(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞質雄性不稔性イネ科植物の作製方法及び細胞質雄性不稔性イネ科植物の提供。【解決手段】イネ科植物において、核遺伝子の細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質であって、以下から選択されるタンパク質の機能を喪失又は低減させることにより、細胞質雄性不稔性イネ科植物を作製する方法。（１）特定の配列で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質。（２）特定の配列で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリアに局在する機能を有するタンパク質。（３）特定の配列で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子のオーソローグによりコードされるタンパク質。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネ科植物において、核遺伝子の細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質であって、以下から選択されるタンパク質の機能を喪失又は低減させることにより、細胞質雄性不稔性イネ科植物を作製する方法：
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質； 
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリアに局在する機能を有するタンパク質；及び
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子のオーソローグ遺伝子によりコードされるタンパク質。
【請求項２】
イネ科植物において、核遺伝子の細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質であって、以下から選択されるタンパク質の機能を喪失又は低減させることにより、細胞質雄性不稔性イネ科植物を作製する方法：
（ｉ）配列番号２で示される塩基配列を有するcDNAによりコードされるタンパク質； 
（ii）配列番号２で示される塩基配列を有するcDNAと７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するcDNAによりコードされ、ミトコンドリアに局在する機能を有するタンパク質；及び
（iii）配列番号２で示される塩基配列を有するcDNAが由来する遺伝子のオーソローグ遺伝子によりコードされるタンパク質。
【請求項３】
細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質の機能の喪失又は低減が、細胞質機能制御遺伝子に変異を導入することにより行われる、請求項１又は２に記載の細胞質雄性不稔性イネ科植物を作製する方法。
【請求項４】
細胞質機能制御遺伝子における変異が、ミトコンドリア移行シグナルドメインをコードする塩基配列、又は、ミトコンドリア移行シグナルドメインと触媒ドメインの間に挟まれた領域をコードする塩基配列に導入されるものである、請求項３に記載の細胞質雄性不稔性イネ科植物を作製する方法。
【請求項５】
イネ科植物が、ムギ類植物である、請求項１〜４のいずれか１に記載の細胞質雄性不稔性イネ科植物を作製する方法。
【請求項６】
イネ科植物において、核遺伝子の細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質であって、以下から選択されるタンパク質の機能が喪失又は低減しているか否かを確認することにより、細胞質雄性不稔性イネ科植物を選択する方法：
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質； 
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリアに局在する機能を有するタンパク質；及び
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子のオーソローグによりコードされるタンパク質。
【請求項７】
細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質の機能が喪失又は低減しているか否かの確認が、細胞質機能制御遺伝子の変異の有無を確認することである、請求項６に記載の細胞質雄性不稔性イネ科植物を選択する方法。
【請求項８】
イネ科植物において、核遺伝子の細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質であって、以下から選択されるタンパク質の機能が喪失又は低減している、細胞質雄性不稔性イネ科植物：
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質； 
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリアに局在する機能を有するタンパク質；及び
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子のオーソローグによりコードされるタンパク質。
【請求項９】
細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質の機能の喪失又は低減が、細胞質機能制御遺伝子の変異を導入することによるものである、請求項８に記載の細胞質雄性不稔性イネ科植物。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の細胞質雄性不稔性イネ科植物を用いて、一代雑種品種を育種する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞質雄性不稔性イネ科植物の作製方法よび細胞質雄性不稔性イネ科植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
雑種強勢（ヘテロシス）を利用した育種は、多くの作物においてその質や生産性をあげるための非常に優れた方法であることが知られている。雑種強勢は、他殖性植物であるトウモロコシなどで有効性が顕著であるが、自殖性のイネでもその有効性が立証されており、一代雑種品種（ハイブリッド：F1）種子生産に結びついている。高収量のF1種子を生産するために、異質細胞質に起因する雄性不稔現象（細胞質雄性不稔：Cytoplasmic Male Sterility（CMS））が広く利用されている。
【０００３】
多くの植物種では、細胞質は雌性側からのみ伝達されるため、連続戻し交雑法により、異種の細胞質をもった系統（細胞質置換系統）を作製することができる。細胞質置換系統には花粉が不稔となるものが含まれ、「細胞質雄性不稔（CMS）系統」と呼ばれる。CMS系統は、他の形質に大きな異常がなければ、母親としてF1種子の生産に供することができる。F1種子の生産は、CMS系統に、CMS系統の稔性を回復させる遺伝子（細胞質雄性不稔回復遺伝子：Fertiltity restorer（Rf）遺伝子）を保持する稔性回復系統を、父親として掛け合わせることにより行われる（特許文献１及び２）。
【０００４】
近年、分子生物学的手法を用いた研究によって、CMS系統の細胞質のミトコンドリア遺伝子の一部に構造的変化が起きていることが明らかになり、Rf遺伝子が単離されつつある。トウモロコシでは、Rf遺伝子の一つであるRf2遺伝子が、ミトコンドリア局在アルデヒド脱水素酵素をコードしていることが示された（非特許文献１及び２）。またペチュニアやイネでは、Rf遺伝子がpentaricopeptiderepeat（PPR）タンパク質をコードしており、ミトコンドリアや葉緑体といったオルガネラの機能維持に深く関与していることが明らかとなった（非特許文献３〜５）。これらのことから、CMSはミトコンドリア遺伝子の構造変異に起因しており、Rf遺伝子に基づく様々な機構によって不稔性が回復すると考えられた。しかしながら、その詳細な機構は未知のままである。
【０００５】
世界三大穀物の一つであるコムギにおいては、CMS系統を用いたF1種子の生産は、いまだ実用化されていない。これは優れたCMS系統とRf遺伝子の保持系統が育成されていないためである。有用なCMS系統を得るために、多くの細胞質置換系統を作製し、雄性不稔の誘発を調べるというアプローチが採用されているのが現状であり、計画的なアプローチを取ることができないという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2010-545779号公報
【特許文献２】特開2004-283126号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Cui X, Wise RP, Schnable PS.1996. Science. 272:1334-1336.
