(57)【要約】      （修正有）【課題】体細胞突然変異生成の原因を判定するための方法の提供。【解決手段】核酸分子の配列を解析して、1種または複数種のモチーフにおける突然変異タイプについて突然変異のコドン文脈を判定する工程を含む、突然変異誘発物質による核酸分子の標的体細胞突然変異生成が生じている可能性を判定するための方法であって、予想されるよりも高いパーセンテージまたは数の突然変異が核酸分子におけるコドン内の1つの箇所に存在する場合に、標的体細胞突然変異生成が生じている可能性があるという判定がなされる、方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子の配列を解析して、1種または複数種のモチーフにおける突然変異タイプについて突然変異のコドン文脈を判定する工程を含む、突然変異誘発物質による核酸分子の標的体細胞突然変異生成が生じている可能性を判定するための方法であって、予想されるよりも高いパーセンテージまたは数の突然変異が核酸分子におけるコドン内の1つの箇所に存在する場合に、標的体細胞突然変異生成が生じている可能性があるという判定がなされる、方法。
【請求項２】
突然変異の予想されるパーセンテージまたは数が、コドン文脈とは無関係に突然変異が生じると仮定することによって算出される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
突然変異の予想されるパーセンテージが、約11％または17％である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
突然変異の予想される数が、およそ、9個の突然変異毎に1個または6個の突然変異毎に1個である、請求項2記載の方法。
【請求項５】
突然変異のパーセンテージが少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％、またはそれを上回ることが観察される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
1種または複数種の突然変異誘発物質のどれが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるかを判定する工程をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
突然変異誘発物質が、アフラトキシン、4-アミノビフェニル、アリストロキン酸、ヒ素化合物、アスベスト、アザチオプリン、ベンゼン、ベンジジン、ベリリウムおよびベリリウム化合物、1,3-ブタジエン、1,4-ブタンジオールジメチルスルホネート、カドミウムおよびカドミウム化合物、クロラムブシル、1-(2-クロロエチル)-3-(4-メチルシクロヘキシル)-1-ニトロソウレア（MeCCNU）、ビス(クロロメチル)エーテルおよびテクニカルグレードのクロロメチルメチルエーテル、六価クロム化合物、コールタールピッチ、コールタール、コークス炉排出物、シクロホスファミド、シクロスポリンA、ジエチルスチルベストロール（DES）、エリオナイト、エチレンオキシド、ホルムアルデヒド、メルファラン、紫外線A併用メトキサレン療法（PUVA）、マスタードガス、2-ナフチルアミン、中性子、ニッケル化合物、ラドン、結晶性シリカ（呼吸域サイズ）、太陽放射、すす、硫酸を含有する強い無機酸ミスト、タモキシフェン、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン（TCDD）、チオテパ、二酸化トリウム、たばこの煙、塩化ビニル、紫外線放射、木材粉塵、X線放射、ガンマ線放射、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）、アポリポタンパク質B mRNA編集酵素触媒ポリペプチド様（APOBEC）シチジンデアミナーゼ、ならびにエラープローン（error-prone）DNAポリメラーゼの中より選択される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
APOBECシチジンデアミナーゼが、APOBEC1、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G、およびAPOBEC3Hの中より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
突然変異誘発物質が、AID、APOBEC1、APOBEC3G、APOBEC3H、およびアフラトキシンの中より選択され；かつ
AIDが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のコドン内の第2の箇所（MC-2部位）で、GYWモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；
AIDが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のコドン内の第1の箇所（MC-1部位）で、WRCモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；
APOBEC3Gが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、CGモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；
APOBEC3Gが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、CGモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；
APOBEC3Gが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、CCモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；
APOBEC3Hが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、GAモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；
APOBEC1が標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、CAモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；
APOBEC1が標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、TGモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；かつ
アフラトキシンが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のMC-3部位で、GGモチーフにおける観察されたG＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；
該核酸分子が対象からの生物学的サンプル由来のものである、
請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
AID関連突然変異過程が標的体細胞突然変異生成の推定原因であるかどうかを判定する工程をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
AID関連突然変異過程が標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のMC-2部位での、WAモチーフにおける観察されたA＞G突然変異、MC-2部位での、GYWモチーフにおけるG＞A突然変異、またはMC-1部位での、WRCモチーフにおけるC＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされる、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
AIDが標的体細胞突然変異生成の推定原因であると判定された場合、対象にAID阻害剤を投与する工程をさらに含む、請求項9記載の方法。
【請求項１３】
APOBEC3Gが標的体細胞突然変異生成の推定原因であると判定された場合、対象にAPOBEC3G阻害剤を投与する工程をさらに含む、請求項9記載の方法。
【請求項１４】
APOBEC3Hが標的体細胞突然変異生成の推定原因であると判定された場合、対象にAPOBEC3G阻害剤を投与する工程をさらに含む、請求項9記載の方法。
【請求項１５】
APOBEC1が標的体細胞突然変異生成の推定原因であると予測された場合、対象にAPOBEC1阻害剤を投与する工程をさらに含む、請求項9記載の方法。
【請求項１６】
標的体細胞突然変異生成が生じているかつ/または突然変異誘発物質が標的体細胞突然変異生成の推定原因であると判定された場合に、対象におけるがんを診断する工程、または対象ががんを発症するであろう可能性を判定する工程をさらに含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
対象からの生物学的サンプル由来の核酸分子を解析して、1種または複数種の突然変異誘発物質による標的体細胞突然変異生成が生じているかどうかを検出する工程、および標的体細胞突然変異生成が生じている場合に、対象ががんを有するまたは発症する可能性があることを判定する工程を含む、対象ががんを有する可能性またはがんを発症するであろう可能性を判定するための方法。
【請求項１８】
突然変異誘発物質が、アフラトキシン、4-アミノビフェニル、アリストロキン酸、ヒ素化合物、アスベスト、アザチオプリン、ベンゼン、ベンジジン、ベリリウムおよびベリリウム化合物、1,3-ブタジエン、1,4-ブタンジオールジメチルスルホネート、カドミウムおよびカドミウム化合物、クロラムブシル、1-(2-クロロエチル)-3-(4-メチルシクロヘキシル)-1-ニトロソウレア（MeCCNU）、ビス(クロロメチル)エーテルおよびテクニカルグレードのクロロメチルメチルエーテル、六価クロム化合物、コールタールピッチ、コールタール、コークス炉排出物、シクロホスファミド、シクロスポリンA、ジエチルスチルベストロール（DES）、エリオナイト、エチレンオキシド、ホルムアルデヒド、メルファラン、紫外線A併用メトキサレン療法（PUVA）、マスタードガス、2-ナフチルアミン、中性子、ニッケル化合物、ラドン、結晶性シリカ（呼吸域サイズ）、太陽放射、すす、硫酸を含有する強い無機酸ミスト、タモキシフェン、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン（TCDD）、チオテパ、二酸化トリウム、たばこの煙、塩化ビニル、紫外線放射、木材粉塵、X線放射、ガンマ線放射、AID、APOBECシチジンデアミナーゼ、ならびにエラープローンDNAポリメラーゼの中より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、GYWモチーフにおける観察されたGからAへの突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、WRCモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、CGモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、CGモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、CAモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、GAモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、TGモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-3部位で、GGモチーフにおける観察されたG＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、CCモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；または
核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、WAモチーフにおける観察されたA＞G突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合に、
標的体細胞突然変異生成が検出される、請求項17または18記載の方法。
【請求項２０】
核酸分子の非転写鎖のMC-2部位での、GYWモチーフにおける観察されたG＞A突然変異、またはMC-1部位での、WRCモチーフにおけるC＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合、突然変異誘発物質はAIDである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
核酸分子の非転写鎖のMC-2部位での、CGモチーフにおける観察されたG＞A突然変異、MC-1部位での、CGモチーフにおけるC＞T突然変異、またはMC-1部位での、CGモチーフにおけるC＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合、突然変異誘発物質はAPOBEC3Gである、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
核酸分子の非転写鎖のMC-1部位での、CAモチーフにおける観察されたC＞T突然変異、またはMC-2部位での、TGモチーフにおけるG＞A突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合、突然変異誘発物質はAPOBEC1である、請求項19記載の方法。
【請求項２３】
核酸分子の非転写鎖のMC-1部位での、GAモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合、突然変異誘発物質はAPOBEC3Hである、請求項19記載の方法。
【請求項２４】
核酸分子の非転写鎖のMC-3部位での、GGモチーフにおける観察されたG＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合、突然変異誘発物質はアフラトキシンである、請求項19記載の方法。
【請求項２５】
生物学的サンプルが、乳房、前立腺、肝臓、結腸、胃、膵臓、皮膚、甲状腺、子宮頸部、リンパ系、造血系、膀胱、肺、腎臓、直腸、卵巣、子宮、および頭頸部の組織または細胞を含む、請求項16〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
がんが、乳房、前立腺、肝臓、結腸、胃、膵臓、皮膚、甲状腺、子宮頸部、リンパ系、造血系、膀胱、肺、腎臓、直腸、卵巣、子宮、および頭頸部のがんの中より選択される、請求項16〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
がんが、肝細胞癌、黒色腫、または腺様嚢胞癌である、請求項16〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
サンプルが前立腺の組織または細胞を含む場合、対象は前立腺癌を有すると診断される、または癌を有するもしくは発症する可能性があると判定される、請求項16〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
サンプルが乳房の組織または細胞を含む場合、対象が乳癌を有すると診断される、または乳癌を有するもしくは発症する可能性があると判定される、請求項16〜267のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
対象に療法を施す工程をさらに含む、請求項16〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
療法には、放射線療法、外科手術、化学療法、ホルモン除去（hormone ablation）療法、アポトーシス促進療法、および/または免疫療法が含まれる、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
対象にAID阻害剤を投与する工程をさらに含む、請求項20記載の方法。
【請求項３３】
対象にAPOBEC3G阻害剤を投与する工程をさらに含む、請求項21記載の方法。
【請求項３４】
対象にAPOBEC1阻害剤を投与する工程をさらに含む、請求項22記載の方法。
【請求項３５】
対象にAPOBEC3H阻害剤を投与する工程をさらに含む、請求項23記載の方法。
【請求項３６】
核酸分子の配列を解析して、突然変異誘発物質と関連していることが公知の突然変異タイプの体細胞突然変異を同定する工程；
突然変異のコドン文脈を判定して、予想されるよりも高い頻度で突然変異が生じる優先ヌクレオチド箇所を同定する工程；および
優先ヌクレオチド箇所における突然変異に隣接するヌクレオチドを同定して、該突然変異に共通しているモチーフを同定する工程
を含む、突然変異誘発物質に標的とされる核酸モチーフを同定するための方法。
【請求項３７】
核酸分子の配列を解析して、該核酸分子における体細胞突然変異を同定する工程；
コドン内の優先ヌクレオチド箇所で、予想されるよりも高い頻度で生じる突然変異タイプを同定する工程；および
優先ヌクレオチド箇所における該突然変異タイプに隣接するヌクレオチドを同定して、該突然変異タイプに共通しているモチーフを同定する工程
を含む、突然変異誘発物質に標的とされる核酸モチーフを同定するための方法。
【請求項３８】
突然変異タイプが、C＞T、C＞A、C＞G、G＞T、G＞A、G＞C、A＞T、A＞C、A＞G、T＞A、T＞C、およびT＞G突然変異より選択される、請求項36または37記載の方法。
【請求項３９】
優先ヌクレオチド箇所が、MC-1、MC-2、およびMC-3の中より選択される、請求項36〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
予想される頻度が、突然変異がコドン文脈とは無関係に生じると仮定することによって算出される、請求項36〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
予想される頻度が、およそ、9個の突然変異毎に1個または6個の突然変異毎に1個である、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
優先ヌクレオチド箇所において、突然変異が生じる機会が、少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％、またはそれを上回る、請求項30〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
核酸分子の非転写鎖が解析される、請求項30〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
突然変異誘発物質が、核酸入手元の細胞に対して内因性である、請求項30〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
突然変異誘発物質が、核酸入手元の細胞に対して外因性である、請求項35〜44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
突然変異誘発物質が、4-アミノビフェニル、アリストロキン酸、ヒ素化合物、アスベスト、アザチオプリン、ベンゼン、ベンジジン、ベリリウムおよびベリリウム化合物、1,3-ブタジエン、1,4-ブタンジオールジメチルスルホネート、カドミウムおよびカドミウム化合物、クロラムブシル、1-(2-クロロエチル)-3-(4-メチルシクロヘキシル)-1-ニトロソウレア（MeCCNU）、ビス(クロロメチル)エーテルおよびテクニカルグレードのクロロメチルメチルエーテル、六価クロム化合物、コールタールピッチ、コールタール、コークス炉排出物、シクロホスファミド、シクロスポリンA、ジエチルスチルベストロール（DES）、エリオナイト、エチレンオキシド、ホルムアルデヒド、メルファラン、紫外線A併用メトキサレン療法（PUVA）、マスタードガス、2-ナフチルアミン、中性子、ニッケル化合物、ラドン、結晶性シリカ（呼吸域サイズ）、太陽放射、すす、硫酸を含有する強い無機酸ミスト、タモキシフェン、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン（TCDD）、チオテパ、二酸化トリウム、たばこの煙、塩化ビニル、紫外線放射、木材粉塵、X線放射、ガンマ線放射、APOBECシチジンデアミナーゼ、ならびにエラープローンDNAポリメラーゼの中より選択される、請求項35〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
核酸分子または核酸分子入手元の細胞が、解析前に、突然変異誘発物質に曝露されたことが分かっている、請求項6〜48のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
核酸分子をまず単離する工程を含む、請求項1〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
核酸分子のすべてまたは一部をシークエンシングする工程を含む、請求項1〜48のいずれか一項記載の方法。
【請求項５０】
核酸分子が、単一遺伝子または単一遺伝子のcDNAのすべてまたは一部を含む、請求項1〜49のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
核酸分子が、2種もしくはそれを上回る種類の遺伝子または2種もしくはそれを上回る種類の遺伝子のcDNAのすべてまたは一部を含む、請求項1〜50のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
遺伝子が、がんと関連した遺伝子である、請求項50または請求項51記載の方法。
【請求項５３】
遺伝子が、TP53、PIK3CA、ERBB2、DIRAS3、TET2、および一酸化窒素合成酵素（NOS）遺伝子の中より選択される、請求項50〜52のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
細胞の全エクソームを構成する核酸分子が解析される、請求項1〜55のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
細胞の全ゲノムを構成する核酸分子が解析される、請求項1〜53のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
請求項1〜55のいずれか一項記載の方法における使用のための試薬を含む、キット。
【請求項５７】
試薬が、プライマー、dNTP、およびポリメラーゼの中より選択される、請求項56記載のキット。
【請求項５８】
