(57)【要約】【課題】正確に希釈倍率を求めて成分の定量分析をする血液分析方法及び血液検査キットを提供すること。【解決手段】採取された血液検体を希釈液で希釈する工程と、血液中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定する工程と、血液検体中の対象成分の濃度を分析する工程とを含む、血液分析方法であり、血液分析方法が、希釈液が収納された第一の収容器具と、血液を採取する採取器具と、希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具と、分離器具を保持するための保持器具と、回収した血漿を収容するための第二の収容器具とからなる群により選択される部材を用いる血液分析方法であって、希釈液由来の標準成分量、及び／又は、希釈液中に含まれうる部材の少なくとも１つに由来する標準成分の量を予め算出した上で希釈倍率を補正する、血液分析方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
採取された血液検体を希釈液で希釈する工程と、
血液中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定する工程と、
血液検体中の対象成分の濃度を分析する工程と、
を含む、血液分析方法であり、
前記血液分析方法が、
前記希釈液が収納された第一の収容器具と、
前記血液を採取する採取器具と、
前記希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具と、
前記分離器具を保持するための保持器具と、
回収した血漿を収容するための第二の収容器具と、
からなる群により選択される部材を用いる血液分析方法であって、
前記希釈液由来の標準成分量、及び／又は、前記希釈液中に含まれうる前記部材の少なくとも１つに由来する前記標準成分の量を予め算出した上で前記希釈倍率を補正する、血液分析方法。
【請求項２】
前記部材の少なくとも１つが、分離器具である、請求項１に記載の血液分析方法。
【請求項３】
前記分離器具がガラス繊維で構成されている、請求項２に記載の血液分析方法。
【請求項４】
血液中に恒常的に存在する前記標準成分が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンである、請求項１から３のいずれか一項に記載の血液分析方法。
【請求項５】
血液中に恒常的に存在する前記標準成分が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンと、さらに、別の血液中に恒常的に存在する標準成分である、請求項１から４のいずれか一項に記載の血液分析方法。
【請求項６】
前記別の標準成分が、総タンパク又はアルブミンである、請求項５に記載の血液分析方法。
【請求項７】
採取された血液検体を希釈液で希釈する工程の後に、血液検体を希釈した希釈液を輸送する工程を有し、
前記輸送工程の環境履歴の影響を考慮して、前記希釈液由来の標準成分量、及び／又は、前記希釈液中に含まれうる前記部材の少なくとも１つに由来する前記標準成分の量を予め算出した上で前記希釈倍率を補正する、請求項１から６のいずれか一項に記載の血液分析方法。
【請求項８】
前記希釈液の容量が、血漿の容量の４倍以上である、請求項１から７のいずれか一項に記載の血液分析方法。
【請求項９】
希釈液が収納された第一の収容器具と、血液を採取する採取器具と、前記希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具と、前記分離器具を保持するための保持器具と、回収した血漿を収容するための第二の収容器具とを含む、請求項１から８の何れか１項に記載の血液分析方法において使用するための血液検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量の血液検体中の対象成分を分析するための、血液分析方法及び血液検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、採血には、医師等一定の有資格者が注射器を用いて静脈から血液を採取する一般採血と、検査対象者が、自分の手の指等に採血針を刺して血液を採取する自己採血とがある。
【０００３】
一般採血により採取された血液は、採取容器に密閉された状態で医療機関又は検査機関に輸送され、そこで検査が行われている。血液を血球と血漿とに分離せずに輸送する場合には、医療機関又は検査機関にて遠心分離機により血液を血球と血漿とに分離した後に検査が行われる。また、検査対象者が行う自己採血では、採血後の血液は分離膜により血球と血漿とに分離され、この分離された状態で検査場所に輸送され、そこで検査が行われる。
【０００４】
特許文献１には、自己採血により採取された血液検体の検査方法が記載されている。具体的には、１）容量を定量することなしに採取した定量すべき成分を含有する未知容量の生体試料と一定量の指示物質を含有する一定量の水性溶液とからなる定量用試料を調製する工程、２）一定量の指示物質を含有する一定量の水性溶液中の指示物質の濃度（Ｃ1）と定量用試料中の指示物質の濃度（Ｃ2）とから生体試料の希釈倍率（ａ）を求める工程、３）定量用試料中の定量すべき成分の濃度（Ｙ）を求める工程、４）上記２）で求めた生体試料希釈倍率（ａ）と上記３）で求めた定量用試料中の定量すべき物質の濃度（Ｙ）とから生体試料中の定量すべき成分を決定する工程を含む生体試料中の定量すべき成分の定量方法が記載されている。
【０００５】
特許文献２には、検体中の分析対象成分量を測定し、さらに、これ以外の恒常的に検体中に元来存在する標準成分の量を測定し、この標準成分の量と、検体中での標準成分の既知濃度とから検体の量を決定し、この検体量と、分析対象成分量とから、検体中の分析対象成分の濃度を決定する定量分析法が記載されている。
【０００６】
また、特許文献３には、血液希釈定量器具を用いてヒトや動物から微量血液を採取しそのまま又は希釈したのち一定量を他の機器や容器又は直接試薬に供給することが記載されている。さらに特許文献４には、希釈用水溶液中の指示物質の吸光度を利用して、生物学的試料中の定量すべき成分の濃度を定量する方法が記載されている。
【０００７】
一方、血液検体を検査対象者が採取する際には、小型ナイフが具備されたランセットにて採取し、血液中の任意成分の濃度の定量に使用されているが、通常１００μＬ以上の血液検体を採取することが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−１６１７２９号公報
【特許文献２】特開２００１−３３０６０３号公報
【特許文献３】特開２００９−１２２０８２号公報
【特許文献４】特開２００９−１０９１９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１に記載の方法においては、血液検体が微量である場合には、血液検体量に対する希釈液の割合を高くすることが必要になる。しかし、この場合、血液検体を希釈する前後での希釈液の体積変化率が非常に小さくなるため、内部標準物質の濃度の変化率が小さくなり、測定値の繰り返し再現性が低下するという問題がある。
【００１０】
特許文献２には、健常者全血約１００μＬを多孔質膜に滴下し、血球を分離して血清を展開した後に、１５０μＬの生食等張ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：  ｐＨ７．４）を添加して得た液を遠心分離して得られた上清を分析試料として分析しているが、１００μＬ未満の採血については記載されていない。
【００１１】
特許文献３の方法では、１０μＬの血液量をマイクロピペットで正確に採取して分析しているが、採血に不慣れな患者が採取する場合には一定量を正確に採取することは難しく、誤差を含む採血で検査をした場合には測定値に誤差が含まれる結果となる。
【００１２】
特許文献４に記載の測定方法は希釈倍率が１０倍程度の測定であり、希釈倍率をさらに高めて希釈血液量を十分に確保する場合には、特許文献１と同様に、測定値の繰り返し再現性が低下するという問題がある。
【００１３】
上述の通り、微量の血液検体を使用する場合について測定値の繰り返し再現性が高い血液分析方法が望まれている。本発明者らは、分析を精度高く行う為には、従来から提案されている内部標準物質を用いることでは充分ではないと考え、外部標準物質を用いる方法を検討した。
【００１４】
