(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞中でポリペプチドを組換えによって作製するための方法の提供。【解決手段】ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養する段階、および細胞または培養培地からポリペプチドを回収する段階を含み、ポリペプチドのアミノ酸残基のそれぞれは、少なくとも1つのコドンによってコードされており、同じアミノ酸残基をコードする異なるコドンは1つのグループにまとめられており、かつグループ中のコドンのそれぞれは、該グループ内での固有の使用頻度により定められ、1つのグループ中の全コドンの固有の使用頻度の合計は100％であり、かつポリペプチドをコードする核酸中のあるコドンの使用頻度は、そのグループ内でのその固有の使用頻度とほぼ同じである、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌(E. coli)細胞中でポリペプチドを組換えによって作製するための方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸を含む大腸菌(E. coli)細胞を培養する段階、および該大腸菌(E. coli)細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階を含み、
該ポリペプチドのアミノ酸残基のそれぞれは、少なくとも1つのコドンによってコードされており、同じアミノ酸残基をコードするコドンは1つのグループにまとめられており、かつグループ中のコドンのそれぞれは、該グループ内での固有の使用頻度に基づいて定められ、1つのグループ中の全コドンの固有の使用頻度の合計は100％であり、
ポリペプチドをコードする該核酸中の各コドンの総使用頻度は、そのグループ内でのその固有の使用頻度と同じであり、
ポリペプチドのN末端から開始して、該ポリペプチド中に順次的に出現する特定のアミノ酸のそれぞれについて、コード核酸の対応する位置において、該特定のアミノ酸のための各々のアミノ酸コドンモチーフ中の対応する順次的位置に存在するものと同じコドンが使用されていることを特徴とし、
アラニンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 01、02、03、04、および05より選択され、かつ/または
アルギニンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 06、および07より選択され、かつ/または
アスパラギンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 08、09、10、11、および12より選択され、かつ/または
アスパラギン酸のためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 13、および14より選択され、かつ/または
システインのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 15、16、および17より選択され、かつ/または
グルタミンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 18、19、20、および21より選択され、かつ/または
グルタミン酸のためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 22、23、および24より選択され、かつ/または
グリシンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 25、および26より選択され、かつ/または
ヒスチジンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 27、および28より選択され、かつ/または
イソロイシンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 29、および30より選択され、かつ/または
ロイシンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 31、32、および33より選択され、かつ/または
リジンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 34、35、36、および37より選択され、かつ/または
フェニルアラニンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 38、39、および40より選択され、かつ/または
プロリンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 41、42、43、44、45、および46より選択され、かつ/または
セリンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 47、および48より選択され、かつ/または
トレオニンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 49、50、および51より選択され、かつ/または
チロシンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 52、および53より選択され、かつ/または
バリンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 54、55、および56より選択されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
i)アミノ酸コドンモチーフの最終コドンの使用後、ポリペプチドにおいて特定のアミノ酸が次に出現する際、各々のアミノ酸コドンモチーフの最初の位置にあるコドンが、対応するコード核酸において再び使用され、
ii)該ポリペプチド中に順次的に出現する、さらなるこの特定のアミノ酸のそれぞれについて、該コード核酸の対応する位置において、該特定のアミノ酸のための各々のアミノ酸コドンモチーフ中の対応する位置に存在するコドンが使用される
ことを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】
アミノ酸コドンモチーフ中のコドンが、固有の使用頻度が低くなる順に並べられ、固有の使用頻度が最も低いコドンまたは固有の使用頻度が二番目に低いコドンの後には、固有の使用頻度が最も高いコドンが使用されることを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
アミノ酸コドンモチーフ中のコドンが、固有の使用頻度が低くなる順に並べられ、固有の使用頻度が最も低いコドンの後には、固有の使用頻度が最も高いコドンが使用されることを特徴とする、請求項3記載の方法。
【請求項５】
ポリペプチドが、抗体、もしくは抗体断片、または抗体融合ポリペプチドであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において報告する方法は、ポリペプチドをコードする核酸の最適化、および本明細書において報告する方法を用いて最適化された核酸によってコードされるポリペプチドの改良された発現の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Cannarozzi, G.らは、翻訳のダイナミクス(dynamics)におけるコドンの順序の役割を報告している(Cell 141 (2010) 355-367) (非特許文献1)。コドンバイアスの原因および結果は、Plotkin, J.B. and Kudla, G. (Nat. Rev. Gen. 12 (2011) 32-42) (非特許文献2)によって報告されている。Weygand-Durasevic, I.およびIbba, M.は、コドン使用の新しい役割を報告している(Science 329 (2010) 1473-1474) (非特許文献3)。タンパク質のコード配列内の重複コードは、Itzkovitz, S., et al. (Gen. Res. 20 (2010) 1582-1589) (非特許文献4)によって報告されている。
【０００３】
WO97/11086 (特許文献1)では、タンパク質の高レベル発現が報告されている。植物ポリペプチドの作製が、WO03/70957 (特許文献2)において報告されている。WO03/85114 (特許文献3)では、宿主細胞における最適なタンパク質発現のために合成核酸配列を設計するための方法。コドン対の最適化が、US5,082,767 (特許文献4)において報告されている。WO2008/000632 (特許文献5)では、改良されたポリペプチド発現を実現するための方法が報告されている。コドン最適化方法は、WO2007/142954 (特許文献6)およびUS8,128,938 (特許文献7)において報告されている。
【０００４】
Watkins, N.E.らは、DNA二重鎖中のデオキシイノシン対の最近接熱力学を報告している(Nucl. Acids Res. 33 (2005) 6258-6267) (非特許文献5)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO97/11086
【特許文献２】WO03/70957
【特許文献３】WO03/85114
【特許文献４】US5,082,767
【特許文献５】WO2008/000632
【特許文献６】WO2007/142954
【特許文献７】US8,128,938
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cannarozzi, G.ら (Cell 141 (2010) 355-367)
【非特許文献２】Plotkin, J.B. and Kudla, G. (Nat. Rev. Gen. 12 (2011) 32-42)
【非特許文献３】Weygand-Durasevic, I.およびIbba, M. (Science 329 (2010) 1473-1474)
【非特許文献４】Itzkovitz, S., et al. (Gen. Res. 20 (2010) 1582-1589)
【非特許文献５】Watkins, N.E.ら (Nucl. Acids Res. 33 (2005) 6258-6267)
【発明の概要】
【０００７】
細胞中でポリペプチドを発現させるために、本明細書において報告される特徴を有する、ポリペプチドをコードする核酸の使用が有益であることが判明している。ポリペプチドをコードする核酸は、各アミノ酸がコドングループによってコードされていることを特徴とし、その際、コドングループ中の各コドンは、細胞ゲノムにおけるこのコドンの総使用頻度に関係しているグループ内での固有の使用頻度に基づいて定められ、ポリペプチドをコードする(全)核酸におけるコドンの使用頻度は、各々のグループ内での使用頻度とほぼ同じである。
【０００８】
本明細書において報告される1つの局面は、細胞中でポリペプチドを組換えによって作製するための方法であって、ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養する段階、および細胞または培養培地からポリペプチドを回収する段階を含み、
ポリペプチドの各アミノ酸残基は、1つまたは複数の(少なくとも1つの)コドンによってコードされており、同じアミノ酸残基をコードする(異なる)コドンは1つのグループにまとめられており、グループ中の各コドンは、グループ内での固有の使用頻度に基づいて定められ、1つのグループ中の全コドンの固有の使用頻度の合計は100％であり、
ポリペプチドをコードする核酸中の各コドンの総使用頻度は、そのグループ内でのその固有の使用頻度とほぼ同じである、方法である。
【０００９】
1つの態様において、アミノ酸残基G、A、V、L、I、P、F、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、およびEは、コドングループによってそれぞれコードされており、アミノ酸残基MおよびWは単一のコドンによってコードされている。
【００１０】
1つの態様において、アミノ酸残基G、A、V、L、I、P、F、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、およびEは、少なくとも2つのコドンを含むコドングループによってそれぞれコードされており、アミノ酸残基MおよびWは単一のコドンによってコードされている。
【００１１】
1つの態様において、アミノ酸残基がちょうど1つのコドンによってコードされている場合、コドンの固有の使用頻度は100％である。
【００１２】
1つの態様において、アミノ酸残基Gは、最大で4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Aは、最大で4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Vは、最大で4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Lは、最大で6個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Iは、最大で3個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Mは、ちょうど1つのコドンによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Pは、最大で4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Fは、最大で2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Wは、ちょうど1つのコドンによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Sは、最大で6個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Tは、最大で4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Nは、最大で2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Qは、最大で2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Yは、最大で2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Cは、最大で2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Kは、最大で2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Rは、最大で6個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Hは、最大で2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Dは、最大で2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Eは、最大で2個のコドンからなるグループによってコードされている。
【００１３】
1つの態様において、アミノ酸残基Gは、1〜4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Aは、1〜4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Vは、1〜4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Lは、1〜6個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Iは、1〜3個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Mは、1つのコドンからなるグループによって、すなわち、ちょうど1つのコドンによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Pは、1〜4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Fは、1〜2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Wは、1つのコドンからなるグループによって、すなわち、ちょうど1つのコドンによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Sは、1〜6個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Tは、1〜4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Nは、1〜2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Qは、1〜2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Yは、1〜2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Cは、1〜2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Kは、1〜2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Rは、1〜6個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Hは、1〜2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Dは、1〜2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Eは、1〜2個のコドンからなるグループによってコードされている。
【００１４】
1つの態様において、各グループは、細胞ゲノム内での総使用頻度が5％より多いコドンのみを含む。1つの態様において、各グループは、細胞ゲノム内での総使用頻度が8％またはそれ以上であるコドンのみを含む。1つの態様において、各グループは、細胞ゲノム内での総使用頻度が10％またはそれ以上であるコドンのみを含む。1つの態様において、各グループは、細胞ゲノム内での総使用頻度が15％またはそれ以上であるコドンのみを含む。
【００１５】
1つの態様において、ポリペプチドをコードする核酸における、特定のアミノ酸残基に関するコドンの5'から3'への方向の配列は、各々のアミノ酸コドンモチーフにおけるコドンの配列である、すなわち、それに相当する。
【００１６】
1つの態様において、ポリペプチドのN末端から開始して、ポリペプチド中に順次的に出現する特定のアミノ酸のそれぞれについて、コード核酸は、各々の特定のアミノ酸のアミノ酸コドンモチーフ中の対応する順次的位置におけるコドンと同じであるコドンを含む。
【００１７】
1つの態様において、アミノ酸コドンモチーフにおけるあるコドンの使用頻度は、そのグループ内でのその固有の使用頻度とほぼ同じである。
