(57)【要約】      （修正有）【課題】ＴＬＲ９を標的とする新規な抗体の提供。【解決手段】ＴＬＲ９のＮ末端を認識する抗体で、ＴＬＲ９のＮ末端が、特定のアミノ酸配列、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列；及び特定のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、Ｎ末端認識抗体は、複数の特定の配列で表されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列；及び特定の配列のいずれかで表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＬＲ９のＮ末端を認識する、抗体。
【請求項２】
ＴＬＲ９のＮ末端における１位〜３５６位の領域を認識する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＴＬＲ９のＮ末端における２４３位〜３５６位の領域を認識する、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
ＴＬＲ９のＮ末端が、以下の少なくとも１つのアミノ酸配列である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体：
（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列；及び
（ｃ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項５】
以下の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体：
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号：８で表されるアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号：２、４、６、８、及び１０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列；及び
（ｈ）配列番号：２、４、６、８、及び１０のいずれかで表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項６】
ＴＬＲ９のＮ末端が、マウスＴＬＲ９のＮ末端である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体を含む、ＴＬＲ９に関連する疾患の治療又は予防に用いられる医薬組成物。
【請求項８】
ＴＬＲ９に関連する疾患が、全身性エリテマトーデス、乾癬、又は非アルコール性脂肪性肝炎である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体を含む、ＴＬＲ９に関連する疾患の診断に用いられるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＴＬＲ９抗体、医薬組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｏｌｌ様受容体（Toll-like receptor；ＴＬＲ）は病原体センサーの一つのファミリーを形成しており、病原体成分に応答して活性化シグナルを誘導し、感染防御反応を誘導する。ＴＬＲは感染防御に重要であるばかりでなく、自己免疫疾患などの病態における炎症誘導にも関わっている。
【０００３】
約１０種類のＴＬＲのうちＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９は、細胞内小器官である小胞体に分布し、細菌やウイルス由来の核酸を認識する。ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は１本鎖ＲＮＡを認識し、ＴＬＲ９はＣｐＧモチーフを含む非メチル化１本鎖ＤＮＡ（ＣｐＧ−ＤＮＡ）を認識する。しかし、ウイルス特有の２本鎖ＲＮＡとは異なり、一本鎖ＲＮＡやＤＮＡは宿主由来の核酸と大きな違いはなく、ＴＬＲによるリガンド認識機構が厳密に制御されなければ、自己に対する反応を惹起し、自己免疫疾患に陥ってしまう。
【０００４】
この点、ＴＬＲ９による自己免疫反応は、核酸を認識する場所をエンドリソソームに限定することによって調節されている（非特許文献１）。定常時、細胞外にある自己の核酸は急速に分解されるため、細胞内のエンドリソソームには到達せず、ＴＬＲ９には認識されない。一方、微生物の核酸は、細菌の細胞壁やウイルス粒子に保護されているのでエンドリソソームに到達し、そこで初めて放出され、ＴＬＲ９に認識される。
【０００５】
これに対し、抗微生物ペプチドや自己抗体との相互作用によって自己の核酸が分解に耐性を有するようになり、エンドリソソームに到達できるようになると、ＴＬＲ９依存性自己免疫反応が引き起こされる。実際、ＴＬＲ９については、乾癬や全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus；ＳＬＥ）との関連が示唆されている（非特許文献２）。
【０００６】
したがって、ＴＬＲ９は、乾癬やＳＬＥ等のＴＬＲ９依存性自己免疫疾患の治療標的と考えられ、これまでにＴＬＲ９の発現や機能を抑制する様々な方法が提案されている。具体的には、ＴＬＲ９に対して拮抗作用を持つオリゴＤＮＡや、ＴＬＲ９の発現を抑制するマイクロＲＮＡ等を用いた方法が試みられている。しかしながら、一般に核酸医薬の安全性は未知数であり、また、ＴＬＲ９の機能を完全に抑制すると、感染症等の危険性を招く可能性も否定できない。
【０００７】
安全性及び特異性の面では抗体医薬が望ましいが、上述のとおり、ＴＬＲ９は、自己免疫反応を制限するためにエンドリソソームに局在し、細胞表面からは隔絶されており、細胞表面にのみ作用する抗体は使用できないと考えられており、ＴＬＲ９に対する抗体医薬を使用する試みはこれまでほとんどなされていない。
【０００８】
また、ＴＬＲ９の機能を発現するためには、ＴＬＲ９の細胞外ドメインがエンドリソソーム内でカテプシン等により切断されることが必要であることが報告されている（非特許文献３）。すなわち、ＴＬＲ９の機能を発現するために、主としてＴＬＲ９のＣ末端側が重要であると考えられていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Barton, G.et al. d Medzhitov, R. Nat Immunol 7, 49-56. (2006).
【非特許文献２】Lande, R. et al. Nature 449, 564-569 (2007).
【非特許文献３】Ewald, S. E. et al. The ectodomain of Toll-like receptor 9 is cleaved to generate afunctional receptor. Nature 456, 658-662 (2008)..
