(57)【要約】【課題】カロテノイド類の製造効率に優れ、かつ安全性の高いスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）の提供。【解決手段】トマトを発酵させたときの発酵物における菌体あたりの総カロテノイドの含有量が、０．５ｍｇ／ｇ菌体以上であるスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）である。前記スポリジオボラス・パラロゼウスが、スポリジオボラス・パラロゼウス受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２３６である態様が好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トマトを発酵させたときの発酵物における菌体あたりの総カロテノイドの含有量が、０．５ｍｇ／ｇ菌体以上であることを特徴とするスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）。
【請求項２】
スポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２３６である請求項１に記載のスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）。
【請求項３】
請求項１から２のいずれかに記載のスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項４】
リコペン含有物の発酵物であり、総カロテノイドの含有量が０．００１ｍｇ／ｇ以上である請求項３に記載の飲食品。
【請求項５】
請求項１から２のいずれかに記載のスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）を用いてリコペン含有物を発酵させ、総カロテノイドの含有量が０．００１ｍｇ／ｇ以上である飲食品を得ることを特徴とする飲食品の製造方法。
【請求項６】
請求項１から２のいずれかに記載のスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）を含有することを特徴とする皮膚化粧料。
【請求項７】
請求項１から２のいずれかに記載のスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）を用いてリコペン含有物を発酵させ、総カロテノイドの含有量が０．００１ｍｇ／ｇ以上である皮膚化粧料を得ることを特徴とする皮膚化粧料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カロテノイド類の製造効率に優れる新菌株であるスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）、並びに前記スポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）を含む、飲食品、飲食品の製造方法、皮膚化粧料、及び皮膚化粧料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カロテノイドは、天然に存在する色素成分の総称であり、活性酸素を捕捉して抗酸化作用を示す。特に、植物由来のルテイン及び藻類由来のアスタキサンチンは、眼病疾患改善や皮膚のＵＶ防護作用が明らかになり、我が国でも需要量が伸びている。しかし、原料の大部分は中国等からの輸入に依存しており、低コストで自給するには、代替品の活用、及び効率的生産法の開発が技術的課題として挙げられている。
微生物、特に一部の酵母は、カロテノイド類を合成し、細胞内に蓄積することが知られている。β−カロテン等を含むカロテノイド類の混合物は、ＵＶ照射後の皮膚の紅斑を減少させることが知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
前記カロテノイド類の発酵生産法として、酵母の一種、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）を培養し、培養菌体からβ-カロテンやトルラロジン等を含むカロテノイド類を採取する方法が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
しかしながら、前記カロテノイド類の発酵生産法では、バブリングによる通気培養を行うことにより、総カロテノイドの収量を０．０４ｍｇ／Ｌ培地まで高めることができるが、収量が低く、効率が良い方法ではなかった。
【０００４】
したがって、カロテノイド類の製造効率に優れ、かつ安全性の高いカロテノイド類の製造方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０００−５１１９２３号公報
【特許文献２】特開平６−２７７０９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、カロテノイド類の製造効率に優れ、かつ安全性の高いスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）を提供することを目的とする。
また、本発明は、カロテノイド類を高濃度で含有し、かつ安全性の高いスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）を含む飲食品、及び前記飲食品の製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、カロテノイド類を高濃度で含有し、かつ安全性の高いスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）を含む皮膚化粧料、及び前記皮膚化粧料の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  トマトを発酵させたときの発酵物における菌体あたりの総カロテノイドの含有量が、０．５ｍｇ／ｇ菌体以上であることを特徴とするスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）である。
＜２＞  スポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２３６である前記＜１＞に記載のスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）である。
