(57)【要約】【課題】ウレアプラズマ属細菌を簡便に検出する技術を提供する。【解決手段】ウレアプラズマ属細菌をＬｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号１に記載の塩基配列又はその変異配列からなるプライマー、配列番号２に記載の塩基配列又はその変異配列からなるプライマー、配列番号３に記載の塩基配列又はその変異配列からなるプライマー、及び配列番号４に記載の塩基配列又はその変異配列からなるプライマー、を含み、ウレアプラズマ属細菌のウレアーゼβサブユニット遺伝子を増幅する、プライマーセット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウレアプラズマ属細菌をＬｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号２に記載の塩基配列、又は配列番号２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号３に記載の塩基配列、又は配列番号３に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、ウレアプラズマ属細菌のウレアーゼβサブユニット遺伝子を増幅する、プライマーセット。
【請求項２】
配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、又は
配列番号６に記載の塩基配列、又は配列番号６に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を更に含む、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー、又は
配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー、
を更に含む、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
【請求項５】
配列番号７に記載の塩基配列、又は配列番号７に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号８に記載の塩基配列、又は配列番号８に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号１０に記載の塩基配列、又は配列番号１０に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項６】
配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号１０に記載の塩基配列からなるプライマー、
を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項７】
配列番号１１に記載の塩基配列、又は配列番号１１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、又は
配列番号１２に記載の塩基配列、又は配列番号１２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を更に含む、請求項５又は６に記載のプライマーセット。
【請求項８】
配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマー、又は
配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマー、
を更に含む、請求項５又は６に記載のプライマーセット。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のプライマーセットを含む、ウレアプラズマ属細菌をＬＡＭＰ法で検出するためのキット。
【請求項１０】
ウレアプラズマ属細菌の検出方法であって、
生体試料に請求項１〜８のいずれか一項に記載のプライマーセットを混合してＬＡＭＰ法による等温増幅反応を行う工程を含み、
前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にウレアプラズマ属細菌が存在していたことを示す、検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウレアプラズマ属細菌検出用プライマーセット及びその使用に関する。より具体的には、ウレアプラズマ属細菌をＬｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するためのプライマーセット、ウレアプラズマ属細菌をＬＡＭＰ法で検出するためのキット及びウレアプラズマ属細菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウレアプラズマ属細菌は、炎症性サイトカインの産生を介して、妊娠中の母体の破水、流早産、新生児の慢性肺疾患、脳室内出血、壊死性腸炎等の原因となると考えられている（例えば、非特許文献１を参照。）。
【０００３】
ウレアプラズマ属細菌は、マクロライド系抗生物質には感受性であるが、例えばペニシリン系抗生物質には耐性である。抗生物質の使用は、抗生物質耐性菌の出現を誘導するため、むやみに抗生物質を投与することは避ける必要がある。このため、例えば切迫早産等に対処するためには、患者がウレアプラズマ属細菌に感染しているか否かを早期に判断し、正しい抗生物質を選択する必要がある。
【０００４】
