(57)【要約】【課題】パン類の製造において、良好な製パン性を有し、且つフロア時間の延長によるパン生地の物性の変化を抑制し、製造されるパン類の品質の差を低減しうる新規パン酵母、当該パン酵母を含有するパン生地、当該パン酵母を用いるパン類の製造方法及び製パン性に優れ且つパン生地にフロア時間安定性を付与しうるパン酵母のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】試験発酵法において、３０℃で２時間発酵したときの培地中へのグルタチオンの分泌量が２ｐｐｍ以上である、パン生地にフロア時間安定性を付与しうるパン酵母である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の発酵条件において、３０℃で２時間発酵したときの培地中へのグルタチオンの分泌量が２ｐｐｍ以上である、パン生地にフロア時間安定性を付与しうることを特徴とするパン酵母。
〔発酵条件〕
酵母濃度が１０％ｗ／ｖの酵母懸濁液  ５ｍＬと、ショ糖濃度が６６．７％ｗ／ｖのショ糖溶液  ３ｍＬと、イオン交換水  １２ｍＬとからなる２０ｍＬの発酵液を１００ｃｃの三角フラスコ中で、水平往復式、震盪幅６．０ｃｍ、震盪回数１００回／分で振盪発酵する。
【請求項２】
下記のパン類の製造方法において、フロア時間を２０分間としたときに得られるパンの長さと、４０分間としたときに得られるパンの長さとの差が３％以内である請求項１に記載のパン酵母。
〔パン類の製造方法〕
＜配合＞
−中種−
・  パン用小麦粉    ・・・  ７０質量部
・  パン酵母        ・・・  ３質量部
・  イーストフード  ・・・  ０．１質量部
・  ビタミンＣ      ・・・  １０ｐｐｍ
・  ぶどう糖        ・・・  ３質量部
・  全卵            ・・・  １０質量部
・  水              ・・・  ３２質量部
−本捏−
・  パン用小麦粉    ・・・  ３０質量部
・  食塩            ・・・  １質量部
・  砂糖            ・・・  ２２質量部
・  脱脂粉乳        ・・・  ２質量部
・  マーガリン      ・・・  １０質量部
・  水              ・・・  ２２質量部
＜工程＞
−中種−
・  ミキシング  ・・・  低速２分中速２分
・  捏上温度    ・・・  ２６℃
・  発酵条件    ・・・  ２８℃、２時間
−本捏−
・  ミキシング  ・・・  低速２分中速６分↓中速３分高速１分
・  フロア時間  ・・・  ２０分又は４０分
・  フロア条件  ・・・  ２８℃、相対湿度７５％
・  分割重量    ・・・  ７０ｇ
・  ベンチ時間  ・・・  ２０分
・  ベンチ条件  ・・・  ２８℃、相対湿度７５％
・  成型方法    ・・・  モルダー使用、ロール成型（フロア時間２０分のパン生地の長さが１７±０．５ｃｍになるようにモルダーを調整）
・  ホイロ時間  ・・・  ７０分
・  ホイロ条件  ・・・  ３５℃、相対湿度８５％
・  焼成条件    ・・・  ２００℃、９分
前記本捏のミキシングにおける「↓」は、マーガリンの投入時期を表す。
【請求項３】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤ０１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５１）、ＡＤ０２株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５２）、ＡＤ０４株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５３）又はＡＤ０６株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５４）である請求項１又は２に記載のパン酵母。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のパン酵母を含有することを特徴とするパン生地。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のパン酵母を用いることを特徴とするパン類の製造方法。
【請求項６】
パン生地にフロア時間安定性を付与しうるパン酵母のスクリーニング方法であって、
下記の発酵条件において、３０℃で２時間発酵したときの培地中へのグルタチオンの分泌量が２ｐｐｍ以上であることを指標とすることを特徴とする方法。
〔発酵条件〕
酵母濃度が１０％ｗ／ｖの酵母懸濁液  ５ｍＬと、ショ糖濃度が６６．７％ｗ／ｖのショ糖溶液  ３ｍＬと、イオン交換水  １２ｍＬとからなる２０ｍＬの発酵液を１００ｃｃの三角フラスコ中で、水平往復式、震盪幅６．０ｃｍ、震盪回数１００回／分で振盪発酵する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、製パン性に優れ且つパン生地にフロア時間安定性を付与しうる新規パン酵母、当該パン酵母を含有するパン生地、当該パン酵母を用いるパン類の製造方法及び製パン性に優れ且つパン生地にフロア時間安定性を付与しうるパン酵母のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的には、パン類は、小麦粉等の穀粉類とその他の製パン類原料に加水して、混捏、フロア時間（一次発酵）、分割、ベンチ時間、成型、ホイロ（二次発酵）、焼成・油揚げ等の工程を経て製造される。
製造の際、リテールベーカリー等の小規模な製造施設では生じ難いが、パン工場等の比較的に規模が大きい製造施設では、取扱うパン生地の量が多いために、フロア時間終了後、パン生地の全てが分割されるまでに時間差が生じてしまう。このフロア時間の延長が原因で、パン生地の弾力が増大することでパン生地が過度に縮んでしまい、その結果、製造されるパン類の外観、食感等の点でばらつきが発生してしまい、これがパン製品のロスにつながるという問題がある。
【０００３】
前記問題を解決するために、アミラーゼなどの酵素製剤や、グルテンやＬ−アスコルビン酸などを配合することが行われているが、未だ十分とはいえないのが現状である。
また、これまで、パン酵母によりパン生地にフロア時間安定性を付与するということは、試みられていなかった。
