(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト及びその他哺乳類における安全で効果的な膵リパーゼ阻外、並びに、眼の酸化ストレス低減及び／又はドライアイ改善のための組成物及び方法の提供。【解決手段】眼の酸化ストレス及び／又はドライアイを改善するためのルテイン含有組成物。投与対象の血中における好中球率の上昇、リンパ球率の低下、好中球数の上昇、ＺＴＴの低下、クレアチニンの低下、又はカリウムの上昇のために用いる組成物。ルテインを重量比１〜５０％の量で含有する組成物。一日当り、１０〜２０００ｍｇを対象に、少なくとも８週間投与される方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼の酸化ストレス及び／又はドライアイを改善するためのルテイン含有組成物。
【請求項２】
ルテインを重量比１％〜５０％の量で含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
さらに投与対象の血中における、好中球率の上昇、リンパ球率の低下、好中球数の上昇、ＺＴＴの低下、クレアチニンの低下、またはカリウム上昇のために用いることを特徴とする、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
一日あたり１０〜２０００ｍｇの範囲で対象に投与されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも８週間対象に投与されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
経口投与されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、眼の酸化ストレス低減及び／又はドライアイ改善のためのルテイン含有組成物及び方法に関する。また本発明は、当該ルテイン含有組成物が対象の血液成分を変化させる効果に関する。さらに本発明は、膵リパーゼを安全且つ効果的に阻害するために有効な組成物及びその使用、並びにその組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ルテインは、眼の中の水晶体や黄斑部などにもともと存在しており、ほうれん草やブロッコリーなどの緑黄色野菜に多く含まれる成分である。
【０００３】
日常生活において、光、特に青色光と紫外線により、眼は特に活性酸素の害を受けやすいが、眼細胞が光による酸化ダメージを受ける危険性が生じた場合でも、抗酸化作用によってこれを防止することができる。
【０００４】
一方、食物脂肪の消化と吸収は、脾臓トリグリセリドリパーゼ（ＰＴＬ）及び小さなタンパク質補助因子であって食物中の脂質を効率的に加水分解するために膵リパーゼによって必要とされるコリパーゼの働きによって調節される。当該酵素及び補助因子は、脾臓から十二指腸へと分泌される。ＰＴＬはヒトの十二指腸において食物中の脂質分子を加水分解し、トリグリセリドをモノグリセリドと遊離脂肪酸に変換する主要なリパーゼである。結果物であるモノマー（２分子の遊離脂肪酸及び１分子の２−モノアシルグリセロール）は、ミセルに封じられ、その後乳糜管と呼ばれる特別な管によってリンパ系に吸収される。膵リパーゼファミリーに属するコリパーゼは、リパーゼの非触媒ドメインに結合し、安定性と結合サイトの疎水性を高める。コリパーゼは、リパーゼによって触媒される食物中の長鎖トリグリセリドの加水分解に対する様々な食物中の因子の阻害効果を抑える。
【０００５】
食物中の脂肪の消化及び吸収のメカニズムをブロックすることは、肥満の管理において利用されてきた。Ａｌｌｉというブランド名で処方箋なしで買えるテトラヒドロリポスタチン（Ｏｒｌｉｓｔａｔ／Ｘｅｎｉｃａｌ）およびその希釈物によるＰＴＬ活性の阻害は、肥満の薬物療法に広く使用されてきた。テトラヒドロリポスタチンを基礎とした製品は安全で効果的であると臨床的に証明されてきた一方、その治療においては幾つかの既知の副作用と潜在的な副作用が存在する。
【０００６】
当該医薬の主要な副作用は、消化管に関連しており、脂肪便（大腸に到達した未吸収の脂肪に起因する過剰量の腸管の腐敗物および腸内ガスを含む、油状のゆるい糞便）、便失禁、頻回の排便および急な排便を含む。テトラヒドロリポスタチンの潜在的な臓器毒性は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって示唆されてきた。２０１０年５月２６日、ＦＤＡはテトラヒドロリポスタチンを基礎とした医薬に対し、この医薬の使用によって稀に報告される肝障害の事象についての新しい安全情報を含む改定ラベルを承認した（非特許文献１）。
【０００７】
テトラヒドロリポスタチンの使用は、急性腎障害の特殊な症例に結びつく。これはおそらく膵リパーゼの過剰な阻害の結果である脂肪の吸収不良に起因するものである。脂肪の吸収不良により、カルシウムと共に脂肪酸のアルカリ塩（ｓｏａｐ）が形成され、遊離シュウ酸塩の吸収が増加し、高シュウ酸尿（症）となることが分かっている（非特許文献２）。
【０００８】
テトラヒドロリポスタチンにより、脂溶性ビタミン及び他の脂溶性栄養素の吸収が減弱することがあるので、テトラヒドロリポスタチン治療の間は、その治療より起こるビタミン欠乏症を防ぐため、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ及びベータカロチンを含むマルチビタミンサプリメントを一日一回摂取すべきである。
【０００９】
また、テトラヒドロリポスタチンの体重減少メカニズムでは、治療効果が不十分であることが知られている。それは数週間の治療後に起こる食欲増進と時間依存的な医薬の有効性の消失を含む。ある研究では、テトラヒドロリポスタチンを投与されている対象においては、満腹の知覚が有意に減少し、同時に、当該研究対象においてＣＣＫ、ＰＹＹ及びＧＬＰ−１のような循環型満腹ホルモン（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｓａｔｉｅｔｙ  ｈｏｒｍｏｎｅ）が有意に減少した（非特許文献３）。
【００１０】
このように、現世代の膵リパーゼインヒビターは、潜在的に深刻な副作用を有しており、また当該インヒビターの有効性は、長期間使用するうちに減少する傾向にある。即ち、速成耐性および食欲増進により、体重減少の可能性を減退させてしまうのである。  
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／Ｄｒｕｇｓ／ＤｒｕｇＳａｆｅｔｙ／ＰｏｓｔｍａｒｋｅｔＤｒｕｇＳａｆｅｔｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｆｏｒＰａｔｉｅｎｔｓａｎｄＰｒｏｖｉｄｅｒｓ／ｕｃｍ２１３０３８．ｈｔｍ
