(57)【要約】【課題】リガンドを固定した場合に高い動的結合容量を発揮し、しかも、優れた防汚性を有し不純物が非特異吸着しにくい固相担体およびアフィニティ精製用担体を提供すること。【解決手段】固相担体と、リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基と、を有するアフィニティ精製用担体であって、前記リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基が、固相担体に結合しており、前記固相担体を構成する高分子が、チオ基、スルフィニル基またはスルホニル基を介して鎖の末端に、ヒドロキシ基、チオール基、カルボニル基、アミノ基、チオ基、ジスルフィド基、スルフィニル基、スルホニル基、カルボキシ基、硫酸基およびリン酸基から選ばれる少なくとも一つを有する末端構造を有することを特徴とする、アフィニティ精製用担体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相担体と、リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基と、を有するアフィニティ精製用担体であって、
前記リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基が、固相担体に結合しており、
前記固相担体を構成する高分子が、チオ基、スルフィニル基またはスルホニル基を介して鎖の末端に、ヒドロキシ基、チオール基、カルボニル基、アミノ基、チオ基、ジスルフィド基、スルフィニル基、スルホニル基、カルボキシ基、硫酸基およびリン酸基から選ばれる少なくとも一つを有する末端構造を有することを特徴とする、アフィニティ精製用担体。
【請求項２】
前記固相担体を構成する高分子が、スルフィニル基またはスルホニル基を介して鎖の末端に、ヒドロキシ基、チオール基、カルボニル基、アミノ基、チオ基、ジスルフィド基、スルフィニル基、スルホニル基、カルボキシ基、硫酸基およびリン酸基から選ばれる少なくとも一つを有する末端構造を有するものである、請求項１に記載のアフィニティ精製用担体。
【請求項３】
前記固相担体を構成する高分子が、スルフィニル基またはスルホニル基を介して鎖の末端に、ヒドロキシ基、カルボニル基およびカルボキシ基から選ばれる少なくとも一つを有する末端構造を有するものである、請求項１に記載のアフィニティ精製用担体。
【請求項４】
前記末端構造が、下記式（２１）で表される末端構造である、請求項１に記載のアフィニティ精製用担体。
【化１】
2018109643.tif 000049
〔式（２１）中、
Ｒ51は、炭素数１〜２０の有機基を示し、
Ｚは、ヒドロキシ基、チオール基、アミノ基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基またはアルカノイル基を示し、
ｋは、１以上の整数を示す。〕
【請求項５】
Ｚが、ヒドロキシ基、チオール基、カルボキシ基、硫酸基またはアルカノイル基である、請求項４に記載のアフィニティ精製用担体。
【請求項６】
Ｚが、ヒドロキシ基、カルボキシ基またはアルカノイル基である、請求項４に記載のアフィニティ精製用担体。
【請求項７】
前記リガンドを結合するための反応性基が、環状エーテル基である、請求項４に記載のアフィニティ精製用担体。
【請求項８】
Ｚが、ヒドロキシ基、チオール基、カルボキシ基、硫酸基またはアルカノイル基であり、前記リガンドを結合するための反応性基が、環状エーテル基である、請求項４に記載のアフィニティ精製用担体。
【請求項９】
Ｚが、ヒドロキシ基、カルボキシ基またはアルカノイル基であり、前記リガンドを結合するための反応性基が、環状エーテル基である、請求項４に記載のアフィニティ精製用担体。
【請求項１０】
ｋが、１〜５の整数である、請求項４〜９のいずれか１項に記載のアフィニティ精製用担体。
【請求項１１】
前記末端構造が、固相担体の重合前或いは重合中にチオール化合物を添加して導入されるものである、請求項１および４〜１０のいずれか１項に記載のアフィニティ精製用担体。
【請求項１２】
前記固相担体を構成する高分子が、スチレン系モノマー、ビニルケトン系モノマー、（メタ）アクリロニトリル系モノマー、（メタ）アクリレート系モノマーおよび（メタ）アクリルアミド系モノマーから選ばれる１種または２種以上のモノマーに由来する構造単位を有する高分子である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアフィニティ精製用担体。
【請求項１３】
前記固相担体が、下記式（２２）で表される架橋剤に由来する架橋構造を更に有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアフィニティ精製用担体。
【化２】
2018109643.tif 000050
〔式（２２）中、
Ｒ52は、炭素数１〜１０の２価の有機基を示し、
Ｘ11およびＸ12は、それぞれ独立して、ヒドロキシ基、アミノ基またはチオール基を示す。〕
【請求項１４】
Ｘ11およびＸ12が、チオール基である、請求項１３に記載のアフィニティ精製用担体。
【請求項１５】
式（２２）で表される架橋剤に由来する架橋構造中のチオ基を酸化してなる、請求項１４に記載のアフィニティ精製用担体。
【請求項１６】
前記リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基が、リガンドである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のアフィニティ精製用担体。
【請求項１７】
前記リガンドが、イムノグロブリン結合タンパク質である請求項１６に記載のアフィニティ精製用担体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のアフィニティ精製用担体を担体とする、クロマトグラフィーカラム用充填剤。
【請求項１９】
請求項１８に記載の充填剤がカラム容器に充填されている、クロマトグラフィーカラム。
【請求項２０】
標的物質を含む組成物を用意する工程と、
請求項１９に記載のクロマトグラフィーカラムに前記組成物を通液する工程を含むことを特徴とする、
標的物質の精製方法。
【請求項２１】
前記標的物質が、タンパク質である、請求項２０に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相担体、固相担体の製造方法、アフィニティ精製用担体、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤の製造方法、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤、クロマトグラフィーカラムおよび精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アフィニティクロマトグラフィーは、モノクローナル抗体を含めたタンパク質の研究、開発および製造において重要な役割を担っている。これに使用されるアフィニティ精製用担体は一般的に、標的物質と選択的に結合するリガンドや、このリガンドを結合するための反応性基を有する固相担体を含む。アフィニティクロマトグラフィーは、固相担体上のリガンドが標的物質に対して高い選択性を有するため、イオンクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフィーに比べて、優れた収率で且つ高速で経済的な精製が可能となる。
【０００３】
一般に、タンパク精製用のアフィニティクロマトグラフィーに求められる性能としては、標的タンパク質以外の不純物が非特異吸着しにくいことや、リガンドが固定された際にそのリガンドに対応する標的タンパク質に対する動的結合容量を備えることなどが挙げられる。
【０００４】
こうしたなか、アフィニティ精製用担体の固相担体として、アガロース粒子（特許文献１、２）、スチレン−ジビニルベンゼンの共重合体からなる多孔質粒子（特許文献３、４）、メタクリレート系ビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子（特許文献５、６）が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００８−５２３１４０号公報
【特許文献２】特表２００９−５２２５８０号公報
【特許文献３】特開平０８−２７８２９９号公報
【特許文献４】特表平１０−５０１１７３号公報
【特許文献５】国際公開第２０１１／１２５６７４号
【特許文献６】特開２０１２−１４１２１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のような背景の下、本発明は、リガンドを固定した場合に高い動的結合容量を発揮し、しかも、優れた防汚性を有し不純物が非特異吸着しにくい固相担体およびアフィニティ精製用担体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本発明者らは鋭意検討した結果、リガンドを固定可能な官能基に加えて、さらに、スルフィニル基、スルフィド基、オキシ基またはイミノ基とヒドロキシ基、チオール基、アミノ基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基またはアルカノイル基とを有する基を有する固相担体が、優れた防汚性を有し、しかも、リガンドを固定した場合に高い動的結合容量を発揮することを見出し、本発明を完成した。
また、本発明者らは鋭意検討した結果、チオ基、スルフィニル基またはスルホニル基を介した特定の末端構造を有する高分子化合物により構成される固相担体を有するアフィニティ精製用担体が、優れた防汚性を有し、しかも、リガンドが固定された場合には高い動的結合容量を発揮することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、＜１＞リガンドを固定可能な官能基を有する固相担体であって、スルフィニル基、スルフィド基、オキシ基またはイミノ基とヒドロキシ基、チオール基、アミノ基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基またはアルカノイル基とを有する基を有することを特徴とする、固相担体（以下、この固相担体を固相担体Ａとも称する）を提供するものである。
【０００９】
また、本発明は、＜２＞リガンドを固定可能な官能基を有する固相担体と下記式（４）で表される化合物とを接触させる工程を含む、リガンドを固定可能な官能基および下記式（５−１）、（５−２）または（５−３）で表される基を有する固相担体の製造方法（以下、この製造方法を製造方法Ｂとも称する）を提供するものである。
【００１０】
【化１】
2018109643.tif 000002
【００１１】
〔式（４）中、
Ｒ2は炭素数１〜１０の１価の有機基を示し、
Ｙはスルフィド基、オキシ基またはイミノ基を示す。〕
【００１２】
【化２】
2018109643.tif 000003
【００１３】
〔式（５−１）中、
Ｒ1は炭素数１〜６の２価の炭化水素基を示し、
＊＊は結合手を示し、
Ｒ2およびＹは前記と同義である。〕
【００１４】
【化３】
2018109643.tif 000004
【００１５】
〔式（５−２）中、Ｒ2、Ｙおよび＊＊は前記と同義である。〕
【００１６】
【化４】
2018109643.tif 000005
【００１７】
〔式（５−３）中、Ｒ2、Ｙおよび＊＊は前記と同義である。〕
【００１８】
更に、本発明は、＜３＞上記＜１＞の固相担体、または上記＜２＞の製造方法により製造された固相担体に、リガンドを固定する工程を含む、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤の製造方法（以下、この製造方法を製造方法Ｃとも称する）を提供するものである。
【００１９】
更に、本発明は、＜４＞上記＜３＞の製造方法で得られる、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
【００２０】
更に、本発明は、＜５＞固相担体と、リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基と、を有するアフィニティ精製用担体であって、
前記リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基が、固相担体に結合しており、
前記固相担体を構成する高分子が、チオ基、スルフィニル基またはスルホニル基を介して鎖の末端に、ヒドロキシ基、チオール基、カルボニル基、アミノ基、チオ基、ジスルフィド基、スルフィニル基、スルホニル基、カルボキシ基、硫酸基およびリン酸基から選ばれる少なくとも一つを有する末端構造を有することを特徴とする、アフィニティ精製用担体（以下、このアフィニティ精製用担体をアフィニティ精製用担体Ｄとも称する）を提供するものである。
【００２１】
更に、本発明は、＜６＞上記＜５＞のアフィニティ精製用担体を担体とする、クロマトグラフィーカラム用充填剤を提供するものである。
【００２２】
更に、本発明は、＜７＞上記＜４＞または＜６＞の充填剤がカラム容器に充填されている、クロマトグラフィーカラムを提供するものである。
【００２３】
更に、本発明は、＜８＞標的物質を含む組成物を用意する工程と、上記＜７＞のクロマトグラフィーカラムに前記組成物を通液する工程を含むことを特徴とする、標的物質の精製方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の固相担体Ａは、優れた防汚性を有し、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ＝Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等のような不純物が非特異吸着しにくい。しかも、リガンドを固定した場合に高い動的結合容量を発揮する。
また、本発明のアフィニティ精製用担体Ｄは、優れた防汚性を有し、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ＝Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等のような不純物が非特異吸着しにくい。しかも、リガンドが固定された場合には高い動的結合容量を発揮する。
したがって、本発明のアフィニティクロマトグラフィー用充填剤およびクロマトグラフィーカラムは、リガンドに対応する標的物質の動的結合容量が大きく、優れた防汚性を有する。
また、本発明の固相担体の製造方法Ｂ、本発明のアフィニティクロマトグラフィー用充填剤の製造方法Ｃによれば、上記のような性能を有する固相担体、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤を簡便に製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の固相担体の製造方法の一例を示す図である。
【図２】本発明のアフィニティクロマトグラフィー用充填剤の製造方法の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
＜固相担体Ａ＞
本発明の固相担体Ａは、リガンドを固定可能な官能基に加えて、スルフィニル基（＞Ｓ（＝Ｏ））、スルフィド基（＞Ｓ）、オキシ基（＞Ｏ）またはイミノ基（＞ＮＨ）とヒドロキシ基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、アミノ基（−ＮＨ2）、カルボキシ基（−ＣＯＯＨ）、硫酸基（−ＯＳ（＝Ｏ）2（ＯＨ））、リン酸基（−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）2）またはアルカノイル基とを有する基を有することを特徴とするものである。なお、当該アルカノイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、その炭素数は、好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜６、特に好ましくは２〜４である。アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基が挙げられる。
また、本発明の固相担体Ａは、リガンドを固定可能な官能基にリガンドが固定されていないものである。
【００２７】
上記リガンドを固定可能な官能基としては、例えば、環状エーテル基、カルボキシ基、コハク酸イミドオキシ基、ホルミル基、イソシアネート基、アミノ基が挙げられる。これらの中でも、環状エーテル基が好ましく、環を構成する原子数が３〜７個の環状エーテル基がより好ましく、下記式（１−１）、（１−２）または（１−３）で表される基が更に好ましく、下記式（１−１）で表される基が特に好ましい。
