(57)【要約】      （修正有）【課題】浮遊粒子状物質に対する特異的な結合能を有するペプチドを提供する。【解決手段】アミノ酸配列の少なくとも一部が、ＬＨＹＨＨＲＨＨＲＹＨＬ、ＲＨＶＲＴＲＴＹＬＰＬＧ、ＧＬＨＴＳＡＴＮＬＹＬＨ、ＡＧＹＰＬＳＥＮＦＹＹＰ、ＷＱＤＦＧＡＶＲＳＴＲＳ、ＦＨＰＲＬＱＱＤＨＷＬＨからなるペプチド、又は、これらのアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ浮遊粒子状物質に対する結合活性を有するペプチドからなる、浮遊粒子状物質結合性ペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列の少なくとも一部が、配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ浮遊粒子状物質に対する結合活性を有するペプチドからなる、浮遊粒子状物質結合性ペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列の少なくとも一部が、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ浮遊粒子状物質に対する結合活性を有するペプチドからなる、請求項１に記載の浮遊粒子状物質結合性ペプチド。
【請求項３】
配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ浮遊粒子状物質に対する結合活性を有するペプチドからなる、請求項１に記載の浮遊粒子状物質結合性ペプチド。
【請求項４】
配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ浮遊粒子状物質に対する結合活性を有するペプチドからなる、請求項３に記載の浮遊粒子状物質結合性ペプチド。
【請求項５】
固相と、前記固相上に配置された請求項１〜４のいずれか一項に記載の浮遊粒子状物質結合性ペプチドと、を備える、浮遊粒子状物質検出用センサー。
【請求項６】
請求項５に記載の浮遊粒子状物質検出用センサーと被検試料とを接触させる工程と、
前記浮遊粒子状物質結合性ペプチドへの浮遊粒子状物質の結合量を測定する工程と、
を備える、被検試料中の浮遊粒子状物質の存在量を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、浮遊粒子状物質結合性ペプチド及びその使用に関する。より具体的には、浮遊粒子状物質結合性ペプチド、浮遊粒子状物質検出用センサー及び被検試料中の浮遊粒子状物質の存在量を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中に存在する粒子状物質には、物の燃焼等によって直接排出されるものと、硫黄酸化物（ＳＯｘ）、窒素酸化物（ＮＯｘ）、揮発性有機化合物（ＶＯＣ）等のガス状大気汚染物質が、主として環境大気中での化学反応により粒子化したものとが存在する。粒子状物質の発生源としては、ボイラー、焼却炉等のばい煙を発生する施設、コークス炉、鉱物の堆積場等の粉じんを発生する施設、自動車、船舶、航空機等の人為起源のもの、土壌、海洋、火山等の自然起源のものが存在する。
【０００３】
大気中に浮遊している粒子状物質は、浮遊粒子状物質と呼ばれる場合がある。更に、浮遊粒子状物質の中でも特に粒径の小さなもの、例えば、直径２．５μｍ以下のものは、微小粒子状物質、ＰＭ２．５等と呼ばれる場合がある。微小粒子状物質は非常に小さいため、肺の奥深くまで入りやすく、呼吸器系への影響に加え、循環器系への影響が懸念されている。
【０００４】
ところで、金属結晶や酸化物結晶等の無機物質に対する特異的な結合能を有するペプチドが知られている。例えば、特許文献１には、希土類金属に特異的に結合するペプチドが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−５１４４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、浮遊粒子状物質に対する特異的な結合能を有するペプチドは知られていない。そこで、本発明は、浮遊粒子状物質結合性ペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の態様を含む。
［１］アミノ酸配列の少なくとも一部が、配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ浮遊粒子状物質に対する結合活性を有するペプチドからなる、浮遊粒子状物質結合性ペプチド。
