(57)【要約】【課題】培養容器の移動や培養液の交換の際のスフェロイドの移動を抑制可能な培養容器を提供すること。【解決手段】被培養物が培養される隔室が形成された底部と前記底部の周縁部分から立ち上がった周壁部とを備える容器本体と、底部と対向する位置に配置される仕切り部材とを備え、仕切り部材は、少なくとも一部が容器本体内の培養液中に浸漬される培養容器である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被培養物が培養される隔室が形成された底部と前記底部の周縁部分から立ち上がった周壁部とを備える容器本体と、
前記底部と対向する位置に配置される仕切り部材とを備え、
前記仕切り部材は、少なくとも一部が前記容器本体内の培養液中に浸漬されることを特徴とする培養容器。
【請求項２】
前記仕切り部材は、前記容器本体内の培養液の液面に対し略鉛直方向に立設された少なくとも１つの壁部を備えることを特徴とする請求項１記載の培養容器。
【請求項３】
前記容器本体の開口を塞ぐ蓋体を備え、
前記仕切り部材は、前記蓋体の前記底部と対向する位置に設けられることを特徴とする請求項１または請求項２記載の培養容器。
【請求項４】
前記蓋体と前記仕切り部材との距離は調整可能であることを特徴とする請求項３記載の培養容器。
【請求項５】
前記仕切り部材は、前記底部の隔室に対応した位置に仕切りを備えることを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか１項記載の培養容器。
【請求項６】
前記仕切り部材もしくは前記底部は、細胞の接着を抑制するための表面処理コート層を備えることを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか１項記載の培養容器。
【請求項７】
前記仕切り部材もしくは前記底部は、細胞の接着を抑制する材料からなることを特徴とする請求項１ないし請求項６のいずれか１項記載の培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞などの被培養物を培養してスフェロイド（細胞凝集塊）を得るための培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトや動物など由来の細胞を培養容器などで人工的に培養して三次元的に凝集させるスフェロイド培養が知られている。スフェロイド培養では、細胞集団が立体的な構造を形成し、細胞同士が相互作用しているため、生体内での三次元構造により近い状態で培養または維持できると考えられており、それが通常の平面接着培養と比べ優れた特性を示すことが知られている。実際に、がん細胞を用いた抗がん剤スクリーニングや、多能性幹細胞などの増殖や分化などにスフェロイド培養が利用されている。
【０００３】
このようなスフェロイド培養に用いられる培養容器としては、容器本体の底部に、細胞及び培養液を収容するための凹部を備え、この凹部の底面には、細胞を重力によって集合させるための複数のマイクロウェルが設けられており、さらに、この凹部の開口端へ近付くにつれて開口面積が広がるように凹部の側面を傾斜面で構成した培養容器が知られている（特許文献１〜特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１５−０２９４３１号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４／１９６２０４号公報
【特許文献３】特願２０１５−１８３７７９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
スフェロイドを形成する培養容器は、細胞が培養面に接着しないよう、細胞低接着処理を施した基材が用いられることが多い。しかし、細胞が基材に接着しないが故に、培養容器を移動させる際に、培地が揺れることでスフェロイドが当初収まっていた凹部から別の凹部に移動してしまい、所望の大きさ、形状のものを作ることができない等の問題が生じる。
【０００６】
特許文献２のように、複数のウェルを形成した培養容器の場合、ウェル内からのスフェロイドの移動を解決するために、傾斜（１〜２０°）を形成したり、ウェルの深さを従来より深くしたりする（特許文献２の実施例及び比較例参照）ことが記載されているが、従来から使用されているシャーレ状の培養容器を用いた場合、底面の厚みに対して深くウェルを形成することになるため、底面の強度が低くなり、破損やクラック等が発生するおそれがある。
【０００７】
