(57)【要約】【課題】骨量の減少を伴う骨代謝性疾患を効果的に予防又は治療することができる、予防又は治療剤、及び予防又は治療用組成物を提供する。【解決手段】潜在型Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）−β３又は潜在型ＴＧＦ−β１を有効成分として含有する、骨量の減少を伴う骨代謝性疾患の予防又は治療剤、及び予防又は治療用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
潜在型Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）−β１又は潜在型ＴＧＦ−β３を有効成分として含有する、骨量の減少を伴う骨代謝性疾患の予防又は治療剤。
【請求項２】
潜在型ＴＧＦ−β１を含有し、前記潜在型ＴＧＦ−β１が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、且つ活性型に変換された場合にＴＧＦ−βシグナルを伝達する活性を有するタンパク質である、請求項１に記載の予防又は治療剤。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列
【請求項３】
潜在型ＴＧＦ−β３を含有し、前記潜在型ＴＧＦ−β３が、以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、且つ活性型に変換された場合にＴＧＦ−βシグナルを伝達する活性を有するタンパク質である、請求項１に記載の予防又は治療剤。
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列
（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列
【請求項４】
前記骨代謝性疾患が、骨粗鬆症、転移性骨腫瘍、多発性骨髄腫、悪性腫瘍による高カルシウム血症又は変形性骨炎である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の予防又は治療剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の予防又は治療剤、及び薬学的に許容可能な担体を含有する、骨量の減少を伴う骨代謝性疾患の予防又は治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨量の減少を伴う骨代謝性疾患の予防又は治療剤、及び骨量の減少を伴う骨代謝性疾患の予防又は治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症は破骨細胞の過剰な活性化に骨芽細胞の活性が追いつかず、結果として骨量が減少するなどして、骨折のリスクが増加する疾患である。現在、骨粗鬆症治療薬としては、女性ホルモン、カルシトニン、ビスホスホネート、イプリフラボン、ラロキシフェン、ビタミンＫ２、ビタミンＤ等が用いられている。しかしながら、これらの骨粗鬆症治療薬は、効果が局所的でないため、副作用が問題となる場合がある。
【０００３】
例えば、女性ホルモンの投与は乳癌、子宮体癌等の発症率を高める場合がある。また、カルシトニンの投与は、顔面の紅潮、吐き気、アレルギー反応等を引き起こす場合がある。また、ビスホスホネートの投与は、顎骨壊死、顎骨骨髄炎等を引き起こす場合がある。また、イプリフラボンの投与は、発心、吐き気、腹痛等を引き起こす場合がある。また、ラロキシフェンの投与は、ほてり、吐き気、下肢のけいれん等を引き起こす場合がある。また、心筋梗塞の患者にビタミンＫ２を投与することは危険な場合がある。また、ビタミンＤの投与は血中カルシウムが増えすぎてしまう場合がある。
【０００４】
ところで、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）−βは、腎臓、骨髄、血小板等生体内のほぼすべての細胞で産生されるサイトカインの一種である。ＴＧＦ−βには、不活性な潜在型と活性を有する活性型が存在し、潜在型から活性型への変換による活性調節が行われていることが知られている。また、ＴＧＦ−βには、５種類のサブタイプ（β１〜β５）が存在することが知られている。哺乳類が有するＴＧＦ−βは、５つのサブタイプのうち、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２及びＴＧＦ−β３である。
【０００５】
骨代謝におけるＴＧＦ−βの機能については不明な点が多い。例えば、ＴＧＦ−βは骨吸収及び破骨細胞形成に阻害的に働くという報告がなされていると同時に促進的に働くという報告もなされている（例えば、非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Yan T, Riggs BL, Boyle WJ, Khosla S. 2001. Regulation of osteoclastogenesis and RANK expression by TGF-beta1. J Cell Biochem 83:320-5.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、副作用が少なく、骨量の減少を伴う骨代謝性疾患を効果的に予防又は治療することができる予防又は治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の態様を含む。
（１）潜在型ＴＧＦ−β１又は潜在型ＴＧＦ−β３を有効成分として含有する、骨量の減少を伴う骨代謝性疾患の予防又は治療剤。