【００１８】
1つの態様において、アミノ酸コドンモチーフの最終コドンに達した後、ポリペプチドにおいて特定のアミノ酸が次に出現する際、コード核酸は、アミノ酸コドンモチーフの最初の位置にあるコドンを含む。
【００１９】
1つの態様において、アミノ酸コドンモチーフ中のコドンは、アミノ酸コドンモチーフの全体にわたってランダムに分布している。
【００２０】
1つの態様において、アミノ酸コドンモチーフは、その中のコドンを並べ換えることによって獲得できる可能性があるすべてのアミノ酸コドンモチーフを含むアミノ酸コドンモチーフの群より選択され、その際、すべてのモチーフは同じ数のコドンを有し、各モチーフ中のコドンは、同じ固有の使用頻度を有する。
【００２１】
1つの態様において、アミノ酸コドンモチーフ中のコドンは、固有の使用頻度が低くなる順に並べられ、ある使用頻度であるコドンはすべて、互いのすぐ次に続く。1つの態様において、あるコドン使用頻度であるコドンが、一緒にグループ分けされている。
【００２２】
1つの態様において、アミノ酸コドンモチーフ中の(異なる)コドンは、アミノ酸コドンモチーフの全体にわたって均等に分布している。
【００２３】
1つの態様において、アミノ酸コドンモチーフ中のコドンは、固有の使用頻度が低くなる順に並べられ、固有の使用頻度が最も低いコドンまたは固有の使用頻度が二番目に低いコドンの後には、固有の使用頻度が最も高いコドンが存在する(使用される)。
【００２４】
1つの態様において、アミノ酸コドンモチーフ中のコドンは、固有の使用頻度が低くなる順に並べられ、固有の使用頻度が最も低いコドンの後には、固有の使用頻度が最も高いコドンが存在する(使用される)。
【００２５】
1つの態様において、細胞は原核細胞である。
【００２６】
1つの態様において、原核細胞は大腸菌(E. coli)細胞である。
【００２７】
1つの態様において、
アラニンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 01、02、03、04、および05より選択され、かつ/または
アルギニンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 06およびSEQ ID NO: 07より選択され、かつ/または
アスパラギンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 08、09、10、11、および12より選択され、かつ/または
アスパラギン酸のためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 13およびSEQ ID NO: 14より選択され、かつ/または
システインのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 15、16、および17より選択され、かつ/または
グルタミンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 18、19、20、および21より選択され、かつ/または
グルタミン酸のためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 22、23、および24より選択され、かつ/または
グリシンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 25およびSEQ ID NO: 26より選択され、かつ/または
ヒスチジンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 27およびSEQ ID NO: 28より選択され、かつ/または
イソロイシンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 29およびSEQ ID NO: 30より選択され、かつ/または
ロイシンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 31、32、および33より選択され、かつ/または
リジンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 34、35、36、および37より選択され、かつ/または
フェニルアラニンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 38、39、および40より選択され、かつ/または
プロリンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 41、42、43、44、45、および46より選択され、かつ/または
セリンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 47およびSEQ ID NO: 48より選択され、かつ/または
トレオニンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 49、50、および51より選択され、かつ/または
チロシンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 52およびSEQ ID NO: 53より選択され、かつ/または
バリンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 54、55、および56より選択される。
【００２８】
1つの態様において、
アラニンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 03であり、
アルギニンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 07であり、
アスパラギンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 10であり、
アスパラギン酸のためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 13であり、
システインのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 17であり、
グルタミンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 20であり、
グルタミン酸のためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 23であり、
グリシンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 26であり、
ヒスチジンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 28であり、
イソロイシンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 30であり、
ロイシンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 33であり、
リジンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 36であり、
フェニルアラニンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 39であり、
プロリンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 43であり、
セリンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 48であり、
トレオニンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 51であり、
チロシンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 53であり、かつ
バリンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 56である。
【００２９】
1つの態様において、細胞は、CHO細胞、BHK細胞、HEK細胞、SP2/0細胞、またはNS0細胞より選択される真核細胞である。
【００３０】
1つの態様において、真核細胞はCHO細胞である。
【００３１】
1つの態様において、
アラニンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 64、65、66、67、および68より選択され、かつ/または
アルギニンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 69およびSEQ ID NO: 70より選択され、かつ/または
アスパラギンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 71およびSEQ ID NO: 72より選択され、かつ/または
アスパラギン酸のためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 73およびSEQ ID NO: 74より選択され、かつ/または
システインのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 75およびSEQ ID NO: 76より選択され、かつ/または
グルタミンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 77、78、79、および80より選択され、かつ/または
グルタミン酸のためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 81およびSEQ ID NO: 82より選択され、かつ/または
グリシンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 83およびSEQ ID NO: 84より選択され、かつ/または
ヒスチジンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 85およびSEQ ID NO: 86より選択され、かつ/または
イソロイシンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 87およびSEQ ID NO: 88より選択され、かつ/または
ロイシンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 89、90、および91より選択され、かつ/または
リジンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 92およびSEQ ID NO: 93より選択され、かつ/または
フェニルアラニンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 94およびSEQ ID NO: 95より選択され、かつ/または
プロリンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 96およびSEQ ID NO: 97より選択され、かつ/または
セリンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 98、99、および100より選択され、かつ/または
トレオニンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 101、102、および103より選択され、かつ/または
チロシンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 104およびSEQ ID NO: 105より選択され、かつ/または
バリンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 106、107、および108より選択される。
【００３２】
1つの態様において、
アラニンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 68であり、
アルギニンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 69であり、
アスパラギンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 72であり、
アスパラギン酸のためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 74であり、
システインのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 76であり、
グルタミンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 79であり、
グルタミン酸のためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 82であり、
グリシンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 84であり、
ヒスチジンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 86であり、
イソロイシンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 88であり、
ロイシンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 90であり、
リジンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 93であり、
フェニルアラニンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 95であり、
プロリンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 97であり、
セリンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 99であり、
トレオニンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 103であり、
チロシンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 105であり、かつ
バリンのためのアミノ酸コドンモチーフは、SEQ ID NO: 108である。
【００３３】
1つの態様において、ポリペプチドは、抗体、もしくは抗体断片、または抗体融合ポリペプチドである。
【００３４】
本明細書において報告される1つの局面は、ポリペプチドの各アミノ酸残基が1つまたは複数の(少なくとも1つの)コドンによってコードされていることを特徴とする、ポリペプチドをコードする核酸であり、
その際、同じアミノ酸残基をコードする異なるコドンは1つのグループにまとめられており、グループ中の各コドンは、グループ内での固有の使用頻度に基づいて定められ、1つのグループ中の全コドンの固有の使用頻度の合計は100％であり、
ポリペプチドをコードする核酸中のあるコドンの使用頻度は、そのグループ内でのその固有の使用頻度とほぼ同じである。
【００３５】
1つの態様において、アミノ酸残基G、A、V、L、I、P、F、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、およびEは、コドングループによってそれぞれコードされており、アミノ酸残基MおよびWは単一のコドンによってコードされている。
【００３６】
1つの態様において、アミノ酸残基G、A、V、L、I、P、F、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、およびEは、少なくとも2つのコドンを含むコドングループによってそれぞれコードされており、アミノ酸残基MおよびWは単一のコドンによってコードされている。
【００３７】
1つの態様において、アミノ酸残基がちょうど1つのコドンによってコードされている場合、コドンの固有の使用頻度は100％である。
【００３８】
1つの態様において、アミノ酸残基Gは、最大で4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Aは、最大で4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Vは、最大で4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Lは、最大で6個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Iは、最大で3個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Mは、ちょうど1つのコドンによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Pは、最大で4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Fは、最大で2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Wは、ちょうど1つのコドンによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Sは、最大で6個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Tは、最大で4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Nは、最大で2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Qは、最大で2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Yは、最大で2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Cは、最大で2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Kは、最大で2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Rは、最大で6個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Hは、最大で2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Dは、最大で2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Eは、最大で2個のコドンからなるグループによってコードされている。
【００３９】