【０００４】
また、従来、パン酵母の開発においては、冷凍生地製パン法に適するパン酵母や、生地の軟化抑制とカビ抑制の機能を併せ持つパン酵母などが報告されている（例えば、特許文献１及び２参照）。
しかし、これらの報告では、いずれも菌体内成分（特にグルタチオン）の菌体外への漏出（以下、「分泌」又は「放出」と称することもある）は生地の軟化を引き起こすため、パン酵母のスクリーニングではグルタチオンの漏出の少ない菌株を選択する指標としている。
【０００５】
また、本出願人は、冷凍及び／又は冷蔵によるパン生地への悪影響のない、低コストで品質の安定したパンを製造するための冷凍耐性能及び低温発酵抑制能を有するパン酵母に関する出願を行っている（特許文献３参照）。
前記出願では、パン酵母の育種・スクリーニングの基本的な方法が記載されているが、パン生地にフロア時間安定性を付与しうるパン酵母は、記載されていない。
【０００６】
一方、本出願人らによって、パン酵母及び／又は変異処理したパン酵母の中から、一次スクリーニングとしてカドミウム耐性株を選択して取得し、更に、二次スクリーニングとしてシクロヘキシミド耐性株を選択して取得する、グルタチオン高生産パン酵母の造成方法が提案されている（特許文献４参照）。
しかしながら、前記提案で得られるパン酵母は、グルタチオンを菌体外に分泌するものではないと考えられ、また、このパン酵母を用いてパン類を製造しても良好なパン類を得られないと考えられる。
【０００７】
したがって、パン類の製造において、良好な製パン性を有し、且つフロア時間の延長によるパン生地の物性の変化を抑制し、製造されるパン類の品質の差を低減しうるパン酵母は未だ提供されておらず、その速やかな提供が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１４−８３０２２号公報
【特許文献２】国際公開第２０１３／１６１３０３号
【特許文献３】特開平８−３３２０８４号公報
【特許文献４】特開２０１２−２１３３６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような要望に応え、現状を打破し、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、パン類の製造において、良好な製パン性を有し、且つフロア時間の延長によるパン生地の物性の変化を抑制し、製造されるパン類の品質の差を低減しうる新規パン酵母、当該パン酵母を含有するパン生地、当該パン酵母を用いるパン類の製造方法及び製パン性に優れ且つパン生地にフロア時間安定性を付与しうるパン酵母のスクリーニング方法を提供すること目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記目的を達成するべく鋭意検討を行った結果、従来、良好なパン類が得られないとされていた菌体外へのグルタチオン（以下、「ＧＳＨ」と称することがある）の分泌量がある一定量以上であることを主たる指標とし、製パン性に優れるパン酵母を選択し、用いることにより、製パン性に優れ且つパン類の製造において、フロア時間の延長によるパン生地の物性の変化を抑制し、製造されるパン類の品質の差を低減し、優れた品質のパン類を安定的に製造しうることを知見した。
【００１１】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  下記の発酵条件において、３０℃で２時間発酵したときの培地中へのグルタチオンの分泌量が２ｐｐｍ以上である、パン生地にフロア時間安定性を付与しうることを特徴とするパン酵母である。
〔発酵条件〕
酵母濃度が１０％ｗ（重量）／ｖ（体積）の酵母懸濁液  ５ｍＬと、ショ糖濃度が６６．７％ｗ／ｖのショ糖溶液  ３ｍＬと、イオン交換水  １２ｍＬとからなる２０ｍＬの発酵液を１００ｃｃの三角フラスコ中で、水平往復式、震盪幅６．０ｃｍ、震盪回数１００回／分で振盪発酵する。
＜２＞  下記のパン類の製造方法において、フロア時間を２０分間としたときに得られるパンの長さと、４０分間としたときに得られるパンの長さとの差が３％以内である前記＜１＞に記載のパン酵母である。
〔パン類の製造方法〕
＜配合＞
−中種−
・  パン用小麦粉    ・・・  ７０質量部
・  パン酵母        ・・・  ３質量部
・  イーストフード  ・・・  ０．１質量部
・  ビタミンＣ      ・・・  １０ｐｐｍ
・  ぶどう糖        ・・・  ３質量部
・  全卵            ・・・  １０質量部
・  水              ・・・  ３２質量部
−本捏−
・  パン用小麦粉    ・・・  ３０質量部
・  食塩            ・・・  １質量部
・  砂糖            ・・・  ２２質量部
・  脱脂粉乳        ・・・  ２質量部
・  マーガリン      ・・・  １０質量部
・  水              ・・・  ２２質量部
＜工程＞
−中種−
・  ミキシング  ・・・  低速２分中速２分
・  捏上温度    ・・・  ２６℃
・  発酵条件    ・・・  ２８℃、２時間
−本捏−
・  ミキシング  ・・・  低速２分中速６分↓中速３分高速１分
・  フロア時間  ・・・  ２０分又は４０分
・  フロア条件  ・・・  ２８℃、相対湿度７５％
・  分割重量    ・・・  ７０ｇ
・  ベンチ時間  ・・・  ２０分
・  ベンチ条件  ・・・  ２８℃、相対湿度７５％
・  成型方法    ・・・  モルダー使用、ロール成型（フロア時間２０分のパン生地の長さが１７±０．５ｃｍになるようにモルダーを調整）
・  ホイロ時間  ・・・  ７０分
・  ホイロ条件  ・・・  ３５℃、相対湿度８５％
・  焼成条件    ・・・  ２００℃、９分
前記本捏のミキシングにおける「↓」は、マーガリンの投入時期を表す。
＜３＞  サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤ０１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５１）、ＡＤ０２株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５２）、ＡＤ０４株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５３）又はＡＤ０６株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５４）である前記＜１＞又は＜２＞に記載のパン酵母である。
