(57)【要約】      （修正有）【課題】脳腫瘍のミクロ環境において、血液脳関門を横切る内皮エンドサイトーシス／トランスサイトーシスまたは、通常の手法に従ってナノ粒子が前記ミクロ環境中に進入した他の機構を必要とすることなく、治療上有意な濃度でミニセルの速やかな蓄積をもたらす、画像化剤を脳腫瘍へ送達する方法の提供。【解決手段】複数のインタクトな、細菌由来のミニセルを含む脳腫瘍を有する被験体の脳腫瘍の画像化において使用するための医薬組成物であって、(A)前記複数の各ミニセルが、(i)腫瘍細胞抗原を特異的に認識する非ファゴサイトーシス哺乳動物細胞表面受容体に対して特異性を有するリガンド、および(ii)画像化剤を含み、かつ(B)脳腫瘍はその壁に窓を有する血管を有し、ミニセルは該窓を通って受動的に遊出することができる、前記医薬組成物。【選択図】図１
2018024678.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のインタクトな、細菌由来のミニセルを含む組成物の治療上有効量を全身投与するステップを含むものである被験体の脳腫瘍を治療する方法であって、前記複数の各ミニセルが抗新生物剤を包含する前記方法。
【請求項２】
前記抗新生物剤が放射性核種である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
放射性核種がイットリウム-90、テクネチウム-99m、ヨウ素-123、ヨウ素-131、ルビジウム-82、タリウム-201、ガリウム-67、フッ素-18、キセノン-133、およびインジウム-111から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
放射性核種が前記ミニセルの表面上のタンパク質または糖質と結合している、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
放射性核種がミニセルの表面と会合した二特異的抗体と結合している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が約30Gy〜約100Gy放射能を含有する、請求項２〜５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗新生物剤が化学療法薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記化学療法薬が約400ダルトン超の分子量を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記化学療法薬が標的化癌に対する前記化学療法薬のED50より低いLD50を有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が多くても約1mgの前記化学療法薬を含有する、請求項７〜９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗新生物剤が機能性核酸または機能性核酸をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記機能性核酸が腫瘍細胞増殖、血管新生もしくは化学療法に対する耐性を促進する遺伝子および／またはアポトーシスもしくは細胞周期停止を阻害する遺伝子を阻害する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記機能性核酸がsiRNA、miRNA、shRNA、lincRNA、アンチセンスRNA、またはリボザイムから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗新生物剤がアポトーシスを促進する遺伝子をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の各ミニセルが非ファゴサイトーシス哺乳動物細胞表面受容体に対して特異性を有するリガンドを含むものである、請求項１〜１４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
前記受容体が腫瘍細胞抗原である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記リガンドが前記腫瘍細胞抗原を特異的に認識する抗体を含むものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数が少なくとも約108ミニセルを含むものである、請求項１〜１７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数が少なくとも約1010ミニセルを含むものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が約10 EU未満の遊離内毒素を含有する、請求項１〜１９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が108 ミニセル当たり多くても1つの親細菌細胞を含有する、請求項1〜２０のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
前記脳腫瘍が膠芽細胞腫、星状膠細胞腫、希突起膠細胞腫、上衣細胞腫、頭蓋咽頭腫、下垂体腫、脳の原発性リンパ腫、松果体腺腫、脳の原発性胚細胞腫、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1〜２１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
前記脳腫瘍が転移性脳腫瘍である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
脳腫瘍の治療用医薬品を製造するための組成物の使用であって、組成物が複数のインタクトな、細菌由来のミニセルを含み、前記複数の各ミニセルが抗新生物剤を包含するものである前記使用。
【請求項２５】
前記組成物が多くとも約1mgの化学療法薬を前記抗新生物剤として含有する、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記抗新生物剤が機能性核酸または機能性核酸をコードするポリヌクレオチドである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】
前記機能性核酸が腫瘍細胞増殖、血管新生もしくは化学療法に対する耐性を促進する遺伝子および／またはアポトーシスもしくは細胞周期停止を阻害する遺伝子を阻害する、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記抗新生物剤がアポトーシスを促進する遺伝子をコードするポリヌクレオチドである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２９】
前記抗新生物剤が放射性核種である、請求項２４に記載の使用。
【請求項３０】
前記複数が少なくとも約1010ミニセルを含む、請求項２４に記載の使用。
【請求項３１】
前記組成物が約10 EU未満の遊離内毒素を含有する、請求項２４に記載の使用。
【請求項３２】
前記複数の各ミニセルが非ファゴサイトーシス哺乳動物細胞の表面受容体に対して特異性を有するリガンドを含むものである、請求項２４に記載の使用。
【請求項３３】
前記脳腫瘍が膠芽細胞腫、星状膠細胞腫、希突起膠細胞腫、上衣細胞腫、頭蓋咽頭腫、下垂体腫、脳の原発性リンパ腫、松果体腺腫、脳の原発性胚細胞腫、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２４に記載の使用。
【請求項３４】
前記脳腫瘍が転移性脳腫瘍である、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記抗新生物剤が約400ダルトン超の分子量を有する化学療法薬である、請求項２４に記載の使用。
【請求項３６】
前記化学療法薬が標的化癌に対する前記化学療法薬のED50より低いLD50を有する、請求項３５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
原発性脳腫瘍は、様々な異なる細胞系譜由来の新生物の多様な群から構成される。世界保健機構分類（World Health Organization categorization）（Louisら、2007）によると、中枢神経系の腫瘍は星状膠細胞型、希突起膠細胞型、または混合型（希突起星状膠細胞型）として分類される。これらの腫瘍はさらに亜型により分類され、組織学に基づいてI〜IVに格付けされ、IVが最も攻撃的である）。原発性悪性脳腫瘍の最も攻撃的な型である膠芽細胞腫多形（GBM）は原発性脳腫瘍全体のおよそ45％〜50％に相当し（Wrenschら、2002；Behinら、2003）、25歳以下の成人における癌死の２番目に大きい病因である（Allardら、2009）。
【０００２】
細胞縮小外科、放射線療法および化学療法を含む数多くの治療努力に関わらず、神経膠腫患者の予後判定の成果は非常に乏しい（Stewart、2002；Stuppら、2005）。大部分は、その結果、再発性および進行性の疾患を生じて、その後のメジアン生存期間はおよそ6か月である（Wongら、1999；Lambornら、2008）。GBM患者のメジアン生存期間はおよそ12〜14箇月である（Stuppら、2005）。
【０００３】
加えて、乳房、肺および皮膚（黒色腫）などの原発性腫瘍からの脳転移が重要なかつ増大しつつある公衆保健上の問題である。米国において推測250,000人の患者が、2009年に脳転移と診断され（Foxら、2011）、これは原発性脳腫瘍の発生率より10倍以上多い（Jemalら、2009）。脳転移の患者の予後は非常に悪く、ほとんどの患者は診断後4〜6箇月しか生存しない。現行の治療レジメンは最低限の生存成果を提供するだけである（EichlerおよびLoeffler、2007）。
【０００４】
神経膠腫の完全な外科切除は、その散在する湿潤的性質と致命的な脳構造に近接する故に、ほとんど不可能である。全身投与療法も、いわゆる血液脳関門（BBB）の所為で限られている。概要はCecchelliら（2007）を参照されたい。
【０００５】
この関門は脳毛細管内皮内に存在し、100年を超える研究対象となっている。実際、ほとんどの脳腫瘍の薬物候補が臨床に使われなかった事実（Pardridge、2007）は、BBBを横切って治療効果を有するレベルに到達することができないことに起因した（Groothuis、2000）。
【０００６】
数十年にわたる徹底的な努力にも係わらず、脳癌治療の治癒率は暗闇のままである。脳癌治療は従って、腫瘍学における最大の課題の一つである。さらに、BBBは脳腫瘍への薬物送達の大きな制限因子であるという共通認識が支配的である。
【０００７】
従って、BBBを横切るのに十分小さくかつGBM患者の生存期間を改善する新しい薬物の発見と開発を目指して世界的に大きな努力が払われている。加えて、BBBを通過して脳腫瘍のミクロ環境中に薬物を輸送する技法が開発中である。
【０００８】
BBB制限を克服する企てで研究されている手法には次のものがある。
【０００９】
・高浸透圧BBB破壊（KrollおよびNeuwelt、1998）。
【００１０】
・化学的なバリアー改変（Blackら、1997）
・BBBを横切る輸送体を有する化合物に治療薬を連結する企て（Bickelら、2001；ZhangおよびPardridge、2007）
・脳腫瘍中におよび周辺への薬物の直接投与（Hassenbuschら、2002；Hauら、2002；Reardonら、2002；Weberら、2002）。この手法は腫瘍切除床を囲む薬物充填ウエハーの設置、腫瘍切除腔の中もしくは周りへの薬剤の注入、または腫瘍本体中への薬物の直接注入を必要とする。
【００１１】
・対流増強送達または「CED」（Boboら、1994；Morrisonら、1994；Hadjipanayisら、2008；Hadjipanayisら、2010）。CEDでは、小さい静水圧をシリンジポンプによって課し、注入物を中枢神経系（CNS）の領域中に直接配給する。CEDは、圧力勾配により脳内にBBBをバイパスする液対流を起こす最小限の侵襲性外科処置である。全身送達で一般的に接触する正常な組織および器官に対して最小限の毒性しか伴わずに、治療薬が脳中に送達することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Louis, D. N. et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol. 114, 97-109 (2007).
【非特許文献２】Wrensch, M., Minn, Y., Chew, T., Bondy, M., Berger, M.S. Epidemiology of primary brain tumors: current concepts and review of the literature. Neuro. Oncol. 4, 278-299 (2002).
【非特許文献３】Behin, A., Hoang-Xuan, K., Carpentier, A.F., Delattre, J.Y. Primary brain tumours in adults. Lancet 361, 323-331 (2003).
【非特許文献４】Allard, E., Passirani, C., Benoit, J.P. Convection-enhanced delivery of nanoparticles for the treatment for brain tumors. Biomaterials 30, 2302-2318 (2009).
【非特許文献５】Stewart, L.A. Chemotherapy in adult high-grade glioma: a systematic review and meta-analysis of individual patient data from 12 randomised trials. Lancet  359, 1011-18 (2002).
【非特許文献６】Stupp R, Mason WP, van den Bent MJ, Weller M, Fisher B, Taphoorn MJ, et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med. 352, 987-996  (2005).
【非特許文献７】Wong, E.T. et al. Outcomes and prognostic factors in recurrent glioma patients enrolled onto phase II clinical trials. J. Clin. Oncol. 17, 2572-2578 (1999).
【非特許文献８】Lamborn, K.R. et al. Progression-free survival: an important end point in evaluating therapy for recurrent high-grade gliomas. Neuro Oncol. 10, 162-70 (2008).
【非特許文献９】Fox, B.D., Cheung, V.J., Patel, A.J., Suki, D., Rao, G. Epidemiology of metastatic brain tumors. Neurosurg. Clin. N. Am. 22, 1-6 (2011).
【非特許文献１０】Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M.J. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J. Clin. 59, 225-49 (2009).
【非特許文献１１】Eichler, A.F., Loeffler, J.S. Multidisciplinary management of brain metastases. Oncologist 12, 884-98 (2007).
【非特許文献１２】Cecchelli, R., Berezowski, V., Lundquist, S., Culot, M., Renftel, M., Dehouck, M.P., Fenart, L. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development.  Nat. Rev. Drug Discov. 6, 650-661 (2007).
【非特許文献１３】Pardridge, W.M. Drug targeting to the brain. Pharm. Res. 9, 1733-1744 (2007).
【非特許文献１４】Pardridge, W.M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discov. Today 12, 54-61 (2007).
【非特許文献１５】Groothuis, D.R. The blood-brain and blood tumor barriers: a review of strategies for increasing drug delivery. Neuro-oncol. 2, 45-59 (2000).
【非特許文献１６】Kroll, R.A., Neuwelt, E.A. Outwitting the blood-brain barrier for therapeutic purposes: osmotic opening and other means. Neurosurgery 42, 1083-99 (1998).
【非特許文献１７】Hassenbusch, S.J., Gunes, S., Wachsman, S., Willis, K.D. Intrathecal clonidine in the treatment of intractable pain: a phase I/II study. Pain Med. 3, 85-91 (2002).
【非特許文献１８】Hau, V.S., Huber, J.D., Campos, C.R., Lipkowski, A.W., Misicka, A., Davis, T.P. Effect of guanidino modification and proline substitution on the in vitro stability and blood-brain barrier permeability of endomorphin II. J. Pharm. Sci. 91, 2140-9 (2002).
【非特許文献１９】Reardon, D.A. et al. Phase II trial of murine (131)I-labeled antitenascin monoclonal antibody 81C6 administered into surgically created resection cavities of patients with newly diagnosed malignant gliomas. J. Clin. Oncol. 20, 1389-97 (2002).
【非特許文献２０】Bobo, R.H., Laske, D.W., Akbasak, A., Morrison, P.F., Dedrick, R.L., Oldfield, E.H. Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 91, 2076-2080 (1994).
【非特許文献２１】Morrison, P.F., Laske, D.W., Bobo, H., Oldfield, E.H., Dedrick, R.L. High-flow microinfusion: tissue penetration and pharmacodynamics. Am. J. Physiol. 266, R292-305 (1994).
【非特許文献２２】Hadjipanayis, C.G., Fellows-Mayle, W., Deluca, N.A. Therapeutic efficacy of a herpes simplex virus in combination with radiation or temozolomide for intracranial glioblastoma after convection enhanced delivery. Mol. Ther. 16, 1783-1788 (2008).
【非特許文献２３】Hadjipanayis, C.G., Machaidze, R., Kaluzova, M., Wang, L., Schuette, A.J., Chen, H., et al. EGFRvIII antibody-conjugated iron oxide nanoparticles for magnetic resonance imaging-guided convection-enhanced delivery and targeted therapy of glioblastoma. Cancer Res. 70, 6303-6312 (2010).