1つの態様において、アミノ酸残基Gは、1〜4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Aは、1〜4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Vは、1〜4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Lは、1〜6個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Iは、1〜3個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Mは、1個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Pは、1〜4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Fは、1〜2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Wは、1個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Sは、1〜6個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Tは、1〜4個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Nは、1〜2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Qは、1〜2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Yは、1〜2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Cは、1〜2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Kは、1〜2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Rは、1〜6個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Hは、1〜2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Dは、1〜2個のコドンからなるグループによってコードされている。1つの態様において、アミノ酸残基Eは、1〜2個のコドンからなるグループによってコードされている。
【００４０】
1つの態様において、各グループは、細胞ゲノム内での総使用頻度が5％より多いコドンのみを含む。1つの態様において、各グループは、細胞ゲノム内での総使用頻度が8％またはそれ以上であるコドンのみを含む。1つの態様において、各グループは、細胞ゲノム内での総使用頻度が10％またはそれ以上であるコドンのみを含む。1つの態様において、各グループは、細胞ゲノム内での総使用頻度が15％またはそれ以上であるコドンのみを含む。
【００４１】
1つの態様において、ポリペプチドをコードする核酸における、特定のアミノ酸残基に関するコドンの5'から3'への方向の配列は、各々のアミノ酸コドンモチーフにおけるコドンの配列である、すなわち、それに相当する。
【００４２】
1つの態様において、ポリペプチドのN末端から開始して、ポリペプチド中に順次的に出現する特定のアミノ酸のそれぞれについて、コード核酸は、各々の特定のアミノ酸のアミノ酸コドンモチーフ中の対応する順次的位置におけるコドンと同じであるコドンを含む。
【００４３】
1つの態様において、アミノ酸コドンモチーフにおけるあるコドンの使用頻度は、そのグループ内でのその固有の使用頻度とほぼ同じである。
【００４４】
1つの態様において、アミノ酸コドンモチーフの最終コドンに達した後、ポリペプチドにおいて特定のアミノ酸が次に出現する際、コード核酸は、アミノ酸コドンモチーフの最初の位置にあるコドンを含む。
【００４５】
1つの態様において、アミノ酸コドンモチーフ中の各コドンは、アミノ酸コドンモチーフの全体にわたってランダムに分布している。
【００４６】
1つの態様において、アミノ酸コドンモチーフ中の各コドンは、アミノ酸コドンモチーフの全体にわたって均等に分布している。
【００４７】
1つの態様において、アミノ酸コドンモチーフ中のコドンは、固有の使用頻度が低くなる順に並べられ、固有の使用頻度が最も低いコドンまたは固有の使用頻度が二番目に低いコドンの後には、固有の使用頻度が最も高いコドンが使用される。
【００４８】
1つの態様において、アミノ酸コドンモチーフ中のコドンは、固有の使用頻度が低くなる順に並べられ、固有の使用頻度が最も低いコドンの後には、固有の使用頻度が最も高いコドンが使用される。
【００４９】
本明細書において報告される1つの局面は、本明細書において報告される核酸を含む細胞である。
【００５０】
本明細書において報告される1つの局面は、原核細胞または真核細胞におけるポリペプチドの発現を増大させるための方法であって、
-ポリペプチドをコードする核酸を提供する段階を含み、
その際、ポリペプチドの各アミノ酸残基は少なくとも1つのコドンによってコードされており、同じアミノ酸残基をコードする異なるコドンは1つのグループにまとめられており、グループ中の各コドンは、グループ内での固有の使用頻度に基づいて定められ、1つのグループ中の全コドンの固有の使用頻度の合計は100％であり、
ポリペプチドをコードする核酸中のあるコドンの使用頻度は、そのグループ内でのその固有の使用頻度とほぼ同じである、
方法である。
[本発明1001]
原核細胞中でポリペプチドを組換えによって作製するための方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸を含む原核細胞を培養する段階、および該原核細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階を含み、
該ポリペプチドのアミノ酸残基のそれぞれは、少なくとも1つのコドンによってコードされており、同じアミノ酸残基をコードするコドンは1つのグループにまとめられており、かつグループ中のコドンのそれぞれは、該グループ内での固有の使用頻度に基づいて定められ、1つのグループ中の全コドンの固有の使用頻度の合計は100％であり、
ポリペプチドをコードする該核酸中の各コドンの総使用頻度は、そのグループ内でのその固有の使用頻度とほぼ同じである、
方法。
[本発明1002]
前記グループが、細胞ゲノム内での総使用頻度が5％より多いコドンのみを含むことを特徴とする、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記グループが、細胞ゲノム内での総使用頻度が8％またはそれ以上であるコドンのみを含むことを特徴とする、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記グループが、細胞ゲノム内での総使用頻度が10％またはそれ以上であるコドンのみを含むことを特徴とする、本発明1001の方法。
[本発明1005]
ポリペプチドのN末端から開始して、該ポリペプチド中に順次的に出現する特定のアミノ酸のそれぞれについて、コード核酸の対応する位置において、該特定のアミノ酸のための各々のアミノ酸コドンモチーフ中の対応する順次的位置に存在するものと同じコドンが使用されていることを特徴とする、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
i)アミノ酸コドンモチーフの最終コドンの使用後、ポリペプチドにおいて特定のアミノ酸が次に出現する際、各々のアミノ酸コドンモチーフの最初の位置にあるコドンが、対応するコード核酸において再び使用され、
ii)該ポリペプチド中に順次的に出現する、さらなるこの特定のアミノ酸のそれぞれについて、該コード核酸の対応する位置において、該特定のアミノ酸のための各々のアミノ酸コドンモチーフ中の対応する位置に存在するコドンが使用される
ことを特徴とする、本発明1005の方法。
[本発明1007]
アミノ酸コドンモチーフ中のコドンが、固有の使用頻度が低くなる順に並べられ、固有の使用頻度が最も低いコドンまたは固有の使用頻度が二番目に低いコドンの後には、固有の使用頻度が最も高いコドンが使用されることを特徴とする、本発明1005〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
アミノ酸コドンモチーフ中のコドンが、固有の使用頻度が低くなる順に並べられ、固有の使用頻度が最も低いコドンの後には、固有の使用頻度が最も高いコドンが使用されることを特徴とする、本発明1007の方法。
[本発明1009]
細胞が大腸菌(E. coli)であることを特徴とする、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
アラニンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 01、02、03、04、および05より選択され、かつ/または
アルギニンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 06およびSEQ ID NO: 07より選択され、かつ/または
アスパラギンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 08、09、10、11、および12より選択され、かつ/または
アスパラギン酸のためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 13およびSEQ ID NO: 14より選択され、かつ/または
システインのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 15、16、および17より選択され、かつ/または
グルタミンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 18、19、20、および21より選択され、かつ/または
グルタミン酸のためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 22、23、および24より選択され、かつ/または
グリシンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 25およびSEQ ID NO: 26より選択され、かつ/または
ヒスチジンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 27およびSEQ ID NO: 28より選択され、かつ/または
イソロイシンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 29およびSEQ ID NO: 30より選択され、かつ/または
ロイシンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 31、32、および33より選択され、かつ/または
リジンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 34、35、36、および37より選択され、かつ/または
フェニルアラニンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 38、39、および40より選択され、かつ/または
プロリンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 41、42、43、44、45、および46より選択され、かつ/または
セリンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 47およびSEQ ID NO: 48より選択され、かつ/または
トレオニンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 49、50、および51より選択され、かつ/または
チロシンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 52およびSEQ ID NO: 53より選択され、かつ/または
バリンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 54、55、および56より選択される
ことを特徴とする、本発明1009の方法。
[本発明1011]
ポリペプチドが、抗体、もしくは抗体断片、または抗体融合ポリペプチドであることを特徴とする、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【発明を実施するための形態】
【００５２】
発明の詳細な説明
定義
本出願内で使用される「アミノ酸」という用語は、核酸によって直接または前駆体の形態でコードされ得るカルボキシα-アミノ酸の群を意味する。個々のアミノ酸は、3個のヌクレオチドからなる核酸、いわゆるコドンまたは塩基トリプレットによってコードされている。各アミノ酸は、少なくとも1つのコドンによってコードされている。同じアミノ酸が異なるコドンによってコードされていることは、「遺伝コードの縮退(degeneration)」として公知である。本出願内で使用される「アミノ酸」という用語は、天然のカルボキシα-アミノ酸を意味し、アラニン(3文字記号:ala、1文字記号:A)、アルギニン(arg、R)、アスパラギン(asn、N)、アスパラギン酸(asp、D)、システイン(cys、C)、グルタミン(gln、Q)、グルタミン酸(glu、E)、グリシン(gly、G)、ヒスチジン(his、H)、イソロイシン(ile、I)、ロイシン(leu、L)、リジン(lys、K)、メチオニン(met、M)、フェニルアラニン(phe、F)、プロリン(pro、P)、セリン(ser、S)、トレオニン(thr、T)、トリプトファン(trp、W)、チロシン(tyr、Y)、およびバリン(val、V)を含んでいる。
【００５３】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、限定されるわけではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、および所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片を含む、様々な抗体構造体を包含する。
【００５４】
「抗体断片」とは、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体部分を含む、インタクト抗体以外の分子を意味する。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子(例えばscFv)、および抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００５５】
「コドン」という用語は、所定のアミノ酸をコードしている3つのヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを意味する。遺伝コードの縮退があるため、大半のアミノ酸は複数のコドンによってコードされている。同じアミノ酸をコードするこれらの異なるコドンの相対的使用頻度は、個々の宿主細胞において異なる。したがって、ある特定のアミノ酸は、ちょうど1つのコドンによって、または異なるコドンのグループによってコードされている。同様に、あるポリペプチドのアミノ酸配列も、異なる核酸によってコードされ得る。したがって、あるポリペプチドの特定のアミノ酸(残基)は、異なるコドンのグループによってコードされてよく、これらのコドンのそれぞれは、所与の宿主細胞内で、ある使用頻度を有する。
【００５６】
多数の遺伝子配列が、頻繁に使用されるいくつかの宿主細胞において利用可能であるため、コドン使用の相対的頻度を算出することができる。算出されたコドン使用表は、例えば、「Codon Usage Database」(www.kazusa.or.jp/codon/), Nakamura, Y., et al., Nucl. Acids Res. 28 (2000) 292から入手可能である。
【００５７】
酵母、大腸菌、ヒト(homo sapiens)、およびハムスターに関するコドン使用表は、「EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite」Rice, P., et al., Trends Gen. 16 (2000) 276-277, Release 6.0.1, 15.07.2009)から複写され、以下の表に示される。64種のコドンすべてについてではなく、大腸菌、酵母、ヒト細胞、およびCHO細胞における20種の天然アミノ酸のための異なるコドン使用頻度が、各アミノ酸について算出された。
【００５８】
表:サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のコドン総使用頻度
(コードされるアミノ酸|コドン|使用頻度[％])
2018038408.tif 000002
【００５９】
表:大腸菌(Escherichia Coli)のコドン総使用頻度
(コードされるアミノ酸|コドン|使用頻度[％])
2018038408.tif 000003
【００６０】
表:ヒトのコドン総使用頻度
(コードされるアミノ酸|コドン|使用頻度[％])
2018038408.tif 000004
【００６１】
表:ハムスターのコドン総使用頻度
(コードされるアミノ酸|コドン|使用頻度[％])
2018038408.tif 000005
【００６２】
本明細書において使用される「発現」という用語は、細胞内で起こる転写プロセスおよび/または翻訳プロセスを意味する。細胞における関心対象の核酸配列の転写レベルは、細胞中に存在する対応するmRNAの量に基づいて決定され得る。例えば、関心対象の配列から転写されたmRNAは、RT-PCR(qRT-PCR)またはノーザンハイブリダイゼーションによって定量され得る(Sambrook, J., et al., 1989、前記を参照されたい)。関心対象の核酸によってコードされるポリペプチドは、様々な方法、例えばELISAによって、ポリペプチドの生物活性を分析することによって、またはそのような活性に依存しないアッセイ法、例えば、そのポリペプチドを認識し結合する免疫グロブリンを用いるウェスタンブロット法またはラジオイムノアッセイ法などを実施することによって、定量することができる(Sambrook, J., et al., 1989、前記を参照されたい)。
【００６３】
「発現カセット」とは、少なくともその含まれる核酸(at least the contained nucleic acid)を細胞において発現させるための、プロモーターおよびポリアデニル化部位などの必要な調節エレメントを含む構築物を意味する。
【００６４】
