(57)【要約】【課題】前立腺癌のための診断マーカーおよび臨床標的としての再発性の遺伝子融合物を提供すること【解決手段】前立腺癌におけるアンドロゲン調節遺伝子またはハウスキーピング遺伝子とＥＴＳファミリーメンバー遺伝子との再発性の遺伝子融合物が記載される。前立腺癌の診断、研究および療法で有用性を有する組成物および方法も提供される。一局面において、本発明は、患者で前立腺癌を同定するための方法を提供し、この方法は、患者からの試料を提供するステップ、および試料中でＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域からの５’部分およびＥＲＧ遺伝子からの３’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップを含み、試料中での遺伝子融合物の存在を検出することによって、患者で前立腺癌を同定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、出願第１１／８２５，５５２号（７／６／０７出願）の一部継続であり、出願第１１／８２５，５５２号は、出願第１１／５１９，３９７号（９／１２／０６出願）の一部継続であり、出願第１１／５１９，３９７号は、仮特許出願第６０／７１６，４３６号（９／１２／０５出願）、同第６０／７７９，０４１号（３／３／０６出願）、同第６０／７３０，３５８号（１０／２７／０５出願）および同第６０／７９５，５９０号（４／２８／０６出願）への優先権を主張する。上記の各々は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府によって資金援助を受けた研究または開発に関する声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与されたＣＡ０６９５６８、ＣＡ１０２８７２およびＣＡ１１１２７５の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、それに限定されないが、癌マーカーを含む、癌の診断、研究および療法のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、前立腺癌のための診断マーカーおよび臨床標的としての再発性の遺伝子融合物に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
癌研究の中心の目的は、発癌の因果関係に関与する変化した遺伝子を同定することである。塩基の置換、挿入、欠失、転位ならびに染色体の増加および減少を含む、数種の体細胞性突然変異が同定されているが、そのすべては癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の活性変化をもたらす。１９００年代前半に最初に仮定されていたが、今では、癌における染色体再配列の起因的役割についての動かぬ証拠がある（非特許文献１）。再発性の染色体異常は、主に白血病、リンパ腫および肉腫の特徴であると考えられた。ずっとより一般的であり、ヒト癌に関連する罹患率および死亡率の比較的大きな割合に寄与する上皮性腫瘍（癌腫）は、公知の、疾患特異的染色体再配列の１％未満を構成する（非特許文献２）。血液悪性疾患は、平衡した、疾患特異的染色体再配列をしばしば特徴とするが、ほとんどの固形腫瘍は過剰の非特異的染色体異常を有する。固形腫瘍の核型複雑性は、癌の進展または進行を通して得られる二次的変化によると思われる。
【０００５】
染色体再配列の２つの主要な機構が記載されている。１つの機構では、１つの遺伝子のプロモーター／エンハンサーエレメントが癌原遺伝子に隣接して再配列され、したがって、発癌性タンパク質の発現変化を引き起こす。この種の転位は、それぞれＢ細胞およびＴ細胞の悪性疾患でのこの癌遺伝子の活性化をもたらす、ＭＹＣへの免疫グロブリン（ＩＧ）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子の付加によって例示される（非特許文献３）。第二の機構では、再配列は２つの遺伝子の融合をもたらし、それは、新しい機能または変化した活性を有することができる融合タンパク質を生成する。この転位の原型例は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）でのＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子融合である（非特許文献４、非特許文献５）。重要なことに、この知見は、ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼを首尾よく標的にする、イマチニブメシレート（Ｇｌｅｅｖｅｃ）の合理的な開発をもたらした。（非特許文献６）。したがって、一般的な上皮性腫瘍で再発性の遺伝子再配列を特定することは、癌創薬の努力ならびに患者の治療に関して奥深い意味を有することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒｏｗｌｅｙ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ（２００１年）１巻：２４５頁
【非特許文献２】Ｍｉｔｅｌｍａｎ、Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ（２０００年）４６２巻：２４７頁
【非特許文献３】Ｒａｂｂｉｔｔｓ、Ｎａｔｕｒｅ（１９９４年）３７２巻：１４３頁
【非特許文献４】Ｒｏｗｌｅｙ、Ｎａｔｕｒｅ（１９７３年）２４３巻：２９０頁
【非特許文献５】ｄｅ  Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８２年）３００巻：７６５頁
【非特許文献６】Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒら、Ｂｌｏｏｄ（２００５年）１０５巻：２６４０頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一部の実施形態では、本発明は、患者で前立腺癌を同定するための方法であって、患者からの試料を提供するステップ、および試料中でＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域からの５’部分およびＥＲＧ遺伝子からの３’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップを含み、試料中での遺伝子融合物の存在を検出することによって、患者で前立腺癌を同定する方法を提供する。一部の実施形態では、ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域は、ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子のプロモーター領域を含む。一部の実施形態では、検出ステップは、ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域からの５’ＤＮＡ部分およびＥＲＧ遺伝子からの３’ＤＮＡ部分を有するゲノムＤＮＡの染色体再配列を検出することを含む。一部の実施形態では、検出ステップは、ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域から転写される５’ＲＮＡ部分およびＥＲＧ遺伝子から転写される３’ＲＮＡ部分を有するキメラｍＲＮＡ転写物を検出することを含む。一部の実施形態では、試料は、組織、血液、血漿、血清、尿、尿上清、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物または前立腺細胞である。
【０００８】
一部の実施形態では、本発明は、患者で前立腺癌を同定するための方法であって、患者からの試料を提供するステップ、および試料中でＦＬＪ３５２９４遺伝子の転写調節領域からの５’部分およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子からの３’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップを含み、試料中での遺伝子融合物の存在を検出することによって、患者で前立腺癌を同定する方法を提供する。一部の実施形態では、ＦＬＪ３５２９４遺伝子の転写調節領域は、ＦＬＪ３５２９４遺伝子のプロモーター領域を含む。一部の実施形態では、ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子は、ＥＴＶ１である。一部の実施形態では、検出ステップは、ＦＬＪ３５２９４遺伝子の転写調節領域からの５’ＤＮＡ部分およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子からの３’ＤＮＡ部分を有するゲノムＤＮＡの染色体再配列を検出することを含む。一部の実施形態では、検出ステップは、ＦＬＪ３５２９４遺伝子の転写調節領域から転写される５’ＲＮＡ部分およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子から転写される３’ＲＮＡ部分を有するキメラｍＲＮＡ転写物を検出することを含む。一部の実施形態では、試料は、組織、血液、血漿、血清、尿、尿上清、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物または前立腺細胞である。
【０００９】
一部の実施形態では、本発明は、患者で前立腺癌を同定するための方法であって、患者からの試料を提供するステップ、および試料中でＤＤＸ５遺伝子からの５’部分およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子からの３’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップを含み、試料中での遺伝子融合物の存在を検出することによって、患者で前立腺癌を同定する方法を提供する。一部の実施形態では、ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子は、ＥＴＶ４である。一部の実施形態では、検出ステップは、ＤＤＸ５遺伝子からの５’ＤＮＡ部分およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子からの３’ＤＮＡ部分を有するゲノムＤＮＡの染色体再配列を検出することを含む。一部の実施形態では、検出ステップは、ＤＤＸ５遺伝子から転写される５’ＲＮＡ部分およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子から転写される３’ＲＮＡ部分を有するキメラｍＲＮＡ転写物を検出することを含む。一部の実施形態では、検出ステップは、ＤＤＸ５遺伝子によってコードされるアミノ（ａｍｉｎｏ）末端部分およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子によってコードされるカルボキシ末端部分を有するキメラタンパク質を検出することを含む。一部の実施形態では、試料は組織、血液、血漿、血清、尿、尿上清、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物または前立腺細胞である。
【００１０】
一部の実施形態では、本発明は、診断、治療および研究の目的のための組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの接合部とハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを含む。一部の実施形態では、組成物は、キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第一のオリゴヌクレオチドプローブ、およびキメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分とハイブリダイズする配列を含む第二のオリゴヌクレオチドプローブを含む。一部の実施形態では、組成物は、キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第一の増幅オリゴヌクレオチド、およびキメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分とハイブリダイズする配列を含む第二の増幅オリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、５’遺伝子によってコードされるアミノ末端部分および３’遺伝子によってコードされるカルボキシ末端部分を有するキメラタンパク質に対する抗体を含む。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態が、下の説明および実施例で提供される。
したがって、本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）
患者で前立腺癌を同定するための方法であって、
（ａ）上記患者からの試料を提供するステップ、ならびに
（ｂ）上記試料中でＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域からの５’部分およびＥＲＧ遺伝子からの３’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップ
を含み、上記試料中での上記遺伝子融合物の存在を検出することによって、上記患者で前立腺癌を同定する、方法。
（項目２）
上記ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の上記転写調節領域が上記ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子のプロモーター領域を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
ステップ（ｂ）が、上記ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の上記転写調節領域からの５’ＤＮＡ部分および上記ＥＲＧ遺伝子からの３’ＤＮＡ部分を有するゲノムＤＮＡの染色体再配列を検出することを含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
ステップ（ｂ）が、上記ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の上記転写調節領域から転写される５’ＲＮＡ部分および上記ＥＲＧ遺伝子から転写される３’ＲＮＡ部分を有するキメラｍＲＮＡ転写物を検出することを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記試料が、組織、血液、血漿、血清、尿、尿上清、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物および前立腺細胞からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目６）
患者で前立腺癌を同定するための方法であって、
（ａ）上記患者からの試料を提供するステップ、ならびに
（ｂ）上記試料中でＦＬＪ３５２９４遺伝子の転写調節領域からの５’部分およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子からの３’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップ
を含み、上記試料中での上記遺伝子融合物の存在を検出することによって、上記患者で前立腺癌を同定する、方法。
（項目７）
上記ＦＬＪ３５２９４遺伝子の上記転写調節領域が上記ＦＬＪ３５２９４遺伝子のプロモーター領域を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
上記ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子がＥＴＶ１である、項目６に記載の方法。
（項目９）
ステップ（ｂ）が、上記ＦＬＪ３５２９４遺伝子の上記転写調節領域からの５’ＤＮＡ部分および上記ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子からの３’ＤＮＡ部分を有するゲノムＤＮＡの染色体再配列を検出することを含む、項目６に記載の方法。
（項目１０）
ステップ（ｂ）が、上記ＦＬＪ３５２９４遺伝子の上記転写調節領域から転写される５’ＲＮＡ部分および上記ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子から転写される３’ＲＮＡ部分を有するキメラｍＲＮＡ転写物を検出することを含む、項目６に記載の方法。
（項目１１）
上記試料が、組織、血液、血漿、血清、尿、尿上清、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物および前立腺細胞からなる群から選択される、項目６に記載の方法。
（項目１２）
患者で前立腺癌を同定するための方法であって、
（ａ）上記患者からの試料を提供するステップ、ならびに
（ｂ）上記試料中でＤＤＸ５遺伝子からの５’部分およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子からの３’部分を有する遺伝子融合物の存在または不在を検出するステップ
を含み、上記試料中での上記遺伝子融合物の存在を検出することによって、上記患者で前立腺癌を同定する、方法。
（項目１３）
上記ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子がＥＴＶ４である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
ステップ（ｂ）が、上記ＤＤＸ５遺伝子からの５’ＤＮＡ部分および上記ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子からの３’ＤＮＡ部分を有するゲノムＤＮＡの染色体再配列を検出することを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
ステップ（ｂ）が、上記ＤＤＸ５遺伝子から転写される５’ＲＮＡ部分および上記ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子から転写される３’ＲＮＡ部分を有するキメラｍＲＮＡ転写物を検出することを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
ステップ（ｂ）が、上記ＤＤＸ５遺伝子によってコードされるアミノ末端部分および上記ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子によってコードされるカルボキシ末端部分を有するキメラタンパク質を検出することを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
上記試料が、組織、血液、血漿、血清、尿、尿上清、尿細胞ペレット、精液、前立腺分泌物および前立腺細胞からなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１８）
組成物であって、以下：
（ａ）キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの接合部とハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、上記キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分がＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域に由来し、上記キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分がＥＲＧ遺伝子に由来する、オリゴヌクレオチドプローブ、
（ｂ）ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域に由来するキメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第一のオリゴヌクレオチドプローブ、およびＥＲＧ遺伝子に由来する上記キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分とハイブリダイズする配列を含む第二のオリゴヌクレオチドプローブ、
（ｃ）ＳＬＣ４５Ａ３遺伝子の転写調節領域に由来するキメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第一の増幅オリゴヌクレオチド、およびＥＲＧ遺伝子に由来する上記キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分とハイブリダイズする配列を含む第二の増幅オリゴヌクレオチド、
（ｄ）キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの接合部とハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、上記キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分がＦＬＪ３５２９４遺伝子の転写調節領域に由来し、上記キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分がＥＴＶ１遺伝子に由来する、オリゴヌクレオチドプローブ、
（ｅ）ＦＬＪ３５２９４遺伝子の転写調節領域に由来するキメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第一のオリゴヌクレオチドプローブ、およびＥＴＶ１遺伝子に由来する上記キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分とハイブリダイズする配列を含む第二のオリゴヌクレオチドプローブ、
（ｆ）ＦＬＪ３５２９４遺伝子の転写調節領域に由来するキメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第一の増幅オリゴヌクレオチド、およびＥＴＶ１遺伝子に由来する上記キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分とハイブリダイズする配列を含む第二の増幅オリゴヌクレオチド、
（ｇ）キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの接合部とハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、上記キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分がＤＤＸ５遺伝子に由来し、上記キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分がＥＴＶ４遺伝子に由来する、オリゴヌクレオチドプローブ、
（ｈ）ＤＤＸ５遺伝子に由来するキメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第一のオリゴヌクレオチドプローブ、およびＥＴＶ４遺伝子に由来する上記キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分とハイブリダイズする配列を含む第二のオリゴヌクレオチドプローブ、
（ｉ）ＤＤＸ５遺伝子に由来するキメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの５’部分とハイブリダイズする配列を含む第一の増幅オリゴヌクレオチド、およびＥＴＶ４遺伝子に由来する上記キメラゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの３’部分とハイブリダイズする配列を含む第二の増幅オリゴヌクレオチド、
（ｊ）上記ＤＤＸ５遺伝子によってコードされるアミノ末端部分および上記ＥＴＶ４遺伝子によってコードされるカルボキシ末端部分を有するキメラタンパク質に対する抗体
のうちの少なくとも１つを含む、組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】図１は、マイクロアレイデータの癌のアウトライアープロファイル分析（ＣＯＰＡ）を示す。（Ａ）２つの大規模な遺伝子発現研究におけるすべてのプロファイルされた試料から得られたＥＴＶ１（左パネル）およびＥＲＧ（中央パネル）発現（標準化発現ユニット）を示す。（Ｂ）（Ａ）に示すように、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションされた試料からのデータ以外を使用した。（Ｃ）（Ａ）に示すように、複数の骨髄腫における免疫グロブリン重鎖プロモーター（ＩｇＨ）への公知の転位を有する癌遺伝子（ＦＧＦＲ３およびＣＣＮＤ１）以外を試験した。
【図１−２】図１は、マイクロアレイデータの癌のアウトライアープロファイル分析（ＣＯＰＡ）を示す。（Ａ）２つの大規模な遺伝子発現研究におけるすべてのプロファイルされた試料から得られたＥＴＶ１（左パネル）およびＥＲＧ（中央パネル）発現（標準化発現ユニット）を示す。（Ｂ）（Ａ）に示すように、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションされた試料からのデータ以外を使用した。（Ｃ）（Ａ）に示すように、複数の骨髄腫における免疫グロブリン重鎖プロモーター（ＩｇＨ）への公知の転位を有する癌遺伝子（ＦＧＦＲ３およびＣＣＮＤ１）以外を試験した。
【図１−３】図１は、マイクロアレイデータの癌のアウトライアープロファイル分析（ＣＯＰＡ）を示す。（Ａ）２つの大規模な遺伝子発現研究におけるすべてのプロファイルされた試料から得られたＥＴＶ１（左パネル）およびＥＲＧ（中央パネル）発現（標準化発現ユニット）を示す。（Ｂ）（Ａ）に示すように、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションされた試料からのデータ以外を使用した。（Ｃ）（Ａ）に示すように、複数の骨髄腫における免疫グロブリン重鎖プロモーター（ＩｇＨ）への公知の転位を有する癌遺伝子（ＦＧＦＲ３およびＣＣＮＤ１）以外を試験した。
【図２−１】図２は、前立腺癌（ＰＣＡ）におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合物およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合物の同定および特徴付けを示す。（Ａ）前立腺癌細胞株（ＤｕＣａＰ、ＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ）およびホルモン抵抗性転移性（ＭＥＴ）前立腺癌組織を、ＥＲＧ（黒塗りのバー）およびＥＴＶ１（白抜きのバー）のｍＲＮＡ発現を定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）により分析したものである。（Ｂ）ＬＮＣａＰ細胞と対比したＭＥＴ２６におけるＥＴＶ１のエクソン２および３の過剰発現の消失。（Ｃ）ＴＭＰＲＳＳ２への遺伝子融合物を明らかにする、ＭＥＴ２６−ＬＮにおけるＥＴＶ１およびＭＥＴ２８−ＬＮにおけるＥＲＧに対する、ｃＤＮＡ末端の５’ＲＮＡリガーゼ介在性急速増幅（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ）の結果の概略。（Ｄ）ＭＥＴ２６−ＬＮおよびＭＥＴ２６−ＲＰにおいて転位特異性ＱＰＣＲを用いたＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１発現の検証。（Ｅ）細胞株およびＰＣＡ標本において転位特異性ＱＰＣＲを用いたＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ発現の検証。
【図２−２】図２は、前立腺癌（ＰＣＡ）におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合物およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合物の同定および特徴付けを示す。（Ａ）前立腺癌細胞株（ＤｕＣａＰ、ＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ）およびホルモン抵抗性転移性（ＭＥＴ）前立腺癌組織を、ＥＲＧ（黒塗りのバー）およびＥＴＶ１（白抜きのバー）のｍＲＮＡ発現を定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）により分析したものである。（Ｂ）ＬＮＣａＰ細胞と対比したＭＥＴ２６におけるＥＴＶ１のエクソン２および３の過剰発現の消失。（Ｃ）ＴＭＰＲＳＳ２への遺伝子融合物を明らかにする、ＭＥＴ２６−ＬＮにおけるＥＴＶ１およびＭＥＴ２８−ＬＮにおけるＥＲＧに対する、ｃＤＮＡ末端の５’ＲＮＡリガーゼ介在性急速増幅（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ）の結果の概略。（Ｄ）ＭＥＴ２６−ＬＮおよびＭＥＴ２６−ＲＰにおいて転位特異性ＱＰＣＲを用いたＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１発現の検証。（Ｅ）細胞株およびＰＣＡ標本において転位特異性ＱＰＣＲを用いたＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ発現の検証。
【図２−３】図２は、前立腺癌（ＰＣＡ）におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合物およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合物の同定および特徴付けを示す。（Ａ）前立腺癌細胞株（ＤｕＣａＰ、ＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ）およびホルモン抵抗性転移性（ＭＥＴ）前立腺癌組織を、ＥＲＧ（黒塗りのバー）およびＥＴＶ１（白抜きのバー）のｍＲＮＡ発現を定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）により分析したものである。（Ｂ）ＬＮＣａＰ細胞と対比したＭＥＴ２６におけるＥＴＶ１のエクソン２および３の過剰発現の消失。（Ｃ）ＴＭＰＲＳＳ２への遺伝子融合物を明らかにする、ＭＥＴ２６−ＬＮにおけるＥＴＶ１およびＭＥＴ２８−ＬＮにおけるＥＲＧに対する、ｃＤＮＡ末端の５’ＲＮＡリガーゼ介在性急速増幅（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ）の結果の概略。（Ｄ）ＭＥＴ２６−ＬＮおよびＭＥＴ２６−ＲＰにおいて転位特異性ＱＰＣＲを用いたＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１発現の検証。（Ｅ）細胞株およびＰＣＡ標本において転位特異性ＱＰＣＲを用いたＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ発現の検証。
【図２−４】図２は、前立腺癌（ＰＣＡ）におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合物およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合物の同定および特徴付けを示す。（Ａ）前立腺癌細胞株（ＤｕＣａＰ、ＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ）およびホルモン抵抗性転移性（ＭＥＴ）前立腺癌組織を、ＥＲＧ（黒塗りのバー）およびＥＴＶ１（白抜きのバー）のｍＲＮＡ発現を定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）により分析したものである。（Ｂ）ＬＮＣａＰ細胞と対比したＭＥＴ２６におけるＥＴＶ１のエクソン２および３の過剰発現の消失。（Ｃ）ＴＭＰＲＳＳ２への遺伝子融合物を明らかにする、ＭＥＴ２６−ＬＮにおけるＥＴＶ１およびＭＥＴ２８−ＬＮにおけるＥＲＧに対する、ｃＤＮＡ末端の５’ＲＮＡリガーゼ介在性急速増幅（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ）の結果の概略。（Ｄ）ＭＥＴ２６−ＬＮおよびＭＥＴ２６−ＲＰにおいて転位特異性ＱＰＣＲを用いたＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１発現の検証。（Ｅ）細胞株およびＰＣＡ標本において転位特異性ＱＰＣＲを用いたＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ発現の検証。
【図３】図３は、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１遺伝子融合物およびＥＲＧ遺伝子再配列を確認する、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織切片での間期蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を示す。（ＡおよびＢ）は、ＴＭＰＲＳＳ２（緑シグナル）とＥＴＶ１（赤シグナル）の融合物を検出するための２色、融合シグナルアプローチを示す。（ＣおよびＤ）は、ＥＲＧの５’（緑シグナル）および３’（赤シグナル）領域に及ぶ２つのプローブを２色分断シグナルアプローチに用いたＥＲＧ遺伝子再配列の検出を示す。（Ｅ）は、臨床的に局在化した前立腺癌（ＰＣＡ）の１３症例と転移性前立腺癌（ＭＥＴ）の１６症例由来のコアを含む独立した組織マイクロアレイに（Ａ−Ｄ）と同じプローブを用いたＦＩＳＨ結果のマトリックス表示を示す。
【図４】図４は、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ転位を担持する前立腺癌細胞におけるＥＲＧのアンドロゲン制御を示す。
【図５−１】図５は、癌のアウトライアープロファイル分析（ＣＯＰＡ）を示す。図５Ａは、ＣＯＰＡ分析の概略を示す。図５Ｂは、ＲＵＮＸ１Ｔ１（ＥＴＯ）がＶａｌｋらの急性骨髄性白血病データセット（ｎ＝２９３）における９０パーセンタイルでの最も高いスコアのアウトライアープロファイルを有したことを示す。図５Ｃは、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１のアウトライアー発現プロファイルを示す。
【図５−２】図５は、癌のアウトライアープロファイル分析（ＣＯＰＡ）を示す。図５Ａは、ＣＯＰＡ分析の概略を示す。図５Ｂは、ＲＵＮＸ１Ｔ１（ＥＴＯ）がＶａｌｋらの急性骨髄性白血病データセット（ｎ＝２９３）における９０パーセンタイルでの最も高いスコアのアウトライアープロファイルを有したことを示す。図５Ｃは、５２Ａ−ＰＢＸ１のアウトライアー発現プロファイルを示す。
【図６】図６は、ＴＭＰＲＳＳ２（ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧｂ融合物）との遺伝子融合物を明らかにする、ＭＥＴ２６−ＬＮにおけるＥＴＶ１およびＰＣＡ４におけるＥＲＧについてのｃＤＮＡ末端のＲＮＡリガーゼ介在性急速増幅結果（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ）の概略を示す。
【図７】図７は、前立腺癌におけるＥＴＳファミリーメンバーの過剰発現を示す。全体解剖組織（Ａ）、またはレーザーキャプチャーマイクロダイセクションにより摘出した組織（Ｂ）由来のプロファイルした良性前立腺、前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）、臨床的に局在化した前立腺癌、および転移性前立腺癌におけるモニターしたＥＴＳファミリーメンバーのすべての発現をＯｎｃｏｍｉｎｅを利用して視覚化したものである。
【図８−１】図８は、ＥＴＶ４を過剰発現している、前立腺癌の症例におけるＴＭＰＲＳＳ２およびＥＴＶ４遺伝子座の過剰発現を示す。Ａは、プールした良性前立腺組織（ＣＰＰ）におけるＥＴＶ４の図示のエクソンまたは領域、ＥＴＶ４を過剰発現せず、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ陽性（ＰＣＡ１−２）または陰性（ＰＣＡ３−４）であった前立腺癌、およびＥＴＶ４超過剰発現を有する本発明者らのＬＣＭ集団（ｃｏｈｏｒｔ）由来の前立腺癌の症例（ＰＣＡ５）の発現を示す。Ｂは、ＲＬＭ−ＲＡＣＥが、ＰＣＡ５におけるＴＭＰＲＳＳ２の上流の配列のＥＴＶ４との融合を明らかにする。Ｃは、ＰＣＡ５における、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４ａおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４ｂのＱＰＣＲによる発現を示す。Ｄは、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織での間期蛍光インサイチュハイブリダイゼーションが、ＰＣＡ５における、ＴＭＰＲＳＳ２およびＥＴＶ４遺伝子座の融合を確認していることを示す。
【図８−２】図８は、ＥＴＶ４を過剰発現している、前立腺癌の症例におけるＴＭＰＲＳＳ２およびＥＴＶ４遺伝子座の過剰発現を示す。Ａは、プールした良性前立腺組織（ＣＰＰ）におけるＥＴＶ４の図示のエクソンまたは領域、ＥＴＶ４を過剰発現せず、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ陽性（ＰＣＡ１−２）または陰性（ＰＣＡ３−４）であった前立腺癌、およびＥＴＶ４超過剰発現を有する本発明者らのＬＣＭ集団（ｃｏｈｏｒｔ）由来の前立腺癌の症例（ＰＣＡ５）の発現を示す。Ｂは、ＲＬＭ−ＲＡＣＥが、ＰＣＡ５におけるＴＭＰＲＳＳ２の上流の配列のＥＴＶ４との融合を明らかにする。Ｃは、ＰＣＡ５における、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４ａおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４ｂのＱＰＣＲによる発現を示す。Ｄは、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織での間期蛍光インサイチュハイブリダイゼーションが、ＰＣＡ５における、ＴＭＰＲＳＳ２およびＥＴＶ４遺伝子座の融合を確認していることを示す。
【図９−１】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−２】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−３】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−４】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−５】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−６】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−７】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−８】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−９】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−１０】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−１１】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−１２】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−１３】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−１４】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−１５】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−１６】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−１７】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−１８】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−１９】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−２０】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−２１】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９−２２】図９は、典型的なＥＴＳファミリー遺伝子のｍＲＮＡ配列を示す。
【図１０−１】図１０は、ＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡ配列を示す。
【図１０−２】図１０は、ＴＭＰＲＳＳ２のｍＲＮＡ配列を示す。
【図１１】図１１は、ＦＩＳＨによるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合物分析を示す。パネルＡは、イデオグラム、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合物の間接的検出に関する分離分析を示す。パネルＢは、間質細胞（左）および前立腺癌の腺（右）の間期核を示す。パネルＣは、テロメアプローブの消失により示される分離および同時欠失を示す前立腺癌の腺の間期核（１００倍、油浸対物レンズ倍率）である。パネルＤは、テロメアプローブの分離および消失のある２つの核を示すＣの囲み部分の拡大図である（６０倍、油浸対物レンズ倍率）。
【図１２−１】図１２は、ＥＲＧとＴＭＰＲＳＳ２との間の第２１染色体におけるゲノム欠失を示す。パネルＡは、６つの細胞株、１３個の異種移植試料、および１１個の転移性ＰＣＡ試料を含む試料を、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１状態（陰性をグレーの棒状部分、陽性状態を青の棒状部分で示す）について、ｑＰＣＲおよび／またはＦＩＳＨにより特徴付けした結果を示す。パネルＢは、Ａ中の緑の囲み部分の拡大図である。パネルＣは、Ａ中の黒の囲み部分の拡大図である。
【図１２−２】図１２は、ＥＲＧとＴＭＰＲＳＳ２との間の第２１染色体におけるゲノム欠失を示す。パネルＡは、６つの細胞株、１３個の異種移植試料、および１１個の転移性ＰＣＡ試料を含む試料を、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１状態（陰性をグレーの棒状部分、陽性状態を青の棒状部分で示す）について、ｑＰＣＲおよび／またはＦＩＳＨにより特徴付けした結果を示す。パネルＢは、Ａ中の緑の囲み部分の拡大図である。パネルＣは、Ａ中の黒の囲み部分の拡大図である。
【図１３】図１３は、臨床的に局在化した前立腺癌におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列を病理学的パラメーターと関連させて示している。パネルＡは、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列が主要ＰＣＡ試料の４９．２％およびホルモン無処置の転移性ＬＮ試料の４１．２％で確認されたことを示す。パネルＢは、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧで再配列した欠失のある腫瘍が、進行した腫瘍段階のＰＣＡ症例の高い割合で観察される傾向にあったことを示す（ｐ＝０．０３）。
【図１４】図１４は、ＥＲＧ（セントロメア）とＴＭＰＲＳＳ２（テロメア）との間の２１ｑ２２−２３に位置する公知の遺伝子を示す。黒線上側の遺伝子は、５’セントロメアから３’テロメアに指向しており、黒線下側の遺伝子は、５’テロメアから３’セントロメアに指向している。イメージの下半分には、ＥＲＧ遺伝子座の拡大図をＦＩＳＨプローブで示している。
【図１５】図１５は、欠失（右側の核）のあるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列および欠失のない（左側の核）ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列を示す小領域のみを主に示す「異質性」前立腺癌の症例を示す。
【図１６】図１６は、８つの公開された発現アレイデータセットにわたる、ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間に位置する遺伝子のメタ分析を示す。
【図１７】図１７は、ＦＩＳＨ分析が、疾患の進行と関連したＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合物に伴う特徴的な欠失を検出していることを示す。パネルＡおよびＢでは、第２１染色体ｑ２２．２上でのＥＲＧ再配列を分析するため、ビオチン−１４−ｄＣＴＰ標識したＢＡＣクローンＲＰ１１−２４Ａ１１（最終的には赤のシグナルを生成するようにコンジュゲートしている）およびジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ標識したＢＡＣクローンＲＰ１１−１３７Ｊ１３（最終的には緑のシグナルを生成するようにコンジュゲートしている）からなる、ＥＲＧ遺伝子座の隣接するセントロメアおよびテロメア領域にそれぞれ及ぶ、分断プローブシステム（ｂｒｅａｋ  ａｐａｒｔ  ｐｒｏｂｅ  ｓｙｓｔｅｍ）が適用された。この分断プローブシステムを用いて、ＥＲＧ再配列のない核は、２対の並置した赤および緑シグナルを示す。並置した赤−緑のシグナルは、黄色の融合シグナルを生成する（パネルＢ、矢印）。パネルＣは、累積罹患率回帰モデルにおいて、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧを累積罹患率または転移または前立腺癌特異的な死亡に関する決定因子とした評価を示した。
【図１８】図１８は、融合転写産物のないＦＬＩ１過剰発現を示す。
【図１９】図１９は、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ＋細胞におけるアンドロゲンによるＥＲＧタンパク質発現の誘発を示す。
【図２０】図２０は、内因性および融合ＥＲＧポリペプチドの模式図である。
【図２１】図２１は、ＥＲＧ２に対する核相互作用因子を示す。
【図２２】図２２は、ペプチド抗体についての配列およびＥＲＧ１に対するアクアプローブ生成を示す。
【図２３】図２３は、ペプチド抗体についての配列およびＥＴＶ１に対するアクアプローブ生成を示す。
【図２４】図２４は、ペプチド抗体についての配列およびＦＬＩ１に対するアクアプローブ生成を示す。
【図２５】図２５は、ペプチド抗体についての配列およびＥＴＶ４に対するアクアプローブ生成を示す。
【図２６】図２６は、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株におけるＥＴＶ１の過剰発現およびアンドロゲン制御を示す。図２６Ａは、ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株におけるアンドロゲン制御遺伝子の発現シグナチャーを示す。図２６Ｂは、ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ細胞の両者におけるアンドロゲンによるＰＳＡ誘導の定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）による確認を示す。図２６Ｃは、ＬＮＣａＰ細胞におけるアンドロゲンによるＥＴＶ１誘導を示す。図２６Ｄは、ＥＴＶ１がＬＮＣａＰ細胞において顕著に過剰発現されていることを示す。
【図２７】図２７は、ＬＮＣａＰ細胞におけるＥＴＶ１の再配列を示す。図２７Ａは、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）のためのプローブとして使用されたＢＡＣの模式図である。図２７Ｂは、ＲＰ１１−１２４Ｌ２２およびＲＰ１１−１１４９Ｊ１３の、正常な末梢リンパ球（ＮＰＬ）における第７染色体に同時に局在することを示す。図２７Ｃは、中期スプレッド上（上段パネル）でのＢＡＣ＃１およびＢＡＣ＃４の局在化を示し、間期細胞（下段パネル）が、近接４倍体ＬＮＣａＰ細胞株において決定された。図２７Ｄは、ＲＰ１１−１２４Ｌ２２からのシグナルが、ＬＮＣａＰ細胞の第１４染色体に局在化することを示す。
【図２８】図２８は、ＥＴＶ１遺伝子座全体がＬＮＣａＰ細胞の第１４染色体に挿入されていることを示す。図２８Ａは、本実験で使用されたＢＡＣの模式図である。図２８Ｂは、中期スプレッド（上段パネル）と間期細胞（下段パネル）におけるＲＰ１１−１２４Ｌ２２（ＢＡＣ＃１）およびＲＰ１１−３１３Ｃ２０（ＢＡＣ＃２）の局在化をＬＮＣａＰ細胞におけるＦＩＳＨによって決定したことを示す。
【図２９】図２９は、ＬｎＣａＰにおけるＥＴＶ１のｓｉＲＮＡノックダウンを示す。
【図３０】図３０は、ＶＣａＰにおけるＥＲＧのｓｉＲＮＡノックダウンを示す。
【図３１】図３１は、ウイルス過剰発現システムを示す。
【図３２】図３２は、トランスジェニックマウスの模式図である。
【図３３】図３３は、尿中のＥＲＧとＥＴＶ１転写産物の検出を示す。図３３Ａは、ＬＮＣａＰ（高ＥＴＶ１発現）またはＶＣａＰ（高ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ発現）前立腺癌細胞におけるＥＲＧとＥＴＶ１の検出を示す。図３３Ｂは、前立腺癌を有する疑いのある患者の尿中のＥＲＧとＥＴＶ１の検出を示す。
【図３４】図３４は、前立腺癌におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳ遺伝子融合物を検出するのに用いられるアッセイを示す。図３４Ａは、ＴＭＰＲＳＳ２およびＥＲＧについての分離アッセイを示す。１対の分断した５’および３’シグナルにより示されるように、ＥＲＧ再配列の陽性症例（欠失なし）を左パネルに示す。１つの３’シグナルの消失に示されるように、ＴＭＰＲＳＳ２再配列の陽性症例（欠失あり）を右パネルに示す。図３４Ｂは、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１遺伝子融合物についての融合アッセイを示す。図３４Ｃは、ＥＴＶ４についての分離アッセイを示す。
【図３５】図３５は、ＦＩＳＨにより検出された、ＴＭＰＲＳＳ２、ＥＲＧ、ＥＴＶ１およびＥＴＶ４再配列を示す。図３５Ａは、図３４に示されるアッセイにより検出された、ＴＭＰＲＳＳ２、ＥＲＧ、ＥＴＶ１およびＥＴＶ４内の再配列についての結果の表を示す。図３４Ｂは、Ａに記載のように、４つすべてのアッセイが評価できる３８症例からのＴＭＰＲＳＳ２、ＥＲＧ、ＥＴＶ１およびＥＴＶ４状態のヒートマップ表示を示す。図３４Ｃは、不調和なＴＭＰＲＳＳ２とＥＴＳ再配列状態を有する症例のヒートマップ表示を示す。
【図３６−１】図３６は、本発明の遺伝子融合物の配列を示す。
【図３６−２】図３６は、本発明の遺伝子融合物の配列を示す。
【図３６−３】図３６は、本発明の遺伝子融合物の配列を示す。
【図３６−４】図３６は、本発明の遺伝子融合物の配列を示す。
【図３６−５】図３６は、本発明の遺伝子融合物の配列を示す。
【図３６−６】図３６は、本発明の遺伝子融合物の配列を示す。
【図３６−７】図３６は、本発明の遺伝子融合物の配列を示す。
【図３７】図３７は、ＦＬＩ−１発現分析についてのプライマーおよびプローブを示す。
【図３８−１】図３８は、前立腺特異的、または例外（ｏｕｔｌｉｅｒ）腫瘍標本においてＥＴＶ１に融合した遍在的に活性な制御エレメントの同定を示す。ａは、ＥＴＶ１例外症例の同定を示す。ｂは、例外症例におけるＥＴＶ１に融合した新規５’パートナーの構造を示す。ｃは、プローブ５’を図示のパートナーへ、３’をＥＴＶ１に用いたＥＴＶ１融合物のＦＩＳＨによる確認を示す。ｄは、５’融合パートナーの組織特異性を示す。ｅは、５’融合パートナーのアンドロゲン制御の評価を示す。
【図３８−２】図３８は、前立腺特異的、または例外（ｏｕｔｌｉｅｒ）腫瘍標本においてＥＴＶ１に融合した遍在的に活性な制御エレメントの同定を示す。ａは、ＥＴＶ１例外症例の同定を示す。ｂは、例外症例におけるＥＴＶ１に融合した新規５’パートナーの構造を示す。ｃは、プローブ５’を図示のパートナーへ、３’をＥＴＶ１に用いたＥＴＶ１融合物のＦＩＳＨによる確認を示す。ｄは、５’融合パートナーの組織特異性を示す。ｅは、５’融合パートナーのアンドロゲン制御の評価を示す。
【図３８−３】図３８は、前立腺特異的、または例外（ｏｕｔｌｉｅｒ）腫瘍標本においてＥＴＶ１に融合した遍在的に活性な制御エレメントの同定を示す。ａは、ＥＴＶ１例外症例の同定を示す。ｂは、例外症例におけるＥＴＶ１に融合した新規５’パートナーの構造を示す。ｃは、プローブ５’を図示のパートナーへ、３’をＥＴＶ１に用いたＥＴＶ１融合物のＦＩＳＨによる確認を示す。ｄは、５’融合パートナーの組織特異性を示す。ｅは、５’融合パートナーのアンドロゲン制御の評価を示す。
【図３８−４】図３８は、前立腺特異的、または例外（ｏｕｔｌｉｅｒ）腫瘍標本においてＥＴＶ１に融合した遍在的に活性な制御エレメントの同定を示す。ａは、ＥＴＶ１例外症例の同定を示す。ｂは、例外症例におけるＥＴＶ１に融合した新規５’パートナーの構造を示す。ｃは、プローブ５’を図示のパートナーへ、３’をＥＴＶ１に用いたＥＴＶ１融合物のＦＩＳＨによる確認を示す。ｄは、５’融合パートナーの組織特異性を示す。ｅは、５’融合パートナーのアンドロゲン制御の評価を示す。
【図３９】図３９は、ｑＰＣＲによる新規なＥＴＶ１遺伝子融合物の確認を示す。
【図４０−１】図４０は、ＦＩＳＨによる新規なＥＴＶ１遺伝子融合物の確認を示す。ａは、間期ＦＩＳＨのためのプローブとして使用されたＥＴＶ１、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１、ＨＥＲＶ−Ｋ  ２２ｑ１１．２３、Ｃ１５ＯＲＦ２１およびＳＬＣ４５Ａ３への５’および３’に位置するＢＡＣの模式図を示す。ｂ〜ｄは、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織切片に、対応する蛍光標識で示すようにＢＡＣを用いてＦＩＳＨを実施したものであり、ｂ）は、５’融合パートナーの分断シグナルアッセイ、ｃ）は、５’パートナーとＥＴＶ１の融合物、ｄ）は、ＥＴＶ１の分断シグナルアッセイである。
【図４０−２】図４０は、ＦＩＳＨによる新規なＥＴＶ１遺伝子融合物の確認を示す。ａは、間期ＦＩＳＨのためのプローブとして使用されたＥＴＶ１、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１、ＨＥＲＶ−Ｋ  ２２ｑ１１．２３、Ｃ１５ＯＲＦ２１およびＳＬＣ４５Ａ３への５’および３’に位置するＢＡＣの模式図を示す。ｂ〜ｄは、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織切片に、対応する蛍光標識で示すようにＢＡＣを用いてＦＩＳＨを実施したものであり、ｂ）は、５’融合パートナーの分断シグナルアッセイ、ｃ）は、５’パートナーとＥＴＶ１の融合物、ｄ）は、ＥＴＶ１の分断シグナルアッセイである。
【図４１−１】図４１は、前立腺細胞でのＥＴＶ１過剰発現が侵襲性を付与することを示す。ａは、ＥＴＶ１遺伝子融合生産物（エクソン４−から既報の停止コドン）を発現しているアデノウイルスおよびレンチウイルスを示す。ｂは、良性不死化前立腺細胞株ＲＷＰＥを示したようにＥＴＶ１または対照（ＧＵＳ）レンチウイルスに感染させ、安定なクローンを作製し、改変された基底膜を通した侵襲について分析した。ｃは、初代培養の前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）を示したようにＥＴＶ１またはＬＡＣＺアデノウイルスに感染させ、侵襲について分析した。平均（ｎ＝３）＋Ｓ．Ｅ．を示す。感染細胞の顕微鏡写真を差し込み図に示す。ｄ〜ｅは、ＬＮＣａＰ細胞のＥＴＶ１のｓｉＲＮＡノックダウンが侵襲を阻害していることを示す。ＬＮＣａＰ細胞をトランスフェクション試薬単独（未処理）で処理し、または示されるように、非標的またはＥＴＶ１のｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたものを示す。ｄは、ＥＴＶ１ノックダウンをｑＰＣＲで確認したものである（平均（ｎ＝４）＋Ｓ．Ｅ．）。ｅは、細胞をｂおよびｃのように侵襲について分析したものである（平均（ｎ＝３）＋Ｓ．Ｅ．）。ｆは、ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１およびＲＷＰＥ−ＧＵＳ細胞のＡｇｉｌｅｎｔの全ゲノムマイクロアレイ上での分析結果である。ＲＷＰＥ−ＧＵＳ細胞に対比したＲＷＰＥ−ＥＴＶ１で過剰発現した遺伝子の分子概念分析のネットワーク図を示す。各ノードは、分子概念または生物学的に関連した遺伝子の組を表す。ノードの大きさは、上記概念の遺伝子数（例として、「ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１」および「細胞外マトリックス」概念は、それぞれ５２７および１８６個の遺伝子を包含する）に比例する。概念の色は、その説明文に応じた概念の種類を示す。各端は、顕著なエンリッチメントを表す（Ｐ＜０．００５）。ｇは、ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１細胞で過剰発現した侵襲に関与する選択した遺伝子のｑＰＣＲによる確認を示す。
【図４１−２】図４１は、前立腺細胞でのＥＴＶ１過剰発現が侵襲性を付与することを示す。ａは、ＥＴＶ１遺伝子融合生産物（エクソン４−から既報の停止コドン）を発現しているアデノウイルスおよびレンチウイルスを示す。ｂは、良性不死化前立腺細胞株ＲＷＰＥを示したようにＥＴＶ１または対照（ＧＵＳ）レンチウイルスに感染させ、安定なクローンを作製し、改変された基底膜を通した侵襲について分析した。ｃは、初代培養の前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）を示したようにＥＴＶ１またはＬＡＣＺアデノウイルスに感染させ、侵襲について分析した。平均（ｎ＝３）＋Ｓ．Ｅ．を示す。感染細胞の顕微鏡写真を差し込み図に示す。ｄ〜ｅは、ＬＮＣａＰ細胞のＥＴＶ１のｓｉＲＮＡノックダウンが侵襲を阻害していることを示す。ＬＮＣａＰ細胞をトランスフェクション試薬単独（未処理）で処理し、または示されるように、非標的またはＥＴＶ１のｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたものを示す。ｄは、ＥＴＶ１ノックダウンをｑＰＣＲで確認したものである（平均（ｎ＝４）＋Ｓ．Ｅ．）。ｅは、細胞をｂおよびｃのように侵襲について分析したものである（平均（ｎ＝３）＋Ｓ．Ｅ．）。ｆは、ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１およびＲＷＰＥ−ＧＵＳ細胞のＡｇｉｌｅｎｔの全ゲノムマイクロアレイ上での分析結果である。ＲＷＰＥ−ＧＵＳ細胞に対比したＲＷＰＥ−ＥＴＶ１で過剰発現した遺伝子の分子概念分析のネットワーク図を示す。各ノードは、分子概念または生物学的に関連した遺伝子の組を表す。ノードの大きさは、上記概念の遺伝子数（例として、「ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１」および「細胞外マトリックス」概念は、それぞれ５２７および１８６個の遺伝子を包含する）に比例する。概念の色は、その説明文に応じた概念の種類を示す。各端は、顕著なエンリッチメントを表す（Ｐ＜０．００５）。ｇは、ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１細胞で過剰発現した侵襲に関与する選択した遺伝子のｑＰＣＲによる確認を示す。
【図４１−３】図４１は、前立腺細胞でのＥＴＶ１過剰発現が侵襲性を付与することを示す。ａは、ＥＴＶ１遺伝子融合生産物（エクソン４−から既報の停止コドン）を発現しているアデノウイルスおよびレンチウイルスを示す。ｂは、良性不死化前立腺細胞株ＲＷＰＥを示したようにＥＴＶ１または対照（ＧＵＳ）レンチウイルスに感染させ、安定なクローンを作製し、改変された基底膜を通した侵襲について分析した。ｃは、初代培養の前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）を示したようにＥＴＶ１またはＬＡＣＺアデノウイルスに感染させ、侵襲について分析した。平均（ｎ＝３）＋Ｓ．Ｅ．を示す。感染細胞の顕微鏡写真を差し込み図に示す。ｄ〜ｅは、ＬＮＣａＰ細胞のＥＴＶ１のｓｉＲＮＡノックダウンが侵襲を阻害していることを示す。ＬＮＣａＰ細胞をトランスフェクション試薬単独（未処理）で処理し、または示されるように、非標的またはＥＴＶ１のｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたものを示す。ｄは、ＥＴＶ１ノックダウンをｑＰＣＲで確認したものである（平均（ｎ＝４）＋Ｓ．Ｅ．）。ｅは、細胞をｂおよびｃのように侵襲について分析したものである（平均（ｎ＝３）＋Ｓ．Ｅ．）。ｆは、ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１およびＲＷＰＥ−ＧＵＳ細胞のＡｇｉｌｅｎｔの全ゲノムマイクロアレイ上での分析結果である。ＲＷＰＥ−ＧＵＳ細胞に対比したＲＷＰＥ−ＥＴＶ１で過剰発現した遺伝子の分子概念分析のネットワーク図を示す。各ノードは、分子概念または生物学的に関連した遺伝子の組を表す。ノードの大きさは、上記概念の遺伝子数（例として、「ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１」および「細胞外マトリックス」概念は、それぞれ５２７および１８６個の遺伝子を包含する）に比例する。概念の色は、その説明文に応じた概念の種類を示す。各端は、顕著なエンリッチメントを表す（Ｐ＜０．００５）。ｇは、ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１細胞で過剰発現した侵襲に関与する選択した遺伝子のｑＰＣＲによる確認を示す。
【図４２】図４２は、前立腺でＥＴＶ１遺伝子融合生産物を発現しているトランスジェニックマウスは、マウス前立腺上皮内腫瘍（ｍＰＩＮ）を発生することを示す。ａ〜ｆは、形態学的評価のための、ＡＲＲ２Ｐｂ−ＥＴＶ１前立腺のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す。ｃは、ｂの高倍率図であり、挿入図にｍＰＩＮ病変内の顕著な核小体を示している。ｄは、ＡＲＲ２Ｐｂ−ＥＴＶ１マウス＃３（３３週）の腹側前立腺（ＶＰ）内に観察されるｍＰＩＮの正常な腺および病巣を示す。ｅは、ｄ図の高倍率図である。ｆは、単一の腺がｍＰＩＮと共に、正常な上皮構造を示している。図の挿入部分は、矢印で示すｍＰＩＮの病巣を示す。ｇ〜ｌは、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）を用いた免疫組織化学的検査が、ｇ）良性腺、およびｈ）すべてのｍＰＩＮ病変の周囲の連続した繊維筋層を実証するのに対し、基底細胞マーカーのｉ−ｊ）サイトケラチン５（ＣＫ５）、およびｋ−ｌ）ｐ６３が、ＡＲＲ２Ｐｂ−ＥＴＶ１マウス＃３の背外側前立腺（ＤＬＰ）における正常な腺（ｉ、ｋ）と比較して、ｍＰＩＮ病巣（ｊ、ｌ）において周囲基底細胞が消失していることを実証している。ａ、ｂ、およびｄの元の拡大倍率は１００倍であり、ｃおよびｅ〜ｌの倍率は４００倍である。
【図４３】図４３は、染色体再編成の特徴的なクラスが、前立腺癌におけるＥＴＳ癌遺伝子を活性化することを示す。
【図４４】図４４は、ＥＴＶ１の過剰発現が増殖をもたらさず、または良性前立腺上皮細胞を形質転換しないことを示す。ａでは、良性不死化前立腺細胞株ＲＷＰＥが、示されるようにＥＴＶ１または対照（ＧＵＳ）レンチウイルスに感染させ、安定なクローンを作製して増殖を評価した。ｂでは、初代培養前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）を示されるようにＥＴＶ１またはＬＡＣＺアデノウイルスに感染させ、増殖を評価した。平均（ｎ＝３）＋Ｓ．Ｅ．を示す。結果は、３つの独立した実験の典型的なものである。ｃでは、ＥＴＶ１過剰発現はＳ期におけるＲＷＰＥ細胞の割合を増加させない。ｄでは、ＥＴＶ１過剰発現はＲＷＰＥ細胞の足場非依存性増殖を増強しない。