＜４＞  前記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のパン酵母を含有することを特徴とするパン生地である。
＜５＞  パン生地が冷凍生地である前記＜４＞に記載のパン生地である。
＜６＞  前記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のパン酵母を用いることを特徴とするパン類の製造方法である。
＜７＞  パン生地にフロア時間安定性を付与しうるパン酵母のスクリーニング方法であって、
下記の発酵条件において、３０℃で２時間発酵したときの培地中へのグルタチオンの分泌量が２ｐｐｍ以上であることを指標とすることを特徴とする方法である。
〔発酵条件〕
酵母濃度が１０％ｗ／ｖの酵母懸濁液  ５ｍＬと、ショ糖濃度が６６．７％ｗ／ｖのショ糖溶液  ３ｍＬと、イオン交換水  １２ｍＬとからなる２０ｍＬの発酵液を１００ｃｃの三角フラスコ中で、水平往復式、震盪幅６．０ｃｍ、震盪回数１００回／分で振盪発酵する。
＜８＞  更に、下記のパン類の製造方法において、フロア時間を２０分間としたときに得られるパンの長さと、４０分間としたときに得られるパンの長さとの差が３％以内であることを指標とする前記＜７＞に記載のパン酵母のスクリーニング方法である。
〔パン類の製造方法〕
＜配合＞
−中種−
・  パン用小麦粉    ・・・  ７０質量部
・  パン酵母        ・・・  ３質量部
・  イーストフード  ・・・  ０．１質量部
・  ビタミンＣ      ・・・  １０ｐｐｍ
・  ぶどう糖        ・・・  ３質量部
・  全卵            ・・・  １０質量部
・  水              ・・・  ３２質量部
−本捏−
・  パン用小麦粉    ・・・  ３０質量部
・  食塩            ・・・  １質量部
・  砂糖            ・・・  ２２質量部
・  脱脂粉乳        ・・・  ２質量部
・  マーガリン      ・・・  １０質量部
・  水              ・・・  ２２質量部
＜工程＞
−中種−
・  ミキシング  ・・・  低速２分中速２分
・  捏上温度    ・・・  ２６℃
・  発酵条件    ・・・  ２８℃、２時間
−本捏−
・  ミキシング  ・・・  低速２分中速６分↓中速３分高速１分
・  フロア時間  ・・・  ２０分又は４０分
・  フロア条件  ・・・  ２８℃、相対湿度７５％
・  分割重量    ・・・  ７０ｇ
・  ベンチ時間  ・・・  ２０分
・  ベンチ条件  ・・・  ２８℃、相対湿度７５％
・  成型方法    ・・・  モルダー使用、ロール成型（フロア時間２０分のパン生地の長さが１７±０．５ｃｍになるようにモルダーを調整）
・  ホイロ時間  ・・・  ７０分
・  ホイロ条件  ・・・  ３５℃、相対湿度８５％
・  焼成条件    ・・・  ２００℃、９分
前記本捏のミキシングにおける「↓」は、マーガリンの投入時期を表す。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決することができ、パン類の製造において、良好な製パン性を有し、且つフロア時間の延長によるパン生地の物性の変化を抑制し、製造されるパン類の品質の差を低減しうる新規パン酵母、当該パン酵母を含有するパン生地、当該パン酵母を用いるパン類の製造方法及び製パン性に優れ且つパン生地にフロア時間安定性を付与しうるパン酵母のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、試験例１において製造したロールパンの長さを測定した結果を示すグラフである。
【図２】図２は、試験例１において製造したロールパンの高さを測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（パン酵母、パン酵母のスクリーニング方法）
本発明のパン酵母は、特定の発酵条件において、３０℃で２時間発酵したときの培地中へのグルタチオンの分泌量が２ｐｐｍ以上である、パン生地にフロア時間安定性を付与しうる酵母である。
本発明のパン酵母は、本発明のパン酵母のスクリーニング方法により、好適に選抜することができる。
【００１５】
＜フロア時間安定性＞
本発明において、「パン生地にフロア時間安定性を付与しうる」とは、パン類の製造において、フロア時間の延長によるパン生地の物性の変化を抑制し、製造されるパン類の品質の差を低減しうることをいう。
【００１６】
前記フロア時間安定性を評価する方法としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、下記のパン類の製造方法（以下、「試験製パン法」ということがある）において、フロア時間を２０分間としたときに得られるパンと、４０分間としたときに得られるパンとを比較することにより評価する方法などが挙げられる。
〔パン類の製造方法〕
−配合−
−−中種−−
・  パン用小麦粉    ・・・  ７０質量部
・  パン酵母        ・・・  ３質量部
・  イーストフード  ・・・  ０．１質量部
・  ビタミンＣ      ・・・  １０ｐｐｍ
・  ぶどう糖        ・・・  ３質量部
・  全卵            ・・・  １０質量部
・  水              ・・・  ３２質量部
−−本捏−−
・  パン用小麦粉    ・・・  ３０質量部
・  食塩            ・・・  １質量部
・  砂糖            ・・・  ２２質量部
・  脱脂粉乳        ・・・  ２質量部
・  マーガリン      ・・・  １０質量部
・  水              ・・・  ２２質量部
−工程−
−−中種−−
・  ミキシング  ・・・  低速２分中速２分
・  捏上温度    ・・・  ２６℃
・  発酵条件    ・・・  ２８℃、２時間
−−本捏−−
・  ミキシング  ・・・  低速２分中速６分↓中速３分高速１分
