(57)【要約】      （修正有）【課題】高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の提供。【解決手段】下記式Ａにより表される化合物又はゲニピンを加熱してなる反応物を含む、高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤、架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾル。2018090777.tif 000009【選択図】図３
2018090777.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ａにより表される化合物を含む、高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤。
【化１】
2018090777.tif 000008
式Ａ中、Ｍは対カチオンを表し、Ｒは置換基を表し、ｎは０〜２の整数を表す。
【請求項２】
ゲニピンを加熱してなる反応物である、高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤と、高分子多糖類又はタンパク質を含む、架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾル。
【請求項４】
前記高分子多糖類又はタンパク質が、キトサンである、請求項３に記載の架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾル。
【請求項５】
前記高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の含有量が、架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルの全量に対し、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜６ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項３又は請求項４に記載の架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾル。
【請求項６】
前記高分子多糖類又はタンパク質の含有量が、架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルの全質量に対し、０．５質量％〜１０質量％である、請求項３〜請求項５のいずれか１項に記載の架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾル。
【請求項７】
ｐＨが６．０〜９．０である、請求項３〜請求項６のいずれか１項に記載の架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾル。
【請求項８】
リン酸緩衝液中で、ゲニピンを加熱する工程を含む、高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の製造方法。
【請求項９】
前記リン酸緩衝液が、リン酸ナトリウム緩衝液である、請求項８に記載の高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の製造方法。
【請求項１０】
前記リン酸緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水である、請求項８に記載の高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の製造方法。
【請求項１１】
前記リン酸緩衝液が、リン酸二水素ナトリウム溶液である、請求項８に記載の高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の製造方法。
【請求項１２】
前記加熱する工程における加熱温度が２０℃〜７０℃であり、かつ、加熱時間が３時間〜１６８時間である、請求項８〜請求項１１のいずれか１項に記載の高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の製造方法。
【請求項１３】
請求項１又は請求項２に記載の高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤と、高分子多糖類又はタンパク質と、を混合する工程を含む
架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルの製造方法。
【請求項１４】
請求項８〜請求項１２のいずれか１項に記載の高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の製造方法により得られた高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤と、高分子多糖類又はタンパク質と、を混合する工程を含む
架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤及びその製造方法、架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾル及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体組織の再構築および機能再生を目的とした組織再生工学において、これらを達成するために世界中でバイオマテリアルの開発が実施されている。例えば、生体高分子多糖類又は生体タンパク質のキトサン、コラーゲン、ゼラチンなどを生体内に移植しようとした場合、機械的強度が乏しいために材料自体を成形できない、生体内に移植した場合ただちに分解、吸収されてしまうなど生体内での安定性が低いといった問題がある。そこで、このような高分子多糖類又はタンパク質の機械的特性や生体内安定性を高める方法の一つとして化学的架橋が知られている。
【０００３】
従来の化学的架橋の方法として、非特許文献１には、グルタルアルデヒドを用いた化学的架橋の方法が記載されている。
【０００４】