［２］アミノ酸配列の少なくとも一部が、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ浮遊粒子状物質に対する結合活性を有するペプチドからなる、［１］に記載の浮遊粒子状物質結合性ペプチド。
［３］配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ浮遊粒子状物質に対する結合活性を有するペプチドからなる、［１］に記載の浮遊粒子状物質結合性ペプチド。
［４］配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ浮遊粒子状物質に対する結合活性を有するペプチドからなる、［３］に記載の浮遊粒子状物質結合性ペプチド。
［５］固相と、前記固相上に配置された［１］〜［４］のいずれかに記載の浮遊粒子状物質結合性ペプチドと、を備える、浮遊粒子状物質検出用センサー。
［６］［５］に記載の浮遊粒子状物質検出用センサーと被検試料とを接触させる工程と、前記浮遊粒子状物質結合性ペプチドへの浮遊粒子状物質の結合量を測定する工程と、を備える、被検試料中の浮遊粒子状物質の存在量を測定する方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、浮遊粒子状物質に対する特異的な結合能を有するペプチドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】（ａ）は、実験例２において、浮遊粒子状物質と反応後のペプチドアレイの写真である。（ｂ）は、（ａ）の結果を数値化したグラフである。
【図２】実験例４において、浮遊粒子状物質結合性ペプチドの１〜３回目のスクリーニングの結果をまとめたグラフである。
【図３】（ａ）〜（ｅ）は、実験例５において、各浮遊粒子状物質結合性ペプチドに結合した浮遊粒子状物質が含有する無機元素の代表的な測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［浮遊粒子状物質結合性ペプチド］
１実施形態において、本発明は、アミノ酸配列の少なくとも一部が、配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ浮遊粒子状物質に対する結合活性を有するペプチドからなる、浮遊粒子状物質結合性ペプチドを提供する。
【００１１】
実施例において後述するように、本実施形態のペプチドは、浮遊粒子状物質に対する特異的な結合能を有する。このため、例えば浮遊粒子状物質を簡便に検出するセンサー等に利用することができる。
【００１２】
本明細書において、浮遊粒子状物質とは、大気中に浮遊している浮遊粒子状物質を意味する。浮遊粒子状物質の粒径は、例えば１０μｍ以下であってもよく、例えば２．５μｍ以下であってもよく、例えば０．１μｍ以下であってもよい。本明細書において、粒径とは、粒子の大きさを、空気動力学的挙動が等価な比重１．０の球形粒子の直径で表したものをいう。
【００１３】
浮遊粒子状物質は、環境大気中に浮遊する粒子状物質のうち空気動力学的特性が粒径２．５μｍで５０％カット性をもつ粒子状物質であってもよい。いいかえると、浮遊粒子状物質は、大気中に浮遊する粒子状物質のうち、粒径２．５μｍで５０％分粒された小粒径側の粒子状物質であってもよい。このような浮遊粒子状物質のことをＰＭ２．５という場合がある。また、浮遊粒子状物質のうち、特に粒径が０．１μｍ以下のものをＰＭ０．１という場合がある。
【００１４】
本実施形態の浮遊粒子状物質結合性ペプチドが結合する浮遊粒子状物質は、例えばＰＭ２．５であってもよいし、例えばＰＭ０．１であってもよい。
【００１５】
浮遊粒子状物質は、環境大気中での化学反応を経て形成されているため、多様な成分から構成されており、高純度の金属結晶や、高純度の酸化物結晶等とは異なる物質である。
【００１６】
本明細書において、１若しくは複数個とは、例えば１〜５個であってもよく、例えば１〜４個であってもよく、例えば１〜３個であってもよく、例えば１〜２個であってもよい。以下、あるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列のことを「変異配列」という場合がある。また、あるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドのことを「変異ペプチド」等という場合がある。
【００１７】
