(57)【要約】【課題】不妊症を改善可能な医薬組成物及びその製造方法を提供する。【解決手段】脂肪組織に由来する再生細胞を含む医薬組成物である。また脂肪組織を脱凝集剤で処理して脱凝集組織を得ることと、脱凝集組織から遠心分離処理により再生細胞を濃縮することと、濃縮される再生細胞を回収することとを含む、不妊症の処置に用いられる医薬組成物の製造方法である。【選択図】図６Ａ
2018177687.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織由来再生細胞を含み、不妊症の処置に用いられる医薬組成物。
【請求項２】
前記脂肪組織由来再生細胞は、脂肪幹細胞を含む請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記脂肪組織由来再生細胞は、血管新生誘導作用を有する請求項１又は請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記脂肪組織由来再生細胞は、子宮内膜増殖能を有する請求項１から請求項３のいずか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
着床不全を改善する請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
子宮内に投与される請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
グルコサミノグリカンおよびその誘導体から選択される少なくとも１種を更に含む請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
エストロゲン受容体活性化因子を更に含む請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記脂肪組織由来再生細胞が、用時調製したもの又は凍結したものである請求項１から８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
脂肪組織を脱凝集剤で処理して脱凝集組織を得ることと、脱凝集組織から遠心分離処理により再生細胞を濃縮することと、濃縮される再生細胞を回収することとを含む、不妊症の処置に用いられる医薬組成物の製造方法。
【請求項１１】
前記脂肪組織は、皮下組織に由来する請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
脂肪組織由来再生細胞又は請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の医薬組成物を、対象の子宮内に投与して子宮内膜細胞を増殖させることを含む着床不全改善方法。
【請求項１３】
前記脂肪組織由来再生細胞又は前記医薬組成物に含まれる脂肪組織由来再生細胞が、用時調製したもの又は凍結したものである請求項１２に記載の着床不全改善方法。
【請求項１４】
脂肪組織由来再生細胞又は請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の医薬組成物を、対象の子宮内に投与することを含む不妊症治療方法。
【請求項１５】
前記脂肪組織由来再生細胞又は前記医薬組成物に含まれる脂肪組織由来再生細胞が、用時調製したもの又は凍結したものである請求項１４に記載の不妊症治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不妊症の処置に用いられる医薬組成物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本においては、現在６組に１組の夫婦が不妊症と診断されている。不妊症の原因のうち、女性因子として子宮因子、頸管因子、排卵因子および卵管因子がある。子宮因以外の３つに対しては人工受精や体外受精などすでに確立した治療法がある。また子宮因子のうち、子宮自体の構造が問題になる器質性疾患（たとえば子宮腺筋膜症、子宮奇形等）があるが、これらは手術で治療可能とされている。一方、子宮の機能に問題がある機能性疾患で子宮内膜菲薄症いわゆる着床不全症に起因する不妊症については、有効な治療方法がないのが現状である。
【０００３】
