(57)【要約】【課題】アマトキシンの合成のためのビルディングブロックとしてのγ，δ−ジヒドロキシイソロイシン１（ＣＡＳ番号５５３９９−９４−５）のためのシントンの新規合成方法、及びかかるビルディングブロックを使用するアマトキシンの新規合成方法の提供。【解決手段】γ，δ−ジヒドロキシイソロイシン１の、又は化合物１のためのシントンの合成方法であって、特に、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（ＬＨＭＤＳ）の存在下、化合物３をヨウ化メチルでメチル化するステップを含む、前記方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ，δ−ジヒドロキシイソロイシン１の、又は化合物１のためのシントンの合成方法であって、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（ＬＨＭＤＳ）の存在下、化合物３又は３*をヨウ化メチルでメチル化するステップを含む、前記方法。
【化１】
2018090610.tif 000038
【請求項２】
反応が、エーテル中、約１２〜約２０時間、約−１０℃〜約−８０℃で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下のステップ：
（ａ）Ｌ−アスパラギン酸モノメチルエステルＡを２−メチルプロペンと反応させて化合物Ｂを製造すること；
【化２】
2018090610.tif 000039
（ｂ）Ｂをベンズアルデヒドと反応させて化合物Ｃを製造すること；
【化３】
2018090610.tif 000040
（ｃ）Ｃをフェニルフルオレニルブロミドと反応させて化合物３を製造するか、又はＣをベンジルブロミドと反応させて化合物３*を製造すること；
【化４】
2018090610.tif 000041
の１又は２以上をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
以下のステップ：
（ａ）化合物２又は化合物２*を還元して、特に水素化ジイソブチルアルミニウムを用いて還元して、それぞれ化合物Ｄ又はＤ*を製造すること；
【化５】
2018090610.tif 000042
（ｂ）ヒドロキシ化合物Ｄ又はＤ*を酸化して、特にＳｗｅｒｎ酸化を使用して酸化して、それぞれ化合物Ｅ又はＥ*を製造すること；
【化６】
2018090610.tif 000043
（ｃ）Ｅ又はＥ*を転換して、特にＷｉｔｔｉｇ反応条件下で転換して、それぞれ化合物４又は４*を製造すること；
【化７】
2018090610.tif 000044
（ｄ）４又は４*を転換して、特にＳｈａｒｐｌｅｓｓ酸化条件下で転換して、それぞれ化合物Ｆ又はＦ*を製造すること；
【化８】
2018090610.tif 000045
（ｅ）Ｆ又はＦ*を転換して、特に触媒的エステル化反応条件下で転換して、それぞれ化合物５又は５*を製造すること；
【化９】
2018090610.tif 000046
及び、
（ｆ）５又は５*をＮ−脱保護して、特にパラジウム触媒的水素化を使用してＮ−脱保護して、化合物６を製造すること；
【化１０】
2018090610.tif 000047
の１又は２以上をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
化合物６を単離し、そして精製するステップをさらに含み、ここで特に、塩酸塩として沈殿させること、及び／又はクロマトグラフィー精製を使用することで化合物６が精製される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
構造６：
【化１１】
2018090610.tif 000048
で表される化合物。
【請求項７】
前記化合物が９０％超の純度を有し、特に９５％超の純度を有する、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記化合物６が、７０：３０超のジアステレオマー純度を有する、請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
化合物６と、特に少なくとも１００ｍｇの化合物６と、１又は２以上の追加のアマトキシン合成用試薬又はその前駆体とを含むキット。
【請求項１０】
前記１又は２以上の追加の試薬が、以下のリスト：
(i) 樹脂、特に、Merrifield樹脂、Rink-Amid 樹脂及びTHP 樹脂からなる群から選択される樹脂；
(ii) 保護されたヒドロキシプロリン、特に、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護されたＯ−アリルヒドロキシプロリン（ＦｍｏｃＨｙｐＯＡｌｌ）；
(iii) 保護されたアスパラギン、特に、Ｆｍｏｃ保護されたＮ−トリチルアスパラギン（Ｆｍｏｃ（Ｎ−Ｔｒｉ）ＡｓｎＯＨ）；
(iv) 保護されたＣｙｓ−Ｔｒｐジペプチド、特に、−ＳＨ及び−ＯＨの保護基を有するＦｍｏｃ保護されたＣｙｓ−Ｔｒｐジペプチド（ＦｍｏｃＣｙｓ（Ｓ−２−（（ｏ−ＮＯ2Ｐｈ）ＳＯ2Ｔｒｐ−Ｏ−Ａｌｌｙｌ））］ＯＨ）；
(v) 保護されたグリシン、特に、Ｆｍｏｃ保護されたグリシン（ＦｍｏｃＧｌｙ）；
(vi) 保護されたイソロイシン、特に、Ｆｍｏｃ保護されたイソロイシン（ＦｍｏｃＩｌｅ）；
(vii) ペプチドカップリング試薬、特に：Ｏ−（ベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）；ベンゾトリアゾル−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）；及び、ｏ−（７−アザベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）からなる群から選択されるペプチドカップリング試薬；及び
(viii) 三級アミン、特に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤｉＰＥＡ）
から選択される、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
アマトキシン、又はその前駆体分子の合成方法であって、以下のステップ：
（ａ）化合物６をヒドロキシルプロリンとカップリングすること、特に、化合物６をヒドロキシプロリンがあらかじめロードされた樹脂と反応させることによって化合物６をヒドロキシルプロリンとカップリングすること、特に、樹脂Ｌ上に固定化されたＦｍｏｃＨｙｐＯＨの遊離のＣ末端へと化合物６をカップリングすることによって、化合物６をヒドロキシルプロリンとカップリングすること
を含む、前記方法。
【化１２】
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【請求項１２】
残りのアミノ酸がその後、Ｎ末端合成手順によってカップリングされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
以下のステップ：
（ｂ）Ｆｍｏｃ−Ｎ−脱保護、及び、ＧとＦｍｏｃ−（Ｎ−Ｔｒｉ）Ａｓｎ ＯＨ、ＦｍｏｃＣｙｓ（Ｓ−２−（（ｏ−ＮＯ2Ｐｈ）ＳＯ2Ｔｒｐ−Ｏ−Ａｌｌｙｌ））］ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ｌｌｅ ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ ＯＨとのカップリングを反復して、化合物Ｈを製造すること：
【化１３】
2018090610.tif 000050
（ｃ）ＨのＯ−アリル−及びＦｍｏｃ−Ｎ−の脱保護を行い、その後環化して化合物Ｉを製造すること（Ｂ環の閉環）：
【化１４】
2018090610.tif 000051
（ｄ）２−ニトロアリールスルホンアミド−Ｎ−を脱保護し、そしてＩを樹脂から切り出して化合物Ｊを製造すること：
【化１５】
2018090610.tif 000052
（ｅ）Ｊを液体相で環化してアマニチン誘導体Ｋを製造すること：
【化１６】
2018090610.tif 000053
の１又は２以上をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アマトキシンが、アミノ酸３としてジヒドロキシイソロイシン部位を有するアマトキシンである、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アマトキシンの合成のためのビルディングブロックとしてのγ，δ−ジヒドロキシイソロイシン１（ＣＡＳ番号５５３９９−９４−５）のためのシントンの新規合成方法、及びかかるビルディングブロックを使用するアマトキシンの新規合成方法に関する。
【化１】
2018090610.tif 000003
【背景技術】
【０００２】
