(57)【要約】【課題】  本発明は、抗トキソプラズマ剤として利用可能な物質を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、トリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートを有効成分とする抗トキソプラズマ剤に関する。本発明によれば、より優れた抗トキソプラズマ活性及び選択性を有し、宿主に対する安全性が高い抗トキソプラズマ剤を提供することができる。【選択図】図１
2018177663.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートを有効成分とする抗トキソプラズマ剤。
【請求項２】
金属ナノ粒子が金ナノ粒子又は銀ナノ粒子である、請求項１に記載の抗トキソプラズマ剤。
【請求項３】
トキソプラズマ原虫タキゾイトの増殖抑制剤である、請求項１又は２に記載の抗トキソプラズマ剤。
【請求項４】
トキソプラズマ原虫ブラディゾイトの駆除剤である、請求項１又は２に記載の抗トキソプラズマ剤。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の抗トキソプラズマ剤を含む、トキソプラズマ症の予防及び／又は治療のための医薬。
【請求項６】
急性感染期の、又は潜伏感染していたトキソプラズマ原虫の再活性化により再発したトキソプラズマ症の治療のための、請求項５に記載の医薬。
【請求項７】
トキソプラズマ原虫の再活性化によるトキソプラズマ症の再発を予防するための、請求項５に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートを有効成分とする抗トキソプラズマ剤及びこれを含む医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
トキソプラズマ症は、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）に感染した家畜の肉を加熱調理などが不十分な状態で食べること、又は終宿主であるネコの糞便に含まれるオーシストを経口摂取することなどにより引き起こされる人獣共通性の原虫感染症である。現在、全世界人口の約３割ほどが感染状態にあると推定されている。
【０００３】
トキソプラズマの終宿主はネコ科動物であるが、ヒト、家畜を含む全ての恒温動物は中間宿主となる。トキソプラズマに感染した中間宿主は、免疫系が健全であるときは症状を示さない、又は軽度な急性感染症状を示すに留まるが、感染したトキソプラズマ原虫は組織シストと呼ばれる安定な壁に覆われた構造の中で緩やかに増殖し、宿主免疫系による排除を回避しつつ宿主に感染し続ける。この時期の原虫はブラディゾイト（緩増虫体）と呼ばれる。一方、ＨＩＶ感染、臓器移植後その他の宿主免疫系の機能が低下した状態になるとトキソプラズマ原虫は再活性化し、視力障害、トキソプラズマ脳炎又は肺炎などを引き起こす。また、胎児が妊娠中の母体を通じて感染する先天性トキソプラズマ症は、流産、胎児の水頭症、失明、頭蓋内石灰化、神経系の発達障害などを引き起こす。
【０００４】
現在用いられている抗トキソプラズマ薬は、ピリメサミン、葉酸代謝経路を標的とするサルファ剤とピリメサミンとの合剤、タンパク質合成系を標的とするスピラマイシンなどである。しかし、上記抗トキソプラズマ薬は、増殖期の原虫（タキゾイト）を排除し得るが、ブラディゾイトに対する効果は限定的である。
【０００５】
一方、金属ナノ粒子は、比表面積が極めて大きく、バルク金属とは異なる物性を有することから、エレクトロニクス分野における利用に加え、医療分野における利用も検討されている。例えば、金ナノ粒子又は銀ナノ粒子が、抗微生物活性（非特許文献１）、抗リーシュマニア活性（非特許文献２）、選択的酵素阻害活性（非特許文献３）などを示すことが知られている。また、金属ナノ粒子、特に銀ナノ粒子が抗トキソプラズマ剤として利用可能であることも報告されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＭｕｂａｒａｋＡｌｉ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ  Ｂ  Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．２０１１，８５（２）：３６０−３６５
【非特許文献２】Ａｌｌａｈｖｅｒｄｉｙｅｖ  ＡＭ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１１，６：２７０５−２７１４