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＴＬＲ９を標的とする新規な抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、驚くべきことに、ＴＬＲ９から切断される、細胞外領域であるＮ末端を認識する抗体がＴＬＲ９応答抑制効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本願は以下の発明を包含する。
〔１〕  ＴＬＲ９のＮ末端を認識する、抗体。
〔２〕  ＴＬＲ９のＮ末端における１位〜３５６位の領域を認識する、〔１〕に記載の抗体。
〔３〕  ＴＬＲ９のＮ末端における２４３位〜３５６位の領域を認識する、〔１〕又は〔２〕に記載の抗体。
〔４〕  ＴＬＲ９のＮ末端が、以下の少なくとも１つのアミノ酸配列である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の抗体：
（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列；及び
（ｃ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
〔５〕  以下の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の抗体：
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号：８で表されるアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号：２、４、６、８、及び１０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列；及び
（ｈ）配列番号：２、４、６、８、及び１０のいずれかで表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
〔６〕  ＴＬＲ９のＮ末端が、マウスＴＬＲ９のＮ末端である、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の抗体。
〔７〕  〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の抗体を含む、ＴＬＲ９に関連する疾患の治療又は予防に用いられる医薬組成物。
〔８〕  ＴＬＲ９に関連する疾患が、全身性エリテマトーデス、乾癬、又は非アルコール性脂肪性肝炎である、〔７〕に記載の医薬組成物。
〔９〕  〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の抗体を含む、ＴＬＲ９に関連する疾患の診断に用いられるキット。
【発明の効果】
【００１３】
ＴＬＲ９のＮ末端側を認識する抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの骨髄由来マクロファージ（ＢＭ−ＭＣｓ）において、ＴＬＲ９アゴニストであるＣｐＧ−Ｂとともに投与した場合でもＴＬＲ９応答を阻害し、腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor；ＴＮＦ）−αの産生を抑制した。
【００１４】
また、かかる抗体のＴＬＲ９応答抑制効果はｉｎ  ｖｉｖｏでも同様に確認された。具合的には、ＴＬＲ９アゴニスト（ＣｐＧ−Ｂ及びＤ−ガラクトサミン）を投与されたマウスは、肝細胞由来マクロファージから産生されるＴＮＦαによって誘導される肝細胞アポトーシスにより個体死に至るが、かかる抗体を投与することで、血清中のＴＮＦαやＩＬ−１２ｐ４０などのサイトカインの産生が有意に抑制され、結果としてマウスの個体死が回避されることが明らかとなった。
【００１５】
これらの結果は、本発明の抗体はＴＬＲ９が異常に活性化される病態を制御し得ることを示唆している。例えば、ＳＬＥの誘導は、ＤＮＡ分解酵素遺伝子の欠損によるＤＮＡ蓄積がＤＮＡセンサーを刺激し、これによりＩ型ＩＦＮが産生されることが一因として考えられるが、本発明の抗体はＤＮＡセンサーであるＴＬＲ９を制御することができるため、ＳＬＥの治療又は予防等に使用可能であると考えられる。
【００１６】
このように、本発明に係る抗体によれば、細胞表面に存在するＴＬＲ９の機能を阻害して、ＴＬＲ９に関連する疾患を予防又は治療することが可能である。また、本発明に係る抗体は、ＴＬＲ９に対する特異性が高いため、安全性に優れる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】抗体の特異性を検証するためにマウス脾臓のcDCを用いて、TLR9の発現を明らかにした実験結果である。
【図２】脾臓cDCを用いて、TLR9の免疫沈降実験を行った結果である。
【図３】TLR9抗体（B33A4、J15A7）を用いた、染色阻害実験を行った結果である。
【図４】NaR9のTLR9応答抑制効果を検証するために、野生型マウスよりBM-MCsを誘導した実験結果である。
【図５】NaR9によるin vivoでのTLR9応答抑制効果を検証するために、CpGBとD-(+)-Galactosamineをマウスに投与する実験を行った結果である。
【図６】リガンド刺激後、１、３、６時間後の血中のTNF-αを測定した結果である。
【図７】マウスTLR9とヒトTLR9のキメラTLR9を作製したキメラTLR9である。
【図８】キメラTLR9に対するNaR9抗体の結合を調べることによってNaR9抗体のエピトープを解析した結果である。
【図９】ＮａＲ９抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１４）である。
【図１０】ＮａＲ９抗体の重鎖の塩基配列（配列番号１５）である。
【図１１】ＮａＲ９抗体の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１６）である。
【図１２】ＮａＲ９抗体の軽鎖の塩基配列（配列番号１７）である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
〔抗体〕
ＴＬＲ９の機能を発現するために、主としてＴＬＲ９のＣ末端側が重要であると考えられていたところ、本発明に係る抗体は、ＴＬＲ９のＮ末端、特にエンドリソソーム内で切断される細胞外メイン及びその周辺を認識し得る。以下、本発明に係る抗体は、「Ｎ末端認識抗体」又は「抗ＴＬＲ９抗体」ともいう。
【００１９】
本明細書において、「ＴＬＲ９のＮ末端」とは、ＴＬＲ９のタンパク質において、アミノ基が結合しておらず、かつカルボキシル基が結合しているアミノ酸単位側の構造、特に、エンドリソソーム内で切断される細胞外ドメインのうち、ＴＬＲ９のＮ末端における４４０位又は４５４位の領域より前半を意味する。なお、細胞外ドメインとは、ＴＬＲ９のＮ末端から１位〜８１８位の領域を意味する。また、「ＴＬＲ９のＣ末端」とは、ＴＬＲ９のタンパク質において、カルボキシル基が結合しておらず、かつアミノ基が結合しているアミノ酸単位側の構造、特に、ＴＬＲ９から細胞外ドメインを除いた構造を意味する。