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この分野における通常の手法の持つ欠点を考慮して、本発明は複数のインタクトな、細菌由来のミニセルを含む組成物の治療上有効量を全身投与する方法を提供するものであり、ここで前記複数のミニセルはそれぞれ抗新生物剤を包含する。同様な趣旨で、本明細書は脳腫瘍治療用の医薬を製造するためのかかる組成物の使用を意図する。前記複数は少なくとも約108ミニセルを含んでもよく、限定されるものでないが、少なくとも約1010ミニセルを含む。また、本明細書に記載の組成物は108ミニセル当たり、例えば、1010ミニセル当たり、約10 EU未満の遊離内毒素および／または多くても1個の親細菌細胞を含有しうる。
【００１４】
ミニセルが包含する抗新生物剤は、放射性核種、例えば、イットリウム-90、テクネチウム-99m、ヨウ素-123、ヨウ素-131、ルビジウム-82、タリウム-201、ガリウム-67、フッ素-18、キセノン-133、またはインジウム-111などであってもよく、これらはミニセルの表面上のタンパク質または糖質に付着していてもよく、またはミニセルの表面上に付着した腫瘍を標的化するリガンドの表面上に付着していてもよい。この状況において、前記組成物は、例えば、約30 Gy〜約100 Gyの放射能を含有しうる。抗新生物剤はまた、化学療法薬であってもよく、その場合、例えば、組成物は多くてもその約1mgを含有する。さらに、抗新生物剤は機能性核酸、または機能性核酸をコードするポリヌクレオチドであってもよい。こうして機能性核酸は、腫瘍細胞増殖、血管新生または化学療法耐性を促進するおよび／またはアポトーシスまたは細胞サイクル停止を阻害する遺伝子を抑制することができる。機能性核酸のクラスの例は、siRNA、miRNA、shRNA、lincRNA、アンチセンスRNA、およびリボザイムからなる群より選択されるリボ核酸分子である。
【００１５】
上記のいずれかによる特定の実施形態に従って、上述の複数のミニセルはそれぞれ、非ファゴサイトーシス型の哺乳動物細胞表面受容体、例えば、腫瘍細胞抗原に特異性を有するリガンドを含んでもよい。従って、リガンドは、例えば、かかる腫瘍細胞抗原を特異的に認識する抗体を含みうる。
【００１６】
本明細書の手法を用いて、ある範囲の脳腫瘍、限定されるものでないが、膠芽細胞腫、星状膠細胞腫、希突起膠細胞腫、上衣細胞腫、頭蓋咽頭腫、下垂体腫瘍、脳の原発性リンパ腫、松果体腺腫、脳の原発性胚細胞腫瘍、およびそれらの組み合わせからなる群より例示される脳腫瘍を治療することができる。治療する腫瘍は原発性脳腫瘍または転移性脳腫瘍であってもよい。
【００１７】
他の目的、特徴、および利点は以下の詳しい説明から明らかになろう。詳しい説明および具体的な例は説明のために与えるのであり、従って、特定の実施形態の精神と範囲内の様々な変化および改変はこの説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】抗EGFR MAbで、次にR-フィコエリトリンと結合したヤギ抗マウスIgGで処理したヒト（U87-MG）およびイヌ脳腫瘍細胞上のEGF受容体の定量。細胞をFACSを用いて分析し、蛍光R-フィコエリトリンマイクロビーズ標準と比較した。一次抗体を除いて、対照細胞を同じやり方で処理した。EGFR定量結果は、BCD-1、U87-MG、BCD-9、BCD-8およびJ3T細胞に対する細胞当たりのEGFR濃度（減少順に）がそれぞれ2,866,854、1,465,755、930,440、774,352および287,622であることを示した。各細胞株の結果を、対照（暗い縁取りをした曲線）および抗EGFR MAb処理済み（暗い縁取りの無い曲線）として示した。
【図２】イヌおよびヒト（U87-MG）脳癌細胞のドキソルビシン感受性を確認する細胞増殖（MTS）アッセイの結果を示した。誤差バー、±SEM。
【図３】FACS分析から得た代表的なヒストグラムは、EGFRミニセルDoxのイヌおよびヒト脳癌細胞との結合の効率を示す。各ケースにおける＞95％の細胞はEGFRミニセルDoxの有意な結合を示した。非特異的に標的化したgpl20ミニセルDoxで処理した細胞は細胞との結合を提示しなかった。抗gpl20抗体は、いずれの腫瘍細胞にも見出されないHIVウイルスのカプシドタンパク質gpl20を指向する。
【図４】ヒトおよびイヌ脳腫瘍細胞をEGFRミニセルDoxおよび対照gpl20ミニセルDoxで3時間処理した。腫瘍細胞と結合したミニセルを、それぞれのミニセルを標的化するのに用いた二特異的抗体の抗LPS成分（IgG2a）と結合するヤギ抗マウスIgG2a-AF488による処理により可視化（緑色蛍光、明るい斑で示した）した。右側画像またはそれぞれの垂直方向パネルはdox自己蛍光（赤色蛍光、暗い斑として）について可視化し、doxがほとんどのトランスフェクトされた細胞の核内に存在することを示す。画像はLeica蛍光顕微鏡を用いて撮影した。尺度バー、20μm。
【図５】EGFRミニセルDoxによる治療後の後期脳腫瘍を患う7匹のイヌにおける腫瘍安定化／後退。それぞれのイヌに対する、治療前（投与前）のMRIスキャンを左側の垂直カラムに示す。中央および右側の垂直カラムはEGFRミニセルDoxによる治療後のMRIスキャンを示し、投与後数がそれぞれのMRIについて示す。記したMRI断面図には矢状（sagital）（BCD-1および6）、軸方向（axial）（BCD-2〜5）および冠状（coronal）（BCD-7）が含まれる。腫瘍体積（寸法はcm）を各MRIの下に示し、矢印はそれぞれの腫瘍の位置を示す。
【図６】脳癌を患う7匹のイヌ（BCD-1〜BCD-7）に対して、治療後、血清生化学パラメーターを測定した。それぞれのグラフの水平線はイヌの正常な参照範囲を表す。誤差バー、±SEM。
【図７】脳癌を患う7匹のイヌ（BCD-1〜BCD-7）に対して、治療後、血清血液学パラメーターを測定した。それぞれのグラフの水平線はイヌの正常な参照範囲を表す。誤差バー、±SEM。
【図８】脳癌のイヌにおける、EGFRミニセルDoxによる治療後の、血清TNFα、IL-6、およびIL-10応答の例示である。
【図９】EGFRミニセルDoxによる治療後の7匹の脳癌のイヌ（生存）における抗LPS抗体応答を記載した。
【図１０】7匹の脳癌のイヌの生存（日数）（左側y軸およびバーで表わす）、ならびに、投与したEGFRミニセルDoxの用量数（右側y軸および各バーに付した菱型で示す）を図解した。縞模様のバーは生存しかつ緩解中のイヌを示す。黒色のバーはおそらくdox耐性の発生により疾患が安定し、ついに腫瘍が再発したので、これらのイヌは安楽死させた。灰色のバーは緩解中に無関係な感染によって死亡した。
【図１１】(a)同時登録したT1ポスト-コントラストMRIとSPECTスキャンを(i)および(iii)別々に、ならびに融合画像ディスプレイ(ii)で、3つの直交平面（冠状、矢状および横断）にて示した。取込み域および局在領域を矢印で示した。取込みは、頭部の両側で左右対称にみられる脳外巣より低かったが、脳内で観察される唯一の取込みであった。(b)他の動物に対する結果を示す。MRI(i)およびSPECT(iii)に対する横断面の図だけを示した。MRIで示された異常部における強烈な取込みは明らかである。画像(ii)はTlポスト-コントラストMRI、SPECT、および融合画像の同時登録したディスプレイである。矢印は放射標識したミニセルの強烈な局在化域を示し、これはMRIスキャンの異常部分に対応する。(c)注入後30分および3時間における全身、2D平面画像を示す。甲状腺およびいくらかの頸部取込みと共に、肝臓における初期取込み、ならびに後期には腸内へのいくらかの排泄が見られる。
【図１２】Balb/c nu/nuマウス（n=8/グループ）中のヒト膵臓癌（MIAPaCa）異種移植片を、遊離ゲムシタビン（Gemzar(登録商標)）またはEGFR標的化しGemzar充填したミニセル（EGFRミニセルGemzar）のいずれかと共にi.v.投与した。ここで、全てのミニセル治療は10ミニセル/用量を受給した。治療日をx軸の下側に示した（三角形）。誤差バー：+/- SEM。チャートは投与後の示した日における腫瘍体積を示す。
【図１３】Balb/c nu/nuマウス（n=8/グループ）中のヒト乳癌（MDA-MB-468）異種移植片を、遊離カルボプラチンまたはカルボプラチンを充填した非標的化ミニセル（ミニセルcarboplatin）もしくはEGFR標的化ミニセル（EGFRミニセルcarboplatin）と共にi.v.投与した。ここで、全てのミニセル治療は10ミニセル/用量を受給した。治療日をx軸の下側に示した（三角形）。誤差バー：+/- SEM。チャートは投与後の示した日における腫瘍体積を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
本開示は脳腫瘍を治療する組成物および方法を提供する。この点について、本発明者らは、１種以上の抗新生物剤を充填したインタクトな、細菌由来のミニセルを全身投与すると、治療上有効な濃度で脳腫瘍のミクロ環境に速やかに蓄積することを発見した。この発見は驚くべきことであった、何故なら、直径およそ400nmのミニセルは、通常の解釈が血液脳関門（BBB）を通過できる粒子の上限とする12nmより遥かに大きいからである（Sarinら（2008）およびLaquintanaら（2009）を参照されたい）。
【００２０】
従って、本発明者らは、原発性および転移性両方の多様な脳腫瘍を、複数のかかるミニセルを含む組成物の治療上有効量を全身投与することによって治療できることを確証したのであり、各ミニセルは腫瘍に対する活性剤のビヒクルになるのである。
【００２１】
（A）定義
特に断らない限り、本明細書で用いる全ての技術的および化学的用語は、関連業者が通常解釈しているのと同じ意味を有する。
【００２２】
便宜上、本明細書、実施例、および添付した特許の請求項で使われる特定の用語および表現の意味を以下に与える。他の用語および表現は本明細書全体で定義される。
【００２３】
単数形は、前後関係からそうでないと明白に示されない限り複数形を含む。
【００２４】
本明細書で互換的に使用される「癌」、「新生物」、「腫瘍」、「悪性腫瘍」、および「癌腫」は、細胞増殖の著しい制御不能によって特徴付けられる、異常な増殖表現型を示す細胞または組織を意味する。本開示の方法および組成物は、特に、悪性、前転移性、転移性、および非転移性細胞に適用される。
【００２５】
「薬物」は、動物、特に、哺乳動物およびヒトで、局所的もしくは全身的効果が得られる任意の生理学的または薬理学的活性物質を意味する。
【００２６】
本明細書で互換的に使用される「個体」、「被験体」、「宿主」、および「患者」は、診断、処置、または治療が所望される任意の哺乳動物被験体を意味する。個体、被験体、宿主、または患者はヒトまたは非ヒト動物であってもよい。従って、好適な被験体には、限定されるものでないが、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、およびマウスが含まれる。
【００２７】
「治療」、「治療すること」、「治療する」などの用語は、脳腫瘍患者が所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、脳腫瘍またはその症状を完全にまたは部分的に予防するという意味で予防であってもよく、ならびに／あるいは、脳腫瘍および／または脳腫瘍に起因しうる有害作用を部分的にまたは完全に安定化もしくは治癒するという意味で治療であってもよい。治療は、哺乳動物、特にヒトにおける脳腫瘍のあらゆる治療を包含する。所望の効果は、特に、腫瘍塊の減少または腫瘍塊増加の阻害として測定できる腫瘍応答である。腫瘍応答だけでなく、全生存の増加、進行の無い生存、または腫瘍再発までの時間または有害効果の減少も臨床において所望の治療効果として用いることができる。
【００２８】
（B）治療
本発明の開示は、本発明者らの発見を踏まえて、直径約400nmである細菌由来のインタクトなミニセルが静脈内（i.v.）投与時に治療上有意な濃度で脳腫瘍ミクロ環境に速やかに蓄積するという実験的確証に反映されかつ実証される。本発明者らはまた、この脳腫瘍貫入は、ナノ粒子が脳腫瘍ミクロ環境中へ進入する機構として提案されているBBB内皮エンドサイトーシス／経細胞輸送または他のいずれの機構にも頼らないことを発見した。それ故に、これらの発見は通常知識の視点から全く予期しないことであった。
【００２９】
1.  BBBを横切るサイズについての一般的知識
ナノ粒子はBBBを通って薬物を運ぶための可能な担体であると考えられている（Juillerat-Jeanneret、2008）。これに関する実例はナノ粒子送達戦略であり、この戦略はナノ粒子の、BBBを含む内皮細胞の内腔中の受容体との結合、続いてエンドサイトーシスおよび内皮細胞を横切る脳腫瘍ミクロ環境中への経細胞輸送によるナノ粒子薬物送達による克服を目指す。他の手法は、以下に考察した「浸透と保持効果の増強」を利用して、BBBの内皮細胞間の細かいギャップを通って粒子の経路を達成することである。
【００３０】
2.  ナノ粒子の経細胞輸送
ポリソルベート80（Tween(登録商標)80）でコートしたポリブチルシアノアクリレート（PBCA）ナノ粒子は、遊離型ではBBBを横切らないいくつもの薬物の脳送達を可能にすることが示された（Kreuterら、1995、1997、2001、2002、2003、および2008；Steinigerら、2004）。
【００３１】
ポリソルベート80は、特定の血漿タンパク質（特に、アポリポタンパク質EおよびB）のナノ粒子表面上の吸着を選択的に促進する（Petriら、2007；Reら、2011）。従ってこれらのナノ粒子の、BBBに関連する内皮の血液毛細血管で過剰発現されることが知られる（Dehouckら、1994）それぞれの低密度リポタンパク質受容体（LDLr；Xinら、2011）との結合を可能にする。
【００３２】
LDLrとの結合後、ナノ粒子は血管内皮の細胞により内部化され（Zensiら、2009）これらの細胞を横切って経細胞輸送され、次いで、脳腫瘍ミクロ環境中に輸送される。
【００３３】
脳腫瘍を治療するためのナノ粒子を開発する世界中の努力は、BBBに関連する内皮細胞の経細胞輸送と脳腫瘍ミクロ環境中への進入によりBBBを横断する革新的方法を見出すことに注力している。これには、これらの粒子が経細胞の細胞内運動中にインタクトのまま保たれかつリソソームにより分解してはならないという事が主な挑戦課題となる。リソソームは通常、エンドサイトーシスを受ける物質を分解する強酸性の細胞内コンパートメントである。
【００３４】
この手法のさらなる厳しい欠点は、LDLrがBBBにとってユニークでないという事実である。BBBに関連する内皮細胞で過剰発現されるだけである。従って、これらの受容体は循環系全体の内皮細胞中に普遍的に存在するので、これらのナノ粒子は多数の通常の組織および通常の中枢神経系中に進入することができる。今までのところ、血管関連のBBBにだけユニークである受容体は見いだされていない、そこで、通常組織に対する重篤な毒性の可能性が懸念される。
【００３５】
3. 脳腫瘍中への受動進入
最近の確証は、悪性神経膠腫微小血管系のBBB孔径の生理学的上限はわずか約12nmであることを示している（Sarinら、2008）。さらに、分子がBBBに見出される孔を横切るには＜400ダルトンまで小さい必要があることが示されている（Bickel、2005；Pardridge、2007）。
【００３６】
このサイズの束縛はこの分野の研究者および臨床医師の間で広く受け入れられている。例えば、最近の文献の総括は、ナノ粒子が悪性神経膠腫微小血管系のBBBを横切るためには12nmより小さくかつ長い血液半減期を有する必要があると結論した（Laquintanaら、2009）。
【００３７】
様々なナノ粒子がこの点について研究されており、それにはリポソーム、ポリマーナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、ポリマーミセル、およびデンドリマーが含まれる。静脈内投与後に、これらの粒子は、脳腫瘍血管のBBB破壊の所為で脳腫瘍中に、またそれより低い程度で正常な脳組織中にも血管外遊出しうる（Moghimiら、2005）。
【００３８】
破壊されたBBBに伴う脳腫瘍中のナノ粒子のこの受動的標的化は一般に、上述の透過性と保持の増強（EPR：Enhanced Permiability and Retention）効果と連結していて、固体腫瘍への薬物送達に重要な役割を果たすとみなされる。例えば、Laquintanaら（2009）は、典型的には50〜150nmの範囲にあるリポソームは神経膠腫微小血管系内に留まり、その際、封入された小さい化学療法薬がリポソーム膜を横切りかつ悪性神経膠腫のBBBとの孔を横切って拡散するという最近の見方を反映している。従って、より大きい粒子（50〜150nm）がバリアーの破壊を介してBBBを通って遊出することができるとは考えられていない。
【００３９】
それ故に、通常の解釈では、EPR効果を介してBBBを受動的に横切りかつ脳腫瘍ミクロ環境中の薬理学的に有意な量に到達するためには、ナノ粒子は＜12nmのサイズでかつ薬物などの高分子は＜400ダルトンの分子量を有しなければならない。この解釈はPardridge（2010）による総括で下線が引かれており、この総括は「脳薬開発における唯一の最重要因子は有効な脳薬標的化技法の利用可能性である」と強調している。
【００４０】
何故なら、中枢神経系（CNS）用の候補薬物の大部分は血液脳関門（BBB）を横切らないからである。大分子の薬物であるバイオ医薬はBBBを横切らない。それ故に、脳標的化技法が存在しない場合、組換えタンパク質、モノクローナル抗体、ペプチド、低分子干渉RNA（siRNA）、および遺伝子治療薬を脳用に開発することはできない、何故ならこれらの薬物はBBBを横切らないからである。低分子については一般に、これらの薬剤はBBBを横切ると仮定されている。しかし、全低分子の98％超はBBBを横切らない（Pardridgeら、2005）。分子量（MW）＜400ダルトン（Da）の脂質可溶低分子だけが脂質を介してBBBを横切るが、低分子薬物の大部分はMW＞400Daを有するかまたは水溶解度が高く、BBBを通しての自由拡散を妨げる。それ故に、CNS薬物開発者が低分子に重点をおいたとしても、ほとんどの薬物に対するCNS低分子薬物開発計画を首尾よく完全に達成するには、なおBBB薬物標的化技法が必要であろう。
【００４１】
4. 脳腫瘍進入へのさらなるバリアー
