(57)【要約】【課題】精度よく被験者のHLA遺伝子のアレルを判定することができる新たな方法の提供。【解決手段】以下の工程を含む、被験者のHLA遺伝子のアレルペアを判定する方法：（１）被験者から得られた生体試料中の配列解析情報（リード）を取得する工程、（２）公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの塩基配列情報を取得し、該エクソンおよび該イントロンの塩基配列情報と該HLAアレルのエクソンおよびイントロンとの対応関係を記録したHLA辞書を作成する工程、（３）工程（１）で取得されたリードが工程（２）で作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのエクソンまたはイントロンの塩基配列にと一致する場合、該リードは該塩基配列が含まれるアレルに一致すると判定する工程、（４）工程（３）でリードに一致すると判定されたアレルが含まれるHLA遺伝子に対する該リードの重みを計算する工程、（５）工程（４）で計算されたリードの重みを基に、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する工程、（６）工程（５）で計算されたスコアを最大にするアレルペアを探査し、被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、被験者のHLA遺伝子のアレルペアを判定する方法：
（１）被験者から得られた生体試料中のHLA遺伝子の部分塩基配列情報（リード）を取得する工程、
（２）公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの塩基配列情報を取得し、該エクソンおよび該イントロンの塩基配列情報と該HLAアレルのエクソンおよびイントロンとの対応関係を記録したHLA辞書を作成する工程、
（３）工程（１）で取得されたリードが工程（２）で作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのエクソンまたはイントロンの塩基配列に一致する場合、該リードは該塩基配列が含まれるアレルに一致すると判定する工程、
（４）工程（３）でリードに一致すると判定されたアレルが含まれるHLA遺伝子に対する該リードの重みを計算する工程、
（５）工程（４）で計算されたリードの重みを基に、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する工程、
（６）工程（５）で計算されたスコアを最大にするアレルペアを探査し、被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する工程。
【請求項２】
以下の工程を含む、被験者のHLA遺伝子のアレルペアを判定する方法：
（１）被験者から得られた生体試料中のHLA遺伝子の部分塩基配列情報（リード）を取得する工程、
（２）公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの塩基配列情報を取得し、該塩基配列情報にIDを割り当て、該IDと該HLAアレルのエクソンおよびイントロンの対応関係を記録したHLA辞書を作成する工程、
（３）以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を行う工程：
（Ａ）工程（１）で取得されたリード全長の５０％以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列が、工程（２）で作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのエクソンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が完全に一致する場合、該リードは該エクソンの塩基配列に割り当てられたIDと対応関係にあるエクソンが含まれるアレルと一致すると判定する、
（Ｂ）工程（１）で取得されたリード全長の５０％以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列が、工程（２）で作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのイントロンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が2塩基ミスマッチ以内で一致した場合、該リードは該イントロンの塩基配列に割り当てられたIDと対応関係にあるイントロンが含まれるアレルと一致すると判定する、
（Ｃ）工程（１）で取得されたリード全長の５０％以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列が、工程（２）で作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのイントロンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が2塩基ミスマッチ以内で一致しており、かつ該イントロンに一致しない残りの塩基配列が該イントロンと隣接する該HLA辞書に含まれるいずれかのエクソンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列に完全に一致する場合、該リードは該エクソンの塩基配列に割り当てられたIDと対応関係にあるエクソンが含まれるアレルと一致すると判定する、
（４）工程（１）で取得されたリードが、シングルエンドリードの場合、
【数１】
2018108042.tif 000033
に従い、工程（１）で取得されたリードが、ペアエンドリードの場合、
【数２】
2018108042.tif 000034
にさらに従い、工程（３）でリードに一致すると判定されたアレルが含まれるHLA遺伝子に対する該リードの重みを計算する工程、
（５）
【数３】
2018108042.tif 000035
に従い、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する工程、および
（６）
【数４】
2018108042.tif 000036
に従い、工程（５）で計算されたスコアを最大にするアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する（ただし、該スコアを最大にするアレルペアが
【数５】
2018108042.tif 000037
を満たす場合、スコアを最大にするアレルペアA, BにおけるアレルAのホモ接合型を被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する）工程。
【請求項３】
工程（２）で作成されるHLA辞書に記録される公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの塩基配列情報は、IPD-IMGT/HLAデータベースから取得される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（２）で作成されるHLA辞書に記録される公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの両端に工程（１）で取得されるリードの最大長の1/2倍のN配列が付加される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（５）の集合Tに、Class IのHLA遺伝子の第２エクソンおよび第３エクソン、Class IIのHLA遺伝子の第２エクソンが含まれる、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（６）において2種類以上のアレルペアで同一の最大スコアが得られた場合、以下の工程をさらに含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法：
（７）工程（５）の集合Tに、該アレルペアに含まれるアレル間でHLA辞書に共通して含まれるエクソンを追加し、再度、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する工程、
（８）工程（７）で計算されるスコアを最大にするアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する工程。
【請求項７】
工程（６）において2種類以上のアレルペアで同一の最大スコアが得られ、かつ該アレルペアに含まれるアレル間でHLA辞書に共通して含まれるエクソンが存在しない場合、以下の工程をさらに含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法：
（７’）工程（６）において得られた同一の最大スコアを有する2種類以上のアレルペアのうち、公知のデータベースに登録されているHLA遺伝子のアレル頻度数データを用いて、該アレルペアの各アレルの頻度の積が最も高いアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する工程。
【請求項８】
工程（７’）の公知のデータベースが、Allele Frequency Net Databaseである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
コンピュータを
被験者から得られた生体試料中のHLA遺伝子の部分塩基配列情報（リード）を受け付ける受付手段１;
公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの塩基配列情報を取得し、該エクソンおよび該イントロンの塩基配列情報と該HLAアレルのエクソンおよびイントロンとの対応関係を記録したHLA辞書を受け付ける受付手段２;
前記受け付けられたリードが前記受け付けられたHLA辞書に含まれるいずれかのエクソンまたはイントロンの塩基配列に一致する場合、該リードは該塩基配列が含まれるアレルに一致すると判定する判定手段１;
リードに一致すると判定された前記アレルが含まれるHLA遺伝子に対する該リードの重みを計算する計算手段１;
前記計算されたリードの重みを基に、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する計算手段２;
前記計算されたスコアを最大にするアレルペアを探査し、被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する判定手段２;
前記判定されたアレルペアを出力する出力手段;
として機能させるための被験者のHLA遺伝子のアレルペア判定用プログラム。
【請求項１０】
コンピュータを
被験者から得られた生体試料中のHLA遺伝子の部分塩基配列情報（リード）を受け付ける受付手段１;
公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの塩基配列情報を取得し、該塩基配列情報にIDを割り当て、該IDと該HLAアレルのエクソンおよびイントロンの対応関係を記録したHLA辞書を受け付ける受付手段２;
以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を行う判定手段１：
（Ａ）前記取得されたリード全長の５０％以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列が、前記作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのエクソンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が完全に一致する場合、該リードは該エクソンの塩基配列に割り当てられたIDと対応関係にあるエクソンが含まれるアレルと一致すると判定する、