【非特許文献２】Ｆｉｌｉｐｐａｔｏｓ  ＴＤ，  Ｄｅｒｄｅｍｅｚｉｓ  ＣＳ，  Ｇａｚｉ  ＩＦ，  Ｎａｋｏｕ  ＥＳ，  Ｍｉｋｈａｉｌｉｄｉｓ  ＤＰ，  Ｅｌｉｓａｆ  ＭＳ．  Ｏｒｌｉｓｔａｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ．  Ｄｒｕｇ  Ｓｕｆ  ２００８；３１（１）：５３−６５）．
【非特許文献３】Ｅｌｌｒｉｃｈｍａｎｎ  Ｍ，  Ｋａｐｅｌｌｅ  Ｍ，  Ｒｉｔｔｅｒ  ＰＲ，  Ｈｏｌｓｔ  ＪＪ，  Ｈｅｒｚｉｇ  ＫＨ，  Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＷＥ，  Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｆ，  Ｍｅｉｅｒ  ＪＪ  Ｏｒｌｉｓｔａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｌｉｐａｓｅ  ａｃｕｔｅｌｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ａｐｐｅｔｉｔｅ  ａｎｄ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１−（７−３６）−ａｍｉｄｅ−１，  ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ，  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＹＹ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２００８  Ｏｃｔ；９３（１０）：３９９５−８．  Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｊｕｌ  ２２．
【非特許文献４】Ｂａｄｍａｅｖ  Ｖ，  Ｍａｊｅｅｄ  Ａ，  Ｃｏｎｔｅ  Ａ，  Ｐａｒｋｅｒ  ＪＥ．  Ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ  Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ  （Ｃｏｌｅｕｓ  ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ，  Ｂｅｎｔｈ．）：  Ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｎｅｗ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｆｏｒ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｌｅａｎ  ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ．ＮｕｔｒａＣｏｓ  Ｖｏｌ．１，  Ｎｏ．２（Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ）；２００２．
【非特許文献５】Ｇｏｄａｒｄ  ＭＰ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＢＡ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  ＳＲＢｏｄｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｏｒｍｏｎａｌ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｏｂｅｓｅ  ｍｅｎ．  Ｏｂｅｓ  Ｒｅｓ２００５  Ａｕｇ；１３（８）：１３３５−４３．
【非特許文献６】Ｄｕａｎ  ＲＤ，  Ｅｒｌａｎｓｏｎ−Ａｌｂｅｒｔｓｓｏｎ  Ｃ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｏｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｌｉｐａｓｅ  ａｎｄ  ｃｏｌｉｐａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  １９９２  Ａｕｇ；２７（８）：６４４−８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、眼の酸化ストレス低減のため及び／又はドライアイの改善のための組成物及び方法を提供することである。また本発明のさらなる目的は、対象の血液成分に対して有用な効果を有する組成物を提供することである。
【００１３】
また、本発明の目的は、ヒト及びその他哺乳類における安全で効果的な膵リパーゼの阻害のための方法及び組成物、並びに当該組成物の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、マリーゴールドエキス由来のルテイン含有組成物を対象に投与することにより、眼の酸化ストレス低減、及びドライアイの改善がもたらされることを見出した。また本発明者らは、当該組成物が投与対象の血液成分の有意な変化をもたらすことを見出した。
【００１５】
また本発明者らは、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ  ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ、本明細書においてＣＦとも呼ぶ。）、サラシア・レティキュラータ（Ｓａｌａｃｉａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ、本明細書においてＳＲとも呼ぶ。）及びゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ、本明細書においてＳＩとも呼ぶ。）の抽出物が、それぞれ膵リパーゼ阻害活性を有することを見出した。更にこれら抽出物のうちの一つ以上を含む組成物が、安全且つ効果的に膵リパーゼを阻害することをも見出し、本発明を完成した。
【００１６】
すなわち、本発明は、ルテイン含有組成物、並びにＣＦ抽出物、ＳＲ抽出物及びＳＩ抽出物のうちの一つ以上を含む組成物を提供する。また、本発明は、上記組成物を栄養学的及び／又は薬理学的有効量でヒト及びその他哺乳類に投与する方法も提供する。本発明は、さらに上記組成物の製造方法も提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明者らは、本発明のルテイン含有組成物により眼の酸化ストレスが低減されることを見出した。また、当該ルテイン含有組成物によりドライアイが改善されることをも見出した。
【００１８】
