(57)【要約】      （修正有）【課題】コクシジウム原虫の種特異的検出法及びそれに使用される試薬の提供。【解決手段】高病原性ウシコクシジウム原虫を検出するための試薬であって、下記の一方又は両方のポリヌクレオチドを含む試薬。（ｉ）特定の塩基配列又はその相補配列における連続した１５塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ii）（ｉ）と別の特定の塩基配列又はその相補配列に含まれる連続した１５塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド。前記（ｉ）及び（ｉｉ）がハイブリダイゼーションプロブであり、ＰＣＲ用プライマーである試薬。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
高病原性ウシコクシジウム原虫を検出するための試薬であって、
下記の一方または両方のポリヌクレオチドを含む試薬。
（ｉ）配列番号１の塩基配列またはその相補配列における連続した１５塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号２の塩基配列またはその相補配列に含まれる連続した１５塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記（ｉ）のポリヌクレオチドが配列番号１の塩基配列またはその相補配列からなり、前記（ii）のポリヌクレオチドが配列番号２の塩基配列またはその相補配列からなる、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
前記（ｉ）および（ii）のポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションプローブである、請求項１または２に記載の試薬。
【請求項４】
前記（ｉ）および（ii）のポリヌクレオチドがＰＣＲ用プライマーである、請求項１または２に記載の試薬。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の試薬を用いることを特徴とする、高病原性ウシコクシジウム原虫の検出方法。
【請求項６】
ウシコクシジウム原虫を検出するための試薬であって、
配列番号３の塩基配列またはその相補配列における連続した１５塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む試薬。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが配列番号３の塩基配列またはその相補配列からなる、請求項６に記載の試薬。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションプローブである、請求項６または７に記載の試薬。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の試薬を用いることを特徴とする、ウシコクシジウム原虫の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドを用いたウシ寄生性コクシジウム原虫の検出方法に関し、詳しくは種特異的配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた高病原性ウシコクシジウム原虫の検出方法およびウシコクシジウム原虫に共通する配列を有するオリゴヌクレオチドを用いたウシコクシジウム原虫の包括的検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウシコクシジウム症はウシ、特に仔ウシに頻発する感染症であり、Eimeria属の原虫によって引き起こされ、下痢や血便などの症状を引き起こし、重篤な感染例ではウシの斃死、体重減少、発育不全などにつながり、畜産産業に莫大な被害を与えている。ウシコクシジウム症の病因原虫は、主に、Eimeria alabamensis (E. alabamensis)、Eimeria bukidnonensis (E. bukidnonensis)、Eimeria subspherica (E. subspherica)、Eimeria zuernii (E. zuernii)、Eimeria bovis (E. bovis)、Eimeria ellipsoidalis (E. ellipsoidalis)、Eimeria cylindrica (E. cylindrica)、Eimeria wyomingensis (E. wyomingensis)、Eimeria canadensis (E. canadensis)が挙げられ、特にそのうちの２種、E. bovisおよびE. zuerniiは病原性が強く、しかも種によって病態が異なるため、各々の種に適した対策をとる必要がある。
【０００３】
一般に、ウシコクシジウム症の診断は、糞便内に排出されるオオシストを顕微鏡で観察し、その形態から各種の病因原虫を判別することにより行われている。しかし、糞便の状態によってオオシストの観察が困難であったり、その形態的特徴が類似しているために、病因原虫を判別するためには高度の熟練を必要とするといった問題がある。また、解剖所見から診断する方法も行われているが、相当の時間と手間を要する。
