(57)【要約】      （修正有）【課題】線維化関連分子に対する抗体およびその医療応用の提供。【解決手段】ＣＨＬ１タンパク質に結合する抗体又は前記抗体の抗原結合性断片であって、前記ＣＨＬ１タンパク質の粘膜固有層ならびに粘膜下層の非免疫系、及び非上皮系の非血球系細胞への結合を中和する、前記抗体又は、前記抗体の抗原結合性断片。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＨＬ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、ＣＨＬ１タンパク質の粘膜固有層ならびに粘膜下層の非免疫系および非上皮系の非血球系細胞への結合を中和する、抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
ＣＨＬ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、抗体が、
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域とを有する抗体であるか、または
（２）上記（１）とＣＨＬ１タンパク質に対する結合に関して競合する抗体である、
抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３】
抗体が、（３）配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有する抗体、または、（４）上記（３）とＣＨＬ１タンパク質に対する結合に関して競合する抗体である、請求項２に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、組織または臓器の線維化を治療または予防することに用いるための医薬組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、組織または臓器における線維芽細胞の活性を抑制することに用いるための医薬組成物。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、炎症組織の炎症治癒を促進することに用いるための医薬組成物。
【請求項７】
組織において炎症の有無を分析する方法であって、前記組織におけるＣＨＬ１タンパク質の存在を決定することを含む、方法。
【請求項８】
ＣＨＬ１タンパク質の有無を検出することが、ＣＨＬ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片を用いて行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＣＨＬ１タンパク質の有無を検出することが、請求項１〜３のいずれか一項に記載された抗体またはその抗原結合性断片を用いて行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＨＬ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む、組織における炎症の有無を診断することに用いるための、診断薬。
【請求項１１】
ＣＨＬ１タンパク質を含む、線維化誘導性非血球系細胞の検出用プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維化関連分子に対する抗体およびその医療応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、組織損傷の修復過程として必要である。しかしながら、組織の修復後に炎症が消えない場合が存在する。そのような炎症においては、線維芽細胞が活性化され、コラーゲンの排出量が高まっており、組織の線維化を引き起こすリスクがある。
【０００３】
組織の線維化は不可逆的であり治療ができないため、線維化は未然に防ぐことが大切である。従って、線維化を診断する手法や線維化を予防する手法に対するニーズが存在する。
【０００４】
ＣＨＬ１は、脳神経細胞の接着因子であるＬ１に類似する細胞接着分子として知られている（非特許文献１）。しかし、その生理的機能はほとんど知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】MH Wei et al., Hum. Genet. 103 (39: 355-364, 1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、線維化関連分子に対する抗体およびその医療応用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、炎症の急性期および慢性期特異的に発現する因子としてＣＨＬ１を同定した。本発明者らは、ＣＨＬ１は線維芽細胞の膜表面に提示されていること、分泌されて粘膜固有層ならびに粘膜下層の筋線維芽細胞などの非免疫系および非上皮系の非血球系細胞に結合することを明らかにした。また、本発明者らは、抗ＣＨＬ１抗体が、炎症の急性期における線維芽細胞による組織修復を遅延させること、炎症の慢性期においては過剰なコラーゲン産生や線維芽細胞の活性を抑制できることを見出した。さらに本発明者らは、ＣＨＬ１が炎症の急性期のみならず慢性期にも発現が持続することを見出し、炎症急性期が過ぎてからの抗ＣＨＬ１抗体の投与は、コラーゲンの沈着と線維芽細胞の活性化の抑制を引き起こすことを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］ＣＨＬ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、ＣＨＬ１タンパク質の粘膜固有層ならびに粘膜下層の非免疫系および非上皮系の非血球系細胞への結合を中和する、抗体またはその抗原結合性断片。
［２］ＣＨＬ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、抗体が、
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域とを有する抗体であるか、または
（２）上記（１）とＣＨＬ１タンパク質に対する結合に関して競合する抗体である、
抗体またはその抗原結合性断片。
［３］抗体が、（３）配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有する抗体、または、（４）上記（３）とＣＨＬ１タンパク質に対する結合に関して競合する抗体である、上記［２］に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
［４］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、組織または臓器の線維化を治療または予防することに用いるための医薬組成物。
［５］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、組織または臓器における線維芽細胞の活性を抑制することに用いるための医薬組成物。
［６］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、炎症組織の炎症治癒を促進することに用いるための医薬組成物。