また、特許文献１には、ゼラチンをスクシンイミド化ポリ−Ｌ−グルタミン酸により架橋して成る医用材料が記載されている。
【０００５】
非特許文献２には、水溶性カルボジイミドが、タンパク質・ペプチド合成の縮合剤として記載されている。
【０００６】
非特許文献３には、クチナシ由来で漢方薬として経口しているゲニピンという架橋剤が記載されている。
【０００７】
非特許文献４には、生体材料にジエポキシ化合物を使用した場合の細胞毒性について記載されている。
【０００８】
非特許文献５には、コラーゲンゲルに対するゲニピン架橋の影響について記載されている。
【０００９】
特許文献２には、ゲニピンとコラーゲンとを含むコラーゲン水溶液であって、前記コラーゲン水溶液は２５℃でのゲル化時間が３０分以上であるものである、コラーゲン水溶液が記載されている。
【００１０】
非特許文献６には、ペプシン消化コラーゲン（PSC）を基質としたコラーゲン／ゲニピン水溶液が記載されている。
【００１１】
非特許文献７には、塩基性条件下でキトサンとゲニピンとを重合させる方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平９−１０３４７９号公報
【特許文献２】特開２０１４−１０３９８５号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｖａｎ  Ｌｕｙｎ  Ｍ  Ｊ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  １３（１４），  ｐｐ．１０１７−１０２４（１９９２）
【非特許文献２】Ｈｕａｎｇ  Ｌｅｅ  ＬＬ．，  Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．，  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．，  ２４（９），  ｐｐ．１１８５−１２０１（１９９０）
【非特許文献３】Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２３，ｐｐ．２４４７−２４５７（２００２）
【非特許文献４】Ｎｉｓｈｉ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ．  ２９（７）：８２９−８３４（１９９５）
【非特許文献５】Ｈａｒｉｎｉ  Ｇ．  Ｓｕｎｄａｒａｒａｇｈａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ．  ８７（２），ｐｐ．３０８−３２０（２００８）
【非特許文献６】Ｙｕｎｏｋｉ  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ６２０７６５（２０１３）
【非特許文献７】ＭＩ  Ｌ−Ｆ．，  Ｊ  Ｐｏｌｙｍ  Ｓｃｉ  Ｐａｒｔ  Ａ  ４３，１９８５−２０００（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
非特許文献１や特許文献１には、グルタルアルデヒドを架橋剤として使用することが記載されているが、非特許文献１には、グルタルアルデヒドは細胞毒性が高いことが示されている。
また、非特許文献２には、水溶性カルボジイミドを細胞に直接投与した場合、細胞毒性が高いことが示されている。
非特許文献３に記載のゲニピンは、上述のグルタルアルデヒドや水溶性カルボジイミド等と比較すると、細胞毒性が極めて低いことが知られている。例えば、グルタルアルデヒドよりも細胞毒性が５，０００〜１０，０００倍も低いことがわかっている（非特許文献４）。しかしながら、このゲニピンでさえ、添加濃度を上げると細胞毒性が高くなることが示されている（非特許文献５）。
【００１５】
上述のゲニピンについて、非特許文献６によれば、ペプシン消化によりテロペプチドフリーとなったブタ皮膚由来コラーゲンを用いて，コラーゲン／ゲニピン混合水溶液のゲル化特性を明らかにした。この際、コラーゲン／ゲニピン混合水溶液は、室温流動性が３０分以上もありながら、体温では急速にゲル化することが示されている。
しかしながら、本発明者らは、ゲル化時間が更に短いことが要求される用途（例えば、止血剤など）においては、ゲニピンを用いることが適していない場合があることを見出した。
また、非特許文献７には、ゲニピンは強アルカリ水溶液のＯＨプロトンによってアルドール縮合による開環重合することが報告されている。
【００１６】
本発明者らは、鋭意検討した結果、後述する式Ａにより表される化合物は高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤として非常に優れた架橋活性を有していること、及び、式Ａにより表される化合物と高分子多糖類又はタンパク質とを含む架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルは、ゲル化時間が短いことを見出した。
優れた架橋活性を有する架橋剤を用いることにより、生体への毒性が抑えられるような低濃度（例えば、１ｍＭ〜６ｍＭなど）で用いた場合であっても、高分子多糖類又はタンパク質の架橋が可能となる点で、非常に有用であると考えている。
また、架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルのゲル化時間が短いことにより、組織用接着剤、止血剤等のような、ゲル化時間が短いことが求められる用途にも架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルを適用することが可能となる点で、非常に有用であると考えている。
更に、本発明者らは、式Ａにより表される化合物は、例えばゲニピンの加熱により、ゲニピンのピラン環構造部分が開環した化合物として得られるが、ゲニピンの加熱条件を変えることにより、架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルのゲル化時間を調整できることを見出した。
