(57)【要約】【課題】本発明は、RHA1株を地下環境に送って揮発性有機塩素化合物を浄化するにあたり、揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させるために加える必要のあるビフェニルやエチルベンゼンなどの物質による地下環境の汚染が発生しない方法を開発することを目的とする。【解決手段】ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）RHA1株培養液中に、RHA1株に揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させる化合物を含むガスを送気して、揮発性有機塩素化合物分解能を有するRHA1株を培養する方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）RHA1株培養液中に、RHA1株に揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させる化合物を含むガスを送気して、揮発性有機塩素化合物分解能を有するRHA1株を培養する方法。
【請求項２】
揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させる化合物が、エチルベンゼンまたはビフェニルであることを特徴とする請求項１記載の揮発性有機塩素化合物分解能を有するRHA1株を培養する方法。
【請求項３】
揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させる化合物を含むガスの送気を停止したのちに、空気を送気して培養液中に残存する揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させる化合物を除去することを特徴とする請求項１又は２に記載された揮発性有機塩素化合物分解能を有するRHA1株を培養する方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載されたRHA1株を培養する方法を閉鎖系で行い、排気系に揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させる化合物を除去する手段を設けたことを特徴とする揮発性有機塩素化合物分解能を有するRHA1株を培養する方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の培養方法で培養された揮発性有機塩素化合物を分解する能力を備えたRHA1株を用いて、揮発性有機塩素化合物汚染土壌を浄化する方法。
【請求項６】
送気手段Ａ、揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させる化合物をガス化する手段Ｂ、RHA1株培養手段Ｃを備えた揮発性有機塩素化合物に分解能力を発現させたRHA1株を培養する装置であって、送気手段Ａから手段Ｂ、手段Ｃの順にパイプで連結する配管系Ｄを備えていることを特徴とするRHA1株培養装置。
【請求項７】
さらに、排気に含まれる揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させる化合物を除去する除去手段Ｅを設け、配管系ＤとしてRHA1株培養手段Ｃと除去手段Ｅとを連結するパイプを設けたことを特徴とする請求項６記載のRHA1株培養装置。
【請求項８】
さらに、請求項６又は７に記載されたRHA1株培養装置と培養されたRHA1株を揮発性有機塩素化合物で汚染された土壌に供給する注入手段Ｆを備えていることを特徴とする土壌浄化装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を利用して揮発性有機塩素化合物を分解する技術に関する。特に、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）RHA1株に着目した分解技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中に拡散した化学汚染物質を、微生物を用いて浄化する技術は、廃水処理における活性汚泥法、嫌気処理法等に広く利用されている。
また、近年では、有害化学物質に汚染された土壌及び地下水を微生物によって浄化する技術（バイオレメディエーション）が、環境負荷及び浄化コストの小さい方法として注目されている。
例えば、（１）嫌気性脱塩素化細菌を利用した技術が非特許文献１等に開示されている。トリクロロエチレン、シス-1,2-ジクロロエチレン等の塩素化エチレン類で汚染された地下水を浄化するために、微生物の栄養源となる有機物を浄化井戸等から帯水層中に注入し、地下水を嫌気環境にし、嫌気性脱塩素化細菌を活性化させて、塩素化エチレンを無害なエチレンに浄化する技術が広く実用化されている。
