(57)【要約】【課題】ヒトに適用しても安全で安定して生産することが可能な化粧品や各種の医薬用組成物、およびそれらの製造方法を提供する。【解決手段】ウマ由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する化粧品や各種医薬用組成物である。これらの製造方法は、競走馬または競技馬から細胞を採取する採取工程；採取された前記細胞から間葉系幹細胞を選別する選別工程；メタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッドおよびメルカプトエタノールをいずれも含有しない無血清培地を用いて前記間葉系幹細胞を培養する培養工程；および前記培養工程で生成された培養上清を前記無血清培地および前記間葉系幹細胞から分離して回収する回収工程；を含む。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウマ由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する化粧品。
【請求項２】
前記間葉系幹細胞が、競走馬または競技馬から採取された幹細胞または前記幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞である請求項１に記載の化粧品。
【請求項３】
メタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッドおよびメルカプトエタノールをいずれも含有しないことを特徴とする請求項１または２に記載の化粧品。
【請求項４】
ウマ由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する抗アレルギー治療用組成物。
【請求項５】
ウマ由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する発毛または育毛用組成物。
【請求項６】
ウマ由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する抗炎症治療用組成物。
【請求項７】
ウマ由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する皮膚代謝促進用組成物。
【請求項８】
競走馬または競技馬から細胞を採取する採取工程；
採取された前記細胞から間葉系幹細胞を選別する選別工程；
メタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッドおよびメルカプトエタノールをいずれも含有しない無血清培地を用いて前記間葉系幹細胞を培養する培養工程；および
前記培養工程で生成された培養上清を前記無血清培地および前記間葉系幹細胞から分離して回収する回収工程；
を含む、化粧品または医薬用組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧品、各種の医薬用組成物、およびそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肌のシワの解消や予防、または肌のツヤや滑らかさの改善などに有効な各種の化粧品がこれまで提案されている。これらの化粧品の有効成分は、大別すると植物由来のものと動物由来のものとがある。動物由来の有効成分としては、プラセンタやコラーゲンなど動物から直接採取されたエキスのほか、動物細胞の培養上清を用いるものが知られている。
【０００３】
特許文献１には、ブタ脱落乳歯の歯髄、ブタ骨髄またはブタ脂肪組織から採取された幹細胞の培養上清を凍結乾燥して化粧品を得ることが記載されている。この化粧品は、シワ取り、美白、発毛、育毛等の効果を有するとされている。また、特許文献２には、ヒトの脱落乳歯の歯髄幹細胞の培養上清を薬効成分とする損傷部の治療用組成物が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１１８８７７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１１／１１８７９５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
培養上清は細胞を培地で培養することにより上澄みとして生成される。特に間葉系幹細胞を培養する際に生成される培養上清には様々な成長因子やサイトカインが含まれるため、各種の美容効果や薬効が期待される。
【０００６】
ヒトに適用することを目的とする化粧品や各種の医薬用組成物を得るにあたっては、安全性および幹細胞の培養速度という２つの観点が求められる。安全性については更に、劇物や毒物などヒトへの投与を避けるべき成分を含有しないという観点と、伝染病や疫病のリスクが無いという観点の両面が考えられる。また、培養される幹細胞の数量と培養上清の液量は略比例するため、商業的に安定して培養上清を生産するには幹細胞の培養速度が重要な観点となる。幹細胞の培養速度を高めるためには、提供動物の生体から多くの幹細胞（初代幹細胞）が採取できること、そして採取された幹細胞を初代培養および継代培養するにあたって各世代での細胞分裂が早いことが重要となる。
【０００７】
しかしながら、特許文献１のようにブタを提供動物とする場合、その飼育環境の問題から伝染病や疫病を排除することが難しい。また、ブタの脱落乳歯の歯髄や骨髄に関しては特に、存在する幹細胞が僅かであるため初代幹細胞を多量に採取することが難しい。また、特許文献２のようにヒトの脱落乳歯の歯髄幹細胞を用いる場合も同様に、十分な初代幹細胞を採取することが難しい。さらに本発明者の検討によれば、歯髄や骨髄由来の幹細胞は培養しても増殖が進みにくいため、継代培養しても多量の幹細胞を得ることができない。このため、特許文献１や特許文献２の方法では安全な培養上清を安定して生産することが困難である。
