(57)【要約】      （修正有）【課題】組織修復材およびその製造方法。【解決手段】幹細胞自己生成組織とコラーゲンシートの複合体であって、コラーゲン層、幹細胞自己生成組織層および界面層を含む。幹細胞は、間葉系幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）。培養培地中に浸漬させたコラーゲンシート上へ幹細胞を播種し、培地中で２８日以上培養することにより、幹細胞自己生成組織とコラーゲンシートの複合体を形成させることによる、組織修復材の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）コラーゲン層；
（ｂ）幹細胞自己生成組織層；および
（ｃ）界面層；
を含み、当該界面層はコラーゲン層と幹細胞自己生成組織層の間に存在する、組織修復材。
【請求項２】
幹細胞が、間葉系幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、請求項１に記載の組織修復材。
【請求項３】
シート状である、請求項１または２に記載の組織修復材。
【請求項４】
腱、靱帯および軟骨の修復のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組織修復材。
【請求項５】
出発原料であるコラーゲンシートに対するシート強度比が１．０以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組織修復材。
【請求項６】
組織修復材の製造方法であって、以下の工程：
（１）幹細胞を、培養培地中に浸漬させたコラーゲンシート上に播種する；
（２）（１）で播種した幹細胞を培地中で２８日以上培養することにより、幹細胞自己生成組織とコラーゲンシートの複合体を形成させる；
を含む、前記方法。
【請求項７】
幹細胞が、間葉系幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（１）において、間葉系幹細胞を４．０×１０５細胞／ｃｍ２〜６．０×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種することを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
工程（２）において、アスコルビン酸もしくはアスコルビン酸誘導体またはそれらの塩を含む培地中で培養することを特徴とする、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織修復材およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節に存在する腱、靱帯、軟骨は関節の安定を保つ重要な役割を担う一方で、一度損傷すると自己治癒しにくい特性を有している。これらの組織が損傷した場合、同一個体内の移植により治療が行われることが多いが、修復組織の力学特性が正常組織と比較して劣るという問題がある。
【０００３】
コラーゲン繊維からなるシートであるコラーゲンシート（ＣＳ）は、生体組織の修復に有用であることが報告されている（特許文献１、非特許文献１）。また、コラーゲンは細胞の伸展、増殖や細胞外基質生成を促進させることが知られており（非特許文献２）、特許文献２は軟骨細胞をコラーゲンに塗布して得られる人工膝半月を示唆している。
【０００４】
腱、靱帯、軟骨の修復に関する問題を解決するための別のアプローチとして、膝滑膜より採取した間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）にコラーゲンなどの細胞外基質（extracellular matrix：ＥＣＭ）を自己生成させて作製される幹細胞自己生成組織（stem cell-based self-assembled tissue:ｓｃＳＡＴ）が開発され、基礎的な研究が行われている（非特許文献３）。ｓｃＳＡＴは、当該技術分野においてティッシュ・エンジニアード・コンストラクト（tissue engineered construct：ＴＥＣ）としても知られている。ｓｃＳＡＴは、動物由来のコラーゲンや人工化合物からなるスキャフォールドを必要としないため、生体内に埋入した際に拒絶反応等を起こしにくいといった特徴を有している。これまでにｓｃＳＡＴは軟骨修復に効果があることが報告されている。しかし、ｓｃＳＡＴは細胞およびそれが自己生成する細胞外基質で構成される組織であり、薄く破れやすいなど移植手術の現場での取り扱いが難しい点が課題であったことに加え、修復組織の力学特性は正常軟骨と比較して低く、特に表層のコラーゲン密度が正常軟骨ほど高まらないことが課題となっている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１６−５０２４２６号公報
【特許文献２】特表２０１４−５０８５５５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】鈴木  大輔、他、日本臨床バイオメカニクス学会抄録集、Vol.39, pp.161, 2012
【非特許文献２】Gentleman, E., et al., Biomaterials, Vol.24, pp.3805-3813, 2003
【非特許文献１】Ando, W., et al., Biomaterials, Vol.36, pp.5462-5470, 2007
【非特許文献２】Ando, W., et al., European Cells and Materials, Vol.24, pp.292-307, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、組織修復材およびその製造方法を提供する。
上記のとおり、ｓｃＳＡＴは薄く破れやすいなど移植手術の現場での取り扱いが難しい点が課題であったことに加え、修復組織の力学特性は正常軟骨と比較して低いことも課題であった。本発明は、ｓｃＳＡＴの利用に関して、この課題を解決できる力学特性を有する組織修復材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
以上に鑑み、本件の発明者は、幹細胞自己生成組織（ｓｃＳＡＴ）およびコラーゲンシート（ＣＳ）に注目し研究を開始した。鋭意検討の結果、ｓｃＳＡＴをＣＳと複合することで、ｓｃＳＡＴの構造・力学特性を向上させることができることを見いだした。当該知見に基づいて、本発明は完成された。