脳取込みは、BBBに加えてさらに、脳毛細管内皮細胞内の窓およびピノサイトーシス小胞の相対的な不足により、ならびに周囲の細胞外マトリックス、周皮細胞、および星状膠細胞足突起の存在により制限を受ける（HawkinsおよびDavis、2005）。さらに、BBBは通常、薬物を脳外へ動かす多数の薬物輸送タンパク質の所為で薬物および高分子に不浸透性であるとみなされる。
【００４２】
例えば、ATP依存性輸送体は、BBBを比較的容易に横切ると予想される好都合な物理化学的特性を持つ治療薬ですら、その脳貫入を厳しく制限しうることが示されている。ほとんどのこれらの輸送体は2つのスーパーファミリー、ATP結合カセット（ABC）および溶質担体ファミリーに属する。P-糖タンパク質（P-gp、ABCB1）、乳癌耐性タンパク質（BCRP、ABCG2）、および多剤耐性関連タンパク質（MRP、ABCC）はABCファミリーの重要なメンバーである。Schinkel（1999）、Borstら（2000）、Sunら（2003）、SchinkelおよびJonker（2003）、KusuharaおよびSugiyama（2005）、LoscherおよびPotschka（2005）、ならびに、NicolazzoおよびKatneni（2009）を参照されたい。
【００４３】
従って本発明者らはインタクトな、細菌由来のミニセルが、ミニセルは脳腫瘍に進入するナノ粒子の共通認識である上限サイズ（＜12nm）より相当大きい（約400nm）という事実に関わらず、脳腫瘍に集積することを発見して真に驚いた。また予想外であったのは、ミニセルが破壊されたBBBを経由して受動的に脳に進入するという発見であった。これに関連して、本発明者らは、脳腫瘍に関係する血管はBBB型だけでないという驚くべき観察をした。初期段階においてすら、増殖中の腫瘍は多数の血管を特にそのコアに有することを見出した。かかる血管は完全性を失っている；すなわち、これらの血管はBBB型血管と異なり、大きな窓を有しかつ「漏れる」のである。それ故に、通常の解釈に反して、ミニセルのように大きい、すなわち、先に考察した共通認識のBBBの孔サイズ制限より遥かに大きいが、それにも関わらず、漏れる血管の壁の窓より小さいこれらの粒子は、従って、窓を通って脳腫瘍ミクロ環境中に受動的に遊出することができる。
【００４４】
さらに、本発明者らが発見したのは、比較的大きいサイズのインタクトな、細菌由来のミニセルは、脳腫瘍ミクロ環境において、本発見に従って速やかに治療上有意なミニセル濃度を達成するための実に前向きで重要な因子ですらある。粒子が小さいほど、粒子は血管の血流により拘束されうると思われる。対照的に、ミニセルは比較的大きい質量であり、それ故に血流が作用する力の影響を受けることが少ない。その結果、ミニセルは血液毛細管を通る経路に従うと思われ、血液毛細管の内皮壁に対する衝突を繰り返す。この純粋に物理的な現象が、腫瘍の破壊されたBBBの特徴である（本発明者らの発見した）漏れる脈管構造中の窓を通して、大粒子のミニセルを押し出す可能性を増加すると思われる。
【００４５】
ヒト脳内には1000億以上で全長およそ400マイルの毛細管が存在し、それでもこれらの毛細管の内皮中の体積はわずか約1μL/g脳（Pardridge、2011）である。脳内のこの非常に高密度の血管はまた、本発明者らの発見による、脳腫瘍におけるミニセルの速やかな高密度蓄積にも寄与すると思われる。
【００４６】
BBBに関連する毛細管内腔の直径がこのように1μm程度であることを認識し、本発明者らは、インタクトな、細菌由来のミニセルの大きさの粒子（約400nm）がBBBに関わる毛細血管の直径の約半分であり、それ故にギャップが400nmより大きいサイズである破壊されたBBBから速やかに遊出しうると洞察した。他方において、哺乳動物の身体の正常な脈管構造の窓はサイズが約100μmを超えないので、本発見に従って全身に導入されるインタクトな、細菌由来のミニセルは、専門的なファゴサイトーシス細胞により除去されるまでまたは漏れる脈管構造から脳腫瘍ミクロ環境中に受動的に遊出されるまで一般血管系中に保持される。
【００４７】
従って、2つの型のナノ粒子、例えば、直径12nm未満のナノ粒子とインタクトな、細菌由来のミニセルの等量をi.v.投与した場合、小さい方の粒子は、脈管構造が12nmより大きい孔を有する正常組織中の血液循環から遊出しうるので、粒子の循環中の濃度が速やかに減少しうる。例えば、肝臓および胃腸の組織は約100nmの正常な脈管構造窓を有し（Wisseら、2008）、そして末梢の皮膚はほぼ40nmの程度の窓を有することが公知である。対照的に、ミニセルは正常な脈管構造から流出するには大き過ぎるであろう；従って、これらは正常な血液循環中に高濃度で留まり、多数は上記のように脳腫瘍ミクロ環境中に遊出するであろう。
【００４８】
一実施形態においては、それ故に、本発明の開示は多数の抗悪性腫瘍薬を運ぶ、細菌由来のミニセルを含む組成物の治療上有効量の投与を必要とする脳腫瘍の治療を提供する。ミニセルを含有する組成物の投与は、好ましくは、全身に、例えば、静脈内または動脈内に行う。
【００４９】
（C）抗新生物剤
記載したように、本開示のミニセル組成物は抗新生物剤を脳腫瘍に送達するのに有用である。この文脈において、表現「抗新生物剤」は、新生物細胞の増殖、発生、成熟、または伝播を阻止または阻害する化学的または生物学的薬物を意味する。
【００５０】
本開示の文脈において、所与の脳腫瘍患者を治療するための抗新生物剤の選択は、汎用の医療慣習に沿ったいくつかの因子によるものである。これらの因子には、限定されるものでないが、患者の年齢、カルノフスキースコア、および患者が受けたかも知れないいずれかの従来の療法が含まれる。一般に、"PRINCIPLES AND PRACTICE OF NEURO-ONCOLOGY、M. Mehta"（Demos Medical Publishing 2011）および"PRINCIPLES OF NEURO-ONCOLOGY、D.SchiffおよびP.O'Neill、eds.（McGraw-Hill 2005）"を参照されたい。
【００５１】
さらに一般に、所与の脳癌に応用しうる看護の標準は、まず最初に、使用する活性剤の選択を通知すべきであるという臨床上の考慮を推奨している。この視点では、例えば、下にコピーした表1のリストからの活性剤の選択を案内しうるが、これはthe University of California（Los Angeles）が脳腫瘍治療用に好適な抗新生物剤を出版したものである。
【００５２】
表1  脳腫瘍治療用の公知の抗生成物剤
【表１】
2018024678.tif 000003
【００５３】
本開示によると、インタクトな、細菌由来のミニセル中に充填して次いで脳癌を治療するために投与する薬物はまた、以下に記載のクラスの1つから選択することができる。
【００５４】
・多官能アルキル化剤、例えば、シクロホスファミド（サイトキサン）、メクロレタミン、メルファラン（アルケラン）、クロラムブシル（ロイケラン）、チオペタ（チオプレックス）、ブスルファン（ミレラン）。
【００５５】
・アルキル化薬、例えば、プロカルバジン（マツレン）、ダカルバジン（DTIC）、アルトレタミン（Hexalen）、クロラムブシル、シスプラチン（プラチノール）、カルボプラチン、イホスファミド、オキサリプラチン。
【００５６】
・抗代謝物、例えば、メトトレキサート（MTX）、6-チオプリン（メルカプトプリン[6-MP]、チオグアニン[6-TG]）、メルカプトプリン（プリネトール）、チオグアニン、リン酸フルダラビン、クラドリビン：（ロイスタチン）、ペントスタチン、フルオロウラシル（5-FU）、シタラビン（ara-C）、アザシチジン。
【００５７】
・植物アルカロイド、テルペノイドおよびトポイソメラーゼインヒビター、例えば、ビンブラスチン（ヴェルバン）、ビンクリスチン（オンコヴィン）、ビンデシン、ビノレルビン、ポドフィロトキシン（エトポシド{VP-16}およびテニポシド{VM-26}）、カンプトテシン（トポテカンおよびイリノテカン）、タキサン、例えば、パクリタキセル（タキソール）およびドセタキセル（タキソテール）。
【００５８】
・抗生物質、例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン、ルベックス、ドキシル）、ダウノルビシン、イダルビシン、ダクチノマイシン（コスメゲン）、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシン（ムタマイシン）、ブレオマイシン（ブレノキサン）。
【００５９】
・ホルモン剤、例えば、エストロゲンおよびアンドロゲンインヒビター（タモキシフェンおよびフルタミド）、性腺刺激ホルモン-放出ホルモンアゴニスト（ロイプロリドおよびゴセレリン（ゾラデックス））、アロマターゼインヒビター（アミノグルテチミドおよびアナストロゾール（アリミデックス））。
【００６０】
・種々の抗癌薬、例えば、アムサクリン、アスパラギナーゼ（El-spar）、ヒドロキシウレア、ミトキサントロン（ノバントロン）、ミトタン（リソドレン）、レチノイン酸誘導体、骨髄増殖因子（サルグラモスチムおよびフィルグラスチム）、アミホスチン。
【００６１】
・葉酸代謝破壊剤、例えば、ペメトレキセド。
【００６２】
・DNA低メチル化剤、例えば、アザシチジン、デシタビン。
【００６３】
・ポリ(アデノシン二リン酸[ADP]-リボース)ポリメラーゼ（PARP）経路インヒビター、例えば、イニパリブ、オラパリブ、ベリパリブ。
【００６４】
・PI3K/Akt/mTOR経路インヒビター、例えば、エベロリムス.
・ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）インヒビター、例えば、ボリノスタット、エンチノスタット（SNDX-275）、モセチノスタット（MGCD0103）、パノビノスタット（LBH589）、ロミデプシン、バルプロ酸。
【００６５】
・サイクリン-依存性キナーゼ（CDK）インヒビター、例えば、フラボピリドール、オロモウシン、ロスコビチン、ケンパウロン、AG-024322（Pfizer）、ファスカプリシン（Fascaplysin）、リュビジン（Ryuvidine）、プルバラノールA、NU2058、BML-259、SU9516、PD-0332991、P276-00。
【００６６】
・熱ショックタンパク質（HSP90）インヒビター、例えば、 ゲルダナマイシン、タネスピマイシン、アルベスピマイシン、ラディシコール、デグエリン、BIIB021。
【００６７】
・マウス二重微小染色体2（MDM2）インヒビター、例えば、Cis-イミダゾリン、ベンゾジアゼピンジオン、スピロ-オキシインドールs、イソキノリン、チオフェン、5-デアザフラビン、トリプタミン。
【００６８】
・未分化リンパ腫キナーゼ（ALK）インヒビター、例えば、アミノピリジンン、ジアミノピリミジン、ピリドイソキノリン、ピロロピラゾール、インドロカルバゾール、ピロロピリミジン、ジアニリノピリミジン。
【００６９】
・ポリ[ADPリボース]ポリメラーゼ(PARP)インヒビター、例えば、ベンズアミド、フタラジノン、3環インドール、ベンズイミダゾール、インダゾール、ピロロカルバゾール、フタラジノン、イソインドリノン
本開示に使用可能な活性剤は上に掲げた薬物クラスまたは特定の薬剤に限定されるものでない。色々な発見の場が、癌細胞のユニークな分子的特徴を指向する新しい薬剤を生じている；実に、数千のかかる化学的および生物学的薬物が発見されており、そのいくつかだけをここに掲げたに過ぎない。さらに、親水性または疎水性の様々な活性剤の充填に適応するインタクトな、細菌由来のミニセルの驚くべき能力は、本質的にいずれのかかる薬物も、ミニセルに充填されると、本開示の発見により脳癌を治療する可能性を有することを意味する。
【００７０】
原理的に、脳腫瘍を治療する所与の抗新生物剤の潜在的適合性は、部分的に、薬剤を脳中に効果的に送達できるかどうかの関数である。薬物を積載したミニセルはBBBを横切って薬物積荷を脳腫瘍中に特異的に送達するという本発明の発見のお蔭で、さもなくば、脳腫瘍の治療に有効であることが証明されなかった多数の薬物が今やかかる治療用候補として存続しうることになる。従って、本明細書において、標題「抗新生物剤」は脳癌治療に対する公知の効力を持つ薬物に限定されるものでなく、むしろ、新生物細胞に対する上記活性の１以上を有することが確認された薬剤を包含するものである。
【００７１】
同様に、抗新生物剤のクラスの例は、放射性核種、化学療法薬、および限定されないが調節RNAを含む機能性核酸である。
【００７２】
1. 放射性核種
「放射性核種」は不安定な核を持つ原子である、すなわち、核内で新しく作られた照射粒子へまたは原子性電子へ与えられる利用可能な過剰エネルギーを特徴とする前記原子である。それ故に、放射性核種は放射性崩壊を起こしてガンマ線および／または素粒子を放射する。多数の放射性核種が当技術分野で公知であり、そのいくつか、例えば、イットリウム-90、テクネチウム-99m、ヨウ素-123、ヨウ素-131、ルビジウム-82、タリウム-201、ガリウム-67、フッ素-18、キセノン-133、およびインジウム-111は医療用に好適であることが知られる。
【００７３】
放射性核種は原子医学において、特に腫瘍細胞を損傷するためのβ線エミッターとして広範な用途が見出されている。放射性核種は、それ故に、本発明の開示における抗新生物剤として使用するのに好適である。
【００７４】
放射性核種をインタクトな、細菌由来のミニセルといずれかの公知の技法により結合することができる。こうして、タンパク質または他のミニセル表面部分（以下参照）を、市販の標識手法［例えば、Riceら（2011）が詳述したPierce Biotechnology Inc.（Rockford、IL）製のPierceヨード化試薬］を用いて、放射性核種で標識することができる。あるいは、放射性核種をミニセル内に存在するタンパク質中に組み込んでもよい。
【００７５】
後者の場合、ミニセルを産生する細菌株を外来タンパク質をコードするプラスミドDNAを用いて形質転換する。ミニセルが非対称細胞分裂中に形成される場合、いくつかのコピーのプラスミドDNAがミニセル細胞質中に分離する。得られる組み換えミニセルを、放射標識したアミノ酸の存在にて、プラスミドDNAからミニセル内で発現される外来タンパク質が放射性核種を運ぶアミノ酸を取り込む条件下でインキュベートする。Clark-CurtissおよびCurtiss（1983）のプロトコルに従い、例えば、35S-メチオニンを含有する最少成長培地において組換えミニセルをインキュベートし、それにより、プラスミドがコードする新しく発現されたタンパク質は35S-メチオニンを組み込む。類似の手法を用いて、組み換えミニセルに所望の他の放射標識を充填することができる。
【００７６】
ミニセル表面上のオリゴ糖を、例えば、Fukuda（1994）が記載した十分確立されたプロトコルを用いて放射標識することもできる。ミニセルに固有であるかかるオリゴ糖の例は、グラム陰性菌由来のミニセルの表面に見出されるリポ多糖（LPS）のO-多糖成分である（以下参照）。
【００７７】
これに関する好ましい技法は、ミニセルを特定の腫瘍に標的化するために用いる二特異的抗体を放射標識することである。下記のセクション(G)および参照により本明細書に組み込まれる米国特許公報US 2007/0237744を参照されたい。すなわち、ミニセル上に「コート」された二特異的抗体は、有意な量のさらなる放射標識用表面タンパク質を曝露する。従って、抗体をコートしたミニセルと結合した放射標識を用いて、より高い特異的活性を達成することができる。対照的に、コートされなかったミニセルの放射標識は、すなわち、固有部分だけの放射性核種標識は弱い標識しか生じ得ない（低特異的活性）。一実施形態において、この弱い標識は、さらに以下で考察するように、グラム陰性菌由来のミニセルの外膜に結合したタンパク質が、ミニセル表面を覆うO-多糖の長鎖を含むLPSによりマスクされる故に生じると考えられる。
【００７８】
脳腫瘍を治療するためには、本開示の組成は、腫瘍を全て除去するというのではないが、少なくとも腫瘍塊を減少するのに十分な腫瘍照射のレベルを全体で与える単用量または多用量を送達するであろう。治療の進行はケースバイケースで、この方針に沿ってモニターすることができる。全体としては、しかし、組成中に充填される放射能の量は、典型的には、約30〜50Gyのオーダーであろうが、本発明はまた、それより高い量の放射能、例えば、約30Gy〜約100Gyの全域を含む、約50〜100Gyを意図する。
【００７９】
いくつかの事例において、ミニセルの生じる放射性核種の脳腫瘍への送達はより高い効率および特異性であって、組成物中に充填される放射能の量は上記のものよりむしろ低くなりうる。従って、一態様においては、本組成物は約20〜40Gy、または約10〜30Gy、または約1〜約20Gy、または10Gy未満を含有する。
【００８０】
2. 化学療法薬
本開示で用いた抗新生物剤はまた、化学療法薬であってもよい。本明細書においては「化学療法薬」、「化学療法剤」および「化学療法」を互換的に用いて、新生物細胞を殺滅または破壊する能力を有する薬物を意味する。化学療法薬は、以下でさらに詳述する小分子薬物または生物学的薬物であってもよい。
【００８１】
「小分子薬物」亜分類は(i)生物学的プロセスに対する効果および(ii)高分子と比較して相対的に低分子量を有することを特徴とする有機化合物を包含する。小分子薬物は典型的には約800ダルトン以下であり、ここで「約」は指定した分子量値が数ダルトンもしくは数十ダルトンのオーダーの分散および実験誤差の測定精度を有することを示す。従って、小分子薬物は約900ダルトン以下、約800以下、約700以下、約600以下、約500以下、または約400ダルトン以下の分子量を有しうる。さらに具体的に、小分子化学療法薬は約400ダルトン以上、約450ダルトン以上、約500ダルトン以上、約550ダルトン以上、約600ダルトン以上、約650ダルトン以上、約700ダルトン以上、または約750ダルトン以上の分子量を有しうる。他の実施形態において、ミニセル中に充填された小分子化学療法薬は分子量約400〜約900ダルトン、約450〜約900ダルトン、約450〜約850ダルトン、約450〜約800ダルトン、約500〜約800ダルトン、または約550〜約750ダルトンの分子量を有する。
【００８２】
一方、本明細書の目的に対して「生物学的薬物」は、以下に考察する「機能性核酸」、およびサイズにより上記の小分子薬物とされるポリペプチドを除外し、生物学的プロセスにより作製しうるいずれかの生物学的活性高分子を示すと定義される。従って「生物学的薬物」亜分類は小分子薬物および機能性核酸の亜分類を除外し、重複するものではない。生物学的薬物の例は、自然のまたは組換えもしくは合成で、例えば、医療化学および薬物設計のツールを用いて作られる治療タンパク質および抗体である。
