のＮＧＦ関連ニューロトロフィン（ＮＴ３、ＮＴ４／５、ＢＤＮＦ）との間に相互作用が検出されなかったため、抗体Ｅ３が、ＮＧＦに対する選択的特異性を保有していたことが実証された。さらに、これらの結果により、抗体またはＦａｂ  Ｅ３を加えた際に、ＮＧＦを添加したＮＧＦ依存性のニューロンの培養物で見られた神経細胞死は、これらの抗体とＮＧＦとの間の特異的相互作用が原因であり、全身性の毒性効果が原因ではないことが実証された。マウス抗ＮＧＦ拮抗抗体９１１も試験し、同様の結果が観察された。高濃度のニューロトロフィンを使用したことが原因で、抗体Ｅ３および９１１はどちらもその滴定条件に非常に近く、これらの抗体のＮＧＦに対する結合親和性の差異は、これらの条件下であまり明確でなくなるため、同様のレベルでＮＧＦと結合することが予測されたことに注意されたい。
【０３４５】
これらの実験の結果は、ＷＯ２００４／０５８１８４の図１２、１３、１４、および１５に示されている。データは、それぞれの実験の陽性対照（たとえば、それぞれ、飽和ＮＧＦ濃度の存在下で成長させた三叉神経ニューロンの１００％生存、および飽和ＢＤＮＦ濃度の存在下で成長させた節状神経ニューロンの１００％生存）で見られる生存と比較した、４８時間の培養の後の平均の％生存（±標準誤差、それぞれのデータ点でｎ＝３）を示した。ＷＯ２００４／０５８１８４の図１２〜１３は、抗ＮＧＦ拮抗抗体Ｅ３またはＦａｂ  Ｅ３が、ＮＴ３およびＭＳＰによって促進された生存を、２００ｎＭと高い抗体濃度でも阻害しなかったことを示すグラフである。対照的に、２０ｎＭの抗体Ｅ３またはＦａｂ  ３ＥおよびＦａｂ９１１は、ＮＧＦ誘発性の生存を完全に遮断した。マウス抗ＮＧＦ拮抗抗体９１１も試験し、同様の結果が観察された。具体的には、ＷＯ２００４／０５８１８４の図１２は、加えたニューロトロフィンが存在しない（「対照」と呼ばれる）、４００ｐＭのＮＧＦ（「ＮＧＦ−４００ｐＭと呼ばれる）、１０ｎＭのＮＴ３（「ＮＴ３−１０ｎＭと呼ばれる）または６００ｐＭのＭＳＰ（「ＭＳＰ−６００ｐＭと呼ばれる）の存在下における、様々な濃度（２０ｎＭ、２ｎＭ、または０．２ｎＭ）のＥ３Ｆａｂ（図中で「３Ｅ」と呼ばれる）およびマウス抗体９１１Ｆａｂの、Ｅ１８三叉神経ニューロンの生存に対する効果の比較を示すグラフである。ＷＯ２００４／０５８１８４の図１３は、Ｅ１７三叉神経ニューロンの生存に対する、加えたニューロトロフィンが存在しない（「因子なし」と呼ばれる）、４００ｐＭのＮＧＦ（「ＮＧＦ−４００ｐＭと呼ばれる）、１０ｎＭのＮＴ３（「ＮＴ３−１０ｎＭと呼ばれる）または６００ｐＭのＭＳＰ（「ＭＳＰ−６００ｐＭと呼ばれる）の存在下における、様々な濃度（２００ｎＭおよび８０ｎＭ）のＥ３Ｆａｂおよび完全抗体ならびにマウス抗体９１１の完全抗体およびＦａｂの効果の比較を示すグラフである。
【０３４６】
ＷＯ２００４／０５８１８４の図１４〜１５は、抗ＮＧＦ拮抗抗体Ｅ３またはＦａｂ  Ｅ３が、ＢＤＮＦ、ＮＴ４／５またはＬＩＦによって促進されたＥ１７節状神経ニューロンの生存を阻害しなかったことを示すグラフである。マウス抗ＮＧＦ拮抗抗体９１１も試験し、同様の結果が観察された。具体的には、ＷＯ２００４／０５８１８４の図１４は、加えたニューロトロフィンが存在しない（「因子なし」と呼ばれる）、４００ｐＭのＢＤＮＦ（「ＢＤＮＦ−４００ｐＭと呼ばれる）、４００ｐＭのＮＴ４／５（「ＮＴ４／５−４００ｐＭと呼ばれる）、または２．５ｎＭのＬＩＦ（「ＬＩＰ−２．５ｎＭと呼ばれる）の存在下における、様々な濃度（２００ｎＭまたは８０ｎＭ）の完全抗体Ｅ３（「図中の３Ｅ」と呼ばれる）、Ｆａｂ  Ｅ３、完全抗体９１１、またはＦａｂ９１１の効果の、Ｅ１７節状神経ニューロンの生存に対する比較を示すグラフである。ＷＯ２００４／０５８１８４の図１５は、加えたニューロトロフィンが存在しない（「対照」と呼ばれる）、４００ｐＭのＢＤＮＦ（「ＢＤＮＦ−４００ｐＭと呼ばれる）、４００ｐＭのＮＴ４／５（「ＮＴ４／５−４００ｐＭと呼ばれる）、または２．５ｎＭのＬＩＦ（「ＬＩＰ−２．５ｎＭと呼ばれる）の存在下における、様々な濃度（２００ｎＭ、２０ｎＭ、２ｎＭ）のＦａｂ  Ｅ３（「図中の３Ｅ」と呼ばれる）、またはＦａｂ９１１の、Ｅ１７節状神経ニューロンの生存に対する効果の比較を示すグラフである。
【０３４７】
（実施例４）
哺乳動物発現ベクターの調製および哺乳動物細胞における抗体Ｅ３の発現
哺乳動物細胞における抗体Ｅ３の発現に使用するために、３つの哺乳動物発現ベクターを設計および構築した。
【０３４８】
