(57)【要約】【課題】ミクロ孔やミクロないしメソ孔を有する多孔質シリケートや、これと類似した表面性状を有する機能性微粒子の特性を保持しながら、同時に高い耐水性や濾過性、反応性を有する多元多孔質成形体及びその製造方法を提供する。【解決手段】ミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体は、細孔直径が０．３ｎｍ〜５０ｎｍのミクロないしメソ孔を有する、シリケート、アルミノシリケート、アルミナ又はチタニアを主成分とし、粒径が０．０１μｍ〜２００μｍである機能性微粒子と、有機高分子とを含む多孔質成形体であって、細孔直径が５０ｎｍ〜１００μｍのマクロ孔を有し、空隙率が３４％以上の多孔体であり、成形体中の機能性微粒子の含有率が４６質量％以上であり、機能性微粒子の表面の少なくとも一部が成形体から表出しており、ミクロないしメソ孔の細孔容積が、原料機能性微粒子の４０％以上保持されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細孔直径が０．３ｎｍ〜５０ｎｍのミクロないしメソ孔を有する、シリケート、アルミノシリケート、アルミナ又はチタニアを主成分とし、粒径が０．０１μｍ〜２００μｍである機能性微粒子と、有機高分子とを含む多孔質成形体であって、
細孔直径が５０ｎｍ〜１００μｍのマクロ孔を有し、
空隙率が３４％以上の多孔体であり、
前記成形体中の前記機能性微粒子の含有率が４６質量％以上であり、
前記機能性微粒子の表面の少なくとも一部が前記成形体から表出しており、
前記機能性微粒子の前記ミクロないしメソ孔の細孔容積が、原料機能性微粒子の４０％以上保持されている、
ことを特徴とするミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体。
【請求項２】
水中で２４時間以上連続攪拌した時の前記多孔質成形体の攪拌前後での重量変化が１％以下であることを特徴とする、請求項１に記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体。
【請求項３】
前記多孔質成形体の形状が、粒状、中空粒子状又は中空糸状であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体。
【請求項４】
前記機能性微粒子及び／又は前記有機高分子が複数種による混合体であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体。
【請求項５】
前記機能性微粒子の原料機能性微粒子の機能が、吸着性能であり、多孔質成形体の成形後に前記機能の特性発現が保持されていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体。
【請求項６】
数ミクロンサイズの粒子を分散液中から加圧濾過できることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体。
【請求項７】
前記有機高分子がポリエーテルサルホン、ポリサルホン、ＥＶＯＨ樹脂、ＰＭＭＡ樹脂又はポリアミドイミド樹脂であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体。
【請求項８】
前記有機高分子を予め溶解させた有機溶媒中にミクロないしメソ孔を有するシリケート、アルミノシリケート、アルミナ又はチタニアを主成分とする機能性微粒子を分散させて原料スラリーを得る工程と、
非溶媒中に前記原料スラリーを射出することによって成形する工程と、を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体の製造方法。
【請求項９】
前記有機高分子が親水基を有する、請求項８に記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体の製造方法。
【請求項１０】
前記有機高分子がＰＭＭＡ樹脂又はポリアミドイミド樹脂であり、成形後に重合促進剤又は硬化促進剤で処理する工程、を更に含むことを特徴とする請求項８又は９に記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体の製造方法。
【請求項１１】
前記ミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体を、減圧下のエタノール中又は良溶媒の低濃度水溶液中において低温加熱処理する工程、を更に含むことを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体の製造方法。
【請求項１２】
前記機能性微粒子は、細孔直径が２ｎｍ〜５０ｎｍのメソ孔を有し、粒径が０．０１μｍ〜２００μｍであるメソポーラス微粒子であり、原料機能性微粒子の機能が、１種類又は２種類以上の酵素及び／又はタンパク質の固定化能を含み、前記成形体中の前記機能性微粒子の含有率が４６質量％以上である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多孔質成形体である酵素担持用担体。
【請求項１３】
請求項１２に記載の酵素担持用担体と酵素との複合体。
【請求項１４】
前記酵素は、酸化還元酵素、加水分解酵素、転移酵素、脱離酵素、異性化酵素、及び／又は合成酵素である、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１５】
前記酵素の酵素反応は、酸化還元反応、加水分解反応、転移反応、脱離反応、異性化反応、及び／又は合成反応である、請求項１３又は１４に記載の複合体。
【請求項１６】
前記酵素の酵素反応に関わる１種類又は２種類以上の酵素及び／又はタンパク質のそれぞれが細孔直径２ｎｍ〜５０ｎｍのメソ孔に固定化された請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の複合体を製造する方法であって、
前記酵素及び／又はタンパク質を、ｐＨ３〜１１に調整した緩衝液中でメソポーラス微粒子の多孔質成形体に固定化させる固定化工程を含む、製造方法。
【請求項１７】
さらに、固定化終了後のメソポーラス微粒子の多孔質成形体をｐＨ３〜１１に調整した緩衝液で複数回洗浄する洗浄工程を含む、請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記酵素反応に関わる１種類又は２種類以上の酵素及び／又はタンパク質のそれぞれがメソポーラス微粒子の多孔質成形体に固定化された、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の複合体を用いた酵素反応方法であって、
前記酵素及び／又はタンパク質をメソポーラス微粒子の多孔質成形体にｐＨ３〜１１に調整した緩衝液中で固定化する固定化工程、
前記固定化工程で得られたメソポーラス微粒子の多孔質成形体と酵素との複合体を含むｐＨ３〜１１の緩衝液中に、反応基質を添加するか、又は
前記固定化工程で得られたメソポーラス微粒子の多孔質成形体と酵素との複合体を、反応基質を含むｐＨ３〜１１の緩衝液中に添加して前記の酵素及び／又はタンパク質が関わる酵素反応を行う酵素反応工程、含む酵素反応方法。
【請求項１９】
前記酵素反応に関わる１種類又は２種類以上の酵素及び／又はタンパク質のそれぞれがメソポーラス微粒子の多孔質成形体に固定化された、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の複合体を用いた酵素反応方法であって、
前記酵素及び／又はタンパク質をメソポーラス微粒子の多孔質成形体にｐＨ３〜１１に調整した緩衝液中で固定化する固定化工程、
前記固定化工程で得られたメソポーラス微粒子の多孔質成形体と酵素との複合体をｐＨ３〜１１の緩衝液で洗浄する洗浄工程、
前記洗浄工程で得られた洗浄後のメソポーラス微粒子の多孔質成形体と酵素との複合体を、反応基質を含む反応液中で、前記酵素及び／又はタンパク質が関わる酵素反応を行う酵素反応工程、含む酵素反応方法。
【請求項２０】
前記酵素反応が、反応基質から機能性の有用物質を製造する方法である、請求項１８又は１９に記載の酵素反応方法。
【請求項２１】
前記酵素反応が、環境中に存在する反応基質となる環境汚染物質を分解する方法である、請求項１８又は１９に記載の酵素反応方法。
【請求項２２】
前記酵素反応方法が、被検試料中に存在するか又は存在する可能性のある反応基質を検出又は定量する方法である、請求項１８又は１９に記載の酵素反応方法。
【請求項２３】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の複合体を含む、前記酵素及び／又はタンパク質が関わる酵素反応用キット、センサー又は装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体、酵素担持用担体、その酵素複合体及びこれらの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
無機の高機能性材料としては、古くから粘土やゼオライト、珪藻土、活性炭など天然のミクロないしメソ孔を有する微粒子が知られている。これらの微粒子は、その分子オーダーの規則的な細孔や、特定の分子やイオンに対する吸着性、構造から生じる触媒能などの特性から、分子篩、吸着剤、反応触媒などとして、工業プロセスのみでなく、一般の生活の中でも様々に利用されてきた。
【０００３】
ゼオライトの利用例として、特許文献１には、液体混合物の分離膜として、通気性を有する支持体上にゼオライトが固定されてなる分離膜が開示されている。さらに、支持体が、織物、編物、組物、又はセラミック、金属、若しくは合成樹脂よりなる連続発泡体よりなることも開示されている。
【０００４】
また、特許文献２には、超高分子量ポリエチレン樹脂と、耐熱性を有する微細フィラーとを含有してなる、有機溶剤又は有機洗浄剤用フィルタ濾材が開示されている。さらに、微細フィラーが、ゼオライト、チタン酸カリウム、酸化チタン、セピオライト、活性炭から選ばれた１種又は２種以上であることも開示されている。
【０００５】
また、特許文献３には、ポリアミド樹脂にて構成された中空糸膜について開示されている。さらに、ポリアミド樹脂がフィラー粒子を樹脂の質量に対して５〜１００質量％、すなわち中空糸膜中に約４．７〜５０質量％含むものであることも開示されている。
【０００６】
また、本発明者らは、特許文献４において、天然ゼオライト中空糸多孔体、ゼオライト膜複合多孔体及びその製造方法について報告した。この天然ゼオライト中空糸多孔体は、天然ゼオライト粉末と、３−５０重量％の有機高分子によって構成される、湿式紡糸された中空糸多孔体であって、細孔径が０．０１−１００ミクロンの範囲に複数の径の細孔が分布する多元多孔体であり、浸水可能な耐水性を有し、乾燥処理後も、含水状態にすることによって、可逆的にフレキシビリティ性能を示すことを特徴とする。
【０００７】
メソ孔を有する合成微粒子としては、メソポーラスシリカ等のメソポーラス物質が知られている。このメソポーラス物質の利用法としては、例えば、これらの規則性のメソ孔に、生体触媒である酵素やタンパク質を固定化して固定化支持体としての利用法が挙げられる。例えば非特許文献１は、酵素を利用した医薬品等の機能性化学品の生産プロセスにおいて、生成物と酵素の分離、酵素の再利用等に向けた酵素の固定化支持体としてのメソポーラスシリカ微粒子の利用法を開示する。
【０００８】
また、近年、利用し易くするためにメソポーラスシリカを成型体に加工する方法が報告されている。例えば非特許文献２は、メソポーラスシリカ微粒子粉末を用いた中空糸状成型法を開示する。また、非特許文献３は、ペレット状成型法を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００９−６１３６９号公報
【特許文献２】特開２００４−２７５８４５号公報
【特許文献３】特開２０１０−１０４９８３号公報
【特許文献４】特開２０１２−７２５３４号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ニルス  カールソン（Ｎｉｌｓ  Ｃａｒｌｓｓｏｎ）ら、「メソポーラスシリカに固定化された酵素：物理的化学的視点（Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｉｎ  ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ  ｓｉｌｉｃａ：  Ａ  ｐｈｙｓｉｃａｌ−ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ）」、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１４年、２０５巻、ｐ．３３９−３６０
【非特許文献２】アリ  エー．  ロウナグヒ（Ａｌｉ  Ａ．  Ｒｏｗｎａｇｈｉ）ら、「二酸化炭素捕捉用単分散球状メソポーラスナノシリカ−トーロン中空繊維複合体のその場形成（Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅｄ  Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  Ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ  Ｎａｎｏｓｉｌｉｃａ−Ｔｏｒｌｏｎ  Ｈｏｌｌｏｗ−Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｄｉｏｘｉｄｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ）」、ＣｈｅｍＳｕｓＣｈｅｍ、２０１５年、８巻、ｐ．３４３９−３４５０
【非特許文献３】ハルシュ  マヘシワリ（Ｈａｒｓｈ  Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉ）ら、「強固なメソポーラスシリカ成形体：物理的・機械的特性に関する微細構造変化のマルチスケール特性評価（Ｒｏｂｕｓｔ  ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ  ｓｉｌｉｃａ  ｃｏｍｐａｃｔｓ：  ｍｕｌｔｉ−ｓｃａｌｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｐｈｙｓｉｃａｌ−ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１６年、５１巻、ｐ．４４７０−４４８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ゼオライトは、規則的に配列したミクロ孔を有し、その骨格構造中の主成分であるＳｉの一部がＡｌに置換したアルミノシリケートであり、このＳｉ／Ａｌの比率が、ゼオライトの触媒としての強度や機能に影響するだけでなく、ゼオライト自体の吸着分子、反応分子、反応溶媒との親和性を左右する。ゼオライト中の細孔は３〜１０Å程度の３次元規則細孔であるのに対し、粘土は２次元の層状構造、珪藻土はナノサイズから数ミクロンサイズにわたる比較的大きな細孔を有している。また、これら、主にシリカによる骨格を有するものの他、活性炭はカーボンが主成分で２ｎｍ〜１０ｎｍ程度のサイズの細孔を有している。
【００１２】
このような天然に産出する多孔体の他に、天然にはなかなか得られない１ｎｍ以上の規則細孔を有したシリケートであるメソポーラスシリカや、シリカの代わりにチタニアを骨格とするメソポーラス酸化チタン、カーボンによるメソポーラスカーボン、陰イオンの吸着が可能な層状化合物であるハイドロタルサイト等、天然では得られない機能や細孔サイズを有する機能性材料が、近年様々に開発されてきている。これらの微粒子の機能は、粒子の表面で反応対象と接触することによって発現するため、機能の向上を目指して、より高い表面積を有する微粒子化が進められてきている。
【００１３】
メソポーラスシリカをはじめとするメソポーラス物質は、ゼオライトが１ｎｍ以下の規則細孔を有するのに対して、１〜５０ｎｍ程度の規則細孔を有する多孔体粒子群である。層状シリケートを原料に４級アルキルアミンをテンプレートにしてメソポーラスシリカが合成されたのを初めとして、この中のシリカの一部をアルミナに置き換えたアルミノシリケート、シリカの代わりにアルミナやチタニアを原料にした、メソポーラス酸化アルミニウム、メソポーラス酸化チタン、カーボンによるメソポーラスカーボンなどが合成されてきている。
【００１４】
これらのメソポーラス物質はいずれも有機物を鋳型とした合成品で、規則孔にタンパクや酵素などの様々な有機物を固定化することが可能であることから、様々な分野での利用が期待されているが、非常に高価であり、またサブミクロン大の微粒子が多く、分離精製が難しいことが産業上での利用法の課題になっている。
【００１５】
一方、新規に合成された微粒子の多くは、１次粒子のままでは分散性が低く、また分散性を高めた後は分離回収が困難になるという欠点を有している。工業的にこれらの機能性微粒子を利用するためには、もとの表面積を極力維持した状態での成形・部材化又は分離手法が必須になってくる。例えば、ゼオライトは自己焼結性に乏しいため、一般的には、無機や有機のバインダーを介してのペレット成形が行なわれるが、いずれの手法に於いても、バインダー量が少ないと強度や耐水性が下がり、バインダー量が多いと微粒子表面をバインダーがつぶしてしまい、本来の機能が充分に発現されないという問題が生じ、特に薄膜状への成形を試みた場合、この問題は大きい。
【００１６】
成形手法として、特許文献１には、ゼオライトが固定されてなる分離膜の製膜化手法のひとつとして、水熱合成などの合成の段階から、基板上などに２次成長させるなどの成形手法が記載されているが、この手法は、得られるものの可塑性が低くなりがちであり、また熱水合成が可能な特定の微粒子の場合の成形でなければ採用できない。
【００１７】
一方、有機高分子の成形体に無機微粒子をフィラーとして複合化することによって、有機高分子膜の強度を向上させたり、光学的性質や耐熱性・耐火性等の機能を付与させることができる。これらでは、有機高分子とフィラーとの親和性やフィラー粒子の配向性が、複合体の性質に大きく影響すると考えられ、フィラー粒子や樹脂側を表面修飾して親和性を高めることが盛んにおこなわれている。
