(57)【要約】      （修正有）【課題】分解性クロストリジウム毒素を提供すること。【解決手段】不活性化切断部位領域内に位置する少なくとも１つの不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位領域が転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置し、少なくとも１つの不活性化切断部位がトロンビン切断部位を含み、少なくとも１つの不活性化切断部位が特定のアミノ酸配列の範囲内に位置し、アミノ酸配列ＶＰＲＧが特定の不活性化切断部位に挿入されている、クロストリジウム毒素。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活性化切断部位領域内に位置する少なくとも１つの不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、該不活性化切断部位領域が転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置し、該少なくとも１つの不活性化切断部位が、トロンビン切断部位を含み、該少なくとも１つの不活性化切断部位が、配列番号１のアミノ酸８７１〜８９５の範囲内に位置し、該不活性化切断部位において、アミノ酸配列ＶＰＲＧが、配列番号１のＬ８９１の後に挿入されている、クロストリジウム毒素。
【請求項２】
前記不活性化切断部位が、さらに、配列番号１のアミノ酸４６２〜４９６の範囲内に位置する、請求項１に記載のクロストリジウム毒素。
【請求項３】
前記不活性化切断部位が、さらに、配列番号１のアミノ酸８４４〜８６３の範囲内に位置する、請求項１又は２に記載のクロストリジウム毒素。
【請求項４】
クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインを含む、請求項１〜３いずれかに記載のクロストリジウム毒素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分解性クロストリジウム毒素に関する。
【０００２】
本願は、２０１０年５月２０日出願の米国仮出願第６１／３４６，５７８号の優先権を主張し、その開示全体をこの特定の参照により本明細書中に組み込む。
【背景技術】
【０００３】
例えばボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ及びＢｏＮＴ／Ｇ及び破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）などのクロストリジウム毒素の神経伝達阻害能は多岐にわたる治療及び美容用途において活用されている。例えば、非特許文献１を参照のこと。医薬組成物として市販されているクロストリジウム毒素としては、ＢｏＮＴ／Ａ製剤、例えばＢＯＴＯＸ（登録商標）（Ａｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）、ＤＹＳＰＯＲＴ（登録商標）／ＲＥＬＯＸＩＮ（登録商標）、（Ｂｅａｕｆｏｕｒ  Ｉｐｓｅｎ，Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、ＮＥＵＲＯＮＯＸ（登録商標）（Ｍｅｄｙ−Ｔｏｘ，Ｉｎｃ．，Ｏｃｈａｎｇ−ｍｙｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）ＢＴＸ−Ａ（Ｌａｎｚｈｏｕ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃｈｉｎａ）及びＸＥＯＭＩＮ（登録商標）（Ｍｅｒｚ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＧｍｂＨ．，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）など；及びＢｏＮＴ／Ｂ製剤、例えば、ＭＹＯＢＬＯＣ（商標）／ＮＥＵＲＯＢＬＯＣ（商標）（Ｅｌａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）などが挙げられる。一例として、ＢＯＴＯＸ（登録商標）は現在、以下の適応に対して１以上の国で承認されている：アカラシア、成人性痙縮、裂肛、背部痛、眼瞼痙攣、歯ぎしり、痙性斜頚、本態性振戦、眉間の皺又は運動過多による顔面の皺、頭痛、片側顔面痙攣、膀胱の運動亢進、多汗症、小児脳性麻痺、多発性硬化症、ミオクローヌス性障害、鼻唇溝、攣縮性発声障害、斜視及びＶＩＩ神経障害。
【０００４】
クロストリジウム毒素の処置は、シナプス間隙に神経伝達物質を分泌させるために使用されるエキソサイトーシス過程を撹乱することによって、神経伝達物質放出を阻害する。現在の筋弛緩のための用途だけでなく、感覚神経性の疾患、例えば様々な種類の慢性疼痛、神経性炎症及び泌尿生殖障害など、ならびにその他の疾患、例えば膵炎などを治療するためにクロストリジウム毒素療法の使用を拡大することが製薬業界で非常に望まれている。クロストリジウム毒素に基づく治療を拡大するために現在利用されているあるアプローチには、クロストリジウム毒素非標的細胞に対する改変毒素の細胞標的能が変化するように、クロストリジウム毒素を改変することが含まれる。この再標的化能は、天然起源のクロストリジウム毒素の標的化ドメインを、クロストリジウム毒素非標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に対する選択的結合活性を示す標的化ドメインで置き換えることにより達成される。標的化ドメインに対するこのような改変の結果、クロストリジウム毒素非標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体（標的受容体）に選択的に結合することができる、標的小胞エキソサイトーシス調節タンパク質（ＴＶＥＭＰ）と呼ばれるクロストリジウム毒素キメラが得られる（再標的化）。クロストリジウム毒素非標的細胞への標的化活性を有するクロストリジウム毒素キメラは、クロストリジウム毒素非標的細胞上に存在する受容体に結合し、細胞質に移動し、クロストリジウム毒素非標的細胞のＳＮＡＲＥ複合体においてそのタンパク質分解効果を発揮することができる。
【０００５】
クロストリジウム毒素及びクロストリジウム毒素キメラ療法は多くの適応症に対して良好に使用される。一般に、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの投与の耐容性は良好である。しかし、一部の適用での投与は、有益な効果を達成するためにより高用量の投与が必要とされるため、問題が多い場合がある。用量が高くなることによって、本毒素又はクロストリジウム毒素キメラが、間質液及び循環系、例えば心血管系及びリンパ系などを通じて身体を移動し得、その結果、治療の標的ではない部位への本毒素又はクロストリジウム毒素キメラの望ましくない拡散が起こる可能性が高くなり得る。このような拡散によって、例えば、毒素治療に対する標的ではないニューロンにおいて放出される神経伝達物質の阻害又は治療標的ではない筋肉の麻痺など、望ましくない副作用がもたらされ得る。例えば、斜頸に対して頸部筋肉に治療的有効量のＢｏＮＴ／Ａ治療薬を投与された患者は、中咽頭への毒素の拡散のために嚥下障害を引き起こし得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｊ．Ｌｉｐｈａｍ，ＣＯＳＭＥＴＩＣ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＢＯＴＵＬＩＮＵＭ  ＴＯＸＩＮ（Ｓｌａｃｋ，Ｉｎｃ．，２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、治療部位で有効であるが、毒素治療に対する標的ではない部位での影響が最小限から無視できる程度である、改良されたクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラ依然として必要とされている。
【０００８】
より高用量を必要とする治療におけるクロストリジウム毒素及びクロストリジウム毒素キメラの臨床、治療及び美容用途の増加により、適用標的部位で有効であるが、不要な部位への毒素の拡散にともなう副作用を軽減又は予防する改変クロストリジウム毒素及びクロストリジウム毒素キメラを開発することが医薬業界で必要とされるようになっている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細は、非標的部位への毒素拡散に伴う不要な副作用を軽減又は予防する新規改変クロストリジウム毒素及びクロストリジウム毒素キメラを提供する。これら及び関連する長所は、例えば、神経筋疾患、神経障害、眼疾患、疼痛、筋肉損傷、頭痛、心血管系疾患、精神神経疾患、内分泌疾患、癌、耳の疾患及び運動過剰による顔の皺ならびに哺乳動物へのクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラ投与が有益な効果をもたらし得る他の疾患の治療など、様々な臨床、治療及び美容用途に有用である。
【００１０】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕不活性化切断部位領域内に位置する少なくとも１つの不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、該不活性化切断部位領域が転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置し、該少なくとも１つの不活性化切断部位が、トロンビン切断部位を含み、該少なくとも１つの不活性化切断部位が、配列番号１のアミノ酸８７１〜８９５の範囲内に位置し、該不活性化切断部位において、アミノ酸配列ＶＰＲＧが、配列番号１のＬ８９１の後に挿入されている、クロストリジウム毒素、
〔２〕前記不活性化切断部位が、さらに、配列番号１のアミノ酸４６２〜４９６の範囲内に位置する、〔１〕に記載のクロストリジウム毒素、
〔３〕前記不活性化切断部位が、さらに、配列番号１のアミノ酸８４４〜８６３の範囲内に位置する、〔１〕又は〔２〕に記載のクロストリジウム毒素、
〔４〕クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインを含む、〔１〕〜〔３〕いずれかに記載のクロストリジウム毒素
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、分解性クロストリジウム毒素が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】中枢及び末梢ニューロンにおける神経伝達物質放出及びクロストリジウム毒素中毒の現在のパラダイムの概略を示す。図１Ａは、中枢及び末梢ニューロンの神経伝達物質放出機構に対する概略を示す。この放出過程は、２段階、すなわち１）神経伝達物質分子を含有する小胞の小胞結合ＳＮＡＲＥタンパク質が、形質膜にある膜結合ＳＮＡＲＥタンパク質と会合する小胞ドッキング、及び２）小胞が形質膜と融合し、神経伝達物質分子がエキソサイトーシスにより放出される、神経伝達物質放出を含むものとして説明することができる。
【図１−２】中枢及び末梢ニューロンにおける神経伝達物質放出及びクロストリジウム毒素中毒の現在のパラダイムの概略を示す。図１Ｂは、中枢及び末梢ニューロンにおける破傷風及びボツリヌス毒素活性に対する中毒機構の概略を示す。この中毒過程は、４段階、すなわち１）クロストリジウム毒素がクロストリジウム受容体系に結合し、中毒過程を開始させる、受容体結合、２）毒素結合後、毒素／受容体系複合体を含有する小胞がエンドサイトーシスで細胞に取り込まれる、複合体内部移行、３）例えば小胞の内部ｐＨの変化、クロストリジウム毒素重鎖のＨＮドメインを含むチャネルポアの形成、重鎖からのクロストリジウム毒素軽鎖の分離及び活性のある軽鎖の放出を含む複数の事象が起こると考えられる、軽鎖転移、及び４）クロストリジウム毒素の活性化軽鎖がタンパク質分解によってその標的ＳＮＡＲＥ基質、例えばＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ又はシンタキシンを切断し、それによって小胞ドッキング及び神経伝達物質放出を阻止する、酵素性標的変化を含むものとして説明することができる。
【図２】天然起源のクロストリジウム毒素のドメイン編成を示す。１本鎖形態は、酵素ドメイン、転移ドメイン及び結合ドメインを含むアミノからカルボキシルの直線的な編成を示す。転移ドメインと酵素ドメインとの間にある２本鎖ループ領域は、２本鎖ＳＳブラケットにより示される。この領域は、例えば内在性クロストリジウム毒素プロテアーゼ又はその環境下で産生される天然起源のプロテアーゼなど、天然起源のプロテアーゼでのタンパク質分解性切断の際に毒素の１本鎖形態を２本鎖形態に変換する、内在性２本鎖ループプロテアーゼ切断部位を含む。１本鎖形態の上に、クロストリジウム毒素結合ドメインのＨＣＣ領域が示される。この領域は、アミノからカルボキシルの直線的な編成で、α−フォールド、β４／β５ヘアピンターン、β−フォールド、β８／β９ヘアピンターン及びγ−フォールドを含むβ−トレフォイルドメインを含む。
【図３】結合ドメインが毒素のアミノ末端に位置している、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素（ｔｏｘｎ）キメラを示す。図３Ａは、結合エレメント、転移エレメント、外因性プロテアーゼ切断部位（Ｐ）を含む２本鎖ループ領域及び治療エレメントを含むアミノからカルボキシルの直線的な配置の、毒素又はキメラの１本鎖ポリペプチド形態を示す。Ｐプロテアーゼでのタンパク質分解性切断時に、毒素又はキメラの１本鎖形態が２本鎖形態に変換される。図３Ｂは、結合エレメント、治療エレメント、外因性プロテアーゼ切断部位（Ｐ）を含む２本鎖ループ領域及び転移エレメントを含むアミノからカルボキシルの直線的な配置の、毒素又はキメラの１本鎖ポリペプチド形態を示す。Ｐプロテアーゼでのタンパク質分解性切断時に、毒素又はキメラの１本鎖形態が２本鎖形態に変換される。
【図４−１】結合ドメインが毒素のアミノ末端にある、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素（ｔｏｘｎ）キメラを示す。図４Ａは、治療エレメント、外因性プロテアーゼ切断部位（Ｐ）を含む２本鎖ループ領域、結合エレメント及び転移エレメントを含むアミノからカルボキシルの直線的な配置の、毒素又はキメラの１本鎖ポリペプチド形態を示す。Ｐプロテアーゼでのタンパク質分解性切断時に、毒素又はキメラの１本鎖形態が２本鎖形態に変換される。図４Ｂは、転移エレメント、外因性プロテアーゼ切断部位（Ｐ）を含む２本鎖ループ領域、結合エレメント及び治療エレメントを含むアミノからカルボキシルの直線的な配置の、毒素又はキメラの１本鎖ポリペプチド形態を示す。Ｐプロテアーゼでのタンパク質分解性切断時に、毒素又はキメラの１本鎖形態が２本鎖形態に変換される。
【図４−２】結合ドメインが毒素のアミノ末端にある、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素（ｔｏｘｎ）キメラを示す。図４Ｃは、治療エレメント、結合エレメント、外因性プロテアーゼ切断部位（Ｐ）を含む２本鎖ループ領域及び転移エレメントを含むアミノからカルボキシルの直線的な配置の、毒素又はキメラの１本鎖ポリペプチド形態を示す。Ｐプロテアーゼでのタンパク質分解性切断時に、毒素又はキメラの１本鎖形態が２本鎖形態に変換される。図４Ｄは、転移エレメント、結合エレメント、外因性プロテアーゼ切断部位（Ｐ）を含む２本鎖ループ領域及び治療エレメントを含むアミノからカルボキシルの直線的な配置で、毒素又はキメラの１本鎖ポリペプチド形態を示す。Ｐプロテアーゼでのタンパク質分解性切断時に、毒素又はキメラの１本鎖形態が２本鎖形態に変換される。
【図５】結合ドメインが毒素のアミノ末端にある、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを示す。図５Ａは、治療エレメント、外因性プロテアーゼ切断部位（Ｐ）を含む２本鎖ループ領域、転移エレメント及び結合エレメントを含むアミノからカルボキシルの直線的な配置の、毒素又はキメラの１本鎖ポリペプチド形態を示す。Ｐプロテアーゼでのタンパク質分解性切断時に、毒素の１本鎖形態が２本鎖形態に変換される。図５Ｂは、転移エレメント、外因性プロテアーゼ切断部位（Ｐ）を含む２本鎖ループ領域、治療エレメント及び結合エレメントを含む、アミノからカルボキシルの直線的な配置の、毒素又はキメラの１本鎖ポリペプチド形態を示す。Ｐプロテアーゼでのタンパク質分解性切断時に、毒素又はキメラの１本鎖形態が２本鎖形態に変換される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細は、間質液及び循環系、例えば心血管系及びリンパ系などに存在するプロテアーゼの存在を利用することにより、望まれない１つの部位または複数の部位から迅速に不活性化され得る改変クロストリジウム毒素及び改変クロストリジウム毒素キメラを開示する。これは、本明細で開示される改変クロストリジウム毒素及び改変クロストリジウム毒素が、間質液及び／又は循環系に存在するプロテアーゼに対するプロテアーゼ切断部位を含むことによる。このようなプロテアーゼ切断部位が存在することによって、改変クロストリジウム毒素又は改変クロストリジウム毒素キメラがその同系プロテアーゼによるタンパク質分解性切断を受け易くなり、このような改変毒素が不活性化される。例えば、細胞外マトリクスプロテアーゼに対する切断部位を含むように改変されたクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラが間質液に拡散している状況下では、この改変毒素又は改変クロストリジウム毒素キメラは同系細胞外マトリクスプロテアーゼによって効率的に切断され得る。別の例として、血液プロテアーゼに対する切断部位を含むように改変されたクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラが心血管系に拡散されている状況下では、この改変毒素又は改変クロストリジウム毒素キメラは、同系血液プロテアーゼによって効率的に切断され得る。さらに別の例として、リンパプロテアーゼに対する切断部位を含むように改変されたクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラがリンパ系に拡散されている状況下では、この改変毒素又は改変クロストリジウム毒素キメラは同系リンパプロテアーゼによって効率的に切断され得る。従って、間質液及び／又は循環系に存在するプロテアーゼに対する切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを利用することによって、このようなクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを望まれない部位から減少させるか又は除去し、それによって望まれない部位に対するクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの拡散に伴う望ましくない副作用を軽減又は予防する。
【００１４】
従って、本明細の態様は、転移ドメイン又はＨＣＮ結合サブドメインに位置する不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素を提供する。このような開示される毒素は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン、クロストリジウム毒素結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位を含む２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含み得る。不活性化切断部位の非限定例としては、トロンビン切断部位、プラスミン切断部位、凝固第ＶＩＩａ因子切断部位、凝固第ＩＸａ因子切断部位、凝固第Ｘａ因子切断部位、凝固第ＸＩａ因子切断部位、凝固第ＸＩＩａ因子切断部位、血漿カリクレイン切断部位、プロテアーゼ活性化Ｇタンパク質共役型受容体−１（ＰＡＲ１）切断部位、ＰＡＲ２切断部位、ＰＡＲ３切断部位、ＰＡＲ４切断部位、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）切断部位、マトリクスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）切断部位、フューリン切断部位、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）切断部位、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）切断部位、トリプターゼ−ε切断部位、マウス肥満細胞プロテアーゼ−７（ｍＭＣＰ−７）切断部位、エンドセリン変換酵素−１（ＥＣＥ−１）切断部位、ケル式血液型切断部位、ＤＰＰＩＶ切断部位、トロンボスポンジン１型モチーフ−１３があるＡＤＡＭメタロペプチダーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）切断部位及びカテプシンＬ切断部位が挙げられる。不活性化切断部位の付加により、同じ又は類似しているがさらなる不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域が広くなる。
【００１５】
本明細の他の態様は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン及び、転移ドメイン又はＨＣＮ結合サブドメインに位置する不活性化切断部位領域内にある不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素キメラを提供する。このような開示される毒素は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位を含む２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内にある不活性化切断部位を含み得る。不活性化切断部位の非限定例としては、トロンビン切断部位、プラスミン切断部位、凝固第ＶＩＩａ因子切断部位、凝固第ＩＸａ因子切断部位、凝固第Ｘａ因子切断部位、凝固第ＸＩａ因子切断部位、凝固第ＸＩＩａ因子切断部位、血漿カリクレイン切断部位、プロテアーゼ活性化Ｇタンパク質共役型受容体−１（ＰＡＲ１）切断部位、ＰＡＲ２切断部位、ＰＡＲ３切断部位、ＰＡＲ４切断部位、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）切断部位、マトリクスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）切断部位、フューリン切断部位、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）切断部位、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）切断部位、トリプターゼ−ε切断部位、マウス肥満細胞プロテアーゼ−７（ｍＭＣＰ−７）切断部位、エンドセリン変換酵素−１（ＥＣＥ−１）切断部位、ケル式血液型切断部位、ＤＰＰＩＶ切断部位、トロンボスポンジン１型モチーフ−１３があるＡＤＡＭメタロペプチダーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）切断部位及びカテプシンＬ切断部位が挙げられる。不活性化切断部位の付加により、同じ又は類似しているがさらなる不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域が広くなる。
【００１６】
本明細の他の態様は、本明細において開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをコードするポリヌクレオチド分子を提供する。このようなクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをコードするポリヌクレオチド分子は、発現ベクターをさらに含み得る。
【００１７】
本明細の他の態様は、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを含む組成物を提供する。このようなクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを含む組成物は医薬組成物であり得る。このような医薬組成物は、本明細で開示される改変クロストリジウム毒素に加えて、医薬担体、医薬成分又はその両方を含み得る。
【００１８】
本明細の他の態様は、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを作製する方法を提供し、本方法は、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをコードするポリヌクレオチド分子を細胞で発現させる段階を含み、そのポリヌクレオチド分子からの発現によって、コードされるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラが産生される。他の態様において、本方法は、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをコードするポリヌクレオチド分子を細胞に導入する段階、およびこのポリヌクレオチド分子を発現させる段階を含み、このポリヌクレオチド分子からの発現により、コードされるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラが産生される。
【００１９】
クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・バラティ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂａｒａｔｉｉ）及びクロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）により産生されるクロストリジウム毒素は、ヒト及び他の哺乳動物の治療及び美容処置において最も広く使用されている。Ｃ．ボツリヌム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）株は、７種類の抗原性の異なるタイプのボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）を産生し、それらは、ヒト（ＢｏＮＴ／Ａ、／Ｂ、／Ｅ及び／Ｆ）、動物（ＢｏＮＴ／Ｃ１及び／Ｄ）でのボツリヌス中毒症発生を調べることによって同定されているか又は土壌から単離されている（ＢｏＮＴ／Ｇ）。ＢｏＮＴは、互いにおよそ３５％アミノ酸同一性を保持し、同じ機能的ドメイン編成及び全体的構造構成が共通する。クロストリジウム毒素の各タイプ内で、それらのアミノ酸配列及びまたこれらのタンパク質をコードする核酸において幾分異なるサブタイプがあり得ることが当業者により認識されている。例えば、現在、５種類のＢｏＮＴ／Ａサブタイプ、すなわちＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３、ＢｏＮＴ／Ａ４及びＢｏＮＴ／Ａ５があり、特定のサブタイプは、配列番号１のＢｏＮＴ／Ａサブタイプと比較した場合、約８４％から９３％のアミノ酸同一性を示す。別の例として、現在、５種類のＢｏＮＴ／Ｂサブタイプ、すなわちＢｏＮＴ／Ｂ１、ＢｏＮＴ／Ｂ２、ＢｏＮＴ／Ｂ３、ＢｏＮＴ／Ｂｎｐ及びＢｏＮＴ／Ｂｂｖがあり、特定のサブタイプは、配列番号６のＢｏＮＴ／Ｂサブタイプと比較した場合、約９３％から９６％のアミノ酸同一性を示す。また別の例として、現在、３種類のＢｏＮＴ／Ｅサブタイプ、すなわちＢｏＮＴ／Ｅ１、ＢｏＮＴ／Ｅ２及びＢｏＮＴ／Ｅ３があり、特定のサブタイプは、配列番号１５のＢｏＮＴ／Ｅサブタイプと比較した場合、約９５％から９９％のアミノ酸同一性を示す。７種類のＢｏＮＴ血清型全てが類似の構造及び薬理学的特性を有するが、これらが示す細菌学的特徴はそれぞれ異なる。対照的に、破傷風毒素（ＴｅＮＴ）はＣ．テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）の均一な群により産生される。他の２種類のクロストリジウム種である、Ｃ．バラティ（Ｃ．ｂａｒａｔｉｉ）及びＣ．ブチリカム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）は、それぞれＢｏＮＴ／Ｆ及びＢｏＮＴ／Ｅと類似する毒素、ＢａＮＴ及びＢｕＮＴを産生する。
【００２０】
クロストリジウム毒素はそれぞれ、およそ１５０ｋＤａの１本鎖ポリペプチドとして翻訳され、続いてこれは天然起源のプロテアーゼによりジスルフィドループ内でタンパク質分解性切断によって切断される（図１）。この切断は、ジスルフィド架橋を形成する２個のシステイン残基間で生じる別個の２本鎖ループ領域内で起こる。この翻訳後プロセシングによって、２本の鎖の間の単一のジスルフィド結合及び非共有相互作用によって一緒に保持されるおよそ５０ｋＤａ軽鎖（ＬＣ）及びおよそ１００ｋＤａ重鎖（ＨＣ）を含む２本鎖分子が得られる。１本鎖分子を２本鎖に変換するために使用される天然起源のプロテアーゼは現在のところ知られていない。例えばＢｏＮＴ／Ａなど、一部の血清型において、細菌血清型によって内因的に天然起源のプロテアーゼが産生され、周辺環境に毒素が放出される前に細胞内で切断が起こる。しかし、例えばＢｏＮＴ／Ｅなど、他の血清型において、細菌株は、毒素の１本鎖形態を２本鎖形態に変換することができる内因性プロテアーゼを産生しないと思われる。これらの状況において、本毒素は、１本鎖毒素として細胞から放出され、続いてこれが、周辺環境で見出される天然起源のプロテアーゼによって２本鎖形態に変換される。
【００２１】
各成熟２本鎖分子は、以下の３個の機能的に別個のドメインを含む：１）神経伝達物質放出装置のコア成分を特異的に標的とする亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性を含有するメタロプロテアーゼ領域を含むＬＣに位置する酵素ドメイン；２）細胞内小胞から標的細胞の細胞質へのＬＣの放出を促進する、ＨＣ（ＨＮ）のアミノ末端側半分内に含有される転移ドメイン；及び３）標的細胞の表面に位置する受容体複合体への毒素の結合活性及び結合特異性を決定する、ＨＣ（ＨＣ）のカルボキシル末端側半分内で見出される結合ドメイン。Ｄ．Ｂ．Ｌａｃｙ及びＲ．Ｃ．Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９１：１０９１−１１０４（１９９９）。ＨＣドメインは、概ね同等な大きさで、αへリックスにより分離され、ＨＣＮ及びＨＣＣサブドメインと呼ばれる、２個の別個の構造特性を含む。表１は、例示的なクロストリジウム毒素で見られる各ドメイン及びサブドメインに対するおおよその境界領域を与える。
【表１】
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【００２２】
これらの３個の機能ドメインの結合、転移及び酵素活性は、全て毒性に必要である。この過程の全詳細はまだ正確に分かっていないが、クロストリジウム毒素がニューロンに侵入し、神経伝達物質放出を阻害する全体的な細胞中毒機構は、血清型又はサブタイプにかかわらず同様である。出願者らは、次の記載により限定されることを望んではいないが、中毒機構は、少なくとも４段階、すなわち１）受容体結合、２）複合体内部移行、３）軽鎖転移及び４）酵素標的修飾を含むものとして説明することができる（図３）。この過程は、クロストリジウム毒素のＨＣドメインが、標的細胞の形質膜表面に位置する毒素特異的な受容体系に結合する際に開始される。受容体複合体の結合特異性は、部分的に、各クロストリジウム毒素受容体複合体を別個に含むと思われるガングリオシド及びタンパク質受容体の特異的な組み合わせによって達成されると考えられる。結合すると、毒素／受容体複合体はエンドサイトーシスにより内部に移行し、内部に移行した小胞が特異的な細胞内経路に選別される。転移段階は、小胞区画の酸性化により惹起されると思われる。この過程は、疎水性を向上させ、毒素の２本鎖形態の形成を促進する２つの重要なｐＨ依存性の構造再編成を開始させると考えられる。活性化されると、細胞内小胞から細胞質に毒素の軽鎖エンドペプチダーゼが放出され、ここで、この軽鎖エンドペプチダーゼは神経伝達物質放出装置の３種類の既知の成分の１つを特異的に標的とすると思われる。これらのコアタンパク質、すなわち小胞結合膜タンパク質（ＶＡＭＰ）／シナプトブレビン、２５ｋＤａのシナプトソーム関連タンパク質（ＳＮＡＰ−２５）及びシンタキシンは、神経末端でのシナプス小胞ドッキング及び融合に必要であり、可溶性Ｎ−エチルマレイミド−感受性因子連結タンパク質−受容体（ＳＮＡＲＥ）ファミリーのメンバーを構成する。ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｅは、カルボキシル末端領域においてＳＮＡＰ−２５を切断し、９又は２６個のアミノ酸セグメントをそれぞれ放出して、ＢｏＮＴ／Ｃ１もまたカルボキシル末端付近でＳＮＡＰ−２５を切断する。ボツリヌス血清型、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｆ及びＢｏＮＴ／Ｇ及び破傷風毒素は、ＶＡＭＰの保存的な中央部で作用し、ＶＡＭＰのアミノ末端部分を細胞質に放出させる。ＢｏＮＴ／Ｃ１は、細胞質膜表面付近の１つの部位でシンタキシンを切断する。シナプスＳＮＡＲＥの選択的タンパク質分解は、インビボでクロストリジウム毒素により引き起こされる神経伝達物質放出のブロックの原因である。クロストリジウム毒素のＳＮＡＲＥタンパク質標的は、様々な非ニューロン型においてエキソサイトーシスに共通し；これらの細胞において、ニューロンにおけるように、軽鎖ぺプチダーゼ活性はエキソサイトーシスを阻害する。例えば、Ｙａｎｎ  Ｈｕｍｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｏｗ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  Ｂｌｏｃｋ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  Ｒｅｌｅａｓｅ，８２（５）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．４２７−４４６（２０００）；Ｋａｔｈｒｙｎ  Ｔｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ：Ｓｔｒ���ｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｔｉｌｉｔｙ，２７（１１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．５５２−５５８．（２００２）；Ｇｉｏｖａｎｎａ  Ｌａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎｅｙ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｎｓ，１１（９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３１−４３７，（２００３）を参照のこと。
【００２３】
ＴｅＮＴのＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ及びＨＣドメインの三次元結晶構造から、クロストリジウム神経毒素のこの３つの機能ドメインが、全クロストリジウム毒素に共通する、構造的に別個のドメインであることが示される。軽鎖のＨＥＸＸＨコンセンサスモチーフは、チャネルにより接近可能である、タンパク質表面の深い間隙に位置する触媒部位の４面体亜鉛結合ポケットを形成する。ＨＮ及びＨＣドメインの構造は、１個のαへリックスが連結するβ−シートトポロジーから主として構成される。円筒状のＨＮドメインは、一部のウイルスタンパク質で見られるコイルドコイルモチーフに類似している２個の長い両親媒性α−へリックスを含む。ＨＮドメインはまた、「転移ベルト」と呼ばれる長い非構造ループも形成するが、これは、活性部位の触媒結合ポケットへの亜鉛原子の接近を阻止する、軽鎖の負に荷電した大きな間隙周囲を包み込む。ＨＣドメインは、機能を示すほぼ同じ大きさの２つの別個の構造特性を含む。第一に、ＨＣＮドメインと呼ばれるものは、ＨＣドメインのアミノ側半分に位置する。ＨＣＮドメインは、β−バレル、ゼリーロールフォールドを形成する。ＨＣＣドメインは、ＨＣドメインをなす第二のドメインである。このカルボキシル末端ドメインは、例えば血清アミロイドＰ、シアリダーゼ、ｃｒｙｉａ、殺虫性−∂内毒素及びレクチンなどの多くの糖結合タンパク質中で見出される炭水化物結合部分に類似した３つの別個の炭水化物結合領域を形成する、改変β−トレフォイルドメインを含む。生化学的研究から、ＨＣＣドメインのβ−トレフォイルドメイン構造が細胞表面上のクロストリジウム毒素受容体の成分を含有する特異的な炭水化物への結合に介在するようであることが示されている。例えばＫｒｚｙｓｚｔｏｆ  Ｇｉｎａｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｅｔａ−Ｔｒｅｆｏｉｌ  Ｓｕｂｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｒｏｖｉｄｅｓ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｌｅｖｅｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ａｂｏｕｔ  ｔｈｅ  Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ，４８２（１−２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１１９−１２４（２０００）を参照のこと。ＨＣドメインは、ＨＮドメインから傾き離れ、表面ループを露出させ、それらが結合のために接近できるようにする。軽鎖とＨＣドメインとの間に接触は起こらない。
【００２４】
本明細の態様は、ある部分においては、クロストリジウム毒素を提供する。本明細書中で使用される場合、「クロストリジウム毒素」という用語は、クロストリジウム毒素が細胞を中毒化する全体的な細胞機構を遂行することができるクロストリジウム毒素株により産生される何らかの神経毒素を指し、低又は高親和性受容体複合体に対するクロストリジウム毒素の結合、毒素／受容体複合体の内部移行、細胞質へのクロストリジウム毒素軽鎖の転移及びクロストリジウム毒素基質の酵素性修飾を包含する。クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含む。例示的なクロストリジウム毒素としては、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・バラティ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂａｒａｔｉｉ）及びクロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）により産生されるものが挙げられる。
【００２５】
クロストリジウム毒素としては、天然起源のクロストリジウム毒素変異体、例えばクロストリジウム毒素アイソフォーム及びクロストリジウム毒素サブタイプなど；非天然のクロストリジウム毒素変異体、例えば保存的クロストリジウム毒素変異体、非保存的クロストリジウム毒素変異体及びそれらの活性のあるクロストリジウム毒素断片又はそれらの何らかの組み合わせなどが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書中で使用される場合、「クロストリジウム毒素変異体」という用語は、天然であれ非天然であれ、開示される参照配列（表１）の対応する領域からの少なくとも１つのアミノ酸の変化を有するクロストリジウム毒素を指し、その参照配列の対応する領域に対する同一性パーセントとして記載され得る。非限定例として、配列番号１のＢｏＮＴ／Ａ変異体は、配列番号１の対応する位置と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；配列番号６のＢｏＮＴ／Ｂ変異体は、配列番号６の対応する位置と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；配列番号１１のＢｏＮＴ／Ｃ１変異体は、配列番号１１の対応する位置と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；配列番号１３のＢｏＮＴ／Ｄ変異体は、配列番号１３の対応する位置と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；配列番号１５のＢｏＮＴ／Ｅ変異体は、配列番号１５の対応する位置と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；配列番号１８のＢｏＮＴ／Ｆ変異体は、配列番号１８の対応する位置と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；配列番号２１のＢｏＮＴ／Ｇ変異体は、配列番号２１の対応する位置と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；配列番号２２のＴｅＮＴ変異体は、配列番号２２の対応する位置と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；配列番号２３のＢａＮＴ変異体は、配列番号２３の対応する位置と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；配列番号２４のＢｕＮＴ変異体は、配列番号２４の対応する位置と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有する。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「天然起源のクロストリジウム毒素変異体」という用語は、何ら人間の操作による補助なく産生される何らかのクロストリジウム毒素を指し、オルタナティブスプライシングを受けた転写物から産生されるクロストリジウム毒素アイソフォーム、自然突然変異により産生されるクロストリジウム毒素アイソフォーム及びクロストリジウム毒素サブタイプが挙げられるがこれらに限定されない。クロストリジウム毒素アイソフォームの非限定例としては、例えば、ＢｏＮＴ／Ａアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｂアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｃ１アイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｄアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｅアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｆアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｇアイソフォーム、ＴｅＮＴアイソフォーム、ＢａＮＴアイソフォーム及びＢｕＮＴアイソフォームが挙げられる。クロストリジウム毒素サブタイプの非限定例としては、例えば、ＢｏＮＴ／ＡサブタイプであるＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３、ＢｏＮＴ／Ａ４及びＢｏＮＴ／Ａ５；ＢｏＮＴ／ＢサブタイプであるＢｏＮＴ／Ｂ１、ＢｏＮＴ／Ｂ２、ＢｏＮＴ／Ｂ３、ＢｏＮＴ／Ｂ二価及びＢｏＮＴ／Ｂ非タンパク質分解性；ＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプであるＢｏＮＴ／Ｃ１−１及びＢｏＮＴ／Ｃ１−２；ＢｏＮＴ／ＥサブタイプであるＢｏＮＴ／Ｅ１、ＢｏＮＴ／Ｅ２及びＢｏＮＴ／Ｅ３；ＢｏＮＴ／ＦサブタイプであるＢｏＮＴ／Ｆ１、ＢｏＮＴ／Ｆ２及びＢｏＮＴ／Ｆ３；及びＢｕＮＴサブタイプであるＢｕＮＴ−１及びＢｕＮＴ−２が挙げられる。クロストリジウム毒素サブタイプの他の非限定例としては、例えば、ＢｏＮＴ／Ａサブタイプである配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５；ＢｏＮＴ／Ｂサブタイプである配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０；ＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプである配列番号１１及び配列番号１２；ＢｏＮＴ／Ｅサブタイプである配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７；ＢｏＮＴ／Ｆサブタイプである配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０；及びＢｕＮＴサブタイプである配列番号２４及び配列番号２５が挙げられる。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「非天然クロストリジウム毒素変異体」という用語は、人間による操作のもと産生される何らかのクロストリジウム毒素を指し、無作為変異誘発又は合理的設計を用いて遺伝子改変することにより作製されるクロストリジウム毒素及び化学合成により作製されるクロストリジウム毒素が挙げられるがこれらに限定されない。非天然クロストリジウム毒素変異体の非限定例としては、例えば、保存的クロストリジウム毒素変異体、非保存的クロストリジウム毒素変異体及び活性のあるクロストリジウム毒素断片が挙げられる。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「保存的クロストリジウム毒素変異体」という用語は、少なくとも１つの特性が参照クロストリジウム毒素配列（表１）からの元のアミノ酸の特性と同様である別のアミノ酸又はアミノ酸類似体によって少なくとも１つのアミノ酸が置換されている、クロストリジウム毒素を指す。特性の例としては、同様の大きさ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能、水素結合能、物理化学的特性など又はそれらの何らかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。保存的クロストリジウム毒素変異体は、その保存的クロストリジウム毒素変異体が基づく参照クロストリジウム毒素と実質的に同じように機能し得、本明細のいずれの態様においても参照クロストリジウム毒素と置き換えられ得る。保存的クロストリジウム毒素変異体は、その保存的クロストリジウム毒素変異体が基づく参照クロストリジウム毒素から１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００又は５００個以上のアミノ酸を置換し得る。保存的クロストリジウム毒素変異体はまた、その保存的クロストリジウム毒素変異体が基づく参照クロストリジウム毒素から少なくとも５、１０、１５、２０又は２５連続アミノ酸も置換し得る。保存的クロストリジウム毒素変異体の非限定例としては、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａ変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｂ変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｄ変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｅ変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｆ変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｇ変異体、保存的ＴｅＮＴ変異体、保存的ＢａＮＴ変異体及び保存的ＢｕＮＴ変異体が挙げられる。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「非保存的クロストリジウム毒素変異体という用語は、１）少なくとも１つのアミノ酸がその非保存的クロストリジウム毒素変異体が基づく参照クロストリジウム毒素から欠失しているか；２）少なくとも１つのアミノ酸がその非保存的クロストリジウム毒素が基づく参照クロストリジウム毒素に付加されているか；又は３）少なくとも１つのアミノ酸が、参照クロストリジウム毒素配列（表１）からの元のアミノ酸の特性と類似の特性を何ら共有しない別のアミノ酸又はアミノ酸類似体により置換されている、クロストリジウム毒素を指す。非保存的クロストリジウム毒素変異体は、その非保存的クロストリジウム毒素変異体が基づく参照クロストリジウム毒素と実質的に同じように機能し得、本明細のいずれの態様においても、参照クロストリジウム毒素と置き換えられ得る。非保存的クロストリジウム毒素変異体は、その非保存的クロストリジウム毒素変異体が基づく参照クロストリジウム毒素から、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸及び１０以上のアミノ酸が欠失しているものであり得る。非保存的クロストリジウム毒素変異体は、その非保存的クロストリジウム毒素変異体が基づく参照クロストリジウム毒素に、１以上のアミノ酸、２以上のアミノ酸、３以上のアミノ酸、４以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸及び１０以上のアミノ酸が付加しているものであり得る。非保存的クロストリジウム毒素変異体は、その非保存的クロストリジウム毒素変異体が基づく参照クロストリジウム毒素から、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００又は５００個以上のアミノ酸が置換されているものであり得る。非保存的クロストリジウム毒素変異体はまた、その非保存的クロストリジウム毒素変異体が基づく参照クロストリジウム毒素から、少なくとも５、１０、１５、２０又は２５連続アミノ酸が置換されているものであり得る。非保存的クロストリジウム毒素変異体の非限定例としては、例えば非保存的ＢｏＮＴ／Ａ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ変異体、非保存的ＴｅＮＴ変異体、非保存的ＢａＮＴ変異体及び非保存的ＢｕＮＴ変異体が挙げられる。
【００３０】
様々なクロストリジウム毒素断片の何れも本明細の態様において有用であり得ることも想定されるが、ただし、これらの活性断片は、クロストリジウム毒素が基質をタンパク質分解性に切断する全体的な細胞性機構を遂行することができるものとする。従って、この実施形態の態様は、例えば、少なくとも６００、７００、８００、９００、１０００、１１００又は少なくとも１２００アミノ酸長を有するクロストリジウム毒素断片を含み得る。この実施形態の他の態様は、例えば、最長で６００、７００、８００、９００、１０００、１１００又は最長で１２００アミノ酸長であるクロストリジウム毒素断片を含み得る。
【００３１】
軽鎖を含む様々なクロストリジウム毒素断片の何れも、本明細の態様において有用であることも想定されるが、ただし、これらの軽鎖断片は神経伝達物質放出装置のコア成分を特異的に標的とし、従って、クロストリジウム毒素がタンパク質分解性に基質を切断する全体的な細胞性機構の遂行に関与し得るものとする。クロストリジウム毒素の軽鎖はおよそ４２０〜４６０アミノ酸長であり、クロストリジウム毒素酵素ドメインを含む（表１）。研究から、クロストリジウム毒素酵素ドメインの酵素活性にとって、クロストリジウム毒素軽鎖の全長が必要なわけではないことが示されている。非限定例として、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の最初の８個のアミノ酸は酵素活性に必要ではない。別の非限定例として、ＴｅＮＴ軽鎖の最初の８個のアミノ酸は酵素活性に必要ではない。同様に、軽鎖のカルボキシル末端は活性に必要ではない。非限定例として、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の最後の３２個のアミノ酸は酵素活性に必要ではない。別の非限定例として、ＴｅＮＴ軽鎖の最後の３１アミノ酸は酵素活性に必要ではない。従って、この実施形態の態様は、例えば、少なくとも３５０、３７５、４００、４２５又は４５０アミノ酸長のクロストリジウム毒素酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含む。この実施形態の他の態様は、例えば、最長で３５０、３７５、４００、４２５又は４５０アミノ酸長のクロストリジウム毒素酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含む。
【００３２】
本明細の態様においてクロストリジウム毒素転移ドメインを含む様々なクロストリジウム毒素ＨＮ領域の何れも有用であり得ることも想定されるが、ただしこれらの活性断片は細胞内小胞から標的細胞の細胞質へのＬＣの放出を促進し、従って、クロストリジウム毒素がタンパク質分解性に基質を切断する全体的な細胞性機構の遂行に関与し得るものとする。クロストリジウム毒素の重鎖からのＨＮ領域はおよそ４１０〜４３０アミノ酸長であり、クロストリジウム毒素転移ドメインを含む（表１）。研究から、クロストリジウム毒素重鎖からのＨＮ領域の全長がクロストリジウム毒素転移ドメインの転移活性に必要なわけではないことが示されている。従って、この実施形態の態様は、例えば、少なくとも３５０、３７５、４００又は４２５個のアミノ酸長のクロストリジウム毒素転移ドメインを含むクロストリジウム毒素ＨＮ領域を含み得る。この実施形態の他の態様は、例えば、最長で３５０、３７５、４００又は４２５アミノ酸長のクロストリジウム毒素転移ドメインを含むクロストリジウム毒素ＨＮ領域を含み得る。
【００３３】
クロストリジウム毒素結合ドメインを含む様々なクロストリジウム毒素ＨＣ領域の何れも本明細の態様において有用であり得ることも想定されるが、ただし、これらの活性断片は、標的細胞の表面にある受容体複合体への毒素の結合活性及び結合特異性を決定し、クロストリジウム毒素がタンパク質分解性に基質を切断する全体的な細胞性機構を促進することができるものとする。クロストリジウム毒素の重鎖からのＨＣ領域は、およそ４００〜４４０アミノ酸長であり、結合ドメインを含む（表１）。研究から、クロストリジウム毒素重鎖からのＨＣ領域の全長がクロストリジウム毒素結合ドメインの結合活性に必要なわけではないことが示されている。従って、この実施形態の態様は、例えば、少なくとも３５０、３７５、４００又は４２５アミノ酸長の結合ドメインを含むクロストリジウム毒素ＨＣ領域を含み得る。この実施形態の他の態様は、例えば、最長で３５０、３７５、４００又は４２５アミノ酸長の結合ドメインを含むクロストリジウム毒素ＨＣ領域を含み得る。
【００３４】
包括的方法、ローカル法及びハイブリッド法、例えばセグメントアプローチ法などを含むがこれらに限定されない様々な配列アラインメント法の何れかを使用して同一性パーセントを決定することができる。同一性パーセントを決定するためのプロトコールは、当業者の範囲内の及び本明細書中の教示からの通例の手段である。
【００３５】
包括的方法は、分子の最初から最後までの配列を並べ、個々の残基ペアのスコアを加算することによって及びギャップペナルティーを課すことによって最良のアラインメントを決定する。非限定法としては例えばＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（例えば、Ｊｕｌｉｅ  Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｃｈｏｉｃｅ，２２（２２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４６７３−４６８０（１９９４）を参照）；及び反復改良法（例えば、Ｏｓａｍｕ  Ｇｏｔｏｈ，Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｂｙ  Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ａｓ  Ａｓｓｅｓｓｅｄ  ｂｙ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ，２６４（４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８２３−８３８（１９９６）を参照）が挙げられる。
【００３６】
ローカル法は、入力配列の全てが共有する１以上の保存モチーフを特定することによって配列を並べる。非限定法としては例えば、Ｍａｔｃｈ−ｂｏｘ（例えばＥｒｉｃ  Ｄｅｐｉｅｒｅｕｘ  ａｎｄ  Ｅｒｎｅｓｔ  Ｆｅｙｔｍａｎｓ，Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ：Ａ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｌｙ  Ｎｅｗ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｅｖｅｒａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，８（５）ＣＡＢＩＯＳ  ５０１−５０９（１９９２）を参照）；ギブズサンプリング（例えば、Ｃ．Ｅ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｓｕｂｔｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｉｇｎａｌｓ：Ａ  Ｇｉｂｂｓ  Ｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ，２６２（５１３１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０８−２１４（１９９３）参照）；Ａｌｉｇｎ−Ｍ（例えば、Ｉｖｏ  Ｖａｎ  Ｗａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｉｇｎ−Ｍ−Ａ  Ｎｅｗ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，２０（９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，：１４２８−１４３５（２００４）を参照）が挙げられる。
【００３７】
ハイブリッド法は、包括的及びローカルアラインメント法の両方の機能的側面を組み合わせる。非限定的な方法は例えば次のものを含む：セグメント対セグメント比較（例えば、Ｂｕｒｋｈａｒｄ  Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｂａｓｅｄ  Ｏｎ  Ｓｅｇｍｅｎｔ−Ｔｏ−Ｓｅｇｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，９３（２２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１２０９８−１２１０３（１９９６）参照）；Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅ（例えば、Ｃｅｄｒｉｃ  Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅ：Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ，３０２（１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０５−２１７（２０００）参照）；ＭＵＳＣＬＥ（例えば、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃ．Ｅｄｇａｒ，ＭＵＳＣＬＥ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｓｃｏｒｅ  Ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ，３２（５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７９２−１７９７（２００４）参照）；及びＤＩＡＬＩＧＮ−Ｔ（例えばＡｍａｒｅｎｄｒａｎ  Ｒ  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＡＬＩＧＮ−Ｔ：Ａｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｓｅｇｍｅｎｔ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ，６（１）ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ６６（２００５）を参照）が挙げられる。
【００３８】
本明細は、例えばクロストリジウム毒素変異体、クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、クロストリジウム毒素転移ドメイン変異体、クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体及びプロテアーゼ切断部位変異体など、１つのアミノ酸が別のもので置換されている様々なポリペプチド変異体を記載する。例えば置換されているアミノ酸の物理的特性（表２）又は元のアミノ酸がどのように置換に耐えるか（表３）など、様々な因子によって、置換を評価することができる。ポリペプチド中でどのアミノ酸が別のアミノ酸に対して置換され得るかの選択は当業者にとって公知である。
【表２】
2018012696.tif 000003
【表３】
2018012696.tif 000004
【００３９】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含む。この実施形態の態様において、クロストリジウム毒素は、天然起源のクロストリジウム毒素変異体、例えば、クロストリジウム毒素アイソフォーム又はクロストリジウム毒素サブタイプなどを含む。この実施形態の別の態様において、クロストリジウム毒素は、非天然のクロストリジウム毒素変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素変異体、非保存的クロストリジウム毒素変異体又は活性のあるクロストリジウム毒素断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態の別の態様において、クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素酵素ドメインもしくは活性のあるその断片、クロストリジウム毒素転移ドメインもしくは活性のあるその断片、クロストリジウム毒素結合ドメインもしくは活性のあるその断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態の他の態様において、クロストリジウム毒素は、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＴｅＮＴ、ＢａＮＴ又はＢｕＮＴを含み得る。
【００４０】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素のポリペプチド鎖のある特定の位置の疎水性アミノ酸は、別の疎水性アミノ酸で置換され得る。疎水性アミノ酸の例としては、例えば、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ及びＷが挙げられる。この実施形態の別の態様において、クロストリジウム毒素のポリペプチド鎖のある特定の位置の脂肪族アミノ酸を別の脂肪族アミノ酸で置換し得る。脂肪族アミノ酸の例としては、例えば、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｐ及びＶが挙げられる。この実施形態のまた別の態様において、クロストリジウム毒素のポリペプチド鎖のある特定の位置の芳香族アミノ酸を別の芳香族アミノ酸で置換し得る。芳香族アミノ酸の例としては、例えば、Ｆ、Ｈ、Ｗ及びＹが挙げられる。この実施形態のさらに別の態様において、クロストリジウム毒素のポリペプチド鎖のある特定の位置のスタッキングアミノ酸を別のスタッキングアミノ酸で置換し得る。スタッキングアミノ酸の例としては、例えば、Ｆ、Ｈ、Ｗ及びＹが挙げられる。この実施形態のさらなる態様において、クロストリジウム毒素のポリペプチド鎖のある特定の位置の極性アミノ酸を別の極性アミノ酸で置換し得る。極性アミノ酸の例としては、例えば、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｑ及びＲが挙げられる。この実施形態のさらなる態様において、クロストリジウム毒素のポリペプチド鎖のある特定の位置の低極性又は中性的アミノ酸を別の低極性又は中性的アミノ酸で置換し得る。低極性又は中性的アミノ酸の例としては、例えば、Ａ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ及びＹが挙げられる。この実施形態のまたさらなる態様において、クロストリジウム毒素のポリペプチド鎖のある特定の位置の正に荷電したアミノ酸を別の正に荷電したアミノ酸で置換し得る。正に荷電したアミノ酸の例としては例えば、Ｋ、Ｒ及びＨが挙げられる。この実施形態のまたさらなる態様において、クロストリジウム毒素のポリペプチド鎖のある特定の位置の負に荷電したアミノ酸を別の負に荷電したアミノ酸で置換し得る。負に荷電したアミノ酸の例としては、例えば、Ｄ及びＥが挙げられる。この実施形態の別の態様において、クロストリジウム毒素のポリペプチド鎖のある特定の位置の小型アミノ酸を別の小型アミノ酸で置換し得る。小型アミノ酸の例としては、例えば、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ及びＴが挙げられる。この実施形態のまた別の態様において、クロストリジウム毒素のポリペプチド鎖のある特定の位置のＣ−β分岐型アミノ酸を別のＣ−β分岐型アミノ酸で置換し得る。Ｃ−β分岐型アミノ酸の例としては例えば、Ｉ、Ｔ及びＶが挙げられる。
【００４１】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素はＢｏＮＴ／Ａを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ａは、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａは、天然起源のＢｏＮＴ／Ａ変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ａアイソフォーム又はＢｏＮＴ／Ａサブタイプなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の天然起源のＢｏＮＴ／Ａ変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ａアイソフォーム又はＢｏＮＴ／Ａサブタイプなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａは、非天然のＢｏＮＴ／Ａ変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ変異体もしくは活性のあるＢｏＮＴ／Ａ断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の非天然のＢｏＮＴ／Ａ変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ａ断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のまた別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａは、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインもしくは活性のあるその断片、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインもしくは活性のあるその断片、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインもしくは活性のあるその断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のまた別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａは、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５又は活性のあるその断片、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５のＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインもしくは活性のあるその断片、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５のＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインもしくは活性のあるその断片又はそれらの何らかの組み合わせを含む。
【００４２】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に対して、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％；又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％又は最大で９５％の、アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００又は５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００又は５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００又は５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００又は５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【００４３】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素はＢｏＮＴ／Ｂを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂは、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｂ変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｂアイソフォーム又はＢｏＮＴ／Ｂサブタイプなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０の天然起源のＢｏＮＴ／Ｂ変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｂアイソフォーム又はＢｏＮＴ／Ｂサブタイプなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂは、非天然のＢｏＮＴ／Ｂ変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｂ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｂ断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０の非天然のＢｏＮＴ／Ｂ変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｂ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｂ断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のまた別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂは、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメインもしくは活性のあるその断片、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメインもしくは活性のあるその断片、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインもしくは活性のあるその断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のまた別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０のＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン又は活性のあるその断片、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０のＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン又は活性のあるその断片、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０のＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン又は活性のあるその断片、又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【００４４】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂは、例えば、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％又は最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂは、例えば、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂは、例えば、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【００４５】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素はＢｏＮＴ／Ｃ１を含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、配列番号１１又は配列番号１２を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、天然起源のＢｏＮＴ／Ｃ１変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｃ１アイソフォーム又はＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、配列番号１１又は配列番号１２の天然起源のＢｏＮＴ／Ｃ１変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｃ１アイソフォーム又はＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、非天然のＢｏＮＴ／Ｃ１変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｃ１断片又はそれらの何らかの組み合わせを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、配列番号１１又は配列番号１２の非天然のＢｏＮＴ／Ｃ１変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｃ１断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のまた別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメインもしくは活性のあるその断片、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメインもしくは活性のあるその断片、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン、活性のあるその断片又はそれらの何らかの組み合わせを含む。この実施形態のまた別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、配列番号１１もしくは配列番号１２のＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン又は活性のあるその断片、配列番号１１もしくは配列番号１２のＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン又は活性のあるその断片、配列番号１１もしくは配列番号１２のＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン又は活性のあるその断片、又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【００４６】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、例えば、配列番号１１もしくは配列番号１２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１１もしくは配列番号１２に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、例えば、配列番号１１もしくは配列番号１２に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号１１もしくは配列番号１２に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、例えば、配列番号３に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号１１もしくは配列番号１２に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【００４７】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素はＢｏＮＴ／Ｄを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄは、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄは、配列番号１３又は配列番号１４を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｄ変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｄアイソフォーム又はＢｏＮＴ／Ｄサブタイプなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄは、配列番号１３又は配列番号１４の天然起源のＢｏＮＴ／Ｄ変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｄアイソフォーム又はＢｏＮＴ／Ｄサブタイプなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄは、非天然のＢｏＮＴ／Ｄ変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｄ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｄ断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄは、配列番号１３又は配列番号１４の非天然のＢｏＮＴ／Ｄ変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｄ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｄ断片又はそれらの何らかの組み合わせなど含む。この実施形態のまた別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄは、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメインもしくは活性のあるその断片、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメインもしくは活性のあるその断片、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインもしくは活性のあるその断片又はそれらの何らかの組み合わせ含む。この実施形態のまた別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄは、配列番号１３もしくは配列番号１４のＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン又は活性のあるその断片、配列番号１３もしくは配列番号１４のＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン又は活性のあるその断片、配列番号１３もしくは配列番号１４のＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン又は活性のあるその断片、又はそれらの何らかの組み合わせを含む。
【００４８】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄは、例えば、配列番号１３もしくは配列番号１４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１３もしくは配列番号１４に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄは、例えば、配列番号１３もしくは配列番号１４に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号１３もしくは配列番号１４に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄは、例えば、配列番号１３もしくは配列番号１４に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号１３もしくは配列番号１４に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチド含む。
【００４９】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素はＢｏＮＴ／Ｅを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅは、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅは、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｅ変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｅアイソフォーム又はＢｏＮＴ／Ｅサブタイプなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅは、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７の天然起源のＢｏＮＴ／Ｅ変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｅアイソフォーム又はＢｏＮＴ／Ｅサブタイプなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅは、非天然のＢｏＮＴ／Ｅ変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｅ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｅ断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅは、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７の非天然のＢｏＮＴ／Ｅ変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｅ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｅ断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のまた別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅは、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメインもしくは活性のあるその断片、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメインもしくは活性のあるその断片、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインもしくは活性のあるその断片又はそれらの何らかの組み合わせを含む。この実施形態のまた別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅは、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７のＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン又は活性のあるその断片、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７のＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン又は活性のあるその断片、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７のＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン又は活性のあるその断片、又はそれらの何らかの組み合わせを含む。
【００５０】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅは、例えば、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅは、例えば、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅは、例えば、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【００５１】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素はＢｏＮＴ／Ｆを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆは、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆは、配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｆ変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｆアイソフォーム又はＢｏＮＴ／Ｆサブタイプなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆは、配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０の天然起源のＢｏＮＴ／Ｆ変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｆアイソフォーム又はＢｏＮＴ／Ｆサブタイプなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆは、非天然のＢｏＮＴ／Ｆ変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｆ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｆ断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆは、配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０の非天然のＢｏＮＴ／Ｆ変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｆ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｆ断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のまた別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆは、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメインもしくは活性のあるその断片、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメインもしくは活性のあるその断片、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインもしくは活性のあるその断片又はそれらの何らかの組み合わせを含む。この実施形態のまた別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆは、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０のＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン又は活性のあるその断片、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０のＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン又は活性のあるその断片、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０のＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン又活性のあるその断片、又はそれらの何らかの組み合わせを含む。
