(57)【要約】【課題】  流体中に含まれるサブビジブル凝集体に相当する粒子（具体的には、直径が０．１から数μｍの粒子）を精度よく分離および検出できる装置を提供すること。【解決手段】  粒子を含む分散液をキャピラリー管に導入し、当該キャピラリー管からの前記粒子の排出時間から、粒子をその径に基づき分離する装置において、前記キャピラリー管の前にシース液を導入する手段をさらに備えることで、前記課題を解決する。【選択図】  図１
2018089576.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子を含む分散液をキャピラリー管に導入し、当該粒子をその径に基づき分離する装置であって、
前記キャピラリー管の前にシース液を導入する手段をさらに備えた、前記装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流体中に含まれる粒子をその径に基づき分離する装置に関する。特に本発明は、液体中に含まれる直径が０．１μｍから数μｍの粒子をその径に基づき分離する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品用途で用いる抗体は通常、当該抗体を発現可能な細胞を培養後、得られた培養液を遠心分離、濾過、カラムクロマトグラフィーなどの精製操作を行ない製造する。その際、得られた前記抗体を含む溶液中には、当該抗体の凝集体が含まれている可能性がある。抗体凝集体は免疫原性を有するおそれがあるため、特に医薬品用途で用いる場合、当該凝集体を精度よく検出し、抗体を含む溶液中に当該凝集体を極力含まないように製造する必要がある。一般に抗体凝集体の評価はサイズ排除クロマトグラフィーや光遮蔽粒子計数法で評価されているが、サブビジブル（ｓｕｂｖｉｓｉｂｌｅ）凝集体といわれる、直径が０．１μｍから２μｍ程度の凝集体は前記手法では原理的に検出不能である。
【０００３】
サブビジブル凝集体を検出する装置として、レーザ回折・散乱法を利用した装置であるＡｇｇｒｅｇａｔｅｓ  Ｓｉｚｅｒ（島津製作所製）や、共振式質量測定法を利用した装置であるＡｒｃｈｉｍｅｄｅｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）が市販されている。しかしながら、これらの装置も検出再現性が悪いという問題点があり、抗体凝集体の評価装置として確立されていない。
【０００４】
この他、直径数μｍ程度のポリマービーズや細胞などを分級可能な方法としては、キャピラリー管を用いた方法（特許文献１）や、マイクロ流路を用いた方法（特許文献２）が知られている。
また流路の流れと垂直の方向（流路断面が円形の場合、半径方向に等しい）では、分散液中に含まれる各粒子が、その粒径に基づき整列することが知られている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表平５−５０２７１７号公報
【特許文献２】特開２００５−２０５３８７号公報
【特許文献３】特開２００５−２０５３８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、流体中に含まれるサブビジブル凝集体に相当する粒子（具体的には、直径が０．１μｍから数μｍの粒子）を精度よく分離および検出できる装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、キャピラリー管を備えた粒子分離装置において、前記キャピラリー管の前にシース液を導入する手段をさらに備えることで、キャピラリー管を備えた粒子分離装置による、サブビジブル凝集体に相当する粒子の精度良い分離を実現した。
【０００８】
すなわち本発明は、
粒子を含む分散液をキャピラリー管に導入し、当該粒子をその径に基づき分離する装置であって、
前記キャピラリー管の前にシース液を導入する手段をさらに備えた、前記装置である。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