さらに本発明者らは、鋭意検討の結果、本発明のルテイン含有組成物を投与された対象の血中において、好中球率の上昇、リンパ球率の低下、好中球数の上昇、ＺＴＴの低下、クレアチニンの低下、またはカリウム上昇が起こることを見出した。即ち、本発明のルテイン含有組成物は、低い好中球率、高いリンパ球率、低い好中球数、高いＺＴＴ値、高いクレアチニン濃度、または低いカリウム濃度を示す疾患の予防若しくは治療またはそれら疾患により引き起こされる症状の緩和に用いることができる。そのような疾患としては、例えば好中球減少症、細菌感染症、ウイルス感染症、再生不良性貧血、巨赤芽球性貧血、肝硬変、リンパ腫、急性・慢性リンパ球性白血病、バセドウ病（グレーヴス病）、クローン病、結核、百日咳、流行性耳下腺炎、梅毒などの慢性感染症、慢性肝炎、自己免疫性肝炎、肝硬変、肝細胞がん、慢性炎症、膠原病、結核、骨髄腫、急性・慢性腎炎、腎不全、尿毒症、腎盂腎炎、腎臓結石、肝硬変、心不全、原発性アルドステロン症、アルカローシス、バセドウ病、クッシング症候群、甲状腺機能亢進症等が挙げられる。
【００１９】
すなわち本発明は、ルテインを含む組成物を提供する。また本発明は、当該組成物を栄養学的及び／又は薬理学的有効量でヒト及びその他哺乳類に投与する方法も提供する。
【００２０】
また本発明により、膵リパーゼを安全且つ効果的に阻害するために有効なＣＦ抽出物、ＳＲ抽出物及びＳＩ抽出物のうちの一つ以上を含む組成物が提供される。本発明の組成物を対象に投与することにより、当該対象の内臓脂肪、肝臓脂肪、トリグリセリド、食欲、カロリー摂取量、体脂肪率、体重、胴囲及び／若しくは血中の脂質の減少並びに／又は速成耐性の防止が達成される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＣＦ抽出物（Ｃ．Ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ  ９８％又は４０％）、ＳＲ抽出物（Ｓａｌａｃｉａ）又はＳＩ抽出物（Ｓｅｓａｍｉｎ  ７０％）を各々単独で用いた場合の膵リパーゼ活性の阻害率を表すグラフである。
【図２】ＳＲ抽出物（Ｓａｌａｃｉａ）とＣＦ抽出物（Ｃ．Ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ  ９８％又は４０％）、又は、ＳＲ抽出物（Ｓａｌａｃｉａ）とＳＩ抽出物（Ｓｅｓａｍｉｎ  ７０％）をそれぞれ組み合わせた場合の膵リパーゼ活性の阻害率を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の一実施形態においては、本発明のルテイン含有組成物は、眼の酸化ストレスを低減するため及び／又はドライアイを改善するための栄養学的及び／又は薬理学的有効量で投与される。
【００２３】
一実施形態においては、本発明のルテイン含有組成物は、対象の血中における、好中球率の上昇、リンパ球率の低下、好中球数の上昇、ＺＴＴの低下、クレアチニンの低下、またはカリウム上昇のために投与される。
【００２４】
一実施態様において、本発明の組成物に含まれるルテインは、マリーゴールドから抽出することができる。
【００２５】
一実施態様において、本発明の組成物は、ルテインを特定の濃度で含んでいてもよい。例えば、本発明の組成物は、ルテインを重量比１％〜５０％、好ましくは５％〜４５％の量で含有する。
【００２６】
一実施態様において、本発明の組成物は、ルテインとして一日あたり１０〜２０００ｍｇの範囲で対象に投与することができる。好ましくはルテインとして一日あたり２０〜２００ｍｇの範囲で対象に投与することができる。
【００２７】
また本発明は、ヒト又はその他哺乳類における、臓器に過剰に蓄積した消化性脂肪酸（肝臓脂肪）、内臓脂肪（腹部脂肪）及び抹消組織の白色（貯蔵）脂肪の安全で効果的なコントロールを達成するために、膵リパーゼ活性を阻害する方法及び組成物を提供する。また、当該組成物の製造方法も提供する。
【００２８】
本発明の組成物は、それぞれフォルスコリンについて標準化されたＣＦ抽出物、α−グルコシダーゼ及びα−アミラーゼを５０％阻害（ＩＣ５０）するように標準化されたＳＲ抽出物、並びにセサミンについて標準化されたＳＩ抽出物からなる群から選択された一つ以上の抽出物を含む。
【００２９】
一実施態様において、本発明の組成物は、ＣＦ抽出物、ＳＲ抽出物及びＳＩ抽出物のうちの一つ以上を特定の濃度で含んでいてもよい。例えば、本発明の組成物は、約１％〜９８％のフォルスコリンを含有するように標準化されたＣＦ抽出物、α−グルコシダーゼを０．１〜２００μｇ／ｍｇの濃度で５０％阻害し、且つα−アミラーゼを０．１〜１００μｇ／ｍｇの濃度で５０％阻害するように標準化されたＳＲ抽出物、及び約４０％〜９０％のセサミンを含有するように標準化されたＳＩ抽出物のうちの一つ以上を含有する。前記ＣＦ抽出物は、より好ましくは４０％〜９８％の範囲でフォルスコリンを含有するように標準化される。前記ＳＲ抽出物は、より好ましくはα−グルコシダーゼを０．５〜１５０μｇ／ｍｇの濃度で５０％阻害し、且つα−アミラーゼを０．５〜５０μｇ／ｍｇの濃度で５０％阻害するように標準化される。前記ＳＲ抽出物は、さらにより好ましくはα−グルコシダーゼを１〜７５μｇ／ｍｇの濃度で５０％阻害し、且つα−アミラーゼを１〜３５μｇ／ｍｇの濃度で５０％阻害するように標準化される。前記ＳＩ抽出物は、より好ましくは６０％〜８０％の範囲でセサミンを含有するように標準化される。これらの抽出物の好ましい比（重量比）は、ＣＦ抽出物  ２〜３０：ＳＲ抽出物  ０．２５〜３：ＳＩ抽出物  ０．０２５〜０．３であり、より好ましくは、ＣＦ抽出物  ５〜１５：ＳＲ抽出物  ０．５〜１．５：ＳＩ抽出物  ０．０５〜０．１５であり、更に好ましくは、ＣＦ抽出物  １０：ＳＲ抽出物  １：ＳＩ抽出物  ０．１である。
【００３０】
ここで前記ゴマ抽出物は、いかなるゴマから抽出されたものでもよい。例えば、白ゴマ、黒ゴマ、金ゴマ、茶ゴマなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明の組成物は、室温で、相対湿度約６０〜８０％で保存されるのが好ましい。また、相対湿度約７０％で保存されるのがより好ましい。
【００３２】
本発明の組成物は、経口、舌下、又は非経口的に局所投与され得るが、経口投与が好ましい。経口投与の場合、本発明の組成物は、適切な賦形剤と共にカプセル剤、錠剤、水分散性パウダー、又は飲料の形状で提供され得る。クリーム若しくはローション形状で局所に使用される場合、又は経皮的に適用する場合、本発明の組成物は０．１％〜１５％の範囲の濃度の適切な賦形剤と共に適用される。賦形剤は、薬学的に許容される賦形剤であればよく、例えば、着色剤、矯味剤、保存剤、安定化剤、酸化防止剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明の一実施形態においては、本発明の組成物は内臓脂肪（肝臓脂肪を含む）及び体脂肪を減少させるための栄養学的及び／又は薬理学的有効量で投与される。これは、膵リパーゼ活性の継続的（速成耐性の防止）且つ安全な阻害（膵リパーゼ活性の穏やかな阻害）をもたらすためである。
【００３４】