【０００４】
一方、種特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法によるコクシジウム原虫の検出法が開発されている（特許文献１，２）。しかし、これらは鶏コクシジウム原虫の検出に関するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表2003-527112号公報
【特許文献２】特開2007-020543号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、正確、かつ簡単で迅速なウシコクシジウム原虫の検出法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、Eimeria属に属するウシコクシジウム原虫のribosomal RNA 遺伝子クラスター上の塩基配列に基づいて、ウシコクシジウム原虫の種特異的検出及び包括的検出に使用できる領域について検討した結果、ウシコクシジウム原虫のうち病原性の強いE. bovisおよびE. zuerniiに対する種特異的なオリゴヌクレオチド（以下、種特異的オリゴヌクレオチドとも呼ぶ）を開発することに成功した。さらに、ウシコクシジウム原虫に共通するオリゴヌクレオチド（以下、種共通オリゴヌクレオチドとも呼ぶ）の開発にも成功し、これらを用いてウシコクシジウム原虫を種特異的または包括的に検出できることを見出し
、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下を提供する。
［１］高病原性ウシコクシジウム原虫を検出するための試薬であって、
下記の一方または両方のポリヌクレオチドを含む試薬。
（ｉ）配列番号１の塩基配列またはその相補配列における連続した１５塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ii）配列番号２の塩基配列またはその相補配列に含まれる連続した１５塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
［２］前記（ｉ）のポリヌクレオチドが配列番号１の塩基配列またはその相補配列からなり、前記（ii）のポリヌクレオチドが配列番号２の塩基配列またはその相補配列からなる、［１］に記載の試薬。
［３］前記（ｉ）および（ii）のポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションプローブである、［１］または［２］に記載の試薬。
［４］前記（ｉ）および（ii）のポリヌクレオチドがＰＣＲ用プライマーである、［１］または［２］に記載の試薬。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の試薬を用いることを特徴とする、高病原性ウシコクシジウム原虫の検出方法。
［６］ウシコクシジウム原虫を検出するための試薬であって、
配列番号３の塩基配列またはその相補配列における連続した１５塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む試薬。
［７］前記ポリヌクレオチドが配列番号３の塩基配列またはその相補配列からなる、［６］に記載の試薬。
［８］前記ポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションプローブである、［６］または［７］に記載の試薬。
［９］［６］〜［８］のいずれかに記載の試薬を用いることを特徴とする、ウシコクシジウム原虫の検出方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の種特異的オリゴヌクレオチドによれば、ウシコクシジウム原虫のうち、病原性の高いE. bovisおよびE. zuerniiを特異的に、迅速かつ簡便に検出できる。
また、本発明の種共通オリゴヌクレオチドによれば、ウシコクシジウム原虫を包括的に、迅速かつ簡便に検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Eimeriaリボソーム遺伝子クラスター上での各DNA プローブの位置を示す図。
【図２】共通プローブの領域の配列アラインメントを示す図。
【図３】共通プローブを用いたハイブリダイゼーションの結果を示す図（写真）。
【図４】E. bovis特異的プローブの領域の配列アラインメントを示す図。
【図５】E. bovis特異的プローブを用いた各種プラスミドに対するハイブリダイゼーションの結果を示す図（写真）。
【図６】E. bovis特異的プローブを用いた混合プラスミドに対するハイブリダイゼーションの結果を示す図（写真）。
【図７】E. zuernii特異的プローブの領域の配列アラインメントを示す図。
【図８】E. zuernii特異的プローブを用いた各種プラスミドに対するハイブリダイゼーションの結果を示す図（写真）。
【図９】E. zuernii特異的プローブを用いた混合プラスミドに対するハイブリダイゼーションの結果を示す図（写真）。