キャピラリー管内の流れによる、径に基づく粒子分離は、ＤｉＭａｒｚｉｏおよびＧｕｔｔｍａｎ（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，７，２６７（１９６９））により、以下の２つの要因に依ることが示されている。
（１）大きな粒子は、小さな粒子ほどにはキャピラリー内壁に接近することができないため、大きな粒子はキャピラリー半径方向の中心付近に小さな粒子は断面の外側に偏在すること。
（２）キャピラリー管を通過する流体により生じる半径方向の速度特性により、粒子がそれぞれ異なった速度で移動可能であること。
そのため、大きな粒子は概して分散媒の平均速度より速い速度で移動し、より速い速度の流体流線の見本となる。
【００１０】
ＤｉＭａｒｚｉｏらの知見に基づき、Ｄｏｓ  Ｒａｍｏｓらは、直径が０．１μｍから数μｍの粒子をキャピラリー管に導入し、当該キャピラリー管からの前記粒子の排出時間から、径に基づく粒子分離を評価している（特表平５−２０２７１７号公報）。しかしながら本発明者らが検討した結果、径の小さい粒子における前記キャピラリー管からの排出時間が非常にばらつき、径の大きい粒子における前記キャピラリー管からの排出時間と重なったため、径に基づく精度良い分離が困難なことが判明した。
【００１１】
前記結果は、径の小さい粒子がキャピラリー管の断面（半径方向）の外側付近に十分に偏在せずキャピラリー管の断面（半径方向）の中心付近にも分散したことが原因と考えられたため、導入した粒子をキャピラリー管の半径方向に整列させる方法を検討した。その結果、キャピラリー管の前にシース液を導入すると、キャピラリー管に導入した粒子が小さいほど当該管内壁に押し付けられ、キャピラリー管の半径方向に前記粒子が整列することが判明した。その理由として、粒子を含む分散液が流れる流路に、層流となるようシース液を連続的に導入すると、流路の径が細い部分では、前記分散液は流路壁（キャピラリー管）へほぼ接しながら流れることが要因と考えられる。
【００１２】
本発明の装置における分離対象粒子は、試料および分散液に対し不溶性の物質からなる粒子であれば特に限定はなく、一例としてビーズ、粉砕用ボール、液晶用スペーサー、クロマトグラフィー用分離剤、吸着剤といった工業材料や、細胞、ＤＮＡ、抗体などのタンパク質、ウイルスといった研究用・医療用材料があげられる。
【００１３】
抗体などタンパク質の大きさ（粒径）は一般に数ｎｍ程度であるが、製造工程で機械的または熱ストレスなどにさらされると凝集し、不溶化するおそれがある。不溶化したタンパク質の大きさ（粒径）は数十ｎｍから数十μｍ程度である。数十ｎｍ程度の不溶化タンパク質であれば、従来のカラムクロマトグラフィー法や超遠心分離法で分離・除去することができる。しかしながら粒径０．１μｍから２μｍ程度のサブビジブル（ｓｕｂｖｉｓｉｂｌｅ）凝集体に該当する不溶化タンパク質は、前述した方法では精度よく分離することができなかった。本発明の装置は、サブビジブル凝集体であっても精度よく分離できるため、抗体などタンパク質の凝集体の分離や除去を精度よく実施できる。
【００１４】
本発明の装置に備えたキャピラリー管に導入する分散液は、分離する粒子に応じ、適宜当該粒子に対し不溶性の液体を選択すればよい。例えば分離する粒子が工業材料の場合、製造時用いた溶媒をそのまま用いてもよいし、水などの安価かつ無害な溶媒に置換してもよい。一方、分離する粒子が細胞、ウイルス、抗体といった生体試料の場合は、製造時または調製時に用いた溶媒を用いると好ましい。具体的には分離する粒子が細胞の場合、当該細胞の生存を担保する点で、培養に用いた培地、全血、血漿、生理食塩水、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）などが好ましい。なお、分散液および／またはシース液に界面活性剤、タンパク質、ｐＨ調製剤、安定剤、増粘剤、保存剤、抗生物質、ポリマー、モノマーなどの添加物を添加してもよい。これら添加物により、液体の粘性を変えたり、非ニュートン性流体にすることで、キャピラリー管内の速度分布を変化させ、本発明の装置による粒子分離能を高めることができる。