【００１８】
特許文献２には、洗浄用有機溶媒のフィルタ濾材として、高分子量ポリエチレン樹脂に耐熱性を有する繊維状の無機フィラーを配合することによって得られた、平均孔径０．０１〜５μｍの貫通孔を有し、膜厚が２５〜３００μｍである多孔質膜が開示されている。しかし、特許文献２に記載されている有機高分子膜の溶融成形の手法は、有機高分子の高温加熱溶融・混練・押出成形を行うため、これらの成形過程に耐性を有する微粒子以外には使用することができない。また、溶融混練中に無機粒子の表面が潰れてしまうため、可塑剤及び細孔の形成剤として多量の鉱物オイルやフタル酸ジ−２−エチルヘキシルを使用せねばならず、更にこの可塑剤を抽出除去するための抽出剤として、多量のヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン等の飽和炭化水素系や、発がん性の高いトリクロロエチレン、テトラクロロエチレン等のハロゲン化炭化水素系の有機溶剤を用いなければならない。
【００１９】
このような溶融成形手法の他に、有機高分子の成形手法として相分離法が考えられる。相分離法は、溶媒中に有機高分子を溶解してスラリーとし、これを非溶媒又は貧溶媒の侵入や温度変化等で凝集させて成形する手法である。特許文献３には、ポリアミド中空糸膜とその製造方法として、熱誘起相分離法での製膜方法が開示されている。しかし、この手法では有機高分子スラリーを１７０℃以上に加熱して作製せねばならず、１００℃以下に温度低下させることによって製膜し、且つフィラーを樹脂に対して１００重量％まで、つまり構成物の５０重量％以上担持させると強度が得られない恐れがある。このように、この相分離法は、有機高分子膜の性質に主眼を置いた製膜方法として用いられており、上述のような強度の問題から、機能性微粒子を主原料として多孔体化する製膜方法といては適していない。
【００２０】
特許文献４では、貧溶媒中での相分離を利用して、無機吸着体と有機高分子の複合体の成形を行なっている。この手法に依れば無機吸着体を主原料として５０重量％以上含む多孔性成形体を製造することが可能であり、且つこの成形体は水溶液中で数年にわたって安定であり、粉落ちなしに濾過膜として使用できる強度を有している。
【００２１】
しかしながら、特許文献４では、成形用スラリーを作成するにあたって無機微粒子を高分散させるためとして、無機粒子をスラリー用の良溶媒中で粉砕しながら分散させることが特徴となっている。しかし、特許文献４の手法に従い、先にシリカ／アルミナ比の高い合成ゼオライトを溶媒に分散した状態で有機高分子としてポリサルホンを混入すると、溶媒と微粒子の相互作用や親和性のバランスによってポリサルホンの溶媒中への溶解が阻害され、無機粒子が均一に分散したスラリーが得られないケースや成形体からの粉落ちが多くなってしまうケースがあった。また、このような問題を避けるため、無機粒子との親和性の高い有機高分子を用いた場合、無機粒子の表面のみでなく細孔内部まで有機高分子が浸入して、成型時に無機粒子のミクロ孔が塞がり潰れてしまい易いことが判明した。このように、従来技術では、種々のサイズの細孔をもち、天然ゼオライトとは親疎水性の異なる表面を有する多孔質シリケート微粒子を成形する際に、粉落ちを防止できる構造の緻密性と液透過性や細孔機能を保持する多孔性を両立することが難しいという問題があった。
【００２２】
また、非特許文献１が提案するような、従来のメソポーラスシリカ微粒子を利用した固定化酵素に関する基礎研究では、主に粉末の状態の「メソポーラスシリカ微粒子粉末」が使用されており、一般にも微粒子粉末状で使用されることが多いが、特にバイオリアクターなどの装置、器具の一部としてメソポーラスシリカ微粒子粉末を利用する場合には、微粒子粉末の微粉化、粉落ちといった問題があった。
【００２３】
また、非特許文献２が開示する有機高分子をバインダーとして得られた成形体は、有機高分子の影響によって、メソポーラスシリカ本来の細孔径や表面積を維持することが困難になることがあるといった問題があった。
【００２４】
また、非特許文献３が開示する焼結により得られた成形体は、焼結温度の影響によって、メソポーラスシリカ本来の細孔径や表面積を維持することが困難になることがあるといった問題があった。
【００２５】
したがって、本発明の課題は、天然ゼオライト粒子に限定されず、合成ハイシリカゼオライトのような表面の親水性が低くより小さな粒子のミクロ孔やメソポーラスシリカ、メソポーラス酸化アルミ、メソポーラス酸化チタンのようなミクロないしメソ孔を有する多孔質シリケート、また、これと類似した表面性状を有する機能性微粒子の特性を保持しながら、同時に高い耐水性や濾過性、反応性を有する多元多孔質成形体及びこれを作製できる新規な手法を提供することである。また、この手法によって、ポリサルホンやポリエーテルサルホンに限定されず、用途に応じ、耐候性が高いポリアミドイミド、より安価なＥＶＯＨやＰＭＭＡといった親水性樹脂をバインダーとして使用しても良好な結果が得られる。
【００２６】
また、本発明の課題は、メソポーラスシリカ等のメソポーラス物質の微粒子粉末を用途に合わせて中空糸状又はペレット状などの適宜の形状に成形して用いても安定で機械的強度が高く、粉末状のメソポーラスシリカ微粒子と同様の物性を維持し、更に、酵素の固定化支持体として粉末と同様の効果を発揮できる、メソポーラス微粒子の多孔質成形体、その酵素複合体及びそれらの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明者らは、前記課題を達成すべく鋭意検討を行った結果、多孔質粒子の成形手法としては、有機高分子との混合スラリーを貧溶媒中で相分離する方法が、貧溶媒の浸入経路が貫通孔となって成形体の反応性を高め、多孔質微粒子の表面を一部表出させるという観点から好ましいが、細孔表面を塞ぐことなく保持するためには、スラリー調製の際に、良溶媒に溶解した有機高分子が多孔質粒子の細孔に侵入して重合、又は、多孔質粒子の表面を完全に覆って、成形体の貫通孔から微粒子の表面を遮蔽してしまうことを、避けることに留意することが大切であるという見解に至った。
【００２８】
その観点から、
１．多孔質粒子の成形用スラリーの調製は、先に有機高分子を良溶媒中に入れて充分に溶解できる温度で溶解してから、微粒子が反応を起こさず、有機高分子が粘性スラリー状を保てる温度で高速攪拌しながら、微粒子を少しずつ投入するといった手順で行うことが好ましく、
２．また、粉落ちを防止するためには構造中にシリケート表面に形成されるシラノールとの親和性が高い官能基を有する親水性の有機高分子をバインダーとすることが有効であるが、親水性有機高分子でも低分子の状態であったり、粘性が低く細孔内部へと侵入し易いものは避けることが好ましいという知見を得た。更に、これらの親水性の有機高分子は疎水性有機高分子に比べて水中で緻密な凝集構造を取り易いので、サブミクロンサイズの微粒子間に入り込んで成形体が緻密になり易いが、本発明の手法に依り、微粒子との混合スラリー作製にあたり、先に有機高分子を溶解した粘性スラリーに微粒子を添加した際に微粒子の含む気体や粘性スラリーの高速攪拌によって生じるナノサイズであって欠陥にならない程度に極微小な気泡を意図的に混入させることができ、成形後の粒子間に空隙が生じ易く、濾過性や柔軟性が向上することを見い出した。更に、親水性有機高分子が貧溶媒と微粒子との親和性のバランスから、微粒子を完全に包埋する凝集構造をとってしまう場合、成形体形成後の後処理によって、成形体構造を大きく破壊することなく、また強度低下を招くことなく微粒子へのアクセシビリティーを上げることができることを見出した。
【００２９】
本発明者らは、これらの知見に基づき本発明を完成するに至った。
【００３０】
すなわち本発明は、以下の態様を含む。
（１）細孔直径が０．３ｎｍ〜５０ｎｍのミクロないしメソ孔を有する、シリケート、アルミノシリケート、アルミナ又はチタニアを主成分とし、粒径が０．０１μｍ〜２００μｍである機能性微粒子と、有機高分子とを含む多孔質成形体であって、
細孔直径が５０ｎｍ〜１００μｍのマクロ孔を有し、
空隙率が３４％以上の多孔体であり、
前記成形体中の前記機能性微粒子の含有率が４６質量％以上であり、
前記機能性微粒子の表面の少なくとも一部が前記成形体から表出しており、
前記機能性微粒子の前記ミクロないしメソ孔の細孔容積が、原料機能性微粒子の４０％以上保持されている、
ことを特徴とするミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体。
【００３１】
（２）水中で２４時間以上連続攪拌した時の前記多孔質成形体の攪拌前後での重量変化が１％以下であることを特徴とする、前記（１）に記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体。
【００３２】
（３）前記多孔質成形体の形状が、粒状、中空粒子状又は中空糸状であることを特徴とする、前記（１）又は（２）に記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体。
【００３３】
（４）前記機能性微粒子及び／又は前記有機高分子が複数種による混合体であることを特徴とする、前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体。
【００３４】
（５）前記機能性微粒子の原料機能性微粒子の機能が、吸着性能であり、多孔質成形体の成形後に前記機能の特性発現が保持されていることを特徴とする、前記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体。
【００３５】
（６）数ミクロンサイズの粒子を分散液中から加圧濾過できることを特徴とする、前記（１）〜（５）のいずれか１つに記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体。
【００３６】
（７）前記有機高分子がポリエーテルサルホン、ポリサルホン、ＥＶＯＨ樹脂、ＰＭＭＡ樹脂又はポリアミドイミド樹脂であることを特徴とする、前記（１）〜（６）のいずれか１つに記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体。
【００３７】
（８）前記有機高分子を予め溶解させた有機溶媒中にミクロないしメソ孔を有するシリケート、アルミノシリケート、アルミナ又はチタニアを主成分とする機能性微粒子を分散させて原料スラリーを得る工程と、
非溶媒中に前記原料スラリーを射出することによって成形する工程と、を含むことを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれか１つに記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体の製造方法。
【００３８】
（９）前記有機高分子が親水基を有する、前記（８）に記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体の製造方法。
【００３９】
（１０）前記有機高分子がＰＭＭＡ樹脂又はポリアミドイミド樹脂であり、成形後に重合促進剤又は硬化促進剤で処理する工程、を更に含むことを特徴とする前記（８）又は（９）に記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体の製造方法。
【００４０】
（１１）前記ミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体を、減圧下のエタノール中又は良溶媒の低濃度水溶液中において低温加熱処理する工程、を更に含むことを特徴とする前記（８）〜（１０）のいずれか１つに記載のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体の製造方法。
【００４１】
（１２）前記機能性微粒子は、細孔直径が２ｎｍ〜５０ｎｍのメソ孔を有し、粒径が０．０１μｍ〜２００μｍであるメソポーラス微粒子であり、原料機能性微粒子の機能が、１種類又は２種類以上の酵素及び／又はタンパク質の固定化能を含み、前記成形体中の前記機能性微粒子の含有率が４６質量％以上である、前記（１）〜（７）のいずれか１つに記載の多孔質成形体である酵素担持用担体。
【００４２】
（１３）前記（１２）に記載の酵素担持用担体と酵素との複合体。
【００４３】
（１４）前記酵素は、酸化還元酵素、加水分解酵素、転移酵素、脱離酵素、異性化酵素、及び／又は合成酵素である、前記（１３）に記載の複合体。
【００４４】
（１５）前記酵素の酵素反応は、酸化還元反応、加水分解反応、転移反応、脱離反応、異性化反応、及び／又は合成反応である、前記（１３）又は（１４）に記載の複合体。
【００４５】
（１６）前記酵素の酵素反応に関わる１種類又は２種類以上の酵素及び／又はタンパク質のそれぞれが細孔直径２ｎｍ〜５０ｎｍのメソ孔に固定化された前記（１３）〜（１５）のいずれか１つに記載の複合体を製造する方法であって、
前記酵素及び／又はタンパク質を、ｐＨ３〜１１に調整した緩衝液中でメソポーラス微粒子の多孔質成形体に固定化させる固定化工程を含む、製造方法。
【００４６】
（１７）さらに、固定化終了後のメソポーラス微粒子の多孔質成形体をｐＨ３〜１１に調整した緩衝液で複数回洗浄する洗浄工程を含む、前記（１６）に記載の製造方法。
【００４７】
（１８）前記酵素反応に関わる１種類又は２種類以上の酵素及び／又はタンパク質のそれぞれがメソポーラス微粒子の多孔質成形体に固定化された、前記（１３）〜（１５）のいずれか１つに記載の複合体を用いた酵素反応方法であって、
前記酵素及び／又はタンパク質をメソポーラス微粒子の多孔質成形体にｐＨ３〜１１に調整した緩衝液中で固定化する固定化工程、
前記固定化工程で得られたメソポーラス微粒子の多孔質成形体と酵素との複合体を含むｐＨ３〜１１の緩衝液中に、反応基質を添加するか、又は
前記固定化工程で得られたメソポーラス微粒子の多孔質成形体と酵素との複合体を、反応基質を含むｐＨ３〜１１の緩衝液中に添加して前記酵素及び／又はタンパク質が関わる酵素反応を行う酵素反応工程、含む酵素反応方法。
【００４８】
（１９）前記酵素反応に関わる１種類又は２種類以上の酵素及び／又はタンパク質のそれぞれがメソポーラス微粒子の多孔質成形体に固定化された、前記（１３）〜（１５）のいずれか１項に記載の複合体を用いた酵素反応方法であって、
前記酵素及び／又はタンパク質をメソポーラス微粒子の多孔質成形体にｐＨ３〜１１に調整した緩衝液中で固定化する固定化工程、
前記固定化工程で得られたメソポーラス微粒子の多孔質成形体と酵素との複合体をｐＨ３〜１１の緩衝液で洗浄する洗浄工程、
前記洗浄工程で得られた洗浄後のメソポーラス微粒子の多孔質成形体と酵素との複合体を、反応基質を含む反応液中で、前記酵素及び／又はタンパク質が関わる酵素反応を行う酵素反応工程、含む酵素反応方法。
（２０）前記酵素反応が、反応基質から機能性の有用物質を製造する方法である、前記（１８）又は（１９）に記載の酵素反応方法。
（２１）前記酵素反応が、環境中に存在する反応基質となる環境汚染物質を分解する方法である、前記（１８）又は（１９）に記載の酵素反応方法。
（２２）前記酵素反応方法が、被検試料中に存在するか又は存在する可能性のある反応基質を検出又は定量する方法である、前記（１８）又は（１９）に記載の酵素反応方法。
（２３）前記（１３）〜（１５）のいずれか１つに記載の複合体を含む、前記酵素及び／又はタンパク質が関わる酵素反応用キット、センサー又は装置。
【発明の効果】
【００４９】
本発明により、天然ゼオライト粒子に限定されず、合成ハイシリカゼオライトのような表面の親水性が低くより小さな粒子のミクロ孔やメソポーラスシリカ、メソポーラス酸化アルミ、メソポーラス酸化チタンのようなミクロないしメソ孔を有する多孔質シリケート、また、これと類似した表面性状を有する機能性微粒子の特性を保持しながら、同時に高い耐水性や濾過性、反応性を有する多元多孔質成形体及びこれを作製できる新規な手法が提供される。また、この手法によって、ポリサルホンやポリエーテルサルホンに限定されず、用途に応じ、耐候性が高いポリアミドイミド、より安価なＥＶＯＨやＰＭＭＡといった親水性樹脂をバインダーとして使用しても良好な結果が得られる。
【００５０】
また、本発明により、メソポーラスシリカ等のメソポーラス物質の微粒子粉末を用途に合わせて中空糸状又はペレット状などの適宜の形状に成形して用いても安定で機械的強度が高く、粉末状のメソポーラスシリカ微粒子と同様の物性を維持し、更に、酵素の固定化支持体として粉末と同様の効果を発揮できる、メソポーラス微粒子の多孔質成形体、その酵素複合体及びそれらの製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】実施例１の成形体の長手方向に直交した断面のＳＥＭ像。
【図２】実施例１の成形体の長手方向断面のＳＥＭ像。
【図３】実施例１の成形体の水銀ポロシメトリによる細孔径分布曲線図。
【図４】実施例１の成形体と原料粒子Ａとの室温での窒素吸着等温線を示した図。
【図５】実施例１３と実施例１４と原料粒子Ｆとの室温での窒素吸着等温線を示した図。
【図６】実施例１８の成形体の外観像。
【図７】実施例２３の（ａ）メソポーラスシリカの粉末、（ｂ）成形体、（ｃ）酵素複合体の外観像。
【図８】実施例１８の成形体とアゾ還元酵素との複合体の調製方法、アゾ染料の分解反応、及び、固定化酵素の再使用までの手順を模式的に示した図。
【図９】実施例３０におけるＡｚｏＲの固定化量及び固定化率を示した図。
【図１０】実施例３０の吸光度変化及びメチルレッドの分解率を示した図。
【図１１】実施例３１の各種メソポーラス微粒子に対するＡｚｏＲの固定化量を示した図。
【図１２】実施例３１の各種ＡｚｏＲ−メソポーラス微粒子複合体によるメチルレッドの分解率及び耐久性を示した図。
【図１３】実施例３１における（ａ）実施例２３の成形体、（ｂ）そのＡｚｏＲ複合体、（ｃ）比較例８の成形体、及び（ｄ）そのＡｚｏＲ複合体の外観像。
【図１４】脱色率に与える遊離ＡｚｏＲ濃度の影響を示した図。
【図１５】実施例３２の各種メソポーラス微粒子に対するグルコース脱水素酵素の固定化量を示した図。
【図１６】実施例３２の各種ＧＤＨ−メソポーラス微粒子複合体による生成ＮＡＤＨ濃度及び固定化酵素の耐久性を示した図。
【図１７】生成ＮＡＤＨ濃度に与える未固定の遊離ＧＤＨ濃度の影響を示した図。
【図１８】実施例３３の各種メソポーラス微粒子に対するリパーゼの固定化量を示した図。