（２）潜在型ＴＧＦ−β１を含有し、前記潜在型ＴＧＦ−β１が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、且つ活性型に変換された場合にＴＧＦ−βシグナルを伝達する活性を有するタンパク質である、（１）に記載の予防又は治療剤。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列
（３）潜在型ＴＧＦ−β３を含有し、前記潜在型ＴＧＦ−β３が、以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、且つ活性型に変換された場合にＴＧＦ−βシグナルを伝達する活性を有するタンパク質である、（１）に記載の予防又は治療剤。
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列
（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列
（４）前記骨代謝性疾患が、骨粗鬆症、転移性骨腫瘍、多発性骨髄腫、悪性腫瘍による高カルシウム血症又は変形性骨炎である、（１）〜（３）のいずれかに記載の予防又は治療剤。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の予防又は治療剤、及び薬学的に許容可能な担体を含有する、骨量の減少を伴う骨代謝性疾患の予防又は治療用組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、副作用が少なく、骨量の減少を伴う骨代謝性疾患を効果的に予防又は治療することができる予防又は治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（ａ）は、実験例１において、ＴＧＦ−β１〜３の破骨細胞形成に対する作用を比較したＴＲＡＰ染色の結果を示す顕微鏡写真である。（ｂ）は、（ａ）の染色結果を定量化したグラフである。
【図２】（ａ）及び（ｂ）は、実験例３の結果を示すグラフである。
【図３】（ａ）及び（ｂ）は、実験例４において、骨破壊モデルマウスに潜在型ＴＧＦ−β１−Ｆｃを投与した結果を示すマイクロＣＴ画像である。（ｃ）は、（ａ）及び（ｂ）の画像により確認された吸収窩数を数値化した結果を示すグラフである。
【図４】実験例４において、骨破壊モデルマウスに潜在型ＴＧＦ−β１−Ｆｃを投与した後、破骨細胞のマーカーであるカテプシンＫに対する抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図５】（ａ）及び（ｂ）は、実験例５において、骨破壊モデルマウスに潜在型ＴＧＦ−β３−Ｆｃを投与した結果を示すマイクロＣＴ画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［予防又は治療剤］
１実施形態において本発明は、潜在型ＴＧＦ−β１又は潜在型ＴＧＦ−β３を有効成分として含有する、骨量の減少を伴う骨代謝性疾患の予防又は治療剤を提供する。
【００１２】
哺乳類のＴＧＦ−βには、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３のサブタイプが存在することが知られている。また、ＴＧＦ−βは、潜在型ＴＧＦ−βとして生合成され、分子内切断を受けて活性型ＴＧＦ−βとなることが知られている。
【００１３】
潜在型ＴＧＦ−βとは、ＴＧＦ−β活性を有さず、活性化されて活性型ＴＧＦ−βに変換された場合にＴＧＦ−βシグナルを伝達する活性を示すタンパク質である。ＴＧＦ−βシグナルを伝達する活性は、例えば、ＴＧＦ−βレセプターの下流に存在する、Ｓｍａｄの活性化を検出すること等により測定することができる。潜在型ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−βシグナルを伝達する活性を有さないことが知られている。
【００１４】
実施例において後述するように、発明者らは、潜在型ＴＧＦ−β１又は潜在型ＴＧＦ−β３を骨破壊モデルマウスに投与することにより、インビボで骨破壊を抑制できることを明らかにした。したがって、潜在型ＴＧＦ−β１又は潜在型ＴＧＦ−β３は、骨量の減少を伴う骨代謝性疾患の予防又は治療剤として用いることができる。
【００１５】
本実施形態の予防又は治療剤において、骨量の減少を伴う骨代謝性疾患の予防又は治療に有効であるとは、例えば、当該疾患の症状の軽減、進行の阻止、又は発病の予防のいずれか一つ以上が達成されることを意味する。骨量の減少を伴う骨代謝性疾患の予防又は治療に有効であるか否かは、例えば、破骨細胞の形成抑制作用、破骨細胞による骨吸収の抑制作用、骨形成の促進作用、又は全身若しくは局所的な骨量増加作用等の作用のいずれか一つ以上を有することにより判断することができる。
【００１６】
潜在型ＴＧＦ−β１の具体例としては、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ヒトの潜在型ＴＧＦ−β１である。配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸としては、配列番号５に記載の塩基配列からなる核酸が挙げられる。
【００１７】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、マウスの潜在型ＴＧＦ−β１である。配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸としては、配列番号６で表される塩基配列からなる核酸が挙げられる。
【００１８】
