(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に結合する単離されたモノクローナル抗体の提供。【解決手段】ヒト組織因子経路インヒビターに特異的に結合し、ａ）特定のアミノ酸配列に対応する重鎖可変領域を含み、ｂ）特定のアミノ酸配列に対応する軽鎖可変領域を含む単離されたヒトモノクローナル抗体。ＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメイン２に結合し、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１には結合しなく、ＴＦＰＩ活性を阻害することができるモノクロナール抗体。該ヒトモノクローナル抗体をコードする単離された核酸分子、該ヒトモノクローナル抗体を含む医薬組成物。血友病Ａ及び血友病Ｂを治療するための医薬組成物。該ヒトモノクローナル抗体の製造法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）のＫｕｎｉｔｚドメイン１およびＫｕｎｉ
ｔｚドメイン２を含む結合部位に特異的に結合する、単離されたヒトモノクローナルＩｇ
Ｇ抗体を含む、治療組成物であって、抗体重鎖が配列番号１６と少なくとも８０％の相同
性を有するアミノ酸配列から構成され、抗体軽鎖が配列番号１４と少なくとも８０％の相
同性を有するアミノ酸配列から構成され、前記重鎖が配列番号３０５と少なくとも８０％
の相同性を有するアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−１領域、配列番号３４８と少なく
とも８０％の相同性を有するアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−２領域、および配列番
号３９１と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−３領
域を有し、かつ該ヒトモノクローナルＩｇＧがＴＦＰＩ活性の５０％以上の阻害を示す、
組成物。
【請求項２】
第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
第ＶＩＩ因子が存在しない、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
抗体がＢｉａｃｏｒｅアッセイにより、１．２５から１１４０ｎＭのヒトＴＦＰＩへの
結合親和性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
抗体が皮下注射用の薬学的に許容される担体中に製剤化される、請求項１に記載の組成
物。
【請求項６】
重鎖ＣＤＲ−２領域が配列番号３４８と少なくとも８０％の相同性を有する、請求項１
に記載の組成物。
【請求項７】
重鎖ＣＤＲ−３領域が配列番号３９１と少なくとも８０％の相同性を有する、請求項１
に記載の組成物。
【請求項８】
抗体が一本鎖の断片である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
抗体重鎖が配列番号３０５に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−１領域、配
列番号３４８に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−２領域、および配列番号３
９１に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−３領域を有する、請求項１に記載の
組成物。
【請求項１０】
抗体重鎖が配列番号３０５に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−１領域、配
列番号３４８に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−２領域、および配列番号３
９１に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−３領域を有し、かつ抗体軽鎖が配列
番号１７６に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−１領域、配列番号２１９に示
されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−２領域、および配列番号２６２に示されるア
ミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−３領域を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
抗体重鎖が配列番号１６に示されるアミノ酸配列から構成される、請求項１に記載の組
成物。
【請求項１２】
抗体軽鎖が配列番号１４に示されるアミノ酸配列から構成される、請求項１０に記載の
組成物。
【請求項１３】
抗体がＢｉａｃｏｒｅアッセイにより、１．２５ｎＭのヒトＴＦＰＩへの結合親和性を
有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
抗体が注射用の薬学的に許容される担体中に１０から１００ｍｇの用量で製剤化される
、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）のＫｕｎｉｔｚドメイン１およびＫｕｎｉ
ｔｚドメイン２を含む結合部位に特異的に結合する、単離されたヒトモノクローナルＩｇ
Ｇ抗体を含む、治療組成物であって、抗体重鎖が配列番号１６０と少なくとも８０％の相
同性を有するアミノ酸配列から構成され、抗体軽鎖が配列番号１５８と少なくとも８０％
の相同性を有するアミノ酸配列から構成され、前記重鎖が配列番号３４１と少なくとも８
０％の相同性を有するアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−１領域、配列番号３８４と少
なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−２領域、および配
列番号４２７と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−
３領域を有し、かつ該ヒトモノクローナルＩｇＧがＴＦＰＩ活性の５０％以上の阻害を示
す、組成物。
【請求項１６】
第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
第ＶＩＩ因子が存在しない、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
抗体がＢｉａｃｏｒｅアッセイにより、１５．８ｎＭのヒトＴＦＰＩへの結合親和性を
有する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
抗体が注射用の薬学的に許容される担体中に１０から１００ｍｇの用量で製剤化される
、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
重鎖ＣＤＲ−１領域が配列番号３４１と少なくとも８５％の相同性を有する、請求項１
５に記載の組成物。
【請求項２１】
重鎖ＣＤＲ−２領域が配列番号３８４と少なくとも８５％の相同性を有する、請求項１
５に記載の組成物。
【請求項２２】
重鎖ＣＤＲ−３領域が配列番号４２７と少なくとも８５％の相同性を有する、請求項１
５に記載の組成物。
【請求項２３】
抗体が一本鎖の断片である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２４】
抗体重鎖が配列番号３４１に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−１領域、配
列番号３８４に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−２領域、および配列番号４
２７に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−３領域を有する、請求項１５に記載
の組成物。
【請求項２５】
抗体重鎖が配列番号１６０に示されるアミノ酸配列から構成される、請求項１５に記載
の組成物。
【請求項２６】
抗体重鎖が配列番号３４１に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−１領域、配
列番号３８４に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−２領域、および配列番号４
２７に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−３領域を有し、かつ抗体軽鎖が配列
番号２１２に示されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−１領域、配列番号２５５に示
されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−２領域、および配列番号２９８に示されるア
ミノ酸配列から構成されるＣＤＲ−３領域を有する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２７】
抗体重鎖が配列番号１６０に示されるアミノ酸配列から構成され、かつ抗体軽鎖が配列
番号１５８に示されるアミノ酸配列から構成される、請求項１５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の提出
本願と関連する配列表は、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子形式で出願されており、その全体
を引用により本明細書の一部とする。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＭＳＢ７
３２９ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５である。
【０００２】
実施態様の分野
ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に結合する単離されたモノクローナル抗体
およびその断片ならびに関連する発明を提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
血液凝固は、血液が出血を止める安定した血栓を形成する過程である。該過程は、血中
を循環している多くのプロ酵素（ｐｒｏｅｎｚｙｍｅｓ）およびプロ補因子（ｐｒｏｃｏ
ｆａｃｔｏｒｓ）（または「凝固因子」）を含む。それらのプロ酵素およびプロ補因子は
、いくつかの経路を介して相互作用し、その間にそれらは、連続してもしくは同時に活性
化型に変換される。最終的に、該過程は、第Ｖａ因子、イオン化カルシウムおよび血小板
の存在下で活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）により、プロトロンビンのトロンビンへの活性化を
生じる。活性化されたトロンビンは、順に、血小板凝集を誘導し、フィブリノーゲンをフ
ィブリンに変換し、その後、活性化第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩａ）により架橋されて血
栓を形成する。
【０００４】
第Ｘ因子の活性化を生じる過程は、下記の２個の異なる経路により行われ得る：接触活
性化経路（以前は内因性経路と呼ばれていた）および組織因子経路（以前は外因性経路と
呼ばれていた）。以前、凝固カスケードは、共通の経路に加えられる等しく重要な２個の
経路からなると考えられていた。現在では、血液凝固の開始についての主要な経路は、組
織因子経路であることが知られている。
【０００５】
第Ｘ因子は、活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）と組み合わせて組織因子（ＴＦ）によ
り活性化され得る。ＦＶＩＩａとその重要な補因子であるＴＦの複合体は、血液凝固カス
ケードの有力なイニシエーターである。
【０００６】
血液凝固の組織因子経路は、組織因子経路インヒビター（「ＴＦＰＩ」）により負に制
御される。ＴＦＰＩは、ＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体の天然のＦＸａ依存性フィードバックイ
ンヒビターである。ＴＦＰＩは、多価Ｋｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼインヒビターの
メンバーである。生理学的には、ＴＦＰＩは、活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）に結合してヘテ
ロダイマー複合体を形成し、次いで、ＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体と相互作用してその活性を
阻害し、その結果、血液凝固の組織因子経路を阻害する。原理上は、ＴＦＰＩ活性の妨害
は、ＦＸａおよびＦＶＩＩａ／ＴＦ活性を回復させ、その結果、組織因子経路の作用の持
続を延長させ、血友病ＡおよびＢにおいて共通して欠損しているＦＸａの産生を増幅し得
る。
【０００７】
確かに、いくつかの予備実験による証拠は、ＴＦＰＩに対する抗体によるＴＦＰＩ活性
の阻害が、遅延した血液凝固時間を標準化するか、もしくは出血時間を短縮することを示
している。例えば、Ｎｏｒｄｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、血友病血漿の延長した希釈プロ
トロンビン時間（ｄｉｌｕｔｅ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｔｉｍｅ）が、ＴＦＰＩに対
する抗体で血漿を処理した後に標準化されることを示した（Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏ
ｓｔ．，  １９９１，  ６６（４）：４６４−４６７）。同様に、Ｅｒｈａｒｄｔｓｅｎ
ｅｔ  ａｌ．は、血友病Ａウサギモデルにおける出血時間が抗ＴＦＰＩ抗体により顕著
に短縮することを示した（Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｉｂｒｉｎ
ｏｌｙｓｉｓ，  １９９５，  ６：３８８−３９４）。これらの研究は、抗ＴＦＰＩ抗体
によるＴＦＰＩの阻害が血友病ＡもしくはＢの処置において有用であり得ることを示す。
ポリクローナル抗ＴＦＰＩ抗体のみがこれらの研究において用いられた。
【０００８】
ハイブリドーマ技術を用いて、組み換えヒトＴＦＰＩ（ｒｈＴＦＰＩ）に対するモノク
ローナル抗体が作製され、同定された。Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｉｎ．  Ｍｅｄ
．  Ｊ．，  １９９８，  １１１（８）：７１８−７２１を参照のこと。希釈プロトロン
ビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）についてのモノ
クローナル抗体の効果が試験された。実験は、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体が第ＩＸ因
子を欠損した血漿の希釈トロンボプラスチン血液凝固時間を短縮することを示した。組織
因子経路が、生理学的な血液凝固においてだけでなく、血友病の出血においても重要な役
割を果たしていることが示される（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｎａｎ  Ｙｉ  Ｋｅ
Ｄａ  Ｘｕｅ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ，  １９９７，  ２２（４）：２９７−３００）。
【０００９】
Ｋｊａｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第７，０１５，１９４号は、ＦＶＩＩａ、
ならびにポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、またはその断片を含むＴＦＰＩイ
ンヒビターを含む、出血症状または凝固処置の処置または予防用組成物を開示している。
そのような組成物の使用は、正常な哺乳類血漿における凝固時間を短縮することがまた開
示されている。さらに、第ＶＩＩＩ因子またはその変異型が、ＦＶＩＩａおよびＴＦＰＩ
インヒビターの開示された組成物中に含まれ得ることが示されている。ＦＶＩＩＩまたは
第ＩＸ因子とＴＦＰＩモノクローナル抗体の組み合わせについては、示されていない。
【００１０】
血友病の処置に加えて、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を含むＴＦＰＩイ
ンヒビターは、癌処置のために使用され得ることがまた示されている（Ｈｕｎｇによる米
国特許第５，９０２，５８２号を参照のこと）。
【００１１】
したがって、ＴＦＰＩに特異的な抗体は、血液疾患および癌を処置するために必要とさ
れる。
【００１２】
一般に、ヒト疾患についての治療抗体は、マウス、キメラ、ヒト化もしくは完全ヒト抗
体を作製するために、遺伝学的改変により作製されている。マウスモノクローナル抗体は
、短い血清半減期、ヒトエフェクター機能誘導不能、およびヒト抗マウス抗体の産生のた
めに、治療剤として限定的な使用を有することが示されていた。Ｂｒｅｋｋｅ  ａｎｄ  