＜３＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）を含有することを特徴とする飲食品である。
＜４＞  リコペン含有物の発酵物であり、総カロテノイドの含有量が０．００１ｍｇ／ｇ以上である前記＜３＞に記載の飲食品である。
＜５＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）を用いてリコペン含有物を発酵させ、総カロテノイドの含有量が０．００１ｍｇ／ｇ以上である飲食品を得ることを特徴とする飲食品の製造方法である。
＜６＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）を含有することを特徴とする皮膚化粧料である。
＜７＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）を用いてリコペン含有物を発酵させ、総カロテノイドの含有量が０．００１ｍｇ／ｇ以上である皮膚化粧料を得ることを特徴とする皮膚化粧料の製造方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、カロテノイド類の製造効率に優れ、かつ安全性の高いスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）の新菌株、並びにカロテノイド類を高濃度で含有し、かつ安全性の高い前記スポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）を含む飲食品、及び皮膚化粧料、並びに前記スポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）を用いることにより、カロテノイド類を高濃度で含有し、かつ安全性の高い飲食品の製造方法、及び皮膚化粧料の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（スポリジオボラス・パラロゼウスの新菌株）
本発明のスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）は、トマトを発酵させたときの発酵物における菌体あたりの総カロテノイドの含有量が、０．５ｍｇ／ｇ菌体以上である。
ここで、「トマトを発酵させたときの発酵物」は、トマトとしてトマトペーストを滅菌水により５倍希釈したもの（１００ｍＬ）、及び前培養したスポリジオボラス・パラロゼウスを用い、２５℃、２００ｒｐｍで振盪した条件で、４８時間培養して発酵させることにより得ることができる。
また、総カロテノイドの含有量は、カロテノイド類の含有量の総量を意味し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの公知の方法により測定することができ、例えば、測定装置名：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）により測定することができる。
【００１０】
本発明のスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）は、本発明者らが鋭意検討した結果、得られた新菌株ＴＹＣ−２１９０株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター  特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に２０１６年４月１３日付けで寄託されており、その受託番号は、ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２３６（受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２２３６）である。また、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構においても保有しており、許諾手続きを経て分譲可能である。
【００１１】
本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスは、カロテノイド類の製造効率に優れ、カロテノイド類を高濃度で製造することができる。
前記カロテノイド類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、γ−カロテン、トルレン、トルラロジン、リコペン、Δ−カロテン、ルテイン、β−カロテン、アスタキサンチン、フコキサンチンなどが挙げられる。
前記γ−カロテン、トルレン、トルラロジン、Δ−カロテン、ルテイン、β−カロテン、及びアスタキサンチンは、前記リコペンから生合成されることが知られているが、本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスは、リコペン含有物を発酵させることにより、前記カロテノイド類を高濃度で含有する発酵物を得ることができる。
なお、本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスは、本発明者らが、カロテノイドの代替原料として酵母に着目し、カロテノイド類を高濃度生産する酵母の選抜と効率的な発酵生産技術の開発を行い、鋭意検討した結果、得られた知見に基づくものであり、本発明者ら自らブドウから分離した酵母である。
本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスは、食品から分離した酵母であり、安全性が高く、また、カロテノイド類を高濃度で製造することができるため、カロテノイド類を高濃度で含有する飲食品、皮膚化粧料に好適である。
また、前記カロテノイド類は、前記スポリジオボラス・パラロゼウスの新菌株を用いてリコペン含有物を発酵させて得られた発酵物から、抽出、精製等をすることにより、前記スポリジオボラス・パラロゼウスの新菌株と分離した状態で得ることができ、分離したカロテノイド類を飲食品、皮膚化粧料等に利用してもよい。
【００１２】
本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスは、スポリジオボラス属に属する酵母の一種であり、カロテノイド類を産生し、菌体内に蓄積することが知られている。
