(57)【要約】【課題】デキストリンを分解できる酵母を提供する。【解決手段】グルコアミラーゼ（STA1)遺伝子を有する酵母株と食品を製造することができる酵母株を接合させて食品用酵母株を育種する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコアミラーゼ（STA1）遺伝子を有する酵母株と食品用酵母株とが接合して得られた酵母株であって、グルコアミラーゼ活性を有する酵母株。
【請求項２】
前記酵母株が、Saccharomyces cerevisiae 278/113 （受託番号NITE AP-02330）である請求項１記載の酵母株。
【請求項３】
請求項１または２に記載の酵母株を用いて生産する発酵食品の製造方法。
【請求項４】
前記発酵食品がビール類である、請求項３に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母、特に食品用酵母にデキストリン分解能を与えることに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母Saccharomyces cerevisiaeは、ビールやパンを始めとした発酵食品を製造する際に用いる微生物である。この酵母は通常、デンプンは分解できないので、発酵の基質となる発酵液を作成する際に、デンプンを糖にする糖化の工程を入れるのが一般的である。しかしながら、この糖化工程でも、デンプンが、単糖や二糖だけではなく、多糖、デキストリンとなっている場合がある。実際に、食品製造（特に、ビール類）での発酵液には、グルコースが結合した多糖類であるデキストリンが相当量溶解している。通常の食品用酵母は、グルコースが3分子、α-1,4結合したマルトトリオースまでしか分解することができないため、発酵終了時に多くのデキストリンが残存し、その大部分は、製造された食品製品中に残存していた。
したがって、発酵液中のデキストリンを分解できる食品用酵母を育種できると、エタノール生産量が増加し、製造効率の向上が期待される。また、カロリー量を低下させた食品製品の製造が可能となり、さらに、香気成分等が多く産生された新しいタイプの食品製品の製造も期待できる。
【０００３】
デキストリンを分解する酵素であるグルコアミラーゼを分泌する酵母Saccharomyces cerevisiae ver. diastaticusがある。この酵母株は、食品製造で用いられる酵母Saccharomyces cerevisiaeと同種であるが、発酵力や製造される食品の香味に問題があり、技術的に食品製造には不向きとされてきた。そこで、S. diastaticusのグルコアミラーゼ（STA1）遺伝子をクローニングして、食品用酵母に形質転換することが試みられてきた（非特許文献１，２）。しかし、これらの例では、STA1遺伝子は、プラスミド上にあり、プラスミドは形質転換酵母株から脱落することが予想され、グルコアミラーゼを分泌する形質は安定的に維持されず、グルコアミラーゼが発現された明確な効果が確認できていない。また、これらの酵母株は遺伝子組み換え体に該当し、直ちに食品に使用することはできず、また、これら遺伝子組み換え体酵母株の使用は消費者の支持も得られているとはいえない。また、STA1遺伝子は、酵母の接合型を決定する接合性遺伝子（MAT）座にYa配列とYa配列がともに挿入されていると、遺伝子発現が抑制されることが報告されている（非特許文献３，４）。酵母の接合によって、接合性遺伝子(MAT)座にYa配列とYa配列がともに挿入されている2倍体酵母が育種されるので、この遺伝子発現抑制がかかると、接合性遺伝子(MAT)座にYa配列とYa配列がともに挿入されている2倍体酵母でのデキストリン分解食品用酵母を育種することは難しくなる。一方、非特許文献５には、STA1遺伝子があるプラスミドを、接合性遺伝子(MAT)座にYa配列とYa配列がともに挿入されている2倍体実験室酵母株や様々な産業用酵母株に導入を試みた実験結果が記載されている。その結果、接合性遺伝子(MAT)座にYa配列とYa配列がともに挿入されている2倍体実験室酵母株であっても、グルコアミラーゼを培地中に分泌する場合があることを示している。さらに、産業用酵母株のなかには、STA1遺伝子の導入によっても、グルコアミラーゼ活性の発現がみられない場合もあり、STA1遺伝子の発現制御には、いくつかの制御要因があり、酵母菌株によっては、STA1遺伝子の発現がみられない酵母菌株があることが予想された（非特許文献５）。また、ビール酵母にSTA1遺伝子を有するプラスミドを導入した形質転換体を造成した実験結果が、非特許文献１、２に示されている。但し、いずれの文献も発酵液のデキストリンがどの程度分解されたかは明らかにしていない。また、いずれも形質転換体では、STA1遺伝子はプラスミドとして存在しており、プラスミドの脱落等が予想され、遺伝的に安定であるとは考えられない。また、グルコアミラーゼが培地上に十分に分泌されたかは明らかにされていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Perry, C. et al. J. Inst. Brew. Vol.94, p64-67 (1988)
【非特許文献２】Sakai, K. et al. J. Am. Soc. Brew. Chem. Vol.47, p87-91 (1989)
【非特許文献３】Yamashita, I. et al. J. Bacteriol. Vol.164, p769-773 (1985).