【００２０】
ＴＬＲ９のタンパク質において、アミノ基が結合しておらず、かつカルボキシル基が結合しているアミノ酸単位を１位として、ＴＬＲ９のＮ末端からＴＬＲ９のＣ末端へ向けて、２位、３位という。
【００２１】
Ｎ末端認識抗体は、例えば、ＴＬＲ９のＮ末端における１位〜１６６位、１位〜２４２位、１位〜３０６位、１位〜３５６位、１位〜４４０位の領域を認識し、好ましくは１位〜３５６位の領域を認識し、より好ましくは１６７位〜３５６位の領域を認識し、さらに好ましくは２４３位〜３５６位の領域を認識する。
【００２２】
Ｎ末端認識抗体は、具体的に、以下の少なくとも１つのアミノ酸配列であるＴＬＲ９のＮ末端を認識する。
（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列
（ｃ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００２３】
ＴＬＲは、マウスで１２種類、ヒトで１０種類のファミリーが知られている。ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、及びＴＬＲ６は細胞表面に分布し、細菌膜成分であるリポタンパク質、ＬＰＳ等の糖脂質、フラジェリン等のタンパク質を認識する。ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９は細胞内小器官である小胞体に分布し、細菌やウイルス由来の核酸を認識する。また、ＴＬＲはＩ型の膜タンパク質で細胞外にLeucine rich repeat（ＬＲＲ）を有する。
【００２４】
Ｎ末端認識抗体は、マウスＴＬＲ９やヒトＴＬＲ９、マウス／ヒトのキメラＴＬＲ９のＮ末端を認識するが、ＴＬＲ９のＮ末端であれば特に限定されない。例えば、Ｎ末端認識抗体が認識するＴＬＲ９のＮ末端は、図７に示すマウス／ヒトのキメラＴＬＲ９のＮ末端である。
【００２５】
Ｎ末端認識抗体は、ＴＬＲ９のＮ末端を認識するものであれば特に限定されないが、例えば、以下の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列
（ｃ）配列番号：６で表されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号：８で表されるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号：１２で表されるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号：２、４、６、８、１０、及び１２のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列
（ｈ）配列番号：２、４、６、８、１０、及び１２のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００２６】
Ｎ末端認識抗体は、重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３の少なくとも１つ、好ましくは重鎖ＣＤＲ１〜３の少なくとも１つ、より好ましくは重鎖ＣＤＲ３に、上記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００２７】
本明細書において、「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含むものを意味する。アミノ酸の例としては、天然タンパク原性Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体等の化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチン等の天然非タンパク原性アミノ酸；アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物等が挙げられるがこれらに限定されない。非天然アミノ酸の例としては、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニン等）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン等）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２８】
本明細書において、「１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する」という場合、欠失、置換等されるアミノ酸の個数は、結果として得られるＣＤＲのセットが抗原認識機能を保持する限り特に限定されない。また、ここでの「複数」は、２以上の整数を意味し、好ましくは、数個例えば２〜５個、より好ましくは２個、３個、４個である。各ＣＤＲにおける欠失、置換又は付加の位置は、結果として得られるＣＤＲのセットが抗原認識機能を保持する限り、Ｎ末端でも、Ｃ末端でも、その中間であってもよい。
【００２９】
本明細書において、「配列番号：Ｘで表されるアミノ酸配列とＹ％以上の同一性を有する」とは、２つのポリペプチドのアミノ酸配列の一致が最大になるように整列（アライメント）させたときに、共通するアミノ酸残基数の、配列番号：Ｘに示す全アミノ酸数に対する割合が、Ｙ％以上であることを意味する。
【００３０】
Ｎ末端認識抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また、Ｎ末端認識抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥのいずれのアイソタイプであってもよい。
【００３１】
Ｎ末端認識抗体は、細胞表面のＴＬＲ９にそれぞれ結合してその機能を阻害する限り、マウス抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体であってもよく、低分子抗体であってもよいが、これらに限定されない。
【００３２】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＣＤＲを、ヒト抗体のＣＤＲで置換した抗体である。ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体に由来する可変領域と、ヒト抗体に由来する定常領域からなる抗体である。また、ヒト化抗体とは、ヒト以外の動物の抗体において、安全性の高い一部の領域を残して、ヒトの抗体に由来する部分を組み込んだものをいい、ヒト型キメラ抗体、及びヒト型ＣＤＲ移植抗体を含む概念である。
【００３３】