【００５２】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆは、例えば、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆは、例えば、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８，９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆは、例えば、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【００５３】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素はＢｏＮＴ／Ｇを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇは、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇは配列番号２１を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｇ変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｇアイソフォーム又はＢｏＮＴ／Ｇサブタイプなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇは、配列番号２１の天然起源のＢｏＮＴ／Ｇ変異体、例えば、配列番号２１のＢｏＮＴ／Ｇアイソフォーム又はＢｏＮＴ／Ｇサブタイプなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇは、非天然のＢｏＮＴ／Ｇ変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｇ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ変異体もしくは活性のあるＢｏＮＴ／Ｇ断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄは、配列番号２１の非天然のＢｏＮＴ／Ｇ変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｇ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｇ断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のまた別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇは、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインもしくは活性のあるその断片、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメインもしくは活性のあるその断片、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインもしくは活性のあるその断片又はそれらの何らかの組み合わせを含む。この実施形態のまた別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇは、配列番号２１のＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインもしくは活性のあるその断片、配列番号２１のＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメインもしくは活性のあるその断片、配列番号２１のＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインもしくは活性のあるその断片又はそれらの何らかの組み合わせを含む。
【００５４】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇは、例えば、配列番号２１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２１に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇは、例えば、配列番号２１に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号２１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９，１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇは、例えば、配列番号２１に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号２１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【００５５】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素はＴｅＮＴを含む。この実施形態の態様において、ＴｅＮＴは、ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ転移ドメイン及びＴｅＮＴ結合ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＴｅＮＴは、配列番号２２を含む。この実施形態の別の態様において、ＴｅＮＴは、天然起源のＴｅＮＴ変異体、例えば、ＴｅＮＴアイソフォーム又はＴｅＮＴサブタイプなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＴｅＮＴは、配列番号２２の天然起源のＴｅＮＴ変異体、例えば、ＴｅＮＴアイソフォーム又はＴｅＮＴサブタイプを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＴｅＮＴは、非天然のＴｅＮＴ変異体、例えば、保存的ＴｅＮＴ変異体、非保存的ＴｅＮＴ変異体、活性のあるＴｅＮＴ断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＴｅＮＴは、配列番号２２の非天然のＴｅＮＴ変異体、例えば、保存的ＴｅＮＴ変異体、非保存的ＴｅＮＴ変異体、活性のあるＴｅＮＴ断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のまた別の態様において、ＴｅＮＴは、ＴｅＮＴ酵素ドメインもしくは活性のあるその断片、ＴｅＮＴ転移ドメインもしくは活性のあるその断片、ＴｅＮＴ結合ドメインもしくは活性のあるその断片又はそれらの何らかの組み合わせを含む。この実施形態のまた別の態様において、ＴｅＮＴは、配列番号２２のＴｅＮＴ酵素ドメインもしくは活性のあるその断片、配列番号２２のＴｅＮＴ転移ドメインもしくは活性のあるその断片、配列番号２２のＴｅＮＴ結合ドメインもしくは活性のあるその断片又はそれらの何らかの組み合わせを含む。
【００５６】
この実施形態の他の態様において、ＴｅＮＴは、例えば、配列番号２２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２２に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＴｅＮＴは、例えば、配列番号２２に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号２２に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＴｅＮＴは、例えば、配列番号２２に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号２２対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【００５７】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素はＢａＮＴを含む。この実施形態の態様において、ＢａＮＴは、ＢａＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ転移ドメイン及びＢａＮＴ結合ドメインを含む。この実施形態の別の態様において、ＢａＮＴは配列番号２３を含む。この実施形態の別の態様において、ＢａＮＴは、天然起源のＢａＮＴ変異体、例えば、ＢａＮＴアイソフォーム又はＢａＮＴサブタイプなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢａＮＴは、配列番号２３の天然起源のＢａＮＴ変異体、例えば、ＢａＮＴアイソフォーム又はＢａＮＴサブタイプなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢａＮＴは、非天然のＢａＮＴ変異体、例えば、保存的ＢａＮＴ変異体、非保存的ＢａＮＴ変異体もしくは活性のあるＢａＮＴ断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢａＮＴは、配列番号２３の非天然のＢａＮＴ変異体、例えば、保存的ＢａＮＴ変異体、非保存的ＢａＮＴ変異体、活性のあるＢａＮＴ断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のまた別の態様において、ＢａＮＴは、ＢａＮＴ酵素ドメインもしくは活性のあるその断片、ＢａＮＴ転移ドメインもしくは活性のあるその断片、ＢａＮＴ結合ドメインもしくは活性のあるその断片又はそれらの何らかの組み合わせを含む。この実施形態のまた別の態様において、ＢａＮＴは、配列番号２３のＢａＮＴ酵素ドメインもしくは活性のあるその断片、配列番号２３のＢａＮＴ転移ドメインもしくは活性のあるその断片、配列番号２３のＢａＮＴ結合ドメインもしくは活性のあるその断片、又はそれらの何らかの組み合わせを含む。
【００５８】
この実施形態の他の態様において、ＢａＮＴは、例えば、配列番号２３に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２３に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢａＮＴは、例えば、配列番号２３に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号２３に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢａＮＴは、例えば、配列番号２３に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号２３に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【００５９】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素はＢｕＮＴを含む。この実施形態の態様において、ＢｕＮＴは、ＢｕＮＴ酵素ドメイン、ＢｕＮＴ転移ドメイン及びＢｕＮＴ結合ドメインを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｕＮＴは、配列番号２４又は配列番号２５を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｕＮＴは、天然起源のＢｕＮＴ変異体、例えば、ＢｕＮＴアイソフォーム又はＢｕＮＴサブタイプなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｕＮＴは、配列番号２４又は配列番号２５の天然起源のＢｕＮＴ変異体、例えば、ＢｕＮＴアイソフォーム又はＢｕＮＴサブタイプなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｕＮＴは、非天然のＢｕＮＴ変異体、例えば、保存的ＢｕＮＴ変異体、非保存的ＢｕＮＴ変異体、活性のあるＢｕＮＴ断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｕＮＴは、配列番号２４又は配列番号２５の非天然のＢｕＮＴ変異体、例えば、保存的ＢｕＮＴ変異体、非保存的ＢｕＮＴ変異体、活性のあるＢｕＮＴ断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のまた別の態様において、ＢｕＮＴは、ＢｕＮＴ酵素ドメインもしくは活性のあるその断片、ＢｕＮＴ転移ドメインもしくは活性のあるその断片、ＢｕＮＴ結合ドメイン、活性のあるその断片又はそれらの何らかの組み合わせを含む。この実施形態のまた別の態様において、ＢｕＮＴは、配列番号２４もしくは配列番号２５のＢｕＮＴ酵素ドメイン又は活性のあるその断片、配列番号２４もしくは配列番号２５のＢｕＮＴ転移ドメイン又は活性のあるその断片、配列番号２４もしくは配列番号２５のＢｕＮＴ結合ドメイン又は活性のあるその断片、又はそれらの何らかの組み合わせを含む。
【００６０】
この実施形態の他の態様において、ＢｕＮＴは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２４もしくは配列番号２５に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｕＮＴは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号２４もしくは配列番号２５に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｕＮＴは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；配列番号２４もしくは配列番号２５に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００もしくは５００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、「クロストリジウム毒素キメラ」又は「クロストリジウム毒素キメラ」という用語は、１つのクロストリジウム毒素からの少なくとも一部分及び少なくとも１つの他のタンパク質からの一部分を含んで、表１の参照クロストリジウム毒素とは異なる少なくとも１つの特性を有する毒素を形成する分子を指す。クロストリジウム毒素キメラの非限定例としては、非クロストリジウム毒素酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素、非クロストリジウム毒素転移ドメインを含むクロストリジウム毒素、非クロストリジウム毒素結合ドメインを含むクロストリジウム毒素又はそれらの何らかの組み合わせが挙げられる。クロストリジウム毒素キメラの他の非限定例としては、異なるクロストリジウム毒素からの酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素、異なるクロストリジウム毒素からの転移ドメインを含むクロストリジウム毒素、異なるクロストリジウム毒素からの結合ドメインを含むクロストリジウム毒素又はそれらの何らかの組み合わせが挙げられる。
【００６２】
クロストリジウム毒素キメラのあるクラスは、天然起源のクロストリジウム毒素の酵素ドメイン又はその一部、転移ドメイン又はその一部及び／又は結合ドメイン又はその一部が、異なるクロストリジウム毒素の、酵素ドメイン又はその一部、転移ドメイン又はその一部及び／又は結合ドメイン又はその一部で修飾されているか又は置換されているかの何れかである、改変クロストリジウム毒素を含む。非限定例として、ＢｏＮＴ／Ｂの結合ドメインでＢｏＮＴ／Ａの結合ドメインを置換し、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインを含むクロストリジウム毒素キメラを作製することができる。このようなクロストリジウム毒素キメラは、例えば、Ｊ．Ｏｌｉｖｅｒ  Ｄｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，米国特許第７，１３２，２５９号（その全体が参照により組み込まれる。）に記載されている。別の非限定例として、生物学的持続性を向上させるために、ＢｏＮＴ／ＡからのロイシンモチーフをＢｏＮＴ／Ｅの軽鎖に挿入することができる。このようなクロストリジウム毒素キメラは、例えば、Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｃｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  Ｍｏｔｉｆ  ａｎｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ，米国特許公開第２００３／００２７７５２号（２００３年２月６日）；Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，米国特許公開第２００３／０２１９４６２号（２００３年１１月２３日）；及びＬａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，米国特許公開第２００４／０２２０３８６号（２００４年１１月４日）（それぞれその全体が参照により組み込まれる。）に記載されている。
【００６３】
クロストリジウム毒素キメラの別のクラスは、天然起源のクロストリジウム毒素の結合ドメインが非クロストリジウム毒素の結合ドメインで修飾されているか又は置換されているかの何れかのクロストリジウム毒素を含む。このようなクロストリジウム毒素キメラの細胞結合活性は変化しているが、これは、この改変毒素が、例えば、１）天然起源のクロストリジウム毒素標的細胞の表面に存在する、天然起源のクロストリジウム毒素により使用されるものと同じ受容体を使用することができる（天然起源のクロストリジウム毒素標的細胞に対する細胞結合活性の向上と呼ぶ。）か；２）天然起源のクロストリジウム毒素標的細胞の表面に存在する異なる受容体を使用することができる（天然起源のクロストリジウム毒素標的細胞に対する細胞結合活性の変化と呼ぶ。）か；又は３）クロストリジウム毒素非標的細胞の表面に存在する異なる受容体を使用することができる（非天然のクロストリジウム毒素標的細胞に対する細胞結合活性の変化、再標的化された毒素又はＴＶＥＭＰと呼ぶ。）からである。
【００６４】
クロストリジウム毒素キメラは、例えば運動ニューロンなど、天然起源のクロストリジウム毒素標的細胞を中毒化することが可能な細胞結合活性が増強したクロストリジウム毒素であり得る。１つの方法では、この結合活性増強は、その天然起源の受容体に対する毒素の細胞結合活性を増強するために天然起源のクロストリジウム毒素の内在性結合ドメインを修飾することにより達成される。標的化ドメインに対するこのような修飾の結果、例えば、天然起源のクロストリジウム毒素標的細胞上に存在する内在性クロストリジウム毒素受容体に対する結合親和性を向上させる、細胞結合活性の向上；天然起源のクロストリジウム毒素標的細胞上に存在する内在性クロストリジウム毒素受容体のサブグループに対する結合特異性を向上させる、細胞結合活性の向上；又は結合親和性及び結合特異性の両方を向上させる、細胞結合活性の向上が起こる。天然起源のクロストリジウム毒素受容体に対する細胞結合活性が増強した改変クロストリジウム毒素の非限定例は、例えば、Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，米国特許公開第２００８／００９６２４８号；Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ，国際公開第２００８／１０５９０１号（それぞれ、その全体が参照により本明細書によって組み込まれる。）に記載されている。
【００６５】
クロストリジウム毒素キメラは、例えば運動ニューロンなど、天然起源のクロストリジウム毒素標的細胞を中毒化することが可能な細胞結合活性が増強したクロストリジウム毒素であり得る。１つの方法では、この能力の増強は、クロストリジウム毒素標的細胞の表面に存在する異なる受容体に選択的に結合する別の分子の結合ドメインで天然起源のクロストリジウム毒素の内在性結合ドメインを置換することにより達成される。結合ドメインに対するこのような修飾の結果、クロストリジウム毒素標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合することができる改変毒素が得られる。天然起源のクロストリジウム毒素標的細胞に対するこの結合活性増強によって、より多くの毒素が標的細胞に送達されるので、個体に投与しようとする改変クロストリジウム毒素の有効量を低くすることができるようになる。従って、結合活性が増強した改変クロストリジウム毒素によって、治療の標的ではない領域への毒素の望ましくない拡散が減少し、それにより、不要な部位へのクロストリジウム毒素の拡散に関連する望ましくない副作用を軽減又は予防する。クロストリジウム毒素標的細胞に対する細胞結合能が変化した改変クロストリジウム毒素の非限定例は、例えば、Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ，米国特許第７，５１４，０８８号；Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ，米国特許公開第２００８／０１６１５４３号；Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ，米国特許公開第２００８／０２４１８８１号；Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ，米国特許公開第２００９／００４８４３１号；Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ，国際公開第ＷＯ２００７／１０６１１５号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書によって組み込まれる。）に記載されている。
【００６６】
クロストリジウム毒素キメラは、クロストリジウム毒素標的細胞以外の細胞、例えば運動ニューロン以外の細胞を中毒化することができる細胞結合活性が変化しているクロストリジウム毒素であり得る。ＴＶＥＭＰと呼ばれるこれらの分子は、クロストリジウム毒素非標的細胞上に存在する標的受容体を使用することによってこの中毒化を達成する。この再標的化能は、クロストリジウム毒素非標的細胞に存在する非クロストリジウム毒素受容体に対する選択的結合活性を示す結合ドメインでクロストリジウム毒素の天然起源の結合ドメインを置換することにより達成される。結合ドメインに対するこのような修飾の結果、クロストリジウム毒素非標的細胞上に存在する非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合することができる改変毒素が得られる。クロストリジウム毒素非標的細胞に対する標的化活性が変化しているクロストリジウム毒素キメラは、標的受容体に結合し、細胞質に移動し、クロストリジウム毒素非標的細胞のＳＮＡＲＥ複合体上でそのタンパク質分解性効果を発揮し得る。クロストリジウム毒素非標的細胞に対する標的化活性が変化しているクロストリジウム毒素キメラの非限定例は、例えば、Ｋｅｉｔｈ  Ａ．Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ａｂｌｅ  Ｔｏ  Ｍｏｄｉｆｙ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ａｆｆｅｒｅｎｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，米国特許第５，９８９，５４５号；Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  Ｃ．Ｓｈｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔｏｘｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，米国特許第６，４６１，６１７号；Ｃｏｎｒａｄ  Ｐ．Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｕｃｕｓ  Ｈｙｐｅｒｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，米国特許第６，６３２，４４０号；Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ，米国特許第６，８４３，９９８号；Ｊ．Ｏｌｉｖｅｒ  Ｄｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，米国特許第７，１３２，２５９号；Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｉｎ，米国特許第７，２４４，４３７号；Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｉｎ，米国特許第７，４１３，７４２号；Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｉｎ，米国特許第７，４１５，３３８号；Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ，米国特許第７，５１４，０８８号；Ｋｅｉｔｈ  Ａ．Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｉ��ｎ  ｆｒｏｍ  Ｎｏｎ−ｎｅｕｒａｌ  Ｃｅｌｌｓ，米国特許公開第２００６／０２１６２８３号；Ｋｅｉｔｈ  Ａ．Ｆｏｓｔｅｒ，Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，米国特許公開第２００８／００６４０９２号；Ｋｅｉｔｈ  Ａ．Ｆｏｓｔｅｒ，Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，米国特許公開第２００９／００３５８２２号；Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ，米国特許公開第２００９／００４８４３１号；Ｋｅｉｔｈ  Ａ．Ｆｏｓｔｅｒ，Ｎｏｎ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，米国特許公開第２００９／０１６２３４１号；Ｋｅｉｔｈ  Ａ．Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，国際公開第ＷＯ２００５／０２３３０９号；及びＬａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｏｎ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ，国際出願第ＷＯ２００８／００８８０５号（それぞれが、その全体が参照により本明細書によって組み込まれる。）に記載されている。
【００６７】
本明細の態様は、ある一部分において、クロストリジウム毒素酵素ドメインを提供する。本明細書中で使用される場合、「クロストリジウム毒素酵素ドメイン」という用語は、中毒化過程の酵素標的修飾段階を遂行することができる何らかのクロストリジウム毒素ポリペプチドを指す。従って、クロストリジウム毒素酵素ドメインは、クロストリジウム毒素基質を特異的に標的化し、例えばＳＮＡＰ−２５基質、ＶＡＭＰ基質及びシンタキシン基質のようなＳＮＡＲＥタンパク質など、クロストリジウム毒素基質のタンパク質分解性切断を包含する。クロストリジウム毒素酵素ドメインの非限定例としては、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ酵素ドメイン及びＢｕＮＴ酵素ドメインが挙げられる。
【００６８】
クロストリジウム毒素酵素ドメインとしては、天然起源のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、例えば、クロストリジウム毒素酵素ドメインアイソフォーム及びクロストリジウム毒素酵素ドメインサブタイプなど；及び非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、非保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、それらの活性のあるクロストリジウム毒素酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、「クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体」という用語は、天然であれ又は非天然であれ、開示される参照配列（表１）の対応する領域からの少なくとも１つのアミノ酸変化を有するクロストリジウム毒素酵素ドメインを指し、その参照配列の対応する領域に対する同一性パーセントで記載され得る。明確な指示がない限り、開示される実施形態を実施するために有用なクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体は、中毒化過程の酵素標的修飾段階を遂行する変異体である。非限定例として、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体は、配列番号１のアミノ酸１／２〜４２９と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体は、配列番号６のアミノ酸１／２〜４３６と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体は、配列番号１１のアミノ酸１／〜４３６と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体は、配列番号１３のアミノ酸１／２〜４３６と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体は、配列番号１５のアミノ酸１／２〜４１１と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体は、配列番号１８のアミノ酸１／２〜４２８と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体は、配列番号２１のアミノ酸１／２〜４３８と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体は、配列番号２２のアミノ酸１／２〜４３８と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢａＮＴ酵素ドメイン変異体は、配列番号２３のアミノ酸１／２〜４２０と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体は、配列番号２４のアミノ酸１／２ｖ４１１と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有する。
【００７０】
クロストリジウム毒素の各血清型内で、それらのアミノ酸配列及びまたこれらのタンパク質をコードする核酸が幾分異なる天然起源のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体があり得ることは当業者により認識される。例えば、現在のところ、５種類のＢｏＮＴ／Ａサブタイプ、すなわちＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３、ＢｏＮＴ／Ａ４及びＢｏＮＴ／Ａ５があり、特定の酵素ドメインサブタイプは配列番号１のＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインと比較した場合に約８０％から９５％のアミノ酸同一性を示す。本明細書中で使用される場合、「天然起源のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体」という用語は、オルタナティブスプライシングを受けた転写物から産生されるクロストリジウム毒素酵素ドメインアイソフォーム、自然突然変異により産生されるクロストリジウム毒素酵素ドメインアイソフォーム及びクロストリジウム毒素酵素ドメインサブタイプを含むが限定されない、天然起源の過程により産生される何らかのクロストリジウム毒素酵素ドメインを指す。天然起源のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体は、その天然起源のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素酵素ドメインと実質的に同じように機能し得、本明細のいずれの態様においても、参照クロストリジウム毒素酵素ドメインと置き換えられ得る。
【００７１】
天然起源のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の非限定例は、クロストリジウム毒素酵素ドメインアイソフォーム、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインアイソフォーム、ＴｅＮＴ酵素ドメインアイソフォーム、ＢａＮＴ酵素ドメインアイソフォーム及びＢｕＮＴ酵素ドメインアイソフォームなどである。天然起源のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の別の非限定例は、クロストリジウム毒素酵素ドメインサブタイプ、例えばサブタイプＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３、ＢｏＮＴ／Ａ４又はＢｏＮＴ／Ａ５からの酵素ドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｂ１、ＢｏＮＴ／Ｂ２、ＢｏＮＴ／Ｂｂｖ又はＢｏＮＴ／Ｂｎｐからの酵素ドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｃ１−１又はＢｏＮＴ／Ｃ１−２からの酵素ドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｅ１、ＢｏＮＴ／Ｅ２及びＢｏＮＴ／Ｅ３からの酵素ドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｆ１、ＢｏＮＴ／Ｆ２又はＢｏＮＴ／Ｆ３からの酵素ドメイン；及びサブタイプＢｕＮＴ−１又はＢｕＮＴ−２からの酵素ドメインなどである。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、「非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体」という用語は、無作為変異誘発又は合理的設計を用いて遺伝子改変することにより作製されるクロストリジウム毒素酵素ドメイン及び化学合成により作製されるクロストリジウム毒素酵素ドメインを含むが限定されない、ヒト操作の助力のもと産生される何らかのクロストリジウム毒素酵素ドメインを指す。非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の非限定例としては、例えば保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、非保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、クロストリジウム毒素酵素ドメインキメラ変異体及び活性のあるクロストリジウム毒素酵素ドメイン断片が挙げられる。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、「保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸が、参照クロストリジウム毒素酵素ドメイン配列（表１）からの元のアミノ酸の特性と類似した少なくとも１つの特性を有する別のアミノ酸又はアミノ酸類似体により置換されているクロストリジウム毒素酵素ドメインを指す。特性の例としては、類似した大きさ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能、水素結合能、物理化学的特性など又はそれらの何らかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体は、その保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素酵素ドメインと実質的に同じように機能し得、本明細のいずれの態様においても、参照クロストリジウム毒素酵素ドメインと置き換えられ得る。保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の非限定例としては、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体、保存的ＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体、保存的ＢａＮＴ酵素ドメイン変異体及び保存的ＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体が挙げられる。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、「非保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体」という用語は、１）少なくとも１つのアミノ酸が、その非保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素酵素ドメインから欠失しているか；２）少なくとも１つのアミノ酸が、その非保存的クロストリジウム毒素酵素ドメインが基づく参照クロストリジウム毒素酵素ドメインに付加されているか；又は３）少なくとも１つのアミノ酸が、参照クロストリジウム毒素酵素ドメイン配列（表１）からの元のアミノ酸の特性と類似の特性を何ら共有しない別のアミノ酸又はアミノ酸類似体により置換されている、クロストリジウム毒素酵素ドメインを指す。非保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体は、その非保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素酵素ドメインと実質的に同じように機能し得、本明細のいずれの態様においても、参照クロストリジウム毒素酵素ドメインと置き換えられ得る。非保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の非限定例としては、例えば、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体及び非保存的ＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢａＮＴ酵素ドメイン変異体及び非保存的ＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体が挙げられる。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、「活性のあるクロストリジウム毒素酵素ドメイン断片」という用語は、本明細の態様において有用であり得る酵素ドメインを含む様々なクロストリジウム毒素断片の何れかを指すが、ただし、これらの酵素ドメイン断片は、神経伝達物質放出装置のコア成分を特異的に標的とし得、従って、クロストリジウム毒素がタンパク質分解性に基質を切断する全体的な細胞性機構の遂行に関与するものとする。クロストリジウム毒素の酵素ドメインは、およそ４２０〜４６０アミノ酸長であり、酵素ドメイン（表１）を含む。研究から、クロストリジウム毒素酵素ドメインの全長が酵素ドメインの酵素活性に必要であるわけではないことが示されている。非限定例として、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインの最初の８個のアミノ酸は酵素活性に必要ではない。別の非限定例として、ＴｅＮＴ酵素ドメインの最初の８個のアミノ酸は酵素活性に必要ではない。同様に、酵素ドメインのカルボキシル末端は、活性に必要ではない。非限定例として、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインの最後の３２個のアミノ酸は酵素活性に必要ではない。別の非限定例として、ＴｅＮＴ酵素ドメインの最後の３１アミノ酸は酵素活性に必要ではない。従って、この実施形態の態様は、例えば、少なくとも３５０、３７５、４００、４２５又は４５０アミノ酸長の酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素酵素ドメインを含む。この実施形態の他の態様は、例えば最長で３５０、３７５、４００、４２５又は４５０アミノ酸長の酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素酵素ドメインを含む。
【００７６】
天然起源のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体及び非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体の同一性パーセントを決定するために、包括的方法、ローカル法及びハイブリッド法、例えばセグメントアプローチ法などを含むがこれらに限定されない様々な配列アラインメント法の何れかを使用することができる。同一性パーセントを決定するためのプロトコールは、当業者の範囲内の及び本明細書中の教示からの通例の手段である。
【００７７】
従って、実施形態において、本明細で開示される改変クロストリジウム毒素はクロストリジウム毒素酵素ドメインを含む。この実施形態の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメインは、天然起源のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、例えば、クロストリジウム毒素酵素ドメインアイソフォーム又はクロストリジウム毒素酵素ドメインサブタイプなどを含む。この実施形態の別の態様において、クロストリジウム毒素酵素ドメインは、非天然のクロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、非保存的クロストリジウム毒素酵素ドメイン変異体、活性のあるクロストリジウム毒素酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【００７８】
別の実施形態において、本クロストリジウム毒素酵素ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸で置換し得る。疎水性アミノ酸の例としては、例えば、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ及びＷが挙げられる。この実施形態の別の態様において、本クロストリジウム毒素酵素ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の脂肪族アミノ酸を別の脂肪族アミノ酸で置換し得る。脂肪族アミノ酸の例としては、例えば、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｐ及びＶが挙げられる。この実施形態のまた別の態様において、本クロストリジウム毒素酵素ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の芳香族アミノ酸を別の芳香族アミノ酸で置換し得る。芳香族アミノ酸の例としては、例えば、Ｆ、Ｈ、Ｗ及びＹが挙げられる。この実施形態のさらに別の態様において、本クロストリジウム毒素酵素ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置のスタッキングアミノ酸を別のスタッキングアミノ酸で置換し得る。スタッキングアミノ酸の例としては、例えば、Ｆ、Ｈ、Ｗ及びＹが挙げられる。この実施形態のさらなる態様において、本クロストリジウム毒素酵素ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の極性アミノ酸を別の極性アミノ酸で置換し得る。極性アミノ酸の例としては、例えば、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｑ及びＲが挙げられる。この実施形態のさらなる態様において、本クロストリジウム毒素酵素ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の低極性又は中性的アミノ酸を別の低極性又は中性的アミノ酸で置換し得る。低極性又は中性的アミノ酸の例としては、例えば、Ａ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ及びＹが挙げられる。この実施形態のまたさらなる態様において、本クロストリジウム毒素酵素ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の正に荷電したアミノ酸を別の正に荷電したアミノ酸で置換し得る。正に荷電したアミノ酸の例としては、例えば、Ｋ、Ｒ及びＨが挙げられる。この実施形態のまたさらなる態様において、本クロストリジウム毒素酵素ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の負に荷電したアミノ酸を別の負に荷電したアミノ酸で置換し得る。負に荷電したアミノ酸の例としては、例えば、Ｄ及びＥが挙げられる。この実施形態の別の態様において、本クロストリジウム毒素酵素ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の小型アミノ酸を別の小型アミノ酸で置換し得る。小型アミノ酸の例としては、例えばＡ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ及びＴが挙げられる。この実施形態のまた別の態様において、本クロストリジウム毒素酵素ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置のＣ−β分岐型アミノ酸を別のＣ−β分岐型アミノ酸で置換し得る。Ｃ−β分岐型アミノ酸の例としては、例えばＩ、Ｔ及びＶが挙げられる。
【００７９】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の酵素ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインは、配列番号１のアミノ酸１／２〜４２９を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ａアイソフォームからの酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ａサブタイプからの酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の天然起源のＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ａアイソフォーム酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ａサブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインは、配列番号１の天然起源のＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４２９、例えば、ＢｏＮＴ／Ａアイソフォーム酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ａサブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の非天然のＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体の酵素ドメイン、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインは、配列番号１の非天然のＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４２９、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【００８０】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の酵素ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％；又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の酵素ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％又は最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインは、例えば、配列番号１のアミノ酸１／２〜４２９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１のアミノ酸１／２〜４２９に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００８１】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインは、例えば、配列番号１のアミノ酸１／２〜４２９に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１のアミノ酸１／２〜４２９に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の酵素ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインは、例えば、配列番号１のアミノ酸１／２〜４２９に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１のアミノ酸１／２〜４２９に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【００８２】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０の酵素ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメインは、配列番号６のアミノ酸１／２〜４３６を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体、例えばＢｏＮＴ／Ｂアイソフォームからの酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｂサブタイプからの酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０の天然起源のＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｂアイソフォーム酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｂサブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメインは、配列番号６の天然起源のＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４３６、例えば、ＢｏＮＴ／Ｂアイソフォーム酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｂサブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０の非天然のＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体の酵素ドメイン、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメインは、配列番号６の非天然のＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４３６、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【００８３】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメインは、例えば、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の酵素ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の酵素ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメインは、例えば、配列番号６のアミノ酸１／２〜４３６に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号６のアミノ酸１／２〜４３６に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００８４】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメインは、例えば、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメインは、例えば、配列番号６のアミノ酸１／２〜４３６に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号６のアミノ酸１／２〜４３６に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメインは、例えば、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の酵素ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメインは、例えば、配列番号６のアミノ酸１／２〜４３６に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号６のアミノ酸１／２〜４３６に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【００８５】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメインは、配列番号１１又は配列番号１２の酵素ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメインは、配列番号１１のアミノ酸１／２〜４３６を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｃ１アイソフォームからの酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプからの酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメインは、配列番号１１又は配列番号１２の天然起源のＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｃ１アイソフォーム酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメインは、配列番号１１の天然起源のＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４３６、例えば、ＢｏＮＴ／Ｃ１アイソフォーム酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメインは、配列番号１１又は配列番号１２の非天然のＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体の酵素ドメイン、例えば保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメインは、配列番号１１の非天然のＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４３６、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【００８６】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメインは、例えば、配列番号１１もしくは配列番号１２の酵素ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１１もしくは配列番号１２の酵素ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメインは、例えば、配列番号１１のアミノ酸１／２〜４３６に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１１のアミノ酸１／２〜４３６に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００８７】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメインは、例えば、配列番号１１もしくは配列番号１２の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１１もしくは配列番号１２の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメインは、例えば、配列番号１１のアミノ酸１／２〜４３６に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１１のアミノ酸１／２〜４３６に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメインは、例えば、配列番号１１もしくは配列番号１２の酵素ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１１もしくは配列番号１２の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメインは、例えば、配列番号１１のアミノ酸１／２〜４３６に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１１のアミノ酸１／２〜４３６に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【００８８】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメインは、配列番号１３又は配列番号１４の酵素ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメインは、配列番号１３のアミノ酸１／２〜４３６を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｄアイソフォームからの酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｄサブタイプからの酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメインは、配列番号１３又は配列番号１４の天然起源のＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｄアイソフォーム酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｄサブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメインは、配列番号１３の天然起源のＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４３６、例えば、ＢｏＮＴ／Ｄアイソフォーム酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｄサブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメインは、配列番号１３又は配列番号１４の非天然のＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体の酵素ドメイン、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメインは、配列番号１３の非天然のＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４３６、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【００８９】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメインは、例えば、配列番号１３もしくは配列番号１４の酵素ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１３もしくは配列番号１４の酵素ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメインは、例えば、配列番号１３のアミノ酸１／２〜４３６に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１３のアミノ酸１／２〜４３６に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００９０】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメインは、例えば、配列番号１３もしくは配列番号１４の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１３もしくは配列番号１４の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメインは、例えば、配列番号１３のアミノ酸１／２〜４３６に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１３のアミノ酸１／２〜４３６に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメインは、例えば、配列番号１３もしくは配列番号１４の酵素ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１３もしくは配列番号１４の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメインは、例えば、配列番号１３のアミノ酸１／２〜４３６に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１３のアミノ酸１／２〜４３６に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【００９１】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素酵素ドメインは、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメインは、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７の酵素ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメインは、配列番号１５のアミノ酸１／２〜４１１を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体、例えばＢｏＮＴ／Ｅアイソフォームからの酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｅサブタイプからの酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメインは、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７の天然起源のＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｅアイソフォーム酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｅサブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメインは、配列番号１５の天然起源のＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４１１、例えばＢｏＮＴ／Ｅアイソフォーム酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｅサブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメインは、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７の非天然のＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体の酵素ドメイン、例えば保存的ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメインは、配列番号１５の非天然のＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４１１、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【００９２】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメインは、例えば、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７の酵素ドメインに対する少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７の酵素ドメインに対する最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメインは、例えば、配列番号１５のアミノ酸１／２〜４１１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１５のアミノ酸１／２〜４１１に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００９３】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメインは、例えば、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメインは、例えば、配列番号１５のアミノ酸１／２〜４１１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１５のアミノ酸１／２〜４１１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメインは、例えば、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７の酵素ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメインは、例えば、配列番号１５のアミノ酸１／２〜４１１に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１５のアミノ酸１／２〜４１１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【００９４】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメインは、配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０の酵素ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメインは、配列番号１８のアミノ酸１／２〜４２８を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｆアイソフォームからの酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｆサブタイプからの酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメインは、配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０の天然起源のＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｆアイソフォーム酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｆサブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメインは、配列番号１８の天然起源のＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４２８、例えば、ＢｏＮＴ／Ｆアイソフォーム酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｆサブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメインは、配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０の非天然のＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体の酵素ドメイン、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメインは、配列番号１８の非天然のＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４２８、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【００９５】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメインは、例えば、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の酵素ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の酵素ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメインは、例えば、配列番号１８のアミノ酸１／２〜４２８に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１８のアミノ酸１／２〜４２８対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００９６】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメインは、例えば、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメインは、例えば、配列番号１８のアミノ酸１／２〜４２８に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１８のアミノ酸１／２〜４２８に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメインは、例えば、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の酵素ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメインは、例えば、配列番号１８のアミノ酸１／２〜４２８に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１８のアミノ酸１／２〜４２８に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【００９７】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインは配列番号２１の酵素ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインは、配列番号２１のアミノ酸１／２〜４４３５を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体、例えばＢｏＮＴ／Ｇアイソフォームからの酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｇサブタイプからの酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインは、配列番号２１の天然起源のＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｇアイソフォーム酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｇサブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインは、配列番号２１の天然起源のＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４４３５、例えば、ＢｏＮＴ／Ｇアイソフォーム酵素ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｇサブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインは、配列番号２１の非天然のＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体の酵素ドメイン、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインは、配列番号２１の非天然のＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４４３５、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【００９８】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインは、例えば、配列番号２１の酵素ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２１の酵素ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインは、例えば、配列番号２１のアミノ酸１／２〜４４３５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２１のアミノ酸１／２〜４４３５に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００９９】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインは、例えば、配列番号２１の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２１の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインは、例えば、配列番号２１のアミノ酸１／２〜４４３５に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２１のアミノ酸１／２〜４４３５に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインは、例えば、配列番号２１の酵素ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２１の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメインは、例えば、配列番号２１のアミノ酸１／２〜４４３５に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２１のアミノ酸１／２〜４４３５に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１００】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはＴｅＮＴ酵素ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＴｅＮＴ酵素ドメインは、配列番号２２の酵素ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＴｅＮＴ酵素ドメインは、配列番号２２のアミノ酸１／２〜４３８を含む。この実施形態の別の態様において、ＴｅＮＴ酵素ドメインは、天然起源のＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体、例えば、ＴｅＮＴアイソフォームからの酵素ドメイン又はＴｅＮＴサブタイプからの酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＴｅＮＴ酵素ドメインは、配列番号２２の天然起源のＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体、例えば、ＴｅＮＴアイソフォーム酵素ドメイン又はＴｅＮＴサブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＴｅＮＴ酵素ドメインは、配列番号２２の天然起源のＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４３８、例えば、ＴｅＮＴアイソフォーム酵素ドメイン又はＴｅＮＴサブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＴｅＮＴ酵素ドメインは、非天然のＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体、例えば保存的ＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体、非保存的ＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体、活性のあるＴｅＮＴ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＴｅＮＴ酵素ドメインは、配列番号２２の非天然のＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体の酵素ドメイン、例えば、保存的ＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体、非保存的ＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体、活性のあるＴｅＮＴ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＴｅＮＴ酵素ドメインは、配列番号２２の非天然のＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４３８、例えば、保存的ＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体、非保存的ＴｅＮＴ酵素ドメイン変異体、活性のあるＴｅＮＴ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１０１】
この実施形態の他の態様において、ＴｅＮＴ酵素ドメインは、例えば、配列番号２２の酵素ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２２の酵素ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＴｅＮＴ酵素ドメインは、例えば、配列番号２２のアミノ酸１／２〜４３８に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２２のアミノ酸１／２〜４３８に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１０２】
この実施形態の他の態様において、ＴｅＮＴ酵素ドメインは、例えば、配列番号２２の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２２の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＴｅＮＴ酵素ドメインは、例えば、配列番号２２のアミノ酸１／２〜４３８に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２２のアミノ酸１／２〜４３８に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＴｅＮＴ酵素ドメインは、例えば、配列番号２２の酵素ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２２の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＴｅＮＴ酵素ドメインは、例えば、配列番号２２のアミノ酸１／２〜４３８に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２２のアミノ酸１／２〜４３８に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１０３】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはＢａＮＴ酵素ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢａＮＴ酵素ドメインは、配列番号２３の酵素ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢａＮＴ酵素ドメインは、配列番号２３のアミノ酸１／２〜４２０を含む。この実施形態の別の態様において、ＢａＮＴ酵素ドメインは、天然起源のＢａＮＴ酵素ドメイン変異体、例えば、ＢａＮＴアイソフォームからの酵素ドメイン又はＢａＮＴサブタイプからの酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢａＮＴ酵素ドメインは、配列番号２３の天然起源のＢａＮＴ酵素ドメイン変異体、例えば、ＢａＮＴアイソフォーム酵素ドメイン又はＢａＮＴサブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢａＮＴ酵素ドメインは、配列番号２３の天然起源のＢａＮＴ酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４２０、例えば、ＢａＮＴアイソフォーム酵素ドメイン又はＢａＮＴサブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢａＮＴ酵素ドメインは、非天然のＢａＮＴ酵素ドメイン変異体、例えば、保存的ＢａＮＴ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢａＮＴ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢａＮＴ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢａＮＴ酵素ドメインは、配列番号２３の非天然のＢａＮＴ酵素ドメイン変異体の酵素ドメイン、例えば、保存的ＢａＮＴ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢａＮＴ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢａＮＴ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢａＮＴ酵素ドメインは、配列番号２３の非天然のＢａＮＴ酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４２０、例えば、保存的ＢａＮＴ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢａＮＴ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢａＮＴ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１０４】
この実施形態の他の態様において、ＢａＮＴ酵素ドメインは、例えば、配列番号２３の酵素ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２３の酵素ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢａＮＴ酵素ドメインは、例えば、配列番号２３のアミノ酸１／２〜４２０に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２３のアミノ酸１／２〜４２０に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１０５】
この実施形態の他の態様において、ＢａＮＴ酵素ドメインは、例えば、配列番号２３の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２３の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢａＮＴ酵素ドメインは、例えば、配列番号２３のアミノ酸１／２〜４２０に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２３のアミノ酸１／２〜４２０に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢａＮＴ酵素ドメインは、例えば、配列番号２３の酵素ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２３の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢａＮＴ酵素ドメインは、例えば、配列番号２３のアミノ酸１／２〜４２０に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２３のアミノ酸１／２〜４２０に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１０６】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素酵素ドメインはＢｕＮＴ酵素ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｕＮＴ酵素ドメインは配列番号２４又は配列番号２５の酵素ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｕＮＴ酵素ドメインは、配列番号２４のアミノ酸１／２〜４１１を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｕＮＴ酵素ドメインは、天然起源のＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体、例えば、ＢｕＮＴアイソフォームからの酵素ドメイン又はＢｕＮＴサブタイプからの酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｕＮＴ酵素ドメインは、配列番号２４又は配列番号２５の天然起源のＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体、例えば、ＢｕＮＴアイソフォーム酵素ドメイン又はＢｕＮＴサブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｕＮＴ酵素ドメインは、配列番号２４の天然起源のＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４１１、例えば、ＢｕＮＴアイソフォーム酵素ドメイン又はＢｕＮＴサブタイプ酵素ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｕＮＴ酵素ドメインは、非天然のＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｕＮＴ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｕＮＴ酵素ドメインは、配列番号２４又は配列番号２５の非天然のＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体の酵素ドメイン、例えば、保存的ＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｕＮＴ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｕＮＴ酵素ドメインは、配列番号２４の非天然のＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体のアミノ酸１／２〜４１１、例えば、保存的ＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体、非保存的ＢｕＮＴ酵素ドメイン変異体、活性のあるＢｕＮＴ酵素ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１０７】