ところで、特許文献１には、生体組織から再生細胞を分離するための自動化システムが記載され、再生細胞が種々の疾患及び障害に適用可能であることが記載されている。また特許文献２には、脂肪組織から得られる再生細胞を心血管状態の治療に用いることができることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−７５４３９号公報
【特許文献２】特開２０１２−５１９２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、不妊症を改善可能な医薬組成物およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りであり、本発明は以下の態様を包含する。
第一態様は、脂肪組織由来再生細胞を含み、不妊症の処置に用いられる医薬組成物である。
第二態様は、脂肪組織を脱凝集剤で処理して脱凝集組織を得ることと、脱凝集組織から遠心分離処理により再生細胞を濃縮することと、濃縮される再生細胞を回収することとを含む、不妊症の処置に用いられる医薬組成物の製造方法である。
第三態様は、対象の不妊症を処置する方法であり、脂肪組織由来再生細胞を含む医薬組成物を、処置対象の子宮内に投与することを含む不妊症の処置方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、不妊症を改善可能な医薬組成物およびその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】脂肪組織の一例を示す電子顕微鏡写真である。
【図１Ｂ】脂肪組織の一例を示す模式図である。
【図２】マウスＡＤＲＣｓのフローサイトメトリー検出結果である。
【図３】正常マウスの子宮内膜を示す組織染色図である。
【図４Ａ】対照群マウスの子宮の矢状断面を示す組織染色図である。
【図４Ｂ】対照群マウスの子宮の横断面を示す組織染色図である。
【図５Ａ】試験群マウスの子宮の矢状断面を示す組織染色図である。
【図５Ｂ】試験群マウスの子宮の横断面を示す組織染色図である。
【図６Ａ】マウスＡＤＲＣｓの子宮内膜増殖能を示す図である。
【図６Ｂ】マウスＡＤＲＣｓによる子宮腺数の増加能を示す図である。
【図７】マウスＡＤＲＣｓの子宮内膜増殖能を示す図である。
【図８Ａ】マウスに対するヒトＡＤＲＣｓによる子宮内膜増殖能を示す図である。
【図８Ｂ】マウスに対するヒトＡＤＲＣｓによる子宮腺数の増加能を示す図である。
【図９Ａ】対照群マウスの子宮の矢状断面を示す蛍光免疫染色図である。
【図９Ｂ】試験群マウスの子宮の矢状断面を示す蛍光免疫染色図である。
【図１０】マウスＡＤＲＣｓの血管新生能を示す図である。
【図１１】ＡＤＲＣｓ有効性評価に用いた実験スケジュールの概略図である
【図１２Ａ】対照群マウスの胚移植後の摘出子宮を示す図である。
【図１２Ｂ】試験群マウスの胚移植後の摘出子宮を示す図である。
【図１３】マウスＡＤＲＣｓの着床率評価の結果を示す図である。
【図１４】マウスに対するヒトＡＤＲＣｓの着床率評価の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書において、組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。以下、本発明を実施形態に基づいて説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、不妊症の処置に用いられる医薬組成物及びその製造方法を例示するものであって、本発明は、以下に示す医薬組成物及びその製造方法に限定されない。
【００１０】
医薬組成物
本発明の不妊症の処置に用いられる医薬組成物は、脂肪組織由来再生再細胞（Adipose Tissue Derived Reproductive Cells：以下、「ＡＤＲＣｓ」ともいう）を含むことを特徴とする。ＡＤＲＣｓは、例えば、血管新生、組織修復等を促進する特性があり、子宮内の菲薄化した子宮内膜に投与されることよって子宮内膜を修復することができると考えられる。その結果、受精卵の子宮内膜への着床率を改善することができ、不妊症を改善することが可能になると考えられる。
【００１１】