ところで、ＬＡＭＰ法は、４〜６種類のプライマーを用いて、等温反応により標的遺伝子を増幅し、反応溶液の濁度によって標的遺伝子の存在を検出する遺伝子増幅法である（例えば、特許文献１を参照。）。等温反応であることから簡単な装置で実施することができ、また、肉眼で結果を判断することができることから、臨床検査で使用することも可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０００／０２８０８２号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Rose M. and Viscardi M. D., Ureaplasma species: Role in Diseases of Prematurity., Clin. Perinatol., 37 (2), 393-409, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来、ウレアプラズマ属細菌の検出は培養法、ＰＣＲ法等により行われてきた。しかしながら、培養法は操作が煩雑であり、判断に熟練を要し、迅速性に乏しい問題がある。また、ＰＣＲ法は、操作が煩雑であり、臨床検査で使用することが困難である。
【０００８】
このような背景のもと、本発明は、ウレアプラズマ属細菌を簡便に検出する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下の通りである。
［１］ウレアプラズマ属細菌をＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号２に記載の塩基配列、又は配列番号２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号３に記載の塩基配列、又は配列番号３に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を含み、ウレアプラズマ属細菌のウレアーゼβサブユニット遺伝子を増幅する、プライマーセット。
［２］配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、を含む、［１］に記載のプライマーセット。
［３］配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、又は配列番号６に記載の塩基配列、又は配列番号６に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を更に含む、［１］又は［２］に記載のプライマーセット。
［４］配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー、又は配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー、を更に含む、［１］又は［２］に記載のプライマーセット。
［５］配列番号７に記載の塩基配列、又は配列番号７に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号８に記載の塩基配列、又は配列番号８に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１０に記載の塩基配列、又は配列番号１０に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を更に含む、［１］〜［４］のいずれかに記載のプライマーセット。
［６］配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１０に記載の塩基配列からなるプライマー、を更に含む、［１］〜［４］のいずれかに記載のプライマーセット。
［７］配列番号１１に記載の塩基配列、又は配列番号１１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、又は配列番号１２に記載の塩基配列、又は配列番号１２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を更に含む、［５］又は［６］に記載のプライマーセット。
［８］配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマー、又は配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマー、を更に含む、［５］又は［６］に記載のプライマーセット。
［９］［１］〜［８］のいずれか一項に記載のプライマーセットを含む、ウレアプラズマ属細菌をＬＡＭＰ法で検出するためのキット。
［１０］ウレアプラズマ属細菌の検出方法であって、生体試料に［１］〜［８］のいずれかに記載のプライマーセットを混合してＬＡＭＰ法による等温増幅反応を行う工程を含み、前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にウレアプラズマ属細菌が存在していたことを示す、検出方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ウレアプラズマ属細菌を簡便に検出する技術を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
上述したように、ＬＡＭＰ法は、４〜６種類のプライマーを用いて、等温反応により標的遺伝子を増幅し、反応溶液の濁度によって標的遺伝子の存在を検出する遺伝子増幅法である。
【００１２】
ＬＡＭＰ法は、同じ遺伝子増幅技術であるＰＣＲに比べて増幅効率が高く、ＤＮＡを１５分〜１時間で１０９〜１０１０倍に増幅することができる。また、ＬＡＭＰ法は、最低４種類のプライマーを用いる核酸増幅法であるため、２種類のプライマーを用いるＰＣＲ法と比較して特異性が極めて高い。また、ＬＡＭＰ法は、等温（約６５℃）での遺伝子増幅が可能であることから、従来の機器と比べると小型で安価な反応装置で実施することができる。
【００１３】
ＬＡＭＰ法では、２本鎖の鋳型核酸の塩基配列に６つの領域を規定し、これらの領域の塩基配列に基づいてプライマーを設計する。より具体的には、鋳型核酸の一方の鎖の３’末端側から順にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという領域と、同一鎖の５’末端側から順にＢ３、Ｂ２、Ｂ１という領域をそれぞれ規定する。そして、これらの領域の塩基配列に基づいて、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３と呼ばれる４種類のプライマーを設計する。
