(57)【要約】      （修正有）【課題】アディポネクチン発現増加誘導化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む抗老化用または皮膚の赤み緩和用化粧料組成物の提供。【解決手段】式（１）で表されるアディポネクチン発現増加誘導化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む、抗老化用化粧料組成物。2018177805.tif 000020（ｎは２の整数。）【選択図】図１１
2018177805.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式（１）で表されるアディポネクチン発現増加誘導化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む、抗老化用化粧料組成物。
【化１】
2018177805.tif 000016
（前記化学式（１）中、ｎは２の整数である。）
【請求項２】
下記化学式（１）で表されるアディポネクチン発現増加誘導化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む、皮膚の赤み緩和用化粧料組成物。
【化２】
2018177805.tif 000017
【請求項３】
化学式（１）で表される化合物は、下記化学式（２）で表される、請求項１または２に記載の化粧料組成物。
【化３】
2018177805.tif 000018
【請求項４】
アディポネクチン発現増加誘導化合物またはその薬学的に許容可能な塩が、０．０００１〜１０重量％含まれる、請求項１または２に記載の化粧料組成物。
【請求項５】
香料、色素、殺菌剤、酸化防止剤、防腐剤、保湿剤、安定化剤、乳化剤、粘増剤、液晶膜強化剤、顔料、賦形剤、希釈剤、無機塩類および合成高分子物質から選択される一つまたは二つ以上をさらに含む、請求項１または２に記載の化粧料組成物。
【請求項６】
光老化によるしわ、皮膚の老化または皮膚の赤みの予防または改善に使用される、請求項１または２に記載の化粧料組成物。
【請求項７】
化粧料組成物の剤形が、懸濁液、エマルション、ペースト、ジェル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング剤形、オイル、パウダーファンデーション、エマルジョンファンデーション、ワックスファンデーションまたはスプレーである、請求項１または２に記載の化粧料組成物。
【請求項８】
下記化学式（１）で表されるアディポネクチン発現増加誘導化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、光による皮膚炎症疾患の予防および治療用医薬組成物。
【化４】
2018177805.tif 000019
（前記化学式（１）中、ｎは２の整数である。）
【請求項９】
アディポネクチン発現増加誘導化合物またはその薬学的に許容可能な塩が０．０００１〜１０重量％含まれる、 請求項８に記載の光による皮膚炎症疾患の予防および治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗老化用または皮膚の赤み緩和用化粧料組成物、並びに皮膚疾患の予防および治療用組成物に関し、より詳細には、アディポネクチンの発現とオートファジー活性を増加させるアディポネクチン発現増加誘導化合物またはその薬学的に許容される塩を含む抗老化用または皮膚の赤み緩和用化粧料組成物、並びに皮膚炎症疾患の予防および治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
太陽光の紫外線による皮膚の損傷と再生の繰り返しは、しわを形成し、「光老化（photo‐aging）」につながる。紫外線への慢性的な露出は、マトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinases、MMPs）の発現を増加させ、真皮層の８０％以上を占めて、皮膚組織の弾性と強度に重要な細胞外マトリックス（extracellular matrix、ECM）タンパク質であるコラーゲン（collagen）を破壊する。破壊されたコラーゲンは、傷の治癒過程で再生される過程で変形された形態で蓄積され、臨床的にしわを形成する。また、継続した紫外線への皮膚の露出は、炎症性サイトカインの分泌を増加させ、慢性的な皮膚炎症反応を起こす。
【０００３】
一方、アディポネクチン（Adiponectin）は、脂肪細胞（adipocyte）から分泌する代表的なアディポカイン（Adipokine）であり、脂肪の生成および抑制、食欲調節、インスリン抵抗性の調節、炎症調節などの働きをすると知られている。近年、光老化した皮膚の皮下脂肪でアディポネクチンが減少し、紫外線に露出した時にアディポネクチンの生成が減少するという研究結果が発表されており、紫外線によってアディポネクチンの発現が減少すると、MMP‐１の増加およびコラーゲン生合成を抑制し、光老化が加速化することが報告されている。
【０００４】
また、オートファジー（autophagy）は、細胞内のエネルギー源が枯渇したり細胞内のストレス要因が過剰に発生した際、老朽あるいは損傷した細胞内物質および小器官を分解することで、エネルギーの再生成および損傷物質の除去を行うメカニズムを意味し、正常な細胞の維持を可能にする。オートファジーは、細胞内の恒常性を維持するだけでなく、兔疫細胞反応と炎症経路にも関連している。細胞内微生物の除去のためのメカニズムをオートファジーアダプタにより提供する。
【０００５】
近年、様々な研究により老化が進むほどまたは老化を加速化するほど、細胞内のオートファジー活性が急激に減少すると報告されている。また、オートファジーを抑制した場合、細胞内に老朽ミトコンドリアや誤って折り畳まれたタンパク質などが過剰に蓄積され、細胞内のフリーラジカルおよび酸化ストレスが増加し、結局、細胞の死滅が増加し、老化を促進する結果をもたらすことになる。したがって、細胞内の老化した物質および小器官を分解し、その分解産物をリサイクルするオートファジーメカニズムの活性化により、変形したタンパク質、脂質およびミトコンドリアなどを迅速に除去し、これにより、細胞がより健康な状態で生存できる環境を提供する。
【０００６】
したがって、アディポネクチンの発現増加とともに、細胞内のオートファジー活性化を促進する新たな活性の素材が開発されると、紫外線によるしわ形成と酸化ストレスによってもたらされた毒性物質、また、微細な炎症環境から損傷した皮膚を回復させ、光老化を予防できることが期待される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】The New England Journal of MEDicine,1997; 337:1419-29
【非特許文献２】Scientific Reports, 2016; 6: 25616-25
【非特許文献３】International Journal of Molecular Sciences, 2016, 17(7), 1129-1145
【非特許文献４】International Journal of Molecular Sciences,2016, 17(12): 2063-2078
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、アディポネクチンの発現増加とオートファジー活性化を誘導することができる化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む抗老化用化粧料組成物、特に、光老化による皮膚炎症疾患の予防または紫外線によるしわおよび炎症緩和による抗老化用化粧料組成物を提供する。
【０００９】
本発明は、アディポネクチンの発現増加とオートファジー活性化を誘導することができる化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む皮膚の赤み緩和用化粧料組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明のアディポネクチンの発現増加およびオートファジー活性化を誘導する化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む光による皮膚炎症疾患の予防および治療用医薬組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、アディポネクチンの発現とオートファジー活性を増加させることで、太陽光の紫外線によるしわの生成および炎症を抑制し、酸化ストレスを減少させる働きをする下記化学式（１）で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む抗老化用化粧料組成物を提供する。