この実施形態の他の態様において、ＢｕＮＴ酵素ドメインは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５の酵素ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２４もしくは配列番号２５の酵素ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｕＮＴ酵素ドメインは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸１／２〜４１１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸１／２〜４１１に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１０８】
この実施形態の他の態様において、ＢｕＮＴ酵素ドメインは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２４もしくは配列番号２５の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｕＮＴ酵素ドメインは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸１／２〜４１１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸１／２〜４１１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｕＮＴ酵素ドメインは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５の酵素ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２４もしくは配列番号２５の酵素ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｕＮＴ酵素ドメインは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸１／２〜４１１に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸１／２〜４１１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１０９】
「転移ドメイン」は、転移活性を有するクロストリジウム神経毒素重鎖の一部分を含む。「転移」とは、小胞膜を通じてポリペプチド輸送を促進し、それによりそのポリペプチドの一部又は全てが細胞質に曝露される、能力を意味する。様々なボツリヌス神経毒素において、転移には、エンドソーム内のｐＨ低下により起こる重鎖のアロスステリックな構造変化が関与すると考えられている。この構造変化は、重鎖のＮ末端側半分が関与し、これが介在し、その結果、小胞膜で小孔が形成されると思われるが；この変化によって細胞質へのエンドソーム小胞内からのタンパク質分解性軽鎖の移動が可能になる。例えば、Ｌａｃｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：８９８−９０２（１９９８年１０月）を参照のこと。
【０１１０】
ボツリヌス神経毒素重鎖の転移媒介部分のアミノ酸配列は当業者には公知であり；さらに、転移活性を付与するのに必須であることが知られているこの部分内のアミノ酸残基も公知である。従って、例えば、様々なクロストリジウム・テタヌス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｕｓ）又はクロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒素サブタイプの何れかの重鎖の天然起源のＮ末端ペプチド半分を転移ドメインとして使用すること又は様々な重鎖のＮ末端側半分の一次配列をアラインすること及び配列間の保存性アミノ酸、極性、立体及び疎水性の特徴に基づいてコンセンサス一次転移配列を選択することによって、転移ドメイン類似物を設計することも、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１１１】
本明細の態様は、ある一部分において、クロストリジウム毒素転移ドメインを提供する。本明細書中で使用される場合、「クロストリジウム毒素転移ドメイン」という用語は、クロストリジウム毒素軽鎖転移に介在する中毒化過程の転移段階を遂行することができる何らかのクロストリジウム毒素ポリペプチドを指す。従って、クロストリジウム毒素転移ドメインは、膜を横切るクロストリジウム毒素軽鎖の移動を促進し、細胞の細胞質への膜、細胞内小胞を通じたクロストリジウム毒素軽鎖の移動を包含する。クロストリジウム毒素転移ドメインの非限定例としては、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン、ＴｅＮＴ転移ドメイン、ＢａＮＴ転移ドメイン及びＢｕＮＴ転移ドメインが挙げられる。
【０１１２】
クロストリジウム毒素転移ドメインとしては、天然起源のクロストリジウム毒素転移ドメイン変異体、例えば、クロストリジウム毒素転移ドメインアイソフォーム及びクロストリジウム毒素転移ドメインサブタイプなど；非天然のクロストリジウム毒素転移ドメイン変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素転移ドメイン変異体、非保存的クロストリジウム毒素転移ドメイン変異体、それらの活性のあるクロストリジウム毒素転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１３】
本明細書中で使用される場合、「クロストリジウム毒素転移ドメイン変異体」という用語は、天然であれ又は非天然であれ、開示される参照配列（表１）の対応する領域からの少なくとも１つのアミノ酸変化を有するクロストリジウム毒素転移ドメインを指し、その参照配列の対応する領域に対する同一性パーセントで記載することができる。明確な指示がない限り、開示される実施形態を実施するために有用なクロストリジウム毒素転移ドメイン変異体は、クロストリジウム毒素軽鎖転移に介在する中毒化過程の転移段階を遂行する変異体である。非限定例として、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン変異体は、配列番号１のアミノ酸４５５〜８７３と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン変異体は、配列番号６のアミノ酸４４７〜８６０と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン変異体は、配列番号１１のアミノ酸４５４〜８６８と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン変異体は、配列番号１３のアミノ酸４５１〜８６４と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン変異体は、配列番号１５のアミノ酸４２７〜８４７と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン変異体は、配列番号１８のアミノ酸４４６〜８６５と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン変異体は、配列番号２１のアミノ酸４５１〜８６５と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＴｅＮＴ転移ドメイン変異体は、配列番号２２のアミノ酸４６８〜８８１と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢａＮＴ転移ドメイン変異体は、配列番号２３のアミノ酸４３６〜８５７と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｕＮＴ転移ドメイン変異体は、配列番号２４のアミノ酸４２７〜８４７と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有する。
【０１１４】
クロストリジウム毒素の各血清型内で、それらのアミノ酸配列及びまたこれらのタンパク質をコードする核酸が幾分異なる天然起源のクロストリジウム毒素転移ドメイン変異体があり得ることは当業者により認識される。例えば、現在のところ、５種類のＢｏＮＴ／Ａサブタイプ、すなわちＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３、ＢｏＮＴ／Ａ４及びＢｏＮＴ／Ａ５があり、特定の転位ドメインサブタイプは、配列番号１のＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインサブタイプと比較した場合に約８５から８７％のアミノ酸同一性を示す。本明細書中で使用される場合、「天然起源のクロストリジウム毒素転移ドメイン変異体」という用語は、オルタナティブスプライシングを受けた転写物により産生されるクロストリジウム毒素転移ドメインアイソフォーム、自然突然変異により産生されるクロストリジウム毒素転移ドメインアイソフォーム及びクロストリジウム毒素転移ドメインサブタイプを含むが限定されない、天然起源の過程により産生される何らかのクロストリジウム毒素転移ドメインを指す。天然起源のクロストリジウム毒素転移ドメイン変異体は、その天然起源のクロストリジウム毒素転移ドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素転移ドメインと実質的に同じように機能し得、本明細のいずれの態様においても、参照クロストリジウム毒素転移ドメインと置き換えられ得る。
【０１１５】
天然起源のクロストリジウム毒素転移ドメイン変異体の非限定例は、クロストリジウム毒素転移ドメインアイソフォーム、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメインアイソフォーム、ＴｅＮＴ転移ドメインアイソフォーム、ＢａＮＴ転移ドメインアイソフォーム及びＢｕＮＴ転移ドメインアイソフォームなどである。天然起源のクロストリジウム毒素転移ドメイン変異体の別の非限定例は、クロストリジウム毒素転移ドメインサブタイプ、例えばサブタイプＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３、ＢｏＮＴ／Ａ４及びＢｏＮＴ／Ａ５からの転移ドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｂ１、ＢｏＮＴ／Ｂ２、ＢｏＮＴ／Ｂ二価及びＢｏＮＴ／Ｂ非タンパク質分解性からの転移ドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｃ１−１及びＢｏＮＴ／Ｃ１−２からの転移ドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｅ１、ＢｏＮＴ／Ｅ２及びＢｏＮＴ／Ｅ３からの転移ドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｆ１、ＢｏＮＴ／Ｆ２、ＢｏＮＴ／Ｆ３からの転移ドメイン；及びサブタイプＢｕＮＴ−１及びＢｕＮＴ−２からの転移ドメインである。
【０１１６】
本明細書中で使用される場合、「非天然のクロストリジウム毒素転移ドメイン変異体」という用語は、無作為変異誘発又は合理的設計を用いて遺伝子改変することにより作製されるクロストリジウム毒素転移ドメイン及び化学合成により作製されるクロストリジウム毒素転移ドメインを含むが限定されない、ヒト操作の助力のもと産生される何らかのクロストリジウム毒素転移ドメインを指す。非天然のクロストリジウム毒素転移ドメイン変異体の非限定例としては、例えば、保存的クロストリジウム毒素転移ドメイン変異体、非保存的クロストリジウム毒素転移ドメイン変異体及び活性のあるクロストリジウム毒素転移ドメイン断片が挙げられる。
【０１１７】
本明細書中で使用される場合、「保存的クロストリジウム毒素転移ドメイン変異体」という用語は、参照クロストリジウム毒素転移ドメイン配列（表１）からの元のアミノ酸の特性と類似した少なくとも１つの特性を有する別のアミノ酸又はアミノ酸類似体により置換されている少なくとも１つのアミノ酸を有するクロストリジウム毒素転移ドメインを指す。特性の例としては、同様の大きさ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能、水素結合能、物理化学的特性など又はそれらの何らかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。保存的クロストリジウム毒素転移ドメイン変異体は、その保存的クロストリジウム毒素転移ドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素転移ドメインと実質的に同じように機能し得、本明細のいずれの態様においても、参照クロストリジウム毒素転移ドメインと置き換えられ得る。保存的クロストリジウム毒素転移ドメイン変異体の非限定例としては、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン変異体、保存的ＴｅＮＴ転移ドメイン変異体、保存的ＢａＮＴ転移ドメイン変異体及び保存的ＢｕＮＴ転移ドメイン変異体が挙げられる。
【０１１８】
本明細書中で使用される場合、「非保存的クロストリジウム毒素転移ドメイン変異体」という用語は、１）少なくとも１つのアミノ酸が、その非保存的クロストリジウム毒素転移ドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素転移ドメインから欠失しているか；２）少なくとも１つのアミノ酸が、その非保存的クロストリジウム毒素転移ドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素転移ドメインに付加されているか；又は３）少なくとも１つのアミノ酸が、参照クロストリジウム毒素転移ドメイン配列（表１）からの元のアミノ酸の特性と類似の特性を何ら共有しない別のアミノ酸又はアミノ酸類似体により置換されている、クロストリジウム毒素転移ドメインを指す。非保存的クロストリジウム毒素転移ドメイン変異体は、その非保存的クロストリジウム毒素転移ドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素転移ドメインと実質的に同じように機能し得、本明細のいずれの態様においても、参照クロストリジウム毒素転移ドメインと置き換えられ得る。非保存的クロストリジウム毒素転移ドメイン変異体の非限定例としては、例えば、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン変異体及び非保存的ＴｅＮＴ転移ドメイン変異体、非保存的ＢａＮＴ転移ドメイン変異体及び非保存的ＢｕＮＴ転移ドメイン変異体が挙げられる。
【０１１９】
本明細書中で使用される場合、「活性のあるクロストリジウム毒素転移ドメイン断片」という用語は、本明細の態様において有用であり得る転移ドメインを含む様々なクロストリジウム毒素断片の何れかを指すが、ただし、これらの活性断片は、細胞内小胞から標的細胞の細胞質へのＬＣの放出を促進し得、従って、クロストリジウム毒素がタンパク質分解性に基質を切断する全体的な細胞性機構の遂行に関与するものとする。クロストリジウム毒素の重鎖由来の転移ドメインはおよそ４１０〜４３０アミノ酸長であり、転移ドメインを含む（表１）。研究から、クロストリジウム毒素重鎖からの転移ドメインの全長が転移ドメインの転移活性に必要であるわけではないことが示される。従って、この実施形態の態様は、例えば、少なくとも３５０、３７５、４００又は４２５アミノ酸長を有するクロストリジウム毒素転移ドメインを含む。この実施形態の他の態様は、例えば、最長で３５０、３７５、４００又は４２５個のアミノ酸長のクロストリジウム毒素転移ドメインを含む。
【０１２０】
天然起源のクロストリジウム毒素転移ドメイン変異体及び非天然のクロストリジウム毒素転移ドメイン変異体の同一性パーセントを決定するために、包括的方法、ローカル法及びハイブリッド法、例えばセグメントアプローチ法を含むがこれらに限定されない様々な配列アラインメント法の何れかを使用することができる。同一性パーセントを決定するためのプロトコールは、当業者の範囲内の及び本明細書中の教示からの通例の手段である。
【０１２１】
従って、実施形態において、本明細で開示される改変クロストリジウム毒素はクロストリジウム毒素転移ドメインを含む。この実施形態の態様において、クロストリジウム毒素転移ドメインは、天然起源のクロストリジウム毒素転移ドメイン変異体、例えばクロストリジウム毒素転移ドメインアイソフォーム又はクロストリジウム毒素転移ドメインサブタイプなどを含む。この実施形態の別の態様において、クロストリジウム毒素転移ドメインは、非天然のクロストリジウム毒素転移ドメイン変異体、例えば保存的クロストリジウム毒素転移ドメイン変異体、非保存的クロストリジウム毒素転移ドメイン変異体、活性のあるクロストリジウム毒素転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１２２】
別の実施形態において、本クロストリジウム毒素転移ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の疎水性アミノ酸転移ドメインを別の疎水性アミノ酸で置換し得る。疎水性アミノ酸の例としては、例えば、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ及びＷが挙げられる。この実施形態の別の態様において、本クロストリジウム毒素転移ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の脂肪族アミノ酸を別の脂肪族アミノ酸で置換し得る。脂肪族アミノ酸の例としては、例えば、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｐ及びＶが挙げられる。この実施形態のまた別の態様において、本クロストリジウム毒素転移ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の芳香族アミノ酸を別の芳香族アミノ酸で置換し得る。芳香族アミノ酸の例としては、例えば、Ｆ、Ｈ、Ｗ及びＹが挙げられる。この実施形態のさらに別の態様において、本クロストリジウム毒素転移ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置のスタッキングアミノ酸を別のスタッキングアミノ酸で置換し得る。スタッキングアミノ酸の例としては、例えば、Ｆ、Ｈ、Ｗ及びＹが挙げられる。この実施形態のさらなる態様において、本クロストリジウム毒素転移ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の極性アミノ酸を別の極性アミノ酸で置換し得る。極性アミノ酸の例としては、例えば、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｑ及びＲが挙げられる。この実施形態のさらなる態様において、本クロストリジウム毒素転移ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の低極性又は中性的アミノ酸を別の低極性又は中性的アミノ酸で置換し得る。低極性又は中性的アミノ酸の例としては、例えば、Ａ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ及びＹが挙げられる。この実施形態のまたさらなる態様において、本クロストリジウム毒素転移ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の正に荷電したアミノ酸を別の正に荷電したアミノ酸で置換し得る。正に荷電したアミノ酸の例としては、例えば、Ｋ、Ｒ及びＨが挙げられる。この実施形態のまたさらなる態様において、本クロストリジウム毒素転移ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の負に荷電したアミノ酸を別の負に荷電したアミノ酸で置換し得る。負に荷電したアミノ酸の例としては、例えば、Ｄ及びＥが挙げられる。この実施形態の別の態様において、本クロストリジウム毒素転移ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の小型アミノ酸を別の小型アミノ酸で置換し得る。小型アミノ酸の例としては、例えばＡ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ及びＴが挙げられる。この実施形態のまた別の態様において、本クロストリジウム毒素転移ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置のＣ−β分岐型アミノ酸を別のＣ−β分岐型アミノ酸で置換し得る。Ｃ−β分岐型アミノ酸の例としては、例えばＩ、Ｔ及びＶが挙げられる。
【０１２３】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素転移ドメインはＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の転移ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインは、配列番号１のアミノ酸４５５〜８７３を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン変異体、例えばＢｏＮＴ／Ａアイソフォームからの転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ａサブタイプからの転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の天然起源のＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ａアイソフォーム転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ａサブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインは、配列番号１の天然起源のＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン変異体のアミノ酸４５５〜８７３、例えば、ＢｏＮＴ／Ａアイソフォーム転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ａサブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の非天然のＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン変異体の転移ドメイン、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインは、配列番号１の非天然のＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン変異体のアミノ酸４５５〜８７３、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１２４】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の転移ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の転移ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインは、例えば、配列番号１のアミノ酸４５５〜８７３に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１のアミノ酸４５５〜８７３に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１２５】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインは、例えば、配列番号１のアミノ酸４５５〜８７３に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１のアミノ酸４５５〜８７３に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の転移ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインは、例えば、配列番号１のアミノ酸４５５〜８７３に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１のアミノ酸４５５〜８７３に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１２６】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素転移ドメインは、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の転移ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメインは、配列番号６のアミノ酸４４７〜８６０を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｂアイソフォームからの転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｂサブタイプからの転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の天然起源のＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｂアイソフォーム転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｂサブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメインは、配列番号６の天然起源のＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン変異体のアミノ酸４４７〜８６０、例えば、ＢｏＮＴ／Ｂアイソフォーム転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｂサブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の非天然のＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン変異体の転移ドメイン、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメインは、配列番号６の非天然のＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン変異体のアミノ酸４４７〜８６０、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１２７】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメインは、例えば、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の転移ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の転移ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメインは、例えば、配列番号６のアミノ酸４４７〜８６０に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号６のアミノ酸４４７〜８６０に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１２８】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメインは、例えば、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメインは、例えば、配列番号６のアミノ酸４４７〜８６０に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号６のアミノ酸４４７〜８６０に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメインは、例えば、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の転移ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメインは、例えば、配列番号６のアミノ酸４４７〜８６０に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号６のアミノ酸４４７〜８６０に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１２９】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素転移ドメインはＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメインは、配列番号１１又は配列番号１２の転移ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメインは、配列番号１１のアミノ酸４５４〜８６８を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｃ１アイソフォームからの転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプからの転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメインは、配列番号１１又は配列番号１２の天然起源のＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｃ１アイソフォーム転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメインは、配列番号１１の天然起源のＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン変異体のアミノ酸４５４〜８６８、例えば、ＢｏＮＴ／Ｃ１アイソフォーム転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメインは、配列番号１１又は配列番号１２の非天然のＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン変異体の転移ドメイン、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメインは、配列番号１１の非天然のＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン変異体のアミノ酸４５４〜８６８、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１３０】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメインは、例えば、配列番号１１もしくは配列番号１２の転移ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１１もしくは配列番号１２の転移ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメインは、例えば、配列番号１１のアミノ酸４５４〜８６８に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１１のアミノ酸４５４〜８６８に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１３１】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメインは、例えば、配列番号１１もしくは配列番号１２の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１１もしくは配列番号１２の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメインは、例えば、配列番号１１のアミノ酸４５４〜８６８に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１１のアミノ酸４５４〜８６８に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメインは、例えば、配列番号１１もしくは配列番号１２の転移ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１１もしくは配列番号１２の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメインは、例えば、配列番号１１のアミノ酸４５４〜８６８に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１１のアミノ酸４５４〜８６８に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１３２】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素転移ドメインはＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメインは、配列番号１３又は配列番号１４の転移ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメインは、配列番号１３のアミノ酸４５１〜８６４を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｄアイソフォームからの転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｄサブタイプからの転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメインは、配列番号１３もしくは配列番号１４の天然起源のＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｄアイソフォーム転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｄサブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメインは、配列番号１３の天然起源のＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン変異体のアミノ酸４５１〜８６４、例えば、ＢｏＮＴ／Ｄアイソフォーム転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｄサブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメインは、配列番号１３もしくは配列番号１４の非天然のＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン変異体の転移ドメイン、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメインは、配列番号１３の非天然のＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン変異体のアミノ酸４５１〜８６４、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１３３】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメインは、例えば、配列番号１３もしくは配列番号１４の転移ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１３もしくは配列番号１４の転移ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメインは、例えば、配列番号１３のアミノ酸４５１〜８６４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１３のアミノ酸４５１〜８６４に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１３４】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメインは例えば、配列番号１３もしくは配列番号１４の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１３もしくは配列番号１４の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメインは、例えば、配列番号１３のアミノ酸４５１〜８６４に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１３のアミノ酸４５１〜８６４に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメインは、例えば、配列番号１３もしくは配列番号１４の転移ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１３もしくは配列番号１４の転移ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメインは、例えば、配列番号１３のアミノ酸４５１〜８６４に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１３のアミノ酸４５１〜８６４に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１３５】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素転移ドメインはＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメインは、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７の転移ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメインは、配列番号１５のアミノ酸４２７〜８４７を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン変異体、例えばＢｏＮＴ／Ｅアイソフォームからの転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｅサブタイプからの転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメインは、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７の天然起源のＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｅアイソフォーム転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｅサブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメインは、配列番号１５の天然起源のＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン変異体のアミノ酸４２７〜８４７、例えば、ＢｏＮＴ／Ｅアイソフォーム転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｅサブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメインは、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７の非天然のＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン変異体の転移ドメイン、例えば保存的ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメインは、配列番号１５の非天然のＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン変異体のアミノ酸４２７〜８４７、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１３６】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメインは、例えば、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７の転移ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７の転移ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメインは、例えば、配列番号１５のアミノ酸４２７〜８４７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１５のアミノ酸４２７〜８４７に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１３７】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメインは、例えば、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメインは、例えば、配列番号１５のアミノ酸４２７〜８４７に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１５のアミノ酸４２７〜８４７に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメインは、例えば、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７の転移ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメインは、例えば、配列番号１５のアミノ酸４２７〜８４７に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１５のアミノ酸４２７〜８４７に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１３８】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素転移ドメインはＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメインは、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の転移ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメインは、配列番号１８のアミノ酸４４６〜８６５を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｆアイソフォームからの転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｆサブタイプからの転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメインは、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の天然起源のＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｆアイソフォーム転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｆサブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメインは、配列番号１８の天然起源のＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン変異体のアミノ酸４４６〜８６５、例えば、ＢｏＮＴ／Ｆアイソフォーム転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｆサブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメインは、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の非天然のＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン変異体の転移ドメイン、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメインは、配列番号１８の非天然のＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン変異体のアミノ酸４４６〜８６５、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１３９】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメインは、例えば、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の転移ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の転移ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメインは、例えば、配列番号１８のアミノ酸４４６〜８６５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１８のアミノ酸４４６〜８６５に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１４０】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメインは、例えば、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメインは、例えば、配列番号１８のアミノ酸４４６〜８６５に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１８のアミノ酸４４６〜８６５に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメインは、例えば、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の転移ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメインは、例えば、配列番号１８のアミノ酸４４６〜８６５に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１８のアミノ酸４４６〜８６５に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１４１】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素転移ドメインはＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメインは、配列番号２１の転移ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメインは、配列番号２１のアミノ酸４５１〜８６５を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｇアイソフォームからの転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｇサブタイプからの転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメインは、配列番号２１の天然起源のＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｇアイソフォーム転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｇサブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメインは、配列番号２１の天然起源のＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン変異体のアミノ酸４５１〜８６５、例えば、ＢｏＮＴ／Ｇアイソフォーム転移ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｇサブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメインは、配列番号２１の非天然のＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン変異体の転移ドメイン、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメインは、配列番号２１の非天然のＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン変異体のアミノ酸４５１〜８６５、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１４２】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメインは、例えば、配列番号２１の転移ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２１の転移ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメインは、例えば、配列番号２１のアミノ酸４５１〜８６５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２１のアミノ酸４５１〜８６５に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１４３】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメインは、例えば、配列番号２１の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２１の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメインは、例えば、配列番号２１のアミノ酸４５１〜８６５に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２１のアミノ酸４５１〜８６５に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメインは、例えば、配列番号２１の転移ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２１の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメインは、例えば、配列番号２１のアミノ酸４５１〜８６５に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２１のアミノ酸４５１〜８６５に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１４４】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素転移ドメインはＴｅＮＴ転移ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＴｅＮＴ転移ドメインは、配列番号２２の転移ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＴｅＮＴ転移ドメインは、配列番号２２のアミノ酸４６８〜８８１を含む。この実施形態の別の態様において、ＴｅＮＴ転移ドメインは、天然起源のＴｅＮＴ転移ドメイン変異体、例えば、ＴｅＮＴアイソフォームからの転移ドメイン又はＴｅＮＴサブタイプからの転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＴｅＮＴ転移ドメインは、配列番号２２の天然起源のＴｅＮＴ転移ドメイン変異体、例えば、ＴｅＮＴアイソフォーム転移ドメイン又はＴｅＮＴサブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＴｅＮＴ転移ドメインは、配列番号２２の天然起源のＴｅＮＴ転移ドメイン変異体のアミノ酸４６８〜８８１、例えば、ＴｅＮＴアイソフォーム転移ドメイン又はＴｅＮＴサブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＴｅＮＴ転移ドメインは、非天然のＴｅＮＴ転移ドメイン変異体、例えば、保存的ＴｅＮＴ転移ドメイン変異体、非保存的ＴｅＮＴ転移ドメイン変異体、活性のあるＴｅＮＴ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＴｅＮＴ転移ドメインは、配列番号２２の非天然のＴｅＮＴ転移ドメイン変異体の転移ドメイン、例えば、保存的ＴｅＮＴ転移ドメイン変異体、非保存的ＴｅＮＴ転移ドメイン変異体、活性のあるＴｅＮＴ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＴｅＮＴ転移ドメインは、配列番号２２の非天然のＴｅＮＴ転移ドメイン変異体のアミノ酸４６８〜８８１、例えば、保存的ＴｅＮＴ転移ドメイン変異体、非保存的ＴｅＮＴ転移ドメイン変異体、活性のあるＴｅＮＴ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１４５】
この実施形態の他の態様において、ＴｅＮＴ転移ドメインは、例えば、配列番号２２の転移ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２２の転移ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＴｅＮＴ転移ドメインは、例えば、配列番号２２のアミノ酸４６８〜８８１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２２のアミノ酸４６８〜８８１に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１４６】
この実施形態の他の態様において、ＴｅＮＴ転移ドメインは、例えば、配列番号２２の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２２の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＴｅＮＴ転移ドメインは、例えば、配列番号２２のアミノ酸４６８〜８８１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２２のアミノ酸４６８〜８８１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＴｅＮＴ転移ドメインは、例えば、配列番号２２の転移ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２２の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＴｅＮＴ転移ドメインは、例えば、配列番号２２のアミノ酸４６８〜８８１に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２２のアミノ酸４６８〜８８１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１４７】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素転移ドメインはＢａＮＴ転移ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢａＮＴ転移ドメインは、配列番号２３の転移ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢａＮＴ転移ドメインは、配列番号２３のアミノ酸４３６〜８５７を含む。この実施形態の別の態様において、ＢａＮＴ転移ドメインは、天然起源のＢａＮＴ転移ドメイン変異体、例えば、ＢａＮＴアイソフォームからの転移ドメイン又はＢａＮＴサブタイプからの転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢａＮＴ転移ドメインは、配列番号２３の天然起源のＢａＮＴ転移ドメイン変異体、例えば、ＢａＮＴアイソフォーム転移ドメイン又はＢａＮＴサブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢａＮＴ転移ドメインは、配列番号２３天然起源のＢａＮＴ転移ドメイン変異体のアミノ酸４３６〜８５７、例えば、ＢａＮＴアイソフォーム転移ドメイン又はＢａＮＴサブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢａＮＴ転移ドメインは、非天然のＢａＮＴ転移ドメイン変異体、例えば、保存的ＢａＮＴ転移ドメイン変異体、非保存的ＢａＮＴ転移ドメイン変異体、活性のあるＢａＮＴ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢａＮＴ転移ドメインは、配列番号２３の非天然のＢａＮＴ転移ドメイン変異体の転移ドメイン、例えば、保存的ＢａＮＴ転移ドメイン変異体、非保存的ＢａＮＴ転移ドメイン変異体、活性のあるＢａＮＴ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢａＮＴ転移ドメインは、配列番号２３の非天然のＢａＮＴ転移ドメイン変異体のアミノ酸４３６〜８５７、例えば、保存的ＢａＮＴ転移ドメイン変異体、非保存的ＢａＮＴ転移ドメイン変異体、活性のあるＢａＮＴ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１４８】
この実施形態の他の態様において、ＢａＮＴ転移ドメインは、例えば、配列番号２３の転移ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２３の転移ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢａＮＴ転移ドメインは、例えば、配列番号２３のアミノ酸４３６〜８５７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２３のアミノ酸４３６〜８５７に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１４９】
この実施形態の他の態様において、ＢａＮＴ転移ドメインは、例えば、配列番号２３の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２３の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢａＮＴ転移ドメインは、例えば、配列番号２３のアミノ酸４３６〜８５７に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２３のアミノ酸４３６〜８５７に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢａＮＴ転移ドメインは、例えば、配列番号２３の転移ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２３の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢａＮＴ転移ドメインは、例えば、配列番号２３のアミノ酸４３６〜８５７に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２３のアミノ酸４３６〜８５７に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１５０】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素転移ドメインはＢｕＮＴ転移ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｕＮＴ転移ドメインは、配列番号２４又は配列番号２５の転移ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｕＮＴ転移ドメインは、配列番号２４のアミノ酸４２７〜８４７を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｕＮＴ転移ドメインは、天然起源のＢｕＮＴ転移ドメイン変異体、例えば、ＢｕＮＴアイソフォームからの転移ドメイン又はＢｕＮＴサブタイプからの転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｕＮＴ転移ドメインは、配列番号２４又は配列番号２５の天然起源のＢｕＮＴ転移ドメイン変異体、例えば、ＢｕＮＴアイソフォーム転移ドメイン又はＢｕＮＴサブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｕＮＴ転移ドメインは、配列番号２４の天然起源のＢｕＮＴ転移ドメイン変異体のアミノ酸４２７〜８４７、例えば、ＢｕＮＴアイソフォーム転移ドメイン又はＢｕＮＴサブタイプ転移ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｕＮＴ転移ドメインは、非天然のＢｕＮＴ転移ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｕＮＴ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｕＮＴ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｕＮＴ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｕＮＴ転移ドメインは、配列番号２４又は配列番号２５の非天然のＢｕＮＴ転移ドメイン変異体の転移ドメイン、例えば、保存的ＢｕＮＴ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｕＮＴ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｕＮＴ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｕＮＴ転移ドメインは、配列番号２４の非天然のＢｕＮＴ転移ドメイン変異体のアミノ酸４２７〜８４７、例えば、保存的ＢｕＮＴ転移ドメイン変異体、非保存的ＢｕＮＴ転移ドメイン変異体、活性のあるＢｕＮＴ転移ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１５１】
この実施形態の他の態様において、ＢｕＮＴ転移ドメインは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５の転移ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２４もしくは配列番号２５の転移ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｕＮＴ転移ドメインは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸４２７〜８４７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸４２７〜８４７に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１５２】
この実施形態の他の態様において、ＢｕＮＴ転移ドメインは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２４もしくは配列番号２５の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｕＮＴ転移ドメインは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸４２７〜８４７に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸４２７〜８４７に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｕＮＴ転移ドメインは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５の転移ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２４もしくは配列番号２５の転移ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｕＮＴ転移ドメインは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸４２７〜８４７に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸４２７〜８４７に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１５３】
本明細の態様は、ある一部分において、結合ドメインを提供する。本明細書中で使用される場合、「結合ドメイン」という用語は、「リガンド」又は「標的化部分」と同義であり、生理的条件下で細胞表面上に存在する別の分子と選択的に相互作用し得るいずれの分子をも指す。細胞表面分子は、ポリペプチド、多糖類、脂質を含み得るか又はこれらのうちの複数の構造的特徴を有し得る。本明細書中で使用される場合、「選択的に相互作用する」という用語は、他の非標的受容体と比較して、統計学的に有意に高い程度まで、生理的条件下で又は実質的に生理的条件に近いインビトロ条件で、分子がその標的受容体に結合できることを指す。本明細で開示されるクロストリジウム毒素結合ドメインに関して、他の受容体と比較して、クロストリジウム毒素結合ドメインのその同系受容体に対する差別的結合がある。本明細で開示される非クロストリジウム毒素結合ドメインに関して、他の受容体と比較して、非クロストリジウム毒素結合ドメインのその同系受容体に対する差別的結合がある。
【０１５４】
従って、実施形態において、標的受容体と選択的に結合する結合ドメインの、標的受容体に対する平衡解離定数（ＫＤ）は、非標的受容体と比較して、例えば、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００、少なくとも１０，０００又は少なくとも１００，０００倍高い。
【０１５５】
本明細の態様は、一部分においてクロストリジウム毒素結合ドメインを提供する。本明細書中で使用される場合、「クロストリジウム毒素結合ドメイン」という用語は、本明細で開示される改変クロストリジウム毒素が標的細胞を中毒化する、全体的な内部移行機構を開始させる中毒化過程の結合段階を遂行することができる何らかのクロストリジウム毒素ポリペプチドを指す。クロストリジウム毒素結合ドメインの非限定例としては、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン、ＴｅＮＴ結合ドメイン、ＢａＮＴ結合ドメイン及びＢｕＮＴ結合ドメインが挙げられる。クロストリジウム毒素結合ドメインの他の非限定例としては、例えば、配列番号１のアミノ酸８７４〜１２９６、配列番号２のアミノ酸８６１〜１２９１，配列番号３のアミノ酸８６９〜１２９１、配列番号４のアミノ酸８６５〜１２９１、配列番号５のアミノ酸８４８〜１２５２、配列番号６のアミノ酸８６６〜１２７４、配列番号７のアミノ酸８６６〜１２９７、配列番号８のアミノ酸８８２〜１３１５、配列番号９のアミノ酸８５８〜１２６８及び配列番号１０のアミノ酸８４８〜１２５１が挙げられる。
【０１５６】
クロストリジウム毒素結合ドメインとしては、天然起源のクロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、例えば、クロストリジウム毒素結合ドメインアイソフォーム及びクロストリジウム毒素結合ドメインサブタイプなど；非天然のクロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、非保存的クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、それらの活性のあるクロストリジウム毒素結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５７】
本明細書中で使用される場合、「クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体」という用語は、天然であれ又は非天然であれ、開示される参照配列（表１）の対応する領域からの少なくとも１つのアミノ酸変化を有するクロストリジウム毒素結合ドメインを指し、その参照配列の対応する領域に対する同一性パーセントで記載することができる。明確な指示がない限り、開示される実施形態を実施するために有用なクロストリジウム毒素結合ドメイン変異体は、クロストリジウム毒素軽鎖転移に介在する中毒化過程の転移段階を遂行する変異体である。非限定例として、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン変異体は、配列番号１のアミノ酸８７４〜１２９６と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン変異体は、配列番号６のアミノ酸８６１〜１２９１と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン変異体は、配列番号１１のアミノ酸８６９〜１２９１と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン変異体は、配列番号１３のアミノ酸８６５〜１２９１と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン変異体は、配列番号１５のアミノ酸８４８〜１２５２と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン変異体は、配列番号１８のアミノ酸８６６〜１２７４と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン変異体は、配列番号２１のアミノ酸８６６〜１２９７と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＴｅＮＴ結合ドメイン変異体は、配列番号２２のアミノ酸８８２〜１３１５と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢａＮＴ結合ドメイン変異体は、配列番号２３のアミノ酸８５８〜１２６８と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加など、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有し；ＢｕＮＴ結合ドメイン変異体は、配列番号２４のアミノ酸８４８〜１２５１と比較した場合、例えばアミノ酸置換、欠失又は付加などの少なくとも１つのアミノ酸の相違を有する。
【０１５８】
クロストリジウム毒素の各血清型内で、それらのアミノ酸配列及びまたこれらのタンパク質をコードする核酸が幾分異なる天然起源のクロストリジウム毒素結合ドメイン変異体があり得ることは当業者により認識される。例えば、現在のところ、５種類のＢｏＮＴ／Ａサブタイプ、すなわちＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３、ＢｏＮＴ／Ａ４及びＢｏＮＴ／Ａ５があり、特定の結合ドメインサブタイプは、配列番号１のＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインサブタイプと比較した場合に約８３から９７％のアミノ酸同一性を示す。別の例として、現在のところ、５種類のＢｏＮＴ／Ａサブタイプ、すなわちＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３、ＢｏＮＴ／Ａ４及びＢｏＮＴ／Ａ５があり、特定の結合ドメインサブタイプは、配列番号１のＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインサブタイプと比較した場合に約８３から９７％のアミノ酸同一性を示す。本明細書中で使用される場合、「天然起源のクロストリジウム毒素結合ドメイン変異体」という用語は、オルタナティブスプライシングを受けた転写物から産生されるクロストリジウム毒素結合ドメインアイソフォーム、自然突然変異により産生されるクロストリジウム毒素結合ドメインアイソフォーム及びクロストリジウム毒素結合ドメインサブタイプを含むが限定されない、天然起源の過程により産生される何らかのクロストリジウム毒素結合ドメインを指す。天然起源のクロストリジウム毒素結合ドメイン変異体は、その天然起源のクロストリジウム毒素結合ドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素結合ドメインと実質的に同じように機能し得、本明細いずれの態様においても、参照クロストリジウム毒素結合ドメインと置き換えられ得る。
【０１５９】
天然起源のクロストリジウム毒素結合ドメイン変異体の非限定例は、クロストリジウム毒素結合ドメインアイソフォーム、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインアイソフォーム、ＴｅＮＴ結合ドメインアイソフォーム、ＢａＮＴ結合ドメインアイソフォーム及びＢｕＮＴ結合ドメインアイソフォームなどである。天然起源のクロストリジウム毒素結合ドメイン変異体の別の非限定例は、クロストリジウム毒素結合ドメインサブタイプ、例えば、サブタイプＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３、ＢｏＮＴ／Ａ４及びＢｏＮＴ／Ａ５からの結合ドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｂ１、ＢｏＮＴ／Ｂ２、ＢｏＮＴ／Ｂ二価及びＢｏＮＴ／Ｂ非タンパク質分解性からの結合ドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｃ１−１及びＢｏＮＴ／Ｃ１−２からの結合ドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｅ１、ＢｏＮＴ／Ｅ２及びＢｏＮＴ／Ｅ３からの結合ドメイン；及びサブタイプＢｏＮＴ／Ｆ１、ＢｏＮＴ／Ｆ２及びＢｏＮＴ／Ｆ３からの結合ドメイン；及びサブタイプＢｕＮＴ−１及びＢｕＮＴ−２からの結合ドメインである。
【０１６０】
本明細書中で使用される場合、「非天然のクロストリジウム毒素結合ドメイン変異体」という用語は、無作為変異誘発又は合理的設計を用いて遺伝子改変することにより作製されるクロストリジウム毒素結合ドメイン及び化学合成により作製されるクロストリジウム毒素結合ドメインを含むが限定されない、ヒト操作の助力のもと産生される何らかのクロストリジウム毒素結合ドメインを指す。非天然のクロストリジウム毒素結合ドメイン変異体の非限定例としては、例えば、保存的クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、非保存的クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、クロストリジウム毒素結合ドメインキメラ変異体及び活性のあるクロストリジウム毒素結合ドメイン断片が挙げられる。
【０１６１】
本明細書中で使用される場合、「保存的クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体」という用語は、参照クロストリジウム毒素結合ドメイン配列（表１）からの元のアミノ酸の特性と類似した少なくとも１つの特性を有する別のアミノ酸又はアミノ酸類似体により置換されている少なくとも１つのアミノ酸を有するクロストリジウム毒素結合ドメインを指す。特性の例としては、同様の大きさ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能、水素結合能、物理化学的特性など又はそれらの何らかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。保存的クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体は、その保存的クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素結合ドメインと実質的に同じように機能し得、本明細のいずれの態様においても、参照クロストリジウム毒素結合ドメインと置き換えられ得る。保存的クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体の非限定例としては、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン変異体、保存的ＴｅＮＴ結合ドメイン変異体、保存的ＢａＮＴ結合ドメイン変異体及び保存的ＢｕＮＴ結合ドメイン変異体が挙げられる。
【０１６２】
本明細書中で使用される場合、「非保存的クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体」という用語は、１）少なくとも１つのアミノ酸が、その非保存的クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素結合ドメインから欠失しているか；２）少なくとも１つのアミノ酸が、その非保存的クロストリジウム毒素転移ドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素転移ドメインに付加されているか；又は３）少なくとも１つのアミノ酸が、参照クロストリジウム毒素結合ドメイン配列（表１）からの元のアミノ酸の特性と類似の特性を何ら共有しない別のアミノ酸又はアミノ酸類似体により置換されている、クロストリジウム毒素結合ドメインを指す。非保存的クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体は、その非保存的クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体が基づく参照クロストリジウム毒素結合ドメインと実質的に同じように機能し得、本明細のいずれの態様においても、参照クロストリジウム毒素結合ドメインと置き換えられ得る。非保存的クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体の非限定例としては、例えば、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン変異体及び非保存的ＴｅＮＴ結合ドメイン変異体、非保存的ＢａＮＴ結合ドメイン変異体及び非保存的ＢｕＮＴ結合ドメイン変異体が挙げられる。
【０１６３】
本明細書中で使用される場合、「活性のあるクロストリジウム毒素結合ドメイン断片」という用語は、本明細の態様において有用であり得る結合ドメインを含む様々なクロストリジウム毒素断片の何れかを指すが、ただし、これらの活性断片は、標的細胞の細胞質への細胞内小胞からのＬＣの放出を促進し得、従って、クロストリジウム毒素がタンパク質分解性に基質を切断する全体的な細胞性機構の遂行に関与するものとする。クロストリジウム毒素の重鎖からの結合ドメインはおよそ４００〜４４０アミノ酸長であり、結合ドメイン（表１）を含む。研究から、クロストリジウム毒素重鎖からの結合ドメインの全長が結合ドメインの転移活性に必要であるわけではないことが示されている。従って、この実施形態の態様は、例えば、少なくとも３５０、３７５、４００又は４２５アミノ酸長のクロストリジウム毒素結合ドメインを含む。この実施形態の他の態様は、例えば、最長で３５０、３７５、４００又は４２５アミノ酸長のクロストリジウム毒素結合ドメインを含む。
【０１６４】
天然起源のクロストリジウム毒素結合ドメイン変異体及び非天然のクロストリジウム毒素結合ドメイン変異体の同一性パーセントを決定するために、包括的方法、ローカル法及びハイブリッド法、例えばセグメントアプローチ法を含むがこれらに限定されない様々な配列アラインメント法の何れかを使用することができる。同一性パーセントを決定するためのプロトコールは、当業者の範囲内の及び本明細書中の教示からの通例の手段である。
【０１６５】
従って、実施形態において、本明細で開示される改変クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素結合ドメインを含む。この実施形態の態様において、クロストリジウム毒素結合ドメインは、天然起源のクロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、例えば、クロストリジウム毒素結合ドメインアイソフォーム又はクロストリジウム毒素結合ドメインサブタイプなどを含む。この実施形態の別の態様において、クロストリジウム毒素結合ドメインは、非天然のクロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、例えば、保存的クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、非保存的クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、活性のあるクロストリジウム毒素結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１６６】
別の実施形態において、本クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の疎水性アミノを別の疎水性アミノ酸で置換し得る。疎水性アミノ酸の例としては、例えば、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ及びＷが挙げられる。この実施形態の別の態様において、本クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の脂肪族アミノ酸を別の脂肪族アミノ酸で置換し得る。脂肪族アミノ酸の例としては、例えば、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｐ及びＶが挙げられる。この実施形態のまた別の態様において、本クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の芳香族アミノ酸を別の芳香族アミノ酸で置換し得る。芳香族アミノ酸の例としては、例えば、Ｆ、Ｈ、Ｗ及びＹが挙げられる。この実施形態のさらに別の態様において、本クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置のスタッキングアミノ酸を別のスタッキングアミノ酸で置換し得る。スタッキングアミノ酸の例としては、例えば、Ｆ、Ｈ、Ｗ及びＹが挙げられる。この実施形態のさらなる態様において、本クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の極性アミノ酸を別の極性アミノ酸で置換し得る。極性アミノ酸の例としては、例えば、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｑ及びＲが挙げられる。この実施形態のさらなる態様において、本クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の低極性又は中性的アミノ酸を別の低極性又は中性的アミノ酸で置換し得る。低極性又は中性的アミノ酸の例としては、例えば、Ａ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ及びＹが挙げられる。この実施形態のまたさらなる態様において、本クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の正に荷電したアミノ酸を別の正に荷電したアミノ酸で置換し得る。正に荷電したアミノ酸の例としては、例えば、Ｋ、Ｒ及びＨが挙げられる。この実施形態のまたさらなる態様において、本クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の負に荷電したアミノ酸を別の負に荷電したアミノ酸で置換し得る。負に荷電したアミノ酸の例としては、例えば、Ｄ及びＥが挙げられる。この実施形態の別の態様において、本クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の小型アミノ酸を別の小型アミノ酸で置換し得る。小型アミノ酸の例としては、例えばＡ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ及びＴが挙げられる。この実施形態のまた別の態様において、本クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置のＣ−β分岐型アミノ酸を別のＣ−β分岐型アミノ酸で置換し得る。Ｃ−β分岐型アミノ酸の例としては、例えばＩ、Ｔ及びＶが挙げられる。