また、本実施形態の浮遊粒子状物質結合性ペプチドは、その部分ペプチドとして、配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列又はその変異配列からなるペプチドを１つ含んでいてもよいし、２個以上含んでいてもよい。ここで、配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列又はその変異配列からなるペプチドは、１種であってもよく、２種以上であってもよい。また、浮遊粒子状物質結合性ペプチドに、配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列又はその変異配列からなるペプチドが２種以上含まれている場合、それらのペプチドは任意の順序で並んでいてもよい。ここで、上記の２種以上のペプチドは、互いに直接連結されていてもよいし、上記の２種以上のペプチドの間に他のペプチドを挟んで連結されていてもよい。
【００１８】
本実施形態の浮遊粒子状物質結合性ペプチドの長さは、例えば５〜１００アミノ酸であってもよく、例えば５〜５０アミノ酸であってもよく、例えば５〜４０アミノ酸であってもよく、例えば５〜３０アミノ酸であってもよく、例えば５〜２０アミノ酸であってもよく、例えば５〜１２アミノ酸であってもよい。
【００１９】
上記の浮遊粒子状物質結合性ペプチドは、アミノ酸配列の少なくとも一部が、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ浮遊粒子状物質に対する結合活性を有するペプチドからなるものであってもよい。
【００２０】
実施例において後述するように、配列番号１又は２のペプチドは、浮遊粒子状物質の中でも、Ｐｂ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｚｎ等の含有量が高い浮遊粒子状物質を検出することができる。
【００２１】
環境省  水・大気環境局が制定した「微小粒子状物質（ＰＭ２．５）の成分分析ガイドライン」（平成２３年７月）には、微小粒子状物質の成分分析にあたり、ナトリウム（Ｎａ）、アルミニウム（Ａｌ）、ケイ素（Ｓｉ）＊、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）＊、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）＊、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）＊、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）＊、亜鉛（Ｚｎ）、ヒ素（Ａｓ）、セレン（Ｓｅ）＊、ルビジウム（Ｒｂ）＊、モリブデン（Ｍｏ）＊、アンチモン（Ｓｂ）、セシウム（Ｃｓ）＊、バリウム（Ｂａ）＊、ランタン（Ｌａ）＊、セリウム（Ｃｅ）＊、サマリウム（Ｓｍ）＊、ハフニウム（Ｈｆ）＊、タングステン（Ｗ）＊、タンタル（Ｔａ）＊、トリウム（Ｔｈ）＊、鉛（Ｐｂ）等の無機元素成分を測定することが重要であると記載されている。上記の成分のうち、「＊」を付した成分は測定の実施が望まれる実施推奨項目である。これらの元素成分を測定することにより、微小粒子状物質の発生源の特定に寄与することができる。
【００２２】
１実施形態において、本実施形態の浮遊粒子状物質結合性ペプチドは、配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ浮遊粒子状物質に対する結合活性を有するペプチドであってもよい。
【００２３】
また、上記の浮遊粒子状物質結合性ペプチドは、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ浮遊粒子状物質に対する結合活性を有するペプチドからなるものであってもよい。上述したように、配列番号１又は２のペプチドは、浮遊粒子状物質の中でも、Ｐｂ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｚｎ等の含有量が高い浮遊粒子状物質を検出することができる。
【００２４】
本明細書において、「ペプチドが浮遊粒子状物質と結合する」とは、「ペプチドが浮遊粒子状物質に対する結合性を有する」、「ペプチドが浮遊粒子状物質に対する結合能を有する」、「ペプチドが浮遊粒子状物質と反応する」、「ペプチドが浮遊粒子状物質を認識する」、「ペプチドが浮遊粒子状物質を結合対象とする」等といいかえることもできる。
【００２５】
［浮遊粒子状物質検出用センサー］
１実施形態において、本発明は、固相と、前記固相上に配置された上記の浮遊粒子状物質結合性ペプチドと、を備える、浮遊粒子状物質検出用センサーを提供する。本実施形態において、固相としては、例えば、ビーズ等の粒子；ガラス、金属薄膜等の板状基板；膜等が挙げられる。
【００２６】