すべてまたは一部が処理システムによって実施される、請求項1〜55のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、突然変異誘発物質による核酸分子の標的体細胞突然変異生成が生じている可能性、および突然変異誘発物質が核酸分子の標的体細胞突然変異生成の原因である可能性を判定するための方法に関する。本発明は、さらに、対象におけるがんを診断するための、および/または対象ががんを有する可能性もしくはがんを発症するであろう可能性を判定するための方法、ならびにがんを有すると診断された対象またはがんを有するもしくは発症する可能性があると判定された対象を治療するための方法に関する。さらなる局面において、本発明は、突然変異誘発物質によって認識されるまたは標的とされる、核酸分子内のモチーフを同定するための方法に関する。
【０００２】
関連出願
本出願は、2012年11月5日に提出された「Method for the diagnosis of disease associated with somatic mutagenesis」と題したオーストラリア仮出願第2012904826号；2012年11月13日に提出された「Database system and method for the diagnosis of disease associated with somatic mutagenesis」と題したオーストラリア仮出願第2012904940号；および2013年4月12日に提出された「Method for the diagnosis of disease associated with mutagenesis using small numbers of somatic mutations」と題したオーストラリア仮出願第2013901253号に対する優先権を主張するものである。オーストラリア仮出願第2012904826号、第2012904940号、および第2013901253号の対象物は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
がん細胞への正常細胞の進行は、免疫系、ホルモン状態、遺伝子発現、および組織間のシグナル伝達の変化を含めた多様な因子によって影響を受け得る。がん進行においてとくに重要な因子は、すべてではないとしてもほとんどの組織タイプのがんにおいて役割を担う体細胞突然変異である。
【０００４】
様々な遺伝子における体細胞突然変異の蓄積は、がん進行に直接関係しているように思われる。このことは、例えばDNAポリメラーゼ校正またはDNA修復の欠損により生じる体細胞突然変異生成の増加が、腫瘍進行の加速と関連していた様々な動物モデルを用いて実証されている（例えば、Venkatesan et al. (2007). Mol. Cell. Biol. 27:7669-7682（非特許文献1）；およびAlbertson (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17101-17104（非特許文献2）を参照されたい）。様々な遺伝子の体細胞突然変異生成の増加は、多様ながんとも関連している。例えば、TP53遺伝子における体細胞突然変異は、ヒトがんにおける最も高頻度な変更のうちの1つである。TP53体細胞突然変異は、卵巣癌、食道癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、喉頭癌、および肺癌における38％〜50％から、原発性白血病、肉腫、精巣癌、悪性黒色腫、および子宮頸癌における約5％までの割合で、ほぼあらゆるタイプのがんにおいて生じ、かつ進行期または侵襲性のがんの亜型（トリプルネガティブ乳癌またはHER2増幅乳癌など）は、TP53における体細胞突然変異の頻度の増加と関連している（Olivier et al. (2010) Cold Spring Harb Perspect Biol 2:a001008（非特許文献3）において概説されている）。体細胞突然変異を蓄積する、がんと関連した他の遺伝子には、例えばBRAF、HRAS、KRAS2、およびNRASが含まれ、とはいえヒトがんにおいて見出される、体細胞で獲得された突然変異についてのオンラインデータベースのCOSMICには、現在25000種を超える遺伝子が含まれている。
【０００５】
体細胞突然変異生成は、タバコの煙、UV光、および放射線などの環境因子によって、ならびに/あるいは染色体転座、DNA修復ミスもしくは無修復、および酵素により始動される体細胞超変異（SHM）などの生物学的因子または過程によって引き起こされ得る。細胞における体細胞突然変異生成の原因および程度を判定することは、体細胞突然変異生成と関連した病状を診断することまたはそのような病状を発症する危険性を予測することに役立ち得るだけでなく、最適な治療または予防プロトコールを開発することにも役立ち得る。ゆえに、体細胞突然変異生成の存在を判定するための、および1種または複数種の突然変異誘発物質のどれが対象における体細胞突然変異生成に関わっているかを同定するための正確な方法の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Venkatesan et al. (2007). Mol. Cell. Biol. 27:7669-7682
【非特許文献２】Albertson (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17101-17104
【非特許文献３】Olivier et al. (2010) Cold Spring Harb Perspect Biol 2:a001008
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、核酸分子内の特定のコドン文脈にモチーフが存在している場合、モチーフにおいて、様々な突然変異誘発物質によって体細胞突然変異生成に向かう傾向があるという判定に一部基づいている。ゆえに、一部の突然変異誘発物質はモチーフを標的とするとこれまでは理解されていたが、本明細書において記載されるように、これらのモチーフにおける突然変異生成は、特定のコドン文脈内にモチーフがある場合に主に生じ、過程は本明細書において標的体細胞突然変異生成と称される。モチーフのコドン文脈に対するこの付加的要件を同定することによって、本発明者らは、このタイプの標的体細胞突然変異生成が生じている可能性、および1種または複数種の特定の突然変異誘発物質が標的体細胞突然変異生成の原因である可能性を判定するための方法を開発した。標的体細胞突然変異の例を評価することにより、突然変異誘発物質に標的とされるモチーフを同定するための一般化方法も開発されており、かつ本明細書に記載されている。
【０００８】
体細胞突然変異の蓄積は、がんの発症および進行と関連しているため、対象におけるがんを診断するための方法、および対象ががんを有する可能性またはがんを発症するであろう可能性を判定するための方法も開発された。原因となる突然変異誘発物質を同定し、かつ/またはがんを診断するもしくはがんを発症する可能性を診断することによって、適当かつ特異的な治療プロトコールを開発して、突然変異誘発物質の活性を阻害するもしくは低下させることができ、かつ/またはがんを治療するもしくは阻止することができる。
【０００９】
ゆえに、一局面において、本発明は、核酸分子の配列を解析して、1種または複数種のモチーフにおける突然変異タイプについて突然変異のコドン文脈を判定する工程を含む、突然変異誘発物質による核酸分子の標的体細胞突然変異生成が生じている可能性を検出するまたは判定するための方法に向けられており、標的体細胞突然変異生成が検出されたまたは生じている可能性があるという判定は、予想されるよりも高いパーセンテージまたは数の突然変異が、核酸分子におけるコドン内の1つの箇所に存在する場合になされる。
【００１０】
一般的に、突然変異の予想されるパーセンテージまたは数は、突然変異がコドン文脈とは無関係に生じると仮定することによって算出される。いくつかの態様において、突然変異の予想されるパーセンテージはおよそ11％もしくは17％であり、かつ/または突然変異の予想される数は、およそ、9個の突然変異毎に1個もしくは6個の突然変異毎に1個である。いくつかの例において、突然変異のパーセンテージは、少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％、またはそれを上回ることが観察される。
【００１１】
標的体細胞突然変異生成が生じているかどうかを判定するための方法は、どの突然変異誘発物質が標的体細胞突然変異生成の推定原因であるかを判定する工程をさらに含み得る。突然変異誘発物質は、例えばアフラトキシン、4-アミノビフェニル、アリストロキン酸、ヒ素化合物、アスベスト、アザチオプリン、ベンゼン、ベンジジン、ベリリウムおよびベリリウム化合物、1,3-ブタジエン、1,4-ブタンジオールジメチルスルホネート、カドミウムおよびカドミウム化合物、クロラムブシル、1-(2-クロロエチル)-3-(4-メチルシクロヘキシル)-1-ニトロソウレア（MeCCNU）、ビス(クロロメチル)エーテルおよびテクニカルグレードのクロロメチルメチルエーテル、六価クロム化合物、コールタールピッチ、コールタール、コークス炉排出物、シクロホスファミド、シクロスポリンA、ジエチルスチルベストロール（DES）、エリオナイト、エチレンオキシド、ホルムアルデヒド、メルファラン、紫外線A併用メトキサレン療法（PUVA）、マスタードガス、2-ナフチルアミン、中性子、ニッケル化合物、ラドン、結晶性シリカ（呼吸域サイズ）、太陽放射、すす、硫酸を含有する強い無機酸ミスト、タモキシフェン、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン（TCDD）、チオテパ、二酸化トリウム、たばこの煙、塩化ビニル、紫外線放射、木材粉塵、X線放射、ガンマ線放射、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）、アポリポタンパク質B mRNA編集酵素触媒ポリペプチド様（APOBEC）シチジンデアミナーゼ、ならびにエラープローン（error-prone）DNAポリメラーゼより選択され得る。いくつかの例において、APOBECシチジンデアミナーゼは、APOBEC1、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G、およびAPOBEC3Hの中より選択される。
【００１２】
突然変異誘発物質がAID、APOBEC1、APOBEC3G、APOBEC3H、およびアフラトキシンの中より選択される特定の態様において、AIDが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定は、核酸分子の非転写鎖において、コドン内の第2の箇所（MC-2部位）でGYWモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；AIDが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定は、核酸分子の非転写鎖のコドン内の第1の箇所（MC-1部位）でWRCモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；APOBEC3Gが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定は、核酸分子の非転写鎖のMC-2部位でCGモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；APOBEC3Gが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定は、核酸分子の非転写鎖のMC-1部位でCGモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；APOBEC3Gが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定は、核酸分子の非転写鎖のMC-1部位でCCモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；APOBEC3Hが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定は、核酸分子の非転写鎖のMC-1部位でGAモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；APOBEC1が標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定は、核酸分子の非転写鎖のMC-1部位でCAモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；APOBEC1が標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定は、核酸分子の非転写鎖のMC-2部位でTGモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；かつアフラトキシンが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定は、核酸分子の非転写鎖のMC-3部位でGGモチーフにおける観察されたG＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ、該核酸分子は対象からの生物学的サンプル由来のものである。
【００１３】
標的体細胞突然変異生成が生じているかどうかを判定するための方法の他の態様は、AID関連突然変異過程が標的体細胞突然変異生成の推定原因であるかどうかを判定する工程をさらに含む。例えば、AID関連突然変異過程が標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定は、核酸分子の非転写鎖のMC-2部位での、WAモチーフにおける観察されたA＞G突然変異、MC-2部位での、GYWモチーフにおけるG＞A突然変異、またはMC-1部位での、WRCモチーフにおけるC＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされる。
【００１４】
本発明の方法の特定の例において、AIDが標的体細胞突然変異生成の推定原因であると判定された場合、方法は、対象にAID阻害剤を投与する工程をさらに含み；APOBEC3Gが標的体細胞突然変異生成の推定原因であると判定された場合、対象にAPOBEC3G阻害剤を投与する工程をさらに含み；APOBEC3Hが標的体細胞突然変異生成の推定原因であると判定された場合、対象にAPOBEC3G阻害剤を投与する工程をさらに含み；またはAPOBEC1が標的体細胞突然変異生成の推定原因であると判定された場合、対象にAPOBEC1阻害剤を投与する工程をさらに含む。
【００１５】
さらなる態様において、方法は、標的体細胞突然変異生成が生じているかつ/または突然変異誘発物質が標的体細胞突然変異生成の推定原因であると判定された場合に、対象におけるがんを診断する工程、または対象ががんを発症するであろう可能性を判定する工程も含む。
【００１６】
他の局面において、本発明は、対象からの生物学的サンプル由来の核酸分子を解析して、1種または複数種の突然変異誘発物質による標的体細胞突然変異生成が生じているかどうかを検出する工程、および標的体細胞突然変異生成が生じている場合に、対象ががんを有するまたは発症する可能性があることを判定する工程を含む、対象ががんを有する可能性またはがんを発症するであろう可能性を判定するための方法に向けられている。
【００１７】
一例において、核酸分子の非転写鎖のMC-2部位でGYWモチーフにおける観察されたGからAへの突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；核酸分子の非転写鎖のMC-1部位でWRCモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；核酸分子の非転写鎖のMC-2部位でCGモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；核酸分子の非転写鎖のMC-1部位でCGモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；核酸分子の非転写鎖のMC-1部位でCAモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；核酸分子の非転写鎖のMC-1部位でGAモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；核酸分子の非転写鎖のMC-2部位でTGモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；核酸分子の非転写鎖のMC-3部位でGGモチーフにおける観察されたG＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；核酸分子の非転写鎖のMC-1部位でCCモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；または核酸分子の非転写鎖のMC-2部位でWAモチーフにおける観察されたA＞G突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合に、標的体細胞突然変異生成が検出される。
【００１８】
特定の例において、突然変異誘発物質は、核酸分子の非転写鎖のMC-2部位でGYWモチーフにおける観察されたG＞A突然変異、もしくはMC-1部位でWRCモチーフにおけるC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合に、AIDであると判定され；核酸分子の非転写鎖のMC-2部位でCGモチーフにおける観察されたG＞A突然変異、MC-1部位でCGモチーフにおけるC＞T突然変異、もしくはMC-1部位でCCモチーフにおけるC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合に、APOBEC3Gであると判定され；核酸分子の非転写鎖のMC-1部位でCAモチーフにおける観察されたC＞T突然変異、もしくはMC-2部位でTGモチーフにおけるG＞A突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合に、APOBEC1であると判定され；核酸分子の非転写鎖のMC-1部位でGAモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合に、APOBEC3Hであると判定され；または核酸分子の非転写鎖のMC-3部位でGGモチーフにおける観察されたG＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合に、アフラトキシンであると判定される。
【００１９】
生物学的サンプルには、乳房、前立腺、肝臓、結腸、胃、膵臓、皮膚、甲状腺、子宮頸部、リンパ系、造血系、膀胱、肺、腎臓、直腸、卵巣、子宮、および頭頸部の組織または細胞が含まれてよく、いくつかの場合において、がんは、乳房、前立腺、肝臓、結腸、胃、膵臓、皮膚、甲状腺、子宮頸部、リンパ系、造血系、膀胱、肺、腎臓、直腸、卵巣、子宮、および頭頸部のがんの中より選択される。特定の例において、がんは、肝細胞癌、黒色腫、または腺様嚢胞癌である。
【００２０】
本発明のいくつかの態様において、サンプルが前立腺の組織または細胞を含む場合、対象は前立腺癌を有すると診断される、または癌を有するもしくは発症する可能性があると判定される。他の態様において、サンプルが乳房の組織または細胞を含む場合、対象は乳癌を有すると診断される、または乳癌を有するもしくは発症する可能性があると判定される。
【００２１】
本発明の方法は、例えば放射線療法、外科手術、化学療法、ホルモン除去（hormone ablation）療法、アポトーシス促進療法、および/または免疫療法など、対象に療法を施す工程をさらに含んでよい。特定の例において、方法は、AID阻害剤、APOBEC3G阻害剤、APOBEC1阻害剤、および/またはAPOBEC3H阻害剤を対象に投与する工程を含む。
【００２２】
別の局面において、本発明は、核酸分子の配列を解析して、突然変異誘発物質と関連していることが公知の突然変異タイプの体細胞突然変異を同定する工程；突然変異のコドン文脈を判定して、予想されるよりも高い頻度で突然変異が生じる優先ヌクレオチド箇所を同定する工程；および優先ヌクレオチド箇所における該突然変異に隣接するヌクレオチドを同定して、該突然変異に共通しているモチーフを同定する工程を含む、突然変異誘発物質に標的とされる核酸モチーフを同定するための方法に向けられている。
【００２３】
本発明は、核酸分子の配列を解析して、該核酸分子における体細胞突然変異を同定する工程；コドン内の優先ヌクレオチド箇所で、予想されるよりも高い頻度で生じる突然変異タイプを同定する工程；および優先ヌクレオチド箇所における該突然変異タイプに隣接するヌクレオチドを同定して、該突然変異タイプに共通しているモチーフを同定する工程を含む、突然変異誘発物質に標的とされる核酸モチーフを同定するための方法にも向けられている。
【００２４】
突然変異タイプは、C＞T、C＞A、C＞G、G＞T、G＞A、G＞C、A＞T、A＞C、A＞G、T＞A、T＞C、およびT＞G突然変異より選択され得、かつ優先ヌクレオチド箇所は、MC-1、MC-2、およびMC-3の中より選択され得る。
【００２５】
そのような方法において、予想される頻度は、突然変異がコドン文脈とは無関係に生じると仮定することによって算出される。例えば、予想される頻度は、およそ、9個の突然変異毎に1個または6個の突然変異毎に1個であり得る。いくつかの態様において、優先ヌクレオチド箇所において、突然変異が生じる機会は、少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％、またはそれを上回る。
【００２６】
本発明の方法のいくつかの態様において、核酸分子の非転写鎖が解析される。
【００２７】
突然変異誘発物質は、核酸入手元の細胞に対して内因性または外因性であり得る。例えば、突然変異誘発物質は、4-アミノビフェニル、アリストロキン酸、ヒ素化合物、アスベスト、アザチオプリン、ベンゼン、ベンジジン、ベリリウムおよびベリリウム化合物、1,3-ブタジエン、1,4-ブタンジオールジメチルスルホネート、カドミウムおよびカドミウム化合物、クロラムブシル、1-(2-クロロエチル)-3-(4-メチルシクロヘキシル)-1-ニトロソウレア（MeCCNU）、ビス(クロロメチル)エーテルおよびテクニカルグレードのクロロメチルメチルエーテル、六価クロム化合物、コールタールピッチ、コールタール、コークス炉排出物、シクロホスファミド、シクロスポリンA、ジエチルスチルベストロール（DES）、エリオナイト、エチレンオキシド、ホルムアルデヒド、メルファラン、紫外線A併用メトキサレン療法（PUVA）、マスタードガス、2-ナフチルアミン、中性子、ニッケル化合物、ラドン、結晶性シリカ（呼吸域サイズ）、太陽放射、すす、硫酸を含有する強い無機酸ミスト、タモキシフェン、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン（TCDD）、チオテパ、二酸化トリウム、たばこの煙、塩化ビニル、紫外線放射、木材粉塵、X線放射、ガンマ線放射、APOBECシチジンデアミナーゼ、ならびにエラープローンDNAポリメラーゼの中より選択され得る。本発明の方法の特定の例において、核酸分子または核酸分子入手元の細胞は、解析前に、突然変異誘発物質に曝露されたことが分かっている。
【００２８】
