(57)【要約】      （修正有）【課題】マイクロ流体装置内での溶液（液体）を混合するための方法及びその装置、並びにシステムの提供。【解決手段】第一チャンバー１１０とのみ流体的連通状態にある第二チャンバー１１６にコネクティングチャンネル１１５を介して接続される第一チャンバー１１０を有するマイクロ流体装置を備えてなる、溶液を混合するためのマイクロ流体装置、システム及び方法。第一チャンバー１１０中の溶液は、第二チャンバー１１６内に強制的に押し出され、第二チャンバー１１６内にトラップされた空気が圧縮され、次いで、その溶液が第一チャンバー１１０に戻され、第一チャンバー１１０に戻る時に、溶液はコネクティングチャンネル１１５を出て、そして第一チャンバー１１０における混合を引き起こすマイクロ流体の混合システム。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一チャンバー；
第一チャンバーから第一ロードウェルに繋がる第一ロードチャンネル；
第一チャンバーから第二ロードウェルに繋がる第二ロードチャンネル；
第二チャンバー；及び
第一チャンバーから第二チャンバーに繋がるコネクティングチャンネル；を備えてなり、
第一チャンバーの容積が１μＬ〜１ｍＬであり；
コネクティングチャンネルの断面積が０．００１ｍｍ2〜０．１２ｍｍ2であり；
第二チャンバーが第一チャンバーの０．１〜１．５倍容積であり、そして第二チャンバーがコネクティングチャンネルを介してのみ流体的連通状態にある、マイクロ流体装置。
【請求項２】
（第二チャンバー充填率）×（第二チャンバー容積）が、（ｉ）第一ロードチャンネルと第一ロードウェルの容積の和及び（ｉｉ）第二ロードチャンネルと第二ロードウェルの容積の和の少ない方の二倍未満であり、そして第二チャンバー充填率が０．２〜０．９９である、請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項３】
（第二チャンバー充填率）×（第二の容積）が、（ｉ）第一ロードチャンネルと第一ロードウェルの容積及び（ｉｉ）第二ロードチャンネルと第二ロードウェルの容積の総和よりも小さい、請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項４】
第一チャンバー容積が２μＬ〜１００ｍＬである、請求項１〜３の何れか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項５】
第二チャンバーが第一チャンバーの０．２〜０．９５倍容積である、請求項１〜４の何れか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項６】
第二チャンバー充填率が０．５〜０．７である、請求項１〜５の何れか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項７】
コネクティングチャンネル断面積が０．００２ｍｍ2〜０．０６ｍｍ2である、請求項１〜６の何れか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項８】
第一チャンバーに接続されるキャピラリー電気泳動チャンネルネットワークをさらに備えてなる、請求項１〜７の何れか１項に記載のマイクロ流体装置。
【請求項９】
請求項１〜８の何れかに記載のマイクロ流体装置を供し；
第一ロードウェルを介して、第一ロードウェル、第一ロードチャンネル、第一チャンバー、第二ロードチャンネル、及び第二ロードウェル内に溶液を添加し；
第一ロードウェル及び第二ロードウェルのガス圧を圧力Ｐhighに上げるガス圧上昇工程に付し；
第一ロードウェル及び第二ロードウェルのガス圧を、大気圧以上であってＰhighより低い圧力Ｐlowに下げるガス圧下降工程に付すことを含む、
マイクロ流体装置中の溶液を混合する方法。
【請求項１０】
ガス圧上昇工程及びガス圧下降工程が、交互に少なくとも二度繰り返される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ガス圧上昇工程において、圧力Ｐhighの最大ガス圧が５０〜２００ｋＰａである、請求項９又は請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ガス圧下降工程において、圧力Ｐlowが０〜１８０ｋＰａである、請求項９〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ガス圧下降工程において、下降の速度が５０ｋＰａ／秒〜１５００ｋＰａ／秒である、請求項９〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ガス圧上昇工程において、上昇の速度が２０ｋＰａ／秒〜１５００ｋＰａ／秒である、請求項９〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
更に、溶液を添加した後、且つガス圧上昇工程の前に、水不混和性流体を、第一ロードウェル及び第二ロードウェル中の溶液上に置く、請求項９〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
下記（ｉ）及び（ｉｉ）を備えてなるマイクロ流体装置システムであって、
（ｉ）第一チャンバー；
第一チャンバーから第一ロードウェルに繋がる第一ロードチャンネル；
第一チャンバーから第二ロードウェルに繋がる第二ロードチャンネル；
第二チャンバー；及び
第一チャンバーから第二チャンバーに繋がるコネクティングチャンネル；を備えてなり、
第一チャンバー容積が１μＬと１ｍＬの間であり；
コネクティングチャンネル断面積が０．００１ｍｍ2〜０．１２ｍｍ2であり；
第二チャンバーが第一チャンバーの０．１〜１．５倍容積であり、そして第二チャンバーがコネクティングチャンネルとのみ流体的連通状態にあり；そして
（第二チャンバー充填率）×（第二チャンバー容積）が、（ｉ）第一ロードチャンネルと第一ロードウェルの容積和及び（ｉｉ）第二ロードチャンネルと第二ロードウェルの容積和の少ない方の二倍未満であり、そして第二チャンバー充填率が０．４〜０．９９である；マイクロ流体装置、及び
（ｉｉ）マイクロ流体装置に接する第一の表面上の開口部、第一の表面とは異なる外部表面上のポート、及び第一の表面上の少なくとも一つの開口部とポートとを連通するガスマニフォールドブロック内部のチャンネルを備えてなる、ガスマニフォールドブロックを備えてなる、上記マイクロ流体装置システム。
【請求項１７】
加圧されたガス源； 
第一の開口部及び第二の開口部を備えてなるバルブ；
加圧されたガス源を第一のバルブ開口部に連結する第一のチューブ；及び
第二のバルブ開口部をガスマニフォールドブロックのポートに連結する第二のチューブ；をさらに備えてなる、請求項１６に記載のマイクロ流体装置システム。
【請求項１８】
加圧されたガス源が、シリンジポンプ及び制御された圧縮された空気タンクから選ばれる、請求項１７に記載のマイクロ流体装置システム。
【請求項１９】
加圧されたガス源及び／又はバルブを制御することによって、ガスマニフォールドブロック中の圧力の昇降を制御するように構成されたマイクロプロセッサをさらに備えてなる、請求項１７又は１８に記載のマイクロ流体装置システム。
【請求項２０】
マイクロ流体装置を受け取るように適合された、温度制御可能な表面をさらに備えてなる、請求項１７〜１９の何れか１項に記載のマイクロ流体装置システム。
【請求項２１】
マイクロ流体装置が、第一チャンバーに接続されたキャピラリー電気泳動チャンネルネットワーク；及び
キャピラリー電気泳動チャンネルネットワークにおける電気泳動解析のために構成されたマイクロ流体装置中の電極；をさらに備えてなり、システムが、マイクロ流体装置中の電極に操作可能に接続された電源；をさらに備えてなる、請求項１７〜２０の何れか１項に記載のマイクロ流体装置システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体装置内での溶液（液体）を混合するための方法及びその装置、並びにシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
化学的及び生物学的な分析物の解析のため、マイクロ流体装置への大きな関心は続いている。「マイクロ流体」又は「マイクロスケール装置」は、一般的に、少なくとも一つのエレメントが、約０．５μｍ〜約５００μｍの少なくとも一つの寸法を有する、マイクロ流体エレメント（例えば、チャンネル、チャンバー、及び液体を保持し又は動かすその他の空間）のネットワークを備えてなる、流体を操作するための装置のことである。例えば、チャンネルはこの範囲にある深さ及び／又は幅を有し、チャンバーはこの範囲にある深さを少なくとも有する。
【０００３】
マイクロ流体装置においては、小さいスケールの反応が可能であり、それは当該分野の技術において周知である通り、試薬の使用量を減らす、サンプルサイズを小さくする、操作が迅速になるなど多くの利点が提供される。また、単一装置内への幾つかの機能の統合が可能であり、その装置において、続いて行われる取扱い、反応又は解析のために、サンプルは一つのエレメントから別のところへと輸送される。統合の態様によっては、オペレータ又はロボットステーションによるサンプルの取扱いの手間が低減されるため、サンプル処理量が改良され、必要とされる空間が小さくなり、遠隔地や現場で使用するために携帯することもできるようになる。
【０００４】
サンプルの測定においては、一般的に、サンプルを少なくとも一つの試薬と接触させ、反応を進行させ、測定の結果を解析することが必要となる。そして、通常、溶液中で測定成分が均一な濃度となることが好まれる。
【０００５】
マイクロ流体装置内の流体流は、一般的に、乱流ではないため、溶液の混合が必要となる。溶液の混合により、対流輸送が起こり、拡散輸送のみに依存する必要がなくなるため、反応動力学は改善される。
【０００６】
上記のようにサンプルサイズを小さくすると、サンプル容積が小さくなるため、分析物の濃度が同じ場合、分析物の量は少なくなる。解析方法においては、分析物の絶対数が少なくなると、その結果はそれに応じて不正確になる。例えば、コピーサンプルに対して測定された値は、より大きな変動（標準偏差）を有する。これは例えば、測定溶液中で分析物が均一に分布していない、アンプリコンのような反応生成物が反応の進行につれて測定溶液中に均一に分布しなくなる、検出工程において測定される溶液部分が測定溶液を代表していないなど、幾つかの理由によって生じる。
【０００７】
マイクロ流体装置であっても、分子（試薬及び／又は測定生成物）の拡散混合は、要求水準よりも更に遅いと認識される。
【０００８】
μＬ未満の容積に対する装置の寸法は小さいものの、小さい分子に対する拡散混合時間は数分のオーダーであり、例えば、核酸、酵素、蛋白質のようなより大きな分子や１オーダー又は数オーダーだけ小さい拡散係数を有する粒子を均一に混合するためには、より長い時間が必要となる。そのため、マイクロ流体装置の開発者らは、装置中の試薬の混合を向上させる方法を開発してきた。例えば、Ｌｉｕら（米国特許公告第２００３／０１７５９４７Ａ１号）は、マイクロ流体チャンバー内のガスポケットにかけられる超音波又は温度変化を用いて混合を向上させるための装置を開示しており、そこでは超音波場内で又は温度の影響下でガスポケットが膨張収縮して、装置内の振動流体流をもたらす。マイクロ流体装置における第二の液相内で液滴を混合するための混合技術の別の例は、Ｗａｎｇら（バイオームマイクロ装置、１２：５３３〜５４１（２０１０））が開示している。
【０００９】
しかしながら、一般的に、当該技術分野におけるこれら及び他の方法においては、まだ以下の問題の少なくとも１つが残されている：（１）コストや空間が要求される追加の装置又は器具が必要であること、（２）分析物と二相システムが適合しないこと、（３）より大容積のものに対する混合が不適切であること、（４）局所温度変化のような、混合プロセス独特の他の変動が生じること。
【００１０】
従って、以下のような装置が要求されている：正確で、再現性があり、そして信頼性がある解析結果を達成するため、装置内で溶液を混合するマイクロ流体装置、方法、及びシステム；コンパクトシステムにおいて、自動化を含み、低コストかつ効率的な製作及び操作が可能な一方で、操作コストを下げながら、広範囲なサンプル容積、例えば、約１００ｎＬ〜数ｍＬまたはそれを超える容積を処理できる装置。
【発明の概要】
【００１１】
実施態様に従う装置は、第一チャンバー、第二チャンバー、及び第一チャンバーから第二チャンバーに繋がるコネクティングチャンネルを備えてなり、ここで第二チャンバーはコネクティングチャンネル以外に出口を持たないように構成され、つまり、本明細書において述べられた方法に従って装置が使用されるとき、第二チャンバーはコネクティングチャンネルを介してのみ流体的に連通している状態にある。