この技術では、脱塩素化細菌が塩素化エチレンの塩素を一個ずつ水素に置換するため、浄化過程において塩化ビニルモノマーが中間生成物として必ず生成される（図６）。塩化ビニルモノマーは、環境省により2009年に地下水環境基準の項目に追加されている。この塩化ビニルモノマーの規制濃度は、トリクロロエチレン及びシス-1,2-ジクロロエチレンより1オーダー以上小さく設定されており、この技術による浄化では、進捗によって地下水中に環境基準値を超過する塩化ビニルモノマーが生成して二次的な地下水汚染が生じるおそれがある。
【０００３】
（２）好気性菌を利用する例が非特許文献２等に開示されている。
トリクロロエチレン、シス-1,2-ジクロロエチレン等を分解可能な好気性細菌が多く報告されている。
好気的な脱塩素化反応は、トルエン、フェノール、メタン等を単一炭素源として増殖するトルエン資化性菌、フェノール資化性菌、メタン資化性菌等によって主に行われる。これらの菌が、トルエン、フェノール、メタン等を好気条件下で炭素源として利用する際に生成する酸化酵素は、基質特異性が広い。例えば、メタンオキシゲナーゼの場合、メタンと共にトリクロロエチレンが存在していると、メタンの酸化に加えて、トリクロロエチレンの共代謝（共酸化）反応が同時に進行して、トリクロロエチレンの脱塩素化反応が促進することが知られている（非特許文献２）。
この技術において、これらの共代謝反応を促進するために必要な炭素源（電子供与体）は、トルエン、フェノール等の有害な物質であるため、分解されずに残存した有害物質の地下環境への汚染が課題となっていた。
【０００４】
（３）ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）RHA1株を利用して揮発性有機塩素化合物を分解する方法が特許文献１（特許第２９９００１６号公報）や非特許文献３に開示されている。
RHA1株は、ビフェニルジオキシゲナーゼ（BphA及びEtbA）の水酸化反応によってトリクロロエチレン、シス-1,2-ジクロロエチレン等の揮発性有機塩素化合物を分解することができる（非特許文献3）。これらの酵素遺伝子を発現させるためにはビフェニルやエチルベンゼンといった有害物質を加えて誘導する必要がある。
RHA1株を利用して汚染された土壌を浄化するために地下環境へ導入する場合、これらの有害物質を地下環境に送ることは、副次的に注入した物質による汚染になる可能性があり、慎重に行う必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２９９００１６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】化学と生物, Vol. 49, No. 4, pp. 256-260, 2011
【非特許文献２】Takeda, H., Yamada, A., Miyauchi, K., Masai, E., & Fukuda, M. (2004). Characterization of transcriptional regulatory genes for biphenyl degradation in Rhodococcus sp. strain RHA1. Journal of bacteriology, 186(7), 2134-2146.
【非特許文献３】千野佳奈子, 米塚健太, 荒木直人, 笠井大輔, & 福田雅夫. (2014). P19-3 Rhodococcus jostii RHA1による cis-1, 2-ジクロロエチレンの分解に関わる酵素遺伝子の解析 (ポスター発表). 日本微生物生態学会講演要旨集, 2014, 188.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、RHA1株を地下環境に送って揮発性有機塩素化合物を浄化するにあたり、揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させるために加える必要のあるビフェニルやエチルベンゼンなどの物質による地下環境の汚染が発生しない方法を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、主に次の構成を主として、揮発性有機塩素化合物を分解する能力が発現したRHA1株を得ることができ、揮発性有機塩素化合物を浄化することができるものである。
１．ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）RHA1株培養液中に、RHA1株に揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させる化合物を含むガスを送気して、揮発性有機塩素化合物分解能を有するRHA1株を培養する方法。
２．揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させる化合物が、エチルベンゼンまたはビフェニルであることを特徴とする１．記載の揮発性有機塩素化合物分解能を有するRHA1株を培養する方法。
