(57)【要約】      （修正有）【課題】リン酸化Ｓｍａｄの核内移行を阻害することによる、特発性肺線維症を治療、予防する抗線維症剤の提供。【解決手段】グルコシルセラミド合成酵素阻害剤、ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤のいずれか、または両方を有効成分とする抗線維症剤。【効果】組織の線維化関連タンパク質の発現プロセスを抑制し、肺、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、骨髄、膵臓、眼等の多様な組織での線維症の治療と予防、特に特発性肺線維症の治療、予防へ用いることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコシルセラミド合成酵素阻害剤、ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤のいずれか、または両方を有効成分とすることを特徴とする抗線維症剤。
【請求項２】
前記グルコシルセラミド合成酵素阻害剤が、１−フェニル−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−モルフォリノ−１−プロパノール（ＰＰＭＰ）、１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルフォリノ−１−プロパノール（ＰＤＭＰ）、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシン（ミグルスタット、ＮＢ−ＤＮＪ）、Ｎ−ブチルデオキシガラクトノジリマイシン（ＮＢ−ＤＧＪ）、デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）、Ｎ―［（ｌＲ，２Ｒ）−１−（２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イル）−１−ヒドロキシ−３−（ピロリジン−１−イル）プロパン−２−イル］オクタンアミドヘミ−（２Ｒ，３Ｒ）−酒石酸塩（エリグルスタット酒石酸塩）から選択される１以上であることを特徴とする請求項１に記載の抗線維症剤。
【請求項３】
前記ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤が、Ｎ−ドデシルデオキシノジリマイシン、ノジリマイシン亜硫酸付加物、ノジリマイシン亜硫酸付加物疎水性誘導体及びこれらの塩から選択される１以上であることを特徴とする請求項１に記載の抗線維症剤。
【請求項４】
特発性肺線維症の治療剤、または予防剤であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の抗線維症剤。
【請求項５】
グルコシルセラミド合成酵素阻害剤、ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤のいずれか、または両方を有効成分とするリン酸化Ｓｍａｄ核内移行阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維症の治療、または予防に用いられる抗線維症剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
特発性間質性肺炎は、日本国において特定疾患に指定されている呼吸器難病である。中でも特発性肺線維症は、原因が不明であり、診断後の生存期間の中央値が２−３年と、大変予後の悪い疾患である。特発性肺線維症の罹患率は１０万人に１０〜２０人と言われているが、潜在的な患者数はその１０倍以上だと推定されている。特発性肺線維症の主な症状として、肺胞組織を支持する部位である「間質」の線維化（肥厚化）が挙げられる。肺間質が線維化することにより、肺の柔軟性が失われ、肺機能が低下した結果、ガス交換が上手くいかなくなり呼吸困難や乾性咳嗽等が引き起こされる。
【０００３】
特発性肺線維症の明確な原因は突き止められていないが、喫煙が危険因子であることが指摘されている。特発性肺線維症患者の肺組織では間質を構成する線維芽細胞や筋線維芽細胞が凝集し、これらが病巣を形成することが確認されている（非特許文献１）。そして、この病巣の形成は、多種多様な炎症性サイトカインが複雑に作用した結果だと捉えられている。
【０００４】
日本国では、特発性肺線維症の治療薬として、ピルフェニドン及びニンテダニブが承認されている。
ピルフェニドンは、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６等）の産生抑制と抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０）の産生亢進を示す。また、線維化形成に関与する増殖因子（ＴＧＦβ１、ｂ−ＦＧＦ、ＰＤＧＦ）に対する産生抑制作用を有する。さらに、線維芽細胞増殖抑制作用やコラーゲン産生抑制作用も有する。ピルフェニドンは、これらの複合的な作用に基づき抗線維化作用を示すと考えられるが、ピルフェニドンの標的分子は明らかになっていない。
ニンテダニブは、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）α、β、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）１、２、３、及び血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）を標的とする低分子量チロシンキナーゼ阻害薬であり、線維芽細胞の増殖および遊走を阻害することで、抗線維化作用を示す。
しかし、ピルフェニドン及びニンテダニブは、特発性肺線維症患者において努力肺活量の改善を示すが、生存期間を延長することはできないことが報告されている（非特許文献２）。
そこで、新たなアプローチによる治療薬の開発が望まれている。
【０００５】
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−β（ＴＧＦβ）は、腎臓、骨髄、血小板等ほぼすべての細胞で産生されるタンパク質であり、細胞増殖・分化を制御し、骨芽細胞の増殖および間葉細胞の増殖やコラーゲン合成を促進する等、多様な生物活性を示すサイトカインである。ＴＧＦβは、５種類のサブタイプ（β１〜β５）が存在し、哺乳類にはβ１、β２、β３の３種類が存在する。
特発性肺線維症等で見られる組織線維化において、ＴＧＦβ１が重要な役割を果たしていると指摘されている（非特許文献１、３）。ＴＧＦβ１は、創傷治癒に深く関わる分子としても知られているが、組織における過剰なＴＧＦβ１の作用が線維化に深く関わると考えられている。肺間質においても、ＴＧＦβ１は、線維芽細胞を筋線維芽細胞へと分化させ、コラーゲンやフィブロネクチン等の細胞外マトリクスや、筋線維芽細胞に特徴的なタンパク質であるα平滑筋アクチン（αＳＭＡ：α−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ）の発現を誘導することが知られている。なお、αＳＭＡは、線維化のマーカータンパク質である。
