(57)【要約】【課題】ＴＲＰＶ４の活性を抑制し、ＩＢＳの予防又は改善に有用なＴＲＰＶ４活性抑制剤、ＩＢＳの予防又は改善を提供する。【解決手段】ロズマリン酸 、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制剤。
【請求項２】
ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善剤。
【請求項３】
ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制用食品。
【請求項４】
ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善用食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＲＰＶ４活性抑制剤、及び過敏性腸症候群の予防又は改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＲＰＶ４（Transient receptor potential cation channel subfamily V member 4）は、温度感受性ＴＲＰチャネルを構成するタンパク質の１つである。ＴＲＰＶ４は、腎、肺、膀胱、心臓、皮膚、脳、消化管など幅広い組織で発現しており、異なった幅広い生理的役割を果たしていると考えられている。
【０００３】
過敏性腸症候群（Irritable Bowel Syndrome：IBS）は、細菌やウイルスの感染による腸炎や、潰瘍性大腸炎・大腸がん等の病気とは異なり、検査を行っても炎症や潰瘍といった器質的疾患が認められないにもかかわらず、下痢や便秘、腹痛、ガス過多による下腹部の張りなどの腹部不快感が生じる疾患である。
【０００４】
その原因として、腸の運動を司る自律神経の異常による大腸を中心とした消化管運動の異常、消化管知覚閾値の低下、精神的不安や過度の緊張などを原因とするストレス、ライフスタイルのゆがみなど複合的な要因が指摘されている。ＩＢＳ患者ではＴＲＰＶ４アゴニストである多価不飽和脂肪酸の代謝産物（５，６−エポキシエイコサトリエン酸；５，６−ＥＥＴ）量が結腸で多いこと、当該５，６−ＥＥＴを含む結腸の破砕液をマウス結腸へ投与した場合に腸運動反応が増加して腸が過剰反応するが、この場合においてＴＲＰＶ４の発現を抑制すると当該過剰反応が抑制されることが報告されている（非特許文献１）。
したがって、ＴＲＰＶ４活性を抑制することにより、ＩＢＳを予防又は改善することが期待される。
【０００５】
シソ科植物に多く含有されているタンニンの一種であるロズマリン酸は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の発症や進行を抑制する作用があること（特許文献１）、インスリン分泌促進作用があること（特許文献２）、花粉症の改善作用があること（非特許文献２）等が報告されている。
また、ロズマリン酸の代謝産物としてヒト尿中に排出されるジメチルロズマリン酸は、シクロオキシゲナーゼ２の誘導抑制活性を有し、抗炎症作用があることが報告されている（特許文献３）。
しかし、ロズマリン酸やジメチルロズマリン酸がＴＲＰＶ４活性抑制作用を有することや、ＩＢＳの予防又は改善に有用であることは全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−２５６２８２号公報
【特許文献２】特開２００５−１３９１３６号公報
【特許文献３】特開２００５−２７２３６２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nicolas Cenac et al., Gastroenterology 2015 149, 433-444
【非特許文献２】Osakabe N et al., Biofactors. 2004 21,127-31
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＴＲＰＶ４の活性を抑制し、ＩＢＳの予防又は改善に有用なＴＲＰＶ４活性抑制剤、ＩＢＳの予防又は改善剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、ＴＲＰＶ４活性を抑制する素材について鋭意検討を行った結果、ロズマリン酸のヒト代謝産物であるジメチルロズマリン酸が、ＴＲＰＶ４活性を抑制する作用を有し、ＩＢＳの予防又は改善に有用であることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の１）〜４）に係るものである。
１）ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制剤。
２）ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善剤。
３）ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制用食品。
４）ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善用食品。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＴＲＰＶ４活性抑制剤は、ＴＲＰＶ４活性を効果的に抑制することができ、ＴＲＰＶ４チャネルが活性化されることによって生じる疾患、例えば過敏性腸症候群の予防又は改善に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において「ＴＲＰＶ４」とは、「Transient receptor potential cation channel subfamily V member 4」を意味する。ＴＲＰＶ４は、ヒトにおいてＴＲＰＶ４遺伝子によってコードされているタンパク質である。