医薬組成物は不妊症の処置に用いられる。本明細書において用いられる「処置」とは、不妊症について施される何らかの処置であればよく、例えば、不妊症の治療、改善、悪化の防止等が挙げられる。
【００１２】
不妊症の女性因子のうち、子宮因子として子宮の機能に問題がある機能性疾患として、着床不全が知られている。着床不全とは、３回以上、体外受精による良好な胚を移植したにもかかわらず、妊娠しないか流産に終わった状態をいう。その原因の１つとして、子宮内膜が厚くならない（子宮内膜菲薄症ともいう）ことが挙げられる。子宮内膜菲薄症は、例えば、女性ホルモン（例えば、エストロゲンとプロゲステロン）の分泌低下によって、着床に適した子宮内膜の増殖が起こらない状態である。子宮内膜菲薄症に対して女性ホルモンを投与することによる改善が試みられるが、効果が認められない場合がある。その原因は不明であるが、子宮内膜の増殖能自体は維持されている場合がある。
【００１３】
子宮内膜菲薄症による着床不全については以下のように考えられる。受精が成立した後、受精卵は卵管から子宮内部へ移動し、子宮内膜に着床して妊娠が成立する。ところが、子宮内膜が菲薄化していると、卵管から子宮内部に移動した受精卵は、子宮内膜と接着することができず、子宮内膜に着床することがうまくできないと考えられている。例えば、菲薄化した子宮内膜では血管新生が乏しく、子宮内膜増殖作用を持つエストロゲンの反応性が低いことが知られている。このような場合には、子宮内膜菲薄症による着床不全に対してホルモン剤治療を試みても、治療が効かないということになる。ここで本発明者らは、子宮内膜菲薄症に対して子宮内に脂肪幹細胞を注入する治療方法を着想し、本発明を完成するに至ったのである。
【００１４】
本発明に用いられる脂肪組織由来再生再細胞（ＡＤＲＣｓ）とは、脂肪組織から後述の方法により調製することができる再生細胞であって、例えば、脂肪幹細胞、前駆細胞等の少なくとも１種を含むものである。なかでもＡＤＲＣｓは、少なくとも脂肪幹細胞を含むことが好ましい。またＡＤＲＣｓは、少なくとも血管新生誘導作用（血管新生能ともいう）を有することが好ましく、子宮内膜増殖能を有することもまた好ましい。
【００１５】
ＡＤＲＣｓは、陽性マーカーとしてＳｃａ−１、ＣＤ１０５およびＣＤ２９からなる群から選択される少なくとも１つ発現していることが好ましく、Ｓｃａ−１、ＣＤ１０５およびＣＤ２９すべてを発現していることがより好ましい。またＡＤＲＣｓは、陰性マーカーであるＣＤ４５を発現していないことが好ましい。
【００１６】
再生細胞が得られる脂肪組織は、生体のいずれの部位に存在するものであってもよく、皮下組織に存在する皮下脂肪であることが好ましい。皮下脂肪は生体のいずれの部位から採取されるものであってもよく、例えば、腰背部、大腿部等から採取してもよい。皮下脂肪の一例を図１Ａの顕微鏡画像（Matsumoto D, et al., Tissue Engineering. Dec 2006, 12(12): 3375-3382.のFigure1Aより改変）および図１Ｂの模式図に示す。図１Ｂでは、大きな細胞として脂肪細胞１０の周囲に小さい細胞として脂肪幹細胞２０が描かれている。図１Ｂには、さらに血管３０および細胞外基質４０も描かれている。皮下脂肪における脂肪細胞１０の存在率は、例えば２０％程度であり、脂肪幹細胞２０の存在率は、例えば１％から５％程度である。また血管３０は１５％から２０％程度含まれている。脂肪幹細胞は、心臓、骨格筋、骨・軟骨、血管などの様々な臓器に分化することができる。また、脂肪幹細胞は生理活性物質を分泌するともに、血管新生を誘導する作用有している。
【００１７】
医薬組成物に含まれるＡＤＲＣｓは、用時調製したものであってもよく、凍結保存したＡＤＲＣｓであってもよい。なお、凍結保存したＡＤＲＣｓは、連日投与が可能であり着床率をさらに改善することが期待できることから、より好ましい。なお、ＡＤＲＣｓの凍結保存には、通常用いられる細胞の凍結保存条件を適用することができる。またＡＤＲＣｓは、投与対象から採取した脂肪組織から調製されたものであってもよく、投与対象とは異なる個体から採取した脂肪組織から調製されたものであってもよい。さらにＡＤＲＣｓは、投与対象とは異種の動物から採取した脂肪組織から調製されたものであってよい。
【００１８】
