(57)【要約】【課題】赤色蛍光タンパク質用の遺伝子発現制御方法を提供する。【解決手段】  単量体の赤色蛍光タンパク質に対する結合分子をコードする配列番号１の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質のＮ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドを翻訳させる。また、赤色蛍光タンパク質に対する結合分子をコードする配列番号２の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質のＣ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドを翻訳させる。また、赤色蛍光タンパク質にそれぞれの結合分子が結合することで、翻訳されたＮ末断片と翻訳されたＣ末断片とを結合させ、遺伝子発現制御タンパク質を活性化させて、目的の遺伝子の発現を制御させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単量体の赤色蛍光タンパク質に対する結合分子をコードする配列番号１の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質のＮ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドを翻訳させ、
前記赤色蛍光タンパク質に対する結合分子をコードする配列番号２の塩基配列と前記遺伝子発現制御タンパク質のＣ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドを翻訳させ、
前記赤色蛍光タンパク質にそれぞれの結合分子が結合することで、翻訳された前記Ｎ末断片と翻訳された前記Ｃ末断片とを結合させ、前記遺伝子発現制御タンパク質を活性化させて、目的の遺伝子の発現を制御させる
ことを特徴とする遺伝子発現制御方法。
【請求項２】
前記配列番号１及び前記配列番号２の塩基配列は、コドン最適化された
ことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子発現制御方法。
【請求項３】
前記単量体の赤色蛍光タンパク質は、
サンゴ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）由来のｍＣｈｅｒｒｙ又はｍＲＦＰ１である
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の遺伝子発現制御方法。
【請求項４】
多量体の赤色蛍光タンパク質に対する結合分子をコードする配列番号３の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質のＮ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドを翻訳させ、
前記配列番号３の塩基配列と前記遺伝子発現制御タンパク質のＣ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドを翻訳させ、
前記赤色蛍光タンパク質にそれぞれの結合分子が結合することで、翻訳された前記Ｎ末断片と翻訳された前記Ｃ末断片とを結合させ、前記遺伝子発現制御タンパク質を活性化させて、目的の遺伝子の発現を制御させる
ことを特徴とする遺伝子発現制御方法。
【請求項５】
前記配列番号３の塩基配列は、コドン最適化された
ことを特徴とする請求項４に記載の遺伝子発現制御方法。
【請求項６】
前記多量体の赤色蛍光タンパク質は、
サンゴ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）由来のｔｄＴｏｍａｔｏである
ことを特徴とする請求項４又は５に記載の遺伝子発現制御方法。
【請求項７】
前記遺伝子発現制御タンパク質は、
部位特異的ＤＮＡ組換え酵素である
ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の遺伝子発現制御方法。
【請求項８】
前記赤色蛍光タンパク質及び／又は前記遺伝子発現制御タンパク質は、
細胞内局在性を変化可能に構成され、
前記細胞内局在性の変化により、前記遺伝子発現制御タンパク質の活性を変化させる
ことを特徴とする１乃至７のいずれか１項に記載の遺伝子発現制御方法。
【請求項９】
配列番号１の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質のＮ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドと、
配列番号２の塩基配列と前記遺伝子発現制御タンパク質のＣ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドとを含む