【非特許文献３】Ａｄｅｙｅｍｉ  ＯＳ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．２０１３，６２：４５０−４５６
【非特許文献４】Ａｄｅｙｅｍｉ  ＯＳ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１７，１２：１６４７−１６６１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、抗トキソプラズマ剤として利用可能な物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、アミノ酸の一種であるトリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートが、金属ナノ粒子よりも高い抗トキソプラズマ活性及び選択性を有していることを見い出し、以下の発明を完成させた。
【０００９】
（１）トリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートを有効成分とする抗トキソプラズマ剤。
（２）金属ナノ粒子が金ナノ粒子又は銀ナノ粒子である、（１）に記載の抗トキソプラズマ剤。
（３）トキソプラズマ原虫タキゾイトの増殖抑制剤である、（１）又は（２）に記載の抗トキソプラズマ剤。
（４）トキソプラズマ原虫ブラディゾイトの駆除剤である、（１）又は（２）に記載の抗トキソプラズマ剤。
（５）（１）から（４）のいずれかに記載の抗トキソプラズマ剤を含む、トキソプラズマ症の予防及び／又は治療のための医薬。
（６）急性感染期の、又は潜伏感染していたトキソプラズマ原虫の再活性化により再発したトキソプラズマ症の治療のための、（５）に記載の医薬。
（７）トキソプラズマ原虫の再活性化によるトキソプラズマ症の再発を予防するための、（５）に記載の医薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、金属ナノ粒子と比較して、より優れた抗トキソプラズマ活性及び選択性を有し、宿主に対して安全性が高い抗トキソプラズマ剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】トリプトファン、トリプトファンと金ナノ粒子とのコンジュゲート（ＡｕＮＰＴＲＰ）、トリプトファンと銀ナノ粒子とのコンジュゲート（ＡｇＮＰＴＲＰ）、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）及び銀ナノ粒子（ＡｇＮＰ）の波長２８０、２８５、２９０及び２９５ｎｍにおける蛍光を示すグラフである。
【図２】ＡｕＮＰＴＲＰ、ＡｇＮＰＴＲＰ及びトリプトファンのＦＴＩＲスペクトルである。
【図３】トリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートによるトキソプラズマ原虫の宿主細胞侵入阻害を示すグラフである。縦軸は、被験物質を加えないコントロールにおける原虫生存率を１００％としたときの、ＡｕＮＰＴＲＰ又はＡｇＮＰＴＲＰ添加時の原虫生存率である。
【図４】トリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートによるトキソプラズマ原虫の宿主細胞内増殖阻害を示すグラフである。縦軸は、被験物質を加えないコントロールにおける原虫生存率を１００％としたときの、ＡｕＮＰＴＲＰ又はＡｇＮＰＴＲＰ添加時の原虫生存率である。
【図５】トリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートによるトキソプラズマ原虫の宿主細胞内分裂阻止を示すグラフである。縦軸は、カウントした全寄生体胞数に対する所定数の虫体を含む寄生体胞数の割合である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の第１の態様は、トリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートを有効成分とする抗トキソプラズマ剤に関する。
【００１３】
本発明にいう抗トキソプラズマ剤とは、トキソプラズマ原虫の増殖抑制及び殺滅、宿主細胞への感染阻害、宿主組織からのトキソプラズマ原虫の駆除など、トキソプラズマ原虫の数及び／又はその活動の抑制、低減、停止などのために用いられる剤をいう。本発明の第一の態様にかかる抗トキソプラズマ剤は、トキソプラズマ原虫タキゾイトの増殖抑制及び／又はトキソプラズマ原虫ブラディゾイトの駆除のために、特にトキソプラズマ原虫タキゾイトの増殖抑制のために用いることができる。