【０００６】
ＴＧＦβ１は、２量体リガンドとしてＴＧＦβ受容体に結合する。ＴＧＦβ１シグナルにおいて特徴的かつ最も主要な分子として転写因子Ｓｍａｄが知られている（非特許文献４、５）。Ｓｍａｄは、Ｎ末端側とＣ末端側にそれぞれ核移行やＤＮＡ結合に関与するＭＨ１ドメインと、転写活性や他分子との結合に関与するＭＨ２ドメインを有している。Ｓｍａｄは、不活性状態においては、ＭＨ１ドメインとＭＨ２ドメインが分子内で結合しているが、ＴＧＦβ受容体が活性化すると、Ｓｍａｄ２／３のＭＨ２ドメインのＣ末端に存在するＳＸＳＳモチーフがリン酸化する。これによりＳｍａｄ２／３は、ＭＨ２ドメインを介してＳｍａｄ４と複合体（以下、リン酸化Ｓｍａｄという。）を形成し、このリン酸化Ｓｍａｄが核内へ移行してＭＨ１ドメインを介してＤＮＡと結合し、様々な転写因子と相互作用してαＳＭＡを含む多様な標的遺伝子の転写を制御する。
【０００７】
ＴＧＦβ１を含む様々な細胞内シグナル伝達において、受容体と細胞内シグナル分子が会合する足場として、細胞膜上の脂質ラフトが挙げられる。脂質ラフトには、セラミドに糖鎖が負荷したスフィンゴ糖脂質が豊富に存在する。スフィンゴ糖脂質は、数百種類の分子が存在するが、セラミドにガラクトースが付加したガラクトシルセラミドを基質とする群と、セラミドにラクトース（グルコースとガラクトースの二糖）が付加したラクトシルセラミドを基質とする群の２種類に大別される。ラクトシルセラミドは、セラミドにグルコースが付加したグルコシルセラミドを経由して合成される。
ラクトシルセラミドが豊富な脂質ラフト領域は、炎症性のシグナル伝達を担うことが報告されている（非特許文献６−１０）。
しかしながら、ラクトシルセラミドが、ＴＧＦβ１シグナルを担う分子として機能するかは報告されておらず、ラクトシルセラミドとＴＧＦβ１シグナルとの関与は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】King TE Jr, Pardo A, Selman M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 2011 Dec 3; 378 (9807): 1949-61.
【非特許文献２】Ganesh Raghu, Bram Rochwerg, Yuan Zhang, Carlos A. Cuello Garcia, Arata Azuma, Juergen Behr, Jan L. Brozek, Harold R. Collard, William Cunningham, Sakae Homma, Takeshi Johkoh, Fernando J. Martinez, Jeffrey Myers, Shandra L. Protzko, Luca Richeldi, David Rind, Moises Selman, Arthur Theodore, Athol U. Wells, Henk Hoogsteden, and Holger J. Schunemann "An Official ATS/ERS/JRS/ALAT Clinical Practice Guideline: Treatment of Idiopathic Pulmonary Fibrosis. An Update of the 2011 Clinical Practice Guideline", American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, Vol. 192, No. 2 (2015), pp. e3-e19.
【非特許文献３】Leask A. Potential therapeutic targets for cardiac fibrosis: TGFbeta, angiotensin, endothelin, CCN2, and PDGF,partners in fibroblast activation. Circ Res. 2010 Jun 11; 106 (11): 1675-80.
【非特許文献４】Moustakas A. Smad signalling network. J Cell Sci. 2002 Sep 1; 115 (Pt 17): 3355-6.
【非特許文献５】Derynck R, Zhang YE. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling. Nature.2003 Oct 9; 425 (6958): 577-84.
【非特許文献６】Nakamura H, Moriyama Y, Makiyama T, Emori S, Yamashita H, Yamazaki R, Murayama T. Lactosylceramideinteracts with and activates cytosolic phospholipase A2α. J Biol Chem. 2013 Aug 9; 288 (32): 23264-72.
【非特許文献７】Pannu R, Singh AK, Singh I. A novel role of lactosylceramide in the regulation of tumor necrosis factor alphamediated proliferation of rat primary astrocytes. Implications for astrogliosis following neurotrauma. J Biol Chem.2005 Apr 8; 280 (14): 13742-51.
【非特許文献８】Kolmakova A, Chatterjee S. Platelet derived growth factor recruits lactosylceramide to induce cell proliferation in UDP Gal:GlcCer: beta1 --> 4Galactosyltransferase (GalT-V) mutant Chinese hamster ovary cells. Glycoconj J. 2005 Nov; 22 (7-9): 401-7.
【非特許文献９】Mayo L, Trauger SA, Blain M, Nadeau M, Patel B, Alvarez JI, Mascanfroni ID, Yeste A, Kivisakk P, Kallas K,Ellezam B, Bakshi R, Prat A, Antel JP, Weiner HL, Quintana FJ. Regulation of astrocyte activation by glycolipids drives chronic CNS inflammation. Nat Med. 2014 Oct; 20 (10): 1147-56.