本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスは、上述の通り、トマトを発酵させたときの発酵物における前記スポリジオボラス・パラロゼウスの菌体あたりの総カロテノイドの含有量が、０．５ｍｇ／ｇ菌体以上であることを指標として選択することができる。
本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスを培養する場合、使用できる培地としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の酵母培養培地の中から適宜選択することができ、また、培養条件としては、特に制限はなく、目的に公知の酵母培養条件の中から適宜選択することができる。
【００１３】
（飲食品）
本発明の飲食品は、本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスを少なくとも含有し、総カロテノイドの含有量が０．００１ｍｇ／ｇ以上であることが好ましく、更に必要に応じてその他の成分を含む。
【００１４】
前記飲食品における、本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスの含有量としては、特に制限は無く、用途等に応じて適宜選択することができ、カロテノイド類を製造するのに十分な量であってもよいし、カロテノイド類を製造した後の前記スポリジオボラス・パラロゼウスが残存するのみであってもよい。
前記飲食品に含有される本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスとしては、生菌であってもよく、殺菌された状態であってもよい。
前記飲食品に本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスが含有されていることを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１８Ｓ  ｒＲＮＡと５．８Ｓ  ｒＲＮＡ間のスペーサー領域（ＩＴＳ１）、及び２６Ｓ  ｒＲＮＡと５Ｓ  ｒＲＮＡ間のスペーサー領域（ＩＧＳ１）をＰＣＲ増幅後、シークエンス解析を行う方法などが挙げられる。
【００１５】
前記飲食品においては、本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスが製造するカロテノイド類が熱に安定であり、オートクレーブ滅菌処理等を行っても安定なので、滅菌処理等の加熱処理を行うことが必要な飲食品であってもよく、前記飲食品の具体例としては、各種乳製品、各種パン、うどん等の麺類、各種惣菜、菓子類、ジュース等の清涼飲料、酒類、弁当類などが挙げられる。前記飲食品には、前記飲食品の原料、材料のほかに、目的に応じて適宜選択した、公知の食品添加物、調味料、着色料、保存料などのその他の成分を含有していてもよい。前記飲食品は、カロテノイド類を高濃度で含有し、かつ安全性の高い点で、カロテノイド類を含有する健康食品、機能性表示食品などの飲食品としての用途に好適である。
前記飲食品においては、本発明のスポリジオボラス・パラロゼウス以外に、本発明の効果を害しない範囲内で他の公知の食用菌を含んでいてもよいが、全菌が本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスであることが好ましい。
前記飲食品中に本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスを含有させる方法としては、特に制限はなく、前記飲食品の種類、目的等に応じて適宜選択することができる。
【００１６】
前記カロテノイド類の前記飲食品における菌体あたりの含有量としては、特に制限は無く、用途等に応じて適宜選択することができるが、高含有量であることが好ましく、総カロテノイドの含有量で０．０５ｍｇ／ｇ菌体以上が好ましく、０．１ｍｇ／ｇ菌体以上がより好ましく、０．５ｍｇ／ｇ菌体以上が特に好ましい。
前記総カロテノイドの前記飲食品における含有量としては、特に制限は無く、用途等に応じて適宜選択することができるが、高含有量であることが好ましく、０．００１ｍｇ／ｇ以上が好ましく、０．００４ｍｇ／ｇ以上がより好ましく、０．０１ｍｇ／ｇ以上が特に好ましい。
前記飲食品としては、リコペン含有物の発酵物であり、総カロテノイドの含有量が０．００１ｍｇ／ｇ以上であることが好ましい。
【００１７】
（飲食品の製造方法）
本発明の飲食品の製造方法は、本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスを用いてリコペン含有物を発酵させ、総カロテノイドの含有量が０．００１ｍｇ／ｇ以上である飲食品を得ることを含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
【００１８】
前記飲食品の原材料としては、飲食に適する材料であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスの菌体における生合成により、カロテノイド類を高濃度で製造できる。これらの中でも、カロテノイド類の製造効率を向上させる点で、カロテノイド類の生合成の原料（中間体）であるリコペンを含有する、リコペン含有物であることが好ましい。
前記リコペン含有物としては、リコペンを含むものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トマト、スイカ、柿、ピンクグレープフルーツなどが挙げられる。
前記リコペン含有物におけるリコペン含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００５ｍｇ／ｇ以上が好ましく、０．０１ｍｇ／ｇ以上がより好ましく、０．０５ｍｇ／ｇ以上が特に好ましい。
【００１９】
前記飲食品の製造方法に使用する本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスの生菌数としては、カロテノイド類を生合成することができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記飲食品の製造方法に使用する本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前培養により調製したものが挙げられる。前記前培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜公知の酵母の培養方法を選択することができ、例えば、酵母完全培地（ＹＰＤ培地）を用いて培養する方法などが挙げられる。