【００２８】
【化５】
2018109643.tif 000006
【００２９】
〔式（１−１）中、
Ｒ1は炭素数１〜６の２価の炭化水素基を示し、
＊は結合手を示す。〕
【００３０】
【化６】
2018109643.tif 000007
【００３１】
〔式（１−２）中、＊は前記と同義である。〕
【００３２】
【化７】
2018109643.tif 000008
【００３３】
〔式（１−３）中、＊は前記と同義である。〕
【００３４】
式（１−１）中、Ｒ1は炭素数１〜６の２価の炭化水素基を示す。斯かる２価の炭化水素基の炭素数としては、１〜４が好ましく、１または２がより好ましく、１が特に好ましい。また、２価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
また、上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。好適な具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基等が挙げられる。
【００３５】
また、本発明の固相担体Ａは、スルフィニル基、スルフィド基、オキシ基またはイミノ基とヒドロキシ基、チオール基、アミノ基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基またはアルカノイル基とを有する基を有するものであるが、ヒドロキシ基、チオール基、アミノ基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基、アルカノイル基の中では、リガンドを固定した場合の動的結合容量、防汚性の観点から、ヒドロキシ基、チオール基、カルボキシ基、硫酸基、アルカノイル基が好ましく、ヒドロキシ基、カルボキシ基、硫酸基がより好ましく、ヒドロキシ基が特に好ましい。スルフィニル基、スルフィド基、オキシ基またはイミノ基とヒドロキシ基とを有する基の好適な具体例としては、下記式（２−１）、（２−２）または（２−３）で表される基が挙げられ、下記式（２−１）で表される基が特に好ましい。
【００３６】
【化８】
2018109643.tif 000009
【００３７】
〔式（２−１）中、
Ｒ2は炭素数１〜１０の１価の有機基を示し、
Ｘはスルフィニル基、スルフィド基、オキシ基またはイミノ基を示し、
＊＊は結合手を示し、
Ｒ1は前記と同義であり、炭素数１〜６の２価の炭化水素基を示す。〕
【００３８】
【化９】
2018109643.tif 000010
【００３９】
〔式（２−２）中、Ｒ2、Ｘおよび＊＊は前記と同義である。〕
【００４０】
【化１０】
2018109643.tif 000011
【００４１】
〔式（２−３）中、Ｒ2、Ｘおよび＊＊は前記と同義である。〕
【００４２】
式（２−１）〜（２−３）中、Ｘはスルフィニル基、スルフィド基、オキシ基またはイミノ基を示すが、防汚性の観点から、スルフィニル基、スルフィド基、オキシ基が好ましく、スルフィニル基が特に好ましい。
【００４３】
また、式（２−１）〜（２−３）中、Ｒ2は炭素数１〜１０の１価の有機基を示す。斯かる１価の有機基の炭素数としては、リガンドを固定した場合の動的結合容量、防汚性の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。
【００４４】
また、上記１価の有機基としては、１価の炭化水素基、該１価の炭化水素基に含まれる水素原子の少なくとも１個以上が親水性基に置換された基、−（Ｒ6Ｏ）m−Ｈ（Ｒ6は炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、ｍは１〜５０の整数を示す）が挙げられる。これらは直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
【００４５】
また、上記１価の炭化水素基は、１価の脂肪族炭化水素基、１価の脂環式炭化水素基および１価の芳香族炭化水素基を包含する概念であるが、好ましくは１価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルキル基である。斯かるアルキル基の炭素数としては、親水性、リガンドを固定した場合の動的結合容量の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。
上記アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等が挙げられる。
【００４６】
また、上記親水性基としては、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基等が挙げられるが、リガンドを固定した場合の動的結合容量、防汚性の観点から、ヒドロキシ基が好ましい。
また、親水性基の置換位置および個数は任意であるが、その個数は、リガンドを固定した場合の動的結合容量、防汚性の観点から、好ましくは１〜６個であり、より好ましくは１〜４個であり、特に好ましくは２個である。
【００４７】
また、上記−（Ｒ6Ｏ）m−Ｈにおいて、Ｒ6で示されるアルカンジイル基の炭素数としては、２または３が好ましく、２がより好ましい。また、斯かるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。具体例としては、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基等が挙げられる。
また、ｍは、１〜５０の整数を示すが、防汚性、リガンドを固定した場合の動的結合容量、耐圧性能の観点から、１〜３０の整数が好ましく、１〜２５の整数がより好ましく、１〜２０の整数が更に好ましく、１〜１５の整数が更に好ましく、１〜１０の整数が更に好ましく、１〜５の整数が更に好ましく、１〜３の整数が特に好ましい。
【００４８】
斯様なＲ2の中でも、上記１価の炭化水素基に含まれる水素原子の少なくとも１個以上が親水性基に置換された基が好ましく、好適な具体例としては、下記式（３）で表される１価の有機基が挙げられる。
【００４９】
【化１１】
2018109643.tif 000012
【００５０】
〔式（３）中、
Ｒ3は炭素数１〜１０の２価または３価の有機基を示し、
ｎは１または２を示す。〕
【００５１】
式（３）中、Ｒ3で示される２価または３価の有機基の炭素数としては、リガンドを固定した場合の動的結合容量、防汚性の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。
【００５２】
また、上記２価の有機基としては、２価の炭化水素基が挙げられ、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。斯かるアルカンジイル基の炭素数としては、リガンドを固定した場合の動的結合容量、防汚性の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。
【００５３】
上記アルカンジイル基の具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基等が挙げられる。
【００５４】
また、上記３価の有機基としては、３価の炭化水素基が挙げられ、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。上記３価の炭化水素基は、好ましくは３価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。斯かるアルカントリイル基の炭素数としては、リガンドを固定した場合の動的結合容量、防汚性の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。
【００５５】
上記アルカントリイル基の具体例としては、メタン−１，１，１−トリイル基、エタン−１，１，２−トリイル基、プロパン−１，２，３−トリイル基、プロパン−１，２，２−トリイル基等が挙げられる。
【００５６】
また、式（３）中、ｎとしては、リガンドを固定した場合の動的結合容量、防汚性の観点から、２が好ましい。
【００５７】
また、リガンドを固定可能な官能基の含有量としては、固定可能なリガンド量とリガンドを固定した場合の動的結合容量の観点から、固相担体Ａ１ｇあたり、０．０５〜６．５ｍｍｏｌが好ましく、０．２〜３．５ｍｍｏｌがより好ましく、０．５〜２ｍｍｏｌが特に好ましい。
リガンドを固定可能な官能基の含有量は、各官能基の定量方法に従えばよく、例えばエポキシ基なら、酸で開環してアルカリで中和した後、酸で逆滴定する等により測定可能である。
【００５８】
また、スルフィニル基、スルフィド基、オキシ基またはイミノ基の含有量としては、リガンドを固定した場合の動的結合容量と防汚性の観点から、固相担体Ａ１ｇあたり、０．１〜６．５ｍｍｏｌが好ましく、０．５〜４．５ｍｍｏｌがより好ましく、１〜３ｍｍｏｌが特に好ましい。
また、固相担体Ａがスルフィニル基を有する場合、スルフィニル基の含有量としては、リガンドを固定した場合の動的結合容量と防汚性の観点から、固相担体Ａ１ｇあたり、０．１〜６．５ｍｍｏｌが好ましく、０．５〜４．５ｍｍｏｌがより好ましく、１〜３ｍｍｏｌが特に好ましい。
また、固相担体Ａがスルフィド基を有する場合、スルフィド基の含有量としては、リガンドを固定した場合の動的結合容量と防汚性の観点から、固相担体Ａ１ｇあたり、０．１〜６．５ｍｍｏｌが好ましく、０．５〜４．５ｍｍｏｌがより好ましく、１〜３ｍｍｏｌが特に好ましい。
また、固相担体Ａがスルフィニル基およびスルフィド基を有する場合、スルフィニル基とスルフィド基との含有量の比率は、モル比で、１００：０〜３０：７０が好ましく、１００：０〜５０：５０がより好ましく、１００：０〜７０：３０が特に好ましい。
【００５９】
また、本発明の固相担体Ａは、上記リガンドを固定可能な官能基を表面に有するものが好ましい。また、上記スルフィニル基、スルフィド基、オキシ基またはイミノ基とヒドロキシ基、チオール基、アミノ基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基またはアルカノイル基とを有する基を表面に有するものが好ましい。
また、本発明の固相担体Ａとしては、上記リガンドを固定可能な官能基、および上記スルフィニル基、スルフィド基、オキシ基またはイミノ基とヒドロキシ基、チオール基、アミノ基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基またはアルカノイル基とを有する基を有する樹脂を含む固相担体が好ましく、上記樹脂を表面に含む固相担体がより好ましい。
また、固相担体Ａの形態は、モノリス、膜、中空繊維、粒子、カセット、チップ等のいずれでもよいが、粒子が好ましい。また、固相担体Ａは多孔質でも非多孔質でもよいが、表面積の向上の観点から、多孔質粒子等の多孔質化されたものが好ましい。また、多孔質粒子としては、多孔質ポリマー粒子が好ましい。また、上記樹脂は、上記リガンドを固定可能な官能基、および上記スルフィニル基、スルフィド基、オキシ基またはイミノ基とヒドロキシ基、チオール基、アミノ基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基またはアルカノイル基とを有する基を有するものであれば特に限定されるものではなく、アガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類で構成される天然高分子でもよく、合成高分子でもよい。樹脂としては、エチレン性不飽和モノマーに由来する構造単位を有する樹脂が好ましい。例えば、スチレン系モノマー、ビニルケトン系モノマー、（メタ）アクリロニトリル系モノマー、（メタ）アクリレート系モノマーおよび（メタ）アクリルアミド系モノマーから選ばれる１種又は２種以上のモノマーに由来する構造単位を有する樹脂などである。
【００６０】
また、本発明の固相担体Ａが高分子で構成される場合、当該高分子は、チオ基、スルフィニル基またはスルホニル基を介して鎖の末端に、ヒドロキシ基、チオール基、カルボニル基、アミノ基、チオ基、ジスルフィド基、スルフィニル基、スルホニル基、カルボキシ基、硫酸基およびリン酸基から選ばれる少なくとも一つを有する末端構造を有していてもよい。斯かる高分子やその末端構造は、アフィニティ精製用担体Ｄが有するものと同様である。
【００６１】
また、本発明の固相担体Ａが粒子である場合、その平均粒径（体積平均粒径）は、耐圧性能の観点から、好ましくは２０〜１５０μｍであり、より好ましくは４０〜１００μｍである。また、平均粒径の変動係数は、好ましくは４０％以下であり、より好ましくは３０％以下である。
また、本発明の固相担体Ａの比表面積は、リガンドを固定した場合の動的結合容量の観点から、ポアサイズ１０ｎｍ〜５０００ｎｍにおける比表面積で、好ましくは７０ｍ2／ｇ以上であり、より好ましくは９０ｍ2／ｇ以上である。
また、本発明の固相担体Ａの比表面積は、リガンドを固定した場合の動的結合容量の観点から、ポアサイズ１０ｎｍ〜５０００ｎｍにおける比表面積で、好ましくは７０ｍ2／ｇ以上であり、より好ましくは９０ｍ2／ｇ以上である。
平均粒径および比表面積は、レーザー回折・散乱式粒度分析測定装置や水銀ポロシメータ等により測定できる。
【００６２】
次に、本発明の固相担体Ａの製造方法について詳細に説明する。
本発明の固相担体Ａは、常法を適宜組み合わせて製造すればよく特に限定されないが、例えば、以下の方法〔ＰＲ−１〕および〔ＰＲ−２〕により得ることができる。方法〔ＰＲ−１〕および〔ＰＲ−２〕によれば、優れた防汚性を有し、しかも、リガンドを固定した場合に高い動的結合容量を発揮する固相担体Ａを簡便に得ることができる。
【００６３】
〔ＰＲ−１〕リガンドを固定可能な官能基を有する固相担体（以下、原料担体（Ｉ）とも称する）と式（４）で表される化合物とを接触させる方法。具体的には、＜工程１−１＞原料担体（Ｉ）を常法に従って得て、＜工程１−２＞原料担体（Ｉ）と式（４）で表される化合物とを接触させる方法が挙げられる。
斯かる方法〔ＰＲ−１〕によれば、リガンドを固定可能な官能基および式（５−１）、（５−２）または（５−３）で表される基を有する固相担体が得られる。
【００６４】
〔ＰＲ−２〕原料担体（Ｉ）と、式（４）で表される化合物のうちＹがスルフィド基であるものを接触させて、リガンドを固定可能な官能基および式（５−１）、（５−２）または（５−３）で表される基を有する固相担体のうちＹがスルフィド基であるもの（以下、スルフィド基含有固相担体（II）とも称する）を得て、スルフィド基含有固相担体（II）と、酸化剤とを接触させる方法。
具体的には、＜工程２−１＞原料担体（Ｉ）を常法に従って得て、＜工程２−２＞原料担体（Ｉ）と、式（４）で表される化合物のうちＹがスルフィド基であるものを接触させて、スルフィド基含有固相担体（II）を得て、＜工程２−３＞スルフィド基含有固相担体（II）と、酸化剤とを接触させる方法。
斯かる方法〔ＰＲ−２〕によれば、リガンドを固定可能な官能基および式（６−１）、（６−２）または（６−３）で表される基を有する固相担体が得られる。
【００６５】
【化１２】
2018109643.tif 000013
【００６６】
〔式（４）中、
Ｙはスルフィド基、オキシ基またはイミノ基を示し、
Ｒ2は前記と同義であり、炭素数１〜１０の１価の有機基を示す。〕
【００６７】
【化１３】
2018109643.tif 000014
【００６８】
〔式（５−１）中、
Ｒ1は前記と同義であり、炭素数１〜６の２価の炭化水素基を示し、
Ｒ2は前記と同義であり、炭素数１〜１０の１価の有機基を示し、
Ｙは前記と同義であり、スルフィド基、オキシ基またはイミノ基を示す。
また、＊＊は結合手を示す。〕
【００６９】
【化１４】
2018109643.tif 000015
【００７０】
〔式（５−２）中、Ｒ2、Ｙおよび＊＊は前記と同義である。〕
【００７１】
【化１５】
2018109643.tif 000016
【００７２】
〔式（５−３）中、Ｒ2、Ｙおよび＊＊は前記と同義である。〕
【００７３】
【化１６】
2018109643.tif 000017
【００７４】
〔式（６−１）中、Ｒ1、Ｒ2および＊＊は前記と同義である。〕
【００７５】
【化１７】
2018109643.tif 000018
【００７６】
〔式（６−２）中、Ｒ2および＊＊は前記と同義である。〕
【００７７】
【化１８】
2018109643.tif 000019
【００７８】
〔式（６−３）中、Ｒ2および＊＊は前記と同義である。〕
【００７９】
以下、上記各工程について詳細に説明する。
＜工程１−１および２−１＞
工程１−１および２−１は、原料担体（Ｉ）を得る工程である。例えば、リガンドを固定可能な官能基を有するモノマーを（共）重合させればよい。上記（共）重合の方法は、例えば、シード重合、懸濁重合等が挙げられ、好ましくは懸濁重合である。