【０００９】
すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
[１]（ａ）コラーゲン層；
（ｂ）幹細胞自己生成組織層；および
（ｃ）界面層；
を含み、当該界面層はコラーゲン層と幹細胞自己生成組織層の間に存在する、組織修復材。
[２]幹細胞が、間葉系幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、上記［１］に記載の組織修復材。
［３］シート状である、上記［１］または［２］に記載の組織修復材。
［４］腱、靱帯および軟骨の修復のための、上記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の組織修復材。
［５］出発原料であるコラーゲンシートに対するシート強度比が１．０以上である、上記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の組織修復材。
［６］組織修復材の製造方法であって、以下の工程：
（１）幹細胞を、培養培地中に浸漬させたコラーゲンシート上に播種する；
（２）（１）で播種した幹細胞を培地中で２８日以上培養することにより、幹細胞自己生成組織とコラーゲンシートの複合体を形成させる；
を含む、前記方法。
［７］幹細胞が、間葉系幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、上記［６］に記載の方法。
［８］工程（１）において、間葉系幹細胞を４．０×１０５細胞／ｃｍ２〜６．０×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種することを特徴とする、上記［６］または［７］に記載の方法。
［９］工程（２）において、アスコルビン酸もしくはアスコルビン酸誘導体またはそれらの塩を含む培地中で培養することを特徴とする、上記［６］〜［８］のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体は、豊富なコラーゲンを含有するとともに培養を継続することで引張特性が向上することが確認された。ｓｃＳＡＴを用いた組織修復ではコラーゲン密度の低い表層部の修復が課題であったが、ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体は軟骨表層や腱、靱帯修復に優れた効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体を引張試験に供した際の荷重−ひずみ線図である。グラフ中のS/C 7d、S/C 14d、S/C 28dは、それぞれ７日間、１４日間、２８日間培養したｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体を示す。グラフ中のscSAT 28dおよびCSは対照である。
【図２】図２は、ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体を引張試験に供した際の破断荷重を示すグラフである。グラフ中のS/C 7d、S/C 14d、S/C 28dは、それぞれ７日間、１４日間、２８日間培養したｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体を示す。グラフ中のscSAT 28dおよびCSは対照である。
【図３】図３は、ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体を引張試験に供した際の、荷重−ひずみ線図の線形部における傾きを剛性として評価した結果を示すグラフである。グラフ中のS/C 7d、S/C 14d、S/C 28dは、それぞれ７日間、１４日間、２８日間培養したｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体を示す。グラフ中のscSAT 28dおよびCSは対照である。
【図４】図４は、走査型電子顕微鏡によるS/C 7d群（ａ）、S/C 14d群（ｂ）、S/C 28d群（ｃ）の観察像である。観察層のそれぞれにおいて、界面層の厚さを矢印で表す。
【図５】図５は、ｓｃＳＡＴ／ＲＣＳ複合体およびｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ複合体を引張試験に供した際の破断荷重を示すグラフである。グラフ中のscSAT/RCSについて、１ｗ、４ｗ、および８ｗは、ＲＣＳ上で間葉系幹細胞をそれぞれ１週間、４週間、および８週間培養したｓｃＳＡＴ／ＲＣＳ複合体を示す。グラフ中のscSAT/SCSについて、１ｗ、４ｗ、および８ｗは、ＳＣＳ上で間葉系幹細胞をそれぞれ１週間、４週間、および８週間培養したｓｃＳＡＴ／ＲＣＳ複合体を示す。グラフ中のRCS、SCSおよびscSATは対照である。
【図６】図６は、ｓｃＳＡＴ／ＲＣＳ複合体およびｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ複合体の剛性を評価した結果を示すグラフである。グラフ中のscSAT/RCSについて、１ｗ、４ｗ、および８ｗは、ＲＣＳ上で間葉系幹細胞をそれぞれ１週間、４週間、および８週間培養したｓｃＳＡＴ／ＲＣＳ複合体を示す。グラフ中のscSAT/SCSについて、１ｗ、４ｗ、および８ｗは、ＳＣＳ上で間葉系幹細胞をそれぞれ１週間、４週間、および８週間培養したｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ複合体を示す。グラフ中のRCS、SCSおよびscSATは対照である。
【図７】図７は、ｓｃＳＡＴ／ＲＣＳ複合体についてのＨＥ染色断面像（上段）、ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ複合体についてのＨＥ染色断面像（中段）、およびｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ複合体についてのＳＥＭによる組織断面像（下段）である。４ｗは４週間培養した複合体、８ｗは８週間培養した複合体であることを示す。