本発明の方法の態様は、核酸分子をまず単離する工程、および/または該核酸分子のすべてもしくは一部をシークエンシングする工程も含んでよい。核酸分子は、単一遺伝子または単一遺伝子のcDNAのすべてまたは一部、あるいは2種もしくはそれを上回る種類の遺伝子または2種もしくはそれを上回る種類の遺伝子のcDNAのすべてまたは一部を含み得る。いくつかの場合において、遺伝子は、がんと関連した遺伝子である。例えば、遺伝子は、TP53、PIK3CA、ERBB2、DIRAS3、TET2、および一酸化窒素合成酵素（NOS）遺伝子の中より選択され得る。さらなる態様において、細胞の全エクソームまたは細胞の全ゲノムを構成する核酸分子が解析される。
【００２９】
本発明は、本明細書において記載される方法における使用のための試薬を含むキットにも向けられている。試薬は、例えばプライマー、dNTP、およびポリメラーゼの中より選択され得る。
【００３０】
本発明の方法の特定の態様において、方法のすべてまたは一部は処理システムによって実施される。
[本発明1001]
核酸分子の配列を解析して、1種または複数種のモチーフにおける突然変異タイプについて突然変異のコドン文脈を判定する工程を含む、突然変異誘発物質による核酸分子の標的体細胞突然変異生成が生じている可能性を判定するための方法であって、予想されるよりも高いパーセンテージまたは数の突然変異が核酸分子におけるコドン内の1つの箇所に存在する場合に、標的体細胞突然変異生成が生じている可能性があるという判定がなされる、方法。
[本発明1002]
突然変異の予想されるパーセンテージまたは数が、コドン文脈とは無関係に突然変異が生じると仮定することによって算出される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
突然変異の予想されるパーセンテージが、約11％または17％である、本発明1002の方法。
[本発明1004]
突然変異の予想される数が、およそ、9個の突然変異毎に1個または6個の突然変異毎に1個である、本発明1002の方法。
[本発明1005]
突然変異のパーセンテージが少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％、またはそれを上回ることが観察される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
1種または複数種の突然変異誘発物質のどれが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるかを判定する工程をさらに含む、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
突然変異誘発物質が、アフラトキシン、4-アミノビフェニル、アリストロキン酸、ヒ素化合物、アスベスト、アザチオプリン、ベンゼン、ベンジジン、ベリリウムおよびベリリウム化合物、1,3-ブタジエン、1,4-ブタンジオールジメチルスルホネート、カドミウムおよびカドミウム化合物、クロラムブシル、1-(2-クロロエチル)-3-(4-メチルシクロヘキシル)-1-ニトロソウレア（MeCCNU）、ビス(クロロメチル)エーテルおよびテクニカルグレードのクロロメチルメチルエーテル、六価クロム化合物、コールタールピッチ、コールタール、コークス炉排出物、シクロホスファミド、シクロスポリンA、ジエチルスチルベストロール（DES）、エリオナイト、エチレンオキシド、ホルムアルデヒド、メルファラン、紫外線A併用メトキサレン療法（PUVA）、マスタードガス、2-ナフチルアミン、中性子、ニッケル化合物、ラドン、結晶性シリカ（呼吸域サイズ）、太陽放射、すす、硫酸を含有する強い無機酸ミスト、タモキシフェン、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン（TCDD）、チオテパ、二酸化トリウム、たばこの煙、塩化ビニル、紫外線放射、木材粉塵、X線放射、ガンマ線放射、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）、アポリポタンパク質B mRNA編集酵素触媒ポリペプチド様（APOBEC）シチジンデアミナーゼ、ならびにエラープローン（error-prone）DNAポリメラーゼの中より選択される、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1008]
APOBECシチジンデアミナーゼが、APOBEC1、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G、およびAPOBEC3Hの中より選択される、本発明1007の方法。
[本発明1009]
突然変異誘発物質が、AID、APOBEC1、APOBEC3G、APOBEC3H、およびアフラトキシンの中より選択され；かつ
AIDが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のコドン内の第2の箇所（MC-2部位）で、GYWモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；
AIDが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のコドン内の第1の箇所（MC-1部位）で、WRCモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；
APOBEC3Gが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、CGモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；
APOBEC3Gが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、CGモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；
APOBEC3Gが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、CCモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；
APOBEC3Hが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、GAモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；
APOBEC1が標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、CAモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；
APOBEC1が標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、TGモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；かつ
アフラトキシンが標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のMC-3部位で、GGモチーフにおける観察されたG＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされ；
該核酸分子が対象からの生物学的サンプル由来のものである、
本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
AID関連突然変異過程が標的体細胞突然変異生成の推定原因であるかどうかを判定する工程をさらに含む、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1011]
AID関連突然変異過程が標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定が、核酸分子の非転写鎖のMC-2部位での、WAモチーフにおける観察されたA＞G突然変異、MC-2部位での、GYWモチーフにおけるG＞A突然変異、またはMC-1部位での、WRCモチーフにおけるC＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合になされる、本発明1010の方法。
[本発明1012]
AIDが標的体細胞突然変異生成の推定原因であると判定された場合、対象にAID阻害剤を投与する工程をさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1013]
APOBEC3Gが標的体細胞突然変異生成の推定原因であると判定された場合、対象にAPOBEC3G阻害剤を投与する工程をさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1014]
APOBEC3Hが標的体細胞突然変異生成の推定原因であると判定された場合、対象にAPOBEC3G阻害剤を投与する工程をさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1015]
APOBEC1が標的体細胞突然変異生成の推定原因であると予測された場合、対象にAPOBEC1阻害剤を投与する工程をさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1016]
標的体細胞突然変異生成が生じているかつ/または突然変異誘発物質が標的体細胞突然変異生成の推定原因であると判定された場合に、対象におけるがんを診断する工程、または対象ががんを発症するであろう可能性を判定する工程をさらに含む、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
対象からの生物学的サンプル由来の核酸分子を解析して、1種または複数種の突然変異誘発物質による標的体細胞突然変異生成が生じているかどうかを検出する工程、および標的体細胞突然変異生成が生じている場合に、対象ががんを有するまたは発症する可能性があることを判定する工程を含む、対象ががんを有する可能性またはがんを発症するであろう可能性を判定するための方法。
[本発明1018]
突然変異誘発物質が、アフラトキシン、4-アミノビフェニル、アリストロキン酸、ヒ素化合物、アスベスト、アザチオプリン、ベンゼン、ベンジジン、ベリリウムおよびベリリウム化合物、1,3-ブタジエン、1,4-ブタンジオールジメチルスルホネート、カドミウムおよびカドミウム化合物、クロラムブシル、1-(2-クロロエチル)-3-(4-メチルシクロヘキシル)-1-ニトロソウレア（MeCCNU）、ビス(クロロメチル)エーテルおよびテクニカルグレードのクロロメチルメチルエーテル、六価クロム化合物、コールタールピッチ、コールタール、コークス炉排出物、シクロホスファミド、シクロスポリンA、ジエチルスチルベストロール（DES）、エリオナイト、エチレンオキシド、ホルムアルデヒド、メルファラン、紫外線A併用メトキサレン療法（PUVA）、マスタードガス、2-ナフチルアミン、中性子、ニッケル化合物、ラドン、結晶性シリカ（呼吸域サイズ）、太陽放射、すす、硫酸を含有する強い無機酸ミスト、タモキシフェン、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン（TCDD）、チオテパ、二酸化トリウム、たばこの煙、塩化ビニル、紫外線放射、木材粉塵、X線放射、ガンマ線放射、AID、APOBECシチジンデアミナーゼ、ならびにエラープローンDNAポリメラーゼの中より選択される、本発明1017の方法。
[本発明1019]
核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、GYWモチーフにおける観察されたGからAへの突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、WRCモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、CGモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、CGモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、CAモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、GAモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、TGモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-3部位で、GGモチーフにおける観察されたG＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、CCモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；または
核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、WAモチーフにおける観察されたA＞G突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合に、
標的体細胞突然変異生成が検出される、本発明1017または1018の方法。
[本発明1020]
核酸分子の非転写鎖のMC-2部位での、GYWモチーフにおける観察されたG＞A突然変異、またはMC-1部位での、WRCモチーフにおけるC＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合、突然変異誘発物質はAIDである、本発明1019の方法。
[本発明1021]
核酸分子の非転写鎖のMC-2部位での、CGモチーフにおける観察されたG＞A突然変異、MC-1部位での、CGモチーフにおけるC＞T突然変異、またはMC-1部位での、CGモチーフにおけるC＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合、突然変異誘発物質はAPOBEC3Gである、本発明1019の方法。
[本発明1022]
核酸分子の非転写鎖のMC-1部位での、CAモチーフにおける観察されたC＞T突然変異、またはMC-2部位での、TGモチーフにおけるG＞A突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合、突然変異誘発物質はAPOBEC1である、本発明1019の方法。
[本発明1023]
核酸分子の非転写鎖のMC-1部位での、GAモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合、突然変異誘発物質はAPOBEC3Hである、本発明1019の方法。
[本発明1024]
核酸分子の非転写鎖のMC-3部位での、GGモチーフにおける観察されたG＞T突然変異の数またはパーセンテージが予想されるよりも高い場合、突然変異誘発物質はアフラトキシンである、本発明1019の方法。
[本発明1025]
生物学的サンプルが、乳房、前立腺、肝臓、結腸、胃、膵臓、皮膚、甲状腺、子宮頸部、リンパ系、造血系、膀胱、肺、腎臓、直腸、卵巣、子宮、および頭頸部の組織または細胞を含む、本発明1016〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
がんが、乳房、前立腺、肝臓、結腸、胃、膵臓、皮膚、甲状腺、子宮頸部、リンパ系、造血系、膀胱、肺、腎臓、直腸、卵巣、子宮、および頭頸部のがんの中より選択される、本発明1016〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
がんが、肝細胞癌、黒色腫、または腺様嚢胞癌である、本発明1016〜1025のいずれかの方法。
[本発明1028]
サンプルが前立腺の組織または細胞を含む場合、対象は前立腺癌を有すると診断される、または癌を有するもしくは発症する可能性があると判定される、本発明1016〜1026のいずれかの方法。
[本発明1029]
サンプルが乳房の組織または細胞を含む場合、対象が乳癌を有すると診断される、または乳癌を有するもしくは発症する可能性があると判定される、本発明1016〜1267のいずれかの方法。
[本発明1030]
対象に療法を施す工程をさらに含む、本発明1016〜1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
療法には、放射線療法、外科手術、化学療法、ホルモン除去（hormone ablation）療法、アポトーシス促進療法、および/または免疫療法が含まれる、本発明1030の方法。
[本発明1032]
対象にAID阻害剤を投与する工程をさらに含む、本発明1020の方法。
[本発明1033]
対象にAPOBEC3G阻害剤を投与する工程をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1034]
対象にAPOBEC1阻害剤を投与する工程をさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1035]
対象にAPOBEC3H阻害剤を投与する工程をさらに含む、本発明1023の方法。
[本発明1036]
核酸分子の配列を解析して、突然変異誘発物質と関連していることが公知の突然変異タイプの体細胞突然変異を同定する工程；
突然変異のコドン文脈を判定して、予想されるよりも高い頻度で突然変異が生じる優先ヌクレオチド箇所を同定する工程；および
優先ヌクレオチド箇所における突然変異に隣接するヌクレオチドを同定して、該突然変異に共通しているモチーフを同定する工程
を含む、突然変異誘発物質に標的とされる核酸モチーフを同定するための方法。
[本発明1037]
核酸分子の配列を解析して、該核酸分子における体細胞突然変異を同定する工程；
コドン内の優先ヌクレオチド箇所で、予想されるよりも高い頻度で生じる突然変異タイプを同定する工程；および
優先ヌクレオチド箇所における該突然変異タイプに隣接するヌクレオチドを同定して、該突然変異タイプに共通しているモチーフを同定する工程
を含む、突然変異誘発物質に標的とされる核酸モチーフを同定するための方法。
[本発明1038]
突然変異タイプが、C＞T、C＞A、C＞G、G＞T、G＞A、G＞C、A＞T、A＞C、A＞G、T＞A、T＞C、およびT＞G突然変異より選択される、本発明1036または1037の方法。
[本発明1039]
優先ヌクレオチド箇所が、MC-1、MC-2、およびMC-3の中より選択される、本発明1036〜1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
予想される頻度が、突然変異がコドン文脈とは無関係に生じると仮定することによって算出される、本発明1036〜1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
予想される頻度が、およそ、9個の突然変異毎に1個または6個の突然変異毎に1個である、本発明1039の方法。
[本発明1042]
優先ヌクレオチド箇所において、突然変異が生じる機会が、少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％、またはそれを上回る、本発明1030〜1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
核酸分子の非転写鎖が解析される、本発明1030〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
突然変異誘発物質が、核酸入手元の細胞に対して内因性である、本発明1030〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
突然変異誘発物質が、核酸入手元の細胞に対して外因性である、本発明1035〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
突然変異誘発物質が、4-アミノビフェニル、アリストロキン酸、ヒ素化合物、アスベスト、アザチオプリン、ベンゼン、ベンジジン、ベリリウムおよびベリリウム化合物、1,3-ブタジエン、1,4-ブタンジオールジメチルスルホネート、カドミウムおよびカドミウム化合物、クロラムブシル、1-(2-クロロエチル)-3-(4-メチルシクロヘキシル)-1-ニトロソウレア（MeCCNU）、ビス(クロロメチル)エーテルおよびテクニカルグレードのクロロメチルメチルエーテル、六価クロム化合物、コールタールピッチ、コールタール、コークス炉排出物、シクロホスファミド、シクロスポリンA、ジエチルスチルベストロール（DES）、エリオナイト、エチレンオキシド、ホルムアルデヒド、メルファラン、紫外線A併用メトキサレン療法（PUVA）、マスタードガス、2-ナフチルアミン、中性子、ニッケル化合物、ラドン、結晶性シリカ（呼吸域サイズ）、太陽放射、すす、硫酸を含有する強い無機酸ミスト、タモキシフェン、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン（TCDD）、チオテパ、二酸化トリウム、たばこの煙、塩化ビニル、紫外線放射、木材粉塵、X線放射、ガンマ線放射、APOBECシチジンデアミナーゼ、ならびにエラープローンDNAポリメラーゼの中より選択される、本発明1035〜1043のいずれかの方法。
[本発明1047]
核酸分子または核酸分子入手元の細胞が、解析前に、突然変異誘発物質に曝露されたことが分かっている、本発明1006〜1048のいずれかの方法。
[本発明1048]
核酸分子をまず単離する工程を含む、本発明1001〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
核酸分子のすべてまたは一部をシークエンシングする工程を含む、本発明1001〜1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
核酸分子が、単一遺伝子または単一遺伝子のcDNAのすべてまたは一部を含む、本発明1001〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
核酸分子が、2種もしくはそれを上回る種類の遺伝子または2種もしくはそれを上回る種類の遺伝子のcDNAのすべてまたは一部を含む、本発明1001〜1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
遺伝子が、がんと関連した遺伝子である、本発明1050または本発明1051の方法。
[本発明1053]
遺伝子が、TP53、PIK3CA、ERBB2、DIRAS3、TET2、および一酸化窒素合成酵素（NOS）遺伝子の中より選択される、本発明1050〜1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
細胞の全エクソームを構成する核酸分子が解析される、本発明1001〜1055のいずれかの方法。
[本発明1055]
細胞の全ゲノムを構成する核酸分子が解析される、本発明1001〜1053のいずれかの方法。
[本発明1056]
本発明1001〜1055のいずれかの方法における使用のための試薬を含む、キット。
[本発明1057]
試薬が、プライマー、dNTP、およびポリメラーゼの中より選択される、本発明1056のキット。
[本発明1058]
すべてまたは一部が処理システムによって実施される、本発明1001〜1055のいずれかの方法。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】核酸分子の非転写鎖上の関心対象の領域における標的体細胞突然変異を示した図解である。
