(57)【要約】【課題】ＰＣＲ法において、高感度なＦＥＴ検出方法を提供することを目的とする。【解決手段】電界効果型トランジスタを使用して、ＰＣＲ法で増幅させた核酸または使用するプライマー部分を有する核酸を検出する方法において、電界効果型トランジスタの静電遮蔽距離が１ｎｍ超である核酸を検出する方法。ＰＣＲ反応液のイオン濃度が１．５〜２０ｍＭであってよい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電界効果型トランジスタを使用して、ＰＣＲ法で増幅させた核酸または使用するプライマー部分を有する核酸を検出する方法において、電界効果型トランジスタの静電遮蔽距離が１ｎｍ超である核酸を検出する方法。
【請求項２】
ＰＣＲ反応液のイオン濃度が３．０〜２０ｍＭである請求項１記載の核酸を検出する方法。
【請求項３】
前記プライマー部分を有する核酸を検出する請求項１または２記載の核酸を検出する方法。
【請求項４】
前記プライマー部分を有する核酸が、シトシンバルジ構造を有する請求項１から３いずれか記載の核酸を検出する方法。
【請求項５】
電界効果型トランジスタを使用して、ＰＣＲ法で増幅させた核酸または使用するプライマー部分を有する核酸を検出するＰＣＲ法で使用されるＰＣＲ試薬であって、ＰＣＲ反応液のイオン濃度が１．５〜２０ｍＭであるＰＣＲ試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ法によって増幅させた核酸またはＰＣＲ法で使用するプライマー部分を有する核酸を検出する方法、およびＰＣＲ法で使用する試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、ＰＣＲ法におけるＤＮＡ等の核酸の検出確認には、電気泳動法、蛍光強度測定が使用されてきた（特許文献１）。そして、ＰＣＲ法が広がり改良されるにつれ、より高感度、高再現性の進行検出、確認する方法が求められてきた。一方、新たな検出方法として、電界効果型トランジスタ（以下、ＦＥＴと略す）による電気的検出方法が提案された（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１３３４０２号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】大阪大学産業科学研究所  岡野誠之等「グラフェンＦＥＴによる蛍光性結合分子−ＤＮＡ結合の検出」第７５回応用物理学会秋季学術講演会講演予稿集、１７ａ−Ｂ１−３（２０１４秋）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながらＰＣＲ法におけるＦＥＴによる核酸の検出では、せっかくの高感度が期待されながら、十分に発揮できないことがあった。
【０００６】
本発明は、ＰＣＲ法において、高感度なＦＥＴによる核酸の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題の原因がＦＥＴの静電遮蔽距離の短さであり、その一つの要因が、ＤＮＡの複製に必須とされるＭｇ塩、ＰＨ調整のためのバッファー等１００ｍＭにおよぶ塩が反応溶液中に含まれているため電気的な外乱を起こすためであることを見出し、下記によって本発明の目的を達成した。
【０００８】
（１）電界効果型トランジスタを使用してＰＣＲ法で増幅させた核酸または使用するプライマー部分を有する核酸を検出する検出方法において、電界効果型トランジスタの静電遮蔽距離が１ｎｍ超である核酸を検出する方法。
【０００９】
（２）ＰＣＲ反応液のイオン濃度が３．０〜２０ｍＭである前記（１）記載の核酸を検出する方法。
【００１０】
（３）前記プライマー部分を有する核酸を検出する前記（１）または（２）記載の核酸を検出する方法。
【００１１】
（４）前記プリマー部分を有する核酸が、シトシンバルジ構造を有する前記（１）から（３）いずれか記載の核酸を検出する方法。
【００１２】
（５）電界効果型トランジスタを使用してＰＣＲ法で増幅させた核酸または使用するプライマー部分を検出するＰＣＲ法で使用されるＰＣＲ試薬であって、ＰＣＲ反応液のイオン濃度が１．５〜２０ｍＭであるＰＣＲ試薬。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＦＥＴによる検出を高感度で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明のＤＮＡ検出用素子を示す概念図である。
【図２】本発明の基体、中間層、ＤＮＡと結合する化合物層、の具体例を示す図である。
【図３】本発明の静電遮蔽距離を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
＜反応液＞
ＰＣＲ反応液には、一般に、プライマー、ｄＮＴＰ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型ＤＮＡ、バッファーが含まれる。これらは別々の容器に各々収容されたうえでＰＣＲ試薬キットとして市販され、使用時にこれらを混合することで反応液としている。本発明においては、例えばＰＣＲ反応液のイオン濃度を１．５〜２０ｍＭとすることで、後述のように基体からの静電遮蔽距離を１ｎｍ超とすることができるが、特にこれに限定されるものではない。