【図４５】図４５は、ＥＴＶ１のｓｈＲＮＡノックダウンがＬＮＣａＰ細胞における侵襲を阻害することを示す。ａは、示されるように、対照ＬＮＣａＰ細胞、または非標的もしくはＥＴＶ１  ｓｈＲＮＡｍｉｒを発現しているレンチウイルスに感染したＬＮＣａＰ細胞を、図４１ｅに示すように、侵襲について評価したものである。平均（ｎ＝３）＋Ｓ．Ｅ．を示す。ｂは、ａから得た感染細胞の顕微鏡写真である。
【図４６】図４６は、ＥＴＶ１の過剰発現により増殖に係る概念の発現低下を生じることを示す。
【図４７】図４７は、ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１細胞に過剰発現した侵襲関連の遺伝子の同定を示す。ａは、ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１およびＲＷＰＥ−ＧＵＳ細胞のアジレント社の全ゲノムマイクロアレイ上での分析結果である。ｂは、ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１概念およびエンリッチメントネットワーク（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｎｅｔｗｏｒｋ）（数で示す）中のその他の１４概念のうち少なくとも５つにある遺伝子を同定するオーバーレイマップである。
【図４８】図４８は、ＡＲＲ２Ｐｂ−ＥＴＶ１マウスの前立腺のｍＰＩＮの領域におけるＡＲＲ２Ｐｂ−ＥＴＶ１−ＦＬＡＧ発現の確認を示す。ａは、ＡＲＲ２Ｐｂ−ＥＴＶ１  マウス＃４の腹側前立腺（ＶＰ）の低倍率拡大図であり、良性領域およびｍＰＩＮ病巣を黄色および黒の矢印でそれぞれ示している。ｂは、ａの良性腺の高倍率拡大図であり、ＥＴＶ１−ＦＬＡＧ発現の欠如を示す。ｃは、ａ図のｍＰＩＮ腺の高倍率拡大図であり、ＥＴＶ１−ＦＬＡＧ発現を実証している。
【図４９】図４９は、アンドロゲン制御遺伝子の発現を調節するＬＮＣａＰ細胞のアンドロゲン欠乏を示す。
【図５０】図５０は、Ｒ１８８１がアンドロゲン応答性ＶＣａＰ細胞株におけるＥＴＶ１発現を誘導しないことを示す。
【図５１−１】図５１は、本発明のさらなる遺伝子融合物の配列を示す。
【図５１−２】図５１は、本発明のさらなる遺伝子融合物の配列を示す。
【図５２−１】図５２は、本発明のさらなる遺伝子融合物の配列を示す。
【図５２−２】図５２は、本発明のさらなる遺伝子融合物の配列を示す。
【図５３−１】図５３は、前立腺癌（ＰＣａ）の症例２つの同定であり、ＱＰＣＲによるＥＴＶ５例外発現を示す。パネルＢは、上記２症例についてのＲＡＣＥで決定した融合転写産物の構造を示す。
【図５３−２】図５３は、前立腺癌（ＰＣａ）の症例２つの同定であり、ＱＰＣＲによるＥＴＶ５例外発現を示す。パネルＢは、上記２症例についてのＲＡＣＥで決定した融合転写産物の構造を示す。
【図５４】図５４は、前立腺癌のＥＴＳ異常の包括的ＦＩＳＨスクリーニングのための模式的アプローチを示す。ａ）分断プローブＦＩＳＨアプローチを約１ＭｂのプローブフランキングＥＴＳブレイクポイントと共に用い、ＥＴＳファミリー遺伝子に関わる遺伝子再配列をスクリーニングするための前立腺癌ＴＭＡに適用した。ｂ）前立腺癌のＦＩＳＨに基づくスクリーニングからの可能な結果を示す。ｃ）１Ｍｂの分断プローブが異常を示唆する場合、対象遺伝子の側面にしっかりと位置するプローブ（１００〜２００Ｋｂ）が、初期スクリーニングによって同定された異常を確認するために組織切片に適用された。ｄ）ＥＴＳ遺伝子および公知の５’パートナーの両方に対して再配列された症例について、潜在的な遺伝子融合物を確認するために融合プローブＦＩＳＨアッセイを行った；ＥＴＳのみの遺伝子再配列を伴う症例では、ＥＴＳ遺伝子の新規な５’パートナーを同定するためにＲＬＭ−ＲＡＣＥを用いた。
【図５５−１】図５５ａおよびｂは、前立腺癌におけるＥＴＳおよび５’融合パートナー異常の概要マトリックスを示す。
【図５５−２】図５５ａおよびｂは、前立腺癌におけるＥＴＳおよび５’融合パートナー異常の概要マトリックスを示す。
【図５６】図５６は、ＥＲＧに対する新規な５’融合パートナーとしてのＳＬＣ４５Ａ３の同定を示す。ａ）間期ＦＩＳＨのためのプローブとして使用されたＳＬＣ４５Ａ３およびＥＲＧへの５’および３’に位置するＢＡＣの模式図を示す。ｂ）それぞれＳＬＣ４５Ａ３、ＥＲＧ、およびＳＬＣ４５Ａ３に対して５’とＥＲＧに対して３’の融合の分断シグナルアッセイのために、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織切片で対応の蛍光標識を用いて示されたＢＡＣを用いてＦＩＳＨを行った。
【図５７−１】図５７は、前立腺癌における５’融合パートナーのＦＬＪ３５２９４、ＣＡＮＴ１およびＤＤＸ５の同定を示す。ａ）５’ＲＡＣＥ分析によって同定されたＦＬＪ３５２９４−ＥＴＶ１（ＰＣａ＿５４）、ＣＡＮＴ１−ＥＴＶ４（ＰＣａ＿４６）およびＤＤＸ５−ＥＴＶ４（ＰＣａ＿８５）融合物の模式図を示す。ボックス中の数はエクソンを表す。ボックス上部の数は、各エクソンの最終塩基を示す。非翻訳領域は、より明るい陰影中に示される（ＦＬＪ３５２９４は特徴付けられていない遺伝子構造を有する予期された転写産物である）。ｂ）Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータセットにアクセスした国際ゲノムコンソーシアムのｅｘｐＯデータセットに基づいて、２８個の他の癌種と比較した、前立腺癌におけるＦＬＪ３５２９４、ＣＡＮＴ１およびＤＤＸ５遺伝子の発現プロットを示す。
【図５７−２】図５７は、前立腺癌における５’融合パートナーのＦＬＪ３５２９４、ＣＡＮＴ１およびＤＤＸ５の同定を示す。ａ）５’ＲＡＣＥ分析によって同定されたＦＬＪ３５２９４−ＥＴＶ１（ＰＣａ＿５４）、ＣＡＮＴ１−ＥＴＶ４（ＰＣａ＿４６）およびＤＤＸ５−ＥＴＶ４（ＰＣａ＿８５）融合物の模式図を示す。ボックス中の数はエクソンを表す。ボックス上部の数は、各エクソンの最終塩基を示す。非翻訳領域は、より明るい陰影中に示される（ＦＬＪ３５２９４は特徴付けられていない遺伝子構造を有する予期された転写産物である）。ｂ）Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータセットにアクセスした国際ゲノムコンソーシアムのｅｘｐＯデータセットに基づいて、２８個の他の癌種と比較した、前立腺癌におけるＦＬＪ３５２９４、ＣＡＮＴ１およびＤＤＸ５遺伝子の発現プロットを示す。
【図５８−１】図５８は、ＦＩＳＨによるＦＬＪ３５２９４：ＥＴＶ１、ＣＮＡＴ１：ＥＴＶ４およびＤＤＸ５：ＥＴＶ４融合物の確認を示す。ａ）間期ＦＩＳＨのためのプローブとして使用されたＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＦＬＪ３５２９４およびＣＮＡＴ１への５’および３’に位置するＢＡＣの模式図を示す。ｂ−ｄ）ｂ）ＥＴＶ１およびＥＴＶ４の分断シグナルアッセイ、ｃ）５’融合パートナーの分断シグナルアッセイ、およびｄ）５’パートナーおよびＥＴＶ１またはＥＴＶ４の融合物について、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織切片で対応の蛍光標識を用いて指示されるＢＡＣを用いてＦＩＳＨを行った。分断シグナルは矢印によって示され、融合シグナルは黄色の矢印によって示される。
【図５８−２】図５８は、ＦＩＳＨによるＦＬＪ３５２９４：ＥＴＶ１、ＣＮＡＴ１：ＥＴＶ４およびＤＤＸ５：ＥＴＶ４融合物の確認を示す。ａ）間期ＦＩＳＨのためのプローブとして使用されたＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＦＬＪ３５２９４およびＣＮＡＴ１への５’および３’に位置するＢＡＣの模式図を示す。ｂ−ｄ）ｂ）ＥＴＶ１およびＥＴＶ４の分断シグナルアッセイ、ｃ）５’融合パートナーの分断シグナルアッセイ、およびｄ）５’パートナーおよびＥＴＶ１またはＥＴＶ４の融合物について、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織切片で対応の蛍光標識を用いて指示されるＢＡＣを用いてＦＩＳＨを行った。分断シグナルは矢印によって示され、融合シグナルは黄色の矢印によって示される。
【図５９−１】図５９は、ＦＬＪ３５２９４およびＣＡＮＴ１ゲノム遺伝子座のアンドロゲン制御、ならびに前立腺癌におけるＤＤＸ５：ＥＴＶ４融合タンパク質の特徴付けを示す。ａ）ＥＲＧ、ＥＴＶ１およびＥＴＶ４の発現は、良性前立腺、およびＦＬＪ３５２９４−ＥＴＶ１、ＣＡＮＴ１−ＥＴＶ４、ＤＤＸ５−ＥＴＶ４またはＳＬＣ４５Ａ３：ＥＲＧのいずれかに陽性である前立腺癌におけるＱＰＣＲによって決定された。ｂ）ＬＮＣａＰ細胞を４８時間、ホルモン枯渇にし、Ｒ１８８１またはエタノール対照で処理し、ＦＬＪ３５２９４、ＣＡＮＴ１およびＤＤＸ５転写発現をＱ−ＰＣＲによって評価した。ｃ）各遺伝子座のＡＲエンリッチメント値をクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析によって評価した。ｄ）上部パネルは、ＥＴＶ４のアミノ酸６５から４８４に融合したＤＤＸ５のアミノ酸１〜１０２によって示されるＤＤＸ５−ＥＴＶ４融合タンパク質の模式図を示す。中央パネルは、ｐＣＤＮＡ３．２−ＤＤＸ５−ＥＴＶ４発現構築物で一時的にトランスフェクトしてＨＥＫ２９３細胞の免疫ブロット分析によるＦＬＡＧタグ化されたＤＤＸ５−ＥＴＶ４融合タンパク質の検出を示す。下部パネルは、ＤＤＸ５−ＥＴＶ４遺伝子融合物（ＰＣａ＿８５）を有する患者由来の組織溶解物中の内因性ＤＤＸ５−ＥＴＶ４融合タンパク質（５７ｋＤａ）の検出を示す。
【図５９−２】図５９は、ＦＬＪ３５２９４およびＣＡＮＴ１ゲノム遺伝子座のアンドロゲン制御、ならびに前立腺癌におけるＤＤＸ５：ＥＴＶ４融合タンパク質の特徴付けを示す。ａ）ＥＲＧ、ＥＴＶ１およびＥＴＶ４の発現は、良性前立腺、およびＦＬＪ３５２９４−ＥＴＶ１、ＣＡＮＴ１−ＥＴＶ４、ＤＤＸ５−ＥＴＶ４またはＳＬＣ４５Ａ３：ＥＲＧのいずれかに陽性である前立腺癌におけるＱＰＣＲによって決定された。ｂ）ＬＮＣａＰ細胞を４８時間、ホルモン枯渇にし、Ｒ１８８１またはエタノール対照で処理し、ＦＬＪ３５２９４、ＣＡＮＴ１およびＤＤＸ５転写発現をＱ−ＰＣＲによって評価した。ｃ）各遺伝子座のＡＲエンリッチメント値をクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析によって評価した。ｄ）上部パネルは、ＥＴＶ４のアミノ酸６５から４８４に融合したＤＤＸ５のアミノ酸１〜１０２によって示されるＤＤＸ５−ＥＴＶ４融合タンパク質の模式図を示す。中央パネルは、ｐＣＤＮＡ３．２−ＤＤＸ５−ＥＴＶ４発現構築物で一時的にトランスフェクトしてＨＥＫ２９３細胞の免疫ブロット分析によるＦＬＡＧタグ化されたＤＤＸ５−ＥＴＶ４融合タンパク質の検出を示す。下部パネルは、ＤＤＸ５−ＥＴＶ４遺伝子融合物（ＰＣａ＿８５）を有する患者由来の組織溶解物中の内因性ＤＤＸ５−ＥＴＶ４融合タンパク質（５７ｋＤａ）の検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語および句を下で定義する。
【００１４】
本明細書で用いるように、用語「遺伝子融合物」は、第一の遺伝子の少なくとも一部と第二の遺伝子の少なくとも一部との融合から生じる、キメラゲノムＤＮＡ、キメラメッセンジャーＲＮＡ、切断されたタンパク質またはキメラタンパク質を指す。遺伝子融合物は、遺伝子全体または遺伝子のエクソンを含む必要はない。
【００１５】
本明細書で用いるように、用語「癌で上方制御される遺伝子」は、他の組織でのレベルと比較して、癌（例えば、前立腺癌）においてより高いレベルで発現される（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現）遺伝子を指す。一部の実施形態では、癌で上方制御される遺伝子は、他の組織での発現レベルよりも少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも１００％、さらにより好ましくは少なくとも２００％、最も好ましくは少なくとも３００％高いレベルで発現される。一部の実施形態では、前立腺癌で上方制御される遺伝子は、「アンドロゲン調節遺伝子」である。
【００１６】
本明細書で用いるように、用語「前立腺組織で上方制御される遺伝子」は、他の組織でのレベルと比較して、前立腺組織においてより高いレベルで発現される（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現）遺伝子を指す。一部の実施形態では、前立腺組織で上方制御される遺伝子は、他の組織での発現レベルよりも少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも１００％、さらにより好ましくは少なくとも２００％、最も好ましくは少なくとも３００％高いレベルで発現される。一部の実施形態では、前立腺組織で上方制御される遺伝子は、前立腺組織で排他的に発現される。
【００１７】
本明細書で用いるように、用語「高発現プロモーター」は、遺伝子と融合させると、その遺伝子を特定の組織（例えば、前立腺）で、高発現プロモーターと融合されない場合のその遺伝子の発現レベルよりも高いレベル（例えば、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも１００％、さらにより好ましくは少なくとも２００％、最も好ましくは少なくとも３００％高いレベル）で発現させるプロモーターを指す。一部の実施形態では、高発現プロモーターは、アンドロゲン調節遺伝子またはハウスキーピング遺伝子（例えば、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１）に由来するプロモーターである。
【００１８】
本明細書で用いるように、用語「転写調節領域」は、その遺伝子の発現を調節（例えば、上方制御または下方制御）する配列を含む遺伝子の領域を指す。一部の実施形態では、遺伝子の転写調節領域は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）とも呼ばれる遺伝子の上流非コード配列を含む。他の実施形態では、転写調節領域は、遺伝子のコード領域の中、またはイントロンの中に位置する配列（例えば、エンハンサー）を含む。
【００１９】
本明細書で用いるように、用語「アンドロゲン調節遺伝子」は、その発現がアンドロゲン（例えば、テストステロン）によって誘導または抑制される遺伝子または遺伝子の一部を指す。アンドロゲン調節遺伝子のプロモーター領域は、アンドロゲンまたはアンドロゲンシグナル伝達分子（例えば、下流シグナル伝達分子）と相互作用する「アンドロゲン応答エレメント」を含むことができる。
【００２０】
本明細書で用いるように、用語「検出する」、「検出すること」または「検出」は、検出可能に標識された組成物を発見もしくは認識することの一般的な行為か、またはその特定の観察を記載することができる。
【００２１】
本明細書で用いるように、用語「遺伝子融合物の少なくとも１つの生物活性を阻害する」は、本発明の遺伝子融合物の任意の活性（例えば、本明細書に記載の活性を含むがこれに限らず）を、遺伝子融合タンパク質を直接に接触させ、遺伝子融合ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを接触させ、遺伝子融合ポリペプチドの立体配置的変化を引き起こすか、遺伝子融合タンパク質レベルを低減させるか、またはシグナル伝達パートナーとの遺伝子融合相互作用を妨害して、遺伝子融合標的遺伝子の発現に影響を及ぼすことを通して低減させる任意の剤を指す。阻害剤には、上流側シグナル伝達分子を妨害することによって遺伝子融合物の生物活性を間接に調節する分子も含まれる。
【００２２】
本明細書で用いるように、用語「ｓｉＲＮＡ」は、低分子干渉ＲＮＡを指す。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さが約１８〜２５ヌクレオチドの二重鎖または二本鎖領域を含む。しばしば、ｓｉＲＮＡは、各鎖の３’末端に約２〜４個の不対のヌクレオチドを含む。ｓｉＲＮＡの二重鎖または二本鎖領域の少なくとも１つの鎖は、標的ＲＮＡ分子に実質的に相同であるか、または実質的に相補的である。標的ＲＮＡ分子に相補的な鎖は、「アンチセンス鎖」である。標的ＲＮＡ分子に相同である鎖は「センス鎖」であり、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖にも相補的である。ｓｉＲＮＡは、さらなる配列を含むこともできる。そのような配列の非限定例には、連結配列、またはループ、ならびにステム構造および他の折畳み構造が含まれる。ｓｉＲＮＡは、無脊椎動物および脊椎動物でのＲＮＡ干渉の誘発において、ならびに植物での転写後遺伝子サイレンシングの間の配列特異的ＲＮＡ分解の誘発において、重要な仲介者として機能するようである。
【００２３】
用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のサイレンシングまたは低減を指す。それは、動物および植物での配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの過程であり、サイレンシングされる遺伝子の配列にその二重鎖領域が相同であるｓｉＲＮＡによって開始される。その遺伝子は、生物体に内因性もしくは外因性であることができるか、染色体に組み込まれて存在することができるか、またはゲノムに組み込まれていないトランスフェクションベクターに存在することができる。遺伝子の発現は、完全にまたは部分的に阻害される。ＲＮＡｉは、標的ＲＮＡの機能を阻害すると見なすこともできる。標的ＲＮＡの機能は、完全または部分的であってもよい。
【００２４】
本明細書で用いるように、用語「癌の病期」は、癌の発達レベルの定性的または定量的な評価を指す。癌の病期を判定するために用いられる基準には、腫瘍のサイズおよび転移の程度（例えば、限局性または遠隔）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
本明細書で用いるように、用語「遺伝子導入系」は、核酸配列を含む組成物を細胞または組織に送達する任意の手段を指す。例えば、遺伝子導入系には、ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよび他の核酸ベースの送達系）、裸の核酸の微量注入、ポリマーベースの送達系（例えば、リポソームベースおよび金属粒子ベースの系）、微粒子銃注射などが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で用いるように、用語「ウイルス遺伝子導入系」は、所望の細胞または組織への試料の送達を促進するためにウイルスエレメント（例えば、改変前のウイルス、改変ウイルスおよび核酸またはタンパク質などのウイルス成分）を含む遺伝子導入系を指す。本明細書で用いるように、用語「アデノウイルス遺伝子導入系」は、アデノウイルス科に属する改変前の、または変化させたウイルスを含む遺伝子導入系を指す。
【００２６】
本明細書で用いるように、用語「部位特異的組換え標的配列」は、組換え因子のための認識配列および組換えが起こる場所を提供する核酸配列を指す。
【００２７】
本明細書で用いるように、用語「核酸分子」は、それらに限定されないがＤＮＡまたはＲＮＡを含む、任意の核酸含有分子を指す。本用語は、それらに限定されないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロムウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ−アミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシンおよび２，６−ジアミノプリンを含む、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列を包含する。
【００２８】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド、前駆体またはＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の生成のために必要なコード配列を含む、核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。その完全長または断片の所望の活性または機能的特性（例えば、酵素活性、リガンド結合性、シグナル伝達、免疫原性など）が保持される限り、ポリペプチドは、完全長コード配列によって、またはコード配列の任意の部分によってコードされてもよい。本用語は、構造遺伝子のコード領域、および５’および３’末端の両方のコード領域に、いずれかの末端で約１ｋｂ以上の距離で隣接し、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに対応する配列を包含する。コード領域の５’側に位置し、ｍＲＮＡの上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’側、すなわち下流に位置し、ｍＲＮＡの上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼ばれる。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡ形およびゲノム形の両方を包含する。遺伝子のゲノム形またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列でさえぎられるコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子セグメントである。イントロンは、エンハンサーなどの調節エレメントを含むことができる。イントロンは、核または一次の転写産物から除去または「スプライスアウト」される。したがって、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物に存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳の間、生成期のポリペプチドのアミノ酸の配列または順序を規定する働きをする。
【００２９】
本明細書で用いるように、用語「異種遺伝子」は、その天然での環境にない遺伝子を指す。例えば、異種遺伝子には、別の種に導入される１つの種からの遺伝子が含まれる。異種遺伝子には、何らかの方法で変化させた（例えば、突然変異させた、複数のコピーで加えた、本来のものでない調節配列に連結した、など）生物体に固有の遺伝子も含まれる。異種遺伝子配列が、染色体中の遺伝子配列と天然に関連していることが見出されないＤＮＡ配列に一般的に結合するか、または天然で見出されない染色体の部分（例えば、その遺伝子が通常発現されない遺伝子座で発現される遺伝子）に関連するという点で、異種遺伝子は内因性遺伝子と区別される。
【００３０】
本明細書で用いるように、用語「オリゴヌクレオチド」は、短い長さの一本鎖ポリヌクレオチド鎖を指す。オリゴヌクレオチドは、一般的に長さが２００残基未満（例えば、１５〜１００）であるが、本明細書で用いるように、本用語はより長いポリヌクレオチド鎖も包含するものとする。オリゴヌクレオチドは、それらの長さによってしばしば呼ばれる。例えば、２４残基オリゴヌクレオチドは、「２４量体」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイズすることによって、または他のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることによって、二次および三次構造を形成することができる。そのような構造には、二重鎖、ヘアピン、十字形、ベンドおよびトリプレックスを含めることができるが、これらに限定されない。
【００３１】
本明細書で用いるように、用語「相補的」または「相補性」は、塩基対形成規則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に関して用いられる。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に相補的である。相補性は、核酸塩基のいくつかだけが塩基対形成規則に従って一致している、「部分的」であることができる。または、核酸の間に「完全な」または「全体的」相補性があることができる。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度にかなりの影響を及ぼす。これは、増幅反応だけでなく、核酸間の結合に依存する検出方法で特に重要である。
【００３２】
用語「相同性」は、相補性の程度を指す。部分的相同性または完全な相同性（すなわち、同一性）が存在することができる。部分的に相補的な配列は、完全に相補的な核酸分子が、「実質的に相同」である標的核酸とハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害する核酸分子である。完全に相補的な配列の標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロットまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を用いて調べることができる。実質的に相同な配列またはプローブは、低ストリンジェンシー条件下で、完全に相同な核酸分子の標的への結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）に関して競合し、阻害する。これは、低ストリンジェンシー条件が非特異的結合を許すものであるということではない。低ストリンジェンシー条件は、２つの配列の相互結合が特異的（すなわち、選択的）相互作用であることを要求する。非特異的結合の非存在は、実質的に非相補的である（例えば、約３０％未満の同一性）第二の標的を用いて試験することができる。非特異的結合の不在下で、プローブは第二の非相補的標的とハイブリダイズしない。
【００３３】
ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に関して用いる場合、用語「実質的に相同である」は、上記の低ストリンジェンシー条件下で二本鎖核酸配列の一方または両方の鎖とハイブリダイズすることができる任意のプローブを指す。
【００３４】
遺伝子は、一次ＲＮＡ転写産物の差別的スプライシングによって生成される複数のＲＮＡ種を生成することができる。同じ遺伝子のスプライス変異体であるｃＤＮＡは、配列同一性または完全相同性（両方のｃＤＮＡ上の同じエクソンまたは同じエクソンの一部の存在を表す）の領域、および完全非同一性（例えば、ｃＤＮＡ  １の上にエクソン「Ａ」が存在し、ｃＤＮＡ  ２は代わりにエクソン「Ｂ」を含むことを表す）の領域を含む。２つのｃＤＮＡが配列同一性の領域を含むので、それら両方は、両ｃＤＮＡで見出される配列を含む遺伝子全体または遺伝子の部分に由来するプローブとハイブリダイズする。したがって、２つのスプライス変異体は、そのようなプローブに、およびお互いに実質的に相同である。
【００３５】
一本鎖核酸配列に関して用いる場合、用語「実質的に相同である」は、上記の低ストリンジェンシー条件下で一本鎖核酸配列とハイブリダイズすることができる（すなわち、それはその補体である）任意のプローブを指す。
【００３６】
本明細書で用いるように、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸の対合に関して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の結合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比のような因子の影響を受ける。その構造中の相補的核酸の対合を含む単一分子は、「自己ハイブリダイズしている」と言われる。
【００３７】
本明細書で用いるように、用語「ストリンジェンシー」は、その下で核酸ハイブリダイゼーションが実行される、温度、イオン強度および有機溶媒などの他の化合物の存在の条件に関して用いられる。「低ストリンジェンシー条件」下では、対象の核酸配列は、その正確な補体、一塩基ミスマッチを有する配列、緊密に関連する配列（例えば、９０％以上の相同性を有する配列）および部分的相同性だけを有する配列（例えば、５０〜９０％の相同性を有する配列）とハイブリダイズする。「中程度のストリンジェンシー条件」下では、対象の核酸配列は、その正確な補体、一塩基ミスマッチを有する配列、および緊密に関連する配列（例えば、９０％以上の相同性）だけとハイブリダイズする。「高ストリンジェンシー条件」下では、対象の核酸配列は、その正確な補体だけと、および（温度などの条件によっては）一塩基ミスマッチを有する配列とハイブリダイズする。言い換えると、高ストリンジェンシー条件下で、一塩基ミスマッチを有する配列とのハイブリダイゼーションを除外するように温度を上昇させることができる。
【００３８】
核酸ハイブリダイゼーションに関して用いる場合、「高ストリンジェンシー条件」は、長さが約５００ヌクレオチドのプローブを用いる場合、５Ｘ  ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４  Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節）、０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハート試薬、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中の４２℃での結合またはハイブリダイゼーションと、続く０．１Ｘ  ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む４２℃の溶液での洗浄と同等の条件を含む。
【００３９】
核酸ハイブリダイゼーションに関して用いる場合、「中程度のストリンジェンシー条件」は、長さが約５００ヌクレオチドのプローブを用いる場合、５Ｘ  ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４  Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節）、０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハート試薬、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中の４２℃での結合またはハイブリダイゼーションと、続く１．０Ｘ  ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む４２℃の溶液での洗浄と同等の条件を含む。
【００４０】
「低ストリンジェンシー条件」は、長さが約５００ヌクレオチドのプローブを用いる場合、５Ｘ  ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４  Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節）、０．１％ＳＤＳ、５Ｘデンハート試薬［５０Ｘデンハートは、５００ｍｌ中に５ｇのＦｉｃｏｌｌ（Ｔｙｐｅ  ４００、Ｐｈａｒａｍｃｉａ）、５ｇのＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ、Ｓｉｇｍａ）を含む］および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中の４２℃での結合またはハイブリダイゼーションと、続く５Ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む４２℃の溶液での洗浄と同等の条件を含む。
【００４１】
当分野の技術では、低ストリンジェンシー条件を含むために、多数の同等の条件を使用することができることが周知されている。プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）ならびに標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、液中に存在するかまたは固定されているか、など）、ならびに塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの有無）などの因子が考慮され、上記の条件と異なるが同等の低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を生成するように、ハイブリダイゼーション溶液を変更することができる。さらに、当分野の技術では、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションを促進する条件が公知である（例えば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄工程の温度を上昇させること、ハイブリダイゼーション溶液でのホルムアミドの使用、など）（「ストリンジェンシー」について上の定義を参照）。
【００４２】
本明細書で用いるように、用語「増幅オリゴヌクレオチド」は、標的核酸またはその補体とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指し、核酸増幅反応に関与する。増幅オリゴヌクレオチドの例は、鋳型核酸とハイブリダイズし、増幅過程でポリメラーゼによって延長される３’ＯＨ末端を含む「プライマー」である。増幅オリゴヌクレオチドの別の例は、ポリメラーゼによって延長されない（例えば、３’ブロック末端を有するために）が、増幅に関与するか、またはそれを促進するオリゴヌクレオチドである。任意選択で、増幅オリゴヌクレオチドは、増幅反応に関与するが、標的核酸に相補的でないかその中に含まれない改変ヌクレオチドもしくは類似体、またはさらなるヌクレオチドを含むことができる。増幅オリゴヌクレオチドは、標的配列または鋳型配列に相補的でない配列を含むことができる。例えば、プライマーの５’領域は、標的核酸に非相補的なプロモーター配列を含むことができる（「プロモーター−プライマー」と呼ばれる）。当分野の技術者は、プライマーとして機能する増幅オリゴヌクレオチドを、５’プロモーター配列を含み、したがってプロモーター−プライマーとして機能するように改変することができることを理解しよう。同様に、プロモーター−プライマーは、プロモーター配列の除去、またはそれなしの合成によって改変し、しかもプライマーとして機能することができる。３’ブロック増幅オリゴヌクレオチドは、プロモーター配列を提供して、重合のための鋳型の役目を果たすことができる（「プロモーター−プロバイダー」と呼ばれる）。
【００４３】
本明細書で用いるように、用語「プライマー」は、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下、ならびに適する温度およびｐＨ）に置かれると、合成開始点として作用することができる、精製制限消化物の場合のように天然に存在するか、または合成的に生成されるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは増幅の最高効率のためには好ましくは一本鎖であるが、代わりに二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは伸長生成物を調製するために用いられる前に、その鎖を分離するために先ず処理される。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボ核酸である。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長生成物の合成を初回刺激するために、十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源および方法の使用を含む、多くの因子によって決まる。
【００４４】
本明細書で用いるように、用語「プローブ」は、別の対象のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズすることができる、精製制限消化物の場合のように天然に存在するか、または合成、組換えもしくはＰＣＲ増幅によって生成されるオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。プローブは、一本鎖または二本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定および単離で有用である。本発明で用いられるあらゆるプローブは、それらに限定されないが、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、ならびに酵素ベースの組織化学的アッセイ）、蛍光、放射性および発光性の系を含む任意の検出系で検出可能であるように、任意の「リポーター分子」で標識されることが想定される。本発明は、いかなる特定の検出系または標識にも限定されるものではない。
【００４５】
「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」の場合のように核酸に関して用いられる場合、用語「単離された」は、同定され、その天然源でそれが通常関連している少なくとも１つの成分または汚染物から分離される核酸配列を指す。単離された核酸は、それが天然で見出されるものと異なる形またはセッティングで存在するようなものである。対照的に、単離されていない核酸は、それらが天然に存在する状態で見出されるＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸である。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、隣接遺伝子に近接して宿主細胞染色体の上に見出される。特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列などのＲＮＡ配列は、多数のタンパク質をコードする他の多数のｍＲＮＡとの混合物として、細胞に見出される。しかし、所与のタンパク質をコードする単離された核酸には、例として、所与のタンパク質を通常発現する細胞中の核酸が含まれ、その核酸は、天然の細胞のそれと異なる染色体位置にあるか、さもなければ、天然に見出されるものと異なる核酸配列に連なる。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の形で存在することができる。タンパク質を発現させるために単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが利用される場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、最低でもセンス鎖またはコード鎖を含む（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖であってもよい）が、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含むことができる（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは二本鎖であってもよい）。
【００４６】
本明細書で用いるように、用語「精製した」または「精製すること」は、試料からの成分（例えば、汚染物）の除去を指す。例えば、抗体は、混在する非免疫グロブリンタンパク質の除去によって精製される。それらは、標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去によっても精製される。非免疫グロブリンタンパク質の除去および／または標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去は、試料中の標的反応性免疫グロブリンの割合の増加をもたらす。別の例では、組換えポリペプチドは細菌宿主細胞で発現され、ポリペプチドは宿主細胞タンパク質の除去によって精製される。組換えポリペプチドの割合は、それによって試料中で増加する。
【００４７】
発明の詳細な説明
本発明は、前立腺癌での再発性遺伝子融合物の発見に基づく。本発明は、遺伝子融合物を直接的または間接的に検出するかまたは標的にする、診断、研究および治療の方法を提供する。本発明は、診断、研究および治療の目的のための組成物も提供する。
【００４８】
Ｉ．遺伝子融合物
本発明は、前立腺癌を示す再発性の遺伝子融合物を同定する。遺伝子融合物は、アンドロゲン調節遺伝子（ＡＲＧ）またはハウスキーピング遺伝子（ＨＧ）およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子の染色体再配列の結果である。それらの再発にもかかわらず、ＡＲＧまたはＨＧがＥＴＳファミリーメンバー遺伝子に融合する接合部は変動する。遺伝子融合物は、ＡＲＧまたはＨＧの転写調節領域からの５’部分、およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子からの３’部分を一般的に含む。再発性遺伝子融合物は、前立腺癌のための診断マーカーおよび臨床標的としての用途を有する。
【００４９】
Ａ．アンドロゲン調節遺伝子
男性ホルモンによって調節される遺伝子は、ヒト前立腺の正常な生理機能のためにきわめて重要である。それらは、前立腺癌の発達および進行にも寄与する。確認されているＡＲＧには、それらに限定されないが以下のものが含まれる。ＴＭＰＲＳＳ２；ＳＬＣ４５Ａ３；ＨＥＲＶ−Ｋ＿２２ｑ１１．２３；Ｃ１５ＯＲＦ２１；ＦＬＪ３５２９４；ＣＡＮＴ１；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＫＬＫ２；ＳＮＲＫ；Ｓｅｌａｄｉｎ−１；およびＦＫＢＰ５１（Ｐａｏｌｏｎｉ−Ｇｉａｃｏｂｉｎｏら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４４巻：３０９頁（１９９７年）；Ｖｅｌａｓｃｏら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４５巻（８号）：３９１３頁（２００４年））。
【００５０】
ＴＭＰＲＳＳ２（ＮＭ＿００５６５６）は、他の正常なヒト組織と比較して、前立腺上皮で強く発現されることが証明されている（Ｌｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
５９巻：４１８０頁（１９９９年））。ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子は、第２１染色体に位置する。この遺伝子は、ｐｔｅｒから４１，７５０，７９７〜４１，８０１，９４８ｂｐに位置する（合計５１，１５１ｂｐ；マイナス鎖の方向）。ヒトＴＭＰＲＳＳ２タンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ５１７８４（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ受託番号Ｏ１５３９３）で、および対応するｃＤＮＡはＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ７５３２９で見出すことができる（Ｐａｏｌｏｎｉ−Ｇｉａｃｏｂｉｎｏら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４４巻：３０９頁（１９９７年）も参照）。
【００５１】
プロスタインまたはＰ５０１Ｓとしても公知のＳＬＣ４５Ａ３は、正常な前立腺および前立腺癌において、転写産物レベルおよびタンパク質レベルの両方で排他的に発現されることが示されている（Ｋａｌｏｓら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６０巻、２４６〜５６頁（２００４年）；Ｘｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１巻、１５６３〜８頁（２００１年））。
【００５２】
ＨＥＲＶ−Ｋ＿２２ｑ１１．２３は、ＥＳＴ分析および大規模並列配列決定によって、ヒト内因性レトロウイルスエレメントのＨＥＲＶ−Ｋファミリーの２番目に強く発現されるメンバーであることが見出され、他の正常な組織と比較して前立腺で最も強く発現された（Ｓｔａｕｆｆｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ  ４巻、２頁（２００４年））。ＨＥＲＶ−Ｋエレメントのアンドロゲン調節は記載されていないが、内因性レトロウイルスエレメントは、マウス性連鎖タンパク質遺伝子Ｃ４Ａに対してアンドロゲン応答性を付与することが示されている（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら、Ｃｅｌｌ  ５５巻、２４７〜５４頁（１９８８年））。他のＨＥＲＶ−Ｋファミリーメンバーは、乳癌および乳癌細胞系で強く発現され、かつエストロゲンによって調節されることが示され（Ｏｎｏら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６１巻、２０５９〜６２頁（１９８７年）；Ｐａｔｉｅｎｃｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０巻、２６５４〜７頁（１９９６年）；Ｗａｎｇ−Ｊｏｈａｎｎｉｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２巻、１５２８〜３５頁（２００３年））、ｔ（８；１９）（ｐ１２；ｑ１３．３）の幹細胞骨髄増殖性疾患の場合、第１９染色体上のＨＥＲＶ−Ｋ３エレメントからの配列はＦＧＦＲ１に融合していた（Ｇｕａｓｃｈら、Ｂｌｏｏｄ  １０１巻、２８６〜８頁（２００３年））。
【００５３】
Ｄ−ＰＣＡ−２としても公知のＣ１５ＯＲＦ２１は、当初、正常な前立腺および前立腺癌でのその排他的な過剰発現に基づいて単離された（Ｗｅｉｇｌｅら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １０９巻、８８２〜９２頁（２００４年））。
【００５４】
ＦＬＪ３５２９４は、配列決定されたヒトｃＤＮＡの「完全長Ｊａｐａｎ」（ＦＬＪ）コレクションのメンバーと同定された（Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００４年１月；３６巻（１号）：４０〜５頁。Ｅｐｕｂ２００３年１２月２１日）。
【００５５】
ｓＳＣＡＮ１としても公知のＣＡＮＴ１は、溶解性のカルシウム活性化ヌクレオチダーゼである（Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２００２年１０月１日；４０６巻（１号）：１０５〜１５頁）。ＣＡＮＴ１は、３７１アミノ酸タンパク質である。切断可能なシグナルペプチドは、３７，１９３Ｄａの予測されたコア分子質量を有する３３３残基の分泌タンパク質を生成する。ノーザン分析は、精巣、胎盤、前立腺および肺を含む、様々なヒト組織で転写産物を同定した。このヒト酵素では従来のアピラーゼ保存領域およびヌクレオチド結合性ドメインは同定されず、細胞外ヌクレオチダーゼの新しいファミリーのメンバーであることを示している。
【００５６】
本発明の遺伝子融合物は、ＡＲＧの転写調節領域を含むことができる。ＡＲＧの転写調節領域は、ＡＲＧのコード領域または非コード領域を含むことができ、これにはプロモーター領域が含まれる。ＡＲＧのプロモーター領域は、ＡＲＧのアンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ）をさらに含むことができる。特に、ＴＭＰＲＳＳ２のプロモーター領域は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２７６４０４によって提供される。
【００５７】
Ｂ．ハウスキーピング遺伝子
ハウスキーピング遺伝子は構成的に発現され、すべての組織で一般に遍在的に発現される。これらの遺伝子は、すべての細胞が生存するために必要な、基本的な、必須機能を提供するタンパク質をコードする。ハウスキーピング遺伝子は、すべての細胞および組織で同じレベルで通常発現されるが、特に細胞増殖および生物体の発達の間、多少の変動がある。ヒト細胞がどれくらい多くのハウスキーピング遺伝子を有するかは正確には分かっていないが、ほとんどの推定値は３００〜５００の範囲にある。
【００５８】
何百ものハウスキーピング遺伝子の多くが、同定されている。最も一般に公知の遺伝子、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）は、解糖経路に不可欠な酵素をコードする。別の重要なハウスキーピング遺伝子はアルブミンであり、それは、体全体に化合物を輸送することに役立つ。いくつかのハウスキーピング遺伝子は、βアクチンおよびチューブリンなどの細胞骨格を構成する構造タンパク質をコードする。他は、リボソームの１８Ｓまたは２８Ｓ  ｒＲＮＡサブユニットをコードする。ＨＮＲＰＡ２Ｂ１は、遍在的に発現される異核リボ核タンパク質のメンバーである。そのプロモーターは、メチル化されていないことが示されており、導入遺伝子のＣＭＶプロモーターの転写サイレンシングを阻止する（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５巻、１７頁（２００５年））。ハウスキーピング遺伝子の例示的なリストは、例えば、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９巻、３６２〜３６５頁（２００３年）に見ることができる。
【００５９】
Ｃ．ＥＴＳファミリーメンバー遺伝子
ＥＴＳファミリーの転写因子は、遺伝子発現を制御する細胞内シグナル伝達経路を調節する。下流エフェクターとして、それらは特定の標的遺伝子を活性化または抑制する。上流エフェクターとして、それらは多数の増殖因子受容体の空間的および時間的な発現を担う。このファミリーのほぼ３０メンバーが同定され、広範囲の生理的および病理学的過程と関連付けられている。それらに限定されないが、これらには以下のものが含まれる。ＥＲＧ；ＥＴＶ１（ＥＲ８１）；ＦＬＩ１；ＥＴＳ１；ＥＴＳ２；ＥＬＫ１；ＥＴＶ６（ＴＥＬ１）；ＥＴＶ７（ＴＥＬ２）；ＧＡＢＰα；ＥＬＦ１；ＥＴＶ４（Ｅ１ＡＦ；ＰＥＡ３）；ＥＴＶ５（ＥＲＭ）；ＥＲＦ；ＰＥＡ３／Ｅ１ＡＦ；ＰＵ．１；ＥＳＥ１／ＥＳＸ；ＳＡＰ１（ＥＬＫ４）；ＥＴＶ３（ＭＥＴＳ）；ＥＷＳ／ＦＬＩ１；ＥＳＥ１；ＥＳＥ２（ＥＬＦ５）；ＥＳＥ３；ＰＤＥＦ；ＮＥＴ（ＥＬＫ３；ＳＡＰ２）；ＮＥＲＦ（ＥＬＦ２）；およびＦＥＶ。例示的なＥＴＳファミリーメンバー配列を、図９に示す。
【００６０】
ＥＲＧ（ＮＭ＿００４４４９）は、他の正常なヒト組織と比較して前立腺上皮で強く発現されることが証明されている。ＥＲＧ遺伝子は、第２１染色体に位置する。この遺伝子は、ｐｔｅｒから３８，６７５，６７１〜３８，９５５，４８８塩基対に位置する。ＥＲＧ遺伝子は、合計２７９，８１７ｂｐのマイナス鎖方向である。対応するＥＲＧ  ｃＤＮＡおよびタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１７２５４およびＮＰ０４４４０（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ受託番号Ｐ１１３０８）でそれぞれ与えられる。
【００６１】
ＥＴＶ１遺伝子は、第７染色体に位置する（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００００７．１１；ＮＣ＿０８６７０３．１１およびＮＴ＿００７８１９．１５）。この遺伝子は、ｐｔｅｒから１３，７０８，３３０〜１３，８０３，５５５塩基対に位置する。ＥＴＶ１遺伝子は、合計９５，２２５ｂｐの、マイナス鎖方向である。対応するＥＴＶ１  ｃＤＮＡおよびタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４９５６およびＮＰ＿００４９４７（Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ受託番号Ｐ５０５４９）でそれぞれ与えられる。
【００６２】
ヒトＥＴＶ４遺伝子は、第１４染色体に位置する（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００１７．９；ＮＴ＿０１０７８３．１４およびＮＴ＿０８６８８０．１）。この遺伝子は、ｐｔｅｒから３８，９６０，７４０〜３８，９７９，２２８塩基対に位置する。ＥＴＶ４遺伝子は、合計１８，４８８ｂｐの、マイナス鎖方向である。対応するＥＴＶ４  ｃＤＮＡおよびタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１９８６およびＮＰ＿０１９７７（Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ受託番号Ｐ４３２６８）でそれぞれ与えられる。
【００６３】
ヒトＥＴＶ５遺伝子は、第３染色体の３ｑ２８に位置する（ＮＣ＿０００００３．１０（１８７３０９５７０．．１８７２４６８０３）。対応するＥＴＶ５  ｍＲＮＡおよびタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４５４およびＣＡＧ３３０４８によってそれぞれ与えられる。
【００６４】
Ｄ．ＥＴＳ遺伝子融合物
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳ遺伝子融合物の最初の同定を含み、前立腺癌で５つのクラスのＥＴＳ再配列が同定されている（図４３）。本発明は、特定の機構に限定されない。実際、機構の理解は、本発明を実施するために必要でない。それにもかかわらず、ＡＲＧまたはＨＧとの融合、または癌で増加した発現を有する遺伝子座への挿入を経たＥＴＳファミリーメンバーの上方制御された発現は、前立腺癌の機構を提供することが想定される。特定の個体に存在する再配列のクラスについての知識は、カスタマイズされた癌療法を可能にする。
【００６５】
１．遺伝子再配列のクラス
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳ遺伝子融合物（クラスＩ）は、前立腺癌でのＥＴＳ再配列の優勢なクラスを表す。他の前立腺特異的アンドロゲン誘導遺伝子（クラスＩＩａ）および内因性レトロウイルスエレメント（クラスＩＩｂ）からの非翻訳領域との融合を含む再配列、例えばそれぞれＳＬＣ４５Ａ３およびＨＥＲＶ−Ｋ＿２２ｑ１１．２３は、ＥＴＳ再配列でのＴＭＲＰＳＳ２と同様に機能する。クラスＩおよびＩＩ再配列での５’パートナーに類似して、Ｃ１５ＯＲＦ２１は前立腺癌で著しく過剰発現される。しかし、クラスＩおよびＩＩ再配列での融合パートナーとは異なり、Ｃ１５ＯＲＦ２１はアンドロゲンによって抑制され、前立腺特異的アンドロゲン抑制５’融合パートナーを含む新規クラスのＥＴＳ再配列（クラスＩＩＩ）を表している。対照的に、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１は、前立腺特異的発現またはアンドロゲン応答性を示さなかった。したがって、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１：ＥＴＶ１は、非組織特異的プロモーターエレメントを含む融合物がＥＴＳ発現を誘起する、新規クラスのＥＴＳ再配列（クラスＩＶ）を表す。クラスＶ再配列では、ＥＴＳ遺伝子全体が前立腺特異的領域に再配列される。
【００６６】
進行した前立腺癌の男性はアンドロゲン剥奪療法で一般に治療され、通常腫瘍回帰を生じる。しかし、癌はほとんど常に、ホルモン治療抵抗性の表現型で進行する。クラスＩＶ再配列（例えばＨＮＲＰＡ２Ｂ１：ＥＴＶ１）はアンドロゲン非感受性プロモーターエレメントによって誘起されるので、これらの遺伝子融合物はアンドロゲン剥奪に応答性でないであろうから、これらの患者が抗アンドロゲン治療に応答することができないことを結果は示す。クラスＩＩＩ再配列を有する患者の抗アンドロゲン治療は、ＥＴＳ融合物発現を増加させることができる。例えば、抗アンドロゲン治療がＣ１５ＯＲＦ２１：ＥＴＶ１発現を増加させたホルモン治療抵抗性の転移性前立腺癌を有する患者から、Ｃ１５ＯＲＦ２１：ＥＴＶ１が単離された。この仮説を裏付けるように、ＬＮＣａＰのアンドロゲン飢餓は、内因性ＰＳＡおよびＴＭＰＲＳＳ２の発現をかなり減少させ、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１に対して影響を及ぼさず、Ｃ１５ＯＲＦ２１の発現を増加させた（図４９）。これは、存在する融合物のクラスに基づく、前立腺癌男性のカスタマイズされた治療を可能にする（例えば、アンドロゲンブロック療法または他の代替療法の選択）。
【００６７】
前立腺癌での遺伝子再配列の複数のクラスは、一般的な上皮癌での染色体再配列のより一般化された役割を示す。例えば、乳癌での癌遺伝子に融合するエストロゲン応答エレメントなど、組織特異的プロモーターエレメントは、他のホルモン誘発癌での癌遺伝子に融合することができる。さらに、前立腺特異的融合物（クラスＩ〜ＩＩＩ、Ｖ）は、他の上皮癌で増殖の利点を提供せず、選択されないであろうが、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１などの、遍在的に発現される遺伝子の強いプロモーターを含む融合物は、腫瘍型横断的に癌遺伝子の異常な発現をもたらす。要約すると、この研究は、血液学的悪性疾患と同様に、様々な機構を通した、一般的な上皮性腫瘍の発達での染色体再配列の役割を裏付ける。
【００６８】
２．ＡＲＧ／ＥＴＳ遺伝子融合物
上に述べたように、本発明は、ＡＲＧとＥＴＳファミリーメンバー遺伝子との融合物を提供する。例示的な遺伝子融合物配列を、図３６、５１および５２に示す。ＴＭＰＲＳＳ２、ＥＲＧ、ＥＴＶ１およびＥＴＶ４については、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列番号が提供され、エクソンは、ＵＣＳＣヒトゲノムの２００４年５月のアセンブリーを用いて整列されている。同定されたすべての融合物については、図３６は、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の開始から融合およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子の終止コドンまでの、完全な配列を提供する。公開されている各変異体の寄託ＧｅｎＢａｎｋ配列も提供される。一部のＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合物は、ＴＭＰＲＳＳ２およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子の中断点エクソンによって記載される。例えば、ＴＭＰＲＳＳ２のエクソン１をＥＲＧのエクソン４〜１１に融合するＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａは、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ（１，４）として識別される。
【００６９】
特定の遺伝子融合物は、前立腺癌で他より一般的である。本発明は、前立腺癌の５０〜８０％が、ＥＲＧ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４またはＦＬＩ１とのＴＭＰＲＳＳ２の再発性遺伝子融合物を有すると同定する。そのうち、５０〜７０％はＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧであり、その５０％〜６０％は第２１染色体上のＴＭＰＲＳＳ２およびＥＲＧ遺伝子座の間の遺伝情報の欠失から生じ（下でさらに詳細に記載される）、５〜１０％はＴＭＰＲＳＳ２−ＥＴＶ１であり、１〜２％はＴＭＰＲＳＳ２−ＥＴＶ４であり、１〜２％はＴＭＰＲＳＳ２−ＦＬＩ１である。
【００７０】
本発明の開発中に行った実験は、特定の融合遺伝子は融合転写産物を発現するが、他は機能的転写産物を発現しないことを示した（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１０巻：６４４〜６４８頁（２００５年）、Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６巻：３３９６〜３４００頁（２００６年））。
【００７１】
ａ．ＥＲＧ遺伝子融合物
上に述べたように、ＥＲＧを含む遺伝子融合物は、前立腺癌で最も一般的な遺伝子融合物であることが見出された。本発明の開発中に行った実験は、第２１染色体ｑ２２．２〜３上のＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間に位置するかなりのゲノム欠失を同定した。欠失は、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合物陽性ＰＣＡ試料で見られた。欠失はコンセンサス領域に現れるが、この領域中で変動を示す。Ｐａｒｉｓら（Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．１３巻：１３０３〜１３頁（２００４年））による既刊の研究では、ＣＧＨ分析は、ＴＭＰＲＳＳ２から６ｋｂ動原体寄りであるＣＴＤ−２１０３Ｏ７  ＢＡＣに欠失を検出した。これらの欠失は、臨床的に限局性のＰＣＡ試料の１２．５％（９／７２）で、および転移性ＰＣＡ試料の３３％（５／１５）で観察された。これらの結果は、本研究からのＳＮＰ配列データを裏付け、ＰＣＡ欠失が進行に伴いより一般的になるか、またはより速やかに進行する傾向があるＰＣＡで欠失がより頻繁に特定されることを示す。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列の特筆すべき腫瘍内均一性を考慮すると、これらの分子サブタイプが異なる疾患進行特性に関連する可能性がより高い。
【００７２】
４９．２％のＥＲＧ再配列を抱える１１８個の臨床的に限局性のＰＣＡ症例を評価した。イントロン欠失が、これらのＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合物陽性症例の６０．３％で観察された。ＥＲＧの著しい過剰発現を有するほとんどすべてのＰＣＡ試料は再配列を有し、過剰発現は、再配列とほぼ同じ症例数で起こる。遺伝子発現データの公開解説であるＯｎｃｏｍｉｎｅを用いて、一般的な欠失部位の領域に位置するかなり下方制御された４遺伝子を同定した（図１６）。
【００７３】
本発明は、特定の機構に限定されない。実際、機構の理解は、本発明を実施するために必要でない。それにもかかわらず、すべてのＰＣＡのほぼ半分をＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列によって定義することができることを結果は示唆する。これらの腫瘍の大部分は、イントロン欠失を証明し、それは、オリゴヌクレオチドＳＮＰ配列ゲノム分析によるとサイズが異なる。しかし、約３０〜４０％は欠失を証明せず、したがってＴＭＲＰＳＳ２およびＥＲＧの均衡した転位を抱えている可能性がある。欠失の程度のこの変動は、ＣＭＬで観察されているように疾患進行に関連している可能性がある。本研究は、腫瘍病期およびリンパ節状態との有意な臨床上の関連性を特定した。欠失を有するＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列腫瘍は、ＰＳＡの生化学的不全の割合が高まる傾向も示した。
【００７４】
本発明の開発中に行ったさらなる実験は、長期追跡調査を行った早期前立腺癌の注意待期コホートで、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合物の存在に基づいて、転移または前立腺癌特異的死を起こす危険を探究した。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合の頻度は、９２症例を用いて評価した。この集団ベースのコホートにおけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合の頻度は１５．２％（１４／９２）であって、２つの病院ベースのコホートで観察された５０％の頻度よりも低かった。本発明は、特定の機構に限定されない。実際、機構の理解は、本発明を実施するために必要でない。それにもかかわらず、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合前立腺癌でのこの差は、民族的および人種的な遺伝的差による可能性がある。これらの差は、他の非集団ベースの研究と比較して、この注意待期コホートでのより低い割合の高グレード症例によって説明することもできる。
【００７５】
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合物と遠隔転移の発生および前立腺癌特異的死との間の有意な関連性は、３．６の累積発生比率（Ｐ＝０．００４、９５％信頼区間＝１．５〜８．９）で観察された。これらのデータは、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合前立腺癌がより攻撃的な表現型を有することを示唆する。追実験は、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合物でのゲノム欠失が、進行したおよび／または転移性の前立腺癌と相関することを示した（例えば、実施例５を参照）。