Ｓａｎｄｌｉｅ，  “Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍ
ａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｄａｗｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｗｅｎｔｙ−ｆｉ
ｒｓｔ  Ｃｅｎｔｕｒｙ，”  Ｎａｔｕｒｅ  ２，  ５３，  ５２−６２（Ｊａｎ．  ２
００３）を参照のこと。キメラ抗体は、ヒト抗キメラ抗体応答を生じることが示されてい
た。ヒト化抗体はさらに、抗体のマウス構成要素を最小化する。しかしながら、完全ヒト
抗体は、マウス構成要素に関連する免疫原性を完全に回避する。したがって、遺伝学的に
改変されたモノクローナル抗体の他の形態に関連する免疫原性を回避する完全ヒト抗体を
開発する必要性が存在する。特に、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体を用いた血友病処置の
ために必要とされるような慢性的な予防処置は、マウス構成要素またはマウス起源が、所
要の頻回投与および治療の長期持続のために必要とされる場合、該治療に対して免疫応答
を発症する高いリスクを有する。例えば、血友病Ａについての抗体治療は、患者の生涯に
わたって週１回の投与を必要とし得る。これは、免疫系に対する継続したチャレンジであ
り得る。したがって、血友病Ａおよび関連する先天的および後天的な血液凝固欠乏もしく
は欠損の抗体治療のための完全ヒト抗体について、必要性が存在する。
【００１３】
治療抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎにより“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕ
ｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｆｕｓｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  Ａｎｔｉ
ｂｏｄｙ  ｏｆ  Ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，”  Ｎａｔｕｒｅ  
２５６，  ４９５−４９７（１９７５）に記載されたハイブリドーマ技術を用いて作製さ
れ得る。完全ヒト抗体はまた、原核生物および真核生物において組み換え的に産生され得
る。宿主細胞における抗体の組み換え的産生は、ハイブリドーマ産生よりも治療抗体のた
めに好ましい。組み換え的産生は、より高い産物の一貫性、より高い産生レベル、および
動物由来タンパク質の存在を最小化するか、もしくは除去する制御された製造の利点を有
する。これらの理由により、組み換え的に産生される抗ＴＦＰＩ抗体を有することが望ま
しい。
【発明の概要】
【００１４】
要約
ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に対するモノクローナル抗体が提供される
。さらに、該抗体をコードする単離された核酸分子が提供される。抗ＴＦＰＩモノクロー
ナル抗体を含む医薬組成物ならびに血友病ＡおよびＢのような先天的および後天的な血液
凝固欠乏もしくは欠損の処置法がまた提供される。抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体をそれ
を必要とする患者に投与することにより出血時間を短縮するための方法がまた提供される
。本発明により、ヒトＴＦＰＩに結合するモノクローナル抗体を製造する方法がまた提供
される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヒトＴＦＰＩ（「ｈ−ＴＦＰＩ」）およびマウスＴＦＰＩ（「ｍ−ＴＦＰＩ」）に対するパニングおよびスクリーニングから選択されるＦａｂの代表例の結合活性。エストラジオール−ＢＳＡ（「ＥｓＢ」）に対するコントロールＦａｂおよびＴＦＰＩのパニングから選択される１２個のＦａｂ（１−４および６−１３）を試験した。Ｙ軸は、ＥＬＩＳＡ結果の蛍光ユニットを示す。
【図２】短縮化ｄＰＴにより示されるとおり、ヒト抗体ライブラリーのパニングおよびスクリーニングから取得された４個の代表的な抗ＴＦＰＩ抗体（４Ｂ７：ＴＰ−４Ｂ７、２Ａ８：ＴＰ−２Ａ８、２Ｇ６：ＴＰ−２Ｇ６、２Ｇ７：ＴＰ−２Ｇ７）の用量依存的インビトロ機能活性。実験は、ＴＦＰＩ欠損血漿にスパイクした０．５  ｕｇ／ｍＬのｍＴＦＰＩを含んでいた。
【図３】ＲＯＴＥＭアッセイにおいて試験された抗ＴＦＰＩ  Ｆａｂ、Ｆａｂ−２Ａ８（ＴＰ−２Ａ８由来）のインビトロ機能活性。
【図４】ＩｇＧへの変換後のクローンＴＰ−２Ｇ６（「２Ｇ６」）のヒトＴＦＰＩおよびマウスＴＦＰＩの結合活性。Δ：マウスＴＦＰＩへのＩｇＧ−２Ｇ６結合；□：ヒトＴＦＰＩへのＩｇＧ−２Ｇ６；▲：マウスＴＦＰＩへのコントロールＩｇＧ結合；■：ヒトＩｇＧへのコントロールＩｇＧ結合。
【図５】抗ＴＦＰＩ抗体ＴＰ−２Ａ８（「２Ａ８」）、ＴＰ−３Ｇ１（「３Ｇ１」）、およびＴＰ−３Ｃ２（「３Ｃ２」）は、ＲＯＴＥＭアッセイにおいて試験されたとおり、血友病Ａマウスにおける全血液凝固時間を短縮させた。各点は、一匹の個々の血友病Ａマウスを示す。
【図６】抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体ＴＰ−２Ａ１０（配列番号１８）、ＴＰ−２Ｂ１（配列番号２２）、ＴＰ−２Ａ２（配列番号２）、ＴＰ−２Ｇ２（配列番号６６）、ＴＰ−２Ａ５．１（配列番号６）、ＴＰ−３Ａ３（配列番号９８）、ＴＰ−２Ａ８（配列番号１４）、ＴＰ−２Ｂ８（配列番号３４）、ＴＰ−２Ｇ７（配列番号８２）、ＴＰ−４Ｈ８（配列番号１７０）、ＴＰ−２Ｇ４（配列番号７０）、ＴＰ−３Ｆ２（配列番号１３４）、ＴＰ−２Ａ６（配列番号１０）、ＴＰ−３Ａ２（配列番号９４）、ＴＰ−２Ｃ１（配列番号４２）、ＴＰ−３Ｅ１（配列番号１２６）、ＴＰ−３Ｆ１（配列番号１３０）、ＴＰ−３Ｄ３（配列番号１２２）、ＴＰ−４Ａ７（配列番号１５０）、ＴＰ−４Ｇ８（配列番号１６６）、ＴＰ−２Ｂ３（配列番号２６）、ＴＰ−２Ｆ９（配列番号６２）、ＴＰ−２Ｇ５（配列番号７４）、ＴＰ−２Ｇ６（配列番号７８）、ＴＰ−２Ｈ１０（配列番号９０）、ＴＰ−２Ｂ９（配列番号３８）、ＴＰ−２Ｃ７（配列番号４６）、ＴＰ−３Ｇ３（配列番号１４２）、ＴＰ−３Ｃ２（配列番号１１４）、ＴＰ−３Ｂ４（配列番号１１０）、ＴＰ−２Ｅ５（配列番号５８）、ＴＰ−３Ｃ３（配列番号１１８）、ＴＰ−３Ｇ１（配列番号１３８）、ＴＰ−２Ｄ７（配列番号５０）、ＴＰ−４Ｂ７（配列番号１５８）、ＴＰ−２Ｅ３（配列番号５４）、ＴＰ−２Ｇ９（配列番号８６）、ＴＰ−３Ｃ１（配列番号８６）、ＴＰ−３Ａ４（配列番号１０２）、ＴＰ−２Ｂ４（配列番号３０）、ＴＰ−３Ｈ２（配列番号１４６）、ＴＰ−４Ａ９（配列番号１５４）、ＴＰ−４Ｅ８（配列番号１６２）、およびＴＰ−３Ｂ３（配列番号１０６）の可変軽鎖間のアミノ酸配列アライメント。
【図７】抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体ＴＰ−２Ａ１０（配列番号２０）、ＴＰ−３Ｂ３（配列番号１０８）、ＴＰ−２Ｇ４（配列番号７２）、ＴＰ−２Ａ５．１（配列番号８）、ＴＰ−４Ａ９（配列番号１５６）、ＴＰ−２Ａ８（配列番号１６）、ＴＰ−２Ｂ３（配列番号２８）、ＴＰ−２Ｂ９（配列番号４０）、ＴＰ−２Ｈ１０（配列番号９２）、ＴＰ−３Ｂ４（配列番号１１２）、ＴＰ−２Ｃ７（配列番号４８）、ＴＰ−２Ｅ３（配列番号５６）、ＴＰ−３Ｃ３（配列番号１２０）、ＴＰ−２Ｇ５（配列番号７６）、ＴＰ−４Ｂ７（配列番号１６０）、ＴＰ−２Ｇ６（配列番号８０）、ＴＰ−３Ｃ２（配列番号１１６）、ＴＰ−２Ｄ７（配列番号５２）、ＴＰ−３Ｇ１（配列番号１４０）、ＴＰ−２Ｅ５（配列番号６０）、ＴＰ−２Ｂ８（配列番号３６）、ＴＰ−３Ｆ１（配列番号１３２）、ＴＰ−３Ａ３（配列番号１００）、ＴＰ−４Ｅ８（配列番号１６４）、ＴＰ−４Ａ７（配列番号１５２）、ＴＰ−４Ｈ８（配列番号１７２）、ＴＰ−２Ａ６（配列番号１２）、ＴＰ−２Ｃ１（配列番号４４）、ＴＰ−３Ｇ３（配列番号１４４）、ＴＰ−２Ｂ１（配列番号２４）、ＴＰ−２Ｇ７（配列番号８４）、ＴＰ−３Ｈ２（配列番号１４８）、ＴＰ−２Ａ２（配列番号４）、ＴＰ−３Ｅ１（配列番号１２８）、ＴＰ−２Ｇ２（配列番号６８）、ＴＰ−３Ｄ３（配列番号１２４）、ＴＰ−２Ｇ９（配列番号８８）、ＴＰ−２Ｂ４（配列番号３２）、ＴＰ−３Ａ２（配列番号９６）、ＴＰ−２Ｆ９（配列番号６４）、ＴＰ−３Ａ４（配列番号１０４）、ＴＰ−３Ｃ１（配列番号１３６）、ＴＰ−３Ｆ２（配列番号１３６）、およびＴＰ−４Ｇ８（配列番号１６８）の可変重鎖間のアミノ酸配列アライメント。
【図８】（１）抗ＴＦＰＩ抗体ＴＰ−２Ａ８（「２Ａ８」）、（２）２Ａ８および組み換え第ＶＩＩＩ因子、（３）マウスＩｇＧ、ならびに（４）組み換え第ＶＩＩＩ因子で処理されたマウスについて、尾静脈切断後２４時間にわたる生存率を示す図式。
【図９】抗ＴＦＰＩ抗体ＴＰ−２Ａ８（「２Ａ８」）、第ＶＩＩａ因子、および２Ａ８と第ＶＩＩａ因子の組み合わせで処理されたマウスについて、血液凝固時間および血栓形成時間アッセイを示す図式。
【図１０】ＦＶＩＩＩインヒビター単独の場合と比較して、ＦＶＩＩＩインヒビターと抗ＴＦＰＩ抗体ＴＰ−２Ａ８（「２Ａ８」）および抗ＴＦＰＩ抗体ＴＰ−４Ｂ７（「４Ｂ７」）で処理された正常なヒト血液についての血液凝固時間を示す図式。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明
本明細書で使用される「組織因子経路インヒビター」または「ＴＦＰＩ」なる用語は、
天然において細胞で発現するヒトＴＦＰＩのすべての変異型、アイソフォームおよび種ホ
モログを意味する。本発明の好ましい態様において、本発明の抗体のＴＦＰＩへの結合は
、血液凝固時間を減少させる。
【００１７】
本明細書で使用される「抗体」は、全抗体およびその任意の抗原結合断片（すなわち、
「抗原結合部分」）もしくは一本鎖を意味する。該用語は、天然で生じるか、もしくは通
常の免疫グロブリン遺伝子断片組み換え工程により形成される全長免疫グロブリン分子（
例えば、ＩｇＧ抗体）、または特定の結合活性を保持する免疫グロブリン分子の免疫学的
に活性な部分、例えば、抗体断片を含む。構造にかかわらず、抗体断片は、全長抗体によ
り認識されるものと同一の抗原と結合する。例えば、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体断片
は、ＴＦＰＩのエピトープに結合する。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片により行
われ得る。抗体の「抗原結合部分」なる用語の範囲内に包含される結合断片の例は、下記
を含む：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断
片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により結合した２個のＦａｂ断片を含
む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦ
ｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）
ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ
３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。さ
らに、Ｆｖ断片の２個のドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によりコードさ
れるが、組み換え法を用いて、それらを単一タンパク質鎖として結合させる合成リンカー
によりそれらを結合させることができ、そこでは、ＶＬおよびＶＨは、対となって一価分
子を形成する（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として既知である；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａ
ｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ
ａｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５
８７９−５８８３を参照のこと）。そのような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分
」なる用語の範囲内に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に既知
の慣用的な技術を用いて取得され、該断片は、インタクト抗体と同様の方法で使用のため
にスクリーニングされる。
【００１８】
本明細書で使用される「結合を阻害する」および「結合を妨害する」なる用語（例えば
、ＴＦＰＩリガンドのＴＦＰＩへの結合の阻害／妨害を参照のこと）は、同義であり、部
分的および完全な阻害もしくは妨害の両方を包含する。阻害および妨害はまた、抗ＴＦＰ
Ｉ抗体と接触させていないＴＦＰＩと比較して、抗ＴＦＰＩ抗体と接触させた場合におけ
るＴＦＰＩと生理学的な基質との結合親和性の任意の測定可能な減少、例えば、少なくと
も約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％までのＴＦＰＩと第Ｘａ因子の相
互作用の妨害、またはＴＦＰＩ−第Ｘａ因子複合体と組織因子、第ＶＩＩａ因子もしくは
組織因子／第ＶＩＩａ因子の複合体の相互作用の妨害を含むことが意図される。
【００１９】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」な
る用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は
、特定のエピトープについての単一結合特異性および親和性を示す。したがって、「ヒト
モノクローナル抗体」なる用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変
および定常領域を有する単一結合特異性を示す抗体を意味する。本発明のヒト抗体は、ヒ
ト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基（例えば、イ
ンビトロでの無作為もしくは部位特異的突然変異誘発によるか、またはインビボでの体細
胞突然変異により導入された突然変異）を含み得る。
【００２０】
本明細書で使用される「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的に
存在しない抗体を意味することが意図される（例えば、ＴＦＰＩに結合する単離抗体は、
ＴＦＰＩ以外の抗原に結合する抗体が実質的に存在しない）。しかしながら、ヒトＴＦＰ
Ｉのエピトープ、アイソフォームもしくは変異型に結合する単離抗体は、例えば他の種に
由来する他の関連抗原（例えば、ＴＦＰＩ種ホモログ）との交差反応を有する。さらに、
単離抗体は、他の細胞物質および／または化学物質が実質的に存在しないことであり得る
。
【００２１】
本明細書で使用される「特異的結合」は、所定の抗原に結合する抗体を意味する。一般
に、抗体は、少なくとも約１０５Ｍ−１の親和性で結合し、所定の抗原または密接に関連
する抗原以外の無関係な抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に結合する親和性よりも高い
親和性、例えば、少なくとも２倍以上の親和性で所定の抗原に結合する。「抗原を認識す
る抗体」および「抗原に特異的な抗体」なる用語は、本明細書において「抗原に特異的に
結合する抗体」なる用語と同義である。
【００２２】
本明細書で使用されるＩｇＧ抗体についての「高親和性」なる用語は、少なくとも約１
０７Ｍ−１、ある態様において、少なくとも約１０８Ｍ−１、ある態様において、少なく
とも約１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１もしくはそれ以上、例えば、１０
１３Ｍ−１もしくはそれ以上までの結合親和性を意味する。しかしながら、「高親和性」
結合は、他の抗体アイソタイプについて変わり得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプについ
ての「高親和性」結合は、少なくとも約１．０ｘ１０７Ｍ−１の結合親和性を意味する。
本明細書で使用される「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体
クラス（例えば、ＩｇＭもしくはＩｇＧ１）を意味する。
【００２３】
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、結合する抗原の三次元構造に相補的なＮ末端
抗原結合表面を形成する抗体分子の重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域内の３個の超可
変領域のうちの１個を意味する。重鎖または軽鎖のＮ末端から順に、これらの相補性決定
領域は、各々「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」として示される。ＣＤＲは
、抗原−抗体結合に関与し、ＣＤＲ３は、抗原−抗体結合に特異的な特定の領域を含む。