【図１９】実施例３３の各種リパーゼ−メソポーラス微粒子複合体によるトリグリセリド分解における遊離ピレン濃度及び固定化酵素の耐久性を示した図。
【図２０】トリグリセリド分解により遊離する蛍光物質（ピレン）濃度に与える未固定の遊離リパーゼ濃度の影響を示した図。
【図２１】実施例３４の各種メソポーラス微粒子および活性炭に対するプロテアーゼの固定化量を示した図。
【図２２】実施例３４の各種プロテアーゼ−メソポーラス微粒子複合体およびプロテアーゼ−活性炭複合体によるゼラチンの分解活性及び固定化酵素の耐久性を示した図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
次に、本発明の好適な実施の形態を説明する。なお、本発明において、数値範囲の記載は、両端値のみならず、その中に含まれる全ての任意の中間値を含むものである。
【００５３】
本発明の、ミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体は、機能性微粒子と有機高分子とを含む多孔質成形体である（以下、本発明の、ミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体を、本発明の多孔質成形体と称することがある）。
【００５４】
本発明に係る機能性微粒子は、細孔直径が０．３ｎｍ〜５０ｎｍのミクロないしメソ孔を有する、シリケート、アルミノシリケート、アルミナ又はチタニアを主成分とする。
【００５５】
ここで、ミクロ孔とは、マイクロ孔やマイクロポアとも呼ばれ、細孔直径が１ｎｍ未満の細孔をいう。メソ孔とは、ミクロ孔より大きく、細孔直径が１ｎｍ以上５０ｎｍ以下の細孔をいう。従って、細孔直径が０．３ｎｍ〜５０ｎｍのミクロないしメソ孔を有するとは、細孔直径が０．３ｎｍ〜５０ｎｍの細孔を有するとの意味である。
【００５６】
本発明に係る機能性粒子の細孔直径は、０．３ｎｍ〜５０ｎｍであり、好ましくは０．３ｎｍ〜１０ｎｍ、より好ましくは０．５ｎｍ〜５ｎｍである。
【００５７】
また、シリケート、アルミノシリケート、アルミナ又はチタニアは、純粋なシリケート、アルミノシリケート、アルミナ又はチタニアのほか、他の金属元素がシリケートやアルミノシリケート又はチタニア構造の骨格中の欠陥部に導入されたもの、シリケートやアルミノシリケートの構造中のシリコンやアルミニウム元素の一部が他の金属に置換したもの（金属置換体）を含む。
【００５８】
また、シリケート、アルミノシリケート、アルミナ又はチタニアを主成分とするとは、機能性微粒子がこれらの純相のもの、又はこれらの質量割合が、通常５０％以上、好ましくは９０％以上の混合物であることをいう。
【００５９】
また、機能性微粒子の機能は、特に限定されないが、例えば吸着性能や除去能が挙げられる。これらの機能は、多孔質成形体の成形後に特性発現が保持されていると好ましい。
【００６０】
本発明に係るシリケート、アルミナ、アルミノシリケート、アルミナ及びチタニアの種類や構造、結晶性は、特に限定されない。
【００６１】
また、本発明に係る機能性微粒子の粒径は、０．０１μｍ〜２００μｍであり、好ましくは０．０１μｍ〜１０μｍであり、より好ましくは０．１μｍ〜５μｍである。ここで粒径とは、凝集粒子のサイズを意味する。結晶粒子径がこの範囲より小さい粒子が凝集塊を形成して分離していないものを含むことができる。後述する原料スラリーの調整の際には、前記の範囲の粒径を有する機能性微粒子は、そのままの粒径で分散し、又は、凝集粒子がほぐれてより微細な粒径となって分散する。本発明の多孔質成形体が中空糸状もしくは微細粒状である場合、多孔質成形体、原料スラリー、又は溶媒中では、機能性微粒子は、好ましくは粒径０．０１μｍ〜１０μｍの範囲で分散し、より好ましくは０．１μｍ〜５μｍの範囲で分散する。粒径は、例えば、透過型電子顕微鏡観察による２０〜３０個の粒子の直径の平均値として求めることができる。
【００６２】
本発明に係る機能性微粒子は、スラリー溶媒中に有機高分子と共に安定に分散できるように化学修飾又は処理された改質機能性微粒子とすることができる。機能性微粒子の化学修飾又は処理としては、例えば、シラノール基末端の有機鎖修飾などが挙げられる。
【００６３】
本発明に係る機能性微粒子は、単独であっても複数種であってもよいが、複数種による混合体であると、一つの成形体で同時に複数の反応対象を選択的に吸着又は除去できるなど、複数の機能を付与できる点で好ましい。
【００６４】
本発明の多孔質成形体の機能性粒子の含有率は、４６質量％以上であり、好ましくは５０質量％以上であり、より好ましくは６０質量％以上、さらに好ましくは６７質量％以上である。
【００６５】
本発明に係る有機高分子は、特に限定されないが、本発明の多孔質成形体中の多孔体とする、ミクロないしメソ孔を有する、シリケート、アルミナ、アルミノシリケート又はチタニアを主成分とする機能性微粒子との親和性が高い官能基（例えばヒドロキシル基、スルホニル基、カルボキシル基などの親水基）を有すると好ましく、比較的低温でジメチルスルホキシドをはじめとする両親媒性の汎用的な有機溶剤に対して、重量に関し、７〜２０重量％程度以上溶解可能であり、これらを分散した際に均一なスラリーを調製可能で、更にそのスラリーを非溶媒もしくは貧溶媒中で凝集させて成形できるものであるとより好ましい。より具体的には、熱可塑性樹脂の中で、比較的親水性の高いポリエーテルサルホン、ポリサルホン、ＯＨ基を有するポリエチレン−ポリビニルアルコール共重合樹脂（ＥＶＯＨ樹脂）、ポリエチレン−酢酸ビニル共重合樹脂のケン化物、アクリル樹脂（ＰＭＭＡ樹脂）、ポリアミドイミド樹脂などが好ましい。さらに好ましくはポリエーテルサルホンやポリエチレンモル比４４％以上のポリエチレン−ポリビニルアルコール共重合樹脂、ポリアミドイミド樹脂である。
【００６６】
本発明に係る有機高分子は、単独であっても複数種であってもよいが、成形体の強度などの物理的性質、耐薬品性、耐熱性などの化学的性質は有機高分子の性質に依存するところが大きいため、複数種による混合体とすることによってこれらの成形体の性質を制御することも可能である。
【００６７】
本発明に係る有機高分子は、化学修飾又は処理された改質機能性微粒子であると好ましい。有機高分子の化学修飾又は処理としては、例えば、ポリエーテルサルホンへのヒドロキシル基の付与やポリエチレン−酢酸ビニル共重合樹脂のケン化処理などが挙げられる。
【００６８】
本発明に係る有機高分子の親水基の含有比は特に限定されないが、７０モル％未満であると好ましく、５６モル％未満であるとより好ましい。親水基の含有比が低いと親水性が高くなり過ぎず、凝固用の貧溶媒表面でフィルム状に広がらずに任意形状の成形が容易になる傾向にある。
【００６９】
また、本発明に係る有機高分子のポリエチレン含有率は特に限定されないが、７０モル％未満であると好ましく、４８モル％以下であるとより好ましい。ポリエチレン含有率が低いと溶媒に溶け、微粒子との親和性も上昇する傾向にある。
【００７０】
本発明の多孔質成形体における、有機高分子の含有率は、成形体の形状や、機能性微粒子の種類により適宜選択されるが、多孔質成形体の全重量に対して通常５〜５０重量％、好ましくは１５〜４０重量％前後である。有機高分子の含有率がこの範囲にあると、成形体が機械的に安定であり、機能性微粒子の粒子間隙が塞がれずにミクロないしメソ孔が機能する傾向にある。
【００７１】
本発明の多孔質成形体は、その製造方法によっては限定されないが、例えば、有機高分子を予め溶解させた有機溶媒中にミクロないしメソ孔を有するシリケート、アルミノシリケート、アルミナ又はチタニアを主成分とする機能性微粒子を分散させて原料スラリーを得る工程と、非溶媒中に前記原料スラリーを射出することによって成形する工程と、を含む方法により製造できる。
【００７２】
また、本発明の多孔質成形体の有機高分子がＰＭＭＡ樹脂又はポリアミドイミド樹脂である場合は、成形後に重合促進剤又は硬化促進剤で処理する工程を更に含む方法により製造できる。
【００７３】
この製造方法は、機能性微粒子と有機高分子を含む原料スラリーから相分離法によって、成形体を得る方法である。
【００７４】
有機高分子は、機能性微粒子のバインダーとして機能する他、マクロ孔を形成することによって機能性微粒子間の間隙が多孔体形成後の使用時にも潰れないように保持する役目を担う。有機高分子は、特に限定されず、前述の成形体に係る有機高分子として例示したものが挙げられるが、室温では揮発しにくい種類の有機溶媒に比較的低温で可溶であり、機能性微粒子との親和性が高いものが適宜選択される。シリケートやアルミノシリケートとの親和性から親水基を有するものが好ましい。また、原料スラリー中において、ミクロないしメソ孔への浸入を防ぐ観点、成形に際して、低濃度で十分な粘性と成形性が得られる観点、成型後の成形体の構造や強度の観点から、ポリスチレン換算の重量平均分子量（Ｍｗ）が５０，０００以上の比較的分子量の高いものが好ましい。原料スラリーへの有機高分子の添加量は、成形体の形状や、機能性微粒子の種類により適宜選択されるが、得られる乾燥後の成形体の全重量に対して通常５〜５０重量％、好ましくは１５〜４０重量％前後である。有機高分子の添加率が少なすぎると安定な成形体の形成が困難となり、多過ぎると原料機能性微粒子の粒子間隙が塞がれてしまい、ミクロないしメソ孔が機能しなくなる傾向にある。また、ＰＭＭＡ樹脂などを用いると、成形後に再重合処理を行うことで、成形体の強度を高められる。
【００７５】
有機高分子を溶解させる溶剤としては、前述のように、有機高分子を比較的低温で溶剤の重量に対して６〜２０重量％程度以上溶解可能であり、樹脂を凝固させるための非溶媒・貧溶媒と相溶性があるものであり、且つ、多孔体とするミクロないしメソ孔を有するシリケート、アルミノシリケート、アルミナ又はチタニアを主成分とする機能性微粒子を、それと化学的又は物理的反応を起こすことなく、均一に分散させることが可能な溶媒であることが好ましい。そのような溶媒として、例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ｎ−メチルピロリドンが挙げられる。
【００７６】
本発明において、機能性微粒子を、有機高分子を溶解させた有機溶媒に分散させた、原料スラリーの調製は、ミクロないしメソ孔を有するシリケート、アルミノシリケート又はチタニアを主成分とする機能性微粒子を前述のバインダーとなる有機高分子と共に前述の溶媒に加えて攪拌することで行うことができる。
【００７７】
原料の機能性微粒子は、添加前に十分乾燥させておくと、原料スラリー中での有機高分子の成形前の局部的な重合を防ぎ、成形後の複合体の強度の低下を防ぐ点で好ましい。乾燥温度は、特に限定されないが、原料微粒子の性質変化が起きない範囲で脱湿される温度が好ましい。原料スラリー中の機能性微粒子濃度は、特に限定されないが、機能性微粒子の種類やサイズによる粘性の違い、成形体や有機高分子の種類によって適宜選択される。中空糸膜成形に関しては、原料スラリー中の機能性微粒子濃度は、好ましくは６〜４０重量％（質量％）である。この濃度が低くなると成形が困難になる、又は成形体中の多孔性が低くなり、濃度が高くなると成形体中でのバインダーとなる有機物との分布が不均一になり易く、柔軟性や耐圧性が得られない恐れがある。
【００７８】
原料スラリー調製時の機能性微粒子、有機高分子の添加の順番は特に限定されないが、予め加温した溶媒へ有機高分子を十分に溶解させた粘性スラリーを高速攪拌している状態で、乾燥した状態の原料粉末を少量ずつ添加投入して、分散させる方法であると、比較的低温で短時間に均一で粘性が高いスラリーを得やすく、更にナノバブルの発生をより効果的にできるので好ましい。有機高分子を後から添加する手法では、微粒子と溶媒との親和性のバランスから、添加濃度によって、有機高分子の溶解が阻害され、結果、安定なスラリーが得にくい場合がある。
【００７９】
原料スラリー調製時の撹拌速度は、特に限定されないが、気相中で２００ｒｐｍ以上であることが好ましい。攪拌速度がこの範囲にあるとマクロ孔が形成され易くなる。
【００８０】
本発明のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体の製造方法においては、上記によって調整した原料スラリーを非溶媒中に射出することによって凝固させて成形することができるが、原料スラリーを貧溶媒中で凝固させて成形することもできる。これにより、数オングストロームから数十ミクロン径の細孔径分布を有する自立性の耐水性複合多孔体材料を得ることができる。
非溶媒としては、例えば水アルコールなどが挙げられる。貧溶媒としては、原料スラリーに用いる溶媒の水溶液などが挙げられる。
【００８１】
本発明のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体の製造方法においては、前記ミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体を、減圧下のエタノール中又は良溶媒の低濃度水溶液中において低温加熱処理する工程、を更に含むことができる。
【００８２】
成形の方法は、多孔質成形体の種類によって、それに適した型などを用いることができ、例えば成形体の形状が中空糸である場合には、ノズル等を用い、既存の手法で成形することができる。
【００８３】
本発明の多孔質成形体は、５０ｎｍ〜１００μｍ径の範囲にマクロ孔を有し、空隙率が３４％以上の多孔体であり、機能性微粒子の表面の少なくとも一部が前記成形体から表出しており、前記機能性微粒子の前記ミクロないしメソ孔の細孔容積が、原料機能性微粒子の４０％以上保持されている。
【００８４】
本明細書において、多孔質成形体が５０ｎｍ〜１００μｍ径の範囲にマクロ孔を有するとは、多孔質成形体作製の際に凝固液である貧溶媒の原料スラリー側への進入路、つまり接触界面で、原料の凝固が起きることによって、多孔質成形体の外側から内部に通じるマクロスコピックな細孔が形成されていることを意味している。このマクロ孔のサイズはポロシメーター等で測定した際に細孔径分布曲線の当範囲にピークを有していることで確認でき、原料粒子の特性である微細孔とその粒子がバインダーの有機高分子と形成するマクロスコピックな細孔が共存しているということを意味する。また、この貧溶媒の進入路は同時に原料スラリー中の微粒子間の隙間に相当するため、このマクロ孔に原料粒子の表面が表出し易い。
【００８５】
また、本発明の多孔質成形体は、成形後にエタノール中、又は低温の良溶媒中などにて、短時間減圧脱気処理することによって、マクロ孔の壁にできる緻密層に微小孔を設けることによって、マクロ孔に原料粒子の表面が表出するように改質することが可能である。
【００８６】
本発明の多孔質成形体は、このような特性を有するので、通常の成形体と比較して吸着又は除去や反応対象となる物質が成形体中を拡散し、内包する原料粒子の表面と接触し易く、結果として反応速度や反応効率が高くなるという点で優れる。
【００８７】
また、本発明の多孔質成形体は、耐熱性、耐水性及び調湿性の他に、イオン交換性、吸着性等ミクロないしメソポーラス微粒子の特性を有する。
【００８８】
本発明の多孔質成形体は、水中で２４時間以上連続攪拌した時の攪拌前後での重量変化が１％以下であると好ましい。ここで重量変化があるということは、多孔質成形体中から微粒子が外れて水中に落ちる、又は微粒子や有機高分子の性質が変化するということを意味する。重量変化がこの範囲にあると、成形体を水中において使用した際に、この劣化による微粒子流失が殆ど起きていないと考えられる観点で好ましい。
【００８９】
本発明の多孔質成形体は、６０℃以下などでの低温乾燥後は、アルコール類への浸漬によって柔軟性を取り戻すことが可能である。１５０℃以上での加熱は、多孔質成形体の柔軟性が失われる傾向にあるため、１５０℃未満で、保存や加工をすることが好ましい。
【００９０】
本発明の多孔質成形体の形状は特に限定されないが、粒状、中空粒子状又は中空糸状であると好ましい。特に形状が中空粒子状又は中空糸状であると、中空構造が無い場合に比べて、たとえば吸着対象や除去対象物質などの反応対象物質が多孔質成形体中に拡散し易くなり、反応速度や反応効率の向上が得られるという点、モジュールなどへのスケールアップが行ない易いという点、また多孔質成形体の内側と外側から物質を供給して表面で反応させるなど原料粒子や中空構造が無い成形体にはできない反応への応用が広がるという点など様々な点での優位性が期待できる。
【００９１】
また、本発明の多孔質成形体は、中空糸膜やペレット状などの成形体として、水の濾過や浄化などに用いることができる精密濾過膜、水溶液中での反応物質の担体などとして使用可能である。この精密濾過膜は、耐水性の精密濾過膜でありながら、ミクロないしメソポーラス微粒子の細孔特性や反応性を併せ持つ。
【００９２】
本発明の多孔質成形体から作製した複合膜は、有害物質の吸着除去作用、陽イオンを含有する水溶液のイオン交換作用を有し、かつ耐水性で自立複合膜とすることができる。この複合膜は、例えば、食品工業用排水の処理剤として好適に使用することができる。
【００９３】
本発明の多孔質成形体は、数ミクロンサイズの粒子を分散液中から加圧濾過できるものであると、膜材料などに使用する場合、微生物など原料粒子では除去不能な大きいサイズの中性粒子も同時に除去できるなどの点で好ましい。
【００９４】
本発明の成形体の成形後の保管については、乾燥せずにそのまま水中又はアルコール中で、保管すれば、フレキシビリティを保ったまま使用することが可能である。また、本発明の成形体は、液相中でも安定な成形体でありながら、成形後も成形前の機能性多孔質微粒子の細孔特性、吸着特性、反応性等を保持することができる。
【００９５】
本発明の成形体は、酵素担持用担体として用いることができる。本発明の成形体は、酵素担持用担体として、酵素と複合体を形成することができる。特に本発明の成形体のうち、機能性微粒子が、細孔直径が２ｎｍ〜５０ｎｍのメソ孔を有し、粒径が０．０１μｍ〜２００μｍであるメソポーラス微粒子であり、成形体中の機能性微粒子の含有率が４６質量％以上である成形体は、酵素担持用担体として好適である。また、本発明の成形体を構成する機能性微粒子の原料である機能性微粒子の機能が、１種類又は２種類以上の酵素及び／又はタンパク質の固定化能を含むと、酵素担持用担体として好適である。
【００９６】
この酵素は、特に限定されないが、酸化還元酵素、加水分解酵素、転移酵素、脱離酵素、異性化酵素、及び／又は合成酵素であると好ましい。酵素としては、具体的には、例えば、アゾ還元酵素、リパーゼ、グルコース脱水素酵素、プロテアーゼが挙げられる。