【０００８】
本発明は上述のような課題に鑑みてなされたものであり、ヒトに適用しても安全で安定して生産することが可能な化粧品や各種の医薬用組成物、およびそれらの製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、ウマ由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する化粧品が提供される。
また本発明によれば、ウマ由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する抗アレルギー治療用組成物、発毛または育毛用組成物、抗炎症治療用組成物および皮膚代謝促進用組成物が提供される。
【００１０】
また本発明によれば、競走馬または競技馬から細胞を採取する採取工程；採取された前記細胞から間葉系幹細胞を選別する選別工程；メタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッドおよびメルカプトエタノールをいずれも含有しない無血清培地を用いて前記間葉系幹細胞を培養する培養工程；および前記培養工程で生成された培養上清を前記無血清培地および前記間葉系幹細胞から分離して回収する回収工程；を含む、化粧品または医薬用組成物の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の化粧品、各種医薬用組成物およびそれらの製造方法によれば、ヒトに適用しても安全で安定して生産することが可能な化粧品や各種の医薬用組成物が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】（ａ）および（ｂ）は細菌感染したイヌの皮膚に実施例組成物を適用する前後の状態を示す患部写真である（実施例１）。
【図２】（ａ）および（ｂ）は頭髪に実施例組成物を適用する前後の状態を示す患部写真である（実施例２）。
【図３】抜け毛本数の経時推移を示すグラフである（実施例３）。
【図４】（ａ）から（ｄ）は睫毛および目周りに実施例組成物を適用する前後の状態を示す写真である（実施例４）。
【図５】（ａ）および（ｂ）は術後痕に実施例組成物を適用する前後の状態を示す患部写真である（実施例５）。
【図６】（ａ）から（ｃ）はウオノメに実施例組成物を適用する前後の状態を示す写真である（実施例６）。
【図７】（ａ）から（ｄ）はアトピー性皮膚炎に実施例組成物を適用する前後の状態を示す写真である（実施例７）。
【図８】アトピー性皮膚炎の改善効果を示すグラフである。
【図９】（ａ）から（ｃ）は脂漏性湿疹に実施例組成物を適用する前後の状態を示す写真である（実施例８）。
【図１０】花粉症の改善効果を示すグラフである（実施例９）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１４】
本発明の化粧品および医薬用組成物は、ウマ由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する。医薬用組成物としては、抗アレルギー治療用組成物、発毛または育毛用組成物、抗炎症治療用組成物ならびに皮膚代謝促進用組成物を挙げることができる。これらの組成物の薬効については後述する実施例を用いて詳細に説明する。
【００１５】
本実施形態に用いられる培養上清は液状であり、間葉系幹細胞を培養した後の培養液である。培養上清には多数の成長因子が含まれており、抗酸化作用、創傷治癒効果、シワの改善または防止効果、毛髪再生効果などが発揮される。
【００１６】
本実施形態の化粧品および医薬用組成物はヒトに適用することが可能であるが、ヒトに限らず、犬や猫等の愛玩動物や、牛や馬などの家畜など、非ヒト哺乳類に広く適用してもよい。ヒトに適用する場合の例としては、スキンケア、頭髪改善、各種炎症の抑制、外傷の治癒など各種の用途に用いることができ、具体的には後述する。また、非ヒト哺乳類に適用する場合も、愛玩動物や家畜の、体表の外傷や湿疹の治癒、体毛の再生、口腔内顎腫症などの腫瘍の治療、など各種の用途に用いることができる。
【００１７】
本実施形態の培養上清を得るための間葉系幹細胞は、ウマから採取された幹細胞または当該幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞である。幹細胞は、自己複製能および多分化能を有し、その分化能から、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞などが知られる。本実施形態ではこのうち、中胚葉性組織（間葉）に由来する体性幹細胞である間葉系幹細胞が用いられる。間葉系幹細胞は、皮膚、骨、血管、筋または腱等の生体内の多くの組織の再構築に関与する。間葉系幹細胞は、ウマのいずれの組織から採取されたものであるかは特に限定されない。たとえば、脂肪由来の幹細胞（脂肪幹細胞）のほか、臍帯、臍帯血または胎盤（以下、臍帯等ともいう）由来の幹細胞（臍帯幹細胞）を挙げることができる。これらの幹細胞は、ウマを生かしたまま採取可能な幹細胞である。また、脂肪由来幹細胞は骨髄由来幹細胞に比べて、多量の幹細胞を比較的容易に採取することができ、大量培養に優れ、様々な細胞に分化する多分化能に優れ、さらに臓器幹細胞に分化する割合が高い点で好ましい。
【００１８】