【０１６７】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素結合ドメインはＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の結合ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸８７４〜１２９６を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ａアイソフォームからの結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ａサブタイプからの結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の天然起源のＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ａアイソフォーム結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ａサブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインは、配列番号１の天然起源のＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン変異体のアミノ酸８７４〜１２９６、例えば、ＢｏＮＴ／Ａアイソフォーム結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ａサブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の非天然のＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン変異体の結合ドメイン、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインは、配列番号１の非天然のＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン変異体のアミノ酸８７４〜１２９６、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１６８】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の結合ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の結合ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインは、例えば、配列番号１のアミノ酸８７４〜１２９６に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１のアミノ酸８７４〜１２９６に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１６９】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインは、例えば、配列番号１のアミノ酸８７４〜１２９６に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１のアミノ酸８７４〜１２９６に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の結合ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインは、例えば、配列番号１のアミノ酸８７４〜１２９６に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１のアミノ酸８７４〜１２９６に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１７０】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素結合ドメインはＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の結合ドメイン含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインは、配列番号６のアミノ酸８６１〜１２９１を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｂアイソフォームからの結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｂサブタイプからの結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の天然起源のＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｂアイソフォーム結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｂサブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインは、配列番号６の天然起源のＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン変異体のアミノ酸８６１〜１２９１、例えば、ＢｏＮＴ／Ｂアイソフォーム結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｂサブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０の非天然のＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン変異体の結合ドメイン、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインは、配列番号６の非天然のＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン変異体のアミノ酸８６１〜１２９１、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１７１】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインは、例えば、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の結合ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の結合ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインは、例えば、配列番号６のアミノ酸８６１〜１２９１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号６のアミノ酸８６１〜１２９１に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１７２】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインは、例えば、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインは、例えば、配列番号６のアミノ酸８６１〜１２９１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号６のアミノ酸８６１〜１２９１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインは、例えば、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の結合ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインは、例えば、配列番号６のアミノ酸８６１〜１２９１に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号６のアミノ酸８６１〜１２９１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１７３】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素結合ドメインはＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインは、配列番号１１又は配列番号１２の結合ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインは、配列番号１１のアミノ酸８６９〜１２９１を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｃ１アイソフォームからの結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプからの結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインは、配列番号１１又は配列番号１２の天然起源のＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｃ１アイソフォーム結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインは、配列番号１１の天然起源のＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン変異体のアミノ酸８６９〜１２９１、例えば、ＢｏＮＴ／Ｃ１アイソフォーム結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインは、配列番号１１又は配列番号１２の非天然のＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン変異体の結合ドメイン、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインは、配列番号１１の非天然のＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン変異体のアミノ酸８６９〜１２９１、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１７４】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインは、例えば、配列番号１１もしくは配列番号１２の結合ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１１もしくは配列番号１２の結合ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインは、例えば、配列番号１１のアミノ酸８６９〜１２９１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１１のアミノ酸８６９〜１２９１に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１７５】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインは、例えば、配列番号１１もしくは配列番号１２の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１１もしくは配列番号１２の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインは、例えば、配列番号１１のアミノ酸８６９〜１２９１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１１のアミノ酸８６９〜１２９１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインは、例えば、配列番号１１もしくは配列番号１２の結合ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１１もしくは配列番号１２の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインは、例えば、配列番号１１のアミノ酸８６９〜１２９１に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１１のアミノ酸８６９〜１２９１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１７６】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素結合ドメインはＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインは、配列番号１３又は配列番号１４の結合ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインは、配列番号１３のアミノ酸８６５〜１２９１を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｄアイソフォームからの結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｄサブタイプからの結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインは、配列番号１３もしくは配列番号１４の天然起源のＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｄアイソフォーム結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｄサブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインは、配列番号１３の天然起源のＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン変異体のアミノ酸８６５〜１２９１、例えば、ＢｏＮＴ／Ｄアイソフォーム結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｄサブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインは、配列番号１３もしくは配列番号１４の非天然のＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン変異体の結合ドメイン、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインは、配列番号１３の非天然のＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン変異体のアミノ酸８６５〜１２９１、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１７７】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインは、例えば、配列番号１３もしくは配列番号１４の結合ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１３もしくは配列番号１４の結合ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインは、例えば、配列番号１３のアミノ酸８６５〜１２９１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１３のアミノ酸８６５〜１２９１に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１７８】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインは、例えば、配列番号１３もしくは配列番号１４の結合ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１３もしくは配列番号１４の結合ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインは、例えば、配列番号１３のアミノ酸８６５〜１２９１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１３のアミノ酸８６５〜１２９１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインは、例えば、配列番号１３もしくは配列番号１４の結合ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１３もしくは配列番号１４の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインは、例えば、配列番号１３のアミノ酸８６５〜１２９１に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１３のアミノ酸８６５〜１２９１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１７９】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素結合ドメインは、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインは、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７の結合ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインは、配列番号１５のアミノ酸８４８〜１２５２を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｅアイソフォームからの結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｅサブタイプからの結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインは、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７の天然起源のＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｅアイソフォーム結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｅサブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインは、配列番号１５の天然起源のＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン変異体のアミノ酸８４８〜１２５２、例えば、ＢｏＮＴ／Ｅアイソフォーム結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｅサブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインは、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７の非天然のＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン変異体の結合ドメイン、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインは、配列番号１５の非天然のＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン変異体のアミノ酸８４８〜１２５２、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１８０】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインは、例えば、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７の結合ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７の結合ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインは、例えば、配列番号１５のアミノ酸８４８〜１２５２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１５のアミノ酸８４８〜１２５２に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１８１】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインは、例えば、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインは、例えば、配列番号１５のアミノ酸８４８〜１２５２に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１５のアミノ酸８４８〜１２５２に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインは、例えば、配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７の結合ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインは、例えば、配列番号１５のアミノ酸８４８〜１２５２に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１５のアミノ酸８４８〜１２５２に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１８２】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素結合ドメインはＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインは、配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０の結合ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインは、配列番号１８のアミノ酸８６６〜１２７４を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン変異体、例えばＢｏＮＴ／Ｆアイソフォームからの結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｆサブタイプからの結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインは、配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０の天然起源のＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｆアイソフォーム結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｆサブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインは、配列番号１８の天然起源のＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン変異体のアミノ酸８６６〜１２７４、例えば、ＢｏＮＴ／Ｆアイソフォーム結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｆサブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインは、配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０の非天然のＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン変異体の結合ドメイン、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインは、配列番号１８の非天然のＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン変異体のアミノ酸８６６〜１２７４、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１８３】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインは、例えば、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の結合ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の結合ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインは、例えば、配列番号１８のアミノ酸８６６〜１２７４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１８のアミノ酸８６６〜１２７４に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１８４】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインは、例えば、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインは、例えば、配列番号１８のアミノ酸８６６〜１２７４に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１８のアミノ酸８６６〜１２７４に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインは、例えば、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の結合ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０の結合ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインは、例えば、配列番号１８のアミノ酸８６６〜１２７４に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１８のアミノ酸８６６〜１２７４に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１８５】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素結合ドメインはＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインは、配列番号２１の結合ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸８６６〜１２９７を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインは、天然起源のＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン変異体、例えばＢｏＮＴ／Ｇアイソフォームからの結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｇサブタイプからの結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインは、配列番号２１の天然起源のＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン変異体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｇアイソフォーム結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｇサブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインは、配列番号２１の天然起源のＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン変異体のアミノ酸８６６〜１２９７、例えば、ＢｏＮＴ／Ｇアイソフォーム結合ドメイン又はＢｏＮＴ／Ｇサブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインは、非天然のＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインは、配列番号２１の非天然のＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン変異体の結合ドメイン、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインは、配列番号２１の非天然のＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン変異体のアミノ酸８６６〜１２９７、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１８６】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインは、例えば、配列番号２１の結合ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２１の結合ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％，最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインは、例えば、配列番号２１のアミノ酸８６６〜１２９７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２１のアミノ酸８６６〜１２９７に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１８７】
この実施形態の他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインは、例えば、配列番号２１の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２１の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインは、例えば、配列番号２１のアミノ酸８６６〜１２９７に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２１のアミノ酸８６６〜１２９７に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインは、例えば、配列番号２１の結合ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２１の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインは、例えば、配列番号２１のアミノ酸８６６〜１２９７に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２１のアミノ酸８６６〜１２９７に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１８８】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素結合ドメインはＴｅＮＴ結合ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＴｅＮＴ結合ドメインは、配列番号２２の結合ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＴｅＮＴ結合ドメインは、配列番号２２のアミノ酸８８２〜１３１５を含む。この実施形態の別の態様において、ＴｅＮＴ結合ドメインは、天然起源のＴｅＮＴ結合ドメイン変異体、例えば、ＴｅＮＴアイソフォームからの結合ドメイン又はＴｅＮＴサブタイプからの結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＴｅＮＴ結合ドメインは、配列番号２２の天然起源のＴｅＮＴ結合ドメイン変異体、例えば、ＴｅＮＴアイソフォーム結合ドメイン又はＴｅＮＴサブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＴｅＮＴ結合ドメインは、配列番号２２の天然起源のＴｅＮＴ結合ドメイン変異体のアミノ酸８８２〜１３１５、例えば、ＴｅＮＴアイソフォーム結合ドメイン又はＴｅＮＴサブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＴｅＮＴ結合ドメインは、非天然のＴｅＮＴ結合ドメイン変異体、例えば、保存的ＴｅＮＴ結合ドメイン変異体、非保存的ＴｅＮＴ結合ドメイン変異体、活性のあるＴｅＮＴ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＴｅＮＴ結合ドメインは、配列番号２２の非天然のＴｅＮＴ結合ドメイン変異体の結合ドメイン、例えば、保存的ＴｅＮＴ結合ドメイン変異体、非保存的ＴｅＮＴ結合ドメイン変異体、活性のあるＴｅＮＴ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＴｅＮＴ結合ドメインは、配列番号２２の非天然のＴｅＮＴ結合ドメイン変異体のアミノ酸８８２〜１３１５、例えば、保存的ＴｅＮＴ結合ドメイン変異体、非保存的ＴｅＮＴ結合ドメイン変異体、活性のあるＴｅＮＴ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１８９】
この実施形態の他の態様において、ＴｅＮＴ結合ドメインは、例えば、配列番号２２の結合ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２２の結合ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＴｅＮＴ結合ドメインは、例えば、配列番号２２のアミノ酸８８２〜１３１５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２２のアミノ酸８８２〜１３１５に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１９０】
この実施形態の他の態様において、ＴｅＮＴ結合ドメインは、例えば、配列番号２２の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２２の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＴｅＮＴ結合ドメインは、例えば、配列番号２２のアミノ酸８８２〜１３１５に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２２のアミノ酸８８２〜１３１５に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＴｅＮＴ結合ドメインは、例えば、配列番号２２の結合ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２２の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＴｅＮＴ結合ドメインは、例えば、配列番号２２のアミノ酸８８２〜１３１５に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２２のアミノ酸８８２〜１３１５に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１９１】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素結合ドメインはＢａＮＴ結合ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢａＮＴ結合ドメインは、配列番号２３の結合ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢａＮＴ結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸８５８〜１２６８を含む。この実施形態の別の態様において、ＢａＮＴ結合ドメインは、天然起源のＢａＮＴ結合ドメイン変異体、例えば、ＢａＮＴアイソフォームからの結合ドメイン又はＢａＮＴサブタイプからの結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢａＮＴ結合ドメインは、配列番号２３の天然起源のＢａＮＴ結合ドメイン変異体、例えば、ＢａＮＴアイソフォーム結合ドメイン又はＢａＮＴサブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢａＮＴ結合ドメインは、配列番号２３の天然起源のＢａＮＴ結合ドメイン変異体のアミノ酸８５８〜１２６８、例えば、ＢａＮＴアイソフォーム結合ドメイン又はＢａＮＴサブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢａＮＴ結合ドメインは、非天然のＢａＮＴ結合ドメイン変異体、例えば、保存的ＢａＮＴ結合ドメイン変異体、非保存的ＢａＮＴ結合ドメイン変異体、活性のあるＢａＮＴ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢａＮＴ結合ドメインは、配列番号２３の非天然のＢａＮＴ結合ドメイン変異体の結合ドメイン、例えば、保存的ＢａＮＴ結合ドメイン変異体、非保存的ＢａＮＴ結合ドメイン変異体、活性のあるＢａＮＴ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢａＮＴ結合ドメインは、配列番号２３の非天然のＢａＮＴ結合ドメイン変異体のアミノ酸８５８〜１２６８、例えば、保存的ＢａＮＴ結合ドメイン変異体、非保存的ＢａＮＴ結合ドメイン変異体、活性のあるＢａＮＴ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１９２】
この実施形態の他の態様において、ＢａＮＴ結合ドメインは、例えば、配列番号２３の結合ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２３の結合ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢａＮＴ結合ドメインは、例えば、配列番号２３のアミノ酸８５８〜１２６８に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２３のアミノ酸８５８〜１２６８に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１９３】
この実施形態の他の態様において、ＢａＮＴ結合ドメインは、例えば、配列番号２３の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２３の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢａＮＴ結合ドメインは、例えば、配列番号２３のアミノ酸８５８〜１２６８に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２３のアミノ酸８５８〜１２６８に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢａＮＴ結合ドメインは、例えば、配列番号２３の結合ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２３の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢａＮＴ結合ドメインは、例えば、配列番号２３のアミノ酸８５８〜１２６８に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２３のアミノ酸８５８〜１２６８に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１９４】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素結合ドメインはＢｕＮＴ結合ドメインを含む。この実施形態の態様において、ＢｕＮＴ結合ドメインは、配列番号２４又は配列番号２５の結合ドメインを含む。この実施形態の他の態様において、ＢｕＮＴ結合ドメインは、配列番号２４のアミノ酸８４８〜１２５１を含む。この実施形態の別の態様において、ＢｕＮＴ結合ドメインは、天然起源のＢｕＮＴ結合ドメイン変異体、例えば、ＢｕＮＴアイソフォームからの結合ドメイン又はＢｕＮＴサブタイプからの結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｕＮＴ結合ドメインは、配列番号２４又は配列番号２５の天然起源のＢｕＮＴ結合ドメイン変異体、例えば、ＢｕＮＴアイソフォーム結合ドメイン又はＢｕＮＴサブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態の別の態様において、ＢｕＮＴ結合ドメインは、配列番号２４の天然起源のＢｕＮＴ結合ドメイン変異体のアミノ酸８４８〜１２５１、例えば、ＢｕＮＴアイソフォーム結合ドメイン又はＢｕＮＴサブタイプ結合ドメインなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｕＮＴ結合ドメインは、非天然のＢｕＮＴ結合ドメイン変異体、例えば、保存的ＢｕＮＴ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｕＮＴ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｕＮＴ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｕＮＴ結合ドメインは、配列番号２４又は配列番号２５の非天然のＢｕＮＴ結合ドメイン変異体の結合ドメイン、例えば、保存的ＢｕＮＴ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｕＮＴ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｕＮＴ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、ＢｕＮＴ結合ドメインは、配列番号２４の非天然のＢｕＮＴ結合ドメイン変異体のアミノ酸８４８〜１２５１、例えば、保存的ＢｕＮＴ結合ドメイン変異体、非保存的ＢｕＮＴ結合ドメイン変異体、活性のあるＢｕＮＴ結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０１９５】
この実施形態の他の態様において、ＢｕＮＴ結合ドメインは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５の結合ドメインに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２４もしくは配列番号２５の結合ドメインに対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｕＮＴ結合ドメインは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸８４８〜１２５１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸８４８〜１２５１に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０１９６】
この実施形態の他の態様において、ＢｕＮＴ結合ドメインは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２４もしくは配列番号２５の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ＢｕＮＴ結合ドメインは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸８４８〜１２５１に対する最大で１、２，３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸８４８〜１２５１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ＢｕＮＴ結合ドメインは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５の結合ドメインに対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２４もしくは配列番号２５の結合ドメインに対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらなる他の態様において、ＢｕＮＴ結合ドメインは、例えば、配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸８４８〜１２５１に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸８４８〜１２５１に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは１００個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０１９７】
本明細の態様は、ある一部分において、非クロストリジウム毒素結合ドメインを提供する。本明細書中で使用される場合、「非クロストリジウム毒素結合ドメイン」という用語は、本明細で開示される改変クロストリジウム毒素が標的細胞を中毒化する、全体的な内部移行機構を開始させる中毒化過程の結合段階を遂行することができる何らかのポリペプチドを指す。結合ドメインの例は、例えば、Ｋｅｉｔｈ  Ａ．Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ａｂｌｅ  Ｔｏ  Ｍｏｄｉｆｙ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ａｆｆｅｒｅｎｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，米国特許第５，９８９，５４５号；Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  Ｃ．Ｓｈｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔｏｘｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，米国特許第６，４６１，６１７号；Ｃｏｎｒａｄ  Ｐ．Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｕｃｕｓ  Ｈｙｐｅｒｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，米国特許第６，６３２，４４０号；Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ，米国特許第６，８４３，９９８号；Ｊ．Ｏｌｉｖｅｒ  Ｄｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，米国特許第７，１３２，２５９号；Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｉｎ，米国特許公開第２００２／００３７８３３号；Ｋｅｉｔｈ  Ａ．Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｎｏｎ−ｎｅｕｒａｌ  Ｃｅｌｌｓ，米国特許公開第２００３／０１８０２８９号；Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ，米国特許公開第２００６／０２１１６１９号；Ｋｅｉｔｈ  Ａ．Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｎ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，米国特許公開第２００８／０１８７９６０号；Ｓｔｅｗａｒｄ，Ｌ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｆｏｒ  Ｎｏｎ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ，米国特許出願第１１／７７６，０７５号；Ｋｅｉｔｈ  Ａ．Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，米国特許出願第１１／７９２，２１０号（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）に記載されている。
【０１９８】
非クロストリジウム毒素結合ドメインとしては、天然起源の非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、例えば、非クロストリジウム毒素結合ドメインアイソフォーム及び非クロストリジウム毒素結合ドメインサブタイプなど；及び非天然の非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、例えば、保存的非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、非保存的非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、非クロストリジウム毒素結合ドメインキメラ、それらの活性のある非クロストリジウム毒素結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１９９】
本明細書中で使用される場合、「非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体」という用語は、天然であれ又は非天然であれ、参照配列の対応する領域からの少なくとも１つのアミノ酸変化を有し、その参照配列の対応する領域に対する同一性パーセントで記載することができる、非クロストリジウム毒素結合ドメインを指す。明確な指示がない限り、開示される実施形態を実施するために有用な非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体は、中毒化過程の結合段階を遂行する変異体である。
【０２００】
各非クロストリジウム毒素結合ドメイン内で、それらのアミノ酸配列及びまたこれらのタンパク質をコードする核酸が幾分異なる天然起源の変異体があり得ることは当業者により認識される。本明細書中で使用される場合、「天然起源の非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体」という用語は、オルタナティブスプライシングを受けた転写物から産生される非クロストリジウム毒素結合ドメインアイソフォーム及び自然突然変異により産生される非クロストリジウム毒素結合ドメインアイソフォームを含むが限定されない、天然起源の過程により産生される何らかの非クロストリジウム毒素結合ドメインを指す。天然起源の非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体は、その天然起源の非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体が基づく参照非クロストリジウム毒素結合ドメインと実質的に同じように機能し得、本明細のいずれの態様においても、参照非クロストリジウム毒素結合ドメインと置き換えられ得る。天然起源の非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体の非限定例は、非クロストリジウム毒素結合ドメインアイソフォームである。非クロストリジウム毒素結合ドメインアイソフォームの非限定例としては、例えば、オピオド（ｏｐｉｏｄ）結合ドメインアイソフォーム、タキキニン結合ドメインアイソフォーム、メラノコルチン結合ドメインアイソフォーム、ガラニン結合ドメインアイソフォーム、グラニン結合ドメインアイソフォーム、神経ペプチドＹ関連ペプチド結合ドメインアイソフォーム、神経ホルモン結合ドメインアイソフォーム、神経調節サイトカイン結合ドメインアイソフォーム、キニンペプチド結合ドメインアイソフォーム、成長因子結合ドメインアイソフォーム及びグルカゴン様ホルモン結合ドメインアイソフォームが挙げられる。
【０２０１】
本明細書中で使用される場合、「非天然の非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体」という用語は、無作為変異誘発又は合理的設計を用いて遺伝子改変することにより作製される非クロストリジウム毒素結合ドメイン及び化学合成により作製される非クロストリジウム毒素結合ドメインを含むが限定されない、ヒト操作の助力のもと産生される何らかの非クロストリジウム毒素結合ドメインを指す。非天然の非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体の非限定例としては、例えば、保存的非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、非保存的非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、非クロストリジウム毒素結合ドメインキメラ変異体及び活性のある非クロストリジウム毒素結合ドメイン断片が挙げられる。
【０２０２】
本明細書中で使用される場合、「保存的非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体」という用語は、参照非クロストリジウム毒素結合ドメイン配列からの元のアミノ酸の特性と類似した少なくとも１つの特性を有する別のアミノ酸又はアミノ酸類似体により置換されている少なくとも１つのアミノ酸を有する非クロストリジウム毒素結合ドメインを指す。特性の例としては、同様の大きさ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能、水素結合能、物理化学的特性など又はそれらの何らかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。保存的非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体は、その保存的非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体が基づく参照非クロストリジウム毒素結合ドメインと実質的に同じように機能し得、本明細のいずれの態様においても、参照非クロストリジウム毒素結合ドメインと置き換えられ得る。保存的非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体の非限定例としては、例えば、保存的オピオド（ｏｐｉｏｄ）結合ドメイン変異体、保存的タキキニン結合ドメイン変異体、保存的メラノコルチン結合ドメイン変異体、保存的ガラニン結合ドメイン変異体、保存的グラニン結合ドメイン変異体、保存的神経ペプチドＹ関連ペプチド結合ドメイン変異体、保存的神経ホルモン結合ドメイン変異体、保存的神経調節サイトカイン結合ドメイン変異体、保存的キニンペプチド結合ドメイン変異体、保存的成長因子結合ドメイン変異体及び保存的グルカゴン様ホルモン結合ドメイン変異体が挙げられる。
【０２０３】
本明細書中で使用される場合、「非保存的非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体」という用語は、１）少なくとも１つのアミノ酸が、その非保存的非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体が基づく参照非クロストリジウム毒素結合ドメインから欠失しているか；２）少なくとも１つのアミノ酸が、その非保存的非クロストリジウム毒素結合ドメインが基づく参照非クロストリジウム毒素結合ドメインに付加されているか；又は３）少なくとも１つのアミノ酸が、参照非クロストリジウム毒素結合ドメイン配列からの元のアミノ酸の特性と類似の特性を何ら共有しない別のアミノ酸又はアミノ酸類似体により置換されている、非クロストリジウム毒素結合ドメインを指す。非保存的非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体は、その非保存的非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体が基づく参照非クロストリジウム毒素結合ドメインと実質的に同じように機能し得、本明細のいずれの態様においても、参照非クロストリジウム毒素結合ドメインと置き換えられ得る。非保存的非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体の非限定例としては、例えば、非保存的オピオド（ｏｐｉｏｄ）結合ドメイン変異体、非保存的タキキニン結合ドメイン変異体、非保存的メラノコルチン結合ドメイン変異体、非保存的ガラニン結合ドメイン変異体、非保存的グラニン結合ドメイン変異体、非保存的神経ペプチドＹ関連ペプチド結合ドメイン変異体、非保存的神経ホルモン結合ドメイン変異体、非保存的神経調節サイトカイン結合ドメイン変異体、非保存的キニンペプチド結合ドメイン変異体、非保存的成長因子結合ドメイン変異体及び非保存的グルカゴン様ホルモン結合ドメイン変異体が挙げられる。
【０２０４】
本明細書中で使用される場合、「活性のある非クロストリジウム毒素結合ドメイン断片」という用語は、本明細の態様において有用であり得る結合ドメインを含む様々なクロストリジウム毒素断片の何れかを指すが、ただし、これらの結合ドメイン断片は、同系受容体と選択的に相互作用し得、従って、クロストリジウム毒素がタンパク質分解性に基質を切断する全体的な細胞性機構の遂行に関与し得るものとする。
【０２０５】
天然起源のクロストリジウム毒素結合ドメイン変異体及び非天然のクロストリジウム毒素結合ドメイン変異体の同一性パーセントを決定するために、包括的方法、ローカル法及びハイブリッド法、例えばセグメントアプローチ法を含むがこれらに限定されない様々な配列アラインメント法の何れかを使用することができる。同一性パーセントを決定するためのプロトコールは、当業者の範囲内の及び本明細書中の教示からの通例の手段である。
【０２０６】
従って、実施形態において、本明細で開示される改変クロストリジウム毒素は非クロストリジウム毒素結合ドメインを含む。この実施形態の態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、天然起源の非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、例えば、非クロストリジウム毒素結合ドメインアイソフォームなどを含む。この実施形態の別の態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、非天然の非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、例えば、保存的非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、非保存的非クロストリジウム毒素結合ドメイン変異体、活性のある非クロストリジウム毒素結合ドメイン断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０２０７】
別の実施形態において、非クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸で置換し得る。疎水性アミノ酸の例としては、例えば、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ及びＷが挙げられる。この実施形態の別の態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の脂肪族アミノ酸を別の脂肪族アミノ酸で置換し得る。脂肪族アミノ酸の例としては、例えば、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｐ及びＶが挙げられる。この実施形態のまた別の態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の芳香族アミノ酸を別の芳香族アミノ酸で置換し得る。芳香族アミノ酸の例としては、例えば、Ｆ、Ｈ、Ｗ及びＹが挙げられる。この実施形態のさらに別の態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置のスタッキングアミノ酸を別のスタッキングアミノ酸で置換し得る。スタッキングアミノ酸の例としては、例えば、Ｆ、Ｈ、Ｗ及びＹが挙げられる。この実施形態のさらなる態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の極性アミノ酸を別の極性アミノ酸で置換し得る。極性アミノ酸の例としては、例えば、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｑ及びＲが挙げられる。この実施形態のさらなる態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の低極性又は中性的アミノ酸を別の低極性又は中性的アミノ酸で置換し得る。低極性又は中性的アミノ酸の例としては、例えば、Ａ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ及びＹが挙げられる。この実施形態のまたさらなる態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の正に荷電したアミノ酸を別の正に荷電したアミノ酸で置換し得る。正に荷電したアミノ酸の例としては、例えば、Ｋ、Ｒ及びＨが挙げられる。この実施形態のまたさらなる態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の負に荷電したアミノ酸を別の負に荷電したアミノ酸で置換し得る。負に荷電したアミノ酸の例としては、例えば、Ｄ及びＥが挙げられる。この実施形態の別の態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置の小型アミノ酸を別の小型アミノ酸で置換し得る。小型アミノ酸の例としては、例えばＡ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ及びＴが挙げられる。この実施形態のまた別の態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインのポリペプチド鎖のある特定の位置のＣ−β分岐型アミノ酸を別のＣ−β分岐型アミノ酸で置換し得る。Ｃ−β分岐型アミノ酸の例としては、例えばＩ、Ｔ及びＶが挙げられる。
【０２０８】
別の実施形態において、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、オピオド（ｏｐｉｏｄ）結合ドメイン、例えば、エンケファリン、エンドモルフィン、エンドルフィン、ダイノルフィン、ノシセプチン又はへモルフィンなどを含む。この実施形態のまた別の態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、タキキニン結合ドメイン、例えば、サブスタンスＰ、神経ペプチドＫ（ＮＰＫ）、神経ペプチドγ（ＮＰγ）、ニューロキニンＡ（ＮＫＡ；サブスタンスＫ、ニューロキニンα、ニューロメジンＬ）、ニューロキニンＢ（ＮＫＢ）、ヘモキニン又はエンドキニンなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、非クロストリジウム毒素は、メラノコルチン結合ドメイン、例えば、メラニン細胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン又はリポトロピンなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、ガラニン結合ドメイン、例えば、ガラニン又はガラニンメッセージ関連ペプチドなどを含む。この実施形態のさらなる態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、グラニン結合ドメイン、例えば、クロモグラニンＡ、クロモグラニンＢ又はクロモグラニンＣなどを含む。この実施形態の別の態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、神経ペプチドＹ関連ペプチド結合ドメイン、例えば、神経ペプチドＹ、ペプチドＹＹ、膵臓ペプチド又は膵臓イコサペプチドなどを含む。この実施形態のまた別の態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、神経ホルモン結合ドメイン、例えば、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン又はソマトスタチンなどを含む。この実施形態のさらに別の態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、神経調節サイトカイン結合ドメイン、例えば、毛様体神経栄養因子、グリコホリン−Ａ、白血病抑制因子、コリン作動性分化因子、インターロイキン、オノスタチン（ｏｎｏｓｔａｔｉｎ）Ｍ、カルジオトロフィン−１、カルジオトロフィン様サイトカイン又はニューロロイキンなどを含む。この実施形態のさらなる態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、キニンペプチド結合ドメイン、例えば、ブラジキニン、カリジン、ｄｅｓＡｒｇ９ブラジキニン又はｄｅｓＡｒｇ１０ブラジキニンを含む。この実施形態の別の態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、成長因子結合ドメイン、例えば、繊維芽細胞増殖因子結合ドメイン、神経成長因子結合ドメイン、インスリン成長因子結合ドメイン、上皮成長因子結合ドメイン、血管内皮成長因子結合ドメイン、脳由来神経栄養因子結合ドメイン、成長由来神経栄養因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）結合ドメイン、ニューロトロフィン結合ドメイン、例えば、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４／５など、ヘッド活性化因子（ｈｅａｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）ペプチド結合ドメイン、ニュールツリン結合ドメイン、パーセフリン（ｐｅｒｓｅｐｈｒｉｎ）結合ドメイン、アルテミン結合ドメイン、形質転換成長因子β結合ドメイン、例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３もしくはＴＧＦβ４など、骨形態形成タンパク質結合ドメイン、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８もしくはＢＭＰ１０など、増殖分化因子結合ドメイン、例えば、ＧＤＦ１、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１もしくはＧＤＦ１５など又はアクチビン結合ドメイン、例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥもしくはインヒビンＡなど、を含む。この実施形態の別の態様において、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、グルカゴン様ホルモン結合ドメイン、例えば、セクレチン、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２のようなグルカゴン様ペプチド、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド結合ドメイン、成長ホルモン放出ホルモン結合ドメイン、ＶＩＰ１又はＶＩＰ２のような血管作用性小腸ペプチド結合ドメイン、胃抑制ポリペプチド結合ドメイン、ガストリン、ガストリン放出ペプチドもしくはコレシストキニンのようなカルシトニン関連ペプチド内臓（ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｇｕｔ）ペプチド結合ドメイン又は、ＰＡＲ１ペプチド、ＰＡＲ２ペプチド、ＰＡＲ３ペプチドもしくはＰＡＲ４ペプチドのようなＰＡＲペプチド結合ドメインを含む。
【０２０９】
別の実施形態において、オピオイドペプチドは、エンケファリンペプチドを含む。この実施形態の態様において、エンケファリンペプチドは、Ｌｅｕ−エンケファリン、Ｍｅｔ−エンケファリン、Ｍｅｔ−エンケファリンＭＲＧＬ又はＭｅｔ−エンケファリンＭＲＦを含む。この実施形態の他の態様において、エンケファリンペプチドは、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８又は配列番号２９を含む。
【０２１０】
この実施形態の他の態様において、エンケファリンは、例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８もしくは配列番号２９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８もしくは配列番号２９に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、エンケファリンは、例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８もしくは配列番号２９に対する少なくとも１、２もしくは３個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８もしくは配列番号２９に対する最大で１、２もしくは３個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、エンケファリンは、例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８もしくは配列番号２９に対する少なくとも１、２もしくは３個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８もしくは配列番号２９に対する最大で１、２もしくは３個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０２１１】
別の実施形態において、オピオイドペプチドは、ウシ副腎髄質−２２（ＢＡＭ２２）ペプチドを含む。この実施形態の態様において、ＢＡＭ２２ペプチドは、ＢＡＭ２２ペプチド（１−１２）、ＢＡＭ２２ペプチド（６−２２）、ＢＡＭ２２ペプチド（８−２２）又はＢＡＭ２２ペプチド（１−２２）を含む。この実施形態の他の態様において、ＢＡＭ２２ペプチドは、配列番号３０のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３１のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３２のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３３のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３４のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２又は配列番号３５のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２を含む。
【０２１２】
この実施形態の他の態様において、ＢＡＭ２２ペプチドは、例えば、配列番号３０のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３１のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３２のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３３のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３４のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２又は配列番号３５のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号３０のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３１のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３２のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３３のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３４のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２又は配列番号３５のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２１３】
この実施形態のさらに他の態様において、ＢＡＭ２２ペプチドは、例えば、配列番号３０のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３１のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３２のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３３のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３４のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２又は配列番号３５のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２に対する少なくとも１、２、３、４もしくは５個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号３０のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３１のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３２のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３３のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３４のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２又は配列番号３５のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２に対する最大で１、２、３、４もしくは５個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０２１４】
この実施形態のまた他の態様において、ＢＡＭ２２ペプチドは、例えば、配列番号３０のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３１のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３２のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３３のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３４のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２又は配列番号３５のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２に対する少なくとも１、２、３、４もしくは５個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号３０のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号７１のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３２のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３３のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２；配列番号３４のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２又は配列番号３５のアミノ酸１〜１２、アミノ酸６〜２２、アミノ酸８〜２２もしくはアミノ酸１〜２２に対する最大で１、２、３、４もしくは５個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０２１５】
別の実施形態において、オピオイドペプチドは、エンドモルフィンペプチドを含む。この実施形態の態様において、エンドモルフィンペプチドは、エンドモルフィン−１又はエンドモルフィン−２を含む。この実施形態の他の態様において、エンドモルフィンペプチドは、配列番号３６又は配列番号３７を含む。
【０２１６】
この実施形態の他の態様において、エンドモルフィンは、例えば、配列番号３６もしくは配列番号３７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号３６もしくは配列番号３７に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、エンドモルフィンは、例えば、配列番号３６もしくは配列番号３７に対する少なくとも１、２もしくは３個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号３６もしくは配列番号３７に対する最大で１、２もしくは３個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、エンドモルフィンは、例えば、配列番号３６もしくは配列番号３７に対する少なくとも１、２もしくは３個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号３６もしくは配列番号３７に対する最大で１、２もしくは３個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０２１７】
別の実施形態において、オピオイドペプチドは、エンドルフィンペプチドを含む。この実施形態の態様において、エンドルフィンペプチドは、エンドルフィン−α、ネオエンドルフィン−α、エンドルフィン−β、ネオエンドルフィン−β又はエンドルフィン−γを含む。この実施形態の他の態様において、エンドルフィンペプチドは、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２又は配列番号４３を含む。
【０２１８】
この実施形態の他の態様において、エンドルフィンは、例えば、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２もしくは配列番号４３に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２もしくは配列番号４３に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、エンドルフィンは、例えば、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２もしくは配列番号４３に対する少なくとも１、２、３、４もしくは５個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２もしくは配列番号４３に対する最大で１、２、３、４もしくは５個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、エンドルフィンは、例えば、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２もしくは配列番号４３に対する少なくとも１、２、３、４もしくは５個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２もしくは配列番号４３に対する最大で１、２、３、４もしくは５個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０２１９】
別の実施形態において、オピオイドペプチドはダイノルフィンペプチドを含む。この実施形態の態様において、ダイノルフィンペプチドは、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィンＢ（ロイモルフィン）又はリモルフィンを含む。この実施形態の他の態様において、ダイノルフィンペプチドは、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３又は配列番号７４を含む。
【０２２０】
この実施形態の他の態様において、ダイノルフィンは、例えば、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５３もしくは配列番号６９に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５３もしくは配列番号６９に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ダイノルフィンは、例えば、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５３もしくは配列番号６９に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５３もしくは配列番号６９に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ダイノルフィンは、例えば、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５３もしくは配列番号６９に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号５３もしくは配列番号６９に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０２２１】
別の実施形態において、オピオイドペプチドはノシセプチンペプチドを含む。この実施形態の態様において、ノシセプチンペプチドは、ノシセプチンＲＫ、ノシセプチン、神経ペプチド１、神経ペプチド２又は神経ペプチド３を含む。この実施形態の他の態様において、ノシセプチンペプチドは、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３又は配列番号８４を含む。
【０２２２】
この実施形態の他の態様において、ノシセプチンは、例えば、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３もしくは配列番号８４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３もしくは配列番号８４に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％又は最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ノシセプチンは、例えば、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３もしくは配列番号８４に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３もしくは配列番号８４に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ノシセプチンは、例えば、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３もしくは配列番号８４に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３もしくは配列番号８４に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０２２３】
別の実施形態において、オピオイドペプチドはへモルフィンペプチドを含む。この実施形態の態様において、へモルフィンペプチドは、ＬＶＶＨ７、ＶＶＨ７、ＶＨ７、Ｈ７、ＬＶＶＨ６、ＬＶＶＨ５、ＶＶＨ５、ＬＶＶＨ４及びＬＶＶＨ３を含む。この実施形態の他の態様において、へモルフィンペプチドは、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２又は配列番号９３を含む。
【０２２４】
この実施形態の他の態様において、へモルフィンは、例えば、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２もしくは配列番号９３に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２もしくは配列番号９３に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ノシセプチンは、例えば、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２もしくは配列番号９３に対する少なくとも１、２もしくは３個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２もしくは配列番号９３に対する最大で１、２もしくは３個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ノシセプチンは、例えば、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２もしくは配列番号９３に対する少なくとも１、２もしくは３個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２もしくは配列番号９３に対する最大で１、２もしくは３個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０２２５】
また別の実施形態において、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、ガラニンペプチド結合ドメインを含む。この実施形態の態様において、ガラニンペプチド結合ドメインは、ガラニン又はガラニンメッセージ関連ペプチド（ＧＭＡＰ）を含む。この実施形態の他の態様において、ガラニンペプチド結合ドメインは、配列番号９４又は配列番号９５を含む。
【０２２６】
この実施形態の他の態様において、ガラニン結合ドメインは、例えば、配列番号９４もしくは配列番号９５に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号９４もしくは配列番号９５に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、ガラニン結合ドメインは、例えば、配列番号９４もしくは配列番号９５に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号９４もしくは配列番号９５に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、ガラニン結合ドメインは、例えば、配列番号９４もしくは配列番号９５に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号９４もしくは配列番号９５に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０２２７】
さらに別の実施形態において、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、タキキニンペプチド結合ドメインを含む。この実施形態の態様において、タキキニンペプチド結合ドメインは、サブスタンスＰ、神経ペプチドＫ（ＮＰＫ）、神経ペプチドγ（ＮＰγ）、ニューロキニンＡ（ＮＫＡ；サブスタンスＫ、ニューロキニンα、ニューロメジンＬ）、ニューロキニンＢ（ＮＫＢ）、ヘモキニン又はエンドキニンを含む。この実施形態の他の態様において、タキキニンペプチド結合ドメインは、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６又は配列番号１０７を含む。
【０２２８】
この実施形態の他の態様において、タキキニンペプチド結合ドメインは、例えば、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６もしくは配列番号１０７に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６もしくは配列番号１０７に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、タキキニンペプチド結合ドメインは、例えば、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６もしくは配列番号１０７に対する少なくとも１、２、３、４もしくは５個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６もしくは配列番号１０７に対する最大で１、２、３、４もしくは５個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、タキキニンペプチド結合ドメインは、例えば、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６もしくは配列番号１０７に対する少なくとも１、２、３、４もしくは５個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６もしくは配列番号１０７に対する最大で１、２、３、４もしくは５個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０２２９】
さらに別の実施形態において、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、神経ペプチドＹ関連ペプチド結合ドメインを含む。この実施形態の態様において、神経ペプチドＹ関連ペプチド結合ドメインは、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、膵臓ペプチド（ＰＰ）又は膵臓イコサペプチド（ＰＩＰ）を含む。この実施形態の他の態様において、神経ペプチドＹ関連ペプチド結合ドメインは、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１又は配列番号１１２を含む。