この酵素は、酸化還元反応、加水分解反応、転移反応、脱離反応、異性化反応、及び／又は合成反応の酵素反応に用いることができる。
【００９７】
複合体を製造する方法は、特に限定されないが、例えば、前記酵素の酵素反応に関わる１種類又は２種類以上の酵素及び／又はタンパク質を、ｐＨ３〜１１に調整した緩衝液中でメソポーラス微粒子の多孔質成形体に固定化させる固定化工程を含むことができる。また、さらに、固定化終了後のメソポーラス微粒子の多孔質成形体をｐＨ３〜１１に調整した緩衝液で複数回洗浄する洗浄工程を含むと更に好ましい。
【００９８】
本発明の複合体を用いた酵素反応方法は特に限定されないが、例えば、１）酵素及び／又はタンパク質をメソポーラス微粒子の多孔質成形体にｐＨ３〜１１に調整した緩衝液中で固定化する固定化工程、２）前記固定化工程で得られたメソポーラス微粒子の多孔質成形体と酵素との複合体を含むｐＨ３〜１１の緩衝液中に、反応基質を添加するか、又は３）前記固定化工程で得られたメソポーラス微粒子の多孔質成形体と酵素との複合体を、反応基質を含むｐＨ３〜１１の緩衝液中に添加して前記の酵素及び／又はタンパク質が関わる酵素反応を行う酵素反応工程、含む方法が挙げられる。また、その他の酵素反応方法としては、１）酵素及び／又はタンパク質をメソポーラス微粒子の多孔質成形体にｐＨ３〜１１に調整した緩衝液中で固定化する固定化工程、２）前記固定化工程で得られたメソポーラス微粒子の多孔質成形体と酵素との複合体をｐＨ３〜１１の緩衝液で洗浄する洗浄工程、３）前記洗浄工程で得られた洗浄後のメソポーラス微粒子の多孔質成形体と酵素との複合体を、反応基質を含む反応液中で、前記の酵素及び／又はタンパク質が関わる酵素反応を行う酵素反応工程、含む方法が挙げられる。
【００９９】
これらの酵素反応は、特に限定されないが、例えば、反応基質から機能性の有用物質を製造する方法、環境中に存在する反応基質となる環境汚染物質を分解する方法、被検試料中に存在するか又は存在する可能性のある反応基質を検出又は定量する方法などが挙げられる。
【０１００】
本発明の多孔質成形体と酵素との複合体は、前記の酵素及び／又はタンパク質が関わる酵素反応用キット、センサー又は装置に用いることができる。この酵素反応用キット、センサー又は装置の用途は特に限定されないが、反応基質から機能性の有用物質を製造するためのもの、環境中に存在する反応基質となる環境汚染物質を分解するためのもの、被検試料中に存在する可能性のある反応基質又は酵素反応後の産物を検出又は定量するためのものとすることができる。
【０１０１】
（実施例）
次に、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等によって何ら限定されるものではない。本発明に係る多孔質成形体の空隙率及び細孔径分布は水銀ポロシメトリなどの測定手法で評価が可能である。また、原料微粒子のミクロないしメソ孔の細孔容積の保持率は、ガス吸着や蒸気吸着測定結果を原料粒子の測定値と比較することによって評価が可能である。
【０１０２】
尚、実施例で用いた微粒子の物性については表１及び表６に、得られた成形体の物性については表２〜表４及び表７に一覧として示した。
【０１０３】
（実施例１）
有機高分子としてのエチレン含有量（モル比）４８ｍｏｌ％のエチレン−ビニルアルコール共重合樹脂（エバールＧ１５６Ｂ、（株）クラレ）９．９８ｇをジメチルスルホキシド（和光純薬工業（株）、特級）１０２．８８ｇに混合し、４０℃にて２００ｒｐｍで一晩攪拌して溶解させた。これを加温攪拌したまま、粒子径０．２μｍ〜２μｍ、細孔径２ｎｍ〜３ｎｍのＭＣＭ４１タイプの合成メソポーラスシリカ（ＳｉＯ２、シグマアルドリッチ  Ｎｏ．６４３６５３）（原料粒子Ａ）１９．９９ｇを添加して、多孔体成形用のスラリーを調製した。この時のスラリー中の粒子の濃度は１５重量％、エチレン−ビニルアルコール共重合樹脂の添加量は７．５重量％で、成形体に対するＭＣＭ粒子の仕込量は６７重量％あった。一晩攪拌したのち、乾湿式紡糸装置にて、スラリー用吐出口径３ｍｍφ、芯液用吐出口径０．７ｍｍφの２重口ノズルを用い、得られたスラリーをシリンダーポンプに入れて２０．５ｍｌ／ｍｉｎで、３７℃の湯浴に射出しながら、芯液として２９℃のお湯を７ｍｌ／ｍｉｎで流して中空糸状に製膜した。
【０１０４】
作製した中空糸膜は外径１．２ｍｍ、内径０．７ｍｍ（図１参照）で、６０℃で一晩乾燥した後に水銀ポロシメーターで測定すると空隙率が６２％前後であり、細孔径分布曲線によるとＭＣＭ４１由来の４ｎｍ〜１０ｎｍ径のナノポア及び０．１μｍ−１μｍのマクロポアを有する多元多孔質成形体であった（図２参照）。この中空糸状成形体の６０℃乾燥物０．０２９９ｇを３ｍｌの蒸留水中に入れ、１００ｒｐｍで３６時間以上連続的に浸透し、再度６０℃乾燥して重量測定を行うと、０．０２９７ｇであり、重量変化は１％以内であり、殆ど粉落ちはないと考えられる。熱分析によると６００℃まで加温した時２００℃以上で有機高分子が分解し、この分解による減量は３４重量％であることから、成形体中のＭＣＭ４１粒子の含量は６６重量％であると考えられる。また、窒素吸着等温線によると成形体と原料粒子の等温線のヒステリシスの相対圧（Ｐ／Ｐｏ）域は一致し、原料粒子のメソ細孔のサイズは、ほぼ保たれていると考えられる。更に成形体中細孔容積は０．２８ｃｍ３／ｇであり、原料のＭＣＭ４１粉末粒子のメソ孔容積は０．５９ｃｍ３／ｇであったことから、成形体の細孔容積を含有されるＭＣＭ粒子の量で換算すると粉末試料の細孔容積の７１％が保持されていると考えられる（図３参照）。また、図４に、実施例１の成形体と原料粒子Ａとの室温での窒素吸着等温線を示す。なお、６０℃２４時間減圧条件にて前処理を行い、粒子含有量で換算した。
【０１０５】
（実施例２）
有機高分子としてのポリエーテルサルホン（Ｖｅｒａｄｅｌ  ＰＥＳ  ３０００Ｐ、ソルベイアドバンストポリマーズ（株）、重量平均分子量（Ｍｗ）＝５７，０００）０．５４ｇをジメチルスルホキシド（和光特級）５．５０ｇに５０℃で完全に溶解し、これに実施例１で用いた合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ａ）０．５５ｇを混合して、スラリーを調製した。この時のスラリー中の粒子の濃度は８．３重量％、ポリエーテルサルホンの添加量は８．２重量％で、成形体に対するＭＣＭ粒子の仕込量は５０重量％あった。このスラリーを約３２℃のお湯を入れたビーカーに滴下して２時間以上凝固させ、６０℃で乾燥、更に、室温で２５時間以上白濁が無くなるまで攪拌洗浄して、ＭＣＭ−ＰＥＳペレットを成形した。
【０１０６】
白濁が無くなるまで攪拌洗浄した後のペレット０．０２８８ｇを３ｍＬの水中で室温７２時間以上攪拌し、乾燥重量を測定すると殆ど重量変化は認められなかった。これを熱分析で６００℃まで加温した時、有機高分子は４５０℃以上で分解し、分解による減量は４７％であったことから、ペレット中のＭＣＭ粒子の含有量は５３％程度であると考えられる。（１２０℃前後に原料粒子及び有機高分子にはない可逆的な吸熱ピーク及び減量が認められ、成形に由来する新たな吸着サイトが生じたと考えられる。）水銀ポロシメーターで測定すると空隙率が７８％前後であり、細孔径分布曲線によるとＭＣＭ４１由来の４ｎｍ〜１０ｎｍ径のナノポア及び０．１μｍ〜１μｍのマクロポアを有する多元多孔体であった。また、窒素吸着等温線によると成形体の細孔容積は０．５０ｃｍ３／ｇであり、同条件で測定した粉末試料の細孔容積が０．５９ｃｍ３／ｇであったことから、成形体に含有されるＭＣＭ４１粒子の量で換算すると成形体中のＭＣＭ４１のメソ孔容積はほぼ全て保持されていると考えられる。
【０１０７】
（実施例３）
有機高分子としてメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ＣＡＳＮｏ．９０１１−１４−７、東京化成工業（株）、Ｍ００８８、Ｍｗ＝１３５，０００〜１４０，０００）０．６０ｇをジメチルホルムアミド（和光特級）７．０ｇに５０℃で完全に溶解し、これに実施例１で用いた合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ａ）０．６０ｇを混合して、スラリーを調製した。このスラリーを約３２℃のお湯を入れたビーカーに滴下して２時間以上凝固させ、６０℃で一晩乾燥させて、ＭＣＭ−アクリルペレットを成形した。このペレットは機械的強度が非常に低かったため、このペレット０．２０ｇを過酸化ベンゾイル（バイオラッド）０．０５１ｇと共にエタノール（和光特級）４．９８ｇにいれて、ゆっくりと昇温し、最終的に６０℃で４時間加温して取り出した。取り出したペレットはゴムのように柔軟で割れにくい性質に変化していた。更にこれを６０℃で乾燥させると、圧縮強度１．４ＭＰａ程度のペレットが得られた。
【０１０８】
この重合及び硬化後のペレットについて、これを熱分析で６００℃まで加温した時、有機高分子は４００℃前後で分解し、分解による減量は５０％であったことから、ペレット中のＭＣＭ粒子の含有量は５０％程度であると考えられる。また、窒素吸着等温線によると成形体中細孔容積は０．３０ｃｍ３／ｇであり、原料のＭＣＭ４１粉末粒子のメソ孔容積は０．９６ｃｍ３／ｇであったことから、成形体の細孔容積を含有されるＭＣＭ粒子の量で換算すると粉末試料の細孔容積の６３％が保持されていると考えられる。
【０１０９】
（実施例４）
実施例１で用いた有機高分子０．１０ｇをジメチルスルホキシド（和光特級）０．７ｍＬに入れ、加熱攪拌して溶解し、これに粒子径１０〜１００ｎｍ、平均細孔径４．２ｎｍのメソポーラス酸化チタン（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ  Ｎｏ．４３２５０）（原料粒子Ｂ）０．２０ｇを混合して、スラリーを調製した。このスラリー室温水を入れたビーカーに滴下して凝固させ、６０℃で乾燥して、メソポーラスＴｉＯ２−ＥＶＯＨペレットを成形した。
【０１１０】
熱分析によると６００℃まで加温した時の有機高分子の分解による減量は４７％であり、原料粒子を加熱したときの減量は１８％であることから、ペレット中の粒子の含有量は６５％程度であると考えられる。また、１００℃で前処理し窒素吸着測定結果によって計算した成形体中の細孔容積を、含有されるメソポーラス酸化チタン粒子の量で換算すると成形体中のメソポーラス酸化チタンのメソ孔容積は６４％程度保持されていると考えられる。
【０１１１】
（実施例５）
原料粒子として平均細孔径が５．７ｎｍサイズのＭＳＵ−Ｘタイプの合成メソポーラス酸化アルミ（Ａｌ２Ｏ３、シグマアルドリッチ  Ｎｏ．５１７７４７）（原料粒子Ｃ）を使用する他は、実施例２と同様にしてメソポーラスアルミナ−ＰＥＳペレットを成形した。熱分析によると、ペレット中の粒子の含有量は５０％程度であった。
【０１１２】
（実施例６）
原料粒子として細孔径が８ｎｍサイズのＦＳＭ２２タイプの合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｄ）を使用する他は、実施例２と同様にしてＦＳＭ２２−ＰＥＳペレットを成形した。熱分析によると、ペレット中の粒子の含有量は５５％程度であった。
【０１１３】
（実施例７）
有機高分子としてエチレン含有量４４ｍｏｌ％のエチレン−ビニルアルコール共重合樹脂（ソアノールＡ４４１２、日本合成化学工業（株））を実施例１で用いたジメチルスルホキシドに溶解し、原料粒子として粒子径が２−３μｍで、結晶粒子径１μｍ以下、細孔径０．９０ｎｍの合成ハイシリカゼオライト（ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３＝１００）（原料粒子Ｅ）を使用する他は、実施例２と同様にしてハイシリカゼオライト−ＥＶＯＨペレットを成形した。６０℃で一晩乾燥した後、水銀ポロシメーターで測定すると空隙率が６２％であった。６０℃で乾燥後のペレットの熱分析によると６００℃まで加温した時の減量は５０重量％であり、成型体中のゼオライト粒子の含量は５０重量％であると考えられる。また、窒素吸着等温線によると成形体中の全細孔容積はゼオライト粒子量換算で、粉末試料の８０％以上であった。
【０１１４】
（実施例８）
有機高分子として実施例１で用いたエチレン含有量４８ｍｏｌ％のエチレン−ビニルアルコール共重合樹脂３４．５ｇを実施例１で用いたジメチルスルホキシド１８１．７１ｇに混合し、４８℃にて２００ｒｐｍで一晩攪拌して溶解させた。これを加温攪拌したまま、実施例７で用いた合成ハイシリカゼオライト（原料粒子Ｅ）６８．０１ｇを添加して、多孔体成形用のスラリーを調製した。この時のスラリー中のゼオライト粒子の濃度は２２．０重量％で、成形体に対するゼオライト粒子の仕込量は６７重量％であった。一晩攪拌したのち、スラリー用吐出口径６ｍｍφ、芯液用吐出口径２．５ｍｍφの２重口ノズルを用い、得られたスラリーをシリンダーポンプに入れて４０．０ｍｌ／ｍｉｎで、３４℃の水浴に射出しながら、芯液として２５℃の水を７０．０ｍｌ／ｍｉｎで流して中空糸状に製膜した。
【０１１５】
作製した中空糸膜は外径４．８ｍｍ、内径３．０ｍｍであった。熱分析によると６００℃まで加温した時の減量は３６重量％であり、成形体中のゼオライト粒子の含量は６４重量％であると考えられる。水銀ポロシメトリによると６０℃で一晩乾燥した後の空隙率は４０％、更に１５０℃で２時間加温してＥＶＯＨを結晶化させた後は、空隙率が３７％であり、細孔径分布曲線によると０．２８μｍのマクロポアを有する多孔体であった。窒素吸着測定によると６０℃乾燥処理後の成形体中の全細孔容積はゼオライト粒子量換算で、粉末試料の８９％以上であった。
【０１１６】
（実施例９）
有機高分子として実施例１で用いた樹脂３５．０３ｇを実施例１で用いたジメチルスルホキシド１８１．２９ｇに混合し、５０℃にて２０２ｒｐｍで一晩攪拌して溶解させた。これを加温攪拌したまま、粒子径１０μｍ、結晶粒子径２μｍ−４μｍ、細孔径０．５８ｎｍの合成ハイシリカゼオライト（ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３＝４０）（原料粒子Ｆ）６０．２０ｇを添加して、多孔体成形用のスラリーを調製した。この時のスラリー中の粒子の濃度は２１．８重量％で成形体に対するゼオライト粒子の仕込量は６３重量％あった。一晩攪拌したのち、乾湿式紡糸装置にて、２重口ノズルを用い、得られたスラリーをシリンダーポンプに入れて２２．３ｍｌ／ｍｉｎで、２５℃の水浴に射出しながら、芯液として２５℃の水を１１．７ｍｌ／ｍｉｎで流して中空糸状に製膜した。
【０１１７】
作製した中空糸膜は外径２．４ｍｍ、内径１．４ｍｍであった。熱分析によると６００℃まで加温した時の減量は３６重量％であり、成形体中のゼオライト粒子の含量は６４重量％であると考えられる。６０℃で一晩乾燥し、更に１５０℃で２時間加熱した後、水銀ポロシメーターで測定すると空隙率が４０％であり、細孔径分布曲線によると０．４３μｍのマクロポアを有する多孔体であった。また、窒素吸着測定によると６０℃乾燥処理後の成形体中の全細孔容積はゼオライト粒子量換算で、粉末試料の１００％以上、そのうちゼオライト孔に起因する低圧部（相対圧Ｐ／Ｐｏ＜０．１２）の窒素吸着量は粉末試料の６４％以上であった。
【０１１８】
（実施例１０）
有機高分子としてポリサルホン（Ｕｄｅｌ  ＰＳＦ  ｐ−１７００、ソルベイアドバンストポリマーズ（株））を用い、スラリー用の良溶媒として実施例３のジメチルホルムアミドを使用する他は、実施例９と同様に有機高分子を先に溶解させた溶媒を攪拌しながら原料粒子Ｆを投入しての成形用スラリーを調製し、実施例９と同じノズルを用い、同条件で中空糸の紡糸を行なった。
【０１１９】
作製した中空糸膜は外径１．８ｍｍ、内径１．０ｍｍであった。熱分析による成形体中のゼオライト粒子の含量は５９重量％であり、紡糸に際して仕込比に対して４−５％の微粒子のロスがあったと考えられる。６０℃で一晩乾燥し、水銀ポロシメーターで測定すると空隙率が６６％で、細孔径分布曲線によると０．２２μｍと１．４３μｍのマクロポアを有する多元多孔体であった。また、窒素吸着測定によると６０℃乾燥処理後の成形体中の全細孔容積はゼオライト粒子量換算で、粉末試料の８５％、そのうちゼオライト孔に起因する低圧部（相対圧Ｐ／Ｐｏ＜０．１２）の窒素吸着量は粉末試料の７７％以上であった。
【０１２０】
（実施例１１）
実施例３で用いたジメチルホルムアミド２０３．５０ｇを加温攪拌した状態で有機高分子として実施例３で用いたメタクリル酸メチル樹脂２０．２４ｇを徐々に混合し、５０℃にて３３０ｒｐｍで一晩攪拌して溶解させた。これを加温攪拌したまま、実施例９で用いた合成ハイシリカゼオライト（原料粒子Ｆ）４０．２２ｇを添加して、更に４−５時間攪拌を続けて、多孔体成形用のスラリーを調製した。この時のスラリー中のゼオライト粒子の濃度は１５．０重量％で、成形体に対するゼオライト粒子の仕込量は６７重量％であった。５時間攪拌したのち、実施例１で用いた２重口ノズルを用い、得られたスラリーをシリンダーポンプに入れて２０．６ｍｌ／ｍｉｎで、３０℃の湯浴に射出しながら、芯液として２５℃の水を７．６ｍｌ／ｍｉｎで流して中空糸状に製膜した。
【０１２１】
作製した中空糸膜は外径２．２ｍｍ、内径１．０ｍｍであった。熱分析によると６００℃まで加温した時の減量は３９重量％であり、成形体中のゼオライト粒子の含量は６１重量％であると考えられる。水銀ポロシメトリによると６０℃で一晩乾燥した後の空隙率は５５％であった。細孔径分布曲線によると、２．５μｍ径と６μｍ径のマクロ孔を有する多元多孔体であった。窒素吸着測定によると６０℃乾燥処理後の成形体中の全細孔容積はゼオライト粒子量換算で、粉末試料の８２％、そのうちゼオライト孔に起因する低圧部（相対圧Ｐ／Ｐｏ＜０．１２）の窒素吸着量は粉末試料の６４％以上であった。
【０１２２】
（実施例１２）
実施例１１で得られた中空糸について、強度及び柔軟性を改善するために実施例３と同様に、エタノール（和光特級９９．５％）３９６．２ｇに過酸化ベンゾイル４ｇを入れて溶解させた容器に室温で一晩乾燥した後の中空糸を入れて、２時間４０−５０℃で加温し、再重合処理を行なった。更に洗浄して室温乾燥した後、再度エタノール中にて減圧下で加熱処理を２時間行なった。水銀ポロシメトリによると空隙率は、重合処理のため、４０％と処理前に比べて減少し、細孔径分布曲線によると０．４３、１．３、２．５μｍ径にマクロ孔が生じていた。窒素吸着測定によると１５０℃２４時間の真空乾燥処理後の成形体中の全細孔容積は微粒子含有量換算で、粉末試料の９７％、そのうちミクロ孔に起因する低圧部（相対圧Ｐ／Ｐｏ＜０．１２）の窒素吸着量は粉末試料の７７％以上と、処理前の中空糸に比べて細孔保持率も増加した。また、この中空糸の６０℃乾燥物０．３０８７ｇを３０ｍｌの蒸留水中に入れ、１２０ｒｐｍで３０時間以上連続的に浸透し、再度６０℃で一晩乾燥して重量測定を行ったところ、粉落ちも減量も認められなかった。