ことを特徴とする遺伝子発現制御キット。
【請求項１０】
配列番号３の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質のＮ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドと、
前記配列番号３の塩基配列と前記遺伝子発現制御タンパク質のＣ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドとを含む
ことを特徴とする遺伝子発現制御キット。
【請求項１１】
発現させたい遺伝子の配列を前記遺伝子発現制御タンパク質による標的配列に対応して備えた塩基配列を含むヌクレチオドを更に備える
ことを特徴とする請求項９又は１０に記載の遺伝子発現制御キット。
【請求項１２】
それぞれの前記ヌクレチオドは、アデノ随伴ウィルスベクターである
ことを特徴とする請求項９乃至１１のいずれか１項に記載の遺伝子発現制御キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に遺伝子発現制御方法及び遺伝子発現制御キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の特定の細胞において遺伝子発現を制御することができれば、その細胞の生理機能を明らかにすることに役立ち、各種病態の治療につながる。
このため、特定の細胞において、Ｃｒｅリコンビナーゼ等の核酸組換え酵素を発現させる遺伝子改変（トランスジェニック）動物や、核酸組換え酵素依存的に遺伝子発現を誘導する各種ベクターが開発されている。
【０００３】
一方、特定の細胞を可視化するために、特定の細胞に選択的に蛍光タンパク質を発現させるトランスジェニック動物も数多く作成されている。
【０００４】
ここで、特許文献１及び非特許文献１を参照すると、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に選択的に結合する抗体様分子であるナノボディを結合ドメインとして備えたＣｒｅリコンビナーゼのＮ末断片のフュージョンタンパク質と、ＧＦＰの結合ドメインとして同一の抗体様分子を備えたＣ末断片のフュージョンタンパク質とを用いる遺伝子制御方法が記載されている。
特許文献１及び非特許文献１の技術（以下、「従来技術１」と称する。）では、ＧＦＰの発現している細胞でのみ、Ｃｒｅリコンビナーゼの活性を発揮させることができる。つまり、従来技術１では、特定の細胞に選択的に蛍光タンパク質を発現させる既存のトランスジェニック動物を利用して、目的とする遺伝子の発現制御を行うことが可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１５／００９６０６６号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔａｎｇ，Ｊ他、「Ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＧＦＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ．」、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０１５年、１８号、ｐ．１３３４−１３４１
【非特許文献２】Ｆｒｉｄｙ，Ｐ．Ｃ．他、「Ａ  ｒｏｂｕｓｔ  ｐｉｐｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｎａｎｏｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．」、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１４年、１１号、ｐ．１２５３−１２６０
【非特許文献３】Ｂｒａｕｃｈｌｅ，Ｍ他、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｕｓｉｎｇ  ＤＡＲＰｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ＧＦＰ  ａｎｄ  ｍＣｈｅｒｒｙ」、Ｂｉｏｉ  Ｏｐｅｎ、２０１４年、３号、ｐ．１２５２−１２６１
【非特許文献４】Ｎｉｏｐｅｋ，Ｄ他、「Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｏｒｔ．」、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１６年、Ｆｅｂ  ８；７：１０６２４．、ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１０６２４．