また、特許文献３のように、仕切りを培養面に接するように形成すると、培養のための有効面積が少なくなり、形成できるスフェロイドの数が少なくなる。
【０００８】
本発明は、培養容器の移動や培養液の交換の際のスフェロイドの移動を抑制可能な培養容器を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、被培養物が培養される隔室が形成された底部と底部の周縁部分から立ち上がった周壁部とを備える容器本体と、底部と対向する位置に配置される仕切り部材とを備え、仕切り部材は、少なくとも一部が容器本体内の培養液中に浸漬される培養容器を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、培養容器の移動や培養液の交換の際に、培養液の流動によるスフェロイドの移動を抑制することが可能な培養容器を提供することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る培養容器の縦断面図である。
【図２】本発明の第１の実施形態に係る培養容器の平面図である。
【図３】本発明の第２の実施形態に係る培養容器の縦断面図である。
【図４】本発明の第２の実施形態に係る培養容器の平面図である。
【図５】本発明の第３の実施形態に係る培養容器の縦断面図である。
【図６】本発明の第３の実施形態に係る培養容器の平面図である。
【図７】本発明の第４の実施形態に係る培養容器の縦断面図である。
【図８】本発明の第４の実施形態に係る培養容器の平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、実施形態について、図面に基づき説明する。なお、本発明は以下に記載する実施形態に限られるものでなく、適宜変更可能である。
【００１３】
［第１の実施形態］
本発明の第１の実施形態に係る培養容器について、図１および図２を用いて説明する。図１は、培養容器の縦断面図である。図２は、培養容器の平面図である。
本実施形態に係る培養容器１００は、細胞を培養して三次元的に凝集させてなるスフェロイドを作製する培養容器である。
【００１４】
まず、本実施形態に係る培養容器１００の構成について説明する。  
培養容器１００は、図１および図２に示したように、容器本体１０、仕切り部材２０、蓋体３０とを備えている。仕切り部材２０は、蓋体３０に固定されており、蓋体３０を容器本体１０の開口部に載置することで、仕切り部材２０の一部が培地１６に浸漬する。
なお、本実施形態において、容器本体１０の底部１１が培養面１５に相当する部分となる。
【００１５】
容器本体１０は、円板状の底部１１、および環状の側壁部１２を有している。側壁部１２は、底部１１の外周縁から起立している。本実施形態では、底部１１の直径は８５ｍｍ、底部１１の厚さは１ｍｍである。また、側壁部１２の高さは２０ｍｍである。容器本体１０は、ポリスチレン等の合成樹脂材を用い、射出成形等で成形される。
【００１６】
容器本体１０の底部１１には、被培養物５０が培養される隔室１７が形成されている。隔室１７の内面は、滑らかな凹面になっている。隔室１７は、被培養物が培養される窪みを形成する。本実施形態では、直径８５ｍｍの円形の底部１１に１４２００個程度（約２５０個／ｃｍ２）の隔室１７が形成されている。１つの隔室１７には、所望の大きさの均一な１つの被培養物５０（スフェロイド）が最終的に培養される。
【００１７】
仕切り部材２０は、容器本体１０の底部１１と対向する位置に配置され、少なくとも一部が容器本体１０内の培地１６中に浸漬される。仕切り部材２０は、移動等により容器本体１０が大きく搖動する際、培地１６の波立ちを抑制するものである。これにより、隔室１７にて培養されている被培養物５０が、隣接する他の隔室１７に移動することを抑制することができる。
【００１８】
仕切り部材２０は、培地１６の液面に対し略鉛直方向に立設された少なくとも１つの壁部２１を備える。仕切り部材２０は、壁部２１により培養液を小さな領域に区画することで、培養液の液面方向の波立ちや移動を規制する。
本実施形態において、仕切り部材２０は、図２に示すとおり壁部２１を格子状に配置したものであり、一部が培地１６に浸漬している。
【００１９】
壁部２１で形成される領域は、図２に記載の構成に限らず、どのような形状、サイズであってもかまわない。壁部２１で形成される領域の形状は、仕切り部材２０の平面視において、例えば、４角形、３角形、その他多角形、円形、楕円形、不定形状等である。また、仕切り部材２０は、全体が培地１６に浸漬してもよく、一部が培地１６に浸漬してもよい。