［７］組織において炎症の有無を分析する方法であって、前記組織におけるＣＨＬ１タンパク質の存在を決定することを含む、方法。
［８］ＣＨＬ１タンパク質の有無を検出することが、ＣＨＬ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片を用いて行われる、上記［７］に記載の方法。
［９］ＣＨＬ１タンパク質の有無を検出することが、上記［１］〜［３］のいずれかに記載された抗体またはその抗原結合性断片を用いて行われる、上記［７］に記載の方法。
［１０］ＣＨＬ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む、組織における炎症の有無を診断することに用いるための、診断薬。
［１１］ＣＨＬ１タンパク質を含む、線維化誘導性非血球系細胞の検出用プローブ。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、マイクロアレイを用いた発現解析の結果を示す図である。図中「Fibro」は線維芽細胞を表し、「Mac」はマクロファージを表し、「BM Mac」は骨髄マクロファージを表し、「Ｂ」はＢ細胞を表す。また、図中「正」は、正常の線維芽細胞を表し、「急」は急性炎症を誘発した線維芽細胞を表し、「慢」は、慢性炎症を誘発した線維芽細胞を表す。図１では、図の右側に示された遺伝子の発現が示されている。
【図２】図２は、Ｃｈｌ１遺伝子の各種細胞における発現量を示す図である。
【図３】図３は、ＣＨＬ１が炎症時に細胞膜上に発現することを示す図である。
【図４】図４は、炎症の慢性期におけるＣＨＬ１タンパク質の発現およびヒトクローン病大腸検体におけるＣＨＬ１タンパク質の発現を示す図である。
【図５】図５は、ＣＨＬ１ノックアウト（ＣＨＬ１ＫＯ）マウス由来線維芽細胞における組織損傷の修復に対する影響を示す図である。
【図６】図６は、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）による腸炎モデルにおけるＣＨＬ１の役割を示す図である。図６Ａは、ＤＳＳによる腸炎モデルの体重回復を指標として腸炎の修復能がＣＨＬ１ＫＯマウスにおいて低下することを示す。図６Ｂは、ヘマトキシリンエオジン染色による大腸組織像を示す。図６Ｂでは、ＣＨＬ１ＫＯマウスでは上皮細胞の再形成の遅延がみられる。図６Ｃは、大腸線維芽細胞におけるα平滑筋アクチンの発現により線維芽細胞の活性化度合いがＣＨＬ１ＫＯマウスにおいて低下しており、上皮細胞下への線維芽細胞の配備が遅延することを示す。図６Ｃでは、炎症組織における上皮細胞（ＥｐＣＡＭで染色される）および線維芽細胞（ａＳＭＡで染色される）の集積能がＣＨＬ１ＫＯマウスにおいて低下していることが示されている。
【図７】図７は、粘膜固有層、粘膜下組織の線維化部（アザン染色青色部：図面では暗いグレー）におけるＣＨＬ１タンパク質が会合する細胞の局在（赤：図面では明るいグレー）を示す写真（図７左）および細胞の分画（図７右）を示す。図中の矢じりは、線維化が顕著な箇所を示しており、ＣＨＬ１タンパク質が会合する細胞集団と局在が一致していることが示される。
【図８】図８は、Ｒ３の分画の細胞の一部に対してＣＨＬ１が結合することを示す図である。ＣＨＬ１はＦｃタグを有し、図ではＦｃタグが検出されている。
【図９】図９は、ＣＨＬ１タンパク質に対するモノクローナル抗体３３６抗体が細胞表面に発現したＣＨＬ１タンパク質を認識することを示す図である。
【図１０】図１０は、３３６抗体が、細胞とＣＨＬ１タンパク質との結合を中和できることを示す図である。
【図１１】図１１は、細胞とＣＨＬ１タンパク質との結合を中和できる３３６抗体が炎症の急性期における体重の回復を遅延させること（図１１左のグラフ）および腸粘膜の治癒を遅延させること（図１１右の写真）を示す図である。
【図１２】図１２は、ＣＨＬ１タンパク質が炎症の慢性期においても線維芽細胞に持続的に発現していることを示す図である。
【図１３】図１３は、腸炎モデル（急性および慢性）の排泄物中からＣＨＬ１タンパク質が検出されることを示す図である。
【図１４】図１４は、炎症慢性期の線維化誘導過程におけるコラーゲンの沈着および線維芽細胞の活性化をＣＨＬ１抗体が抑制することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書では、「対象」とは、哺乳動物であり得、好ましくは、ヒトである。対象は、組織炎症を有する、または組織線維化のリスクがある対象であり得る。
【００１１】
本明細書では、「炎症」とは、障害に対する生体組織の防御反応をいう。炎症に関与する組織は、通常、終末血管床、血液および結合組織であると言われており、一連の応答によって原因を除去し、組織を修復する。本明細書では、「急性炎症」または「炎症の急性期」とは、組織の修復に関わる炎症を意味し、「慢性炎症」または「炎症の慢性期」とは、組織の修復の後の炎症を意味する。急性炎症は、臨床的には組織に障害が発生してから７日間程度以内の炎症であると言われ、慢性炎症は、臨床的には７日間を超えて（例えば、月または年の単位で）持続する炎症であると言われている。
【００１２】
本明細書では、「線維化」とは、慢性炎症により組織に余剰のコラーゲンが沈着し、組織が硬化することをいう。線維化の過程では、線維芽細胞が分化成熟して筋線維芽細胞となり、活発にコラーゲンを産生・分泌し、その後細胞自体は消失し、線維性結合組織が生じる。線維化の過程は目立たないため、線維化が進行してから線維症が発覚することがあるが、線維症は治療することができない疾患であるため、その予防が重要である。
【００１３】
本明細書では、「活性型線維芽細胞」とは、線維芽細胞のうち、定常状態よりもコラーゲン産生能の高まった細胞集団をいい、例えば、筋線維芽細胞を含む集団が挙げられる。活性型線維芽細胞は、炎症の急性期および慢性期において線維芽細胞から生じる。
【００１４】
本明細書では、「抗体」は、免疫グロブリンを意味し、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。好ましい抗体は、モノクローナル抗体である。抗体の由来は、特に限定されないが例えば、非ヒト動物の抗体、非ヒト哺乳動物の抗体、およびヒト抗体が挙げられる。また、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。また、抗体は、二重特異性抗体であってもよい。
抗体は、２本の重鎖と２本の軽鎖とが会合した構造を取る。重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）、重鎖定常領域（ＣＨ１）、ヒンジ領域、ＣＨ２、およびＣＨ３からなり、軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とからなる。
【００１５】
本明細書では、「抗原結合性断片」とは、抗原への結合性が維持された抗体の一部を意味する。抗原結合性断片は、本発明の抗体の重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域またはその両方を含みうる。抗原結合性断片は、キメラ化またはヒト化されていてもよい。抗原結合性断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、ダイアボディー、ｓｃ（Ｆｖ）2（単鎖（Ｆｖ）2）が挙げられる。このような抗体の断片は、特に限定されないが例えば、抗体を酵素で処理して得ることができる。例えば、抗体をパパインで消化すると、Ｆａｂを得ることができる。あるいは、抗体をペプシンで消化すると、Ｆ（ａｂ’）2を得ることができ、これをさらに還元するとＦａｂ’を得ることができる。本発明ではこのような抗体の抗原結合性断片を用いることができる。