【０２３０】
この実施形態の他の態様において、神経ペプチドＹ関連ペプチド結合ドメインは、例えば、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１もしくは配列番号１１２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％；又は配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１もしくは配列番号１１２に対して最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％もしくは最大で９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらに他の態様において、神経ペプチドＹ関連ペプチド結合ドメインは、例えば、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１もしくは配列番号１１２に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１もしくは配列番号１１２に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の非連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のまた他の態様において、神経ペプチドＹ関連ペプチド結合ドメインは、例えば、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１もしくは配列番号１１２に対する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換；又は配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１もしくは配列番号１１２に対する最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個の連続アミノ酸欠失、付加及び／又は置換を有するポリペプチドを含む。
【０２３１】
本明細で開示されるクロストリジウム毒素キメラは、ありとあらゆる位置で非クロストリジウム結合ドメインを含み得ることが想定されるが、ただし、クロストリジウム毒素キメラは中毒化過程を遂行し得るものとする。非限定例としては、改変クロストリジウム毒素のアミノ末端に非クロストリジウム結合ドメインを置くこと；改変クロストリジウム毒素のクロストリジウム毒素酵素ドメインと転移ドメインとの間に非クロストリジウム結合ドメインを置くこと；及び改変クロストリジウム毒素のカルボキシル末端に非クロストリジウム結合ドメインを置くことが挙げられる。他の非限定例としては、改変クロストリジウム毒素のクロストリジウム毒素酵素ドメインとクロストリジウム毒素転移ドメインとの間に非クロストリジウム結合ドメインを置くことが挙げられる。天然起源のクロストリジウム毒素の酵素ドメインは、自然の開始メチオニンを含有する。従って、酵素ドメインがアミノ末端の位置にないドメイン編成において、開始メチオニンを含むアミノ酸配列がアミノ末端ドメインの前に置かれるべきである。同様に、非クロストリジウム結合ドメインがアミノ末端の位置にある場合、開始メチオニン及びプロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸配列は、非クロストリジウム結合ドメインが自由アミノ末端を必要とする状況において操作可能に連結され得る。例えば、Ｓｈｅｎｇｗｅｎ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ，米国特許出願第１１／５７２，５１２号（２００７年１月２３日）（これはその全体が参照により本明細書によって組み込まれる。）を参照のこと。さらに、開始メチオニンを含む別のポリペプチドのアミノ末端と操作可能に連結されるポリペプチドを付加する場合、元のメチオニン残基を欠失させ得ることは当技術分野で公知である。
【０２３２】
従って、実施形態において、改変クロストリジウム毒素は、非クロストリジウム結合ドメイン、転移ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位及び酵素ドメインを含む、アミノからカルボキシルの１本のポリペプチドの直線的順序（図３Ａ）を含み得る。この実施形態の態様において、改変クロストリジウム毒素は、非クロストリジウム結合ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位及びクロストリジウム毒素酵素ドメインを含む、アミノからカルボキシルの１本のポリペプチドの直線的順序を含み得る。
【０２３３】
別の実施形態において、改変クロストリジウム毒素は、非クロストリジウム結合ドメイン、酵素ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位及び転移ドメインを含む、アミノからカルボキシルの１本のポリペプチドの直線的順序（図３Ｂ）を含み得る。この実施形態の態様において、改変クロストリジウム毒素は、非クロストリジウム結合ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転移ドメインを含む、アミノからカルボキシルの１本のポリペプチドの直線的順序を含み得る。
【０２３４】
また別の実施形態において、改変クロストリジウム毒素は、酵素ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、非クロストリジウム結合ドメイン及び転移ドメインを含む、アミノからカルボキシルの１本のポリペプチドの直線的順序（図４Ａ）を含み得る。この実施形態の態様において、改変クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、非クロストリジウム結合ドメイン及びクロストリジウム毒素転移ドメインを含む、アミノからカルボキシルの１本のポリペプチドの直線的順序を含み得る。
【０２３５】
また別の実施形態において、改変クロストリジウム毒素は、転移ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、非クロストリジウム結合ドメイン及び酵素ドメインを含む、アミノからカルボキシルの１本のポリペプチドの直線的順序（図４Ｂ）を含み得る。この実施形態の態様において、改変クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素転移ドメイン、非クロストリジウム結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位及びクロストリジウム毒素酵素ドメインを含む、アミノからカルボキシルの１本のポリペプチドの直線的順序を含み得る。
【０２３６】
別の実施形態において、改変クロストリジウム毒素は、酵素ドメイン、非クロストリジウム結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位及び転移ドメインを含む、アミノからカルボキシルの１本のポリペプチドの直線的順序（図４Ｃ）を含み得る。この実施形態の態様において、改変クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、非クロストリジウム結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転移ドメインを含む、アミノからカルボキシルの１本のポリペプチドの直線的順序を含み得る。
【０２３７】
また別の実施形態において、改変クロストリジウム毒素は、転移ドメイン、非クロストリジウム結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位及び酵素ドメインを含む、アミノからカルボキシルの１本のポリペプチドの直線的順序（図４Ｄ）を含み得る。この実施形態の態様において、改変クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素転移ドメイン、非クロストリジウム結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位及びクロストリジウム毒素酵素ドメインを含む、アミノからカルボキシルの１本のポリペプチドの直線的順序を含み得る。
【０２３８】
さらに別の実施形態において、改変クロストリジウム毒素は、酵素ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、転移ドメイン及び非クロストリジウム結合ドメインを含む、アミノからカルボキシルの１本のポリペプチドの直線的順序（図５Ａ）を含み得る。この実施形態の態様において、改変クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素転移ドメイン及び非クロストリジウム結合ドメインを含む、アミノからカルボキシルの１本のポリペプチドの直線的順序を含み得る。
【０２３９】
さらに別の実施形態において、改変クロストリジウム毒素は、転移ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、酵素ドメイン及び非クロストリジウム結合ドメインを含む、アミノからカルボキシルの１本のポリペプチドの直線的順序（図５Ｂ）を含み得る。この実施形態の態様において、改変クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素転移ドメイン、非クロストリジウム結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位及びクロストリジウム毒素酵素ドメインを含むアミノからカルボキシルの１本のポリペプチドの直線的順序を含み得る。
【０２４０】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位を提供する。本明細書中で使用される場合、「不活性化切断部位」という用語は、例えば、心血管系又はリンパ系など、間質液又は循環系に存在するプロテアーゼによる切断可能な結合での選択的タンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又はその両方と一緒の、切断可能な結合を指す。このような不活性化切断部位は、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラに対して融合タンパク質として操作可能に連結される。定義上、不活性化切断部位は、間質液又は循環系に存在する少なくとも１つのプロテアーゼによる選択的切断を受け易い。不活性化切断部位の非限定例としては、トロンビン切断部位、プラスミン切断部位、凝固第ＶＩＩａ因子切断部位、凝固第ＩＸａ因子切断部位、凝固第Ｘａ因子切断部位、凝固第ＸＩａ因子切断部位、凝固第ＸＩＩａ因子切断部位、血漿カリクレイン切断部位、プロテアーゼ活性化Ｇタンパク質共役型受容体−１（ＰＡＲ１）切断部位、ＰＡＲ２切断部位、ＰＡＲ３切断部位、ＰＡＲ４切断部位、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）切断部位、マトリクスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）切断部位、フューリン切断部位、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）切断部位、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）切断部位、トリプターゼ−ε切断部位、マウス肥満細胞プロテアーゼ−７（ｍＭＣＰ−７）切断部位、エンドセリン変換酵素−１（ＥＣＥ−１）切断部位、ケル式血液型切断部位、ＤＰＰＩＶ切断部位、トロンボスポンジン１型モチーフ−１３があるＡＤＡＭメタロペプチダーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）切断部位及びカテプシンＬ切断部位（表４）が挙げられる。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【０２４１】
ありとあらゆる長さの不活性化切断部位が本明細の態様において有用であり得ることが想定されるが、ただし、不活性化切断部位は間質液又は循環系プロテアーゼにより切断されることが可能であるものとする。従って、この実施形態の態様において、不活性化切断部位は、例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０アミノ酸長であり得る。この実施形態の他の態様において、不活性化切断部位は、例えば、最大で３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０アミノ酸長であり得る。
【０２４２】
本明細の態様において有用な不活性化切断部位としては、天然起源の不活性化切断部位；天然起源の不活性化切断部位変異体；及び非天然の不活性化切断部位変異体、例えば、保存的不活性化切断部位変異体、非保存的不活性化切断部位変異体及び不活性化切断部位ペプチド模倣物などが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書中で使用される場合、「不活性化切断部位変異体」という用語は、天然であれ又は非天然であれ、開示される参照配列の対応する領域からの少なくとも１つのアミノ酸変化を有する不活性化切断部位を指し、その参照配列の対応する領域に対する同一性パーセントで記載され得る。同一性パーセントを決定するために、包括的方法、ローカル法及びハイブリッド法、例えばセグメントアプローチ法を含むがこれらに限定されない様々な配列アラインメント法の何れかを使用することができる。同一性パーセントを決定するためのプロトコールは、当業者の範囲内の及び本明細書中の教示からの通例の手段である。
【０２４３】
本明細書中で使用される場合、「天然起源の不活性化切断部位変異体」という用語は、ヒト操作の助力なしで産生される何らかの不活性化切断部位を指す。不活性化切断部位の非限定例としては、トロンビン切断部位変異体、プラスミン切断部位変異体、凝固第Ｖ因子切断部位変異体、凝固第ＶＩＩ因子切断部位変異体、凝固第ＶＩＩＩ因子切断部位変異体、凝固第ＩＸａ因子切断部位変異体、凝固第Ｘａ因子切断部位変異体、凝固第ＸＩａ因子切断部位変異体、凝固第ＸＩＩａ因子切断部位変異体、血漿カリクレイン切断部位変異体、ＭＭＰ−２切断部位変異体、ＭＭＰ−９切断部位変異体、フューリン切断部位変異体、ｕ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位変異体、ｔ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位変異体、トリプターゼ−ε切断部位変異体、ｍＭＣＰ−７切断部位変異体、ＥＣＥ−１切断部位変異体、ＫＢＧＰ切断部位変異体、カテプシンＬ切断部位変異体、ＰＡＲ１切断部位変異体、ＰＡＲ２切断部位変異体、ＰＡＲ３切断部位変異体、ＰＡＲ４切断部位変異体及びＡＤＡＭ−ＴＳ１３切断部位変異体が挙げられる。
【０２４４】
本明細書中で使用される場合、「非天然の不活性化切断部位変異体」という用語は、無作為変異誘発又は合理的設計を用いて遺伝子改変することにより作製される不活性化切断部位変異体及び化学合成により作製される不活性化切断部位変異体を含むが限定されない、ヒト操作の助力のもと産生される何らかの不活性化切断部位を指す。非天然の不活性化切断部位変異体の非限定例としては、例えば、保存的不活性化切断部位変異体、非保存的不活性化切断部位変異体及び不活性化切断部位ペプチド模倣物が挙げられる。
【０２４５】
本明細書中で使用される場合、「保存的不活性化切断部位変異体」という用語は、参照不活性化切断部位配列からの元のアミノ酸の特性と類似した少なくとも１つの特性を有する別のアミノ酸又はアミノ酸類似体により置換されている少なくとも１つのアミノ酸を有する不活性化切断部位を指す。特性の例としては、同様の大きさ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能、水素結合能、物理化学的特性など又はそれらの何らかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。保存的不活性化切断部位変異体は、その保存的不活性化切断部位変異体が基づく参照不活性化切断部位と実質的に同じように機能し得、本明細のいずれの態様においても、参照不活性化切断部位と置き換えられ得る。保存的不活性化切断部位変異体の非限定例としては、例えば、保存的トロンビン切断部位変異体、保存的プラスミン切断部位変異体、保存的凝固第Ｖ因子切断部位変異体、保存的凝固第ＶＩＩ因子切断部位変異体、保存的凝固第ＶＩＩＩ因子切断部位変異体、保存的凝固第ＩＸａ因子切断部位変異体、保存的凝固第Ｘａ因子切断部位変異体、保存的凝固第ＸＩａ因子切断部位変異体、保存的凝固第ＸＩＩａ因子切断部位変異体、保存的血漿カリクレイン切断部位変異体、保存的ＭＭＰ−２切断部位変異体、保存的ＭＭＰ−９切断部位変異体、保存的フューリン切断部位変異体、保存的ｕ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位変異体、保存的ｔ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位変異体、保存的トリプターゼ−ε切断部位変異体、保存的ｍＭＣＰ−７切断部位変異体、保存的ＥＣＥ−１切断部位変異体、保存的ＫＢＧＰ切断部位変異体、保存的カテプシンＬ切断部位変異体、保存的ＰＡＲ１切断部位変異体、保存的ＰＡＲ２切断部位変異体、保存的ＰＡＲ３切断部位変異体、保存的ＰＡＲ４切断部位変異体及び保存的ＡＤＡＭ−ＴＳ１３切断部位変異体が挙げられる。
【０２４６】
本明細書中で使用される場合、「非保存的不活性化切断部位変異体」という用語は、１）少なくとも１つのアミノ酸が、その非保存的不活性化切断部位変異体が基づく参照不活性化切断部位から欠失しているか；２）少なくとも１つのアミノ酸が、その非保存的不活性化切断部位変異体が基づく参照不活性化切断部位に付加されているか；又は３）少なくとも１つのアミノ酸が、参照不活性化切断部位配列（表４）からの元のアミノ酸の特性と類似の特性を何ら共有しない別のアミノ酸又はアミノ酸類似体により置換されている、不活性化切断部位を指す。非保存的不活性化切断部位変異体は、その非保存的不活性化切断部位が基づく参照不活性化切断部位と実質的に同じように機能し得、本明細のいずれの態様においても、参照不活性化切断部位と置き換えられ得る。非保存的不活性化切断部位変異体の非限定例としては、例えば、非保存的トロンビン切断部位変異体、非保存的プラスミン切断部位変異体、非保存的凝固第Ｖ因子切断部位変異体、非保存的凝固第ＶＩＩ因子切断部位変異体、非保存的凝固第ＶＩＩＩ因子切断部位変異体、非保存的凝固第ＩＸａ因子切断部位変異体、非保存的凝固第Ｘａ因子切断部位変異体、非保存的凝固第ＸＩａ因子切断部位変異体、非保存的凝固第ＸＩＩａ因子切断部位変異体、非保存的血漿カリクレイン切断部位変異体、非保存的ＭＭＰ−２切断部位変異体、非保存的ＭＭＰ−９切断部位変異体、非保存的フューリン切断部位変異体、非保存的ｕ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位変異体、非保存的ｔ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位変異体、非保存的トリプターゼ−ε切断部位変異体、非保存的ｍＭＣＰ−７切断部位変異体、非保存的ＥＣＥ−１切断部位変異体、非保存的ＫＢＧＰ切断部位変異体、非保存的カテプシンＬ切断部位変異体、非保存的ＰＡＲ１切断部位変異体、非保存的ＰＡＲ２切断部位変異体、非保存的ＰＡＲ３切断部位変異体、非保存的ＰＡＲ４切断部位変異体及び非保存的ＡＤＡＭ−ＴＳ１３切断部位変異体が挙げられる。
【０２４７】
本明細書中で使用される場合、「不活性化切断部位ペプチド類似体」という用語は、第一のアミノ酸の特性と同様の少なくとも１つの特性を有する非天然のオリゴマーにより置換されている少なくとも１つのアミノ酸を有する不活性化切断部位を指す。特性の例としては、ペプチド一次構造エレメントのトポグラフィー、ペプチド一次構造エレメントの機能性、ペプチド二次構造エレメントのトポロジー、ペプチド二次構造エレメントの機能性など又はそれらの何らかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。不活性化切断部位ペプチド模倣物は、その不活性化切断部位ペプチド模倣物が基づく参照不活性化切断部位と実質的に同じように機能し得、本明細のいずれの態様においても、参照不活性化切断部位と置き換えられ得る。ペプチド模倣法の例については、例えば、Ａｍｙ  Ｓ．Ｒｉｐｋａ  ＆  Ｄａｎｉｅｌ  Ｈ．Ｒｉｃｈ，Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｄｅｓｉｇｎ，２（４）ＣＵＲＲ．ＯＰＩＮ．ＣＨＥＭ．ＢＩＯＬ．４４１−４５２（１９９８）；及びＭ．Ａｎｇｅｌｓ  Ｅｓｔｉａｒｔｅ  ＆  Ｄａｎｉｅｌ  Ｈ．Ｒｉｃｈ，Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，８０３−８６１（ＢＵＲＧＥＲ’Ｓ  ＭＥＤＩＣＩＮＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  Ｖｏｌ．１  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｄｏｎａｌｄ  Ｊ．Ａｂｒａｈａｍ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，６ｔｈ  ｅｄ  ２００３）を参照のこと。不活性化切断部位ペプチド類似体の非限定例としては、例えば、トロンビン切断部位ペプチド模倣物、プラスミン切断部位ペプチド模倣物、凝固第Ｖ因子切断部位ペプチド模倣物、凝固第ＶＩＩ因子切断部位ペプチド模倣物、凝固第ＶＩＩＩ因子切断部位ペプチド模倣物、凝固第ＩＸａ因子切断部位ペプチド模倣物、凝固第Ｘａ因子切断部位ペプチド模倣物、凝固第ＸＩａ因子切断部位ペプチド模倣物、凝固第ＸＩＩａ因子切断部位ペプチド模倣物、血漿カリクレイン切断部位ペプチド模倣物、ＭＭＰ−２切断部位ペプチド模倣物、ＭＭＰ−９切断部位ペプチド模倣物、フューリン切断部位ペプチド模倣物、ｕ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位ペプチド模倣物、ｔ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位ペプチド模倣物、トリプターゼ−ε切断部位ペプチド模倣物、ｍＭＣＰ−７切断部位変異体、ＥＣＥ−１切断部位ペプチド模倣物、ＫＢＧＰ切断部位ペプチド模倣物、カテプシンＬ切断部位ペプチド模倣物、ＰＡＲ１切断部位ペプチド模倣物、ＰＡＲ２切断部位ペプチド模倣物、ＰＡＲ３切断部位ペプチド模倣物、ＰＡＲ４切断部位ペプチド模倣物及びＡＤＡＭ−ＴＳ１３切断部位ペプチド模倣物が挙げられる。
【０２４８】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素は、不活性化切断部位を含む。この実施形態の態様において、クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン、クロストリジウム毒素結合ドメイン及び不活性化切断部位を含む。この実施形態の別の態様において、クロストリジウム毒素は、天然起源の不活性化切断部位変異体、例えば、不活性化切断部位アイソフォームなどを含む。この実施形態の別の態様において、クロストリジウム毒素は、非天然の不活性化切断部位変異体、例えば、保存的不活性化切断部位変異体、非保存的不活性化切断部位変異体又は活性のある不活性化切断部位断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０２４９】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素キメラは、不活性化切断部位を含む。この実施形態の態様において、クロストリジウム毒素キメラは、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン及び不活性化切断部位を含む。この実施形態の別の態様において、クロストリジウム毒素キメラは、天然起源の不活性化切断部位変異体、例えば、不活性化切断部位アイソフォームなどを含む。この実施形態の別の態様において、クロストリジウム毒素キメラは、非天然の不活性化切断部位変異体、例えば、保存的不活性化切断部位変異体、非保存的不活性化切断部位変異体又は活性のある不活性化切断部位断片又はそれらの何らかの組み合わせなどを含む。
【０２５０】
別の実施形態において、不活性化切断部位のある特定の位置の疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸で置換し得る。疎水性アミノ酸の例としては、例えば、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ及びＷが挙げられる。この実施形態の別の態様において、不活性化切断部位のある特定の位置の脂肪族アミノ酸を別の脂肪族アミノ酸で置換し得る。脂肪族アミノ酸の例としては、例えば、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｐ及びＶが挙げられる。この実施形態のまた別の態様において、不活性化切断部位のある特定の位置の芳香族アミノ酸を別の芳香族アミノ酸で置換し得る。芳香族アミノ酸の例としては、例えば、Ｆ、Ｈ、Ｗ及びＹが挙げられる。この実施形態のさらに別の態様において、不活性化切断部位のある特定の位置のスタッキングアミノ酸を別のスタッキングアミノ酸で置換し得る。スタッキングアミノ酸の例としては、例えば、Ｆ、Ｈ、Ｗ及びＹが挙げられる。この実施形態のさらなる態様において、不活性化切断部位のある特定の位置の極性アミノ酸を別の極性アミノ酸で置換し得る。極性アミノ酸の例としては、例えば、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｑ及びＲが挙げられる。この実施形態のさらなる態様において、不活性化切断部位のある特定の位置の低極性又は中性的アミノ酸を別の低極性又は中性的アミノ酸で置換し得る。低極性又は中性的アミノ酸の例としては、例えば、Ａ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ及びＹが挙げられる。この実施形態のまたさらなる態様において、不活性化切断部位のある特定の位置の正に荷電したアミノ酸を別の正に荷電したアミノ酸で置換し得る。正に荷電したアミノ酸の例としては、例えば、Ｋ、Ｒ及びＨが挙げられる。この実施形態のまたさらなる態様において、不活性化切断部位のある特定の位置の負に荷電したアミノ酸を別の負に荷電したアミノ酸で置換し得る。負に荷電したアミノ酸の例としては、例えば、Ｄ及びＥが挙げられる。この実施形態の別の態様において、不活性化切断部位のある特定の位置の小型アミノ酸を別の小型アミノ酸で置換し得る。小型アミノ酸の例としては、例えばＡ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ及びＴが挙げられる。この実施形態のまた別の態様において、不活性化切断部位のある特定の位置のＣ−β分岐型アミノ酸を別のＣ−β分岐型アミノ酸で置換し得る。Ｃ−β分岐型アミノ酸の例としては、例えばＩ、Ｔ及びＶが挙げられる。
【０２５１】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位としてトロンビン切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「トロンビン切断部位」という用語は、トロンビンプロテアーゼ活性に適切な条件下でトロンビンによる切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様においてトロンビンにより切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、トロンビン切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３（Ｒ／Ｋ）＊Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号１１３）であり、式中、Ｘ１は好ましくはＳ、Ｔ、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど、脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は任意のアミノ酸であり；Ｘ３は好ましくはＦ、Ｓ、Ｔ、アミド性アミノ酸、例えばＮもしくはＱなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は好ましくはＳ、Ｔ、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲ又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は、独立して任意のアミノ酸である。表４は、トロンビンに対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号１１４−１２３）。さらなるトロンビン切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。例えば、Ｏ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ，Ｄａｔａｂａｓｅ−Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：６８５−６９４（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３２０−Ｄ３２５（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２２７−Ｄ２３３（２０１０）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１０）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）を参照のこと。
【０２５２】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、トロンビン切断部位を含む。この実施形態の態様において、トロンビン切断部位は、コンセンサス配列である配列番号１１３を含み、式中、Ｘ１はＳ、Ｔ、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど、脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は任意のアミノ酸であり；Ｘ３は、Ｆ、Ｓ、Ｔ、アミド性アミノ酸、例えばＮもしくはＱなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は独立して任意のアミノ酸である。この実施形態の別の態様において、トロンビン切断部位は、コンセンサス配列である配列番号１１３を含み、式中、Ｘ１は、Ｓ、Ｑ、Ｋ又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、ＬもしくはＩであり；Ｘ４はＳ、Ｔ、Ｈ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＩであり；Ｘ５はＳ、Ｔ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｆ、Ｙであるか又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６はＳ、Ｔ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ又はＩであり；Ｘ７は、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ又はＩである。この実施形態の別の態様において、トロンビン切断部位は、コンセンサス配列である配列番号１１３を含み、式中、Ｘ１はＱ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＭであり；Ｘ２はＳ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ａ、Ｖ又はＩであり；Ｘ３はＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ又はＬであり；Ｘ４はＳ、Ｇ、Ａ又はＬであり；Ｘ５はＱ、Ｋ、Ｆ、Ａ、Ｖ又はＬであり；Ｘ６は、Ｓ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｖ又はＬであり；Ｘ７はＳ、Ｔ、Ｋ、Ｇ、Ｖ、Ｌ又はＩである。この実施形態の他の態様において、トロンビン切断部位は、例えば、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２又は配列番号１２３を含む。
【０２５３】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位としてプラスミン切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「プラスミン切断部位」という用語は、プラスミンプロテアーゼ活性に適切な条件下でのプラスミンによる切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。プラスミンにより切断されるいずれのアミノ酸配列も本明細の態様において有用であり得ることが想定される。プラスミンは、トリプシンと同様の特異性でＬｙｓ｜及びＡｒｇ｜結合の切断を触媒する。しかし、プラスミンはトリプシンよりも著しく効率が低い酵素であり、タンパク質中のこれらの結合の一部しか切断しない。トリプシンは、プロリンが続く場合を除き、主にアミノ酸リジン又はアルギニンのカルボキシル側でペプチド鎖を切断する。
【０２５４】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位として凝固第ＶＩＩａ因子切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「凝固第ＶＩＩａ因子切断部位」又は「ＦＶＩＩａ切断部位」という用語は、ＦＶＩＩａプロテアーゼ活性に適切な条件下でのＦＶＩＩａによる切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。ＦＶＩＩａにより切断されるアミノ酸配列は何れも、本明細の態様において有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、ＦＶＩＩａ切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３（Ｒ／Ｋ）＊Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号１２４）であり、式中、Ｘ１は、好ましくは酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、Ｑ、Ｓ、Ｔ、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、好ましくはＱ、Ｓ、Ｔ又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は、独立して任意のアミノ酸である。表４は、ＦＶＩＩａに対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号１２５〜１３３）。さらなるＦＶＩＩａ切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。例えば、Ｊ．Ｈ．Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ．Ｉｎ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＯＬＹＴＩＣ  ＥＮＺＹＭＥＳ，ｐｐ．１６５９−１６６２（Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，ｅｄｓ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，２ｄ，２００４）；Ｏ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ，Ｄａｔａｂａｓｅ−Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：６８５−６９４（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３２０−Ｄ３２５（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２２７−Ｄ２３３（２０１０）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１０）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）を参照のこと。
【０２５５】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、凝固第ＶＩＩａ因子切断部位を含む。この実施形態の態様において、凝固第ＶＩＩａ因子切断部位は、コンセンサス配列である配列番号１２４を含み、式中、Ｘ１は、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、Ｑ、Ｓ、Ｔ、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、Ｑ、Ｓ、Ｔ又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は独立して任意のアミノ酸である。この実施形態の他の態様において、凝固第ＶＩＩａ因子切断部位は、例えば、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２又は配列番号１３３を含む。
【０２５６】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位として凝固第ＩＸａ因子切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「凝固第ＩＸａ因子切断部位」又は「ＦＩＸａ切断部位」という用語は、ＦＩＸａプロテアーゼ活性に適切な条件下でのＦＩＸａによる切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、ＦＩＸａにより切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、ＦＩＸａ切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３（Ｒ／Ｋ）＊Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号１３４）であり、式中、Ｘ１は、好ましくは酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、好ましくは酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、好ましくはＳ、Ｔ、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は独立して任意のアミノ酸である。表４は、ＦＩＸａ（配列番号１３５〜１３８）に対する例示的な参照切断部位を列挙する。さらなるＦＩＸａ切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。例えば、Ａ．Ｔ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ．Ｉｎ  ＨＥＭＯＳＴＡＳＩＳ  ＡＮＤ  ＴＨＲＯＭＢＯＳＩＳ，ＢＡＳＩＣ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，ｐｐ．１２８−１２９（Ｒ．Ｗ．Ｃｏｌｍａｎ，Ｊ．Ｈｉｒｓｈ，Ｖ．Ｊ．Ｍａｒｄｅｒ，Ａ．Ｗ  Ｃｌｏｗｅｓ，Ｊ．Ｎ．Ｇｅｏｒｇｅ，ｅｄｓ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，２ｄ，２００１）；Ｓ．Ｋａｗａｂａｔａ  ａｎｄ  Ｓ．Ｉｗａｎａｇａ，Ｒｕｓｓｅｌｌｙｓｉｎ．Ｉｎ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＯＬＹＴＩＣ  ＥＮＺＹＭＥＳ，ｐｐ．６８３−６８４（Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，ｅｄｓ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，２ｄ，２００４）；Ａ．Ｅ．Ｓｃｈｍｉｄｔ  ａｎｄ  Ｓ．Ｐ．Ｂａｊａｊ，Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸａ．Ｉｎ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＯＬＹＴＩＣ  ＥＮＺＹＭＥＳ，ｐｐ．１６５５−１６５９（Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，ｅｄｓ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，２ｄ，２００４）；Ｏ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ，Ｄａｔａｂａｓｅ−Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：６８５−６９４（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅ��  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３２０−Ｄ３２５（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２２７−Ｄ２３３（２０１０）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１０）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）を参照のこと。
【０２５７】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、凝固第ＩＸａ因子切断部位を含む。この実施形態の態様において、凝固第ＩＸａ因子切断部位は、コンセンサス配列である配列番号１３４を含み、式中、Ｘ１は、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、Ｓ、Ｔ、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は独立して任意のアミノ酸である。この実施形態の別の態様において、凝固第ＩＸａ因子切断部位は、コンセンサス配列である配列番号１３４を含み、式中、Ｘ１は、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、Ｓ、Ｔ、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は独立して、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。この実施形態の他の態様において、凝固第ＩＸａ因子切断部位は、例えば、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７又は配列番号１３８を含む。
【０２５８】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位として凝固第Ｘａ因子切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「凝固第Ｘａ因子切断部位」又は「ＦＸａ切断部位」という用語は、ＦＸａプロテアーゼ活性に適切な条件下でのＦＸａによる切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、ＦＸａにより切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、ＦＸａ切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３（Ｒ／Ｋ）＊Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号１３９）であり、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であり、Ｘ２は、好ましくはＧ、Ａ、Ｓ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＱ及びＮなど又は芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなどであり、Ｘ３は、好ましくは芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は、好ましくはアミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は独立して任意のアミノ酸である。表４は、ＦＸａに対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号１４０〜１５５）。さらなるＦＸａ切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。例えば、Ｄ．Ｌ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｅ．Ｗ．Ｄａｖｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ：Ｔｈｅｉｒ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡｓ，Ｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｉｎ  ＨＥＭＯＳＴＡＳＩＳ  ＡＮＤ  ＴＨＲＯＭＢＯＳＩＳ，ＢＡＳＩＣ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，ｐｐ．３４−３５（Ｒ．Ｗ．Ｃｏｌｍａｎ，Ｊ．Ｈｉｒｓｈ，Ｖ．Ｊ．Ｍａｒｄｅｒ，Ａ．Ｗ  Ｃｌｏｗｅｓ，Ｊ．Ｎ．Ｇｅｏｒｇｅ，ｅｄｓ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰA．，２ｄ，２００１）；Ｏ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ，Ｄａｔａｂａｓｅ−Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：６８５−６９４（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３２０−Ｄ３２５（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２２７−Ｄ２３３（２０１０）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ��ｎ  ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１０）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）を参照のこと。
【０２５９】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、凝固第Ｘａ因子切断部位を含む。この実施形態の態様において、凝固第Ｘａ因子切断部位は、コンセンサス配列である配列番号１３９を含み、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であり、Ｘ２はＧ、Ａ、Ｓ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＱ及びＮなど又は芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなどであり、Ｘ３は、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は独立して任意のアミノ酸である。この実施形態の別の態様において、凝固第Ｘａ因子切断部位は、コンセンサス配列である配列番号１３９を含み、式中、Ｘ１はＥ、Ｆ、Ｐ、Ａ、Ｌ又はＩであり；Ｘ２はＳ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ又はＡであり；Ｘ３は、Ｆ、Ｇ又はＰであり；Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、Ｌ又はＩであり；Ｘ５は、Ｓ、Ｆ、Ａ又はＶであり；Ｘ６は、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、Ｇ、Ａ又はＭであり；Ｘ７はＳ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｒ又はＧである。この実施形態の別の態様において、凝固第Ｘａ因子切断部位は、コンセンサス配列である配列番号１３９を含み、式中、Ｘ１は、Ｉ又はＡであり；Ｘ２は、Ｅ又はＦであり；Ｘ３は、Ｆ、Ｇ又はＰであり；Ｘ４は、Ｓ、Ｔ又はＩであり；Ｘ５は、Ｓ、Ｆ又はＶであり；Ｘ６は、Ｅ又はＧであり；Ｘ７はＳ又はＧである。この実施形態の他の態様において、凝固第Ｘａ因子切断部位は、例えば、アミノ酸配列、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４又は配列番号１５５を含む。
【０２６０】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位として凝固第ＸＩａ因子切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「凝固第ＸＩａ因子切断部位」又は「ＦＸＩａ切断部位」という用語は、ＦＸＩａプロテアーゼ活性に適切な条件下でのＦＸＩａによる切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、ＦＸＩａにより切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、ＦＸＩａ切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３（Ｒ／Ｋ）＊Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号１５６）であり、式中、Ｘ１は、好ましくは酸性アミノ酸、例えばＤ又はＥなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、好ましくは酸性アミノ酸、例えばＤ又はＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＱ及びＮなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、好ましくはＨ、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は、好ましくはＨ、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５は、好ましくは酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６は、好ましくはアミド性アミノ酸、例えばＱ及びＮなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ７は、好ましくは非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。表４は、ＦＸＩａに対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号１５７〜１６６）。さらなるＦＸＩａ切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。例えば、Ｐ．Ｎ．Ｗａｌｓｈ，Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩａ．Ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ｐｐ．１６５１−１６５５（Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，ｅｄｓ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，２ｄ，２００４）；Ｏ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ，Ｄａｔａｂａｓｅ−Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：６８５−６９４（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）��Ｄ３２０−Ｄ３２５（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２２７−Ｄ２３３（２０１０）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１０）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）を参照のこと。
【０２６１】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、凝固第ＸＩａ因子切断部位を含む。この実施形態の態様において、凝固第ＸＩａ因子切断部位は、コンセンサス配列である配列番号１５６を含み、式中、Ｘ１は、酸性アミノ酸、例えばＤ又はＥなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、酸性アミノ酸、例えばＤ又はＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＱ及びＮなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、Ｈ、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は、Ｈ、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５は、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６は、アミド性アミノ酸、例えばＱ及びＮなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ７は、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。この実施形態の別の態様において、凝固第ＸＩａ因子切断部位は、コンセンサス配列である配列番号１５６を含み、式中、Ｘ１は、酸性アミノ酸、例えばＤ又はＥなど又は塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなどであり；Ｘ２は、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は、脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５は、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６は、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ７は、脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。この実施形態の別の態様において、凝固第ＸＩａ因子切断部位は、コンセンサス配列である配列番号１５６を含み、式中、Ｘ１は、Ｄ又はＫであり；Ｘ２は、Ｆ又はＬであり；Ｘ３は、Ｔ又はＰであり；Ｘ４は、Ａ又はＶであり；Ｘ５は、Ｅ又はＶであり；Ｘ６は、Ｔ又はＧであり；Ｘ７は、Ｇ又はＶである。この実施形態の他の態様において、凝固第ＸＩａ因子切断部位は、例えば、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５又は配列番号１６６を含む。
【０２６２】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位として凝固第ＸＩＩａ因子切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「凝固第ＸＩＩａ因子切断部位」又は「ＦＸＩＩａ切断部位」という用語は、ＦＸＩＩａプロテアーゼ活性に適切な条件下でのＦＸＩＩａによる切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、ＦＸＩＩａにより切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、ＦＸＩＩａ切断部位に対する一般化コンセンサス配列はＸ１Ｘ２Ｘ３（Ｒ／Ｋ）＊Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号１６７）であり、式中、Ｘ１は、好ましくは非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、好ましくは酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、好ましくは塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は、好ましくは脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５は、好ましくは非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６は、好ましくは脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ７は、好ましくは脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。表４は、ＦＸＩＩａに対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号１６８〜１７２）。さらなるＦＸＩＩａ切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。例えば、Ｏ．Ｄ．Ｒａｔｎｏｆｆ，Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩａ．Ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ｐｐ．１６４２−１６４４（Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，ｅｄｓ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，２ｄ，２００４）；Ｏ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ，Ｄａｔａｂａｓｅ−Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：６８５−６９４（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３２０−Ｄ３２５（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２２７−Ｄ２３３（２０１０）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅ���  ａｌ．，Ａ  Ｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１０）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）を参照のこと。
【０２６３】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、凝固第ＸＩＩａ因子切断部位を含む。この実施形態の態様において、凝固第ＸＩＩａ因子切断部位は、コンセンサス配列である配列番号１６７を含み、式中、Ｘ１は、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は、脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５は、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６は、脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ７は、脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。この実施形態の他の態様において、凝固第ＸＩＩａ因子切断部位は、コンセンサス配列である配列番号１６７を含み、式中、Ｘ１は、Ｓ、Ｔ、Ｐ又はＩであり；Ｘ２は、Ｑ、Ｋ、Ｓ又はＭであり；Ｘ３は、Ｋ、Ｔ、Ｇ又はＰであり；Ｘ４は、Ｌ、Ｉ又はＶであり；Ｘ５は、Ｔ又はＶであり；Ｘ６は、Ｇ又はＬであり；Ｘ７はＧである。この実施形態の他の態様において、凝固第ＸＩＩａ因子切断部位は、例えば、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１又は配列番号１７２を含む。
【０２６４】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位としてカリクレイン１切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「カリクレイン１切断部位」という用語は、カリクレイン１プロテアーゼ活性に適切な条件下でのカリクレイン１による切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、カリクレイン１により切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、カリクレイン１切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４＊（Ｒ／Ｋ／Ｓ）Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号１７３）であり、式中、Ｘ１は、好ましくは酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＱ及びＮなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は任意のアミノ酸であり；Ｘ３は任意のアミノ酸であり；Ｘ４は、好ましくは陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、大型の非極性アミノ酸、例えばＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ及びＶなど又は芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなどであり；Ｘ５は任意のアミノ酸であり；Ｘ６は任意のアミノ酸であり；Ｘ７は、任意のアミノ酸である。表４は、カリクレイン１に対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号１７４〜１９８）。さらなるカリクレイン１切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。例えば、Ｒ．Ｗ．Ｃｏｌｍａｎ，Ｃｏｎｔａｃｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｐａｔｈｗａｙ：Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ，Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ，Ａｎｔｉａｄｈｅｓｉｖｅ，ａｎｄ  Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｉｎ  ＨＥＭＯＳＴＡＳＩＳ  ＡＮＤ  ＴＨＲＯＭＢＯＳＩＳ，ＢＡＳＩＣ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，ｐｐ．１０３−１０４（Ｒ．Ｗ．Ｃｏｌｍａｎ，Ｊ．Ｈｉｒｓｈ，Ｖ．Ｊ．Ｍａｒｄｅｒ，Ａ．Ｗ  Ｃｌｏｗｅｓ，Ｊ．Ｎ．Ｇｅｏｒｇｅ，ｅｄｓ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２ｄ，２００１）；Ｊ．Ｃｈａｏ，Ｈｕｍａｎ  Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ  １，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ．Ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ｐｐ．１５７７−１５８０（Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，ｅｄｓ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，２ｄ，２００４）；Ｈ．Ｘ．Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎｓ  １  ａｎｄ  ６  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１７：６６４−６７２（２００８）；Ｏ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ，Ｄａｔａｂａｓｅ−Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：６８５−６９４（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３２０−Ｄ３２５（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２２７−Ｄ２３３（２０１０）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１０）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）を参照のこと。
【０２６５】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、カリクレイン１切断部位を含む。この実施形態の態様において、カリクレイン１切断部位は、コンセンサス配列である配列番号１７３を含み、式中、Ｘ１は、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＱ及びＮなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は任意のアミノ酸であり；Ｘ３は任意のアミノ酸であり；Ｘ４は、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、大型の非極性アミノ酸、例えばＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ及びＶなど又は芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなどであり；Ｘ５は任意のアミノ酸であり；Ｘ６は任意のアミノ酸であり；Ｘ７は任意のアミノ酸である。この実施形態の別の態様において、カリクレイン１切断部位は、コンセンサス配列である配列番号１７３を含み、式中、Ｘ１は、Ｄ、Ｓ、Ｔ又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｐ又はＶであり；Ｘ３は、Ｓ、Ｆ又はＬであり；Ｘ４は、Ｒ又は芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなどであり；Ｘ５は、Ｒ、Ｓ、Ｔ又はＡであり；Ｘ６は、Ｒ、Ｓ又はＧであり；Ｘ７は、Ｒ、Ｇ又はＡである。この実施形態の他の態様において、カリクレイン１切断部位は、例えば、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７又は配列番号１９８を含む。
【０２６６】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位としてプロテインＣ切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「プロテインＣ切断部位」という用語は、プロテインＣプロテアーゼ活性に適切な条件下でのプロテインＣによる切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、プロテインＣにより切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、プロテインＣ切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３（Ｒ／Ｋ）＊Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号１９９）であり、式中、Ｘ１は、好ましくは塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、好ましくは酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＱ及びＮなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、好ましくはアミド性アミノ酸、例えばＱ及びＮなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は、好ましくはアミド性アミノ酸、例えばＱ及びＮなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５は、好ましくはアミド性アミノ酸、例えばＱ及びＮなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６は、好ましくはアミド性アミノ酸、例えばＱ及びＮなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなどであり；Ｘ７は、好ましくは酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＱ及びＮなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。表４は、プロテインＣに対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号２００〜２０９）。さらなるプロテインＣ切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。例えば、Ｌ．Ｓｈｅｎ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄａｈｉｂａｃｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ．Ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ｐｐ．１６７３−１６７７（Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，ｅｄｓ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，２ｄ，２００４）；Ｏ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ，Ｄａｔａｂａｓｅ−Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：６８５−６９４（２００８）；��ｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３２０−Ｄ３２５（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２２７−Ｄ２３３（２０１０）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１０）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）を参照のこと。
【０２６７】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、プロテインＣ切断部位を含む。この実施形態の態様において、プロテインＣ切断部位は、コンセンサス配列である配列番号１９９を含み、式中、Ｘ１は、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＱ及びＮなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３及びＸ４は独立して、アミド性アミノ酸、例えばＱ及びＮなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５は、アミド性アミノ酸、例えばＱ及びＮなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６は、アミド性アミノ酸、例えばＱ及びＮなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなどであり；Ｘ７は、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＱ及びＮなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。この実施形態の別の態様において、プロテインＣ切断部位は、配列配列番号１９９を含み、式中、Ｘ１は、Ｋ、Ｒ又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｎ又はＫであり；Ｘ３は、Ｐ、Ｌ、Ｔ、Ｑ、Ｋ又はＲであり；Ｘ４は、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｎ又はＫであり；Ｘ５は、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｆ又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６は、Ｆ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｋ又はＨであり；Ｘ７は、Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｑ又はＮである。この実施形態の他の態様において、プロテインＣ切断部位は、例えば、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８又は配列番号２０９を含む。
【０２６８】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位としてプラスミノーゲン切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「プラスミノーゲン切断部位」という用語は、プラスミノーゲンプロテアーゼ活性に適切な条件下でのプラスミノーゲンによる切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、プラスミノーゲンにより切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、プラスミノーゲン切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３（Ｒ／Ｋ）＊Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号２１０）であり、式中、Ｘ１は、好ましくは陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、好ましくはアミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、好ましくはアミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど、芳香族アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は、好ましくは陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５は、好ましくは陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６は任意のアミノ酸であり；Ｘ７は、好ましくはＨ、Ｆ、Ｙ、Ｒ、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど、脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。表４は、プラスミノーゲンに対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号２１１〜２４０）。さらなるプラスミノーゲン切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。例えば、Ｏ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ，Ｄａｔａｂａｓｅ−Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：６８５−６９４（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３２０−Ｄ３２５（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２２７−Ｄ２３３（２０１０）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１０）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）を参照のこと。
【０２６９】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、プラスミノーゲン切断部位を含む。この実施形態の態様において、プラスミノーゲン切断部位は、コンセンサス配列である配列番号２１１を含み、式中、Ｘ１は、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど、芳香族アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５は、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６は任意のアミノ酸であり；Ｘ７は、Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｒ、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど、脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。この実施形態の別の態様において、プラスミノーゲン切断部位は、配列番号２１１を含み、式中、Ｘ１は、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｇ、Ｌ又はＰであり；Ｘ２は、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｇ、Ｉ又はＬであり；Ｘ３は、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｆ、Ｙ、Ａ又はＬであり；Ｘ４は、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｌ又はＶであり；Ｘ５は、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｓ、Ｆ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｐ又はＶであり；Ｘ６は、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｓ、Ｆ、Ｙ、Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｐ又はＶであり；Ｘ７は、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ又はＰである。この実施形態の他の態様において、プラスミノーゲン切断部位は、例えば、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９又は配列番号２４０を含む。
【０２７０】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位としてマトリクスメタロプロテイナーゼ−２切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「マトリクスメタロプロテイナーゼ−２切断部位」又は「ＭＭＰ−２切断部位」という用語は、ＭＭＰ−２プロテアーゼ活性に適切な条件下でのＭＭＰ−２による切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、ＭＭＰ−２により切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、ＭＭＰ−２切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、Ｘ１（Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｌ／Ｉ）Ｘ２Ｘ３＊（Ｖ／Ｌ／Ｉ／Ｆ／Ｑ）Ｘ４Ｘ５Ｘ６（配列番号２４１）であり、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６は、任意のアミノ酸である。表４は、ＭＭＰ−２に対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号２４２〜２７３）。さらなるＭＭＰ−２切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。例えば、Ｏ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ，Ｄａｔａｂａｓｅ−Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：６８５−６９４（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３２０−Ｄ３２５（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２２７−Ｄ２３３（２０１０）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１０）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）を参照のこと。
【０２７１】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２切断部位を含む。この実施形態の態様において、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２切断部位は、コンセンサス配列である配列番号２４１を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６は、任意のアミノ酸である。この実施形態の別の態様において、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２切断部位は、コンセンサス配列である配列番号２４１を含み、式中、Ｘ１は、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、Ｈ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど、芳香族アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５は、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６は、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。この実施形態の別の態様において、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２切断部位は、配列、配列番号２４１を含み、式中、Ｘ１は、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｅ又はＱであり；Ｘ２は、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｗ又はＫであり；Ｘ３は、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｓ、Ｑ、Ｄ、Ｅ又はＨであり；Ｘ４は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｑ又はＫであり；Ｘ５は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｑ又はＫであり；Ｘ６は、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ又はＱである。この実施形態の別の態様において、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２切断部位は、配列番号２４１の配列を含み、式中、Ｘ１は、Ｇ、Ａ又はＬ又はＱであり；Ｘ２は、Ｇ、Ａ又はＳであり；Ｘ３は、Ｇ、Ａ、Ｓ又はＮであり；Ｘ４は、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＫであり；Ｘ５は、Ｇ、Ａ又はＳであり；Ｘ６は、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ又はＤである。この実施形態の他の態様において、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２切断部位は、例えば、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、配列番号２７２又は配列番号２７３を含む。
【０２７２】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位としてマトリクスメタロプロテイナーゼ−９切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「マトリクスメタロプロテイナーゼ−９切断部位」又は「ＭＭＰ−２切断部位」という用語は、ＭＭＰ−９プロテアーゼ活性に適切な条件下でのＭＭＰ−９による切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、ＭＭＰ−９により切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、ＭＭＰ−９切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４＊Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号２７４）であり、式中、Ｘ１は、好ましくはＦ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、好ましくはＦ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、好ましくはＦ、Ｙ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は任意のアミノ酸であり；Ｘ５は、好ましくはＳ、Ｔ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６は任意のアミノ酸であり；Ｘ７は任意のアミノ酸であり；Ｘ８は、好ましくはＦ、Ｙ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。表４は、ＭＭＰ−９に対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号２７５〜３１９）。さらなるＭＭＰ−９切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。例えば、Ｓ．Ｌ．Ｋｒｉｄｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｂｙ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２０５７２−２０５７８（２００１）；Ｅ．Ｙ．Ｚｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ａｒｔｉｃｕｌａｒ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５８：２４２０−２４３１（２００８）；Ｏ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ，Ｄａｔａｂａｓｅ−Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉ���ｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：６８５−６９４（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３２０−Ｄ３２５（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２２７−Ｄ２３３（２０１０）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１０）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）を参照のこと。
