(57)【要約】【課題】アフェレーシス血液から血小板を除去する。【解決手段】血小板を含まないように単核球を調製する。本発明は、（１）アフェレーシス血液に、細胞非障害性であり、かつ非イオン性である密度調節剤を混合し、血漿の密度を１．０６６ｇ／ｍｌ以上１．０７８ｇ／ｍｌ以下 に調整し；そして（２）下記ａ層およびｂ層を含む重層物を遠心して、単核球を分離する工程を含む、単核球の調製方法を提供する：ａ．単核球分離用密度勾配遠心媒体の層、ｂ．ａ層の下の、密度調整したアフェレーシス血液の層。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）アフェレーシス血液に、細胞非障害性であり、かつ非イオン性である密度調節剤を混合し、血漿の密度を１．０６６〜１．０７８ｇ／ｍｌに調整し；そして
（２）下記ａ層およびｂ層を含む重層物を遠心して、単核球を分離する
工程を含む、単核球の調製方法：
ａ．単核球分離用密度勾配遠心媒体の層、
ｂ．ａ層の下の、密度調整したアフェレーシス血液の層。
【請求項２】
重層物が、さらに下記のｃ層を含む、請求項１に記載の調製方法：
ｃ．ａ層の上の、等張液の層。
【請求項３】
密度調節剤が、ヨウ化造影剤である、請求項１または２に記載の調製方法。
【請求項４】
ヨウ化造影剤が、イオジキサノールである、請求項３に記載の調製方法。
【請求項５】
ｂ層が、血漿の密度を１．０６９〜１．０７８ｇ／ｍｌに調整したアフェレーシス血液の層である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項６】
ｂ層が、血漿の密度を１．０７３〜１．０７８ｇ／ｍｌに調整したアフェレーシス血液の層である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項７】
ｂ層が、アフェレーシス血液１００容量部に対して、２０〜２２容量部の６０ｗ／ｖ％イオジキサノール水溶液を混合して密度を調整したものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項８】
単核球分離用密度勾配媒体が、ポリスクロース４００およびジアトリゾ酸ナトリウムを含み、密度が１．０７２〜１．０８５ｇ／ｍｌである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項により定義される工程を含み、さらに
（３）調製された単核球から有用細胞を得る
工程を含む、有用細胞の調製方法。
【請求項１０】
有用細胞が、樹状細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、活性化Ｔ細胞、およびＣＡＲ−Ｔ細胞からなる群より選択されるいずれかである、請求項９に記載の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフェレーシス血液から単核球を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞は、抗原提示細胞として、獲得免疫および自然免疫の両方を含む免疫系を刺激または抑制することができる。そこで、がん、感染症、自己免疫疾患、アレルギー疾患等に関連する特定の抗原を提示させるように予め体外で処理された樹状細胞を患者に移植することによって、患者の免疫系を制御する、樹状細胞移植療法が試みられている。療法に用いる樹状細胞は、体内から直接分離することができない。そのため、樹状細胞は、患者より採取した血液から単球または単球を含む単核球を分離して培養し、樹状細胞に分化させることで得る（特許文献１等）。
【０００３】
血液からの単球または単球を含む単核球の分離方法がいくつか検討されている。例えば、特許文献２は、遠心分離管内に、比重が１．０６４〜１．０７９ｇ／ｍｌに調整された高比重液層と、当該高比重液層を封入するよう積層され、２価カチオンによって水不溶性とされたハイドロゲルを主成分とする不溶性ハイドロゲル層とを収納してなることを特徴とする単核球分離管を提案する。また特許文献３は、遠心分離管内に、２価カチオンによって水不溶性とされたハイドロゲルを主成分とし、かつ比重が１．０６４〜１．０７９ｇ／ｍｌに調整された単核球分離用媒体が収納されてなることを特徴とする単核球分離管を提案する。
【０００４】
さらに特許文献４は、フィルターの表面積１ｍｍ2当たりの有核細胞総数として１０００〜１００００個の単核球浮遊液を、単球を捕捉し、リンパ球を通過するフィルターを充填してなる装置に流し、その後該フィルター装置に回収液を導入し、単球を回収することを特徴とする単球の分離回収方法を提案する。さらに特許文献５は、単核球を含む複数成分からなる試料溶液を、遠心分離媒体を用いて遠心分離処理することで、前記複数成分を比重の違いにより分離させ、低比重成分である単核球を採取するための単核球分離管であって、上側に配置されて前記試料溶液が導入される導入開口および下側に配置された下側開口を有し、遠心分離処理前には前記試料溶液が収納されると共に遠心分離処理後には前記低比重成分である単核球が位置する上チャンバと、上側に上側開口が配置され下側が閉塞し、遠心分離処理前には前記遠心分離媒体が収納されると共に遠心分離処理後には不要成分である高比重成分が位置する下チャンバと、前記上チャンバの下側開口と前記下チャンバの上側開口とを連通状態または非連通状態に切り換える活栓と、前記上チャンバの前記導入開口を密栓する蓋と、を備えることを特徴とする単核球分離管を提案する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１６−９４４５８号公報
【特許文献２】特開平５−３４３３８号公報
【特許文献３】特開平５−３４３３９号公報
【特許文献４】特開２００４−１２９５５０号公報
【特許文献５】特開２０１２−３４７２５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】M. Kobayashi et al., Dendritic Cell-Based Immunotherapy Targeting Synthesized Peptides for Advanced Biliary Tract Cancer, J Gastrointest Surg. 2013 Sep;17(9):1609-17
【非特許文献２】H. Takahashi et al., Impact of dendritic cell vaccines pulsed with Wilms' tumour-1 peptide antigen on the survival of patients with advancednon-small cell lung cancers, European Journal of Cancer (2013) 49, 852-859