【００１６】
本明細書では、ＣＨＬ１とは、Ｌ１様細胞接着因子（Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｌ１−ｌｉｋｅ）またはＬ１細胞接着分子２（Ｌ１  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ２）とも呼ばれる。元々は脳において発現し、知能障害の原因となる分子として知られ、神経細胞のシナプスにおいて機能すると考えられている。
【００１７】
本明細書では、「抗体−薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）とは、抗体と薬物との結合体を意味する。薬物は、抗体との結合により、標的部位に送達され、送達部位において機能を発揮しうる。ＡＤＣにおいては、抗体と薬物はリンカーを介して連結していてもよい。ＡＤＣの設計や調製法は、当業者に周知である。
【００１８】
本発明によれば、以下の抗体または抗原結合性のその断片が提供される。
［１］ＣＨＬ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、ＣＨＬ１タンパク質の線維芽細胞への結合を中和する、抗体またはその抗原結合性断片。
本発明者らによれば、ＣＨＬ１の線維芽細胞への結合を中和することができる抗体は、炎症の慢性期において組織へのコラーゲンの沈着や線維芽細胞の活性化を抑制することができた。従って、この抗体または抗原結合性断片は、ＣＨＬ１の線維芽細胞への結合を中和することにより、炎症の慢性期において組織へのコラーゲンの沈着や線維芽細胞の活性化を抑制することができると考えられる。ある態様では、この抗体または抗原結合性断片は、ＣＨＬ１と粘膜固有層ならびに粘膜下層の筋線維芽細胞などの非免疫系および非上皮系の非血球系細胞（この細胞を本明細書では「線維化誘導性非血球系細胞」と呼ぶことがある）との結合を中和する。ＣＨＬ１の受容体はインテグリン、ビトロネクチンなどの接着分子（Katic J J Neurosci. 2014 Oct 29;34(44):14606-23. doi: 10.1523/JNEUROSCI.3280-13.2014.）、セロトニン受容体（Kleene R J Cell Sci. 2015 Dec 15;128(24):4642-52. doi: 10.1242/jcs.176941）を含むタンパクと考えられている。
【００１９】
本発明によればまた、
［２］ＣＨＬ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、抗体が、
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域とを有する抗体であるか、または
（２）上記（１）とＣＨＬ１タンパク質に対する結合に関して競合する抗体である、
抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００２０】
本発明によればまた、抗体が、（３）配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを有する抗体、または、（４）上記（３）とＣＨＬ１タンパク質に対する結合に関して競合する抗体である、上記［２］に記載の抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００２１】
上記（１）や（３）に記載の抗体は、ＣＨＬ１の粘膜固有層ならびに粘膜下層の筋線維芽細胞などの非免疫系および非上皮系の非血球系細胞への結合を中和できる。これは、ＣＨＬ１タンパク質の粘膜固有層ならびに粘膜下層の筋線維芽細胞などの非免疫系および非上皮系の非血球系細胞への結合面に抗体が結合し、抗体による立体障害が生じてＣＨＬ１タンパク質が線維芽細胞に結合できなくなるためであると考えられる。従って、上記（１）や（３）に記載の抗体と競合する抗体は、同様にＣＨＬ１タンパク質の筋線維芽細胞などの非免疫系および非上皮系の非血球系細胞への結合面に結合して立体障害を発生させ、これによりＣＨＬ１の筋線維芽細胞などの非免疫系および非上皮系の非血球系細胞への結合を中和できると考えられる。また、必要に応じてＣＨＬ１の筋線維芽細胞などの非免疫系および非上皮系の非血球系細胞への結合を中和するか否かを確認してもよいであろう。
【００２２】
本発明によれば、上記（１）または（３）に記載の抗体とＣＨＬ１タンパク質に対する結合に関して競合する抗体であって、ＣＨＬ１の筋線維芽細胞などの非免疫系および非上皮系の非血球系細胞への結合を中和することができる抗体が提供される。
【００２３】
本発明の抗体は、組織または臓器（特に炎症を引き起こした組織または臓器の炎症を引き起こした領域）において、線維芽細胞の活性を低下させる、コラーゲンの産生を低下させる、またはコラーゲンの沈着を抑制することができる。そしてこれにより、本発明の抗体は、組織または臓器（特に炎症を引き起こした組織または臓器の炎症を引き起こした領域）において、組織または臓器の線維化を予防することができる。従って、本発明によれば、本発明の抗体を含む、線維芽細胞の活性を低下させる、コラーゲンの産生を低下させる、またはコラーゲンの沈着を抑制することに用いるための組成物または医薬組成物が提供される。本発明によればまた、本発明の抗体を含む、線維症を治療することに用いるための医薬組成物が提供される。本発明によればまた、本発明の抗体を含む、炎症を引き起こした組織において、組織の線維化を予防することに用いるための医薬組成物が提供される。炎症を引き起こした組織または臓器としては、腸（例えば、小腸および大腸）が挙げられる。本発明の医薬組成物は、慢性炎症を引き起こした組織に対して、組織の線維化を予防しうる。従って、本発明の医薬組成物は、慢性炎症を引き起こした組織に対して、特に組織の線維化が完了する前の慢性炎症を引き起こした組織に対して用いられ得る。従って、ある態様では、本発明の医薬組成物は、慢性炎症を有する対象（特に組織の線維化が完了する前の慢性炎症を有する対象）に対して投与することができる。本発明の医薬組成物は、炎症を引き起こす前の組織または臓器において（すなわち、平常状態の組織または臓器において）、組織または臓器の線維化を予防することに用いるために用いてもよい。本明細書では、「治療」には、症状の悪化を遅らせる、症状の悪化を停止させる、および症状を改善することが含まれる。本明細書では、「臓器」の一部のことを「組織」ということがある。
【００２４】
ある態様では、本発明の医薬組成物は、クローン病、潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患から選択される炎症性疾患を有する対象に対して投与することができる。
【００２５】
後述するように、炎症を引き起こしている対象は、組織中、体液中または排泄物中にＣＨＬ１を放出している。従って、本発明の医薬組成物は、ＣＨＬ１陽性である対象に対して投与してもよいであろう。
