(57)【要約】【課題】  マラリア原虫のアルテミシニン耐性を検出するための簡便かつ容易な方法を提供すること。【解決手段】  （１）所定濃度のアルテミシニン又はその誘導体の存在下でマラリア原虫を少なくとも当該マラリア原虫の赤血球期生育ステージが完了する時間だけ培養する薬剤暴露工程、（２）前記薬剤暴露工程を経たマラリア原虫をアルテミシニン又はその誘導体を含まない状態で培養する通常培養工程及び（３）その後にマラリア原虫の生存率を調べる生存率確認工程を含むマラリア原虫のアルテミシニン耐性検出方法によって達成される。このとき、薬剤暴露工程におけるアルテミシニン又はその誘導体の濃度が、2.5nM〜10nMであることが好ましく、マラリア原虫が熱帯熱マラリア原虫であり、薬剤暴露工程の培養時間が、48時間〜120時間の間であることが好ましい。【選択図】          図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）所定濃度のアルテミシニン又はその誘導体の存在下でマラリア原虫を少なくとも当該マラリア原虫の赤血球期生育ステージが完了する時間だけ培養する薬剤暴露工程、（２）前記薬剤暴露工程を経たマラリア原虫をアルテミシニン又はその誘導体を含まない状態で培養する通常培養工程及び（３）その後にマラリア原虫の生存率を調べる生存率確認工程を含むマラリア原虫のアルテミシニン耐性検出方法。
【請求項２】
前記薬剤暴露工程におけるアルテミシニン又はその誘導体の濃度が、2.5nM〜10nMである請求項１に記載のマラリア原虫のアルテミシニン耐性検出方法。
【請求項３】
前記マラリア原虫が熱帯熱マラリア原虫であり、前記薬剤暴露工程の培養時間が、48時間〜120時間の間である請求項１または２に記載のマラリア原虫のアルテミシニン耐性検出方法。
【請求項４】
前記薬剤暴露工程の実施中に、所定の時間毎にアルテミシニン又はその誘導体を添加した培地を交換する薬剤添加培地交換工程を含む請求項１〜３のいずれか一つに記載のマラリア原虫のアルテミシニン耐性検出方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一つに記載のマラリア原虫のアルテミシニン耐性検出方法を実施するためのキットまたは装置であって、
アルテミシニン又はその誘導体と、マラリア原虫を培養する培地とを備えることを特徴とするキットまたは装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マラリア原虫のアルテミシニン耐性検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは、マラリア原虫の感染により引き起こされ、東南アジア・アフリカを中心に年間約2〜3億人の感染者と約65万人の死者を出す感染症である。マラリア原虫は、蚊の吸血により人体内に侵入し、肝臓に感染後、赤血球に感染することで、マラリア特有の症状である発熱等を引き起こす。赤血球内のマラリア原虫は、リング期、トロホゾイト期、シゾント期と生育ステージを通過し、最終的に赤血球感染型のメロゾイト期原虫となり赤血球感染を繰り返す。人に感染するマラリア原虫として、(i)熱帯熱マラリア原虫、(ii)三日熱マラリア原虫、(iii)四日熱マラリア原虫、(iv)卵形マラリア原虫が存在する。これらのうち、(i)熱帯熱マラリア原虫による被害は甚大であり、死者のほとんどがこの原虫の感染によるものである。
【０００３】
マラリアの治療には、赤血球期原虫を標的とした薬物が用いられる。ところが現在、殆ど全ての抗マラリア薬に対する薬剤耐性原虫が出現し、地球規模で蔓延しており、その使用は中止もしくは制限されている。そこで、耐性原虫が出現していない唯一の薬剤であるアルテミシニンが第一選択薬とした治療が行われている。しかし近年、カンボジアにおいてアルテミシニン耐性熱帯熱マラリア原虫の出現が報告され、アルテミシニンの治療効果の低下が強く懸念されている。
これまでに原虫を様々な濃度のアルテミシニン又はその誘導体（ジヒドロアルテミシニン・アルテスネート・アルテメーター等）（以下、「アルテミシニン等」という）の存在下で48時間培養し、原虫の生存率を指標することによりアルテミシニン耐性を評価することが試みられた。しかし、アルテミシニンの半減期（＜1時間）が極めて短いため培養中に薬剤が不活性化し、耐性原虫と感受性原虫間で耐性に差を見出すことができず、耐性を正しく評価することはできなかった（非特許文献１）。