【図８】図８は、ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ複合体を埋入した後摘出した膝蓋腱の膝蓋骨と脛骨の引張強度を示すグラフである。グラフ中のscSAT/SCSは、ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ複合体を埋入したscSAT/SCS群の結果を示す。対照である正常群および切除群の結果は、グラフ中で「正常」および「切除」として記載した。
【図９】図９は、ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ複合体を埋入した後摘出した膝蓋腱の膝蓋骨と脛骨について、低ひずみ域（ひずみ５〜１０％）および線形部分の接線係数を示すグラフである。グラフ中のscSAT/SCSは、ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ複合体を埋入したscSAT/SCS群の結果を示す。対照である正常群および切除群の結果は、グラフ中で「正常」および「切除」として記載した。
【図１０】図１０は、ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ複合体を埋入した後摘出した膝蓋腱の横断面のＴＥＭ画像（左）および切除群の膝蓋腱の横断面のＴＥＭ画像（右）である。
【図１１】図１１は、ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ複合体を埋入した後摘出した膝蓋腱の縦断面のＳＥＭ画像（左）および切除群の膝蓋腱の縦断面のＳＥＭ画像（右）である。上段は低倍率の画像であり、下段は上段において実線の四角で囲った部分についての高倍率の画像である。
【図１２】図１２は、軟骨欠損モデルについて術後１２週で摘出した修復部の肉眼所見によるｓｃＳＡＴ／ＣＳ群（ａ）、ｓｃＳＡＴ群（ｂ）、欠損群（ｃ）の観察像である。
【図１３】図１３は、軟骨欠損モデルについて術後１２週で摘出した修復部の組織断面をサフラニンＯ−ファーストグリーン染色により観察した結果を示す画像である。左の画像はｓｃＳＡＴ／ＣＳ群、中央の画像はｓｃＳＡＴ群、右の画像は欠損群である。青色は軟骨下骨、赤色はプロテオグリカン、青紫色は核、緑色は他の組織、を示す。下段の画像は、それぞれの上段の画像において点線の四角で囲った部分についての高倍率の画像である。
【図１４】図１４は、正常軟骨（normal）、ｓｃＳＡＴを埋入した欠損軟骨（scSAT）、ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体を埋入した欠損軟骨（scSAT/CS）および組織修復材を埋入しなかった欠損群（defect）について、動摩擦係数の測定の際に記録した最初のストロークの動摩擦係数（First）と最後の動摩擦係数（Last）を示すグラフである。縦軸は動摩擦係数（Coefficient of dynamic friction）である。
【図１５】図１５は、正常軟骨（normal）、ｓｃＳＡＴを埋入した欠損軟骨（scSAT）、ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体を埋入した欠損軟骨（scSAT/CS）および組織修復材を埋入しなかった欠損群（defect）について、インデンテーション試験により求めた弾性係数を示すグラフである。縦軸は弾性係数（Elastic modulus）であり、単位はＭＰａである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
【００１３】
組織修復材の製造方法
一態様において本発明は、以下の工程：
（１）幹細胞を、培養培地中に浸漬させたコラーゲンシート上に播種する；
（２）（１）で播種した幹細胞を培地中で２８日以上培養することにより、幹細胞自己生成組織とコラーゲンシートの複合体を形成させる；
を含む、組織修復材の製造方法に関する。
【００１４】
上記の方法において、幹細胞の種類は特に限定されないが、例えば、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、からなる群より選択してもよい。好ましくは、幹細胞は間葉系幹細胞である。幹細胞は哺乳動物由来の細胞、好ましくはヒト由来の細胞である。
【００１５】
コラーゲンシート（ＣＳ）は、コラーゲン線維で構成されるシート状の高分子材料である。すなわち、本発明の方法に使用するＣＳは、生体に存在するコラーゲンと同様に、分子同士が会合した線維構造を保持したコラーゲンで構成される。ＣＳを構成するコラーゲンの線維直径は、特に限定されないが、例えば、０．１０μｍ〜０．５μｍ、０．１０μｍ〜０．３μｍ、０．１５μｍ〜０．２５μｍであってもよい。
【００１６】
ＣＳの厚みは、特に限定されず、移植手術の現場での取り扱いが容易であり、かつ、組織修復材として生体に埋め込むのに適した厚さという観点から当業者が適宜設定することができる。この観点に照らせば、例えば８００μｍ〜２０００μｍの厚みを有することが好ましい。
【００１７】
ＣＳを構成するコラーゲンの由来は特に限定されない。好ましくは哺乳動物、特にブタ由来のコラーゲンを含む。
ＣＳの間隙率は、特に限定されないが、例えば、０．３５以下、０．３０以下、０．２５以下、０．２以下であってもよい。ＣＳの間隙率は、組織観察または走査型顕微鏡（ＳＥＭ）観察によって測定することができる。ＣＳの間隙率は、例えば、ＣＳを冷凍・解凍を繰り返すことで調整することが可能である。
【００１８】
上記の方法の工程（１）において、幹細胞を播種する密度は特に限定されないが、例えば、１．０×１０５細胞／ｃｍ２〜１．０×１０６細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種してもよく、好ましくは４．０×１０５細胞／ｃｍ２〜６．０×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種する。さらに好ましくは４．０×１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種する。
【００１９】
培養培地または培地は、幹細胞の培養に適した培地である限り特に限定はないが、例えば、ＤＭＥＭなどを好適に使用することができる。培養培地または培地は、血清、抗生物質等の追加の成分を含んでいてもよく、これらは培養する幹細胞の種類に応じて当業者が適宜選択することができる。培養温度は、幹細胞の培養に適した温度である限り特に制限はなく、当業者が適宜選択することができる。好ましい培養温度は、例えば、３５℃〜４０℃、より好ましくは３７℃である。