本実施形態の浮遊粒子状物質検出用センサーにおいて、上記の浮遊粒子状物質結合性ペプチドは、１種が単独で固相上に配置されていてもよく、２種以上が混合して固相上に配置されていてもよい。また、複数の浮遊粒子状物質結合性ペプチドが固相上に配置される場合、１つの固相上に複数の浮遊粒子状物質結合性ペプチドが配置されていてもよく、１種の浮遊粒子状物質結合性ペプチドが配置された固相が複数備えられていてもよい。
【００２７】
また、１つの固相上に複数の浮遊粒子状物質結合性ペプチドが配置される場合、各浮遊粒子状物質結合性ペプチドは、同一の領域に混合して配置されていてもよく、それぞれ独立した領域にアレイ状に配置されていてもよい。
【００２８】
本実施形態の浮遊粒子状物質検出用センサーは、例えば板状基板、膜等の形状の固相上にペプチドが配置されたペプチドアレイであってもよい。この場合、浮遊粒子状物質結合性ペプチドに対する浮遊粒子状物質の結合は、スキャナー等により検出することができる。
【００２９】
あるいは、本実施形態の浮遊粒子状物質検出用センサーは、例えば、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）センサー、水晶振動子マイクロバランス（ｑｕａｒｔｚ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ、ＱＣＭ）センサー、電気化学計測（インピーダンス、電位計測等）や分光電気化学計測を原理とするセンサー等であってもよい。
【００３０】
本実施形態の浮遊粒子状物質検出用センサーにより、被検試料中の浮遊粒子状物質の存在を定量的又は定性的に検出することができる。
【００３１】
ＳＰＲセンサーとは、金属薄膜上の質量変化を高感度に検出するセンサーである。まず、ＳＰＲ現象について説明する。ガラス板上に蒸着された金属薄膜の裏面等に対して光源からレーザー等で光を照射すると、金属薄膜裏面で光が全反射すると同時に金属薄膜でエバネッセント波が発生する。このとき、金属薄膜表面側では表面プラズモンが発生する。このエバネッセント波と表面プラズモンのそれぞれの波数・周波数が一致した際、共鳴により光子エネルギーが表面プラズモンの電子を励起するために消費される。そのため、ある入射角で光を入射すると反射光が減衰する現象が生じる。これがＳＰＲ現象であり、このときの入射角を共鳴角と呼ぶ。
【００３２】
上記の共鳴角は金属薄膜表面近傍の状態によって変化し、この変化は質量変化に対応している。ＳＰＲ測定法は、質量変化による共鳴角の変化を利用して金属薄膜表面上の吸着物を測定するものである。これにより、金属薄膜がその表面にどれほどの分子を吸着したのかを測定することが可能となる。
【００３３】
ＱＣＭセンサーとは、水晶振動子に取り付けた電極表面に物質が吸着するとその質量に応じて水晶振動子の共振周波数が減少する現象を利用して、共振周波数の変化量によって極微量な吸着物を定量的に検出するものである。
【００３４】
固相の材質は、センサーの原理等に応じて適宜選択すればよい。例えば、ＳＰＲセンサーやＱＣＭセンサーの場合、固相は金属薄膜で構成される。金属種は特に限定されないが、化学的に不活性であり、信号の発生効率がよい等の理由から金（Ａｕ）が好ましい。
【００３５】
固相上に浮遊粒子状物質結合性ペプチドを配置（固定化）する方法としては、物理的吸着法、化学的吸着法等が挙げられる。物理的吸着法の場合、固相表面の材質が金属の場合には金属と浮遊粒子状物質結合性ペプチドとの親和性によって固定化することができる。化学的吸着法の場合、固相表面上に自己組織化単分子膜（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ；ＳＡＭｓ）を予め形成させておくと便利である。自己組織化単分子膜は固相表面上に種々の分子を自発的に配向させ、また集積させることが可能なため、浮遊粒子状物質結合性ペプチドを簡便に、高密度に、高配向で基板上に固定化することができる。
【００３６】
例えば、自己組織化単分子膜は、チオール溶液中に固相を浸漬すること等により形成することができる。浮遊粒子状物質結合性ペプチドは、例えば、分子中のアミノ基を介してアミノカップリング法によって固相表面上に修飾されたチオール化合物のカルボキシル基に固定化してもよい。
【００３７】
あるいは、浮遊粒子状物質結合性ペプチドに予めシステイン残基を導入しておき、当該システイン残基のチオール基を介した架橋反応により、固相表面上に修飾された自己組織化単分子膜に固定化してもよい。システイン残基は浮遊粒子状物質結合性ペプチドのＮ末端に導入してもよいし、Ｃ末端に導入してもよいし、ペプチドの内部に導入してもよいが、浮遊粒子状物質に対する良好な反応性を確保する観点からは、Ｎ末端又はＣ末端に導入することが好ましい。
