(57)【要約】      （修正有）【課題】親及び既知のα−アミラーゼ変異体と比較して改善された安定性を有するα−アミラーゼ変異体の提供。【解決手段】親α−アミラーゼの変異体であって、α−アミラーゼ活性を有し、特定の配列と少なくとも８９％の配列同一性を有し、特定の配列のアミノ酸１８０〜１８３に対応する位置にＦＸ１Ｘ２Ｋのアミノ酸モチーフを含み、ここでＸ１はＲ又はＳであり；そしてＸ２は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され得、但し、Ｘ１がＲのとき、Ｘ２はＳではなく、ここで前記変異体は、ＦＲＳＫモチーフを含むアミラーゼと比較して、改善された残効性を有する、変異体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
親α−アミラーゼの変異体であって、
α−アミラーゼ活性を有し、配列番号１と少なくとも８９％の配列同一性を有し、配列番号２のアミノ酸１８０〜１８３に対応する位置にＦＸ１Ｘ２Ｋ（配列番号４）のアミノ酸モチーフを含み、
ここでＸ１はＲ又はＳであり；そして
Ｘ２は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され得、
ただし、Ｘ１がＲのとき、Ｘ２はＳではなく、
ここで前記変異体は、ＦＲＳＫモチーフを含むアミラーゼと比較して、改善された残効性（ＲＡ）を有する、
変異体。
【請求項２】
Ｘ２がＳ、Ｇ又はＴである、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
Ｘ１がＲであるとき、Ｘ２はＧ又はＴである、請求項１又は２に記載の変異体。
【請求項４】
Ｘ１がＳであるとき、Ｘ２はＳ、Ｇ、又はＴである、請求項１又は２に記載の変異体。
【請求項５】
Ｘ１がＲであるとき、Ｘ２はＴである、請求項１に記載の変異体。
【請求項６】
Ｘ１はＲであり、かつＸ２はＧである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項７】
Ｘ１はＳであり、かつＸ２はＴである、請求項１、２又は４のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項８】
Ｘ１はＳであり、かつＸ２はＧである、請求項１、２又は４のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項９】
改変、例えば置換、挿入及び／又は欠失をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項１０】
Ｙ２４２及びＦ２６６に対応する位置の少なくとも１つにおいて置換をさらに含み、ここで番号付けは配列番号２に従う、請求項１〜９のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項１１】
位置Ｙ２４２における前記置換はＹ２４２Ｆであり、そして位置Ｆ２６６における前記置換はＦ２６６Ｙである、請求項１０に記載の変異体。
【請求項１２】
前記親α−アミラーゼは、配列番号１、２又は３のアミノ酸配列と少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項１３】
前記親α−アミラーゼは、配列番号１、２又は３のアミノ酸配列を含む、又はから成る、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項１４】
親α−アミラーゼのアミノ酸配列と少なくとも８９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％であって、１００％未満である配列同一性を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項１５】
改変の数は１〜２０個であり、例えば１〜１０個及び１〜５個であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の改変である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項１６】
前記親α−アミラーゼと比較して、改善された安定性、例えば貯蔵安定性、熱安定性、洗剤中での安定性及びキレート剤安定性を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項１７】
前記親α−アミラーゼは、配列番号１、２又は３のアミノ酸配列を含む、又はから成る、請求項１４に記載の変異体。
【請求項１８】
前記改善された安定性は、ファデバス（Phadebas）アッセイによって決定される、請求項１６又は１７に記載の変異体。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の変異体を含む、組成物。
【請求項２０】
清浄用組成物である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
洗剤成分、例えば界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、ポリマー、及び布地色調剤 (fabric hueing agents)をさらに含む、請求項１９又は２０に記載の組成物。
【請求項２２】
液体、固体、棒状石鹸、フィルム、単位用量又はパウチ洗剤組成物として製剤化される、請求１９〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
少なくとも１つの追加の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、グルカナーゼ、別のデンプン分解酵素、及び／又はセルラーゼをさらに含む、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の変異体を含み、必要に応じて非発塵性の粒状物、安定化された液体、又は保護された酵素の形態である、洗剤添加物。
【請求項２５】
洗剤添加物１ｇあたり０．０２〜２００ｍｇの酵素タンパク質を含む、請求項２４に記載の洗剤添加物。
【請求項２６】
別の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、グルカナーゼ、別のデンプン分解酵素、及び／又はセルラーゼを追加で含む、請求項２４又は２５に記載の洗剤添加物。
【請求項２７】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の変異体、及び必要に応じて界面活性剤を含む、手動又は自動食器洗浄用の洗剤組成物。
【請求項２８】
別の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、グルカナーゼ、別のデンプン分解酵素、及び／又はセルラーゼを追加で含む、請求項２７に記載の手動又は自動食器洗浄用の洗剤組成物。
【請求項２９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の変異体を含む、手動又は自動の洗濯用洗剤組成物。
【請求項３０】
別の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、グルカナーゼ、別のデンプン分解酵素、及び／又はセルラーゼを追加で含む、請求項２９に記載の手動又は自動洗濯用洗剤組成物。
【請求項３１】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の変異体の使用。
【請求項３２】
洗濯、食器洗い例えば自動又は手動食器洗い、硬質表面清浄、工業用及び業務用の清浄、織物の糊抜き(textile desizing)、デンプンの改質、デンプンの液化、糖化、食事、ベーキング又は醸造における、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の変異体の使用。
【請求項３３】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の変異体をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項３３に記載のポリヌクレオチドを含む、核酸構築物。
【請求項３５】
請求項３３に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項３６】
請求項３３に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項３７】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ変異体の製造方法であって：
ａ．前記変異体の発現のために適切な条件下、請求項３７に記載の宿主細胞を培養し；そして
ｂ．前記変異体を回収すること
を含む、方法。
【請求項３８】
α−アミラーゼの変異体の製造方法であって、
配列番号１のアミノ酸配列のＲ１８０、Ｓ１８１、Ｔ１８２、及びＧ１８３に相当する位置から選択される２つのアミノ酸の欠失を親α−アミラーゼに導入して、ＦＸ１Ｘ２Ｋ（配列番号４）のアミノ酸モチーフを提供し；そして
前記変異体を回収すること
を含み、
ここでＸ１はＲ又はＳであり、Ｘ２は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され得、ただし、Ｘ１がＲのとき、Ｘ２はＳではなく、
ここで前記変異体は、ＦＲＳＫモチーフを含むアミラーゼと比較して、改善された残効性（ＲＡ）を有し、前記変異体はα−アミラーゼ活性を有する、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本願はコンピュータ可読形式の配列表を含み、その内容を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は安定化α−アミラーゼ変異体 (variant)、この変異体をコードするポリヌクレオチド、この変異体の製造方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
α−アミラーゼ類（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．（＝酵素番号）３．２．１．１）は、デンプン並びに他の直鎖・分岐鎖の１，４−グルコシド結合を有するオリゴ糖及び多糖の加水分解を触媒する一群の酵素を構成する。
【０００４】
α−アミラーゼは洗剤、ベーキング、醸造、デンプンの液化及び糖化（例えば高果糖シロップを調製する際やデンプンからエタノールを製造する際）などいくつかの公知の用途で長年にわたり産業利用されてきた。α−アミラーゼの上記の用途や他の用途は公知であり、微生物（特に細菌）由来のα−アミラーゼを利用する。
【０００５】
最初に使用された細菌由来α−アミラーゼの一つはＢ．リケニフォルミス（B. licheniformis）由来α−アミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）としても知られる）であり、この酵素は詳細に特性評価されており結晶構造も決定されている。バシラス属（Bacillus）由来のアミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）及びＳＰ７０７など）は、洗剤に使用できることがわかっているα−アミラーゼの特定の群を構成する。これらの公知の細菌由来アミラーゼの多くは特定の用途での機能を改善するため改変されてきた。
【０００６】
α−アミラーゼの熱安定性を高める方法は十分に研究されてきた。Ｓｕｚｕｋｉらの文献（１９８９年）にはＢ．アミロリクエファキエンス（B. amyloliquefaciens）のα−アミラーゼの特定領域をＢ．リケニフォルミス（B. licheniformis）のα−アミラーゼの対応領域で置換したキメラα−アミラーゼが開示されている。このキメラα−アミラーゼは熱安定性に関与する領域を特定する目的で構築された。この領域はＢ．アミロリクエファキエンス由来α−アミラーゼの１７７位〜１８６位及び２５５位〜２７０位のアミノ酸残基を含むことがわかった。Ｉｇａｒａｓｈｉらの文献（１９９８年）はＡｍｙＳ（＝Ｂ．ステアロテルモピルス（B. stearothermophilus）由来α−アミラーゼ）型アミラーゼの熱安定性はループ（Ｆ１７８〜Ａ１８４）から２個のアミノ酸残基Ｒ１７９〜Ｇ１８０（ＡｍｙＳでの番号）を欠失させることによって向上できると示している。しかし、Ｓｈｉａｕらの文献（２００３年）は、それと同じループに欠失を有するＡｍｙＳ酵素は高温でのトウモロコシのデンプンの加水分解に関する比活性が親酵素よりも低く、ＡｍｙＳアミラーゼの主要な利点の一つが無効になることを示した。
【０００７】
国際公開第2014/195356号において、α−アミラーゼ変異体、例えばバシラスＴＳ−２３−α−アミラーゼは、改善された安定性を有すると記載されている。当該変異体は、ｉ）２個以上の位置における欠失、及びｉｉ）リストから選択される１つ以上の位置における変更を含み得る。
【０００８】
環境上の理由で、洗浄、食器洗浄、及び／又は清浄の作業温度を低くすることはますます重要となっている。しかし、アミラーゼを含む大多数の酵素の最適温度は低温洗浄に通常使用する温度より高い。α−アミラーゼは洗剤組成物に用いられる重要な酵素であり、これを洗濯又は食器洗浄の際にデンプンによる汚れを除去するため使用することがますます重要になっている。したがって、温度を低くしても洗浄性能、汚れ除去効果及び／又は活性を保持するα−アミラーゼ変異体を見出すことが重要である。しかし、現在の洗剤酵素組成物の効率でも完全に除去するのが難しい汚れは多い。これらの問題は、低い（例えば冷水）洗浄温度や短い洗浄サイクルの使用が増えることにより悪化している。そこで、低温で機能すると共に比活性（デンプン分解活性）、安定性、及び／又は洗浄性などのその他の所望の性質を維持又は向上できるデンプン分解酵素を得るのが望ましい。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、液体洗剤などの洗剤組成物に含有させた場合、特にキレート剤、界面活性剤、プロテアーゼ、及び／又はアルカリ条件の存在下で高い安定性を示すα−アミラーゼ変異体を提供することである。
【００１０】
本発明は親及び既知のα−アミラーゼ変異体と比較して改善された安定性を有するα−アミラーゼ変異体を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一側面では、本発明は、親α−アミラーゼの変異体であって、α−アミラーゼ活性を有し、配列番号１と少なくとも８９％の配列同一性を有し、配列番号２のアミノ酸１８０〜１８３に対応する位置にＦＸ１Ｘ２Ｋのアミノ酸モチーフを含み、ここでＸ１はＲ又はＳであり、そしてＸ２は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され得、ただし、Ｘ１がＲのとき、Ｘ２はＳではなく、ここで前記変異体は、ＦＲＳＫモチーフを含むアミラーゼと比較して、改善された残効性（Residual Activity (RA)）を有する変異体に関する。
【００１２】
さらなる側面では、本発明は本発明の変異体を含む組成物に関する。
【００１３】
さらなる側面では、本発明は、本発明の変異体を含み、必要に応じて非発塵性の粒状物（non-dusting granulate）、安定化された液体、又は保護された酵素の形態の洗剤添加物に関する。
【００１４】
さらなる側面では、本発明は、本発明の変異体及び必要に応じて界面活性剤を含む手動又は自動食器洗浄用の洗剤組成物に関する。
【００１５】
さらなる側面では、本発明は本発明の変異体を含む手動又は自動洗濯用の洗剤組成物に関する。
【００１６】
さらなる側面では、本発明は本発明の変異体の使用に関する。
【００１７】
一側面では、本発明は、洗濯、食器洗浄例えば自動又は手動の食器洗浄、硬質表面の清浄、工業用及び業務用の (institutional)清浄、繊維製品の糊抜き（textile desizing）、デンプンの改質、デンプンの液化 (liquefaction)、糖化、食事（feed）、ベーキング(baking)又は醸造 (brewing)における本発明の変異体の使用に関する。
【００１８】
さらなる側面では、本発明は本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１９】
一側面では、本発明は本発明のポリペプチドを含む核酸構築物に関する。
【００２０】
一側面では、本発明は本発明のポリペプチドを含む発現ベクターに関する。
【００２１】
一側面では、本発明は本発明のポリペプチドを含む宿主細胞に関する。
【００２２】
さらなる側面では、本発明は、本発明のα−アミラーゼ変異体の製造方法であって：（ａ）前記変異体の発現のために適切な条件下、本発明の宿主細胞を培養することと；（ｂ）前記変異体を回収することを含む、方法に関する。
【００２３】
さらなる側面では、本発明は、α−アミラーゼの変異体の製造方法であって、配列番号１のアミノ酸配列のＲ１８０、Ｓ１８１、Ｔ１８２、及びＧ１８３に相当する位置から選択される２つのアミノ酸の欠失を親α−アミラーゼに導入して、ＦＸ１Ｘ２Ｋ（配列番号４）のアミノ酸モチーフを提供し；そして前記変異体を回収することを含み、ここでＸ１はＲ又はＳであり、Ｘ２は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され得、ただし、Ｘ１がＲのとき、Ｘ２はＳではなく、ここで前記変異体は、ＦＲＳＫモチーフを含むアミラーゼと比較して、改善された残効性（Residual Activity (RA)）を有し、前記変異体はα−アミラーゼ活性を有する、方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（定義）
α−アミラーゼ：本明細書で使用する場合、「α−アミラーゼ活性」という用語は、デンプン並びにその他の直鎖・分岐鎖の１，４−グルコシド結合を有するオリゴ糖及び多糖類の加水分解を触媒する一群の酵素を構成するα−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）の活性を指す。本発明の目的のため、「方法」の項に記載の手順に従いα−アミラーゼ活性を決定する。一側面では、本発明の変異体のα−アミラーゼ活性は以下に示す配列番号１、２、又は３の成熟ポリペプチドのα−アミラーゼ活性の少なくとも２０％（例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％）である。
【００２５】
【化１】
2018019680.tif 000002
【００２６】
【化２】
2018019680.tif 000003
【００２７】
【化３】
2018019680.tif 000004
【００２８】
【化４】
2018019680.tif 000005
【００２９】
α−アミラーゼ活性：本明細書で使用する場合、「α−アミラーゼ活性」という用語は、「方法」の項に記載の手順に従い決定したα−アミラーゼの活性を指す。α−アミラーゼ活性は実施例１に記載のファデバス（Ｐｈａｄｅｂａｓ（商標））による方法で決定してもよい。他のα−アミラーゼ活性アッセイ、例えばＥｎｚＣｈｅｃｋ又はＡｍｙｌａｚｙｍｅが使用されてもよい。
【００３０】
アミノ酸：本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、遺伝的にコードされた標準的な２０種のアミノ酸とそれに対応する立体異性体ｄ体（天然型が「ｌ」体であるのに対して）、オメガアミノ酸、その他の天然アミノ酸、特殊なアミノ酸（例えばα，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸など）、及び化学誘導体化アミノ酸を指す。１つ以上のアミノ酸の化学誘導体は官能側基との反応によって得られる。このような誘導体化分子としては、例えば、遊離アミノ基が誘導体化してアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、又はホルミル基を形成している分子が挙げられる。遊離カルボキシ基を誘導体化して塩、メチルエステル及びエチルエステル、又は他の種類のエステル及びヒドラジドを形成してもよい。遊離ヒドロキシ基を誘導体化してＯ−アシル誘導体又はＯ−アルキル誘導体を形成してもよい。化学誘導体としては２０種の標準アミノ酸の天然アミノ酸誘導体を含むペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンをプロリンに置換してもよく；５−ヒドロキシリジンをリジンに置換してもよく；３−メチルヒスチジンをヒスチジンに置換してもよく；ホモセリンをセリンに置換してもよく、オルニチンをリジンに置換してもよい。誘導体としては、必要な活性が維持される限り、１つ以上の付加又は欠失を有するペプチドも含まれる。その他に含まれる修飾はアミド化、アミノ末端のアシル化（例えばアセチル化又はチオグリコール酸アミド化）、カルボキシ末端のアミド化（例えばアンモニア又はメチルアミンによる）などの末端修飾である。
【００３１】
「アラニン」、「Ａｌａ」、又は「Ａ」のように具体的にアミノ酸を挙げた場合、この用語は特に明記しない限りｌ−アラニンとｄ−アラニンの両方を指す。その他の特殊なアミノ酸も、所望の機能的性質をポリペプチドが保持する限り、本発明のポリペプチドに適切な成分とすることができる。記載するペプチドについて、適切な場合には、コードされた各アミノ酸残基を従来のアミノ酸の慣用名に対応する一文字表記で表す。一態様では、本発明のポリペプチドはｌ体アミノ酸を含むか、それらから成る。
【００３２】
アミノ酸モチーフ：本明細書で使用する場合、「アミノ酸モチーフ」又は「モチーフ」という用語は、あるポリペプチドのうちの特に定義されたアミノ酸配列を指す。したがって、アミノ酸モチーフは親ポリペプチドに含まれるアミノ酸の短い配列に関連する。本発明によれば、このアミノ酸モチーフは配列番号２のアミノ酸１８０位〜１８３位に対応する配列番号４に相当する。
【００３３】
ｃＤＮＡ：本明細書で使用する場合、「ｃＤＮＡ」という用語は、真核細胞又は原核細胞から得たスプライシング後の成熟ｍＲＮＡ分子から逆転写により調製できるＤＮＡ分子を指す。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡに存在し得るイントロン配列を有さない。初期の一次ＲＮＡ転写物はｍＲＮＡの前駆体であり、スプライシングなどの一連の工程によるプロセシングを受けた後、スプライシング後の成熟ｍＲＮＡとなる。
【００３４】
コード配列：本明細書で使用する場合、「コード配列」という用語は変異体のアミノ酸配列を直接特定するポリヌクレオチドを指す。コード配列の境界は一般に翻訳領域で決定され、開始コドン（ＡＴＧ、ＧＴＧ、又はＴＴＧなど）で開始し、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、又はＴＧＡなど）で終了する。コード配列はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はその組み合わせであってよい。
【００３５】
制御配列：本明細書で使用する場合、「制御配列」という用語は、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を指す。各制御配列は変異体をコードするポリヌクレオチドに固有の（同じ遺伝子に由来する）配列でも異質な（異なる遺伝子に由来する）配列でもよく、互いに固有でも異質でもよい。このような制御配列としては、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、転写開始配列、シグナルペプチド配列、及び転写終結配列などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。制御配列は少なくとも転写開始配列と転写終止シグナル及び翻訳終止シグナルを含む。制御配列と変異体をコードするポリヌクレオチドのコード領域とをライゲートしやすくする特定の制限部位を導入するため、制御配列にリンカーを付加してもよい。