【非特許文献４】Dranginis, A. Mol. Cell. Biol. Vol.9, p3992-3998 (1989).
【非特許文献５】Latorre-Garcia, L. et al. World J. Microbiol. Biotechnol. Vol.24, p2957-2963 (2008).
【非特許文献６】Katou, T. et al. Yeast Vol.25, p799-807 (2008).
【非特許文献７】Shima, H. et al. Agric. Biol. Chem. Vol.53, p749-755 (1989)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、非遺伝子組み換え体でありながら、グルコアミラーゼを安定的に、かつ十分に分泌するデキストリン分解食品用酵母を提供する。
さらに、本発明は、非遺伝子組み換え体であるデキストリン分解食品用酵母を用いて、酒類等の食品を製造する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１）本発明の一つの特徴は、デキストリン分解食品用酵母を遺伝子組み換え体にはならないように、接合等で育種することである。接合で育種することで、育種された酵母株は、非遺伝子組み換え体である。また、育種された酵母株には、グルコアミラーゼ(STA1)遺伝子がゲノムDNAに挿入されており、グルコアミラーゼを分泌する形質は安定である。また、酵母菌株によっては、STA1遺伝子の発現がみられない酵母菌株があると予想される。そこで、STA1遺伝子が十分に発現する酵母菌株を見出す必要がある。
２）本発明の別の特徴は、上記のように育種された非遺伝子組み換え体であり、安定的にグルコアミラーゼを分泌する形質を有するデキストリン分解食品用酵母を使用して、食品を製造することで、発酵液あるいは、食品製品中のデキストリンの含量が低減された、あるいは、発酵生産物であるエタノール濃度、香気成分濃度を上昇させた食品を製造することである。
【０００７】
すなわち本発明は、
（１）グルコアミラーゼ（STA1）遺伝子を有する酵母株と食品用酵母株とが接合して得られた酵母株であって、グルコアミラーゼ活性を有する酵母株、
（２）前記酵母株が、Saccharomyces cerevisiae 278/113 （受託番号NITE AP-02330）である前記（１）記載の酵母株、
（３）前記（１）または（２）に記載の酵母株を用いて生産する発酵食品の製造方法、
（４）前記発酵食品がビール類である、前記（３）に記載の製造方法
に係るものである。
【発明の効果】
【０００８】
非遺伝子組み換え体であり、グルコアミラーゼ遺伝子が染色体に導入され、安定的に、かつ十分にグルコアミラーゼを分泌するデキストリン分解食品用酵母を用いて、食品を製造することで、デキストリン含量が低下した、および／あるいは、発酵生産物であるエタノール濃度、および／あるいは、香気成分濃度が上昇した食品を製造することができた。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図1a)は、接合によって育種されたグルコアミラーゼ発現2倍体酵母S. cerevisiae 278/113 （受託番号NITE AP-02330）の接合性遺伝子(MAT)座のPCRのアガロース電気泳動の結果である。Mは、分子量マーカー、λDNA Hind III処理物、1は、Ya配列のPCR増幅結果、2は、Ya配列のPCR増幅結果、接合によって育種されたグルコアミラーゼ発現2倍体酵母S. cerevisiae 278/113 （受託番号NITE AP-02330）の接合性遺伝子(MAT)座にYa配列とYa配列がともに挿入されていることがわかった。図１b)は、グルコアミラーゼ(STA1)遺伝子が挿入されていることを確認するためのPCRのアガロース電気泳動の結果である。Mは、分子量マーカー、λDNA Hind III処理物、1は、グルコアミラーゼ(STA1)遺伝子のPCR増幅結果、接合によって育種されたグルコアミラーゼ発現2倍体酵母S. cerevisiae 278/113 （受託番号NITE AP-02330）には、グルコアミラーゼ(STA1)遺伝子が挿入されていることがわかった。