【００２０】
特に工程（２）において、培地は、アスコルビン酸もしくはアスコルビン酸誘導体またはそれらの塩を含むことが好ましい。アスコルビン酸もしくはアスコルビン酸誘導体またはそれらの塩は、細胞によるコラーゲンを含む細胞外基質の生成を向上させる作用がある。
【００２１】
アスコルビン酸誘導体は、特に限定されないが、アスコルビン酸の２位、３位、５位、および／または６位の水酸基が、リン酸、硫酸、グルコースなどの糖、脂肪酸（例えば、ステアリン酸、パルミチン酸、ヘキシルデカン酸、など）、でエステル化された誘導体やアルキル基（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル）でエーテル化された誘導体、などが挙げられる。アスコルビン酸誘導体には、アスコルビン酸２−リン酸、アスコルビン酸２−硫酸、アスコルビル−２−グルコシド、アスコルビル−６−グルコシド、が含まれてもよい。
【００２２】
アスコルビン酸の塩またはアスコルビン酸誘導体の塩は、特に限定されないが、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（マグネシウム塩、カリウム塩など）を含む。
【００２３】
アスコルビン酸もしくはアスコルビン酸誘導体またはそれらの塩は、水和物の形で存在していてもよい。
工程（２）において、ＣＳ上に播種した幹細胞を培地中で培養することにより、幹細胞がＣＳ上で組織化しつつ、ＣＳのコラーゲンを分解しながらＣＳ内部に浸潤する。ＣＳ内部に浸潤した幹細胞は、浸潤した領域に新たな基質を生成し、ｓｃＳＡＴとＣＳの複合組織を形成する。この複合組織を本明細書において「界面層」と記載する。界面層は、培養時間の増加に伴い厚さが増加し、培養２８日（４週）で、約３〜１０μｍに達する。したがって、工程（２）においてＣＳ上に播種した細胞を培地中で培養することにより、コラーゲン層、ｓｃＳＡＴ層、およびコラーゲン層とｓｃＳＡＴ層の間に存在する界面層を含む、ｓｃＳＡＴとＣＳの複合体が形成される。このｓｃＳＡＴとＣＳの複合体は、組織修復材として利用できる。
【００２４】
工程（２）において、ＣＳ上に播種した幹細胞を培地中で培養する期間は２８日（４週）以上、好ましくは３０日以上、３５日（５週）以上、４２日（６週）以上、４９日（７週）以上、５６日（８週）以上である。培養期間の上限は、特に制限されないが、幹細胞の継続培養に適した期間の上限として当業者が把握する期間であり得る。そのような培養期間の上限は例えば約３９２日（約５６週）である。
【００２５】
工程（２）において、培養期間を２８日以上とするのは、得られるｓｃＳＡＴとＣＳの複合体が、組織修復材として好ましい力学特性を有するためである。短い培養期間では、幹細胞がＣＳのコラーゲンを分解しながらＣＳ内部に浸潤するために破断荷重または剛性は、出発原料のＣＳの値よりも低下する傾向がみられる。培養期間が２８日以上になると、界面層が十分に形成され、ｓｃＳＡＴとＣＳの複合体の破断荷重および／または剛性が出発原料のＣＳの値と同等かそれ以上に回復する。また、さらに培養期間長くすることで、ｓｃＳＡＴとＣＳの複合体の破断荷重および／または剛性が、出発原料のＣＳの値およびＣＳなしで形成させたｓｃＳＡＴの値よりも大きくなる。したがって、工程（２）においてコラーゲンシート上に播種した幹細胞を２８日以上培養することにより得られるｓｃＳＡＴとＣＳの複合体は、組織修復材として好ましい力学特性を有する。
【００２６】
組織修復材
一態様において本発明は、
（ａ）コラーゲン層；
（ｂ）幹細胞自己生成組織層；
（ｃ）界面層；
を含み、当該界面層はコラーゲン層と幹細胞自己生成組織層の間に存在する、組織修復材に関する。
【００２７】
当該組織修復材は、上述した組織修復材の製造方法により作製されるものであってもよい。
コラーゲン層は、生体に存在するコラーゲンと同様に、分子同士が会合した線維構造を保持したコラーゲンで構成される。ＣＳを構成するコラーゲンの線維直径は、特に限定されないが、例えば、０．１０μｍ〜０．５μｍ、０．１０μｍ〜０．３μｍ、０．１５μｍ〜０．２５μｍであってもよい。コラーゲンの由来は特に限定されない。好ましくは哺乳動物、特にブタ由来のコラーゲンを含む。
【００２８】
コラーゲン層の厚みは、特に限定されず、移植手術の現場での取り扱いが容易であり、かつ、組織修復材として生体に埋め込むのに適した厚さという観点から当業者が適宜設定することができる。この観点に照らせば、例えば８００μｍ〜２０００μｍの厚みを有することが好ましい。
【００２９】
幹細胞自己生成組織層（ｓｃＳＡＴ層）は、幹細胞に細胞外基質を自己生成させることで形成される層である。幹細胞の種類は特に限定されないが、例えば、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、からなる群より選択してもよい。好ましくは、幹細胞は間葉系幹細胞である。幹細胞は哺乳動物由来の細胞、好ましくはヒト由来の細胞である。
【００３０】
界面層は、幹細胞自己生成組織とコラーゲンの複合組織であり、幹細胞がコラーゲン材料の内部にコラーゲンを分解しながら浸潤し、その浸潤した領域に新たな細胞外基質を生成することで生じる層である。この界面層が存在することで、本発明の組織修復材は優れた力学特性および組織修復効果を発揮していると考えられる。
【００３１】
本発明の組織修復材の形状は特に限定されないが、好ましくはシート状である。
本発明の組織修復材において、界面層の厚みは３μｍ以上、好ましくは５μｍ以上である。
【００３２】
組織修復材の強度は、破断荷重を測定することにより評価できる。破断荷重は引張試験機を用いて、試験サンプルが破断するまで引張荷重を加えることで測定および評価できる。そのような方法の一例は、実施例１及び２に記載される。また、組織修復材の強度は、出発材料であるコラーゲンシートの破断荷重に対する組織修復材の破断荷重の比として表されるシート強度比により、相対的に評価することも可能である。本発明の組織修復材のシート強度比は、出発材料であるコラーゲンシートに対して１以上、１．２以上、１．５以上、２．０以上、２．５以上、３．０以上である。
【００３３】