実施例において後述するように、潜在型ＴＧＦ−β１とイムノグロブリン定常領域（Ｆｃ）との融合タンパク質である潜在型ＴＧＦ−β１−Ｆｃは、インビボで骨破壊を抑制することができることが明らかとなった。したがって、潜在型ＴＧＦ−β１には任意のタンパク質又はポリペプチドが付加されていてもよい。ここで、付加されていてもよいタンパク質又はポリペプチドとしては、例えば、Ｆｃタグ、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、ＧＦＰタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等が挙げられる。
【００１９】
潜在型ＴＧＦ−β１は、活性型に変換された場合にＴＧＦ−βシグナルを伝達する活性を有するタンパク質である限り、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して変異を有していてもよい。
【００２０】
潜在型ＴＧＦ−β１の具体例としては、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、且つ活性型に変換された場合にＴＧＦ−βシグナルを伝達する活性を有するタンパク質が挙げられる。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列
【００２１】
本明細書において、１又は複数個とは、例えば１〜１０個であってもよく、例えば１〜５個であってもよく、例えば１〜４個であってもよく、例えば１〜３個であってもよく、例えば１〜２個であってもよい。
【００２２】
また、本明細書において、アミノ酸配列の配列同一性は８０％以上であってもよく、８５％以上であってもよく、９０％以上であってもよく、９５％以上であってもよく、９８％以上であってもよい。
【００２３】
ここで、基準アミノ酸配列に対する、対象アミノ酸配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列をアラインメントする。ここで、各アミノ酸配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列において、一致したアミノ酸の数を算出し、下記式にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致したアミノ酸数／対象アミノ酸配列の総アミノ酸数×１００
【００２４】
潜在型ＴＧＦ−β３の具体例としては、配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ヒトの潜在型ＴＧＦ−β３である。配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸としては、配列番号７で表される塩基配列からなる核酸が挙げられる。
【００２５】
配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、マウスの潜在型ＴＧＦ−β３である。配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸としては、配列番号８で表される塩基配列からなる核酸が挙げられる。
【００２６】
潜在型ＴＧＦ−β３は、活性型に変換された場合にＴＧＦ−βシグナルを伝達する活性を有するタンパク質である限り、配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して変異を有していてもよい。
【００２７】
潜在型ＴＧＦ−β３の具体例としては、以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、且つ活性型に変換された場合にＴＧＦ−βシグナルを伝達する活性を有するタンパク質が挙げられる。ここで、１又は複数個、及びアミノ酸配列の配列同一性については上述したものと同様である。
（ｄ）配列番号３に記載のアミノ酸配列
（ｅ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列
（ｆ）配列番号３に記載のアミノ酸配列と配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列
【００２８】
骨量の減少を伴う骨代謝性疾患としては、骨粗鬆症、転移性骨腫瘍、多発性骨髄腫、悪性腫瘍による高カルシウム血症、変形性骨炎等の疾患が挙げられる。骨量の減少は、骨粗鬆症のように全身的なものであってよく、転移性骨腫瘍のように局所的なものであってもよい。
【００２９】
本実施形態の予防又は治療剤によれば、骨量の減少を伴う骨代謝性疾患を効果的に予防又は治療することができる。
【００３０】
潜在型ＴＧＦ−β１及び潜在型ＴＧＦ−β３は、破骨細胞の作用により活性型に変換される。ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３の潜在型から活性型への変換は、おそらく破骨細胞の周囲の酸性条件が要因となり生じるものと考えられる。
【００３１】
従来、ＴＧＦ−βの破骨細胞への作用は、破骨細胞形成促進と破骨細胞形成抑制の両方が報告されていた。このため、ＴＧＦ−βが骨量の減少を伴う骨代謝性疾患の予防又は治療効果を有するか否かは不明であった。また、実施例で後述するとおり、潜在型ＴＧＦ−βを含む培地での破骨細胞の一次培養では、破骨細胞の抑制効果の有意性は認められなかった。
【００３２】
これに対し、実施例において後述するように、発明者らは、潜在型ＴＧＦ−β１又は潜在型ＴＧＦ−β３を骨破壊モデルマウスに投与することにより、インビボで骨破壊を抑制できることを明らかにした。このような結果は、当業者であっても予測することは困難である。
【００３３】
骨は、破骨細胞による骨吸収と、破骨細胞により骨吸収された部分に骨芽細胞による骨形成が生じるというリモデリングのバランスにより恒常性が保たれている。従来、このリモデリング機序を利用した骨代謝性疾患の予防又は治療剤は存在していない。