【００８０】
ここで、原料担体（Ｉ）に含まれるリガンドを固定可能な官能基としては、例えば、環状エーテル基、カルボキシ基、コハク酸イミドオキシ基、ホルミル基、イソシアネート基、アミノ基が挙げられる。これらの中でも、環状エーテル基が好ましく、環を構成する原子数が３〜７個の環状エーテル基がより好ましく、下記式（１−１）、（１−２）または（１−３）で表される基が更に好ましく、下記式（１−１）で表される基が特に好ましい。
【００８１】
【化１９】
2018109643.tif 000020
【００８２】
〔式（１−１）中、
Ｒ1は炭素数１〜６の２価の炭化水素基を示し、
＊は結合手を示す。〕
【００８３】
【化２０】
2018109643.tif 000021
【００８４】
〔式（１−２）中、＊は前記と同義である。〕
【００８５】
【化２１】
2018109643.tif 000022
【００８６】
〔式（１−３）中、＊は前記と同義である。〕
【００８７】
式（１−１）中、Ｒ1は炭素数１〜６の２価の炭化水素基を示す。斯かる２価の炭化水素基の炭素数としては、１〜４が好ましく、１または２がより好ましく、１が特に好ましい。また、２価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
また、上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。好適な具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基等が挙げられる。
【００８８】
リガンドを固定可能な官能基を有するモノマーとしては、式（１−１）で表される基を有するモノマーが好ましく、例えば、エポキシ基含有不飽和モノマーが挙げられる。斯かるエポキシ基含有不飽和モノマーとしては、（メタ）アクリレート系モノマー、スチレン系モノマー等が好ましく、（メタ）アクリレート系モノマーがより好ましく、下記式（７）で表される（メタ）アクリレート系モノマーが特に好ましい。
【００８９】
【化２２】
2018109643.tif 000023
【００９０】
〔式（７）中、
Ｒ4は水素原子またはメチル基を示し、
Ｒ5は単結合、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基または−（Ｒ6Ｏ）m−を示し（Ｒ6は炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、ｍは１〜５０の整数を示す）、
Ｒ1は前記と同義であり、炭素数１〜６の２価の炭化水素基を示す。〕
【００９１】
Ｒ5で示される２価の炭化水素基の炭素数としては、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、１〜４が更に好ましい。２価の炭化水素基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
また、上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。斯かるアルカンジイル基の炭素数としては、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、１〜４が更に好ましい。
【００９２】
上記アルカンジイル基の具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基等が挙げられる。
【００９３】
Ｒ6で示されるアルカンジイル基の炭素数としては、２または３が好ましく、２がより好ましい。また、斯かるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。具体例としては、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基等が挙げられる。
また、ｍは、１〜５０の整数を示すが、１〜３０の整数が好ましく、１〜２５の整数がより好ましく、１〜２０の整数が更に好ましく、１〜１５の整数が更に好ましく、１〜１０の整数が更に好ましく、１〜５の整数が更に好ましく、１〜３の整数が特に好ましい。
【００９４】
また、上記のようなＲ5の中でも、単結合が好ましい。
【００９５】
また、上記リガンドを固定可能な官能基を有するモノマーとしては、グリシジル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテル、α−（メタ）アクリル−ω−グリシジルポリエチレングリコール、（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテル、（メタ）アクリル酸（７‐オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタン‐３‐イル）メチル、アリルグリシジルエーテル、３，４−エポキシ−１−ブテン、３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブテン等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【００９６】
また、上記リガンドを固定可能な官能基を有するモノマーの合計使用量としては、固定可能なリガンド量とリガンドを固定した場合の動的結合容量の観点から、モノマー総量を１００質量部に対して、１〜９０質量部が好ましく、２０〜８０質量部がより好ましく、３０〜７０質量部が特に好ましい。
【００９７】
また、工程１−１および２−１には、リガンドを固定可能な官能基を有するモノマーとともに他のモノマーを用いてもよい。該他のモノマーとしては、非架橋性モノマー、架橋性モノマーのいずれも使用でき、これらを併用してもよい。
【００９８】
上記非架橋性モノマーとしては、ヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマー、ヒドロキシ基を含まない非架橋性不飽和モノマーが挙げられ、架橋性モノマーとしては、ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマー、ヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーが挙げられる。
【００９９】
上記ヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマーとしては、（メタ）アクリレート系モノマー、（メタ）アクリルアミド系モノマーが好ましく、（メタ）アクリレート系モノマーがより好ましい。中でも、下記式（８）で表される（メタ）アクリレート系モノマーが特に好ましい。なお、上記ヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマーに含まれるヒドロキシ基の個数としては、１〜５が好ましく、１〜３がより好ましい。
【０１００】
【化２３】
2018109643.tif 000024
【０１０１】
〔式（８）中、
Ｒ7は水素原子またはメチル基を示し、
Ｒ8は炭素数１〜６の３価の炭化水素基を示す。〕
【０１０２】
Ｒ8で示される３価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、その炭素数は、好ましくは２〜４である。
また、上記３価の炭化水素基は、好ましくは３価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。具体的には、エタン−１，１，２−トリイル基等が挙げられる。
【０１０３】
上記ヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマーとしては、例えば、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンモノ（メタ）アクリレート、ブタントリオールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、イノシトールモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０１０４】
また、上記ヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマーの合計使用量としては、動的結合容量、防汚性の観点から、モノマー総量を１００重量部に対して、０〜７０質量部が好ましく、３〜５０質量部がより好ましく、５〜２０質量部が特に好ましい。
【０１０５】
また、上記ヒドロキシ基を含まない非架橋性不飽和モノマーとしては、（メタ）アクリレート系モノマー、（メタ）アクリルアミド系モノマーが好ましく、（メタ）アクリレート系モノマーがより好ましい。中でも、下記式（９）で表される（メタ）アクリレート系モノマーが特に好ましい。
【０１０６】
【化２４】
2018109643.tif 000025
【０１０７】
〔式（９）中、
Ｒ9は水素原子またはメチル基を示し、
Ｒ10は炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、
Ｒ11は炭素数１〜６の１価の炭化水素基を示し、
ｐは０〜５０の整数を示す。〕
【０１０８】
Ｒ10で示されるアルカンジイル基の炭素数としては、２または３が好ましく、２がより好ましい。また、斯かるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。具体例としては、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基等が挙げられる。
【０１０９】
Ｒ11で示される１価の炭化水素基の炭素数としては、１〜４が好ましく、１または２がより好ましい。
上記１価の炭化水素基は、１価の脂肪族炭化水素基、１価の脂環式炭化水素基および１価の芳香族炭化水素基を包含する概念であるが、好ましくは１価の脂肪族炭化水素基である。１価の脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
１価の脂肪族炭化水素基としては、アルキル基が好ましい。斯かるアルキル基の炭素数としては、１〜４が好ましく、１または２がより好ましい。
上記アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。
【０１１０】
ｐは０〜５０の整数を示すが、１〜２５の整数が好ましく、１〜１５の整数がより好ましい。
【０１１１】
上記ヒドロキシ基を含まない非架橋性不飽和モノマーとしては、例えば、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、ジメチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリロイルモルホリン、ダイアセトン（メタ）アクリルアミド等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０１１２】
また、ヒドロキシ基を含まない非架橋性不飽和モノマーの合計使用量としては、動的結合容量、防汚性の観点から、モノマー総量を１００質量部に対して、０〜７０質量部が好ましく、３〜５０質量部がより好ましく、５〜３０質量部が特に好ましい。
【０１１３】
また、上記ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマーとしては、２〜５官能のものが好ましく、２または３官能のものがより好ましい。また、ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマーに含まれるヒドロキシ基の個数としては、動的結合容量と防汚性の観点から、１〜５が好ましく、１〜３がより好ましい。
また、ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマーとしては、（メタ）アクリレート系モノマーが好ましい。中でも、下記式（１０）で表される（メタ）アクリレート系モノマーが特に好ましい。
【０１１４】
【化２５】
2018109643.tif 000026
【０１１５】
〔式（１０）中、
Ｒ12およびＲ13は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示し、
Ｒ14は炭素数１〜８の３価の炭化水素基を示す。〕
【０１１６】
Ｒ14で示される３価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、その炭素数は、好ましくは１〜５である。
また、上記３価の炭化水素基は、好ましくは３価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。具体的には、メタン−１，１，１−トリイル基等が挙げられる。
【０１１７】
上記ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマーとしては、例えば、グリセリンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、ブタントリオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、イノシトールジ（メタ）アクリレート、イノシトールトリ（メタ）アクリレート、イノシトールテトラ（メタ）アクリレート等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０１１８】
また、ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマーを使用する場合、その合計使用量としては、動的結合容量、防汚性の観点から、モノマー総量を１００質量部に対して、０〜７０質量部が好ましく、３〜５０質量部がより好ましく、５〜２０質量部が好ましい。
【０１１９】
また、上記ヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーとしては、２〜５官能のものが好ましく、２または３官能のものがより好ましい。
また、ヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーとしては、（メタ）アクリレート系モノマーが好ましい。中でも、下記式（１１）または（１２）で表される（メタ）アクリレート系モノマーが特に好ましい。
【０１２０】
【化２６】
2018109643.tif 000027
【０１２１】
〔式（１１）中、
Ｒ15〜Ｒ17は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示し、
Ｒ18は炭素数１〜６の３価の炭化水素基を示す。〕
【０１２２】
【化２７】
2018109643.tif 000028
【０１２３】
〔式（１２）中、
Ｒ19およびＲ20は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示し、
Ｒ21は炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、
ｒは１〜５０の整数を示す。〕
【０１２４】
式（１１）中、Ｒ18で示される３価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、その炭素数は、好ましくは２〜４である。
また、上記３価の炭化水素基は、好ましくは３価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。具体的には、プロパン−１，１，１−トリイル基等が挙げられる。
【０１２５】
また、式（１２）中のＲ21で示されるアルカンジイル基の炭素数としては、２または３が好ましく、２がより好ましい。また、斯かるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。具体例としては、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基等が挙げられる。
また、ｒは、１〜５０の整数を示すが、１〜３０の整数が好ましく、１〜２５の整数がより好ましく、１〜２０の整数が更に好ましく、１〜１５の整数が更に好ましく、１〜１０の整数が特に好ましい。
【０１２６】
上記ヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーとしては、
トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０１２７】
また、上記ヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーの合計使用量としては、動的結合容量、防汚性の観点から、モノマー総量を１００質量部に対して、１〜９０質量部が好ましく、５〜７０質量部がより好ましく、１０〜６０質量部が更に好ましく、２０〜５０質量部が特に好ましい。