【非特許文献５】Ｋｒｅｄｅｌ，Ｓ他、「ｍＲｕｂｙ，  ａ  ｂｒｉｇｈｔ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．」、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４、２００９年、ｅ４３９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来技術１のＣｒｅのＮ末断片及びＣ末断片のフュージョンタンパク質は、オワンクラゲに由来するＧＦＰの改変体であるＣＦＰ、ＹＦＰといった蛍光タンパク質には結合するものの、サンゴ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）に由来するｄｓＲｅｄや、その改変体であるｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ｔｄＴｏｍａｔｏといった赤色蛍光タンパク質には結合しなかった。
このため、従来技術１では赤色蛍光タンパク質を標的とした遺伝子発現誘導のような遺伝子発現制御方法を実現できなかった。
【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の遺伝子発現制御方法は、単量体の赤色蛍光タンパク質に対する結合分子をコードする配列番号１の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質のＮ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドを翻訳させ、前記赤色蛍光タンパク質に対する結合分子をコードする配列番号２の塩基配列と前記遺伝子発現制御タンパク質のＣ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドを翻訳させ、前記赤色蛍光タンパク質にそれぞれの結合分子が結合することで、翻訳された前記Ｎ末断片と翻訳された前記Ｃ末断片とを結合させ、前記遺伝子発現制御タンパク質を活性化させて、目的の遺伝子の発現を制御させることを特徴とする。
本発明の遺伝子発現制御方法は、前記配列番号１及び前記配列番号２の塩基配列は、コドン最適化されたことを特徴とする。
本発明の遺伝子発現制御方法は、前記単量体の赤色蛍光タンパク質は、サンゴ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）由来のｍＣｈｅｒｒｙ又はｍＲＦＰ１であることを特徴とする。
本発明の遺伝子発現制御方法は、多量体の赤色蛍光タンパク質に対する結合分子をコードする配列番号３の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質のＮ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドを翻訳させ、前記配列番号３の塩基配列と前記遺伝子発現制御タンパク質のＣ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドを翻訳させ、前記赤色蛍光タンパク質にそれぞれの結合分子が結合することで、翻訳された前記Ｎ末断片と翻訳された前記Ｃ末断片とを結合させ、前記遺伝子発現制御タンパク質を活性化させて、目的の遺伝子の発現を制御させることを特徴とする。
本発明の遺伝子発現制御方法は、前記配列番号３の塩基配列は、コドン最適化されたことを特徴とする。
本発明の遺伝子発現制御方法は、前記多量体の赤色蛍光タンパク質は、サンゴ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）由来のｔｄＴｏｍａｔｏであることを特徴とする。
本発明の遺伝子発現制御方法は、前記遺伝子発現制御タンパク質は、部位特異的ＤＮＡ組換え酵素であることを特徴とする。
本発明の遺伝子発現制御方法は、前記赤色蛍光タンパク質及び／又は前記遺伝子発現制御タンパク質は、細胞内局在性を変化可能に構成され、前記細胞内局在性の変化により、前記遺伝子発現制御タンパク質の活性を変化させることを特徴とする。
本発明の遺伝子発現制御キットは、配列番号１の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質のＮ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドと、配列番号２の塩基配列と前記遺伝子発現制御タンパク質のＣ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドとを含むことを特徴とする。