【００１２】
【化１】
2018177805.tif 000003
（前記化学式（１）中、ｎは２の整数である。）
【００１３】
また、本発明は、本発明のアディポネクチンの発現とオートファジー活性を増加させることで、太陽光の紫外線による皮膚の赤みを減少させる働きをする前記化学式（１）で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む皮膚の赤み緩和用化粧料組成物を提供する。
【００１４】
より優れた抗老化および皮膚の赤み緩和効果を有するための面において好ましく本発明の一実施形態による前記化学式（１）で表される化合物は、下記化学式（２）で表され得る。
【００１５】
【化２】
2018177805.tif 000004
【００１６】
好ましくは、本発明の一実施形態による化粧料組成物は、前記化学式（１）で表されるアデポネクチン発現増加誘導化合物またはその薬学的に許容可能な塩が、０．０００１〜１０重量％含まれてもよく、懸濁液、エマルション、ペースト、ジェル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング剤形、オイル、パウダーファンデーション、エマルジョンファンデーション、ワックスファンデーションまたはスプレーである剤形であってもよい。
【００１７】
好ましくは、本発明の一実施形態による化粧料組成物は、光老化によるしわ、赤みまたは皮膚の老化の予防および治療用であってもよい。
【００１８】
また、本発明は、本発明の前記化学式１で表されるアディポネクチンの発現増加誘導化合物を含む光による皮膚炎症疾患の予防および治療用医薬組成物を提供する。
【００１９】
本発明の一実施形態による医薬組成物は、アディポネクチン発現増加誘導化合物またはその薬学的に許容可能な塩が、０．０００１〜１０重量％含まれ得る。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の化粧料組成物は、本発明のアディポネクチンおよびオートファジー活性化誘導化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含むことにより、アディポネクチンとオートファジー活性関連タンパク質の発現を増加させ、太陽光、特に紫外線によって増加したMMP‐１遺伝子の分解を抑制することで、光老化によるしわ、皮膚の老化および皮膚の赤みを予防および改善することができる。
【００２１】
また、本発明の医薬組成物は、本発明のアディポネクチンおよびオートファジー活性化誘導化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むことにより、炎症性サイトカインIL‐６とIL‐８の発現を減少させることで、光による皮膚炎症を減少させ、光による皮膚炎症疾患の予防および治療に非常に効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の化合物１の処理によるオートファジー活性化関連タンパク質発現を分析した結果を示す図である。
【図２】本発明の化合物１によるアディポネクチンの遺伝子発現を分析した結果を示す図である。
【図３】本発明の化合物１および化合物４による紫外線誘導アディポネクチンの遺伝子発現を比較分析した結果を示す図である。
【図４】本発明の化合物１および化合物４による紫外線誘導MMP‐１の遺伝子発現を分析した結果を示す図である。
【図５】本発明の化合物１および化合物４による紫外線誘導炎症性サイトカインIL‐６（interleukin‐６）の遺伝子発現を分析した結果を示す図である。
【図６】本発明の化合物１による紫外線誘導炎症性サイトカインIL‐６（interleukin‐６）の分泌変化を分析した結果を示す図である。
【図７】本発明の化合物１および化合物４による紫外線誘導炎症性サイトカインIL‐８（interleukin‐８）の分泌変化を分析した結果を示す図である。
【図８】本発明の化合物１のオートファジー活性によるアディポネクチン生成増加を示した結果を示す図である。
【図９】本発明の化合物１による紫外線誘導DNA損傷反応物CPD（cyclobutane pyrimidine dimer）生成変化に対するELISA分析結果を示す図である。
【図１０】本発明の化合物１による紫外線誘導DNA損傷反応物CPD生成変化を緑色蛍光強度で観察した結果を示す図である。
【図１１】本発明の化合物１により紫外線によって損傷したDNA回復に対するXPC、XPA遺伝子発現を分析した結果を示す図である。
【図１２】本発明の化合物１に対する紫外線損傷予防人体効力試験結果であり、MED増加率を測定した結果を示す図である。
【図１３】本発明の化合物１に対する皮膚の赤み緩和効能評価試験結果であり、試験部位と対照部位の皮膚の赤みの改善程度を比率化した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、アディポネクチンおよびオートファジー活性化関連タンパク質の発現を増加させるアディポネクチン発現増加誘導化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含み、様々な因子による皮膚の老化を予防および改善することができる抗老化用または皮膚の赤み緩和用化粧料組成物を提供するものであり、本発明のアディポネクチン発現増加誘導化合物は、下記化学式１で表される。
【００２４】
【化３】
2018177805.tif 000005
（前記化学式（１）中、ｎは２の整数である。）
【００２５】
本発明の抗老化用および皮膚の赤み緩和用化粧料組成物に含まれる前記化学式（１）の化合物は、抗老化または皮膚の赤みの緩和に著しい効果を示す化合物であり、驚くことに、本発明の前記化学式（１）中、単にｎが０、１および３〜１０の化合物では、本発明の前記化学式１の化合物が有する抗老化効果が現れない。
【００２６】
換言すると、驚くことに、本発明の化合物と同じ骨格であり、単にアルキルの数のみが相違する化合物であるｎが０、１および３〜１０であるそれぞれの化合物では、オートファジー活性化を誘導するだけであって、アディポネクチン発現を増加させなかった。
【００２７】
本発明の前記化学式（１）で表される化合物、すなわち、ｎが２の化合物のみがオートファジー活性化を誘導するとともにアディポネクチン発現を増加させ、抗老化および皮膚の赤み、好ましくは太陽光の紫外線によるコラーゲンタンパク質の分解を減少させ、光老化、皮膚の赤みおよび酸化ストレスなどに驚くほどの効果を示す。
【００２８】
本発明の前記化学式１のアディポネクチン発現増加誘導化合物は、一つ以上のカイラル非対称炭素原子を含有し、これにより、前記化学式（１）のアディポネクチン発現増加誘導化合物は、ラセミ体および光学的活性形態で存在することができる。かかる化合物および鏡像異性体はいずれも本発明の範疇内に含まれる。
【００２９】
優れた抗老化および皮膚の赤み緩和効果を有するために、好ましくは、本発明の一実施形態による前記化学式（１）で表される化合物は、下記化学式（２）で表され得る。
【００３０】
【化４】
2018177805.tif 000006
【００３１】
細胞内オートファジー活性化は、若い人の組織および細胞では活溌に行われるが、老化が進むにつれて細胞内のオートファジー関連タンパク質の発現量が急激に減少することからオートファジー活性度が急激に低下し、これにより、細胞内の老朽タンパク質、脂質およびミトコンドリアが適切な時期に除去され得ず、細胞老化現象が急速に生じる。
【００３２】
したがって、本発明の前記化学式（１）で表される化合物は、細胞内のオートファジーを活性化させることで、各細胞、組織および個体の老化を抑制し、皮膚の赤みを緩和し、老化によってもたらされる皮膚の疾患の予防および治療を可能にすることができる。
【００３３】
また、本発明者らは、本発明のアディポネクチン発現増加誘導化合物が、オートファジー活性化だけでなく、光に露出すると生成が減少するアディポネクチンの発現を活性化させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００３４】
つまり、本発明の前記化学式（１）で表されるアディポネクチン発現増加誘導化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、オートファジー活性化関連タンパク質の発現を増大させるだけでなく、光によって減少するアディポネクチンの発現を増加させることで、皮膚の抗老化および皮膚の赤みの緩和に非常に効果的であり、光によって発現する皮膚疾患、特に、炎症疾患の予防、改善または治療に非常に有用に使用され得る。
【００３５】
本発明の抗老化用および皮膚の赤み緩和用化粧料組成物は、貯蔵安定性に優れ、様々な原因による、好ましくは、光による、より好ましくは、紫外線による皮膚の老化の改善および予防に有用であり、光老化または酸化ストレスの改善および予防においてより有用であり、具体的には、しわまたは皮膚の老化の予防または改善においてより有用である。