・  フロア時間  ・・・  ２０分又は４０分
・  フロア条件  ・・・  ２８℃、相対湿度７５％
・  分割重量    ・・・  ７０ｇ
・  ベンチ時間  ・・・  ２０分
・  ベンチ条件  ・・・  ２８℃、相対湿度７５％
・  成型方法    ・・・  モルダー使用、ロール成型（フロア時間２０分のパン生地の長さが１７±０．５ｃｍになるようにモルダーを調整）
・  ホイロ時間  ・・・  ７０分
・  ホイロ条件  ・・・  ３５℃、相対湿度８５％
・  焼成条件    ・・・  ２００℃、９分
前記本捏のミキシングにおける「↓」は、マーガリンの投入時期を表す。
【００１７】
試験製パン法に使用する前記パン用小麦粉としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、日清製粉株式会社製「オーション」などが挙げられる。
【００１８】
試験製パン法の前記比較の項目としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、パンの長さ、高さ、幅、比容積、体積などが挙げられる。前記フロア時間を２０分間としたときに得られるパンと、４０分間としたときに得られるパンとの間で、前記比較の項目における差が小さい場合には、フロア時間安定性が付与されたと判断することができる。
【００１９】
試験製パン法において、フロア時間を２０分間としたときに得られるパンの長さと、４０分間としたときに得られるパンの長さとの差としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、３％以内が好ましく、２％以内がより好ましい。
【００２０】
また、試験製パン法で得られるパン類としては、前記フロア時間を２０分間としたときに得られるパンの長さと、４０分間としたときに得られるパンの長さとの差が２％以内であり、且つパン類の比容積が６．５±０．５ｍＬ／ｇの範囲であることが好ましい。試験製パン法における比容積は、パン類の製造が異常なく実施されたことを示す指標であり、前記範囲になるように試験製パン法は設計されている。
【００２１】
また、試験製パン法において、フロア時間を２０分間としたときに得られるパンの高さと、４０分間としたときに得られるパンの高さとの差としては、特に制限はなく、適宜選択することができるが、２．５％以内が好ましく、１．５％以内がより好ましい。
【００２２】
＜酵母の選抜＞
本発明のパン酵母のスクリーニング方法は、パン生地にフロア時間安定性を付与しうるパン酵母のスクリーニング方法であって、特定の発酵条件において、３０℃で２時間発酵したときの培地中へのグルタチオンの分泌量が２ｐｐｍ以上であることを指標とする。
【００２３】
−酵母−
前記スクリーニング方法に用いる酵母（以下、「親株」と称することがある）としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、ミコトルラ（Ｍｙｃｏｔｏｒｕｌａ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属などが挙げられ、具体的な菌株の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｕｔｉｌｉｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｃａｎｄｉｄａ、Ｍｙｃｏｔｏｒｕｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｍｙｃｏｔｏｒｕｌａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓａｋｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｎｏｍａｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｌｉｇｅｒａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｒｕｂｒａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆａｒｉｎｏｓａなどが挙げられる。
前記スクリーニング方法に用いる酵母は、自然に存在するパン酵母を用いてもよいし、市販のパン酵母を用いてもよいし、突然変異処理した酵母を用いてもよいし、これらを混合して用いてもよい。
前記突然変異処理の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【００２４】
−特定の発酵条件−
前記特定の発酵（以下、「本発酵」又は「グルタチオン分泌発酵」と称することがある）条件とは、「酵母濃度が１０％ｗ／ｖの酵母懸濁液  ５ｍＬと、ショ糖濃度が６６．７％ｗ／ｖのショ糖溶液  ３ｍＬと、イオン交換水  １２ｍＬとからなる２０ｍＬの発酵液を１００ｃｃの三角フラスコ中で、３０℃で２時間、水平往復式、震盪幅６．０ｃｍ、震盪回数１００回／分で振盪発酵する」ことをいう（以下、「試験発酵法」ということがある）。試験発酵法は、パン用酵母試験法（日本イースト工業会平成８年８月）第５頁の（１）液発酵法に従ったものである。
【００２５】
前記酵母懸濁液の調製方法（以下、「前培養」と称することがある）としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、以下のようにして調製することができる。
ＹＰＤ培地５ｍＬが入った試験管に菌株を植菌し、３０℃で２４時間振盪培養したものを１００ｍＬのＹＭＰＤ培地（イーストエキス０．３％、マルツエキス０．３％、ペプトン０．５％、グルコース３％）が入ったフラスコに全量植菌し、３０℃で４８時間振盪培養する。
上記培養液を定法で２回菌体洗浄し、培養菌体とする。これを、下記に示した〔前培養の培養条件〕で培養する。使用する糖は、糖蜜を用いて常に糖濃度が３５％となるように希釈して使用する。糖蜜は、マルチホルダー付きシリンジポンプＰＨＤ２０００（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社製）を用いて流加して、培養する。
この培養液を１００ｍＬ回収し、定法（遠心法）で２回菌体洗浄後、滅菌水で、酵母濃度が１０％ｗ／ｖになるようにメスアップし、酵母懸濁液とする。