【０１２３】
（実施例１３）
有機高分子としてポリアミドイミド樹脂を１４重量％含有したノルマルメチルピロリドン溶液（バイロマックスＨＲ−１６ＮＮ、東洋紡（株））１１０．９５ｇを４５℃、３３５ｒｐｍで加温攪拌した状態で、実施例９−１２で用いた合成ハイシリカゼオライト（原料粒子Ｆ）３１．１９ｇを添加し、一晩攪拌を続けて、多孔体成形用のスラリーを調製した。この時のスラリー中のゼオライト粒子の濃度は２２重量％で、成形体に対するゼオライト粒子の仕込量は６７重量％であった。５時間攪拌したのち、実施例１で用いた２重口ノズルを用い、得られたスラリーをシリンダーポンプに入れて２１．４ｍｌ／ｍｉｎで、３０℃の湯浴に射出しながら、芯液として２５℃の水を１０．４ｍｌ／ｍｉｎで流して中空糸状に製膜した。
【０１２４】
作製した中空糸膜は外径２．６ｍｍ、内径１．０ｍｍで、曲げ強度は４−５ＭＰａ程度であった。熱分析によると成形体中のゼオライト粒子の含量は６５重量％前後であった。水銀ポロシメトリによると６０℃で一晩乾燥した後の空隙率は５０％であった。細孔径分布曲線によると、２０ｎｍ径以下のメソ孔と０．２μｍ前後の径のマクロ孔を有する多元多孔体であった。窒素吸着測定によると６０℃乾燥処理後の成形体中の全細孔容積はゼオライト粒子量換算で、粉末試料の９８％以上となったが、ゼオライト孔に起因する低圧部（相対圧Ｐ／Ｐｏ＜０．１２）の窒素吸着量は粉末試料の２４％以下とメソ孔の細孔容積は大きいがミクロ孔がかなり潰れた状態であった。
【０１２５】
（実施例１４）
実施例１３で得られたポリアミドイミド中空糸について、ミクロ孔機能を改善するために、実施例１２と同様に、室温乾燥後の中空糸について、減圧下のエタノール中で加熱処理を４０−５０℃で２時間行なった。熱分析によるとゼオライトの含有量については６５重量％と変化は認められなかった。水銀ポロシメトリによると空隙率は５９％と処理前に比べて増加し、細孔径分布曲線によると０．２μｍ径の代わりに０．４３μｍ径にマクロ孔が生じていた。窒素吸着測定によると１５０℃２４時間の真空乾燥処理後の成形体中の全細孔容積は０．１７ｃｍ３／ｇと原料粒子の１．４倍となり、そのうちミクロ孔に起因する低圧部（相対圧Ｐ／Ｐｏ＜０．１２）の窒素吸着量は粉末試料の８４％以上と、処理前の中空糸に比べて細孔保持率も大幅に増加した。また、この中空糸について強度測定を行なったところ、曲げ強度は４−６ＭＰａと、処理前と比較して強度の低下は認められなかった。図５に、実施例１３と実施例１４（実施例１３の改質物）の原料粒子Ｆに対する室温での窒素吸着等温線比較を示す。なお、１５０℃２４時間減圧条件にて前処理し、粒子Ｆの含有量による換算である。
【０１２６】
（実施例１５）
原料粒子として粒子径０．５−１μｍ、結晶粒子径５０ｎｍ、細孔径０．５８ｎｍの合成ハイシリカゼオライト（ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３＝５２）（原料粒子Ｇ）２０．１０ｇを実施例２で用いたジメチルスルホキシド５０．１０ｇに予め混合し、４７℃にて２００ｒｐｍで加温攪拌しながら、有機高分子として実施例２で用いた樹脂９．９８ｇを添加した。２００ｒｐｍ−３００ｒｐｍで４時間攪拌した後、加温攪拌を続けながら５０℃に加温したジメチルスルホキシドを２０．０７ｇ添加して更に３時間攪拌を続けて、多孔体成形用のスラリーを調製した。この時のスラリー中の粒子の濃度は２０重量％で成形体に対するゼオライト粒子の仕込量は６７重量％あった。実施例１で用いた２重口ノズルを用い、空走距離５ｃｍ湯浴２７℃の条件で、スラリーを１９〜２２．５ｍＬ／ｍｉｎ流しながら、中空糸の紡糸を試みたが、芯液を０−２ｍＬ／ｍｉｎ流すとスラリーの射出が途切れて断続的になり、中空糸成形はできず、代わりにペレット状の成形体が得られた。
【０１２７】
洗浄乾燥後のペレット状成形体を水銀ポロシメーターで測定すると空隙率が６９％前後であった。熱分析から見積もられる粒子含有量は６７％で仕込比通りであった。窒素吸着測定によると成形体中の全細孔容積はゼオライト粒子量換算で、粉末試料の５６％、ゼオライト孔に起因する低圧部（相対圧Ｐ／Ｐｏ＜０．１２）の窒素吸着量は粉末試料の５７％であった。
【０１２８】
（実施例１６）
有機高分子として実施例２で用いたポリエーテルサルホン１．６８ｇを１１．７０ｇのジメチルスルホキシドに５０℃で溶解し、これに原料粒子Ａを０．８５ｇ、原料粒子Ｆを１．７３ｇ添加して成形用スラリーを調製した他は、実施例２と同様にペレットを作製した。この時のスラリー中の微粒子濃度は１６重量％で、成形体に対する微粒子の仕込比は原料粒子Ａが２０重量％、原料粒子Ｆが４１重量％であった。得られたペレットについて、熱分析を行なうと有機物の分解による減量は大凡２０％で微粒子の含有量が８０％と仕込比に対して高くなった。水銀ポロシメトリによると成形体の空隙率は６９％で、細孔径分布曲線によると複数のマクロポアの他に５ｎｍ前後の領域にメソポアを有する多元多孔体となっていた。更に、窒素吸着測定によると成形体中の全細孔容積は微粒子含有量換算で、粉末試料の５０％程度であった。
【０１２９】
（実施例１７）
有機高分子としてＰＭＭＡ樹脂を用いて成形し、更に過酸化ベンゾイルによる再重合処理を行なった比較例７の成形体は表２に示す通りミクロ孔の保持率が低いが、減圧下のエタノール中で４０−５５℃の煮沸処理を１−２時間行なったところ、表３に示すように、ミクロ孔の吸着性能試験結果に著しい改善が得られた。（実施例１１及び比較例７とその改質物を用いて行なった水溶液中からのコバルト吸着試験結果を表３に示す。）
【０１３０】
（比較例１）
実施例２において原料粒子を入れず、有機高分子であるポリエーテルサルホンを倍量添加する他は、実施例２と同様にして、ポリエーテルサルホンのみのペレットを作成した。水銀ポロシメトリによるとペレットは空隙率４２％の多孔体であったが、窒素吸着によるミクロ〜メソ孔の全細孔容積は０．０１ｍＬ／ｇ以下であった。
【０１３１】
（比較例２）
有機高分子として実施例１０で用いているポリサルホン１．１５ｇを原料粒子Ａ１．１５ｇと同時に、実施例３、１０及び１１で用いているジメチルホルムアミド２０．３６ｇに入れて攪拌を行ない成形用スラリーを調製した他は、実施例２と同様にペレット成形を試みたが、成形できなかった。
【０１３２】
（比較例３）
有機高分子としてエチレン含有量２９ｍｏｌ％のエチレン−ビニルアルコール共重合樹脂（ソアノールＤ２９０８、日本合成化学工業（株））を用いた他は、実施例７と同様にしてペレットの作製を試みたが、調製したスラリーが凝固用の貧溶媒の表面に膜状に広がってしまい、ペレット状の成形はできなかった。
【０１３３】
（比較例４）
スラリー用の溶媒として、実施例３、１０及び１１で用いているジメチルホルムアミド９５．５ｇとジメチルアセトアミド（和光特級）５４．８３ｇの混合溶媒を用い、これに予め原料粒子Ｆ６０．１２ｇを分散させて、加温攪拌しながら、有機高分子としてのポリサルホンを添加する他は、実施例１０と同様にして多孔体成形用のスラリー調製を試みたが、ポリサルホンがスラリー中に混和せず、撹拌機を停止すると底に沈殿が生じて均一なスラリーが得られなかった。
【０１３４】
（比較例５）
有機高分子として非晶性ポリエステル樹脂（バイロン２００、東洋紡（株））０．５４ｇを実施例３、１０及び１１で用いているジメチルホルムアミドに溶解させた後、加温攪拌しながら原料粒子Ｆ０．５４ｇを添加して、成形用スラリーの調製を試みたが、均一なスラリーが得られなかった。
【０１３５】
（比較例６）
実施例１５に記載の通りに、原料粒子Ｇを予め混合する方法で、成形用スラリーを調製したが、スラリーの射出が安定せず、中空糸の成形はできなかった。
【０１３６】
（比較例７）
有機高分子として実施例３及び１１で用いたメチルメタクリル樹脂１６．２３ｇをジメチルスルホキシド１６０．６９ｇに４５℃で加温攪拌して溶解した後、攪拌したまま、上愛子産天然モルデナイト粉末（新東北化学工業（株）、原料粒子Ｈ）４０．０ｇを３０メッシュのＳＵＳ金網でふるいながら添加し、成形用スラリーを調製した。この時のスラリー中の微粒子の濃度は１８重量％で、成形体に対するゼオライト粒子の仕込量は７１重量％であった。一晩攪拌したのち、乾湿式紡糸装置にて、実施例１で用いた２重口ノズルを用い、得られたスラリーをシリンダーポンプに入れて２２．８ｍｌ／ｍｉｎで、４０℃の湯浴に射出しながら、芯液として２５℃の水を１０．１ｍｌ／ｍｉｎで流して中空糸状に製膜した。
【０１３７】
作製した中空糸は外径２．２ｍｍ、内径１．０ｍｍであった。そのままでは非常に脆いので、実施例３と同様に、エタノール（和光特級９９．５％）１Ｌ７９１．８２ｇ）に過酸化ベンゾイル８ｇを入れて溶解させた容器に室温で一晩乾燥した後の中空糸を入れて、２時間４０−６０℃で加温し、再重合処理を行なった。処理後の中空糸を洗浄乾燥して、熱分析すると有機物の分解による減量は４０重量％であり、成形体中のゼオライト粒子の含量は６０重量％であったが、成形時よりも成形用スラリーへの原料添加時のロスが大きかったと考えられる。水銀ポロシメトリによると空隙率は４６％であった。窒素吸着測定によると１５０℃２４時間の真空乾燥処理後の成形体中の全細孔容積は微粒子含有量換算で、粉末試料の２４％、特にミクロ孔に起因する低圧部（相対圧Ｐ／Ｐｏ＜０．１２）の窒素吸着量は粉末試料の５％以下であり、重合処理前の中空糸について測定を行なっても同様であった。
【０１３８】
表１に、実施例及び比較例で用いた機能性微粒子の物性を示す。
【０１３９】
【表１】
2018090767.tif 000003
【０１４０】
表２〜４に、実施例又は比較例で得られた（多孔質）成形体の物性を示す。
【０１４１】
【表２】
2018090767.tif 000004
【０１４２】
【表３】
2018090767.tif 000005
【０１４３】
【表４】
2018090767.tif 000006
【０１４４】
実施例１１、比較例７及び比較例７のエタノール処理後の成形体のコバルト（ＣｏＣｌ２）吸着性能について、室温２４時間における、バッチ試験によって、其々の原料粒子と比較を行なった。結果を表５に示す。吸着剤其々０．３ｇを３０ｍＬのコバルト水溶液５０ｐｐｍに添加して行った。原料ＦとＨではゼオライト中のＳｉ／Ａｌ比が異なっている。ゼオライト粒子では構造中のＳｉをＡｌが置換することによって、イオン交換サイトが生じるため、原料ＨのＣｏ吸着容量はＦのそれに比べて、かなり大きくなっている。実施例１１では原料ＦよりもＰＭＭＡ樹脂による成形体へのコバルト吸着量が高くなっているが、比較例７のＰＭＭＡ成形体は原料Ｈに比べて吸着量がかなり低くなっている。比較例７を実施例１２、１４のように、減圧下でエタノール中で加温処理すると、表５に示すように原料粒子相当のコバルトの吸着能が認められるようになった。
【０１４５】
【表５】
2018090767.tif 000007
【０１４６】
（実施例１８）
有機高分子としてのエチレン含有量（モル比）４８ｍｏｌ％のエチレン−ビニルアルコール共重合樹脂（エバールＧ１５６Ｂ、（株）クラレ）９．９８ｇをジメチルスルホキシド（和光特級）１０２．８８ｇに混合し、４０℃にて２００ｒｐｍで一晩攪拌して溶解させた。これを加温攪拌したまま、粒子径０．２μｍ〜２μｍ、細孔径２ｎｍ〜３ｎｍのＭＣＭ−４１タイプの合成メソポーラスシリカ（ＳｉＯ２、シグマアルドリッチ  Ｎｏ．６４３６５３）（原料粒子Ｉ）１９．９９ｇを添加して、多孔体成形用のスラリーを調製した。この時のスラリー中の粒子の濃度は１５重量％、エチレン−ビニルアルコール共重合樹脂の添加量は７．５重量％で、成形体に対するＭＣＭ粒子の仕込量は６７重量％あった。一晩攪拌したのち、乾湿式紡糸装置にて、スラリー用吐出口径３ｍｍφ、芯液用吐出口径０．７ｍｍφの２重口ノズルを用い、得られたスラリーをシリンダーポンプに入れて２０．５ｍｌ／ｍｉｎで、３７℃の湯浴に射出しながら、芯液として２９℃のお湯を７ｍｌ／ｍｉｎで流して中空糸状に製膜して、「ＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸」を得た。図６に得られた成形体の外観像を示す。
【０１４７】
作製した中空糸膜は外径１．２ｍｍ、内径０．７ｍｍで、６０℃で一晩乾燥した後に水銀ポロシメーターで測定すると空隙率が６２％前後であり、細孔径分布曲線によるとＭＣＭ−４１由来の４ｎｍ〜１０ｎｍ径のナノポア及び０．１μｍ−１μｍのマクロポアを有する多元多孔質成形体であった。この中空糸状成形体の６０℃乾燥物０．０２９９ｇを３ｍｌの蒸留水中に入れ、１００ｒｐｍで３６時間以上連続的に浸透し、再度６０℃乾燥して重量測定を行うと、０．０２９７ｇであり、重量変化は１％以内であり、殆ど粉落ちはないと考えられる。熱分析によると６００℃まで加温した時２００℃以上で有機高分子が分解し、この分解による減量は３４重量％であることから、成形体中のＭＣＭ−４１粒子の含量は６６重量％であると考えられる。また、窒素吸着等温線によると成形体と原料粒子の等温線のヒステリシスの相対圧（Ｐ／Ｐｏ）域は一致し、原料粒子のメソ細孔のサイズは、ほぼ保たれていると考えられる。更に成形体中細孔容積は０．２８ｃｍ３／ｇであり、原料のＭＣＭ−４１粉末粒子のメソ孔容積は０．５９ｃｍ３／ｇであったことから、成形体の細孔容積を含有されるＭＣＭ粒子の量で換算すると粉末試料の細孔容積の７１％が保持されていると考えられる。
【０１４８】
（実施例１９）
有機高分子としてのポリエーテルサルホン（Ｖｅｒａｄｅｌ  ＰＥＳ  ３０００Ｐ  ソルベイアドバンストポリマー（株）、重量平均分子量（Ｍｗ）＝５７，０００）０．５４ｇをジメチルスルホキシド（和光特級）５．５０ｇに５０℃で完全に溶解し、これに実施例１８で用いた合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｉ）０．５５ｇを混合して、スラリーを調製した。この時のスラリー中の粒子の濃度は８．３重量％、ポリエーテルサルホンの添加量は８．２重量％で、成形体に対するＭＣＭ粒子の仕込量は５０重量％あった。このスラリーを約３２℃のお湯を入れたビーカーに滴下して２時間以上凝固させ、６０℃で乾燥、更に、室温で２５時間以上白濁が無くなるまで攪拌洗浄して、「ＭＣＭ−４１−ＰＥＳペレット」を成形した。
【０１４９】
白濁が無くなるまで攪拌洗浄した後のペレット０．０２８８ｇを３ｍＬの水中で室温７２時間以上攪拌し、乾燥重量を測定すると殆ど重量変化は認められなかった。これを熱分析で６００℃まで加温した時、有機高分子は４５０℃以上で分解し、分解による減量は４７％であったことから、ペレット中のＭＣＭ粒子の含有量は５３％程度であると考えられる。（１２０℃前後に原料粒子及び有機高分子にはない可逆的な吸熱ピーク及び減量が認められ、成形に由来する新たな吸着サイトが生じたと考えられる。）水銀ポロシメーターで測定すると空隙率が７８％前後であり、細孔径分布曲線によるとＭＣＭ−４１由来の４ｎｍ〜１０ｎｍ径のナノポア及び０．１μｍ〜１μｍのマクロポアを有する多元多孔体であった。また、窒素吸着等温線によると成形体の細孔容積は０．５０ｃｍ３／ｇであり、同条件で測定した粉末試料の細孔容積が０．５９ｃｍ３／ｇであったことから、成形体に含有されるＭＣＭ−４１粒子の量で換算すると成形体中のＭＣＭ−４１のメソ孔容積はほぼ全て保持されていると考えられる。
【０１５０】
（実施例２０）
原料粒子として細孔径が４．５ｎｍサイズのＦＳＭ−２２タイプの合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｊ）を使用した他は、実施例１９と同様にして「ＦＳＭ−２２−４．５ｎｍ−ＰＥＳペレット」を成形した。熱分析によると、ペレット中の粒子の含有量は５０％程度であった。
【０１５１】
（実施例２１）
原料粒子として細孔径が６ｎｍサイズのＦＳＭ−２２タイプの合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｋ）を使用した他は、実施例１９と同様にして「ＦＳＭ−２２−６ｎｍ−ＰＥＳペレット」を成形した。熱分析によると、ペレット中の粒子の含有量は５２％程度であった。
【０１５２】
（実施例２２）
原料粒子として細孔径が８ｎｍサイズのＦＳＭ−２２タイプの合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｌ）を使用した他は、実施例１９と同様にして「ＦＳＭ−２２−８ｎｍ−ＰＥＳペレット」を成形した。熱分析によると、ペレット中の粒子の含有量は５５％程度であった。
【０１５３】
（実施例２３）
原料粒子として細孔径が４ｎｍサイズのＳＢＡ−１５タイプの合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｍ）を使用した他は、実施例１９と同様にして「ＳＢＡ−１５−４ｎｍ−ＰＥＳペレット」を成形した。熱分析によると、ペレット中の粒子の含有量は５０％程度であった。また、図７に実施例２３で用いたＳＢＡ−１５タイプの合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｍ）、得られた成形体、及び当該成形体と酵素（リパーゼ）との複合体の外観像を示す。（ａ）は、典型的なメソポーラスシリカ（ＳＢＡ−１５タイプ、原料粒子Ｍ）の粉末（１０ｍｇ）であり、（ｂ）は、成形体（２０ｍｇ）であり、（ｃ）は、当該成形体と酵素（リパーゼ）との複合体である。（ａ）はと（ｂ）は白色であり、（ｃ）は褐色である。
【０１５４】
（実施例２４）
原料粒子として細孔径が６ｎｍサイズのＳＢＡ−１５タイプの合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｎ）を使用した他は、実施例１９と同様にして「ＳＢＡ−１５−６ｎｍ−ＰＥＳペレット」を成形した。熱分析によると、ペレット中の粒子の含有量は５０％程度であった。
【０１５５】
（実施例２５）