アマトキシン (amatoxin)は、８個のアミノ酸からなる環状ペプチドであり、タマゴテングダケ（Amantia phalloides）キノコ中に見いだされる（図１を参照）。アマトキシンは、特に哺乳動物細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩを特異的に阻害し、従って、影響を受ける細胞の転写とタンパク質生合成も阻害する。細胞の転写阻害は、成長と増殖の停止を引き起こす。共有結合されていないが、アマニチンとＲＮＡポリメラーゼＩＩとの複合体は、非常に緊密である（ＫD＝３ｎＭ）である。酵素からのアマニチンの解離は非常にゆっくりしたプロセスであり、従って、影響を受けた細胞の回収の可能性を低いものにしている。転写の阻害が長く続きすぎる場合は、細胞は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）を受けるであろう。
【０００３】
腫瘍治療のための細胞傷害性部分としてのアマトキシンの使用は、すでに１９８１年に、ジアゾ化を経由してＴｒｐ（アミノ酸４：図１を参照）のインドール環に結合されたリンカーを使用して、抗Ｔｈｙ１．２抗体をα−アマニチンに結合することにより研究されていた（Davis & Preston, Science 1981, 213, 1385-1388）。Davis & Prestonは、結合部位を７’位として同定した。Morris & Ventonは、７’位での置換が誘導性であり、これが細胞障害活性を維持することも証明した（Morris & Venton, Int. J. Peptide Protein Res. 1983, 21 419-430）。
【０００４】
特許出願ＥＰ１８５９８１１  Ａ１（２００７年１１月２８日公開）は、β−アマニチンのアマトキシンアミノ酸１のγ Ｃ原子が直接（すなわち、リンカー構造無しで）アルブミン又はモノクローナル抗体ＨＥＡ１２５、ＯＫＴ３、又はＰＡ−１に結合された結合体を記載した。さらに、乳癌細胞（ＭＣＦ−７）、バーキット (Burkitt)リンパ腫細胞（Ｒａｊｉ）、及びＴリンパ腫細胞（Ｊｕｒｋａｔ）の増殖に対するこれらの結合体の阻害効果が証明された。アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などを含むリンカーの使用が提案されたが、そのような構築物は実際には示されず、アマトキシン上の結合部位などのそれ以上の詳細も提供されなかった。
【０００５】
特許出願ＷＯ２０１０／１１５６２９及びＷＯ２０１０／１１５６３０（いずれも２０１０年１０月１４日公開）は、ヒト化抗体ｈｕＨＥＡ１２５などの抗ＥｐＣＡＭ抗体のような抗体が、（ｉ）アマトキシンアミノ酸１のγ Ｃ原子、（ｉｉ）アマトキシンアミノ酸４の６’ Ｃ原子、又は（ｉｉｉ）アマトキシンアミノ酸３のδ Ｃ原子、を介してアマトキシンに結合している（それぞれ、直接、又は抗体とアマトキシン間のリンカーを介して）結合体を記載している。示唆されたリンカーは、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などの要素を含む。さらに、これらの結合体の、乳癌細胞（細胞株ＭＣＦ−７）、膵臓癌（細胞株Ｃａｐａｎ−１）、結腸癌（細胞株Ｃｏｌｏ２０５）、及び胆管癌（細胞株ＯＺ）の増殖に対する阻害効果が証明された。
【０００６】
アマトキシンは、採取されたタマゴテングダケ（Amantia phalloides）キノコの子実体から、又は純粋培養物から単離することができる（Zhang P, Chen Z, Hu J, Wei B, Zhang Z, and Hu W, Production and characterization of Amanitin toxins from a pure culture of Amanita exitialis, FEMS Microbiol Lett. 2005 Nov 15;252(2):223-8. Epub 2005 Sep 15）。しかし、得られるアマトキシンの量は、かなり少なく（天然の子実体からは約０．３〜３ｍｇ／ｇ乾燥物質の範囲、及び純粋培養物からは約１０％）、天然に存在するアマトキシン変種をさらに修飾するための柔軟性は限定されている（［０００３］〜［０００５］に記載された文献及びそこに引用された文献を参照）。
【０００７】
あるいは、アマトキシンは担子菌（basidiomycete） (Muraoka S, and Shinozawa T., Effective production of amanitins by two-step cultivation of the basidiomycete, Galerina fasciculata GF-060, J Biosci Bioeng. 2000;89(1):73-6；報告された収率は約５ｍｇ／ｌ培養物であった）、又はエー・フィッサ（A. fissa）（Guo XW, Wang GL, and Gong JH, Culture conditions and analysis of amanitins on Amanita spissa, Wei Sheng Wu Xue Bao. 2006 Jun;46(3):373-8；報告された収率は約３０μｇ／ｌ培養物であった）を使用して、発酵から得ることができる。再度、収率は低く、天然に存在するアマトキシン変種をさらに修飾する柔軟性は同様に限定されている。
【０００８】
最後に、アマトキシンは部分合成又は全合成によって調製されている（例えば、Zanotti G, Mohringer C, and Wieland T., Synthesis of analogues of amaninamide, an amatoxin from the white Amanita virosa mushroom, Int J Pept Protein Res. 1987 Oct;30(4):450-9; Zanotti G, Wieland T, Benedetti E, Di Blasio B, Pavone V, and Pedone C., Structure-toxicity relationships in the amatoxin series. Synthesis of S-deoxy[gamma(R)-hydroxy-Ile3]-amaninamide, its crystal and molecular structure and inhibitory efficiency, Int J Pept Protein Res. 1989 Sep;34(3):222-8; Zanotti G, Petersen G, and Wieland T., Structure-toxicity relationships in the amatoxin series. Structural variations of side chain 3 and inhibition of RNA polymerase II, Int J Pept Protein Res. 1992 Dec; 40(6):551-8）。
【０００９】
アマトキシンへの完全な合成経路の使用は、治療用途に必要なアマトキシンのより大量の供給を提供することができ、適切な出発物質をビルディングブロックとして使用して、種々の新規アマトキシン変異体の構築を提供できるが、最も関連するアマトキシンであるα−アマニチンやβ−アマニチン、並びにアマニン及びアマニンアミドへの完全な合成アプローチはこれまでに報告されていない。これは、少なくとも部分的には、基本的なビルディングブロックであるγ，δ−ジヒドロキシイソロイシン１又はそのシントンが、純粋なジアステレオマーとして利用できなかったという事実に起因する可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って先行技術には、アマトキシンの合成のためのビルディングブロックとしてγ，δ−ジヒドロキシイソロイシン１又はそのシントン得るための、及び１もしくはそのシントンの製造法を同定するための、大きなニーズがあった。さらに、先行技術には、アマトキシンを合成するため代替法を同定するための、大きなニーズがあった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、適切に保護されたアスパラギン酸誘導体の位置選択的メチル化が主要なステップである多工程プロセスで、γ，δ−ジヒドロキシイソロイシン１又はそのシントンを得ることができる、という予想外の観察に基づく。
【００１２】
すなわち、ある形態において本発明は、γ，δ−ジヒドロキシイソロイシン１の、又は化合物１のためのシントンの合成方法であって、特に、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（ＬＨＭＤＳ）の存在下、化合物３をヨウ化メチルでメチル化するステップを含む、前記方法に関する。
【化２】
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【００１３】
別の形態において本発明は、γ，δ−ジヒドロキシイソロイシン１の、又は化合物１のためのシントンの合成方法であって、特に、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（ＬＨＭＤＳ）の存在下、化合物３*（化合物３中のフェニルフルオレニル基の代わりに、窒素原子に第２のベンジル保護基を有する）をヨウ化メチルでメチル化するステップを含む、前記方法に関する。
【化３】
