(57)【要約】      （修正有）【課題】松樹皮抽出物を含有するＤＮＡ組成物に関して、十分な供給量を確保できると共に製造コストを低く抑える得るデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）保存用組成物の提供。【解決手段】ＤＮＡ保存用組成物は、多糖体を含有する乳酸菌産生物を有効成分とする。前記乳酸菌産生物は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１２４７菌と、ストレプトコッカス・サーモフィラスＯＬＳ３０７８菌との組合せによって生成されることが好ましい、ＤＮＡ保存用組成物。尚、ここにいう「組成物」には、医薬品，サプリメント及び食品添加剤等の製剤、飲食品並びに飲食品組成物等の動物（ヒトを含む）が摂取し得る物が含まれ、「保存」とは、ＤＮＡの損傷を抑制したり、ＤＮＡの損傷修復を促進したりすることを意味する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖体を含有する乳酸菌産生物を有効成分とするデオキシリボ核酸保存用組成物。
【請求項２】
前記乳酸菌産生物は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）とストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）との組合せによって生成される
請求項１に記載のデオキシリボ核酸保存用組成物。
【請求項３】
前記ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスは、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１２４７菌（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８１４）であり、
前記ストレプトコッカス・サーモフィラスは、ストレプトコッカス・サーモフィラスＯＬＳ３０７８菌（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６９７）である
請求項２に記載のデオキシリボ核酸保存用組成物。
【請求項４】
多糖体を含有する乳酸菌産生物をデオキシリボ核酸保存用組成物として使用する方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のデオキシリボ核酸保存用組成物を経口投与することによりデオキシリボ核酸を保存する方法（ただし、人を治療する行為を除く。）。
【請求項６】
デオキシリボ核酸保存用組成物としての使用のための、多糖体を含有する乳酸菌産生物。
【請求項７】
デオキシリボ核酸を保存するための組成物の製造のための、多糖体を含有する乳酸菌産生物の使用。
【請求項８】
多糖体を産生する乳酸菌に乳原料を供給してデオキシリボ核酸保存用組成物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デオキシリボ核酸（以下「ＤＮＡ」と称する。）を保存するための組成物およびその製造方法に関する。また、本発明は、ＤＮＡを保存する方法にも関する。さらに、本発明は、乳酸菌産生物およびその使用方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
過去に「松樹皮抽出物を含有するＤＮＡ保護剤および健康食品」が提案されている（例えば、特開２００３−２３８４２７等参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−２３８４２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、松は成木になるまでに期間が比較的長く、その供給量に限りがある。また、その抽出物を得るためには伐採等の比較的危険な作業が必要となる共に、抽出後の残りカスの処分も必要となる。このため、「松樹皮抽出物を含有するＤＮＡ保護剤および健康食品」の製造コストは必然的に高くなってしまう。したがって、「松樹皮抽出物を含有するＤＮＡ保護剤および健康食品」は、高価な商品となることが想定される。
【０００５】
本発明の課題は、十分な供給量を確保することができると共に製造コストを低く抑えることができるＤＮＡ保存用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１局面に係るＤＮＡ保存用組成物は、多糖体を含有する乳酸菌産生物（以下「多糖体含有乳酸菌産生物」と称する。）を有効成分とする。すなわち、多糖体含有乳酸菌産生物をＤＮＡ保存用組成物としてまたはその一成分として使用する。なお、ここにいう「組成物」には、医薬品，サプリメントおよび食品添加剤等の製剤、飲食品（動植物そのものを除く。）ならびに飲食品組成物（加工された飲食品を含む。）等の動物（ヒトを含む）が摂取し得る物が含まれる。また、ここにいう「保存」とは、ＤＮＡの損傷を抑制したり、ＤＮＡの損傷修復を促進したりすることを意味する。