【００２０】
前記リコペン含有物を発酵させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記リコペン含有物に本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスを添加し、２５℃〜３５℃、２４時間〜９６時間、２００ｒｐｍ〜３００ｒｐｍの条件で振盪培養することにより実施することができる。
【００２１】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜飲食品の製造における各種工程を選択することができ、例えば、滅菌工程、濃縮工程、乾燥工程などが挙げられる。
【００２２】
前記滅菌工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜飲食品の製造における公知の滅菌工程を選択することができ、例えば、加熱滅菌、濾過滅菌などが挙げられる。
前記濃縮工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜飲食品の製造における公知の濃縮工程を選択することができ、例えば、遠心濃縮、膜濃縮などが挙げられる。
前記乾燥工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜飲食品の製造における公知の乾燥工程を選択することができ、例えば、凍結乾燥、減圧乾燥などが挙げられる。
【００２３】
（皮膚化粧料）
本発明の皮膚化粧料は、本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスを少なくとも含有し、総カロテノイドの含有量が０．００１ｍｇ／ｇ以上であり、必要に応じてその他の成分を含む。
前記皮膚化粧料については、前記飲食品について記載した事項を目的に応じて適宜選択することができる。
【００２４】
（皮膚化粧料の製造方法）
本発明の皮膚化粧料の製造方法は、本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスを用いてリコペン含有物を発酵させ、総カロテノイドの含有量が０．００１ｍｇ／ｇ以上である皮膚化粧料を得ることを含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
前記皮膚化粧料の製造方法については、前記飲食品の製造方法について記載した事項を目的に応じて適宜選択することができる。
【００２５】
＜用途＞
本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスは、カロテノイド類の製造効率に優れ、かつ安全性が高いため、カロテノイド類を高濃度で含有し、かつ安全性の高いスポリジオボラス・パラロゼウスを含む飲食品、及び皮膚化粧料に好適に利用できる。
本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスは、安全性に優れ、優れたＳＯＤ様作用、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用、メラニン産生抑制作用、ＶＩＩ型コラーゲン産生促進作用、ラミニン−５産生促進作用、エラスチン産生促進作用、皮膚角化細胞増殖促進作用、及びグルタチオン産生促進作用を有するため、スーパーオキサイド消去剤、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制剤、メラニン産生抑制剤、ＶＩＩ型コラーゲン産生促進剤、ラミニン−５産生促進剤、エラスチン産生促進剤、皮膚角化細胞増殖促進剤、及びグルタチオン産生促進剤として利用可能である。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００２７】
スポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）の新菌株の分離
本発明のスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）ＴＹＣ−２１９０株（特許微生物寄託センターに寄託済、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２３６、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２２３６）を以下のようにして分離した。
即ち、採取したヤマブドウをＹＰＤ液体培地を用いて４８時間培養後、培養液の一部をクロラムフェニコール含有のＹＰＤ寒天プレートへ塗布し、５日間培養し酵母様のコロニーを選別した。単一コロニーを釣菌し、ＹＰＤ寒天プレートへ塗布、培養を繰り返すことで単一株を分離し、ＴＹＣ−２１９０株を得た。
得られたＴＹＣ−２１９０株のコロニー色調は、赤色であった。ＴＹＣ−２１９０株の１８Ｓ  ｒＲＮＡと５．８Ｓ  ｒＲＮＡ間のスペーサー領域（ＩＴＳ１）をＰＣＲ増幅後、シークエンス解析を行ったところ、スポリジオボラス・パラロゼウスの標準株（ＮＢＲＣ  ０３７６）と１００％一致したことから、スポリジオボラス・パラロゼウスと同定した。さらに、株レベルの同定の指標となるＩＧＳ１（２６Ｓ  ｒＲＮＡと５Ｓ  ｒＲＮＡ間のスペーサー領域）をＰＣＲ増幅後、シークエンス解析を行ったところ、標準株との相同性は９４．５７％であり、挿入や置換などの相違があった。また、ＮＣＢＩが管理する塩基配列データベース上において、ＴＹＣ−２１９０株のＩＧＳ１と完全に一致する配列は登録されていなかった。
【００２８】
（実施例１）
培地として下記組成の酵母完全培地（ＹＰＤ培地）１，０００ｍＬ、及びスポリジオボラス・パラロゼウスＴＹＣ−２１９０株として、少量のＹＰＤ培地を用いて前培養して得られたＴＹＣ−２１９０株を用い、２５℃、２００ｒｐｍで振盪した条件で、２日間培養して、実施例１の培養物を得た。
遠心分離（６，３００ｒｐｍ、１５分間）により得られた培養物から菌体を回収し、下記に示す測定方法により、菌体中の総カロテノイドの含有量を測定した。結果を表１に示す。
【００２９】
＜ＹＰＤ培地の組成＞
前記ＹＰＤ培地は、酵母エキス１０ｇ、ペプトン２０ｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１Ｌを用いて調製し、オートクレーブにて滅菌後に使用した。
