(57)【要約】      （修正有）【課題】ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート）受容体の機能低下による認知機能の低下を改善するプロポリス組成物の提供。【解決手段】好ましくはミセル化抽出物が、水素結合し得る複数個のＯＨ基含有媒体に可溶のプロポリス成分であるプロポリスのミセル化抽出物を有効成分とする認知機能の改善剤。更に好ましくは、プロポリス成分が、プロポリス片又はプロポリス粉末を、ポリオール・脂肪酸エステル系界面活性剤が均一溶解或いは安定分散された水素結合し得る複数個のＯＨ基含有媒体中に存在させ、50〜100℃の温度条件で混合撹拌することで得られたものである。プロポリスのミセル化抽出物は、そのまま用いる又は、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口剤に製剤化して経口的投与する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロポリスのミセル化抽出物を有効成分とする認知機能の改善剤。
【請求項２】
ミセル化抽出物が、水素結合し得る複数個のＯＨ基含有媒体に可溶のプロポリス成分である請求項１に記載の認知機能の改善剤。
【請求項３】
プロポリス成分が、プロポリス片またはプロポリス粉末を、ポリオール・脂肪酸エステル系界面活性剤が均一溶解もしくは安定分散された水素結合し得る複数個のＯＨ基含有媒体中に存在させ、50〜100℃の温度条件で混合撹拌することで得られたものである請求項２記載の認知機能の改善剤。
【請求項４】
認知機能が、ＮＭＤＡ受容体の機能低下によるのである請求項１〜３に記載の認知機能の改善剤。
【請求項５】
請求項１〜４に記載の認知機能の改善剤を含有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロポリスのミセル化抽出物を有効成分とする認知機能の改善剤、より詳しくは低下した認知機能の改善するプロポリスのミセル化抽出物の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知機能とは、理解力、判断力、計算力、見当識、実行機能などの能力を指し、記憶も、認知機能のひとつある。
一方、グルタミン酸は、脳内で働く興奮性の神経伝達物質である。そして、グルタミン酸の受容体の一つにＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート）受容体がある。
ＮＭＤＡ受容体は、記憶・学習機能に関わる生体分子であり、その拮抗薬が記憶・学習障害を引き起こすことが知られている（非特許文献１）。
統合失調症やアルツハイマー病では、記憶・学習機能障害といった認知機能の障害が発症するが、ＭＫ−８０１(ジゾシルピン Dizocilpine)などのＮＭＤＡ拮抗薬が投与されたマウスは、認知機能障害の疾患モデル動物であることが知られている（特許文献１）。
【０００３】
プロポリスは、ミツバチが樹木の特定の部位から採集した物質に、ミツバチ自身の蜜蝋などの分泌物を混合して作った樹脂状固形物質であり、多彩な生物活性が知られている（非特許文献２）。また、プロポリスやそのアルコール抽出物が末梢神経障害の予防・治療に有用であること（特許文献２）、水抽出プロポリスが投与されたラット脳内のコリンアセチルトランスフェラーゼの発現を上昇させモーリス水迷路試験による学習・記憶力を向上させた（非特許文献３）、エタノール抽出プロポリスの粉末を添加した餌を摂食させた高ホモステイン血症モデルマウスでの認知障害を抑制した（非特許文献４）、マウスにおいてプロポリスの水溶性誘導体がスコポラミン誘発性の記憶障害を改善した（非特許文献５）などの報告がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO2005/080976
【特許文献２】特開2005-60242
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Brain Research Reviews, 41,268-287,2003.
【非特許文献２】Biotherapy,14,991-998,2000
【非特許文献３】医学と生物学,145(3),39-44,2002.
【非特許文献４】第66回日本栄養・食糧学会大会講演要旨集,172(2Q-03a),2012.