【０００７】
本願発明者らの鋭意検討の結果、本発明の第１局面に係るＤＮＡ保存用組成物がＤＮＡの損傷を抑制したり、ＤＮＡの損傷修復を促進したりすることができることが明らかとされた。すなわち、このＤＮＡ保存用組成物は、良好にＤＮＡを保存することができる。また、このＤＮＡ保存用組成物の有効成分は、上述の通り乳酸菌によって産生される。このため、このＤＮＡ保存用組成物の有効成分は、比較的安全な作業で廃棄物を出すことなく短時間で産生することができる。このため、このＤＮＡ保存用組成物は、十分な供給量を確保することができると共に製造コストを低く抑えることができる。
【０００８】
ところで、上述のＤＮＡ保存用組成物において、多糖体含有乳酸菌産生物は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）とストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）との組合せによって生成されることが好ましい。なお、ここで、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスは具体的にはラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１２４７菌（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８１４）であることが好ましく、ストレプトコッカス・サーモフィラスは具体的にはストレプトコッカス・サーモフィラスＯＬＳ３０７８菌（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６９７）であることが好ましい。
【０００９】
本発明の第２局面に係る方法は、多糖体含有乳酸菌産生物をＤＮＡ保存用組成物として使用する方法である。すなわち、ＤＮＡ保存用組成物としての使用のための多糖体含有乳酸菌産生物を提供することである。
【００１０】
本発明の第３局面に係るＤＮＡを保存する方法は、上述のＤＮＡ保存用組成物を経口摂取する方法である。ただし、ヒトを治療する行為を除かれる。なお、摂取期間は、１週間以上であることが好ましく、２週間以上であることがより好ましく、３週間以上であることがさらに好ましく、４週間以上であることが特に好ましい。
【００１１】
本発明の第４局面に係るＤＮＡ保存用組成物の製造方法では、多糖体を産生する乳酸菌に乳原料が供給されることによってＤＮＡ保存用組成物が製造される。すなわち、ここでは、多糖体含有乳酸菌産生物が、ＤＮＡを保存するための組成物を製造するために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実験例に係る各試料から採取されたＤＮＡ中のシクロブタンピリミジンダイマーの存在量を示す棒グラフ図である。
【図２】実験例に係る各試料から採取されたＤＮＡ中の８−オキソ−２’−デオキシグアノシンの存在量を示す棒グラフ図である。
【図３】実験例に係る各試料から抽出されたＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを用いて測定されたカタラーゼのｍＲＮＡの相対量を示す棒グラフ図である。
【図４】実験例に係る各試料から抽出されたＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを用いて測定されたｘｅｒｏｄｅｒｍａ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｇｒｏｕｐ  Ａ（ＸＰＡ）のｍＲＮＡの相対量を示す棒グラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の実施の形態に係るＤＮＡ保存用組成物は、ＤＮＡの損傷を抑制したり、ＤＮＡの損傷修復を促進したりするための経口摂取組成物であって、多糖体を含有する乳酸菌産生物（以下「多糖体含有乳酸菌産生物」と称する。）を有効成分とする。以下、このＤＮＡ保存用組成物の有効成分について詳述した後、ＤＮＡ保存用組成物の形態について説明を行い、各形態における任意成分について詳述する。また、その後、さらに、ＤＮＡ保存用組成物の効率的な摂取方法やその効果についても詳述する。
【００１４】
（１）多糖体含有乳酸菌産生物