【００１４】
ＦＩＰは、Ｆ２ｃ領域と相補的な塩基配列であるＦ２領域の塩基配列を３’末端側に持ち、５’末端側にＦ１ｃ領域の塩基配列と同じ塩基配列を持つように設計する。Ｆ３は、Ｆ３ｃ領域と相補的な塩基配列であるＦ３領域の塩基配列を持つように設計する。ＢＩＰは、Ｂ２領域の塩基配列を３’末端側に持ち、５’末端側にＢ１領域と相補的な塩基配列であるＢ１ｃ領域の塩基配列を持つように設計する。Ｂ３は、Ｂ３領域の塩基配列を持つように設計する。これらのプライマーは、設計支援ソフト（http://primerexplorer.jp/）等を利用して適宜設計することができる。
【００１５】
［プライマーセット］
１実施形態において、本発明は、ウレアプラズマ属細菌をＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号２に記載の塩基配列、又は配列番号２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号３に記載の塩基配列、又は配列番号３に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を含み、ウレアプラズマ属細菌のウレアーゼβサブユニット遺伝子を増幅する、プライマーセットを提供する。
【００１６】
実施例において後述するように、本実施形態のプライマーセットは、ウレアプラズマ属細菌をＬＡＭＰ法で検出するために好適に用いることができる。
【００１７】
ウレアプラズマ属細菌としては、ウレアプラズマ・パルバム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｐａｒｖｕｍ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）等が挙げられる。なかでも、ウレアプラズマ・パルバムは、感染者数がより多いため重要である。
【００１８】
本実施形態のプライマーセットの開発は困難であり、多数のプライマーセットを作製し、ウレアプラズマ属細菌の検出試験を積み重ねた結果得られたものである。ウレアプラズマ属細菌検出用プライマーの設計には、ＬＡＭＰ法用のプライマー設計支援ソフトを用いたが、実用に耐えるプライマーセットは容易には得られなかった。
【００１９】
更に、実施例において後述するように、本実施形態のプライマーセットによれば、従来のＰＣＲ法によるウレアプラズマ属細菌の検出感度と比較して、１００倍高い感度でウレアプラズマ属細菌を検出することができた。
【００２０】
また、本実施形態のプライマーセットを用いて、多数のウレアプラズマ属細菌の類縁菌種の検出を試みた結果、本実施形態のプライマーセットは交差反応を示さないことが確認された。
【００２１】
また、臨床検体を用いて、従来法である培養法と、本実施形態のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法により、ウレアプラズマ属細菌を検出した結果、両者の結果は完全に一致し、感度、特異度とも１００％であることが確認された。
【００２２】
したがって、本実施形態のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法により、ウレアプラズマ属細菌を実用的に迅速に検出することができる。
【００２３】
（ウレアプラズマ・パルバム検出用プライマーセット）
上述したように、ウレアプラズマ・パルバムは、感染者数がより多いため、検出対象としてより重要である。本実施形態のプライマーセットにおいて、配列番号１〜４に記載の塩基配列からなるプライマーは、ウレアプラズマ・パルバムのウレアーゼβサブユニット遺伝子を増幅することができる。ウレアプラズマ・パルバムのウレアーゼβサブユニット遺伝子の塩基配列を配列番号１３に示す。
【００２４】
ウレアプラズマ・パルバムには、ＳＶ３Ｆ４株、Ｂ７株、Ｓ５５株、ＯＭＣ−Ｐ１６２株等が存在する。実施例において後述するように、本実施形態のプライマーセットを用いることにより、これらの株の全てを検出することができる。
【００２５】
配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＦＩＰプライマーに対応する。また、配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＦ３プライマーに対応する。また、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＢＩＰプライマーに対応する。また、配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＢ３プライマーに対応する。
【００２６】
本実施形態のプライマーセットは、配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、を含んでいてもよい。
【００２７】
本実施形態のプライマーセットは、プライマーの塩基配列が多少変異を含んでいても、ＬＡＭＰ法によるウレアプラズマ属細菌の検出を行うことができる。したがって、本実施形態のプライマーセットは、配列番号１〜４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するプライマーを含んでいてもよい。
【００２８】
ここで、複数個とは、プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法によってウレアプラズマ・パルバムのウレアーゼβサブユニット遺伝子を増幅することができる限り特に限定されず、例えば２〜４個であってもよく、例えば２〜３個であってもよい。
【００２９】