組織修復材の特性はまた、剛性を求めることでも評価できる。剛性は、引張試験機を用いて、試験サンプルに引張荷重を与えて得られた荷重−ひずみ線曲線について、線形部における傾きとして求めることができる。そのような方法の一例は、実施例１及び２に記載される。本発明の組織修復材の剛性は、出発材料であるコラーゲンシートの剛性と比較して１倍以上、１．２倍以上、１．５倍以上、２．０倍以上、２．５倍以上、３．０倍以上である。
【００３４】
本発明の組織修復材は、腱、靱帯および軟骨の修復のために用いることができる。腱、靱帯および軟骨の修復のために本発明の組織修復材を用いる際は、腱、靱帯および軟骨の欠損部位に本発明の組織修復材を置くことで埋入し、当該欠損部位を覆う皮膚を縫合すればよい。本発明の組織修復材に含まれるｓｃＳＡＴは細胞外基質を自己生成していることから接着因子等が分泌されるため、腱、靱帯および軟骨の欠損部位と組織修復材を抱合または接着するための特別な手順は不要である。
【実施例】
【００３５】
以下に本発明の具体例を示す。これらの具体例は、本発明を理解するための説明を提供することを目的とするものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００３６】
実施例１：ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体の力学特性評価（ウサギＭＳＣｓ）
１．１  ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体の作製
日本白色家兎膝関節滑膜より採取した間葉系幹細胞（MSCs）を、培養培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレイプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ））中に２４時間浸漬させたＣＳ（株式会社ニッピ）上に初期細胞密度４．０×１０５細胞／ｃｍ２で播種した。ＣＳはブタ真皮由来コラーゲン線維からなるシートであり、生体組織と同様の２０％〜３０％程度のコラーゲン密度、多孔性、架橋剤を使用していないという特徴を有している。細胞外基質生成を促進させる為、アスコルビン酸２−リン酸を０．２ｍＭ添加し、７日間、１４日間、および２８日間培養を行ってｓｃＳＡＴ／ＣＳの複合体（それぞれ、S/C 7d群, S/C 14d群, S/C 28d群と表記する）を作製した。比較対照には、ＣＳを用いずに２８日間培養したscSAT 28d群と、ＭＳＣｓを播種せずに培地に２８日間浸漬させたＣＳ群とを用いた。
【００３７】
１．２  ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体の力学試験
（１）力学試験方法
力学試験には本発明者が開発した引張試験機を用いた。試験片をチャック部で把時し、横幅６ｍｍに切りそろえた。２色のマーカをｓｃＳＡＴに取り付け、画像センサ（CV-700, Keyence）を用いてマーカ間の変位を計測し、非接触でひずみを測定した。ひずみゲージを用いてチャック部のひずみを計測し、荷重を測定した。プレロードを４ｍＮ与え，その状態をひずみ０と定義し、引張速度０．０５ｍｍ／ｓでｓｃＳＡＴが破断するまで引張った。試験は、３７℃のＰＢＳ（−）溶液中で行った。ｓｃＳＡＴの厚さと引張試験機のチャック部幅６ｍｍから試験片の断面積を求めた。荷重−ひずみ関係とその線形部分の傾きおよび破断荷重を求めた。
【００３８】
（２）力学試験結果
引張試験により得た代表的な荷重−ひずみ線図を図１に、破断荷重を図２に示す。破断ひずみは，S/C 7d群が０．５６９±０．２４３、S/C 14d群が０．３６８±０．１７３、S/C 28d群が０．２６６±０．０５０、scSAT 28d群が０．４２８±０．０８７、ＣＳ群が０．２１３±０．０１８であった。S/C 28d、scSAT 28d群は非線形性が強かった。
【００３９】
破断荷重はS/C 7d群が０．１３２±０．０１６Ｎ、S/C 14d群が０．０７２±０．０２５Ｎとなり、S/C 14d群の破断荷重はS/C 7d群と比較して有意に低下した。S/C 28d群の破断荷重は０．１２０±０．０１３ＮとなりS/C 14d群と比較して有意に増大した。scSAT 28dの破断荷重は０．１１４±０．０１０Ｎ、ＣＳ群が０．０７４±０．０２４Ｎとなり、S/C 7d、S/C 28d、scSAT 28d群は同程度の値を示した。
【００４０】
また、荷重−ひずみ線図の線形部における傾きを剛性として評価した結果を図３に示す。S/C 7d群の接線係数が０．３０５±０．０７４Ｎ、S/C 14d群が０．２５８±０．１１６Ｎ、S/C 28d群が０．６４４±０．１８８Ｎ、scSAT 28d群が０．５２６±０．１７４Ｎ、ＣＳ群が０．２６８±０．０６２Ｎとなり、S/C 28d群、scSAT 28d群は、S/C 7d群、S/C 14d群、ＣＳ群と比較して有意に高い値となった。
【００４１】
１．３  ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体の組織観察
（１）組織観察方法
試験片をカーノフスキー（Karnovsky）溶液に２４時間浸漬させて固定した後、１％四酸化オスミウム溶液により２時間の固定処理を行った。その後、５０、７０、８０、９０、９５％エタノールの順に各２０分間浸漬させ、３回１００％エタノールで８分間浸漬させ脱水し、臨界点乾燥した。その後Ｐｔ−Ｐｄを１０ｎｍコーティングし、走査型電子顕微鏡（SEM, JSM-6380LA, JEOL）で組織の断面と表面を観察した。
【００４２】
（２）組織観察結果
走査型電子顕微鏡によるS/C 7d群（ａ）、S/C 14d群（ｂ）、S/C 28d群（ｃ）の観察像を図４に示した。観察像のそれぞれにおいて幹細胞自己生成組織とコラーゲンが複合した界面層の厚さを矢印で表した。S/C 7d群ではＣＳ上面にｓｃＳＡＴが組織化し、組織表面は滑らかであった。S/C 14d群では細胞がＣＳ内部に浸潤する様子が観察された。S/C 28d群では界面層の厚さがS/C 7d群、S/C 14d群と比較して増大していることが分かった。
【００４３】
１．４  考察