（Ｂ）前記取得されたリード全長の５０％以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列が、前記作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのイントロンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が2塩基ミスマッチ以内で一致した場合、該リードは該イントロンの塩基配列に割り当てられたIDと対応関係にあるイントロンが含まれるアレルと一致すると判定する、
（Ｃ）前記取得されたリード全長の５０％以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列が、前記作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのイントロンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が2塩基ミスマッチ以内で一致しており、かつ該イントロンに一致しない残りの塩基配列が該イントロンと隣接する該HLA辞書に含まれるいずれかのエクソンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列に完全に一致する場合、該リードは該エクソンの塩基配列に割り当てられたIDと対応関係にあるエクソンが含まれるアレルと一致すると判定する;
前記取得されたリードが、シングルエンドリードの場合、
【数６】
2018108042.tif 000038
に従い、前記取得されたリードが、ペアエンドリードの場合、
【数７】
2018108042.tif 000039
にさらに従い、前記のリードに一致すると判定されたアレルが含まれるHLA遺伝子に対する該リードの重みを計算する計算手段１；
【数８】
2018108042.tif 000040
に従い、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する計算手段２；
【数９】
2018108042.tif 000041
に従い、前記計算されたスコアを最大にするアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する（ただし、該スコアを最大にするアレルペアが
【数１０】
2018108042.tif 000042
を満たす場合、スコアを最大にするアレルペアA, BにおけるアレルAのホモ接合型を被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する）判定手段２；
前記判定されたアレルペアを出力する出力手段；
として機能させるための被験者のHLA遺伝子のアレルペア判定用プログラム。
【請求項１１】
受付手段２で受け付けられるHLA辞書に記録された公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの塩基配列情報は、IPD-IMGT/HLAデータベースから取得される、請求項９または１０に記載のプログラム。
【請求項１２】
受付手段２で受け付けられるHLA辞書に記録される公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの両端に受付手段１で受け付けられるリードの最大長の1/2倍のN配列が付加される、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のプログラム。
【請求項１３】
計算手段２において、集合Tに、Class IのHLA遺伝子の第２エクソンおよび第３エクソン、Class IIのHLA遺伝子の第２エクソンが含まれる、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のプログラム。
【請求項１４】
判定手段２において、2種類以上のアレルペアで同一の最大スコアが得られた場合、以下の手段をさらに含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のプログラム：
計算手段２において、集合Tに、該アレルペアに含まれるアレル間でHLA辞書に共通して含まれるエクソンが追加され、再度、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する計算手段２’、
計算手段２’に計算されるスコアを最大にするアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する判定手段２
前記判定されたアレルペアを出力する出力手段。
【請求項１５】
判定手段２において、2種類以上のアレルペアで同一の最大スコアが得られ、かつ該アレルペアに含まれるアレル間でHLA辞書に共通して含まれるエクソンが存在しない場合、以下の手段をさらに含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のプログラム：
判定手段２において得られた同一の最大スコアを有する2種類以上のアレルペアのうち、公知のデータベースに登録されているHLA遺伝子のアレル頻度数データを用いて、該アレルペアの各アレルの頻度の積が最も高いアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する判定手段２’、
前記判定されたアレルペアを出力する出力手段。
【請求項１６】
判定手段２’の公知のデータベースが、Allele Frequency Net Databaseである、請求項１５に記載のプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は被験者のHLA遺伝子のアレルペアを判定する方法、および被験者のHLA遺伝子のアレルペア判定用プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
正確にHLAアレルを決定（タイピング）することは移植や免疫に関わる難病研究において極めて重要である。HLA遺伝子は30以上存在し、HLAアレルデータベースとして最も有名なIPD-IMGT/HLAデータベースでは10,000種類を超えるアレルが登録されており、日々更新が行なわれている。高速な遺伝子配列決定技術である次世代シークエンサーとこのデータベース情報を用いることで、高精度かつ高効率なHLAタイピングが可能となる。
【０００３】
しかし、登録されているHLAアレルのうち、完全長配列が登録されているHLAアレルはほとんどなく、９割以上のHLAアレルが一部のエクソンしか登録されていない。特にG-DOMAINと呼ばれる抗原提示部に相当するエクソンは全てのアレルで登録されているが、それ以外のエクソンについては情報のないアレルが大半である。この理由から、次世代シークエンサーを用いる既存のタイピング技術は一部のアレルの判定にしか対応していなかった。例えば、HLA遺伝子の部分塩基配列情報（以下、リード）を複数のHLA遺伝子のアレルへのマッピングし、その結果を線形計画問題に当てはめ、最も当てはまりの良いアレルペアを検出する方法(OptiType)が報告されている（非特許文献１）。しかし、該方法は、Class I 遺伝子であるHLA-A, B, Cの一部のアレルの判定しか行うことができないという問題があった。さらに、該方法は、アレルを判定する際、4-digitの結果までしか対応できない問題もあった。また、別の方法として、リードのマッピング結果をDe novoアセンブリし、その結果からアレルを判定する方法(HLAreporter)が報告されている（非特許文献２）。該方法は、アレルを判定する際、6-digitの結果まで判定することができる。しかし、該方法は、解析に高いシークエンスカバレージを要求する為、判定不能なサンプルが多くなるという問題を有していた。さらに、OptiTypeおよびHLAreporterとも、一部のエクソンのみを用いてアレルの判定を行う為、それ以外のエクソン間の多様性を考慮できず、誤ったアレルを選択してしまうという問題もあった。
【０００４】
従って、従来法では困難であった「データベースに一部のエクソンの塩基配列情報のみしか登録されていないHLAアレルも含めた、全てのHLAアレルを同一比較する」という課題を克服する必要があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Szolek, A., Schubert, B., Mohr, C., Sturm, M., Feldhahn, M. and Kohlbacher, O. (2014) OptiType: precision HLA typing from next-generation sequencing data. Bioinformatics, 30, 3310-3316.
【非特許文献２】Huang, Y., Yang, J., Ying, D., Zhang, Y., Shotelersuk, V., Hirankarn, N., Sham, P.C., Lau, Y.L. and Yang, W. (2015) HLAreporter: a tool for HLA typing from next generation sequencing data. Genome Med, 7, 25.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、データベースに登録されているエクソンの塩基配列情報が不統一なHLAアレル群をリファレンスとして用いても、精度よく被験者のHLA遺伝子のアレルを判定することができる新たな方法およびプログラムを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、初めにIPD-IMGT/HLAデータベースから、登録されている全HLAアレルのエクソンおよびイントロンの全塩基配列を抽出し、塩基配列パターンごとにグループ化した。これらのパターンとその属するアレル情報を記録したHLA辞書を作成し、これをリファレンスとして、次世代シークエンサーで得られたリードをマッピングした。この際、辞書のエクソンおよびイントロンの両端に固定長のN配列を付与し、次に、各リードがどのエクソンもしくはイントロンにマップしたか調べた。リード全長の５０％以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列が、HLA辞書に含まれるいずれかのエクソンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が完全に一致する、もしくはHLA辞書に含まれるいずれかのイントロンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が2塩基ミスマッチ以内で一致すれば該リードを該エクソンもしくは該イントロンが含まれるアレルに一致させた。さらにイントロンに一致した該リードにおいて、該イントロンの塩基配列に一致しなかった残りの塩基配列が該イントロンと隣接する該HLA辞書に含まれるエクソンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列に完全に一致する場合、該リードは該エクソンが含まれるアレルに一致させた。次に、一致したアレル数に応じて、各リードに遺伝子毎の重みを付け、アレルペアを判定する際のスコアへの重みとして用いた。