【００１５】
本発明の装置に備えたキャピラリー管の内径は、分離する粒子径の大きさに応じ、適宜選択すればよいが、通常は、分散液中に含まれる粒子の最大径（直径）の５倍から５０倍までの間とするとよく、２０倍から３０倍までの間とすると好ましい。具体例として、分散液中に含まれる粒子の径が０．１μｍから２μｍの場合、キャピラリー管４０の内径は１０μｍから１００μｍまでの間とすればよく、４０μｍから６０μｍまでの間とすると好ましい。
【００１６】
キャピラリー管の形状および断面に特に限定はなく、形状としては直線状、曲線状、管状、面状などが、断面としては円形、楕円形、矩形、多角形、台形などが、それぞれあげられるが、断面形状は円形とした方が、耐圧の点および入手しやすさの点で好ましい。なお内面に様々な修飾が施されたキャピラリー管が市販されているが、分離したい粒子によりこのような修飾を施したキャピラリー管を適宜選択してもよい。
【００１７】
キャピラリー管の材質は、分散液および分離対象粒子に対して不活性（すなわち、分散液に対して不溶性であり、かつ分離対象粒子との反応や吸着を起こさない）であればよく、さらに数ＭＰａ以上の耐圧性を持つ材質が好ましい。好ましい材質のキャピラリー管として、ポリイミドで被覆したフューズドシリカ（ｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ）管、ＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）樹脂製のキャピラリー管、融解石英などのガラス製キャピラリー管、ステンレスなどの金属製キャピラリー管が例示できる。なおコイル状にまとめられる材質を用いると、キャピラリー管の占有スペースが抑えられる点で好ましい。
【００１８】
キャピラリー管の長さは、要求する粒子の分離（分画）度合に応じて適宜決定すればよいが、一般には１０ｃｍから５０ｍまでの間、好ましくは１ｍから３０ｍまでの間である。ただし細い内径のキャピラリー管を用いる場合、送液ポンプの送液限界圧力の関係上、短くする必要がある。またキャピラリー管を直列および／または並列に複数備える態様であってもよい。
【００１９】
本発明の装置で分離した粒子の検出は、分離する粒子の性状に応じ、適宜選択すればよい。一例として、分離する粒子が、タンパク質、細胞やポリマービーズの場合、特定波長（例えば、２５４ｎｍや２８０ｎｍ）の吸収を検出する、ＵＶ検出器を用いることができる。なお分離対象粒子が蛍光色素や発光色素などで染色されている場合は、当該蛍光や発光を検出可能な検出器を用いてもよい。また粒子の通過を検出可能な装置（フローサイトメーターやコールターカウンターなど）や粒子の径を計測可能な装置（パーティクルカウンターなど）を用いて検出してもよい。さらに本発明の装置による分析結果に基づき、所望の径を有した粒子の分離・採取・除去も行なえる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のキャピラリー管を備えた粒子分離装置は、前記キャピラリー管の前にシース液を導入する手段をさらに備えていることを特徴としている。本発明により、試料中に含まれる粒子（特に直径が０．１μｍから数μｍである、サブビジブル凝集体に相当する粒子）をその径に基づき、精度よく分離（分級）することができる。
【００２１】
また本発明の装置は、粒子をその径に基づき流路中央部へ移動させることができるため、粒子分離に必要な流路を短くできる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の装置の一態様を示した図である。