【００１４】
本発明における金属ナノ粒子は、金属、好ましくは金又は銀よりなる、平均粒子径がナノメートルレベルの金属粒子である。金属ナノ粒子の平均粒子径は１〜１００ｎｍ、好ましくは１〜５０ｎｍである。以下、本発明において、金ナノ粒子をＡｕＮＰ、銀ナノ粒子をＡｇＮＰと表記する。なお、本発明における金属ナノ粒子には、一般的に微量の不純物として認識される程度の量の他の元素を含むものも包含される。
【００１５】
本発明におけるトリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートとは、トリプトファンと金属ナノ粒子との結合体であって、金属ナノ粒子表面のほぼ全体にわたってトリプトファン分子が結合しているものをいう。結合は、水素結合、ファンデルワールス結合いずれであってもよい。かかるコンジュゲートは、トリプトファンが表面に付着した金属ナノ粒子、トリプトファンで被覆された金属ナノ粒子、又はトリプトファンで表面修飾された金属ナノ粒子などと表すこともできる。本発明におけるトリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートの好ましい形態は、トリプトファンで表面が被覆された金属ナノ粒子である。
【００１６】
なお、本発明におけるトリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートには、金属ナノ粒子よりも高い抗トキソプラズマ活性を有するとの観点において、抗トキソプラズマ活性が実質的に変化しない微量のトリプトファン分子が金属ナノ粒子に結合したものや、ナノ粒子が有する特徴を失うような、例えばマイクロメートルレベルの厚さのトリプトファン被膜を有するものなどは包含されない。
【００１７】
アミノ酸と金属ナノ粒子とのコンジュゲートの製造方法は、例えばＤｕｂｅｙら（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ．２０１５，４７（１２）：２５５１−６０）、又はＺａｒｅら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３，９（９）：９５７−９６５）によって報告されており、トリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートもかかる方法に準じて製造することができる。具体的には、金属塩を還元して金属ナノ粒子を調製する際に、金属塩１モルに対して５〜１５モルのトリプトファンを共存させることで、本発明の第１の態様にかかるトリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートを製造することができる。
【００１８】
後の実施例に示すように、本発明の第１の態様にかかるトリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートは、金属ナノ粒子と比較して高い抗トキソプラズマ活性、すなわちトキソプラズマ原虫の宿主細胞への侵入を抑制する活性及び／又は宿主細胞内での増殖を抑制する活性を有する。また本発明の第１の態様にかかるトリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートは、金属ナノ粒子と比較して、宿主細胞に対する毒性（ＩＣ５０）と抗トキソプラズマ活性（ＥＣ５０）との比で表される選択指数（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ、ＳＩ、ＩＣ５０／ＥＣ５０）が高く、トキソプラズマに対して高い選択性を有する。
【００１９】
本発明の第１の態様にかかる抗トキソプラズマ剤は、トリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートを含む液体製剤、特に懸濁液製剤の形態にあることが好ましい。このような製剤は、トリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートの懸濁状態を損なわない限り、希釈剤、乳化剤、分散安定化剤、保存剤、ｐＨ調節剤などの液体製剤化用の添加物を含む組成物であってもよい。
【００２０】
本発明の第１の態様にかかる抗トキソプラズマ剤は、トキソプラズマ原虫に対して直接的に、又はトキソプラズマ原虫が感染した細胞に対して用いることができる。感染細胞に対して用いる場合、抗トキソプラズマ剤の濃度は、当該細胞に対する毒性を発揮しない程度に設定することが好ましい。