【００３６】
本発明に記載の「しわ」は、皮膚が衰えて生じた細かい線を意味するが、遺伝子による原因、皮膚の真皮に存在するコラーゲンの減少、外部環境などによってもたらされ得る。
【００３７】
本発明に記載の「皮膚の老化」は、皮膚の弾力減少、つや減少、しわ生成、再生力弱化またはひどい乾燥などの症状が現れるものであり、時間の経過または外部環境などによってもたらされ得る。
【００３８】
本発明に記載の「皮膚の赤み」は、皮膚に赤みが増加する現象であり、紫外線、大気汚染、気候といった環境的要因およびニキビ、乾癬、ホルモン変化による内在的な要因などによってもたらされ得る。本発明の抗老化用または皮膚の赤み緩和用化粧料組成物において、前記化学式（１）で表されるアディポネクチン発現増加誘導化合物の含有量は、組成物の用途、適用形態、使用目的および所望の効果に応じて適宜調節可能であり、含有量に対する効果を考慮し、例えば、全組成物重量に対して０．０００１〜１０重量％、好ましくは０．００１〜５重量％、さらに好ましくは０．００１〜１重量％、最も好ましくは０．０３〜０．１重量％であることが好ましい。前記範囲未満の場合には、実質的なオートファジー活性化およびアディポネクチン発現増加効果を得ることができず、前記範囲以上の場合には、剤形の安定性および貯蔵性を低下させ得るため、前記範囲であることが好ましい。
【００３９】
本発明の抗老化用または皮膚の赤み緩和用化粧料組成物は、本発明の前記化学式（１）で表されるアディポネクチン発現増加誘導化合物またはその薬学的に許容可能な塩の他に、通常の製品化または製剤化に使用可能な全種類の成分、例えば、香料、色素、殺菌剤、酸化防止剤、防腐剤、保湿剤、安定化剤、乳化剤、粘増剤、液晶膜強化剤、顔料、賦形剤、希釈剤、無機塩類および合成高分子物質などをさらに含んでもよく、その種類と含有量は、最終産物の用途および使用目的に応じて適宜調節してもよい。
【００４０】
前記にさらに含まれ得る添加剤は、当業界において一般的に使用される原料であれば限定されず、具体的な一例としては、プロパンジオール、１，２‐ヘキサンジオール、エチルヘキシルグリセリン、フェノキシエタノール、カプリルヒドロキサム酸およびグリセリルカプリレートなどの防腐剤；メトキシケイ皮酸誘導体、ジフェニルアクリル酸誘導体、サリチル酸誘導体、パラアミノベンゾ酸誘導体、トリアジン誘導体、ベンゾフェノン誘導体、ベンジリデンマロネート誘導体、アントラニル誘導体、イミダゾリン誘導体、４，４‐ジアリールブタジエン誘導体およびフェニルベンゾイミダゾール誘導体などの紫外線吸収剤；セテアリルアルコール、セタノールおよびベヘニルアルコールなどの脂肪（fatty）アルコールおよびビス‐PEG１５/メチルエチルジメチルシラン、ジメチコン/ジメチコンPEG‐１０/１５、ジメチコン/ポリグリセリン‐３、ジメチコン/ジメチコノール、ジメチコン/ジメチコンビニルジメチコン、シクロメチコン/ジメチコノール、シクロメチコン/ジメチコン、シクロメチコン/トリメチルシロキシシリケート、シクロペンタシロキサン/ジメチコン、シクロペンタシロキサン/PEG‐１２ジメチコン、シクロペンタシロキサン/セテアリルジメチコン/ビニルジメチコン、シクロペンタシロキサン/ジメチコン/ビニルジメチコン、ジメチコン/ビニルジメチコンクロスポリマーなどのシリコーンポリマーなどから選択される安定化剤；カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤などから選択される乳化剤が混合されてもよく、好ましくは、ポリグリセリル‐４カプリレート/カプレート、ポリグリセリル‐５カプリレート/カプレート、ポリグリセリル‐６カプリレート/カプレート、ポリグリセリル‐７カプリレート/カプレート、ポリグリセリル‐８カプリレート/カプレート、ポリグリセリル‐９カプリレート/カプレート、ポリグリセリル‐１０カプリレート/カプレート、ポリグリセリル‐４カプレート、ポリグリセリル‐５カプレート、ポリグリセリル‐６カプレート、ポリグリセリル‐７カプレート、ポリグリセリル‐８カプレート、ポリグリセリル‐９カプレート、ポリグリセリル‐１０カプレート、ポリグリセリル‐４ラウレート、ポリグリセリル‐５ラウレート、ポリグリセリル‐６ラウレート、ポリグリセリル‐７ラウレート、ポリグリセリル‐８ラウレート、ポリグリセリル‐９ラウレート、ポリグリセリル‐１０ラウレート、ポリグリセリル‐６ココエート、ポリグリセリル‐７ココエート、ポリグリセリル‐８ココエート、ポリグリセリル‐９ココエート、ポリグリセリル‐１０ココエート、ポリグリセリル‐１１ココエート、ポリグリセリル‐１２ココエート、ポリグリセリル‐６ミリステート、ポリグリセリル‐７ミリステート、ポリグリセリル‐８ミリステート、ポリグリセリル‐９ミリステート、ポリグリセリル‐１０ミリステート、ポリグリセリル‐１１ミリステート、ポリグリセリル‐１２ミリステート、ポリグリセリル‐１０オレエート、ポリグリセリル‐１１オレエート、ポリグリセリル‐１２オレエート、ポリグリセリル‐１０ステアレート、ポリグリセリル‐１１ステアレート、ポリグリセリル‐１２ステアレート、ポリグリセリル��６ベヘネートなどのポリグリセリル脂肪酸エステル系界面活性剤であり、ポリグリセリルと脂肪酸を反応させて直接製造するか、市販のものを購入して使用してもよいことは言うまでもない。前記粘増剤は、化粧料組成物の適切な粘度を付与して使用感および剤形の安定度を向上させるためのものであり、カルボマー、カーボポール、ゼラチン、キサンタンガム、天然セルロース、ハイセル、メチルセルロースなどから選択されてもよく、これに限定されるものではない。前記液晶膜強化剤は、液晶の強度を増加させ、稠密に囲いを連結して液晶の長期安定性を維持する役割をするものであり、フィトスフィンゴシン、ビスヒドロキシエチルビスセチルマロアミド、コレステロールイソステアレート、コレステロールオレート、コレステロールステアレート、レシチン、セラミド類（一例として、セラミド３、セラミド６）などであってもよく、これに限定されるものではない。
【００４１】
また、前記顔料は、体質顔料、白色顔料、着色顔料、真珠光沢顔料、金属粉体、有機粉体などを含み、前記体質顔料としては、タルク、マイカ、カオリン、炭酸カルシウム、アルミナ、ケイ酸バリウム、ゼオライト、白雲母、炭酸マグネシウム、硫酸バリウムなどが可能であり、白色顔料としては、酸化チタン、酸化亜鉛などが可能であり、着色顔料としては、ベンガラ、硫酸化鉄、黒酸化鉄、酸化クロム、群青、紺青、およびカーボンブラックなどが可能であり、真珠光沢顔料としては、二酸化チタン、雲母チタン、チタン酸鉄および酸化チタン被覆雲母、シリカ、酸化スズ、およびフェロシアン化第二鉄などが可能であり、金属粉体としては、金、銀、銅、パラジウム、白金などが可能であり、有機粉体としては、ポリメチルメタクリレート、ナイロン、セルロース、デンプンなどが可能である。また、通常、化粧料において公知の、無機系、および有機系顔料がいずれも使用されてもよく、前記天産物顔料としては、クチナシ黄色、クチナシ青色、クチナシ緑色、クチナシ赤色、ベニコウジ赤色素、ベニコウジ黄色素、ベニバナ黄色素、アナトー色素、コチニール色素、ラック色素、コウリャン色素、葡萄果皮色素、赤キャベツ色素、エルダーベリー色素、ブルーベリー色素、パプリカ色素、キャラメル色素、アカダイコン色素、カキ色素 、リボフラビン、ベータカロチン、カカオ色素、ターメリック色素、コーンレッド色素、ビートレッド色素、アントシアン、アントシアニン、ピコシアン、ピコシアニン、クロロピル色素、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される１種が可能であり、無機系顔料としては、金属酸化物、特に、酸化鉄（赤色、黒色、黄色、茶色）、二酸化チタン、酸化亜鉛、酸化クロム、ビズマスオキシクロライド、酸化アルミニウム、酸化ジルコニウム、酸化コバルト、酸化セリウム、酸化ニッケル、水酸化カリウム、水酸化鉄、水酸化アルミニウム、水酸化クロミウム、水酸化マグネシウム、フェロシアン化第二鉄アンモニウム、紺青、硫化鉄、マンガンバイオレット、カーボンブラック、マイカー、カオリン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される１種が可能であり、有機系顔料としては、インディゴレーキ、カルミンレーキ、周知のＦＤ＆ＣおよびＤ＆Ｃ染料シリーズ由来のレーキ、例えば、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ２１アルミニウムレーキ、Ｄ＆Ｃ  Ｒｅｄ  ７カルシウムレーキ、芳香性アゾ、インジゴイド、トリフェニルメタン、アントラキノンおよびキサンチン染色剤のような天然または合成の有機性染料などが使用可能である。