本実施形態に用いられる培養上清を得るための間葉系幹細胞の初代幹細胞はウマから採取される。ウマはウマ科の動物の総称であり、狭義のウマ（馬）、シマウマおよびロバを含む。このうち、特に好ましいのは競走馬および競技馬である。
【００１９】
競走馬は、競走馬として登録された馬だけでなく、競走馬として登録可能な育成中の馬も含む。競走馬は馬名登録義務があり、たとえば日本では、所定の団体（平成２８年現在、公益財団法人ジャパン・スタッドブック・インターナショナル）による馬名審査を通過した名前が正式な馬名として登録される。また、競技馬とは、競技を行うために大会に出場することが可能な馬を指す。競技としては、乗馬競技、馬術競技、牛追い、ロデオ、ポロ、ホルター等を例示することができる。競技馬には、血統を有し、血統情報を付して登録されている競技馬、および血統情報を有さずに登録された競技馬を含む。
【００２０】
特に本実施形態の培養上清を得るための間葉系幹細胞としては、血統情報を有する競走馬または競技馬から採取された幹細胞、またはかかる幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞が好ましい。血統情報を有する競走馬または競技馬を間葉系幹細胞の提供動物とすることで、予防接種が継続的に実施されるなど常に体調管理がなされ、また薬剤の投与履歴や傷病履歴を複数世代（競走馬の場合は少なくとも５世代）に亘って把握することが可能であるため培養上清の安全性が確保できる。更に、血統情報を有する現役の競走馬または競技馬を提供動物とすることが好ましい。現役の競走馬または競技馬であることで、薬剤の投与履歴や傷病履歴がより確実に保証される。
【００２１】
本実施形態の化粧品または医薬用組成物の製造方法（以下、本方法と略記する場合がある）は、少なくとも採取工程、選別工程、培養工程および回収工程を含む。
採取工程では、提供動物から細胞を採取する。本方法では特に、現役の競走馬または競技馬から細胞を採取するとよい。
選別工程では、採取された細胞から間葉系幹細胞を選別する。
培養工程では、無血清培地を用いて上記の間葉系幹細胞を培養する。本方法に用いられる無血清培地は、メタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッドおよびメルカプトエタノールをいずれも含有しないことを特徴とする。
回収工程では、上記の培養工程で生成された培養上清を、無血清培地および間葉系幹細胞から分離して回収する。
【００２２】
以下、本方法について更に詳細に説明する。
【００２３】
（採取工程）
本方法の採取工程では、提供動物であるウマから細胞を採取する。ウマから幹細胞を採取する方法は特に限定されず、動物における任意の組織から幹細胞のみを採取する方法、または幹細胞以外の任意の他の生体成分とともに幹細胞を採取する方法を含み、公知の採取方法を適宜採用することができる。一例として、提供動物を殺傷せずに間葉系幹細胞を採取するため、臀部の皮下脂肪を採取することが好ましい。特に競走馬は体脂肪が少ないが、臀部の皮膚を切除して皮下脂肪を採取することで、１頭あたり数グラムの脂肪細胞を採取することができる。その後、脂肪細胞の採取患部に皮膚を移植することで、提供動物が生体のまま本方法の採取工程を行なうことができる。また、提供動物が牝馬である場合は、出産時に臍帯等から間葉系幹細胞を採取してもよい。これにより、出産時に特段の外科的行為を必要とせずに間葉系幹細胞を入手することができる。
【００２４】
本発明者の研究によれば、競走馬の脂肪から分画された間葉系幹細胞は、その後の継代培養において良好な増殖率を示すことが確認された。このため本方法においては、競走馬から採取された脂肪由来の間葉系幹細胞を培養して培養上清を得ることが望ましい。
【００２５】
（選別工程）
選別工程では、上記の採取工程で採取された脂肪細胞や臍帯等の試料細胞を細かく裁断する。一方で、コラゲナーゼを含む酵素溶液を調製しておく。試料細胞を恒温槽中にて酵素溶液で処理したのち、遠心分離を行なうことで、間葉系幹細胞を含む間質血管画分(Stromal Vascular Fraction)を得る。これにより、提供動物から採取された細胞より間葉系幹細胞が選別される。以下、間葉系幹細胞を「幹細胞」と略記する場合がある。
【００２６】
選別された幹細胞は、続けて下記の培養工程に供されてもよく、または凍結保存されてもよい。
【００２７】
（培養工程）
培養工程では、選別工程で試料細胞された幹細胞、または凍結保存された後に解凍された幹細胞を用いて、培地で初代培養および必要により継代培養する。継代培養の世代間に凍結保存および解凍工程を行なってもよい。
【００２８】
本方法の培養工程は、ディッシュやフラスコなどの培養容器に収容された培地に幹細胞を播種して行なう。培地は、動物由来成分を含まない無血清培地を用いることが好ましい。無血清培地を用いることで、未知成分を含まず既知成分のみを配合した培地を得ることができる。より具体的には、本方法で用いられる無血清培地は、少なくともヒト血清アルブミン、インスリン、リノール酸およびトランスフェリンを含有するとともに、毒劇物を含有しないことが好ましい。毒劇物としては、メタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッドおよびメルカプトエタノールを挙げることができる。培地がこれらの毒劇物成分をいずれも含有しないことにより、本実施形態の培養上清、およびこれを用いて作成された化粧品や医薬用組成物は、メタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッドおよびメルカプトエタノールをいずれも含有しないこととなる。このため、本方法により得られる化粧品や医薬用組成物をヒトに適用した場合でも副作用の発生が抑制され、安全に適用することができる。また、培養工程に用いられる無血清培地は、抗生物質を含有しないものであることが好ましい。なお、化粧品や医薬用組成物が上記成分を含有しないとは、これらの成分の濃度が、一般的な市販の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：High Performance Liquid Chromatography）装置における検出下限以下であることをいう。