【００３６】
対応する：本明細書で使用する場合、「対応する」という用語は、ある配列の特定のアミノ酸を特定のアミノ酸配列を参照して決定する方法を指す。例えば、本発明の目的のため、特定のアミノ酸位置を参照する場合、当業者は別のアミノ酸配列のうちどの特定のアミノ酸を対象とすればよいかを決めるため、参照したその特定のアミノ酸配列にその別のアミノ酸配列を整列させることができる。別のアミノ酸配列と例えば配列番号１、２、又は３に示す配列あるいは本明細書に示す他の任意の配列との整列については本明細書の別の箇所で説明する。他の整列方法も使用でき、当業者には周知である。
【００３７】
食器洗浄組成物：本明細書で使用する場合、「食器洗浄組成物」という用語は硬質表面を清浄するためのあらゆる形態の組成物を指す。本発明は、いかなる特定の種類の食器洗浄組成物又は特定の洗剤にも限定されない。したがって、一態様では食器洗浄組成物は液体や粉末の食器洗浄組成物であり、ここで、組成物は必要に応じて単位用量(unit dose)の形態であってもよい。
【００３８】
酵素洗浄に関する利点：本明細書で使用する場合、「酵素洗浄に関する利点」という用語は、酵素を含まない同じ洗剤と比較して酵素が洗剤に付与できる有利な効果を指す。酵素がもたらすことのできる洗浄に関する重要な利点は、洗浄及び／又は清浄後に目に見える汚れが全く又はほとんどなくなる汚れ除去、洗浄工程で落ちた汚れが再付着するのを予防又は低減すること（再付着防止とも呼ばれる効果）、元は白かったが使用と洗浄を繰り返したため灰色又は黄色がかって見えるようになった繊維製品の白さを完全に又は一部回復すること（増白とも呼ばれる効果）である。触媒による汚れ除去又は汚れの再付着防止には直接関係しない繊維製品の手入れに関する利点も酵素洗浄に関する利点にとって重要である。このような繊維製品の手入れに関する利点の例は、ある布地から別の布地又は同じ布地の別の部分への染料移りを予防又は低減すること（染料移り防止又は色移り防止とも呼ばれる効果）、布地の表面から隆起した繊維や傷んだ繊維を取り除いてピリングの傾向を低減すること、あるいは既にあるピリングや毛羽立ちを除去すること（ピリング防止とも呼ばれる効果）、布地の柔軟性を改善すること、布地の色を鮮明にすること、布地又は衣類の繊維に入り込んだ粒子状の汚れを除去することである。酵素漂白も酵素洗浄に関する利点であり、一般に触媒活性を利用して漂白成分（過酸化水素又はその他の過酸化物など）の形成を触媒する。
【００３９】
発現：本明細書で使用する場合、「発現」という用語は、変異体の生成に関与する任意の工程（転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌などが挙げられるが、これらに限定されるものではない）を指す。
【００４０】
発現ベクター：本明細書で使用する場合、「発現ベクター」という用語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、それを発現させる制御配列に作動可能に連結されている直鎖状又は環状のＤＮＡ分子を指す。
【００４１】
断片：本明細書で使用する場合、「断片」という用語は、配列番号１の成熟ポリペプチドのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端の１つ以上（例えば数個）のアミノ酸を欠くポリペプチドを指し、ここで、この断片はα−アミラーゼ活性を有する。一側面では、断片は配列番号１のうち少なくとも２００個（例えば少なくとも３００個、少なくとも３５０個、少なくとも４００個、又は少なくとも４５０個）の連続するアミノ酸残基を含む。
【００４２】
硬質表面の清浄：本明細書で使用する場合、「硬質表面の清浄」という用語は、硬質表面をきれいにすることを指し、硬質表面としては、床、テーブル、壁、屋根など、さらには車（洗車）や食器（食器洗浄）などの硬い物体の表面を挙げることができる。食器洗浄としては、皿、カップ、グラス、ボウル、食卓用金物（スプーン、ナイフ、フォーク、取分け用の器具など）、陶器、プラスチック、金属、磁器、ガラス、アクリルなどの清浄が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
宿主細胞：本明細書で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物又は発現ベクターを用いた形質転換、形質移入、形質導入などの影響を受けやすい任意の細胞型を指す。この用語は複製中に起こる変異が原因で親細胞と同一ではない任意の子孫細胞を包含する。
【００４４】
強度値：白色光で照らしたときに試料から反射する光の強度で表される輝度として洗浄性能を測定する。試料が汚れた場合、反射光の強度は清浄な試料の場合よりも低い。したがって、反射光の強度によって洗浄性能を測定でき、強度値が高くなるとそれに関連して洗浄性能も高くなる。色彩の測定は、洗浄した繊維製品の画像を取り込むのに使用されるプロフェッショナル仕様の平台スキャナ（Kodak iQsmart、Kodak）で行う。走査した画像から光強度値を抽出するため、画像の２４ビット画素値を赤、緑、青（ＲＧＢ）の値に変換する。強度値（Ｉｎｔ）はＲＧＢ値をベクトルとして合計して得られるベクトルの長さを求めることで計算する。
【数１】
2018019680.tif 000006
【００４５】
改善された性質：本明細書で使用する場合、「改善された性質」という用語は、変異体に関連する性質で親と比較して改善されたものを指す。このような改善された性質としては、洗浄性能及び貯蔵条件での安定性が挙げられるが、これらに限定されるものではない。改善された性質は本明細書で定義・説明した性質（安定性など）のいずれであってもよい。
【００４６】
単離された：本明細書中で使用する場合、「単離された」という用語は、天然に存在しない形態又は環境にある物質を指す。単離された物質の例としては以下が挙げられるが、これらに限定されるものではない：（１）任意の非天然物質、（２）本来は付随している天然成分の１つ以上又は全体から少なくとも部分的に取り出された任意の酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチド、又は補助因子などの（ただし、これらに限定されるものではない）任意の物質、（３）天然の物質を人工的に改変した任意の物質、（４）物質の量をその物質に本来は付随している他の成分よりも多くすることで改変された任意の物質（例えば、その物質をコードする遺伝子の複数のコピー；その物質をコードする遺伝子に本来付随している転写開始配列より強力な転写開始配列の使用）。単離された物質は発酵ブロス試料中に存在してもよい。
【００４７】
成熟ポリペプチド：本明細書で使用する場合、「成熟ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化など、翻訳及び任意の翻訳後修飾の後の最終形態のポリペプチドを指す。宿主細胞は、同じポリヌクレオチドによって発現される２種以上の異なる成熟ポリペプチドの混合物（すなわち異なるＣ末端及び／又はＮ末端アミノ酸を有する）を産生できることが当技術分野では公知である。
【００４８】
成熟ポリペプチドコード配列：本明細書で使用する場合、「成熟ポリペプチドコード配列」という用語は、α−アミラーゼ活性を有する成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【００４９】
改変：本発明のポリペプチドに関して「改変 (modification)」という用語は、基準アミノ酸配列（すなわち配列番号１、２、又は３）の１個以上のアミノ酸を他のアミノ酸との置換あるいはアミノ酸の挿入又は欠失によって変更することを意味する。この変異は基準アミノ酸配列に１つ以上の追加のアミノ酸を挿入することに相当する可能性もある。「改変」、「変更 (alteration)」、及び「変異 (mutation)」という用語は互換的に用いてよく、同じ意味及び目的を構成する。
【００５０】
核酸構築物：本明細書で使用する場合、「核酸構築物」という用語は、天然の遺伝子から単離されたか、本来は天然には存在しない形で核酸のセグメントを含むよう改変された（すなわち合成された）、１つ以上の制御配列を含む一本鎖又は二本鎖の核酸分子を指す。
【００５１】
作動可能に連結された：本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」という用語は、制御配列がコード配列の発現を指示するようにポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に制御配列が配置されている構成を指す。
【００５２】
親又は親α−アミラーゼ：本明細書で使用する場合、「親」又は「親α−アミラーゼ」という用語は、配列番号１、２、又は３のα−アミラーゼ、あるいは配列番号１、２、又は３のポリペプチドのうちいずれかに対し少なくとも８９％の配列同一性を有する任意のα−アミラーゼを指す。親α−アミラーゼはまた、配列番号１、２、又は３の断片を含むポリペプチドであってもよい。すなわち、親α−アミラーゼはα−アミラーゼ活性を有する融合ポリペプチドであってよい（これについては本明細書の別の箇所で定義する）。
【００５３】
残効性（ＲＡ）：本明細書で使用する場合、「残効性（ＲＡ）」という用語は、特定温度で特定の期間インキュベーションした後の、本発明の変異体の残存、及び／又は酵素の残存の活性を指す。ＲＡは、実施例１に記載された通りに、例えばファデバス（Phadebas）アッセイを用いて決定されてもよい。
【００５４】
デンプンの改質：本明細書で使用する場合、「デンプンの改質」という用語は、製紙業で紙パルプの製造時にデンプンを分解する処理を指す。製紙業の工程では紙パルプの粘度を最適にするため紙の糊抜きを用いてもよい。
【００５５】
配列同一性：２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の関連性を「配列同一性」というパラメータで説明する。
【００５６】
本発明の目的のため、２つのアミノ酸配列間の配列同一性はＥＭＢＯＳＳパッケージ（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16：276-277）（バージョン５．０．０以降が好ましい）のＮｅｅｄｌｅプログラムで実行されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453）を用いて決定する。使用するパラメータは、ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．５、ＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳ版）置換行列であってよい。「最長の一致」と表示されたＮｅｅｄｌｅの結果（ｎｏ−ｂｒｉｅｆオプションを利用して得られる）は％同一性として用いられ、以下のように計算される：
（同一の残基×１００）／（アライメントの長さ−アライメントに含まれるギャップの総数）
【００５７】
あるいは、使用するパラメータをギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．５、ＥＤＮＡＦＵＬＬ（NCBI NUC4.4のＥＭＢＯＳＳ版）置換行列としてもよい。「最長の一致」と表示されたＮｅｅｄｌｅの結果（ｎｏ−ｂｒｉｅｆオプションを利用して得られる）は％同一性として用いられ、以下のように計算される：
（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アライメントの長さ−アライメントに含まれるギャップの総数）
【００５８】
部分配列：本明細書で使用する場合、「部分配列」という用語は、成熟ポリペプチドコード配列の５’末端及び／又は３’末端に存在しない１個以上（例えば数個）のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを指す。ここで、部分配列はα−アミラーゼ活性を有する断片をコードする。
【００５９】
繊維製品：繊維製品試料ＣＳ−２８（米のデンプンが付着した綿）をCenter For Testmaterials BV（P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, the Netherlands）より入手する。
【００６０】
繊維製品の手入れに関する利点：本明細書で使用する場合、「繊維製品の手入れに関する利点」という用語は、触媒による汚れ除去又は汚れの再付着防止には直接関係しないと定義されるが、これも酵素洗浄に関する利点にとって重要である。このような繊維製品の手入れに関する利点の例は、ある繊維製品から別の繊維製品又は同じ繊維製品の別の部分への染料移りを予防又は低減すること（染料移り防止又は色移り防止とも呼ばれる効果）、繊維製品の表面から隆起した繊維や傷んだ繊維を取り除いてピリングの傾向を低減すること、あるいは既にあるピリングや毛羽立ちを除去（ピリング防止とも呼ばれる効果）すること、繊維製品の柔軟性を改善すること、繊維製品の色を鮮明にすること、繊維製品の繊維に入り込んだ粒子状の汚れを除去することである。酵素漂白も酵素洗浄に関する利点であり、一般に触媒活性を利用して漂白成分（過酸化水素又はその他の過酸化物など）や他の漂白性の化学種の形成を触媒する。
【００６１】
変異体：本明細書で使用する場合、「変異体」という用語は、配列番号１の「親」α−アミラーゼに対して１個以上（例えば数個）の位置に変異（すなわち置換、挿入、及び／又は欠失）を含みα−アミラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。置換はある位置のアミノ酸を別のアミノ酸に置き換えることを意味し、欠失はある位置のアミノ酸を取り除くことを意味し、挿入はある位置のアミノ酸のすぐ後に隣接してアミノ酸を付加することを意味する。本発明の変異体は、配列番号１、２、又は３の成熟ポリペプチドの少なくとも２０％（例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％）のα−アミラーゼ活性を有する。
【００６２】
野生型α−アミラーゼ：本明細書で使用する場合、「野生型α−アミラーゼ」という用語は天然の微生物（天然に見られる細菌、酵母、又は糸状菌など）が発現するα−アミラーゼを指す。
【００６３】
（変異体の命名に関する慣例）
α−アミラーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、配列番号１、２、及び３に示すバシラス属由来のα−アミラーゼの変異体に相当する。
【００６４】
【化５】
2018019680.tif 000007
【００６５】
本発明のポリペプチドのうち変化した（すなわち変異した）アミノ酸は、配列番号１（バシラス属種ＴＳ−２３の成熟タンパク質ＴＳ２３に相当）のアミノ酸番号を参照して定義される。配列番号１とのアミノ酸配列の違いを下線付きの太字で示す。配列番号１と２のアミノ酸配列は配列番号２の強調した位置Ｘ１及びＸ２以外は同一である。
【００６６】
【化６】
2018019680.tif 000008
【００６７】
本発明の目的のため、配列番号１に開示する成熟ポリペプチドを用いて別のα−アミラーゼポリペプチド中の対応するアミノ酸残基を決定する。ただし、当業者であれば配列番号２の配列を用いて別のα−アミラーゼポリペプチド中の対応するアミノ酸残基を決定してもよいと認識できるであろう。別のα−アミラーゼのアミノ酸配列を配列番号１に開示する成熟ポリペプチドと整列させ、そのアライメントに基づき、配列番号１に開示する成熟ポリペプチド中の任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号をＥＭＢＯＳＳパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）（バージョン５．０．０以降が好ましい）のＮｅｅｄｌｅプログラムで実行されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）で決定する。使用するパラメータは、ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．５、ＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳ版）置換行列とする。
【００６８】
別のα−アミラーゼ中の対応するアミノ酸残基の特定は、複数のポリペプチド配列をいくつかのコンピュータプログラムをそれぞれの初期設定パラメータで用いて整列させることで決定できる。このようなプログラムとしては、ＭＵＳＣＬＥ（対数予測による複数配列の比較；バージョン３．５以降；Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797）、ＭＡＦＦＴ（バージョン６．８５７以降；Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066；Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518；Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374；Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64；Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900）、及びＣｌｕｓｔａｌＷ（１．８３以降；Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680）を用いるEMBOSS EMMAが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００６９】
他方のα−アミラーゼが配列番号１の成熟ポリペプチドとは異なっており従来の配列比較ではそれらの関連性を検出できない場合（Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615）、他のペアワイズ配列比較アルゴリズムを使用できる。ポリペプチドファミリー（プロファイル）の確率的表現を利用する検索プログラムでデータベースを検索すれば、配列検索の感度をより高くすることができる。例えば、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは反復的なデータベース検索工程によってプロファイルを作成し、関係の遠い相同体を検出できる（Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402）。タンパク質構造データベースにポリペプチドのファミリー又はスーパーファミリーの代表が１つ以上ある場合、さらに高い感度を得ることができる。ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815；McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881）などのプログラムは、様々な情報源（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、二次構造予測、構造アライメントプロファイル、及び溶媒和ポテンシャル）からの情報を、問い合わせ配列に関する構造の折りたたみを予測するニューラルネットワークへの入力値として用いる。同様に、Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919の方法で未知の構造の配列をＳＣＯＰデータベースに存在するスーパーファミリーモデルと整列させることができる。これらのアライメントを用いてそのポリペプチドに関する相同性モデルを作成し、専用に開発された様々な手段でこのモデルの精度を評価できる。
【００７０】
既知の構造のタンパク質については、構造アライメントを検索・作成するためのいくつかの手段や情報源を利用できる。例えば、タンパク質のＳＣＯＰスーパーファミリーの構造は整列されており、それらのアライメントはアクセス可能であり、ダウンロード可能である。２つ以上のタンパク質構造を距離行列法（Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96）又はCombinatorial Extension（Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11：739-747）などの様々なアルゴリズムを用いて整列させることができ、構造相同体である可能性のあるものを見つけるためにこれらのアルゴリズムを追加で実行して構造データベースで目的の構造を問い合わせることができる（例えば、Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567）。
【００７１】
本発明のα−アミラーゼ変異体の記述では、参照しやすいように以下に記載する命名法に合わせる。公認されているＩＵＰＡＣ式の１文字又は３文字のアミノ酸の略号を用いる。
【００７２】
置換：アミノ酸置換については「元のアミノ酸、位置、置換後のアミノ酸」という命名法を用いる。したがって、例えば、２２６位のスレオニンをアラニンで置換する場合、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」と命名する。複数の変異がある場合はプラス記号（「＋」）で区切り、例えば「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」又は「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」（２０５位のグリシン（Ｇ）をアルギニン（Ｒ）、４１１位のセリン（Ｓ）をフェニルアラニン（Ｆ）でそれぞれ置換することを表す）とする。
【００７３】
欠失：アミノ酸欠失については「元のアミノ酸、位置、＊」という命名法を用いる。したがって、１８１位のグリシンの欠失は「Ｓｅｒ１８１＊」又は「Ｓ１８１＊」と命名する。複数の欠失はプラス記号（「＋」）で区切る（例えば、「Ｓｅｒ１８１＊＋Ｔｈｒ１８２＊」又は「Ｓ１８１＊＋Ｔ１８２＊」）。
【００７４】
挿入：アミノ酸挿入については「元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入するアミノ酸」という命名法を用いる。したがって、例えば１９５位のグリシンの後にリジンを挿入する場合、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」又は「Ｇ１９５ＧＫ」と命名する。複数のアミノ酸を挿入する場合、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入するアミノ酸＃１、挿入するアミノ酸＃２．．．］と命名する。例えば、１９５位のグリシンの後にリジンとアラニンを挿入する場合、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」又は「Ｇ１９５ＧＫＡ」と表す。
【００７５】
このような場合、挿入するアミノ酸残基の番号は、その挿入するアミノ酸残基の前のアミノ酸残基の位置番号に小文字を添えて表す。したがって、上の例では配列は以下のようになる。
【表１】
2018019680.tif 000009
【００７６】