本発明の遺伝子発現制御キットは、配列番号３の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質のＮ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドと、前記配列番号３の塩基配列と前記遺伝子発現制御タンパク質のＣ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドとを含むことを特徴とする。
本発明の遺伝子発現制御キットは、発現させたい遺伝子の配列を前記遺伝子発現制御タンパク質による標的配列に対応して備えた塩基配列を含むヌクレチオドを更に備えることを特徴とする。
本発明の遺伝子発現制御キットは、それぞれの前記ヌクレチオドは、アデノ随伴ウィルスベクターであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、単量体の赤色蛍光タンパク質に最適化された結合分子をコードする配列番号１及び配列番号２の塩基配列を含むヌクレチオドを翻訳させて用いることで、赤色蛍光タンパク質を標的とした遺伝子発現誘導を行う遺伝子発現制御方法を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御方法の概念図である。
【図２Ａ】本発明の実施例１に係るベクターＮ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ６の構造図である。
【図２Ｂ】本発明の実施例１に係るベクターＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ１の構造図である。
【図２Ｃ】本発明の実施例１に係るベクターＮ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８の構造図である。
【図２Ｄ】本発明の実施例１に係るベクターＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８の構造図である。
【図３】本発明の実施例１に係る赤色蛍光タンパク質に対するＭＢＰの機能的なペアのスクリーニングを行うためのルシフェラーゼ・アッセイの結果を示すグラフ及びヒートマップである。
【図４】本発明の実施例１に係るＣｒｅ−ＤＯＲのルシフェラーゼ・アッセイの結果を示すグラフ及び写真である。
【図５】本発明の実施例１に係るＣｒｅ−ＤＯＴのルシフェラーゼ・アッセイの結果を示すグラフ及び写真である。
【図６Ａ】本発明の実施例２に係るマウス脳内でのＣｒｅ−ＤＯＭの機能確認において、野生型マウスの大脳皮質Ｍ１領域に４種類のウイルスを注入する際の模式図である。
【図６Ｂ】本発明の実施例２に係るマウス脳内でのＣｒｅ−ＤＯＭの機能確認におけるＣｒｅ−ＤＯＭの作用機序を示す模式図である。
【図６Ｃ】本発明の実施例２に係るマウス脳内でのＣｒｅ−ＤＯＭの機能確認におけるウイルス注入部位及び投射先でのｐａｌＧＦＰ発現の写真である。
【図６Ｄ】本発明の実施例２に係るマウス脳内でのＣｒｅ−ＤＯＭの機能確認におけるｐａｌＧＦＰ発現の定量化データを示すグラフである。
【図６Ｅ】本発明の実施例２に係るＧＲＰＲニューロン特異的にｍＲＦＰ１を発現するトランスジェニックラット脳内でのＣｒｅ−ＤＯＭの機能確認の模式図である。
【図６Ｆ】本発明の実施例２に係るトランスジェニックラット脳内でのＣｒｅ−ＤＯＭ機能確認の写真である。
【図７Ａ】本発明の実施例２に係るマウス脳内でのＣｒｅ−ＤＯＴの機能確認において、野生型マウスの大脳皮質Ｍ１領域に４種類のウイルスを注入する際の模式図である。
【図７Ｂ】本発明の実施例２に係るマウス脳内でのＣｒｅ−ＤＯＴの機能確認におけるＣｒｅ−ＤＯＴの作用機序を示す模式図である。
【図７Ｃ】本発明の実施例２に係るマウス脳内でのＣｒｅ−ＤＯＴの機能確認におけるＭ１皮質でのｐａｌＧＦＰ発現の写真である。
【図７Ｄ】本発明の実施例２に係るマウス脳内でのＣｒｅ−ＤＯＴが標的として認識しないｍＲｕｂｙを用いた対照実験の模式図である。
【図７Ｅ】本発明の実施例２に係るマウス脳内でのｍＲｕｂｙを用いた対照実験におけるＭ１皮質及び脳梁のｐａｌＧＦＰ発現の写真である。
【図７Ｆ】本発明の実施例２に係るマウス脳内でのＣｒｅ−ＤＯＴの機能確認における。
【図８Ａ】本発明の実施例２に係るＣｒｅ−ＤＯＲの細胞内局在変化による機能変化確認におけるシグナル配列を示す図である。
【図８Ｂ】図８Ａのシグナル配列付加によるｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏの細胞内局在変化を示す写真である。
【図８Ｃ】図８Ｂのそれぞれに対してＣｒｅ−ＤＯＲを機能させたときのＣｒｅ活性の変化を示すグラフである。
【図９Ａ】本発明の実施例２に係る青色光を用いたＣｒｅ−ＤＯＲの活性調節において、光駆動性ドメイン（ＬＥＸＹ）を用いたＲＦＰの核外移行の概念図である。