【００７６】
アンドロゲンが、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ陽性細胞系で、おそらくＡＲＥを通して、ＥＲＧの過剰発現を誘発することができることも本発明は証明した。本発明は、特定の機構に限定されない。実際、機構の理解は、本発明を実施するために必要でない。それにもかかわらず、総合して、ＴＭＰＲＳＳ２の上流のＡＲＥを通してのＥＴＳファミリー活性の調節不全が、前立腺癌の発達を誘起することができることを結果は示唆する。
【００７７】
ｂ．ＥＴＶ１遺伝子融合物
本発明の一部の実施形態の開発中に行ったさらなる研究は、ＥＴＶ１の異常発現の頻度とＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１陽性前立腺癌との間の不一致を調査した。結果は、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合物を、前立腺癌でＥＲＧ過剰発現を誘起する優勢な機構として同定した前の試験を確認した。しかし、ＥＴＶ１を過剰発現する３つの前立腺癌では、新規の５’融合パートナーが同定された。本発明は、特定の機構に限定されない。実際、機構の理解は、本発明を実施するために必要でない。それにもかかわらず、ＥＲＧおよびＥＴＶ１を含む融合物の５’パートナーでのこの矛盾の理由は不明であるが、ＴＭＰＲＳＳ２およびＥＲＧは第２１染色体上に約〜３ＭＢ離れて位置しているので、それらの近接性がＥＲＧの５’パートナーとしてＴＭＰＲＳＳ２を有利にしている可能性がある。
【００７８】
遺伝子導入マウスでのアンドロゲン調節下のＥＴＶ１の過剰発現は、マウス前立腺で高度に貫通性のｍＰＩＮをもたらした（１２中９、７５％）。癌腫の発達は観察されなかった。これらの結果は、ＥＴＶ１過剰発現が良性前立腺上皮細胞で浸潤を増加させたが、形質転換に十分でなかったｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究、および、ヒトで、ＰＩＮから癌腫への移行の間、または前立腺癌進行の早期にＥＴＳ融合物がおそらく出現することを示す前の研究を裏付ける（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３９巻、４１〜５１頁（２００７年））。本発明は、特定の機構に限定されない。実際、機構の理解は、本発明を実施するために必要でない。それにもかかわらず、ヒト前立腺癌の発達では、単一のＮＫＸ３−１および／またはＰＴＥＮ対立遺伝子の喪失などの、より早期の病変との関連でＥＴＳ遺伝子融合物が出現することが予想される（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  １巻、２４３〜２７１頁（２００６年））。さらに、癌腫への早期進行のないＥＴＶ１遺伝子導入マウスでのｍＰＩＮの発達は、ＮＫＸ３−１＋／−およびＰＴＥＮ＋／−マウスなどの、ヒト前立腺癌のこれらの他の早期事象のマウスモデルに類似している（Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９巻、２８８４〜９頁（２００２年）、Ａｂｄｕｌｋａｄｉｒら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２２巻、１４９５〜５０３頁（２００２年）、Ｄｉ  Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｏら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２７巻、２２２〜４頁（２００１年））。したがって、ＡＲＲ２Ｐｂ−ＥＴＶ１マウスとこれらのマウスとの交雑が、ヒト前立腺癌の発達における早期事象を模倣する癌遺伝子／腫瘍サプレッサーモデルを生成することが想定される。
【００７９】
ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１のＥＴＶ１によって調節される転写プログラムを特定するために、発現シグネチャーを、増殖する分子概念コレクションまたは生物学的に関連する遺伝子セットの間の相互関係のネットワークを探究するための分析フレームワークである、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  Ｍａｐに加えた。関連性分析のための遺伝子セットの最も大きなコレクションであることに加えて、ＭＣＭは、データベース中のすべての遺伝子セットの間のペア毎の関連を計算して、関連する概念の「濃縮ネットワーク」の同定および可視化を可能にする点で特異である。
【００８０】
この分析は、ＥＴＳ遺伝子の異常発現のない癌に対してＥＴＶ１異常発現を有する前立腺癌で過剰発現される遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏシグネチャーが、ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１細胞で過剰発現される遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏシグネチャーで濃縮される（Ｐ＝０．００３）ことを示し（図４１ｆ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの生物学的関連性を裏付けた。より一般的には、ＭＣＭ分析は、ＥＴＶ１が過剰に発現されたシグネチャーで濃縮された細胞浸潤に関連する分子概念のネットワークを特定し、この報告に記載される表現型効果と一貫していた。例えば、シグネチャーは、表面的な移行細胞膀胱癌に対して浸潤性のもので過剰発現された遺伝子（Ｍｏｄｌｉｃｈら、Ｐ＝２．９Ｅ−１４、Ｄｙｒｓｋｊｏｔら、Ｐ＝１．２Ｅ−８）２９、３０および上皮内腺管癌に対して浸潤性の乳腺管癌で過剰発現された遺伝子（Ｓｃｈｕｅｔｚら、Ｐ＝３．８Ｅ−１３）を表す概念と濃縮を共有した。より直接には、シグネチャーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン（ＡＤＡＭ）を含む、「ペプチダーゼＭ１０ＡおよびＭ１２Ｂ、マトリキシンまたはアダマリシンドメイン」（Ｐ＝８．５Ｅ−５）を含むタンパク質のＩｎｔｅｒＰｒｏ概念と濃縮を共有した。
【００８１】
その両方は浸潤を媒介することが公知であり、ＥＴＳ転写因子の直接の標的であることが報告されている、いくつかのＭＭＰおよびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子経路のメンバーは、ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１細胞で過剰発現された（図４１ｇ）。さらに、「ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１で過剰発現された」シグネチャーは、ＳＴＡＴ３−Ｃ癌遺伝子を過剰発現するＭＣＦ−１０Ａ細胞で過剰発現される遺伝子のシグネチャーと重複部分を共有した（Ｐ＝８．９Ｅ−１４）。このモデルでは、ＳＴＡＴ３−Ｃ過剰発現は、増殖に影響しなかったが、ＭＭＰ９依存的に浸潤を増加させた。結果は、ＥＷＳ：ＦＬＩ１のノックダウンまたは過剰発現が浸潤に影響を及ぼすが増殖に影響しないことを証明した、ユーイング肉腫でのＥＷＳＲ１：ＥＴＳ遺伝子融合の研究とも一致する（Ｓｍｉｔｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ９巻、４０５〜１６頁（２００６年））。ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１シグネチャーで過小発現されるもののＭＣＭ分析は、増殖関連の概念による濃縮を明らかにし（図５０）、ＦＡＣＳまたは増殖アッセイでは明らかでない細胞増殖に対する微妙な効果を示した。
【００８２】
本研究は、細胞遺伝学研究を導くために異常な遺伝子発現を用いることの有用性も証明する。例えば、多数の核型分析、ＳＫＹおよび高分解能アレイＣＧＨ試験にもかかわらず、潜在的なＥＴＶ１再配列は、最も一般的に用いられる前立腺癌のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルであるＬＮＣａＰで報告されていない（Ｂｅｈｅｓｈｔｉら、Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ  ５巻、２３〜３２頁（２０００年）、Ｂｅｈｅｓｈｔｉら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ３巻、６２〜９頁（２００１年）、Ｇｉｂａｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  １１巻、３９９〜４０４頁（１９８４年）、Ｗａｔｓｏｎら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １２０巻、７９５〜８０５頁（２００７年）、Ｐａｎｇら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６６巻、１５７〜７２頁（２００６年）、Ｍｕｒｉｌｌｏら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ４５巻、７０２〜１６頁（２００６年）、Ｓｈｉら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６０巻、２５７〜７１頁（２００４年）、Ｔａｋａｈａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２巻、６４７〜５１頁（２００２年）、Ｓｔｒｅｆｆｏｒｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  １２４巻、１１２〜２１頁（２００１年）、Ｔｈａｌｍａｎｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４巻、２５７７〜８１頁（１９９４年））。同様に、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合物は、核型分析によって検出することができない、２１ｑ上のＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間の染色体内欠失にしばしば起因する。同様に、本明細書で同定されるＨＮＲＰＡ２Ｂ１：ＥＴＶ１融合物も、約１５ＭＢにわたる染色体内欠失を通して起こる。これらの結果は、癌遺伝子を活性化する潜在的な再配列および染色体内欠失が、他の一般的な上皮癌で起こる可能性を示す。
【００８３】
ｃ．ＥＴＶ４遺伝子融合物
Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータベースからの前立腺癌プロファイリング試験で監視したすべてのＥＴＳファミリーメンバーの発現を調べるために、実験を行った（Ｒｈｏｄｅｓら、上記）。ＥＴＳファミリーメンバーＥＴＶ４の顕著な過剰発現が、２つの研究の各々からの単一の前立腺癌症例で特定された−１つは、肉眼的に切開した組織をプロファイリングし（Ｌａｐｏｉｎｔｅら、上記）（図７Ａ）、他は、レーザー捕捉マイクロ切開（ＬＣＭ）組織１をプロファイリングした（図７Ｂ）。ＥＴＶ４は、癌組織でＴＭＰＲＳＳ２に融合されることが見出された。
【００８４】
ｄ．ＥＴＶ５遺伝子融合物
さらなる実験は、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ５およびＳＬＣ４５Ａ３：ＥＴＶ５遺伝子融合物を同定した（実施例２０）。ＥＴＶ５は、前立腺癌試料で異常発現を有することが見出され、その後遺伝子融合物に存在することが見出された。
【００８５】
３．ＨＧ／ＥＴＳ遺伝子融合物
さらなる実験は、前立腺癌でＨＮＲＰＡ２Ｂ１：ＥＴＶ１遺伝子融合物を同定した。ＨＮＲＰＡ２Ｂ１は、前立腺特異的発現およびアンドロゲン調節を示さず、その代わりにすべての腫瘍型にわたって強く発現される。ＨＮＲＰＡ２Ｂ１は遍在的に発現される異核リボ核タンパク質のメンバーをコードし、そのプロモーターは、他のハウスキーピング遺伝子と構造類似性を共有する（Ａｎｔｏｎｉｏｕら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８２巻、２６９〜７９頁（２００３年））。さらに、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１プロモーターはメチル化されていないことが示されており、導入遺伝子のＣＭＶプロモーターの転写サイレンシングを阻止する（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５巻、１７頁（２００５年））。したがって、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１：ＥＴＶ１は、非組織特異的プロモーターエレメントが癌遺伝子の発現を誘起する、一般的な上皮癌の新規クラスの遺伝子融合物を表す。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳ融合物はＢ細胞悪性疾患でのＩＧＨ−ＭＹＣ再配列に機能的に類似しているが、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１：ＥＴＶ１は、構成的に発現されるＲＰＮ１遺伝子のエンハンサーエレメントの支配下へのＥＶＩの配置をもたらすと考えられている、急性骨髄性白血病でのｉｎｖ（３）（ｑ２１ｑ２６）およびｔ（３；３）（ｑ２１；ｑ２６）により類似している（Ｓｕｚｕｋａｗａら、Ｂｌｏｏｄ  ８４巻、２６８１〜８頁（１９９４年）、Ｗｉｅｓｅｒら、Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ４３巻、５９〜６５頁（２００２年））。
【００８６】
他の一般的な上皮癌は、乳癌で癌遺伝子に融合するエストロゲン応答エレメントなどの、組織特異的プロモーターエレメントによって誘起されることが想定される。さらに、本明細書で同定される前立腺特異的融合物（例えばＳＬＣ４５Ａ３：ＥＴＶ１）は、他の上皮癌で増殖の利点を提供しないであろうが、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１などの、遍在的に発現される遺伝子の強いプロモーターを含む融合物は、腫瘍型横断的に癌遺伝子の異常な発現をもたらすことができる。本明細書で同定されるＨＮＲＰＡ２Ｂ１：ＥＴＶ１融合物は、約１５ＭＢにわたる染色体内欠失を通して起こる。これらの結果は、癌遺伝子を活性化する潜在的な再配列および染色体内欠失が、他の一般的な上皮癌で起こる可能性を示す。
【００８７】
ＩＩ．抗体
その断片、誘導体および類似体を含む本発明の遺伝子融合タンパク質は、下記の診断、研究および治療の方法で用いることができる抗体を生成するための免疫原として用いることができる。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル、キメラ、ヒト化、単鎖またはＦａｂ断片であることができる。そのような抗体および断片の生成および標識化のために、当分野の技術者に公知である様々な手順を用いることができる。例えば、Ｂｕｒｎｓ編、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第３版、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００５年）、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８年）、Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４巻：７２頁（１９８３年）、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６巻：４９５頁（１９７５年）を参照。トランケーションされたＥＴＳファミリーメンバータンパク質またはキメラタンパク質とそれらのそれぞれの本来のタンパク質との間の差を活用する抗体または断片が、特に好ましい。
【００８８】
ＩＩＩ．診断への適用
ＡＲＧまたはＨＧとＥＴＳファミリーメンバー遺伝子との融合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質として検出可能である。当初、遺伝子融合物は、ＡＲＧまたはＨＧの転写調節領域からの５’部分、およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子からの３’部分を有するゲノムＤＮＡの染色体再配列として検出可能である。転写されると、遺伝子融合物は、ＡＲＧまたはＨＧの転写調節領域からの５’部分、およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子からの３’部分を有するキメラｍＲＮＡとして検出可能である。翻訳されると、遺伝子融合物は、ＡＲＧまたはＨＧの転写調節領域とＥＴＳファミリーメンバー遺伝子との融合物から生じる、アミノ末端がトランケーションされたＥＴＳファミリーメンバータンパク質として；ＡＲＧまたはＨＧの転写調節領域からのアミノ末端部分およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子からのカルボキシ末端部分を有するキメラタンパク質として；または、上方制御されているが、さもなければ区別できない本来のＥＴＳファミリーメンバータンパク質として検出可能である。トランケーションされたＥＴＳファミリーメンバータンパク質およびキメラタンパク質は、アミノ酸配列、翻訳後プロセシングおよび／または二次、三次もしくは四次構造において、それらのそれぞれの本来のタンパク質と異なることができる。存在する場合、そのような差を用いて遺伝子融合物の存在を特定することができる。具体的な検出方法を、下でさらに詳細に記載する。
【００８９】
本発明は、遺伝子融合物を直接的または間接的に検出する、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質ベースの診断方法を提供する。本発明は、診断目的のための組成物およびキットも提供する。
【００９０】
本発明の診断方法は、定性的または定量的でもよい。定量的な診断方法は、例えばカットオフまたは閾値レベルを通して無痛性および攻撃的な癌を区別するために用いることができる。該当する場合、定性的または定量的な診断方法は、標的、シグナルまたは仲介者（例えば、汎用性プライマー）の増幅を含むこともできる。
【００９１】
最初のアッセイは、遺伝子融合物の存在を確認することができるが、特定の融合物を同定することができない。所望により、特定の融合物の同一性を判定するために、次に二次アッセイが実施される。第二のアッセイは、最初のアッセイと異なる検出技術を用いることができる。
【００９２】
本発明の遺伝子融合物は、多重またはパネルフォーマットの他のマーカーと共に検出することができる。マーカーは、それらの予測的価値について単独で、または遺伝子融合物と組み合わせて選択される。例示的前立腺癌マーカーには、それらに限定されないが、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＡＭＡＣＲ／Ｐ５０４Ｓ（米国特許第６，２６２，２４５号）、ＰＣＡ３（米国特許第７，００８，７６５号）、ＰＣＧＥＭ１（米国特許第６，８２８，４２９号）、プロスタイン／Ｐ５０１Ｓ、Ｐ５０３Ｓ、Ｐ５０４Ｓ、Ｐ５０９Ｓ、Ｐ５１０Ｓ、プロスターゼ／Ｐ７０３Ｐ、Ｐ７１０Ｐ（米国特許出願公開第２００３０１８５８３０号）、ならびに、米国特許第５，８５４，２０６号および第６，０３４，２１８号および米国特許出願公開第２００３０１７５７３６号に開示のものが含まれる。他の癌、疾患、感染症および代謝状態のマーカーも、多重のパネルフォーマットに組入れられることが想定される。
【００９３】
本発明の診断方法は、特定の遺伝子融合物を疾患の病期、攻撃性もしくは進行、または転移の存在もしくは危険に関連させるデータに関して改変することもできる。最終的に、本発明の方法によって提供される情報は、特定の患者のために最良の治療クールを医師が選択するのに役立つ。
【００９４】
Ａ．試料
遺伝子融合物を含むことが疑われるいかなる患者試料も、本発明の方法によって検査することができる。非限定例として、試料は、組織（例えば、前立腺生検試料もしくは前立腺切除によって得た組織試料）、血液、尿、精液、前立腺分泌物またはそれらの分画（例えば、血漿、血清、尿上清、尿細胞ペレットもしくは前立腺細胞）であることができる。好ましくは、尿試料は、前立腺からの前立腺細胞を尿路に排出させる、注意深い直腸指診（ＤＲＥ）の直後に収集される。
【００９５】
患者試料は、遺伝子融合物または遺伝子融合物を含む細胞のための試料を単離または濃縮するように設計された、予備処理を一般的に必要とする。この目的のために、それらに限定されないが、遠心分離、免疫捕捉、細胞溶解および核酸標的捕捉を含む、当分野の技術者に公知である様々な技術を用いることができる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、欧州特許第１４０９７２７号を参照）。
【００９６】
Ｂ．ＤＮＡおよびＲＮＡ検出
本発明の遺伝子融合物は、それらに限定されないが、核酸配列決定、核酸ハイブリダイゼーションおよび核酸増幅を含む、当分野の技術者に公知である様々な核酸技術を用いて、ゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの染色体再配列として検出することができる。
【００９７】
１．配列決定
核酸配列決定技術の例示的な非限定例には、連鎖停止剤（Ｓａｎｇｅｒ）配列決定および染色停止剤配列決定が含まれるが、これらに限定されない。ＲＮＡは細胞中でより不安定であり、ヌクレアーゼ攻撃により感受性であるので、当分野の技術者は、実験的ＲＮＡが配列決定の前にＤＮＡに通常逆転写されることを認識する。
【００９８】
連鎖停止剤配列決定は、改変ヌクレオチド基質を用いるＤＮＡ合成反応の配列特異的停止を用いる。その領域で鋳型に相補的である、放射性の、または他の標識された短いオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより、伸長は、鋳型ＤＮＡ上の特異的部位で開始される。オリゴヌクレオチドプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、標準の４つのデオキシヌクレオチド塩基、および低濃度の１つの連鎖停止ヌクレオチド、最も一般的にはジデオキシヌクレオチドを用いて伸長される。この反応は４つの別々の管で繰り返され、各塩基はジデオキシヌクレオチドと交替する。ＤＮＡポリメラーゼによる連鎖停止ヌクレオチドの限定的組込みは、その特定のジデオキシヌクレオチドが用いられる位置だけで停止される一連の関連ＤＮＡ断片をもたらす。各反応管について、スラブポリアクリルアミドゲルまたは粘性ポリマーを満たした毛細管での電気泳動によって、断片はサイズ別に分離される。ゲルの上端から下端までスキャンするときに、どのレーンが標識プライマーから可視化マークを生成するかを読み取ることによって、配列が決定される。
【００９９】
染色停止剤配列決定は、代わりに停止剤を標識する。ジデオキシヌクレオチド連鎖停止剤の各々を、異なる波長で蛍光を発する別々の蛍光染料で標識することによって、完全な配列決定を単一の反応で実施することができる。
【０１００】
２．ハイブリダイゼーション
核酸ハイブリダイゼーション技術の例示的な非限定例には、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、マイクロアレイおよびサザンブロットまたはノーザンブロットが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０１】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、組織の一部または切片で（ｉｎ
ｓｉｔｕ）、または組織が十分に小さい場合には組織全体で（ホールマウントＩＳＨ）、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の位置を特定するためのプローブとして、標識された相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖を用いる種類のハイブリダイゼーションである。ＤＮＡ  ＩＳＨは、染色体の構造を判定するために用いることができる。ＲＮＡ  ＩＳＨは、組織切片またはホールマウントの中のｍＲＮＡおよび他の転写産物の位置を特定するために用いられる。試料細胞および組織は、通常、標的転写産物を適所に固定して、プローブのアクセスを増加させるために処理される。プローブは昇温状態で標的配列とハイブリダイズし、過剰なプローブはその後洗い流される。放射能、蛍光または抗原で標識された塩基で標識されたプローブは、それぞれオートラジオグラフィ、蛍光顕微鏡検査または免疫組織化学を用いて、組織で位置が特定され、定量化される。ＩＳＨは、２つ以上の転写産物を同時に検出するために、放射能または他の非放射性標識で標識された２つ以上のプローブを用いることもできる。
【０１０２】
ａ．ＦＩＳＨ
一部の実施形態では、融合物配列は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて検出される。本発明のための好ましいＦＩＳＨアッセイは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）を利用する。これらは、ヒトゲノム配列決定プロジェクト（Ｎａｔｕｒｅ
４０９巻：９５３〜９５８頁（２００１年）を参照）で広範に用いられ、特異的ＢＡＣを含むクローンは、多くの提供元、例えばＮＣＢＩを通して捜すことができる販売業者を通して入手可能である。ヒトゲノムからの各ＢＡＣクローンは、それを明白に特定する参照名称が与えられている。これらの名称は、対応するＧｅｎＢａｎｋ配列を捜し出し、販売業者からクローンのコピーを注文するために用いることができる。
【０１０３】
一部の実施形態では、検出アッセイは、ＥＴＶ１のためのプローブ（例えば、ｂａｃ  ＲＰ１１−６９２Ｌ４）、ｃ−ＥＲＧ：ｔ−ＥＲＧ分断のためのプローブのセット（例えば、ｂａｃ  ＲＰ１１−２４Ａ１１およびｔ−ＥＲＧ  ＲＰ１１−３７２Ｏ１７またはＲＰ１１−１３７Ｊ１３のためのプローブ）を利用するＦＩＳＨアッセイである。他の実施形態では、ＦＩＳＨアッセイは、ＥＴＶ１の欠失または増幅についてプローブのセットで試験することによって実施され、そこで、１つのプローブはＥＴＶ１遺伝子座にわたり（例えば、ｂａｃ  ＲＰ１１−６９２Ｌ４）、他のプローブは第７染色体とハイブリダイズする（例えば、染色体のセントロメア上のプローブ）。さらなる実施形態では、本方法は、ＥＲＧの欠失または増幅についてプローブのセットで試験することによって実施され、１つはＥＲＧ遺伝子座にわたり（例えば、ｂａｃ  ＲＰ１１−４７６Ｄ１７）、１つは第２１染色体上の参照プローブである（例えば、ＰＲ１１−３２Ｌ６、ＲＰ１１−７５２Ｍ２３、ＲＰ１１−１１０７Ｈ２１、ＲＰ１１−６３９Ａ７またはＲＰ１１−１０７７Ｍ２１）。さらなる他の実施形態では、本方法は、ＴＭＰＲＳＳ２の欠失／増幅についてプローブのセットで試験することによって実施され、１つはＴＭＰＲＳＳ２遺伝子座にわたり（例えば、ＲＰ１１−１２１Ａ５、ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＰＲ１１−８１４Ｆ１３またはＲＲ１１−５３５Ｈ１１）、１つは第２１染色体上の参照プローブである（例えば、ＰＲ１１−３２Ｌ６、ＲＰ１１−７５２Ｍ２３、ＲＰ１１−１１０７Ｈ２１、ＲＰ１１−６３９Ａ７またはＲＰ１１−１０７７Ｍ２１）。一部の実施形態では、本方法は、それらに限定されないが、ＲＰ１１−１２１Ａ５、ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＰＲ１１−８１４Ｆ１３およびＲＲ１１−５３５Ｈ１１を含む群から選択されるプローブを用いるハイブリダイゼーションをさらに含む。
【０１０４】
本発明は、ヒト前立腺細胞、ヒト前立腺組織、または前記ヒト前立腺細胞もしくはヒト前立腺組織を囲む液体でＦＩＳＨアッセイを実施する方法をさらに提供する。
【０１０５】
一部の実施形態では、本アッセイは、それらに限定されないが、ＲＰ１１−３７２Ｏ１７；ＲＰ１１−１３７Ｊ１３；ＲＰ１１−６９２Ｌ４；ＲＰ１１−４７６Ｄ１７；ＰＲ１１−３２Ｌ６；ＲＰ１１−７５２Ｍ２３；ＲＰ１１−１１０７Ｈ２１；ＲＰ１１−６３９Ａ７；ＲＰ１１−１０７７Ｍ２１；ＲＰ１１−１２１Ａ５；ＲＰ１１−１２０Ｃ１７；ＰＲ１１−８１４Ｆ１３；およびＲＲ１１−５３５Ｈ１１を含む群から選択されるプローブを用いるハイブリダイゼーションステップを含む。
【０１０６】
本発明に関連した再配列を検出するためのＦＩＳＨプロトコールで用いることができる具体的なＢＡＣクローンは、以下の通りである：
・ＥＴＶ１−ＴＭＰＲＳＳ２融合物について試験するために、ＥＴＶ１にわたる１つのプローブ、およびＴＭＰＲＳＳ２遺伝子座にわたる１つを用いることができる：
ＥＴＶ１のためのＢＡＣ：ＲＰ１１−６９２Ｌ４
ＴＭＰＲＳＳ２のためのＢＡＣ：ＲＰ１１−１２１Ａ５、（ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＰＲ１１−８１４Ｆ１３、ＲＲ１１−５３５Ｈ１１）
・ｃ−ＥＲＧ：ｔ−ＥＲＧ分断のためのプローブのセットによるＥＲＧ転位の試験：
ｃ−ＥＲＧのためのＢＡＣ：ＲＰ１１−２４Ａ１１
ｔ−ＥＲＧのためのＢＡＣ：ＲＰ１１−３７２Ｏ１７、ＲＰ１１−１３７Ｊ１３
・プローブのセット、ＥＴＶ１遺伝子座にわたる１つのプローブ、および第７染色体上の１つの参照プローブによるＥＴＶ１欠失／増幅の試験：
ＥＴＶ１のためのＢＡＣ：ＲＰ１１−６９２Ｌ４
・プローブのセット、ＥＲＧ遺伝子座にわたる１つのプローブ、および第２１染色体上の１つの参照プローブによるＥＲＧ欠失／増幅の試験：
ＥＲＧのためのＢＡＣ：ＲＰ１１−４７６Ｄ１７  第２１染色体上の参照プローブのためのＢＡＣ：＊
・プローブのセット、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子座にわたる１つのプローブ、および第２１染色体上の１つの参照プローブによるＴＭＰＲＳＳ２欠失／増幅の試験：
ＴＭＰＲＳＳ２のためのＢＡＣ：ＲＰ１１−１２１Ａ５、（ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＰＲ１１−８１４Ｆ１３、ＲＲ１１−５３５Ｈ１１）
第２１染色体上の参照プローブのためのＢＡＣ：ＰＲ１１−３２Ｌ６、ＲＰ１１−７５２Ｍ２３、ＲＰ１１−１１０７Ｈ２１、ＲＰ１１−６３９Ａ７、（ＲＰ１１−１０７７Ｍ２１）。
【０１０７】
ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間の融合物をもたらす欠失突然変異を検出するための最も好ましいプローブは、ＲＰ１１−２４Ａ１１およびＲＰ１１−１３７Ｊ１３である。これらのプローブ、または上記のそれらは、適当な蛍光マーカーまたは他のマーカーで標識され、その後ハイブリダイゼーションで用いられる。本明細書で提供される実施例のセクションは、欠失を測定するのに有効な１つの特定のプロトコールを示すが、当業技術者は、このアッセイの多くの変形形態を等しく都合よく用いることができることを認識する。具体的なプロトコールは当技術分野で周知であって、本発明に容易に応用することができる。方法論に関する指針は、以下を含む多くの参考文献から得ることができる：Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｇ．  Ｒ．  ＣｏｕｌｔｏｎおよびＪ．  ｄｅ  Ｂｅｌｌｅｒｏｃｈｅ編）、Ｋｌｕｗｅｒ
Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂｏｓｔｏｎ（１９９２年）、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  Ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｊ．  Ｈ．  Ｅｂｅｒｗｉｎｅ、Ｋ．  Ｌ．  ＶａｌｅｎｔｉｎｏおよびＪ．  Ｄ．  Ｂａｒｃｈａｓ編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９４年）、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．  Ｇ．  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９２年）、Ｋｕｏら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．４９巻：１１２〜１１９頁（１９９１年）、Ｋｌｉｎｇｅｒら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．５１巻：５５〜６５頁（１９９２年）、およびＷａｒｄら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．５２巻：８５４〜８６５頁（１９９３年）。ＦＩＳＨアッセイの実施のためにプロトコールを提供する市販キットもある（例えば、Ｏｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤから入手可能）。方法論に関する指針を提供する特許には、米国特許第５，２２５，３２６号、第５，５４５，５２４号、第６，１２１，４８９号および第６，５７３，０４３号が含まれる。これらの参考文献のすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、特定の研究室に便利な手順工程を確立するために、当技術分野の類似参考文献および本明細書の実施例のセクションで提供される情報と共に用いることができる。
【０１０８】
下の表１３は、ＦＩＳＨプローブとして利用可能なさらなるＢＡＣクローンを示す。
【０１０９】
【表１３−１】
2018019720.tif 000002
【０１１０】
【表１３−２】
2018019720.tif 000003
本発明の方法で有用なさらなるＦＩＳＨプローブを、表１６（図４６）に示す。
【０１１１】
ｂ．マイクロアレイ
それらに限定されないが、ＤＮＡマイクロアレイ（例えば、ｃＤＮＡマイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ）、タンパク質マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、トランスフェクションまたは細胞マイクロアレイ、化合物マイクロアレイ、ならびに抗体マイクロアレイを含む、異なる種類のバイオアッセイがマイクロアレイと呼ばれる。遺伝子チップ、ＤＮＡチップまたはバイオチップとして一般に公知のＤＮＡマイクロアレイは、数千の遺伝子の同時の発現プロファイリングまたは発現レベルの監視のための、アレイを形成する、固体表面（例えば、ガラス、プラスチックまたはシリコンチップ）に結合する顕微鏡的ＤＮＡスポットの集合である。付着したＤＮＡ断片はプローブとして公知であり、それの数千を単一のＤＮＡマイクロアレイで用いることができる。マイクロアレイは、病気の細胞および正常な細胞で遺伝子発現を比較することによって疾患遺伝子を同定するために用いることができる。マイクロアレイは、それらに限定されないが、ガラススライド上への先の鋭いピンによるプリント、予め作られたマスクを用いる写真平版、ダイナミックマイクロミラー装置を用いる写真平版、インクジェット式プリント、または微小電極アレイ上の電気化学法を含む、様々な技術を用いて作製することができる。
【０１１２】
サザンブロッティングおよびノーザンブロッティングは、それぞれ特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を検出するために用いられる。試料から抽出されるＤＮＡまたはＲＮＡを分断し、マトリックスゲルの上で電気泳動的に分離し、メンブランフィルターに移す。フィルターに結合したＤＮＡまたはＲＮＡを、対象の配列に相補的である標識プローブとハイブリダイズさせる。フィルターに結合している、ハイブリダイズしたプローブを検出する。この手順の変形は逆ノーザンブロットであり、そこでは、膜に付着した基質核酸が単離されたＤＮＡ断片の集合であり、プローブは、組織から抽出され、標識されたＲＮＡである。
【０１１３】
３．増幅
ゲノムＤＮＡおよびキメラｍＲＮＡの染色体再配列は、検出の前かまたは同時に増幅することができる。核酸増幅技術の例示的な非限定例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれるが、これらに限定されない。当分野の技術者は、特定の増幅技術（例えば、ＰＣＲ）は、ＲＮＡが増幅の前にＤＮＡに逆転写されることを必要とする（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）が、他の増幅技術はＲＮＡを直接に増幅する（例えば、ＴＭＡおよびＮＡＳＢＡ）ことを認識する。
【０１１４】
ＰＣＲと一般に呼ばれるポリメラーゼ連鎖反応（その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号および第４，９６５，１８８号）は、変性、反対の鎖へのプライマー対のアニーリング、およびプライマー伸長の複数のサイクルを用いて、標的核酸配列のコピー数を指数的に増加させる。ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる変形形態では、逆転写酵素（ＲＴ）はｍＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製するために用いられ、ｃＤＮＡはＤＮＡの複数のコピーを生成するために次にＰＣＲによって増幅される。ＰＣＲの他の様々な置換については、例えば、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，８００，１５９号、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５巻：３３５頁（１９８７年）ならびにＭｕｒａｋａｗａら、ＤＮＡ  ７巻：２８７頁（１９８８年）を参照。
【０１１５】
一般にＴＭＡと呼ばれる転写によって媒介される増幅（その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４８０，７８４号および第５，３９９，４９１号）は、標的核酸配列の複数のＲＮＡコピーがさらなるコピーを自己触媒的に生成する、実質的に一定の温度、イオン強度およびｐＨの条件下で、標的核酸配列の複数のコピーを自己触媒的に合成する。例えば、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，８２４，５１８号を参照。米国特許出願公開第２００６００４６２６５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される変形形態では、ＴＭＡ工程感度および精度を向上させるために、ＴＭＡは任意選択でブロッキング部分、停止部分、および他の改変部分の使用を組み込む。
【０１１６】
一般にＬＣＲと呼ばれるリガーゼ連鎖反応（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗｅｉｓｓ，  Ｒ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４巻：１２９２頁（１９９１年））は、標的核酸の隣接部位とハイブリダイズする２セットの相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、検出可能な二本鎖のライゲーションされたオリゴヌクレオチド生成物を生成するために、熱変性、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの反復サイクルにおいて、ＤＮＡリガーゼによって共有結合される。
【０１１７】
一般にＳＤＡと呼ばれる鎖置換増幅（その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗａｌｋｅｒ，  Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：３９２〜３９６頁（１９９２年）、米国特許第５，２７０，１８４号および第５，４５５，１６６号）は、プライマー配列の対を標的配列の反対の鎖にアニールすること、二重鎖ヘミホスホロチオエート化プライマー伸長生成物を生成するためのｄＮＴＰαＳの存在下でのプライマー伸長、半改変制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介ニッキング、ならびに既存の鎖を置換し、次のラウンドのプライマーアニーリング、ニッキングおよび鎖置換のための鎖を生成して、生成物の幾何学的な増幅をもたらすための、ニックの３’末端からのポリメラーゼ媒介プライマー伸長のサイクルを用いる。好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）は、事実上同じ方法でより高い温度において、好熱性エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼを用いる（欧州特許第０  ６８４  ３１５号）。
【０１１８】
他の増幅方法には、例えば以下のものが含まれる。一般にＮＡＳＢＡと呼ばれる核酸配列ベースの増幅（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１３０，２３８号）、一般にＱβレプリカーゼと呼ばれる、プローブ分子自体を増幅するためのＲＮＡレプリカーゼを用いるもの（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｉｚａｒｄｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．６巻：１１９７頁（１９８８年））、転写ベースの増幅方法（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６巻：１１７３頁（１９８９年））、および自立的配列複製（その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７巻：１８７４頁（１９９０年））。公知の増幅方法に関するさらなる議論については、Ｐｅｒｓｉｎｇ，  Ｄａｖｉｄ  Ｈ．、「Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇら編）、５１〜８７頁（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ（１９９３年））を参照。
【０１１９】
４．検出方法
増幅されていないかまたは増幅された遺伝子融合核酸は、従来の任意の手段によって検出することができる。例えば、遺伝子融合物は、検出可能に標識されたプローブとのハイブリダイゼーションおよび生じたハイブリッドの測定によって検出することができる。検出方法の例示的な非限定例を、下に記載する。
【０１２０】
１つの例示的な検出方法、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）は、化学発光オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、アクリジニウムエステル標識（ＡＥ）プローブ）を標的配列とハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしていないプローブの上に存在する化学発光標識を選択的に加水分解し、ルミノメーター中の残存プローブから生成される化学発光を測定することを含む。例えば、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２８３，１７４号およびＮｏｒｍａｎ  Ｃ．  Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｐｒｏｂｉｎｇ，  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ，  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、１７章（Ｌａｒｒｙ  Ｊ．  Ｋｒｉｃｋａ編、２版、１９９５年）を参照。
【０１２１】
別の例示的な検出方法は、増幅過程のリアルタイムでの定量評価を可能にする。「リアルタイム」での増幅過程の評価は、増幅反応の間、反応混合液中のアンプリコンの量を連続的または定期的に測定し、測定値を用いて試料中に最初に存在する標的配列の量を計算することを含む。リアルタイム増幅に基づいて試料中に存在する最初の標的配列の量を測定するための様々な方法は、当技術分野で周知である。これらには、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３０３，３０５号および第６，５４１，２０５号に開示の方法が含まれる。試料中に最初に存在する標的配列の量を測定するための、しかしリアルタイム増幅に基づかない別の方法が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７１０，０２９号に開示されている。
【０１２２】
増幅生成物は、そのほとんどはステム−ループ構造を有する様々な自己ハイブリダイゼーションプローブを用いることによって、リアルタイムで検出することができる。そのような自己ハイブリダイゼーションプローブは、プローブが自己ハイブリダイズした状態にあるかまたは標的配列とのハイブリダイゼーションを通して変化した状態にあるかによって、それらが検出可能なシグナルを異なって放射するように標識される。非限定例として、「分子トーチ」は、連結領域（例えば、非ヌクレオチドリンカー）によって連結され、所定ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いとハイブリダイズする、自己相補性の異なる領域（「標的結合ドメイン」および「標的クロージングドメイン」と呼ばれる）を含む、自己ハイブリダイゼーションプローブの１種である。好ましい実施形態では、分子トーチは、長さが１〜約２０塩基であって、鎖置換条件下で増幅反応に存在する標的配列とのハイブリダイゼーションにアクセス可能である一本鎖塩基領域を標的結合ドメインに含む。鎖置換条件下では、標的結合ドメインに存在する一本鎖領域に結合して、標的クロージングドメインのすべてまたは一部を置換する標的配列が存在する場合を除いて、分子トーチの、完全または部分的に相補的であってよい２つの相補的領域のハイブリダイゼーションが有利である。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的クロージングドメインは、分子トーチが標的核酸とハイブリダイズする場合ではなく、分子トーチが自己ハイブリダイズする場合に異なるシグナルが生成され、それによって、ハイブリダイズしていない分子トーチの存在下で試験試料中のプローブ：標的二重鎖の検出を可能にするように置かれる検出可能な標識または対の相互作用標識（例えば、発光／失活剤）を含む。分子トーチおよび様々な種類の相互作用標識対は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３４，２７４に開示されている。
【０１２３】
自己相補性を有する検出プローブの別の例は、「分子ビーコン」である。分子ビーコンは、標的相補的配列を有する核酸分子、増幅反応に存在する標的配列の不在下で閉じた立体構造でプローブを保持する親和性対（または核酸アーム）、およびプローブが閉じた立体構造のときに相互作用する標識対を含む。標的配列および標的相補的配列のハイブリダイゼーションは親和性対のメンバーを分離し、それによってプローブを開いた立体構造へ移行させる。開いた立体構造への移行は、例えば蛍光団および失活剤（例えば、ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）であってもよい標識対の相互作用の減少のために検出可能である。分子ビーコンは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９２５，５１７号および第６，１５０，０９７号に開示されている。
【０１２４】
他の自己ハイブリダイゼーションプローブは、当分野の技術者に周知である。非限定例として、米国特許第５，９２８，８６２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるものなどの、相互作用標識を有するプローブ結合対を、本発明で使用するために応用することができるかもしれない。一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するために用いられるプローブ系も、本発明で利用できるかもしれない。さらなる検出系には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００４２６３８号に開示されている「分子スイッチ」が含まれる。挿入色素および／または蛍光色素を含むものなどの他のプローブも、本発明で増幅生成物の検出のために有用である。例えば、（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）米国特許第５，８１４，４４７号を参照。
【０１２５】
Ｃ．タンパク質検出
本発明の遺伝子融合物は、それらに限定されないが、タンパク質配列決定およびイムノアッセイを含む、当分野の技術者に公知である様々なタンパク質技術を用いて、トランケーションされたＥＴＳファミリーメンバータンパク質またはキメラタンパク質として検出することができる。
【０１２６】
１．配列決定
タンパク質配列決定技術の例示的な非限定例には、質量分析およびエドマン分解が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２７】
質量分析は、原則としていかなるサイズのタンパク質も配列決定することができるが、サイズが大きくなるにつれて計算がより困難になる。タンパク質をエンドプロテアーゼによって消化し、生じた溶液を高圧液体クロマトグラフィーカラムに通す。このカラムの末端で、高い正電位に荷電した狭いノズルから溶液を質量分析計にスプレーする。液滴上の電荷は、単一のイオンだけが残るまでそれらを断片化させる。その結果ペプチドが断片化され、断片の質量−電荷比を測定する。質量スペクトルをコンピュータで分析し、それは、断片の配列を判定するために、前に配列決定をしたタンパク質のデータベースに対してしばしば比較される。この工程を次に異なる消化酵素で繰り返し、配列中の重複部分を用いてタンパク質の配列を構築する。
【０１２８】
エドマン分解反応では、配列決定をされるペプチドは、固体表面（例えば、ポリブレンでコーティングしたガラス繊維）に吸着される。エドマン試薬、フェニルイソチオシアナート（ＰＴＣ）は、１２％トリメチルアミンの弱塩基性の緩衝液と一緒に吸着ペプチドに加えられ、Ｎ末端アミノ酸のアミン基と反応する。次に無水酸の添加によって、末端アミノ酸誘導体を選択的に分離することができる。誘導体は異性化して置換されたフェニルチオヒダントインを与え、それを洗い流してクロマトグラフィーによって同定することができ、そのサイクルを繰り返してもよい。各ステップの効率は約９８％であり、それは、約５０アミノ酸が確実に測定されることを可能にする。
【０１２９】
２．イムノアッセイ
イムノアッセイの例示的な非限定例には、それらに限定されないが、以下のものが含まれる。免疫沈降、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリーおよびイムノＰＣＲ。当分野の技術者に公知である様々な技術（例えば、比色、蛍光、化学発光または放射）を用いて検出可能に標識されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が、イムノアッセイで使用するために適する。
【０１３０】
免疫沈降は、その抗原に特異的である抗体を用いて溶液から抗原を沈殿させる技術である。この方法は、複合体中にあると思われるタンパク質をターゲッティングすることによって、細胞抽出物に存在するタンパク質複合体を同定するために用いることができる。複合体は、プロテインＡおよびプロテインＧなどの、細菌から最初に単離された不溶性抗体結合性タンパク質によって、溶液から取り出される。抗体は、溶液から容易に分離することができるセファロースビーズに結合させることもできる。洗浄後、沈殿物は、質量分析、ウェスタンブロット法、または複合体中の構成成分を同定するための任意数の他の方法を用いて分析することができる。
【０１３１】
ウェスタンブロットまたはイムノブロットは、組織ホモジネートまたは抽出物の所与の試料中のタンパク質を検出する方法である。それは、質量によって変性タンパク質を分離するために、ゲル電気泳動を用いる。タンパク質は次にゲルから膜に、一般的にポリビニルジフルオリドまたはニトロセルロース上に移され、そこでそれらは対象のタンパク質に特異的である抗体を用いて探索される。その結果、研究者は所与の試料中のタンパク質の量を検査して、いくつかの群の間でレベルを比較することができる。
【０１３２】
酵素結合免疫吸着検定法を省略したＥＬＩＳＡは、試料中の抗体または抗原の存在を検出する生化学技術である。それは最低２つの抗体を利用し、その抗体のうちの一方は抗原に特異的であり、他方は酵素に結合する。二次抗体は、発色性または蛍光発生性の基質にシグナルを生成させる。ＥＬＩＳＡの変形形態には、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳＰＯＴが含まれる。ＥＬＩＳＡは試料中の抗原の存在または抗体の存在を評価するために実施することができるので、それは、血清抗体濃度を測定するための、そのうえ抗原の存在を検出するための有用なツールである。
【０１３３】
免疫組織化学および免疫細胞化学は、それらのそれぞれの抗体に結合する組織または細胞中の抗原成分を通して、それぞれ組織切片または細胞でタンパク質の位置を特定する方法を指す。可視化は、抗体を発色性または蛍光性の標識で標識することによって可能になる。色標識の一般的な例には、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが含まれるが、これらに限定されない。蛍光団標識の一般的な例には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３４】
フローサイトメトリーは、液体の流れに懸濁している顕微鏡的粒子を計数、検査および選別するための技術である。それは、光学／電子検出装置の中を流れる単一細胞の物理的および／または化学的特性の、同時多重パラメーター分析を可能にする。単一の周波数または色の光線（例えば、レーザー）を、流体力学的に集中させた液体の流れに誘導する。いくつかの検出器が、流れが光線を通過するポイントを標的にする。１つは光線と並列し（順方向散乱またはＦＳＣ）、いくつかはそれ（側方散乱（ＳＳＣ）および１つまたは複数の蛍光検出器）と垂直である。ビームを通過する各懸濁粒子は何らかの方法で光を散乱し、粒子中の蛍光化学物質は、光源よりも低い周波数で光を放射するように励起させることができる。散乱光および蛍光光の組合せが検出器によって拾われ、蛍光発光ピーク毎に１つの各検出器で輝度の変動を分析することによって、各個々の粒子の物理化学的構造について様々な事実を推測することが可能である。ＦＳＣは細胞容量と相関し、ＳＳＣは粒子の密度または内部の複雑性（例えば、核の形、細胞質顆粒の量および種類または膜の粗さ）と相関する。
【０１３５】
イムノポリメラーゼ連鎖反応（ＩＰＣＲ）は、抗体ベースのイムノアッセイでシグナル生成を増加させるために、核酸増幅技術を利用する。ＰＣＲのタンパク質同等物が存在しないので、すなわち、核酸がＰＣＲの間に複製されるのと同じ方法でタンパク質を複製することができないので、検出感度を増加させる唯一の方法はシグナル増幅によるものである。標的タンパク質を抗体に結合させ、それをオリゴヌクレオチドに直接または間接にコンジュゲートさせる。未結合の抗体を洗い流し、残留する結合抗体はそれらのオリゴヌクレオチドが増幅される。タンパク質検出は、リアルタイム法を含む標準の核酸検出方法を用いる、増幅オリゴヌクレオチドの検出を通して起こる。
【０１３６】
Ｄ．データ分析
一部の実施形態では、検出アッセイによって生成される生データ（例えば、所与の遺伝子融合物または他のマーカーの存在、非存在または量）を、臨床医にとって予測的価値のあるデータに翻訳するために、コンピュータベースの分析プログラムが用いられる。臨床医は、任意の適する手段を用いて予測的データにアクセスすることができる。したがって、一部の好ましい実施形態では、本発明は、遺伝学および分子生物学の訓練をおそらく受けていない臨床医が生データを理解する必要がないという、さらなる利点を提供する。データは、その最も有用な形で臨床医に直接に示される。そこで臨床医は、被験体のケアを最適化するためにその情報を直ちに利用することができる。
【０１３７】
本発明は、アッセイを実行する研究室、情報提供者、医療職および被験体に対して、およびそれらから、情報を受け取り、処理し、伝えることができる任意の方法を想定する。例えば、本発明の一部の実施形態では、試料（例えば、生検または血清もしくは尿の試料）を被験体から得、世界の任意の地域（例えば、被験体が居住する国とは異なるか、または情報が最終的に用いられる国）に位置するプロファイリングサービス（例えば、医療施設の臨床検査室、ゲノムプロファイリングビジネスなど）に提出し、生データを生成する。試料が組織または他の生体試料を含む場合、被験体は医療施設を訪問し、試料を得てプロファイリング施設に送ることができるか、または被験体は自身で試料（例えば、尿試料）を収集して、プロファイリング施設にそれを直接に送ることができる。試料がそれ以前に判定された生体情報を含む場合、その情報は被験体によってプロファイリングサービスに直接に送られてもよい（例えば、その情報を含む情報カードをコンピュータでスキャンすることができ、データは、電子伝達システムを用いてプロファイリング施設のコンピュータに送ることができる）。プロファイリングサービスによって受領されると、試料は処理され、その被験体に望まれる診断または予後診断情報に特異的であるプロファイルが生成される（すなわち、発現データ）。
【０１３８】
次いで、プロファイルデータは、治療臨床医による解釈に適するフォーマットで作成される。例えば、生の発現データを提供するのではなく、作成されたフォーマットは、特定の治療選択肢の推奨と共に、被験体のための診断またはリスクの評価（例えば、癌が存在する可能性）を表すことができる。データは、任意の適する方法によって臨床医に提示されてもよい。例えば、一部の実施形態では、プロファイリングサービスは、臨床医（例えば、ケアの発生するポイント）のために印刷することができるか、またはコンピュータモニターで臨床医に提示することができる報告を生成する。
【０１３９】
一部の実施形態では、情報は先ずケアの発生するポイント、または地域の施設で分析される。生データは、さらなる分析のためにおよび／または臨床医もしくは患者に有用な情報に生データを変換するために、次に中央処理施設に送られる。中央処理施設は、データ分析のプライバシー（すべてのデータは、均一なセキュリティプロトコールを有する中央施設で保存される）、速度および均一性の利点を提供する。次に、中央処理施設は、被験体の治療後にデータの消長を管理することができる。例えば、電子伝達システムを用いて、中央施設は、臨床医、被験体または研究者にデータを提供することができる。
【０１４０】
一部の実施形態では、被験体は電子伝達システムを用いて、データに直接にアクセスすることができる。被験体は、結果に基づいてさらなる介入またはカウンセリングを選択することができる。一部の実施形態では、データは研究用途のために用いられる。例えば、特定の状態または疾患の病期の有用な指標として、マーカーの組入れまたは排除をさらに最適化するために、このデータを用いることができる。
【０１４１】
Ｅ．ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化
本発明の遺伝子融合物は、それらに限定されないが、以下を含むｉｎ  ｖｉｖｏ画像化技術を用いて検出することもできる。放射性核種画像化、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、コンピュータ体軸断層撮影、Ｘ線または磁気共鳴画像化法、蛍光検出および化学発光検出。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化技術が、動物（例えば、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物）で癌マーカーの存在または発現を可視化するために用いられる。例えば、一部の実施形態では、癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質は、癌マーカーに特異的な標識抗体を用いて標識される。特異的に結合している、標識された抗体は、それらに限定されないが、放射性核種画像化、陽電子放射断層撮影、コンピュータ体軸断層撮影、Ｘ線または磁気共鳴画像方法、蛍光検出および化学発光検出を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化方法を用いて個体で検出することができる。本発明の癌マーカーに対する抗体を生成する方法を、下に記載する。
【０１４２】
本発明のｉｎ  ｖｉｖｏ画像化方法は、本発明の癌マーカーを発現する癌（例えば、前立腺癌）の診断で有用である。ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化は、癌を示すマーカーの存在を可視化するために用いられる。そのような技術は、不快な生検を使用しない診断を可能にする。本発明のｉｎ  ｖｉｖｏ画像化方法は、癌患者に予後診断を提供するためにも有用である。例えば、転移しそうな癌を示すマーカーの存在を検出することができる。本発明のｉｎ  ｖｉｖｏ画像化方法は、体の他の部分で転移性癌を検出するためにさらに用いることができる。
【０１４３】
一部の実施形態では、本発明の癌マーカーに特異的な試薬（例えば、抗体）が、蛍光で標識される。標識抗体は、被験体に導入される（例えば、経口的または非経口的に）。蛍光標識抗体は、任意の適する方法を用いて（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９８，１０７号に記載の装置を用いて）検出される。
【０１４４】
他の実施形態では、抗体は放射標識される。ｉｎ  ｖｉｖｏ診断のための抗体の使用は、当技術分野で周知である。Ｓｕｍｅｒｄｏｎら、（Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ  １７巻：２４７〜２５４頁（１９９０年））は、標識としてインジウム１１１を用いる腫瘍のラジオイムノシンチグラフィー画像化のための、最適化された抗体−キレート剤を記載している。Ｇｒｉｆｆｉｎら、（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃ  ９巻：６３１〜６４０頁（１９９１年））は、再発性の結腸直腸癌が疑われる患者で腫瘍を検出することにおける、この剤の使用を記載している。磁気共鳴画像化のための標識としての常磁性イオンを有する類似の剤の使用は、当技術分野で公知である（Ｌａｕｆｆｅｒ、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２２巻：３３９〜３４２頁（１９９１年））。用いられる標識は、選択される画像化様式によって決まる。平面スキャンまたは単光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）のために、インジウム１１１、テクネチウム９９ｍまたはヨウ素１３１などの放射性標識を用いることができる。フッ素１９などの陽電子放射標識を、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）のために用いることもできる。ＭＲＩについては、ガドリニウム（ＩＩＩ）またはマンガン（ＩＩ）などの常磁性イオンを用いることができる。
【０１４５】
スカンジウム４７（３．５日）、ガリウム６７（２．８日）、ガリウム６８（６８分）、テクネチウム９９ｍ（６時間）およびインジウム１１１（３．２日）などの、１時間から３．５日の範囲の半減期を有する放射性金属が抗体へのコンジュゲーションに利用可能であるが、そのうちガリウム６７、テクネチウム９９ｍおよびインジウム１１１はガンマカメラ画像化のために好ましく、ガリウム６８は陽電子放射断層撮影のために好ましい。
【０１４６】