2018090610.tif 000005
【００１４】
第２の形態において本発明は、化合物６に関する。
【化４】
2018090610.tif 000006
【００１５】
第３の形態において本発明は、アマトキシンもしくはその前駆体の合成のため、化合物６と少なくとも１種の追加の試薬とを含むキットに関する。
【００１６】
さらに別の形態において本発明は、特に、化合物６に、ヒドロキシプロリンがあらかじめロードされた樹脂（ＰＳ）Ｌを反応させることにより、化合物６をヒドロキシプロリンにカップリングするステップを含む、アマトキシン又はその前駆体分子を合成するための方法に関する。
【化５】
2018090610.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】異なるアマトキシンの構造式を示す。太字の数字（１〜８）は、アマトキシンを形成する８個のアミノ酸の標準的番号付けを示す。アミノ酸１、３、４中の原子の標準的表示も示される（それぞれ、α〜γまでのギリシア文字、α〜δまでのギリシア文字、及び１’〜７’までの字）。
【図２】化合物６のジアステレオマー比７０：３０を示す1Ｈ−ＮＭＲスペクトル及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図３】アマトキシンの合成の一般的合成スキームを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載の具体的な方法、プロトコール、及び試薬に限定されず、これらは変化し得ることを、理解すべきである。また、本発明で使用される用語は、具体的な態様を説明することのみが目的であり、これらは本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも、理解すべきである。特に別の指定がなければ、本発明で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。
【００１９】
好ましくは、本発明で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland) に記載のように定義される。
【００２０】
本明細書と引き続く特許請求の範囲を通して、特に、別の指定がなければ、用語「含む」（"comprise"）及びその変種（"comprises", "comprising"）は、記載された整数、組成、もしくはステップ、又は整数もしくはステップの群を含むと理解されるが、追加の整数、組成、もしくはステップ、又は整数、組成、もしくはステップの群が存在しない態様を含む、任意の追加の整数、組成、もしくはステップ、又は整数、組成、もしくはステップの群が、任意選択的に存在してもよい。このような後者の態様において、用語「含む」は、「からなる（consisting of）」と同義に使用される。
【００２１】
本明細書の本文を通して、いくつかの文書が引用される。ここで引用される、前述の又は後述の各文書（すべての特許、特許出願、科学文献、製造業者の仕様書、説明書、GenBank 受入番号配列提出物などを含む）は、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。ここで、本発明は、先行発明によるそのような開示に先行する資格がないことの承認として解釈されるべきではない。
【００２２】
本発明を、ここでさらに説明する。以下の節では、本発明の異なる形態がより詳細に定義される。特に別の指定がなければ、定義された各形態は、任意の他の形態と組み合わせることができる。特に、好適であるか又は有利であるとして示されている任意の特徴は、好適であるか又は有利であるとして示されている他の特徴と組み合わせることができる。
【００２３】
すなわち、ある形態において本発明は、γ，δ−ジヒドロキシイソロイシン１の、又は化合物１のためのシントンの合成方法であって、特に、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（ＬＨＭＤＳ）の存在下、化合物３をヨウ化メチルでメチル化するステップを含む、前記方法に関する。
【化６】
2018090610.tif 000008
【００２４】
別の形態において本発明は、γ，δ−ジヒドロキシイソロイシン１の、又は化合物１のためのシントンの合成方法であって、特に、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（ＬＨＭＤＳ）の存在下、化合物３*（化合物３中のフェニルフルオレニル基の代わりに、窒素原子に第２のベンジル保護基を有する）をヨウ化メチルでメチル化するステップを含む、前記方法に関する。
【化７】
2018090610.tif 000009
【００２５】
本発明の文脈において、用語「シントン (synthon)」は、化学反応において、目的の特定の化合物の合成同等物であるか合成同等物として使用できる化合物を指す。この定義は、上記化学反応で使用される条件下で不安定であるか又は反応性であるであろう目的の化合物の部分が、上記化学反応後に切断することができる適切な保護基により保護されるか又はマスクされる化合物を含む。
【００２６】
具体的態様において、反応は、エーテル中、約１２〜約２０時間、特に約１６時間、約−１０℃〜約−８０℃で行われる。具体的態様において、反応は、−２０℃でテトラヒドロフランを溶媒として行われる。具体的態様において、３０：１超、特に、４０：１超、特に、約５０：１超の、ジアステレオマー純度が得られる。
【００２７】
本発明の文脈において、用語「約」又は「ほぼ」は、ある値又は範囲の９０％〜１１０％を意味する。
【００２８】
具体的態様において、本方法は、化合物３を合成するための以下のステップ：
（ａ）Ｌ−アスパラギン酸モノメチルエステルＡを２−メチルプロペンと反応させて化合物Ｂを製造すること；
【化８】
2018090610.tif 000010
（ｂ）Ｂをベンズアルデヒドと反応させて化合物Ｃを製造すること；
【化９】
2018090610.tif 000011
（ｃ）Ｃをフェニルフルオレニルブロミドと反応させて化合物３を製造すること
【化１０】
2018090610.tif 000012
の１又は２以上をさらに含む。
【００２９】
別の形態の態様において、本方法は、化合物３*を合成するための以下のステップ：
（ａ）Ｌ−アスパラギン酸モノメチルエステルＡを２−メチルプロペンと反応させて化合物Ｂを製造すること；
（ｂ）Ｂをベンズアルデヒドと反応させて化合物Ｃを製造すること；
（ｃ）Ｃをベンジルブロミドと反応させて化合物３*を製造すること、
の１又は２以上をさらに含む。
【００３０】
具体的態様において、本方法は、以下のステップ：
（ａ）化合物２を還元して、特に水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤｉＢＡｌ−Ｈ）を用いて還元して、化合物Ｄを製造すること；
【化１１】
2018090610.tif 000013
（ｂ）ヒドロキシ化合物Ｄを酸化して、特にＳｗｅｒｎ酸化を使用して酸化して、化合物Ｅを製造すること；
【化１２】
2018090610.tif 000014
（ｃ）Ｅを転換して、特にＷｉｔｔｉｇ反応条件下で転換して、化合物４を製造すること；
【化１３】
2018090610.tif 000015
（ｄ）４を転換して、特にＳｈａｒｐｌｅｓｓ酸化条件下で転換して、化合物Ｆを製造すること；
【化１４】
2018090610.tif 000016
（ｅ）Ｆを転換して、特に触媒的エステル化反応条件下で転換して、化合物５を製造すること；
【化１５】
2018090610.tif 000017
及び、
（ｆ）５をＮ−脱保護して、特にパラジウム触媒的水素化を使用してＮ−脱保護して、化合物６を製造すること、
【化１６】
2018090610.tif 000018
の１又は２以上をさらに含む。
【００３１】
別の形態の具体的態様において、本方法は、以下のステップ：
（ａ）化合物２*を還元して、特に水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤｉＢＡｌ−Ｈ）を用いて還元して、化合物Ｄ*（化合物Ｄ中のフェニルフルオレニル基の代わりに、窒素原子に第２のベンジル保護基を有する）を製造すること；
（ｂ）ヒドロキシ化合物Ｄ*を酸化して、特にＳｗｅｒｎ酸化を使用して酸化して、化合物Ｅ*（化合物Ｅ中のフェニルフルオレニル基の代わりに、窒素原子に第２のベンジル保護基を有する）を製造すること；
（ｃ）Ｅ*を転換して、特にＷｉｔｔｉｇ反応条件下で転換して、化合物４*（化合物４中のフェニルフルオレニル基の代わりに、窒素原子に第２のベンジル保護基を有する）を製造すること；
（ｄ）４*を転換して、特にＳｈａｒｐｌｅｓｓ酸化条件下で転換して、化合物Ｆ*（化合物Ｆ中のフェニルフルオレニル基の代わりに、窒素原子に第２のベンジル保護基を有する）を製造すること；
（ｅ）Ｆ*を転換して、特に触媒的エステル化反応条件下で転換して、化合物５*（化合物５中のフェニルフルオレニル基の代わりに、窒素原子に第２のベンジル保護基を有する）を製造すること；
及び、
（ｆ）５*をＮ−脱保護して、特にパラジウム触媒的水素化を使用してＮ−脱保護して、化合物６を製造すること、