【非特許文献３】M. Kobayashi et al., Prognostic factors related to add-on dendritic cell vaccines on patients with inoperable pancreatic cancer receivingchemotherapy: a multicenter analysis, Cancer Immunol Immunother. 2014 Aug;63(8):797-806
【非特許文献４】S. Mayanagi et al., Phase I pilot study of Wilms tumor gene 1 peptide-pulsed dendritic cell vaccination combined with gemcitabine in pancreatic cancer, Cancer Sci. 2015 Apr; 106(4): 397-406
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
移植療法用の樹状細胞の製造に際し、成分採血装置を使用して得られた血液（アフェレーシス血液）から分離して得た単球を培養に供する方法がある（非特許文献１〜４）。アフェレーシス血液には単球以外の血球成分が含まれているので、アフェレーシス血液からは、密度勾配遠心分離により単核球（リンパ球、単球）が採取される。そして採取された単核球をプレートに入れ、単球をプレートに付着させることにより分離するが、このとき単核球に混入している血小板が単球のプレートへの付着を妨げるため、通常、単核球は、遠心洗浄を繰り返して血小板を除去した後に、プレートに供されている。洗浄工程では血小板の除去とともに単球の損失が生じ、最終目的とする樹状細胞の数が減ってしまうという問題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、樹状細胞等の治療用の細胞を高品質で安定的に調製する方法について検討してきた。そして、上記の問題を、血小板を含まない単核球を調製することにより解決することを鋭意検討した。その結果、アフェレーシス血液を密度勾配遠心法で分離する際に、当該アフェレーシス血液の密度を適切に調整ことにより目的が達成できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
本発明は、以下を提供する。
（１）アフェレーシス血液に、細胞非障害性であり、かつ非イオン性である密度調節剤を混合し、血漿の密度を１．０６６〜１．０７８ｇ／ｍｌに調整し；そして
（２）下記ａ層およびｂ層を含む重層物を遠心して、単核球を分離する
工程を含む、単核球の調製方法：
ａ．単核球分離用密度勾配遠心媒体の層
ｂ．ａ層の下の、密度調整したアフェレーシス血液の層。
［２］重層物が、さらに下記のｃ層を含む、１に記載の調製方法：
ｃ．ａ層の上の、等張液の層。
［３］密度調節剤が、ヨウ化造影剤である、１または２に記載の調製方法。
［４］ヨウ化造影剤が、イオジキサノールである、３に記載の調製方法。
［５］ｂ層が、血漿の密度を１．０６９〜１．０７８ｇ／ｍｌに調整したアフェレーシス血液の層である、１〜３のいずれか１項に記載の調製方法。
［６］ｂ層が、血漿の密度を１．０７３〜１．０７８ｇ／ｍｌに調整したアフェレーシス血液の層である、１〜３のいずれか１項に記載の調製方法。
［７］ｂ層が、アフェレーシス血液１００容量部に対して、２０〜２２容量部の６０％イオジキサノール水溶液を混合して密度を調整したものである、１〜３のいずれか１項に記載の調製方法。
［８］単核球分離用密度勾配媒体が、ポリスクロース４００およびジアトリゾ酸ナトリウムを含み、密度が１．０７２〜１．０８５ｇ／ｍｌである、１〜７のいずれか１項に記載の調製方法。
［９］請求項１〜８のいずれか１項により定義される工程を含み、さらに
（３）調製された単核球から有用細胞を得る
工程を含む、有用細胞の調製方法。
［１０］有用細胞が、樹状細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、活性化Ｔ細胞、およびＣＡＲ−Ｔ細胞からなる群より選択されるいずれかである、９に記載の調製方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、アフェレーシス血液から高い回収率で、十分に血小板の除去された単核球を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】単核球のフローサイトメトリーによる解析結果。
【図２】(1)はOptiPrep 20ml方、(2)は陽性対照の顕微鏡写真である。上段は倍率4倍、下段は倍率20倍。
【図３】血小板の除去効率
【図４】単核球のフローサイトメトリーによる解析結果
【図５】単核球のフローサイトメトリーによる解析結果
【図６】単核球のフローサイトメトリーによる解析結果
【図７】14日間の細胞数推移
【発明を実施するための形態】
【００１２】
数値範囲「Ｘ〜Ｙ」は、特に記載した場合を除き、両端の数値ＸおよびＹを含む。「Ａおよび／またはＢ」は、特に記載した場合を除き、ＡおよびＢのうちのすくなくとも一方の意である。
【００１３】
密度の単位は、特に記載した場合を除き、ｇ／ｍｌであり、２０℃における値である。液体に関する密度は比重と同じ意味である。％および部は、容量（体積）に基づく場合と、質量に基づく場合と、双方に基づく場合がある。調製方法は製造方法と言い換えることができる。
【００１４】
本発明は、以下の工程（１）および（２）を含む、単核球の調製方法に関する。
（１）アフェレーシス血液の血漿の密度を１．７８ｇ／ｍｌ以下に調整し；そして
（２）下記ａ層およびｂ層を含む重層物を遠心して、単核球を分離する
ａ．単核球分離用密度勾配媒体の層
ｂ．ａ層の下の、密度調整したアフェレーシス血液の層
【００１５】
［工程（１）：密度調整工程］
工程（１）は、アフェレーシス血液の密度を調製する工程である。アフェレーシスとは、一般に、体外循環によって血液中から血漿成分、細胞成分を分離することをいう。アフェレーシス血液とは、体外循環により採血された血液をいい、通常、体外循環中に連続的に抗凝固処理がされており、抗凝固成分を含む。抗凝固成分の例は、EDTA(ethylene-diamine-tetraacetic acid）、ヘパリン(Heparin）、クエン酸ナトリウム（Sodium citrate）、フッ化ナトリウム（Sodium fluoride）、およびACD（acid citrate dextrose solution）である。好ましい態様においては、アフェレーシス血液は、ＡＣＤ−Ａ液を含む。ＡＣＤ−Ａ液は、有効成分として、クエン酸ナトリウム水和物２．２０ｗ／ｖ％、クエン酸水和物０．８０ｗ／ｖ％、ブドウ糖２．２０ｗ／ｖ％を含む。アフェレーシスの際、ＡＣＤ−Ａ液は、通常、血液量１００ｍｌにつき、１５ｍｌの割合で使用される。特に好ましい態様においては、アフェレーシス血液は、この割合でＡＣＤ−Ａ液を含む。