【００３４】
本実施形態の予防又は治療剤によれば、上記のリモデリング機序に沿った作用を発揮し、破骨細胞により骨吸収された局所でのみ活性を発揮して骨吸収を抑制することができ、他の組織や細胞への副作用がほとんどない。また、本実施形態の予防又は治療剤によれば、骨吸収の抑制だけでなく、活性型ＴＧＦ−βによる骨形成の促進効果も期待することができる。
【００３５】
［予防又は治療用組成物］
１実施形態において、本発明は、上述した骨量の減少を伴う骨代謝性疾患の予防又は治療剤、及び薬学的に許容可能な担体を含有する、骨量の減少を伴う骨代謝性疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
【００３６】
本実施形態の予防又は治療用組成物は、非経口的に使用される剤型に製剤化されていることが好ましい。非経口的に使用される剤型としては例えば注射剤、軟膏剤、貼付剤等が挙げられる。
【００３７】
薬学的に許容される担体としては、通常製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。
【００３８】
治療用組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノールの安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。
【００３９】
治療用組成物は、上記の薬学的に許容される担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【００４０】
治療用組成物の投与量は、治療用組成物の剤型、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、例えば、注射剤の場合には、投与単位形態あたり０．０１〜５０ｍｇの有効成分（潜在型ＴＧＦ−β１又は潜在型ＴＧＦ−β３）を皮下注射、静脈注射、点滴等により投与すればよい。
【００４１】
また、治療用組成物の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、例えば、成人１日あたり０．００５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分を１日〜６ヶ月に１回程度に分けて投与すればよい。
【００４２】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、潜在型ＴＧＦ−β１又は潜在型ＴＧＦ−β３の有効量を、治療を必要とする患者に投与する工程を含む、骨量の減少を伴う骨代謝性疾患の予防又は治療方法を提供する。潜在型ＴＧＦ−β１又は潜在型ＴＧＦ−β３としては、上述したものが挙げられる。
【００４３】
１実施形態において、本発明は、骨量の減少を伴う骨代謝性疾患の予防又は治療のための潜在型ＴＧＦ−β又は潜在型ＴＧＦ−β３を提供する。潜在型ＴＧＦ−β１又は潜在型ＴＧＦ−β３としては、上述したものが挙げられる。
【００４４】
１実施形態において、本発明は、骨量の減少を伴う骨代謝性疾患の予防薬又は治療薬を製造するための潜在型ＴＧＦ−β１又は潜在型ＴＧＦ−β３の使用を提供する。潜在型ＴＧＦ−β１又は潜在型ＴＧＦ−β３としては、上述したものが挙げられる。
【実施例】
【００４５】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００４６】
［実験例１］
（活性型マウスＴＧＦ−β１〜３の破骨細胞形成に対する作用比較）
Ｃ５７／ＢＬ６バックグラウンドの野生型マウスから得た破骨細胞前駆細胞を、終濃度５０ｎｇ／ｍＬのｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（Ｍ−ＣＳＦ、Ｒ＆Ｄ社）を含む培地（以下「Ｍ」と表記する場合がある。）、終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ及び終濃度２５ｎｇ／ｍＬのｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａ  Ｂ  ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ、Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ社）を含む培地（以下、「Ｍ＋Ｒ」と表記する場合がある。）、終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ、終濃度２５ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫＬ及び終濃度２００ｎｇ／ｍＬのリコンビナントＢＭＰ２（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ社）を含む培地（以下「Ｍ＋Ｒ＋ＢＭＰ２」と表記する場合がある）、終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ、終濃度２５ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫＬ及び終濃度１０ｎｇ／ｍＬの活性型ＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ社）を含む培地（以下、「Ｍ＋Ｒ＋ＴＧＦβ１」と表記する場合がある。）、終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ、終濃度２５ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫＬ及び終濃度１０ｎｇ／ｍＬの活性型ＴＧＦ−β２（Ｒ＆Ｄ社）を含む培地（以下、「Ｍ＋Ｒ＋ＴＧＦβ２」と表記する場合がある。）、又は終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ、終濃度２５ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫＬ及び終濃度１０ｎｇ／ｍＬの活性型ＴＧＦ−β３（Ｒ＆Ｄ社）を含む培地（以下、「Ｍ＋Ｒ＋ＴＧＦβ３」と表記する場合がある。）中で５日間培養した。その後、破骨細胞のマーカーとして知られる酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）を市販のキット（Ｓｉｇｍａ社）で染色し、破骨細胞形成の程度を評価した。