【非特許文献１０】Bodas M, Min T, Vij N. Lactosylceramide-accumulation in lipid-rafts mediate aberrant-autophagy, inflammation and apoptosis in cigarette smoke induced emphysema. Apoptosis. 2015 May; 20 (5): 725-39.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、リン酸化Ｓｍａｄの核内移行を阻害することにより、線維症を治療、予防す
る抗線維症剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
１．グルコシルセラミド合成酵素阻害剤、ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤のいずれか、または両方を有効成分とすることを特徴とする抗線維症剤。
２．前記グルコシルセラミド合成酵素阻害剤が、１−フェニル−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−モルフォリノ−１−プロパノール（ＰＰＭＰ）、１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルフォリノ−１−プロパノール（ＰＤＭＰ）、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシン（ミグルスタット、ＮＢ−ＤＮＪ）、Ｎ−ブチルデオキシガラクトノジリマイシン（ＮＢ−ＤＧＪ）、デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）、Ｎ―［（ｌＲ，２Ｒ）−１−（２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イル）−１−ヒドロキシ−３−（ピロリジン−１−イル）プロパン−２−イル］オクタンアミドヘミ−（２Ｒ，３Ｒ）−酒石酸塩（エリグルスタット酒石酸塩）から選択される１以上であることを特徴とする１．に記載の抗線維症剤。
３．前記ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤が、Ｎ−ドデシルデオキシノジリマイシン、ノジリマイシン亜硫酸付加物、ノジリマイシン亜硫酸付加物疎水性誘導体及びこれらの塩から選択される１以上であることを特徴とする１．に記載の抗線維症剤。
４．特発性肺線維症の治療剤、または予防剤であることを特徴とする１．〜３．のいずれかに記載の抗線維症剤。
５．グルコシルセラミド合成酵素阻害剤、ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤のいずれか、または両方を有効成分とするリン酸化Ｓｍａｄ核内移行阻害剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明者らは、ＴＧＦβ１からのαＳＭＡやコラーゲンを合成するシグナルを伝達するリン酸化Ｓｍａｄの核内移行を制御するＴＧＦβ１シグナル制御メカニズムを見出した。本発明の抗線維症剤は、この新たなメカニズムに基づくものであり、リン酸化Ｓｍａｄの核内移行を阻害するものである。
本発明の抗線維症剤は、グルコシルセラミド合成酵素阻害剤、またはラクトシルセラミド合成酵素阻害剤を有効成分とし、リン酸化Ｓｍａｄの核内移行を阻害することにより、線維症の原因となるαＳＭＡやコラーゲンの合成を抑制する。本発明の抗線維症剤は、組織の線維化関連タンパク質の発現プロセスを抑制するものであり、肺、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、骨髄、膵臓、眼等の多様な組織での線維症の治療と予防に用いることができ、特に、特発性肺線維症の治療剤、予防剤への応用が期待される。
グルコシルセラミド合成酵素阻害剤であるＮ−ブチルデオキシノジリマイシン（ミグルスタット、ＮＢ−ＤＮＪ）は、ゴーシェ病、ニーマンピック病Ｃ型の経口治療薬として認可されている。他の疾患の治療薬として既に使用されている薬剤は、副作用のおそれが小さく、安全性が高いことから、ミグルスタットを有効成分とする抗線維症剤は、臨床研究への応用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＴＧＦβ１刺激によるラクトシルセラミド合成増大を介したリン酸化Ｓｍａｄの核内移行を制御する経路の模式図。
【図２】実験１におけるラクトシルセラミド合成活性試験の結果を示す図。
【図３】実験２におけるαＳＭＡ発現量を示す図。図３Ａ：ＰＰＭＰ、図３Ｂ：ＮＢ−ＤＮＪ、図３Ｃ：グルコシルセラミド合成酵素ノックアウト。
【図４】実験２におけるヒト肺線維芽（ＨＦＬ１）細胞のαＳＭＡとβチューブリンの発現を示すウェスタンブロッティング図。
【図５】実験３におけるＨＦＬ１のＳｍａｄ２／３、リン酸化Ｓｍａｄ２／３の発現を示すウェスタンブロッティング図。図５Ａ：ＰＰＭＰ、図５Ｂ：ラクトシルセラミド。
【図６】実験３におけるＨＦＬ１細胞の共焦点レーザー顕微鏡画像。図６Ａ：Ｓｍａｄ２、図６Ｂ：Ｓｍａｄ３。
【図７】実験４におけるＨＦＬ１細胞の共焦点レーザー顕微鏡画像。図７Ａ：ＰＰＭＰ、Ｒｏｔｔｌｅｒｉｎ、図７Ｂ：ラクトシルセラミド。
【図８】実験５におけるＨＦＬ１のαＳＭＡとβチューブリンの発現を示すウェスタンブロッティング図（図８Ａ）と、αＳＭＡ発現量を示す図（図８Ｂ）。
【図９】実験５において、各ＰＫＣ阻害剤処置を行った際のＨＦＬ１のαＳＭＡとβチューブリンの発現を示すウェスタンブロッティング図（図９Ａ）と、αＳＭＡ発現量を示す図（図９Ｂ）。
【図１０】実験５におけるＨＦＬ１細胞の共焦点レーザー顕微鏡画像。
【図１１】実験５におけるＨＦＬ１のＳｍａｄ２、リン酸化Ｓｍａｄ２の発現を示すウェスタンブロッティング図。図１１Ａ：Ｒｏｔｔｌｅｒｉｎ、図１１Ｂ：ＧＦ１０９２０３Ｘ。
【図１２】実験６におけるＨＦＬ１のαＳＭＡとβチューブリンの発現を示すウェスタンブロッティング図（図１２Ａ）と、αＳＭＡ発現量を示す図（図１２Ｂ）。
【図１３】実験６におけるＨＦＬ１細胞の共焦点レーザー顕微鏡画像（図１３Ａ）と、ＨＦＬ１のＳｍａｄ２、リン酸化Ｓｍａｄ２の発現を示すウェスタンブロッティング図（図１３Ｂ）。
【図１４】実験７における患者由来肺線維芽細胞のαＳＭＡとフィブロネクチンの発現を示すウェスタンブロッティング図（図１４Ａ）と、αＳＭＡとフィブロネクチンの発現量を示す図（図１４Ｂ）。
【図１５】実験８におけるαＳＭＡの発現を示す図。
【図１６】実験８におけるヘマトキシリン・エオジン染色した経気管投与群の肺切片のＡｓｈｃｒｏｆｔ  ｓｃｏｒｅと顕微鏡画像。