架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルのゲル化時間を調整することにより、例えば内視鏡用ゲルのような、室温における流動性が高いことが求められる架橋タンパク質の提供、組織用接着剤、止血剤等のような、ゲル化時間が短いことが求められる架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質の提供等、用途の異なる材料の提供が可能となるため、非常に有用であると考えている。
【００１７】
上記効果が得られる詳細なメカニズムは不明であるが、加熱によりゲニピンの開環する割合が高くなるため、ピラン環構造部分が開環したゲニピンとタンパク質のアミノ基との接触確率が高くなり、タンパク質のアミノ基を早く架橋することが可能となると推測している。
【００１８】
本発明の一実施形態が解決しようとする課題は、架橋活性に優れた高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤を提供することである。
本発明の他の一実施形態が解決しようとする課題は、ゲル化時間が短い架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルを提供することである。
本発明の他の一実施形態が解決しようとする課題は、架橋活性に優れた高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の製造方法を提供することである。
本発明の他の一実施形態が解決しようとする課題は、ゲル化時間が短い架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記課題を解決するための手段には、以下の態様が含まれる。
＜１＞  下記式Ａにより表される化合物を含む、高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤。
【００２０】
【化１】
2018090777.tif 000003
【００２１】
式Ａ中、Ｍは対カチオンを表し、Ｒは置換基を表し、ｎは０〜２の整数を表す。
＜２＞  ゲニピンを加熱してなる反応物である、高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤。
＜３＞  前記＜１＞又は＜２＞に記載の高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤と、高分子多糖類又はタンパク質とを含む、架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾル。
＜４＞  前記高分子多糖類又はタンパク質が、キトサンである、前記＜３＞に記載の架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾル。
＜５＞  前記高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の含有量が、架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルの全量に対し、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜６ｍｍｏｌ／Ｌである、前記＜３＞又は＜４＞に記載の架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾル。
＜６＞  前記高分子多糖類又はタンパク質の含有量が、架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルの全質量に対し、０．５質量％〜１０質量％である、前記＜３＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾル。
＜７＞  ｐＨが６．０〜９．０である、前記＜３＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾル。
＜８＞  リン酸緩衝液中で、ゲニピンを加熱する工程を含む、高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の製造方法。
＜９＞  前記リン酸緩衝液が、リン酸ナトリウム緩衝液である、前記＜８＞に記載の高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の製造方法。
＜１０＞  前記リン酸緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水である、前記＜８＞に記載の高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の製造方法。
＜１１＞  前記リン酸緩衝液が、リン酸二水素ナトリウム溶液である、前記＜８＞に記載の高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の製造方法。
＜１２＞  前記加熱する工程における加熱温度が２０℃〜７０℃であり、かつ、加熱時間が３時間〜１６８時間である、前記＜８＞〜＜１１＞のいずれか１つに記載の高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の製造方法。
＜１３＞  前記＜１＞又は＜２＞に記載の高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤と、高分子多糖類又はタンパク質と、を混合する工程を含む
架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルの製造方法。
＜１４＞前記＜８＞〜＜１２＞のいずれか１つに記載の高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の製造方法により得られた高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤と、高分子多糖類又はタンパク質と、を混合する工程を含む