【非特許文献２】Liu F, Cui X, Horner HT, Weiner H, Schnable PS. 2001. Plant Cell 13:1063-78.
【非特許文献３】Bentolila S, Alfonso AA, Hanson MR. 2002. Proc Natl Acad Sci U S A. 99:10887-10892.
【非特許文献４】Akagi H, Nakamura A, Yokozeki-Misono Y, Inagaki A, Takahashi H, Mori K, Fujimura T. 2004. Theor Appl Genet. 108:1449-1457.
【非特許文献５】Komori T, Ohta S, Murai N, Takakura Y, Kuraya Y, Suzuki S, Hiei Y, Imaseki H, Nitta N. 2004. Plant J. 37:315-325.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、細胞質雄性不稔性イネ科植物（以下、「CMSイネ科植物」と称す。）の作製方法及びCMSイネ科植物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、イネ科植物において核遺伝子である細胞質機能制御遺伝子を同定し、当該細胞質機能制御遺伝子が種特異的に細胞質の機能を維持し得ることを見出し、当該細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質の機能が喪失又は低減することによりCMS系統のイネ科植物を作製することができ、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．  イネ科植物において、核遺伝子の細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質であって、以下から選択されるタンパク質の機能を喪失又は低減させることにより、CMSイネ科植物を作製する方法：
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質； 
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリアに局在する機能を有するタンパク質；及び
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子のオーソローグによりコードされるタンパク質。
２．  イネ科植物において、核遺伝子の細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質であって、以下から選択されるタンパク質の機能を喪失又は低減させることにより、CMSイネ科植物を作製する方法：
（ｉ）配列番号２で示される塩基配列を有するcDNAによりコードされるタンパク質； 
（ii）配列番号２で示される塩基配列を有するcDNAと７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するcDNAによりコードされ、ミトコンドリアに局在する機能を有するタンパク質；及び
（iii）配列番号２で示される塩基配列を有するcDNAが由来する遺伝子のオーソローグによりコードされるタンパク質。
３．  細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質の機能の喪失又は低減が、細胞質機能制御遺伝子に変異を導入することにより行われる、前項１又は２に記載のCMSイネ科植物を作製する方法。
４．  細胞質機能制御遺伝子における変異が、ミトコンドリア移行シグナルドメインをコードする塩基配列、又は、ミトコンドリア移行シグナルドメインと触媒ドメインの間に挟まれた領域をコードする塩基配列に導入されるものである、前項３に記載のCMSイネ科植物を作製する方法。
５．  イネ科植物が、ムギ類植物である、前項１〜４のいずれか１に記載のCMSイネ科植物を作製する方法。
６．  イネ科植物において、核遺伝子の細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質であって、以下から選択されるタンパク質の機能が喪失又は低減しているか否かを確認することにより、CMSイネ科植物を選択する方法：
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質； 
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリアに局在する機能を有するタンパク質；及び
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子のオーソローグによりコードされるタンパク質。
７．  細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質の機能が喪失又は低減しているか否かの確認が、細胞質機能制御遺伝子の変異の有無を確認することである、前項６に記載のCMSイネ科植物を選択する方法。
８．  イネ科植物において、核遺伝子の細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質であって、以下から選択されるタンパク質の機能が喪失又は低減している、CMSイネ科植物：
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質； 
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリアに局在する機能を有するタンパク質；及び
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子のオーソローグによりコードされるタンパク質。
９．  細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質の機能の喪失又は低減が、細胞質機能制御遺伝子の変異を導入することによるものである、前項８に記載のCMSイネ科植物。