【００２６】
本発明の抗体を有効成分として含む医薬組成物または薬剤は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、本発明の医薬組成物または薬剤は、薬学上許容可能な賦形剤を含んでいてもよい。賦形剤は、有効成分である本発明の抗体の有効量を対象に与えるために適宜投与されうる賦形剤とすることができる。ある態様では、本発明の医薬組成物または薬剤は、注射剤とすることができ、注射用の賦形剤は、無菌の水性溶液、例えば、リンガー溶液、ハンクス溶液または生理食塩水などの薬学的に許容可能な緩衝液、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液とすることができる。補助剤としては、エタノールなどのアルコール、ポリエチレングリコールなどのポリアルコール、ポリソルベート８０などの非イオン性界面活性剤などが挙げられ、製剤化の際に添加することができる。注射用の油性液としては、ゴマ油、ヤシ油および大豆油を用いることができ、補助剤として、安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールを用いることができる。本発明の医薬組成物または薬剤は、注射剤の形で非経口投与（例えば、静脈内投与または胸腔内投与）することができる。
【００２７】
抗体の作製
抗体は、当業者に周知の方法により作成することができる。すなわち、抗原とアジュバントとを動物に免疫することと、免疫した動物の血漿を得ることによりポリクローナル抗体を得ることができる。あるいは、抗原とアジュバントとを動物に免疫し、免疫した動物からＢリンパ球を得て、ミエローマと細胞融合させてハイブリドーマを形成させ、所望の抗体を産生するハイブリドーマをクローニングして得てもよい。免疫の工程は、細胞株（例えば、２９３細胞またはＣＨＯ細胞等）に強制発現させ、細胞を動物に免疫してもよい。細胞株に発現させた場合、ＣＨＬ１タンパク質は細胞表面に暴露するので免役された動物はＣＨＬ１タンパク質に対する抗体を産生しうる。または、ＣＨＬ１タンパク質を発現する細胞、好ましくは、ＣＨＬ１タンパク質を精製して動物に免疫してもよい。
【００２８】
キメラ抗体は、本分野において周知の方法により作製することができる。例えば、抗体の定常領域をヒトの抗体の定常領域に置換することにより作製することができる。ヒト化抗体は、例えば、ヒト以外の動物由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびヒト抗体由来の定常領域とを含む。ヒト化抗体は、例えば、上記のＣＤＲをヒト抗体に移植して得ることができる。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体を産生する遺伝子改変マウスに抗原を免疫することにより得ることができる。二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープまたは抗原に結合することができる抗体であって、当業者に周知の方法で調製することができる。二重特異性抗体は、例えば、２つの異なる抗体を産生する細胞をさらに融合して、ハイブリッドハイブリドーマを作製する方法や、ＶH領域とＶL領域を、上記２つの領域間では対を形成できない短いリンカーを介して１本のポリペプチド鎖上で発現させ、別のポリペプチド鎖であって、前記ＶH領域とＶL領域と対形成する相補的なＶH領域とＶL領域を有するポリペプチド鎖と複合体を形成させることにより作製できる。
【００２９】
ある抗体と抗原との結合において競合する抗体は、当業者に周知の競合アッセイなどにより確認することができる。競合アッセイで、例えば、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２０〜５０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、所望の抗体の結合をブロックすることができるならば、同じ抗原に対する結合において競合する抗体とすることができる。競合する抗体は、交差ブロッキングアッセイ、好ましくは、競合ＥＬＩＳＡアッセイにより確認することができる。交差ブロッキングアッセイでは、抗原を、例えばマイクロタイタープレート上にコーティングし、ここに候補となる競合抗体存在を添加してインキュベートし、抗原と候補抗体との結合を形成させる。その後、所望の抗体を標識した上でさらにウェルに添加してインキュベートし、洗浄して、所望の抗体の結合量を定量することにより、抗体が競合したか否かを判断することができる。競合する場合には、ウェル中に残存する標識量が少なくなるはずである。
【００３０】
線維芽細胞とＣＨＬ１タンパク質との結合を中和できる抗体は、筋線維芽細胞などの非免疫系および非上皮系の非血球系細胞に対してＣＨＬ１と結合において競合するか否かにより確認することができる。例えば、後述する実施例に記載されるように、ＣＨＬ１タンパク質にタグ（例えば、Ｆｃタグ）を結合させた融合タンパク質を筋線維芽細胞などの非免疫系および非上皮系の非血球系細胞に結合させると、前記タグに結合する抗体により細胞へのＣＨＬ１タンパク質の結合を検出することができる。この結合を、例えば、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２０〜５０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、ＣＨＬ１の筋線維芽細胞などの非免疫系および非上皮系の非血球系細胞に対する結合をブロックすることができるならば、筋線維芽細胞などの非免疫系および非上皮系の非血球系細胞とＣＨＬ１タンパク質との結合を中和できる抗体とすることができる。
【００３１】
本発明の別の側面では、組織において炎症の有無を分析（または検査）する方法であって、前記組織におけるＣＨＬ１タンパク質の存在（有無）を決定することを含む方法が提供される。本発明者らによると、ＣＨＬ１タンパク質は炎症組織において高発現を示した。本発明者らによると、ＣＨＬ１タンパク質は炎症を有する組織から分泌され、個体の体液、特に排泄物中から検出できた。従って、組織におけるＣＨＬ１タンパク質の有無を決定するとは、炎症組織中のＣＨＬ１タンパク質の存在を決定することに加えて、炎症組織から分泌された、体液中または排泄物中のＣＨＬ１タンパク質の存在を決定することも含む。
【００３２】
本発明のある態様では、ＣＨＬ１タンパク質の存在は、ＣＨＬ１に結合する抗体を用いて検出することができる。ある態様では、抗体は、本発明の抗体であり得る。また、別のある態様では、ＣＨＬ１タンパク質の存在は、ＣＨＬ１のｍＲＮＡ量を測定することにより決定することができる。ｍＲＮＡ量は、サザンブロッティング、定量的ＰＣＲ等の当業者に周知の方法により測定することができる。
【００３３】
本発明のある側面では、組織における炎症の有無を診断することに用いるための診断薬または診断キットであって、ＣＨＬ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む診断薬または診断キットが提供される。診断キットは、診断薬に加えて他の追加の構成を備えていてもよく、炎症の診断方法を解説する説明書を備えていてもよい。本発明のある側面では、組織における炎症の有無を診断することに用いるための検査薬または検査キットであって、ＣＨＬ１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む検査薬または検査キットが提供される。検査キットは、検査薬に加えて他の追加の構成を備えていてもよく、炎症の検査方法を解説する説明書を備えていてもよい。