【００３８】
あるいは、浮遊粒子状物質結合性ペプチドに化学リンカーを付加した上で固相上に固定化してもよい。あるいは、ビオチン、アビジン等の互いに結合する分子を利用して、浮遊粒子状物質結合性ペプチドを固相上に固定化してもよい。
【００３９】
［被検試料中の浮遊粒子状物質の存在量を測定する方法］
１実施形態において、本発明は、上記の浮遊粒子状物質検出用センサーと被検試料とを接触させる工程と、前記浮遊粒子状物質結合性ペプチドへの浮遊粒子状物質の結合量を測定する工程と、を備える、被検試料中の浮遊粒子状物質の存在量を測定する方法を提供する。本実施形態の方法により、被検試料中の浮遊粒子状物質の存在量を、簡便に測定することができる。
【００４０】
また、浮遊粒子状物質結合性ペプチドとして、配列番号１若しくは２のペプチド又はこれらの変異ペプチド、又は、配列番号１若しくは２のペプチド又はこれらの変異ペプチドをその部分配列に有するペプチドを用いた場合には、浮遊粒子状物質の中でも、Ｐｂ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｚｎ等の含有量が高い浮遊粒子状物質の存在量を測定することができる。
【００４１】
被検試料は、浮遊粒子状物質の存在量を測定する対象の試料であり、例えば、環境省が定めた「大気中微小粒子状物質（ＰＭ２．５）成分測定マニュアル」に記載された方法により採取した微小粒子状物質試料であってもよい。
【００４２】
具体的には、試料大気導入口、分粒装置、フィルター保持具、流量制御器、吸引ポンプ、表示部、記録部等を備える捕集装置を用いて捕集された試料であってもよい。分粒装置としては、サイクロン方式、バーチャルインパクタ方式、インパクタ方式のもの等が挙げられる。被検試料は、ヒトが通常生活し呼吸する面の高さを考慮して、地上３〜１０ｍで捕集された試料であってもよい。また、試料捕集時間は、２４±１時間であってもよい。
【００４３】
浮遊粒子状物質検出用センサーと被検試料とを接触させる工程は、センサーの原理等に応じて適宜行えばよい。例えば、浮遊粒子状物質検出用センサーがＳＰＲセンサー又はＱＣＭセンサーである場合、被検試料を緩衝液中に溶解させてセンサー部に導入するとよい。ここで、ＳＰＲセンサー又はＱＣＭセンサーが、フローシステムを採用したものであると簡便である。ここで、フローシステムとは、固定化した固相の分子に液相の分子を一定の条件（濃度、速度、供給量）で供給する続けるシステムをいう。
【００４４】
これにより、浮遊粒子状物質検出用センサーにおける、浮遊粒子状物質結合性ペプチドが配置された固相と、被検試料とを接触させることができる。
【００４５】
浮遊粒子状物質結合性ペプチドへの浮遊粒子状物質の結合量を測定する工程は、センサーの原理等に応じて適宜行えばよい。例えば、ＳＰＲセンサーの場合には、共鳴角の質量変化による変化を測定することにより、固相上に配置した浮遊粒子状物質結合性ペプチドへの浮遊粒子状物質の結合量を測定するとよい。
【００４６】
また、ＱＣＭセンサーの場合には、水晶振動子に取り付けた電極表面上に配置した浮遊粒子状物質結合性ペプチドに、浮遊粒子状物質が結合すると、その質量に応じて水晶振動子の共振周波数が減少する現象を利用して、浮遊粒子状物質の結合量を測定するとよい。
【００４７】
測定された浮遊粒子状物質結合性ペプチドへの浮遊粒子状物質の結合量は、被検試料中の浮遊粒子状物質の存在量に対応する。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
［実験例１］
（ファージディスプレイライブラリのスクリーニング）
市販のキット（商品名「Ｐｈ．Ｄ．（商標）−１２  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ」、カタログ番号「Ｅ８１１１Ｌ」、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）を使用して、ファージライブラリから浮遊粒子状物質に対する特異的な結合能を有するペプチドをスクリーニングした。
【００５０】
浮遊粒子状物質として、浮遊粒子状物質の標準物質（ＮＩＥＳ  ＣＲＭ  Ｎｏ．２８  都市大気粉塵、国立環境研究所製）を使用した。使用した標準物質は、大気粉塵中の多元素分析を行う際の分析値の精度管理や分析機器の校正に使われることを目的として、国立環境研究所（ＮＩＥＳ）において研究開発された標準物質であり、１９９６年から２００５年の１０年間に北京市中心部のビルの換気フィルターに捕集された大気粉塵を原料とするものであった。
【００５１】