したがって、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲ領域を含む６個
のＣＤＲを含み得る。
【００２４】
本明細書で使用される「保存的置換」は、１個またはそれ以上のアミノ酸の、類似の生
化学的特性を有するアミノ酸での置換を含み、ポリペプチドの生物学的もしくは生化学的
機能の欠損を生じないポリペプチドの修飾を意味する。「保存的アミノ酸置換」は、アミ
ノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換である。類似の側鎖を有す
るアミノ酸残基のファミリーは、当分野において定義されている。これらのファミリーは
、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖
を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有する
アミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシ
ン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、
プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β鎖側鎖を有するアミノ
酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸
（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。本発明
の抗体は、保存的アミノ酸置換を有し得て、なお活性を保持していることが想定される。
【００２５】
核酸およびポリペプチドについて、「実質的な相同性」なる用語は、２個の核酸もしく
は２個のポリペプチド、またはその指定された配列が適当なヌクレオチドまたはアミノ酸
挿入もしくは欠失を伴って最適に並べられ、比較された場合に、ヌクレオチドまたはアミ
ノ酸の少なくとも約８０％において、通常は少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、
９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、または９
９．５％において同一であることを示す。あるいは、核酸についての実質的な相同性は、
断片が選択的ハイブリダイゼーション条件下で鎖の相補体にハイブリダイズする場合に存
在する。本発明は、本明細書に記載された特定の核酸配列およびアミノ酸配列と実質的な
相同性を有する核酸配列およびポリペプチド配列を含む。
【００２６】
２個の配列間の％同一性は、ギャップの数、および各ギャップの長さを考慮した配列に
より共有される同一の位置の数の関数であり（すなわち、％同一性＝同一の位置の数  ／
位置の全数  ｘ  １００）、それは、２個の配列の最適アライメントについて導入され
る必要がある。配列の比較および２個の配列間の％同一性の決定は、数学的アルゴリズム
、例えば、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（商標）のＡｌｉｇｎＸ（商標）モジュール（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いて達成され得る。Ａｌｉ
ｇｎＸ（商標）について、多重アライメントの既定パラメーターは、下記のとおりである
：ギャップ開始ペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）：１０；ギャッ
プ伸長ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）：０．０５；ギャッ
プ分離ペナルティ範囲（ｇａｐ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ  ｒａｎｇｅ）
：８；アライメント遅延（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｄｅｌａｙ）についての％同一性：４０
．（さらなる詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ
／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ＬＩＮＮＥＡ−Ｏｎｌｉｎｅ−Ｇｕｉｄｅｓ／ＬＩＮＮＥＡ−
Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ／Ｖｅｃｔｏｒ−ＮＴＩ−Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ／Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ−ａｎａｌｙｓｉｓ−ａｎｄ−ｄａｔａ−ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ−ｓｏｆｔｗａｒｅ−
ｆｏｒ−ＰＣｓ／ＡｌｉｇｎＸ−Ｍｏｄｕｌｅ−ｆｏｒ−Ｖｅｃｔｏｒ−ＮＴＩ−Ａｄｖ
ａｎｃｅ．ｒｅｇ．ｕｓ．ｈｔｍｌにおいて見出される）。
【００２７】
クエリー配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体一致を決定する他の方法
（また、グローバル配列アライメントと呼ばれる）は、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピューター
プログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ，  １９９４，  ２（２２）：４６７３−４６８０）を用いて決定され得て、
それは、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．のアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＢＩＯＳ），  １９９２
，  ８（２）：１８９−１９１）に基づくものである。配列アライメントにおいて、クエ
リーおよび対象配列の両方は、ＤＮＡ配列である。該グローバル配列アライメントの結果
は、％同一性である。ペアワイズアライメント（ｐａｉｒｗｉｓｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ
ｓ）により％同一性を計算するために、ＤＮＡ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメントにお
いて使用される好ましいパラメーターは、下記のとおりである：マトリクス＝ＩＵＢ、ｋ
−タプル（ｋ−ｔｕｐｌｅ）＝１、Ｔｏｐ  Ｄｉａｇｏｎａｌｓの数（Ｎｕｍｂｅｒ  ｏ
ｆ  Ｔｏｐ  Ｄｉａｇｏｎａｌｓ）＝５、ギャップペナルティ＝３、ギャップ開始ペナル
ティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．１。多重アライメントについて、下記のＣＬ
ＵＳＴＡＬＷパラメーターが好ましい：ギャップ開始ペナルティ＝１０，ギャップ伸長パ
ラメーター＝０．０５；ギャップ分離ペナルティ範囲＝８；アライメント遅延についての
％同一性＝４０。
【００２８】
核酸は、全細胞、細胞溶解物、または部分的に精製されるか、もしくは実質的に純粋な
形態で存在し得る。天然の環境において通常関連している他の細胞構成要素から分離され
た（ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ａｗａｙ）場合に、核酸は「単離される」か、または「実質的に
純粋に」なる。核酸を単離するために、下記のような標準的な技術が使用され得る：アル
カリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル
電気泳動および当分野において既知の他の技術。
【００２９】
モノクローナル抗体
ヒトＴＦＰＩに対するヒト抗体ライブラリーのパニングおよびスクリーニングから４４
個のＴＦＰＩ結合抗体が同定された。各モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可
変領域が塩基配列決定され、それらのＣＤＲ領域が同定された。各モノクローナル抗体の
これらの領域に相当する配列識別番号（「配列番号」）を表１に要約する。
【００３０】
表１．  各ＴＦＰＩ結合モノクローナル抗体の重鎖可変領域（「ＶＨ」）および軽鎖可変
領域（「ＶＬ」）の配列識別番号（「配列番号」）の要約。各重鎖および軽鎖のＣＤＲ領
域（「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」）についての配列識別番号がまた
提供される。Ｎ．Ａ．：核酸配列；Ａ．Ａ．：アミノ酸配列。
【表１】
2018038398.tif 000002
【００３１】
【表２】
2018038398.tif 000003
【００３２】
１つの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離モノクローナル抗
体であって、配列番号３８８−４３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤ
Ｒ３を含む、抗体が提供される。これらのＣＤＲ３は、パニングおよびスクリーニングの
間に同定された抗体の重鎖から同定される。さらなる態様において、この抗体はさらに、
（ａ）配列番号３０２−３４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３４５−３８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、
または（ｃ）配列番号３０２−３４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤ
Ｒ１および配列番号３４５−３８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ
２の両方を含む。
【００３３】
他の態様において、パニングおよびスクリーニングの間に同定される抗体の軽鎖の１つ
に由来するＣＤＲ３を共有する抗体が提供される。したがって、本発明は、ヒト組織因子
経路インヒビターに結合する単離モノクローナル抗体であって、配列番号２５９−３０１
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗体に向けられる。さら
なる態様において、抗体はさらに、（ａ）配列番号１７３−２１５からなる群から選択さ
れるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２１６−２５８からなる群から選択さ
れるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または（ｃ）配列番号１７３−２１５からなる群から
選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１および配列番号２１６−２５８からなる群から選
択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２の両方を含む。
【００３４】
他の態様において、抗体は、パニングおよびスクリーニングの間に同定される抗体の重
鎖に由来するＣＤＲ３および軽鎖に由来するＣＤＲ３を含む。したがって、本発明は、ヒ
ト組織因子経路インヒビターに結合する抗体であって、配列番号３８８−４３０からなる
群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３および配列番号２５９−３０１からなる群
から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗体が提供される。さらなる態様に
おいて、抗体はさらに、（ａ）配列番号３０２−３４４からなる群から選択されるアミノ
酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）配列番号３４５−３８７からなる群から選択されるアミノ
酸配列を含むＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１７３−２１５からなる群から選択されるアミノ
酸配列を含むＣＤＲ１、および／または（ｄ）配列番号２１６−２５８からなる群から選
択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２を含む。
【００３５】
他の特定の態様において、抗体は、下記：
（ａ）配列番号１７３、２１６および２５９を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３０２、３４５および３８８を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１７４、２１７および２６０を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３０３、３４６および３８９を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１７５、２１８および２６１を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３０４、３４７および３９０を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｄ）配列番号１７６、２１９および２６２を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３０５、３４８および３９１を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｅ）配列番号１７７、２２０および２６３を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３０６、３４９および３９２を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｆ）配列番号１７８、２２１および２６４を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３０７、３５０および３９３を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｇ）配列番号１７９、２２２および２６５を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３０８、３５１および３９４を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｈ）配列番号１８０、２２３および２６６を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３０９、３５２および３９５を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｉ）配列番号１８１、２２４および２６７を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３１０、３５３および３９６を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｊ）配列番号１８２、２２５および２６８を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３１１、３５４および３９７を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｋ）配列番号１８３、２２６および２６９を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３１２、３５５および３９８を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｌ）配列番号１８４、２２７および２７０を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３１３、３５６および３９９を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｍ）配列番号１８５、２２８および２７１を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３１４、３５７および４００を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｎ）配列番号１８６、２２９および２７２を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３１５、３５８および４０１を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｏ）配列番号１８７、２３０および２７３を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３１６、３５９および４０２を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｐ）配列番号１８８、２３１および２７４を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３１７、３