タイピングは各HLA遺伝子において、エクソンにマップされた重み付きリード数（スコア）が最も多いアレルペアを選択することで判定した（6-digitで判定した）。この際、マップリード数は塩基配列が登録されているエクソン数に依存するため、単純なリード数の比較で全てのアレル間を公平に判定できない。そこで始めは、各HLA遺伝子において全てのアレルで共通して登録されているエクソン(ほとんどのHLA遺伝子ではG-DOMAINと呼ばれている、抗原提示に関わる部位に対応するエクソンであり、具体的には、Class IのHLA遺伝子の場合は第２エクソンおよび第３エクソン、Class IIのHLA遺伝子の場合は第２エクソン)に限定して、スコアを最大にするアレルペアの探査を行った。この場合、G-DOMAINにおいて、共通の配列を持った複数のアレルペア候補が最大のスコアを持つ可能性がある。そこで、選択されたアレルペア候補内のアレル間でHLA辞書内にG-DOMAIN以外でも塩基配列が共通して登録されているエクソンが存在する場合、このエクソンを新たにスコアの計算対象に含め、スコアを最大にするアレルペアを候補の中から再探査した。これをアレルペアが一意に決定されるまで逐次的に繰り返した。
1000 Genomes Projectで得られたゲノムデータを用いて、従来法および上記の開発法によるアレルタイピングをそれぞれ行い、PCR-SBT法およびPCR-SSOP法でタイピングされたHLAアレルとの一致率を確認した。その結果、開発法は従来法に比べて高い精度の一致率を示し、さらに、一致しないアレルの多くはPCR-SSOP法や他手法では検出不可能なアレルであった。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下よりなる。
［１］以下の工程を含む、被験者のHLA遺伝子のアレルペアを判定する方法：
（１）被験者から得られた生体試料中のHLA遺伝子の部分塩基配列情報（リード）を取得する工程、
（２）公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの塩基配列情報を取得し、該エクソンおよび該イントロンの塩基配列情報と該HLAアレルのエクソンおよびイントロンとの対応関係を記録したHLA辞書を作成する工程、
（３）工程（１）で取得されたリードが工程（２）で作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのエクソンまたはイントロンの塩基配列に一致する場合、該リードは該塩基配列が含まれるアレルに一致すると判定する工程、
（４）工程（３）でリードに一致すると判定されたアレルが含まれるHLA遺伝子に対する該リードの重みを計算する工程、
（５）工程（４）で計算されたリードの重みを基に、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する工程、
（６）工程（５）で計算されたスコアを最大にするアレルペアを探査し、被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する工程。
［２］以下の工程を含む、被験者のHLA遺伝子のアレルペアを判定する方法：
（１）被験者から得られた生体試料中のHLA遺伝子の部分塩基配列情報（リード）を取得する工程、
（２）公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの塩基配列情報を取得し、該塩基配列情報にIDを割り当て、該IDと該HLAアレルのエクソンおよびイントロンの対応関係を記録したHLA辞書を作成する工程、
（３）以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を行う工程：
（Ａ）工程（１）で取得されたリード全長の５０％以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列が、工程（２）で作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのエクソンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が完全に一致する場合、該リードは該エクソンの塩基配列に割り当てられたIDと対応関係にあるエクソンが含まれるアレルと一致すると判定する、
（Ｂ）工程（１）で取得されたリード全長の５０％以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列が、工程（２）で作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのイントロンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が2塩基ミスマッチ以内で一致した場合、該リードは該イントロンの塩基配列に割り当てられたIDと対応関係にあるイントロンが含まれるアレルと一致すると判定する、
（Ｃ）工程（１）で取得されたリード全長の５０％以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列が、工程（２）で作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのイントロンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が2塩基ミスマッチ以内で一致しており、かつ該イントロンに一致しない残りの塩基配列が該イントロンと隣接する該HLA辞書に含まれるいずれかのエクソンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列に完全に一致する場合、該リードは該エクソンの塩基配列に割り当てられたIDと対応関係にあるエクソンが含まれるアレルと一致すると判定する、
（４）工程（１）で取得されたリードが、シングルエンドリードの場合、
【０００９】
【数１】
2018108042.tif 000002
【００１０】
に従い、工程（１）で取得されたリードが、ペアエンドリードの場合、
【００１１】
【数２】
2018108042.tif 000003
【００１２】
にさらに従い、工程（３）でリードに一致すると判定されたアレルが含まれるHLA遺伝子に対する該リードの重みを計算する工程、
（５）
【００１３】
【数３】
2018108042.tif 000004
【００１４】
に従い、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する工程、および
（６）
【００１５】
【数４】
2018108042.tif 000005
【００１６】
に従い、工程（５）で計算されたスコアを最大にするアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する（ただし、該スコアを最大にするアレルペアが
【００１７】
【数５】
2018108042.tif 000006
【００１８】
を満たす場合、スコアを最大にするアレルペアA, BにおけるアレルAのホモ接合型を被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する）工程。
［３］工程（２）で作成されるHLA辞書に記録される公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの塩基配列情報は、IPD-IMGT/HLAデータベースから取得される、［１］または［２］に記載の方法。
［４］工程（２）で作成されるHLA辞書に記録される公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの両端に工程（１）で取得されるリードの最大長の1/2倍のN配列が付加される、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法。
［５］工程（５）の集合Tに、Class IのHLA遺伝子の第２エクソンおよび第３エクソン、Class IIのHLA遺伝子の第２エクソンが含まれる、［２］〜［４］のいずれか１つに記載の方法。
［６］工程（６）において2種類以上のアレルペアで同一の最大スコアが得られた場合、以下の工程をさらに含む、［２］〜［５］のいずれか１つに記載の方法：
（７）工程（５）の集合Tに、該アレルペアに含まれるアレル間でHLA辞書に共通して含まれるエクソンを追加し、再度、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する工程、
（８）工程（７）で計算されるスコアを最大にするアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する工程。
［７］工程（６）において2種類以上のアレルペアで同一の最大スコアが得られ、かつ該アレルペアに含まれるアレル間でHLA辞書に共通して含まれるエクソンが存在しない場合、以下の工程をさらに含む、［２］〜［５］のいずれか１つに記載の方法：
（７’）工程（６）において得られた同一の最大スコアを有する2種類以上のアレルペアのうち、公知のデータベースに登録されているHLA遺伝子のアレル頻度数データを用いて、該アレルペアの各アレルの頻度の積が最も高いアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する工程。
［８］工程（７’）の公知のデータベースが、Allele Frequency Net Databaseである、［７］に記載の方法。
［９］コンピュータを
被験者から得られた生体試料中のHLA遺伝子の部分塩基配列情報（リード）を受け付ける受付手段１;
公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの塩基配列情報を取得し、該エクソンおよび該イントロンの塩基配列情報と該HLAアレルのエクソンおよびイントロンとの対応関係を記録したHLA辞書を受け付ける受付手段２;
前記受け付けられたリードが前記受け付けられたHLA辞書に含まれるいずれかのエクソンまたはイントロンの塩基配列に一致する場合、該リードは該塩基配列が含まれるアレルに一致すると判定する判定手段１;
リードに一致すると判定された前記アレルが含まれるHLA遺伝子に対する該リードの重みを計算する計算手段１;
前記計算されたリードの重みを基に、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する計算手段２;
前記計算されたスコアを最大にするアレルペアを探査し、被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する判定手段２;
前記判定されたアレルペアを出力する出力手段;
として機能させるための被験者のHLA遺伝子のアレルペア判定用プログラム。
［１０］コンピュータを
被験者から得られた生体試料中のHLA遺伝子の部分塩基配列情報（リード）を受け付ける受付手段１;
公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの塩基配列情報を取得し、該塩基配列情報にIDを割り当て、該IDと該HLAアレルのエクソンおよびイントロンの対応関係を記録したHLA辞書を受け付ける受付手段２;
以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を行う判定手段１：
（Ａ）前記取得されたリード全長の５０％以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列が、前記作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのエクソンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が完全に一致する場合、該リードは該エクソンの塩基配列に割り当てられたIDと対応関係にあるエクソンが含まれるアレルと一致すると判定する、
