(57)【要約】【課題】画像に基づいてコロニーの領域を精度よく特定することができ、コロニーの領域の特定およびコロニー内の細胞の移動速度算出の自動化を可能とする細胞の評価方法および細胞評価装置を提供する。【解決手段】細胞の画像を撮影する撮影ステップと、撮影された細胞撮影画像Ｗから解析用画像ＡＷを形成する領域判別ステップと、解析用画像ＡＷを比較してコロニーの移動速度を算出する移動速度算出ステップと、を備えており、領域判別ステップでは、細胞撮影画像を複数のブロックに分割して各ブロックの輝度値を二値化してコロニー領域を特定し、細胞撮影画像Ｗにおけるコロニー領域ＣＡに対応するブロック以外のブロックを背景とする解析用画像ＡＷを形成し、移動速度算出ステップでは、異なる時間に撮影された細胞撮影画像Ｗの解析用画像ＡＷに基づいて、コロニー領域ＣＡ内に位置する各ブロックｂに対応する細胞の移動速度および移動方向を算出する。【選択図】図１
2018019632.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の画像を撮影する撮影ステップと、
撮影ステップにおいて撮影された細胞撮影画像から解析用画像を形成する領域判別ステップと、
異なる時間に撮影された細胞撮影画像に基づいて形成された解析用画像を比較して、コロニーの移動速度を算出する移動速度算出ステップと、を備えており、
前記領域判別ステップでは、
細胞撮影画像を複数のブロックに分割して、各ブロックにおける輝度値の分散を算出し、
各ブロックにおける輝度値の分散に基づいて、各ブロックの輝度値を二値化してコロニー領域を特定し、
細胞撮影画像におけるコロニー領域に対応するブロック以外のブロックを背景とする解析用画像を形成し、
前記移動速度算出ステップでは、
異なる時間に撮影された細胞撮影画像の解析用画像に基づいて、コロニー領域内に位置する各ブロックに対応する細胞の移動速度および移動方向を算出する
ことを特徴とする細胞の評価方法。
【請求項２】
前記領域判別ステップでは、
各ブロックの輝度値を二値化して得られたコロニー領域についてオープニング処理およびクロージング処理を行った後、解析用画像を形成する
ことを特徴とする請求項１記載の細胞の評価方法。
【請求項３】
前記領域判別ステップでは、
各ブロックの輝度値を二値化して得られたコロニー領域について、直接またはオープニング処理およびクロージング処理を行った後にラベリング処理を行い、その後、解析用画像を形成する
ことを特徴とする請求項２記載の細胞の評価方法。
【請求項４】
細胞を撮影する画像撮影手段と、
該画像撮影手段によって撮影された複数の細胞撮影画像に基づいて、細胞の移動速度を算出する移動速度算出段と、を備えており、
該移動速度算出段は、
前記画像撮影手段によって撮影された各細胞撮影画像の解析用画像を形成する画像処理部と、
異なる時間に撮影された細胞撮影画像の解析用画像に基づいてコロニーの移動速度を算出する移動速度算出部と、を備えており、
前記画像処理部は、
細胞撮影画像を複数のブロックに分割して、各ブロックにおける輝度値の分散を算出する分散算出機能と、
該分散算出機能によって算出された各ブロックにおける輝度値の分散に基づいて、各ブロックの輝度値を二値化してコロニー領域を特定するコロニー領域特定機能と、
細胞撮影画像における該コロニー領域特定機能によって特定されたコロニー領域以外の部分を背景とした解析用画像を形成する解析用画像形成機能と、を有しており、
前記移動速度算出部は、
異なる時間に撮影された細胞撮影画像の解析用画像に基づいて、コロニー領域内に位置する各ブロックに対応する細胞の移動速度および移動方向を算出する機能を有している
ことを特徴とする細胞評価装置。
【請求項５】
前記解析用画像形成部は、
前記コロニー領域特定機能が特定したコロニー領域についてオープニング処理およびクロージング処理を行った後、解析用画像を形成する
ことを特徴とする請求項４記載の細胞評価装置。