【図１７】実験８におけるヘマトキシリン・エオジン染色した経口投与群の肺切片の顕微鏡画像。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者らは、ＴＧＦβ１が、ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）の合成増大を誘導し、このラクトシルセラミドが、プロテインキナーゼＣδ（ＰＫＣδ）／Ｒｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）シグナルを介して、リン酸化Ｓｍａｄの核内移行を正に制御するという、これまでに知られていない新規なＴＧＦβ１シグナル制御メカニズムを発見した。
図１に、このメカニズムの経路の模式図を示す。
【００１４】
ＴＧＦβ１がラクトシルセラミドの合成増大を誘導すること、ラクトシルセラミドが、ＰＫＣδ／ＲＯＣＫシグナルを活性化して、リン酸化Ｓｍａｄの核内移行を制御することは、これまでに知られていない本発明者らによる新たな知見である。
【００１５】
この経路から明らかなように、ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤、ＰＫＣδ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤は、リン酸化Ｓｍａｄ核内移行を阻害する。また、ラクトシルセラミドの前駆体であるグルコシルセラミドの合成酵素を阻害するグルコシルセラミド合成酵素阻害剤もリン酸化Ｓｍａｄの核内移行を阻害する。そのため、ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤、グルコシルセラミド合成酵素阻害剤、ＰＫＣδ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤は、リン酸化Ｓｍａｄ核内移行阻害剤としても用いることができる。
【００１６】
本発明の抗線維症剤は、グルコシルセラミド合成酵素阻害剤、ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤のいずれか、または両方を有効成分とし、上記経路におけるリン酸化Ｓｍａｄの核内移行を阻害することにより、αＳＭＡ等の線維化に関連するタンパク質を含む標的遺伝子の転写、翻訳を抑制する。リン酸化Ｓｍａｄによる線維化関連タンパク質の合成発現機構は共通しているため、本発明の抗線維症剤は、肺、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、骨髄、膵臓、眼等の多様な組織での線維症の治療剤、予防剤として用いることができる。
【００１７】
本発明の抗線維症剤として使用するグルコシルセラミド合成酵素阻害剤は特に制限されず、例えば、１−フェニル−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−モルフォリノ−１−プロパノール（ＰＰＭＰ）、ＰＰＭＰと基本骨格が共通する１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルフォリノ−１−プロパノール（ＰＤＭＰ）、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシン（ミグルスタット、ＮＢ−ＤＮＪ）、Ｎ−ブチルデオキシガラクトノジリマイシン（ＮＢ−ＤＧＪ）、デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）、Ｎ―［（ｌＲ，２Ｒ）−１−（２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イル）−１−ヒドロキシ−３−（ピロリジン−１−イル）プロパン−２−イル］オクタンアミドヘミ−（２Ｒ，３Ｒ）−酒石酸塩（エリグルスタット酒石酸塩）等から選択される１以上を用いることができる。
【００１８】
本発明の抗線維症剤として使用するラクトシルセラミド合成酵素阻害剤は特に制限されず、例えば、Ｎ−ドデシルデオキシノジリマイシン、ノジリマイシン亜硫酸付加物、ノジリマイシン亜硫酸付加物疎水性誘導体及びこれらの塩等から選択される１以上を用いることができる。
【００１９】
なお、ＰＰＭＰ、ＮＢ−ＤＮＪは、グルコシルセラミド合成酵素阻害剤としても、ラクトシルセラミド合成酵素阻害剤としても作用する。
【００２０】
本発明の抗線維症剤は、リン酸化Ｓｍａｄ核内移行阻害剤をそのまま単独で用いることもできるが、薬学的に許容される医薬品添加剤を用いて医薬組成物の形態で供給することが好ましい。本明細書で言う薬学的に許容される製剤添加物としては、賦形剤、安定剤、保存剤、緩衝材、矯味剤、懸濁化剤、乳化剤、着香剤、溶解補助剤、着色剤、粘稠剤等を用いることができる。
【００２１】
本発明の抗線維症剤は、経口的、非経口的のいずれか、または両方で投与することができる。経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、吸入剤、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤等を挙げることができるが、本発明の薬剤の形態はこれらに限定されることはない。
【００２２】
本発明の抗線維症剤は、ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。本発明の薬剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路等の条件に応じて決定される。本発明の抗線維症剤の成人一日あたりの投与量は、通常、０．００１ｍｇ／ｋｇ以上２０００ｍｇ／ｋｇ以下の範囲であり、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ以上５００ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ以上２００ｍｇ／ｋｇ以下、さらに好ましくは、１ｍｇ／ｋｇ以上１００ｍｇ／ｋｇ以下である。本発明の抗線維症剤は、毎日投与することもでき、１日から４日の間隔で投与することもできる。
【実施例】
【００２３】
実験方法
「細胞培養」
ヒト肺線維芽細胞（ＨＦＬ１）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１５３）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、６６．７μｇ／ｍＬペニシリンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、９５％ａｉｒ−５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。
【００２４】
「ウェスタンブロット」