医薬組成物は、ＡＤＲＣｓに加えて、必要に応じて、薬学的に許容される賦形剤等その他の成分を更に含んでいてもよい。その他の成分としては、薬学的に許容される賦形剤の他、界面活性剤、生理活性物質、安定化剤、液状媒体等を挙げることができる。その他の成分として具体的には、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等のグリコサミノグリカンおよびその誘導体；エストロゲン、プロゲステロン等の女性ホルモン受容体活性化因子を挙げることができる。
【００１９】
医薬組成物の形態は、不妊症の処置として投与可能な製剤の形態である限りにおいて特に限定されない。投与時における形態が液体であることが好ましい。
【００２０】
医薬組成物の投与方法としては、例えば、有効量の医薬組成物を対象の子宮内に注入する方法が挙げられる。医薬組成物は子宮内に注入されることで、例えば、子宮内膜における血管新生を促進し、エストロゲン不応性の菲薄化した子宮内膜を増生させることによって、着床不全を改善することができる。
【００２１】
医薬組成物の製造方法
不妊症の処置に用いられる医薬組成物の製造方法は、脂肪組織を脱凝集剤で処理して脱凝集組織を得ることと、脱凝集組織から遠心分離処理により再生細胞を濃縮することと、濃縮される再生細胞を回収することとを含む。
【００２２】
製造方法に用いられる脂肪組織は、例えば皮下組織から採取される。皮下組織から採取された脂肪組織は、生理食塩水、緩衝若しくは非緩衝電解質溶液等で洗浄処理されてもよい。脂肪組織は、脱凝集剤で処理されて脱凝集組織が得られる。脱凝集剤としては、例えば、中性プロテアーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ペプシン等を挙げることができ、中でもコラゲナーゼが好ましい。脱凝集剤は生理食塩水等の他の溶液と共に脂肪組織に添加されてもよい。脱凝集剤による処理は、例えば、３７℃またはその付近の温度で２０分から１２０分振とうして実施することができる。
【００２３】
脱凝集剤で処理されて得られる脱凝集組織から、遠心分離処理により再生細胞が濃縮される。遠心分離処理に先立ち脱凝集組織から非浮遊物成分を除去して、浮遊物層からなる画分を得ることが好ましい。浮遊物層からなる画分には再生細胞が含まれる。再生細胞を含む浮遊物層は、必要に応じて洗浄処理されてもよい。
【００２４】
遠心分離処理により濃縮された再生細胞は、常法により回収されて医薬組成物を構成する。上述した脂肪組織から再生細胞を回収する方法の詳細については、例えば、特開２０１２−５１９２３号公報、特開２０１２−７５４３９号公報等を参照することができる。また、脂肪組織からの再生細胞の回収は、市販されているサイトリ（Ｃｙｔｏｒｉ）社製のセリューションシステム（Ｃｅｌｕｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて実施してもよい。
【００２５】
不妊症の処置方法
不妊症の処置方法は、対象の不妊症を処置する方法であり、脂肪組織由来再生細胞（ＡＤＲＣｓ）を含む医薬組成物の有効量を、処置対象の子宮内に投与することを含む。子宮内に投与される医薬組成物に含まれる脂肪組織由来再生細胞により、着床不全が改善されて着床率が向上する。医薬組成物に含まれる脂肪組織由来再生細胞は、用時調製したものであっても、凍結したものであってもよい。また不妊症の処置方法は、不妊症の治療方法であってもよい。
【００２６】
不妊症の処置方法の対象となる動物は、哺乳動物であればよく、哺乳動物にはヒトが含まれる。有効量のＡＤＲＣｓとしては、例えば、細胞数として５×１０５から５×１０６個とすることができる。また医薬組成物の子宮内への投与は、常法により行うことができる。
【００２７】
着床不全改善方法
着床不全改善方法は、対象の着床不全を改善する方法であり、肪組織由来再生細胞（ＡＤＲＣｓ）を含む医薬組成物の有効量を、処置対象の子宮内に投与して、子宮内膜細胞を増殖させることを含む。医薬組成物に含まれる脂肪組織由来再生細胞は、用時調製したものであっても、凍結したものであってもよい。
【００２８】
着床不全改善方法の対象となる動物は、哺乳動物であればよく、哺乳動物にはヒトが含まれる。有効量のＡＤＲＣｓとしては、例えば、細胞数として５×１０５から５×１０６個とすることができる。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３０】
