(57)【要約】【課題】ピンチドフローフラクショネーション（ＰＦＦ）において、狭窄流路の壁面へ粒子を精度よく整列させるための要素は、サンプル液流量、シース液流量、狭窄流路の幅とその長さ、拡大流路の幅、狭窄流路と拡大流路の幅の比、各流路の高さなど複数あり、これらが互いに複雑に関連し合っている。従ってその条件の最適化には時間を要するため、より単純な方法で精度よく粒子を分離できる粒子分離装置、及びその方法を提供が求められている。【解決手段】流路材質の硬さを大きくすることで、一般に想定される流れる粒子の位置の正確さを上げるのではなく、流れる粒子位置の精度を上げ、前記課題を解決する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１の末端に流体導入口を備える２以上の分岐流路、及び当該分岐流路が合流して形成される流路を含み、少なくとも１の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含有する流体を導入される、粒子分離装置であって、
（１）合流して形成される流路の末端側の拡大開始点より下流側が拡大し、拡大された流路の末端に少なくとも１の回収口が備えられ、
（２）分岐流路の合流点から拡大開始点までの流路の壁が、外側方向に膨張しにくい素材で構成されることを特徴とする、前記粒子分離装置。
【請求項２】
前記素材が、デュロメータ硬さ４０以上であることを特徴とする、請求項１に記載の粒子分離装置。
【請求項３】
分離対象の粒子を含有する流体の流量が、他の流体の流量よりも小さいことを特徴とする、請求項１又は２に記載の粒子分離装置。
【請求項４】
分離対象の粒子を含有する流体と、他の分岐流路に導入された流体とが合流して形成される流路において層流を形成することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の粒子分離装置。
【請求項５】
１の末端に流体導入口を備える２以上の分岐流路、及び当該分岐流路が合流して形成される流路であって、
（１）合流して形成される流路の末端側の拡大開始点より下流側が拡大し、拡大された流路の末端に少なくとも１の回収口を備えられ、
（２）分岐流路の合流点から拡大開始点までの流路の壁が、外側方向に膨張しにくい素材で構成されている
ことを特徴とする流路を用いて粒子を分離する方法であって、
分離対象の粒子を含有する流体を少なくとも１の分岐流路の流体導入口から導入する工程、
分離対象の粒子を含まない流体を少なくとも１の分岐流路の流体導入口から導入する工程、
少なくとも１の回収口から、粒子を分離、または回収する工程
を含む、前記方法。
【請求項６】
前記素材が、デュロメータ硬さ４０以上であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
分離対象の粒子を含有する流体の流量が、他の流体の流量よりも小さいことを特徴とする、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
分離対象の粒子を含有する流体と、他の分岐流路に導入された流体とが、合流して形成される流路において層流を形成することを特徴とする、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
分離対象の粒子を含有する流体を少なくとも１の分岐流路の流体導入口から導入する工程の前に、予め当該粒子を含んでいない点でのみ異なる流体を導入することで、層流を形成させておくことを特徴とする、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流体中に含まれる粒子の分離装置及び前記装置を用いた流体中に含まれる粒子を操作する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
無機物、有機物、金属などから構成された固形物を様々な産業分野に材料として適用する場合、例えば１次原料としては粉末での供給、また粉末を球状粒子に成形するか、他の形状に成形して製品として供給されている。これらの素材（固形物）は最終製品の性能を向上させるべく物性等を吟味して設計されている。また、最終製品として球状粒子が適用される例も数多く存在し、例えば粉砕用ボール（アルミナ、ジルコニア、シリカ等）、液晶用スペーサー（樹脂、シリカ等）、クロマトグラフィー用分離材、その他吸着剤などが挙げられる。このような粒子製品は一般的に形状、サイズ、密度が均一なものが最終形態としての製品の特徴に大きく影響し、より均一な粒子が求められているのが現状である。
【０００３】
このような粒子の製造法としては、最初から均一な粒子を製造する技術を開発する方法と、均一ではない分布がある粒子から必要なサイズ、密度、形状のものを取り出す方法の２つが存在する。前者は比較的に新しい技術であり製造設備の更新が必要であるが、後者については現行設備に追加することが可能なため比較的容易に製造プロセスに取り込まれやすい。後者の技術として数十μｍ以上の粒子であれば、例えばフィルター分離法（篩分級も含む）、重力分級法、遠心分離法、サイクロン分離法、などが存在する。