【００１６】
本発明では標準的なＰＣＲ反応液に使用されるバッファーＰＣＲＢｕｆｆｅｒを基本として説明する。その組成は、反応液中では、５０ｍＭ―ＫＣｌ、１０ｍＭ―Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭ−ＭｇＣｌ２である。
本発明においては、反応液のイオン濃度を１．５〜２０ｍＭとすることを特徴とするが、ＭｇＣｌ２以外の成分が１．５〜１８．５ｍＭであることが好ましい。ＫＣｌは、０〜１０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、１．５〜１８．５ｍＭであることが好ましい。ＭｇＣｌ２は０．５〜１．５ｍＭであることが好ましい。
この範囲であれば、ＰＣＲ法の進行に、ＦＥＴでの核酸検出に支障を与える程の差はなく、ＦＥＴにより核酸を検出確認することができる。
本発明のＦＥＴは、下記核酸検出素子を有している。
【００１７】
＜核酸検出用素子＞
本発明で用い得る核酸検出素子は、溶液中の所定の核酸を検出するための核酸を検出するための素子であって、少なくとも、ＦＥＴ又はその一部である基体、該核酸と結合する化合物層、をこの順で有する。
【００１８】
本発明のＦＥＴは、１ｎｍ超の静電遮蔽距離を有することを特徴とする。ＦＥＴから静電遮蔽距離範囲内に存在する核酸の負電荷が好感度に検出されるため、本発明のように長い静電遮蔽距離を有するＦＥＴを用いることで好感度での核酸検出が可能である。静電遮蔽距離の好ましい下限は、例えば２ｎｍであってよく、上限は特に限定されず例えば、１０ｎｍ以上であってよい。
【００１９】
本発明の静電遮蔽距離は、一般的に使われるデバイ長計算式により簡単に得ることができる。
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はデバイ長 、
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は溶液の比誘電率、
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は真空の誘電率、ｎはイオン濃度、ｚはイオンの価数である。
【００２０】
本発明で用い得る核酸検出素子は、好ましくは、基体と該核酸と結合する化合物層との間に、基体とは異なる中間層を有してもよい。なお、本発明の核酸には、例えばＤＮＡ、ＤＮＡ修飾体、ＲＮＡ、ＲＮＡ修飾体が含まれる。
【００２１】
≪プライマー部分を有する核酸≫
本発明の核酸検出用素子は、観測対象である溶液中に含まれるプライマー部分を有する核酸、又はＰＣＲ法で増幅させた核酸を検出する機能を有する。プライマー部分を有する核酸は、各核酸の配列に依存せずに幅広い核酸検出用素子を検出可能な点で、プライマー部分の他に二次構造または三次構造を有してよい。この二次構造または三次構造は、本発明の核酸検出用素子と結合する構造を有しており、結合する形態は特に問わないが、ヘアピン構造、中でもヘアピン型シトシンバルジ構造であることが好ましい。ヘアピン型シトシンバルジ構造を有することにより、検出用素子に結合する核酸の選択性が向上し、検出感度も上げることができる。ただし、本発明の核酸検出用素子は、これに限定されず、プライマー部分を有する核酸、又はＰＣＲ法で増幅させた核酸が有する部分配列に相補的な配列の核酸を有し、配列に依存して核酸を検出してもよい。
【００２２】
≪核酸と結合する化合物層≫
本発明の核酸検出用素子は、前記溶液中に含まれるプライマー部分を有する核酸と結合する化合物層を有してもよい。このプライマー部分を有する核酸と結合する化合物としては、被検出体である核酸（例えばＤＮＡ）と、選択的に結合する機能を有する化合物であることが好ましく、典型的には、核酸の有する二次構造または三次構造によって適宜選択される。
【００２３】
本発明の被検出体であるＤＮＡのプライマー部分の標識として、ヘアピン型シトシンバルジ構造が存在する場合、選択的に結合する化合物としては、ナフチリジン環を有する化合物、例えばＰｙＤＡＮＰを好ましく使用することができる。その他、特開２０１１−１８２７６３号公報、ＷＯ２０１３／１３３４０２号公報記載の化合物を使用することができる。
【００２４】
本発明のプライマー部分を有するＤＮＡと結合する化合物層は、例えば当該化合物としてＰｙＤＡＮＰを使用する場合、ＰｙＤＡＮＰが特に限定されないが５０質量％以上含有されていればよく、ＰｙＤＡＮＰの密度を上げるための他の添加剤を使用してもよい。
【００２５】
本発明の核酸と結合する化合物層は、本発明の中間層上に公知の方法で設けることができる。化合物の量としては、核酸検出感度向上の観点では１０９〜１０１５個／ｃｍ２であることが好ましく、例えばＰｙＤＡＮＰの場合は、１０９〜１０１３個／ｃｍ２であってよい。なお、このように高密度の化合物層は、後述の中間層を適切に選択することで形成可能である。
【００２６】
≪基体とは異なる中間層≫
本発明の中間層は、基体と、本発明の核酸と結合する化合物層の中間に位置し、基体とは異なった特性を有する。このため、中間層を適宜選択することで、基体に化合物層を直接積層する態様では得難い特性を付与し得る。