【００２９】
本方法のように、提供動物が血統情報を有する競走馬または競技馬であり、かつ培養工程に用いる培地に既知成分のみで配合され毒劇物を含有しない無血清培地を用いることで、本方法により得られる培養上清は、厚生労働省が規定する「再生医療等の安全性の確保等に関する法律」に準拠するものとすることができる。
【００３０】
培養工程では、培地の上澄み液として培養上清が生成される。培養上清には幹細胞から分泌されたサイトカインなどの生体成分が含まれる。サイトカインは、細胞から産生される生理活性タンパク質であり、一般的には分子量８万以下、より多くは３万以下の低分子のものが多く知られる。生理活性とは、生体内において、化学物質が特定の生理的な調節機能に対して作用する性質を意味する。サイトカインとしては、ケモカイン、細胞増殖因子、インターロイキン、若しくはインターフェロン、またはこれらの誘導体を例示することができるが、これに限定されない。上記ケモカインは、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣケモカインまたはＣＸ３Ｃケモカインに大別される８ｋＤａから約１４ｋＤａ程度の低分子量のタンパク質である。ケモカインは、ケモカイン受容体を介して作用する。培養上清に含まれるサイトカインの好ましい例として、ＣＸＣＬ１２またはその誘導体を挙げることができる。ＣＸＣＬ１２またはその誘導体を含む幹細胞含有液には、ＣＸＣＬ１２の受容体であるＣＸＣＲ４またはその誘導体が含まれることが好ましい。
【００３１】
培養工程では、培養容器の大半が幹細胞で覆われたサブコンフルエントになって細胞数の増大速度が減速するまで、例えば３〜５日程度おきに培地を交換するとよい。
【００３２】
継代培養する場合は、サブコンフルエントまたはコンフルエントになった時点で、培養された幹細胞を培地から剥離して、培地を同一組成の新しいものに交換し、幹細胞を播種するとよい。競走馬の脂肪細胞から得られた幹細胞の場合、一例として、２グラムの初代幹細胞から、４世代の継代培養により４０億個の幹細胞と４０リットルの培養上清液を得ることが可能である。これは、本発明者の検討によれば、骨髄から採取した幹細胞を継代培養した場合に採取される幹細胞数（１００万個程度）の１０００倍以上にのぼる。
【００３３】
（回収工程）
回収工程では、培養工程で生成された培養上清を無血清培地および間葉系幹細胞から分離して回収する。培養上清は培地の上澄み液として生成されるため、市販の吸引装置を用いて培養上清を吸引して回収することができる。培養上清を回収するタイミングは特に限定されないが、例えば培地を交換するタイミングで行なうとよい。
【００３４】
このほか、本方法では、回収された培養上清に対して任意で種々の後工程を適用してもよい。かかる後工程としては、回収された培養上清をフィルタ濾過する濾過工程、培養上清を希釈する希釈工程、化粧品または医薬用組成物としてのその他の配合成分を添加する添加工程などが挙げられる。例えば化粧品を得るにあたり、培養上清に添加される配合成分としては、アルコール、保湿剤、乳化剤、ゲル化剤、クリーム、香料、防腐剤などを挙げることができる。
【００３５】
以上、本方法により培養上清を含有する化粧品および各種医薬用組成物が作成される。
本方法により得られる化粧品は、皮膚や毛髪に対して各種の美容効果（スキンケア効果、ヘアケア効果）を与える。毛髪としては、頭髪、体毛、睫毛、眉毛を挙げることができる。
具体的な美容効果としては、皮膚に関しては、肌に潤いを与え水分を保つ、肌の乾燥を防ぐ、肌荒れを防ぐ、肌にハリを与える、毛穴の目立ちを抑える、肌にツヤを与える、肌の肌理（きめ）を整える、目の下のクマや弛みを抑える、肌のくすみを抑える、頭皮の痒みや頭垢（ふけ）を抑える、などの効果が挙げられる。毛髪に関しては、毛髪にハリやこしを与える、毛髪にうるおいを与える、毛髪をしなやかにする、櫛どおりをよくする、毛髪にツヤを与える、などの効果が挙げられる。また、本発明にいう化粧品とはヒトの皮膚や毛髪に塗布や散布されて美容に用いられるものであれば特に限定されるものではなく、化粧水、クリーム、乳液、美容液、洗顔料などの基礎化粧品；化粧下地やチークなどのメイクアップ化粧品；シャンプー、コンディショナー、整髪料などのヘアケア製品；洗口液などのオーラルケア製品；香水、美白剤、脱毛剤などのその他化粧料を広く例示することができる。また、本発明にいう化粧品は、下記に例示するような薬効を示す薬用化粧品を含む。
【００３６】
また、本発明の化粧品は、液剤やクリームなどの流動体として瓶やスプレー容器等の収容容器に収容して提供されてもよく、または不織布やガーゼなどのシート体に含浸させて提供されてもよい。
【００３７】
また、本方法により得られる医薬用組成物の薬効としては、抗アレルギー作用、発毛および育毛作用、抗炎症作用、ならびに皮膚代謝の促進作用が少なくとも確認されている。
より具体的には、抗アレルギー作用としては、アレルギー性鼻炎（花粉症）の改善、アレルギー性結膜炎の改善、気管支喘息の症状抑制および喘息無症状状態の長時間維持、が確認されている。