【請求項６】
前記領域判別ステップでは、
各ブロックの輝度値を二値化して得られたコロニー領域について、直接またはオープニング処理およびクロージング処理を行った後にラベリング処理を行い、その後、解析用画像を形成する
ことを特徴とする請求項５記載の細胞評価装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の評価方法および細胞評価装置に関する。さらに詳しくは、シャーレ等において培養されている細胞の状態を評価するために使用される細胞の評価方法および細胞評価装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、人体の組織から採取し、摂取した細胞を人工培養して組織を形成し、その組織を人体に戻す再生医療が研究開発されている。例えば、人の表皮細胞や角膜上皮細胞、口腔上皮細胞、軟骨細胞の組織では、既に、人工培養された組織を人体に戻す製品も実用化されている。
【０００３】
かかる人工培養では、採取した細胞が細胞分裂によって増殖することによって組織が形成される。したがって、良好な組織を効率よく製造する上では、増殖能の高い細胞を使用して培養を行うことが重要であり、かかる組織を見分けることが必要である。
【０００４】
従来、細胞や複数の細胞からなるコロニーの画像を撮影して、細胞やコロニー等（以下細胞等という）の状態を分析することが行われている。例えば、特許文献１〜３には、培養中の細胞等の画像を撮影し、その細胞等の画像の画素値や細胞等の画像の形状に基づいて、細胞等の状態や品質を評価する技術が開示されている。
【０００５】
一方、特許文献４には、細胞の運動を解析することで、幹細胞コロニーを同定する技術が開示されている。具体的には、インターバル撮像された画像からコロニーを特定し、このコロニーに含まれる特定ピクセルでの輝度の変化に基づいて、コロニー内の細胞の移動速度を求め、この移動速度を指標として細胞の増殖能を評価する技術が開示されている。また、特許文献４には、インターバル撮像された２枚の細胞撮影画像から、コロニー内の各ピクセルにおける輝度差の絶対値を算出し、コロニー内の輝度差の絶対値の総量をコロニーの面積値で除したモーション・インデックスを利用して、コロニー内の細胞の増殖能を評価する技術も開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１５−１５４７２９
【特許文献２】特開２０１５−０６５８１２
【特許文献３】特開２０１４−０１８１８４
【特許文献４】特開２０１４−０８３０４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献４の技術によって、コロニー内の細胞の増殖能をある程度の精度で推定することは可能であるが、画像中には、多数のコロニーや細胞が撮影されているため、コロニーの領域を特定することが難しい。コロニーの領域を適切に特定できなければ、細胞の移動速度に基づく細胞の増殖能の評価を適切に行えないので、コロニーの領域を精度よく特定する方法が求められている。
【０００８】
また、現状では、インターバル撮像された画像に基づくコロニーの領域の特定は、実験者が撮影された画像を確認しながら行っている。このため、作業に非常に手間と時間が掛かっており、コロニーの領域の特定を自動化する方法が望まれている。
【０００９】
本発明は上記事情に鑑み、画像に基づいてコロニーの領域を精度よく特定することができ、コロニーの領域の特定およびコロニー内の細胞の移動速度算出の自動化を可能とする細胞の評価方法および細胞評価装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（細胞の評価方法）