架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルの製造方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の一実施形態によれば、架橋活性に優れた高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤を提供することができる。
本発明の他の一実施形態によれば、ゲル化時間が短い架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルを提供することができる。
本発明の他の一実施形態によれば、架橋活性に優れた高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の製造方法を提供することができる。
本発明の他の一実施形態によれば、ゲル化時間が短い架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例１、２、３及び比較例１における分光光度計実験の結果である。
【図２】実施例４、比較例２及び３における貯蔵粘弾性（Ｇ’）を測定した結果である。
【図３】加熱時間の異なるゲニピン反応物を用いた架橋高分子多糖類形成用ゾルのゲル化曲線である。
【図４】ゲニピンの加熱時間と架橋高分子多糖類形成用ゾルのゲル化時間の関係を示すグラフである。
【図５】ゲルの硬さの評価結果を示すグラフである。
【図６】ゲニピン反応物の濃度を変更した場合の動的粘弾性測定結果を示すグラフである。
【図７】ＵＶ吸収スペクトルの測定結果を示すチャートである。
【図８】ＦＴ−ＩＲスペクトルの測定結果を示すチャートである。
【図９】１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの測定結果を示すチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本開示について詳細に説明する。
なお、本開示において、「ｘｘ〜ｙｙ」の記載は、ｘｘ及びｙｙを含む数値範囲を表す。
また、本開示において、２以上の好ましい態様の組み合わせは、より好ましい態様である。
本開示において、式で表される化合物における基の表記に関して、置換あるいは無置換を記していない場合、上記基が更に置換基を有することが可能な場合には、他に特に規定がない限り、無置換の基のみならず置換基を有する基も包含する。例えば、式において、「Ｒはアルキル基を表す」との記載があれば、「Ｒは無置換アルキル基又は置換基を有するアルキル基を表す」ことを意味する。
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
以下、本開示を詳細に説明する。
【００２５】
（高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤）
本開示に係る高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤（以下、単に「架橋剤」ともいう。）の第一の態様は、下記式Ａにより表される化合物を含む。
式Ａにより表される構造は、ゲニピンに由来する構造であってもよいし、他の化合物に由来する構造であってもよいが、ゲニピンに由来する構造であることが好ましい。
また、本開示に係る架橋剤の第二の態様は、ゲニピンを加熱してなる反応物である。ゲニピンを加熱することにより、式Ａにより表される化合物、すなわち、ゲニピンの開環反応物が得られているものと推測されるが、他の構造のゲニピン反応物が更に含まれている可能性等もあり、定かではない。
本開示に係る高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤は、アミノ基を含む高分子多糖類又はタンパク質を架橋することが可能である。
本開示に係るタンパク質架橋用架橋剤は、高分子多糖類中のアミノ基、又は、タンパク質中のアミノ基（例えば、リシン（リジン）の側鎖アミノ基）同士を架橋すると考えられる。
【００２６】
【化２】
2018090777.tif 000004
【００２７】
Ｒとしては、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基が好ましく挙げられる。
ｎは０又は１が好ましく、０であることがより好ましい
式Ａ中、Ｍは対カチオンを表す。Ｍは式Ａ中のＯ−と結合していても解離していてもよいが、少なくとも一部が解離していることが好ましい。
また、Ｍとしては、特に限定されないが、例えば水素イオン、ナトリウムイオン又はマグネシウムイオン等が挙げられる。
【００２８】
（高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の製造方法）
本開示に係る高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の製造方法は、リン酸緩衝液中で、ゲニピンを加熱する工程（以下、「加熱工程」ともいう）を含むことが好ましい。
本開示に係る高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤は、ゲニピンの加熱をリン酸緩衝液中で行うことにより、身体に直接塗布可能である等、生体に適用しやすいという利点がある。
【００２９】
＜加熱工程＞
〔リン酸緩衝液〕
加熱工程において用いられるリン酸緩衝液としては、特に制限なく公知のリン酸緩衝液を用いることが可能であるが、生体に適用しやすい観点から、リン酸ナトリウム緩衝液であることが好ましく、リン酸緩衝生理食塩水であることがより好ましい。
また、調製を容易とする観点から、リン酸二水素ナトリウム溶液であることが好ましい。
リン酸緩衝液としては、例えば、５０ｍｍｏｌ/Ｌのリン酸水素二ナトリウム水溶液（１４０ｍｍｏｌ/Ｌの塩化ナトリウムを含有）と、５０ｍｍｏｌ/Ｌのリン酸二水素ナトリウム水溶液（１４０ｍｍｏｌ/Ｌの塩化ナトリウムを含有）とを、超純水を溶媒として、ｐＨメータによりｐＨを測定しながら撹拌、混合して、ｐＨ７．０、１４０ｍｍｏｌ/Ｌ塩化ナトリウム含有５０ｍｍｏｌ/Ｌリン酸緩衝液として調整することが可能である。
【００３０】
〔加熱方法〕
加熱工程における加熱方法としては、特に限定されないが、ｐＨを６．０〜９．０としたリン酸緩衝液中に、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ〜２０ｍｍｏｌ／Ｌとしてゲニピンを溶解し、３７℃とすることにより加熱される。