発毛および育毛作用としては、産毛の発毛、頭髪の発毛、抜け毛の低減、睫毛の伸長、睫毛の発毛、が確認されている。
抗炎症作用としては、アトピー性皮膚炎などの内因性湿疹の改善および治癒、皮膚炎（脂漏性湿疹）の治癒、虫刺されなどの接触性皮膚炎（かぶれ）の痒みおよび腫れの治癒、乾皮症（皮脂欠乏性湿疹）の治癒、その他の尋常性湿疹の治癒、が確認されている。
皮膚代謝とは、皮膚の既存の角質の代謝を意味し、外傷（傷口）の止血や治癒などの真皮の再生はこれに含まれない。具体的な皮膚代謝の促進作用としては、肌のツヤや滑らかさの向上など肌の美容効果を得ることのほか、限局性角質の増殖を低減したり、皮膚の色素細胞の異常増殖を低減したり、または外傷痕や術後痕等に過剰産生された線維組織を代謝低減させたりすることが挙げられる。そして本方法により得られる医薬用組成物による皮膚代謝の促進作用としては、中足骨胼胝腫（ウオノメおよびタコ）等の限局性角質の低減および消失、色素細胞の異常増殖に伴う痣の軽減および消失、外傷痕や術後痕の軽減、火傷や打撲痕の治癒などが確認されている。
【００３８】
本発明の医薬用組成物は、抗アレルギー治療剤、発毛剤または育毛剤、抗炎症治療剤ならびに皮膚代謝促進剤の主たる薬効成分として配合される組成物である。本発明の培養上清が上記のように多様な薬効を呈する理由は必ずしも明らかではないが、培養上清に含まれる成長因子が以下の(i)〜(v)の効果を発揮するためと考えられる。
(i)塩基性繊維芽細胞増殖因子：本発明の培養上清は皮膚内の毛細血管の血管新生を促進し、コラーゲンを分泌する繊維芽細胞の増殖を促進するため皮膚代謝促進効果を発揮し、また組織修復や神経保護の作用を有するため抗アレルギー作用や抗炎症作用を発揮すると考えられる。
(ii)上皮細胞成長因子：本発明の培養上清は、新しい皮膚細胞の創生によりシワを予防および解消し、肌をなめらかにし、また新しい皮膚細胞を再生することで、皮膚代謝促進効果を発揮すると考えられる。
(iii)トランスフォーミング効果：本発明の培養上清は、コラーゲンとエラスチンの構造を強化することで肌の弾力性を増し、肌の成長や傷の治癒を促進し、新しい細胞を生産することで、シワを防止および改善すると考えられる。
(iv)血小板由来成長因子：本発明の培養上清は、皮膚細胞の再生を促進し、コラーゲン合成を促進することで、シワを防止および改善し、毛髪の育毛を促進すると考えられる。
(v)インスリン様成長因子：本発明の培養上清は、新しい皮膚細胞の創生によりシワを予防および解消し、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸を増やすことで皮膚感触を良くし、毛根を刺激することで毛髪の育毛を促進すると考えられる。
(vi)血管内皮細胞増殖因子：本発明の培養上清は、毛根へ栄養を運ぶことで毛髪の発毛を促進し、新しい細胞を生産することでシワを防止および改善し、そして肌にエネルギーを与えることで肌ツヤを改善すると考えられる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４０】
（幹細胞の採取）
現役の競走馬を提供動物とし、その臀部を切開し脂肪細胞を約５ｇ採取し幹細胞採取用の試料とした。上記試料を、１ｍｍ角程度に裁断した後、コラゲナーゼ溶液を用いて３７℃で１時間処理した。次いで、処理後の当該試料を約１０分間、４００×ｇの遠心力で遠心分離し、１００μｍのメッシュを備えたセルストレイナーで未消化の脂肪組織片を除去した後、脂肪由来の間葉系幹細胞を含む間質血管画分を得た。
【００４１】
（幹細胞の培養）
ヒト血清アルブミン、インスリン、リノール酸およびトランスフェリンを含有するとともに、メタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッドおよびメルカプトエタノールをいずれも含有しないオリジナルの無血清培地を調製し、フラスコに収容した。上記フラスコに上述で得た分画物を播種し、３７℃／５％ＣＯ２条件下で液体静置培養を行った。２日おきに培地の上澄み液（培養上清）を全量収集するとともに、フレッシュな培地に交換した。そして、位相差顕微鏡にてフラスコの底面の全面積に対し８０％以上９０％以下の面積に細胞が付着したことが確認された段階で培養を終了し、それまでに生成された培養上清を収集した。
【００４２】
収集された培養上清を、目開き２０ｎｍのメッシュでフィルタ濾過し、更に精製水で５０倍に希釈して、実施例組成物を得た。
【００４３】
（比較例１）
提供動物を競走馬からイヌに変更して皮下脂肪を採取し、その他は上記実施例と同様の手法で幹細胞を培養した。
【００４４】
（比較例２）
提供動物を競走馬からヒトに変更して皮下脂肪を採取し、その他は上記実施例と同様の手法で幹細胞を培養した。
【００４５】
比較例１および比較例２の場合、幹細胞の培養が途中で停止し、フラスコの底面の全面積に対し８０％以上の面積まで幹細胞が増殖することはなかった。このことから、提供動物をウマにすることで、採取された幹細胞が良好に増殖して多量の培養上清が得られることが確認された。
【００４６】
上記で得られた実施例組成物を、各種動物やヒトを被検体動物として適用し、薬効を検証した。
【００４７】
（実施例１）
被検体動物は、皮膚が細菌感染したイヌであり、図１（ａ）に示すように皮膚に炎症が見られた。この被検体動物の炎症患部に約１日間隔で実施例組成物を噴霧したところ、噴霧開始から１週間後には図１（ｂ）に示すように炎症患部の腫れや赤味が消失した。
このほか、同一犬種のイヌ１５頭をサンプルとして実施例組成物を約１日間隔で２週間に亘って体表や口腔内に噴霧したところ、以下が確認された。