の１又は２以上をさらに含む。
【００３２】
具体的態様において、本方法は、化合物６を単離し精製するステップをさらに含む。具体的態様において、化合物６は、塩酸塩としての沈殿及び／又はクロマトグラフィー精製を使用して、精製される。
【００３３】
第２の形態において、本発明は、化合物６に関する。
【化１７】
2018090610.tif 000019
【００３４】
具体的態様において、化合物６は、９０％超、特に９５％超の純度を有する。
【００３５】
本発明の文脈において、用語「純度」は、化合物６と存在するそのジアステレオ異性体の総量を指す。９０％を超える純度は、例えば化合物６を含む組成物１ｇ中に、９０％を超える、すなわち９００ｍｇを超える化合物６及び／又はその立体異性体が存在することを意味する。残りの部分、すなわち不純物は、未反応の出発物質、及び他の反応物、溶媒、切断生成物、及び／又は副生成物を含んでもよい。
【００３６】
具体的態様において、９０％超の純度を有する化合物６を含む組成物は、１００ｍｇ超の化合物６を含む。
【００３７】
具体的態様において、化合物６は、７０：３０を超えるジアステレオマー純度を有する。
【００３８】
本発明の文脈において、用語「ジアステレオマー純度」は、化合物６を含む組成物中に存在する化合物６の量と、この組成物中に存在するそのジアステレオ異性体の量との比率を指す。例えば、７０：３０を超えるジアステレオマー純度は、化合物６を含む組成物中の保護されたジヒドロキシイソロイシンとそのジアステレオマーの総量の７０％超が化合物６であり、一方、化合物６のジアステレオマーの総量は、対応して３０％未満であることを意味する。
【００３９】
具体的態様において、ジアステレオマー純度が７０：３０超の化合物６を含む組成物は、１００ｍｇ超の化合物６を含む。
【００４０】
第３の態様において、本発明は、化合物６を含むキットに関し、特に、少なくとも１００ｍｇの化合物６と、アマトキシン又はその前駆体の合成のための少なくとも１種の追加の試薬と、を含むキットに関する。
【００４１】
具体的態様において、上記少なくとも１種の追加の試薬は、以下のリスト：
(i) 樹脂、特に、Merrifield樹脂、Rink-Amid 樹脂及びTHP 樹脂からなる群から選択される樹脂；
(ii) 保護されたヒドロキシプロリン、特に、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護されたＯ−アリルヒドロキシプロリン（ＦｍｏｃＨｙｐＯＡｌｌ）；
(iii) 保護されたアスパラギン、特に、Ｆｍｏｃ保護されたＮ−トリチルアスパラギン（Ｆｍｏｃ（Ｎ−Ｔｒｉ）ＡｓｎＯＨ）；
(iv) 保護されたＣｙｓ−Ｔｒｐジペプチド、特に、−ＳＨ及び−ＯＨの保護基を有するＦｍｏｃ保護されたＣｙｓ−Ｔｒｐジペプチド（ＦｍｏｃＣｙｓ（Ｓ−２−（（ｏ−ＮＯ2Ｐｈ）ＳＯ2Ｔｒｐ−Ｏ−Ａｌｌｙｌ））］ＯＨ）；
(v) 保護されたグリシン、特に、Ｆｍｏｃ保護されたグリシン（ＦｍｏｃＧｌｙ）；
(vi) 保護されたイソロイシン、特に、Ｆｍｏｃ保護されたイソロイシン（ＦｍｏｃＩｌｅ）；
(vii) ペプチドカップリング試薬、特に、：Ｏ−（ベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）；ベンゾトリアゾル−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）；及び、ｏ−（７−アザベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）からなる群から選択されるペプチドカップリング試薬；及び
(viii) 三級アミン、特に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤｉＰＥＡ）
から選択される。
【００４２】
さらに別の形態において、本発明は、アマトキシン、又はその前駆体分子の合成方法であって、以下のステップ：
（ａ）化合物６をヒドロキシルプロリンとカップリングすること、特に化合物６を、ヒドロキシプロリンがあらかじめロードされた樹脂と反応させることによって化合物６をヒドロキシルプロリンとカップリングすること、特に、樹脂Ｌ上に、例えばテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）樹脂上に、固定化されたＦｍｏｃＨｙｐＯＨの遊離のＣ末端へと化合物６をカップリングすることによって、化合物６をヒドロキシルプロリンとカップリングすることを含む、前記方法に関する。
【化１８】
2018090610.tif 000020
【００４３】
具体的態様において、残りのアミノ酸はその後、Ｎ末端合成手順によってカップリングされる。具体的なこのような態様において、本発明の方法は、以下のステップ：
（ｂ）Ｆｍｏｃ−Ｎ−脱保護、及び、ＧとＦｍｏｃ−（Ｎ−Ｔｒｉ）Ａｓｎ ＯＨ、ＦｍｏｃＣｙｓ（Ｓ−２−（（ｏ−ＮＯ2Ｐｈ）ＳＯ2Ｔｒｐ−Ｏ−Ａｌｌｙｌ））］ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ｌｌｅ ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ ＯＨとのカップリングを反復して、化合物Ｈを製造すること：
【化１９】
2018090610.tif 000021
（ｃ）ＨのＯ−アリル−及びＮ−Ｆｍｏｃの脱保護を行い、その後環化して化合物Ｉを製造すること（Ｂ環の閉環）：
【化２０】
2018090610.tif 000022
（ｄ）２−ニトロアリールスルホンアミド−Ｎ−を脱保護し、そしてＩを樹脂から切り出して化合物Ｊを製造すること：
【化２１】
2018090610.tif 000023
（ｅ）Ｊを液体相で環化してアマニチン誘導体Ｋを製造すること：
【化２２】
2018090610.tif 000024
の１又は２以上をさらに含む。
【００４４】
さらに別の形態において、本発明は、溶液中で、アマトキシン、又はその前駆体分子を合成するための方法に関する。
【００４５】
ある実施態様において、そのような方法は、以下のステップ：
【００４６】
（ａ）化合物６をヒドロキシルプロリンとカップリングすること、特に、Ｆｍｏｃ（ＯtＢｕ）ＨｙｐＯＨの遊離のＣ末端へと化合物６をカップリングすることによって、化合物６をヒドロキシルプロリンとカップリングすること；
【化２３】
2018090610.tif 000025
（ｂ）Ｆｍｏｃ−Ｎ−脱保護、及び、ＭとＦｍｏｃ−（Ｎ−Ｔｒｉ）Ａｓｎ ＯＨ、Ｆｍｏｃ−（Ｓ−Ｔｒｉ）Ｃｙｓ ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ｌｌｅ ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ ＯＨ、及びＮ−Ｂｏｃ−ＨＰＩとのカップリングを反復して、化合物Ｎを製造すること：
【化２４】
2018090610.tif 000026
（ｃ）Ｎ−及びＳ−トリチル、Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル、及びＮ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル保護基の酸性脱保護と、Savige-Fontana反応（Savige & Fontana, Int J Pept Protein Res. 15 (1980) 102-12）によるインサイチュ閉環によって、化合物Ｊを製造すること、
の１又は２以上をさらに含む。
【００４７】
さらに別の形態において、本発明は、溶液中で、アマトキシン、又はその前駆体分子を合成するための方法であって、化合物６をヒドロキシルプロリンとカップリングすること、特に化合物６をヒドロキシルプロリンと反応すること、特にＦｍｏｃ（ＯtＢｕ）ＨｙｐＯＨの遊離のＣ末端へと化合物６をカップリングすること、を含む方法に関する。
【００４８】
具体的態様において、アマトキシンは、アミノ酸３としてジヒドロキシイソロイシン部分を有するアマトキシンである（図１を参照）。
【００４９】
本発明の文脈において、用語「アマトキシン」は、テングタケ属（Amanita）から単離される８個のアミノ酸からなり、Wieland, T. and Faulstich H. (Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. 1978 Dec;5(3):185-260)に記載されているすべての環状ペプチドを含み、さらに、そのすべての化学的誘導体；さらにそのすべての半合成類似体；さらに、天然化合物（環状、８個のアミノ酸）のマスター構造に従うビルディングブロックから構築されたそのすべての合成類似体、その水酸化アミノ酸の代わりに非水酸化アミノ酸を含有するすべての合成又は半合成類似体、さらに、そのスルホキシド部分が、スルフィド、スルホン、又はイオウとは異なる原子（例えば、アマニチンのカルバ類似体中のような炭素原子）で置換されている、すべての合成又は半合成類似体を含み、ここで、各場合に、任意のそのような誘導体又は類似体は、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害することにより機能的に活性である。