【非特許文献５】Pharmacology, Biochemistry and Behavior 90 (2008) 441-446.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
平成24年度において、65歳以上の、高齢者の認知症有病者数は約462万人と推計され、認知症の前段階である軽度認知障害（MCI）の有病者数は約400万人と推計されている。認知症の患者本人に加えて、介護をする家族、また社会的な負担も大きい。このような負担を減じるためには、認知症の治療も重要であるが、発症を遅らせる予防的な観点で有用な健康食品を明確にすることも重要である。予防的に医薬品を投与することは、現状では世界のいずれの国でもほとんど認められていない。これは、医薬品が多少なりとも副作用を持つことから、疾病を発症していない人に対しての投与について課題があること、さらに、医療費の観点からも前向きな検討が難しいと考えられているからである。
医薬品ではなく天然物由来で永年利用している食品・飲料の中に、認知症など神経疾患や加齢から生じる認知機能の低下を予防するものが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記のような事情に鑑み、薬物として古くから利用され、近年は栄養補助食品として日常の健康管理、さらには炎症・肝疾患、癌などの予防・治療補助目的で用いられるプロポリスに着目した。
プロポリスは、樹脂状固形物質であり、食品などにする場合、プロポリスをエタノールなどのアルコール、水、エチレングリコール、グリセリンなどのポリオールといった溶媒により抽出した抽出物が使用される。
水および／またはポリオールと乳化剤からなる混合物を溶媒として抽出したミセル化抽出物は、アルコール、水のそれぞれにより抽出される成分の両成分をより多く含有していることが特徴である。
【０００８】
本発明者らは、ＮＭＤＡ受容体の阻害薬による認知機能の低下したマウスにおいて、プロポリスのミセル化抽出物の経口投与により認知機能が回復すること、プロポリスのミセル化抽出物は、プロポリスの水抽出物に比して、認知機能の改善効果がより高まることを見出した。結果、プロポリスのミセル化抽出物は、認知機能の回復をより高めた改善剤としての発明を完成した。
【０００９】
本発明に用いられるプロポリスは、特に限定されないが、クマル酸類、カフェ酸エステル類、テルペン類な豊富なプロポリスがよく、例えば、ブラジル産プロポリスが好ましい。ブラジル産プロポリスとして、主な基原植物がキク科植物アレクリン（Baccharis dracunculifolia）であるグリーンプロポリスと称されるプロポリスが挙げられる
【００１０】
本発明に用いられるプロポリスのミセル化抽出物は、特公平4-66544に記載されている「水素結合し得る複数個のＯＨ基含有媒体に可溶のプロポリス成分」である。
水素結合し得る複数個のＯＨ基含有媒体とは、例えば、グリセリン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリンのアルキレンオキサイド付加物、エチレングリコールのアルキレンオキサイド付加物、プロピレングリコールのアルキレンオキサイド付加物、グルコノデルタラクトン、Ｄ−キシロース、Ｄ−ソルビツト液、グルコン酸液、シヨ糖水溶液、水などを挙げることができる。
【００１１】
上記のＯＨ基含有媒体可溶プロポリス成分は、プロポリス片またはプロポリス粉末を、ポリオール・脂肪酸エステル系界面活性剤が均一溶解もしくは安定分散された水素結合し得る複数個のＯＨ基含有媒体中に存在させ、50〜100℃の温度条件で混合撹拌することで得られたものである。
【００１２】
上記のポリオール・脂肪酸エステル系界面活性剤は、例えば、グリセリン＝モノラウラート、グリセリン＝モノオレアート、グリセリン＝モノリノラート、グリセリン＝モノリシノラートなどのグリセリンの脂肪酸エステル；ジグリセリン＝モノラウラート、テトラグリセリン＝モノラウラート、テトラグリセリン＝モノオレアート、ペンタグリセリン＝モノパルミタート、デカグリセリン＝セスキイソステアラートなどのポリグリセリンの脂肪酸エステル；プロピレングリコール＝モノラウラート、プロピレングリコール＝モノオレアート、プロピレングリコール＝モノリノラート、プロピレングリコール＝モノリシノラートなどのプロピレングリコールの脂肪酸エステル；ソルビタン＝モノラウラート、ソルビタン＝ジラウラート、ソルビタン＝モノオレアート、ソルビタン＝ジオレアート、ソルビタン＝モノリノラート、ソルビタン＝ジリノラート、ソルビタン＝モノリシノラート、ソルビタン＝ジリシノラートなどのソルビタンの脂肪酸エステル；シヨ糖＝モノラウラート、シヨ糖＝ジラウラート、シヨ糖＝モレオレアート、シヨ糖＝ジオレアート、シヨ糖＝モノリノラート、シヨ糖＝ジリノラート、シヨ糖＝モノリシノラート、シヨ糖＝ジリシノラート、などのシヨ糖の脂肪酸エステル；大豆油レシチンなどのレシチンが挙げられる。また、それらの使用は、１種であつてもよく、また２種以上を同時に用いてもよい。
【００１３】