３．揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させる化合物を含むガスの送気を停止したのちに、空気を送気して培養液中に残存する揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させる化合物を除去することを特徴とする１．又は２．に記載された揮発性有機塩素化合物分解能を有するRHA1株を培養する方法。
４．１．〜３．のいずれかに記載されたRHA1株を培養する方法を閉鎖系で行い、排気系に揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させる化合物を除去する手段を設けたことを特徴とする揮発性有機塩素化合物分解能を有するRHA1株を培養する方法。
５．１．〜４．のいずれかに記載の培養方法で培養された揮発性有機塩素化合物を分解する能力を備えたRHA1株を用いて、揮発性有機塩素化合物汚染土壌を浄化する方法。
６．送気手段Ａ、揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させる化合物をガス化する手段Ｂ、RHA1株培養手段Ｃを備えた揮発性有機塩素化合物に分解能力を発現させたRHA1株を培養する装置であって、送気手段Ａから手段Ｂ、手段Ｃの順にパイプで連結する配管系Ｄを備えていることを特徴とするRHA1株培養装置。
７．さらに、排気に含まれる揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させる化合物を除去する除去手段Ｅを設け、配管系ＤとしてRHA1株培養手段Ｃと除去手段Ｅとを連結するパイプを設けたことを特徴とする６．記載のRHA1株培養装置。
８．さらに、６．又は７．に記載されたRHA1株培養装置と培養されたRHA1株を揮発性有機塩素化合物で汚染された土壌に供給する注入手段Ｆを備えていることを特徴とする土壌浄化装置。
【発明の効果】
【０００９】
１．RHA1株に揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させる誘導物質が残存しない状態の下で揮発性有機塩素化合物を分解する能力を備えたRHA1株を培養することができる。
２．揮発性有機塩素化合物を分解する能力を獲得したRHA1株を地下環境に送って揮発性有機塩素化合物を浄化することができるので、発現させるために加えるビフェニルやエチルベンゼンなどの物質は土壌に注入する必要が無く、これらの物質による地下環境の汚染を発生させる恐れはない。
３．発現誘発物質をガス状態で添加することにより、添加量を少なく調整することができ、また、余剰ガスを吸着回収するので、空気中の汚染防止も図ることができる。仮に、放出されたとしても、微量であって、土壌には浸透せずに重大汚染を防止することができる。
４．高濃度のエチルベンゼン等はRHA1株に対しても、有害であり、培養の妨げになるので添加濃度をコントロールする必要がある。高濃度のエチルベンゼン等を添加する場合は、均一に分散するまでに接触するRHA1株に害を与え、菌体濃度が減少する恐れが生じる。気化したエチルベンゼン等を含む空気には、微量のエチルベンゼンが含まれており、液分を増加することもないので、発現に必要で、RHA1株の培養にマイナスとならない程度のエチルベンゼンを添加することができる。
発現に必要なエチルベンゼン等の化合物の量も少なく、排気中に取り込むことでRHA1株培養液中に残存するエチルベンゼン等が少なくなる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】塩化エチレン類による土壌・地下水の汚染状況を示すモデル図。
【図２】本発明によるRHA1株の塩素化エチレン類を分解する酵素遺伝子を発現させる培養装置を示す図。
【図３】試験条件１〜４の７日経過後のシス-1,2-ジクロロエチレン分解率を示すグラフ。
【図４】試験条件５〜９の７日経過後のシス-1,2-ジクロロエチレン分解率を示すグラフ。
【図５】残存エチルベンゼン濃度の経時変化を示すグラフ。
【図６】脱塩素化細菌が塩素化エチレンの塩素を一個ずつ水素に置換する、浄化過程において中間物として生成する塩化ビニルモノマーの変化を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）RHA1株培養液中に、RHA1株に揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させる化合物を含むガスを送気して、揮発性有機塩素化合物分解能を有するRHA1株を培養する方法である。
ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）RHA1株は、製品評価技術基盤機構から入手することができる（ＮＢＲＣ  １０８８０３）。