ベクターＤｂ．９１１．３Ｅとは、Ｅ３抗体の重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ２ａ定常領域を含む発現ベクターであり、重鎖の一過性または安定な発現に適している。Ｄｂ．９１１．３Ｅは、以下の領域に対応するヌクレオチド配列からなる：ネズミサイトメガロウイルスプロモーター領域（ヌクレオチド１〜６１２）、合成イントロン（ヌクレオチド６１９〜１５０７）、ＤＨＦＲコード領域（ヌクレオチド７０７〜１２６７）、ヒト成長ホルモンシグナルペプチド（ヌクレオチド１５２５〜１６０２）、抗体３Ｅ重鎖可変領域（ヌクレオチド１６０３〜１９６５）、Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１の突然変異を含有するヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域（アミノ酸の番号づけは野生型ＩｇＧ２ａ配列を参考とする、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３〜２６２４を参照）、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド２９７４〜３２１７）、ＳＶ４０エンハンサー領域（ヌクレオチド３２１８〜３４６３）、ファージｆ１領域（ヌクレオチド３５５１〜４００６）およびβラクタマーゼ（ＡｍｐＲ）コード領域（ヌクレオチド４４４３〜５３００）。Ｄｂ．９１１．３Ｅは、２００３年１月８日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４８９５が割り当てられている。
【０３４９】
ベクターＥｂ．９１１．３Ｅとは、Ｅ３抗体の軽鎖可変領域およびヒトκ鎖定常領域を含む発現ベクターであり、軽鎖の一過性の発現に適している。Ｅｂ．９１１．３Ｅは、以下の領域に対応するヌクレオチド配列からなる：ネズミサイトメガロウイルスプロモーター領域（ヌクレオチド１〜６１２）、ヒトＥＦ−１イントロン（ヌクレオチド６１９〜１１４２）、ヒト成長ホルモンシグナルペプチド（ヌクレオチド１１７３〜１１５０）、抗体Ｅ３軽鎖可変領域（ヌクレオチド１２５１〜１５７１）、ヒトκ鎖定常領域（ヌクレオチド１５７２〜１８９２）、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド１９１０〜２１５３）、ＳＶ４０エンハンサー領域（ヌクレオチド２１５４〜２３９９）、ファージｆ１領域（ヌクレオチド２４８７〜２９４２）およびβラクタマーゼ（ＡｍｐＲ）コード領域（ヌクレオチド３３７９〜４２３６）。Ｅｂ．９１１．３Ｅは、２００３年１月８日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４８９３が割り当てられている。
【０３５０】
ベクターＥｂ．ｐｕｒ．９１１．３Ｅとは、Ｅ３抗体の軽鎖可変領域およびヒトκ定常領域を含む発現ベクターであり、軽鎖の安定な発現に適している。Ｅｂ．ｐｕｒ．９１１．３Ｅは、以下の領域に対応するヌクレオチド配列からなる：ネズミサイトメガロウイルスプロモーター領域（ヌクレオチド１〜６１２）、ヒトＥＦ−１イントロン（ヌクレオチド６１９〜１７５８）、ｐａｃ遺伝子（プロマイシンＲ）コード領域（ヌクレオチド７３９〜１２３５）、ヒトｈｓｐ７０  ５’ＵＴＲ  領域（ヌクレオチド１７７１〜１９７３）、ヒト成長ホルモンシグナルペプチド（ヌクレオチド１９８５〜２０６２）、抗体Ｅ３軽鎖可変領域（ヌクレオチド２０６３〜２３８３）、ヒトκ鎖定常領域（ヌクレオチド２３８４〜２７０４）、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド２７２２〜２９６５）、ＳＶ４０エンハンサー領域（ヌクレオチド２９６６〜３２１１）、ファージｆ１領域（ヌクレオチド３２９９〜３６５４）およびβラクタマーゼ（ＡｍｐＲ）コード領域（ヌクレオチド４１９１〜５０４８）。Ｅｂ．ｐｕｒ．９１１．Ｅ３は、２００３年１月８日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４８９４が割り当てられている。
【０３５１】
一過性の細胞発現は、以下のように行った：１５０ｍｍの皿中のＣＨＯおよびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２５ｕｇのそれぞれのプラスミド（すなわち、重鎖を含有する１つのプラスミドおよび軽鎖を含有する１つのプラスミド）を用いて、一過的に同時形質移入した。ＤＮＡを、１００ｕｌのリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、製造者の指示に従って混合した。ＤＮＡ−脂質の複合体を、血清または抗生物質を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で、５時間、細胞と接触させた。