第１発明の細胞の評価方法は、細胞の画像を撮影する撮影ステップと、撮影ステップにおいて撮影された細胞撮影画像から解析用画像を形成する領域判別ステップと、異なる時間に撮影された細胞撮影画像に基づいて形成された解析用画像を比較して、コロニーの移動速度を算出する移動速度算出ステップと、を備えており、前記領域判別ステップでは、細胞撮影画像を複数のブロックに分割して、各ブロックにおける輝度値の分散を算出し、各ブロックにおける輝度値の分散に基づいて、各ブロックの輝度値を二値化してコロニー領域を特定し、各細胞撮影画像におけるコロニー領域に対応するブロック以外のブロックを背景とする解析用画像を形成し、前記移動速度算出ステップでは、異なる時間に撮影された細胞撮影画像の解析用画像に基づいて、コロニー領域内に位置する各ブロックに対応する細胞の移動速度および移動方向を算出することを特徴とする。
第２発明の細胞の評価方法は、第１発明において、前記領域判別ステップでは、各ブロックの輝度値を二値化して得られたコロニー領域についてオープニング処理およびクロージング処理を行った後、解析用画像を形成することを特徴とする。
第３発明の細胞の評価方法は、第１または２発明において、前記領域判別ステップでは、各ブロックの輝度値を二値化して得られたコロニー領域について、直接またはオープニング処理およびクロージング処理を行った後にラベリング処理を行い、その後、解析用画像を形成することを特徴とする。
（細胞評価装置）
第４発明の細胞評価装置は、細胞を撮影する画像撮影手段と、該画像撮影手段によって撮影された複数の細胞撮影画像に基づいて、細胞の移動速度を算出する移動速度算出段と、を備えており、該移動速度算出段は、前記画像撮影手段によって撮影された各細胞撮影画像の解析用画像を形成する画像処理部と、異なる時間に撮影された細胞撮影画像の解析用画像に基づいてコロニーの移動速度を算出する移動速度算出部と、を備えており、前記画像処理部は、細胞撮影画像を複数のブロックに分割して、各ブロックにおける輝度値の分散を算出する分散算出機能と、該分散算出機能によって算出された各ブロックにおける輝度値の分散に基づいて、各ブロックの輝度値を二値化してコロニー領域を特定するコロニー領域特定機能と、各細胞撮影画像における前記コロニー領域特定機能によって特定されたコロニー領域以外の部分を背景とした解析用画像を形成する解析用画像形成機能と、を有しており、前記移動速度算出部は、異なる時間に撮影された細胞撮影画像の解析用画像に基づいて、コロニー領域内に位置する各ブロックに対応する細胞の移動速度および移動方向を算出する機能を有していることを特徴とする。
第５発明の細胞評価装置は、第４発明において、前記解析用画像形成部は、前記コロニー領域特定機能が特定したコロニー領域についてオープニング処理およびクロージング処理を行った後、解析用画像を形成することを特徴とする。
第６発明の細胞評価装置は、第４または第５発明において、前記領域判別ステップでは、各ブロックの輝度値を二値化して得られたコロニー領域について、直接またはオープニング処理およびクロージング処理を行った後にラベリング処理を行い、その後、解析用画像を形成することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
（細胞の評価方法）
第１発明によれば、コロニー領域を抽出した解析用画像を自動で形成することができるので、コロニー領域内に位置する各ブロックに対応する細胞の移動速度および移動方向を簡便に算出することができる。すると、コロニー領域内の各細胞の移動速度および移動方向に基づいて、コロニーの移動をその移動方向を含めて把握できるので、コロニーの状態を簡単に判断することができる。
第２発明によれば、特定されるコロニー領域と実際のコロニーのズレを小さくできるので、コロニー領域内の各細胞の移動速度および移動方向をより精度よく算出することができる。
第３発明によれば、コロニー領域を最大化することができるので、より多くの細胞を用いて移動速度が算出できるため、精度の向上が期待できる。
（細胞評価装置）