また、仕切り部材２０の壁部２１と隣接する壁部２１との間は、培地１６が通り抜ける程度の隙間があってもよく、なくてもよい。なお、培地１６が通り抜ける程度の隙間とは、培地１６の波立ちの抑制に影響がない程度の隙間をいうものであり、一例としてスリット形状や小穴などがあげられる。また、壁部２１は、培地１６が透過できる材質から形成されてもよく、培地１６が透過できない材質から形成されてもよい。なお、培地１６が透過できる材質とは、培地１６の波立ちの抑制に影響がない程度の透過をいうものである。
上述のように仕切り部材２０の壁部間を培地１６が行き来できると、仕切り部材２０を培地１６に浸漬した状態で培養容器１００にて細胞培養を行う際に、容器本体１０内の培地１６が壁部２１で区画されるそれぞれの領域の濃度等の偏りがなく、均一なスフェロイド培養を行うことができる。
また、上述のように仕切り部材２０の壁部間を培地１６が行き来きできない場合、より高い培地１６の波立ち抑制効果を得ることができる。
【００２０】
仕切り部材２０（壁部２１を含む）は、金属、樹脂、セルロース、ガラス、天然繊維からなる群より選択される材質又はこれらの組合せからなる。また、仕切り部材２０の壁部は、板状物、板厚方向に連通孔が形成された板状物、網状物（メッシュ）、筒状体等であってもよい。
【００２１】
蓋体３０は、容器本体１０上方の開口部に対応した形状であり、開口部を覆うものである。蓋体３０の容器本体１０の底部１１と対向する面には、仕切り部材２０が接続具４１を介して固定されている。蓋体３０は、細胞の培養環境を維持するために、細胞の培養中は容器本体１０に被せられて使用される。また、容器本体１０を移動する場合のみ使用されることもある。
蓋体３０は、培養の環境を一定するため容器本体１０内部を気密封止可能なものでよい。また、蓋体３０は、培養中の細胞の呼吸を阻害しないよう容器本体１０との間に隙間があってもよい。
蓋体３０は、天面に培地１６を出し入れするための孔部（図示省略）を備えてもよい。仕切り部材２０を培地１６に浸漬した状態で、培地１６の交換をする場合、孔部に吸引器を差し込み、古い培地１６を回収する。次いで、孔部から新しい培地１６を補充する。
【００２２】
本実施形態では、隔室１７は、容器本体１０の培養面１５に対してレーザ光を照射することにより形成される。レーザ照射は、底部１１の上面に対して、レーザ光を深さ方向に照射して行う。その他、隔室１７は、インプリント、射出成形等、容器本体１０の成形と同時に形成してもよい。
【００２３】
隔室１７は、培養面１５の単位面積あたり、１０個／ｃｍ２〜１００００個／ｃｍ２、形成するのが好ましい。さらに好ましくは、２０個／ｃｍ２〜８０００個／ｃｍ２、さらに好ましくは、２０個／ｃｍ２〜３０００個／ｃｍ２である
上記した数値範囲を示す「〜」とは、特段の定めがない限り、その前後に記載された数値を下限値及び上限値として含む意味で使用され、以下本明細書において「〜」は、同様の意味をもって使用される。
【００２４】
本実施形態では、レーザ光源には、ＣＯ２レーザを用い、レーザ光は、出力１２Ｗ、照射速度６１００ｍｍ／ｓｅｃでパルス照射される。照射スポットの形状は、円形であり、その直径は、約４００μｍである。スフェロイドは、小さすぎると所望の生理機能が生じず、また、大きすぎるとスフェロイドの中心部が壊死してしまう。これを考慮すると、照射スポットの直径は、２０μｍ〜１５００μｍが適当である。
【００２５】
培養面１５（底部１１の上面）にレーザ光が照射されると、底部１１を構成する合成樹脂材が溶解して、隔室１７が形成される。さらに、隔室１７の開口周辺には、溶解した合成樹脂材が盛り上がって、土手部が形成されてもよい。互いに隣り合った２個の隔室１７は、１個または複数個の土手部を介して形成されており、互いに近接する隔室１７間の頂部には、平坦面が残らない。すなわち、互いに近接する隔室１７間の培養面１５が非平坦面になっている。
【００２６】
なお、隔室１７の深さｄ（レーザ照射前の底部１１の上面を基準とした深さ）は、１０μｍ〜１５００μｍに設計されることが望ましく、本実施形態では、２００μｍ±２０μｍに設計されている。なお、底部１１の厚さは、深さｄに応じて貫通しないよう適宜設計される。また、略楕円形の隔室１７の開口の長径（レーザ照射前の底部１１の上面での長径）Ｄは、１０μｍ〜１５００μｍに設計されることが望ましく、本実施形態では、５００μｍ±２０μｍに設計されている。さらに、土手部の高さｈ（レーザー照射前の底部の厚み方向の位置を基準とした高さ）は、１０μｍ〜５０μｍに設計されることが望ましく、本実施形態では、２５μｍ±５μｍに設計されている。
【００２７】