【００４２】
本発明の化粧料組成物は、投与経路に応じて、皮膚外用、経皮または皮下投与が可能であり、好ましくは、皮膚外用または経皮、より好ましくは、皮膚外用投与が可能な組成物であってもよく、特に、光老化による皮膚の老化、赤みおよび酸化を予防および治療に使用されることから皮膚外用剤が好ましい。
【００４３】
また、前記化粧料組成物は、適用される形態に通常含まれる溶媒を含んでもよく、例えば、エタノール、グリセリン、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、１，２，４‐ブタントリオール、ソルビトールエステル、１，２，６‐ヘキサントリオール、ベンジルアルコール、イソプロパノール、ブタンジオール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジメチルイソソルビド、Ｎ‐メチル‐２‐ピロリドン、プロピレンカーボネート、グリセレス‐２６、メチルグルセス‐２０、イソセチルミリステート、イソセチルオクタノエート、オクチルドデシルミリステート、オクチルドデカノール、イソステアリルイソステアレート、セチルオクタノエートおよびネオペンチルグリコールジカプレートなどから選択される１種以上を含んでもよい。かかる溶媒を使用して本発明の化粧料組成物を製造する場合、溶媒の混合比に応じて溶媒に対する化合物の溶解度が少しずつ異なるが、本発明が属する技術分野における当業者であれば、製品の特性に応じて溶媒の種類および使容量を適宜選択して適用することができる。
【００４４】
また、前記化粧料組成物は、経皮投与時の経皮透過を強化するための様々な物質を含んでもよい。例えば、ラウロカプラム（laurocapram）誘導体およびオレイン酸、モノオレート誘導体のエステル誘導体、アダパレン、トレチノイン、レチンアルデヒド、タザロテン、サリチル酸、アゼライン酸、グリコール酸、エトキシジグリコール、ツイン８０、レシチンオルガノゲルなどを含んでもよい。また、本発明の化粧料組成物は、さらなる機能を付与するために、本発明の組成物によるオートファジー活性化の効果を害しない範囲内で、共界面活性剤、界面活性剤、フケ防止剤、角質軟化剤、血行促進剤、細胞活性剤、清涼剤、保湿剤、抗酸化剤、pH調節剤、精製水などの補助成分を添加してもよく、適用される形態に応じて適切な香料、色素、防腐剤、賦形剤などの添加剤を含んでもよい。
【００４５】
本発明の化粧料組成物は、皮膚、頭皮または毛髪に経皮的に適用されてもよく、基礎化粧品、メイクアップ化粧品、ボディー製品、髭剃り用製品、毛髪製品などのすべての化粧品製品の製造に使用可能な組成物を意味するものであり、懸濁液、エマルション、ペースト、ジェル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング剤形、オイル、パウダーファンデーション、エマルジョンファンデーション、ワックスファンデーションまたはスプレーに剤形化したものであってもよく、その形態は特に制限されない。
【００４６】
詳細には、本発明の化粧料組成物の剤形がペースト、クリームまたはジェルの場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが用いられ得る。
【００４７】
本発明の化粧料組成物の剤形がパウダーまたはスプレーの場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケートまたはポリアミドパウダーが用いられてもよく、特に、スプレーの場合には、さらに、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン/ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含んでもよい。
【００４８】
本発明の化粧料組成物の剤形が溶液またはエマルションの場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤または解乳化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３‐ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルが用いられ得る。
【００４９】
本発明の化粧料組成物の剤形が懸濁液の場合には、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天またはトラガントなどが用いられ得る。
【００５０】
本発明の化粧料組成物の剤形が界面‐活性剤含有クレンジング剤形の場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられ得る。
【００５１】
本発明の化粧料組成物が、石鹸、界面活性剤含有クレンジング剤形または界面活性剤非含有クレンジング剤形の場合、皮膚に塗布した後、拭き取ったり剥ぎ取ったり水洗してもよい。具体例として、前記石鹸は、液状石鹸、パウダー石鹸、固形石鹸およびオイル石鹸であり、前記界面活性剤含有クリンジング剤形は、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、クレンジングタオルおよびクレンジングパックであり、前記界面活性剤非含有クレンジング剤形は、クレンジングクリーム、クレンジングローション、クレンジングウォーターおよびクレンジングジェルであり、これに限定されるものではない。
【００５２】
また、本発明の前記化学式（１）で表されるアディポネクチン発現増加誘導化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む光による皮膚炎症疾患の予防および治療用医薬組成物を提供する。
【００５３】
本発明の前記化学式（１）で表されるアディポネクチン発現増加誘導化合物は、オートファジー作用活性化を誘導するとともに、光、特に、紫外線によって光老化した皮膚で減少するアディポネクチンの発現を増加させることで、光に露出して生成された皮膚炎症の予防および治療に非常に効果的である。
【００５４】
好ましくは、本発明の前記化学式（１）で表されるアディポネクチン発現増加誘導化合物は、前記化学式（２）で表されてもよく、全組成物の全重量に対して、０．００１〜１０重量％、好ましくは０．００１〜１重量％であってもよい。
【００５５】
本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩は、当業界に知られている通常の技術を使用して製造されてもよく、本発明における用語、「薬学的に許容可能な塩」とは、薬学的に許容される無機酸、有機酸、または塩基から誘導された塩を含む。好適な酸の例としては、塩酸、臭酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン‐ｐ‐スルホン酸、酒石酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ホルム酸、ベンゾ酸、マロン酸、ナフタレン‐２‐スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられる。好適な塩基から誘導された塩は、ナトリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、およびアンモニウムなどを含んでもよい。
【００５６】
本発明の医学組成物は、主に、経口、静脈、腹腔、筋肉および皮下投与の方法で使用され得る。また、通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルション、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤または滅菌注射溶液などの形態に剤形化して使用されてもよく、その形態は特に制限されない。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、医学組成物の製造に通常使用する薬学的に許容される添加剤をさらに含んでもよい。薬学的に許容可能な添加剤とは、生物体をよほど刺激することなく投与化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤を言う。また、前記添加剤は、製剤の製造、圧縮性、外観および味を向上させることができ、例えば、安定化剤、界面活性剤、滑沢剤、可溶化剤、緩衝剤、甘味剤、基剤、吸着剤、矯味剤、結合剤、懸濁化剤、硬化剤、抗酸化剤、光沢剤、着香剤、香味剤、顔料、コーティング剤、湿潤剤、湿潤調整剤、充填剤、消泡剤、清涼化剤、咀嚼剤、静電防止剤、着色剤、糖衣剤、等張化剤、軟化剤、乳化剤、粘着剤、粘増剤、発泡剤、pH調節剤、賦形剤、分散剤、崩解剤、防水剤、防腐剤、保存剤、溶解補助剤、溶剤、流動化剤などを必要に応じて添加することができる。