本発明のＣＦ抽出物、ＳＲ抽出物及びＳＩ抽出物のうちの一つ以上を含む組成物は、栄養学的及び／又は薬理学的有効量で、例えば一日あたり１０〜２０００ｍｇの範囲で投与することができる。好ましくは、約８３２．５〜１６６５ｍｇの範囲で投与することができる。一日あたりの投与量は、好ましくは２回以上、さらに好ましくは２回又は３回に分けて投与される。また投与は、好ましくは食事の１５分〜１時間前、より好ましくは食事の３０分前に行われる。この場合、一回の投与量は、好ましくは１０〜１０００ｍｇ／回、より好ましくは約２７７．５ｍｇ〜約５５５ｍｇ／回である。
【００３５】
また、本発明のＣＦ抽出物、ＳＲ抽出物及びＳＩ抽出物のうちの一つ以上を含む組成物は、栄養補助食品として、好ましくは、体重あたり５〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、１２〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲の量を毎日経口投与することができる。
【００３６】
さらに、本発明のＣＦ抽出物、ＳＲ抽出物及びＳＩ抽出物のうちの一つ以上を含む組成物は、例えば維持投与量として、一日単回投与を行うことができる。維持投与量は、好ましくは、一日あたり３０．８ｍｇ〜５５５ｍｇの範囲であり、より好ましくは、一日あたり１００ｍｇ〜４００ｍｇの範囲であり、最も好ましくは、一日あたり２００ｍｇ〜３００ｍｇである。
【００３７】
また、一実施態様においては、本発明の組成物は、生物学的反応を修飾する量のゴマ抽出物と、コレウス・フォルスコリ抽出物またはサラシア・レティキュラータ抽出物を組み合わせたものである。これにより、膵リパーゼ活性の過剰で非生理学的な阻害とその潜在的な副作用を防止することができる。
【００３８】
また、別の実施態様においては、本発明の組成物は、臨床的有効量のコレウス・フォルスコリ抽出物、生物学的に無視できる（無症状の）量のサラシア・レティキュラータ抽出物を組み合わせたものである。これにより、速成耐性が防止される。
【００３９】
上述の実施態様において、好ましいコレウス・フォルスコリ抽出物の臨床的有効量は、０．１〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜１００μｇ／ｍｌの範囲であり、サラシア・レティキュラータ抽出物の生物学的に無視できる（無症状の）量は、０．０１〜１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜１０μｇ／ｍｌの範囲であり、ゴマ抽出物の生物学的反応を修飾する量は、０．１〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜１００μｇ／ｍｌの範囲である。
【００４０】
上述のような投与方法により、本発明の組成物は、現世代の膵リパーゼインヒビターが有する欠点及び副作用の無い、安全なものとして、膵リパーゼを効率的に阻害するために提供される。そして、老齢の対象において本発明の組成物の作用メカニズムが減退することを防ぎ、過剰で非生理学的な膵リパーゼ活性の阻害を防ぐことができる。
【００４１】
特定の論理に拘束されることはないが、本発明の組成物の作用メカニズムは、減退した食欲によって表される食後のグレリン反応を阻害するものである。グレリンは、上昇した血漿レプチンレベルと関連するホルモン物質である。この組み合わされた作用は膵リパーゼの生産と分泌を低下させる。本発明の組成物は膵リパーゼとも直接作用し、コリパーゼを阻害して、ＰＴＬ酵素の活性化を抑える。
【００４２】
また、本発明は、コレウス・フォルスコリ、サラシア・レティキュラータ及びゴマから本発明の組成物を製造する方法をも包含する。
【００４３】
以下、本発明を実施例に基づき、より具体的に説明する。ただし、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
１．ルテイン含有組成物の調製
ルテイン含有組成物として、１カプセルあたり、ルテイン２０％  ５０．０ｍｇ、中性脂肪酸トリグリセリド  ８９．０ｍｇ、及びミツロウ  １１．０  ｍｇ（計１５０ｍｇ）を含有するルテイン含有カプセルを調製した。
【００４５】
２．ルテイン含有組成物の臨床試験
本試験は、目の乾きを自覚している３０歳以上４９歳以下の日本人男女を対象とした。具体的には男性４名、女性１１名、４１．６±５．８歳であった。対象は、１日当たり２カプセルを朝食前、夕食前に１カプセルずつ摂取した。摂取期間は８週間とし、摂取前と摂取後に以下の定量、測定を行った。
【００４６】
酸化ストレス度を評価するために、シルマー試験紙を用いて、試験紙に付着した両目の涙液に含まれる酸化ストレス物質（８−ヒドロキシデオキシグアノシン）を定量した。
【００４７】
ドライアイの評価として、涙液層破壊時間（ｔｅａｒ  ｆｉｌｍ  ｂｒｅａｋ−ｕｐ  ｔｉｍｅ；ＢＵＴ）検査を行った。具体的には、フルオレセインの点眼後、瞬きを禁じて角膜表面の涙液層が破壊されるまでの時間を細隙灯で観察し、涙液保持力を測定した。
【００４８】
試験結果の解析は、対応のあるｔ検定を用いて摂取前と摂取８週後の測定値を比較した。集計単位は平均値と標準偏差とした。
統計解析は両側検定で行うものとし、統計解析においては、有意水準を５％とし、両側検定で有意確率５％未満（ｐ＜０．０５０）を有意差あり、５％以上１０％未満（ｐ＜０．１００）を傾向差ありと判定した。統計解析はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７  およびＩＢＭ  ＳＰＳＳ  ｖｅｒ１８．０を用いた。
【００４９】
またカプセル摂取前および摂取８週後に以下の項目について血液検査を行った。
検査項目：
（ｉ）  血液学検査：  白血球数、赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット値、血小板数、ＭＣＶ（平均赤血球容積）、ＭＣＨ（平均赤血球色素量）、ＭＣＨＣ（平均赤血球色素濃度）、白血球像
（ｉｉ）  生化学検査：ＡＳＴ（ＧＯＴ）、ＡＬＴ（ＧＰＴ）、γ−ＧＴＰ、ＡＬＰ、ＬＤ  （ＬＤＨ）、ＬＡＰ、総ビリルビン、直接ビリルビン、間接ビリルビン、コリンエステラーゼ、ＺＴＴ、総蛋白、尿素窒素、クレアチニン、尿酸、ＣＫ、ナトリウム、カリウム、クロール、カルシウム、無機リン、血清鉄、血清アミラーゼ、総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、トリグリセリド（ＴＧ：中性脂肪）、遊離脂肪酸、グルコース
【００５０】
３．ルテイン含有組成物の臨床試験結果
本試験では、ルテイン含有組成物の摂取による酸化ストレス低減効果を涙液中の８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ；  ８−ＯＨｄＧ）分泌量を測定することで検証した。紫外線や青色光の刺激を受けると眼組織が損傷し８−ＯＨｄＧを含めた酸化ストレス物質を生じる。８−ＯＨｄＧは生体におけるＤＮＡ酸化ストレスマーカーである。
【００５１】
８−ＯＨｄＧは、ルテイン含有組成物の摂取前から摂取８週後にかけて有意に低下した（表１）。８−ＯＨｄＧの低下により、ルテイン含有組成物の酸化ストレス低減効果が示された。
【００５２】
【表１】