【００３０】
＜総カロテノイドの含有量の測定方法＞
回収した菌体にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、超音波破砕機により菌体を破砕した。これをメンブランフィルターを用いて濾過した後、ＨＰＬＣを用いて下記の条件にてカロテノイド（トルラロジン、リコペン、トルレン、γ−カロテン、β−カロテン）の合計量を測定し、総カロテノイド量とした。
カラム：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｃｉｆｉｃ，Ｓｙｎｃｒｏｎｉｓ  Ｃ１８，１５０×４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．，５μｍ
カラム温度：３０℃
移動相：９０体積％アセトニトリル：酢酸エチル＝５０：５０（体積比）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
測定波長：４５０ｎｍ
サンプル溶解液：ジメチルスルホキシド
標準品溶解液：ブチル化ヒドロキシトルエン含有ｔ−ブチルメチルエーテル−メタノール混合液
【００３１】
（実施例２）
実施例１において、ＹＰＤ培地に代えてリコペン含有物としてのトマトを用いたこと以外は、実施例１と同様にして培養を行い、実施例２の発酵物を得た。
なお、トマトとしては、トマトペースト（商品名：カゴメトマトペーストＣＢ、カゴメ株式会社製、リコペン含有量０．５６ｍｇ／ｇ）を滅菌水により５倍希釈したものを用いた。
実施例１と同様にして菌体中の総カロテノイドの含有量を測定した結果を表１に示す。
【００３２】
（比較例１）
特許文献２（特開平６−２７７０９３号公報）の実施例２の結果を比較例１として表１に併記した。
【００３３】
【表１】
2018038345.tif 000002
【００３４】
下記の試験例１〜８に示す通り、抗酸化（活性酸素消去）作用の評価として、ＳＯＤ様作用試験（試験例１）を行い、抗炎症作用の評価として、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用試験（試験例２）を行い、美白作用の評価として、メラニン産生抑制作用試験（試験例３）を行い、抗老化作用の評価として、ＶＩＩ型コラーゲン産生促進作用試験（試験例４）、ラミニン−５産生促進作用試験（試験例５）、エラスチン産生促進作用試験（試験例６）、皮膚角化細胞増殖促進作用試験（試験例７）、及びグルタチオン産生促進作用試験（試験例８）を行った。
【００３５】
試験例１：スーパー・オキサイド・ディスムターゼ（ＳＯＤ）様作用試験
試験管に０．０５ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．２）２．４ｍＬ、３ｍｍｏｌ／Ｌキサンチン０．１ｍＬ、３ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ０．１ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン０．１ｍＬ、及び０．７５ｍｍｏｌ／Ｌニトロブルーテトラゾリウム０．１ｍＬを加え、これに被験試料溶液０．１ｍＬを添加し２５℃で１０分間放置した。キサンチンオキシダーゼ溶液０．１ｍＬを加え素早く攪拌し、２５℃で２０分間反応させた。その後、６ｍｍｏｌ／Ｌ塩化銅０．１ｍＬを加えて反応を停止させ、波長５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。同様の方法で空試験を行い補正した。
【００３６】
スーパーオキサイド消去率の計算方法は以下の通りである。
消去率（％）＝｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００
Ａ：被験試料溶液の波長５６０ｎｍにおける吸光度
Ｂ：被験試料溶液ブランクの波長５６０ｎｍにおける吸光度
Ｃ：コントロール溶液の波長５６０ｎｍにおける吸光度
Ｄ：コントロール溶液ブランクの波長５６０ｎｍにおける吸光度
【００３７】
【表２】
2018038345.tif 000003
【００３８】
試験例２：一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用試験
マウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）を１０体積％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、セルスクレーパーにより細胞を回収した。回収した細胞を３．０×１０６細胞／ｍＬの濃度になるように１０％ＦＢＳ含有フェノールレッド不含ダルベッコＭＥＭで希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００μＬずつ播種し、４時間培養した。培養終了後、培地を抜き、終濃度０．５体積％ＤＭＳＯを含む１０体積％ＦＢＳ含有フェノールレッド不含ダルベッコＭＥＭで溶解した被験試料を各ウェルに１００μＬ添加し、終濃度１μｇ／ｍＬで１０体積％ＦＢＳ含有フェノールレッド不含ダルベッコＭＥＭに溶解したリポポリサッカライド（ＬＰＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ０１１１；Ｂ４、ＤＩＦＣＯ社）を１００μＬ加え、４８時間培養した。ＮＯ産生量は亜硝酸イオン  （ＮＯ２−）量を指標に測定した。培養終了後、各ウェルの培養液に、同量のグリス試薬（１質量％スルファニルアミド、０．１質量％Ｎ−１−ｎａｐｈｔｈｙｌ  ｅｔｈｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｐｒｉｄｅ  ｉｎ  ５質量％リン酸溶液）を添加し、１０分間室温にて反応させた。反応後、波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。ＮＯ２−を指標として検量線を作製し、培養上清中のＮＯの産生量を求めた。
【００３９】
ＮＯ産生抑制率の計算方法は以下の通りである。
ＮＯ産生抑制率（％）＝｛（Ｂ−Ａ）／Ｂ｝×１００
Ａ：被験試料添加時のＮＯ量
Ｂ：被験試料無添加時のＮＯ量
【００４０】
【表３】
2018038345.tif 000004
【００４１】
試験例３：Ｂ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用試験