１０．  前項８又は９に記載のCMSイネ科植物を用いて、一代雑種品種を育種する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、優れたCMSイネ科植物を計画的かつ効率的に作製又は選択することができる。当該CMSイネ科植物は、F1植物の育種に利用することができ、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ライコムギとコムギとの反復戻し交雑を説明する図である。（実施例１）
【図２】反復戻し交雑により得られた系統より採取したコムギ種子の写真図である。（実施例１）
【図３】反復戻し交雑により得られたコムギ種子を生育させた場合の植物の形態を示す写真図である。（実施例１）
【図４】各系統についてミジェット特異的DNAマーカーの有無を確認した結果を示す図である。（実施例１）
【図５】ミジェット特異的DNAマーカーの塩基配列を解析した結果を示す図である。開始コドンATGと終始コドンTGAに挟まれた塩基配列のうち、網掛けで示す部分はRcs遺伝子のエクソンである。（実施例１）
【図６】ミジェットに座乗するRcs遺伝子のcDNAの塩基配列（Ａ）、当該遺伝子がコードするアミノ酸配列（Ｂ）、Rcs遺伝子とオーソローグが各々コードするアミノ酸配列アライメントの結果（Ｃ）を示す図である。図６Ｃ中、Sceはライムギ（Secale cereale）IR51系統、TaeRmは本実施例のミジェット染色体、TaeAはコムギCS系統のAゲノム、TaeBはコムギCS系統のB ゲノム、TaeDはコムギCS系統のDゲノム、AtaDは、Aegilops tauschiiのDゲノムに由来するアミノ酸配列である。（実施例１）
【図７】本発明の細胞質機能制御遺伝子（X遺伝子）の機能を概説した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、CMSイネ科植物の作製方法及びCMSイネ科植物に関する。本発明のCMSイネ科植物は、核遺伝子の細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質であって、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのタンパク質の機能を喪失又は低減させることにより作製される。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質； 
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ミトコンドリアに局在する機能を有するタンパク質；及び
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子のオーソローグによりコードされるタンパク質。
【００１４】
本明細書において「イネ科植物」とは、イネ科に属する植物であればいかなるものであってもよい。イネ科に属する植物としては、例えばトウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギなどが例示されるが、好ましくはコムギ、オオムギ、ライムギ、ライコムギ等のムギ類植物である。
【００１５】
本明細書における「核遺伝子」は、細胞の核内に存在する遺伝子であり、ミトコンドリアや葉緑体等の細胞質内に所在する遺伝子と区別される。本明細書における「細胞質機能制御遺伝子」とは、細胞質の機能維持に不可欠なタンパク質をコードする遺伝子をいう。細胞質の機能維持に不可欠なタンパク質は、イネ科植物のミトコンドリアに局在し、ミトコンドリアの機能維持に関与すると考えられる。当該タンパク質の機能が喪失又は低減するとは、当該タンパク質がミトコンドリアに局在できないか、又はミトコンドリアに局在できたとしても、機能を発揮し得ないことを意味する。
【００１６】
本発明の「細胞質機能制御遺伝子」及び「細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質」を見出した経緯について、ライコムギとコムギとの交雑を例示し、以下具体的に詳細に説明する。
【００１７】
ライコムギとコムギとの反復戻し交雑により、ライムギの細胞質を有するコムギが得られる（図１）。かかるコムギには、「ミジェット」と呼ばれる非常に小型の染色体が核内に存在する。ミジェットが次代に伝達せずに失われると、種子の胚乳が退化してしまい、発芽したとしても植物は虚弱で不稔になってしまう（図２および図３）。本発明では、ミジェットを解析することにより、ライムギの細胞質の機能維持に不可欠な遺伝子（Rye-cytoplasm-specific gene：Rcs遺伝子）を同定し、そのcDNAを単離することに成功した。ミジェットが由来したと考えられているライムギ1R染色体には、近年マーカーとなるDNAが見出されつつある。ミジェットは小型染色体ではあるが、DNAサイズは50メガ塩基対（Mb）をこえており、DNAマーカーを利用したとしても遺伝子のクローニングは容易ではない。本発明では、ミジェット特異的なDNAマーカーであるM1マーカー（「TNAC1094」又は「TOP1094」とも称する：Ishikawa et al., BMC Genomics 8:135 (2007) doi:10.1186/1471-2164-8-135., Li et al., Chromosoma 122(6):555-64. (2013)）の近傍に、Rcs遺伝子が存在することを見出し、その塩基配列を解読することができた。Rcs遺伝子はミトコンドリアに局在するタンパク質の合成に関わる酵素をコードする遺伝子であり、細胞質の機能維持に関与していると考えられた。Rcs遺伝子がコードするタンパク質は、ミトコンドリア近傍またはそのうちに局在しミトコンドリアの機能を制御していると考えられる。Rcs遺伝子のオーソローグ（相同）遺伝子は真核生物に広く存在するが、イネ科植物においては、顕著なミトコンドリア移行シグナルをコードしている。またコムギの核内には、Rcs遺伝子のオーソローグが３種類存在するが、それらの遺伝子がコードするタンパク質はいずれもライムギのミトコンドリアには局在できないか、局在できても機能を発揮し得ない。つまり、Rcs遺伝子とそのオーソローグは、種特異的に働くという特徴を有しており、かかる特徴は従来のミトコンドリア局在タンパク質において報告のないものである。従って、Rcs遺伝子は細胞質雄性不稔を引き起こす遺伝子の一つであると考えられた。
【００１８】