2018024649.tif 000002
【００５３】
この結果からルテイン含有組成物の継続摂取によってルテインが眼組織に蓄積され、紫外線や青色光を吸収することで眼組織の損傷を防いだために、酸化物質の１つである８−ＯＨｄＧの分泌を抑制する可能性が示唆された。
【００５４】
涙液層破壊時間（ｔｅａｒ  ｆｉｌｍ  ｂｒｅａｋ−ｕｐ  ｔｉｍｅ；  ＢＵＴ）検査による涙液保持力の測定では、ＢＵＴはルテイン含有組成物の摂取前から摂取８週後にかけて有意に上昇した（表１）。
【００５５】
以上のように本発明のルテイン含有組成物を摂取することで、眼の酸化ストレス低減効果が得られ、また涙液層破壊時間（ＢＵＴ）の改善効果、即ちドライアイ改善効果が得られることが明らかとなった。
【００５６】
さらに血液検査について、ルテイン含有組成物の摂取８週後の測定値を摂取前の測定値と比較した統計解析の結果を表２に示す。
本発明のルテイン含有組成物の摂取前後で有意差が認められた項目は、好中球率（ｐ＝０．００６）、リンパ球率（ｐ＝０．０１２）、好中球数（ｐ＝０．０４９）、ＺＴＴ（ｐ＝０．０１７）、クレアチニン（ｐ＝０．０２０）、カリウム（ｐ＝０．００４）であった。また、摂取前と比較して好中球率は８．７％の上昇（５６．４  →６１．３％）、リンパ球率は１０．９％の低下（３３．２  →２９．６％）、好中球数は１３．４％の上昇（３１１１．９  →３５３０．４）、ＺＴＴは６．９％の低下（７．６  →７．１Ｕ）、クレアチニンは５．２％の低下（０．７０→０．６６  ｍｇ／ｄｌ）、カリウムは５．９％の上昇（４．０  →４．３ｍＥｑ／Ｌ）であった。
【表２】
2018024649.tif 000003
【００５７】
４．ＣＦ抽出物の調製
コレウス・フォルスコリの根の粉末は、２倍量の水で６０°Ｃで２時間抽出した。用いた材料を乾燥させ、超臨界流体抽出（ＳＣＦＥ）を通じて抽出した。ＳＣＦＥ含油樹脂は、２倍量の７０％エタノール（サトウキビエタノール）で５０°Ｃで１時間洗浄した。混合物は１８時間静置し、その後最上層から透明な液体の層をサイフォンによって分離した。最下層は、ヌッチェフィルターを通じて濾過した。ウェット・ケーキ（ｗｅｔ  ｃａｋｅ）を減圧下、６５°Ｃで１６時間乾燥させた。乾燥した抽出物は、０．５ｍｍのメッシュを通して粉砕し、フォルスコリン含有量を分析した。結果物を、マルトデキストリンと３％アエロジルと混合し、所望のフォルスコリン濃度を得た。
【００５８】
５．ＣＦ抽出物とＳＲ抽出物の混合物の調製
次に、１０〜９８％の範囲で所望の強さのＣＦ抽出物を、サラシア・レティキュラータの根の抽出物と混合した。
サラシア・レティキュラータの根の粉末は、５倍量の水で、７０〜８０°Ｃで抽出した。当該水抽出は、３回繰り返し、結果得られた抽出物は５ミクロンのフィルター布を用いて濾過した。透明な濾液を、８時間静置し、最上層をサイフォンによって分離し、減圧下で８０°Ｃで濃度２５―３０％  ＴＤＳ（全蒸発残留物）になるまで濃縮した。半分ほど濃縮されたところで、次に噴霧乾燥した。乾燥した粉末は、０．５ｍｍメッシュを通して粉砕した。
次にα−グルコシダーゼ阻害活性及びα−アミラーゼ阻害活性を測定した。
【００５９】
α−グルコシダーゼ阻害活性の測定
ＳＲ抽出物を標準化するためのα−グルコシダーゼ阻害活性の測定は、以下の方法で行った。
【００６０】
原理
α−グルコシダーゼ活性は、ラット小腸由来のα−グルコシダーゼによるショ糖の加水分解から生じる還元糖（グルコース）を測定することにより、インビトロで測定できる。
【００６１】
材料
α−グルコシダーゼは、次のように調製した。ラットを屠殺し、腸を取り出し、氷冷した８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で冷却した。腸を切り開き、粘膜をガラス棒で剥離し、４倍量（容積／容積）の氷冷した８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いてホモジナイズした。ホモジナイズの間、サンプル管を氷で冷却した。核および細胞の破片を、２０００〜４０００ｒｐｍ、１０分の遠心により取り除き、上清を１．５ｍｌのバイアルに分注し、−２０℃で保存した。これをα−グルコシダーゼ酵素溶液とした。ビウレット法により測定したタンパク質含量は、約０．５ｇ／ｄｌであった。ビウレット法は、Ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｂ−０２１１，  Ｓｐａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行った。
基質には、ショ糖（ＲＭ３０６３、Ｈｉｍｅｄｉａ、インド、室温保存）を８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、３７ｍＭにしたものを用いた。
陽性対照には、アカルボース（グルコバイ）（Ｂａｙｅｒ  Ｐｈａｒｍａ，インド、室温保存）を８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に５μｇ／ｍｌで溶解したものを用いた。
グルコース試薬は、インド、ＡＧＡＰＰＥ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社  １１２０８１０２を用いた。
【００６２】
方法
Ｖｏｇｅｌ  ＧＨ，  Ｖｏｇｅｌ  ＷＨ  (１９９７) ，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，  Ｐｈｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｓａｙ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：  Ｇｅｒｍａｎｙ，  ５８８−５８９に記載の方法を改変してα−グルコシダーゼ阻害活性を測定した。簡潔に言えば、緩衝液、陽性対照又は様々な濃度のテストサンプルを含む８０ｍＭリン酸緩衝液  ２５０μｌに、酵素溶液  ５０μｌを添加し、反応混合物とした。反応混合物を混合し、３７℃にて３０分プレインキュベーションを行った。基質（３７ｍＭ  ショ糖）５００μｌを添加し、３７℃にて２０分インキュベーションを行った。反応混合物を沸騰水中に２分保持することで反応を停止し、その後冷却した。グルコース試薬２５０μｌを反応混合物５０μｌに添加し、２５℃、１０分インキュベートした。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ社製  Ｖｅｒｓａｍａｘマイクロプレートリーダを用いて、５１０ｎｍの吸光度を測定した。対照として、テストサンプル無しで、同様な実験を行った。
【００６３】
阻害率（％）は、以下の式により計算した。
阻害率（％）＝（吸光度（対照）−吸光度（テストサンプル））／吸光度（対照）ｘ１００
ＩＣ５０は、ログ−プロビット アナリシス（ｌｏｇ−ｐｒｏｂｉｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて計算した。サンプルが着色している場合や水溶液ではない場合、着色及び溶媒のための補正を適切に行った。