【０００４】
上記に挙げた分離、または分級法は数十μｍ以下の粒子、特に１０μｍ以下の粒子分離は極めて難しいこと、また一般的にはバッチ式のプロセスであり連続的に分離することが困難であった。バッチ式のプロセスでは分離収率により１回の処理量が決まるため比較的に大きな設備（元原料のストック容器、供給設備、不必要な製品の回収容器）が必要となる。例えば、篩分級法は大量処理に向いているが篩の目のサイズを徐々に変える必要があるため、バッチ式プロセスとなる。重力分級法も、基本的には篩分級法と同様バッチプロセスであり、粒子サイズが小さくなるにつれ処理するのに膨大な時間がかかる。遠心分離法やサイクロン分離法は高速処理に適するものの、大型装置が必要であり、連続プロセスには不向きである。
【０００５】
しかし、連続的に分級ができれば元原料の仕込み量及び製造量を極限まで小さくすることが可能である。また、医療関係においても抗原抗体反応を用い検査する際に粒子に吸着した蛍光物質と反応していない成分を分離するためにＢ／Ｆ分離と呼ばれる工程が存在し、このような微少量の検体検査にも粒子分離が利用されている。しかしここで用いられている粒子分離の多くが磁性粒子を用いて磁石による粒子分離と洗浄を行うため、本工程分の時間がかかる課題が存在している。
【０００６】
また、更に微細な粒子（ＤＮＡ、ワクチン等）を分離する技術としてはブラウニアラチェットという微細加工した鈎状の突起を規則的にならべ粒子のブラウン振動を使って主流となる流動軌跡から目的のサイズのＤＮＡあるいはワクチンを分流（分離）するという技術も存在する（非特許文献１）。ただしこの方法は、分離モードとしてブラウン振動による分流形成であるため、分離速度が遅く、主となる流動形成は電気泳動という形態で実施されており、分離に時間がかかること、特に径１μｍ以上の粒子に対しては分離に長大な時間を要し、その間の乱れの影響を受けることなどにより、実用に耐えないことが課題として存在した。
【０００７】
また細胞を大きさに基づいて分離又は分級する方法としては、ＦＡＣＳを用いて前方散乱光を測定することにより細胞の大きさを測定し分離する方法が知られている。ＦＡＣＳは大量の微粒子や細胞から大まかに目的物を分離することが可能であるが、細胞の形状や屈折率の影響のため少量を正確に分離することは困難であり、また衝撃に弱い目的物は分離時に破壊される可能性がある。
【０００８】
様々な大きさを有する粒子の中から特定の大きさの粒子を分離する技術及び装置が存在しており、例えば篩分級法、重力分級法、遠心分離法、電気泳動法などが挙げられるが、それぞれバッチ式処理には適しているものの、連続的な分離処理には不向きであった。
【０００９】
一方近年、微細加工技術を用いて作製された、幅が数ミクロン〜数百ミクロンの微小な流路構造（マイクロ流路）を用いることで、微粒子や細胞を正確に分離する研究が報告されている（非特許文献２乃至４）。一般的にマイクロ流路内では安定な層流が形成され、その流れのプロファイルをマイクロメートルオーダーで任意に制御できるため、そのような特徴を利用することで微粒子や細胞を正確に、かつ連続的に分離できる。
【００１０】
例えば特許文献１に、大きさによって正確かつ連続的に細胞・微粒子を分離するピンチドフローフラクショネーション（Ｐｉｎｃｈｅｄ  Ｆｌｏｗ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）（以下ＰＦＦと記載）という手法が報告されている。この手法の利点としては、前記ＦＡＣＳで必要となる光学系・情報処理系などの複雑な機器・装置を必要とせず、連続的な微粒子、細胞分離を容易に可能とする点、一つの要因を利用した分離ではあるものの複数のフラクションへの分離が可能である、つまり、たとえば大きさで分離する場合、大きいものと小さいものという２段階だけではなく、大きさによる３グループ以上の集団へと分離することができる点、さらに、流路の並列化などを行うことで、大量・高速な微粒子や細胞の分離が可能である点などがあげられる。
【００１１】
ＰＦＦでは、径が部分的に細くなっている流路（以下狭窄流路と記載）に複数の分岐から流体を導入し、流れに垂直な方向における粒子の位置を制御し、その後相対的に径が太い流路（以下拡大流路と記載）に粒子が流れる際、狭窄流路内における粒子の位置によって流れが粒子に与える力の方向が異なることに着目してなされたものであり、連続的にかつ精密に分離が可能な技術である。ＰＦＦでは、特許文献１に記載のように、２つのインレットを持つ構造を用いることができ、例えば一方のインレットから目的の粒子を含む液、他方のインレットから目的の粒子を含まない液を流すことで実施することができる。
【００１２】