【００１６】
本発明においては、アフェレーシス血液の血漿（採血された血液中の液体成分）の密度が、細胞非障害性であり、かつ非イオン性である密度調節剤により調整される。非イオン性であり、細胞膜を透過するので、アフェレーシス血液に混合することにより、血漿のみならず、血球成分の密度も調整されうる。細胞非障害性、すなわち血液細胞に対して毒性がなく、かつ非イオン性であり、血液または血漿の密度を調節することができる剤としては、数種類のものが当業者にはよく知られており、市販もされている。
【００１７】
細胞非障害性であり、かつ非イオン性である密度調節剤の好ましい例は、ヨウ化造影剤である。ヨウ化造影剤には、イオヘキサノール、 イオジキサノール 、イオベルソール、イオパミドール、イオトロラン、メトリザミド、イオデシモール、イオグルコール、イオグルカミド、イオグルニド、イオグラミド、イオメプロール、イオペントール、イオプロミド、イオザルコール、イオシミド、イオツサール、イオキシラン、イオフロタール、イオデコール、およびそれらの誘導体が含まれる。
【００１８】
好ましい態様においては、アフェレーシス血液の血漿の密度は、イオジキサノールを用いて調整することができる。イオジキサノール（IUPAC名は、5-[N-[3-(N-[3,5-bis[(2,3-dihydroxypropyl)carbamoyl]-2,4,6-triiodophenyl]acetamido)-2-hydroxypropyl]acetamido]-1-N,3-N-bis(2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-triiodobenzene-1,3-dicarboxamide）は、適切な濃度の水溶液として、例えば４０〜８０ｗ／ｖ％の水溶液として、アフェレーシス血液と混合することができる。イオジキサノールは滅菌済の水溶液として市販されている。例えば、滅菌済の６０ｗ／ｖ％イオジキサノール水溶液であるOptiPrep（登録商標）（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ社）は、本発明にも好適に利用することができる。イオジキサノールの溶液には、他に、浸透圧調整等の目的で、エデト酸カルシウムナトリウム水和物、トロメタモール、塩化ナトリウム、塩化カルシウムが含まれていてもよく、またpH調節剤が含まれていてもよい。なお明細書では、細胞非障害性の非イオン性密度調節剤としてイオジキサノールを用いた態様を例に本発明を説明することがあるが、当業者であればその説明を適宜、他の細胞非障害性の非イオン性密度調節剤を用いた場合に当てはめて、容易に理解することができる。血漿の密度を調製したアフェレーシス血液は、本発明ではｂ層と称される。
【００１９】
密度は、アフェレーシス血液の血漿の密度が適切になるように調整される。一般に、タンパク質濃度、ヘマトクリット値、ヘモグロビン含量等によっても異なるが、通常、末梢血の全血の比重は男性では１．０５７（１．０５５〜１．０６）、女性では１．０５３（１．０５０〜１．０５６）であり、末梢血の血漿の比重は、１．０２７（１．０２５〜１．０２９）程である。血漿中のアフェレーシス血液の密度は、この通常の血漿の密度の値１．０２７ｇ／ｍｌと、ＡＣＤ−Ａ液の密度の値１．００８ｇ／ｍｌに基づき、計算により簡易に求めることができる。ＡＣＤ−Ａ液を標準的な使用量で用いた場合、すなわち血液量１００ｍｌにつき、ＡＣＤ−Ａ液を１５ｍｌの割合で使用した場合の標準的なアフェレーシス血液の血漿の密度は、１．０２５ｇ／ｍｌ程と計算される。
【００２０】
ｂ層においては、アフェレーシス血液に非イオン性密度調節剤が混合されているので、血漿の密度は、標準的なアフェレーシス血液より高くなるように調整され、かつ後述するａ層の下に重層することができる密度、すなわちａ層より高い密度に調整される。このような密度は、具体的には、１．０６６ｇ／ｍｌ以上である。先行技術の方法においては、末梢血から単核球を分離するためには、血漿の密度を１．０６３〜１．０６６ｇ／ｍｌに調整すべき旨を開示しているものがあるが、本発明者らの検討によると、この密度範囲を、アフェレーシス血液に適用したとしても、単核球の分離を行うことはできない。具体的には、血漿の密度が上記の範囲となるようにイオジキサノール溶液を計算して添加し、調整した場合、ａ層を上に、ｂ層を下に積層することができない。これは、アフェレーシス血液の比重が末梢血とは異なっていることに起因すると考えられる。また、イオジキサノール溶液は多く混合すればよいわけではない。多すぎると、血漿の密度が赤血球の密度よりも大きくなり、遠心した際には血漿が最下層となる。その上、イオジキサノールは血球にも浸透するため、単核球の密度も上昇し、単核球を含む層は遠心してもａ層の上に形成されることはなく、採取することができない。
【００２１】
したがって、ｂ層は、血漿の密度が１．０７８ｇ／ｍｌ以下となるように調整とするとよい。好ましい態様においては、ｂ層は、血漿の密度が１．６９〜１．７８ｇ／ｍｌとなるように調整される。より好ましくは、ｂ層が、血漿の密度を１．７３〜１．７８ｇ／ｍｌに調整される。
【００２２】
特に好ましい態様においては、ｂ層は、アフェレーシス血液１００容量部に対して、２０〜２２容量部の６０％イオジキサノール水溶液を混合することにより、密度が調整される。
【００２３】
本発明においては、ａ層として、単核球分離用密度勾配媒体を用いる。血液から密度勾配遠心により単核球を分離するための媒体としては、種々のものが市販されており、当業者にはよく知られている。本発明にもそれらのいずれかを用いることができる。好ましい態様において、単核球分離用密度勾配媒体は、ポリスクロース４００およびジアトリゾ酸ナトリウムを含み、密度が１．０７２〜１．０８５ｇ／ｍｌである。このような単核球分離用密度勾配媒体として、Ficoll PM400、Ficoll-Paque PLUS、Percoll PLUS、Percoll、Ficoll-Paque PREMIUM等が市販されている（いずれもＧＥヘルスケア社）。
【００２４】
ｂ層に対するａ層の量は、後述の遠心操作を行うことができ、かつ遠心後の目的の単核球を含む層の回収を適切に行うことができる限り特に限定されない。ａ層として、市販のものを用いる場合は、付随する指示書にしたがって、末梢血単核球（Peripheral Blood Mononuclear Cells;PBMCs）を得る際の条件に拠ってもよい。例えば、ｂ層１用量部に対し、ａ層を０．５０〜２．０容量部用いることができ、０．６６〜１．５容量部用いることが好ましく、０．６６〜１．３容量部用いることがより好ましい。