【００１２】
一つの実施態様において、マイクロ流体装置が供され、装置は第一チャンバー、第一チャンバーから第一ロードウェルに繋がる第一ロードチャンネル、第一チャンバーから第二ロードウェルに繋がる第二ロードチャンネル、第二チャンバー、及び第一チャンバーから第二チャンバーに繋がるコネクティングチャンネルを備えてなる。好ましい実施態様において、第一チャンバーの容積は約１μＬ〜１ｍＬであり、そして第二チャンバーの容積は第一チャンバーの容積の０．１〜１．５倍であり、第二チャンバー充填率の設計パラメータは、約０．２〜約０．９９である。尚、第二チャンバー充填率とは、本発明の溶液を混合する方法において、第一ロードウェル及び第二ロードウェルのガス圧を圧力Ｐhighに上げ、第一チャンバーの溶液が第二チャンバーに流れこんだ時に、該溶液が第二チャンバー内に占める割合を表す。また、好ましい実施態様において、コネクティングチャンネルは、約０．００１ｍｍ2〜０．１２ｍｍ2の断面積を有する。
【００１３】
一つの実施態様において、（第二チャンバー充填率）×（第二チャンバー容積）の積は、（ｉ）第一ロードチャンネルと第一ロードウェルの容積和及び（ｉｉ）第二ロードチャンネルと第二ロードウェルの容積和の少ない方の二倍未満である。即ち、本発明の溶液を混合する方法において、第一及び第二ロードウェルのガス圧を圧力Ｐhighに上げた時でも、第一及び第二ロードチャンネルから溶液が第一チャンバーに供給され、第一チャンバーに空気等が混入することはない。
別の実施態様において、（第二チャンバー充填率）×（第二チャンバーの容積）の積は、（ｉ）第一ロードチャンネルと第一ロードウェルの容積と（ｉｉ）第二ロードチャンネルと第二ロードウェルの容積の総和よりも小さい。
【００１４】
幾つかの実施態様において、第一チャンバー容積は約２μＬ〜１００ｍＬである。さらに他の実施態様において、第二チャンバー容積は第一チャンバーの容積の約０．２倍〜約０．９５倍である。さらに他の実施態様において、第二チャンバー充填率の設計パラメータは約０．５〜約０．７である。
幾つかの実施態様において、コネクティングチャンネルは、少なくとも第一チャンバーと比べて比較的小さな断面積を有する。好ましい実施態様において、コネクティングチャンネルは約０．００２ｍｍ2〜０．０６ｍｍ2の断面積を有する。
【００１５】
追加の実施態様において、キャピラリー電気泳動チャンネルネットワークは第一チャンバーに接続される。これらの追加の実施態様において、一つの好ましい実施態様は、キャピラリー電気泳動チャンネルネットワークにおける電気泳動解析のために構成されたマイクロ流体装置中の電極を備えてなる。
本発明のマイクロ流体装置内の溶液の混合方法は、コネクティングチャンネルを介して、第一チャンバーから第二チャンバー内に液体を動かし、次いで、液体を第二チャンバーから抜き出して第一チャンバーに戻すことを含む。幾つかの実施態様において、コネクティングチャンネルの位置、角度及びサイズの結果として、コネクティングチャンネルを出る溶液によって、第一チャンバー内で渦混合が引き起こされる。
【００１６】
一つの実施態様は、上記実施態様によって記載されたマイクロ流体装置を供し、第一ロードウェルを介して、第一ロードチャンネル、第一チャンバー、第二ロードチャンネル、及び第二ロードウェル内に溶液を添加し、第一ロードウェル及び第二ロードウェルに亘って、ガス圧を圧力Ｐhighに上げ、次いで第一ロードウェル及び第二ロードウェルに亘って、ガス圧を圧力Ｐlowに下げることを含む。ここで、Ｐlowは大気圧以上であり、そしてＰhighより低い。幾つかの実施態様において、ガス圧上昇工程及びガス圧下降工程は、交互に少なくとも二度繰り返される。
【００１７】
別の実施態様は、上記実施態様によって記載されたマイクロ流体装置を供し、第一ロードウェルを介して、第一ロードチャンネル、第一チャンバー、第二ロードチャンネル、及び第二ロードウェルを満たすために溶液を添加し、第一及び第二ロードウェル上にガスマニフォールドブロックを配置し、そしてガスマニフォールドブロック中でガス圧を昇降することによって、第一ロードウェル及び第二ロードウェルにおけるガス圧の昇降が引き起こされる。当該ガスマニフォールドブロックは、マイクロ流体装置に接する第一の表面上の開口部、第一の表面とは異なる外部表面上のポート、及び第一の表面上の少なくとも一つの開口部とポートとを連通するガスマニフォールドブロック内部のチャンネルを備えてなる。そして、ガスマニフォールドブロックは、ガスで満たされた空間を形成するように、マイクロ流体装置をシールし、ガスマニフォールドブロック及びマイクロ流体装置は、ガスマニフォールドブロック中のポートを介してのみ外部環境と連通する。第一ロードウェル及び第二ロードウェルにおけるガス圧のＰhighまでの昇圧、次いで、第一ロードウェル及び第二ロードウェルにおけるガス圧がＰlowまでの降圧（ここで、Ｐlowは大気圧以上であり、そしてＰhighより低い）が、ガスマニフォールドブロック中のガス圧の昇降によって達成されるよう、ガスマニフォールドブロック中のガス圧の変化が、第一ロードウェル及び第二ロードウェルにおける容積に伝えられる。幾つかの実施態様において、ガス圧上昇工程及びガス圧下降工程は、交互に少なくとも二度繰り返される。
【００１８】
上記方法の幾つかの実施態様において、ガス圧上昇工程において、Ｐhighは、約５０〜約２００ｋＰａであり、幾つかの実施態様において、ガス圧下降工程において、Ｐlowは約０（大気圧）〜約１８０ｋＰａである。別途示されない限り、この明細書において、述べられる圧力数字は、一般的に、ゲージ圧のことであって、そして絶対圧ではなく、従って、周囲、又は大気圧に対して述べられた場合の圧力はゼロである。
【００１９】
上記方法の幾つかの実施態様でのガス圧上昇工程において、上昇の速度は約２０ｋＰａ／秒〜約９００ｋＰａ／秒であり、そして幾つかの実施態様でのガス圧下降工程において、下降の速度は約５０ｋＰａ／秒〜約１５００ｋＰａ／秒である。実施態様によっては、上昇の速度が大きい場合、第二チャンバーに溶液を押し出した時に第二チャンバー内に溶液が急激に流入し、溶液に泡がみが生じる可能性があるため、上昇の速度は約２０ｋＰａ／秒〜約１００ｋＰａ／秒が好ましい。下降の速度は、約１００ｋＰａ／秒〜約１０００ｋＰａ／秒が好ましい。
【００２０】
さらに上記方法の幾つかの実施態様において、流体の添加工程の後、水不混和性流体が、第一ロードウェル及び第二ロードウェル中の溶液の頂部上に置かれる。好ましい実施態様において、水不混和性流体はシリコーンオイルである。
下記を備えてなるシステムも供される：（ｉ）上記如何なる装置の実施態様にも記載された、第一ロードウェル及び第二ロードウェル、及び（ｉｉ）マイクロ流体装置に接する第一の表面上の開口部、第一の表面とは異なる外部表面上のポート、及び第一の表面上の少なくとも一つの開口部とポートとを連通するガスマニフォールドブロック内部のチャンネルを備えてなるガスマニフォールドブロック。該ガスマニフォールドブロックは、マイクロ流体装置の第一ロードウェル及び第二ロードウェル、要すればその他のマイクロ流体装置中のウェルにガスをかけるためのものである。ここで、ガスマニフォールドブロックの開口部は、第一及び第二ロードウェル上に、配置されるように構成される。そのため、ガスマニフォールドブロックをマイクロ流体装置に配置したとき、第一及び第二ロードウェルは、ガスマニフォールドブロックの開口部及びチャンネルを通じてポートを介してのみ、外部環境と連通する。
【００２１】
幾つかの実施態様において、システムは以下をさらに備えてなる：加圧されたガス源、 第一のバルブ開口部及び第二のバルブ開口部を備えてなるバルブ、加圧されたガス源を第一のバルブ開口部に連結する第一のチューブ、及び第二のバルブ開口部をガスマニフォールドブロックポートに連結する第二のチューブ。幾つかの好ましい実施態様において、加圧されたガス源は、シリンジポンプ又は制御された圧縮された空気タンクである。
上記システムの幾つかの実施態様において、システムは、加圧されたガス源及び／又はバルブを制御することによって、ガスマニフォールドブロック中の圧力の昇降を制御するように構成されたマイクロプロセッサをさらに備えてなる。
追加の実施態様において、上記システムは、マイクロ流体装置を受け取るように適合された、温度制御可能な表面をさらに備えてなる。
【００２２】
本システムの更なる追加の実施態様において、マイクロ流体装置が、第一チャンバーに接続されたキャピラリー電気泳動チャンネルネットワーク、及びキャピラリー電気泳動チャンネルネットワークにおける電気泳動解析のために構成された、マイクロ流体装置中の電極を備えてなるとき、システムは、マイクロ流体装置中の電極を操作できるように接続された電源をさらに備えてなる。
本発明の目的および特徴は、添付図面と併せて、本発明の以下の詳細な記述により完全に明確になる。          
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】混合方法の実施態様を実施するために有用な装置の実施態様を説明する。
【図１Ｂ】混合方法の実施態様を実施するために有用な装置の実施態様を説明する。
【図２】マイクロ流体チャンネルのネットワークと統合される、本発明の実施態様に従う混合方法を実施するために有用な装置を説明する。
【図３Ａ】混合方法の実施態様を実施するために有用な装置の第一チャンバー及び第二チャンバーの追加の実施態様のための設計を示す。
【図３Ｂ】混合方法の実施態様を実施するために有用な装置の第一チャンバー及び第二チャンバーの追加の実施態様のための設計を示す。
【図３Ｃ】混合方法の実施態様を実施するために有用な装置の第一チャンバー及び第二チャンバーの追加の実施態様のための設計を示す。
【図４】混合方法中の２つの段階における装置内の溶液の位置を説明する。
【図５Ａ】ヒートサイクルされた核酸増幅反応と組み合わせる混合方法のタイミングプロトコールを説明する。
【図５Ｂ】ヒートサイクルされた核酸増幅反応と組み合わせる混合方法のタイミングプロトコールを説明する。
【図６】本発明に係るマニフォールドブロックの一つの実施態様を説明した図である。
【図７】本発明に係るマニフォールドブロック一つの実施態様を説明した図である。
【図８】本発明に係るマニフォールドブロック一つの実施態様を説明した図である。
【図９Ａ】本発明に係るマニフォールドブロックの実施態様を説明した図である。
【図９Ｂ】本発明に係るマニフォールドブロックの実施態様を説明した図である。
【図９Ｃ】本発明に係るマニフォールドブロックの実施態様を説明した図である。
【図１０Ａ】混合方法の実施態様を実施するとき、装置内の圧力を制御するために有用なシステムの実施態様を説明する。
【図１０Ｂ】混合方法の実施態様を実施するとき、装置内の圧力を制御するために有用なシステムの実施態様を説明する。
【図１１Ａ】図１０Ａで説明されたシステムの実施態様における圧力設定点に対する、装置内で測定された圧力を示す。
【図１１Ｂ】バルブを作動させた場合、及び作動させなかった場合の、図６Ｂで説明されたシステムの実施態様に用いて装置内で測定された圧力を示す。
【図１２】本発明の実施態様に従う、サンプルを混合しなかった場合（Ａ〜Ｃ）、及びサンプルを混合した場合の（Ｄ〜Ｆ）、実施例１に記載のＰＣＲ反応産物を解析したキャピラリー電気泳動図を示す。
【図１３】混合有りのサンプル、混合なしのサンプルを用い、実施例２に記載された本発明の実施態様に従う装置におけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の装置、方法、及びシステムは、マイクロ流体装置内の溶液を混合するために一般的に有用である。マイクロ流体装置は、多くの異なるタイプの分子状の生物学的又は化学的な反応又は測定を実行するために設計され開発されている。駆動原理の一つは、解析結果を得るためにサンプル上で幾つかの異なる操作を実行できる装置を有することである。上述の通り、装置内で溶液を混合することができると、そのようなマイクロスケールの測定を実行するときに多くの便益が供される。
【００２５】
一つの例は、抗体、蛋白質、又は核酸のような生物分子に係る結合反応に基づくバイオアッセイである。そのような測定には、その検出が直接的であれ間接的であれ、検出され得る結合反応生成物を形成するために、少なくとも二つの分子、場合によりより多くの分子が係わる。測定が増幅反応（例えば、ＰＣＲなど）に係る場合、結合相互反応は測定を通して繰り返し起こる必要がある。元のサンプル中の分析物の濃度又はコピー数を適切に反映する結果を有するという点での正確さ、及び測定反応の動力学は、一般的に、均一に混合された測定溶液中で反応させることに依存する。また、そのような測定は通常、非常に低い濃度の分析物を検出できることを必要とし、従って代表的な溶液の一部（分取した溶液）が検出器に確実に提供されるためには、溶液中での反応生成物の均一な分布が必要とされる。