【００５８】
一例として、経口投与のための製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、かかる製剤は、少なくとも一つ以上の賦形剤および/または滑剤などを含んでもよい。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが相当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他に、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。また、非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれ得る。
【００５９】
前記医学組成物の好ましい投与量は、患者の状態および体重、疾病の程度、薬物の形態、投与経路および期間に応じて異なるが、当業者によって適宜選択され得る。より好ましい効果のために、本発明の組成物の投与量は、有効成分を基準として、１日０．１mg/kg〜１００mg/kgにすることが好ましいが、これに制限されるものではない。投与は、１日に１度投与してもよく、数回分けて投与してもよい。本発明の医薬組成物の薬学的投与形態は、有効成分の薬学的許容可能な塩の形態でも使用され得、また単独でまたは他の薬学的活性化合物と結合だけでなく、適当な集合で使用され得る。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、経口または非経口投与することができ、非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができる。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、薬剤学的に許容される担体を含んでもよい。本発明の医薬組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の医薬組成物は、前記成分以外に、滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでもよい。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、当該発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法によって、薬学的に許容される担体および/または賦形剤を用いて通常の製剤に剤形化することで、単位容量形態に製造されるかまたは多容量容器内に取り入れて製造され得る。通常の剤形とは、例えば、経口（錠剤、カプセル剤、粉末剤）、舌下、直腸内、膣内、鼻腔内、局所または非経口（静脈内、海綿体内、筋肉内、皮下および管内を含む）投与剤形を称する。例えば、本発明に係るオートファジー活性化誘導化合物は、デンプンまたはラクトースを含む錠剤形態で、または単独または賦形剤を含むカプセル形態で、または味をつけるか色をつける化学薬品を含むエリキシルまたは懸濁剤形態で、経口、または舌下投与され得る。液体製剤は、懸濁剤（例えば、メチルセルロース、ウィテップゾール（witepsol）のような半合成グリセリドまたは杏仁油（apricot kernel oil）とPEG‐６エステルの混合物またはPEG‐８とカプリリック/カプリックグリセリドの混合物のようなグリセリド混合物）のような薬剤学的に許容可能な添加剤とともに製造される。また、非経口的に、例えば、静脈内、海綿体内、筋肉内、皮下および管内を介して注射される場合、無菌の水溶液形態で使用することが最も好ましく、この際、前記溶液は、血液との等張性を有するために、他の物質（例えば、塩（salt）またはマンニトール、グルコースのような単糖類）を含有してもよい。
【００６３】
好ましくは、本発明の一実施形態による医薬組成物は、錠剤、ピル、カプセル、料粒、粉末、液剤、パッチ剤または注射剤の形態で使用され得る。
【００６４】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するものであって、本発明は、下記実施例によって限定されるものではない。
【００６５】
［実施例１］化合物１の合成
実施例１‐１．化合物１ａの合成
【化５】
2018177805.tif 000007
【００６６】
８００mlの反応容器に２‐chloro trityl chloride resin（１００‐２００mesh、Novabiochem２０g、１当量）とFmoc‐Lys（Dde）‐OH（Nα‐Fmoc‐Nε‐Dde‐L‐lysine、Nα‐Fmoc‐Nε‐［１‐（４，４‐dimethyl‐２，６‐dioxocyclohexylidene）ethyl］‐L‐lysine）（２１．３g、２当量）およびDIPEA（２９．９ml、８当量）をDCM（７００ml）に入れて常温で１２時間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成されたレジンをそれぞれ５００mlのDCM（ジクロロメタン）とMeOH、DCM、DMF（ジメチルホルムアミド）を用いて順に洗浄した。真空乾燥し、固体相形態の化合物１ａ（Fmoc‐Lys（Dde）‐O‐２‐chloro trityl resin）を９９％収率で２３ｇ取得した。
【００６７】
実施例１‐２．化合物１ｂの合成
【化６】
2018177805.tif 000008
【００６８】
８００mlの反応容器に化合物１ａと７００mlの２０％piperidine in DMFを入れて常温で５分間反応させた後、濾過して反応液を除去した。７００mlの２０％piperidine in DMFをもう一度加え、常温で５分間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成されたレジンをそれぞれ５００mlのDCMとMeOH、DCM、DMFを用いて順に洗浄した。真空乾燥し、固体相形態のFmocが除去された生成物にFmoc‐Lys（Fmoc）‐OH（４７．３g、４当量）とHOBt（１０．８g、４当量）およびDIC（１２．４ml、４当量）を６００mlのDMFに溶解して加え、常温で４時間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成されたレジンをそれぞれ５００mlのDCMとMeOH、DCM、DMFを用いて順に洗浄した。真空乾燥し、固体相形態の化合物１ｂ（Fmoc‐Lys（Fmoc）‐Lys（Dde）‐O‐２‐chloro trityl resin）を９８％収率で２５ｇ取得した。
【００６９】
実施例１‐３．化合物１ｃの合成
【化７】
2018177805.tif 000009
【００７０】
８００mlの反応容器に化合物１ｂと７００mlの２０％piperidine in DMFを入れて常温で５分間反応させた後、濾過して反応液を除去した。７００mlの２０％piperidine in DMFをもう一度加え、常温で５分間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成されたレジンをそれぞれ５００mlのDCMとMeOH、DCM、DMFを用いて順に洗浄した。真空乾燥し、固体相形態のFmocが除去された生成物にtert‐butyl bromoacetate（５９．１ml、２０当量）とDIPEA（６９．７ml、２０当量）を６００mlのDMFに溶解して加え、常温で１２時間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成されたレジンを５００mlのDMFを用いて洗浄した。また１、８‐Bis（dimethylamino）napthalene（８５．７g、２０当量）とtert‐butyl bromoacetate（５９．１ml、２０当量）およびDIPEA（６９．７ml、２０当量）を６００mlのDMFに溶解して加え、常温で１２時間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成されたレジンをそれぞれ５００mlのDCMとMeOH、DCM、DMFを用いて順に洗浄した。真空乾燥し、固体相形態の化合物１ｃ（tert‐butoxycarbonylmethyl）２‐Lys（tert‐butoxycarbonylmethyl）２‐Lys（Dde）‐O‐２‐chloro trityl resin）を９５％収率で３１ｇ取得した。
【００７１】
実施例１‐４．化合物１ｄの合成
【化８】
2018177805.tif 000010
【００７２】