本明細書において「低分子抗体」とは、抗体の断片又は抗体の断片に任意の分子を結合させたものであって、もとの抗体と同一のエピトープを認識するものを意味する。具体的には、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１領域からなるＦａｂ；２つのＦａｂがヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結されているＦ（ａｂ´）２；ＶＬ及びＶＨからなるＦｖ；ＶＬ及びＶＨを人工のポリペプチドリンカーで連結した一本鎖抗体であるｓｃＦｖのほか、ｓｄＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃ（Ｆｖ）２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
〔抗体の作製方法〕
Ｎ末端認識抗体の作製方法は限定されないが、例えば、モノクローナル抗体は、ＴＬＲ９又はその断片で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、ＴＬＲ９はその断片で免疫した動物の血清から得ることができる。免疫に用いるＴＬＲ９の断片は、得られる抗体が細胞表面のＴＬＲ９に結合してその機能を阻害する限り特に限定されない。
【００３５】
特定のアミノ酸配列を有する抗体を作製する場合は、例えば、抗体をコードする核酸を含む発現ベクターで適当な宿主を形質転換し、この形質転換体を適当な条件で培養して抗体を発現させ、公知の方法に従って単離精製することによって、抗体を作製することができる。単離精製方法としては、例えば、プロテインＡ等を用いたアフィニティカラム、その他のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等が挙げられ、これらを適宜組み合わせることができる。
【００３６】
また、「ある抗体Ｘと同一のエピトープに特異的に結合する抗体Ｙ」は、下記のようにエピトープの配列を決定してから作製することができる。
【００３７】
例えば、多数のランダムな配列のペプチドを固相担体に固定してアレイ化し、抗体Ｘと反応させ、酵素標識２次抗体で結合を検出して、抗体Ｘが特異的に結合するペプチドのアミノ酸配列を調べ、このアミノ酸配列と抗原タンパク質のアミノ酸配列の相同性を検索することによって、抗原タンパク質上のエピトープを決定することが可能である。固相担体に固定するペプチドを、予め、抗原タンパク質の部分ペプチド群としてもよい。また、抗原タンパク質の種々の部分ペプチドの存在下で、抗体Ｘと抗原タンパク質との結合をＥＬＩＳＡ法で検出し、競合活性の有無を調べることによっても、抗原タンパク質上のエピトープを決定することが可能である。
【００３８】
エピトープの配列を決定することができれば、これに特異的に結合する抗体Ｙは、公知の方法にしたがって当業者が作製することができる。例えば、エピトープ配列を含むペプチドを固相担体に固定し、当該ペプチドと種々の抗体の結合を検出することにより、同エピトープに特異的に結合する抗体を得ることができる。
【００３９】
ここで、「種々の抗体」としては、動物を抗原タンパク質又はその部分ペプチドで免疫することによって得たものを用いてもよいし、ファージディスプレイ法によって作製した抗体ライブラリ又は抗体フラグメントライブラリを用いてもよい。ファージディスプレイ法によるライブラリを用いる場合、エピトープ配列を含むペプチドを固相担体に固定しパニングを繰り返すことによって、同エピトープに特異的に結合する抗体Ｙを得ることもできる。
【００４０】
また、ヒトキメラ抗体及びヒトＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体を産生するハイブリドーマのｍＲＮＡから抗体遺伝子をクローン化し、これをヒト抗体遺伝子の一部と遺伝子組換え技術で連結することによって作製することができる。
【００４１】
例えば、ヒト型キメラ抗体の場合、マウス抗体を産生するハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＬＨ）をＰＣＲでクローニングして配列を解析する。次に、一致率の高い抗体塩基配列から、リーダー配列を含む５’プライマーを作製し、５’プライマーと可変部３’プライマーによって上記ｃＤＮＡから、シグナル配列から可変領域の３’末端までをＰＣＲでクローニングする。一方で、ヒトＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖の定常領域をクローニングし、重鎖と軽鎖それぞれについて、マウス抗体由来可変領域と、ヒト抗体由来定常領域とをＰＣＲによるOverlapping Hanging法で連結し、増幅する。得られたＤＮＡを適当なベクターに挿入し、これを形質転換して、ヒト型キメラ抗体を得ることができる。
【００４２】
ＣＤＲ移植抗体の場合、使用するマウス抗体可変部と最も相同性の高いヒト抗体可変部を選択してクローン化し、メガプライマー法を用いた部位選択的突然変異導入により、ＣＤＲの塩基配列を改変する。なお、フレームワーク領域を構成するアミノ酸配列をヒト化すると抗原との特異的な結合ができなくなる場合には、フレームワークの一部のアミノ酸をヒト型からラット型に変換してもよい。
【００４３】
「配列番号：Ｘに示されるアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列」からなるＣＤＲや、「配列番号：Ｘで表されるアミノ酸配列とＹ％以上の同一性を有するアミノ酸配列」からなるＣＤＲは、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、チェーンシャフリング法、ＣＤＲウォーキング法などの公知の方法を用いて作製され得る。
【００４４】
これらの方法により、ファージディスプレイ法によってＣＤＲに種々の変異を有する抗体又は抗体断片をファージ表面に提示させ、抗原を使用してスクリーニングすることにより、より親和性が成熟したＣＤＲを得られることが当業者によく知られている（例えば、Wu et al., PNAS, 95:6037-6042(1998); Schier, R. et al., J. Mol. Bio. 263:551-567(1996); Schier, R. et al., J.Mol. Biol. 255:28-43(1996); Yang, W.P. et al., J. Mol. Biol., 254:392-403(1995)）。本発明は、このような方法で成熟させたＣＤＲを含む抗体も包含する。
【００４５】
その他の抗体の製造方法として、トリコスタチンＡ処理ニワトリＢ細胞由来ＤＴ４０細胞株から抗体産生株を取得するＡｄｌｉｂ法（Seo, H. et al., Nat. Biotechnol., 6:731-736, 2002）、マウス抗体遺伝子が破壊されヒト抗体遺伝子が導入されたマウスであるＫＭマウスを免疫してヒト抗体を作製する方法（Itoh,K. et al., Jpn. J. Cancer Res., 92:1313-1321, 2001;Koide, A. et al., J. Mol. Biol., 284:1141-1151, 1998）等があり、これらもＮ末端認識抗体の産生に応用することができる。