複数の変更：複数の変更を含む変異体はプラス記号（「＋」）で区切る（例えば、１７０位のアルギニンをチロシン、１９５位のグリシンをグルタミン酸でそれぞれ置換することを示す「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」又は「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」など）。
【００７７】
異なる変更：ある位置に異なる変更を導入できる場合、その異なる変更をコンマで区切る（例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は１７０位のアルギニンをチロシン又はグルタミン酸で置換することを表す）。したがって、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は以下の変異体を指す：
「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、及び「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」。
【００７８】
発明の詳細な説明
本発明は、親α−アミラーゼの変異体であって、α−アミラーゼ活性を有し、配列番号１と少なくとも８９％の配列同一性を有し、配列番号２のアミノ酸１８０〜１８３に対応する位置にＦＸ１Ｘ２Ｋ（配列番号４）のアミノ酸モチーフを含み、ここでＸ１はＲ又はＳであり；そしてＸ２は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され得、ただし、Ｘ１がＲのとき、Ｘ２はＳではなく、ここで前記変異体は、ＦＲＳＫモチーフを含むアミラーゼと比較して、改善された残効性（ＲＡ）を有する、変異体に関する。
【００７９】
本発明は、既知の相同的なα−アミラーゼ変異体と比較して有意に改善された安定性を有することを示した、親α−アミラーゼの変異体を提供する。当該相同的なα−アミラーゼ変異は、配列番号１に対して８９％未満の配列同一性を有する主鎖（backbone）の変異体であり、ここで前記変異体は本発明と類似のモチーフを有する。特に、実施例２の遠位α−アミラーゼ（ＳＰ７２２）における類似の変異体との比較データから分かるように、本発明の変異体は有意に改善された安定性を有する。従って、理論に拘束されることなく、本発明の欠失変異体は、例えばＳＰ７２２のような既知の欠失変異体と同じ安定性パターンを示すとは予想できないと考えられる。 
【００８０】
一態様では、前記変異体は配列番号１に対して少なくとも８９％（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）であって、１００％未満である配列同一性を有する。
【００８１】
一態様では、配列番号２のＸ２はＳ、Ｇ、又はＴである。したがって、一態様ではＸ２はＳ、Ｇ、又はＴである。
【００８２】
別の態様では、配列番号２のＸ１はＲであり、その場合配列番号２のＸ２はＧ、又はＴである。したがって、一態様では、Ｘ１がＲである場合、Ｘ２はＧ、又はＴである。
【００８３】
別の態様では、配列番号２のＸ１はＳであり、その場合配列番号２のＸ２はＳ、Ｇ、又はＴである。したがって、一態様では、Ｘ１がＳであるとき、Ｘ２はＳ、Ｇ、又はＴである。
【００８４】
別の特定の態様では、配列番号２のＸ１はＲであり、かつ配列番号２のＸ２はＧである。したがって、特定の一態様では、Ｘ１はＲであり、かつＸ２はＧである。
【００８５】
別の特定の態様では、配列番号２のＸ１はＲであり、かつ配列番号２のＸ２はＴである。したがって、特定の一態様では、Ｘ１はＲであり、かつＸ２はＴである。
【００８６】
別の特定の態様では、配列番号２のＸ１はＳであり、かつ配列番号２のＸ２はＴである。したがって、特定の一態様では、Ｘ１はＳであり、かつＸ２はＴである。
【００８７】
別の特定の態様では、配列番号２のＸ１はＳであり、かつ配列番号２のＸ２はＧである。したがって、特定の一態様では、Ｘ１はＳであり、かつＸ２はＧである。
【００８８】
本発明の変異体は１つ以上の追加の改変を他の１つ以上（例えば数個）の位置にさらに有してもよい。
【００８９】
アミノ酸の変化は軽微なもの、すなわち、タンパク質の折りたたみ及び／又は活性に有意に影響しない保存的なアミノ酸置換又は挿入；わずかな欠失（一般に１個〜３０個のアミノ酸）；アミノ末端又はカルボキシ末端のわずかな伸長（アミノ末端のメチオニン残基など）；最大２０〜２５残基の短いリンカーペプチド；あるいは正味電荷又は別の機能を変更することにより精製を容易にするわずかな伸長（ポリヒスチジン路、抗原エピトープ又は結合ドメインなど）であってよい。
【００９０】
保存的置換の例としては、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン）、及び小さなアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、及びメチオニン）の各群内での置換が挙げられる。比活性を大きく変えないアミノ酸置換は当技術分野で公知であり、例えば、H. Neurath and R.L. HillがThe Proteins, Academic Press, New York（1979）に記載している。一般的なものはＡｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙの置換である。
【００９１】
あるいは、アミノ酸変化はポリペプチドの物理化学的性質が変わるような性質のものである。たとえば、アミノ酸変化によってポリペプチドの熱安定性の改善、基質特異性の変化、最適ｐＨ値の変化などが起こってもよい。
【００９２】
ポリペプチドのうち本質的なアミノ酸は当技術分野で公知の方法（部位特異的変異誘導又はアラニン置換変異誘導など）に従い特定できる（Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085）。後者の方法では、分子中のすべての残基を１つずつアラニンに変異させ、得られた変異分子の（酵素）活性を試験してその分子の活性にとって決定的なアミノ酸残基を特定する。Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708も参照のこと。酵素の活性部位又は他の生物学的相互作用も、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、又は光親和性標識などの技術で決定される構造の物理的分析と推定上の接触部位アミノ酸の変異を組み合わせることによって決定できる。例えば、de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312；Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904；Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64を参照のこと。本質的なアミノ酸の同一性も、関連するポリペプチドと整列させることによって推測できる。
【００９３】
このように、本発明の変異体はさらなる改変（置換、挿入、及び／又は欠失など）を含んでもよい。本発明の変異体は、改善された性能（例えば改善された洗浄性能、液化性、及び脱糊性など）を有する変異体を得るため上記のさらなる改変を含んでもよい。
【００９４】
一態様では、本発明の変異体が有するさらなる改変の数は、１個〜３０個、例えば１個〜２０個、１個〜１０個、及び１個〜５個（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個の改変など）である。
【００９５】
したがって、一態様では改変の数は１個〜２０個（例えば１個〜１０個、１個〜５個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個の改変など）である。
【００９６】
本発明の変異体をさらに改変することでさらに安定化、かつ／又は高性能化してもよいと考えられる。特定の改変は本発明の変異体の安定性に関連する可能性がある。特定の態様では、変異体はＹ２４２及びＦ２６６に対応する位置の少なくとも１つにおいて置換をさらに含み、ここで番号付けは配列番号２に従う。
【００９７】
特定の態様では、Ｙ２４２の位置における置換はＹ２４２ＦでありＦ２６６における置換はＦ２６６Ｙである。一態様では、変異体はＹ２４２ＦとＦ２６６Ｙの両方の置換を含む。特定の態様では、本発明の変異体は、本明細書に記載されているモチーフの他に、置換Ｙ２４２Ｆ又はＦ２６６Ｙのいずれか一方、あるいは置換Ｙ２４２Ｆ及びＦ２６６Ｙの両方から成る。
【００９８】
本発明の変異体は、配列番号２のＳ２４３及びＧ４７５に対応する位置に少なくとも１つの置換をさらに含んでもよい。特に、この置換はＳ２４３Ｑ及びＧ４７５Ｋであってよい。したがって、一態様では、本発明の変異体は以下の改変を含むか、それらから成る：
Ｔ１８２＊＋Ｇ１８３＊＋Ｙ２４２Ｆ＋Ｓ２４３Ｑ＋Ｆ２６６Ｙ＋Ｇ４７５Ｋ、
Ｓ１８１＊＋Ｔ１８２＊＋Ｙ２４２Ｆ＋Ｓ２４３Ｑ＋Ｆ２６６Ｙ＋Ｇ４７５Ｋ、
Ｒ１８０＊＋Ｔ１８２＊＋Ｙ２４２Ｆ＋Ｓ２４３Ｑ＋Ｆ２６６Ｙ＋Ｇ４７５Ｋ、又は
Ｒ１８０＊＋Ｇ１８３＊＋Ｙ２４２Ｆ＋Ｓ２４３Ｑ＋Ｆ２６６Ｙ＋Ｇ４７５Ｋ（ここで、番号付けは配列番号２に従う）。
【００９９】
一側面では、親α−アミラーゼは配列番号１のポリペプチドと少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、α−アミラーゼ活性を有する。一側面では、親α−アミラーゼのアミノ酸配列は配列番号１のポリペプチドと最大で１０個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個）のアミノ酸が異なる。
【０１００】
一側面では、親α−アミラーゼは配列番号２のポリペプチドと少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、α−アミラーゼ活性を有する。一側面では、親α−アミラーゼのアミノ酸配列は配列番号２のポリペプチドと最大で１０個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個）のアミノ酸が異なる。
【０１０１】
一側面では、親α−アミラーゼは配列番号３のポリペプチドと少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、α−アミラーゼ活性を有する。一側面では、親α−アミラーゼのアミノ酸配列は配列番号３のポリペプチドと最大で１０個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個）のアミノ酸が異なる。
【０１０２】
一側面では、親α−アミラーゼは配列番号１、２、又は３のアミノ酸配列を含む、又はから成る。
【０１０３】
別の側面では、親α−アミラーゼは配列番号１のアミノ酸配列を含む、又はから成る。別の側面では、親α−アミラーゼは配列番号１のアミノ酸１〜４８５を含む、又はから成る。
【０１０４】
別の側面では、親α−アミラーゼは、少なくとも１００個のアミノ酸残基（例えば少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも４５０個のアミノ酸残基）を有する配列番号１の成熟ポリペプチドの断片である。
【０１０５】
別の態様では、親α−アミラーゼは配列番号１のポリペプチドのアレル変異体である。
【０１０６】
別の側面では、親α−アミラーゼは配列番号２のアミノ酸配列を含む、又はから成る。別の側面では、親α−アミラーゼは配列番号２のアミノ酸１〜４８５を含む、又はから成る。
【０１０７】
別の側面では、親α−アミラーゼは、少なくとも１００個のアミノ酸残基（例えば少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも４５０個のアミノ酸残基）を有する配列番号２の成熟ポリペプチドの断片である。
【０１０８】
別の態様では、親α−アミラーゼは配列番号２のポリペプチドのアレル変異体である。
【０１０９】
別の側面では、親α−アミラーゼは配列番号３のアミノ酸配列を含む、又はから成る。別の側面では、親α−アミラーゼは配列番号３のアミノ酸１〜４８５を含む、又はから成る。
【０１１０】
別の側面では、親α−アミラーゼは、少なくとも１００個のアミノ酸残基（例えば少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも４５０個のアミノ酸残基）を有する配列番号３の成熟ポリペプチドの断片である。
【０１１１】
別の態様では、親α−アミラーゼは配列番号３のポリペプチドのアレル変異体である。
【０１１２】
当技術分野で公知の方法に従い、配列番号１のポリペプチド又はその断片を用いて核酸プローブを設計し、異なる属又は種の株に由来する親α−アミラーゼをコードするＤＮＡを特定しクローン化してもよい。特に、標準のサザンブロッティング法に続いてこのようなプローブを目的の細胞のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡとハイブリダイズさせ、対応する遺伝子を特定・単離してもよい。このようなプローブは全体の配列よりかなり短くてもよいが、長さが少なくとも１５ヌクレオチド（例えば少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチド、又は少なくとも７０ヌクレオチド）であるべきである。核酸プローブの長さは少なくとも１００ヌクレオチド（例えば少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、又は少なくとも９００ヌクレオチド）が好ましい。ＤＮＡプローブもＲＮＡプローブも使用できる。プローブは一般に、対応する遺伝子を検出するために標識（例えば32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチン、又はアビジンで）される。このようなプローブも本発明に包含される。
【０１１３】
このような他の株から調製したゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリで上記のプローブとハイブリダイズし親をコードするＤＮＡを選別してもよい。このような他の株に由来するゲノムＤＮＡ又はその他のＤＮＡをアガロースゲル電気泳動又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、あるいはその他の分離技術で分離してもよい。ライブラリから得たＤＮＡ又は分離ＤＮＡをニトロセルロース又はその他の適切な担体材料に移動し固定してもよい。配列番号１又はその部分配列とハイブリダイズするクローン又はＤＮＡを特定するため、担体材料を用いてサザンブロッティングを行う。
【０１１４】
ポリペプチドは、１種のポリペプチドの領域を別のポリペプチドの領域のＮ末端又はＣ末端に融合させた複合ポリペプチドであってもよい。
【０１１５】
親は、本発明のポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に別のポリペプチドを融合させた融合ポリペプチド又は切断可能な融合ポリペプチドであってもよい。融合ポリペプチドは本発明のポリヌクレオチドに別のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを融合させることで作製される。融合ポリペプチドの作製技術は当技術分野で公知であり、ポリペプチドをコードするコード配列をインフレームで、融合ポリペプチドの発現が同じ転写開始配列及び転写終止配列に制御されるようにライゲートすることを含む。融合ポリペプチドが翻訳後に作製されるインテイン技術を用いて融合ポリペプチドを構築してもよい（Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779）。
【０１１６】
融合ポリペプチドは２つのポリペプチドの間に切断部位をさらに含んでもよい。融合タンパク質の分泌時にこの部位は切断され、２つのポリペプチドは遊離される。切断部位の例としては以下の文献に開示されているものが挙げられるがこれらに限定されるものではない：Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576；Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251；Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493；Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503；Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381；Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512；Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987；Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248；及びStevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48。
【０１１７】
親α−アミラーゼは任意の属の微生物から入手できる。本発明の目的のため、本明細書で所定の供給源に関連して使用する場合、「から入手する」という用語は、あるポリヌクレオチドによってコードされる親がその供給源又はそれに由来するポリヌクレオチドを挿入した株によって産生されることを意味するものとする。一側面では、親は細胞外へ分泌される。
【０１１８】
親は細菌由来α−アミラーゼであってもよい。例えば、親はグラム陽性細菌のポリペプチド（バシラス属のα−アミラーゼなど）であってもよい。
【０１１９】
一側面では、親はバシラス属種ＴＳ−２３のα−アミラーゼ（例えば配列番号１、２、又は３のα−アミラーゼ）である。
【０１２０】
配列番号１、２、及び３のα−アミラーゼ及びその変異体は当技術分野で公知の方法で人工的に製造できる。
【０１２１】
一側面では、変異体は親α−アミラーゼのアミノ酸配列と少なくとも８９％（例えば少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）であって１００％未満の配列同一性を有する。
【０１２２】
本発明の変異体は親α−アミラーゼのアミノ酸配列と少なくとも８９％の配列同一性を有し、複数の改変、例えば１個〜２０個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、又は２０個）の改変を含む。特に、改変の数は１個〜１０個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個）であってよい。改変の数は１個〜５個（例えば１個、２個、３個、４個、又は５個）であってもよい。
【０１２３】
実施例からわかるように、本発明の変異体は親α−アミラーゼと比較して改善された性質を有することを示した。
【０１２４】
一態様では、変異体は前記親α−アミラーゼと比較して改善された安定性、例えば貯蔵安定性、熱安定性、洗剤中での安定性、及びキレート剤安定性を有する。
【０１２５】
一態様では、変異体は親α−アミラーゼと比較して改善された化学安定性を有する。
【０１２６】
本明細書で使用する場合、「化学安定性」という用語は、化学成分を含む組成物中に存在するときのα−アミラーゼ変異体又は親の安定性を指す。化学安定性は、実施例に示すのと同様の方法、すなわち、化学成分を含む組成物中のα−アミラーゼ変異体又は親を特定の温度（例えば４０℃）で所定の時間（例えば４時間）保温した後にα−アミラーゼ活性試験で残効性を測定することで決定できる。
【０１２７】
一態様では、変異体は親α−アミラーゼと比較して改善された酸化安定性を有する。
【０１２８】
本明細書で使用する場合、「酸化安定性」という用語は、酸化性成分を含む組成物中に存在するときのα−アミラーゼ変異体又は親の安定性を指す。酸化安定性は、実施例に示すのと同様の方法、すなわち、酸化性成分を含む組成物中のα−アミラーゼ変異体又は親を特定の温度（例えば４０℃）で所定の時間（例えば４時間）保温した後にα−アミラーゼ活性試験で残効性を測定することで決定できる。
【０１２９】
一態様では、変異体は親α−アミラーゼと比較して改善されたｐＨ安定性を有する。
【０１３０】
本明細書で使用する場合、「ｐＨ安定性」という用語は、α−アミラーゼに最適である可能性のあるｐＨ値とは変更されたｐＨ値の組成物中に存在するときのα−アミラーゼ変異体又は親の安定性を指す。ｐＨ安定性は、実施例に示すのと同様の方法、すなわち、α−アミラーゼの本来のｐＨとは変更されたｐＨプロファイルを有する組成物中のα−アミラーゼ変異体又は親を特定の温度（例えば４０℃）で所定の時間（例えば４時間）保温した後にα−アミラーゼ活性試験で残効性を測定することで決定できる。
【０１３１】
一態様では、変異体は親α−アミラーゼと比較して改善された比活性を有する。
【０１３２】
本明細書で使用する場合、「比活性」という用語は、実施例に記載のα−アミラーゼ比活性試験で決定されるα−アミラーゼ変異体又は親の活性を指す。
【０１３３】
一態様では、変異体は親α−アミラーゼと比較して改善された貯蔵条件での安定性を有する。
【０１３４】
本明細書で使用する場合、「貯蔵安定性」及び「貯蔵条件での安定性」という用語は、製剤中に存在するときのα−アミラーゼ変異体又は親の安定性を指す。貯蔵安定性は、実施例に示すのと同様の方法、すなわち、組成物中のα−アミラーゼ変異体又は親を特定の温度（例えば２５℃）で所定の時間（例えば２時間）保温した後にα−アミラーゼ活性試験で残効性を測定することで決定できる。
【０１３５】
一態様では、変異体は親α−アミラーゼと比較して改善された基質安定性を有する。
【０１３６】
本明細書で使用する場合、「基質安定性」という用語は、洗剤組成物などの組成物中に存在するときのα−アミラーゼ変異体又は親α−アミラーゼの安定性を指す。基質安定性は、実施例に示すのと同様の方法、すなわち組成物中のα−アミラーゼ変異体又は親を特定の温度（例えば６０℃）で所定の時間（例えば２時間）保温した後にα−アミラーゼ活性試験で残効性を測定することで決定できる。
【０１３７】
一態様では、変異体は親α−アミラーゼと比較して改善された熱活性を有する。
【０１３８】
本明細書で使用する場合、「熱活性」という用語は、例えば熱ストレス又は熱変化を受けた場合のα−アミラーゼ変異体又は親α−アミラーゼの活性を指す。熱活性は実施例に示すのと同様の方法、すなわちα−アミラーゼ変異体又は親を高温（例えば６０℃）で所定の時間（例えば２時間）保温した後にα−アミラーゼ活性試験で残効性を測定することで決定できる。
【０１３９】
一態様では、変異体は親α−アミラーゼと比較して改善された熱安定性を有する。
【０１４０】
本明細書で使用する場合、「熱安定性」という用語は、特定の高温（例えば６０℃）で試験又は静置した場合のα−アミラーゼ変異体又は親の安定性を指す。熱安定性は、実施例に示すのと同様の方法、すなわち組成物中のα−アミラーゼ変異体又は親を高温（例えば６０℃）で所定の時間（例えば２４時間）保温した後にα−アミラーゼ活性試験で残効性を測定することで決定できる。
【０１４１】
一態様では、変異体は親α−アミラーゼと比較して改善された洗剤中での安定性を有する。
【０１４２】
本明細書で使用する場合、「洗剤中での安定性」という用語は、洗剤組成物又は製剤に存在するときのα−アミラーゼ変異体又は親の安定性を指す。この安定性は実施例に示すのと同様の方法、すなわち洗剤組成物中のα−アミラーゼ変異体又は親を特定の温度（例えば２５℃）で所定の時間（例えば２時間）保温した後にα−アミラーゼ活性試験で残効性を測定することで決定できる。
【０１４３】
一態様では、変異体は親α−アミラーゼと比較して改善されたキレート剤安定性を有する。