本発明は、微量血液を希釈液で希釈して成分を定量分析する方法として、血液中に恒常的に存在する標準成分を用いて血液検体中の対象成分の濃度を分析する方法において、希釈液に由来する標準成分、及び、血液検査キットの部材から希釈液中に溶出する標準成分濃度を予め算出した上で補正することにより、例えば、特許文献１及び特許文献２の従来技術にはない精度で、正確に希釈倍率を求めて成分の定量分析をする血液分析方法及び血液検査キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、採取された血液検体を希釈液で希釈し、血液中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定し、血液検体中の対象成分の濃度を分析する血液検査キットにおいて、希釈液に由来する標準物質の量、及び、血液分析を行う部材に由来する標準物質の量を予め算出し、その算出した値から希釈倍率を補正する方法によって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
【００１６】
（１）  採取された血液検体を希釈液で希釈する工程と、
血液中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定する工程と、
血液検体中の対象成分の濃度を分析する工程と、
を含む、血液分析方法であり、
上記血液分析方法が、
上記希釈液が収納された第一の収容器具と、
上記血液を採取する採取器具と、
上記希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具と、
上記分離器具を保持するための保持器具と、
回収した血漿を収容するための第二の収容器具と、
からなる群により選択される部材を用いる血液分析方法であって、
上記希釈液由来の標準成分量、及び／又は、上記希釈液中に含まれうる上記部材の少なくとも１つに由来する上記標準成分の量を予め算出した上で上記希釈倍率を補正する、血液分析方法。
（２）  上記部材の少なくとも１つが、分離器具である、（１）に記載の血液分析方法。
（３）  上記分離器具がガラス繊維で構成されている、（２）に記載の血液分析方法。
（４）  血液中に恒常的に存在する上記標準成分が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンである、（１）から（３）のいずれか一に記載の血液分析方法。
（５）  血液中に恒常的に存在する上記標準成分が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンと、さらに、別の血液中に恒常的に存在する標準成分である、（１）から（４）のいずれか一に記載の血液分析方法。
（６）  上記別の標準成分が、総タンパク又はアルブミンである、（５）に記載の血液分析方法。
（７）  採取された血液検体を希釈液で希釈する工程の後に、血液検体を希釈した希釈液を輸送する工程を有し、
上記輸送工程の環境履歴の影響を考慮して、上記希釈液由来の標準成分量、及び／又は、上記希釈液中に含まれうる上記部材の少なくとも１つに由来する上記標準成分の量を予め算出した上で上記希釈倍率を補正する、（１）から（６）のいずれか一に記載の血液分析方法。
（８）  上記希釈液の容量が、血漿の容量の４倍以上である、（１）から（７）のいずれか一に記載の血液分析方法。
（９）  希釈液が収納された第一の収容器具と、血液を採取する採取器具と、上記希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具と、上記分離器具を保持するための保持器具と、回収した血漿を収容するための第二の収容器具とを含む、（１）から（８）の何れか一に記載の血液分析方法において使用するための血液検査キット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の血液分析方法及び血液検査キットによれば、血液中に恒常的に存在する標準成分を用いて血液検体中の対象成分の濃度の分析を精度よく行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明の実施の態様に係る血液検査キットの断面図である。
【図２】図２は、希釈液へのナトリウムイオンの許容溶出濃度（希釈液に溶出する許容溶出濃度）を算出した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。なお、Ｘ〜Ｙで示される範囲は、上限Ｘと下限Ｙの値を含む。血液中に恒常的に存在する標準成分のことを、外部標準物質又は外部標準ということがある。また、血液中に存在しない標準成分のことを、内部標準物質又は内部標準ということがある。
【００２０】
微量の血液を採取する方法として濾紙を用い血液分析を行う方法が特開平１０−１０４２２６号公報に開示されている。また濾紙の代わりに血液保持性の高い多孔質材を用いる方法が特許文献２に開示されている。これらの方法では、素材に吸収された血液成分を緩衝液などで抽出して測定することになるため、血液に恒常的に存在する外部標準物質であるナトリウムイオン、塩化物イオン、カルシウムイオン、蛋白などを、血液を溶出して再溶解した場合の緩衝液による希釈率を見積もる基準物質として用いる。しかしながらこれらの方法では、血液の採取量はさまざまで、採取した血液の希釈率が高くなってしまうとその後の分析精度が下がるため結果がばらつき、また、一旦血液を凝集させて固化するために分析対象となる成分の安定性の保証が不十分であった。また、乾燥した試料から生体成分を抽出する緩衝液は、ｐＨ調整や生体成分安定化のためにＮａＯＨやＮａＣｌ、ＨＣｌを添加した緩衝液を利用する必要がある。このため、試料の成分で比較的高い濃度で存在し、恒常性があり、個体間差が少ないナトリウムイオンや塩化物イオンの濃度を外部標準として、希釈された元の他の生体成分濃度の補正をすることに利用できないという問題があった。
【００２１】
一方、採取した微量血液を内部標準入り緩衝液で希釈し、内部標準物質の希釈倍数から希釈血漿中の未知量の存在する成分量を定量する方法として特許文献１に記載の方法が開示されている。内部標準物質としてはＮ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン・ナトリウム塩（ＨＳＤＡ）、あるいはアシッドブルー９（ブリリアントブルーＦＣＦ）が利用されており、血液を安定に保持するための緩衝剤や防腐剤が用いられている。このような処方は、血液を凝固させないことでその成分の安定性を維持することを実現したが、やはり血液採取量がばらつき、採取量が少ない場合には、希釈後の内部標準物質の希釈率が小さくなることや、血液成分量そのものが低下する為に、検査精度の信頼性が低下することが問題であった。また、緩衝液で希釈する方法は生体成分がｐＨ７．４の生理的条件の緩衝液で保存され、輸送中の安定性にも優れているが、内部標準添加緩衝液への試料による内部標準の希釈率が小さく、少ない試料添加では測定誤差が生じ易い問題があった。
【００２２】
さらにこれら先行技術の実施例では、抽出する緩衝液にはリン酸緩衝生理食塩水が生体成分の安定保持に優れているので利用されているが、リン酸緩衝生理食塩水にはナトリウムイオンや塩化物イオンが含まれている。そのためナトリウムイオンや塩化物イオンは外部標準として利用できず、カルシウムイオン、蛋白等が利用されている。従って、微量血液での血液検査を精度高く行う為には、従来技術にあるように希釈率を補正する外部標準物質の使用や、従来提案されている内部標準物質を含有する緩衝液の使用では検査精度の確保が充分でなかった。
【００２３】
また、血液中の恒常性物質とはいえ、例えば、ナトリウムイオンにおいては、正常値１３４〜１４６ｍｍｏｌ／Ｌの分布の幅を有するため、より正確な希釈倍率を算出することが必要となる。希釈倍率の精度が低下すると検査精度に悪影響を与えて、検査の信頼性を損なうリスクが高まってしまう。特に、キットを構成する部材から緩衝液中に溶出する外部標準物質による汚染（いわゆるコンタミ）が多少なりともあった場合に、血液採取量が多かったり少なかったりすると、コンタミの希釈倍率算出に与える影響度が異なってしまう。特許文献２には、このようなキットを構成する部材から緩衝液中に溶出する外部標準物質のコンタミの希釈倍率算出に与える影響度を一定にすることに関しては、一切言及していない。
【００２４】
また、特許文献１には、内部標準に関する記載はあるが、外部標準と併用することに関する記載はない。従って、外部標準のコンタミに関する記載はなく、コンタミを防止するための具体的な手段は一切提案されていない。
【００２５】