遺伝子の発現は、一過性発現または持続的発現のいずれかとして遂行される。一般に、関心対象のポリペプチドは、分泌性ポリペプチドであり、したがって、細胞壁を通過して細胞外媒体中にポリペプチドを輸送/分泌するのに必要であるN末端伸長(シグナル配列としても公知)を含む。一般に、シグナル配列は、分泌性ポリペプチドをコードする任意の遺伝子に由来してよい。異種シグナル配列が使用される場合、好ましくは、それは宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。酵母中で分泌させる場合、例えば、発現させようとする異種遺伝子の天然のシグナル配列を、分泌される遺伝子に由来する同種の酵母シグナル配列、例えば、酵母のインベルターゼシグナル配列、α因子リーダー(サッカロミセス属(Saccharomyces)、クリベロミセス属(Kluyveromyces)、ピキア属(Pichia)、およびハンゼヌラ属(Hansenula)のα因子リーダーを含む、2番目はUS5,010,182において説明されている)、酸性ホスファターゼシグナル配列、またはC.アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼシグナル配列(EP0362179)によって置換してよい。哺乳動物細胞で発現させる場合、関心対象のタンパク質の天然のシグナル配列で申し分ないが、他の哺乳動物のシグナル配列、例えば、同じ種または近縁種の分泌ポリペプチドに由来する(例えば、ヒト由来またはマウス由来の免疫グロブリンのための)シグナル配列、ならびにウイルスの分泌シグナル配列、例えば、単純ヘルペス糖タンパク質Dシグナル配列が適切である場合もある。このようなプレセグメントをコードするDNA断片は、関心対象のポリペプチドをコードするDNA断片にインフレームでライゲーションされる、すなわち機能的に連結される。
【００６５】
「細胞」または「宿主細胞」という用語は、例えば異種ポリペプチドをコードする核酸がトランスフェクトされ得る、またはトランスフェクトされる細胞を意味する。「細胞」という用語は、プラスミドの増殖を含めて核酸の発現およびコードされるポリペプチドの産生のために使用される原核細胞と、核酸の発現およびコードされるポリペプチドの産生のために使用される真核細胞との両方を含む。1つの態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。1つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞、任意で、CHO K1細胞(ATCC CCL-61もしくはDSM ACC 110)、またはCHO DG44細胞(CHO-DHFR[-]、DSM ACC 126としても公知)、またはCHO XL99細胞、CHO-T細胞(例えば、Morgan, D., et al., Biochemistry 26 (1987) 2959-2963を参照されたい)、またはCHO-S細胞、またはSuper-CHO細胞(Pak, S.C.O., et al. Cytotechnology 22 (1996) 139-146)である。これらの細胞が、無血清培地中または懸濁液中での増殖に順応していない場合、本発明の(current)方法において使用する前に順応を実施すべきである。本明細書において使用される場合、「細胞」という表現は、対象の細胞およびその子孫を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という単語は、初代対象細胞、および移し替え(transfer)の回数にも継代培養の回数にも関係なく、それに由来する培養物を含む。また、意図的な変異または偶発性の変異が原因で、あらゆる子孫のDNA内容がまったく同じではない場合があることが理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物活性を有する変異子孫は含まれる。
【００６６】
1つの態様において、真核細胞は酵母細胞である。1つの態様において、酵母細胞は、サッカロミセス属、またはピキア属もしくはハンゼヌラ属、またはクリベロミセス属、あるいはシゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)である。
【００６７】
1つの態様において、原核細胞は、エシェリキア(Escherichia)細胞、またはサルモネラ(Salmonella)細胞、あるいはバチルス(Bacillus)細胞、またはラクトコッカス(Lactococcus)細胞、もしくはストレプトコッカス(Streptococcus)細胞である。
【００６８】
1つの態様において、真核細胞は植物細胞である。1つの態様において、植物細胞は、シロイヌナズナ(Arabidopsis)属、タバコ(Tobacco)属、およびトマト(Tomato)属のものである。
【００６９】
「コドン最適化」という用語は、ポリペプチドをコードする核酸中の1つ、少なくとも1つ、または複数のコドンを、各々の細胞において異なる使用頻度を有する異なるコドンと交換することを意味する。
【００７０】
「コドン最適化された核酸」という用語は、ポリペプチドをコードする親核酸中の1つ、少なくとも1つ、または複数のコドンを、その細胞における相対的使用頻度が異なる同じアミノ酸残基をコードするコドンで置換することにより、細胞、例えば、哺乳動物細胞または細菌細胞における改良された発現に順応させられた、ポリペプチドをコードする核酸を意味する。
【００７１】
「遺伝子」とは、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の発現をもたらし得る、例えば、染色体上またはプラスミド上のセグメントである核酸を意味する。コード領域、すなわち構造遺伝子のほかに、遺伝子は、他の機能的エレメント、例えば、シグナル配列、プロモーター、イントロン、および/またはターミネーターを含む。
【００７２】
「コドングループ」という用語およびその意味上の等価物は、1種類の(すなわち、同じ)アミノ酸残基をコードする所定の数の異なるコドンを意味する。1つのグループの個々のコドンは、細胞ゲノムにおける総使用頻度が異なる。コドングループの各コドンは、グループ内での固有の使用頻度を有し、この使用頻度は、グループ中のコドンの数に応じて変わる。グループ内でのこの固有の使用頻度は、細胞ゲノムにおける総使用頻度とは異なり得るが、総使用頻度に応じて変わる(それに関係している)。コドングループは、コドンを1つだけしか含まなくてもよいが、最大で6個のコドンを含んでもよい。
【００７３】
「細胞ゲノムにおける総使用頻度」という用語は、細胞ゲノム全体における特定のコドンの出現頻度を意味する。
【００７４】
コドングループ中のコドンの「固有の使用頻度」という用語は、1つのグループの全コドンに対して、コドングループの単一の(すなわち、特定の)コドンが、本明細書において報告される方法を用いて得られるポリペプチドをコードする核酸中に存在し得る頻度を意味する。固有の使用頻度の値は、細胞ゲノムにおける特定のコドンの総使用頻度およびそのグループ中のコドンの数に応じて変わる。したがって、コドングループは、1種類の特定のアミノ酸残基をコードする可能性があるコドンすべてを必ずしも含まないため、コドングループ中のあるコドンの固有の使用頻度は、細胞ゲノムにおけるその総使用頻度と少なくとも同じであり、最大で100％である、すなわち、少なくとも同じであるが、細胞ゲノムにおける総使用頻度より多い場合がある。コドングループの全メンバーの固有のコドン使用頻度の合計は、常に約100％である。
【００７５】
「アミノ酸コドンモチーフ」という用語は、すべてが同じコドングループのメンバーである、したがって、同じアミノ酸残基をコードするコドンの配列を意味する。アミノ酸コドンモチーフ中の異なるコドンの数は、コドングループ中の異なるコドンの数と同じであるが、各コドンは、アミノ酸コドンモチーフ中に複数回存在してよい。さらに、各コドンは、その固有の使用頻度でアミノ酸コドンモチーフ中に存在する。したがって、アミノ酸コドンモチーフは、同じアミノ酸残基をコードする異なるコドンの配列を表し、異なるコドンのそれぞれは、その固有の使用頻度で存在し、配列は、固有の使用頻度が最も高いコドンで始まり、コドンは所定の順序で並んでいる。例えば、アミノ酸残基アラニンをコードするコドングループは、4種類のコドンGCG、GCT、GCA、およびGCCを、それぞれ32％、28％、24％、および16％の固有の使用頻度(4:4:3:2の比に対応)で含む。アミノ酸残基アラニンのためのアミノ酸コドンモチーフは、4種類のコドンGCG、GCT、GCA、およびGCCを4:4:3:2の比で含むものと定義され、最初のコドンはGCGである。アラニンのための1つの例示的なアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000006
である。このモチーフは、13個の連続したコドン(4+4+3+2=13)からなる。ポリペプチドのアミノ酸配列中にアミノ酸残基アラニンが最初に出現する場合、アミノ酸コドンモチーフの最初のコドンが、対応するコード核酸において使用されている。アラニンが2回目に出現する場合、アミノ酸コドンモチーフの2番目のコドンが使用されており、以下同様である。ポリペプチドのアミノ酸配列中にアラニンが13回目に出現する場合、アミノ酸コドンモチーブ(motiv)の13番目、すなわち最後の位置にあるコドンが、対応するコード核酸において使用されている。ポリペプチドのアミノ酸配列中にアミノ酸アラニンが14回目に再び出現する場合、アミノ酸コドンモチーフの最初のコドンが使用されており、以下同様である。
【００７６】
「核酸」または「核酸配列」(これらの用語は、本出願内で交換可能に使用される)とは、個々のヌクレオチド(塩基とも呼ばれる)a、c、g、およびt(またはRNAにおけるu)からなるポリマー分子、例えば、DNA、RNA、またはそれらの改変物を意味する。このポリヌクレオチド分子は、天然ポリヌクレオチド分子もしくは合成ポリヌクレオチド分子、または1つもしくは複数の天然ポリヌクレオチド分子と1つもしくは複数の合成ポリヌクレオチド分子の組合せでよい。また、1つまたは複数のヌクレオチドが(例えば変異誘発によって)変更されているか、欠失しているか、または付加されている天然ポリヌクレオチド分子も、この定義に包含される。核酸は、単離されているか、または、別の核酸中、例えば発現カセット、プラスミド、もしくは宿主細胞の染色体中に組み込まれているかのいずれかでよい。核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列によって特徴付けられる。
【００７７】
当業者にとって、例えばあるポリペプチドのアミノ酸配列を、このアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列に変換するための手順および方法は周知である。したがって、ある核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列によって特徴付けられ、同様に、それによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列によっても特徴付けられる。
【００７８】
「構造遺伝子」とは、シグナル配列のない遺伝子領域、すなわちコード領域を意味する。
【００７９】
「トランスフェクションベクター」とは、コード核酸/構造遺伝子を含むトランスフェクションベクターを宿主細胞において発現させるために必要とされるエレメントすべてを提供する核酸(核酸分子とも表される)である。トランスフェクションベクターは、例えば大腸菌のための原核生物プラスミド増殖単位を含み、すなわち、原核生物の複製起点および原核生物選択剤に対する耐性を与える核酸を含み、トランスフェクションベクターは、真核生物選択剤に対する耐性を与える1つまたは複数の核酸、および関心対象のポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸をさらに含む。好ましくは、選択剤に対する耐性を与える核酸および関心対象のポリペプチドをコードする核酸は、発現カセットの内部にそれぞれ配置され、各発現カセットは、プロモーター、コード核酸、およびポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの制御下に置かれ、このような構造遺伝子は、プロモーター「に機能的に連結された」と言われる。同様に、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合には、調節エレメントおよびコアプロモーターは、機能的に連結されている。
【００８０】
本明細書において使用される「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を意味する。この用語は、自己複製する核酸構造体としてのベクター、ならびに導入された先の宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。ある種のベクターは、機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
【００８１】
組換え法
抗体は、例えば、US4,816,567において説明されているようにして、組換え法および組換え組成物を用いて作製することができる。1つの態様において、本明細書において報告される抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および/または抗体のVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖および/または重鎖)をコードし得る。1つの態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター(例えば発現ベクター)が提供される。1つの態様において、このような核酸を含む細胞が提供される。1つの態様において、細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターおよび抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば、それらで形質転換されている)。1つの態様において、細胞は、真核生物性、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはリンパ系細胞(例えば、Y0細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞)である。1つの態様において、抗体を作製する方法が提供され、この方法は、抗体の発現に適した条件下で、本明細書において提供される抗体をコードする核酸を含む細胞を培養する段階、および任意で、細胞(または培地)から抗体を回収する段階を含む。
【００８２】
抗体を組換え作製する場合、例えば本明細書において報告される抗体をコードする核酸は、単離され、細胞におけるその後のクローニングおよび/または発現のために、1つまたは複数のベクター中に挿入される。このような核酸は、従来の手順を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって)、容易に単離および配列決定され得る。
【００８３】
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適した細胞には、本明細書において説明する原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、グリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない場合には特に、細菌において産生させることができる。細菌における抗体断片および抗体ポリペプチドの発現については、例えば、US5,648,237、US5,789,199、およびUS5,840,523;大腸菌における抗体断片の発現を説明するCharlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003) pp. 245-254を参照されたい。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離することができ、さらに精製することができる。
【００８４】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主または発現宿主であり、これらには、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、その結果、部分的または全面的にヒトグリコシル化パターンを有する抗体を産生する真菌株および酵母株が含まれる(Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414;およびLi, H., et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照されたい)。
【００８５】
また、グリコシル化抗体の発現のために適した宿主細胞は、多細胞生物(無脊椎動物および脊椎動物)にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞および昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と組み合わせて、特にスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞のトランスフェクションのために使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。
【００８６】
植物細胞培養物もまた、宿主として使用することができる(例えば、US5,959,177、US6,040,498、US6,420,548、US7,125,978、およびUS6,417,429(トランスジェニック植物において抗体を産生させるためのPLANTIBODIES(商標)技術を説明している)を参照されたい)。
【００８７】
脊椎動物細胞もまた、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するように順応させた哺乳動物細胞株が、有用である場合がある。有用な哺乳動物細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7);ヒト胚性腎臓株(例えばGraham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74で説明されている293細胞);仔ハムスター腎臓細胞(BHK);マウスセルトリ細胞(例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252で説明されているTM4細胞);サル腎臓細胞(CV1);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76);ヒト子宮頸部癌細胞(HELA);イヌ腎臓細胞(MDCK);バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A);ヒト肺細胞(W138);ヒト肝臓細胞(Hep G2);マウス乳房腫瘍(MMT 060562);TRI細胞(例えば、Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68で説明されている);MRC 5細胞;およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物細胞株には、DHFR- CHO細胞(Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ならびにY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に適したいくつかの哺乳動物宿主細胞株の概要については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004) pp. 255-268を参照されたい。
【００８８】
コドン使用