【００２６】
一つの特定の用途は、以下に述べられる通り、第二チャンバーと流体的に連通状態にある反応チャンバーを少なくとも備えてなるマイクロ流体装置中でのリアルタイムＰＣＲ解析又は定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である。装置において、サンプルは、オリゴヌクレオチドプライマー対並びに、例えば、ポリメラーゼ酵素及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸類（ｄＮＴＰｓ）のようなＰＣＲ反応のための必要な試薬と接触することになる。溶液は反応チャンバー中でヒートサイクルにかけられ、二本鎖ポリヌクレオチドの変性、プライマーのテンプレートへのアニーリング、及びアンプリコンとも呼ばれるポリヌクレオチド生成物へのプライマーの伸長を各々サポートする、温度の繰り返しサイクルにかけられる。マイクロ流体装置内に導入される元のサンプルは、例えば、数百の又はわずか数十のコピー、又はターゲット配列の十未満のコピーを含有する。測定が実行されるときのターゲットの均一な分布は、異なるサンプルの中で正確で、精密に、そして再現性がある測定を達成するために重要であると理解され得る。本発明の種々の実施態様に従えば、（ｉ）試薬と最初に接触するとき、（ｉｉ）測定中の一定の時点又は規則的間隔で、及び／又は（ｉｉｉ）反応又は加温後に、サンプルの混合を行うことが望ましい。
【００２７】
幾つかの実施態様において、装置は、反応生成物（例えば、アンプリコンなど）を検出するべく、電気泳動分離を実行するためのマイクロチャンネルのネットワークのようなマイクロ流体構造をさらに含む。統合された反応チャンバー及び電気泳動分離チャンネルを含む装置の例は、例えば、両者とも、Ｂｏｕｓｓｅ及びＺｈａｎｇによる米国特許第８，３９４，３２４号、並びに米国特許出願第１４／３９５，２３９号（付与前の公表第２０１５／００７５９８３号）に開示されており、その全文が本明細書で参照するために取り込まれているものとする。
【００２８】
このように、主題発明の装置、方法、及びシステムは、増幅反応の実行、そして終点検出又は増幅の過程でのリアルタイム解析の何れかによって、反応で生み出されるアンプリコン（ポリヌクレオチド生成物）の量の測定ができる統合された装置内の反応溶液及び測定溶液の効率的な混合を可能にすることによって、Ｂｏｕｓｓｅら又はＬｉｕらによって開示されたもののような装置、方法、及びシステムも改良する。
【００２９】
本明細書において開示された装置、方法、及びシステムに対する他の関係する使用には、異なるタイプの核酸増幅反応が含まれる。ターゲットはＤＮＡ又はＲＮＡ配列の何れかである。増幅反応は等温プロセスである。同様に、他の使用には、分析物を検出するための蛋白質又は抗体に基づく結合反応が含まれる。結合反応測定の一例は、Ｋ．Ｓｕｍｉｄａらによる米国特許出願第１２／５７８，５７６号「ヒアルロン酸−結合蛋白質を用いるヒアルロン酸の測定方法」で開示されたヒアルロン酸の解析に対するものである。このような結合反応測定は、一般的に、等温条件下で実行される。これらの場合、熱駆動対流輸送による溶液混合への寄与が少ないため、溶液の混合はなおいっそう有益である。
【００３０】
［Ａ．マイクロ流体装置及び設計パラメータ］
本発明に従う装置は、一般的に反応チャンバーと称される第一チャンバー、及びコネクティングチャンネルによって接続されるサイドチャンバーと一般的に称される第二チャンバーを備えてなる。尚、該装置は、第一チャンバー及び第二チャンバーを少なくとも１以上備えるが、それぞれ一つ備えるのが好ましい。用語「反応チャンバー」又は「サイドチャンバー」は議論を助けるためにのみ使用され、そして本明細書で述べられる装置、方法、及びシステムを制限することを意図するものではない。一般的に、溶液は装置内に導入され、そして概念的には、反応チャンバー中の溶液の部分は、何らかの反応が起きる間に亘ってある条件に晒される。本反応は、測定又は解析の目的及びタイプに従って、結合反応、化学反応、酵素反応、増幅反応などの一つ以上である。反応は、装置の他の部分中にある溶液中で起こるため、用語「反応チャンバー」は、発明を限定することを意図するものではなく、又はどこで何らかの反応が起きているか又は起きていないかを断定するものではない。
【００３１】
反応の前、反応中及び／又は反応後に、反応チャンバー中に存在する溶液を混合するためにサイドチャンバーが使用され得る。以下に述べる通り、溶液を混合するために、反応チャンバー中の流体はコネクティングチャンネルを通ってサイドチャンバー内に強制的に押し出され、次いで、サイドチャンバー中の流体はコネクティングチャンネルを通って反応チャンバー内に引き戻される。コネクティングチャンネルから出てそして反応チャンバー内に引き戻される溶液の流れによって反応チャンバー中の溶液の対流混合が引き起こされ、そして反応チャンバー内におそらく渦流を起こして溶液がさらに混合される。
【００３２】
サイドチャンバーは装置の構造の結果としてこの機能を果たす。この機能を支えるサイドチャンバー構造の一つの態様として、操作において、サイドチャンバーは反応チャンバーとのみ、そしてコネクティングチャンネルを介してのみ流体的連通状態にある。反応チャンバーをサイドチャンバーと接続する一つ以上、好ましくは１つのコネクティングチャンネルが供される。幾つかの実施態様において、一つのコネクティングチャンネルが供され、他の実施態様においては、二つ以上のコネクティングチャンネルが供される。幾つかの実施態様において、装置は一つ以上のコネクティングチャンネルを有して製作され、第二チャンバーへの又はそれからの流体的連通を供する。他の実施態様において、第二チャンバーは、チャンネル、ポートなどのような他の流体的連通経路を有して製作されるが、装置は、操作において、第二チャンバーのみが第一チャンバーと流体的連通状態にあるように構成され得る。
【００３３】
溶液が装置内に最初に導入されるとき、溶液は反応チャンバーを充填するが、ガス（例えば、空気）がサイドチャンバー中にトラップされる故に、ガス圧によって、溶液がサイドチャンバーを充填することが妨げられる。混合工程を実行しないとき、サイドチャンバー中にトラップされた空気圧は、反応チャンバー中の溶液がサイドチャンバー内を自由に動かないように維持することに役立つ。混合工程を実行するために、最初に、ロードウェル上の空域に圧力をかけ、反応チャンバー中の溶液を、トラップされた空気の圧力に対抗してサイドチャンバー内に強制的に動かし、そうすることによってトラップされた空気が圧縮される。次いで、ロードウェルの上方の空域中の圧力を減じ、ここでサイドチャンバー中にトラップされて圧縮された空気が膨張して、コネクティングチャンネルを介して反応チャンバー内に溶液が押し出される。
【００３４】
図１Ａは、本発明に従うマイクロ流体装置１００の実施態様を説明する。本装置は、第一チャンバー１１０、第一チャンバー１１０から第一ロードウェル１１２に繋がる第一ロードチャンネル１１１；第一チャンバー１１０から第二ロードウェル１１４に繋がる第二ロードチャンネル１１３；第二チャンバー１１６；及び第一チャンバー１１０から第二チャンバー１１６に繋がるコネクティングチャンネル１１５、を備えてなる。
【００３５】
図１Ａで示された通り、幾つかの実施態様におけるロードチャンネルはほぼ等しい寸法を有するように設計される。例えば、ウェルから第一チャンバーまでのチャンネル長、チャンネル幅、及びチャンネル深さは、第一及び第二ロードチャンネルに対してほぼ等しい。しかしながら、一つの好まれる設計上の配慮は、ロードウェルと第一チャンバーの間のロードチャンネルの容積である。このように、第一及び第二ロードチャンネルのチャンネル容積がほぼ等しく、例えば、約３％を超えてまで異ならない場合、各ロードチャンネルの線形寸法（長さ、幅、深さ）の一つ以上が互いに異なっていても、ロードチャンネルは設計目的に対して等しいと考えられ得る。
【００３６】
図１Ｂは、本発明に従うマイクロ流体装置１００の別の実施態様を示す。本装置は、第一チャンバー１１０、第一チャンバー１１０から第一ロードウェル１１２に繋がる第一ロードチャンネル１１１’；第一チャンバー１１０から第二ロードウェル１１４に繋がる第二ロードチャンネル１１３’；第二チャンバー１１６；及び第一チャンバー１１０から第二チャンバー１１６に繋がるコネクティングチャンネル１１５、を備えてなる。図１Ｂで説明された通り、幾つかの実施態様におけるロードチャンネルは等しくない寸法を用いて設計される。この図においては、第二ロードチャンネルと長さが異なる第一ロードチャンネルが例示され、その結果、チャンネル容積が異なる。他のチャンネル寸法（幅及び／又は深さ）もロードチャンネルの間で異なっていてもよい。
【００３７】
第一及び第二ロードチャンネル容積がほぼ等しいか又は異なるかは、以下に論議されるように、第二チャンバーの寸法の設計及び混合方法の操作パラメータに影響を及ぼす。
第一チャンバー１１０は、約１μＬ〜約１ｍＬの容積を有するように設計される。幾つかの実施態様において、第一チャンバー１１０は、約２μＬ〜約１００μＬの容積を有するように設計される。第一チャンバー１１０の容積は、その中で実行される反応のタイプに従い、解析、検出できるサイズであり、又はその他の目的に使用されるのに十分な生成物の量が反応によって生成されるようなサイズであり得る。例えば、反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅反応である場合、装置中で実行されるＰＣＲアッセイの望まれる感度が、反応チャンバーの容積の設定因子となる。１０個のターゲットコピーが信頼できるように増幅され得る場合、そして望まれる感度がμＬ当たり１コピーである場合、第一チャンバー容積は少なくとも約１０μＬであるべきである。約１、２、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、又は１０００μＬの容積を有する第一チャンバー１１０が考えられる。
【００３８】
第一チャンバー１１０は、サポート構造及び／又は流体流制御構造を有するように設計される。サポート構造はしばしばピラー又はポストと称され、そしてチャンバーを囲んでチャンバー内にフィルム又は積層体が垂れ下がるのを防ぐようそれをサポートするために役立つ。これらは装置中の任意の構造であるが、装置を構築するために使用される材料で、垂れ下がりが起きるような十分に大きな領域をチャンバーが占める実施態様においては、垂れ下がりを防ぐためのサポート構造を有することが好ましい。幾つかの実施態様において、ピラー又はポストは、結合反応のための大きな表面積を供するような囲まれた表面をサポートすることに代わる機能又は追加される他の機能を有してもよい。流体流制御構造は、泡の形成を防ぐ、チャンバーの全容積の充填を促進する堰、溝などを含むものである。
【００３９】
第二チャンバー１１６は、第一チャンバー１１０の約０．１倍〜約１．５倍容積を有するように設計される。幾つかの実施態様において、第二チャンバー１１６は、第一チャンバー１１０の約０．２倍〜約０．９５倍容積を有する。第二チャンバー１１６の容積は、第一チャンバー１１０から強制的に押し込まれる溶液の量（容積）、及び溶液が第一チャンバー１１０から強制的に押し込まれるとき、トラップされた空気がそこまで圧縮される容積を収容するようなサイズにされる。溶液が第二チャンバー１１６を充填する程度、及びトラップされた空気が圧縮される程度は、装置の外部から溶液にかけられる力に依存する。外力が大きいほど、より多くの溶液が第二チャンバー１１６を充填し、そしてトラップされた空気が圧縮される容積がより小さくなる。第二チャンバー１１６の容積に対する第二チャンバー１１６を充填する溶液の比率は、「第二チャンバー充填率」と呼ばれる。例えば、第二チャンバー充填率が０．５とは、混合方法を実行する際に、溶液が第一チャンバー１１０から強制的に押し込まれるとき、第二チャンバー１１６の容積の半分が溶液によって占められることを意味する。幾つかの実施態様において、第二チャンバー充填率は約０．２〜約０．９９である。幾つかの好ましい実施態様において、第二チャンバー充填率は約０．５〜約０．７である。
【００４０】
コネクティングチャンネル１１５は、第一チャンバー１１０と第二チャンバー１１６の間で流体的連通を供する、比較的に小さな断面のチャンネルである。一般的に、コネクティングチャンネル１１５の断面は、ロードチャンネルよりも高い水力学的流れ抵抗を有するようなサイズであり、そしてキャピラリー電気泳動チャンネルネットワークを備えてなる装置１００の実施態様において、断面は、キャピラリー電気泳動チャンネルよりも低い水力学的流れ抵抗を有するようなサイズである。このように、コネクティングチャンネル１１５の断面は、ロードチャンネル及びキャピラリー電気泳動チャンネルと比較してサイズが中間である。