RHA1株に揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させる化合物であるエチルベンゼン、ビフェニル等を培養液に直接添加することは、これらの添加化合物による地下環境への汚染に繋がる。本発明は、これらの化合物を揮発させて、気化したガスを培養液に送り込み曝気することで、RHA1株の酵素遺伝子を発現させる。また化合物ガスを停止して、培養終了前に空気のみを送り込むことで培養液中に溶け込んだ化合物ガスを再度揮発させ、培養液から除去する。空気にとけ込んだ化合物ガス成分は排気系に吸着手段を設けて、吸着して、環境中に有害な化合物ガスを放散させないようにする。
揮発性有機塩素化合物を分解する能力を獲得したRHA1株培養液を浄化対象土壌に注入することにより、二次汚染が発生しない土壌浄化方法である。
【００１２】
（RHA1株の揮発性有機塩素化合物分解能力について）
RHA1株は、ビフェニルジオキシゲナーゼの水素化反応によって、トリクロロエチレン、シス-1,2-ジクロロエチレン等の揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発揮することができることを利用するものである。
これらの酵素遺伝子を発現させるためには、エチルベンゼン、ビフェニル等などの有害物質を加えて誘導する必要がある。加えられたこれらの誘導物質は、発現過程ですべてが消費されることは無く、RHA1株培養液中に残存することとなり、揮発性有機塩素化合物分解能力を獲得したRHA1株培養液を土壌中に注入することは、誘導物質による二次汚染を発生させる恐れがあって、このままでは使用できない。
本発明は、エチルベンゼン、ビフェニル等などの有害物質を含まない揮発性有機塩素化合物分解能力を獲得したRHA1株培養液を提供する。
【００１３】
（誘導物質）
誘導物質は、エチルベンゼン、ビフェニル等である。本発明では、これらの誘導物質を気化させたガスを利用する。気化してガス化することにより、空気に混ぜて濃度をコントロールして添加することができ、液体で添加するよりも少ない量を曝気によってRHA1株培養液中に導入することにより、RHA1株の揮発性有機塩素化合物分解遺伝子を発現させることができる。特に、エチルベンゼンは、揮発性が高く、利用しやすい。
RHA1株培養液に送り込んだエチルベンゼンは、所定時間曝気した後、RHA1株に消費されずにいくらか残存するが、空気の曝気を行うことにより、排気中に取り出すことができ、揮発性有機塩素化合物分解能力を獲得したRHA1株培養液から除去することができる。
さらに、排気中に取り込まれたエチルベンゼンは、吸着剤などを利用して、除去することができ、最終的に大気中に放出される排気には有害なエチルベンゼンは含まれない。
【００１４】
（揮発性有機塩素化合物）
分解対象の揮発性有機塩素化合物は、シス-1,2-ジクロロエチレン、テトラトリクロロエチレン、トリクロロエチレン、トランス−1,2-ジクロロエチレン、1,１-ジクロロエチレン等の塩素化合物である。
シス-1,2-ジクロロエチレン（1,2-DCE）、トリクロロエチレン（TCE）、テトラクロロエチレン（PCE）などの、塩素化エチレン類は油に対する洗浄剤として、金属産業、半導体のハイテク産業分野で使用されている。ドライクリーニング店など幅広い産業分野でも使用されている。これらは、難水溶性の液体で、工場などから地盤に漏洩すると、途上に吸着せず、分解せずに、シルト層や粘土層の難透水層上にとどまる。
物質的に難水溶性であるが、一部は地下水に溶け込み、土壌中に拡散する。したがって、浄化対象は、かなり深くにある難透水層の上部に形成される帯水層が中心となる。
【００１５】
（洗浄対象土壌）
前記するように、塩化エチレンが拡散している帯水層を中心に土壌浄化を行う。土壌モデルを図１に示す。
本発明は、注入井戸を設けて、対象地層へ活性化したRHA1株の培養液を注入する。大規模な対象地では、現場に培養サイトを設けて、注入する。RHA1株は好気性であるので、空気が少ない場合は、空気を土中に送る。
また、クリーニング店等の小面積な跡地の浄化は、注入管とRHA1株の培養液を搭載した移動施用機を用いることができる。さらに、培養装置も搭載して移動培養装置つきの使施用機とすることもできる。  
【００１６】
（装置構成）
本発明は次のような培養装置を開発することにより、RHA1株の培養を実現した。
送気手段A、揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させる化合物をガス化する手段B、RHA1株培養手段Cを備えた揮発性有機塩素化合物に分解能力を発現させたRHA1株を培養する装置であって、送気手段Aから手段B、手段Cの順にパイプで連結する配管系Dを備えているRHA1株培養装置である。
送気手段Aは、エアポンプなどである。
化合物をガス化する手段Bは、エチルベンゼンなどの化合物液を収納したタンクや槽などの密閉した容器であり、この容器にエアポンプからパイプで空気を導入し、曝気して空気中に気化したエチルベンゼンを取り込んで、パイプで連結したRHA1株培養手段Cへ送る。