（Ｂ）前記取得されたリード全長の５０％以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列が、前記作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのイントロンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が2塩基ミスマッチ以内で一致した場合、該リードは該イントロンの塩基配列に割り当てられたIDと対応関係にあるイントロンが含まれるアレルと一致すると判定する、
（Ｃ）前記取得されたリード全長の５０％以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列が、前記作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのイントロンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が2塩基ミスマッチ以内で一致しており、かつ該イントロンに一致しない残りの塩基配列が該イントロンと隣接する該HLA辞書に含まれるいずれかのエクソンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列に完全に一致する場合、該リードは該エクソンの塩基配列に割り当てられたIDと対応関係にあるエクソンが含まれるアレルと一致すると判定する;
前記取得されたリードが、シングルエンドリードの場合、
【００１９】
【数６】
2018108042.tif 000007
【００２０】
に従い、前記取得されたリードが、ペアエンドリードの場合、
【００２１】
【数７】
2018108042.tif 000008
【００２２】
にさらに従い、前記のリードに一致すると判定されたアレルが含まれるHLA遺伝子に対する該リードの重みを計算する計算手段１；
【００２３】
【数８】
2018108042.tif 000009
【００２４】
に従い、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する計算手段２；
【００２５】
【数９】
2018108042.tif 000010
【００２６】
に従い、前記計算されたスコアを最大にするアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する（ただし、該スコアを最大にするアレルペアが
【００２７】
【数１０】
2018108042.tif 000011
【００２８】
を満たす場合、スコアを最大にするアレルペアA, BにおけるアレルAのホモ接合型を被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する）判定手段２；
前記判定されたアレルペアを出力する出力手段；
として機能させるための被験者のHLA遺伝子のアレルペア判定用プログラム。
［１１］受付手段２で受け付けられるHLA辞書に記録された公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの塩基配列情報は、IPD-IMGT/HLAデータベースから取得される、［９］または［１０］に記載のプログラム。
［１２］受付手段２で受け付けられるHLA辞書に記録される公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの両端に受付手段１で受け付けられるリードの最大長の1/2倍のN配列が付加される、［９］〜［１１］のいずれか１つに記載のプログラム。
［１３］計算手段２において、集合Tに、Class IのHLA遺伝子の第２エクソンおよび第３エクソン、Class IIのHLA遺伝子の第２エクソンが含まれる、［１０］〜［１２］のいずれか１つに記載のプログラム。
［１４］判定手段２において、2種類以上のアレルペアで同一の最大スコアが得られた場合、以下の手段をさらに含む、［１０］〜［１３］のいずれか１つに記載のプログラム：
計算手段２において、集合Tに、該アレルペアに含まれるアレル間でHLA辞書に共通して含まれるエクソンが追加され、再度、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する計算手段２’、
計算手段２’に計算されるスコアを最大にするアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する判定手段２
前記判定されたアレルペアを出力する出力手段。
［１５］判定手段２において、2種類以上のアレルペアで同一の最大スコアが得られ、かつ該アレルペアに含まれるアレル間でHLA辞書に共通して含まれるエクソンが存在しない場合、以下の手段をさらに含む、［１０］〜［１３］のいずれか１つに記載のプログラム：
判定手段２において得られた同一の最大スコアを有する2種類以上のアレルペアのうち、公知のデータベースに登録されているHLA遺伝子のアレル頻度数データを用いて、該アレルペアの各アレルの頻度の積が最も高いアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する判定手段２’、
前記判定されたアレルペアを出力する出力手段。
［１６］判定手段２’の公知のデータベースが、Allele Frequency Net Databaseである、［１５］に記載のプログラム。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、IPD-IMGT/HLAデータベースを含む公知のデータベースに登録されている全てのHLA遺伝子およびアレルに基づいて被験者のHLAアレルタイピングを行うことができる。また、本発明は、HLA遺伝子データベースのデータ更新にも迅速に対応出来る。さらに、本発明は、全ゲノムシークエンス法、全エクソームシークエンス法、Long-PCR法によるHLA遺伝子シークエンスなどを用いたNGSシークエンスデータをHLAアレルタイピングに使用する塩基配列情報として適用できる。特に、Long-PCR法による大規模シークエンスとの組み合わせにおいては、従来のPCR-SSOP法やPCR-SBT法に比べて低コストタイピングが可能になる。また、従来法によって誤って判定されてきたアレルが修正されることで、正しいHLAアレル頻度の計算が可能となる。加えて、レアアレルや抗原提示ドメイン以外のエクソン箇所の変異を検出および解析することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明のプログラムが用いられる被験者のHLA遺伝子のアレルペア判定用装置の一例を示す図である。
【図２】本発明のプログラムを実行するコンピュータシステムの一例を示す図である。
【図３】本発明のプログラムによる具体的な動作のフローチャートである。
【図４】Ａ）およびＢ）は、リードが特定のエクソンに一致するか否かを判定するための条件を示す図である。Ａ）リード全長の５０％以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列が、HLA辞書に含まれるいずれかのエクソンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が完全に一致する場合、該リードを該エクソンの塩基配列に割り当てられたIDと対応関係にあるエクソンが含まれるアレルに一致させる、Ｂ）リード全長の５０％以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列が、HLA辞書に含まれるいずれかのイントロンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が2塩基ミスマッチ以内で一致する場合、該リードを該イントロンの塩基配列に割り当てられたIDと対応関係にあるイントロンが含まれるアレルに一致させる。さらに該イントロンに一致した該リードにおいて、該イントロンの塩基配列に一致しなかった残りの塩基配列が該イントロンと隣接する該HLA辞書に含まれるエクソンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列に完全に一致する場合、該リードを該エクソンの塩基配列に割り当てられたIDと対応関係にあるエクソンが含まれるアレルと一致させる。
【図５】シングルエンドリードに関して重みの計算例を示した図である。リードrが遺伝子G1のエクソンX1の4種類のアレルと一致、遺伝子G2のエクソンX2、X3にそれぞれ1種類のアレルと一致した場合の、リードrの遺伝子G1およびG2に対する重みの計算方法を示す。
【図６】スコア比較によるアレルペアの決定過程を示す図である。初期探査ではスコアの計算に用いられるエクソンの集合Tは同遺伝子中の全アレル共通で存在するエクソンセットで行われる。従って、初期探査において集合T に含まれるエクソンは、HLA Class Iの遺伝子ではExon 2および3、 HLA Class IIの遺伝子ではExon 2に限定される。初期探査で複数のアレルペア候補が選出された場合においては、該候補のアレル共通で塩基配列が登録されているエクソンをTに追加してスコアを再計算し、最大スコアを持つアレルペアを再探査する。これを一つのアレルペア候補が求まるまたは追加可能なエクソンが存在するまで行う。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、以下の工程：
（１）被験者から得られた生体試料中のHLA遺伝子の部分塩基配列情報（リード）を取得する工程、
（２）公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの塩基配列情報を取得し、該エクソンおよび該イントロンの塩基配列情報と該HLAアレルのエクソンおよびイントロンの対応関係を記録したHLA辞書を作成する工程、
（３）工程（１）で取得されたリードが工程（２）で作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのエクソンまたはイントロンの塩基配列情報に一致する場合、該リードは該塩基配列が含まれるアレルに一致すると判定する工程、
（４）工程（３）でリードに一致すると判定されたアレルが含まれるHLA遺伝子に対する該リードの重みを計算する工程、
（５）工程（４）で計算されたリードの重みを基に、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する工程、
（６）工程（５）で計算されたスコアを最大にするアレルペアを探査し、被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する工程
を含む、被験者のHLA遺伝子のアレルペアを判定する方法（以下、本発明の判定方法１）を提供する。
【００３２】
本発明の判定方法１が適用される被験者としては、特に制限されないが、例えば、臓器、組織またはiPS細胞由来の組織の移植ためのレシピエントまたはドナー、あるいはiPS細胞ライブラリー構築のためのiPS細胞の提供者などが挙げられる。またコホート研究における大規模な健常者のHLA遺伝子型決定にも有効である。
【００３３】
本発明の判定方法１で判定可能な被験者のHLA遺伝子としては、HLA辞書に登録される限り特に制限されないが、Class I遺伝子に分類される遺伝子としてHLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-FおよびHLA-G、Class II遺伝子に分類される遺伝子としてHLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DOAおよびHLA-DOBが挙げられる。その中でもClassical HLAと呼ばれる、HLA-A, HLA-B, HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRB1は特に重要な遺伝子てして挙げられる。