ＬＡＭＰ法においては、上記のＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３の４種類のプライマーに加えて、ＬＦ、ＬＢと呼ばれるプライマー（ループプライマー）を用いることができる。ＬＦは、Ｆ１領域とＦ２領域の間の塩基配列に相補的な塩基配列を持つように設計する。ＬＢは、Ｂ１領域とＢ２領域の間の塩基配列に相補的な塩基配列を持つように設計する。これらのプライマーを追加で用いることにより、ＬＡＭＰ法による核酸増幅における核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる。ＬＦ、ＬＢも、上述した設計支援ソフト等を利用して設計することができる。
【００３０】
したがって、本実施形態のプライマーセットは、配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、又は配列番号６に記載の塩基配列、又は配列番号６に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を更に含むことが好ましい。
【００３１】
ここで、配列番号５及び６に記載の塩基配列からなるプライマーは、いずれもウレアプラズマ・パルバムのウレアーゼβサブユニット遺伝子を標的とするものである。配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＬＦプライマーに対応する。また、配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＬＢプライマーに対応する。
【００３２】
ＬＦプライマー及びＬＢプライマーは、いずれか一方を用いてもよいし、双方を用いてもよい。上述したＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３の４種類のプライマーに加えて、ＬＦプライマー又はＬＢプライマーのいずれか一方を用いることにより、ＬＡＭＰ法による反応時間を短縮し、検出感度を上昇させることができる。
【００３３】
また、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３の４種類のプライマーに加えて、ＬＦプライマー及びＬＢプライマーの双方を用いることにより、ＬＡＭＰ法による反応時間を更に短縮し、検出感度を更に上昇させることができる。
【００３４】
したがって、本実施形態のプライマーセットは、配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー、又は配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー、を更に含むことが好ましい。
【００３５】
ここで、上述したＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３プライマーと同様に、ＬＦプライマー及びＬＢプライマーの塩基配列が多少変異を含んでいても、ＬＡＭＰ法によるウレアプラズマ属細菌の検出を行うことができる。
【００３６】
したがって、ＬＦプライマー及びＬＢプライマーは、配列番号５、６に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有していてもよい。
【００３７】
ここで、複数個とは、プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法によってウレアプラズマ・パルバムのウレアーゼβサブユニット遺伝子を増幅することができる限り特に限定されず、例えば２〜４個であってもよく、例えば２〜３個であってもよい。
【００３８】
（ウレアプラズマ・ウレアリチカム検出用プライマーセット）
上述したように、ウレアプラズマ・パルバムは、感染者数がより多いため、検出対象としてより重要である。しかしながら、別のウレアプラズマ属細菌であるウレアプラズマ・ウレアリチカムに感染する患者も存在する。
【００３９】
このため、本実施形態のプライマーセットは、ウレアプラズマ・パルバム検出用プライマーセットに加えて、ウレアプラズマ・ウレアリチカム検出用プライマーセットを更に含んでいてもよい。
【００４０】
これにより、患者のウレアプラズマ・パルバムへの感染だけでなく、ウレアプラズマ・ウレアリチカムへの感染も検出することが可能となる。
【００４１】
したがって、本実施形態のプライマーセットは、配列番号７に記載の塩基配列、又は配列番号７に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号８に記載の塩基配列、又は配列番号８に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１０に記載の塩基配列、又は配列番号１０に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を更に含んでいてもよい。
【００４２】
ここで、配列番号７〜１０に記載の塩基配列からなるプライマーは、ウレアプラズマ・ウレアリチカムのウレアーゼβサブユニット遺伝子を増幅することができる。ウレアプラズマ・ウレアリチカムのウレアーゼβサブユニット遺伝子の塩基配列を配列番号１４に示す。
【００４３】
ウレアプラズマ・ウレアリチカムには、Ｆ２４株、Ｆ７株、Ｓ１８株、Ｓ５９株、Ｓ１００株等が存在する。実施例において後述するように、ウレアプラズマ・ウレアリチカム検出用プライマーセットを用いることにより、これらの株の全てを検出することができる。
【００４４】
配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＦＩＰプライマーに対応する。また、配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＦ３プライマーに対応する。また、配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＢＩＰプライマーに対応する。また、配列番号１０に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＢ３プライマーに対応する。