【図１０】共通プローブ、E. bovis特異的プローブおよびE. zuernii特異的プローブを用いたin situ ハイブリダイゼーションの結果を示す図（写真）。
【図１１】E. cylindrica特異的プローブ、E. subspherica特異的プローブおよびE. bukidnonensis特異的プローブそれぞれの領域の配列アラインメントを示す図。
【図１２】E. cylindrica特異的プローブ、E. subspherica特異的プローブおよびE. bukidnonensis特異的プローブを用いた各種プラスミドに対するハイブリダイゼーションの結果を示す図（写真）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について、具体的に説明する。
【００１２】
＜種特異的検出用オリゴヌクレオチド＞
本発明の種特異的ウシコクシジウム原虫検出用オリゴヌクレオチドは、E. bovisまたはE. zuerniiに特徴的な塩基配列を有する。従って、核酸分析によりE .bovisまたはE. zuerniiを特異的に検出することができる。
【００１３】
E. bovis特異的塩基配列として、具体的には、配列番号１の塩基配列を挙げることができる。配列番号１の塩基配列は、図１に示されるEimeriaリボソーム遺伝子クラスター上のITS1 領域に存在するE. bovis特異的塩基配列である（図４）。
E. bovis特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列またはその相補配列に含まれる、１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上の連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用することができる。E. bovis特異的オリゴヌクレオチドは配列番号１の塩基配列（全長）またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドでもよい。
【００１４】
E. zuernii特異的塩基配列として、具体的には、配列番号２の塩基配列を挙げることができる。配列番号１の塩基配列は、図１に示されるEimeriaリボソーム遺伝子クラスター上のITS1 領域に存在するE. zuernii特異的塩基配列である（図７）。
E. zuernii特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列またはその相補配列に含まれる１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上の連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用することができる。E. zuernii特異的オリゴヌクレオチドは配列番号２の塩基配列（全長）またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドでもよい。
【００１５】
なお、E. bovis特異的オリゴヌクレオチドおよびE. zuernii特異的オリゴヌクレオチドは対象の種のコクシジウム原虫の特異的検出が可能である限り、そのいずれかまたは両方の末端側に他の任意の配列を含んで構成されるものであってもよい。例えば、E. bovisまたはE. zuerniiの染色体上における配列番号１または２の領域の前後の数塩基の配列や検出に必要な付加配列などである。ただし、後述のプライマーとして使用される場合には３’側には他の配列が付加されないことが好ましい。前記配列には１もしくは複数（例えば２〜５、好ましくは２〜３）の塩基の置換、欠失および／または挿入が含まれる構成であってもよい。
【００１６】
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、必要に応じて適当な標識を施して用いることができる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドを放射性同位元素により標識化し、オートラジオグラフィー法により可視化する方法、本発明のオリゴヌクレオチドをジゴキシゲニンにより標識化し、抗ジゴキシゲニン抗体を用いた免疫組織化学法により可視化する方法、本発明のオリゴヌクレオチドをビオチンにより標識化し、抗ビオチン抗体によって検出する方法、さらには、ストレプトアビジンまたはアビジンを用いて検出する方法、消光色素、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ（ALP)や西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP)などの酵素等で標識、及び本発明のオリゴヌクレオチドをフルオレッセインやローダミン等の蛍光標識を用いて蛍光シグナルを検出する方法などが挙げられる。
【００１７】
本発明のE. bovis特異的オリゴヌクレオチドおよびE. zuernii特異的オリゴヌクレオチ
ドはPCR用のプライマーやハイブリダイゼーション用のプローブとして、試料中のE. bovisまたはE. zuerniiに由来する核酸を特異的に検出するために使用できる。
【００１８】