【図２】図2は、育種したグルコアミラーゼ発現2倍体酵母株S. cerevisiae 278/113 （受託番号NITE AP-02330）、親株S. cerevisiae MAFF113371、最も典型的な下面ビール酵母Weihenstephan34/70を用いた12%モルトエクストラクト培地での発酵液の重量減少量を示している。グルコアミラーゼ発現2倍体酵母株S. cerevisiae 278/113 （受託番号NITE AP-02330）では、発酵日数5日までは、他の2株に比べて、発酵液の重量減少量が小さいことがわかる。
【図３】図3は、12%モルトエキストラクト培地のマルトオリゴ糖のHPLCのチャートである。同培地には、グルコース、マルトース、マルトトリオース以外に、グルコースが4分子以上結合しているマルトオリゴ糖（マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース）が存在していることが確認できる。
【図４】図4は、最も典型的な下面ビール酵母Weihenstephan34/70の12%モルトエキストラクト培地で、9日間発酵試験した後の発酵液のマルトオリゴ糖のHPLCのチャートである。発酵試験前に培地中に存在していたグルコース、マルトース、マルトトリオースは、ほとんど消費され、グルコースが4分子以上結合したマルトオリゴ糖は、培地上に相当量残存していることが確認できる。
【図５】図5は、育種したグルコアミラーゼ発現2倍体酵母株S. cerevisiae 278/113371 （受託番号NITE AP-02330）の12%モルトエキストラクト培地で、9日間発酵試験した後の発酵液のマルトオリゴ糖のHPLCのチャートである。下面ビール酵母Weihenstephan34/70の発酵試験後では残存していたグルコースが4分子以上結合したマルトオリゴ糖も消費されていることが確認できる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明では、非遺伝子組換え体であるデキストリン分解食品用酵母を接合によって育種した。酵母の接合とは、接合性aを示す1倍体細胞と接合性aを示す1倍体細胞が接触し、お互いの細胞の核、細胞が融合し、接合性を示さない2倍体細胞になる現象である。1倍体酵母の接合性は、接合遺伝子(MAT)座に、Ya配列が挿入された場合、接合性aを示し、接合遺伝子(MAT)座に、Ya配列が挿入された場合、接合性aを示す。2倍体酵母は、接合遺伝子(MAT)座に、Ya配列とYa配列がともに挿入され、接合性は示さない。
【００１１】
本発明では、グルコアミラーゼ(STA1)遺伝子を有し、接合性aを示す1倍体酵母Sacchromyces cerevisiae 278株と、マルトース分解力が強く、アルコール産生量も多い接合性aを示す1倍体酵母S. cerevisiae MAFF113371を接合させ、2倍体酵母S. cerevisiae 278/113371を育種した。また、グルコアミラーゼ(STA1)遺伝子を有し、接合性aを示す1倍体酵母S. cerevisiae 278株と、上面ビール酵母由来の1倍体酵母であって、接合性aを示すS. cerevisiae Y7株を接合させ、2倍体酵母S. cerevisiae Y7/278を育種した。
【００１２】
酵母の接合は、両酵母菌株を、107 cells/ml程度となるように、YPD液体培地(1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose)に懸濁し、約25℃で、4時間から24時間培養した後、YPD寒天培地に菌液を塗布し、形成するコロニーを接合して生じた2倍体酵母であるかを調べることでおこなった。
【００１３】