加熱温度、加熱時間を調整することにより、開環するゲニピンの割合（開環比）が調整される。
加熱温度としては、特に制限されないが、２０℃〜７０℃が好ましく、３０℃〜４０℃がより好ましい。
加熱時間としては、特に制限されないが、３時間〜１６８時間が好ましく、３時間〜７２時間がより好ましく、６時間〜４８時間が更に好ましい。
【００３１】
（架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾル）
本開示に係る架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルは、本開示に係る高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤と、高分子多糖類又はタンパク質とを含む。
本開示に係る架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルは、例えば３７℃等に加熱することにより、前記高分子多糖類又はタンパク質間に本開示に係るタンパク質架橋用架橋剤による架橋が形成され、ゲルが形成される。
【００３２】
＜高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の含有量＞
本開示に係る架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルは、生体への毒性及びゲル化速度の観点から、前記高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の含有量が、架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルの全量に対し、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜６ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５ｍｍｏｌ/Ｌ〜３ｍｍｏｌ/Ｌであることがより好ましい。
【００３３】
＜高分子多糖類又はタンパク質＞
前記高分子多糖類又はタンパク質としては、特に限定されず、公知の高分子多糖類又はタンパク質が用いられる。
本開示に係る高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤は、キトサン、コラーゲン、ゼラチンなどの生体高分子多糖類又は生体タンパク質を架橋できる点が非常に有用である。
従って、前記タンパク質としては、キトサン、コラーゲン、ゼラチン等の生体高分子多糖類又は生体タンパク質が好ましく、キトサンがより好ましい。
【００３４】
＜高分子多糖類又はタンパク質の含有量＞
本開示に係る架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルは、高分子多糖類又はタンパク質を、１種単独で含有してもよいし、２種以上を併用してもよい。
本開示に係る架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルにおける、高分子多糖類又はタンパク質の含有量は、ゲル強度の向上およびゲル化時間を短くする観点から、架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルの全質量に対し、０．５質量％〜１０質量％であることが好ましく、０．５質量％〜５質量％がより好ましく、０．５質量％〜３質量％がより好ましい。
【００３５】
＜ｐＨ＞
架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルのｐＨは、６．０〜９．０であることが好ましく、７．０〜８．０であることがより好ましい。
上記ｐＨは、ｐＨメータ（堀場製作所社製、ＮａＶｉｈ  Ｆ−７１）により測定される。
【００３６】
（架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルの製造方法）
本開示に係る架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルの製造方法の第一の態様は、高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤と、高分子多糖類又はタンパク質と、を混合する工程を含む。
本開示に係る架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルの製造方法の第二の態様は、本開示に係る高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤の製造方法により得られた高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤と、高分子多糖類又はタンパク質と、を混合する工程を含む。
いずれの態様においても、混合方法としては特に制限されず、公知の混合方法を使用することが可能である。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例により本開示を詳細に説明するが、本開示はこれらに限定されるものではない。
【００３８】
（実施例１〜３及び比較例１）
＜キトサン溶液の準備＞
３ｇキトサンパウダー（和光純薬工業（株）製）を４００ｍｍｏｌ/Ｌ酢酸溶液（３００ｍＬ）に入れ、溶解し、１％キトサン溶液を調製した。１％キトサン溶液を透析チューブに分注した後、超純水内に透析チューブを浸漬させ、脱塩を行った。なお、３時間毎に超純水を交換し、この作業を３回実施した。その後、１５ｍＬチューブに分注し、冷蔵庫（４℃）に保管した。
【００３９】
＜リン酸緩衝液（ＮＰＢ）の準備＞
濃度５０ｍｍｏｌ/Ｌのリン酸水素二ナトリウム水溶液（１４０ｍｍｏｌ/Ｌの塩化ナトリウム含有）及び濃度５０ｍｍｏｌ/Ｌのリン酸二水素ナトリウム水溶液（１４０ｍｍｏｌ/Ｌの塩化ナトリウム含有）を、超純水を溶媒として調製した。ｐＨメータ（堀場製作所社製、商品名「ＮＡＶＩｈ  Ｆ−７１」）によりｐＨを測定しながら、これらを撹拌、混合し，ｐＨ７．０、１４０ｍｍｏｌ/Ｌ塩化ナトリウム含有５０ｍｍｏｌ/Ｌリン酸緩衝液を調整し、これをＮＰＢとした。