本発明の「核遺伝子の細胞質機能制御遺伝子」として、具体的には上記Rcs遺伝子が例示され、本発明の「核遺伝子の細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質」として、上述のRcs遺伝子がコードするタンパク質であって、ミトコンドリアに局在しミトコンドリアの機能を制御するタンパク質が例示される。本明細書の細胞質機能制御遺伝子は、植物種特異的に、核と細胞質との親和性に影響を与える。例えば、ライムギの細胞質機能制御遺伝子であるRcs遺伝子は、コムギの細胞質には局在できない。すなわち、A種の細胞質機能制御遺伝子Xaがコードするタンパク質Xaは、自身の細胞質内に存在するミトコンドリアαには局在できるが、B種のミトコンドリアβには局在できないと考えられる。また、逆にB種の細胞質機能制御遺伝子Xbがコードするタンパク質XbはA種のミトコンドリアαには共生できないと考えられる（図７）。
【００１９】
本明細書において、核遺伝子の細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質の一例として特定される配列番号１で示されるアミノ酸配列は、以下の通りである。
MARVSSSKKRMLHTNSSSNNSRSNATANAAGSDGRPVRVYADGIFDLFHFGHARALEQAKLLFPNTYLLVGCCNDELTRRYKGKTVMNQEERYESLRHCKWVDEVIPDAPWVLTPEFIEKHQIDYVAHDALPYADTSGAANDVYEFVKKIGKFKETKRTDGVSTSDLIMRIVKDYNQYVMRNLARGYSRKDMGVSYVKEKQLQVNMKINKLRETVKAQQEKLQTVAKTAGINHEEWLANADRWVAGFLEKFEEHCHVMETAIKDRIQERLGRQAGKGIASGLMRQPVVAA-
【００２０】
配列番号１で示されるアミノ酸配列は、ライムギ細胞質の機能維持に不可欠なRye-cytoplasm-specific（Rcs）遺伝子（配列番号２に示す塩基配列を有するcDNAが由来する遺伝子）によりコードされる。配列番号１の1〜20番目までのアミノ酸配列は、ミトコンドリア移行シグナルドメインであり、21番目〜32番目のアミノ酸配列は変動領域（Variable region：VR）であり、33番目以後のアミノ酸配列は触媒ドメインである。Rcs遺伝子によりコードされるタンパク質は、ミトコンドリア移行シグナルドメインを持つことから、ミトコンドリアまで運搬されミトコンドリアに局在するものと考えられる。VRは、植物種によってアミノ酸配列が変化に富むことから（図６参照）、VRのアミノ酸配列によって当該細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質が共生可能な細胞質が特定されるものと考えられる。
【００２１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子は、本発明の実施例において同定されたRcs遺伝子である。上記（３）の「オーソローグ」は、ライムギとは異なる植物種に由来する核遺伝子であって、Rcs遺伝子に対して高い配列同一性を示す遺伝子である。また、オーソローグがコードするタンパク質は、Rcs遺伝子がコードするタンパク質と同様の機能を有するものであり、すなわち当該オーソローグが由来する植物種のミトコンドリアには局在できるが、それ以外の植物種のミトコンドリアには局在できないという機能を有するものである。一般的にオーソローグとは、特定の遺伝子と起源（祖先）を同じくする遺伝子として定義される。オーソローグは、特定の植物種の遺伝子の中でRcs遺伝子に最も高い配列同一性を示す遺伝子である。なお「配列同一性」とは、異なる２つのアミノ酸配列又は塩基配列間で、ギャップを導入するか又はギャップを導入しないで配列を整列比較したときの２つの配列の一致度を表わし、一般に全アミノ酸数（又は全塩基数）に対する同一アミノ酸数（又は同一塩基数）の割合（％）を意味する。通常、類似性又は同一性のある配列の検索は、BLAST（例えばBLASTX、BLASTNなど）、FASTAなどの公知のプログラムを利用して行うことができる。
【００２２】
上記（３）に示される、オーソローグによりコードされるタンパク質には、具体的には以下のアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。
【００２３】
コムギ（Triticum aestivum、品種：Chinese Spring（CS））のAゲノムによりコードされるタンパク質：
MARVSNSKKRMLHTNSSSGNKKEEATTASANASAAGSDDGRPVRVYADGIFDLFHFGHARALEQAKLLFPNTYLLVGCCNDDLTRRYKGKTVMNQEERYESLRHCKWVDEVIPDAPWVLTPEFIEKHQIDYVAHDALPYADTSGAANDVYEFVKKIGKFKETKRTDGVSTSDLIMRIVKDYNQYVMRNLARGYSRKDMGVSYVKEKQLQVNMKINKLRETVKAQQEKLQTVAKTAGINHEEWLANADRWVAGFLEKFEEHCHVMETAIKDRIQERLGRQAGKGIAGGLMRQPVAAA-（配列番号３）
【００２４】
コムギ（Triticum aestivum、品種：CS）のBゲノムによりコードされるタンパク質：
MARVSNSKKRMLHTNSSSNKKEEATTANANANAAGNDGRPIRVYADGIFDLFHFGHARALEQAKLLFPNTYLLVGCCNDDLTRRYKGKTVMNQEERYESLRHCKWVDEVIPDAPWVLTPEFIEKHQIDYVAHDALPYADTSGAANDVYEFVKKIGKFKETKRTDGVSTSDLIMRIVKDYNQYVMRNLARGYSRKDMGVSYVKEKQLQVNMKINKLRETVKAQQEKLQTVAKTAGINHEEWLANADRWVAGFLEKFEEHCHVMETAIKDRIQERLGRQAGKGIAGGLMRQPVAAA-（配列番号４）
【００２５】
コムギ（Triticum aestivum、品種：CS）のDゲノムによりコードされるタンパク質：