原料粒子として細孔径が８ｎｍサイズのＳＢＡ−１５タイプの合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｏ）を使用した他は、実施例１９と同様にして「ＳＢＡ−１５−８ｎｍ−ＰＥＳペレット」を成形した。熱分析によると、ペレット中の粒子の含有量は５０％程度であった。
【０１５６】
（実施例２６）
原料粒子として細孔径が５ｎｍサイズのＳＢＡ−１６タイプの合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｐ）を使用した他は、実施例１９と同様にして「ＳＢＡ−１６−５ｎｍ−ＰＥＳペレット」を成形した。熱分析によると、ペレット中の粒子の含有量は５４％程度であった。
【０１５７】
（実施例２７）
実施例１８で用いた有機高分子０．５３ｇをジメチルスルホキシド（和光特級）５．５５ｍＬに入れ、加熱攪拌して溶解し、これに平均細孔径が５．８ｎｍサイズのＭＳＵ−Ｘタイプの合成メソポーラス酸化アルミ（Ａｌ２Ｏ３、シグマアルドリッチ  Ｎｏ．５１７７４７）（原料粒子Ｑ）０．５４ｇを混合して、スラリーを調製した。このスラリー室温水を入れたビーカーに滴下して凝固させ、６０℃で乾燥して、「メソポーラスＡｌ２Ｏ３−ＥＶＯＨペレット」を成形した。
【０１５８】
熱分析によると６００℃まで加温した時の有機高分子の分解による減量は５４％であり、ペレット中の粒子の含有量は４６％程度であると考えられる。
【０１５９】
（実施例２８）
原料粒子として平均細孔径が５．８ｎｍサイズのＭＳＵ−Ｘタイプの合成メソポーラス酸化アルミ（Ａｌ２Ｏ３、シグマアルドリッチ  Ｎｏ．５１７７４７）（原料粒子Ｑ）を使用した他は、実施例１９と同様にして「メソポーラスＡｌ２Ｏ３−ＰＥＳペレット」を成形した。熱分析によると、ペレット中の粒子の含有量は５０％程度であった。
【０１６０】
（実施例２９）
実施例１８で用いた有機高分子０．１０ｇをジメチルスルホキシド（和光特級）０．７ｍＬに入れ、加熱攪拌して溶解し、これに粒子径１０〜１００ｎｍ、平均細孔径４．２ｎｍのメソポーラス酸化チタン（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ  Ｎｏ．４３２５０）（原料粒子Ｒ）０．２０ｇを混合して、スラリーを調製した。このスラリー室温水を入れたビーカーに滴下して凝固させ、６０℃で乾燥して、「メソポーラスＴｉＯ２−ＥＶＯＨペレット」を成形した。
【０１６１】
熱分析によると６００℃まで加温した時の有機高分子の分解による減量は４７％であり、ペレット中の粒子の含有量は６５％程度であると考えられる。また、１００℃で前処理し蒸気吸着測定結果によって計算した成形体中の比表面積は、１２７ｍ２／ｇとなり、原料粉末の細孔容積は０．２９ｃｍ３／ｇ、比表面積は２３５ｍ２／ｇであることから、含有されるメソポーラス酸化チタン粒子の量で換算すると成形体中のメソポーラス酸化チタンのメソ孔容積はほぼ全て保持されていたと考えられる。
【０１６２】
（比較例８）
実施例１９において原料粒子を入れず、有機高分子であるポリエーテルサルホンを倍量添加した他は、実施例１９と同様にして、ポリエーテルサルホンのみのペレットである「ＰＥＳペレット」を作製した。水銀ポロシメトリによるとペレットは空隙率４２％の多孔体であったが、窒素吸着測定によると当該成形体の全細孔容積は０．０１ｍＬ／ｇ以下であった。
【０１６３】
表６に、メソポーラス微粒子の多孔質成形体の製造に用いた各種メソポーラス微粒子の物性を示す。
【０１６４】
【表６】
2018090767.tif 000008
【０１６５】
表７に、実施例１８〜２９で得られたメソポーラス微粒子の多孔質成形体、及び、実施例１９において原料粒子を入れず、有機高分子であるポリエーテルサルホンのみを用いて製造した成形体の物性を示す。
【０１６６】
【表７】
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【０１６７】
（実施例３０：ＡｚｏＲ−ＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸複合体の製造及び酵素反応）
本実施例では、実施例１８で得られた成形体（ＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸）に対するアゾ還元酵素（ＡｚｏＲ）の固定化と酵素活性の評価を行った。図８に、ＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸とＡｚｏＲとの複合体の製造法、アゾ染料（メチルレッド）の還元分解反応、及び、固定化酵素の再使用までの実験手順の例を示す。
【０１６８】
（１−１）ＡｚｏＲ−ＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸複合体の製造方法
酵素の固定化支持体には、メソポーラス微粒子の多孔質成形体として、実施例１８で得られたＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸（平均細孔径：２．６６ｎｍ）を使用した。また、比較のための成型前のメソポーラスシリカ微粒子として、ＭＣＭ−４１タイプの合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｉ）を使用した。また、アゾ還元酵素としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のＡｚｏＲ（二量体、アミノ酸残基数：２０１、分子量（単量体）：約２３ｋＤ）を用いた。
【０１６９】
まず、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの染色体ＤＮＡから増幅したＡｚｏＲ遺伝子をｐＥＴ１００／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入することによって、ＡｚｏＲ発現用の環状プラスミドＤＮＡを作製した。次に、前記環状プラスミドＤＮＡを組換え大腸菌に導入し、大腸菌タンパク発現系を利用してＡｚｏＲを製造した。
【０１７０】
酵素を固定化する際には、図８に記載の手順に従い、ＡｚｏＲ（０．３８７ｍｇ）を含んだ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５））１ｍＬと、予め５ｍｍ長に切断し、マイクロチューブに量り取り、同緩衝液を用いて平衡化しておいたＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸（１５又は３０ｍｇ）とを、ローテーターを用いて室温で２０時間穏やかに混合することによって複合化させ、遠心分離操作、及び、同緩衝液を用いた洗浄操作を２度行うことでＡｚｏＲ−ＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸複合体を得た。なお、本発明の酵素とメソポーラス微粒子の多孔質成形体との複合体としては、未洗浄のままで用いることもできるが、本実施例及び以下の実施例３１、３２、及び３３では、成形体への酵素の結合安定性を評価するために、以下の遠心分離工程と共に洗浄工程を行っている。
【０１７１】
具体的には、前記のＡｚｏＲ−ＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸複合体（未洗浄）の分散液に対して遠心分離（４℃、１８，０００Ｇ、１０分間）を行い、上清を全て回収した。続いて、洗浄用緩衝液（固定化時に選択した緩衝液を使用）１ｍＬを添加し、Ｖｏｒｔｅｘ  Ｍｉｘｅｒを用いて約５秒間室温で攪拌し、ＡｚｏＲとメソポーラスシリカ成形体との複合体を再懸濁した後、遠心分離（４℃、１８，０００Ｇ、１０分間）を行い、上清を全て回収する洗浄操作を行った。再び、前記洗浄用緩衝液１ｍＬを用いて洗浄操作を繰り返し、最終的に、ＡｚｏＲ−ＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸複合体（洗浄済）を得た。以下、「ＡｚｏＲ−ＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸」という。
また、比較のためにＭＣＭ−４１タイプの合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｉ）（１０ｍｇ）を用いて、同様の手順により複合体を得た。以下、「ＡｚｏＲ−ＭＣＭ−４１−粉末」という。
【０１７２】
成形体に対する酵素の固定化量及び固定化率は、固定化前の酵素量（１ｍＬ中、０．３８７ｍｇ）を基準とし、前記の遠心分離工程及び洗浄工程の回収液に含まれる遊離の酵素量の引き算及び割り算によって評価した。図９に、ＭＣＭ−４１−粉末（典型的なメソポーラスシリカ（ＭＣＭ−４１タイプ、原料粒子Ｉ）、又は、実施例１８のＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸に対するＡｚｏＲの固定化量及び固定化率を示す。
【０１７３】
図９より、ＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸に対するＡｚｏＲの固定化量及び固定化率は、成形体の量に比例して増大する傾向が認められた。実施例１８より、成形体中のＭＣＭ−４１粒子の含量が６６重量％であることを鑑みると、ＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸の１５ｍｇ及び３０ｍｇに含まれるＭＣＭ−４１粒子は各々１０ｍｇ及び２０ｍｇに相当すると考えられる。ここで、ＭＣＭ−４１−粉末（１０ｍｇ）とＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸（１５ｍｇ）とを比較すると、ＭＣＭ−４１粒子の量が同等であるにもかかわらず、粉末よりも中空糸成形体の方が酵素の固定化量及び固定化率が低下したが、成形体においても粉末の８２．５％に相当する酵素の固定化能を保持していることが判明した。
【０１７４】
（１−２）メチルレッドの分解活性の評価
（１−１）で得られたＡｚｏＲ−ＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸及びＡｚｏＲ−ＭＣＭ−４１−粉末それぞれの酵素活性を、反応基質としてのアゾ染料（メチルレッド）の分解率（脱色率）により評価した。
具体的には、図８に示したように、複合体それぞれに対して、以下の酵素反応を起こさせ、各種の反応基質（メチルレッド及び補酵素（ＮＡＤＨ））の吸光度変化を調べることで酵素活性を評価した。
【０１７５】
酵素反応は、（１−１）で得られた、マイクロチューブ内のＡｚｏＲ−ＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸及びＡｚｏＲ−ＭＣＭ−４１−粉末に対して、メチルレッド、ＮＡＤＨ等を含んだ反応基質（１ｍＬ）を添加することによって開始した。
その際、反応基質の反応組成が、「２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、０．０５ｍＭ  メチルレッド、０．３ｍＭ  ＮＡＤＨ、１μＭ  ＦＭＮ、反応液量：１ｍＬ」となるように調整した。また、比較のために固定化支持体を用いない遊離のＡｚｏＲについても、同様の反応基質と混合することで反応を行った。
反応条件は、ローテーターを用いて穏やかに混合しながら３７℃で３０分間の加温状態を保持することとした。反応終了時に遠心分離（４℃、１８，０００Ｇ、５分間）によって上清を回収し、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２ｅ；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製）を用いて、回収液の３４０ｎｍ、又は、４３０ｎｍの吸光度を測定することによって、メチルレッド分解反応における反応３０分後のＮＡＤＨの消費率、又は、メチルレッドの分解率（脱色率）を評価した。図１０及び表８に、ＡｚｏＲ−ＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸及びＡｚｏＲ−ＭＣＭ−４１−粉末によるメチルレッドの還元分解におけるＮＡＤＨとメチルレッドの吸光度変化、又、メチルレッドの分解率を示す。図１０に、ＡｚｏＲ−メソポーラスシリカ複合体（粉末又は成形体）によるアゾ染料（メチルレッド）の還元分解における（ａ）補酵素（ＮＡＤＨ）と（ｂ）メチルレッドの吸光度変化を示した。図１０の（ｃ）にメチルレッドの分解率を示した。
【０１７６】
【表８】
2018090767.tif 000010
【０１７７】
図１０（ａ）及び（ｂ）より、固定化支持体を用いない遊離のＡｚｏＲ、ＡｚｏＲ−ＭＣＭ−４１−粉末、又は、ＡｚｏＲ−ＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸のいずれの場合も、ＮＡＤＨ及びメチルレッドの吸光度が著しく低下する傾向が認められた。このことは、固定化酵素においても、ＮＡＤＨの消費に伴ったメチルレッドの分解反応が効率良く進行していることを示している。
【０１７８】
興味深いことに、図１０（ａ）の酵素反応後の吸光度変化に着目すると、遊離の酵素の場合と比較して、固定化酵素の場合により大きい吸光度の低下が示された。これより、ＮＡＤＨがより効率良く消費されたか、或いは、固定化状態の酵素とＮＡＤＨが複合体を形成していることが推察される。
【０１７９】
更に、酵素が無い場合のＮＡＤＨ及びメチルレッドの吸光度は、反応溶液そのものと比較して、ＭＣＭ−４１−粉末とＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸いずれを用いた場合も同等の値が示された。このことより、ＭＣＭ−４１−粉末のメソ細孔やＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸のメソ細孔及び有機高分子部分には、反応基質自身、すなわち、ＮＡＤＨ及びメチルレッド分子はほとんど吸着しないことが示唆された。
【０１８０】
また、図１０（ｃ）より、ＭＣＭ−４１−粉末とＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸に固定化した酵素によるメチルレッドの分解率は、未固定の遊離酵素の場合と同等であったことから、固定化状態においても本来の酵素活性を保持していることが判明した。
【０１８１】
（実施例３１：ＡｚｏＲと各種多孔質成形体との複合体の製造及び酵素反応）
本実施例では、実施例１８〜２８で得られたメソポーラス微粒子の多孔質成形体、及び、比較例８において原料粒子を入れず、有機高分子であるポリエーテルサルホンのみを用いて製造した成形体に対するアゾ還元酵素（ＡｚｏＲ）の固定化と酵素活性の評価を行った。
【０１８２】
（１−１）ＡｚｏＲと各種多孔質成形体との複合体の製造方法
ＡｚｏＲの固定化支持体には、メソポーラス微粒子の多孔質成形体として、実施例１８〜２８により得られた１１種類の成形体を使用した。また、比較のための原料粒子を含まない成形体として、比較例８により得られた「ＰＥＳペレット」を使用した。更に、比較のための成型前のメソポーラスシリカ微粒子として、９種類の合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｉ〜Ｑ）を使用した。
【０１８３】
酵素を固定化する際には、ＡｚｏＲ（０．３２８ｍｇ）を含んだ緩衝液（２５ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ  ６））１ｍＬと、予め９６ウェルの深底タイププレートの各ウェルに量り取り、同緩衝液を用いて平衡化しておいた１１種類の成形体及び「ＰＥＳペレット」（２０ｍｇ相当）とを、攪拌装置（ＴＡＩＴＥＣ社製、Ｄｅｅｐ  Ｗｅｌｌ  Ｍａｘｉｍｉｚｅｒ、ＢｉｏＳｈａｋｅｒ  Ｍ・ＢＲ−０２２ＵＰ）を用いて混合（２５℃、１，２００ｒｐｍ、２４時間）することによって複合化させ、遠心分離操作、及び、同緩衝液を用いた洗浄操作を２度行うことでＡｚｏＲと各種多孔質成形体との複合体を得た。なお、本発明の酵素とメソポーラス微粒子の多孔質成形体との複合体としては、未洗浄のままで用いることもできるが、本実施例では、成形体への酵素の結合安定性を評価するために、以下の遠心分離工程と共に洗浄工程を行っている。
【０１８４】
具体的には、前記のＡｚｏＲと各種多孔質成形体との複合体（未洗浄）の分散液に対して遠心分離（２５℃、４，７００ｒｐｍ、１０分間）を行い、上清を全て回収した。続いて、洗浄用緩衝液（固定化時に選択した緩衝液を使用）１ｍＬを添加し、前記の攪拌装置を用いて２５℃で１時間、ＡｚｏＲとメソポーラスシリカ成形体との複合体を攪拌した後、遠心分離（２５℃、４，７００ｒｐｍ、１０分間）を行い、上清を全て回収する洗浄操作を行った。再び、前記洗浄用緩衝液１ｍＬを用いて洗浄操作を繰り返し、最終的に、ＡｚｏＲと各種多孔質成形体との複合体（洗浄済）を得た。以下、「ＡｚｏＲ−メソポーラス微粒子成形体」という。
【０１８５】
また、比較のために９種類の合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｉ〜Ｑ）（１０ｍｇ相当）を用いて、マイクロチューブ、ローテーター、及び、マイクロチューブ用の遠心分離機（２５℃、２０，０００Ｇ、１０分間）を使用した他は、前記成形体と同様の手順により複合体を得た。以下、「ＡｚｏＲ−メソポーラス微粒子粉末」という。
【０１８６】
各種のメソポーラス微粒子の成形体及び粉末に対する酵素の固定化量は、固定化前の酵素量（１ｍＬ中、０．３２８ｍｇ）から、前記の遠心分離工程及び洗浄工程の回収液に含まれる遊離の酵素量を差し引くことによって算出した。図１１に、メソポーラス微粒子成形体、原料粒子を含まない成形体、又は、メソポーラス微粒子粉末に対するＡｚｏＲの固定化量を示す。（ａ）はメソポーラス微粒子の各種成形体に対するＡｚｏＲの固定化量である。（ｂ）は、メソポーラス微粒子の各種粉末に対するＡｚｏＲの固定化量である。
【０１８７】