【００４０】
＜ゲニピン溶液の準備＞
ゲニピン（和光純薬工業（株）製）をＮＰＢに溶解し，濃度２ｍｍｏｌ/Ｌ〜１０ｍｍｏｌ/Ｌのゲニピン水溶液を調製した。これを５０ｍＬチューブに入れた後、冷蔵庫（４℃）に保管した。
【００４１】
＜ゲニピン溶液の加熱＞
上記ゲニピン溶液を３７℃水浴で６時間、１２時間又は２４時間加熱した。その後、１０ｍＬシリンジ（テルモ社製  製品名「テルモシリンジ  ＳＳ−１０ＬＺＰ」）の先端に０．４５μｍサイズのフィルター（Ｍｅｒｃｋ  ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社  製品名Ｆｉｌｔｅｒ  ｕｎｉｔ）を取り付けた後、加熱したゲニピンをろ過した。フィルターろ過後、５０ｍＬチューブに分注し、ゲニピン溶液として、冷蔵庫に保管した。６時間加熱したゲニピン反応物溶液をＧｅ（６）、１２時間加熱したゲニピン反応物溶液をＧｅ（１２）、２４時間加熱したゲニピン反応物溶液をＧｅ（２４）、加熱を行わなかったゲニピン溶液をＧｅ（０）とした。
【００４２】
＜１３Ｃ−ＮＭＲ実験＞
Ｇｅ（２４）を用い、１３Ｃ−ＮＭＲ（ＪＥＯＬ社 製品名ＪＮＭ−ＥＣＡ６００）にて構造変化を評価した。
Ｇｅ（２４）を凍結した後凍結乾燥機にて２４時間乾燥した。
凍結乾燥したサンプルをＤ２Ｏ溶液に溶かした後、ＮＭＲチューブ（直径４ｍｍ）に注入した。その後、１３Ｃの周波数は１５０ＭＨｚで実施した。
【００４３】
＜分光光度計実験＞
ゲニピン溶液Ｇｅ（６）、Ｇｅ（１２）、Ｇｅ（２４）及びＧｅ（０）に対し、分光光度計（（株）島津製作所製  ＵＶ−３１００Ｓ）を用いて、極大吸収波長を調べた。測定波長は２００〜４００ｎｍで実施した。
【００４４】
＜動的粘弾性実験＞
キトサンを基質として、ゲニピン反応物溶液Ｇｅ（６）、Ｇｅ（１２）、Ｇｅ（２４）及びＧｅ（０）の架橋活性を動的粘弾性測定により評価した。動的粘弾性装置として、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製の商品名「ＨＡＡＫＥ  ＭＡＲＳ  ＩＩＩ」を用いた。ジオメトリ及び測定プログラムは実験目的に応じて使い分けた。以下に測定条件を示す。
【００４５】
下記表１に、各実施例及び比較例において用いたキトサン含有量、高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤のゲニピン反応物（ゲニピン）含有量、溶媒、加熱時間、ゲニピン反応物溶液の種類を記載した。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
（実施例１の結果）
表１の実施例１のゲニピン反応物溶液を用いた、分光光度計実験の結果を図１に示す。実施例１の結果、極大吸収波長は２５０ｎｍであり、加熱を行っていない比較例１のゲニピン溶液の極大吸収波長２４０ｎｍと比較して、極大吸収波長がシフトしていることがわかる。
これは、ゲニピンの加熱により極大吸収波長がシフトしたためであると推測される。
【００４８】
（実施例２の結果）
表１の実施例２のゲニピン反応物溶液を用いた、分光光度計実験の結果を図１に示す。実施例２の結果、極大吸収波長は２４８ｎｍであり、比較例１のゲニピン溶液の極大吸収波長２４０ｎｍ及び実施例１のゲニピン溶液の極大吸収波長２４６ｎｍと比較して、極大吸収波長がシフトしていることがわかる。
これは、ゲニピンの開環により極大吸収波長がシフトしたためであると推測され、実施例１におけるゲニピン溶液よりも、実施例２におけるゲニピン反応物溶液の方が、開環したゲニピンが多いことが推測される。
【００４９】
（実施例３の結果）
表１の実施例３のゲニピン反応物溶液を用いた、分光光度計実験の結果を図１に示す。実施例３の結果、極大吸収波長は２５２ｎｍであり、比較例１のゲニピン溶液の極大吸収波長２４０ｎｍ、実施例１のゲニピン反応物溶液の極大吸収波長２４６ｎｍ及び実施例２のゲニピン反応物溶液の極大吸収波長２４８ｎｍと比較して、極大吸収波長がシフトしていることがわかった。
これは、ゲニピンの開環により極大吸収波長がシフトしたためであると推測され、実施例１及び実施例２におけるゲニピン反応物溶液よりも、実施例３におけるゲニピン反応物溶液の方が、更に開環したゲニピンが多いことが推測される。
【００５０】
（比較例１の結果）
表１の比較例１のゲニピン溶液を用いた、分光光度計実験の結果を図１に示す。比較例１の結果、極大吸収波長は２４０ｎｍを示した。
【００５１】
（実施例４及び比較例２〜３）
＜ゼラチン溶液の準備＞
濃度１０質量％になるようゼラチンパウダー（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を超純水にて調整した後、７０℃の水浴で溶解した。これを１５ｍＬ遠心チューブにて小分けし冷蔵庫（４℃）に保管した。
【００５２】
〔３７℃における架橋活性〕
上述のゼラチン溶液と、上述のＧｅ（２４）又はＧｅ（０）を混合し、撹拌操作を経て測定を開始した。
２３℃にて６０秒間保持した後、３７℃まで３０秒間昇温し、３０分間その温度で一定に保持したときの貯蔵粘弾性を測定した。測定条件は下記のとおりであった。
ジオメトリ：パラレルセンサー(内径６０ｍｍ)
測定プロファイル：ＣＤ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ）モードによるオシレーション測定（せん断応力＝１Ｐａ、温度２３℃〜３７℃、周波数＝１Ｈｚ、時間＝６０分）とした。
測定開始後、貯蔵粘弾性（Ｇ’）と損失弾性率（Ｇ’’）とが交差するまでの時間を「３７℃のゲル化時間」とした。
【００５３】
下記表２に、各実施例及び比較例において用いたゼラチン含有量、高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤のゲニピン反応物（ゲニピン）含有量、溶媒、加熱時間、ゲニピン反応物溶液の種類を記載した。
【００５４】
【表２】
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【００５５】