【００４５】
したがって、ウレアプラズマ・ウレアリチカム検出用プライマーセットは、配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１０に記載の塩基配列からなるプライマー、を含んでいてもよい。
【００４６】
ここで、ウレアプラズマ・ウレアリチカム検出用プライマーセットは、プライマーの塩基配列が多少変異を含んでいても、ＬＡＭＰ法によるウレアプラズマ・ウレアリチカムの検出を行うことができる。
【００４７】
したがって、ウレアプラズマ・ウレアリチカム検出用プライマーセットは、配列番号７〜１０に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するプライマーを含んでいてもよい。
【００４８】
ここで、複数個とは、プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法によってウレアプラズマ・ウレアリチカムのウレアーゼβサブユニット遺伝子を増幅することができる限り特に限定されず、例えば２〜４個であってもよく、例えば２〜３個であってもよい。
【００４９】
また、ウレアプラズマ・ウレアリチカム検出用プライマーセットは、上述したウレアプラズマ・パルバム検出用プライマーセットと同様に、ウレアプラズマ・ウレアリチカム検出用のＬＦプライマー又はＬＢプライマーを更に含むことが好ましい。
【００５０】
したがって、ウレアプラズマ・ウレアリチカム検出用プライマーセットは、配列番号１１に記載の塩基配列、又は配列番号１１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、又は配列番号１２に記載の塩基配列、又は配列番号１２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を更に含むことが好ましい。
【００５１】
ここで、配列番号１１及び１２に記載の塩基配列からなるプライマーは、いずれもウレアプラズマ・ウレアリチカムのウレアーゼβサブユニット遺伝子を標的とするものである。配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＬＦプライマーに対応する。また、配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＬＢプライマーに対応する。
【００５２】
したがって、ウレアプラズマ・ウレアリチカム検出用プライマーセットは、配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマー、又は配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマー、を更に含むことが好ましい。
【００５３】
また、上述したように、ＬＦプライマー及びＬＢプライマーの塩基配列が多少変異を含んでいても、ＬＡＭＰ法によるウレアプラズマ・ウレアリチカムの検出を行うことができる。
【００５４】
したがって、ＬＦプライマー及びＬＢプライマーは、配列番号１１、１２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有していてもよい。
【００５５】
ここで、複数個とは、プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法によってウレアプラズマ・ウレアリチカムのウレアーゼβサブユニット遺伝子を増幅することができる限り特に限定されず、例えば２〜４個であってもよく、例えば２〜３個であってもよい。
【００５６】
［キット］
１実施形態において、本発明は、上述したプライマーセットを含む、ウレアプラズマ属細菌をＬＡＭＰ法で検出するためのキットを提供する。本実施形態のキットを用いてＬＡＭＰ法を行うことにより、試料中に存在するウレアプラズマ属細菌を簡便に検出することができる。
【００５７】
上述したように、本実施形態のキットは、ウレアプラズマ・パルバム検出用プライマーセットに加えて、ウレアプラズマ・ウレアリチカム検出用プライマーセットを更に含んでいてもよい。これにより、試料中のウレアプラズマ・パルバムの存在だけでなく、ウレアプラズマ・ウレアリチカムの存在も検出することが可能となる。
【００５８】
本実施形態のキットが、ウレアプラズマ・パルバム検出用プライマーセット及びウレアプラズマ・ウレアリチカム検出用プライマーセットを含んでいる場合、ウレアプラズマ・パルバム検出用プライマーセットと、ウレアプラズマ・ウレアリチカム検出用プライマーセットは、それぞれ別々に含まれていてもよいし、ウレアプラズマ・パルバム検出用プライマーセットと、ウレアプラズマ・ウレアリチカム検出用プライマーセットが互いに混合されて含まれていてもよい。
【００５９】
ウレアプラズマ・パルバム検出用プライマーセットと、ウレアプラズマ・ウレアリチカム検出用プライマーセットが別々に含まれている場合、ウレアプラズマ・パルバム検出用の等温増幅反応と、ウレアプラズマ・ウレアリチカム検出用の等温増幅反応を別々に行い、ウレアプラズマ・パルバム又はウレアプラズマ・ウレアリチカムのいずれに感染しているかを迅速に確定することができる。
【００６０】
また、ウレアプラズマ・パルバム検出用プライマーセットと、ウレアプラズマ・ウレアリチカム検出用プライマーセットが混合されたキットを用いて等温増幅反応を行うことにより、試料中のウレアプラズマ・パルバム又はウレアプラズマ・ウレアリチカムのいずれかの存在を迅速に検出することができる。
【００６１】
本実施形態のキットは、上述したプライマーセットのほか、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、基質であるｄＮＴＰ、陰性コントロール、陽性コントロール、ＤＮＡ抽出試薬等を含んでいてもよい。