【０２７３】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、マトリクスメタロプロテイナーゼ−９切断部位を含む。この実施形態の態様において、マトリクスメタロプロテイナーゼ−９切断部位は、コンセンサス配列である配列番号２７４を含み、式中、Ｘ１は、Ｆ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、Ｆ、Ｙ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は任意のアミノ酸であり；Ｘ５は、Ｓ、Ｔ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６は任意のアミノ酸であり；Ｘ７は任意のアミノ酸であり；Ｘ８は、Ｆ、Ｙ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。この実施形態の別の態様において、マトリクスメタロプロテイナーゼ−９切断部位は、コンセンサス配列である配列番号２７４を含み、式中、Ｘ１は、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｋ又はＲであり；Ｘ２は、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＳであり；Ｘ３は、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｑ、Ｅ、Ｋ又はＲであり；Ｘ４は、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｎ、Ｅ又はＫであり；Ｘ５は、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｑ又はＫであり；Ｘ６は、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｅ、Ｋ又はＲであり；Ｘ７は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｓ又はＴであり；Ｘ８は、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＲである。この実施形態の別の態様において、マトリクスメタロプロテイナーゼ−９切断部位は、コンセンサス配列である配列番号２７４を含み、式中、Ｘ１は、Ｇ又はＬであり；Ｘ２は、Ｐ、Ａ又はＶであり；Ｘ３は、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｋ又はＳであり；Ｘ４はＧであり；Ｘ５は、Ａ、Ｖ、Ｌ又はＩであり；Ｘ６は、Ｔ、Ｑ、Ｋ又はＲであり；Ｘ７は、Ｇ、Ａ又はＳであり；Ｘ８は、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ又はＥである。この実施形態の他の態様において、マトリクスメタロプロテイナーゼ−９切断部位は、例えば、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号２９９、配列番号３００、配列番号３０１、配列番号３０２、配列番号３０３、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号３０７、配列番号３０８、配列番号３０９、配列番号３１０、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１５、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１８又は配列番号３１９を含む。
【０２７４】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位としてフューリン切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「フューリン切断部位」という用語は、フューリンプロテアーゼ活性に適切な条件下でのフューリンによる切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、フューリンにより切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、フューリン切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、（Ｒ／Ｉ／Ａ）Ｘ１（Ｒ／Ｋ／Ａ／Ｐ）Ｒ＊Ｘ２＊Ｘ３Ｘ４Ｘ５（配列番号３２０）であり、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は、任意のアミノ酸である。表４は、フューリンに対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号３２１〜３４６）。さらなるフューリン切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。例えば、Ａ．Ｂａｓａｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅｓ  Ｆｕｒｉｎ，ＰＣ５  Ａｎｄ  ＰＣ７  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ，Ｅｂｏｌａ  ａｎｄ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５３：５３７−５４５（２００１）；Ｏ．Ｂａｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｋｅｘ２  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ，Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ａｎｄ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ，ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：１１６（２００８）；Ｏ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ，Ｄａｔａｂａｓｅ−Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：６８５−６９４（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３２０−Ｄ３２５（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２２７−Ｄ２３３（２０１０）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１０）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）を参照のこと。
【０２７５】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、フューリン切断部位を含む。この実施形態の態様において、フューリン切断部位は、コンセンサス配列である配列番号３２０を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は、任意のアミノ酸である。この実施形態の別の態様において、フューリン切断部位は、コンセンサス配列である配列番号３２０を含み、式中、Ｘ１は、Ｆ、Ｓ、Ｔ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、Ｇ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど又は非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなどであり；Ｘ３は、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｈ、Ｋ又はＲであり；Ｘ４は、Ｆ、Ｙ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５は、Ｆ、Ｙ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。この実施形態の別の態様において、フューリン切断部位は、コンセンサス配列である配列番号３２０を含み、式中、Ｘ１は、Ｋ、Ｒ、Ｓ又はＴであり；Ｘ２は、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ａ又はＧであり；Ｘ３は、Ａ、Ｖ、Ｌ又はＩであり；Ｘ４は、Ｓ、Ｇ、Ｄ、Ｅ又はＲであり；Ｘ５は、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｄ又はＥである。この実施形態の他の態様において、フューリン切断部位は、例えば、配列番号３２１、配列番号３２２、配列番号３２３、配列番号３２４、配列番号３２５、配列番号３２６、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３２９、配列番号３３０、配列番号３３１、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３３４、配列番号３３５、配列番号３３６、配列番号３３７、配列番号３３８、配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５又は配列番号３４６を含む。
【０２７６】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位としてｕ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「ｕ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位」又は「ｕ−ＰＡ切断部位」という用語は、ｕ−ＰＡプロテアーゼ活性に適切な条件下でのｕ−ＰＡによる切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、ｕ−プラスミノーゲン活性化因子により切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、ｕ−ＰＡ切断部位に対する一般化コンセンサス配列はＸ１Ｘ２Ｘ３（Ｒ／Ｋ）＊Ｘ４＊Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号３４７）であり、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であり；Ｘ２は、好ましくは非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど、芳香族アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、好ましくはアミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は任意のアミノ酸であり；Ｘ５は、好ましくは塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、芳香族アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６は、好ましくは非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど、芳香族アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ７は任意のアミノ酸である。表４は、ｕ−ＰＡに対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号３４７〜３６８）。さらなるｕ−ＰＡ切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。例えば、Ｖ．Ｅｌｌｉｓ，ｕ−Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ｐｐ．１６７７−１６８３（Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，ｅｄｓ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，２ｄ，２００４）；Ｏ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ，Ｄａｔａｂａｓｅ−Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：６８５−６９４（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３２０−Ｄ３２５（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２２７−Ｄ２３３（２０１０）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃ��ｅａｖａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１０）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）を参照のこと。
【０２７７】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、ｕ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位を含む。この実施形態の態様において、ｕ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位は、コンセンサス配列である配列番号３４７を含み、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であり；Ｘ２は、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど、芳香族アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は任意のアミノ酸であり；Ｘ５は、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、芳香族アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６は、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど、芳香族アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ７は、任意のアミノ酸である。この実施形態の別の態様において、ｕ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位は、コンセンサス配列である配列番号３４７を含み、式中、Ｘ１は、Ｐ、Ａ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ又はＲであり；Ｘ２は、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｙ、Ｓ又はＴであり；Ｘ３は、Ｇ、Ａ、Ｓ又はＮであり；Ｘ４は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｙ、Ｓ又はＲであり；Ｘ５は、Ｐ、Ｖ、Ｌ、Ｆ又はＲであり；Ｘ６は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｙ、Ｓ又はＴであり；Ｘ７は、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｎ又はＨである。この実施形態の別の態様において、ｕ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位は、コンセンサス配列である配列番号３４７を含み、式中、Ｘ１は、Ｐ、Ａ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｎ又はＲであり；Ｘ２は、Ｇ、Ｙ又はＳであり；Ｘ３は、Ｇ又はＳであり；Ｘ４は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｙ、Ｓ又はＲであり；Ｘ５は、Ｖ又はＲであり；Ｘ６は、Ｔ又はＹであり；Ｘ７は、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｎ又はＨである。この実施形態の他の態様において、ｕ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位は、例えば、配列番号３４８、配列番号３４９、ＮＯ：３５０、配列番号３５１、配列番号３５２、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５又は配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６６、配列番号３６７又は配列番号３６８を含む。
【０２７８】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位としてｔ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「ｔ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位」又は「ｔ−ＰＡ切断部位」という用語は、ｔ−ＰＡプロテアーゼ活性に適切な条件下でのｔ−ＰＡによる切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、ｔ−ＰＡにより切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、ｔ−ＰＡ切断部位に対する一般化コンセンサス配列はＸ１Ｘ２Ｘ３（Ｒ／Ｋ）＊Ｘ４＊Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号３６９）であり、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は、任意のアミノ酸である。表４は、ｔ−ＰＡに対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号３７０〜３７３）。さらなるｔ−ＰＡ切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。例えば、Ｈ．Ｒ．Ｌｉｊｎｅｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｃｏｌｌｅｎ，ｔ−Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ｐｐ．１６８４−１６８９（Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，ｅｄｓ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，２ｄ，２００４）；Ｏ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ，Ｄａｔａｂａｓｅ−Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：６８５−６９４（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３２０−Ｄ３２５（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２２７−Ｄ２３３（２０１０）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１０）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）を参照のこと。
【０２７９】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、ｔ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位を含む。この実施形態の態様において、ｔ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位は、コンセンサス配列である配列番号３６９を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は、任意のアミノ酸である。この実施形態の別の態様において、ｔ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位は、コンセンサス配列である配列番号３６９を含み、式中、Ｘ１は、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５は、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６は、脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ７は、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。この実施形態の別の態様において、ｔ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位は、コンセンサス配列である配列番号３６９を含み、式中、Ｘ１は、Ａ、Ｐ、Ｃ又はＮであり；Ｘ２は、Ａ、Ｌ、Ｐ又はＱであり；Ｘ３は、Ｇ、Ｌ、Ｓ又はＦであり；Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｍ又はＹであり；Ｘ５は、Ａ、Ｖ又はＫであり；Ｘ６は、Ｇ、Ｖ又はＰであり；Ｘ７は、Ｇ、Ｌ又はＤである。この実施形態の他の態様において、ｔ−プラスミノーゲン活性化因子切断部位は、例えば、配列番号３７０、配列番号３７１、配列番号３７２又は配列番号３７３を含む。
【０２８０】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位としてトリプターゼ−ε切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「トリプターゼ−ε切断部位」又は「プロセミン（Ｐｒｏｓｅｍｉｎ）切断部位」という用語は、トリプターゼ−εプロテアーゼ活性に適切な条件下でのトリプターゼ−εによる切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、トリプターゼ−εにより切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、トリプターゼ−ε切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、＊（Ｒ／Ｋ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４（Ｄ／Ｅ）（配列番号３７４）であり、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は独立して、脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。表４は、トリプターゼ−εに対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号３７５〜３８６）。さらなるトリプターゼ−ε切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。例えば、Ｏ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ，Ｄａｔａｂａｓｅ−Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：６８５−６９４（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３２０−Ｄ３２５（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２２７−Ｄ２３３（２０１０）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１０）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）を参照のこと。
【０２８１】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、トリプターゼ−ε切断部位を含む。この実施形態の態様において、トリプターゼ−ε切断部位は、コンセンサス配列である配列番号３７４を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４、は独立して、脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。この実施形態の別の態様において、トリプターゼ−ε切断部位は、コンセンサス配列である配列番号３７４を含み、式中、Ｘ１は、Ｉ又はＶであり；Ｘ２は、Ｉ又はＶであり；Ｘ３は、Ｇ又はＳであり；Ｘ４は、Ｇ又はＳである。この実施形態の他の態様において、トリプターゼ−ε切断部位は、例えば、配列番号３７５、配列番号３７６、配列番号３７７、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２、配列番号３８３、配列番号３８４、配列番号３８５又は配列番号３８６を含む。
【０２８２】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位としてマウス肥満細胞プロテアーゼ−７切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「マウス肥満細胞プロテアーゼ−７切断部位」又は「ｍＭＣＰ−７切断部位」という用語は、ｍＭＣＰ−７プロテアーゼ活性に適切な条件下でのｍＭＣＰ−７による切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、ｍＭＣＰ−７により切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、ｍＭＣＰ−７切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３（Ｋ／Ｒ）＊Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号３８７）であり、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であり；Ｘ２は、好ましくはアミド性アミノ酸、例えばＮもしくはＱなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、好ましくは脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７は、任意のアミノ酸である。表４は、ｍＭＭＣＰ−７に対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号３８８〜３９１）。さらなるｍＭＭＣＰ−７切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。例えば、Ｏ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ，Ｄａｔａｂａｓｅ−Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：６８５−６９４（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３２０−Ｄ３２５（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２２７−Ｄ２３３（２０１０）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１０）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）を参照のこと。
【０２８３】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、マウス肥満細胞プロテアース（Ｐｒｏｔｅａｓ）−７切断部位を含む。この実施形態の態様において、マウス肥満細胞プロテアース（Ｐｒｏｔｅａｓ）−７切断部位は、コンセンサス配列である配列番号３８７を含み、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であり；Ｘ２は、アミド性アミノ酸、例えばＮもしくはＱなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７は独立して任意のアミノ酸である。この実施形態の別の態様において、マウス肥満細胞プロテアース（Ｐｒｏｔｅａｓ）−７切断部位は、コンセンサス配列である配列番号３８７を含み、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であり；Ｘ２は、Ｇ、Ｓ又はＱであり；Ｘ３は、Ａ、Ｐ又はＳであり；Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７は、任意のアミノ酸である。この実施形態の他の態様において、マウス肥満細胞プロテアース（Ｐｒｏｔｅａｓ）−７切断部位は、例えば、配列番号３８８、配列番号３８９、配列番号３９０又は配列番号３９１を含む。
【０２８４】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位としてエンドセリン変換酵素−１切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「エンドセリン変換酵素−１切断部位」又は「ＥＣＥ−１切断部位」という用語は、ＥＣＥ−１プロテアーゼ活性に適切な条件下でのＥＣＥ−１による切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、ＥＣＥ−１により切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、ＥＣＥ−１切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４＊（Ｆ／Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｙ）５Ｘ６Ｘ７（配列番号３９２）であり、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は、任意のアミノ酸である。表４は、ＥＣＥ−１に対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号３９３〜４１２）。さらなるＥＣＥ−１切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。例えば、Ｋ．Ａｈｎ  ａｎｄ  Ｇ．Ｄ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ−１．Ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ｐｐ．４２９−４３４（Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，ｅｄｓ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，２ｄ，２００４）；Ｏ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ，Ｄａｔａｂａｓｅ−Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：６８５−６９４（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３２０−Ｄ３２５（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２２７−Ｄ２３３（２０１０）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１０）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）を参照のこと。
【０２８５】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、エンドセリン変換酵素−１切断部位を含む。この実施形態の態様において、エンドセリン変換酵素−１切断部位は、コンセンサス配列である配列番号３９２を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は独立して任意のアミノ酸である。この実施形態の別の態様において、エンドセリン変換酵素−１切断部位は、コンセンサス配列である配列番号３９２を含み、式中、Ｘ１は、Ｇ、Ｐ、Ｙ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど又は非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなどであり；Ｘ２は、Ｆ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、Ｓ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は、Ｓ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５は、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｅ、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６は、Ｇ、Ｐ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど又は非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなどであり；Ｘ７は、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｎ、Ｄ又はＫである。この実施形態の別の態様において、エンドセリン変換酵素−１切断部位は、コンセンサス配列である配列番号３９２を含み、式中、Ｘ１は、Ｇ、Ｐ、Ｙ、Ｃ、Ｄ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；Ｘ２は、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｃ、Ｑ、Ｄ、Ｒ又はＨであり；Ｘ３は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｑ、Ｋ又はＲであり；Ｘ４は、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｗ又はＲであり；Ｘ５は、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｎ、Ｒ又はＨであり；Ｘ６は、Ｐ、Ｌ、Ｆ、Ｔ、Ｅ又はＨであり；Ｘ７は、Ｐ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｎ、Ｄ又はＫである。この実施形態の別の態様において、エンドセリン変換酵素−１切断部位は、コンセンサス配列である配列番号３９２を含み、式中、Ｘ１は、Ｇ、Ｄ又はＨであり；Ｘ２は、Ｉ又はＦであり；Ｘ３は、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ｑ又はＫであり；Ｘ４は、Ｐ、Ｆ又はＷであり；Ｘ５は、Ｉ、Ｎ、Ｒ又はＨであり；Ｘ６は、Ｌ、Ｔ又はＨであり；Ｘ７は、Ｐ、Ｓ又はＤである。この実施形態の他の態様において、エンドセリン変換酵素−１切断部位は、例えば、配列番号３９３、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、配列番号４０７、配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１１又は配列番号４１２を含む。
【０２８６】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位としてケル式血液型タンパク質切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「ケル式血液型タンパク質切断部位」又はＫＢＧＰ切断部位」という用語は、ＫＢＧＰプロテアーゼ活性に適切な条件下でのＫＢＧＰによる切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、ＫＢＧＰにより切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、ＫＢＧＰ切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４＊Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号４１３）であり、式中、Ｘ１は、好ましくは酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなどであり；Ｘ２は、好ましくは脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、好ましくは脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は、好ましくは芳香族アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなどであり；Ｘ５は、好ましくは脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６は、好ましくはアミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなどであり；Ｘ７は、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなどであり；Ｘ８は、好ましくは脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。表４は、ＫＢＧＰに対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号４１４〜４１５）。さらなるＫＢＧＰ切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。例えば、Ｏ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ，Ｄａｔａｂａｓｅ−Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：６８５−６９４（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３２０−Ｄ３２５（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２２７−Ｄ２３３（２０１０）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１０）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）を参照のこと。
【０２８７】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、ケル式血液型タンパク質切断部位を含む。この実施形態の態様において、ケル式血液型タンパク質切断部位は、コンセンサス配列である配列番号４１３を含み、式中、Ｘ１は、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなどであり；Ｘ２は、Ｔ又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は、芳香族アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなどであり；Ｘ５は、Ｔ又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ６は、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなどであり；Ｘ７は、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又はＣ−β分岐型アミノ酸、例えばＩ、Ｖ又はＴなどであり；Ｘ８は、脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。この実施形態の別の態様において、ケル式血液型タンパク質切断部位は、コンセンサス配列である配列番号４１３を含み、式中、Ｘ１はＤであり；Ｘ２は、Ｉ、Ｖ又はＴであり；Ｘ３は、Ｉ、Ｖ又はＴであり；Ｘ４はＷであり；Ｘ５は、Ｉ、Ｖ又はＴであり；Ｘ６はＮであり；Ｘ７はＴであり；Ｘ８はＰである。この実施形態の他の態様において、ケル式血液型タンパク質切断部位は、例えば、配列番号４１４又は配列番号４１５を含む。
【０２８８】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位としてカテプシンＬ切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「カテプシンＬ切断部位」という用語は、カテプシンＬプロテアーゼ活性に適切な条件下でのカテプシンＬによる切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、カテプシンＬにより切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、カテプシンＬ切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４＊Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号４１６）であり、式中、Ｘ１は、好ましくはＷ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は任意のアミノ酸であり；Ｘ３は、好ましくはＬ、Ｖ、Ｆ又はＹであり；Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７及びＸ８は、任意のアミノ酸である。表４は、カテプシンＬに対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号４１７〜４４３）。さらなるカテプシンＬ切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。例えば、Ｊ．Ｃ．Ｋｅｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｃａｌｐａｉｎ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ＦＲＥＴ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １７９４：１５０５−１５０９（２００９）；Ｏ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ，Ｄａｔａｂａｓｅ−Ｓｅａｒｃｈａｂｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：６８５−６９４（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３２０−Ｄ３２５（２００８）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２２７−Ｄ２３３（２０１０）；Ｎｅｉｌ  Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｌａｒｇｅ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＥＲＯＰＳ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１０）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。）を参照のこと。
【０２８９】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、カテプシンＬ切断部位を含む。この実施形態の態様において、カテプシンＬ切断部位は、コンセンサス配列である配列番号４１６を含み、式中、Ｘ１は、Ｗ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど、非電荷アミノ酸、例えばＣ、Ｓ及びＴなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ２は任意のアミノ酸であり；Ｘ３は、Ｌ、Ｖ、Ｆ又はＹであり；Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７及びＸ８は任意のアミノ酸である。この実施形態の別の態様において、カテプシンＬ切断部位は、コンセンサス配列である配列番号４１６を含み、式中、Ｘ１は、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｌ、Ｑ、Ｅ又はＫであり；Ｘ２は、芳香族アミノ酸、例えばＦ、Ｗ及びＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ３は、Ｌ、Ｖ、Ｆ又はＹであり；Ｘ４は、Ｇ、Ａ、Ｆ、Ｔ、Ｑ、Ｅ、Ｋ又はＲであり；Ｘ５は、Ｇ、Ａ、Ｓ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど又は陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなどであり；Ｘ６は、Ｐ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｑ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど又は陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなどであり；Ｘ７は、陽性アミノ酸、例えばＨ、Ｋ及びＲなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ８は、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど又は塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなどである。この実施形態の別の態様において、カテプシンＬ切断部位は、コンセンサス配列である配列番号４１６を含み、式中、Ｘ１は、Ｇ、Ａ、Ｑ、Ｅ又はＫであり；Ｘ２は、Ｇ、Ｐ、Ｌ又はＦであり；Ｘ３は、Ｌ、Ｖ、Ｆ又はＹであり；Ｘ４は、Ｇ、Ａ、Ｆ、Ｔ、Ｑ、Ｅ、Ｋ又はＲであり；Ｘ５は、Ａ、Ｓ、Ｑ、Ｅ、Ｋ又はＲであり；Ｘ６は、Ｐ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｓ又はＥであり；Ｘ７は、Ｐ、Ｌ又はＲであり；Ｘ８は、Ｐ、Ｌ、Ｓ又はＫである。この実施形態の他の態様において、カテプシンＬ切断部位は、例えば、配列番号４１７、配列番号４１８、配列番号４１９、配列番号４２０、配列番号４２１、配列番号４２２、配列番号４２３、配列番号４２４、配列番号４２５、配列番号４２６、配列番号４２７、配列番号４２８、配列番号４２９、配列番号４３０、配列番号４３１、配列番号４３２、配列番号４３３、配列番号４３４、配列番号４３５、配列番号４３６、配列番号４３７、配列番号４３８、配列番号４３９、配列番号４４０、配列番号４４１、配列番号４４２又は配列番号４４３を含む。
【０２９０】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位としてＰＡＲ１切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「ＰＡＲ１切断部位」という用語は、ＰＡＲ１プロテアーゼ活性に適切な条件下でのＰＡＲ１による切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、ＰＡＲ１により切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、ＰＡＲ１切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４（Ｋ／Ｒ）Ｘ５（配列番号４４４）であり、式中、Ｘ１は、好ましくは小型の非極性アミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ及びＴなどであり；Ｘ２は、好ましくは大型の非極性アミノ酸、例えばＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖなど又は芳香族アミノ酸、例えばＦ、Ｈ、Ｗ又はＹなどであり；Ｘ３は、好ましくは大型の非極性アミノ酸、例えばＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖなど又は芳香族アミノ酸、例えばＦ、Ｈ、Ｗ又はＹなどであり；Ｘ４は、好ましくは脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５は、好ましくはアミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど又は芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ又はＹなどである。表４は、ＰＡＲ１に対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号４４５〜４５２）。さらなるＰＡＲ１切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。
【０２９１】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、ＰＡＲ１切断部位を含む。この実施形態の態様において、ＰＡＲ１切断部位は、コンセンサス配列である配列番号４４４を含み、式中、Ｘ１は、小型の非極性アミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ及びＴなどであり；Ｘ２は、大型の非極性アミノ酸、例えばＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖなど又は芳香族アミノ酸、例えばＦ、Ｈ、Ｗ又はＹなどであり；Ｘ３は、大型の非極性アミノ酸、例えばＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖなど又は芳香族アミノ酸、例えばＦ、Ｈ、Ｗ又はＹなどであり；Ｘ４は、脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５は、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど又は芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ又はＹなどである。この実施形態の別の態様において、ＰＡＲ１切断部位は、コンセンサス配列である配列番号４４４を含み、式中、Ｘ１は、Ｓ、Ｔ又はＧであり；Ｘ２は、Ｆ又はＹであり；Ｘ３は、Ｌ、Ｐ又はＦであり；Ｘ４は、Ａ、Ｇ、Ｉ又はＬであり；Ｘ５は、Ｆ又はＮである。この実施形態の他の態様において、ＰＡＲ１切断部位は、例えば、配列番号４４５、配列番号４４６、配列番号４４７、配列番号４４８、配列番号４４９、配列番号４５０、配列番号４５１又は配列番号４５２を含む。
【０２９２】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位としてＰＡＲ２切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「ＰＡＲ２切断部位」という用語は、ＰＡＲ２プロテアーゼ活性に適切な条件下でのＰＡＲ２による切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、ＰＡＲ２により切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、ＰＡＲ２切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４（Ｋ／Ｒ）Ｘ５（配列番号４５３）であり、式中、Ｘ１は、好ましくは小型の非極性アミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ及びＴなどであり；Ｘ２は、好ましくは大型の非極性アミノ酸、例えばＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖなどであり；Ｘ３は、好ましくは大型の非極性アミノ酸、例えばＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖなどであり；Ｘ４は、好ましくは脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５は、好ましくは大型の非極性アミノ酸、例えばＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖなどである。表４は、ＰＡＲ２に対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号４５４〜４５５）。さらなるＰＡＲ２切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。
【０２９３】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、ＰＡＲ２切断部位を含む。この実施形態の態様において、ＰＡＲ２切断部位は、コンセンサス配列である配列番号４５３を含み、式中、Ｘ１は、小型の非極性アミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ及びＴなどであり；Ｘ２は、大型の非極性アミノ酸、例えばＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖなどであり；Ｘ３は、大型の非極性アミノ酸、例えばＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖなどであり；Ｘ４は、脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５は、大型の非極性アミノ酸、例えばＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖなどである。この実施形態の別の態様において、ＰＡＲ２切断部位は、コンセンサス配列である配列番号４５３を含み、式中、Ｘ１はＳであり；Ｘ２は、Ｉ又はＬであり；Ｘ３は、Ｉ又はＬであり；Ｘ４は、Ａ又はＧであり；Ｘ５は、Ｌ又はＶである。この実施形態の他の態様において、ＰＡＲ２切断部位は、例えば、配列番号４５４又は配列番号４５５を含む。
【０２９４】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位としてＰＡＲ３切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「ＰＡＲ３切断部位」という用語は、ＰＡＲ３プロテアーゼ活性に適切な条件下でのＰＡＲ３による切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、ＰＡＲ３により切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、ＰＡＲ３切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（配列番号４５６）であり、式中、Ｘ１は、好ましくは小型の非極性アミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ及びＴなどであり；Ｘ２は、好ましくは大型の非極性アミノ酸、例えばＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖなどであり；Ｘ３は、好ましくはアミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど又は塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなどであり；Ｘ４は、好ましくは小型の非極性アミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ及びＴなどであり；Ｘ５は、好ましくは小型の非極性アミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ及びＴなど又は小型極性アミノ酸、例えばＤ、Ｎ又はＰなどであり；Ｘ６は、好ましくは酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど又は小型極性アミノ酸、例えばＤ、Ｎ又はＰなどである。表４は、ＰＡＲ３に対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号４５７〜４５９）。さらなるＰＡＲ３切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。
【０２９５】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、ＰＡＲ３切断部位を含む。この実施形態の態様において、ＰＡＲ３切断部位は、コンセンサス配列である配列番号４５６を含み、式中、Ｘ１は、小型の非極性アミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ及びＴなどであり；Ｘ２は、大型の非極性アミノ酸、例えばＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖなどであり；Ｘ３は、アミド性アミノ酸、例えばＮ及びＱなど又は塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなどであり；Ｘ４は、小型の非極性アミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ及びＴなどであり；Ｘ５は、小型の非極性アミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ及びＴなど又は小型極性アミノ酸、例えばＤ、Ｎ又はＰなどであり；Ｘ６は、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなど又は小型極性アミノ酸、例えばＤ、Ｎ又はＰなどである。この実施形態の別の態様において、ＰＡＲ３切断部位は、コンセンサス配列である配列番号４５６を含み、式中、Ｘ１は、Ｓ又はＴであり；Ｘ２はＦであり；Ｘ３は、Ｎ又はＲであり；Ｘ４は、Ａ又はＧであり；Ｘ５は、Ａ、Ｇ又はＮであり、Ｘ６は、Ｐ又はＥである。この実施形態の他の態様において、ＰＡＲ３切断部位は、例えば、配列番号４５７、配列番号４５８又は配列番号４５９を含む。
【０２９６】
本明細の態様は、ある一部分において、不活性化切断部位としてＰＡＲ４切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「ＰＡＲ４切断部位」という用語は、ＰＡＲ４プロテアーゼ活性に適切な条件下でのＰＡＲ４による切断可能結合における検出可能なタンパク質分解に十分な、隣接もしくは非隣接認識要素又は両方を伴う、切断可能結合を指す。本明細の態様において、ＰＡＲ４により切断されるいかなるアミノ酸配列も有用であり得ることが想定される。例外が知られているが、ＰＡＲ４切断部位に対する一般化コンセンサス配列は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４（Ｋ／Ｒ／Ｑ／Ｆ）Ｘ５（配列番号４６０）であり、式中、Ｘ１は、好ましくは小型の非極性アミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ及びＴなどであり；Ｘ２は、好ましくは大型の非極性アミノ酸、例えばＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖなど又は芳香族アミノ酸、例えばＦ、Ｈ、Ｗ又はＹなどであり；Ｘ３は、好ましくは脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は、好ましくは脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５は、好ましくは塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ又はＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。表４は、ＰＡＲ４に対する例示的な参照切断部位を列挙する（配列番号４６１〜４７８）。さらなるＰＡＲ４切断部位は当技術分野で周知であるか又は通例の方法によって定められ得る。
【０２９７】
従って、実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、ＰＡＲ４切断部位を含む。この実施形態の態様において、ＰＡＲ４切断部位は、コンセンサス配列である配列番号４６０を含み、式中、Ｘ１は、小型の非極性アミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ及びＴなどであり；Ｘ２は、大型の非極性アミノ酸、例えばＦ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖなど又は芳香族アミノ酸、例えばＦ、Ｈ、Ｗ又はＹなどであり；Ｘ３は、脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ４は、脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどであり；Ｘ５は、塩基性アミノ酸、例えばＫ及びＲなど、芳香族疎水性アミノ酸、例えばＦ、Ｗ又はＹなど又は脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。この実施形態の別の態様において、ＰＡＲ４切断部位は、コンセンサス配列である配列番号４６０を含み、式中、Ｘ１は、Ａ、Ｇ、Ｓ又はＴであり；Ｘ２は、Ｆ又はＹであり；Ｘ３は、Ａ又はＰであり；Ｘ４は、Ａ又はＧであり；Ｘ５は、Ａ、Ｖ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｙ又はＫである。この実施形態の他の態様において、ＰＡＲ４切断部位は、例えば、配列番号４６１、配列番号４６２、配列番号４６３、配列番号４６４、配列番号４６５、配列番号４６６、配列番号４６７、配列番号４６８、配列番号４６９、配列番号４７０、配列番号４７１、配列番号４７２、配列番号４７３、配列番号４７４、配列番号４７５、配列番号４７６、配列番号４７７又は配列番号４７８を含む。
【０２９８】
不活性化切断部位の位置は、いくつかの規準により支配される重要な側面である。第一に、不活性化切断部位の配置は、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラがその標的細胞を中毒化する能力に、実質的に影響を及ぼすべきではない。本明細書中で使用される場合、「実質的に影響を及ぼさない」という用語は、中毒に関して、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラが標的細胞に侵入し、標的基質をタンパク質分解により切断する全体的な中毒機構を、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラが依然として遂行できることを指し、低又は高親和性受容体複合体へのクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの結合、毒素／受容体複合体の内部移行、細胞質への軽鎖の転移及び標的基質の酵素性修飾を包含する。
【０２９９】
この実施形態の態様において、不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、同じ又は類似するが不活性化切断部位修飾がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと同程度まで標的細胞を中毒化することができる。この実施形態の他の態様において、不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、例えば、同じ又は類似するが不活性化切断部位修飾がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％程度、標的細胞を中毒化することができる。この実施形態の他の態様において、例えば、不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、同じ又は類似するが不活性化切断部位修飾がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの最大で５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％程度、標的細胞を中毒化することができる。
【０３００】
第二に、不活性化切断部位の配置は、毒素又はクロストリジウム毒素キメラの表面露出領域にあるべきであり、タンパク質内で内部に埋め込まれていたり二次構造エレメントにより隠蔽されるべきではない。不活性化切断部位の正しい表面露出によって、この部位がその対応するプロテアーゼに適正に接近し易くなり、それによってタンパク質分解性切断が可能になる。その対応するプロテアーゼによる不活性化切断部位のタンパク質分解性切断によって、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラが細胞を中毒化する能力が実質的に不活性化される。本明細書中で使用される場合、「実質的に不活性化する」という用語は、中毒に関して、不活性化切断部位での切断後、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラが標的細胞に侵入し、標的基質をタンパク質分解により切断する全体的な中毒機構を遂行する、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの能力が低下していることを指し、低又は高親和性受容体複合体へのクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの結合、毒素／受容体複合体の内部移行、細胞質への軽鎖の転移及び標的基質の酵素性修飾を包含する。
【０３０１】
この実施形態のある態様において、不活性化切断部位での本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラのタンパク質分解性切断の結果、同じ又は類似するが、タンパク質分解による切断が起こっていない状態（即ち中毒切断部位が無傷であるか又は未切断である。）のクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと比較した場合、毒素の標的細胞中毒化能が完全に不能になる。この実施形態の他の態様において、不活性化切断部位での本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラのタンパク質分解性切断の結果、同じ又は類似するが、タンパク質分解による切断が起こっていない状態のクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと比較した場合、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％、標的細胞に対する中毒化能が低下する。この実施形態の他の態様において、不活性化切断部位での本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラのタンパク質分解性切断の結果、同じ又は類似するが、タンパク質分解による切断が起こっていない状態のクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと比較した場合、例えば、最大で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％、標的細胞に対する中毒化能が低下する。
【０３０２】
本明細の態様において、不活性化切断部位は不活性化切断部位領域内に位置する。本明細書中で使用される場合、「不活性化切断部位領域」という用語は、不活性化切断部位を含有するように改変され得るクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラのアミノ酸配列を指すが、これは、このような改変がタンパク質の標的細胞中毒化能を実質的に撹乱しないであろうからであり、その同系プロテアーゼへの曝露時に、不活性化切断部位が切断され、実質的にクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラが不活性化されるであろう。不活性化切断部位の位置は不活性化切断部位領域内の何れの位置でもあり得るが、ただし、このような位置は、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの標的細胞中毒化能に実質的に影響を与えず、その同系プロテアーゼへの曝露時に、不活性化切断部位の切断によって、実質的にクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラが不活性化されるものとする。表５は、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラとの使用に適切な例示的な不活性化切断部位領域を列挙する。
【０３０３】
従って、実施形態において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含む。この実施形態の態様において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、転移ドメイン又はＨＣＮサブドメインからの不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含む。
【０３０４】
この実施形態の他の態様において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、不活性化切断部位を含み、これは、配列番号１、配列番号２、配列番号４又は配列番号５のアミノ酸４６２〜４９６；配列番号３のアミノ酸４５８〜４９２；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸４６４〜４８７；配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸４６３〜４９６；配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸４５８〜４９１；配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７のアミノ酸４３４〜４６７；配列番号１８、配列番号１９又は配列番号２０のアミノ酸４５３〜４８６；配列番号２１のアミノ酸４５８〜４９１；配列番号２２のアミノ酸４７５〜５０８配列番号２３のアミノ酸４４３〜４７６；又は配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸４３４〜４６７を含む不活性化切断部位領域内に位置する。
【０３０５】
この実施形態のさらに他の態様において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、不活性化切断部位を含み、これは、配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５のアミノ酸６１８〜６３４；配列番号３のアミノ酸６１４〜６３０；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸６０５〜６２１；配列番号１１もしくは配列番号１２のアミノ酸６１３〜６２９；配列番号１３もしくは配列番号１４のアミノ酸６０９〜６２５；配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７のアミノ酸５８７〜６０３；配列番号１８のアミノ酸６０４〜６２０；配列番号１９もしくは配列番号２０のアミノ酸６０５〜６２１；配列番号２１のアミノ酸６１０〜６２６；配列番号２２のアミノ酸６２７〜６４３；配列番号２３のアミノ酸５９６〜６１２；又は配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸５８７〜６０３を含む不活性化切断部位領域内に位置する。
【表５】
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【０３０６】
この実施形態のさらなる他の態様において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、不活性化切断部位を含み、これは、配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５のアミノ酸６３８〜６５１；配列番号３のアミノ酸６３４〜６４７；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸６２５〜６３８；配列番号１１もしくは配列番号１２のアミノ酸６３３〜６４６；配列番号１３もしくは配列番号１４のアミノ酸６２９〜６４２；配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７のアミノ酸６０７〜６２０；配列番号１８のアミノ酸６２４〜６３７；配列番号１９もしくは配列番号２０のアミノ酸６２５〜６３８；配列番号２１のアミノ酸６３０〜６４３；配列番号２２のアミノ酸６４７〜６６０；配列番号２３のアミノ酸６１６〜６２９；又は配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸６０７〜６２０を含む不活性化切断部位領域内に位置する。
【０３０７】
この実施形態のさらなる態様において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、不活性化切断部位を含み、これは、配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５のアミノ酸６６５〜６８７；配列番号３のアミノ酸６６１〜６８３；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸６５２〜６７４；配列番号１１もしくは配列番号１２のアミノ酸６６０〜６８２；配列番号１３もしくは配列番号１４のアミノ酸６５６〜６７８；配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７のアミノ酸６３４〜６５９；配列番号１８のアミノ酸６５１〜６７６；配列番号１９もしくは配列番号２０のアミノ酸６５２〜６７７；配列番号２１のアミノ酸６５７〜６７９；配列番号２２のアミノ酸６７４〜６９６；配列番号２３のアミノ酸６４３〜６６８；又は配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸６３４〜６５９を含む不活性化切断部位領域内に位置する。
【０３０８】
この実施形態の他の態様において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、不活性化切断部位を含み、これは、配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５のアミノ酸７５２〜７６５；配列番号３のアミノ酸７４８〜７６１；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸７３９〜７５２；配列番号１１もしくは配列番号１２のアミノ酸７４７〜７６０；配列番号１３もしくは配列番号１４のアミノ酸７４３〜７５６；配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７のアミノ酸７２４〜７３９；配列番号１８のアミノ酸７４１〜７５６；配列番号１９もしくは配列番号２０のアミノ酸７４２〜７５７；配列番号２１のアミノ酸７４４〜７５７；配列番号２２のアミノ酸７６１〜７７４；配列番号２３のアミノ酸７３３〜７４８；又は配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸７２４〜７３９を含む不活性化切断部位領域内に位置する。
【０３０９】
この実施形態のさらに他の態様において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、不活性化切断部位を含み、これは、配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５のアミノ酸８２６〜８３５；配列番号３のアミノ酸８２４〜８３１；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸８１３〜８２４；配列番号１１もしくは配列番号１２のアミノ酸８２１〜８３０；配列番号１３もしくは配列番号１４のアミノ酸８１７〜８２６；配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７のアミノ酸８００〜８０９；配列番号１８のアミノ酸８１７〜８２６；配列番号１９もしくは配列番号２０のアミノ酸８１８〜８２７；配列番号２１のアミノ酸８１８〜８２７；配列番号２２のアミノ酸８３５〜８４４；配列番号２３のアミノ酸８０９〜８１９；又は配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸８００〜８０９を含む不活性化切断部位領域内に位置する。
【０３１０】
この実施形態のさらなる他の態様において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、不活性化切断部位を含み、これは、配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５のアミノ酸８４４〜８６３；配列番号３のアミノ酸８４０〜８５９；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸８３１〜８５０；配列番号１１もしくは配列番号１２のアミノ酸８３９〜８５８；配列番号１３もしくは配列番号１４のアミノ酸８３５〜８５４；配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７のアミノ酸８１８〜８３７；配列番号１８のアミノ酸８３５〜８５４；配列番号１９もしくは配列番号２０のアミノ酸８３６〜８５５；配列番号２１のアミノ酸８３６〜８５５；配列番号２２のアミノ酸８５４〜８７１；配列番号２３のアミノ酸８２８〜８４７；又は配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸８１８〜８３７を含む不活性化切断部位領域内に位置する。
【０３１１】
この実施形態のさらなる態様において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、不活性化切断部位を含み、これは、配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５のアミノ酸８７１〜８９５；配列番号３のアミノ酸８６７〜８９１；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸８５８〜８８２；配列番号１１もしくは配列番号１２のアミノ酸８６６〜８９０；配列番号１３もしくは配列番号１４のアミノ酸８６２〜８８６；配列番号１５、配列番号１６もしくは配列番号１７のアミノ酸８４５〜８６９；配列番号１８のアミノ酸８６２〜８８６；配列番号１９もしくは配列番号２０のアミノ酸８６３〜８８７；配列番号２１のアミノ酸８６３〜８８７；配列番号２２のアミノ酸８７９〜９０３；配列番号２３のアミノ酸８５５〜８７９；又は配列番号２４もしくは配列番号２５のアミノ酸８４５〜８６９を含む不活性化切断部位領域内に位置する。
【０３１２】
この実施形態の別の態様において、本明細で開示されるＢｏＮＴ／Ａ又はＢｏＮＴ／Ａキメラは、不活性化切断部位を含み、これは、転移ドメイン又はＨＣＮサブドメインからの不活性化切断部位領域内に位置する。この実施形態の他の態様において、本明細で開示されるＢｏＮＴ／Ａ又はＢｏＮＴ／Ａキメラは、不活性化切断部位を含み、これは、配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５のアミノ酸４６２〜４９６、６１８〜６３４、６３８〜６５１、６６５〜６８７、７５２〜７６５、８２６〜８３５、８４４〜８６３もしくは８７１〜８９５を含むか；又は配列番号３のアミノ酸４５８〜４９２、６１４〜６３０、６３４〜６４７、６６５〜６８７、７４８〜７６１、８２２〜８３１、８４０〜８５９又は８６７〜８９１を含む不活性化切断部位領域内に位置する。この実施形態のさらに他の態様において、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むＢｏＮＴ／Ａは、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４又は配列番号５３６によりコードされる。この実施形態のまた他の態様において、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むＢｏＮＴ／Ａは、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５又は配列番号５３７を含む。
【０３１３】
この実施形態のまた別の態様において、本明細で開示されるＢｏＮＴ／Ｂ又はＢｏＮＴ／Ｂキメラは、不活性化切断部位を含み、これは、転移ドメイン又はＨＣＮサブドメインからの不活性化切断部位領域内に位置する。この実施形態の他の態様において、本明細で開示されるＢｏＮＴ／Ｂ又はＢｏＮＴ／Ｂキメラは、不活性化切断部位を含み、これは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０のアミノ酸４６４〜４８７、６０５〜６２１、６２５〜６３８、６５２〜６７４、７３９〜７５２、８１３〜８２４、８３１〜８５０又は８５８〜８８２を含む不活性化切断部位領域内に位置する。
【０３１４】
この実施形態のさらに別の態様において、本明細で開示されるＢｏＮＴ／Ｃ１又はＢｏＮＴ／Ｃ１キメラは、不活性化切断部位を含み、これは、転移ドメイン又はＨＣＮサブドメインからの不活性化切断部位領域内に位置する。この実施形態の他の態様において、本明細で開示されるＢｏＮＴ／Ｃ１又はＢｏＮＴ／Ｃ１キメラは、不活性化切断部位を含み、これは、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸４６３〜４９６、６１３〜６２９、６３３〜６４６、６６０〜６８２、７４７〜７６０、８２１〜８３０、８３９〜８５８又は８６６〜８９０を含む不活性化切断部位領域内に位置する。
【０３１５】
この実施形態のさらなる態様において、本明細で開示されるＢｏＮＴ／Ｄ又はＢｏＮＴ／Ｄキメラは、不活性化切断部位を含み、これは、転移ドメイン又はＨＣＮサブドメインからの不活性化切断部位領域内に位置する。この実施形態の他の態様において、本明細で開示されるＢｏＮＴ／Ｄ又はＢｏＮＴ／Ｄキメラは、不活性化切断部位を含み、これは、配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸４５８〜４９１、６０９〜６２５、６２９〜６４２、６５６〜６７８、７４３〜７５６、８１７〜８２６、８３５〜８５４又は８６２〜８８６を含む不活性化切断部位領域内に位置する。
【０３１６】
この実施形態の別の態様において、本明細で開示されるＢｏＮＴ／Ｅ又はＢｏＮＴ／Ｅキメラは、不活性化切断部位を含み、これは、転移ドメイン又はＨＣＮサブドメインからの不活性化切断部位領域内に位置する。この実施形態の他の態様において、本明細で開示されるＢｏＮＴ／Ｅ又はＢｏＮＴ／Ｅキメラは、不活性化切断部位を含み、これは、配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７のアミノ酸４３４〜４６７、５８７〜６０３、６０７〜６２０、６３４〜６５９、７２４〜７３９、８００〜８０９、８１８〜８３７又は８４５〜８６９を含む不活性化切断部位領域内に位置する。
【０３１７】
この実施形態のさらに別の態様において、本明細で開示されるＢｏＮＴ／Ｆ又はＢｏＮＴ／Ｆキメラは、不活性化切断部位を含み、これは、転移ドメイン又はＨＣＮサブドメインからの不活性化切断部位領域内に位置する。この実施形態の他の態様において、本明細で開示されるＢｏＮＴ／Ｆ又はＢｏＮＴ／Ｆキメラは、不活性化切断部位を含み、これは、配列番号１８のアミノ酸４５３〜４８６、６０４〜６２０、６２４〜６３７、６５１〜６７６、７４１〜７５６、８１７〜８２６、８３５〜８５４もしくは８６２〜８８６を含むか；又は配列番号１９もしくは配列番号２０のアミノ酸４５３〜４８６、６０５〜６２１、６２５〜６３８、６５２〜６７７、７４２〜７５７、８１８〜８２７、８３６〜８５５もしくは８６３〜８８７を含む不活性化切断部位領域内に位置する。
【０３１８】
この実施形態のさらなる態様において、本明細で開示されるＢｏＮＴ／Ｇ又はＢｏＮＴ／Ｇキメラは、不活性化切断部位を含み、これは、転移ドメイン又はＨＣＮサブドメインからの不活性化切断部位領域内に位置する。この実施形態の他の態様において、本明細で開示されるＢｏＮＴ／Ｇ又はＢｏＮＴ／Ｇキメラは、不活性化切断部位を含み、これは、配列番号２１のアミノ酸４５８〜４９１、６１０〜６２６、６３０〜６４３、６５７〜６７９、７４４〜７５７、８１８〜８２７、８３６〜８５５又は８６３〜８８７を含む不活性化切断部位領域内に位置する。
【０３１９】
この実施形態の別の態様において、本明細で開示されるＴｅＮＴ又はＴｅＮＴキメラは、不活性化切断部位を含み、これは、転移ドメイン又はＨＣＮサブドメインからの不活性化切断部位領域内に位置する。この実施形態の他の態様において、本明細で開示されるＴｅＮＴ又はＴｅＮＴキメラは、不活性化切断部位を含み、これは、配列番号２２のアミノ酸４７５〜５０８、６２７〜６４３、６４７〜６６０、６７４〜６９６、７６１〜７７４、８３５〜８４４、８５４〜８７１又は８７９〜９０３を含む不活性化切断部位領域内に位置する。
【０３２０】
この実施形態のまた別の態様において、本明細で開示されるＢａＮＴ又はＢａＮＴキメラは、不活性化切断部位を含み、これは、転移ドメイン又はＨＣＮサブドメインからの不活性化切断部位領域内に位置する。この実施形態の他の態様において、本明細で開示されるＢａＮＴ又はＢａＮＴキメラは、不活性化切断部位を含み、これは、配列番号２３のアミノ酸４４３〜４７６、５９６〜６１２、６１６〜６２９、６４３〜６６８、７３３〜７４８、８０９〜８１９、８２８〜８４７又は８５５〜８７９を含む不活性化切断部位領域内に位置する。
【０３２１】
この実施形態のさらに別の態様において、本明細で開示されるＢｕＮＴ又はＢｕＮＴキメラは、不活性化切断部位を含み、これは、転移ドメイン又はＨＣＮサブドメインからの不活性化切断部位領域内に位置する。この実施形態の他の態様において、本明細で開示されるＢｕＮＴ又はＢｕＮＴキメラは、不活性化切断部位を含み、これは、配列番号２４又は配列番号２５のアミノ酸４３４〜４６７、５８７〜６０３、６０７〜６２０、６３４〜６５９、７２４〜７３９、８００〜８０９、８１８〜８３７又は８４５〜８６９を含む不活性化切断部位領域内に位置する。
【０３２２】
本明細の態様において、不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域は、同じ又は類似するが不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラに対する安全域よりも広い。言い換えると、不活性化切断部位の付加によって、同じ又は類似するがさらなる不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域が広くなる。
