(57)【要約】【課題】短時間で確実に青枯病菌を死滅させることができる青枯病防除剤及び青枯病防除方法を提供する。【解決手段】青枯病防除剤は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍに感染し、かつ、ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子がゲノムの初期発現制御遺伝子群をコードする機能モジュール内にコードされているバクテリオファージを含む。前記バクテリオファージの溶菌酵素をコードする遺伝子が、前記ゲノムのＤＮＡ代謝遺伝子群をコードする機能モジュール内にコードされている、こととしてもよい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍに感染し、かつ、ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子がゲノムの初期発現制御遺伝子群をコードする機能モジュール内にコードされているバクテリオファージを含む、青枯病防除剤。
【請求項２】
前記バクテリオファージの溶菌酵素をコードする遺伝子が、
前記ゲノムのＤＮＡ代謝遺伝子群をコードする機能モジュール内にコードされている、
請求項１に記載の青枯病防除剤。
【請求項３】
前記バクテリオファージは、
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１６年６月１７日に受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２８８で受託されたＲＳＢ２である、
請求項１又は２に記載の青枯病防除剤。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の青枯病防除剤を、植物又は植物成長媒体に投与する投与ステップを含む、
青枯病防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、青枯病防除剤及び青枯病防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）はナス科植物等の２００種以上の植物に感染し、青枯病を引き起こす。青枯病が進行すると、青枯病菌に感染した植物は枯死してしまう。青枯病の対策に使用されてきた主な化学農薬は、劇物であるクロロピクリン又は臭化メチルである。しかし、有効散布量の増大、環境汚染、オゾン層破壊、健康への影響及び残留農薬等の問題から、化学農薬に代わる安全な代替農薬及び防除技術の開発が望まれている。
【０００３】
非特許文献１には、タイの土壌から単離された、青枯病菌に感染するジャンボファージＲＳＬ２及びＲＳＦ１が開示されている。非特許文献１に開示されたバクテリオファージは、クロロピクリン又は臭化メチル等の化学農薬より安全性が高い農薬への応用が期待されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｕｈｎｃｈｏｔｈ  Ａ、外１２名、「Ｔｗｏ  ａｓｉａｎ  ｊｕｍｂｏ  ｐｈａｇｅｓ，φＲＳＬ２  ａｎｄ  φＲＳＦ１，ｉｎｆｅｃｔ  Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ａｎｄ  ｓｈｏｗ  ｃｏｍｍｏｎ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  φＫＺ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｈａｇｅｓ．」、２０１６年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、４９４、ｐ．５６−６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のようなバクテリオファージを用いて青枯病菌の植物への病害を極力防ぐためには、青枯病菌をより短時間で死滅させればよい。青枯病菌の死滅に要する時間は、バクテリオファージの青枯病菌への感染サイクルの時間に依存する。上述の非特許文献１によれば、ＭＡＦＦ７３０１３８株を宿主とした場合、ＲＳＦ１の感染サイクルが４時間で、ＲＳＬ２の感染サイクルが４．５時間であった。感染サイクルの時間がさらに短いバクテリオファージを用いれば、短時間で確実に青枯病菌を死滅させることができる。