なお、ＣＯ２レーザを用いて隔室を形成する場合、そのレーザ出力は５〜５００Ｗであることが好ましい。レーザの出力は、を照射する材質によっても適宜強度を調整してもよい。例えば、ポリスチレンの場合は５〜３０Ｗ、ガラスの場合は８０〜２００Ｗが好ましい。
【００２８】
仕切り部材２０の壁部２１もしくは容器本体１０の底部１１には、細胞の接着を抑制する表面処理コート層（図示省略）を備えることが好ましい。表面処理コート層は、細胞が底部１１の上面、特に隔室１７の内面や仕切り部材２０の壁部２１に接着するのを抑制する役割を果たす。そのため、容器本体１０の底部１１に細胞の接着を抑制する表面処理コート層により被膜されていると、より効果的にスフェロイドを培養することができる。また、仕切り部材２０の壁部２１に細胞の接着を抑制する表面処理コート層により被膜されていると、壁部２１に細胞が接着することがなく、ロスが少ない効率的な細胞の培養が可能となる。
表面処理コート層としては、例えば、リン脂質ポリマー（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン等））、フッ素系ポリマー、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、あるいは、ポリエチレングリコールなどを用いることで形成することができる。
また、仕切り部材２０もしくは容器本体１０は、細胞の接着を抑制する材料を用いて形成することにより、上述の表面処理コート層を用いた場合と同様の効果を得ることができる。このような樹脂としては、例えばフッ素成分を含有する樹脂材が挙げられる。
【００２９】
次に、本実施形態に係る培養容器１００を用いた被培養物５０の培養方法について説明する。
【００３０】
被培養物であるスフェロイド前駆体としての細胞を培地１６に入れて、撹拌する。撹拌後、培地１６を液面が隔室１７の頂部より上となるように容器本体１０内に流し入れる。そうすると、培地１６中の細胞は、沈殿して、隔室１７内に収まる。
【００３１】
その後、容器本体１０に仕切り部材２０（壁部間に隙間を備える）が固定された蓋体２０を被せて、数日〜数十日間放置する。隔室１７内の細胞は、培養され、増殖する。そして、細胞は、隔室１７の形状・大きさに対応して、三次元的に凝集する。こうして、スフェロイドが得られる。
【００３２】
本実施形態に係る培養容器１００は、容器本体１０の移動や培地１６の交換の際に、培地１６の波立ちが抑制されるため、培養中の細胞が隣接する別の隔室１７に移動するおそれがない。そのため、均一なスフェロイドが形成される確率が高く、スフェロイド培養を効率良く行うことができる。
【００３３】
［第２の実施形態］
本発明の第２の実施形態に係る培養容器２００について、図３および図４を用いて説明する。図３は、培養容器２００の縦断面図である。図４は、培養容器２００の平面図である。なお、本実施形態は、第１の実施形態の変形例であって、第１の実施形態と同一部分または類似部分には、同一符号を付して、重複説明を省略する。
【００３４】
容器本体１０の底部１１は、格子状に配置された凸部１３より構成された隔室１７を備える。この隔室１７は、幅または直径５μｍ〜１０００μｍ、深さ５μｍ〜１０００μｍである。また、仕切り部材２０の壁部２１も容器本体の凸部１３と同様の形状に形成されている。そして、仕切り部材２０を蓋体３０を用いて容器本体１０に設置する際に、容器本体１０の凸部１３と仕切り部材２０の壁部２１とを対応するように配置することで、凸部１３と壁部２１により形成した領域が略閉空間となる、そのため、より高い培地１６の波立ち抑制効果を得ることができる。
なお、容器本体１０の凸部１３により形成された隔室１７は、隣接する隔室１７と空間が互いに連通していてもよい。
【００３５】
本実施形態に係る培養容器２００における仕切り部材２０の使用方法については、第１の実施形態と同様である。
培養容器２００を用いることで、容器本体１０を移動する際に、容器本体１０が大きく搖動して、隔室１７内の被培養物５０が隔室１７の開口から隣接する別の隔室１７に移動することを抑制できる。
【００３６】
［第３の実施形態］
本発明の第３の実施形態に係る細胞培養容器３００について、図５および図６を用いて説明する。図５は、細胞培養容器３００の縦断面図である。図６は、細胞培養容器３００の平面図である。なお、本実施形態は、第１の実施形態の変形例であって、第１の実施形態と同一部分または類似部分には、同一符号を付して、重複説明を省略する。
【００３７】