【００２１】
本発明の第２の態様は、第１の態様にかかる抗トキソプラズマ剤を含む、トキソプラズマ症の予防及び／又は治療のための医薬に関する。本発明との関連でトキソプラズマ症とは、トキソプラズマ原虫の感染、又は感染により引き起こされるあらゆる症状若しくは状態をいう。本発明の医薬は、かかる感染又はこれに伴う症状若しくは状態の治癒、寛解、改善、予防のために、恒温動物に投与することで使用される。
【００２２】
トキソプラズマ症の急性感染期には、タキゾイトが宿主細胞に侵入し、細胞内で増殖する。トキソプラズマ原虫はその後ブラディゾイトに変化して潜伏感染に移行するが、宿主免疫系の機能低下などにより再活性化され、再びタキゾイトに変化して細胞内での増殖を開始し、これがトキソプラズマ症の再発につながる。
【００２３】
本発明の第２の態様にかかる医薬はタキゾイトに対する増殖抑制効果を有することから、急性感染期の、又は潜伏感染していたトキソプラズマ原虫の再活性化により再発したトキソプラズマ症の治療のために用いることができる。また、本発明の第２の態様にかかる医薬は、宿主組織内でシストを形成して潜伏感染しているブラディゾイトに対する駆除効果も有すると期待される。したがって、本発明の第２の態様にかかる医薬は、トキソプラズマ原虫の再活性化によるトキソプラズマ症の再発を予防するために用いることもできる。
【００２４】
本発明の第２の態様にかかる医薬は、トキソプラズマ原虫に感染し得る全ての恒温動物を対象として適用することができる。そのような恒温動物の例としては、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、アヒルなどの鳥類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、サルその他の非ヒト哺乳動物及びヒトを挙げることができる。
【００２５】
本発明の第２の態様にかかる医薬の剤形としては、経口剤（錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤など）、注射剤、エアゾール剤などを挙げることができる。
【００２６】
錠剤、散剤、顆粒剤などの経口用固形製剤は、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、無水第２リン酸カルシウム、部分アルファ化デンプン、コーンスターチ及びアルギン酸などの賦形剤；単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、水及びエタノールなどの結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸、寒天末、デンプン、架橋ポリビニルピロリドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム及びデンプングリコール酸ナトリウムなどの崩壊剤；ステアリルアルコール、ステアリン酸、カカオバター及び水素添加油などの崩壊抑制剤；ケイ酸アルミニウム、リン酸水素カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、無水ケイ酸などの固結防止・付着防止剤；カルナバロウ、軽質無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム、硬化油、硬化植物油誘導体、胡麻油、サラシミツロウ、酸化チタン、乾燥水酸化アルミニウムゲル、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、リン酸水素カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びポリエチレングリコールなどの滑沢剤；第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム、尿素及び酵素などの吸収促進剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、無水ケイ酸、含水二酸化ケイ素、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム及びコロイド状ケイ酸などの吸収・吸着担体といった固形製剤化医薬用添加物を用い、常法に従い調製すればよい。
【００２７】
さらに錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、胃溶性被覆錠、腸溶性被覆錠及び水溶性フィルムコーティング錠とすることができる。