【０００６】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、短時間で確実に青枯病菌を死滅させることができる青枯病防除剤及び青枯病防除方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者は、バクテリオファージの青枯病菌に対する感染サイクルについて鋭意研究を重ねたところ、従来のバクテリオファージよりも短時間の感染サイクルを有するバクテリオファージを見出し、本発明を完成させた。すなわち、
本発明の第１の観点に係る青枯病防除剤は、
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍに感染し、かつ、ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子がゲノムの初期発現制御遺伝子群をコードする機能モジュール内にコードされているバクテリオファージを含む。
【０００８】
この場合、前記バクテリオファージの溶菌酵素をコードする遺伝子が、
前記ゲノムのＤＮＡ代謝遺伝子群をコードする機能モジュール内にコードされている、
こととしてもよい。
【０００９】
また、前記バクテリオファージは、
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１６年６月１７日に受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２８８で受託されたＲＳＢ２である、
こととしてもよい。
【００１０】
本発明の第２の観点に係る青枯病防除方法は、
上記本発明の第１の観点に係る青枯病防除剤を、植物又は植物成長媒体に投与する投与ステップを含む。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、短時間で確実に青枯病菌を死滅させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に係るバクテリオファージＲＳＢ２の遺伝子地図を示す図である。
【図２】ＲＳＢ２の外観の一例を示す図である。
【図３】ＲＳＢ２の感染サイクルを示す図である。
【図４】ＲＳＢ２の青枯病防除効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に係る実施の形態について添付の図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。
【００１４】
（実施の形態）
本実施の形態に係るバクテリオファージは、ｐｏｄｏｖｉｒｕｓに分類される。該バクテリオファージのファージ粒子は、正二十面体の頭部と、尾部とを含む。頭部の径は３０〜６０ｎｍ、好ましくは４０〜５０ｎｍである。尾部の長さは５〜２０ｎｍ、好ましくは１０〜１５ｎｍである。尾部の幅は５〜１５ｎｍ、好ましくは８〜１２ｎｍである。本実施の形態に係るバクテリオファージのゲノムは線状で２本鎖ＤＮＡである。該ゲノムのサイズは、４００００〜４０６００ｂｐ、好ましくは４０３００〜４０５００ｂｐ、より好ましくは４０４００〜４０４５０ｂｐである。
【００１５】
例えば、上記バクテリオファージのゲノムには、約５０個の遺伝子が同一方向にコードされており、ゲノムの３’末端に２００〜２５０ｂｐの重複配列があってもよい。該バクテリオファージのゲノムにおける特徴としては、公知の大腸菌ファージＴ７のように、３つの明確な機能モジュールが存在することが挙げられる。
【００１６】
機能モジュールは、初期発現制御遺伝子群をコードする機能モジュール（クラスＩ）、ＤＮＡ代謝遺伝子群をコードする機能モジュール（クラスＩＩ）及び粒子構造遺伝子群をコードする機能モジュール（クラスＩＩＩ）である。クラスＩには、該バクテリオファージが宿主に感染した初期に発現する遺伝子が主にコードされている。クラスＩＩには、該バクテリオファージのゲノムの複製に関連する遺伝子が主にコードされている。クラスＩＩＩには、該バクテリオファージのファージ粒子を構成する構造タンパク質の遺伝子が主にコードされている。通常、クラスＩはゲノムの５’末端に存在し、クラスＩＩは、ＤＮＡプライメース遺伝子からＯＲＦ３４遺伝子までの領域である。クラスＩＩＩは、ＯＲＦ３５遺伝子からＯＲＦ５０遺伝子までの領域である。