・産毛の発毛
・雲脂（ふけ）が出なくなった
・体毛がしっとりした
・口臭が抑えられた
・上顎に発生して鼻まで貫通していた重度の口腔内顎腫症が改善した
・湿疹が完治した
以上、本実施例によれば、本発明の発毛効果および抗炎症治療効果が確認された。
【００４８】
（実施例２）
被検体動物（被験者）は、頭髪が薄くなった中年男性（ヒト）である。図２（ａ）に示すように頭頂部の頭髪が薄くなっていたところ、頭部に実施例組成物を約１日間隔で塗布したところ、塗布開始から約８ヶ月後には図２（ｂ）に示すように顕著な発毛が見られ頭頂部の頭髪の本数密度が劇的に増大した。
本実施例によれば、本発明の発毛効果および育毛効果が確認された。
【００４９】
（実施例３）
被検体動物（被験者）は、抜け毛に悩む成人女性（ヒト）である。頭部に実施例組成物を毎日塗布して抜け毛の本数を確認した。図３は、シャンプー時、ドライヤー時およびこれらの合計の抜け毛本数の経時推移を示すグラフである。塗布開始から３日目の２月３日において抜け毛の本数はシャンプー時：７５本、ドライヤー時：５０本であったところ、塗布開始から５日目の２月５日には抜け毛の本数はシャンプー時：７０本、ドライヤー時：４８本となり、塗布開始から１３日目の２月１３日において抜け毛の本数はシャンプー時：６０本、ドライヤー時：３８本と減少した。更に塗布開始から２１日目の２月２１日においては、抜け毛の本数はシャンプー時：３２本、ドライヤー時：３０本と顕著に減少した。
本実施例によれば、本発明の育毛効果（抜け毛の低減）が確認された。
【００５０】
（実施例４）
被検体動物（被験者）は、睫毛が短いことに悩む成人女性（ヒト）である。目周りに実施例組成物を毎日塗布した。図４（ａ）は塗布開始時（２０１６年１月２９日）の状態である。図４（ｂ）は塗布４日目（２０１６年２月２日）の状態であり、図４（ｃ）は塗布７日目（２０１６年２月５日）の状態であり、図４（ｄ）は塗布１１日目（２０１６年２月８日）の状態である。このように、塗布開始から４日目には一部の睫毛が伸長したことが確認され（図４（ｂ））、７日目には睫毛が全体的に長く伸長したことが確認された。
また、睫毛が長くなっただけでなく本数密度も向上し、更に睫毛には根元から先端にかけてハリとコシが増えたため、図４（ｃ）や図４（ｄ）に示すように、睫毛が上向きにピンと立ち上がるように生えるようになったことが確認された。
更に、睫毛の育毛効果だけでなく、実施例組成物の塗布前後で比較して、瞳がよりくっきりし、二重瞼がよりくっきりとしたことが確認された。
本実施例によれば、本発明の育毛効果（睫毛の伸長）および瞼（肌）のハリの増大効果が確認された。
【００５１】
（実施例５）
被検体動物（被験者）は３０代の男性（ヒト）である。図５（ａ）に示すように頭部に目立って発生していた術後痕に対して実施例組成物を毎日噴霧したところ、噴霧開始より１４日目には図５（ｂ）に示すように術後痕は周囲の皮膚と色が同化するとともに痕自体も小さくなり、目立ちが低下した。
本実施例によれば、術後痕の軽減すなわち皮膚代謝促進効果が確認された。
【００５２】
（実施例６）
被検体動物（被験者）は４０代の女性（ヒト）である。図６（ａ）に示すように足の小指横に発生していたウオノメに対して実施例組成物を毎日噴霧したところ、噴霧開始より６日目に痛みが消えるとともにウオノメが消失していた（図６（ｂ）参照）。その後、８ヶ月間が経過してもウオノメの再発はなく正常な状態を維持していた（図６（ｃ）参照）。
本実施例によれば、限局性角質の低減すなわち皮膚代謝促進効果が確認された。
【００５３】
（実施例７）
被検体動物（被験者）は、アトピー性皮膚炎を発症している男子児童（ヒト）である。図７（ａ）に示すように、実施例組成物を噴霧する前の２０１６年１月１４日には、ただれを伴う広範囲の炎症部が腋の下に確認された。実施例組成物を毎日噴霧したところ、１０日目の同年１月２５日にはただれが鎮静化しはじめ（図７（ｂ）参照）、６５日目の同年３月２０日には炎症が顕著に低下し（図７（ｃ）参照）、そして９４日目の同年４月１８日には炎症がほぼ見られず顕著な治癒が見られた。
【００５４】
また、被検体動物（被験者）を、同じくアトピー性皮膚炎を発症している、男女を含む２０人の成人（ヒト）として、１４日間に亘って実施例組成物を毎日噴霧した結果を示すグラフである。噴霧開始前と噴霧最終日に、下記の表１に「モニター名」として示すＮｏ．１〜１４の観点でアトピー性皮膚炎の症状を０〜５の６段階でポイントを自己評価してもらった。かかるアンケート結果を表１に併せて示す。ポイント０は「全く気にならない」、ポイント１は「気にならない」、ポイント２は「どちらでもない」、ポイント３は「やや気になる」、ポイント４は「気になる」、ポイント５は「とても気になる」に対応し、症状が軽いほど小さなポイントとなる。図８は、表１の噴霧最終日ポイントを左側に、そして噴霧前ポイントを右側に、モニター名ごとに対比して図示したものである。また、表１において改善ポイントとは、噴霧前ポイントと噴霧最終日ポイントとの差分であり、改善率は改善ポイントを噴霧前ポイントで除した値である。
【００５５】
【表１】
2018024595.tif 000003
【００５６】
図８および表１に示す結果によると、アトピー性皮膚炎の症状自体が大幅に改善しており、その副次的な効果として、症状が自身の精神面に及ぼす心理的に影響も改善していることが分かった。
以上より、本実施例によれば、本発明の抗炎症作用が確認された。
【００５７】
（実施例８）