【０１２８】
リガンドを固定可能な官能基を有するモノマーと他のモノマーの組み合わせとしては、リガンドを固定した場合の動的結合容量、防汚性の観点から、リガンドを固定可能な官能基を有するモノマーとヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマーとヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーを少なくとも含む組み合わせが好ましく、リガンドを固定可能な官能基を有するモノマーとヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマーとヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーとの組み合わせ、リガンドを固定可能な官能基を有するモノマーとヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマーとヒドロキシ基を含まない非架橋性不飽和モノマーとヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーとの組み合わせがより好ましく、リガンドを固定可能な官能基を有するモノマーとヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマーとヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーとの組み合わせが特に好ましい。
【０１２９】
また、工程１−１および２−１の具体的な方法としては、例えば、モノマーおよび必要に応じて多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）に重合開始剤を溶解し、水系媒体中に懸濁させて所定温度まで加熱して重合させる方法や、モノマーおよび必要に応じて多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）に重合開始剤を溶解し、所定温度まで加熱した水系媒体中に添加して重合させる方法、モノマーおよび必要に応じて多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）を、水系媒体中に懸濁させて所定温度まで加熱して、重合開始剤を添加し重合させる方法等が挙げられる。
【０１３０】
重合開始剤としてはラジカル重合開始剤が好ましい。ラジカル重合開始剤としては、例えば、アゾ系開始剤、過酸化物系開始剤、レドックス系開始剤等が挙げられ、具体的には、アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソ酪酸メチル、アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル、過酸化ベンゾイル、過酸化ジ−ｔｅｒｔ−ブチル、過酸化ベンゾイル−ジメチルアニリン等が挙げられる。重合開始剤の合計使用量は、通常、モノマー総量１００質量部に対して０．０１〜１０質量部程度である。
【０１３１】
上記多孔化剤は、多孔質粒子を製造するために使用され、油滴内の重合において、モノマーと共に存在し、非重合成分として孔を形成する役割を有する。多孔化剤は、多孔質表面において容易に除去可能なものであれば特に限定されるものではなく、例えば、各種の有機溶剤や混合モノマーに可溶な線状重合物等が挙げられ、これらを併用してもよい。
【０１３２】
上記多孔化剤としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン等の脂肪族炭化水素類；シクロヘキサン、シクロペンタン等の脂環式炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、ナフタレン、エチルベンゼン等の芳香族炭化水素類；四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、テトラクロロエタン、クロロベンゼン、等のハロゲン化炭化水素類；ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、ヘキサノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ヘキサノール等の脂肪族アルコール類；シクロヘキサノール等の脂環式アルコール類；２−フェニルエチルアルコール、ベンジルアルコール等の芳香族アルコール類；ジエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン、アセトフェノン、２−オクタノン、シクロヘキサノン等のケトン類；ジブチルエーテル、ジイソブチルエーテル、アニソール、エトキシベンゼン等のエーテル類；酢酸イソペンチル、酢酸ブチル、酢酸−３−メトキシブチル、マロン酸ジエチル等のエステル類の他、非架橋性ビニルモノマーのホモポリマー等の線状重合物が挙げられる。多孔化剤は単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。
【０１３３】
上記多孔化剤の合計使用量は、通常、モノマー総量１００質量部に対して４０〜４００質量部程度である。
【０１３４】
上記水系媒体としては、例えば水溶性高分子水溶液等が挙げられ、水溶性高分子としては、例えばヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン等が挙げられる。
水系媒体の合計使用量は、モノマー総量１００質量部に対して、通常、２００〜７０００質量部程度である。
【０１３５】
また、水系媒体の分散媒として水を用いる場合、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸カルシウム等の分散安定剤を使用してもよい。
【０１３６】
また、工程１−１および２−１には、アルキル硫酸エステル塩、アルキルアリール硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、脂肪酸塩等のアニオン性界面活性剤をはじめとする各種界面活性剤を用いてもよい。
また、亜硝酸ナトリウム等の亜硝酸塩、ヨウ化カリウム等のヨウ化物塩、ｔｅｒｔ−ブチルピロカテコール、ベンゾキノン、ピクリン酸、ハイドロキノン、塩化銅、塩化第二鉄等の重合禁止剤を用いることもできる。
また、ドデシルメルカプタン等の重合調製剤を用いてもよい。
【０１３７】
また、工程１−１および２−１の重合温度は重合開始剤に応じて決定すればよいが、例えば、アゾビスイソブチロニトリルを重合開始剤として用いる場合は、５０〜１００℃が好ましく、６０〜９０℃がより好ましい。
また、重合時間は通常５分〜４８時間、好ましくは１０分〜２４時間である。
【０１３８】
＜工程１−２および２−２＞
工程１−２は、原料担体（Ｉ）と下記式（４）で表される化合物とを接触させて、リガンドを固定可能な官能基および下記式（５−１）、（５−２）または（５−３）で表される基を有する固相担体を得る工程である。
また、工程２−２は、原料担体（Ｉ）と、下記式（４）で表される化合物のうちＹがスルフィド基であるものを接触させて、スルフィド基含有固相担体（II）を得る工程である。
【０１３９】
【化２８】
2018109643.tif 000029
【０１４０】
〔式（４）中、
Ｙはスルフィド基、オキシ基またはイミノ基を示し、
Ｒ2は前記と同義であり、炭素数１〜１０の１価の有機基を示す。〕
【０１４１】
【化２９】
2018109643.tif 000030
【０１４２】
〔式（５−１）中、
Ｒ1は前記と同義であり、炭素数１〜６の２価の炭化水素基を示し、
Ｒ2は前記と同義であり、炭素数１〜１０の１価の有機基を示し、
Ｙは前記と同義であり、スルフィド基、オキシ基またはイミノ基を示す。
また、＊＊は結合手を示す。〕
【０１４３】
【化３０】
2018109643.tif 000031
【０１４４】
〔式（５−２）中、Ｒ2、Ｙおよび＊＊は前記と同義である。〕
【０１４５】
【化３１】
2018109643.tif 000032
【０１４６】
〔式（５−３）中、Ｒ2、Ｙおよび＊＊は前記と同義である。〕
【０１４７】
工程１−２および２−２で用いる化合物（４）としては、チオグリセロール、メルカプトエタノール、モノエタノールアミン等が挙げられるが、チオグリセロールが好ましい。
上記化合物（４）の合計使用量は、リガンドを固定可能な官能基１モルに対し、通常０．１〜１２モル当量であり、好ましくは１〜１０モル当量であり、より好ましくは２〜８モル当量である。
【０１４８】
なお、工程１−２および２−２は、塩基性触媒存在下で行ってもよい。斯かる塩基性触媒としては、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン、ジイソプロピルエチルアミン等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０１４９】
また、工程１−２および２−２の反応時間は特に限定されないが、通常０．５〜７２時間程度であり、好ましくは１〜４８時間である。また、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常２〜１００℃程度である。
【０１５０】
＜工程２−３＞
工程２−３は、工程２−２で得たスルフィド基含有固相担体（II）と、酸化剤とを接触させ、スルフィド基をスルフィニル基に酸化し、リガンドを固定可能な官能基および下記式（６−１）、（６−２）または（６−３）で表される基を有する固相担体を得る工程である。
【０１５１】
【化３２】
2018109643.tif 000033
【０１５２】
〔式（６−１）中、Ｒ1、Ｒ2および＊＊は前記と同義である。〕
【０１５３】
【化３３】
2018109643.tif 000034
【０１５４】
〔式（６−２）中、Ｒ2および＊＊は前記と同義である。〕
【０１５５】
【化３４】
2018109643.tif 000035
【０１５６】
〔式（６−３）中、Ｒ2および＊＊は前記と同義である。〕
【０１５７】
工程２−３で用いる酸化剤は、有機酸化剤と無機酸化剤とに大別され、有機酸化剤としては、例えば、過酢酸、過安息香酸、メタクロロ過安息香酸等が挙げられる。一方、無機酸化剤としては、例えば、過酸化水素、クロム酸、過マンガン酸塩等が挙げられる。なお、これら酸化剤は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
また、酸化剤の合計使用量は、スルフィド基１モルに対し、通常０．１〜１０モル当量程度であるが、好ましくは０．５〜３モル当量である。
【０１５８】
また、工程２−３は、溶媒存在下で行うのが好ましい。斯かる溶媒としては、水；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒；メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒等が挙げられ、これら溶媒は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
上記溶媒の合計使用量は、原料となる固相担体に対し、通常１〜５０質量倍程度であるが、好ましくは５〜１５質量倍である。
【０１５９】
また、工程２−３の反応時間は特に限定されないが、通常１〜７２時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常１〜９０℃程度である。
【０１６０】
なお、上記各工程で得られる固相担体は、必要に応じて多孔化剤や未反応モノマーを蒸留、抽出、洗浄等により除去することで得ることができる。
【０１６１】
そして、上記のようにして得られる本発明の固相担体Ａは、リガンドを固定した場合に高い動的結合容量を発揮し、しかも、優れた防汚性を有し、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ＝Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等のような不純物が非特異吸着しにくい。
本発明の固相担体Ａは、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤や流路、センサーチップ等に用いる固相担体として有用である。
【０１６２】
＜アフィニティクロマトグラフィー用充填剤の製造方法Ｃ＞
本発明のアフィニティクロマトグラフィー用充填剤の製造方法Ｃは、本発明の固相担体Ａまたは本発明の製造方法Ｂで得られた固相担体に、リガンドを固定する工程を含むことを特徴とするものである。
【０１６３】
上記リガンドは標的物質と結合する分子であればよいが、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合タンパク、アビジン等のタンパク質；インシュリン等のペプチド；モノクローナル抗体等の抗体；酵素；ホルモン；ＤＮＡ；ＲＮＡ；ヘパリン、ルイスＸ、ガングリオシド等の糖質；イミノジ酢酸、合成色素、２−アミノフェニル硼素酸、４−アミノベンズアミジン、グルタチオン、ビオチンやその誘導体のような低分子化合物が挙げられる。なお、上記に例示したリガンドはその全体を用いてもよいが、リコンビナント、酵素処理等によって得られるそのフラグメントを用いてもよい。また、人工的に合成されたペプチドやペプチド誘導体であってもよい。
斯様なリガンドの中でも、精製の標的物質が抗体である場合は、アミノ基を含むものが好ましく、タンパク質、ペプチドがより好ましく、タンパク質が更に好ましく、イムノグロブリン結合タンパク質が更に好ましい。イムノグロブリン結合性タンパク質としては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合タンパクおよびそれらの機能性変異体よりなる群から選ばれる少なくとも１種以上が好ましい。中でも、好ましくはプロテインＡ、プロテインＧ、それらの機能性変異体であり、より好ましくはプロテインＡ、その機能性変異体である。
【０１６４】
また、リガンドの合計使用量は、固相担体Ａ１ｇあたり、通常５０〜３００ｍｇ程度であるが、好ましくは１２０〜１８０ｍｇである。
【０１６５】
リガンドの固定は、上記固相担体Ａを用いる以外は常法と同様にして行えばよいが、塩を添加した緩衝液中で行うのが好ましい。
上記塩の種類としては、クエン酸三ナトリウム、硫酸ナトリウム等が挙げられ、上記緩衝液としては、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。
緩衝液の合計使用量は、固相担体Ａに対し、通常２０〜８０質量倍程度であるが、好ましくは３５〜４５質量倍である。
【０１６６】
また、反応時間は特に限定されないが、通常０．５〜７２時間程度であり、反応温度は通常１〜４０℃程度である。
【０１６７】
また、本発明の充填剤の製造方法Ｃにおいては、上記固定工程後、得られたアフィニティクロマトグラフィー用充填剤を、式（４）で表される化合物と接触させ、未反応のリガンドを固定可能な官能基を反応させてもよい。また、この反応の後に酸化剤と接触させてもよい。
これによって、リガンドが結合しなかった官能基が、式（２−１）、（２−２）または（２−３）で表される基に変換される。
【０１６８】
そして、上記本発明の充填剤の製造方法Ｃによれば、簡便且つ容易に、動的結合容量が高く、優れた防汚性を有するアフィニティクロマトグラフィー用充填剤を製造できる。
【０１６９】
＜アフィニティ精製用担体Ｄ＞
本発明のアフィニティ精製用担体Ｄは、固相担体と、リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基と、を有するアフィニティ精製用担体であって、前記リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基が、固相担体に結合しており、前記固相担体を構成する高分子が、チオ基、スルフィニル基またはスルホニル基を介して鎖の末端に、ヒドロキシ基、チオール基、カルボニル基、アミノ基、チオ基、ジスルフィド基、スルフィニル基、スルホニル基、カルボキシ基、硫酸基およびリン酸基から選ばれる少なくとも一つを有する末端構造を有することを特徴とするものである。
上記末端構造を連結するチオ基、スルフィニル基またはスルホニル基としては、チオ基またはスルホニル基が好ましい。
【０１７０】
（末端構造）
上記末端構造は、チオ基、スルフィニル基またはスルホニル基を介して高分子鎖の末端に位置している。末端構造としては、下記式（２１）で表される末端構造が好ましい。
【０１７１】
【化３５】
2018109643.tif 000036
【０１７２】
〔式（２１）中、
Ｒ51は、炭素数１〜２０の有機基を示し、
Ｚは、ヒドロキシ基、チオール基、アミノ基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基またはアルカノイル基を示し、