【００３４】
本発明の判定方法１で判定される被験者のHLAアレルは、エクソン長が特異的な値を持たない限り、公知のアレルを全て判定することができる。また、本発明の判定方法１は、6-digitのアレルとして判定することができる。
【００３５】
本発明の判定方法１は、被験者から得られた生体試料中のHLA遺伝子の部分塩基配列情報（リード）を取得する工程（以下、本発明の工程（１））を含む。
本発明の工程（１）は、受付手段１に受け付けられる。
【００３６】
本発明の工程（１）の生体試料としては、被験者由来のDNAを含む生体試料であれば特に制限されず、被験者の組織、細胞などでよいが、被験者への侵襲が少ないものであることが好ましく、例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液などの生体から容易に採取できるものが挙げられる。血清や血漿を用いる場合、常法に従って被験者から採血し、液性成分を分離することによりそれらを調製することができる。
【００３７】
本発明の工程（１）のリードは、被験者から得られた生体試料から抽出されるゲノムDNAから取得できる。生体試料からゲノムDNAを抽出する方法は、当該技術において知られるゲノムDNA抽出法を用いて行うことができる。例えば、生体試料を遠心分離して、ゲノムDNAを含む細胞を沈殿させ、該細胞を物理的または酵素的に破壊し、細胞破片を除去することによりゲノムDNA抽出物を得ることができる。ゲノムDNAの抽出は、市販のゲノムDNA抽出キットなどを用いて行うこともできる。抽出されたゲノムDNAからは、例えば、次世代シークエンサーを用いて塩基配列解析することによってリードを取得することができる。他にも、National Center for Biotechnology Information (NCBI) やEuropean Molecular Biology Laboratory (EMBL)等の公共のデータベースで公開されているリードの塩基配列情報をダウンロードして入手することも可能である。リードは、HLA遺伝子内外のランダムな箇所における塩基配列情報を有する。リードの長さとしては、後述するHLA辞書の塩基配列情報に対してマッピングすることができる限り特に制限はないが、通常、50〜300塩基長であり、長い程好ましい。ただし長いリードの場合、該リードの後半の塩基配列情報のクオリティが低くなるため、クオリティコントロールソフトを用いてトリミングをすることが好ましい。また、本発明の判定方法１に適したリードの数としては、HLA遺伝子のエクソン上の任意の箇所の塩基配列を含むリードが、通常、平均してアレル毎に50以上、より好ましくは、平均してアレル毎に100以上である。
リードは、シングルエンド法によって得られるリード（以下、シングルエンドリード）であってもペアエンド法によって得られるリード（以下、ペアエンドリード）であってもよいが、精度向上が期待出来る点で、ペアエンドリードが好ましい。
【００３８】
本発明の判定方法１は、公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの塩基配列情報を取得し、該エクソンおよび該イントロンの塩基配列情報と該HLAアレルのエクソンおよびイントロンとの対応関係を記録したHLA辞書を作成する工程（以下、本発明の工程（２））を含む。
本発明の工程（２）で作成されるHLA辞書は、受付手段２に受け付けられる。
【００３９】
本発明の工程（２）のHLA辞書に含まれるHLAアレルのエクソンおよびイントロンの塩基配列情報は、公知のデータベースから取得することができる。公知のデータベースとしては、例えば、European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI)から提供されているIPD-IMGT/HLAデータベース、NCBI Reference Sequences (RefSeq)などが挙げられる。また新たに発見されたHLA遺伝子およびHLAアレル情報を逐次追加することも可能である。
【００４０】
本発明の工程（２）で取得されたエクソンおよびイントロンの塩基配列情報とHLAアレルのエクソンおよびイントロンの対応関係の記録は、該塩基配列情報にIDを割り当て、該IDと該HLAアレルのエクソンおよびイントロンの対応関係を記録することによって行われる。IDの割り当てについて、同一の塩基配列には同一IDが割り当てられる。そして、どのHLAアレルがどのエクソンおよびイントロンにおいてどのIDの塩基配列を持つか、その対応関係がHLA辞書に記録される。例えばHLA-A*01:01:01とHLA-A*03:01:01はExon1で同じ塩基配列を持つため、該塩基配列に対してA:Exon1_1という同一のIDが割り当てられ、HLA-A*01:01:01とHLA-A*03:01:01のExon1はA:Exon1_1というIDの塩基配列を有することがHLA辞書に記録される。リードのマッピングはIDを割り当てられた塩基配列に対して行われ、HLA辞書を通して各アレルの一致リードの集計やスコア計算を行う。
【００４１】
HLA辞書に登録された各エクソンおよび各イントロンには、その両端にN配列を付加してもよい。ここでN配列とは、リードをHLA辞書に登録された各エクソンおよび各イントロンの塩基配列情報にマッピングする際、リードがどのような塩基配列であっても不一致と見なされない配列をいう。リードの50%までカバーできるようにするために全てのリードのうち最大長を有するリードの1/2倍の塩基配列長のN配列が付加される。マッピングソフトによってNとは異なる文字を使用する場合は、対応する文字に置き換えて配列が付加される。
【００４２】
本発明の判定方法１は、本発明の工程（１）で取得されたリードが本発明の工程（２）で作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのエクソンまたはイントロンの塩基配列に一致する場合、該リードは該塩基配列が含まれるアレルに一致すると判定する工程（以下、本発明の工程（３））を含む。
本発明の工程（３）は、判定手段１に判定される。
【００４３】
本発明の工程（３）において、リードがHLA辞書に含まれるいずれかのエクソンまたはイントロンの塩基配列に一致すると判定する場合とは、以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のいずれかの場合である。
（Ａ）本発明の工程（１）で取得されたリード全長の５０％以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列が、本発明の工程（２）で作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのエクソンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が完全に一致する。
（Ｂ）本発明の工程（１）で取得されたリード全長の５０％以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列が、本発明の工程（２）で作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのイントロンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が2塩基ミスマッチ以内で一致する。
（Ｃ）本発明の工程（１）で取得されたリード全長の５０％以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列が、本発明の工程（２）で作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのイントロンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が2塩基ミスマッチ以内で一致しており、かつ該イントロンに一致しない残りの塩基配列が該イントロンと隣接する該HLA辞書に含まれるいずれかのエクソンの塩基配列に完全に一致する。
これらのいずれかを満たす場合、該リードは該エクソンまたはイントロンの塩基配列に割り当てられたIDと対応関係にあるエクソンまたはイントロンが含まれるアレルと一致すると判定する。
【００４４】
本発明の判定方法１は、本発明の工程（３）でリードに一致すると判定されたアレルが含まれるHLA遺伝子に対する該リードの重みを計算する工程（以下、本発明の工程（４））を含む。
本発明の工程（４）は、計算手段１に計算される。
【００４５】
本発明の工程（４）において、リードに一致するエクソンまたはイントロンを判定する際には、異なるHLA遺伝子を含む複数のエクソンまたはイントロンに跨って一致する場合が存在する。例えば、HLA-Aの第１エクソンに一致し、かつHLA-Bの第１エクソンにも一致するリードが存在する場合がある。その場合、該リードを、各エクソンで一致したアレル数に応じて各遺伝子に重み付けをする。リードの各HLA遺伝子に対する重みは、該リードが一致するエクソンの塩基配列と該塩基配列を含むアレルの対応関係に基づいて計算される。本発明の工程（４）において、各HLA遺伝子に対する該リードの重みは、本発明の工程（１）で取得されたリードが、シングルエンドリードの場合は以下の式
【００４６】
【数１１】
2018108042.tif 000012
【００４７】
に従い、本発明の工程（１）で取得されたリードが、ペアエンドリードの場合はさらに以下の式
【００４８】
【数１２】
2018108042.tif 000013
【００４９】
に従い、計算することができる。
【００５０】
本発明の判定方法１は、本発明の工程（４）で計算されるリードの重みを基に、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する工程（以下、本発明の工程（５））を含む。
本発明の工程（５）は、計算手段２に計算される。
【００５１】
本発明の工程（５）において、リードの重みを基にしたHLA遺伝子のアレルペアのスコアは以下の式
【００５２】
【数１３】
2018108042.tif 000014
【００５３】
に従い、計算することができる。
【００５４】
アレルペア間のスコア比較に用いるエクソンの集合Tは、比較するアレル全て共通で塩基配列が得られている必要がある。そのようなエクソンとしては、Class IのHLA遺伝子では第２エクソンおよび第３エクソン、およびClass IIのHLA遺伝子では第２エクソンが対応する。Tをこれらのエクソン集合とすることで、全てのアレルペアで同一な条件においてスコアを取得することができる。
【００５５】
本発明の判定方法１は、本発明の工程（５）で計算されるスコアを最大にするアレルペアを探査し、被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する工程（以下、本発明の工程（６））を含む。
本発明の工程（６）は、判定手段２に判定される。
【００５６】
本発明の工程（６）において、被験者のHLA遺伝子のアレルペアの判定は以下の式
【００５７】
【数１４】
2018108042.tif 000015
【００５８】
に従い、本発明の工程（５）で計算されるスコアを最大にするアレルペアを探査し、被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する。ただし、該スコアを最大にするアレルペアが
【００５９】
【数１５】
2018108042.tif 000016
【００６０】
を満たす場合、スコアを最大にするアレルペアA, BにおけるアレルAのホモ接合型を、被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する。
【００６１】