コドン使用表(例えば、前記の表を参照されたい)は、例えば、http://www.kazusa.or.jp/codon/において入手可能な「コドン使用データベース」から容易に入手可能であり、これらの表はいくつかの方法で改変され得る(adapted)(Nakamura, Y., et al., Nucl. Acids Res. 28 (2000) 292)。
【００８９】
組換えポリペプチドを高収量で発現させるためには、コード核酸が重要な役割を果たす。天然に存在し、自然から単離されたコード核酸は通常、異種宿主細胞において発現される場合には特に、高収量の発現用に最適化されていない。遺伝コードの縮退があるため、アミノ酸トリプトファンおよびメチオニンを除いて、1つのアミノ酸残基は、複数のヌクレオチドトリプレット(コドン)によってコードされ得る。したがって、1つのアミノ酸配列に対して、異なるコードコドン(＝対応するコード核酸配列)が存在し得る。
【００９０】
1つのアミノ酸残基をコードする異なるコドンは、異なる生物によって異なる相対的頻度(コドン使用)で使用される。通常、1つの特定のコドンが、使用され得る他のコドンより高い頻度で使用される。
【００９１】
WO2001/088141において、高発現される哺乳動物遺伝子において見出されるコドン使用に基づくリーディングフレーム最適化が報告されている。この目的のために、以下の表に示すように、高発現される哺乳動物遺伝子において、最も頻繁に使用されるコドン、および好ましさは劣るが、2番目に多い頻度で使用されるものにほぼ限定して考えた行列が作成された。高発現されるヒト遺伝子に由来するこれらのコドンを用いて、天然には存在しない完全に合成のリーディングフレームが作り出されたが、このリーディングフレームは、元の野生型遺伝子構築物とまったく同じ産生物をコードする。
【００９２】
US8,128,938において、個々のコドンの使用頻度を用いたコドン最適化の様々な方法、例えば、均一最適化、完全最適化、および最小限最適化などが報告されている。
【００９３】
以下の表において、高発現される哺乳動物遺伝子において見出される最も頻繁に使用されるコドン(コドン1)および2番目に頻繁に使用されるコドン(コドン2)が示される。
【００９４】
表
2018038408.tif 000007
(Ausubel, F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology 2 (1994), A1.8-A1.9)。
【００９５】
(i)独特な制限部位の導入を受け入れるために、(ii)合成遺伝子産物の連続的PCR増幅および配列決定を可能にするために7塩基対より長く伸びているGストレッチまたはCストレッチを中断するために、最も頻繁に存在するコドンの使用の厳守から起こしてよい逸脱は、わずかである。
【００９６】
コドン使用を改変されたコード核酸を発現させることによってポリペプチドを作製するための方法
細胞においてポリペプチドを発現させるためには、ポリペプチドをコードする核酸(各アミノ酸はコドングループによってコードされており、その際、コドングループ中の各コドンは、細胞ゲノムにおける総使用頻度に対応しているグループ中での固有の使用頻度に基づいて定められ、ポリペプチドをコードする(全)核酸におけるコドンの使用頻度は、グループ内での使用頻度とほぼ同じである)の使用が有益であることが判明している。
【００９７】
本明細書の1つの局面は、ポリペプチドを作製するための方法であって、
ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養する段階、および細胞または培養培地からポリペプチドを回収する段階を含み、
ポリペプチドの各アミノ酸残基は、少なくとも1つのコドンによってコードされており、同じアミノ酸残基をコードする異なるコドンが1つのグループにまとめられており、グループ中の各コドンは、グループ内での固有の使用頻度に基づいて定められ、1つのグループ中の全コドンの固有の使用頻度の合計は100％であり、
ポリペプチドをコードする核酸中のコドンの使用頻度は、そのグループ内でのその固有の使用頻度とほぼ同じである、
方法である。
【００９８】
本明細書において報告される方法において、ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸は、ポリペプチドを発現させるために使用され、その際、獲得できる発現収量は、他の核酸と比べて増加している。
【００９９】
天然においてもコドングループによってコードされているポリペプチドの各アミノ酸をコードするコドングループを用いることによって、および核酸全体内でもまた1つのグループの個々のコドン間の同じ相対比を用いることによって、発現された際に、例えば、最も使用頻度が高いコドンが常に存在する核酸と比べて収量が向上している、ポリペプチドをコードする核酸が提供され得ることが判明している。
【０１００】
1つの態様において、細胞は原核細胞である。1つの態様において、細胞は細菌細胞である。
【０１０１】
1つの好ましい態様において、細胞は大腸菌細胞である。大腸菌の場合の、特定のアミノ酸残基をコードする全コドンを考慮に入れた総コドン使用頻度が、以下の表に示される。
【０１０２】
表
2018038408.tif 000008
【０１０３】
アミノ酸残基アラニンをコードするために、4種の異なるコドン、すなわちGCG、GCA、GCT、およびGCCが利用可能である。したがって、このアミノ酸残基をコードするコドングループは、最大で4個のコドンを含み得る。4個のコドンを含むグループにおいて、各コドンのグループにおける固有の使用頻度は、細胞ゲノムにおける総使用頻度と同じである。すなわち、コドンGCGの固有かつ総合的な使用頻度は32％であり、コドンGCAの固有かつ総合的な使用頻度は24％であり、コドンGCTの固有かつ総合的な使用頻度は28％であり、コドンGCCの固有かつ総合的な使用頻度は16％である。グループ中のコドンの数が減少する場合、例えば、固有の使用頻度がそれぞれ24％および16％であるコドンGCAおよびGCCがグループから除外される場合、グループの残りのメンバー、すなわちGCGおよびGCTの固有の使用頻度は、それぞれ53％(=32/(32+28)*100)および47％(=28/(32+28) *100)に変わる。これは、1つのグループにおける全コドンの固有の使用頻度の合計は100％であるためである。したがって、2種類のコドンGCGおよびGCTを含むグループにおいては、各コドンのグループにおける固有の使用頻度は、細胞ゲノムにおけるその総使用頻度より高い。すなわち、コドンGCGの固有の使用頻度は53％であり、総使用頻度は32％であり、コドンGCTの固有の使用頻度は47％であり、総使用頻度は28％である。
【０１０４】
アミノ酸残基アラニンをコードするコドングループが4種の利用可能なコドンすべてを含む場合、アミノ酸残基アラニンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンGCG、GCT、GCA、およびGCCを32:28:24:16の比で含み、この比は8:7:6:4に相当する。これは、25箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、4:4:3:2に相当する8:8:6:4に調整される。
【０１０５】
特定のアミノ酸をコードする異なるコドンの使用は、ゲノム内で交互に起こる。この交代は、本明細書においてアミノ酸コドンモチーフの定義に反映される。アミノ酸コドンモチーフ内で、個々のコドンは、固有の使用頻度を考慮に入れて分布しており、頻度のより高いコドンが最初に選択されている。アミノ酸配列モチーフは、コドンの特定の配列を含み、その際、コドングループの使用頻度を対応するアミノ酸コドンモチーフに割り当てる(mapping)するのを可能にするために、アミノ酸コドンモチーフ中のコドンの総数は、コドングループ中のコドンの数と少なくとも同じであるか、またはさらに多い。
【０１０６】
したがって、アミノ酸残基アラニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000009
である。
【０１０７】
したがって、アミノ酸残基アラニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000010
である。
【０１０８】
したがって、アミノ酸残基アラニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000011
である。
【０１０９】
アミノ酸残基アラニンをコードするコドングループが2種のコドンGCGおよびGCTを含む場合、アミノ酸残基アラニンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンGCGおよびGCTを53:47の比で含む。これは、100箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、1:1に相当する50:50に調整される。
【０１１０】
したがって、アミノ酸残基アラニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、gcg gct(SEQ ID NO: 04)である。
【０１１１】
したがって、アミノ酸残基アラニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、gct gcg(SEQ ID NO: 05)である。
【０１１２】
アミノ酸残基アルギニンをコードするコドングループが2種のコドンCGTおよびCGCを含む場合、アミノ酸残基アルギニンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンCGTおよびCGCを66:34の比で含み、この比は33:17に相当する。これは、51箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、2:1に相当する66:33に調整される。
【０１１３】
したがって、アミノ酸残基アルギニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、cgt cgt cgc(SEQ ID NO: 06)である。
【０１１４】
したがって、アミノ酸残基アルギニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、cgt cgc cgt(SEQ ID NO: 07)である。
【０１１５】
アミノ酸残基アスパラギンをコードするコドングループが2種のコドンAACおよびAATを含む場合、アミノ酸残基アスパラギンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンAACおよびAATを84:16の比で含み、この比は21:4に相当する。これは、25箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、5:1に相当する20:4に調整される。
【０１１６】
したがって、アミノ酸残基アスパラギンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000012
である。
【０１１７】
したがって、アミノ酸残基アスパラギンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000013
である。
【０１１８】
したがって、アミノ酸残基アスパラギンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000014
である。
【０１１９】
したがって、アミノ酸残基アスパラギンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000015
【０１２０】
したがって、アミノ酸残基アスパラギンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000016
である。
【０１２１】
アミノ酸残基アスパラギン酸をコードするコドングループが2種のコドンGACおよびGATを含む場合、アミノ酸残基アスパラギン酸をコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンGACおよびGATを54:46の比で含み、この比は27:23に相当する。これは、50箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、1:1に相当する25:25に調整される。
【０１２２】
したがって、アミノ酸残基アスパラギン酸をコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、gac gat (SEQ ID NO: 13)である。
【０１２３】
したがって、アミノ酸残基アスパラギン酸をコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、gat gac (SEQ ID NO: 14)である。
【０１２４】
アミノ酸残基システインをコードするコドングループが2種のコドンTGCおよびTGTを含む場合、アミノ酸残基システインをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンTGCおよびTGTを64:36の比で含み、この比は16:9に相当する。これは、25箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、5:3に相当する15:9に調整される。
【０１２５】
したがって、アミノ酸残基システインをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000017
である。
【０１２６】
したがって、アミノ酸残基システインをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000018
である。
【０１２７】
したがって、アミノ酸残基システインをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000019
である。
【０１２８】
アミノ酸残基グルタミンをコードするコドングループが2種のコドンCAGおよびCAAを含む場合、アミノ酸残基グルタミンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンCAGおよびCAAを82:18の比で含み、この比は41:9に相当する。これは、50箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、4:1に相当する40:10に調整される。
【０１２９】
したがって、アミノ酸残基グルタミンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000020
である。
【０１３０】
したがって、アミノ酸残基グルタミンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000021
である。
【０１３１】
したがって、アミノ酸残基グルタミンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000022
である。
【０１３２】
したがって、アミノ酸残基グルタミンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000023
である。
【０１３３】
アミノ酸残基グルタミン酸をコードするコドングループが2種のコドンGAAおよびGAGを含む場合、アミノ酸残基グルタミン酸をコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンGAAおよびGAGを76:24の比で含み、この比は19:6に相当する。これは、50箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、3:1に相当する18:6に調整される。
【０１３４】
したがって、アミノ酸残基グルタミン酸をコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000024
である。
【０１３５】
したがって、アミノ酸残基グルタミン酸をコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000025
である。
【０１３６】
したがって、アミノ酸残基グルタミン酸をコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000026
である。
【０１３７】
アミノ酸残基グリシンをコードするコドングループが2種のコドンGGTおよびGGCを含む場合、アミノ酸残基グリシンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンGGTおよびGGCを54:46の比で含み、この比は27:23に相当する。これは、50箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、グリシンが4種の異なるコドンによってコードされ得ることを考慮に入れて、5:4に相当する30:24に調整される。
【０１３８】
したがって、アミノ酸残基グリシンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000027
である。
【０１３９】
したがって、アミノ酸残基グリシンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000028
である。
【０１４０】
アミノ酸残基ヒスチジンをコードするコドングループが2種のコドンCACおよびCATを含む場合、アミノ酸残基ヒスチジンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンCACおよびCATを71:29の比で含む。これは、100箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、2:1に相当する66:33に調整される。
【０１４１】
したがって、アミノ酸残基ヒスチジンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、cac cac cat(SEQ ID NO: 27)である。
【０１４２】
したがって、アミノ酸残基ヒスチジンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、cac cat cac(SEQ ID NO: 28)である。
【０１４３】
アミノ酸残基イソロイシンをコードするコドングループが2種のコドンATCおよびATTを含む場合、アミノ酸残基イソロイシンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンATCおよびATTを68:32の比で含み、この比は17:8に相当する。これは、25箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、2:1に相当する16:8に調整される。
【０１４４】
したがって、アミノ酸残基イソロイシンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、atc atc att(SEQ ID NO: 29)である。
【０１４５】
