(57)【要約】【課題】本発明は、種々の癌に対して高い効果を示すことが期待される癌抗原ペプチド提示細胞を利用した新規な癌ワクチンの製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、癌抗原ペプチドを提示する細胞を有効成分として含む癌ワクチンの製造方法であって、癌細胞から核酸を抽出する工程と、抗原提示能を有する細胞に前記核酸を導入して、癌抗原ペプチドを該細胞に発現及び提示させる工程と、含む方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌抗原ペプチドを提示する細胞を有効成分として含む癌ワクチンの製造方法であって、
癌細胞から核酸を抽出する工程と、
抗原提示能を有する細胞に前記核酸を導入して、癌抗原ペプチドを該細胞に発現及び提示させる工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記癌細胞は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに由来する、請求項１に記載の方法：
（ａ）手術又は生検で得られた腫瘍組織；
（ｂ）組織サンプル；及び
（ｃ）血中循環腫瘍細胞。
【請求項３】
前記核酸は、トータルDNAである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗原提示能を有する細胞に前記核酸を導入する工程は、リポフェクション法を使用する方法又はエレクトロポレーションにより行う、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗原提示能を有する細胞は、樹状細胞である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載の製造方法で製造された癌ワクチン。
【請求項７】
癌細胞を特異的に攻撃する細胞傷害性Ｔ細胞を有効成分とする癌ワクチンの製造方法であって、
癌細胞から核酸を抽出する工程と、
前記核酸を樹状細胞に導入して樹状細胞に癌抗原ペプチドを発現及び提示させる工程と、
前記癌抗原ペプチド提示樹状細胞とナイーブＴ細胞を共培養して細胞傷害性Ｔ細胞を得る工程と、
を含む方法。
【請求項８】
前記癌細胞は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに由来する、請求項７に記載の方法。
（ａ）手術又は生検で得られた腫瘍組織；
（ｂ）組織サンプル；及び
（ｃ）血中循環腫瘍細胞。
【請求項９】
前記核酸は、トータルDNAである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸を樹状細胞に導入する工程は、リポフェクチンを使用する方法又はエレクトロポレーションにより行う、請求項７から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項７から１０のいずれか１項に記載の製造方法で製造された癌ワクチン。
【請求項１２】
請求項１１に記載の癌ワクチンをヒトに投与する工程を含む癌免疫療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌抗原ペプチドを提示する細胞を有効成分として含む癌ワクチンの製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体に本来備わる免疫を増強して癌を排除しようとする種々の癌免疫療法が開発されており、中でも、樹状細胞を用いる方法が活発に検討されている。
【０００３】
樹状細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞の一つであり、未成熟型と成熟型とが存在する。未成熟樹状細胞は抗原の貪食能が高く、抹消組織で抗原を取り込むと、これをプロセシングしながら成熟型に分化する。そして、プロセシングされたアミノ酸９個前後のペプチドは、樹状細胞の小胞体で主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子と結合すると、成熟樹状細胞の表面に提示される。こうして抗原由来ペプチドを表面に提示した成熟樹状細胞はリンパ節に移動し、ナイーブＴ細胞とも呼ばれるＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化して細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）にする。このＣＴＬは、当該抗原を発現する細胞を特異的に認識して破壊する。