被検体動物（被験者）は零歳児（ヒト）である。図９（ａ）に示すように、本発明の適用前は胸の広範囲に脂漏性湿疹が見られていた。かかる被検体に対し、実施例組成物を毎日朝と夕方に各１回噴霧したところ、噴霧１日目において図９（ｂ）に示すように湿疹の赤味が低減し、そして驚くべきことに噴霧２日目には図９（ｃ）に示すように消失した。
本実施例によれば、本発明の抗炎症作用が確認された。
【００５８】
（実施例９）
被検体動物（被験者）は、花粉症を発症している、男女比を６：４とする２０人の成人（ヒト）であり、以下の条件で実施例組成物を噴霧した。被験者の平均年齢は４５．９歳であり、平均花粉症歴は７．８年であった。すなわち、花粉症に長年悩んでいる被験者を対象とした。モニター期間中は他の薬剤の服用（併用）は行わなかった。
【００５９】
（１）被験者は、洗顔後に１日２回（朝および夕方）以上の噴霧を行なった。
（２）被験者は、右目および左鼻の周り（順不同）にそれぞれ１回〜２回の噴霧を行なった。
（３）被験者は、噴霧後、各々の箇所および周辺を指で軽くマッサージして馴染ませた。
（４）噴霧する日数は３日以上、２３日以下とし、症状の改善状態に応じて被験者ごとの任意とした。
【００６０】
噴霧開始前、噴霧開始から４８時間経過後、そして噴霧最終日に、２０項目に亘るアンケートを実施し、花粉症の症状を１〜５の５段階でポイントを自己評価してもらった。下記の表２には、改善度合いの高かった上位１２個のアンケート項目を「モニター名」として示し、アンケート結果を表２に併せて示す。ポイント１は「症状なし」、ポイント２は「軽症」、ポイント３は「中等症」、ポイント４は「重症」、ポイント５は「最重症」に対応し、症状が軽いほど小さなポイントとなる。図１０は、表２の噴霧最終日のポイントを左側に、噴霧から４８時間経過後のポイントを中央に、そして噴霧前のポイントを右側に、モニター名ごとに対比して図示したものである。また、表２において改善ポイントとは、噴霧前のポイントと噴霧最終日のポイントとの差分であり、改善率は改善ポイントを噴霧前のポイントで除した値である。
【００６１】
【表２】
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【００６２】
図１０および表２に示す結果によると、噴霧開始から４８時間という短期間に花粉症の症状の多くが改善し、その後も噴霧を継続することで症状が更に改善するものも見られた。このことから、本実施例によれば、本発明の抗アレルギー作用が確認され、また抗アレルギー作用が極めて迅速に発揮されることが分かった。
【００６３】
上記の実施形態および実施例により、本発明により得られる培養上清は、少なくとも抗アレルギー作用、発毛および育毛作用、抗炎症作用ならびに皮膚代謝の促進作用を奏するものであることが実証された。
【００６４】
上記実施形態および実施例は、以下の技術思想を包含するものである。
（１）ウマ由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する化粧品。
（２）前記間葉系幹細胞が、競走馬または競技馬から採取された幹細胞または前記幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞である上記（１）に記載の化粧品。
（３）メタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッドおよびメルカプトエタノールをいずれも含有しないことを特徴とする上記（１）または（２）に記載の化粧品。
（４）ウマ由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する抗アレルギー治療用組成物。
（５）ウマ由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する発毛または育毛用組成物。
（６）ウマ由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する抗炎症治療用組成物。
（７）ウマ由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する皮膚代謝促進用組成物。
（８）競走馬または競技馬から細胞を採取する採取工程；採取された前記細胞から間葉系幹細胞を選別する選別工程；メタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッドおよびメルカプトエタノールをいずれも含有しない無血清培地を用いて前記間葉系幹細胞を培養する培養工程；および前記培養工程で生成された培養上清を前記無血清培地および前記間葉系幹細胞から分離して回収する回収工程；を含む、化粧品または医薬用組成物の製造方法。
【図１】
2018024595.tif 000005
【図２】
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【図３】
2018024595.tif 000007
【図４】
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【図５】
2018024595.tif 000009
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年3月10日(2017.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
競走馬の脂肪由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する化粧品であって、