ＰＦＦにおいて、より精度よく分離するためには、狭窄流路の壁面へ粒子を整列させることが重要であり、そのためには粒子を含む液（以下サンプル液と記載）の送液流量が、粒子を含まない液（以下シース液と記載）の送液流量に対して小さいこと、またその比、狭窄流路の幅とその長さ、拡大流路の幅、狭窄流路と拡大流路の幅の比、各流路の高さを調整することが重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００５−２０５３８７号公報
【特許文献２】特許第２８４５６２０号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，９６，２３，１３１６５−１３１６９，１９９９．
【非特許文献２】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７６，５４６５-５４７１，２００４．
【非特許文献３】Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ，５，１２３３-１２３９，２００５．
【非特許文献４】Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ，６，９７４-９８０，２００６．
【非特許文献５】Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ，５，７７８-７８４，２００５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、狭窄流路の壁面へ粒子を精度よく整列させるための要素は、サンプル液流量、シース液流量、狭窄流路の幅とその長さ、拡大流路の幅、狭窄流路と拡大流路の幅の比、各流路の高さなど複数あり、これらが互いに複雑に関連し合っているため、その条件の最適化には時間を要する。
【００１６】
本発明の課題は、より単純な方法でＰＦＦにおいてより精度よく粒子を分離できる粒子分離装置、及びその方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは上記課題を鑑み、検討したところ、流路の材質を硬くすることで、流路壁の外方向への膨張を抑制することができ、それにより一般に想定される流れる粒子の位置の正確さ（Accuracy）を上げるのではなく、流れる粒子位置の精度(Precision)が上がることを見出した。この発見に基づき、ＰＦＦにおいてより精度よく粒子を分離できる粒子分離装置、及びその方法の発明に至った。なお、ここで「正確さ」とは拡大領域壁面からの粒子位置の理論値と測定値の間の乖離の度合いを示し、「精度」とは拡大領域壁面からの粒子位置が、複数回測定した際にどれだけ再現性があるかを示す。
【００１８】
ここで、本明細書における硬さとは、デュロメータ硬さ（タイプＡデュロメータ使用）を指し、一定荷重を加えた際の物質の変形量で定義され、硬さが大きいほどその変形量は小さい。
【００１９】
ＰＦＦでは、粒子が狭窄流路壁面へ整列される送液条件において、拡大流路内の粒子位置はその粒子径と狭窄流路幅、拡大流路幅から予測することができる。しかしながら一般に流体が流れるマイクロ流路内壁面は、常に流体のせん断力にさらされるため、送液中はマイクロ流路が拡大する方向に力が加えられている。したがって拡大流路内の粒子位置の予測には、送液による各流路の膨張を加味する必要がある。
【００２０】
ポリジメチルシロキサン（以下ＰＤＭＳと記載）を含む、弾性のあるシリコーン樹脂で作製された流路の場合、送液による各流路の膨張、特に狭窄流路の幅に影響を受けやすいことが予想されるため、膨張しにくい材を用いること、すなわちより硬さの大きい樹脂へ変えることで、拡大流路内の位置をより正確に予測することが可能となるといえる。なお深さ方向については特に限定はなく膨張する材であってもよい。ここで言う狭窄流路の幅とは、狭窄流路の内壁１６aの壁面に対して垂直方向（以下幅方向と記載）、深さとは幅方向に対して垂直方向（以下深さ方向と記載）の流路の長さをいう。しかしながら、この手法は粒子位置の「正確さ」をあげるものであり、流した粒子全てを毎回一定の位置に流すという「精度」を上げることにはつながらないと考えられる。
【００２１】
しかしながら、本発明では流路の硬さを大きくすることで粒子が流れる位置の精度が上がることを見出した。これは、各流路の膨張を抑制することで、流路の広がりによる流速のむらを防ぐことができ、狭窄流路の壁面へ粒子を精度よく整列させられたためと考えられる。
したがって、前記観点において、本発明は以下のものに関する：
[１]  １の末端に流体導入口を備える２以上の分岐流路、及び当該分岐流路が合流して形成される流路を含み、少なくとも１の分岐流路の流体導入口から分離対象の粒子を含有する流体を導入される、粒子分離装置であって、
（１）合流して形成される流路の末端側の拡大開始点より下流側が拡大し、拡大された流路の末端に少なくとも１の回収口が備えられ、