図１１（ａ）及び（ｂ）より、メソポーラスＡｌ２Ｏ３−ＥＶＯＨペレット、ＳＢＡ−１６−５ｎｍ−粉末、又は、メソポーラスＡｌ２Ｏ３粉末以外の固定化支持体では、全体的に同等のＡｚｏＲの固定化量が示された。表７より、実施例１８〜２８により得られた１１種類の成形体中のメソポーラス微粒子の含量が平均５２重量％であることを鑑みると、成形体２０ｍｇに含まれるメソポーラス微粒子は１０ｍｇに相当するため、図１１（ａ）で示されたＡｚｏＲの固定化量と図１１（ｂ）におけるメソポーラス微粒子粉末（１０ｍｇ）に対するＡｚｏＲの固定化量が同等であったことは、成形体に含まれるメソポーラス微粒子が粉末と同等の酵素固定化能を保持していることを示唆している。ここで、ＳＢＡ−１６−５ｎｍ−粉末、又は、メソポーラスＡｌ２Ｏ３粉末と、これらの粉末を含んだ、ＳＢＡ−１６−５ｎｍ−ＰＥＳペレット、メソポーラスＡｌ２Ｏ３−ＥＶＯＨペレット、又は、メソポーラスＡｌ２Ｏ３−ＰＥＳペレットとを比較すると、前記の２種類の粉末にはほとんど酵素が固定しなかったにもかかわらず、前記の３種類の成形体のうち、特に、有機高分子としてポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）を用いて成形した、ＳＢＡ−１６−５ｎｍ−ＰＥＳペレット、及び、メソポーラスＡｌ２Ｏ３−ＰＥＳペレットの場合に、原料粒子を含まないＰＥＳペレットを用いた場合と同等の酵素の固定化量が示された。これより、当該酵素（ＡｚｏＲ）は、成形体のＰＥＳ表面部分に非特異的に吸着することが判明し、有機高分子としてポリエチレンポリビニルアルコール共重合樹脂（ＥＶＯＨ）を用いた成形体を用いた場合には、成形体に含まれるメソ細孔部分に特異的に固定化する可能性が示唆された。従って、実施例３０及び図１１の結果より、ＡｚｏＲの固定化には、ＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸のように、ＥＶＯＨを用いた成形体が好適であることが明らかになった。
【０１８８】
（１−２）メチルレッドの分解活性の評価
（１−１）で得られた１１種類のＡｚｏＲ−メソポーラス微粒子成形体、ＡｚｏＲ−ＰＥＳペレット（原料粒子なし）、及び、９種類のＡｚｏＲ−メソポーラス微粒子粉末それぞれの酵素活性を、反応基質としてのアゾ染料（メチルレッド）の分解率（脱色率）により評価した。またこの際、前記複合体の繰り返し使用における耐久性（反応５回）の評価も行った。
具体的には、前記複合体それぞれに対して、以下の酵素反応を起こさせ、メチルレッドの吸光度変化を調べることで脱色率を求めた。
【０１８９】
各種のＡｚｏＲ−メソポーラス微粒子粉末は、酵素反応前に、マイクロチューブから、既にＡｚｏＲ−メソポーラス微粒子成形体及びＡｚｏＲ−ＰＥＳペレット（原料粒子なし）が入っている９６ウェルの深底タイププレートの各ウェルに移し替えた。酵素反応は、前記の９６ウェルの深底タイププレートの各ウェル内のＡｚｏＲ−メソポーラス微粒子成形体、ＡｚｏＲ−ＰＥＳペレット（原料粒子なし）、及び、ＡｚｏＲ−メソポーラス微粒子粉末に対して、メチルレッドを含まず、ＮＡＤＨとＦＭＮのみが含まれたトリス緩衝液（０．９６６ｍＬ）を添加し、前記の撹拌装置を用いて撹拌（３０℃、１，２００ｒｐｍ、１０分間）した後、メチルレッド溶液（０．０３４ｍＬ）を添加することによって開始した（反応１回目）。
その際、反応基質の反応組成が、「２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、０．０５ｍＭ  メチルレッド、０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ、１μＭ  ＦＭＮ、反応液量：１ｍＬ」となるように調整した。反応２回目以降は、下記の遠心分離操作後に反応後の上清と分離されたＡｚｏＲ複合体に対して、前記と同様の手順で緩衝液、基質等を添加することによって反応を開始した。
また、比較のために固定化支持体を用いない遊離のＡｚｏＲについても、同様の反応基質と混合することで反応を行った。
反応条件は、前記の撹拌装置を用いて混合（１，２００ｒｐｍ）しながら３０℃で１０分間の加温状態を保持することとした。続いて、１０分経過後に加温状態での遠心分離（３０℃、４，７００ｒｐｍ、５分間）によって上清を全て回収し、前記のマイクロプレートリーダーを用いて、回収液の４３０ｎｍの吸光度を測定することによって、メチルレッドの分解率（脱色率）を評価した。図１２に、各種のＡｚｏＲ複合体の繰り返し使用時（反応５回）におけるメチルレッドの脱色率を示す。ＡｚｏＲ−メソポーラス微粒子複合体（ａ：成形体、ｂ：粉末）によるメチルレッドの分解率（脱色率）及び固定化酵素の繰り返し使用における耐久性（反応５回）を示した。
【０１９０】
図１３の（ａ）に実施例２３の成形体を、（ｂ）にメチルレッド分解反応終了後の当該成形体とＡｚｏＲとの複合体（ＡｚｏＲ−ＳＢＡ−１５−４ｎｍ−ＰＥＳペレット）を、（ｃ）に比較例８の成形体を、（ｄ）にメチルレッド分解反応終了後の当該成形体とＡｚｏＲとの複合体（ＡｚｏＲ−ＰＥＳペレット（原料粒子なし））の外観の写真をそれぞれ示す。
【０１９１】
図１２（ａ）及び（ｂ）より、ＳＢＡ−１５−６ｎｍ−粉末以外は、図１０（ｃ）と同様に九十数％程度のメチルレッドの脱色率が示され、繰り返し利用における高い耐久性が認められた。
【０１９２】
一方、図１４に遊離のＡｚｏＲ（酵素量：０、１、１０、１００μｇ）の酵素活性を評価した結果を示す。図１４では、メチルレッドの分解率（脱色率）に与える未固定の遊離ＡｚｏＲ濃度の影響が示される。図１４より、９０％以上のメチルレッドの脱色率を可能にする最適な酵素量は、１〜１０μｇであり、１００μｇでは酵素活性が発現しないことが判明した。図１１より、各種のＡｚｏＲ複合体に対して１００〜２００μｇ程度の酵素が固定化されていることを鑑みると、固定化状態の酵素の一部、すなわち、１〜１０μｇ相当の酵素が反応に関与していることが推察される。これより、高濃度酵素の利用時において、遊離の酵素では活性が著しく低下するが、固定化状態では本来の酵素活性を安定に発現できることが示唆された。
【０１９３】
興味深いことに、図１２（ａ）での反応終了後のＡｚｏＲ−メソポーラス微粒子成形体及びＡｚｏＲ−ＰＥＳペレット（原料粒子なし）の外観を確認したところ、前記メソポーラス微粒子成形体はピンク色を呈したが、前記ＰＥＳペレット（原料粒子なし）は反応前と同じ白色を呈した（図１３）。このことは、ＡｚｏＲ−メソポーラス微粒子成形体では、成形体中のメソ細孔においてＡｚｏＲ−ＮＡＤＨ−メチルレッドの複合体を形成していることを示唆している。一方、ＡｚｏＲ−ＰＥＳペレット（原料粒子なし）では、図１１より、相当量のＡｚｏＲが成形体のＰＥＳ表面部分に非特異的に吸着していると考えられるが、吸着状態のＡｚｏＲが反応基質と複合体を形成しないことが推察される。すなわち、図１２（ａ）で示されたＡｚｏＲ−ＰＥＳペレット（原料粒子なし）による高活性のメチルレッドの分解反応は、成形体から脱離した微量の遊離ＡｚｏＲの寄与によるものと考えられる。従って、ＡｚｏＲ−メソポーラス微粒子成形体による酵素反応には、成形体中のメソ細孔に固定化されたＡｚｏＲが大きく寄与していることが示唆された。
【０１９４】
（実施例３２：ＧＤＨと各種多孔質成形体との複合体の製造及び酵素反応）
本実施例では、実施例１８〜２８で得られたメソポーラス微粒子の多孔質成形体、及び、比較例８において原料粒子を入れず、有機高分子であるポリエーテルサルホンのみを用いて製造した成形体に対するグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．由来、和光純薬工業社）の固定化と酵素活性の評価を行った。
【０１９５】
（１−１）ＧＤＨと各種多孔質成形体との複合体の製造方法
ＧＤＨの固定化支持体には、メソポーラス微粒子の多孔質成形体として、実施例１８〜２８により得られた１１種類の成形体を使用した。また、比較のための原料粒子を含まない成形体として、比較例８により得られた「ＰＥＳペレット」を使用した。更に、比較のための成型前のメソポーラスシリカ微粒子として、９種類の合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｉ〜Ｑ）を使用した。
【０１９６】
酵素を固定化する際には、ＧＤＨ（０．３６３ｍｇ）を含んだ緩衝液（２５ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ  ６））１ｍＬと、予め９６ウェルの深底タイププレートの各ウェルに量り取り、同緩衝液を用いて平衡化しておいた１１種類の成形体及び「ＰＥＳペレット」（２０ｍｇ相当）とを、前記の攪拌装置を用いて混合（２５℃、１，２００ｒｐｍ、２４時間）することによって複合化させ、遠心分離操作、及び、同緩衝液を用いた洗浄操作を２度行うことでＧＤＨと各種多孔質成形体との複合体を得た。なお、本発明の酵素とメソポーラス微粒子の多孔質成形体との複合体としては、未洗浄のままで用いることもできるが、本実施例では、成形体への酵素の結合安定性を評価するために、以下の遠心分離工程と共に洗浄工程を行っている。
【０１９７】
具体的には、前記のＧＤＨと各種多孔質成形体との複合体（未洗浄）の分散液に対して遠心分離（２５℃、４，７００ｒｐｍ、１０分間）を行い、上清を全て回収した。続いて、洗浄用緩衝液（固定化時に選択した緩衝液を使用）１ｍＬを添加し、前記の攪拌装置を用いて２５℃で１時間、ＧＤＨとメソポーラスシリカ成形体との複合体を攪拌した後、遠心分離（２５℃、４，７００ｒｐｍ、１０分間）を行い、上清を全て回収する洗浄操作を行った。再び、前記洗浄用緩衝液１ｍＬを用いて洗浄操作を繰り返し、最終的に、ＧＤＨと各種多孔質成形体との複合体（洗浄済）を得た。以下、「ＧＤＨ−メソポーラス微粒子成形体」という。
【０１９８】
また、比較のために９種類の合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｉ〜Ｑ）（１０ｍｇ相当）を用いて、マイクロチューブ、ローテーター、及び、マイクロチューブ用の遠心分離機（２５℃、２０，０００Ｇ、１０分間）を使用した他は、前記成形体と同様の手順により複合体を得た。以下、「ＧＤＨ−メソポーラス微粒子粉末」という。
【０１９９】
各種のメソポーラス微粒子の成形体及び粉末に対する酵素の固定化量は、固定化前の酵素量（１ｍＬ中、０．３６３ｍｇ）から、前記の遠心分離工程及び洗浄工程の回収液に含まれる遊離の酵素量を差し引くことによって算出した。図１５に、メソポーラス微粒子成形体、原料粒子を含まない成形体、又は、メソポーラス微粒子粉末に対するＧＤＨの固定化量を示す。図１５の（ａ）は、各種メソポーラス微粒子の成形体に対するグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）の固定化量を示している。（ｂ）は、各種メソポーラス微粒子の粉末に対するグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）の固定化量を示している。
【０２００】
図１５（ａ）及び（ｂ）より、全体的には、ＳＢＡ−１６−５ｎｍの成形体及び粉末、メソポーラスＡｌ２Ｏ３の成形体及び粉末、又は、原料粒子を含まないＰＥＳペレットと比較して、ＭＣＭ−４１、ＦＳＭ−２２、又は、ＳＢＡ−１５タイプの合成メソポーラスシリカの成形体及び粉末を用いた場合に、より大きいＧＤＨの固定化量が示された。ＭＣＭ−４１、ＦＳＭ−２２、又は、ＳＢＡ−１５タイプの合成メソポーラスシリカの成形体と粉末とを比較すると、微粒子粉末に対する固定化量の方が若干多かったものの、ＦＳＭ−２２、又は、ＳＢＡ−１５タイプの合成メソポーラスシリカに着目すれば、成形体及び粉末ともに全体的には細孔径に比例してＧＤＨの固定化量が増大する傾向が認められた。これは、実施例３１においてＡｚｏＲが飽和吸着したのと比較して、より分子サイズが大きいＧＤＨは飽和吸着していないために、固定化量が細孔径に依存したものと考えられる。すなわち、成形体に含まれるメソポーラス微粒子が粉末と同等の酵素固定化能を保持していることを示唆している。ここで、ＳＢＡ−１６−５ｎｍの成形体及び粉末、メソポーラスＡｌ２Ｏ３の成形体及び粉末、又は、原料粒子を含まないＰＥＳペレットに対するＧＤＨの固定化量から考察すれば、有機高分子としてＥＶＯＨを用いた成形体よりもＰＥＳを用いた成形体のＰＥＳ表面部分に対してより多くのＧＤＨが非特異的に吸着したことが推察される。それにも係わらず、ＭＣＭ−４１、ＦＳＭ−２２、又は、ＳＢＡ−１５タイプの合成メソポーラスシリカの成形体では、ＰＥＳペレット（原料粒子なし）を用いた場合と比較して２倍以上の固定化量が示されたことより、成形体のメソ細孔部分に対して相当量のＧＤＨが固定化されていることが判明した。
【０２０１】
（１−２）ＮＡＤＨの生成活性の評価
（１−１）で得られた１１種類のＧＤＨ−メソポーラス微粒子成形体、ＧＤＨ−ＰＥＳペレット（原料粒子なし）、及び、９種類のＧＤＨ−メソポーラス微粒子粉末それぞれの酵素活性を、反応基質としての補酵素（酸化型ＮＡＤ＋）から生成される還元型ＮＡＤＨのモル濃度により評価した。またこの際、前記複合体の繰り返し使用における耐久性（反応５回）の評価も行った。
具体的には、前記複合体それぞれに対して、以下の酵素反応を起こさせ、ＮＡＤＨの吸光度変化を調べることで生成ＮＡＤＨ濃度を求めた。
【０２０２】
各種のＧＤＨ−メソポーラス微粒子粉末は、酵素反応前に、マイクロチューブから、既にＧＤＨ−メソポーラス微粒子成形体及びＧＤＨ−ＰＥＳペレット（原料粒子なし）が入っている９６ウェルの深底タイププレートの各ウェルに移し替えた。酵素反応は、前記の９６ウェルの深底タイププレートの各ウェル内のＧＤＨ−メソポーラス微粒子成形体、ＧＤＨ−ＰＥＳペレット（原料粒子なし）、及び、ＧＤＨ−メソポーラス微粒子粉末に対して、グルコースを含まず、ＮＡＤ＋のみが含まれたトリス緩衝液（０．９６７ｍＬ）を添加し、前記の撹拌装置を用いて撹拌（３０℃、１，２００ｒｐｍ、１０分間）した後、グルコース溶液（０．０３３ｍＬ）を添加することによって開始した（反応１回目）。
【０２０３】
その際、反応基質の反応組成が、「２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、０．５ｍＭ  ＮＡＤ＋、１０ｍＭ  グルコース、反応液量：１ｍＬ」となるように調整した。反応２回目以降は、下記の遠心分離操作後に反応後の上清と分離されたＧＤＨ複合体に対して、前記と同様の手順で緩衝液、基質等を添加することによって反応を開始した。
また、比較のために固定化支持体を用いない遊離のＧＤＨについても、同様の反応基質と混合することで反応を行った。
【０２０４】
反応条件は、前記の撹拌装置を用いて混合（１，２００ｒｐｍ）しながら３０℃で１０分間の加温状態を保持することとした。続いて、１０分経過後に加温状態での遠心分離（３０℃、４，７００ｒｐｍ、５分間）によって上清を全て回収し、前記のマイクロプレートリーダーを用いて、回収液の３４０ｎｍの吸光度を測定することによって、ＮＡＤＨの生成効率（ＮＡＤＨ濃度）を評価した。図１６に、各種のＧＤＨ複合体の繰り返し使用時（反応５回）における生成ＮＡＤＨ濃度を示す。図１６の（ａ）はＧＤＨ−メソポーラス微粒子複合体の成形体による生成ＮＡＤＨ濃度及び固定化酵素の繰り返し使用における耐久性（反応５回）を示す。（ｂ）はＧＤＨ−メソポーラス微粒子複合体の粉末による生成ＮＡＤＨ濃度及び固定化酵素の繰り返し使用における耐久性（反応５回）を示す。
【０２０５】
図１６（ａ）及び（ｂ）より、全体的には、ＭＣＭ−４１タイプの合成メソポーラスシリカの成形体及び粉末に固定化したＧＤＨは低い活性に留まったものの、ＦＳＭ−２２、又は、ＳＢＡ−１５タイプの合成メソポーラスシリカの成形体及び粉末に固定化したＧＤＨは、細孔径に比例して酵素活性が高くなる傾向を示した。また、図１６（ａ）より、ＧＤＨ−メソポーラス微粒子成形体及びＧＤＨ−ＰＥＳペレット（原料粒子なし）の活性を比較すると、大半のＧＤＨ−メソポーラス微粒子成形体がＧＤＨ−ＰＥＳペレット（原料粒子なし）よりも明らかに高い活性を発現しており、このことは、成形体のメソ細孔に固定化された酵素の安定性の高さを示唆している。ＧＤＨ−ＰＥＳペレット（原料粒子なし）では、図１５より、相当量のＧＤＨが成形体のＰＥＳ表面部分に非特異的に吸着していると考えられるが、図１６（ａ）より、吸着状態のＧＤＨの活性が極めて低いことが判明した。以上より、ＧＤＨ−メソポーラス微粒子成形体による高活性のＮＡＤＨの生成反応には、成形体中のメソ細孔に固定化されたＧＤＨが大きく寄与していることが示唆された。
また、成形体と粉末とを比較すると、成形体に固定化したＧＤＨの場合に、反応１回目の活性が低いものの、繰り返し使用回数と共に徐々に活性が増大する傾向が認められた。このことは、反応初期においては成形体中のマクロ孔及びメソ細孔における反応基質の拡散が律速となっており、メソ細孔に固定化された酵素と反応基質との接触頻度が低い状態にあることが推察される。
【０２０６】
一方、図１７に遊離のＧＤＨ（酵素量：０、１、１０、１００μｇ）の酵素活性を評価した結果を示す。図１７には、生成ＮＡＤＨ濃度に与える未固定の遊離ＧＤＨ濃度の影響が示される。図１７より、反応収率１００％（〜０．５ｍＭ  ＮＡＤＨ）を与える酵素量は１０〜１００μｇであり、又、０．１〜０．５ｍＭのＮＡＤＨを生成するために必要な酵素量は１〜１０μｇの範囲であることが判明した。図１６より、各種のＧＤＨ複合体による生成ＮＡＤＨ濃度は０〜０．４ｍＭ程度であり、図１５より、ＧＤＨ複合体に対して１００〜３００μｇ程度の酵素が固定化されていることを鑑みると、固定化状態の酵素の一部、すなわち、１〜１０μｇ相当の酵素が反応に関与していることが推察される。
【０２０７】
（実施例３３：リパーゼと各種多孔質成形体との複合体の製造及び酵素反応）
本実施例では、実施例１８〜２８で得られたメソポーラス微粒子の多孔質成形体、及び、比較例８において原料粒子を入れず、有機高分子であるポリエーテルサルホンのみを用いて製造した成形体に対するリパーゼ（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ  ｎｉｔｅｎｓ由来、和光純薬工業社）の固定化と酵素活性の評価を行った。
【０２０８】
（１−１）リパーゼと各種多孔質成形体との複合体の製造方法
リパーゼの固定化支持体には、メソポーラス微粒子の多孔質成形体として、実施例１８〜２８により得られた１１種類の成形体を使用した。また、比較のための原料粒子を含まない成形体として、比較例８により得られた「ＰＥＳペレット」を使用した。更に、比較のための成型前のメソポーラスシリカ微粒子として、９種類の合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｉ〜Ｑ）を使用した。
【０２０９】