ｋは、１以上の整数を示す。〕
【０１７３】
ここで、式（２１）中のｋは、１以上の整数を示すが、１〜５の整数が好ましく、１〜３の整数がより好ましく、１または２が特に好ましい。すなわち、Ｒ51で示される有機基の価数は、好ましくは２〜６価であり、より好ましくは２〜４価であり、特に好ましくは２または３価である。
【０１７４】
式（２１）中、Ｒ51で示される炭素数１〜２０の有機基の炭素数としては、リガンドを結合させた場合の動的結合容量や防汚性等の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。
【０１７５】
また、Ｒ51で示される有機基としては、炭化水素基が好ましい。炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、好ましくは脂肪族炭化水素基であり、より好ましくは２または３価の脂肪族炭化水素基である。
２価の脂肪族炭化水素基としては、アルカンジイル基が好ましい。斯かるアルカンジイル基の炭素数としては、リガンドを結合させた場合の動的結合容量や防汚性等の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。アルカンジイル基の具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基等が挙げられる。
３価の脂肪族炭化水素基としては、アルカントリイル基が好ましい。斯かるアルカントリイル基の炭素数としては、リガンドを結合させた場合の動的結合容量や防汚性等の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。アルカントリイル基の具体例としては、メタン−１，１，１−トリイル基、エタン−１，１，２−トリイル基、プロパン−１，２，３−トリイル基、プロパン−１，２，２−トリイル基等が挙げられる。
【０１７６】
式（２１）中、Ｚは、ヒドロキシ基、チオール基、アミノ基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基またはアルカノイル基を示す。当該アルカノイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、その炭素数は、好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜６、特に好ましくは２〜４である。アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基が挙げられる。
Ｚとしては、リガンドを結合させた場合の動的結合容量や防汚性等の観点から、ヒドロキシ基、チオール基、カルボキシ基、硫酸基、アルカノイル基が好ましく、ヒドロキシ基、カルボキシ基、硫酸基がより好ましい。これらの中でも、ヒドロキシ基が特に好ましい。
【０１７７】
（リガンド等）
また、本発明のアフィニティ精製用担体Ｄは、リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基を有する。
上記リガンドは標的物質と結合する分子であればよいが、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合タンパク、アビジン等のタンパク質；インシュリン等のペプチド；モノクローナル抗体等の抗体；酵素；ホルモン；ＤＮＡ；ＲＮＡ；ヘパリン、ルイスＸ、ガングリオシド等の糖質；イミノジ酢酸、合成色素、２−アミノフェニル硼素酸、４−アミノベンズアミジン、グルタチオン、ビオチンやその誘導体のような低分子化合物が挙げられる。なお、上記に例示したリガンドはその全体を用いてもよいが、リコンビナント、酵素処理等によって得られるそのフラグメントを用いてもよい。また、人工的に合成されたペプチドやペプチド誘導体であってもよい。
斯様なリガンドの中でも、精製の標的物質が抗体である場合は、アミノ基を含むものが好ましく、タンパク質、ペプチドがより好ましく、タンパク質が更に好ましく、イムノグロブリン結合タンパク質が更に好ましい。イムノグロブリン結合性タンパク質としては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合タンパクおよびそれらの機能性変異体よりなる群から選ばれる少なくとも１種以上が好ましい。中でも、好ましくはプロテインＡ、プロテインＧ、それらの機能性変異体であり、より好ましくはプロテインＡ、その機能性変異体である。
リガンドの結合量は、固相担体１ｇ当たり、好ましくは１０〜２００ｍｇ、より好ましくは２５〜１００ｍｇである。
【０１７８】
リガンドを結合するための反応性基としては、例えば、環状エーテル基、カルボキシ基、コハク酸イミドオキシ基、ホルミル基、イソシアネート基、アミノ基が挙げられる。これらの中でも、環状エーテル基が好ましく、環を構成する原子数が３〜７個の環状エーテル基がより好ましく、下記式（２３）、（２４）または（２５）で表される１価の基が更に好ましく、下記式（２３）で表される１価の基が特に好ましい。
【０１７９】
【化３６】
2018109643.tif 000037
【０１８０】
〔式（２３）中、
Ｒ53は炭素数１〜６の２価の炭化水素基を示す。〕
【０１８１】
【化３７】
2018109643.tif 000038
【０１８２】
【化３８】
2018109643.tif 000039
【０１８３】
式（２３）中、Ｒ53は炭素数１〜６の２価の炭化水素基を示す。斯かる２価の炭化水素基の炭素数としては、１〜４が好ましく、１または２がより好ましく、１が特に好ましい。また、２価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
また、上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。好適な具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基等が挙げられる。
【０１８４】
また、固相担体を構成する高分子は、高分子鎖の末端に、チオ基、スルフィニル基またはスルホニル基を介して上記末端構造を有するものであれば特に限定されるものではなく、アガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類で構成される天然高分子でもよく、合成高分子でもよい。
固相担体を構成する高分子としては、エチレン性不飽和モノマーに由来する構造単位を有する高分子が好ましい。例えば、スチレン系モノマー、ビニルケトン系モノマー、（メタ）アクリロニトリル系モノマー、（メタ）アクリレート系モノマーおよび（メタ）アクリルアミド系モノマーから選ばれる１種または２種以上のモノマーに由来する構造単位を有する高分子などである。
【０１８５】
また、固相担体の形態は、モノリス、膜、中空繊維、粒子、カセット、チップ等のいずれでもよいが、粒子が好ましい。また、固相担体は、表面積の向上の観点から、多孔質粒子等の多孔質化されたものが好ましい。また、多孔質粒子としては、多孔質ポリマー粒子が好ましい。
本発明のアフィニティ精製用担体Ｄを構成する固相担体が粒子である場合、その平均粒径（体積平均粒径）は、通常、３５〜１００μｍであり、好ましくは４０〜８５μｍである。平均粒径を３５μｍ以上とすることにより、圧力特性が向上する。また、１００μｍ以下とすることによりリガンドを結合した場合の動的結合容量が大きくなる。また、平均粒径の変動係数は、好ましくは４０％以下であり、より好ましくは３０％以下である。
平均粒径は、重合する際の条件で調整することができる。なお、平均粒径は、レーザー回折・散乱式粒度分析測定装置等により測定できる。
【０１８６】
（アフィニティ精製用担体Ｄの製造方法）
本発明のアフィニティ精製用担体Ｄの製造方法は、常法を適宜組み合わせて製造することができる。
例えば、（工程Ｐ１）リガンドを結合するための反応性基を有するモノマーと、必要に応じで当該モノマー以外のモノマー（以下、他のモノマーとも称する）を、チオール化合物および重合開始剤の存在下で（共）重合させ、必要に応じて、（工程Ｐ２−１）架橋剤を用いた架橋化反応や（工程Ｐ２−２）酸化剤を用いるなどしてチオ基をスルフィニル基に酸化をするなどして製造できる。また、（工程Ｐ３）斯様な方法で得られた固相担体にリガンドを結合させてもよい。
【０１８７】
（工程Ｐ１）
リガンドを結合するための反応性基を有するモノマー、他のモノマーとしては、いずれも、エチレン性不飽和モノマーが挙げられる。具体的には、スチレン系モノマー、ビニルケトン系モノマー、（メタ）アクリロニトリル系モノマー、（メタ）アクリレート系モノマーおよび（メタ）アクリルアミド系モノマーから選ばれる１種または２種以上のモノマーを例示することができる。
【０１８８】
リガンドを結合するための反応性基を有するモノマーとしては、上記式（２３）で表される１価の基、上記式（２４）で表される１価の基、上記式（２５）で表される１価の基、カルボキシ基、コハク酸イミドオキシ基、ホルミル基、イソシアネート基およびアミノ基から選ばれる反応性基を有するモノマーが好ましく、式（２３）で表される１価の基を有するモノマーがより好ましい。式（２３）で表される１価の基を有するモノマーとしては、エポキシ基含有不飽和モノマーが挙げられる。当該エポキシ基含有不飽和モノマーとしては、（メタ）アクリレート系モノマー、スチレン系モノマー等が好ましく、（メタ）アクリレート系モノマーがより好ましく、下記式（２６）で表される（メタ）アクリレート系モノマーがさらに好ましい。
【０１８９】
【化３９】
2018109643.tif 000040
【０１９０】
〔式（２６）中、
Ｒ54は水素原子またはメチル基を示し、
Ｒ55は単結合、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基または−（Ｒ56Ｏ）k2−を示し（Ｒ56は炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、ｋ２は１〜５０の整数を示す）、
Ｒ53は前記と同義であり、炭素数１〜６の２価の炭化水素基を示す。〕
【０１９１】
Ｒ55で示される２価の炭化水素基の炭素数としては、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、１〜４が更に好ましい。２価の炭化水素基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
また、上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。斯かるアルカンジイル基の炭素数としては、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、１〜４が更に好ましい。
【０１９２】
上記アルカンジイル基の具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基等が挙げられる。
【０１９３】
Ｒ56で示されるアルカンジイル基の炭素数としては、２または３が好ましく、２がより好ましい。また、斯かるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。具体例としては、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基等が挙げられる。
【０１９４】
また、ｋ２は、１〜５０の整数を示すが、１〜３０の整数が好ましく、１〜２５の整数がより好ましく、１〜２０の整数が更に好ましく、１〜１５の整数が更に好ましく、１〜１０の整数が更に好ましく、１〜５の整数が更に好ましく、１〜３の整数が特に好ましい。
【０１９５】
また、上記のようなＲ55の中でも、単結合が好ましい。
【０１９６】
リガンドを結合するための反応性基を有するモノマーの具体例としては、グリシジル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテル、α−（メタ）アクリル−ω−グリシジルポリエチレングリコール、（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテル、（メタ）アクリル酸（７‐オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタン‐３‐イル）メチル、アリルグリシジルエーテル、３，４−エポキシ−１−ブテン、３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブテン等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０１９７】
また、リガンドを結合するための反応性基を有するモノマーの合計使用量としては、固定可能なリガンド量とリガンドを固定した場合の動的結合容量の観点から、モノマー総量１００質量部に対し、１〜９０質量部が好ましく、２０〜８０質量部がより好ましく、３０〜７０質量部がさらに好ましく、４０〜６０質量部が特に好ましい。
【０１９８】
また、他のモノマーとしては、非架橋性モノマー、架橋性モノマーのいずれも使用でき、これらを併用してもよい。
また、上記非架橋性モノマーとしては、ヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマー、ヒドロキシ基を含まない非架橋性不飽和モノマーが挙げられ、架橋性モノマーとしては、ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマー、ヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーが挙げられる。
【０１９９】
上記ヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマーとしては、（メタ）アクリレート系モノマー、（メタ）アクリルアミド系モノマー等が好ましい。また、上記ヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマーに含まれるヒドロキシ基の個数としては、１〜５が好ましく、１〜３がより好ましい。また、上記（メタ）アクリレート系モノマーとしては、下記式（２７）で表される（メタ）アクリレート系モノマーが好ましい。
【０２００】
【化４０】
2018109643.tif 000041
【０２０１】
〔式（２７）中、
Ｒ57は水素原子またはメチル基を示し、
Ｒ58は炭素数１〜６の３価の炭化水素基を示す。〕
【０２０２】
Ｒ58で示される３価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、その炭素数は、好ましくは２〜４である。
また、上記３価の炭化水素基は、好ましくは３価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。具体的には、エタン−１，１，２−トリイル基等が挙げられる。
【０２０３】
ヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマーの具体例としては、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンモノ（メタ）アクリレート、ブタントリオールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、イノシトールモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０２０４】
また、上記ヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマーを使用する場合、その合計使用量としては、製造時の凝集防止の観点から、モノマー総量１００重量部に対し、１〜３０質量部が好ましく、２〜２０質量部がより好ましく、３〜１５質量部が特に好ましい。
【０２０５】
また、上記ヒドロキシ基を含まない非架橋性不飽和モノマーとしては、（メタ）アクリレート系モノマー、（メタ）アクリルアミド系モノマー等が好ましい。また、上記（メタ）アクリレート系モノマーとしては、下記式（２８）で表される（メタ）アクリレート系モノマーがより好ましい。
【０２０６】
【化４１】
2018109643.tif 000042
【０２０７】
〔式（２８）中、
Ｒ59は、水素原子またはメチル基を示し、
Ｒ60は、炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、
Ｒ61は、炭素数１〜６の１価の炭化水素基を示し、
ｓは、０〜５０の整数を示す。〕
【０２０８】