第４発明によれば、コロニー領域を抽出した解析用画像を自動で形成することができるので、コロニー領域内に位置する各ブロックに対応する細胞の移動速度および移動方向を簡便に算出することができる。すると、コロニー領域内の各細胞の移動速度および移動方向に基づいて、コロニーの移動をその移動方向を含めて把握できるので、コロニーの状態をより簡単に判断することができる。
第５発明によれば、特定されるコロニー領域と実際のコロニーのズレを小さくできるので、コロニー領域内の各細胞の移動速度および移動方向をより精度よく算出することができる。
第６発明によれば、コロニー領域を最大化することができるので、より多くの細胞を用いて移動速度が算出できるため、精度の向上が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本実施形態の細胞評価装置１の概略説明図である。
【図２】（Ａ）は本実施形態の細胞評価装置１によって撮影された細胞撮影画像Ｗの一例であり、（Ｂ）は細胞撮影画像Ｗを枡目状のブロックに分割した一例である。
【図３】（Ａ）は細胞撮影画像Ｗを二値化した二値化画像ＤＷの一例であり、（Ｂ）は二値化画像ＤＷにオープニングクロージング処理した画像の一例である。
【図４】（Ａ）は二値化画像ＤＷに対してラベリング処理をした画像の一例であり、（Ｂ）は細胞撮影画像Ｗにおいてコロニー領域ＣＡ以外の部分を背景画像とした解析用画像ＡＷの一例である。
【図５】（Ａ）は解析用画像ＡＷとオプティカルフローを重ねた画像の一例であり、（Ｂ）は実施例の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の細胞評価方法は、細胞が集まって形成されたコロニーの状態を判断する方法であって、コロニー領域の特定を精度よくしかも自動でできるようにしたことに特徴を有している。
【００１４】
本発明の細胞の評価方法によって評価される細胞はとくに限定されない。シャーレなどにおいて培養した際に、複数の細胞が集積してコロニーを形成するものであればよい。例えば、ヒト表皮角化細胞や角膜上皮角化細胞、口腔上皮角化細胞等をあげることができる。
【００１５】
（細胞評価装置１）
【００１６】
本発明の細胞の評価方法では、シャーレなどにおいて培養されコロニーを形成した細胞を撮影し、撮影された画像を解析してコロニーを形成する細胞の移動速度および移動方向を算出する。そして、算出された細胞の移動速度および移動方向に基づいてコロニーの状態を判断する。
【００１７】
まず、本発明の細胞の評価方法を説明する前に、本発明の細胞の評価方法に使用される細胞評価装置１を説明する。
【００１８】
（光源２）
図１に示すように、細胞評価装置１は、シャーレ内の細胞に光を照射する光源２を備えている。この光源２は、培養している細胞に影響を与えない光を照射するものであればよく、とくに限定されない。例えば、一般的な白色の蛍光灯や白色のＬＥＤ等を光源２として採用することができる。なお、シャーレに光を照射する方法はとくに限定されず、シャーレの裏面（底側）から光を照射してもよいし（図１参照）、シャーレの表面（細胞側）から光を照射してもよい。細胞を撮影した画像（細胞撮影画像Ｗ）の解析において、輝度を利用する場合には、シャーレの裏面から光を照射する方が、輝度差が生じやすくなるという点では好ましい。
【００１９】
（画像撮影手段３）
細胞評価装置１は、シャーレ内の細胞を撮影する画像撮影手段３を備えている。画像撮影手段３は、シャーレ内の細胞を時間連続的に撮影できるものである。ここでいう時間連続的とは、所定の時間間隔を空けて細胞撮影画像Ｗ（図２（Ａ）参照）を撮影する場合を含んでいる。細胞の動きは非常に遅く数μｍ／ｈから数十μｍ／ｈ程度であるので、１〜６０分間隔で細胞撮影画像Ｗを撮影することも、ここでいう時間連続的撮影に該当する。かかる撮影を実施する機器としては、例えば、顕微鏡に搭載されている画像撮影機能や、顕微鏡に搭載可能な公知の撮影機器(例えばＣＣＤカメラなど)等をあげることができる。なお、画像撮影手段３が撮影した細胞撮影画像Ｗは、移動速度算出手段５の記憶部に記憶されるようになっている。