したがって、アミノ酸残基イソロイシンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、atc att atc(SEQ ID NO: 30)である。
【０１４６】
アミノ酸残基ロイシンをコードするコドングループが2種のコドンCTGおよびCTCを含む場合、アミノ酸残基ロイシンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンCTGおよびCTCを91:9の比で含む。これは、100箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、9:1に相当する90:10に調整される。
【０１４７】
したがって、アミノ酸残基ロイシンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000029
である。
【０１４８】
したがって、アミノ酸残基ロイシンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000030
である。
【０１４９】
したがって、アミノ酸残基ロイシンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000031
である。
【０１５０】
アミノ酸残基リジンをコードするコドングループが2種のコドンAAAおよびAAGを含む場合、アミノ酸残基リジンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンAAAおよびAAGを80:20の比で含み、この比は4:1に相当する。
【０１５１】
したがって、アミノ酸残基リジンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000032
である。
【０１５２】
したがって、アミノ酸残基リジンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000033
である。
【０１５３】
したがって、アミノ酸残基リジンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000034
である。
【０１５４】
したがって、アミノ酸残基リジンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000035
である。
【０１５５】
アミノ酸残基フェニルアラニンをコードするコドングループが2種のコドンTTCおよびTTTを含む場合、アミノ酸残基フェニルアラニンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンTTCおよびTTTを72:28の比で含み、この比は18:7に相当する。これは、25箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、3:1に相当する18:6に調整される。
【０１５６】
したがって、アミノ酸残基フェニルアラニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000036
である。
【０１５７】
したがって、アミノ酸残基フェニルアラニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000037
である。
【０１５８】
したがって、アミノ酸残基フェニルアラニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000038
である。
【０１５９】
アミノ酸残基プロリンをコードするコドングループが3種のコドンCCG、CCA、およびCCTを含む場合、アミノ酸残基プロリンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンCCG、CCA、およびCCTを76:14:10の比で含み、この比は38:7:5に相当する。これは、50箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、5:1:1に相当する35:7:7に調整される。
【０１６０】
したがって、アミノ酸残基プロリンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000039
である。
【０１６１】
したがって、アミノ酸残基プロリンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000040
である。
【０１６２】
したがって、アミノ酸残基プロリンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000041
である。
【０１６３】
したがって、アミノ酸残基プロリンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000042
である。
【０１６４】
したがって、アミノ酸残基プロリンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000043
である。
【０１６５】
したがって、アミノ酸残基プロリンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000044
である。
【０１６６】
アミノ酸残基セリンをコードするコドングループが3種のコドンTCT、TCC、およびAGCを含む場合、アミノ酸残基セリンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンTCT、TCC、およびAGCを38:32:30の比で含み、この比は19:16:15に相当する。これは、50箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、6:5:5に相当する18:15:15に調整される。
【０１６７】
したがって、アミノ酸残基セリンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000045
である。
【０１６８】
したがって、アミノ酸残基セリンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000046
である。
【０１６９】
アミノ酸残基トレオニンをコードするコドングループが3種のコドンACC、ACT、およびACGを含む場合、アミノ酸残基トレオニンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンACC、ACT、およびACGを58:29:13の比で含む。これは、100箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、4:2:1に相当する56:28:14に調整される。
【０１７０】
したがって、アミノ酸残基トレオニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000047
である。
【０１７１】
したがって、アミノ酸残基トレオニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000048
である。
【０１７２】
したがって、アミノ酸残基トレオニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000049
である。
【０１７３】
アミノ酸残基チロシンをコードするコドングループが2種のコドンTACおよびTATを含む場合、アミノ酸残基チロシンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンTACおよびTATを64:34の比で含み、この比は32:17に相当する。これは、49箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、2:1に相当する32:16に調整される。
【０１７４】
したがって、アミノ酸残基チロシンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、tac tac tat(SEQ ID NO: 52)である。
【０１７５】
したがって、アミノ酸残基チロシンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、tac tat tac(SEQ ID NO: 53)である。
【０１７６】
アミノ酸残基バリンをコードするコドングループが4種の利用可能なコドンすべてを含む場合、アミノ酸残基バリンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンGTT、GTG、GTA、およびGTCを40:27:20:13の比で含む。これは、100箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、4:3:2:1に相当する40:30:20:10に調整される。
【０１７７】
したがって、アミノ酸残基バリンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000050
である。
【０１７８】
したがって、アミノ酸残基バリンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000051
である。
【０１７９】
したがって、アミノ酸残基バリンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000052
である。
【０１８０】
以下に、本明細書において報告される方法を、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いて例示する:
2018038408.tif 000053
【０１８１】
精製を容易にするために、精製タグがポリペプチドのN末端またはC末端に結合されてよい。精製タグは、ポリペプチドのアミノ酸配列に直接的に融合されてもよく、または短いリンカーもしくはプロテアーゼ切断部位によってアミノ酸配列から離されていてもよい。1つの例示的な精製タグは、ポリペプチドのC末端に融合するためのN末端GSリンカーを伴うヘキサヒスチジンタグ:
2018038408.tif 000054
であり、これは、以下の核酸配列:
2018038408.tif 000055
によってコードされている。
【０１８２】
試験ポリペプチドの前に、短いキャリアペプチド(carrier peptide)が存在してよい。1つの例示的なキャリアペプチドは、成熟したヒトインターフェロン-αのN末端部分に由来し、
2018038408.tif 000056
であり、これは、以下の核酸配列:
2018038408.tif 000057
によってコードされている。
【０１８３】
各細胞において最も多く使用されるコドンを常に用いる逆翻訳(backtranslation)法によって得られる、SEQ ID NO: 57の試験ポリペプチドをコードする核酸配列は、
2018038408.tif 000058
である。
【０１８４】
本明細書において報告される方法によって得られる、SEQ ID NO: 57の試験ポリペプチドをコードする核酸配列は、
2018038408.tif 000059
である。
【０１８５】
使用頻度が最も高いコドンを常に用いることによって得られた核酸配列を、本明細書において報告される方法によって得られた核酸配列と比較することにより、これら2種の核酸では、300個のコドンの内の146個のコドンが異なっている、すなわち、最適化された配列では、コードする全コドンの48.7％が異なっている(異なるコドンは、以下のアライメントにおいて下線を引いている)ことを認めることができる。
2018038408.tif 000060
2018038408.tif 000061
2018038408.tif 000062
(上の列:SEQ ID NO: 62;中央の列: SEQ ID NO: 63;下の列:SEQ ID NO: 57)。
【０１８６】
以下の表において、各々のコード核酸のコドンは、各々の核酸の5'末端から始めて、出現する順番で示されている。
【０１８７】
表
2018038408.tif 000063
2018038408.tif 000064
2018038408.tif 000065
【０１８８】
以下の表において、細胞における総使用頻度に対する、アミノ酸コドンモチーフにおけるコドン使用頻度が示される。
【０１８９】
表
2018038408.tif 000066
2018038408.tif 000067
2018038408.tif 000068
2018038408.tif 000069
【０１９０】
以下の表において、コード核酸全体におけるコドンの頻度が示される。
【０１９１】
表
2018038408.tif 000070
2018038408.tif 000071
2018038408.tif 000072
2018038408.tif 000073
2018038408.tif 000074
【０１９２】
両方の核酸が、SEQ ID NO: 61の核酸によってコードされるSEQ ID NO: 60のN末端インターフェロン-αキャリアペプチドおよびSEQ ID NO: 59の核酸によってコードされるSEQ ID NO: 58 のC末端精製タグを含めて、大腸菌において発現された。発現カセットを含む大腸菌発現ベクターは、別の仕方でコードされた試験ポリペプチドに対して同一であった。別の仕方でコードされた試験ポリペプチドの発現収量は、定量的ウェスタンブロット解析によって測定された。したがって、大腸菌の全細胞溶解物が調製され、遠心分離によって可溶性上清画分および不溶性細胞沈殿物画分に分画された。その後、タンパク質はSDS PAGEにより電気泳動によって分離され、電気泳動によってニトロセルロース膜に移され、次いで、ポリHis精製タグを認識する抗体POD結合体で染色された。染色された、ポリHisを含む別の仕方でコードされた試験ポリペプチドは、Lumi-Imager F1アナライザー(Roche Molecular Biochemicals)およびLumi Analystソフトウェアバージョン3.1を用いて、scFv-ポリHisタンパク質濃度が公知である同じポリHis精製タグを含む純粋なタンパク質参照標準(scFv-ポリHis抗体断片)と比較することによって定量された。
【０１９３】
図1および2において、別の仕方でコードされたポリHisタグ付き試験ポリペプチドのウェスタンブロットが示されている。大腸菌の全細胞溶解物は、SDS PAGEおよびイムノブロッティングの前に、可溶性上清画分および不溶性細胞沈殿物画分に分画された。参照として、タンパク質分子量標準物質およびタンパク質濃度が公知のポリHisタグを含むscFv抗体断片が使用された。
【０１９４】
レーン2、4、6、および8は、0時間、4時間、6時間、および21時間の培養後の、最も使用頻度が高いコドンを常に用いることによって作製された核酸を用いて得られた発現された試験ポリペプチドの量を示す試料である。
【０１９５】
レーン3、5、7、および9は、0時間、4時間、6時間、および21時間の培養後の、本明細書において報告される新しい/本発明のタンパク質逆翻訳法によって作製された核酸を用いて得られた発現された試験ポリペプチドの量を示す試料である。
【０１９６】
レーン11〜14は、濃度が公知である(5ng、10ng、20ng、30ng、および40ng)精製されたscFv-ポリHisタンパク質参照標準に相当する。
【０１９７】
発現される試験ポリペプチドの量は、不溶性細胞片画分(沈殿物)内で、SDS試料緩衝液を用いて不溶性タンパク質凝集物を可溶化/抽出した後に、測定された。これは、発現される試験ポリペプチドの大部分が、細胞溶解および細胞分画の後の不溶性細胞沈殿物画分(封入体としても公知の沈殿した不溶性タンパク質凝集物)中に存在したためである。
【０１９８】
不溶性細胞沈殿物画分から可溶化された試験ポリペプチドの測定量が、以下の表に示される。
【０１９９】
表
2018038408.tif 000075
*:試料緩衝液によって1:50に希釈された試料;分析体積5μl
【０２００】
上記の表から認めることができるように、コードコドンが本発明において報告される方法に従って選択される、試験ポリペプチドをコードする核酸を用いて得られる発現収量は、従来のコドン最適化方法を用いて得られる収量の少なくとも約1.8倍である。
【０２０１】
以下に、本発明において報告される方法が真核細胞を用いて例示される。
【０２０２】
1つの態様において、細胞はCHO細胞である。キヌゲネズミ(Cricetulus)属の種(CHO細胞、メソクリセタス(Mesocricetus)属の種;ハムスター)の場合の、特定のアミノ酸残基をコードする全コドンを考慮に入れた総コドン使用頻度は、以下の表に示される。
【０２０３】
表
2018038408.tif 000076
【０２０４】
アミノ酸残基アラニンをコードするために、4種の異なるコドン、すなわちGCG、GCA、GCT、およびGCCが利用可能である。したがって、このアミノ酸残基をコードするコドングループは、最大で4個のコドンを含み得る。4個のコドンを含むグループにおいて、各コドンのグループにおける固有の使用頻度は、細胞ゲノムにおける総使用頻度と同じである。すなわち、コドンGCGの固有かつ総合的な使用頻度は9％であり、コドンGCAの固有かつ総合的な使用頻度は23％であり、コドンGCTの固有かつ総合的な使用頻度は30％であり、コドンGCCの固有かつ総合的な使用頻度は38％である。グループ中のコドンの数が減少する場合、例えば、固有の使用頻度がそれぞれ9％および23％であるコドンGCGおよびGCAがグループから除外される場合、グループの残りのメンバー、すなわちGCTおよびGCCの固有の使用頻度は、それぞれ44％(=30/(30+38)*100)および56％(=38/(30+38) *100)に変わる。これは、1つのグループにおける全コドンの固有の使用頻度の合計は100％であるためである。したがって、2種類のコドンGCTおよびGCCを含むグループにおいては、各コドンのグループにおける固有の使用頻度は、細胞ゲノムにおけるその総使用頻度より高い。すなわち、コドンGCTの固有の使用頻度は44％であり、総使用頻度は30％であり、コドンGCCの固有の使用頻度は56％であり、総使用頻度は38％である。
【０２０５】
アミノ酸残基アラニンをコードするコドングループが4種の利用可能なコドンすべてを含む場合、アミノ酸残基アラニンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンGCC、GCT、GCA、およびGCGを38:30:23:9の比で含む。これは、100箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、4:3:2:1に相当する40:30:20:10に調整される。
【０２０６】
したがって、アミノ酸残基アラニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000077
である。
【０２０７】
コドンがゲノム内に分布するのと同様に、上記の比率および使用頻度を考慮に入れたアミノ酸コドンモチーフ内での分布が使用され、その際、頻度のより高いコドンが最初に選択される。
【０２０８】
したがって、アミノ酸残基アラニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000078