Ｒ60で示されるアルカンジイル基の炭素数としては、２または３が好ましく、２がより好ましい。また、斯かるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。具体例としては、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基等が挙げられる。
【０２０９】
Ｒ61で示される１価の炭化水素基の炭素数としては、１〜４が好ましく、１または２がより好ましい。
上記１価の炭化水素基は、１価の脂肪族炭化水素基、１価の脂環式炭化水素基および１価の芳香族炭化水素基を包含する概念であるが、好ましくは１価の脂肪族炭化水素基である。１価の脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
１価の脂肪族炭化水素基としては、アルキル基が好ましい。斯かるアルキル基の炭素数としては、１〜４が好ましく、１または２がより好ましい。
上記アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。
【０２１０】
ｓは、０〜５０の整数を示すが、１〜２５の整数が好ましく、１〜１５の整数がより好ましい。
【０２１１】
ヒドロキシ基を含まない非架橋性不飽和モノマーの具体例としては、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、ジメチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリロイルモルホリン、ダイアセトン（メタ）アクリルアミド等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０２１２】
また、上記ヒドロキシ基を含まない非架橋性不飽和モノマーの合計使用量としては、動的結合容量の観点から、モノマー総量１００質量部に対し、０〜７０質量部が好ましく、０〜３０質量部がより好ましく、０〜２０質量部が特に好ましい。
【０２１３】
また、上記ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマーに含まれるヒドロキシ基の個数としては、動的結合容量と防汚性の観点から、１〜５が好ましく、１〜３がより好ましい。また、上記ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマーとしては、反応性基が、２〜５官能のものが好ましく、２または３官能のものがより好ましい。
また、上記ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマーとしては、（メタ）アクリレート系モノマーが好ましく、下記式（２９）で表される（メタ）アクリレート系モノマーがより好ましい。
【０２１４】
【化４２】
2018109643.tif 000043
【０２１５】
〔式（２９）中、
Ｒ62およびＲ63は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示し、
Ｒ64は、炭素数１〜８の３価の炭化水素基を示す。〕
【０２１６】
Ｒ64で示される３価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、その炭素数は、好ましくは１〜５である。
また、上記３価の炭化水素基は、好ましくは３価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。具体的には、メタン−１，１，１−トリイル基等が挙げられる。
【０２１７】
ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマーの具体例としては、グリセリンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、ブタントリオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、イノシトールジ（メタ）アクリレート、イノシトールトリ（メタ）アクリレート、イノシトールテトラ（メタ）アクリレート等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０２１８】
また、ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマーを使用する場合、その合計使用量としては、動的結合容量、防汚性の観点から、モノマー総量１００質量部に対し、１〜７０質量部が好ましく、１０〜５０質量部がより好ましく、１５〜４０質量部が好ましい。
【０２１９】
また、上記ヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーとしては、反応性基が、２〜５官能のものが好ましく、２または３官能のものがより好ましい。また、上記ヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーとしては、（メタ）アクリレート系モノマーが好ましく、下記式（３０）または（３１）で表される（メタ）アクリレート系モノマーがより好ましい。
【０２２０】
【化４３】
2018109643.tif 000044
【０２２１】
〔式（３０）中、
Ｒ65〜Ｒ67は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示し、
Ｒ68は、炭素数１〜６の３価の炭化水素基を示す。〕
【０２２２】
【化４４】
2018109643.tif 000045
【０２２３】
〔式（３１）中、
Ｒ69およびＲ70は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示し、
Ｒ71は、炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、
ｔは、１〜５０の整数を示す。〕
【０２２４】
式（３０）中、Ｒ68で示される３価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、その炭素数は、好ましくは２〜４である。
また、上記３価の炭化水素基は、好ましくは３価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。具体的には、プロパン−１，１，１−トリイル基等が挙げられる。
【０２２５】
また、式（３１）中のＲ71で示されるアルカンジイル基の炭素数としては、２または３が好ましく、２がより好ましい。また、斯かるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。具体例としては、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基等が挙げられる。
また、ｔは、１〜５０の整数を示すが、１〜３０の整数が好ましく、１〜２５の整数がより好ましく、１〜２０の整数が更に好ましく、１〜１５の整数が更に好ましく、１〜１０の整数が特に好ましい。
【０２２６】
ヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーの具体例としては、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、２以上のエチレングリコールを含むポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、２以上のエチレングリコールを含むポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０２２７】
また、上記ヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーを使用する場合、その合計使用量としては、動的結合容量、防汚性の観点から、モノマー総量１００質量部に対し、１〜９０質量部が好ましく、５〜７０質量部がより好ましく、１０〜６０質量部が更に好ましく、２０〜５０質量部が特に好ましい。
【０２２８】
工程Ｐ１における（共）重合反応は、チオール化合物存在下で行われるものであるが、チオール化合物の添加は、重合前でも重合中でもよい。チオール化合物の添加により、ラジカル重合中の生長炭素ラジカルが、チオール化合物からの水素引き抜き反応を伴って容易に反応し、水素末端のポリマーと硫黄ラジカルを生成する。この硫黄ラジカルからの再開始により再びポリマー鎖が形成される。このようにチオール化合物が連鎖移動剤として作用し、生成ポリマーの末端にチオール化合物由来の残基が導入される。これにより、得られる担体の親水性が高くなり、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ＝Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等のような不純物が非特異吸着しにくくなり、しかも、リガンドを結合した際の動的結合容量も大きくなる。
【０２２９】
チオール化合物としては、チオグリセロール、２−メルカプトエタノール、３−メルカプト−２−ブタノン、３−メルカプト−１−プロパノール、３−メルカプトイソ酪酸等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。また、２個以上のチオール基を有する多官能チオール化合物を使用してもよい。チオール化合物を使用した場合には、重合時のポア分布の変動や粒子表面が親水化することによってリガンドを結合させた場合の動的結合容量が向上することが見込める。
上記チオール化合物の使用量は、モノマー総量１００質量部に対し、０．０１〜２００質量部が好ましく、１〜１５０質量部がより好ましく、１０〜１００質量部が特に好ましい。
なお、上記のとおりチオール化合物の添加は重合前でも重合中でもよいが、重合開始剤の投入と同時または重合開始剤の投入後にチオール化合物を添加する場合は、重合開始剤の投入から、好ましくは０〜５時間以内、より好ましくは０〜３時間以内、さらに好ましくは０〜１時間以内にチオール化合物を添加する。また、チオール化合物の添加は、塩基性触媒存在下で行ってもよい。
【０２３０】
上記モノマーを重合させるための重合開始剤としてはラジカル重合開始剤が好ましい。ラジカル重合開始剤としては、例えば、アゾ系開始剤、過酸化物系開始剤、レドックス系開始剤等が挙げられ、具体的には、アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソ酪酸メチル、アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル、過酸化ベンゾイル、過酸化ジ−ｔｅｒｔ−ブチル、過酸化ベンゾイル−ジメチルアニリン等が挙げられる。
重合開始剤の合計使用量は、通常、モノマー総量１００質量部に対して、０．０１〜１０質量部程度である。
【０２３１】
また、工程Ｐ１における（共）重合反応は、懸濁重合が好ましい。懸濁重合の具体的な手法としては、例えば、モノマーおよび必要に応じて多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）に重合開始剤を溶解し、水系媒体中に懸濁させて所定温度まで加熱して重合させる方法や、モノマーおよび必要に応じて多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）に重合開始剤を溶解し、所定温度まで加熱した水系媒体中に添加して重合させる方法、モノマーおよび必要に応じて多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）を、水系媒体中に懸濁させて所定温度まで加熱して、重合開始剤を添加し重合させる方法等が挙げられる。
【０２３２】
上記多孔化剤としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン等の脂肪族炭化水素類；シクロヘキサン、シクロペンタン等の脂環式炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、ナフタレン、エチルベンゼン等の芳香族炭化水素類；四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、テトラクロロエタン、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類；ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、ヘキサノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ヘキサノール等の脂肪族アルコール類；シクロヘキサノール等の脂環式アルコール類；２−フェニルエチルアルコール、ベンジルアルコール等の芳香族アルコール類；ジエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン、アセトフェノン、２−オクタノン、シクロヘキサノン等のケトン類；ジブチルエーテル、ジイソブチルエーテル、アニソール、エトキシベンゼン等のエーテル類；酢酸イソペンチル、酢酸ブチル、酢酸−３−メトキシブチル、マロン酸ジエチル等のエステル類の他、非架橋性ビニルモノマーのホモポリマー等の線状重合物が挙げられる。多孔化剤は単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。
上記多孔化剤の合計使用量は、通常、モノマー総量１００質量部に対して４０〜４００質量部程度である。
【０２３３】
上記水系媒体としては、例えば水溶性高分子水溶液等が挙げられ、水溶性高分子としては、例えばヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン等が挙げられる。
水系媒体の合計使用量は、モノマー総量１００質量部に対して、通常、２００〜７０００質量部程度である。
【０２３４】
また、水系媒体の分散媒として水を用いる場合、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸カルシウム等の分散安定剤を使用してもよい。
【０２３５】
また、工程Ｐ１の重合反応には、アルキル硫酸エステル塩、アルキルアリール硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、脂肪酸塩等のアニオン性界面活性剤をはじめとする各種界面活性剤を用いてもよい。
また、亜硝酸ナトリウム等の亜硝酸塩、ヨウ化カリウム等のヨウ化物塩、ｔｅｒｔ−ブチルピロカテコール、ベンゾキノン、ピクリン酸、ハイドロキノン、塩化銅、塩化第二鉄等の重合禁止剤を用いることもできる。
【０２３６】
また、重合温度は重合開始剤に応じて決定すればよいが、例えば、通常２〜１００℃程度であり、アゾビスイソブチロニトリルを重合開始剤として用いる場合は、５０〜１００℃が好ましく、６０〜９０℃がより好ましい。
また、重合時間は通常５分〜４８時間、好ましくは１０分〜２４時間である。
【０２３７】
（工程Ｐ２−１）
工程Ｐ２−１は、リガンドを結合するための反応性基を有するモノマーに由来するリガンドを結合するための反応性基の一部に、架橋剤を開環付加させ、架橋剤由来の架橋構造を固相担体に導入する架橋化反応である。これにより、固相担体表面等に架橋構造が形成される。このような特定の架橋構造を固相担体に導入することによって、高い親水性と優れた耐圧性能が両立される。
【０２３８】
上記架橋剤としては、２〜６価の多価の架橋剤が好ましく、２または３価の架橋剤がより好ましく、下記式（２２）で表される架橋剤が好ましい。
【０２３９】
【化４５】
2018109643.tif 000046
【０２４０】
〔式（２２）中、
Ｒ52は、炭素数１〜１０の２価の有機基を示し、
Ｘ11およびＸ12は、それぞれ独立して、ヒドロキシ基、アミノ基またはチオール基を示す。〕
【０２４１】
Ｒ52における２価の有機基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、斯かる２価の有機基としては、２価の炭化水素基、２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基およびエステル結合から選ばれる１種以上を有する基が挙げられる。
【０２４２】
また、上記２価の有機基が２価の炭化水素基である場合、その炭素数は、好ましくは１〜２０であり、より好ましくは１〜１０であり、更に好ましくは１〜６であり、特に好ましくは２〜６である。また、２価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
また、上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。
アルカンジイル基の具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。
【０２４３】