【００５０】
機能的にアマトキシンは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害するペプチド又はデプシペプチドとして定義される。好ましいアマトキシンは、上記したリンカー分子又は標的結合部分と反応することができる官能基（例えば、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基、又はチオール捕捉基）を有するものである。図１に示されるように、本発明の結合体に特に適しているアマトキシンは、図１に示されるように、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン、及びアマヌリン酸、並びに、その塩、化学的誘導体、半合成類似体、及び合成類似体である。本発明における使用のための特に好ましいアマトキシンは、α−アマニチン、β−アマニチン、及びアマニンアミドある。
【００５１】
本明細書において、ある化合物の「化学的誘導体」（又は、単に「誘導体」）は、その化合物に類似した化学構造を有するが、その化合物中に存在しない少なくとも１つの化学基を含み、及び／又はその化合物中に存在する少なくとも１つの化学基が欠損している、分子種を指す。誘導体が比較される化合物は、「親」化合物として知られている。典型的には「誘導体」は、１又は２以上の化学反応ステップで親化合物から製造することができる。
【実施例】
【００５２】
以下において、本発明は非限定例によりさらに詳細に説明される。
【００５３】
実施例１
プロピオンアルデヒドとＮ−ＰＭＰグリオキサルイミンを使用するマンニッヒ (Mannich)反応
【化２５】
2018090610.tif 000027
【００５４】
１の主要な構造的特徴の１つは、アミノ基とメチル基の２Ｓ，３Ｒコンフォメーションである。隣接する立体中心の構築のためにアクセスが容易なのが、マンニッヒ反応である。しかし、両方の立体中心は、高いジアステレオ制御及びエナンチオ制御を有するマンニッヒ型反応をする。この根拠は、J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 1040-1041に記載されている設計された有機触媒の使用により説明されている。しかし、ＰＭＰ群を除去するための異なるアプローチは失敗して反応混合物を与え、従ってこのアプローチは最終的に廃棄された。この除去は極めて退屈でうまくいかないことが文献で知られているが、ＰＭＰ基は反応に必要である。
【００５５】
実施例２
アスパラギン酸誘導体のアルキル化
２．１  序論
正しい立体配向（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）を有するγ，δ−ジヒドロキシイソロイシンシントンを合成するための別のアプローチは、アスパラギン酸誘導体３で開始された。同様のアプローチが文献に記載されている（Yoshida et al., A large scale production of (3S,4S)-3-(tert-Butoxycarbonyl)amino-4-methylpyrrolidine and its analogs from L-Aspartic acid, Chem Pharm Bull (1996), 44, 1128-1131; Wolf and Rapoport, Conformationally constrained Peptides. Chirospecific Synthesis of 4-Alkyl-Substituted g-Lactam-Bridged Dipeptides from L-Aspartic Acid', J Org Chem (1989), 54, 3164-3173を参照）。（ｉ）遊離アミノ基を保護するために、（ｉａ）ベンジル基とフェニルフルオレニル基、又は（ｉｂ）２つのベンジル基、のいずれかの組合せを使用すること、及び（ｉｉ）対応するカリウム塩の代わりにリチウムヘキサメチルジシラザン（ＬＨＭＤＳ）を使用すること、が決定的に重要であることがわかった。カリウムヘキサメチルジシラザン（ＫＨＭＤＳ）は、反対の配向を与えた。
【００５６】
２．２  化合物２の合成
【化２６】
2018090610.tif 000028
【００５７】
磁気攪拌棒、滴下ロート、及び低温温度計を有する三ツ首丸底フラスコに、１５ｍｌの無水テトラヒドロフランに溶解した１６．３ｍｍｏｌ、８．７ｇの化合物３（実施例３を参照）を投入し、−２０℃に冷却した。リチウムヘキサメチルジシラジド（ヘキサン中１．０Ｍ溶液の４０ｍｌ）を、１５分以内に滴下して加えた。反応を−２０℃で２時間維持した後、−８０℃に冷却した。最後に、１２．２ｍｌ、１９．６ｍｍｏｌ、１．２当量のヨウ化メチルを加えた。反応物をゆっくり加温し、−２０℃でさらに４時間維持した。最後に１０ｍｌのメタノールを添加して反応をクエンチさせ、室温まで加温し、１５０ｍｌの水に注いだ。水相をｔ−ブチルメチルエーテルで抽出し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、真空下で濃縮した。粗生成物：９．０ｇ。粗生成物の１Ｈ−ＮＭＲは、ジアステレオマー選択的純度が５：１より良好であることを示した。収率７．２ｇ，８１％。
【００５８】
粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィー、３３０ｇのシリカ、０％〜５０％へのｎ−ヘキサン／ｔ−ブチルメチルエーテル勾配により、精製した。
【００５９】
1H-NMR: d 0.72 (d, 3 H, J = 5.6 Hz), 1.03 (s, 9 H), 2.64 (dt, 1 H, J = 5.6, 8.4 Hz), 3.55 (s, 3 H), 3.85 (d, 1 H, J = 8.4 Hz), 4.31 (d, 1 H, J = 11.2 Hz), 4.65 (d, 1 H, J = 11.2 Hz), 7.15-7.94 (m, 18 H). 
【００６０】
２．３  化合物２*の合成
実施例２．２と同様に、化合物２*は３*から合成することができる。
【００６１】
実施例３
化合物３の合成
３．１  序論
化合物３は、Dunn et al. (Dunn et al., Stereoselective synthesis of 2,3-diamino acids. 2,3-Diamino-4-phenylbutanoic acid, J. Org. Chem. 55 (1990) 5017-25) により記載されたプロトコールに従って合成された。
【００６２】
３．２  化合物Ｂの合成窒素
【化２７】
2018090610.tif 000029
【００６３】
スクリューキャップと攪拌棒を有する丸底ガラスシリンダーに、２５ｇの１３６ｍｍｏｌの４−メチル−Ｌ−アスパラギン酸塩酸塩を入れた。モノエステルＡを１００ｍｌのジオキサン／テトラヒドロフラン（１：１、ｖ／ｖ）及び２５ｍｌの硫酸に懸濁し、−３０℃（クリオスタット）に冷却した。２−メチルプロペン（２００ｇ，３．５６ｍｌ）を凝結させた。シリンダーを閉じ、室温まで加温した。反応混合物を１０００ｍｌの飽和重炭酸ナトリウム溶液上に注ぎ、酢酸エチルで抽出した（５回、４００ｍｌ）。一緒にした有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、真空下で濃縮した。収率：１７．８８ｇ，６４．６％。
【００６４】
３．３  化合物Ｃの合成
【化２８】
2018090610.tif 000030
【００６５】
温度計と攪拌棒を有する丸底フラスコに、５００ｍｌのメタノールと１５０ｍｌの酢酸に溶解したＢ（１７．９ｇ、８７．９ｍｍｏｌ）を投入した。ベンズアルデヒド（１６．０ｍｌ、１５８ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応物を室温で２時間維持し、最後に０℃に冷却した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１０．０ｇ，１５９ｍｍｏｌ）を４５分以内に加え、０℃でさらに１５分間攪拌した。最後に、反応混合物を１０００ｍｌの重炭酸ナトリウムに注ぎ、１０分間攪拌した。ジクロロメタンで抽出（５回、２５０ｍｌ）後、一緒にした有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、真空下で濃縮した。粗生成物：３５ｇ。収率１４．３ｇ，５５．４％。
【００６６】
フラッシュクロマトグラフィー精製、３３０ｇのＳｉＯ2、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル勾配  ０〜５０％。
【００６７】
1H-NMR: d 1.42 (s, 9 H), 2.29 (s, 1 H), 2.62 (t, 2 H, J = 9.2 Hz), 2.50 (t, 1 H, J = 8 Hz), 3.62 (s, 3 H), 3.67 (d, 1 H, 17.6 Hz), 3.83 (d, 1 H, J = 17.2 Hz), 7.19-7.30 (m, 5 H).