〔前培養の培養条件〕
培養容器        ：  ２００ｍＬメスシリンダー
培養液量        ：  １００ｍＬ
種              ：  培養菌体
種量            ：  ３ｇ
培養温度        ：  ３２℃
培養時間        ：  １４時間
通気量          ：  ０．４Ｌ／分
糖量            ：  ７．８ｇ
窒素（Ｎ）源    ：  ウレア
Ｎ／炭素（Ｃ）  ：  ４．０
リン（Ｐ）源    ：  リン酸１ナトリウム
Ｐ／Ｃ          ：  ０．４
【００２６】
−グルタチオン量の測定−
試験発酵法での発酵により、菌体外へ分泌されたグルタチオン量を測定する方法としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、以下のようにして測定することができる。
分光光度計用ガラスセルに、５ｍＬのピペットマンでリン酸バッファを２．５ｍＬ分取する。次に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を１００μＬと、５−５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ［２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ］（ＤＴＮＢ）溶液を３０μＬとをピペットマンで添加する。校正したピペットマンを用いてサンプルを２００μＬ添加し、セル内でピペッティングを行いよく混合する。１分間インキュベート後、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）を１００μＬ添加後、１０秒ごとに９０秒間、吸収波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定する。反応開始２０秒後と８０秒後の吸光度から反応速度を求める。
スタンダードとして０ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１５ｐｐｍのグルタチオン溶液を作製し、検量線を求める。
菌体量を補正するためファクターで補正し、グルタチオン量を算出する。
【００２７】
以上により、試験発酵法において、３０℃で２時間発酵したときの培地中へのグルタチオンの分泌量が２ｐｐｍ以上であるパン酵母を選別することができる。
後述する試験例１で示されるように、グルタチオンの分泌量が２ｐｐｍ以上である本発明のパン酵母は、パン生地にフロア時間安定性を付与できる。
【００２８】
前記パン酵母の前記グルタチオンの分泌量としては、２ｐｐｍ以上であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、パン生地へのフロア時間安定性の付与がより優れる点で、２〜３０ｐｐｍの範囲が好ましい。
【００２９】
前記スクリーニング方法は、前記指標として、前記グルタチオンの分泌量以外の指標（以下、「その他の指標」と称することがある）を更に用いてもよい。
前記その他の指標としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、上記＜フロア時間安定性＞の項目に記載のフロア時間安定性を評価する方法における比較の項目、発酵力、生地感や作業性（生地の伸展性、ベタつきの有無）、収率、前記フロア時間安定性以外の製パン性、得られるパン類の品質（内相、食感、風味）などが挙げられる。
【００３０】
本発明のパン酵母としては、試験発酵法において、３０℃で２時間発酵したときの培地中へのグルタチオンの分泌量が２ｐｐｍ以上であるパン酵母であれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、上記＜フロア時間安定性＞の項目に記載のフロア時間安定性を評価する方法における比較の項目において、フロア時間を２０分間としたときに得られるパンの長さと、４０分間としたときに得られるパンの長さとの差が３％以内であるパン酵母が好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤ０１株、ＡＤ０２株、ＡＤ０４株又はＡＤ０６株がより好ましい。
前記好ましいパン酵母は、前記フロア時間安定性を付与できるだけでなく、後述する試験例２及び３に示すように、優れた冷凍耐性や低糖域から高糖域まで使用できるなどの汎用性を有する点で、有利である。
【００３１】
前記４株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託申請し、前記ＡＤ０１株はＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５１、前記ＡＤ０２株はＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５２、前記ＡＤ０４株はＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５３、前記ＡＤ０６株はＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５４として、２０１６年５月１１日に受託されている。
【００３２】
また、本発明のパン酵母によれば、パン生地にフロア時間安定性を付与しつつ、外観（体積、比容積、高さ・長さ）、食感及び風味も良好なパン類を得ることができる。
【００３３】
（パン生地、パン類の製造方法）
本発明のパン生地としては、本発明のパン酵母を含む限り、特に制限はなく、公知のパン生地を適宜選択することができる。本発明のパン酵母は、後述する試験例２に示されるように、冷凍耐性も有することから、冷凍生地にも使用することができる。
本発明のパン類の製造方法としては、本発明のパン酵母を用いる限り、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、小麦粉を主体とする穀粉類を主原料とし、これに水分、本発明のパン酵母、乳、卵、油脂、塩、糖類などの他の原料を添加して混捏し、得られた生地を、通常の手順で発酵、成型、焼成する方法などが挙げられる。
製パン方法の種類としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、中種製法、ストレート製法、湯種製法、冷蔵若しくは冷凍生地製法などが挙げられる。