また、上記２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基およびエステル結合から選ばれる１種以上を有する基としては、２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合を有する基が好ましく、−Ｒa（ＯＲb）qＯＲc−で表される基がより好ましい（Ｒa、ＲbおよびＲcは、それぞれ独立して炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、ｑは０〜３０の整数を示す）。
【０２４４】
上記Ｒa、ＲbおよびＲcで示されるアルカンジイル基の炭素数としては、２または３が好ましく、２がより好ましい。また、斯かるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよいが、好適な具体例としては、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基が挙げられる。
また、ｑは０〜３０の整数を示すが、０〜２５の整数が好ましく、０〜２０の整数がより好ましく、０〜１５の整数が更に好ましく、０〜１０の整数が更に好ましく、０〜５の整数が更に好ましく、０〜３の整数が特に好ましい。
【０２４５】
Ｘ11およびＸ12は、それぞれ独立して、ヒドロキシ基、アミノ基またはチオール基を示すが、チオール基が好ましい。
【０２４６】
架橋剤の種類としては、例えば、１，２−エタンジチオール、１，３−プロパンジチオール、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール、２，３−ジメルカプト−１−プロパノール、ビス（２−メルカプトエチル）スルフィド、トリス（メルカプト酢酸）トリメチロールプロパン、ビス（メルカプト酢酸）エチレングリコール、（±）−ジチオスレイトールなどが挙げられる。
架橋反応の反応温度は、通常２５〜２００℃であるが、好ましくは５０〜１００℃である。
架橋反応の反応時間は、通常３０分〜２４時間程度であり、好ましくは１〜１２時間程度である。
【０２４７】
（工程Ｐ２−２）
工程Ｐ２−２は、酸化剤を用いるなどして、チオール化合物由来のチオ基や架橋構造中のチオ基を酸化する工程である。工程Ｐ２−２により、これらチオ基は、スルフィニル基またはスルホニル基に、好ましくはスルフィニル基に酸化される。
【０２４８】
上記酸化剤は、有機酸化剤と無機酸化剤とに大別され、有機酸化剤としては、例えば、過酢酸、過安息香酸、メタクロロ過安息香酸等が挙げられる。一方、無機酸化剤としては、例えば、過酸化水素、クロム酸、過マンガン酸塩等が挙げられる。なお、これら酸化剤は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
また、酸化剤の合計使用量は、チオ基１モルに対し、通常０．１〜１０モル当量程度であるが、好ましくは０．５〜３モル当量である。
【０２４９】
また、上記酸化反応は、溶媒存在下で行うのが好ましい。斯かる溶媒としては、水；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒；メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒等が挙げられ、これら溶媒は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
上記溶媒の合計使用量は、原料となる固相担体に対し、通常１〜５０質量倍程度であるが、好ましくは５〜１５質量倍である。
【０２５０】
また、上記酸化反応の反応時間は特に限定されないが、通常１〜７２時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常１〜９０℃程度である。
【０２５１】
なお、上記各工程で得られる固相担体は、必要に応じて多孔化剤や未反応モノマーを蒸留、抽出、洗浄等により除去することで得ることができる。
【０２５２】
（工程Ｐ３）
リガンドの固定は、上記で得られた固相担体を用いる以外は常法と同様にして行えばよいが、塩を添加したバッファー下で行うのが好ましい。塩の種類としては、クエン酸三ナトリウム、硫酸ナトリウム等が挙げられ、上記バッファーとしては、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ホウ酸等が挙げられる。バッファーの合計使用量は、原料となる固相担体に対し、通常２０〜８０質量倍程度であるが、好ましくは３５〜４５質量倍である。
また、反応時間は特に限定されないが、通常０．５〜７２時間程度であり、反応温度は通常１〜４０℃程度である。
なお、リガンドが固定された担体を、チオール化合物と接触させ、未反応の反応性基を開環させてもよい。
【０２５３】
そして、本発明のアフィニティ精製用担体Ｄは、高い親水性を備え、優れた防汚性を有し、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ＝Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等のような不純物が非特異吸着しにくく、しかも、リガンドが固定された場合には高い動的結合容量を発揮する。したがって、本発明のアフィニティ精製用担体Ｄは、クロマトグラフィーカラム用充填剤の担体として有用である。
【０２５４】
＜クロマトグラフィーカラム＞
本発明のクロマトグラフィーカラムは、本発明の製造方法Ｃで得られるアフィニティクロマトグラフィー用充填剤、または本発明のアフィニティ精製用担体Ｄを担体とするクロマトグラフィーカラム用充填剤が、カラム容器に充填されているものである。該クロマトグラフィーカラムはアフィニティクロマトグラフィーへの使用に適する。
【０２５５】
＜標的物質の精製方法＞
本発明の標的物質の精製方法は、標的物質を含む組成物を用意する工程と、上記クロマトグラフィーカラムに前記組成物を通液する工程を含むことを特徴とするものである。上記標的物質としては、タンパク質が挙げられる。
また、精製は本発明のクロマトグラフィーカラムを用いる以外は常法に従い行えばよい。例えば、標的物質を含む組成物を準備する準備工程と、上記クロマトグラフィーカラムに前記組成物を通液する通液工程と、該通液工程により担体に吸着された標的物質を溶出させる溶出工程を含む方法が挙げられる。なお、溶出の後に、充填剤をアルカリ洗浄してもよい。
本発明の精製方法は、タンパク質の精製に適し、イムノグロブリンの精製に特に適する。
【実施例】
【０２５６】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【０２５７】
実施例１〜５および比較例１〜２における各分析条件を以下に示す。
（体積平均粒径）
平均粒径は、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン・コールター社製  ＬＳ１３３２０）にて測定した。
【０２５８】
（比表面積）
比表面積は、水銀ポロシメーター（島津製作所社製  オートポアＩＶ９５２０）を用いて、細孔径の測定範囲を１０−５０００ｎｍとして測定した。
【０２５９】
＜実施例１＞
（実施例１−１）
（１）３６０ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製  ＰＶＡ−２１７）０．７２ｇを添加し、加熱撹拌してポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製  エマール１０Ｇ）０．１８ｇ、炭酸ナトリウム（和光純薬社製）０．３６ｇ、および亜硝酸ナトリウム（和光純薬社製）０．１８ｇを添加し、撹拌して水溶液（Ｓ−１）を調製した。
一方、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）６．８８ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）１．３７ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）４．１２ｇおよびポリエチレングリコール＃４００ジメタクリレート（新中村化学社製、９Ｇ）１．３７ｇからなる単量体組成物を、２−オクタノン（東洋合成社製）２０．６３ｇおよびアセトフェノン（井上香料製造所社製）５．３０ｇの混液に溶解させ、単量体溶液（Ｍ−１）を調製した。
次いで、上記水溶液（Ｓ−１）を、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、攪拌翼および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液（Ｍ−１）を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２'−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．５３ｇを添加し、内温を８６℃に維持した。
（２）その後、上記反応液にチオグリセロール（旭化学工業社製）３１．３９ｇを添加し、８６℃に温度を維持し、３時間撹拌を行い、チオグリセロール処理粒子（ＰＡ−１）を得た。
次いで、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子（ＰＡ−１）を純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。ここで得られた粒子を、チオグリセロール処理粒子（ＰＡ−２）とする。
次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように粒子を純水に分散させ、本発明の固相担体Ａであるチオグリセロール処理粒子（ＰＡ−２）の分散液を得た。ここで得られた分散液を、分散液（Ｌ−１）とする。
【０２６０】
（実施例１−２）
実施例１−１で得た分散液（Ｌ−１）に過酸化水素（和光純薬工業社製）４．３０ｇを添加した後、２５℃で２４時間転倒混和し、粒子をスルホキシド化した。その後、この反応液をろ過し、純水で洗浄した。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように粒子を純水に分散させ、本発明の固相担体Ａであるスルホキシド化粒子（ＰＡ−３）の分散液を得た。ここで得られた分散液を、スルホキシド化粒子分散液（Ｌ−２）とする。
【０２６１】
（実施例１−３）
配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡがｐＥＴ−２４（ａ）に挿入されたベクターを宿主（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３））に導入して作製される遺伝子組換え大腸菌が発現する配列番号２のアミノ酸配列で表される改変プロテインＡ  ０．１５ｇを、１．０Ｍクエン酸三ナトリウム／０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）４０ｍＬに分散させプロテインＡ分散液を得て、このプロテインＡ分散液に、実施例１−２で得たスルホキシド化粒子分散液（Ｌ−２）を粒子乾燥質量換算で１ｇ添加した。得られた分散液を２５℃で５時間振とう撹拌し、プロテインＡを粒子に固定した。
生成したプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）で洗浄した後、１．０Ｍチオグリセロール／０．１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で１７時間振とう撹拌することで、過剰量のチオグリセロールで未反応のエポキシ基を開環させた。
その後、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で順次洗浄し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤１を得た。
アフィニティクロマトグラフィー用充填剤１の体積平均粒径は、６４μｍであり、比表面積は、９３ｍ2／ｇであった。
【０２６２】
＜実施例２＞
配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡがｐＥＴ−２４（ａ）に挿入されたベクターを宿主（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３））に導入して作製される遺伝子組換え大腸菌が発現する配列番号２のアミノ酸配列で表される改変プロテインＡ  ０．１５ｇを、１．０Ｍクエン酸三ナトリウム／０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）４０ｍＬに分散させプロテインＡ分散液を得て、このプロテインＡ分散液に、実施例１−１で得た分散液（Ｌ−１）を粒子乾燥質量換算で１ｇ添加した。得られた分散液を２５℃で５時間振とう撹拌し、プロテインＡを粒子に固定した。
生成したプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）で洗浄した後、１．０Ｍチオグリセロール／０．１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で１７時間振とう撹拌することで、過剰量のチオグリセロールで未反応のエポキシ基を開環させた。
その後、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤２を得た。
アフィニティクロマトグラフィー用充填剤２の体積平均粒径は、６４μｍであり、比表面積は、９２ｍ2／ｇであった。
【０２６３】
＜実施例３＞
単量体組成物を、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）６．８８ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）１．３８ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）３．０３ｇおよびポリエチレングリコール＃４００ジメタクリレート（新中村化学社製、９Ｇ）２．４８ｇからなる単量体組成物に変更した以外は実施例１−１〜１−３と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤３を得た。
アフィニティクロマトグラフィー用充填剤３の体積平均粒径は、６７μｍであり、比表面積は、９２ｍ2／ｇであった。
【０２６４】
＜実施例４＞
単量体組成物を、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）６．８７ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）１．３７ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）４．１２ｇおよびメトキシポリエチレングリコール＃４００メタクリレート（新中村化学社製、Ｍ−９０Ｇ）１．３７ｇからなる単量体組成物に変更した以外は実施例１−１〜１−３と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤４を得た。
アフィニティクロマトグラフィー用充填剤４の体積平均粒径は、７０μｍであり、比表面積は、９４ｍ2／ｇであった。
【０２６５】
＜実施例５＞
単量体組成物を、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）７．４１ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）１．３７ｇおよびトリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）４．９４ｇからなる単量体組成物に変更し、２，２'−アゾイソブチロニトリルの使用量を０．５３ｇから０．９３ｇに、実施例１−１の（２）におけるチオグリセロールの添加量を３１．３９ｇから５６．３７ｇにそれぞれ変更した以外は実施例１−１〜１−３と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤５を得た。なお、上記チオグリセロールの添加工程を実施例５（２）とする。
アフィニティクロマトグラフィー用充填剤５の体積平均粒径は、６７μｍであり、比表面積は、９５ｍ2／ｇであった。
【０２６６】
＜比較例１＞
実施例１−１の（２）におけるチオグリセロールの添加と、過酸化水素によるスルホキシド化（実施例１−２の工程）を行わない以外は、実施例１−１〜１−３と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤６を得た。
アフィニティクロマトグラフィー用充填剤６の体積平均粒径は、８６μｍであり、比表面積は、９７ｍ2／ｇであった。
【０２６７】
＜比較例２＞