【０００４】
樹状細胞を利用した癌ワクチンは、このような樹状細胞の特徴を利用するものであり、その多くにおいて、癌抗原に由来するペプチドを用いて樹状細胞を活性化する。しかしながら、ＭＨＣクラスＩ分子と結合してＣＴＬを活性化させるペプチドの探索は、多数のペプチドを合成してスクリーニングを行う必要があり、容易ではない。また、癌ワクチンを繰り返し投与すると、癌細胞が学習し、癌ワクチンの標的となる癌抗原を発現しなくなることもある。このような場合、再度奏功する抗原由来ペプチドを見出すのは非常に難しい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、種々の癌に対して高い効果を示すことが期待される樹状細胞を利用した新規な癌ワクチンの製造方法等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、癌細胞から抽出した核酸を、抗原提示能を有する細胞に導入すると、該細胞内で癌細胞特異的なタンパク質である癌抗原が優先的に発現し、これがプロセシングされ、ＭＨＣクラスＩ分子と結合して細胞表面に提示されることを見出した。そして、かかる細胞を癌ワクチンとして投与すると、ＣＴＬを刺激して、癌細胞を特異的に破壊するＣＴＬが得られることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は
〔１〕癌抗原ペプチドを提示する細胞を有効成分として含む癌ワクチンの製造方法であって、
癌細胞から核酸を抽出する工程と、
抗原提示能を有する細胞に前記核酸を導入して、癌抗原ペプチドを該細胞に発現及び提示させる工程と、
を含む方法；
〔２〕前記癌細胞は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに由来する、上記〔１〕に記載の方法：
（ａ）手術又は生検で得られた腫瘍組織；
（ｂ）組織サンプル；及び
（ｃ）血中循環腫瘍細胞；
〔３〕前記核酸は、トータルDNAである、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法；
〔４〕前記抗原提示能を有する細胞に前記核酸を導入する工程は、リポフェクション法を使用する方法又はエレクトロポレーションにより行う、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載の方法；
〔５〕前記抗原提示能を有する細胞は、樹状細胞である、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の方法；
〔６〕上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載の製造方法で製造された癌ワクチン；
〔７〕癌細胞を特異的に攻撃する細胞傷害性Ｔ細胞を有効成分とする癌ワクチンの製造方法であって、
癌細胞から核酸を抽出する工程と、
前記核酸を樹状細胞に導入して樹状細胞に癌抗原ペプチドを発現及び提示させる工程と、
前記癌抗原ペプチド提示樹状細胞とナイーブＴ細胞を共培養して細胞傷害性Ｔ細胞を得る工程と、
を含む方法；
〔８〕前記癌細胞は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに由来する、上記〔７〕に記載の方法。
（ａ）手術又は生検で得られた腫瘍組織；
（ｂ）組織サンプル；及び
（ｃ）血中循環腫瘍細胞；
〔９〕前記核酸は、トータルDNAである、上記〔７〕又は〔８〕に記載の方法；
〔１０〕前記核酸を樹状細胞に導入する工程は、リポフェクチンを使用する方法又はエレクトロポレーションにより行う、上記〔７〕から〔９〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１１〕上記〔７〕から〔１０〕のいずれか１項に記載の製造方法で製造された癌ワクチン；及び
〔１２〕上記〔１１〕に記載の癌ワクチンをヒトに投与する工程を含む癌免疫療法
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係る方法では、癌細胞が発現する癌抗原やＨＬＡクラスＩ分子に結合する癌抗原ペプチドを同定することなく、癌抗原ペプチドを提示した細胞を得ることができる。したがって、本発明に係る方法によれば、癌細胞を攻撃するＣＴＬを誘導できる細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで効率よく産生することができ、かかる細胞やＣＴＬを有効成分とする癌ワクチンを得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明に係る癌ワクチンの製造方法の一態様は、癌抗原ペプチドを提示する細胞を有効成分として含む癌ワクチンの製造方法であって、癌細胞から核酸を抽出する工程と、抗原提示能を有する細胞（以下「抗原提示細胞」という。）に前記核酸を導入して、癌抗原ペプチドを抗原提示細胞に発現及び提示させる工程と、を含む。