【００６８】
３．４  化合物３の合成
【化２９】
2018090610.tif 000031
【００６９】
攪拌棒を有する丸底フラスコに、５００ｍｌのアセトニトリル中のＣ（２１．３ｇ，５１．６ｍｍｏｌ）、９−ブロモ−９−フェニルフルオレン（２５．０ｇ，７７．８ｍｍｏｌ）、２０．０ｇ、８０．３ｍｍｏｌの硝酸鉛、３１．７ｇ、１４９．３ｍｍｏｌのＫ3ＰＯ4を加えた。反応混合物を室温で２．０時間維持した。完了後、反応物を５００ｍｌのジクロロメタンで希釈し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、セライトで濾過した。生成物を真空下で濃縮した。収率：１６．２ｇ，４１．７％。
【００７０】
フラッシュクロマトグラフィー精製、３３０ｇのＳｉＯ2、ｎ−ヘキサン／ｔ−ブチルメチルエーテル、勾配０〜５０％。
【００７１】
1H-NMR: d 1.14 (s, 9 H), 1.92 (dd, 1 H, J = 2.8, 16 Hz), 2.54 (dd, 1 H, 10.8, 15.8 Hz), 3.40 (s, 3 H), 3.86 (d, 1 H, J = 13.6 Hz), 4.21 (d, 1 H, J = 14 Hz), 7.17-7.83 (m, 18 H).
【００７２】
実施例４
化合物６の合成
４．１  化合物Ｄの合成
【化３０】
2018090610.tif 000032
【００７３】
攪拌棒、温度計、及び滴下ロートを取り付けた丸底フラスコに、１５０ｍｌの無水テトラヒドロフラン中に溶解した２（１６．４ｇ，２９．９ｍｍｏｌ）を投入し、−３０℃に冷却した。１．０Ｍ水素化ジイソブチルアルミニウムの溶液（１５０ｍｌ）を不活性雰囲気（アルゴン）下で１．０時間以内に加え、さらに１６時間攪拌した。反応物をＮａ2ＳＯ4  １０水和物で加水分解し、室温まで加温した。沈殿物をろ別し、ｔ−ブチルメチルエーテルで充分に洗浄した。有機相を真空下で濃縮した。収率：１４．３ｇ，９２％。
【００７４】
フラッシュクロマトグラフィー精製、３３０ｇのＳｉＯ2、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル勾配  ０〜５０％。
【００７５】
1H-NMR: d 0.45 (d, 3 H, J = 6.8 Hz), 1.02 (s, 9 H), 3.09 (d, 1 H, J = 10.8 Hz), 3.34 (dq, 1 H, J = 7.2 Hz, J = 14.8 Hz), 4.00 (d, 2 H, J = 10.8 Hz), 4.36 (d, 1 H, 13.6 Hz), 4.73 (d, 1 H, J = 13.6 Hz), 7.20-7.76 (m, 18 H).
【００７６】
４．２  化合物Ｅの合成
【化３１】
2018090610.tif 000033
【００７７】
攪拌棒、温度計、滴下ロート、及びアルゴン注入口を取り付けた丸底フラスコに、ジクロロメタン中のオキサルクロリド（３．２８ｍｌ、３５．５ｍｍｏｌ）を投入し、−８０℃に冷却した。２０ｍｌのジクロロメタンで希釈した無水ジメチルスルホキシド（５．４７ｍｌ、７１．１ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。３０ｍｌのジクロロメタンに溶解した化合物Ｄ（１３．６７ｇ，２５．９ｍｍｏｌ）を１５分間かけて加えた。−８０℃でさらに１５分後、トリエチルアミンを加え、反応物を室温まで加温した。両方の層を分離し、水相をジクロロメタンで抽出した（４回、１５０ｍｌ）。一緒にした有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、真空下で濃縮した。粗生成物：１６．９ｇ。粗生成物を直接オレフィンに変換した。
【００７８】
４．３  化合物４の合成
【化３２】
2018090610.tif 000034
【００７９】
攪拌棒、温度計、及びアルゴン注入口を取り付けた丸底フラスコに、１２０ｍｌのジメチルスルホキシドに懸濁した水素化ナトリウム（２．３２ｇ，５７．９ｍｍｏｌ）を投入した。懸濁物を５０℃に３０分間加温し、室温まで冷却した。次に、固体のメチルトリフェニルホスホニウムブロミドを加え、１５分間攪拌した。２０ｍｌのジメチルスルホキシドに溶解した粗生成物Ｅを加え、さらに１６時間攪拌した。加水分解（３００ｍｌの水）後、酢酸エチルで抽出（４回、１５０ｍｌ）し、一緒にした有機相を水（３回、１５０ｍｌ）と食塩水で充分洗浄し、溶液をＭｇＳＯ4で乾燥し、真空下で濃縮した。収率：１３．３ｇ，９９．２％（２ステップ）。
【００８０】
フラッシュクロマトグラフィー精製、３３０ｇのＳｉＯ2、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル勾配  ０〜８０％。
【００８１】
1H-NMR: d 0.51 (d, 3 H, J = 1.6 Hz), 1.05 (s, 9 H), 2.14 (hept, 1 H, J = 0.8 Hz), 3.15 (d, 1 H, 10.8 Hz), 4.30 (d, 1 H, J = 14 Hz), 4.49 (dd, 1 H, J = 1.2, 17.6 Hz), 4.57 (d, 1 H, 13.6 Hz), 5.03 (d, 1 H, J = 0.8, 10.8 Hz), 5.95 (m, 1 H), 7.26-7.60 (m, 18 H).
【００８２】
４．４  化合物Ｆの合成
【化３３】
2018090610.tif 000035
【００８３】
丸底フラスコに、１００ｇのＡＤ−ミックス（ベータ、市販）を投入し、６０ｍｌのｔ−ブタノール／水（１：１、ｖ／ｖ）に溶解した。１７ｍｌのジオキサンに溶解した化合物５（３．７５ｇ，７．３ｍｍｏｌ）を１回で加えた。反応物を、反応が完了するまで室温で４日間攪拌した。Ｎａ2ＳＯ3を加えて反応をクエンチし、酢酸エチルで抽出（４回、５０ｍｌ）し、飽和ＮＨ4Ｃｌと食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、真空下で濃縮した。収率：１．１９ｇ，２０％。
【００８４】
フラッシュクロマトグラフィー精製、３３０ｇのＳｉＯ2、ジクロロメタン／ｔ−ブチルメチルエーテル勾配  ０〜８０％。
【００８５】
1H-NMR: d 0.38 (D, 3 H, J = 6.8 Hz), 1.03 (s, 9 H), 1.84 (s + m, 2 H, J = 8.8 Hz), 3.24 (dd, 1 H, J = 4.8, 11.4 Hz), 3.38 (d, 2 H, J = 10.9 Hz), 3.76 (m, 1H), 4.40 (d, 1 H, J = 13.3 Hz), 4.95 (d, 1 H, J = 13.3 Hz), 5.55 (s, 1 H), 7.26-7.91 (m, 18 H).