このインキュベーション後、発現のために、培地を、添加剤を全く含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に２日間変えた。抗体を含有する細胞上清を、４回まで、その後に培地を交換して順次収集した。上清は、ＭａｐＳｅｌｅｃｔタンパク質Ａ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １７−５１９９−０２）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。抗体を、０．３Ｍのグリシン、０．６ＭのＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ８中でタンパク質Ａ樹脂と結合させ、その後、０．１Ｍのクエン酸緩衝液、ｐＨ３で溶出させた。抗体を含有する画分を、１Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ８．０ですぐに中和し、その後、抗体画分をＰＢＳ中で透析および濃縮した。
【０３５２】
（実施例５）
臨床研究
間質性膀胱炎の臨床的診断を有する患者を抗ＮＧＦ拮抗抗体Ｅ３で治療して、間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱および／または膀胱痛症候群に関連する１つまたは複数の疼痛および下部尿路症状の治療における、抗ＮＧＦ抗体である抗体Ｅ３の安全性および有効性を確認する。治療する患者は、治療前のスクリーニングにおいて、少なくとも１６の骨盤痛および切迫／頻発（ＰＵＦ−Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｕｒｏｌｏｇｙ  ２００２、６０：５７３〜５７８））スコアならびに少なくとも８のオリアリー−サント間質性膀胱炎症状指標（ＩＣＳＩ−Ｏ’Ｌｅａｒｙら、Ｕｒｏｌｏｇｙ  １９９７、４９（補遺５Ａ）：５８〜６３）スコアによって定義される中等度から重篤な間質性膀胱炎に罹患している。他の組み入れ基準も満たされているべきである。すべての組み入れ基準を満たさない、または１つもしくは複数の除外基準を満たす患者は、スクリーニング失敗とみなされ、研究にランダム化しない。
【０３５３】
間質性膀胱炎および／または有痛性膀胱症候群および／または膀胱痛症候群に関連する疼痛および下部尿路症状の治療における、プラセボと比較した、インフュージョンによる単一用量の抗体の有効性を評価する。Ｅ３抗体を２００μｇ／ｋｇの用量で患者に静脈内投与する。有効性に加えて、他の測度のなかで、とりわけ、プラセボと比較した治療の効果の規模、抗体を用いた治療に対する、間質性膀胱炎に対するバイオマーカーの応答、および治療応答速度を評価する。バイオマーカーには、とりわけ、ＮＧＦ、糖タンパク質−５１（ＧＰ−５１）、抗増殖因子（ＡＰＦ）およびＨＢ−表皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）が含まれる。
【０３５４】
一次エンドポイントを、単一用量のＥ３抗体を静脈点滴した６週間後に分析する。投薬後２、１０および１６週間での評価が二次エンドポイントとして含まれる。一次エンドポイントは、１１点の疼痛数値化スケール（ＮＣＳ）の変化である。オリアリー−サント間質性膀胱炎症状指標（ＩＣＳＩ）スコアを二次エンドポイントとして用いる。他の二次エンドポイントには、オリアリー−サント間質性膀胱炎問題指数（ＩＣＰＩ−Ｏ’Ｌｅａｒｙら、Ｕｒｏｌｏｇｙ  １９９７、４９（補遺５Ａ）：５８〜６３）、ＩＣＳＩ＋ＩＣＰＩ、骨盤痛および切迫／頻発（ＰＵＦ）、平均の毎日の疼痛、また、排尿頻度、夜間頻度、失禁発症頻度、１回の排尿あたり排尿される平均体積、平均の間質性膀胱炎疼痛重篤度、尿意切迫発症、平均睡眠障害スコア、平均の性行為痛に関連する疼痛のスコア、全体応答評価、開存性報告治療影響評価、治療失敗、バイオマーカー、安全性エンドポイントおよび／または薬物動態学測度を含めた、研究期間中に患者が記録した排尿日誌変数が含まれる。バイオマーカーには、とりわけ、ＮＧＦ、糖タンパク質−５１（ＧＰ−５１）、抗増殖因子（ＡＰＦ）およびＨＢ−表皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）が含まれ得る。
【０３５５】
以下のデータは、間質性膀胱炎／有痛性膀胱症候群／膀胱痛症候群（ＩＣ／ＰＢＳ／ＢＰＳ）に罹患している患者におけるＥ３抗体の安全性および有効性を評価するための、上記プロトコルを利用した継続中の臨床治験の暫定分析から誘導したものである。２４人の患者からのデータを暫定分析に使用した。疼痛のＮＲＳおよびＩＣＳＩスコアのどちらでも、明らかな改善（減少）が見られる。Ｅ３抗体を受けている患者において観察された改善は、プラセボを受けている患者で見られるものよりも大きい。これらのデータは、Ｅ３抗体が、ＩＣ／ＰＢＳ／ＢＰＳに関連する疼痛および他の下部尿路症状（ＬＵＴＳ）の治療において有効であり得るという事実の支援を提供する。しかし、最終的な研究結果を評価する必要がある。