【００１０】
本明細書において「癌ワクチン」は、癌抗原に対する免疫を利用して癌の治療又は予防に用いられる医薬を意味する。本明細書において「癌抗原」は、癌細胞に特異的に発現し、正常細胞には発現しないタンパク質をいうが、正常細胞に多少の発現が見られるタンパク質であっても、癌細胞における発現が優勢で、当該タンパク質を標的とした癌免疫療法が可能である限り癌抗原に当たるものとする。本明細書において「癌抗原ペプチド」は、癌抗原タンパク質の一部のアミノ酸配列からなるペプチドを意味する。
【００１１】
本明細書において癌の予防又は治療とは、癌の発生の阻害（遅延又は停止）、腫瘍サイズの低下（遅延又は停止）、腫瘍の転移の阻害（遅延又は停止）、腫瘍増殖の阻害（遅延又は停止）、及びがんと関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも１つを生じさせることをいう。
【００１２】
本発明に係る癌ワクチンの投与対象は、ヒトを含む哺乳動物とすることができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ヒツジ、ウマ、ウシ等とすることができるがこれらに限定されない。投与対象は典型的にはヒトである。
【００１３】
本明細書において、「抗原提示能を有する細胞」は、癌細胞から抽出された核酸を導入すると、癌抗原ペプチドを発現させ、これを細胞表面に提示させることができる細胞であれば特に限定されないが、例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞が挙げられる。典型的には樹状細胞である。
【００１４】
本明細書において「癌抗原ペプチドを提示する細胞」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、癌抗原ペプチドとＭＨＣクラスＩ分子との複合体を表面に提示させた細胞を意味する。上述のとおり、細胞内に存在する癌抗原は、プロセシングを受けて断片化され、癌抗原ペプチドとなる。癌抗原ペプチドは抗原提示細胞の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子と結合すると細胞表面に提示される。ヒトのＭＨＣはヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる。
【００１５】
また、癌抗原ペプチドを提示する樹状細胞を含む癌ワクチンを対象に投与すると、ＭＨＣクラスＩ分子と癌抗原ペプチドの複合体を認識したナイーブＴ細胞が活性化されて細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）となり、同じ癌抗原を発現している細胞を破壊するようになる。
本明細書において「ナイーブＴ細胞」とは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞であって、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子と抗原ペプチドとの複合体による刺激を受ける前の、細胞傷害活性を有しないＴ細胞をいう。
【００１６】
本発明に係る癌ワクチンの製造方法の一態様では、まず、癌細胞から核酸を抽出する工程を行う。癌細胞は、癌ワクチンを投与する対象となる癌細胞としてもよいが、別の癌に由来する細胞であってもよい。また、癌ワクチンの投与対象個体から得た癌細胞であっても、別の個体から得た癌細胞であってもよい。例えば、投与対象個体から得た癌細胞を用いることも好ましく、その場合、当該個体の癌細胞は、癌ワクチンに含まれる樹状細胞に提示され且つＣＴＬが認識する癌抗原を発現している可能性が高いので、ＣＴＬによる細胞傷害効果が期待される。
【００１７】
本発明に用いられる癌細胞の具体例としては、頭頸部癌、肺癌、食道癌、乳癌、胃癌、肝臓癌、腎臓癌、大腸癌、胆道癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、皮膚癌、脳腫瘍、骨肉腫、又は甲状腺癌の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１８】