【０３２３】
従って、実施形態において、不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域は、同じ又は類似するが不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと比較して広い。この実施形態の態様において、不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域は、同じ又は類似するが不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％又は少なくとも３００％よりも大きい。この実施形態の他の態様において、不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域は、同じ又は類似するが不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、例えば、最大で１０％、最大で２０％、最大で３０％、最大で４０％、最大で５０％、最大で６０％、最大で７０％、最大で８０％、最大で９０％、最大で１００％、１１０％、最大で１２０％、最大で１３０％、最大で１４０％、最大で１５０％、最大で１６０％、最大で１７０％、最大で１８０％、最大で１９０％、最大で２００％、２１０％、最大で２２０％、最大で２３０％、最大で２４０％、最大で２５０％、最大で２６０％、最大で２７０％、最大で２８０％、最大で２９０％又は最大で３００％よりも大きい。この実施形態のさらに他の態様において、不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域は、同じ又は類似するが不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、例えば、約１０％から約３００％、約２０％から約３００％、約３０％から約３００％、約４０％から約３００％、約５０％から約３００％、約６０％から約３００％、約７０％から約３００％、約８０％から約３００％、約９０％から約３００％又は約１００％から約３００％、大きい。
【０３２４】
他の態様実施形態において、不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域は、同じ又は類似するが不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、例えば、少なくとも１倍、少なくとも１倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍又は少なくとも１０倍より大きい。さらに他の態様実施形態において、不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域は、同じ又は類似するが不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、例えば、少なくとも１倍、最大で１倍、最大で３倍、最大で４倍、最大で５倍、最大で６倍、最大で７倍、最大で８倍、最大で９倍又は最大で１０倍より大きい。この実施形態のさらなる他の態様において、不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域は、例えば、約１倍から約１０倍、約１倍から約９倍、約１倍から約８倍、約１倍から約７倍、約１倍から約６倍、約１倍から約５倍、約２倍から約１０倍、約２倍から約９倍、約２倍から約８倍、約２倍から約７倍、約２倍から約６倍又は約２倍から約５倍大きい。
【０３２５】
別の実施形態において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、同じ又は類似するがさらなる不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと比較してクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域を向上させる不活性化切断部位の付加を含む。この実施形態の態様において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、同じ又は類似するがさらなる不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％又は少なくとも３００％、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域を向上させる、不活性化切断部位の付加を含む。この実施形態の他の態様において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、同じ又は類似するがさらなる不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、例えば、最大で１０％、最大で２０％、最大で３０％、最大で４０％、最大で５０％、最大で６０％、最大で７０％、最大で８０％、最大で９０％、最大で１００％、１１０％、最大で１２０％、最大で１３０％、最大で１４０％、最大で１５０％、最大で１６０％、最大で１７０％、最大で１８０％、最大で１９０％、最大で２００％、２１０％、最大で２２０％、最大で２３０％、最大で２４０％、最大で２５０％、最大で２６０％、最大で２７０％、最大で２８０％、最大で２９０％又は最大で３００％クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域を向上させる、不活性化切断部位の付加を含む。この実施形態のさらに他の態様において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、同じ又は類似するがさらなる不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、例えば、約１０％から約３００％、約２０％から約３００％、約３０％から約３００％、約４０％から約３００％、約５０％から約３００％、約６０％から約３００％、約７０％から約３００％、約８０％から約３００％、約９０％から約３００％又は約１００％から約３００％、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域を向上させる、不活性化切断部位の付加を含む。
【０３２６】
この実施形態の他の態様において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、同じ又は類似するがさらなる不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、例えば、少なくとも１倍、少なくとも１倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍又は少なくとも１０倍、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域を向上させる、不活性化切断部位の付加を含む。この実施形態のさらに他の態様において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、同じ又は類似するがさらなる不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、例えば、最大で１倍、最大で３倍、最大で４倍、最大で５倍、最大で６倍、最大で７倍、最大で８倍、最大で９倍又は最大で１０倍、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域を向上させる、不活性化切断部位の付加を含む。この実施形態のさらなる他の態様において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、同じ又は類似するがさらなる不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、例えば、約１倍から約１０倍、約１倍から約９倍、約１倍から約８倍、約１倍から約７倍、約１倍から約６倍、約１倍から約５倍、約２倍から約１０倍、約２倍から約９倍、約２倍から約８倍、約２倍から約７倍、約２倍から約６倍又は約２倍から約５倍、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域を向上させる、不活性化切断部位の付加を含む。
【０３２７】
別の実施形態において、不活性化切断部位領域は、１つの不活性化切断部位を含むように改変することができる。また別の実施形態において、不活性化切断部位領域は、複数の不活性化切断部位を含むように改変することができる。この実施形態の態様において、不活性化切断部位切断部位領域は、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の不活性化切断部位を含み得る。この実施形態の他の態様において、不活性化切断部位切断部位領域は、例えば、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の不活性化切断部位を含み得る。この実施形態のさらに他の態様において、不活性化切断部位切断部位領域は、例えば、２から１０個の不活性化切断部位、２から８個の不活性化切断部位、２から６個の不活性化切断部位、２から４個の不活性化切断部位、２から３個の不活性化切断部位、３から９個の不活性化切断部位、３から７個の不活性化切断部位、３から５個の不活性化切断部位又は３から４個の不活性化切断部位を含み得る。
【０３２８】
別の実施形態において、不活性化切断部位領域は、ただ１つのタイプの不活性化切断部位、例えば、トロンビン切断部位などを含むように改変することができる。さらに別の実施形態において、不活性化切断部位領域は、複数の異なるタイプの不活性化切断部位、例えば、トロンビン切断部位、第Ｘａ因子切断部位、ＭＭＰ−２切断部位及びＭＭＰ−９切断部位などを含むように改変することができる。この実施形態の態様において、不活性化切断部位領域は、例えば、少なくとも２、３、４又は５の異なるタイプの不活性化切断部位を含み得る。この実施形態の他の態様において、不活性化切断部位領域は、例えば、最大で２、３、４又は５の異なるタイプの不活性化切断部位を含み得る。この実施形態の他の態様において、不活性化切断部位領域は、例えば、２から５の異なるタイプの不活性化切断部位、２から４の異なるタイプの不活性化切断部位、２から３の異なるタイプの不活性化切断部位、３から５の異なるタイプの不活性化切断部位又は３から４の異なるタイプの不活性化切断部位を含み得る。
【０３２９】
不活性化切断部位を含むようにするための不活性化切断部位領域の改変は、不活性化切断部位領域内のアミノ酸のうち少なくとも１つを変更することによって行われ得る。アミノ酸の変更の非限定例としては、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加又は異なるアミノ酸での元のアミノ酸の置換が挙げられる。この実施形態の態様において、不活性化切断部位領域は、不活性化切断部位領域内の、例えば、少なくとも１、２、３、４又は５個のアミノ酸を変更することによって、不活性化切断部位を含むように改変される。この実施形態の他の態様において、不活性化切断部位領域は、例えば、不活性化切断部位領域内の最大で１、２、３、４又は５個のアミノ酸を変更することによって不活性化切断部位を含むように改変される。この実施形態のさらなる態様において、不活性化切断部位領域は、例えば、不活性化切断部位領域内の１から５個のアミノ酸、不活性化切断部位領域内の１から４個のアミノ酸、不活性化切断部位領域内の１から３個のアミノ酸、不活性化切断部位領域内の１から２個のアミノ酸、不活性化切断部位領域内の２から５個のアミノ酸、不活性化切断部位領域内の２から４個のアミノ酸、不活性化切断部位領域内の２から３個のアミノ酸、不活性化切断部位領域内の３から５個のアミノ酸又は不活性化切断部位領域内の４から５個のアミノ酸を変更することによって不活性化切断部位を含むように改変される。
【０３３０】
この実施形態の態様において、不活性化切断部位領域は、例えば、不活性化切断部位領域内の、少なくとも１、２、３、４又は５個のアミノ酸を、欠失させるか、付加するか、置換するか又はそれらの何らかの組み合わせを行うことによって、不活性化切断部位を含むように改変される。この実施形態の他の態様において、不活性化切断部位領域は、例えば、不活性化切断部位領域内の、最大で１、２、３、４又は５個のアミノ酸を、欠失させるか、付加するか、置換するか又はそれらの何らかの組み合わせを行うことによって、不活性化切断部位を含むように改変される。この実施形態のさらなる態様において、不活性化切断部位領域は、例えば、不活性化切断部位領域内の１から５個のアミノ酸、不活性化切断部位領域内の１から４個のアミノ酸、不活性化切断部位領域内の１から３個のアミノ酸、不活性化切断部位領域内の１から２個のアミノ酸、不活性化切断部位領域内の２から５個のアミノ酸、不活性化切断部位領域内の２から４個のアミノ酸、不活性化切断部位領域内の２から３個のアミノ酸、不活性化切断部位領域内の３から５個のアミノ酸又は不活性化切断部位領域内の４から５個のアミノ酸を、欠失させるか、付加するか、置換するか又はそれらの何らかの組み合わせを行うことによって、不活性化切断部位を含むように改変される。
【０３３１】
当業者にとって公知の標準的な突然変異誘発手順を用いて、不活性化切断部位を含むようにするための不活性化切断部位領域の改変を達成することができる。突然変異誘発法、ならびに特徴がよく分かっている試薬、条件及びプロトコールの非限定例は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡを含むが、これらに限定されない民間業者から容易に入手可能である。これらのプロトコールは、当業者の範囲内の及び本明細書中での教示からの通例の手順である。
【０３３２】
上述のように、本明細で開示されるクロストリジウム毒素及びクロストリジウム毒素キメラは１本鎖ポリペプチドとして翻訳され、続いてジスルフィドループ領域内でタンパク質分解性切断により切断される。この翻訳後プロセシングによって、１個のジスルフィド結合及び非共有相互作用によって一緒に保持される２本鎖分子が得られる。ジスルフィドループ領域内のタンパク質分解性切断は、２本鎖ループ領域内に天然に存在する内在性プロテアーゼ切断部位を使用することによって又は外因性プロテアーゼ切断部位を含むようにこの２本鎖ループ領域を改変することによって、達成され得る。
【０３３３】
本明細の態様は、ある一部分において、２本鎖ループ領域を開示する。本明細書中で使用される場合、「２本鎖ループ領域」という用語は、システインアミノ酸が隣接し、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの１本鎖形態をその２本鎖形態に変換するために使用されるプロテアーゼ切断部位を含有するクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラのアミノ酸配列を指す（表６）。２本鎖ループ領域の非限定例としては、配列番号１のアミノ酸４３０〜４５４を含むＢｏＮＴ／Ａの２本鎖ループ領域；配列番号２のアミノ酸４３７〜４４６を含むＢｏＮＴ／Ｂの２本鎖ループ領域；配列番号３のアミノ酸４３７〜４５３を含むＢｏＮＴ／Ｃ１の２本鎖ループ領域；配列番号４のアミノ酸４３７〜４５０を含むＢｏＮＴ／Ｄの２本鎖ループ領域；配列番号５のアミノ酸４１２〜４２６を含むＢｏＮＴ／Ｅの２本鎖ループ領域；配列番号６のアミノ酸４２９〜４４５を含むＢｏＮＴ／Ｆの２本鎖ループ領域；配列番号７のアミノ酸４３６〜４５０を含むＢｏＮＴ／Ｇの２本鎖ループ領域；及び配列番号８のアミノ酸４３９〜４６７を含むＴｅＮＴの２本鎖ループ領域が挙げられる（表６）。
【表６】
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【０３３４】
従って、実施形態において、２本鎖ループ領域は、クロストリジウム毒素２本鎖ループ領域を含む。この実施形態の態様において、２本鎖ループ領域は、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ  ２本鎖ループ領域、ＢｏＮＴ／Ｂ  ２本鎖ループ領域、ＢｏＮＴ／Ｃ１  ２本鎖ループ領域、ＢｏＮＴ／Ｄ  ２本鎖ループ領域、ＢｏＮＴ／Ｅ  ２本鎖ループ領域、ＢｏＮＴ／Ｆ  ２本鎖ループ領域、ＢｏＮＴ／Ｇ  ２本鎖ループ領域、ＴｅＮＴ  ２本鎖ループ領域、ＢａＮＴ  ２本鎖ループ領域又はＢｕＮＴ  ２本鎖ループ領域を含む。この実施形態の他の態様において、２本鎖ループ領域は、例えば、配列番号１のアミノ酸４３０〜４５４を含むＢｏＮＴ／Ａ  ２本鎖ループ領域；配列番号２のアミノ酸４３７〜４４６を含むＢｏＮＴ／Ｂ  ２本鎖ループ領域；配列番号３のアミノ酸４３７〜４５３を含むＢｏＮＴ／Ｃ１  ２本鎖ループ領域；配列番号４のアミノ酸４３７〜４５０を含むＢｏＮＴ／Ｄ  ２本鎖ループ領域；配列番号５のアミノ酸４１２〜４２６を含むＢｏＮＴ／Ｅ  ２本鎖ループ領域；配列番号６のアミノ酸４２９〜４４５を含むＢｏＮＴ／Ｆ  ２本鎖ループ領域；配列番号７のアミノ酸４３６〜４５０を含むＢｏＮＴ／Ｇ  ２本鎖ループ領域；又は配列番号８のアミノ酸４３９〜４６７を含むＴｅＮＴ  ２本鎖ループ領域を含む。配列番号９のアミノ酸４２１〜４３５を含むＢａＮＴ  ２本鎖ループ領域；又は配列番号１０のアミノ酸４１２〜４２６を含むＢｕＮＴ  ２本鎖ループ領域を含む
【０３３５】
本明細の態様は、ある一部分において、内在性２本鎖ループプロテアーゼ切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「内在性２本鎖ループプロテアーゼ切断部位」という用語は、「天然起源の２本鎖ループプロテアーゼ切断部位」と同義であり、天然起源のクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの２本鎖ループ領域内で見出される天然起源のプロテアーゼ切断部位を指し、天然起源のクロストリジウム毒素２本鎖ループプロテアーゼ切断部位変異体、例えば、クロストリジウム毒素２本鎖ループプロテアーゼ切断部位アイソフォーム及びクロストリジウム毒素２本鎖ループプロテアーゼ切断部位サブタイプなどが挙げられるがこれらに限定されない。内在性プロテアーゼ切断部位の非限定例としては、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ  ２本鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｂ  ２本鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｃ１  ２本鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｄ  ２本鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｅ  ２本鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｆ  ２本鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｇ  ２本鎖ループプロテアーゼ切断部位及びＴｅＮＴ２本鎖ループプロテアーゼ切断部位が挙げられる。
【０３３６】
プロテアーゼの正体が現在のところ未知であるが、多くのクロストリジウム毒素に対する２本鎖ループプロテアーゼ切断部位が決定されている。ＢｏＮＴにおいて、Ｋ４４８−Ａ４４９での切断によってＢｏＮＴ／Ａの１本鎖ポリペプチド形態が２本鎖形態に変換され；Ｋ４４１−Ａ４４２での切断によって、ＢｏＮＴ／Ｂの１本鎖ポリペプチド形態が２本鎖形態に変換され；Ｋ４４９−Ｔ４５０での切断によって、ＢｏＮＴ／Ｃ１の１本鎖ポリペプチド形態が２本鎖形態に変換され；Ｒ４４５−Ｄ４４６での切断によって、ＢｏＮＴ／Ｄの１本鎖ポリペプチド形態が２本鎖形態に変換され；Ｒ４２２−Ｋ４２３での切断によって、ＢｏＮＴ／Ｅの１本鎖ポリペプチド形態が２本鎖形態に変換され；Ｋ４３９−Ａ４４０での切断によって、ＢｏＮＴ／Ｆの１本鎖ポリペプチド形態が２本鎖形態に変換され；Ｋ４４６−Ｓ４４７での切断によって、ＢｏＮＴ／Ｇの１本鎖ポリペプチド形態が２本鎖形態に変換される。Ａ４５７−Ｓ４５８におけるＴｅＮＴの１本鎖ポリペプチド形態のタンパク質分解性切断の結果、２本鎖形態が得られる。Ｋ４３１−Ｎ４３２でのＢａＮＴの１本鎖ポリペプチド形態のタンパク質分解性切断の結果、２本鎖形態が得られる。Ｒ４２２−Ｋ４２３でのＢｕＮＴの１本鎖ポリペプチド形態のタンパク質分解性切断の結果、２本鎖形態が得られる。このような２本鎖ループプロテアーゼ切断部位は、融合タンパク質として、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラに対して操作可能に連結される。しかし２本鎖ループ内のさらなる切断部位も切断され、その結果、小さなペプチド断片が生成し、失われると思われることにも留意されたい。非限定例として、ＢｏＮＴ／Ａ  １本鎖ポリペプチド切断の結果、最終的に２本鎖ループ内の１０個のアミノ酸断片が失われる。
【０３３７】
従って、実施形態において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、内在性２本鎖ループプロテアーゼ切断部位を含む２本鎖ループ領域を含む。この実施形態の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する内在性２本鎖ループプロテアーゼ切断部位は、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ  ２本鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｂ  ２本鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｃ１  ２本鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｄ  ２本鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｅ  ２本鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｆ  ２本鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｇ  ２本鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＴｅＮＴ  ２本鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＢａＮＴ  ２本鎖ループプロテアーゼ切断部位又はＢｕＮＴ  ２本鎖ループプロテアーゼ切断部位を含む。この実施形態の他の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する内在性２本鎖ループプロテアーゼ切断部位は、例えば、配列番号１のアミノ酸４３０〜４５４を含むＢｏＮＴ／Ａの２本鎖ループ領域；配列番号２のアミノ酸４３７〜４４６を含むＢｏＮＴ／Ｂの２本鎖ループ領域；配列番号３のアミノ酸４３７〜４５３を含むＢｏＮＴ／Ｃ１の２本鎖ループ領域；配列番号４のアミノ酸４３７〜４５０を含むＢｏＮＴ／Ｄの２本鎖ループ領域；配列番号５のアミノ酸４１２〜４２６を含むＢｏＮＴ／Ｅの２本鎖ループ領域；配列番号６のアミノ酸４２９〜４４５を含むＢｏＮＴ／Ｆの２本鎖ループ領域；配列番号７のアミノ酸４３６〜４５０を含むＢｏＮＴ／Ｇの２本鎖ループ領域；又は配列番号８のアミノ酸４３９〜４６７を含むＴｅＮＴの２本鎖ループ領域、配列番号９のアミノ酸４２１〜４３５を含むＢａＮＴの２本鎖ループ領域；又は配列番号１０のアミノ酸４１２〜４２６を含むＢｕＮＴの２本鎖ループ領域を含む。
【０３３８】
本明細の態様は、ある一部分において、外因性プロテアーゼ切断部位を開示する。本明細書中で使用される場合、「外因性プロテアーゼ切断部位」という用語は、「改変プロテアーゼ切断部位」、「非天然のプロテアーゼ切断部位」又は「非自然のプロテアーゼ切断部位」と同義であり、天然起源のクロストリジウム毒素からの２本鎖ループ領域に通常は存在しないプロテアーゼ切断部位を指す。２本鎖ループ領域内のこのような改変又は外因性プロテアーゼ切断部位を使用して、本明細で開示されるクロストリジウム毒素キメラのクロストリジウム毒素の１本鎖ポリペプチド形態をその２本鎖形態に変換する。クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの１本鎖ポリペプチド形態を、本明細の態様を実施するために有用である活性のあるその２本鎖形態へと変換するために、ありとあらゆる外因性プロテアーゼ切断部位を使用することができることが想定される。外因性プロテアーゼ切断部位の非限定例としては、例えば、植物パパイン切断部位、昆虫パパイン切断部位、甲殻類（ｃｒｕｓｔａｃｉａｎ）パパイン切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、タバコ葉脈斑点ウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｖｅｉｎ  Ｍｏｔｔｌｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓ）（ＴＶＭＶ）切断部位、スブチリシン切断部位、ヒドロキシルアミン切断部位又はカスパーゼ３切断部位が挙げられる。２本鎖ループ内に位置する改変プロテアーゼ切断部位は、例えば、Ｄｏｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，米国特許第７，４１９，６７６号，Ｄｏｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，米国特許第７，４２２，８７７号，Ｓｔｅｗａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，米国特許出願公開第２００９／００６９２３８号，Ｓｔｅｗａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，米国特許出願公開第２００８／００３２９３０号，Ｓｔｅｗａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，米国特許出願公開第２００９／００１８０８１号，Ｓｔｅｗａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，米国特許出願公開第２００９／０００５３１３号，Ｓｔｅｗａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，米国特許出願公開第２００９／０００４２２４号に記載されている（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書によって組み込まれる。）。
【０３３９】
ありとあらゆる長さの外因性プロテアーゼ切断部位が本明細の態様において有用であり得ることが想定されるが、ただし、外因性プロテアーゼ切断部位はその個々のプロテアーゼによって切断され得るものとする。従って、この実施形態の態様において、外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０もしくは少なくとも６０アミノ酸長；又は最大で６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０もしくは少なくとも６０アミノ酸長を有し得る。
【０３４０】
実施形態において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、外因性プロテアーゼ切断部位を含む２本鎖ループ領域を含む。この実施形態の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、植物パパイン切断部位、昆虫パパイン切断部位、甲殻類（ｃｒｕｓｔａｃｉａｎ）パパイン切断部位、非ヒトエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位、タバコ葉脈斑点ウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｖｅｉｎ  Ｍｏｔｔｌｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼ切断部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、ヒトエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、スブチリシン切断部位、ヒドロキシルアミン切断部位、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位及び非ヒトカスパーゼ３切断部位を含む。
【０３４１】
この実施形態の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、非ヒトエンテロキナーゼ切断部位を含む。実施形態の別の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、ウシエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位を含む。実施形態のさらに別の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、配列番号４８０を含む。
【０３４２】
この実施形態の別の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えばタバコエッチウイルスプロテアーゼ切断を含む。本実施形態の他の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、コンセンサス配列ＥＸ１Ｘ２ＹＸ３Ｑ＊Ｇ（配列番号４８１）又はＥＸ１Ｘ２ＹＸ３Ｑ＊Ｓ（配列番号４８２）であり、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は、任意のアミノ酸である。本実施形態の他の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、配列番号４８３、配列番号４８４、配列番号４８５、配列番号４８６、配列番号４８７、配列番号４８８、配列番号４８９、配列番号４９０、配列番号４９１又は配列番号４９２を含む。
【０３４３】
この実施形態の別の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、タバコ葉脈斑点ウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｖｅｉｎ  Ｍｏｔｔｌｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼ切断部位を含む。本実施形態の他の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、コンセンサス配列Ｘ１Ｘ２ＶＲＦＱ＊Ｇ（配列番号４９３）又はＸ１Ｘ２ＶＲＦＱ＊Ｓ（配列番号４９４）を含み、式中、Ｘ１及びＸ２は独立して任意のアミノ酸である。本実施形態の他の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、配列番号４９５、配列番号４９６、配列番号４９７又は配列番号４９８を含む。
【０３４４】
この実施形態のまた別の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位を含む。実施形態の別の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、コンセンサス配列Ｘ１Ｘ２ＬＦＱ＊ＧＰ（配列番号４９９）を含み、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であり、酸性アミノ酸、例えばＤ又はＥなどが好ましく；Ｘ２は、好ましくはＳ、Ｔ及び脂肪族疎水性アミノ酸、例えばＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ及びＭなどである。本実施形態の他の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、配列番号５００、配列番号５０１、配列番号５０２、配列番号５０３、配列番号５０４又は配列番号５０５を含む。実施形態の別の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、ＰＲＥＳＣＩＳＳＩＯＮ（登録商標）により切断されるヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼを含む。
【０３４５】
この実施形態のまた別の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、スブチリシン切断部位を含む。本実施形態の他の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、コンセンサス配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｈ＊Ｙ（配列番号５０６）又はＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＹＨ＊（配列番号５０７）を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は独立して任意のアミノ酸である。本実施形態の他の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、配列番号５０８、配列番号５０９又は配列番号５１０を含む。本実施形態の他の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、ＧＥＮＥＮＡＳＥ（登録商標）により切断されるスブチリシン切断部位を含む。
【０３４６】
この実施形態のまた別の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、ヒドロキシルアミン切断部位を含む。本実施形態の他の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、ジペプチドＮ＊Ｇを含む。本実施形態の他の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、配列番号５１１又は配列番号５１２を含む。
【０３４７】
この実施形態のまた別の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位を含む。本実施形態の他の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、コンセンサス配列ＧＧ＊Ｘ１Ｘ２Ｘ３（配列番号５１３）を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は独立して任意のアミノ酸である。本実施形態の他の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、配列番号５１４を含む。
【０３４８】
この実施形態の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、カスパーゼ３切断部位を含む。本実施形態の他の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、非ヒトカスパーゼ３プロテアーゼ切断部位を含む。本実施形態の他の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、コンセンサス配列ＤＸ１Ｘ２Ｄ＊Ｘ３（配列番号５１５）を含み、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であり、酸性アミノ酸、例えばＤ及びＥなどが好ましく、Ｘ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ３は、アミノ酸であり、小型の非極性アミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ及びＴなどが好ましい。本実施形態の他の態様において、２本鎖ループ領域内に位置する外因性プロテアーゼ切断部位は、例えば、配列番号５１６、配列番号５１７、配列番号５１８、配列番号５１９、配列番号５２０又は配列番号５２１を含む。
【０３４９】
天然起源の２本鎖ループプロテアーゼ切断部位が外因性プロテアーゼ切断部位により置き換えられるように２本鎖ループ領域を改変することができる。この改変において、天然起源の２本鎖ループプロテアーゼ切断部位が操作不能になり、従ってそのプロテアーゼによって切断され得なくなる。外因性プロテアーゼ切断部位のみがその対応する外因性プロテアーゼによって切断され得る。このタイプの改変において、外因性プロテアーゼ部位は、融合タンパク質としてクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラに操作可能に連結され、この部位はその個々の外因性プロテアーゼにより切断され得る。内在性２本鎖ループプロテアーゼ切断部位の外因性プロテアーゼ切断部位での置き換えは、内在性部位の切断部位の位置に近い位置で外因性部位を遺伝操作するという、部位の置換であり得る。内在性２本鎖ループプロテアーゼ切断部位の外因性プロテアーゼ切断部位での置き換えは、内在性部位の切断部位とは異なる位置で外因性部位を遺伝子操作し、内在性部位が操作不能になるように改変するという、外因性部位の付加であり得る。ある種の結合ドメインは自由アミノ末端又はカルボキシル末端アミノ酸を必要とするので、プロテアーゼ切断部位の位置及び種類は重要であり得る。例えば、ペプチド結合ドメインが２個の他のドメインの間にある場合、例えば、図４を参照して、プロテアーゼ切断部位の選択に対する規準は、その部位を切断するプロテアーゼが平滑末端を残し、その受容体への結合ドメインの選択的結合に必要な結合ドメインの自由アミノ末端又はカルボキシル末端を露出させるか否かであり得る。
【０３５０】
天然起源の２本鎖ループプロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸のうち少なくとも１個を変更することによって、天然起源のプロテアーゼ切断部位を操作不能にすることができる。より大きな変更を行うことができるが、ただし、２本鎖ループ領域のこの２個のシステイン残基が無傷のままであり、この領域が依然としてジスルフィド架橋を形成し得るものとする。アミノ酸の変更の非限定例としては、アミノ酸の欠失又は異なるアミノ酸での元のアミノ酸の置換が挙げられる。従って、ある実施形態において、天然起源のプロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸のうち少なくとも１個を含む少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個のアミノ酸を変化させることによって、天然起源のプロテアーゼ切断部位を操作不能にする。別の実施形態において、天然起源のプロテアーゼにより切断されるペプチド結合に隣接する２個のアミノ酸のうち少なくとも１個を含む最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個のアミノ酸を変化させることによって、天然起源のプロテアーゼ切断部位を操作不能にする。
【０３５１】
本明細で開示される改変クロストリジウム毒素は、場合によっては、フレキシブルスペーサーを含むフレキシブル領域をさらに含み得ることが理解される。フレキシブルスペーサーを含むフレキシブル領域は、ポリペプチドの特徴、属性又は特性を最適化するため、ポリペプチド領域の長さを調整するために使用することができる。非限定例として、縦方向に１以上のフレキシブルスペーサーを含むポリペプチド領域を、プロテアーゼ切断部位をより良好に露出させ、それによってプロテアーゼによるその部位の切断を促進するために使用することができる。別の非限定例として、縦方向に１以上のフレキシブルスペーサーを含むポリペプチド領域を、ペプチド結合ドメインをより良好に提示し、それによってその結合ドメインのその受容体への結合を促進するために使用することができる。
【０３５２】
ペプチドを含むフレキシブルスペースは、少なくとも１アミノ酸長であり、小さな側鎖Ｒ基が付いた非電荷アミノ酸、例えば、小型の非極性アミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｓ及びＴなどを含む。従って、実施形態において、フレキシブルスペーサーは、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸長；又は最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸長を有し得る。さらに別の実施形態において、フレキシブルスペーサーは、例えば１から３個のアミノ酸、２から４個のアミノ酸、３から５個のアミノ酸、４から６個のアミノ酸又は５から７個のアミノ酸であり得る。フレキシブルスペーサーの非限定例としては、例えば、Ｇ−スペーサー、例えばＧＧＧ、ＧＧＧＧ（配列番号５２２）及びＧＧＧＧＳ（配列番号５２３）など又はＡ−スペーサー、例えばＡＡＡ、ＡＡＡＡ（配列番号５２４）及びＡＡＡＡＴ（配列番号５２５）などが挙げられる。このようなフレキシブル領域は、融合タンパク質としてインフレームで改変クロストリジウム毒素に操作可能に連結される。
【０３５３】
従って、実施形態において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、フレキシブルスペーサーを含むフレキシブル領域をさらに含み得る。別の実施形態において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、縦方向に並ぶ複数のフレキシブルスペーサーを含むフレキシブル領域をさらに含み得る。この実施形態の態様において、フレキシブル領域は、縦方向に、例えば、少なくとも１、２、３、４もしくは５個のＧ−スペーサー；又は最大で１、２、３、４もしくは５個のＧ−スペーサーを含み得る。この実施形態のさらに他の態様において、フレキシブル領域は、縦方向に、例えば、少なくとも１、２、３、４もしくは５個のＡ−スペーサー；又は最大で１、２、３、４もしくは５個のＡ−スペーサーを含み得る。この実施形態の別の態様において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、同じフレキシブルスペーサーの１以上のコピー、異なるフレキシブルスペーサー領域の１以上のコピー又はそれらの何らかの組み合わせを含むフレキシブル領域を含み得る。
【０３５４】
本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、ありとあらゆる位置においてフレキシブルスペーサーを含み得ることが想定されるが、ただし、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは全体的な中毒化過程を遂行することができるものとする。この実施形態の態様において、フレキシブルスペーサーは、例えば、酵素ドメインと転移ドメイン、酵素ドメインと結合ドメイン、酵素ドメインと外因性プロテアーゼ切断部位の間に位置する。この実施形態の他の態様において、フレキシブルスペーサーは、例えば、結合ドメインと転移ドメイン、結合ドメインと酵素ドメイン、結合ドメインと外因性プロテアーゼ切断部位の間に位置する。この実施形態のさらに他の態様において、フレキシブルスペーサーは、例えば、転移ドメインと酵素ドメイン、転移ドメインと結合ドメイン、転移ドメインと外因性プロテアーゼ切断部位の間に位置する。
【０３５５】
任意の成分の別の非限定例として、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、エピトープ結合領域をさらに含み得る。例えば、タンパク質精製及びタンパク質の視覚化を含む多岐にわたる手順においてエピトープ結合領域を使用することができる。このようなエピトープ結合領域は、融合タンパク質として改変クロストリジウム毒素にインフレームで操作可能に連結される。エピトープ結合領域の非限定例としては、例えば、ＦＬＡＧ、Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）、ヒトインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、ヒトｐ６２ｃ−Ｍｙｃタンパク質（ｃ−ＭＹＣ）、水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の糖タンパク質−Ｄ前駆体、Ｖ５、ＡＵ１及びＡＵ５；親和性結合、例えば、ポリヒスチジン（ＨＩＳ）、ストレプトアビジン結合ペプチド（ｓｔｒｅｐ）及びビオチン又はビオチン付加配列など；ペプチド−結合領域、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのグルタチオン結合ドメイン、カルモジュリン結合タンパク質のカルモジュリン結合ドメイン及びマルトース結合タンパク質のマルトース結合ドメインが挙げられる。適切な結合ペプチドを選択し、作製し、使用するための具体的なプロトコールの非限定例は、例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｔａｇｇｉｎｇ，ｐｐ．１７．９０−１７．９３（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄｓ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｖｏｌ．３，３ｒｄ  ｅｄ．２００１）；ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９９８）；及びＵＳＩＮＧ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ：ＰＯＲＴＡＢＬＥ  ＰＲＯＴＯＣＯＬ  Ｎｏ．１（Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８）に記載されている。さらに、結合ペプチドならびに特徴がよく分かっている試薬、条件及びプロトコールの非限定例は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡを含むがこれらに限定されない民間業者から容易に入手可能である。これらのプロトコールは、当業者の十分に範囲内の及び本明細書中での教示からの通例の手順である。
【０３５６】
従って、実施形態において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、エピトープ結合領域をさらに含み得る。別の実施形態において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、複数のエピトープ結合領域をさらに含み得る。この実施形態の態様において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、例えば、少なくとも１、２、３、４又は５個のエピトープ結合領域を含み得る。この実施形態の他の態様において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラは、例えば、最大で１、２、３、４又は５個のエピトープ結合領域を含み得る。この実施形態の別の態様において、改変クロストリジウム毒素は、同じエピトープ結合領域の１以上のコピー、異なるエピトープ結合領域の１以上のコピー又はそれらの何らかの組み合わせを含み得る。
【０３５７】
エピトープ結合領域の位置は、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの、アミノ末端、カルボキシル末端内又はカルボキシル末端を含むが限定されない、様々な位置であり得る。従って、実施形態において、エピトープ結合領域は、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラのアミノ末端に位置する。別の実施形態において、エピトープ結合領域は、改変クロストリジウム毒素のカルボキシル末端に位置する。
【０３５８】
本明細の態様は、ある一部分において、ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド分子」という用語は、「核酸分子」と同義であり、ヌクレオチドのポリマー形態、例えば、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドなどを指す。天然起源の及び非天然のＤＮＡ分子及び天然起源の及び非天然のＲＮＡ分子を含むが限定されない、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをコードし得るありとあらゆるポリヌクレオチド分子が有用であり得ることが想定される。天然起源の及び非天然のＤＮＡ分子の非限定例としては、１本鎖ＤＮＡ分子、２本鎖ＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、ベクターコンストラクト、例えば、プラスミドコンストラクト、ファージミドコンストラクト、バクテリオファージコンストラクト、レトロウイルスコンストラクト及び人工染色体コンストラクトなどが挙げられる。天然起源の及び非天然のＲＮＡ分子の非限定例としては、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ及びｍＲＮＡが挙げられる。
【０３５９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、制限酵素反応、アガロースゲル電気泳動、核酸ライゲーション、細菌形質転換、核酸精製、核酸配列決定及び組み換えに基づく技術を含む手順を含むが限定されない、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをコードするポリヌクレオチド分子を作製するために必要であり得る定着している分子生物学技術は、十分に当業者の範囲内であり、本明細書中での教示からの通例の手順である。改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を作製するために必要な具体的なプロトコールの非限定例は、例えば、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、前出（２００１）；及びＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２００４）に記載されている。さらに、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをコードするポリヌクレオチド分子を作製するために有用な様々な市販製品が広く利用可能である。これらのプロトコールは、十分に当業者の範囲内であり、本明細書中での教示からの通例の手順である。
【０３６０】
従って、実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをコードする。
【０３６１】
本明細の別の態様は、ある一部分において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを作製する方法を提供し、このような方法は、細胞中でクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをコードするポリヌクレオチド分子を発現させる段階を含む。本明細の別の態様は、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを作製する方法を提供し、このような方法は、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをコードするポリヌクレオチド分子を含む発現コンストラクトを細胞に導入し、その細胞中で発現コンストラクトを発現させる段階を含む。
【０３６２】
本明細で開示される方法には、ある一部分において、クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラが含まれる。本明細で開示されるありとあらゆるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラが本明細で開示される方法を用いて作製され得ることが想定される。本明細で開示される方法を用いて本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを作製することにおいて、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをコードするありとあらゆるポリヌクレオチド分子が有用であり得ることも想定される。
【０３６３】
本明細で開示される方法には、ある一部分において、発現コンストラクトが含まれる。発現コンストラクトは、細胞又は細胞不含抽出物中でポリヌクレオチド分子を発現させるために有用な発現ベクターに操作可能に連結された本明細で開示されるポリヌクレオチド分子を含む。ウイルス発現ベクター；原核生物発現ベクター；真核生物発現ベクター、例えば、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクター及び哺乳動物発現ベクターなど；及び細胞不含抽出物発現ベクターを含むが限定されない、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをコードするポリヌクレオチド分子を発現させるために多岐にわたる発現ベクターを使用し得る。これらの方法の態様を実施するために有用な発現ベクターには、構成的、組織特異的、細胞特異的又は誘導性プロモーターエレメント、エンハンサーエレメント又は両方の制御下でクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを発現させるものが含まれ得ることがさらに理解される。このような発現ベクターからのコンストラクトを作製し、使用するための定着している試薬及び条件を伴う発現ベクターの非限定例は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡが含まれるがこれらに限定されない民間業者から容易に入手可能である。適切な発現ベクターの選択、作製及び使用は、十分に当業者の範囲内であり、本明細書中での教示からの通例の手順である。
【０３６４】
従って、この実施形態の態様において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをコードするポリヌクレオチド分子は、発現ベクターに操作可能に連結される。この実施形態の態様において、この発現ベクターは、例えば、ウイルス発現ベクター、原核生物発現ベクター、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクター又は哺乳動物発現ベクターである。この実施形態の他の態様において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをコードするポリヌクレオチド分子は、細胞不含抽出物発現ベクターに操作可能に連結される。
【０３６５】
本明細で開示される方法は、一部分において細胞を含む。ありとあらゆる細胞が使用され得ることが想定される。従って、この実施形態の態様には、好気性、微好気性、好二酸化炭素性、通性、嫌気性、グラム陰性及びグラム陽性細菌細胞の株、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クロストリジア・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジア・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ナイセリア・メニンギルルス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｒｕｌｌｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）及びネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のものを含むが限定されない原核細胞；及び酵母株、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来のものなどを含むが限定されない真核細胞；昆虫細胞及び昆虫由来の細胞株、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）及びタバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）由来のものなど；及び哺乳動物細胞及び哺乳動物細胞由来の細胞株、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類及びヒト由来のものなどが含まれるが、これらに限定されない。株化細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ及びＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓから入手することができる。適切な株化細胞を選択し、作製し、使用するための具体的なプロトコールの非限定例は、例えば、ＩＮＳＥＣＴ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（Ｍａｔｔｈｅｕｓ  Ｆ．Ａ．Ｇｏｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，１９９３）；ＩＮＳＥＣＴ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥＳ：ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＡＳＰＥＣＴＳ（Ｊ．Ｍ．Ｖｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９６）；Ｍａｕｒｅｅｎ  Ａ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＆  Ｉａｎ  Ｆ．Ｒａｅ，ＧＥＮＥＲＡＬ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  ＯＦ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）；ＣＥＬＬ  ＡＮＤ  ＴＩＳＳＵＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ：ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ（Ａｌａｎ  Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ  ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９８）；Ｒ．Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＦ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬＳ：Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，４ｔｈ  ｅｄ．２０００）；ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｊｏｈｎ  Ｒ．Ｗ．Ｍａｓｔｅｒｓ  ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ  ｅｄ．２０００）；ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，前出（２００１）；ＢＡＳＩＣ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｊｏｈｎ  Ｍ．Ｄａｖｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．２００２）；及びＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，前出（２００４）に記載されている。これらのプロトコールは、当業者の範囲内であり、本明細書中での教示からの通例の手順である。
【０３６６】
本明細で開示される方法は、ある一部分において、ポリヌクレオチド分子を細胞に導入することを含む。細胞に導入されたポリヌクレオチド分子は、その細胞によって一過性に又は安定的に維持され得る。安定的に維持されるポリヌクレオチド分子は染色体外であり、自己複製し得るか又はそれらは、細胞の染色体物質に組み込まれ、非自律的に複製し得る。本明細で開示されるポリヌクレオチド分子を細胞に導入するためのありとあらゆる方法を使用することができることが想定される。ポリヌクレオチド分子を細胞に導入するための有用な方法としては、化学的形質移入又は形質転換、例えば、塩化カルシウム介在、リン酸カルシウム介在、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン介在、脂質介在、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在、ポリリジン介在及びポリブレン介在法など；物理的形質移入又は形質転換、例えば、微粒子銃粒子送達、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーションなど；及びウイルス介在性の形質移入、例えば、レトロウイルス介在性の形質移入などが挙げられるが、これらに限定されず、例えば、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎｔｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，ｐｐ．１６．１−１６．６２（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌ．３，３ｒｄ  ｅｄ．２００１）を参照のこと。発現コンストラクトを細胞に導入するための具体的な方法の選択が、部分的に、細胞が一過性に発現コンストラクトを含有するか否か又は細胞が発現コンストラクトを安定的に含有するか否かに依存することを当業者は理解する。これらのプロトコールは当業者の範囲内であり、本明細書中での教示からの通例の手順である。
【０３６７】
この実施形態の態様において、形質移入と呼ばれる化学的方法を使用して、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをコードするポリヌクレオチド分子を細胞に導入する。形質移入の化学的方法において、化学試薬は、細胞へのその取り込みを促進する、核酸との複合体を形成する。このような化学試薬としては、リン酸カルシウム介在法、例えば、Ｍａｒｔｉｎ  Ｊｏｒｄａｎ  ＆  Ｆｌｏｒｉａｎ  Ｗｏｒｍ，Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，３３（２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３６−１４３（２００４）参照；ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン介在法、脂質介在法、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在法及びポリリジン介在法及びポリブレン介在法のようなカチオンポリマー介在法、例えば、Ｃｈｕｎ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ，３３（２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４４−１５０（２００４）参照が挙げられるが、これらに限定されない。このような化学的送達系は標準的方法により調製することができ、市販されており、例えば、ＣｅｌｌＰｈｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）；Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｎｄ  ＤＥＡＥ  Ｄｅｘｔｒａｎ，（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）；ＥｘＧｅｎ  ５００  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｎｏｖｅｒ，ＭＤ）及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ及びＥｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を参照のこと。
【０３６８】
この実施形態の別の態様において、物理的方法を使用して、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをコードするポリヌクレオチド分子を細胞に導入する。物理的技術としては、エレクトロポレーション、微粒子銃及びマイクロインジェクションが挙げられるが、これらに限定されない。微粒子銃及びマイクロインジェクション技術は核酸分子を細胞に導入するために細胞壁を穿孔し、例えば、Ｊｅｉｋｅ  Ｅ．Ｂｉｅｗｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，７１（１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６７−７５（１９９７）；及びＪｏｈｎ  Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ＆  Ｓａｒａｈ  Ｃ．Ｒ．Ｌｕｍｍｉｓ，Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ：ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｇｕｎ  ｔｏ  ｄｅｌｉｖｅｒ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｙｅｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，３３（２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２１−１２５（２００４）を参照のこと。電気的透過法とも呼ばれるエレクトロポレーションは、短時間の高電圧の電気パルスを使用して、核酸分子が侵入する膜において一過的な孔を生成させ、全ての細胞タイプの安定的及び一過性形質移入に対して効果的に使用することができ、例えば、Ｍ．Ｇｏｌｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ，ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，３３（２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２６−１３５（２００４）；及びＯｌｉｖｅｒ  Ｇｒｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ，３３（２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５１−１６３（２００４）を参照のこと。
【０３６９】
この実施形態の別の態様において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをコードするポリヌクレオチド分子を細胞に導入するために、形質導入と呼ばれるウイルス介在法が使用される。細胞にポリヌクレオチド分子を導入するためのこの機構を使用するために、一過性形質導入のウイルス介在法において、ウイルス粒子が感染し、宿主細胞で複製する過程が行われている。レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス及びバキュロウイルスを含むが限定されない多岐にわたるウイルスからウイルス介在法が開発されており、例えば、Ａｒｍｉｎ  Ｂｌｅｓｃｈ，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ＭＬＶ  ｂａｓｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ，３３（２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６４−１７２（２００４）；及びＭａｕｒｉｚｉｏ  Ｆｅｄｅｒｉｃｏ，Ｆｒｏｍ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ  ｔｏ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ，２２９  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３−１５（２００３）；Ｅ．Ｍ．Ｐｏｅｓｃｈｌａ，Ｎｏｎ−ｐｒｉｍａｔｅ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ，５（５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５２９−５４０（２００３）；Ｋａｒｉｍ  Ｂｅｎｉｈｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，１０（５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４０−４４７（１９９９）；Ｈ．Ｂｕｅｌｅｒ，Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ，３８０（６）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６１３−６２２（１９９９）；Ｃｈｏｏｉ  Ｍ．Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ，２１（１２）ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８９５−９１３（２００２）；Ｅｄｗａｒｄ  Ａ．Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ，２１（１２）ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９１５−９３６（２００２）；Ｐａｏｌａ  Ｇｒａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＨＳＶ  ａｍｐｌｉｃｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ，３３（２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７９−１８６（２００４）；Ｉｌｙａ  Ｆｒｏｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，９３（２１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１３７１−１１３７７（１９９６）；Ｍａｒｋｕｓ  Ｕ．Ｅｈｒｅｎｇｒｕｂｅｒ，Ａｌｐｈａｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５９（１）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．１３−２２（２００２）；Ｔｈｏｍａｓ  Ａ．Ｋｏｓｔ  ＆  Ｊ．Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｃｏｎｄｒｅａｙ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃ��ｏｒｓ，２０（４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７３−１８０（２００２）；ａｎｄ  Ａ．Ｈｕｓｅｒ  ＆  Ｃ．Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｎｏｖｅｌ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，３（１）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５３−６３（２００３）を参照のこと。
【０３７０】
外被のない２本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスは、アデノウイルスが比較的大きい約３６ｋｂのポリヌクレオチド分子を操作し、高タイターで産生され、多岐にわたる分裂及び非分裂細胞の両方に効率的に感染し得るので、哺乳動物細胞形質導入のために選択されることが多く、例えば、Ｗｉｍ  Ｔ．Ｊ．Ｍ．Ｃ．Ｈｅｒｍｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｇｌｉａ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＮＳ  ａｎｄ  ＰＮＳ，７１（１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８５−９８（１９９７）；及びＨｉｒｏｙｕｋｉ  Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ，５２（３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．１６５−１７６（２００１）を参照のこと。アデノウイルスに基づく系を使用する形質導入は、核酸分子が、宿主細胞染色体に組み込まれるのではなく細胞核のエピソームにより担持されるので、長期間のタンパク質発現を支持しない。アデノウイルスベクター系及びこのようなベクターの使用法についての具体的なプロトコールは、例えば、ＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標）Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標）Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  ２５−０５４３  ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，（Ｊｕｌ．１５，２００２）；及びＡＤＥＡＳＹ（商標）Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）及びＡＤＥＡＳＹ（商標）Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  ０６４００４ｆ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．で開示される。
【０３７１】
ポリヌクレオチド分子送達は、１本鎖ＲＮＡレトロウイルス、例えば、癌レトロウイルス及びレンチウイルスなども使用し得る。レトロウイルス介在形質導入は、１００％に近い形質導入効率が得られることが多く、感染多重度（ＭＯＩ）を変化させることによってプロウイルスコピー数を容易に調整することができ、一過性に又は安定的の何れかで細胞に対して形質導入するために使用することができ、例えば、Ｔｉｚｉａｎａ  Ｔｏｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ−ａｎｄ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，２８５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４１−１４８（２００４）；Ａｒｍｉｎ  Ｂｌｅｓｃｈ，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ＭＬＶ  ｂａｓｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ，３３（２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６４−１７２（２００４）；Ｆｅｌｉｘ  Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ，Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ，２６７  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１７−４３３（２００４）；及びＲｏｌａｎｄ  Ｗｏｌｋｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，２４６  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９１−４１１（２００４）を参照のこと。レトロウイルス粒子は、タンパク質キャプシド中に封入され、脂質エンベロープにより囲まれるＲＮＡゲノムから構成される。レトロウイルスは、リバーストランスクリプターゼ酵素とともにそのＲＮＡを細胞質に注入することによって、宿主細胞に感染する。次に、このＲＮＡ鋳型が直線状の２本鎖ｃＤＮＡに逆転写され、これは、宿主細胞ゲノムに組み込むことによってそれ自身を複製する。垂直（プロウイルスを介して親細胞から娘細胞へ）ならびに水平（ビリオンを介して細胞から細胞へ）の両方でウイルス粒子が拡散される。この複製ストラテジーによって、関心のある核酸分子が宿主細胞の染色体に安定に組み込まれ、それによってタンパク質の長期発現が可能になるので、長期の持続的発現が可能になる。例えば、動物での研究から、様々な組織に注入したレンチウイルスベクターが１年を超えて持続的タンパク質発現を生じさせたことが示されており、例えば、Ｌｕｉｇｉ  Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｄｉｖｉｄｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ，２７２（５２５９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３−２６７（１９９６）を参照のこと。癌レトロウイルス由来ベクター系、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）などは、広く使用されており、多くの様々な非分裂細胞に感染する。レンチウイルスは、分裂及び非分裂細胞を含む多くの様々な細胞タイプにも感染し、複合体エンベロープタンパク質を保持し得るが、これにより非常に特異的な細胞標的化が可能になる。
【０３７２】
レトロウイルスベクター及びこのようなベクターの使用法についての具体的なプロトコールは、例えば、Ｍａｎｆｒｅｄ  Ｇｏｓｓｅｎ  ＆  Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｔｉｇｈｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ，米国特許第５，４６４，７５８号（１９９５年１１月７日）及びＨｅｒｍａｎｎ  Ｂｕｊａｒｄ  ＆  Ｍａｎｆｒｅｄ  Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，米国特許第５，８１４，６１８号（１９９８年９月２９日）Ｄａｖｉｄ  Ｓ．Ｈｏｇｎｅｓｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｉｎｓｅｃｔ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓａｍｅ，米国特許第５，５１４，５７８号（１９９６年５月７日）及びＤａｖｉｄ  Ｓ．Ｈｏｇｎｅｓｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｉｎｓｅｃｔ  ｅｃｄｙｓｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，米国特許第６，２４５，５３１号（２００１年６月１２日）；Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ  Ｖｅｇｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈａｖｉｎｇ  Ｃ．ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ，米国特許第５，３６４，７９１号（１９９４年１１月１５日），Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ  Ｖｅｇｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔｅｄ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ，米国特許第５，８７４，５３４号（１９９９年２月２３日）及びＥｌｉｓａｂｅｔｔａ  Ｖｅｇｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔｅｄ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ，米国特許第５，９３５，９３４号（１９９９年８月１０日）で開示される。さらに、このようなウイルス送達系を標準的方法によって調製することができ、市販されており、例えば、ＢＤ（商標）Ｔｅｔ−Ｏｆｆ  ａｎｄ  Ｔｅｔ−Ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）及びＢＤ（商標）Ｔｅｔ−Ｏｆｆ  ａｎｄ  Ｔｅｔ−Ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ，ＰＴ３００１−１，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，（２００３年３月１４日），ＧＥＮＥＳＷＩＴＣＨ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びＧＥＮＥＳＷＩＴＣＨ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ  Ａ  Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｄ，２５−０３１３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，（２００２年１１月４日）；ＶＩＲＡＰＯＷ��Ｒ（商標）Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標）Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  ２５−０５０１  ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，（２００３年１２月８日）；及びＣＯＭＰＬＥＴＥ  ＣＯＮＴＲＯＬ（登録商標）Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）及びＣＯＭＰＬＥＴＥ  ＣＯＮＴＲＯＬ（登録商標）Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ，０６４００５ｅを参照のこと。
【０３７３】
本明細で開示される方法は、ある一部分において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをポリヌクレオチド分子から発現させることを含む。細胞に基づく系及び細胞不含発現系を含むが限定されない様々な発現系の何れも、ポリヌクレオチド分子から本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを発現させるために有用であり得ることが想定される。細胞に基づく系としては、ウイルス発現系、原核生物発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系、昆虫発現系及び哺乳動物発現系が挙げられるが、これらに限定されない。細胞不含の系としては、小麦胚芽抽出物、ウサギ網状赤血球抽出物及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抽出物が挙げられるが、これらに限定されず、一般に本明細書中で開示される方法と同等である。発現系を用いたポリヌクレオチド分子の発現は、誘導性発現、非誘導性発現、構成的発現、ウイルス介在発現、安定的に組み込まれた発現及び一過性発現を含むが限定されない、様々な特徴の何れかを含み得る。特徴がよく分かっているベクター、試薬、条件及び細胞を含む発現系が定着しており、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡを含むがこれらに限定されない民間業者から容易に入手可能である。適切な異種発現系の選択及び使用における非限定例は、例えば、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ．Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄａｖｉｄ  Ｈａｍｅｓ  ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｊｏｓｅｐｈ  Ｍ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＆  Ｊａｍｅｓ  Ｐ．Ｈｏｅｆｆｌｅｒ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭＳ．ＵＳＩＮＧ  ＮＡＴＵＲＥ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＡＲＴ  ＯＦ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；及びＭｅｅｎａ  Ｒａｉ  ＆  Ｈａｒｉｓｈ  Ｐａｄｈ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８０（９）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＳＣＩＥＮＣＥ  １１２１−１１２８（２００１）に記載されている。これらのプロトコールは、十分に当業者の範囲内であり、本明細書中での教示からの通例の手順である。
【０３７４】
様々な細胞に基づく発現手順は、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをコードするポリヌクレオチド分子を発現させるために有用である。例としては、ウイルス発現系、原核生物発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系、昆虫発現系及び哺乳動物発現系が挙げられるがこれらに限定されない。ウイルス発現系としては、ＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標）Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ），Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＡＤＥＡＳＹ（商標）ＸＬ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）及びＶＩＲＡＰＯＲＴ（登録商標）Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，，ＣＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。原核生物発現系の非限定例としては、ＣＨＡＭＰＩＯＮ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴＲＩＥＸ（商標）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＱＩＡＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．）及びＡＦＦＩＮＩＴＹ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。酵母発現系としては、ＥＡＳＹＳＥＬＥＣＴ（商標）Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＹＥＳ−ＥＣＨＯ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びＳＰＥＣＴＲＡ（商標）Ｓ．ｐｏｍｂｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。バキュロウイルス発現系の非限定例としては、ＢＡＣＵＬＯＤＩＲＥＣＴ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，，ＣＡ）、ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，，ＣＡ）及びＢＤ  ＢＡＣＵＬＯＧＯＬＤ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。昆虫発現系としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＥＳ（登録商標））（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＩＮＳＥＣＴＳＥＬＥＣＴ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びＩＮＳＥＣＴＤＩＲＥＣＴ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物発現系の非限定例としては、Ｔ−ＲＥＸ（商標）（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦＬＰ−ＩＮ（商標）Ｔ−ＲＥＸ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ｐｃＤＮＡ（商標）ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ｐＳｅｃＴａｇ２  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＥＸＣＨＡＮＧＥＲ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ，ＩＮＴＥＲＰＬＡＹ（商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＴＡＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ＣＯＭＰＬＥＴＥ  ＣＯＮＴＲＯＬ（登録商標）Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）及びＬＡＣＳＷＩＴＣＨ（登録商標）ＩＩ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）が挙げられる。