【００６４】
α−アミラーゼ阻害活性の測定
ＳＲ抽出物を標準化するためのα−アミラーゼ阻害活性の測定は、以下の方法で行った。
【００６５】
原理
膵臓のα−アミラーゼは、２−クロロ−４−ニトロフェノール  α−Ｄ−マルトトリオシド（ＣＮＰ−Ｇ３）を加水分解し、２−クロロ−４−ニトロフェノールを放出し、２−クロロ−４−ニトロフェノール  α−Ｄ−マルトシド（ＣＮＰＧ２）、マルトトリオース及びグルコースを生じる。２−クロロ−４−ニトロフェノールの形成率は、４０５ｎｍの吸光度により測定できる。
【００６６】
材料
α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）は、米国シグマ社から購入したブタ膵臓由来ＴｙｐｅＶＩ−Ｂ、５００，０００ユニット（ｐＨ６．９において１５．８ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、固体）（Ａ３１７６）を用いた。α−アミラーゼは、４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）に溶解し、０．５１２８ｕｎｉｔｓ／ｍｌとしたものを用いた。
基質には、既製のＣＮＰ−Ｇ３試薬（２−クロロ−４−ニトロフェノール  α−Ｄ−マルトトリオシド、ＡＭＦ０６０ＣＨ，  Ｃｈｅｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，イタリア、２−８℃保存）を２．３ｍＭ濃度で用いた。
陽性対照には、アカルボース（グルコバイ）（Ｂａｙｅｒ  Ｐｈａｒｍａ，インド、室温保存）を４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）に２．５μｇ／ｍｌで溶解したものを用いた。
【００６７】
方法
Ｇｅｌｌａ  ＦＪ，Ｇｕｂｅｒｎ  Ｇ，  Ｖｉｄａｌ  Ｒ，  Ｃａｎａｌｉａｓ  Ｆ，（１９９７），Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  α―ａｍｙｌａｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｗｉｔｈ  ２−ｃｈｌｏｒｏ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ―α―Ｄ−ｍａｌｔｏｔｒｉｏｓｉｄｅ  ａｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．，  Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ２５９，  １４７−１６０に記載の方法を改変してα−アミラーゼ阻害活性を測定した。簡潔に言えば、緩衝液、陽性対照又はテストサンプルを含む４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）６０μｌに、酵素溶液（０．５１２８ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）３０μｌを添加し、反応混合物とした。反応混合物を混合し、３７℃にて１０分プレインキュベーションを行った。基質（２．３ｍＭ  ＣＮＰ−Ｇ３）１２５μｌを添加し、３７℃にて８分インキュベーションを行った。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ社製  Ｖｅｒｓａｍａｘマイクロプレートリーダを用いて、４０５ｎｍの吸光度を測定した。対照として、テストサンプル無しで、同様な実験を行った。
【００６８】
阻害率（％）は、以下の式により計算した。
阻害率（％）＝（吸光度（対照）−吸光度（テストサンプル））／吸光度（対照）ｘ１００
ＩＣ５０は、ログ−プロビット アナリシスを用いて計算した。サンプルが着色している場合や水溶液ではない場合、着色及び溶媒のための補正を適切に行った。
【００６９】
上述の方法に基づき、ＳＲ抽出物は、α−グルコシダーゼを１〜７５μｇ／ｍｇの濃度で５０％阻害し、且つα−アミラーゼを１〜３５μｇ／ｍｇの濃度で５０％阻害するように標準化した。
【００７０】
６．ＣＦ抽出物、ＳＲ抽出物及びＳＩ抽出物の混合物の調製
ＣＦ抽出物とＳＲ抽出物の混合物を、次にゴマの種の抽出物と組み合わせた。
ゴマの種は、水で洗浄し、乾燥させ、油を集めるために押し出した。当該油は、フィルタープレスを通して濾過し、その透明な油を抽出に用いた。ゴマ油をエタノール（サトウキビエタノール）を用いて７５〜８０°Ｃで２時間抽出した。それを１時間静置し、層を分離した。最上層はＳＩ材料を含有しており、これを抽出装置底部のバルブを通してガラス部分を目視することにより分離した。最下層は、さらに３回の抽出を行った。４つの抽出物を減圧下、７０°Ｃで粘度の高いペースト状になるまで濃縮した。そのペーストは、熟成させるために７日間静置した。熟成した材料は、２倍量のサトウキビエタノールと混合し、ヌッチェフィルターで濾過した。ウェット・ケーキを、１．５倍量のエタノールで洗浄し、濾過した。得られたウェット・ケーキは、２倍量の水と混合し、６０°Ｃに熱し、ヌッチェフィルターで濾過した。ウェット・ケーキは、６５°Ｃで減圧下で乾燥させた。乾燥した材料は、次に２１倍量のエタノールに溶解し、活性炭処理（ｃｈａｒｃｏｌｉｓｅ）した。乾燥重量に基づき、５％の活性炭を添加した。ハイフローベッドは、２ミクロンのフィルター布を用いて調製した。新しいハイフローベッドを用いてハイフロー濾過を２回繰り返した。透明な濾液を減圧下で６５°Ｃにて粘度の高いペースト状になるまで濃縮した。次に、当該粘度の高いペーストを、３〜４時間、減圧下で６０〜６５°Ｃで乾燥させた。乾燥した材料は０．５ｍｍまで挽き、再度減圧下、７０°Ｃで３時間乾燥させた。再乾燥した材料を挽き、ふるいにかけ、品質を確認した後包装した。最終製品はＨＰＬＣにより７０％セサミンを含有するように標準化した。
【００７１】
７．ＣＦ抽出物の臨床試験
１０％フォルスコリンを含有するように標準化された本発明の構成要素であるコレウス・フォルスコリ（ＣＦ）抽出物について、１５人のボランティア（試験食事群に８人のボランティア（平均年齢４１±４歳、平均体重７７．５±１１．４ｋｇ、平均ＢＭＩ  ２７．２±０．９）、対照食事群に７人のボランティア（平均年齢３６±９歳、平均体重７５．６±７．３ｋｇ、平均ＢＭＩ  ２７．５±１．４））による６週間の臨床試験を行った。ランダムに選択したこれらの試験対象は、１０％ＣＦ抽出物を含む２５０ｍｇ×２カプセル又はそれに対応するプラセボの２５０ｍｇ×２カプセルを、朝食３０分前および夕食３０分前に服用した。一日の全ＣＦ抽出物／プラセボ量は、１０００ｍｇ（４カプセル）であり、これを６週間続けた。本試験の過程で食事や生活スタイルには何らの変更も行わなかった。
【００７２】
８．ＣＦ抽出物の臨床試験結果
体脂肪率