【００１３】
本発明の「ロズマリン酸」はシソ科植物に多く含有されているタンニンの一種であり、下記式（Ａ）で示される。本発明の「ジメチルロズマリン酸」は、当該ロズマリン酸のヒト代謝産物であり（前記特許文献３）、下記式（Ｂ）で示される、３，３’−ジメチルロズマリン酸を意味する。
【００１４】
【化１】
2018177738.tif 000002
【００１５】
本発明において、ロズマリン酸は、市販品であってもよいし、常法に基づき化学合成すること（SYNTHESIS, 755-762 (1996)、Can. J. Chem., 75, 1783-1794 (1997)）、或いはロズマリン酸を含有するシソ科植物等の植物体又は培養細胞から抽出・精製することにより取得することができる（特開昭６２−３２８８９号公報）。
ジメチルロズマリン酸は、後記製造例に示すとおり、例えば下記の反応スキームに従って合成することができる。
【００１６】
【化２】
2018177738.tif 000003
【００１７】
本発明のロズマリン酸及びジメチルロズマリン酸には、光学異性体が存在する。本発明のロズマリン酸及びジメチルロズマリン酸は、これらのいずれかの光学異性体であっても、光学異性体の混合物であってもよい。本発明ではＲ体又は光学異性体混合物が好ましい。
【００１８】
本発明のロズマリン酸及びジメチルロズマリン酸は、その薬学的に許容される塩又は溶媒和物とすることができる。このような塩の好ましい例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩のようなアルカリ金属およびアルカリ土類金属塩、あるいは酸付加塩などが挙げられる。溶媒和物の好ましい例としては、水和物、アルコール和物あるいはアセトン和物などが挙げられる。
【００１９】
後記実施例で示すように、ロズマリン酸の代謝産物であるジメチルロズマリン酸は、ＴＲＰＶ４活性を抑制する。すなわち、ＴＲＰＶ４刺激物質（ＴＲＰＶ４作動薬、アゴニスト）の存在下で、ＴＲＰＶ４遺伝子導入により、ＴＲＰＶ４が機能的に発現している形質転換細胞（ＴＲＰＶ４発現細胞）とジメチルロズマリン酸とを接触させた場合、ＴＲＰＶ４刺激物質による細胞内の陽イオン量の流入を抑制するという、ＴＲＰＶ４活性を抑制する作用を有する。
したがって、ジメチルロズマリン酸、その前駆体であるロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物（以下、「本発明の化合物」とも称する）は、ＴＲＰＶ４活性抑制剤となり、ＴＲＰＶ４活性抑制のため、或いはＴＲＰＶ４活性抑制剤を製造するために使用できる。
【００２０】
前述のとおり、ＩＢＳ患者の結腸においては、多価不飽和脂肪酸の代謝産物ある５，６−ＥＥＴ（ＴＲＰＶ４アゴニスト）の量が多いこと、また当該５，６−ＥＥＴを含む結腸の破砕液をマウス結腸へ投与した場合に腸が過剰反応し、当該過剰反応はＴＲＰＶ４の発現を抑制することにより抑制されることが報告されている（前記非特許文献１）。
したがって、ＴＲＰＶ４活性抑制剤は、ＩＢＳの予防又は改善剤として、ＩＢＳに対する予防又は改善のために使用することができると考えられる。
【００２１】
本発明において、「ＴＲＰＶ４の活性抑制」とは、受容体であるＴＲＰＶ４の活性を抑制することを指す。具体的には、ＴＲＰＶ４刺激物質がＴＲＰＶ４に結合することによって発現する活性、例えばイオン流束の調節能（例えば、細胞外から細胞内へのカルシウムイオン、ナトリウムイオンなどの陽イオンの輸送能など）、膜電位の調節能（例えば、電流の発生能など）を抑制又は阻害することを意味する。
【００２２】
本発明において、「ＩＢＳ（Irritable Bowel Syndrome」とは、主として大腸の運動および分泌機能の異常で起こる疾患の総称であり、細菌やウイルスの感染による腸炎や、潰瘍性大腸炎・大腸がん等の病気とは異なり、検査では異常が見当たらないが下痢や便秘を繰り返す症状が続く場合に診断される疾患を意味する。
【００２３】
本発明において、ＴＲＰＶ４活性抑制のため、或いはＩＢＳの予防又は改善のための「使用」は、ヒトを含む動物への投与又は摂取であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
【００２４】
なお、本明細書において「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止若しくは遅延、又は個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。また、「改善」とは、疾患、症状若しくは状態の好転、疾患、症状若しくは状態の悪化の防止若しくは遅延、又は疾患、症状若しくは状態の進行の逆転、防止若しくは遅延をいう。
【００２５】
本発明のＴＲＰＶ４活性抑制剤、ＩＢＳの予防又は改善剤は、ヒトを含む動物に摂取又は投与した場合に、ＴＲＰＶ４活性抑制効果、ＩＢＳの予防又は改善効果を発揮する医薬品、医薬部外品、サプリメント又は食品となり、或いはこれらへ配合するための素材又は製剤となり得る。
また、本発明の食品には、一般飲食品のほか、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品、機能性表示食品、サプリメントが包含される。
【００２６】
本発明の化合物を含む上記医薬品（医薬部外品を含む）は、任意の投与形態で投与され得るが、経口投与が好ましい。投与に際しては、有効成分を経口投与、直腸内投与、注射等の投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。
【００２７】
このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００２８】
また、本発明の化合物を配合した上記食品の形態は、清涼飲料水、茶系飲料、コーヒー飲料、果汁飲料、炭酸飲料、ゼリー、ウエハース、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品や栄養食等の各種食品の他、さらには、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、トローチ剤等の固形製剤）の栄養補給用組成物が挙げられる。なかでも、錠剤が好ましく、チュアブル錠がより好ましい。
種々の形態の食品を調製するには、本発明の化合物を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００２９】
上記の医薬品（医薬部外品を含む）や食品中の本発明の化合物の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、更に好ましくは１質量％以上であり、また、好ましくは９５質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、更に好ましくは７０質量％以下である。また、好ましくは０．０１〜９５質量％、より好ましくは０．１〜９０質量％、更に好ましくは１〜７０質量％である。
【００３０】
本発明の化合物を医薬品や食品として、或いは医薬品や食品に配合して使用する場合のヒトへの投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人１人当たりの１日の投与量は、通常、ジメチルロズマリン酸又はロズマリン酸として、好ましくは０．０１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上、更に好ましくは１００ｍｇ以上であり、また、好ましくは８００００ｍｇ以下、より好ましくは１５０００ｍｇ以下、更に好ましくは５０００ｍｇ以下である。また、好ましくは０．０１〜８００００ｍｇ、より好ましくは１〜１５０００ｍｇ、更に好ましくは１００〜５０００ｍｇである。
また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数ヶ月間継続して投与することが好ましい。
【００３１】
投与又は摂取対象としては、ＴＲＰＶ４活性抑制、ＩＢＳの予防又は改善を必要とする若しくは希望するヒトを含む動物であれば特に限定されないが、ストレス等により下痢や便秘、腹痛、ガス過多による下腹部の張りなどの症状を呈するヒトへの投与又は摂取が有効である。
【００３２】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制剤。
＜２＞ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善剤。
＜３＞ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とするＴＲＰＶ４活性抑制用食品。
＜４＞ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善用食品。
【００３３】
＜５＞ＴＲＰＶ４活性抑制剤を製造するためのロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上の使用。
＜６＞過敏性腸症候群の予防又は改善剤を製造するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上の使用。
＜７＞ＴＲＰＶ４活性抑制用食品を製造するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上の使用。
＜８＞過敏性腸症候群の予防又は改善用食品を製造するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上の使用。
【００３４】
＜９＞ＴＲＰＶ４活性抑制に使用するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上。
＜１０＞過敏性腸症候群の予防又は改善に使用するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上。
【００３５】
＜１１＞ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取するＴＲＰＶ４活性抑制方法。
＜１２＞ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する過敏性腸症候群の予防又は改善方法。
【００３６】
＜１３＞＜１＞及び＜５＞のＴＲＰＶ４活性抑制剤、＜２＞及び＜６＞の過敏性腸症候群の予防又は改善剤、＜３＞及び＜７＞のＴＲＰＶ４活性抑制用食品、＜４＞及び＜８＞の過敏性腸症候群の予防又は改善用食品における、前記有効成分の含有量は、総量中好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、更に好ましくは１質量％以上であり、また、好ましくは９５質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、更に好ましくは７０質量％以下である。また、好ましくは０．０１〜９５質量％、より好ましくは０．１〜９０質量％、更に好ましくは１〜７０質量％である。
【００３７】