接合により生じた2倍体酵母であるかは、接合性遺伝子(MAT)座にYa配列とYa配列がともに挿入されていること、グルコアミラーゼ(STA1)遺伝子が挿入されていることを、PCRで確かめることでおこなった。接合性遺伝子(MAT)座のPCRのうち、Ya配列が挿入されていることを確認するためには、MAT特異的プライマー(5’-ATACTTTGCTTCCATGAGGATTCTTATATTAGGGA-3’)と、MATa特異的プライマー(5’-TGGCATTACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3’)を用いたPCRをおこなう。Ya配列が挿入されていることを確認するためには、MAT特異的プライマー(5’-ATACTTTGCTTCCATGAGGATTCTTATATTAGGGA-3’)と、MATa特異的プライマー(5’- AAATGCAGCACGGAATATGGGACTACTTCG-3’)を用いたPCRをおこなう。このPCRは、非特許文献６に基づくものである。グルコアミラーゼ(STA1)遺伝子が挿入されていることを確認するためには、STA1-U1プライマー(5’- CCATCTATCGAATTATGAATGATGCTATTT-3’)、STA1-D1プライマー(5’- GTCGACAGATACAATCCTGGCAACAAGTTG-3’)を用いたPCRをおこなう。このPCRで用いたプライマー配列は、非特許文献７に基づくものである。
【００１４】
接合により生じた2倍体酵母が、グルコアミラーゼを分泌しているかは、YPGL培地(1% yeast extract, 2% peptone, 2% glycerol, 2% lactic acid, pH6.2)に、3日間培養し、培養上清を、キッコーマンの糖化力測定キットを用いてグルコアミラーゼ活性を測定し、確認した。
【００１５】
育種したグルコアミラーゼ発現2倍体酵母S. cerevisiae 278/113 （受託番号NITE AP-02330）を用いて、モルトエキストラクト培地を用いた食品製造を模した発酵試験をおこなった。Difco社製のmalt extractを12%濃度で溶解させ、酵母を2.0×107 cells/mlの初期菌濃度で接種後、25℃に静置し、二酸化炭素の発生に伴う発酵液の重量減少を測定した。発酵試験終了後に、産生されたエタノール量は、JKインターナショナル製のF-キット（エタノール）を用いて測定した。発酵試験終了後の発酵液中の各マルトオリゴ糖含量は、HPLCを用いて測定した。HPLCの分離条件は、以下のようにおこなった。カラム：4.6mmI.D.×250mm COSMOSIL Sugar-D packed column (ナカライテスク)、移動相：65/35 アセトニトリル/H2O、流量：1.0ml/min、検出器：日立L-3300示差屈折計。
【実施例】
【００１６】
以下に本発明の詳細を実施例により示す。なお、これらは本発明の理解を助けるための例示であって、本発明を限定するものと解すべきではない。
【００１７】
＜実施例１＞
１）グルコアミラーゼ発現食品用酵母の接合による育種
接合性aを示し、グルコアミラーゼ(STA1)遺伝子を有する1倍体酵母Sacchromyces cerevisiae 278株と、マルトース分解力が強く、アルコール産生量も多い接合性aを示す1倍体酵母S. cerevisiae MAFF113371の両酵母菌株を、107 cells/ml程度となるように、YPD液体培地(1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose)に懸濁し、約25℃で、4時間から24時間培養した後、YPD寒天培地に菌液を塗布し、約25℃で、2日から4日間培養し、コロニーを形成させた。形成されたコロニーが、接合した2倍体酵母であるかは、接合性遺伝子(MAT)座にYa配列とYa配列がともに挿入されていること、グルコアミラーゼ(STA1)遺伝子が挿入されていることを、PCRで確かめることでおこなった。形成されたコロニーは、YPD液体培地で培養し、集菌後、タカラバイオ製Genとるくん（酵母用）等の方法に従い、ゲノムDNAを抽出し、これを鋳型としたPCRをおこなった。接合性遺伝子(MAT)座のPCRのうち、Ya配列が挿入されていることを確認するためには、MAT特異的プライマー(5’-ATACTTTGCTTCCATGAGGATTCTTATATTAGGGA-3’)と、MATa特異的プライマー(5’-TGGCATTACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3’)を用いたPCRをおこなった。