（２）分岐流路の合流点から拡大開始点までの流路の壁が、外側方向に膨張しにくい素材で構成されることを特徴とする、前記粒子分離装置。
[２]  前記素材が、デュロメータ硬さ４０以上であることを特徴とする、項目１に記載の粒子分離装置。
[３]  分離対象の粒子を含有する流体の流量が、他の流体の流量よりも小さいことを特徴とする、項目１又は２に記載の粒子分離装置。
[４]  分離対象の粒子を含有する流体と、他の分岐流路に導入された流体とが合流して形成される流路において層流を形成することを特徴とする、項目１〜３のいずれか一項に記載の粒子分離装置。
[５]  １の末端に流体導入口を備える２以上の分岐流路、及び当該分岐流路が合流して形成される流路であって、
（１）合流して形成される流路の末端側の拡大開始点より下流側が拡大し、拡大された流路の末端に少なくとも１の回収口を備えられ、
（２）分岐流路の合流点から拡大開始点までの流路の壁が、外側方向に膨張しにくい素材で構成されている
ことを特徴とする流路を用いて粒子を分離する方法であって、
分離対象の粒子を含有する流体を少なくとも１の分岐流路の流体導入口から導入する工程、
分離対象の粒子を含まない流体を少なくとも１の分岐流路の流体導入口から導入する工程、
少なくとも１の回収口から、粒子を分離、または回収する工程
を含む、前記方法。
[６]  前記素材が、デュロメータ硬さ４０以上であることを特徴とする、項目５に記載の方法。
[７]  分離対象の粒子を含有する流体の流量が、他の流体の流量よりも小さいことを特徴とする、項目５又は６に記載の方法。
[８]  分離対象の粒子を含有する流体と、他の分岐流路に導入された流体とが、合流して形成される流路において層流を形成することを特徴とする、項目５〜７のいずれか一項に記載の方法。
[９]  分離対象の粒子を含有する流体を少なくとも１の分岐流路の流体導入口から導入する工程の前に、予め当該粒子を含んでいない点でのみ異なる流体を導入することで、層流を形成させておくことを特徴とする、項目５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【００２２】
前記観点の本発明により、流路の材質を変えるという単純な改良により、より精度よく目的の粒子を分離する事ができる、という優れた効果を発揮する。また流路終端を分岐することで分離した目的の粒子の回収も出来る。また本発明は、以上に述べられたように構成されているため、複雑な操作や機器を必要としない、という優れた効果を発揮する。また本発明は、以上に述べられたように構成されるため、粒子の分離および回収を連続的に行うことが可能であり、バッチ処理の分離技術と比較して、大量の微粒子や細胞を処理できる、という優れた効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明による連続粒子分級方法の実施形態を備えたマイクロチップ１０を示し、図１（ａ）は図１（ｂ）におけるＡ 矢視図であり、図１（ｂ）は図１（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図である。
【図２】本発明による連続粒子分級方法の実施形態を備えたマイクロチップ１０を示し、図２（ａ）は図２（ｂ）におけるＡ 矢視図であり、図２（ｂ）は図２（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図であり、図２（ｃ）は図２（ａ）における部分２１の拡大図である。
【図３】（ａ）硬さ７０の素材で作製したマイクロチップ１０を用いた２μｍ粒子の分離評価（実施例１）（ｂ）硬さ６０の素材で作製したマイクロチップ１０を用いた２μｍ粒子の分離評価（実施例２）（ｃ）硬さ４４の素材で作製したマイクロチップ１０を用いた２μｍ粒子の分離評価（実施例３）（ｄ）硬さ３０の素材で作製したマイクロチップ１０を用いた２μｍ粒子の分離評価（比較例１）
【図４】図２（ａ）で示したマイクロチップ１０における、２つの分岐から導入された流体の挙動と粒子の分離の様子を示す説明概略図であり、図４は、図２における部分２１の拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面を用いて詳細に説明する。但し本発明は多くの異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例の例示にのみ限定されるものでは無い。
【００２５】
まず、図４をもとに、ピンチドフローフラクショネーション（Ｐｉｎｃｈｅｄ  Ｆｌｏｗ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ：ＰＦＦ）の原理についての詳細を説明する。
【００２６】