本発明に用いられる癌細胞は、核酸を抽出できる限り、生きた細胞であっても死んだ細胞であってもよく、例えば、手術や針生検（バイオプシー）で得られた組織の癌細胞や、組織サンプルを用いることができる。組織サンプルは、切片状の組織切片であってもよく、組織をパラフィン等の包埋剤に埋めた組織ブロックであってもよい。染色や、ホルマリン固定などの処理をされた組織サンプルを用いることもできる。
また、癌細胞として、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を用いてもよい。ＣＴＣは、血液から得ることができるので、患者の負担が小さい。
【００１９】
本明細書において「核酸」は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。抽出する核酸は、例えば、トータルＤＮＡ又はトータルＲＮＡとすることができる。例えば、トータルｍＲＮＡを抽出し、これからトータルｃＤＮＡを得て、抗原提示細胞に導入してもよい。
【００２０】
核酸の抽出は、公知の方法又はそれに準ずる方法にしたがって当業者が適宜行うことができる。
例えばＤＮＡの場合、細かく刻んだ臓器・組織や培養細胞をＴＮＥ緩衝液（例えば、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ）で懸濁し、ＳＤＳを加え、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫでタンパク質を分解した後、フェノールを加えて消化しきれなかったタンパク質とＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを変性させて除く方法が挙げられる。さらにＤＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＲＮａｓｅを加えてＲＮＡを分解し、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを加えてこのＲＮａｓｅを除くことにより、ＤＮＡのみを得ることができる。
ＲＮＡを抽出する場合、グアニジン・酸性フェノール法（Chomczynski, P. and Sacchi, N.:Anal. Biochm., 162:156-159,1987）を用いることができる。
ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれの抽出においても、市販のキットを用いてもよい。例えば、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）や、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）を用い、使用説明書に従って、それぞれトータルＤＮＡ及びトータルＲＮＡを精製することが可能である。
【００２１】
本発明に係る癌ワクチンの製造方法の一態様では、次に、癌細胞から抽出した核酸を樹状細胞に導入して癌抗原ペプチドを樹状細胞に提示させる工程を行う。
本発明に用いる樹状細胞は、未成熟樹状細胞であっても成熟樹状細胞であってもよく、公知の方法で調製することができる。例えば、成熟樹状細胞は、末梢血から比重遠心法により分離することができる。
【００２２】
また、本発明に用いる樹状細胞は、より未分化な細胞から分化誘導して得てもよい。樹状細胞は、末梢血や骨髄に由来するＣＤ１４陽性単球又はＣＤ３４陽性細胞、皮膚ランゲルハンス細胞などから誘導することができる。これらの細胞から樹状細胞への分化は公知の方法に従って行うことができ、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ４、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ、ＩＬ１５等を培地に加えて分化誘導する方法が知られており、中でもＧＭ−ＣＳＦとＩＬ４を加えて末梢血単球から樹状細胞を誘導する方法が広く用いられている。また、樹状細胞は公知の方法にしたがって増殖させることができ、例えば、Ｆｌｔ３Ｌ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ３等を適宜培地に加えて培養する方法が知られている。
【００２３】