Ya配列が挿入されていることを確認するためには、MAT特異的プライマー(5’-ATACTTTGCTTCCATGAGGATTCTTATATTAGGGA-3’)と、MATa特異的プライマー(5’- AAATGCAGCACGGAATATGGGACTACTTCG-3’)を用いたPCRをおこなった。結果は、図１に示した。接合によって育種されたグルコアミラーゼ発現2倍体酵母S. cerevisiae 278/113 （受託番号NITE AP-02330）の接合性遺伝子(MAT)座にYa配列（図１a） lane 1）とYa配列（図１a） lane 2）がともに挿入されていること、グルコアミラーゼ(STA1)遺伝子が挿入されていること（図１b） lane1）が確認された。一方、同様に接合により育種した2倍体酵母S. cerevisiae Y7/278も同様の結果であった。
【００１８】
２）2倍体酵母S. cerevisiae 278/113 （受託番号NITE AP-02330）のグルコアミラーゼ活性の測定
接合により育種された2倍体酵母S. cerevisiae 278/113 （受託番号NITE AP-02330）を、YPGL培地(1% yeast extract, 2% peptone, 2% glycerol, 2% lactic acid, pH6.2)で、3日間培養し、培養上清について、キッコーマンの糖化力測定キットを用いてグルコアミラーゼ活性を測定した。2倍体酵母S. cerevisiae 278/113 （受託番号NITE AP-02330）のグルコアミラーゼ活性は、3.0 mU/mlあり、グルコアミラーゼの分泌が確認された。この2倍体酵母S. cerevisiae 278/113 （受託番号NITE AP-02330）は、接合性遺伝子(MAT)座にYa配列（図１a） lane 1）とYa配列（図１a） lane 2）がともに挿入されているが、グルコアミラーゼ活性を有していた。一方、同様に接合により育種した2倍体酵母S. cerevisiae Y7/278は、グルコアミラーゼ活性は検出限界以下であった（検出限界0.1mU/ml）。従って、接合性遺伝子(MAT)座にYa配列とYa配列がともに挿入されている2倍体酵母株であっても、グルコアミラーゼを培地中に分泌する場合があり、また、産業用酵母株のうちには、STA1遺伝子の導入によっても、グルコアミラーゼ活性の発現がみられない場合もあり（非特許文献５）、STA1遺伝子の発現制御には、いくつかの制御要因があると考えられた。
【００１９】
３）2倍体酵母S. cerevisiae 278/113 （受託番号NITE AP-02330）のモルトエキストラクト培地を用いた発酵試験
接合により育種された2倍体酵母S. cerevisiae 278/113 （受託番号NITE AP-02330）に、グルコアミラーゼ活性があることが確認されたので、デキストリンを含有する発酵液で発酵させることで、通常の食品用酵母が分解することができないデキストリンを分解することができるかを確認した。HPLCによって測定したデキストリンは、グルコースが4つ以上重合したマルトオリゴ糖4種（マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース）である。発酵試験の経過観察は、発生する二酸化炭素が系外に排出されることによる発酵液重量の減少を測定することでおこなった（図２）。発酵終了後には、発酵液中のエタノール濃度を測定した。発酵試験に用いた酵母は、最も典型的な下面ビール酵母Weihenstephan34/70、接合試験の親株であるS. cerevisiae MAFF113371及び育種されたグルコアミラーゼ発現2倍体酵母S. cerevisiae278/113 （受託番号NITE AP-02330）である。
【００２０】
発酵経過は、図2に示した通りである。親株であるS. cerevisiae MAFF113371及び最も典型的な下面ビール酵母Weihenstephan34/70は、順調な発酵経過を示し、発酵開始3日目以降、発酵液の重量の減少はみられなかった。一方、グルコアミラーゼを発現する育種された2倍体酵母S. cerevisiae 278/113 （受託番号NITE AP-02330）は、発酵初期（0日目から5日目）の発酵液重量減少量が、他の2株と比べて低かったが、その後、上回り、最終的には、他の2株以上の発酵液重量減少量を示した。