【００６２】
ＤＮＡポリメラーゼとしては鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとは、鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成していく過程で、伸長方向に２本鎖領域があった場合に、その鎖を解離しながら相補鎖合成を継続することができるＤＮＡポリメラーゼである。
【００６３】
ＤＮＡポリメラーゼとしては、通常ＬＡＭＰ法で用いられているものを使用することができ、例えば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメント、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６４】
［ウレアプラズマ属細菌の検出方法］
１実施形態において、本発明は、ウレアプラズマ属細菌の検出方法であって、生体試料に上述したプライマーセットを混合してＬＡＭＰ法による等温増幅反応を行う工程を含み、前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にウレアプラズマ属細菌が存在していたことを示す、検出方法を提供する。
【００６５】
上述したように、従来、ウレアプラズマ属細菌の検出は培養法、ＰＣＲ法等により行われてきた。しかしながら、培養法は操作が煩雑であり、判断に熟練を要し、迅速性に乏しい問題がある。また、ＰＣＲ法は、操作が煩雑であり、臨床検査で使用することが困難である。
【００６６】
これに対し、本実施形態の検出方法によれば、従来法である培養法と比較して、簡便かつ迅速にウレアプラズマ属細菌を検出することができる。また、ＰＣＲ法と比較して操作が簡便であるため、本実施形態の検出方法を臨床検査で実施することも可能になる。
【００６７】
この結果、患者がウレアプラズマ属細菌に感染しているか否かを早期に判断し、正しい抗生物質を投与することが容易になる。
【００６８】
生体試料としては、尿、膣分泌物、尿道分泌物等の泌尿器又は生殖器由来の試料、羊水、臍帯血、膿、これらの試料から抽出したＤＮＡ等が挙げられる。試料をそのままＬＡＭＰ法に適用することもできるが、試料から抽出したＤＮＡをＬＡＭＰ法に適用することが好ましい。
【００６９】
ＬＡＭＰ法による等温増幅反応は、生体試料に、上述したプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、基質であるｄＮＴＰ等を混合し、ＤＮＡ増幅温度でインキュベートすることにより実施することができる。ＤＮＡ増幅温度は、使用するＤＮＡポリメラーゼによって異なるが、約６０〜７０℃である。
【実施例】
【００７０】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７１】
［実験例１］
（ウレアプラズマ・パルバム検出用プライマーの検討）
まず、ウレアプラズマ・パルバム（ＳＶ３Ｆ４株）から、市販のキット（型式「Ｍａｘｗｅｌｌ  ＲＳＣ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  キット」、プロメガ社）を用いてＤＮＡを抽出した。
【００７２】
続いて、抽出したＤＮＡを鋳型として配列番号４１に記載のセンスプライマー及び配列番号４２に記載のアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲを行い、ウレアプラズマ・パルバムのウレアーゼβサブユニット遺伝子を含む領域を増幅し、プラスミドベクターにクローニングした。
【００７３】
続いて、遺伝子断片をクローニングしたプラスミドベクターを精製して濃度を測定し、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０、１コピー／μＬとなるように段階希釈した。
【００７４】
続いて、表１に記載のプライマーセット（名称：「ＵＰ１」〜「ＵＰ７」）を用いて、各濃度の鋳型ＤＮＡ各１μＬを、ＬＡＭＰ法によりそれぞれ増幅し、増幅の有無を確認した。増幅は６３℃で６０分間行った。増幅の有無は、目視及びリアルタイム濁度測定装置（型式「Ｌｏｏｐａｍｐ  ＥＸＩＡ（登録商標）」、栄研化学株式会社）を用いて吸光度を測定することにより判断した。
【００７５】
また、比較のために、各濃度の鋳型ＤＮＡ各１μＬを、配列番号１５に記載のセンスプライマー及び配列番号１６に記載のアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲにより増幅し、増幅の有無を確認した。増幅の有無は、増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色したものを目視で観察し、増幅バンドが確認されるか否かにより判断した。
【００７６】
【表１】
2018126089.tif 000002
【００７７】
表２に、増幅結果を示す。表２中、「＋」は増幅が認められたことを示し、「−」は増幅が認められなかったことを示す。また、「ＰＣＲ」は比較のために行ったＰＣＲ増幅の結果を示す。
【００７８】
【表２】
2018126089.tif 000003
【００７９】
その結果、プライマーセット「ＵＰ７」が最も高感度にウレアプラズマ・パルバムのウレアーゼβサブユニット遺伝子を増幅できることが明らかとなった。
【００８０】
プライマーセット「ＵＰ７」による検出感度は、ＰＣＲによる検出感度の１００倍であった。更に検討を行った結果、プライマーセット「ＵＰ７」を用いたＬＡＭＰ法により、５０コピーまでの鋳型ＤＮＡを増幅できることが明らかとなった。
【００８１】
この結果は、プライマーセット「ＵＰ７」を用いたＬＡＭＰ法により、生体試料中に存在するウレアプラズマ・パルバムを、臨床検査において実用的に検出することができることを示す。
【００８２】
［実験例２］
（ウレアプラズマ・ウレアリチカム検出用プライマーの検討）