核酸を樹状細胞に導入する方法は、特に限定されず公知の方法を用いることができるが、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸−カルシウム法が挙げられる。リポフェクション法は、リン脂質などから作られたリポソームとＤＮＡの複合体を細胞に取り込ませる方法であり、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）など市販の試薬を用いて行うことができる。
【００２４】
樹状細胞に核酸を導入させた後、樹状細胞を培養して核酸から癌抗原を発現させる。この工程は、公知の方法又はそれに準ずる方法によって当業者が適宜行うことができる。
【００２５】
癌細胞から抽出した核酸を樹状細胞で発現させると、癌抗原が優先的に発現し、発現された癌抗原が樹状細胞によるプロセシングを受け、その結果生じた癌抗原ペプチドが樹状細胞のＭＨＣクラスＩ分子と結合して、樹状細胞表面に提示される。
したがって、本発明の方法によれば、癌抗原を同定することなく、癌抗原ペプチドを樹状細胞表面に効率よく提示させることができる。
【００２６】
核酸を導入する工程から、樹状細胞表面に癌抗原ペプチドが提示される工程の全部又は一部において、ＣＴＬ誘導能を高めるために樹状細胞の成熟化を行ってもよい。樹状細胞の成熟化は、公知の方法にしたがって行うことができ、例えば、微生物成分（ＯＫ４３２、ＢＣＧ−ＣＷＳ等）や合成化合物（ＣｐＧ−ＤＮＡ、ｐｏｌｙＩＣ誘導体、Ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ、抗ＣＤ４０）を培地に加えて培養することによって行うことができる。
また、樹状細胞の培地にサイトカインを加えて成熟化させる方法も知られており、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ、ＩＬ１、ＩＬ６、ＩＬ１５、ＰＧＥ２、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ等を培地に加える方法が挙げられる。
【００２７】
上述の方法で得られた癌抗原ペプチドを表面に提示した樹状細胞は、皮内への注射投与、静脈注射、腫瘍内への注射投与、リンパ節内への注射投与により、対象に投与することができる。投与量や投与間隔は、投与対象の年齢、性別、体重、重篤度等によって当業者が適宜決定することができるが、例えば、１〜４週間間隔で、１×１０6〜１×１０8個、又は１×１０4〜１×１０6個の樹状細胞を投与してもよい。この際、微生物成分（ＯＫ４３２、ＢＣＧ−ＣＷＳ等）や合成化合物（ＣｐＧ−ＤＮＡ、ｐｏｌｙＩＣ誘導体、Ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ、抗ＣＤ４０）をアジュバントとして同時に投与してもよく、樹状細胞を成熟・活性化させるサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ、ＩＬ１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＰＧＥ２、ＣＤ４０Ｌ等）を同時に投与してもよい。
【００２８】
本発明は、上述の方法で得られた癌抗原ペプチドを提示する樹状細胞を有効成分として含む癌ワクチンも包含する。かかる癌ワクチンは、癌細胞由来の核酸を発現させることによって得た癌抗原ペプチドを提示する樹状細胞を含むので、かかる癌抗原を発現する癌細胞を特異的に攻撃するＣＴＬを誘導する。
【００２９】
本発明に係る癌ワクチンの製造方法の別の一態様は、上述の方法で癌抗原ペプチドを提示する樹状細胞を得た後、この樹状細胞とナイーブＴ細胞を共培養することで、ナイーブＴ細胞を細胞傷害性Ｔ細胞へと活性化する工程を含む。
【００３０】
このように、ナイーブＴ細胞と、癌抗原ペプチドを提示する樹状細胞とを共培養することにより、ナイーブＴ細胞は、その癌抗原を発現する癌細胞を特異的に攻撃するＣＴＬとなる。ＣＴＬは、パーフォリン、グランザイム、ＴＮＦ等を放出したり、標的細胞のＦａｓを刺激してアポトーシスを誘導するなどして、標的細胞を破壊する。
【００３１】
本発明は、かかる方法で得られたＣＴＬを有効成分として含むがんワクチンも包含する。がんワクチンには、癌抗原ペプチドを提示する樹状細胞とＣＴＬの双方が含まれていてもよい。また、抗腫瘍免疫を活性化する他の物質を含んでいてもよい。
【００３２】
本発明は、上述した本発明に係る癌ワクチンを対象に投与することを含む癌の予防又は治療方法も包含する。本発明に係る癌の予防又は治療方法は、他の治療方法（例えば、各種の抗がん剤の投与、放射線照射、外科的治療）と組合せてもよい。
【００３３】
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
【００３５】