実施例５（２）におけるチオグリセロールの添加と、過酸化水素によるスルホキシド化（実施例１−２の工程）を行わない以外は、実施例５と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤７を得た。
アフィニティクロマトグラフィー用充填剤７の体積平均粒径は、７４μｍであり、比表面積は、９５ｍ2／ｇであった。
【０２６８】
＜試験例１  動的結合容量（ＤＢＣ）測定試験＞
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓを用いて、線流速６０ｃｍ／ｈｒにおけるタンパク質（ヒトＩｇＧ抗体、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ社製  ＨＧＧ−１０００）に対する実施例１〜５および比較例１〜２の充填剤１〜７のＤＢＣを測定した。カラム容器は容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）のものを、タンパク質は２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）で２５ｍｇ／ｍＬに希釈したものをそれぞれ使用し、充填剤を４ｍＬ充填して、溶出先端１０％ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からＤＢＣを求めた。結果を表１に示す。
【０２６９】
＜試験例２  防汚性試験＞
実施例１〜５および比較例１〜２の充填剤１〜７を２ｍＬ、シリンジカラム（内径１．５ｃｍ）にそれぞれ充填し、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液(ｐＨ７．５)で置換した後、濃度が０．００１５質量％となるようにフェノールレッドを溶解させた２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液(ｐＨ７．５)を１０ｍＬ流した。
次いで、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液(ｐＨ７．５)１０ｍＬで洗浄し、５０ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ３．２）１０ｍＬ、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液(ｐＨ７．５)１０ｍＬを順次流した。次いで、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ流し、以下の評価基準に従い充填剤の防汚性を目視で評価した。結果を表１に示す。
【０２７０】
（防汚性評価基準）
◎：着色がほぼ確認できない
○：着色が少し確認できる
△：着色が確認できる
×：着色がひどく、はっきりと確認できる
【０２７１】
【表１】
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【０２７２】
実施例２の充填剤２と比較例１の充填剤６についての試験例１および２の結果から、チオグリセロール処理をプロテインＡ固定前に行っておき、チオグリセロール処理粒子を固相担体として用いることによって、ＤＢＣが大きく、防汚性に優れた充填剤が得られることがわかる。
また、実施例１の充填剤１と比較例１の充填剤６についての試験例１および２の結果から、プロテインＡ固定前にチオグリセロール処理粒子をスルホキシド化しておき、スルホキシド化粒子を固相担体として用いることによって、ＤＢＣが大きく、防汚性に優れた充填剤が得られることがわかる。
【０２７３】
＜実施例６＞
（１）グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）８．２３ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）１．３７ｇおよびトリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）４．１２ｇからなる単量体組成物を、２−オクタノン（東洋合成社製）２０．６３ｇおよびアセトフェノン（井上香料製造所社製）５．３０ｇの混液に溶解させ、単量体溶液（Ｍ−２）を調製した。
次いで、実施例１−１と同様にして調製した水溶液（Ｓ−１）を、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、攪拌翼および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液（Ｍ−２）を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２'−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．５３ｇを添加し、内温を８６℃に維持した。
（２）その後、上記反応液にチオグリセロール（旭化学工業社製）６．２６ｇを添加し、８６℃に温度を維持し、３時間撹拌を行うことで、チオグリセロール存在下での重合反応を行った。
（３）次いで、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子を純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように粒子を純水に分散させた。この分散液を、チオグリセロール処理粒子分散液（Ｌ−３）とする。
（４）上記チオグリセロール処理粒子分散液（Ｌ−３）に過酸化水素（和光純薬工業社製）４．３０ｇを添加した後、２５℃で２４時間転倒混和し、粒子をスルホキシド化した。その後、この反応液をろ過し、純水で洗浄した。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように粒子を純水に分散させた。この分散液を、スルホキシド化粒子分散液（Ｌ−４）とする。
（５）配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡがｐＥＴ−２４（ａ）に挿入されたベクターを宿主（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３））に導入して作製される遺伝子組換え大腸菌が発現する配列番号２のアミノ酸配列で表される改変プロテインＡ  ０．１５ｇを、１．０Ｍクエン酸三ナトリウム／０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）４０ｍＬに分散させプロテインＡ分散液を得て、このプロテインＡ分散液に上記スルホキシド化粒子分散液（Ｌ−４）（粒子乾燥質量換算で１ｇ）を添加した。この分散液を２５℃で５時間振とう撹拌し、プロテインＡを粒子に固定した。
生成したプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）で洗浄した後、１．０Ｍチオグリセロール／０．１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で１７時間振とう撹拌することで、過剰量のチオグリセロールで未反応のエポキシ基を開環させた。
その後、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で順次洗浄し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤８を得た。
【０２７４】
＜実施例７＞
実施例６の工程（１）の部分において、単量体組成物の組成を、グリシジルメタクリレート８．８７ｇ、グリセロールモノメタクリレート１．４８ｇおよびグリセリンジメタクリレート（新中村化学工業社製）４．４４ｇとし、工程（２）の部分においてチオグリセロールの添加の部分を２−メルカプトエタノール（東京化成工業社製）４．８８ｇの添加に変更した以外は実施例６と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤９を得た。
【０２７５】
＜実施例８＞
実施例６の工程（１）の部分において、単量体組成物の組成を、グリシジルメタクリレート８．７９ｇ、グリセロールモノメタクリレート１．４６ｇおよびエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）４．４０ｇとし、工程（２）の部分においてチオグリセロールの添加の部分を３−メルカプト−２−ブタノン（東京化成工業社製）５．４３ｇの添加に変更した以外は実施例６と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤１０を得た。
【０２７６】
＜実施例９＞
実施例６の工程（１）の部分において、単量体組成物の組成を、グリシジルメタクリレート８．８６ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）０．７４ｇおよびトリメチロールプロパントリメタクリレート５．１７ｇとし、工程（２）の部分においてチオグリセロールの添加の部分を３−メルカプト−１−プロパノール（東京化成工業社製）４．８１ｇの添加に変更し、工程（４）の粒子のスルホキシド化を行わない以外は実施例６と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤１１を得た。
【０２７７】
＜実施例１０＞
実施例６の工程（１）の部分において、単量体組成物の組成を、グリシジルメタクリレート７．４１ｇ、グリセロールモノメタクリレート１．４８ｇおよびトリメチロールプロパントリメタクリレート５．９３ｇに変更した以外は、実施例６の工程（１）および（２）と同様の操作を行った。
次いで、反応液を２５℃まで冷却し、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール（丸善油化社製）を４５．５６ｇ添加して３０分撹拌した後に温水バスによって再び加温し、内温が８５℃に到達した時点から５時間撹拌しながら８５℃に温度を維持することで、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオールを用いた架橋化を行った。
その後、実施例６の工程（３）〜（５）と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤１２を得た。
【０２７８】
＜実施例１１＞
実施例６の工程（１）の部分において、単量体組成物の組成を、グリシジルメタクリレート７．４１ｇ、グリセロールモノメタクリレート１．４８ｇおよびトリメチロールプロパントリメタクリレート５．９３ｇとし、工程（２）の部分においてチオグリセロールの添加の部分を３−メルカプトイソ酪酸６．９６ｇに変更した以外は実施例６と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤１３を得た。
【０２７９】
＜比較例３＞
実施例６の工程（１）の後、工程（２）のチオグリセロールの添加を行わず、反応液を２５℃まで冷却し、３,６−ジオキサ−１,８−オクタンジチオールを４５．５６ｇ添加して実施例１０と同様の架橋化を行った以外は、実施例６と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤１４を得た。
【０２８０】
＜比較例４＞
実施例７におけるチオグリセロールの添加と、過酸化水素によるスルホキシド化（実施例６（４）の工程）を行わない以外は、実施例７と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤１５を得た。
【０２８１】
＜試験例３  平均粒径の測定＞
実施例６〜１１および比較例３〜４で得られたアフィニティクロマトグラフィー用充填剤の平均粒径（体積平均粒径）について、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン・コールター社製  ＬＳ１３３２０）により測定した。結果を表２に示す。
【０２８２】
＜試験例４  プロテインＡ結合量の定量＞
実施例６〜１１および比較例３〜４で得られたアフィニティクロマトグラフィー用充填剤に結合したリガンドであるプロテインＡの結合量を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬を用いて定量した。具体的には、固形分換算で１ｍｇの充填剤をテストチューブに採取し、これをＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔで定量した。反応は、３７℃で３０分間、転倒混和することによって行った。検量線は、担体に結合させたプロテインＡと同一のものを用いて作成した。結果を表２に示す。
【０２８３】
＜試験例５  動的結合容量（ＤＢＣ）測定試験＞
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるタンパク質（ヒトＩｇＧ抗体、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ社製  ＨＧＧ−１０００）に対する実施例６〜１１および比較例３〜４の各充填剤のＤＢＣを測定した。カラム容器は容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）のものを、タンパク質は２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）で５ｍｇ／ｍＬに希釈したものをそれぞれ使用し、充填剤を４ｍＬ充填して、溶出先端１０％ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からＤＢＣを求めた。結果を表２に示す。
【０２８４】
＜試験例６  ＨＣＰの定量＞
カラム容器（ＧＥヘルスケア社製Ｔｒｉｃｏｒｎ１０／５０  ｃｏｌｕｍｎ）に、実施例６〜１１および比較例３〜４の各充填剤を、充填高さ約５ｃｍで充填してカラムを作製した。得られたカラムをＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ  Ｐｌｕｓにそれぞれ接続し、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を５カラム容量（カラム容積の５倍）、流速１ｍＬ／分にて通液し、平衡化させた。
次いで、モノクローナル抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂを含有するＣＨＯ細胞培養上清を、約２３ｍｇ抗体／ｍＬ担体の負荷量で、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液した。
次いで、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、および２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を、それぞれ５カラム容量、流速１ｍＬ／分にてカラムに順次通液した。
その後、５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）を、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液し、カラム内に捕捉されていたモノクローナル抗体を溶出させ、Ａｂｓ．２８０＞１００ｍＡｕの溶出フラクションを回収した。
そして、分光光度計を用い、回収したフラクション中に含有される抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）を測定した。また、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製  ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ，３Ｇを用い、回収したフラクション中に含有されるＨｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を測定した。さらにＨＣＰの濃度を抗体濃度で除することにより、単位抗体量当たりのＨＣＰ量を算出した。結果を表２に示す。
【０２８５】
【表２】
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【０２８６】
実施例６〜１１の充填剤と比較例３〜４の充填剤についての試験例５、６の結果から、重合中にチオエーテルを添加して、鎖の末端にチオ基を介した親水性基を導入することによって、ＤＢＣが大きく、ＨＣＰも低減させる優れた充填剤が得られることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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