【００２８】
カプセル剤は、上記で例示した各種の医薬を、硬質ゼラチンカプセル及び軟質カプセルなどに充填して調製される。
【００２９】
また、溶剤、増量剤、等張化剤、溶解補助剤、乳化剤、懸濁化剤、増粘剤などの液体製剤化用添加物を用い、常法に従い調製して、水性又は油性の懸濁液、溶液、シロップ及びエリキシル剤とすることもできる。
【００３０】
注射剤は、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、クエン酸、酢酸、リン酸、乳酸、乳酸ナトリウム、硫酸及び水酸化ナトリウムなどの希釈剤；クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及びリン酸ナトリウムなどのｐＨ調整剤及び緩衝剤；ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸及びチオ乳酸などの安定化剤；食塩、ブドウ糖、マンニトール又はグリセリンなどの等張化剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロピレングリコール、安息香酸ナトリウム、安息香酸ベンジル、ウレタン、エタノールアミン、グリセリンなどの溶解補助剤；グルコン酸カルシウム、クロロブタノール、ブドウ糖、ベンジルアルコールなどの無痛化剤；及び局所麻酔剤などの液体製剤化用の医薬品添加物を用い、常法に従い調製すればよい。
【００３１】
本発明の第２の態様にかかる医薬の好ましい例は、トリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートを適当な溶媒、特に生理食塩水等のヒトを含む治療対象に投与可能な薬学的に許容される溶媒に懸濁した懸濁液製剤である。トリプトファンと金属ナノ粒子とのコンジュゲートの懸濁量は、溶媒１ｍＬあたり１〜１０００μｇ、好ましくは１〜１００μｇ、より好ましくは１〜１０μｇとすればよい。
【００３２】
本発明の第２の態様にかかる医薬の投与方法は特に限定されないが、製剤の形態に応じて適宜決定される。例えば、非経口製剤である場合は、血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与などを挙げることができる。好ましい実施形態の一つにおいて、本発明の第２の態様にかかる医薬は、経口投与、静脈内投与又は腹腔内投与により生体に投与される。
【００３３】
本発明の第２の態様にかかる医薬の投与量は、投与された対象において予防及び／又は治療効果を奏する量、すなわち有効量であればよい。有効量は対象となる動物の種類、症状の程度、ヒトにあっては患者の年齢、性別、疾患の形態その他の条件などに応じて適宜選択されるが、通常成人に対して体重１ｋｇあたり１０μｇ〜２０００μｇ、好ましくは５０μｇ〜１０００μｇ、より好ましくは１００μｇ〜５００μｇであり、これを１日に１回若しくは複数回に分けて、又は間歇的に投与することができる。
【００３４】
本発明の第３の態様は、第２の態様にかかる医薬の有効量を対象に投与することを含む、トキソプラズマ症を予防及び／又は治療する方法に関する。投与方法、投与形態及び投与量は、いずれも本発明の第２の態様にかかる医薬において説明したとおりである。
【００３５】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
実験材料
・試薬
硝酸銀（ＡｇＮＯ３）、塩化銀酸（ＨＡｕＣｌ４）、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アルギニンは、いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【００３７】
・細胞
ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ細胞）はＡＴＣＣから入手し、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）−Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭを用いて、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下でコンフルエントまで培養して使用した。
【００３８】
・トキソプラズマ原虫