【００８３】
これまで、広く解釈されていたのは、400ダルトンより大きい分子はBBBに見出される細孔を横切ることはできない（Bickel、2005；Pardridge、2007）；従って、これらは脳腫瘍を治療するのに不適であるということであった。しかし、ミニセル中に充填すると、かかる化学療法薬はBBBをバイパスして標的化した脳腫瘍細胞に到達する。
【００８４】
小分子薬物または生物学的薬物、さらに、化学療法用にデザインした特定の分子は、それにも関わらず、前臨床または臨床試験中に、許容できない毒性または他の安全上の懸念によって不合格となる。本発明者らは、化学療法薬をミニセルに充填した後に腫瘍患者、例えば、脳腫瘍患者へ全身送達すると、薬物の腫瘍細胞への送達がもたらされることを示した。さらに、腫瘍細胞が壊れて薬物を含有する細胞質が近くの正常組織に放出された後にすら、その結果は正常組織に対して毒性でない。これは、薬物が既にDNAなどの腫瘍細胞構造と結合して、もはや正常細胞を攻撃しないからである。従って、本発明は、高毒性の化学療法薬の腫瘍患者への送達に特に有用である。
【００８５】
本明細書における表現「高毒性の化学療法薬」または「超毒性の化学療法薬」は、その標的とする癌に対する有効用量と比較して相対的に低い致死量を有する化学療法薬を意味する。従って一態様において、高毒性の化学療法薬は、標的化した癌、例えば、(1)その薬物をデザインした癌型、(2)その薬物について前臨床または臨床試験を行う最初の癌型、または、(3)その薬物が試験した全ての癌の中で最高効力を示す癌型に対するメジアン有効用量より低いメジアン致死用量（LD50）を有する。例えば、高毒性の化学療法薬は、標的化した癌に対する薬物のED50の約500％、400％、300％、250％、200％、150％、120％、または100％より低いLD50を有しうる。他の態様において、高毒性の化学療法薬は、標的化した癌に対するその最小有効用量より低い、例えば、最小有効用量の約500％、400％、300％、250％、200％、150％、120％、100％、90％、80％、70％、60％または50％である最大亜致死用量（すなわち、重篤なまたは不可逆的な毒性を生じない最高用量）を有する。
【００８６】
本明細書の実施形態によれば、それ故に、被験体の脳腫瘍を、それぞれ高毒性の化学療法薬を含む複数のインタクトな、細菌由来のミニセルを含んで成る組成物の治療上有効な量を全身投与するステップを含む方法により治療する。以下に考察するメイタンシノイドおよびデュオカルマイシンはこうして使う超有毒な化学療法薬の代表的なクラスである。
【００８７】
この文脈における好適な癌化学療法薬には、とりわけ、窒素マスタード、ニトロソウレア、エチレンイミン、アルカンスルホン酸、テトラジン、白金化合物、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗代謝物、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ビンカアルカロイド、トポイソメラーゼインヒビター、およびホルモン剤が含まれる。
【００８８】
小分子薬物亜分類の例である化学療法薬は、アクチノマイシン-D、アルケラン、Ara-C、アナストロゾール、BiCNU、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルボプラチナム、カルムスチン、CCNU、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、CPT-11、シクロホスファミド、シタラビン、シトシンアラビノシド、サイトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デキスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、DTIC、エピルビシン、エチレンイミン、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、ホテムスチン、ゲムシタビン、ヘキサメチルアミン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、ステロイド、ストレプトゾシン、STI-571、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テトラジン、チオグアニン、チオテパ、トムデキス、トポテカン、トレオスルファン、トリメトレキセート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、VP-16、およびゼローダである。
【００８９】
メイタンシノイド（分子量：〜738ダルトン）は強力な細胞傷害性を有するメイタンシンの化学誘導体の一グループである。毒性懸念によりヒト患者に対して安全でないと考えられるが、メイタンシノイドは本発明による、ミニセル経由で脳腫瘍患者へ送達するのには好適である。
【００９０】
デュオカルマイシン(分子量:〜588ダルトン)は、ストレプトマイセス菌から最初に単離された一連の関係する自然産物である。これらはまた強力な細胞傷害性を有するが、ヒト用には安全でないと考えられる。メイタンシノイドのように、デュオカルマイシンは本発明での使用に好適な化学療法薬である。
【００９１】
生物学的化学療法薬の亜分類には、限定されるものでないが、アスパラギナーゼ、AIN-457、バピヌズマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダロツズマブ、デノスマブ、エプラツズマブ、エスタフェナトキス、ファルレツズマブ、フィジツムマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ（WX-G250）、ハーセプチン、イブリツモマブ、イノツズマブ、イピリムマブ、メポリズマブ、ムロモナブ-CD3、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オテリキシズマブ、オゾガミシン、パギバキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、REGN88、ソラネズマブ、タネズマブ、テプリズマブ、チウキセタン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ベドリズマブ、ザルツムマブ、およびザノリムマブが含まれる。
【００９２】
本組成物は多くても約1mgの化学療法薬を含有しうる。あるいは、化学療法薬の総量は多くても約750μg、500μg、250μg、100μg、50μg、10μg、5μg、1μg、0.5g、または0.1μgでありうる。他の態様において、本組成物は、ミニセル中に充填しないで用いる場合の薬物の治療上有効量の約1/1,000未満、またはあるいは約1/2,000、1/5,000、1/10,000、1/20,000、1/50,000、1/100,000、1/200,000または1/500,000未満の量を有する化学療法薬を含有する。本開示のさらに他の態様によれば、組成物は少なくとも約1nmolの化学療法薬を含有しうる。従って、本開示はまた、化学療法薬の量がそれぞれ少なくとも約2nmol、約3nmol、約4nmol、約5nmol、約10nmol、約20nmol、約50nmol、約100nmol、および約800nmolである実施形態を包含する。
【００９３】
3. 機能性核酸
「機能性核酸」は、宿主細胞中に導入するとタンパク質の発現に特異的に干渉する核酸分子を意味する。本開示に従う脳腫瘍の治療に関しては、インタクトな、細菌由来のミニセルを介して腫瘍細胞に送達される機能性核酸の積荷は、腫瘍細胞増殖、血管新生または化学療法耐性を増強するおよび／またはアポトーシスまたは細胞サイクル停止を阻害する遺伝子を阻害する遺伝子（すなわち、「腫瘍促進遺伝子」）を阻害することが好ましい。
【００９４】
一般に、本開示で用いる機能性核酸分子は、タンパク質に対する転写物と相互作用することによりタンパク質の発現を低下する能力を有する。本開示のミニセル積荷のこのカテゴリーには、とりわけ、調節RNA、例えば、siRNA、shRNA、ショートRNA（典型的には長さが400塩基未満）、ミクロRNA（miRNA）、リボザイムおよびデコイRNA、アンチセンス核酸、およびLincRNAが含まれる。これに関連して、「リボザイム」は、ヌクレオチド塩基配列特異的なやり方で他のRNA分子を繰り返し切断する酵素活性を有するRNA分子を意味する。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、特定の遺伝子転写物の一部分に相補的である核酸分子であって、その結果、その分子が転写物とハイブリダイズして翻訳をブロックする前記核酸分子を意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドはRNAまたはDNAを含みうる。「LincRNA」または「長い遺伝子間非コーディングRNA（Long intergenic non-coding RNA）」の範疇は200ヌクレオチドより長い転写物をコードする非タンパク質を包含する。LincRNAは遺伝子の転写、スプライシング、および／または翻訳を調節することができて、これは、例えば、"Khalil et al, Proc Nat'l Acad. USA 106: 11667-72 (2009)"に考察されている。
【００９５】
調節RNAのそれぞれの型は、上述の腫瘍促進遺伝子を阻害し、それ故に、本開示による使用に好適である機能性核酸分子の供給源でありうる。従って、本開示の好ましい実施形態において、インタクトなミニセルは、転写後の遺伝子サイレンシングRNA干渉（RNAi）機構に介在し、腫瘍促進遺伝子を標的化するのに使うことができるsiRNA分子を運ぶ。例えば、"MacDiarmid et al., Nature Biotech. 27： 645-51 (2009)"（抗体提示ミニセルは化学療法薬と共に、薬物に対する耐性の発生に反対するsiRNAを送達する）および"Oh and Park, Advanced Drug Delivery Rev. 61: 850-62 (2009)"（乳房、卵巣、頚部の、肝臓、肺および前立腺癌をそれぞれ治療するための治療用siRNAの送達）を参照されたい。
【００９６】
記載した「siRNA」は、タンパク質発現を妨害するその特異的能力に対して名付けられた一般に約10〜約30ヌクレオチド長さの2本鎖RNA分子を意味する。好ましくは、siRNA分子は12〜28ヌクレオチド長さ、より好ましくは15〜25ヌクレオチド長さ、さらにより好ましくは19〜23ヌクレオチド長さそして最も好ましくは21〜23ヌクレオチド長さである。それ故に、siRNA分子は長さが12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29ヌクレオチドでありうる。
【００９７】
1つの鎖の長さがsiRNA分子の長さを表す。例えば、21リボヌクレオチド長さ（21量体）と記載されたsiRNAは19隣接塩基対がアニールする2つの反対鎖のRNAを含みうる。各鎖上の2個の残りのリボヌクレオチドは「オーバーハング」を形成しうる。siRNAが異なる長さの2つの鎖を含有する場合、鎖の長い方がsiRNAの長さを表す。例えば、21ヌクレオチド長さである1つの鎖と20ヌクレオチド長さである第2鎖は21量体を形成する。
【００９８】
siRNAのデザインを特異的にかつRNAを一般的に助けるツールは直ぐ入手できる。例えば、コンピューターに基づくsiRNAデザインツールはインターネット上でwww.dharmacon.comにおいて利用しうる。
【００９９】
他の好ましい実施形態において、本開示のインタクトなミニセルは、siRNAのように、転写後、遺伝子サイレンシングRNA干渉（RNAi）機構に介在することができるmiRNAを運ぶ。またsiRNAのように、miRNAが介在する遺伝子サイレンシング効果を使って腫瘍促進遺伝子を標的化することができる。例えば、"Kota et al., Cell 137: 1005-17 (2009)"（トランスフェクションを介するmiRNAの送達は癌細胞増殖の阻害、腫瘍特異的アポトーシスおよび疾患進行からの劇的な保護をマウス肝臓癌モデルにおいて毒性なしにもたらす）、および"Takeshita, et al., Molec. Ther. 18: 181-87 (2010)"（一過性形質導入を介する合成miRNAの送達は骨組織の転移性前立腺腫瘍細胞の増殖を阻害した）を参照されたい。
【０１００】
両方ともRNA干渉に介在するが、miRNAとsiRNAには顕著な相違がある。この点について、「miRNA」は一般に17〜27ヌクレオチド一本鎖RNA分子のクラスを意味する（siRNAの場合の2本鎖の代わりに）。それ故に、miRNA分子は17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27ヌクレオチド長さでありうる。好ましくは、miRNA分子は21〜25ヌクレオチド長さである。
【０１０１】
miRNAとsiRNAの間の他の相違は、前者が一般にmRNA標的と完全に相補性でない点である。他方、siRNAはmRNA標的に完全に相補性でなければならない。その結果、siRNAは一般に単一の、特異的な標的のサイレンシングをもたらす一方、miRNAは乱雑である。
【０１０２】
さらに、両方ともRISC（RNA-誘導サイレンシング複合体）中にアセンブルされるが、siRNAとmRNAはRISCアセンブリー前のそれぞれの初期プロセシングが異なる。これらの相違は"Chu et al., PLoS Biology 4: 1122-36 (2006)"、および"Gregory et al., Methods in Molecular Biology 342: 33-47 (2006)"に詳しく記載されている。
【０１０３】
いくつものデータベースがmiRNA保管場所を果たしている。例えば、miRBase（www.mirbase.org）およびtarbase（http://diana.cslab.ece.ntua.gr/DianaToolsNew/index.php?r=tarbase/index）を参照されたい。通常の使用では、miRNAは典型的には続き番号と組み合わせた接頭辞「mir」を用いて名付けられる。例えば、マウスmir-352の後に発見された新しいmiRNAはマウス mir-353と名付けられるであろう。
【０１０４】
さらに、miRNAを含む調節RNAのデザインを助けるツールが直ぐ利用できる。この点については、コンピューターに基づくmiRNAデザインツールがインターネットでwmd2.weigelworld.org/cgi-bin/mirnatools.p1にて利用できる。
【０１０５】
上記のように、本開示で用いる機能性核酸は腫瘍細胞増殖、血管新生または化学療法耐性を促進する遺伝子を阻害することができる。阻害された遺伝子はまたそれ自身、アポトーシスまたは細胞サイクル停止を阻害することができる。機能性核酸により標的化できる遺伝子の例を以下に与える。
【０１０６】
本開示の機能性核酸は、好ましくは、薬物耐性を増進し、アポトーシスを阻害しまた新生物表現型を促進する遺伝子またはタンパク質の転写物を標的化する。これらの領域における機能性核酸戦略応用の成功は当技術分野で達成されているが、ミニセルベクターによる利益は記載されてない。例えば、Sioud（2004）、Caplen（2003）、Niethら（2003）、CaplenおよびMousses（2003）、Duxburyら（2004）、Yagueら（2004）、およびDuanら（2004）を参照されたい。
【０１０７】
薬物耐性に寄与するタンパク質は機能性核酸の好ましい標的と成る。このタンパク質は後天性薬物耐性または内因性薬物耐性に寄与しうる。腫瘍細胞などの病める細胞は、初期には薬物に応答するが、引き続く治療サイクルで不応性になり、この耐性表現型は後天性である。後天性薬物耐性に関わる有用な標的にはATP結合カセット輸送体、例えば、P-糖タンパク質（P-gp、P-170、PGYl、MDRl、ABCBl、MDR-結合タンパク質、多剤耐性タンパク質1）、MDR-2およびMDR-3が含まれる。MRP2（多剤薬物耐性関連タンパク質）、BCR-ABL（切断点クラスター領域-Abelsonプロトオンコジーン）、STI-571耐性関連タンパク質、肺耐性関係タンパク質、シクロオキシゲナーゼ-2、核因子κ、XRCC1（X線修復交差補完グループ1）、ERCC1（切除交差補完遺伝子）、GSTP1（グルタチオンS-トランスフェラーゼ）、突然変異体β-チューブリンおよびIL-6などの増殖因子は後天性薬物耐性に関わるさらなる標的である。
【０１０８】
薬物耐性に寄与する特に有用な標的には、ATP結合カセット輸送体、例えばP-糖タンパク質、MDR-2、MDR-3、BCRP、APT1la、およびLRPが含まれる。
【０１０９】
有用な標的にはまた、アポトーシス耐性を増強するタンパク質が含まれる。これらには、Bcl-2（B細胞白血病/リンパ腫）、BC1-XL、A1/Bfl 1、細胞接着斑キナーゼ、ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、およびp53突然変異体タンパク質が含まれる。
【０１１０】
有用な標的にはさらに、発癌性および突然変異腫瘍抑制タンパク質が含まれる。
【０１１１】
これらの例は、β-カテニン、PKC-α（タンパク質キナーゼC）、C-RAF、K-Ras（V12）、DP97 DEADボックスRNAヘリカーゼ、DNMTl（DNAメチルトランスフェラーゼ1）、FLIP（Flice-様阻害タンパク質）、C-Sfc、53BPI、ポリコーム群タンパク質EZH2（zeste同族体のエンハンサー）、ErbBl、HPV-16E5およびE7（ヒトパピローマウイルス早期5および早期7）、フォルティリン（Fortilin）およびMCI IP（骨髄細胞白血病1タンパク質）、DIP13α（DDC相互作用タンパク質13a）、MBD2（メチルCpG結合ドメイン）、p21、KLF4（Kruppel様因子4）、tpt/TCTP（翻訳制御された腫瘍タンパク質）、SPK1およびSPK2（スフィンゴシンキナーゼ）、P300、PLK1（Polo様キナーゼ-1）、Trp53、Ras、ErbBl、VEGF（血管内皮増殖因子）、BAG-1（BCL2関連athanogene 1）、MRP2、BCR-ABL、STI-571耐性関連タンパク質、肺耐性関係タンパク質、シクロオキシゲナーゼ-2、核因子κ、XRCC1、ERCC1、GSTP1、突然変異体β-チューブリン、および増殖因子である。