【００２５】
本発明においては、ａ層の上に、等張液の層（ｃ層）を重層することができる。ｃ層の重層により、遠心後に目的の層を回収することが容易となる。等張液としては、生理食得水、リンゲル液（乳酸リンゲル液、 酢酸リンゲル液 、重炭酸リンゲル液等）、５％グルコース水溶液のほか、緩衝効果のある、リン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline；ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（Tris Buffered Saline；ＴＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（HEPES Buffered Saline）、動物細胞培養用基礎培地（ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９等）等を用いることができる。
【００２６】
ｃ層の量は、遠心操作を行うことができ、かつ遠心後の目的の層の回収を適切に行うことができる限り特に限定されない。例えば、ｂ層１用量部に対し、ｃ層を０．０１〜１０容量部用いることができ、０．０５〜２容量部用いることが好ましく、０．１〜１容量部用いることがより好ましい。
【００２７】
ａ層、ｂ層、および必要に応じｃ層は、下から、上から順に、ｃ層（もしあれば）、ａ層、ｂ層の順で重層された状態で次に説明する遠心分離工程に供されるが、その状態で重層した状態とすることができる限り、重層する順は限定されない。典型的には、遠心のためのチューブにまずａ層が充填され、次にａ層の下にピペット等を用いてｂ層が充填され、必要に応じ、最上層として、すなわちａ層の上にｃ層が重層される。
【００２８】
［工程（２）：遠心分離工程］
工程（２）は、少なくともａ層およびｂ層を含む重層物を遠心して、単核球を分離する工程である。工程（２）において、少なくともａ層およびｂ層を含む重層物は、１５〜３０℃で、４００〜２０００ｇの遠心加速度で、１０〜４０分間程度遠心操作を行う。この遠心操作により、ｂ層は単核球を含む層（ＰＢＭＣ層ということもある。）とその他の層に分離され、前者はａ層の上に、後者はａ層の下に形成される。
【００２９】
遠心分離の後、ピペット１２等を用いて、別の管に単核球を含む層を採取し、その層から単核球を回収することができる。回収された単核球は、必要に応じ、適切な等張液を用いて洗浄してもよく、また等張液を用いて適切な細胞密度に希釈した細胞懸濁液としてもよい。ここで用いることができる等張液の例は、ｃ層に関して挙げたものと同じである。単核球の回収量、回収率は、当業者には周知の手法によって求めることができる。
【００３０】
本発明の工程（１）および工程（２）の操作は、手作業で行うこともできる一方で、再生医療等製品の製造工程で用いられる、プロセッシング装置にも適用可能である。このようなプロセッシング装置の例として、フレゼニウスカービジャパン社製の、血液成分分離装置COM.TEC.を挙げることができる。
【００３１】
なお、本発明は、アフェレーシス血液からの単核球の調製方法に関するが、アフェレーシス血液と同様に血漿の密度を調整できる限り、末梢血、臍帯血、骨髄またはリンパ節から採取される血球細胞を含む液への適用が期待できる。
【００３２】
［本発明の利点、得られた単核球および単球の特徴］
本発明により、アフェレーシス血液から、従来法と比較して同等以上の回収率で、単核球が回収できる。その上、得られた単核球には、血小板の混入が少ないという特徴がある。血小板の混入が少ないことは、例えばフローサイトメーターにより、有核細胞率、顆粒球混入率等を計測することにより、評価することができる。有核細胞率は、（対象となる細胞集団中の有核細胞数）／（対象となる細胞集団中の全細胞数）×１００で表され、高いほど血小板または赤血球の混入が少ないことを表す。顆粒球混入率は、（対象となる細胞集団中の顆粒球細胞数）／（対象となる細胞集団中の全細胞数）×１００で表され、低いほど単核球率が高いことを表す。
【００３３】
本発明を用いることにより、有核細胞率を、４０％以上とすることができ、好ましい態様においては８０％以上とすることができ、より好ましい態様においては８５％以上とすることができる。また本発明を用いることにより、顆粒球混入率を、０．７％以下とすることができ、また好ましい態様においては０．４％以下とすることができ、より好ましい態様においては０．３３％以下とすることができる。
【００３４】
本発明を用いることにより、血小板の混入が少ないにも関わらず、十分な量の単球が回収できる。すなわち、得られた単核球に含まれる単球の割合（単球率）は、従来法に劣らない。単核球に占める単球の割合は、例えばフローサイトメーターにより、単球率を計測することにより、評価できる。単球率は、（対象となる細胞集団中の単球細胞数）／（対象となる細胞集団中の全細胞数）×１００で表される。好ましい態様においては単球率を１５〜２０％とすることができる。
【００３５】
本発明により得られた単核球からは、従来技術にしたがい、単球を回収することができる。具体的には、単核球をプレートに適切な密度で播種した後、３７℃で数十分間インキュベートすることにより、単球をプレートに付着させる。その後、プレート表面を適切な溶液で洗浄することにより、付着していない細胞を除去することができる。本発明の方法により得られた単核球には血小板の混入が少ないので、プレートの底面が血小板で覆われることが少なく、十分な量の単球をプレートに付着させ、得ることができる。
【００３６】
一般に、アフェレーシス血液の血小板は、末梢血（血小板数は、通常１．４０〜３．４０×１０8ｍｌ）に比較し、２〜５倍に濃縮されている。そのため単核球に混在する血小板の除去効率を〜０．１％のオーダーでも高めることができれば、単核球に混在する血小板の絶対数を大幅に減じることができ、技術的に意義が大きい。本発明者らの検討によると、従来技術の方法では、血小板の除去効率は、９９．３０％前後であり、この場合、遠心分離後に得られた単核球をプレートに播種した際、プレート上では血小板の付着が目立ち、プレート底面を覆う単球の比率が低いことが顕微鏡下で確認できる。プレート法によって単球を得る観点からは、遠心分離後に回収した単核球における血小板除去効率は９９．５０％以上であることが好ましい。この程度除去されていれば、血小板の付着が目立つことなく、プレートのほぼ全面を単球が覆うことができるからである。血小板の除去効率は、９９．６５％以上であることがより好ましく、９９．８０％以上であることがさらに好ましい。このような高い血小板除去効率は、本発明の好ましい態様によって容易に達成することができる。なお血小板除去効率は[（アフェレーシス血液中の血小板数）−（得られた単核球に混在する血小板数）]／（アフェレーシス血液中の血小板数）×１００で表される。