潜伏感染型虫体に分化する能力が低く、バクテリア型β−ガラクトシダ−ゼを高発現する組換えトキソプラズマ原虫ＲＨ−２Ｆ株（ＡＴＣＣ５０８３９）を使用した。ＲＨ−２Ｆ株は、ＨＦＦ細胞の単層培養中で継代培養を行うことで維持した。ＲＨ−２Ｆ株が感染したＨＦＦ細胞を２７ゲージニードルに通して細胞を溶解した後、溶解液を５μｍのフィルターに通すことで、細胞残渣を含まないトキソプラズマ原虫タキゾイトの懸濁液を調製した。新たな培地で洗浄した後、原虫濃度を血球計を用いて測定した。また、懸濁液中のトキソプラズマ原虫タキゾイト数は、ＲＨ−２Ｆ株が発現するβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）活性を、Ｂｅｔａ−Ｇｌｏ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者のプロトコルに従って用いて測定することにより決定した。
【００３９】
データ解析
データは一元配置分散分析を用いて解析し（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）、平均値±標準誤差で表した。群間比較は一元配置分散分析及びその後のＤｕｎｎｅｔ検定により決定した。ｐ＜０．０５を有意差とした。
【００４０】
実施例１．アミノ酸と金属ナノ粒子とのコンジュゲートの調製
アミノ酸と金属ナノ粒子とのコンジュゲートは、既報の方法（Ｚａｒｅ  Ｄ．  ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３，９（９）：９５７−９６５；Ｄｕｂｅｙ  Ｋ．  ｅｔ．ａｌ．，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ．２０１５，４７（１２）：２５５１−６０）を少し改変して調製した。簡潔には、２５ｍＭのＬ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−アルギニンの溶液を、等量の５ｍＭ  ＨＡｕＣｌ４又はＡｇＮＯ３の溶液に温度５０〜６０℃で撹拌しながら加えた。色の変化が安定するまで撹拌を続け、濃赤色のアミノ酸−金ナノ粒子コンジュゲート（ＡｕＮＰＴＲＰ、ＡｕＮＰＴＹＲ、ＡｕＮＰＰＨＥ、ＡｕＮＰＡＲＧ）、又は淡黄色のアミノ酸−銀ナノ粒子コンジュゲート（ＡｇＮＰＴＲＰ、ＡｇＮＰＴＹＲ、ＡｇＮＰＡＲＧ）を得た。対照の金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）及び銀ナノ粒子（ＡｇＮＰ）は、アミノ酸溶液を加えずに上記反応を行うことにより調製した。
【００４１】
５，０００×ｇで１５分間の遠心分離及び孔径０．４５μｍのフィルターでのろ過により上記ナノ粒子を精製した後、ＵＶ／可視光吸光分析（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、蛍光分光分析（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ＨＴ７７００；Ｃｏｒｏｎａ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）、誘導結合プラズマ原子発光分析（島津製作所）、走査型電子顕微鏡観察（ＪＳＭ−７８００Ｆ；日本電子）、フーリエ変換型赤外線分光分析（ＦＴＩＲ；日立製作所）及び透過型電子顕微鏡観察（日立製作所）による分析を行った。いずれの分析結果も既報のアミノ酸−金属ナノ粒子コンジュゲート（Ｚａｒｅ  Ｄ．  ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３，９（９）：９５７−９６５；Ｄｕｂｅｙ  Ｋ．  ｅｔ．ａｌ．，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ．２０１５，４７（１２）：２５５１−６０；Ｓｉ  Ｓ．  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｅｕｒ  Ｊ．２００７，１３：３１６０−３１６８；Ｒａｔｉｖａ  Ｄ．  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃ．２００８，１８（６）：１１５１−１１５５）と一致していた。以上から、アミノ酸−金属ナノ粒子コンジュゲートが成功裏に調製されたことが確認された。
【００４２】
一例としてＡｕＮＰＴＲＰ及びＡｇＮＰＴＲＰの分析結果を図１及び図２に示す。ＡｕＮＰＴＲＰ及びＡｇＮＰＴＲＰでは、波長２８０〜２９５ｎｍにおいてトリプトファン由来の蛍光が検出され（図１）、また赤外吸収スペクトルによってもトリプトファンの存在が確認された（図２）。また、透過型電子顕微鏡観察により、ＡｕＮＰＴＲＰは直径３５〜４５ｎｍ程度、ＡｇＮＰＴＲＰは直径２〜１０ｎｍの球形であることが確認された。