本発明の実施の形態において、多糖体含有乳酸菌産生物には、多糖体を含有する乳酸菌発酵物（以下「多糖体含有乳酸菌発酵物」という。）、多糖体を含有する乳酸菌培養物（以下「多糖体含有乳酸菌培養物」という。）、多糖体を含有する乳酸菌代謝物等が含まれる。
【００１５】
なお、ここにいう「多糖体」とは、ガラクトース、グルコース、ラムノース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミンなどの糖類から構成される糖鎖高分子である。この多糖体には、中性多糖体の他、リン酸基が結合した酸性多糖体が含まれてもよい。また、その分子量は、通常、５０００から５０万の範囲内である。
【００１６】
また、ここにいう「乳酸菌」とは、ブドウ糖を資化して対糖収率で５０％以上の乳酸を生産する微生物の総称で、生理学的性質としてグラム陽性菌の球菌または桿菌で、運動性なし、胞子形成能なし、カタラーゼ陰性などの特徴を有しているものである。乳酸菌は古来、発酵乳等を介して世界各地で食されており、極めて安全性の高い微生物と言える。乳酸菌は現在までに、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、リューコノストック（Leuconostoc）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ワイセラ（Wissella）属、テトラジェノコッカス（Tetragenococcus）属、オエノコッカス（Oenococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、バゴコッカス（Vagococcus）属、カルノバクテリウム（Carnobacterium）属の１１属に分類されている。本発明の実施の形態ではこれら全ての乳酸菌を用いることができるが、これらの中でも、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）とストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）とを混合して用いることが特に好ましい。なお、ここにいうラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスはラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクスＯＬＬ１２４７菌（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８１４）であることが好ましく、ストレプトコッカス・サーモフィラスはストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）ＯＬＳ３０７８菌（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６９７）であることが好ましい。ここで、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）ＯＬＬ１２４７菌は、２０１４年３月６日付（受託日）で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８１４として、ブタペスト条約に基づき国際寄託されている。また、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）ＯＬＳ３０７８菌は、２０１３年８月２３日付（受託日）で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６９７として、ブタペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００１７】
ここにいう「乳酸菌発酵物」とは、乳酸菌による発酵によって得られた培養物自体を意味する。そして、この乳酸菌発酵物には、乳酸菌の発酵物およびその処理物、例えば、培養物（乳酸菌発酵物）をろ過・遠心分離もしくは膜分離等で除菌して得られた培養濾液や培養上清液、培養濾液・培養上清液や乳酸菌発酵物等をエバポレーター等により濃縮した濃縮物、ペースト化物、希釈物又は（凍結、加熱、減圧など）乾燥物が含まれる。なお、処理物の調製の際は、ろ過、遠心分離、膜分離等の除菌処理、沈殿、濃縮、ペースト化、希釈、乾燥などの前述の処理工程の１つ又は複数を組み合わせて実施することができる。また、培養物用の培地としては、例えば、酵母エキスを添加した脱脂粉乳培地、ＭＲＳ培地等が挙げられる。
【００１８】