Ｂ１６メラノーマ細胞を１０体積％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１０体積％ＦＢＳ、及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭで２４．０×１０４細胞／ｍＬの濃度に希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェル当たり３００μＬずつ播種し、６時間培養した。培養終了後、１０体積％ＦＢＳ、及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭで溶解した被験試料を各ウェルに３００μＬ添加し、４日間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を取り除き、２ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ溶液２００μＬを添加して超音波破砕器により細胞を破壊し、波長４７５ｎｍにおける吸光度を測定した。測定した吸光度の値から、合成メラニンを用いて作成した検量線をもとにメラニン量を算出した。
【００４２】
また、細胞生存率の測定のため、同様に培養後、４００μＬのＰＢＳ（−）で洗浄し、終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬで１０体積％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解したニュートラルレッドを各ウェルに２００μＬ添加した。２．５時間培養した後、ニュートラルレッド溶液を捨て、エタノール・酢酸溶液（エタノール：酢酸：水＝５０：１：４９、体積比）を各ウェルに２００μＬ添加し、色素を抽出した。抽出後、波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。空試験として、１０体積％ＦＢＳ、及び１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭのみで培養した細胞を同様の方法で試験した。
【００４３】
メラニン産生抑制率、及び細胞生存率の計算方法は以下の通りである。
メラニン産生抑制率（％）＝｛１−（Ｂ／Ｄ）／（Ａ／Ｃ）｝×１００
細胞生存率（％）＝（Ｄ／Ｃ）×１００
Ａ：被験試料無添加におけるメラニン量
Ｂ：被験試料添加におけるメラニン量
Ｃ：被験試料無添加での５４０ｎｍにおける吸光度
Ｄ：被験試料添加での５４０ｎｍにおける吸光度
【００４４】
【表４】
2018038345.tif 000005
【００４５】
試験例４：ＶＩＩ型コラーゲン産生促進作用試験
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１×１０５細胞／ｍＬの濃度になるようにＢＰＥ無添加ＫＧＭ（ＫＧＭ−ＢＰＥ）で希釈した後、２４ウェルプレートに１ウェル当たり５００μＬずつ播種し、１日間培養した。培養終了後、培地を抜き、ＫＧＭ−ＢＰＥで溶解した被験試料を各ウェルに５００μＬ添加し、４８時間培養した。培養終了後、各ウェルの培地中のＶＩＩ型コラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００４６】
ＶＩＩ型コラーゲン産生促進率の計算方法は以下の通りである。
ＶＩＩ型コラーゲン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度
Ｂ：被験試料無添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度
【００４７】
【表５】
2018038345.tif 000006
【００４８】
試験例５：ラミニン−５産生促進作用試験
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を正常ヒト表皮角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１×１０５細胞／ｍＬの濃度になるようにＢＰＥ無添加ＫＧＭ（ＫＧＭ−ＢＰＥ）で希釈した後、２４ウェルプレートに１ウェル当たり５００μＬずつ播種し、１日間培養した。培養終了後、培地を抜き、ＫＧＭ−ＢＰＥで溶解した被験試料を各ウェルに５００μＬ添加し、４８時間培養した。培養終了後、各ウェルの培地中のラミニン−５量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００４９】
ラミニン−５産生促進率の計算方法は以下の通りである。
ラミニン−５産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度
Ｂ：被験試料無添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度
【００５０】
【表６】
2018038345.tif 000007
【００５１】
試験例６：エラスチン産生促進作用試験
ヒト正常線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０体積％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．２×１０５細胞／ｍＬの濃度に上記培地で希釈した後、９６ウェルマイクロプレートに１ウェル当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、０．２５体積％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解した被験試料を各ウェルに１５０μＬ添加し、５日間培養した。培養終了後、各ウェルの培養上清中のエラスチン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００５２】
エラスチン産生促進率の計算方法は以下の通りである。
エラスチン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時のエラスチン量
Ｂ：被験試料無添加時のエラスチン量
【００５３】
【表７】
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【００５４】
試験例７：皮膚線維芽細胞増殖促進作用試験