【００４１】
コネクティングチャンネル１１５の断面は一般的に、約０．１２ｍｍ2より小さい。幾つかの実施態様において、断面は約０．０６ｍｍ2より小さい。理論に固執するものではないが、断面がより大きくなるにつれ、混合方法におけるコネクティングチャンネル１１５を通る溶液の流速は低下し、そして混合効率がより悪くなる。また、断面積が大きくなると、第一チャンバーから第二チャンバーへ強制的に溶液を押し込む時に泡が発生しやすくなる。コネクティングチャンネル１１５の断面は一般的に、約０．００１ｍｍ2より大きい。幾つかの実施態様において、断面は約０．００２ｍｍ2より大きい。理論に固執するものではないが、断面がより小さくなるにつれ、混合方法においてコネクティングチャンネル１１５を出ていく溶液の流れの流速は低下し、そして混合効率がより悪くなる。
【００４２】
適切である断面から適切でない断面への明確な線引きはないが（それがあまりにも小さいか又はあまりにも大きいかの何れかの理由のため）、効率は以下のような多くの因子に依存する：溶液粘度、第一チャンバー１１０のサイズ及び形状、コネクティングチャンネル１１５のアスペクト比、並びに第一チャンバー１１０に対するコネクティングチャンネル１１５の入口の角度（およびそのサイズ及び形状）、第一チャンバー１１０内の如何なるピラーの場所及び形状など。コネクティングチャンネル１１５の断面が特定の用途に対して適切であるか否かは、以下にさらに述べられるように、装置を用いて達成された結果を見て当業者は決定できる。
【００４３】
コネクティングチャンネル１１５のアスペクト比（幅に対する深さの比）は、幾つかの実施態様において、約０．２５〜約４である。幾つかの実施態様において、その比は約０．５〜約２である。コネクティングチャンネルの寸法、従って断面積及びアスペクト比は、コネクティングチャンネルの長さに亘って変わる。
コネクティングチャンネルに関して他に設計上考慮すべき点として、第一チャンバーに対するその場所及び角度が含まれる。一般的に、チャンネルから出る溶液が、チャンバー壁又はチャンバー内の他の構造体にぶつかる前に、長い経路を横切って向かう第一チャンバーのレイアウトに対する入口位置及び入口角度を、コネクティングチャンネルは有する。経路は第一チャンバー内で最も長くて妨害されない経路である必要ではないが、第一チャンバーを通る経路が最短であることは、短い混合手順中、チャンバーを通した完全な混合を供するために最も好ましくない。幾つかの実施態様において、設計によって示される経路は十分長く、本発明に従う方法を実行するときに得られる混合効果は、意図された用途に対して十分であり、それは、例えば、この明細書で述べられたように経験的に求められた通りである。
【００４４】
第二チャンバー充填率は設計パラメータであり、それは第二チャンバー１１６に出入りして動くことを望む溶液の量、及び第一チャンバー１１０に入る際にコネクティングチャンネル１１５を出る溶液の望まれる出口速度を考慮することによって設定され得る。出口速度は、コネクティングチャンネル１１５の寸法及び溶液の粘度のような多くの因子に依存するが、一般的原理として、装置の外部から溶液にかけられる力が早い速度で除かれるとして、第二チャンバー充填率が増すにつれて、第二チャンバー１１６中にトラップされる空気がより大きく圧縮される故に、出口速度はより速くなる。しかしながら、第二チャンバー充填率は、他の因子、例えば、高い内圧下での装置１００の構造的統合性を維持する能力、又は利用可能な圧力源の強さによって制限される。
【００４５】
第二チャンバー１１６に出入りして動く溶液の量、及びその出口速度によって溶液の十分な混合が供されるか否かは経験的に決定され得る。例えば、染料又は対象物（例えば、ビーズ、ナノ粒子など）が溶液内に導入することができ、そしてそれらの動きは、異なる装置構造及び／又は操作圧力に対する混合プロセスの進展を決定するために観察され得る。当業者はマイクロ流体装置内の流体流を可視化する方法に精通している。又は、数セットの測定若しくは分析は、異なる装置構造及び／又は操作圧力を用いて実行することができ、そして均一性の証拠を示す解析結果が、混合方法の成果として得られる。例えば、実施例１及び２以下で述べる実験は、より均一な溶液を達成し、より小さな変動係数を有する結果を得るという混合の成果を示す。
【００４６】
第二チャンバー１１６は、溶液が第二チャンバーを出入りして円滑に動くよう、そして本来コネクティングチャンネル１１５を介して排出されるべき溶液が第二チャンバー内に残る可能性を最小化するように形成される。従って、第二チャンバー１１６は、コネクティングチャンネル１１５が第二チャンバー１１６内で広がるように形づけられる。第二チャンバー１１６を斜視的に見ると、溶液がコネクティングチャンネル１１５内に向けられるべく、それが漏斗の如く作用するように、チャンバーは狭まり又はテーパ状になる。但し、第二チャンバー１１６が漏斗の形状を有すること、又は側部がコネクティングチャンネル１１５に向かって対称的にテーパになることは必須ではない。むしろ、好ましい設計基準は、そのような「流体を向かわす形状」を有する第二チャンバー１１６の結果として、混合方法の操作中に、第二チャンバーに入る溶液が、第二チャンバーから実質的に排出されることである。本発明は、入る溶液の１００％が排出されることを要求しない。しかし、第二チャンバー１１６の「流体を向かわす形状」設計の結果として、トラップされ圧縮された空気の幾らかが、実質的にごく少量の溶液とコネクティングチャンネル１１５の入口の間を動き得るので、実質的にごく少量の溶液が第二チャンバー中に残ることはない。一回の混合サイクルで排出される溶液の量は、幾つかの場合、かけられた力の間の違い（圧力の違い）故に、混合サイクルの初めに無理やり押し込まれた溶液の量と同じではない。その結果、幾らかの溶液が第二チャンバー１１６中に残る場合でも、混合方法において、第二チャンバーに入る溶液が第二チャンバーから実質的に排出されるという設計基準を損なうものではない。第二チャンバー１１６の形状はコネクティングチャンネルよりは広いが、０．１〜１ｍｍ2の断面積を有するチューブ状（例えば図２や図３等）であることが好ましい。
【００４７】
第二チャンバー１１６の設計の第二の態様においては、第二チャンバー充填率に基づいて、トラップされ圧縮された空気と溶液とが接する場所（空気／液体インターフェイス）と期待される第二チャンバー部分は、混合方法において溶液で満たされる第二チャンバー部分の特徴的断面積よりも小さい断面積を有する。特徴的断面積は、溶液で満たされる第二チャンバーのその部分において最大、平均、又は中間の断面積であり、通常、最大の断面積である。尚、当該特徴的断面積は、通常０．１〜１ｍｍ2、好ましくは０．１〜０．５ｍｍ2である。通常、このようの実施態様において、空気と溶液とが接する場所として期待される部分の断面積は、溶液で満たされる第二チャンバーの部分の特徴的断面積の約８０％、又は約６０％、又は約４０％、又は約２０％である。断面積は、第二チャンバーのその部分の幅及び／又は深さを変えることによって調節される。本発明の幾つかのアプリケーションで、空気／液体インターフェイスの領域を最小化するために、そしてそれによって気相と液相の間の温度差の影響、及び／又は空気／液体インターフェイスの存在によって引き起こされる他の影響を最小化するために、そのような実施態様が望ましい。さらに、これらの実施態様において、混合方法中にトラップされた空気が圧縮される第二チャンバー１１６の遠位端は、空気／液体インターフェイスが期待される部分と同じくより小さな断面積を維持し、より小さくなり及び／又はより大きくなり、そしてこれらの変化は、第二チャンバーの幅及び／又は深さを変えることによって達成される。
【００４８】
第二チャンバーが流体を向かわせる形状を有し、そして種々の実施態様が上記設計基準を満たす限り、第二チャンバー１１６の全体的形状は、装置設計及び混合方法の操作において重要なものではない。第二チャンバー１１６は、（例えば、四角形又は矩形の形状を有する）チャンバー状又は（例えば、ロードチャンネルのそれと類似の幅を有する）チャンネル状、又はその二つの幾つかの組み合わせである。第二チャンバー１１６の全体的形状は、一般的に、全体としてのマイクロ流体装置のレイアウト、及びマイクロ流体装置内に第二チャンバーを置くために利用できる領域に依存する。幾つかの実施態様において、第二チャンバー１１６は、特に、溶液が二つのチャンバー中に存在しその間を動くときに溶液の温度を制御することが望まれる場合、第一チャンバー１１０及び第二チャンバー１１６の組合わされた面積を最小化するように設計される。温度制御が望まれる場合、二つのチャンバーによって占められる面積を最小化することによって、温度制御された領域に対して必要な領域が最小化され、そしてこれは温度制御の精度及び／又は正確さ及び／又は付随する装備のコストに対して望ましい。
【００４９】
第二チャンバー１１６を出入りさせて動かしたいと望む溶液の量によって、第一及び第二ロードチャンネル（１１１、１１３；又は１１１’、１１３’）および第一及び第二ロードウェル（１１２、１１４）の構造も決定づけられる。操作の好ましい実施態様において、溶液が混合方法中に第一チャンバー１１０から第二チャンバー１１６内に無理やり押し込まれるときでさえ、第一チャンバー１１０は溶液で満たされたまま留まる。第一チャンバー１１０を溶液で満たされた状態に維持するために、ロードチャンネル１１１及び１１３、又は１１１’及び１１３’そして必要に応じてロードウェル１１２及び１１４において溶液の適切な容積が利用可能でなければならない。
【００５０】
第一及び第二ロードチャンネル、そして必要に応じて第一及び第二ロードウェルが、第一チャンバー１１０に供給する必要がある溶液の量は、第一チャンバー１１０から第二チャンバー１１６に動く溶液の量に等しい。その容積は、（第二チャンバー充填率）×（第二チャンバー容積）として表され得る。これら二つの値を乗じると、第二チャンバー１１６を強制的に占めさせられる溶液の量が得られ、そして述べられた通り、装置の好ましい実施態様において、ローディング量は、ロードチャンネル及びロードウェルから第一チャンバー１１０へと供給されるべく利用可能な溶液の量のような多さである。
通常、第一及び第二ロードチャンネル１１１及び１１３、又は１１１’及び１１３’は第一チャンバー１１０と同じ深さを有するが、深さはロードチャンネルの長さに沿って変わる。ロードチャンネルは、通常、約５０μｍ〜約２０００μｍの、又は約１００μｍ〜１５００μｍの幅を有し、そして幅はロードチャンネルの長さに沿って変わる。ロードチャンネルの長さは、一般的に、ロードウェルのサイズ及び空間取り、及びこれらの装備と第一及び／又は第二チャンバーの間の相対的位置のような装置のレイアウトを考慮することによって決定される。
【００５１】
上述の通り、幾つかの実施態様において、第一ロードチャンネル１１１及び第二ロードチャンネル１１３はほぼ同じ容積を有する。別の実施態様において、第一ロードチャンネル１１１’及び第二ロードチャンネル１１３’は、通常、異なる長さを有する故に、異なる容積を有する。
【００５２】
一般的に、ロードチャンネルは、特に水溶液に対して低い流体動力学的流れ抵抗を示すよう、比較的大きな断面積を有する。このように、操作において、ロードウェルに添加される溶液は、圧力をかけられることなくロードチャンネルを通して第一チャンバー内に流れる傾向にある。しかしながら、幾つかの実施態様において、ロードウェルからロードチャンネルを通して第一チャンバー内に溶液が確実に動くようにするために、小さい圧力、例えば、約７ｋＰａ未満がかけられる。
【００５３】
幾つかの実施態様において、第一及び第二ロードチャンネルは、約０．０５μＬ〜約５０μＬの容積を有する。他の実施態様において、第一及び第二ロードチャンネルは、約０．１μＬ〜約１０μＬの容積を有し、そして他の実施態様においては約１μＬ〜約５μＬの容積を有する。
【００５４】
第一ロードウェル１１２及び第二ロードウェル１１４は、溶液をマイクロ流体装置１００内に導入するためのアクセスポートとして供される。ロードウェルは各々、第一ロードチャンネル１１１、第一チャンバー１１０、第二ロードチャンネル１１３、並びに第一及び第二ロードウェル１１２及び１１４の両者の少なくとも一部を満たすのに足りるだけの十分な溶液の量を保持するために十分大きな容積を有すべきである。好ましい実施態様において、利便性のために、ロードウェル１１２及び１１４は、同じサイズ及び構造を有するように設計されるがこれは必須条件ではない。幾つかの実施態様において、第一及び第二ロードウェルは、約１μＬ〜約１０００μＬの容積を有する。他の実施態様において、第一及び第二ロードウェルは、約５μＬ〜約１００μＬの容積を有する。