【図２】図１に示す装置における、流路合流部５１周辺の分散液１１およびシース液１２の流れ、および径に基づく各粒子７１・７２の整列を示した図である。
【図３】本発明の装置の別の態様における、流路合流部５１周辺の分散液１１およびシース液１２の流れ、および径に基づく各粒子７１・７２の整列を示した図である。
【図４】本発明の装置に備えたキャピラリー管４０内で生じる、粒径に基づく各粒子７１・７２の分離を示した図である。
【図５】図１に示す本発明の装置を用いて粒子（直径０．１μｍおよび／または１μｍの粒子）を分離した際、得られたクロマトグラムである。
【図６】比較例で用いた装置を示した図である。
【図７】図６に示す装置を用いて粒子（直径０．１μｍおよび／または１μｍの粒子）を分離した際、得られたクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、図面を用いて本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明の装置の一態様を図１に示す。図１に示す粒子分離装置１００は、
粒子を含む試料を導入するためのインジェクター（試料導入手段）３０と、
粒子を含む試料を希釈し、粒子を分散させるための分散液１１、およびその送液ポンプ２１と、
粒子をその径に基づき分離させるためのキャピラリー管４０と、
分離した粒子を検出するための検出器６０と、
を備えており、さらに、
シース液１２およびその送液ポンプ２２を、その流路がインジェクター３０とキャピラリー管４０との間に設けた流路合流部５１で連通するよう、備えている。なお図１に示す粒子分離装置１００には、この他に、補給液１３およびその送液ポンプ２３を、その流路がキャピラリー管４０と検出器６０との間に設けた流路合流部５２で連通するよう、備えているが、これは検出器６０内の流路配管内径がキャピラリー管４０の内径より大きく、検出器６０内の流路配管で粒子が再混合することを防ぐ目的で備えている。
【００２５】
図１に示す粒子分離装置１００を用いた粒子分離は、具体的には、以下に示す流れで実施される。
（ｉ）インジェクター３０を用いて、粒子を含む試料を、分散液１１が流れる流路に導入する。
（ｉｉ）流路合流部５１で、粒子を含む分散液が流れる流路にシース液１２が合流する。前記粒子はシース液１２の押しつけ効果により、管壁から中心に向かって小さい粒子から大きい粒子の順に整列する（図２）。
【００２６】
（ｉｉｉ）径の大きさに基づき粒子が整列した状態で、粒子を含む分散液がキャピラリー管４０に導入される。キャピラリー管４０内は管壁から中心に向かって溶離液の速度勾配があるため、前記整列した粒子はその径の大きさに基づき排出時間に差が生じる（図４）。そのため当該排出時間の違いにより、径に基づく粒子の分離（分級）が可能となる。
（ｉｖ）キャピラリー管４０から排出された粒子は、流路合流部５２で流量調製用の補給液１３の供給を受けた後、検出器６０で検出する。検出器６０からの出力は、Ａ／Ｄコンバーターを介してコンピュータ（図示せず）に取り込むことで、コンピュータによる解析を行なった後、クロマトグラムとして出力する。
【００２７】
ポンプ２１・２２・２３は微小流量（例えば０．００１ｍＬ／ｍｉｎから０．５ｍＬ／ｍｉｎ）を正確に送液可能なポンプであれば特に限定はなく、一例としてＤＰ−８０２０（東ソー製）やＮＰＬ−５２００（日本精密科学製）などの高速液体クロマトグラフ用ポンプがあげられる。このうちＤＰ−８０２０は３０ＭＰａまで使用可能であり、流速は０．００１ｍＬ／ｍｉｎから５ｍＬ／ｍｉｎまで調整可能である。
【００２８】
インジェクター（試料導入手段）３０は、微小試料（例えば、０．１μＬから１０μＬ）を導入可能かつ、高速液体クロマトグラフなど耐圧性を必要とするシステム内で使用可能なインジェクターであれば特に限定はなく、一例としてＲｈｅｏｄｙｎｅ社製のＭｏｄｅｌ  ７５２０があげられる。Ｍｏｄｅｌ  ７５２０は導入試料量として、０．２μＬ、０．５μＬ、１μＬおよび５μＬのサンプル・ループが選択可能なインジェクターである。