Ｓ／Ｃ群の破断荷重は培養７日目から１４日目にかけて減少し、２８日目に再び向上した。Ｓ／Ｃ培養１４日目でＣＳ内へのＭＳＣの浸潤が確認されたことからＣＳが分解されたために破断荷重が低下し、Ｓ／Ｃ培養２８日目に観察された、生成されたＥＣＭによる界面層の厚さの増大により、再び破断荷重が向上したと考えられる。また、S/C 28d群はS/C 7d群、S/C 14d群、ＣＳ群と比較して剛性において有意に高い値を示し、荷重−ひずみ線図ではscSAT 28d群も有する非線形性の向上を示すなど、界面層の厚さの増大により物性の変化を伴った引張特性の向上が確認された。
【００４４】
実施例２：ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体の力学特性評価（ヒトＭＳＣｓ）
２．１  ＣＳの構造解析
株式会社ニッピにより開発された構造の異なるラフＣＳ（Rough CS：ＲＣＳ）とスムースＣＳ（Smooth CS：ＳＣＳ）を培地に１週間浸漬し、カーノフスキー溶液に２４時間浸透させ固定した。次に、７０、８０、９０％のエタノールに各１時間浸漬し、１００％のエタノールに１時間浸漬を２回行った。その後、キシレンに２時間浸漬し、６時間パラフィンに浸漬した。試料をパラフィンで包埋し、ミクロトームで厚さ４μｍに薄切し、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色により組織断面を観察した。また、カーノフスキー溶液で２４時間前固定した後、１％四酸化オスミウム溶液により２時間後固定処理を行った。その後、５０、７０、８０、９０、９５％の順に各１５分間エタノールに浸漬し、１００％エタノールに８分間浸漬を３回行い、臨界点乾燥した。Ｐｔ−Ｐｄを１０ｎｍコーティングして、走査型電子顕微鏡（SEM, JSM-6380LA, JEOL)で観察した。ＨＥ染色画像を染色されていない領域を間隙と定義してＲＣＳ、ＳＣＳの間隙率を算出した。ＳＥＭの観察画像からＲＣＳ、ＳＣＳの線維直径を計測した。
【００４５】
ＲＣＳとＳＣＳの間隙率はそれぞれ０．３８±０．０６、０．１９±０．０３であり、ＲＣＳの方がＳＣＳよりも有意に高かった。ＲＣＳ、ＳＣＳの線維直径はそれぞれ０．１９±０．０５μｍ、０．２１±０．０７μｍであり，同程度の値だった．
２．２  ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体の作製
ＲＣＳまたはＳＣＳ上にヒト膝滑膜由来ＭＳＣｓを初期細胞密度４．０×１０５細胞／ｃｍ２で培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）／ストレイプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ））中に播種し、０．２ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸を含む培地中で１、４、または８週間培養し、ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体を作製した（それぞれ、scSAT/RCS 1w群、scSAT/RCS 4w群、およびscSAT/RCS 8w群、ならびにscSAT/SCS 1w群、scSAT/SCS 4w群、およびscSAT/SCS 8w群と表記する）。比較対照として、ＣＳを用いずに最も力学特性が向上する４週間の培養を行ったｓｃＳＡＴ群と、４週間培地に浸漬したＲＣＳ群、ＳＣＳ群を作製した。
【００４６】
２．３  ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体の引張試験
（１）引張試験方法
試験片をスライドガラスに広げてカバーガラスで挟み、スライドガラスとカバーガラス間距離を５カ所測定し、その平均を厚さとした。マイクロ引張試験機（小川  充、日本機械学会バイオフロンティア講演会講演論文、Vol.19, pp.101-102, 2008）に試験片を把持し、プレロードを４ｍＮ、引張速度０．０５ｍｍ／ｓで試験片が破断するまで引張荷重を与えた。試験は、３７℃のリン酸緩衝塩（−）溶液中で行った。破断荷重と降伏領域を除いた破断直前の５％のひずみ区間の剛性を求めた。
（２）引張試験結果
ｓｃＳＡＴの厚さは約３００μｍであるのに対し、ｓｃＳＡＴ／ＲＣＳ、ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳの厚さは約１０００μｍだった。破断荷重の結果を図５に、剛性の結果を図６に示す。scSAT/RCS 1w群の破断荷重はＲＣＳ群よりも有意に低かった。培養を継続したscSAT/RCS 8w群の破断荷重および剛性はscSAT/RCS 1w群やscSAT/RCS 4w群と比べ増大したが、ＲＣＳ群と同程度の値だった。一方、scSAT/SCS 1w群の破断荷重はＳＣＳ群と比較して低下したが、その後培養を継続したscSAT/SCS 4w群の破断荷重はscSAT/SCS 1w群と比較して有意に増大した。さらに培養を継続したscSAT/SCS 8w群の破断荷重は、scSAT/SCS 4w群、ＳＣＳ群、およびｓｃＳＡＴ群と比較して有意に増大した。scSAT/SCS 8w群の剛性は、scSAT/SCS 1w群、scSAT/SCS 4w群、およびＳＣＳ群と比較して有意に高く、ｓｃＳＡＴ群とは有意な差はないが高かった。
【００４７】
２．４  ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体の組織観察
（１）組織観察方法
上記２．１の手法でＨＥ染色とＳＥＭによりｓｃＳＡＴ／ＲＣＳおよびｓｃＳＡＴ／ＳＣＳの組織断面を観察した。
【００４８】
（２）組織観察結果
ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体の組織観察結果を図７に示す。scSAT/RCS 4w群およびscSAT/RCS 8w群では、ＣＳ内にＭＳＣｓが分散している様子が観察された。一方、scSAT/SCS 4w群ではＭＳＣｓがＣＳのコラーゲンを分解しながら浸潤している様子が観察された。scSAT/SCS 8w群では、ＭＳＣｓがＣＳ内に浸潤した領域に新たな基質を生成し、組織最表層には線維性の基質が観察され、ＳＣＳ表層においてｓｃＳＡＴとＳＣＳの複合組織である界面層が生成されていた。
【００４９】
２．５  考察