１．癌抗原情報の採取
１−１．腫瘍組織を原材料とする場合
（腫瘍組織の前処理）
腫瘍組織（手術切除腫瘍組織又は生検の検体）の大きさにあわせて、遠沈管のサイズ（50ml又は15ml）を決定し、培地を用意する。抗原用培地（50ml遠沈管の場合は45ml、15ml遠沈管の場合は14ml）は、DMEM培地に抗生物質としてペニシリン 200U/ml, ストレプトマイシン 200ug/ml、ゲンタマイシン 250ug/ml、アンフォテリシンB 100ug/mlの濃度で添加したものを用い、4℃で保存し、腫瘍組織を加える。
腫瘍組織をシャーレに移し、ハサミとピンセットを用いて腫瘍部分以外を除く。次に、新しいシャーレに移し、メスを用いて腫瘍を分割する。分割部分に壊死部があれば、それをメスないしハサミにより取り除く。新しいシャーレに分割された腫瘍部分のみを移す。DNA抽出用の腫瘍部（1cm3 程度）を選定する。
凍結保存する場合、腫瘍は、5mm大にメスで細切し、凍結用培地バンバンカーに再浮遊させる。1mlずつクライオチューブに移し、-80℃で保存する。
凍結保存した場合は、トータルDNA抽出工程に先立って、組織を37℃で溶解し、15mlチューブで10ml PBS-Bufferに細胞を浮遊させて、細胞凍結保存液（DMSO）を除去するためにPBS洗浄を行う。1200rpm（300xg）で5分間遠心後、洗浄上清を吸引する。細胞沈渣に、新しいPBS-Bufferを1.0ml加えて、撹拌懸濁し、1.5ｍlエッペンチューブに移して混和する。
凍結せずに培養する場合も同様に細切し、抗原用培地で3回洗浄する。培養用培地（10%牛胎児血清含有RPMI1640培地）に再浮遊し、6ウェルプレートに接種する。37℃、5% CO2培養装置に移して培養開始する。増殖の程度に合わせて培地交換を行い、培養を維持する。
【００３６】
（DNA抽出・精製）
細切した腫瘍組織をグアニジン−HCLで破壊し溶解し、DNeasy Blood & Tissue（QIAGEN）を用い、使用説明書に従って、トータルDNAを抽出する。簡単に説明すると、細胞溶解液にATL-Bufferを加えた後（ATLは、PBSの1/10量が目安）、混和し、熱処理として55℃20分間反応させる（時々混和してできるだけ溶解させる）。DNAに結合しているタンパク質を消化するために、10μl Proteinase-Kを加えて混和した後、55℃ヒートブロックにて60分間酵素反応させる。Proteinase-K消化で細胞が完全タンパク溶解したこと（白濁色から透明に変化）を確認する。
続いて、フェノールによりタンパク質を除いてDNAを精製する。当量のフェノールを添加した後、激しく転倒混和し、5000rpm（1650xg）で2分間遠心した後、新しい1.5mlエッペンチューブに上層部を回収する。精製が不十分な場合Proteinase-Kを加えて70℃で30分間加温からやり直し、チューブに当量のフェノールを再度添加した後、激しく転倒混和して、5000rpm（1650xg）で2分間遠心した後、新しい1.5mlエッペンチューブに上層部を回収する。回収したSampleの2倍量の100％アルコールを加えた後、激しく混和する。‐20℃冷凍庫内で静置し、DNAを析出させる。4℃で、14000rpmで5分間遠心した後、上清を吸引し、TE-Buffer200〜500μlにて抽出精製DNAを溶解した後、混和する。スピンダウンした後、GENESYS 10S UV-Visを用いてDNA濃度を測定する。
【００３７】
１−２．ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織サンプルを原材料とする場合
（組織サンプルの前処理）
FFPE組織切片からトータルDNAを抽出する場合は、まず、FFPE組織サンプルからゲノムDNAを抽出し、精製せずにHot start PCR法で増幅し、これをトータルDNAとして用いる。
FFPE組織サンプルは、少なくとも直径1cmの腫瘍組織を含んでいることが望ましく、適切な厚みは10〜40μmであり、この範囲で薄いほど好ましい。
FFPE組織サンプル10mg〜20mgをオペ用メスで削り取り、片刃フェザーで出来るだけ細かく裁断する。組織片が細かいほど抽出効率は良くなる。細かく裁断した組織を1.5mlエッペンTube1本に回収する。
【００３８】
（細胞破砕・脱パラフィン操作、及びProteinase-K処理）
QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN)、QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN)、及びREPLI-g（登録商標）Mini/Midi Kit(QIAGEN)を用いる。