例えば、本発明のE. bovis特異的オリゴヌクレオチドまたはE. zuernii特異的オリゴヌクレオチドをプライマーの１つとして用いてPCRを行うことにより、試料中のE. bovisまたはE. zuerniiに由来する核酸を特異的に検出できる。
プライマーを用いてPCR増幅する方法としては、上記本発明のE. bovis特異的オリゴヌクレオチドまたはE. zuernii特異的オリゴヌクレオチドと、E. bovisまたはE. zuerniiのITS1領域（配列番号４または５）またはこれら原虫の染色体におけるITS1領域の近傍領域に設定されたオリゴヌクレオチド（相補鎖プライマー）を含むプライマーセットを用いて、試料中のE. bovisまたはE. zuernii に由来する核酸における標的配列を選択的に増幅させ、増幅された産物の有無を測定、または増幅産物をプローブ等で検出して測定することにより、試料中にE. bovisまたはE. zuerniiに特徴的な配列が存在しているか否かを検出する方法が挙げられる。
【００１９】
DNA増幅の有無の確認は、通常、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド、サイバーグリーンIなどで核酸染色することにより行うことができる。リアルタイムPCR装置を用いてPCRを行う場合は、その装置の検出システムにより自動的に短時間でDNA増幅の有無を確認することができる。例えば、PCR反応液中にサイバーグリーンIを添加した場合では、サイバーグリーンIが二本鎖DNAに結合したときに発する蛍光値から増幅産物量をサイクル毎にモニターすることが可能である。さらに、PCR後に融解曲線分析を行うことによりPCR増幅産物が目的の増幅産物であるかどうかを確認できる。
【００２０】
また、本発明のE. bovis特異的オリゴヌクレオチドまたはE. zuernii特異的オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブとして用いてハイブリダイゼーション反応を行うことにより、試料中のE. bovisまたはE. zuerniiに由来する核酸を特異的に検出できる。具体的には、E. bovis特異的オリゴヌクレオチドまたはE. zuernii特異的オリゴヌクレオチドを標識化して標識プローブとし、次いで、該標識プローブと試料中の核酸とをハイブリダイズさせ、標識プローブに由来するシグナルにより、ハイブリダイズ形成の有無を検出して、試料中のE .bovisまたはE. zuerniiに由来する核酸の検出を行うことができる。
【００２１】
また、Taq Man法に代表されるように、本発明のE. bovis特異的オリゴヌクレオチドまたはE. zuernii特異的オリゴヌクレオチドを蛍光標識し、該蛍光物質標識プローブを含む反応系でE. bovisまたはE. zuernii に由来する核酸を含む核酸配列を増幅させるためのPCRを行い、増幅産物を該プローブによる蛍光強度値として、リアルタイムPCR装置で自動的に検出することによってDNA増幅の有無を確認することができる。
【００２２】
また、Molecular Beacon法にも適用可能である。例えば、配列番号１または２に含まれる１５塩基以上の連続する塩基配列またはその相補配列の前後にステム形成配列を付加し、両末端に蛍光物質と消光物質を付加することでMolecular Beacon法用のプローブとすることもできる。
【００２３】
上記のようなプローブやプライマーを用いて検出反応を行い、E. bovisまたはE. zuerniiに由来する核酸の増幅の有無やハイブリダイズ形成の有無により、試料中に、E. bovisまたはE. zuerniiに特異的な塩基配列が存在するか否かを調べることができる。
なお、より正確な試験結果を得るために、上記のように本発明のE. bovisまたはE. zuernii特異的オリゴヌクレオチドを用いた検出を行った後、更にオオシストの解析など、他の公知の検出試験を行ってもよい。
【００２４】
本発明のE. bovisまたはE. zuerniiを特異的に検出する方法において、対象となる被検試料の種類は被検対象のウシより得られ、核酸を含むものであれば特に限定されない。例えば、ウシの糞便、唾液、皮膚、消化管粘膜などが挙げられる。検出対象の核酸としては、E. bovisまたはE. zuernii に由来するDNAやRNAが挙げられるがDNAが好ましい。
【００２５】
本発明は、また、E. bovisまたはE. zuerniiを特異的に検出するための試薬に関する。該試薬は、上述した、本発明のE. bovis特異的オリゴヌクレオチドまたはE. zuernii特異的オリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含むものであれば、その構成は特に限定されない。
該キットには、使用目的等に応じて、適当な試薬や検出手段、各種容器等を含めることができる。例えば、プライマー伸長生成物を合成するためのPCR用試薬、DNAポリメラーゼなどの酵素や、標識を検出するための手段、試料中に含まれる２本鎖ＤＮＡの鎖を分離するための手段、コントロールの核酸、ハイブリダイゼーション用試薬、などを含めることができる。 
【００２６】
＜ウシコクシジウム原虫共通検出用オリゴヌクレオチド＞