【０１１２】
また、標的として有用なのは細胞質ポリアデニル化エレメント結合タンパク質（CEPB）に例示される全体的な制御エレメントである。例えば、CEPB4は膠芽細胞腫および膵臓癌に過剰発現され、このタンパク質は腫瘍増殖に関連する数百の遺伝子を活性化するが、健康な細胞では検出されない（Oritz-Zapater ら、2011）。それ故に本明細書によれば、膠芽細胞腫の治療は、CEPB4の過剰発現に反対する薬剤、例えば、脳腫瘍細胞によるCEPB4発現を破壊するsiRNAまたは他の機能性核酸分子を包含するインタクトな、細菌由来のミニセルの投与を介して行うことができる。
【０１１３】
(D)脳腫瘍
以上詳述した血管の完全性の喪失が脳腫瘍の全ての型および段階の特徴であるという事実は、本明細書による技法をいずれの脳腫瘍の治療における使用にも適応しうることを意味する。この点について「脳腫瘍」は頭蓋内または中心脊柱管に存在する固体新生物を含む。
【０１１４】
120種を超える脳腫瘍の型がある。ほとんどの医療機関は世界保健組織（WHO）分類システムを用いて脳腫瘍を同定している。WHOは脳腫瘍を、細胞起源および最小攻撃性（良性）から最大攻撃性（悪性）迄の細胞の挙動により分類する。いくつかの腫瘍型は増殖速度を表すグレードI（最小悪性）〜グレードIV（最大悪性）の範囲のグレードに割り当てられる。グレードを付けるシステムは腫瘍型によってばらつきがある。個々の腫瘍の分類とグレードはそのありそうな挙動を予測する助けとなる。最も頻繁に診断される型には、聴神経腫、星状膠細胞腫［グレードI-毛様細胞性星状膠細胞腫、グレードII-低グレード星状膠細胞腫、グレードIII-退形成性星状膠細胞腫、およびグレードIV-膠芽細胞腫（GBM）を含む］、脊索腫、CNSリンパ腫、頭蓋咽頭腫、他の神経膠腫（脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、混合神経膠腫、視神経神経膠腫および上衣下腫）、髄芽腫、髄膜腫、転移性脳腫瘍、希突起細胞腫、下垂体腫瘍、原始神経外胚葉性腫瘍（PNET）、その他の脳関係症状、およびシュワン腫が含まれる。
【０１１５】
小児の間では、次の脳腫瘍型がより普通である：脳幹神経膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、若年性毛様細胞性星状膠細胞腫（JPA）、髄芽腫、視神経神経膠腫、松果体腫瘍、原始神経外胚葉性腫瘍（PNET）、および棒状体腫瘍。
【０１１６】
本発明の技法は、限定されるものでないが、血管新生に誘発される限り、上記の型およびグレードを含むいずれの脳腫瘍を治療するのにも応用することができる。実施に当たって、この評価基準は少なくとも腫瘍がMRIにより検出可能である、すなわち、サイズが成長して新血管形成が必要である場合に妥当である。従って、本発明の技法はいずれかの段階における以下の原発性脳腫瘍または転移性二次脳腫瘍を治療するのに好適である：
グレードI：組織は良性である。細胞がほとんど正常な脳細胞の様に見え、かつ細胞増殖が遅い。
【０１１７】
グレードII：組織は悪性である。細胞がグレードI腫瘍の細胞ほど正常細胞の様に見えない。
【０１１８】
グレードIII：悪性組織が正常細胞とは非常に異なって見える細胞を有する。異常細胞が盛んに増殖している。これらの異常に見える細胞は未分化と呼ばれる。
【０１１９】
グレードIV：悪性組織が最も異常に見えかつ非常に速やかに増殖する傾向にある。
【０１２０】
色々な腫瘍型がその細胞表面上に特定の受容体を過剰発現することは公知である。例えば、脳へ転移する乳癌はHER2受容体を過剰発現する転移性乳癌細胞の比率が大きい傾向がある（Palmieriら、2007）。同著者は脳転移体中のEGF受容体発現も非常に高いことを示した。他の例においては、α3β1インテグリン受容体が、脳に転移した肺癌細胞において過剰発現されることが示されている（Yoshimasuら、2004）。
【０１２１】
そういうわけで、特定の原発性癌から生じる脳転移の本発明による治療は、薬剤を充填したミニセルに対して、原発性癌に適当な特異性を有する標的化リガンドを用いる工夫をすることができる。従って、原発性乳癌から生じる脳転移に対する治療はHER2特異性を示すリガンドを用いて、そのリガンドをミニセルに付着させることができる。同様に、原発性肺癌から生じる脳転移を治療するためのリガンドはα3β1特異性を示すもの、例えば、抗α3β1抗体でありうる、などである。
【０１２２】
通常の技法に従えば、抗HER-2の様なモノクローナル抗体（例えば、Roche/Genentech製品、トラスツマブ）の全身投与は原発性乳癌がもたらす脳転移を治療することはないと解釈される。この解釈は、抗体活性剤が脳転移性腫瘍において治療上有効な濃度を達成するのに十分、効果的に血液脳関門を横切らないという事実に基づく。例えば、Stemmlerら（2007）（脳脊髄液中のトラスツズマブレベルは髄膜癌腫症または照射療法などの血液脳関門障害の症状のもとでだけ増加した）を参照されたい。それ故に、上記方式でリガンドにより標的化した転移性脳癌を治療する本明細書に記載の組成物の有効性は、全て非常に驚くべきかつ重要なことである。
【０１２３】
(E)ミニセル
「ミニセル」はDNA分離を伴う細胞分裂の二分裂中に、染色体を欠く（「染色体を含まない」）かつ協調の障害により生じる細菌細胞誘導体を意味する。ミニセルはいわゆる「膜ブレブ」（〜0.2μm以下のサイズ）などの他の小胞（特定の状況で自発的に作製されかつ放出されるが、特異的な遺伝子再配列またはエピソームの遺伝子発現によらないもの）と異なる。同様に、インタクトなミニセルは細菌ゴースト（bacterial ghost）（特定の遺伝子再配列またはエピソームの遺伝子発現に因らない）と異なる。本開示で使われる細菌由来のミニセルは完全にインタクトであって、従って、破壊もしくは分解、または除去すらされた外膜または定義膜を特徴とする他の染色体を含まない型の細菌細胞誘導体とは区別される。米国特許7,183,105のカラム111、ライン54以下を参照されたい。本開示のミニセルを特徴づけるインタクトな膜は、治療用積荷が腫瘍細胞内で取込まれた後に放出されるまで、その積荷のミニセル内の保持を可能にする。
【０１２４】
本開示で使うミニセルは大腸菌およびネズミチフス菌（S. typhymurium）などの細菌細胞から調製することができる。原核生物染色体の複製は正常な二分裂と連結していて、細胞中央隔壁形成に関わる。大腸菌においては、例えば、min Dなどのmin遺伝子の突然変異は細胞分裂中の細胞極における隔壁形成の阻害を取り除くことができ、正常な娘細胞と無染色体ミニセルを得ることができる。（Boerら、1992；Raskin & de Boer、1999；Hu & Lutkenhaus、1999；Harry、2001）を参照されたい。
【０１２５】
minオペロン突然変異だけでなく、無染色体ミニセルはまた、隔壁形成に影響を与えるある範囲の他の遺伝子再配列または突然変異の後に作製される（例えば、枯草菌のdivIVBIにおいて）。ReeveおよびCornett（1975）を参照されたい。ミニセルはまた、細胞分裂／染色体分離に関わるタンパク質の遺伝子発現のレベルにおいて摂動後に形成されうる。例えば、minEの過剰発現は極分裂およびミニセルの産生へと導く。同様に、無染色体ミニセルは染色体分離の欠陥、例えば、枯草菌のsmc突然変異（Brittonら、1998）、枯草菌のspoOJ欠失（Iretonら、1994）、大腸菌のmuk突然変異（Hiragaら、1989）、および大腸菌のparC突然変異（StewartおよびD'Ari、1992）から生じうる。さらに、CafAは細胞分裂速度を増進および／または複製後の染色体分配を阻害し（Okadaら、1994）、鎖状細胞と無染色体ミニセルの形成をもたらしうる。
【０１２６】
従って、本開示のためのミニセルは、グラム陽性菌またはグラム陰性菌を問わず、いずれかの細菌細胞から調製することができる。さらに、本開示で用いるミニセルは、上記のとおり、インタクトな細胞壁を持たねばならず（すなわち、「インタクトなミニセル」であり）、特定の遺伝子再配列またはエピソームの遺伝子発現に起因しない膜ブレブなどの他の小胞とは区別しかつ分離すべきである。
【０１２７】
ある所与の実施形態において、ミニセル用の親（供給源）細菌はグラム陽性であってもよく、または記載のように、グラム陰性であってもよい。一態様においては、それ故に、親細菌はTerra-/Glidobacteria（BV1）、プロテオバクテリア（BV2）、BV4（Spirochaetes、Sphingobacteria、およびPlanctobacteriaを含む）から選択される１以上のものである。他の態様によれば、細菌はFirmicutes（BV3）、例えばBacilli、ClostridiaもしくはTenericutes/Mollicutes、または、Actinobacteria（BV5）、例えば、ActinomycetalesもしくはBifidobacterialesから選択される１以上のものである。
【０１２８】
なおさらなる態様において、細菌はEobacteria（Chloroflexi、Deinococcus-Thermus）、Cyanobacteria、Thermodesulfobacteria、thermophiles（Aquificae、Thermotogae）、α、β、γ（Enterobacteriaceae）、δまたはε（Proteobacteria）、Spirochaetes、Fibrobacteres、Chlorobi/Bacteroidetes、Chlamydiae／Verrucomicrobia、Planctomycetes、Acidobacteria、Chrysiogenetes、Deferribacteres、Fusobacteria、Gemmatimonadetes、Nitrospirae、Synergistetes、Dictyoglomi、Lentisphaerae Bacillales、Bacillaceae、Listeriaceae、Staphylococcaceae、Lactobacillales、Enterococcaceae、Lactobacillaceae、Leuconostocaceae、Streptococcaceae、Clostridiales、Halanaerobiales、Thermoanaerobacterales、Mycoplasmatales、Entomoplasmatales、Anaeroplasmatales、Acholeplasmatales、Haloplasmatales、Actinomycineae、Actinomycetaceae、Corynebacterineae、Mycobacteriaceae、Nocardiaceae、Corynebacteriaceae、Frankineae、Frankiaceae、Micrococcineae、Brevibacteriaceae、およびBifidobacteriaceaeから選択される１以上のものである。
【０１２９】
医薬品用の本開示の組成物は、免疫原性成分および他の毒性夾雑物から可能な限り徹底的に単離したミニセルを含むものでなければならない。細菌由来のミニセルを精製して遊離内毒素および親細菌細胞を除去する技法は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれるWO 2004/113507に記載されている。簡単に述べると、その精製プロセスは、(a)一般にサイズが0.2μmより小さい小胞、例えば、膜細片、(b)細胞膜から遊離される遊離内毒素、および(c)生存もしくは死滅いずれもの親細菌とそのデブリス（これらは遊離内毒素の供給源である）も除去する。かかる除去は、とりわけ、より小さい小胞および細胞細片を除去する0.2μmフィルター、糸状体を形成する親細胞の誘導後に親細胞、生細菌細胞を殺滅する抗生物質、および遊離内毒素に対する抗体を除去する0.45μmフィルターを用いて実施する。
【０１３０】
精製手順の基礎となるのは、細菌源の相違に関わらず、全てのミニセルはおよそ400nmのサイズである、すなわち、膜ブレブおよび他の小さい小胞より大きく、それでもなお親細菌より小さいという本発明者らによる発見である。ミニセルのサイズ決定は、電子顕微鏡などの固体状態を用いることにより、または液体系の技法、例えば、動的光散乱により実施することができる。それぞれのかかる技法により得られるサイズ値は誤差範囲を有しうるのであって、値は技法間で若干異なりうる。従って、乾燥状態のミニセルのサイズは電子顕微鏡を介して測定することができ、およそ400nm±50nmである。他方、動的光散乱による同じミニセルの測定値はほぼ500nm±50nmのサイズである。また、薬物を充填してリガンドを標的化したミニセルは、再び、動的光散乱を用いて測定することができ、およそ600nm±50nmである。
【０１３１】
サイズ値のこの分散は実用上、例えば、ミニセルを先に記載した免疫原性成分および他の毒性夾雑物から単離する目的に、容易に適応しうる。すなわち、インタクトな細胞由来のミニセルは、ミニセルに強固な球状構造を与える強固な膜で囲まれた細胞質が特徴である。この構造は透過型電子顕微鏡写真により明らかであり、それによって強固な膜の外側間のミニセルを横切るミニセル直径が測定される。この測定は400nm±50nmの上記サイズ値を与える。
【０１３２】
グラム陰性菌由来のミニセルの他の構造エレメントは、脂質Aアンカーを介して外膜に包埋されたリポ多糖（LPS）のO-多糖成分である。この成分は1つの鎖当たり4〜5糖の70〜100の反復ユニットを持つ反復糖質残基ユニットの鎖である。これらの鎖はin vivoのような液環境において強固でないので、サンゴ海環境の海藻の外観を与える波状のフレキシブルな構造を採用しうる；すなわち、これらの鎖はミニセル膜にアンカーして留まる一方、液と共に動く。
【０１３３】
O-多糖成分により影響されて、動的光散乱は前述の通り、約500nm〜約600nmのミニセルサイズに対する値を与える。それにも関わらず、グラム陰性とグラム陽性の細菌由来のミニセルは同様に容易に400nm±50nmの有効ミニセルサイズを実証する0.45μmフィルターを通過する。上記のサイズの分散は本発明に包含され、特に、表現「およそ400nmのサイズ」などにおける修飾語「およそ」により示される。
【０１３４】
毒性夾雑物に関しては、本開示の組成物は約350 EU未満の遊離内毒素を含有しうる。この関係の例としては、遊離内毒素のレベルはそれぞれ、約250 EU、約200 EU、約150 EU、約100 EU、約90 EU、約80 EU、約70 EU、約60 EU、約50 EU、約40 EU、約30 EU、約20 EU、約15 EU、約10 EU、約9 EU、約8 EU、約7 EU、約6 EU、約5 EU、約4 EU、約3 EU、約2 EU、約1 EU、約0.9 EU、約0.8 EU、約0.7 EU、約0.6 EU、約0.5 EU、約0.4 EU、約0.3 EU、約0.2 EU、約0.1 EU、約0.05 EU、および約0.01 EUである。
【０１３５】
開示の組成物はまた、少なくとも約108ミニセル、例えば、少なくとも約5x108を含有しうる。あるいは、組成物は109または1010のオーダーのミニセル、例えば、5 x 109、1 x 1010または5 x 1010のミニセルを含有しうる。かかる数のミニセルのいずれかのなかで、さらに、本開示の組成物は約10未満の夾雑性親細菌細胞、例えば、約9、8、7、6、5、4、3、2、または1個未満の親細菌細胞を含有しうる。
【０１３６】
（F）抗新生物剤のミニセル中への充填
核酸がコードし得る抗新生物剤、例えば、タンパク質および機能性核酸は、抗新生物剤をコードするプラスミドなどのベクターを親細菌細胞中に形質転換することによりミニセル中に導入することができる。ミニセルが親細菌細胞から形成される場合、ミニセルはプラスミドおよび／または発現産物、抗新生物剤のある特定のコピーを保持する。発現産物のミニセル中への充填のさらなる詳細はWO 03/033519に記載されており、その内容は参照によりその全てが本開示に組み込まれる。
【０１３７】
WO 03/033519に記載のデータは、例えば、哺乳動物の遺伝子発現プラスミドを運ぶ組換えミニセルはファゴサイトーシス細胞へおよび非ファゴサイトーシス細胞へ送達することができることを実証した。前記出願はまた、ミニセル産生親細菌株の、エピソーム複製型プラスミドDNA上に運ばれた異種核酸を用いる遺伝子形質転換も記載する。親細菌およびミニセルの分離時に、エピソームDNAのいくつかがミニセル中に分離された。得られる組み換えミニセルは哺乳動物のファゴサイトーシス細胞により容易に取り込まれ、細胞内ファゴリソーム内で分解された。さらに、組換えDNAのいくつかはファゴリソーム膜を逃れて哺乳動物細胞核に輸送され、ここで組換え遺伝子が発現された。
【０１３８】
核酸をミニセル中に直接充填することもできる。すなわち、複数のインタクトなミニセルをバッファー中で核酸と共にインキュベートすることにより、核酸を直接インタクトなミニセル中に充填することができる。インタクトなミニセル中の核酸の積込みを最適化するために、この分野で周知の条件の関数として、バッファー組成物を変えることができる。バッファーはまた、ミニセルに積み込むヌクレオチド配列および核酸の長さに応じて変えてもよい。充填し終わると、核酸はミニセル内に留まり、分解から保護される。無菌生理食塩水中でsiRNAを充填したミニセルを用いる長いインキュベーション研究は、例えば、siRNAが漏洩しないことを示した。
【０１３９】
他の実施形態において、色々なmRNA標的に指向した多重核酸を同じミニセル内に充填することができる。かかる手法を用いて薬物耐性およびアポトーシス耐性と闘うことができる。例えば、癌患者は日常的に化学療法薬に耐性を示す。かかる耐性は、とりわけ、多剤耐性（MDR）ポンプおよび抗アポトーシス遺伝子などの遺伝子の過剰発現により介在しうる。この耐性と闘うために、ミニセルに治療上有意な濃度のMDR関連遺伝子に対する機能性核酸を充填し、化学療法前の患者に投与してもよい。さらに、同じミニセル中に色々なmRNA標的を指向する多機能性核酸を充填することは、ほとんどの分子標的が突然変異を受けかつ多重対立遺伝子を有するので、治療の成功を高めることができる。核酸をミニセル中に直接充填する方法のさらなる詳細は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれるWO 2009/027830に与えられている。