６ウェルプレートにＨＦＬ１細胞を、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、１０％ＦＢＳを含む２．０ｍＬのＤＭＥＭで７０％コンフルエントとなるよう培養した。０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（４．２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．３６ｍＭ  ＫＣｌ、０．４ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．３４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、５．５５ｍＭ  グルコース、０．４４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．７２ｍＭ  ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ、ｐＨ＝７．４）で洗浄し、０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭで４８時間無血清培養した。
その後、０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭに培地交換し、各試薬で一定時間刺激を行った後（各阻害剤は刺激剤の３０分前処置）、プロテアーゼ阻害剤として１０μｇ／ｍＬアプロチニン、１０μｇ／ｍＬロイペプチン、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む１００μＬ  ＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＮａＦ、１０ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム二塩基性、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム、０．５％  デオキシコール酸ナトリウム、ｐＨ８．０）で氷上回収した。
【００２５】
ボルテックス法により細胞を破砕し、１５０００ｒｐｍ、４℃、３０ｍｉｎの条件で遠心をかけて上清をサンプルとした。ブラッドフォード法によりタンパク定量を行い、一定量のタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。タンパク質を、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に転写し、ブロッキングを室温、１時間、１次抗体を４℃、オーバーナイト、２次抗体を室温、１時間の条件で施した。各抗体ごとの条件を表１に示す。
その後、ＰＶＤＦ膜をＥＣＬ液に浸し、画像撮影解析システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、装置名：ＣｈｅｍｉＤｏｃＭＰシステム）にて蛍光を検出した。検出されたバンドの数値化は、画像処理ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ）を用いて行った。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
「免疫蛍光染色試験」
３．５ｃｍガラスボトムディッシュにＨＦＬ１細胞を、１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈとなるように播種し、１０％ＦＢＳを含む２．０ｍＬのＤＭＥＭで７０％コンフルエントとなるように培養した。０．１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで洗浄し、０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭで４８時間無血清培養した。
その後、０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭに培地交換し、各試薬で一定時間刺激を行った後（各阻害剤は、刺激剤の３０分前処置）、各サンプルを４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で、４℃、１５分間固定した。その後、適宜透過化（０．３％サポニン、室温、１時間）ブロッキング（３％ＢＳＡ、室温、１時間）、１次抗体を４℃、オーバーナイト、２次抗体を室温、１時間の条件で施した。Ｓｍａｄ、リン酸化Ｓｍａｄ免疫染色時は、その後、リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）（２００μｇ／ｍＬ、室温、３０分間）、プロピジウムイオダイド（ＰＩ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）（２０μｇ／ｍＬ、室温、３０分間）を施して核を染色し、染色像を共焦点顕微鏡（オリンパス株式会社製、装置名：ＦＶ５００）で観察した。
【００２８】
「ラクトシルセラミド合成活性試験」
実験は、Chatterjee S, Pandey A. The Yin and Yang of lactosylceramide metabolism: implications in cell function. Biochim Biophys Acta. 2008 Mar; 1780 (3): 370-82.を参考に行った。
１０ｃｍディッシュにＨＦＬ１細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ播種し、１０％ＦＢＳを含む８ｍＬのＤＭＥＭで７０％コンフルエントとなるよう培養した。０．１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで洗浄し、０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭで４８時間無血清培養した。その後、０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭに培地交換し、各試薬で一定時間刺激を行った後（各阻害剤は刺激剤の３０分前処置）、細胞をリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬ／ｄｉｓｈで回収し遠心（４℃、３０００ｒｐｍ、１０分間）、得られたペレットを反応バッファー（１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２０ｍＭ  カコジル酸ナトリウム三水和物、０．００６７％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．０１２５％  ＮＰ−４０）１００μＬ／ｔｕｂｅで懸濁し、超音波で細胞を破砕した。
【００２９】
サンプルをタンパク定量後、５０μＬのサンプルに対し、３００μＭ  ガラクトシルセラミド、１００μＭ  ウリジン二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ、うち［３Ｈ］ＵＤＰ−Ｇａｌを７．５×１０５ｄｐｍ含む）、反応バッファーを加え、ｆｉｎａｌ  １００μＬ／ｔｕｂｅとした。この反応サンプルを３７℃、２時間インキュベートし、ｆｉｎａｌ  ５０ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡを加え反応を停止させた。その後サンプルをブライダイヤー法により脂質抽出し、全脂質をＴＬＣ（クロロホルム：メタノール：水＝１００：４２：６）で展開した。分離された脂質をヨウ素ガスで染め、ラクトシルセラミド標品と同じ位置にあるシリカゲルを掻き取り、その放射活性を液体シンチレーションカウンター（日立アロカメディカル株式会社製、装置名：アロカＬＳＣ−５１００）で測定し、ラクトシルセラミド合成量を算出した。なお、バックグラウンドのサンプルには、インキュベート時間が０時間のサンプルを用いた。