８００mlの反応容器に化合物１ｃと７００mlの２％hydrazine in DMFを入れて５分間常温で反応させた。濾過して反応液を除去し、合成されたレジンを５００mlDMFを用いて洗浄した。また７００mlの１０％DIPEA in DMFを加え、常温で５分間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成されたレジンをそれぞれ５００mlのDCMとMeOH、DCM、DMFを用いて順に洗浄した。真空乾燥し、固体相形態の化合物１ｄ（tert‐butoxycarbonylmethyl）２‐Lys（tert‐butoxycarbonylmethyl）２‐Lys（NH２）‐O‐２‐chloro trityl resin）を９９％収率で３０g取得した。
【００７３】
実施例１‐５．化合物１の合成
【化９】
2018177805.tif 000011
【００７４】
１０mlの反応容器に化合物１ｄ（４６０mg、１当量）を入れて、hexanoic acid（１８６μl、８当量）とDIC（２４８μl、８当量）およびHOBt（２１６mg、８当量）を５mlのDMFに溶解して加え、常温で２時間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成されたレジンをそれぞれ５mlのDCMとMeOH、DCMを用いて順に洗浄した。真空乾燥した後、５mlのcleavage cocktail（trifluoro acetic acid：triisopropylsilane：DW＝９５：２．５：２．５）を加え、常温で３時間反応させた。濾過して反応液を集め、これに４５mlのdiethyl etherを加えて生成物を沈殿させた。遠心分離機を用いて固体生成物を集め、４５mlのdiethyl etherで２回洗浄した。得られた固体生成物をPrep‐HPLC（column C１８、１０μm、２５０mm×２２mm）を用いて精製した後、凍結乾燥して化合物１（LC‐Massで測定した分子量：６０４．６５）を６４％収率で７７mg取得した。
【００７５】
［比較例１］化合物２の合成
【化１０】
2018177805.tif 000012
【００７６】
１０mlの反応容器に化合物１ｄ（４６０mg、１当量）を入れて、octanoic acid（２３０μl、８当量）とDIC（２４８μl、８当量）およびHOBt（２１６mg、８当量）を５mlのDMFに溶解して加え、常温で２時間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成されたレジンをそれぞれ５mlのDCMとMeOH、DCMを用いて順に洗浄した。真空乾燥した後、５mlのcleavage cocktail（trifluoro acetic acid：triisopropylsilane：DW＝９５：２．５：２．５）を加え、常温で３時間反応させた。濾過して反応液を集め、これに４５mlのdiethyl etherを加えて生成物を沈殿させた。遠心分離機を用いて固体生成物を集め、４５mlのdiethyl etherで２回洗浄した。得られた固体生成物をPrep‐HPLC（column C１８、１０μm、２５０mm×２２mm）を用いて精製した後、凍結乾燥して化合物２（LC‐Massで測定した分子量：６３２．７）を５６％収率で６２mg取得した。
【００７７】
［比較例２］化合物３の合成
【化１１】
2018177805.tif 000013
【００７８】
１０mlの反応容器に化合物１ｄ（４６０mg、１当量）を入れて、decanoic acid（２７５μl、８当量）とDIC（２４８μl、８当量）およびHOBt（２１６mg、８当量）を５mlのDMFに溶解して加え、常温で２時間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成されたレジンをそれぞれ５mlのDCMとMeOH、DCMを用いて順に洗浄した。真空乾燥した後、５mlのcleavage cocktail（trifluoro acetic acid：triisopropylsilane：DW＝９５：２．５：２．５）を加え、常温で３時間反応させた。濾過して反応液を集め、これに４５mlのdiethyl etherを加えて生成物を沈殿させた。遠心分離機を用いて固体生成物を集め、４５mlのdiethyl etherで２回洗浄した。得られた固体生成物をPrep‐HPLC（column C１８、１０μm、２５０mm×２２mm）を用いて精製した後、凍結乾燥して化合物３（LC‐Massで測定した分子量：６６０．３６）を６６％収率で７９mg取得した。
【００７９】
［比較例３］化合物４の合成
【化１２】
2018177805.tif 000014
【００８０】
１０mlの反応容器に化合物１ｄ（４６０mg、１当量）を入れて、dodecanoic acid（３２０μl、８当量）とDIC（２４８μl、８当量）およびHOBt（２１６mg、８当量）を５mlのDMFに溶解して加え、常温で２時間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成されたレジンをそれぞれ５mlのDCMとMeOH、DCMを用いて順に洗浄した。真空乾燥した後、５mlのcleavage cocktail（trifluoro acetic acid：triisopropylsilane：DW＝９５：２．５：２．５）を加え、常温で３時間反応させた。濾過して反応液を集め、これに４５mlのdiethyl etherを加えて生成物を沈殿させた。遠心分離機を用いて固体生成物を集め、４５mlのdiethyl etherで２回洗浄した。得られた固体生成物をPrep‐HPLC（column C１８、１０μm、２５０mm×２２mm）を用いて精製した後、凍結乾燥して化合物４（LC‐Massで測定した分子量：６８８．８１）を６２％収率で７２mg取得した。
【００８１】
［実施例２］本発明の化合物１によるオートファジー活性増加
本発明の化合物１の処理による細胞内オートファジー活性増加を分析するために、LC３（light chain ３）タンパク質に対するwestern blotを行った。
【００８２】
具体的な実験方法として、ヒト線維芽細胞であるHDF（Human dermal fibroblast）は培養用６well plate に１well当たり１×１０５個の細胞数で一定に分注し、DF‐１培地（Dermal Fibroblast Growth MEDium、Zenbio）で２４時間３７℃、５％CO２条件でインキュベータで培養した。本発明の化合物１を１００mMの濃度で水に溶解して濃縮液とし、これを培地に希釈して２００μmの濃度に希釈した後、各wellに１mlの培地が予め入っている状態で希釈液を１mlずつ入れて処理した後、所定時間培養し、培養終了後、培地を除去し、SDS sample bufferで細胞を破砕した後、SDS‐PAGE gel電気泳動で各タンパク質を分離し、PVDF（Polyvinylidene difluoride）membraneに移動させた後、ブロッキングバッファーを用いて非特異的結合を除去し、LC３タンパク質に対する抗体およびこれに対するHRP結合された二次抗体（anti‐rabbit IgG HRP、Sigma）を反応させた後、ECL prime kit（Amersham pharmacia）を用いたEnhanced chemiluminescence（ECL）反応をさせて、ChemiDoc（UVITEC）分析を行った。
【００８３】
その結果を図１に示しており、図１に示されているように、本発明の化合物１によりLC３‐II（Microtubule‐associated protein１A/１B‐light chain ３）の生成が増加することが分かる。
【００８４】
［実施例３および比較例４］本発明の化合物１および比較例３の化合物４によるアディポネクチン発現増加
本発明の化合物１と比較例３の化合物４の処理による細胞内アディポネクチン発現増加効果を比較分析するために、アディポネクチン遺伝子に対するreal‐time PCRを行った。
【００８５】
具体的な実験方法として、ヒト線維芽細胞であるHDF（Human dermal fibroblast）は、培養用６well plateに１well当たり１×１０５個の細胞数で一定に分注し、DF‐１培地（Dermal Fibroblast Growth MEDium、Zenbio）で２４時間３７℃、５％CO２条件でインキュベータで培養した。本発明の化合物１または化合物４それぞれを１００mMの濃度で水に溶解して濃縮液とし、これを培地に希釈して２００μmの濃度に希釈した後、各wellに１mlの培地が予め入っている状態で希釈液を１mlずつ入れて処理した後、２４時間培養し、培養終了後に培地を除去した後、DF‐２培地（Dermal Fibroblast Basal MEDium、Zenbio）１mlを入れてUVA（紫外線A）を１０J/cm２で照射し、また同じ方式で各wellを化合物１または化合物４で処理した後、２４時間さらに培養した。培養終了後、Trizol（Ambion）で細胞を破砕し、chloroform/isopropanolで全体のmRNAを集めた後、reverse trascriptaseでcDNAを合成してアディポネクチンに対する特異的なprimerを用いてreal‐time PCR（QuantStudio ３、Thermo Fisher）を行い、その結果を図２と図３に示した。