【００３４】
本発明のある側面では、ＣＨＬ１タンパク質は、筋線維芽細胞などの非免疫系および非上皮系の非血球系細胞に対して結合する。従って、ＣＨＬ１タンパク質は、筋線維芽細胞を検出することに用いることができる。例えば、ＣＨＬ１タンパク質にタグを結合させ、またはさせずに、ＣＨＬ１タンパク質を筋線維芽細胞を含む細胞画分と接触させると、ＣＨＬ１タンパク質は筋線維芽細胞に結合する。フローサイトメトリーにより、ＣＨＬ１タンパク質が表面に結合した細胞を検出することにより筋線維芽細胞を検出することができる。また、フローサイトメトリーにより、ＣＨＬ１タンパク質が表面に結合した細胞をゲートすることにより、筋線維芽細胞を濃縮または単離することができる。このように、本発明のある側面では、ＣＨＬ１タンパク質を含む、筋線維芽細胞などの線維化誘導性非血球系細胞の検出用プローブが提供される。本発明のある態様では、ＣＨＬ１タンパク質を含む、筋線維芽細胞を濃縮することまたは単離することに用いるための組成物が提供される。ここで「濃縮」とは、筋線維芽細胞などの線維化誘導性非血球系細胞の全細胞に対する割合を上昇させることを意味し、「単離」とは、筋線維芽細胞などの線維化誘導性非血球系細胞を他の細胞から実質的に単離することを意味する。本発明では、このようにして検出用プローブを用いて濃縮または単離された線維化誘導性非血球系細胞を含む細胞集団をも提供する。検出用プローブを用いて濃縮または単離された線維化誘導性非血球系細胞を含む細胞集団は、例えば、ＣＨＬ１と粘膜固有層ならびに粘膜下層の非免疫系および非上皮系の非血球系細胞との相互作用の抗体等による中和の検出に用いることができる。
【００３５】
本発明のある側面では、炎症組織における線維化をその必要のある対象において予防する方法であって、前記対象に本発明の抗体を投与することを含む、方法が提供される。本発明のある側面では、炎症組織の有無をそれを有している対象または有している可能性がある対象において診断する方法であって、前記組織におけるＣＨＬ１タンパク質の存在を決定することを含む、方法が提供される。本発明のある側面では、筋線維芽細胞を濃縮または単離する方法であって、ＣＨＬ１タンパク質を含むプローブを筋線維芽細胞を含む細胞画分と接触させることと、ＣＨＬ１タンパク質と結合した細胞を結合しなかった細胞から分離することとを含む、方法が提供される。
【００３６】
本発明のある側面では、線維芽細胞の活性を低下させる、コラーゲンの産生を低下させる、またはコラーゲンの沈着を抑制することに用いるための組成物または医薬の製造における本発明の抗体の使用が提供される。本発明のある側面では、炎症組織における線維芽細胞の活性を抑制することに用いるための医薬の製造における本発明の抗体の使用が提供される。本発明のある側面では、組織における炎症の有無を診断することに用いるための診断薬または診断キットの製造のための、ＣＨＬ１タンパク質に結合する抗体の使用が提供される。
【実施例】
【００３７】
実施例１：活性化線維芽細胞におけるマイクロアレイ分析
本実施例では、活性化線維芽細胞において遺伝子発現が変動している因子を同定する。
【００３８】
（Ａ）COL1a2-GFP tg/+ C57Bl/6マウス（東海大学医学部稲垣教授より寄与）を用いて未処理正常（図中では、「正」と略すことがある）、デキストラン硫酸ナトリウム水溶液(株式会社医学生物学研究所MBL)2.25-2.5%の自由飲水(5日間)後のday7-10（図中では、「急」と略すことがある）、急性腸炎を2週間の間隔で3回反復したday70-90（図中では「慢」と略すことがある）にマウスを解剖し、大腸粘膜固有層細胞をエチレンジアミン四酢酸、Collagenase処理により単離した。得られた細胞に対して、抗体染色を行いセルソーター(FACS AriaIII BD)で細胞ソーティングを行った。
【００３９】
常法により、線維芽細胞（COL1a2-GFP陽性CD45陰性Podoplanin陽性）、マクロファージ(CD45陽性F480陽性CD11b陽性)B細胞（CD45陽性CD19陽性B220陽性）、およびRecombinant Mouse M-CSF (carrier-free) （Biolegend：576404）により誘導したC57Bl/6マウス由来の骨髄マクロファージ(BM Mac)をそれぞれ分取した。
【００４０】
本実施例で用いた抗体は以下の通りであった。
【表１】
2018090524.tif 000002
【００４１】
その後、TRIZOL (Thermo Fisher Scientific)、SuperScript VILO (Thermo Fisher Scientific)を用いてRNA精製を行った。製品添付の製造者マニュアルに従って、得られたRNAをAgilent遺伝子発現マイクロアレイを用いて分析した。マイクロアレイで用いた試薬は以下の通りであった。
【００４２】
【表２】
2018090524.tif 000003
【００４３】
結果は、図１に示される通りであった。図１に示されるように、炎症を誘発させた急性期および慢性期の線維芽細胞においてのみ強発現する因子としてＣｈｌ１を同定できた。
【００４４】
実施例２：Ｃｈｌ１の組織特異的発現の検証
次に、Ｃｈｌ１の発現を各種組織または細胞を用いて確認した。
【００４５】
（Ｂ）上記同様に腸管上皮（EpCAM陽性CD45陰性）、線維芽細胞（COL1a2-GFP陽性CD45陰性Podoplanin陽性）、マクロファージ（F480陽性 CD11b陽性）、CD4陽性T細胞、B細胞（CD19陽性B220陽性）、大腸粘膜固有層細胞（whole colon cell)を単離し、それぞれの細胞からTRIZOL (Thermo Fisher Scientific/ Invitrogen: 15596018)を用いてRNAを精製し、次いでVILO (Thermo Fisher Scientific/ Invitrogen: 11755500)で逆転写を行い、Chl1の発現解析をUniversal Probe Library (ロシュ・ライフサイエンス)を用いて行ったLightCycler（商標） 480システム (ロシュ・ライフサイエンス)。Gapdhとの発現比較を示す(n=3)。結果は、図２に示される通りであった。
【００４６】
図２に示されるように、Ｃｈｌ１は、線維芽細胞において、特に急性期および慢性期の炎症を誘発した線維芽細胞において高発現を示した。このことから、Ｃｈｌ１は、急性および慢性炎症のマーカーとして好ましく用い得ることが示唆された。
【００４７】
実施例３：Ｃｈｌ１の発現部位の同定
本実施例では、Ｃｈｌ１が細胞膜上に発現することを示した。
【００４８】