本発明は、微量血液検体を緩衝液で希釈して対象成分の濃度を分析するための分析方法であって、血液中に恒常的に存在する外部標準を用いて対象成分の分析を行うに際して、従来技術にはない精度で希釈倍率を求めることができる、血液分析方法を提供することを目的とする。そのための解決手段として、希釈液由来の標準成分量、及び／又は、希釈液中に含まれうる所定の部材の少なくとも１つに由来する標準成分の量を予め算出した上で希釈倍率を補正するものである。
【００２６】
本発明により、血液中の分析対象成分を測定する測定方法において、患者自らが血液を採血する場合に微量な血液成分を希釈液に投入して希釈したときに、希釈液由来の標準物質、あるいは合成樹脂（なお本明細書では、プラスチックを合成樹脂と同義に用いている。）、ガラス又はゴムを素材とするキットを構成する部材由来の希釈液に混入する標準物質の量を事前に把握して、希釈倍率を補正することにより、分析対象成分の定量を精度よく行うことができる測定方法、あるいは、測定方法を使用した血液検査システムを実現することが可能となる。
【００２７】
［１］血液分析方法
本発明の血液分析方法は、
採取された血液検体を希釈液で希釈する工程と、
血液中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定する工程と、
血液検体中の対象成分の濃度を分析する工程と、
を含む、血液分析方法であり、
上記血液分析方法が、
上記希釈液が収納された第一の収容器具と、
上記血液を採取する採取器具と、
上記希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具と、
上記分離器具を保持するための保持器具と、
回収した血漿を収容するための第二の収容器具と、
からなる群により選択される部材を用いる血液分析方法であって、
上記希釈液由来の標準成分量、及び／又は、上記希釈液中に含まれうる上記部材の少なくとも１つに由来する上記標準成分の量を予め算出した上で上記希釈倍率を補正することにより血液検体中の対象成分を分析する。
【００２８】
血液検体中の対象成分の濃度を分析するとは、対象成分の濃度を決定すること（即ち、対象成分を定量すること）、又は対象成分の濃度が所定の基準値以上であるか所定の基準値以下であるかを決定することなどを包含し、分析の形態は特に限定されない。
【００２９】
〔採血方法と量〕
本発明では、血液検体を採取して、血液検体中の対象成分を分析する。本発明の血液分析方法における血液の採取は、対象者自身が行ってもよく、医師等の有資格者が行ってもよい。
【００３０】
好ましい態様では、患者本人が、ランセットなどのナイフ付の器具を用いて指先などを傷つけて皮膚外にでた血液を採取する。患者の負担を減らすために、侵襲性低く血液を採取することが好ましく、血液を採取するときに無痛、あるいは、痛みが非常に少ない状態で採血できることがより好ましく、その場合、傷の深さ、大きさは小さいことが望ましく、採取できる血液も非常に少なくなる。従って、本発明の血液検査キットで採取される検体の容量（すなわち、採血量）は１００μＬ以下であることが好ましい。このように少ない患者の採血量でも、本発明では、血液分析方法に用いられる希釈液、あるいは血液検査キットの部材から、希釈液中に溶出しうる血液に恒常的に存在する標準成分濃度を予め算出し希釈倍率を補正すること、また、血液に恒常的に存在する標準成分として、例えば、ナトリウムイオン、又は塩化物イオンを用いることで、測定精度よく分析対象物を測定するための方法を提供することが可能となる。
【００３１】
〔血液に恒常的に存在する標準成分〕
上記のように、血漿成分の希釈倍率の高い希釈血漿の希釈後の対象成分について、希釈前の血液の血漿中に存在する濃度を正確に分析するためには、希釈液中にあらかじめ存在する物質の濃度の変化率から求める方法では、濃度の変化の割合が非常に小さくなるために測定誤差が大きく、また、測定の再現性が悪化する弊害がある。従って本発明の血液分析方法は、血液中に恒常的に存在する標準成分を用いて血液検体中の対象成分の濃度を分析する血液分析方法である。
【００３２】
ここで、標準成分を「用いて」とは、標準成分についての標準値（恒常値）に基づき、対象成分の濃度を分析するための希釈倍率を決定する意である。したがって、血液中に恒常的に存在する標準成分を用いて血液検体中の対象成分の濃度を分析することは、血液中に恒常的に存在する標準成分の恒常値（標準値）に基づき希釈倍率を決定し、対象成分の濃度を分析することでもある。
【００３３】
血液中に恒常的に存在する標準成分は、例えば、ナトリウムイオン、塩化物イオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、総タンパク、及びアルブミン等が挙げられる。血液検体の血清及び血漿中に含まれるこれらの標準成分の濃度は、ナトリウムイオン濃度は、１３４〜１４６ｍｍｏｌ／Ｌ（平均値：１４２ｍｍｏｌ／Ｌ）、塩化物イオン濃度は、９７〜１０７ｍｍｏｌ／Ｌ（平均値：１０２ｍｍｏｌ／Ｌ）、カリウムイオン濃度は、３．２〜４．８ｍｍｏｌ／Ｌ（平均値：４．０ｍｍｏｌ／Ｌ）、マグネシウムイオン濃度は、０．７５〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌ（平均値：０．９ｍｍｏｌ／Ｌ）、カルシウムイオン濃度は、４．２〜５．１ｍｍｏｌ／Ｌ（平均値：４．６５ｍｍｏｌ／Ｌ）、総タンパク濃度は、６．７〜８．３ｇ／１００ｍＬ（平均値：７．５ｇ／１００ｍＬ）、アルブミン濃度は、４．１〜５．１ｇ／１００ｍＬ（平均値：４．６ｇ／１００ｍＬ）である。本発明では、患者の痛みを和らげるために採血する血液量が非常に少ない場合でも対象成分の測定を精度よく行うことを可能にするものである。採取した血液が微量の場合には、希釈液中に存在する「血液中に恒常的に存在する標準成分」の濃度を精度よく測定する必要がある。希釈倍率が高くなると、もともと血液中に存在する成分の希釈液中の濃度が低下し、希釈倍率によっては濃度測定時に、測定誤差を含む可能性がある。従って、微量な血液成分を希釈倍率高く希釈したときに、上記標準成分を十分に精度高く検出するためには、微量な血液中に高い濃度で存在する標準成分を測定することが好ましい。本発明では、血液検体中に恒常的に存在する成分の中でも高濃度に存在する、ナトリウムイオン（Ｎａ+）又は塩化物イオン（Ｃｌ-）を用いることが好ましい。更には、上述の血液中に恒常的に存在する標準成分の中でも血液中に存在する量が一番高いナトリウムイオンを測定することが最も好ましい。ナトリウムイオンは、平均値が標準値（基準範囲の中央値）を表し、その値は、１４２ｍｍｏｌ／Ｌであり、血漿中の総陽イオンの９０モル％以上を占める。本発明においては、血液中に恒常的に存在する標準成分が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンと、さらに、別の血液中に恒常的に存在する標準成分であることも好ましい。この場合、別の標準成分は、総タンパク又はアルブミンであることが好ましい。
【００３４】
被検者の血液中における血漿成分の占有率は、容積の比率で約５５％であるが、被検者の塩分摂取量の変化などで変動する。そのため、本発明の血液分析方法で対象成分を分析する場合は、血漿中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて血漿の希釈倍率を決定し、決定された希釈倍率を用いて血液検体の血漿中の対象成分の濃度を分析する。標準物質が、希釈液中に存在しないか、存在しても無視できる程度に少ない場合において希釈倍率を決定する方法としては、血漿の希釈液中の外部標準物質（例えば、ナトリウムイオンなど）の測定値（濃度Ｘ）と、血液検体の血漿中に含まれる上記外部標準物質（例えば、ナトリウムイオンなど）の既知濃度値（濃度Ｙ；ナトリウムイオンの場合には１４２ｍｍｏｌ／Ｌ）とから、血液検体中の血漿成分の希釈倍率（Ｙ／Ｘ）を算出することにより希釈倍率を求めることができる。この希釈倍率を用いて、血漿の希釈液中の対象成分の測定値（濃度Ｚ）を測定し、この測定値に希釈倍率を掛け合わせることにより、実際に血液検体の血漿中に含まれる分析対象成分の濃度［Ｚ×（Ｙ／Ｘ）］を測定することが可能となる。
【００３５】