【００３４】
＜小麦粉を主体とする穀粉類＞
前記小麦粉を主体とする穀粉類とは、小麦粉を含む穀粉、澱粉類及びその加工澱粉をいう。前記小麦粉を主体とする穀粉類は、小麦粉を単独で使用してもよいし、小麦粉と他の穀粉や澱粉類などを併用してもよい。
【００３５】
前記穀粉としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、小麦粉、ライ麦粉、そば粉、米粉、大麦粉、大豆粉、コーンフラワーなどが挙げられる。前記穀粉は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３６】
前記澱粉類としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、小麦澱粉、米澱粉、馬鈴薯澱粉、タピオカ澱粉、コーンスターチ、甘藷澱粉などが挙げられる。前記澱粉類は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３７】
前記加工澱粉としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、熱処理澱粉、α化澱粉、酸処理澱粉、架橋澱粉、エーテル化澱粉、エステル化澱粉などが挙げられる。前記加工澱粉は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、複数の加工処理（架橋とエーテル化、酸処理と架橋等）を施したものでもよい。
【００３８】
前記パン酵母の使用量としては、特に制限はなく、常法に従って適宜選択することができ、例えば、小麦粉を主体とする穀粉類１００質量部に対して、２〜５質量部などが挙げられる。
【００３９】
＜パン類＞
前記パン類としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、食パン、ロールパン、菓子パン、惣菜パン、クロワッサン、デニッシュ、ブリオッシュ、フランスパン、ドイツパン（カイザーゼンメル、ライ麦パン等）、フォカッチャ、パネトーネなどが挙げられる。
【００４０】
本発明のパン生地又はパン類の製造方法は、本発明のパン酵母を用いるので、パン類の製造において、フロア時間の延長によるパン生地の物性の変化を抑制し、製造されるパン類の品質の差を低減しうる。
したがって、本発明は、本発明のパン酵母を用いることを特徴とするフロア時間の延長によるパン生地の物性の変化の抑制方法、製造されるパン類の品質の差の低減方法にも関する。
【実施例】
【００４１】
以下、試験例を示して本発明を説明するが、本発明はこれらの試験例に何ら限定されるものではない。
【００４２】
（試験例１：パン酵母のスクリーニング試験）
出願人が保有するサッカロマイセス・セレビシエ株（２倍体）のライブラリー及びパン酵母製品について、特開２０１４−１１７２１２号公報に記載の方法に従い、約３，０００株を造成した。
【００４３】
＜グルタチオン分泌量の測定＞
（１）前培養
ＹＰＤ培地５ｍＬが入った試験管に前記菌株を植菌し、３０℃で２４時間振盪培養したものを１００ｍＬのＹＭＰＤ培地（イーストエキス０．３％、マルツエキス０．３％、ペプトン０．５％、グルコース３％）が入ったフラスコに全量植菌し、３０℃で４８時間振盪培養した。
上記培養液を定法で２回菌体洗浄し、培養菌体とした。これを、下記に示した〔前培養の培養条件〕で培養した。使用する糖は、糖蜜を用いて常に糖濃度が３５％となるように希釈して使用した。糖蜜は、マルチホルダー付きシリンジポンプＰＨＤ２０００（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社製）を用いて流加して、培養した。
この培養液を１００ｍＬ回収し、定法（遠心法）で２回菌体洗浄後、滅菌水で、酵母濃度が１０％ｗ／ｖになるようにメスアップした。
〔前培養の培養条件〕
培養容器        ：  ２００ｍＬメスシリンダー
培養液量        ：  １００ｍＬ
種              ：  培養菌体
種量            ：  ３ｇ
培養温度        ：  ３２℃
培養時間        ：  １４時間
通気量          ：  ０．４Ｌ／分
糖量            ：  ７．８ｇ
窒素（Ｎ）源    ：  ウレア
Ｎ／炭素（Ｃ）  ：  ４．０
リン（Ｐ）源    ：  リン酸１ナトリウム
Ｐ／Ｃ          ：  ０．４
【００４４】
（２）本発酵（グルタチオン分泌発酵）
パン用酵母試験法（日本イースト工業会平成８年８月）第５頁の（１）液発酵法に従って、パン酵母を発酵した。具体的には、前記（１）前培養で得られた酵母懸濁液を下記に示した〔発酵液〕の量で１００ｃｃの三角フラスコ中、３０℃の温水槽で２時間震盪発酵（水平往復式、震盪幅６．０ｃｍ、震盪回数１００回／分）した。得られた菌体発酵液を遠心分離により菌体と上清に分離し、上清をグルタチオン測定サンプルとした。
〔発酵液〕
酵母懸濁液（１０％ｗ／ｖ）      ：  ５ｍＬ
ショ糖溶液（６６．７％ｗ／ｖ）  ：  ３ｍＬ
イオン交換水                    ：  １２ｍＬ
全量    ２０ｍＬ
【００４５】
（３）グルタチオン（ＧＳＨ）量の測定
分光光度計用ガラスセルに、５ｍＬのピペットマンでリン酸バッファを２．５ｍＬ分取した。次に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を１００μＬと、５−５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ［２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ］（ＤＴＮＢ）溶液を３０μＬとをピペットマンで添加した。校正したピペットマンを用いてサンプルを２００μＬ添加し、セル内でピペッティングを行いよく混合した。１分間インキュベート後、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）を１００μＬ添加後、１０秒ごとに９０秒間、吸収波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定した。反応開始２０秒後と８０秒後の吸光度から反応速度を求めた。