（実施例１）
マウス（ＩＣＲ、雌、５週齢）の両肢の皮下から、マウス脂肪組織を採取した。採取した脂肪組織１ｇから２ｇに対して１０ｍｌの０．２％コラゲナーゼ溶液（ＧＩＢＣＯ  １７１００−０１７）を加えて脂肪組織を浸漬した状態で、はさみで細切りにした。細切りにした脂肪組織に０．２％コラゲナーゼ溶液２０ｍｌを加え、３７℃で１２０ｒｐｍ、１時間振とうした。その後セルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ社製、ＲＥＦ  ３５２３６０）で濾過し、濾液を４００Ｇで５分間遠心処理した。上清を除去し、得られたペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１０ｍｌに懸濁して４００Ｇで５分間遠心処理することを３回繰り返して細胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットをマウスＡＤＲＣｓとした。
【００３１】
得られたマウスＡＤＲＣｓについて、マルチカラーフローサイトメトリーキット（Ｒ＆Ｄシステム社製、カタログ番号：ＦＭＣ００３）を用いて、陽性マーカーであるＳｃａ−１、ＣＤ１０５及びＣＤ２９、並びに陰性マーカーであるＣＤ４５の抗体を用いて染色して陽性細胞をフローサイトメトリーで検出した。結果を図２に示す。図２から、上記で得られたＡＤＲＣｓは、Ｓｃａ−１、ＣＤ１０５及びＣＤ２９が陽性で、ＣＤ４５が陰性であることが分かる。
【００３２】
（実施例２）
書面でのインフォームドコンセントに同意した被験者について、全身麻酔下に腰背部および大腿部の皮下組織から、ヒト脂肪組織を採取した。採取したヒト脂肪組織から、サイトリ社製のセリューションシステムを用いて再生細胞を抽出して得られた細胞ペレットをヒトＡＤＲＣｓとした。
【００３３】
子宮内膜菲薄化モデルマウスの作製
マウス（ＩＣＲ、雌、５週齢）の背部を切開して、子宮周囲の脂肪組織を同定した。同定した子宮周囲の脂肪組織を牽引して子宮を固定し、子宮内に９５％エタノールを注入して、子宮内膜菲薄化モデルマウスを作製した。
【００３４】
（試験例１）
ＡＤＲＣｓ有効性評価１  子宮内膜増殖能の評価
上記で作製した子宮内膜菲薄化モデルマウスを用いて、以下のようにしてマウスＡＤＲＣｓの子宮内膜増殖能の評価を行った。９５％エタノールを注入してから１０日後（月経周期２サイクル後）の子宮内膜菲薄化モデルマウスの子宮内に、被験薬を注入した。被験薬を注入してから７日後に子宮内膜の状態を調べた。なお、被験薬として、試験群にはマウスＡＤＲＣｓを１×１０６個含む組成物（ＰＢＳ  ３０μｌ）を注入し、対照群には生理食塩水（３０μｌ）を注入した。なお、試験群には９頭のモデルマウスを用い、対照群には８頭のモデルマウスを用いた。子宮内膜の組織ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色図（１００倍）を図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ａおよび図５Ｂに示す。
【００３５】
図３は正常マウスの子宮内膜を示す組織ＨＥ染色図である。図４Ａは子宮内膜菲薄化モデルマウスに生理食塩水を注入した対照群の子宮の矢状断面を示し、図４Ｂはその子宮の横断面を示す組織ＨＥ染色図である。図５Ａは子宮内膜菲薄化モデルマウスにマウスＡＤＲＣｓを注入した試験群の子宮の矢状断面を示し、図５Ｂはその子宮の横断面を示す組織ＨＥ染色図である。また図６Ａに子宮内膜の厚みを、図６Ｂに子宮腺の数を示す。子宮内膜の厚みは、対照群では５４±５．２μｍ（ｍｅａｎ±ＳＤ，Ｎ＝８）であり、試験群では２６８±２８．６μｍ（ｍｅａｎ±ＳＤ，Ｎ＝９）とＡＤＲＣｓを注入した試験群で有意に高値であった（ｐ＜０．０１）。また子宮腺の数は、対照群では２．４±０．８個（ｍｅａｎ±ＳＤ，Ｎ＝８）であり、試験群では３７±８．６個（ｍｅａｎ±ＳＤ，Ｎ＝９）とＡＤＲＣｓを注入した試験群で有意に高値であった（Ｐ＜０．０１）。なお、統計学的検討には、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ  Ｕ  ｔｅｓｔを用いた。以上から、マウスＡＤＲＣｓを子宮内に投与することで子宮内膜菲薄化モデルマウスの子宮内膜が増殖することが分かる。