【００５５】
図１Ｂで説明されたように、第一ロードウェルと第一ロードチャンネルの組み合わせ容積が、第二ロードウェルと第二ロードチャンネルの組み合わせ容積と異なる場合は、混合方法において第一チャンバー１１０に供給するために利用できる溶液の量は、二つの組み合わせ容積のより少ない方によって制限される。このように、この状況において装置１００に対する設計基準を考慮するとき、（第二チャンバー充填率）×（第二チャンバー容積）は、（ｉ）第一ロードチャンネルと第一ロードウェルの容積和及び（ｉｉ）第二ロードチャンネルと第二ロードウェルの容積和のより小さい方の２倍未満である。
各ロードウェル及びロードチャンネル対の組み合わせ容積がほぼ等しい場合、装置１００の設計基準は、（第二チャンバー充填率）×（第二チャンバー容積）が、ｉ）第一ロードチャンネルと第一ロードウェルの容積及び（ｉｉ）第二ロードチャンネルと第二ロードウェルの容積の総和未満であるとして表される。これらの実施態様において、ロードウェル及びロードチャンネル対の各々は、溶液の同等容積を第一チャンバー１１０に供することができ、このように装置の設計は、これらのマイクロ流体エレメントの容積の総和に関して表される。
【００５６】
本発明に従う装置は他のマイクロ流体エレメントをさらに備えてなる。特に、幾つかの実施態様において、装置はその中の化学的又は生物学的成分を検出するために有用なチャンネル及び／又はチャンバーをさらに備えてなる。例えば、幾つかの実施態様において、チャンネルは第一のチャンバー１１０から外に繋がる。特定の例は、Ｂｏｕｓｓｅらの米国特許第８，３９４、３２４号に開示された装置中の反応チャンバーから抜き出される反応成分のキャピラリー電気泳動解析のためのマイクロ流体ネットワークを含む。好ましくは、成分は第一チャンバーからチャンネル内に、次いで電気泳動輸送によってチャンネルに沿って動かされる。幾つかの実施態様において、チャンネルは、ＵＶ、可視、及び／又は赤外線の当該波長が光源から通過して入り検出器から出ることを装置材料が可能にする光学的検出に適する領域のような、成分を検出するのに適する領域を有するように構成される。幾つかの実施態様において、チャンネルは、チャンバーに繋がり、そこで第一チャンバー１１０から輸送されて入ってきた成分の更なる処理又は反応が実行される。他の実施態様において、チャンネルは、出口ポートに繋がり、そこで更なる使用又は解析のために溶液成分がマイクロ流体装置１００の外側に除去される。
【００５７】
さらに他の実施態様において、第一チャンバー１１０から外側に繋がるチャンネルは、第一チャンバーから、第一チャンバーから除去された連続分取又はサンプルを迅速解析するために最適化されたキャピラリーネットワークへと成分を送達する。例示的用途は、リアルタイムｑＰＣＲ解析に対するものである。そのようなキャピラリー電気泳動ネットワークは、その全文が本明細書に参照することにより取り込まれているものとする、Ｌｉｕらによる米国特許出願第１４／３９５、２３９号（付与前の公表第２０１５／００７５９８３号）に開示されている。
【００５８】
図２は、本発明に従う、第一チャンバー１１０、第一チャンバー１１０から第一ロードウェル１１２に繋がる第一ロードチャンネル１１１；第一チャンバー１１０から第二ロードウェル１１４に繋がる第二ロードチャンネル１１３；第二チャンバー１１６；及び第一チャンバー１１０から第二チャンバー１１６に繋がるコネクティングチャンネル１１５、を備えてなる装置の実施態様を説明する。第二チャンバー１１６は、コネクティングチャンネル１１５のより近くに位置する第二チャンバー１１６の部分よりもより小さな断面積を有するチャンバーセクション１１７をさらに含む。装置は、第一チャンバー１１０、ロードチャンネル１１１及び１１３、ロードウェル１１２及び１１４、並びに第二チャンバー１１６の相対的容積、そして、上で論じられたように、溶液が第一チャンバー１１０から第二チャンバー１１６に強制的に押し込まれるときに、第二チャンバー充填率が与えられ、そしてトラップされ圧縮された空気と溶液の間の空気／液体の接する場所が、第二チャンバー１１６のチャンバーセクション１１７内となるように設計される。第一チャンバーは、フィルム又は積層体をサポートするために役立つ二つのサポート構造（例えば、ピラー、ポストなど）をさらに含む。そのようなピラー又はポストが第一チャンバー中に存在する場合、装置は一般的に、流体がピラー又はポストに向かうことを妨げる一つ又は複数のコネクティングチャンネルを有するように設計される。このように、コネクティングチャンネルから排出された溶液のメインの流れが、チャンネルを出る際にピラー又はポストと直接ぶつからないように、コネクティングチャンネルの位置及び角度を設計することが一般的に好ましいが、これは必須事項ではない。キャピラリー電気泳動チャンネルネットワーク、ウェル、電極、検出領域などを備えてなる図２で説明されたマイクロ流体装置エレメント１２０の残りの部品は、Ｌｉｕらによる米国特許出願第１４／３９５，２３９号で述べられている。
【００５９】
図２はまた、第一チャンバー１１０の容積が（アームを含んで）約１７μＬであり、そして第二チャンバー１１６が約６．２μＬであり、このようにして第二チャンバーに対する第一チャンバーの比が２．７である、混合方法をその中で実行するための装置の実施態様を説明する。図３Ａ〜３Ｃは、第一及び第二チャンバーの異なる相対的サイズを有する他の実施態様を説明する。図３Ａでは、第一チャンバー１１０の容積が約２１μＬであり、そして第二チャンバー１１６が約６μＬであり、このようにして第二チャンバーに対する第一チャンバーの比が３．５である。図３Ｂでは、第一チャンバー１１０の容積が約１８．９μＬであり、そして第二チャンバー１１６が約１０μＬであり、このようにして第二チャンバーに対する第一チャンバーの比が１．９である。図３Ｃでは、第一チャンバー１１０の容積が約１５．５μＬであり、そして第二チャンバー１１６が約１４μＬであり、このようにして第二チャンバーに対する第一チャンバーの比が１．１である。
【００６０】
本発明に従うマイクロ流体装置の製作は、一般的に、異なる寸法、特に異なる深さを有する流体的装備（例えば、チャンネル、チャンバー）を有する装置を準備することを含む。例えば、ロードチャンネル１１１及び１１３、並びに第一チャンバー１１０は、他の寸法（幅及び長さ）が過度に大きいものであることを必要とせずに、必要なサンプル容積を収容するために、通常、例えば、約５０〜５００μｍの深さをしている。他方、キャピラリー電気泳動チャンネルネットワークは通常、より浅い、例えば、２０〜６０μｍの深さである小さな断面を有するチャンネルを備えてなる。解析チャンネルネットワークの断面及び全体容積を小さくすることによって、反応溶液の小量のみが解析のために除去されればよくなり、そしてチャンネルネットワーク内に入るための大きな水力学的流れ抵抗がバルブとして役立つ。
【００６１】
マイクロ流体装置は、当業者に公知の好適な材料からも作られ得る。Ｂｏｕｓｓｅらの米国特許第８、３９４、３２４号で開示された通り、そのような装置を準備するための方法は、当業技術において公知である。ポリメタクリル酸メチル及び環状オレフィンポリマーは、深さを変えることを含む異なった寸法のチャンネルを用意するのに適する。材料を接合して装置を製造することを含む、微細加工技術との適合性に対して、材料が選択される。例えば、装置は、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）又は環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエステル（ＰＥ）及びその他適切なポリマー又はエラストマーなどのポリマー材料、並びにガラス、石英及び半導体材料などから形成され得る。
【００６２】
環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）は、例えば、ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン（ノルボルネン）又は、１，２，３，４，４ａ，５，８，８ａ−オクタヒドロ−１，４：５，８−ジメタノナフタレン（テトラシクロドデセン）のような環状モノマーとエテンとの連鎖共重合により製造される。ＣＯＣの例としては、Ｔｉｃｏｎａ社のＴＯＰＡＳ（登録商標）及び三井化学社のＡＰＥＬ（登録商標）が挙げられる。ＣＯＣは、また、種々の環状モノマーの開環メタセシス重合とそれに続く水素化により準備される。そのようなポリマーの例としては、日本合成ゴム社のＡＲＴＯＮ及びゼオン化成社のＺｅｏｎｅｘ（登録商標）及びＺｅｏｎｏｒ（登録商標）が挙げられる。単一タイプの環状モノマーの重合により、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）が得られる。三菱化学社のルピロン（登録商標）ポリカーボネートのようなポリカーボネート、及びＥｖｏｎｉｋ  ＣＹＲＯ社のアクリレートのＡｃｒｙｌｉｔｅ（登録商標）シリーズ（例えば、Ｓ１０、Ｌ４０、Ｍ３０）のようなＰＭＭＡは、マイクロ流体装置の製作のために適するプラスチックである。
【００６３】
一般的に、そのようなポリマーは多くのグレードで入手できる。用途によっては、ＦＤＡ認可されたグレードが適切であるが、他のグレードタイプも十分である。マイクロ流体装置用の基板の選択に関する他の配慮には、製作の容易さ及び再現性、並びに光学測定における低いバックグラウンドが挙げられる。これらのパラメータは当業者によって容易に最適化される。
【００６４】
通常、チャンバー、チャンネル及びウェルのネットワークを備えてなるマイクロ流体装置は、装置を形成するために一緒に接合される二つ以上の基板層から製作される。通常、微細加工技術と称されるそのような装置の製作技術は当業技術において周知である。装置準備方法の一つの例において、マイクロ流体チャンバー及びチャンネル装備は、第一の層を備えてなる基板の第一の表面で製作され、そして第一の層の第一の表面に第二の層が接合され、そこで装備が微細加工され、そうすることによって装備が取り囲まれる。多層化装置は当業技術において準備され得てそして周知である。
【００６５】
一つの実施態様において、装置は、その中に定義されるマイクロ流体的ネットワークを有する基板の第一の表面（つまり、堀、突起、溝、孔などを供する表面）に、ポリマーの薄いフィルムを接合することによって準備され、そうすることによってネットワークを囲む。薄いフィルムは約２０μｍ〜約５００μｍ、又は約５０μｍ〜約２００μｍの厚みを有する。薄いフィルムは、厚みの均一性、入手性、接合のしやすさ、透明性、光学的性質、熱的性質、化学的性質及び他の物性に従って選択される。接合技術は、当業技術において公知であるラミネーション、超音波溶接、ＩＲ溶接などを含む。薄いフィルム材料はそれに接合される基板と同じか又は異なり得る。仕上げられた装置が、本明細書で記述された方法の実行において使用される操作圧力に耐え得る限り、如何なる接合技術も装置を製作するために使用される。
【００６６】
［Ｂ．操作の方法］
本発明に従う方法は、マイクロ流体装置内で溶液を混合するために有用である。本方法は、本発明に従う装置中の第一チャンバー内の溶液の混合に関する。幾つかの実施態様において、本発明の方法は、その第一チャンバー中の溶液の渦混合を引き起こす。
【００６７】
本方法の実施態様における溶液の動きが、図４に説明されている。図１Ａに関して述べられるように、構造エレメント１００、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、及び１１６を備えてなる装置１００が供される。使用において、溶液はロードウェル１１２又は１１４を介して装置内に導入される。幾つかの装置実施態様及び／又は幾つかのシステム実施態様において、ロードウェル１１２及び１１４は互換的に使用され得るが、幾つかの実施態様において、装置又はシステムは、装置内に溶液を導入するために一つの特定のウェルを使用するように設計される。例えば、第一チャンバー１１０は、泡の形成を抑制するか、又はローディング中にチャンバーの全体容積の充填を促進する、堰又は溝のような構造エレメントを備えてなる。しばしばそのような構造は、溶液が特定の方向から導入されるとき、最もよく働く。又は、例えば、装置１００は、システムにおける一つの特定のウェル中に溶液が導入されるよう、特定の向きにおいてマイクロ流体装置に合体される流体管理装置を含んだ、自動化又は半自動化されたシステムでの使用に対して設計される。
【００６８】