乳酸菌産生物は乳酸菌の乳発酵物や、乳培養物、乳代謝物であるのが特に好ましい。乳発酵物や、乳培養物、乳代謝物としては、例えば、発酵乳（ヨーグルト）や多糖体が挙げられる。発酵乳（ヨーグルト）は、乳に乳酸菌や酵母を混ぜて発酵することによって調製される発酵食品であり、その美味しさと、美容や健康面から幅広く食されている。発酵乳（ヨーグルト）は、好ましくはその上清とすることができる。この発酵乳には、脱脂粉乳や、ホエイ分解物等の培養液の他、ペクチン、グアーガム、キサンタンガム、カラギーナン、加工でんぶん等の増粘剤やゲル化剤が添加されていてもよい。
【００１９】
乳としては、例えば、牛乳等の獣乳や、その加工品（例えば、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳、れん乳、カゼイン、乳清、生クリーム、コンパウンドクリーム、バター、バターミルクパウダー、チーズ等）、大豆由来の豆乳等の植物性乳等が挙げられる。なお、乳は、殺菌処理されていてもよいし、殺菌処理されていなくてもよい。
【００２０】
ところで、発酵乳の原料として、例えば、発酵乳原料ミックスと呼ばれるものが挙げられる。発酵乳原料ミックスとは、原料乳および他の成分を含む混合物である。この発酵乳原料ミックスは、例えば、原料乳、水、他の任意成分（例えば、砂糖、糖類、甘味料、酸味料、ミネラル、ビタミン、香料等）等の発酵乳の製造に常用される原料を加温して溶解し、混合することによって得られる。原料乳には、水、生乳、殺菌乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳、全脂濃縮乳、脱脂濃縮乳、バターミルク、バター、クリーム、チーズ等が含まれてもよい。また、原料乳には、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、α−ラクトアルブミン（α−Ｌａ）、β−ラクトグロブリン（β−Ｌｇ）等が含まれてもよい。
【００２１】
発酵乳は、従来の方法と同様に、原料ミックスの調合工程、原料ミックスの（加熱）殺菌工程、原料ミックスの冷却工程、スターターの添加工程、発酵工程、発酵乳の冷却工程等の工程を経て製造される。原料ミックスの調合工程では、原材料が混合（調合）される。なお、上述の工程では、発酵乳を製造する際に用いられる通常の条件を適宜採用すればよい。また、原料ミックスの（加熱）殺菌工程、原料ミックスの冷却工程、スターターの添加工程、発酵工程および発酵乳の冷却工程は、この順番で実施されることが好ましい。
【００２２】
乳酸菌を培養するための培地としては、通常用いられる培地を使用することができる。すなわち、主炭素源のほか窒素源、無機物その他の栄養素を程良く含有する培地であれば、いずれの培地も使用することができる。炭素源としては、使用菌の資化性に応じて、ラクトース、グルコース、スクロース、フラクトース、澱粉加水分解物、廃糖蜜等を使用することができる。窒素源としては、カゼインの加水分解物、ホエイタンパク質加水分解物、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、グリコマクロペプチド、大豆タンパク質加水分解物等の有機窒素含有物を使用することができる。ほかに増殖促進剤としては、肉エキス、魚肉エキス、酵母エキス等を使用することができる。
【００２３】
乳酸菌は、嫌気状態で培養されることが好ましいが、通常、液体静置培養等で用いられる微好気状態で培養されることが好ましい。なお、嫌気状態下での培養方法には、炭素ガス気相下で培養する方法などの公知の手法を採用することができるが、他の方法が採用されてもかまわない。培養温度は一般に３０℃以上４７℃以下の範囲内であることが好ましく、３５℃以上４６℃以下の範囲内であることがより好ましく、３７℃以上４５℃以下の範囲内であることがさらに好ましい。乳酸菌培養中の培地のｐＨは、６以上７以下の範囲内に維持されることが好ましいが、菌が生育するｐＨであれば他のｐＨ範囲でもよい。乳酸菌等の培養時間としては、通常、１時間以上４８時間以下の範囲内が好ましく、１．５時間以上３６時間以下の範囲内であることがより好ましく、２時間以上２４時間以下の範囲内であることがさらに好ましい。
【００２４】
発酵乳（ヨーグルト）は、典型的には、無脂乳固形分が８重量％以上であり、乳酸菌数又は酵母数が１０６個／ｍｌ以上１０１１個／ｍｌ以下の範囲内である。
【００２５】
（２）ＤＮＡ保存用組成物の形態および任意成分
本発明の実施の形態に係るＤＮＡ保存用組成物は、医薬品，サプリメントおよび食品添加剤等の製剤、飲食品（動植物そのものを除く。）ならびに飲食品組成物（加工された飲食品を含む。）等の形態を採り得る。
【００２６】