６０および４０３を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｑ）配列番号１８９、２３２および２７５を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３１８、３６１および４０４を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｒ）配列番号１９０、２３３および２７６を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３１９、３６２および４０５を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｓ）配列番号１９１、２３４および２７７を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３２０、３６３および４０６を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｔ）配列番号１９２、２３５および２７８を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３２１、３６４および４０７を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｕ）配列番号１９３、２３６および２７９を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３２２、３６５および４０８を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｖ）配列番号１９４、２３７および２８０を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３２３、３６６および４０９を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｗ）配列番号１９５、２３８および２８１を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３２４、３６７および４１０を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｘ）配列番号１９６、２３９および２８２を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３２５、３６８および４１１を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｙ）配列番号１９７、２４０および２８３を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３２６、３６９および４１２を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｚ）配列番号１９８、２４１および２８４を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域なら
びに配列番号３２７、３７０および４１３を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ａａ）配列番号１９９、２４２および２８５を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域な
らびに配列番号３２８、３７１および４１４を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｂｂ）配列番号２００、２４３および２８６を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域な
らびに配列番号３２９、３７２および４１５を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｃｃ）配列番号２０１、２４４および２８７を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域な
らびに配列番号３３０、３７３および４１６を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｄｄ）配列番号２０２、２４５および２８８を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域な
らびに配列番号３３１、３７４および４１７を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｅｅ）配列番号２０３、２４６および２８９を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域な
らびに配列番号３３２、３７５および４１８を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｆｆ）配列番号２０４、２４７および２９０を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域な
らびに配列番号３３３、３７６および４１９を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｇｇ）配列番号２０５、２４８および２９１を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域な
らびに配列番号３３４、３７７および４２０を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｈｈ）配列番号２０６、２４９および２９２を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域な
らびに配列番号３３５、３７８および４２１を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｉｉ）配列番号２０７、２５０および２９３を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域な
らびに配列番号３３６、３７９および４２２を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｊｊ）配列番号２０８、２５１および２９４を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域な
らびに配列番号３３７、３８０および４２３を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｋｋ）配列番号２０９、２５２および２９５を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域な
らびに配列番号３３８、３８１および４２４を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｌｌ）配列番号２１０、２５３および２９６を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域な
らびに配列番号３３９、３８２および４２５を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｍｍ）配列番号２１１、２５４および２９７を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域な
らびに配列番号３４０、３８３および４２６を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｎｎ）配列番号２１２、２５５および２９８を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域な
らびに配列番号３４１、３８４および４２７を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｏｏ）配列番号２１３、２５６および２９９を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域な
らびに配列番号３４２、３８５および４２８を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｐｐ）配列番号２１４、２５７および３００を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域な
らびに配列番号３４３、３８６および４２９を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｑｑ）配列番号２１５、２５８および３０１を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域な
らびに配列番号３４４、３８７および４３０を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ま
たは
（ｒｒ）配列番号１９４、２３７および２８０を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域な
らびに配列番号３３５、３７８および４２１を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む。
【００３６】
他の態様において、本発明は、下記：
（ａ）配列番号２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号４のポリペプ
チド配列を有する重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号８のポリペプ
チド配列を有する重鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１２のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｄ）配列番号１４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１６のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｅ）配列番号１８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号２０のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｆ）配列番号２２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号２４のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｇ）配列番号２６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号２８のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｈ）配列番号３０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号３２のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｉ）配列番号３４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号３６のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｊ）配列番号３８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号４０のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｋ）配列番号４２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号４４のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｌ）配列番号４６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号４８のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｍ）配列番号５０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号５２のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｎ）配列番号５４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号５６のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｏ）配列番号５８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号６０のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｐ）配列番号６２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号６４のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｑ）配列番号６６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号６８のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｒ）配列番号７０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号７２のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｓ）配列番号７４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号７６のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｔ）配列番号７８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号８０のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｕ）配列番号８２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号８４のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｖ）配列番号８６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号８８のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｗ）配列番号９０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号９２のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｘ）配列番号９４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号９６のポリ
ペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｙ）配列番号９８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１００のポ
リペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｚ）配列番号１０２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１０４の
ポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ａａ）配列番号１０６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１０８
のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｂｂ）配列番号１１０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１１２
のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｃｃ）配列番号１１４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１１６
のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｄｄ）配列番号１１８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１２０
のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｅｅ）配列番号１２２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１２４
のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｆｆ）配列番号１２６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１２８
のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｇｇ）配列番号１３０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１３２
のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｈｈ）配列番号１３４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１３６
のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｉｉ）配列番号１３８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１４０
のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｊｊ）配列番号１４２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１４４
のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｋｋ）配列番号１４６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１４８
のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｌｌ）配列番号１５０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１５２
のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｍｍ）配列番号１５４のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１５６
のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｎｎ）配列番号１５８のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１６０
のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｏｏ）配列番号１６２のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１６４
のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｐｐ）配列番号１６６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１６８
のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；
（ｑｑ）配列番号１７０のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１７２
のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域；または
（ｒｒ）配列番号８６のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域および配列番号１３６の
ポリペプチド配列を有する重鎖可変領域
を含む抗体に向けられる。
【００３７】
ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離モノクローナル抗体であって、配列番号
４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号
２８、配列番号３２、配列番号３６、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４８、配列
番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、
配列番号７６、配列番号８０、配列番号８４、配列番号８８、配列番号９２、配列番号９
６、配列番号１００、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１
６、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１２８、配列番号１３２、配列番号１３
６、配列番号１４０、配列番号１４４、配列番号１４８、配列番号１５２、配列番号１５
６、配列番号１６０、配列番号１６４、配列番号１６８、および配列番号１７２で示され
るアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８９％、９０％、９
１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９
９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域を含む、抗体がまた提供
される。
【００３８】
ヒト組織因子経路インヒビターに結合する単離モノクローナル抗体であって、配列番号
２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、配列番号
２６、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４６、配列
番号５０、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６６、配列番号７０、
配列番号７４、配列番号７８、配列番号８２、配列番号８６、配列番号９０、配列番号９
４、配列番号９８、配列番号１０２、配列番号１０６、配列番号１１０、配列番号１１４
、配列番号１１８、配列番号１２２、配列番号１２６、配列番号１３０、配列番号１３４
、配列番号１３８、配列番号１４２、配列番号１４６、配列番号１５０、配列番号１５４
、配列番号１５８、配列番号１６２、配列番号１６６、および配列番号１７０で示される
アミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％の同一性を有するアミノ酸配
列を含むヒト軽鎖可変領域を含む、抗体がまた提供される。
【００３９】
上記の配列識別子を用いた抗体記載に依存することに加えて、ある態様はまた、本明細
書に記載された実験において単離されるＦａｂクローンにより記載され得る。ある態様に
おいて、組み換え抗体は、下記のクローンの重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３を含む：Ｔ
Ｐ−２Ａ２、ＴＰ−２Ａ５．１、ＴＰ−２Ａ６、ＴＰ−２Ａ８、ＴＰ−２Ａ１０、ＴＰ−
２Ｂ１、ＴＰ−２Ｂ３、ＴＰ−２Ｂ４、ＴＰ−２Ｂ８、ＴＰ−２Ｂ９、ＴＰ−２Ｃ１、Ｔ
Ｐ−２Ｃ７、ＴＰ−２Ｄ７、ＴＰ−２Ｅ３、ＴＰ−２Ｅ５、ＴＰ−２Ｆ９、ＴＰ−２Ｇ２
、ＴＰ−２Ｇ４、ＴＰ−２Ｇ５、ＴＰ−２Ｇ６、ＴＰ−２Ｇ７、ＴＰ−２Ｇ９、ＴＰ−２
Ｈ１０、ＴＰ−３Ａ２、ＴＰ−３Ａ３、ＴＰ−３Ａ４、ＴＰ−３Ｂ３、ＴＰ−３Ｂ４、Ｔ
Ｐ−３Ｃ１、ＴＰ−３Ｃ２、ＴＰ−３Ｃ３、ＴＰ−３Ｄ３、ＴＰ−３Ｅ１、ＴＰ−３Ｆ１
、ＴＰ−３Ｆ２、ＴＰ−３Ｇ１、ＴＰ−３Ｇ３、ＴＰ−３Ｈ２、ＴＰ−４Ａ７、ＴＰ−４
Ａ９、ＴＰ−４Ｂ７、ＴＰ−４Ｅ８、ＴＰ−４Ｇ８、またはＴＰ−４Ｈ８。ある態様にお
いて、抗体はさらに、これらの抗体のＣＤＲ２を含み得て、さらにこれらの抗体のＣＤＲ
１を含み得る。他の態様において、抗体はさらに、ＣＤＲの任意の組み合わせを含み得る
。
【００４０】
したがって、他の態様において、（１）ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖ＣＤＲ
１領域、ヒト重鎖ＣＤＲ２領域、およびヒト重鎖ＣＤＲ３領域（ここで、該ヒト重鎖ＣＤ
Ｒ３領域は、ＴＰ−２Ａ２、ＴＰ−２Ａ５．１、ＴＰ−２Ａ６、ＴＰ−２Ａ８、ＴＰ−２
Ａ１０、ＴＰ−２Ｂ１、ＴＰ−２Ｂ３、ＴＰ−２Ｂ４、ＴＰ−２Ｂ８、ＴＰ−２Ｂ９、Ｔ
Ｐ−２Ｃ１、ＴＰ−２Ｃ７、ＴＰ−２Ｄ７、ＴＰ−２Ｅ３、ＴＰ−２Ｅ５、ＴＰ−２Ｆ９
、ＴＰ−２Ｇ２、ＴＰ−２Ｇ４、ＴＰ−２Ｇ５、ＴＰ−２Ｇ６、ＴＰ−２Ｇ７、ＴＰ−２
Ｇ９、ＴＰ−２Ｈ１０、ＴＰ−３Ａ２、ＴＰ−３Ａ３、ＴＰ−３Ａ４、ＴＰ−３Ｂ３、Ｔ
Ｐ−３Ｂ４、ＴＰ−３Ｃ１、ＴＰ−３Ｃ２、ＴＰ−３Ｃ３、ＴＰ−３Ｄ３、ＴＰ−３Ｅ１
、ＴＰ−３Ｆ１、ＴＰ−３Ｆ２、ＴＰ−３Ｇ１、ＴＰ−３Ｇ３、ＴＰ−３Ｈ２、ＴＰ−４
Ａ７、ＴＰ−４Ａ９、ＴＰ−４Ｂ７、ＴＰ−４Ｅ８、ＴＰ−４Ｇ８、またはＴＰ−４Ｈ８
の重鎖ＣＤＲ３である）；および（２）ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ１
領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域、およびヒト軽鎖ＣＤＲ３領域（ここで、該ヒト軽鎖ＣＤＲ
３領域は、ＴＰ−２Ａ２、ＴＰ−２Ａ５．１、ＴＰ−２Ａ６、ＴＰ−２Ａ８、ＴＰ−２Ａ
１０、ＴＰ−２Ｂ１、ＴＰ−２Ｂ３、ＴＰ−２Ｂ４、ＴＰ−２Ｂ８、ＴＰ−２Ｂ９、ＴＰ
−２Ｃ１、ＴＰ−２Ｃ７、ＴＰ−２Ｄ７、ＴＰ−２Ｅ３、ＴＰ−２Ｅ５、ＴＰ−２Ｆ９、
ＴＰ−２Ｇ２、ＴＰ−２Ｇ４、ＴＰ−２Ｇ５、ＴＰ−２Ｇ６、ＴＰ−２Ｇ７、ＴＰ−２Ｇ
９、ＴＰ−２Ｈ１０、ＴＰ−３Ａ２、ＴＰ−３Ａ３、ＴＰ−３Ａ４、ＴＰ−３Ｂ３、ＴＰ
−３Ｂ４、ＴＰ−３Ｃ１、ＴＰ−３Ｃ２、ＴＰ−３Ｃ３、ＴＰ−３Ｄ３、ＴＰ−３Ｅ１、
ＴＰ−３Ｆ１、ＴＰ−３Ｆ２、ＴＰ−３Ｇ１、ＴＰ−３Ｇ３、ＴＰ−３Ｈ２、ＴＰ−４Ａ
７、ＴＰ−４Ａ９、ＴＰ−４Ｂ７、ＴＰ−４Ｅ８、ＴＰ−４Ｇ８、またはＴＰ−４Ｈ８の
軽鎖ＣＤＲ３である）を含む抗ＴＦＰＩ抗体であって、ＴＦＰＩに結合する抗体が提供さ
れる。抗体はさらに、ＴＰ−２Ａ２、ＴＰ−２Ａ５．１、ＴＰ−２Ａ６、ＴＰ−２Ａ８、
ＴＰ−２Ａ１０、ＴＰ−２Ｂ１、ＴＰ−２Ｂ３、ＴＰ−２Ｂ４、ＴＰ−２Ｂ８、ＴＰ−２
Ｂ９、ＴＰ−２Ｃ１、ＴＰ−２Ｃ７、ＴＰ−２Ｄ７、ＴＰ−２Ｅ３、ＴＰ−２Ｅ５、ＴＰ
−２Ｆ９、ＴＰ−２Ｇ２、ＴＰ−２Ｇ４、ＴＰ−２Ｇ５、ＴＰ−２Ｇ６、ＴＰ−２Ｇ７、
ＴＰ−２Ｇ９、ＴＰ−２Ｈ１０、ＴＰ−３Ａ２、ＴＰ−３Ａ３、ＴＰ−３Ａ４、ＴＰ−３
Ｂ３、ＴＰ−３Ｂ４、ＴＰ−３Ｃ１、ＴＰ−３Ｃ２、ＴＰ−３Ｃ３、ＴＰ−３Ｄ３、ＴＰ
−３Ｅ１、ＴＰ−３Ｆ１、ＴＰ−３Ｆ２、ＴＰ−３Ｇ１、ＴＰ−３Ｇ３、ＴＰ−３Ｈ２、
ＴＰ−４Ａ７、ＴＰ−４Ａ９、ＴＰ−４Ｂ７、ＴＰ−４Ｅ８、ＴＰ−４Ｇ８、またはＴＰ
−４Ｈ８の重鎖ＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ２を含み得る。抗体はさらに、ＴＰ−
２Ａ２、ＴＰ−２Ａ５．１、ＴＰ−２Ａ６、ＴＰ−２Ａ８、ＴＰ−２Ａ１０、ＴＰ−２Ｂ
１、ＴＰ−２Ｂ３、ＴＰ−２Ｂ４、ＴＰ−２Ｂ８、ＴＰ−２Ｂ９、ＴＰ−２Ｃ１、ＴＰ−
２Ｃ７、ＴＰ−２Ｄ７、ＴＰ−２Ｅ３、ＴＰ−２Ｅ５、ＴＰ−２Ｆ９、ＴＰ−２Ｇ２、Ｔ
Ｐ−２Ｇ４、ＴＰ−２Ｇ５、ＴＰ−２Ｇ６、ＴＰ−２Ｇ７、ＴＰ−２Ｇ９、ＴＰ−２Ｈ１
０、ＴＰ−３Ａ２、ＴＰ−３Ａ３、ＴＰ−３Ａ４、ＴＰ−３Ｂ３、ＴＰ−３Ｂ４、ＴＰ−
３Ｃ１、ＴＰ−３Ｃ２、ＴＰ−３Ｃ３、ＴＰ−３Ｄ３、ＴＰ−３Ｅ１、ＴＰ−３Ｆ１、Ｔ
Ｐ−３Ｆ２、ＴＰ−３Ｇ１、ＴＰ−３Ｇ３、ＴＰ−３Ｈ２、ＴＰ−４Ａ７、ＴＰ−４Ａ９
、ＴＰ−４Ｂ７、ＴＰ−４Ｅ８、ＴＰ−４Ｇ８、またはＴＰ−４Ｈ８の重鎖ＣＤＲ１およ
び／または軽鎖ＣＤＲ１を含み得る。
【００４１】
上記改変抗体のＣＤＲ１、２および／または３領域は、本明細書に記載されたＴＰ−２
Ａ２、ＴＰ−２Ａ５．１、ＴＰ−２Ａ６、ＴＰ−２Ａ８、ＴＰ−２Ａ１０、ＴＰ−２Ｂ１
、ＴＰ−２Ｂ３、ＴＰ−２Ｂ４、ＴＰ−２Ｂ８、ＴＰ−２Ｂ９、ＴＰ−２Ｃ１、ＴＰ−２
Ｃ７、ＴＰ−２Ｄ７、ＴＰ−２Ｅ３、ＴＰ−２Ｅ５、ＴＰ−２Ｆ９、ＴＰ−２Ｇ２、ＴＰ
−２Ｇ４、ＴＰ−２Ｇ５、ＴＰ−２Ｇ６、ＴＰ−２Ｇ７、ＴＰ−２Ｇ９、ＴＰ−２Ｈ１０
、ＴＰ−３Ａ２、ＴＰ−３Ａ３、ＴＰ−３Ａ４、ＴＰ−３Ｂ３、ＴＰ−３Ｂ４、ＴＰ−３
Ｃ１、ＴＰ−３Ｃ２、ＴＰ−３Ｃ３、ＴＰ−３Ｄ３、ＴＰ−３Ｅ１、ＴＰ−３Ｆ１、ＴＰ
−３Ｆ２、ＴＰ−３Ｇ１、ＴＰ−３Ｇ３、ＴＰ−３Ｈ２、ＴＰ−４Ａ７、ＴＰ−４Ａ９、
ＴＰ−４Ｂ７、ＴＰ−４Ｅ８、ＴＰ−４Ｇ８、またはＴＰ−４Ｈ８のＣＤＲ１、２および
／または３領域の正確なアミノ酸配列を含み得る。
【００４２】
しかしながら、当業者は、ＴＦＰＩに効率的に結合する抗体の能力を保持する、ＴＰ−
２Ａ２、ＴＰ−２Ａ５．１、ＴＰ−２Ａ６、ＴＰ−２Ａ８、ＴＰ−２Ａ１０、ＴＰ−２Ｂ
１、ＴＰ−２Ｂ３、ＴＰ−２Ｂ４、ＴＰ−２Ｂ８、ＴＰ−２Ｂ９、ＴＰ−２Ｃ１、ＴＰ−
２Ｃ７、ＴＰ−２Ｄ７、ＴＰ−２Ｅ３、ＴＰ−２Ｅ５、ＴＰ−２Ｆ９、ＴＰ−２Ｇ２、Ｔ
Ｐ−２Ｇ４、ＴＰ−２Ｇ５、ＴＰ−２Ｇ６、ＴＰ−２Ｇ７、ＴＰ−２Ｇ９、ＴＰ−２Ｈ１
０、ＴＰ−３Ａ２、ＴＰ−３Ａ３、ＴＰ−３Ａ４、ＴＰ−３Ｂ３、ＴＰ−３Ｂ４、ＴＰ−
３Ｃ１、ＴＰ−３Ｃ２、ＴＰ−３Ｃ３、ＴＰ−３Ｄ３、ＴＰ−３Ｅ１、ＴＰ−３Ｆ１、Ｔ
Ｐ−３Ｆ２、ＴＰ−３Ｇ１、ＴＰ−３Ｇ３、ＴＰ−３Ｈ２、ＴＰ−４Ａ７、ＴＰ−４Ａ９
、ＴＰ−４Ｂ７、ＴＰ−４Ｅ８、ＴＰ−４Ｇ８、またはＴＰ−４Ｈ８の正確なＣＤＲ配列
からのいくらかの逸脱物が可能であり得ることを十分に理解している。したがって、他の
態様において、改変抗体は、例えばＴＰ−２Ａ２、ＴＰ−２Ａ５．１、ＴＰ−２Ａ６、Ｔ
Ｐ−２Ａ８、ＴＰ−２Ａ１０、ＴＰ−２Ｂ１、ＴＰ−２Ｂ３、ＴＰ−２Ｂ４、ＴＰ−２Ｂ
８、ＴＰ−２Ｂ９、ＴＰ−２Ｃ１、ＴＰ−２Ｃ７、ＴＰ−２Ｄ７、ＴＰ−２Ｅ３、ＴＰ−
２Ｅ５、ＴＰ−２Ｆ９、ＴＰ−２Ｇ２、ＴＰ−２Ｇ４、ＴＰ−２Ｇ５、ＴＰ−２Ｇ６、Ｔ
Ｐ−２Ｇ７、ＴＰ−２Ｇ９、ＴＰ−２Ｈ１０、ＴＰ−３Ａ２、ＴＰ−３Ａ３、ＴＰ−３Ａ
４、ＴＰ−３Ｂ３、ＴＰ−３Ｂ４、ＴＰ−３Ｃ１、ＴＰ−３Ｃ２、ＴＰ−３Ｃ３、ＴＰ−
３Ｄ３、ＴＰ−３Ｅ１、ＴＰ−３Ｆ１、ＴＰ−３Ｆ２、ＴＰ−３Ｇ１、ＴＰ−３Ｇ３、Ｔ
Ｐ−３Ｈ２、ＴＰ−４Ａ７、ＴＰ−４Ａ９、ＴＰ−４Ｂ７、ＴＰ−４Ｅ８、ＴＰ−４Ｇ８
、またはＴＰ−４Ｈ８の１個またはそれ以上のＣＤＲと少なくとも９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％同一で
ある１個またはそれ以上のＣＤＲからなり得る。
【００４３】
抗体は、さまざまなクラスの抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４
、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体（これらに限
定されるものではない）のいずれかであり得る。
【００４４】
１つの態様において、ヒト組織因子経路インヒビターに対する単離完全ヒトモノクロー
ナル抗体が提供される。
【００４５】
他の態様において、ヒト組織因子経路インヒビターのＫｕｎｉｔｚドメイン２に対する
単離完全ヒトモノクローナル抗体が提供される。
【００４６】
核酸
上記のモノクローナル抗体のいずれかをコードする単離核酸分子がまた提供される。
【００４７】
ＴＦＰＩに対する抗体の製造法
モノクローナル抗体は、宿主細胞において本発明の態様によるモノクローナル抗体の可
変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させることにより組み換え的に産生され得る
。ヌクレオチド配列を含む核酸は、発現ベクターの助けを得て、製造のために適当な宿主
細胞に導入され、発現され得る。したがって、ヒトＴＦＰＩに結合するモノクローナル抗
体を製造する方法であって、下記工程：
（ａ）本発明のモノクローナル抗体をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する工程；
（ｂ）該宿主細胞を培養して、宿主細胞内においてモノクローナル抗体を発現させる工程
；（ｃ）産生されたモノクローナル抗体を単離および精製する工程
を含み、ここで、該核酸分子が本発明のモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配
列を含む、方法がまた提供される。
【００４８】
１つの例において、抗体またはその抗体断片を発現させるために、標準的な分子生物学
の技術により取得された部分もしくは全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡが発現ベク
ターに挿入され、その結果、遺伝子が転写および翻訳制御配列と操作可能に結合する。本
明細書において「操作可能に結合」なる用語は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が
抗体遺伝子の転写および翻訳を制御するというそれらの意図される機能を発揮するように
、抗体がベクターに連結されることを意味することが意図される。発現ベクターおよび発
現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子お
よび抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入されるか、またはより一般には、両遺伝子
は同じ発現ベクターに挿入され得る。抗体遺伝子は、標準的な方法により発現ベクターに
挿入される（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限酵素部位の連結、ま