例えば、溶液がロードウェル１１２（例えば「第一ロードウェル」）内に導入されると仮定すると、溶液はロードチャンネル１１１（例えば「第一ロードチャンネル」）、第一チャンバー１１０及びロードチャンネル１１３（例えば「第二ロードチャンネル」）を通して流しそれを充填する。溶液はロードウェル１１４（例えば「第二ロードウェル」）にも入る。最終的に、溶液は流体静力学的平衡に到達し、そしてロードウェル１１２及び１１４を同様の高さまで充填する。導入される溶液の量は、混合方法の実施において、溶液が第二チャンバー１１６内に押し込まれるとき、少なくとも幾らかの溶液がロードチャンネル１１１及び１１３中に残るのに十分な量である。また、溶液を第一ロードチャンネル１１１、第一チャンバー１１０、及びロードチャンネル１１３を通して流しそれらを充填するとき、幾らかの溶液が通常、コネクティングチャンネル１１５に入る。溶液がコネクティングチャンネル１１５内に流れる程度は、チャンネルの断面及び長さ、溶液がロードウェル１１２及び１１４、ロードチャンネル１１１及び１１３、並びに第一チャンバー１１０を充填するために使用される力、及び第二チャンバー１１６の容積に依存する。本方法の好ましい実施態様において、溶液添加プロセス中に、溶液は第二チャンバー１１６には入らないが、幾つかの実施態様において、溶液は第二チャンバー１１６に入る。第二チャンバー１１６内に溶液が入るのを許すことは、一般的に避けられる。なぜなら、それが混合方法において第二チャンバー１１６内の圧縮範囲を減じるからである。第二チャンバー１１６内に溶液が入ることを抑制するために、例えば、長さを増し又はチャンネル断面が減じることによって、コネクティングチャンネル１１５の寸法が変えられ得る。疎水性材料でチャンネル表面を被覆することによるなど、チャンネルを通る溶液の前進に抵抗するために、コネクティングチャンネルの表面の性質を適合するような他の手段も適用され得る。
【００６９】
第一ロードウェルを介して、第一ロードウェル、第一ロードチャンネル、第一チャンバー、第二ロードチャンネル、及び第二ロードウェル内に溶液を添加することは、例えば、キャピラリー作用、重力下での水力学的流れによって、又は溶液に圧力をかけることによって達成され得る。圧力には、第二ロードウェルを通して溶液を押すために第一ロードウェルにかけられる正圧、第二ロードウェルを通して溶液を引くために第二ロードウェルにかけられる負圧、又は別々に及び／又は同時にかけられる正圧と負圧の組合せがある。また、圧力は、第一及び第二ロードウェルの両方において同時にかけられる正圧であり、そこで溶液は、かけられた圧力下で水力学的平衡になる。第一ロードウェルの容積は、チャンバー及び二つのロードチャンネルの少なくとも一部を充填するのに十分な溶液の容積を収容するために十分大きい。好ましい実施態様において、第一ロードウェルの容積は、第一チャンバー、第一及び第二ロードチャンネル、並びに第一及び第二ロードウェルの少なくとも一部を充填するのに十分な溶液の容積を収容するために十分大きい。
【００７０】
一般的に、多くの実施態様において、水溶液は第一チャンバーを充填することができ、そして重力下で水力学的流れによって第二ロードウェルに到達することができる。添加工程において圧力がかけられるとき、正圧は幾つかの実施態様において約３５ｋＰａを超えず、そして通常、約７ｋＰａを超えない。さらに、溶液が装置内で適切に位置し、そして、例えば、装置から無理やり押し出されない十分に短い時間だけ圧力がかけられる。このように、一般的に、圧力をかけることは、溶液の容積と粘度、装置の幾何形状、及び使用される圧力制御システムに基づいて、事前に決定されたプロトコールに従って実行される。
【００７１】
図４の上方部分において、第一のウェル１１２を介して溶液を添加することによって、第一ロードウェル（２１２）、第一ロードチャンネル（２１１）、第一チャンバー（２１０）、第二ロードチャンネル（２１３）、及び第二ロードウェル（２１４）中に溶液がもたらされる。上で論じられた通り、添加工程の結果として、幾らかの溶液がコネクティングチャンネル（２１５）中に存在することになる。また、添加工程の結果として、空気（２００）が第二チャンバー内にトラップされることになる。好ましくは、第一ロードウェル（２１２）及び第二ロードウェル（２１４）中の溶液は、各ロードウェル１１２及び１１４の全容積を満たしはしない。
【００７２】
幾つかの実施態様において、溶液が装置に添加された後、第一ロードウェル及び第二ロードウェル中の溶液の頂部上に水不混和性流体が添加される。好ましくは、同じ容積の水不混和性流体が各ウェルに添加される。各ウェルに水不混和性流体が添加されるとき、好ましい実施態様において、各ロードウェル１１２及び１１４の全容積が満たされはしない。
【００７３】
幾つかの実施態様において、水不混和性流体は、疎水性ポリマーである。ポリマーは無機ポリマーであり、そして好ましい実施態様は、シリコーンオイル（シリコーン流体としても知られている）である。幾つかの実施態様において、ポリマーは、鉱物油、パラフィン油、Ｖａｐｏｒ  Ｌｏｃｋ（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州）、ベビーオイル、またはホワイト油などの有機ポリマーである。ポリマーは、天然、合成、または半合成の生成物である。水不混和性流体は、また、好ましくは、方法、装置材料、及び装置に加えられる溶液の内容物と化学的に及び物理的に相性が良い。当業者は、水不混和性流体のような試薬とマイクロ流体装置、並びにその中で実施される測定、反応及び分析の相性を確認するための必要性及び方法に精通している。
【００７４】
次に、第一及び第二ロードウェルの上方の空域におけるガス圧が、初期圧力から、例えば、Ｐhighへと上げられる。初期圧力は、大気圧であってもよく、又はそれは大気圧を超える圧力であってもよい。図４で説明された通り、第一及び第二ロードウェルにおいて圧力を上げることによって、溶液位置が、図の上方部分において示されるところから、下方部分において示されるところに変わる。説明された通り、装置中の溶液は再分布され、溶液（２１２及び２１４）はロードウェルから出ていき、そして溶液（２１６）は第二チャンバー１１６に入る。また、第二チャンバー１１６中にトラップされた空気（２００）は圧縮されそして占める容積は小さくなる。
【００７５】
引き続いて、第一及び第二ロードウェルの上方の空域中のガス圧がＰhighからより低い圧力、例えば、Ｐlowへと下げられる。ロードウェルの上方の圧力を下げることにより、第二チャンバー１１６中の圧縮された空気（２００）は膨張し、そして第二チャンバー１１６中の溶液（２１６）は、コネクティングチャンネル１１５を介して外へ第一チャンバー１１０内に押し出され、そして最終的に溶液（２１２及び２１４）はロードウェルを再度満たす。Ｐlowは初期圧と同じでも異なっていてもよく、大気圧であってよい。好ましい実施態様において、Ｐlowは大気圧より高い。
【００７６】
（ｉ）第一及び第二ロードウェルの上方のガス圧を上げる工程に続いて、（ｉｉ）第一及び第二ロードウェルの上方のガス圧を下げる工程が、望まれる通り多くの回数繰り返される。一般的に、ガス圧の昇降工程は、望まれる量の溶液が混合されるように十分な回数だけ繰り返される。
【００７７】
図４の説明は、ロードウェルにおいてガス圧を上げる結果として、溶液がロードウェルを出て、そして第一及び第二ロードチャンネルを部分的にのみ占めることを示す。（説明されていない）他の実施態様において、第二チャンバー１１６内に強制的に入れられる溶液（２１６）の容積と比較して、第一及び第二ロードウェル（２１２及び２１４）中の溶液の容積は十分であるので、装置１００のある設計及び各マイクロ流体エレメントの容積に対して、Ｐhighでさえ、溶液（２１２及び２１３）は第一及び第二ロードチャンネルを完全に満たし、そして溶液（２１２及び２１４）は、第一及び第二ロードウェルを少なくとも部分的に満たす。そのような実施態様において、水不混和性流体がロードウェル中の溶液の頂部上に添加されるとき、水不混和性流体はロードウェル中に残り、そしてロードチャンネルには入らない。
【００７８】
述べられた通り、ガス圧の昇降の二つの工程は、望まれる量の溶液が混合されるように十分な回数だけ繰り返される。さらに、反応、測定、及び他の解析を実行するための装置１００の使用において、反応、測定、及び他の解析の前、後、及び／又はこれらの実施中如何なる時点においても混合プロトコールは実行される。反応を行う場合、特にＰＣＲ反応を行う場合には、反応の途中で混合プロトコールを実行するのが好ましい。混合プロトコールが実行されるそれぞれの時点で、ガス圧の昇降の二つの工程が繰り返される回数は、手順の要求によって異なる。
【００７９】
ガス圧の昇降工程の間の時間間隔は適宜設定される。幾つかの実施態様において、混合を実行するために溶液は第二チャンバーを出入りして通過するが、第一チャンバー中に主として留まるよう、ガス圧の降下工程は上昇工程のすぐ後に、例えば、２秒以内、又はガス圧の上昇工程の６０秒以内に起こる。他の実施態様において、溶液は第二チャンバー内へと通過し、そして排出され、第一チャンバー内に戻される前の測定中に、実質的な時間、そこに留まる。
【００８０】
圧力パルス混合プロトコールの二つの例が図５Ａ及び５Ｂで説明される。図５Ａで、ＰＣＲ増幅反応の過程中に、圧力パルスの一つのセッションが実行される。ＰＣＲのような、そこで温度が変えられる測定と併せて混合プロセスが実行されるとき、温度が安定に保持される間に混合プロセスが実行されることが好ましい。このように、例えば、温度サイクルの初期の設定がＸ回実行され、次いで、温度が安定に保持される間に、圧力パルス混合サイクルがＹ回実行され、次いで、残りのＰＣＲサイクルがＺ回実行される。この例において、Ｘ＋Ｚの合計は一般的にＰＣＲサイクルの通常の数であり、それは当業技術において周知である通りのアプリケーションに従って変わる。感染生物の核酸材料の存否を解析する測定において、例えば、３０〜５０サイクルが一般に実行される。
【００８１】
幾つかの実施態様において、測定の最初に測定分析物の均一な分布を確保することが望まれる場合、圧力パルス混合工程が測定の最初に実行される（例えば、Ｘ＝０）。幾つかの実施態様において、測定反応の最後の、例えば、生成物検出工程の前に、測定生成物の均一な分布を確保することが望まれる場合、測定の最後に圧力パルス混合工程が実行される（例えば、Ｚ＝０）。幾つかの実施態様において、溶液全体を通して測定反応の中間体の均一な分布および反応領域における非クラスタ化の確保（析出防止）が望まれる場合、測定の中間に圧力パルス混合工程が実行される（例えば、Ｘが０でない、Ｚが０でない）。
【００８２】
圧力パルス混合サイクルの数（Ｙ）は、１のように少ないか、および２、３、４、５、６、又は８、又は１０、又は２０、又は３０、又はそれを超えるように多い。有用な混合サイクルの数は、多くの因子、例えば、第一および第二チャンバーの相対的サイズ、コネクティングチャンネルのサイズと角度を含む装置の幾何形状、第二チャンバー充填率、かけられた圧力変化の大きさ、溶液粘度などに依存し、そして各装置およびアプリケーションに対して容易に決定され得る。混合サイクルの数を決定するとき、合計測定時間も考慮され、そして合計測定時間と溶液を混合する必要性のバランスを取って、混合工程のために使用される時間が適宜、割り当てられる。
【００８３】
他の実施態様において（図５Ａで示されていない）、圧力パルス混合サイクルが１セッションより多く実行される。例えば、アッセイプロトコールの前後に、プロトコール前及びその途中に、プロトコールの途中及びその後に、又は、プロトコール前、途中及びその後に溶液は混合される。プロトコールの途中で混合が実行されるとき、一回以上の異なる時点で実行される。例えば、それはプロトコールを通した途中の半分及び４分の３で実行される。プロトコールが、ＰＣＲプロトコールにおいて使用されるような、温度サイクルなどの別個のサイクルを含む場合、混合は、例えば、各サイクル、各２回目のサイクル又は各３回目又は４回目のサイクルの後で実行される。図５Ｂは、サイクルの初期の設定がＸ回（Ｘは０から約４０まで、又はそれを超えて変わる）実行された後、圧力パルス混合サイクルの組が各２回目のサイクルの後で実行される実施態様を説明する。上で論じられた通り、サイクルの数は調節されるが、二つの混合サイクル（Ｙ＝２）が説明される。幾つかの実施態様においてこれはアッセイプロトコールの最後までを通して続く。
ロードウェルにおいてガス圧が如何にして制御されるかを含む本方法の他の態様は、システム成分と合わせて次のセクションで述べられる。
【００８４】
［Ｃ．システム成分］
一つの実施態様において、装置中の溶液を混合するためのマイクロ流体装置システムは、この明細書において述べられる通りのマイクロ流体装置、およびガスマニフォールドを備えてなる。一般的に、ガスマニフォールドはマイクロ流体装置に完全に適合し、そしてマイクロ流体装置のウェルにおいてガス圧を制御することを可能にする装置である。幾つかの実施態様において、それは装置のすべてのウェルにおいてガス圧を同時に制御することをさらに可能にする。幾つかの実施態様において、これは同じ共通の狭い空間に全てのウェルを晒すことによってなされ、そうすることによって、その共通の狭い空間の圧力を制御することで、全てのウェルが本質的に同じガス圧になる結果となる。