＜１４＞＜１１＞又は＜１２＞において、成人１人当たりの１日の投与量は、ロズマリン酸又はジメチルロズマリン酸として、好ましくは０．０１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上、更に好ましくは１００ｍｇ以上であり、また、好ましくは８００００ｍｇ以下、より好ましくは１５０００ｍｇ以下、更に好ましくは５０００ｍｇ以下である。また、好ましくは０．０１〜８００００ｍｇ、より好ましくは１〜１５０００ｍｇ、更に好ましくは１００〜５０００ｍｇである。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
製造例  ジメチルロズマリン酸の合成
（１）試薬
３−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）乳酸ナトリウム（１）（ラセミ混合物）は東京化成より、フェルラ酸（３）は和光純薬工業より、それぞれ購入して使用した。
【００３９】
（２）α−ヒドロキシ−３−メトキシ−４−（２−プロピレニロキシ）ベンゼンプロパン酸２−プロピレニルエステル（２）の合成
【００４０】
【化３】
2018177738.tif 000004
【００４１】
３−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）乳酸ナトリウム（１）（５００ｍｇ、２．１４ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（８８５ｍｇ、６．４１ｍｍｏｌ）を５０ｍＬナスフラスコにとり、アルゴン置換した後、超脱水アセトン  ７．１ｍＬを加え、分散させた。その後、臭化アリル（２．７７ｍＬ、３２．０ｍｍｏｌ）を加え、Ｎ２置換後ｒｅｆｌｕｘ条件下に２０時間撹拌した。
反応終了後、ろ過、ろ過残渣を塩化メチレン（２５ｍＬ）で洗浄し、ろ液と洗浄液を併せ、減圧濃縮を行った。これに塩化メチレン  ２０ｍＬとＨ２Ｏ  ２０ｍＬを加え、分層後、塩化メチレン層を回収した。水層は、さらに塩化メチレン  ５ｍＬで３回抽出し、回収した。回収した塩化メチレン層を併せて、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧濃縮した（９８８．２ｍｇ）。
これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、標題化合物（２）の精製品５１３ｍｇ（無色、油状、収率８２％）を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件は、以下の通り。
【００４２】
＜シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件＞
カラム： Universal Premium L (30μm, 60Å, 3.0x16.5cm, 40g) [YAMAZEN]
インジェクトカラム：INJECT COLUMN S [YAMAZEN]
溶離液：ヘキサン / 酢酸エチル = 95 / 5 (4min) 95 / 5 (11min) 74 / 26 (14min) 74 / 26
流速：20mL / min、分取時間：29min、分取容量：12mL / 本、48本分取
分取各Fr.をTLCにて確認後、目的Fr.（fr.43-53）を減圧濃縮、乾燥。
【００４３】
（３）３−メトキシ−４−（２−プロピレニロキシ）フェニル−２−プロピレン酸（４）の合成
【００４４】
【化４】
2018177738.tif 000005
【００４５】
フェルラ酸（３）（５００ｍｇ、２．５８ｍｍｏｌ）に、超脱水エタノール１７ｍＬを加え、溶解させた。その後、臭化アリル（２６７μＬ、３．０９ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（４２７ｍｇ、３．０９ｍｍｏｌ）を順次加え、Ｎ２置換後ｒｅｆｌｕｘ条件下に５．５時間撹拌した。ＴＬＣにより反応進行を確認しつつ、室温まで放冷し、水酸化カリウム（４３４ｍｇ、７．７４ｍｍｏｌ）を加え、さらに１６時間撹拌した。
反応終了後、減圧濃縮し、再度Ｈ２Ｏ  ２５ｍＬに溶解後、２Ｎ塩酸および濃塩酸を添加して、ｐＨ＝０とした。これを酢酸エチル（２５ｍＬ）で５回抽出した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥、減圧濃縮した（６８７．５ｍｇ）。
これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、標題化合物（４）の精製品２２１．４ｍｇ（無色、油状、収率３７％）を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件は、以下の通り。
【００４６】
＜シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件＞
カラム： Universal Premium L (30μm, 60Å, 3.0x16.5cm, 40g) [YAMAZEN]
インジェクトカラム：INJECT COLUMN M [YAMAZEN]
溶離液：
1%酢酸 in ヘキサン / 1%酢酸 in 酢酸エチル = 100 / 0 (4min) 100 / 0 (11min) 84 / 16 (24min) 84 / 16 (0min) 80 / 20 (7min) 80 / 20
流速：20mL / min、分取時間：46min、分取容量：12mL / 本、77本分取
分取各Fr.をTLCにて確認後、目的Fr.（fr.48-75）を減圧濃縮、乾燥。
【００４７】
（４）α−[[３−[３−メトキシ−４−（２−プロピレニロキシ）フェニル]−１−オキソ−２−プロピレニル]オキシ]-３−メトキシ−４−（２−プロピレニロキシ）ベンゼンプロパン酸２−プロピレニルエステル（５）の合成
【００４８】
【化５】
2018177738.tif 000006
【００４９】