【００８６】
４．４  化合物５の合成
【化３４】
2018090610.tif 000036
【００８７】
磁気攪拌棒を有する丸底フラスコに、７５ｍｌのジクロロメタンに溶解したＦ（２．１ｇ，３．６４ｍｍｏｌ）を投入した。過剰の無水酢酸（５．０ｍｌ，５２．３ｍｍｏｌ）と触媒量のジメチルアミノピリジンを加えた。反応物を室温で一晩攪拌した。収率：１．８３ｇ，８１％。
【００８８】
フラッシュクロマトグラフィー精製、３３０ｇのＳｉＯ2、ヘキサン／ｔ−ブチルメチルエーテル勾配  ０〜２０％。
【００８９】
1H-NMR: d 0.49 (d, 3 H, J = 7.2 Hz), 1.05 (s, 9 H), 1.74 (m, 1 H, J = 2.90 Hz), 1.88 (s, 3 H), 2.11 (s, 3 H), 3.18 (d, 1 H, J = 10.5 Hz), 3.60 (dd, 1 H, J = 2.3, 12.2 Hz), 4.32 (d, 1 H, J = 13.9 Hz), 4.74 (d, 1 H, J = 13.9 Hz), 5.98 (dd, 1 H, J = 2.4, 84 Hz), 7.10-7.73 (m, 18 H)．
【００９０】
４．４  化合物６の合成
【化３５】
2018090610.tif 000037
【００９１】
アルゴン注入口と真空マニホールドを取り付けた丸底フラスコに、エタノール中の０．１Ｍ塩酸５０ｍｌに溶解した５（２．０ｇ，３．１ｍｍｏｌ）と２００ｍｇの１０％パラジウム担持活性炭を投入した。フラスコを水素でフラッシュ後、反応物を室温で１６時間攪拌した。フラスコをアルゴンでフラッシュし、濾過し、濾液を真空下で濃縮した。透明の油をｎ−ヘキサンで処理（３回）して、フェニルフルオレンを除去した。６の塩酸塩を白色の固体として得た。収率：０．９２ｇ，９８％。
【００９２】
沈殿又はクロマトグラフィーによる精製
【００９３】
1H-NMR: (主要な異性体) d 1.16 (d, 3 H, J = 6.8 Hz), 1.47 (S, 9 H), 2.06 (s, 3 H), 2.09 (s, 3 H), 2.78 (m, 1 H, J = 7.7 Hz), 4.04 (dd, 1 H, J = 3.9, 12.5 Hz), 4.15 (s, 1 H), 4.52 (dd, 2 H, J = 2.08, 12.6 Hz), 5.02 (m, 2 H), 8.86 (s, 2 H).
【００９４】
13C-NMR: (主要な異性体) d 11.5, 20.8, 21.7, 35.0, 53.9, 62.4, 72.2, 84.9, 166.2, 169.9, 170.7.
【００９５】
実施例５
α−アマトキシンの合成
５．１  化合物Ｇの合成
フリットとドレインバルブとを取り付けた開放容器ポリプロピレン反応管に、０．５ｇ、０．５ｍｍｏｌのＦｍｏｃＨｙｐＯＨテトラヒドロピラニルポリスチレンを投入し、３．０ｍｌのジメチルホルムアミド中で２０分間膨潤させた。ドレインバルブを介して溶媒を除去した後、反応容器に、１．５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した１７９ｍｇ、０．６ｍｍｏｌの６、ジメチルホルムアミド中のヒドロキシベンゾチアゾールの１ｍＭ溶液１．５ｍｌ、ジメチルホルムアミド中の（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェートの１ｍＭ溶液１．５ｍｌ、及び２５９μｌのジイソプロピルエチルアミンを投入した。ガラス棒でホモジナイズ後、反応物をマイクロ波支援により７０℃に４．０分間加熱し、最後にジメチルホルムアミド（３回）とジクロロメタン（２回）で洗浄した。
【００９６】
質量分光分析のために、ポリマーの約２０ｍｇのアリコートを、トリフルオロ酢酸／水／トリエチルシラン（８：２：１０、ｖ／ｖ／ｖ）で切断した。
【００９７】
MS: 582.92; [M-tBu+H]+; Fmoc-Hyp-ビス(O-アセチル)ジヒドロキシ-Ile-OtBu
【００９８】
５．２  化合物Ｈの合成
次に化合物Ｇを、反復してＦｍｏｃ脱保護し、残りの６アミノ酸と次のように結合した：
【００９９】
Ｆｍｏｃ−Ｎ−脱保護：
この樹脂を、ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジン溶液４．５ｍｌで２回処理し、マイクロ波支援により７０℃に３分間加熱した。次に樹脂をジメチルホルムアミドで洗浄（３回）した。
【０１００】
アミノ酸カップリング：
１．５ｍｌのジメチルホルムアミド中の脱保護した樹脂結合ペプチドを、１．５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解したアミノ酸（リストを参照）、ジメチルホルムアミド中のヒドロキシベンゾチアゾールの１ｍＭ溶液１．５ｍｌ、ジメチルホルムアミド中の（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェートの１ｍＭ溶液１．５ｍｌ、及び２５９μｌのジイソプロピルエチルアミンと順調に反応した。ガラス棒でホモジナイズ後、反応物をマイクロ波支援により７０℃に４．０分間加熱し、最後にジメチルホルムアミド（３回）とジクロロメタン（２回）で洗浄した。
【０１０１】
質量分光分析のために、ポリマーの約２０ｍｇのアリコートを、トリフルオロ酢酸／水／トリエチルシラン（８：２：１０、ｖ／ｖ／ｖ）で切断した。
【０１０２】
カップリングすべきアミノ酸：
１．  Ｆｍｏｃ−（Ｎ−Ｔｒｉ）Ａｓｎ  ＯＨ
２．  Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｓ−２−（（ｏ−ＮＯ2Ｐｈ）ＳＯ2Ｔｒｐ−Ｏ−Ａｌｌｙｌ））］ＯＨ
３．  Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ  ＯＨ
４．  Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ  ＯＨ
５．  Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ  ＯＨ
【０１０３】
MS: 1227.14; [M-tBu+H]+; 1283.00; [M+H]+; FmocCys(S-2-((o-NO2Ph)SO2Trp-O-Allyl))]-Asn-Hyp-ビス(O-アセチル)ジヒドロキシ-Ile-OtBu.
【０１０４】
MS: 1453.98; [M-tBu+H]+; [M+H]+; FmocGly-Ile-Gly-Cys(S-2-((o-NO2Ph)SO2Trp-O-Allyl))]-Asn-Hyp-ビス(O-アセチル)ジヒドロキシ-Ile-OtBu.
【０１０５】
５．３  化合物Ｉの合成：Ｂ環の閉環
樹脂Ｈは、Ｂ環の環化の前に、順調にアリル−及びＦｍｏｃ−脱保護された。
【０１０６】
アリル−Ｏ−脱保護
樹脂を、ジクロロメタン中の８７４ｍｇ、５．６ｍｍｏｌのＮ，Ｎ−ジメチルバルビツール酸と２５８ｍｇ、０．２２４ｍｍｏｌのＰｄ（ＰＰｈ3）4を用いて、室温で一晩攪拌した。１６時間後、樹脂をジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、及びｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄した。
【０１０７】
Ｆｍｏｃ−Ｎ−脱保護：
樹脂をジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジン溶液４．５ｍｌで２回処理し、マイクロ波支援により７０℃に３分間加熱した。次に、樹脂をジメチルホルムアミドで洗浄（３回）した。
【０１０８】
Ｂ環形成
３．０ｍｌのジメチルホルムアミド中の脱保護した樹脂結合ペプチドを、ジメチルホルムアミド中のヒドロキシベンゾチアゾールの１ｍＭ溶液１．５ｍｌ、ジメチルホルムアミド中の（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェートの１ｍＭ溶液１．５ｍｌ、及び２５９μｌのジイソプロピルエチルアミンと反応させた。ガラス棒でホモジナイズ後、反応物をマイクロ波支援により７０℃に４．０分間加熱し、最後にジメチルホルムアミド（３回）とジクロロメタン（２回）で洗浄した。
【０１０９】
質量分光分析のために、ポリマーの約２０ｍｇのアリコートを、トリフルオロ酢酸／水／トリエチルシラン（８：２：１０、ｖ／ｖ／ｖ）で切断した。
【０１１０】
MS: 1174.08; [M-tBu+H]+; 1229.96; [M+H]+; [Gly-Ile-Gly-Cys(S-2-((o-NO2Ph)SO2Trp))]ring-Asn-Hyp-ビス(O-アセチル)ジヒドロキシ-Ile-OtBu.