【０００４】
一方、生育期を区切って耐性を検討した結果、カンボジア由来耐性原虫はリング期のみで耐性を示すことが明らかとなった。そこでこの特徴に着目しリング期の原虫を短時間（6時間）・高濃度（700 nM）のアルテミシニン等で処理して耐性を評価する方法（Ring survival assay : RSA）が開発された。
カンボジア由来耐性原虫についてRSAにより試験した結果、アルテミシニン耐性は正しく検出され、RSAの有効性が示された（非特許文献２）。
【０００５】
前述のようにカンボジア由来アルテミシニン耐性原虫はリング期のみに耐性を示すことが判明しているが、それ以外の地域由来のマラリア原虫の耐性の生育ステージ特異性は検討されたことがなく、実際には如何なる生育ステージで耐性を示すかは不明である。その為、他地域由来の原虫がリング期以外で耐性を示した場合はRSAで試験したとしても耐性を看過する問題点がある。またRSAではリング期のみを対象とするため細胞周期を高度に同調しトロホゾイト期・シゾント期の原虫を除去する必要があり、極めて煩雑な手順と習熟した技術を要する問題点もある。以上のようにRSAには正確性・簡便性の点で欠点が存在する。
このように、マラリア原虫のアルテミシニン耐性の検出法はいまだ改良の余地があり、赤血球期生育ステージを通じてアルテミシニン耐性を検出できる簡便な方法の開発が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Artemisinin resistance in Plasmodium falciparum malaria. N Engl J Med. 2009 Jul 30;361(5):455-67. doi: 10.1056/NEJMoa0808859.
【非特許文献２】Novel phenotypic assays for the detection of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum malaria in Cambodia: in-vitro and ex-vivo drug-response studies. Lancet Infect Dis. 2013 Dec;13(12):1043-9. doi: 10.1016/S1473-3099(13)70252-4.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、特定の生育ステージを対象とすることなく如何なる生育ステージであっても原虫のアルテミシニン耐性を検出することができ、且つ試験の際には原虫の細胞周期を同調することなく簡便に行える手法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するための発明に係るマラリア原虫のアルテミシニン耐性検出方法は、（１）所定濃度のアルテミシニン又はその誘導体の存在下でマラリア原虫を少なくとも当該マラリア原虫の赤血球期生育ステージが完了する時間だけ培養する薬剤暴露工程、（２）前記薬剤暴露工程を経たマラリア原虫をアルテミシニン等を含まない状態で培養する通常培養工程及び（３）その後にマラリア原虫の生存率を調べる生存率確認工程を含むことを特徴とする。
赤血球内に侵入したマラリア原虫は、リング期、トロホゾイト期、シゾント期と生育ステージを通過し、最終的に赤血球感染型のメロゾイト期原虫となり赤血球生育ステージを繰り返す。この赤血球期生育ステージは、マラリア原虫に応じて決まっており、熱帯熱マラリア原虫では概ね48時間である。
アルテミシニンは、化学式C15H22O5、分子量282.3の抗マラリア活性を有するセスキテルペンラクトンのひとつであり、多剤耐性を示す熱帯熱マラリア原虫にも効果を有する天然物である。古くから漢方薬として利用されていたヨモギ属の植物であるクソニンジンから分離・命名された。アルテミシニンは、水にも油にも溶けにくいため、医薬品としては扱いにくいという問題がある。このため、アルテミシニンの誘導体が、アルテミシニン系抗マラリア剤として開発されている。
【０００９】
アルテミシニン誘導体としては、アルテスネイト、アルテメテル、アルテモチル、ジヒドロアルテミシニン、アルテリン酸、アルテニモール、アルテモチル、アルテロランなど（以下、「アルテミシニン等」という）が例示される。