まず、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｆ２４株）から、市販のキット（型式「Ｍａｘｗｅｌｌ  ＲＳＣ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  キット」、プロメガ社）を用いてＤＮＡを抽出した。
【００８３】
続いて、抽出したＤＮＡを鋳型として配列番号４３に記載のセンスプライマー及び配列番号４４に記載のアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲを行い、ウレアプラズマ・ウレアリチカムのウレアーゼβサブユニット遺伝子を含む領域を増幅、プラスミドベクターにクローニングした。
【００８４】
続いて、遺伝子断片をクローニングしたプラスミドベクターを精製して濃度を測定し、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０、１コピー／μＬとなるように段階希釈した。
【００８５】
続いて、表３に記載のプライマーセット（名称：「ＵＵ１」〜「ＵＵ４」）を用いて、各濃度の鋳型ＤＮＡ各１μＬを、ＬＡＭＰ法によりそれぞれ増幅し、増幅の有無を確認した。増幅は６３℃で６０分間行った。増幅の有無は、目視及びリアルタイム濁度測定装置（型式「Ｌｏｏｐａｍｐ  ＥＸＩＡ（登録商標）」、栄研化学株式会社）を用いて吸光度を測定することにより判断した。
【００８６】
また、比較のために、各濃度の鋳型ＤＮＡ各１μＬを、配列番号３５に記載のセンスプライマー及び配列番号３６に記載のアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲにより増幅し、増幅の有無を確認した。増幅の有無は、増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色したものを目視で観察し、増幅バンドが確認されるか否かにより判断した。
【００８７】
【表３】
2018126089.tif 000004
【００８８】
表４に、増幅結果を示す。表２中、「＋」は増幅が認められたことを示し、「−」は増幅が認められなかったことを示す。また、「ＰＣＲ」は比較のために行ったＰＣＲ増幅の結果を示す。
【００８９】
【表４】
2018126089.tif 000005
【００９０】
その結果、プライマーセット「ＵＵ４」が最も高感度にウレアプラズマ・パルバムのウレアーゼβサブユニット遺伝子を増幅できることが明らかとなった。
【００９１】
プライマーセット「ＵＵ４」による検出感度は、ＰＣＲによる検出感度の１００倍であった。更に検討を行った結果、プライマーセット「ＵＵ４」を用いたＬＡＭＰ法により、５０コピーまでの鋳型ＤＮＡを増幅できることが明らかとなった。
【００９２】
この結果は、プライマーセット「ＵＵ４」を用いたＬＡＭＰ法により、生体試料中に存在するウレアプラズマ・ウレアリチカムを、臨床検査において実用的に検出することができることを示す。
【００９３】
［実験例３］
（ウレアプラズマ属細菌検出用プライマーの交差反応の検討）
実験例１及び２で見出したウレアプラズマ属細菌検出用プライマーの交差反応について検討した。具体的には、実験例１で見出したプライマーセット「ＵＰ７」及び実験例２で見出したプライマーセット「ＵＵ４」を用いたＬＡＭＰ法により、ウレアプラズマ属細菌の類縁菌種のＤＮＡが増幅されるか否かを検討した。
【００９４】
下記表５に、使用したウレアプラズマ属細菌の類縁菌種を示す。まず、表５に記載した各菌体から、市販のキット（型式「ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ」、キアゲン社）を用いてＤＮＡを抽出した。
【００９５】
続いて、抽出したＤＮＡ各１０６コピー／μＬの１μＬを、上述したプライマーセット「ＵＰ７」又はプライマーセット「ＵＵ４」を用いてＬＡＭＰ法によりそれぞれ増幅し、増幅の有無を確認した。増幅は６３℃で６０分間行った。増幅の有無は、目視及びリアルタイム濁度測定装置（型式「Ｌｏｏｐａｍｐ  ＥＸＩＡ（登録商標）」、栄研化学株式会社）を用いて吸光度を測定することにより判断した。
【００９６】
【表５】
2018126089.tif 000006
【００９７】
その結果、プライマーセット「ＵＰ７」もプライマーセット「ＵＵ４」も、表５に示すウレアプラズマ属細菌の類縁菌種の遺伝子を増幅せず、交差反応しないことが明らかとなった。この結果から、これらのプライマーセットにより、特異的にウレアプラズマ属細菌を検出できることが確認された。
【００９８】
この結果は、プライマーセット「ＵＰ７」及び「ＵＵ４」を用いたＬＡＭＰ法により、生体試料中に存在するウレアプラズマ属細菌を、臨床検査において実用的に検出することができることを更に支持するものである。
【００９９】
［実験例４］
（検出可能なウレアプラズマ・パルバム株の検討）
ウレアプラズマ・パルバムには、ＳＶ３Ｆ４株、Ｂ７株、Ｓ５５株、ＯＭＣ−Ｐ１６２株等が存在する。そこで、実験例１で見出したプライマーセット「ＵＰ７」を用いたＬＡＭＰ法により、これらの株を検出することができるか否かを検討した。
【０１００】
まず、ＳＶ３Ｆ４株、Ｂ７株、Ｓ５５株、ＯＭＣ−Ｐ１６２株から、市販のキット（型式「Ｍａｘｗｅｌｌ  ＲＳＣ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  キット」、プロメガ社）を用いてＤＮＡを抽出した。
【０１０１】
続いて、抽出したＤＮＡ各１０６コピー／μＬの１μＬを、上述したプライマーセット「ＵＰ７」を用いてＬＡＭＰ法によりそれぞれ増幅し、増幅の有無を確認した。増幅は６３℃で６０分間行った。増幅の有無は、目視及びリアルタイム濁度測定装置（型式「Ｌｏｏｐａｍｐ  ＥＸＩＡ（登録商標）」、栄研化学株式会社）を用いて吸光度を測定することにより判断した。
【０１０２】