そのような放射性金属で抗体を標識する有用な方法は、例えばＩｎ−１１１およびＴｃ−９９ｍについてはＫｈａｗら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９巻：２９５頁（１９８０年））によって、およびＳｃｈｅｉｎｂｅｒｇら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１５巻：１５１１頁（１９８２年））によって記載されるように、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）などの二官能基のキレート化剤によるものである。他のキレート化剤を用いることもできるが、１−（ｐ−カルボキシメトキシベンジル）ＥＤＴＡおよびＤＴＰＡのカルボキシ炭酸無水物が有利であり、その理由は、それらの使用が、抗体の免疫活性に実質的影響を及ぼさないコンジュゲーションを可能にするからである。
【０１４７】
ＤＰＴＡをタンパク質に結合するための別の方法は、Ｉｎ−１１１によるアルブミンの標識についてＨｎａｔｏｗｉｃｈら（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｒａｄｉａｔ．  Ｉｓｏｔ．３３巻：３２７頁（１９８２年））によって記載されるようにＤＴＰＡの環状無水物の使用によるものであるが、それは、抗体の標識に応用することができる。ＤＰＴＡによるキレート化を用いずにＴｃ−９９ｍで抗体を標識するのに適する方法は、Ｃｒｏｃｋｆｏｒｄら、（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，３２３，５４６号）の予備はんだ法である。
【０１４８】
Ｔｃ−９９ｍで免疫グロブリンを標識する好ましい方法は、血漿タンパク質についてＷｏｎｇら（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｒａｄｉａｔ．  Ｉｓｏｔ．２９巻：２５１頁（１９７８年））によって記載され、抗体を標識するためにＷｏｎｇら（Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．２３巻：２２９頁（１９８１年））が最近応用して成功した方法である。
【０１４９】
特異抗体にコンジュゲートされる放射性金属の場合、その免疫特異性を破壊することなく、抗体分子にできるだけ高い割合の放射標識を導入することが同様に望ましい。抗体上の抗原結合部位が保護されることを保証するために、本発明の特異的癌マーカーの存在下で放射標識を実行することによって、さらなる改善を達成することができる。抗原は、標識した後に切り離される。
【０１５０】
さらなる実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏバイオフォトニック画像化（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ａｌｍｅｄａ、ＣＡ）が、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化のために利用される。このリアルタイムｉｎ  ｖｉｖｏ画像化は、ルシフェラーゼを利用する。ルシフェラーゼ遺伝子は、細胞、微生物および動物に組み込まれる（例えば、本発明の癌マーカーとの融合タンパク質として）。活性な場合、それは光を放射する反応をもたらす。画像を捕捉して、それを分析するために、ＣＣＤカメラおよびソフトウェアが用いられる。
【０１５１】
Ｆ．組成物とキット
本発明の診断方法に用いられる組成物は、プローブ、増幅オリゴヌクレオチドおよび抗体を含むが、これらに限定されない。特に好ましい組成物は、ＡＲＧまたはＨＧがＥＴＳファミリーメンバー遺伝子と融合する場合だけ、生成物を検出する。これらの組成物は、以下を含む。ＡＲＧまたはＨＧの転写調節領域からの５’部分がＥＴＳファミリーメンバー遺伝子からの３’部分と融合する接合部とハイブリダイズする（すなわち、遺伝子融合物接合部にわたる）配列を含む単一の標識プローブ、第一の増幅オリゴヌクレオチドがＡＲＧまたはＨＧの転写調節領域とハイブリダイズする配列を含み、第二の増幅オリゴヌクレオチドがＥＴＳファミリーメンバー遺伝子とハイブリダイズする配列を含む、増幅オリゴヌクレオチドの対、ＡＲＧまたはＨＧの転写調節領域とＥＴＳファミリーメンバー遺伝子との融合物から生じる、アミノ末端がトランケーションされたＥＴＳファミリーメンバータンパク質に対する抗体、あるいは、ＡＲＧまたはＨＧの転写調節領域からのアミノ末端部分およびＥＴＳファミリーメンバー遺伝子からのカルボキシ末端部分を有するキメラタンパク質に対する抗体。しかし、他の有用な組成物は以下を含む。第一の標識プローブがＡＲＧまたはＨＧの転写調節領域とハイブリダイズする配列を含み、第二の標識プローブがＥＴＳファミリーメンバー遺伝子とハイブリダイズする配列を含む、標識プローブの対。
【０１５２】
これらの組成物のいずれかを、単独でまたは本発明の他の組成物と組み合わせて、キットの形で提供することができる。例えば、単一の標識プローブおよび増幅オリゴヌクレオチドの対は、本発明の遺伝子融合物の増幅および検出のためのキットで提供することができる。キットは、適当な対照および／または検出試薬をさらに含むことができる。本発明のプローブおよび抗体組成物は、アレイの形で提供することもできる。
【０１５３】
ＩＶ．予後的適用
本発明の開発の過程で行われた実験により、本発明の遺伝子融合物と前立腺癌を抱えた患者の予後間の密接な相関関係が実証された（例えば、下の実施例５参照）。特に、融合物がＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧ間に位置するゲノムＤＮＡの欠失から生じる場合には、癌細胞はより高悪性度の表現型を呈することが見出されている。したがって、いくつかの実施形態では、介在性ＤＮＡの欠失があったＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧ間の遺伝子融合物を検出することができるアッセイを使用して予後を提供し医者が適切な治療戦略を決定する一助とする。例えば、いくつかの実施形態では、このような特定の再配列を有する腫瘍を抱えた患者は、その予後が再配列を欠く患者よりも有意に悪いために、より集中的に治療される。
【０１５４】
上で考察された種類の再配列（例えば、上記の再配列）を有する細胞が存在するかどうかを判定するためには、どんなアッセイでも使用し得る。
【０１５５】
本発明は最も好ましくは前立腺癌患者の予後を得ることと関連して使用されることになるが、他の上皮細胞腫瘍を調べてもよく、これらの腫瘍由来の癌細胞が特に高悪性度になる可能性がある、すなわち浸潤性および転移性になる可能性のある再配列を有するかどうかを判定する際には本明細書に記載されるアッセイおよびプローブを使用し得る。この手順を使用して特徴付けられる腫瘍の例には、乳房、肺、結腸、卵巣、子宮、食道、胃、肝臓、腎臓、脳、皮膚および筋肉の腫瘍が挙げられる。前記アッセイは、細胞系統および動物モデルにおけるこれらの癌を研究している研究者にも価値があることになる。
【０１５６】
本発明の開発の過程で行われた追加の実験により、試料をアッセイして欠失領域に位置する１つまたは複数の遺伝子に発現の欠失があるかどうかを判定することにより染色体欠失を検出することが可能であることが実証された。例えば、ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧ間の融合物を形成する際には、典型的にはほぼ２．８メガベースのゲノムＤＮＡが欠失しており、これが起きる時にはこの領域に位置する少なくとも４つの遺伝子が失われている。これらの遺伝子は、ＥＴＳ２遺伝子、ＷＲＢ遺伝子、ＰＣＰ４遺伝子およびＭＸ１遺伝子である。癌性前立腺細胞におけるこれらのうちの１つまたは複数の遺伝子の減少は不良な予後を示唆している。
【０１５７】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は癌関連再配列を示す染色体ＤＮＡの欠失について上皮細胞をアッセイする方法であって、第一プローブが少なくとも１５ヌクレオチド（例えば、少なくとも、１５、２０、３５、等）長であり；第一の蛍光標識に結合しており；第一の配列がアンドロゲン応答遺伝子（例えば、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子）またはＥＴＳファミリー遺伝子（例えば、ＥＲＧ遺伝子、ＥＴＶ１遺伝子、もしくはＥＴＶ４遺伝子）のどちらかの少なくとも一部分を含むヒトゲノム中の第一の配列に厳格な条件下でハイブリダイズし；第二プローブが少なくとも１５ヌクレオチド長であり；第一の蛍光標識とは異なる第二の蛍光標識に結合しており；第一の配列とは異なり、アンドロゲン応答遺伝子（例えば、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子）またはＥＴＳファミリー遺伝子（例えば、ＥＲＧ遺伝子、ＥＴＶ１遺伝子、もしくはＥＴＶ４遺伝子）の少なくとも一部分を含むヒトゲノム中の第二の配列に厳格な条件下でハイブリダイズする、少なくとも第一および第二プローブを使用するＦＩＳＨアッセイを実施することを含む方法を提供する。
【０１５８】
追加の実施形態では、本発明は、癌関連再配列を示すゲノムＤＮＡの欠失について上皮細胞（例えば、前立腺細胞）をアッセイするための方法であって、上皮細胞の試験試料を得ること；上皮細胞の試料をアッセイして、ＥＴＳ２；ＷＲＢ；ＰＣＰ４；およびＭＸ１を含むがこれらに限定されない群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを決定すること；ステップｂ）で決定された発現レベルを対照試料のレベルと比較すること；ならびに試験試料における遺伝子について決定された発現レベルが対照試料について決定されたレベルよりも低い場合には欠失が起きていると結論することを含む方法を提供する。
【０１５９】
Ｖ．薬物スクリーニング適用
いくつかの実施形態では、本発明は薬物スクリーニングアッセイ（例えば、抗癌薬を求めてスクリーニングすること）を提供する。本発明のスクリーニング法は、本発明の方法（例えば、本発明の遺伝子融合物を含むがこれに限定されない）を使用して同定される癌マーカーを利用する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、遺伝子融合物の発現を変化させる（例えば、減少させる）化合物を求めてスクリーニングする方法を提供する。化合物または作用薬は、例えば、プロモーター領域と相互作用することにより転写を妨げ得る。化合物または作用薬は、融合物から産生されるｍＲＮＡを妨げ得る（例えば、ＲＮＡ干渉、アンチセンス技術、等により）。化合物または作用薬は、融合物の生物活性の上流または下流である経路を妨げ得る。いくつかの実施形態では、候補化合物は、癌マーカーに対して向けられるアンチセンスまたは干渉ＲＮＡ剤（例えば、オリゴヌクレオチド）である。他の実施形態では、候補化合物は、本発明の癌マーカー調節因子または発現産物に特異的に結合しその生物学的機能を阻害する抗体または小分子である。
【０１６０】
一スクリーニング法では、化合物を癌マーカーを発現している細胞に接触させ次に発現に対する候補化合物の効果についてアッセイすることにより、癌マーカー発現を変化させるその能力について候補化合物は評価される。いくつかの実施形態では、細胞により発現される癌マーカーｍＲＮＡのレベルを検出することにより、癌マーカー遺伝子の発現に対する候補化合物の効果についてアッセイされる。ｍＲＮＡ発現は、適切などんな方法によっても検出することが可能である。
【０１６１】
他の実施形態では、癌マーカーによりコードされるポリペプチドのレベルを測定することにより、癌マーカー遺伝子の発現に対する候補化合物の効果がアッセイされる。発現されるポリペプチドのレベルは、本明細書で開示される方法を含むがこれらに限定されない適切などんな方法でも使用して測定することが可能である。
【０１６２】
具体的には、本発明は、モジュレーター、すなわち、本発明の癌マーカーに結合し、例えば、癌マーカー発現もしくは癌マーカー活性に対する阻害（もしくは刺激）効果を有する、または、例えば、癌マーカー基質の発現もしくは活性に対する刺激もしくは阻害効果を有する候補または試験化合物または作用薬（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣剤、ペプトイド、小分子もしくは他の薬物）を同定するためのスクリーニング法を提供する。このようにして同定される化合物を使用して、治療プロトコールにおいて直接的にもしくは間接的に標的遺伝子産物（例えば、癌マーカー遺伝子）の活性を調節する、標的遺伝子産物の生物学的機能を詳細に詰める、または正常な標的遺伝子相互作用を混乱させる化合物を同定することが可能である。癌マーカーの活性または発現を阻害する化合物は、増殖性障害、例えば、癌、特に前立腺癌の治療において有用である。
【０１６３】
一実施形態では、本発明は癌マーカータンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物活性部分の基質である候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の実施形態では、本発明は癌マーカータンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物活性部分に結合する、あるいは癌マーカータンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物活性部分の活性を調節する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【０１６４】
生物学的ライブラリー；ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能性を有するが新規の非ペプチド骨格を有し、酵素的分解に抵抗性であるが、それにもかかわらず依然生理活性である分子のライブラリー；例えば、Ｚｕｃｋｅｎｎａｎｎら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７巻：  ２６７８〜８５頁［１９９４年］参照）；空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー；逆重畳積分を必要とする合成的ライブラリー法；「一ビーズ一化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成的ライブラリー法を含む当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における数多くのアプローチのうちのいずれでも使用して本発明の試験化合物を得ることが可能である。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーアプローチはペプチドライブラリーを用いて使用するために好ましく、他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適応可能である（Ｌａｍ  （１９９７年）  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．  １２巻：１４５頁）。
【０１６５】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当技術分野において、例えば、ＤｅＷｉｔｔら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０巻：６９０９頁［１９９３年］；  Ｅｒｂら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｄ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１巻  ：１１４２２頁［１９９４年］；  Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７巻：２６７８頁［１９９４年］；  Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１巻：１３０３頁［１９９３年］；  Ｃａｒｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．
Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３３巻．２０５９頁［１９９４年］；  Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３３巻：２０６１頁［１９９４年］；およびＧａｌｌｏｐら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７巻：１２３３頁［１９９４年］に見出すことが可能である。
【０１６６】
化合物のライブラリーは、溶液で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３巻：４１２〜４２１頁［１９９２年］）、またはビーズ上（Ｌａｍ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４巻：８２〜８４頁［１９９１年］）、チップ（Ｆｏｄｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ
３６４巻：５５５〜５５６頁［１９９３年］）、細菌もしくは胞子（米国特許第５２２３４０９号、この特許文献は参照により本明細書に組み込まれている）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｄ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：１８６５〜１８６９頁［１９９２年］）またはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻：３８６〜３９０頁［１９９０年］；  Ｄｅｖｌｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻：４０４〜４０６頁［１９９０年］；  Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８７巻：６３７８〜６３８２頁［１９９０年］；  Ｆｅｌｉｃｉ、Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２巻：３０１頁［１９９１年］）で提示され得る。
【０１６７】
一実施形態では、アッセイは、癌マーカーｍＲＮＡもしくはタンパク質またはその生物活性部分を発現する細胞を試験化合物に接触させ、癌マーカーの活性を調節する試験化合物の能力が判定される細胞ベースアッセイである。癌マーカー活性を調節する試験化合物の能力を判定するのは、例えば、酵素活性、破壊またはｍＲＮＡまたはそれと同類のものの変化をモニターすることにより実現することが可能である。
【０１６８】
化合物、例えば、癌マーカー基質またはモジュレーターへの癌マーカーの結合を調節する試験化合物の能力も評価することが可能である。これは、例えば、化合物、例えば、基質の癌マーカーへの結合を複合体における標識化合物、例えば、基質を検出することにより判定することができるように、化合物、例えば、基質を放射性同位体元素または酵素標識とカップリングすることにより、実現することが可能である。
【０１６９】
代わりに、癌マーカーを放射性同位体元素または酵素標識とカップリングして、複合体における癌マーカーの癌マーカー基質への結合を調節する試験化合物の能力をモニターする。例えば、化合物（例えば、基質）を１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで、直接的にまたは間接的に標識することが可能であり、放射性同位体元素は放射性放出を直接計測することによりまたはシンチレーション計測により検出することが可能である。代わりに、化合物を、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識することが可能であり、酵素標識は適切な基質の生成物への転換を判定することにより検出することが可能である。
【０１７０】
相互作用物のうちのどれかを標識してまたは標識せずに、癌マーカーと相互作用をする化合物（例えば、癌マーカー基質）の能力を評価することが可能である。例えば、マイクロフィジオメーターを使用して、化合物も癌マーカーも標識化せずに癌マーカーとの化合物の相互作用を検出することが可能である（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７巻：１９０６〜１９１２頁［１９９２年］）。本明細書で使用されるように、「マイクロフィジオメーター」（例えば、細胞センサ）は、光アドレッサブル電位差センサ（ＬＡＰＳ）を使用して細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化を、化合物と癌マーカー間の相互作用の指標として使用することが可能である。
【０１７１】
さらに別の実施形態では、癌マーカータンパク質またはその生物活性部分を試験化合物に接触させ、癌マーカータンパク質、ｍＲＮＡ、またはその生物活性部分に結合する試験化合物の能力を評価する無細胞アッセイが提供される。本発明のアッセイにおいて使用される癌マーカータンパク質またはｍＲＮＡの好ましい生物活性部分には、基質または他のタンパク質との相互作用に関与する断片、例えば、表面確率スコアが高い断片が挙げられる。
【０１７２】
無細胞アッセイは、標的遺伝子タンパク質と試験化合物の反応混合物を、前記２つの成分が相互作用し、結合し、したがって取り除いておよび／または検出することが可能な複合体を形成することを可能にするのに十分な条件下および時間で調製することを含む。
【０１７３】
２つの分子間の相互作用は、例えば、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して検出することも可能である（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚら、米国特許第５，６３１，１６９号；  Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，９６８，１０３号参照；これらの特許文献はそれぞれが参照により本明細書に組み込まれている）。第一のドナー分子の放出される蛍光エネルギーが、第二の「アクセプター」分子上の蛍光標識に吸収され、次に第二の分子は吸収したエネルギーのせいで蛍光を発することができるように、フルオロフォア標識が選択される。
【０１７４】
代わりに、「ドナー」タンパク質分子は、トリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを利用するだけでもよい。「アクセプター」分子標識が「ドナー」の標識と識別し得るように、異なった波長の光を放出する標識が選択される。標識間のエネルギー移動の効率は分子を隔てている距離に関係するために、分子間の空間的関係を評価することが可能である。分子間で結合が生じる状況では、「アクセプター」分子標識の蛍光放出は最大になるはずである。ＦＲＥＴ結合事象は、当技術分野で周知の標準蛍光定量的検出手段により（例えば、蛍光光度計を使用して）都合よく測定することが可能である。
【０１７５】
別の実施形態では、標的分子に結合する癌マーカータンパク質またはｍＲＮＡの能力を判定することは、リアルタイム生物分子間相互作用解析（ＢＩＡ）を使用して実現することが可能である（例えば、ＳｊｏｌａｎｄｅｒおよびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ、Ａｎａｌ．
Ｃｈｅｍ．  ６３巻：２３３８〜２３４５頁［１９９１年］およびＳｚａｂｏら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５巻：６９９〜７０５頁［１９９５年］参照）。「表面プラズモン共鳴」または「ＢＩＡ」は、相互作用物質のどれにも標識せずに、生体分子特異的相互作用をリアルタイムで検出する（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）。結合表面における質量の変化（結合事象を示す）により、表面近傍の光の屈折率が変化し（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）、生体分子間のリアルタイム反応の指標として使用することができる検出可能なシグナルを発生する。
【０１７６】
一実施形態では、標的遺伝子産物または試験物質は固相上に固定される。固相上に固定された標的遺伝子産物／試験化合物複合体は、反応の終了時に検出することが可能である。好ましくは、標的遺伝子産物は固体表面上に固定することが可能であり、試験化合物（固定されていない）は、本明細書で考察される検出可能標識を用いて直接的にまたは間接的に標識することが可能である。
【０１７７】
癌マーカー、抗癌マーカー抗体またはその標的分子を固定化し、前記タンパク質のうちの１つまたは両方の非複合化形からの複合化形の分離を促進し、他にもアッセイの自動化を提供することが望ましいことがある。試験化合物の癌マーカータンパク質への結合、または候補化合物の存在下および不在下での癌マーカータンパク質と標的分子の相互作用は、反応物を含有するのに適したどんな容器内でも実現することが可能である。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心分離管が挙げられる。一実施形態では、前記タンパク質のうちの１つまたは両方がマトリックスに結合されることを可能にするドメインを追加する融合タンパク質を提供することが可能である。例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−癌マーカー融合タンパク質またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化されたマイクロタイタープレート上に吸着させることが可能であり、次に前記融合タンパク質は、試験化合物または試験化合物と非吸着標的タンパク質もしくは癌マーカータンパク質のどちらかと組み合わされ、混合物は複合体形成に資する条件下で（例えば、塩分およびｐＨの生理的条件で）インキュベートされる。インキュベーションに続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルは洗浄されて非結合成分はどれも取り除かれ、ビーズの場合はマトリックスは固定化され、例えば、上記の通りに複合体は直接的にまたは間接的に判定される。
【０１７８】
代わりに、複合体をマトリックスから分離することが可能であり、癌マーカー結合または活性のレベルが標準技法を使用して決定される。癌マーカータンパク質または標的分子をマトリックス上に固定化するための他の技法には、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを使用することが挙げられる。ビオチン化された癌マーカータンパク質または標的分子は、当技術分野で公知の技法（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＥＬ）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシサクシニミド）から調製し、ストレプトアビジン被膜９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）の壁に固定化することが可能である。
【０１７９】
前記アッセイを行うために、非固定化成分が、固定化された成分を含有する被膜表面に添加される。反応が完了した後、形成されたどんな複合体も固体表面上に固定化されたままであるような条件下で未反応成分は取り除かれる（例えば、洗浄することにより）。固体表面上に固定化された複合体の検出はいくつかの方法で実現することが可能である。前もって非固定化された成分が前標識されている場合、表面上に固定化された標識を検出すれば複合体が形成されたことを示す。前もって非固定化された成分が前標識されていない場合、間接的標識を使用して、例えば、固定化された成分に特異的な標識された抗体（抗体は、今度は、例えば、標識された抗ＩｇＧ抗体を用いて直接的に標識することも間接的に標識することも可能である）を使用して表面上に固定化された複合体を検出することが可能である。
【０１８０】
このアッセイは、癌マーカータンパク質または標的分子とは反応するが癌マーカータンパク質のその標的分子への結合を妨げない抗体を利用して実施される。そのような抗体は、プレートの壁に誘導体化することが可能であり、未結合標的または癌マーカータンパク質は抗体コンジュゲーションにより壁に捕捉される。そのような複合体を検出するための方法は、ＧＳＴ固定化複合体についての上記の方法に加えて、癌マーカータンパク質または標的分子と反応する抗体を使用する複合体の免疫検出の他にも、癌マーカータンパク質または標的分子に関連する酵素活性を検出することに頼る酵素連結アッセイが挙げられる。
【０１８１】
代わりに、無細胞アッセイは液相で行うことが可能である。そのようなアッセイでは、分画遠心法（例えば、ＲｉｖａｓおよびＭｉｎｔｏｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １８巻：２８４〜７頁［１９９３年］参照）；クロマトグラフィー（ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー）；電気泳動法（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９年、Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）；および免疫沈殿法（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９年、Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）を含むがこれらに限定されないいくつかの標準技法のどれかにより反応生成物は未反応成分から分離される。そのような樹脂およびクロマトグラフ法は当業者には公知である（例えば、Ｈｅｅｇａａｒｄ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １１巻：１４１〜８頁［１９９８年］；  Ｈａｇｅａｎｄ  Ｔｗｅｅｄ  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  Ａｐｐｌ  ６９９巻：４９９〜５２５頁［１９９７年］参照）。さらに、本明細書に記載されるように、蛍光エネルギー移動を都合よく利用して、複合体を溶液からそれ以上精製することなく結合を検出してもよい。
【０１８２】
アッセイは、癌マーカータンパク質、ｍＲＮＡ、またはその生物活性部分を、癌マーカーに結合する公知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成させ、前記アッセイ混合物を試験化合物に接触させ、癌マーカータンパク質またはｍＲＮＡと相互作用する試験化合物の能力を判定することを含み、癌マーカータンパク質またはｍＲＮＡと相互作用する試験化合物の能力を判定することが、公知の化合物と比べて、癌マーカーまたはその生物活性部分に優先的に結合する、または標的分子の活性を調節する試験化合物の能力を判定することを含むことが可能である。
【０１８３】
癌マーカーが、タンパク質などの１つまたは複数の細胞または細胞外巨大分子とｉｎ  ｖｉｖｏで相互作用することができる程度に、そのような相互作用の阻害剤は有用である。阻害剤を同定するのに同種のアッセイを使用することが可能である。
【０１８４】
例えば、標的遺伝子産物と相互作用的細胞または細胞外結合パートナー産物の前もって形成された複合体が、標的遺伝子産物またはその結合パートナーのどちらかが標識されているが、その標識により生み出されるシグナルが複合体形成のせいで消光されるように、調製される（例えば、米国特許第４，１０９，４９６号参照。参照によりこの特許文献は本明細書に組み込まれており、このアプローチを免疫アッセイのために利用する）。前もって形成された複合体由来の種の１つと競合し取って代わる試験物質の添加により、バックグラウンド以上のシグナルが生じることになる。このようにして、標的遺伝子産物−結合パートナー相互作用を乱す試験物質を同定することが可能である。代わりに、癌マーカータンパク質をツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら、Ｃｅｌｌ  ７２巻：２２３〜２３２頁［１９９３年］；  Ｍａｄｕｒａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８巻．１２０４６〜１２０５４頁［１９９３年］；  Ｂａｒｔｅｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
１４巻：９２０〜９２４頁［１９９３年］；  Ｉｗａｂｕｃｈｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
８巻：１６９３〜１６９６頁［１９９３年］；およびＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００参照；これらの文献はそれぞれが参照により本明細書に組み込まれている）において「ベイトタンパク質」として使用して、癌マーカー（「癌マーカー結合タンパク質」もしくは「癌マーカーｂｐ」）に結合するまたは相互作用し、癌マーカー活性に関与する他のタンパク質を同定することが可能である。そのような癌マーカーｂｐは、例えば、癌マーカー媒介シグナル伝達経路の下流エレメントとしての癌マーカータンパク質または標的によりシグナルの活性化剤または阻害剤となることが可能である。
【０１８５】
癌マーカー発現のモジュレーターも同定することが可能である。例えば、細胞または無細胞混合物を候補化合物に接触させ、癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を、候補化合物の不在下での癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比べて評価する。癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下でのほうがその不在下でよりも大きい場合には、候補化合物は癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激剤として同定される。代わりに、癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下でのほうがその不在下でよりも少ない（すなわち、統計的に有意に少ない）場合には、候補化合物は癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤として同定される。癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルは、癌マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するための本明細書に記載される方法により決定することが可能である。
【０１８６】
調節剤は、細胞ベースまたは無細胞アッセイを使用して同定することが可能であり、癌マーカータンパク質の活性を調節する作用薬の能力は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、疾病の動物モデルなどの動物（例えば、前立腺癌もしくは転移性前立腺癌を抱える動物、または動物（例えば、ヒト）由来の前立腺癌の異種移植片を宿す動物）または前立腺癌の（例えば、リンパ節、骨、もしくは肝臓への）転移から生じる癌由来の細胞、または前立腺癌細胞系統由来の細胞において確証することが可能である。
【０１８７】
本発明は、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規の作用薬にさらに関する（例えば、癌治療の以下の説明参照）。したがって、適切な動物モデルにおいて（例えば、本明細書に記載される動物）本明細書に記載される通りに同定される作用薬（例えば、癌マーカー調節剤、アンチセンス癌マーカー核酸分子、ｓｉＲＮＡ分子、癌マーカー特異的抗体、または癌マーカー結合パートナー）をさらに使用して、そのような作用薬を用いた治療の有効性、毒性、副作用、または作用機序を決定することは本発明の範囲内である。さらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規の作用薬は、例えば、本明細書に記載される治療のために使用することが可能である。
【０１８８】
ＶＩ．治療的適用
いくつかの実施形態では、本発明は、癌（例えば、前立腺癌）の治療法を提供する。いくつかの実施形態では、治療法は、直接的にまたは間接的に、本発明の遺伝子融合物を標的にする。
【０１８９】
Ａ．ＲＮＡ干渉およびアンチセンス治療
いくつかの実施形態では、本発明は遺伝子融合物の発現を標的にする。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の癌マーカーをコードする核酸分子の機能を調節し、最終的には発現される癌マーカーの量を調節するのに使用するための、オリゴマーアンチセンスまたはＲＮＡｉ化合物、特にオリゴヌクレオチド（例えば、上記の薬物スクリーニング法において同定されるオリゴヌクレオチド）を含む組成物を用いる。
【０１９０】
１．ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉを利用して融合タンパク質機能を阻害する。ＲＮＡｉは、ヒトを含む大半の真核生物において外来遺伝子の発現を制御するための進化的に保存された細胞防御を表す。ＲＮＡｉは典型的には、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により誘発され、ｄｓＲＮＡに応答して相同な一本鎖標的ＲＮＡの配列特異的ｍＲＮＡ分解を引き起こす。ｍＲＮＡ分解の媒介物は低分子干渉ＲＮＡ二重鎖（ｓｉＲＮＡ）であり、これは通常、細胞内での酵素的切断により長いｄｓＲＮＡから産生される。ｓｉＲＮＡは一般に、ほぼ２１ヌクレオチド長（例えば、２１〜２３ヌクレオチド長）であり、２つのヌクレオチド３’−オーバーハングにより特徴付けられる塩基対構造を有する。低分子ＲＮＡまたはＲＮＡｉの細胞内への導入に続いて、その配列はＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）と呼ばれる酵素複合体へ送達されると考えられている。ＲＩＳＣは標的を認識し、その標的をエンドヌクレアーゼを用いて切断する。比較的大きなＲＮＡ配列が細胞に送達される場合は、リボヌクレアーゼＩＩＩ酵素（ダイサー）が比較的長いｄｓＲＮＡを２１〜２３ｎｔ  ｄｓ  ｓｉＲＮＡ断片に変換する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、融合タンパク質の接合部領域を標的にするように設計される。
【０１９１】
化学的に合成されたｓｉＲＮＡは、培養された体細胞における哺乳動物遺伝子機能の全ゲノム解析のための強力な試薬になっている。遺伝子機能の確認のためのその価値以上に、ｓｉＲＮＡは遺伝子特異的治療薬としての大きな可能性もある（ＴｕｓｃｈｌおよびＢｏｒｋｈａｒｄｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ．  ２００２年；  ２巻（３号）：  １５８〜６７頁、この文献は参照により本明細書に組み込まれている）。
【０１９２】
動物細胞へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、特定の遺伝子の強力で持続的な転写後サイレンシングが生じる（Ｃａｐｌｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ２００１年；  ９８巻：  ９７４２〜７頁；  Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ．  ２００１年；  ４１１巻：４９４〜８頁；  Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２００１年；１５巻：  １８８〜２００頁；およびＥｌｂａｓｈｉｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２００１年；  ２０巻：  ６８７７〜８８頁、これらの文献はすべて参照により本明細書に組み込まれている）。ｓｉＲＮＡを用いてＲＮＡｉを実施するための方法および組成物は、例えば、米国特許第６，５０６，５５９号に記載されており、この特許文献は参照により本明細書に組み込まれている。
【０１９３】
ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡの量を、伸長タンパク質により、高頻度で検出不能レベルにまで低下させるのに並はずれて有効である。サイレンシング効果は数カ月持続することがあり、並はずれて特異的である。なぜならば、標的ＲＮＡとｓｉＲＮＡの中心領域間の１ヌクレオチドのミスマッチでサイレンシングを妨げるのに高頻度で十分であるからである（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２年；  ２９６巻：５５０〜３頁；およびＨｏｌｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００２年；  ３０巻：１７５７〜６６頁、これらの文献は両方とも参照により本明細書に組み込まれている）。
【０１９４】
ｓｉＲＮＡの設計において重要な要因は、ｓｉＲＮＡ結合のための到達可能な部位の存在である。Ｂａｈｏｉａら（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２００３年；  ２７８巻：
１５９９１〜１５９９７頁；  この文献は参照により本明細書に組み込まれている）は、効果的なｓｉＲＮＡを設計するためのｍＲＮＡにおける到達可能な部位を見つけるスキャニングアレイと呼ばれるＤＮＡアレイの１種の使用を記載している。これらのアレイは、モノマーから、配列中の各塩基を段階的に付加することにより物理的バリアー（マスク）を使用して合成されるある種の最大量、通常Ｃｏｍｅｒｓまでのサイズの幅があるオリゴヌクレオチドを含む。したがって、アレイは、標的遺伝子の一領域の完全なオリゴヌクレオチド相補体を表している。標的ｍＲＮＡのこれらのアレイへのハイブリダイゼーションは、標的ｍＲＮＡのこの領域の徹底的な到達性プロファイルを提供する。そのようなデータは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（７ｍｅｒｓから２５ｍｅｒｓまでの範囲がある）の設計に有用であり、ここでは有効性と標的特異性を保持するためにオリゴヌクレオチド長と結合親和性の妥協を達成することが重要である（Ｓｏｈａｉｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００１年；  ２９巻（１０号）：  ２０４１〜２０４５頁）。ｓｉＲＮＡを選択するための追加の方法および関心事は、例えば、ＷＯ０５０５４２７０、ＷＯ０５０３８０５４Ａ１、ＷＯ０３０７０９６６Ａ２、Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．
２００５年５月１３日；３４８巻（４号）：８８３〜９３頁、  Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．  ２００５年５月１３日；３４８巻（４号）：８７１〜８１頁、およびＮｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００３年８月１日；３１巻（１５号）：４４１７〜２４頁に記載されており、これらの文献はそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。さらに、ソフトウェア（例えば、ｔｈｅ  ＭＷＧ  ｏｎｌｉｎｅ  ｓｉＭＡＸ  ｓｉＲＮＡ設計ツール）が、ｓｉＲＮＡの選択において使用するために市販されておりまたは公的に入手可能である。
【０１９５】
２．アンチセンス
他の実施形態では、融合タンパク質発現は、本発明の癌マーカーをコードする１つまたは複数の核酸に特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を使用して調節される。オリゴマー化合物がその標的核酸に特異的にハイブリダイズすれば、核酸の正常機能が干渉を受ける。核酸に特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸の機能のこのような調節は、一般に「アンチセンス」と呼ばれている。干渉を受けるＤＮＡの機能には、複製および転写が挙げられる。干渉を受けるＲＮＡの機能には、例えば、ＲＮＡのタンパク質翻訳部位への転位、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つまたは複数のｍＲＮＡ種を生じるＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡに関与し得るまたはＲＮＡにより促進され得る触媒活性などのきわめて重要な機能すべてが挙げられる。標的核酸機能へのそのような干渉の全体的効果は、本発明の癌マーカーの発現の調節である。本発明の文脈では、「調節」は、遺伝子の発現の増加（刺激）または減少（阻害）のどちらかを意味する。例えば、発現が阻害されれば、腫瘍増殖を潜在的に予防し得る。
【０１９６】
アンチセンスに対して特異的な核酸を標的にすることが好ましい。本発明の文脈で、アンチセンス化合物を特定の核酸に「標的すること」は多段階プロセスである。そのプロセスは通常、その機能が調節されることになる核酸配列の同定から始まる。例えば、これは、その発現が特定の障害もしくは病状、または感染病原体由来の核酸分子と関連している細胞遺伝子（またはその遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）であり得る。本発明では、標的は本発明の遺伝子融合物をコードする核酸分子である。ターゲティングプロセスは、望ましい効果、例えば、タンパク質の発現の検出または調節が生じるようにアンチセンス相互作用が起こるためのこの遺伝子内の部位（複数可）を決定することを含む。本発明の文脈内では、好ましい遺伝子内部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンまたは終止コドンを包含する領域である。翻訳開始コドンは典型的には、５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子では；対応するＤＮＡ分子では５’−ＡＴＧ）であるので、翻訳開始コドンは「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」または「ＡＵＧ開始コドン」とも呼ばれる。少数の遺伝子がＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧまたは５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧおよび５’−ＣＵＧはｉｎ  ｖｉｖｏで機能することが明らかにされている。したがって、用語「翻訳開始コドン」および「開始コドン」は多くのコドン配列を包含することが可能であるが、各例におけるイニシエーターアミノ酸は典型的に、メチオニン（真核生物では）またはホルミルメチオニン（原核生物では）である。真核生物遺伝子および原核生物遺伝子は２つまたはそれ以上の代わりの開始コドンを有していることがあり、そのうちのいずれか１つが、特定の細胞型もしくは組織において、または特定の組の条件下で翻訳開始のために優先的に利用されることがある。本発明の文脈では、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」とは、そのようなコドンの配列（複数可）とは無関係に、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用されて本発明の腫瘍抗原をコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ分子の翻訳を開始するコドン（複数可）のことである。
【０１９７】
遺伝子の翻訳終止コドン（または「停止コドン」）は３つの配列（すなわち、５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧおよび５’−ＵＧＡ；対応するＤＮＡ配列はそれぞれ５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡである）のうちの１つを有し得る。用語「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」とは、翻訳開始コドンからどちらかの方向（すなわち、５’または３’）に約２５から約５０連続ヌクレオチドを包含するそのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部のことである。同様に、用語「停止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」とは、翻訳終止コドンからどちらかの方向（すなわち、５’または３’）に約２５から約５０連続ヌクレオチドを包含するそのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部のことである。
【０１９８】
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コード領域」は、翻訳開始コドンと翻訳終止コドン間の領域のことであり、効果的に標的され得る領域でもある。他の標的領域には、ｍＲＮＡの翻訳開始コドンから５’方向の部分であり、したがって遺伝子上のｍＲＮＡまたは対応するヌクレオチドの５’キャップ部位と翻訳開始コドン間のヌクレオチドを含む５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）およびｍＲＮＡの翻訳終止コドンから３’方向の部分のことであり、したがって遺伝子上のｍＲＮＡまたは対応するヌクレオチドの翻訳終止コドンと３’末端間のヌクレオチドを含む３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）が挙げられる。ｍＲＮＡの５’キャップは、５’−５’三リン酸連鎖を介してｍＲＮＡの最も５’側の残基に連結しているＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造自体の他にも前記キャップに隣接した最初の５０ヌクレオチドを含むと見なされている。キャップ領域も好ましい標的領域であり得る。
【０１９９】
一部の真核生物ｍＲＮＡ転写物は直接翻訳されるが、多くが翻訳される前に転写物から切除される「イントロン」として公知の１つまたは複数の領域を含む。残りの（および、したがって、翻訳される）領域は「エクソン」として公知であり、一緒にスプライスされて連続するｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡスプライス部位（すなわち、イントロン−エクソン接合部）も好ましい標的領域であり得、異常なスプライシングが疾病に関わっているまたは特定のｍＲＮＡスプライス産物の過剰産生が疾病に関わっている状況では特に有用である。再配列または欠失による異常な融合接合部も好ましい標的である。イントロンも効果的であり、したがって、例えば、ＤＮＡまたはプレｍＲＮＡに標的されたアンチセンス化合物のための好ましい標的領域であることが可能であることも見出されている。
【０２００】
いくつかの実施形態では、アンチセンス阻害のための標的部位は、市販されているソフトウェアプログラムを使用して同定される（例えば、Ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｋ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ；  ＳｙｓＡｒｒｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｂａｎｇａｌｏｒｅ、Ｉｎｄｉａ；  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ、Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ、Ｅｎｇｌａｎｄ；  ＧｅｎｅＴｒｏｖｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。他の実施形態では、アンチセンス阻害のための標的部位は、ＰＣＴ公開ＷＯ０１９８５３７Ａ２に記載されている到達可能な部位法を使用して同定され、この特許文献は参照により本明細書に組み込まれている。
【０２０１】
１つまたは複数の標的部位が同定されると、望ましい効果を与えるのに十分標的に相補的である（すなわち、十分によくおよび十分に特異的にハイブリダイズする）オリゴヌクレオチドが選択される。例えば、本発明の好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが開始コドンにまたは開始コドン近くに標的される。
【０２０２】
本発明の文脈では、「ハイブリダイゼーション」は、アンチセンス組成物および方法に関しては、ワトソン−クリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン水素結合でもよい、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間の水素結合を意味する。例えば、アデニンとチミンは水素結合の形成を通じて対になる相補的核酸塩基である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるためにはその標的核酸の配列に１００％相補的である必要はないことが理解されている。アンチセンス化合物の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨げ有用性の喪失を引き起こし、特異的結合が望ましい条件下で（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたは治療療法の場合には生理的条件下で、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合には前記アッセイが実施される条件下で）、アンチセンス化合物の非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度に相補性が存在するときには、アンチセンス化合物は特異的にハイブリダイズ可能である。
【０２０３】
アンチセンス化合物は、研究試薬および診断薬として一般に使用されている。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を特異的に阻害することができるが、特定の遺伝子の機能を解明するのに使用することが可能である。アンチセンス化合物は、例えば、生物学的経路の様々なメンバーの機能を区別するのにも使用される。
【０２０４】
アンチセンスの特異性および感受性も治療的使用に適用される。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトにおける病状の治療において治療成分として用いられてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに安全に効果的に投与されてきており、数多くの臨床試験が現在進行中である。したがって、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織、および動物、特にヒトの治療のための治療計画において有用であるように形成することが可能である有用な治療モダリティであることが確立している。
【０２０５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明は、下に記載されているようなオリゴヌクレオチド模倣剤を含むがこれに限定されない他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明に従ったアンチセンス化合物は、好ましくは約８から約３０核酸塩基（すなわち、約８から約３０連結塩基）を含むが、さらに長い配列もさらに短い配列も本発明で利用法を見出し得る。特に好ましいアンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、さらに好ましくは、約１２から約２５核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０２０６】
本発明で有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例には、改変された骨格または非天然ヌクレオシド間連結を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書において定義されるように、改変された骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格にリン原子を保持しているオリゴヌクレオチドおよび骨格にリン原子を有していないオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書の目的のために、そのヌクレオシド間骨格にリン原子を有していない改変されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオシドと見なすことも可能である。
【０２０７】
好ましい改変されたオリゴヌクレオチド骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホン酸およびキラルホスホン酸を含むメチルおよび他のアルキルホスホン酸、ホスフィン酸、３’−アミノホスホロアミド酸およびアミノアルキルホスホロアミド酸を含むホスホロアミド酸、チオノホスホロアミド酸、チオノアルキルホスホン酸、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに正常な３’−５’連鎖、これらの２’−５’連結類似体を有するボラノリン酸およびヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’へ連結されている反転極性を有するボラノリン酸が挙げられる。様々な塩類、混合塩類および遊離酸形も含まれる。
【０２０８】
その中にリン原子を含まない好ましい改変されたオリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連鎖、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連鎖、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間連鎖により形成される骨格を有する。これらの骨格には、モルフォリノ連鎖（一部ヌクレオシドの糖部分から形成されている）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸およびスルホアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有する他の骨格が挙げられる。
【０２０９】
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣剤では、ヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間連鎖（すなわち、骨格）の両方が新規の基で置き換えられる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのそのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが明らかにされているオリゴヌクレオチド模倣剤は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格はアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的にまたは間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教唆する代表的米国特許には、米国特許第５，５３９，０８２号、米国特許第５，７１４，３３１号および米国特許第５，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されない。これらの特許文献はそれぞれが参照により本明細書に組み込まれている。ＰＮＡ化合物の追加の教唆は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４巻：１４９７頁（１９９１年）に見出すことができる。
【０２１０】
本発明の最も好ましい実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシド、および特に、−ＣＨ２、−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として公知の］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、および上で参照の米国特許第５，４８９，６７７号の−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［天然のホスホジエステル骨格は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表されている］、および上で参照の米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を有するオリゴヌクレオシドである。上で参照の米国特許第５，０３４，５０６号のモルフォリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい。
【０２１１】
改変されたオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の置換された糖成分を含有し得る。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’の位置に以下の：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含み、前記アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換されたまたは非置換のＣ１からＣ１０アルキルまたはＣ２からＣ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。特に好ましいのは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、ｎおよびｍは１から約１０までである。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’の位置に以下の：Ｃ１からＣ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、リポーター基、インターカレータ、オリゴヌクレオチドの薬物動態的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、および類似の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。好ましい改変には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても公知である）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  ７８巻：４８６頁［１９９５年］）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。さらに好ましい改変には、２’−ＤＭＡＯＥとしても公知の２’−ジメチルアミノオキシエトキシ（すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基）、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野では２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知の）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２が挙げられる。
【０２１２】
他の好ましい改変には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位置または２’−５’連結オリゴヌクレオチド内および５’末端ヌクレオチド上の５’位置にも類似の改変を行い得る。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル成分などの糖模倣剤も有し得る。
【０２１３】