である。
【０２０９】
したがって、アミノ酸残基アラニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000079
である。
【０２１０】
アミノ酸残基アラニンをコードするコドングループが3種のコドンGCC、GCT、およびGCAを含む場合、アミノ酸残基アラニンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンGCC、GCT、およびGCAを42:33:25の比で含む。これは、100箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、4:3:3に相当する40:30:30に調整される。
【０２１１】
したがって、アミノ酸残基アラニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000080
である。
【０２１２】
したがって、アミノ酸残基アラニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000081
である。
【０２１３】
アミノ酸残基アルギニンをコードするコドングループが4種のコドンAGG、AGA、CGG、およびCGCを含む場合、アミノ酸残基アルギニンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンAGG、AGA、CGG、およびCGCを27:25:24:24の比で含む。これは、100箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、1:1:1:1に相当する25:25:25:25に調整される。
【０２１４】
したがって、アミノ酸残基アルギニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000082
である。
【０２１５】
したがって、アミノ酸残基アルギニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000083
である。
【０２１６】
アミノ酸残基アスパラギンをコードするコドングループが2種のコドンAACおよびAATを含む場合、アミノ酸残基アスパラギンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンAACおよびAATを61:39の比で含む。これは、100箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、3:2に相当する60:40に調整される。
【０２１７】
したがって、アミノ酸残基アスパラギンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000084
である。
【０２１８】
したがって、アミノ酸残基アスパラギンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000085
である。
【０２１９】
アミノ酸残基アスパラギン酸をコードするコドングループが2種のコドンGACおよびGATを含む場合、アミノ酸残基アスパラギン酸をコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンGACおよびGATを61:39の比で含む。これは、100箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、3:2に相当する60:40に調整される。
【０２２０】
したがって、アミノ酸残基アスパラギン酸をコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000086
である。
【０２２１】
したがって、アミノ酸残基アスパラギン酸をコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000087
である。
【０２２２】
アミノ酸残基システインをコードするコドングループが2種のコドンTGCおよびTGTを含む場合、アミノ酸残基システインをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンTGCおよびTGTを58:42の比で含み、この比は29:21に相当する。これは、50箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、3:2に相当する30:20に調整される。
【０２２３】
したがって、アミノ酸残基システインをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000088
である。
【０２２４】
したがって、アミノ酸残基システインをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000089
である。
【０２２５】
アミノ酸残基グルタミンをコードするコドングループが2種のコドンCAGおよびCAAを含む場合、アミノ酸残基グルタミンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンCAGおよびCAAを78:22の比で含み、この比は39:11に相当する。これは、50箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、4:1に相当する40:10に調整される。
【０２２６】
したがって、アミノ酸残基グルタミンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000090
である。
【０２２７】
したがって、アミノ酸残基グルタミンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000091
である。
【０２２８】
したがって、アミノ酸残基グルタミンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000092
である。
【０２２９】
したがって、アミノ酸残基グルタミンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000093
である。
【０２３０】
アミノ酸残基グルタミン酸をコードするコドングループが2種のコドンGAGおよびGAAを含む場合、アミノ酸残基グルタミン酸をコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンGAGおよびGAAを64:36の比で含み、この比は32:18に相当する。これは、50箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、2:1に相当する32:16に調整される。
【０２３１】
したがって、アミノ酸残基グルタミン酸をコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、gag gag gaa(SEQ ID NO: 81)である。
【０２３２】
したがって、アミノ酸残基グルタミン酸をコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、gag gaa gag(SEQ ID NO: 82)である。
【０２３３】
アミノ酸残基グリシンをコードするコドングループが利用可能なコドンすべてを含む場合、アミノ酸残基グリシンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンGGC、GGA、GGG、およびGGTを33:25:24:19の比で含む。これは、100箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、7:5:5:4に相当する35:25:25:20に調整される。
【０２３４】
したがって、アミノ酸残基グリシンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000094
である。
【０２３５】
したがって、アミノ酸残基グリシンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000095
である。
【０２３６】
アミノ酸残基ヒスチジンをコードするコドングループが2種のコドンCACおよびCATを含む場合、アミノ酸残基ヒスチジンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンCACおよびCATを58:42の比で含み、この比は29:21に相当する。これは、50箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、3:2に相当する30:20に調整される。
【０２３７】
したがって、アミノ酸残基ヒスチジンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000096
である。
【０２３８】
したがって、アミノ酸残基ヒスチジンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000097
である。
【０２３９】
アミノ酸残基イソロイシンをコードするコドングループが利用可能なコドンすべてを含む場合、アミノ酸残基イソロイシンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンATC、ATT、およびATAを51:35:15の比で含む。これは、100箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、10:7:3に相当する50:35:15に調整される。
【０２４０】
したがって、アミノ酸残基イソロイシンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000098
である。
【０２４１】
したがって、アミノ酸残基イソロイシンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000099
である。
【０２４２】
アミノ酸残基ロイシンをコードするコドングループが4種のコドンCTG、CTC、CTT、およびTTGを含む場合、アミノ酸残基ロイシンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンCTG、CTC、CTT、およびCTGを44:19:13:12の比で含む。これは、100箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、4:2:1:1に相当する40:20:10:10に調整される。
【０２４３】
したがって、アミノ酸残基ロイシンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000100
である。
【０２４４】
したがって、アミノ酸残基ロイシンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000101
である。
【０２４５】
したがって、アミノ酸残基ロイシンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000102
である。
【０２４６】
アミノ酸残基リジンをコードするコドングループが2種のコドンAAGおよびAAAを含む場合、アミノ酸残基リジンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンAAGおよびAAAを67:33の比で含む。これは、100箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、2:1に相当する66:33に調整される。
【０２４７】
したがって、アミノ酸残基リジンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、aag aag aaa(SEQ ID NO: 92)である。
【０２４８】
したがって、アミノ酸残基リジンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、aag aaa aag(SEQ ID NO: 93)である。
【０２４９】
アミノ酸残基フェニルアラニンをコードするコドングループが2種のコドンTTCおよびTTTを含む場合、アミノ酸残基フェニルアラニンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンTTCおよびTTTを56:44の比で含み、この比は14:11に相当する。これは、25箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、3:2に相当する15:10に調整される。
【０２５０】
したがって、アミノ酸残基フェニルアラニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000103
である。
【０２５１】
したがって、アミノ酸残基フェニルアラニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000104
である。
【０２５２】
アミノ酸残基プロリンをコードするコドングループが3種のコドンCCC、CCA、およびCCTを含む場合、アミノ酸残基プロリンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンCCC、CCA、およびCCTを34:29:29の比で含む。これは、100箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、7:6:6に相当する35:30:30に調整される。
【０２５３】
したがって、アミノ酸残基プロリンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000105
である。
【０２５４】
したがって、アミノ酸残基プロリンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000106
である。
【０２５５】
アミノ酸残基セリンをコードするコドングループが4種のコドンTCC、AGC、TCT、およびTCAを含む場合、アミノ酸残基セリンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンTCC、AGC、TCT、およびTCAを24:24:18:15の比で含み、この比は8:8:6:3に相当する。これは、25箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、3:3:2:1に相当する9:9:6:3に調整される。
【０２５６】
したがって、アミノ酸残基セリンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000107
である。
【０２５７】
したがって、アミノ酸残基セリンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000108
である。
【０２５８】
したがって、アミノ酸残基セリンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000109
である。
【０２５９】
アミノ酸残基トレオニンをコードするコドングループが3種のコドンACC、ACA、およびACTを含む場合、アミノ酸残基トレオニンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンACC、ACA、およびACTを45:32:23の比で含む。これは、100箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、5:3:2に相当する50:30:20に調整される。
【０２６０】
したがって、アミノ酸残基トレオニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000110
である。
【０２６１】
したがって、アミノ酸残基トレオニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000111
である。
【０２６２】
したがって、アミノ酸残基トレオニンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000112
である。
【０２６３】
アミノ酸残基チロシンをコードするコドングループが2種のコドンTATおよびTACを含む場合、アミノ酸残基チロシンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンTATおよびTACを61:39の比で含む。これは、100箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、3:2に相当する60:40に調整される。
【０２６４】
したがって、アミノ酸残基チロシンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000113
である。
【０２６５】
したがって、アミノ酸残基チロシンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000114
である。
【０２６６】
アミノ酸残基バリンをコードするコドングループが4種の利用可能なコドンすべてを含む場合、アミノ酸残基バリンをコードするコドンのアミノ酸コドンモチーフは、コドンGTG、GTC、GTT、およびGTAを48:25:16:11の比で含む。これは、100箇所の位置を含むアミノ酸コドンモチーフをもたらすと思われるため、8:4:3:2に相当する48:24:18:12に調整される。
【０２６７】
したがって、アミノ酸残基バリンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000115
である。
【０２６８】
したがって、アミノ酸残基バリンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000116
である。
【０２６９】
したがって、アミノ酸残基バリンをコードするコドンの1つのアミノ酸コドンモチーフは、
2018038408.tif 000117
である。
【０２７０】
以下の実施例、配列、および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲において説明される。本発明の精神から逸脱することなく、説明される手順に修正を加え得ることが理解される。
【実施例】
【０２７１】
タンパク質測定:
280nmにおける光学濃度(OD)を測定し、アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を用いることによって、タンパク質濃度を決定した。
【０２７２】
組換えDNA技術:
Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)において説明されているように、標準的方法を用いてDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の取扱い説明書に従って使用した。
【０２７３】
実施例1
試験ポリペプチド発現プラスミドの作製および説明