【０１４４】
したがって、一態様では、変異体は改善された安定性を有し、ここで、安定性はファデバス（登録商標）アッセイによって決定される。すなわち、改善された安定性は変異体を１００ｍＭのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液で希釈する工程と得られた青色の溶液を６２０ｎｍで分光法により測定する工程を含む試験法によって確認できる。
【０１４５】
（本発明の変異体の調製）
本発明は、α−アミラーゼ変異体の製造方法であって、配列番号１のアミノ酸配列のＲ１８０、Ｓ１８１、Ｔ１８２、及びＧ１８３に対応する位置から選択される２つのアミノ酸の欠失を親α−アミラーゼに導入してＦＸ１Ｘ２Ｋ（配列番号４）のアミノ酸モチーフを提供し、そして前記変異体を回収することを含み、ここでＸ１はＲ又はＳであり；Ｘ２は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され得、ただし、Ｘ１がＲのとき、Ｘ２はＳではなく、ここで前記変異体は、ＦＲＳＫモチーフを含むアミラーゼと比較して、改善された残効性（ＲＡ）を有し、前記変異体はα−アミラーゼ活性を有する、方法にも関する。
【０１４６】
前記変異体は当技術分野で公知の任意の変異誘導法（部位特異的変異誘導、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、ランダム変異誘導、シャフリングなど）を用いて調製できる。
【０１４７】
部位特異的変異誘導は、親α−アミラーゼをコードするポリヌクレオチドに含まれる１つ以上の特定部位に１つ以上（例えば数個）の変異を導入する技術である。
【０１４８】
部位特異的変異誘導は、所望の変異を有するオリゴヌクレオチドプライマーの使用を含むＰＣＲによってインビトロで行ってもよいし、親α−アミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドのうちのある部位を制限酵素で切断することと、次に変異を有するオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドにライゲートすることを含むカセット変異誘導によってインビトロで実施してもよい。通常、プラスミドとオリゴヌクレオチドを消化する制限酵素は同じであり、プラスミドと挿入断片の粘着末端を互いにライゲートできる。例えば、Scherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955；及びBarton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966を参照のこと。
【０１４９】
部位特異的変異誘導を当技術分野で公知の方法でインビボで実行してもよい。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号明細書；Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776；Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290；Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16を参照のこと。
【０１５０】
本発明では任意の部位特異的変異誘導法を利用してよい。変異体の調製に使用できる市販のキットは多数存在する。
【０１５１】
合成遺伝子構築には、目的のポリペプチドをコードするよう設計したポリヌクレオチド分子をインビトロで合成する必要がある。遺伝子合成は、いくつかの技術、例えばＴｉａｎらが記載した多重マイクロチップを利用する技術（2004, Nature 432: 1050-1054）や同様の技術を利用して実行でき、これらの技術ではオリゴヌクレオチドを合成し、光でプログラム化できる微小流体チップに集積する。
【０１５２】
単一又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入は、変異誘導、組換え、及び／又はシャフリングの公知の方法に続いて関連の選別方法（Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57；Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156；国際公開第９５／１７４１３号；又は国際公開第９５／２２６２５号で開示されている方法など）を用いることにより作製・試験できる。利用できるその他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４）、及び領域特異的変異誘導（Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145；Ner et al., 1988, DNA 7: 127）が挙げられる。
【０１５３】
変異誘導／シャフリング法を高処理の自動選別方法と組み合わせて、宿主細胞が発現する変異誘導しクローン化したポリペプチドの活性を検出してもよい（Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896）。活性ポリペプチドをコードする変異誘導後のＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、当技術分野の標準の方法で迅速に配列決定できる。これらの方法により、ポリペプチドに含まれる個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に決定できる。
【０１５４】
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築及び／又は部位特異的変異誘導、及び／又はランダム変異誘導、及び／又はシャフリングの側面を組み合わせることで実行される。半合成構築の代表は、合成したポリヌクレオチド断片をＰＣＲ技術と組み合わせて利用する方法である。すなわち、遺伝子の特定の領域を新規合成し、他の領域を部位特異的変異誘導プライマーで増幅し、さらに他の領域をエラープローンＰＣＲ又はそれ以外のＰＣＲ増幅に供してもよい。その後にポリヌクレオチドの部分配列を混合してもよい。
【０１５５】
（ポリヌクレオチド）
本発明は、本発明の変異体をコードする単離ポリヌクレオチドにも関する。したがって、本発明は、「α−アミラーゼ活性を有し、配列番号１と少なくとも８９％の配列同一性を有し、配列番号２のアミノ酸１８０〜１８３に対応する位置にＦＸ１Ｘ２Ｋ（配列番号４）のアミノ酸モチーフを含み；ここでＸ１はＲ又はＳであり、Ｘ２はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され得、ただし、Ｘ１がＲのとき、Ｘ２はＳではなく、ここで前記変異体は、ＦＲＳＫモチーフを含むアミラーゼと比較して、改善された残効性（ＲＡ）を有する、変異体」をコードするポリヌクレオチドに関する。
【０１５６】
（核酸構築物）
本発明は、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。したがって、本発明は、「α−アミラーゼ活性を有し、配列番号１と少なくとも８９％の配列同一性を有し、配列番号２のアミノ酸１８０〜１８３に対応する位置にＦＸ１Ｘ２Ｋ（配列番号４）のアミノ酸モチーフを含み；ここでＸ１はＲ又はＳであり、Ｘ２はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され得、ただし、Ｘ１がＲのとき、Ｘ２はＳではなく、ここで前記変異体は、ＦＲＳＫモチーフを含むアミラーゼと比較して、改善された残効性（ＲＡ）を有する、変異体」をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。
【０１５７】
本発明は、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを、制御配列に適合する条件のもと適切な宿主細胞でコード配列の発現を誘導する１つ以上の制御配列と作動可能に連結した核酸構築物にも関する。したがって、本発明は、「α−アミラーゼ活性を有し、配列番号１と少なくとも８９％の配列同一性を有し、配列番号２のアミノ酸１８０〜１８３に対応する位置にＦＸ１Ｘ２Ｋ（配列番号４）のアミノ酸モチーフを含み；ここでＸ１はＲ又はＳであり、Ｘ２はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され得、ただし、Ｘ１がＲのとき、Ｘ２はＳではなく、ここで前記変異体は、ＦＲＳＫモチーフを含むアミラーゼと比較して、改善された残効性（ＲＡ）を有する、変異体」をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、ここで前記ポリヌクレオチドは、制御配列に適合する条件のもと適切な宿主細胞でコード配列の発現を誘導する１つ以上の制御配列と作動可能に連結される、前記核酸構築物に関する。
【０１５８】
前記ポリヌクレオチドを様々な方法で操作して変異体を発現させてもよい。発現ベクターに応じて、ポリヌクレオチドをベクターに挿入する前に操作するのが望ましい又は必要となる場合がある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドを改変する技術は当技術分野で周知である。
【０１５９】
制御配列は、転写開始配列、すなわちポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞が認識するポリヌクレオチドであってよい。転写開始配列は、変異体の発現を媒介する転写制御配列を含む。転写開始配列は、変異型、短縮型、及び複合型の転写開始配列など、宿主細胞で転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであってよく、宿主細胞に対して相同又は異種の細胞外ポリペプチド又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【０１６０】
細菌宿主細胞で本発明の核酸構築物の転写を誘導するのに適切な転写開始配列の例は、バシラス・アミロリクエファキエンス（Bacillus amyloliquefaciens）のα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バシラス・リケニフォルミスのペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バシラス・ステアロテルモピルス（Bacillus stearothermophilus）のマルトース生成α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バシラス・スブティリス（Bacillus subtilis）のレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バシラス・スブティリスのｘｙｌＡ遺伝子及びｘｙｌＢ遺伝子、バシラス・トゥリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）のｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107）、大腸菌（E. coli）のｌａｃオペロン、Ｅ．コリのｔｒｃ転写開始配列（Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315）、ストレプトマイセス・コエリコロール（Streptomyces coelicolor）のアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、原核生物のβ−ラクタマーゼ遺伝子（Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731）から得た転写開始配列、さらにはｔａｃ転写開始配列（DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25）である。Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94, "Useful proteins from recombinant bacteria"；及びSambrookらの上記文献（１９８９年）にはさらに転写開始配列が記載されている。国際公開第９９／４３８３５号には直列型の転写開始配列の例が開示されている。
【０１６１】
糸状菌宿主細胞で本発明の核酸構築物の転写を誘導するのに適切な転写開始配列の例は、アスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）のアセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）のα−グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)のα−アミラーゼ（タカアミラーゼ）、アスペルギルス・オリゼーのアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼーのトリオースリン酸イソメラーゼ、フサリウム・オクシスポルム（Fusarium oxysporum）のトリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号）、フサリウム・ウェネナートゥム（Fusarium venenatum）のアミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号）、フサリウム・ウェネナートゥムのＤａｒｉａ遺伝子（国際公開第００／５６９００号）、フサリウム・ウェネナートゥムのＱｕｉｎｎ遺伝子（国際公開第００／５６９００号）、リゾムコール・ミエエイ（Rhizomucor miehei）のリパーゼ、リゾムコール・ミエエイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・レーセイ（Trichoderma reesei）のβ−グルコシダーゼ、トリコデルマ・レーセイのセロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・レーセイのセロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・レーセイのエンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レーセイのエンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・レーセイのエンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レーセイのエンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・レーセイのエンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レーセイのキシラナーゼＩ、トリコデルマ・レーセイのキシラナーゼＩＩ、及びトリコデルマ・レーセイのβ−キシロシダーゼの遺伝子から得た転写開始配列；ＮＡ２−ｔｐｉ転写開始配列（アスペルギルス属の中性α−アミラーゼ遺伝子の非翻訳リーダー配列をアスペルギルス属のトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子の非翻訳リーダー配列で置換して得られた改変転写開始配列で、例としてはアスペルギルス・ニガーの中性α−アミラーゼ遺伝子の非翻訳リーダー配列をアスペルギルス・ニドゥランス又はアスペルギルス・オリゼーのトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子の非翻訳リーダー配列で置換した改変転写開始配列が挙げられるがこれらに限定されるものではない）；それらの変異型、短縮型、及び複合型の転写開始配列が挙げられる。
【０１６２】
酵母が宿主の場合、有用な転写開始配列は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエのガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエのアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロミセス・セレビシエのトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロミセス・セレビシエのメタロチオネイン（ＣＵＰ１）、及びサッカロミセス・セレビシエの３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488には酵母宿主細胞の場合に有用なその他の転写開始配列が記載されている。
【０１６３】
制御配列は、宿主細胞によって認識され転写を終止する転写終止配列であってもよい。変異体をコードするポリヌクレオチドの３’末端に転写終止配列を作動可能に連結する。宿主細胞で機能する任意の転写終止配列を使用してよい。
【０１６４】
細菌宿主細胞の場合に好ましい転写終止配列は、バシラス・クラウシイ（Bacillus clausii）のアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＨ）、バシラス・リケニフォルミスのα−アミラーゼ（ａｍｙＬ）、及び大腸菌（Escherichia coli）のリボソームＲＮＡ（ｒｒｎＢ）の遺伝子から得られる。
【０１６５】
糸状菌宿主細胞の場合に好ましい転写終止配列は、アスペルギルス・ニドゥランスのアントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガーのα−グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのα−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼーのα−アミラーゼ（タカアミラーゼ）、及びフサリウム・オクシスポルムのトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【０１６６】
酵母宿主細胞の場合に好ましい転写終止配列は、サッカロミセス・セレビシエのエノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエのシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、及びサッカロミセス・セレビシエのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞の場合に有用なその他の転写終止配列は上記のＲｏｍａｎｏｓらの文献（１９９２年）に記載されている。
【０１６７】
制御配列は、転写開始配列の下流及び遺伝子のコード配列の上流で遺伝子の発現を増強するｍＲＮＡ安定化領域であってもよい。
【０１６８】
適切なｍＲＮＡ安定化領域の例は、バシラス・トゥリンギエンシスのｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（国際公開第９４／２５６１２号）及びバシラス・スブティリスのＳＰ８２遺伝子（Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471）由来のものである。
【０１６９】
制御配列はリーダー配列（宿主細胞が翻訳を行うのに重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）であってもよい。変異体をコードするポリヌクレオチドの５’末端にリーダー配列を作動可能に連結する。宿主細胞で機能する任意のリーダー配列を用いてよい。
【０１７０】
糸状菌宿主細胞の場合に好ましいリーダー配列は、アスペルギルス・オリゼーのα−アミラーゼ（タカアミラーゼ）及びアスペルギルス・ニドゥランスのトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得ることができる。
【０１７１】
酵母宿主細胞の場合に適切なリーダー配列は、サッカロミセス・セレビシエのエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエの３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエのα因子、及びサッカロミセス・セレビシエのアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【０１７２】
制御配列は、ポリアデニル化配列（変異体をコードする配列の３’末端に作動可能に連結され、転写されると宿主細胞にシグナルとして認識され転写ｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加する配列）。宿主細胞で機能する任意のポリアデニル化配列を用いてよい。
【０１７３】
糸状菌宿主細胞の場合に好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・ニドゥランスのアントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガーのα−グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのα−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼーのα−アミラーゼ（タカアミラーゼ）、及びフサリウム・オクシスポルムのトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。
【０１７４】
酵母宿主細胞に有用なポリアデニル化配列はGuo and Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990に記載されている。
【０１７５】
制御配列は、変異体のＮ末端に連結されたシグナルペプチドをコードし変異体を細胞の分泌経路に誘導するシグナルペプチドコード領域であってもよい。ポリヌクレオチドのコード配列の５’末端は、変異体をコードするコード配列のセグメントと翻訳読み枠内で元々連結したシグナルペプチドコード配列を固有に含んでもよいし、そのコード配列とは異種のシグナルペプチドコード配列を含んでもよい。異種のシグナルペプチドコード配列はコード配列が元々シグナルペプチドコード配列を含まない場合に必要となることもあるし、変異体の分泌を高めるために単純に天然のシグナルペプチドコード配列を異種のシグナルペプチドコード配列で置換することもあるが、発現した変異体を宿主細胞の分泌経路へ誘導する任意のシグナルペプチドコード配列を用いてよい。
【０１７６】
細菌宿主細胞の場合に有効なシグナルペプチドコード配列は、バシラス属NCIB 11837マルトース生成α−アミラーゼ、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）のスブチリシン、バシラス・リケニフォルミスのβ−ラクタマーゼ、バシラス・ステアロテルモピルス（Bacillus stearothermophilus）のα−アミラーゼ、バシラス・ステアロテルモピルスの中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、及びバシラス・スブティリス（Bacillus subtilis）のｐｒｓＡの遺伝子から得たシグナルペプチドコード配列である。Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137にはさらにシグナルペプチドが記載されている。
【０１７７】