【００４７】
図１（ａ）は５日間培養後の各細胞のＴＲＡＰ染色の結果を示す顕微鏡写真である。図１（ｂ）は図１（ａ）に基づいて、ＴＲＡＰ陽性の多核の細胞の数を計測した結果を示すグラフである。Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ  ｔｅｓｔにより有意差の有無を検討した。「＊」は、Ｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１で有意差があることを示す。その結果、活性型ＴＧＦ−β１又は活性型ＴＧＦ−β３の培地への添加により破骨細胞の形成が有意に抑制されることが明らかとなった。一方、活性型ＴＧＦ−β２の培地への添加により破骨細胞の形成が有意に促進されることが明らかとなった。
【００４８】
［実験例２］
（潜在型ＴＧＦ−β−Ｆｃの製造）
潜在型マウスＴＧＦ−β１をコードする塩基配列（配列番号６）のストップコドンに対応する塩基を除いた塩基配列を有するＤＮＡ断片を、Ｆｃ融合タンパク質発現ベクターに連結し、潜在型ＴＧＦ−β−Ｆｃの発現ベクターを作製した。続いて、潜在型ＴＧＦ−β−Ｆｃの発現ベクターをＣＯＳ７細胞にトランスフェクションして潜在型ＴＧＦ−β１−Ｆｃを発現させ、プロテインＧカラムを用いて精製し、潜在型ＴＧＦ−β１−Ｆｃを得た。
【００４９】
潜在型マウスＴＧＦ−β１をコードするＤＮＡ断片に代えて、潜在型マウスＴＧＦ−β３をコードする塩基配列（配列番号８）を用いたこと以外は、上記と同様にして潜在型ＴＧＦ−β３−Ｆｃを得た。
【００５０】
［実験例３］
（インビトロにおける潜在型ＴＧＦ−β１−Ｆｃの活性の検討）
Ｃ５７／ＢＬ６バックグラウンドの野生型マウスの大腿骨及び脛骨から取り出した骨髄細胞を、１０％（ｖ／ｖ）血清を含むα−ＭＥＭ培地に、Ｍ−ＣＳＦを終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した培地で７２時間培養した。
【００５１】
その後、接着細胞を回収し、一次培養（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅ）として、終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦを含む培地（以下「Ｍ」と表記する場合がある。）、終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ及び終濃度２５ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫＬを含む培地（以下、「ＭＲ」と表記する場合がある。）、終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ、終濃度２５ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫＬ及び終濃度１０ｎｇ／ｍＬの潜在型ＴＧＦ−β１を含む培地（以下、「ｌａｔｅｎｔ  ＴＧＦβ１」と表記する場合がある。）、終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ、終濃度２５ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫＬ及び終濃度１０ｎｇ／ｍＬの活性型ＴＧＦ−β１を含む培地（以下、「ａｃｔｉｖｅ  ＴＧＦβ１」と表記する場合がある。）中、１×１０５細胞／ウェルの細胞密度で９６ウェルプレートに播種して５日間培養した。
【００５２】
一次培養後、各細胞からＲＮＡを回収し、破骨細胞マーカーであるカテプシンＫ（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ、Ｃｔｓｋ）及びｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  １（ＮＦＡＴｃ１）の発現をリアルタイムＰＣＲにより解析した。
【００５３】
図２（ａ）は、一次培養後のＣｔｓｋとＮＦＡＴｃ１の発現量を示すグラフである。図２（ａ）において、データは、β−ａｃｔｉｎの平均発現量でＣｔｓｋ又はＮＦＡＴｃ１の平均発現量を標準化し、平均値±ＳＤで示す。Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ  ｔｅｓｔにより有意差の有無を検討した。「＊＊」は、Ｐ＜０．０１で有意差があることを示し、「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１で有意差があることを示し、「ＮＳ」は有意差がないことを示す。
【００５４】