【図２】AIDまたはAOPBEC3Gによる標的体細胞突然変異生成が生じているかどうかを判定するための、核酸分子の解析についての例示的な過程を示した図解である。
【図３】突然変異が無作為にまたは標的体細胞突然変異生成の結果として生じるかどうかを判定するために実施された解析を示した図解である。
【図４】子宮頸癌を有する対象から得られた核酸のTP53遺伝子におけるGYW/WRC部位（AID）、CG/CG部位（APOBEC3G）、TG/CA部位（APOBEC1）、およびWA部位での突然変異の頻度およびコドン内の位置、ならびに該突然変異の出現率についての統計解析を示している。
【図５】結腸腺癌を有する対象から得られた核酸のTP53遺伝子におけるGYW/WRC部位（AID）、CG/CG部位（APOBEC3G）、TG/CA部位（APOBEC1）、およびWA部位での突然変異の頻度およびコドン内の位置、ならびに該突然変異の出現率についての統計解析を示している。
【図６】肝細胞癌を有する対象から得られた核酸のTP53遺伝子におけるGYW/WRC部位（AID）、CG/CG部位（APOBEC3G）、TG/CA部位（APOBEC1）、WA部位、およびGG部位（アフラトキシン）での突然変異の頻度およびコドン内の位置、ならびに該突然変異の出現率についての統計解析を示している。
【図７】膵臓癌を有する対象から得られた核酸のTP53遺伝子におけるGYW/WRC部位（AID）、CG/CG部位（APOBEC3G）、TG/CA部位（APOBEC1）、およびWA部位での突然変異の頻度およびコドン内の位置、ならびに該突然変異の出現率についての統計解析を示している。
【図８】前立腺癌を有する対象から得られた核酸のTP53遺伝子におけるGYW/WRC部位（AID）、CG/CG部位（APOBEC3G）、TG/CA部位（APOBEC1）、およびWA部位での突然変異の頻度およびコドン内の位置、ならびに該突然変異の出現率についての統計解析を示している。
【図９】悪性黒色腫を有する対象から得られた核酸のTP53遺伝子におけるGYW/WRC部位（AID）、CG/CG部位（APOBEC3G）、およびWA部位での突然変異の頻度およびコドン内の位置、ならびに該突然変異の出現率についての統計解析を示している。
【図１０】子宮頸部腺癌を有する対象から得られた核酸のTP53遺伝子におけるGYW/WRC部位（AID）、CG/CG部位（APOBEC3G）、TG/CA部位（APOBEC1）、およびWA部位での突然変異の頻度およびコドン内の位置、ならびに該突然変異の出現率についての統計解析を示している。
【図１１】子宮頸部腺癌を有する対象から得られた核酸のNOS遺伝子におけるGYW/WRC部位（AID）、CG/CG部位（APOBEC3G）、およびWA部位での突然変異の頻度およびコドン内の位置、ならびに該突然変異の出現率についての統計解析を示している。
【図１２】乳癌を有する対象から得られた核酸のPIK3CA遺伝子におけるGYW/WRC部位（AID）、CG/CG部位（APOBEC3G）、およびWA部位での突然変異の頻度およびコドン内の位置、ならびに該突然変異の出現率についての統計解析を示している。
【図１３】造血系およびリンパ系のがんを有する対象から得られた核酸のTET2遺伝子におけるGYW/WRC部位（AID）、CG/CG部位（APOBEC3G）、TG/CA部位（APOBEC1）、およびWA部位での突然変異の頻度およびコドン内の位置、ならびに該突然変異の出現率についての統計解析を示している。
【図１４】腺様嚢胞癌を有する2人の対象から得られた組織の全エクソームにおけるGYW/WRC部位（AID）、CG/CG部位（APOBEC3G）、およびWA部位での突然変異の頻度およびコドン内の位置、ならびに該突然変異の出現率についての統計解析を示している。（A）対象PD3185a。（B）対象PD3181a。
【図１５Ａ】前立腺癌腫を有する4人の対象から得られた組織の全エクソームにおけるGYW/WRC部位（AID）、CG/CG部位（APOBEC3G）、およびWA部位での突然変異の頻度およびコドン内の位置、ならびに該突然変異の出現率についての統計解析を示している。対象WA7。
【図１５Ｂ】前立腺癌腫を有する4人の対象から得られた組織の全エクソームにおけるGYW/WRC部位（AID）、CG/CG部位（APOBEC3G）、およびWA部位での突然変異の頻度およびコドン内の位置、ならびに該突然変異の出現率についての統計解析を示している。対象WA26。
【図１５Ｃ】前立腺癌腫を有する4人の対象から得られた組織の全エクソームにおけるGYW/WRC部位（AID）、CG/CG部位（APOBEC3G）、およびWA部位での突然変異の頻度およびコドン内の位置、ならびに該突然変異の出現率についての統計解析を示している。対象PR-09-3421。
【図１５Ｄ】前立腺癌腫を有する4人の対象から得られた組織の全エクソームにおけるGYW/WRC部位（AID）、CG/CG部位（APOBEC3G）、およびWA部位での突然変異の頻度およびコドン内の位置、ならびに該突然変異の出現率についての統計解析を示している。対象PR-2762。
【図１６】膀胱癌を有する対象から得られた核酸の全エクソームにおけるGA部位（APOBEC3H）での突然変異の頻度およびコドン内の位置、ならびに該突然変異の出現率についての統計解析を示している。
【図１７】膀胱癌を有する8人の対象（A）および膀胱癌を有する1人の対象（B）から得られた核酸の全エクソームにおけるCC部位（APOBEC3G）での突然変異の頻度およびコドン内の位置、ならびに該突然変異の出現率についての統計解析を示している。
【図１８】処理システムを用いた、核酸分子における標的体細胞突然変異生成を検出する過程の図解である。
【００３２】
表A
ヌクレオチド記号
2018108105.tif 000003
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
1. 定義
別様に定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術的および科学的な用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと同様のまたは同等の任意の方法および材料を、本発明の実践または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料を記載する。本発明の目的のために、以下の用語を下記に定義する。
【００３４】
「a」および「an」という冠詞は、1つまたは1つを上回る数の（すなわち、少なくとも1つの）、冠詞の文法的目的語を指すために本明細書において用いられる。例として、「要素（an element）」は、1つの要素または1つを上回る数の要素を意味する。
【００３５】
本明細書において用いられる「生物学的サンプル」という用語は、対象または患者由来の、抽出され得る、未処理であり得る、処理され得る、希釈され得る、または濃縮され得るサンプルを指す。適切には、生物学的サンプルは、毛髪、皮膚、爪、組織、または唾液および血液などの体液を含むがそれらに限定されない、患者の身体の任意の部分より選択される。
【００３６】
本明細書において使用する、突然変異に関連した「コドン文脈」という用語は、突然変異が生じる、コドン内のヌクレオチド箇所を指す。本発明の目的のために、突然変異コドン（MC；すなわち、突然変異を含有するコドン）内のヌクレオチド箇所は、MC-1、MC-2、およびMC-3と注釈され、コドンの配列が5'から3'に読まれる場合、それぞれ第1、第2、および第3のヌクレオチド箇所を指す。したがって、「突然変異のコドン文脈を判定する」という語句または同様の語句は、突然変異コドン内のどのヌクレオチド箇所で突然変異が生じるか、すなわちMC-1、MC-2、またはMC-3を判定することを意味する。
【００３７】
本明細書を通じて、文脈において別様に要求されない限り、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、および「含む（comprising）」という単語は、明記された工程もしくは要素、または工程もしくは要素の群の包含を含意するものであり、任意の他の工程もしくは要素、または工程もしくは要素の群の排除を含意するわけではないと理解されるであろう。
【００３８】
「遺伝子」とは、ゲノム上の特異的遺伝子座を占有し、かつ転写および/もしくは翻訳調節配列、ならびに/またはコード領域、ならびに/または非翻訳配列（すなわち、イントロン、5'および3'非翻訳配列）を含む、遺伝的形質の単位を意味する。
【００３９】
本明細書において使用する、「可能性」という用語は、所定の数理モデルに基づく、標的体細胞突然変異生成が生じているかどうか、特定の突然変異誘発物質が標的体細胞突然変異生成の原因であるかどうか、および標的体細胞突然変異を含有する核酸を有する対象が、がんを有するかどうかまたはがんを発症するであろうかどうかの尺度として用いられる。可能性の増加は、例えば、相対的または絶対的なものであり得、かつ定性的または定量的に表現され得る。例えば、対象ががんを発症するであろう可能性または危険性の増加は、標的体細胞突然変異の数を簡単に判定し（本明細書において教示されるように）、かつ以前の集団調査に基づき、「可能性または危険性の増加」カテゴリーに試験対象を入れる形で表現され得る。
【００４０】
いくつかの態様において、方法は、標的体細胞突然変異の数またはパーセンテージを、あらかじめ選択されたまたは閾値の数またはパーセンテージと比較する工程を含む。診断、可能性、または予後の危険性を予測し得る満足できる能力を提供する閾値が選択され得る。例証的な例において、受信者動作特性（receiver operating characteristic）（ROC）曲線は、第1の集団が第1の病状または危険性を有し、かつ第2の集団が第2の病状または危険性を有する2つの集団において（任意に、例えば「健常状態」および「がん」、または「低い危険性」および「高い危険性」と呼ばれる）、変数の値をその相対頻度に対してプロットすることによって算出される。
【００４１】
疾患の有無にかかわらず、対象に対する突然変異の数の分布は、おそらく重複すると考えられる。そのような条件下では、試験は、第1の病状と第2の病状とを100％の精度で絶対に区別するとは限らず、重複のエリアは、試験が第1の病状と第2の病状とを区別できないところを表す。ある閾値が選択され、それよりも上で試験は「陽性」であると見なされ、それよりも下で試験は「陰性」であると見なされる。ROC曲線下面積（AUC）は、把握される測定結果により病状の正しい識別が可能となる確率の尺度である、C統計量を提供する（例えば、Hanley et al., Radiology 143:29-36 (1982)を参照されたい）。「曲線下面積」または「AUC」という用語は、受信者動作特性（ROC）曲線の曲線下面積を指し、その両方は当技術分野において周知である。AUC測定は、全データ範囲にわたる分類器の精度を比較するのに有用である。より大きなAUCを有する分類器は、関心対象の2つの群（例えば、健常状態の突然変異状況およびがんの突然変異状況）の間の未知数を正しく分類するより高い能力を有する。ROC曲線は、2つの集団（例えば、がんを有する症例およびがんを有しない対照）を区別するまたは判別する際に、特定の性質の性能をプロットするのに有用である。典型的には、集団全体（例えば、症例および対照）にわたる性質データを、単一性質の値に基づいて昇順に並べ替える。次いで、その性質に対する各値に対して、データの真陽性率および偽陽性率を算出する。感度は、その性質に対する値よりも上の症例の数をカウントし、次いで症例の総数で割ることによって決定される。特異度は、その性質に対する値よりも下の対照の数をカウントし、次いで対照の総数で割ることによって決定される。この定義は、対照と比較して症例において性質が上昇しているシナリオを指すが、この定義は、対照と比較して症例において性質がより低いシナリオにも適用される（そのようなシナリオでは、その性質に対する値より下のサンプルがカウントされる）。単一性質に対しておよび他の単一出力に対して、ROC曲線を作成することができ、例えば2つまたはそれを上回る数の性質の組み合わせを数学的に組み合わせて（例えば、足す、差し引く、掛ける等）、単一の値を生み出すことができ、かつこの単一の値をROC曲線にプロットすることができる。加えて、その組み合わせが単一出力値に由来する、複数の性質（例えば、1種または複数種の他のエピジェネティックマーカー）の任意の組み合わせを、ROC曲線にプロットすることができる。これらの性質の組み合わせは、試験を構成し得る。ROC曲線は、試験の特異度に対する試験の感度のプロットであり、感度は伝統的に縦軸に提示され、かつ特異度は伝統的に横軸に提示される。ゆえに、「AUC ROC値」は、分類器が、無作為選出の陽性例を無作為選出の陰性例よりも上にランク付けする確率に等しい。AUC ROC値は、群が連続データのものである場合に、考慮される2つの群で得られるスコア間の差の中央値に対して検定するMann-Whitney U検定、またはWilcoxonの順位検定と同等のものとして考えられ得る。
【００４２】
あるいはまたは加えて、より後期の結果が比較され得る、同じ患者からのより早期の突然変異状況の結果を得ることによって、閾値は確立され得る。これらの態様において、個体は事実上それら自身の「対照群」としての役割を果たす。別の態様において、患者からの非罹患組織または健常組織由来の核酸における標的体細胞突然変異の数を解析し、かつそれを、罹患組織またはがん性組織由来の核酸における標的体細胞突然変異の数を解析することと比較することによって、閾値は確立され得る。
【００４３】
「突然変異誘発物質」という用語は、DNAの突然変異生成を引き起こし得る作用物質を指す。突然変異誘発物質には、内因性作用物質（すなわち、DNAが含有される細胞に対して内因性である、またはその細胞によって産生される作用物質）および外因性作用物質（すなわち、DNAが含有される細胞に対して外因性である、またはその細胞によって産生されない作用物質）が含まれ、例えば化学物質、タンパク質、酵素、放射線、およびウイルスが含まれる。
【００４４】
本明細書において使用する、「突然変異タイプ」は、突然変異を含む特異的なヌクレオチド置換を指し、C＞T、C＞A、C＞G、G＞T、G＞A、G＞C、A＞T、A＞C、A＞G、T＞A、T＞C、およびT＞G突然変異の中より選択される。ゆえに、例えば、C＞Tという突然変異タイプは、標的とされるまたは突然変異されるヌクレオチドCが、置換するヌクレオチドTで置き換えられている突然変異を指す。
【００４５】
本明細書において用いられる「核酸」は、DNA、cDNA、mRNA、RNA、rRNA、またはcRNAを指し示す。該用語は、典型的に、長さが30ヌクレオチド残基よりも大きいポリヌクレオチドを指す。
【００４６】
「患者」および「対象」という用語は、互換可能に用いられ、ヒトまたは他の哺乳類の患者および対象を指し、かつ本発明の方法を用いて検査するまたは治療することが望まれる任意の個体を含む。しかしながら、「患者」は、症状が存在していることを含意するわけではないことは理解されるであろう。本発明の範囲内に入る適切な哺乳類には、ヒトおよび他の霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、実験室試験動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、伴侶動物（例えば、ネコ、イヌ）、および捕獲野生動物（例えば、キツネ、シカ、ディンゴ）が含まれるが、それらに制限されるわけではない。
【００４７】
「体細胞突然変異」という用語は、受精後に生じる体細胞（すなわち、生殖細胞ではない）のDNAにおける突然変異を指す。したがって、「体細胞突然変異生成」とは、体細胞突然変異が生じる過程を指す。
【００４８】
本明細書において使用する、「標的体細胞突然変異生成」とは、突然変異生成がモチーフ内の標的ヌクレオチドで生じ、該標的ヌクレオチドはコドン内の特定の箇所に存在しており（例えば、5'から3'に読む突然変異コドンの第1、第2、または第3の箇所、それぞれMC-1、MC-2、およびMC-3と注釈される）、かつ該標的ヌクレオチドが特定の置換ヌクレオチドに突然変異される（すなわち、突然変異が特定の突然変異タイプのもの、例えばC＞AでもC＞GでもなくC＞Tである）、1種または複数種の突然変異誘発物質により生じる体細胞突然変異生成の過程を指す。ゆえに、標的体細胞突然変異生成が生じているという判定は、突然変異のタイプ（例えば、C＞T）について、突然変異が生じるモチーフ（例えば、WRC）について、および突然変異のコドン文脈、すなわち突然変異が生じるコドン内の箇所（例えば、MC-1、MC-2、またはMC-3）についての解析を要する。したがって、「標的体細胞突然変異原」とは、標的体細胞突然変異生成により生じる突然変異を指す。
【００４９】
本明細書において使用する、「治療」、「治療する」等の用語は、所望の薬理学的および/または生理学的な効果を得ることを指す。効果は、病状（がんなど）もしくはその症状を完全にもしくは部分的に阻止するという点で予防的であり得、かつ/または病状および/もしくは該病状に起因する有害な影響に対する部分的なもしくは完全な治癒という点で治療的であり得る。本明細書において用いられる「治療」は、哺乳類における、とくにヒトにおける病状の任意の治療を網羅し、かつ（a）病状を発症する危険性はあり得るがそれを有するとはまだ診断されていない対象において、病状が生じるのを阻止すること；（b）病状を阻害する、すなわちその発症を食い止めること；および（c）病状を軽減する、すなわち病状の退縮を引き起こすことを含む。
【００５０】
本明細書において使用する、「全エクソーム」とは、ゲノムにおけるすべてのエクソンを指す。ゆえに、細胞由来の全エクソームの配列の解析とは、細胞由来のゲノムにおけるすべてのエクソンの配列の解析を指す。
【００５１】
2. 体細胞突然変異生成に関与する突然変異誘発物質
外因性および内因性の因子はどちらも、体細胞突然変異生成を引き起こすまたはそれにおいて役割を担う突然変異誘発物質として作用し得る。外因性因子には、アフラトキシン、4-アミノビフェニル、アリストロキン酸、ヒ素化合物、アスベスト、アザチオプリン、ベンゼン、ベンジジン、ベリリウムおよびベリリウム化合物、1,3-ブタジエン、1,4-ブタンジオールジメチルスルホネート（ブスルファン、Myleran（登録商標））、カドミウムおよびカドミウム化合物、クロラムブシル、1-(2-クロロエチル)-3-(4-メチルシクロヘキシル)-1-ニトロソウレア（MeCCNU）、ビス(クロロメチル)エーテルおよびテクニカルグレードのクロロメチルメチルエーテル、六価クロム化合物、コールタールピッチ、コールタール、コークス炉排出物、シクロホスファミド、シクロスポリンA、ジエチルスチルベストロール（DES）、エリオナイト、エチレンオキシド、ホルムアルデヒド、メルファラン、紫外線A併用メトキサレン療法（PUVA）、マスタードガス、2-ナフチルアミン、中性子、ニッケル化合物、ラドン、結晶性シリカ（呼吸域サイズ）、太陽放射、すす、硫酸を含有する強い無機酸ミスト、タモキシフェン、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン（TCDD）、チオテパ、二酸化トリウム、たばこの煙、塩化ビニル、紫外線放射、木材粉塵、X線放射、ならびにガンマ線放射が含まれるが、それらに限定されるわけではない。内因性因子には、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）、アポリポタンパク質B mRNA編集酵素触媒ポリペプチド様（APOBEC）シチジンデアミナーゼ、およびDNAポリメラーゼηなどのエラープローンDNAポリメラーゼが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００５２】
2.1 AID
活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）は、B細胞における、体細胞超変異（SHM）および免疫グロブリン遺伝子のクラススイッチ組み換えに関与する、適応免疫における重要な酵素である。AIDは、シチジンをウラシルに（C＞U）脱アミノ化して、免疫グロブリン可変領域遺伝子（VDJ）を多様化し、かつ新たな抗原結合部位を創出することによって、SHMの引き金を引く。
【００５３】
新たな抗原結合部位を生じさせるこれらのSHM過程により生じる突然変異パターンが無作為ではないことは十分に認識されている。近隣塩基配列によって影響を受ける突然変異活性のクラスター化およびホットスポットが同定されており、AIDにより生じる触媒特性および特異的突然変異スペクトル、ならびに再編成された免疫グロブリン可変領域遺伝子のAID介在性DNA脱アミノ化におけるその関与は十分に立証されている。
【００５４】
SHM過程は、現在のところ、2つの段階で生じると見なされている。第1段階において、AIDタンパク質をコードする遺伝子が、胚中心Bリンパ球で上方制御される（Muramatsu et al. (2000) Cell 102:553-563）。次いで、AIDは、転写中に露出されたDNAの転写された一本鎖（ss）領域におけるシチジンのウラシルへの（C＞U）直接脱アミノ化によって、逆相補鎖ホットスポットGYW/WRC（Y＝C/T、W＝A/T、R＝A/G；かつ下線を引かれたヌクレオチドは標的塩基対となる）におけるG：C塩基対に対する突然変異を標的とする（Di Noia and Neuberger (2007) Annu Rev Biochem. 76:1-22；Teng and Papavasiliou (2007) Annu Rev Genet 41:107-120）。AIDは、脱アミノ化前に標的シチジンを占有する（Bhutani et al. (2011) Cell 146:866-872）。DNAにおけるウラシルは、修復されないままである場合に極めて突然変異生成性であり、それらは、脱プリン脱ピリミジン（AP）部位、すなわち「無塩基」部位を引き起こすウラシルDNAグリコシラーゼ（UNG）を伴うDNA塩基除去修復（BER）過程を活性化し、これがssDNAニック（脱プリン/脱ピリミジンエンドヌクレアーゼ活性、APEを介した）につながり、かつさらなるDNAパッチ修復活性を招く（Peled et al. (2008) Ann Rev Immunol 26:481-511）。いったんUNGがBER経路の引き金を引いてウラシルを取り除くと、創出された無塩基部位は、複製および修復時に、A、G、C、またはTの塩基のいずれかによって置き換えられ得る。
【００５５】
第1段階に伴う主なストランドバイアス（strand bias）突然変異パターンは、優勢なC＞TおよびG＞A塩基転位を特徴とし、Gの突然変異の総数がCの数を上回ることを伴う（Steele (2009) Mol Immunol 46:305-320）。結果として生じたストランドバイアス突然変異パターンは、AID損傷部、ウラシル、およびAP部位を保持する鋳型DNA鎖を複写する哺乳類RNAポリメラーゼIIの公知の誤取り込みシグネチャと一致すると推論されている（例えば、Steele (2009) Mol Immunol 46:305-320を参照されたい）。
【００５６】