【００４６】
Ｎ末端認識抗体が低分子抗体である場合、該低分子抗体をコードするＤＮＡを用いて上記方法で発現させてもよいし、また、全長の抗体をパパイン、ペプシン等の酵素で処理して作製してもよい。
【００４７】
Ｎ末端認識抗体は、作製方法や精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が、Ｎ末端認識抗体と同等の機能を有している限り、その抗体は本発明に含まれる。例えば、Ｎ末端認識抗体を、大腸菌等の原核細胞で発現させた場合、元の抗体のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加される。しかし、本発明は、かかる抗体も包含する。
【００４８】
〔医薬組成物〕
本発明に係る医薬組成物は、Ｎ末端認識抗体を含み、ＴＬＲ９に関連する疾患の治療又は予防に用いられる。
【００４９】
ＴＬＲ９に関連する疾患の治療又は予防に用いられるか否かは、当業者が適宜決定することができる。例えば、実施例に示される方法にしたがって、（ｉ）得られた抗体が細胞表面のＴＬＲ９に結合するか否か；（ｉｉ）免疫細胞をＴＬＲ９のリガンドによって刺激しつつ、得られた抗体と接触させたときに、免疫細胞から分泌される炎症性サイトカイン量が抑制されるか否か；（ｉｉｉ）Ｂ細胞をＴＬＲ９のリガンドによって刺激しつつ、得られた抗体と接触させたときに、Ｂ細胞の増殖が抑制されるか否か；及び、（ｉｖ）炎症性疾患モデル動物に得られた抗体を投与することによって、病態が改善されるか否か、の少なくとも１つを確認することにより、ＴＬＲ９に関連する疾患の治療又は予防に用いられるかを決定できる。
【００５０】
ＴＬＲ９に関連する疾患としては、各種の自己免疫疾患（関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、多発性筋炎、シェーグレン症候群（ＳＳ）、ＡＮＣＡ関連性血管炎、ベーチェット病、川崎病、混合性クリオグロブリン血症、多発性硬化症（ＭＳ）、ギランバレー症候群、筋無力症、１型糖尿病、バセドウ病、橋本病、アジソン病、ＩＰＥＸ、ＡＰＳ  ｔｙｐｅ−ＩＩ、自己免疫性心筋炎、間質性肺炎、気管支喘息、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、アトピー性皮膚炎、溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、特発性若年性関節炎の多関節炎型等）や、移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）が挙げられる。
【００５１】
この中でも、その発症の機序に特にＴＬＲ９が関与する、ＳＬＥや乾癬、ＮＡＳＨへの用途が有望である。例えば、理論に拘束されることを意図するものではないが、Ｎ末端認識抗体は、細胞表面のＴＬＲ９を認識し、当該細胞のＴＬＲ９応答を阻害することにより、免疫の異常な活性化を抑制してＴＬＲ９に関連する乾癬の治療又は予防に寄与すると考えられる。
【００５２】
例えば、ＳＬＥやその関連疾患である全身性強皮症に対しては、従来からプレドニゾロン等のステロイド剤が用いられている。また、生物学的製剤としてＢ細胞の活性化に関わるＢリンパ球刺激因子（Ｂｌｙｓ）に対する抗体のベリムマブも用いられている。しかし、いずれも抵抗性の症例がある。したがって、このような疾患に対して、新たな分子を標的とする治療薬が求められている。
【００５３】
ここで、ＳＬＥではＩ型インターフェロン（Interferon；ＩＦＮ）を過剰に産生している。Ｉ型ＩＦＮを産生している細胞は、ｐＤＣｓ（plasmacytoid dendritic cells）であり、その産生はＤＮＡによる刺激で誘導されている。Ｎ末端認識抗体は、ｐＤＣｓに発現しているＤＮＡセンサーとしてのＴＬＲ９を治療標的とすることができるため、ＳＬＥの治療又は予防に有用である。
【００５４】
本発明に係る医薬組成物は、Ｎ末端認識抗体を有効成分として含み、薬学的に許容できる担体や添加物をさらに含む。
【００５５】
担体及び添加物の例として、水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等の薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５６】
本発明に係る医薬組成物は、様々な形態、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤等とすることができる。好ましい態様は、注射剤であり、それを非経口（例えば、静脈内、経皮、腹腔内、筋内）で投与することが好ましい。
【００５７】
本明細書において、「治療又は予防」とは、疾患の治癒や寛解に加え、発症の防止又は遅延、疾患の進行の防止又は遅延、及び疾患に関連する少なくとも１つの症状の緩和のうち、少なくとも１つを生じさせることを意味する。
【００５８】
本発明に係る医薬組成物を、哺乳類（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ウマ、サル、ブタ等）、特にヒトに投与する場合の投与量は、症状、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、有効成分の種類、製剤の種類によって異なり、特に限定されないが、例えば、３０μｇ〜１０００ｍｇ、１００μｇ〜５００ｍｇ、１００μｇ〜１００ｍｇを１回又は数回に分けて投与することができる。注射投与の場合、患者の体重により、１μｇ／ｋｇ〜５０００μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ〜３０００μｇ／ｋｇを１回又は数回に分けて投与してもよい。
【００５９】
（キット）
本発明に係るキットは、Ｎ末端認識抗体を含む。用途は特に限定されず、ＴＬＲ９の検出や、ＴＬＲ９に関連する疾患の診断に用いられる。
【００６０】
キットは、その用途に応じて試薬や、医薬組成物と同様に担体や添加物を含んでいてもよく、更には緩衝液、容器、使用説明書等を含んでいてもよい。
【００６１】
（方法）
本発明に係る方法は、Ｎ末端認識抗体を、対象に投与する工程を含む。
【００６２】
本発明に係る方法においては、Ｎ末端認識抗体を本発明に係る医薬組成物として投与することができる。
【００６３】
本発明に係る方法によれば、対象であるヒト又はその他の哺乳類等において、ＴＬＲ９に関連する疾患を治療又は予防することができる。あるいは、本発明の方法を他の用途、例えば診断に用いてもよい。
【００６４】
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