第１の実施形態では、仕切り部材２０は接続具３１を介して蓋体３０に固定される。一方、本実施形態では、蓋体３０を用いない。一例として、図６に示すように、仕切り部材２０の少なくとも１カ所に保持具４０を設ける。保持具４０は、容器本体１０と仕切り部材２０とを固定するものである。これにより、容器本体１０の上方空間が開放であるため、培地１６の交換作業を容易に行いことが可能である。
【００３８】
保持具４０は、仕切り部材２０を容器本体１０内に保持するためのものである。保持具４０は、一端が仕切り部材２０に固定され、他端が容器本体１０の側壁部１２に固定される。他端は、クリップのように側壁部１２を挟み込むようになっていてもよいし、その他の手段で固定されてもよい。保持具４０は、樹脂成型品であってもよいし、金属線の成形品であってもよく、その他前述の機能を備えればどのような素材や形態であってもよい。また、保持具４０は、単一または複数のいずれであってもよい。
【００３９】
また、他の例として、保持具４０を用いず、仕切り部材２０の外周の少なくとも一部が容器本体１０の内側面に圧接されることで、培地１６中に保持されるようにしてもよい。この場合、仕切り部材２０の外周寸法と容器本体１０の内径寸法等によって、適宜調整する。また、仕切り部材２０の外周に圧接用の枠体を設けてもよい。
【００４０】
本実施形態に係る培養容器３００における仕切り部材２０の使用方法については、第１の実施形態と同様である。
培養容器３００を用いることで、容器本体１０を移動する際に、容器本体１０が大きく搖動して、隔室１７内の被培養物５０が隔室１７の開口から隣接する別の隔室１７に移動することを抑制できる。
【００４１】
［第４の実施形態］
本発明の第４の実施形態に係る培養容器４００について、図７および図８を用いて説明する。図７は、培養容器４００の縦断面図である。図８は、培養容器４００の平面図である。なお、本実施形態は、第１の実施形態の変形例であって、第１の実施形態と同一部分または類似部分には、同一符号を付して、重複説明を省略する。
【００４２】
本実施形態では、蓋体３０と仕切り部材２０とを接合する接続具３１がネジ構造である。そのため、容器本体１０の底部１１と仕切り部材２０との距離を調整可能である。これにより、培地１６の液面が相違する場合や、容器本体１０の深さが相違する場合にも、適切な位置関係に調整可能である。その他、蓋体３０と仕切り部材２０との位置関係を調整可能な接続具３１であれば、ネジ構造に限らず用いることが可能である。
【００４３】
本実施形態に係る培養容器４００における仕切り部材２０の使用方法については、第１の実施形態と同様である。
培養容器４００を用いることで、容器本体１０を移動する際に、容器本体１０が大きく搖動して、隔室１７内の被培養物５０が隔室１７の開口から隣接する別の隔室１７に移動することを抑制できる。
【００４４】
［他の実施形態］
上記の各実施形態に係る細胞培養容器は、代表的な例示であって、本発明はこれらに限定されるものではない。
容器本体１０は、シャーレ、フラスコ、多層フラスコ、マイクロプレート等が挙げられるが特に形状は限定しない。シート状の部材に培養面を形成したものを、シャーレ等の容器に載置したものでもよい。
容器本体１０の素材は、樹脂製、ガラス製、金属製、またはそれらの組合せ等から適宜選択できる。樹脂製の場合、例えばアクリル樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリカーボネート、ポリプロピレン等に加え、前述した細胞低接着となる物質を混合したものや、着色剤（例えば、酸化チタン、カーボン等）を混合したもの等を用いることができる。
容器本体１０および仕切り部材２０の作製方法としては、射出成形、ナノインプリント、プレス成型、真空成型、ブロー成形やこれら成形方法の組合せの他、いくつかのパーツをそれぞれ成形した後に組み立てることで得てもよい。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の培養容器は、培養容器の移動や培養液の交換の際のスフェロイドの移動を抑制可能な培養容器を提供することができる。
【符号の説明】
【００４６】
１０…容器本体、１１…容器本体の底部、１２…容器本体の側壁部、１３…凸部、１５…培養面、１６…培養液、１７…隔室、２０…仕切り部材、２１…壁部、３０…蓋体、３１…接続具、４０…保持具、５０…被培養物、１００，２００，３００，４００，５００…細胞培養容器。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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