たは制限酵素部位が存在しない場合における平滑末端連結）。本明細書に記載される抗体
の軽鎖および重鎖可変領域を用いて、望まれるアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領
域をすでにコードする発現ベクターにそれらを挿入することにより、任意の抗体アイソタ
イプの全長抗体遺伝子を作製することができ、その結果、ＶＨ断片は、ベクター内のＣＨ
断片と操作可能に結合し、ＶＬ断片は、クター内のＣＬ断片と操作可能に結合する。さら
にあるいは、組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体の分泌を促進するシグナルペ
プチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端
とインフレームで結合するように、ベクターにクローン化され得る。シグナルペプチドは
、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロ
ブリンタンパク質に由来するシグナルペプチド）であり得る。
【００４９】
抗体鎖をコードする遺伝子に加えて、本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞にお
ける抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を有し得る。「制御配列」なる用語は、抗体
鎖遺伝子の転写もしくは翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御
エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような制
御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。
制御配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、望まれる
タンパク質発現のレベルなどのような要因に依存し得ることが当業者により理解される。
哺乳類宿主細胞発現のための制御配列の例は、哺乳類細胞における高レベルのタンパク質
発現を志向するウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミア
ンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモ
ーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハ
ンサーを含む。あるいは、非ウイルス制御配列、例えば、ユビキチンプロモーターまたは
β−グロビンプロモーターが使用され得る。
【００５０】
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、組み換え発現ベクターは、さらなる配列、例え
ば、宿主細胞内でのベクターの複製を制御する配列（例えば、複製開始点）および選択可
能マーカー遺伝子を有し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細
胞の選択を促進する（例えば、Ａｘｅｌ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第４，３９９，２
１６号、第４，６３４，６６５号および第５，１７９，０１７号を参照のこと）。例えば
、一般に、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞において、薬剤、
例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートに対する耐性を付与する。
選択可能マーカー遺伝子の例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキ
サート選択／増幅を用いたｄｈｆｒ−宿主細胞での使用のために）を含む。
【００５１】
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターが、標準的
な技術により宿主細胞に導入される。「導入」なる用語のさまざまな形態は、外因性ＤＮ
Ａの原核もしくは真核宿主細胞への導入のために通常使用される広範な技術、例えば、エ
レクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン導入などを包含
することが意図される。原核もしくは真核宿主細胞内で本発明の抗体を発現させることが
理論上は可能であるが、真核細胞、および最も好ましくは哺乳類宿主細胞における抗体の
発現が、そのような真核細胞、および特定の哺乳類細胞が原核細胞と比較した場合に、適
当に折り畳まれ、免疫学的に活性な抗体を構築および分泌する可能性が高いために最も好
ましい。
【００５２】
組み換え抗体を発現させるための哺乳類宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．  Ｎａ
ｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されたｄｈｆ
ｒ−  ＣＨＯ細胞を含み、ＤＨＦＲ選択可能マーカー、例えば、Ｒ．  Ｊ．  Ｋａｕｆｍ
ａｎ  ａｎｄ  Ｐ．  Ａ．  Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５９：６
０１−６２１に記載されたものと共に使用される）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、Ｈ
ＫＢ１１細胞およびＳＰ２細胞を含む。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが
哺乳類宿主細胞に導入されると、抗体は、宿主細胞内での抗体の発現または宿主細胞が増
殖している培養培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な時間、宿主細胞を培養する
ことにより産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法、例えば、限外ろ過、サイズ
排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび遠心分離を用いて、培養
培地から回収され得る。
【００５３】
インタクト抗体を発現させるための部分抗体配列の使用
抗体は、主に、６個の重鎖および軽鎖ＣＤＲに位置するアミノ酸残基を介して標的抗原
と相互作用する。このために、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも個
々の抗体間で多様性がある。例えば、本発明によるモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖
可変部の各々におけるＣＤＲ領域が同定されている、図６および７を参照のこと。ＣＤＲ
配列は、多くの抗体−抗原相互作用に関与しているので、異なる特性を有する異なる抗体
に由来するフレームワーク配列に移植された特定の天然で生じる抗体に由来するＣＤＲ配
列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然で生じる抗体の特性を模倣した
組み換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，  Ｌ．  ｅ
ｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ，  Ｐ
．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；およびＱｕ
ｅｅｎ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  
Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６：１００２９−１００３３を参照のこと）。そのようなフ
レームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公のＤＮＡデータベースから取
得され得る。これらの生殖細胞系列配列は、それらが完全に集合した可変遺伝子を含んで
いない（Ｂ細胞成熟の間にＶ（Ｄ）Ｊ連結（ｊｏｉｎｉｎｇ）により形成される）ために
、成熟した抗体遺伝子配列とは異なる。元の抗体と同様の結合特性を有するインタクト組
み換え抗体を再構築するために、特定の抗体の全ＤＮＡ配列を取得することは必要ではな
い（ＷＯ  ９９／４５９６２を参照）。ＣＤＲ領域にわたる部分的な重鎖および軽鎖配列
は、一般にこの目的のために十分である。部分的配列は、どの生殖細胞系列可変および連
結遺伝子断片が組み換え抗体可変遺伝子に関与するかを決定するために使用される。次い
で、生殖細胞系列配列は、可変領域の欠損部分を埋めるために使用される。重鎖および軽
鎖リーダー配列は、タンパク質成熟の間に切断され、最終的な抗体の特性に関与しない。
したがって、発現構築体のために対応する生殖細胞系列リーダー配列を使用する必要があ
る。欠損配列を付加するために、クローン化ｃＤＮＡ配列が、連結またはＰＣＲ増幅によ
り合成オリゴヌクレオチドと組み合わされ得る。あるいは、全可変領域は、一組の短い重
複オリゴヌクレオチドとして合成され、ＰＣＲ増幅により組み合わされ、全体の合成可変
領域クローンが作製され得る。この工程は、特定の制限酵素部位の排除もしくは包含、ま
たは特定のコドンの最適化のような特定の利点を有する。
【００５４】
重鎖および軽鎖転写産物のヌクレオチド配列は、重複する一組の合成オリゴヌクレオチ
ドを設計するために使用され、天然の配列と同一のアミノ酸をコードする能力を有する合
成Ｖ配列が作製される。合成重鎖およびκ鎖配列は、下記の３つの点で天然の配列とは異
なり得る：繰り返しヌクレオチド塩基のストリングがオリゴヌクレオチド合成およびＰＣ
Ｒ増幅を促進するために遮断される；最適な翻訳開始部位がＫｏｚａｋルール（Ｋｏｚａ
ｋ，  １９９１，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：１９８６７−１９８７０）
にしたがって組み込まれる；およびＨｉｎｄＩＩＩ部位が翻訳開始部位の上流で改変され
る。
【００５５】
重鎖および軽鎖可変領域について、最適なコード鎖配列および対応する非コード鎖配列
は、対応する非コードオリゴヌクレオチドのほぼ真ん中で３０−５０ヌクレオチド切片に
切断される。したがって、各鎖について、オリゴヌクレオチドは、１５０−４００ヌクレ
オチドの断片にわたる重複二本鎖セットに構築され得る。次いで、該プールは、鋳型とし
て使用され、１５０−４００ヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物が産生される。一般に、単一
の可変領域オリゴヌクレオチドセットは、２つのプールに分割され、それは、別々に増幅
され、２個の重複ＰＣＲ産物が産生される。次いで、これらの重複産物は、ＰＣＲ増幅に
より組み合わされ、完全な可変領域が形成される。発現ベクター構築体に容易にクローン
化され得る断片を作製するために、ＰＣＲ増幅において重鎖または軽鎖定常領域の重複断
片を含むことがまた望ましくあり得る。
【００５６】
次いで、再構築された重鎖および軽鎖可変領域は、クローン化プロモーター配列、翻訳
開始配列、定常領域配列、３’非翻訳領域配列、ポリアデニル化配列、および転写終結配
列と組み合わされ、発現ベクター構築体が形成される。重鎖および軽鎖発現構築体は、単
一ベクターにおいて組み合わされ、宿主細胞に共導入、連続導入、または別々に導入され
、次いで、誘導され、両鎖を発現する宿主細胞が形成される。
【００５７】
したがって、他の局面において、ヒト抗ＴＦＰＩ抗体、例えば、ＴＰ２Ａ８、ＴＰ２Ｇ
６、ＴＰ２Ｇ７、ＴＰ４Ｂ７などの構造的特徴は、ＴＦＰＩに結合する機能を保持する、
構造的に関連するヒト抗ＴＦＰＩ抗体を作製するために使用される。とりわけ、本発明の
モノクローナル抗体の特に同定された重鎖および軽鎖領域の１個またはそれ以上のＣＤＲ
を既知のヒトフレームワーク領域およびＣＤＲと組み換え的に結合させることができ、さ
らに組み換え的に改変された本発明のヒト抗ＴＦＰＩ抗体を作製し得る。
【００５８】
したがって、他の態様において、抗ＴＦＰＩ抗体を製造する方法であって、下記：（１
）ヒト重鎖フレームワーク領域およびヒト重鎖ＣＤＲ（ここで、ヒト重鎖ＣＤＲ３は、配
列番号３８８−４３０のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む）および／また
は（２）ヒト軽鎖フレームワーク領域およびヒト軽鎖ＣＤＲ（ここで、軽鎖ＣＤＲ３は、
配列番号２５９−３０１のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む）を含む抗体
（ここで、該抗体は、ＴＦＰＩに結合する能力を保持する）を製造することを含む、方法
が提供される。他の態様において、該方法は、本発明の他のＣＤＲを用いて実施される。
【００５９】
医薬組成物
治療上有効量の抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体および薬学的に許容される担体を含む医
薬組成物がまた提供される。「薬学的に許容される担体」は、製剤化を補助するか、もし
くは製剤を安定させるために有効成分に加えられ得て、患者に対して顕著な副作用毒性効
果を生じない物質である。そのような担体の例は、当業者に既知であり、水、糖、例えば
、マルトースもしくはスクロース、アルブミン、塩、例えば、塩化ナトリウムなどを含む
。他の担体は、例えば、Ｅ．  Ｗ．  ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。そのような組成物は、
治療上有効量の少なくとも１個の抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体を含み得る。
【００６０】
薬学的に許容される担体は、滅菌水性溶液もしくは分散剤および滅菌注射用溶液もしく
は分散剤の即時調製用滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のための該媒体および物質の
使用は、当分野において既知である。組成物は、好ましくは、非経腸投与のために製剤化
される。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度のた
めに適当な他の秩序構造として製剤化され得る。担体は、例えば水、エタノール、ポリオ
ール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど
）およびその適当な混合物を含む溶媒もしくは分散媒体であり得る。ある場合において、
それは、組成物中に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソル
ビトール、または塩化ナトリウムを含み得る。
【００６１】
滅菌注射用溶液は、活性化合物を上記で列挙された１個またはそれ以上の成分の組み合
わせを含む適当な溶媒に必要とされる用量で組み込み、その後、フィルター滅菌を行うこ
とにより製造され得る。一般に、分散剤は、活性化合物を、必須の分散剤媒体および上記
で列挙された必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことにより製造される
。滅菌注射用溶液の製造のための滅菌粉末の場合において、製造法のいくつかは、真空乾
燥および凍結乾燥技術であり、それらは、上記のその滅菌ろ過溶液からの有効成分と任意
のさらに望まれる成分の粉末を産生する。
【００６２】
医薬的使用
モノクローナル抗体は、先天的および後天的な血液凝固欠乏もしくは欠損を処置するた
めの治療目的で使用され得る。例えば、上記の態様におけるモノクローナル抗体は、ＴＦ
ＰＩとＦＸａの相互作用を妨害するか、またはＴＦ／ＦＶＩＩａ活性のＴＦＰＩ依存的阻
害を妨害するために使用され得る。さらに、モノクローナル抗体はまた、ＦＸａのＴＦ／
ＦＶＩＩａ誘導産生を回復させ、ＦＸａのＦＶＩＩＩもしくはＦＩＸ依存的増幅の不十分
性をバイパスするために使用され得る。
【００６３】
モノクローナル抗体は、止血障害、例えば、血小板減少症、血小板障害および出血障害
（例えば、血友病Ａおよび血友病Ｂ）の処置における治療的使用を有する。そのような障
害は、治療上有効量の抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体をそれを必要とする患者に投与する
ことにより処置され得る。モノクローナル抗体はまた、外傷および脳卒中のような適応症
における制御不能な出血の処置における治療的使用を有する。したがって、治療上有効量
の本発明の抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体をそれを必要とする患者に投与することを含む
、出血時間を短縮させるための方法がまた提供される。
【００６４】
抗体は、止血障害に取り組むべく、単剤療法として、または他の治療と組み合わせて使
用され得る。例えば、本発明の１個またはそれ以上の抗体と第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ
因子または第ＩＸ因子のような血液凝固因子の共投与は、血友病を処置するために有用で