所定濃度とは、2.5nM〜10nM、好ましくは3nM〜8nM、更に好ましくは4nM〜6nMである。アルテミシニン等の濃度が低いと、マラリア原虫の成育を十分に阻止することができない一方、アルテミシニン等の濃度が高いと、マラリア原虫が死滅してしまい、耐性を評価することはできない。
【００１０】
薬剤暴露工程において、マラリア原虫を培養する時間を決定するためには、次のような考慮点がある。すなわち、マラリア原虫のアルテミシニン等への耐性は、カンボジア由来の場合にはリング期において示すが、他の地域の耐性原虫の場合、何れの赤血球期生育ステージで耐性を示すか不明であるため、原虫が如何なる生育ステージに在っても薬剤で処理する必要がある。これを達成するためには全赤血球期生育ステージを超えて試験対象の原虫を薬剤に対し暴露しなければならない。赤血球期生育ステージに必要な時間はマラリア原虫の種類によって概ね決まっており熱帯熱マラリア原虫では約48時間である。よって熱帯熱マラリア原虫の場合は少なくとも48時間以上、暴露する必要がある。その他のマラリア原虫についてはこの原理に従う。
【００１１】
またアルテミシニン耐性を簡便に検出するためにはRSAで行われている細胞周期の同調工程を省略する必要がある。よって本発明で示す方法では様々な生育ステージのマラリア原虫が混在した状態で薬剤暴露工程を行っても確実に耐性を検出できるものとする。
こうして、評価するマラリア原虫の赤血球期生育ステージが完了する時間（少なくとも1回、好ましくは2回）だけ、マラリア原虫とアルテミシニン等を接触させる必要がある。薬剤暴露工程の時間について熱帯熱マラリア原虫の場合には、48時間〜120時間、好ましくは60時間〜120時間、更に好ましくは80時間〜110時間である。
【００１２】
また、アルテミシニン等は化学的な安定性が低いため半減期が極めて短く、薬剤暴露工程の間に不活性化する。このため、薬剤暴露工程の実施中には、所定の時間毎（例えば、12、24、36時間毎など）にアルテミシニン等を添加した培地（薬剤添加培地）を交換する工程（（１−１）薬剤添加培地交換工程）を追加することが好ましい。
通常培養工程の時間としては、1時間〜240時間、好ましくは24時間〜216時間、更に好ましくは48時間〜192時間、更に好ましくは72時間〜168時間である。薬剤暴露工程と通常培養工程の培養時間を加えたものが本発明の検出方法全体の時間の大部分を占めることになる。このため、両工程を加えた時間が、可能な限り短い方が検出方法に掛ける時間を短縮でき好ましい。
生存率確認工程では、適当な染色（例えば、ギムザ染色）によって、マラリア原虫の生死を判定できるようにして、生存率を調べることが好ましい。これに加え、SYBRGreen等の蛍光試薬を用いてマラリア原虫の増殖を検出し、生存率を調べることも可能である。
また、別の発明に係るキットまたは装置は、上記マラリア原虫のアルテミシニン耐性検出方法を実施するためのものであって、アルテミシニン又はその誘導体と、マラリア原虫を培養する培地とを備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、如何なる生育ステージであっても原虫のアルテミシニン耐性を簡便に検出することが可能な方法を提供できる。また、当該方法を実施するためのキットまたは装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】カンボジア由来熱帯熱マラリア原虫株のアルテミシニン耐性を薬剤濃度を変えて評価した結果を示すグラフである。  薬剤濃度は、(A)2.5nM、(B)5nM、(C)7.5nMであった。図中のデータは、カンボジア由来アルテミシニン耐性株（MRA1236（三角・破線）、MRA1240（三角・実線））と感受性株（MRA1239（丸・実線））を用いて得られた。
【図２】図１で使用したカンボジア由来熱帯熱マラリア原虫株に加え、その他のカンボジア由来原虫株についてアルテミシニン耐性を評価した結果を示すグラフである。
【図３】タイ由来熱帯熱マラリア原虫株のアルテミシニン耐性を評価した結果を示すグラフである。
【図４】タイ由来及びカンボジア由来原虫株のアルテミシニン耐性の各生育ステージ特異性を調べた結果を示すグラフである。図中の実線はタイ由来耐性原虫株を、点線はカンボジア由来耐性原虫株のデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく、様々な形態で実施できる。