【００８５】
ガスマニフォールドの幾つかの実施態様は、第一の表面に少なくとも一つの開口部を有するマニフォールドブロックを備えてなる。ガスマニフォールドは、外部表面上に開口部と連通するポートも備えてなる。ガスマニフォールドの第一の表面は、第一の表面における少なくとも一つの開口部が、第一および第二ロードウェルの両方において囲まれた空間を形成するように、マイクロ流体装置と嵌合する。外部表面上のポートは圧力源と連結され得る。代表的な図を図６に示す。図中、１００はマイクロ流体デバイスを、１４０は圧力源を、２００はマニフォールドブロックを、２１０は開口部を、２２０はポートを、２５０はガスケットを、３００はマイクロ流体装置（チップ）を、３１０はウェルを、３２０はチャネルをそれぞれ表す。
【００８６】
一つの実施態様において、ガスマニフォールドは、第一および第二ロードウェルの両方における空間を囲む第一の表面に単一の開口部を有する。第一の表面は、第一および第二ロードウェルを囲む領域上のマイクロ流体装置の上方表面に接触してそしてシールを形成する。第一および第二ロードウェルと最終的に連通するチャンネルと連通するマイクロ流体装置中に他のウェルが存在する場合、好ましい実施態様において、第一の表面における単独開口部も、第一および第二ロードウェルを有するマイクロ流体チャンネルによって相互接続されるすべてのウェルに亘る空間を囲む。代表的な図を図７及び８に示す。図中、７００及び９１０はマニフォールドブロックを、７０５はポートを、７１０及び９３０はマイクロ流体装置（チップ）を、７２０及び９４０はウェルを、７４０及び９２５はガスケットを、７５０は開口部を、８００及び９００は第一の表面にある空洞を、８１０は管状延長部を、８３０は電極を、９２０は基板を、９５０はサーマルサイクラーをそれぞれ表す。  
【００８７】
別の実施態様において、ガスマニフォールドは、第一の表面に複数の開口部を有し、ここで開口部は各々、ガスマニフォールドブロック内の相互コネクティングチャンネルシステムのチャンネルの端部を示す。この相互コネクティングチャンネルシステムは、ガスマニフォールドの外部表面上のポートにも接続し、そしてポートはガス圧源に連結され得る。好ましい態様において、ガスマニフォールドがマイクロ流体装置上に配置されるとき、第一の表面における複数の開口部は、第一および第二ロードウェル上に位置する。第一の表面における開口部は、各ロードウェルを囲むマイクロ流体装置の表面に対して、又はウェルを囲む（そして部分的に定義する）チューブ状の延長部が存在する場合、延長部（「隆起したリム」としても知られる）の表面に接触しそしてシールを形成する。第一および第二ロードウェルと最終的に連通するチャンネルと連通するマイクロ流体装置中に他のウェルが存在する場合、好ましい実施態様において、第一の表面における追加の開口部も、マイクロ流体チャンネルによって第一および第二ロードウェルと相互接続されるウェルの各々に整列する。ガスマニフォールドは、他のウェルの各々の上に位置する別個の開口部を有するか、又は幾つかの場合、二つ以上のウェルは同じ開口部によって覆われる。代表的な図を図９Ａ〜９Ｃに示す。図中、４００はマニフォールドブロックを、４１０は相互チャンネルを、４２０はポートを、４３０はプラグを、４４０は電極を、４５０はエポキシ接着剤を、５００はマイクロ流体装置（チップ）を、５１０はウェルを、５１５はｏ−リングを、５２０は管状延長部を、５３０はチャンネルをそれぞれ表す。
【００８８】
ガスマニフォールドの如何なる実施態様においても、ガスマニフォールドとマイクロ流体装置の間の気密シールの形成を助けるために、ガスマニフォールドがマイクロ流体装置と接触するところに圧縮可能な材料が存在する。圧縮可能な材料は、ガスマニフォールドとマイクロ流体装置の間の、ロードウェルにおける狭い共通空間を確立する一つ以上の領域の周辺に沿って気密シールの形成を助けるためのガスケット又はＯリングの形態でもある。
【００８９】
ガスマニフォールドをマイクロ流体装置に固定し、そしてポートを介して接続される圧力源からマニホールドに供給されるガス圧を制御するために、第一および第二ロードウェルにおける圧力が昇降される。第一および第二ロードウェルにおける圧力を昇降することによって、本発明に従う方法が実行される。
【００９０】
例として、マイクロ流体装置のウェルにおける圧力を制御するために有用なガス圧マニホールドの幾つかの実施態様が、その全文が本明細書に参照することにより取り込まれているものとする、米国特許出願第１２／６００、１７１号（付与前の公表第２０１０／０２００４０２号）でＬｉらによって開示されている。Ｌｉらは、疑問を避けるべく、本明細書に参照することにより取り込まれているものとする、分子生物学的測定を実行するためのマイクロ流体装置と共にそのようなガスマニフォールドを使用するシステムおよび方法をさらに開示している。
ロードウェルにおける圧力を制御するために、ガスマニフォールドに供給されるガスは、空気、窒素、アルゴン又は装置の材料及びマイクロ流体装置内に導入される溶液の化学的（生物学的）成分と適合する他の類似ガスである。
【００９１】
図１０Ａ及び６Ｂは、マイクロ流体装置１００及びガスマニフォールド３１０を備えてなる装置中で溶液を混合するためのマイクロ流体装置システムの二つの例示的実施態様を説明する。図１０Ａのシステムは、導管３０６、変換器３３０及び導管３０７を介してガスマニフォールド３１０に接続される圧力制御器３４０に、導管３０５を介して接続されるガス圧源３５０をさらに備えてなる。変換器３３０は、コンピュータ（示されていない）から電気入力信号を受け取り、そして受け取られた信号に比例する制御された電気出力信号を生み出すことによって、導管３０７中の下流の圧力を制御する。このように、一連の圧力サイクルを生み出すために、時間の関数としての圧力プロファイル、一連の圧力設定点がコンピュータから変換器に送られる。変換器３３０は導管３０７中に（例えば、制御器３４０によって設定される値までの）より高い圧力を生み出すために、又はより低い圧力（例えば、ベント）を生み出すために使用され得る。導管３０６に接続される圧力ゲージ３２０によって、導管中の圧力を目視及び／又は電気シグナルで読み取ることができる。導管３０５及び３０６は、システムにかけられる圧力差に耐えるために十分に剛直である限り、如何なる材料からも作られ得る。各導管は同じ又は異なる材料で作られる。通常使用される材料には金属及びエンジニアリングプラスチックが含まれるが、当業技術において使用される如何なる材料も選択される。ガス圧源３５０は、ガス圧縮機、「家庭用」圧力源、又は圧縮されたガスタンクのような高圧ガスの如何なるものでもよい。
【００９２】
操作において、図１０Ａのシステムは、システム内のガス圧を昇降するために、制御器での圧力設定を制御することによって使用される。高圧状態から出発して、圧力制御器設定点を下げ、そして設定点圧力まで圧力を抜き取ると、システムにおけるロードウェルにおける狭い共通の空間における圧力が下がる。逆に、低圧状態から出発して、制御器により圧力設定を上げると、狭い共通の空間における圧力が上がることになる。そのようなシステムにおける、時間の関数としての圧力変化を説明する実験データが図１１Ａに示される。この数字は、狭い共通の空間内及びこのようにマイクロ流体装置のロードウェルにおいて測定された圧力と圧力設定点を比較している。この数字は、約１３５ｋＰａの高圧（設定点）と約３６ｋＰａの低圧設定点の間の行き来を示す。高圧から低圧への移行時間は約０．２５秒であり、そして低圧から高圧への移行時間は約１秒であった。圧力の変化速度は、他の因子のなかでも圧力制御の速度に主に依存するであろう。
【００９３】
図１０Ｂのシステムは、導管３０９を介してガスマニフォールド３１０に接続されるバルブ１５に、導管３０８を介して接続されるシリンジポンプ３６０をさらに備えてなる。圧力ゲージ３２０は、導管を介してバルブ１５に任意に接続される。圧力ゲージの代わりに、システムをベントするために第三のポートが使用され得るか又は第三のポートがふたされて二ポートバルブと同等のバルブが与えられる。導管３０８及び３０９の材料は、導管３０５及び３０６に対して上で述べられた通りである。シリンジポンプは、約２００ｋＰａまでの圧力に耐えるように設計された如何なる標準シリンジであればよい。シリンジはガラス又はプラスチックである。シリンジは、達成され得る容積変化によって、混合方法で望まれる必要な圧力差が供され得るようなサイズにされる。例えば、（シリンジポンプ、配管及び装置を備えてなる）システムの囲まれた空間が約２８．５ｍＬである場合、２６ｍＬの容積を有するシリンジが、圧力変化（例えば、Ｐhigh−Ｐlow＝２００ｋＰａ）を駆動するために使用され得る。そのような場合、シリンジ中の容積変化は約１８ｍＬである。シリンジのプランジャを駆動するために標準モータが使用される。通常、プランジャを駆動するモータの線形力は少なくとも約１３ポンドである。モータがついた多くのシリンジポンプが市販品で入手でき、そして本明細書において述べられたシステムで使用することができる。
【００９４】
操作において、図１０Ｂのシステムは、システム内のガス圧を昇降するためにシリンジポンプを作動することによって使用される。高圧状態から出発して、プランジャを外側に動かすと、システムにおいてロードウェルにおける狭い共通の空間内の容積が増す。逆に、低圧状態から出発して、プランジャを内側に動かすと、狭い共通の空間内の容積が減り、そして圧力が上がることになる。そのようなシステム内の、時間の関数としての圧力変化を説明する実験データが図１１Ｂに、「バルブを使用しないシリンジポンプ」（〇）と標識された曲線で示される。この数字は約１４０ｋＰａの高圧と約１０ｋＰａの低圧の間の繰り返しの行き来を示す。高圧から低圧への移行時間は約５秒であり、そして低圧から高圧への移行時間は約４秒であった。圧力の変化速度は、他の因子の中でも、シリンジプランジャの駆動速度及び狭い共通の空間の容積に主として依存するであろう。
【００９５】
システム上の圧力変化のより速い速度を供する一つの手段は、シリンジポンプと共にバルブ３１５のようなバルブを作動させることである。バルブはガス流体と共に使用する、例えば、手動又は電気機械的に操作される如何なる標準のバルブでもよい。幾つかの実施態様において、バルブは、ソレノイドバルブでありそしてバルブはコンピュータ制御される。さらに、バルブ操作は、以下に述べられる通り、本発明の種々の実施態様に従う方法を実行するのに有用な圧力変化を供するために、シリンジの動きと共に調整される。バルブは、シリンジを、装置の第一および第二ロードウェルに亘る空域と接続している二ポートバルブである。幾つかの実施態様において、バルブは、シリンジ、装置の第一および第二ロードウェルに亘る空域、及び、例えば、圧力ゲージ又は排出ラインを大気に接続している三ポートバルブである。バルブ接続は、装置に亘る空域がシリンジ及びゲージ／排出部に交互に接続されるように構成される。
【００９６】
シリンジポンプ及びバルブの両方を使用して、そして装置１００の狭い共通空間、ガスマニフォールド３１０、導管３０９及び３０８、並びにシリンジポンプ３６０における高圧状態から出発して、最初にバルブ３１５が閉じられ、そして次いでプランジャが外側に動かされると、容積が増し、そしてシリンジポンプ３６０及び導管３０８内の圧力が下がる。次いで、バルブ３１５が開かれ、そして狭い共通空間全体を通して圧力が均等化するにつれ、装置１００中のロードウェルにおける圧力が低下する。逆に、低圧状態から出発し、バルブ３１５が閉じられ、そしてシリンジプランジャが内側に動かされると、容積が減じられそしてシリンジポンプ３６０及び導管３０８中の圧力が上がる。次いで、バルブ３１５が開けられ、そして狭い共通空間全体を通して圧力が均等化するにつれて、装置１００のロードウェルの圧力が上がる。
【００９７】
幾つかの実施態様において、シリンジポンプ及びバルブは高圧状態から低圧状態への移行に対して協調して働くが、逆（低圧から高圧への移行）プロセス中はそうではない。シリンジポンプ及びバルブの協調によってガス圧の降圧工程が加速され、そしてシリンジのみを使用する他の場合の速度よりも速い速度で移行が生じる。この工程中に、第二チャンバーから第一チャンバー内にその溶液が追い出され、そして移行速度がより速いとき、混合がより顕著であることが通常、観察される。一方、シリンジと装置の間でバルブが開かれて、シリンジのみを作動させて、ガス圧の昇圧工程が実行される。
【００９８】