本発明の工程（６）において、２種類以上のアレルペアで同一の最大スコアが得られた場合、本発明の判定方法１にさらに以下の工程：
（７）本発明の工程（５）の集合Tに、該アレルペアに含まれるアレル間でHLA辞書に共通して含まれるエクソンを追加し、再度、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する工程（以下、本発明の工程（７））、
（８）本発明の工程（７）で計算されたスコアを最大にするアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する工程（以下、本発明の工程（８））、
を含む、被験者のHLA遺伝子のアレルペアを判定する方法(以下、本発明の判定方法２)を提供する。
【００６２】
さらに、本発明の工程（６）において、2種類以上のアレルペアで同一の最大スコアが得られ、かつ該アレルペアに含まれるアレル間でHLA遺伝子辞書に共通して含まれるエクソンが存在しない場合、本発明の判定方法１にさらに以下の工程：
（７’）本発明の工程（６）において得られた同一の最大スコアを有する2種類以上のアレルペアのうち、公知のデータベースに登録されているHLA遺伝子のアレル頻度数データを用いて、該アレルペアの各アレルの頻度の積が最も高いアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する工程（以下、本発明の工程（７’））、
を含む、被験者のHLA遺伝子のアレルペアを判定する方法(以下、本発明の判定方法３)を提供する。
【００６３】
本発明の工程（７’）において、公知のデータベースは、HLA遺伝子のアレル頻度数データが登録されているデータベースであれば特に制限はないが、Allele Frequency Net Databaseが代表的に挙げられる。
【００６４】
上記の本発明の判定方法１、２または３をコンピュータにより行うための被験者のHLA遺伝子のアレルペア判定用プログラムも、本発明の１つである。従って、本発明はまた、
コンピュータを
被験者から得られた生体試料中のHLA遺伝子の部分塩基配列を（リード）を受け付ける受付手段１；
公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの塩基配列情報を取得し、該エクソンおよび該イントロンの塩基配列情報と該HLAアレルのエクソンおよびイントロンとの対応関係を記録したHLA辞書を受け付ける受付手段２；
前記受け付けられたリードが前記受け付けられたHLA辞書に含まれるいずれかのエクソンまたはイントロンの塩基配列に一致する場合、該リードは該塩基配列が含まれるアレルに一致すると判定する判定手段１；
リードに一致すると判定された前記アレルが含まれるHLA遺伝子に対する該リードの重みを計算する計算手段１；
前記計算されたリードの重みを基に、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する計算手段２；
前記計算されたスコアを最大にするアレルペアを探査し、被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する判定手段２；
前記判定されたアレルペアを出力する出力手段；
として機能させるための被験者のHLA遺伝子のアレルペア判定用プログラム（以下、本発明のプログラム）を提供する。
【００６５】
より具体的には、本発明のプログラムは、
コンピュータを
被験者から得られた生体試料中のHLA遺伝子の部分塩基配列情報（リード）を受け付ける受付手段１、
公知のHLAアレルのエクソンおよびイントロンの塩基配列情報を取得し、該塩基配列情報にIDを割り当て、該IDと該HLAアレルのエクソンおよびイントロンの対応関係を記録したHLA辞書を受け付ける受付手段２、
以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を行う判定手段１：
（Ａ）前記取得されたリード全長の５０％以上を有する連続する塩基配列が、前記作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのエクソンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が完全に一致する場合、該リードは該エクソンの塩基配列に割り当てられたIDと対応関係にあるエクソンが含まれるアレルと一致すると判定する、
（Ｂ）前記取得されたリード全長の５０％以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列が、前記作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのイントロンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が2塩基ミスマッチ以内で一致した場合、該リードは該イントロンの塩基配列に割り当てられたIDと対応関係にあるイントロンが含まれるアレルと一致すると判定する、
（Ｃ）前記取得されたリード全長の５０％以上を有する連続する塩基配列が、前記作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのイントロンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が2塩基ミスマッチ以内で一致しており、かつ該イントロンに一致しない残りの塩基配列が該イントロンと隣接する該HLA辞書に含まれるいずれかのエクソンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列に完全に一致する場合、該リードは該エクソンの塩基配列に割り当てられたIDと対応関係にあるエクソンが含まれるアレルと一致すると判定する、
前記取得されたリードが、シングルエンドリードの場合、
【００６６】
【数１６】
2018108042.tif 000017
【００６７】
に従い、前記取得されたリードが、ペアエンドリードの場合、
【００６８】
【数１７】
2018108042.tif 000018
【００６９】
にさらに従い、前記のリードに一致すると判定されたアレルが含まれるHLA遺伝子に対する該リードの重みを計算する計算手段１、
【００７０】
【数１８】
2018108042.tif 000019
【００７１】
に従い、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する計算手段２、
【００７２】
【数１９】
2018108042.tif 000020
【００７３】
に従い、前記計算されたスコアを最大にするアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する（ただし、該スコアを最大にするアレルペアが
【００７４】
【数２０】
2018108042.tif 000021
【００７５】
を満たす場合、スコアを最大にするアレルペアA, BにおけるアレルAのホモ接合型を被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する）判定手段２、
前記判定されたアレルペアを出力する出力手段
として機能させるための被験者のHLA遺伝子のアレルペア判定用プログラムである。
【００７６】
また、前記判定手段２に判定される2種類以上のアレルペアで同一の最大スコアが得られた場合、本発明のプログラムは以下の手段をさらに含む。
計算手段２において、集合Tに、該アレルペアに含まれるアレル間でHLA辞書に共通して含まれるエクソンが追加され、再度、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する計算手段２’、
計算手段２’に計算されるスコアを最大にするアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する判定手段２
前記判定されたアレルペアを出力する出力手段。
【００７７】
さらに、判定手段２において、2種類以上のアレルペアで同一の最大スコアが得られ、かつ該アレルペアに含まれるアレル間でHLA辞書に共通して含まれるエクソンが存在しない場合、本発明のプログラムは以下の手段をさらに含む。
判定手段２において得られた同一の最大スコアを有する2種類以上のアレルペアのうち、公知のデータベースに登録されているHLA遺伝子のアレル頻度数データを用いて、該アレルペアの各アレルの頻度の積が最も高いアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する判定手段２’、
前記判定されたアレルペアを出力する出力手段。
【００７８】
図１に、本発明のプログラムが用いられる被験者のHLA遺伝子のアレルペア判定用装置の一例を示す。該装置は、被験者から得られた生体試料中のDNA断片の塩基配列を解析する装置１（以下、リード解析装置１）と、コンピュータ２と、これらを接続するケーブル３とから構成される。リード解析装置１で解析されるリードの塩基配列データは、ケーブル３を介してコンピュータ２の不揮発性記憶装置（ハードディスク）に格納することができる。また、リード解析装置１は、コンピュータ２と接続されていなくてもよくこの場合、可搬型記録媒体に記録されたリードの塩基配列データをコンピュータ２に入力してハードディスクに格納する。他にもNCBIやEMBL等の公共データベースからインターネット回線を介してダウンロードすることにより他研究機関等で解析されたリードの塩基配列データを入手し、ハードディスクに格納できる。
コンピュータ２は、読み込まれたリードが別途作成されたHLA辞書に含まれるいずれかのエクソンまたはイントロンの塩基配列と一致する場合、該リードは該塩基配列が含まれるアレルに一致すると判定し、リードに一致すると判定された該アレルが含まれるHLA遺伝子に対する該リードの重みを計算し、計算されたリードの重みを基に、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算し、計算されたスコアを最大にするアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する。
【００７９】
本発明のプログラムは、中央処理装置、記憶部、コンパクトディスクやフロッピー（登録商標）ディスクなどの記録媒体の読取装置、キーボードなどの操作入力部、およびディスプレイなどの出力部を備えるコンピュータ２と協働して、上記の本発明の判定方法を実現することができる。上記の方法を実施するための、より具体的なコンピュータシステムの一例を、図２に示す。
【００８０】
図２に示されたコンピュータ２は、本体110と、ディスプレイ120と、操作入力部130とから主として構成されている。本体110は、CPU110aと、RAM110bと、ハードディスク110cと、読出装置110dと、入出力インタフェース110eと、画像出力インタフェース110fとから主として構成されており、CPU110a、RAM110b、ハードディスク110c、読出装置110d、入出力インタフェース110e、および画像出力インタフェース110fは、バス110gによってデータ通信可能に接続されている。
【００８１】
CPU110aは、RAM110bにロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。
【００８２】
RAM110bは、SRAMまたはDRAMなどによって構成されている。RAM110bは、ハードディスク110cに記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、CPU110aの作業領域として利用される。
【００８３】