上記の浮遊粒子状物質の標準物質は、より詳細には、換気フィルターに機械的振動を与えることにより３ｋｇの粉塵を得、得られた粉塵を３２μｍの篩にかけた後、均質化して２ｋｇの試料を得、得られた試料を１．５ｇずつ洗浄済みの褐色ガラス瓶１０３１本に詰め、コバルト−６０（６０Ｃｏ）照射（２．５Ｍｒａｄ）による減菌処理を行ったものであった。したがって、上記の浮遊粒子状物質の標準物質は、ＰＭ２．５やＰＭ０．１等を含有するものであった。
【００５２】
浮遊粒子状物質を固定したプレートにファージライブラリのファージを結合させ、親和性の弱いファージを洗浄除去した後、浮遊粒子状物質に結合したファージを溶出して回収し増幅した。この操作を３回繰り返した後、回収されたファージの塩基配列を解析し、ファージが発現していたペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【００５３】
回収された１０クローンのファージの塩基配列を解析した結果、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するペプチドをコードしていたクローンが７クローン取得された。また、配列番号４、５及び６に記載のアミノ酸配列を有するペプチドをコードしていたクローンがそれぞれ１クローンずつ取得された。
【００５４】
［実験例２］
（実験例１で得られたペプチドの浮遊粒子状物質に対する結合性の検討）
《ペプチドアレイの作製》
まず、活性化メンブレンを作製した。３７℃で１日乾燥させたセルロースメンブレンを、ジメチルホルムアミド（以下、「ＤＭＦ」という。）に１日浸漬した。続いて、メンブレンをメタノールで２回洗浄した後乾燥させた。続いて、ＤＭＦ  ３００ｍＬ、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａｎｉｎｅ  ２４ｍＬ（１．０Ｍ）、ジイソプロピルカルボジイミド（以下、「ＤＩＰＣＩ」という。）５００μＬ、１−メチルイミダゾール（以下、「ＮＭＩ」という。）４００μＬを混合して調製した活性化試薬に、上記のメンブレンを２日間浸漬した。最後に、メンブレンを、ＤＭＦ及びメタノールでそれぞれ３回ずつ洗浄し、冷風をあてて乾燥させた。完成した活性化メンブレンは−２０℃の冷凍庫中で保存した。
【００５５】
続いて、ペプチドアレイを作製した。ペプチド合成機（型式「ＲｅｓＰｅｐ  ＳＬ、ＫＩＦＵ２０１４００４７−００００」、Ｉｎｔａｖｉｓ社）を用いて、上述した活性化メンブレン上の決められた位置にアミノ酸のスポッティングを繰り返すことにより、Ｆｍｏｃ固相合成反応によるペプチドの伸長反応を行った。スポットするアミノ酸溶液としては、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（以下、「ＮＭＰ」という。）に溶解した０．５Ｍ  Ｆｍｏｃアミノ酸溶液、及び、ＤＩＰＣＩとヒドロキシベンゾトリアゾール（以下、「ＨｏＢｔ」という。）をモル比で２：８に混合して調製した活性化剤を、１７：１００の容量比で混合させたものを使用した。Ｆｍｏｃ基の脱保護には、２０％ピペリジン（渡辺化学工業製）を用いた。キャッピングには、無水酢酸とＤＭＦとを容量比で２：１００に混合した溶液を使用した。また、メンブレンの洗浄には、ＤＭＦ及びエタノールを使用した。
【００５６】
以上の操作により、実験例１で得られた配列番号３、４、５及び６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをメンブレン上に合成した。また、対照として、アラニンのペンタマーであるペプチド（配列番号７）もメンブレン上に合成した。
【００５７】
《ペプチドの浮遊粒子状物質に対する結合性の検討》
続いて、実験例１で使用した浮遊粒子状物質の標準物質を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で０．１ｖ／ｖ％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液（以下、「ＴＢＳＴ」という場合がある。）に懸濁した懸濁液を調製し、作製したペプチドアレイを浸漬して１６時間撹拌した。続いて、ペプチドアレイを取出し、スキャナー（型式「ＬｉＤＥ２２０」、キャノン社製）でスキャンした。続いて、得られた画像を画像解析ソフト（商品名「ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ」、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）で解析し、ペプチドアレイに結合した浮遊粒子状物質の色の濃さ（シグナル強度）を数値化することにより、各ペプチドの浮遊粒子状物質に対する結合能を評価した。