図４は図１や図２のマイクロチップにおける流路が合流して形成される狭窄流路及び拡大流路を示している。具体的には、図２（a）における部分２１の拡大図である。また、流体１００Ｐと、斜線で示した流体１００Ｎは、それぞれ粒子を含む流体と、粒子を含まない流体であり、粒子３００ａ、３００ｂは、それぞれ相対的に大きな粒子と相対的に小さな粒子を示している。
【００２７】
また、図４において、矢印２００は、狭窄流路１６と拡大流路１７の境界における流線のプロファイルを示しており、矢印２１０ａ、２１０ｂは、それぞれ大きな粒子３００ａと小さな粒子３００ｂの運動ベクトルを示している。
【００２８】
まず、粒子を含む流体１００Ｐおよび粒子を含まない流体１００Ｎを、シリンジポンプなどを用いて２つのインレット１４ａ、１４ｂからそれぞれ連続的に供給する。この時、流路１３内では、それぞれの流体が安定な層流を保ちながら流れる。
【００２９】
そして、粒子を含む流体１００Ｐおよび粒子を含まない流体１００Ｎの流量を調節することで、狭窄流路１６における流体１００Ｐの幅（流路壁面から、流体１００Ｐと流体１００Ｎの界面までの距離）が、分離対象とする最小の粒子の粒径よりも小さくなるようにする。この操作により、分離対象とする全ての粒子は、狭窄流路の内壁１６ａに沿って流れるようになり、狭窄流路の内壁１６ａの壁面に対して垂直方向における粒子の位置を、粒子の大きさによって一定にすることができる。
【００３０】
そして狭窄流路１６と拡大流路１７の境界において、流線はプロファイル２００に示されているように広がるため、狭窄流路１６における任意の流線間の距離は、拡大流路１７においてより拡大される。
【００３１】
したがって、狭窄流路１６における流れと垂直な方向における粒子の位置は、粒子の大きさによってそれぞれ異なるため、狭窄流路１６と拡大流路１７の境界において、大きい粒子３００ａの運動ベクトル２１０ａと小さい粒子３００ｂの運動ベクトル２１０ｂの方向に差が生じ、つづく拡大流路１７において、粒子の大きさごとの位置差が拡大され、分級が可能となる。
【００３２】
なお、分離した粒子を拡大流路１７における検出ライン２０に沿って、適当な検出系を用いて観察することで、粒子の粒径と粒子群の粒径分布を調べることが可能となる。
【００３３】
図１（ａ）（ｂ）には、本発明による連続分級方法の実施形態を備えたマイクロチップ１０が示されており、図１（ａ）は図１（ｂ）におけるＡ 矢視図であり、図１（ｂ）は図１（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図である。
【００３４】
図１におけるマイクロチップ１０は、どの地点においても断面形状が矩形であり、流路深さは均一である。断面形状は、粒子を断面において２つの要因によって分離するために、また、流路構造の作製上の容易さから、矩形であることが望ましいが、部分的に矩形以外の形状、例えば円形などを有する断面であってもよく、また、部分的に深さが異なっていてもよい。
【００３５】
このマイクロチップ１０は、粒子をその大きさにより分離し、適当な検出系を用いることにより、粒径と粒径分布を測定するためのマイクロチップであり、例えば、ＰＤＭＳなどの高分子（ポリマー）材料により形成された、２枚の平板状の基板１１と基板１２により形成された平板状の構造を有している。
【００３６】
なお、マイクロチップ１０を作製する場合に用いる技術としては、例えば、モールディングやエンボッシングといった鋳型を用いる作製技術は、流路構造を正確かつ容易に作製可能であるという点において好ましいが、その他にも、ウェットエッチング、ドライエッチング、ナノインプリンティング、レーザー加工、電子線直接描画、機械加工等の作製技術を用いることも可能である。
【００３７】
また、マイクロチップ１０を作製する場合の材質としては、流路の壁面が膨張しにくい素材で構成する必要があるが、少なくとも流路の壁面が、流路の幅方向に膨張しにくい素材で構成することが必要である。より具体的にはデュロメータ硬さ４０以上となる素材で構成されることが好ましい。使用できる素材としてはＰＤＭＳ、アクリル等の各種ポリマー材料、ガラス、シリコーン、セラミクス、ステンレスなどの各種金属、などを用いることができる。より好ましくはデュロメータ硬さ４０以上のＰＤＭＳ、アクリル樹脂等の各種ポリマー材料、ガラス、シリコーン、セラミクス、ステンレスなどを使用することができる。これらの材料のうち、任意の２種類の材料を組み合わせて用いることも可能である。ただし、流路自体を安価に作製し、ディスポーザブルな装置を提供するためには、少なくとも部分的にポリマー材料を用いることが好ましく、全体がポリマー材料で構成されることがより好ましい。そのような素材としては、デュロメータ硬さ４０以上のＰＤＭＳ、アクリル樹脂などが特に好ましい。
【００３８】
そして、基板１１の下面１１ａには、流路１３が形成されており、流路の深さは１０ｎｍから１ｃｍまでの任意の値に設定することが可能であるが、作製の容易さから、サブミクロンから数十μｍの値に設定することが好ましい。
【００３９】