【００２１】
発酵液のマルトオリゴ糖を測定したHPLCのチャートは、図３から図５に示した。発酵試験開始前の12%モルトエキストラクト培地のHPLCのチャートは、図３に示した。12%モルトエキストラクト培地には、グルコース、マルトース、マルトトリオースのみならず、グルコースが4分子以上結合したマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースも存在することが明らかになった。最も典型的な下面ビール酵母Weihenstephan34/70の発酵最終日9日目の発酵液のHPLCのチャートは、図４に示した。グルコース、マルトース、マルトトリオースは、発酵試験終了後の発酵液には、ほとんど残存しておらず、食品用酵母は、マルトトリオースまでは利用できることの通説を裏付けるものであった。一方、グルコアミラーゼ発現2倍体酵母S. cerevisiae278/113 （受託番号NITE AP-02330）の発酵最終日9日目の発酵液のHPLCのチャートは、図５に示した。グルコース、マルトース、マルトトリオースのみならず、4分子以上結合したマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースも分解され、発酵試験終了後の発酵液にはほとんど残存していないことが明らかになった。これは、グルコアミラーゼ発現2倍体酵母S. cerevisiae278/113 （受託番号NITE AP-02330）からグルコアミラーゼが分泌され、培地中のマルトオリゴ糖（デキストリン）が分解されたことを示している。なお、発酵試験終了後に、培地中に残存していた各マルトオリゴ糖の濃度は、表1に示した。グルコアミラーゼ発現2倍体酵母S. cerevisiae278/113 （受託番号NITE AP-02330）は、培地中のデキストリンを分解するのに十分なグルコアミラーゼを分泌する酵母菌株であるといえる。
【００２２】
【表１】
2018038282.tif 000002
【００２３】
発酵試験終了後の発酵液のエタノール濃度について、表２に示した。グルコアミラーゼ発現2倍体酵母S. cerevisiae278/113 （受託番号NITE AP-02330）では、グルコアミラーゼが培地中に分泌され、培地中のマルトオリゴ糖（デキストリン）が分解され、産生されるエタノール量が増加したと考えられた。
【００２４】
【表２】
2018038282.tif 000003
【００２５】
12%モルトエキストラクト培地での発酵試験で、発酵期間1日目から5日目のグルコアミラーゼ発現2倍体酵母S. cerevisiae278/113 （受託番号NITE AP-02330）の発酵速度（発酵液重量減少速度）が、他の酵母株2株と比較して遅くなっていることは、培地中に分泌されたグルコアミラーゼの作用で、マルトオリゴ糖（デキストリン）が分解され、生成されるグルコースによって、マルトース等の分解が抑制されたことによると考えられた。
【００２６】
12%モルトエキストラクト培地での発酵試験終了後の発酵液の香気成分（酢酸エチル、イソアミルアルコール）を、ヘッドスペースガスクロマトグラフィー法で測定した。測定した結果は、表3に示した。
【００２７】
【表３】
2018038282.tif 000004
【００２８】
12%モルトエキストラクト培地での発酵試験で、グルコアミラーゼ発現2倍体酵母S. cerevisiae278/113 （受託番号NITE AP-02330）の香気成分の濃度は、他の酵母株2株と比較して高かった。これは、培地中に分泌されたグルコアミラーゼの作用で、マルトオリゴ糖（デキストリン）が分解され、生成されるグルコース等の糖が、酢酸エチルやイソアミルアルコール等の香気成分に変換されることによるものと考えられた。
【図１】
2018038282.tif 000005
【図２】
2018038282.tif 000006
【図３】
2018038282.tif 000007
【図４】
2018038282.tif 000008
【図５】
2018038282.tif 000009