しかしながら、患者の血液成分又は血球を除去した血漿成分などを取り扱う容器及び分離器具などから、血漿を希釈する希釈液に溶出するナトリウム量が無視できない量で溶出している場合、又は、抗凝固剤エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの化学物質中のカウンターイオンとして外部標準物質（例えば、ナトリウムイオン）を使用する場合がある。本発明は、このような場合についても精度よく測定対象物質を分析することが可能な血液分析方法であり、予め、部材からの溶出量や、希釈液中の化合物由来などの標準物質の量を計算し、又は事前に溶出量を測定しておくことで、希釈倍率を補正し精度良く測定対象物質を分析することが可能となる。その場合の希釈倍率の補正方法としては、血漿と希釈液の混合液中の外部標準物質（例えば、ナトリウムイオンなど）の測定値（濃度Ｘ）と、血漿中の上記外部標準物質の既知濃度値（濃度Ｙ；ナトリウムイオンの場合には１４２ｍｍｏｌ／リットル）、及び血漿と希釈液の混合液中に予め存在する血漿起因でない標準物質（例えば、ナトリウムイオンなど）の、希釈液中の濃度（濃度Ｚ）とから、血液検体中の血漿成分の希釈倍率は、Ｙ／（Ｘ−Ｚ）より求めることができる。この希釈倍率を用いて、血漿の希釈液中の対象成分の測定値（濃度Ｄ）を測定し、この測定値に希釈倍率を掛け合わせることにより、実際に血液検体中に含まれる分析対象成分の濃度［Ｄ×Ｙ／（Ｘ−Ｚ）］を求めることが可能となる。
【００３６】
ナトリウムイオン濃度及び塩化物イオン濃度は、例えば、炎光光度法、ガラス電極法、滴定法、イオン選択電極法、酵素活性法等により測定することができる。
【００３７】
ナトリウムイオンの測定ではナトリウムイオンにより酵素ガラクトシダーゼは酵素活性が活性化することから、緩衝液で希釈された非常に低濃度のナトリウムイオン試料を数μＬで測定する酵素的測定法を用いることができる。この方法は生化学・免疫自動分析装置に適応でき、ナトリウムイオン測定のために別の測定機器を必要としない点で効率性が高く経済的である。
【００３８】
また、部材に由来する標準成分の量を規定した血液検査キットが実際に使用されているか、また、血液の希釈と血漿の回収の方法が正常に行われているか確証するためには、血漿中の別の標準成分から独立に希釈倍率を追加的に求めて、その値が上で求めた希釈倍率と一致することを確認することが好ましい。一致するとは、２つの測定値（ａ，ｂ）において、それらの差のそれらの平均値に対する割合、すなわち（ａ−ｂ）／｛（ａ＋ｂ）／２｝×１００が、２０％以下であることであり、好ましくは１０％以下であることであり、より好ましくは５％以下であることである。これにより、血液検体中の対象成分の濃度の分析が正常に行われていることの検証が可能となる。ここで、ナトリウムイオン又は塩化物イオン以外の血漿中に恒常的に存在する標準成分の例としては、総タンパク又はアルブミンから選択されることが好ましく、総タンパクであることがより好ましい。総タンパクの測定法は、ビューレット法や、紫外吸収法、ブレッドフォード法、ローリー法、ビシンコニン酸（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ：ＢＣＡ）法、蛍光法など公知の方法があり、測定試料の特性や感度、試料量などに応じて適宜使用する方法を選択することができる。
【００３９】
〔血液中に存在しない標準成分〕
好ましい態様の一つとして、血液中に恒常的に存在する標準成分とともに、血液中に存在しない標準成分を用いて血液検体中の対象成分の濃度を分析し、血液中に恒常的に存在する標準成分から求めた希釈倍率の補正に使用することもできる。また、血液中に恒常的に存在する標準成分と共に希釈倍率を算出することも可能である。
【００４０】
血液中に存在しない標準成分は、キット中の希釈液（後述する。）に、所定の濃度になるように添加して用いることができる。血液中に存在しない標準成分としては、血液検体中に全く含まれないか、若しくは含まれていたとしても極微量である物質を使用することができる。血液中に存在しない標準成分としては、血液検体中の対象成分の測定に干渉を与えない物質、血液検体中の生体酵素の作用を受けて分解しない物質、希釈液中で安定な物質、血球膜を透過せず血球中に含まれない物質、緩衝液の保存容器に吸着しない物質、精度良く測定できる検出系が利用できる物質を用いることが好ましい。
【００４１】
血液中に存在しない標準成分としては、希釈液に添加した状態で長期間保管しても安定な物質が好ましい。血液中に存在しない標準成分の例としては、グリセロール三リン酸、アルカリ金属としてＬｉ、Ｒｂ、Ｃｓ、又はＦｒ、そしてアルカリ土類金属としてはＳｒ、Ｂａ、又はＲａが挙げられ、これらの中で、Ｌｉ及びグリセロール三リン酸が好ましい。
【００４２】
これらの血液中に存在しない標準成分は、血液希釈後の濃度測定時に第二の試薬を添加することで発色させ、その発色濃度から希釈血液中の濃度を求めることができる。例えば、希釈液に添加したリチウムイオンの測定は、キレート比色法（ハロゲン化ポルフィリンキレート法：パーフルオロ−５，１０，１５，２０−テトラフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィリン）を利用して生化学自動分析装置で大量試料を微量の試料で容易に測定できる。
【００４３】
血液中に恒常的に存在する標準成分とともに、血液中に存在しない標準成分を用いて血液検体中の対象成分の濃度を分析するための血液検査キットを用いること、すなわち２つの標準成分を併用することで、より信頼性の高い分析が実現可能となる。
【００４４】
２つの標準成分を併用する態様において、血液中に恒常的に存在する標準成分としてナトリウムイオンを、血液中に存在しない標準成分としてリチウムイオンを用い、ナトリウムイオンの測定をβ−ガラクトシダーゼ活性が比例関係にあることを利用した酵素活性法で行い、リチウムイオンの測定を上述のキレート比色法で測定する場合には、血液検体の希釈倍率は、下記式１から４のいずれかの式で算出することができる。
【００４５】
【数１】
2018105828.tif 000002
【００４６】
上記式において、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｂ’及びＸは、以下のように定義される。
Ａ  ：  緩衝液を発色させた際の吸光度
Ｂ  ：  血漿添加後の吸光度変化量
Ｃ  ：  血漿ナトリウム中央値１４２  ｍｍｏｌ／Ｌの吸光度
Ｄ  ：  血漿希釈後のナトリウムイオン濃度における吸光度
Ｂ’：  血漿ナトリウムの吸光度から算出した希釈倍率による、希釈血漿中の血液中に存在しない標準成分の吸光度の補正値
Ｘ  ：  血漿希釈倍数
【００４７】
希釈率を求める際のもう一つの算出方法として、二乗平均法を用いた式５で算出し、希釈液中の分析対象成分の濃度に、式５で算出した希釈率を乗じて血液検体の成分中の対象成分の濃度を分析する態様も好ましい。
【００４８】
【数２】
2018105828.tif 000003
【００４９】
血液検体の成分中の対象成分の濃度は、希釈液中の対象成分の濃度から、上記希釈倍率に基づいて算出できる。
【００５０】
〔希釈液〕
本発明の血液分析方法においては、希釈液を用いて採取した血液検体を希釈する。この血液検体を希釈するための希釈液は、希釈倍率を求めるために使用する血液中に恒常的に存在する標準成分を含有する場合には、含有量を予め算出し、希釈液による血漿成分の希釈倍率を補正することにより精度よく測定対象成分の測定を行うものであるが、恒常的に存在する標準成分を含有しない希釈液を用いる態様が好ましい。本明細書において「含有しない」とは、「実質的に含有しない」ことを意味する。ここで、「実質的に含有しない」とは、希釈倍率を求める時に使用する恒常性のある物質をまったく含まないか、あるいは含まれていたとしても、血液検体を希釈した後の希釈液の恒常性のある物質の測定に影響を及ぼさない程度の極微量の濃度で含まれる場合を意味する。血液中に恒常的に存在する標準成分として、ナトリウムイオン又は塩化物イオンを用いる場合には、希釈液としては、ナトリウムイオン又は塩化物イオンを実質的に含有しない希釈液を使用する態様が好ましい。
【００５１】
本発明においては、患者又は被検者が採血した血液検体を希釈した後、医療機関又は検査機関に輸送して対象成分の濃度を分析することができる。即ち、本発明の血液分析方法は、採取された血液検体を希釈液で希釈する工程の後に、血液検体を希釈した希釈液を輸送する工程を有していてもよい。採血から分析までには長時間かかる可能性があることから、その間に、希釈液中における血液の対象成分の分解や変性を防止することが好ましい。血液のｐＨは、健常者では通常ｐＨ７．３０〜７．４０程度で一定に保たれている。従って、対象成分が分解や変性するのを防止するために、希釈液は、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０、好ましくはｐＨ７．０〜ｐＨ７．５、更に好ましくはｐＨ７．３〜ｐＨ７．４のｐＨ域で緩衝作用を有する緩衝液であることが好ましく、希釈液は、ｐＨの変動を抑える緩衝成分を含有する緩衝液であることが好ましい。