【００４３】
実施例２．トリプトファン−金属ナノ粒子コンジュゲートの抗トキソプラズマ活性及び宿主細胞毒性の評価
（１）トキソプラズマ原虫の増殖阻害アッセイ
Ａｄｅｙｅｍｉら（Ａｄｅｙｅｍｉ  ＯＳ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１７，１２：１６４７−１６６１）の記載に従って行った。簡潔には、９６ウェルオプティカルボトムプレート（Ｎｕｎｃ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中でコンフルエントになるまで培養したＨＦＦ細胞の単層培養にタキゾイトの懸濁液を加え、１時間、感染させた。培地を除去して洗浄した後、新たな培地に懸濁したＡｕＮＰ、ＡｇＮＰ、各アミノ酸−金ナノ粒子コンジュゲート、各アミノ酸−銀ナノ粒子コンジュゲート又は対照薬剤（スルファジアジン、ピリメタミン）をそれぞれ終濃度０．０１〜１０００μｇ／ｍｌになるように加えて４８時間インキュベートした。被験物質の代わりに培地を加えた細胞のウェルをコントロールとし、培地のみのウェルをバックグラウンドシグナルの補正のために用いた。インキュベート後、β−ｇａｌ活性を測定することにより原虫の生存率を決定した。横軸に被験物質濃度を、縦軸に原虫生存率をプロットし、Ｐｒｉｓｍ  ５（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いて、非線形回帰分析により曲線に当てはめることでＥＣ５０を算出した。
【００４４】
（２）宿主細胞に対する細胞毒性アッセイ
コンフルエントになるまで培養したＨＦＦ細胞をトリプシン処理して回収し、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１×１０５個／ウェルとなるように播種して３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で７２時間インキュベートした。ＡｕＮＰ、ＡｇＮＰ、各アミノ酸−金ナノ粒子コンジュゲート、各アミノ酸−銀ナノ粒子コンジュゲート又は対照薬剤（スルファジアジン、ピリメタミン）をそれぞれ終濃度０．０１〜１０００μｇ／ｍｌになるように加えて、さらに７２時間インキュベートした後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、製造業者のプロトコルに従って、各ウェルの生存細胞数（４９０ｎｍ吸光度）を測定した。被験物質の代わりに培地を加えた細胞のウェルをコントロールとし、培地のみのウェルをバックグラウンドシグナルの補正のために用いた。横軸に被験物質濃度を、縦軸に細胞生存率をプロットし、Ｐｒｉｓｍ  ５（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いて、非線形回帰分析により曲線に当てはめることでＩＣ５０を算出した。
【００４５】
（３）結果
結果を表１に示す。ＡｕＮＰ及びＡｇＮＰのＥＣ５０はトリプトファンとのコンジュゲーションにより約１／２０〜１／３０の値になり、トキソプラズマ原虫増殖阻害効果の増強が認められた。また、選択性の指標であるＩＣ５０／ＥＣ５０もトリプトファンとのコンジュゲーションにより大きい値となった。このような傾向は、他のアミノ酸とのコンジュゲーションでは認められなかった。
【表１】
2018177663.tif 000003
【００４６】
以上から、ＡｕＮＰＴＲＰ及びＡｇＮＰＴＲＰは、アミノ酸とコンジュゲートしていない金属ナノ粒子、トリプトファン以外のアミノ酸とコンジュゲートした金属ナノ粒子、及び既存の抗トキソプラズマ薬のいずれと比較しても、強力なトキソプラズマ原虫に対する増殖阻害効果を有すると同時に高い選択性を有することが示された。
【００４７】
実施例３．トリプトファン−金属ナノ粒子コンジュゲートによるトキソプラズマ原虫の宿主細胞侵入阻害及び増殖阻害の評価
（１）宿主細胞侵入アッセイ