本発明の実施の形態において、製剤とは、製剤化のために許容されうる添加剤を併用して、常法に従い、経口製剤として調製したものである。この製剤は、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤などの固形製剤、溶液、懸濁液、乳濁液などの液状製剤の形態を採り得る。製剤化のために許容され得る添加剤としては、例えば、賦形剤、安定剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味料、着色料、香料、緩衝剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤などが挙げられる。なお、食品添加剤としては、具体的には加工調味料、風味調味料、調理ミックス等の調味料等が挙げられる。
【００２７】
また、本発明の実施の形態において、飲食品および飲食品組成物とは、ヒトや動物の飲食のために加工されたものであって、溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、固体成形物等の経口摂取可能な形態であればよく特に限定されない。飲食品および飲食品組成物の例としては、具体的には、乳飲料（加工乳を含む）、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、発酵乳、アイスクリーム類、クリーム類、チーズ類などの乳製品；清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、ゼリー飲料、ココア、スムージーなどの粉末飲料やスポーツ粉末飲料、栄養強化の粉末飲料、美容用の粉末食品、粉末スープ、蒸しパンのもと、濃縮飲料、アルコール飲料などの飲料類；パン、パスタ、麺、ケーキミックス、唐揚げ粉、パン粉などの小麦粉製品；チョコレート、ガム、飴、クッキー、グミ、スナック、和菓子、ゼリー、プリンなどのデザート菓子などの菓子類；カレー、バスタソース、ポトフ、シチュー、和風食品のレトルト食品；加工油脂、バター、マーガリン、スプレッド、マヨネーズなどの油脂類；フリーズドライ食品などの即席食品類；農産缶詰、ジャム・マーマレード類、漬け物、煮豆、シリアル、雑炊などの農産加工品；水産加工品；畜産加工品；ピッツア、ドリア、グラタン、惣菜、フライなど冷凍食品；流動食、さらには動物の飼料、タブレット、口腔内に使用する化粧品などが挙げられる。
【００２８】
なお、本発明の実施の形態において、飲食品および飲食品組成物には、機能性食品、健康栄養食品、健康食品、特定保健用食品、機能性表示食品、栄養機能食品、病者用食品、乳幼児用調製粉乳、妊産婦もしくは授乳婦用粉乳、または疾病リスク低減表示を付した飲食品のような分類のものも包含される。ここで、疾病リスク低減の表示とは、疾病リスクを低減する可能性のある飲食品の表示であって、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会（コーデックス委員会）の定める規格に基づいて、またはその規格を参考にして、定められた表示または認められた表示である。
【００２９】
本発明の実施の形態において、飲食品および飲食品組成物には、必要に応じて、任意の成分を加えることができる。このような任意の成分としては、特段の制限はないが、通常、飲食品に配合される成分である甘味料、酸味料、野菜や果物や種実の汁やそのエキス、ビタミン、ミネラル、アミノ酸などの栄養素、乳酸菌（本発明の実施の形態に係る必須の乳酸菌を除く。）、ビフィズス菌、プロピオン酸菌などの有用な微生物やその発酵物、オリゴ糖などの機能性をもつ糖類、ローヤルゼリー、グルコサミン、アスタキサンチン、ポリフェノールなどの既存の機能性素材、香料、ｐＨ調整剤、賦形剤、酸味料、着色料、乳化剤、保存料等が挙げられる。
【００３０】
＜ＤＮＡ保存用組成物の効率的な摂取方法およびその効果＞
本発明の実施の形態に係るＤＮＡ保存用組成物は、多糖体の摂取量が２００μｇ以上／日となるように、少なくとも７日間、経口摂取することが好ましい。このＤＮＡ保存用組成物をこのように摂取することによって、ＤＮＡの損傷を有効に抑制することができると共に、ＤＮＡの損傷修復を有効に促進させることができる。
【００３１】
なお、多糖体の摂取量は、人体に害を及ぼさない限り特に制限されないが、費用対効果を考慮すると、２００μｇ／日以上６００００μｇ／日以下の範囲内であることが好ましく、３００μｇ／日以上４５０００μｇ／日以下の範囲内であることがより好ましく、４００μｇ／日以上３００００μｇ／日以下の範囲内であることがさらに好ましく、５００μｇ／日以上１５０００μｇ／日以下の範囲内であることが特に好ましい（なお、「質量／日以上」の表記は「質量以上／日」の表記と同義であり、「質量／日以下」の表記は「質量以下／日」の表記と同義である。）。