【０１４０】
親水性または疎水性を問わず、ミニセルを含有する細胞外培地とミニセル細胞質の間に薬物の濃度勾配を作ることにより、小分子薬物をミニセルに充填してもよい。細胞外培地がミニセル細胞質より高い薬物濃度を含有する場合、薬物は自然にこの濃度勾配の下方へ、ミニセル細胞質中に移動する。しかし濃度勾配が逆転した時に、薬物はミニセルの外へ移動しない。
【０１４１】
ミニセルに通常水溶性でない薬物を積み込むために、薬物を最初、適当な溶媒に溶解してもよい。例えば、パクリタキセルをエタノールとクレモホアEL（ポリエトキシル化ヒマシ油）の1：1ブレンドに溶解し、次いでPBSに希釈して、水媒質に部分的に希釈しかつ薬物が溶液中に留まるのを確実にする最小限の量の有機溶媒を運ぶパクリタキセルの溶液を作ることができる。ミニセルをこの最終培地中でインキュベートして薬物を積込むことができる。こうして、本発明者らは、疎水性薬物でもミニセルの細胞質または膜中に拡散し、治療上有意な細胞質の薬物積込みを達成し得ることを発見した。これは予想外である、何故なら、ミニセル膜は疎水性リン脂質二重層から構成され、疎水性分子の細胞質中への核酸を阻止すると予想されうるからである。
【０１４２】
下記の実施例10は、色々なサイズと化学特性の例である多様な代表的小分子薬物：ドキソルビシン、パクリタキセル、フルオロ-パクリタキセル、シスプラチン、ビンブラスチン、モナストロール（Monsatrol）、チミジル酸シンターゼ（TS）インヒビターOSI-7904、イリノテカン、5-フルオロウラシル、ゲムシタビン、およびカルボプラチンのミニセル中への積込みを実証する。さらに、全体を通して、得られる小分子薬物を充填したミニセルは有意な抗腫瘍効力in vitroおよびin vivoを示す。本明細書に示したこれらのデータは、それ故に、明らかに、ミニセル積込み方法の有効性と多用性を実証する。
【０１４３】
（G）ミニセルの特定の哺乳動物細胞への指向化
本開示のさらなる態様によれば、先に記したように、組成物のミニセルをリガンドを介して哺乳動物の腫瘍細胞に指向させる。いくつかの実施形態において、リガンドは「二特異的」である。すなわち、リガンドはミニセルと哺乳動物(腫瘍)細胞成分の両方に対して特異性を示し、その結果、所与のミニセルは標的細胞と結合するようになり、後者が前者を呑み込む。ミニセルを腫瘍細胞に標的化するための二特異性リガンドの使用はさらにWO05/056749およびWO05/079854に記載され、これらのそれぞれの内容は本明細書にその全てが参照により組み込まれる。かかるリガンドがミニセルに付着すると、リガンドの非占有特異性（「一特異性」）はリガンドが標的(腫瘍)哺乳動物細胞と相互作用するまで付随する。
【０１４４】
リガンドはミニセルまたはその親の内側から発現されてもよく、次いでミニセル表面に表示される。あるいは、リガンドを、例えば、リガンド-受容体相互作用によってミニセルの細胞膜に付着させる（コートする）ことができる。いずれの場合でも、リガンドはミニセルに対して特異性を必要とせず、ただ哺乳動物細胞の特徴である一成分に対して特異性を示すだけである。すなわち、かかる成分は、腫瘍細胞がそれらの細胞表面上にその成分を提示する限り、本質的に、腫瘍細胞にまたは治療中の特定の種類の腫瘍細胞に対してすらユニークである必要はない。静脈内投与すると、本発明者らが発見したように、ミニセルは速やかに腫瘍ミクロ環境に蓄積する（以下の実施例も参照されたい）。この蓄積は先に記載した洩れる腫瘍脈管構造の機能として起こり、ミニセルに充填された治療薬積荷の、腫瘍細胞を標的とする送達を果たす。さらにこれは、本開示と一致して、リガンドが治療すべき腫瘍の成分を標的化する助けとなり、しばしば好ましいであろう。
【０１４５】
いずれの場合でも本開示の投与した組成物に含有されるミニセルは、上記の脳腫瘍ミクロ環境で蓄積すると、標的化した腫瘍細胞と接触しかつ結合してその取込み物を細胞中に放出し、次いで腫瘍細胞は治療用積荷による作用を受ける。
【０１４６】
この積荷は、先に記載した細胞傷害薬、例えば、ドキソルビシンまたはいずれか他の抗新生物薬であってもよい。積荷はまた、siRNAまたはmRNA、例えば、抗Bcl2などの抗アポトーシスRNAi配列であってもよい。
【０１４７】
本発明者らは、この標的化送達手法がミニセルの特異的接着およびエンドサイトーシスに通常は不応性である細胞を含む、或る範囲の哺乳動物の腫瘍細胞に広く応用可能であることを見出した。例えば、抗HER2受容体または抗EGF受容体を指向する抗体を含むリガンドは、ミニセルを、ある範囲の標的化された非ファゴサイトーシス細胞上のそれぞれの受容体と効率よく結合する。これらの細胞には、肺、卵巣、脳、乳房、前立腺および皮膚癌細胞が含まれる。
【０１４８】
こうして作られた結合後に、各型の非ファゴサイトーシス細胞により、ミニセルの速やかなエンドサイトーシスが行われる。もっと一般的には、本開示にとって好適な標的細胞は、リガンドが結合するとエンドサイトーシスを促進する細胞表面受容体の発現により特徴付けられる。宿主細胞は通常、接着に抵抗性がある。それ故に、リガンドが接着すると、宿主細胞はエンドサイトーシス機構を活性化してリガンドを除去する。
【０１４９】
用語「エンドサイトーシス」は、(1)ファゴサイトーシスおよび(2)ピノサイトーシス［分類(2)には(2a)マクロピノサイトーシス（受容体結合を必要としない）ならびに(2b)クラスリン介在型エンドサイトーシス、(2c)カベオラ介在型エンドサイトーシスおよび(2d)クラスリン／カベオラ非依存型エンドサイトーシスが含まれる］を包含し、これらは全て後期エンドソーム/リソソーム経路にアクセスする傾向がある。ミニセル上のリガンドと哺乳動物細胞表面の間の相互作用は、本発明者らが発見したのであるが、後期エンドソーム／リソソームコンパートメントへの受容体介在型エンドサイトーシス（rME）が関わる特定のエンドサイトーシス経路を活性化する。本発明者らはさらに、かかるエンドサイトーシス経路のお蔭で、ミニセルはその積荷を標的哺乳動物細胞の細胞質中に放出できることを発見した。積荷がコーディングする核酸である場合には、核酸は後期エンドソームの/リソソームのコンパートメントで完全に分解されないだけでなく、標的哺乳動物細胞においても発現される。
【０１５０】
本開示によれば、上記の標的化送達手法で有用なリガンドには、標的細胞上の表面成分およびミニセル上の表面成分と結合するいずれの薬剤も含まれる。好ましくは、標的細胞上の表面成分は受容体である。リガンドはポリペプチドおよび／または糖質成分を含みうる。抗体は好ましいリガンドである。
【０１５１】
例えば、哺乳動物の脳腫瘍細胞上の腫瘍抗原などの表面成分に対する特異性を運ぶ抗体を用いて、治療すべき脳腫瘍中の標的細胞にミニセルを効率的に標的化することができる。細胞表面受容体の例には、上皮増殖因子受容体（EGFR）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血小板由来の増殖因子受容体（PDGFR）およびインスリン様増殖因子受容体（IGFR）が含まれ、これらは全てある範囲の脳腫瘍を含む固体腫瘍およびいくつかの下垂体腺腫において過剰発現される葉酸受容体において高度に発現される。二特異的リガンドはまた、突然変異体もしくは変異体受容体、例えば、IL-13Ra2受容体を標的化することもでき、このIL-13Ra2受容体はヒトGBMの50％〜80％に発現される（Debinskiら、2000；Jarboeら、2007；Okadaら、2008；Wykoskyら、2008）が、正常組織に発現されるその生理学的カウンターパートIL4R/IL13Rとは異なる（Hershey 2003）。IL13Ra2は実質的に正常な脳細胞には存在しない（DebinskiおよびGibo2000）。さらに、脳へ転移する腫瘍はある特定の受容体を過剰発現し、これらの受容体も好適な標的である。例えば、一研究（DaSilvaら、2010）は乳癌の脳転移がチロシンキナーゼ受容体のHERファミリーの全メンバーを発現することを示す。HER2は増幅されて脳転移の20％に過剰発現され、EGFRは脳転移の21％に過剰発現され、HER3は脳転移の60％に過剰発現され、そしてHER4は脳転移の22％に過剰発現された。興味深いことに、HER3発現は脳に存在する乳癌細胞において増加した。
【０１５２】
好ましいリガンドは抗体および／または抗体誘導体を含むものである。本明細書において使用する用語「抗体」は免疫原性応答のin vitroまたはin vivo作製によって得られる免疫グロブリン分子を包含する。従って、「抗体」のカテゴリーには、モノクローナル抗体およびヒト化抗体、ならびに抗体誘導体、例えば、一本鎖抗体フラグメント（scFv）、二特異的抗体などが含まれる。多数の色々な二特異的タンパク質および抗体に基づくリガンドが公知であり、参照によりその全てが本明細書に組み込まれるCaravellaおよびLugovskoy（2010）の総括記事に証言されている。本開示に有用である抗体および抗体誘導体はまた、組換えDNA技法により得ることもできる。
【０１５３】
(H)製剤および投与経路とスケジュール
本開示の組成物の製剤は単位投与剤形、例えば、アンプルまたはバイアルで、または複数回用量容器に入れて、防腐剤を加えもしくは加えないで提供しうる。製剤は、油性もしくは水性ビヒクルの溶液、懸濁液、または乳濁液であり、かつ懸濁化剤、安定化剤、および／または分散化剤などの製剤用薬剤を含有しうる。好適な溶液は、受給者の血液と等張であり、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液により例示される。あるいは、製剤は、好適なビヒクル、例えば、滅菌しパイロジェンを含まない水または生理食塩水によって再調製するための凍結乾燥粉末であってよい。製剤はまた、デポー製剤の剤形であってよい。かかる長時間作用製剤は、移植（例えば、皮下にまたは筋肉内）または筋肉内注射によって投与しうる。
【０１５４】
いくつかの態様において、治療上有効量の抗新生物剤を含むミニセルを含有する組成物が提供される。抗新生物剤の「治療上有効な」量は、本開示に従って被験体に投与した時に薬理学的応答を生じる問題の薬剤、例えば、siRNAまたは化学療法薬の用量である。
【０１５５】
本開示の文脈においては、それ故に、治療上有効な量は、さらに以下に記載するように、ミニセルが運ぶ治療用積荷を投与したときに動物モデルまたはヒト被験体のいずれかにおいて脳腫瘍もしくは脳腫瘍の症候の予防もしくは改善を参照して判断することができる。特定の被験体に対する所与の一例における「治療上有効な量」を証する一つの量は、かかる用量が「治療上有効量」と専門医によりみなされたとしても、脳腫瘍に対して同じように治療した被験体の100％に対して有効であり得ない。この点について、適当な用量はまた、例えば、脳腫瘍の型、段階、および重篤度の関数として変わりうる。いずれの場合にも、本開示によるin vitro試験（実施例3および4）およびin vivo試験（実施例5、7および8）の本例示、ならびにin vivoの薬物分布を数値化する技法（実施例9）は、全明細書を照らし合わせて考察するときに、薬物候補の全臨床および臨床試験の有識者に、通常の実験を通して、特定の効能に対する活性剤の治療上有効量を決定する力を与えるものである。同様に、「治療上有効な」を用いて医薬組成物中のミニセルの数を指す場合、その数はどの抗新生物剤がミニセル中に充填されたかおよび脳腫瘍を治療するその薬剤の効力に基づいて確かめることができる。この点については、治療効果を腫瘍質量などの臨床学的または病理学的パラメーターを用いて測定することができる。従って、腫瘍質量の減少または増加の低下を治療効果を測定するために用いることができる。
【０１５６】
開示内の製剤を様々な経路を介してかつ哺乳動物の身体の様々な部位へ、局所にまたは全身に投与して、所望の治療効果を達成することができる。特定の態様においては、投与経路は静脈内注射である。
【０１５７】
一般に、いずれかの潜在的な毒性を最小化する一方、開示の製剤を定期試験により規定した適当な用量で用いて、最適な生理学的効果を得ることができる。用量レジメンは、様々な因子（患者の年齢、体重、医学的症状；脳腫瘍の重症度と段階、投与経路、および患者の腎臓と肝臓の機能を含む）に従って、選択することができる。
【０１５８】
最大の効力を最小の副作用で得る範囲内のミニセルと治療薬の濃度を達成する上での最適の精度は、部位を標的化しかつおよび細胞を標的化する薬剤利用可能性の動力学に基づくレジメンを必要としうるしかつ典型的にはそうであろう。治療レジメンの最適濃度を決定する際に、ミニセルまたは薬剤の分布、平衡、および排除を考慮しうる。ミニセルと治療薬の用量を、それぞれ、調節して所望の効果を達成することができる。
【０１５９】
さらに、製剤の用量投与は薬物動態学／薬物動力学モデル系を用いて最適化することができる。こうして、１以上の用量レジメンを選びかつ薬物動態学／薬物動力学モデルを用いて、１以上の用量レジメンの薬物動態学／薬物動力学プロファイルを決定することができる。特定のかかるプロファイルに基づいて、所望の薬物動態学的／薬物動力学応答を達成する投与のための用量レジメンの１つを選択することができる。例えば、WO 00/67776を参照されたい。
【０１６０】
本開示の製剤を、少なくとも週1回、脳腫瘍患者に数週間にわたって投与することができる。従って、製剤を少なくとも週1回、数週間〜数箇月の期間にわたって投与することができる。
【０１６１】
さらに具体的には、本発明の製剤を、少なくとも1日1回、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30または31日間投与してもよい。あるいは、本製剤を毎日約1回または毎2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30または31日以上に約1回投与してもよい。
【０１６２】
本開示の他の実施形態においては、製剤を毎週1回または毎2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20週以上に約1回投与してもよい。あるいは、製剤を1週に少なくとも1回、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20週間投与してもよい。
【０１６３】
あるいは、製剤を毎月1回または毎2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12箇月以上に約1回投与してもよい。
【０１６４】
製剤は一日用量で投与してもよい。あるいは、全一日用量を2、3、または4回の分割用量で投与してもよい。
【０１６５】
以下の実施例は限定よりもむしろ説明するためのものであって、本開示のより完全な理解を与えるものである。
【実施例】
【０１６６】
実施例１  ドキソルビシンを充填したイヌEGFR-標的化ミニセルの調製
ミニセルを、先にMacDiarmidら（2007）が記載した通り、サルモネラ菌enterica serovar Typhimurium、S. typhimuriumのminCDE-染色体欠失突然変異体から誘導し、精製し、ドキソルビシン（dox）を充填し、そして、抗ミニセル表面O-多糖および抗イヌEGFR特異性を含む二特異的モノクローナル抗体（MAb）の付着を介して標的化した（EGFRミニセルDoxと名付けた）。
【０１６７】
EGFRミニセルDoxを最初に、後期脳癌の7匹のイヌ（イヌをBCD-1〜BCD-7と名付けた）中へのi.v.投与好適性について特徴付ける試験をした。2匹のさらなるイヌ、BCD-8およびBCD-9がVeterinary Specialist Centreで提示されたが、それらの脳腫瘍は極く後期であったので研究を行わず安楽死させた。脳バイオプシーサンプルをそれぞれのin vitro研究用の脳腫瘍細胞に提供した。
【０１６８】
実施例２  イヌ脳腫瘍細胞と結合する抗ヒトEGFRモノクローナル抗体の特徴付け
ヒト（Smithら、2001）とイヌ（Higginsら、2010）両方のGBM症例のほぼ60％におけるEGFRのアップレギュレーションおよび過剰発現は公知である。特定のイヌEGFR MAbを利用できなかったので、市販の抗ヒトEGFR MAbをイヌおよびヒト脳腫瘍細胞株で試験し、MAbのイヌ脳腫瘍細胞上のEGFRに対する交差反応性を確認した。
【０１６９】
実行可能な場合、脳腫瘍バイオプシーサンプルはイヌのケーススタディから得た。BCD-1、-8、および-9からの組織サンプルを、10％ウシ胎児血清（FCS）およびペンストレップを含有するDulbecco改変Eagle培地（DMEM）中のlmg/mlコラゲナーゼで、10分間処理した。未消化の組織を滅菌ガーゼスワブの二重層を通して濾過により除去した。細胞を5ml培地で薄めてコラゲナーゼ消化を停止し、1,200gにて5分間遠心分離した。細胞をさらなる5ml培地で洗浄し、次いで遠心分離と再懸濁を繰り返した。次いで細胞を組織培養フラスコにまいた。
【０１７０】
イヌGBM細胞株、J3T（Rainovら、2000）は、the Translation Genomics Research Institute （Phoenix、AZ、USA）のDr. Michael Berensから得た。全てのイヌ脳腫瘍細胞培養を10％(vol/vol)FCS、lOO U/mlペニシリン、100 U/mlストレプトマイシン、2mM l-グルタミン、および2mM非必須アミノ酸を補充したDMEM中に維持した。
【０１７１】
ヒトGBM星状膠細胞腫上皮細胞株（U87-MG）はthe American Type Culture Collection（ATCC）から得て、5％ウシ胎児血清（FBS）を伴うOPTI-MEM培地（Invitrogen、USA）で増殖した。
【０１７２】
細胞を、2mM EDTA/PBSを用いてフラスコから剥がして採集し、1 x 106 細胞/チューブに分割した。細胞をブロック溶液（2％BSAおよび0.1％ナトリウムアジドを加えたPBS）で2回洗浄し、そして氷上で10分間ブロック溶液中でインキュベートした後に、1μg/μl抗ヒトEGFRモノクローナル抗体（IgG2a；Calbiochem）と共に氷上で45分間インキュベートした。ブロック溶液による2回洗浄後に、細胞をR-フィコエリトリン結合ヤギ抗マウスIgG（分子プローブ／Invitrogen）と共に穏やかに撹拌しながら氷上で45分間インキュベートした。ブロック溶液中の2回洗浄後、細胞をPBSに再懸濁してフローサイトメトリー分析に用いた。対照として、一次抗体の代わりにPBSを用いて自己蛍光を測定した。