流路１３は、インレット１４ａ、１４ｂおよびアウトレット１５を有し、インレット１４ａ、１４ｂは、それぞれ粒子を含む流体と粒子を含まない流体の流体導入口であり、アウトレット１５は流体の出口である。
【００４０】
また、流路１３の一方の端は、２つの分岐流路（１８ａ、１８ｂ）になっており、さらに流路１３は２つの異なる形状を持つ狭窄流路１６、拡大流路１７から構成されている。狭窄流路１６と拡大流路１７の接続部を拡大開始点ということができ、図２（ｃ）で表されるように拡大開始点において流路幅が変わる。拡大流路１７は、狭窄流路１６よりも流路幅が大きくなれば任意の形状であってよい。ここで、分岐流路１８ａ、１８ｂは、それぞれインレット１４ａ、１４ｂへ接続されており、また拡大流路１７はアウトレット１５へ接続されている。
【００４１】
なお、流路１３の全体の長さ、つまり、インレット１４ａ、１４ｂのある一方の端から、アウトレット１５のあるもう一方の端までの長さは１μｍ以上の任意の値に設定することが可能であるが、流路作製の容易さと圧力損失の観点から数μｍ〜数十ｍｍ程度に設定することが好ましい。
【００４２】
また狭窄流路１６、拡大流路１７の長さは、１０ｎｍ以上の任意の値に設定することが可能であるが、流路作製の容易さと圧力損失の観点からサブミクロン〜数十ｍｍ程度に設定することが好ましい。また、粒子の整列を達成する観点から、狭窄流路１６の長さの下限が１μｍ以上であることが好ましく、１０μｍ以上がさらに好ましく、狭窄流路１６の長さの上限が５００μｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以下がさらに好ましい。
【００４３】
狭窄流路１６の幅は、狭窄流路の内壁１６aの壁面に対して垂直方向の流路の長さをいう。狭窄流路１６の幅は、拡大流路１７の幅未満であるという条件を満たす限り、１０ｎｍ以上の任意の値に設定することが可能である。また、粒子の整列を達成する観点から、狭窄流路１６の幅の下限が１μｍ以上であることが好ましく、１０μｍ以上がさらに好ましく、幅の上限が１００μｍ以下であることが好ましく、２０μｍ以下がさらに好ましい。
【００４４】
なお、拡大流路１７の出口ポート１５は複数設けてもよく、「非対称ピンチドフローフラクショネーション（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｐｉｎｃｈｅｄ  Ｆｌｏｗ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ（ＡｓＰＦＦ））」（非特許文献５）の原理に基づいて、一部の出口ポートに多量の流体を流すことで分離能を向上させることもできる。より具体的には、流路の抵抗値を適切に設計し、また、狭窄流路１６の流路幅および粒子径の関係から、ある特定のサイズの粒子を、特定の出口ポートにのみ導入できる、という原理である。
【００４５】
なお、複数のアウトレットを有する連続粒子分離装置及びその方法の場合、流路ネットワーク全体を抵抗回路のアナロジーとしてみなし、適切な設計を行うことで、任意の流量分配比を達成することができるため、そのような考えに基づいた設計を行うことが望ましい。
【００４６】
そして、流路内部におけるこれらの流量条件を達成するための導入量の調節方法として、導入口からシリンジポンプ等を用いて溶液を導入することが操作上簡便であり好ましいが、ペリスタポンプ等の他のポンプを用いる手法、ボンベ、圧力装置等を用いた定圧送液方法、電気浸透流や遠心力等を用いた送液方法などを用いることも可能である。また、アウトレットから陰圧を付す圧力装置を用いることもできる。なお、送液圧力は安定して送液が可能な範囲であることが望ましく、流路や送液ポンプ自体の耐久性の観点から２０ＭＰａ以下であることが好ましい。
【００４７】
なお、粒子の安定的かつ効率的な分離を達成するためには、流路内で安定な層流が保たれることが好ましく、具体的には、レイノルズ数が１０００以下になる条件下で送液操作を行うことが好ましい。ただし、直径１ｍｍ以下の流路構造を用いる場合、乱流を形成することは比較的困難であり、そのような条件を達成することは容易である。
【００４８】
また分岐流路１８ａ、１８ｂの幅は、１００μｍのものを用いたが、これらの値はそれぞれ１０ｎｍ以上の任意の値に設定することが可能である。
【００４９】
分離を行う粒子としては、直径２μｍの蛍光ポリスチレン−ジビニルベンゼンビーズを用いたが、目的に応じて、ポリスチレン等のポリマー粒子、金属微粒子、セラミックス粒子、またはそれらの表面に物理的あるいは化学的な処理を施した粒子を用いることができる他、動植物細胞、細菌、バクテリア、ウイルスやそれらの構成要素であるオルガネラ等の生物粒子、タンパク質、タンパク質の凝集体等を用いることができる。分級対象とする粒子の最大直径は流路１３における狭窄流路１６の幅以下であれば、任意の大きさの粒子を分離することができる。例えば、狭窄流路１６の幅が２０μｍである流路を用いる場合、分離される粒子の直径は、０．１μｍ〜２０μｍであり、１μｍ〜１０μｍがさらに好ましい。