本発明はまた、ウシコクシジウム原虫共通検出用オリゴヌクレオチドを提供する。
ウシコクシジウム原虫共通の塩基配列として、具体的には、配列番号３の塩基配列を挙げることが出来る。配列番号３の塩基配列は、図１に示されるEimeriaリボソーム遺伝子クラスター上の5.8S rRNA遺伝子領域に存在する各種ウシコクシジウム原虫間で保存された塩基配列である（図２）。
ウシコクシジウム原虫共通オリゴヌクレオチドは、配列番号３の塩基配列またはその相補配列に含まれる、１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上の連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用することができる。ウシコクシジウム原虫共通オリゴヌクレオチドは配列番号１の塩基配列（全長）またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドでもよい。
【００２７】
ウシコクシジウム原虫共通オリゴヌクレオチドは、上記＜種特異的検出用オリゴヌクレオチド＞で述べたのと同様に、PCR用プライマーやハイブリダイゼーション用プローブとして、標識されるなどして、試料中に含まれるウシコクシジウム原虫に由来する核酸を包括的に検出するために使用できる。ウシコクシジウム原虫共通オリゴヌクレオチドを用いた検出法、ウシコクシジウム原虫共通オリゴヌクレオチドを含む検出試薬の具体的態様も、上記＜種特異的検出用オリゴヌクレオチド＞で述べたのと同様とすることができる。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００２９】
１．共通プローブの設計・使用
E. alabamensis、E. bukidnonensis、E. subspherica、E. zuernii、E. bovis、E. ellipsoidalis、E. cylindrica、E. wyomingensis、E. canadensisのリボソーム遺伝子クラスター（図１）の塩基配列を解析し、共通プローブ（配列番号３）を、5.8SrRNA遺伝子上の、これら９種のうちEimeria canadensis を除く８種で保存された領域に設計した。この領域の配列アラインメントを図２に示す。ただし、プローブの設計配列（配列番号３）と E. canadensis の既知配列との違いは 1 塩基であることから、この共通プローブが E. canadensis を認識することも期待される。
【００３０】
上記で設計した共通プローブをジゴキシゲニン（DIG）で標識し、得られたDIG標識プローブを用いて以下の通りウシコクシジウム原虫の検出を行った。野外からコクシジウム原虫を採取し、従来のクローニング・シーケンス法で原虫 5 種を同定した。これら原虫の
標的配列部位（図２）を含むDNAを pMD19 (simple) (タカラバイオ) ベクターへ挿入し、各原虫のDNAを含むプラスミドを作成した。これらプラスミド DNAをメンブレン上へ 100 ng スポットし、DIGラベルされた上記共通プローブをハイブリダイズさせた。メンブレンのブロッキングではDIG Easy Hyb（Roche）を、またハイブリダイズではDIG Easy Hybへ0.1 mg/mlとなるようにpoly (A)を加えて用いた。ハイブリダイズは４２℃で１６時間として行った。プローブの濃度は、1 mlあたり2 pmolとした。結果を図３に示す。本発明の共通プローブは原虫 5 種すべての DNA とハイブリダイズすることが確認された。
【００３１】
２．Eimeria bovis特異的プローブの設計・使用
E. alabamensis、E. bukidnonensis、E. subspherica、E. zuernii、E. bovis、E. ellipsoidalis、E. cylindrica、E. wyomingensis、E. canadensisのリボソーム遺伝子クラスター（図１）の塩基配列を解析し、Eimeria bovis特異的プローブ（配列番号１）は、原虫種間で配列の差異の大きい ITS1 領域で設計した。図４に示すように、この領域は種ごとに塩基配列が著しく異なっている。
【００３２】
上記で設計したE. bovis特異的プローブをジゴキシゲニン（DIG）で標識し、得られたDIG標識プローブを用いて以下の通りウシコクシジウム原虫の検出を行った。上記の共通プローブを用いた解析と同様にし、メンブレン上に、５種類の原虫種の標的配列部位（図４）を含むプラスミド DNA 100 ng をスポットし、DIGラベルされた上記E. bovis特異的プローブをハイブリダイズさせた。結果を図５に示す。本発明のE. bovis特異的プローブは、E. bovisの配列を含むプラスミド DNA（スポット A）と特異的にハイブリダイズした。したがって、本プローブが E. bovis を特異的に検出することが示された。
【００３３】