＜試験方法＞
１．カンボジア由来のアルテミシニン耐性マラリア原虫の評価試験（１）
熱帯熱マラリア患者由来感染血液をヘマトクリット2%の赤血球を含むRPMI1640培地(RPMI1640, 25mM HEPES, 0.005% Hypoxanthine, 0.225% Sodium Bicarbonate, 10μg/ml Gentamicin, 0.5% Albumax Iを含む。以下、「試験培地A」という。）で培養し、安定培養株を得た。マラリア原虫をギムザ染色し、顕微鏡下で計測後、原虫寄生率を0.06% 〜 0.14%となるように試験培地Aで希釈した。この際、原虫は細胞周期を同調させる必要はなく、培養している原虫の生育ステージはリング期・トロホゾイト期・シゾント期が混在した状態のままとした。
【００１６】
原虫寄生率は、総赤血球に対する感染赤血球を百分率で表した。寄生率を調整後、5nMとなるようにアルテミシニンを添加した培地で原虫を96時間培養した（薬剤暴露工程）。熱帯熱マラリア原虫の赤血球期生育ステージは48時間で完了することから、96時間の培養を行うことにより、原虫は2回の赤血球期生育ステージを通じて薬剤処理されることになる。また、アルテミシニンおよびその誘導体は半減期が極めて短いことを考慮し、薬剤添加培地を24時間おきに調製し交換した（薬剤添加培地交換工程）。96時間の培養後、薬剤非添加培地に交換し、さらに6日間培養（最大で10日間）した（通常培養工程）。その後、ギムザ染色して原虫の生存を顕微鏡にて確認し、生存率でアルテミシニン耐性を評価した（生存率確認工程）。
【００１７】
２．カンボジア由来のアルテミシニン耐性マラリア原虫の評価試験（２）
次に、上記１で調べたMRA1236、MRA1239、MRA1240に加え、その他のカンボジア由来アルテミシニン耐性熱帯熱マラリア原虫株（MRA1238・MRA1241）および感受性株（MRA1237）のアルテミシニン耐性を評価した。
試験方法としては、上記１に記載の手順に従った。
３．タイ由来のアルテミシニン耐性マラリア原虫の評価試験
タイ国境地域熱帯熱マラリア患者から採取した感染血液から安定培養が可能な原虫を40株獲得しアルテミシニン耐性を評価した。
試験方法としては、上記１に記載の手順に従った。
【００１８】
４．タイ由来及びカンボジア由来のアルテミシニン耐性マラリア原虫の特性評価試験
タイ由来耐性原虫株が如何なる生育ステージで耐性を示すかを検討する目的のアルテミシニン耐性の生育ステージ特異性を評価した。コントロールとしてリング期で耐性を示すことが判明しているカンボジア由来耐性原虫株を使用し、タイ由来耐性原虫株と比較した。具体的には原虫の赤血球期生育ステージ（48時間）を八期に分割し、各期（6時間）の原虫を700 nMのジヒドロアルテミシニンにより処理した。処理後、直ちに薬剤を除去し、薬剤非添加培地にて培養した。最終的に原虫生存率をギムザ染色による顕微鏡観察で評価した。
【００１９】
＜試験結果＞
１．カンボジア由来のアルテミシニン耐性マラリア原虫の評価試験（１）
まず、カンボジア由来のアルテミシニン耐性原虫株（MRA1236、MRA1240）と感受性原虫株（MRA1239）を用いて本発明で示す手法によって耐性を評価した。実験にはアルテミシニン誘導体の一種であるジヒドロアルテミシニンを使用した。また、使用した薬剤濃度は5 nMに加え、2.5 nM、7.5 nMについても実施した。
その結果、2.5 nMの薬剤存在下では耐性原虫及び感受性原虫株のいずれも生存し（図１A）、逆に7.5 nMでは耐性原虫及び感受性原虫株の両方とも生存数を確認できなかった（図１C）。
【００２０】
なお、別の実験系において、10nMのアルテミシニン誘導体を添加し、最大で14日間の培養（4日間の薬剤暴露工程に続き、10日間の通常培養工程）を行ったところ、耐性原虫は12日目〜14日目に生存が確認された。このため、アルテミシニン等の濃度が高い場合には、通常培養工程の期間を長くすることにより、本発明の評価系として成立し得ることが分かった。
但し、全体の培養期間が長期に及ぶと使用する際の実用性に乏しいため、薬剤暴露工程と通常培養工程を合わせて最大で10日間程度で培養が完了する方法とするのが好ましいと分かった。