【００５８】
図１（ａ）は、浮遊粒子状物質と反応後のペプチドアレイの写真である。レーン１に配列番号７のペプチド（対照）、レーン２に配列番号６のペプチド、レーン３に配列番号５のペプチド、レーン４に配列番号４のペプチド、レーン３に配列番号３のペプチドがそれぞれ３個ずつスポットされている。図１（ｂ）は、図１（ａ）の結果を数値化したグラフである。その結果、実験例１で得られたペプチドが、確かに浮遊粒子状物質に対する結合能を有することが確認された。
【００５９】
［実験例３］
（配列番号３のペプチドの改変）
続いて、実験例２と同様の方法により、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、アミノ酸残基を順にアラニンに置換したペプチドをメンブレン上に合成したペプチドアレイを作製し、実験例２と同様にして、浮遊粒子状物質に対する結合性を評価した。以下、この評価手法を「アラニンスキャン」という場合がある。下記表１に、アラニンスキャンの代表的な結果を示す。表１中、「平均強度」は、ペプチドアレイに結合した浮遊粒子状物質の色の濃さ（シグナル強度）を数値化した値である（ｎ＝３）。
【００６０】
【表１】
2018020978.tif 000002
【００６１】
その結果、配列番号３のアミノ酸配列からなるプチドにおいて、ヒスチジン残基（Ｈ）又はチロシン残基（Ｙ）をアラニン（Ａ）に置換すると、浮遊粒子状物質に対する結合能が顕著に低下することが明らかとなった。この結果は、浮遊粒子状物質に対する結合能に、ヒスチジン残基及びチロシン残基が重要であることを示す。
【００６２】
［実験例４］
（浮遊粒子状物質結合性ペプチドのスクリーニング）
《ペプチドアレイの設計》
実験例１で得られた配列番号３、４、５及び６の４種のペプチドのアミノ酸配列に基づいて、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチドアレイを設計した。まず、上記の４種のペプチドのアミノ酸の出現回数を数えた。表２に結果を示す。
【００６３】
【表２】
2018020978.tif 000003
【００６４】
続いて、表２に基づいて、ペプチドアレイを構成するペプチドのアミノ酸出現頻度を決定した。具体的には、ペプチドの多様性を確保するために、表２において出現回数が０であったアミノ酸について０．５を加えた。
【００６５】
続いて、各アミノ酸の出現回数を百分率で表し、ペプチドアレイを構成するペプチドのアミノ酸出現頻度とした。表３に、設計したアミノ酸出現頻度（％）を示す。
【００６６】
【表３】
2018020978.tif 000004
【００６７】
続いて、表３に示すアミノ酸出現頻度を有し、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチドを約３００種類設計した。各ペプチドの長さは１２アミノ酸とした。続いて、実験例２と同様にして、設計したペプチドを有するペプチドアレイを作製した。
【００６８】
《浮遊粒子状物質結合性ペプチドのスクリーニング》
続いて、実験例２と同様にして、浮遊粒子状物質に対する結合性を評価した（以下、「１回目のスクリーニング」という場合がある。）。
【００６９】
続いて、１回目のスクリーニングの結果、浮遊粒子状物質に対する結合能が高かった上位２０個のペプチドについて、上述したものと同様にしてアミノ酸の出現頻度を解析した。続いて、得られたアミノ酸出現頻度を有し、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチドを約３００種類設計した。各ペプチドの長さは１２アミノ酸とした。続いて、実験例２と同様にして、設計したペプチドを有するペプチドアレイを作製した。続いて、実験例２と同様にして、浮遊粒子状物質に対する結合性を評価した（以下、「２回目のスクリーニング」という場合がある。）。
【００７０】
続いて、２回目のスクリーニングと同様の操作をもう一度繰り返した（以下、「３回目のスクリーニング」という場合がある。）。
【００７１】
図２は、１〜３回目のスクリーニングの結果をまとめたグラフである。より詳細には、各スクリーニングの結果得られたペプチドの浮遊粒子状物質に対する結合能を、配列番号５のペプチドの浮遊粒子状物質に対する結合能を１００とした場合の相対値としてそれぞれ算出し、更に結合能の相対値毎にペプチドの出現頻度を示した結果である。
【００７２】
その結果、２回目のスクリーニングで得られたペプチドは、１回目のスクリーニングで得られたペプチドよりも浮遊粒子状物質に対する結合能が向上したことが明らかとなった。また、３回目のスクリーニングにおいて、ペプチドの浮遊粒子状物質に対する結合能の向上が、ほぼ飽和したことが明らかとなった。