【００３６】
（試験例２）
被験薬として、マウスＡＤＲＣｓにヒアルロン酸を添加した組成物、マウスＡＤＲＣｓにヒアルロン酸およびエストロゲンを添加した組成物、凍結マウスＡＤＲＣｓにヒアルロン酸を添加した組成物、並びに凍結マウスＡＤＲＣｓにヒアルロン酸およびエストロゲンを添加した組成物を用いて、試験例１と同様にして子宮内膜増殖能を評価した。ここでマウスＡＤＲＣｓとしては、マウスＡＤＲＣｓを１×１０６個含むＰＢＳを用い、組成物中のヒアルロン酸の添加量は２０μＬ（０．２ｍｇ）、エストロゲンの添加量は３μＬ（３ｐｇ）であった。子宮内膜の厚みを測定した結果を図７に示す。
【００３７】
図９から、ＡＤＲＣｓにヒアルロン酸、エストロゲンを添加しても子宮内膜増殖能は大きくは変化しないことが分かる。またＡＤＲＣｓは凍結保存後であってもフレッシュな（用時調製した）ＡＤＲＣｓと同等の子宮内膜増殖能を有することが分かる。
【００３８】
（試験例３）
被験薬として、マウスＡＤＲＣｓの代わりにヒトＡＤＲＣｓを用いて、試験例１と同様にしてマウスにおける子宮内膜増殖能を評価した。結果として図８Ａに子宮内膜の厚みを、図８Ｂに子宮腺の数を示す。
【００３９】
図８Ａおよび図８Ｂから、ヒトＡＤＲＣｓを子宮内膜菲薄化モデルマウスの子宮内に注入した場合でも、子宮内膜増殖能を示すことが分かる。
【００４０】
（試験例４）
ＡＤＲＣｓ有効性評価２  血管新生能の評価
組織をＨＥ染色する代わりに、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）蛍光免疫染色用抗体（ａｂｃａｍ社製、ａｂ４６１５４）を用いて染色したこと以外は、試験例１と同様にして、子宮内膜菲薄化モデルマウスを用いたマウスＡＤＲＣｓの子宮内膜における血管新生能の評価を行った。子宮内膜のＶＥＧＦ蛍光免疫組織学的染色の結果を、図９Ａ、図９Ｂおよび図１０に示す。
【００４１】
図９Ａは子宮内膜菲薄化モデルマウスに生理食塩水を注入した対照群の子宮の矢状断面を示し、図９Ｂは子宮内膜菲薄化モデルマウスにマウスＡＤＲＣｓを注入した試験群の子宮の矢状断面を示す蛍光免疫組織染色図（２００倍）である。また図１０はＶＥＧＦ発現量を、子宮内膜領域における発光面積の割合（％）で評価した図である。子宮内膜におけるＶＥＧＦ発現量は、対照群では３．４±２．５％（ｍｅａｎ±ＳＤ，Ｎ＝８）であり、試験群では３４．８±９．５％（ｍｅａｎ±ＳＤ，Ｎ＝９）とＡＤＲＣｓを注入した試験群で有意に高値であった。またＶＥＧＦは、特に子宮内膜の間質部位で高発現していることが分かる。
【００４２】
（試験例５）
ＡＤＲＣｓ有効性評価３  着床率の評価
上記で作製した子宮内膜菲薄化モデルマウスを用いて、図１１に示す実験スケジュールにしたがって、着床率についてのＡＤＲＣｓ有効性評価を実施した。
具体的には９５％エタノールを注入してから１０日後の子宮内膜菲薄化モデルマウスの子宮内に、被験薬を注入した。その後、交配して胚移植した。胚移植してから５日後に屠殺して受精卵の着床状態を調べた。被験薬として、試験群にはマウスＡＤＲＣｓを１×１０６個含む組成物を注入し、対照群には生理食塩水を注入した。図１２Ａに対照群から摘出した子宮の画像を、図１２Ｂに試験群から摘出した子宮の画像を示す。
【００４３】
図１２Ａおよび図１２Ｂに示すように、子宮内膜菲薄化モデルマウスに生理食塩水を注入した対照群の子宮では、移植胚の着床は認められなかったが、ＡＤＲＣｓを注入した試験群の子宮では、移植胚の着床が認められた。
【００４４】
（試験例６）
被験薬として、マウスＡＤＲＣｓにヒアルロン酸を添加した組成物、マウスＡＤＲＣｓにヒアルロン酸およびエストロゲンを添加した組成物、凍結マウスＡＤＲＣｓにヒアルロン酸を添加した組成物、並びに凍結マウスＡＤＲＣｓにヒアルロン酸およびエストロゲンを添加した組成物を用いて、試験例５と同様にして着床状態を調べて着床率を評価した。ここでマウスＡＤＲＣｓとしては、マウスＡＤＲＣｓを１×１０６個含むＰＢＳを用い、組成物中のヒアルロン酸の添加量は２０μＬ（０．２ｍｇ）であり、エストロゲンの添加量は３μＬ（３ｐｇ）であった。結果を図１３に示す。