第2段階において、突然変異は、WAホットスポットモチーフにおけるA：T塩基対を主に標的とし、Tの突然変異を2〜3倍上回るAの突然変異を有する明確なストランドバイアス性を示す（例えば、Steele (2009) Mol Immunol 46:305-320を参照されたい）。第2段階において、G：Uの対合ミスは、ミスマッチDNA修復ヘテロ二量体のMSH2-MSH6複合体の結合を導き、それが今度は、WA部位およびVDJ標的配列領域における他のいくつかの配列伸長の両方に対する、ショートパッチエラープローンDNA修復過程において、エラープローンYファミリー損傷乗り越えタンパク質DNAポリメラーゼηによる標的突然変異を導く。
【００５７】
いくつかの研究により、異常なAID始動性SHM過程は、胚中心環境の外側のDNAにおいてC＞Uの変換をもたらし得、ゆえに他の遺伝子における発がんの一因となり得る可能性が示唆されている（Beale et al. (2004) J Mol. Biol 337:585-594；Marusawa H. (2008) Int J Biochem Cell Biol 40:1399-1402）。SHM様活性は、ヒト扁桃B細胞におけるBCL-6（Yavuz et al. (2002) Mol Immunol 39:485-493）、Tリンパ腫におけるCD5/4、PIM 1、およびCMYC遺伝子（Kotani et al. (2005) PNAS 102:4506-4511）、ならびにBリンパ腫におけるBCL-6およびC-MYC（Nilsen et al. (2005) Oncogene 24:3063-3066）など、広範な遺伝子において生じることが見出されている。AID始動性SHM活性は、多数の研究において、TP53突然変異の潜在源としても検討されている。1つのそのような研究において、B細胞慢性リンパ球性白血病（B-CLL）におけるTP53を標的とする突然変異は、SMH過程の特徴的形質を呈することが見出された（Malcikova et al. (2008) Molecular Immunology 45:1525-9）。観察された2人の患者に関して突然変異の数は低かったものの、データは、CG対合での点突然変異への有意なバイアス、およびRGYW/WRCYモチーフに対する有意な優先性（第1および第2の患者において、それぞれ28％および44％）を明らかにしている。第2の患者では、A：T対合に影響を及ぼす6/8個の点突然変異が、WA/TWモチーフに位置することが見出されており、これはSHM単一点突然変異スペクトルに特徴的な証である。AID転写産物の高発現は、第1の患者で見出されたが、すでにIgVHを突然変異させた第2の患者では見出されなかった。本明細書において示され、かつLindleyおよびSteele（ISRN Genomics (2013) 921418）ならびにLindley（Cancer Genet. (2013) 206(6):222-6）に記載されているように、ストランドバイアスSHM様突然変異過程は、がんと密接に関連しているように思われる。
【００５８】
AID発現を活発に誘導し、かつIg遺伝子におけるSHM活性の公知の特徴と一致するTP53突然変異パターンをもたらす、感染性物質の例も存在する。例には、C型肝炎ウイルス（Machida et al. (2004) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 101:4262-4267）、エプスタイン・バールウイルス（Epeldegui et al. (2007) Mol. Immunol 44:934-942）、およびヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）（Matsumoto et al. (2007) Nat Med. 13:470-476）が含まれる。AIDは、B細胞腫瘍生成および他のがんに関連付けられており（Honjo et al. (2012) Adv Cancer Res. 2012; 113:1-44）、かつAIDのトランスジェニック発現は、マウスにおいて腫瘍形成を引き起こす（Okazaki et al. (2003) J Exp Med 197:1173-1181）。
【００５９】
2.2 APOBECシチジンデアミナーゼ
AIDに加えて、ヒトゲノムは、先天性免疫およびRNA編集に関与することが知られている、いくつかの相同APOBECシチジンデアミナーゼ（Smith et al. (2012) Semin. Cell. Dev. Biol. 23:258-268）をコードする。ヒトでは、少なくともAPOBEC1、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G、およびAPOBEC3Hが、先天性免疫および/または細胞内mRNA編集をもたらすことに関与している。
【００６０】
例えば、APOBEC1はApoBプレmRNA編集に関わり、それはシチジン6666の脱アミノ化を引き起こして、グルタミンコドンを終止コドンに変化させ、ゆえにApoBのより短い形態（ApoB48）を生じる。APOBEC1は、DNAにおけるシチジンも脱アミノ化する（Harris et al. (2002) Mol Cell. 10:1247-1253；Petersen-Mahrt and Neuberger (2003) J Biol Chem.278:19583-19586）。APOBEC3酵素は、可動遺伝要素（すなわち、内因性レトロエレメントおよび外因性ウイルス）を脱アミノ化し、先天性免疫の形態としてDNAを突然変異させる。例えば、APOBEC3Gは、HIVおよび他のレトロウイルス（例えば、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ウマ感染性貧血ウイルス（EIAV）、マウス白血病ウイルス（MLV）、および泡沫状ウイルス（FV））に作用して、逆転写中にマイナス鎖DNAを突然変異させる。他のAPOBEC3酵素も、HIVおよび他のレトロウイルス、ならびにB型肝炎ウイルス、パルボウイルス、およびAAV-2に作用することが示されている（Smith et al. (2012) Sem Cell Dev Biol 23:258-268において概説されている）。
【００６１】
AIDと同様に、APOBECシチジンデアミナーゼは発がんに関係している。例えば、APOBEC1のトランスジェニック発現は、マウスにおいて腫瘍形成を引き起こし（Yamanaka et al. (1995) PNAS 92:8483-8487）；APOBEC3Bの高発現は、腫瘍関連遺伝子における体細胞突然変異につながり（Shinohara et al. (2012) Scientific Reports 2:806）；APOBEC3Bは、少なくとも乳癌、膀胱癌、頸癌（腺癌および扁平上皮細胞癌腫）、および頭頸部癌において上方制御され、これはAPOBEC3Bモチーフにおける突然変異の関連増加を伴う（Burns et al (2013) Nature 494:366-370；Burns et al. (2013) Nature Genetics 45:977-983）；ならびにAPOBEC酵素による突然変異シグネチャは、多様ながんに広まっていることが示されている。
【００６２】
細菌突然変異アッセイを用いた、AID、APOBEC1、およびAPOBEC3Gに対する標的優先性を比較する研究により、シチジンデアミナーゼの特異性にとって、標的Cの5'および3'直近のヌクレオチドの決定的な重要性が実証された（Beale et al. (2004) J Mol. Biol 337:585-594）。APOBEC3GのみがssDNA上のシチジンを脱アミノ化し得る一方で、APOBEC1はDNAまたはdsRNA上のシチジンを編集し得る。APOBEC1の存在下での塩基転位の79％は5'Tと関連していることが観察されており、ゆえにAPOBEC1に対するTG/CAのモチーフを暗示している。APOBEC3Gモチーフは、CG/CGおよび/またはCCであると示唆されている（Beale et al. (2004) J Mol. Biol 337:585-594；およびRathmore et al (2013). J. Mol. Biology 425(22):4442-54）。他の研究により、APOBEC3A、APOBEC3B、およびAPOBEC3Fなどの他のAPOBEC酵素は、TCモチーフ、またはよりストリンジェントなTCWモチーフ（Wは、AまたはTのいずれかに相当する）を有することが示されている（Bishop et al. (2004) Curr Biol. 14:1392-1396；Thielen et al. (2010) J Biol Chem 285:27753-27766；Henry et al. (2009) PLoS One. 4:e4277；Shinohara et al. (2012) Scientific Reports 2:806；Burns et al. (2013) Nature Genetics 45:977-983）。APOBEC3Hは、GA/TCモチーフを標的とすることが示唆されている。
【００６３】
3. 標的体細胞突然変異生成を検出するための方法
本明細書において実証されるように、一部の突然変異誘発物質は、1種または複数種の特定のモチーフでヌクレオチドの突然変異生成を引き起こすだけでなく、モチーフおよび突然変異ヌクレオチドは、コドン文脈内で認識される、すなわち突然変異ヌクレオチドは、突然変異コドン内の第1、第2、または第3のヌクレオチドなど（5'から3'に読む）、コドン構造内の特定の箇所にある。置き換えまたは置換するヌクレオチドに対する明らかな優先性も存在する。突然変異誘発物質によるこのモチーフ特異的およびコドン文脈特異的な標的化の組み合わせは、本明細書において標的体細胞突然変異生成と称される。非限定的な例として、かつ図1に示されるように、核酸分子の非転写鎖のWAモチーフにおけるAの突然変異は、突然変異コドンの第1の箇所（MC-1）で優先的に生じ得、かつCへの突然変異であり得る（すなわち、A＞C）。ゆえに、核酸分子の標的体細胞突然変異が生じているか否かの可能性は、核酸分子の配列を解析して、1種または複数種の特定のモチーフ（例えば、WAモチーフ）におけるある突然変異タイプ（例えば、A＞C）の突然変異のコドン文脈を判定することによって判定され得る。モチーフにおける該突然変異タイプの突然変異の位置にコドンバイアスがない（すなわち、突然変異が、コドンの各箇所にわたって本質的に均等に分布している）場合には、突然変異は偶然に起き、突然変異誘発物質による標的体細胞突然変異生成の結果としてのものではなかった可能性が最も高い。しかしながら、核酸分子におけるコドン内の1つの特定の箇所（例えば、MC-1、MC-2、またはMC-3部位）に、予想されるよりも高いパーセンテージまたは数の、該突然変異タイプの突然変異が存在する場合には、これは、標的体細胞突然変異生成が生じているまたは生じている可能性があることを表している。
【００６４】
上記で記載される突然変異の「予想される数またはパーセンテージ」とは、突然変異が他の突然変異およびコドン文脈とは無関係である場合、すなわちコドン内の各箇所における各標的ヌクレオチドでの突然変異の分布が本質的に均等である場合に予想される突然変異の数またはパーセンテージである。ゆえに、例えば、MC-1、MC-2、およびMC-3箇所または部位にわたって起こっている突然変異を評価する場合、3つの部位（例えば、MC-1、MC-2、またはMC-3）のうちのいずれか1つにおける1個のヌクレオチド（例えば、A）の、他の3種のヌクレオチド（例えば、G、C、またはT）のうちのいずれか1個への突然変異は、9個の突然変異毎に1個（すなわち、Aの、G、C、またはTのいずれか1個への3種類の見込み中1種類、かつ任意の部位での3種類の見込み中1種類、全体として9種類の見込み中1種類に等しい）、つまりおよそ11％の機会で生じるであろうと予想される。MC-1およびMC-2部位など、突然変異コドン内のヌクレオチド箇所のうちの2つのみにわたって起こっている突然変異を評価する場合、2つの部位（例えば、MC-1またはMC-2）のうちのいずれかにおける1個のヌクレオチド（例えば、A）の、他のヌクレオチド（例えば、G、C、またはT）のうちのいずれか1個への突然変異は、6個の突然変異毎に1個、つまりおよそ17％の機会（すなわち、Aの、G、C、またはTのいずれか1個への3種類の見込み中1種類、かつ任意の部位での2種類の見込み中1種類、全体として6種類の見込み中1種類に等しい）で生じるであろうと予想される。同様に、部位の1つ（例えば、MC-1）のみにわたって起こっている突然変異を評価する場合、1個のヌクレオチド（例えば、A）の、他のヌクレオチド（例えば、G、C、またはT）のうちのいずれか1個への突然変異は、3個の突然変異毎に1個、つまりおよそ33％の機会で生じるであろうと予想される。
【００６５】
このことは、MC-1部位での（すなわち、突然変異コドン内の第1のヌクレオチド箇所での）C＞T突然変異の保有率を評価して、標的体細胞突然変異が生じているかどうか、または観察された突然変異が無作為に起きているかどうかを判定している図2において例証されている。WRCモチーフにおけるMC-1およびMC-2部位にわたるシトシンの突然変異が無作為である場合には、該突然変異のタイプおよび箇所は均等に分布しており、かつMC-2でのC＞T突然変異は、6回毎に1回（つまり、およそ17％）生じ、他の5個の突然変異は、MC-1でのC＞A、MC-2でのC＞A、MC-1でのC＞G、MC-2でのC＞G、およびMC-1でのC＞Tであると予想される。図2に示されている特定の例では、WRCモチーフにおけるMC-1またはMC-2部位で、シトシンについて合計82個の突然変異が存在する。突然変異生成が無作為であった場合、これらのうちの6分の1（つまり、17％）は、MC-2部位でのC＞T突然変異であり、約14個の出現率に等しいと予想される。しかしながら、この例では、MC-2部位で72個の観察されたC＞T突然変異が存在し、核酸の標的体細胞突然変異生成が生じていることを表している。
【００６６】
典型的に、標的体細胞突然変異生成が1種または複数種の突然変異誘発物質の活性の結果として生じ、かつ評価がコドンの3つの部位（例えば、MC-1、MC-2、およびMC-3）にわたってなされる場合、突然変異誘発物質と関連する特定の突然変異が観察される機会は、少なくともまたは約20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれを上回る。評価が2つの部位（例えば、MC-1およびMC-2；MC-1およびMC-3；またはMC-2およびMC-3）にわたってなされる場合、突然変異誘発物質と関連する特定の突然変異が観察される機会は、典型的に、少なくともまたは約30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれを上回る。評価が1つの部位のみ（例えば、MC-1；MC-2；またはMC-3）にわたってなされる場合、突然変異誘発物質と関連する特定の突然変異が観察される機会は、典型的に、少なくともまたは約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれを上回る。
【００６７】
特定のモチーフにおける突然変異のタイプ（例えば、WRCモチーフにおけるC＞T突然変異）、ならびに突然変異のコドン文脈（例えば、突然変異がMC-2部位にあるかどうか）を評価することによって、モチーフにおける突然変異のみが評価されかつコドン文脈が考慮に入れられない場合と比較して、突然変異誘発物質の活性についてのより正確な評価を行うことが可能である。したがって、本明細書において記載される方法を用いることにより、核酸分子の配列を解析して、突然変異誘発物質または突然変異生成過程に標的とされるモチーフにおける突然変異のコドン文脈を判定することによって、特定の突然変異誘発物質、またはAID関連突然変異生成過程などの突然変異生成過程が核酸分子の標的体細胞突然変異生成の原因であるという可能性を評価することが可能である。
【００６８】
3.1 AID、APOBEC1、APOBEC3G、APOBEC3H、およびアフラトキシンによる標的体細胞突然変異生成
上記で記載されるように、AIDは、GYW/WRCというモチーフを標的とすることが知られている（下線を引かれたヌクレオチドが突然変異される）。本明細書において実証されるように、MC-2部位で起こるGの標的化（G＞A突然変異をもたらす）に対する有意な優先性が存在する。したがって、核酸分子の非転写鎖のMC-2部位での、GYWモチーフにおける予想されるよりも高い数またはパーセンテージのG＞A突然変異は、AIDが該核酸の標的体細胞突然変異生成の推定原因であること、ならびに該核酸入手元の細胞および/または組織においてAIDが活性を有することを表している。また本明細書において実証されるように、MC-1部位で起こるCの標的化（C＞T突然変異をもたらす）に対する有意な優先性が存在する。したがって、核酸分子の非転写鎖のMC-1部位での、WRCモチーフにおける予想されるよりも高い数またはパーセンテージのC＞T突然変異は、AIDが該核酸の標的体細胞突然変異生成の推定原因であること、ならびに該核酸入手元の細胞および/または組織においてAIDが活性を有することを表している。
【００６９】
APOBEC3Gは、CG/CGモチーフを標的とすることが知られている。本明細書において記載される研究により、MC-2部位で起こるGの標的化（G＞A突然変異をもたらす）に対する有意な優先性が存在することが実証されている。したがって、核酸分子の非転写鎖のMC-2部位での、CGモチーフにおける予想されるよりも高い数またはパーセンテージのG＞A突然変異は、APOBEC3Gが該核酸の標的体細胞突然変異生成の推定原因であること、ならびに該核酸入手元の細胞および/または組織においてAPOBEC3Gが活性を有することを表している。MC-1部位で起こるCの標的化（C＞T突然変異をもたらす）に対する有意な優先性も存在する。したがって、核酸分子の非転写鎖のMC-1部位での、CGモチーフにおける予想されるよりも高い数またはパーセンテージのC＞T突然変異は、APOBEC3Gが該核酸の標的体細胞突然変異生成の推定原因であること、ならびに該核酸入手元の細胞および/または組織においてAPOBEC3Gが活性を有することを表している。
【００７０】
APOBEC3Gは、CCモチーフを標的とすることも知られている。本明細書において記載される研究により、MC-1部位で起こるCの標的化（C＞T突然変異をもたらす）に対する有意な優先性が存在することが実証されている。したがって、核酸分子の非転写鎖のMC-1部位での、CCモチーフにおける予想されるよりも高い数またはパーセンテージのC＞T突然変異は、APOBEC3Gが該核酸の標的体細胞突然変異生成の推定原因であること、ならびに該核酸入手元の細胞および/または組織においてAPOBEC3Gが活性を有することを表している。
【００７１】
APOBEC1は、核酸分子におけるTG/CAモチーフを優先的に標的とする。さらに、MC-1部位で起こるCAモチーフにおけるCの標的化（C＞T突然変異をもたらす）に対する有意な優先性が存在する。したがって、核酸分子の非転写鎖のMC-1部位での、CAモチーフにおける予想されるよりも高い数またはパーセンテージのC＞T突然変異は、APOBEC1が該核酸の標的体細胞突然変異生成の推定原因であること、ならびに該核酸入手元の細胞および/または組織においてAPOBEC1が活性を有することを表している。MC-2部位で起こるTGモチーフにおけるGの標的化（G＞A突然変異をもたらす）に対する優先性も存在する。したがって、核酸分子の非転写鎖のMC-2部位での、TGモチーフにおける予想されるよりも高い数またはパーセンテージのG＞A突然変異は、APOBEC1が該核酸の標的体細胞突然変異生成の推定原因であること、ならびに該核酸入手元の細胞および/または組織においてAPOBEC1が活性を有することを表し得る。
【００７２】
WAモチーフにおける体細胞突然変異は、胚中心B細胞におけるAID関連SHM過程の第2段階で生じることが知られており、ゆえにAID関連突然変異過程の指標であり、かつ拡大解釈するとAID活性の指標であり得る。本明細書において実証されるように、MC-2部位で起こるAの標的化（A＞T突然変異をもたらす）に対する優先性が存在する。したがって、核酸分子の非転写鎖のMC-2部位での、WAモチーフにおける予想されるよりも高い数またはパーセンテージのA＞T突然変異は、該核酸入手元の細胞および/または組織において、AID関連体細胞突然変異過程が活発であること、ならびに該細胞および/または組織においてAIDも活性を有し得ることを表している。AID関連突然変異過程が標的体細胞突然変異生成の推定原因であるという判定もまた、MC-2部位での、GYWモチーフにおける観察されたG＞A突然変異、またはMC-1部位での、WRCモチーフにおけるC＞T突然変異（AID活性の代表的なもの）の数またはパーセンテージもなされ得た場合に、行うことが可能である。
【００７３】
アフラトキシンは、TP53におけるコドン249の第3の箇所でのG＞T塩基転換と関連している。GGモチーフ内のGの標的化（標的ヌクレオチドはMC-3部位にある）に対する優先性が存在することが、本明細書において判定されている。したがって、核酸分子の非転写鎖のMC-3部位での、GGモチーフにおける予想されるよりも高い数またはパーセンテージのG＞T突然変異は、アフラトキシンが該核酸の標的体細胞突然変異生成の推定原因であることを表している。特定の例において、アフラトキシンはアフラトキシンB1である。他の例において、アフラトキシンは、アフラトキシンB2、G1、G2、M1、またはM2である。
【００７４】
3.2 他の突然変異誘発物質に対するモチーフの同定
本明細書においてはっきりと実証されるように、突然変異誘発物質は、特定のコドン文脈内のモチーフにおけるヌクレオチドを標的とし得る。ゆえに、そのような作用物質による標的体細胞突然変異は、概して、コドン構造内の1つの箇所（例えばMC-1、かつMC-2でもMC-3でもない）においておよび1つのモチーフ（例えば、CG）において、1つのタイプの突然変異（例えばC＞T、かつC＞GでもC＞Aでもない）をもたらす。上記で記載されるように、モチーフにおけるかつ特定のコドン文脈内の、特定の突然変異タイプについて核酸配列を解析することによって、モチーフにおける突然変異の発生率のみが検査される場合よりも、突然変異誘発物質の活性についてのより正確な指標を得ることができる。
【００７５】
コドン文脈に対するこのバイアスを用いて、他の突然変異誘発物質に対するモチーフを同定することができる。突然変異誘発物質と関連していることが公知の突然変異タイプ（例えば、G＞T）の体細胞突然変異の発生率について核酸分子を解析し、かつ該突然変異のコドン文脈および該突然変異に隣接するヌクレオチドも評価することによって、突然変異誘発物質に対するモチーフが同定され得る。特定の突然変異（例えば、G＞T）が、無作為に生じるよりも高頻度にコドン内の特定の箇所（例えば、MC-3）で生じる場合、すなわち突然変異が生じる優先ヌクレオチド箇所が存在する場合には、この箇所における突然変異は、突然変異誘発物質による標的体細胞突然変異の結果として生じる可能性がある。優先ヌクレオチド箇所（例えば、MC-3）における突然変異に隣接するヌクレオチドを解析することによって、該突然変異に共通の、ゆえに突然変異誘発物質に標的とされる任意のモチーフを同定することができる。
【００７６】