スタンダードとして０ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１５ｐｐｍのＧＳＨ溶液を作製し、検量線を求めた。
菌体量を補正するためファクターで補正し、グルタチオン量を算出した。
以下に、測定に使用した試薬の組成を示す。
・  リン酸バッファ  ：  ５０ｍＭ、ｐＨ７．０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ
・  ＧＲ  ：  ５Ｕ／ｍＬ  ＧＲ  ｉｎ  リン酸バッファ
・  ＤＮＴＢ溶液  ：  １９．８ｍｇ  ＤＮＴＢ、７．５ｍｇ  ＮａＨＣＯ３／５ｍＬ  リン酸バッファ
・  β−ＮＡＤＰＨ  ：  ４ｍｇ／ｍＬ  ＮＡＤＰＨ  ｉｎ  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ溶液
【００４６】
前記グルタチオン分泌量の測定により、グルタチオンの分泌量が２ｐｐｍ以上であったパン酵母を複数得た。
【００４７】
＜フロア時間安定性＞
前記グルタチオンの分泌量が２ｐｐｍ以上であったパン酵母と、市販のパン酵母１〜３のそれぞれを用い、中種法によりロールパンを製造した。配合及び工程は、以下のとおりである。
【００４８】
［配合］
−中種−
・  パン用小麦粉※  ・・・  ７０質量部
・  パン酵母        ・・・  ３質量部
・  イーストフード  ・・・  ０．１質量部
・  ビタミンＣ      ・・・  １０ｐｐｍ
・  ぶどう糖        ・・・  ３質量部
・  全卵            ・・・  １０質量部
・  水              ・・・  ３２質量部
−本捏−
・  パン用小麦粉※  ・・・  ３０質量部
・  食塩            ・・・  １質量部
・  砂糖            ・・・  ２２質量部
・  脱脂粉乳        ・・・  ２質量部
・  マーガリン      ・・・  １０質量部
・  水              ・・・  ２２質量部
※：日清製粉株式会社製「オーション」
【００４９】
［工程］
−中種−
・  ミキシング  ・・・  低速２分中速２分
・  捏上温度    ・・・  ２６℃
・  発酵条件    ・・・  ２８℃、２時間
−本捏−
・  ミキシング  ・・・  低速２分中速６分↓中速３分高速１分
・  フロア時間  ・・・  ２０分又は４０分
・  フロア条件  ・・・  ２８℃、相対湿度７５％
・  分割重量    ・・・  ７０ｇ
・  ベンチ条件  ・・・  ２８℃、相対湿度７５％
・  成型方法    ・・・  モルダー使用、ロール成型（フロア時間２０分のパン生地の長さが１７±０．５ｃｍになるようにモルダーを調整）
・  ホイロ時間  ・・・  ７０分
・  ホイロ条件  ・・・  ３５℃、相対湿度８５％
・  焼成条件    ・・・  ２００℃、９分
前記本捏のミキシングにおける「↓」は、マーガリンの投入時期を表す。
【００５０】
［評価］
製造したロールパンの長さ、高さ及び比容積を測定した結果を表１−１〜１−３に示す。なお、前記比容積は、得られたパンの容積（ｍｌ）／生地質量（ｇ）で算出したものである。
前記長さ及び高さについては、測定結果を図１及び図２に示し、また、以下の評価基準で評価した結果も併せて表１−１及び１−２に示す。
なお、前記グルタチオンの分泌量が２ｐｐｍ以上であったパン酵母については、代表例として、ＡＤ０１株、ＡＤ０２株、ＡＤ０４株及びＡＤ０６株の結果を示す。
−ロールパンの長さの評価基準−
○  ：  フロア時間２０分間としたときのパンの長さと、フロア時間４０分間としたときのパンの長さとの差が、２％以内である。
△  ：  フロア時間２０分間としたときのパンの長さと、フロア時間４０分間としたときのパンの長さとの差が、２％超、３％以内である。
×  ：  フロア時間２０分間としたときのパンの長さと、フロア時間４０分間としたときのパンの長さとの差が、３％超である。
−ロールパンの高さの評価基準−
○  ：  フロア時間２０分間としたときのパンの高さと、フロア時間４０分間としたときのパンの高さとの差が、１．５％以内である。
△  ：  フロア時間２０分間としたときのパンの高さと、フロア時間４０分間としたときのパンの高さとの差が、１．５％超、２．５％以内である。
×  ：  フロア時間２０分間としたときのパンの高さと、フロア時間４０分間としたときのパンの高さとの差が、２．５％超である。
【００５１】
前記ＡＤ０１株、ＡＤ０２株、ＡＤ０４株及びＡＤ０６株と、市販のパン酵母１〜３のグルタチオンの分泌量は以下のとおりである。
−グルタチオン分泌量−
・  ＡＤ０１株  ・・・  ４．０ｐｐｍ
・  ＡＤ０２株  ・・・  ８．８ｐｐｍ
・  ＡＤ０４株  ・・・  ８．０ｐｐｍ
・  ＡＤ０６株  ・・・  ６．３ｐｐｍ
・  市販のパン酵母１  ・・・  ０．６ｐｐｍ
・  市販のパン酵母２  ・・・  １．２ｐｐｍ
・  市販のパン酵母３  ・・・  ０．９ｐｐｍ
【００５２】
【表１−１】
2018019662.tif 000002
【００５３】
【表１−２】
2018019662.tif 000003
【００５４】
【表１−３】
2018019662.tif 000004
【００５５】
表１−１〜１−３並びに図１及び２の結果から、グルタチオンの分泌量が２ｐｐｍ未満である市販のパン酵母を用いた場合では、フロア時間の違いにより、パンの長さ及び高さの少なくともいずれかにおいて、差が生じており、パンの品質に差が生じてしまうことが確認された。具体的には、市販パン酵母１ではフロア時間の違いによりパン生地の縮みが生じ、また市販パン酵母２および３ではパン生地の縮みが顕著でその結果、パンの高さの差も大きくなった。一方、グルタチオンの分泌量が２ｐｐｍ以上である本発明のパン酵母を用いた場合では、フロア時間の違いによるパンの品質（長さ、高さなどの外観）の差が抑制されていた。したがって、本発明のパン酵母を用いることにより、パン生地にフロア時間安定性を付与できることが確認された。
また、パン生地にフロア時間安定性が付与された結果、本発明のパン酵母を用いたパンはフロア時間が２０分間、４０分間のいずれでもパンの内相がきめ細かく、食感も軽い食感となっていた。これに対し、市販のパン酵母を用いたパンでは、フロア時間が２０分間のパンと比較して、４０分間のパンは内相がやや粗く、食感もやや弾きがある食感となっていた。