【００５２】
緩衝液の種類としては、酢酸緩衝液（Ｎａ）、リン酸緩衝液（Ｎａ）、クエン酸緩衝液（Ｎａ）、ホウ酸緩衝液（Ｎａ）、酒石酸緩衝液（Ｎａ）、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン）緩衝液（Ｃｌ）、ＨＥＰＥＳ（［２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸］）緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（Ｎａ）等が知られている。これらの中でｐＨ７．０〜ｐＨ８．０付近の緩衝液としては、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液が代表的なものである。しかしながら、リン酸緩衝液はリン酸のナトリウム塩が含まれていること、Ｔｒｉｓ緩衝液は、解離ｐＫａが８．０８であるため、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０付近で緩衝能を持たせるためには通常は塩酸と組み合わせて使用されること、ＨＥＰＥＳのスルホン酸の解離のｐＫａは７．５５であるが、イオン強度一定での緩衝溶液を調製するため、通常は水酸化ナトリウムと塩化ナトリウムとＨＥＰＥＳの混合物が用いられることから、これらはｐＨを一定に保つ作用を有する緩衝液としては有用であるが、本発明において外部標準物質として用いることが好ましい物質であるナトリウムイオンあるいは塩化物イオンを含有するため、本発明への適用は好ましくない。
【００５３】
本発明のキットに含まれる希釈液としては、ナトリウムイオン又は塩化物イオンを含有しない緩衝液を用いることが好ましい。本発明で用いる希釈液は好ましくは、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、２−エチルアミノエタノール、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミンからなる群から選択される少なくとも１種のアミノアルコール化合物、並びにＧｏｏｄ’ｓ緩衝液（グッドバッファー）でｐＫａが７．４付近の緩衝剤であるＨＥＰＥＳとも称する２−［４−（２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）（ｐＫａ＝７．５５）、ＴＥＳとも称するＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ｐＫａ＝７．５０）、ＭＯＰＳとも称する３−モルホリノプロパンスルホン酸（ｐＫａ＝７．２０）、及びＢＥＳとも称する（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ｐＫａ＝７．１５）からなる群から選択される緩衝剤を含む希釈液である。上記の中でも、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）とＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ又はＢＥＳとの組み合わせが好ましく、さらに、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）とＨＥＰＥＳとの組み合わせが最も好ましい。
【００５４】
上記緩衝液を調製するためには、アミノアルコールとＧｏｏｄ’ｓ緩衝液を１：２〜２：１、好ましくは１：１．５〜１．５：１、更に好ましくは１：１の濃度比で混合すればよい。緩衝液の濃度は限定されないが、アミノアルコール又はＧｏｏｄ’ｓ緩衝液の濃度は、０．１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは、１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００５５】
緩衝液中には、分析対象成分を安定に保つことを目的にキレート剤、界面活性剤、抗菌剤、防腐剤、補酵素、糖類等が含有されていてもよい。キレート剤としては、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、シュウ酸塩等が挙げられる。界面活性剤としては、例えば、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性界面活性剤又は非イオン界面活性剤が挙げられる。防腐剤としては、たとえば、アジ化ナトリウムや抗性物質等が挙げられる。補酵素としては、ピリドキサールリン酸、マグネシウム、亜鉛等が挙げられる。赤血球安定化剤の糖類としては、マンニトール、デキストロース、オリゴ糖等が挙げられる。特に、抗生物質の添加により、手指採血時に手指表面から一部混入する細菌の増殖を抑えることができ、生体成分の細菌による分解の安定化を図ることができる。
【００５６】
これらの緩衝液は血液に恒常的に存在する標準成分や内部標準物質を含まず、測定系に干渉を与えないことが重要である。また、これらの緩衝液で希釈された成分は生化学・免疫自動分析装置での種々の測定法でも測定に干渉しないこと、さらに血球が溶血をしないことや生体成分が３７℃でも安定に保存できることが好ましい。
【００５７】
血液検体に全血を使用する場合には、希釈した血液中の血球成分をフィルターなどにより分離する必要から、緩衝液の浸透圧を血液と同等（２８５ｍＯｓｍ／ｋｇ（ｍＯｓｍ／ｋｇは、溶液の水１ｋｇが持つ浸透圧で、イオンのミリモル数をあらわす））又はそれ以上とすることにより血球の溶血を防止することができる。浸透圧は、対象成分の測定、及び血液中に恒常的に存在する標準成分の測定に影響しない塩類、糖類又は緩衝剤等により、等張に調整することができる。
【００５８】
緩衝液で希釈された血漿ナトリウムイオンを血液に恒常的に存在する標準成分として測定する方法には炎光光度計、原子吸光法、そしてイオン選択電極法がある。本発明では微量な血液を手指から採取して緩衝液で希釈した試料は僅か数百μＬ程度であり、生化学成分や免疫検査項目を１０項目以上測定することから血液に恒常的に存在する標準成分の測定は数μＬの微量で測定できることが好ましい。また、多数の試料を分析する必要から、市販の生化学・免疫自動分析装置に適応できることが好ましい。
【００５９】
〔希釈液の量、希釈倍率〕
血液検査として、肝機能、腎機能、メタボリズムなど、特定の臓器、特定の疾患を検査する場合には、臓器や疾患に特有の複数の測定対象成分の情報を入手して、臓器の状態、生活習慣の予測などを行うために、一般的には、複数の測定対象成分の分析が同時に行われる。例えば、肝臓の状態を検査するためには、一般的には、ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、γ―ＧＴＰ（γグルタミルトランスペプチダーゼ）、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）、総ビリルビン、総タンパク、アルブミン等、数種類以上もの物質の血液中の濃度が測定される。このように、複数の対象成分を一つの血液検体から測定するためには、再測定の可能性も考慮して、希釈された血液の量はある程度必要となる。従って、採取した血液を希釈する希釈液は、ある程度の量を確保することが重要である。キットにおける希釈液の量は、血漿の容量の４倍以上（すなわち希釈倍率は、血漿の容量の５倍以上）であることが好ましく、１０倍以上がより好ましく、１４倍以上が更に好ましい。例えば、採血量を５０μＬとすると、血液量中の血漿量の比が０．５５の場合、血漿の容量は２７．５μＬと計算でき、希釈液が３６０μＬであれば、希釈倍率は１４倍となる。なお、血漿を基準とした場合の希釈倍率から、計算で求めた血漿量をＲ、希釈液量をＳとすると、（Ｒ＋０．５５×Ｓ）／Ｒを求めることにより、血液検体を基準とした希釈倍率が概算できる。血液分析に使用する希釈液の量は、血液検体の容量に対しては２．７倍以上であることが好ましく、６．０倍以上がより好ましく、８．２倍以上が更に好ましい。
【００６０】
〔血液検体の希釈物から血漿を分離回収するための分離器具〕