（実施例４及び比較例２〜３の結果）
表２の実施例４又は比較例２〜３の架橋高分子多糖類又は架橋タンパク質形成用ゾルを用いて、貯蔵粘弾性（Ｇ’）を測定した結果を図２に示した。測定温度は３７℃とした。
図２に記載の結果から、加熱していないゲニピンを用いた場合と比較して、加熱したゲニピンを用いた場合には、基質としてゼラチンを用いた場合であっても、ゲル化時間が短くなることがわかる。
【００５６】
（実施例５〜１０及び比較例４〜５）
【００５７】
＜材料＞
以下の実施例において使用した化合物の詳細は下記の通りである。
・ゲニピン粉末：和光純薬工業（株）製、
・キトサン１００：和光純薬工業（株）製
・酢酸：和光純薬工業（株）製
・リン酸二水素ナトリウム：和光純薬工業（株）製
・リン酸水素二ナトリウム：和光純薬工業（株）製
・重水：ＩＳＯＴＥＣ（株）製
【００５８】
＜リン酸緩衝液の調製＞
リン酸水素二ナトリウム水溶液及びリン酸二水素ナトリウム水溶液を濃度１００  ｍｍｏｌ／Ｌで調製し、ｐＨが７．０になるように混合した（ＰＢ−１００）。同様の操作で濃度４００ｍＭのリン酸緩衝液も調製した（ＰＢ−４００）。
【００５９】
＜キトサン水溶液の調製＞
キトサン１００の粉末２ｇを５％酢酸水溶液に加え、キトサンが完全に溶解するまで攪拌した。得られた水溶液を透析チューブ（分画分子量：１ｋＤａ）に入れ、純水に対して透析した。透析外液のｐＨが５．０を超えたことを確認し、透析外液であるキトサン水溶液を回収した。その一部を取り出して６０℃、一晩乾燥させた後の質量からキトサン濃度を求めた。イオン交換水を添加して濃度を１．４質量％に調節したものを以下の実験に用いた。
【００６０】
＜ゲニピン反応物溶液の調製＞
ゲニピン粉末（５ｍｇ／ｍＬ）を２００ｍＬのＰＢ−１００もしくはイオン交換水に加え、室温にてマグネティックスターラーで完全に溶解させた。ＰＢ−１００に溶解したＧｅを３７℃の水浴で加熱し、加熱時間が１２時間、２４時間、３６時間、及び４８時間のゲニピン反応物溶液を調製した。
加熱時間が１２時間のゲニピン反応物溶液をＧｅ−１２、加熱時間が２４時間のゲニピン反応物溶液をＧｅ−２４、加熱時間が３６時間のゲニピン反応物溶液をＧｅ−３６、加熱時間が４８時間のゲニピン反応物溶液をＧｅ−４８とした。
また、イオン交換水に溶解したゲニピンを使用直前にＰＢ−４００と混合して希釈し、溶媒をＰＢ−１００としたゲニピン溶液をＧｅ−０と定義した。
【００６１】
＜架橋高分子多糖類形成用ゾルの製造＞
バイオロジカルチューブ（容量１５ｍＬ又は５０ｍＬ）に１．４質量％キトサン水溶液を所定重量加え、撹拌を促すためにマグネティックスターラーを装填した。ＰＢ−１００で５０μｇ／ｍＬまで希釈した上記Ｇｅ−１２、Ｇｅ−２４、Ｇｅ−３６、Ｇｅ−４８、及び、Ｇｅ−０を、それぞれ、キトサン水溶液の比重を１と見なして等容積添加した。チューブを振り混ぜた後、２５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離して脱泡し、架橋高分子多糖類形成用ゾルを製造した。製造後、速やかに動的粘弾性測定へと供した。
【００６２】
＜動的粘弾性測定によるゲニピン架橋特性の評価＞
〔粘弾性変化の追跡〕
レオメータ（HAAKE Mars III、Thermo fisher Scientific Inc.製）を用いて架橋高分子多糖類形成用ゾルの動的粘弾性測定を行い、粘弾性の時間変化を追跡した。温度を３７℃に設定したパラレルプレートセンサー（直径６０ｍｍ）のボトムに架橋高分子多糖類形成用ゾルを流し、上部センサーをギャップ１ｍｍまで近づけ、一定応力下（１Ｐａ）、周波数１Ｈｚの動的粘弾性測定を開始した。貯蔵弾性率（Ｇ’）および損失弾性率（Ｇ’’）の変化を記録し、Ｇ’とＧ’’の交点（ゲル化点）に達する時間をゲル化時間と定義した。
【００６３】
〔ゲルの硬さの評価〕
シャーレ上に作製したゲルの動的粘弾性測定を行い、架橋されたキトサンゲルの硬さからゲニピン反応物の架橋能を評価した。架橋高分子多糖類形成用ゾルを内径３５ｍｍのバイオロジカルディッシュに流し込み、ゲルの乾燥を防ぐために加湿した３７℃インキュベーターに静置した。２４時間後にディッシュをインキュベーターから取り出し、動的粘弾性測定に供した。ディッシュの底面には滑り防止のためシリコーンゴムシートを挿入し、内径２０ｍｍの上部センサーには紙やすりを予め貼付した。上部センサーをゲルに接触させ、周波数０．２Ｈｚの応力分散測定（０．１Ｐａ〜１００Ｐａ）を行った。線形粘弾性測定が実行された応力１Ｐａもしくは１０ＰａにおけるＧ’を記録した。
【００６４】
上記粘弾性変化の追跡及びゲルの硬さの評価における、各実施例又は比較例において使用された架橋高分子多糖類形成用ゾルの詳細は、表３に記載の通りである。
実施例９、実施例１０及び比較例５においては、ゲニピン反応物又はゲニピンの含有量（最終濃度）が下記値となるように、ゲニピン溶液を希釈した後にキトサン水溶液と混合した。
【００６５】
【表３】
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【００６６】
上記粘弾性変化の追跡及びゲルの硬さの評価結果を図３〜図６に示す。
図３は加熱時間の異なるゲニピン反応物を用いた架橋高分子多糖類形成用ゾルのゲル化曲線である。
図３から、架橋高分子多糖類形成用ゾルの１０分後のＧ’の増加はゲニピンの加熱時間が長くなるにつれて促進されることがわかる。
Ｇｅ−０を用いた場合にＧ’は最も穏やかな増加を示し、測定開始から１０分後におけるＧ’は０．６５Ｐａであった。一方、Ｇｅ−４８を用いた場合にＧ’は最も鋭い増加を示し、測定開始から１０分後におけるＧ’は４１Ｐａに達した。
【００６７】
ゲニピンの加熱時間と架橋高分子多糖類形成用ゾルのゲル化時間の関係を図４に示す。加熱時間が長いほどゲル化時間が短くなり、図３で示されたゲニピンの加熱時間とＧ’の関係性を反映していた。Ｇｅ−０を用いた場合のゲル化時間が５．８分間であったのに対し、Ｇｅ−４８ではゲル化時間が０．６分間まで短縮された。
【００６８】