あると考えられる。１つの態様において、（ａ）ヒト組織因子経路インヒビターに結合す
る第１量のモノクローナル抗体および（ｂ）第２量の第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を
投与することを含む、先天的および後天的な血液凝固欠乏もしくは欠損を処置する方法で
あって、該第１量および第２量が共に該欠乏もしくは欠損を処置するのに有効である、方
法が提供される。他の態様において、（ａ）ヒト組織因子経路インヒビターに結合する第
１量のモノクローナル抗体および（ｂ）第２量の第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を投与
することを含む、先天的および後天的な血液凝固欠乏もしくは欠損を処置する方法であっ
て、該第１量および第２量が共に該欠乏もしくは欠損を処置するのに有効であり、さらに
第ＶＩＩ因子が共投与されない、方法が提供される。本発明はまた、治療上有効量の本発
明ののモノクローナル抗体および第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の組み合わせを含むが
、第ＶＩＩ因子を含まない、医薬組成物を含む。「第ＶＩＩ因子」は、第ＶＩＩ因子およ
び第ＶＩＩａ因子を含む。これらの組み合わせ治療は、血液凝固因子の必要な点滴頻度を
減少させ得る。共投与または組み合わせ治療は、各々別々に製剤化されるか、または１つ
の組成物中に共に製剤化される２個の治療剤の投与を意味し、別々に製剤化された場合に
は、ほぼ同じ時間点または異なる時間点で投与されるが、同じ治療期間である。
【００６５】
医薬組成物は、出血エピソードの重篤度と共に変わり得るか、または予防的治療の場合
においては、患者の血液凝固欠損の重篤度と共に変わり得る用量および頻度で、血友病Ａ
もしくはＢを患う対象に非経腸で投与され得る。
【００６６】
組成物は、それを必要とする患者に、ボーラス投与として、または持続点滴により投与
され得る。例えば、Ｆａｂ断片として存在する本発明の抗体のボーラス投与は、０．００
２５から１００  ｍｇ／ｋｇ体重、０．０２５から０．２５  ｍｇ／ｋｇ、０．０１０か
ら０．１０  ｍｇ／ｋｇまたは０．１０−０．５０  ｍｇ／ｋｇの量であり得る。持続点
滴について、Ｆａｂ断片として存在する本発明の抗体は、１−２４時間、１−１２時間、
２−１２時間、６−１２時間、２−８時間、または１−２時間の間、０．００１から１０
０  ｍｇ／ｋｇ体重／分、０．０１２５から１．２５  ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０から
０．７５  ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０から１．０  ｍｇ／ｋｇ／分、または０．１０−
０．５０  ｍｇ／ｋｇ／分で投与され得る。全長抗体（全長定常領域を有する）として存
在する本発明の抗体の投与について、投与量は、約１−１０  ｍｇ／ｋｇ体重、２−８  
ｍｇ／ｋｇ、または５−６  ｍｇ／ｋｇであり得る。そのような全長抗体は、一般に、３
０分から３時間延長した点滴により投与され得る。投与の頻度は、状態の重篤度に依存し
得る。頻度は、週に３回から２もしくは３週毎に１回の範囲内であり得る。
【００６７】
さらに、組成物は、皮下注射により患者に投与され得る。例えば、１０から１００  ｍ
ｇの抗ＴＦＰＩ抗体の用量が、週１回、２週間に１回、または月１回、皮下注射により患
者に投与され得る。
【００６８】
本明細書で使用される「治療上有効量」は、それを必要とする患者にインビボでの血液
凝固時間を有効に増大させるか、またはインビボで測定可能な利益を生じるのに必要であ
る抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体または該抗体と第ＶＩＩＩ因子もしくは第ＩＸ因子の組
み合わせの量を意味する。正確な量は、治療組成物の構成要素および物理的特性、意図さ
れる患者集団、個々の患者の考慮事項などを含むがこれらに限定されない多くの要因に依
存し、当業者により容易に決定され得る。
【実施例】
【００６９】
実施例
一般的な材料および方法
実施例１．  ヒトＴＦＰＩに対するヒト抗体ライブラリーのパニングおよびスクリーニン
グ
ＴＦＰＩに対するヒト抗体ライブラリーのパニング
ヒトＴＦＰＩ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）に対するファージディス
プレイコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーＨｕＣａｌ  Ｇｏｌｄ（Ｒｏｔｈｅ  ｅｔ
ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２００８，  ３７６：１１８２−１２００
）をパニングすることにより、抗ＴＦＰＩ抗体を選択した。要約すると、９６ウェルＭａ
ｘｉｓｏｒｐプレートを、４℃で一晩、２００  μｌのＴＦＰＩ（５  μｇ／ｍｌ）で被
覆し、次いで、プレートを、５％  ミルクを含むＰＢＳバッファーでブロックした。０．
０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）でプレートを洗浄した後、コンビナ
トリアルヒト抗体ライブラリーのアリコートをＴＦＰＩで被覆されたウェルに加え、２時
間インキュベートした。非結合ファージをＰＢＳＴで洗い流し、抗原結合ファージをジチ
オスレイトールで溶出し、Ｅ．  ｃｏｌｉ株ＴＧ１に感染させ、増幅させた。次回のパニ
ングのために、ヘルパーファージによりファージをレスキューした。全３回のパニングを
行い、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、最後の２回からのクローンをヒトＴＦＰＩに対して
スクリーニングした。
【００７０】
ＥＬＩＳＡでの抗原結合による抗体クローンのスクリーニング
ヒトＴＦＰＩに結合する抗体クローンを選択するために、２回目および３回目のパニン
グからのファージクローンのＦａｂ遺伝子を細菌発現ベクターにサブクローン化し、Ｅ．
ｃｏｌｉ株ＴＧ１において発現させた。細菌溶解物をヒトＴＦＰＩ被覆化Ｍａｘｉｓｏ
ｒｐプレートのウェルに加えた。洗浄後、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＦａｂを検出抗体として
使用し、過酸化水素を含むＡｍｐｌｅｘＲｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えることに
より、プレートを発現させた。バックグラウンドよりも少なくとも５倍以上高いシグナル
を陽性として考えた。抗ヒトＴＦＰＩ抗体のマウスＴＦＰＩに対する交差反応を、同様の
マウスＴＦＰＩ結合ＥＬＩＳＡにより決定した。プレートをマウスＴＦＰＩ（Ｒ＆Ｄ  Ｓ
ｙｓｔｅｍ）、ＢＳＡおよびリゾチームで被覆した。最後の２個の抗原（ＢＳＡおよびリ
ゾチーム）をネガティブコントロールとして使用した。代表的な一組のデータを図１に示
す。
【００７１】
抗ＴＦＰＩヒト抗体の配列
ＴＦＰＩに対するＨｕＣａｌ  Ｇｏｌｄヒト抗体ライブラリーのパニングおよびスクリ
ーニング後、ＤＮＡ塩基配列決定を陽性抗体クローンについて行い、４４個の特定の抗体
配列を生じた（表２）。これらの抗体配列の内、２９個がλ軽鎖であり、１５個がκ軽鎖
であった。重鎖可変領域の我々の解析は、２８個のＶＨ３、１４個のＶＨ６、１個のＶＨ
１および１個のＶＨ５を示す。
【００７２】
表２．  ４４個の抗ＴＦＰＩ抗体の可変領域のペプチド配列
【表３】
2018038398.tif 000004
【００７３】
【表４】
2018038398.tif 000005
【００７４】
【表５】
2018038398.tif 000006
【００７５】
【表６】
2018038398.tif 000007
【００７６】
【表７】
2018038398.tif 000008
【００７７】
【表８】
2018038398.tif 000009
【００７８】
【表９】
2018038398.tif 000010
【００７９】
【表１０】
2018038398.tif 000011
【００８０】
【表１１】
2018038398.tif 000012
【００８１】
マウスＴＦＰＩに対する交差反応
上記４４個のヒトＴＦＰＩ結合クローンをまた、ＥＬＩＳＡによりマウスＴＦＰＩへの
結合について試験した。１９個の抗体について、マウスＴＦＰＩに対する交差反応が見出
された。マウス血友病モデルを用いた試験を容易にするために、我々はさらに、これらの
１９個の抗体およびヒトＴＦＰＩに特異的な５個の抗体を特徴づけた。代表的な一組のデ
ータを図１に示す。これらの抗体のいずれもがＥＬＩＳＡにおいてＢＳＡまたはリゾチー
ムに結合しなかった。
【００８２】
実施例２．  抗ＴＦＰＩ抗体の発現および精製
抗ＴＦＰＩ抗体（Ｆａｂ断片として）を細菌株ＴＧ１において発現させ、精製した。要
約すると、抗体発現プラスミドを含む細菌株ＴＧ１の単一コロニーを取り出し、３４  μ
ｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールおよび１％  グルコースの存在下、８  ｍｌの２ｘＹＴ
培地で一晩増殖させた。７  ｍｌ容量の培養物を、３４  μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコ
ールおよび０．１％  グルコースを含む２５０  ｍｌの新鮮な２ｘＹＴ培地に移した。イ
ンキュベーションの３時間後、Ｆａｂ発現を誘導するために、０．５  ｍＭ  ＩＰＴＧを
加えた。培養を、２５℃で一晩、継続した。培養物を遠心分離し、細菌細胞を沈殿させた
。次いで、沈殿物をＢｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ溶解バッファー（Ｎｏｖａｇｅｎ）に再懸濁し
た。遠心分離後、細菌溶解物の上清をろ過した。製造者の指示にしたがって、Ｎｉ−ＮＴ
Ａカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を介して、Ｆａｂ断片を親和性精製した。
【００８３】
実施例３．  抗ＴＦＰＩ抗体のＥＣ５０および結合親和性の決定
精製化Ｆａｂ抗体を用いて、抗ＴＦＰＩ抗体のヒトもしくはマウスＴＦＰＩに対するＥ
Ｃ５０を決定した。上記と同様に、ＥＣ５０をＥＬＩＳＡにより評価した。ＳｏｆｔＭａ
ｘを用いて、結果を解析した。抗ＴＦＰＩ抗体の結合親和性をＢｉａｃｏｒｅアッセイに
おいて決定した。要約すると、抗原（すなわち、ヒトもしくはマウスＴＦＰＩ）を、製造
者の指示にしたがって、アミンカップリングキット（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）を用
いてＣＭ５−チップに固定した。固定化ＴＦＰＩの量を、約３００  ＲＵを提供する抗原
量に調整した。抗体Ｆａｂを移動相において解析し、精製化抗体の少なくとも５個の異な
る濃度（０．１、０．４、１．６、６．４および２５  ｎＭ）をＢｉａｃｏｒｅアッセイ
において使用した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用
いて、動力学および結合親和性を計算した。
【００８４】
表３で示されるとおり、２４個の抗ＴＦＰＩ  Ｆａｂは、ヒトＴＦＰＩ（０．０９から
７９２  ｎＭ）およびマウスＴＦＰＩ（０．０６から１０３５  ｎＭ）に対するさまざま
なＥＣ５０を示し、したがって、Ｂｉａｃｏｒｅにより決定された親和性は、ヒトＴＦＰ
Ｉに対してさまざまであった（１．２５から１１４０  ｎＭ）。マウスＴＦＰＩに対する
ＦａｂのＢｉａｃｏｒｅ試験において、親和性のバリエーションはより小さかった（３．
０８から５１．８  ｎＭ）。
【００８５】
表３．  ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅにより決定されたヒトもしくはマウスＴＦＰＩ
に対する２４個の抗体の結合活性（ｈＴＦＰＩ：ヒトＴＦＰＩ；ｍＴＦＰＩ：マウスＴＦ
ＰＩ；Ｎｅｇ：シグナルは、バックグラウンドの２倍未満であった；ＮＤ：実施なし）
【表１２】
2018038398.tif 000013
【００８６】
実施例４．  抗ＴＦＰＩ  ＦａｂのＩｇＧへの変換
同定されたすべての抗ＴＦＰＩ抗体は完全ヒトＦａｂであり、それは、治療剤としてヒ
トＩｇＧに適当に変換され得る。しかしながら、この実施例にいて、選択されたＦａｂを
、マウスモデルにおける試験のためにより適当なマウスＩｇＧ定常領域を含むキメラ抗体
に変換した。選択された抗体の可変領域を、マウス定常領域を含む哺乳類発現ベクターに
移植した。次いで、完全集合ＩｇＧ分子をＨＫＢ１１細胞に導入して、発現させた（Ｍｅ
ｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２００６，  ３４：１６５
−１７８）。培養物上清を回収して、濃縮した。製造者の指示にしたがって、Ｈｉｔｒａ
ｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を介して、抗ＴＦＰＩ  
ＩｇＧ分子を親和性精製した。
【００８７】
実施例５．  抗ＴＦＰＩ中和抗体の選択
抗ＴＦＰＩ中和抗体を、３個の実験条件下でのＴＦＰＩ活性の阻害に基づいて選択した
。ＴＦＰＩの活性を、ＡＣＴＩＣＨＲＯＭＥ（登録商標）ＴＦＰＩ活性アッセイ（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｉｎｃ．，  Ｓｔａｍｆｏｒｄ，  ＣＴ）（すな
わち、第Ｘ因子を活性化して第Ｘａ因子にするＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体の触媒活性を阻害
するＴＦＰＩの能力を測定するための三段階発色アッセイ）を用いて測定した。抗ＴＦＰ
Ｉ抗体の中和活性は、回復したＦＸａ産生量に比例する。最初の設定において、精製化抗
ＴＦＰＩ抗体を、示された濃度でヒトもしくはマウス組み換えＴＦＰＩ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓ
ｔｅｍ）と共にインキュベートした。インキュベーション後、サンプルをＴＦ／ＦＶＩＩ
ａおよびＦＸと混合し、次いで、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体の残余活性を、高度に特異的な
ｆＸａ発色基質であるＳＰＥＣＴＲＯＺＹＭＥ（登録商標）ＦＸａを用いて測定した。こ
の基質は、該アッセイにおいて産生されるＦＸａによってのみ切断され、ｐ−ニトロアニ
リン（ｐＮＡ）発色団を放出し、それを４０５  ｎｍで測定した。サンプル中に存在する
ＴＦＰＩ活性を、既知のＴＦＰＩ活性レベルを用いて構築された標準曲線から補間した。
アッセイをエンドポイント様式で行った。他の２個の設定において、抗ＴＦＰＩ抗体を正
常なヒト血漿もしくは血友病Ａ血漿にスパイクし、回復したＦＸａ産生を測定した。
【００８８】
実施例６．  抗ＴＦＰＩ抗体は、希釈プロトロンビン時間（ｄＰＴ）アッセイにおいて血
液凝固時間を短縮する
本質的にＷｅｌｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．，  １９９
１，  ６４（２）：２１３−２２２に記載されたとおり、ｄＰＴアッセイを行った。要約
すると、ヒト正常血漿（ＦＡＣＴ，  Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）
、ヒトＴＦＰＩ欠損血漿（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）または血友病Ａ
血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を、血漿と０．１当量のコント
ロールバッファーまたは抗ＴＦＰＩ抗体を混合することにより調整した。２５℃で３０分
間のインキュベーション後、血漿サンプル（１００  μｌ）を、トロンボプラスチンの起
源として２００  μｌの適当に希釈された（１：５００希釈）Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ（Ｂ
ｉｏｍｅｔｉｅｕｘ）と組み合わせて、ｆｉｂｒｏｍｅｔｅｒ  ＳＴＡ４（Ｓｔａｇｏ）
を用いて血液凝固時間を決定した。ＰＢＳまたは０．１  Ｍ  塩化ナトリウム、０．１％
ウシ血清アルブミンおよび２０  μＭ  塩化カルシウムを含む０．０５  Ｍ  Ｔｒｉｓ
に基づくバッファー（ｐＨ  ７．５）で、トロンボプラスチンを希釈した。
【００８９】
実施例７．  抗ＴＦＰＩ抗体単独または抗ＴＦＰＩ抗体と組み換え第ＶＩＩＩ因子もしく
は第ＩＸ因子の組み合わせは、ＲＯＴＥＭアッセイにおいて血液凝固時間を短縮する
ＲＯＴＥＭシステム（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ  ＧｍｂＨ）は、４チャンネル装置、コン
ピューター、血漿標準物、アクチベーターならびに使い捨てカップおよびピン（ｃｕｐｓ
ａｎｄ  ｐｉｎｓ）を含んでいた。ＲＯＴＥＭ止血システムのトロンボエラストグラフ
ィパラメーターは、下記を含んでいた：血液凝固を開始するための反応時間を反映する血
液凝固時間（ＣＴ）（データ収集の開始後、２  ｍｍの振幅を得るために必要とされる時
間）；血液凝固増幅を反映する血栓形成時間（ＣＦＴ）およびα角、ならびに血栓の硬度
を反映する最大振幅および最大弾性係数。ＲＯＴＥＭアッセイにおいて、３００  μｌの