【００１７】
さらに、上記バクテリオファージのゲノムにおける特徴として、ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子がゲノムのクラスＩ内にコードされていることが挙げられる。上記バクテリオファージの一例としてのＲＳＢ２の遺伝子地図を図１に示す。青枯病菌を宿主とする公知のＴ７型のバクテリオファージＲＳＢ１のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ＲＮＡＰ）は、クラスＩＩにコードされているが、ＲＳＢ２の場合、ＲＮＡＰがＴ７と同じくクラスＩにコードされている。
【００１８】
本実施の形態に係るバクテリオファージ、例えばＲＳＢ２の感染サイクルの時間は、下記実施例６に示すように６０分で、ＲＳＢ１よりも短い。この短期の感染サイクルは、ＲＮＡＰがクラスＩ内にコードされているため、ＲＮＡポリメラーゼが感染初期に迅速に発現するためと考えられる。
【００１９】
好ましくは、上記バクテリオファージでは、溶菌酵素をコードする遺伝子がゲノムのクラスＩＩ内にコードされていてもよい。図１に示すように、溶菌酵素であるリゾチーム遺伝子（ＬＹＳ）が、ＲＳＢ１ではクラスＩＩＩ内にコードされているのに対して、ＲＳＢ２では、ＬＹＳがクラスＩＩ内にコードされている。
【００２０】
また、上記バクテリオファージのＤＮＡリガーゼをコードする遺伝子が、ゲノムのクラスＩ内にコードされていてもよい。図１に示すように、ＤＮＡリガーゼ遺伝子（ＤＮＡＬ）が、ＲＳＢ１ではクラスＩＩ内にコードされているのに対して、ＲＳＢ２では、ＤＮＡＬがクラスＩ内にコードされている。なお、図１のＭＣＰは主カプシドタンパク質を示す。
【００２１】
本実施の形態に係るバクテリオファージは、青枯病菌に感染する。該バクテリオファージは、レース、生理型及び系統型が異なる多様な青枯病菌に感染する。該バクテリオファージは、感染した青枯病菌に対する溶菌活性を有する。当該バクテリオファージが有効な青枯病菌の株としては、例えば、Ｃ３１９、Ｐｓ６５、Ｐｓ７２、Ｐｓ７４、さらには、独立行政法人農業生物資源研究所等から入手可能なＭＡＦＦ１０６６０３、２１１２７０、２１１２７１、２１１２７２、３０１４８５、３０１５５８、３２７０３２、７３０１３５、７３０１３８、７３０１３９等が挙げられる。なお、ここに挙げた株は例示であって、上記バクテリオファージの宿主域は、さらに広いと考えられる。
【００２２】
上記バクテリオファージの一例として、図２にＲＳＢ２の外観を示す。ＲＳＢ２は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１６年６月１７日に受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２８８で受託されている。
【００２３】
上記バクテリオファージは、土壌等を含む試料を、洗浄して遠心分離し、膜フィルターで上清を濾過することで得られる。さらに、宿主として適切な青枯病菌を用いることで、目的とするバクテリオファージを単離することができる。バクテリオファージの単離及び力価の測定には、寒天培地に青枯病菌とバクテリオファージ試料との混合液を加えた軟寒天培地（０．４５％寒天）を重層してプラークを形成させるプラークアッセイが好適である。
【００２４】
バクテリオファージの青枯病菌への感染方法は、当該技術分野で公知である任意の方法を用いることができる。一例としては０．１％カザミノ酸、１％ペプトン及び０．５％グルコースを含有するＣＰＧ培地で培養した青枯病菌を含む培養液にバクテリオファージを加え、培養することでバクテリオファージを青枯病菌に感染させることができる。
【００２５】