ＣＦ抽出物群における体脂肪率は、投与が完了した時点で、統計的に有意にベースラインより低かった（Ｐ＜０．０５）。プラセボ群における体脂肪率は、投与が完了した時点で、統計的に有意にベースラインより高かった（ｐ＜０．０５）。投与前のＣＦ抽出物群の体脂肪率は、３４．１±４．２％であり、投与後は３３．５±４．４％であったのに対し、プラセボ群では、投与前３５．０±６．６％、投与後３５．９±６．５％であった。レジメンの前及び後６週の時点において、ＣＦ抽出物群の３人の対象について、ＣＴスキャンで体の様々な部位の脂肪量の変化を測定した。全身の体脂肪、皮下脂肪及び中心腹部脂肪は、本試験が完了した時点で、ベースラインに比べて減少していた（表３参照）。
【００７３】
表３は、コレウス・フォルスコリ抽出物  （２５０ｍｇ×４カプセル／日）を投与された３人の対象において、その試験前及び後６週の時点での、様々な体の部位における体脂肪量をＣＴスキャンで測定した結果を表す。
【００７４】
【表３】
2018024649.tif 000004
【００７５】
体重
ベースラインに比べて、ＣＦ抽出物群は６週の最後には減少した体重を示し、プラセボ群は増加した体重を示した。ＣＦ抽出物群の試験前の体重は７７．５±１２ｋｇであり、試験後の体重は７６．６±１２．１ｋｇであった。プラセボ群の体重は、試験前は７５．５±７．２ｋｇ、試験後は７６±７．４ｋｇであった。
【００７６】
胴囲
ＣＦ抽出物群における胴囲は、ベースラインに比べて数値的に低かった。即ち、試験前９３．９±７．８ｃｍ、試験後９３．２±８ｃｍであった。一方、プラセボ群においては、試験の最後には胴囲がベースラインに比べて数値的に増加した。即ち、試験前９２．１±７．１ｃｍ、試験後９２．４±７．１ｃｍであった。胴囲と同様な変化のパターンが、ヒップ周りにおいても記録された。即ち、ＣＦ抽出物群においては、試験前１０１±２．９ｃｍ、試験後１００．１±３ｃｍであり、プラセボ群においては、試験前１００．２±３．４ｃｍ、試験後１００．４±３．３ｃｍであった。
【００７７】
血中の脂肪
血中の脂肪の実験室データは、ＣＦ抽出物およびプラセボ群において次のような傾向を示した。即ち、ＣＦ抽出物群の総コレステロールは、ベースライン値（２１３±２８ｍｇ／ｄｌ）より減少し、２００±１５ｍｇ／ｄｌであった。プラセボ群の総コレステロールは、ベースライン値（２１８±３８ｍｇ／ｄｌ）より増加し、２２１±３５ｍｇ／ｄｌであった。ＣＦ抽出物群のトリグリセリドは、試験前は１３７±６９ｍｇ／ｄｌであったが、試験後は１２０±７４ｍｇ／ｄｌに減少した。プラセボ群では、トリグリセリド値は、ベースライン値（９８±３３ｍｇ／ｄｌ）より増加し、試験後は１０９±５４ｍｇ／ｄｌであった。
【００７８】
カロリー摂取量
ＣＦ抽出物を６週間投与した際の食物のカロリー摂取における影響をプラセボ群と比較した。プラセボ群においては、６週の最後には、カロリー摂取量は、およそ７００ｋｃａｌ増加した。一方、ＣＦ抽出物群においては、カロリー摂取量はおよそ３００ｋｃａｌ減少した。ＣＦ抽出物群とプラセボ群のカロリー摂取における差異は、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５、表４参照）。プラセボ群に比べてＣＦ抽出物群において有意に減少したカロリー摂取量は、本発明の安全な効果を示している。食欲を増進する傾向を示す現世代の膵リパーゼインヒビター（非特許文献３）を鑑みると、これは予想外の効果であると言える。
【００７９】
表４は、コレウス・フォルスコリ抽出物またはプラセボを６週間投与した対象における、カロリー摂取量により測定された食欲に対する影響を表す。
【００８０】
【表４】
2018024649.tif 000005
【００８１】
９．インビトロにおける膵リパーゼの阻害
本発明の構成要素である、コレウス・フォルスコリ、サラシア・レティキュラータ及びゴマ各々の抽出物について、膵リパーゼ活性を阻害する性質についてインビトロで以下の方法で評価した。
【００８２】
（１）試験材料
被験物質には、コレウス・フォルスコリ抽出物  ９８％（ロット番号：ＯＬ１１００４８），コレウス・フォルスコリ抽出物  ４０％（ロット番号：ＢＡＪ／ＣＯＬ４０／１１０２１１）、サラシア・レティキュラータ抽出物（ロット番号：ＢＡＪ／ＳＲＥ／１００８１６）、白ゴマ抽出物  ７０％（ロット番号：ＢＡＪ／ＳＭＥ／１００２２０），Ｔａｒｒａｇｏｎ抽出物（ロット番号：０７０８／９０８００５）を用いた。これらは室温で保存した。
試薬には、ブタ膵リパーゼ（ロット番号：０２０Ｍ１５８９Ｖ，ＳＩＧＭＡ），ＭＯＰＳ（ロット番号：ＢＣＢＢ５９４８，ＳＩＧＭＡ）、ＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ（ロット番号：ＢＣＢＢ４８１４，ＳＩＧＭＡ）、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）Ｂａｓｅ（ロット番号：０００１４１４４４８，ＳＩＧＭＡ）、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ（ロット番号：ＢＣＢＣ３０２８Ｖ、ＳＩＧＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ロット番号：６０７９６ＨＭ，ＳＩＧＭＡ）、４−ニトロフェニルブチラート（ロット番号：０２９Ｋ５２１７Ｖ，ＳＩＧＭＡ）、塩酸（ロット番号：ＫＷＭ６９３７、和光純薬工業（株））、Ｏｒｌｉｓｔａｔ（ロット番号：０４２２５８３−６、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いた。
測定機器には、マルチモードマイクロプレートリーダーＭｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０（ＢＥＲＴＨＯＬＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）を用いた。
【００８３】
（２）試験方法
試薬の調製方法