【００２９】
ここで前記（ｉｉ）に記載の、流路合流部５１における粒子の整列について、図２を用いて詳細に説明する。粒子を含む分散液１１は流路合流部５１でポンプ２２によって供給されるシース液１２と層流を形成する。分散液中の粒子のうち、径の大きな粒子７２と径の小さな粒子７１はシース液１２により流路壁面に押し付けられるが、径の大きな粒子７２は径の小さな粒子７１と比較し、立体反発があるため流路の中央に寄る。結果、粒子は分散液（およびシース液）の流れに対し垂直な方向（管の半径方向）に粒子径の大きさごとに整列する。
【００３０】
なお図１に示す粒子分離装置１００は、流路合流部５１において流路の片側から分散液１１を送液しているが、分散液１１（およびインジェクター３０で導入した試料）が流れる流路を流路合流部５１手前で分岐させることで、流路合流部５１において流路の両側から分散液１１を送液する態様としてもよい。前記態様における流路合流部５１周辺の分散液１１およびシース液１２の流れ、ならびに粒径に基づく各粒子７１・７２の整列を図３に示す。図３に示す態様は、粒子を含む分散液の液量が多い場合でも、粒子分離能の低下を防ぐことができる。
【００３１】
次に前記（ｉｉｉ）に記載のキャピラリー管４０中での粒子の分離について、図４を用いて詳細に説明する。ＤｉＭａｒｚｉｏおよびＧｕｔｔｍａｎが論文（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，７，２６７（１９６９））中で説明しているように、キャピラリー管４０を通過する液体には当該管の中心を頂点とした流速分布が形成される。そして図２および図３に示すように、径の大きな粒子７２はキャピラリー管４０の中央に、径の小さな粒子７１はキャピラリー管４０の壁面に、それぞれ整列しているため、径の大きな粒子７２は径の小さな粒子７１よりも速くキャピラリー管４０内を移動する。結果、前記移動時間の違いにより、径に基づく粒子の分離（分級）が可能となる。
【００３２】
前記（ｉｖ）では、前記（ｉｉｉ）で径に基づき分離された粒子を、検出器６０で検出するが、キャピラリー管４０と検出器６０とを直結すると、一般に検出器６０内のセルおよび当該セルまでの流路配管の内径はキャピラリー管４０よりも大きいため、セル内または当該セルまでの流路配管内で、分離された粒子が再混合する。そこで、検出器６０の前（図１では流路合流部５２の位置）に補給液を供給する系（図１では補給液１３およびポンプ２３）を備えることで、前記粒子の再混合を抑え、検出器６０で得られるピークの拡散を防止する。補給液を導入する系に特に限定はなく、図１に示す系でもよく、特表平５−５０２７１７号公報に開示の系でもよい。なお検出器６０内のセルおよび当該セルまでの流路配管の内径がキャピラリー管４０よりも小さい場合は、前記粒子の再混合はないため、補給液を供給する系を備える必要はない。また補給液１３は、分散液１１およびシース液１２と同じ溶液を使用すればよい。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１  本発明の装置を用いた粒子分離
本実施例で用いた本発明の装置を図１に示す。図１に示す本発明の装置１００のうち、分散液１１、シース液１２および補給液１３としては純水を、ポンプ２１・２２としてはＤＰ−８０２０（東ソー製）を、ポンプ２３としてはＮＰＬ−５２００（日本精密科学製）を、インジェクター３０としてはＲｈｅｏｄｙｎｅ社製Ｍｏｄｅｌ  ７５２０（０．２μＬのサンプル・ループを使用）を、キャピラリー管４０としては内径５０μｍ、長さ１０ｍの融解石英製キャピラリー管（ＳＧＥ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製）を、検出器６０としてはＵＶ検出器ＵＶ−８０２０（東ソー製）を、それぞれ用いた。なおポンプ２１・２２の流速は０．０１ｍＬ／ｍｉｎ、ポンプ２３の流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎであり、ポンプの圧力が安定した後、試料を導入した。