このことは下記の実施例7で実証されている。TP53におけるコドン249の第3の箇所でのG＞T塩基転換は、これまでにアフラトキシンと関連付けられている。肝細胞癌を有する対象からの全エクソームサンプル由来の核酸をG＞T突然変異について解析した場合、MC-3部位において9個のG＞T突然変異が存在し、かつ各突然変異は、突然変異したGのすぐ5'側の別のGと同時に発生したことが観察されており、このことは、アフラトキシンが、標的とされる（下線を引かれた）GがMC-3部位にあるGGモチーフを標的として、G＞T突然変異を引き起こすことを示唆している。
【００７７】
ゆえに、本発明は、突然変異誘発物質に標的とされるモチーフを同定するための方法も提供する。該方法は、核酸分子の配列を解析して、突然変異誘発物質と関連した突然変異タイプが、コドンの1つの箇所または部位（例えば、MC-1、MC-2、またはMC-3）で主に生じるかどうかを判定する工程を伴う。突然変異のタイプおよび部位の同時発生が存在する場合には、突然変異ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドを同定して、突然変異ヌクレオチドを含む共通モチーフを同定する。より具体的には、該方法は、核酸分子の配列を解析して、突然変異誘発物質と関連していることが公知の突然変異タイプの体細胞突然変異を同定する工程、突然変異のコドン文脈を判定して、予想されるよりも高い頻度で突然変異が生じる優先ヌクレオチド箇所を同定する工程、および優先ヌクレオチド箇所における突然変異に隣接するヌクレオチドを同定して、該突然変異に共通しているモチーフを同定する工程を伴う。
【００７８】
突然変異誘発物質と関連した突然変異タイプがまだ知られていない場合にも、同様の過程を適用することができる。そのような場合には、核酸分子の配列をまず解析して、体細胞突然変異を同定し、かつ突然変異が無作為に生じた場合に予想されるよりも高い頻度でコドン内の1つの箇所（例えば、MC-3）で（すなわち、優先ヌクレオチド箇所で）生じる任意の突然変異タイプ（例えば、G＞T）も同定する。次いで、優先ヌクレオチド箇所における突然変異に隣接する配列を評価して、該突然変異に共通しているモチーフが存在するかどうかを判定する。存在する場合、このモチーフは、該突然変異誘発物質の標的である可能性がある。
【００７９】
他の例において、突然変異誘発物質の公知のモチーフをさらに解析して、突然変異タイプに対するコドンバイアスおよび優先性を判定することができる。実施例1においてなど、本明細書において記載されるように核酸配列を評価して、モチーフにおける突然変異と関連したコドン文脈および突然変異タイプを判定し、コドン内の1つのヌクレオチド箇所に、ある突然変異タイプに対する優先性が存在するかどうかを評価することができる。例えば、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3F、およびAPOBEC3Hは、TCモチーフ、またはよりストリンジェントなTCWモチーフを標的とすると考えられる。1種または複数種の核酸分子の配列を解析して、モチーフにおける突然変異が生じるコドン文脈、すなわちCがMC-1、MC-2、またはMC-3にあるかどうか、およびどのタイプの突然変異（例えば、C＞A、C＞T、またはC＞G）が生じるかを判定することができる。いったん同時発生の突然変異タイプ、モチーフ、およびコドン文脈が同定されると、この基準のセット、つまり診断ルールを用いて、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3F、またはAPOBEC3H（または他の突然変異誘発物質）が、核酸分子における体細胞突然変異生成の推定原因であり、ゆえに該核酸入手元の細胞において活性を有するかどうかをより正確に判定することができる。
【００８０】
上記で記載される方法を用いてモチーフおよび/または診断ルールを同定するために、解析される核酸は、典型的に、突然変異誘発物質と接触したことが分かっているもしくは疑われる核酸であり、または突然変異誘発物質と接触したことが分かっているもしくは疑われる細胞から得られた核酸である。例えば、核酸を解析する前に、該核酸を含む細胞を突然変異誘発物質にインビトロで曝露してよい。他の例において、突然変異誘発物質に曝露されたことが分かっている対象由来の組織または細胞から、核酸を得てよい。知見を検証するために、多数のサンプルを用いた多数の調査を実施してもよい。
【００８１】
3.3 核酸分子の評価
核酸分子の配列を得るおよび評価するための、当技術分野において公知の任意の方法を、本発明の方法において用いることができる。本発明の方法を用いて解析される核酸分子は、任意の核酸分子であってよいが、とはいえ概してDNA（cDNAを含む）である。典型的に、核酸は、ヒト核酸などの哺乳類核酸である。核酸を、任意の生物学的サンプルから得ることができる。例えば、生物学的サンプルには、血液、組織、または細胞が含まれてよい。いくつかの例において、生物学的サンプルは生検材料である。さらに、サンプルは、身体の任意の部分由来のものであってよく、かつ、例えば乳房、前立腺、肝細胞、結腸、胃、膵臓、皮膚、甲状腺、子宮頸部、リンパ系、造血系、膀胱、肺、腎臓、直腸、卵巣、子宮、および頭頸部の組織もしくは細胞、または脳脊髄液由来の細胞など、任意のタイプの細胞または組織を含んでよい。ある場合には、核酸は、がんを有することが疑われるもしくは有する危険性がある対象由来の細胞もしくは組織サンプルから得られ、またはがんを有する対象由来の細胞もしくは組織サンプルから得られる。
【００８２】
核酸分子は、1つの遺伝子の一部もしくはすべて、または2つもしくはそれを上回る遺伝子の一部もしくはすべてを含有し得、本発明の方法に従って解析されるのは、この1つまたは複数の遺伝子の配列である。例えば、核酸分子は、TP53、PIK3CA、ERBB2、DIRAS3、TET2、または一酸化窒素合成酵素（NOS）遺伝子のすべてまたは一部を含み得る。ある場合には、核酸分子は全ゲノムまたは全エクソームを含み、本発明の方法において解析されるのは、該全ゲノムまたは全エクソームの配列である。
【００８３】
本発明の方法を用いる場合、核酸分子の配列はあらかじめ決定されていてもよい。例えば、配列はデータベースまたは他の記憶媒体内に保存され得、本発明の方法に従って解析されるのは、この配列である。他の場合において、核酸分子の配列は、本発明の方法の採用前に、まず決定されなければならない。特定の例において、核酸分子はまた、生物学的サンプルからまず単離されなければならない。
【００８４】
核酸を得るおよび/または核酸をシークエンシングするための方法は、当技術分野において周知であり、そのような任意の方法を、本明細書において記載される方法に利用することができる。ある場合には、方法は、シークエンシングの前に単離核酸の増幅を含み、適切な核酸増幅技術は当業者に周知である。核酸シークエンシング技術は当技術分野において周知であり、単一もしくは複数の遺伝子、または全エクソームもしくは全ゲノムに適用され得る。これらの技術には、例えば「サンガーシークエンシング」（Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467）（すなわち、チェーンターミネーションによるシークエンシングを伴う方法）に依存するキャピラリーシークエンシング法、ならびに数千から数百種の分子の一斉シークエンシングを容易にする「次世代シークエンシング」技術が含まれる。そのような方法には、ルシフェラーゼを使用して、個々のヌクレオチドがDNA鋳型に付加される際のシグナルを読み取る、パイロシークエンシング；各サイクルにおいて単一ヌクレオチドをDNA鋳型に付加する可逆的ダイターミネーター技術を用いる、「合成によるシークエンシング」技術（Illumina）；および固定長のオリゴヌクレオチドの優先的ライゲーションによってシークエンシングする、SOLiD（商標）シークエンシング（Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection；Life Technologies）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。これらの次世代シークエンシング技術は、全エクソームおよび全ゲノムをシークエンシングするのにとくに有用である。
【００８５】
いったん核酸分子の配列が得られたら、次いで体細胞単一点突然変異を同定する。単一点突然変異は、配列を対照配列と比較することによって同定され得る。対照配列は、疾患のない健常個体などの対照個体由来のサンプルから得られた核酸分子の配列；健常な非罹患組織由来のサンプルなどの対照サンプルから得られた核酸分子の配列であってよく、または体細胞突然変異を含有しないと理解されているコンセンサス配列であってよい。単一点突然変異を同定することに加えて、突然変異を含有するコドン、およびコドン内の突然変異の箇所（MC-1、MC-2、またはMC-3）を同定する。5'および3'隣接コドンにおけるヌクレオチドも同定して、モチーフを同定する。典型的には、本発明の方法用に、核酸分子の非転写鎖の配列（cDNA配列に等しい）を解析する。ある場合には、転写鎖の配列を解析する。
【００８６】
図2は、APOBEC3Gおよび/またはAIDが体細胞突然変異生成の推定原因であるかどうかを判定するための、上記で記載される、生物学的サンプル由来の核酸に対して実施され得る解析の例を示している。この例では、各箇所におけるGYW/WRC、CG/CG、およびWAモチーフで何個の突然変異およびどのタイプの突然変異が生じるかを評価するために、サンプルPD3185aに関して、cDNA配列（開始コドン「ATG」が、分子の第1、第2、および第3のヌクレオチドを含む）における単一点突然変異の位置が同定され、かつそれらのコドン文脈が判定されている。次いで、データを一覧にし、かつ統計解析を適用して、突然変異が偶然に起きたか、またはAIDおよび/もしくはAPOBEC3Gによって引き起こされる標的体細胞突然変異生成の結果として起きたかどうかを判定する。図2に示されているこの例では、非転写鎖上のMC-2部位で、GYWモチーフにおいて予想されるよりも多くのG＞A突然変異、およびMC-1部位で、WRCモチーフにおいて予想されるよりも多くのC＞T突然変異が存在するため、AIDはこの核酸分子における標的体細胞突然変異生成の原因である可能性がある。さらに、非転写鎖上のMC-2部位で、CGモチーフにおいて予想されるよりも多くのG＞A突然変異が存在するため、APOBEC3Gもこの核酸分子における標的体細胞突然変異生成の原因である可能性がある。
【００８７】
本明細書において実証されるように、本発明の方法を用いて、標的体細胞突然変異生成が、特定の突然変異誘発物質の活性の結果として生じているかどうかを統計的有意性を有して判定するためには、モチーフにおけるほんの少数の突然変異を解析する必要がある。ある場合には、本発明の方法を用いて解析される、特定のモチーフにおける突然変異の数はわずか2個の突然変異であり得る。例えば、明らかに健常な患者が、解析された核酸において2個のみの体細胞突然変異を有し、かつこれらの両方がMC-2部位での、GYWモチーフにおけるG＞A突然変異であることが見出された場合には、このパターンが偶然に起こった確率は0.04238である（p＜95％、カイ二乗検定、9−1＝9の自由度（df）を用いて）。あるいは、偶然に生じる突然変異のそれぞれの確率は1/9であると言え（すなわち、上記で記述されるように、G＞A突然変異の1/3の見込み、かつ該突然変異の1/3の見込みはMC-2部位にある）、したがって2個の突然変異のうちの2個がこのパターンで生じる確率は1/81（つまり、0.012346）である。しかしながら、当業者によって理解されるであろうように、特定のモチーフにおいてより多くの突然変異が解析された場合に、統計的有意性は向上し得る。ゆえに、ある場合には、本発明の方法を用いて解析される、特定のモチーフにおける突然変異の数は、少なくとも20個であり得る。治療の前または後の対象由来の多くの核酸サンプルは、40個またはそれを上回る数の突然変異を有し、一部は最高400個またはそれを上回る数の突然変異を持つ。したがって、本発明の方法を用いて解析される、特定のモチーフにおける突然変異の数は、少なくともまたは約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、またはそれを上回る数であり得る。
【００８８】
対象における標的体細胞突然変異生成を検出し、かつ突然変異誘発物質が該標的体細胞突然変異生成の原因である可能性をさらに同定するために要されるすべての必須の材料および試薬、ならびに本明細書において記載される関連方法を、キット内に一緒にまとめてよい。例えば、本発明の方法が、解析される対象となる核酸をまず単離する工程および/またはシークエンシングする工程を含む場合、その単離および/またはシークエンシングを容易にする試薬を含むキットが想定される。そのような試薬には、例えばDNAの増幅のためのプライマー、ポリメラーゼ、dNTP（標識dNTPを含む）、陽性および陰性の対照、ならびにバッファーおよび溶液が含まれてよい。そのようなキットは、一般的に、適切な手段で、それぞれ個々の試薬に対する別個の容器も含む。キットは、様々な装置、および/またはキットを用いるための印刷された指示書も特色とし得る。
【００８９】
いくつかの態様において、本明細書において概して記載される方法は、少なくとも部分的に、適切にプログラムされたコンピューターシステムなどの処理システムによって実施される。上記で記載される方法が実施されるのを可能にするアプリケーションソフトウェアを実行するマイクロプロセッサーを備えた独立型コンピューターが用いられ得る。あるいは、該方法は、少なくとも部分的に、分散型アーキテクチャーの一部として動作する1つまたは複数の処理システムによって実施され得る。例えば、処理システムを用いて、1種または複数種の核酸配列内の突然変異タイプ、突然変異のコドン文脈、および/またはモチーフを同定することができる。いくつかの例において、ユーザーによって処理システムに入力されたコマンドは、処理システムがこれらの判定を行うのを支援する。
【００９０】
一例において、処理システムは、バスを介して相互接続された、少なくとも1つのマイクロプロセッサー、メモリー、キーボードおよび/またはディスプレイなどの入力/出力装置、ならびに外部インターフェースを含む。外部インターフェースは、処理システムを通信ネットワーク、データベース、または記憶装置などの周辺装置に接続するために利用され得る。マイクロプロセッサーは、メモリー内に記憶されたアプリケーションソフトウェアの形態の命令を実行して、本発明の方法が実施されるのを可能にし得、ならびにコンピューターシステムと通信するなど、他の任意の要求された処理を実施し得る。アプリケーションソフトウェアは、1つまたは複数のソフトウェアモジュールを含み得、かつオペレーティングシステム環境などの適切な実行環境で実行され得る。
【００９１】
別の例において、処理システムを用いて、データベースまたは他の供給源から配列情報および他の関連データをアップロードすることができる。図18に示されているものなど、本明細書において開示される方法に適当であるように考案されたアルゴリズムをデータに適用することができる。この例では、入力データ［1］および試験パラメーター（用いられる対象となるモチーフなど）［2］をシステム内にアップロードするまたは入力する。次いで、コドン文脈データおよび他の情報がサンプル詳細およびヌクレオチド配列に関連付けされ、データは整列されかつ突然変異と関連付けされ、関心対象のゲノム領域内の突然変異に対する塩基置換表が作成される［3、4、5］。次の工程は、コドン内の各ヌクレオチド箇所での各モチーフにおける各突然変異タイプについての同時発生の出現率の同定を伴う［6］。データは一覧にされて、コドン文脈とともに各モチーフの各突然変異タイプについて同時発生の出現率が記録され［7］、各診断に対する信頼性のレベルとともに相対的可能性のグレードが含まれる［8］。結果が関連付けされて、突然変異を産生することに関与する可能性がある突然変異誘発物質（または分子構造）および生化学的過程、ならびに関連臨床情報が同定される［8］。入力として用いられたサービス要求情報に従って出力レポートが作成され［9］、かつ読み取り可能な出力が作成される［10］。
【００９２】
4．診断的および治療的な応用
標的体細胞突然変異が生じているかどうかを検出するための、および突然変異誘発物質が核酸分子の体細胞突然変異生成の原因である可能性を判定するための、本明細書において記載される方法は、多くの有用な診断的および治療的な応用を有する。体細胞突然変異生成は、多くのがんの発症および進行と関連していることが知られている。同様に、一部の突然変異誘発物質は、多くのがんの発症および進行と関連していることが知られている。本明細書において記載される方法を用いて、1種または複数種の突然変異誘発物質により生じる標的体細胞突然変異生成の存在および/または程度、ならびに体細胞突然変異生成の推定原因である突然変異誘発物質の正体を判定することができる。これにより、がんの早期診断、対象ががんを有する可能性もしくはがんを発症するであろう可能性の判定、および/または適当な治療もしくは予防プロトコールの開発が容易となり得る。加えて、1種または複数種の突然変異誘発物質に起因する標的体細胞突然変異の継続的評価を用いて、がんが進行しているかどうかもしくは退縮しているかどうか、および/または治療レジメンの成功もしくは失敗を評価することができる。例えば、同じ対象における、生検材料などのサンプル由来の核酸において検出される標的体細胞突然変異の数の経時的な増加は、がんの悪化または治療レジメンの失敗を表し得、一方で突然変異の数の安定または低下は、病状の寛解または治療レジメンの成功を表し得る。
【００９３】
特定の場合において、本発明の方法は、対象におけるがんの診断、または対象ががんを有する可能性もしくはがんを発症するであろう可能性の判定にまで及び得る。例えば、対象ががんを有する可能性またはがんを発症するであろう可能性は、該対象からの生物学的サンプル由来の核酸分子を解析して、1種または複数種の突然変異誘発物質による標的体細胞突然変異生成が生じているかどうかを判定することによって評価され得る。標的体細胞突然変異生成が生じている場合、対象はがんを有するまたは発症する可能性があるという判定がなされ得る。
【００９４】
いくつかの例において、上記で記載される診断ルールを利用して、標的体細胞突然変異生成が生じている可能性を判定する。例えば、AID、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC1、およびアフラトキシンに関して上記で記載されるように、核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、GYWモチーフにおける観察されたGからAへの突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、WRCモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、CGモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、CGモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、CAモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、GAモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、TGモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；核酸分子の非転写鎖のMC-3部位で、GGモチーフにおける観察されたG＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、CCモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；または核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、WAモチーフにおける観察されたA＞G突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合に、標的体細胞突然変異生成は検出され得る。他の例において、本明細書において記載される方法を用いた、他の突然変異誘発物質に対して決定された診断ルールを用いて、標的体細胞突然変異の出現率を検出する。
【００９５】
ある場合には、乳房、前立腺、肝臓、結腸、胃、膵臓、皮膚、甲状腺、子宮頸部、リンパ系、造血系、膀胱、肺、腎臓、直腸、卵巣、子宮、および頭頸部の組織または細胞など、対象における特定の領域または位置由来の細胞または組織を含有するサンプルにおいて標的体細胞突然変異が検出された場合には、対象は、その組織またはそれらの細胞を伴うがんを有するというまたは発症する可能性があるという判定がなされる。ゆえに、例えば、対象は、乳房、前立腺、肝臓、結腸、胃、膵臓、皮膚、甲状腺、子宮頸、リンパ系、造血系、膀胱、肺、腎臓、直腸、卵巣、子宮、または頭頸部のがんを有するというまたは発症する可能性があるという判定がなされ得る。
【００９６】
特定の例において、AIDまたはAPOBEC3Gなどの突然変異誘発物質が、前立腺の組織または細胞における核酸の標的体細胞突然変異生成の推定原因であることが観察された場合には、対象は前立腺癌を有すると診断され得、または前立腺癌を有するもしくは発症する可能性があると判定され得る。同様に、突然変異誘発物質が、乳房の組織または細胞における核酸の標的体細胞突然変異生成の推定原因であることが観察された場合には、対象は乳癌を有すると診断され得、または乳癌を有するもしくは発症する可能性があると判定され得る。
【００９７】
突然変異誘発物質による標的体細胞突然変異生成の程度（すなわち、核酸における、突然変異誘発物質に起因する標的体細胞突然変異の数）を用いても、対象ががんを有する可能性もしくはがんを発症するであろう可能性、がんが進行しているもしくは退縮している可能性、および/または治療が効いているもしくは効いていない可能性の判定を支援することができる。典型的に、標的体細胞突然変異生成の数が多ければ多いほど、対象ががんを有する可能性またはがんを発症するであろう可能性は高い。さらに、対象において標的体細胞突然変異の数の経時的な増加がある場合、がんが進行しているかつ/または治療が失敗している可能性がより高い。逆に、対象において標的体細胞突然変異の数の経時的な減少がある場合、がんが退縮しているかつ/または治療が成功している可能性がより高い。
【００９８】
本発明の方法は、治療または予防プロトコールにも及ぶ。対象ががんを発症する可能性があると判定される例では、その可能性を低下させるように設計されたプロトコールが設計されかつ適用され得る。例えば、対象が、特定の突然変異誘発物質と関連したがんを発症する危険性があると判定された場合、対象に助言して、その突然変異誘発物質への曝露を低下させることができる。例えば、対象が黒色腫を発症する危険性があると判定された場合、対象に助言して、UV放射への曝露を低下させることができる。上記で記載される方法を用いて、対象ががんを有すると診断されているまたはがんを発症する高い可能性を有すると判定されている例では、適当な治療プロトコールが該対象に対して設計されかつ施され得る。これには、例えば放射線療法、外科手術、化学療法、ホルモン除去療法、アポトーシス促進療法、および/または免疫療法が含まれてよい。いくつかの例において、さらなる診断テストを実施して、療法前に診断を確認し得る。
【００９９】