侵入アッセイはＡｄｅｙｅｍｉら（Ａｄｅｙｅｍｉ  ＯＳ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１７，１２：１６４７−１６６１）の記載に従って行った。簡潔には、カバーグラス上で増殖させたＨＦＦ細胞の単層培養に、トキソプラズマ原虫（１×１０５個）を、ＡｕＮＰＴＲＰ（終濃度１０００ｎｇ／ｍｌ）を含む培地、ＡｇＮＰＴＲＰ（終濃度６００ｎｇ／ｍｌ）を含む培地又はコントロールの培地と共に接種し、３７℃で１時間インキュベートして原虫を感染させた。氷冷ＰＢＳで細胞を３回洗浄した後、２％  ＦＣＳを含有するＰＢＳ（２％  ＦＣＳ−ＰＢＳ）中で、ウサギ抗トキソプラズマ・ゴンディＲＨ株ポリクローナル抗体［１：１０００］（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して氷冷下で３０分間、細胞外の原虫を染色した。２％  ＦＣＳ−ＰＢＳ中で細胞を３回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド加ＰＢＳ中で固定し、氷冷メタノールで２０分間透過処理を行った。細胞を２％  ＦＣＳ−ＰＢＳで３回洗浄した後、２％  ＦＣＳ−ＰＢＳ中でマウス抗ＳＡＧ１モノクローナル抗体［１：１０００］（Ｈｙｔｅｓｔ）を使用してさらに染色した。２次染色は、ＡＬＥＸＡ  ４８８ヤギ抗マウス抗体及びＡＬＥＸＡ  ５９４ヤギ抗ウサギ抗体を含有する抗体溶液［１：１０００］により、並びに核染色用のＤＡＰＩにより、２％  ＦＣＳ−ＰＢＳ中で行った。細胞を蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ４００）で可視化した。顕微鏡の視野をランダムに選び、細胞外の原虫をウサギ抗トキソプラズマ抗体を用いて、全原虫をマウス抗ＳＡＧ１抗体で検出した。
【００４８】
（２）宿主細胞内増殖アッセイ
宿主細胞内増殖アッセイはＡｄｅｙｅｍｉら（Ａｄｅｙｅｍｉ  ＯＳ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１７，１２：１６４７−１６６１）の記載に従って行った。簡潔には、カバーグラス上で増殖させたＨＦＦ細胞の単層培養にトキソプラズマ原虫（１×１０５個）を接種し、３７℃で１時間インキュベートして原虫を感染させた。温めた培地で細胞を３回洗浄して侵入していない原虫を除去した後、ＡｕＮＰＴＲＰ（終濃度１０００ｎｇ／ｍｌ）若しくはＡｇＮＰＴＲＰ（終濃度６００ｎｇ／ｍｌ）を含む培地、又は培地のみ（コントロール）を加えて２４時間インキュベートした。細胞を４％パラホルムアルデヒド加ＰＢＳ中、室温で３０分間固定し、室温で２０分間氷冷メタノールでの透過処理を行い、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を２％  ＢＳＡ加ブロッキングバッファー（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳ）中、室温で１時間ブロッキングした。１次抗体のマウス抗ＳＡＧ１モノクローナル抗体［１：１０００］（Ｈｙｔｅｓｔ）を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞をブロッキングバッファーで３回洗浄した（各洗浄の間は５分間）。ブロッキングバッファー中にＡＬＥＸＡ  ５４６  ヤギ抗マウス抗体及び核染色用のＤＡＰＩを含有する２次抗体溶液を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。カバーグラスをＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ４００）下、ランダムに選んだ視野内に存在する寄生体胞の数をカウントし、その中に含まれる虫体の数を算出した。
【００４９】
（３）結果
上記２つのアッセイにおいて細胞内で検出された原虫数の相対値をそれぞれ図３及び図４に示す。ＡｕＮＰＴＲＰ及びＡｇＮＰＴＲＰはいずれも、トキソプラズマ原虫の宿主細胞への侵入阻害、及び細胞内増殖阻害を有しており、特にＡｇＮＰＴＲＰはＡｕＮＰＴＲＰよりも低濃度でありながら強い阻害効果を発揮した。
【００５０】
カウントした全寄生体胞数に対する所定数の虫体を含む寄生体胞数の割合を図５に示す。コントロールでは１６個のタキゾイトを含む寄生体胞の割合が最も多かったのに対し、ＡｕＮＰＴＲＰでは４個の、ＡｇＮＰＴＲＰでは１個のタキゾイトを含む寄生体胞の割合が最も多かった。このことから、ＡｕＮＰＴＲＰ及びＡｇＮＰＴＲＰはいずれもトキソプラズマ原虫の宿主細胞内での分裂を阻止すること、特にＡｇＮＰＴＲＰはＡｕＮＰＴＲＰよりも低濃度でありながら強い分裂阻止効果を発揮することが示された。
【図１】
2018177663.tif 000004
【図２】
2018177663.tif 000005
【図３】
2018177663.tif 000006
【図４】
2018177663.tif 000007
【図５】
2018177663.tif 000008