【０１７３】
染色した細胞懸濁液を、フローサイトメーターFC500によりCXP Cytometerソフトウエア（Beckman Coulter）を用いて測定した。EGF受容体の数を分析フローサイトメトリーにより、蛍光R-フィコエリトリンマイクロビーズ標準（Quantum R-PE MESFビーズ；Bang Laboratories Inc、Fishers、IN、USA）と比較して決定した。ビーズ毎に等価のR-フィコエリトリン分子の所与の数を平均蛍光強度の対数と対比してプロットすることにより較正曲線を作製した。細胞蛍光強度を標準蛍光較正曲線上に外挿した。平均蛍光の値を、ネガティブ対照を差し引いた後の細胞毎に結合した抗体の数に変換した。
【０１７４】
その結果（図1）は、イヌ（J3T、BCD-1、-8および-9）およびヒト（U87-MG）脳癌細胞の両方において、MAbがEGFRと強く結合することを示した。
【０１７５】
FACS分析を用いる受容体定量研究（図1）は、BCD-1、U87-MG、BCD-9、BCD-8およびJ3T細胞に対する細胞毎のEGFR濃度（低下順に）はそれぞれ2,866,854、1,465,755、930,440、774,352および287,622を示した。この結果はそれぞれの細胞型がEGFRを過剰発現することを示した。
【０１７６】
抗ヒトEGFR MAbのイヌEGFRに対する結合交差反応性は、それ故に、このイヌおよびヒト脳癌細胞に対するin vitro 結合アッセイにより確証された。
【０１７７】
それ故に、脳腫瘍細胞の有効な標的化を達成するために、抗ヒトEGFR MAbを選択してDox充填ミニセルをコートした。
【０１７８】
実施例３  イヌ脳腫瘍細胞の化学療法薬ドキソルビシンに対する感受性の定量
dox充填、EGFR標的化ミニセルを用いて後期脳癌のイヌを治療する前に、イヌ脳腫瘍細胞が化学療法薬ドキソルビシンに対して感受性か不応性であるかを確認することが重要である。
【０１７９】
イヌ脳腫瘍細胞BCD-1、-8、-9およびJ3Tおよびヒト脳腫瘍細胞株U87-MGを、96ウエルプレート中に1ウエル当たり5 x 103細胞をまいた。細胞を一晩37℃、5％C02にてインキュベートした。
【０１８０】
血清を含有する関連培地100μL中の細胞に、ドキソルビシンを1.7nM〜8,600nMの範囲の濃度にて加え、72時間インキュベートした。
【０１８１】
ドキソルビシンの細胞傷害効果を測定するために、MTS細胞増殖アッセイを実施した。各ウエルに、20μLのMTS溶液（CellTitre 96（登録商標）Aquous One MTS試薬-Promega）を加え、暗所にて30分間インキュベートした。吸収を490nmの波長にて読み取った。データを、非線形回帰と4-パラメーター曲線フィットを用いてPrism GraphPad （La Jolla、CA、USA）で分析した。
【０１８２】
細胞増殖アッセイは全ての上記細胞株がドキソルビシンに等しく感受性であることを示した（図2）。
【０１８３】
実施例４  EGFRミニセルDoxのイヌ脳腫瘍細胞との結合の効率
イヌおよびヒト腫瘍細胞を2時間、特異的-および非-特異的に標的化したミニセル、EGFRミニセルDoxおよびgpl20ミニセルDOxでそれぞれトランスフェクトし、そして非接着ミニセルを洗浄除去した後に、それらの細胞をAlexa-Fluor488蛍光染料（AF-488）でタグ付けした抗マウスIgG2a MAbで処理した。gpl20 MAbはヒト免疫不全ウイルス1エンベロープ糖タンパク質を指向し、本研究で試験した脳腫瘍細胞株の表面上には見出されない。次いで細胞をFACSを用いて分析した。その結果（図3）は、EGFRミニセルDoxで処理すると細胞の＞95％が強く蛍光を発し、対照のspl20ミニセルDOxで処理すると細胞は蛍光を発しないことを示した。
【０１８４】
観察された結合効率をさらに、EGFRミニセルDoxの脳腫瘍細胞との結合およびまた癌細胞におけるドキソルビシンの細胞内送達を直接可視化する蛍光顕微鏡を用いて確認した。
【０１８５】
EGFRミニセルDoxを用いてイヌ脳腫瘍およびヒト対照細胞株をトランスフェクトした。トランスフェクションおよび過剰の無結合ミニセル洗浄後3時間に、細胞株になお付着するミニセルを、抗IgG2a-AF488でEGFR標的化Mabを標識することにより明らかにした。結果（図4）は、特異的標的化ミニセル（EGFRミニセルDox）は大多数がヒトおよびイヌ脳癌細胞と結合する一方、対照ミニセルは結合しないことを示した。さらに、EGFRミニセルDoxで処理した細胞のほとんどは細胞核内にdox自己蛍光を示し、有意な数のミニセルがエンドサイトーシスを受け、細胞内のリソソームに溶解されてdoxが細胞内に放出されたことを示唆した。二特異的抗体で標的化した薬物充填ミニセルを介する、薬物の異なる腫瘍細胞株へのこの細胞内送達機構は、本出願の著者が先に記載し出版している（MacDiarmid ら、2007）。
【０１８６】
以上の結果は、ミニセルにdoxを充填しかつそれらをEGFRへ標的化することに合理性を与えるものである。
【０１８７】
実施例５  EGFRミニセルDoxを用いる7匹の後期脳癌のイヌの治療と抗腫瘍効力
この研究のイヌは、動物専門医センター（Veterinary Specialist Centre (VSC)）または小動物専門医病院（the Small Specialist Hospital(SASH)）（Sydney、Australia）に患者として滞在するペットのイヌであった。研究参加はイヌの所有者が標準療法を辞退していたか、または意味のある標準療法が存在しない進行性疾患の事例において提案した。イヌは、国家保健および医療研究委員会、実験動物のケアおよび使用のオーストラリア指針、ならびにEnGeneIC動物倫理委員会の承認を遵守して治療した。説明と同意の署名を全ての所有者から得た。全患者はその時点でまたはいずれかの原因による死亡時に剖検を受けた。
【０１８８】
全ての脳腫瘍は組織学または実行可能な場合には細胞学により診断された。死亡前の診断は、磁気共鳴画像（MRI）の特徴的な外見と臨床徴候の組み合わせに基づいて行った。組織学的診断はこれらの脳腫瘍の症例においては過度に侵襲性であるとみなし、診断は剖検により確認することにした。
【０１８９】
使用したステージ判定の方法は腫瘍の組織型および解剖部位ならびに臨床状態に応じて変化した。これらには、限定されるものでないが、物理試験、全血球計算値、血清生化学プロファイル、検尿、凝集プロファイル、胸部X線像、腹部超音波および磁気共鳴画像（MRI）が含まれた。MRIスキャンは1.5T Phillips Achievaで実施した。
【０１９０】
イヌは治療を受けるのに十分な挙動状態、および血液学および血清生化学パラメーターを有すれば、研究用に適格である。全てのイヌは研究参加時に測定可能な疾患を有したが、疾患の段階または疾患負荷の制限はなかった。患者は、発作およびCNS浮腫の予防を助ける投薬を続けることが認められた。併用条件として先に処方されていた投薬も続けることを許容した。代わりの治療法は試験期間中許容しなかった。
【０１９１】
1用量当たり1x1010 EGFRミニセルDoxの治療を毎週ベースで実施した。治療は、無菌的に配置した末梢静脈カテーテル（左頭部）を介して2分間にわたり2ml注入で投与した。
【０１９２】
患者を入院させて頸静脈経由で3ml血液を採集した。これを血液学用にEDTAカリウム塩中に、および生化学用に血清クロットアクチベーターチューブ中に入れた。さらなる5mlを、EGFRミニセルDox投与前およびミニセル投与後4時間に採集した。臨床治療期間を通じてイヌをモニターし、EGFRミニセルDox治療後4時間まで毒性副作用が存在しない場合、そのイヌを帰宅させた。
【０１９３】
血液を無菌チューブに入れて、1,580 x gで15分間室温（20〜22℃）で遠心分離し、そして血清を無菌的に採集した。血清を、サイトカインまたは抗体反応プロファイル作成に必要な時まで-80℃にて貯蔵した。治療の15分前に、患者にマレイン酸クロルフェニラミン0.5mg/kgおよびリン酸デキサメタゾンナトリウム0.2mg/kgを投薬した。
【０１９４】
脳の臨床観察およびMRIによる最初の臨床段階を終えた7匹の後期脳癌のイヌについてケーススタディを行った。
【０１９５】
BCD-1〜BCD-7と名付けたイヌ患者は、発作、失調症、部分的な肢麻痺、末梢視野の部分喪失および攻撃性行動（下表2を参照されたい）を含む典型的な後期脳腫瘍の臨床徴候を示した。
【０１９６】
1x1010 EGFRミニセルDox（2ml）の静脈内（i.v.）ボーラス注入をこれらのイヌに毎週1回投与し、臨床評価、血清血液学、生化学、免疫応答（ミニセル優先抗原、LPSに対する抗体力価）およびサイトカイン応答研究を毎週行った。脳のMRIスキャンをおよそ毎8週間に行って抗腫瘍応答を確認した。イヌに投与するミニセルの用量は、20匹のイヌの後期血管肉腫の研究およびアカゲザルサルの毒性学試験（データは示してない）から予め決定した。
【０１９７】
結果は、臨床段階の時点で確認した脳腫瘍の異常な臨床症候群（表2）がEGFRミニセルDoxのおよそ5〜15用量の投与後に正常に戻ることを示した。
【０１９８】
応答をMRIスキャンにより評価した。応答を固体腫瘍に対して「固体腫瘍の応答判定基準（Response Criteria In Solid Tumors）RECIST v 1.1」に従って分類した。さらに脳腫瘍体積を式：長さ x 幅 x 高さ x (π/6)を用いて評価した。完全応答（CR）を全ての公知の巨視的疾患の消滅と定義し、部分応答（PR）を腫瘍サイズの基線からの＞50％減少であるがCRでないものと定義し、安定な疾患は判定基準またはCR、PRもしくは進行性疾患に適合しない腫瘍と名付け、進行性疾患（PD）は腫瘍サイズの＞25％増加または新しい病変の出現と定義した。
【０１９９】
MRIスキャンは、全てのイヌにおいて、腫瘍増殖が停止しかつ一事例、BCD-2では、丁度5用量のEGFRミニセルDox後に、大きな腫瘍塊が確認されないことを示した（図5）。
【０２００】
実施例６  EGFRミニセルDox反復投与に関わらず、脳腫瘍のイヌにおける毒性の非存在
毒性を胃腸器官の機能障害の徴候（摂食障害、下痢、嘔吐、および腸炎）および本質的な徴候（嗜眠／疲労）についての顧客への質問により評価した。血液学的および生化学的毒性を各治療に先だって毎週ベースで確認した。毒性をイヌおよびネコの化学的または生物学的抗新生物療法後の副作用に対する「獣医学共同腫瘍学グループ−有害事象共通用語規準（Veterinary Co-operative Oncology Group-common terminology criteria for adverse events (VCOG-CTCAE)）v1.0」に従って格付けした。
【０２０１】
体重は治療のコース全体で不変でとどまった。体温は投与後の1時間内に38.5から39℃に上昇し4時間で正常に戻った。
【０２０２】
血清をイヌからEGFRミニセルDoxの投与前および投与後4時間に採集した（5 ml）。血清生化学的および血液学的プロファイルの評価（図6および7）をIDEXX Laboratories（Sydney、Australia）により行った。イヌに対する参照範囲はIDEXX laboratoriesから提供された。
【０２０３】
血清の生化学パラメーターは正常な参照範囲内に留まった（図6）。最初の臨床段階の時点に、全てのイヌは肝臓酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）およびアルカリホスファターゼ（ALP）の際立った上昇を示し、おそらく、全てのイヌが制御困難な発作に対して、毎日0.5〜2 mg/kgの範囲の用量グルココルチコイド(プレドニゾロン)およびフェノバルビトン（毎日2回1mg）による通常の治療を受けたからと思われる。肝臓超音波を定期的に全てのイヌに対して実施し、肝臓腫瘍の徴候はいずれも示さなかった。研究を通して、肝臓は正常のまま留まって、EGFRミニセルDoxの反復投与にも関わらず肝臓になんら有害な事象は示さなかった。
【０２０４】
全てのイヌに対する血液学的指標も研究を通して正常範囲内に留まった。
【０２０５】
実施例７  EGFRミニセルDox反復投与後の脳癌イヌにおけるサイトカインと抗体の応答
R&D Systems（USA）より補給されたELISA DuoSetキットを用いて、製造業者の取扱説明書による各ELISAの検証後に、イヌ血清をイヌ炎症性サイトカインTNFα、IL-6および抗炎症性のサイトカインIL-10について分析した。高結合マイクロウエルプレート（Greiner）をTMB基質（Sigma）を用いて現像し、Biotek uQuant プレートリーダーで450nmにて読み取った。
【０２０６】
炎症性サイトカインTNFαの応答は各イヌによって変化し、一致したパターンを示さなかった。3匹のイヌ（BCD-2、-4および-6）は反復投与に関わらず上昇を示さなかった（図8）。また、BCD-5とBCD-7はそれぞれ用量9および10まで上昇を示さなかったものの、続いての3および7用量はそれぞれ有意な上昇を示したが臨床の有害な徴候がなかった。BCD-1は臨床段階でTNFが上昇し、続いての97用量のEGFRミニセルDoxはTNFのさらなる上昇を示さなかった。
【０２０７】
炎症性サイトカインIL-6は投与後4時間にある傾向を示し（図8）、IL-6に小さいスパイクがあり、これは24時間までに正常に復した。引き続いての用量はIL-6スパイクの増加を生じることなく、各投与後にその傾向は同じままに留まった。例外はBCD-4であり、そのIL-8は研究を通して正常に留まった（288日にわたる39投与）。
【０２０８】
興味深いことに、抗炎症性サイトカインIL-10は、TNFαおよびIL-6にスパイクが存在すると上昇した（図8）。単球およびマクロファージは、細菌LPSなどの様々なメディエーターによる活性化後に、IL-10を分泌することがよく確立された。
【０２０９】
S. typhimurium（Sigma）から精製したLPSを、コーティングバッファー（lOmM 炭酸ナトリウム、pH 9.6）中のウエルにまいて（250ng/ウエル）、一晩4℃にてインキュベートした。プレートを、PBS中に1％BSAを含有するブロックバッファーにより37℃にて1時間ブロックした。血清サンプルの連続希釈液を各プレートに加え、4℃にて一晩インキュベートした。洗浄後、結合した抗体をヤギ抗イヌIgG西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲート（RDI）を用いて検出した。
【０２１０】
抗体力価を、半最大光学密度（450nm）読取値を与える血清希釈の逆数値と定義した。KC Junior ソフトウエアを用いて各血清サンプルに対する2パラメーター曲線を適合させた。全てのサンプルを二重に分析し、データは平均の標準誤差を表す。
【０２１１】
O-多糖血清抗体力価（図9）は、3用量（3週間にわたる）によるIgG力価の20倍増加を示しかつ各イヌに対する研究コースを通して、さらなる上昇のない安定域に到達する典型的な応答を示す。これは驚くことではない、何故なら、LPSのO-多糖成分はT細胞非依存性の1型抗原であって、これらの抗原分裂促進受容体、例えば主にToll様受容体（TLR）によりB細胞を活性化することが知られているからである。
【０２１２】
実施例８  投与したEGFRミニセルDoxの反復用量数と後期脳癌のイヌの生存
興味深いことに、イヌBCD-1〜BCD-7はそれぞれ822、709、471、288、408、140および101日生存し、それぞれ97、43、44、39、32、20および13用量のEGFRミニセルDoxを受けた（図10）。BCD-2、-3および-5は生存中であり、BCD-2は300日にわたり用量を受けず、腫瘍の再発がない。BCD-4は288日生存し、安定な疾患で留まったが、腎臓感染で死んだ。死後分析は死亡が脳腫瘍とは無関係であることを明らかにした。驚いたことに、全身投与したEGFRミニセルDoxが非常に多数の用量であったにも関わらず、有害事象の臨床徴候は存在しなかった。
【０２１３】
実施例９  2匹の後期脳癌のイヌにおけるEGFRミニセルのin vivo画像
ナノ粒子のin vivo体内分布は、特に大きい動物種において、粒子のサイズが非常に小さいので、1粒子当たり可視化を可能にする十分な蛍光分子を運ぶ能力ならびにいずれかの特定の器官でin vivoで達成される濃度により妨げられてきた。さらに、現行の解釈では12nmより大きいナノ粒子はBBBの存在によって脳腫瘍に進入しないだろうとされている。しかし、全ての7匹のイヌで観察された著しい抗腫瘍効力は、EGFRミニセルDoxが禁じられた大サイズの〜400nmにも関わらず、脳腫瘍中への進入を何とか果たしたのかを急いで確認するよう本発明者らを促した。
【０２１４】
このEGFRミニセルをヨウ素で放射標識し、1 x 1010ミニセルをBCD-3およびBCD-5にi.v.投与した。イヌを鎮静して単一光子放射コンピューター断層撮影（SPECT）を用いて画像化した。両方のイヌはまた腫瘍サイズおよび位置を明白に示す事前のMRIスキャンを有した。
【０２１５】
動物におよそ40MBqの放射標識[123I]-EGFRミニセル注射し、その後4時間にわたって様々な時点で画像を撮影した。全ての画像作成は、低エネルギー全目的平行孔コリメーター（all purpose parallel hole collimator）を備えたPicker 3000XP 三重検出器SPECT（単一光子放射コンピューター断層撮影）γカメラで実施した。全ての撮影は159 keV ± 10％のフォトピーク・ウインドウを用いた。動物は画像撮影の前に若干の軽い麻酔薬を与えられた。あるイヌ（BCD-3）は生体分布を研究するために、仰臥位で、注入後30分間および3時間に非断層撮影をした。頭部および胴体をカバーする複数平面の画像を256 x 256マトリックスで1ベッド当たり2分間、両方の時点で撮影し、撮影後に接合して全身の2Dスキャンを得た。全ての断層（SPECT）画像は128x128 マトリックスで、3°ラジアル増分（合計360°）、1投影当たり20秒間の120投影を用いて取得した。全てのデータをオフラインの核医療ワークステーション（HERMES, Nuclear Diagnostic, Stockholm, Sweden）に伝達し、反復再構築アルゴリズム（OSEM、8 サブセット、4反復）を用いて再構築した。画像は、2.0のソフトウエアズームで再構築し、を測定するボクセル1.78 x 1.78 x 2.56mm（X x Y x Z）を得た。画像を再構築後、オーダー10および1.25 cycles.pixel-1のカットオフのButterworthフィルターでフィルターした。先に得たイヌのMRIスキャンをワークステーション中に取り入れ、解剖学的（MRI）および機能的（SPECT）スキャンをソフトウエアに登録した。