MARVSNSKKRMLHTNSSSNSQNKKEDAATAAGSADGRPVRVYADGIFDLFHFGHARALEQAKLLFPNTYLLVGCCNDDLTRRYKGKTVMNQEERYESLRHCKWVDEVIPDAPWVLTPEFIETHQIDYVAHDALPYADTSGAANDVYEFVKKIGKFKETKRTDGVSTSDLIMRIVKDYNQYVMRNLARGYSRKDMGVSYVKEKQLQVNMKINKLRETVKAQQEKLQTVAKTAGINHEEWLANADRWVAGFLEKFEEHCHVMETAIKDRIQERLGRQAGKGIAGGLMQQPVAAA-（配列番号５）
【００２６】
コムギ（Triticum aestivum、品種：CS）Dゲノムの親品種（Ae.squarrosa, Ae.tauschii）によりコードされるタンパク質：
MARVSNSKKRMLHTNSSSNSQNKKEDAATAAGSADGRPVRVYADGIFDLFHFGHARALEQAKLLFPNTYLLVGCCNDDLTRRYKGKTVMNQEERYESLRHCKWVDEVIPDAPWVLTPEFIEKHQIDYVAHDALPYADTSGAANDVYEFVKKIGKFKETKRTDGVSTSDLIMRIVKDYNQYVMRNLARGYSRKDMGVSYVKEKQLQVNMKINKLRETVKAQQEKLQTVAKTAGINHEEWLANADRWVAGFLEKFEEHCHVMETAIKDRIQERLGRQAGKGIAGGLMRQPVAAA-（配列番号６）
なお、上記アミノ酸配列（配列番号６）では、コムギ（品種CS）Dゲノム上のタンパク質（配列番号５）と比較して、T122KとQ286Rのアミノ酸置換がある。
【００２７】
イネ（Oryza sativa、品種：日本晴）によりコードされるタンパク質：
MARVSHSRKRTRAPSNSNSKPTSQTQPPPPELTDRPVRVYADGIFDLFHFGHARALEQAKLLFPNTYLLVGCCNDELTNRYKGKTVMTQDERYESLRHCKWVDEVIPDAPWVLTQEFIDKHQIDYVAHDALPYADTSGAANDVYEFVKKIGKFKETKRTDGVSTSDLIMRILKDYNQYVMRNLARGYTRKDLGVSYVKEKQLQVNMKINKLRETVKAHQEKLQTVAKTAGINHEEWLANADRWVAGFLEKFEEHCHNMETAIKGRIQEKLRRQTSRGIIGGLMQQPVAA-（配列番号７）
なお、ジャポニカ米とインディカ米では、上記アミノ酸配列は共通している。
【００２８】
細胞質機能制御遺伝子は、上記（１）〜（３）のタンパク質をコードする遺伝子であればいかなる遺伝子であってもよいが、例えば以下の（i）〜（iii）のタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
（i）配列番号２で示される塩基配列を有するcDNAによりコードされるタンパク質； 
（ii）配列番号２で示される塩基配列を有するcDNAと７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するcDNAによりコードされ、ミトコンドリアに局在する機能を有するタンパク質；及び
（iii）配列番号２で示される塩基配列を有するcDNAが由来する遺伝子のオーソローグによりコードされるタンパク質。
【００２９】
配列番号２で示される塩基配列は以下通りである。
ATGGCGCGCGTCTCCAGTTCCAAGAAGCGCATGCTCCACACCAACAGCAGCAGCAACAACAGCCGCAGCAACGCAACCGCCAACGCCGCGGGGAGCGACGGCCGCCCCGTCCGCGTCTACGCCGACGGCATCTTCGACCTCTTCCACTTCGGCCACGCCCGCGCCCTCGAGCAGGCCAAGCTGCTGTTCCCCAACACGTACCTGCTGGTGGGATGCTGCAACGACGAGCTCACGCGGCGCTACAAGGGCAAGACCGTCATGAACCAGGAGGAGCGATACGAGTCCCTGCGCCACTGCAAGTGGGTTGATGAGGTCATTCCTGATGCTCCCTGGGTTCTCACGCCAGAATTCATTGAGAAGCATCAGATTGACTATGTCGCACATGATGCTTTGCCTTATGCCGATACCAGCGGTGCTGCAAATGACGTCTATGAGTTTGTCAAGAAGATTGGAAAATTCAAGGAAACAAAACGGACTGATGGAGTATCGACATCGGACCTCATAATGAGGATAGTCAAGGACTACAACCAGTATGTCATGAGGAATTTAGCACGAGGTTACTCAAGGAAAGATATGGGCGTTAGCTATGTTAAGGAGAAACAACTGCAGGTGAATATGAAGATAAATAAACTGCGGGAGACTGTGAAGGCACAACAAGAAAAGTTGCAAACGGTGGCGAAGACGGCTGGGATAAACCACGAAGAGTGGCTGGCGAACGCGGATCGCTGGGTGGCCGGCTTCCTGGAGAAGTTCGAGGAGCATTGCCACGTCATGGAGACTGCCATCAAGGACCGGATACAGGAGAGGCTGGGGAGGCAGGCCGGCAAAGGCATAGCCAGCGGTCTCATGCGGCAACCGGTGGTGGCGGCCTGA
なお、配列番号２で示される塩基配列を有する遺伝子は、ライコムギとコムギを反復戻し交雑して作製された系統に生じるミジェットに座乗しているRcs遺伝子のcDNAである。
【００３０】
また上記（Ｃ）に示される、配列番号２のcDNAが由来する遺伝子のオーソローグのcDNAとしては、具体的には以下の塩基配列を有するcDNAが含まれる。
【００３１】
コムギ（Triticum aestivum、品種CS）のAゲノム上の遺伝子に由来するcDNA：