オリゴヌクレオチドは核酸塩基（当技術分野ではただ「塩基」と呼ばれることが多い）改変または置換も含み得る。本明細書で使用されるように、「非改変」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。改変された核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。追加の核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示される核酸塩基が挙げられる。これらの核酸塩基のうちのある種のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加するのに特に有用である。これらの核酸塩基には、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含むＯ−６置換プリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増加することが明らかにされており、現在好ましい塩基置換であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖改変と組み合わせた場合には、さらに特に好ましい。
【０２１４】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の改変は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込みを増強する１つまたは複数の成分またはコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学的に連結することである。そのような成分には、コレステロール成分、コール酸、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基）、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸）、ポリアミドもしくはポリエチレングリコール鎖もしくはアダマンタン酢酸、パルミチル成分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール成分などの脂質成分が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１５】
当業者には、上記の改変を含有するオリゴヌクレオチドの作製法が周知である。本発明は上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドに限定されない。どんな適切な改変または置換でも利用し得る。
【０２１６】
所与の化合物のすべての位置が一様に改変される必要はなく、実際、上述の改変のうちの２つ以上が単一の化合物に、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにさえ組み込まれ得る。本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含む。「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、本発明の文脈では、２つまたはそれ以上の化学的に異なる領域であって、それぞれの領域が少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチドで構成されている領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ分解に対する増加した抵抗力、増加した細胞取込み、および／または標的核酸に対する増加した結合親和性を与えるようにオリゴヌクレオチドが改変されている少なくとも１つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドの追加の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質としての働きをし得る。例としては、リボヌクレアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、リボヌクレアーゼＨの活性化により、ＲＮＡ標的が切断され、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率が多いに増強される。したがって、キメラオリゴヌクレオチドが使用される場合には比較的短いオリゴヌクレオチドでは、同一の標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比べて、匹敵する結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断はゲル電気泳動および必要であれば、当技術分野で公知の関連核酸ハイブリダイゼーション法により常に検出することが可能である。
【０２１７】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド、改変されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／または上記のオリゴヌクレオチド模倣剤の複合構造体として形成され得る。
【０２１８】
本発明は、下に記載される本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。
【０２１９】
Ｂ．遺伝子治療
本発明は、本発明の遺伝子融合物の発現を調節するのに使用するためのどんな遺伝子操作の使用でも企図している。遺伝子操作の例には、遺伝子ノックアウト（例えば組換えを使用して染色体から融合遺伝子を取り出すこと）、誘導性プロモーターおよび同類のものを用いたまたは用いないアンチセンス構築物の発現が挙げられるが、これらに限定されない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞への核酸構築物の送達は、適切などんな方法を使用しても行い得る。適切な方法は、望ましい事象（例えば、アンチセンス構築物の発現）が起きるように、核酸構築物を細胞内に導入する方法である。遺伝子治療を使用して、ｓｉＲＮＡまたはｉｎ  ｖｉｖｏで発現される他の干渉分子を送達してもよい（例えば、誘導性プロモーター（例えば、アンドロゲン応答プロモーター）による刺激により）。
【０２２０】
遺伝情報を担う分子の細胞内への導入は、裸のＤＮＡ構築物の定方向注入、前記構築物を載せた金粒子の照射、ならびに、例えば、リポソーム、生体高分子、および同類のものを使用する巨大分子媒介遺伝子移入を含むが、これらに限定されない様々な方法のうちのどれによっても実現される。好ましい方法は、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを含むがこれらに限定されないウイルス由来の遺伝子送達媒体を使用する。レトロウイルスと比べてより高い効率性のために、アデノウイルス由来のベクターが核酸分子をｉｎ  ｖｉｖｏで宿主細胞内に移入するための好ましい遺伝子送達媒体である。アデノウイルスベクターは、動物モデルにおける様々な固形腫瘍へのおよび免疫不全マウスにおけるヒト固形腫瘍移植片への非常に効率的なｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子移入を提供することが明らかにされている。アデノウイルスベクターおよび遺伝子移入のための方法の例は、ＰＣＴ出願ＷＯ００／１２７３８およびＷＯ  ００／０９６７５および米国特許出願公開第６０３３９０８号、米国特許出願公開第６０１９９７８号、米国特許出願公開第６００１５５７号、米国特許出願公開第５９９４１３２号、米国特許出願公開第５９９４１２８号、米国特許出願公開第５９９４１０６号、米国特許出願公開第５９８１２２５号、米国特許出願公開第５８８５８０８号、米国特許出願公開第５８７２１５４号、米国特許出願公開第５８３０７３０号、および米国特許出願公開第５８２４５４４号に記載されており、これらの特許文献はそれぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。
【０２２１】
ベクターは様々な方法で被験体に投与し得る。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、ベクターは、直接注入を使用して腫瘍または腫瘍関連組織内に投与される。他の実施形態では、投与は血液またはリンパ循環を介する（例えば、ＰＣＴ出願９９／０２６８５参照。この特許文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）。アデノウイルスベクターの例となる用量レベルは、好ましくは灌流液に添加される１０８〜１０１１ベクター粒子である。
【０２２２】
Ｃ．抗体治療
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の遺伝子融合物を発現する前立腺腫瘍を標的にする抗体を提供する。適切などんな抗体でも（例えば、モノクローナル、ポリクローナル、または合成の）、本明細書において開示される治療法において利用し得る。好ましい実施形態では、癌治療のために使用される抗体はヒト化抗体である。抗体をヒト化するための方法は当技術分野では周知である（例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第６，０５４，２９７号、および米国特許第５，５６５，３３２号参照。これらの特許文献はそれぞれが参照により本明細書に組み込まれている）。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、治療抗体は、抗体が細胞毒性薬にコンジュゲートされている、本発明の遺伝子融合物に対して産生された抗体を含む。そのような実施形態では、正常細胞を標的にせず、したがって従来の化学療法の有害な副作用の多くを減少させる腫瘍特異的治療薬が産生される。ある種の適用のために、治療薬は、抗体への結合のために有用な薬物として働くことになる薬剤、特に内皮細胞を死滅させるまたは内皮細胞の増殖または細胞分裂を抑制する能力を有する細胞毒性または他の抗細胞薬であることが想定されている。本発明は、抗体にコンジュゲートされ、活性型で送達されることが可能などんな薬剤の使用でも企図している。例となる抗細胞薬には、化学療法薬、放射性同位元素、および細胞毒が挙げられる。本発明の治療抗体は、放射性同位元素（例えば、ヨウ素−１３１、ヨウ素−１２３、テクニシウム−９９ｍ、インジウム−１１１、レニウム−１８８、レニウム−１８６、ガリウム−６７、銅−６７、イットリウム−９０、ヨウ素−１２５またはアスタチン−２１１）、ステロイドなどのホルモン、シトシンなどの代謝拮抗薬（例えば、アラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサートまたはアミノプテリン；アントラサイクリン；マイトマイシンＣ）、ビンカアルカロイド（例えば、デメコルチン；エトポシド；ミトラマイシン）、およびクロラムブシルまたはメルファランなどの抗腫瘍アルキル化剤を含むが、これらに限定されない様々な細胞毒成分が挙げられる。他の実施形態は、血液凝固薬などの作用薬、サイトカイン、増殖因子、細菌内毒素または細菌内毒素のリピドＡ成分を含んでいてよい。例えば、いくつかの実施形態では、治療薬は、少数の例を挙げるだけでも、Ａ鎖毒素、リボソーム不活化タンパク質、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素またはシュードモナス外毒素などの植物由来、真菌由来または細菌由来毒素を含むことになる。いくつかの好ましい実施形態では、脱グリコシル化リシンＡ鎖が利用される。
【０２２４】
いずれにしても、これらの薬剤などの作用薬は、必要ならば、標的腫瘍細胞の部位でのそのターゲティング、内部移行、放出または血液成分への提示を可能にする形で、必要に応じて公知のコンジュゲーション技術を使用して抗体に首尾よくコンジュゲートし得ることが提案されている（例えば、Ｇｈｏｓｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、９３巻：２８０頁［１９８３年］参照）。
【０２２５】
例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の癌マーカー（例えば、ＥＲＧまたはＥＴＶ１融合物）に標的された免疫毒素を提供する。免疫毒素は、特定のターゲティング薬、典型的には腫瘍定方向抗体または断片と毒素成分などの細胞毒性薬とのコンジュゲートである。ターゲティング薬は毒素を標的抗原を担っている細胞に向け、それによって前記細胞を選択的に死滅させる。いくつかの実施形態では、治療抗体は、高いｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を与える架橋剤を用いる（Ｔｈｏｒｐｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４８巻：６３９６頁［１９８８年］）。
【０２２６】
他の実施形態、特に固形腫瘍の治療に関係する実施形態では、抗体は、血管内皮細胞の増殖または細胞分裂を抑制することにより、腫瘍脈管構造に対して細胞毒性または他の抗細胞効果を有するように設計される。この攻撃は、腫瘍局在性血管虚脱をもたらし、腫瘍細胞、特に脈管構造から遠位にある腫瘍細胞から酸素および栄養素を奪い、最終的には細胞死および腫瘍壊死をもたらすことを目的とする。
【０２２７】
好ましい実施形態では、抗体ベース治療薬は、下に記載される医薬組成物として処方される。好ましい実施形態では、本発明の抗体組成物の投与により、癌の測定可能な減少（例えば、腫瘍の減少または消失）がもたらされる。
【０２２８】
Ｄ．医薬組成物
本発明は、（例えば、本発明の遺伝子融合物の発現または活性を調節する医薬品を含む）医薬組成物をさらに提供する。本発明の医薬組成物は、局所的が望ましいのかまたは全身的治療が望ましいのかどうか、および治療される領域に応じていくつかの方法で投与され得る。投与は、局所的（眼部を含むおよび膣および直腸送達を含む粘膜への）、肺（例えば、ネブライザーによりを含む粉末もしくはエアロゾルの吸入もしくはガス注入により；気管内、鼻腔内、上皮および経皮）、経口または非経口でよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射もしくは点滴；または頭蓋内、例えば、くも膜下腔内もしくは脳室内投与が含まれる。
【０２２９】
局所投与のための医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体および粉末を含み得る。従来の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤およびこれと同類のものは、必要であるまたは望ましいこともある。
【０２３０】
経口投与のための組成物および製剤は、粉末もしくは顆粒、水もしくは非水溶媒の懸濁液もしくは溶液、カプセル、サシェまたは錠剤を含む。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散剤または結合剤が望ましいこともある。
【０２３１】
非経口、くも膜下腔内または脳室内投与のための組成物および製剤は、緩衝液、希釈剤ならびに、浸透増強剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体または賦形剤などの、しかしこれらに限定されない他の適切な添加物も含有し得る無菌水溶液を含み得る。
【０２３２】
本発明の医薬組成物は、溶液、乳液、およびリポソーム含有製剤を含むが、これらに限定されない。これらの組成物は、前もって形成された液体、自己乳化固体および自己乳化半流動体を含むが、これらに限定されない様々な成分から作製してよい。
【０２３３】
本発明の医薬製剤は、都合よく単位投与量の形で与えてもよいが、製薬工業において周知の従来の技法に従って調製してもよい。そのような技法は、活性成分を医薬担体（複数可）または賦形剤（複数可）と会合させるステップを含む。一般的には、製剤は、活性成分を液体担体もしくは微粉化された固体担体、またはその両方と均一におよび密に会合させ、次に、必要であれば、製品を成形することにより調製される。
【０２３４】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸剤などの、しかしこれらに限定されない多くの考え得る剤形のどれにでも処方し得る。本発明の組成物は、水媒体、非水媒体または混合媒体の懸濁液として処方してもよい。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁液の粘度を増加させる物質をさらに含有し得る。懸濁液は、安定剤も含有してよい。
【０２３５】
本発明の一実施形態では、医薬組成物は泡沫として処方され使用され得る。医薬泡沫には、乳濁液、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリーおよびリポソームなどの、しかしこれらに限定されない製剤が含まれる。これらの製剤は性質は基本的に類似しているが、最終製品の成分および濃度は異なる。
【０２３６】
細胞レベルでのオリゴヌクレオチドの取込みを増強する作用薬を、本発明の医薬および他の組成物に添加してもよい。例えば、リポフェクチン（米国特許第５７０５１８８号）などの陽イオン性脂質、陽イオン性グリセロール誘導体、およびポリリジン（ＷＯ９７／３０７３１）などのポリカチオン性分子も、オリゴヌクレオチドの細胞取込みを増強する。
【０２３７】
本発明の組成物は、医薬組成物中に従来から含まれる他の補助成分をさらに含有し得る。したがって、例えば、組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔もしくは抗炎症剤などの追加の適合性薬学的活性物質を含有してもよく、色素、香味料、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定剤などの本発明の組成物の様々な剤形を物理的に処方するのに有用な追加の物質を含有していてもよい。しかし、そのような物質は、添加されたときに、本発明の組成物の成分の生物活性を過度に妨げるべきではない。製剤は無菌化し、必要であれば、補助剤、例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩類、緩衝剤、着色剤、香味料、および／または芳香剤ならびに製剤の核酸（複数可）を有害に妨げない同類のものと混合することが可能である。
【０２３８】
本発明のある種の実施形態は、（ａ）１つまたは複数のアンチセンス化合物および（ｂ）非アンチセンス機序により機能する１つまたは複数の他の化学療法剤を含有する医薬組成物を提供する。そのような化学療法剤の例には、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）などの抗癌剤が挙げられるが、これらに限定されない。非ステロイド系抗炎症薬および副腎皮質ステロイドを含むがこれらに限定されない抗炎症薬、ならびにリビビリン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルを含むがこれらに限定されない抗ウイルス薬も、本発明の組成物において組み合わせ得る。他の非アンチセンス化学療法剤も本発明の範囲内である。２つまたはそれ以上の組み合わせた化合物を同時にまたは順次に使用してよい。
【０２３９】
数日から数カ月、または治癒がもたらされるもしくは病状の減少が実現されるまで続く治療の進行に合わせて、投薬は治療される病状の重症度および応答性に依存する。最適な投薬計画は、患者の体内の薬物の蓄積の測定値から計算することが可能である。投薬する医師は、最適投与量、投与方法および繰返し速度を容易に決定することができる。最適投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に応じて変わることがあり、一般には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにおいて効果的であることが分かっているＥＣ５０に基づいてまたは本明細書に記載される例に基づいて見積もることが可能である。一般に、投与量は体重ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇまでであり、毎日、毎週、毎月または毎年１回または複数回与えてよい。治療している医師は、計測された滞留時間および体液または組織中の薬物の濃度に基づいて投与のための繰返し速度を見積もることができる。治療の成功に続いて、オリゴヌクレオチドが、毎日１回または複数回から２０年毎に１回まで、体重ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇまでの範囲の維持投与量で投与される、病状の再発を予防するための維持療法を被験体に受けてもらうことが望ましいことがある。
【０２４０】
ＶＩＩ．トランスジェニック動物
本発明は、本発明の外来性癌マーカー遺伝子（例えば、遺伝子融合物）またはその変異体およびバリアント（例えば、トランケーションまたは一塩基多型）を含むトランスジェニック動物の作製を企図している。好ましい実施形態では、トランスジェニック動物は、野生型動物と比べて変化した表現型（例えば、マーカーの存在の増加または減少）を示す。そのような表現型の存在または不在を解析するための方法は、本明細書に開示される方法を含むが、これらに限定されない。いくつかの好ましい実施形態では、トランスジェニック動物は腫瘍の増殖または癌の証拠の増加または減少をさらに示す。
【０２４１】
本発明のトランスジェニック動物は、薬物（例えば、癌治療）スクリーニングに利用法を見つける。いくつかの実施形態では、試験化合物（例えば、癌を治療するのに有用ではないかと疑われている薬物）および対照化合物（例えば、プラセボ）はトランスジェニック動物および対照動物に投与され、その効果が評価される。
【０２４２】
トランスジェニック動物は様々な方法を介して作製することが可能である。いくつかの実施形態では、様々な発生段階の胎児細胞を使用して、トランスジェニック動物を作製するためのトランス遺伝子を導入する。胎児細胞の発生段階に応じて異なる方法が使用される。接合体はマイクロインジェクションに最良の標的である。マウスでは、雄前核は、１〜２ピコリットル（ｐｌ）のＤＮＡ溶液の再現性のある注入を可能にする直径でほぼ２０マイクロメーターの大きさに到達する。遺伝子移入のための標的としての接合体の使用は、ほとんどの場合に注入されたＤＮＡは最初の卵割前に宿主ゲノムに組み込まれることになる点で大きな利点を有する（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２巻：４４３８〜４４４２頁［１９８５年］）。したがって、トランスジェニック非ヒト動物の細胞はすべて組み込まれたトランス遺伝子を担うことになる。生殖細胞の５０％がトランス遺伝子を宿すことになるために、これは一般には、生みの親の子孫へのトランス遺伝子の効率的な伝達にも反映されることになる。米国特許第４８７３１９１号は、接合体のマイクロインジェクションのための方法を記載しており、この特許の開示はその全体を本明細書に組み込まれている。
【０２４３】
他の実施形態では、レトロウイルス感染を使用して、非ヒト動物にトランス遺伝子を導入する。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターを利用して、卵母細胞の囲卵腔にレトロウイルスベクターを注入することにより卵母細胞をトランスフェクトする（米国特許第６，０８０，９１２号、この特許文献は参照により本明細書に組み込まれている）。他の実施形態では、発生中の非ヒト胚を胚盤胞期までｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することが可能である。この期間中、卵割球はレトロウイルス感染のための標的になることが可能である（Ｊａｎｅｎｉｃｈ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ
７３巻：１２６０頁［１９７６年］）。卵割球の効率的感染は、透明帯を取り除く酵素的処置により得られる（Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ
Ｅｍｂｒｙｏ、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．  ［１９８６年］）。トランス遺伝子を導入するのに使用されるウイルスベクター系は、典型的にはトランス遺伝子を担う複製欠損レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２巻：６９２７頁［１９８５年］）。トランスフェクションは、ウイルス産生細胞の単層上で卵割球を培養することにより、容易に効率的に得られる（Ｓｔｅｗａｒｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６巻：３８３頁［１９８７年］）。代わりに、感染はもっと後の段階で実施することが可能である。ウイルスまたはウイルス産生細胞を胞胚腔に注入することが可能である（Ｊａｈｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９８巻：６２３頁［１９８２年］）。生みの親の大半は、組込みがトランスジェニック動物を形成する細胞のサブセットにおいてのみ起こるために、トランス遺伝子ではモザイク状になる。さらに、生みの親は、一般に子孫において分離することになるゲノム中の異なる位置にトランス遺伝子の様々なレトロウイルス挿入を含有し得る。さらに、妊娠中期胚の子宮内レトロウイルス感染により、トランス遺伝子を生殖系列に、低効率でも導入することも可能である（Ｊａｈｎｅｒら、上記参照  ［１９８２年］）。当技術分野に公知のトランスジェニック動物を作製するためにレトロウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用する追加の手段は、受精卵または初期胚の囲卵腔へのレトロウイルス粒子またはレトロウイルスを産生するマイトマイシンＣ処理細胞のマイクロインジェクションを含む（ＰＣＴ国際出願ＷＯ９０／０８８３２［１９９０年］、ならびにＨａｓｋｅｌｌおよびＢｏｗｅｎ、Ｍｏｌ
Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｄｅｖ．、４０巻：３８６頁［１９９５年］）。
【０２４４】
他の実施形態では、トランス遺伝子は胚性幹細胞に導入され、トランスフェクトされた幹細胞を利用して胚を形成する。ＥＳ細胞は、適切な条件下で着床前胚をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより得られる（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９２巻：１５４頁［１９８１年］；  Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０９巻：２５５頁［１９８４年］；  Ｇｏｓｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３巻：９０６５頁［１９８６年］；  およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２巻：４４５頁［１９８６年］）。リン酸カルシウム共沈、プロトプラストまたはスフェロプラスト融合、リポフェクションおよびＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションを含む当技術分野に公知の様々な方法によるＤＮＡトランスフェクションによりトランス遺伝子はＥＳ細胞に効率的に導入することが可能である。トランス遺伝子は、レトロウイルス媒介形質導入によりまたはマイクロインジェクションによりＥＳ細胞に導入してもよい。そのようなトランスフェクトされたＥＳ細胞は、胚盤胞期胚の胞胚腔へのその導入に続いて、その後、胚をコロニー形成し、こうして得られたキメラ動物の生殖系列に寄与することが可能である（概説については、Ｊａｅｎｉｓｃｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０巻：１４６８頁［１９８８年］参照）。トランスフェクトされたＥＳ細胞の胞胚腔への導入に先立って、トランス遺伝子はそのような選択のための手段を提供すると仮定して、トランスフェクトされたＥＳ細胞はトランス遺伝子を取り込んでいるＥＳ細胞を濃縮する様々な選択プロトコールに供され得る。代わりに、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、トランス遺伝子を取り込んでいるＥＳ細胞を求めてスクリーニングしてもよい。この技法は、胞胚腔への移入に先立つ適切な選択条件下でのトランスフェクトされたＥＳ細胞の増殖を不必要にする。
【０２４５】
さらに他の実施形態では、相同組換えを利用して遺伝子機能をノックアウトするまたは欠失変異体（例えば、トランケーション変異体）を作製する。相同組換えのための方法は、米国特許第５，６１４，３９６号に記載されており、この特許文献は参照により本明細書に組み込まれている。
【０２４６】
実験
以下の実施例は、本発明のある種の好ましい実施形態および局面を実証し、さらに概説するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものであると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２４７】
（実施例１）
ＥＲＧとＥＴＶ１との遺伝子融合物
Ａ．材料および方法
癌のアウトライアープロファイル分析（ＣＯＰＡ）
ＣＯＰＡ分析を１０，４８６のマイクロアレイ実験を含むＯｎｃｏｍｉｎｅ  ３．０の１３２の遺伝子発現データセット上で行った。さらに、９９個の増幅された、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで採取された前立腺組織試料からのデータをＣＯＰＡ分析に含めた。ＣＯＰＡは３つのステップを有する。第１に、遺伝子発現値はメジアンを中心にし、各遺伝子のメジアン発現をゼロに設定する。第２に、メジアン絶対偏差（ＭＡＤ）を計算し、各遺伝子発現値をそのＭＡＤで割ることで１に縮尺調整する。メジアンおよびＭＡＤを、平均および標準偏差とは対照的に、例外発現値が分布推定値に対して過度に影響を与えず、したがって標準化後もこれらが保たれるように、変換に用いた。第３に、変換された発現値の７５、９０、および９５パーセンタイルを各遺伝子について一覧にまとめて、遺伝子をこれらのパーセンタイル値スコアでランク付けし、アウトライアープロファイルについて優先順位付けされた一覧を得る。
【０２４８】
試料
使用した組織は、共にミシガン大学の前立腺癌専門優良研究プログラム（Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ：Ｓ．Ｐ．Ｏ．Ｒ．Ｅ．）組織コアの一部である、ミシガン大学の根治的前立腺切除系列由来および迅速剖検プログラム由来（Ｓｈａｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４巻、９２０９頁（２００４年１２月１５日））のものである。
【０２４９】
組織は、ウルム大学病院（Ｕｌｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）での根治的前立腺切除術系列からも得た。すべての試料は、各それぞれの研究施設での事前の研究所審査委員の承認を得て、同意した患者から収集したものである。すべての試料からの総ＲＮＡを、製造業者の使用説明書に従って、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離した。総ＲＮＡを、ＲＷＰＥ、ＰＣ３、ＰＣ３＋ＡＲ（Ｄａｉら、Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ６１巻、５３１頁（１９９６年））、ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰおよびＤｕＣａＰ細胞株からも単離した。ＲＮＡの完全性を、ホルムアルデヒドゲル変性電気泳動またはアジレント社のバイオアナライザー２１００により検証した。良性前立腺組織の総ＲＮＡ（ＣＰＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の市販のプールも用いた。
【０２５０】
定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）
定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を、本質的には（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５巻、３３２８頁（２００５年）；Ｒｕｂｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４巻、３８１４頁（２００４年））に記載されているように、ＳＹＢＲグリーン色素を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの７３００リアルタイムＰＣＲシステム上で行った。要約すると、１〜５μｇの総ＲＮＡを、ランダムプライマーまたはランダムプライマーおよびオリゴｄＴプライマーの存在下で、スーパースクリプト（Ｓｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ）ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。すべての反応は、ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および２５ｎｇのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの両者を製造業者の推奨する熱サイクル条件を用いて実施した。すべての反応を融解曲線分析に供し、選択した実験から得た生産物を１．５％アガロースゲル上で電気泳動させることで分離した。各実験について、閾値を、配列検出ソフト、バージョン１．２．２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＱＰＣＲ反応の指数期において設定した。各試料について、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）と比較した各標的遺伝子の量を、ｃＤＮＡ試料を図説の各実験について検量用試料として用いて、比較閾値サイクル（Ｃｔ）法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓユーザーマニュアル（Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）＃２）により決定した。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより合成されたものであった。
【０２５１】
ＧＡＰＤＨプライマーは、（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ３巻、ＲＥＳＥＡＲＣＨ００３４（２００２年））に記載されており、その他すべてのプライマーを表４に列挙している。
【０２５２】
およそ等しい効率のプライマーを、比較Ｃｔ法を利用するため、前立腺癌ｃＤＮＡまたはプラスミド鋳型の段階希釈により確認した。
【０２５３】
ｃＤＮＡ末端のＲＮＡリガーゼ介在性迅速増幅（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ）
ｃＤＮＡ末端のＲＮＡリガーゼ介在性迅速増幅をジーンレーサー（ＧｅｎｅＲａｃｅｒ）ＲＬＭ−ＲＡＣＥキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従って用いて実施した。最初に、試料をＥＲＧまたはＥＴＶ１の発現に基づき、ＱＰＣＲにより選択した。総ＲＮＡの５μｇを仔ウシ腸由来ホスファターゼで処理し、切断されたｍＲＮＡおよび非ｍＲＮＡから５’ホスフェートを除去し、タバコ酸性フィロホスファターゼでキャップ構造を除去する。ジーンレーサーＲＮＡオリゴを全長転写産物に連結し、スーパースクリプトＩＩＩを用いて逆転写した。５’末端を得るため、第１鎖のｃＤＮＡをＥＴＶ１に対してジーンレーサー５’プライマーおよびＥＴＶ１エクソン４−５＿ｒ、あるいはＥＲＧに対してジーンレーサー５’プライマーおよびＥＲＧエクソン４ａ＿ｒまたはＥＲＧエクソン４ｂ  ｒを用いて、プラチナＴａｑハイフィデリティ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増幅した。プライマー配列を示す（表Ｓ２）。生産物を１．５％アガロースゲル上で電気泳動により分離し、バンドを切除、精製し、ＴＯＰＯ  ＴＡをｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングした。少なくとも４つの結腸からの精製プラスミドＤＮＡをミシガン大学ＤＮＡ配列決定コアのＡＢＩモデル３７３０自動配列決定装置で、Ｍ１３リバースおよびＭ１３フォワード（−２０）プライマーまたはＴ３およびＴ７プライマーを双方向で用いて配列決定した。ＲＬＭ−ＲＡＣＥｄ  ｃＤＮＡは、その他のアッセイに使用しなかった。
【０２５４】
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合物についての逆転写ＰＣＲ
上述のようにＱＰＣＲを用いてＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ陽性症例を同定後、同一のｃＤＮＡ試料をプラチナＴａｑハイフィデリティおよびＴＰＲＳＳ２：ＥＲＧプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。生産物を電気泳動で分離し、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングし、上述のように配列決定した。
【０２５５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアンドロゲン応答性
ヒトアンドロゲン受容体で安定的にトランスフェクトしたＲＷＰＥ、ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ  ＤｕＣａＰ、ＰＣ３およびＰＣ３細胞（ＰＣ３＋ＡＲ）（３）を１％エタノール対照または１ｎＭの合成アンドロゲンＲ１８８１で２４時間処理した。総ＲＮＡを単離し、ＥＲＧエクソン５−６＿ｆおよび＿ｒプライマーを用いて、上述したように逆転写とＱＰＣＲを行った。各試料についてＥＲＧ／ＧＡＰＤＨの相対量をＲＷＰＥ対照試料に対して較正した。
【０２５６】
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
正常な末梢リンパ球由来のホルマリン固定したパラフィン包理（ＦＦＰＥ）組織切片と転移性前立腺癌試料ＭＥＴ−２６およびＭＥＴ−２８を間期蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析に用いた。さらに、間期ＦＩＳＨを、１３の臨床的に局在化した前立腺癌と１６の転移性前立腺癌試料のＦＦＰＥ切片由来のコアを含む組織マイクロアレイ上で実施した。２色、２シグナルアプローチをＴＭＰＲＳＳ２とＥＴＶ１の融合を評価するために用い、プローブはそれぞれの遺伝子座のほとんどにまたがっていた。ビオチン−１４−ｄＣＴＰ  ＢＡＣクローンＲＰ１１−１２４Ｌ２２をＥＴＶ１遺伝子座に対して用い、ジゴキシン−ｄＵＴＰ標識したＢＡＣクローンＲＰＰ１１−３５ＣＤをＴＭＰＲＳＳ２遺伝子座に対して用いた。ＥＲＧを含む遺伝子再配列を分析するために、２つのプローブがＥＲＧ遺伝子座（ビオチン−１４−ｄＣＴＰ標識したＢＡＣクローンＲＰ１１−４７６Ｄ１７およびジゴキシン−ｄＵＴＰ標識したＢＡＣクローンＲＰ１１−９５Ｉ２１）にまたがる、分断シグナルプローブストラテジーを利用した。すべてのＢＡＣクローンは、オークランド研究所小児科病院（ＣＨＯＲＩ）より入手したものである。組織分析の前に、すべてのプローブの完全性と純度を正常な末梢リンパ球の中期スプレッドのハイブリダイゼーションにより確認した。組織ハイブリダイゼーション、洗浄および色検出を（Ｒｕｂｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４巻、３８１４頁（２００４年）；Ｇａｒｒａｗａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３６巻、１１７頁（２００５年））に記載のように実施した。
【０２５７】
Ｂ．結果
癌のアウトライアープロファイル分析
近年、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現プロファイリングは、癌トランスクリプトームを研究するための通常的な方法となってきている。マイクロアレイ研究は、癌の分子多様性に対する膨大な知見を与えており、多くの場合、腫瘍組織学、患者予後、および治療応答に対応する疾患の新規分子サブタイプを同定してきた（Ｖａｌｋら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５０巻、１６１７頁（２００４年））。しかしながら、一般に、癌トランスクリプトーム分析は、新規の癌の原因となる遺伝子の発見には至らなかった。癌遺伝子の顕著な過剰発現を生じる再配列および高レベルの複製数変化は、癌トランスクリプトームデータで顕著だが、必ずしも従来の分析アプローチで顕著であるわけではなかったと仮定された。
【０２５８】
癌の種類の大多数は、癌遺伝子の活性化の不均一パターンが観察されており、それゆえ癌試料の１つのクラスにわたって遺伝子の通常の活性化を探すような従来の分析方法（例えば、ｔ検定またはシグナル対ノイズ比）では、このような癌遺伝子発現プロファイルを見つけることはできない。代わりに、症例のサブセットにおける顕著な過剰発現を探す方法が必要である。本発明の開発過程において実施した実験は、癌のアウトライアープロファイル分析（ＣＯＰＡ）の発展をもたらした。ＣＯＰＡは、遺伝子発現プロファイルのメジアンおよびメジアン絶対偏差に基づいて簡単な数値的変換を応用することで、アウトライアープロファイルを増強および同定しようとするものである（Ｒｏｓｓら、Ｂｌｏｏｄ
１０２巻、２９５１頁（２００３年））。このアプローチを図５Ａに示す。ＣＯＰＡを１０，４８６のマイクロアレイ実験を示す１３２の遺伝子発現データセットの概要を含むＯｎｃｏｍｉｎｅデータベース（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０６巻、５３６頁（２０００年））に適用した。ＣＯＰＡは、再発性再配列または高レベル増幅が起こることが公知である特定の癌種における遺伝子について、いくつかのアウトライアープロファイルを正確に同定した。この分析では、癌遺伝子調査（Ｖａｓｓｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００巻、６９５８頁（２００３年））により定義されるようなＯｎｃｏｍｉｎｅデータセットにおいて上位１０のアウトライアープロファイルに位置する（表１および表３）公知の癌原因遺伝子のアウトライアープロファイルに着目した。例えば、Ｖａｌｋらの急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）データセットにおいては、ＲＵＮＸ１Ｔ１（ＥＴＯ）は、９５パーセンタイルで最強度のアウトライアープロファイルを示し、ＡＭＬのサブセットにおけるこの遺伝子の公知の転位および発癌活性転位と一致している（Ｄａｖｉｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００巻、６０５１頁（２００３年））（表１）。このアウトライアープロファイルは、ＲＵＮＸ１（ＡＭＬ１）、およびＲＵＮＸ１Ｔ１（ＥＴＯ）（図５Ｂ）を融合させる、既に確認済みのｔ（８；２１）転位を有する症例に正確に関連している。同様に、Ｒｏｓｓらの急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）データセットにおいては、ＰＢＸ１は９０パーセンタイルで最強度のアウトライアープロファイルを示し、ＡＬＬのサブセットで起こることが公知であるＥ２Ａ−ＰＢＸ１転位と一致している（Ｓｅｇａｌら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２１巻、１７７５頁（２００３年））（表１）。ここで、このアウトライアー発現プロファイルは、ＡＬＬに関するこのパネル中の特徴付けられたｔ（１；１９）Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１転位と完全に相関している（図５１Ｃ）。
【０２５９】
前立腺癌におけるＥＴＳファミリーメンバーのＥＲＧとＥＴＶ１に関するアウトライアープロファイルの同定
次に、新規ＣＯＰＡ予測を調べた。いくつかの独立したデータセットにおいて、ＣＯＰＡは、ユーイング肉腫および骨髄性白血病における発癌転位に関与していることが公知である２つのＥＴＳファミリー転写因子、ＥＲＧとＥＴＶ１、について前立腺癌における強いアウトライアープロファイルを同定した（Ｌａｐｏｉｎｔｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１巻、８１１頁（２００４年）；Ｔｉａｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４９巻、２４８３頁（２００３年））。Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎら（Ｋｅａｔｓら、Ｂｌｏｏｄ  １０５巻、４０６０頁（２００５年））、Ｗｅｌｓｈら（Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎら、Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １９巻、２４３頁（２００５年））、およびＬａｐｏｉｎｔｅら（Ｗａｎｇら、Ｌａｎｃｅｔ  ３６５巻、６７１頁（２００５年））の前立腺癌遺伝子発現データセットにおいては、ＥＲＧは、７５パーセンタイルで最高スコアのアウトライアープロファイルを示し（表１）、Ｌａｐｏｉｎｔｅら、およびＴｏｍｌｉｎｓら（Ｗｅｌｓｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１巻、５９７４頁（２００１年））データセットでは、ＥＴＶ１が９０パーセンタイルで最高スコアのアウトライアープロファイルを示した（表１）。総合すると、ＣＯＰＡは、７つの独立した前立腺癌プロファイリング研究において、ＥＲＧまたはＥＴＶ１を例外遺伝子の上位１０番以内に９回ランク付けした。ＥＲＧとＥＴＶ１の両者は、ユーイング肉腫における発癌転位に関与している。ＥＷＳ遺伝子の５’活性化領域のＥＲＧ（ｔ（２１；２２）（ｑ２２；ｑ１２））またはＥＴＶ１（ｔ（７；２２）（ｐ２１；ｑ１２））などのＥＴＳファミリーメンバーの高保存３’ＤＮＡ結合領域への融合は、ユーイング肉腫の特徴である（Ｌａｐｏｉｎｔら、上述；Ｚｈａｎら、Ｂｌｏｏｄ  ９９巻、１７４５頁（２００２年）；Ｆｏｎｓｅｃａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４巻、１５４６頁（２００４年））。ＥＴＳファミリーメンバーの関与する転位は発癌形質転換において機能的に重複するので、転移の１種のみがユーイング肉腫の各症例において通常観察される。
【０２６０】
ＥＲＧとＥＴＶ１が前立腺癌の発達に同様に関与している場合、これらのアウトライアープロファイルは、相互排他的、すなわち、各症例は２つ遺伝子のうち１つのみを過剰発現するはずであると考えられる。機能的に重複した遺伝子または同じ発癌経路にある遺伝子における変異は、腫瘍進行において共に選択される可能性は低い。ＥＲＧとＥＴＶ１の共発現プロファイルをいくつかの前立腺癌データセットにわたって調べたところ、これらが相互排他的なアウトライアープロファイルを示すことが分かった。異なるマイクロアレイプラットフォームを用いて全体的に切除された前立腺組織をプロファイルした、２つの大規模なトランスクリプトーム研究からのＥＲＧとＥＴＶ１の発現プロファイル（Ｗａｎｇら、上述；Ｃｈｅｏｋら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３４巻、８５頁（２００３年））を同定した（図１Ａ、左および中央パネル）。Ｇｌｉｎｓｋｙらの研究が臨床的に局在化した前立腺癌試料のみについてプロファイリングを行ったのに対し、Ｌａｐｏｉｎｔｅらによる研究は、ＥＲＧとＥＴＶ１の例外発現を前立腺癌および転移性前立腺癌に限定して、良性前立腺組織、臨床的に局在化した前立腺癌、および転移性前立腺癌をプロファイリングしている。これら両研究において、前立腺癌は、専らＥＲＧまたはＥＴＶ１を発現している（図１Ａ、右パネル）。同様の結果は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）によって得られた９９の前立腺組織試料に関するプロファイリング研究においても見出される（Ｗｅｌｓｈら、上述）。ＥＲＧまたはＥＴＶ１の排他的な例外発現（図１Ｂ、右パネル）に加え、ＬＣＭ研究の結果は、ＥＴＶ１およびＥＲＧが、推定の前駆病変前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）または隣接する良性上皮内ではなく、前立腺癌または転移性前立腺癌由来の上皮細胞内のみに過剰発現されることを実証した。観察されたこの排他的な例外パターンが、活性化遺伝子が複数のパートナーと融合できるその他の転位と一致しているのかを直接的に決定するため、Ｚｈａｎらは、複数の骨髄腫データセット（Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１２巻、８２２頁（２００１年））について検討した。免疫グロブリン重鎖プロモーターのＣＣＮＤ１またはＦＧＦＲ３、それぞれｔ（１１，１４）またはｔ（４，１４）、への再発性融合は、複数の骨髄腫の特定のサブセットを特徴付ける（Ｗｉｇｌｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２巻、３００５頁（２００２年））。ＣＣＮＤ１が７５パーセンタイルで最高スコアの例外を示し、ＦＧＦＲ３が９５パーセンタイルで３番目に高いスコアの例外を示したので（表１）、これらの転位はアウトライアープロファイル分析（図１Ｃ）に反映されている。２つの症例を除き、骨髄腫試料は、ＣＣＮＤ１またはＦＧＦＲ３の排他的な過剰発現を示した（図１Ｃ、右パネル）。総合すると、複数の前立腺癌データセットにわたるＥＲＧとＥＴＶ１のアウトライアープロファイルは、様々なヒト悪性疾患におけるその他の原因変異と一致している。ＥＲＧまたはＥＴＶ１の個々の前立腺癌試料における排他的な過剰発現は、多発性骨髄腫などの活性化遺伝子が生物学的に重複したパートナー遺伝子と融合できる他の新生物と一致している。
【０２６１】
前立腺癌におけるＴＭＰＲＳＳ２のＥＲＧまたはＥＴＶ１への再発性遺伝子融合の発見
次に、個々の前立腺癌試料におけるＥＲＧとＥＴＶ１過剰発現のメカニズムを決定した。ＥＲＧまたはＥＴＶ１を過剰発現した前立腺癌細胞株および臨床標本を定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を行って同定した（図２Ａ）。ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株およびホルモン抵抗性転移性前立腺癌で死亡した患者から入手した２つの標本（前立腺における残存原発癌腫であるＭＥＴ−２６ＲＰ、およびリンパ節転移であるＭＥＴ−２６ＬＮ）は、ＱＰＣＲにより、ＥＴＶ１を顕著に過剰発現した（図２Ａ）。異なる解剖学的位置由来の５つの独立した転移性病巣、ならびにこの患者の前立腺における残存癌腫もＤＮＡマイクロアレイ分析でＥＴＶ１を過剰発現し（上記既出のＷｅｌｓｈらの文献を参照）、ＥＴＶ１活性化が広範な転移の前に原発性腫瘍で起こったことを示唆している。リンパ節転移はホルモン抵抗性転移性前立腺癌（ＭＥＴ−２８ＬＮ）で死亡した第２の患者、およびＥＲＧを過剰発現したＶＣａＰおよびＤｕＣａＰの２つの前立腺癌細胞株からも同定された（図２Ａ）。これらの細胞株は、椎骨転移（ＶＣａＰ）、およびホルモン抵抗性前立腺癌を有する第３の患者由来の硬膜転移（ＤｕＣａＰ）から独立に単離された（Ｇｏｌｕｂら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６巻、５３１頁（１９９９年）；Ｒｏｓｅｎｗａｌｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３巻、１８５頁（２００３年））。繰り返すと、これらの２つの細胞株におけるＥＲＧの通常の過剰発現は、ＥＲＧ活性化が広範な転移の前に起こったことを示唆する。総合すると、これらの結果は、特定の遺伝事象が、前立腺腫瘍形成中に個々の試料においてＥＲＧまたはＥＴＶ１を活性化している可能性があることを示唆している。
【０２６２】
これらの遺伝事象を特徴付ける上で、高いＥＲＧまたはＥＴＶ１発現を有する試料について、これらのそれぞれの遺伝子座（７ｐ２１．２および２１ｑ２２．３）での染色体増幅を試験した。ゲノムＤＮＡ上のＱＰＣＲによると、試料中のＥＲＧまたはＥＴＶ１の、それぞれの転写産物過剰発現（Ｓｏｔｉｒｉｏｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００巻、１０３９３頁（２００３年））による増幅は見られなかった。続いて、ＤＮＡ再配列の発生を分析した。上述のＱＰＣＲに用いたプライマーは、ユーイング肉腫におけるＥＲＧとＥＴＶ１の公知のブレイクポイントに対して５’に位置するため、同じ転位が前立腺癌において起こる可能性は低かった。したがって、ＥＴＶ１エクソンの発現レベルは、ＥＴＶ１過剰発現を示した上記の同定した試料中のエクソンウォーキングＱＰＣＲにより測定した。ＥＴＶ１のエクソン２〜７に及ぶ５つのプライマー対を用い、ＬＮＣａＰ細胞は、すべての測定したＥＴＶ１のエクソンの本質的に均一な過剰発現を示し、およびＭＥＴ２６の両標本ではエクソン４〜７に比べて、ＥＴＶ１のエクソン２および３の発現が＞９０％減少していることを示した（図２Ｂ）。この結果の可能性のある説明として、選択的スプライシング、新規の癌特異性アイソフォームまたは未報告の再配列が挙げられる。
【０２６３】
全長ＥＴＶ１転写産物を特徴付けるため、ｃＤＮＡ末端の５’ＲＮＡリガーゼ介在性迅速増幅（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ）をＬＮＣａＰ細胞およびＭＥＴ２６−ＬＮ上で行った。さらに、ＭＥＴ２８−ＬＮにおけるＥＲＧの全長転写産物を得るためにＲＬＭ−ＲＡＣＥを行った。ＲＬＭ−ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ由来のＥＴＶ１のＰＣＲ増幅に関して、完全転写産物の５’末端に連結したＲＮＡ−オリゴヌクレオチドに相補的なフォワードプライマーと、ＬＮＣａＰ細胞およびＭＥＴ２６−ＬＮの両者で過剰発現された最も５’側のエクソンである、エクソン４のリバースプライマーを用いた。上述と同様のストラテジーにより、ＥＲＧのエクソン４がＭＥＴ２８−ＬＮで過剰発現されたことを決定した。このエクソンのリバースプライマーをＲＬＭ−ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に用いた。クローニングされた生産物の配列決定により、前立腺特異性遺伝子ＴＭＰＲＳＳ２（２８）（２１ｑ２２．２）の、ＭＥＴ２６−ＬＮにおけるＥＴＶ１との融合およびＭＥＴ２８−ＬＮにおけるＥＲＧとの融合が明らかになった（図２Ｃ）。ＭＥＴ２６−ＬＮでは、２つのＲＬＭ−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物を同定した。
【０２６４】
第１の生産物であるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１ａは、ＴＭＰＲＳＳ２の完全エクソン１の、ＥＴＶ１のエクソン４の最初との融合を生じた（図２Ｃ）。第２の生産物であるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１ｂは、ＴＭＰＲＳＳ２のエクソン１および２の、ＥＴＶ１のエクソン４の最初との融合を生じた（図６）。これらの両生産物は、ＭＥＴ２６−ＬＮがエクソン２および３における過剰発現の消失を示した、上述のエクソン−ウォーキングＱＰＣＲと一致している。ＭＥＴ２８−ＬＮにおいては、単一のＲＬＭ−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物を同定し、配列決定により、ＴＭＰＲＳＳ２の完全エクソン１がＥＲＧのエクソン４の最初に融合していることが明らかになった（ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａ）（図２Ｃ）。
【０２６５】
前立腺癌におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１遺伝子融合物の検証
これらの結果に基づき、ＱＰＣＲプライマー対は、ＴＭＰＲＳＳ２においてはフォワードプライマーで、ＥＲＧとＥＴＶ１のエクソン４においてはリバースプライマーで設計された。ＳＹＢＲグリーンＱＰＣＲを、両プライマー対を臨床的に局在化した前立腺癌および転移性前立腺癌の４２症例より得た一連の試料にわたって用いて行い、代表的な結果を記載した（図２、ＤおよびＥ）。これらの結果は、高レベルのＥＴＶ１またはＥＲＧを有する試料のみがＴＭＰＲＳＳ２を有するそれぞれの融合産物を発現することを実証している。ＱＰＣＲがいくつかの陰性試料において３５サイクル後に測定可能な生産物を生じたにもかかわらず、融解曲線分析は陽性および陰性試料中に異なる生産物を明らかにし、４０サイクルのＱＰＣＲ分析後の生産物のゲル電気泳動は陰性融合試料のプライマーダイマーのみを明らかにした（図２、ＤおよびＥ）。プライマーダイマーの形成は、高いＧＣ含有量（８０．３％）に起因するＴＭＰＲＳＳ２のエクソン１の全体でプライマーを設計する困難さで部分的に説明できる。しかしながら、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａ、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１ａ、およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１ｂ融合物の特異的発現をタックマン（Ｔａｑｍａｎ）ＱＰＣＲでそれぞれの融合物に及ぶフォワードプライマーを用いて確認し、各症例において、生産物はＳＹＢＲグリーンＱＰＣＲと同じ症例においてのみ検出された（Ｓｏｔｉｒｉｏｕら、上述）。ＳＹＢＲグリーンＱＰＣＲとアンプリコンに対して用いたプライマーの特異性をさらに確認するため、標準的な逆転写ＰＣＲをＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａを発現した一連の試料でＳＹＢＲグリーンＱＰＣＲと同じプライマーで行った。同様の大きさの生産物が得られ、クローニング生産物の配列決定はＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａの存在を確認した。高レベルのＥＴＶ１またはＥＲＧをそれぞれ発現したが、ＱＰＣＲによる転位の証拠を示さなかったＰＣＡ１６およびＰＣＡ１７の２症例を同定した（図２、ＤおよびＥ）。ＰＣＡ１６においてＥＴＶ１プライマーで生産された生産物の配列決定が融合転写産物の証拠を示さず、ＰＣＡ１７においてはＥＲＧプライマーで生産物は得られなかったので、ＲＬＭ−ＲＡＣＥはこれらの結果を裏付けた。同様の結果はＬＮＣａＰ細胞についても得られ、ＲＬＭＲＡＣＥまたはＱＰＣＲによる融合の証拠はなく、上記のエクソンウォーキングＱＰＣＲと一致していた。
【０２６６】
前立腺癌試料におけるＥＴＳファミリーメンバーとのＴＭＰＲＳＳ２融合転写産物の証拠の概要
ＲＬＭ−ＲＡＣＥ生産物の配列決定、ＲＴ−ＰＣＲ生産物のＱＰＣＲおよび配列決定を含む、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合転写産物についての３つの異なるアッセイから得られた結果を表２にまとめる。すべての試料において行ったＴＭＰＲＳＳ２融合物に対するＱＰＣＲに加え、これらの融合物の存在を、選択した試料についていくつかの手法を用いて確認した。例えば、ＰＣＡ１（前立腺癌試料１）において、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａをＲＬＭＲＡＣＥ生産物の配列決定、ＲＴ−ＰＣＲ生産物のＱＰＣＲおよび配列決定により同定した。ＱＰＣＲ生産物のＱＰＣＲ融解曲線分析およびゲル電気泳動により、ＰＣＡ４は予想より大きなアンプリコンを生産した。続くＲＬＭ−ＲＡＣＥ分析で、ＴＭＰＲＳＳ２の完全エクソン１の、ＥＲＧのエクソン２の最初との融合（ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧｂ）を確認した（図６）。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧｂ接合部に及ぶフォワードプライマーを用いたタックマンＱＰＣＲはＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧｂがＰＣＡ４のみに存在することを確認し、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａ接合部に及ぶフォワードプライマーを用いたタックマンＱＰＣＲは、この試料中で生産物を生産しなかった（２７）。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合物の証拠は、過剰発現したＥＲＧまたはＥＴＶ１をそれぞれ発現した症例のみにＱＰＣＲまたはＤＮＡマイクロアレイにより見られた。これらの結果は、例外分析で観察された排他的な発現と一致している。
【０２６７】
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１転位およびＥＲＧ再配列の確認
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合転写産物の存在確認後、染色体レベルでのこれらの再配列の証拠を、間期蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をホルマリン固定したパラフィン包理（ＦＦＰＥ）標本を用いて得た。２つの異なるプローブストラテジーを用いた：ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１転位を検出するのに２色、融合−シグナルアプローチ、およびＥＲＧ遺伝子座の再配列を検出するのに２色、分断シグナルアプローチを用いた。これらのプローブストラテジーは、ＲＬＭ−ＲＡＣＥ、ＭＥＴ２６およびＭＥＴ２８に当初使用した２症例で検証した（図３）。ＴＭＰＲＳＳ２とＥＴＶ１に対するプローブを用いて、正常な末梢リンパ球（ＮＰＬ）は１対の赤と１対の緑のシグナルを示した（図３Ａ）。ＭＥＴ２６は、プローブの重複の指標である一対のシグナルの融合を示し（図３Ｂ、黄色矢印）、この試料中におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１転写産物の発現と一致していた。さらに、ＥＴＶ１に対する残りの２つのシグナルにより示されるように（図３Ｂ、赤矢印）、ＥＴＶ１遺伝子座の一貫した低レベル増幅を確認した。同様に、ＥＲＧ遺伝子座の５’および３’領域に及ぶプローブを用いて、ＮＰＬにおける一対の黄色のシグナルを観察した（図３Ｃ）。ＭＥＴ２８においては、一対のプローブは緑と赤の別々のシグナルに分かれ、ＥＲＧ遺伝子座での再配列を示している（図３Ｄ、緑および赤の矢印）。この結果は、この症例におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ転写産物の発現と一致している。これらの結果に基づき、上述の個々のＦＩＳＨ分析を、局在化した前立腺癌の１３症例および転移性前立腺癌の１６症例（図３Ｅ）由来のコアを含む連続組織マイクロアレイで行った。マトリックスで示すように、２９症例中の２３症例（７９．３％）が、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合物（７症例）またはＥＲＧ再配列（１６症例）の証拠を示した。さらに、２９症例中の１２症例（４１．４％）でＥＴＶ１遺伝子座での低レベル増幅の証拠を示した。従来の報告では、ＥＴＶ１、７ｐのゲノム位置を、局在化したおよび転移性前立腺癌において最もよく増幅された領域の１つとして同定した（Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５巻、１７７頁（１９８７年））。しかしながら、ＥＴＶ１増幅がＥＲＧ再配列を有する６症例で起こり、本発明者らの転写産物データが、高いＥＲＧ発現およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合物を有する試料のうち高いＥＴＶ１発現も有するものは１９試料のうち０試料であることを実証しているので、７ｐ増幅はＥＴＶ１発現を誘発していないようである。さらに、ＥＴＶ１増幅およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合物の両者がＦＩＳＨにより存在した場合、融合シグナルではなく、個々のＥＴＶ１シグナルのみが増幅された。それにもかかわらず、このＦＩＳＨ分析結果は、上述の転写産物データと一致したゲノムレベルでのＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１およびＥＲＧ再配列の存在を実証している。