本発明の血液分析方法のために採取された血液検体は、分析が行われるまで、希釈された状態で長時間経過する可能性がある。その間に、例えば赤血球の溶血が起こると、血球内に存在する物質や酵素などが血漿あるいは血清中に溶出して検査結果に影響を与えたり、溶出したヘモグロビンが有する吸収により、分析対象成分の光学的な吸収などの光情報で分析対象成分量を測定する場合に影響を及ぼす可能性がある。従って、溶血を防止することが好ましい。そのため、血液検体の希釈物から血漿を分離回収するための分離器具を血液検査キットに含む態様が好ましい。分離器具の好ましい例は、分離膜である。分離膜は、例えば血液検体の希釈液に圧力を加えることによって、血球成分は分離膜で捕獲し、血漿成分を通過させて、血球を分離して血漿成分を回収するように用いることができる。この場合、抗凝固剤を用いることが好ましい。また、測定の精度を確保するために、分離膜を通過した血漿が血球側へ逆流しないことが好ましく、そのためには具体的には、特開２００３−２７０２３９号公報に記載の、逆流防止手段をキットの構成要素とすることができる。分離器具の素材は特に限定されないが、ガラス繊維で構成されていることが好ましい。
【００６１】
〔予め算出して補正〕
本発明の血液分析方法においては、希釈液中に含まれうる血液分析方法で用いる部材に由来する血液中に恒常的に存在する標準成分の量を予め算出した上で補正される。希釈液中に含まれうる量は、対象となる部材を実際に適切な量の希釈液に一定時間曝し、部材に由来して希釈液に含まれることとなった標準成分の量を測定することにより求めることができる。また、加温経時により溶出するナトリウムイオン濃度が増加する場合があるため、輸送したのちに血液分析を行う場合には、輸送工程の環境履歴（特に、温度履歴など）の影響を考慮した条件で、対象となる部材を希釈液に一定時間曝し、部材に由来して希釈液に含まれることとなった標準成分の量を測定することが好ましい。即ち、輸送したのちに血液分析を行う場合には、輸送工程の環境履歴の影響を考慮して、希釈液由来の標準成分量、及び／又は、希釈液中に含まれうる部材の少なくとも１つに由来する標準成分の量を予め算出した上で希釈倍率を補正することが好ましい。具体的には、輸送工程中、血液検査キットには温度履歴が確認可能なサーモラベル等の履歴確認手段を配備することが好ましく、その場合、輸送工程中の温度履歴と希釈液中に含まれうる部材の少なくとも１つに由来する標準成分の量との関係を、予め確認しておくことにより希釈倍率の補正が可能となる。血液中に恒常的に存在する標準成分としてナトリウムイオンを選択した場合、上記の予め算出した上で補正が必要とされる部材としてはガラスフィルタや抗凝固剤を含有した吸引器等がある。ガラスフィルタが成分としてナトリウムイオンを含有していることは周知である。また、抗凝固剤には、例えばＥＤＴＡやヘパリン等、ナトリウムイオンを含有しているものがある。
【００６２】
通常、血液を採取する吸引器にはファイバーロットが使用されており、このファイバーロットには抗凝固剤としてＥＤＴＡのナトリウム塩が使用されている。また、血漿を分離回収するための器具としてガラスフィルターが使用されており、これにはソーダガラス、炭酸ナトリウム等の微量のナトリウムイオンが含まれている。ソーダガラスは、ケイ砂（ＳｉＯ2）、炭酸ナトリウム（Ｎａ2ＣＯ3）、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ3）を混合して融解することにより得られる。ガラスフィルターを保持するためのガスケットの素材、及び収容した血漿を第二の収容器具内に維持するための封止器具がゴム製であれば、除タンパクのためのＮａＯＨ洗浄、及び成形の際に使用される離型剤（硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム等の混合物）等の残渣分として微量のナトリウムイオンが含まれる場合がある。プラスチック（樹脂）成形品である部材は、表面に微量Ｎａが含まれる場合がある。樹脂成形に使用する離型剤中に金属元素としてスズ、亜鉛、カルシウムなどとともに、ナトリウムが含まれるからである。
【００６３】
補正後において、この部材に由来する標準成分の量は、血液検体の希釈率の測定に大きな影響を与えずに、対象成分の濃度の分析が精度よく行える量であれば、特に限定されない。具体的には、血液に恒常的に存在する標準成分の部材に由来する量は、希釈液の量の３．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、好ましくは２．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、より好ましくは１．５ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。希釈液中に含まれうる血液キットの部材に由来する血液に恒常的に存在する標準成分の量は少ないことが好ましく、下限値は特に限定されない。
【００６４】
血液に恒常的に存在する標準成分であるナトリウムイオンを標準物質とし、ナトリウムイオン濃度の平均値は１４２ｍｍｏｌ／Ｌであるので、血液検体を希釈液で希釈し、分離回収した血漿中に存在するナトリウムイオンの平均値が算出できる。例えば、血漿成分に対する希釈液の希釈倍率が５倍においては、希釈液中の部材に由来するナトリウムイオンの許容濃度は０．７１ｍｍｏｌ／Ｌ、即ち希釈液３６０μＬに対してナトリウムイオンの許容溶出量は５．８μｇであり、また、希釈倍率２０倍においては、希釈液へのナトリウムイオンの許容溶出濃度は０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ、即ち、希釈液３６０μＬに対して、１．２μｇとなり、希釈倍率が高くなるにつれて、急激に希釈液に溶出するナトリウムイオンの許容溶出量が厳しくなり、より少ない希釈液の溶出量がコンタミとして、希釈倍率の精度を低下させてしまうことが判る。
【００６５】
一方、部材に由来する希釈液中のナトリウムイオン量（血液由来でないナトリウムイオン量、即ち、コンタミ成分）が、血漿中のナトリウムイオン量の２％以下となるような溶出量は容易に計算可能である。希釈液を３６０μＬとし、希釈倍率が３〜２５倍の範囲において、希釈液へのナトリウムイオンの許容溶出濃度（希釈液に溶出する許容溶出濃度）を算出した結果を図２に示す。
【００６６】
このように、血液分析方法で使用する部材に由来するナトリウムイオンが、希釈液中に混入することが想定される。本発明者らの検討によると、このように希釈液中に混入するナトリウムイオン量を補正することで、希釈液中に混入するナトリウムイオンによる誤差をほとんど無くし、希釈倍率の算出を高精度に維持して実施することが可能になる。
【００６７】
［２］血液検査キット
本発明の血液分析方法は、希釈液が収納された第一の収容器具と、血液を採取する採取器具と、希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具と、分離器具を保持するための保持器具と、回収した血漿を収容するための第二の収容器具とからなる群により選択される部材を用いる血液分析方法であり、更には、収容した血漿を第二の収容器具内に維持するための封止器具を用いる態様が好ましい。本発明の血液分析方法に用いる血液検査キットの一例としては、血液検体の成分を希釈するための希釈液、希釈液が収容された第一の収容器具、希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具、分離器具を保持するための保持器具、回収した血漿を収容するための第二の収容器具、及び収容した血漿を第二の収容器具内に維持するための封止器具、皮膚に傷をつけて血液を皮膚外に染み出させる針又はランセット、傷に貼る絆創膏又は消毒部材（例えば、イソプロパノール（７０％イソプロパノールなど）又はエタノールなどを含浸させた不織布）、及び取扱説明書、等を備えることができる。希釈された血液検体から血漿成分を回収するための分離器具としては、分離膜である態様が好ましく、血球成分を分離可能な細孔を有するフィルタがより好ましい。
【００６８】
第一の収容器具、及び第二の収容器具は、１つの器具を第一の収容器具及び第二の収容器具として兼用してもよいし、別々の器具を備える態様であってもよい。収容器具内にある血液を希釈した希釈液を、患者、あるいは、希釈倍率の測定や分析対象成分の分析を行う測定者に確認可能とするために、第一の収容器具、及び第二の収容器具は、透明な素材でできていることが好ましい。
【００６９】
分離器具を保持する保持器具は、ガスケットである態様が好ましい。また、封止器具としては、収容器具が筒状の形状をした器具などの場合には、開口に蓋をすることが可能なキャップや、螺旋状の溝を有する蓋、あるいはゴム栓などを使用することができる。
【００７０】