ATGGCGCGCGTCTCCAATTCCAAGAAGCGCATGCTCCACACCAACAGCAGCAGCGGCAACAAGAAGGAGGAGGCGACCACCGCCAGCGCCAACGCCAGCGCCGCGGGGAGCGACGACGGCCGCCCCGTCCGCGTCTACGCCGACGGCATCTTCGACCTCTTCCACTTCGGCCACGCCCGCGCCCTCGAGCAGGCCAAGCTGCTGTTCCCCAACACGTACCTGCTGGTGGGATGCTGCAACGACGACCTCACGCGGCGCTACAAGGGCAAGACCGTCATGAACCAGGAGGAGCGATACGAGTCCCTGCGCCACTGCAAGTGGGTTGATGAGGTCATTCCCGATGCTCCCTGGGTTCTCACGCCAGAATTCATTGAGAAGCATCAGATTGACTATGTCGCACATGATGCTTTGCCTTATGCCGATACAAGCGGTGCTGCAAATGACGTCTATGAGTTTGTCAAGAAGATTGGAAAATTCAAGGAAACAAAACGGACTGATGGAGTATCGACATCGGACCTTATAATGAGGATAGTGAAGGACTACAACCAGTATGTCATGAGGAATTTAGCACGAGGTTACTCAAGGAAAGATATGGGCGTGAGCTATGTTAAGGAGAAACAACTGCAAGTGAATATGAAGATAAATAAACTGCGGGAGACTGTGAAGGCACAACAAGAAAAGTTGCAAACGGTGGCGAAGACGGCTGGGATAAACCACGAAGAGTGGCTGGCGAACGCGGATCGCTGGGTGGCTGGCTTCCTGGAGAAGTTCGAGGAGCACTGCCACGTCATGGAGACTGCCATCAAGGACCGGATACAGGAGAGGTTGGGGAGGCAGGCCGGCAAAGGCATAGCCGGCGGTCTCATGCGGCAGCCGGTGGCGGCGGCCTGA（配列番号８）
【００３２】
コムギ（Triticum aestivum、品種CS）のBゲノム上の遺伝子に由来するcDNA：
ATGGCGCGCGTCTCCAATTCCAAGAAGCGCATGCTCCACACCAACAGCAGCAGCAACAAGAAGGAGGAGGCGACCACCGCCAACGCCAACGCCAACGCCGCTGGGAACGACGGCCGCCCCATCCGCGTCTACGCCGACGGCATCTTCGACCTCTTCCACTTCGGCCACGCCCGCGCCCTCGAGCAGGCCAAGCTGCTGTTCCCCAACACGTACCTGCTGGTGGGATGCTGCAACGACGACCTCACGCGGCGCTACAAGGGCAAGACCGTCATGAACCAGGAGGAGCGCTACGAGTCCCTGCGCCACTGCAAGTGGGTTGATGAGGTCATTCCTGATGCTCCCTGGGTTCTCACGCCAGAATTCATTGAGAAGCATCAGATTGACTATGTCGCACATGATGCTTTGCCTTATGCTGATACAAGCGGTGCTGCAAATGACGTCTATGAGTTTGTCAAGAAGATTGGAAAATTCAAGGAAACAAAAAGGACCGATGGAGTATCGACATCGGACCTTATAATGAGGATAGTGAAGGACTACAACCAGTATGTGATGAGGAATCTAGCACGAGGTTACTCAAGGAAAGATATGGGCGTGAGCTATGTTAAGGAGAAACAACTGCAGGTGAATATGAAGATCAATAAACTGCGGGAGACTGTGAAGGCACAGCAAGAAAAGTTGCAAACGGTGGCGAAGACGGCTGGGATAAACCACGAAGAGTGGCTGGCGAATGCGGATCGCTGGGTGGCAGGTTTCCTGGAGAAGTTTGAGGAGCACTGCCACGTCATGGAGACTGCCATCAAGGACCGGATACAGGAGAGGCTGGGGAGGCAGGCCGGCAAAGGCATAGCCGGCGGTCTCATGCGGCAGCCGGTGGCGGCGGCCTGA（配列番号９）
【００３３】
コムギ（Triticum aestivum、品種CS）のDゲノム上の遺伝子に由来するcDNA：
ATGGCGCGCGTCTCCAATTCCAAGAAGCGCATGCTCCACACCAACAGCAGCAGCAACAGCCAAAACAAAAAGGAGGACGCGGCCACCGCCGCGGGGAGCGCCGACGgCCGCCCCGTCCGCGTCTACGCCGACGGCATCTTCGACCTCTTCCACTTCGGCCACGCCCGCGCCCTCGAGCAGGCCAAGCTGCTGTTCCCCAACACGTACCTGCTGGTGGGATGCTGCAACGACGACCTCACGCGGCGCTACAAGGGCAAGACCGTCATGAACCAGGAGGAGCGATACGAGTCCCTGCGCCACTGCAAGTGGGTTGATGAGGTCATTCCTGATGCTCCCTGGGTTCTCACGCCAGAATTCATTGAGACGCATCAGATTGACTATGTCGCACATGATGCTTTGCCTTATGCTGATACCAGCGGTGCTGCAAATGACGTCTATGAGTTTGTCAAGAAGATTGGAAAATTCAAGGAAACAAAACGGACTGATGGAGTATCGACATCGGACCTCATAATGAGGATAGTCAAGGACTACAACCAGTATGTCATGAGGAATTTAGCACGAGGTTACTCAAGGAAAGATATGGGCGTGAGCTATGTTAAGGAGAAACAACTGCAAGTGAATATGAAGATCAATAAACTACGGGAGACTGTGAAGGCACAGCAAGAAAAGTTGCAAACGGTGGCGAAGACGGCTGGGATAAACCACGAAGAGTGGCTGGCGAACGCGGATCGTTGGGTTGCCGGCTTCCTGGAGAAGTTCGAGGAGCACTGCCACGTCATGGAGACTGCCATCAAGGACCGGATACAGGAGAGGCTGGGGAGGCAGGCGGGCAAAGGCATTGCCGGCGGTCTCATGCAGCAGCCGGTGGCGGCGGCCTGA（配列番号１０）
【００３４】
コムギ（Triticum aestivum、品種：CS）Dゲノムの親品種（Ae.squarrosa, Ae.tauschii）の遺伝子に由来するcDNA：