【００３７】
また血小板との接触時間の長化は、悪影響を及ぼし得る。血小板の混在が多い従来法により得られた単球は、フローサイトメトリーにおいて側方散乱光（Side Scatter、ＳＳＣ）の上昇が見られることがある。これは、分離行程での血小板との長期接触により貪食したものと考察される。血小板の除去効率が高い本発明の方法に拠れば、このような悪影響を減じることができる。
【００３８】
本発明により調製された単核球または単球は、従来法に比較して血小板のみならず、好中球の混在も抑制されうる。
【００３９】
［単核球および単球の用途］
本発明により調製された単核球および単球は、種々の用途に用いうる。例えば、本発明により調製された単核球または単球から、種々の有用細胞を得ることができる。すなわち本発明は、有用細胞の調製方法も提供する。有用細胞は、調製された単核球から得られる限り、特に限定されない。有用細胞の例には、ヒトまたは非ヒト動物の疾患または状態の処置やメカニズムの解明に役立つ細胞、ヒトまたは非ヒト動物のための医薬候補化合物の探索に役立つ細胞、ならびに毒性の評価、および環境の影響の評価に役立つ細胞が含まれる。
【００４０】
有用細胞の調製方法は、上述の工程（１）および工程（２）に加えて、さらに下記の工程（３）を含んでよい。
（３）調製された単核球から有用細胞を得る。
【００４１】
ヒトまたは非ヒト動物の疾患または状態の処置のための有用細胞の例として、樹状細胞、ＮＫ細胞（Natural killer cell）、ＮＫＴ細胞（Natural killer T cell）、活性化Ｔ細胞（ナイーブT細胞が抗原と遭遇して活性化された結果生じるエフェクターT細胞の機能的な亜群であるTh1細胞、Th2細胞、TFH細胞、Th17細胞、Treg細胞等を含む。）、およびＣＡＲ−Ｔ細胞（Chimeric antigen receptor-T cell）を挙げることができる。特に好ましい例として、樹状細胞およびＮＫ細胞を挙げることができる。
【００４２】
樹状細胞の調製方法においては、上述の工程（３）は、下記の工程（３−１）または（３−２）であってもよい。
（３−１）調製された単核球から単球を分離し、分離された単球を培養して樹状細胞を得る。
（３−２）調製された単核球を培養して  樹状細胞を得る。
【００４３】
樹状細胞の調製方法においては、さらにＴ細胞を単核球から除去する工程を含んでいてもよく、その際、Ｔ細胞の除去は、ＣＤ３を発現する細胞を除去することによって行ってもよい。また、工程（３−１）または（３−２）の培養は、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＳＣＦを含む培地で培養してもよく、この培養は、少なくとも３週間、好ましくは４週間実行することができ、その後ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−４を含む培地に切り替えて培養してもよい。詳細な培養条件等は、前掲特許文献１を参考にすることができる。
【００４４】
ＮＫ細胞の調製方法は、上上述の工程（３）は、下記の工程（３−３）であってもよい。
（３−３）調製された単核球を培養してＮＫ細胞を得る
【００４５】
ＮＫ細胞の調製方法においては、調製された単核球に含まれる造血前駆細胞を培養し、分化・誘導することによってＮＫ細胞を得てもよく、調製された単核球に含まれるＮＫ細胞を培養し、増殖させることによってＮＫ細胞を得てもよい。前者の場合、また、工程（３−３）の培養で用いる培地は、ＩＬ−１５、ＳＣＦ、ＩＬ−７およびＦｌｔ３Ｌを含むことが好ましく、ＴＰＯをさらに含むことがより好ましい。さらに増幅された前記造血前駆細胞をＩＬ−２を含む培養条件で培養してもよい。詳細な培養条件等は、特許第5511039号を参考にすることができる。
【００４６】
後者の場合、工程（３−３）の培養で用いる培地は、ＩＬ−２を含むことが好ましい。また、Ｔ細胞を除去する工程をさらに含んでいてもよく、その際、Ｔ細胞の除去は、ＣＤ３を発現する細胞を除去することによって行ってもよい。また、造血前駆細胞を除去する工程を含んでいてもよく、その際、造血前駆細胞の除去は、ＣＤ３４陽性細胞を除去することによって行ってもよい。詳細な培養条件等は、特許第5572863号を参考にすることができる。
【００４７】
ＮＫＴ細胞の調製のためには、例えば、次の文献を参照することができる：Motohashi S, Kobayashi S, Ito T, Magara KK, Mikuni O, Kamada N, Iizasa T, Nakayama T, Fujisawa T, Taniguchi M., Preserved IFN-alpha production of circulating Valpha24 NKT cells in primary lung cancer patients. Int J Cancer. 2002 Nov 10;102(2):159-65. (http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ijc.10678/abstract)
活性化Ｔ細胞の調製のためには、例えば、次の文献を参照することができる：
Schellhorn M, Haustein M, Frank M, Linnebacher M, Hinz B., Celecoxib increases lung cancer cell lysis by lymphokine-activated killer cells via upregulation of ICAM-1., Oncotarget. 2015 Nov 17;6(36):39342-56. doi: 10.18632/oncotarget.5745. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4770776/)
ＣＡＲ−Ｔ細胞の調製のためには、例えば次の文献を参照することができる：Tumaini B, Lee DW, Lin T, Castiello L, Stroncek DF, Mackall C, Wayne A, Sabatino M., Simplified process for the production of anti-CD19-CAR-engineered T cells., Cytotherapy. 2013 Nov;15(11):1406-15. doi: 10.1016/j.jcyt.2013.06.003. Epub 2013 Aug 28.