【００３２】
なお、上述の各有効成分の必要用量は、人体投与実験に基づくものであるが、動物実験（例えばマウス実験）における必要投与用量から食品安全委員会資料に基づく下式を用いて人体への必要投与用量に換算することもできる。
（人体への必要投与用量（換算値））＝（動物への必要投与用量）×（女性体重下限値：４０ｋｇ）÷（安全係数：１００）
【００３３】
＜実験例＞
以下、実験例を示して本発明をより詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実験例に限定されることはない。
【００３４】
−実験例−
本実験例では、紫外線の照射下における皮膚ＤＮＡ損傷および皮膚ＤＮＡ損傷修復に対する多糖体の影響を検証した。具体的には、ヘアレスマウスに紫外線を照射することによって皮膚のＤＮＡを損傷させ、この状態のヘアレスマウスに対する多糖体の影響を検証した。
【００３５】
（１）ヨーグルトの調製
１０質量％の脱脂粉乳を含む培地にラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）ＯＬＬ１２４７菌およびストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）ＯＬＳ３０７８菌を接種した後、その培地を４３℃に保ちながら３時間発酵させた。このようにして得られたヨーグルトには、多糖体が１１０μｇ／ｇ含まれていた。
【００３６】
なお、ヨーグルト中の多糖体の含有量は、フェノール硫酸法（Ｈｏｄｇｅら，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，第１巻，第３３８頁（１９６２年））に従って測定した。具体的には以下の通りである。
【００３７】
先ず、１０ｇのヨーグルトに１ｇのトリクロロ酢酸を加えてよく撹拌した。次に、そのトリクロロ酢酸添加ヨーグルトを１００００ｒｐｍ、１０分、４℃の条件下で遠心分離処理した後、その上清を別のチューブに移した。次いで、その上清に２倍容量の９９．５％エタノールを加えてから、そのエタノール添加上清を冷凍庫で一晩放置したところ、チューブ中に沈殿物が生じていた。この沈殿物を１００００ｒｐｍ、１０分、４℃の条件下で遠心分離処理した後、得られた沈殿物に超純水を３ｍＬ加えて多糖体抽出液とした。そして、５００μＬの多糖体抽出液に５００μＬのフェノール試薬（５％（ｗ/ｖ））を加えてその混合液を撹拌した後に、さらにその混合液に２．５ｍＬの濃硫酸を加えてその混合液を直ぐに１０秒間撹拌した。その後、その混合液を室温で２０分以上放置してから、分光光度計でその混合液の４９０ｎｍの吸光度を測定した。なお、次の通りに対照液を調製してから、上述と同様にしてその対照液の４９０ｎｍの吸光度を測定した。５００μＬの標準グルコース溶液に５００μＬのフェノール試薬（５％（ｗ/ｖ））を加えてその混合液を撹拌した後に、さらにその混合液に２．５ｍＬの濃硫酸を加えてその混合液を直ぐに１０秒間撹拌した。その後、その混合液を室温で２０分以上放置した。
【００３８】
（２）多糖体抽出物の調製
ヨーグルトの一部を分取し、その上清に３倍量のエタノールを添加して冷凍保管した。その後、その上清を遠心分離処理したところ、沈殿物が得られた。そして、この沈殿物を凍結乾燥して多糖体抽出物を得た。なお、１１．３ｇのヨーグルト中に７０ｍｇの多糖体抽出物が含まれていた。
【００３９】
（３）紫外線照射によるＤＮＡ損傷
７２匹のヘアレスマウス（Ｈｏｓ：ＨＲ−１，雌，８週齢，日本エスエルシー株式会社）を４日間馴化させた後、それらのヘアレスマウスを８匹ずつの群（紫外線照射前水群、紫外線照射前ヨーグルト群、紫外線照射前多糖抽出物群、紫外線照射後２４時間水群、紫外線照射後２４時間ヨーグルト群、紫外線照射後２４時間多糖体抽出物群、紫外線照射後４８時間水群、紫外線照射後４８時間ヨーグルト群、紫外線照射後４８時間多糖体抽出物群）に分けて、各群のヘアレスマウスに水、ヨーグルトおよび多糖体抽出物（以下これらをまとめて「試料」と称することがある。）をそれぞれ皮膚採取の前日まで経口投与した。なお、ヨーグルトは１１．３ｇ／ｋｇ体重／日で投与し、多糖体抽出物群は７０ｍｇ／ｋｇ体重／日で投与した。そして、各試料投与開始から７日経過後に紫外線照射前水群、紫外線照射前ヨーグルト群、紫外線照射前多糖抽出物群のヘアレスマウスの背部皮膚をイソフルラン麻酔下採取した。また、各試料投与開始から７日経過後に残りの群のヘアレスマウスの背部に、０．４ｍＷ／ｃｍ２の照度で紫外線を５０秒間照射した（なお、紫外線照射装置として三共電気株式会社製のＧＬ２０ＳＥ（波長領域：２８０ｎｍから４００ｎｍ，ピーク波長：３０６ｎｍ）を用いた。このときの紫外線量は２０ｍＪ／ｃｍ２（＝０．４ｍＷ／ｃｍ２×５０秒）である。）。そして、この紫外線照射から２４時間経過時および７２時間経過時に各群のヘアレスマウスの背部皮膚をイソフルラン麻酔下採取した。なお、以下、説明の便宜上、水を投与したヘアレスマウス群（比較例に相当）を「コントロール群」と称し、ヨーグルトを１１．３ｇ／ｋｇ体重／日で経口投与したヘアレスマウス群（実施例に相当）を「ヨーグルト群」と称し、多糖体抽出物を７０ｍｇ／ｋｇ体重／日で経口投与したヘアレスマウス群（実施例に相当）を「多糖体抽出物群」と称する。