【００４５】
マウスＡＤＲＣｓを含む組成物を注入した試験群はいずれも、生理食塩水を注入した対照群と比べて、着床率が向上していることが分かる。特に、マウスＡＤＲＣｓにヒアルロン酸およびエストロゲンを添加した組成物において、着床率がより向上する傾向が認められた。
【００４６】
（試験例７）
被験薬として、マウスＡＤＲＣｓの代わりにヒトＡＤＲＣｓを用いて、試験例５と同様にして子宮内膜菲薄化モデルマウスの着床状態を調べて着床率を評価した。結果を図１４に示す。
【００４７】
図１４から、ヒトＡＤＲＣｓを子宮内膜菲薄化モデルマウスの子宮内に注入した場合でも、着床率が向上することが分かる。
【００４８】
（試験例８）
ＡＤＲＣｓの品質検証
全身麻酔下にミニブタの臀部から脂肪組織を採取し、サイトリ社製のセルーションシステムを用いてＡＤＲＣｓを採取した。全身麻酔下のミニブタを開腹して子宮を露出させ子宮体部の２箇所に、以下のＡＤＲＣｓ液またはコントロール液を注入して閉腹した。なお、ＡＤＲＣｓ液は脂肪組織を採取した個体と同一の個体に注入し、コントロール液は別の個体に注入した。その後４週間、ミニブタの全身状態の観察と体重測定（注入前、注入後２週、注入後４週）を実施した。また注入前および注入後４週に血液検査を行った。さらに注入後４週に剖検した。
（１）ＡＤＲＣｓ液  ２ｍｌ：ＰＢＳで懸濁したＡＤＲＣｓ（１×１０６ｃｅｌｌｓ）０．７ｍｌ＋ヒアルロン酸＊１．１ｍｌ＋エストロゲン＊＊０．２ｍｌ
（２）コントロール液  ２．０ｍｌ：ＰＢＳ０．７ｍｌ＋ヒアルロン酸＊１．１ｍｌ＋エストロゲン＊＊０．２ｍｌ
＊ヒアルロン酸：ナトリウム「生化学」（アルツ２５ｍｇ／２．５ｍｌ、生化学工業株式会社）
＊＊エストロゲン：１７β−Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ（１０μｇ／ｍｌ  ｉｎ  ＥｔＯＨ、Ａｂｃｏｍ（ａｂ１２０６５７））
【００４９】
＜結果＞
ＡＤＲＣｓ液投与個体は、コントロール液投与個体と比較して、４週間、全身状態に変化なく、体重減少もみとめられなかった。血液検査については、注入前および注入後４週で有意な差はかった。脳（大脳、小脳、延髄）、肺（気管支を含む）、心臓、肝臓（胆嚢を含む）、脾、腎臓、腎副および移植した子宮に肉眼的な異常はく、器官重量も注入前および注入後４週で有意な差はなく、病理学的異常も認められなかった。
【符号の説明】
【００５０】
１０  脂肪細胞、２０  脂肪幹細胞、３０  血管、４０  細胞外基質
【図１Ａ】
2018177687.tif 000003
【図１Ｂ】
2018177687.tif 000004
【図２】
2018177687.tif 000005
【図３】
2018177687.tif 000006
【図４Ａ】
2018177687.tif 000007
【図４Ｂ】
2018177687.tif 000008
【図５Ａ】
2018177687.tif 000009
【図５Ｂ】
2018177687.tif 000010
【図６Ａ】
2018177687.tif 000011
【図６Ｂ】
2018177687.tif 000012
【図７】
2018177687.tif 000013
【図８Ａ】
2018177687.tif 000014
【図８Ｂ】
2018177687.tif 000015
【図９Ａ】
2018177687.tif 000016
【図９Ｂ】
2018177687.tif 000017
【図１０】
2018177687.tif 000018
【図１１】
2018177687.tif 000019
【図１２Ａ】
2018177687.tif 000020
【図１２Ｂ】
2018177687.tif 000021
【図１３】
2018177687.tif 000022
【図１４】
2018177687.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月12日(2017.10.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪幹細胞、血管内皮細胞および血管周皮細胞を含む脂肪組織由来再生細胞を含み、不妊症の処置に用いられる子宮内投与用の医薬組成物。
【請求項２】