（Ｃ）正常(day0)の野生型C57Bl/6マウスおよびCHL1ノックアウトマウス (D. Montag Leibniz, Institute for Neurobiology, Germanより供与)、デキストラン硫酸ナトリウム水溶液による炎症急性期(day10-15)のC57Bl/6マウスの大腸粘膜固有層細胞を単離しCHL1発現についてAnti-Mouse CHL-1/L1CAM-2 Monoclonal Antibody (R&D Systems)およびAPCヤギ抗ラットIgG（Biolegend：405407）を用いてフローサイトメトリー解析FACS Calibur (BD)を行った。ポドプラニン陽性線維芽細胞上に発現しているCHL1の発現を示した。結果は図３に示される通りであった。
【００４９】
図３に示されるように、正常型（Day0）およびＣＨＬ１ノックアウト（ＫＯ）のフォローサイトメトリー解析結果と比較して、急性期（Day10-15）では、ＣＨＬ１の細胞表面での発現が確認された。このことからＣｈｌ１は炎症時に細胞膜上に発現することが明らかとなった。
【００５０】
（Ｄ）次に、慢性炎症を誘発させたマウス大腸組織およびヒトクローン病大腸検体を用いてＣｈｌ１の発現を確認した。
【００５１】
COL1a2-GFP tg/+ C57Bl/6マウスの正常および慢性腸炎時の大腸をそれぞれ回収後4%PFAで固定し、次いで10%および20%スクロースにて置換を行った。得られた組織から凍結組織切片作製用包埋剤（ティシュー・テック O.C.T. コンパウンド）を用いて凍結組織を作製した。凍結組織から薄切切片を作製し、Anti-Mouse CHL-1/L1CAM-2 Monoclonal Antibody (R&D Systems)、Goat anti human IgG (H+L) secondary antibody, Alexa 647 conjugate (Life Technologies: A21445)、およびDAPI（核）を用いて染色を行い蛍光顕微鏡（Keyence）で観察した。
【００５２】
ヒトクローン病大腸検体および健常人の検体（大阪大学消化器内科飯島英樹先生より供与）については下記プロトコルに準じて行った。
1. Retrievagen A(BD: 550524)を用いて賦活化
2. Anti-human Fcblock (ebio 14-9161-73 mouse IgG2a)でブロッキング（室温30分）
3. １次抗体として抗ヒトCHL1ウサギポリクローナル抗体(abcam: ab106269)による一晩のインキュベーション（低温室）100uL/slides
4. 緩やかな震とう条件におけるPBSを用いた5分間×２回の洗浄
5. ２次抗体として抗ウサギAlexa 594ロバ抗体 (Biolegend:406405) による一晩のインキュベーション（低温室）100uL/slides
6. 緩やかな震とう条件におけるPBSを用いた5分間×２回の洗浄
7. DAPIによる染色（室温20分間、100uL/slides）
8. 緩やかな震とう条件におけるPBSを用いた5分間×２回の洗浄
9. Fluoremountによる封入
【００５３】
結果は図４に示される通りであった。図４上に示されるように、慢性期（図４上の右パネル）では、粘膜固有層および粘膜下層に存在するI型コラーゲン産生細胞（Ｃｏｌ１）においてＣＨＬ１分子が強く発現していた。一方で正常組織（図４上の左パネル）では、ＣＨＬ１分子の発現はほとんど認められなかった。
【００５４】
次に、炎症検体における免疫応答を確認した。結果は図４下に示される通りであった。図４下に示されるように、ヒトクローン病大腸検体（クローン病検体番号ＣＤ−１３およびＣＤ−６８）でのＣＨＬ１蛋白質の発現が確認された。一方で健常人（ＨＶ−７０）での発現は観察できなかった。この結果から、クローン病大腸検体では、組織全体にわたってＣＨＬ１タンパク質の蓄積が確認できた。
【００５５】
実施例４：損傷筋繊維の修復におけるＣＨＬ１の役割
本実施例では、ＣＨＬ１の生理機能を調査した。
【００５６】
急性腸炎を呈した野生型（WT）およびCHL1 KOマウスより大腸粘膜固有層細胞を上記方法で単離し、下記表に示される組成を有する培地で培養し、接着細胞を回収し大腸上皮細胞下筋線維芽細胞を得た。
【００５７】
【表３】
2018090524.tif 000004
【００５８】
WTおよびCHL1 KOマウス由来の大腸上皮細胞下筋線維芽細胞を6 cm dishに播種したのち、１００μＬピペットチップの先端を用いて、細胞に傷をつけるscratch assayを行った。開始前、14時間後、19時間後の細胞の回復の様子を観察した。結果は図５に示される通りであった。
【００５９】
図５に示されるように、WTでは、１４時間後には既に損傷部位が回復していることが確認されたがＣＨＬ１をノックアウトすると回復が大幅に遅延することが明らかとなった。このことからＣＨＬ１ノックアウト線維芽細胞は活性が低下していることが示された。
【００６０】
さらに、デキストラン硫酸ナトリウム投与による腸炎モデルを用いてＣＨＬ１の役割を解析した。具体的には、野生型C57Bl/6マウス(n=4)およびCHL1 KO (n=6)マウスにデキストラン硫酸ナトリウム水溶液（2.25%）を飲水投与により5日間投与し、その後、体重を測定した。また、Day18で大腸を採集しPFA固定後パラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン エオシン染色を行った。さらに、COL1a2-GFP背景のCHL WTおよびCHL KOマウスを作製し、デキストラン硫酸ナトリウム水溶液処理後に抗EpCAM抗体、抗アクチン抗体、モノクローナル抗α−平滑筋アクチン抗体−Ｃｙ３TM標識 (Sigma C6198-100UL)で大腸組織を染色し観察した。結果は、図６に示される通りであった。
【００６１】
図６により示されるように、先天的にＣＨＬ１を欠損したノックアウトマウスでは、大腸線維芽細胞の活性が低下して、粘膜の治癒に遅れが生じることが観察された（図６ＢおよびＣ）。また、ＣＨＬ１を欠損したノックアウトマウスでは、体重の回復が野生型と比較して遅れた（図６Ａ）。なお、図６Ｃによると、上皮細胞（ＥｐＣＡＭで染色される）および線維芽細胞（ａＳＭＡで染色される）において、これらの組織への集積レベルが低下していることが示されており、この結果は、線維芽細胞の活性の低下によって組織修復が遅延したことをサポートするデータであると言える。
【００６２】
さらにまた、正常もしくは腸炎を起こしたCOL1a2-GFP tg/+ C57Bl/6マウスの大腸凍結組織をマウスCHL-1タンパク質 (Fcタグ)（Sino Biological Inc）−ヤギ抗ヒトIgG(H+L)二次抗体, Alexa 647標識(Life Technologies: A21445)(赤)、およびDAPI(核)で染色し、蛍光顕微鏡(Keyence)で観察した。結果は図７左パネルの写真に示される通りであった。図７に示されるように、ＣＨＬ１は腸炎を誘発した腸管組織において腸管上皮下筋線維芽細胞および線維化が起こる粘膜下組織の局在する細胞に会合した（図７左写真）。
【００６３】
また、正常C57Bl/6マウスよりＣＤ４５陰性ＥｐＣＡＭ陰性（すなわち、上皮細胞でも免疫細胞でもない画分）として大腸粘膜固有層細胞を単離し、Podoplanin (gp38)、CD146に対する抗体(Biolegend)で染色をし、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５にゲートした（図７右参照）。Ｒ１〜Ｒ５の分画それぞれに対して、CHL-1タンパク質(Fcタグ)（Sino Biological Inc）−ヤギ抗ヒトIgG(H+L)二次抗体Alexa 647標識(Life Technologies: A21445)を用いてFACS解析を行った。結果は図８に示される通りであった。