【００３０】
「データ処理」
平均値±標準誤差は、異なる３回以上の実験から求めた。２群間の有意差検定は、スチューデントの両側ｔ検定により行い、危険率５％未満のものを有意とみなした。
【００３１】
「実験１：ＴＧＦβ１のラクトシルセラミド合成活性に対する影響検討」
ＴＧＦβ１処置により、ラクトシルセラミド合成が増大するかについてｉｎ  ｖｉｔｒｏで検討した。結果を図２に示す。
ＨＦＬ１細胞に、ＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）を処置すると、刺激３０分でラクトシルセラミド合成酵素の活性が増大した。また、グルコシルセラミド合成酵素阻害剤であるＰＰＭＰ（３μＭ）、ＮＢ−ＤＮＪ（１００μＭ）を、ＴＧＦβ１刺激の３０分前に処置することにより、ラクトシルセラミド合成酵素の活性が有意に抑制された。
ＴＧＦβ１が、ラクトシルセラミド合成活性の増大を引き起こすこと、グルコシルセラミド合成酵素阻害剤によりその活性上昇が抑制されることが確かめられた。
【００３２】
「実験２：ラクトシルセラミドのαＳＭＡ発現に対する影響検討」
ＴＧＦβ１によるラクトシルセラミド合成活性の増大が、組織線維化に与える影響について、線維化のマーカータンパクであるαＳＭＡの発現量を元に検討した。結果を図３に示す。
ＨＦＬ１細胞に、ＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）を２４時間処置すると、αＳＭＡ発現量は有意に増大した。
グルコシルセラミド合成酵素阻害剤であるＰＰＭＰ（３μＭ）、ＮＢ−ＤＮＪ（１００μＭ）を、ＴＧＦβ１刺激の３０分前に処置することにより、αＳＭＡの発現量の増大が抑制された。さらにラクトシルセラミド（１０μＭ）とＰＰＭＰ、またはＮＢ−ＤＮＪを併用することにより、αＳＭＡ発現量の抑制作用が回復した（図３Ａ、Ｂ）。ＰＰＭＰとラクトシルセラミドを併用した場合、ＴＧＦβ１単独処置に比べ９５％ほどまで回復した。なお、ラクトシルセラミドに変えて、グルコシルセラミドを併用した場合も、αＳＭＡの発現量は８０％ほどまで回復した（図４）。
また、ラクトシルセラミドの前駆体であるグルコシルセラミド合成酵素（ＧＣＳ）をノックダウンすることにより、ＴＧＦβ１刺激によるαＳＭＡ発現量の増大は有意に抑制された（図３Ｃ）。
以上の結果から、ＴＧＦβ１には、ラクトシルセラミドの合成増大を介したシグナル経路が存在し、このシグナル経路により組織線維化（αＳＭＡの発現）が促進されることが確かめられた。また、このシグナル伝達は、細胞内ラクトシルセラミド量の増大を伴なうことが確かめられた。
【００３３】
「実験３：ラクトシルセラミドのＳｍａｄシグナルに対する影響の検討」
Ｓｍａｄ２／３は、転写因子であり、活性化ＴＧＦ−β受容体によって直接リン酸化を受け、核内移行することで、線維化に関わる分子の転写活性を促すことが知られている（非特許文献４）。
ラクトシルセラミドのＳｍａｄシグナルに対する影響を検討した。結果を図５、６に示す。
【００３４】
Ｓｍａｄ２／３のリン酸化レベルについて検討した結果、ＰＰＭＰ（３μＭ）を、ＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）処置の３０分前に処置したところ、経時的なＳｍａｄ２／３リン酸化レベルに変化は見られなかった（図５Ａ）。また、ラクトシルセラミド（１０μＭ）を細胞に単独処置した際も、Ｓｍａｄ２のリン酸化は生じなかった（図５Ｂ）。
一方、Ｓｍａｄ２／３の局在を観察したところ、ＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）単独刺激後３時間でＳｍａｄ２／３が核に集積した。しかし、ＰＰＭＰ（３μＭ）、ＮＢ−ＤＮＪ（１００μＭ）を前処置することで、Ｓｍａｄ２の核への集積が抑制された。さらに、ラクトシルセラミド（１０μＭ）とＰＰＭＰを併用することにより、ＰＰＭＰによる抑制作用が回復し、Ｓｍａｄ２が核に集積した（図６Ａ）。また、Ｓｍａｄ３に対しても同様の作用効果を示した（図６Ｂ）。
以上の結果から、ラクトシルセラミドは、Ｓｍａｄのリン酸化には影響を及ぼさないこと、ＴＧＦβ１によるＳｍａｄ２／３の核局在化を正に制御することが確認できた。
【００３５】
「実験４：ラクトシルセラミドのＰＫＣδへの影響検討」
ラクトシルセラミドがどのような細胞内シグナルを介しＳｍａｄの局在を制御するか検討した。
細胞膜上のラクトシルセラミドが引き起こす細胞内シグナルの一つに、ＰＫＣα／εの活性化が知られている（Chatterjee S, Pandey A. The Yin and Yang of lactosylceramide metabolism: implications in cell function. Biochim Biophys Acta. 2008 Mar; 1780 (3): 370-82.）。ＰＫＣは、タンパク質をリン酸化する酵素であり、全身の組織で発現しており、遺伝子発現、細胞増殖、細胞死等、多様な生物活性に関与している。ＰＫＣは、活性化にジアシルグリセロールとＣａ２＋とを必要とする「ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ＰＫＣ」、ジアシルグリセロールのみを必要とする「ｎｏｂｅｌ  ＰＫＣ」、その他の機構により活性化する「ａｔｙｐｉｃａｌ  ＰＫＣ」の三種に分類される。哺乳類のＰＫＣは、α、βＩ、βＩＩ、γ、δ等、１０種類のアイソフォームが知られている。
【００３６】
本発明者らは、ラクトシルセラミドはＰＫＣδの活性化を通じて、ＴＧＦβ１によるＳｍａｄ２／３の局在制御を制御するという仮説を立て、検討を行った。結果を図７に示す。図７において、上段の写真の中で、白四角で囲んだ部分を拡大したものが、下段の写真である。
一般的に、ＰＫＣの活性化は、細胞膜への移行により観察されるため、ＰＫＣδの細胞膜への移行を指標としてラクトシルセラミドの関与を検討した。
細胞にＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）を処置すると、２時間後にＰＫＣδの細胞膜への移行が生じた。しかし、ＰＰＭＰ（３μＭ）やＰＫＣδ阻害剤であるＲｏｔｔｌｅｒｉｎ（１μＭ）を前処置することにより、ＰＫＣδの細胞膜への移行が抑制された（図７Ａ）。加えて、ラクトシルセラミド（１０μＭ）の単独刺激においても、刺激後５分でＰＫＣδの細胞膜への移行が観察され、ＰＫＣδの細胞膜上における局在は少なくとも３０分持続した（図７Ｂ）。
以上の結果から、ＴＧＦβ１によりＰＫＣδが活性化すること、この活性化にはラクトシルセラミドが介在することが確かめられた。
【００３７】