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4141724/)
【００４８】
調整された、ヒトまたは非ヒト動物の疾患または状態の処置のための有用細胞が適用可能な疾患または状態には、がん、感染症、自己免疫疾患、アレルギー等が含まれる。移植療法用の樹状細胞の製造に際し、アフェレーシス血液から分離して得た単球を培養に供する方法がよく知られており（前掲非特許文献１〜４）、本発明の方法は、この方法にも好適に適用できる。
【００４９】
調整された、ヒトまたは非ヒト動物の疾患または状態の処置のための有用細胞は、再生医療等製品を構成することができる。したがって本発明はまた、ヒトまたは非ヒト動物の疾患または状態の処置のための有用細胞を含む、医薬組成物（再生医療等製品を含む。）の製造方法も提供する。医薬組成物は、有効成分である有用細胞のほか、医薬として許容される添加物を含んでいてもよい。
【実施例】
【００５０】
［実施例1：健常人アフェレーシス血液からの単核球分離（手作業）］
フレゼニウスカービジャパン社製の血液成分分離装置COM.TEC. （プログラムとして、MNC：単核球の採取を使用。）にて、ACD-A液（テルモ）を用いたアフェレーシスによって採取された健常人ボランティア血液（以下、アフェ血）を対象とし、OptiPrep（60 w/v%イオジキサノール溶液、Axis-Shield社、密度1.320±0.001 g/ml）およびFicoll（Ficoll-Paque PLUS、密度1.077±0.001 g/ml、GEヘルスケア社）を用いた血液分離を行った。
【００５１】
1. Nunc社製の50mlコニカルチューブ（以下、50mlチューブ）にFicollを15ml充填する（5本作成）
2. 同様に別の50mlチューブにアフェ血を10ml充填する（5本作成）
3. 上記2で作成した4本について、OptiPrepを1.6ml、1.8ml、2.0ml、2.2ml添加/混和したものをそれぞれ1本ずつ作成する
4. 上記3で作成したアフェ血/OptiPrep混和物を、25mlピペットを用いて上記1で作成したFicoll層の下層にそれぞれ充填する
5. 上記4で作成した50mlチューブ内の液体の最上層（Ficoll層の上）にPBS 5mlを重層する
6. 陽性対照群として、上記1で作成したFicollの上層に、上記2で作成した血液にPBS10mlを添加した2倍希釈アフェ血を重層したものを作成する
7. 上記5および6で作成した50mlチューブを遠心（500g, 室温, 20分, Brakeなし）する
8. それぞれのPBMC層を回収し、遠心（500g, 4℃, 15分, Brakeあり）する
9. それぞれ上清を破棄し、PBS 5mlに懸濁する（陽性対照群は追加で血小板除去行程を実施する：PBS 50mlを用いて300g, 4℃, 5分, Brakeありの遠心を2回実施する）
10. Turk氏液で20倍希釈し、血球計算板を用いて細胞数を計測する
【００５２】
細胞数計測結果を下表に示す。なお、上記4において、OptiPrepを1.6ml添加したものについてはFicoll下層に充填できず、Ficollと混和してしまったため除外した。
【００５３】
【表１】
2018038353.tif 000002
【００５４】
アフェ血にOptiPrepを1.8〜2.2ml添加した群において、回収できた細胞数は陽性対照と同等以上であった。これは、計算上、血液の液体成分の比重を1.063から1.066の間に調整することが必要であるとするOptiPrepアプリケーションシートC05（http://www.axis-shield-density-gradient-media.com/C05.pdf）に照らし、アフェ血と末梢血の比重の違いを鑑みてOptiPrep添加量を調整することでは、単核球の分離を行うことが不可能であることを意味する（下表）。
【００５５】
【表２】
2018038353.tif 000003
【００５６】
アプリケーションシートC05においては、末梢血（表中の100:0の行）において末梢血10ml当たりOptiPrep1.4ml（実験的に可能、比重1.0630に調整）〜1.539ml（比重1.0661に調整）を添加することで単核球が回収可能とされており、アフェ血（表中の100:20または100:15の行）において同様の比重調整を行うにはアフェ血10ml当たり1.539ml（比重1.0639に調整）〜1.6ml（比重1.0647に調整）の添加が必要になることになる。ところが、アフェ血にOptiPrepを1.6ml添加することではFicoll層の下層に充填することができず（血液全体の比重が、比重1.077のFicollと同等かそれ以下）、遠心分離を実施することが不可能である。
【００５７】
続いて、回収された細胞の有核細胞率（有核細胞数／全細胞数×１００、高いほど血小板/赤血球の混入が少ない）、顆粒球混入率（顆粒球細胞数／全細胞数×１００、低いほど単核球率が高い）、および単球率（単球細胞数／全細胞数×１００）をフローサイトメーターにより計測した。上記9で回収したそれぞれの細胞を4x105cells x2ずつEZ-BindShutII 96wellプレート（旭硝子）に分取し、遠心（500g, 4℃, 5分）を行い、上清を破棄した上で下記の抗体溶液で懸濁し、4℃で30分間、暗所にて反応させた。
【００５８】
抗体液I: CD14-FITC 50μl（Biolegend社）
抗体液II: Isotype control-FITC 50μl（Biolegend社）
【００５９】
反応終了後、それぞれのwellにPBS 200μを添加し、遠心洗浄（500g, 4℃, 5分）を行った。それぞれのwellにPBS 200μlを加え、LSRFortessa（BD社、ソフト：FACSDiva）により解析を行い、図１の結果を得た。
【００６０】
有核細胞率はOptiPrep添加量2.0mlおよび2.2mlの際に高い傾向にあり、顆粒球混入率はOptiPrep添加量1.8ml〜2.2mlでいずれも低く、また単球率はOptiPrep添加量1.8ml〜2.2mlでいずれも陽性対照と同程度であった。これは、OptiPrep添加量2.0mlおよび2.2mlの際に最も効率よく無血小板単核球を分離精製できることを示しており、上記表の斜体で示した値が最適であることを示している。
【００６１】