【００６４】
図８に示されるように、ＣＤ４５陰性ＥｐＣＡＭ陰性の画分をさらにｇｐ３８およびＣＤ１４６でＲ１〜Ｒ５にゲートし、それぞれの画分に対してＣＨＬ１タンパク質を反応させたところ、Ｒ３画分においてＣＨＬ１と会合する細胞群が確認された。Ｒ３画分は、筋線維芽細胞の画分として知られる。このことからＣＨＬ１は筋線維芽細胞に対して機能することが示唆された。
【００６５】
実施例５：抗ＣＨＬ１モノクローナル抗体の作製と得られた抗体の機能解析
【００６６】
マウスＣＨＬ１遺伝子（ｍＣｈｌ１）をＰｈｕｓｉｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィク：Ｆ５３０Ｌ）を用いてＰＣＲを行いｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクターにクローニングした。ｍＣｈｌ１  ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰをＹ３Ａｇ細胞（ラットマクロファージ細胞株）に対してエレクトロポレーション法により遺伝子導入をし、７週令メスもしくはオスのＳＤラット（日本クレア）４匹にＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（フナコシ：Ｇ−１Ｘ５）と混合し足蹠および尾根部に免疫をした。３〜８回の免疫後に鼠径部リンパ節、腸骨リンパ節を単離しＡＧ８ミエローマ細胞とＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ：１０７８３６４１００１）を用いて細胞融合をした。得られたハイブリドーマについては、ＢＭ  ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１（Ｒｏｃｈｅ：１１０８８９４７００１）を加えた条件下でＨＡＴ培地（ＤＳファーマバイオメディカル：１６−８０８−４９）、ＨＴ培地（ＤＳファーマバイオメディカル：１６−８０９−４９）によって選択をした。培養上清を回収しｍＣｈｌ１  ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰを遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞を培養上清との反応後に、ＡＰＣ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｒａｔ  ＩｇＧ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：４０５４０７）を用いてＦＡＣＳ解析により上清内の抗体価を検討した。図９に示されるように、細胞表面上のＣＨＬ１タンパク質を認識した。
【００６７】
上記により得られたハイブリドーマクローン３３６についてはＢａｌｂ／ｃヌードマウス（雌、７週齢、日本クレア社）に約５×１０6細胞腹腔投与し腹水を回収した。腹水についてはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇを用いて抗体を精製し、以後の研究に用いた。
【００６８】
次に、得られた抗体の活性を評価した。阻害活性については、大腸粘膜固有層細胞を回収後、２×１０6細胞をＣＨＬ−１タンパク質（Ｆｃタグ）（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ）５０ｎｇ／５０μｌと４℃で３０分間反応させ、その際にＣＨＬ１抗体（３３６）１μｇ／５０μｌを添加し、その後ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体，Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ａ２１４４５）を用いてＣＨＬ−１タンパク質の吸着反応への阻害をフローサイトメトリーによって検証した。結果は、図１０左の上下パネルに示される通りであった。
【００６９】
図１０左のパネルに示されるように、３３６抗体の非存在下では、大腸粘膜固有層細胞はＣＨＬ１と結合し、細胞表面上のＦｃタグが抗体により検出できた（図１０左上）。一方で、３３６抗体の存在下では、３３６抗体により大腸粘膜固有層細胞とＣＨＬ１タンパク質との結合が遮断された（図１０左下）。同様に、７５ｎｇのＣＨＬ１−Ｆｃ存在下で３３６抗体は大腸粘膜固有層細胞へのＣＨＬ１タンパク質の結合を阻害した（図１０右）。
【００７０】
以下では、得られた３３６抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列と軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ−Ｈ１〜−Ｈ３はそれぞれ、重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３（それぞれ配列番号１〜３）を示し、ＣＤＲ−Ｌ１〜−Ｌ３はそれぞれ、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３（それぞれ配列番号５〜７）を示す。
【００７１】
３３６抗体の重鎖可変領域には、シグナル配列（MKCRWIILFLMAVATGVNS）がそのＮ末端に存在するが以下では記載を省略する。３３６抗体の軽鎖可変領域には、シグナル配列（MDFRVQIFSFLLVSITVIVSSG）がそのＮ末端に存在するが以下では記載を省略する。
【００７２】
【化１】
2018090524.tif 000005
【００７３】
【化２】
2018090524.tif 000006
【００７４】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ阻害実験については、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（日本クレア）雄８週令にデキストラン硫酸ナトリウム水溶液２．２５％による腸炎の誘導をし、３３６抗体（ｎ＝４）もしくはコントロール抗体（ポリクローナルラットＩｇＧ：ＢｉｏＸｃｅｌｌ  ：ＢＥ００９４）（ｎ＝４）を６日目〜１０日目にかけて連日２５０μｇ／回の腹腔投与を行った。体重変化について毎日１６時前後に体重を測定した。１１日目に解剖をし、大腸、および大腸ＨＥ染色（ヘマトキシリンエオシン染色）について代表的な写真を示す。結果は図１１に示される通りであった。
【００７５】
図１１に示されるように、３３６抗体は、急性期における炎症の回復を遅延させた（図１１左グラフ）。また、図１１の右下のＨＥ染色の結果も同様に、３３６抗体は急性期における炎症の回復を遅延させた。このことから、ＣＨＬ１タンパク質の細胞膜上の受容体への結合を遮断できる抗体は、炎症を抑制できることが明らかとなった。
【００７６】
実施例６：ＣＨＬ１発現量を指標とした炎症の検査
【００７７】