ATGGCGCGCGTCTCCAATTCCAAGAAGCGCATGCTCCACACCAACAGCAGCAGCAACAGCCAAAACAAAAAGGAGGACGCGGCCACCGCCGCGGGGAGCGCCGACGGCCGCCCCGTCCGCGTCTACGCCGACGGCATCTTCGACCTCTTCCACTTCGGCCACGCCCGCGCCCTCGAGCAGGCCAAGCTGCTGTTCCCCAACACGTACCTGCTGGTGGGATGCTGCAACGACGACCTCACGCGGCGCTACAAGGGCAAGACCGTCATGAACCAGGAGGAGCGATACGAGTCCCTGCGCCACTGCAAGTGGGTTGATGAGGTCATTCCTGATGCTCCCTGGGTTCTCACGCCAGAATTCATTGAGAAGCATCAGATTGACTATGTCGCACATGATGCTTTGCCTTATGCTGATACCAGCGGTGCTGCAAATGACGTCTATGAGTTTGTCAAGAAGATTGGAAAATTCAAGGAAACAAAACGGACTGATGGAGTATCGACATCGGACCTCATAATGAGGATAGTCAAGGACTACAACCAGTATGTCATGAGGAATTTAGCACGAGGTTACTCAAGGAAAGATATGGGCGTGAGCTATGTTAAGGAGAAACAACTGCAAGTGAATATGAAGATCAATAAACTACGGGAGACTGTGAAGGCACAGCAAGAAAAGTTGCAAACGGTGGCGAAGACGGCTGGGATAAACCACGAAGAGTGGCTGGCGAACGCGGATCGTTGGGTTGCCGGCTTCCTGGAGAAGTTCGAGGAGCACTGCCACGTCATGGAGACTGCCATCAAGGACCGGATACAGGAGAGGCTGGGGAGGCAGGCGGGCAAAGGCATTGCCGGCGGTCTCATGCGGCAGCCGGTGGCGGCGGCCTGA（配列番号１１）
【００３５】
イネ（Oryza sativa、品種：日本晴）の遺伝子に由来するcDNA：
ATGGCGCGCGTTTCGCATTCCAGAAAGCGGACTAGGGCTCCCTCCAACTCCAACTCCAAGCCCACTTCACAAACCCAACCGCCGCCGCCGGAGCTCACCGACCGCCCTGTCCGCGTCTACGCCGACGGCATCTTCGATCTCTTCCACTTCGGCCATGCCCGCGCCCTCGAGCAGGCCAAGTTGCTGTTCCCCAACACGTACCTGCTAGTGGGCTGCTGCAACGACGAGCTCACCAACCGCTACAAGGGCAAGACCGTCATGACCCAGGATGAGCGATACGAGTCCCTTCGCCACTGCAAATGGGTTGATGAGGTCATTCCTGATGCTCCATGGGTCCTCACGCAAGAGTTCATTGACAAACATCAGATTGACTATGTTGCTCATGATGCACTGCCTTATGCCGATACTAGTGGAGCTGCTAATGATGTCTATGAATTTGTTAAAAAGATTGGCAAATTCAAGGAAACGAAACGGACAGACGGTGTATCCACATCAGACCTCATAATGAGGATATTGAAGGACTACAATCAGTATGTCATGAGGAATTTAGCACGTGGATACACAAGGAAAGATTTAGGCGTAAGCTATGTTAAGGAAAAGCAACTCCAGGTCAACATGAAGATAAATAAACTGCGAGAGACTGTAAAGGCGCATCAAGAAAAGTTGCAAACGGTGGCGAAGACAGCTGGAATAAATCATGAAGAATGGTTGGCCAATGCAGATCGCTGGGTTGCTGGTTTCTTGGAGAAGTTTGAGGAACACTGCCACAACATGGAAACTGCCATCAAGGGGCGTATCCAGGAGAAATTGAGGAGGCAAACAAGCAGAGGGATAATTGGGGGTCTAATGCAGCAACCGGTGGCAGCGTAA（配列番号１２）
【００３６】
上記において、配列番号１に示すアミノ酸配列及び配列番号２に示す塩基配列は、GenBankアクセッション番号LC190969に登録される配列に含まれ、配列番号３に示すアミノ酸配列及び配列番号８に示す塩基配列は、GenBankアクセッション番号LC222745に登録される配列に含まれ、配列番号４に示すアミノ酸配列及び配列番号９に示す塩基配列は、GenBankアクセッション番号LC222746に登録される配列に含まれ、配列番号５に示すアミノ酸配列及び配列番号１０に示す塩基配列は、GenBankアクセッション番号LC22274７に登録される配列に含まれる。上記GenBankに登録した内容は、出願時においていずれも未公開である。
【００３７】
本明細書において、「細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質の機能の喪失又は低減」する方法は、当該タンパク質がミトコンドリアに局在できないか、又はミトコンドリアに局在できたとしても、機能を発揮し得ない状態にし得るものであれば、自体公知のいかなる手段によるものであってもよいし、今後開発されるいかなる方法によってもよい。具体的には、細胞質機能制御遺伝子の変異によることができる。細胞質機能制御遺伝子における変異は、タンパク質の機能の喪失又は低減を低減させ得るものであれば、いかなる位置に導入されてもよい。例えば、ミトコンドリア移行シグナルドメインをコードする塩基配列、又は、ミトコンドリア移行シグナルドメインと触媒ドメインの間に挟まれた変動領域（VR）をコードする塩基配列、触媒ドメインをコードする塩基配列のいずれに導入することが例示される。細胞質機能制御遺伝子に変異が導入されることにより、当該遺伝子によりコードされるタンパク質は、ミトコンドリアへの局在能を喪失又は低減し得る。例えば、VRをコードする塩基配列に変異が導入されることにより、VRによる種特異性が喪失又は低減し得ると考えられる。
【００３８】
本発明は、イネ科植物について、前記の細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質の機能が喪失又は低減しているか否かを確認することにより、CMSイネ科植物を選択する方法も包含する。上記タンパク質の機能の喪失又は低減は、当該タンパク質の細胞質における局在の確認や細胞質機能制御遺伝子の変異の有無を確認することにより行うことができる。
【００３９】
本発明は、本発明のCMSイネ科植物を作製する方法又は本発明のCMSイネ科植物を選択する方法により得られた、CMSイネ科植物を包含する。当該CMSイネ科植物は、細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質の機能が喪失又は低減しているものである。あるいは、イネ科植物において、細胞質遺伝子と同一の植物種由来の前記細胞質機能制御遺伝子が核内に含まれていないCMSイネ科植物である。