融合試験ポリペプチドを組換え手段によって調製した。発現される融合試験ポリペプチドのアミノ酸配列は、5'から3'の方向に、キャリアペプチドをコードするSEQ ID NO: 61の核酸、試験ポリペプチドをコードするSEQ ID NO: 62またはSEQ ID NO: 63の核酸、およびヘキサヒスチジン精製タグ(ポリHisタグ)をコードするSEQ ID NO: 59の核酸を含む核酸によってコードした。
【０２７４】
コード性の融合遺伝子は、公知の組換え法および組換え技術を用いて適切な核酸セグメントを連結することによって組み立てた。化学合成によって作製した核酸配列は、DNA配列決定によって検証した。融合ポリペプチドを作製するための発現プラスミドは、以下に概説するようにして調製した。
【０２７５】
大腸菌発現プラスミドの作製
プラスミド4980(4980-pBRori-URA3-LACI-SAC)は、大腸菌においてコアストレプトアビジンを発現させるための発現プラスミドである。これは、プラスミド1966(1966-pBRori-URA3-LACI-Tリピート;EP-B1422237において報告されている)に由来する3142bp長のEcoRI/CelIIベクター断片と、コアストレプトアビジンをコードする435bp長のEcoRI/CelII断片とのライゲーションによって作製した。
【０２７６】
コアストレプトアビジン大腸菌発現プラスミドは、以下のエレメントを含む:
-大腸菌における複製のためのベクターpBR322に由来する複製起点(Sutcliffe, G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90によると塩基対位置2517〜3160に対応する)、
-大腸菌のpyrF変異株(ウラシル栄養要求性)の補完によるプラスミド選択を可能にする、オロチジン5'-リン酸デカルボキシラーゼをコードするサッカロミセス・セレビシエのURA3遺伝子(Rose, M., et al., Gene 29 (1984) 113-124)、
-以下を含む、コアストレプトアビジン発現カセット
-T5ハイブリッドプロモーター(Bujard, H., et al., Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433およびStueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152に記載の T5-PN25/03/04ハイブリッドプロモーター)(Stueber, D., et al.(前記を参照されたい)に記載の合成リボソーム結合部位を含む)、
-コアストレプトアビジン遺伝子、
-バクテリオファージに由来する2つの転写ターミネーター、すなわちλ-T0ターミネーター(Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414)およびfdターミネーター(Beck E. and Zink, B. Gene 1-3 (1981) 35-58)、
-大腸菌に由来するlacI抑制遺伝子(Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769)。
【０２７７】
融合試験ポリペプチドを発現させるための最終的な発現プラスミドは、単一の隣接するEcoRIおよびCelII制限エンドヌクレアーゼ切断部位を用いてベクター4980からコアストレプトアビジン構造遺伝子を切り取り、EcoRII/CelII制限部位に隣接された融合試験ポリペプチドをコードする核酸を、3142bp長のEcoRI/CelII-4980ベクター断片中に挿入することによって調製した。
【０２７８】
従来のコドン使用を用いて作製した試験ポリペプチド遺伝子を含む発現プラスミドを11020と呼び、一方、新しいコドン使用を用いて作製した試験ポリペプチド遺伝子を含む発現プラスミドを11021と呼んだ。
【０２７９】
実施例2
大腸菌における試験ポリペプチドの発現
融合試験ポリペプチドを発現させるために、大腸菌の栄養要求性(PyrF)の補完により抗生物質を用いずにプラスミドを選択することを可能にする大腸菌宿主/ベクター系を使用した(EP0972838およびUS6,291,245)。
【０２８０】
形質転換される大腸菌細胞の形質転換、細胞培養、および誘導
先の段階で得られた発現プラスミド(それぞれ11020および11021)を用いて、大腸菌K12株CSPZ-2(leuB、proC、trpE、thi-1、ΔpyrF)を形質転換した。形質転換されたCSPZ-2細胞を、最初に37℃にて寒天プレート上で、続いて、0.5％カザミノ酸(Difco)を含むM9最少培地中で振盪培養して、550nmにおける光学濃度(OD550)が0.6〜0.9になるまで増殖させ、続いて、IPTG(最終濃度1〜5mmol/l)を用いて誘導した。
【０２８１】
実施例3
試験ポリペプチドの発現解析
発現された融合試験ポリペプチドを、SDS PAGE後に定量的なウェスタンブロット解析によって可視化した。したがって、大腸菌溶解物をドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって処理し、分離されたポリペプチドをゲルから膜に移し、続いて、免疫学的方法によって検出し定量した。
【０２８２】
大腸菌細胞の試料採集およびSDS PAGEのための試料調製
発現解析のために、約24時間の時間経過に渡って、大腸菌細胞培養物試料を振盪培養物から抜き取った。組換えタンパク質発現を誘導する前に、試料を1つ抜き取った。それ以降の試料は、割り当てられた(dedicated)時点、例えば、誘導後4時間目、6時間目、および21時間目に採取した。
【０２８３】
3 OD550nm単位(1 OD550nm=550nmにおけるODが1である細胞懸濁液1ml)の遠心分離した培地に由来する大腸菌細胞沈殿物を、10mmol/lリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)0.25ml中に再懸濁し、超音波処理(強度50％で30秒のパルスを2回)によって細胞を溶解した。不溶性の細胞成分を沈降させ(遠心分離14,000rpm、5分)、清澄にした上清の分取物を、1/4体積(v/v)量の4×LDS試料緩衝液および1/10体積(v/v)量の0.5M  1,4-ジチオトレイトール(DTT)と混合した。不溶性細胞片画分(沈殿物)を、振盪しながら15分間、50mM  1,4-ジチオトレイトール(DTT)を含む1×LDS試料緩衝液0.3ml中で再懸濁/抽出し、再び遠心分離した。
【０２８４】
SDS PAGE
LDS試料用緩衝液、4倍濃縮物(4×):グリセロール4g、TRIS塩基0.682g、TRIS塩酸塩0.666g、LDS(lithium dodecyl sulfate)0.8g、EDTA(ethylene diamin tetra acid)0.006g、1重量％(w/w)のServa Blue G250水溶液0.75ml、1重量％(w/w)のフェノールレッド溶液0.75ml、水を加えて総体積10mlにする。
【０２８５】
製造業者の取扱い説明書に従って、NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen)を使用した(10％ NuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis-TRIS Pre-Castゲル、pH6.4;カタログ番号:NP0301)。これらの試料を70℃で10分間インキュベートし、室温まで放冷した後、5〜40μLをゲル上に添加した。さらに、MagicMark(商標)XP Western Protein Standard(20〜220kDa)(Invitrogen、カタログ番号LC5602)5μl、Precision Plus Protein(商標)着色済みタンパク質標準物質(Bio-Rad、カタログ番号161-0373)5μl、ならびに精製済みscFv-ポリHis定量用標準物質(タンパク質濃度:5ng/μl)1、2、4、6、および8μlをゲル上に添加した。タンパク質の分離は、180Vで60分間、還元性のNuPAGE(登録商標)MOPS SDS泳動用緩衝液(Invitrogen、カタログ番号NP0001)中で行った。
【０２８６】
図1および図2に示した、SDS PAGE/ウェスタンブロットの試料の配列
2018038408.tif 000118
【０２８７】
ウェスタンブロット法
転写緩衝液:39mMグリシン、48mM  TRIS塩酸塩、0.04重量％(w/w)SDS、および20体積％メタノール(v/v)。
【０２８８】
SDS-PAGEの後、Burnetteの「セミドライブロッティング法(Semidry-Blotting-Method)」(Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203)に従って、分離されたポリペプチドを電気泳動によってニトロセルロースろ過膜(孔径:0.45μm、Invitrogen、カタログ番号LC2001)に移した。
【０２８９】
ポリHisタグ付き試験ポリペプチドの免疫学的検出および定量
電気泳動転写(electro-transfer)の後、50mM Tris-HCl、pH7.5、150mM NaCl(TBS、tris buffered saline)中で膜を洗浄し、TBS、1％(w/v)ウェスタンブロッキング試薬(Roche、カタログ番号11921673001)中、4℃で一晩、非特異的結合部位をブロックした。
【０２９０】
TBS、0.5％(w/v)ウェスタンブロッキング溶液中で1:1,000に希釈したマウスモノクローナル抗ペンタHis抗体(Qiagen、カタログ番号34660)を一次抗体として使用した。TBS(Bio-Rad、カタログ番号170-6435)中で2回洗浄し、かつ0.05％ (v/v)Tween-20を添加したTBS(TBST)中で2回洗浄した後、3％(w/v)脱脂(not fat)粉乳粉末を含むTBS中で1:400に希釈した、ペルオキシダーゼに結合させた精製ウサギ抗マウスIgG抗体(Roche Molecular Biochemicals、カタログ番号11693506)を二次抗体として用いて、ポリHisを含むポリペプチドを可視化した。
【０２９１】
室温で10分間、TBTS緩衝液で3回およびTBS緩衝液で1回、膜を洗浄した後、化学発光をもたらすLuminol/過酸化物溶液(Lumi-LightPLUS Western Brotting Substrate, Roche Molecular Biochemicals、カタログ番号12015196001)を用いて、ウェスタンブロット膜を発色させた。したがって、ルミノール/過酸化物溶液10ml中で10秒〜5分間、膜をインキュベートし、その後、LUMI-Imager F1 Analysator(Roche Molecular Biochemicals)を用いて放射光を検出した。scFv-ポリHisタンパク質の公知のタンパク質濃度をそれらの同起源の(cognate)LUMI-Imager測定シグナル(スポットの強度は、単位BLUで表される)に対してプロットすることによって、タンパク質の検量線(reference standard curve)を得た。この検量線を、元の試料中の標的タンパク室の濃度を算出するために使用した。
【０２９２】
スポットの強度は、LumiAnalyst Software(バージョン3.1)を用いて定量した。
【０２９３】
表
2018038408.tif 000119
*:試料緩衝液によって1:50に希釈された試料;分析体積5μl
【０２９４】
公知のscFv-ポリHis濃度5つから得られたタンパク質検量線を図3に示す。
【０２９５】
ポリペプチドを含む上清のウェスタンブロットを図1に示している。SDSによって抽出された細胞沈殿物画分のウェスタンブロットを図2に示している。
【図１】
2018038408.tif 000120
【図２】
2018038408.tif 000121
【図３】
2018038408.tif 000122
【配列表】
2018038408000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月5日(2017.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CHO細胞、BHK細胞、HEK細胞、SP2/0細胞、またはNS0細胞より選択される真核細胞中でポリペプチドを組換えによって作製するための方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を培養する段階、および該真核細胞または培養培地から該ポリペプチドを回収する段階を含み、
該ポリペプチドのアミノ酸残基のそれぞれは、少なくとも1つのコドンによってコードされており、同じアミノ酸残基をコードするコドンは1つのグループにまとめられており、かつグループ中のコドンのそれぞれは、該グループ内での固有の使用頻度に基づいて定められ、1つのグループ中の全コドンの固有の使用頻度の合計は100％であり、
ポリペプチドをコードする該核酸中の各コドンの総使用頻度は、そのグループ内でのその固有の使用頻度とほぼ同じである、
方法。
【請求項２】
前記グループが、細胞ゲノム内での総使用頻度が5％より多いコドンのみを含むことを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記グループが、細胞ゲノム内での総使用頻度が8％またはそれ以上であるコドンのみを含むことを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記グループが、細胞ゲノム内での総使用頻度が10％またはそれ以上であるコドンのみを含むことを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項５】
ポリペプチドのN末端から開始して、該ポリペプチド中に順次的に出現する特定のアミノ酸のそれぞれについて、コード核酸がアミノ酸コドンモチーフ中の対応する順次的位置におけるものと同じコドンを含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
アミノ酸コドンモチーフ中の各コドンの総使用頻度は、そのグループ内でのその固有の使用頻度とほぼ同じであることを特徴とする、請求項5記載の方法。
【請求項７】
アミノ酸コドンモチーフの最終コドンに達した後、ポリペプチドにおいて特定のアミノ酸が次に出現する際、コード核酸がアミノ酸コドンモチーフの最初の位置にあるコドンを含むことを特徴とする、請求項5〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
アミノ酸コドンモチーフ中のコドンが、固有の使用頻度が低くなる順に並べられ、固有の使用頻度が最も低いコドンまたは固有の使用頻度が二番目に低いコドンの後には、固有の使用頻度が最も高いコドンが使用されることを特徴とする、請求項5〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
アミノ酸コドンモチーフ中のコドンが、固有の使用頻度が低くなる順に並べられ、固有の使用頻度が最も低いコドンの後には、固有の使用頻度が最も高いコドンが使用されることを特徴とする、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
細胞がCHO細胞であることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
アラニンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 64、65、66、67、および68より選択され、かつ/または
アルギニンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 69および70より選択され、かつ/または
アスパラギンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 71および72より選択され、かつ/または
アスパラギン酸のためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 73および74より選択され、かつ/または
システインのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 75および76より選択され、かつ/または
グルタミンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 77、78、79、および80より選択され、かつ/または
グルタミン酸のためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 81および82より選択され、かつ/または
グリシンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 83および84より選択され、かつ/または
ヒスチジンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 85および86より選択され、かつ/または
イソロイシンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 87および88より選択され、かつ/または
ロイシンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 89、90、および91より選択され、かつ/または
リジンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 92および93より選択され、かつ/または
フェニルアラニンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 94および 95より選択され、かつ/または
プロリンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 96および97より選択され、かつ/または
セリンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 98、99、および100より選択され、かつ/または
トレオニンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 101、102、および103より選択され、かつ/または
チロシンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 104および105より選択され、かつ/または
バリンのためのアミノ酸コドンモチーフが、SEQ ID NO: 106、107、および108より選択される
ことを特徴とする、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドが、抗体、もしくは抗体断片、または抗体融合ポリペプチドであることを特徴とする、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月12日(2017.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
【図１】ポリペプチドを含む上清のウェスタンブロットを示す図である。
【図２】SDSによって抽出された細胞沈殿物画分のウェスタンブロットを示す図である。
【図３】公知のscFv-ポリHis濃度5つから得られたタンパク質検量線を示す図である。