【００４０】
（４）評価
（４−１）紫外線によるＤＮＡ損傷の抑制効果の検証
上述の通りに採取した各群のヘアレスマウスの背部皮膚からｑｕａｇｅｎ  ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＤＮＡを採取して精製した。紫外線によるＤＮＡ損傷マーカーであるシクロブタンピリミジンダイマーの存在量をＥＬＩＳＡキット（Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＣＰＤ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２，  コスモバイオ社製）を用いて測定した。なお、標準品として、孔牛胸腺のＤＮＡを０、２．５、５．０、７．５、１０Ｊ／ｍ２の紫外線量（紫外線波長は主に２５４ｎｍであった。）で照射したＤＮＡサンプル（ＵＶＣ-ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｓａｍｐｌｅｓ，コスモバイオ社製）を用いた。
【００４１】
本実験例の結果は図１に示される通りであり、紫外線照射２４時間後のシクロブタンピリミジンダイマーの存在量はコントロール群に比べてヨーグルト群、多糖体抽出物群で有意に低くなった。すなわち、ヨーグルトおよび多糖体抽出物に、紫外線照射による直接的なＤＮＡ損傷を抑制する効果が見られた。なお、図１中、「＊」の記号はＰ＜０．０５でコントロール群に対して有意差あることを示している。
【００４２】
（４−２）活性酸素によるＤＮＡ損傷の抑制効果の検証
上述の通りに採取した各群のヘアレスマウスの背部皮膚からｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＤＮＡを採取して精製した。そして、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  （８−ＯＨｄＧ  Ａｓｓａｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｅｔ，和光純薬工業社製）を用いてこのＤＮＡを分解した。その後、ＤＮＡ損傷マーカーである８−オキソ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）の存在量を定量した。
【００４３】
なお、この定量には高速液体クロマトグラフィ／タンデム質量分析計(４５００ＱＴＲＡＰ，サイエックス社製）を用いた。カラムとしてＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８（１．７μｍ，２．１ｍｍＸ１００ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いた。このとき、移動相Ａとして０．１％ギ酸水溶液を、移動相Ｂとして０．１％ギ酸メタノール溶液を用いた。そして、開始時の移動相の組成を移動相Ａ：１００％とし、その後５分後に移動相の組成が「移動相Ａ：５０％，移動相Ｂ：５０％」になるようにグラジエントしてから、移動相の組成を「移動相Ａ：１％，移動相Ｂ：９９％」にして１分間で保持し、さらに移動相の組成を移動相Ａ：１００％になるように切り替えて２分間保持した。ここで、高速液体クロマトグラフィ／タンデム質量分析計における１試料の測定時間を８分間、移動相の流速を０．３ｍＬ／分、カラム温度を４０℃に設定し、エレクトロ・スプレー・イオン化を用いて、ポジティブモードで８−ＯＨｄＧを検出した。高速液体クロマトグラフィ／タンデム質量分析計の分析変数を以下の通りに設定した。
【００４４】
・Ｇａｓ１：８０ｐｓｉ
・Ｇａｓ２：８０ｐｓｉ
・ｉｏｎ  ｓｐｒａｙ  ｖｏｌｔａｇｅ（ＩＳ）：５５００Ｖ
・ｔｕｒｂｏ  ｈｅａｔｅｒ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＴＥＭ）：５００℃
・ｅｎｔｒａｎｃｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＥＰ）：１０Ｖ
・ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＣＡＤ）：８ｐｓｉ