【００８６】
図２〜図３に示されているように、本発明の化合物１を処理してアディポネクチン遺伝子の発現が増加することを確認した。また、本発明の化合物１を処理した後、UVAの照射後に減少したアディポネクチン遺伝子発現量の回復が化合物４よりさらに高いことを確認した。
【００８７】
［実施例４および比較例５］本発明の化合物１によるMMP‐１発現減少
本発明の化合物１または化合物４の処理によるMMP‐１（Matrix metalloproteinase‐１）発現減少効果を比較分析するために、紫外線UVA、UVB（紫外線B）を細胞に照射した後、MMP‐１遺伝子に対するqPCRを行った。
【００８８】
具体的な実験方法として、ヒト線維芽細胞であるHDF（Human dermal fibroblast）は培養用６well plateに１well当たり１×１０５個の細胞数で一定に分注し、DF‐１培地（Dermal Fibroblast Growth MEDium、Zenbio）で２４時間３７℃、５％CO２条件でインキュベータで培養した。本発明の化合物１または化合物４それぞれを１００mMの濃度で水に溶解して濃縮液とし、これを培地に希釈して２００μmの濃度に希釈した後、各wellに１mlの培地が予め入っている状態で希釈液を１mlずつ入れて処理した後、２４時間培養した。紫外線処理群の場合、DF‐２培地（Dermal Fibroblast Basal MEDium、Zenbio）に行った後、UVB１００mJ/cm２あるいは UVA ５J/cm２で照射して２４時間さらに培養した。培養終了後、Trizol（Ambion）で細胞を破砕し、chloroform/isopropanolで全体mRNAを集めた後、reverse transcriptaseでcDNAを合成してMMP‐１に対する特異的なprimerを用いてreal‐time PCR（QuantStudio ３、Thermo Fisher）を行い、その結果を図４に示した。
【００８９】
その結果として、図４に示されているように、本発明の化合物１を処理した後にUVAおよびUVBの照射後に増加したMMP‐１遺伝子の発現量が減少することが分かり、対照群として使用したAdipoRon（Adiponectin receptor agonist）よりMMP‐１発現減少効果がさらに優れていた。また、比較例３の化合物４を処理した時よりもMMP‐１発現減少量がさらに増加した。これにより、本発明の化合物１は、太陽光の紫外線によるコラーゲンタンパク質の分解を減少させて、光老化によるしわ形成を抑制することができる。
【００９０】
［実施例５］本発明の化合物１によるIL‐６発現および分泌減少
本発明の化合物１または化合物４の処理による炎症性サイトカインIL‐６（Interleukin ６）の発現減少効果を比較分析するために、紫外線UVBを細胞に照射した後、IL‐６遺伝子に対するRT‐PCRおよびIL‐６に対するELISA（enzyme‐linked immunosorbent assay）分析を行った。
【００９１】
具体的な実験方法として、ヒト由来表皮角質細胞であるHEKa（Human Epidermal Keratinocytes、adult）細胞を培養用１２well plateに１well当たり２×１０５個の細胞数で一定に分注し、（１X HumanKeratinocyte Growth Supplement、１X antibiotics）EpiLife（Gibco）培地で２４時間３７℃、５％CO２条件でインキュベータで培養した。本発明の化合物１または化合物４それぞれを１００mMの濃度で水に溶解して濃縮液とし、これを培地に希釈して２００μmの濃度に希釈した後、各wellに０．５mlの培地が予め入っている状態で希釈液を０．５mlずつ入れて処理した後、２４時間培養した。その後、growth supplementがない状態の培地に行った後、UVBを３０mJ/cm２で照射して２４時間さらに培養した。培養終了後、培地を集めた後、Trizol（Ambion）で細胞を破砕し、chloroform/isopropanolで全体のmRNAを集めた後 reverse trascriptaseでcDNAを合成してIL‐６に対する特異的なprimerを用いてRT‐PCR（Thermal Cycler、Bio‐rad）を行った。PCRを行った後、agarose gel電気泳動で分析してその結果を図５に示した。また、集めておいた培地をIL‐６に対するELISA分析を行い、その結果を図６に示した。
【００９２】
図５に示されているように、本発明の化合物１を処理した後、UVBの照射後に増加したIL‐６遺伝子の発現がblankに比べて減少する傾向性を確認しており、対照群として使用したAdipoRonより発現減少がさらに優れていた。また、比較例３の化合物４を処理した時よりもIL‐６遺伝子の発現減少がさらに優れていた。図６では本発明の化合物１を処理した後、UVBの照射後に増加したIL‐６の分泌がblankに比べて減少することを確認した。これにより、本化合物１は太陽光の紫外線による炎症緩和に効果的であることが分かる。
【００９３】
［実施例６］本発明の化合物１および化合物４によるIL‐８分泌減少
本発明の化合物１または化合物４の処理による炎症性サイトカインIL‐８（interleukin ８）の分泌減少効果を比較分析するために紫外線UVBを細胞に照射した後、IL‐８に対するELISA（enzyme‐linked immunosorbent assay）分析を行った。
【００９４】
具体的な実験方法として、ヒト由来の表皮角質細胞であるHEKa（Human Epidermal keratinocytes、adult）細胞を培養用１２well plateに１well当たり２×１０５個の細胞数で一定に分注し、（１x Human keratinocyte Growth supplement、１X antibiotics）EpiLife（Gibco）培地で２４時間３７℃、５％CO２条件でインキュベータで培養した。本発明の化合物１または化合物４それぞれを１００mMの濃度で水に溶解して濃縮液とし、これを培地に希釈して２００μmの濃度に希釈した後、各wellに０．５mlの培地が予め入っている状態で希釈液を０．５mlずつ入れて処理した後、２４時間培養した。その後、growth supplementがない状態の培地に行った後、UVBを１００mJ/cm２で照射して２４時間さらに培養した。培養終了後、培地を集めた後、IL‐８に対するELISA分析を行い、その結果を図７に示した。
【００９５】
図７に示されているように、本発明の化合物１を処理した後、UVBの照射後に増加したIL‐８の分泌がblankに比べて減少することを確認した。また、比較例３の化合物４を処理した時よりもIL‐８の分泌が大幅に減少することを確認した。これにより、本化合物１は、太陽光の紫外線による炎症緩和に効果的であることが分かる。
【００９６】
［実施例７］本発明の化合物１のオートファジー活性によるアディポネクチン生成増加
本発明の化合物１の処理によるアディポネクチンの生成増加効果とオートファジー活性増加効果とを比較分析するためにオートファジー抑制剤である３‐MA（３‐Methyladenine）とCQ（Chloroquine）を細胞に処理し、アディポネクチンタンパク質に対するwestern blotを行った。
【００９７】
具体的な実験方法として、ヒト線維芽細胞であるHDF（Human dermal fibroblast、neonatal）は培養用６well plateに１well当たり１×１０５個の細胞数で一定に分注し、LSGS（low serum growth supplement、Gibco）が添加されたMedium １０６（Gibco）培地で２４時間３７℃、５％CO２条件でインキュベータで培養した。本発明の化合物１は、１００mMの濃度で水に溶解して濃縮液とし、これを培地に希釈して３００μmの濃度に希釈し、３‐MAとCQは各５０mMと１０mMの濃度で水に溶解して濃縮液に準備した後、これらの濃縮液を培地で各々１５mMと３０μmの濃度に希釈した。次に、各wellをそれぞれ最終３倍希釈された濃度の前記物質で処理した後、４８時間培養し、培養終了後に培地を除去してSDS sample bufferで細胞を破砕した後、SDS‐PAGE gel電気泳動で各タンパク質を分離し、PVDF（Polyvinylidene difluoride）membraneに移動させた後、ブロッキングバッファーを用いて非特異的結合を除去し、LC３タンパク質に対する抗体およびこれに対するHRP結合された二次抗体（anti‐rabbit IgG HRP、Sigma）を反応させた後、ECL prime kit（Amersham pharmacia）を用いたEnhanced chemiluminescence（ECL）反応をさせて、ChemiDoc（UVITEC）分析を行った。