REPLI-g（登録商標）Mini/Midi Kit操作手順書に従い、1X FFPE Lysis Solution（1検体分 100μl）の調製する。1.5ｍlエッペンTubeにNuclease-Free  Water90μlを取り、FFPE-Lysis Soiution（10X）10μlを添加して調整し、混和後スピンダウンする。組織サンプルに1X FFPE Lysis Solution 100μlを添加し、10秒間混和後、95℃で10〜30分間反応させ、時々Voltexしながら、パラフィンを完全溶解する（脱パラフィン処理）。
続いて、フェノール抽出法を用いる。具体的には、キシレンを1.0ml添加しVoltexで10秒間混和した後、室温にて10分間インキュベート（時々Voltex）する。8000rpm（5300xg）で2分間、室温で遠心した後、上清（キシレン）を吸引する。キシレン添加からキシレン吸引までの操作を繰り返す。
エタノール（96〜100％）を1.0ml添加し、10秒間混和した後、室温にて10分間反応させる（時々Voltex）。8000rpm（5300xg）で2分間、室温で遠心した後、上清（エタノール）を吸引する。エタノール添加からエタノール吸引までの操作を繰り返す。
エッペンTubeの蓋を開け、ヒートブロック（70℃）にて10分間乾燥（時々Voltex）させる。アルコールが残っているとPro-K活性が弱くなるため、アルコールが揮発したかどうか臭気で確認し、完全乾燥させる。
L Buffer-ATLを180μl加えてVoltexで混和後、ヒートブロック（70℃）にて10分間インキュベートする。ペレットの量が多いために溶解できなかった場合、更にBuffer-ATLを180μl添加しVoltexで混和後、ヒートブロック（70℃）にて60分間反応させる（時々Voltexにて混和する）。Proteinase-Kを40μl添加した後、ヒートブロック（70℃）し、30分間反応させる。等量のフェノール液を添加した後、激しく振って混和する。2000rpm（300xg）で5分間または5000rpm（1650xg）で2分間、室温で遠心する。
新しい1.5mlエッペンチューブに遠心上清を採取して、そこに等量のフェノールを再度添加する。2000rpm（300xg）5分間または5000rpm（1650xg）2分間、室温で遠心する。
新しい1.5mlエッペンチューブに遠心上清を採取して、そこに2倍量のエタノール（96〜100％）を添加し、激しく混和する。コアグレーション（−20℃冷凍庫で20分間または一晩静置）を行う。14000rpm（16000xg）10分間、4℃で遠心する。上清を吸引しdH2Oを30μl添加しVoltexで混和した後、スピンダウンする。こうして得たサンプル10μlをPCRのテンプレートとする。
【００３９】
（ライゲーション操作−FFPE組織サンプルが小さい場合）
FFPE組織サンプルが比較的小さく、DNAを十分量抽出できない場合、ライゲーション操作により、短鎖DNAを長鎖DNAに形成する。なお、FFPE組織サンプルが、パラフィンブロックにように比較的大きく、フェノール抽出によって十分量のDNAが得られる場合には、ライゲーション操作を行わずに、次にHot start PCR工程に進む。
以下、ライゲーション操作の工程を説明する。
REPLI-g（登録商標）Mini/Midi Kit操作手順書に従い、0.5ml PCR-TubeにFFPEマスターミックス（全量10μl）を氷上で調製する。上記Proteinase処理で得られたサンプルにFFPEマスターミックス10μlを添加してVoltexで混和した後、スピンダウンする。室温で30分間Incubationする。この段階で組織断片から調整された断片化されたサンプルトータルDNAはランダムにライゲートされ、長鎖トータルDNAを形成する。サンプルトータルDNAを10秒間Voltexで混和した後、スピンダウンして95℃で5分間反応させる（ライゲーション反応の停止）する。氷上で4℃まで冷却する。これを次のHot start PCT工程に供する。
【００４０】
（Hot start PCRを用いた増幅操作）
Ramdom-primerを用いたDNA増幅は、TaKaRa Ex Taq Hot Start Version Kitを使用して行った。
−20℃で保存している増幅DNA-sampleを解凍する。
TaKaRa Ex Taq Hot Start Version Kit.操作手順書に従い、Reaction Mixtureを氷上で調製し、増幅DNA-sampleを加え、サーmら鵜サイクラ―でインキュベーションする。