【００６６】
抗ＴＬＲ9抗体の樹立、一次免疫細胞におけるＴＬＲ9の検出、及び抗ＴＬＲ9抗体によるＴＬＲ9応答阻害実験
〔材料と方法〕
抗ＴＬＲ9モノクローナル抗体、NaR9の作製
抗マウスTLR9モノクローナル抗体を樹立するために、BALB/cバックグランドのTlr9-/-マウスにマウスTLR9を強制発現したBa/F3細胞（TLR9-Ba/F3）を腹腔内投与して免疫を行った。初回の免疫で、免疫賦活剤としてComplete Freund's adjuvant (CFA)を用いた。2回目、3回目の免疫で、免疫賦活剤としてIncomplete Freund's adjuvant (IFA)を用いた。4回目の免疫で、1(PBS (リン酸緩衝生理食塩水)で懸濁したTLR9-Ba/F3を腹腔内投与した。最後の免疫から5日後、マウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫由来細胞株SP2/Oを細胞融合した。細胞融合には石原産業株式会社より購入したセンダイウイルス由来エンベロープ蛋白（GenomeONE-CF）を用いた。TLR9抗体を産生するハイブリドーマを選択するために、TLR9-Ba/F3を用いて細胞膜透過染色を行いフローサイトメトリーにより解析した。BIO-RADより購入したMouse antibody Isotype kitを用いてNaR9のサブクラスをIgG2a/κと決定した。
【００６７】
マウス
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは日本ＳＬＣより購入した。
Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドＴＬＲ9欠損マウス（Tlr9-/-）は本研究室で樹立した。BALB/cバックグラウンドTlr9-/-マウスは日本SLCより購入した野生型BALB/cマウスと7回交配して樹立した。マウスはＳＰＦ環境にて飼育し、すべての動物実験は東京大学医科学研究所の動物実験委員会の承認を受け倫理規定に基づいて実験を行った。
【００６８】
試薬と抗体
CpGA 1585 (5'-G*G*GGTCAACGTTGAG*G*G*G*G*G-3', アスタリスクはホスホロチオエート化残基を示す)（配列番号１９）, PolyU (5'-UUUUUUUUUUUUUUUUUUU-3', すべてホスホロチオエート化残基) （配列番号２０）そして CpGB 1688 (5'-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3', すべてホスホロチオエート化残基) （配列番号１８） はファスマックにより合成された。 Loxoribine (7-allyl-7,8-dihydro8-oxo-guanosine) はEnzo Life Scienceから購入した。 Saponin と D-(+)-GalactosamineはSigma-Aldrichより購入した。 FuGene6 と DOTAP はRoche Applied Scienceより購入した。抗マウスTLR9モノクローナル抗体であるNaR9、J15A7またはB33A4は、オリエンタル酵母株式会社より購入したヌードマウスにハイブリドーマを接種後、腹水から精製された。Streptavidin-PE、anti-mouse IgG1-PE、anti-mouse IgG2a-PE、isotype control antibodies (mouse IgG1, mouse IgG2a)、anti-mouse CD16/32、anti-mouse CD19-APC-Cy7、anti-mouse CD11b-APC、anti-mouse CD11c-APC、anti-mouse CD11c-PE-Cy7、anti-mouse Siglec-H-FITC、そして anti-mouse Ly-6G-PerCP-Cy5.5 はBioLegendより購入した。 Anti-mouse B220-APC はTONBO biosciencesより購入した。 J15A7-PE、anti-mouse CD49b-BV421とanti-mouse CD11b-BV510はBD Biosciencesより購入した。
【００６９】
細胞培養
Ba/F3 細胞はRoswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium（IL-3, 10% FBS, PS/Gln そして50μM 2-ME添加）で培養された。Bone marrow-derived macrophage (BM-MCs), conventional DC (cDC) またはplasmacytoid DC (pDC) は野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはTlr9-/-マウスより誘導された。 マクロファージを誘導するために、1×107個の骨髄細胞は10cm cell culture dishes で6日間、recombinant M-CSF (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) 100 ng/mlを加えた10% FCS-RPMI1640で培養された。cDCまたはpDCを誘導するために 1×107個の骨髄細胞は10cm cell culture dishes で７日間、10 ng/mlのrecombinant GM-CSFまたは100ng/mlのFlt3-L (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA)を加えた10% FCS-RPMI1640で培養された。
【００７０】
プラスミドの構築とレトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入
マウス及びヒトTLR9の配列はPCR法によって増幅され、東京大学の北村俊雄博士より分与していただいたｐMXまたはｐMXｓレトロウイルスベクターにクローニングされた。マウスとヒトTLR９キメラ変異体は以下のものを構築した。TLR9166 (マウスTLR9が１-166、ヒトTLR9が167‐1016アミノ酸)、TLR9242(マウスTLR9が１-242、ヒトTLR9が243‐1016アミノ酸)、TLR9356(マウスTLR9が１-356、ヒトTLR9が357‐1016アミノ酸)、TLR9440(マウスTLR9が１-440、ヒトTLR9が441‐1016アミノ酸)そしてTLR9544(マウスTLR9が１-544、ヒトTLR9が545‐1016アミノ酸)はTLR9変異体のC末端側にGFPが付加するようにｐMX-GFPベクターにクローニングされた。
プラスミドは、polyethylenimine (Polysciences, Inc.)と共にPlat-Eパッケージング細胞 1×105/wellに遺伝子導入された。二日後、ウイルスを含む培養上清をDOTAPと共にBa/F3細胞に加え、2000rpmで60分間の遠心を行った。