scSAT/RCS 8w群の破断荷重はＲＣＳ群と同程度だったが、scSAT/SCS 8w群の破断荷重はscSAT/SCS 4w群、ＳＣＳ群、ｓｃＳＡＴ群と比較して有意に高かった。また、ｓｃＳＡＴ／ＲＣＳ群ではＲＣＳ内に細胞が分散しているのに対し、ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ群ではＳＣＳ表層に細胞が高密度に存在し、ｓｃＳＡＴとＳＣＳの複合体が生成していた。細胞の浸潤度は足場材料の間隙率に依存することが報告されている（Helary, C., et al., Biomaterials, Vol.26, pp.1533-1543, 2005）。ＲＣＳは間隙率が高く、細胞が浸潤しやすいため、ＲＣＳ内に細胞が分散したと考えられる。その結果，ｓｃＳＡＴの細胞密度と比較してＲＣＳ内の細胞密度が低く、ＭＳＣｓの生成した基質の密度も低くなり、破断荷重が増大しなかったと考えられる。一方で、ＳＣＳは間隙率が低いために、細胞が表層に高密度に存在し、ｓｃＳＡＴとＣＳの複合化が行われたと考えられる。この時にＳＣＳのコラーゲン線維や、培養過程で分解され低分子化したコラーゲンによりＭＳＣｓの基質生成が促進した結果、ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ群の破断荷重および剛性がＳＣＳ群やｓｃＳＡＴ群と比較して増大したと考えられる。本出願のｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ複合体は従来のｓｃＳＡＴと比較してコラーゲンを豊富に含み、優れた構造特性を有することから、腱、靱帯、軟骨修復に有効な生体材料であると考えられる。
【００５０】
実施例３：ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ複合体による膝蓋腱修復
３．１  実験方法
札幌医科大学動物実験室において，同大学倫理員会承認の下、以下の動物実験を行った。
【００５１】
（１）膝蓋腱欠損モデルの作製と修復方法
ＳＤラット（週齢１２週、オス）の両膝の膝蓋腱中央１／３を切除し、膝蓋腱欠損モデルを作製した。左膝の切除部に３週間培養したヒト由来ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ複合体を埋入し、縫合した（ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ群）。右膝は膝蓋腱を切除後、材料の埋入を行わず縫合した（切除群）。術後４週で膝蓋腱を両骨端ごと摘出した。また、週齢１２週のＳＤラット膝蓋腱を比較対照として用いた（正常群）。
【００５２】
（２）引張試験方法
摘出した膝蓋腱の膝蓋骨と脛骨をマイクロ引張試験機（今井俊文、修士論文、2008、 工学院大学）に把持部に固定し、ＣＣＤカメラで０°から１８０°まで１０°ごとに試験片の幅を計測し、断面積を算出した。プレロード５０ｍＮ、引張速度０．０５ｍｍ／ｓで試験片が破断するまで引張荷重を与えた。破断荷重を断面積で除し引張強度を求めた。また、ひずみ５〜１０％と応力が２ＭＰａ以上の線形部分の接線係数を求めた。
【００５３】
（３）組織観察方法
摘出した膝蓋腱を３％グルタルアルデヒドに４８時間浸漬した後、１％四酸化オスミウムに２時間浸漬し、固定した。次に５０、７０、８０、９０、９５、１００％のエタノールで各１５分間脱水処理を行った。その後、１００％アセトンに１５分浸漬を３回行った。試料を樹脂に包埋後８０ｎｍに薄切し、ウランと鉛により電子染色を行い、透過型電子顕微鏡（TEM, JEM-1400, JEOL）で組織横断面を観察した。また同様に修復腱を固定、エタノール脱処理まで行った後、ｔ−ブチルアルコールに２０分間浸漬を３回行い、凍結乾燥した。オスミウムと金をそれぞれ１０ｎｍコーティングし、ＳＥＭ（JSM-6510Lv, JEOL）で組織縦断面を観察した。
【００５４】
３．２  実験結果
（１）引張試験結果
ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ群の引張強度は切除群と有意な差はなく、正常群よりも有意に低かった（図８）。ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ群の接線係数は低ひずみ域で正常群、切除群と比較して低かったが、線形部分の接線係数は切除群と比較して有意に増大し、正常群と同程度の値だった（図９）。
【００５５】
（２）組織観察結果
ＴＥＭによる横断面観察結果から、切除群では約５０ｎｍの細線維が均一に分布していたが、ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ群では、細胞近辺に直径約２００ｎｍの太い線維が多く観察された（図１０）。ＳＥＭによる縦断面観察結果から、切除群では細線維が均一に存在しているのに対し、ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ群では細線維とともに太い線維束が観察された（図１１）。さらに線維束を高倍率で観察すると、線維束内にクリンプ様構造が観察された。
【００５６】
３．３  考察
ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ群は高ひずみ域で急激に応力が増大し、接線係数が切除膝と比較して有意に増大し、正常レベルまで回復した。ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ群の線維構造を観察すると、直径の細い線維と太い線維、線維束が混在する二相性材料であり、線維束内にはクリンプ様構造が存在していた。この構造により、ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ群は、低ひずみ域では緩みのある細線維と太い線維が引張荷重を支えることで応力が緩やかに増加し、緩んだ線維がなくなった高ひずみ域では、太い直径の線維が引張荷重を支えることで急激に応力が増大する非線形な挙動を示したと考えられる（Reese, S., et al., Journal of Biomechanics, Vol.43, pp.1394-1400, 2010）。接線係数が正常レベルまで回復したことから、ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ複合体は腱修復に有用な生体材料であると考えられる。
【００５７】