グリコサミノグリカンおよびその誘導体から選択される少なくとも１種を更に含む請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記グリコサミノグリカンがヒアルロン酸である請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
エストロゲン受容体活性化因子を更に含む請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記エストロゲン受容体活性化因子がエストロゲンである請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
着床不全の改善に用いられる請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記脂肪組織由来再生細胞は、血管新生誘導作用を有する請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記脂肪組織由来再生細胞は、子宮内膜増殖能を有する請求項１から請求項７のいずか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記脂肪組織由来再生細胞が、用時調製したもの又は凍結したものである請求項１から８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
脂肪組織を脱凝集剤で処理して脱凝集組織を得ることと、脱凝集組織から遠心分離処理により再生細胞を濃縮することと、濃縮される再生細胞を回収することとを含む、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項１１】
前記脂肪組織は、皮下組織に由来する請求項１０に記載の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
医薬組成物
本発明の不妊症の処置に用いられる医薬組成物は、脂肪組織由来再生細胞（Adipose Tissue Derived Reproductive Cells：以下、「ＡＤＲＣｓ」ともいう）を含むことを特徴とする。ＡＤＲＣｓは、例えば、血管新生、組織修復等を促進する特性があり、子宮内の菲薄化した子宮内膜に投与されることよって子宮内膜を修復することができると考えられる。その結果、受精卵の子宮内膜への着床率を改善することができ、不妊症を改善することが可能になると考えられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明に用いられる脂肪組織由来再生細胞（ＡＤＲＣｓ）とは、脂肪組織から後述の方法により調製することができる再生細胞であって、例えば、脂肪幹細胞、前駆細胞等の少なくとも１種を含むものである。なかでもＡＤＲＣｓは、少なくとも脂肪幹細胞を含むことが好ましい。またＡＤＲＣｓは、少なくとも血管新生誘導作用（血管新生能ともいう）を有することが好ましく、子宮内膜増殖能を有することもまた好ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
再生細胞が得られる脂肪組織は、生体のいずれの部位に存在するものであってもよく、皮下組織に存在する皮下脂肪であることが好ましい。皮下脂肪は生体のいずれの部位から採取されるものであってもよく、例えば、腰背部、大腿部等から採取してもよい。皮下脂肪の一例を図１Ａの顕微鏡画像（Matsumoto D, et al., Tissue Engineering. Dec 2006, 12(12): 3375-3382.のFigure1Aより改変）および図１Ｂの模式図に示す。図１Ｂでは、大きな細胞として脂肪細胞１０の周囲に小さい細胞として脂肪幹細胞２０が描かれている。図１Ｂには、さらに血管３０および細胞外基質４０も描かれている。皮下脂肪における脂肪細胞１０の存在率は、例えば２０％程度であり、脂肪幹細胞２０の存在率は、例えば１％から５％程度である。また血管３０は１５％から２０％程度含まれている。脂肪幹細胞は、心臓、骨格筋、骨・軟骨、血管などの様々な臓器に分化することができる。また、脂肪幹細胞は生理活性物質を分泌するともに、血管新生を誘導する作用を有している。