続いて、二次培養（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を行った。一次培養におけるＭＲ培地の培養上清（以下、「ＭＲ  ＳＵＰ」と表記する場合がある。）、及びｌａｔｅｎｔ  ＴＧＦβ１培地の培養上清（以下、「ｌａｔｅｎｔ  ＴＧＦβ１  ＳＵＰ」と表記する場合がある。）を培地に用いて、上記と同様の接着細胞を５日間培養した。
【００５５】
二次培養後、各細胞からＲＮＡを回収し、破骨細胞マーカーであるカテプシンＫ（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ、Ｃｔｓｋ）及びｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  １（ＮＦＡＴｃ１）の発現をリアルタイムＰＣＲにより解析した。
【００５６】
図２（ｂ）は、二次培養後のＣｔｓｋとＮＦＡＴｃ１の発現量を示すグラフである。図２（ｂ）において、データは、β−ａｃｔｉｎの平均発現量でＣｔｓｋ又はＮＦＡＴｃ１の平均発現量を標準化し、平均値±ＳＤで示す。Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ  ｔｅｓｔにより有意差の有無を検討した。「＊」は、Ｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１で有意差があることを示す。
【００５７】
その結果、一次培養においては潜在型ＴＧＦ−β１の破骨細胞形成に対する影響は認められなかった。しかしながら、二次培養では、ＴＧＦ−β１非添加群と比較して破骨細胞形成の有意な抑制が認められた。この結果は、一次培養において活性化された破骨細胞によって、潜在型ＴＧＦ−β１が活性型ＴＧＦ−β１に変換されたことを示す。
【００５８】
［実験例４］
（骨破壊モデルマウスへの潜在型ＴＧＦ−β１−Ｆｃの投与）
８週齢のメスマウス５匹にリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を５００μｇ／マウスで頭蓋冠上に皮内投与し、骨破壊モデルマウスを作製した。対照としてリン酸バッファー（ＰＢＳ）投与を行った。ＬＰＳ又はＰＢＳの投与の際、２０μｇ／マウスの潜在型ＴＧＦ−β１−Ｆｃ（以下、「ＴＧＦβ１−Ｆｃ」と表記する場合がある。）又は２０μｇ／マウスのＣＤ４−Ｆｃ（対照）を同時に投与した。
【００５９】
投与後５日目でマウスを屠殺し、マイクロＣＴにより骨破壊を評価した。また、頭蓋冠をパラフィン包埋して組織切片を作製し、免疫染色により破骨細胞のマーカーであるカテプシンＫ（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ、Ｃｔｓｋ）を検出した。
【００６０】
図３（ａ）は実験例４で取得したマイクロＣＴの画像であり、図３（ｂ）はその一部分を拡大した画像である。図３（ｃ）は、骨吸収で生じるくぼみである吸収窩（ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｐｉｔ）数を定量したグラフである。吸収窩数は、ＬＰＳ及びＣＤ４−Ｆｃ投与群における吸収窩数を１とした相対値で示している。Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ  ｔｅｓｔにより有意差の有無を検討した。「＊＊」は、Ｐ＜０．０１で有意差があることを示し、「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１で有意差があることを示す。
【００６１】
その結果、潜在型ＴＧＦ−β１−Ｆｃの投与により、インビボにおいて骨破壊が顕著に抑制されたことが明らかとなった。
【００６２】
図４は、頭蓋冠の組織切片の免疫染色により、破骨細胞のマーカーであるカテプシンＫ（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ、Ｃｔｓｋ）を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。対照として、４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）により細胞核を染色した結果も併せて示す。その結果、潜在型ＴＧＦ−β１−Ｆｃ投与により、破骨細胞形成が顕著に抑制されたことが明らかとなった。
【００６３】
［実験例５］
（骨破壊モデルマウスへの潜在型ＴＧＦ−β３−Ｆｃの投与）
上記実験例４において、潜在型ＴＧＦ−β１−Ｆｃに代えて潜在型ＴＧＦ−β３−Ｆｃを用いた以外は、上記実験例４と同様にして、潜在型ＴＧＦ−β３−Ｆｃ（以下、「ＴＧＦβ３−Ｆｃ」と表記する場合がある。）、又はＣＤ４−Ｆｃ（対照）を骨破壊モデルマウスへ投与し、マイクロＣＴにより骨破壊を評価した。
【００６４】
図５（ａ）は実験例５で取得したマイクロＣＴの画像であり、図５（ｂ）はその一部分を拡大した画像である。
【００６５】
その結果、潜在型ＴＧＦ−β３−Ｆｃが投与された骨破壊モデルマウスは、ＣＤ４−Ｆｃが投与された骨破壊モデルマウスに比べ、骨破壊が顕著に抑制されたことが明らかとなった。
【００６６】
以上の結果から、潜在型ＴＧＦ−β１をインビボで投与することにより、破骨細胞が活性化された領域のみで活性型ＴＧＦ−β１に変換され、破骨細胞形成を顕著に抑制することが明らかとなった。また、潜在型ＴＧＦ−β３も潜在型ＴＧＦ−β１と同様の効果を有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明によれば、骨量の減少を伴う骨代謝性疾患を効果的に予防又は治療することができる予防又は治療剤を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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