化合物（２）（１００ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）に、塩化メチレン  １．７ｍＬを加え、溶解させた。その後、化合物（４）（１０４ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（６．３ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）を順次加え、−２０℃に冷却した後、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（８８．２ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を加えた。Ｎ２置換後室温で２４時間撹拌した後、析出した尿素をろ過除去、酢酸エチルで洗浄し、減圧濃縮した（２８８．５ｍｇ）。
これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、標題化合物（５）の精製品１５１．８ｍｇ（白色、ワックス状）を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件は、以下の通り。
【００５０】
＜シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件＞
カラム： Universal Premium L (30μm, 60Å, 3.0x16.5cm, 40g) [YAMAZEN]
インジェクトカラム：INJECT COLUMN S [YAMAZEN]
溶離液：
ヘキサン / 酢酸エチル = 87 / 13 (4min) 87 / 13 (11min) 66 / 34 (14min) 66 / 34
流速：20mL / min、分取時間：29min、分取容量：12mL / 本、48本分取
分取各Fr.をTLCにて確認後、目的Fr.（fr.34-36）を減圧濃縮、乾燥。
【００５１】
（５）３，３’−ジメチルロズマリン酸（Ｂ）の合成
【００５２】
【化６】
2018177738.tif 000007
【００５３】
化合物（５）（８７．３ｍｇ、０．１７２ｍｍｏｌ）をＮ２雰囲気下のグローブボックス中で５０ｍＬナスフラスコに採り、超脱水テトラヒフドロフラン  ８．６ｍＬおよびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）錯体（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４）（１９．８ｍｇ、１７．２μｍｏｌ）、モルホリン（４５０μＬ、５．１５ｍｍｏｌ）を順次加えた。反応混合物は、Ｎ２雰囲気下、室温で１８時間撹拌した。
反応終了後、減圧濃縮した後、１Ｎ塩酸２０ｍＬで酸性化し、これを酢酸エチル（２０ｍＬ）で３回抽出した。酢酸エチル層は併せて、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した（１１７．０ｍｇ）。これを、分取ＴＬＣにて精製し、標題化合物（Ｂ）の精製品６１．４ｍｇ（白色、粉末状、収率９２％）を得た。分取ＴＬＣの条件は、以下の通り。
なお以下の実施例では、合成したジメチルロズマリン酸をジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）で適宜希釈して評価に供した。
＜分取TLCの条件＞
TLC： PLC Silica gel 60 F254 (1mm, 20x20cm, #1.13895.0001) [Merck]
展開溶媒：クロロホルム / アセトン/ 88%ギ酸 = 75 / 16.5 / 8.5   200mL
脱離液：クロロホルム / アセトン / 88%ギ酸 = 75 / 16.5 / 8.5  15mL
【００５４】
【表１】
2018177738.tif 000008
【００５５】
実施例１  ＴＲＰＶ４活性抑制作用の評価
（１）ヒトＴＲＰＶ４遺伝子発現ベクターの作製
ヒト十二指腸由来細胞（Ｈｕｔｕ−８０細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）から抽出したｔｏｔａｌＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡを鋳型にして、公開されているヒトＴＲＰＶ４遺伝子配列を参考に合成した、下記に示す塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて、下記の条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
【００５６】
＜プライマーセット＞
フォワードプライマー；5’-CACCATGGCGGATTCCAGCGAAGGCCC-3’（配列番号１）
リバースプライマー；5’-CTAGAGCGGGGCGTCATCAGTCC-3’（配列番号２）
【００５７】
＜ＰＣＲ条件＞
a）PCR溶液組成
cDNA（Template）                                15μL
5x PrimeStar GXL Buffer                         10μL
dNTPs mixture（2.5mM）                           4μL
PrimeStar GXL DNA Polymerase（タカラバイオ）     1μL
Forward Primer（10μM）                          1μL
Reverse Primer（10μM）                          1μL
Water                                           18μL