また、OptiPrep添加量2.0mlによる方法と、陽性対照によりそれぞれ回収された細胞を、AIM-V培地（Thermo Fisher Scientific社）に懸濁し、Primaria 10cm dish（コーニング社）に6x107cells/6mlで播種し、37℃で30分間インキュベートすることで、単球をdishに付着させた（樹状細胞を培養する際の当業者間での一般的な方法）。その後、AIM-V培地を用いてdish表面を洗浄し、付着していない細胞を回収した。Dishに付着した細胞の様子を撮影したところ、図２のように観察された。陽性対照群では残存血小板の付着が目立ち、dish底面を覆う単球の比率が低下しているのが確認できる。一方、OptiPrep方では残存血小板はほとんど存在せず、底面は単球で覆われている。
【００６２】
各処理における血小板の除去効率を、下表および図３にまとめて示した。単核球数および血小板数は株式会社エスアールエルにその検査を委託し、またそれらの結果をもとに計算を行った。
【００６３】
【表３】
2018038353.tif 000004
【００６４】
アフェ血は末梢血と比較して、血小板が極めて高濃度に濃縮（2〜5倍程度）されている。したがって、その除去効率が1%程度異なると、残存する血小板数は大幅に異なることが分かる。そのため、血小板除去効率は概ね99.5%以上であることが望ましく、且つ単核球のロスを最小限に抑えることを同時に達成するには、OptiPrep2.0あるいは2.2ml添加が最適であることが示された。
【００６５】
［実施例2：健常人アフェレーシス血液からの単核球分離（CliniMACS Prodigy（登録商標））］
【００６６】
フレゼニウスカービジャパン社製のCOM.TEC.にて、ACD-A液を用いたアフェレーシスによって採取された健常人ボランティア血液（以下、アフェ血）を対象とし、OptiPrepおよびFicollを用いた血液分離を行った。
【００６７】
1. 完全閉鎖式自動細胞調製装置CliniMACS Prodigy（登録商標）（ミルテニーバイオテク株式会社）にTS510チュービングセット、および各種試薬（OptiPrep 20ml以上、Ficoll 100ml、EDTA buffer 1,000ml）入りバッグとアフェ血100ml入りバッグを接合し、プログラムを始動する（OptiPrep使用量はアフェ血100mlに対して20ml）
2. 回収された細胞液を回収バッグから225mlチューブに移す
3. Turk氏液で20倍希釈し、血球計算板を用いて細胞数を計測する
【００６８】
細胞数計測結果を下表に示す。手作業と同等程度の細胞が回収できることが示された。
【００６９】
【表４】
2018038353.tif 000005
【００７０】
続いて、回収された細胞の有核細胞率（高いほど血小板/赤血球の混入が少ない）、顆粒球混入率（低いほど単核球率が高い）をフローサイトメーターにより計測した。上記9で回収したそれぞれの細胞を4x105cells x2ずつEZ-BindShutII 96wellプレートに分取し、遠心（500g, 4℃, 5分）を行い、上清を破棄した上で以下の抗体溶液で懸濁し、4℃で30分間反応させた。
【００７１】
抗体液I: CD14-FITC 50μl（Biolegend社）
抗体液II: Isotype control-FITC 50μl（Biolegend社）
【００７２】
反応終了後、それぞれのwellにPBS200μを添加し、遠心洗浄（500g, 4℃, 5分）を行った。それぞれのwellにPBS200μlを加え、LSRFortessa（ソフト：FACSDiva）により解析を行った。結果を図４に示した。
【００７３】
［実施例3：健常人アフェレーシス血液からの単核球分離（手作業、24時間血液保管後）］
フレゼニウスカービジャパン社製のCOM.TEC.にて、ACD-A液（テルモ）を用いたアフェレーシスによって採取された健常人ボランティア血液（以下、アフェ血）を24時間、4℃保存したものを対象とし、OptiPrep（60%イオジキサノール溶液、Axis-Shield社）およびFicoll（GEヘルスケア社）を用いた血液分離を行った。
【００７４】
1. Nunc社製の50mlコニカルチューブ（以下、50mlチューブ）にFicollを15ml充填する（2本作成）
2. 同様に別の50mlチューブにアフェ血を10ml充填する（2本作成）
3. 上記2で作成した1本について、OptiPrepを2.0ml添加/混和する
4. 上記3で作成したアフェ血/OptiPrep混和物を、25mlピペットを用いて上記1で作成したFicoll層の下層に充填する
5. 上記4で作成した50mlチューブ内の液体の最上層（Ficoll層の上）にPBS 5mlを重層する
6. 陽性対照群として、上記1で作成したFicollの上層に、上記2で作成した血液にPBS 10mlを添加した2倍希釈アフェ血を重層したものを作成する
7. 上記5および6で作成した50mlチューブを遠心（500g, 室温, 20分, Brakeなし）する
8. それぞれのPBMC層を回収し、遠心（500g, 4℃, 15分, Brakeあり）する
9. それぞれ上清を破棄し、PBS 5mlに懸濁する（陽性対照群は追加で血小板除去行程を実施する：PBS 50mlを用いて300g, 4℃, 5分, Brakeありの遠心を2回実施する）
10. Turk氏液で20倍希釈し、血球計算板を用いて細胞数を計測する
【００７５】
細胞数計測結果を下表に示す。手作業と同等程度の細胞が回収できることが示された。
【００７６】
【表５】
2018038353.tif 000006
【００７７】
続いて、回収された細胞の有核細胞率（高いほど血小板/赤血球の混入が少ない）、顆粒球混入率（低いほど単核球率が高い）をフローサイトメーターにより計測した。上記9で回収したそれぞれの細胞を4x105cells x2ずつEZ-BindShutII 96wellプレートに分取し、遠心（500g, 4℃, 5分）を行い、上清を破棄した上で以下の抗体溶液で懸濁し、4℃で30分間反応させた。
【００７８】
抗体液I: CD14-FITC 50μl（Biolegend社）
抗体液II: Isotype control-FITC 50μl（Biolegend社）
【００７９】