ゲルの硬さの評価において、ディッシュに作製した架橋高分子多糖類形成用ゾルの２４時間後のＧ’を図５に示す。ゲニピンの加熱時間が増加するにつれてゲルの弾性率が低下した。Ｇｅ−０を用いた場合のゲル弾性率は１９９９±１７３Ｐａであったが、Ｇｅ−４８を用いた場合には７２６±７４Ｐａまで低下した。
【００６９】
ゲニピン反応物の濃度を変更した場合の動的粘弾性測定結果を図６に示す。同じＧｅ濃度（５００μｇ／ｍｌ）において、Ｇｅ−２４を用いた場合のゲル化はＧｅ−０を用いた場合よりも速いことがわかる。またＧｅ−２４の濃度を７５μｇ／ｍｌまで低下させると、ゲル化速度は５００μｇ／ｍｌのＧｅ−０に近い値となった。
【００７０】
以上のように、本実施例に係る加熱後のゲニピンを用いることにより、架橋活性に優れた高分子多糖類又はタンパク質架橋用架橋剤が提供されることがわかる。
ここで、架橋活性に優れるということは、同濃度で添加した場合に架橋速度が速くなるという点においても有用であるし、また、架橋速度を同等とするための架橋剤の濃度を低濃度とすることができるという点においても、細胞毒性等を考慮すると非常に有用であると考えられる。
また、本実施例によれば、ゲニピンの加熱時間を調整することにより、ゲル化時間（ゲル化速度）を調整することができることもわかる。
【００７１】
〔ゲニピンの構造分析〕
加熱によるゲニピンの構造変化を分析するため、紫外（ＵＶ）分光分析、フーリエ変換赤外（ＦＴ−ＩＲ）分光分析、及び１３Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析を行った。
【００７２】
−ＵＶ分光分析−
分光光度計（ＵＶ−３１００Ｓ、島津製作所製）を用いてＧｅ−０（比較例６）、Ｇｅ−２４（実施例１１）及びＧｅ−４８（実施例１２）のＵＶスペクトルを、波長２００〜３００ｎｍの範囲で測定した。調製後のＧｅ−０、Ｇｅ−２４及びＧｅ−４８の濃度はＵＶ分光分析には濃度が高すぎたので、ＰＢ−１００を加えて濃度を２５μｇ／ｍＬまで希釈してから測定した。
【００７３】
−ＦＴ−ＩＲ−
ＦＴ−ＩＲ装置（ＦＴ／ＩＲ−６３００、日本分光社製）を用いてゲニピンの官能基の分析を行った。Ｇｅ−０（比較例７）又はＧｅ−４８（実施例１３）を凍結乾燥した粉末１０ｍｇと臭化カリウム粉末５００ｍｇを混合し、乳鉢で均一化した後、錠剤成形器に入れて加圧製錠した。測定波長は３８００ｃｍ−１から４００ｃｍ−１まで、分解能４ｃｍ−１、積算回数６４回とした。ＰＢ−１００を乾燥したサンプルの測定をブランク測定として同時に行った。各Ｇｅのスペクトルは実測スペクトルとＰＢ−１００のスペクトルの差スペクトルとして表示した。
【００７４】
−１３Ｃ−ＮＭＲ−
ＮＭＲ装置（ＪＮＭ−ＥＣＡ６００、ＪＥＯＬ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎｃ）を用いて、デカップリングモードによる１３Ｃ−ＮＭＲ定量測定を行った。Ｇｅ−０（比較例８）はＧｅ粉末（５ｍｇ／ｍＬ）を脱イオン水で溶解した後、エバポレータ（ＲＥ３０１Ｂ−Ｖ、ヤマト科学製）を用いてＧｅ水溶液を濃縮し、ＰＢ−４００を添加して溶媒濃度がＰＢ−１００になるように調節した。Ｇｅ−４８（実施例１４）は同様にエバポレータを用いて水溶液を濃縮した。その後、重水を４分の１容量添加して、ＮＭＲ管（直径４ｍｍ）に充填した。周波数１５０  ＭＨｚで測定を行った。
【００７５】
＜測定結果＞
図７にＵＶ吸収スペクトルの測定結果を示す。Ｇｅ−０は波長２４０ｎｍに極大吸収を示した。一方、ゲニピンの加熱により極大吸収波長は長波長側へシフトし、Ｇｅ−４８では極大吸収波長が２５２ｎｍであった。Ｇｅ−１２、Ｇｅ−２４、およびＧｅ−３６のＵＶ吸収スペクトルはＧｅ−４８とほぼ重なった。
【００７６】
図８にＦＴ−ＩＲスペクトルの測定結果を示す。Ｇｅ−０およびＧｅ−４８を比べると、ジヒドロピラン環のＣ＝Ｏに帰属されるピーク（１６３２ｃｍ−１）にゲニピンの水酸基に帰属されるピーク（３２８５ｃｍ−１および３３７８ｃｍ−１）が同時に減少した。
【００７７】
図９に１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの測定結果を示す。ゲニピンを構成する炭素の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの帰属はMichael F, Yiu-FAI NG, Paul D, “Mechanism and Kinetics of the Crosslinking Reaction between Biopolymers Containing Priamry Amine Groups and Genipin”, Marine Drugs, 2003:8,3941-3953を参照し、図中に各炭素の帰属を示した。Ｇｅ−０とＧｅ−４８の明確な違いが２点観察された。１つ目は、Ｇｅ−０では見られなかったカルボニル炭素領域（１８０〜２１０  ｐｐｍ）に明瞭な２本のピークがＧｅ−４８に出現したこと、２つ目はピークの数がＧｅ−０の１２本から著しく増加したことである。
【００７８】
ＵＶスペクトルの極大吸収波長のシフト（図７）は、ゲニピンの芳香環においてπ電子の状態を変えるような構造変化が生じたことを意味する。
ＦＴ−ＩＲスペクトルのピラン環由来の吸収ピークの減少（図８）は、ピラン環の開裂を示唆するものである。
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルには、Ｇｅ−０では観察されなかったカルボニル炭素領域に少なくとも２本の新たなピークが出現した（図９）。ＦＴ−ＩＲスペクトルにおける水酸基由来の吸収ピーク強度の減少も考慮すると、ピラン環の開裂によるアルドールの形成が強く示唆され、少なくとも式Ａにより表される化合物は含まれていると考えられる。
以上の解析により、加熱によりゲニピンのピラン環が開環することが示唆されるが、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルに見られる多数のピークから、加熱によるゲニピンの構造変化パターンは複数種あるとも考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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