RHA1株培養手段Cは、RHA1株と培養液を収納した密閉されたタンクや槽であり、エチルベンゼンガスなどが混合した空気を培養液中に曝気して、導入する。曝気によって、エチルベンゼンなどの化合物の添加量を微量にコントロールでき、全体に拡散させるのも容易である。混合ガスを適当な時間続けて、補給しつつ、揮発性有機塩素化合物を分解する能力を発現させた活性化したRHA1株を培養する。
培養液は、通常ロドコッカス・ジョスティ菌を培養する基材を用いる。
培養手段Cから混合ガスを注入する一方、排気を取る。浄化されずに排気中に含まれるエチルベンゼンなどは、有害物質でもあるのでトラップ手段を介して大気中に放出する。
さらに、RHA1株培養液中に消費されないエチルベンゼンなどが残存している場合があり、混合ガスの注入を停止した後に空気のみを培養手段Cに導入して、残存するエチルベンゼンなどを取り込むクリーニング処理を施す。排気は、前述と同様にトラップする。
このように、RHA1株培養装置を閉鎖系で構成し、活性化したRHA1株培養液、及び排気に、有害な物質が含まれないようにすることができる。
【００１７】
装置自体は、エアポンプ、タンク、槽、パイプで構成されるので、コンパクト化することが可能であり、専用の培養装置を移動車に搭載することができ、クリーニング店跡地などの小規模で分散する浄化対象地に適用することができる。
大きな工場跡地などのような場所では、大型装置を据え付けて、多数ポイントへ配管して継続して注入することができる。
【００１８】
［実施形態１］
本発明によるRHA1株の塩素化エチレン類を分解する酵素遺伝子を発現させる培養装置11を図２に示す。
送気ポンプ1、2、エチルベンゼン揮発槽3、RHA1株培養槽4、エチルベンゼン吸着槽5、排気装置7をそれぞれ配管系6でつないで培養装置11を構成する。RHA1株培養槽4には、RHA1株培養液9が充填されており、エチルベンゼン揮発槽3には、エチルベンゼン液8が充填されており、エチルベンゼン吸着槽5には活性炭などの吸着材10が充填されている。
この培養装置11では、（１）エチルベンゼン揮発槽3にエアーポンプ等の送気ポンプ1で空気を、送気ポンプ2でエチルベンゼンを送り込む。なお、エチルベンゼン揮発槽3は、流量調整バルブにより送気量を調整することができる。（２）エチルベンゼン揮発槽3では、揮発性の高いエチルベンゼンは空気と混ざり合い、RHA1株培養槽4の培養液9の方に送り込まれる。（３）培養液中のRHA1株は送り込まれたエチルベンゼンによって誘導され、酵素遺伝子を発現させる。（４）RHA1株培養液9を通過した空気は最後に活性炭などの吸着材10が入ったエチルベンゼン吸着槽5に送られ、ここでエチルベンゼンを吸着し、排気装置７を通して大気中に放出される。
【００１９】
［試験例１］エチルベンゼン誘導によるRHA1株のシス-1,2-ジクロロエチレン分解能確認試験
本試験ではエチルベンゼン誘導によるRHA1株のシス-1,2-ジクロロエチレン分解能を確認するために、W無機塩培地（表1）を使ってシス-1,2-ジクロロエチレンの分解試験を行った。
（１）RHA1株の事前培養
・100 mlのLB液体培地（1 g/l Bacto tryptone、0.5 g/l Yeast extract、0.5 g/l NaCl）にRHA1株を植菌して、24時間培養した。
20 mMのコハク酸、1 g/lの酵母エキス、5 mM 硫酸アンモニウムを添加したW無機塩培地を200 ml用意し、そこにLB液体培地で24時間培養したRHA1株を加え、100 rpm及び30℃で48時間培養した。
（２）活性化培養
その後、ポンプから排出される空気をエチルベンゼンが入った容器を経由させ培養器に送り込み、約6時間曝気する。曝気終了1時間前にエチルベンゼンが入った容器を外し、曝気する。
培養後の菌体を遠心分離（5,000 rpm、10分、25℃）により回収し、W無機塩培地を用いて菌体洗浄を行ったものを分解試験に使用した。
（３）シス-1,2-ジクロロエチレンの分解試験
表2に試験条件を示す。
条件2から条件4は、RHA1株菌体濃度を1.0×107、1.0×108、1.0×109cells/mLとなるように添加した。
条件1はRHA1株を添加しない対照区とした。
それぞれ使用するバイアル瓶にＷ無機塩培地、菌液を投入後、調製したシス-1,2-ジクロロエチレン濃縮液をバイアル瓶内に添加した。ブチルゴム栓とアルミシールにより密栓した後、手動により攪拌して均質化し、20℃の恒温槽内で静置培養を行った。
7日経過後にバイアル瓶を開栓して上澄み液をピペットで採取して分析を行った。
（４）試験結果
図３に各条件の7日経過後のシス-1,2-ジクロロエチレン分解率を示す。なお分解率は対照区である条件1のシス-1,2-ジクロロエチレン濃度を基準に、各条件の分解率を算出した。
この結果よりエチルベンゼンによる誘導作用によって酵素遺伝子が発現しRHA1株によるシス-1,2-ジクロロエチレン分解が起きたことが示された。