放射線療法には、例えばγ線照射、X線、UV照射、マイクロ波、電子放出、放射性同位体等、DNA損傷を誘導する放射線および波動が含まれる。上記で記載される形態の放射線を限局性腫瘍部位に照射することによって、療法は達成され得る。これらの因子のすべては、DNAの前駆体、DNAの複製および修復、ならびに染色体の会合および維持に対して、DNAに広範囲の損傷をきたす可能性が最も高い。
【０１００】
X線に関する線量範囲は、長期間（3〜4週間）にわたる50〜200レントゲンの1日線量から、2000〜6000レントゲンの単回線量に及ぶ。放射線同位体に関する線量範囲は大きく変動し、同位体の半減期、放出される放射線の強度およびタイプ、ならびに新生細胞による取り込みに依存する。
【０１０１】
放射線療法の非限定的な例には、原体外部ビーム放射線療法（50〜100グレイが4〜8週間にわたって分画として与えられる）、単発のまたは分画した高線量率小線源療法、永続的な組織内（interstitial）小線源療法、全身性放射性同位体（例えば、ストロンチウム89）が含まれる。いくつかの態様において、放射線療法を、放射線増感剤と併用して施してよい。放射線増感剤の例証的な例には、エファプロキシラル、エタニダゾール、フルオゾール（fluosol）、ミソニダゾール、ニモラゾール、テモポルフィン、およびチラパザミンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１０２】
化学療法剤は、以下のカテゴリーのうちのいずれか1つまたは複数より選択され得る。
【０１０３】
（i）アルキル化剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、およびニトロソウレア）；抗代謝薬（例えば、5-フルオロウラシルおよびテガフールのようなフルオロピリジン、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシド、ならびにヒドロキシウレアなどの抗葉酸薬）；抗腫瘍性抗生物質（例えば、アドリアマイシンのようなアントラサイクリン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンC、ダクチノマイシン、およびミトラマイシン）；抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビンのようなビンカアルカロイド、ならびにパクリタキセルおよびドセタキセルのようなタキソイド）；およびトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシドおよびテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカン、ならびにカンプトテシン）など、腫瘍内科学において用いられる抗増殖薬/抗新生物薬およびそれらの組み合わせ；
（ii）抗エストロゲン薬（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、およびヨードキシフェン（iodoxyfene））、エストロゲン受容体下方調節因子（例えば、フルベストラント）、抗アンドロゲン薬（例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、および酢酸シプロテロン）、UHアンタゴニストまたはLHRHアゴニスト（例えば、ゴセレリン、リュープロレリン、およびブセレリン）、プロゲステロン薬（例えば、酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾール、およびエキセメスタンのようなもの）、およびフィナステリドなどの5α-レダクターゼの阻害剤など、細胞静止剤；
（iii）がん細胞浸潤を阻害する作用物質（例えば、マリマスタットのようなメタロプロテイナーゼ阻害剤、およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体機能の阻害剤）；
（iv）成長因子機能の阻害剤、例えばそのような阻害剤には、成長因子抗体、成長因子受容体抗体（例えば、抗erbb2抗体のトラスツズマブ［ハーセプチン（商標）］および抗erbb1抗体のセツキシマブ［C225］）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、MEK阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤およびセリン/トレオニンキナーゼ阻害剤、例えば上皮成長因子ファミリーの他の阻害剤（例えば、N-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-7-メトキシ-6-(3-モルホリノプロポキシ)キナゾリン-4--アミン（ゲフィチニブ、AZD1839）、N-(3-エチニルフェニル)-6,7-ビス(2-メトキシエトキシ)キナゾリン-4-アミン（エルロチニブ、OSI-774）、および6-アクリルアミド-N-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-7-(3-モルホリノプロポキシ)キナゾリン-4-アミン（CI 1033））など、他のEGFRファミリーチロシンキナーゼ阻害剤）、例えば血小板由来成長因子ファミリーの阻害剤、ならびに例えば肝細胞成長因子ファミリーの阻害剤が含まれる；
（v）血管内皮成長因子の効果を阻害するものなどの抗血管新生剤（例えば、抗血管内皮細胞成長因子抗体のベバシズマブ［アバスチン（商標）］、国際特許出願WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856、およびWO 98/13354に開示されているものなどの化合物）、および他のメカニズムによって働きかける化合物（例えば、リノミド（linomide）、インテグリンαvβ3機能の阻害剤、およびアンギオスタチン）；
（vi）コンブレタスタチンA4、ならびに国際特許出願WO 99/02166、WO 00/40529、WO 00/41669、WO 01/92224、WO 02/04434、およびWO 02/08213に開示されている化合物などの血管損傷剤；
（vii）アンチセンス療法、例えば、抗rasアンチセンスのISIS 2503など、上記で列挙される標的に向けられているもの；ならびに
（viii）例えば、異常p53などの異常遺伝子を置き換える手法、またはシトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、もしくは細菌ニトロレダクターゼ酵素を用いるものなどの異常GDEPT（遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法）の手法、および多剤抵抗性遺伝子療法など、化学療法または放射線療法に対する患者の耐性を増加させる手法を含めた、遺伝子療法の手法。
【０１０４】
免疫療法の手法には、例えば、インターロイキン2、インターロイキン4、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などのサイトカインのトランスフェクションなど、患者腫瘍細胞の免疫原性を増加させるエクスビボおよびインビボ手法、T細胞アネルギーを減少させる手法、サイトカインをトランスフェクトされた樹状細胞など、トランスフェクトされた免疫細胞を用いる手法、サイトカインをトランスフェクトされた腫瘍細胞株を用いる手法、ならびに抗イディオタイプ抗体を用いる手法が含まれる。これらの手法は、一般的に、免疫エフェクター細胞の使用、およびがん細胞を標的としかつ破壊する分子の使用に依存する。免疫エフェクターは、例えば悪性細胞の表面上のあるマーカーに特異的な抗体であり得る。該抗体は単独で療法のエフェクターとしての役割を果たし得、またはそれは他の細胞を導いて、細胞殺傷を事実上促し得る。該抗体は、また、薬物または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等）に接合され得、単に標的化剤としての役割を果たし得る。あるいは、該エフェクターは、悪性細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を担持するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性T細胞およびNK細胞が含まれる。
【０１０５】
他のがん療法の例には、光線療法、凍結療法、毒素療法、またはアポトーシス促進療法が含まれる。当業者であれば、この列挙は、がんおよび他の過形成病変に利用可能な治療様式のタイプを網羅するものではないことを理解するであろう。
【０１０６】
標的体細胞突然変異を引き起こす突然変異誘発物質の可能性の高い正体が判定された場合のいくつかの例において、治療的または予防的手段には、その突然変異誘発物質の阻害剤の対象への投与が含まれてよい。阻害剤には、例えばsiRNA、miRNA、タンパク質アンタゴニスト（例えば、突然変異誘発物質のドミナントネガティブ変異体）、小分子阻害剤、抗体およびそのフラグメントが含まれ得る。例えば、APOBECシチジンデアミナーゼおよびAIDに特異的な市販のsiRNAおよび抗体は広く入手可能であり、かつ当業者に公知である。APOBEC3G阻害剤の他の例には、Liら（ACS Chem Biol. (2012) 7(3):506-517）によって記載されている小分子が含まれ、そのうちの多くは、オルトキノンへの酸化後にスルフヒドリル反応性であることが知られているカテコール部分を含有する。APOBEC1阻害剤には、mu1（H61K/C93S/C96S）変異体など（Oka et al. (1997) J Biol Chem 272, 1456-1460）、ドミナントネガティブ変異体APOBEC1ポリペプチドも含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１０７】
典型的に、治療剤は、薬学的に許容される担体と一緒に薬学的組成物の状態で、かつそれらの意図される目的を達成する有効量で投与される。対象に投与される活性化合物の用量は、がんの症状の低下もしくは軽減、および/または腫瘍もしくはがん細胞の低下、退縮、もしくは廃絶など、経時的に対象において有益な応答を達成するのに十分であるべきである。投与されるべき薬学的に活性な化合物の分量は、年齢、性別、重量、およびその全般的健康状態を含めた、治療されるべき対象に依存し得る。これに関して、投与のための活性化合物の正確な量は、実践者の判断に依存し、かつ当業者であれば、過度の実験なしに、治療剤の適切な投薬量および適切な治療レジメンを容易に決定し得る。
【０１０８】
本発明が容易に理解され得かつ実際に実行に移され得るために、特定の好ましい態様を、以下の非限定的な例としてここで記載する。
【実施例】
【０１０９】
実施例1
乳癌におけるTP53体細胞突然変異についての解析
乳癌のTP53遺伝子における体細胞突然変異の頻度および前後関係を、IARCによるTP53データベースを評価し、かつ乳癌に特異的なデータを抽出することによって評価した。このデータセットにおける点突然変異の数は大量であった（N＝2,514）。該突然変異の大部分は単一点突然変異であり、TP53のDNA結合部位（コドン約130〜300）に主に集中していた。サンプルのほんの一部のみが、TP53におけるエクソン突然変異を保持していた。TP53の塩基組成によりほんのわずかな変動しか存在しないと推測され、補正はなされなかった。様々な基準の選択により、非突然変異TP53エクソン配列（および、ある場合にはイントロン配列）に関係している5'および3'隣接配列前後関係を有するすべてのタイプの突然変異の構築および解析が容易となった。これにより、関心対象の領域にわたるヌクレオチドおよびコドン箇所に対する、様々なタイプの突然変異（例えば、AからGへ）の頻度分布の開発が容易となった。
【０１１０】
cDNA転写産物（すなわち、非転写鎖と同じ配列前後関係）の配列を解析した。cDNA転写産物は、これらが、抽出および解析の目的でCOSMICおよびEnsemblデータベースにおいて公的に入手可能であるため用いられた。これらの転写産物を用いて、各突然変異周辺の配列前後関係を、AIDモチーフ（GYW/WRC）、APOBEC1モチーフ（TG/CA）、およびAPOBEC3Gモチーフ（CG/CG）における、ならびにSHM過程（ゆえに、AID活性と関連する）の第II段階におけるA：T塩基対での突然変異の潜在的部位を代表するWAモチーフにおける突然変異ついて解析した。突然変異を、突然変異コドンにおけるそれらの箇所との関連で評価した。
【０１１１】
図1は、この解析のための、規定された「関心対象の領域」における突然変異配列の例を示している。関心対象の領域は、突然変異コドン、隣接する5プライム（5'）コドンおよび3プライム（3'）コドンを包含する9個のヌクレオチドを含む。突然変異コドン（MC）配列におけるヌクレオチドのそれぞれの箇所は、MC-1、MC-2、およびMC-3と注釈される（5'から3'に読む）。隣接5'コドンにおけるヌクレオチド（N）のそれぞれの箇所は、それぞれ5'N1、5'N2、および5'N3と注釈される（同じく、5'から3'に読む）。同様に、隣接3'コドンにおけるヌクレオチドの箇所は、それぞれ3'N1、3'N2、および3'N3と注釈される。AからCへの点突然変異（A＞C）に関して示されている例において、非転写鎖（NTS）上のMC-1部位におけるAは、複製された非転写鎖（NTS'）でCに突然変異する。突然変異コドンにおけるAの突然変異は、5'-N3箇所のGと関連している。これは、「S・・A」（SはGまたはCである）と注釈される。突然変異コドン内の突然変異の位置にかかわらず、この注釈を用いる。
【０１１２】
プールされた乳癌データセットからの、TP53遺伝子における2,514個の体細胞突然変異のそれぞれについてのコドン文脈および頻度を表1に示す。上記で言及されるように、MC-1、MC-2、およびMC-3とは、突然変異コドン（MC）内の突然変異の箇所を指す。これらは、非転写鎖から5'から3'に読まれる。コドン文脈が各突然変異タイプにとって重要であるかどうかを判定するために、カイ二乗検定を用いて、P＜0.01レベルでのカットオフに対する統計的有意性を検定した（2DF）。
【０１１３】
（表１）
2018108105.tif 000004
【０１１４】
塩基転換（すなわち、AまたはG⇔CまたはT）よりもはるかに多くの塩基転位（すなわち、A⇔GまたはC⇔T）が存在することが観察された。結果として、突然変異パターンは、Aの突然変異がTの突然変異を上回り（371/283＝1.3）、かつGの突然変異がCの突然変異を上回る（1110/750＝1.5）、有意なストランドバイアス性を示す。このことは、Ig遺伝子のVDJ領域におけるSHM過程に対する同様のストランドバイアスパターンを示した以前の研究、ならびに乳癌を含む広範な非リンパ系がんに対する全ゲノムにわたるタンパク質キナーゼ遺伝子突然変異データ（Steele and Lindley (2010) DNA Repair 9:600-603）と合致している。ストランドバイアスパターンは、B細胞慢性リンパ球性白血病患者から取られた突然変異データ（Malcikova et al. (2008) Molecular Immunology 45:1525-9）とも合致している。
【０１１５】
表1に示されているプールされたデータセットにより、以前には報告されていない有意な突然変異コドンバイアスパターンも明らかとなった。最も有意なコドン文脈のバイアスは、SHM過程と関連した顕著なストランドバイアスパターンをもたらすことが知られている、C＞T（P＜0.001、2DF）、G＞A（P＜0.001、2DF）、およびA＞G（P＜0.001、2DF）塩基転位に対してであった。
【０１１６】
全C＞T塩基転位のうちの397/593（66.9％）はMC-1部位で生じ、かつCの全突然変異（すなわち、C＞A/G/T）のうちの397/750（52.9％）はMC-1部位におけるC＞T塩基転位であることが見出された。対照的に、全G＞A塩基転位のうちの505/795（63.5％）はMC-2部位で生じ、かつGの全突然変異（すなわち、G＞A/C/T）のうちの505/1110（45.5％）はMC-2部位におけるG＞A塩基転位であった。突然変異が無作為にかつコドン構造とは無関係に生じる場合、特定のヌクレオチドの3種の異なるタイプの突然変異のそれぞれに対して、突然変異の9個中1個のみ（つまり、おおよそ11.1％）が、特定の部位（すなわち、MC-1、MC-2、またはMC-3）で生じると予想される。
【０１１７】
A＞G塩基転位に関して、全A＞G塩基転位のうちの194/269（72.1％）はMC-2部位で生じ、かつAの全突然変異（すなわち、A＞C/G/T）のうちの194/371（52.3％）はMC-2部位におけるA＞G塩基転位であった。
【０１１８】
表1におけるデータは、C＞T、G＞A、およびA＞G塩基転位のそれぞれに関して、MC-3における突然変異の数が、MC-1またはMC-2箇所におけるものよりも有意に低かったように、TP53遺伝子におけるミスセンス突然変異の選択の予想も裏付けている。RNAに関して、ナンセンス介在性mRNA分解（NMD）経路は、コドン文脈情報に依存して、早まって翻訳を停止させ得る「ナンセンス」突然変異または終止シグナル（UAG、UGA、およびUAA）を含有する欠陥遺伝子産物を細胞が同定しかつ処分するのを可能にする、1つの公知の細胞監視システムである。結果は、TP53におけるミスセンス変異の選択である。データは、Ig可変（V）領域遺伝子の相補性決定領域におけるMC-1およびMC-2コドン箇所に対する予想されるよりも高い変異性の傾向を報告した以前の別の研究（Shapiro et al. (2002) J. Immunology 168:2302-2306）とも一致している。
【０１１９】
解析により、MC-1部位で生じるC＞T塩基転位（P＜0.001、2DF）に対する、およびMC-2部位で生じるG＞A塩基転位（P＜0.001、2DF）に対する極めて有意な統計的優先性も明らかとなった。開いた「転写バブル」におけるssDNAのTSまたはNTS上のシチジンは、両方ともに脱アミノ化を受け得るため、データは、関与する分子メカニズムが、インフレームで読み取り得かつTSおよびNTS上のシチジンを区別し得るという結論を裏付けている。
【０１２０】
表2は、AID、APOBEC1、およびAPOBEC3Gモチーフ、ならびにWAモチーフで生じている、TP53乳癌データセットに対する2514個の体細胞突然変異のコドン文脈を示している。カイ二乗検定を用いて、P＜0.01レベルでのカットオフに対する統計的有意性を判定した（2DF）。
【０１２１】
突然変異が5'コドン構造とは無関係に生じ、かつ塩基組成に対して補正がなされない場合には、各突然変異タイプのおおよそ3分の1は、MC-1、MC-2、またはMC-3部位に位置すると予想される。同様に、単一ヌクレオチドの全突然変異のうちのおおよそ9分の1（11.1％）のみが、MC-1、MC-2、またはMC-3部位に位置すると予想される。AID、APOBEC1、およびAPOBEC3G活性と関連した主要なモチーフにおける塩基転位に対するコドン文脈バイアスは、表1に示されているプールされたデータセットで見出されるものよりもさらにより統計的に有意であることが見出された。
【０１２２】
（表２）
2018108105.tif 000005
【０１２３】
AID活性に関連付けされるGYWモチーフに関して、全G＞A塩基転位のうちの185/200（92.5％）はMC-2部位で生じ、かつGYW部位での全突然変異（すなわち、G＞A/C/T）のうちの185/248（74.6％）はMC-2部位におけるG＞A塩基転位であった。対照的に、WRC部位では、全C＞T塩基転位のうちの106/132（80.3％）はMC-1部位で生じ、かつCの全突然変異（すなわち、C＞A/G/T）のうちの106/168（63.1％）はMC-1部位におけるC＞T塩基転位であった。
【０１２４】
APOBEC3G活性に関連付けされるCGモチーフでは、全G＞A塩基転位のうちの358/407（87.7％）はMC-2部位で生じ、かつCG部位での全突然変異（すなわち、G＞A/C/T）のうちの358/505（70.9％）はMC-2部位におけるGからAへの塩基転位であった。対照的に、CG部位では、全C＞T塩基転位のうちの240/248（96.8％）はMC-1部位で生じ、かつCの全突然変異（すなわち、C＞A/G/T）のうちの240/288（83.3％）はMC-1部位におけるC＞T塩基転位であった。
【０１２５】
APOBEC1活性に関連付けされるTG/CAモチーフに関して、コドン文脈バイアスは統計的に有意なほどではなかった。CA部位では、C＞T塩基転位のうちの93/160（58.1％）はMC-1部位で生じ、かつCの全突然変異（すなわち、C＞A/G/T）のうちの93/188（49.5％）はMC-1部位におけるC＞T塩基転位であった。TG部位では全G＞A塩基転位のうちの62/155（40.0％）のみがMC-2部位で生じ、かつTG部位でのGの全突然変異（すなわち、G＞A/C/T）のうちの62/136（45.6％）はMC-2部位におけるG＞A塩基転位であった。
【０１２６】
表2に示されている、主要なモチーフにおける観察されたコドンバイアスパターンの別の性質は、AID、APOBEC1、およびAPOBEC3Gに関するモチーフにおけるそれぞれに対するGの全突然変異の大多数はMC-2部位で優先的に生じるということである。比較すると、モチーフのそれぞれに対するCの突然変異のほとんどは、MC-1標的部位で生じた。このことは、転写の開始の間に、DNAレベルでインフレーム感知メカニズムが関与していること、およびそれは、開いた「転写バブル」の前後関係におけるNTS上のシチジンとTS上のシチジンとを区別し得ることを含意している。
【０１２７】
WA部位におけるA＞G塩基転位に関して、128/141（90.8％）はMC-2部位で生じ、かつWA部位でのAの全突然変異（すなわち、A＞C/G/T）のうちの128/167（76.6％）はMC-2部位におけるG＞A塩基転位であった。WA部位における上昇したレベルのA＞G突然変異は、SHM活性の特徴的性質として認識されかつRNA鋳型中間体の関与を診断するものであるため、この知見は、内因性AID始動性の突然変異過程が、データセット内のサンプルの少なくとも多くにおいて活発であるという予測を裏付ける。
【０１２８】
表3は、AID、APOBEC1、およびAPOBEC3Gと関連しかつ5'N3箇所における強力なヌクレオチド（S＝G/C）と共配置している、主要なモチーフで生じている突然変異のコドン文脈を示している。「S・・M」（Mは、突然変異ヌクレオチドA、G、C、またはTである）という注釈は、突然変異コドンに隣接する5'N3箇所における「S」ヌクレオチドの存在を表すために用いられ、かつ突然変異ヌクレオチド標的はMC-1、MC-2、またはMC-3箇所のうちのいずれか1箇所にある。突然変異が5'コドン構造とは無関係に生じ、かつ塩基組成に対して補正がなされない場合には、モチーフのそれぞれにおける突然変異の半分のみが、5'N3箇所におけるSと共配置すると予想される。
【０１２９】
（表２）
2018108105.tif 000006
* MC-1箇所での突然変異に関して、5'N3箇所におけるヌクレオチドが、両方とも「S」かつWAまたはTGであることは不可能である。同様に、MC-2箇所での突然変異に関して、5'N3箇所におけるヌクレオチドは、「S」およびWRCではあり得ず、かつMC-1箇所でのCG部位における全突然変異は5'N3箇所に「S」を有する。
【０１３０】