・ｃｕｒｔａｉｎ  ｇａｓ（ＣＵＲ）：３０ｐｓｉ
・ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＤＰ）：５５Ｖ
・ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ（ＣＥ）：１８Ｖ
・ｃｅｌｌ  ｅｘｉｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＣＸＰ）：７Ｖ
【００４５】
本実験例の結果は図２に示される通りであり、いずれの時点においても、８−ＯＨｄＧの存在量はコントロール群に比べてヨーグルト群、多糖体抽出物群で有意に低くなった。すなわち、ヨーグルトおよび多糖体抽出物に、活性酸素によるＤＮＡ損傷を抑制する効果が見られた。なお、図２中、「＊」の記号はＰ＜０．０５でコントロール群に対して有意差あることを示している。
【００４６】
（４−３）紫外線による活性酸素生成の抑制効果の検証
上述の通りに採取した各群のヘアレスマウスの背部皮膚からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。その後、抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡからＲｉｖｅｒｔＡｉｄ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャー社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。そして、ＡＢＩ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、そのｃＤＮＡおよび内在性遺伝子としてのＧＡＰＤＨからカタラーゼのｍＲＮＡの相対量を定量した。
【００４７】
本実験例の結果は図３に示される通りであり、紫外線照射後２４時間後、７２時間後において抗酸化酵素であるカタラーゼのｍＲＮＡの相対量はコントロール群に比べてヨーグルト群および多糖体抽出物群で有意に増加した。すなわち、ヨーグルトおよび多糖体抽出物に、紫外線照射による活性酸素の生成を抑制する効果が見られた。ヨーグルトおよび多糖体抽出物が紫外線照射による活性酸素の生成を抑制した結果、活性酸素により生成するＤＮＡ損傷８−ＯＨｄＧが低下したためであると考えられた。なお、図３中、「＊」の記号はＰ＜０．０５でコントロール群に対して有意差あることを示している。
【００４８】
（４−４）ＤＮＡ損傷修復促進効果の検証
上述の通りに採取した各群のヘアレスマウスの背部皮膚からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。その後、抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡからＲｉｖｅｒｔＡｉｄ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャー社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。そいｓて、ＡＢＩ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、そのｃＤＮＡおよび内在性遺伝子としてのＧＡＰＤＨからｘｅｒｏｄｅｒｍａ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｇｒｏｕｐ  Ａ（ＸＰＡ）のｍＲＮＡの相対量を定量した。
【００４９】
本実験例の結果は図４に示される通りであり、紫外線照射後２４時間後、７２時間後においてＤＮＡ修復たんぱく質であるＸＰＡのｍＲＮＡの相対量はコントロール群に比べてヨーグルト群および多糖体抽出物群で有意に増加した。すなわち、ヨーグルトおよび多糖体抽出物に、紫外線照射や活性酸素により生じるＤＮＡ損傷の修復を促進する効果が見られた。なお、図４中、「＊」の記号はＰ＜０．０５でコントロール群に対して有意差あることを示している。
【受託番号】
【００５０】
ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６９７
ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８１４
【図１】
2018012648.tif 000003
【図２】
2018012648.tif 000004
【図３】
2018012648.tif 000005
【図４】
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