上記の構成により、希釈液により血液を希釈した後に、直ちに血漿と血球を分離する機能を血液と希釈液の混合容器に付与することにより、血液成分の安定性と  血球細胞からの溶血による成分の変動の影響を排除し、血液採取後の試料の安定性を付与できる。
【００７１】
本発明の血液分析方法では、１００μＬ以下の採血量であっても、測定精度よく分析対象成分を分析できる方法を実現可能とするものであり、血液分析用の血液検査キットには、患者に、１００μＬ以下の少ない採血量でも精度よく測定することが可能であること等の情報が記載された取り扱い説明書を含むことが好ましい。
【００７２】
〔血液検査キットの具体例〕
好ましい態様の一つにおいて、血液分析用の血液検査キットは、希釈液、希釈液が収容された第一の収容器具（血液検体の希釈物を収容するための収容器具でもある。）、希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具、分離器具を保持するための保持器具、回収した血漿を収容するための第二の収容器具、及び収容した血漿を第二の収容器具内に維持するための封止器具を含む。具体的な器具としては、例えば、特許第３５９７８２７号公報の図１から図１３に記載された器具を使用することができる。特許第３５９７８２７号公報の図１を、本願の図１として援用する。
【００７３】
血液分離器具１は採血容器２（希釈液が収容された収容器具、第一の収容器具ということもある。血液検体の希釈物を収容するための収容器具でもある。）と、採血容器２に嵌挿可能な筒体３（回収した血漿を収容するための第二の収容器具）と、筒体３に冠着可能なキャップピストン４と、キャップピストン４の下端に設けられた密閉蓋５（封止器具）とを備え、使用前は、図１に示すように、採血容器２の上端開口部はキャップ６によりパッキン７を介して密閉されている。本発明における希釈された血液検体を収容するための収容器具は、図１の構成においては、採血容器２と筒体３の組み合わせに対応する。すなわち、希釈された血液検体を収容するための収容器具は１個でも２個以上の組み合わせでもよい。
【００７４】
採血容器２は透明な材質製で円筒状を成し、その上端部には、外面に螺子部８が形成され、内面に係止部９が突設されている。また、採血容器２の下端部には、逆円錐状の底部１０が形成され、底部１０の周囲に円筒状の脚部１１が形成されている。脚部１１は、血液の分析検査時に使用するサンプルカップと同一外径を有しており、好ましくは、その下端の対向する位置にそれぞれ鉛直方向にスリット溝１２が形成されている。さらに、採血容器２内には、図１に示されているように、所要量、例えば、５００ｍｍ3の希釈液１３が予め入れられていてもよい。
【００７５】
筒体３は透明な材質製で円筒状を成し、その上端部には拡径部１４が形成されている。拡径部１４は薄肉部１５を介して本体部１６と接続されている。筒体３の下端部には、縮径部１８が形成され、縮径部１８の内面には係止突起部１９が形成されている。さらに、縮径部１８の下端部には外鍔部２０（保持器具）が形成され、外鍔部２０の下端開口部は濾過膜２１（分離器具）により覆われ、濾過膜２１は血液中の血漿の通過を許容し、血球の通過を阻止するようになっている。
【００７６】
縮径部１８の外周にはシリコンゴム製のカバー２２が装着されている（図１）。
【００７７】
キャップピストン４は、略円筒状の摘み部２６と、摘み部２６と同心で下方に延びる心棒部２７とで構成されている。摘み部２６の内側上端部には筒体３の拡径部１４が嵌合可能な円筒状の空間２８が形成され、また、その下方は螺刻され、螺子に螺合可能となっている。心棒部２７はその下端部２９がピン状に形成され、下端部２９に密閉蓋５が着脱可能に設けられている（図１参照）。密閉蓋５はシリコンゴム製である。
【００７８】
血液検体の希釈物からの血漿の分離回収操作は、具体的には、次のように行う。希釈液を収容する採血容器２に、採取した血液を投入した後、採血容器２の上部を持って泡立てないように注意しながら血液と希釈液とを十分に振り混ぜる。次に、濾過膜２１を保持する筒体３（血漿、血球分離時のシリンダ側面への回りこみによる液漏れを防止）を濾過膜が下になるように採血容器２に差し込み、ゆっくりと一定のスピードで採血容器２の底面まで濾過膜を押し下げる。このとき、筒体３の濾過膜を通って血漿が上部に上がり、血球は採血容器２の下部に残る。その後、キャップピストン４を筒体３にゆっくりと差し込んで、密閉栓５により逆流による血漿と血球の混合を防止する。
【００７９】
上記した器具による血液分離方法の詳細は、特許第３５９７８２７号公報の段落番号００２３〜００２６並びに図１２及び図１３に記載されており、その内容は本明細書に引用される。
【００８０】
本発明の血液分析用の血液検査キットに含まれる各々の要素の個数は特に限定されず、各々１個でもよいし、２個以上の複数でもよい。
【００８１】
本発明の血液分析用の血液検査キットに含まれる部材の材料は、破損しにくさ、衛生面、価格等の観点から、合成樹脂であることが好ましい。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリ乳酸、アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂（ＡＢＳ樹脂）、アクリロニトリルスチレン樹脂（ＡＳ樹脂）、アクリル樹脂（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、シリコーン樹脂等が挙げられる。
【００８２】
本発明の血液分析用の血液検査キットは、種々の部材のすべてを、収納容器に収納した形態として提供することができる。本発明の血液分析用の血液検査キットに使用される部材は、プラスチック、ガラス又はゴムを素材としているが、本発明者らは、こうした部材から溶出するであろう血液に恒常的に存在する標準成分の量を予め算出した上で補正することを見出した。
【００８３】
血液中に恒常的に存在する標準成分の量を予め算出する具体的な例としては、ガラスフィルタや抗凝固剤を含む血液吸引器から溶出するＮａイオン量が挙げられる。これらのＮａイオン量を予め算出した上で補正したところ、２％以下の誤差で希釈倍率を求めることが可能であることを本発明者らは見出した。
【００８４】
［３］その他
本発明はまた、本明細書の上記［１］及び［２］で説明した構成の血液検査キットを用いた血液分析方法を提供する。血液分析方法は、ヒトに対する医療行為（医師が行う行為）である態様とヒトに対する医療行為ではない態様（例えば、採血者が患者自身であり、かつ分析者が医師以外の者である態様、非ヒト動物に対する態様、等）が含まれる。本発明の血液分析方法は、対象者自身が血液を採取する自己採血で実施してもよいし、医師等の有資格者が注射器を使用して血液を採取する一般採血においても実施してもよい。好ましい態様としては、患者本人が、ランセットなどのナイフ付の器具を用いて指先などを傷つけて皮膚外に滲み出た血液を採取する。
【００８５】
本発明の血液分析方法の対象となる生体試料は血液であり、血液とは、血清又は血漿を含む概念である。血液の起源はヒトに限定されず、ヒト以外の動物（非ヒト動物）である哺乳類、鳥類、魚類等であっても良い。ヒト以外の動物としては、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、クマ、パンダ等が挙げられる。好ましくは、生体試料の起源はヒトである。
【００８６】
本発明の血液分析を行う場合、分析の対象成分は限定されず、血液中に含まれるあらゆる物質が対象となる。例えば臨床診断に用いられる血液中の生化学検査項目、腫瘍マーカーや肝炎のマーカー等各種疾患のマーカー等が挙げられ、タンパク質、糖、脂質、低分子化合物等が挙げられる。また、測定は物質濃度だけでなく、酵素等の活性を有する物質の活性も対象となる。各対象成分の分析は、公知の方法で行うことができる。
【実施例】
【００８７】
以下、本発明の実施例、比較例及び参考例について説明する。
（参考例１）
１．希釈液組成
希釈液を以下の組成で調製した。浸透圧は、ＯＳＭＯＡＴＡＴ  ＯＭ−６０４０（アークレイ（株）社製）を用いて測定した値を表示した。浸透圧の単位は、溶液の水１ｋｇが持つ浸透圧で、イオンのミリモル数をあらわす。
ＨＥＰＥＳ  ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）  ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｄ−マンニトール  ２８４ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化リチウム    １ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＤＴＡ−２Ｋ  ０．８ｍｍｏｌ／Ｌ