【００２０】
（移動速度算出手段５）
図１に示すように、細胞評価装置１は、画像撮影手段３が撮影した細胞撮影画像Ｗに基づいて、細胞の移動速度を算出する移動速度算出手段５を備えている。この移動速度算出手段５は、画像処理部６と、移動速度算出部１０と、を備えている。
【００２１】
（画像処理部６）
画像処理部６は、画像撮影手段３が撮影した各細胞撮影画像Ｗの解析用画像ＡＷを形成するものであり、分散算出機能６ａと、コロニー領域特定機能６ｂと、解析用画像形成機能６ｃと、を備えている。
【００２２】
まず、分散算出機能６ａは、各細胞撮影画像Ｗを複数のブロックｂに分割して、各ブロックｂにおける輝度値の分散を算出する機能である。具体的には、図２（Ｂ）に示すように、分散算出機能６ａは、細胞撮影画像を枡目状のブロックに分割して各ブロックｂの輝度値を求める。そして、各ブロックｂにおいて、それぞれ輝度値の分散を算出する。例えば、ＣＣＤカメラ等の画像撮影手段３を使用した場合には、各ブロックｂは、１つのブロックｂに画像撮影手段３が撮影した細胞撮影画像Ｗの複数の画素が存在するように設定される。すると、各ブロックｂの輝度値の分散は以下の式１によって算出することができる。
【数１】
2018019632.tif 000003
【００２３】
コロニー領域特定機能６ｂは、分散算出機能６ａによって算出された各ブロックｂにおける輝度値の分散に基づいて、各ブロックｂの輝度値の分散を二値化してコロニー領域を特定する機能を有している。
【００２４】
具体的には、コロニー領域特定機能６ｂは、判別法分析法によって、各ブロックｂにおける輝度値の分散を利用して、以下の式２によって、細胞撮影画像Ｗを二値化する際の閾値を算出する機能も有している。
【数２】
2018019632.tif 000004
【００２５】
なお、コロニー領域特定機能６において、細胞撮影画像Ｗを二値化する際の閾値を算出する方法は判別法分析法に限られず、種々の方法を採用することができる。例えば、モード法や注目画素の平均を用いた適応的な方法を使用して、閾値を求めてもよい。
【００２６】
コロニー領域特定機能６ｂは、算出された閾値を基準として、細胞撮影画像Ｗを二値化した二値化画像ＤＷを形成する機能を有している。つまり、細胞撮影画像Ｗにおいて、輝度値の分散が閾値以上のブロックｂを白、輝度値の分散が閾値より小さいブロックｂを黒、とした二値化画像ＤＷを形成する。すると、二値化画像ＤＷにおいて、白色で表示されている部分を、コロニー領域ＣＡとして特定することができる（図３（Ａ）参照）。
【００２７】
解析用画像形成機能６ｃは、コロニー領域特定機能６ｂによって特定されたコロニー領域ＣＡに基づいて、解析用画像ＡＷを形成する機能を有している。具体的には、二値化画像ＤＷを形成した細胞撮影画像Ｗから、コロニー領域ＣＡの部分は細胞撮影画像Ｗをそのまま使用し、コロニー領域ＣＡ以外の部分を背景画像とした解析用画像ＡＷを形成する（図４（Ｂ）参照）。このように形成された各細胞撮影画像Ｗの解析用画像ＡＷは、各細胞撮影画像Ｗおよびその細胞撮影画像Ｗが撮影された時間と関連付けられた状態で記憶部に記憶される。なお、背景画像は、背景画像に相当するブロックｂの輝度を落としたりすることによって形成することができる。
【００２８】
（オープニングクロージング処理）
なお、二値化画像ＤＷのコロニー領域ＣＡでは、細胞撮影画像Ｗにおけるコロニー領域の境界が不鮮明であることに起因して、コロニー領域ＣＡの判断ミスが生じる。例えば、本来コロニー領域ＣＡと判断されるべきブロックｂが背景として判断されてコロニー領域ＣＡ内に欠損（孔）が形成される可能性がある（図３（Ａ）参照）。また、本来コロニー領域ＣＡと判断されるべきではないブロックｂがコロニー領域ＣＡと判断されて、コロニー領域ＣＡの周囲に突起状の凹凸が形成されたりする可能性がある（図３（Ａ）参照）。