前記間葉系幹細胞は、前記競走馬から採取された脂肪由来の間葉系幹細胞または前記間葉系幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞であり、
メタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッド、メルカプトエタノールおよび抗生物質をいずれも含有しないことを特徴とする化粧品。
【請求項２】
インスリン、リノール酸およびトランスフェリンを含有する請求項１に記載の化粧品。
【請求項３】
競走馬の脂肪由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する抗アレルギー治療用組成物であって、
前記間葉系幹細胞は、前記競走馬から採取された脂肪由来の間葉系幹細胞または前記間葉系幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞であり、
メタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッド、メルカプトエタノールおよび抗生物質をいずれも含有しないことを特徴とする抗アレルギー治療用組成物。
【請求項４】
競走馬の脂肪由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する発毛または育毛用組成物であって、
前記間葉系幹細胞は、前記競走馬から採取された脂肪由来の間葉系幹細胞または前記間葉系幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞であり、
メタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッド、メルカプトエタノールおよび抗生物質をいずれも含有しないことを特徴とする発毛または育毛用組成物。
【請求項５】
競走馬の脂肪由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する抗炎症治療用組成物であって、
前記間葉系幹細胞は、前記競走馬から採取された脂肪由来の間葉系幹細胞または前記間葉系幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞であり、
メタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッド、メルカプトエタノールおよび抗生物質をいずれも含有しないことを特徴とする抗炎症治療用組成物。
【請求項６】
競走馬の脂肪由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する皮膚代謝促進用組成物であって、
前記間葉系幹細胞は、前記競走馬から採取された脂肪由来の間葉系幹細胞または前記間葉系幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞であり、
メタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッド、メルカプトエタノールおよび抗生物質をいずれも含有しないことを特徴とする皮膚代謝促進用組成物。
【請求項７】
競走馬から脂肪細胞を採取する採取工程；
採取された前記脂肪細胞から間葉系幹細胞を選別する選別工程；
メタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッド、メルカプトエタノールおよび抗生物質をいずれも含有しない無血清培地を用いて前記間葉系幹細胞を培養する培養工程；および
前記培養工程で生成された培養上清を前記無血清培地および培養された前記間葉系幹細胞から分離して回収する回収工程；
を含む、化粧品または医薬用組成物の製造方法。
【請求項８】
前記培養工程で用いられる前記無血清培地が、インスリン、リノール酸およびトランスフェリンを含有することを特徴とする請求項７に記載の化粧品または医薬用組成物の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明によれば、競走馬の脂肪由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する化粧品が提供される。前記間葉系幹細胞は、前記競走馬から採取された脂肪由来の間葉系幹細胞または前記間葉系幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞であり、本発明の化粧品はメタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッド、メルカプトエタノールおよび抗生物質をいずれも含有しないことを特徴とする。
また本発明によれば、競走馬の脂肪由来の間葉系幹細胞を培養して得られた培養上清を含有する抗アレルギー治療用組成物、発毛または育毛用組成物、抗炎症治療用組成物および皮膚代謝促進用組成物が提供される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
また本発明によれば、競走馬から脂肪細胞を採取する採取工程；採取された前記脂肪細胞から間葉系幹細胞を選別する選別工程；メタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッド、メルカプトエタノールおよび抗生物質をいずれも含有しない無血清培地を用いて前記間葉系幹細胞を培養する培養工程；および前記培養工程で生成された培養上清を前記無血清培地および培養された前記間葉系幹細胞から分離して回収する回収工程；を含む、化粧品または医薬用組成物の製造方法が提供される。