上記バクテリオファージは、下記実施例１に示すように幅広い宿主域を有しており、感染した青枯病菌を溶菌する。このため、当該バクテリオファージは、青枯病防除剤の有効成分として好適である。ここで、「防除」とは、青枯病菌の植物への感染の予防、青枯病菌による植物の病害の予防、青枯病菌による植物の病害の拡大防止及び青枯病菌の駆除を含む。
【００２６】
本実施の形態に係る青枯病防除剤は、上記バクテリオファージを含む。青枯病防除剤におけるバクテリオファージの含有量は、例えば感染単位で特定される。感染単位は細菌培養用平板上に透明領域又はプラークを形成する能力であるプラーク形成単位（ｐｆｕ）として定義される。青枯病防除剤は、例えば、滅菌水に懸濁した状態で、バクテリオファージを、１０３〜１０１４ｐｆｕ／ｍｌ、１０４〜１０１２ｐｆｕ／ｍｌ又は１０３〜１０８ｐｆｕ／ｍｌで含む。青枯病防除剤は、有効成分であるバクテリオファージ以外にも、一般に薬学的又は植物学的に許容される他の物質、組成物等を含んでもよい。
【００２７】
当該青枯病防除剤は、青枯病防除方法に利用できる。青枯病防除方法は、上記青枯病防除剤を、植物又は植物成長媒体に投与する投与ステップを含む。植物は、青枯病菌の病害が及び得るものであれば任意の種類であってよいが、好ましくはナス科の植物、より具体的には、トマト、ジャガイモ、ナス、クルクマ及びタバコ等である。
【００２８】
上記投与ステップにおける青枯病防除剤の用量は、投与対象の植物の種類あるいは植物成長媒体の容積等に応じて、適宜决定することができる。例えば、好適な用量は、植物個体あたり１０２〜１０１０ｐｆｕ、好ましくは１０４〜１０８ｐｆｕである。青枯病防除剤は、上記用量のバクテリオファージを好適な担体又は希釈剤中に含み、投与対象の植物の種類あるいは植物成長媒体の容積等に応じて、例えば１回あたり１００μｌ〜１００ｍｌ又は１〜１０ｍｌの施用量で１回又は複数回投与されてもよい。なお、植物成長媒体は、土壌、マット、固形培地等の構造体、養液栽培における養液、及び水栽培における水等である。
【００２９】
当該青枯病防除剤を含む懸濁液を植物成長媒体に投与する場合、例えば、植物成長媒体の表面積１ｍ２あたり、１μｌ〜１０００ｍｌ、１０μｌ〜１００ｍｌ、１００μｌ〜１０ｍｌ、１〜５ｍｌを散布することで投与してもよく、これ以上の任意の量で投与してもよい。
【００３０】
本実施の形態に係る青枯病防除剤は、植物又は植物成長媒体に単回で投与されてもよいし、任意の時間間隔で植物又は植物成長媒体に複数回投与されてもよい。例えば、青枯病防除剤は、数ヶ月、１ヶ月若しくは１週間に１回又は複数回、植物等に投与されてもよい。投与間隔は、投与対象の植物又は植物成長媒体に応じて、適宜決定することができる。上記バクテリオファージは、青枯病菌を短時間で死滅させることができるため、好ましくは、当該青枯病防除剤を、青枯病菌の存在する土壌又は青枯病菌が感染した植物に投与すればよい。
【００３１】
青枯病防除剤を投与する方法は、植物又は植物成長媒体を、当該青枯病防除剤に暴露することができる方法であれば任意である。青枯病防除剤を投与する方法は、例えば、青枯病防除剤を噴霧、注射すること、あるいは当該青枯病防除剤を植物又は植物成長媒体に浸透させること等である。また、青枯病防除剤をポットの苗根部に添加してもよい。植物に注射する場合、当該防除剤を注射筒に入れ、圧迫接種してもよいし、注射針を介して接種してもよい。
【００３２】
当該青枯病防除剤を、噴霧等により植物に投与することで、青枯病菌に未感染の植物であれば、該植物への青枯病菌の感染、あるいは青枯病菌の病害が該植物に及ぶことを防止できる。青枯病に感染後の植物であれば、当該青枯病防除剤を投与することで病害の拡大を阻止できる。
【００３３】
青枯病防除剤を植物成長媒体に投与することで、青枯病防除剤に含まれるバクテリオファージを、潜在的な青枯病菌に感染させることができる。この結果、青枯病を防除できる。なお、植物成長媒体は、植物が成長する媒体であれば任意のものでよい。
【００３４】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る青枯病防除剤は、ＲＮＡＰがクラスＩ内にコードされているバクテリオファージを含む。これにより、ＲＮＡポリメラーゼが感染初期に迅速に発現するため、該バクテリオファージが短期の感染サイクルで青枯病菌に感染し、短時間で確実に青枯病菌を死滅させることができる。