【００２９】
かかる不良を防止するために、解析用画像形成機能６ｃは、解析用画像ＡＷを形成する前に、二値化画像ＤＷのコロニー領域ＣＡに対してオープニング処理およびクロージング処理（以下、両方を合せてオープニングクロージング処理という）を行う機能を有していてもよい。オープニングクロージング処理を行えば、二値化画像ＤＷのコロニー領域ＣＡと実際のコロニーのズレを小さくできるので、コロニー領域ＣＡの形状を適切な形状にすることができる（図３（Ｂ）参照）。すると、後述する移動速度算出部１０において、コロニー領域ＣＡ内の各細胞の移動速度および移動方向をより精度よく算出することができる。
【００３０】
オープニング処理は、二値化画像ＤＷのコロニー領域ＣＡを縮小させたのち再度膨張させることによって、コロニー領域ＣＡおける外縁部に形成された突起状の部分等を除去する処理である。具体的には、コロニー領域ＣＡを形成するブロックｂのうち、背景と接するブロックｂを一旦削除する（つまり背景と接するブロックｂを一旦背景のブロックｂとする）。すると、コロニー領域ＣＡが縮小された状態となり、細かな凹凸等を形成していたブロックｂが除去される。その後、縮小されたコロニー領域ＣＡと接する背景のブロックｂをコロニー領域ＣＡに追加する。すると、二値化画像ＤＷのコロニー領域ＣＡは、その面積を元のコロニー領域ＣＡと同等としつつ、外縁に位置していた凹凸等が除去される。したがって、コロニー領域ＣＡの最外縁の形状を適切な形状にすることができる。
【００３１】
クロージング処理は、二値化画像ＤＷのコロニー領域ＣＡを膨張させたのち再度縮小することによって、コロニー領域ＣＡの内部に形成された孔等の欠損部を補てんする処理である。具体的には、コロニー領域ＣＡを形成するブロックｂのうち、背景と接するブロックｂを一旦コロニー領域ＣＡのブロックｂとする。すると、コロニー領域ＣＡが拡大された状態となる。すると、コロニー領域ＣＡ内に存在していた小さい孔はコロニー領域ＣＡに組み込まれる。その後、コロニー領域ＣＡにおいて背景のブロックｂと接するブロックｂを除去する。このとき、コロニー領域ＣＡ内部には背景のブロックｂと接するブロックｂが無いので、コロニー領域ＣＡの面積を元の状態に維持しつつ、コロニー領域ＣＡ内の孔を埋めることができる。
【００３２】
なお、オープニング処理とクロージング処理を実施する順番はとくに限定されない。しかし、コロニー領域外に存在する面積が小さいブロック（突起等）を効果的に除去する上では、オープニング処理を実施してからクロージング処理を行う方が望ましい。一方、コロニー領域が細い線状領域で連結している場合に、この線状領域でコロニー領域が途切れることを防ぎつつコロニー領域内の小さい孔を埋める上では、クロージング処理を実施してからオープニング処理を行う方が望ましい。
【００３３】
（ラベリング処理）
解析用画像形成機能６ｃは、二値化画像ＤＷのコロニー領域ＣＡ、または、上述したオープニングクロージング処理後のコロニー領域ＣＡについて、ラベリング処理を行う機能を有していてもよい。ラベリング処理を行えば、つながっているコロニー領域ＣＡを一つのコロニー領域ＣＡとして処理することができるので、コロニー領域ＣＡを最大化することができる。コロニー領域ＣＡを最大化することができれば、より多くの細胞を用いて移動速度が算出できるため、算出される移動速度の精度向上が期待できるという利点が得られる。例えば、図４（Ａ）のように複数の領域が存在している場合にラベリング処理を行えば、コロニー領域ＣＡと他の細胞の領域を区別することができる。
【００３４】
とくに、オープニングクロージング処理後のコロニー領域ＣＡについて、ラベリング処理を行えば、画像の端に存在する細胞のエッジの影響を取り除けるという点で好ましい。
【００３５】