「実験５：ＰＫＣδのＴＧＦβ１／Ｓｍａｄシグナルに対する影響の検討」
ＰＫＣδのＴＧＦβ１シグナルに対する関与を検討した。結果を図８〜１１に示す。
まずαＳＭＡ発現に対するＰＫＣδの関与を検討した。ＰＭＡ（ホルボールミリスタートアセテート）をｏｖｅｒｎｉｇｈｔで処置することにより、ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ＰＫＣ、ｎｏｖｅｌ  ＰＫＣのダウンレギュレーションを引き起こすことが知られてい
る。
ＰＭＡ（１００ｎＭ）処置により、ＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）によるαＳＭＡの発現量の増大が抑制された（図８）。
【００３８】
ＰＫＣα／β／δ／γなどを阻害するＧＦ１０９２０３Ｘ（１０μＭ）、ＰＫＣδ阻害剤であるＲｏｔｔｌｅｒｉｎ（１μＭ）をＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）刺激３０分前に処置することでも、ＴＧＦβ１によるαＳＭＡ発現量の増大は有意に抑制された。一方、ＰＫＣδを阻害せず、ＰＫＣα／βを阻害するＧＯ６９７６（ＯはＯウムラウトである）（０．５μＭ、１．０μＭ）を細胞に処置しても、αＳＭＡ発現量の増大は抑制されなかった（図９）。
続いて、ＰＫＣδのＳｍａｄ２に与える影響を検討したところ、ＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）によるＳｍａｄ２の核局在化は、ＧＦ１０９２０３Ｘ（１０μＭ）およびＲｏｔｔｌｅｒｉｎ（１μＭ）の処置で有意に抑制されたが、ＧＯ６９７６（ＯはＯウムラウトである）（１μＭ）の処置では変化がなかった（図１０）。
また、ＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）処置によるＳｍａｄ２のリン酸化レベルについては、ＧＦ１０９２０３Ｘ（１０μＭ）、Ｒｏｔｔｌｅｒｉｎ（１μＭ）を処置しても変化が確認されなかった（図１１）。
以上の結果より、ラクトシルセラミドによるＳｍａｄ核局在化の制御にはＰＫＣδが介在していることが確認できた。また、ＰＫＣδがＳｍａｄ２のリン酸化に関与しないことが確かめられた。
【００３９】
「実験６：ＲＯＣＫ経路のＴＧＦβ１／Ｓｍａｄシグナルに対する影響の検討」
ＰＫＣδがＳｍａｄを制御する機序として、ＲＯＣＫ経路を介しＳｍａｄの脱リン酸化酵素を負に制御することが報告されている（Lin X, Duan X, Liang YY, Su Y, Wrighton KH, Long J, Hu M, Davis CM, Wang J, Brunicardi FC, Shi Y, Chen YG, Meng A, Feng XH. PPM1A functions as a Smad phosphatase to terminate TGFbeta signaling. Cell. 2006 Jun 2; 125 (5): 915-28）。
本研究でも同様の経路が存在すると仮定し、ＲＯＣＫ阻害剤のＹ２７６３２やＲＯＣＫ下流のアクチン重合を阻害するＣｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ  Ｂを用い、αＳＭＡ発現量を検討した。結果を図１２、１３に示す。
【００４０】
Ｙ２７６３２（１０μＭ、２０μＭ：ウェスタンブロットは１０μＭ）、Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ  Ｂ（２μＭ）によりＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）によるαＳＭＡ発現量の増大が抑制された（図１２）。
また、Ｙ２７６３２（２０μＭ）、Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ  Ｂ（２μＭ）のＳｍａｄ２に対する影響を検討したところ、ＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍＬ）によるＳｍａｄ２の核内移行は抑制されたが、リン酸化レベルには変化が見られなかった（図１３）。
このことから、ＲＯＣＫがＳｍａｄ核局在化に介在していることが確認できた。また、ＲＯＣＫがＳｍａｄ２のリン酸化に関与しないことが確かめられた
【００４１】
「実験７：患者由来肺線維芽細胞の樹立」
「患者由来肺繊維芽細胞」
重篤な上葉限局型肺線維症（ｐｌｅｕｒｏｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ  ｆｉｂｒｏｅｌａｓｔｏｓｉｓ）のために肺移植を受けた１９歳の男性患者の肺組織を手術後に得た。
肺組織を細断し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）ですすいだ後、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩ型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ、ＵＳＡ）、０．５ｍｇ／ｍｌディスパーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２Ｕ／ｍｌ  ＤＮアーゼ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンで、３７℃で１５分間穏やかに振とうしながらインキュベートした。
ＤＭＥＭで２回洗浄した後、８０ｃｍ２培養フラスコに移し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
細胞の増殖は、培養培地を４日毎に交換しながら、毎週確認した。フラスコがコンフルエントに達した後、継代０の細胞として採取し、３回継代した細胞を患者由来肺繊維芽細胞として実験に使用した。
【００４２】
「細胞培養」
患者由来肺線維芽細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、６６．７μｇ／ｍＬペニシリンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、９５％ａｉｒ−５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。
【００４３】
「ウエスタンブロット」
６ウェルプレートに患者由来肺線維芽細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、１０％ＦＢＳを含む２．０ｍＬのＤＭＥＭで９０−９５％コンフルエントとなるよう培養した。その後、ＰＰＭＰ（０．５μＭ、１．０μＭ）、またはＮＢ−ＤＮＪ（１００μＭ、２００μＭ）を加えて４８時間培養し、プロテアーゼ阻害剤として１０μｇ／ｍＬアプロチニン、１０μｇ／ｍＬロイペプチン、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む１００μＬ  ＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＮａＦ、１０ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム二塩基性、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム、０．５％  デオキシコール酸ナトリウム、ｐＨ８．０）で氷上回収した。