糸状菌宿主細胞の場合に有効なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルス・ニガーの中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのα−グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼーのα−アミラーゼ（タカアミラーゼ）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）のセルラーゼ、フミコラ・インソレンスのエンドグルカナーゼＶ、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）のリパーゼ、及びリゾムコール・ミエエイのアスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得たシグナルペプチドコード配列である。
【０１７８】
酵母宿主細胞の場合に有用なシグナルペプチドコード配列は、サッカロミセス・セレビシエのα因子及びサッカロミセス・セレビシエのインベルターゼの遺伝子から得ることができる。その他の有用なシグナルペプチドコード配列は、上記のＲｏｍａｎｏｓらの文献（１９９２年）に記載されている。
【０１７９】
制御配列は、変異体のＮ末端に位置するプロペプチドをコードするプロペプチドコード配列であってもよい。結果として得られるポリペプチドはプロ酵素又はプロポリペプチド（あるいは場合によっては酵素原）として知られる。プロポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドからプロペプチドを触媒又は自己触媒によって切断することにより活性ポリペプチドに変換できる。プロペプチドコード配列は、バシラス・スブティリスのアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、バシラス・スブティリスの中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、ミケリオプトラ・テルモピラ（Myceliophthora thermophila）のラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号）、リゾムコール・ミエエイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、及びサッカロミセス・セレビシエのα因子の遺伝子から得ることができる。
【０１８０】
シグナルペプチド配列とプロペプチド配列の両方が存在する場合、変異体のＮ末端の次にプロペプチド配列、プロペプチド配列のＮ末端の次にシグナルペプチド配列が位置する。
【０１８１】
宿主細胞の増殖に対する変異体の相対的な発現を調節する調節配列を付加するのが望ましい場合もある。調節系の例は、化学的又は物理的な刺激（調節化合物の存在など）に反応して遺伝子の発現を有効又は無効にするものである。原核生物系の調節系としてはｌａｃ、ｔａｃ、及びｔｒｐ作動遺伝子系が挙げられる。酵母では、ＡＤＨ２系又はＧＡＬ１系を用いてよい。糸状菌では、アスペルギルス・ニガーのα−グルコアミラーゼの転写開始配列、アスペルギルス・オリゼーのα−アミラーゼ（タカアミラーゼ）の転写開始配列、及びアスペルギルス・オリゼーのα−グルコアミラーゼの転写開始配列を用いてよい。他の調節配列の例は遺伝子増幅を可能にする配列である。真核生物系では、これらの調節配列としてはメトトレキサートの存在下で増幅するジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、及び重金属によって増幅するメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、変異体をコードするポリヌクレオチドは調節配列と作動可能に連結されるだろう。
【０１８２】
（発現ベクター）
本発明は本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。したがって、本発明は、「α−アミラーゼ活性を有し、配列番号１と少なくとも８９％の配列同一性を有し、配列番号２のアミノ酸１８０〜１８３に対応する位置にＦＸ１Ｘ２Ｋ（配列番号４）のアミノ酸モチーフを含み；ここでＸ１はＲ又はＳであり、Ｘ２はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され得、ただし、Ｘ１がＲのとき、Ｘ２はＳではなく、ここで前記変異体は、ＦＲＳＫモチーフを含むアミラーゼと比較して、改善された残効性（ＲＡ）を有する、変異体」をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
【０１８３】
本発明は本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドと、転写開始配列と、転写終止シグナル及び翻訳終止シグナルとを含む組換え発現ベクターにも関する。したがって、本発明は、「α−アミラーゼ活性を有し、配列番号１と少なくとも８９％の配列同一性を有し、配列番号２のアミノ酸１８０〜１８３に対応する位置にＦＸ１Ｘ２Ｋ（配列番号４）のアミノ酸モチーフを含み；ここでＸ１はＲ又はＳであり、Ｘ２はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され得、ただし、Ｘ１がＲのとき、Ｘ２はＳではなく、ここで前記変異体は、ＦＲＳＫモチーフを含むアミラーゼと比較して、改善された残効性（ＲＡ）を有する、変異体」をコードするポリヌクレオチドと、転写開始配列と、転写終止シグナル及び翻訳終止シグナルとを含む発現ベクターに関する。
【０１８４】
上記の様々なヌクレオチド及び制御配列を連結して組換え発現ベクターを作製してもよく、この組換え発現ベクターは、変異体をコードするポリヌクレオチドの挿入又は置換が可能な１つ以上の好都合な制限部位を含んでもよい。あるいは、ポリヌクレオチド又はそれを含む核酸構築物を発現に適切なベクターへ挿入することによってポリヌクレオチドを発現してもよい。発現ベクターの作製では、コード配列が発現に適切な制御配列と作動可能に連結されるようにコード配列をベクター内に配置する。
【０１８５】
組み換え発現ベクターは組換えＤＮＡ法に有利に使用できてポリヌクレオチドの発現を起こすことができる任意のベクター（例えばプラスミド又はウイルス）であってよい。ベクターの選択は一般にベクターとそれを導入する宿主細胞の適合性に依存する。ベクターは直鎖状プラスミドでも閉環状プラスミドでもよい。
【０１８６】
ベクターは自己複製ベクター（すなわち染色体外物質として存在し、染色体の複製とは独立して複製するベクター）であってもよい（例えばプラスミド、染色体外成分、ミニ染色体、又は人工染色体）。このベクターは自己複製を確実にする任意の手段を含んでもよいし、宿主細胞に導入するとゲノムに組み込まれ、それを組み込んだ染色体と共に複製されるベクターであってもよい。単一又は２つ以上のベクター又はプラスミド（それらを併せると宿主細胞ゲノムに導入する全ＤＮＡを含む）、あるいはトランスポゾンを使用してよい。
【０１８７】
ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入などを受けた細胞を選択しやすくする１つ以上の選択マーカーを含むことが好ましい。選択マーカーは、殺生物剤又はウイルスへの耐性、重金属への耐性、栄養素要求株への原栄養などを提供する物質を生成する遺伝子である。
【０１８８】
細菌の選択マーカーは、バシラス・リケニフォルミス又はバシラス・スブティリスのｄａｌ遺伝子、あるいは抗生物質耐性（例えばアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン、又はテトラサイクリンへの耐性）を付与するマーカーである。酵母宿主細胞の場合に適切なマーカーとしては、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３が挙げられるがこれらに限定されるものではない。糸状菌宿主細胞の場合に用いるのに適切な選択マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）の遺伝子、ならびにその等価物が挙げられるがこれらに限定されるものではない。アスペルギルス属の細胞で用いるのに好ましいのはアスペルギルス・ニドゥランス又はアスペルギルス・オリゼーのａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子と、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）のｂａｒ遺伝子である。
【０１８９】
ベクターは、ベクターを宿主細胞ゲノムに導入、又はゲノムとは独立した細胞で自己複製することを可能にする成分を含むことが好ましい。
【０１９０】
宿主細胞ゲノムへの組込みに関して、ベクターは、変異体をコードするポリヌクレオチドの配列、あるいは相同組換え又は非相同組換えによってゲノムへ組込むためのその他の任意のベクター構成成分に依存してよい。あるいは、ベクターは相同組換えによって染色体の正確な位置で宿主細胞のゲノムへの組込みを誘導する追加のポリヌクレオチドを含んでもよい。正確な位置で組込まれる可能性を高めるため、組み込む成分は相同組換えの確率を高めるのに十分な数（例えば１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対、及び８００〜１０，０００塩基対）の、対応する標的配列との配列同一性が高い核酸を含むべきである。組み込む成分は宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同な任意の配列であってよい。また、組み込む成分は、非コードポリヌクレオチドでもコードポリヌクレオチドでもよい。一方、ベクターを非相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込んでもよい。
【０１９１】
自己複製のため、ベクターは対象とする宿主細胞でベクターが自己複製できるようにする複製起点をさらに含んでもよい。複製起点は細胞内で機能するものであれば自己複製を媒介する任意のプラスミド複製開始点であってよい。「複製起点」又は「プラスミド複製開始点」という用語は、プラスミド又はベクターがインビボで複製できるようにするポリヌクレオチドを意味する。
【０１９２】
細菌の複製起点の例は、大腸菌での複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、及びｐＡＣＹＣ１８４；ならびにバシラス属での複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、及びｐＡＭβ１の複製起点である。
【０１９３】
酵母宿主細胞において用いるための複製起点の例は、２ミクロンＤＮＡの複製起点；ＡＲＳ１；ＡＲＳ４；ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組み合わせ；及びＡＲＳ４とＣＥＮ６の組み合わせである。
【０１９４】
糸状菌細胞で有用な複製起点の例はＡＭＡ１及びＡＮＳ１（Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67；Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175；国際公開第００／２４８８３号）である。ＡＭＡ１遺伝子の単離及びその遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号に開示されている方法に従って行うことができる。
【０１９５】
本発明のポリヌクレオチドのコピーを２つ以上宿主細胞に挿入して変異体の産生量を増加させてもよい。ポリヌクレオチドのコピー数は、配列の追加コピーを少なくとも１つ宿主細胞ゲノムに組み込むか、増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチドと共に含ませる（増幅した選択マーカー遺伝子のコピーとそれによって得たポリヌクレオチドの追加コピーとを含む細胞を、細胞を適切な選択薬剤の存在下で培養することによって選別できる）ことによって増加させることができる。
【０１９６】
本発明の組換え発現ベクターを構築するため上記の成分をライゲートするのに使用する方法は当業者に周知である（例えば上記のSambrookらの文献（１９８９年）を参照のこと）。
【０１９７】
（宿主細胞）
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。したがって、本発明は、「α−アミラーゼ活性を有し、配列番号１と少なくとも８９％の配列同一性を有し、配列番号２のアミノ酸１８０〜１８３に対応する位置にＦＸ１Ｘ２Ｋ（配列番号４）のアミノ酸モチーフを含み；ここでＸ１はＲ又はＳであり、Ｘ２はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され得、ただし、Ｘ１がＲのとき、Ｘ２はＳではなく、ここで前記変異体は、ＦＲＳＫモチーフを含むアミラーゼと比較して、改善された残効性（ＲＡ）を有する、変異体」をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
【０１９８】
本発明は、本発明の変異体の生成を誘導する１つ以上の制御配列と作動可能に連結された本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞にも関する。したがって、本発明は、「α−アミラーゼ活性を有し、配列番号１と少なくとも８９％の配列同一性を有し、配列番号２のアミノ酸１８０〜１８３に対応する位置にＦＸ１Ｘ２Ｋ（配列番号４）のアミノ酸モチーフを含み；ここでＸ１はＲ又はＳであり、Ｘ２はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され得、ただし、Ｘ１がＲのとき、Ｘ２はＳではなく、ここで前記変異体は、ＦＲＳＫモチーフを含むアミラーゼと比較して、改善された残効性（ＲＡ）を有する、変異体」をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ここで、前記ポリヌクレオチドは前記変異体の生成を誘導する１つ以上の制御配列と作動可能に連結されている、宿主細胞に関する。
【０１９９】
先に述べたように、ポリヌクレオチドを含む構築物又はベクターを染色体組込み型ベクター又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように宿主細胞に導入する。「宿主細胞」という用語は複製中に起こる変異が原因で親細胞と同一ではない任意の子孫細胞を包含する。宿主細胞の選択は変異体をコードする遺伝子及びその供給源に大きく依存する。
【０２００】
宿主細胞は、組換えにより変異体を製造するのに有用な任意の細胞（例えば原核細胞又は真核細胞）であってよい。
【０２０１】
原核生物の宿主細胞は任意のグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌であってよい。グラム陽性細菌としては、バシラス属（Bacillus）、クロストリディウム属（Clostridium）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ゲオバシラス属（Geobacillus）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、オケアノバシラス属（Oceanobacillus）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、及びストレプトマイセス属（Streptomyces）が挙げられるがこれらに限定されるものではない。グラム陰性細菌としては、カンピロバクター属（Campylobacter）、大腸菌、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、フゾバクテリウム属（Fusobacterium）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、イリオバクター属（Ilyobacter）、ナイセリア属（Neisseria）、シュードモナス属（Pseudomonas）、サルモネラ属（Salmonella）、及びウレアプラズマ属（Ureaplasma）が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【０２０２】
細菌宿主細胞は任意のバシラス属細胞であってよく、バシラス・アルカロピルス（Bacillus alkalophilus）、バシラス・アミロリクエファキエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バシラス・ブレウィス（Bacillus brevis）、バシラス・キルクランス（Bacillus circulans）、バシラス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バシラス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バシラス・フィルムス（Bacillus firmus）、バシラス・ラウトゥス（Bacillus lautus）、バシラス・レントゥス（Bacillus lentus）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・プミルス（Bacillus pumilus）、バシラス・ステアロテルモピルス（Bacillus stearothermophilus）、バシラス・スブティリス（Bacillus subtilis）、及びバシラス・トゥリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）の細胞が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【０２０３】
細菌宿主細胞は任意のストレプトコッカス属（Streptococcus）の細胞であってもよく、ストレプトコッカス・エクウィシミリス（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、及びストレプトコッカス・エクウィの亜種ゾーエピデミクス（Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus）の細胞が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【０２０４】
細菌宿主細胞は任意のストレプトマイセス属細胞であってもよく、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Streptomyces achromogenes）、ストレプトマイセス・アウェルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・コエリコロール（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及びストレプトマイセス・リウィダンス（Streptomyces lividans）の細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２０５】
バシラス属細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えばChang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115を参照のこと）、形質転換受容性細胞による形質転換（例えばYoung and Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829、又はDubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221を参照のこと）、電気穿孔（例えばShigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751を参照のこと）、又は接合（例えばKoehler and Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278を参照のこと）によって実行できる。大腸菌細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えばHanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580を参照のこと）又は電気穿孔（例えばDower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145を参照のこと）によって実行できる。ストレプトマイセス属細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換、電気穿孔（例えばGong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405を参照のこと）、接合（例えばMazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585を参照のこと）、又は形質導入（例えばBurke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294を参照のこと）によって実行できる。シュードモナス属細胞へのＤＮＡの導入は、電気穿孔（例えばChoi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397を参照のこと）、又は接合（例えばPinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57を参照のこと）によって実行できる。ストレプトコッカス属細胞へのＤＮＡの導入は、天然の形質転換受容性（例えばPerry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297を参照のこと）、プロトプラスト形質転換（例えばCatt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207を参照のこと）、電気穿孔（例えばBuckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804を参照のこと）、又は接合（例えばClewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436を参照のこと）によって実行できる。しかし、ＤＮＡを宿主細胞に導入するための当技術分野で公知の任意の方法を利用できる。
【０２０６】
宿主細胞は真核細胞（哺乳類、昆虫類、又は真菌の細胞など）であってもよい。
【０２０７】
宿主細胞は真菌細胞であってもよい。本明細書で使用する場合、「真菌」には子嚢菌門（Ascomycota）、担子菌門（Basidiomycota）、ツボカビ門（Chytridiomycota）、及び接合菌門（Zygomycota）、さらには卵菌門（Oomycota）及びすべての栄養胞子形成菌が包含される。（HawksworthらがAinsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKで定義したとおりである）。
【０２０８】