b）温度とサイクル条件
95℃  2min
↓
98℃  10sec  33 cycles
70℃   2min
【００５８】
得られたＰＣＲ産物をＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商品名、ロッシュ社製）用いて精製した。精製したＰＣＲ産物と、ｐｃＤＮＡ３．１  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（商品名、インビトロジェン社製）を用いて、ヒトＴＲＰＶ４遺伝子発現ベクターを作製した。
【００５９】
（２）ヒトＴＲＰＶ４発現細胞の作製
１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン社製）を用いて、ヒト子宮頸癌由来細胞株（ＨｅＬａ細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）の培養を行った。ＨｅＬａ細胞をＴ−７５細胞培養用フラスコに５×１０５ｃｅｌｌｓ／Ｆｌａｓｋで播種した。培養３日後、前記（１）で作製したヒトＴＲＰＶ４遺伝子発現用ベクター（８μｇ）をＴｒａｎｓＩＴ−ＨｅＬａＭＯＮＳＴＥＲ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いて細胞にトランスフェクションし、１日培養した。
Ｄｅｔａｃｈｉｎ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ社製）で細胞をはがし９６ｗｅｌｌ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ｂｏｔｔｏｍ  ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ社製）に１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／９０μＬ／ｗｅｌｌの細胞密度で播き、さらに１日培養した。
【００６０】
（３）細胞内カルシウムイオン流入活性の測定
細胞内カルシウムイオン流入活性の測定は、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｋｉｔ  ＩＩ−  ｆｌｕｏ  ４（商品名、ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて行った。Ｆｌｕｏ４−ＡＭを含有したＬｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを前記（２）で作製したヒトＴＲＰＶ４発現細胞に９０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、３７℃で蛍光プレートリーダーＦＤＳＳ３０００（商品名、浜松ホトニクス社製）を用いて蛍光強度（励起波長：４８８ｎｍ、蛍光波長：５２４ｎｍ）を２秒毎に測定した。測定開始３０秒後にＴＲＰＶ４作動薬であるＧＳＫ１０１６７９０ａ（Ｓｉｇｍａ社製）と検体として前記製造例で調製したジメチルロズマリン酸溶液をそれぞれ測定キットの希釈ｂｕｆｆｅｒで希釈し、それらの混合溶液（添加直前に混合）を２０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３００秒まで２秒毎に蛍光強度変化を測定した。なお、ＧＳＫ１０１６７９０ａは終濃度３ｎＭとなるように添加した。
また、ＴＲＰＶ４活性抑制の陽性対照として、ＴＲＰＶ４の拮抗薬であるＨＣ０６７０４７を終濃度１００μＭで添加した。
検体のＴＲＰＶ４活性は、ＴＲＰＶ４作動薬であるＧＳＫ１０１６７９０ａの処理によるカルシウムイオン流入率を１００％として、次式により算出した。
【００６１】
（数１）
カルシウムイオン流入率（%）＝［(F300／F0)- (F300C2／F0C2) ］／［(F300C1／F0C1)- (F300C2／F0C2)］×100
Ｆ３００：測定開始３００秒後のＧＳＫ１０１６７９０ａと検体を添加したウェルの蛍光強度
Ｆ３００Ｃ１：測定開始３００秒後のＧＳＫ１０１６７９０ａと溶媒を添加したウェルの蛍光強度
Ｆ３００Ｃ２：測定開始３００秒後の溶媒のみを添加したウェルの蛍光強度
Ｆ０：測定開始直後のＦ３００と同じウェルの蛍光強度
Ｆ０Ｃ１：測定開始直後のＦ３００Ｃ１と同じウェルの蛍光強度
Ｆ０Ｃ２：測定開始直後の溶媒のみを添加したウェルの蛍光強度
【００６２】
検体を添加した場合のカルシウムイオン流入率を、ＧＳＫ１０１６７９０ａ＋溶媒添加時と比較しＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔを用いて検定した。ジメチルロズマリン酸を添加した場合の結果を表２に示す（表中、ＧＳＫ１０１６７９０ａ、ジメチルロズマリン酸は、それぞれＧＳＫ、ＭｅＲＡと略記）。
【００６３】
【表２】
2018177738.tif 000009
【００６４】
表２より、陽性対照であるＨＣ０６７０４７（ＴＲＰＶ４の拮抗薬）と同様、ジメチルロズマリン酸は濃度依存的にカルシウムイオン流入を有意に低下させた。
【００６５】
以上の結果から、ジメチルロズマリン酸を適用することにより、ＴＲＰＶ４活性が有意に抑制される。これは、ジメチルロズマリン酸が、ＴＲＰＶ４活性の抑制に有効であることを示している。さらに、ＴＲＰＶ４活性を抑制する作用を有するジメチルロズマリン酸は、過敏性腸症候群の予防又は改善に有効であることを示している。
なお、前述のとおり、ジメチルロズマリン酸は、ロズマリン酸の体内代謝産物であることから、前駆体であるロズマリン酸もＴＲＰＶ４活性の抑制、過敏性腸症候群の予防又は改善に有効であると考えられる。
【配列表】
2018177738000001.app