【００７３】
下記表４に、３回のスクリーニングの結果得られたペプチドのうち、浮遊粒子状物質に対する結合能が高かった上位２０個のペプチドのアミノ酸配列を示す。表４中、「相対結合能」は、配列番号５のペプチドの浮遊粒子状物質に対する結合能を１００％とした場合の結合能の相対値を示す。また、「ラウンド」は、そのペプチドが何回目のスクリーニングで得られたかを示す。なお、配列番号１及び２のペプチドは、上位２０位よりも下位の反応性を有するペプチドとして同定された。配列番号１のペプチドの相対結合能は９０.９％であり、配列番号２のペプチドの相対結合能は１０２.２％であった。
【００７４】
【表４】
2018020978.tif 000005
【００７５】
［実験例５］
（特定の無機元素を含有する浮遊粒子状物質に特異的に結合するペプチド配列の検討）
配列番号１〜６のペプチド及び対照として配列番号７のペプチドを有するペプチドアレイに、実験例２と同様にして浮遊粒子状物質を結合させた。
【００７６】
続いて、各ペプチドのスポットを切り出し、各ペプチドに結合した浮遊粒子状物質に含まれる無機元素の単位面積当たりの質量をＩＣＰ−ＭＳ（誘導結合プラズマ質量分析計）により測定した。ここで、比較のために、メンブレンのみ（対照）を切り出した試料も作製した。
【００７７】
より具体的には、まず、各スポットを切り出し、それぞれ新しいチューブに入れた。続いて、各チューブに、純水２５０μＬ、王水（濃塩酸と濃硝酸とを３：１の体積比で混合したもの）５００μＬ及び過酸化水素水５００μＬを添加した。続いて、各チューブを１２０℃で３時間半加熱した。続いて、各チューブを常温に冷却してろ過した。続いて、回収したろ液中の無機元素の単位面積当たりの質量をＩＣＰ−ＭＳ（型式「７７００ｘ」、アジレント・テクノロジー社製）を用いて測定した。
【００７８】
無機元素としては、マグネシウム（Ｍｇ）、アルミニウム（Ａｌ）、バリウム（Ｂａ）、カルシウム（Ｃａ）、鉄（Ｆｅ）、鉛（Ｐｂ）マンガン（Ｍｎ）、チタン（Ｔｉ）、銅（Ｃｕ）、カリウム（Ｋ）、ニッケル（Ｎｉ）、亜鉛（Ｚｎ）、クロム（Ｃｒ）、ランタン（Ｌａ）、イットリウム（Ｙ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、コバルト（Ｃｏ）について測定した。
【００７９】
図３（ａ）〜（ｅ）は、各スポット中の無機元素の代表的な測定結果を示すグラフである。図３（ａ）はＣｏの測定結果であり、図３（ｂ）はＣｕの測定結果であり、図３（ｃ）はＰｂの測定結果であり、図３（ｄ）はＮｉの測定結果であり、図３（ｅ）はＺｎの測定結果である。
【００８０】
その結果、配列番号１及び２のペプチドに結合した浮遊粒子状物質は、他のペプチドと比較して、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｂ、Ｎｉ等の無機元素の含有量が特に高い傾向にあることが明らかとなった。また、配列番号２のペプチドに結合した浮遊粒子状物質は、他のペプチドと比較して、Ｚｎの含有量が特に高い傾向にあることが明らかとなった。
【００８１】
なお、配列番号１及び２のペプチドに結合した浮遊粒子状物質のスポットの色は褐色である傾向にあり、配列番号３〜７のペプチドに結合した浮遊粒子状物質のスポットの色は灰色である傾向にあった。
【００８２】
以上の結果は、配列番号１又は２のペプチドを用いて浮遊粒子状物質を検出することにより、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｂ、Ｎｉ又はＺｎの含有量が高い浮遊粒子状物質を検出することができることを意味する。
【００８３】
中でも、Ｃｏ及びＣｕは、環境省  水・大気環境局が制定した「微小粒子状物質（ＰＭ２．５）の成分分析ガイドライン」（平成２３年７月）において、微小粒子状物質の成分分析にあたり測定の実施が望まれる実施推奨項目として記載された元素に含まれる元素である。配列番号１及び２のペプチドは、Ｃｏ及びＣｕの含有量が高い浮遊粒子状物質を検出することができるため特に有用性が高い。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明によれば、浮遊粒子状物質に対する特異的な結合能を有するペプチドを提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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