【０２６８】
ＴＭＰＲＳＳ２はアンドロゲン調節遺伝子であり、ＥＲＧとの融合でＥＲＧのアンドロゲン制御を生じている。ＴＭＰＲＳＳ２は、初期にＬＮＣａＰ細胞のアンドロゲンにより発現が増大された前立腺特異的遺伝子として同定されたものであり、アンドロゲン応答性エレメント（ＡＲＥ）もそのプロモーターに含む（Ｈｕａｎｇら、Ｌａｎｃｅｔ  ３６１巻、１５９０頁（２００３年）；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２巻、４７２２頁（２００２年））。続く研究により、正常および腫瘍性前立腺組織における高い発現が確認され、ＴＭＰＲＳＳ２がアンドロゲン感受性前立腺細胞株においてアンドロゲン制御されていることが実証された（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２巻、４７２２頁（２００２年）；Ｆｅｒｒａｎｄｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １巻、７５頁（２００２年）；Ｃｈｅｎら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １４巻、３２０８頁（２００３年）；ＬａＴｕｌｉｐｐｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２巻、４４９９頁（２００２年））。さらに、アンドロゲンがアンドロゲン非感受性前立腺癌細胞株ＰＣ３におけるＴＭＰＲＳＳ２の発現を増大しないのに対し、ＰＣ３細胞におけるアンドロゲン受容体の安定な発現はアンドロゲン応答性となるＴＭＰＲＳＳ２を生じた（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、上述；Ｆｅｒｒａｎｄｏら、上述；Ｃｈｅｎら、上述；ＬａＴｕｌｉｐｐｅら、上述）。これに対し、アンドロゲンで処理したＬＮＣａＰ前立腺細胞株のマイクロアレイ研究では、アンドロゲン応答性であるためＥＲＧまたはＥＴＶ１を同定しておらず（Ｊａｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４巻、３９０７頁（２００４年））、これらのプロモーター配列を調べることではコンセンサスＡＲＥを明らかにしなかった（Ｓｏｔｉｒｉｏｕ、上述）。各細胞株において３つの独立したアッセイにより確認された（表２）ＤｕＣａＰおよびＶＣａＰ細胞株におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａ融合物がＥＲＧのアンドロゲン制御を生じていると考えられた。ＥＲＧ発現のアッセイにＱＰＣＲを用いて、ＥＲＧがＶＣａＰおよびＤｕＣａＰ細胞の両者で高発現されたにもかかわらず、合成アンドロゲンＲ１８８１による処理が、ＥＲＧの発現を、未処理対照と比較して、ＤｕＣａＰ細胞では２．５７倍に、およびＶＣａＰ細胞では５．０２倍に増大したことが確認された（図４）。ＥＲＧの発現は最小であり、Ｒ１８８１治療後では未処理対照試料に比べて、ＲＷＰＥ（１．３７倍）、ＬｎＣａＰ（０．８６倍）、ＰＣ３（１．２８倍）、およびアンドロゲン受容体を発現するＰＣ３細胞（０．７３倍）では本質的に変化しなかった。
【０２６９】
同一試料のマイクロアレイ分析は、ＥＲＧが、ＤｕＣａＰおよびＶＣａＰ細胞おけるアンドロゲンに対する応答で、上方制御されるだけであることを確認した（Ｓｏｔｉｒｉｏｕら、上述）。本発明は特定の機構に限定されるものではない。実際に、メカニズムの理解は本発明の実施に必要ではない。それにもかかわらず、これらの結果は、ＴＭＰＲＳＳ２とのそれぞれの融合が存在する場合に前立腺癌におけるＥＲＧまたはＥＴＶ１の異常発現についての可能なメカニズムを示唆していると考えられる。
【０２７０】
表１．癌のアウトライアープロファイル分析（ＣＯＰＡ）。強度のアウトライアープロファイルを有する癌において原因となる変異が起こることが公知である遺伝子。「Ｘ」は、後天性病原ゲノム（ｐａｔｈｏｇｅｎｏｍｉｃ）転位についての文献証拠を示す。「ＸＸ」は、転位について特徴付けられた具体的な研究における試料と、具体的な転位についての文献証拠を示す。「Ｙ」は、公知の増幅との一致を示す。「＊＊」は、前立腺癌におけるＥＲＧとＥＴＶ１のアウトライアープロファイルを示す。
【０２７１】
【表１−１】
2018019720.tif 000004
【０２７２】
【表１−２】
2018019720.tif 000005
表２は、前立腺癌試料および細胞株におけるＥＴＳファミリーメンバー状態に対するＴＭＰＲＳＳ２融合物の概要を示す。すべてのアッセイについて、陽性結果を「＋」で示し、陰性結果を「−」で示している。空欄になっている細胞は、所定のアッセイがその試料について行われなかったことを示す。定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）によるＥＲＧまたはＥＴＶ１の過剰発現が示されており、アステリスクで記された試料は、その試料がｃＤＮＡマイクロアレイでも評価され、過剰発現が確認されたことを示す。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧまたはＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１遺伝子融合物を検出するために、選択された試料について過剰発現したＥＴＳファミリーメンバーについてのＲＬＭ−ＲＡＣＥを行い、配列決定後にＴＭＰＲＳＳ２融合物を有する試料を示す。すべての試料について、ＱＰＣＲによるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ発現を分析した。選択された症例はまた、ＱＰＣＲで用いたものと同じＴＭＰＲＳＳ２融合物プライマーを用いて標準的な逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により増幅し、アンプリコンを配列決定した。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１またはＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合物の証拠を示す試料を最終列に示す。
【０２７３】
【表２−１】
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【０２７４】
【表２−２】
2018019720.tif 000007
表３．癌のアウトライアープロファイル分析（ＣＯＰＡ）。Ｏｎｃｏｍｉｎｅでの検討で上位１０位に入るアウトライアープロファイルを有する癌における原因となる突然変異が起こることが公知である遺伝子を示す。「Ｘ」は、後天性病原ゲノム転位に関する文献証拠を示す。「ＸＸ」は、転位について特徴付けられた具体的な研究における試料と、具体的な転位についての文献証拠を示す。「Ｙ」は、公知の増幅との一致を示す。「＊＊」は、前立腺癌におけるＥＲＧとＥＴＶ１のアウトライアープロファイルを示す。
【０２７５】
【表３−１】
2018019720.tif 000008
【０２７６】
【表３−２】
2018019720.tif 000009
【０２７７】
【表３−３】
2018019720.tif 000010
【０２７８】
【表３−４】
2018019720.tif 000011
表４．本研究で用いたオリゴヌクレオチドプライマー。すべてのプライマーについて、遺伝子、塩基およびエクソン（ＵＣＳＣゲノムブラウザーを用いた、２００４年５月のヒトゲノムのアセンブリーと本明細書中に記載された参照配列のアラインメントに従う）を列挙する。フォワードプライマーを「ｆ」、およびリバースプライマーを「ｒ」で示す。
【０２７９】
【表４】
2018019720.tif 000012
（実施例２）
ＥＴＶ４遺伝子融合
Ａ．材料および方法
プロファイリング研究におけるＥＴＳファミリーの発現
前立腺癌におけるＥＴＳファミリーメンバーの発現を調べるために、Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータベース（Ｒｈｏｄｅｓら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ２００４年；６巻：１〜６頁）にある、２つの前立腺癌プロファイリング研究を利用した（Ｌａｐｏｉｎｔｅら、Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００４年；１０１巻：８１１〜６頁およびＴｏｍｌｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５年；３１０巻：６４４〜８頁）。ＥＴＳ領域を有する遺伝子をＩｎｔｅｒｐｒｏフィルター「Ｅｔｓ」（Ｉｎｔｅｒｐｒｏ  ＩＤ：ＩＰＲ０００４１８）により同定した。ヒートマップ表示を「遺伝子毎にメジアンを中心」のオプションを用いてＯｎｃｏｍｉｎｅ中に作製し、その色の対比を、ＥＲＧとＥＴＶ１の発現差異を強調するように設定した。
【０２８０】
試料
前立腺癌組織（ＰＣＡ１−５）は、ミシガン大学前立腺癌専門優良研究プログラム（Ｓ．Ｐ．Ｏ．Ｒ．Ｅ．）組織コアの一部である、ミシガン大学の根治的前立腺切除術系列から得た。すべての試料は、患者のインフォームドコンセントおよび事前の研究所審査委員の承認を得て収集した。総ＲＮＡをトリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を製造業者の使用説明に従って用いて単離した。良性前立腺組織総ＲＮＡの市販のプール（ＣＰＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）も用いた。
【０２８１】
定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）
ＱＰＣＲを既述のように（Ｔｏｍｌｉｎｓら、上述）、ＳＹＢＲグリーン色素をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）上で用いて実施した。各試料についてのハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対する各標的遺伝子の量を報告した。これらの標的遺伝子の相対量を良性前立腺組織（ＣＰＰ）のプール由来の量に対する値に対して較正した。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）により合成されたものである。ＧＡＰＤＨプライマーについては、文献（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ２００２年；３巻：ＲＥＳＥＡＲＣＨ００３４）に記載の通りであった。ＥＴＶ４のエクソンに対するプライマーは以下の通りであった（５’から３’に列挙）：
ＥＴＶ４＿エクソン２−ｆ：ＣＣＧＧＡＴＧＧＡＧＣＧＧＡＧＧＡＴＧＡ（配列番号２１）、
ＥＴＶ４＿エクソン２−ｒ：ＣＧＧＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧ（配列番号２２）、
ＥＴＶ４＿エクソン３−ｆ：ＧＣＣＧＣＣＣＣＴＣＧＡＣＴＣＴＧＡＡ（配列番号２３）、
ＥＴＶ４＿エクソン４−ｒ：ＧＡＧＣＣＡＣＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＡＣＴ（配列番号２４）、
ＥＴＶ４＿エクソン１１−ｆ：ＣＴＧＧＣＣＧＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧＣ（配列番号２５）、
ＥＴＶ４＿エクソン１２−ｒ：ＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＡＴＧＧＡＧＴ（配列番号２６）、
ＥＴＶ４＿３’ＵＴＲ−ｆ：ＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＡＣＣＧＧＴＴＴＧＴＣＡ（配列番号２７）、
ＥＴＶ４＿３’ＵＴＲ−ｒ：ＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＧＡＡＣＡＣ（配列番号２８）。エクソンを、ＵＣＳＣゲノムブラウザーを用いて２００４年５月凍結のヒトゲノムで、ＥＴＶ４（ＮＭ＿００１９８６．１）に関するＲｅｆＳｅｑのアラインメントにより番号付けした。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４融合転写産物のＱＰＣＲ確認のため、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４ａおよびＴＭＰＲＳＳ２；ＥＴＶ４ｂ転写産物の両者を検出するＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４ａ−ｆ（ＡＡＡＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＴＣ（配列番号２９））およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４ｂ−ｆ（ＡＴＣＧＴＡＡＡＧＡＧＣＴＴＴＴＣＴＣＣＣＣＧＣ（配列番号３０））を、ＥＴＶ４＿エクソン４−ｒと共に用いた。
【０２８２】
ｃＤＮＡ末端のＲＮＡリガーゼ介在性迅速増幅（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ）
ＲＬＭ−ＲＡＣＥを、ジーンレーサーＲＬＭ−ＲＡＣＥキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、記載のように製造業者の使用説明書に従い（Ｔｏｍｌｉｎｓら、上述）実施した。ＥＴＶ４の５’末端を得るために、ＰＣＡ５由来の第１鎖のｃＤＮＡを、ジーンレーサー５’プライマーおよびＥＴＶ４  エクソン４−ｒまたはＥＴＶ４＿エクソン７−ｒ（ＧＡＡＡＧＧＧＣＴＧＴＡＧＧＧＧＣＧＡＣＴＧＴ（配列番号３１））を用いて増幅した。生産物をクローニングし、記載のように配列決定した（Ｔｏｍｌｉｎｓら、上述）。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４転写産物の等価物５’末端を両プライマー対から得た。
【０２８３】
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
ホルマリン固定したパラフィン包理（ＦＦＰＥ）組織切片を間期ＦＩＳＨに用いた。パラフィン除去した組織を０．２ＭのＨＣｌで１０分間、２×ＳＳＣで１０分間、８０℃で処理し、プロテアーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１０分間消化した。この組織とＢＡＣプローブを５分間９４℃で共に変性し、一晩３７℃でハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、洗浄を０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む２×ＳＳＣで５分間行い、蛍光検出をフルオレセインにコンジュゲートした抗ジゴキシゲニン（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、およびアレクサフルオア（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）５９４にコンジュゲートしたストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。スライドを対比染色し、ＤＡＰＩ含有のＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ退色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においた。スライドをＬｅｉｃａのＤＭＲＡ蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）を用いて観察し、サイトビジョンソフトウェアシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いてＣＣＤカメラで撮像した。
【０２８４】
いずれのＢＡＣも、ＢＡＣＰＡＣ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｏａｋｌａｎｄ、ＣＡ）から入手したものであり、プローブ位置を正常な末梢リンパ球の中期スプレッドとのハイブリダイゼーションにより確認した。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４融合物の検出については、ＲＰ１１−３５Ｃ４（ＴＭＰＲＳＳ２に対して５’側）をＥＴＶ４に対して３’側に位置する複数のＢＡＣ（ＥＴＶ４に対して遠位側から近位側へ：ＲＰ１１−２６６Ｉ２４、ＲＰ１１−２４２Ｄ８、およびＲＰ１１−１００Ｅ５）と共に用いた。ＥＴＶ４再配列の検出については、ＲＰ１１−４３６Ｊ４（ＥＴＶ４に対して５’側）をＥＴＶ４に対して３’側に位置する複数のＢＡＣと共に用いた。各ハイブリダイゼーションについて、癌性細胞の領域が病理学者により同定され、一試料につき１００個の細胞をカウントした。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４融合物についての報告された細胞数は、ＲＰ１１−２４２Ｄ８を用い、同様の結果がすべての３’ＥＴＶ４  ＢＡＣで得られた。ＰＣＡ５におけるさらなる再配列を排除するため、ＦＩＳＨを、ＥＴＶ４に対して３’側（ＲＰ１１−２６６Ｉ２４およびＲＰ１１−２４２Ｄ８）、ＥＲＧ分断シグナルプローブ（ＲＰ１１−９５Ｉ２１およびＲＰ１１−４７６Ｄ１７）、およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合物プローブ（ＲＰ１１−３５Ｃ４およびＲＰ１１−１２４Ｌ２２）の２つのプローブを用いて実施した。ＢＡＣ  ＤＮＡをＱＩＡフィルターマキシプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて単離し、プローブをジゴキシゲニン−またはビオチン−ニックトランスレーションミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて合成した。
【０２８５】
Ｂ．結果
最初のＣＯＰＡスクリーニングは、ＥＲＧまたはＥＴＶ１とのＴＭＰＲＳＳ２融合物の特徴付けに至った（実施例１）。これらの遺伝子融合物に対して陰性な前立腺癌は、その他のＥＴＳファミリーメンバーを含む再配列を有しているとさらに考えられる。Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータベース（Ｒｈｏｄｅｓら、上述）からの前立腺癌プロファイリング研究においてモニターされたすべてのＥＴＳファミリーメンバーの発現を調べることで、ＥＴＳファミリーメンバーＥＴＶ４の著しい過剰発現を、１つは全体解剖組織のプロファイリング（Ｌａｐｏｉｎｔｅら、上述）（図７Ａ）であり、もう１つがレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）組織のプロファイリング（図７Ｂ）である、２つの研究の各々から単一の前立腺癌の症例で同定した。これらの症例はＥＲＧまたはＥＴＶ１を過剰発現せず、いずれの良性前立腺組織も過剰発現を示さなかったので、ＴＭＰＲＳＳ２との融合物がこれらの症例におけるＥＴＶ４の過剰発現に関与したと考えられた。ＥＬＦ３が前立腺癌の症例のうちのわずかでも過剰発現されたにもかかわらず、これらの両研究で、正常な前立腺組織試料も顕著なＥＬＦ３過剰発現を示しており、良性および癌性組織の両者での発現を引き起こす遺伝子融合の可能性が低いことを示している。したがって、このＥＴＶ４過剰発現の症例（ＰＣＡ５として表す）をさらに分析した。
【０２８６】
総ＲＮＡをＰＣＡ５から単離し、エクソン−ウォーキング定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を用いてＥＴＶ４の過剰発現を確認した。この場合、ＱＰＣＲは、プールされた良性前立腺組織（ＣＰＰ）（約９００倍）、およびＥＴＶ４を過剰発現せずかつＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ陽性（ＰＣＡ１−２）であるかまたは陰性（ＰＣＡ３−４）であった前立腺癌に比べて、ＥＴＶ４のエクソン３’からエクソン２までのエクソンが顕著に発現されたことを実証した（図８Ａ）。しかしながら、ＰＣＡ５における遠位領域に対する、ＥＴＶ４のエクソン２の発現の劇的な減少（＞９９％）が観察されており、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１陽性の症例（Ｔｏｍｌｉｎｓら、上述）で既に観察されているように、可能性のあるＴＭＰＲＳＳ２との融合を示している。
【０２８７】
ＰＣＡ５におけるＥＴＶ４転写産物の５’末端を同定するために、ｃＤＮＡ末端のＲＮＡ−リガーゼ介在性迅速増幅（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ）をエクソン７においてリバースプライマーを用いて行った。ＲＬＭ−ＲＡＣＥは２つの転写産物を明らかにし、これらは各々、ＥＴＶ４由来の配列に融合したＴＭＰＲＳＳ２のおよそ８ｋｂ上流に位置する配列からなる５’末端を有していた（図８Ｂ）。具体的には、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４ａの５’末端はＴＭＰＲＳＳ２の該領域上流から４７塩基対を有しているが、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４ｂの５’末端は同じ末端１３塩基対を有している。これら両転写産物の５’末端は、ＥＴＶ４のエクソン７のリバースプライマーを通じて、ＥＴＶ４のエクソン３の直前の５’側に位置するイントロンの９塩基対と、エクソン３の既報の基準配列とからなる、同一の隣接ストレッチに融合した。
【０２８８】
ＰＣＡ５における両転写産物の存在およびＣＰＰおよびＰＣＡ１〜４におけるこれらの不存在をＱＰＣＲを用いて確認した。公知のエクソンを含む融合物の存在をＴＭＰＲＳＳ２からさらに排除するため、ＱＰＣＲを、ＴＭＰＲＳＳ２のエクソン１のフォワードプライマー、およびＥＴＶ４エクソン４リバースプライマーを用いて実施し、予測どおり、ＣＰＰまたはＰＣＡ１〜５で産物は検出されなかった。
【０２８９】
ＥＴＶ４調節不全を有するその他の前立腺癌が、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１転写産物（ＴＭＰＲＳＳ２由来の公知のエクソン含む）に構造的により類似したＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４融合転写産物を含み得るかどうかは不明である。本明細書で報告されているＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４融合物は、ＴＭＰＲＳＳ２のすぐ上流の十分特徴付けられたＡＲＥを含んでいない。しかしながら、本明細書に記載のＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４転写産物（Ｒａｂｂｉｔｔｓ、Ｎａｔｕｒｅ  １９９４年；３７２巻：１４３〜９頁）に存在するＴＭＰＲＳＳ２配列の上流に位置するアンドロゲン応答性エンハンサーについての証拠はある。それにもかかわらず、融合転写産物に関わるＥＴＶ４エクソンのみの顕著な過剰発現は、遺伝子融合物がＥＴＶ４の調節不全に関与していることを強く示唆している。総合すると、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４融合転写産物の構造は、転写されたＴＭＰＲＳＳ２配列よりむしろ、ＴＭＰＲＳＳ２上流の制御エレメントがＥＴＳファミリーメンバーの調節不全を引き起こしているという結論を支持する。
【０２９０】
ＲＬＭ−ＲＡＣＥおよびＱＰＣＲで実証されている、ＴＭＰＲＳＳ２（２１ｑ２２）とＥＴＶ４（１７ｑ２１）を取り囲むゲノム遺伝子座の融合を確認するために、間期蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を利用した。ＴＭＰＲＳＳ２に対して５’側、ＥＴＶ４に対して３’側のプローブを用いることで、ＴＭＰＲＳＳ２とＥＴＶ４遺伝子座の融合がＰＣＡ５由来の癌性細胞の６５％で観察された（図８Ｄ）。ＥＴＶ４の再配列のさらなる確認として、５’および３’側のプローブをＥＴＶ４に用いると、ＰＣＡ５由来の癌性細胞の６４％が分断シグナルを示した。ＦＩＳＨも、さらなる再配列を排除するため、ＥＴＶ４に対して３’側の２つのプローブ、ＥＲＧ分断シグナルプローブ、およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合物プローブを用いてＰＣＡ５上で実施し、各ハイブリダイゼーションについて陰性の結果が得られた。
【０２９１】
これらを総合すると、この結果は、多くの分析方法は一貫した調節解除を示さないプロファイルを考慮にいれず（Ｅｉｓｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９８年；９５巻：１４８６３〜８頁；Ｇｏｌｕｂら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９年；２８６巻：５３１〜７頁；Ｔｕｓｈｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ
ＵＳＡ  ２００１年；９８巻：５１１６〜２１頁）、したがって、希少にみえる（９８症例中２症例）前立腺癌におけるＥＴＶ４を同定できないため、腫瘍遺伝子発現データのアウトライアープロファイルを注意深く調べて用いることを強調している。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合物の同定と組み合わせると、本明細書に示された結果は、ＡＲＥまたはＴＭＰＲＳＳ２上流のエンハンサーの破壊によってもたらされるＥＴＳファミリーメンバーの調節不全は、前立腺腫瘍形成の顕著な特徴である。
【０２９２】
（実施例３）
遺伝子融合物ＲＮＡの検出
本実施例では、ＡＰＴＩＭＡ製剤試薬を使用した、４つの異なる定性的アッセイにおける４つの遺伝子融合配列：ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１ａ、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１ｂ、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａ、およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧｂ、を含むＲＮＡ（ＩＶＴ）を標的とした捕捉、増幅および定性的検出、ならびに各々を適当な標的特異的なオリゴヌクレオチド、プライマー、およびプローブを加えたＨＰＡ検出について説明する。表５は、アッセイに用いたオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【０２９３】
【表５】
2018019720.tif 000013
Ａ．材料および方法
ＲＮＡ標的捕捉
溶解緩衝液は、１５ｍＭのリン酸ナトリウム一塩基性一水和塩、１５ｍＭのリン酸ナトリウム二塩基性無水物、１．０ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物、１．０ｍＭのＥＧＴＡ遊離酸、および１１０ｍＭのラウリル硫酸リチウムｐＨ６．７を含有した。標的捕捉試薬は、２５０ｍＭのヘペス（ＨＥＰＥＳ）、３１０ｍＭの水酸化リチウム、１．８８Ｍの塩化リチウム、１００ｍＭのＥＤＴＡ遊離酸（ｐＨ６．４）、および２５０μｇ／ｍＬの１ミクロンの、共有結合したオリゴマー（ｄＴ）１４を有するカルボキシレート改変磁性粒子であるＳＥＲＡ−ＭＡＧ  ＭＧ−ＣＭ（Ｓｅｒａｄｙｎ  Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）を含んだ。洗浄液は、１０ｍＭのヘペス、６．５ｍＭの水酸化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）メチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）プロピルパラベン、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）をｐＨ７．５で含有する。
【０２９４】
ＲＮＡ増幅および検出
増幅試薬は、２６．７ｍＭのｒＡＴＰ、５．０ｍＭのｒＣＴＰ、３３．３ｍＭのｒＧＴＰおよび５．０ｍＭのｒＵＴＰ、１２５ｍＭのヘペス、８％（ｗ／ｖ）トレハロース二水和物、１．３３ｍＭのｄＡＴＰ、１．３３ｍＭのｄＣＴＰ、１．３３ｍＭのｄＧＴＰ、および１．３３ｍＭのｄＴＴＰを、ｐＨ７．５で含有する３．６ｍＬの溶液の凍結乾燥させた形態である。この増幅試薬は、９．７ｍＬの増幅試薬再構成溶液（下記参照）中で再構成した。使用前に、各１５ｐｍｏｌのプライマーオリゴマーを加えた。増幅試薬再構成溶液は、０．４％（ｖ／ｖ）エタノール、０．１０％（ｗ／ｖ）メチルパラベン、０．０２％（ｗ／ｖ）プロピルパラベン、３３ｍＭのＫＣｌ、３０．６ｍＭのＭｇＣｌ２、０．００３％フェノールレッドを含んでいた。酵素試薬は、２０ｍＭのヘペス、１２５ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン、０．１ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物、０．２％（ｖ／ｖ）トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）７Ｘ−１００洗浄液、０．２Ｍのトレハロース二水和物、０．９０ＲＴＵ／ｍＬのモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、および０．２０Ｕ／ｍＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをｐＨ７．０で含有する１．４５ｍＬの溶液の凍結乾燥された形態のものである。１単位（ＲＴＵ）の活性を５．７５ｆｍｏｌのｃＤＮＡの３７℃１５分間におけるＭＭＬＶ逆転写酵素およびＴ７
ＲＮＡポリメラーゼに対する合成および遊離と定義し、１単位（Ｕ）の活性を３７℃２０分間での５．０ｆｍｏｌのＲＮＡ転写産物の産生と定義する。酵素試薬を３．６ｍＬの酵素試薬再構成溶液（下記参照）中で再構成した。酵素試薬再構成溶液は、５０ｍＭのヘペス、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）トリトン７Ｘ−１００、１２０ｍＭの塩化カリウム、２０％（ｖ／ｖ）無水グリセリンをｐＨ７．０で含有する。ハイブリダイゼーション試薬は、１００ｍＭのコハク酸遊離酸、２％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、１００ｍＭの水酸化リチウム、１５ｍＭのアルドリチオール−２、１．２Ｍの塩化リチウム、２０ｍＭのＥＤＴＡ遊離酸、３．０％（ｖ／ｖ）エタノールをｐＨ４．７で含有した。選択試薬は、６００ｍＭのホウ酸、１８２．５ｍＭの水酸化ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）トリトン７Ｘ−１００をｐＨ８．５で含有した。この検出試薬は、１ｍＭの硝酸および３２ｍＭの過酸化水素を含有する検出試薬Ｉと１．５Ｍの水酸化ナトリウムを含有する検出試薬ＩＩとを含んだ。
【０２９５】
Ｂ．アッセイプロトコール
標的捕捉
１．反応管１本につき４００μＬの試料に対して示される複製レベルでＩＶＴストック溶液をＳＴＭに希釈することで試料を調製する。
２．連続分注器を用いて、ＴＣＯを有するＴＣＲ１００μＬを適切な反応管に添加する。３．マイクロピペットを用いて各試料４００μＬを加えて、適切に標識する。４．反応管をシーリングカードでカバーして、ラックを緩やかに手で振とうする。ボルテックスしない。ラックを６２±１℃の水浴中で３０±５分間インキュベートする。
５．水浴からラックを取り出し、反応管の底を吸収性材料で拭いて乾かす。
６．シーリングカードがしっかりと固定されていることを確認する。必要に応じて、シーリングカードを新しいものと取替え、しっかりと密封する。
７．シーリングカードを取り外さずに、ラックを室温で３０±５分間インキュベートする。
８．ラックを５〜１０分間ＴＣＳマグネチックベース上に置く。
９．ＡＰＴＩＭＡ洗浄液を分注マニフォールドを通してポンプでくみあげて、分注装置のポンプラインを準備する。ライン中の気泡がなくすべての１０個のノズルが安定な流れの液体を送液するように、ポンプで十分に液体をシステム内に通す。
１０．真空ポンプを始動し、吸引マニフォールドとトラップ瓶の間の第一のコネクターで吸引マニフォールドの接続を切る。真空計の読みが、２５ｉｎ．Ｈｇを超えないようにする。真空計の読みには１５秒かかる可能性がある。マニフォールドを再び接続して、および真空計の読みが７〜１２ｉｎ．Ｈｇの範囲になるようにする。すべての標的捕捉ステップが完了するまで真空ポンプを運転させておく。
１１．吸引マニフォールドを第１セットの先端部にしっかりと取り付ける。先端部が軽く反応管の底に接触するまで、先端部を第１のＴＴＵに下げて、すべての液体を吸引する。先端部を反応管の底に触れたままにしない。
１２．吸引終了後、先端部をもとの先端カセットに外し入れる。各試料専用の先端部を用いて、吸引ステップを残りのＴＴＵについて繰り返す。
１３．分注マニフォールドを各ＴＴＵに配置し、分注装置ポンプを用いて、１．０ｍＬのＡＰＴＩＭＡ洗浄液をＴＴＵの各反応管に送液する。
１４．反応管をシーリングカードで封をし、ラックをＴＣＳから取り除く。マルチチューブボルテックスミキサーで１度ボルテックスする。
１５．ラックをＴＣＳマグネチックベース上に５〜１０分間置く。
１６．すべての液体をステップ１３および１４のように吸引する。
１７．最終吸引の後、ラックをＴＣＳベースから取り出し、目視で反応管を検査してすべての液体が吸引されたかを確認する。液体がまだ見られる場合、ラックをＴＣＳベースに２分間戻して、各検体について先に用いたものと同じ先端部を用いてＴＴＵに対して吸引を繰り返す。
【０２９６】
プライマーアニーリングおよび増幅
１．連続分注器を用いて、分析物特異性プライマーを含有する再構成増幅試薬７５μＬを各反応管に加える。この時点でラック中のすべての反応混合物は赤色となるはずである。２．連続分注器を用いて、２００μＬの油試薬を加える。
３．シーリングカードで反応管に封をし、マルチチューブボルテックスミキサー上でボルテックスする。
４．ラックを水浴中６２±１℃で１０±５分間インキュベートする。
５．ラックを水浴に移し、４２±１℃で５±２分間放置する。
６．ラックを水浴につけたまま、シーリングカードを注意深く取り外し、連続分注器を用いて、２５μＬの再構成酵素試薬を反応混合物の各々に添加する。この段階で、すべての反応は、オレンジ色となっているはずである。
７．直ちに新しいシーリングカードで反応管に封をして水浴から取り出し、ラックを手で緩やかに振とうさせて反応物を混合する。
８．ラックを４２±１℃で６０±１５分間インキュベートする。
【０２９７】
ハイブリダイゼーション
１．増幅前に水浴からラックを取り出し、増幅後領域に移す。分析物特異性プローブを有する再構成したプローブ試薬１００μＬを、連続分注器を用いて加える。すべての反応混合物はこの時点で黄色となっているはずである。
２．反応管をシーリングカードで封をし、マルチチューブボルテックスミキサー上で１０秒間ボルテックスする。
２．ラックを６２±１℃の水浴中で２０±５分間インキュベートする。
３．ラックを水浴から取り出し、室温で５±１分間インキュベートする。
【０２９８】
選択
１．連続分注器を用いて、２５０μＬの選択試薬を各反応管に加える。すべての反応は、この段階で赤色を呈するはずである。
２．反応管をシーリングカードで封をして１０秒間あるいは色が均一になるまでボルテックスし、ラックを６２±１℃の水浴中で１０±１分間インキュベートする。
３．ラックを水浴から取り出す。ラックを室温で１５±３分間インキュベートする。
【０２９９】
ＴＴＵの読取り
１．試験完了に十分な量の自動検出試薬ＩおよびＩＩがあることを確認する。
２．カセット位置番号１に空のＴＴＵを１つ入れてＬＥＡＤＥＲルミノメーターを準備し、ＷＡＳＨプロトコールを行う。
３．ＴＴＵをルミノメーターにロードし、ＨＣ＋ＲｅｖＢプロトコールを実行する。
【０３００】
Ｃ．結果
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１遺伝子融合物ＩＶＴの各々をＴＣＲに添加した４つのアッセイに対する結果を表６〜９に示す。
【０３０１】
【表６】
2018019720.tif 000014
【０３０２】
【表７】
2018019720.tif 000015
【０３０３】
【表８】
2018019720.tif 000016
【０３０４】
【表９】
2018019720.tif 000017
（実施例４）
遺伝子融合物に関するＦＩＳＨ分析
本実施例では、前立腺癌試料２９試料中２３試料がＥＲＧまたはＥＴＶ１に再配列を保持することを実証するための蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の使用について説明する。細胞株実験は、ＴＭＰＲＳＳ２のアンドロゲン応答性プロモーターエレメントが前立腺癌においてＥＴＳファミリーメンバーの過剰発現を介在していることを示唆する。これらの結果は、癌腫の発症および前立腺癌の分子的診断および治療に意味をもつ。
【０３０５】
ＦＩＳＨアッセイに用いた具体的なＢＡＣプローブの一覧を以下に示す。
【０３０６】
ＥＴＳファミリーメンバーにおける異常をＦＩＳＨにより検査するための臨床的ＦＩＳＨ分析
・１つがＥＴＶ１に及び、１つがＴＭＰＲＳＳ２遺伝子座に及ぶプローブを用いたＥＴＶ１−ＴＭＰＲＳＳ２融合物試験
ＥＴＶ１に対するＢＡＣ：ＲＰ１１−６９２Ｌ４
ＴＭＰＲＳＳ２に対するＢＡＣ：ＲＰ１１−１２１Ａ５、（ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＰＲ１１−８１４Ｆ１３、ＲＲ１１−５３５Ｈ１１）
・ｃ−ＥＲＧ：ｔ−ＥＲＧ分断に関する１組のプローブを用いたＥＲＧ転位試験：
ｃ−ＥＲＧに対するＢＡＣ：ＲＰ１１−２４Ａ１１
ｔ−ＥＲＧに対するＢＡＣ：ＲＰ１１−３７２Ｏ１７、ＲＰ１１−１３７Ｊ１３
・１つがＥＴＶ１遺伝子座に及び、１つの基準プローブが第７染色体上にある１組のプローブを用いたＥＴＶ１欠失／増幅試験：
ＥＴＶ１に対するＢＡＣ：ＲＰ１１−６９２Ｌ４
第７染色体上の標準プローブに対するＢＡＣ：ｃｈｒのセントロメア上の市販プローブ・１つがＥＲＧ遺伝子座に及び、１つの基準プローブが第２１染色体上にある１組のプローブを用いたＥＲＧ欠失／増幅試験：
ＥＲＧに対するＢＡＣ：ＲＰ１１−４７６Ｄ１７
第２１染色体上の標準プローブに対するＢＡＣ：＊
・１つがＴＭＰＲＳＳ２遺伝子座に及び、１つの基準プローブが第２１染色体上にある１組のプローブを用いたＴＭＰＲＳＳ２欠失／増幅試験：
ＴＭＰＲＳＳ２に対するＢＡＣ：ＲＰ１１−１２１Ａ５、（ＲＰ１１−１２０Ｃ１７、ＰＲ１１−８１４Ｆ１３、ＲＲ１１−５３５Ｈ１１）
第２１染色体上の基準プローブに対するＢＡＣ：＊
＊第２１染色体上の基準プローブに対するＢＡＣ：ＰＲ１１−３２Ｌ６、ＲＰ１１−７５２Ｍ２３、ＲＰ１１−１１０７Ｈ２１、ＲＰ１１−６３９Ａ７、（ＲＰ１１−１０７７Ｍ２１）
（実施例５）
欠失を伴うＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合物
本実施例では、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合物に伴う、第２１染色体ｑ２２．２〜３上のＥＲＧとＴＭＰＲＳＳ２との間に位置する共通の欠失の存在について説明する。疾患進行と臨床成績との関連を、広い範囲にわたるヒトＰＣＡ試料、６つの細胞株、および１３の異種移植を用いて調べた。
【０３０７】
Ａ．材料および方法
臨床試料
この研究で用いた前立腺試料は、ＩＲＢ認定プロトコールのもとで収集されたものである。すべての臨床的に局在化したＰＣＡ試料を１人の病理学者により特徴付けし、病理報告の際の観察者間の差異を排除するため、グリーソンスコアをつけた。臨床的に局在化したＰＣＡ試料をウルム大学での現在進行中の研究プロトコールの一部として収集した。これらのホルモン抵抗性試料はミシガン大学の迅速剖検プログラムから採取されたものである。
【０３０８】
ＦＩＳＨ実験を、２１４人の患者由来の８９７の組織コア（ヒストスポット）からなる、２つのＰＣＡ予後評価アレイについて行った。患者のデモグラフィックスの概要を表１０に示す。すべての患者が１９８９年から２００１年の間にウルム大学（独国ウルム）にて、骨盤リンパ節切除術を伴う根治的前立腺切除術を受けた。術前ＰＳＡは１から３１４ｎｇ／ｍＬ（平均３６ｎｇ／ｍＬ）の範囲であった。平均および最大追跡期間は、それぞれ３．４および８．４年である。
【０３０９】
細胞株および異種移植片
アンドロゲン非依存性（ＰＣ−３、ＤＵ−１４５、ＨＰＶ１０、および２２Ｒｖ１）、およびアンドロゲン感受性（ＬＮＣａＰ）ＰＣＡ細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入したものであり、限定培地中で維持した。ＨＰＶ１０は、ＨＰＶ１８ＤＮＡ（１８）によるトランスフェクションで形質転換した、高悪性度ＰＣＡ（グリーソンスコア：４＋４＝８）由来の細胞に由来した。２２Ｒｖ１は、性腺摘除誘発性退縮および親のアンドロゲン依存性ＣＷＲ２２異種移植の再発後にマウスにおいて連続的に増殖させた、異種移植に由来するヒトＰＣＡ上皮細胞株である。ＶＣＡＰ細胞株は、ミシガン大学での迅速剖検プログラムの一部として、椎骨転移性病変から得られたものである。
【０３１０】
ＬｕＣａＰ２３．１、３５、７３、７７、８１、８６．２、９２．１、および１０５は、アンドロゲン非依存性ホルモン抵抗性疾患ＰＣＡの患者由来のものである。ＬｕＣａＰ４９および１１５は、アンドロゲン依存ＰＣＡの患者由来のものである。ＬｕＣａＰ５８は、臨床的に進行した転移性疾患を有する未治療の患者由来のものであり、ＬｕＣａＰ９６は、ホルモン抵抗性ＰＣＡを有する患者で増殖する前立腺由来腫瘍から樹立したものである。ＬｕＣａＰ４９（大網腫瘤より樹立）、およびＬｕＣａＰ９３は、ホルモン非感受性（アンドロゲン受容体［ＡＲ］−陰性）小細胞ＰＣＡである。これらの２つの異種移植は、神経内分泌表現型を実証した。ＬｕＣａＰ２３．１はＳＣＩＤマウス内で維持され、およびその他の異種移植は、雄のＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスに腫瘍を移植することで維持される。
【０３１１】
間期ＦＩＳＨを利用したＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合物の決定
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧの転位に関するＦＩＳＨ分析は、本明細書中や過去にも記載がある（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０巻：６４４〜８頁（２００５年））。この分離アッセイを図１１および１４に示す。第２１染色体ｑ２２．２上におけるＥＲＧ再配列を分析するために、それぞれがＥＲＧ遺伝子座の隣接するセントロメアおよびテロメア領域に広がる、ビオチン−１４−ｄＣＴＰ標識ＢＡＣクローンＲＰ１１−２４Ａ１１（最終的にコンジュゲートして赤のシグナルを生成）、およびジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ標識ＢＡＣクローンＲＰ１１−１３７Ｊ１３（最終的にコンジュゲートして緑のシグナルを生成）からなる分離プローブシステムを応用した。すべてのＢＡＣクローンは、ＢＡＣＰＡＣリソースセンター、オークランド研究所小児科病院（ＣＨＯＲＩ）、Ｏａｋｌａｎｄ、ＣＡより入手したものである。
【０３１２】
この分離プローブシステムを利用して、ＥＲＧ再配列を有さない核は、赤と緑の並列した２対のシグナルを示した。赤−緑の並列シグナルは、黄色の融合シグナルを形成する。ＥＲＧ再配列を有する核は、１つの並んだ赤−緑シグナル対の分離が各細胞において、転位された対立遺伝子に対する単一の赤および緑シグナルと非転位対立遺伝子に対する複合した黄色のシグナルを生じることを示している。組織分析の前に、すべてのプローブの完全性と純度を正常な末梢リンパ球の中期スプレッドとのハイブリダイゼーションにより確認した。組織ハイブリダイゼーション、洗浄、および蛍光検出は、過去の記載に基づいて行った（Ｇａｒｒａｗａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３６巻：１１７〜２２頁（２００５年）；Ｒｕｂｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６４巻：３８１４〜２２頁（２００４年））。少なくとも１つのＴＭＡコアを、２つのＴＭＡ由来の５９％のＰＣＡの症例で評価できた。このアッセイの技術的な難点として、評価する診断材料がないこと、弱いプローブシグナル、および正確な診断を妨げる重複細胞が挙げられた。残りの本分析では、評価可能な臨床的に局在化したＰＣＡの１１８の症例に絞った。１５の症例では、同じく評価可能な、対応するホルモン未処理転移性リンパ節試料を有した。
【０３１３】
これらの試料を、適切なフィルターを装備したオリンパスＢＸ−５１蛍光顕微鏡、ＣＣＤ（電荷結合素子）カメラおよびサイトビジョン（ＣｙｔｏＶｉｓｉｏｎ）ＦＩＳＨ撮像および画像取込み用ソフト（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて、１００ｘ油浸対物レンズで観察した。これらの試験の評価は、ともに間期ＦＩＳＨ実験の分析の経験のある病理学者２人により独立に行った。各症例について、１症例につき少なくとも１００個の核を評定するようにした。両病理学者による結果において顕著な差が見られた場合、その症例は、第３の病理学者が審査した。
【０３１４】
オリゴヌクレオチドＳＮＰアレイ分析
ＳＮＰアレイは対立遺伝子の遺伝子型分析を対象としているにもかかわらず、このＳＮＰアレイデータは、異型接合性の損失（Ｌｉｅｂｅｒｆａｒｂら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ
６３巻：４７８１〜５頁（２００３年）；Ｌｉｎら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０巻：１２３３〜４０頁（２００４年））および複製数変化の検出（Ｚｈａｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３巻：４８３〜９５頁（２００３年））に関する情報を提供できる。ＳＮＰアレイ分析を利用すると、黒色腫（ＭＩＴＦ）等の様々な癌における増幅遺伝子を確認および検証することが可能である（Ｇａｒｒａｗａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３６巻：１１７〜２２頁（２００５年））、およびＰＣＡ（ＴＰＤ５２）（Ｒｕｂｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６４巻：３８１４〜２２頁（２００４年））。
【０３１５】
１００Ｋアレイ上でのＳＮＰ検出は、ゲノム表現の減少で開始した。ゲノムＤＮＡの２５０ｎｇの２つの分注液を別々にＸｂａＩ  ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。これらの消化された断片を独立にオリゴヌクレオチドリンカーに連結した。この結果得られる産物を２００〜２０００ｂｐのＰＣＲ断片を増幅する条件下で単一のＰＣＲプライマーを用いて増幅した。これらの断片はゲノムの細分画を示す。これらはそのＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断片内にあるので、アレイ上にタイル張り状に配置したＳＮＰを予備選択し、アレイ上で強く検出されることを確認した。続いて、これらの得られたＤＮＡの増幅プールを標識して断片化し、さらに、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩオリゴヌクレオチドＳＮＰアレイを分離するためハイブリダイゼーションした。
【０３１６】
アレイをジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）スキャナー３０００で走査した。遺伝子型決定（Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｃａｌｌ）およびシグナル定量化を遺伝子操作システム１．１．１およびアフィメトリックス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）ジェノタイピングツールズ２．０ソフトを用いて得た。遺伝子型決定割合が９０％を超えるアレイのみをさらに分析した。生データファイルを呼び処理し、ｄＣｈｉｐＳＮＰ（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０巻：１２３３〜４０頁（２００４年））において描出した。具体的には、予備処理は、一組の不変プローブを用いたベースラインに対するアレイデータの標準化を含み、続く処理でモデルベースの（ＰＭ／ＭＭ）方法（Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８巻：３１〜６頁（２００１年））を利用して、各試料の各ＳＮＰの単一の強度値を得る。
【０３１７】
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合転写産物の定量的ＰＣＲ
ＱＰＣＲをＳＹＢＲグリーン色素（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＭＪリサーチ社のＤＮＡエンジンオプティコン２マシンで行った。総ＲＮＡを、ランダム６量体の存在下でＴＡＱＭＡＮ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。すべてのＱＰＣＲ反応をＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで設計されたものである。Ｔｏｍｌｉｎらが記載し（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０巻：６４４〜８頁（２００５年））、融合物に特異的なプライマー：
【０３１８】
【数１】
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を用いた。
【０３１９】
ＧＡＰＤＨプライマーについては以前に報告されている（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ３巻：ＲＥＳＥＡＲＣＨ００３４（２００２年））。１０μｍｏｌのフォワードおよびリバースプライマーを用い、製造業者の推奨する熱サイクル条件に従って手順を実施した。閾値は、ＱＰＣＲ反応の指数期の間にオプティコンモニター（Ｏｐｔｉｃｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒ）分析ソフト、バージョン２．０２を用いて設定した。各試料について、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対する各標的遺伝子の量を比較閾値サイクル（Ｃｔ）法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓユーザーブルテン＃２）により決定した。すべての反応について融解曲線分析し、選択した実験から得られた生成物を２％アガロースゲル上で電気泳動させて分離した。
【０３２０】
統計
臨床的および病理学的変数を再配列状態および欠失の存在との関連について調べた。χ（カイ）２乗検定およびフィッシャーの正確確率検定を適切に用いた。カプラン−マイヤー分析を、病態についての前立腺特異的な抗原無再発生存曲線とゲノム変化パラメーターを作製するのに用いた。対数順位検定を関連性の統計学的有意性を評価するのに用いた。ネオアジュバントホルモンアブレーション療法の前歴のある患者は排除した。すべての統計をウィンドウズ（登録商標）用ＳＰＳＳ１３．０（ＳＰＳＳ社、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を用いて有意水準０．０５で行った。
【０３２１】
Ｂ．結果
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子再配列と関連した第２１染色体上の欠失の検出
ＰＣＡにおけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列の頻度の特徴付けるために、Ｔｏｍｌｉｎｓらにより記載されたアッセイ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０巻：６４４〜８頁（２００５年））を改変したＦＩＳＨ分析を用いた。当初のＦＩＳＨ分析は、セントロメア３’およびテロメア５’末端のＥＲＧ上に位置する２つのプローブを用いた。この新しいアッセイは、５’プローブをテロメア方向に移動した（図１４）。ＰＣＡスクリーニング組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を用いて、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列（図１１Ａおよび１１Ｂ）を実証するおよそ７０％のＰＣＡが、テロメア５’ＥＲＧプローブ（図１１Ｃおよび１１Ｄ）に対応する緑のシグナルの消失も示すことが観察され、この染色体領域が消失したことを示唆している。１００ＫオリゴヌクレオチドＳＮＰアレイをこれらの欠失の範囲を特徴付けるために用いた。細胞株、異種移植およびホルモン未処理およびホルモン抵抗性転移性ＰＣＡ試料を含む３０のＰＣＡ試料を調べることにより、第２１染色体ｑ２３上のＥＲＧとＴＭＰＲＳＳ２との間のゲノム消失が確認された（図１２Ａ〜Ｃ）。
【０３２２】
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１に関する再配列状態を、これらの３０個のＰＣＡについてのＦＩＳＨおよび／またはｑＰＣＲにより決定した（図１２Ａ、灰色および薄い青色の棒状部）。個別のゲノム喪失が、ＬｕＣａＰ４９、ＬｕＣａＰ９３、ＵＬＭ  ＬＮ１３、ＭＥＴ６−９、ＭＥＴ１８−２、ＭＥＴ２４−２８、およびＭＥＴ２８−２７について、ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧ遺伝子座の間の領域に関わるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列陽性試料で観察された。これらの個別の欠失の範囲は不均一であった。ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧ遺伝子座の間の領域を含む第２１染色体上でのより広範囲のゲノム喪失は、ＬｕＣａＰ３５、ＬｕＣａＰ８６．２、ＬｕＣａＰ９２．１、およびＭＥＴ３−８１において観察された。ＶＣａＰ細胞株および異種移植片ＬｕＣａＰ２３．１は、この領域での喪失を実証しなかった。試料のサブセット４５％（１１試料のうち５試料）については、欠失が、ＥＲＧイントロン３の近くで起こっている。試料の大半６４％（１１試料のうち７試料）では、欠失がＴＭＰＲＳＳ２上に位置するＳＮＰの近辺で終結している（テロメア方向で次のＳＮＰが約１００Ｋｂｐ離れている）。ＶＣａＰ細胞株は、第２１染色体全体にわたり複製数増加を示した。
【０３２３】
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列陽性腫瘍については、７１％（７試料のうち５試料）のホルモン治療不応性ＰＣＡは、ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧ遺伝子座の間の欠失を実証しているのに対し、欠失は２５％（４試料のうち１試料）のホルモン未処理転移性ＰＣＡ試料（ＵＬＭ  ＬＮ１３）でのみ同定された。３８．７６５Ｍｂまたは３８．９１１Ｍｂの欠失の開始点で区別される２つの個別のサブクラスとの欠失境界について、顕著な均一性がある。標準的なＰＣＡ細胞株（ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ、ＤＵ−１４５、またはＣＷＲ２２（２２Ｒｖ１））のいずれもがＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧまたはＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合を実証しなかった。いくつかのＬｕＣａｐ異種移植片には、共にホルモン非感受性（アンドロゲン受容体［ＡＲ］陰性）小細胞ＰＣＡである、ＬｕＣａＰ４９（大網腫瘤から確立）、およびＬｕＣａＰ９３、等の欠失を有するＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合を実証するものもあった。
【０３２４】
ＥＲＧの複製数増加は、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列のある場合とない場合の両方で小サブセットで観察された。ホルモン抵抗性ＰＣＡ由来のＶＣａＰ細胞株は、顕著な複製数増加を第２１染色体上で実証し（図１２Ａ〜Ｃ）、この増加はＦＩＳＨにより確認された。
【０３２５】
原発性前立腺癌試料におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列とホルモン未処理リンパ節転移
これらの観察についての頻度および潜在的臨床意義を特徴付けるため、１１８の臨床的に局在化したＰＣＡの症例をＦＩＳＨにより調べた。これらの臨床的および病理学的デモグラフィックスを表１０に示す。患者のコホートは、高腫瘍悪性度（グリーソン評価）、病態の段階、および予備治療ＰＳＡレベルにより実証される疾患再発のリスクが高い。ＰＣＡの大きな領域が微視的に調べることのできる、このコホート由来の標準的な組織切片を用いると、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列は所与の腫瘍について均一に観察された。ＴＭＡ実験によりこれらの観察を確認した。３〜６のコアが腫瘍の異なる領域から得られたＰＣＡの症例では、１００％の一致がＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列状態（すなわち、存在または非存在）について観察された。欠失を伴うＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列の場合、９７．９％（９４／９６）の症例で欠失が同じ患者由来のすべてのＴＭＡコアで観察された。
【０３２６】
【表１０−１】
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【０３２７】
【表１０−２】
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ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列を原発性ＰＣＡ試料の４９．２％およびホルモン未処理転移性ＬＮ試料の４１．２％で確認した（図１３Ａ）。テロメアプローブの欠失（緑シグナル）（図１Ｃ〜Ｄ）を原発性ＰＣＡ試料の６０．３％（３５／５８）およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列を有するホルモン未処理リンパ節腫瘍の４２．９％（３／７）で観察した。
【０３２８】
整合した原発性およびホルモン未処理リンパ節腫瘍のあった１５症例においては、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列状態は、再配列を示す対のうちの４７％（１５症例のうちの７症例）と１００％の一致があった。テロメア（緑シグナル）プローブの欠失は４２．９％（７症例のうち３症例）の対で一致して見られた。
【０３２９】
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列状態および前立腺癌の進行
再配列状態と臨床的および病理学的変数との関連を観察した（図１３）。欠失を有するＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列は、進行した腫瘍段階（ｐＴ）（ｐ＝０．０３）（図１３Ｂ）および局所骨盤リンパ節への転移性疾患の存在（ｐＮ０対ｐＮ１−２）（ｐ＝０．０２）を有するＰＣＡの症例でより高い割合で観察された。欠失を伴うまたは伴わないＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列と、経過観察データのある７０人の患者についての前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）生化学的欠陥により決定された臨床成績との関連性も評価した。グリーソン評価、腫瘍段階、核グレード、およびリンパ節状態は、ＰＳＡ生化学的欠陥値（すべてのｐ値＜０．０００５）の良好な予測因子である。ＦＩＳＨアッセイにより決定された欠失のないＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列ＰＣＡの症例におけるＰＳＡ無再発延命効果を示唆する傾向が一変量レベルで観察された。
【０３３０】
（実施例６）
致死性前立腺癌に関連するＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合物
以前の研究において、ＥＲＧ（２１ｑ２２．２）、ＥＴＶ１（７ｐ２１．２）（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０巻：６４４〜８頁（２００５年））、またはＥＴＶ４（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６６巻（７号）：３３９６〜４００頁（２００６年））のいずれかであるＥＴＳ転写因子ファミリーメンバーとのＴＭＰＲＳＳ２（２１ｑ２２．３）の５’非翻訳領域の遺伝子融合は、大多数の前立腺癌におけるＥＴＳ遺伝子の過剰発現に関する機構を与える。さらに、アンドロゲン制御遺伝子であるＴＭＰＲＳＳ２、および癌遺伝子の融合は、疾患の進行がこれらの分子のサブタイプに基づいて変動し得る可能性を示唆している。遺伝子融合に関して最もよくある機構は、ＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧの間の約２．８メガベースのゲノムＤＮＡの喪失である（図１７ＡおよびＢ）。この実施例は、通常のＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合物の存在に基づく転移または前立腺癌特異的な死亡のリスクについて説明する。
【０３３１】
Ａ．方法
本治験対照母集団は、Ａｎｄｒｅｎらの文献（Ｊ．  Ｕｒｏｌ．  １７５巻（４号）１３３７〜４０頁（２００６年））に記載の症候性良性前立腺肥大に対する経尿道的前立腺切除術（ＴＵＲＰ）または経膀胱腺腫核摘出により、１９７７年から１９９１年の間にスウェーデンのオレブロ大学病院で診断された初期の前立腺癌（Ｔ１ａ−ｂ、Ｎｘ、Ｍ０）を有する男性からなる。診断でのベースライン評価として、物理的検査、胸部Ｘ線、骨スキャンおよび骨格Ｘ線検査（必要に応じて）を行った。リンパ節転移段階評価は行わなかった。この評価では遠隔転移の証拠が示されなかったので、患者は診断後最初の２年間は６カ月毎そしてその後１２カ月毎に治験、臨床検査および骨スキャンを受けることとした。骨スキャンによる決定で転移のあった患者は、症状のあった場合、アンドロゲン欠乏療法で治療した。
【０３３２】