本実施形態におけるハードディスク110cには、オペレーティングシステムおよびアプリケーションプログラムなど、CPU110aに実行させるための種々のコンピュータプログラムおよび該コンピュータプログラムの実行に用いるデータが格納されている。またハードディスク110cには、リード解析装置１によって解析されたリードの塩基配列データおよびHLA辞書に関するデータ、取得されたリードがHLA辞書に含まれるいずれかのエクソンまたはイントロンの塩基配列情報に一致するか判定するための条件、前記判定されたリードに一致するアレルが含まれるHLA遺伝子に対する該リードの重みを計算する計算式、HLA遺伝子のアレルペアのスコアを計算する計算式、前記計算されたスコアを最大にするアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する判定式、公知のデータベースから得られたHLAアレルの頻度情報が格納されている。なお、後述するアプリケーションプログラム140aも、このハードディスク110cにインストールされている。
【００８４】
読出装置110dは、フレキシブルディスクドライブ、CD-ROMドライブ、またはDVD-ROMドライブなどによって構成されており、可搬型記録媒体140に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。また、可搬型記録媒体140には、コンピュータに本実施形態の方法を実行させるためのアプリケーションプログラム140aが格納されており、CPU110aが当該可搬型記録媒体140から本発明に係るアプリケーションプログラム140aを読み出し、該アプリケーションプログラム140aをハードディスク110cにインストールすることが可能である。
【００８５】
なお、上記のアプリケーションプログラム140aは、可搬型記録媒体140によって提供されるのみならず、電気通信回線（有線、無線を問わない）によってコンピュータ本体110と通信可能に接続された外部の機器から前記電気通信回線を通じて提供することも可能である。例えば、上記のアプリケーションプログラム140aがインターネット上のサーバコンピュータのハードディスク内に格納されており、このサーバコンピュータに本体110がアクセスして、該アプリケーションプログラムをダウンロードし、これをハードディスク110cにインストールすることも可能である。
【００８６】
また、ハードディスク110cには、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するWindows（登録商標）などのユーザインタフェース環境を提供するオペレーティングシステムがインストールされている。以下の説明においては、本実施形態に係るアプリケーションプログラム140aは、該オペレーティングシステム上で動作するものとしている。
【００８７】
入出力インタフェース110eは、例えば、USB、IEEE1394、RS-232Cなどのシリアルインタフェース、SCSI、IDE、IEEE1284などのパラレルインタフェース、およびD/A変換器、A/D変換器などからなるアナログインタフェースなどから構成されている。入出力インタフェース110eには、リード解析装置１が、ケーブル３を介して接続されており、リード解析装置１で解析されるリードの塩基配列データを、コンピュータ本体110のハードディスク110cに格納することが可能である。また、入出力インタフェース110eには、キーボードからなる操作入力部130が接続されており、ユーザーが該操作入力部130から操作手順を入力することにより、コンピュータ本体110にデータ格納およびアプリケーションプログラム140aの実行を命令することが可能である。また上記の操作は電気通信回線（有線、無線を問わない）によってコンピュータ本体110と通信可能に接続された外部コンピュータの操作入力部から前記電気通信回線を通じて行うことが可能である。
【００８８】
画像出力インタフェース110fは、LCDまたはCRTなどで構成されたディスプレイ120に接続されており、CPU110aから与えられた画像データに応じた映像信号をディスプレイ120に出力するようになっている。ディスプレイ120は、入力された映像信号にしたがって、画像（画面）を表示する。また画像出力インタフェースは本体110に直接接続する以外に、電気通信回線（有線、無線を問わない）によってコンピュータ本体110と通信可能に接続された外部の機器に接続することで前記電気通信回線を通じて出力することが可能である。
【００８９】
本発明のプログラムによる手段としてのより具体的なコンピュータ２の動作のフローチャートを、図３に示す。
リード解析装置１で被験者から得られた生体試料中のDNA断片の塩基配列が解析されると、リード解析装置１が解析された塩基配列のデータ（以下、「リード解析データ」という）を出力し、出力データをコンピュータ2のハードディスク110cに格納する。ユーザーは操作入力部130を通じてアプリケーション140aを呼び出す。アプリケーションからの命令によりCPU110aは、格納されたリード解析データをハードディスク110cから読み込み、RAM110bに記憶する（ステップS1）。
【００９０】
次いで、CPU110aはハードディスク110cに格納されている、各HLAアレルの塩基配列を基に各エクソンおよび各イントロンにおける同一塩基配列毎に付与されたIDおよびIDとアレルの関係性を記述した情報（以下、「HLA辞書」という）および各HLA遺伝子の初期ステップにおけるエクソン集合Tの情報、公知のデータベースから得られたHLAアレルの頻度情報を読み込む（ステップS2）。
【００９１】
次いで、CPU110aは、RAM110cに記憶されたリード解析データの塩基配列が、HLA辞書に含まれるいずれかのエクソンまたはイントロンの塩基配列に一致した場合、該リードは該塩基配列が含まれるアレルに一致すると判定する（ステップS3）。
【００９２】
次いで、CPU110aは、リードに一致したアレルが含まれるHLA遺伝子に対する該リードの重みを計算する（ステップS4）。
【００９３】
次いで、CPU110aは、リードの重みを基に、エクソン集合Tにおけるアレルペアのスコアを計算する（ステップS5）。
【００９４】
次いで、CPU110aは、スコアを最大にするアレルペアが２種類以上存在するか否かを判定する（ステップS6）。
【００９５】
ステップS6の判定の結果、スコアを最大にするアレルペアが、唯１つ存在する場合、CPU110aは、該アレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する（ステップS7）。
【００９６】
ステップS6の判定の結果、スコアを最大にするアレルペアが２種類以上得られた（即ち、同じ最大値スコアを有するアレルペアが２種類以上得られた）場合、CPU110aは、スコアを最大にするアレルペア間でHLA辞書に共通して含まれるエクソン（以下、「共通エクソン」という）がエクソン集合Tに含まれるエクソン以外に存在するか否かを判定する（ステップS8）。
【００９７】
ステップS8の判定の結果、共通エクソンが存在する場合、アレルペアのスコア計算に含まれるエクソン集合Ｔに上記共通エクソンを追加し（ステップS9）、再度、ステップS5に戻る。
【００９８】
ステップS8の判定の結果、共通エクソンが存在しない場合、スコアを最大にするアレルペアのうち、公知のデータベースに登録されているHLA遺伝子のアレル頻度データを用いて、アレルペアの各アレルの頻度の積が最も高いアレルペアを被験者のHLA遺伝子のアレルペアとして判定する（ステップS10）。
【００９９】
最後に、ステップS7またはステップS10で判定した結果をRAM110bに格納するとともに、画像出力インタフェース110fを介してコンピュータのディスプレイ120に表示する（ステップS11）。
【０１００】
なお、本実施形態においては、リード解析データを、リード解析装置１から、入出力インタフェース110eを介してハードディスク110cに格納したが、これに限定されるものではない。例えば、コンピュータ２とは独立したリード解析装置で得たリード解析データを可搬型記録媒体に書き出した後、読出装置110dを通じてハードディスク110cに格納することもできる。またNCBIやEMBL等の公共データベースからインターネット回線を介してダウンロードすることにより他研究機関等で解析されたリードの塩基配列データを入手し、ハードディスク110cに格納することもできる。
【０１０１】
以下に、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではないことは明らかである。
【実施例】
【０１０２】
1. HLA辞書の作成
European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI)から提供されているIPD-IMGT/HLAデータベースに登録されているHLAアレルの塩基配列情報をHLA辞書に登録する。また、NCBI Reference Sequences (RefSeq)に登録されている9種のHLA-Uと7種のHLA-DQB2および京都大学附属ゲノム医学センターが新たに同定したpseudogeneを登録することで精度向上が見込める。なお、HLA辞書に登録するアレルはユーザーが自由に追加・更新できる。登録した塩基配列は各エクソン、イントロンの塩基配列に分割し、同エクソンもしくは同イントロン内で同じ塩基配列毎にIDを付与し、IDとアレルとの間の対応表を作成する。登録された全てのエクソンおよびイントロンの塩基配列の両側にオフターゲット領域としてリードの最大長の1/2倍のN配列を追加する。同一エクソン内の塩基配列の集合から塩基配列の長さの頻度を計算し（頻度はID数ではなくアレル数でカウントする）、1%以下の頻度に含まれるエクソンの塩基配列長を持つアレルは、判別対象から外す（外さないことも可能）。
【０１０３】
2. 次世代シークエンサーを用いたHLA遺伝子の塩基配列の解析
次世代シークエンサーを用いて、サンプルのHLA遺伝子の塩基配列を解析する。各リードはサンプルのHLA遺伝子内外のランダムな箇所における50〜300塩基長の塩基配列情報を持つ。この際、エクソン上の任意箇所の塩基配列を含むリードが平均して100以上(対立遺伝子毎に50以上)となるデータ量が得られることが望ましい。また、リードは、シングルエンドリードであっても、ペアエンドリードであってもよいが、ペアエンドリードが含まれる場合、サンプルのHLA遺伝子タイピングの精度向上が期待出来る。
【０１０４】
3. HLA辞書へのマッピング
各リードをHLA辞書の塩基配列に対してbowtie2(GNU Free Documentation Licenseソフト)を用いてマッピングする。N配列をスコアに含めず、リード全長の50%以上の塩基配列長を有する塩基配列がエクソンまたはイントロン領域に当たる全てのマッピング結果が得られるオプションでマッピングを実行する。例えば、以下のオプションでマッピングを実行することが望ましい。
‘bowtie2 --n-ceil L,0,0.5 -score-min L,-1.0,0 -a’
【０１０５】
4. マッピング結果の精査
マッピング結果を読み込み、各エクソンまたはイントロンの塩基配列に一致したリードの対応関係を調べる。具体的には、リード全長の50%以上の塩基配列長を有する連続する塩基配列がHLA辞書に登録されたいずれかのエクソンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が完全一致、もしくはHLA辞書に登録されたいずれかのイントロンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列が2塩基ミスマッチ以内で一致するかを調べ、一致した場合、該リードは該エクソンまたは該イントロンが含まれるアレルに一致すると判定する。さらに、イントロンの塩基配列に一致した該リードにおいて一致しない残りの塩基配列が該イントロン外におよぶ場合、該部分塩基配列が該イントロンに隣接するいずれかのエクソンの塩基配列と重複しかつ該重複範囲において両塩基配列と完全一致するか調べ、一致した場合、該リードは該エクソンが含まれるアレルに一致すると判定する（図４）。