その結果、プライマーセット「ＵＰ７」を用いることにより、これらの株の全てを検出することができることが明らかとなった。この結果は、プライマーセット「ＵＰ７」を用いたＬＡＭＰ法により、生体試料中に存在するウレアプラズマ・パルバムを、臨床検査において実用的に検出することができることを更に支持するものである。
【０１０３】
［実験例５］
（検出可能なウレアプラズマ・ウレアリチカム株の検討）
ウレアプラズマ・ウレアリチカムには、Ｆ２４株、Ｆ７株、Ｓ１８株、Ｓ５９株、Ｓ１００株等が存在する。そこで、実験例２で見出したプライマーセット「ＵＵ４」を用いたＬＡＭＰ法により、これらの株を検出することができるか否かを検討した。
【０１０４】
まず、Ｆ２４株、Ｆ７株、Ｓ１８株、Ｓ５９株、Ｓ１００株から、市販のキット（型式「Ｍａｘｗｅｌｌ  ＲＳＣ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  キット」、プロメガ社）を用いてＤＮＡを抽出した。
【０１０５】
続いて、抽出したＤＮＡ各１０６コピー／μＬの１μＬを、上述したプライマーセット「ＵＵ４」を用いてＬＡＭＰ法によりそれぞれ増幅し、増幅の有無を確認した。増幅は６３℃で６０分間行った。増幅の有無は、目視及びリアルタイム濁度測定装置（型式「Ｌｏｏｐａｍｐ  ＥＸＩＡ（登録商標）」、栄研化学株式会社）を用いて吸光度を測定することにより判断した。
【０１０６】
その結果、プライマーセット「ＵＵ４」を用いることにより、これらの株の全てを検出することができることが明らかとなった。この結果は、プライマーセット「ＵＵ４」を用いたＬＡＭＰ法により、生体試料中に存在するウレアプラズマ・ウレアリチカムを、臨床検査において実用的に検出することができることを更に支持するものである。
【０１０７】
［実験例６］
（臨床検体を用いたウレアプラズマ属細菌の検出）
４６名の妊婦の膣から綿棒で採取した標本を使用して、従来法である培養法、従来法であるＰＣＲ法及びプライマーセット「ＵＰ７」及び「ＵＵ４」を用いたＬＡＭＰ法により、ウレアプラズマ属細菌を検出し、結果を比較した。
【０１０８】
まず、採取した各検体を、それぞれ検体輸送用チューブ（型式「ＢＤユニバーサルバイラルトランスポートスタンダードセット」、ＢＤ社）２本ずつに保存した。このうち各１本を外注業者に委託し、ウレアプラズマ属細菌の存在を培養法により検討した。
【０１０９】
《培養法による検出》
培養法によるウレアプラズマ属細菌の検出は次のようにして行った。まず、選択培地であるウレアプラズマ寒天培地（アップル科学有限会社）に検体を接種し、３５±１℃、ＣＯ２濃度５±１％の条件下で４日間培養した。培地に含まれる基質をウレアプラズマ属細菌が利用すると、ｐＨの上昇により指示薬であるフェノールレッドが変色する。この指示薬の変色及びコロニー形態の観察によりウレアプラズマ属細菌の存在の有無を判定した。
【０１１０】
《ＰＣＲ法による検出》
もう１本の検体輸送用チューブ内の液体培地１ｍＬを、１．５ｍＬチューブに移し、２０，０００×ｇで２０分間遠心した。続いて、上清９５０μＬを捨て、残りの５０μＬから、Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）ＳＲ  ＤＮＡ抽出キット（栄研化学株式会社）を用いてＤＮＡを抽出した。
【０１１１】
検体から抽出したＤＮＡをＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、増幅の有無を確認した。配列番号１５に記載のセンスプライマー及び配列番号１６に記載のアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲによりウレアプラズマ・パルバムの存在を検出した。また、配列番号３５に記載のセンスプライマー及び配列番号３６に記載のアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲによりウレアプラズマ・ウレアリチカムの存在を検出した。
【０１１２】
表６に、各検体におけるウレアプラズマ属細菌の検出結果を示す。培養法による検出結果及びＰＣＲ法による検出結果を示す。その結果、ＰＣＲ法による判定結果は、培養法による判定結果と比較すると、感度が６６．７％であり、特異度は１００％であることが明らかとなった。
【０１１３】
【表６】
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【０１１４】
《ＬＡＭＰ法による検出》
検体から抽出したＤＮＡを、プライマーセット「ＵＰ７」及び「ＵＵ４」を用いたＬＡＭＰ法によりそれぞれ増幅し、増幅の有無を確認した。プライマーセット「ＵＰ７」によりウレアプラズマ・パルバムの存在を検出し、プライマーセット「ＵＵ４」によりウレアプラズマ・ウレアリチカムの存在を検出した。
【０１１５】
増幅は６３℃で６０分間行った。増幅の有無は、リアルタイム濁度測定装置（型式「Ｌｏｏｐａｍｐ  ＥＸＩＡ（登録商標）」、栄研化学株式会社）を用いて吸光度を測定することにより判断した。
【０１１６】
表７に、各検体におけるウレアプラズマ属細菌の検出結果を示す。培養法による検出結果及びＬＡＭＰ法による検出結果を示す。その結果、ＬＡＭＰ法による判定結果と培養法による判定結果は完全に一致し、感度、特異度共に１００％であることが明らかとなった。
【０１１７】
【表７】
2018126089.tif 000008
【０１１８】
この結果は、プライマーセット「ＵＰ７」及び「ＵＵ４」を用いたＬＡＭＰ法により、生体試料中に存在するウレアプラズマ属細菌を、臨床検査において実用的に検出することができることを更に支持するものである。また、ＬＡＭＰ法により、ＰＣＲ法よりも高感度にウレアプラズマ属細菌を検出できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明によれば、ウレアプラズマ属細菌を簡便に検出する技術を提供することができる。
【配列表】
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