なお、図１はパンの長さを測定した結果を示す図であり、図２はパンの高さを測定した結果を示す図である。図１及び２中、横軸の各項目における左側のグラフはフロア時間を２０分間とした場合の結果を示し、右側のグラフはフロア時間を４０分間とした場合の結果を示す。
【００５６】
前記サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤ０１株、ＡＤ０２株、ＡＤ０４株及びＡＤ０６株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託申請し、前記ＡＤ０１株はＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５１、前記ＡＤ０２株はＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５２、前記ＡＤ０４株はＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５３、前記ＡＤ０６株はＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５４として、２０１６年５月１１日に受託された。
【００５７】
（試験例２：冷凍耐性）
前記試験例１で得られたＡＤ０１株、ＡＤ０２株、ＡＤ０４株及びＡＤ０６株と、市販のパン酵母４及び市販のパン酵母５とを用い、冷凍パン生地を製造した。配合及び工程は、以下のとおりである。
【００５８】
＜配合＞
・  パン用小麦粉※  ・・・  １００質量部
・  パン酵母        ・・・  ５質量部
・  改良剤          ・・・  １質量部
・  食塩            ・・・  １．５質量部
・  砂糖            ・・・  １５質量部
・  脱脂粉乳        ・・・  ３質量部
・  ショートニング  ・・・  ５質量部
・  水              ・・・  ５５質量部
※：日清製粉株式会社製「オーション」
【００５９】
＜工程＞
・  ミキシング  ・・・  ４分
・  捏上温度    ・・・  ２０℃
・  フロア時間  ・・・  ６０分
・  フロア条件  ・・・  ２５℃、相対湿度８０％
・  分割重量    ・・・  ２５ｇ
・  ベンチ時間  ・・・  ２０分
・  ベンチ条件  ・・・  ２５℃、相対湿度８５％
・  成型方法    ・・・  丸め
・  凍結条件    ・・・  −４０℃のフリーザーで１時間凍結後、−２０℃のフリーザーで凍結保存
・  解凍時間    ・・・  ４５分間
・  解凍条件    ・・・  ２５℃、相対湿度８０％
【００６０】
＜評価＞
−２０℃のフリーザーで、７日間〜９０日間保存後のパン生地について、３５℃におけるホイロ炭酸ガス発生量を測定した。また、未凍結のパン生地についても同様にしてホイロ炭酸ガス発生量を測定した。７日間保存後のパン生地のガス発生量を１００％としたときの残存率と併せて、結果を表２に示す。
【００６１】
【表２】
2018019662.tif 000005
【００６２】
表２の結果から、ＡＤ０１株、ＡＤ０２株、ＡＤ０４株及びＡＤ０６株では、生地を冷凍した場合でも十分なガス発生量が認められた。したがって、ＡＤ０１株、ＡＤ０２株、ＡＤ０４株及びＡＤ０６株は、フロア時間安定性に加え、冷凍耐性も有することが確認され、冷凍生地にも用いることができることがわかった。
【００６３】
（試験例３：様々な糖濃度での汎用性）
前記試験例１で得られたＡＤ０１株、ＡＤ０２株、ＡＤ０４株及びＡＤ０６株と、市販のパン酵母６とを用い、糖濃度が５％又は３５％のパン生地を製造した。配合及び工程は、以下のとおりである。なお、前記市販のパン酵母６は、汎用性を有することが確認されているオリエンタル酵母工業株式会社製の「レギュラー」（品名）である。
【００６４】
＜糖濃度  ５％＞
−配合−
・  パン用小麦粉※  ・・・  １００質量部
・  パン酵母        ・・・  ２質量部
・  砂糖            ・・・  ５質量部
・  食塩            ・・・  ２質量部
・  水              ・・・  ６８質量部
※：日清製粉株式会社製「オーション」
【００６５】
−工程−
・  ミキシング  ・・・  ３分
・  捏上温度    ・・・  ２８℃
・  分割重量    ・・・  ３０ｇ
【００６６】
＜糖濃度  ３５％＞
−配合−
・  パン用小麦粉※  ・・・  １００質量部
・  パン酵母        ・・・  ４質量部
・  砂糖            ・・・  ３５質量部
・  食塩            ・・・  ０．５質量部
・  水              ・・・  ５６質量部
※：日清製粉株式会社製「オーション」
【００６７】
−工程−
・  ミキシング  ・・・  ３分
・  捏上温度    ・・・  ２８℃
・  分割重量    ・・・  ３０ｇ
【００６８】
＜評価＞
前記工程において、３０ｇに分割した後、２８℃、２時間におけるガス発生量をファーモグラフ（アトー株式会社製）にて測定した。結果を表３に示す。
【００６９】
【表３】
2018019662.tif 000006
【００７０】
表３の結果から、ＡＤ０１株、ＡＤ０２株、ＡＤ０４株及びＡＤ０６株が、低糖域〜高糖域まで十分なガス発生量を示すことが確認された。したがって、ＡＤ０１株、ＡＤ０２株、ＡＤ０４株及びＡＤ０６株は、フロア時間安定性、冷凍耐性に加え、低糖域〜高糖域まで使用可能という汎用性も有することが確認された。
【受託番号】
【００７１】
ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５１
ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５２
ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５３
ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５４
【図１】
2018019662.tif 000007
【図２】
2018019662.tif 000008