試薬は、Ｌｅｅらの報告（Ｅｕｎ  Ｍｉ  Ｌｅｅ，  Ｓｅｕｎｇ  Ｓｉｋ  Ｌｅｅ，  Ｂｙｕｎｇ  Ｙｅｏｕｐ  Ｃｈｕｎｇ，  Ｊａｅ−Ｙｏｕｎｇ  Ｃｈｏ，  Ｉｎ  Ｃｈｕｌ  Ｌｅｅ，  Ｓｏ  Ｒａ  Ａｈｎ，  Ｓｏｏ  Ｊｅｕｎｇ  Ｊａｎｇ  ａｎｄ  Ｔａｅ  Ｈｏｏｎ  Ｋｉｍ，Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｌｉｐａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ  Ｆｌａｖｏｎｅｓ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｅｒｅｍｏｃｈｌｏａ  ｏｐｈｉｕｒｏｉｄｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１０，  １５，  ８２５１−８２５９；  ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ１５１１８２５１）及びＬｕｎｄｅｒらの報告（Ｌｕｎｄｅｒ，  Ｍ．，  Ｔ．  Ｂｒａｔｋｏｖｉｃ，  Ｓ．  Ｋｒｅｆｔ，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｓｔｒｕｋｅｌｊ．  ２００５．，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｌｉｐａｓｅ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｕｓｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．，Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  ４６：１５１２−１５１６．  ＤＯＩ  １０．１１９４／ｊｌｒ．Ｍ５０００４８−ＪＬＲ２００）を参考に調製した。５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム及び１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ・２Ｎａを含む１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）のＴｒｉｓ緩衝液を調製した。ブタ膵リパーゼは、１０ｍｍｏｌ／ＬのＭＯＰＳ水溶液を加えて懸濁させ、約１０００ｕｎｉｔ／ｍＬのブタ膵リパーゼ溶液とした。３０μＬのブタ膵リパーゼ溶液にＴｒｉｓ緩衝液を８５０μｌ加え、酵素溶液とした。４−ニトロフェニルブチラートにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを加えて溶解させ、４０ｍｍｏｌ／Ｌに調製し、基質溶液とした。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドとＴｒｉｓ緩衝液を１：４の比率で混合して、被験物質調製溶液とした。
【００８４】
被験物質の調製方法
被験物質は、いずれも被験物質調製溶液に溶解させて、１０００μｇ／ｍＬの濃度を調製後、順次１０倍希釈して、１００、１０及び１μｇ／ｍＬの濃度を調製した。試験にはこれらを検体として用い、対照には被験物質調製溶液のみを用いた。
【００８５】
測定方法
測定は、Ｌｅｅら及びＬｕｎｄｅｒらの報告（１、２）を参考にして実施した。簡潔に言えば、マイクロプレートに１００μＬの検体（ｎ＝２）と、８８０μＬの酵素溶液を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベート終了後、２０μＬの基質溶液を加え、３７℃で酵素反応を開始した。酵素反応開始後、４０５ｎｍにおける吸光度の測定を１分毎に１５分後まで継続した。
【００８６】
結果として、これら３つの抽出物が膵リパーゼ活性を阻害する程度は異なっていた。この事実は、膵リパーゼ活性を安全且つ効果的に阻害するために、新しい知見を提供するものである。
【００８７】
膵リパーゼの安全な阻害
膵リパーゼの過剰な阻害を防止する安全なメカニズムは、本発明の方法に係る主な特徴である。ゴマ抽出物は、用量依存的にこのメカニズムをコントロールして、過剰な膵リパーゼ阻害の副作用を防止する。インビトロの実験において、ゴマ抽出物（Ｓｅｓａｍｉｎ）は、単独で、低用量及び高用量において二元的な作用を示した（図１及び図２参照）。
【００８８】
低用量（０．１μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌ）において、ゴマ抽出物は、コレウス・フォルスコリ抽出物（Ｃ．Ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）及びサラシア・レティキュラータ抽出物（Ｓａｌａｃｉａ）よりも統計的に有意に効率よく膵リパーゼを阻害した。しかしながら、高用量（１０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌ）においては、ゴマ抽出物よりも、同用量のコレウス・フォルスコリ抽出物及びサラシア・レティキュラータ抽出物の方が、統計的に有意に効率よく膵リパーゼを阻害した。
【００８９】
予期しないことに、１μｇ／ｍｌのゴマ抽出物を１０μｇ／ｍｌの９８％コレウス・フォルスコリ抽出物に添加すると、膵リパーゼが９．６％だけ阻害された。それぞれの抽出物単独で得られる阻害率を足し合わせると、２３．４％になるのとは対照的である（図１、表５及び表６参照）。ゴマ抽出物の作用を修飾するこの生物学的反応は、膵リパーゼ活性の過剰で非生理学的な阻害とその潜在的な副作用を防止するという意味で新規且つ有用である。
【００９０】
表５は、本発明の成分によるインビトロにおける用量依存的な膵リパーゼの阻害を表す。
【００９１】
【表５】
2018024649.tif 000006
【００９２】
表６は、本発明の成分の組み合わせによるインビトロにおける膵リパーゼの阻害を表す。
【００９３】
【表６】
2018024649.tif 000007
【００９４】
速成耐性の防止
コレウス・フォルスコリとサラシア・レティキュラータの抽出物は、速成耐性の防止に対して、並びに、膵リパーゼ活性を阻害するコレウス・フォルスコリ及びサラシア・レティキュラータの抽出物の、反復使用や時間経過による生物学的活性の減少及び加齢により抵抗性となるメカニズムに対して、相乗的に働く。この事実は、膵リパーゼ活性を安全且つ効果的に阻害するための、新規且つ有用な知見である。
【００９５】
膵リパーゼの相乗的な阻害
本発明の相乗的な作用は、生物学的に不活性な量（１μｇ／ｍｌ）のサラシア・レティキュラータ抽出物と準最適量（１０μｇ／ｍｌ）のコレウス・フォルスコリ抽出物とを組み合わせた、膵リパーゼの阻害についてのインビトロ実験によって例証される（表６参照）。ＣＦ抽出物とＳＲ抽出物それぞれ単独の場合を足し合わせた相加的阻害率は１０．８％でしかないが、この二つは相乗的な効果を示し、膵リパーゼ活性を２０．７％阻害した。従って、生物学的に不活性な量のサラシア・レティキュラータと準最適量のコレウス・フォルスコリの組み合わせは、予期しない相乗効果をもたらすことが明らかである。これは体重管理における本発明の進歩性と有用性を表すものである。
【００９６】
１０．臨床試験とインビトロ試験の結果
６週間の試験で明らかとなった臨床的エビデンスにより、ＣＦ抽出物は、内臓脂肪と血中トリグリセリドを減少させることが示された。この発見と膵リパーゼ活性を阻害するというインビトロの結果とを組み合わせることにより、ＣＦ抽出物が膵リパーゼを阻害することを初めて見出した。膵リパーゼを阻害するＣＦ抽出物の活性の発見は新規であり、これは特に、膵臓組織をジテルペンフォルスコリンと共にインキュベートすると、リパーゼとコリパーゼの合成速度が急速に増加するという知見（非特許文献６）とは正反対のことを示している。
【図１】
2018024649.tif 000008
【図２】
2018024649.tif 000009