そのようなシステムにおける圧力変化を説明する実験データが時間の関数として図１１Ｂの「バルブを伴うシリンジポンプ」（−）と標識された曲線で示される。本図は、約１４０ｋＰａの高圧と約５５ｋＰａの低圧の間の繰り返される実行を示す。高圧から低圧への移行時間は、早い移行速度を生み出すためにシリンジと共にバルブを用いて約１秒未満であり、そして低圧から高圧への移行時間は、シリンジのみを用いて約３秒であった。バルブの開放時間がプランジャの駆動速度よりも早い場合、シリンジポンプと共にバルブを使用すると、より早い圧力変化速度がもたらされるはずである。これらの操作モードの何れかにおいて、望まれる圧力変化を得るために、第二チャンバー内に移動されることになる溶液の容積に基づいて、シリンジポンプ中の必要な容積変化が決定され得る。
システムの実施態様は、マイクロ流体装置、ガスマニフォールド、ガス圧源、又は圧力制御システムとインターフェイスをとる他の装備又は制御システムと組合わされる。
【実施例】
【００９９】
［実施例１．ＰＣＲ後アッセイの混合］
Ａ．ＰＣＲプライマー及びターゲット
ｐｈｉＸ１７４  ＲＦ１  ＤＮＡ  （Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ、ＭＡ；  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｎ３０２１Ｓ）の２４３塩基対のセグメントを、ＰＣＲ増幅ターゲットとして使用した。フォワードプライマーは、検出用の蛍光色素（ＴＡＭＲＡ）で標識した。プライマー配列は以下の通りであった：
配列番号１（フォワードプライマー）：
５’−ＴＡＭＲＡ−ｃｇｔｔｇｇａｔｇａｇｇａｇａａｇｔｇｇ−３’
配列番号２（リバースプライマー）：
５’−  ａｃｇｇｃａｇａａｇｃｃｔｇａａｔｇ−３’
ＰＣＲアッセイ反応混合物を以下の成分を用いて準備した：１ＸのＫＯＤ緩衝液、０．２５％のＣＨＡＰＳ、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．４ｍＭのｄＮＴＰ、０．０９５％のアジ化ナトリウム、１．２５ＵのＫＯＤ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ、（東洋紡、日本）、及び０．５μＭの各プライマー。ｐｈｉＸ１７４  ＲＦ１  ＤＮＡを、１２．５コピー／２５μＬの反応溶液濃度で、ターゲットとして添加した。
【０１００】
Ｂ．マイクロ流体デバイスおよびシステム
ＰＣＲ及びキャピラリー電気泳動を実行するためのマイクロ流体デバイスを、射出成形されたポリカーボネート基板及びポリカーボネートフィルム（ＧＥ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ社製、１２５μｍのＬｅｘａｎ８０１０）を積層により接合して準備した。第一チャンバー１１０、第二チャンバー１１６、チャンバーセクション１１７、およびコネクティングチャンネル１１５の設計が図３Ｂに示されるものであることを除いて、全体的マイクロ流体デバイスの設計を図２に示す。装置の全体的寸法は、約４５．５ｍｍ×２５．５ｍｍ×５．５ｍｍである。第一チャンバー１１０は、約３５０μｍの深さ及び約１８．９μＬの容積を有する。第二チャンバー１１６は約３５０μｍの深さ及び約１０μＬの容積を有する。コネクティングチャンネル１１５は約８０μｍの深さ、約９８μｍの幅（断面積：約７８４０μｍ２、アスペクト比：約１．２）、及び約１．１ｍｍの長さを有する。装置中のマイクロ流体コネクティングチャンネルは、各々約３０μｍの深さ及び約４０μｍの幅である。マイクロ流体デバイスエレメント１２０（図２を参照）は、Ｌｉｕらによる米国特許出願第１４／３９５、２３９号で記載されている。電極は、積層前にポリカーボネートフィルム上にスクリーン印刷し、基板／フィルム積層デバイス中のウェル１〜１０（図２を参照）に添加される溶液に接触するように置かれた。
【０１０１】
マイクロ流体デバイスを以下のような操作のために準備した。ゲル緩衝液としては、３．０ｍＭのＭｇＣｌ２を含むｐＨ８の２００ｍＭＴＡＰＳ緩衝液を準備した。３％のポリジメチルアクリルアミド篩マトリックスをゲル緩衝液中に含む分離ゲルを、ウェル３、４、及び９に添加することによってキャピラリー電気泳動チャンネルネットワークを満たした。０．２μＭの５−カルボキシテトラメチルローダミンをゲル緩衝液中に含むフォーカシング色素溶液をウェル１内にローディングした。ゲル緩衝液をウェル７内にローディングした。Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＮｏＬｉｍｉｔｓ  ＤＮＡ（１５、３００、５００ｂｐ；各々１ｎｇ／μＬ）をゲル緩衝液中に含むＣＥマーカー溶液をウェル８内にローディングした。ＰＣＲ反応溶液（約３５μＬ）（セクションＡ）を第二ロードウェル１１４（同様に、図２でウェル６と標識されている）内にローディングし、そしてこの溶液で第二ロードチャンネル１１３、第一チャンバー１１０、第一ロードチャンネル１１１、及び（同様に、図２でウェル５と標識されている）第一ロードウェル１１２の幾つかを毛管作用によって満たした。最後に、１５μＬの５０ｃｓｔシリコーン流体を、第一及び第二ロードウェル１１２及び１１４（ウェル５及び６）に添加した。
【０１０２】
ローディングされたマイクロ流体デバイスを、熱電ヒーター／クーラーモジュール（モデルＨＶ５６、Ｎｅｘｔｒｅｍｅ、Ｄｕｒｈａｍ、Ｎ．Ｃ．社製）に接続された平らな銅板から成るサーマルサイクリングデバイス上に置いた。その全文が本明細書に参照することにより取り込まれているものとする、Ｌｉｕらの米国特許出願第１２／６００、１７１号で開示されたタイプの圧力マニホールドを、全てのウェルに亘って気密シールする、マイクロ流体デバイスのウェルを囲む縁の表面と接触させた。
【０１０３】
シリンジポンプ（容積２６ｍＬ）およびバルブ（ＣＫＤ  空気入りＵＳＧ２−Ｍ５）を含む気体圧力源を、図１０Ｂに関連して記載された通りに配置し、そして第一及び第二ロードウェルを含む、マイクロ流体デバイスのすべてのウェルにおける圧力を制御するための気体マニホールドに接続した。混合プロセスにおいて使用された操作圧力は、Ｐhigh  ＝１３０ｋＰａ、Ｐlow＝１０ｋＰａであった。ＰlowからＰhighへの移行のためには、バルブを開かれたままに保持したが、ＰhighからＰlowへの移行のためには、バルブを閉じて、シリンジ中に低圧を生み出すべくシリンジプランジャを引く前に、気体マニホールドとマイクロ流体デバイスを隔離し、そして次いで、気体マニホールドを低圧環境に迅速に晒すためにバルブを開いた。ＰＣＲヒートサイクルの間、気体マニホールド中の圧力をＰlowに保持した。
【０１０４】
Ｃ．測定プロトコール
ＰＣＲを４５サイクル実行し、反応生成物をキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によってマイクロ流体デバイス中で解析し、次いで、第一チャンバー１１０の内容物を本発明の実施態様に従って混合し、そして最後に、反応生成物をＣＥによって再度解析した。３つのサンプルを用い、本実験を３回繰り返した。
ＰＣＲヒートサイクルプロトコールを以下の変性、アニーリング、及び伸長温度及び時間の配列を用いて実行した：
サイクル１：９６℃で３００秒間、６０℃で１４秒間、及び７４℃で８秒間。  
サイクル２〜１３：９６℃で１７秒間、６０℃で１４秒間、及び７４℃で８秒間。
サイクル１４〜４５：９６℃で１７秒間、６０℃で１４秒間、及び７４℃で３９秒間。
サイクル１４〜４５の間に、Ｌｉｕらによる米国特許出願第１４／３９５、２３９号で記載された通りに、ＣＥ解析を実施した。
圧力パルス混合は、ヒートサイクリングデバイスの温度を７４℃に保持しながら、圧力をＰhighに上げ、そしてＰlowに下げることを２５０秒間に３０サイクル行うことによって実行した。
圧力パルス混合工程に続いて、ＰＣＲアッセイ溶液の内容物を、Ｌｉｕらによる米国特許出願第１４／３９５、２３９号で記載された通りに、マイクロ流体デバイスにおけるＣＥ解析のために再度採取した。
【０１０５】
Ｄ．結果
試験した３つのサンプルについてのＣＥ電気泳動図を図１２の(Ａ)〜(Ｆ)に示す。電気泳動図の(Ａ)〜(Ｃ)は、ＰＣＲサイクル４５の後であるが、第一チャンバー１１０中の測定溶液が混合される前の３つのサンプルの各々についての結果を示す。電気泳動図(Ｄ)〜(Ｆ)は、圧力パルス混合が実行された後の各サンプルについての結果を示す。
【０１０６】
電気泳動図において、ＰＣＲアンプリコン生成物のピーク（２４３ｂｐ）は２２秒に現れ、そして二つのマーカーピーク（３００および５００ｂｐ）は２４秒および３０秒に現れる。
電気泳動図から、混合前に測定溶液を解析すると、溶液中の生成物アンプリコンの濃度を正確に反映しない誤った結果に導かれることが明らかである。例えば、図１２の(Ａ)では、アンプリコン生成物のピークは、マーカーＤＮＡよりもはるかにより高い濃度で明らかに存在し、そして図１２の(Ｂ)では、非常に少ない量のアンプリコン生成物であるように見える。しかしながら、圧力パルス混合工程を実行した後では、これらの測定溶液の各々は、図１２(Ｄ)及び(Ｅ)で、マーカーＤＮＡと対比して類似の量のアンプリコン生成物を有することが分かる。これは、ヒートサイクル直後の測定溶液においては、アンプリコン生成物が均一に分配されていないが、圧力パルス混合工程の結果、生成物がより均一に分配され、従って解析のために第一チャンバーから抽出されたサンプルが、測定溶液の内容物のより良い代表物であったことを示す。
【０１０７】
［実施例２．測定中の混合を伴うＰＣＲアッセイ］
Ａ．ＰＣＲプライマー及びターゲット
実施例１のプライマー、ターゲット及びＰＣＲアッセイ溶液を使用した。
Ｂ．マイクロ流体デバイスおよびシステム
実施例１のマイクロ流体デバイスおよびシステムを使用した。
Ｃ．アッセイプロトコール
８つのサンプルを用意した。ＰＣＲを４５サイクル実行し、最後の３２サクルごとに、反応生成物を細管電気泳動（ＣＥ）によってマイクロ流体デバイス中で解析した。４つのサンプルは、第一チャンバー中の測定溶液を圧力パルス混合せずに解析した。４つのサンプルは、ＰＣＲサイクル１３と１４の間で、測定溶液を２分間混合（３０回の混合サイクル、Ｐhigh＝１３０ｋＰａ、Ｐlow＝４０ｋＰａ）することによって解析した。
ＰＣＲヒートサイクル及び圧力パルス混合は、以下の変性、アニーリング及び伸長温度及び時間のシーケンス、並びに混合プロトコールを用いて実行した：
サイクル１：９６℃で３００秒間、６０℃で１４秒間、及び７４℃で８秒間。  
サイクル２〜１３：９６℃で１７秒間、６０℃で１４秒間、及び７４℃で８秒間。
混合時間：Ｐhighへの昇圧及び、Ｐlowへの降圧の３０サイクルを用いて、又は用いないで、９５℃で１２０秒間。
サイクル１４〜４５：９６℃で１７秒間、６０℃で１４秒間、及び７４℃で３９秒間。
サイクル１４〜４５中に、Ｌｉｕらによる米国特許出願第１４／３９５，２３９号で記載された通りに、ＣＥ解析を実施した。
【０１０８】
Ｄ．結果
実験の結果を、各サンプルについて、サイクル数（サイクル３１から４５）対アンプリコン生成物の蛍光強度をプロットした図１３に示す。圧力パルス混合を行わなかったコントロールサンプルの増殖曲線を点線で示し、そして本明細書で開示された方法に従って混合したサンプルの増殖曲線を実線で示す。閾値サイクル数（Ｃｑ）、平均Ｃｑ、及び二組のサンプルについて観察された真陽性率を以下の表１に示す。
【０１０９】
【表１】
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【０１１０】
ＰＣＲ増幅プロトコールの途中（サイクル１３と１４の間）で測定溶液を混合することによって、引き続いて観察された増殖曲線は、混合工程なしで増幅されたサンプルよりもはるかにより大きな均一性及び再現性を示す。
ＰＣＲアッセイの初期段階においてサンプルを混合することによって、反応領域のホットスポット発生が最小化され、及び／又はその中間点でのアンプリコンがより均一に分布しており、その結果、生成物のより均一な分布、およびより遅いサイクルにおける測定溶液のより均一なサンプリングをもたらしたものと思われる。対照的に、混合されなかったサンプルは、約３５．３というより早い閾値サイクル数（Ｃｑ）の範囲にある結果を示し、生成物が検出されなかったネガティブ結果に対して、サンプル中のターゲットがはるかにより高い濃度を示した。
この実験の結果も、圧力パルス混合が低濃度成分のより均一な分布をもたらし、その結果、マイクロ流体チャンバーから、溶液内容物の量（濃度）を反映したサンプルを提供できることを示す。
【０１１１】
本発明は特定の実施態様および用途に関して記載されているものの、当業者は本明細書で記載されそして可能にされた本発明のデバイス、システム、および方法の範囲を理解するであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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