実施例４：ｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ複合体による関節軟骨修復
４．１  実験方法
大阪大学医学部において、同大学倫理員会承認の下、以下の動物実験を行った。
【００５８】
（１）軟骨欠損モデルの作製と修復方法
日本白色家兎成熟個体（週齢４０週、メス）の膝蓋大腿関節部の大腿骨側滑走部分の軟骨においてドリルを用いて直径５ｍｍ，深さ２ｍｍの円柱状に欠損させ、軟骨欠損モデルを作製した。２週間培養したｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体（コラーゲンシートとしてＳＣＳを用い、家兎由来のＭＳＣｓを用いて実施例１の方法により作成した）を円形直径５ｍｍの生検トレパンを用いて成型し、右膝に埋入し縫合した（ｓｃＳＡＴ／ＣＳ群）。左膝は、比較対照として、欠損部に家兎由来ｓｃＳＡＴを埋入（ｓｃＳＡＴ群）、または材料を埋入せずに（欠損群）、縫合した。術後４週、１２週で修復部を含む軟骨を大腿骨ごと摘出した。摘出した修復部について、肉眼観察により所見を記録した。
【００５９】
（２）組織観察方法
組織を４％パラホルムアルデヒドと１％グルタルアルデヒドを用いて４日間固定した。４週間の脱灰操作の後、パラフィン包埋し、５μｍ厚の薄切標本を作製した。脱パラフィン操作の後、鉄ヘマトキシリン液に５分水洗の後、ファーストグリーン液３分、１％酢酸で洗浄した後に０．１％サフラニンＯ液に５分浸した。脱水、透徹後、封入し光学顕微鏡で観察した。
【００６０】
（３）動摩擦係数（Coefficinet of dynamic friction）の測定
摩擦試験機（Yarimitsu, S., et al., Biosurface and Biotribology, Vol.2, No.1, pp.40-47, March 2016）を用い、軟骨試料を３℃の生理食塩水中で、直径３ｍｍの球状ステンレス圧子を最大圧力２．２５ＭＰａ（ヘルツ接触仮定）で圧縮しながら、摩擦速度５ｍｍ／sで、ストローク２ｍｍ、トータル１０ｍ摩擦させた。その際の、最初のストロークの動摩擦係数（First）と最後の動摩擦係数（Last）を記録した。
【００６１】
（４）インデンテーション試験
直径３ｍｍの球状ステンレス圧子を速度３０μｍ／ｓで微小変形を与えた際の荷重変形曲線をヘルツ接触式にフィッティングさせ、弾性係数を求めた。
【００６２】
ヘルツ接触式は、ハインリッヒヘルツによって導かれた、弾性体と弾性体または剛体の接触における変形や圧力に関する理論式である。インデンテーション試験に当てはめると、剛体の球状圧子を弾性体の平面上試料に押し付ける際の荷重Ｐと変形量δに以下の関係があることになる。
【００６３】
【数１】
2018038714.tif 000002
【００６４】
実際のインデンテーション試験でδとＰの関係を求め、Ｅを修正して、上記の理論式が実験式に最も一致するときのＥを弾性率の推定値とした。なお、νは一定値として扱い、文献値０．４２（Lai, W. M. and Mow, V. C., Biorheology, Vol.17, Nos. 1-2, pp.111-123, 1980）を当てはめた。
【００６５】
４．２  実験結果
（１）肉眼所見および組織観察結果
術後１２週で摘出した修復部の肉眼所見によるｓｃＳＡＴ／ＣＳ群（ａ）、ｓｃＳＡＴ群（ｂ）、欠損群（ｃ）の観察像を図１２に示す。ｓｃＳＡＴ／ＣＳ群とｓｃＳＡＴ群において白濁色の軟骨様組織が欠損部表面に生成しており、材料の埋入による拒絶反応はなかった。さらに、ｓｃＳＡＴ／ＣＳ群は他群に比べ、修復組織が欠損部全域に行き渡り、平滑であった。
【００６６】
術後１２週で摘出した修復部について、その組織断面をサフラニンＯ−ファストグリーン染色により観察した結果を図１３に示す。ｓｃＳＡＴ群や欠損群と比較してｓｃＳＡＴ／ＳＣＳ群では軟骨の下にある軟骨下骨（図１３において青色で染色されている部分）が良好に形成され、その上に形成された軟骨層（図１３において赤色で染色されている部分）も正常軟骨と同じ程度に厚く、サフラニンＯの染色性も高かった。
【００６７】
したがって、ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体は、ｓｃＳＡＴと比較して優れた基質生成能を有しており、欠損群やｓｃＳＡＴ群と比較して修復が促進される。
（２）動摩擦係数の測定結果
動摩擦係数の測定の際に記録した最初のストロークの動摩擦係数（First）と最後の動摩擦係数（Last）を図１４に示す。それぞれの動摩擦係数の平均値±標準偏差を表１に示す。
【００６８】
【表１】
2018038714.tif 000003
【００６９】
正常群は摩擦係数が低めであり、摩擦距離とともに摩擦係数が低下した。ｓｃＳＡＴ群は摩擦距離とともに摩擦係数が増大するが、ｓｃＳＡＴ／ＣＳ群では正常軟骨と同様に摩擦係数が摩擦距離とともに低下した。欠損群は、摩擦係数が高めであった。
（３）インデンテーション試験結果
インデンテーション試験により求めた弾性係数を図１５に示す。それぞれの動摩擦係数の平均値±標準偏差を表２に示す。
【００７０】
【表２】
2018038714.tif 000004
【００７１】
正常軟骨は１０ＭＰａ以上の弾性係数を示した。一方、ｓｃＳＡＴ群および欠損群の弾性係数は有意に低い値を示した。すなわち、ｓｃＳＡＴ群は正常軟骨と比較して有意に柔らかいことが確認された。
【００７２】
ｓｃＳＡＴ／ＣＳ群の弾性係数の平均値は、正常軟骨のもの比較して低く計算されたものの、有意差はなかった。すなわち、ｓｃＳＡＴ／ＣＳ群は正常軟骨と比較して柔らかい傾向があるが有意差はない。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体は、豊富なコラーゲンを含有するとともに培養を継続することで引張特性が向上するなど、優れた力学特性を有しており、ｓｃＳＡＴ／ＣＳ複合体は軟骨表層や腱、靱帯修復に優れた効果を発揮する。
【図１】
2018038714.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2018038714.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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