【００７１】
脾臓免疫細胞の染色とフローサイトメトリー解析
C57BL/6N系統の野生型マウスおよびTLR9ノックアウトマウスから脾臓を採取し、スライドグラスを用いて細胞を単離した。単離した細胞を赤血球溶解バッファー（BioLegend）によって処理し、赤血球を除去した後にpurified anti-CD16/32 (BioLegend, clone 93)を用いて細胞表面のFc受容体をブロックした。
【００７２】
Fc受容体をブロックした後、Fluorescein (FITC)-conjugated anti-mouse SiglecH (BioLegend, 551)および Phycoerythrin (PE)-Cy7-conjugated anti-mouse CD11c (BioLegend, N418)によって染色し、CD11c陽性/SiglecH陽性の画分をpDCとした。また、CD11c高発現/SiglecH陰性の画分をcDCとした。
【００７３】
細胞表面のSiglecHとCD11cを染色した後、細胞表面および細胞内部のTLR9を染色した。細胞表面のTLR9を染める際には、非固定条件下でpurified anti-TLR9を反応させ、PE conjugated rat anti-mouse IgG2a (BioLegend, clone RMG2a-62)を２次抗体として用いた。細胞内部のTLR9については、BD Cytofix/Cytoperm fixatation/permeabilization solution kitを用いて染色した。これらの細胞は染色用バッファーに置換し、LSR Fortessa X-20 (BD)によって解析を行った。
【００７４】
免疫沈降およびウエスタンブロット
ＴＬＲ９のタンパク質発現をウエスタンブロットにより解析した。BM-cDCは１×ＰＢＳにより２回洗浄し、回収した。回収した細胞を氷冷した溶解用緩衝液（１％  Triton X １００，  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．４），  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  １ｍＭ  ＣａＣｌ2，  １ｍＭ  ＭｇＣｌ2，  １０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，  １ｍＭ  ＤＴＴ  及びＣｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  （Ｒｏｃｈｅ））により３０分間、溶解し、高速遠心後、細胞溶解液の上清を回収した。
【００７５】
回収した細胞溶解液を抗ＴＬＲ９モノクローナル抗体（NaR9）と結合させたＮ−ｈｙｄｒｏｘｙ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦビーズに加え、２時間、４℃で撹拌した。この工程により、ＴＬＲ９を免疫沈降した。撹拌後、ビーズを氷冷した洗浄用緩衝液（０．１％  TritonX１００、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ）で３回洗浄した。洗浄したビーズにＳＤＳサンプル緩衝液（１２５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ［ｐＨ  ６．８］，  ２０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，  ４％  ＳＤＳ，  １０％  ２−ＭＥ，  ０．００５％  ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）を加え、９６℃で５分間加熱してタンパク質を変性処理した。これら調製したサンプルはポリアクリルアミド電気泳動して、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ウエスタンブロットした。
【００７６】
ウエスタンブロットに使用した抗体は、マウスTLR9のTIRドメインをウサギに免疫し、回収した血清より精製した自家製のポリクローナル抗体を用いた。
【００７７】
統計処理
抗体によるマウス投与実験において、抗ＴＬＲ９モノクローナル抗体投与群とコントロール抗体投与群の間におけるデータの有為差検定はＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定により算定した。Ｔ検定における危険率が０．０１未満の場合、比較群間の差が優位であると判定した。
【００７８】
抗ＴＬＲ９モノクローナル抗体によるＴＬＲ９応答阻害実験
（試験管内試験）
細胞はＢＭ−ＭＣｓ、ＢＭ−ｃＤＣｓ、ＢＭ−ｐＤＣｓを用いた。９６ｗｅｌｌ平底プレートにＢＭ−ＭＣｓ、ＢＭ−ｃＤＣｓ、ＢＭ−ｐＤＣｓを５(１０4播種し、抗ＴＬＲ９抗体を各々の濃度で添加した。抗体を添加してから４時間後、ＴＬＲリガンドを藩種した培養細胞に加えた。ＴＬＲリガンド添加した２４時間後、培養上清液を回収した。回収した培養上清液はリガンド刺激によって、産生されたサイトカインを測定するためにＥＬＩＳＡ法により検出した。
（生体試験）
野生型マウスにCpGBリガンドとD-(+)-Galactosamineを同時に腹腔内投与すると10時間以内に死亡することが報告されている。（Sparwasser, T. et al. Eur J Immunol 27, 1671-1679, doi:10.1002/eji.1830270712 (1997)）野生型C57BL/6マウスに抗体またはPBS（リン酸緩衝溶液）を腹腔内投与し、15時間後、さらに CpGB 10 nmol と D-(+)-Galactosamine 20mgを腹腔内投与した。リガンド投与前と投与後、１、３、6時間後の血液を各マウスから採取し、その血清を用いてTNF-αまたはIL-12p40をELISAにて測定した。
【００７９】
抗体及びＣＤＲのアミノ酸配列及び塩基配列解析
TLR9モノクローナル抗体NaR9のアミノ酸配列は、ジーンスクリプト社によって解析された。Ambion社製TRIzol（登録商標）Reagentを用いてハイブリドーマよりトータルRNAを回収し、TAKARA社製PrimeScript（登録商標）1st Strand cDNA Synthesis Kitを用いて、cDNAへ逆転写反応を行った。このcDNAからVHとVL断片を増幅し、各断片は一般的なクローニング用ベクターにクローニングされた。大腸菌に形質転換後、コロニーPCRを行い、サイズの正しいバンドの最低５クローンからプラスミドを回収し、シークエンス解析を行った。シークエンス解析から、最もコンセンサスな配列を抗体の配列として決定した。決定した抗体の配列として、図９はＮａＲ９抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１４）であり、図１０はＮａＲ９抗体の重鎖の塩基配列（配列番号１５）であり、図１１はＮａＲ９抗体の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１６）であり、図１２はＮａＲ９抗体の軽鎖の塩基配列（配列番号１７）である。