ラベリング処理は、コロニー領域ＣＡの各ブロックｂについて、縦、横方向に連続しているブロックｂを同じラベルにする方法（４連結）と、縦、横に加えて斜め方向に連続しているブロックｂも同じラベルにする方法（８連結）がある。このいずれの方法でラベリング処理を実施してもよく、コロニー領域ＣＡの状態に合わせて適宜使用すればよい。例えば、４連結でラベリングすれば、オープニングクロージング処理で取り除けなかった斜めに繋がる細い突起を取り除くことができるという利点がある。一方、８連結でラベリングすれば、なるべく大きなコロニー領域ＣＡを抽出できるという利点がある。
【００３６】
（移動速度算出部１０）
移動速度算出部１０は、異なる時間に撮影された細胞撮影画像Ｗから得られた解析用画像ＡＷに基づいて、コロニー領域ＣＡ内に位置する各ブロックｂに対応する細胞の移動速度および移動方向、つまり、オプティカルフローを算出する機能を有している。具体的には、移動速度算出部１０は、異なる時間に撮影された細胞撮影画像Ｗから得られた解析用画像ＡＷにおいて、同じ細胞が存在していると判断できるブロックｂを求めて、そのブロックｂの相対的位置とその距離から、細胞の移動速度および移動方向を算出する。すると、コロニー領域ＣＡ内の細胞の動きを推定できるので、細胞の動きに基づいてコロニー自体の動きを判断することができる。つまり、コロニー領域自体の移動をその移動方向を含めて把握できるので、コロニーの状態をより精度よく判断することができる。
【００３７】
なお、コロニーの状態を判断するための指標として、移動速度算出部１０は、オプティカルフローの平均速度を算出する機能を有していることが望ましい。オプティカルフローの平均速度が把握できれば、コロニーの活性を評価することができる。
【００３８】
また、移動速度算出部１０は、細胞撮影画像Ｗ（または解析用画像ＡＷ）とオプティカルフローを重ねた画像を形成する機能を有していることが望ましい（図５（Ａ））。すると、コロニー内の細胞の動きやそれに伴うコロニーの動きを画像として確認できるので、コロニーの状態を判断しやすくなる。
【００３９】
なお、細胞の移動速度および移動方向を算出する方法はとくに限定されず、オプティカルフローを求める公知の方法を採用することができる。
例えば、以下のような方法でオプティカルフローを求めることができる（参考文献：G. Farneback: Two-frame motion estimation based on polynomial expansion. Image Analysis, in Lecture Notes in Computer Science, vol. 2749, pp. 363-370. Springer, Heidelberg (2003)）。
【００４０】
まず、時刻ｔおける各位置の輝度値を式３の二次多項式で近似する。
【数３】
2018019632.tif 000005
【００４１】
短い時間で対応する位置（ｘ，ｙ）の明るさが変化しないことを仮定すると以下の式４が成立する。
【数４】
2018019632.tif 000006
【００４２】
係数比較を行うことで得られるオプティカルフローに関する連立方程式（式５）のを解くことでプティカルフローを求めることができる。
【数５】
2018019632.tif 000007
【００４３】
（細胞の評価方法）
つぎに、上述した細胞評価装置１を用いて、細胞を評価する手順を説明する。
【００４４】
（撮影ステップ）
まず、評価対象となる細胞が培養されているシャーレを、画像撮影手段３の撮影位置に設置する。そして、光源２から光を照射しながら、細胞の画像（細胞撮影画像Ｗ（図２（Ａ）））を撮影し、複数枚の細胞撮影画像Ｗを記憶部に記録する。
【００４５】
撮影が終了すると、細胞評価装置１の移動速度算出手段５の画像処理部６によって、複数枚の細胞撮影画像Ｗを処理する。
【００４６】
（領域判別ステップ）