【００５０】
粒子を懸濁させた流体としては、０．５ｗｔ％ツイーン８０水溶液を用いたが、任意の液体または気体を用いることができ、目的に応じて様々な溶液を用いることができる。例えば粒子としてポリマー粒子や金属粒子を用いる場合には、各種化学物質を含む水溶液の他、有機溶液、イオン性流体等を用いることができる。さらに、粒子として細胞等の生物粒子を用いる場合には、細胞培養液や緩衝液などの細胞と等張の水溶液を用いるのが好ましい。ただし、たとえばバクテリアや植物細胞のような比較的低張あるいは高張溶液に対し耐性をもつ細胞の場合には、必ずしも等張である必要はない。また、操作の都合上、溶液の密度と粒子の密度の差が大きくない系がより好ましい。サンプル液、シース液の粘度に関しては、これらの粘度における差が小さい系がより好ましいが、粒子の処理を可能とするシステムであれば、粘度に差があっても構わない。
【００５１】
なお、粒子を含む流体と粒子を含まない流体は、どちらも同じ流体から構成されていてもよく、また、それぞれ２種類以上の異なる流体から構成されていても良い。
【００５２】
流路１３内に導入された粒子は、流れに乗って下流方向に移動するが、この時、２つのインレット１４ａ、１４ｂから導入された流体の流量を適切に調節することで、流路１３における狭窄流路１６において、狭窄流路の内壁１６aの壁面に対して垂直方向における粒子の位置を粒子の大きさによって制御することができる。ここで、狭窄流路の壁面へサンプル液中の粒子を整列させるためには、サンプル液に対するシース液の流量の比は、１以上であることが好ましいが、１０以上がより好ましく、５０以上が最も好ましい。なお、サンプル液とシース液の流量の和は、送液圧力が大きくなり過ぎないよう設定することが好ましく、サンプル液とシース液の流量の和が１０ｍＬ／ｈｏｕｒ以下であることが好ましく、１．０２ｍＬ／ｈｏｕｒであることが最も好ましい。
【００５３】
以上の構成において、本発明は狭窄流路１６の幅が膨張しにくいことを特徴とする。深さ方向については膨張する素材で構成されていてもよい。流路を作製する上で流路の幅方向、深さ方向の膨張の程度を変えることは煩雑であるため、上記したマイクロチップ１０を、硬さ３０、４４、６０、７０のＰＤＭＳにより作製したが、硬さは任意の値に設定することが可能で、好ましくは硬さ４０以上、より好ましくは硬さ７０以上のものが用いられる。ここで、前述の通り、本明細書の硬さとはデュロメータ硬さ（タイプＡデュロメータ使用）を指し、一定荷重を加えた際の物質の変形量で定義され、硬さが大きいほどその変形量は小さい。
【００５４】
硬さ試験はＪＩＳ  Ｋ  ６２４９の標準規格に則ってＪＩＳ  Ｋ  ６２５３ の ５（デュロメータ硬さ試験）で評価される。試験は、タイプＡデュロメータ硬さ試験機を押込み深さ０．０００〜２．５００ｍｍの測定範囲をもつ長さ測定器と変位装置とから成り立っている押込み深さ測定装置に装着し、長さ測定系には、マイクロメータを用いるのが望ましい。長さ測定器（マイクロメータのスピンドル先端）が押針と垂直同軸上で接触するように固定し、スピンドルを移動させて押針に変位を与える。硬さ試験機の押針を１００から０まで、各表示に従って変位させるか、又は既知の押込み深さ値に対する硬さ試験機の指示値を検証する。押込み深さの検証は、指示値１００及び０を含む少なくとも４か所で実施することが好ましい。
【００５５】
また、本発明は上記ＰＦＦに関する改良だけでなく、他の分離方式への応用も可能であり、例としてキャピラリーを用いたＣａｐｉｌｌａｒｙ  ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ（以下ＣＨＤＦと記載）への応用について、以下にその詳細について記載する。
【００５６】
ＣＨＤＦは特許文献２に記載のように、キャピラリー内での流体力学を利用しミクロン以下のサイズの粒子を分離する手法であり、ＤｉＭａｒｚｉｏおよびＧｕｔｔｍａｎ（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ７  ２６７（１９６９））により次の２つの要因に依ることが示されている。すなわち、（１）大きな粒子は、小さな粒子ほどにはキャピラリー壁に接近することができないため、大きな粒子はキャピラリー半径方向の中心付近に小さな粒子は断面の外側に偏在すること。（２）キャピラリー管を通過する流体により生じる半径方向の速度特性により、粒子がそれぞれ異なった速度で移動可能であることである。そのため、大きな粒子は概して溶離剤の平均速度より速い速度で移動し、より速い速度の流体流線の見本となる。
【００５７】