【０３７５】
本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラをコードするポリヌクレオチド分子を発現させる別の手順は、細胞不含発現系、例えば限定されないが、原核生物抽出物及び真核生物抽出物を使用する。原核細胞抽出物の非限定例としては、ＲＴＳ１００  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＹ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＡｃｔｉｖｅＰｒｏ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、ＥＣＯＰＲＯ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及びＥＸＰＲＥＳＳＷＡＹ（商標）Ｐｌｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。真核生物細胞抽出物としては、ＲＴＳ１００  Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  ＣＥＣＦ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＴＮＴ（登録商標）Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  ＩＶＴ（商標）Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、Ｌｙｓａｔｅ  ＩＶＴ（商標）Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、ＰＲＯＴＥＩＮＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＩＩ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）及びＴＮＴ（登録商標）Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７６】
１本鎖形態で細胞によって、本明細で開示される本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラが作製される。完全な活性を達成するために、１本鎖形態は、その２本鎖形態に変換されねばならない。上で論じたように、この変換過程は、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの２本鎖ループ領域内に位置するプロテアーゼ切断部位を切断することによって達成される。標準的なインビトロタンパク質分解性切断アッセイを用いて又は特許出願Ｇｈａｎｓｈａｎｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅｉｒ  Ｄｉ−ｃｈａｉｎ、代理人整理番号１８４６９  ＰＲＯＶ（ＢＯＴ）（その全体が参照により本明細書によって組み込まれる。）で記載されるような細胞に基づくタンパク質分解性切断系において、この変換過程を行うことができる。
【０３７７】
本明細の態様は、ある一部分において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを含む組成物を開示する。さらなる態様において、本組成物は医薬的に許容可能な組成物である。本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容可能な」という用語は、個体に投与した際に有害なアレルギー性又は他の都合の悪い又は望ましくない反応を生じさせないいずれの分子部分又は組成物をも指す。本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容可能な組成物」という用語は、「医薬組成物」と同義であり、例えば本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの何れかなどの活性成分の治療的有効濃度を指す。クロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを含む医薬組成物は、医学的及び獣医学的適用に有用である。医薬組成物は、患者に単独で又は他の補助的な活性成分、薬剤、薬物又はホルモンと組み合わせて投与され得る。本医薬組成物は、従来の混合、溶解、造粒、ドラジェ調製、ゲル化、乳化、カプセル化、封入及び凍結乾燥を含むが限定されない、様々な過程の何れかを用いて製造され得る。本医薬組成物は、滅菌溶液、懸濁液、乳液、凍結乾燥物、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、粉剤、シロップ剤、エリキシル剤を含むが限定されないあらゆる様々な形態の何れか又は投与に適切なその他の何らかの剤形をとり得る。
【０３７８】
本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを含む医薬組成物は、医薬的に許容可能な組成物にするための活性成分の処理を促進する医薬的に許容可能な担体を場合によっては含み得ることも想定される。本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容可能な担体」という用語は、「医薬担体」と同義であり、投与した場合に実質的に長期的又は永久的な有害作用がない何らかの担体を指し、「医薬的に許容可能なビヒクル、安定化剤、希釈剤、添加剤、補助剤又は賦形剤」などの用語を包含する。そのような担体は、一般に、活性化合物と混合するか又は活性化合物を希釈又は封入することができ、固形、半固形又は液剤であり得る。活性成分は可溶性であり得るか又は望ましい担体又は希釈剤中で懸濁液として送達され得ることが理解される。水性媒体、例えば、水、生理食塩水、グリシン、ヒアルロン酸など；固形担体、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース，グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなど；溶媒；分散媒；被覆剤；抗菌及び抗真菌剤；等張及び吸収遅延剤；又は何らかの他の不活性成分などを含むが限定されない様々な医薬的に許容可能な担体の何れかを使用することができる。医薬的に許容可能な担体の選択は投与方式に依存し得る。何らかの医薬的に許容可能な担体が活性成分と非適合性である場合を除き、医薬的に許容可能な組成物中でのその使用が企図される。このような医薬担体の具体的な使用の非限定例は、ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ（Ｈｏｗａｒｄ  Ｃ．Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，７ｔｈ  ｅｄ．１９９９）；ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０ｔｈ  ｅｄ．２０００）；ＧＯＯＤＭＡＮ  ＆  ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ（Ｊｏｅｌ  Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，１０ｔｈ  ｅｄ．２００１）；及びＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＥＸＣＩＰＩＥＮＴＳ（Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｃ．Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＰｈＡ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００３）で見出すことができる。これらのプロトコールは、通例の手順であり、あらゆる修飾が十分に当業者の範囲内及び本明細書中での教示からである。
【０３７９】
本明細で開示される医薬組成物には、緩衝剤、保存剤、等張化剤、塩、抗酸化剤、浸透圧調整剤、生理学的物質、医薬的物質、増量剤、乳化剤、湿潤剤、甘味料又は香味料などを含むが限定されない、他の医薬的に許容可能な成分（又は医薬成分）が場合によっては含まれ得るが、これらに限定されないことが、さらに想定される。得られる調製物が医薬的に許容可能であるという条件で、ｐＨを調節するための様々な緩衝液を使用して、本明細で開示される医薬組成物を調製することができる。このような緩衝液としては、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水及びホウ酸緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。必要に応じて酸又は塩基を使用して組成物のｐＨを調整することができることが理解される。医薬的に許容可能な抗酸化剤としては、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アセチルシステイン、ブチル化ヒドロキシアニソール及びブチル化ヒドロキシトルエンが挙げられるが、これらに限定されない。有用な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、安定化オキシクロロ組成物、例えば、ＰＵＲＩＴＥ（登録商標）など、及びキレート剤、例えば、ＤＴＰＡ又はＤＴＰＡ−ビスアミド、カルシウムＤＴＰＡ及びＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミドなどが挙げられるが、これらに限定されない。医薬組成物において有用な等張化剤としては、塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトール又はグリセリン及び他の医薬的に許容可能な等張化剤が挙げられるが、これらに限定されない。本医薬組成物は、塩として提供され得、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸及びコハク酸を含むが限定されない多くの様々な酸とともに形成され得る。塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性又は他のプロトン性溶媒中でより可溶性である傾向がある。本明細において有用な医薬組成物中に薬理分野で公知のこれらの及び他の物質が含まれ得ることが理解される。
【０３８０】
実施形態において、組成物は、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを含む。この実施形態の態様において、本組成物は、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを含む医薬組成物である。この実施形態の態様において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを含む医薬組成物は、医薬担体、医薬成分又は医薬担体及び医薬成分の両方をさらに含む。この実施形態の他の態様において、本明細で開示されるクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを含む医薬組成物は、少なくとも１つの医薬担体、少なくとも１つの医薬成分又は少なくとも１つの医薬担体及び少なくとも１つの医薬成分をさらに含む。
【０３８１】
本明細の態様を次のようにも説明することができる：
１．毒素不活性化切断部位領域内に位置する少なくとも１つの不活性化切断部位を含むクロストリジウムであって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置し、この少なくとも１つの不活性化切断部位が二重トロンビン−トロンビン部位、第Ｘａ因子部位、二重第Ｘａ因子−トロンビン部位及び／又はＭＭＰ−９部位を含むもの。
２．クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン、クロストリジウム毒素結合ドメイン、２本鎖ループ領域、外因性プロテアーゼ切断部位及び、不活性化切断部位領域内に位置する少なくとも２個の不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、外因性プロテアーゼ切断部位が２本鎖ループ領域内に位置するもの。
３．態様２のクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位が、二重トロンビン−トロンビン部位及び／又は二重第Ｘａ因子−トロンビン部位を含むもの。
４．クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断を含むクロストリジウム毒素キメラであって、不活性化切断部位領域が転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
５．態様１〜４のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラであって、不活性化切断部位領域が、アミノ酸、配列番号１、配列番号２、配列番号４及び／又は配列番号５のアミノ酸４６２〜４９６；配列番号３のアミノ酸４５８〜４９２；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０のアミノ酸４６４〜４８７；配列番号１１及び／又は配列番号１２のアミノ酸４６３〜４９６；配列番号１３及び／又は配列番号１４のアミノ酸４５８〜４９１；配列番号１５、配列番号１６及び／又は配列番号１７のアミノ酸４３４〜４６７；配列番号１８、配列番号１９及び／又は配列番号２０のアミノ酸４５３〜４８６；配列番号２１のアミノ酸４５８〜４９１；配列番号２３のアミノ酸４４３〜４７６；及び／又は配列番号２４及び／又は配列番号２５のアミノ酸４３４〜４６７を含むもの。
６．態様１〜４のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラであって、不活性化切断部位領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号４及び／又は配列番号５のアミノ酸６１８〜６３４；配列番号３のアミノ酸６１４〜６３０；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０のアミノ酸６０５〜６２１；配列番号１１及び／又は配列番号１２のアミノ酸６１３〜６２９；配列番号１３及び／又は配列番号１４のアミノ酸６０９〜６２５；配列番号１５、配列番号１６及び／又は配列番号１７のアミノ酸５８７〜６０３；配列番号１８のアミノ酸６０４〜６２０；配列番号１９及び／又は配列番号２０のアミノ酸６０５〜６２１；配列番号２１のアミノ酸６１０〜６２６；配列番号２３のアミノ酸５９６〜６１２；及び／又は配列番号２４及び／又は配列番号２５のアミノ酸５８７〜６０３を含むもの。
７．態様１〜４のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラであって、不活性化切断部位領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号４及び／又は配列番号５のアミノ酸６３８〜６５１；配列番号３のアミノ酸６３４〜６４７；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０のアミノ酸６２５〜６３８；配列番号１１及び／又は配列番号１２のアミノ酸６３３〜６４６；配列番号１３及び／又は配列番号１４のアミノ酸６２９〜６４２；配列番号１５、配列番号１６及び／又は配列番号１７のアミノ酸６０７〜６２０；配列番号１８のアミノ酸６２４〜６３７；配列番号１９及び／又は配列番号２０のアミノ酸６２５〜６３８；配列番号２１のアミノ酸６３０〜６４３；配列番号２３のアミノ酸６１６〜６２９；及び／又は配列番号２４及び／又は配列番号２５のアミノ酸６０７〜６２０を含むもの。
８．態様１〜４のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラであって、不活性化切断部位領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号４及び／又は配列番号５のアミノ酸６６５〜６８７；配列番号３のアミノ酸６６１〜６８３；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０のアミノ酸６５２〜６７４；配列番号１１及び／又は配列番号１２のアミノ酸６６０〜６８２；配列番号１３及び／又は配列番号１４のアミノ酸６５６〜６７８；配列番号１５、配列番号１６及び／又は配列番号１７のアミノ酸６３４〜６５９；配列番号１８のアミノ酸６５１〜６７６；配列番号１９及び／又は配列番号２０のアミノ酸６５２〜６７７；配列番号２１のアミノ酸６５７〜６７９；配列番号２３のアミノ酸６４３〜６６８；及び／又は配列番号２４及び／又は配列番号２５のアミノ酸６３４〜６５９を含むもの。
９．態様１〜４のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラであって、不活性化切断部位領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号４及び／又は配列番号５のアミノ酸７５２〜７６５；配列番号３のアミノ酸７４８〜７６１；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０のアミノ酸７３９〜７５２；配列番号１１及び／又は配列番号１２のアミノ酸７４７〜７６０；配列番号１３及び／又は配列番号１４のアミノ酸７４３〜７５６；配列番号１５、配列番号１６及び／又は配列番号１７のアミノ酸７２４〜７３９；配列番号１８のアミノ酸７４１〜７５６；配列番号１９及び／又は配列番号２０のアミノ酸７４２〜７５７；配列番号２１のアミノ酸７４４〜７５７；配列番号２３のアミノ酸７３３〜７４８；及び／又は配列番号２４及び／又は配列番号２５のアミノ酸７２４〜７３９を含むもの。
１０．態様１〜４のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラであって、不活性化切断部位領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号４及び／又は配列番号５のアミノ酸８２６〜８３５；配列番号３のアミノ酸８２４〜８３１；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０のアミノ酸８１３〜８２４；配列番号１１及び／又は配列番号１２のアミノ酸８２１〜８３０；配列番号１３及び／又は配列番号１４のアミノ酸８１７〜８２６；配列番号１５、配列番号１６及び／又は配列番号１７のアミノ酸８００〜８０９；配列番号１８のアミノ酸８１７〜８２６；配列番号１９及び／又は配列番号２０のアミノ酸８１８〜８２７；配列番号２１のアミノ酸８１８〜８２７；配列番号２３のアミノ酸８０９〜８１９；及び／又は配列番号２４及び／又は配列番号２５のアミノ酸８００〜８０９を含むもの。
１１．態様１〜４のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラであって、不活性化切断部位領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号４及び／又は配列番号５のアミノ酸８４４〜８６３；配列番号３のアミノ酸８４０〜８５９；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０のアミノ酸８３１〜８５０；配列番号１１及び／又は配列番号１２のアミノ酸８３９〜８５８；配列番号１３及び／又は配列番号１４のアミノ酸８３５〜８５４；配列番号１５、配列番号１６及び／又は配列番号１７のアミノ酸８１８〜８３７；配列番号１８のアミノ酸８３５〜８５４；配列番号１９及び／又は配列番号２０のアミノ酸８３６〜８５５；配列番号２１のアミノ酸８３６〜８５５；配列番号２３のアミノ酸８２８〜８４７；及び／又は配列番号２４及び／又は配列番号２５のアミノ酸８１８〜８３７を含むもの。
１２．態様１〜４のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラであって、不活性化切断部位領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号４及び／又は配列番号５のアミノ酸８７１〜８９５；配列番号３のアミノ酸８６７〜８９１；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０のアミノ酸８５８〜８８２；配列番号１１及び／又は配列番号１２のアミノ酸８６６〜８９０；配列番号１３及び／又は配列番号１４のアミノ酸８６２〜８８６；配列番号１５、配列番号１６及び／又は配列番号１７のアミノ酸８４５〜８６９；配列番号１８のアミノ酸８６２〜８８６；配列番号１９及び／又は配列番号２０のアミノ酸８６３〜８８７；配列番号２１のアミノ酸８６３〜８８７；配列番号２３のアミノ酸８５５〜８７９；及び／又は配列番号２４及び／又は配列番号２５のアミノ酸８４５〜８６９を含む。
１３．態様１〜１２のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラであって、クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＢａＮＴ酵素ドメイン及び／又はＢｕＮＴ酵素ドメインを含むもの。
１４．態様１〜１３のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラであって、不活性化切断部位が、トロンビン切断部位、プラスミン切断部位、凝固第ＶＩＩａ因子切断部位、凝固第ＩＸａ因子切断部位、凝固第Ｘａ因子切断部位、凝固第ＸＩａ因子切断部位、凝固第ＸＩＩａ因子切断部位、血漿カリクレイン切断部位、プロテアーゼ活性化Ｇタンパク質共役型受容体−１（ＰＡＲ１）切断部位、ＰＡＲ２切断部位、ＰＡＲ３切断部位、ＰＡＲ４切断部位、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）切断部位、マトリクスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）切断部位、フューリン切断部位、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）切断部位、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）切断部位、トリプターゼ−ε切断部位、マウス肥満細胞プロテアーゼ−７（ｍＭＣＰ−７）切断部位、エンドセリン変換酵素−１（ＥＣＥ−１）切断部位、ケル式血液型切断部位、ＤＰＰＩＶ切断部位、トロンボスポンジン１型モチーフ−１３があるＡＤＡＭメタロペプチダーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）切断部位及び／又はカテプシンＬ切断部位を含むもの。
１５．態様１〜１４のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラであって、クロストリジウム毒素転移ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン、ＴｅＮＴ転移ドメイン、ＢａＮＴ転移ドメイン及び／又はＢｕＮＴ転移ドメインを含むもの。
１６．態様１〜１５のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラであって、不活性化切断部位が、二重トロンビン−トロンビン部位、第Ｘａ因子部位、二重第Ｘａ因子−トロンビン部位及び／又はＭＭＰ−９部位を含むもの。
１７．態様１〜１６のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラであって、非クロストリジウム毒素結合ドメインが、オピオド（ｏｐｉｏｄ）結合ドメイン、タキキニン結合ドメイン、メラノコルチン結合ドメイン、ガラニン結合ドメイン、グラニン結合ドメイン、神経ペプチドＹ関連ペプチド結合ドメイン、神経ホルモン結合ドメイン、神経調節サイトカイン結合ドメイン、キニンペプチド結合ドメイン、成長因子結合ドメイン及び／又はグルカゴン様ホルモン結合ドメインを含むもの。
１８．不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むＢｏＮＴ／Ａであって、不活性化切断部位領域が転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
１９．ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
２０．ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、外因性プロテアーゼ切断部位が２本鎖ループ領域内に位置し、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
２１．ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
２２．ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、外因性プロテアーゼ切断部位が２本鎖ループ領域内に位置し、不活性化切断部位領域が転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
２３．態様１８〜２２の毒素及び／又はキメラであって、不活性化切断部位領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号４及び／又は配列番号５のアミノ酸４６２〜４９６、６１８〜６３４、６３８〜６５１、６６５〜６８７、７５２〜７６５、８２６〜８３５、８４４〜８６３及び／又は８７１〜８９５及び／又は配列番号３のアミノ酸４５８〜４９２、６１４〜６３０、６３４〜６４７、６６５〜６８７、７４８〜７６１、８２２〜８３１、８４０〜８５９及び／又は８６７〜８９１を含むもの。
２４．不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むＢｏＮＴ／Ｂであって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
２５．ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
２６．ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、外因性プロテアーゼ切断部位が２本鎖ループ領域内に位置し、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
２７．ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
２８．ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、外因性プロテアーゼ切断部位が２本鎖ループ領域内に位置し、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
２９．態様２４〜２８の毒素及び／又はキメラであって、不活性化切断部位領域が、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０のアミノ酸４６４〜４８７、６０５〜６２１、６２５〜６３８、６５２〜６７４、７３９〜７５２、８１３〜８２４、８３１〜８５０及び／又は８５８〜８８２を含むもの。
３０．不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むＢｏＮＴ／Ｃ１であって、不活性化切断部位領域が転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
３１．ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
３２．ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、外因性プロテアーゼ切断部位が２本鎖ループ領域内に位置し、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
３３．ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
３４．ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、外因性プロテアーゼ切断部位が２本鎖ループ領域内に位置し、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
３５．態様３０〜３４の毒素及び／又はキメラであって、不活性化切断部位領域が、配列番号１１及び／又は配列番号１２のアミノ酸４６３〜４９６、６１３〜６２９、６３３〜６４６、６６０〜６８２、７４７〜７６０、８２１〜８３０、８３９〜８５８及び／又は８６６〜８９０を含むもの。
３６．不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むＢｏＮＴ／Ｄであって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
３７．ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
３８．ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、外因性プロテアーゼ切断部位が２本鎖ループ領域内に位置し、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
３９．ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
４０．ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、外因性プロテアーゼ切断部位が２本鎖ループ領域内に位置し、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
４１．態様３６〜４０の毒素及び／又はキメラであって、不活性化切断部位領域が、配列番号１３及び／又は配列番号１４のアミノ酸４５８〜４９１、６０９〜６２５、６２９〜６４２、６５６〜６７８、７４３〜７５６、８１７〜８２６、８３５〜８５４及び／又は８６２〜８８６を含むもの。
４２．不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むＢｏＮＴ／Ｅであって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
４３．ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
４４．ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、外因性プロテアーゼ切断部位が２本鎖ループ領域内に位置し、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
４５．ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
４６．ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、外因性プロテアーゼ切断部位が２本鎖ループ領域内に位置し、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
４７．態様４２〜４６の毒素及び／又はキメラであって、不活性化切断部位領域が、配列番号１５、配列番号１６及び／又は配列番号１７のアミノ酸４３４〜４６７、５８７〜６０３、６０７〜６２０、６３４〜６５９、７２４〜７３９、８００〜８０９、８１８〜８３７及び／又は８４５〜８６９を含むもの。
４８．不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むＢｏＮＴ／Ｆであって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
４９．ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
５０．ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、外因性プロテアーゼ切断部位が２本鎖ループ領域内に位置し、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
５１．ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
５２．ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、外因性プロテアーゼ切断部位が２本鎖ループ領域内に位置し、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
５３．態様４８〜５２の毒素及び／又はキメラであって、不活性化切断部位領域が、配列番号１８のアミノ酸４５３〜４８６、６０４〜６２０、６２４〜６３７、６５１〜６７６、７４１〜７５６、８１７〜８２６、８３５〜８５４及び／又は８６２〜８８６；及び／又は配列番号１９及び／又は配列番号２０のアミノ酸４５３〜４８６、６０５〜６２１、６２５〜６３８、６５２〜６７７、７４２〜７５７、８１８〜８２７、８３６〜８５５及び／又は８６３〜８８７を含むもの。
５４．不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むＢｏＮＴ／Ｇであって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
５５．ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
５６．ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、外因性プロテアーゼ切断部位が２本鎖ループ領域内に位置し、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
５７．ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
５８．ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、外因性プロテアーゼ切断部位が２本鎖ループ領域内に位置し、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
５９．態様５４〜５８の毒素及び／又はキメラであって、不活性化切断部位領域が、配列番号２１のアミノ酸４５８〜４９１、６１０〜６２６、６３０〜６４３、６５７〜６７９、７４４〜７５７、８１８〜８２７、８３６〜８５５及び／又は８６３〜８８７を含むもの。
６０．不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むＢａＮＴであって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
６１．ＢａＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ転移ドメイン、ＢａＮＴ結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
６２．ＢａＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ転移ドメイン、ＢａＮＴ結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、外因性プロテアーゼ切断部位が２本鎖ループ領域内に位置し、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
６３．ＢａＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
６４．ＢａＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、外因性プロテアーゼ切断部位が２本鎖ループ領域内に位置し、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
６５．態様６０〜６４の毒素及び／又はキメラであって、不活性化切断部位領域が、配列番号２３のアミノ酸４４３〜４７６、５９６〜６１２、６１６〜６２９、６４３〜６６８、７３３〜７４８、８０９〜８１９、８２８〜８４７及び／又は８５５〜８７９を含むもの。
６６．不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むＢｕＮＴであって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
６７．ＢｕＮＴ酵素ドメイン、ＢｕＮＴ転移ドメイン、ＢｕＮＴ結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
６８．ＢｕＮＴ酵素ドメイン、ＢｕＮＴ転移ドメイン、ＢｕＮＴ結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、外因性プロテアーゼ切断部位が２本鎖ループ領域内に位置し、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
６９．ＢｕＮＴ酵素ドメイン、ＢｕＮＴ転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
７０．ＢｕＮＴ酵素ドメイン、ＢｕＮＴ転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、外因性プロテアーゼ切断部位、２本鎖ループ領域及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、外因性プロテアーゼ切断部位が２本鎖ループ領域内に位置し、不活性化切断部位領域が、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置するもの。
７１．態様６６〜７０の毒素及び／又はキメラであって、不活性化切断部位領域が、配列番号２４及び／又は配列番号２５のアミノ酸４３４〜４６７、５８７〜６０３、６０７〜６２０、６３４〜６５９、７２４〜７３９、８００〜８０９、８１８〜８３７及び／又は８４５〜８６９を含むもの。
７２．態様１〜７１の毒素及び／又はキメラであって、不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラの安全域が、同じ及び／又は類似するが不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラと比較して大きいもの。
７３．態様７２の毒素及び／又はキメラであって、不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラの安全域が、同じ及び／又は類似するが不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％及び／又は少なくとも３００％より大きく及び／又は
不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラの安全域が、同じ及び／又は類似するが不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、最大で１０％、最大で２０％、最大で３０％、最大で４０％、最大で５０％、最大で６０％、最大で７０％、最大で８０％、最大で９０％、最大で１００％、１１０％、最大で１２０％、最大で１３０％、最大で１４０％、最大で１５０％、最大で１６０％、最大で１７０％、最大で１８０％、最大で１９０％、最大で２００％、２１０％、最大で２２０％、最大で２３０％、最大で２４０％、最大で２５０％、最大で２６０％、最大で２７０％、最大で２８０％、最大で２９０％及び／又は最大で３００％より大きく及び／又は
不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラの安全域が、同じ及び／又は類似するが不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、約１０％から約３００％、約２０％から約３００％、約３０％から約３００％、約４０％から約３００％、約５０％から約３００％、約６０％から約３００％、約７０％から約３００％、約８０％から約３００％、約９０％から約３００％及び／又は約１００％から約３００％、大きいか又は
不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラの安全域が、同じ及び／又は類似するが不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、少なくとも１倍、少なくとも１倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍及び／又は少なくとも１０倍より大きく及び／又は
不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラの安全域が、同じ及び／又は類似するが不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、少なくとも１倍、最大で１倍、最大で３倍、最大で４倍、最大で５倍、最大で６倍、最大で７倍、最大で８倍、最大で９倍及び／又は最大で１０倍よりも大きく及び／又は
不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラの安全域が、約１倍から約１０倍、約１倍から約９倍、約１倍から約８倍、約１倍から約７倍、約１倍から約６倍、約１倍から約５倍、約２倍から約１０倍、約２倍から約９倍、約２倍から約８倍、約２倍から約７倍、約２倍から約６倍及び／又は約２倍から約５倍、大きいもの。
７４．態様１〜７３の毒素及び／又はキメラであって、不活性化切断部位の付加によって、同じ及び／又は類似するがさらなる不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、クロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラの安全域が向上しているもの。
７５．態様74の毒素及び／又はキメラであって、クロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラが、同じ及び／又は類似するがさらなる不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％及び／又は少なくとも３００％、クロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラの安全域を向上させる不活性化切断部位の付加を含むか又は
クロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラが、同じ及び／又は類似するがさらなる不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、最大で１０％、最大で２０％、最大で３０％、最大で４０％、最大で５０％、最大で６０％、最大で７０％、最大で８０％、最大で９０％、最大で１００％、１１０％、最大で１２０％、最大で１３０％、最大で１４０％、最大で１５０％、最大で１６０％、最大で１７０％、最大で１８０％、最大で１９０％、最大で２００％、２１０％、最大で２２０％、最大で２３０％、最大で２４０％、最大で２５０％、最大で２６０％、最大で２７０％、最大で２８０％、最大で２９０％及び／又は最大で３００％、クロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラの安全域を向上させる不活性化切断部位の付加を含むか又は
クロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラが、同じ及び／又は類似するがさらなる不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、約１０％から約３００％、約２０％から約３００％、約３０％から約３００％、約４０％から約３００％、約５０％から約３００％、約６０％から約３００％、約７０％から約３００％、約８０％から約３００％、約９０％から約３００％及び／又は約１００％から約３００％、クロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラの安全域を向上させる不活性化切断部位の付加を含むか又は
クロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラが、同じ及び／又は類似するがさらなる不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、少なくとも１倍、少なくとも１倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍及び／又は少なくとも１０倍、クロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラの安全域を向上させる不活性化切断部位の付加を含み及び／又は
クロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラが、同じ及び／又は類似するがさらなる不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、例えば、最大で１倍、最大で３倍、最大で４倍、最大で５倍、最大で６倍、最大で７倍、最大で８倍、最大で９倍及び／又は最大で１０倍、クロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラの安全域を向上させる不活性化切断部位の付加を含み及び／又は
クロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラが、同じ及び／又は類似するがさらなる不活性化切断部位がないクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラと比較して、約１倍から約１０倍、約１倍から約９倍、約１倍から約８倍、約１倍から約７倍、約１倍から約６倍、約１倍から約５倍、約２倍から約１０倍、約２倍から約９倍、約２倍から約８倍、約２倍から約７倍、約２倍から約６倍及び／又は約２倍から約５倍、クロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラの安全域を向上させる不活性化切断部位の付加を含むもの。
７６．態様１〜７５の何れか１つに記載の毒素及び／又はキメラをコードするポリヌクレオチド分子。
７７．配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４及び／又は配列番号５３６を含む、ポリヌクレオチド分子。
７８．態様７６及び／又は７７に記載のポリヌクレオチド分子を細胞において発現させる段階を含むクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラを作製する方法であって、ポリヌクレオチド分子からの発現によって、コードされるクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラを産生させる、方法。
７９．ａ．態様７６及び／又は７７に記載のポリヌクレオチド分子を細胞に導入し、
ｂ．そのポリヌクレオチド分子を発現させる、
段階を含む、改変クロストリジウム毒素を作製する方法であって、
ポリヌクレオチド分子からの発現によって、コードされるクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラを産生させる、方法。
８０．配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５及び／又は配列番号５３７を含む、クロストリジウム毒素。
８１．配列番号５３１を含むクロストリジウム毒素。
８２．配列番号５３３を含むクロストリジウム毒素。
８３．配列番号５３５を含むクロストリジウム毒素。
８４．配列番号５３７を含むクロストリジウム毒素。
【実施例】
【０３８２】
実施例
次の非限定例は、開示される実施形態のより完全な理解を容易にするために単に説明を目的として提供されるものであり、本明細で開示される実施形態の何れも何ら制限するものではない。
【０３８３】
実施例１
不活性化切断部位領域の特定
この実施例は、不活性化切断部位を含むように毒素を改変するために適切なクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラ内の領域を特定する方法及び不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを作製する方法を例示する。
【０３８４】
不活性化切断部位領域の候補として適切なタンパク質構造の位置を特定するために、コンピュータソフトウェアによって最初にＢｏＮＴ／Ａの三次元構造を解析してプロテアーゼにとってより接近可能である表面露出ループ又は延長領域を特定した。接近可能であると予測される領域のうち、８箇所、すなわち配列番号１のアミノ酸４６２〜４９６、配列番号１のアミノ酸６１８〜６３４、配列番号１のアミノ酸６３８〜６５１、配列番号１のアミノ酸６６５〜６８７、配列番号１のアミノ酸７５２〜７６５及び配列番号１のアミノ酸８２６〜８３５、配列番号１のアミノ酸８４４〜８６３及び配列番号１のアミノ酸８７１〜８９５をさらなる解析のために選択した。
【０３８５】
コンピュータ解析により特定された領域が不活性化切断部位領域として機能し得るか否かを調べるために、マルチプライマー突然変異誘発を用いてトロンビン切断部位を遺伝子操作してこれらの領域に入れ、トロンビンによるその被切断能についてアッセイした。ＢｏＮＴ／Ａをコードする発現コンストラクト、例えば、ｄａｍメチラーゼで高度メチル化された、配列番号５２７をコードする配列番号５２６を含む発現コンストラクト又は配列番号５２９をコードする配列番号５２８を含む発現コンストラクトなどを含むＤＮＡ鋳型と様々な比率で混合された望ましい修飾をそれぞれ含有する一方向性オリゴヌクレオチドプライマーのプライマープール（プライマー各１２５ｎｇ）を含む、５０μＬの反応液を調製した。この混合液に、５μＬの１０ｘＰＣＲ緩衝液、１μＬのデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、１μＬの２．５単位／μＬ  ＰＦＵＵＬＴＲＡ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、Ｐｆｕ  ＤＮＡリガーゼ、ＡＴＰ及びヌクレアーゼ不含水を添加して、５０μＬの最終体積とした。サーモサイクラー条件は、９６℃で１分間、６０℃で３０秒間及び６８℃で２０分間を３０サイクル行うというものであった。サーモサイクル後、１μＬのＤｐｎ１制限酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を反応液に添加し、３７℃で１時間インキュベートして、鋳型ＤＮＡを消化し、野生型クローンの回収を減少させた。消化した反応混合液をエレクトロポレーションによってエレクトロコンピーテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）Ａｃｅｌｌａ細胞（Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ）に形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する１．５％Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天プレート（ｐＨ７．０）に播種し、３７℃のインキュベーターに入れて一晩増殖させた。発現コンストラクトを含有する細菌をカナマイシン耐性コロニーとして特定した。アルカリ溶菌プラスミド小規模調製手順を用いて候補コンストラクトを単離し、組み込まれた突然変異の頻度及び正体を調べるために、配列決定を行うことによって解析した。表７は、作製し、このトロンビンスキャン分析で試験したトロンビン切断部位（ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＣＳ）を含む各ＢｏＮＴ／Ａを列挙する。
【表７−１】
2018012696.tif 000018
【表７−２】
2018012696.tif 000019
【０３８６】
各ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＣＳに対する可溶性タンパク質の発現レベルを調べるために、各ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＣＳを含む発現コンストラクトを発現させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。第一に、９６ウェルプレートを用いて、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する１００μＬのＰＡ−０．５Ｇ培地に適切な発現コンストラクトを有するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の単一コロニーを接種し、振盪しながら一晩３７℃で増殖させた。この出発培養物からの５μＬアリコートを使用して５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する１ｍＬのＺＹＰ−５０５２に接種し、振盪しながら３７℃で３．５時間及び２２℃で１６時間増殖させた。１０ｘＦＡＳＴＢＲＥＡＫ（商標）細胞溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２５０Ｕ／ｍＬベンゾナーゼヌクレアーゼ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及び１０ｘプロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）を含むタンパク質抽出試薬の１１０μＬアリコートを９６ウェルプレート中の各１ｍＬの発現培養物に添加した。次に７５μＬのＨＩＳＬＩＮＫ（商標）レジン（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を各ウェルに移し、ピペッティング処理すること及び９００ｒｐｍで３０分間振盪することを交互に行うことによって、混合物を混合した。膜を予め水で湿らせた２５μｍ細孔サイズのフィルタープレート（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に溶解液を移し、真空ろ過によって液体を除去した。１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭイミダゾールを含む２００μＬ洗浄緩衝液で樹脂を３回洗浄した。１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭイミダゾールを含む２００μＬの溶出緩衝液を添加し、５分間インキュベートすることによってタンパク質を溶出させ、真空ろ過により溶出液を９６ウェルプレートに回収した。
【０３８７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うために、トロンビン切断部位を含むＩＭＡＣ精製ＢｏＮＴ／Ａに等量の２ｘＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液を添加し、混合物を９５℃で５分間インキュベートした。１５μＬのアリコートを載せ、変性、還元条件下で、ＮＵＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。このゲルを洗浄し、１０％メタノール及び７％酢酸中で３０分間固定した。洗浄溶液を除去し、ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色溶液中で３時間から一晩、室温にてゲルをインキュベートした。染色したゲルを１０％メタノール及び７％酢酸中で３０分間脱色した。脱色したゲルをＦｌｕｏｒｏ−Ｓ−Ｍａｘデジタル撮像装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で視覚化した。
【０３８８】
発現分析の結果を表７に示す。全般的に、配列番号１のアミノ酸４６２〜４９６、配列番号１のアミノ酸８４４〜８６３又はアミノ酸８７１〜８９５を含む不活性化領域にトロンビン切断部位が挿入された毒素が良好に発現された。例えば、Ａ４８９ｉｎｓＬＶＰＲＧＳを含む毒素は、野生型対照コンストラクトの場合の約５０％発現され、Ｄ８４８ｉｎｓＬＶＰＲＧＳ又はＮ８８０ｉｎｓＬＶＰＲＧＳを含む毒素は、対照レベルで又はそれに近いレベルで発現された（表７）。これらの結果から、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメイン内に位置する不活性化切断部位領域は、プロテアーゼ切断部位を含むような領域の修飾に耐えたことが明らかになる。
【０３８９】
特定された不活性化切断部位領域がプロテアーゼ切断部位を導入する修飾に耐え得る程度をさらに調べるために、領域全体にわたりトロンビン切断部位を含むように毒素を修飾した。例えば、配列番号１の８４４〜８６３を含む不活性化切断部位領域を調べるために、Ｔ８８４ｉｎｓＬＶＰＲＧＳ又はＬ８６２ｉｎｓＬＶＰＲＧＳを含む毒素を作製した。同様に、配列番号１の８７１〜８９５を含む不活性化切断部位領域を調べるために、Ｅ８６８ｉｎｓＬＶＰＲＧＳ、ｄｅｌＥ８６８ＹＩＫＮＩ−ｉｎｓＬＶＰＲＧＳ、ｄｅｌＮ８７２ＩＩＮＴＳ−ｉｎｓＬＶＰＲＧＳ、Ｔ８７６ｉｎｓＬＶＰＲＧＳ、Ｌ８７９ｉｎｓＶＰＲＧＳ、ｄｅｌＬ８７９ＮＬＲＹＥ−ｉｎｓＬＶＰＲＧＳ、Ｌ８８１ｉｎｓＶＰＲＧＳ、ｄｅｌＬ８８１ＲＹＥＳＮ−ｉｎｓＬＶＰＲＧＳ、Ｙ８８３ｉｎｓＬＶＰＲＧＳ、Ｅ８８４ｉｎｓＬＶＰＲＧＳ、Ｓ８８５ｉｎｓＬＶＰＲＧＳ、ｄｅｌＨ８８７ＬＩＤＬＳ−ｉｎｓＬＶＰＲＧＳ、Ｌ８８８ｉｎｓＬＶＰＲＧＳ、Ｌ８９１ｉｎｓＶＰＲＧ及びｄｅｌＳ８９２ＲＹＡ−ｉｎｓＶＰＲＧを含む毒素を作製した。修飾のタイプが何らかの影響を及ぼすか否かを調べるために、挿入及び置換修飾の両方を行った。一般に、これらの不活性化領域中にトロンビン切断部位が挿入されている全毒素が、野生型対照コンストラクトレベルで又はそれに近いレベルで発現された。これらの結果から、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメイン内の不活性化切断部位領域は、不活性化部位領域内の何れの場所に置かれる修飾にも耐え得ることが明らかになる。
【０３９０】
最後に、２以上のプロテアーゼ切断部位の存在に対する不活性化部位領域の耐容能を調べた（表７）。これらの結果から、転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメイン内の不活性化切断部位領域が、不活性化部位領域内に２以上のプロテアーゼ切断部位が置かれる修飾に耐え得ることが示される。
【０３９１】
トロンビン切断部位を含むＢｏＮＴ／Ａが、トロンビンによって切断され得るか否かを調べるために、インビトロのトロンビン切断アッセイを行った。５μｇの各精製ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＣＳを１Ｕのトロンビン（Ｎｏｖａｇｅｎ）とともに２３℃で１時間、３時間及び１８．５時間インキュベートした。酵素ゼロの対照も各ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＣＳに対して並行して設定した。各時間点で試料を採取し、ＤＴＴを含むＳＤＳローディング緩衝液で反応停止させ、上述のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０３９２】
発現分析の結果を表７に示す。一般に、プロテアーゼ切断部位を含むようにするための配列番号１のアミノ酸４６７〜４９６、８４４〜８６３又は８７１〜８９５を含む不活性化切断部位領域の修飾の結果、毒素が適切なプロテアーゼによるタンパク質分解性切断を受け易くなった。
【０３９３】
トロンビン切断部位を含むＢｏＮＴ／Ａがその効力を維持していたか否かを調べるために、細胞に基づく活性アッセイを使用してＢｏＮＴ／Ａ活性アッセイを行った。細胞に基づく活性アッセイを行うために、アール塩、１ｘＢ２７サプリメント、１ｘＮ２サプリメント、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び２５μｇ／ｍＬ  ＧＴ１ｂとともに最小必須培地、２ｍＭ  ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）Ｉを含有する１ｍＬの血清不含培地を含有する２４ウェル組織培養プレートのウェルに約１．２ｘ１０６個のＮｅｕｒｏ−２ａ又はＳｉＭａ細胞を入れた。３７℃恒温槽中、５％二酸化炭素下で、標準的及び通例の形態学的規準、例えば増殖停止及び軸索伸張などにより評価して細胞が分化するまで（およそ３日間）、細胞をインキュベートした。各ウェルから培地を吸引し、１）毒素を含有しない新鮮培地（未処理株化細胞）又は２）１ｎＭのＢｏＮＴ／Ａ複合体を含有する新鮮培地（処理済株化細胞）の何れかに交換した。一晩温置した後、培地を吸引し、各ウェルを２００μＬの１ｘＰＢＳですすぐことによって細胞を洗浄した。細胞を回収するために、１ｘＰＢＳを吸引し、５０μＬの２ｘＳＤＳローディング緩衝液を添加することによって細胞を溶解し、溶解液を清浄な試験管に移し、９５℃で５分間、試料を加熱した。
【０３９４】
切断されたＳＮＡＰ−２５産物の有無について検出するために、ウエスタンブロットによって各回収試料からのアリコートを分析した。この分析において、変性、還元条件下でＮＵＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  １２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、回収試料の１２μＬのアリコートをＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ（登録商標）ＳＤセミドライ電気泳動転写セル装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて、ウエスタンブロッティングによって、分離したペプチドをゲルからポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に移した。Ｔｒｉｓ−緩衝食塩水（ＴＢＳ）（２５ｍＭ  ２−アミノ２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７．４）、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム）、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５％脱脂乳を含有する溶液中で室温で２時間インキュベートすることによってＰＶＤＦ膜をブロッキング処理した。４℃で一晩、１）一次抗体としてα−ＳＮＡＰ−２５マウスモノクローナル抗体（ＳＭＩ−８１；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｌｕｔｈｅｒｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）の１：５，０００希釈液；又は２）一次抗体としてＳ９６８４α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗血清（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の１：５，０００希釈液の何れかを含有する、ＴＢＳ、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、２％ＢＳＡ及び５％脱脂乳中でブロッキング処理膜をインキュベートした。α−ＳＮＡＰ−２５マウスモノクローナル抗体及びウサギポリクローナル抗体の両方とも、未切断ＳＮＡＰ−２５基質及びＳＮＡＰ−２５切断産物の両方を検出することができ、これによって、各株化細胞において、ＢｏＮＴ／Ａ取り込みの量を評価するためのパラメーターとして、ＢｏＮＴ／Ａ処理後に切断されるＳＮＡＰ−２５のパーセンテージで、全体的なＳＮＡＰ−２５発現の評価が可能となる。ＴＢＳ、ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）中で、一次抗体で探索したブロットを各回１５分間、３回洗浄した。１）二次抗体として、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギポリクローナル抗マウス免疫グロブリンＧ、重及び軽鎖（ＩｇＧ、Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｚｙｍｅｄ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）の１：１０，０００希釈液；又は２）二次抗体として、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギポリクローナル抗ウサギ免疫グロブリンＧ、重及び軽鎖（ＩｇＧ、Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｚｙｍｅｄ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）の１：１０，０００希釈液の何れかを含有する、ＴＢＳ、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、２％ＢＳＡ及び５％脱脂乳中、室温で２時間、洗浄した膜をインキュベートした。ＴＢＳ、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）中で、二次抗体でプローブ処理したブロットを各回１５分間、３回洗浄した。ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（商標）ウエスタンブロット検出システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、標識されたＳＮＡＰ−２５産物のシグナル検出を視覚化し、膜を撮像し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４１０  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ撮像装置及び撮像装置分析ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で切断量のパーセンテージを調べた。ピクセルサイズ（１００から２００ピクセル）及びＰＭＴ電圧設定（３５０から６００、通常は４００）の選択は個々のブロットに依存した。
【０３９５】
発現分析の結果を表７に示す。一般に、プロテアーゼ切断部位を含むようにするための配列番号１のアミノ酸４６７〜４９６、８４４〜８６３又は８７１〜８９５を含む不活性化切断部位領域の修飾の結果、全体的な中毒化過程を遂行することができる強力な毒素が得られた。
【０３９６】
まとめると、これらの結果から、８個の異なる不活性化切断領域が特定されたが、全てが機能的トロンビン切断部位の挿入を担持できたわけではなかったことが示される。一般に、プロテアーゼ切断部位を含むようにするための配列番号１のアミノ酸４６７〜４９６、８４４〜８６３及び８７１〜８９５を含む不活性化切断部位領域の修飾の結果、全体的な中毒化過程を遂行することができ、適切なプロテアーゼによるタンパク質分解性切断に感受性がある毒素が安定して産生された。
【０３９７】
全クロストリジウム毒素の三次元構造が類似しているので、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＴｅＮＴ、ＢａＮＴ及びＢｕＮＴにおける対応する位置も、不活性化切断部位領域として適切である。表５でこれらの領域を列挙する。
【０３９８】
実施例２
プロテアーゼ切断部位分析
この実施例は、不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを作製する方法を説明する。
【０３９９】
トロンビン以外のプロテアーゼ切断部位が不活性化部位として有用であり得るか否かを調べるために、多くの様々なプロテアーゼ切断部位を含む毒素を調べた。
【０４００】
不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを作製するために、実施例１に記載のようにマルチプライマー突然変異誘発を用いて、プロテアーゼ切断部位を遺伝子操作して、不活性化切断部位領域に入れた。表８は、プロテアーゼ切断部位を含有するように改変された発現コンストラクトを列挙する。
【０４０１】
プロテアーゼ切断部位を含むＢｏＮＴ／Ａがその同系プロテアーゼにより切断され得るか否かを調べるために、基本的に上述のように、ただしトロンビンの代わりに適切なプロテアーゼを用いて、インビトロプロテアーゼ切断アッセイを行った。各時間点で試料を採取し、ＤＴＴを含むＳＤＳ−ローディング緩衝液で反応停止させ、実施例１に記載のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０４０２】
発現分析の結果を表７に示す。一般に、プロテアーゼ切断部位を含むようにするための配列番号１のアミノ酸４６７〜４９６、８４４〜８６３又は８７１〜８９５を含む不活性化切断部位領域の改変の結果、毒素が適切なプロテアーゼによるタンパク質分解性切断を受け易くなった。
【表８−１】
2018012696.tif 000020
【表８−２】
2018012696.tif 000021
【表８−３】
2018012696.tif 000022
【０４０３】
プロテアーゼ切断部位を含むＢｏＮＴ／Ａが、その効力を維持しているか否かを調べるために、上記の細胞に基づく活性アッセイを行った（表８）。全般的に、約２０以下のＥＣ５０を示したプロテアーゼ切断部位を含む毒素は、動物を利用したアッセイを使用した正当な評価に十分な効力を保持しているとみなした。
【０４０４】
実施例３
インビボ分析
この実施例は、動物を利用したアッセイ分析を用いて不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを評価する方法を説明する。
【０４０５】
細胞に基づく活性アッセイは、不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラがその同系プロテアーゼにより切断され得るか否かの良好な評価法ではあるが、動物を利用したアッセイにおける評価に対して若干の候補を選択した。
【０４０６】
動物を利用したアッセイを用いて不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの活性を試験するために、インビボでの指外転スコア（Ｄｉｇｉｔ  Ａｂｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｃｏｒｅ）（ＤＡＳ）アッセイを最初に行った。ＣＤ−１  Ｆｅマウスの体重を測定し、個別の各ＤＡＳアッセイのために動物を１０匹ずつサブセットに振り分けた。次の規準に基づき、マウスを特定のサブセットに入れた：１）健康状態良好；２）ロバストなベースラインＤＡＳ反応が０；３）選択したサブセットに対して確証されているＸ±２ｇの中央値体重範囲に含まれること及び４）体重が１７．０ｇより重いこと。
【０４０７】
１）不活性化切断部位を含む５μＬの１０．０ｎＭ  ＢｏＮＴ／Ａ（単回投与ＤＡＳ試験）；又は２）５μＬの、不活性化切断部位を含む７種類の異なる用量（０．０１ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．１２ｎＭ、０．３７ｎＭ、１．１１ｎＭ、３．３３ｎＭ及び１０．０ｎＭ；完全投与ＤＡＳ試験）のＢｏＮＴ／Ａのうち何れか１つを、各マウスの右後肢の腓腹筋に３０ゲージ針を使用して注射した。対照として、左後肢の腓腹筋に、毒素不含の５μＬの溶液を注射した。連続して最初の４日間にわたりＤＡＳ反応についてマウスを観察した。尾をつかんで各マウスを持ち上げ、注射した後肢を精密に観察することによって、ＤＡＳを読み取った。後肢の指の外転又は非外転から、筋肉に注射した試験毒素による麻痺の影響が分かる。注射した後肢の指の外転を注射しなかった後肢の指の外転と比較し、それに応じてスコア化した。μ／Ｋｇ及び／又はｎｇ／Ｋｇ単位として、ピーク平均ＤＡＳスコア及びＡＵＣ（曲線下面積）に基づきＥＤ５０用量を計算することによってＤＡＳデータを分析した。これは次の通り行った：１）各用量に対する平均ピークＤＡＳスコアを各試験に対して計算し；２）何れの試験においても６匹以上が死亡した用量は全て検討の対象から除外し；３）所与の個々の試験で使用した最大用量が、誘発があった最低用量である場合、平均ピークを４．０とし；４）所与の個々の試験で使用した最低用量が、誘発があった最大用量である場合、平均ピークを０とし；５）個々の各試験に対して、平均ピークＤＡＳ  ｖｓ．ｌｏｇ（用量）の曲線を構築し；６）いくつか試験における複数群の１０匹マウスの各群に対するＡＵＣ値を計算し；７）個々の各試験に対して、平均ＡＵＣ  ｖｓ．ｌｏｇ（用量）の曲線を構築し；８）各試験毒素に対する、複数の同一試験の各セットに対してｘ、ｙ反復反応曲線を構築し；９）３パラメーターロジスティック方程式（Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ  ｖ  ８．０；ＳＰＳＳ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を用い、次の式を用いて、非線形回帰（重みなし）により用量反応データを分析した：
ｙ＝ａ／（１＋（ｘ／ｘ０）ｂ）
（式中、ｙは反応であり、ａは漸近ｙｍａｘであり、ｂは傾きであり、ｘは用量であり、０はＥＤ５０用量であり、ピークＥＤ５０の計算に対しては、Ｙｍａｘは４に設定し（スケール上の最大ＤＡＳ読み取り）であった。行った各８用量の試験に対して平均（ピーク及び／又はＡＵＣ）ＥＤ５０値を計算した。
【０４０８】
これらの結果はそれを示す（表９）。一般に、約１０以上の相対強度を示した不活性化切断部位を含む毒素を、その安全域の正当な評価に十分な効力を保持するとみなした。
【０４０９】
不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域を判定するために、マウス致死性アッセイを行った。
【０４１０】
不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラの安全域を計算するために、完全投与ＤＡＳ試験から得られたＥＣ５０値でマウス致死性アッセイから得られたＬＤ５０値を除した。不活性化切断部位を含む毒素は、それが約１５以上の安全域値を示した場合、不活性化切断部位で十分な活性を保持するとみなした。
【表９−１】
2018012696.tif 000023
【表９−２】
2018012696.tif 000024
【０４１１】
ＤＡＳ分析後、ＥＤ５０をＬＤ５０と比較することによって安全域を判定するために、マウス致死性アッセイを用いて不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素又はクロストリジウム毒素キメラを評価した。
【０４１２】
本明細の態様を開示される実施形態に関して述べてきたが、当業者にとって当然のことながら、開示される具体例は単にこれらの態様を説明するものであり、何ら本明細を限定するものではない。本明細の精神から逸脱することなく、様々な変更がなされ得る。
【０４１３】
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
［１］不活性化切断部位領域内に位置する少なくとも１つの不活性化切断部位を含むクロストリジウム毒素であって、該不活性化切断部位領域が転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置し、該少なくとも１つの不活性化切断部位が、二重トロンビン−トロンビン部位、第Ｘａ因子部位、二重第Ｘａ因子−トロンビン部位及び／又はＭＭＰ−９部位を含む、クロストリジウム毒素。
［２］クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン、クロストリジウム毒素結合ドメイン、２本鎖ループ領域、外因性プロテアーゼ切断部位及び、不活性化切断部位領域内に位置する少なくとも２つの不活性化切断部位を含み、該外因性プロテアーゼ切断部位が該２本鎖ループ領域内に位置する、クロストリジウム毒素。
［３］前記不活性化切断部位が、二重トロンビン−トロンビン部位及び／又は二重第Ｘａ因子−トロンビン部位を含む、［２］に記載のクロストリジウム毒素。
［４］クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン及び、不活性化切断部位領域内に位置する不活性化切断を含む、クロストリジウム毒素キメラであって、該不活性化切断部位領域が転移ドメイン及び／又はＨＣＮ結合サブドメインに位置する、クロストリジウム毒素キメラ。
［５］前記不活性化切断部位領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号４及び／又は配列番号５のアミノ酸４６２〜４９６；配列番号３のアミノ酸４５８〜４９２；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０のアミノ酸４６４〜４８７；配列番号１１及び／又は配列番号１２のアミノ酸４６３〜４９６；配列番号１３及び／又は配列番号１４のアミノ酸４５８〜４９１；配列番号１５、配列番号１６及び／又は配列番号１７のアミノ酸４３４〜４６７；配列番号１８、配列番号１９及び／又は配列番号２０のアミノ酸４５３〜４８６；配列番号２１のアミノ酸４５８〜４９１；配列番号２３のアミノ酸４４３〜４７６；及び／又は配列番号２４及び／又は配列番号２５のアミノ酸４３４〜４６７のアミノ酸を含む、［１］から［４］に記載のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラ。
［６］前記不活性化切断部位領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号４及び／又は配列番号５のアミノ酸６１８〜６３４；配列番号３のアミノ酸６１４〜６３０；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０のアミノ酸６０５〜６２１；配列番号１１及び／又は配列番号１２のアミノ酸６１３〜６２９；配列番号１３及び／又は配列番号１４のアミノ酸６０９〜６２５；配列番号１５、配列番号１６及び／又は配列番号１７のアミノ酸５８７〜６０３；配列番号１８のアミノ酸６０４〜６２０；配列番号１９及び／又は配列番号２０のアミノ酸６０５〜６２１；配列番号２１のアミノ酸６１０〜６２６；配列番号２３のアミノ酸５９６〜６１２；及び／又は配列番号２４及び／又は配列番号２５のアミノ酸５８７〜６０３を含む、［１］から［４］に記載のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラ。
［７］前記不活性化切断部位領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号４及び／又は配列番号５のアミノ酸６３８〜６５１；配列番号３のアミノ酸６３４〜６４７；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０のアミノ酸６２５〜６３８；配列番号１１及び／又は配列番号１２のアミノ酸６３３〜６４６；配列番号１３及び／又は配列番号１４のアミノ酸６２９〜６４２；配列番号１５、配列番号１６及び／又は配列番号１７のアミノ酸６０７〜６２０；配列番号１８のアミノ酸６２４〜６３７；配列番号１９及び／又は配列番号２０のアミノ酸６２５〜６３８；配列番号２１のアミノ酸６３０〜６４３；配列番号２３のアミノ酸６１６〜６２９；及び／又は配列番号２４及び／又は配列番号２５のアミノ酸６０７〜６２０を含む、［１］から［４］に記載のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラ。
［８］前記不活性化切断部位領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号４及び／又は配列番号５のアミノ酸６６５〜６８７；配列番号３のアミノ酸６６１〜６８３；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０のアミノ酸６５２〜６７４；配列番号１１及び／又は配列番号１２のアミノ酸６６０〜６８２；配列番号１３及び／又は配列番号１４のアミノ酸６５６〜６７８；配列番号１５、配列番号１６及び／又は配列番号１７のアミノ酸６３４〜６５９；配列番号１８のアミノ酸６５１〜６７６；配列番号１９及び／又は配列番号２０のアミノ酸６５２〜６７７；配列番号２１のアミノ酸６５７〜６７９；配列番号２３のアミノ酸６４３〜６６８；及び／又は配列番号２４及び／又は配列番号２５のアミノ酸６３４〜６５９を含む、［１］から［４］に記載のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラ。
［９］前記不活性化切断部位領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号４及び／又は配列番号５のアミノ酸７５２〜７６５；配列番号３のアミノ酸７４８〜７６１；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０のアミノ酸７３９〜７５２；配列番号１１及び／又は配列番号１２のアミノ酸７４７〜７６０；配列番号１３及び／又は配列番号１４のアミノ酸７４３〜７５６；配列番号１５、配列番号１６及び／又は配列番号１７のアミノ酸７２４〜７３９；配列番号１８のアミノ酸７４１〜７５６；配列番号１９及び／又は配列番号２０のアミノ酸７４２〜７５７；配列番号２１のアミノ酸７４４〜７５７；配列番号２３のアミノ酸７３３〜７４８；及び／又は配列番号２４及び／又は配列番号２５のアミノ酸７２４〜７３９を含む、［１］から［４］に記載のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラ。
［１０］前記不活性化切断部位領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号４及び／又は配列番号５のアミノ酸８２６〜８３５；配列番号３のアミノ酸８２４〜８３１；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０のアミノ酸８１３〜８２４；配列番号１１及び／又は配列番号１２のアミノ酸８２１〜８３０；配列番号１３及び／又は配列番号１４のアミノ酸８１７〜８２６；配列番号１５、配列番号１６及び／又は配列番号１７のアミノ酸８００〜８０９；配列番号１８のアミノ酸８１７〜８２６；配列番号１９及び／又は配列番号２０のアミノ酸８１８〜８２７；配列番号２１のアミノ酸８１８〜８２７；配列番号２３のアミノ酸８０９〜８１９；及び／又は配列番号２４及び／又は配列番号２５のアミノ酸８００〜８０９を含む、［１］から［４］に記載のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラ。
［１１］前記不活性化切断部位領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号４及び／又は配列番号５のアミノ酸８４４〜８６３；配列番号３のアミノ酸８４０〜８５９；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０のアミノ酸８３１〜８５０；配列番号１１及び／又は配列番号１２のアミノ酸８３９〜８５８；配列番号１３及び／又は配列番号１４のアミノ酸８３５〜８５４；配列番号１５、配列番号１６及び／又は配列番号１７のアミノ酸８１８〜８３７；配列番号１８のアミノ酸８３５〜８５４；配列番号１９及び／又は配列番号２０のアミノ酸８３６〜８５５；配列番号２１のアミノ酸８３６〜８５５；配列番号２３のアミノ酸８２８〜８４７；及び／又は配列番号２４及び／又は配列番号２５のアミノ酸８１８〜８３７を含む、［１］から［４］に記載のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラ。
［１２］前記不活性化切断部位領域が、配列番号１、配列番号２、配列番号４及び／又は配列番号５のアミノ酸８７１〜８９５；配列番号３のアミノ酸８６７〜８９１；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び／又は配列番号１０のアミノ酸８５８〜８８２；配列番号１１及び／又は配列番号１２のアミノ酸８６６〜８９０；配列番号１３及び／又は配列番号１４のアミノ酸８６２〜８８６；配列番号１５、配列番号１６及び／又は配列番号１７のアミノ酸８４５〜８６９；配列番号１８のアミノ酸８６２〜８８６；配列番号１９及び／又は配列番号２０のアミノ酸８６３〜８８７；配列番号２１のアミノ酸８６３〜８８７；配列番号２３のアミノ酸８５５〜８７９；及び／又は配列番号２４及び／又は配列番号２５のアミノ酸８４５〜８６９を含む、［１］から［４］に記載のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラ。
［１３］前記クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＢａＮＴ酵素ドメイン及び／又はＢｕＮＴ酵素ドメインを含む、［１］から［１２］に記載のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラ。
［１４］前記不活性化切断部位が、トロンビン切断部位、プラスミン切断部位、凝固第ＶＩＩａ因子切断部位、凝固第ＩＸａ因子切断部位、凝固第Ｘａ因子切断部位、凝固第ＸＩａ因子切断部位、凝固第ＸＩＩａ因子切断部位、血漿カリクレイン切断部位、プロテアーゼ活性化Ｇタンパク質共役型受容体−１（ＰＡＲ１）切断部位、ＰＡＲ２切断部位、ＰＡＲ３切断部位、ＰＡＲ４切断部位、マトリクスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）切断部位、マトリクスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）切断部位、フューリン切断部位、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）切断部位、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）切断部位、トリプターゼ−ε切断部位、マウス肥満細胞プロテアーゼ−７（ｍＭＣＰ−７）切断部位、エンドセリン変換酵素−１（ＥＣＥ−１）切断部位、ケル式血液型切断部位、ＤＰＰＩＶ切断部位、トロンボスポンジン１型モチーフ−１３のあるＡＤＡＭメタロペプチダーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）切断部位及び／又はカテプシンＬ切断部位を含む、［１］から［１３］に記載のクロストリジウム毒素及び／又はクロストリジウム毒素キメラ。
［１５］配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５及び／又は配列番号５３７を含む、クロストリジウム毒素。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【配列表】
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