反応終了後、それぞれのwellにPBS200μを添加し、遠心洗浄（500g, 4℃, 5分）を行った。それぞれのwellにPBS200μlを加え、LSRFortessa（ソフト：FACSDiva）により解析を行った。
【００８０】
陽性対照群では単球のSSCの顕著な上昇が認められ、分離行程での血小板との長期接触により貪食したものと考察される。加えて、陽性対照群では好中球のコンタミネーションが5%を超えており、樹状細胞の培養には不適と判断される。
【００８１】
［実施例4：健常人アフェレーシス血液からの単核球分離（CliniMACS Prodigy（登録商標））]
フレゼニウスカービジャパン社製のCOM.TEC.にて、ACD-A液を用いたアフェレーシスによって採取された健常人ボランティア血液（以下、アフェ血）を対象とし、OptiPrepおよびFicollを用いた血液分離を行った。
【００８２】
1. CliniMACS Prodigy（登録商標）にTS510チュービングセット、および各種試薬（OptiPrep 20ml以上、Ficoll 100ml、EDTA buffer 1,000ml）入りバッグとアフェ血100ml入りバッグを接合し、プログラムを始動する（OptiPrep使用量はアフェ血100mlに対して20ml）
2. 回収された細胞液を回収バッグから225mlチューブに移す
3. Turk氏液で20倍希釈し、血球計算板を用いて細胞数を計測する（PBMC）
4. CliniMACS CD3 beads（ミルテニーバイオテク、130-050-101）とLDカラム（ミルテニーバイオテク、130-042-901）を用いてCD3陽性細胞を除去した。
5. Turk氏液で20倍希釈し、血球計算板を用いて細胞数を計測する（CD3-depleted）
【００８３】
細胞数計測結果を下表に示す。手作業と同等程度の細胞が回収できることが示された。
【００８４】
【表６】
2018038353.tif 000007
【００８５】
続いて、回収された細胞のCD3陽性細胞率およびNK細胞（CD3陰性、CD56陽性）率をフローサイトメーターにより計測した。上記2および4で回収したそれぞれの細胞を4x105cells x2ずつEZ-BindShutII 96wellプレートに分取し、遠心（500g, 4℃, 5分）を行い、上清を破棄した上で以下の抗体溶液で懸濁し、4℃で30分間反応させた。
【００８６】
抗体液I: CD3-PerCP-Cy5.5、CD56-PE 50μl（Biolegend社）
抗体液II: Isotype control-FITC 50μl（Biolegend社）
【００８７】
反応終了後、それぞれのwellにPBS 200μを添加し、遠心洗浄（500g, 4℃, 5分）を行った。それぞれのwellにPBS 200μlを加え、LSRFortessa（ソフト：FACSDiva）により解析を行った。結果を図６に示した。
【００８８】
続いて、CD3-depleted PBMCを以下の要領で培養し、その増殖率を計測した。
(1)：分離後の末梢血単核球の細胞数に従い、2 x 108個の細胞を50 mL遠心管に移し、500 x g、５分間、遠心分離を行った。
(2)：遠心分離後の上清を除去し、細胞を1600μLの分離バッファーに懸濁した。その懸濁液に50μLのCliniMACS CD3beadsを添加・懸濁し、1x 107cellsあたり80μlのIsolation Buffer、2.5μのCliniMACS CD3を加えた。
(3)：4℃で15分間反応させた（5分毎に遠心管を振り、細胞を懸濁させた）。
(4)：反応終了後、40 mLの分離バッファーを添加し(1x 107cellsあたり2ml以上のIsolation Bufferを加える)、300 x g、10分間、遠心分離を行った。
(5)：LDカラムのリンスを行った。(2mlアプライ)
(6)：上清を除去し、1 mLのIsolation Buffeに懸濁し、細胞懸濁液をリンス済みのLDカラムへアプライし、溶出してきた液を回収した。
(7)：その後2回カラムをwashし、回収された液中の細胞数をカウントし、総細胞数を算出した。
(8)：500 x g、５分間、遠心分離を行い、上清を除去後、5 x 105 細胞/mLとなるように５％ヒトAB型血清（コージンバイオ、56℃で30分の反応により非働化処理）を添加したKBM501培地（コージンバイオ）（以下、NK培地とする）に懸濁し、T-175フラスコ（Greiner Bio-One）に12 mL/フラスコで播種した。
(9)：37℃のCO2インキュベーターで培養を行った。
(10)培養9日目に培養液の一部を取り細胞数をカウントした。細胞数が5 x 105 細胞/mLになるようにNK培地を添加し、37℃のCO2インキュベーターで培養を行った。
(11)：14日目に培養上清を回収した。1mMEDTAを含むPBSを上清回収後のフラスコに添加し、室温で５分間反応させ、付着している細胞を剥がし、その細胞を回収した。回収細胞の細胞数をカウントし、総細胞数を算出した。500 x g、5分間、遠心分離を行い、上清を除去し、STEM-CELL BANKER（日本全薬工業）に懸濁後、-80℃で保存を行った。
【００８９】
本培養工程における細胞数の推移は、図７に示す通りとなった。この結果は、発明者らの報告（S. Saito et al., Ex Vivo Generation of Highly Purified and Activated Natural Killer Cells from Human Peripheral Blood: HUMAN GENE THERAPY METHODS 24:241-252 (August 2013)）のデータと照らし、遜色のないものであったことから、調製した単核球からCD3陽性細胞を除去してNK細胞を培養する方法（NK細胞の調製方法：特許第5511039号、NK細胞の増幅方法：特許第5572863号）についても、本法が有用であることが示された。
【００９０】
本発明の方法を用いると、CliniMACS Prodigyでの処理時間が大幅に短縮（4時間程度から2時間程度までに短縮）されることから、将来的に大量製造される際には極めて有用と考えられる。
【図１】
2018038353.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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