解析により、AID、APOBEC3G活性と関連したモチーフにおけるおよびWA部位における、しかしながらAPOBEC1部位ではない、S・・M部位と塩基転位との間の予想外に高い関連性が明らかとなった。AID活性と関連したGYW/WRCモチーフに関して、MC-2箇所における全G＞A塩基転位のうちの184/185（99.5％）は5'N3箇所に存在しているSを有し、かつMC-1箇所における全C＞T塩基転位のうちの102/106（96.2％）は5'N3箇所に存在しているSを有した。APOBEC3G活性と関連したCG/CGモチーフに関して、MC-2箇所における全G＞A塩基転位のうちの352/358（98.3％）は5'N3箇所に存在しているSを有し、かつMC-1箇所における全CからTへの塩基転位のうちの239/240（99.6％）は5'N3箇所に存在しているSを有した。APOBEC1活性と関連したTG/CAモチーフに関して、結果は統計的に有意ではなかった。MC-2部位でのG＞A塩基転位のうちの36/62（58.1％）のみが5'N3箇所に存在しているSを有し、かつMC-1箇所におけるCからTへの塩基転位のうちの52/93（55.9％）は5'N3箇所に存在しているSを有した。WA部位に関して、MC-2部位でのAからGへの塩基転位のうちの121/127（95.3％）は5'N3箇所に存在しているSを有した。
【０１３１】
表3におけるデータにより、5'N3箇所におけるSと共配置している選択されたモチーフにおける塩基転換のうちのいくつかの予想外に高い比率も明らかとなった。とくに、GYWまたはCG標的部位でのGからT/Cへの突然変異とS・・G部位との間に予想されるよりも高い関連性が存在する。選択されたAID、APOBEC3G、およびWAモチーフに関するMC-2標的で生じているGの全塩基転位および全塩基転換に対して、極めて有意な778/799（97.4％）がS・・Gと共配置している。同様に、選択されたAIDおよびAPOBEC3Gモチーフに関するMC-1標的部位で生じているCの全塩基転位および全塩基転換のうちの375/382（98.2％）がS・・Cと共配置している。
【０１３２】
したがって、S・・M（M＝A/G/C/T）の共配置は、AIDおよびAPOBEC3Gデアミナーゼ活性と関連した直接接触結合およびコドンリーディングフレーム感知メカニズム、ならびにWA部位に作用する突然変異誘発メカニズムの不可欠の部分であるように思われる。
【０１３３】
実施例2
AID、APOBEC1、またはAPOBEC3Gの活性を予測する診断ルールの開発
AID、APOBEC1、APOBEC3G、およびWAモチーフにおける突然変異に対して観察されたコドンバイアスパターン（上記で記載される）を用いて、核酸分子の標的体細胞突然変異（TSM）が、AID、APOBEC1、および/またはAPOBEC3G活性の結果として生じているのかどうかを予測することにおける使用のための、以下の「ルール」または診断基準を作成した。
【０１３４】
MC-2部位での、GYW（AID）モチーフの予想されるよりも高い数のG＞A突然変異は、転写鎖上でのAIDデアミナーゼ活性と関連している。
【０１３５】
MC-1部位での、WRC（AID）モチーフの予想されるよりも高い数のC＞T突然変異は、非転写鎖上でのAIDデアミナーゼ活性と関連している。
【０１３６】
MC-2部位での、CG（APOBEC3G）モチーフの予想されるよりも高い数のG＞A突然変異は、APOBEC3G活性と関連している。
【０１３７】
MC-1部位での、CG（APOBEC3G）モチーフの予想されるよりも高い数のC＞T突然変異は、APOBEC3G活性と関連している。
【０１３８】
MC-2での、WAモチーフの予想されるよりも高い数のA＞G突然変異は、AID関連性突然変異過程、ゆえにAID活性の指標である。
【０１３９】
これらのルールを適用する場合、各ヌクレオチドの突然変異のセットは互いに無関係であること、ならびに突然変異誘発物質が存在していない場合、MC-1およびMC-2コドン部位のそれぞれにおける各ヌクレオチドの突然変異の分布は、A、G、C、またはTの突然変異に対して無作為に分布するであろうことを前提とする。
【０１４０】
図2は、コドンバイアス突然変異分布が、偶然に生じる、またはAIDもしくはAPOBEC3Gによる標的体細胞突然変異によって生じる確率を判定するために、上記の診断基準がどのように用いられ得るかの例を示している。上記の選択された診断カテゴリーのそれぞれに対して、観察された（O）および予想される（E）突然変異の数を表形式で一覧にしている。診断カテゴリーのそれぞれに対して、予想される（E）突然変異の数は、突然変異が無作為である場合に、特定のヌクレオチドの3種の考え得るタイプの突然変異のそれぞれに対して、MC-1およびMC-2部位にわたって起こる可能性がある突然変異の総数を用いて算出される。（図2に示されるように、TP53遺伝子の突然変異を解析する場合、TP53遺伝子の突然変異変種は結合機能に対して選択されているため、MC-3部位で生じている突然変異は比較物として排除された。関与するナンセンス介在性メッセンジャーRNA分解（NMCD）経路は、コドン文脈情報に依存して、早まって翻訳を停止させ得るナンセンス突然変異または終止シグナルを含有する欠陥遺伝子産物を細胞が同定しかつ処分するのを可能にする、1つの公知の細胞監視システムである。）例えば、非転写鎖のシトシン（C）の突然変異をもたらすAID活性と関連しているWRCモチーフに関して、Cにおける突然変異の数が無作為に分布した場合、該突然変異は、MC-1/MC-2部位にわたって、かつC＞A、C＞G、およびC＞T（C＞A/G/T）にわたって均等に分布すると考えられる。ゆえに、この例において、MC-1部位におけるC＞T突然変異の予想される（E）数は、考え得るタイプ/箇所の突然変異の数（すなわち、6）で割った、MC-1およびMC-2部位における観察されたC＞A/T/G突然変異の総数（すなわち、1＋1＋72＋6＋1＋1）であり、13.67に等しい。次いで、簡単なカイ二乗検定を適用して、観察された分布が偶然に生じた確率を判定する。図3に示されている例において、MC-1/MC-2コドンバイアス分布が、TET2遺伝子の突然変異セットに適用された選択された診断基準のセットに対して偶然に生じた確率は、7.42E-128である。この結果は、極めて高いレベルの有意性（P＜1E-127）を含意している。
【０１４１】
再度図3に関して、MC-2部位における、GYWモチーフの予想されるよりも高い数のG＞A突然変異、およびMC-1部位における、WRCモチーフの予想されるよりも高い数のC＞T突然変異は、AIDデアミナーゼ活性を表し、一方でMC-2部位における、CGモチーフの予想されるよりも高い数のG＞A突然変異、およびMC-1部位における、CGモチーフの予想されるよりも高い数のC＞T突然変異は、APOBEC3G活性を表す。
【０１４２】
実施例3
他のがんにおけるTP53体細胞突然変異についての解析
乳癌サンプルのTP53において観察された、AID、APOBEC3G、およびWAモチーフにおける突然変異に対するコドンバイアスが、他のがんのTP53においても生じるかどうかを判定するために、子宮頸癌（全タイプ）、子宮頸部腺癌、結腸腺癌、肝細胞癌、膵臓癌、前立腺癌、および悪性黒色腫に対するIARCによるTP53データベースからデータを抽出し、かつ上記で記載されるように解析した。
【０１４３】
図4〜11は、GYW/WRC部位（AID）、CG/CG部位（APOBEC3G）、およびWA部位における突然変異の頻度およびコドン内の位置を示している。これらの図に示されるように、これらのがんのそれぞれにおいて、TP53におけるAID、APOBEC3G、および/またはWAモチーフでの突然変異に対するコドンバイアスパターンが観察されており、TP53突然変異を有する広範ながんは、AID/APOBECデアミナーゼ活性と関連している統計的に極めて高い可能性があることを表している。
【０１４４】
実施例4
PIK3CAおよびTET2における、AIDまたはAPOBEC3Gに起因する体細胞突然変異についての解析
乳癌組織サンプル由来のPIK3CAにおいて、ならびに造血系およびリンパ系組織サンプル由来のTET2において観察された、AID、APOBEC3G、およびWAモチーフにおける体細胞突然変異の頻度およびコドン文脈を、COSMICデータベースを供給源とする種々の患者コホートに対する集約サンプルデータを用いて解析した。図12および13に示されるように、AID、APOBEC3G、およびWAモチーフにおける体細胞突然変異の頻度およびコドン文脈は、AIDおよびAPOBEC3Gがこれらの組織において活性を有し、かつ相当数の観察された体細胞突然変異の推定原因であることを表した。
【０１４５】
実施例5
腺様嚢胞癌を有する対象からのサンプル由来の全エクソームについての解析
上記で記載される診断基準を用いて、AIDおよび/またはAPOBEC3Gが、患者の腺様嚢胞癌（ACC）組織由来の細胞における標的体細胞突然変異生成に関与している可能性を評価した。23個の治療前原発性ACC標本および1個の局所−所属リンパ節転移、ならびに対応する整合する正常唾液腺実質サンプルに対して全エクソームシークエンシングを実施した研究（Stephens et al. (2013) J Clin Invest.123 (7):2965-2968）から、配列データを得た。エクソームシークエンシングにより、他の固形腫瘍と比較して相対的に少ない、1エクソームあたり13個の突然変異という平均を有する312個の突然変異が同定された。上記で記載されるように体細胞突然変異を解析して、GYW/WRC部位（AID）、CG/CG部位（APOBEC3G）、およびWA部位における突然変異の頻度およびコドン位置を判定した。
【０１４６】
図14は、2人の患者サンプル：PD3185aおよびPD3181aで見出された突然変異についての代表的な解析を示している。診断基準を適用することにより、標的体細胞突然変異がPD3185aサンプル由来の核酸において生じたこと、ならびにAIDおよびAPOBEC3Gの両方が、このサンプル由来の細胞において活性を有しかつ標的体細胞突然変異生成の原因である可能性があることが観察された。対照的に、最多数の体細胞突然変異を有したサンプル（PD3181a）では、標的体細胞突然変異の証拠は観察されず、AIDまたはAPOBEC3Gのいずれかが、このサンプルの核酸に存在している体細胞突然変異に関わっているという兆候はなかった。
【０１４７】
全体として、検査されたACCサンプルの24個のうち9個のみが、AIDおよび/またはAPOBEC3G活性により生じる標的体細胞突然変異生成に対して陽性であることが見出された（表4）。突然変異の数と標的体細胞突然変異生成との間に、またはMYB活性化スコアの間に相関はなかった。このMYB活性化スコアは、特定のサンプルがMYB-NFIB遺伝子の融合を有するか否かを表すために導き出された（Stephens et al. (2013) J Clin Invest.123(7):2965-2968）。
【０１４８】
（表４）
2018108105.tif 000007
【０１４９】
実施例6
前立腺癌腫を有する対象からのサンプル由来の全エクソームについての解析
4個の前立腺癌腫サンプルからのエクソーム全域突然変異データを、COSMICデータベース（Wellcome Trust Sanger Institute；http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/）から獲得し、かつ上記で記載されるように解析して、サンプル中の核酸が、AIDおよび/またはAPOBEC3G活性により生じる標的体細胞突然変異を含有しているかどうかを判定した。サンプルのうちの2個は、転移性去勢抵抗性前立腺癌（CRPC）を有する剖検患者からのものであり、他の2個のサンプルは、それぞれpT2cおよびpT3aステージの前立腺癌を有する患者からのものであった。
【０１５０】
表5にまとめられているように、サンプルのうちの3個は、AIDおよび/またはAPOBEC3G活性により生じる標的体細胞突然変異に対して陽性であることが見出された。興味深いことに、低PSAサンプルを有する対象において標的体細胞突然変異が観察されており、このタイプの解析は、PSAレベルが上がり始める前の前立腺癌腫の早期検出に用いられ得ることを表している。
【０１５１】
図15は、4人の患者サンプルで見出された突然変異についての個々の解析を示している。AIDおよび/またはAPOBEC3G活性の兆候に加えて、PR-09-3421サンプルにおける多数のMC-1部位でのG＞T突然変異、およびMC-3部位でのC＞T突然変異、ならびにPR-2762サンプルにおける多数のG＞A突然変異およびC＞T突然変異は、他のAPOBECデアミナーゼがこれらの患者において活性を有し得ることを示唆している。
【０１５２】
（表５）
2018108105.tif 000008
【０１５３】
実施例7
アフラトキシンモチーフの同定
TP53におけるコドン249の第3の箇所におけるG＞T塩基転換は、アスペルギルス（Aspergillus）属由来の外因性突然変異誘発物質であるアフラトキシンと関連付けられ、かつ診断マーカーとして用いられている。図5に示されるように、肝細胞癌（HCC）サンプル由来のTP53遺伝子において、GGモチーフと合わせたMC-3部位に極めて多数のG＞T突然変異が存在する。これをさらに検討するために、COSMICデータベースからの全エクソームサンプル（HCC53T）を、G＞T突然変異について解析した。全エクソームにおいて、MC-3部位に9個のG＞T突然変異が存在し、それぞれはGGモチーフと同時に発生していることが観察された。このことは、アフラトキシンが、GGモチーフのMC-3部位においてG＞T突然変異を引き起こすことを示唆している。
【０１５４】
実施例8
APOBEC3Hの活性を予測する診断ルールの開発
APOBEC3Hは、GAモチーフを標的とすると考えられている。このモチーフにおける突然変異のコドン文脈をさらに解析するために、膀胱癌腫を有する対象からの組織由来の全エクソーム（COSMICデータベースから得られた配列）を解析した。図16に示されるように、MC-1部位におけるG＞A突然変異の優勢性が存在しており、APOBEC3Hは、GがMC-3部位にある場合にGAモチーフにおけるGに対する突然変異を優先的に標的とし、G＞A突然変異をもたらすことを表している。
【０１５５】
実施例9
APOBEC3Hの活性を予測する診断ルールの開発
APOBEC3Gは、CG/CGモチーフに加えてCCモチーフを標的とすると示唆されている。CCモチーフにおける突然変異のコドン文脈をさらに解析するために、治療前の膀胱癌腫を有する8人の対象からの組織由来の全エクソーム（COSMICデータベースから得られた配列）を解析した。8人の対象（B2、B5、B8〜10、B13、B15、およびB20）由来の全エクソームの配列をプールデータとして解析し（図17A）、かつ1人の対象（B13）由来の全エクソームの配列を独立して解析した（図17A）。図17AおよびBに示されるように、MC-1部位におけるC＞T突然変異の統計的に有意な優勢性が存在しており、APOBEC3Gは、標的CがMC-1部位にある場合にCCモチーフにおけるCに対する突然変異を優先的に標的とし、C＞T突然変異をもたらすことを表している。
【０１５６】
本明細書において引用されるあらゆる特許、特許出願、および刊行物の開示内容は、参照によりその全体として本明細書によって本明細書に組み入れられる。
【０１５７】
本明細書における任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が、本出願に対する「先行技術」として利用可能であるという承認として解釈されるべきではない。
【０１５８】
本明細書を通して、目的は、本発明を任意の一態様または性質の特異的収集物に限定することではなく、本発明の好ましい態様を記載することである。したがって、当業者であれば、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく、例示された特定の態様において様々な修正および変化がなされ得ることを解するであろう。すべてのそのような修正および変化は、添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図される。
【図１】
2018108105.tif 000009
【図２】
2018108105.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2018108105.tif 000021
【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
2018108105.tif 000024
【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月2日(2018.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子の配列を解析して、アフラトキシン、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）、およびアポリポタンパク質B mRNA編集酵素触媒ポリペプチド様（APOBEC）シチジンデアミナーゼの中から選択される突然変異誘発物質によって認識されるまたは標的とされる1種または複数種のモチーフにおける突然変異タイプの複数の突然変異について該複数の突然変異のコドン文脈を判定し、それによって該核酸分子中の複数の突然変異コドンの各々について突然変異の位置および突然変異タイプを同定する工程であって、対応する突然変異コドンの3箇所のうちどの箇所で個々の突然変異が生じるかを判定することによって個々の突然変異のコドン文脈が判定される、工程を含み、
予想されるよりも高いパーセンテージまたは数の、突然変異タイプの突然変異が複数の突然変異コドン内の3箇所のうち1箇所に存在する場合に、標的体細胞突然変異生成が生じている可能性があることを示す、該突然変異誘発物質による核酸分子の標的体細胞突然変異生成が生じている可能性を検査するための方法。
【請求項２】
突然変異の予想されるパーセンテージまたは数が、コドン文脈とは無関係に突然変異が生じると仮定することによって算出される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
突然変異の予想されるパーセンテージが、約11％または17％であるか、またはおよそ、9個の突然変異毎に1個または6個の突然変異毎に1個である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
突然変異のパーセンテージが少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％、またはそれを上回ることが観察される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
APOBECシチジンデアミナーゼが、APOBEC1、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G、およびAPOBEC3Hの中より選択される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、GYWモチーフにおける観察されたGからAへの突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、WRCモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、CGモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、CGモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、CAモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、GAモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、TGモチーフにおける観察されたG＞A突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-3部位で、GGモチーフにおける観察されたG＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；
核酸分子の非転写鎖のMC-1部位で、CCモチーフにおける観察されたC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合；または
核酸分子の非転写鎖のMC-2部位で、WAモチーフにおける観察されたA＞G突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合に、
標的体細胞突然変異生成が生じている可能性が高いと判定される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
核酸分子の非転写鎖において観察される、MC-2部位でのGYWモチーフにおけるG＞A突然変異、MC-2部位でのWAモチーフにおけるA＞G突然変異、および/もしくはMC-1部位でのWRCモチーフにおけるC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合、突然変異誘発物質がAIDであり；
核酸分子の非転写鎖において観察される、MC-2部位でのCGモチーフにおけるG＞A突然変異、MC-1部位でのCGモチーフにおけるC＞T突然変異、もしくはMC-1部位でのCCモチーフにおけるC＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合、突然変異誘発物質がAPOBEC3Gであり；
核酸分子の非転写鎖において観察される、MC-1部位でのCAモチーフにおけるC＞T突然変異もしくはMC-2部位でのTGモチーフにおけるG＞A突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合、突然変異誘発物質がAPOBEC1であり；
核酸分子の非転写鎖において観察される、MC-1部位でのGAモチーフにおけるG＞A突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合、突然変異誘発物質がAPOBEC3Hであり；または
核酸分子の非転写鎖において観察される、MC-3部位でのGGモチーフにおける観察されたG＞T突然変異の数もしくはパーセンテージが予想されるよりも高い場合、突然変異誘発物質がアフラトキシンである、
請求項6記載の方法。
【請求項８】
核酸分子をまず単離する工程を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
核酸分子のすべてまたは一部をシークエンシングする工程を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
核酸分子が、単一遺伝子または単一遺伝子のcDNAのすべてまたは一部を含むか、あるいは2種もしくはそれを上回る種類の遺伝子または2種もしくはそれを上回る種類の遺伝子のcDNAのすべてまたは一部を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
細胞の全エクソームまたは全ゲノムを構成する核酸分子が解析される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
すべてまたは一部が処理システムによって実施される、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。