新鮮なクエン酸全血もしくは血漿を評価した。製造者の指示にしたがって、すべての構成
要素を再構成し、混合しつつ、各システムのために必要とされる期間の間、データを収集
した。要約すると、２０  μｌのＣａＣｌ２（２００  ｍｍｏｌ）を加えながら、３００
μｌの血液もしくは血漿を、自動ピペットを用いてＲＯＴＥＭカップ内で回収／分配す
る（ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ／ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ）ことにより、サンプルを混合し、
その直後にサンプルを混合し、データ収集を開始した。コンピューター制御（ソフトウェ
ア２．９６版）ＲＯＴＥＭシステムを用いて、データを２時間収集した。
【００９０】
血液凝固時間の短縮における抗ＴＦＰＩ抗体の効果を検出するためのＲＯＴＥＭアッセ
イの例示的な結果を図３および５に示す。図３は、ＴＰ−２Ａ８−Ｆａｂを単独で、また
は組み換えＦＶＩＩＩと組み合わせた場合に、ヒト血友病Ａ血漿またはマウス血友病Ａ全
血における血液凝固時間を短縮させることを示す（ＲＯＴＥＭシステムをＮＡＴＥＭで開
始させた）。図５は、ＩｇＧ様式での抗ＴＦＰＩ抗体（ＴＰ−２Ａ８、ＴＰ−３Ｇ１およ
びＴＰ−３Ｃ２）がネガティブコントロールマウスＩｇＧ抗体と比較して血液凝固時間を
短縮したことを示す。これらの結果および当分野における理解に基づいて、当業者は、こ
れらの抗ＴＦＰＩ抗体と組み換えＦＩＸの組み合わせがまた、これらの抗体単独の場合と
比較して血液凝固時間を短縮させることを予測し得る。
【００９１】
実施例８．  抗ＴＦＰＩ抗体のインビトロ機能活性
ＴＦＰＩの機能妨害についてＴＦＰＩ抗体を調べるために、発色アッセイＡＣＴＩＣＨ
ＲＯＭＥおよび希釈プロトロンビン時間（ｄＰＴ）を用いて、パニングおよびスクリーニ
ングから得られた抗体の機能活性を試験した。両アッセイにおいて、モノクローナルラッ
ト抗ＴＦＰＩ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）をポジティブコントロールとして用い、ヒト
ポリクローナルＦａｂをネガティブコントロールとして用いた。発色アッセイにおいて、
８個の抗体は、ラットモノクローナル抗体と比較して５０％以上ＴＦＰＩ活性を阻害した
（表４）。ｄＰＴアッセイにおいて、これらの８個の抗ＴＦＰＩ  Ｆａｂのすべては、高
い阻害活性（８０秒未満まで血液凝固時間を短縮する）を示し、８個中４個のＦａｂは、
７０秒未満のｄＰＴを示した。ｄＰＴの短縮における４個の代表的なクローンの用量依存
性を図２に示す。しかしながら、低いＴＦＰＩ阻害活性を示すか、またはＴＦＰＩ阻害活
性を示さない他のヒト抗ＴＦＰＩ  Ｆａｂはまた、ｄＰＴにおける血液凝固時間を短縮し
た。例えば、ＴＰ−３Ｂ４およびＴＰ−２Ｃ７は、２５％未満の阻害活性を示すのみであ
ったが、７０秒未満までｄＰＴを短縮し得た。阻害性活性およびｄＰＴの単純な線形回帰
解析は、有意な相関を示す（ｐ＝０．００９５）が、大きな分散を有する（決定係数（Ｒ
ｓｑｕａｒｅ）＝０．２５８）。
【００９２】
表４．  ヒトＴＦＰＩアッセイおよびｄＰＴアッセイでの阻害活性により決定された抗Ｔ
ＦＰＩ抗体のインビトロ機能活性
【表１３】
2018038398.tif 000014
【００９３】
抗ＴＦＰＩ  Ｆａｂの中の一つであるＦａｂ−２Ａ８をまたＲＯＴＥＭアッセイにおい
て試験し、ここで、低いレベルの第ＶＩＩＩ因子を有するヒト血友病Ａ血漿またはマウス
血友病Ａ全血を使用した。図３に示されたとおり、ポリクローナルウサギ抗ＴＦＰＩ抗体
と比較すると、Ｆａｂ−２Ａ８は、ヒト血友病Ａ血漿において同様の活性を示し、２２０
０秒から約１７００秒まで血液凝固時間（ＣＴ）を減少させた。マウス血友病Ａ全血を使
用すると、コントロール抗体であるウサギ抗ＴＦＰＩは、２７００秒から１０００秒まで
ＣＴを短縮し、Ｆａｂ−２Ａ８は、２６５０秒から１７００秒までＣＴを短縮した。これ
らの結果は、Ｆａｂ−２Ａ８がヒト血漿およびマウス血液において血液凝固時間を有意に
短縮させ得ることを示す（ｐ＝０．０３）。
【００９４】
実施例９．  キメラＩｇＧへの変換後の抗ＴＦＰＩ抗体の機能
第Ｘａ因子産生および希釈プロトロンビン時間のインビトロアッセイは、２４個の抗Ｔ
ＦＰＩ  Ｆａｂ、ＴＰ−２Ａ８、ＴＰ−２Ｂ３、ＴＰ−２Ｇ６、ＴＰ−３Ｃ２、ＴＰ−３
Ｇ１およびＴＰ−４Ｂ７のうちの少なくとも６個がＴＦＰＩ機能を妨害し得ることを示す
。血友病Ａマウスを用いたインビボ試験を容易にするために、我々は、マウスＩｇＧ１ア
イソタイプを用いてこれらの６個の抗ＴＦＰＩヒトＦａｂキメラＩｇＧに変換した。Ｉｇ
Ｇ発現ベクターをＨＫＢ１１細胞に導入し、発現した抗体を培養上清において回収し、Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラムで精製した。代表的なクローンである２Ｇ６−ＦａｂをＩｇＧに
変換すると、２Ｇ６−ＩｇＧは、ヒトＴＦＰＩに結合するＥＣ５０の２倍の増加（０．４
８  ｎＭから０．２２  ｎＭ）およびマウスＴＦＰＩに結合するＥＣ５０のの１０倍の増
加（５．１８  ｎＭから０．５１  ｎＭ）を示した。ヒトおよびマウスＴＦＰＩに結合す
るＩｇＧ−２Ｇ６の結果を図４に示す。
【００９５】
実施例１０．  血友病Ａ（ＨｅｍＡ）マウス尾静脈切断モデルにおける生存率についての
効果
薬理学的評価のために、マウス尾静脈切断モデルを確立した。このモデルは、正常な個
体と重篤な血友病の間で観察される広範囲にわたる出血表現型をシュミレートする。これ
らの試験のために、血友病Ａ雄マウス（８週齢、２０から２６  ｇ）を用いた。尾静脈投
与により、損傷前に、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体（４０  μｇ／マウス）を単独で、
または血液凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩ（０．１  ＩＵ／マウス）と共にマウスに投与
した。投与の２４時間後に、先端から２．７  ｍｍの位置で（直径で）、左尾静脈を切断
した。切断後２４時間にわたって、生存を観察した。組み換えＦＶＩＩＩと共に提供され
ると、生存率は、用量依存的であることが示された（データは示していない）。図８で示
されるデータは、別々の試験からのものであった（各々、ｎ＝１５およびｎ＝１０）。結
果は、ＴＰ−２Ａ８−ＩｇＧが、コントロールマウスＩｇＧと比較して血友病Ａマウスの
生存率を有意に延長させ、組み換えＦＶＩＩＩと組み合わされた場合には、薬剤単独の場
合と比較して改善された生存率を示すことを示した。
【００９６】
実施例１１．  抗ＴＦＰＩ抗体と組み換え第ＶＩＩａ因子の組み合わせはさらに、血液凝
固時間および血栓形成時間を短縮した
抗ＴＦＰＩ抗体および組み換えＦＶＩＩａ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）の組み合わせ
効果を、ＥＸＴＥＭ（１：１０００希釈）およびマウス血友病Ａ全血を用いて、ＲＯＴＥ
Ｍシステムにより評価した。示された量の抗ＴＦＰＩ抗体、ＴＰ−２Ａ８−ＩｇＧ（「２
Ａ８」）、および組み換えＦＶＩＩａ（「ＦＶＩＩａ」）を３００  μｌのクエン酸マウ
ス血友病Ａ全血に加えて、ＥＸＴＥＭシステムにより血液凝固を開始させた。図９は、Ｔ
Ｐ−２Ａ８−ＩｇＧまたは組み換えＦＶＩＩａのマウス血友病Ａ全血への添加が、それぞ
れ血液凝固時間および血栓形成時間を短縮させることを示す。ＴＰ−２Ａ８−ＩｇＧおよ
び組み換えＦＶＩＩａ（「２Ａ８  ＋  ＦＶＩＩａ」）の組み合わせはさらに、血液凝固
時間および血栓形成時間を短縮させ、これは、抗ＴＦＰＩ抗体と組み換えＦＶＩＩａの組
み合わせがインヒビターを有するか、もしくは有さない血友病患者の処置において有用で
あることを示す。
【００９７】
実施例１２．  抗ＴＦＰＩ抗体は、ＦＶＩＩＩインヒビター誘導ヒト血友病血液における
血液凝固時間を短縮した
非血友病患者から採取された全血において血友病を誘導する中和ＦＶＩＩＩ抗体を用い
たＲＯＴＥＭアッセイで、選択された抗ＴＦＰＩ抗体である２Ａ８および４Ｂ７をまた試
験した。図１０は、正常なヒト血液が約１０００秒の血液凝固時間を有することを示す。
ＦＶＩＩＩ中和抗体（ＰＡＨ，  １００  μｇ／ｍＬ）の存在下において、血液凝固時間
は、約５２００秒まで延長された。延長された血液凝固時間は、抗ＴＦＰＩ抗体である２
Ａ８または４Ｂ７の添加により有意に短縮され、これは、抗ＴＦＰＩ抗体がインヒビター
を有する血友病患者の処置において有用であることを示す。
【００９８】
実施例１３．  阻害性抗ＴＦＰＩ抗体は、ヒトＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメイン２に結合
する
ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡを用いて、阻害性抗体がＴＦＰＩのどのドメイン
に結合するかを決定した。組み換え全長ヒトＴＦＰＩもしくはＴＦＰＩドメインをこれら
の試験のために使用した。実施例３と同様の方法でＥＬＩＳＡを行った。ウエスタンブロ
ットにおいて、ヒトＴＦＰＩもしくはドメインを、４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤ
Ｓ  ＰＡＧＥランニングバッファーＭＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ
，  ＣＡ）に流し、次いで、セルロース膜に移した。阻害性抗体と共に１０分間インキュ
ベーションした後、ＳＮＡＰｉｄシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ
，  ＭＡ）を用いて膜を３回洗浄した。１から１０，０００希釈でのＨＲＰ結合ロバ抗マ
ウス抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）を膜と共に１０分間インキュベ
ートした。同様の洗浄工程後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ基質（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋ
ｆｏｒｄ，  ＩＬ  ）を用いて、膜を発現させた。コントロール抗Ｋｕｎｉｔｚドメイン
１抗体は、全長ＴＦＰＩ、切断型ＴＦＰＩおよびドメインに結合するが、阻害性抗ＴＦＰ
Ｉ抗体は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２を含むＴＦＰＩにのみ結合する。これは、Ｋｕｎｉｔ
ｚドメイン２への結合が抗体の阻害性作用のために必要であることを示す。
【００９９】
表５．  ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡにより決定された抗体が結合するドメイン
【表１４】
2018038398.tif 000015
【０１００】
本発明は、特定の態様および実施例に関して記載されているが、さまざまな修飾および
変化が可能であり、本発明の真の精神および範囲から離れることなく同等物が置換され得
るものと理解されるべきである。したがって、明細書および実施例は、限定的な意味では
なく例示的なものとして捉えられるべきである。さらに、本明細書に記載されたすべての
記事、書籍、特許出願および特許は、引用により本明細書の一部とする。
【図１】
2018038398.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月4日(2017.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に特異的に結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体であって、
ａ）重鎖可変領域であって
Ｆ２７、Ｔ２８、Ｆ２９、Ｙ３２およびＭ３４を含むＣＤＲ１領域、
Ｉ５１、Ｓ５６、Ｙ５９、Ｄ６２、Ｓ６３、Ｖ６４およびＧ６６を含むＣＤＲ２領域、および
Ｄ１０５を含むＣＤＲ３領域を含み、
ここで、重鎖可変領域のアミノ酸番号は、配列番号１６におけるものに対応する重鎖可変領域、並びに、
ｂ）軽鎖可変領域であって
Ｓ２６、Ｑ２７、Ｙ３７およびＬ３８を含むＣＤＲ１領域、
Ｓ５７およびＳ６１を含むＣＤＲ２領域、および
Ｑ９５、Ｐ１００およびＴ１０２を含むＣＤＲ３領域を含み、
ここで、軽鎖可変領域のアミノ酸番号は、配列番号１５８におけるものに対応する軽鎖可変領域を含む、前記単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項２】
ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）アッセイによる決定において、１１４０ｎＭ以下の結合親和性でＴＦＰＩに結合する、請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項３】
ＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメイン２に結合する、請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項４】
ＴＦＰＩの単離されたＫｕｎｉｔｚドメイン１には結合しない、請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項５】
ＴＦＰＩ活性を阻害することができる、請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項６】
ＴＦＰＩ活性の５０％超を阻害することができる、請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項７】
出血時間を短縮することができる、請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項８】
軽鎖可変領域が配列番号１５８と少なくとも約８０％の相同性を有する、請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項９】
ＩｇＧ抗体である、請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項１０】
ａ）重鎖可変領域がＦＴＦＲＳＹＧＭＳのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域であって、ここで、１、２または３つのアミノ酸が置換されていてもよいＣＤＲ１領域を含み、および、
ｂ）軽鎖可変領域がＲＳＳＱＳＬＶＦＳＤＧＮＴＹＬＮのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域であって、ここで、１、２、３または４つのアミノ酸が置換されていてもよいＣＤＲ１領域を含む、請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項１１】
ヒト組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に特異的に結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体であって、
ａ）重鎖可変領域であって
Ｆ２７、Ｔ２８、Ｆ２９、Ｓ３０、Ｙ３２、Ａ３３、Ｍ３４およびＳ３５を含むＣＤＲ１領域、
Ｔ５０、Ｉ５１、Ｓ５２、Ｓ５４、Ｇ５５、Ｓ５６、Ｙ５９、Ｄ６２、Ｓ６３、Ｖ６４およびＧ６６を含むＣＤＲ２領域、および
Ｄ１０５を含むＣＤＲ３領域を含み、
ここで、重鎖可変領域のアミノ酸番号は、配列番号１６におけるものに対応する重鎖可変領域、並びに、
ｂ）軽鎖可変領域であって
Ｓ２５、Ｓ２６、Ｑ２７、Ｓ２８、Ｌ２９、Ｓ３２、Ｄ３３、Ｇ３４、Ｔ３６、Ｙ３７、Ｌ３８およびＮ３９を含むＣＤＲ１領域、
Ｓ５７、Ｌ５９およびＳ６１を含むＣＤＲ２領域、および
Ｑ９５、Ｐ１００およびＴ１０２を含むＣＤＲ３領域を含み、
ここで、軽鎖可変領域のアミノ酸番号は、配列番号１５８におけるものに対応する軽鎖可変領域を含む、前記単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項１２】
請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
血友病Ａまたは血友病Ｂを治療するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
出血時間を短縮するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
皮下投与経路にて投与される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
約１０ｍｇから約１００ｍｇの用量にて投与される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
週毎、隔週毎または、月毎に投与される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載のヒトモノクローナル抗体をコードする核酸。
【請求項１９】
（ｉ）請求項１８に記載の核酸分子を宿主細胞に導入する工程、および
（ｉｉ）該宿主細胞を培養して、モノクローナル抗体を発現させる工程
を含む、ヒトモノクローナル抗体を製造する方法。