酵素を固定化する際には、リパーゼ（０．４５６ｍｇ）を含んだ緩衝液（２５ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ  ６））１ｍＬと、予め９６ウェルの深底タイププレートの各ウェルに量り取り、同緩衝液を用いて平衡化しておいた１１種類の成形体及び「ＰＥＳペレット」（２０ｍｇ相当）とを、前記の攪拌装置を用いて混合（２５℃、１，２００ｒｐｍ、２４時間）することによって複合化させ、遠心分離操作、及び、同緩衝液を用いた洗浄操作を２度行うことでリパーゼと各種多孔質成形体との複合体を得た。なお、本発明の酵素とメソポーラス微粒子の多孔質成形体との複合体としては、未洗浄のままで用いることもできるが、本実施例では、成形体への酵素の結合安定性を評価するために、以下の遠心分離工程と共に洗浄工程を行っている。
【０２１０】
具体的には、前記のリパーゼと各種多孔質成形体との複合体（未洗浄）の分散液に対して遠心分離（２５℃、４，７００ｒｐｍ、１０分間）を行い、上清を全て回収した。続いて、洗浄用緩衝液（固定化時に選択した緩衝液を使用）１ｍＬを添加し、前記の攪拌装置を用いて２５℃で１時間、リパーゼとメソポーラスシリカ成形体との複合体を攪拌した後、遠心分離（２５℃、４，７００ｒｐｍ、１０分間）を行い、上清を全て回収する洗浄操作を行った。再び、前記洗浄用緩衝液１ｍＬを用いて洗浄操作を繰り返し、最終的に、リパーゼと各種多孔質成形体との複合体（洗浄済）を得た。以下、「リパーゼ−メソポーラス微粒子成形体」という。
【０２１１】
また、比較のために９種類の合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｉ〜Ｑ）（１０ｍｇ相当）を用いて、マイクロチューブ、ローテーター、及び、マイクロチューブ用の遠心分離機（２５℃、２０，０００Ｇ、１０分間）を使用した他は、前記成形体と同様の手順により複合体を得た。以下、「リパーゼ−メソポーラス微粒子粉末」という。
【０２１２】
各種のメソポーラス微粒子の成形体及び粉末に対する酵素の固定化量は、固定化前の酵素量（１ｍＬ中、０．４５６ｍｇ）から、前記の遠心分離工程及び洗浄工程の回収液に含まれる遊離の酵素量を差し引くことによって算出した。図１８に、メソポーラス微粒子成形体、原料粒子を含まない成形体、又は、メソポーラス微粒子粉末に対するリパーゼの固定化量を示す。図１８の（ａ）は、各種メソポーラス微粒子の成形体に対するリパーゼの固定化量を示す。（ｂ）は、各種メソポーラス微粒子の粉末に対するリパーゼの固定化量を示す。
【０２１３】
図１８（ａ）及び（ｂ）より、メソポーラスＡｌ２Ｏ３−ＥＶＯＨペレットを除いた、ＭＣＭ−４１、ＦＳＭ−２２、ＳＢＡ−１５タイプ、ＳＢＡ−１６タイプ、又は、メソポーラス酸化アルミタイプの合成メソポーラスシリカの成形体と粉末とを比較すると、成形体と粉末に対するリパーゼの固定化量は同等であり、ＦＳＭ−２２、又は、ＳＢＡ−１５タイプの合成メソポーラスシリカに着目すれば、成形体及び粉末ともに全体的には細孔径に比例してリパーゼの固定化量が増大する傾向が認められた。これは、実施例３２におけるＧＤＨの固定化の傾向と類似しており、メソ細孔に対してリパーゼが飽和吸着していないために、固定化量が細孔径に依存したものと考えられる。すなわち、成形体に含まれるメソポーラス微粒子が粉末と同等の酵素固定化能を保持していることを示唆している。
【０２１４】
また、図１８（ａ）より、メソポーラスＡｌ２Ｏ３−ＥＶＯＨペレットのみ、リパーゼの固定化量が低い値に留まったものの、それ以外の、ＭＣＭ−４１、ＦＳＭ−２２、ＳＢＡ−１５タイプ、ＳＢＡ−１６タイプ、又は、メソポーラス酸化アルミタイプの合成メソポーラス微粒子の成形体を用いた場合には、原料粒子を含まないＰＥＳペレットと比較して、２〜３倍程度のリパーゼの固定化量が示された。これより、成形体のメソ細孔部分に対して相当量のリパーゼが固定化されていることが判明した。
【０２１５】
（１−２）トリグリセリドの加水分解活性の評価
（１−１）で得られた１１種類のリパーゼ−メソポーラス微粒子成形体、リパーゼ−ＰＥＳペレット（原料粒子なし）、及び、９種類のリパーゼ−メソポーラス微粒子粉末それぞれの酵素活性を、反応基質としての蛍光性トリグリセリドの加水分解によって生成される脂肪酸に結合した蛍光物質（ピレン）のモル濃度により評価した。またこの際、前記複合体の繰り返し使用における耐久性（反応５回）の評価も行った。
具体的には、前記複合体それぞれに対して、以下の酵素反応を起こさせ、ピレンの蛍光強度を調べることで遊離ピレン濃度を求めた。
【０２１６】
各種のリパーゼ−メソポーラス微粒子粉末は、酵素反応前に、マイクロチューブから、既にリパーゼ−メソポーラス微粒子成形体及びリパーゼ−ＰＥＳペレット（原料粒子なし）が入っている９６ウェルの深底タイププレートの各ウェルに移し替えた。酵素反応は、前記の９６ウェルの深底タイププレートの各ウェル内のリパーゼ−メソポーラス微粒子成形体、リパーゼ−ＰＥＳペレット（原料粒子なし）、及び、リパーゼ−メソポーラス微粒子粉末に対して、リン酸緩衝液（０．９ｍＬ）を添加し、前記の撹拌装置を用いて撹拌（３０℃、１，２００ｒｐｍ、１０分間）した後、蛍光性トリグリセリド溶液（０．１ｍＬ）を添加することによって開始した（反応１回目）。
【０２１７】
その際、反応基質の反応組成が、「１５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ  ８．２）、１μＭ  蛍光性トリグリセリド、反応液量：１ｍＬ」となるように調整した。反応２回目以降は、下記の遠心分離操作後に反応後の上清と分離されたリパーゼ複合体に対して、前記と同様の手順で緩衝液、基質等を添加することによって反応を開始した。また、比較のために固定化支持体を用いない遊離のリパーゼについても、同様の反応基質と混合することで反応を行った。
【０２１８】
反応条件は、前記の撹拌装置を用いて混合（１，２００ｒｐｍ）しながら３０℃で１０分間の加温状態を保持することとした。続いて、１０分経過後に加温状態での遠心分離（３０℃、４，７００ｒｐｍ、５分間）によって上清を全て回収し、前記のマイクロプレートリーダーを用いて、回収液の蛍光強度を測定（測定波長：励起３４２ｎｍ／蛍光４００ｎｍ）することによって、脂肪酸の生成効率（ピレン濃度）を評価した。図１９に、各種のリパーゼ複合体の繰り返し使用時（反応５回）における遊離ピレン濃度を示す。図１９の（ａ）は、リパーゼ−メソポーラス微粒子複合体の成形体によるトリグリセリド分解における遊離ピレン濃度及び固定化酵素の繰り返し使用における耐久性（反応５回）を示す。図１９の（ｂ）は、リパーゼ−メソポーラス微粒子複合体の粉末によるトリグリセリド分解における遊離ピレン濃度及び固定化酵素の繰り返し使用における耐久性（反応５回）を示す。
【０２１９】
図１９（ａ）及び（ｂ）より、全体的には、リパーゼ−メソポーラス微粒子粉末と比較して、リパーゼ−メソポーラス微粒子成形体を用いた場合に遊離のピレン濃度が低くなる傾向が認められたものの、メソポーラス微粒子粉末を用いた場合のようなピレン濃度の幅広い増減は示されなかった。具体的には、ＭＣＭ−４１−ＥＶＯＨ中空糸を除いたリパーゼ−メソポーラス微粒子成形体では、５回の繰り返し反応においても、一定したピレン濃度（２０〜４０ｎＭ）を示した。また、図１９（ａ）より、リパーゼ−ＰＥＳペレット（原料粒子なし）は、繰り返し使用回数と共に徐々に活性が低下し、反応５回目ではほとんど活性を発現しなかった。リパーゼ−ＰＥＳペレット（原料粒子なし）では、図１８より、相当量のリパーゼが成形体のＰＥＳ表面部分に非特異的に吸着していると考えられるが、吸着状態のリパーゼの安定性が極めて低いことが判明した。一方、大半のリパーゼ−メソポーラス微粒子成形体では、反応１〜５回において持続した酵素活性を発現しており、このことは、成形体のメソ細孔に固定化された酵素の安定性の高さを示唆している。以上より、リパーゼ−メソポーラス微粒子成形体による高活性のトリグリセリドの加水分解反応には、成形体中のメソ細孔に固定化されたリパーゼが大きく寄与していることが示唆された。
また、図２０に遊離のリパーゼ（酵素量：０、１、１０、１００μｇ）の酵素活性を評価した結果を示す。図２０により、トリグリセリド分解により遊離する蛍光物質（ピレン）濃度に与える未固定の遊離リパーゼ濃度の影響が示される。図２０より、酵素濃度に比例してピレン濃度が増大する傾向が示された。図１９（ａ）において示された、リパーゼ−メソポーラス微粒子成形体による生成ピレン濃度（２０〜４０ｎＭ）を与える酵素量は、図２０より、５０〜１００μｇの範囲であると考えられる。図１８より、リパーゼ複合体に対して１００〜２５０μｇ程度の酵素が固定化されていることを鑑みると、固定化状態の酵素のうちの半分程度の酵素が反応に関与していることが推察される。
【０２２０】
（実施例３４：プロテアーゼと各種多孔質成形体との複合体の製造及び酵素反応）
本実施例では、実施例２２及び２５で得られたメソポーラス微粒子の多孔質成形体、及び、比較のための活性炭ペレット（籾殻由来、デクセリアルズ株式会社）に対するプロテアーゼＮ（ＰＮ：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属由来、ナガセケムテックス株式会社）の固定化と酵素活性の評価を行った。
【０２２１】
（１−１）プロテアーゼと各種多孔質成形体との複合体の製造方法
プロテアーゼの固定化支持体には、メソポーラス微粒子の多孔質成形体として、実施例２２及び２５により得られた２種類の成形体を使用した。また、比較のための表面親和性の異なる多孔体として、従来の活性炭よりメソ孔容積の大きい「活性炭ペレット」を使用した。更に、比較のための成型前のメソポーラスシリカ微粒子として、２種類の合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｌ及びＯ）、及び「活性炭粉末」を使用した。
【０２２２】
酵素を固定化する際には、プロテアーゼ（０．２７１ｍｇ）を含んだ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７））１ｍＬと、予めマイクロチューブに量り取った２種類の成形体及び「活性炭ペレット」（２０ｍｇ相当）とを、ローテーターを用いて混合（４℃、１５時間）することによって複合化させ、遠心分離操作、及び、同緩衝液を用いた洗浄操作を２度行うことでプロテアーゼと各種多孔質成形体との複合体を得た。なお、本発明の酵素とメソポーラス微粒子の多孔質成形体との複合体としては、未洗浄のままで用いることもできるが、本実施例では、成形体への酵素の結合安定性を評価するために、以下の遠心分離工程と共に洗浄工程を行っている。
【０２２３】
具体的には、前記のプロテアーゼと各種多孔質成形体（又は、活性炭ペレット）との複合体（未洗浄）の分散液に対して遠心分離（４℃、２０，０００Ｇ、１０分間）を行い、上清を全て回収した。続いて、洗浄用緩衝液（固定化時に選択した緩衝液を使用）１ｍＬを添加し、Ｖｏｒｔｅｘ  Ｍｉｘｅｒを用いて室温で約５秒間、プロテアーゼとメソポーラスシリカ成形体（又は、活性炭ペレット）との複合体を攪拌した後、遠心分離（４℃、２０，０００Ｇ、１０分間）を行い、上清を全て回収する洗浄操作を行った。再び、前記洗浄用緩衝液１ｍＬを用いて洗浄操作を繰り返し、最終的に、プロテアーゼと各種多孔質成形体（又は、活性炭ペレット）との複合体（洗浄済）を得た。以下、「プロテアーゼ−メソポーラス微粒子成形体」、又は、「プロテアーゼ−活性炭ペレット」という。
【０２２４】
また、比較のために２種類の合成メソポーラスシリカ（原料粒子Ｌ及びＯ）、及び「活性炭粉末」（１０ｍｇ相当）を用いて、前記成形体と同様の手順により複合体を得た。以下、「プロテアーゼ−メソポーラス微粒子粉末」、又は、「プロテアーゼ−活性炭粉末」という。
【０２２５】
各種のメソポーラス微粒子の成形体及び粉末に対する酵素の固定化量は、固定化前の酵素量（１ｍＬ中、０．２７１ｍｇ）から、前記の遠心分離工程及び洗浄工程の回収液に含まれる遊離の酵素量を差し引くことによって算出した。図２１に、メソポーラス微粒子成形体、又は、メソポーラス微粒子粉末に対するプロテアーゼの固定化量を示す。図２１（ａ）は、各種メソポーラス微粒子の成形体に対するプロテアーゼの固定化量を示す。図２１（ｂ）は、各種メソポーラス微粒子の粉末に対するプロテアーゼの固定化量を示す。
【０２２６】
図２１（ａ）及び（ｂ）より、ＦＳＭ−２２（原料粒子Ｌ）、ＳＢＡ−１５（原料粒子Ｏ）タイプの合成メソポーラスシリカ及び活性炭を比較すると、成形体及び粉末ともに、「活性炭  ＞  ＦＳＭ−２２  ＞  ＳＢＡ−１５」の順にプロテアーゼの固定化量が増大する傾向が認められた。成形体と粉末を比較すると、全体的には、成形体を用いた場合にプロテアーゼの固定化量が低い値に留まったものの、固定化支持体の違いによるプロテアーゼの固定化挙動は粉末を用いた場合の傾向と類似しており、これは、成形体に含まれるメソポーラス微粒子が粉末とおおよそ同等の酵素固定化能を保持していることを示唆している。
【０２２７】
（１−２）ゼラチンの加水分解活性の評価
（１−１）で得られたプロテアーゼ複合体（２種類のプロテアーゼ−メソポーラス微粒子成形体、プロテアーゼ−活性炭ペレット、２種類のプロテアーゼ−メソポーラス微粒子粉末、及び、プロテアーゼ−活性炭粉末）の酵素活性を評価した。評価は、反応基質としての蛍光性ゼラチンの加水分解にともなって増大する蛍光強度を指標として、未固定の遊離酵素における蛍光強度を基準とした相対活性により行った。またこの際、前記複合体の繰り返し使用における耐久性（反応１０回）の評価も行った。
具体的には、前記複合体それぞれに対して、以下の酵素反応を起こさせ、ゼラチンの分解活性を求めた。
【０２２８】
酵素反応は、（１−１）で得られた各マイクロチューブ内のプロテアーゼ複合体（プロテアーゼ−メソポーラス微粒子成形体、プロテアーゼ−活性炭ペレット、プロテアーゼ−メソポーラス微粒子粉末、及び、プロテアーゼ−活性炭粉末）に対して、蛍光性ゼラチン、塩化ナトリウム、又、塩化カルシウムを含んだトリス緩衝液（０．４ｍＬ）を添加することによって開始した（反応１回目）。
【０２２９】
その際、反応基質の反応組成が、「４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．６）、０．１ｍｇ／ｍＬ  蛍光性ゼラチン、１３５ｍＭ  塩化ナトリウム、４．５ｍＭ  塩化カルシウム」となるように調整した。反応２回目以降は、下記の遠心分離操作後に反応後の上清と分離されたプロテアーゼ複合体に対して、前記と同様の手順で反応基質を添加することによって反応を開始した。また、比較のために固定化支持体を用いない遊離のプロテアーゼについても、同様の反応基質と混合することで反応を行った。
【０２３０】
反応条件は、ローテーターを用いて混合しながら３７℃で３０分間の加温状態を保持することとした。続いて、遠心分離（４℃、２０，０００Ｇ、５分間）によって上清を全て回収し、前記のマイクロプレートリーダーを用いて、回収液の蛍光強度を測定（測定波長：励起４９５ｎｍ／蛍光５２０ｎｍ）することによって、ゼラチンの分解効率を評価した。図２２に、各種のプロテアーゼ複合体の繰り返し使用時（反応１０回）における、遊離のプロテアーゼによるゼラチンの分解効率を基準とした場合の相対活性を示す。図２２の（ａ）は、プロテアーゼ−メソポーラス微粒子複合体の成形体によるゼラチンの分解活性及び固定化酵素の繰り返し使用における耐久性（反応１０回）を示す。図２２の（ｂ）は、プロテアーゼ−メソポーラス微粒子複合体の粉末によるゼラチンの分解活性及び固定化酵素の繰り返し使用における耐久性（反応１０回）を示す。
【０２３１】
図２２（ａ）及び（ｂ）より、全体的には、プロテアーゼ−メソポーラス微粒子粉末と比較して、プロテアーゼ−メソポーラス微粒子成形体を用いた場合にゼラチンの分解活性が低くなる傾向が認められたものの、成形体及び粉末ともに、活性炭（ペレット及び粉末）と比較すると、格段に優れた酵素活性の発現率と繰り返し耐久性を示した。
具体的には、反応１０回目におけるゼラチンの分解活性が、プロテアーゼ−活性炭粉末を用いた場合に３．９％であったのに対して、プロテアーゼ−メソポーラス微粒子粉末を用いた場合には１００％程度（ＦＳＭ型：１００％，ＳＢＡ型：９８．３％）であり、極めて高い繰り返し耐久性が示された（図２２（ｂ））。
一方、プロテアーゼ−活性炭ペレットを用いた場合では、反応１０回目におけるゼラチンの分解活性が４１．１％と活性炭粉末の場合よりも高い活性が示されたが、プロテアーゼ−メソポーラス微粒子成形体を用いた場合にはより高い活性（ＦＳＭ型：９２．４％，ＳＢＡ型：８４．６％）が認められた（図２２（ａ））。
【０２３２】
図２１及び図２２の結果から、表面疎水性の高い活性炭（ペレット及び粉末）では、メソポーラスシリカ（成形体及び粉末）と比較して、プロテアーゼの固定化率が高いにもかかわらず、酵素活性が極めて低い値に留まったことより、本反応系におけるメソポーラスシリカ粉末およびその成形体の優位性が示された。
ＦＳＭ型及びＳＢＡ型のメソポーラスシリカを比較すると、成形体及び粉末ともに、全体的には、「ＦＳＭ−２２  ＞  ＳＢＡ−１５」の順にゼラチンの分解活性が増大する傾向が認められたが、これは、図２１で示されたプロテアーゼの固定化量（ＦＳＭ−２２  ＞  ＳＢＡ−１５）に依存した結果と考えられる。
また、図２１の結果より、全体的には、粉末よりも成形体を用いた場合にプロテアーゼの固定化量が低い値（粉末の場合の７０〜８０％）に留まったことを鑑みると、成形体に含まれるメソポーラス微粒子が粉末と同等の酵素の活性発現能を保持していることが推察される。
【産業上の利用可能性】
【０２３３】
以上詳述したように、本発明のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体は、吸着性等を有する多孔質な微粒子粉末を有機高分子樹脂との混合スラリーを相分離法でハンドリングの良い多孔体へと成形することで得られる。また、本発明によれば、上記のミクロないしメソポーラス微粒子の多孔質成形体で構成される精密濾過膜を提供できる。本発明の多孔質成形体は、例えば工業用排水などの処理剤として好適に使用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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