【００４０】
さらに本発明は、本発明のCMSイネ科植物を用いて、一代雑種品種（ハイブリッド：F1）を育種する方法も包含する。本発明のCMSイネ科植物は、そのままF1の育種に用いることもできるし、本発明のCMSイネ科植物を用いて、所望の細胞質雄性不稔（CMS）系統や稔性回復（Rf）系統を作製することができる。得られたCMS系統を含むCMSイネ科植物において、前記の細胞質機能制御遺伝子がコードするタンパク質の機能を回復させることにより、CMSが回復すると考えられる。本発明のCMSイネ科植物におけるCMSは、本発明にて見出された細胞質機能制御遺伝子によることが明らかであるため、CMSを回復させる手段の構築が容易である。これにより従来の方法に比較して、簡便かつ優れた細胞質雄性不稔-稔性回復（CMS-Rf）システムを構築できるものと考えられる。
【００４１】
普通系（パン）コムギの祖先種であるタルホコムギ（学名：Aegilops squarrosa, Aegilops tauschii, 又はTriticum tauschii）の細胞質をもつ二粒系（四倍性）コムギは、すべてがしわ種子となり、1DL染色体（Dゲノムの1番染色体の長腕）を添加すると正常種子になることが報告されている（Murata, M. et al., Wheat Inf. Serv. 41-42: 2-5 (1976)、Tsuji, S. et al., JAPAN. J. GENETICS Vol. 51 No. 5: 327-336 (1976)）。1DL染色体は細胞質機能制御遺伝子を有しており、当該細胞質機能制御遺伝子はタルホコムギの細胞質と相互作用すると考えられる。よってタルホコムギの細胞質を持つ普通系（パン）コムギについて、本発明の細胞質機能制御遺伝子を利用することによりCMS-Rfシステムを構築することが可能と考えられる。特に(squarrosa)-CS系統は、安定的に種子を生産可能である。CMS-Rfシステムの構築に用いる普通系（パン）コムギの系統としては、既に使用されている栽培品種や系統、(squarrosa)-CS系統を用いることができ、今後作製されるAe. squarrosaの細胞質を持つ系統も用いることができる。
【実施例】
【００４２】
以下に、本発明について実施例により説明するが、本発明は実施例の記載に限定されないことはいうまでもない。
【００４３】
（実施例１）  細胞質機能制御遺伝子の同定
（１）ライコムギとコムギの反復戻し交雑
ライムギの細胞質を有するコムギの系統（(cereale)-CS）の種子を、鳥取大学より譲り受け、交雑を続けることにより系統維持したものを用いた。 (cereale)-CSは、ライコムギと、コムギ（Triticum aestivum、Chinese Spring（CS）系統）とを反復戻し交雑法により作製されたものである（図１、Nakata, N.et al., Wheat Inf. Serv. 63:39. (1986)）、(cereale)-CS系統には、ライムギ由来の小型染色体（ミジェット）が含まれている。
【００４４】
(cereale)-CS系統を自家受粉させたところ、次代の個体にはミジェットの含まれる種子と、ミジェットを含まない種子が得られた。ミジェットが次代に伝達されると、正常な種子となり、伝達されないと胚乳が発達せず、しわ種子となることがわかった（図２）。このことから、ミジェットには、ライムギ細胞質の機能維持に不可欠な遺伝子（Rcs遺伝子）が座乗すると考えられた。
【００４５】
（２）ミジェット上のRcs遺伝子の特定、単離及び解析
ミジェットを含まない種子には、発芽が可能な種子（Midget-less germinable:Mlg）が含まれることがわかった（図３）。発芽した植物体Mlgは、虚弱で雄性不稔（雌性稔性は正常）であった（図４）。ミジェットに特異的なDNAマーカー（M1）の有無を、Ishikawa et al. (2007) BMC Genomics 8:135の記載の方法により確認したところ、MlgにはM1マーカーは認められなかった。M1マーカーの塩基配列を常法に沿ってシークエンス解析を行ったところ、Rcs遺伝子を同定した（図５、図６）。Rcs遺伝子は、ホスファチジルコリントランスフェラーゼをコードする遺伝子であることがわかった。ホスファチジルコリントランスフェラーゼは、植物ミトコンドリア内の膜主成分であるホスファチジルコリンの合成に関わる酵素である。
【００４６】
（実施例２）  Rcs遺伝子の機能の確認
ミジェット染色体に座乗するRcs遺伝子からcDNAを合成し、得られたcDNAをパンコムギ（栽培種：Bob White又はFielder）に形質転換する。形質転換は、パーティクルガン又はアグロバクテリウムによって行う。Rcs遺伝子のcDNAが導入された形質転換体の花粉を(cereale)-CSに交配する。ミジェット染色体が存在しなくても、胚乳が正常に発達した種子が得られることにより、Rcs遺伝子がミジェット染色体の代わりとして機能し、Rcs遺伝子が細胞質の機能を制御するものであることを確認することができる（補償実験）。
また、Rcs遺伝子のcDNAにGFP（緑色蛍光タンパク質）を融合させたものを、パンコムギに形質転換することにより、ミトコンドリアとの共局在を確認することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明によれば、優れたCMSイネ科植物を効率的かつ計画的に作製又は選択することができる。本発明により得られたCMSイネ科植物は、F1植物の育種に利用することができ、有用である。従来CMS系統は、その作物の近縁種（コムギではその祖先種を含むエギロプス属（Aegilops）など）を母親として、連続的にその作物の花粉を戻し交雑することより作製されており、多大な時間と労力を必要とするものであった。本発明は、優れたCMS-Rfシステムのデザイン及び構築を可能とするものであり、作物の育種を飛躍的に推進し得るものと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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