【０３５６】
【表９】
2018012692.tif 000012
【０３５７】
疼痛は、１１点（０〜１０）の数値化スケール（ＮＲＳ）を用いて評価した。このスケールは妥当性確認されており、疼痛の緩和に向けられた治療の評価において幅広く使用されている。
【０３５８】
間質性膀胱炎症状指標（ＩＣＳＩ）は、全体的なＩＣ症状の重篤度を評価し、スコアは０〜２０の範囲である。これは、ＩＣ／ＰＢＳ／ＢＰＳに関連する疼痛およびＬＵＴＳに関する４つの質問に基づく。これらには、過去４週間にわたる日中および夜間の頻尿、尿意切迫、および膀胱痛の重篤度の測度が含まれる。
【０３５９】
生物材料の寄託
以下の材料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ（ＡＴＣＣ）に寄託されている：
【０３６０】
【表１０】
2018012692.tif 000013
【０３６１】
これらの寄託に関する詳細は、その内容の全体が本明細書中に参考として組み込まれているＷＯ２００４０５８１８４に見つけることができる。
【０３６２】
抗体配列
重鎖可変領域（カバットＣＤＲは下線付き、コチアＣＤＲは太字かつ斜体である）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＧＹＤＬＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＩＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＶＫＳＲＶＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ（配列番号１）
【０３６３】
軽鎖可変領域（カバットＣＤＲは下線付き、コチアＣＤＲは太字かつ斜体である）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＥＨＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴ（配列番号２）
【０３６４】
Ｅ３重鎖拡張ＣＤＲ
【０３６５】
【表１１】
2018012692.tif 000014
【０３６６】
Ｅ３軽鎖拡張ＣＤＲ
【０３６７】
【表１２】
2018012692.tif 000015
【０３６８】
マウスモノクローナル抗体９１１拡張ＣＤＲ
９１１重鎖拡張ＣＤＲ
【０３６９】
【表１３】
2018012692.tif 000016
【０３７０】
９１１軽鎖拡張ＣＤＲ
【０３７１】
【表１４】
2018012692.tif 000017
【０３７２】
Ｅ３重鎖アミノ酸配列（完全）
【０３７３】
【表１５】
2018012692.tif 000018
【０３７４】
３Ｅ軽鎖アミノ酸配列（完全抗体）
【０３７５】
【表１６】
2018012692.tif 000019
【０３７６】
３Ｅ重鎖ヌクレオチド配列（完全抗体）
【０３７７】
【表１７】
2018012692.tif 000020
【０３７８】
３Ｅ重鎖可変ドメインヌクレオチド配列
【０３７９】
【表１８】
2018012692.tif 000021
【０３８０】
３Ｅ軽鎖ヌクレオチド配列（完全抗体）
【０３８１】
【表１９】
2018012692.tif 000022
【０３８２】
３Ｅ軽鎖可変ドメインヌクレオチド配列
【０３８３】
【表２０】
2018012692.tif 000023
【０３８４】
本明細書中に記載の上記配列および他の配列は、添付の配列表に示す。
【配列表フリーテキスト】
【０３８５】
添付の配列表において配列番号１〜８、１５〜６８、７０〜７２、７４〜７７によって識別される配列は、フリーテキストの「合成構築体」を有する。
【０３８６】
本明細書中に記載の実施例および実施形態は例示目的のみであり、それに鑑みた様々な変形または変化が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲内に含まれるべきであることを、理解されよう。
【受託番号】
【０３８７】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８９３
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８９４
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８９５
【配列表】
2018012692000001.app