【００３５】
また、上記バクテリオファージでは、溶菌酵素をコードする遺伝子がゲノムのクラスＩＩ内にコードされていてもよいこととした。これにより、該バクテリオファージにおける溶菌酵素の発現は、溶菌酵素がクラスＩＩＩ内にコードされているＲＳＢ１よりも早く、該バクテリオファージの溶菌特性はＲＳＢ１と異なると考えられる。実施例８に示すように、上記バクテリオファージは、他のバクテリオファージと比較して青枯病菌への感染力が強く、優先的に感染する。これにより、青枯病菌を迅速に死滅させることができる。
【００３６】
なお、本実施の形態に係る青枯病防除剤に含まれるバクテリオファージは、青枯病菌への特異性が高く、他の有用な微生物に影響を与えない。これにより、当該青枯病防除剤は、環境への影響を極力小さくすることができる。したがって、当該青枯病防除剤は、化学農薬よりも安全性が高く、耐性菌の増加、有効散布量の増大、環境汚染、残留農薬、及び健康への影響等の問題を回避できる。
【００３７】
また、本実施の形態に係る青枯病防除剤は、下記実施例に示すように、長期に渡って青枯病菌による病害を防除することができる。
【実施例】
【００３８】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１：ＲＳＢ２の単離）
広島県東広島市で採取した土壌からバクテリオファージＲＳＢ２を、次のように単離した。１ｇの土壌を２ｍｌの滅菌水に懸濁して調製した試料を、室温で１時間、激しく振った。次に、膜孔の径が０．４５μｍの膜フィルター（Ｓｔｅｒａｄｉｓｃ、クラボウ社製）に試料を通し、１００μｌをプラークアッセイに用いた。プラークアッセイでは、青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３を宿主として、１．５％寒天を含むＣＰＧプレート上に重層した０．４５％の軟寒天培地にプラークを形成させた。
【００４０】
ＭＡＦＦ７３０１３８を、０．１％（Ｗ／Ｖ）カザミノ酸、１．０％（Ｗ／Ｖ）ペプトン及び０．５％（Ｗ／Ｖ）グルコースを含むＣＰＧ培地において、２８℃で振盪培養した（２００〜３００ｒｐｍ）。ＭＡＦＦ７３０１３８の培地のＯＤ６００が０．１（３×１０８細胞／ｍｌ）に達してから、上記で得られたＲＳＢ２をＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝１．０で培地に加えた。１晩培養後、遠心機による遠心分離（６０００×ｇ）で細胞を沈殿させ、得られた上清をさらに遠心分離することで（１５０００×ｇ）、ＲＳＢ２を回収した。ＲＳＢ２の力価は、１０１０〜１０１１ｐｆｕ／ｍｌであった。
【００４１】
（実施例２：ＲＳＢ２のファージ粒子の構造）
超遠心分離（４００００×ｇ、２時間）で濃縮したＲＳＢ２(１０１１ｐｆｕ／ｍｌ)を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ＭｇＳＯ４）に懸濁後、リンタングステン酸でネガティブ染色し、電子顕微鏡（ＪＥＭ−１４００、日本電子社製）で観察した。
【００４２】
（結果）
図２に示すように、ＲＳＢ２のファージ粒子は、径が約４０〜５０ｎｍの正二十面体の頭部と、長さ１０〜１５ｎｍ及び幅１０ｎｍの尾部とを有するｐｏｄｏｖｉｒｕｓ型であった。なお、図２中のバーは４０ｎｍの長さを示す。
【００４３】
（実施例３：ＲＳＢ２のゲノムのサイズの決定）
フェノール抽出によってＲＳＢ２のファージ粒子からゲノムＤＮＡを単離した。ゲノムのサイズを決めるため、精製したファージ粒子を０．７％低融点アガロース（ＩｎＣｅｒｔ（商標）アガロース、ＦＭＣ社製）に包埋した。次に、１ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼＫ（メルク社製）及び１％（Ｗ／Ｖ）のＳａｒｋｏｓｙｌで処理し、核酸に対してＣＨＥＦ  ＭＡＰＰＥＲ（商標）電気泳動装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）でパルスフィールドゲル電気泳動法を実施した。
【００４４】
（結果）