増幅条件は、以下を40サイクルとした。
98.0℃ 10 sec
55.0℃ 30 sec
72.0℃ 60 sec
サーマルサイクラーを停止し、トータルDNA濃度測定操作まで4℃冷蔵庫で保存する。トータルDNA濃度測定は、GENESYS 10S UV-Vis（分光光度計）を用いて常法に従って行った。
【００４１】
１−３．血中循環腫瘍細胞（CTC）を原材料とする場合
（試料）
患者からより末梢血8ml×2を採取する。
（試薬・器具）
細胞分離装置、細胞分離カラム、CD326(EpCAM)抗体結合ビーズを用意する。
AIMV培地6mlを含む15ml遠沈管1本と、同培地10mlを含む15ml遠沈管1本を用意する。
培養用培地として10%牛胎児血清含有RPMI1640培地を用意し、凍結用培地としてバンバンカーを用意する。
【００４２】
（患者血液からのPBMC分離）
血液検体入り採血管のバランスを確認した後、3000rpm（1800×g）で15分間、室温で遠心する。10mlピペットを用いて中間層（末梢血単核球層）を採取し、洗浄用PBSの入った50mlチューブ2本に集める。1500rpm（500×g）5分間遠心後、さらにAIMV培地で１回洗浄する。上清を完全に除いて細胞を浮遊させたものを患者PBMCとしてCTC分離に用いる。
【００４３】
（患者PBMCからのCTC分離）
細胞分離装置にセットしたCTC分離用抗体結合ビーズを100μl充填し、AIMV培地500μlを3回カラムに流してビーズを洗浄し、洗浄後、カラムよりビーズをAIMV培地500μlで15ml遠沈管に押し出す。
続いて、このCTC分離用抗体結合ビーズと患者PBMCを混合してよく撹拌し、4℃で30分、回転させながら反応させる。反応終了後、AIMV培地10mlを加えてよく撹拌し、遠心してから、AIMV培地500ulに戻す。
ビーズと結合させた細胞浮遊液を細胞分離装置にセットしたカラムに移す。AIMV培地500ulを4回カラムに流してビーズに結合していない細胞を除く。
カラムを細胞分離装置より外し、培養用10％FCS-RPMI1640培地1mlでビーズに結合した細胞を15ml遠沈管に押し出し、24ウェルプレートに移して培養を開始する。
【００４４】
「１−１．腫瘍組織を原材料とする場合」の（DNA抽出・精製）と同様にDNAを抽出し精製する。
【００４５】
２．抗原提示細胞への核酸の導入
次に、上記１．で精製した核酸を、抗原提示細胞に導入する。この工程には、Neon（登録商標） Transfection System（Lifetechnologies MPK5000）及びNeon（登録商標） Transfection System 10μL Kit（Lifetechnologies MPK1025）を用いたエレクトロポレーション法で行うことができる。
使用説明書に従って、エレクトロポレーションの条件を決定した。本実験では、ルシフェラーゼDNAを樹状細胞に導入した。
【００４６】
結果を下表に示す。
【表１】
2018090491.tif 000002
R-bufferを用いて1300Vで行うと16〜18％の導入効率を示す結果が得られた。さらに、R-bufferを用いて、パルスの電圧と時間を変動させた結果を下表に示す。
【表２】
2018090491.tif 000003
R-bufferを用いて、1300V、30msのパルス1回で、ヒト樹状細胞に平均14％の導入効率が得られることを確認した。
【００４７】
３．CTLの活性化
核酸導入樹状細胞によりナイーブT細胞がCTL細胞に活性化される能力を51Crリリースアッセイで測定した。
具体的には患者の腫瘍細胞由来の核酸を導入した樹状細胞と患者由来のT細胞とを1:10の割合で4〜10日培養する。同一患者の腫瘍細胞を51Crで標識し、この腫瘍細胞を51Crリリースアッセイのターゲット細胞とし、核酸導入樹状細胞により活性化した同一患者のT細胞をエフェクター細胞として細胞傷害活性を測定した。即ち、ターゲット細胞（2×104細胞/ウェル）を、51クロミウム（NEN-DuPont）と37℃で90分間培養した後、繰り返し洗浄した。エフェクター細胞とターゲット細胞を30：1又は10：1の割合で5-h共培養した後、51Crの放出を定量した。同一条件での実験系を三個ずつ用意して実験結果の平均から、細胞傷害の割合を以下のように計算した。
％細胞毒性＝［（サンプルカウント×自然放出カウント）/（最大カウント×自然放出カウント）］×100
コントロールとしては、核酸を導入していない樹状細胞と共培養したT細胞が用いられる。