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０体積％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を７．０×１０４細胞／ｍＬの濃度に５体積％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、５体積％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで溶解した被験試料を各ウェルに１００μＬ添加し、３日間培養した。皮膚線維芽細胞増殖作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。培養終了後、培地を抜き、終濃度０．４ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（−）に溶解したＭＴＴを各ウェルに１００μＬずつ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール１００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。
【００５５】
皮膚線維芽細胞増殖促進率の計算方法は以下の通りである。
皮膚線維芽細胞増殖促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時の細胞でのブルーホルマザン生成量
Ｂ：被験試料無添加時の細胞でのブルーホルマザン生成量
【００５６】
【表８】
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【００５７】
試験例８：グルタチオン産生促進作用試験（線維芽細胞）
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０体積％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０５細胞／ｍＬの濃度に１０体積％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養後、１体積％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭで溶解した被験試料を各ウェルに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルから培地を抜き、４００μＬのＰＢＳ（−）にて洗浄後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ（登録商標、ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて細胞を溶解した。このうちの１００μＬを用いて総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＡＤＰＨ２５μＬ、及びグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度１７．５ｕｎｉｔ／ｍＬ）を加え３７℃で１０分間加温した後、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）２５μＬを加え、５分間後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は酸化型グルタチオンを用いて作成した検量線をもとに算出した。得られた値は総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式に従いグルタチオン産生促進率を算出した。
【００５８】
グルタチオン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料無添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量
Ｂ：被験試料添加時の細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量
【００５９】
【表９】
2018038345.tif 000010
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明のスポリジオボラス・パラロゼウスは、カロテノイド類の製造効率に優れ、かつ安全性が高いため、カロテノイド類を高濃度で含有し、かつ安全性の高いスポリジオボラス・パラロゼウスを含む飲食品、及び皮膚化粧料に好適に利用できる。
【受託番号】
【００６１】
ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２３６
【手続補正書】
【提出日】平成29年3月23日(2017.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トマトを発酵させたときの発酵物における菌体あたりの総カロテノイドの含有量が、０．５ｍｇ／ｇ菌体以上であり、スポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２３６であることを特徴とするスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）。
【請求項２】
請求項１に記載のスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項３】
リコペン含有物の発酵物であり、総カロテノイドの含有量が０．００１ｍｇ／ｇ以上である請求項２に記載の飲食品。
【請求項４】
請求項１に記載のスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）を用いてリコペン含有物を発酵させ、総カロテノイドの含有量が０．００１ｍｇ／ｇ以上である飲食品を得ることを特徴とする飲食品の製造方法。
【請求項５】
請求項１に記載のスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）を含有することを特徴とする皮膚化粧料。
【請求項６】
請求項１に記載のスポリジオボラス・パラロゼウス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｐａｒａｒｏｓｅｕｓ）を用いてリコペン含有物を発酵させ、総カロテノイドの含有量が０．００１ｍｇ／ｇ以上である皮膚化粧料を得ることを特徴とする皮膚化粧料の製造方法。