サイズマーカーのバンドを参照し、ＲＳＢ２のゲノムは２本鎖ＤＮＡで、ゲノムのサイズは４０４１１ｂｐであった。
【００４５】
（実施例４：ＲＳＢ２のゲノム解析）
ＲＳＢ２のゲノムＤＮＡのショットガン配列決定を、ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ社製）で行った。決定した塩基配列のアセンブリをＧＳ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ及びＧＳ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍａｐｐｅｒ  ｖ２．６で行った。次に、１５０ｂｐより大きいオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＧｌｉｍｍｅｒ  ｖ３．０２及びＧｅｎｅＭａｒｋで同定した。さらに、配列データベースに対してＢＬＡＳＴＰ／ＲＰＳ−ＢＬＡＳＴでホモロジー検索を行った。ホモロジー検索では、著しい類似性のカットオフとして、Ｅ−ｖａｌｕｅが１ｅ−４未満とした。なお、配列データベースは、ＵｎｉＰｒｏｔ配列データベース及びＮＣＢＩ／ＣＤＤデータベースである。
【００４６】
上記実施例１に記載の方法で別に単離されたｐｏｄｏｖｉｒｕｓ型のバクテリオファージＲＳＢ１（ゲノムサイズが４３０７９ｂｐ）のゲノムも同様に解析した。さらに大腸菌ファージＴ７のゲノムの配列も取得し、ＲＳＢ２、ＲＳＢ１及びＴ７のゲノム配列を配列アライメント法で比較した。配列アライメント法は、ＤＮＡＳＩＳプログラム  ｖ３．６（日立ソフトウェアエンジニアリング社製）で実行した。
【００４７】
（結果）
図１に示すように、ＲＳＢ２のゲノムには、同一方向に計５０個の遺伝子がコードされていた。該ゲノムの末端には２１４ｂｐの末端重複配列が存在した。ＲＳＢ２、Ｔ７及びＲＳＢ１のゲノムには、クラスＩ、クラスＩＩ及びクラスＩＩＩの３つの明確な機能モジュールがそれぞれ存在していた。ＲＳＢ１のゲノムでは、Ｔ７型ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ＲＮＡＰ）がクラスＩＩ内にコードされているのに対し、ＲＳＢ２のゲノムでは、ＲＮＡＰがクラスＩ内にコードされていた。なお、ＲＳＢ２のゲノムＤＮＡの塩基配列は、ＤＤＢＪデータベースにアクセション番号ＡＢ５９７１７９として登録されている。なお、ＲＳＢ２のゲノムのＧＣ含量は６１．７％であった。
【００４８】
（実施例５：ＲＳＢ２の宿主域の検討）
種々の青枯病菌株を用いた上記のプラークアッセイによって、ＲＳＢ２の宿主域を検討した。
【００４９】
（結果）
表１は、ＲＳＢ２に感受性がある青枯病菌株を示す。ＲＳＢ２は種々の植物を宿主植物とする１３種類の菌株に感染した。ＲＳＢ２は青枯病菌のみに感染し、腸内細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ及びグラム陽性菌等には感染しなかった。
【００５０】
【表１】
2018024589.tif 000003
【００５１】
（実施例６：ＲＳＢ２の感染サイクルの評価）
以下のようにワンステップ増殖法で感染サイクルを評価した。培養によりＯＤ６００が０．５に達したＭＡＦＦ７３０１３８株を遠心（６０００×ｇ）で回収し、最終培養液量が１０ｍｌとなるようにＣＰＧ培地に懸濁した（３×１０７ｃｆｕ／ｍｌ）。この試料にＲＳＢ２をＭＯＩ＝０．１となるように加えて、室温で５分間吸着させた。遠心後、ＣＰＧに試料を再懸濁し、最終液量が１０ｍｌになるように希釈系列を調製し、２８℃でインキュベーションした。感染後３０分経過した時点で１ｍＭのＥＤＴＡを試料に添加した。ここで、等量のクロロホルムを添加後撹拌した試料も同様に調製した。クロロホルム処理により青枯病菌は溶菌するがファージ粒子は安定である。クロロホルム処理併用によって細胞内のファージ粒子形成の正確なタイミングが把握できる。試料を１０分ごとに３時間後まで採取し、タイターをプラークアッセイで決定した。
【００５２】
（結果）