【０１１１】
５．４．  ２−ＮＯ2−フェニルスルホニル−Ｎ−脱保護と樹脂切断、化合物Ｊ
樹脂Ｉを２−ＮＯ2−フェニルスルホニル−Ｎ−脱保護し、最後に樹脂から切断した。
【０１１２】
２−ＮＯ2−フェニルスルホニル−Ｎ−脱保護：
樹脂を、４ｍｌのジメチルホルムアミド中の５００μｌのメルカプトエタノールと５００μｌのジアザビシクロウンデセンで、２時間、繰り返し（３回）処理した。次に、樹脂を、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、アセトニトリル、及びｔ−ブチルメチルエーテルで激しく洗浄した。
【０１１３】
樹脂切断：
次に樹脂を、６ｍｌのトリフルオロ酢酸／水／トリエチルシラン（８：２：１０；ｖ／ｖ／ｖ）を用いて室温で一晩処理し、粗タンパク質を真空下で濃縮した。
【０１１４】
MS: 989.18; [M-tBu+H]+; [Gly-Ile-Gly-Cys(S-2-(Trp))]ring-Asn-Hyp-ビス(O-アセチル)ジヒドロキシ-Ile-OtBu.
【０１１５】
５．５  化合物Ｋの合成；Ａ環の形成
攪拌棒を有する反応フラスコ中で、粗生成物Ｊを２５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液に、２．５ｍｍｏｌのジイソプロピルエチルアミン８５μｌ及び２．５ｍｍｏｌのジフェニルホスファジド１３５μｌを加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌した。最後に溶液を真空下で濃縮し、０．５ｍｌのメタノールに溶解し、精製した。収率：４．９ｍｇ。
【０１１６】
粗反応混合物を分取カラムクロマトグラフィーにより精製した。
【０１１７】
MS: 858.94; [M+H]+.
【０１１８】
実施例６
化合物３*の合成
化合物３*は、実施例３．４と同様に、Ｎ−保護のために９−ブロモ−９−フェニルフルオレンの代わりにベンジルブロミドを使用して、化合物Ｃから合成することができる。
【０１１９】
実施例７
化合物６の別の合成
化合物６は化合物２*から、実施例４と同様に、中間化合物Ｄ*、Ｅ*、４*、Ｆ*、及び５*（それぞれ、対応する化合物Ｄ、Ｅ、４、Ｆ、及び５中のフェニルフルオレニル基の代わりに、窒素原子に第２のベンジル保護基を有する）を介して合成することができる。
【図１】
2018090610.tif 000054
【図２】
2018090610.tif 000055
【図３】
2018090610.tif 000056
【配列表】
2018090610000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月15日(2018.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ，δ−ジヒドロキシイソロイシン１の、又は化合物１のためのシントンの合成方法であって、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（ＬＨＭＤＳ）の存在下、化合物３又は３*をヨウ化メチルでメチル化するステップを含む、前記方法。
【化１】
2018090610.tif 000057
【請求項２】
反応が、エーテル中、約１２〜約２０時間、約−１０℃〜約−８０℃で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下のステップ：
（ａ）Ｌ−アスパラギン酸モノメチルエステルＡを２−メチルプロペンと反応させて化合物Ｂを製造すること；
【化２】
2018090610.tif 000058
（ｂ）Ｂをベンズアルデヒドと反応させて化合物Ｃを製造すること；
【化３】
2018090610.tif 000059
（ｃ）Ｃをフェニルフルオレニルブロミドと反応させて化合物３を製造するか、又はＣをベンジルブロミドと反応させて化合物３*を製造すること；
【化４】
2018090610.tif 000060
の１又は２以上をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
以下のステップ：
（ａ）化合物２又は化合物２*を還元して、それぞれ化合物Ｄ又はＤ*を製造すること；
【化５】
2018090610.tif 000061
（ｂ）ヒドロキシ化合物Ｄ又はＤ*を酸化して、それぞれ化合物Ｅ又はＥ*を製造すること；
【化６】
2018090610.tif 000062
（ｃ）Ｅ又はＥ*を転換して、それぞれ化合物４又は４*を製造すること；
【化７】
2018090610.tif 000063
（ｄ）４又は４*を転換して、それぞれ化合物Ｆ又はＦ*を製造すること；
【化８】
2018090610.tif 000064
（ｅ）Ｆ又はＦ*を転換して、それぞれ化合物５又は５*を製造すること；
【化９】
2018090610.tif 000065
及び、
（ｆ）５又は５*をＮ−脱保護して、化合物６を製造すること；
【化１０】
2018090610.tif 000066
の１又は２以上をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
化合物６を単離し、そして精製するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
構造６：
【化１１】
2018090610.tif 000067
で表される化合物。
【請求項７】
前記化合物が９０％超の純度を有する、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記化合物６が、７０：３０超のジアステレオマー純度を有する、請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
以下の構造：
【化１２】
2018090610.tif 000068
で表される化合物６と、１又は２以上の追加のアマトキシン合成用試薬又はその前駆体とを含むキット。
【請求項１０】
前記１又は２以上の追加の試薬が、以下のリスト：
(i) 樹脂；
(ii) 保護されたヒドロキシプロリン；
(iii) 保護されたアスパラギン；
(iv) 保護されたＣｙｓ−Ｔｒｐジペプチド；
(v) 保護されたグリシン；
(vi) 保護されたイソロイシン；
(vii) ペプチドカップリング試薬；及び
(viii) 三級アミン
から選択される、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
アマトキシン、又はその前駆体分子の合成方法であって、以下のステップ：
（ａ）以下の構造：
【化１３】
2018090610.tif 000069
で表される化合物６をヒドロキシルプロリンとカップリングすることを含む、前記方法。
【請求項１２】
残りのアミノ酸がその後、Ｎ末端合成手順によってカップリングされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
以下のステップ：
（ｂ）Ｆｍｏｃ−Ｎ−脱保護、及び、ＧとＦｍｏｃ−（Ｎ−Ｔｒｉ）Ａｓｎ ＯＨ、ＦｍｏｃＣｙｓ（Ｓ−２−（（ｏ−ＮＯ2Ｐｈ）ＳＯ2Ｔｒｐ−Ｏ−Ａｌｌｙｌ））］ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ｌｌｅ ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ ＯＨとのカップリングを反復して、化合物Ｈを製造すること：
【化１４】
2018090610.tif 000070
（ｃ）ＨのＯ−アリル−及びＦｍｏｃ−Ｎ−の脱保護を行い、その後環化して化合物Ｉを製造すること（Ｂ環の閉環）：
【化１５】
2018090610.tif 000071
（ｄ）２−ニトロアリールスルホンアミド−Ｎ−を脱保護し、そしてＩを樹脂から切り出して化合物Ｊを製造すること：
【化１６】
2018090610.tif 000072
（ｅ）Ｊを液体相で環化してアマニチン誘導体Ｋを製造すること：
【化１７】
2018090610.tif 000073
の１又は２以上をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アマトキシンが、アミノ酸３としてジヒドロキシイソロイシン部位を有するアマトキシンである、請求項１１に記載の方法。