リードの中には異なるHLA遺伝子に含まれる複数のエクソンもしくはイントロンに跨って一致するものが存在する。その場合、各エクソンの一致アレル数に応じて各遺伝子の重み付けをする。リードの各遺伝子に対する重みは、リードがシングルリードの場合、以下の式
【０１０６】
【数２１】
2018108042.tif 000022
【０１０７】
に従い計算し、リードがペアエンドリードの場合はさらに以下の式
【０１０８】
【数２２】
2018108042.tif 000023
【０１０９】
に従い、計算する。例えば、図５の通り、シングルエンドリードであるリードrが遺伝子G1上のエクソンX1において4種類のアレルと一致し、かつ遺伝子G2上のエクソンX2、X3においてそれぞれ1種類のアレルと一致した場合、リードrの遺伝子G1に対する重みは、以下の式で表される。
【０１１０】
【数２３】
2018108042.tif 000024
【０１１１】
また、リードrの遺伝子G2に対する重みは、以下の式で表される。
【０１１２】
【数２４】
2018108042.tif 000025
【０１１３】
５. アレルペアのスコア計算
上記の通り重み付けされたリードを用いてサンプルのHLA遺伝子の全アレルペアに対してスコアリングを行う。ここで、アレルペアA,Bに対するスコアは以下の式で与えられる。
【０１１４】
【数２５】
2018108042.tif 000026
【０１１５】
ここで、S(R)は、以下の式で与えられる。
【０１１６】
【数２６】
2018108042.tif 000027
【０１１７】
また、S(Rp)は、以下の式で与えられる。
【数２７】
2018108042.tif 000028
【０１１８】
６. アレルペアの探索
下記式の通り、上記の通りに得られるスコアを最大にするアレルペアが、サンプルのHLA遺伝子のアレルペアであると判定する。
【０１１９】
【数２８】
2018108042.tif 000029
【０１２０】
ただし、スコアを最大にするアレルペアであっても、以下の式を満たす場合、スコアを最大にするアレルペアA, BにおけるアレルAのホモ接合型が、サンプルのHLA遺伝子のアレルペアであると判定する。
【数２９】
2018108042.tif 000030
【０１２１】
なお、アレルペアに対するスコア計算は、初期探査においては全てのアレルペアに対するスコアを比較できるようエクソンの集合Tを全てのアレルで共通して塩基配列が得られているエクソンに限定する。具体的には、最初は集合Tとして、Class IのHLA遺伝子についてはExon 2および3、 Class IIのHLA遺伝子についてはExon 2が用いられる(Class IのHLA遺伝子のExon 2および3、 Class IIのHLA遺伝子のExon 2は、G-DOMAINと呼ばれる領域に対応)。その他の遺伝子も同様に予め定める。
【０１２２】
求めるアレルペアの探査は以下の手順で決定される（図３）。またアレルは6-digitで出力する。
1.初期のエクソン集合Tにおいて、アレルペアA,Bに対するスコアを最大にするアレルペアを探査する。
2.得られたアレルペアが一意に定まった場合、アレルペアの探査を終了する。複数のアレルペア候補で同一の最大スコアが得られた場合、それらアレルペア候補内の全てのアレルで共通して塩基配列が登録されているエクソンを初期の集合Tに追加（共通するエクソンが複数ある場合は全て追加する）し、Tを拡張する。なお、追加できるエクソンが存在しない場合、アレルペアの探査を終了する。
3.拡張された集合Tにおいて再びスコアを最大にするアレルペアを探査する。探査するアレルペアは残ったアレル候補におけるペアに限定する。
4.上記2.および3.を集合Tが拡張できる限りもしくはアレルペアが一意に決定されるまで続ける。
5.最終的に一つのアレルペアに定まらない場合、web上で公開されている公知のデータベースAllele Frequency Net Databaseに登録されている頻度数データを用いてアレルペアの各アレル頻度の積が最も高いペアを選択する（結果のデータには全ての最終候補が記録される）。それでも一つのアレルペアに決まらない場合は、残った候補全てを出力する。
【０１２３】
7. 1000 Genomes Projectデータを用いた精度検証
1000 Genomes Project (The 1000 Genomes Project Consortium. (2012) An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes. Nature, 491, 56-65.)で観測した62検体の全エクソームシークエンスデータ(以下、WESデータ)に対して本発明の方法（以下、HLA-HD）を適用し、同検体のうちLiu, C.ら((Liu, C. et al., (2013) ATHLATES: accurate typing of human leukocyte antigen through exome sequencing. Nucleic Acids Res, 41, e142)によるPCR-SBTによる10検体計100アレルのタイピング結果（セットA）およびde Bakker, P.I.ら(de Bakker, P.I. et al. (2006) A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended human MHC. Nat Genet, 38, 1166-1172.)、およびErlich, R.L.ら(Erlich, R.L. et al. (2011) Next-generation sequencing for HLA typing of class I loci. BMC Genomics, 12, 42)によるPCR-SSOPによる51検体計600アレル（セットB）に対しての一致率を測定した。ここでHLA-HDでは6-digitの精度でアレルを判定することができるが、従来法では高々4-digitの精度までしかアレルを判定できていないため、HLA-HDによる判定結果も4-digitもしくは2-digitまで桁落ちして合わせた。
この結果、PCR-SBTによる10検体計100アレルのタイピング結果とHLA-HDによるタイピング結果は完全一致した（表1）。
次にPCR-SSOPによる51検体計600アレルに対しては、一致しないアレルが、Class Iでは17アレル、Class IIでは37アレル、計54アレル存在した（表2）。これらの不一致アレルを精査した結果、ほとんどの場合、PCR-SSOPではカバーされないエクソンにおける塩基配列が異なることが原因であった。そこで、結果が異なる検体に対し、WESデータのマッピング結果を検証し、HLA-HDによる判定結果とPCR-SSOPによる判定結果のどちらが正しいか検証した。その結果、39アレルはHLA-HDによる判定アレルを支持し、5アレルは判断がつかない結果となった(表２)。残りの10アレルはカバレージが低く、HLA-HDがうまく機能しなかったと考えられた。この結果を反映させて一致率を再計算したところ（修正データ）、精度の向上が得られ特にClass IIの一致率は100%に達した（表１、修正データに対応する行）。
次にHLA-HDと同様に次世代シークエンサーを用いる他手法との間で精度を比較した。ここではHLAreporter (Huang, Y. et al., (2015) HLAreporter: a tool for HLA typing from next generation sequencing data. Genome Med, 7, 25.) 、OptiType (Szolek, A. et al. (2014) OptiType: precision HLA typing from next-generation sequencing data. Bioinformatics, 30, 3310-3316.)およびPHLAT (Bai, Y. et al.(2014) Inference of high resolution HLA types using genome-wide RNA or DNA sequencing reads. BMC Genomics, 15, 325.)を比較対象とした。HLAreporterはカバレージが低いデータに対してはタイピングを行わないため、セットBでは一部のサンプルのタイピング結果しか得られていない。OptiType (Szolek, A. et al. (2014) OptiType: precision HLA typing from next-generation sequencing data. Bioinformatics, 30, 3310-3316.)はClass IのA,B,Cにのみ対応するため、Class IIをタイピングできない。 PHLAT (Bai, Y. et al.(2014) Inference of high resolution HLA types using genome-wide RNA or DNA sequencing reads. BMC Genomics, 15, 325.)はセットAの結果だけ公開されている。セットAにおいてはPHLAT以外で完全一致する結果となった(表１)。セットBにおいては、HLAreporter、OptiTypeによる判定アレルは共にPCR-SSOPによる判定アレルとの一致率がHLA-HDを上回っているが、上記の通り、WESデータのマッピング結果からタイピング結果を修正したデータを用いると、HLA-HDによる判定アレルと修正したデータとの一致率は、Class IにおいてはOptiTypeとは同等、HLAreporterとの比較では上回る結果となった。Class IIでも同様にHLA-HDとHLAreporterが互いに、修正前と修正後で逆転した。この結果は、OptiType、HLAreporter共に従来法と同様にタイピングできるアレルの範囲が制限されている事が起因している。
【０１２４】
【表１】
2018108042.tif 000031
【０１２５】
【表２】
2018108042.tif 000032
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明の方法とロボティクスによるHLA遺伝子シークエンスとを組み合わせることで大規模検体に対するHLAの詳細解析が可能となる。また、本発明の方法をバイオインフォマティクスの統合解析ソフトへの組み込むことができる。さらに、本発明の方法は、臓器移植や将来的なiPS治療における安全性の高い適合検査や多くのドナー確保に利用することができる。
【符号の説明】
【０１２７】
1        リード解析装置
2        コンピュータ
3        ケーブル
110      本体
110a     CPU
110b     RAM
110c     ハードディスク
110d     読出装置
110e     入出力インタフェース
110f     画像出力インタフェース
110g     バス
120      ディスプレイ
130      操作入力部
140      可搬型記録媒体
140a     アプリケーションプログラム
【図１】
2018108042.tif 000043
【図２】
2018108042.tif 000044
【図３】
2018108042.tif 000045
【図４】
2018108042.tif 000046
【図５】
2018108042.tif 000047
【図６】
2018108042.tif 000048