【００８０】
〔結果〕
抗ＴＬＲ９モノクローナル抗体の樹立とＴＬＲ９の検出
一次免疫細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ）の内因性ＴＬＲ９の細胞内発現を調べるため、マウスＴＬＲ９に対するモノクローナル抗体NaR9抗体を樹立した。抗体の特異性を検証するためにマウス脾臓のcDCを用いて、ＴＬＲ9の発現を明らかにした。染色の特異性は、TLR9ノックアウトマウスの脾臓cDCが染色されないことによって確認した（図１）。さらに、BM-cDCを用いて、TLR9の免疫沈降実験を行った。以前樹立された、TLR9抗体（J15A7）と比較して、NaR9はより強くTLR9を免疫沈降することが示された（図２）。NaR9の認識部位を明らかにするために、まず、以前樹立されたTLR9抗体（B33A4、J15A7）を用いた、染色阻害実験を行った（B33A4及びJ15A7については、国際公開第２０１４／１７４７０４号公報を参照する。）。NaR9のTLR9染色は、J15A7の細胞前処理によって阻害された（図３）。同様に、J15A7のTLR9染色は、NaR9の細胞前処理によって阻害された（図３）。以上の結果より、新規に樹立されたNaR9は一次免疫細胞のTLR9を認識し、細胞染色や免疫沈降に利用できること、J15A7と抗原認識部位が近いことが判明した。
【００８１】
抗ＴＬＲ９モノクローナル抗体によるＴＬＲ９応答阻害実験（１）
NaR9のTLR9応答抑制効果を検証するために、野生型マウスよりBM-MCｓを誘導し実験に用いた。NaR9を前投与した群では、BM-MCｓでCpGBまたはCpGA応答によるTNF-α及びIL-12p40産生を抗体濃度依存的に抑制した（図４）。BM-cDCについても同様の結果が得られた（結果は示さず）。一方、TLR7リガンドのLoxoribine応答に影響はしなかった。一方、BM-pDCについてはNaR9によるTLR9応答抑制効果は見られなかった（結果は示さず）。
【００８２】
抗ＴＬＲ９モノクローナル抗体によるＴＬＲ９応答阻害実験（２）
続いて、NaR9によるin vivoでのTLR9応答抑制効果を検証するために、CpGBとD-(+)-Galactosamineをマウスに投与する実験を行った。PBSまたはIgG2aコントロール抗体を前投与した群で、リガンド刺激後１０時間内に、90％前後のマウスが死亡したのと比較して、NaR9を前投与した群は、20％まで死亡率を抑制した（図５）。さらに、リガンド刺激後、１、３、６時間後の血中のTNF-αを測定した結果、IgG2aコントロール抗体投与群と比較して、NaR9抗体投与群では、有意にサイトカイン産生を抑制していた（図６）。
【００８３】
NaR9、可変領域のアミノ酸配列解析
ハイブリドーマ株NaR9から得られるモノクローナル抗体の重鎖アミノ酸配列を配列番号：１４に、軽鎖アミノ酸配列を配列番号：１６に示す。また、これらのアミノ酸配列に対応する塩基配列を配列番号１５、１７に示す。
また、同抗体の重鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号：２、４、６に、軽鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を配列番号：８、１０、１２に示す。また、これらのアミノ酸配列に対応する塩基配列を配列番号３、５、７、９、１１、１３に示す。
【００８４】
NaR9の抗原認識部位解析
NaR9の抗原認識部位を決定するために、マウスTLR9とヒトTLR9のキメラTLR9を発現する細胞株を作製した。マウスTLR9は配列番号：１に示すＴＬＲ９のアミノ酸１位から544位（TLR9544）、１位から４５４位（TLR9454）、１位から３５６位（TLR9356）、及び１位から２４２位（TLR9242）までとし、C末端側をヒトTLR9の配列でそれぞれ作製し（図７）、細胞株に発現させ、各キメラTLR9とNaR9との結合をフローサイトメトリーで測定した。
結果を図８に示す。TLR9242にはNaR9が結合しなかったが、TLR9356には結合したことから、NaR9は、ＴＬＲ９のアミノ酸配列の２４３位から３５６位の領域付近にエピトープを有すると考えられた。
【配列表フリーテキスト】
【００８５】
配列番号：１は、マウスＴＬＲ９のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２は、ＮａＲ９抗体の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号：３は、ＮａＲ９抗体の重鎖ＣＤＲ１の塩基配列を表す。
配列番号：４は、ＮａＲ９抗体の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号：５は、ＮａＲ９抗体の重鎖ＣＤＲ２の塩基配列を表す。
配列番号：６は、ＮａＲ９抗体の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号：７は、ＮａＲ９抗体の重鎖ＣＤＲ３の塩基配列を表す。
配列番号：８は、ＮａＲ９抗体の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号：９は、ＮａＲ９抗体の軽鎖ＣＤＲ１の塩基配列を表す。
配列番号：１０は、ＮａＲ９抗体の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１１は、ＮａＲ９抗体の軽鎖ＣＤＲ２の塩基配列を表す。
配列番号：１２は、ＮａＲ９抗体の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１３は、ＮａＲ９抗体の軽鎖ＣＤＲ３の塩基配列を表す。
配列番号：１４は、ＮａＲ９抗体の重鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１５は、ＮａＲ９抗体の重鎖の塩基配列を表す。
配列番号：１６は、ＮａＲ９抗体の軽鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１７は、ＮａＲ９抗体の軽鎖の塩基配列を表す。
配列番号：１８は、ＣｐＧＢのＤＮＡ配列を表す。
配列番号：１９は、ＣｐＧＡのＤＮＡ配列を表す。
配列番号：２０は、ＰｏｌｙＵのＲＮＡ配列を表す。
【図１】
2018090534.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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