真菌宿主細胞は酵母細胞であってもよい。本明細書で使用する場合、「酵母」は子嚢酵母（エンドミケス属（Endomycetales））、担子胞子酵母（basidiosporogenous yeast）、及び不完全菌類（不完全酵母綱(Blastomycetes)に属する酵母を含む。酵母の分類は将来変わる可能性があるため、本発明の目的のため、酵母をBiology and Activities of Yeast（Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980）に記載のとおり定義する。
【０２０９】
酵母宿主細胞は、カンディダ属（Candida）、ハンセヌラ属（Hansenula）、クルイウェロミケス属（Kluyveromyces）、ピキア属（Pichia）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、スキゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、又はヤロウィア属（Yarrowia）の細胞であってよく、例えば、クルイウェロミケス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、サッカロミセス・カルルスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ディアスタティクス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ドウグラシイ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイウェリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、サッカロミセス・オウィフォルミス（Saccharomyces oviformis）、又はヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）の細胞である。
【０２１０】
真菌宿主細胞は糸状菌細胞であってもよい。「糸状菌」には真菌門（Eumycota）及び卵菌門（Oomycota）のあらゆる糸状の形態を包含する（Hawksworthらの上記文献（１９９５）で定義されるとおりである）。糸状菌は一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及びその他の複合多糖類で構成される菌糸の壁（mycelial wall）を特徴とする。栄養生長は菌糸伸長によるものであり、炭素異化は偏性好気性である。一方、酵母（サッカロミセス・セレビシエなど）の栄養生長は単細胞の葉状体の出芽によるものであり、発酵による炭素異化も可能である。
【０２１１】
糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アウレオバシディウム属（Aureobasidium）、ブイェルカンデラ属（Bjerkandera）、ケリポリオプシス属（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム属（Chrysosporium）、コプリヌス属（Coprinus）、コリオルス属（Coriolus）、クリプトコックス属（Cryptococcus）、フィリバシディウム属（Filibasidium）、フサリウム属（Fusarium）、フミコラ属（Humicola）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、ムコール属（Mucor）、ミケリオプトラ属（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス属（Neocallimastix）、ネウロスポラ属（Neurospora）、パエキロミケス属（Paecilomyces）、ペニキリウム属（Penicillium）、パネロカエテ属（Phanerochaete）、プレビア属（Phlebia）、ピロミケス属（Piromyces）、プレウロトゥス属（Pleurotus）、スキゾピルム属（Schizophyllum）、タラロミケス属（Talaromyces）、テルモアスクス属（Thermoascus）、ティエラウィア属（Thielavia）、トリポクラディウム属（Tolypocladium）、トラメテス属（Trametes）、又はトリコデルマ属（Trichoderma）の細胞であってよい。
【０２１２】
例えば、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フォエティドゥス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・フミガートゥス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ヤポニクス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、ブイェルカンデラ・アドゥスタ（Bjerkandera adusta）、ケリポリオプシス・アネイリーナ（Ceriporiopsis aneirina）、ケリポリオプシス・カレギエア（Ceriporiopsis caregiea）、ケリポリオプシス・ギルウェスケンス（Ceriporiopsis gilvescens）、ケリポリオプシス・パンノキンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、ケリポリオプシス・リウロサ（Ceriporiopsis rivulosa）、ケリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、ケリポリオプシス・スブウェルミスポーラ（Ceriporiopsis subvermispora）、クリソスポリウム・イノプス（Chrysosporium inops）、クリソスポリウム・ケラティノピルム（Chrysosporium keratinophilum）、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Chrysosporium lucknowense）、クリソスポリウム・メルダリウム（Chrysosporium merdarium）、クリソスポリウム・パンニコラ（Chrysosporium pannicola）、クリソスポリウム・クウェエンスランディクム（Chrysosporium queenslandicum）、クリソスポリウム・トロピクム（Chrysosporium tropicum）、クリソスポリウム・ゾナトゥム（Chrysosporium zonatum）、コプリヌス・キネレウス（Coprinus cinereus）、コリオルス・ヒルストゥス（Coriolus hirsutus）、フサリウム・バクトリディオイデス（Fusarium bactridioides）、フサリウム・ケレアリス（Fusarium cerealis）、フサリウム・クロオクウェレンセ（Fusarium crookwellense）、フサリウム・クルモルム（Fusarium culmorum）、フサリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）、フサリウム・グラミヌム（Fusarium graminum）、フサリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）、フサリウム・ネグンディ（Fusarium negundi）、フサリウム・オクシスポルム（Fusarium oxysporum）、フサリウム・レティクラトゥム（Fusarium reticulatum）、フサリウム・ロセウム（Fusarium roseum）、フサリウム・サムブキヌム（Fusarium sambucinum）、フサリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フサリウム・スルプレウム（Fusarium sulphureum）、フサリウム・トルロスム（Fusarium torulosum）、フサリウム・トリコテキオイデス（Fusarium trichothecioides）、フサリウム・ウェネナートゥム（Fusarium venenatum）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエエイ（Mucor miehei）、ミケリオプトラ・テルモピラ（Myceliophthora thermophila）、ネウロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニキリウム・プルプロゲヌム（Penicillium purpurogenum）、パネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、プレビア・ラディアタ（Phlebia radiata）、プレウロトゥス・エリンギイ（Pleurotus eryngii）、ティエラウィア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ウィロサ（Trametes villosa）、トラメテス・ウェルシコロール（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギイ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアトゥム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・レーセイ（Trichoderma reesei）、又はトリコデルマ・ウィリデ（Trichoderma viride）の細胞であってよい。
【０２１３】
真菌細胞は、それ自体公知の方式でプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生を行うことを含む方法で形質転換できる。アスペルギルス属及びトリコデルマ属の宿主細胞の適切な形質転換方法は、欧州特許第２３８０２３号明細書；Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474；及びChristensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422に記載されている。フサリウム属の種の適切な形質転換方法はMalardier et al., 1989, Gene 78: 147-156及び国際公開第９６／００７８７号に記載されている。酵母は、Becker and Guarente In: Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York；Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163；及びHinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920に記載の方法で形質転換できる。
【０２１４】
製造方法
本発明は、（ａ）変異体の発現のために適切な条件下、本発明の宿主細胞を培養することと；（ｂ）前記変異体を回収することを含む変異体の製造方法にも関する。したがって、本発明は、変異体の製造方法であって、（ａ）「α−アミラーゼ活性を有し、配列番号１と少なくとも８９％の配列同一性を有し、配列番号２のアミノ酸１８０〜１８３に対応する位置にＦＸ１Ｘ２Ｋ（配列番号４）のアミノ酸モチーフを含み；ここでＸ１はＲ又はＳであり、Ｘ２はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され得、ただし、Ｘ１がＲのとき、Ｘ２はＳではなく、ここで前記変異体は、ＦＲＳＫモチーフを含むアミラーゼと比較して、改善された残効性（ＲＡ）を有する、変異体」の発現のために適切な条件下、前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと；（ｂ）前記変異体を回収することを含む、製造方法に関する。
【０２１５】
宿主細胞は、当技術分野で公知の方法で、変異体の製造に適した栄養培地で培養される。例えば、細胞は、振盪フラスコ培養あるいは研究用又は産業用発酵槽での小規模又は大規模発酵（連続発酵、回分発酵、流加発酵又は固体発酵など）を変異体の発現及び／又は単離が可能な適切な培地及び条件で実施することにより培養できる。培養は当技術分野で公知の方法で、炭素源及び窒素源ならびに無機塩を含む適切な栄養培地で行われる。適切な培地は販売業者から入手でき、あるいは公表されている（例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログで）組成に従い調製してもよい。変異体が栄養培地に分泌される場合、変異体は培地から直接回収できる。変異体が分泌されない場合は細胞可溶化物から回収できる。
【０２１６】
変異体は、その変異体に特異的な当技術分野で公知の方法で検出できる。このような検出方法としては、特異抗体の使用、酵素産物の生成、又は酵素基質の消失が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、酵素試験を用いて変異体の活性を決定してもよい。
【０２１７】
変異体は当技術分野で公知の方法を用いて回収できる。例えば、変異体は収集、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、又は沈殿などの（ただし、これらに限定されるものではない）従来の方法で栄養培地から回収してよい。
【０２１８】
変異体を当技術分野で公知の様々な方法、例えばクロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動法（例えば分取等電点電気泳動）、溶解度差（例えば硫酸アンモニウム沈殿法）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又は抽出（例えば、Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照のこと）など（ただし、これらに限定されるものではない）によって精製して実質的に純粋な変異体を得てもよい。
【０２１９】
別の側面では、変異体を回収せず、その変異体を発現する本発明の宿主細胞を変異体の供給源として用いる。
【０２２０】
（本発明の組成物）
本発明は本発明の変異体を含む組成物にも関する。したがって、本発明は、「α−アミラーゼ活性を有し、配列番号１と少なくとも８９％の配列同一性を有し、配列番号２のアミノ酸１８０〜１８３に対応する位置にＦＸ１Ｘ２Ｋ（配列番号４）のアミノ酸モチーフを含み；ここでＸ１はＲ又はＳであり、Ｘ２はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され得、ただし、Ｘ１がＲのとき、Ｘ２はＳではなく、ここで前記変異体は、ＦＲＳＫモチーフを含むアミラーゼと比較して、改善された残効性（ＲＡ）を有する、変異体」を含む組成物に関する。
【０２２１】
前記組成物は、このような変異体を富化した組成物であることが好ましい。「富化した」という用語は、組成物のα−アミラーゼ活性が例えば１．１の富化係数で増加したことを意味する。
【０２２２】
前記組成物は、主要な酵素成分（例えば一成分組成物）として変異体を含んでよい。あるいは、組成物は複数の酵素活性（アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン、グリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼなど）を含んでもよい。追加の酵素は、例えばアスペルギルス属に属する微生物、例えばアスペルギルス・アクレアトゥス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フォエティドゥス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・フミガートゥス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ヤポニクス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、又はアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）；フサリウム属に属する微生物、例えばフサリウム・バクトリディオイデス（Fusarium bactridioides）、フサリウム・ケレアリス（Fusarium cerealis）、フサリウム・クロオクウェレンセ（Fusarium crookwellense）、フサリウム・クルモルム（Fusarium culmorum）、フサリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）、フサリウム・グラミヌム（Fusarium graminum）、フサリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）、フサリウム・ネグンディ（Fusarium negundi）、フサリウム・オクシスポルム（Fusarium oxysporum）、フサリウム・レティクラトゥム（Fusarium reticulatum）、フサリウム・ロセウム（Fusarium roseum）、フサリウム・サムブキヌム（Fusarium sambucinum）、フサリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フサリウム・スルプレウム（Fusarium sulphureum）、フサリウム・トルロセウム（Fusarium toruloseum）、フサリウム・トリコテキオイデス（Fusarium trichothecioides）、又はフサリウム・ウェネナートゥム（Fusarium venenatum）；フミコラ属（Humicola）に属する微生物、例えばフミコラ・インソレンス（Humicola insolens）又はフミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）；あるいはトリコデルマ属に属する微生物、例えばトリコデルマ・ハルジアヌム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギイ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアトゥム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・レーセイ（Trichoderma reesei）、又はトリコデルマ・ウィリデ（Trichoderma viride）に産生させてもよい。
【０２２３】
組成物は当技術分野で公知の方法に従い調製でき、液状又は乾燥組成物の形態であってよい。例えば、組成物は、顆粒又は微細顆粒の形態でもよい。変異体は当技術分野で公知の方法に従い安定化できる。
【０２２４】
１種以上の酵素を含有する別々の添加剤又はこれらの酵素をすべて含む混合添加剤を添加することにより、洗剤酵素を洗剤組成物に含ませてもよい。本発明の洗剤添加物、すなわち別々の添加物又は混合添加物は、例えば粒状物、液体、懸濁液などに製剤できる。好ましい洗剤添加物の製剤は、粒状物（特に非発塵性の粒状物）、液体（特に安定化した液体）、又は懸濁液である。このように、本発明は本発明の変異体を含み、必要に応じて非発塵性の粒状物、安定化された液体、又は保護された酵素の形態である、洗剤添加物にも関する。したがって、本発明は、「α−アミラーゼ活性を有し、配列番号１と少なくとも８９％の配列同一性を有し、配列番号２のアミノ酸１８０〜１８３に対応する位置にＦＸ１Ｘ２Ｋ（配列番号４）のアミノ酸モチーフを含み；ここでＸ１はＲ又はＳであり、Ｘ２はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され得、ただし、Ｘ１がＲのとき、Ｘ２はＳではなく、ここで前記変異体は、ＦＲＳＫモチーフを含むアミラーゼと比較して、改善された残効性（ＲＡ）を有する、変異体」を含み、必要に応じて非発塵性の粒状物、安定化された液体、又は保護された酵素の形態である、洗剤添加物に関する。
【０２２５】
一側面では、本発明は本発明の変異体と１種以上の追加の清浄組成物成分を含む洗剤組成物に関する。したがって、本発明は、「α−アミラーゼ活性を有し、配列番号１と少なくとも８９％の配列同一性を有し、配列番号２のアミノ酸１８０〜１８３に対応する位置にＦＸ１Ｘ２Ｋ（配列番号４）のアミノ酸モチーフを含み；ここでＸ１はＲ又はＳであり、Ｘ２はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され得、ただし、Ｘ１がＲのとき、Ｘ２はＳではなく、ここで前記変異体は、ＦＲＳＫモチーフを含むアミラーゼと比較して、改善された残効性（ＲＡ）を有する、変異体」と１種以上の追加の清浄組成物成分を含む、洗剤組成物に関する。
【０２２６】
追加の成分の選択は当業者の技術の範囲内であり、以下に示す例（ただしこれらに限定されるものではない）を含む従来の成分が挙げられる。
【０２２７】
成分の選択には、繊維製品の手入れ（洗濯など）のため、清浄する繊維製品の種類、汚れの種類及び／又は程度、清浄を行う温度、ならびに洗剤製品の製剤の考慮が含まれ得る。以下に記載する成分は特定の機能に応じて一般的な見出しで分類するが、当業者であれば認識できるように、成分は追加の機能を含む場合もあるため、限定として解釈すべきではない。
【０２２８】
したがって、本発明は清浄組成物である組成物にも関する。
【０２２９】
本発明の組成物は、洗剤成分、例えば界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、ポリマー、及び布地色調剤（fabric hueing agents）をさらに含んでもよい。
【０２３０】
本発明の洗剤組成物は、例えば本発明の酵素と１種以上の追加の自動食器洗浄（ＡＤＷ）組成物成分を含むＡＤＷ組成物に関する場合もある。追加の成分の選択は当業者の技術の範囲内であり、以下に示す成分の例（ただしこれらに限定されるものではない）を含む従来の成分が挙げられる。したがって、一側面では、本発明は本発明の変異体と必要に応じて界面活性剤を含む、手動又は自動食器洗浄用の洗剤組成物に関する。
【０２３１】
本発明の洗剤組成物は、例えば手動又は機械洗濯用の洗剤組成物（しみの付いた布の前処理に適した洗濯用添加物組成物、及び濯ぎのときに添加する布用柔軟剤組成物などを含む）として製剤化してもよく、手動又は機械の食器洗浄作業用に製剤化してもよい。したがって、一側面では、本発明は本発明の変異体を含む手動又は自動洗濯用の洗剤組成物に関する。
【０２３２】
特定の側面では、本発明は本発明のα−アミラーゼポリペプチドを含む洗剤濃縮物／添加物を提供する。洗剤添加物及び洗剤組成物は、１種以上の他の酵素（プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、別のデンプン分解酵素（例えば別のα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、マルトース生成アミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、及び／又はセルラーゼ）、マンナナーゼ（MANNAWAY（商標）（Novozymes, Denmark）など）、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、クチナーゼ、及び／又はラッカーゼを含んでもよい。
【０２３３】
一般的に、選択した酵素の性質は選択した洗剤に適合すべきであり（すなわち、最適ｐＨ値、他の酵素成分及び非酵素成分との適合性など）、酵素は有効量で存在すべきである。
【０２３４】