また、5 nMの薬剤存在下では耐性原虫の生存のみが確認され、感受性原虫株は死滅した（図１B）。以上の結果より本発明で示す手法によりアルテミシニン耐性を評価することができることが示された。マラリア原虫の耐性を評価するためには、アルテミシニン等の濃度として、約5 nMが最良であることが示された。
【００２１】
２．カンボジア由来のアルテミシニン耐性マラリア原虫の評価試験（２）
次に、MRA1236、MRA1239、MRA1240に加え、その他のカンボジア由来アルテミシニン耐性原虫株（MRA1238・MRA1241）および感受性株（MRA1237）について本発明で示す方法によりアルテミシニン耐性を評価した。MRA1236、MRA1239、MRA1240を含めた全ての株については既にRSAによる耐性評価が行われており、RSA後の生存率はMRA1236: 27.3 %, MRA1237: 0.1 %, MRA1238: 6.2 %, MRA1239: 0.1 %, MRA1240: 88.0 %, MRA1241: 49.3 %と決定されている。
上記試験方法を実施した結果、MRA1236、MRA1238、 MRA1240 およびMRA1241の生存が確認され、一方MRA1237とMRA1239の生存は確認されなかった（図２）。以上の結果より、本発明の方法により、各種のマラリア原虫について、アルテミシニン耐性を検出できることが分かった。生存率はMRA1240が最も高く、次いでMRA1236とMRA1241がほぼ同等であり、MRA1238の生存率が最も低いことが示された。この結果に基づくとアルテミシニン耐性はMRA1240が最も強く、MRA1236とMRA1241は中程度であり、MRA1238は弱い耐性であると評価された。これらの結果はRSAでの評価とほぼ一致したことから、本発明の方法によって、マラリア原虫のアルテミシニン耐性の程度を評価できることが分かった。
【００２２】
３．タイ由来のアルテミシニン耐性マラリア原虫の評価試験
タイ患者由来熱帯熱マラリア患者より40株の安定培養株を得、それぞれTM1-TM40と名付けた。これらについて5nMのジヒドロアルテミシニンをもちいて上記の試験方法によりアルテミシニン耐性を検討した。結果には96時間の薬剤暴露工程および6日間の通常培養工程を終了した後の各原虫株の寄生率を示した（図３）。コントロールとしてカンボジア由来アルテミシニン耐性株（MRA1236及びMRA1240）と感受性株（MRA1239）を用いた。試験の結果、９つの原虫株（TM1-9）がMRA1236株（図中破線）よりも明らかに高いもしくは同等の寄生率を示し、アルテミシニン耐性株を持つことが示された。
【００２３】
４．タイ由来及びカンボジア由来のアルテミシニン耐性マラリア原虫の特性評価試験
タイ由来のアルテミシニン耐性株（TM1-9）について任意に株を選択し、さらにこれについてアルテミシニン耐性の生育ステージ特異性を検討した。その結果、カンボジア由来の耐性株とは異なり、リング期後期からトロホゾイト期において耐性を示すことを確認した（図４）。
結果に示すように、カンボジア株はリング期初期にのみ耐性を示すが、タイ株はリング期後期からトロホゾイト初期において耐性を示した。カンボジア株においてみられるシゾント期での耐性は、再感染した原虫のリング期での耐性が検出されたものである。以上の結果は本発明で示す方法により原虫が如何なる生育ステージに在っても、そのアルテミシニン耐性を検出することができることを示すものである。
【００２４】
カンボジア由来耐性原虫株の初期リング期での生存率は約8％であるのに対し、タイ由来耐性原虫株の初期リング期での生存率は0.1％以下であった。この結果は、RSAで看過されるアルテミシニン耐性についても本発明の方法により同定できることを示している。このことから、本発明の方法は、従来のRSAに比べると、アルテミシニン耐性マラリア原虫の検出において優位性を持っていることが分かった。
このように本実施形態によれば、如何なる生育ステージであってもマラリア原虫のアルテミシニン耐性を簡便に検出することが可能な方法を提供できた。
【図１】
2018019607.tif 000003
【図２】
2018019607.tif 000004
【図３】
2018019607.tif 000005
【図４】
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