【００９８】
その結果を図８に示しており、図８に示されているように、本発明の化合物１でアディポネクチンタンパク質の生成が増加し、オートファジー抑制剤とともに処理後には化合物１によって増加したアディポネクチンタンパク質の生成が減少することを確認した。これにより、本化合物１のアディポネクチンタンパク質の生成増加はオートファジー活性によるものであることが分かる。
【００９９】
［実施例８］本発明の化合物１による細胞DNA損傷保護効果
CPD（cyclobutane pyrimidine dimers）は、紫外線B（UVB）によってDNAのチミン（thymine）あるいはシトシン（cytosine）塩基間のC＝C二重結合の産物であり、DNAの構造を変化させ、結果的に重合酵素を抑制し、複製を抑制し、窮極的に人体の黒色腫の主要原因になると知られている。
【０１００】
本発明の化合物１の細胞DNA損傷保護効果を確認するために、CPD生成をELISA（enzyme‐linked immunosorbent assay）遂行および蛍光免疫染色法（immunofluorescence staining）を用いた共焦点顕微鏡（confocal microscope）撮影により分析した。
【０１０１】
具体的な実験方法として、ヒト線維芽細胞であるHDF（Human dermal fibroblast、neonatal）は培養用９６well plateあるいはpoly‐L‐Lysがコーティングされたconfocal slideに３〜４×１０４個の細胞数で一定に分注し、LSGS（low serum growth supplement、Gibco）が添加されたMedium １０６（Gibco）培地で２４時間３７℃、５％CO２条件でインキュベータで培養した。本発明の化合物１は、１００mMの濃度で水に溶解して濃縮液とし、これをLSGSがない培地で２００μmの濃度に希釈した後、各wellに０．１mlの培地が予め入っている状態で希釈液を０．１mlずつ入れて前処理した後、２４時間培養した。その後、PBSで置換した後、UVBを１００mJ/cm２で照射して、同じ方式で希釈された化合物１をまた後処理し、２４時間さらに培養した。培養終了後、CPD ELISAとCPD stainingは常用化されたkit（OxiSelectTM、Cell biolabs）を用いており、その方法は、製造社のマニュアルにしたがって実施した。
【０１０２】
その結果として、図９に示されているように、UVBの照射後に増加していたCPD生成が本発明の化合物１を処理すると減少することが分かった。また、図１０に示されているように、UVBの照射後に増加した緑色蛍光の強度が本発明の化合物１を処理した後に減少することを確認した。これにより、本発明の化合物１は、紫外線によるDNA損傷を回復し、その結果、細胞を保護するのに効果的であることが分かる。
【０１０３】
［実施例９］本発明の化合物１による細胞DNA損傷回復の効果
損傷されたDNAの修復メカニズムであるヌクレオチド除去修復（nucleotide excision repair、NER）経路の主要因子としてXPAとXPC（Xeroderma pigmentosum、complementation group A and C）があり、XPCは損傷されたDNA部位を感知する役割を行い、XPAはDNA損傷部位にDNA修復タンパク質を集めるための支持台の役割を行う。
【０１０４】
本発明の化合物１の細胞DNA損傷回復の効果を確認するために、XPCおよびXPA（Xeroderma pigmentosum、complementation group C and A）遺伝子の発現変化をqPCRで確認した。
【０１０５】
具体的な実験方法として、ヒト線維芽細胞であるHDF（Human dermal fibroblast、neonatal）は培養用６well plateに１well当たり１×１０５個の細胞数で一定に分注し、LSGS（low serum growth supplement、Gibco）が添加されたMedium １０６（Gibco）培地で２４時間３７℃、５％CO２条件でインキュベータで培養した。本発明の化合物１は、１００mMの濃度で水に溶解して濃縮液とし、これを培地で２００μmの濃度に希釈した後、各wellに０．１mlの培地が予め入っている状態で希釈液を０．１mlずつ入れて前処理した後、２４時間培養した。その後、PBSで置換した後、UVBを１００mJ/cm２で照射して、同じ方式で希釈された化合物１をまた後処理し、２４時間さらに培養した。培養終了後、培養液を除去してRNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて全体のmRNAを集めた後、reverse transcriptaseでcDNAを合成してXPCおよびXPAに対する特異的なprimerを用いてreal‐time PCR（QuantStudio ３、Thermo Fisher）を行った。
【０１０６】
その結果として、図１１に示されているように、UVBの照射後に減少したXPC、XPA遺伝子の発現が、本発明の化合物１の処理後に増加することを確認した。これにより、本発明の化合物１は紫外線によるDNA損傷から細胞を回復させる効果があることを分かる。
【０１０７】
［実施例１０］本発明の化合物１の紫外線による皮膚損傷予防の効果
本発明の化合物１の紫外線による皮膚保護の効果を確認するために、本発明の化合物１を含有する製品に対する臨床テストを西原大学校グローバル皮膚臨床試験センターを介して実施した。
【０１０８】
具体的な試験方法として、ガルデルマコリア社製のセタフィル・デイリーフェイシャルモイスチャライザー（SPF１５/PA＋＋）をvehicleとし、本発明の化合物１を１００ppm、すなわち０．０１重量％含む製品を準備し、被験者１３人（平均年齢２７．０±１０．４）の下膊（肘から手首）の内側部位に総２週間１日２回塗布した後、UV solar simulator（WACOM、Japan）およびUV light meter（Sato Shouji、Japan）装置を用いて紫外線を照射し、MED（Minimal Erythema Dose、最小紅斑量）、すなわち紅斑を起こす最小紫外線照射量の増加率を測定し、効果を判定した。
【０１０９】
その結果を図１２に示しており、図１２に示されているように、MED判定結果、使用前０週に比べ、本発明の化合物１が含有された製品を２週間使用した後、統計的に有意にMEDが増加しており、MED増加率（％）は使用前０週に比べ、本発明の化合物１が含有された製品を２週間使用した後、平均５６．２％増加した。これにより、本発明の化合物１は、紫外線による皮膚損傷予防に効果的であることが分かる。
【０１１０】
［実施例１１］本発明の化合物１の皮膚の赤み緩和効能
本発明の化合物１が紫外線による皮膚保護効果だけでなく（実施例１０）、皮膚の赤みを緩和させるにも効果があるか否かを確認するために、本発明の化合物１を含有する製品に対する赤み緩和効能臨床テストを（株）大韓皮膚科学研究所を介して実施した。
【０１１１】
具体的な試験方法として、白色のクリームをvehicleとし、本発明の化合物１を含有する製品を準備し、総４週間１２人の皮膚の赤みを有する被験者を対象として試験した。被験者の顔面の左側および右側のほお部位をランダムに試験試料塗布部位および対照試料塗布部位に割り付け、本発明の化合物１を含有する製品と対照群であるvehicleをそれぞれ１日２回、朝方、夕方に自分で塗布するようにした。２週目、４週目に色差計（Chromameter）を用いて試験部位である顔面の左側ほおと顔面の右側ほお部位をそれぞれ５回測定した後、皮膚の赤み指数（a‐value）を数値化した。本発明の化合物１を含有する組成物は、下記表1に記載の成分で製造した。
【０１１２】
【表１】
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【０１１３】
その結果を図１３に示しており、図１３に示されているように、対照部位の皮膚の赤み改善率が、試験開始から２週後、４週後、それぞれ−５．３４％、−５．１５％と効果が現われていない一方、本発明の化合物１が含有された製品を使用した試験部位は、試験開始から２週後には５．９３％、試験開始から４週後には１３．２３％の改善率を示した。これにより、本発明の化合物１が、皮膚の赤み緩和の効果を有することが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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