またRHA1株菌数が多いほど、シス-1,2-ジクロロエチレン分解量は増加する傾向が見られた。
表1  Ｗ無機塩培地組成
2018174742.tif 000003
表2  試験条件
2018174742.tif 000004
【００２０】
［試験例２］実汚染地下水を用いたRHA1株によるシス-1,2-ジクロロエチレン分解試験
本試験ではエチルベンゼン誘導によるRHA1株のシス-1,2-ジクロロエチレン分解能が実汚染地下水中においても影響を受けることなくシス-1,2-ジクロロエチレンを分解するか検討を行った。
（１）RHA1株の事前培養
100 mlのLB液体培地（1 g/l Bacto tryptone、0.5 g/l Yeast extract、0.5 g/l NaCl）にRHA1株を植菌して、24時間培養した。
20 mMのコハク酸、1 g/lの酵母エキス、5 mM 硫酸アンモニウムを添加したW無機塩培地を200 ml用意し、そこにLB液体培地で24時間培養したRHA1株を加え、100 rpm及び30℃で48時間培養した。
（２）活性化培養
その後、ポンプから排出される空気をエチルベンゼンが入った容器を経由させ培養器に送り込み、約6時間曝気する。
曝気終了1時間前にエチルベンゼンが入った容器を外し、曝気する。
培養後の菌体を遠心分離（5,000 rpm、10分、25℃）により回収し、W無機塩培地を用いて菌体洗浄を行ったものを分解試験に使用した。
（３）シス-1,2-ジクロロエチレンの分解試験
表3に試験条件を示す。
条件6から条件9は、RHA1株菌体濃度を1.0×107、1.0×108、5.0×108、1.0×109 cells/mLとなるように添加した。
条件5はRHA1株を添加しない対照区とした。
それぞれ使用するバイアル瓶に実汚染地下水、菌液を投入後、調製したシス-1,2-ジクロロエチレン濃縮液をバイアル瓶内に添加した。ブチルゴム栓とアルミシールにより密栓した後、手動により攪拌して均質化し、20℃の恒温槽内で静置培養を行った。7日経過後にバイアル瓶を開栓して上澄み液をピペットで採取して分析を行った。
（４）試験結果
図４に各条件の7日経過後のシス-1,2-ジクロロエチレン分解率を示す。
なお分解率は対照区である条件5のシス-1,2-ジクロロエチレン濃度を基準として、各条件の分解率を算出した。
この結果より実汚染地下水中においてもRHA1株はシス-1,2-ジクロロエチレンを分解することが示された。
表３  試験条件
2018174742.tif 000005
【００２１】
［試験例３］培養液中のエチルベンゼン除去効果の確認検討
本試験では活性化処理により培養液中に残存したエチルベンゼンが実際に除去されるかを確認するための試験を行った。
（１）RHA1株の事前培養
100 mlのLB液体培地（1 g/l Bacto tryptone、0.5 g/l Yeast extract、0.5 g/l NaCl）にRHA1株を植菌して、24時間培養した。
20 mMのコハク酸、1 g/lの酵母エキス、5 mM 硫酸アンモニウムを添加したW無機塩培地を500 ml用意し、そこにLB液体培地で24時間培養したRHA1株を加え、100 rpm及び30℃で48時間培養した。
（２）活性化培養
その後、ポンプから排出される空気をエチルベンゼンが入った容器を経由させ培養器に送り込み、約24時間曝気する。
その後エチルベンゼンが入った容器を外し、空気のみを曝気し培養液中のエチルベンゼンの除去を行う。エチルベンゼンが除去されているかを確認するために、活性化処理を始めて3、24、48、96、168時間後（24時間以降は空気のみによる曝気）にそれぞれ培養液を採取して、ガスクロマトグラフによりエチルベンゼン濃度を測定した。
（３）試験結果
図6に時間経過毎のエチルベンゼン濃度の経時変化を示す。活性化処理中は溶解したエチルベンゼン濃度はほぼ一定であった。また1日空気のみ送り込むことで検出限界近い濃度まで低下することが示された。この濃度くらいであれば、土壌中に導入しても環境汚染に繋がる恐れはないと思われる。今回作成した装置により、RHA1株の培養、活性化、汚染度の低い培養液の作成といった一連の流れを実施できることが示された。
【符号の説明】
【００２２】
１・・・送気ポンプ
２・・・送気ポンプ
３・・・エチルベンゼン揮発槽
４・・・RHA1株培養槽
５・・・エチルベンゼン吸着槽
６・・・配管系
７・・・排気装置
８・・・エチルベンゼン液
９・・・RHA1株培養液
１０・・・吸着材
１１・・・培養装置
【図１】
2018174742.tif 000006
【図２】
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【図３】
2018174742.tif 000008
【図４】
2018174742.tif 000009
【図５】
2018174742.tif 000010
【図６】
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