プロポリスのミセル化抽出物を薬剤の認知機能の改善剤として利用する場合、当該抽出物をそのまま用いてもよく、また、錠剤，散剤、顆粒剤、カプセル剤などの経口剤に製剤化して経口的に投与してもよい。
経口剤は、必要に応じて結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味剤などを加え錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤を常法により製造することができる。
また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、安定化剤などを添加することができる。
【００１４】
プロポリスのミセル化抽出物の投与量は、疾患、症状、年齢、併用される治療的措置などにより異なるが、経口剤としてヒトに投与する場合は、抽出物として0.1〜10mg/kgを1日1回〜数回に分けて投与すればよい。
【００１５】
プロポリスのミセル化抽出物を、該抽出物含有した飲食品にすることもできる。ここで、「飲食品」とは、飲食品全般を意味するが、いわゆる健康食品を含む一般食品の他、厚生労働省の保健機能食品制度に規定された特定保健用食品や栄養機能食品などの保健機能食品をも含むものであり、更にサプリメント、飼料、食品添加物等も本発明の飲食品に包含される。
プロポリスのミセル化抽出物を飲食品に使用するには、そのまま、または種々の栄養成分とともに加工肉、清涼飲料などの飲食品の原料に混ぜて飲食品を製造することができる。
また、付属成分として、麦芽糖、ブドウ糖、デキストリン、ゼラチンなどの増量剤、ソルビン酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、各種ビタミン類などの保存安定剤を含有していてもよい。
また、プロポリスのミセル化抽出物を健康食品、栄養補助食品などとして使用する場合、例えば慣用の手段を用いて、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、懸濁剤、シロップ剤などの形態に調製することができる。
上記の飲食品におけるプロポリスのミセル化抽出物の配合量は、添加形態及び投与形態によっても異なり広い範囲から選択できるが、通常、0.01〜10重量％配合するのが望ましい。
【発明の効果】
【００１６】
ＮＭＤＡ受容体拮抗薬で認知機能が障害されたマウスに、プロポリスのミセル化抽出物を経口投与すると、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬で低下していた認知機能が、対照とした溶媒投与マウスと同レベルまでに回復する。また、スコポラミン誘発性の記憶障害マウスにおいて、プロポリスのミセル化抽出物は、プロポリスの水抽出物に比して、より高い効果を発揮する。    
従って、プロポリスのミセル化抽出物は、ＮＭＤＡ受容体が関与する認知機能の低下を改善する医薬や飲食品または認知機能の低下を予防する医薬や飲食品として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ｙ迷路試験の結果を示す図である。図中、(a)生理食塩液＋溶媒、(b) 生理食塩液＋プロポリス、(c)MK801＋溶媒、(d)MK801＋プロポリス、＊ P<0.05 VS (a)
【図２】新規物体認知試験の結果を示す図である。図中、(a)生理食塩液＋溶媒、(b) 生理食塩液＋プロポリス、(c)MK801＋溶媒、(d)MK801＋プロポリス、＊＊ P<0.01 VS (a)
【図３】スコポラミン処理したマウスにおける新規物体認知試験の結果を示す図である。図中、A1およびA2は生理食塩液＋溶媒、B1およびB2はスコポラミン＋溶媒、C1およびC2はスコポラミン＋プロポリスのミセル化抽出物、D1およびD2は生理食塩液＋水、E1およびE2はスコポラミン＋水、F1およびF2はスコポラミン＋プロポリスの水抽出物。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
＜プロポリスのミセル化抽出物および水抽出物＞
プロポリスのミセル化抽出物は、以下の原材料から製造された日本プロポリス株式会社のミセル化抽出物を使用した。
原材料：プロポリス(ブラジル産)、グリセリン、グリセリンエステル
製造工程：原材料秤量混合⇒抽出⇒ろ過⇒殺菌⇒充填
プロポリス規格成分：200mg／mL
外観・性状：淡〜濃褐色の液体で、特有のプロポリス臭、甘味を有する。異物を認めない。
プロポリスの水抽出物は、上記の原材料の内、グリセリンおよびグリセリンエステルの代わりに水を使用して、上記の製造工程に準じて製造した物を使用した。
【００１９】
＜実験動物＞
C57BL6Jマウス (日本ＳＬＣ）を使用した。全てのマウスは、餌と水を自由に摂取させ、22±2℃、50±5%の湿度、午前7時から始まる12時間の明暗サイクルで制御された環境で飼育した。本実施例においては、C57BL6Jマウスを用いた実験動物の取り扱いは、National Institutes of Health のガイドラインに従い、富山大学動物実験委員会の許可を得た。なお、実験は富山大学動物実験委員会の指針に従って行った。