ＰＡＬＰ（ピリドキサールリン酸）  ０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ
チアベンダゾール  ０．０００１質量％
アミカシン硫酸塩  ０．０００３質量％
硫酸カナマイシン  ０．０００５質量％
メロペネム三水和物  ０．０００５質量％
浸透圧    ３５５ｍＯｓｍ／ｋｇ
ｐＨ    ７．４
【００８８】
２．ナトリウム濃度の測定
１．で調製した希釈液のナトリウム濃度の測定には、β−ガラクトシダーゼがナトリウムで活性化することを利用し、それぞれの希釈液中のナトリウム濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性が比例関係にあることを利用した酵素活性法により行った。具体的には、ナトリウムイオンを含まない精製水で血液の希釈液を５倍希釈した後、３μＬを秤量し下記のように調製した第一試薬５２μＬを加えて、３７℃で５分間加温し、下記のように調製した第二試薬を２６μＬ加え、１分間の吸光度の変化をＪＣＡ−ＢＭ６０５０型生化学自動分析装置（日本電子（株）社製）を用いて主波長４１０ｎｍ、副波長６５８ｎｍで吸光度を測定することにより求めた。あらかじめ作成した検量線から、ナトリウムの濃度を測定した。
【００８９】
（ナトリウム測定試薬の調製）
以下の組成のナトリウム測定試薬を調製した。
第一試薬
ＨＰＥＰＳ・ＬｉＯＨ（ｐＨ８．０）  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｄ−マンニトール  ６０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ−アセチルシステイン  ３０ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸マグネシウム    １．５２ｍｍｏｌ／Ｌ
β−ガラクトシダーゼ    １．１ｋＵ／Ｌ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ０．０５質量％
第二試薬
ＨＰＥＰＳ・ＬｉＯＨ（ｐＨ８．０）  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ｏ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ  １５ｍｍｏｌ／Ｌ
【００９０】
予めガラスフィルタ及び抗凝固剤を含む血液吸引部材等の代表的な部材から溶出するＮａイオン濃度、及び最終的に溶出するＮａイオン濃度を１０回測定（ｎ＝１０）による平均値として求めた。また、各部材からの溶出量が、全体の溶出量に対して占める割合を求めた。更に、Ｎａ溶出量のばらつきの尺度である変動係数ＣＶ（coefficient of variaition）（％）を求めた。結果を表１に示した。
【００９１】
【表１】
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【００９２】
表１からわかるように、部材の中で、ガラスフィルタから溶出するＮａイオン量が溶出量の大部分を占めていることがわかる。ガラスフィルタと血液吸引部材からのＮａ溶出量である１．２６ｍｍｏｌ／Ｌで補正することで、２０倍の希釈倍率において、２％以下、正確には１．２％程度の誤差で希釈倍率を求めることが可能であることが分かった。更に、図２及び表１の結果から、血液中に存在する恒常性のある成分であるナトリウムイオンを標準物質に用いた場合において、血液検査キットの部材に関する１．３５ｍｍｏｌ／Ｌの補正をすることで、希釈液に溶出するナトリウムの希釈液に対する濃度誤差をほとんどなくすことが可能であり、高い希釈倍率までの広い範囲において、高精度の希釈倍率を算出するための希釈液へのナトリウムイオンの許容溶出濃度を十分にクリアできることが判った。
【００９３】
（参考例２）
１．微量血液検体を希釈した希釈液の調製
ボランティアの患者から、インフォームドコンセントを行った後に静脈から注射器で採取した３０ｍＬの血液を採血管に得た。この採血した血液の半分から予め遠心分離機により血漿を得た。ここで用いた注射器、遠心分離機の容器は、ナトリウムイオンの溶出がほとんどないものを選択して用いた。９０μＬ、１９μＬをそれぞれ１０回ずつマイクロピペットで正確に秤量し、参考例１で調製した希釈液と同じ希釈液の３６０μＬにそれぞれ混合した。血漿混合した希釈液を参考例１で使用したガラスフィルタ及び抗凝固剤を含む血液吸引器で通常の採血からの作業を一通り処理した。この希釈血漿を試料として、参考例１と同様にして、ナトリウムイオン濃度の測定を行い、希釈倍率の測定と測定した希釈倍率のばらつきの指標であるＣＶ（％）を求めた。希釈倍率は、以下の式を用いて算出した。結果を表２に示した。
【００９４】
補正無    希釈倍率＝Ｙ／Ｘ
補正有    希釈倍率＝（Ｙ）／（Ｘ−Ｚ）
Ｘ：血漿と希釈液の混合液で測定したナトリウム濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｙ：血漿中のナトリウムの標準濃度（１４２ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｚ：予め求めた、ガラスフィルタ及び抗凝固剤を含む血液吸引器から希釈液に溶出したナトリウム濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）
【００９５】
【表２】
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【００９６】
表２から、ガラスフィルタ及び抗凝固剤を含む血液吸引器からのナトリウム溶出量を予め求めて、その値で補正した場合には、血漿を希釈したときの希釈倍率が実際の希釈倍率値とほぼ同等の希釈倍率が得られ、しかも測定間でのばらつきも低くすることが実現できることがわかった。
【００９７】
（実施例１）ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）及びＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）の測定
参考例２で注射器を用いて静脈から採血した直後に、採血した同じ患者の指先からランセットを用いて血液を指先の皮膚外ににじませた後に、３０μＬ〜４０μＬ程度の血液を、抗凝固剤を含む血液吸引器を用いて採取し、参考例１で調製した希釈液と同じ希釈液３６０μＬ中に血液を混合した。この血液と希釈液の混合液を、参考例２で使用したガラスフィルターで濾過して血球成分を分離し、血液検体の血漿成分の希釈液を得た。その後、希釈液を密閉して、検査が可能な別の施設へと輸送し、輸送後に、希釈液を取り出して、参考例２の補正有の希釈倍率の計算式を用いて希釈倍率を測定したところ、１７．４倍の希釈倍率であった。このことから、採血量は４０μＬ弱であることがわかった。この希釈検体中のＡＬＴ、ＡＳＴの濃度を、市販の測定キット（トランスアミナーゼＣII−テストワコー：和光純薬工業（株）社製）を用いて測定した。希釈液中に混入するナトリウムイオン量を、参考例１で求めた１．３５ｍｍｏｌ／Ｌとして希釈倍率を補正して求め、測定結果を補正したところ、参考例２で調製した遠心分離で得た血漿からナトリウムの溶出のない精製水を用いて測定した、ＡＬＴ値は１７Ｕ／Ｌ、ＡＳＴ値は３２Ｕ／Ｌとの結果に対して、上記のように指先から採取した血液を希釈した希釈液から分析した、ＡＬＴ値は１７Ｕ／Ｌ、ＡＳＴ値３３Ｕ／Ｌであり、ほぼ一致した結果が得られ、本発明の効果を確認した。
【符号の説明】
【００９８】
１  血液分離器具
２  採血容器
３  筒体
４  キャップピストン
５  密閉蓋
６  キャップ
７  パッキン
８  螺子部
９  係止部
１０  底部
１１  脚部
１２  スリット溝
１３  希釈液
１４  拡径部
１５  薄肉部
１６  本体部
１８  縮径部
１９  係止突起部
２０  外鍔部
２１  濾過膜
２２  カバー
２６  摘み部
２７  心棒部
２８  空間
２９  下端部
３１  段差部
３３  上端部
３４  頂部
【図１】
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【図２】
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