【０２１６】
全身スキャン（図11ciおよびii）は、最初の時点（注入後30分間）からの肝臓内の標識した[123I]-EGFRミニセルの強い取込みを示した。
【０２１７】
この事実は、甲状腺の初期可視化の欠如に加えて、ミニセルの良い標識化を示した。腸内への排泄は、頸部におけるいくつかの両側の腺の取込みおよび存在する（仮想）遊離[123I]-ヨウ化物の少量の甲状腺取込みとして、後の画像で可視化された。
【０２１８】
脳のSPECT画像（図lla i-iii および 図llb iii；SPECT）は、MRIスキャン（図1la i-iiiおよび図llb i；MRI）に見出された脳腫瘍に対応する領域における放射能の巣を示した。同時登録したT1 post-contrast MRIおよびSPECTオーバーレイ画像（図lla i-iiiおよび図llb ii；SPECT/MRI）は巣の放射能が各イヌの腫瘍のコアに限定されていることを示した。
【０２１９】
これらの実施例は、後期脳腫瘍の症例の100％における抗腫瘍効力という本開示により達成される前例のない結果を実証するものである。これはまた、次の考察を加えると、非常に驚くべき結果でもある。
【０２２０】
1.  ドキソルビシン（579.98ダルトン）、例えば、パクリタキセル（853.9ダルトン）およびビンブラスチン（810.9ダルトン）のオーダーのサイズの薬物は、これまで、全身（i.v.）送達および脳腫瘍の治療用として決して考えられなかった。以上考察したように、共通認識である約400ダルトンのカットオフを前提とすれば、これらはBBBを横切ることは全く予想されなかった。
【０２２１】
2.  数十年の研究は唯一のFDAが認可した脳癌治療用薬物としてテモゾロミドを得た；その理由は、これがBBBを横切るために認知された400ダルトンカットオフ未満の分子量、194.15ダルトンを有する唯一の薬物であることによる。
【０２２２】
3.  たとえ脳腫瘍の治療のためと考えたとしても、汎用の化学療法においてドキソルビシンは通常、平均的患者（60kg）において100mg〜125mgの用量で投与される。これはいくつかの癌を治療する治療効力を達成する最小値とみなされるi.v. 1用量当たり100,000μg〜125,000μgに等しい。本発明によると、対照的に、1 x 1010 EGFRミニセルDoxに運ばれるドキソルビシン用量は約4μgであり、これは通常のdox化学療法で投与される用量より25,000倍〜31,200倍低い。本開示に従う際、通常のやり方からの相違は、癌治療の現在の解釈と組み合わさって、臨床医がいずれの事情においても、ましてや脳癌の状況において、かかる低薬物療法の見通しを考えることをためらわせる。
【０２２３】
4.  本開示に従うミニセル送達ビヒクルの使用は、以上考察した、共通認識のサイズ制限に矛盾すること、次いで、脳腫瘍におけるBBB破壊の通常の見方が告げられる。さらに、本開示で得たデータは、細菌由来のインタクトなミニセルが有意な濃度で脳腫瘍中に速やかに進入し、例えば、脳腫瘍ミクロ環境における放射標識ミニセルの撮影を可能にすることを示す。この結果はまた、治療した被験体の皆で非常に有意な腫瘍安定化／後退を実証し、これは従来の典型的にはただひどい結果しか得られなかった臨床癌医学の分野にとって、本開示に従う治療パラダイムの有効性を強調する先例のない成果でもある。
【表２】
2018024678.tif 000004
【０２２４】
実施例１０  様々な小分子薬物のミニセル中への充填
本実施例は多様な小分子薬物のミニセル中への充填の実施可能性、および得られる小分子薬物充填ミニセルを含有する組成物の顕著な抗腫瘍効力の両方を説明する。
【０２２５】
関わる小分子薬物は次の通りである：
A. ドキソルビシン、
B. パクリタキセル、
C. フルオロ-パクリタキセル、
D. シスプラチン、
E. ビンブラスチン、
F. モナストロール、
G. チミジル酸シンターゼ（TS）インヒビターOSI-7904 
H. イリノテカン、
I. 5-フルオロウラシル、
J. ゲムシタビン、および 
K. カルボプラチン。
【０２２６】
ドキソルビシン、ビンブラスチンおよびパクリタキセルの充填
ドキソルビシン、蛍光ビンブラスチンおよびフルオロ-パクリタキセルのインタクトなミニセル中への充填の有効性は本発明者らの出版物である"MacDiarmid et al., Cancer Cell 11: 431-45 (2007)"に示されている。MacDiarmidら、Cancer Cell（2007）の図1Eは色々な蛍光色で、ミニセルがそれぞれ大量の（DOX）、ビンブラスチン（VIN）およびパクリタキセル（PAC）によって充填されているのを示す。
【０２２７】
ドキソルビシン、フルオロ-パクリタキセルおよびシスプラチンは、一旦充填されると洩れ出さなかった
MacDiarmidら、Cancer Cell（2007）はさらに、動力学を用いて、（ドキソルビシン、フルオロ-パクリタキセルおよびシスプラチン）はただインタクトなミニセル中に十分充填されるだけでなく、これらの薬物は一旦充填されると洩れ出さないことを示した（この文献の図2Aを参照されたい）。
【０２２８】
ドキソルビシンおよびパクリタキセルを充填したミニセルは乳癌異種移植を治療するのに有効であった。
さらにMacDiarmidら、Cancer Cell（2007）の図4Aに示したデータは、ヒト乳癌異種移植片がドキソルビシン-またはパクリタキセル充填ミニセルを用いて効果的に治療されることを示した。
【０２２９】
モナストロール充填ミニセルの抗腫瘍効果
本発明者ら、MacDiarmid ら、Cell Cycle 17： 1-7 （2007）が出版した他の文献は、ヒト乳癌異種移植片を含有するマウスの腫瘍増殖を阻害するのにモナストロール充填ミニセルの有効性を実証するデータを提示している（この文献の図1Aを参照されたい）。
【０２３０】
図1Aに示すように、モナストロールをインタクトなミニセル中に効果的に充填し、ヒト乳癌異種移植片をモナストロール充填ミニセルによって効果的に治療した。
【０２３１】
チミジル酸シンターゼインヒビターOSI-7904を充填したミニセルの抗腫瘍効果
ヒト大腸癌異種移植片は、同様に、薬物積載ミニセルを用いて効果的に治療された。MacDiarmidら（2007）の図1Bは、OSI-7904積載ミニセルはOSI-7904Lのリポソーム製剤より〜385倍少ない用量で、リポソーム製剤OSI-7904Lより効果的であったことを示す。従って、ミニセル送達ベクターはOSI-7904の治療指数を劇的に増加した。
【０２３２】
イリノテカン耐性ヒト大腸癌異種移植片の効果的治療
イリノテカンもインタクトなミニセル中に充填した。さらに、shRNA-MDR1充填ミニセルに続くイリノテカン標的化ミニセルによる二重連続治療後の、イリノテカン耐性ヒト大腸癌異種移植片の効果的な治療が図5Aおよび本発明者らの他の文献である"MacDiarmid et al., Nature Biotechnology 27: 643-51 (2009)"の5Aに示されている。
【０２３３】
5-フルオロウラシル耐性ヒト大腸癌異種移植片の効果的治療
イリノテカンの様に、5-フルオロウラシルもインタクトなミニセル中も充填し、そしてshRNA-MDR1充填ミニセルに続く5-フルオロウラシル標的化ミニセルによる二重連続治療後に、5-フルオロウラシル-耐性ヒト大腸癌異種移植の効果的治療を達成した。
【０２３４】
MacDiarmid ら、（2009）の添付図4Aおよび4Bを参照されたい。
【０２３５】
ゲムシタビン（Gemzar(登録商標)）充填ミニセルによるヒト膵臓癌異種移植片の効果的治療
図12は、ヒト膵臓癌異種移植片がゲムシタビン（Gemzar(登録商標)）充填ミニセルを用いて効果的に治療されたことを示す。
【０２３６】
Balb/c nu/nu マウスのヒト膵臓癌（MIAPaCa）異種移植片をフリーGemzarまたはEGFR標的化Gemzar充填ミニセル（EGFRミニセルGemzar）のいずれかと共にi.v.投与した。図12は、ミニセル用量がわずか〜50ngのGezmarしか運ばなかったが、EGFRミニセルGemzar治療の抗腫瘍効力は、抗腫瘍効力で表して1用量当たり400,000ngで与えたフリーGezmarと丁度同じ効力であったことを示す。
【０２３７】
ヒト乳癌異種移植片の治療におけるカルボプラチン
カルボプラチン充填ミニセルのヒト乳癌異種移植片を治療する効果を図13に示す。
【０２３８】
Balb/c nu/nuマウス中のヒト乳癌（MDA-MB-468）異種移植片を、フリーカルボプラチンまたはカルボプラチン充填非標的化ミニセルまたはEGFR標的化カルボプラチン充填ミニセル（EGFRミニセルcarboPiatin）と共にi.v.投与した。図13の結果は、カルボプラチンの用量がフリーカルボプラチン用量より〜1000倍低かったにも関わらず、EGFRミニセルcarboplatin治療が腫瘍安定化を達成するのに非常に効果的であったことを示す。
【０２３９】
引用文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月20日(2017.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のインタクトな、細菌由来のミニセルを含む脳腫瘍を有する被験体の脳腫瘍の画像化において使用するための医薬組成物であって、
(A) 前記複数の各ミニセルが、(i) 腫瘍細胞抗原を特異的に認識する非ファゴサイトーシス哺乳動物細胞表面受容体に対して特異性を有するリガンド、および(ii)画像化剤を含み、かつ
(B) 脳腫瘍はその壁に窓を有する血管を有し、ミニセルは該窓を通って受動的に遊出することができる、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記非ファゴサイトーシス哺乳動物細胞表面受容体が腫瘍細胞抗原である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記リガンドが抗体である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抗体が腫瘍細胞抗原を特異的に認識する抗体である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記画像化剤が放射性核種である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
放射性核種がイットリウム-90、テクネチウム-99m、ヨウ素-123、ヨウ素-131、ルビジウム-82、タリウム-201、ガリウム-67、フッ素-18、キセノン-133、およびインジウム-111から選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
放射性核種が前記ミニセルの表面上のタンパク質または糖質と結合している、請求項５または６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
放射性核種がミニセルの表面と会合した二特異的抗体と結合している、請求項５または６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
30Gy〜100Gy放射能を含有する、請求項５〜８のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
画像化が、単一光子放射コンピューター断層撮影（SPECT）により実施される、請求項１〜９のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
画像化剤が、蛍光物質である、請求項１〜４のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記複数が少なくとも108ミニセルを含むものである、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記複数が少なくとも1010ミニセルを含むものである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
10 EU未満の遊離内毒素を含有する、請求項１〜１３のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
108 ミニセル当たり多くても1つの親細菌細胞を含有する、請求項1〜１４のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記脳腫瘍が膠芽細胞腫、星状膠細胞腫、希突起膠細胞腫、上衣細胞腫、頭蓋咽頭腫、下垂体腫、脳の原発性リンパ腫、松果体腺腫、脳の原発性胚細胞腫、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1〜１５のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記脳腫瘍が転移性脳腫瘍である、請求項1〜１６のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
製剤は一日用量で投与してもよい。あるいは、全一日用量を2、3、または4回の分割用量で投与してもよい。本発明の様々な態様を以下に示す。
１．複数のインタクトな、細菌由来のミニセルを含む組成物の治療上有効量を全身投与するステップを含むものである被験体の脳腫瘍を治療する方法であって、前記複数の各ミニセルが抗新生物剤を包含する前記方法。
２．前記抗新生物剤が放射性核種である、１に記載の方法。
３．放射性核種がイットリウム-90、テクネチウム-99m、ヨウ素-123、ヨウ素-131、ルビジウム-82、タリウム-201、ガリウム-67、フッ素-18、キセノン-133、およびインジウム-111から選択される、２に記載の方法。
４．放射性核種が前記ミニセルの表面上のタンパク質または糖質と結合している、２に記載の方法。
５．放射性核種がミニセルの表面と会合した二特異的抗体と結合している、４に記載の方法。
６．前記組成物が約30Gy〜約100Gy放射能を含有する、２〜５のいずれかに記載の方法。
７．前記抗新生物剤が化学療法薬である、１に記載の方法。
８．前記化学療法薬が約400ダルトン超の分子量を有する、７に記載の方法。
９．前記化学療法薬が標的化癌に対する前記化学療法薬のED50より低いLD50を有する、７または８に記載の方法。
１０．前記組成物が多くても約1mgの前記化学療法薬を含有する、７〜９のいずれかに記載の方法。
１１．前記抗新生物剤が機能性核酸または機能性核酸をコードするポリヌクレオチドである、１に記載の方法。
１２．前記機能性核酸が腫瘍細胞増殖、血管新生もしくは化学療法に対する耐性を促進する遺伝子および／またはアポトーシスもしくは細胞周期停止を阻害する遺伝子を阻害する、１１に記載の方法。
１３．前記機能性核酸がsiRNA、miRNA、shRNA、lincRNA、アンチセンスRNA、またはリボザイムから選択される、１１に記載の方法。
１４．前記抗新生物剤がアポトーシスを促進する遺伝子をコードするポリヌクレオチドである、１に記載の方法。
１５．前記複数の各ミニセルが非ファゴサイトーシス哺乳動物細胞表面受容体に対して特異性を有するリガンドを含むものである、１〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．前記受容体が腫瘍細胞抗原である、１５に記載の方法。
１７．前記リガンドが前記腫瘍細胞抗原を特異的に認識する抗体を含むものである、１６に記載の方法。
１８．前記複数が少なくとも約108ミニセルを含むものである、１〜１７のいずれかに記載の方法。
１９．前記複数が少なくとも約1010ミニセルを含むものである、１８に記載の方法。
２０．前記組成物が約10 EU未満の遊離内毒素を含有する、１〜１９のいずれかに記載の方法。
２１．前記組成物が108 ミニセル当たり多くても1つの親細菌細胞を含有する、1〜２０のいずれかに記載の方法。
２２．前記脳腫瘍が膠芽細胞腫、星状膠細胞腫、希突起膠細胞腫、上衣細胞腫、頭蓋咽頭腫、下垂体腫、脳の原発性リンパ腫、松果体腺腫、脳の原発性胚細胞腫、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、1〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．前記脳腫瘍が転移性脳腫瘍である、２２に記載の方法。
２４．脳腫瘍の治療用医薬品を製造するための組成物の使用であって、組成物が複数のインタクトな、細菌由来のミニセルを含み、前記複数の各ミニセルが抗新生物剤を包含するものである前記使用。
２５．前記組成物が多くとも約1mgの化学療法薬を前記抗新生物剤として含有する、２４に記載の使用。
２６．前記抗新生物剤が機能性核酸または機能性核酸をコードするポリヌクレオチドである、２４に記載の使用。
２７．前記機能性核酸が腫瘍細胞増殖、血管新生もしくは化学療法に対する耐性を促進する遺伝子および／またはアポトーシスもしくは細胞周期停止を阻害する遺伝子を阻害する、２６に記載の使用。
２８．前記抗新生物剤がアポトーシスを促進する遺伝子をコードするポリヌクレオチドである、２４に記載の使用。
２９．前記抗新生物剤が放射性核種である、２４に記載の使用。
３０．前記複数が少なくとも約1010ミニセルを含む、２４に記載の使用。
３１．前記組成物が約10 EU未満の遊離内毒素を含有する、２４に記載の使用。
３２．前記複数の各ミニセルが非ファゴサイトーシス哺乳動物細胞の表面受容体に対して特異性を有するリガンドを含むものである、２４に記載の使用。
３３．前記脳腫瘍が膠芽細胞腫、星状膠細胞腫、希突起膠細胞腫、上衣細胞腫、頭蓋咽頭腫、下垂体腫、脳の原発性リンパ腫、松果体腺腫、脳の原発性胚細胞腫、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、２４に記載の使用。
３４．前記脳腫瘍が転移性脳腫瘍である、３３に記載の使用。
３５．前記抗新生物剤が約400ダルトン超の分子量を有する化学療法薬である、２４に記載の使用。
３６．前記化学療法薬が標的化癌に対する前記化学療法薬のED50より低いLD50を有する、３５に記載の使用。
【外国語明細書】
2018024678000001.pdf