野外では複数種の原虫が同時に寄生していることが多い。そこで複数種の原虫の混在する DNA 溶液から上記E. bovis特異的プローブが標的のE. bovisを検出できるか検証した。上記で使用した５種類のプラスミドを混合し、複数種の原虫 DNA が混在する溶液を調製した。これらの DNA 混合溶液に対して上記DIG標識プローブをハイブリダイズさせたところ、図６に示すように、当該プローブは標的種である E. bovis を含む溶液からはシグナルを生じさせたが、E. bovisを含まない４種類のプラスミドを混合した溶液からはシグナルを生じさせなかった。また、検出感度は単一種の溶液に対してハイブリダイズさせた場合と同等であった。したがって、本プローブが 複数の種を含む試料を用いた場合でもE. bovis を特異的に検出することが示された。
【００３４】
３．Eimeria zuernii特異的プローブの設計・使用
E. alabamensis、E. bukidnonensis、E. subspherica、E. zuernii、E. bovis、E. ellipsoidalis、E. cylindrica、E. wyomingensis、E. canadensisのリボソーム遺伝子クラスター（図１）の塩基配列を解析し、E. zuernii特異的プローブ（配列番号２）は、原虫種間で配列の差異の大きい ITS1 領域に設計した。図７に示すように、この領域は種ごとに塩基配列が著しく異なっている。
【００３５】
上記で設計したE. zuernii特異的プローブをジゴキシゲニン（DIG）で標識し、得られたDIG標識プローブを用いて以下の通りウシコクシジウム原虫の検出を行った。上記の共通プローブを用いた解析と同様にし、メンブレン上に、５種類の原虫種の標的配列部位（図７）を含むプラスミド DNA  100 ng をスポットし、DIGラベルされた上記E. zuernii特異的プローブをハイブリダイズさせた。結果を図８に示す。本発明の E. zuernii特異的プローブは、E. zuernii  の配列を含むプラスミド DNA（スポット A）と特異的にハイブリダイズした。したがって、本プローブが E. zuernii を特異的に検出することが示された。
【００３６】
野外では複数種の原虫が同時に寄生していることが多い。そこで複数種の原虫の混在す
る DNA 溶液から上記E. zuernii特異的プローブが標的のE. zuerniiを検出できるか検証した。上記で使用した５種類のプラスミドを混合し、複数種の原虫 DNA が混在する溶液を調製した。これらの DNA 混合溶液に対して上記DIG標識プローブをハイブリダイズさせたところ、図９に示すように、当該プローブは標的種であるE. zuerniiを含む溶液からはシグナルを生じさせたが、E. zuerniiを含まない４種類のプラスミドを混合した溶液からはシグナルを生じさせなかった。また、検出感度は単一種の溶液に対してハイブリダイズさせた場合と同等であった。したがって、本プローブが 複数の種を含む試料を用いた場合でもE. zuerniiを特異的に検出することが示された。
【００３７】
４．ウシ生体試料を用いた解析
上記共通プローブ、E. bovis特異的プローブ、およびE. zuernii特異的プローブを用い、ウシコクシジウム症の患畜から得た腸管を１０％中性緩衝ホルマリン溶液中で室温にて固定して保存した後，さらにパラフィン包埋後に切片での in situ ハイブリダイゼーションを行った。結果を図１０に示す。その結果、各プローブは、パラフィン切片上の原虫ともハイブリダイズすることが分かった。したがって、本発明のプローブは in situ ハイブリダイゼーションに応用できることが確認された。また、本プローブの作出により、腸管組織内に寄生している高病原性の原虫 2 種を顕微鏡観察下で同定することが可能になった。
【００３８】
５．比較例
E. alabamensis、E. bukidnonensis、E. subspherica、E. zuernii、E. bovis、E. ellipsoidalis、E. cylindrica、E. wyomingensis、E. canadensisのリボソーム遺伝子クラスター（図１）の塩基配列を解析し、E. cylindrica特異的プローブ（配列番号６）、E. subspherica特異的プローブ（配列番号７）およびE. bukidnonensis特異的プローブ（配列番号８）を、原虫種間で配列の差異の大きい ITS1 領域で設計した。図１１に示すように、この領域は種ごとに塩基配列が著しく異なっている。
これらの種特異的プローブを用いて、上記の共通プローブを用いた解析と同様にし、メンブレン上に、５種類の原虫種の標的配列部位（図１１のそれぞれ）を含むプラスミド DNA  100 ng をスポットし、DIGラベルされた上記E. cylindrica特異的プローブ、E. subspherica特異的プローブおよびE. bukidnonensis特異的プローブをハイブリダイズさせた。結果を図１２に示す。これらのプローブは種間で差異が大きい領域に設定したにもかかわらず、非特異的シグナルが検出されて、種特異的検出ができなかった。したがって、種間で差異が大きい領域に設定するだけでは、種特異的検出が必ずしも可能となるわけではないことがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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