このコホートにおける死亡原因を、研究調査員による医療記録を調べて決定した。スウェーデン死亡記録（Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｄｅａｔｈ  Ｒｅｇｉｓｔｅｒ）と比較した死亡原因に関する検証研究は、９０％を超える一致を示し、いずれの死亡原因についても系統的な過小または過剰報告がなかった（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｌａｎｃｅｔ  １巻（８６４２号）：７９９〜８０３頁（１９８９年））。死亡率についてのコホートの追跡調査は１００％であり、いずれの患者についても２００５年１０月まで追跡できた。本研究の終了点は、遠隔転移の進行または前立腺癌所定の死亡として定義した（追跡時間のメジアンは９．１年であり、最大２７年）。
【０３３３】
すべてのＴＵＲＰ試料について、過去に報告されたように（Ｊ．Ｕｒｏｌ．１７５巻（４号）：１３３７〜４０頁（２００６年））、前立腺癌の診断確認、グリーソンスコアおよび核グレードの決定、および腫瘍量の評価を１人の病理学者により再調査した。組織マイクロアレイを、マニュアル式のアレイヤー（Ｒｕｂｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．  １４巻（６号）：１４２４〜３２頁（２００５年））を用いて組み立てた。前立腺癌におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ再配列の頻度をＴｏｍｌｉｎｓらによりもともと報告されたアッセイ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０巻：６４４〜８頁（２００５年））から生まれた改変蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを利用して評価した。この新しいアッセイは５’プローブをテロメア方向におよそ６００ｋｂ動かした。少なくとも１つのＴＭＡコアを９２の前立腺癌の症例で評価することができた。
【０３３４】
Ｂ．結果
局在化した癌を診断された男性のこの集団ベースのコホートにおいて、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合の頻度は１５．２％（１４／９２）であった（図１７ＡおよびＢ）。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合陽性腫瘍は、より高いグリーソンスコア（両側Ｐ＝．０１４）を有する可能性が高い（表１１）。融合状態と致死性前立腺癌の関係を評価するために、累積罹患率回帰を用いた。累積罹患率（ＣＩＲ）が３．６（Ｐ＝．００４、９５％信頼区間［ＣＩ］＝１．５〜８．９）である、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合物の存在と転移または疾患特有の死亡との顕著な関連が観察された（図１７Ｃ）。グリーソンスコアを調節した場合、ＣＩＲは２．４であった（Ｐ＝．０７および９５％ＣＩ＝０．９〜６．１）。本発明は特定の機構に限定されるものではない。実際、機構を理解することは、本発明を実施するのに必要ではない。にもかかわらず、所与の細胞腫瘍の細胞内でのＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ遺伝子融合物の均一性および侵襲性前立腺癌のみにおけるその存在（前立腺上皮内腫瘍と比べた場合に）に基づいて、このことは、グリーソンパターンの表現型の影にひそむ生物学に一部寄与する初期の現象であると考えられていた。
【０３３５】
【表１１−１】
2018019720.tif 000021
【０３３６】
【表１１−２】
2018019720.tif 000022
＊ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合物を有する被験体とＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合物を持たない被験体の臨床用パラメーターを、連続変数およびカテゴリー変数のそれぞれについてｔ検定またはχ２乗検定を用いることで比較した。
【０３３７】
＊＊グリーソンスコアは、優勢型グリーソンパターンおよび劣勢型グリーソンパターンを加算することで得た。
【０３３８】
＊＊＊１つの症例について、核グレードは評価しなかった。
【０３３９】
＊＊＊＊２００５年１０月の時点で少なくとも１２年間生存し、転移を発生させなかったあるいは前立腺癌で死亡しなかった個人を長期生存者に分類した。１２年未満の期間生存しおよび転移を発生させなかった個人を短期生存者に分類した。
【０３４０】
（実施例７）
前立腺癌患者の尿中のＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳ融合物の検出
Ａ．材料および方法
尿採取、ＲＮＡ単離および増幅
尿試料は、針生検または根治的前立腺切除術の前に、直腸診後患者から採取した。尿は、ＤＮＡ／ＲＮＡ保存料を含む尿採取用のカップ（Ｓｉｅｒｒａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）への排尿により採取した。ＲＮＡの単離には、少なくとも３０ｍＬの尿を４℃で１５分間４００ｒｐｍで遠心分離した。ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）を尿沈渣に添加し、ＲＮＡが単離するまで、−２０℃で保存した。総ＲＮＡを、キアゲン社のＲＮイージーマイクロキットを製造業者の使用説明書に従って使用して単離した。総ＲＮＡを、オムニプレックス全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）キット（Ｒｕｂｉｃｏｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を製造業者の使用説明書に従って（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ８巻：１５３頁［２００６年］）用いて増幅した。２５ｎｇの総ＲＮＡをＷＴＡライブラリー合成に用い、ｃＤＮＡライブラリーについてＷＴＡ  ＰＣＲ増幅を１回行った。増幅産物をキアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット（キアゲン社）を用いて精製した。概念実験の細胞株証明として、記載数のＶＣａＰまたはＬＮＣａＰ細胞を１ｍＬの滅菌尿中に添加し、これらの試料を排尿採取尿として処理した。
【０３４１】
定量的ＰＣＲ
定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を、本質的に記載される（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ８巻：１５３頁［２００６年］、Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０巻：６４４頁［２００５年］、および上記実施例１）ように、ＷＴＡ増幅ｃＤＮＡ由来のＥＲＧ、ＥＴＶ１およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ転写産物を検出するのに用いた。各ＱＰＣＲ反応について、１０ｎｇのＷＴＡ増幅ｃＤＮＡを鋳型として用いた。ＥＲＧ、ＥＴＶ１、ＰＳＡ、およびＧＡＰＤＨの反応には、２×パワーＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および２５ｎｇのフォワードおよびリバースプライマーを用いた。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａの反応には、２×タックマンユニバーサルＰＣＲマスターミックスおよび最終濃度９００ｎＭのフォワードおよびリバースプライマー、および２５０ｎＭのプローブを用いた。タックマンアッセイでは、３８サイクルを超えるＣｔ値を有する試料は、増幅を示さないと考えた。すべての試料について、ＥＲＧとＥＴＶ１の量は、ＧＡＰＤＨの量に基準化した。尿中の前立腺細胞の乏しい回復を示すＰＳＡの不適切な増幅の試料は、さらなる分析から排除した。ＥＲＧ（エクソン５  ６フォワード）とＥＴＶ１（エクソン６＿７）２、ＧＡＰＤＨ３、およびＰＳＡ４プライマーは記載の通りである。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａに対して特異的なタックマンプライマーおよびプローブ（ＭＧＢ標識）は、以下の通りである：
【０３４２】
【数２】
2018019720.tif 000023
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
整合する針生検から得た、厚さ４μｍのホルマリン固定したパラフィン包理（ＦＦＰＥ）切片を間期蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に用い、既述のように（実施例２およびＴｏｍｌｉｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６巻：３３９６頁［２００６年］）、処理およびハイブリダイゼーションした。ＥＲＧ再配列検出用のＢＡＣプローブである、ＲＰ１１−９５Ｉ２１（ＥＲＧに対して５’側）およびＲＰ１１−４７６Ｄ１７（ＥＲＧに対して３’側）を既述のように調製した（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６巻：３３９６頁［２００６年］；Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
３１０巻：６４４頁［２００５年］；上記実施例１および２）。
【０３４３】
Ｂ．結果
本実施例では、直腸診後の尿に排泄された前立腺癌細胞内のＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳ融合転写産物の存在により前立腺癌を検出する非侵襲性方法について記載する。結果を図３３に示す。概念の証拠として、高レベルのＥＲＧおよびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ（ＶＣａＰ）または高レベルのＥＴＶ１（ＬＮＣａＰ）を発現する前立腺癌細胞株を添加した滅菌尿を用いた。図３３Ａに示すように、１，６００細胞でＶＣａＰ中に排他的に過剰発現したＥＲＧと１６，０００細胞でＬＮＣａＰ中に排他的に過剰発現したＥＴＶ１を定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）により検出することができる。
【０３４４】
添加したＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ細胞の数をＧＡＰＤＨ  Ｃｔ（閾値サイクル）値に相関させることにより、いくつかの症例では、直腸診後に患者から採取した尿は、ＥＲＧまたはＥＴＶ１過剰発現を確実に検出するには不十分な細胞数を含有していたことが観察された。したがって、前立腺癌の疑いのある患者の尿から採取した総ＲＮＡをＱＰＣＲ分析の前にオムニプレックス全トランスクリプトーム増幅（ＯｍｎｉＰｌｅｘ  Ｗｈｏｌｅ
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により増幅した。この手法を利用して、前立腺癌を検出するために直腸診後で針生検前に尿を採取した、１６人の患者のコホートを評価した。続いて行った針生検の評価は、このコホートでは、４人の患者が良性前立腺を有し、１人は高悪性度前立腺上皮内腫瘍（ＨＧＰＩＮ）を有し、そして１１人が前立腺癌を有していたことを実証した。さらに、直腸診後で根治的前立腺切除術前に尿を採取した、３人の前立腺患者のコホートを評価した。
【０３４５】
コホートの特徴を表１２に示す。各尿試料は、固有の患者から得たものであり、認識番号を有する。試料入手源（生検前または根治的前立腺切除術（ＲＰ））を示している。針生検後の診断（良性、高悪性度前立腺上皮内腫瘍（ＨＧＰＩＮ）、および前立腺癌（ＰＣａ）等）を示している。針生検後に前立腺癌と診断された患者については、優勢型グリーソン、劣勢型グリーソン、およびグリーソン合計スコアを示している。すべての患者について、可能なものについては生検前ＰＳＡ（ｎｇ／ｍＬ）および年齢を報告している。
【０３４６】
【表１２−１】
2018019720.tif 000024
【０３４７】
【表１２−２】
2018019720.tif 000025
前記針生検コホートから、５人の患者がＥＲＧの著しい過剰発現を有することが確認され、そのうち１人は針生検でＨＧＰＩＮを有すると診断され、その他の４人は前立腺癌を有すると診断された。前記根治的前立腺切除術コホートからは、前立腺癌を有する３人のうち１人の患者は、高ＥＲＧ発現を有することが確認された（図３３Ｂ）。ＥＴＶ１過剰発現は、いずれのコホートの患者からも検出されなかった。ＥＲＧを過剰発現した試料中のＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧの発現を確認するため、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａを特異的に増幅するように設計されたタックマンプライマー／プローブアッセイを利用した。このアッセイは、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａを発現するＶＣａＰ細胞からの産物を強力に増幅する（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０巻：６４４頁［２００５年］）。さらにまた、ＥＲＧを過剰発現した前立腺癌を有する患者由来の尿試料の６つのうち５つがＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａ（Ｃｔ値：２９．８〜３８．９）も発現したのに対し、ＥＲＧ過剰発現なしの患者の１０試料のうち、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａを発現したものは無かった。１つの試料はＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａの発現なくＥＲＧを過剰発現したので、この試料は、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧｂまたはより最近同定された融合転写産物（Ｓｏｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ４５巻：７１７頁［２００６年］；Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ８巻：４６５頁：２００６年）等の融合転写産物のその他のアイソフォームを発現しているようである。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合転写産物の存在がＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ陽性癌性組織の存在を示すことを確認するため、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を、代表的な症例より得た整合した組織切片上でＥＲＧ配列を検出するように設計されたプローブを用いて実施した。整合した組織は、検出可能なＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ転写産物を尿中に有し癌と診断された３人の患者から得たものであり、１人は検出可能なＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ転写産物を尿中に含有し、高悪性度のＰＩＮと診断され、そして２人の患者は検出可能なＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ転写産物を持たず癌と診断されている。図３３Ｂに示すように、癌と診断されたが検出可能なＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ転写産物を自身の尿に含有しない患者の両人は、ＦＩＳＨでは癌性組織中のＥＲＧ再配列を有さなかった。癌と診断されかつ検出可能なＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ転写産物を自身の尿中に含有する３人の患者はすべて、癌性組織中のＥＲＧ再配列もＦＩＳＨにより示した。最後に、高悪性度ＰＩＮと診断され、検出可能なＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧを自身の尿に有する患者は、高悪性度ＰＩＮ組織中にＥＲＧ再配列を示さなかった。このことは、この患者が前立腺のどこかに未診断の癌を有しているかもしれず、このためこれらの尿中に検出可能なＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ転写産物が存在することになったことを示している。
【０３４８】
（実施例８）
前立腺癌におけるＴＭＰＲＳＳ２とＥＴＳファミリー遺伝子の融合
本検討では、臨床的に局在化した前立腺癌を手術により治療したアメリカ人男性１１１人からなるスクリーニングベースのコホートにおける、ＴＭＰＲＳＳ２とＥＴＳファミリー遺伝子の再配列の頻度に関する包括的な分析について記載する。
【０３４９】
Ａ．材料および方法
治験対象母集団、臨床的データ、および前立腺試料の収集
臨床的に局在化した前立腺癌の供給源として、癌を示す組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）含有コアおよび良性組織を、ミシガン大学で初期単独治療（すなわち、アジュバントまたはネオアジュバントの無いホルモンまたは放射線療法）として根治的前立腺切除術を受けた１１１人の男性から構築した。根治的前立腺切除術系列は、ミシガン大学前立腺癌専門優良研究プログラム（ＳＰＯＲＥ）組織コアの一部である。ＴＭＡを構築するため、３つのコア（直径０．６ｍｍ）を各代表組織ブロックから取り出した。ＴＭＡ構築プロトコールについては、文献（Ｋｏｎｏｎｅｎら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ４巻：８４４頁［１９９８年］；Ｒｕｂｉｎら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ２６巻：３１２頁［２００２年］）に記載されている。詳細な臨床的、病理学的、およびＴＭＡデータは、既述の確実な関連データベースに保存されている（Ｍａｎｌｅｙら、Ａｍ  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １５９巻：８３７頁［２００１年］）。
【０３５０】
間期蛍光インサイチュハイブリダイゼーションアッセイを利用したＴＭＰＲＳＳ２−ＥＴＳ遺伝子融合の評価
厚さ４μｍの組織マイクロアレイ切片を、間期蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に用い、既述のように処理およびハイブリダイゼーションした（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０巻：６４４頁［２００５年］；Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６巻：３３９６頁［２００６年］）。スライドをＡｘｉｏｐｌａｎイメージングＺ１顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて観察し、メタアファー（Ｍｅｔａｆｅｒ）イメージ分析システム（Ｍｅｔａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｌｔｌｕｓｓｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でアイシス（ＩＳＩＳ）ソフトウェアシステムを利用し、ＣＣＤカメラで撮像した。形態学的に無傷のおよび非オーバーラップ核の状態で、ＦＩＳＨシグナルを病理学者により手作業で評価し（１００ｘ油浸）、１つ症例からの３つのコアにある少なくとも３０細胞または最大数の癌細胞を記録した。３０個の評価可能な細胞のない症例は、不十分なハイブリダイゼーションとして報告した。すべてのＢＡＣは、ＢＡＣＰＡＣ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｏａｋｌａｎｄ、ＣＡ）から入手し、プローブ位置は、正常な末梢リンパ球の中期スプレッドとのハイブリダイゼーションにより検証した。ＴＭＰＲＳＳ２、ＥＲＧ、およびＥＴＶ４再配列の検出については、以下のプローブを用いた。すなわち、ＲＰ１１−３５Ｃ４（ＴＭＰＲＳＳ２に対して５’側）、およびＲＰ１１−１２０Ｃ１７（ＴＭＰＲＳＳ２に対して３’側）、ＲＰ１１−９５Ｉ２１（ＥＲＧに対して５’側）、およびＲＰ１１−４７６Ｄ１７（ＥＲＧに対して３’側）、およびＲＰ１１−１００Ｅ５（ＥＴＶ４に対して５’側）、およびＲＰ１１−４３６Ｊ４（ＥＴＶ４に対して３’側）。ＴＭＰＳＳ２−ＥＴＶ１融合物の検出については、ＲＰ１１−３５Ｃ４（ＴＭＰＲＳＳ２に対して５’側）をＲＰ１１−１２４Ｌ２２（ＥＴＶ１に対して３’側）と共に用いた。ＢＡＣ  ＤＮＡをＱＩＡフィルターマキシプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて単離し、プローブをジゴキシゲニン−またはビオチンニックトランスレーションミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて合成した。ジゴキシゲニンおよびビオチン標識されたプローブを、フルオレセインをコンジュゲートしたジゴキシゲニン抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、およびＡｌｅｘａ５９４をコンジュゲートしたストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）をそれぞれ用いて検出した。
【０３５１】
分断（ＴＭＰＲＳＳ２、ＥＲＧ、ＥＴＶ４）または融合（ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＴＶ１）プローブ手法を染色体レベルでの再配列を検出するために用いた。ＤＡＰＩ染色核におけるＴＭＰＲＳＳ２、ＥＲＧ、およびＥＴＶ４についての正常なシグナルを、２対の共存した緑および赤のシグナルにより示した。これらのプローブについて、再配列をこの２つの共存したシグナルの１つを分離することで確認した。ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＴＶ１融合物については、２対の赤と緑の分離シグナルを正常値として記録し、１対の分離シグナルと１対の共存したシグナルを再配列として記録した。
【０３５２】
Ｂ．結果と考察
本実施例では、臨床的に局在化した前立腺癌を外科的に処置したアメリカ人男性の大きなスクリーニングベースのコホートにおけるＴＭＰＲＳＳ２とＥＴＳ転写因子遺伝子再配列のシグネチャーの概要を描く包括的な分析について説明する。ＴＭＰＲＳＳ２分断プローブＦＩＳＨ分析アプローチを、図３４に示すように、公知のＥＴＳファミリーパートナーであるＥＲＧ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４とその他の未知のパートナーを有する前立腺癌における遺伝子再配列の全体的な頻度を検出するのに用いた。３つの公知のＥＴＳパートナー（ＥＲＧ、ＥＴＶ１、およびＥＴＶ４）に対して陰性である前立腺癌は、その他のＥＴＳファミリーメンバーに関わる再配列を有している可能性があると仮定した。これらの結果は、臨床的に局在化した前立腺癌におけるＴＭＰＲＳＳとＥＴＳファミリー遺伝子再配列が、複合分子シグネチャーを示した（図３５ＡおよびＢ）。全体的なＴＭＰＲＳＳ２が評価可能な症例の６５％で再配列したのに対し、ＥＲＧ、ＥＴＶ１およびＥＴＶ４が評価可能な症例の５５％、２％および２％で再配列した（図３５Ａ）。ＴＭＰＲＳＳ２再配列を有する症例の４０．５％において、３’プローブの損失が観察され、これは遺伝子融合の機構としてのＴＭＰＲＳＳ２とＥＲＧとの間の染色体欠失と一致している。これらの結果は、前立腺癌における高頻度のＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳ融合を確認し、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧがきわめて共通の型であることを示す過去の研究を立証している（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０巻：６４４頁；Ｐｅｒｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６巻：３３９６頁［２００６年］；Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ８巻：４６６５頁［２００６年］；Ｓｏｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ４５巻：７１７頁［２００６年］；Ｗａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６巻：８３４７頁［２００６年］および上述の実施例）。
【０３５３】
同様の結果は、すべての４つのプローブが評価可能であったこれらの症例のみに（図３５ＡおよびＢ）コホートが限られる場合に、観察された。いずれの症例も複数のＥＴＳファミリーメンバーの再配列を示さなかったので、本分析でＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＳ再配列が相互排他的であることが確認された。ＥＲＧ、ＥＴＶ１またはＥＴＶ４再配列を有する２４症例のうち２３症例がＴＭＰＲＳＳ２アッセイにより検出されたので、本分析が単一のＴＭＰＲＳＳ２アッセイがほぼすべてのＥＴＳ再配列を効果的に検出できることも実証した。５’ＥＲＧプローブが消失したすべての９つの症例において、３’ＴＭＰＲＳＳ２プローブの欠失が同定された。
【０３５４】
さらに、ＴＭＰＲＳＳ２プローブの分断により２つの症例が同定され、これは、ＥＲＧ、ＥＴＶ１またはＥＴＶ４の再配列を伴わない再配列（症例３２および３６）、ならびにＴＭＰＲＳＳ２再配列を有するがＥＲＧ再配列を有さず、ＥＴＶ１および／またはＥＴＶ４が評価できなかった症例を示した。これらの症例は、前立腺において、ＴＭＰＲＳＳ２が、新規ＥＴＳファミリーメンバーまたは関係のない癌遺伝子と対を作ることを示している。これらのことから、これらの結果は、単一のＴＭＰＲＳＳ２アッセイが前立腺癌における診断および予後の情報を与えることができることを示唆している。
【０３５５】
（実施例９）
ＰＳＡ遺伝子融合
ＦＩＳＨ実験を、ＰＳＡに対し５’および３’に位置するプローブについて分断シグナルを示す症例をＦＩＳＨにより同定するために用いた。ＰＳＡ分断を検出するのに用いた５’および３’ＢＡＣはそれぞれＲＰ１１−５１０Ｉ１６およびＲＰ１１−２６Ｐ１４である。ＰＳＡ遺伝子融合についてのパートナーはいまだ同定されていない。これらの同じプローブは、ＰＳＡのごく近傍に位置しているため、ＥＴＳファミリーメンバーＳＰＩＢ内の分断もとらえる。
【０３５６】
（実施例１０）
ＦＬＩ１過剰発現
ＦＬＩ１発現を、ＦＬＩ１遺伝子融合を有していない異なる細胞試料で評価した。ＦＬＩ１の５’および３’エクソン発現を高ＦＬＩ１発現を有する症例から測定した。結果を図１８に示す。５’および３’転写産物の存在量に差異は検出されなかった。ＲＡＣＥでも融合転写産物を示さなかった。ＦＬＩ１は、対照試料と比較して前立腺癌において過剰発現された。Ｆｌｉ１増幅のためのプライマーを、タックマンプローブと共に図３７に示す。
【０３５７】
ＦＩＳＨを、再配列を示すＦＬＩ１についての分断シグナルを有する試料を同定するのに用いたが、これらの症例は、ＦＩＳＨによるＴＭＰＲＳＳ２：ＦＬＩ１融合物を有していない。ＢＡＣプローブを表１３に示す。これらの症例は、高ＦＬＩ１発現も有する。
【０３５８】
（実施例１１）
組織マイクロアレイ
組織マイクロアレイを遺伝子融合物の存在についての分析に使用した。用いたＴＭＡは、前立腺癌進行アレイ，前立腺癌予後評価アレイ、温式生検アレイ，前立腺癌スクリーニングアレイ、Ｅｒｇ陰性前立腺癌アレイ、および個々の前立腺癌の症例である。以下の遺伝子プローブを組織マイクロアレイ上で使用した。すなわち、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＴＶ１融合プローブ、Ｅｒｇ分断プローブ、ＴＭＰＲＳＳ２分断プローブ、ＥＴＶ１分断プローブ、ＥＴＶ４分断プローブ、およびＦＬ１分断プローブを使用した。
【０３５９】
さらに、Ｅｒｇ分断プローブを予後評価アレイ上に用いた。これらの結果は以下の通りである。すなわち、陰性の症例：３０、陽性の症例：２９、境界の症例：１。Ｅｒｇ陽性の症例の比較的高いグリーソンスコア（≧７）との関連は低かった。
【０３６０】
タンパク質アレイおよび質量分析をＥＲＧ２についての核相互作用因子を同定するのに使用した。これらの結果を図２１に示す。
【０３６１】
（実施例１２）
Ｅｒｇ発現のアンドロゲン制御  本実施例では、Ｅｒｇ発現のアンドロゲン制御について記載する。ＬＮＣａｐ（ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ−）、およびＶＣａＰ（ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ＋）細胞株を用いた。これらの細胞を異なる量のＲ１８８１と４８時間接触させた。Ｅｒｇ、ＰＳＡ（＋（陽性）対照）、およびβ−チューブリン（−（陰性）対照）の発現を評価した。これらの結果を図１９に示す。ＥＲＧ発現は、ＶＣａＰにおいてはアンドロゲン依存であるが、ＬＮＣａｐ細胞ではアンドロゲン依存ではないことが分かった。
【０３６２】
（実施例１３）
ペプチド抗体およびアクアプローブの作製
図２２〜２５は、ペプチド抗体作製およびアクアプローブの作製における使用のためのＥＲＧ１、ＥＴＶ１、ＦＬＩ−１、およびＥＴＶ４の配列（下線部）を示す。プライマーは、すべてのＥＴＳファミリーメンバー用にＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより設計されたものである。発現を前立腺癌の症例においてモニターし、高発現は、可能な遺伝子融合の指標およびＦＩＳＨのための指標である。
【０３６３】
（実施例１４）
ＬｎＣａＰ細胞におけるＥＴＶ１
本実施例では、ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰにおけるアンドロゲンに対する転写応答の分析について記載する。ＰＳＡ等の両細胞株で異なって発現された転写産物の数を検出することに加え、ＶＣａＰまたはＬＮＣａＰ細胞において独自に調節不全な転写産物の数も同定した。本分析は、ＥＴＶ１がＬＮＣａＰ細胞内でアンドロゲンに対し排他的に応答性を示すことを立証した。ＬＮＣａＰ細胞におけるＥＴＶ１の過剰発現と合わせて、ＦＩＳＨをＬＮＣａＰ細胞におけるＥＴＶ１遺伝子座を調べるのに用いた。
【０３６４】
Ａ．材料および方法
細胞株
前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（リンパ節前立腺癌転移由来）、およびＶＣａＰ（Ｋｏｒｅｎｃｈｕｋ，  Ｓ．ら、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  １５巻、１６３〜８頁（２００１年））（椎骨前立腺癌転移由来）を本検討に用いた。マイクロアレイ研究については、ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ細胞を、０．１％エタノール、またはエタノールに溶解した１ｎＭの合成アンドロゲンメチルトリエノロン（Ｒ１８８１、ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いた４８時間の処理の前に、活性炭処理済血清含有培地中で２４時間増殖させた。定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）研究に関しては、細胞の増殖を、活性炭処理済血清含有培地中で２４時間、０．１％エタノール、アセトンに溶解したカソデックス（Ｃａｓｏｄｅｘ）（１０μＭ、ビカルタミド、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）またはエタノールに溶解したフルタミド（１０μＭ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と共に予備インキュベートして行った。２時間後、０．１％エタノールまたは０．５ｎＭのＲ１８８１を添加し、細胞を４８時間後に回収した。総ＲＮＡをすべての試料から製造業者の使用説明書に従ってトリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて単離した。ＲＮＡ完全性を、変性ホルムアルデヒドゲル電気泳動またはＡｇｉｌｅｎｔのバイオアナライザー２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）により確認した。
【０３６５】
マイクロアレイ分析
本検討で用いたｃＤＮＡマイクロアレイは、アレイが３２，４４８の特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）を含むこと意外は、本質的に既述のように構築した。アレイのプリントおよび後処理のためのプロトコールは、インターネット上で入手できる。ｃＤＮＡマイクロアレイ分析を基本的に既述のように行った。要約すると、対照およびＲ１８８１で処理したＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ細胞株由来の総ＲＮＡを逆転写し、ｃｙ５蛍光色素で標識した。対照ＶＣａＰまたはＬＮＣａＰ試料から得たプールした総ＲＮＡを逆転写し、それぞれの細胞株由来のすべてのハイブリダイゼーションに対してｃｙ３蛍光色素で標識した。その後、標識産物を混合し、ｃＤＮＡアレイとハイブリダイゼーションした。イメージを、Ｇｅｎｅｐｉｘソフトウェアパッケージ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ、Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用い、フラグ付けおよび標準化した。データをアレイ単位でメジアンを中心にし、試料の少なくとも８０％に存在する発現値を有した遺伝子のみを本分析に用いた。
【０３６６】
定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）
ＱＰＣＲを文献（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６巻、３３９６〜４００頁（２００６年）；Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０巻、６４４〜８頁（２００５年））に記載のように、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）でＳＹＢＲグリーンの色素を用いて行った。各試料のハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対する各標的遺伝子の量を報告した。各細胞株および／または実験における標的遺伝子の相対量は、対照に対し較正した。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）により合成されたものである。ＧＡＰＤＨ（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ３巻、ＲＥＳＥＡＲＣＨ００３４（２００２年））、ＰＳＡ（Ｓｐｅｃｈｔら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５８巻、４１９〜２９頁（２００１年））、ＥＲＧ（エクソン５−６＿ｆおよびエクソン５−６＿ｒ）およびＥＴＶ１（エクソン６−７＿ｆおよびエクソン６−７＿ｒ）、プライマー（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０巻、６４４〜８頁（２００５年））は、記載の通りである。
【０３６７】
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
中期スプレッドを、標準的な手法により、正常な末梢リンパ球（ＮＰＬｓ）およびＬＮＣａＰ細胞から調製した。スライドを、２倍濃度のＳＳＣで２分間、７０％エタノールで２分間、そしてプローブの添加前に１００％エタノールで２分間処理した。スライドをカバースリップでカバーし、７５℃で２分間インキュベートし、そして一晩３７℃でハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション後の洗浄を２倍濃度のＳＳＣで４２℃にて５分間行い、その後ＰＢＳＴ中で３回洗浄した。蛍光検出を、フルオレセインにコンジュゲートした抗ジゴキシゲニン（ロシュアプライドサイエンス社、インディアナ州インディアナポリス）およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４にコンジュゲートしたストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて実施した。スライドを対比染色し、ＤＡＰＩ含有ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ退色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中においた。スライドをツァイスＡｘｉｏ  ＩｍａｇｅｒＺ１蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）を用いて観察し、ＩＳＩＳソフトウェア（Ｍｅｔａｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｌｔｌｕｓｓｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＣＣＤカメラで撮像した。
【０３６８】
いずれのＢＡＣもＢＡＣＰＡＣリソースセンター（Ｏａｋｌａｎｄ、ＣＡ）より入手したものであり、プローブ位置を正常な末梢リンパ球の中期スプレッドとのハイブリダイゼーションにより確認した。第７染色体ｐ上のＥＴＶ１領域とのハイブリダイゼーションのために、４つのＢＡＣ（テロメアからセントロメア）、すなわちＲＰ１１−１２４Ｌ２２、ＲＰ１１−３１３Ｃ２０、ＲＰ１１−７０３Ａ４、およびＲＰ１１−１１４９Ｊ１３を用いた。第１４染色体ｑに対する局在化については、ＦＩＳＨによりＢＡＣ  ＲＰ１１−４８３Ｋ１３をマッピングし、またこれが１４ｑとハイブリダイゼーションすることも、本発明者らはＮＰＬを用いて確認した。ＢＡＣ  ＤＮＡをＱＩＡフィルターマキシプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて単離し、プローブをジゴキシゲニン−またはビオチンニックトランスレーションミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて合成した。
【０３６９】
Ｂ．結果
結果を図２６〜２８に示す。図２６は、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株におけるＥＴＶ１の過剰発現およびアンドロゲン制御を示す。図２６Ａは、ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株におけるアンドロゲン調節遺伝子の発現シグネチャーを示す。遺伝子のヒートマップは、媒体のみでの治療（灰色）と比較した、１ｎＭの合成アンドロゲンＲ１８８１（緑）によるいずれかの細胞株（特徴数３，４９９、ｐ＜０．０５および変化倍率＞＝１．５）における誘発または抑制を示す。各列は遺伝子、各列は試料を示す。黄色および青色の細胞は、カラースケールに従い、過剰または過小発現をそれぞれ示す。灰色の細胞は、欠測データを示す。各細胞株についての値は、対応する対照試料を中心に示している。ヒートマップ中でＰＳＡ、ＥＲＧ、およびＥＴＶ１の位置を示し、これらの発現を挿入図中に示している。図２６Ｂは、定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）による、ＶＣａＰおよびＬＮＣａＰ細胞の両細胞におけるアンドロゲンによるＰＳＡ誘発を示す。ＬＮＣａＰ（赤色）、およびＶＣａＰ（青色）細胞株におけるＰＳＡ（ＧＡＰＤＨに対し標準化）の相対発現をＱＰＣＲにより決定した。細胞を、媒体または１ｎＭのＲ１８８１で４８時間、抗アンドロゲンカソデックスまたはフルタミドの存在または非存在下で記載どおりに処理した。各試料におけるＰＳＡの相対量を、各細胞株に対する対照試料中の量に対して較正した。図２６Ｃは、ＬＮＣａＰ細胞におけるアンドロゲンによるＥＴＶ１誘発を示す。Ｂと同じ試料を用いて、ＥＴＶ１の相対量をＱＰＣＲにより決定した。図２６Ｄは、ＥＴＶ１がＬＮＣａＰ細胞中で顕著に過剰発現されていることを示す。ＰＳＡ、ＥＴＶ１およびＥＲＧの相対発現を、ＱＰＣＲにより各細胞株由来の４８時間対照試料で決定した。各試料における標的遺伝子の相対量を、両細胞株由来のＰＳＡの平均量に対して較正した。ＬＮＣａＰとＶＣａＰでのＥＲＧとＥＴＶ１発現における差の倍率を示す。
【０３７０】
図２７は、ＬＮＣａＰ細胞におけるＥＴＶ１の再配列を示す。図２７Ａは、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）でプローブとして使用したＢＡＣの模式図である。７ｐ２１および１４ｑ３２での位置と座標（ＥＴＶ１遺伝子座および周囲ＢＡＣを含む）を、ＵＣＳＣゲノムブラウザーを用いて２００４年５月凍結のヒトゲノムで決定した。本研究で用いたＢＡＣを番号の付いた長方形で示す。ＥＴＶ１およびＤＧＫＢの位置を転写の方向を示す矢印で示す。図２７Ｂは、正常な末梢リンパ球（ＮＰＬ）における第７染色体へのＲＰ１１−１２４Ｌ２２およびＲＰ１１−１１４９Ｊ１３同時局在化を示す。中期スプレッド（上段パネル）または間期細胞（下段パネル）上でのＲＰ１１−１２４Ｌ２２（ＢＡＣ＃１）およびＲＰ１１−１１４９Ｊ１３（ＢＡＣ＃４）の局在化をＮＰＬ中でＦＩＳＨにより決定した。すべての中期の写真について、第７染色体上のシグナルを矢印で示し、第１４染色体上のシグナルを対応するプローブの色の矢印で示す。中期スプレッドの情報領域のより高い倍率での拡大図を囲み部分に示す。図２７Ｃは、中期スプレッド（上段パネル）上および間期細胞（下段パネル）でのＢＡＣ＃１およびＢＡＣ＃４の局在化が、ほぼ４倍体のＬＮＣａＰ細胞株で決定されたことを示している。第７染色体上の２つの同時に局在化したシグナル、第７染色体上の２つの赤色シグナル、および異なる染色体上の２つの緑色シグナルが観察された。図２７Ｄは、ＬＮＣａＰ細胞における、第１４染色体に局在化したＲＰ１１−１２４Ｌ２２由来のシグナルを示す。同図Ｃに示すように、ＲＰ１１−１２４Ｌ２２（ＢＡＣ＃１）以外は、ＬＮＣａＰ中期スプレッド上でＲＰ１１−４８３Ｋ１３（ＢＡＣ＃５、第１４染色体ｑにＦＩＳＨマッピング）と同時にハイブリダイゼーションした。ＲＰ１１−４８３Ｋ１３由来の４つの赤色シグナルは第１４染色体ｑに局在し、２つの緑のシグナルは７番染色体ｐに局在し、２つの緑のシグナルは第１４染色体ｑに局在している。
【０３７１】
図２８は、ＥＴＶ１遺伝子座全体がＬＮＣａＰ細胞内の第１４染色体に挿入されていることを示す。図２８Ａは、この実験で用いたＢＡＣの模式図である。図２８Ｂは、中期スプレッド（上段パネル）におけるＲＰ１１−１２４Ｌ２２（ＢＡＣ＃１）および間期細胞（下段パネル）におけるＲＰ１１−３１３Ｃ２０（ＢＡＣ＃２）の局在化が、ＬＮＣａＰ細胞においてＦＩＳＨにより決定されたことを示している。中期スプレッドでは、２対の同時局在化したシグナルは第７染色体（黄色矢印）および第１４染色体（黄色矢印）で観察された。
【０３７２】
これらの結果は、ＥＴＶ１遺伝子座全体が第７染色体から第１４染色体に転座していることを実証している。第１４染色体上の挿入断片上流のゲノム配列が未知であっても、この領域は、ＬＮＣａＰ細胞でのみ観察される高レベルのＥＴＶ１とアンドロゲン応答性を誘発するＡＲＥをおそらく有すると思われる。これらの結果は、ＬＮＣａＰ細胞に、ヒト前立腺癌に見られるＥＴＳ遺伝子融合のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとしての用途があることを示唆している。
【０３７３】
（実施例１５）
前立腺癌におけるＥＴＳファミリーメンバーのノックダウン
本実施例では、前立腺癌におけるＥＴＳファミリーメンバーのノックダウンについて記載する。ｓｉＲＮＡをＬＮＣａＰおよびＶＣＡＰにおけるＥＴＶ１およびＥＲＧの発現をノックダウンするのに用いた。定量的ＰＣＲをこのノックダウンの確認に用いた。結果を図２９および３０に示す。このノックダウンは増殖に影響を与えなかった。ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスを安定なノックダウンのために作製した。
【０３７４】
ＥＲＧ発現がＶＣａＰ細胞（ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合物を有する）においてノックダウンされる場合にどの遺伝子が異なって発現するかを決定するために、マイクロアレイをＡｇｉｌｅｎｔの４４Ｋ全ゲノムアレイ上で実施した。この実験について、３つの条件を用いた。すなわち、ＥＲＧ（ＥＲＧｓｉ）に対してＤｈａｒｍａｃｏｎのｓｉＲＮＡを用いたノックダウン、ルシフェラーゼ（対照）およびトランスフェクトされなかった（非形質移入）ＶＣａＰ細胞のノックダウン。ＥＲＧ／非形質移入の３つのハイブリダイゼーションおよび２つの対照／非形質移入を実施した。これらの遺伝子は、５つすべての実験に存在するとしており、標準偏差（両条件についての平均）は０．５未満であり、ＥＲＧと対照との差の倍率は＜０．７５または＞１．５を示した。ＥＲＧｄｉｆフィールドは、ＥＲＧと対照ノックダウン実験との差の倍率を示すので、１未満は遺伝子がＥＲＧノックダウンにおいて過小発現されていることを意味する（本分析においてＥＲＧ自身は８１番目に位置する）。
【０３７５】
（実施例１６）
トランスジェニックマウス
本発明の遺伝子融合物を過剰発現するトランスジェニックマウスの他に、ＥＴＳとアンドロゲン応答性遺伝子も作製した。図３１は、マウス作製に用いるためのウイルス過剰発現システムである。図３２は、トランスジェニックマウスにおけるゲノム挿入断片の模式図である。このようなマウスは、研究（例えば、機構試験）および薬物スクリーニング応用における用途がある。
【０３７６】
（実施例１７）
ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａの同定
上述のように（実施例１）、ＴＭＰＲＳＳ２のＥＲＧへの融合を観察した。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧａ遺伝子融合物からの発現タンパク質を決定するため、３ｘＦｌａｇタグを停止コドンのすぐ上流に挿入して、ＶＣａＰ前立腺癌細胞株から、エクソン４の始まりにある融合区切り点からエクソン１１内の推定の停止コドンまでのＥＲＧ（ＮＭ＿００４４４９）の部分を増幅するのに、ＰＣＲを用いた。この産物をｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯ  ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＴＡクローン化し、双方向で配列決定した。配列決定は、本明細書においてＥＲＧ１（ＥＲＧアイソフォーム１由来のエクソン６を含む
【０３７７】
【数３】
2018019720.tif 000026
およびＥＲＧ２（このエクソンを含まない）と称する２つの異なるアイソフォームの存在を明らかにした。この生産物をｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴデスティネーションベクターにＧａｔｅｗａｙクローン化した。このプラスミドを、ＥＲＧタンパク質産生のため、直接的にＰＨＩＮＸ細胞にトランスフェクトした。
【０３７８】
Ａ．方法
トランスフェクションアッセイ：Ｐｈｉｎｘ細胞に、ＦｕＧｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を製造業者の使用説明書に従って用いて、ＥＲＧ２または空ベクターをトランスフェクトした。直径１５０ｍｍのプレート計１０個を各コンストラクトに用いた。トランスフェクション後４８時間の時点でこれらの細胞を収集し、以下に記載する免疫沈降アッセイに用いた。
【０３７９】
タンパク質溶解および免疫沈降：細胞を氷冷したＰＢＳ含有プロテアーゼ阻害剤により洗浄し、１％ＮＰ４０含有ＴＢＳ中で均質化して溶解した。タンパク質を含有するこの上澄みについて、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を製造業者の使用説明書に従って用いて、タンパク質含有量を評価した。すべての試料からの等量のタンパク質（緩衝液１５ｍＬ中に約３０ｍｇ）を免疫沈降研究に用いた。ＥＺＶＩＥＷレッド抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の５０％スラリー約２００μＬを各試料に加え、４℃で一晩インキュベートした。この免疫沈降物をＴＢＳ含有０．１％ＮＰ４０およびＴＢＳのみで、３回ずつ洗浄した。結合したタンパク質を、ＦＬＡＧペプチド（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を製造業者の使用説明に従って用い、溶出した。この溶出を３回行った。溶出物中のタンパク質を５０％ＴＣＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて沈殿させた。沈降物を氷冷したアセトンで３回洗浄し、ラエミリ緩衝液に再懸濁し、４〜２０％のＢＩＳ−ＴＲＩＳゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｂａｄ、ＣＡ）上で電気泳動させた。これらのゲルを質量分析用の銀染色（シルバーケスト、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｂａｄ、ＣＡ）で染色した。ＥＲＧ２に対応するバンドおよびベクターレーン中で対応する領域を各１ｃｍの６片に切り取った。ゲル片の各一片は、ゲル上の高分子量領域から始まり移動していくバンド１〜６で標示した。それゆえバンド１は高分子量タンパク質を含む領域に対応するのに対し、バンド６は低分子量領域に対応する。ＥＲＧ２の未変性分子量（約５５ＫＤａ）に基づくと、バンド４および５を移動することになる。ＥＲＧ２配列同定を３回繰り返し、すべての実験からデータをまとめた。
【０３８０】
タンパク質同定
ゲルバンドを採取し、製造業者の使用説明書に従い銀染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｂａｄ、ＣＡ）に含まれる脱染溶液を用いて脱染した。ゲル中で、消化をｐＨ９の１Ｍの重炭酸アンモニウム中でブタ由来トリプシン（１：５０、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて行った。この消化は、３７℃で１６時間行った。２４時間後、トリプシン活性を３％ギ酸により停止した。これらのペプチドを５０％アセトニトリルを用いて抽出した。これらのペプチドを乾燥して０．１％ギ酸含有の２％アセトニトリルに懸濁し、パラダイムＨＰＬＣポンプ（Ｍｉｃｈｒｏｍｅ  Ｂｉｏ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｉｎｃ）に取り付けた０．０７５ｍｍ×１５０ｍｍのＣ１８カラムを用いて、逆相クロマトグラフィーにより分離した。ペプチドを、溶媒Ａを０．１％ギ酸／２％アセトニトリルとし、Ｂ（０．１％ギ酸／９５％アセトニトリル）を４５分５〜９５％の濃度勾配で用いて溶出した。フィニガン（Ｆｉｎｎｉｇａｎ）ＬＴＱ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）をスペクトルを得るのに用い、装置をデータ依存モードでダイナミックエクスクルージョン（ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）を可動状態にして操作した。フルＭＳスキャンにおける３つの最大量ペプチドイオンでのＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。これらのスペクトルを、混成の、非同一のＮＣＢＩヒト標準配列データベースに対してＭＡＳＣＯＴ検索ツールを用いて検索した。これらのデータベースの検索結果は、ペプチド帰属精度について、ペプチドプロヘット（ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｐｈｅｔ）プログラムを用いて確認した。これは混合モデルであり、検索結果スコアやトリプシン（ｔｙｐｔｉｃ）末端数等の様々なペプチドの特徴に基づいた正確なペプチド同定の確率を決める期待値最大化評価である。第２のプログラムであるプロテインプロヘット（ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｐｈｅｔ）をペプチドをタンパク質によりグループ化し、これらの確率を組み合わせて正しいタンパク質帰属の確率を決めるために用いた。識別能は、これらのＮＳＰ値により、またはペプチドグループ化情報および起こり得るマルチヒットのタンパク質の状態を意味する同胞ペプチド数により、個々のペプチドの確率の２次的な再評価で増加する。
【０３８１】
結果：
【０３８２】
【表１４−１】
2018019720.tif 000027
【０３８３】
【表１４−２】
2018019720.tif 000028
【０３８４】
【表１４−３】
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本表は、３つの異なる実験にわたって得たＥＲＧ２についてのカバレージマップを示す。下線部アミノ酸配列は、ＶＣＡＰ細胞からクローン化されたＥＲＧ１のシリコ翻訳配列に対応する。アミノ酸配列ＧＧＡＡＦＩＦＰＮＴＳＶＹＰＥＡＴＱＲＩＴＴＲＰ（配列番号１９６）は、ＥＲＧ１に特異的でＥＲＧ２では欠損しているエクソンに対応している。残りのアミノ酸配列は、３つの実験の各々で同定されたＥＲＧ２配列に対応している。ＥＲＧ２をすべての実験におけるバンド１〜５で同定した。これらのバンドの各々で得たＥＲＧ２についてのペプチド配列を示す。非常に高いカバレージのＥＲＧ２タンパク質が、３つの実験にわたり観察された。このカバレージマップは、第１の５０アミノ酸残基に対応する、クローン化タンパク質のＮ末端領域におけるペプチドのカバレージが、質量分析カバレージマップにおいてほどんど観察されないことを示した。しかしながら、アミノ酸バリンで始まるペプチドＶＰＱＱＤＷＬＳＱＰ（配列番号１９７）はきわめて大量に見られ、したがって、すべての実験において同定された。より詳しい評価は、４７番目の位置にあるアミノ酸がメチオニンのフレームにあることを示唆した。複数の実験における４７番目のメチオニンの上流（Ｎ終端）にあるどのようなペプチドの欠如も、それがＥＲＧ２のＮ末端アミノ酸であることを確認している。さらにまた、５０番目の位置にあるアルギニン残基の存在により、潜在的なトリプシン切断部位とした。この部位でのトリプシンによる消化は、イオン捕捉質量分析計による同定には小さすぎるより短鎖のＮ末端ペプチドＭＳＰＲや、すべての実験で同定された長鎖Ｃ末端ペプチドＶＰＱＱＤＷＬＳＱＰ（配列番号１９８）を生じることになる。さらに、ペプチド配列ＭＩＱＴＶＰＤＰＡＡＨＩ（配列番号１９９）も単一の実験において非常に低い確率スコアで同定された。これは、ＮＣＢＩにおいて報告されているように、ＥＲＧのＮ末端にマッピングされる。この配列は、ＶＣＡＰ細胞からクローン化された、異所的に過剰発現されたコンストラクトの一部ではなかった。これは、ＰＨＩＮＸ細胞において発現されたｉｎ  ｖｉｖｏのＥＲＧより入手できたかもしれず、したがって良性細胞に関連するＥＲＧの一部を示しているのかもしれない。
【０３８５】
したがって、要約すると、この結果は、３番目のメチオニンがＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合産物の翻訳開始部位であることを示している。
【０３８６】
【数４】
2018019720.tif 000030
第１のメチオニンは、内在性ＥＲＧの翻訳開始部位である。
【０３８７】
【数５】
2018019720.tif 000031
図２０は、内在性および融合ポリペプチドの模式図を示す。
【０３８８】
（実施例１８）
尿試料でのＦＩＳＨ分析
尿から前立腺細胞を分離および調製するため、約３０ｍＬの尿を直腸診後に採取する。この後直ちに、１５ｍＬのＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔを加え、試料を５０ｍＬの遠心管中で１０分間室温で４０００ｒｐｍにて遠心分離する。上澄みを廃棄し、ペレットを１５ｍＬの０．７５ＭのＫＣｌ中に１５分間室温で再懸濁し、５０ｍＬの遠心管中で１０分間室温で４０００ｒｐｍにて遠心分離する。上澄みを廃棄し、ペレットを１０ｍＬの３：１比メタノール：氷酢酸中に再懸濁する。この後、４０００ｒｐｍで８分間遠心する。上澄みを２００μＬを除き廃棄し、ペレットを再懸濁する。続いてこの再懸濁したペレットをガラススライドに滴下し、風乾する。ハイブリダイゼーションおよびプローブ調製を上記の実施例２のように、ＥＲＧ５’／３’およびＴＭＰＲＳＳ５’／３’プローブ対で行う。
【０３８９】
（実施例１９）
さらなるＥＴＶ１遺伝子融合
Ａ．材料および方法
試料および細胞株
前立腺組織は、共にミシガン大学前立腺癌専門優良研究プログラム（Ｓ．Ｐ．Ｏ．Ｒ．Ｅ．）組織コアの一部である、ミシガン大学の根治的前立腺切除術系列および迅速剖検プログラム１から得たものである。すべての試料を、患者らのインフォームドコンセントおよび事前の研究所審査委員の承認を得て採取した。
【０３９０】
良性不死化前立腺細胞株ＲＷＰＥおよび前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ、Ｄｕｌ４５ＮＣＩ−Ｈ６６０およびＰＣ３は、ＡＴＣＣから入手したものである。原発性良性前立腺上皮細胞（ＰｒＥＣ）は、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）より入手した。前立腺癌細胞株Ｃ４−２Ｂ、ＬＡＰＣ４およびＭＤＡ−ＰＣａ２Ｂは、Ｅｖａｎ  Ｋｅｌｌｅｒ（ミシガン大学）により提供された。前立腺癌細胞株２２−ＲＶ１は、Ｊｉｌｌ  ＭｃＫｏｓｋａ（ミシガン大学）により提供された。ＶＣａＰは、ホルモン−抵抗性転移性前立腺癌を有する患者由来の椎骨転移から誘導した（Ｋｏｒｅｎｃｈｕｋら、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  １５巻、１６３〜８頁（２００１年））。
【０３９１】
アンドロゲン刺激実験のため、ＬＮＣａＰ細胞を、１％エタノール、またはエタノールに溶解した１ｎＭのメチルトリエノロン（Ｒｌ８８１、ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いた２４時間の処置の前に、活性炭処理済血清含有培地中で２４時間増殖させた。すべての試料について、トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を製造業者の使用説明書に従って用い、総ＲＮＡを単離した。
【０３９２】
定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）
定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を、パワーＳＹＢＲグリーンのマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの７３００リアルタイムＰＣＲシステム上で、文献（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６巻、３３９６〜４００頁（２００６年）；Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＭＰＲＳＳ２  ａｎｄ  ＥＴＳ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０巻、６４４〜８頁（２００５年））に記載のように用いて行った。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）により合成されたものであり、表１５に列挙されている。ＨＭＢＳおよびＧＡＰＤＨ５、およびＰＳＡ６プライマーは記載の通りである。アンドロゲン刺激反応を４回行い、その他すべての反応を２回行った。
【０３９３】
ｃＤＮＡ末端のＲＮＡリガーゼ介在性迅速増幅（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ）
ＲＬＭ−ＲＡＣＥを、既述のように（Ｔｏｍｌｉｎｓら、２００５年、上述；Ｔｏｍｌｉｎｓら、２００６年、上述）、製造業者の使用説明書に従ってジーンレーサーＲＬＭ−ＲＡＣＥキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。ＥＴＶ１の５’末端を得るため、第１の鎖のｃＤＮＡを、ジーンレーサー５’プライマーおよびＥＴＶ１  エクソン４−５−ｒを用いて、プラチナＴａｑハイフィデリティ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増幅した。産物をクローン化し、文献（Ｔｏｍｌｉｎｓら、２００５年、上述；Ｔｏｍｌｉｎｓら、２００６年、上述）に記載のように双方向で配列決定した。ＲＬＭ−ＲＡＣＥされたｃＤＮＡは、その他のアッセイに使用しなかった。
【０３９４】
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
ホルマリン固定したパラフィン包理（ＦＦＰＥ）組織切片に対する間期ＦＩＳＨを文献（Ｔｏｍｌｉｎｓら、２００５年、上述）に記載のように行った。１アッセイにつき少なくとも５０の核を評価した。ＬＮＣａＰおよびＭＤＡ−ＰＣａ２Ｂの中期スプレッドを、標準的な細胞遺伝学的手法により調製した。スライドを２倍濃度のＳＳＣ中で２分間、７０％エタノールで２分間、そして１００％エタノールで２分間前処理し、風乾した。スライドおよびプローブを同時に７５℃で２分間変性し、一晩３７℃でハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション後、０．５倍濃度のＳＳＣ中４２℃で５分間、続いてＰＢＳＴ中で３回洗浄した。蛍光検出を、フルオレセインについては抗ジゴキシゲニン抱合体（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）についてはストレプトアビジンコンジュゲートを用いて行った。スライドを対比染色し、ＤＡＰＩ含有ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ退色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中においた。スライドをＺｅｉｓｓのアキシオイメージャー（Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ）Ｚ１蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）で観察し、ＩＳＩＳソフトウェア（Ｍｅｔａｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｌｔｌｕｓｓｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用しＣＣＤカメラで撮像した。ＢＡＣ（表１６に記載）はＢＡＣＰＡＣリソースセンター（カリフォルニア州オークランド）から入手したものであり、プローブは文献（Ｔｏｍｌｉｎｓら、２００５年、上述）に記載のように調製した。予め標識された第７染色体セントロメアおよび７ｐテロメアプローブはＶｙｓｉｓ（Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬ）から入手したものである。すべてのプローブについて、完全性および正確な局在化を正常な末梢リンパ球の中期スプレッドとのハイブリダイゼーションにより確認した。
【０３９５】
組織特異的発現