プロテアーゼ：好適なプロテアーゼとしては、動物、植物、又は微生物に由来するプロテアーゼが挙げられる。微生物由来のものが好ましい。化学修飾又はタンパク質操作を施した変異体を含む。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼであってよく、微生物アルカリプロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼが好ましい。アルカリプロテアーゼの例はスブチリシン（特にバシラス属由来のもの）であり、例えばスブチリシンＮｏｖｏ、スブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、スブチリシン３０９、スブチリシン１４７、及びスブチリシン１６８（国際公開第８９／０６２７９号に記載）である。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ由来のもの）、及びフサリウム属のプロテアーゼ（国際公開第８９／０６２７０号及び第９４／２５５８３号に記載）である。
【０２３５】
有用なプロテアーゼの例は、国際公開第９２／１９７２９号、第９８／２０１１５号、第９８／２０１１６号、及び第９８／３４９４６号に記載の変異体であり、特に以下の位置のうち１つ以上の位置に置換を有する変異体である：２７、３６、５７、７６、８７、９７、１０１、１０４、１２０、１２３、１６７、１７０、１９４、２０６、２１８、２２２、２２４、２３５、及び２７４。好ましい市販のプロテアーゼ酵素としては、ALCALASE（登録商標）、SAVINASE（登録商標）（配列番号３）、PRIMASE（登録商標）、DURALASE（登録商標）、ESPERASE（登録商標）、及びKANNASE（登録商標）（Novozymes A/S）、MAXATASE（登録商標）、MAXACAL、MAXAPEM（登録商標）、PROPERASE（登録商標）、PURAFECT（登録商標）、PURAFECT OXP（登録商標）、FN2（登録商標）、FN3（登録商標）、FN4（登録商標）（Genencor International Inc.）が挙げられる。
【０２３６】
リパーゼ：好適なリパーゼとしては、細菌又は真菌に由来するものが挙げられる。化学修飾又はタンパク質操作を施した変異体を含む。有用なリパーゼの例は、フミコラ属（Humicola（別名テルモミケス（Thermomyces））由来のリパーゼ、例えば欧州特許第２５８０６８号及び第３０５２１６号明細書に記載のＨ．ラヌギノサ（H. lanuginosa）（Ｔ．ラヌギノスス（T. lanuginosus））又は国際公開第９６／１３５８０号に記載のＨ．インソレンス（H. insolens）に由来のリパーゼ；シュードモナス属のリパーゼ、例えばＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）又はＰ．プセウドアルカリゲネス（P. pseudoalcaligenes）（欧州特許第２１８２７２号）、Ｐ．ケパキア（P. cepacia）（欧州特許第３３１３７６号）、Ｐ．ストゥゼリ（P. stutzeri）（英国特許第１，３７２，０３４号明細書）、Ｐ．フルオレスケンス（P. fluorescens）、シュードモナス属の種（Pseudomonas sp.）のＳＤ７０５株（国際公開第９５／０６７２０号及び第９６／２７００２号）、Ｐ．ウイスコンシネンシス（P. wisconsinensis）（国際公開第９６／１２０１２号）に由来するリパーゼ；バシラス属のリパーゼ、例えばＢ．スブティリス（B. subtilis）（Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131:253-360）、Ｂ．ステアロテルモピルス（B. stearothermophilus）（特表昭６４−７４４９９２号公報）又はＢ．プミルス（B. pumilus）（国際公開第９１／１６４２２号）に由来するリパーゼなどが挙げられる。他の例は、以下の文献に記載されているようなリパーゼ変異体である：国際公開第９２／０５２４９号及び第９４／０１５４１号、欧州特許第４０７２２５号及び第２６０１０５号明細書、国際公開第９５／３５３８１号、第９６／００２９２号、第９５／３０７４４号、第９４／２５５７８号、第９５／１４７８３号、第９５／２２６１５号、第９７／０４０７９号、及び第９７／０７２０２号。
【０２３７】
好ましい市販のリパーゼ酵素としてはLIPOLASE（商標）及びLIPOLASE ULTRA（商標）（Novozymes A/S）が挙げられる。
【０２３８】
アミラーゼ：好適なアミラーゼ（α−アミラーゼ及び／又はβ−アミラーゼ）としては、細菌又は真菌由来のアミラーゼが挙げられる。化学修飾又はタンパク質操作を施した変異体を含む。アミラーゼは、例えばバシラス属（Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）の特殊株から得られるα−アミラーゼが挙げられる（詳細は英国特許第１，２９６，８３９号明細書に記載）。有用なα−アミラーゼの例は、国際公開第９４／０２５９７号、第９４／１８３１４号、第９６／２３８７３号及び第９７／４３４２４号に記載の変異体であり、特に以下の位置のうち１つ以上の位置に置換を有する変異体である：１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、及び４４４。市販のα−アミラーゼは、DURAMYL（商標）、LIQUEZYME（商標）、TERMAMYL（商標）、NATALASE（商標）、Everest（商標）、FUNGAMYL（商標）、及びBAN（商標）、Amplify（商標）、Amplify Prime（商標）、Stainzyme（商標）、Stainzyme Plus（商標）（以上、Novozymes A/S）；PREFERENZ（商標）S100、PREFERENZ（商標）S110、PREFERENZ（商標）S1000（配列番号１１）、EXCELLENZ（商標）S110、EXCELLENZ（商標）S1000、EXCELLENZ（商標）S2000、RAPIDASE（商標）、及びPURASTAR（商標）（Genencor International Inc.）である。
【０２３９】
セルラーゼ：好適なセルラーゼとしては、細菌又は真菌に由来するものが挙げられる。化学修飾又はタンパク質操作を施した変異体を含む。好適なセルラーゼとしては、バシラス属（Bacillus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、フミコラ属（Humicola）、フサリウム属（Fusarium）、ティエラウィア属（Thielavia）、アクレモニウム属（Acremonium）由来のセルラーゼが挙げられる（例えば、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ミケリオプトラ・テルモピラ（Myceliophthora thermophila）、及びフサリウム・オクシスポルム（Fusarium oxysporum）から生成される真菌セルラーゼ（米国特許第４，４３５，３０７号、第５，６４８，２６３号、第５，６９１，１７８号、及び第５，７７６，７５７号明細書、ならびに国際公開第８９／０９２５９号に開示されている）。特に好適なセルラーゼは、色彩保護（colour care）に関する利点を有するアルカリセルラーゼ又は中性セルラーゼである。このようなセルラーゼの例は、欧州特許第０４９５２５７号及び第０５３１３７２号明細書、国際公開第９６／１１２６２号、第９６／２９３９７号、及び第９８／０８９４０号に記載のセルラーゼである。他の例は、国際公開第９４／０７９９８号、欧州特許第０５３１３１５号明細書、米国特許第５，４５７，０４６号、第５，６８６，５９３号、及び第５，７６３，２５４号明細書、国際公開第９５／２４４７１号、国際公開第９８／１２３０７号及びＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９号に記載されているようなセルラーゼ変異体である。
【０２４０】
市販のセルラーゼとしては、CELLUZYME（登録商標）及びCAREZYME（登録商標）（Novozymes A/S）、CLAZINASE（登録商標）及びPURADAX HA（登録商標）（Genencor International Inc.）、ならびにKAC-500(B)（登録商標）（Kao Corporation）が挙げられる。
【０２４１】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては、植物、細菌、又は真菌に由来のものが挙げられる。化学修飾又はタンパク質操作を施した変異体を含む。有用なペルオキシダーゼの例としては、コプリヌス属（Coprinus）（例えばＣ．キネレウス（C. cinereus））由来のペルオキシダーゼ及びその変異体（国際公開第９３／２４６１８号、第９５／１０６０２号、及び第９８／１５２５７号に記載のものなど）が挙げられる。市販のペルオキシダーゼとしては、GUARDZYME（登録商標）（Novozymes A/S）が挙げられる。
【０２４２】
リケナーゼ／β−グルカナーゼ：好適なリケナーゼとしては、細菌又は真菌に由来するものが挙げられる。リケナーゼは化学修飾又はタンパク質操作したものでもよい。有用なβ−グルカナーゼの例としては、国際公開第２０１５／１４４８２４（Novozymes A/S）及び第９９／０６５１６号（Henkel KGAA）に記載のものが挙げられる。
【０２４３】
１種以上の酵素を含有する別々の添加物又はこれらの酵素をすべて含む混合添加物を添加することにより、洗剤酵素を洗剤組成物に含ませてもよい。本発明の洗剤添加物、すなわち別々の添加物又は混合添加物は、例えば粒状物、液体、懸濁液などに製剤できる。好ましい洗剤添加物の製剤は、粒状物（特に非発塵性の粒状物）、液体（特に安定化した液体）、又は懸濁液である。
【０２４４】
非発塵性粒状物は、例えば米国特許第４，１０６，９９１号及び第４，６６１，４５２号明細書に開示されているように製造してもよく、必要に応じて当技術分野で公知の方法で被覆してもよい。蝋状の被覆材の例は、平均モル重量が１０００〜２００００のポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール；１２個〜２０個の炭素原子を有するアルコールを含み、かつ１５〜８０のエチレンオキシド単位を有する、エトキシ化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；及び脂肪酸のモノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリドである。流動層法で塗布するのに適した膜形成被覆材の例が英国特許第１４８３５９１号明細書に記載されている。例えば、確立された方法に従って液体酵素製剤をポリオール（プロピレングリコールなど）、糖又は糖アルコール、乳酸、あるいはホウ酸の添加によって安定化してもよい。保護された酵素は欧州特許第２３８，２１６号明細書に開示されている方法に従い調製できる。
【０２４５】
本発明の洗剤組成物は、任意の有利な形状（例えば棒状、錠剤、粉末、粒状物、ペースト又は液体）で存在してよい。液体洗剤は一般に最大７０％の水と０〜３０％の有機溶媒を含む水性洗剤でもよく、非水性洗剤でもよい。
【０２４６】
洗剤組成物は、１種以上の界面活性剤を含み、界面活性剤は非イオン性（半極性など）及び／又は陰イオン性及び／又は陽イオン性及び／又は両イオン性）であってよい。界面活性剤は一般には０．１〜６０重量％の濃度で存在する。
【０２４７】
含まれる場合、洗剤は通常、陰イオン性界面活性剤（例えば、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩（脂肪アルコール硫酸塩）、アルコールエトキシサルフェート、第二級アルカンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキルコハク酸又はアルケニルコハク酸、あるいは石鹸）を約１％〜約４０％含む。
【０２４８】
含まれる場合、洗剤は通常、非イオン性界面活性剤（アルコールエトキシラート、ノニルフェノールエトキシラート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのＮ−アシル−Ｎ−アルキル誘導体（「グルカミド」）などを約０．２％〜約４０％含む。
【０２４９】
洗剤は、洗剤ビルダー又は錯化剤メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸二酢酸（ＧＬＤＡ）、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキルコハク酸又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（例えば、SKS（登録商標）-6（Hoechst）など）を０〜６５％含んでもよい。
【０２５０】
洗剤は１種以上のポリマーを含んでもよい。例としては、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシラート（例えばスルホン化重合体）、ポリアクリラート、マレイン酸／アクリル酸共重合体、及びメタクリル酸ラウリル／アクリル酸共重合体を含んでもよい。
【０２５１】
洗剤は、漂白剤を含んでもよい。漂白剤は、過ホウ酸塩又は過炭酸塩などのＨ2Ｏ2源を含んでもよく、これを漂白触媒などの過酸形成漂白活性化剤（例えばＭｎ系又はＣｏ系）、テトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩と組み合わせてもよい。あるいは、漂白剤は例えばアミド、イミド又はスルホン型の過酸を含んでもよい。
【０２５２】
本発明の洗剤組成物の酵素を、従来の安定化剤、例えばポリオール（プロピレングリコール又はグリセロールなど）、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸又はホウ酸誘導体（例えば芳香族ホウ酸エステル）、あるいはフェニルボロン酸誘導体（４−ホルミルフェニルボロン酸）で安定化してもよく、この組成物は例えば国際公開第９２／１９７０９号及び第９２／１９７０８号に記載のように製剤化できる。
【０２５３】
洗剤はさらに、他の従来の洗剤成分、例えば布用調整剤（粘土、泡増強剤、泡抑制剤、抗腐蝕剤、汚れ遊離剤、汚れ再付着防止剤、染料、殺菌剤、蛍光増白剤、ハイドロトロープ類、曇り止め剤、又は香料を含んでもよい。
【０２５４】
ハイドロトロープは、疎水性化合物を水溶液に（又は反対に極性物質を非極性環境に）溶解できるようにする化合物である。一般には、ハイドロトロープ類は親水性と疎水性の両方の性質（界面活性剤からわかるいわゆる両親媒性）を有する。しかし、ハイドロトロープの分子構造は一般には自然に自己凝集しにくい（例えば、Hodgdon及びKalerによる概説（2007, Current Opinion in Colloid & Interface Science 12: 121-128）を参照）。ハイドロトロープは、界面活性剤や、ミセル状、層状、又は他の十分に定義されたメソ相を形成する脂質に見られる、超えると自己凝集が起こるような臨界濃度を示さない。代わりに、多くのハイドロトロープは濃度が増加するにつれて凝集体のサイズが増大する連続型の凝集過程を示す。しかし、多くのハイドロトロープは、極性物質と非極性物質を含有する系（水と油と界面活性剤とポリマーとの混合物など）の相挙動、安定性、及びコロイド性を変化させる。ハイドロトロープは、医薬品、パーソナルケア、食品、技術用途など、様々な産業分野で古くから利用されている。洗剤組成物にハイドロトロープを用いることにより、例えば（脱水により液体洗剤を圧縮する工程で見られるような）相分離又は高粘度などの望ましくない現象を誘発することなく、界面活性剤をより高濃度で含む製剤を得ることができる。
【０２５５】
洗剤組成物は、洗剤ビルダーや補助ビルダー又はそれらの混合物を約０〜６５重量％（例えば約５〜約５０重量％）含んでもよい。食器洗浄用の洗剤では、ビルダーの濃度は一般に４０〜６５％（特に５０〜６５％）である。ビルダー及び／又は補助ビルダーは特に、Ｃａ及びＭｇと水溶性錯体を形成するキレート剤であってもよい。洗濯／ＡＤＷ／硬質表面清浄用の洗剤での使用が当技術分野で知られている任意のビルダー及び／又は補助ビルダーを用いてよい。ビルダーの例（ただし、これらに限定されるものではない）としては、ゼオライト；二リン酸塩（ピロリン酸塩）；三リン酸ナトリウム（ＳＴＰ又はＳＴＰＰ）などの三リン酸塩；炭酸ナトリウムなどの炭酸塩；メタケイ酸ナトリウムなどの可溶性ケイ酸塩；層状ケイ酸塩（例えばSKS（登録商標）-6（Hoechst））；２−アミノエタン−１−オール（ＭＥＡ）、ジエタノールアミン（ＤＥＡ、２，２’−イミノジエタン−１−オールともいう）、トリエタノールアミン（ＴＥＡ、２，２’，２”−ニトリロトリエタン−１−オール）などのエタノールアミン；（カルボキシメチル）イヌリン（ＣＭＩ）；及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０２５６】
洗剤は、漂白剤を０〜３０重量％（例えば約１〜約２０重量％）含んでもよい。洗濯／ＡＤＷ／硬質表面清浄用の洗剤での使用が当技術分野で知られている任意の漂白剤を用いてよい。好適な漂白剤成分としては、漂白触媒、光漂白剤、漂白活性化剤、過酸化水素源（過炭酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム、過酸化水素尿素（１：１）など）、過酸前駆体（pre-formed peracid）、及びこれらの混合物が挙げられる。過酸前駆体として好適なものには、ペルオキシカルボン酸及びその塩、ジペルオキシジカルボン酸、ペルイミド酸及びその塩、ペルオキシ一硫酸及びその塩（例えばOxone（登録商標））、ならびにそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。漂白剤の例（ただし、これらに限定されるものではない）としては、過酸化物系漂白剤が挙げられ、これは、無機塩、例えばアルカリ金属塩（過ホウ酸のナトリウム塩（通常は一水和物又は四水和物）、過炭酸塩、過硫酸塩、過リン酸塩、過ケイ酸など）を過酸形成漂白活性化剤と組み合わせて含んでもよい。漂白活性化剤という用語は、本明細書では過酸化水素と反応して過加水分解によって過酸を形成する化合物を意味する。このように形成した過酸は活性化した漂白剤を構成する。本明細書で使用する好適な漂白活性化剤としては、エステル、アミド、イミド、又は無水物の分類に属するものが含まれる。好適な例は、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、４−［（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）オキシ］ベンゼン−１−スルホン酸ナトリウム（ＩＳＯＮＯＢＳ）、４−（ドデカノイルオキシ）ベンゼン−１−スルホナート（ＬＯＢＳ）、４−（デカノイルオキシ）ベンゼン−１−スルホナート、４−（デカノイルオキシ）ベンゾアート（ＤＯＢＳ又はＤＯＢＡ）、４−（ノナノイルオキシ）ベンゼン−１−スルホナート（ＮＯＢＳ）、及び／又は国際公開第９８／１７７６７号に開示されているものが挙げられる。目的の漂白活性化剤の特定のファミリーは欧州特許第６２４１５４号明細書に開示されており、そのなかでもクエン酸アセチルトリエチル（ＡＴＣ）が特に好ましい。ＡＴＣ又は短鎖トリグリセリド（トリアセチンなど）には環境に配慮しているという利点がある。また、クエン酸アセチルトリエチル及びトリアセチンは、貯蔵時の生成物での加水分解安定性が良好であり、効率的な漂白活性化剤である。最後に、ＡＴＣは複数の機能を有する、というのも過加水分解反応で遊離されたクエン酸塩がビルダーとして機能するためである。あるいは、漂白剤は、例えば、アミド型、イミド型、又はスルホン型の過酸を含んでもよく、６−（フタルイミド）ペルオキシヘキサン酸（ＰＡＰ）などの過酸を含んでもよい。また、漂白剤は漂白触媒を含んでもよい。態様によっては、漂白成分は以下の式：
【０２５７】
【化７】
2018019680.tif 000010
【０２５８】
（ｉｉｉ）及び（ｉ）と（ｉｉ）の混合物
を有する有機触媒からなる群より選択される有機触媒である。式中、各Ｒ1は独立に、９〜２４個の炭素原子を含む分岐鎖アルキル基、又は１１〜２４個の炭素原子を含む直鎖アルキル基である。各Ｒ1は独立に、９〜１８個の炭素原子を含む分岐鎖アルキル基、又は１１〜１８個の炭素原子を含む直鎖アルキル基であることが好ましく、各Ｒ1は、２−プロピルヘプチル、２−ブチルオクチル、２−ペンチルノニル、２−ヘキシルデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イソノニル、イソデシル、イソトリデシル、及びイソペンタデシルからなる群より独立に選択されることがより好ましい。他の漂白剤の例は、例えば国際公開第２００７／０８７２５８号、第２００７／０８７２４４号、第２００７／０８７２５９号、欧州特許第１８６７７０８号明細書（ビタミンＫ）及び国際公開第２００７／０８７２４２号に記載されている。好適な光漂白剤は、例えば、スルホン化亜鉛フタロシアニン又はスルホン化アルミニウムフタロシアニンであってよい。
【０２５９】
漂白剤成分は、漂白触媒（特に有機漂白触媒）に加えて過酸の供給源を含むことが好ましい。過酸の供給源は、（ａ）過酸前駆体；（ｂ）過炭酸塩、過ホウ酸塩、又は過硫酸塩（過酸化水素の供給源）（漂白活性化剤と組み合わせるのが好ましい）；（ｃ）繊維製品又は硬質表面を処理する工程中に水の存在下で過酸をその場で形成するためのペルヒドロラーゼ酵素及びエステルから選択され得る。
【０２６０】
洗剤は、ポリマーを０〜１０重量％（例えば０．５〜５重量％、２〜５重量％、０．５〜２重量％、又は０．２〜１重量％）含んでもよい。洗剤に使用される当技術分野で公知の任意のポリマーを利用してよい。ポリマーは、上述の補助ビルダーとして機能してもよく、又は再付着防止、繊維保護、汚れの遊離、染料移り防止、グリース清浄、及び／又は消泡性などの性質を提供してもよい。ポリマーによっては上記の性質のうち２つ以上、及び／又は下記のモチーフのうち２つ以上を有してもよい。ポリマーの例としては、（カルボキシメチル）セルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はポリ（エチレンオキシド）、エトキシ化ポリ（エチレンイミン）、カルボキシメチルイヌリン（ＣＭＩ）、及びポリカルボン酸塩（ＰＡＡ、ＰＡＡ／ＰＭＡ、ポリアスパラギン酸、及びメタクリル酸ラウリル／アクリル酸共重合体）、疎水性を改質したＣＭＣ（ＨＭ−ＣＭＣ）及びシリコーン、テレフタル酸とオリゴマーグリコールの共重合体、ポリ（エチレンテレフタラート）とポリ（オキシエチレンテレフタラート）の共重合体（ＰＥＴ−ＰＯＥＴ）、ＰＶＰ、ポリ（ビニルイミダゾール）（ＰＶＩ）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）（ＰＶＰＯ又はＰＶＰＮＯ）、ならびにポリビニルピロリドン−ビニルイミダゾール（ＰＶＰＶＩ）を含む。さらなるポリマーの例としては、スルホン化ポリカルボキシラート、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド（ＰＥＯ−ＰＰＯ）、ならびにジクオタニウムエトキシスルファート（diquaternium ethoxy sulfate）が挙げられる。その他のポリマーの例は、例えば国際公開第２００６／１３０５７５号に開示されている。上記のポリマーの塩も考慮される。
【０２６１】