しかしここで、小さな粒子の分画が大きな粒子の分画部分まで広がり大きな粒子との分画に問題が見られることがある。このとき、（１）粒子を含む液に対して、粒子を含まない液でキャピラリー壁面へ流体的に押しつけることにより、キャピラリー半径方向に粒子を整列させる工程をキャピラリー分離法の上流に追加し、大きい粒子と小さい粒子をそれぞれ偏在させ（２）下流のキャピラリー管内の流速分布に従って大きい粒子と小さい粒子を分離することで、大きい粒子と小さい粒子の分画が可能になることが報告されている（特願２０１６−２３５０５６号）。
【００５８】
前記方法は、キャピラリーを用いて説明がされているが、材質はガラスやプラスチックなどの硬い材質だけでなく、ＰＤＭＳのようなシリコーン樹脂を用いても実施することができる。この時、粒子の分画には、狭窄流路の内壁１６aの壁面に対して垂直方向における粒子の位置（流れに対して垂直な方向の粒子位置）が分画性能に大きく関わるため、シリコーン樹脂性のキャピラリーの内径が膨張した場合、分離性能が低下することが懸念される。したがって、本発明が見出したように、硬さの大きい材質をキャピラリーに用いることで分離性能が向上するといえる。
【実施例】
【００５９】
実施例１
以下、添付の書類に基づいて、本発明による連続粒子分級方法の実施の形態を図２の図面に従って詳細に説明するものとする。
ＬＳＲ７０７０（Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ社製、硬さ７０）を用いてマイクロチップ１０を作製した。マイクロチップ１０は、２枚の平板状の基板１１と基板１２により形成された平板状の構造を有している。
基板１１の下面１１ａには、流路１３が形成されており、入り口側ポート１４ａ、１４ｂ、アウトレット１５（それぞれ穴の径２ｍｍ）、流路１３の全体の長さ、つまり、インレット１４ａ、１４ｂのある一方の端から、アウトレット１５のあるもう一方の端までの長さは１９ｍｍである。
流路１８から流路１７の深さはすべて２０μｍで分岐流路１８ａ、１８ｂ（幅１００μｍ、長さ８００μｍ）、狭窄流路１６（幅２０μｍ、長さ５０μｍ）、拡大流路１７（幅５００μｍ、長さ１０ｍｍ）の流路を作製した。
粒子の入っている流体１００Ｐは０．５ｗｔ％ ツイーン８０水溶液を用いて、直径２μｍの蛍光ポリスチレン−ジビニルベンゼン粒子（Ｆｌｕｏｒｏ−Ｍａｘ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１μｇ／ｍＬに希釈し用いた。粒子の入っていない流体１００Ｎは０．５ｗｔ％ツイーン８０水溶液を用いた。
流体１００Ｐをインレット１４ａから、流体１００Ｎを１４ｂからシリンジポンプにより流量を調節してそれぞれ２０、１０００μL／ｈの流量で送液した。検出ライン２０を通過する蛍光粒子の軌跡を蛍光顕微鏡で動画に撮影し、粒子計１００個について図２（ｃ）の下側壁面からの通過座標を測定することにより分離能を評価した。計測位置である検出ライン２０は狭窄流路１６の右端（拡大開始点）から１５０μｍの位置とした。
図３（ａ）に測定結果を示したグラフを示す。横軸は検出ライン２０上の通過座標であり（Ｘμｍ）、縦軸は座標ごとのカウント数である。比較例１と比べて粒子分布が狭く、分離精度が高いことがわかる。
【００６０】
実施例２
マイクロチップ１０の作製に使用した素材をＬＳＲ７０６０（ＭＯＭＥＮＴＩＶＥ社製、硬さ６０）へ変更した点以外は実施例１と同様にして粒子の分離評価を行った。図３（ｂ）に測定結果を示したグラフを示す。比較例１と比べて粒子分布が狭く、分離精度が高いことがわかる。
【００６１】
実施例３
マイクロチップ１０の作製に使用した素材をＳＩＬＰＯＴ１８４（ＴＯＲＡＹ社製、硬さ４４）へ変更した点以外は実施例１と同様にして粒子の分離評価を行った。図３（ｃ）に測定結果を示したグラフを示す。比較例１と比べて粒子分布が狭く、分離精度が高いことがわかる。
【００６２】
比較例１
マイクロチップ１０を作製するのに使用した素材をＬＳＲ７０３０（ＭＯＭＥＮＴＩＶＥ社製、硬さ３０）へ変更した点以外は実施例１と同様にして粒子の分離評価を行った。図３（ｄ）に測定結果を示したグラフを示す。実施例１と比べて粒子分布が広く、分離精度が低いことがわかる。以上の結果を持って硬さ４０以上の素材を用いると分離精度を高めることが出来る。
【符号の説明】
【００６３】
１０    マイクロチップ
１１    基板
１１ａ    基板下面
１２    基板
１３    流路
１４ａ、１４ｂ    インレット
１５    アウトレット
１６    狭窄流路
１６ａ    狭窄流路１６の内壁
１７    拡大流路
１８ａ、１８ｂ    分岐流路
２０    検出ライン
２１    図２（ａ）の部分
１００Ｐ    粒子を含む流体
１００Ｎ    粒子を含まない流体
２００    流線のプロファイル
２１０ａ、ｂ    ベクトル
３００ａ、ｂ    粒子
【図１】
2018126736.tif 000003
【図２】
2018126736.tif 000004
【図３】
2018126736.tif 000005
【図４】
2018126736.tif 000006