１４ｑ１３〜ｑ２１における５’融合パートナーと遺伝子の組織特異的発現を決定するため、２９の異なる種類の６３０の腫瘍から得た発現プロファイルからなる、国際ゲノムコンソーシアムのｅｘｐＯデータセットをＯｎｃｏｍｉｎｅデータベースを利用して用いた。市販のアレイプラットフォームではモニターされない、ＨＥＲＶ−Ｋ＿２２ｑ１１．２３の発現を調べるため、リンクスセラピューティクス社（Ｌｙｎｘ  Ｔｈｅｒａｐｕｔｉｃｓ）の正常組織ＭＰＳＳ（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）データセット（ＧＳＥ１７４７）に対するクエリーを文献（Ｓｔａｕｆｆｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ  ４巻、２頁（２００４年））に記載のように、ＨＥＲＶ−Ｋ＿２２ｑｌ１．２３を明確に同定するＭＰＳＳタグ「ＧＡＴＣＴＴＴＧＴＧＡＣＣＴＡＣＴ」（配列番号３０８）を用いて行った。ｅｘｐＯデータセットより得た腫瘍型の記述およびＭＰＳＳデータセットより得た正常な組織型を表１７に示す。
【０３９６】
発現のプロファイリング
ＬＮＣａＰ、Ｃ４−２Ｂ、ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１およびＲＷＰＥ−ＧＵＳ細胞の発現プロファイリングをアジレント社の全ヒトゲノムオリゴマイクロアレイ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を利用して行った。トリゾールを用いて単離した総ＲＮＡをＱｉａｇｅｎのＲＮＡｅａｓｙマイクロキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製した。１μｇの総ＲＮＡをｃＲＮＡに転換し、製造業者のプロトコール（Ａｇｉｌｅｎｔ）に従って標識した。ハイブリダイゼーションを６５℃で１６時間行い、およびアレイをＡｇｉｌｅｎｔＤＮＡマイクロアレイスキャナーでスキャンした。画像を分析し、線形およびＬｏｗｅｓｓ標準化を各アレイに対して実施して、データをＡｇｉｌｅｎｔの特性抽出ソフト９．１．３．１を利用して抽出した。ＬＮＣａＰおよびＣ４−２Ｂハイブリダイゼーションについては、各細胞株に対する標準をプール良性前立腺総ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）とした。各細胞株についてダイフリップも行った。特性を色素フリップの補正後の２つのＣ４−２Ｂアレイにおける平均発現で割った２つのＬＮＣａＰアレイにおける平均発現（対数比）で順位付けした。ＲＷＰＥ細胞については、４つのハイブリダイゼーションを行った（複製ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１／ＲＷＰＥ−ＧＵＳおよびＲＷＰＥ−ＧＵＳ／ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１ハイブリダイゼーション）。過剰および過小発現したシグネチャーを、すべての４つのハイブリダイゼーションで顕著な異なる発現差異（Ｐ値対数比＜０．０１）と、ダイフリップに対する補正後に２倍平均過剰または過小発現（対数比）を有する特性のみを含むようにフィルタリングして作製した。
【０３９７】
サザンハイブリダイゼーション
ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ、プールした正常なヒト雄ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、および正常な胎盤ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）由来のゲノムＤＮＡ（１０μｇ）を、ＥｃｏＲＩまたはＰｓｔＩ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）で一晩消化した。断片を０．８％アガロースゲル上４０Ｖで一晩分離し、ハイボンドＮＸナイロン膜に移し、予備ハイブリダイゼーションして、プローブとハイブリダイゼーションし、標準的なプロトコールに従って洗浄した。ＦＩＳＨにより関連付けられたｃｈｒ７の領域にまたがる一連の２２プローブ（ＲＰ１１−３１３Ｃ２０とＲＰ１１−７０３Ａ４との間）を、プールした正常なヒト雄ゲノムＤＮＡ（表１５）上でプラチナＴａｑハイフィデリティを用いてＰＣＲ増幅により作製した。各プローブ２５ｎｇをｄＣＴＰ−Ｐ３２で標識し、ハイブリダイゼーションに用いた。
【０３９８】
逆ＰＣＲ
ＬＮＣａＰ細胞におけるＥＴＶ１区切り点を同定するため、サザンブロット法により同定した再配列に基づく逆ＰＣＲ法を用いた。野生型の配列由来の逆相補配列であり、プライマーＢ１、Ｂ２、Ｂ３と異なる、プライマーＡ１、Ａ２、Ａ３を、ＰｓｔＩで消化および再連結した（分子内結合を促進するため）ＬＮＣａＰゲノムＤＮＡ鋳型に対する逆ＰＣＲに用いた。ネステッドＰＣＲを、以下のプライマー組の順で実施した。すなわち、Ａ１−Ｂ１、Ａ２−Ｂ２、およびＡ３−Ｂ３。エキスパンド２０ｋｂ  ｐｌｕｓ  ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、製造業者の指示に従い、融合産物の増幅に用いた。このネステッドＰＣＲで観察された濃縮３ＫｂバンドをｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、ミニプレップＤＮＡを挿入断片についてスクリーニングし、陽性クローンを配列決定した（ミシガン大学ＤＮＡ配列決定コア、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）。その後、融合特異性プライマーを用いたプラチナＴａｑハイフィデリティにより、融合物をＰＣＲにより確認した（表１５）。
【０３９９】
ＥＴＶ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ過剰発現
ＥＴＶ１の既報の停止コドンに対するＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合物（２６９−１５２１、ＮＭ＿００４９５６．３）に存在する、ＥＴＶ１のｃＤＮＡをＭＥＴ２６４からＲＴ−ＰＣＲで増幅して、ＧａｔｅｗａｙエントリーベクターｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＴＯＰＯクローン化し、ｐＣＲ８−ＥＴＶ１を得た。アデノウイルスおよびレンチウイルスのコンストラクトを作製するため、ｐＣＲ８−ＥＴＶ１および対照エントリークローン（ｐＥＮＴＲ−ＧＵＳ）をそれぞれｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とｐＬｅｎｔｉ６／ＣＭＶ／Ｖ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、ＬＲクロナーゼＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて組換えた。対照ｐＡＤ／ＣＭＶ／ＬＡＣＺクローンをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。アデノウイルスおよびレンチウイルスは、ミシガン大学ベクターコアにより作製されたものである。この良性不死化前立腺細胞株ＲＷＰＥをＥＴＶ１またはＧＵＳを発現するレンチウイルスに感染させ、安定なクローンをブラストサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた選択により作製した。初代ＰｒＥＣ細胞では安定な系統を作製できないので、良性ＰｒＥＣをＥＴＶ１またはＬＡＣＺを発現するアデノウイルスに感染させた。細胞数を、細胞のトリプシン処理および記載の時点で３回コールターカウンターで分析することで概算した。侵襲アッセイについては、同数のＰＲＥＣ−ＥＴＶ１および−ＬＡＣＺ（感染後４８時間）または安定なＲＰＷＥ−ＥＴＶ１および−ＧＵＳ細胞を、化学誘引物質として下側チャンバーにはウシ胎児血清を加えた、２４ウェル培養プレートのインサート内にある基底膜マトリックス（ＥＣ  ｍａｔｒｉｘ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）上に播種した。４８時間後、非侵襲性細胞およびＥＣマトリックスを綿棒で除去した。感染細胞をクリスタルバイオレットで染色し、写真撮像した。これらのインサートを１０％酢酸で処理し、吸収を５６０ｎｍで測定した。
【０４００】
ＥＴＶ１ノックダウン
ＬＮＣａＰ細胞におけるＥＴＶ１のｓｉＲＮＡノックダウンについて、ダーマコン社のＥＴＶ１用ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（ＭＵ−００３８０１−０１、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を構成する個々のｓｉＲＮＡを、ｑＰＣＲによりＥＴＶ１ノックダウンについて試験し、最も効果的な一本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｄ−００３８０１−０５）をさらなる実験に用いた。ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ非標的ｓｉＲＮＡ＃１（Ｄ−００１２１０−０１）またはＥＴＶ１に対するｓｉＲＮＡを、オリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＬＮＣａＰ細胞にトランスフェクトした。２４時間後、２回目の同一トランスフェクションを実行し、２４時間後に以下に記載するようなＲＮＡおよび侵襲アッセイのために細胞を回収した。ＬＮＣａＰ細胞におけるＥＴＶ１のｓｈＲＮＡノックダウンについては、ｐＭＳ２レトロウイルスベクター由来のＥＴＶ１に対するｓｈＲＮＡｍｉｒコンストラクト（Ｖ２ＨＳ＿６１９２９、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）を、製造業者のプロトコールに従ってｐＧＩＰＺレンチウイルス空ベクター（ＲＨＳ４３４９、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にクローン化した。ＥＴＶ１のｓｈＲＮＡｍｉｒを有するｐＧＩＰＺレンチウイルスまたは非発現抑制対照（ＲＨＳ４３４６）は、ミシガン大学ベクターコアにより作製されたものである。ＬＮＣａＰ細胞をレンチウイルスに感染させ、４８時間後に細胞を以下に記載するように侵襲アッセイに用いた。６つの独立した実験の代表的な結果を示す。
【０４０１】
侵襲アッセイ
同じ数の記載の細胞を、ウシ胎児血清を化学誘引物質として下側のチャンバーに添加した２４ウェル培養プレートのインサート内にある基底膜マトリックス（ＥＣマトリックス、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）上に播種した。４８時間後、非侵襲細胞およびＥＣマトリックスを綿棒で除去した。感染細胞をクリスタルバイオレットで染色し、写真撮像した。これらのインサートを１０％酢酸で処理し、吸収を５６０ｎｍで測定した。
【０４０２】
ＦＡＣＳ細胞周期分析
ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１およびＲＷＰＥ−ＧＵＳ細胞を、細胞周期の特特徴付けについてＦＡＣＳで評価した。細胞を２倍濃度のＰＢＳで洗浄し、およそ２×１０６細胞を７０％エタノール中に固定する前にＰＢＳ中に再懸濁した。沈渣の細胞を洗浄し、ＲＮａｓｅ（１００μｇ／ｍＬ最終濃度）およびヨウ化プロピジウム（１０μｇ／ｍＬ最終濃度）で３０分間３７℃で処理した。染色細胞をＦＡＣＳＤｉｖｉａを利用してＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析し、および細胞周期の段階をＭｏｄＦｉｔ  ＬＴ（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ、Ｔｏｐｓｈａｍ、ＭＥ）を用いて計算した。
【０４０３】
軟寒天アッセイ
正常培地の低融点アガロースの０．６％（質量／体積）の下層を、６ウェル培養プレート中で調製した。一番上に、１×１０４ＲＷＰＥ−ＧＵＳ、ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１、またはＤＵ１４５（陽性対照）細胞を含有する０．３％アガロースの層を入れた。１２日後、病巣をクリスタルバイオレットで染色しカウントした。
【０４０４】
免疫ブロット分析
細胞を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％ＮＰ４０（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、および完全プロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ）を含むＮＰ４０溶解緩衝液中でホモジナイズした。１５μｇのタンパク質抽出物をＳＤＳ試料緩衝液と混合し、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で還元条件下で電気泳動させた。これらの分離したタンパク質を、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上に移した。この膜を、ブロッキング用緩衝液［０．１％ツイーン（ＴＢＳ−Ｔ）および５％脱脂乾燥乳を含有するトリス緩衝生理食塩水］中で１時間インキュベートした。一次抗体を、ブロッキング用緩衝液中一晩４℃で、記載の希釈率で適用した。ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で３回洗浄後、膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートしたロバ抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で、１：５，０００希釈で１時間室温にてインキュベートした。これらのシグナルを、改良型化学発光検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）および放射線写真法で描出した。
【０４０５】
マウスモノクローナル抗ＭＭＰ−３（ＩＭ３６Ｌ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を１：５００希釈で適用し、マウスモノクローナル抗ｕＰＡ（ＩＭ１３Ｌ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を１：５００希釈で適用し、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を１：３０，０００希釈で対照に添加するのに適用した。
【０４０６】
トランスジェニックＥＴＶ１マウス
ＥＴＶ１のｉｎ  ｖｉｖｏでの過剰発現について、Ｃ末端３ＸＦＬＡＧ−エピトープタグをつけたコンストラクトを、停止コドンの前で３×ＦＬＡＧタグをコードするリバースプライマーと、ｐＣＲ８−ＥＴＶ１を鋳型として用いて、ＰＣＲにより作製した。この産物をｐＣＲ８にＴＯＰＯクローン化した。前立腺特異的ＥＴＶ１遺伝子導入コンストラクトを作製するため、３倍濃度のＦＬＡＧ−ＥＴＶ１を、改変低分子複合プロバシンプロモーター（ＡＲＲ２ＰＢ）の下流およびウシ成長ホルモンｐｏｌｙＡ部位（ＰＡ−ＢＧＨ）の上流で、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に挿入した。ＡＲＲ２ＰＢ配列は、本来のプロバシン配列ＰＢ（−４２６／＋２８）とさらに２つのアンドロゲン応答エレメントを有する。このコンストラクトを配列決定し、ＦＶＢマウス卵への微量注入の前の一過性トランスフェクトの際にＬＮＣａＰ細胞におけるアンドロゲンによるプロモーター誘導能を試験した。ＡＲＲ２ＰＢ−ＥＴＶ１プラスミドをＰｖｕＩ／ＫｐｎＩ／／ＳａｃＩＩで直線化し、受精ＦＶＢマウス卵に微量注入し、ミシガン大学遺伝子導入動物モデルコアにより、偽妊娠の雌に手術で移植した。遺伝子導入初代動物を、切り取った尾から単離したゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲによりスクリーニングした。遺伝子導入ＡＲＲ２ＰＢ−ＥＴＶ１初代動物を、ＦＶＢマウスと交配し、導入遺伝子陽性雄マウス子孫を様々な時点で屠殺した。トランスジェニックマウス由来の前立腺をＮｉｋｏｎの切開用顕微鏡を用いて切開し、１０％緩衝ホルマリンに固定し、パラフィン中に包理した。５μｍの切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、３人の病理学者により、ヒト癌コンソーシアム前立腺病理委員会のマウスモデルに関するバーハーバーミーティングのコンセンサスレポートに従って評価した（Ｎａｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ６巻（２００７年））。
【０４０７】
ＥＴＶ１−ＦＬＡＧの免疫組織化学的検出に関しては、基底細胞マーカーであるｐ６３およびサイトケラチン５（ＣＫ５）、および平滑筋アクチン、脱パラフィン化スライドについて、マイクロ波−クエン酸塩抗原検索を行い、ウサギ抗ＦＬＡＧポリクローナル抗体（１：５０希釈、一晩のインキュベーション、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃２３６８）、マウスモノクローナル抗ｐ６３抗体（１：１００希釈、４５’インキュベーション、ＬａｂＶｉｓｉｏｎ、ＭＳ１０８１Ｐ１）、マウスモノクローナル抗平滑筋アクチン抗体（１：５０希釈、３０’インキュベーション、ＤａｋｏＡｂ  Ｍ０８５１）、およびウサギポリクローナル抗ＣＫ５抗体（１：５００希釈、３０’インキュベーション、ＡｂＣａｍ、ａｂ２４６４７）と共に、それぞれインキュベートした。ｐ６３およびＳＭＡの描出を、Ｍ．Ｏ．Ｍ免疫検出キット（ＰＫ２２００、Ｖｅｃｔｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた標準的なビオチン−アビジン複合体手法により行った。ＦＬＡＧおよびＣＫ５をＥｎｖｉｓｉｏｎ＋システム−ＨＲＰ（ＤＡＢ）キット（Ｋ４０１１、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いて検出した。
【０４０８】
【表１５−１】
2018019720.tif 000032
【０４０９】
【表１５−２】
2018019720.tif 000033
【０４１０】
【表１５−３】
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【０４１１】
【表１５−４】
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【０４１２】
【表１６】
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【０４１３】
【表１７】
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Ｂ．結果
前立腺癌における新規５’ＥＴＳ融合パートナーの同定
ｑＰＣＲにより、前立腺組織試料の２つのコホートを、ＥＴＶ１の例外発現を有する症例を同定するために、ＥＲＧとＥＴＶ１の発現についてスクリーニングした。図３８ａに示すように、これら２つのコホートにわたり、５４の局在化した前立腺癌試料のうち２６および３試料が、それぞれＥＲＧ（４８％）およびＥＴＶ１（５．５％）例外発現を示した。さらにまた、２つのホルモン抵抗性転移性前立腺癌試料であるＭＥＴ２６およびＭＥＴ２３は、ＥＴＶ１例外発現を示した。ｑＰＣＲにより、ＥＲＧの例外発現を有する、２６の局在化した試料中の２５試料（９６％）が、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合転写産物を発現した。ＭＥＴ２６を除き、４つのＥＴＶ１例外（ＰＣａ＿ＥＴＶ１＿１〜３およびＭＥＴ２３）を含むいずれの試料も、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合転写産物を発現しなかった。
【０４１４】
これらの症例におけるＥＴＶ１転写産物構造を特徴付けるために、ｃＤＮＡ末端（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ）の５’ＲＮＡリガーゼ介在性迅速増幅を行った。ＭＥＴ２６におけるＴＭＰＲＳＳ２由来の５’エクソンよりむしろ、すべての４つの試料は特有の５’配列を有した（図３８ｂ）。ＰＣａ＿ＥＴＶ１＿１においては、ＥＴＶ１のエクソン１〜４を、５’末端反復配列（ＬＴＲ）に対して相同性を有する２２ｑ１１．２３由来の２つのエクソン、およびヒト内在性レトロウイルスファミリーＫ（以下「ＨＥＲＶ−Ｋ＿２２ｑ１１．２３」と称する）のｇａｇ配列で置換した。ＰＣａ＿ＥＴＶ１＿２では、ＥＴＶ１のエクソン１は、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１（７ｐ１５）由来のエクソン１で置換されていたのに対し、ＰＣａ＿ＥＴＶ１＿３では、ＥＴＶ１のエクソン１〜４がさらなる上流配列およびＳＬＣ４５Ａ３（１ｑ３２）のエクソンで置換されていた。ＭＥＴ２３においては、ＥＴＶ１のエクソン１〜５が、Ｃ１５ＯＲＦ２１（１５ｑ２１）由来のエクソン１および２で置換されていた（図１ｂ）。これらの融合転写産物の排他的な発現は、ｑＰＣＲおよびＦＩＳＨによるこれらの症例におけるゲノムレベルでの融合により確認された（図３８ｃ、３９、および４０）。ＰＣａ＿ＥＴＶ１＿２において、ＦＩＳＨは、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１に対して５’側およびＥＴＶ１に対して３’側のプローブの対応する融合を伴った、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１に対して３’側およびＥＴＶ１に対して５’側のプローブの欠失を実証し、７ｐ上でおよそ１３ＭＢ離れてヘッドからテールの方向に配向する、ＨＮＲＰ２Ａ２Ｂ１とＥＴＶ１との間の染色体内欠失と一致した（図３８ｃおよび４０）。遺伝子融合物の配列を図５１に示す。
【０４１５】
５’融合パートナーの明確な機能分類
ＨＥＲＶ−Ｋ＿２２ｑ１１．２３：ＥＴＶ１、ＳＬＣ４５Ａ３：ＥＴＶ１、およびＣ１５ＯＲＦ２１：ＥＴＶ１融合物は、５’パートナー由来の予測翻訳配列を含まず、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１：ＥＴＶ１融合物におけるＨＮＲＰＡ２Ｂ１配列は、融合タンパク質に対して２つの残基のみが寄与する。したがって、５’パートナーのプロモーターエレメントは、おそらくこれらの症例における異常ＥＴＶ１発現を誘発するので、これらの遺伝子の組織特異性およびアンドロゲン制御が特徴付けられた。ＳＬＣ４５Ａ３、Ｃ１５ＯＲＦ２１、およびＨＮＲＰＡ２Ｂ１の組織特異性を調べるため、２９の異なる種類の６３０の腫瘍から得た発現プロファイルからなる国際ゲノムコンソーシアムｅｘｐＯデータセットをＯｎｃｏｍｉｎｅデータベースを用いて検索した（Ｒｈｏｄｅｓら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ９巻、１６６〜８０頁（２００７年））。ＴＭＰＲＳＳ２と同様に、ＳＬＣ４５Ａ３は、その他すべての腫瘍型（メジアン＝０．３３、Ｐ＝２．４Ｅ−７）と比較して、前立腺癌において著しい過剰発現（メジアン＝２．４５、１つのアレイ当たりのメジアンを超える標準偏差）を示した。Ｃ１５ＯＲＦ２１は、前立腺癌において同様の過剰発現を示した（メジアン＝２．０６対−０．１２、Ｐ＝３．４Ｅ−６）。一方、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１は、前立腺およびその他の腫瘍型で高発現を示した（メジアン＝２．３６対２．４１、Ｐ＞０．０５）（図３８ｄ）。ＨＥＲＶ−Ｋ＿２２ｑ１１．２３をｅｘｐＯデータセットで用いたＤＮＡマイクロアレイでモニターしていないにもかかわらず、Ｓｔａｕｆｆｅｒら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ  ４巻、２頁（２００４年））が記載するように、ＭＰＳＳにより明確に測定される。したがって、ＨＥＲＶ−Ｋ＿２２ｑ１１．２３の発現を、３１のその他の正常な組織（メジアン＝１００万あたり９個の転写産物）と比較して、ＨＥＲＶ−Ｋ＿２２ｑ１１．２３が正常な前立腺組織において最高レベルで発現（１００万あたり９４個の転写産物）した、３２の正常な組織型（Ｊｏｎｇｅｎｅｅｌら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ
１５巻、１００７〜１４頁（２００５年））からのプロファイルを含むリンクス治療法ＭＰＳＳデータセット中で検索した（図３８ｄ）。
【０４１６】
ｑＰＣＲにより、ＳＬＣ４５Ａ３（２１．６倍、Ｐ＝６．５Ｅ−４）とＨＥＲＶ−Ｋ  ２２ｑ１１．２３（７．８倍、Ｐ＝２．４Ｅ−４）の、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株における内在性発現は、ＴＭＰＲＳＳ２（１４．８倍、Ｐ＝９．９５Ｅ−７）と同様に、合成アンドロゲンＲ１８８１によって著しく増加する。逆に、Ｃ１５ＯＲＦ２１の発現は、Ｒ１８８１刺激により著しく減少する（１．９倍、Ｐ＝０．００１２）。最後に、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１の発現は、アンドロゲン刺激により著しくは変化しない（１．１７倍、Ｐ＝０．２９））（図３８ｅ）。
【０４１７】
ＥＴＶ１は良性前立腺細胞において侵襲を誘導する
５’パートナーがコード配列をＥＴＶ１転写産物に与えないので、臨床的試料および前立腺癌細胞株における異なるクラスのＥＴＶ１再配列についての共通の結果は、切断されたＥＴＶ１の異常過剰発現である。したがって、この現象は、前立腺癌における異常ＥＴＳファミリーメンバー発現の役割を決定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで繰り返された。アデノウイルスおよびレンチウイルスコンストラクトは、指標のＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１融合物が陽性の症例、ＭＥＴ２６（ＥＴＶ１のエクソン４から始まってＥＴＶ１の終始コドンまで）で表されるようにＥＴＶ１を過剰発現するようにデザインされている（図４１ａ）。良性不死化前立腺上皮細胞株ＲＷＰＥをＥＴＶ１を発現するレンチウイルスに感染させ、安定なＲＷＰＥ−ＥＴＶ１細胞を選択し、ＥＴＶ１を発現するアデノウイルスによる感染により、原発性良性前立腺上皮細胞株ＰｒＥＣにおいてＥＴＶ１を一時的に過剰発現した。ＲＷＰＥおよびＰｒＥＣ細胞の両者において、ＥＴＶ１の過剰発現は、増殖に対して検出可能な効果はなく（図４４ａ〜ｂ）、細胞周期分析は、Ｓ期におけるＲＷＰＥ−ＥＴＶ１とＲＷＰＥ−ＧＵＳ細胞の割合に何の差異も示さなかった（図４４ｃ）。さらにまた、軟寒天形質転換アッセイでは、ＥＴＶ１過剰発現がＲＷＰＥ細胞を形質転換するには十分でないことが示された（図４４ｄ）。
【０４１８】
ＥＴＶ１過剰発現は、ＲＷＰＥ（３．４倍、Ｐ＝０．０００５）およびＰｒＥＣ（６．３倍、Ｐ＝０．０００６）の両者で顕著に侵襲を増大させた（図４１ｂ〜ｃ）。さらにまた、ＬＮＣａＰにおける、ｓｉＲＮＡ、または異なる配列に対して設計されたｓｈＲＮＡを用いたＥＴＶ１ノックダウンは、侵襲を顕著に阻害し（図４１ｄ〜ｅおよび図４５）、過去の研究と一致している（Ｃａｉら、Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（２００７年））。これらの結果は、ＥＴＶ１過剰発現が重要な発癌表現型である侵襲を誘発することを実証している。安定なＥＴＶ１過剰発現により制御される転写プログラムを調べるために、ＲＷＰＥ−ＥＴＶ１細胞をプロファイリングし、発現シグネチャーを、分子概念マップ（ＭＣＭ）と呼ばれる生物学的に関連した概念の概要に対して分析した。ＭＣＭは、２０，０００以上の生物学的に関連した遺伝子セット間の関連を不均衡なオーバーラップにより探すためのものである（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３９巻、４１〜５１頁（２００７年））。図４１ｆに示すように、ＭＣＭ分析は本発明者らのＥＴＶ１過剰発現されたシグネチャーにおいてエンリッチメントが起こっている細胞侵襲に関連する分子概念のネットワークを明らかにしており、上述の表現型効果と一致している。ｑＰＣＲおよび免疫ブロット法により、マトリックスメタロプロテイナーゼおよびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子経路のメンバー（Ｌａｕｆｓら、Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ５巻、１７６０〜７１頁（２００６年）；Ｆｉｎｇｌｅｔｏｎ、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  １１巻、４７９〜９１頁（２００６年））等の、過去に侵襲に関与した複数の遺伝子のＲＷＰＥ−ＥＴＶ１細胞における過剰発現を確認した（図４１ｇおよび４７）。これらの結果は、ＥＴＶ１がマトリックスメタロプロテイナーゼを通じてＬＮＣａＰ細胞内での侵襲に影響を与えることを実証する最近の研究（Ｃａｉら、上述）と一致している。
【０４１９】
ｍＰＩＮを誘発するマウス前立腺におけるＥＴＶ１発現
次に、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＥＴＶ１過剰発現の効果を、アンドロゲン制御下で前立腺において排他的に強力な導入遺伝子発現を誘発する、改変プロバシンプロモーター（ＡＲＲ２Ｐｂ−ＥＴＶ１）の制御下にあるＦＬＡＧタグの付いた切断されたバージョンのＥＴＶ１（図４１ａ）を発現するトランスジェニックマウスを用いて調べた（Ｅｌｌｗｏｏｄ−Ｙｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４巻、２２３〜３８頁（２００３年））。この導入遺伝子は、ヒト前立腺癌において同定されたＥＴＶ１のアンドロゲン誘導遺伝子融合物に機能的に類似している（すなわち、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ１、ＳＬＣ４５Ａ３：ＥＴＶ１、およびＨＥＲＶ−Ｋ＿２２ｑ１１．２３：ＥＴＶ１）。複数のＡＲＲ２Ｐｂ−ＥＴＶ１初代動物を入手し、表現型分析に展開した。１２〜１４週齢の、ＡＲＲ２Ｐｂ−ＥＴＶ１トランスジェニックマウス８匹中６匹（７５％）がマウス前立腺上皮内腫瘍（ｍＰＩＮ）を発症した（表１８および図４２）。ｍＰＩＮの定義に従い、層形成、高色素血および肥大核小体を含む核異型を示す、ＡＲＲ２Ｐｂ−ＥＴＶ１マウスの前立腺における正常な腺内に含まれる局所性増殖病変を観察した（図４２ａ〜ｆ）。ｍＰＩＮは、ＡＲＲ２Ｐｂ−ＥＴＶ１マウスのすべての３つの前立腺葉（前側、腹側、および背外側）で観察され、腹側葉で最もよく見られた（７／１１、６３．６％）（表１８）。免疫組織化学的検査により、強度のＥＴＶ１−ＦＬＡＧ発現が、ＡＲＲ２Ｐｂ−ＥＴＶ１マウスの良性腺ではなく、排他的にｍＰＩＮ病巣で観察され（図４８）、ｑＰＣＲは、導入遺伝子発現が前立腺に限定されるものであることを確認した。
【０４２０】
すべての病変は、近接する平滑筋アクチン染色により実証されるように、無傷の繊維筋層の存在により、インサイチュであることが確認された（図４２ｇ〜ｈ）。しかしながら、基底細胞マーカーサイトケラチン５およびｐ６３を用いた免疫組織化学的検査は、良性腺と比較した、ＡＲＲ２Ｐｂ−ＥＴＶ１ｍＰＩＮにおける周囲基底上皮層の消失を実証し（図４２ｉ〜ｌ）、これは基底細胞層の破損を示している。これらの結果は、ＥＴＶ１がマウス前立腺における腫瘍表現型を誘導を実証し、ヒト前立腺癌におけるＥＴＳ遺伝子融合の発癌役割を支持する。
【０４２１】
【表１８】
2018019720.tif 000038
（実施例２０）
ＥＴＶ５遺伝子融合物
本実施例では、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ５およびＳＬＣ４５Ａ３：ＥＴＶ５遺伝子融合物の同定を記載する。ＳＹＢＲグリーンＱＰＣＲによるＥＴＶ５例外発現の検出には、以下のプライマー対：
ＥＴＶ５＿エクソン１３−ｆ：５’−ＣＣＧＡＡＧＧＣＴＴＴＧＣＴＴＡＣＴＡＡＧＴＴＴＣＴＧＡ−３’（配列番号４１６）
ＥＴＶ５＿エクソン１３−ｒ：５’−ＣＡＣＴＧＣＣＣＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＧＡＡＴＧ−３’（配列番号４１７）
を用いた。
【０４２２】
ＰＣａ＿ＥＴＶ５＿１由来のＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ５融合物の同定には、ＲＬＭ−ＲＡＣＥに対し、以下のプライマー：
ＥＴＶ５＿エクソン６−ｒ：５’−ＡＧＣＴＣＣＣＧＴＴＴＧＡＴＣＴＴＧＧＴＴＧＧ−３’（配列番号４１８）
を用いた。
【０４２３】
ＰＣａ＿ＥＴＶ５＿２由来のＳＬＣ４５Ａ３：ＥＴＶ５融合物の同定には、以下のプライマー：
ＥＴＶ５＿エクソン１１−ｒ：５’−ＣＡＴＧＧＴＡＧＧＣＴＣＣＴＧＴＴＴＧＡＣＴＴＴＧ−３’（配列番号４１９）
を用いた。
【０４２４】
図５２は、上述の融合物を示す。ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ５については、３つのスプライスバリアントを同定した。すべてについての配列を示した。図５３は、ＥＴＶ５例外発現を示す２つの前立腺癌（ＰＣａ）症例のＱＰＣＲによる同定を示す（Ａ）。パネルＢは、ＲＡＣＥで決定した、両症例についての融合転写産物の構造を示す。
【０４２５】
（実施例２１）
さらなるＥＲＧ、ＥＴＶ１およびＥＴＶ４遺伝子融合物
ＥＴＳ転写因子であるＥＲＧ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４またはＥＴＶ５を伴う再発性遺伝子融合物は、４０〜７０％の前立腺癌において同定されている。包括的な間期インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＴＨ）分断プローブストラテジーを用いて、１１０の臨床的に局在化された前立腺癌患者のコホートにおいて、全２７のＥＴＳファミリーメンバーおよびそれらの５つの公知の５’融合パートナーを調べた。この包括的ＦＩＳＨスクリーニングに基づいて、４つの注目すべき観察がなされた。第１に、大部分の前立腺癌（４４％）をＥＴＳ遺伝子融合物に帰することができない。第２に、ＳＬＣ４５Ａ３は、ＥＲＧの５’融合パートナーである；以前は、ＴＭＰＲＳＳ２が唯一の報告されたＥＲＧの５’パートナーであった。第３に、２つの前立腺特異的なアンドロゲン誘導遺伝子であるＦＬＪ３５２９４およびＣＡＮＴ１は、それぞれＥＴＶ１およびＥＴＶ４に対する５’パートナーである。第４に、普遍的に発現するアンドロゲン非感受性遺伝子であるＤＤＸ５をＥＴＶ４とフレームを合わせて融合させ、ＤＤＸ５：ＥＴＶ４融合タンパク質の発現を導く。
【０４２６】
Ａ．材料および方法
治験対象母集団、臨床的データ、および組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の収集
ミシガン大学病院で２００４から２００６年までの初期治療として根治的前立腺切除術を受けた１１０人の臨床的に局在化した前立腺癌の患者を示すＴＭＡを構築した。コア（直径０．６ｍｍ）を各代表腫瘍病巣から取り出し、病理学者によって形態を確認した。詳細な臨床的、病理学的、およびＴＭＡデータは、既述の確実な関連データベースに保存されている（参照により全体として本明細書に援用されるＭｅｈｒａら、Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２００７年；２０巻（５号）：５３８〜４４頁）。表１９に患者の情報を示す。この根治的前立腺切除シリーズは、ミシガン大学の前立腺癌専門優良研究プログラムの組織コアの一部であった。
【０４２７】
【表１９】
2018019720.tif 000039
間期蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）およびＦＩＳＨに基づくスクリーニングストラテジー
従来の有効なＦＩＳＨに基づく分断プローブストラテジーを利用して、前立腺癌における公知および新規な遺伝子異常を調べた（参照により全体として本明細書に援用されるＴｏｍｌｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２００７年；４４８巻（７１５３号））：５９５〜９頁；Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６年；６６巻（７号）：３３９６〜４００頁；Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５年；３１０巻（５７４８号）：６４４〜８頁）。細菌人工染色体（ＢＡＣ）（表２０に列挙）をＢＡＣＰＡＣリソースセンター（カリフォルニア州オークランド）から得て、プローブを調製した。
【０４２８】
【表２０】
2018019720.tif 000040
すべてのプローブの完全性および正確な局在化を正常な末梢リンパ球の中期スプレッドに対するハイブリダイゼーションによって検証した。スライドをイメージングＺ１顕微鏡（カールツァイス社、独国オーバーコッヘン）を用いて調べた。形態学的に無傷のおよび非オーバーラップ核の状態で、ＦＩＳＨシグナルを病理学者により手作業で評価し（１００×油浸）、各部位から最小数５０個の癌細胞を記録した。非常に弱いかまたはシグナルのない癌部位は、不十分なハイブリダイゼーションとして報告した。全３つのコアにおいて腫瘍組織を含まない症例を排除した。
【０４２９】
ＦＩＳＨに基づくハイスループットスクリーニングストラテジーのフローチャートを示す（図５４）。ブレイクポイントが特徴付けられたＥＲＧ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４およびＥＴＶ５再配列の検出について、分断プローブのためにＢＡＣを用いた（参照により全体として本明細書に援用されるＨｅｌｇｅｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８年  ６８巻（１号）：７３〜８０頁）。前立腺癌において未知の再配列状態の残存ＥＴＳファミリー遺伝子について、対象の約１Ｍｂ領域の側面に位置する分断プローブを前立腺癌ＴＭＡ上の初期スクリーニングに利用した（図５４Ａ、Ｂ）。続いて、対象遺伝子の側面にしっかりと位置するＥＴＳ遺伝子特異的プローブ（約２００ｋｂ）を用いて、初期スクリーニングによって同定された前立腺癌由来の組織切片上にＥＴＳ異常を確認した（図５４Ｃ）。
【０４３０】
この研究が分断プローブＦＩＳＨストラテジーによって開始された時期に知られたすべての５’パートナーの再配列についてこのＴＭＡをさらに評価した。ＥＴＳ遺伝子および公知の５’パートナーの両者について再配列した症例に関して、従来検証された融合プローブストラテジーを用いて潜在的な遺伝子融合を確認した（図５４Ｄ）。ＥＴＳ遺伝子再配列のみを有する症例について、凍結組織を得て、ｃＤＮＡ末端のＲＮＡリガーゼ介在性急速増幅（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ）によって５’融合パートナーを同定した（図５４Ｄ）。
【０４３１】
細胞株研究
アンドロゲン感受性前立腺癌細胞株であるＬｎＣａＰを１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩに維持した。アンドロゲン刺激実験について、活性炭処理された５％ＦＣＳを補足したフェノールレッド不含ＲＰＭＩ中に細胞を２日間置き、その後、以下の時点０、３、１２、２４、および４８時間で、１％エタノールまたは１０ｎＭのＲ１８８１で処理した。アンドロゲンで細胞を１６時間処理し、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析のために架橋した。製造業者の使用説明書に従って、総ＲＮＡをトリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて単離した。
【０４３２】
定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）
Ｑ−ＰＣＲを標準的なプロトコールに従って行った。すべてのオリゴヌクレオチドプライマーをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成し、表２１に列挙する。
【０４３３】
【表２１】
2018019720.tif 000041
ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルによって試料を標準化した。アンドロゲン刺激反応を３点測定で行い、他のすべての反応を２点測定で行った。
【０４３４】
ｃＤＮＡ末端のＲＮＡリガーゼ介在性急速増幅（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ）
前立腺癌における異常ＥＴＳ遺伝子の未知の５’パートナーを同定するためにＲＬＭ−ＲＡＣＥを行った。製造業者の使用説明書によるタッチダウンＰＣＲプロトコールにより、遺伝子特異的リバースプライマーＥＴＶ１＿エクソン４−５ｒ、ＥＴＶ４＿エクソン７ｒおよび５’遺伝子レーサープライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、プラチナＴａｑハイフィデリティ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により第１鎖のｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ増幅産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ  ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、記述したベクタープライマーを用いて双方向に配列決定した。
【０４３５】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析
ホルモン枯渇細胞をＲ１８８１またはエタノール処理を施した後に、５μｇの抗アンドロゲン受容体（ＡＲ）抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）を１６時間用いて、ＣｈＩＰ実験を以前に記載される（参照により全体として本明細書に援用されるＹｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００７年；１２巻（５号）：４１９〜３１頁）ように行った。インプット全細胞抽出ＤＮＡおよびＣｈＩＰに富んだＤＮＡを連結媒介性ＰＣＲによって増幅し、標的プロモーターのｑＰＣＲ評価に供した。ＣｈＩＰエンリッチメントをインプットＤＮＡの割合として評価した。
【０４３６】
組織特異的発現
５’融合パートナーの組織特異的発現を決定するために、Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータベースを用いて、国際ゲノムコンソーシアムのｅｘｐＯデータセットを調べ、これは２９の異なるタイプの６３０個の腫瘍由来の発現プロファイルからなっていた。
【０４３７】
ＤＤＸ５−ＥＴＶ４のクローニングおよび発現
全長ＤＤＸ５−ＥＴＶ４融合ｃＤＮＡを、症例８５番の５’ＲＬＭ−ＲＡＣＥ生産物を用いて、コザック配列−ＦＬＡタグ−開始コドン−ＤＤＸ５  Ｎ末端ヌクレオチド配列（５’−ＣＡＣＣ−ＡＴＧ−ＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧＴＣＧＧＧＴＴＡＴＴＣＧＡＧＴＧＡＣＣＧＡＧＡＣＣＧＣＧＧＣ−３’；配列番号４３８）を含む５’プライマーと終止コドンまでのＥＴＶ４のＣ末端ヌクレオチドに対応する３’プライマー（ＣＴＡＧＴＡＡＧＡＧＴＡＧＣＣＡＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＣＡ；配列番号４３９）により、ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）クローニングシステムエントリーベクターｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＬＲクロナーゼＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＥＮＴＲ−Ｄ−Ｔｏｐｏ−ＤＤＸ５−ＥＴＶ４をｐＣＤＮＡ３．２−ＤＥＳＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み換えることによって発現構築物を生じさせた。ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞をｐＣＤＮ３．２−ＦＬＡＧ−ＤＤＸ５−ＥＴＶ４発現構築物で一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞由来の溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ポリ二フッ化ビニリデンメンブレン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に転写した。このメンブレンをブロッキング緩衝液［トリス緩衝化生理食塩水、０．１％ツイーン（ＴＢＳ−Ｔ）、５％脱脂粉乳］中で１時間インキュベートし、１：１０００に希釈したＦＬＡＧタグに対するウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ
Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に一晩４℃でインキュベートした。ＴＢＳ−Ｔによる洗浄後、このブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした二次抗体と共にインキュベートし、製造業者（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって説明されるように増強ケミルミネッセンスシステムによってシグナルを視覚化した。ローディングが等しいことを確認するために、ブロットをＧＡＰＤＨ（Ａｂｅａｍ）を用いてブロットを再精査した。前立腺組織溶解物をＥＴＶ４ポリクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）を用いた免疫ブロットによって同様に処理した。
【０４３８】
Ｂ．結果
前立腺癌における全２７のＥＴＳファミリー遺伝子、および全５つの公知の５’融合パートナーの再配列状態の包括的プロファイルを、臨床的に局在化された前立腺癌の１１０症例から構成されたＴＭＡに関するＦＩＳＨ分断プローブハイブリダイゼーションを用いて作製した（図５４）。
【０４３９】
２７のＥＴＳ転写因子および５つの５’融合パートナーについての遺伝子再配列のマトリックス表示を作製した（図５５ａ〜ｂ）。ＥＲＧは前立腺癌において最も共通して再配列したＥＴＳ遺伝子であり、ＴＭＰＲＳＳ２は最も共通して再配列した５’融合パートナーであった。このＴＭＡに対して表されるコホートでは、ＥＲＧは４３％（４３／９９）の症例で再配列し、そのうち６３％（２７／４３）は、以前の報告（参照により全体として援用されるＰｅｒｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６年；６６巻（１７号）：８３３７〜４１頁）に類似した、その５’末端の欠失を通じてＴＭＰＲＳＳ２に融合した。全体として、ＥＲＧ陽性症例の９８％（４２／４３）は５’融合パートナーとしてＴＭＰＲＳＳ２を有していた。ＥＲＧ陽性症例の１つは、ＴＭＰＲＳＳ２について陰性であった。本発明者らのＦＩＳＨスクリーニングのさらなる調査により（図５５）、この症例は５’パートナーであるＳＬＣ４５Ａ３の再配列を有していた（症例１０２番）。ＳＬＣ４５Ａ３：ＥＲＧの遺伝子融合をＳＬＣ４５Ａ３の５’側のプローブとＥＲＧの３’側のプローブを用いた融合アッセイにより確認し（図５６）、したがって、ＥＲＧの新規な５’融合パートナーとしてのＳＬＣ４５Ａ３と関係していた。この所見に先んじて、ＥＲＧは、おそらく第２１染色体上の同時局在化に起因して、ＥＲＧは専らＴＭＰＲＳＳ２と一組になると考えられた。ＳＬＣ４５Ａ３は、ＥＴＶ１とＥＴＶ５の５’融合パートナーであるものとして以前に同定された（参照により全体として本明細書に援用されるＨｅｌｇｅｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８年；６８巻（１号）：７３〜８０頁）。
【０４４０】
ＥＲＧとは対照的に、ＥＴＶ１は、患者の約５％（５／９９）において再配列した（症例４、５１、５４、７２、９１番、図５５ａ〜ｂ）。ＥＴＶ１は、ＴＭＰＲＳＳ２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＨＥＲＶＫ＿２２ｑ１１．２３、Ｃ１５ＯＲＦ２１およびＨＮＲＰＡ２Ｂ１を含む多数の遺伝子に融合することが示されている。この研究において示された１１０症例において、症例４番および７２番は、それぞれＳＬＣ４５Ａ３およびＨＮＲＰＡ２Ｂ１に加えて、ＥＴＶ１における再配列を有していた。融合プローブＦＩＳＨアッセイを利用して、これらの２つの症例において、それぞれＳＬＣ４５Ａ３：ＥＴＶ１（ＳＬＣ４５Ａ３の５’側のプローブとＥＴＶ１の３’側のプローブ）、およびＨＮＲＰＡ２Ｂ１：ＥＴＶ１（ＨＮＲＰＡ２Ｂ１の５’側のプローブとＥＴＶ１の３’側のプローブ）を確認した。症例７２番は、文献にて報告されたＨＮＲＰＡ２Ｂ１：ＥＴＶ１の第２の症例であり、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１：ＥＴＶ１融合は前立腺癌において再発性であることが示唆された。ＳＬＣ４５Ａ３：ＥＴＶ１融合物を有した症例４番は先に報告された（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２００７年；４４８巻（７１５３号）：５９５〜９頁）のと同じ症例であることが分かった。ＥＴＶ１陽性症例５１番、５４番、９１番では、公知の５’パートナーにおける再配列はＦＩＳＨによって同定されなかった。症例５４番では、ＲＬＭ−ＲＡＣＥを用いて、本発明者らは、ＥＴＶ１のエクソン１から４が前立腺ＥＳＴ遺伝子ＦＬＪ３５２９４（１７ｐ１３．１）の５’配列の２６３塩基対で置換されていることを同定した（図５７Ａ）。
【０４４１】
ＥＴＶ４再配列は、本発明者らのコホートにおいて５％（５／１００）の患者に存在していた（症例４０番、４６番、５３番、６４番、８５番、図５５ａ〜ｂ）。症例６４番および８５番は、転位（分断）を通じて再配列を有し、ＥＴＶ４の５’側のプローブの欠失が症例４０番および４６番において同定された。対照的に、症例５３番は、ＥＴＶの３’側のプローブの欠失を示した（その意味は不明である）。注目すべきことに、症例４０番および６４番もＴＭＰＲＳＳ２分断プローブによってスクリーニングした場合にＴＭＰＲＳＳ２について異常を示した。これらの２つの症例は、融合プローブアッセイ（ＴＭＰＲＳＳ２の５’側のプローブおよびＥＴＶ４の３’側のプローブを採用）を用いてＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４融合物を有することを確認した。症例４０番では、分断シグナルの代わりに、５’末端欠失をＥＴＶ４の５’側および３’側のプローブを用いて検出し、これは、この症例におけるＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４融合物が不平衡な転位を通じて生じたことを示唆した。ＲＬＭ−ＲＡＣＥによって、ＥＴＶ４のエクソン１がＴＭＰＲＳＳ２のエクソン１−２と置換されたことがさらに示された。したがって、この症例は、以前に報告されたＴＭＰＲＳＳ２：ＥＴＶ４融合症例とは異なり、この場合、ＴＭＰＲＳＳ２の新規な上流エクソンがこの融合に関与していた（Ｔｏｍｌｉｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６年；６６巻（７号）：８３９６〜４００頁）。ＥＴＶ４は症例４６番および８５番において再配列される一方で、公知の５’パートナーにおける遺伝子異常はＦＩＳＨによって観察されなかった。ＲＬＭ−ＲＡＣＥは、これらの２つの症例においてＥＴＶ４転写産物を特徴付けた。症例４６番では、ＥＴＶ４のエクソン５は、従前報告された融合配列と一致した、１７ｑ２５．３に位置したＣＡＮＴ１遺伝子のエクソン１ａに融合した（参照により全体として本明細書に援用されるＨｅｒｍａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８年；６８巻（９号）：３０９４〜８頁）（図５７Ａ）。症例８５番では、別の新規な５’パートナー遺伝子であるＤＥＡＤ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ）ボックスポリペプチド５（ＤＤＸ５）がＲＬＭ−ＲＡＣＥによって同定された（図５７Ａ）。ＤＤＸ５−ＥＴＶ４の配列分析によって、融合転写産物がＥＴＶ４のエクソン５〜１３にフレームを合わせて融合した、ＤＤＸ５のエクソン１〜３からなっていることが示された（図５７Ａ）。ＦＬＪ３５２９４：ＥＴＶ１、ＣＡＮＴ１：ＥＴＶ４およびＤＤＸ５：ＥＴＶ４の遺伝子融合物を融合プローブＦＩＳＨアッセイによって確認した（図５８）。
【０４４２】
本コホートではＥＴＶ５再配列を有する症例は同定されなかった。残りの２３のＥＴＳ転写因子のうち、少ない割合の前立腺癌症例は、ＦＩＳＨスクリーニングストラテジーを用いて、ＥＴＳについて異常５’または３’欠失を示した（図ａ〜ｂ）。欠失の単一症例は、ＥＴＶ３、ＥＬＦ１およびＳＰＩＣの５’末端、ならびにＥＴＶ３、ＥＬＦ２およびＥＬＫ３の３’末端において見出された。約１Ｍｂの分断プローブアプローチを用いたＦＩＳＨスクリーニングにより、症例１２番のＥＬＫ３遺伝子座、および症例２１番のＥＬＦ４遺伝子座について分断シグナルが生じたが、この領域を狭めることによるさらなるＦＩＳＨ分析によって、ＥＬＦ４遺伝子の２２０Ｋｂ下流、およびＥＬＫ３遺伝子の１４０Ｋｂ上流のブレイクポイント位置が同定された。注目すべきことに、ＥＬＫ４再配列を検出するために用いられたＢＡＣは、上記２つの遺伝子の近似（約２０Ｋｂ）のため、ＳＬＣ４５Ａ３の異常を検出するために利用されたものと同じであった。分断シグナルは、４つの症例（４番、３９番、６７番および１０２番）において観察された。これらのうち、４番および１０２番は、それぞれＳＬＣ４５Ａ３：ＥＴＶ１およびＳＬＣ４５Ａ３：ＥＲＧ融合物を１２有することが同定された。これらの症例はＥＬＫ４とＳＬＣ４５Ａ３との融合物を有していなかった。したがって、これらの単独欠失の多くは、非特異的であり、非再発性病変の可能性がある。
【０４４３】
さらに、１１０人の患者ＴＭＡを前立腺癌におけるＥＴＳ異常の公知の５’パートナーのすべてについてスクリーニングし、４７％の症例（４８／１０２）においてＴＭＰＲＳＳ２が再配列したことが見出された。ＳＬＣ４５Ａ３は症例の２％（２／８９）で再配列され、次に、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１が１％（１／９９）であり、Ｃ１５ＯＲＦ２１は１％（１／８８）であった。ＨＥＲＶ−Ｋ＿２２ｑ１１．２３再配列はこのコホートで同定されなかった。ＦＩＳＨ分析により、ＥＴＳ遺伝子異常を伴わない５’パートナー再配列を有するいくつかの症例が見られ、これらの症例がＥＴＳ遺伝子融合パートナーを有しない可能性があることを示している（図５５ａ〜ｂ）。
【０４４４】
この研究において同定されたＥＴＶ１およびＥＴＶ４の５’融合パートナーを特徴付けた。Ｑ−ＰＣＲにより、ＥＴＶ１またはＥＴＶ４過剰発現が症例５４番、４６番、および８５番において確認され、それぞれＦＬＪ３５２９４：ＥＴＶ１、ＣＡＮＴ１：ＥＴＶ４およびＤＤＸ５：ＥＴＶ４融合物を有していた（図５９Ａ）。異常ＥＴＳ発現がＦＬＪ３５２９４、ＣＡＮＴ１およびＤＤＸ５の調節エレメントによって駆動された可能性があるため、前立腺癌におけるそれらの組織特異性およびアンドロゲン制御を調べた。ＴＭＰＲＳＳ２と同様に、ＳＬＣ４５Ａ３、ＦＬＪ３５２９４およびＣＡＮＴ１は、Ｏｎｃｏｍｉｎｅにアクセスされた国際ゲノムコンソーシアムのｅｘｐＯデータセットを用いた他の癌タイプと比較して、前立腺癌において顕著な過剰発現を示した（図５７Ｂ、Ｐ＝２．８×１０−７（ＦＬＪ３５２９４）；Ｐ＝６．８×１０−７（ＣＡＮＴ１））。対照的に、ＤＤＸ５はすべての腫瘍タイプにおいて高い発現を示し（図５７Ｂ）、これは、前立腺特異性というよりもハウスキーピング機能を有する可能性があることを示している。
【０４４５】
Ｑ−ＰＣＲによって、内因性ＦＬＪ３５２９４（４８時間で１１．６倍、Ｐ＝０．０００６）およびＣＡＮＴ１（２４時間で３．８倍、Ｐ＝０．００１４）の発現は、ＬｎＣａＰ前立腺癌細胞株において合成アンドロゲンＲ１８８１による処理によって有意に誘導された（図５９Ｂ）。ＣｈＩＰ分析は、ＦＬＪ３５２９４（９倍エンリッチメント、Ｐ＝０．００５）およびＣＡＮＴ１（４０倍エンリッチメント、Ｐ＝０．００１４）遺伝子におけるプロモーター領域のアンドロゲン受容体（ＡＲ）占有を示した（図５９Ｃ）。対照的に、ＤＤＸ５の発現はＲ１８８１刺激による影響はなく（図５９Ｂ）、ＡＲはＤＤＸ５のプロモーター領域に採用されなかった（図５９Ｃ）。したがって、ＦＬＪ３５２９４−ＥＴＶ１およびＣＡＮＴ１−ＥＴＶ４融合物は、前立腺特異的なアンドロゲン誘導の５’パートナーからの融合物を伴う再配列を含む、前立腺癌におけるクラスＩＩ遺伝子融合物として分類され得る；一方ＤＤＸ５−ＥＴＶ４はクラスＩＶ遺伝子融合物を表す可能性があり、そこでは、非組織特異的なプロモーターエレメントがＥＴＳ遺伝子発現を駆動する。
【０４４６】
ＦＬＪ３５２９４−ＥＴＶ１およびＣＡＮＴ１−ＥＴＶ４融合物は、５’パートナー由来の予測されない翻訳配列（エクソン）を含む。しかしながら、前立腺癌におけるほぼすべての従来報告された遺伝子融合物とは異なり、ＤＤＸ５：ＥＴＶ４融合転写産物は推定の融合タンパク質をコードし、これは、ＤＤＸ５タンパク質のＮ末端の１０２アミノ酸伸長（ｓｔｒｅｔｃｈ）がＥＴＶ４の４１６のＣ末端アミノ酸に融合していた（図５９Ｄ）。融合タンパク質は、フレームを合わせたＮ末端ＦＬＡＧエピトープタグをコードする発現ベクターに症例８５番由来の全長ｃＤＮＡをクローニングすることによって、このキメラ転写産物により発現させた。ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞への一過性トランスフェクションにより、ＤＤＸ５−ＥＴＶ４融合タンパク質の発現を、独立して誘導したクローンの全域で検出した（図５９Ｄ）。症例８５番がＤＤＸ５：ＥＴＶ４融合タンパク質を発現するかどうかを評価するために、組織抽出物を、ＥＴＶ４のＣ末端に対する抗体を用いたイムノブロット分析に曝露した（図５９Ｄ）。ＤＤＸ５：ＥＴＶ４陽性症例だけが異常な５７ｋＤａ融合タンパク質を発現した。
【０４４７】
すべての刊行物、特許、特許出願、および上述の明細書において述べた受託番号を参照により本明細書中に全体として援用する。本発明は特定の実施形態と関連させて記載されているが、特許請求の本発明はこのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際、本発明の記載の組成物および方法の様々な変形および変更は、当業者に明らかであり、以下の請求項の範囲内であると考える。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−８】
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【図９−９】
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【図９−１０】
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【図９−１１】
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【図９−１２】
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【図９−１３】
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【図９−１４】
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【図９−１５】
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【図９−１６】
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【図９−１７】
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【図９−１８】
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【図９−１９】
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【図９−２０】
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【図９−２１】
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【図９−２２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３６−３】
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【図３６−４】
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【図３６−５】
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【図３６−６】
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【図３６−７】
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【図３７】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３８−３】
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【図３８−４】
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【図３９】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４１−３】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１−１】
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【図５１−２】
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【図５２−１】
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【図５２−２】
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【図５３−１】
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【図５３−２】
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【図５４】
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【図５５−１】
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【図５５−２】
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【図５６】
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【図５７−１】
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【図５７−２】
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【図５８−１】
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【図５８−２】
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【図５９−１】
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【図５９−２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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