本発明の洗剤組成物は、染料又は顔料などの布地色調剤を含んでもよく、これを洗剤組成物に配合する場合、前記洗剤組成物を含む洗浄液が前記布地に接触すると、前記色調剤は布地に付着することで可視光の吸収／反射によって前記布地の色合いを変える。蛍光増白剤は、少なくとも何らかの可視光を発する。これに対し、布地色調剤は、可視光スペクトルの少なくとも一部を吸収して、表面の色合いを変える。好適な布地色調剤としては、染料及び染料−粘土複合体が挙げられ、顔料も挙げることができる。好適な染料としては、低分子染料及び高分子染料が挙げられる。好適な低分子染料としては、例えば国際公開第２００５／０３２７４号、第２００５／０３２７５号、第２００５／０３２７６号及び欧州特許第１８７６２２６号明細書（これらを参照により本明細書に援用する）に記載されているように、ダイレクトブルー（Direct Blue）、ダイレクトレッド（Direct Red）、ダイレクトバイオレット（Direct Violet)、アシッドブルー（Acid Blue）、アシッドレッド（Acid Red）、アシッドバイオレット（Acid Violet）、ベーシックブルー（Basic Blue）、ベーシックバイオレット（Basic Violet）及びベーシックレッド（Basic Red）のカラーインデックス（Ｃ．Ｉ．）分類に属する染料からなる群より選択される低分子染料、又はそれらの混合物が挙げられる。洗剤組成物は、布地色調剤を約０．００００３重量％〜約０．２重量％、約０．００００８重量％〜約０．０５重量％、又は約０．０００１重量％〜約０．０４重量％含むことが好ましい。本組成物は、布地色調剤を０．０００１重量％〜約０．２重量％含んでよく、このことは組成物が単位用量パウチの形態である場合に特に好ましいであろう。好適な色調剤については、国際公開第２００７／０８７２５７号及び第２００７／０８７２４３号にも開示されている。
【０２６２】
洗剤組成物では、任意の酵素、特に本発明のα−アミラーゼポリペプチドを洗浄液１リットル当たり酵素タンパク質０．０１〜１００ｍｇ（０．０５〜５ｍｇ、特に０．１〜１ｍｇが好ましい）に相当する量で添加することができると現在考えられている。
【０２６３】
国際公開第２００６／００２６４３号（参照により援用する）に開示されている洗剤製剤に本発明のα−アミラーゼポリペプチドを追加で組み合わせてもよい。
【０２６４】
（使用）
本発明は本発明の変異体の使用方法にも関する。用途は洗剤、特に洗濯用洗剤組成物及び食器洗浄用洗剤組成物での使用であってよい。したがって、本発明は、親α−アミラーゼの変異体の使用であって、前記変異体は、α−アミラーゼ活性を有し、配列番号１と少なくとも８９％の配列同一性を有し、配列番号２のアミノ酸１８０〜１８３に対応する位置にＦＸ１Ｘ２Ｋ（配列番号４）のアミノ酸モチーフを含み；ここでＸ１はＲ又はＳであり、Ｘ２はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶから選択され得、ただし、Ｘ１がＲのとき、Ｘ２はＳではなく、ここで前記変異体は、ＦＲＳＫモチーフを含むアミラーゼと比較して、改善された残効性（ＲＡ）を有する、前記使用に関する。
【０２６５】
したがって、本発明は本発明の親の変異体又は組成物の、家庭又は産業用の清浄工程での使用を提供する。特に、本発明は、洗濯、食器洗浄（自動又は手動の食器洗浄）、硬質表面清浄、工業用及び業務用の清浄、繊維製品の糊抜き（textile desizing）、デンプンの改質、デンプンの液化、糖化、食事（feed）、ベーキング又は醸造における本発明の変異体の使用に関する。
【０２６６】
一態様では、前記使用は布の清浄（例えば洗濯）である。
【０２６７】
別の態様では、前記使用は陶器、プラスチック、又はガラス素材の清浄（例えば食器洗浄）である。
【０２６８】
したがって、本発明のα−アミラーゼポリペプチドは洗浄、食器洗浄、及び硬質表面清浄用の洗剤組成物（家庭環境用でも産業環境用でもよい）の成分として利用できる。
【０２６９】
本発明のα−アミラーゼ変異体は、その他にも様々に産業利用できる有用な性質を有する。たとえば、本発明のα−アミラーゼポリペプチドをデンプンの処理、特にデンプンの変換（特にデンプンの液化）に利用してもよい（たとえば米国特許第３，９１２，５９０号明細書、欧州特許第２５２７３０号及び第６３９０９号明細書、国際公開第９９／１９４６７号及び第９６／２８５６７号（すべての文献を参照により援用する）。デンプンの変換を目的とする組成物も考慮され、この組成物は本発明の変異体に加えてグルコアミラーゼ、プルラナーゼ、及びその他のα−アミラーゼをさらに含んでもよい。
【０２７０】
また、本発明のα−アミラーゼ変異体は、特に甘味料及びエタノール（燃料用、飲用、及び工業用エタノール）をデンプン又は全粒から製造するのにも有用である（例えば、米国特許第５，２３１，０１７号明細書を参照のこと；この文献を参照により援用する）。
【０２７１】
本発明のα−アミラーゼ変異体は、繊維製品、布、及び衣類の糊抜き（例えば国際公開第９５／２１２４７号、米国特許第４，６４３，７３６号明細書、欧州特許第１１９，９２０号明細書を参照；これらの文献を参照により援用する）、ビールの製造又は醸造、パルプ及び紙の製造にも有用となり得る。
【０２７２】
デンプンの変換
従来のデンプン変換方法（液化及び糖化方法）は、例えば米国特許第３，９１２，５９０号明細書、欧州特許第２５２，７３０号及び第６３，９０９号明細書（これらの文献を参照により援用する）に記載されている。
【０２７３】
一態様では、デンプンを分解してより低分子量の糖質成分（代わって生成される糖や脂肪など）にするデンプン変換工程は、脱分岐工程を含む。
【０２７４】
デンプンを糖に変換する場合、デンプンは解重合される。このような解重合処理は、前処理工程と、２つ又は３つの連続の処理工程、すなわち、液化処理、糖化処理、及び所望の最終生成物に応じて必要であれば異性化処理で構成されてもよい。
【０２７５】
（ｉ）天然デンプンの前処理
天然デンプンは、室温では水に溶けない顕微鏡レベルの顆粒から成る。水性デンプン懸濁液を加熱すると顆粒が膨張し、最終的に破裂してデンプン分子が溶液中に分散する。この「糊化」処理中に粘度は著しく上昇する。一般的な産業工程では固形物の濃度が３０〜４０％であるため、処理できるようにデンプンを薄める、すなわち「液化」しなければならない。現在、この粘度の低下は主に酵素分解によって得られている。
【０２７６】
（ｉｉ）液化
液化工程中、長鎖デンプンをα−アミラーゼでより短い分岐鎖状及び直鎖状の単位（マルトデキストリン）に分解する。液化処理は、１０５〜１１０℃で５〜１０分間、続いて９５℃で１〜２時間かけて行う。ｐＨ値は５．５〜６．２である。これらの条件で最適な酵素安定性を確実に得るため、カルシウムを１ｍＭ（４０ｐｐｍの遊離カルシウムイオン）添加する。この処理の後、液化デンプンの「デキストロース当量（ＤＥ）」は１０〜１５である。
【０２７７】
（ｉｉｉ）糖化
液化処理の後、グルコアミラーゼ（例えばＡＭＧ）と、イソアミラーゼ（米国特許第４，３３５，２０８号）又はプルラナーゼ（例えば、Promozyme（商標））（米国特許第４，５６０，６５１号）などの脱分岐酵素を添加することにより、マルトデキストリンをデキストロースに変換する。この工程の前に、脱分岐酵素で適切に加水分解できない「パノース前駆体」と呼ばれる短いオリゴ糖の形成を低減するため、高温（９５℃を超える温度）を維持しながらｐＨ値を４．５未満に低下させて液化用α−アミラーゼを不活性化する。
【０２７８】
温度を６０℃まで下げ、グルコアミラーゼと脱分岐酵素を添加する。糖化処理は２４〜７２時間続く。
【０２７９】
通常、液化工程の後にα−アミラーゼを変性させると、糖化産物の約０．２〜０．５％はプルラナーゼで分解できない分岐鎖状の三糖である６＜２＞−α−グルコシルマルトース（パノース）である。液化工程で得た活性なアミラーゼが糖化中に存在する（すなわち変性しない）場合、この濃度は１〜２％にも及ぶ可能性があり、このことは非常に不都合である。というのも、それによって糖化の収率が有意に減少するためである。
【０２８０】
アミラーゼを使用するとき、最適には、糖化は約３０℃〜約７５℃、例えば、４５℃〜７５℃、又は４７℃〜７４℃の温度範囲で行われる。糖化は、約ｐＨ３〜約ｐＨ７、例えばｐＨ３．０〜ｐＨ７．５、ｐＨ３．５〜ｐＨ５．５、ｐＨ３．５、ｐＨ３．８、又はｐＨ４．５のｐＨ範囲にわたって実施され得る。
【０２８１】
（ｉｖ）異性化
所望の最終糖産物が例えば高果糖シロップである場合、デキストロースシロップを果糖に変換してもよい。糖化処理の後、ｐＨ値を６〜８の範囲（ｐＨ７．５が好ましい）まで上昇させ、カルシウムをイオン交換によって除去する。次いでデキストロースシロップを、例えば固定化グルコースイソメラーゼ（Sweetzyme（商標）ITなど）を用いて高果糖シロップに変換する。
【０２８２】
エタノール製造
全粒からの一般的なアルコール製造（エタノール）は４つの主な工程に分けることができる。すなわち、
−  粉砕、
−  液化、
−  糖化、
−  発酵である。
【０２８３】
（ｉ）粉砕
構造を開いてさらに加工できるようにするため穀物を粉砕する。湿式粉砕・乾式粉砕の２種類の工程を用いる。乾式粉砕では穀粒全体を粉砕し、これを残りの処理に用いる。湿式粉砕は胚芽と粗挽き粉（デンプン顆粒及びタンパク質）を非常に良好に分離し、わずかな例外はあるが、シロップを並行して製造する場所で採用される。
【０２８４】
（ｉｉ）液化
液化工程では、デンプン顆粒は加水分解されて大部分のＤＰが４より高いマルトデキストリンになることにより可溶化する。加水分解は酸処理で行ってもよいしα−アミラーゼによって酵素で行ってもよい。酸による加水分解は限られた基準で使用される。原材料は、全粒を粉砕したものでもデンプン処理で副次的に得た流体でもよい。
【０２８５】
酵素による液化は一般には３工程の高温懸濁液処理として行われる。懸濁液を６０〜９５℃（８０〜８５℃が好ましい）に加熱し、酵素（単数又は複数）を添加する。次いでこの懸濁液を９５〜１４０℃（１０５〜１２５℃が好ましい）で高速加熱（ｊｅｔ−ｃｏｏｋ）し、６０〜９５℃まで冷却してさらに酵素（単数又は複数）を添加して最終加水分解を行う。液化処理はｐＨ４．５〜６．５（一般にはｐＨ５〜６）で行う。粉砕し液化した穀物をマッシュともいう。
【０２８６】
（ｉｉｉ）糖化
酵母が代謝できる低分子糖（ＤＰ１〜３）を製造するには、液化によって得たマルトデキストリンをさらに加水分解しなければならない。加水分解は一般にはグルコアミラーゼによって酵素で行うが、α−グルコシダーゼ又は酸性α−アミラーゼを用いてもよい。完全な糖化工程は最大７２時間続く場合もあるが、一般には４時間の前糖化（ｐｒｅ−ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のみを行った後、発酵中に糖化を完了するのが通常である（ＳＳＦ）。糖化は一般には３０〜６５℃（一般には６０℃前後）の温度でｐＨ４．５で実施する。
【０２８７】
（ｉｖ）発酵
酵母（一般にサッカロミセス属の種）をマッシュに添加し、発酵を２４〜９６時間（例えば一般には３５〜６０時間）行う。温度は２６〜３４℃（一般には約３２℃）であり、ｐＨ値は３〜６（ｐＨ４〜５前後が好ましい）である。
【０２８８】
なお、最も広く用いられている処理は、糖化のための待機段階をとらない同時糖化発酵（ＳＳＦ）処理であり、これは酵母と酵素を同時に添加することを意味する。ＳＳＦを行う場合、発酵の直前に５０℃より高い温度での前糖化工程を導入するのが通常である。
【０２８９】
（ｖ）蒸留
発酵後、マッシュを蒸留してエタノールを取り出す。
【０２９０】
本発明の方法で得たエタノールは、例えば燃料用エタノール、飲用エタノール（すなわち飲料に適したニュートラルスピリッツ）、又は産業用エタノールとして使用できる。
【０２９１】
（ｖｉ）副産物
発酵で得られた穀粒が残るが、これを一般には動物用の飼料（液体又は乾燥）として用いる。
【０２９２】
液化、糖化、発酵、蒸留、及びエタノールの回収の方法の詳細は当業者に周知である。
【０２９３】
本発明の方法によれば、糖化と発酵は同時に行っても別に行ってもよい。
【０２９４】
（パルプ及び紙の製造）
本発明のアルカリ性α−アミラーゼポリペプチドは、デンプンで強化した古紙や厚紙からリグノセルロース材料（パルプ、紙、及び段ボールなど）を製造するのにも利用できる（特に、再パルプ化がｐＨ７を超えるｐＨ値で起こり、アミラーゼによって強化用デンプンを分解することにより廃材が分解しやすくなる場合）。本発明のα−アミラーゼはデンプンを被覆した印刷紙から製紙用パルプを製造する方法に特に有用である。このような方法は国際公開第９５／１４８０７号に記載されているように実施でき、
ａ）紙を分解してパルプを製造する工程と、
ｂ）デンプン分解酵素による処理を工程ａ）の間又はその前後に行う工程と、
ｃ）工程ａ）及びｂ）の後にパルプからインク粒子を分離する工程
を含む。
【０２９５】
本発明のα−アミラーゼは、酵素により改質したデンプンをアルカリ性の賦形剤（炭酸カルシウム、カオリン、粘土など）と共に製紙に用いる場合、デンプンの改質に非常に有用となり得る。本発明のアルカリ性α−アミラーゼにより、賦形剤の存在下でデンプンを改質でき、それによってより処理を単純化し統合することができる。
【０２９６】
（繊維製品、布地、及び衣類の糊抜き）
本発明のα−アミラーゼは、繊維製品、布地、又は衣類の糊抜きにも非常に有用となり得る。繊維加工産業では、α−アミラーゼは従来から糊抜き処理の補助剤としてデンプンを含む糊（製織の間は横糸の保護用塗膜として機能していたもの）を除去しやすくするために使用されている。製織後に糊の塗膜を完全に除去することは、後に布地を精練、漂白、染色する処理で最適な結果を確実に得るために重要である。酵素によるデンプン分解は繊維材料に有害な影響を及ぼさないため好ましい。加工コストを低減し、工場の処理量を高めるため、糊抜き処理を精練工程及び漂白工程と組み合わせることがある。このような場合、従来のα−アミラーゼは高いｐＨ値や漂白剤とあまり適合しないため、一般には酵素以外の補助剤（アルカリ剤又は酸化剤など）を用いてデンプンを分解する。デンプン糊を酵素を使わずに分解すると、非常に強力な化学薬品を使うため、何らかの繊維の損傷が起こる。したがって、本発明のα−アミラーゼはアルカリ性溶液中での性能が改善されているため、これを使用するのが望ましいであろう。α−アミラーゼは単独で使用してもよく、セルロースを含む布地又は繊維製品の糊抜きを行うときにセルラーゼと組み合わせて使用してもよい。
【０２９７】
糊抜き及び漂白の工程は当技術分野で周知である。例えば、このような工程は国際公開第９５／２１２４７号、米国特許第４，６４３，７３６号明細書、欧州特許第１１９，９２０号明細書に記載されている。これらの文献を参照により援用する。
【０２９８】
市販の糊抜き用製品としてはAQUAZYME（登録商標）及びAQUAZYME（登録商標）ULTRA（Novozymes A/S）が挙げられる。
【０２９９】
（ビール製造）
本発明のα−アミラーゼはビールの製造工程でも非常に有用となり得る。一般には醸造処理中にα−アミラーゼを添加する。
【０３００】
以下の実施例によって本発明をさらに説明するが、実施例は本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【０３０１】
本明細書に開示した特定の側面は本発明のいくつかの側面を例示するものであるため、本明細書に記載し特許請求する発明は、それらの側面によって範囲を限定されるものではなく、任意の同等の態様を本発明の範囲に包含するものとする。実際、以上の記載を読めば、本明細書で図示・説明したものの他にも本発明の様々な変更が当業者には明らかになるであろう。添付の特許請求の範囲にはこのような変更も含まれるものとする。矛盾が生じた場合、定義を含む本開示が優先する。
【実施例】
【０３０２】
（実施例１：α−アミラーゼ活性の試験）
１．ファデバス（商標）アッセイ
α−アミラーゼ活性は、ファデバス（登録商標）タブレットを基質とする方法で決定できる。ファデバス（登録商標）タブレット（Phadebas（登録商標） Amylase Test、Pharmacia Diagnostic）は、架橋された不溶性の青色のデンプン高分子をウシ血清アルブミンと緩衝剤と混合してタブレット状にしたものである。
【０３０３】
１回の測定ごとに、１００ｍＭのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液（酢酸１００ｍＭ、リン酸１００ｍＭ、ホウ酸１００ｍＭ、ＣａＣｌ2０．１ｍＭ；目的のｐＨ値になるようＮａＯＨで調整した）５ｍｌを入れた試験管に１錠を懸濁する。試験は、目的の温度で水浴中で実施する。試験するα−アミラーゼを１００ｍＭのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液ｘｍｌで希釈する。このα−アミラーゼ溶液１ｍｌを１００ｍＭのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液５ｍｌに添加する。デンプンはα−アミラーゼによって加水分解され、可溶性の青色の断片が得られる。得られた青色の溶液の吸光度を６２０ｎｍで分光光度法で測定したものをα−アミラーゼ活性の関数とする。
【０３０４】
１０分又は１５分の保温（試験時間）の後に６２０ｎｍで測定した吸光度が６２０ｎｍで０．２〜２．０の吸光度単位の範囲にあることが重要である。この吸光度範囲では、活性と吸光度との間に直線性がある（Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒの法則）。したがって、酵素の希釈はこの基準に適合するように調整しなければならない。指定の一連の条件（温度、ｐＨ値、反応時間、緩衝液条件）のもと、所定のα−アミラーゼ１ｍｇによって一定量の基質が加水分解され、青色が生じる。色彩強度は６２０ｎｍで測定する。測定した吸光度は、所定の一連の条件のもとでは対象α−アミラーゼの比活性（純粋なα−アミラーゼタンパク質の活性／ｍｇ）に直接比例する。
【０３０５】
（２．ＰＮＰ−Ｇ７試験）
α−アミラーゼ活性は、ＰＮＰ−Ｇ７基質を用いる方法で決定する。ＰＮＰ−Ｇ７（ｐ−ニトロフェニル−α，Ｄ−マルトヘプタノシドの略）は、エンドアミラーゼで切断できる阻害されたオリゴ糖である。切断後、キットに含まれるα−グルコシダーゼは基質を消化して遊離ＰＮＰ分子を放出する。このＰＮＰ分子は黄色を有するため、λ＝４０５ｎｍ（４００〜４２０ｎｍ）で可視分光測定によって測定できる。ＰＮＰ−Ｇ７基質及びα−グルコシダーゼを含むキットは、Boehringer-Mannheim（カタログ番号１０５４６３５）により製造されている。
【０３０６】
試薬溶液を調製するには、基質／緩衝液溶液１０ｍｌを製造業者の推奨に従い酵素／緩衝液５０ｍｌに添加する。試験は、試料２０μｌを９６ウェルのマイクロタイタープレートに移し、２５℃で保温することにより実施する。２５℃に予め平衡化した試薬溶液２００μｌを添加する。溶液を混合し、前保温を１分間行い、ＥＬＩＳＡリーダーで４０５ｎｍの光学密度（ＯＤ）で３０秒ごとに４分間、吸収を測定する。
【０３０７】
時間に依存する吸収曲線の勾配は、所定の一連の条件のもとでは対象α−アミラーゼの活性に正比例する。
【０３０８】
（実施例２：本発明のα‐アミラーゼ変異体の残効性）
α−アミラーゼＴＳ２３切断型α−アミラーゼ（配列番号１）に２つのアミノ酸欠失を標準的な部位特異的方法で導入した。得られたα−アミラーゼ変異体のＲ１８０−Ｓ１８１−Ｔ１８２−Ｇ１８３領域に様々な組み合わせの２つのアミノ酸欠失を下記の表１に示すとおりに導入した。位置の番号付けは配列番号１に従う。改変アミラーゼ遺伝子をバシラス・スブティリス（Bacillus subtilis）に形質移入し、バシラス・スブティリスで発現させる。バシラス・スブティリスのブロスを遠心分離し、アミラーゼを含む上清を単離し、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液（ｐＨ７．３）で少なくとも５０倍に希釈した後、ＥＤＴＡを０．３％含むモデルＡ洗剤９０％と混合した。次に、この試料を２つの試料に分け、一方を４℃で保存し、もう一方を４０℃で４時間保温した。その後、試料を１００ｍＭのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液（酢酸１００ｍＭ＋リン酸１００ｍＭ＋ホウ酸１００ｍＭ（ｐＨ７．３）＋ＣａＣｌ2０．１２ｍＭ＋Ｂｒｉｊ０．０１％、ｐＨ７．３に調整）で１０倍に希釈し、アミラーゼ活性を「方法」の項に記載したＰｈａｄｅｂａｓ（登録商標）アミラーゼアッセイを用いて測定した。残効性を、４０℃で保温した試料の活性の４℃で保温した試料の活性に対する比として計算した。
【表２】
2018019680.tif 000011
【０３０９】
本実施例は、２個のアミノ酸を欠失させることによりＥＤＴＡを含む洗剤の存在下で安定性が増加したα−アミラーゼ変異体を生成でき、アミノ酸モチーフに含まれるセリン、スレオニン、及び／又はグリシンを保存することによって最大の効果が明らかに観測されることを実証する。
【０３１０】
（実施例３：残効性（ＲＡ）の比較データ）
実施例２と同様に、α−アミラーゼＳＰ７２２（配列番号５）に２つのアミノ酸欠失を標準的な部位特異的方法で導入した。得られたα−アミラーゼ変異体において、Ｒ１８１−Ｇ１８２−Ｄ１８３−Ｇ１８４領域における２つのアミノ酸欠失の異なる組合せを下記の表２に示すように導入した。位置番号付けは、配列番号５に従う。改変されたアミラーゼ遺伝子は、バシラス・スブティリスに形質転換され、そして発現された。バシラス・スブティリスのブロスを遠心分離し、アミラーゼ含有の上清を単離し、Britton-Robinson緩衝液ｐＨ７．３で少なくとも５０倍に希釈した後、０．３％ＥＤＴＡを含む９０％モデルＡ洗剤と混合した。次に、サンプルを２つのサンプルに分割した。一方を４℃で保存し、他方を４５℃で４時間インキュベートした。その後、試料を１００ｍＭのBritton-Robinson緩衝液（１００ｍＭ酢酸＋１００ｍＭリン酸＋１００ｍＭホウ酸、ｐＨ７．３＋０．１２ｍＭ  ＣａＣｌ＋０．０１％Ｂｒｉｊ、ｐＨ７．３に調整）中で１０倍に希釈し、方法の項で記載された通り、ファデバス（Ｐｈａｄｅｂａｓ）アッセイを使用してアミラーゼ活性を測定した。残効性は、４℃でインキュベートした試料中の活性に対する、４５℃でインキュベートした試料中の活性の比として計算した。
【０３１１】
【表３】
2018019680.tif 000012
【０３１２】
（実施例４：残効性（ＲＡ）の比較データ）
実施例２及び３と同様に、α−アミラーゼＳＰ７２２（配列番号５）に２つのアミノ酸欠失を標準的な部位特異的方法で導入した。残存活性（ＲＡ）は、以前の２つの実施例と比較してわずかに長いインキュベーション後に測定された（当該変異体を４時間の代わりに１８時間インキュベートした）。得られたα−アミラーゼ変異体において、Ｒ１８１−Ｇ１８２−Ｄ１８３−Ｇ１８４領域における２つのアミノ酸欠失の異なる組合せを下記の表３に示すように導入した。位置番号付けは、配列番号５に従う。改変されたアミラーゼ遺伝子は、バシラス・スブティリスに形質転換され、そして発現された。バシラス・スブティリスのブロスを遠心分離し、アミラーゼ含有の上清を単離し、Britton-Robinson緩衝液ｐＨ７．３で少なくとも５０倍に希釈した後、０．３％ＥＤＴＡを含む９０％モデルＡ洗剤と混合した。次に、サンプルを２つのサンプルに分割した。一方を４℃で保存し、他方を４５℃で１８時間インキュベートした。その後、試料を１００ｍＭのBritton-Robinson緩衝液（１００ｍＭ酢酸＋１００ｍＭリン酸＋１００ｍＭホウ酸、ｐＨ７．３＋０．１２ｍＭ  ＣａＣｌ＋０．０１％Ｂｒｉｊ、ｐＨ７．３に調整）中で１０倍に希釈し、方法の項で記載された通り、ファデバス（Ｐｈａｄｅｂａｓ）アッセイを使用してアミラーゼ活性を測定した。残効性は、４℃でインキュベートした試料中の活性に対する、４５℃でインキュベートした試料中の活性の比として計算した。
【表４】
2018019680.tif 000013
【配列表】
2018019680000001.app
【外国語明細書】
2018019680000001.pdf