【００３５】
試料としては下記（Ａ）から（Ｃ）のいずれかを用い、インジェクター３０を用いて粒子分離装置１００へ０．２μＬ導入した。検出器６０による検出は２５４ｎｍにおける吸収を用い、検出器６０からの出力をコンピュータに取り込み、クロマトグラムを作成した。
（Ａ）直径０．１μｍの１ｗｔ％単分散ラテックス溶液（ＪＳＲライフサイエンス製）を純水で１００倍希釈した溶液（粒子０．０１ｗｔ％含有）
（Ｂ）直径１μｍの１ｗｔ％単分散ラテックス溶液（ＪＳＲライフサイエンス製）を純水で１００倍希釈した溶液（粒子０．０１ｗｔ％含有）
（Ｃ）直径０．１μｍの１ｗｔ％単分散ラテックス溶液（ＪＳＲライフサイエンス製）と直径１μｍの１ｗｔ％単分散ラテックス溶液（ＪＳＲライフサイエンス製）とを１：１で混合後、純水で５０倍希釈した溶液（０．１μｍ粒子０．０１ｗｔ％、１μｍ粒子０．０１ｗｔ％含有）
得られたクロマトグラムを図５に示す。試料（Ａ）（直径０．１μｍの粒子）を導入したときは、導入後３００秒付近にメインピークを確認した。試料（Ｂ）（直径１μｍの粒子）を導入したときは、導入後２２０秒付近に単一ピークを確認した。試料（Ｃ）（直径０．１μｍの粒子と直径１μｍの粒子との混合物）を導入したときは、導入後２４０秒後付近に直径１μｍの粒子に相当するピークを、導入後３００秒後から３５０秒後の範囲に直径０．１μｍの粒子に相当するピークを確認し、かつ両ピークは明確に分離していた。以上の結果から、図１に示す本発明の装置１００を用いることで、直径０．１μｍの粒子と直径１μｍの粒子とを明確に分離できることがわかる。
【００３６】
比較例１
本比較例で用いた粒子分離装置を図６に示す。図６に示す粒子分離装置１００は、図１に示す粒子分離装置１００からシース液導入手段（図１におけるシース液１２およびその送液ポンプ２２）を省いた態様である。分散液１１、補給液１３、ポンプ２１・２３、インジェクター３０、キャピラリー管４０、検出器６０は実施例１と同じものを用いた。なおポンプ２１の流速は０．０２ｍＬ／ｍｉｎ、ポンプ２３の流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎであり、ポンプの圧力が安定した後、試料を導入した。試料は実施例１と同じものを用い、実施例１と同様な方法で検出し、クロマトグラムを作成した。
【００３７】
得られたクロマトグラムを図７に示す。試料（Ａ）（直径０．１μｍの粒子）を導入したときは、導入後７０秒から１１０秒の範囲にピークを確認した。試料（Ｂ）（直径１μｍの粒子）を導入したときは、導入後６５秒付近に単一ピークを確認した。試料（Ｃ）（直径０．１μｍの粒子と直径１μｍの粒子との混合物）を導入したときは、導入後６５秒後付近に直径１μｍの粒子に相当するピークを、導入後８５秒後付近に直径０．１μｍの粒子に相当するピークを確認したが、両ピークは導入後７５秒後付近で重なっており、明確な分離が確認できなかった。以上の結果から、シース液導入手段を備えないと、直径０．１μｍの粒子と直径１μｍの粒子との明確な分離ができないことがわかる。
【符号の説明】
【００３８】
１００：粒子分離装置
１１：分散液
１２：シース液
１３：補給液
２１、２２、２３：ポンプ
３０：インジェクター（試料導入手段）
４０：キャピラリー管
５１、５２：流路合流部
６０：検出器
７１：径の小さな粒子
７２：径の大きな粒子
【図１】
2018089576.tif 000003
【図２】
2018089576.tif 000004
【図３】
2018089576.tif 000005
【図４】
2018089576.tif 000006
【図５】
2018089576.tif 000007
【図６】
2018089576.tif 000008
【図７】
2018089576.tif 000009