【００２０】
＜自発的交替行動の測定（Ｙ迷路試験）＞
自発的交替行動を測定するＹ迷路試験（Y-maze test）は、空間認知・記憶の指標を得る試験であり、文献（Behavioural Brain Research 180 (2007) 139-145）に記載の方法に準じた。すなわち、マウスをY字型迷路アームの１つ（40×10×12 cm）の先端に置いた後、8分間マウスを自由に行動させ、マウスが進入したアームを順番に記録した。各アームへの進入回数（total arm entries）と連続して異なるアームを選択した回数（交替行動回数: number of alternations）を記録した。交替行動率（alternation behavior (%)）を以下の式で算出した。
交替行動率（alternation behavior (%) =
[交替行動回数 (number of alternations) / 進入回数 (total arm entries)-2]×100
【００２１】
＜新奇物体認知試験)
認知能力を測定する新奇物体認知試験（Novel object recognition test）は、文献（The Journal of Neuroscience, 2005 25(7)1826-1835）に記載の方法に準じた。すなわち、連続した3日間、マウスをアクリル製の四角い箱（30×30×35 cm）で1日30分間探索させた（habituation）。4日目に、箱内に2つの物体を置きマウスを入れ、それぞれの物体にマウスがアプローチした時間と回数を10分間測定した（training）。いったんマウスをホームケージに戻し、trainingから24時間後に、一方の物体を新奇物体に変えて同様にマウスを箱に入れ、アプローチした時間と回数を10分間測定した（trial）。
【実施例】
【００２２】
実施例１
プロポリス (日本プロポリス、エスタプロント（商品名）、プロポリス 200mg/mL )を、一群6匹のマウス（8週齢、雄）にマウス一匹、1日当たり1mL/kgを７日間、毎日1回、経口投与（最終投与量200mg/kg/day）した。対照として溶媒（水、グリセリンおよびグリセリンエステルの混合物）を同様に経口投与した。プロポリスの投与を継続したまま、MK-801マレイン酸水素塩（MK-801 hydrogen maleate、Sigma-Aldrich）を生理食塩水に溶解させ、最終濃度0.03mg/mLとした、MK-801溶液をマウスに対して1日当たり10 mg/kgを14日間腹腔内投与（最終投与量0.3mg/kg/day）とした。対照として生理食塩水を同様に腹腔内投与した。次いで、7日間 MK-801を無投与でプロポリスの投与を継続した後、Ｙ迷路試験を行った。結果を図１に示す。
【００２３】
実施例２
一群6匹のマウス（8週齢、雄）を使用し、プロポリスとMK801を実施例１と同様の投与方法、投与期間で投与した後、新奇物体認知試験を行った。結果を図２に示す。
【００２４】
実施例３
ミセル化抽出プロポリス (日本プロポリス, エスタプロント (商品名), プロポリス 200mg/mL) をその溶媒 (水、グリセリンおよびグリセリンエステルの混合物) で希釈したもの (50mg/mL) を、一群4匹のマウス (8週齢、雄) に対し、1匹あたり4mL/kgで7日間、毎日1回、経口投与して、最終投与量を200mg/kg/dayとした。対照として、同量の溶媒も経口投与した。
水抽出プロポリスはプロポリスに含まれる成分の1つである3,5-ジカフェオイルキナ酸がミセル化抽出プロポリスとほぼ同等になるように調整し、これを溶媒である蒸留水で4倍に希釈した。希釈された水抽出プロポリスおよび蒸留水をミセル化抽出プロポリと同様に経口投与をした。
ミセル化抽出および水抽出プロポリスとそれらの溶媒の1日1回の投与を継続したまま、新奇物体認識試験を行った。スコポラミン[(-)-Scopolamine hydrobromide trihydrate (Scopolamine;Sigma)] を生理食塩水に溶解させ、0.1mg/mLとし、マウスに10mL/kgで腹腔内投与することで、最終投与量を1.0 mg/kgとした。新奇物体認識試験のtrainingの際に、測定の20分前にスコポラミンの投与を行い、認知機能障害を誘発させた。対照として生理食塩水を同様に腹腔内投与した。
結果を図３に示す。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
プロポリスのミセル化抽出物は、ＮＭＤＡ受容体が関与する認知機能の低下を改善する医薬や飲食品または認知機能の低下を予防する医薬や飲食品として有用である。また、プロポリスのミセル化抽出物は、認知機能の低下を改善することから、軽度認知障害の改善、高齢者うつによる認知機能低下を改善するための健康食品などとして有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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