Ｃ５７Ｂｌ／６野生型マウスにデキストラン硫酸ナトリウム水溶液２．２５％〜２．５％の反復自由飲水によって慢性腸炎（線維化）を誘導した。１０日目〜１５日目、６０日目〜７０日目、１００日目、１２０日目、１３０日目における大腸粘膜固有層中の線維芽細胞のＣＨＬ１発現についてＦＡＣＳ解析を行った。ＣＨＬ１発現について抗マウスＣＨＬ−１／Ｌ１ＣＡＭ−２モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）−ＡＰＣヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：４０５４０７）を用いてＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）によりフローサイトメトリー解析を行った。細胞を血球系マーカーのＣＤ４５、線維芽細胞マーカーのポドプラニンに対する抗体で標識したのちに、ＣＤ４５陰性、ポドプラニン陽性線維芽細胞を選択し、細胞表面上に発現しているＣＨＬ１の発現を解析した。結果は図１２に示される通りであった。
【００７８】
図１２に示されるように、急性炎症の指標となる好中球の浸潤が軽減し且つ、腸炎誘導から60日後の慢性期においても発現が維持されていることが明らかとなった。慢性期におけるＣＨＬ１タンパク質の発現は細胞の線維化の指標となり得るものである。
【００７９】
デキストラン硫酸ナトリウム水溶液を用いた急性（ｎ＝１２）、慢性炎症（ｎ＝１６）を呈しているマウス、ならびに未処理マウス（ｎ＝１３）から糞便を採集し、糞便中のＣＨＬ１量を解析した。下記に実験の手法を示す。
【００８０】
１日目
１．精製された３３６抗体存在下で４℃で一晩インキュベートし９６ウェルプレートをコーティングする（１μｇ／ｍｌを１００μＬ／ウェルで添加）
【００８１】
２日目
１．洗浄緩衝液（０．０５％  ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で３回洗浄
２．ブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）を添加し（３００μＬ／ウェル）、室温で少なくとも１時間インキュベート
３．洗浄緩衝液で３回洗浄
４．１００μｌのサンプル添加(１ｍｇ／１０μＬ  ＰＢＳ  ４℃で３０分間ボルテックスおよび遠心分離１５０００ｒｐｍ（１５分）、次いで上清の回収
一晩
【００８２】
３日目
１．洗浄緩衝液で３回洗浄
２．ビオチン化３３６抗体を添加(detection Ab:stock 1mg/ml希釈液: reagent diluent 1% BSA in PBS)（１μｇ／ｍｌを１００μＬ／ウェルで添加）室温で２時間インキュベート
３．洗浄緩衝液で３回洗浄
４．ストレプトアビジン-HRP(R&D lot#310801/Part#893975)（希釈率1:40で100μL/wells）を添加し２時間インキュベート
５．洗浄緩衝液で３回洗浄
６．ＨＲＰの基質を添加（100μl/well）し、４５分間インキュベート
７．反応停止液（50μL H2SO4）添加
８．吸光測定（450nm/570nm）
【００８３】
結果は図１３に示される通りであった。図１３に示されるように、急性または慢性線炎症のマウス群では通常のマウスよりも糞便中のＣＨＬ１量が統計学的に有意に高まっていた。このことから、糞便を用いてもＣＨＬ１のタンパク質量を測定することにより炎症の有無を判別することが可能であることが示された。この結果からはまた、ＣＨＬ１が分泌因子として機能しうることを示している。
【００８４】
実施例７：線維化誘導過程におけるＣＨＬ１抗体の治療学的意義
本実施例では、急性炎症後の線維化誘導過程におけるＣＨＬ１抗体の役割を調べた。
【００８５】
デキストラン硫酸ナトリウムの反復自由飲水による腸管線維化マウスにおいて、前記反復飲水を３回目行った後に、体重減少が回復したタイミング（５６〜６６日目）で、３３６抗体（２５０μｇ／投与）を連日腹腔内投与した。コントロール抗体としては、ポリクローナルラットＩｇＧ（ＢｉｏＸｃｅｌｌ  ：ＢＥ００９４）の腹腔内投与を行った。６７日目または６８日目にマウスを解剖し、大腸組織を回収後にパラフィン薄切切片を作製した。アザン染色もしくはα−Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  −  Ｃｙ３TM  ａｎｔｉｂｏｄｙ，  Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｃｌｏｎｅ  １Ａ４，  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  （Ｓｉｇｍａ  Ｃ６１９８−１００ＵＬ）（赤）とＤＡＰＩ（核：青）染色を行い、コラーゲンの沈着と活性化線維芽細胞・筋線維芽細胞の集積を解析した。結果は図１４に示される通りであった。
【００８６】
図１４に示されるように、ＣＨＬ１モノクローナル抗体である３３６抗体は、急性炎症後における組織へのコラーゲン沈着を抑制し、また、線維芽細胞の活性化を抑制した。
【００８７】
上記実施例から、ＣＨＬ１に対する抗体は、ＣＨＬ１による炎症を抑制することが示された。また、炎症を慢性期において抑制した場合には、コラーゲンの沈着や線維芽細胞の活性化を抑制することができ、これにより、炎症組織の線維化を抑制しうることが明らかとなった。
【００８８】
配列番号１：３３６抗体の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２：３３６抗体の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３：３３６抗体の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４：３３６抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号５：３３６抗体の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号６：３３６抗体の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号７：３３６抗体の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号８：３３６抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
【図１】
2018090524.tif 000007
【図２】
2018090524.tif 000008
【図３】
2018090524.tif 000009
【図４】
2018090524.tif 000010
【図５】
2018090524.tif 000011
【図６】
2018090524.tif 000012
【図７】
2018090524.tif 000013
【図８】
2018090524.tif 000014
【図９】
2018090524.tif 000015
【図１０】
2018090524.tif 000016
【図１１】
2018090524.tif 000017
【図１２】
2018090524.tif 000018
【図１３】
2018090524.tif 000019
【図１４】
2018090524.tif 000020
【配列表】
2018090524000001.app