細胞あたりのＲＳＢ２の個数の経時変化を図３に示す。ＲＳＢ１は、ＭＡＦＦ７３０１３８株を宿主とした場合、潜伏期が３０分で、感染サイクルは６０分であった。バーストサイズは約３０ｐｆｕ／ｃｅｌｌであった。同様にＲＳＢ１の感染サイクルを評価したところ、潜伏期が３０分で、感染サイクルは９０分であった。図１に示すように、ＲＳＢ２では、ＲＮＡＰがクラスＩ内にコードされているため、ＲＮＡポリメラーゼが迅速に発現することで感染サイクルの時間がＲＳＢ１よりも短いと考えられる。
【００５３】
（実施例７：トマトにおけるＲＳＢ２の青枯病防除効果の評価）
１苗あたり４ｍｌの青枯菌株ＭＡＦＦ２１１２７０の培養液（１．０×１０８ｃｆｕ／ｍｌ）を、ポットに灌注法によって接種することで断根感染させたトマト苗（品種：世界一、１ヶ月苗）を対照区とした（４６苗）。一方、断根後１苗あたり８ｍｌのＲＳＢ２含有液（５．０×１０８ｐｆｕ／ｍｌ）を、灌注法によってポットに投与し、３日後、断根後に１苗あたり３．５ｍｌのＲＳＢ２含有液（１．３×１０９ｐｆｕ／ｍｌ）を、ポットに投与したトマト苗を処理区（４８苗）とした。５時間後、処理区には１苗あたり４ｍｌの上記ＭＡＦＦ２１１２７０の培養液（１．０×１０８ｃｆｕ／ｍｌ）を灌注法によって接種した。対照区及び処理区を接種後約６０日まで観察した。
【００５４】
（結果）
図４（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ対照区及び処理区の病徴が現れたトマト苗の個数を示す。対照区では、約１週間後に顕著な青枯病の病徴が出現し、約２週間で約７０％のトマト苗が枯死した。これに対し、処理区では、２週間後に約１８％のトマト苗に病徴が観察されたが、病徴が現れるトマト苗の個数にその後大きな変化はなく、２５〜６０日後でも病徴が現れるトマト苗は約２０％に限定された。なお、病徴指数「０」は病徴なし、「１」は本葉１葉が萎凋、「２」は本葉２葉が萎凋、「３」は本葉の大部分が萎凋、「４」は枯死、を示す。
【００５５】
（実施例８：ＲＳＢ２及びＲＳＢ１の混合感染の評価）
共通の宿主であるＭＡＦＦ７３０１３８で増殖させたＲＳＢ１及びＲＳＢ２を、１：１（ｐｆｕ／ｐｆｕ）となるように混合し、４種の宿主に対して１５分間室温で吸着させた。次に、遠心分離（４０００×ｇ、５分）により未吸着のバクテリオファージを除いた後、新しいＣＰＧ培地中で３時間、２８℃で培養した。培養後、上清中のＲＳＢ１及びＲＳＢ２を、それぞれの特異的な宿主であるＭ４Ｓ及びＭＡＦＦ３２７０３２で検定した。
【００５６】
（結果）
全液中におけるＲＳＢ１の占める割合（ＲＳＢ１／（ＲＳＢ１＋ＲＳＢ２）、％）を表２に示す。４種の宿主に対して、３段階のＭＯＩいずれの場合も、圧倒的にＲＳＢ１の占有率が低く、混合感染でＲＳＢ２の感染が優先することが示された（ＭＯＩ＝０．１で９９％以上、ＭＯＩ＝３でも９７％以上）。この結果は、ゲノム構造がＲＳＢ１と類似する他の公知のバクテリオファージＲＳＢ３、ＲＳＪ２、ＲＳＪ５を用いた場合も同じ傾向であった。ＲＳＢ２の優先感染特性は、ＲＳＢ２のゲノムにおいてクラスＩ内にコードされたＲＮＡＰが迅速に発現することで、感染サイクルが短期になり、他のバクテリオファージに常に感染が先行するためであると考えられる。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
なお、上記ＲＳＢ１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１６年７月２２日に受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２９７で受託されている。また、ＲＳＢ１のゲノムＤＮＡの塩基配列は、ＤＤＢＪデータベースにアクセション番号ＡＢ４５１２１９として登録されている。
【００５９】
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等な発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は、青枯病の防除、拡大防止又は青枯病菌の駆除に好適である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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