中間層は、核酸と結合する化合物層を固定する機能を有してもよく、化合物層の結合を制御しやすい中間層を採用することで密度を向上させ得る。
【００２７】
本発明の中間層を固定する機能は、核酸と結合する化合物を配列させ密度を向上させるような構造（例えばラビング）、あるいは、核酸と結合する化合物と反応するような化合物層であることが好ましいが、基体と、核酸と結合する化合物層のそれぞれと反応することにより設けられることがより好ましい。この反応が強いほど検出用素子としての耐熱性を向上させることができる。
【００２８】
本発明の中間層は、２官能性の化合物を含有することが好ましく、密度を正確に制御し、また密度を最大化し得るためには、自己組織化可能な化合物を使用することが好ましい。これら化合物の基体への付き量を制御しやすく、かつ、化合物への核酸の付き量も制御しやすいからである。
【００２９】
自己組織化可能な２官能性の化合物としては、カップリング剤、中でもシランカップリング剤等を使用することができる。これらの化合物は、例えば東京化成（株）、プルテック（株）によって市販されている。
【００３０】
本発明の中間層は、塗布、蒸着等の公知の方法によって作製することができる。例えば、シランカップリング剤であればおおよそ１０-6μｇ／ｃｍ２程度を付き量とすることが好ましい。
【００３１】
≪基体≫
本発明の基体は、本発明の検出用素子によって適宜選択されるが、ＦＥＴ等に使用される場合ゲート電極部であることが好ましく、グラフェン、シリコン酸化膜、有機膜を挙げることができ、中でも上記した適切な中間層を形成しやすい点で、シリコン酸化膜、有機膜が好ましい。これらは、公知の方法によって作製することができる。
本発明のＦＥＴにかかるゲート電極部は、通常のソース電極、ドレイン電極を挟む絶縁領域につながるものであることが好ましい。
【００３２】
＜実施態様＞
上記ＤＮＡ検出素子を、本発明のＦＥＴのゲート電極部に使用した場合について説明する。図１は本発明の検出用素子の概念図である。ソース電極（Ｓ）とドレイン電極（Ｄ）に挟まれたゲート電極部のシリコン酸化膜部分を基体１とし、その基体上に自己組織化性を有するシランカップリング剤による中間層２、その中間層上にシランカップリング剤の一方端と反応したＰｙＤＡＮＰ層３、とを順に有している。中間層があることにより、ＰｙＤＡＮＰの量は、適宜調整することができる。
【００３３】
プライマー部分を有するＤＮＡ４は、ヘアピン型シトシンバルジ構造5の部分で、検出用素子と選択的に結合し、ゲート電極部には結合量に応じて負の電荷が検知される。
図２は、基体１上に自己組織化型シランカップリング剤による中間層を設け、さらにＤｙＤＡＮＰを結合させた概念図である。このような強固な結合により、耐熱性を向上させることができ、ＰＣＲ法による高温サイクル（例えば９０℃近辺で３０〜４０サイクル）での使用が可能である。
【００３４】
例えば、試料中のＤＮＡの２本鎖を１本化するために９０℃程度とし、その後いったん６０℃程度に冷却しプライマー部分を有する核酸をＤＮＡに結合させ、ついで所定のＤＮＡを伸長させるためポリメラーゼの活性な７０℃を維持する。
【００３５】
本発明のＦＥＴによるＤＮＡ検出は、ＤＮＡを伸長させた後温度を、ＰＣＲ反応溶液中のプライマー部分を有する核酸（例えばヘアピン型シトシンバルジ構造も有する核酸）と化合物層（例えばＰｙＤＡＮＰを含む）との結合の平衡温度近辺まで下げ、この結合を行わせて行うことができる。つまり、プライマー部分を有する核酸の化合物層への結合に依存して、基体上の負電荷の量が増加するため、電荷量の変化をモニタリングすることでプライマー部分を有する核酸を検出することができる。
【００３６】
ここで、ＰＣＲ反応溶液中のプライマー部分を有する核酸は、試料中の標的核酸（上記プライマー部分が結合する対象）が存在する場合にはＰＣＲ進行過程で消費され、減少していく。このため、本発明の電界効果型トランジスタを使用することにより、ＰＣＲの進行過程におけるプライマー部分を有するＤＮＡの検出（定量）が可能であり、その結果に基づき試料中の標的核酸を検出（定量）が可能である。
【実施例】
【００３７】
下記組成のＰＣＲ試薬を使用し、ＤＮＡの量を検出することによりＰＣＲによるＤＮＡの増幅進行を確認した。結果を下記に示す。ＤＮＡの検出は、本発明の図１に示すＦＥＴにより（ＰｙＤＡＮＰは、１０１２個／ｃｍ２結合している）おこなった。
ＰＣＲ法が問題なく進行することを検出したものを○、検出しなかったものを×とした。比較例１は上述の標準キット処方である。デバイ長は、前述の式によって求めた。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
上記反応液のイオン濃度としてもＰＣＲは進行し、それをＦＥＴによってＤＮＡを検出することで判断することができることがわかる。
【符号の説明】
【００４０】
１  基体
２  中間層
３  プライマー部分を有するＤＮＡと結合する化合物層
４  プライマー部分を有するＤＮＡ
５  ヘアピン構造部分
６  静電遮蔽領域（この厚みが静電遮蔽距離を表す）
７  電荷被検出領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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