まず、画像処理部６の分散算出機能６ａによって、細胞撮影画像Ｗを複数のブロックｂに分割して（図３（Ｂ））、各ブロックｂにおける輝度値の分散を算出する。
【００４７】
（二値化画像ＤＷ形成）
細胞撮影画像Ｗの全てのブロックｂの輝度値の分散が算出されれば、コロニー領域特定機能６ｂは、細胞撮影画像Ｗを二値化する閾値を算出する。そして、閾値が算出されると、細胞撮影画像Ｗを二値化した二値化画像ＤＷを形成する（図４（Ａ））。すると、細胞のコロニーが形成されていると判断されるコロニー領域ＣＡと背景の領域に分離される。
【００４８】
（オープニングクロージング処理）
ついで、二値化画像ＤＷについて、オープニングクロージング処理が実施される。すると、二値化処理だけで特定されたコロニー領域ＣＡが修正されて、適切な形状を有するコロニー領域ＣＡが形成される（図３（Ｂ））。
【００４９】
（ラベリング処理）
さらに、オープニングクロージング処理が実施された二値化画像ＤＷについて、ラベリング処理が実施される。ラベリング処理によって、コロニー領域ＣＡが最大化された二値化画像ＤＷが形成される（図４（Ａ））。
【００５０】
（解析用画像ＡＷ形成）
ラベリング処理された二値化画像ＤＷを使用して、解析用画像形成機能６ｃによって、解析用画像ＡＷが形成される（図４（Ｂ））。つまり、コロニー領域ＣＡの部分は細胞撮影画像Ｗをそのまま使用し、コロニー領域ＣＡ以外の部分を背景画像とした解析用画像ＡＷが形成される。そして、形成された解析用画像ＡＷは、解析用画像ＡＷの元となった細胞撮影画像Ｗおよび撮影された時間と関連付けられた状態で記憶部に記憶される。
【００５１】
（速度算出ステップ）
全ての細胞撮影画像Ｗについて解析用画像ＡＷが形成されると、解析用画像ＡＷを使用して移動速度算出部１０によってコロニー領域ＣＡ内の細胞についてオプティカルフローが算出される。そして、このオプティカルフローに基づいて、平均移動速度を算出すれば、コロニー領域ＣＡに対応するコロニーの活性を評価することができる。
【００５２】
また、細胞撮影画像Ｗ（または解析用画像ＡＷ）とオプティカルフローを重ねた画像を形成すれば、コロニー内の細胞の動きやそれに伴うコロニーの動きを画像として確認できるので、コロニーの状態を判断しやすくなる（図５（Ａ））。
【実施例】
【００５３】
本発明の細胞の評価方法によって、適切に細胞の動きを評価できることを確認した。
実験では、培養した細胞を撮影した画像について、人がコロニーの移動速度を目視で求めた場合（比較例）と、本発明の方法によってコロニーの移動速度を自動で求めた場合（実施例）を比較した。
【００５４】
撮影した細胞は、ヒト表皮角化細胞であり、この細胞を３７℃、１０％二酸化炭素の環境下で６日間培養したものを使用した。
【００５５】
結果を図５（Ｂ）に示す。
図５（Ｂ）示すように、比較例と実施例では、測定されたコロニーの平均移動速度はほぼ正の相関を有している。しかも、比較例と実施例で測定された平均移動速度の差は小さいことから、本発明の方法によって、人が目視で測定する場合と同等程度の精度でコロニーの平均移動速度を測定できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の細胞の評価方法は、人の表皮細胞や角膜上皮角化細胞、口腔上皮角化細胞の組織を構成する細胞を評価する方法として適している。
【符号の説明】
【００５７】
１    細胞評価装置
２    光源
３    画像撮影装置
５    移動速度算出段
６    画像処理部
６ａ  分散算出機能
６ｂ  コロニー領域特定機能
６ｃ  解析用画像形成機能
１０    移動速度算出部
ｗ    細胞撮影画像
ｂ    ブロック
ＷＤ  二値化画像
ＡＷ  解析用画像
ＣＡ  コロニー領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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