【００４４】
ボルテックス法により細胞を破砕し、１５０００ｒｐｍ、４℃、３０ｍｉｎの条件で遠心をかけて上清をサンプルとした。ブラッドフォード法によりタンパク定量を行い、一定量のタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。タンパク質を、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に転写し、ブロッキングを室温、１時間、１次抗体を４℃、オーバーナイト、２次抗体を室温、１時間の条件で施した。各抗体ごとの条件を表２に示す。
その後、ＰＶＤＦ膜をＥＣＬ液に浸し、画像撮影解析システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、装置名：ＣｈｅｍｉＤｏｃＭＰシステム）にて蛍光を検出した。検出されたバンドの数値化は、画像処理ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ）を用いて行った。結果を図１４に示す。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
患者由来肺線維芽細胞において、ＰＰＭＰ、ＮＢ−ＤＮＪにより、αＳＭＡの発現が抑制されることが確認できた（図１４）。
【００４７】
「実験８：ブレオマイシン誘発性肺線維症モデルマウス」
「モデルマウスの作製」
エーテル・アベルチン麻酔下においてＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、８〜１２週齢）の気管支から３ｍｇ／ｋｇブレオマイシン塩酸塩／生理食塩水（日本化薬株式会社）を５０μＬ投与することにより、肺線維症モデルマウスを作製した。ブレオマイシン塩酸塩を処置しない群にはコントロールとして生理食塩水を５０μＬ同様に投与した。
【００４８】
「ＮＢ−ＤＮＪの経気管投与」
ブレオマイシン投与後７、８、９日後にエーテル・アベルチン麻酔下のマウスの気管内に２０ｍｇ／ｋｇのＮＢ−ＤＮＪ／生理食塩水を５０μＬ経気管投与した。ＮＢ−ＤＮＪを投与しないマウスにはコントロールとして生理食塩水を５０μＬ経気管投与した。
【００４９】
「ＮＢ−ＤＮＪの経口投与」
ブレオマイシン投与後７〜１３日にかけて、６００ｍｇ／ｋｇのＮＢ−ＤＮＪ／生理食塩水を０．２ｍＬ連日経口投与した（１日１回）。ＮＢ−ＤＮＪを投与しないマウスにはコントロールとして生理食塩水を０．２ｍＬ経口投与した。
【００５０】
「肺の摘出」
ブレオマイシン投与後１４日目に、エーテル深麻酔下において、マウスを開胸し、注射針を用いてＰＢＳを左心室から全身灌流したのち、同様に右心室から肺の脱血を行い、肺を摘出した。
【００５１】
「ウエスタンブロット」
経気管投与群のマウスについて、肺をフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む２５０μＬ  ＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＮａＦ、１０ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム二塩基性、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム、０．５％  デオキシコール酸ナトリウム、ｐＨ８．０）中で細断した。その後、ホモジナイザーによりさらに組織を細かくし、１５０００ｒｐｍ、４℃、３０ｍｉｎ遠心した。
【００５２】
ボルテックス法により細胞を破砕し、１５０００ｒｐｍ、４℃、３０ｍｉｎの条件で遠心をかけて上清をサンプルとした。ブラッドフォード法によりタンパク定量を行い、一定量のタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。タンパク質を、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に転写し、αＳＭＡ抗体について、上記表２と同様にして、ブロッキングを室温、１時間、１次抗体を４℃、オーバーナイト、２次抗体を室温、１時間の条件で施した。
その後、ＰＶＤＦ膜をＥＣＬ液に浸し、画像撮影解析システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、装置名：ＣｈｅｍｉＤｏｃＭＰシステム）にて蛍光を検出した。検出されたバンドの数値化は、画像処理ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ）を用いて行った。結果を図１５に示す。
【００５３】
ブレオマイシンによりαＳＭＡが発現すること、ブレオマイシン存在下において、ＮＢ−ＤＮＪによりαＳＭＡの発現が抑制されることが確認できた（図１５）。
【００５４】
「肺切片の作製」
肺を４％パラホルムアルデヒドに浸し、４℃で一晩固定した。その後、３０％スクロース／ＰＢＳ溶液中で４℃で２日間脱水した。組織を取り出し、ＯＣＴコンパウンドを用いて包埋し、−８０℃で保存した。クライオスタットを用いて５μｍの厚さの切片を作製し、切片をＡＰＳコートスライドガラスに貼付した。十分に乾燥させた後、スライドガラスはアッセイに用いるまで４℃で保存した。
【００５５】
「ヘマトキシリン・エオジン染色」
切片を貼付したスライドガラスをＰＢＳに１０ｍｉｎ浸すことで、ＯＣＴコンパウンドを洗い流した。２ｇ／Ｌ  マイヤー・ヘマトキシリン溶液に３０ｍｉｎ浸漬したのち、水道水で５ｍｉｎ流水水洗することで色出しを行った。その後、０．２％  エオシンＹ／エタノール溶液に３０ｍｉｎ浸漬した。染色の分別の為、８０％エタノール、９０％エタノール、１００％エタノール、５０％エタノール／５０％キシレン、１００％キシレンで５回ずつ脱色を行い、Ｅｕｋｉｔ液を用いてカバーガラスで封入した。なお、ヘマトキシリン・エオジン染色は、組織の形態を観察する方法であり、ヘマトキシリンは細胞の核を染色し、エオジンは細胞質を染色する。経気管投与群について、染色した肺切片の顕微鏡画像とＡｓｈｃｒｏｆｔ  ｓｃｏｒｅを、図１６に示す。また、経口投与群について、染色した肺切片の顕微鏡画像を、図１７に示す。
【００５６】
ＮＢ−ＤＮＪの経気管投与、経口投与により、ブレオマイシンに誘発される肺線維化が抑制できることが確かめられた（図１６、１７）。このことから、ＮＢ−ＤＮＪは、Ｓｍａｄシグナルを阻害することにより、抗線維化作用を発揮することが推測される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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