【図９Ｂ】本発明の実施例２に係る青色光を用いたＣｒｅ−ＤＯＭの活性調節におけるｍＣｈｅｒｒｙの青色光照射による核外移行の写真である。
【図９Ｃ】図９Ｂの青色光照射によるＣｒｅ−ＤＯＭの活性変化を示すグラフである。
【図９Ｄ】本発明の実施例２に係る青色光を用いたＣｒｅ−ＤＯＴの活性調節におけるｔｄＴｏｍａｔｏの青色光照射による核外移行の写真である。
【図９Ｅ】図９Ｄの青色光照射によるＣｒｅ−ＤＯＴの活性変化を示すグラフである。
【図１０Ａ】本発明の実施例２に係る薬剤を用いたＣｒｅ−ＤＯＲの活性調節において、Ｄｅｘ添加によるＲＦＰの核内移行の概念図である。
【図１０Ｂ】本発明の実施例２に係る薬剤を用いたＣｒｅ−ＤＯＭの活性調節における、Ｄｅｘ添加によるｍＣｈｅｒｒｙの核内移行の写真である。
【図１０Ｃ】図１０ＢのＤｅｘ添加によるＣｒｅ−ＤＯＭの活性変化を示すグラフである。
【図１０Ｄ】本発明の実施例２に係る薬剤を用いたＣｒｅ−ＤＯＴの活性調節において、Ｄｅｘ添加によるｔｄＴｏｍａｔｏの核内移行の写真である。
【図１０Ｅ】図１０ＤのＤｅｘ添加によるＣｒｅ−ＤＯＴの活性変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜実施の形態＞
上述したように、従来技術１のＣｒｅ−ＤＯＧ（Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｎ  ＧＦＰ）では、赤色蛍光タンパクには対応できなかった。すなわち、ＧＦＰ用のナノボディを備えたＣｒｅリコンビナーゼのＮ末断片及びＣ末断片では、サンゴ由来の赤色蛍光タンパク質に結合しないため用いることができなかった。
このため、本発明者らは、標的タンパク質に対する選択的結合ドメインに対して改良を加えることで、赤色蛍光タンパク質依存的な遺伝子発現誘導を達成することを着想して、鋭意実験を繰り返し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
図１を参照して具体例について説明すると、本発明者らは、ナノボディ又はＤＡＲＰｉｎを、赤色蛍光タンパク（ＲＦＰ）を認識する結合ドメインとして利用することを考えた。本実施形態のナノボディは、ラクダ科動物重鎖のみ抗体に由来する、非常にサイズが小さく、結合ドメインとして利用可能なタンパク質（ペプチド）である。また、ＤＡＲＰｉｎ（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ａｎｋｙｒｉｎ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、抗体を模した人工分子のペプチドであり、アンキリンリピートの組み合わせで多様な結合性を示す。
【００１４】
図１（ａ）に示すように、ＣｒｅリコンビナーゼがＮ末端及びＣ末端の断片に分割され、それぞれが標的（ターゲット）タンパク質用の特定のナノボディ又はＤＡＲＰｉｎの結合分子により結合される。また、標的タンパク質であるＲＦＰが存在すると、分割されたＮ末端とＣ末端が結合し、Ｃｒｅリコンビナーゼの酵素活性を機能させる。つまり、本実施形態においては、ＣｒｅリコンビナーゼのＮ末断片（以下、「Ｎ−Ｃｒｅ」という。）又はＣ末断片（以下、「Ｃ−Ｃｒｅ」という。）は、ｍＣｈｅｒｒｙを結合するナノボディ又はＤＡＲＰｉｎを介して結合される。すなわち、Ｎ−Ｃｒｅ及びＣ−Ｃｒｅと、ＲＦＰとの結合により、機能するＣｒｅリコンビナーゼへの再結合が生じる。本発明者らは、このようにして機能する、ＲＦＰ依存のＣｒｅリコンビナーゼ（Ｃｒｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ＲＦＰ、以下「Ｃｒｅ−ＤＯＲ」という。）を作成した。
【００１５】
具体的には、本発明者らは、非特許文献２に記載された、赤色蛍光タンパクであるｍＣｈｅｒｒｙに特異的に結合するナノボディ（６種類）と、非特許文献３に記載されたｍＣｈｅｒｒｙに特異的に結合するＤＡＲＰｉｎ（２種類）とを、分子量やその結合特性から有望であると判断した。本発明者らは、これら６種類のナノボディ及び２種類のＤＡＲＰｉｎについて、ＭＢＰ１〜８（ｍＣｈｅｒｒｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔａｉｎ）と命名した。
以下、選択されたナノボディをＭＢＰ１〜ＭＢＰ６、ＤＡＲＰｉｎをＭＢＰ７、ＭＢＰ８と表記する。
【００１６】
ここで、非特許文献２及び非特許文献３で述べられているように、ＭＢＰ１〜８の元になった配列単独での詳細な結合特性は調べられていた。しかしながら、融合タンパク質の結合モジュールとして用いた場合には、結合特性の高いＭＢＰどうしのペアが必ずしも高い組換え活性をもたらすとは限らないことが容易に想定される。これは、ＣｒｅのＮ末断片とＣ末断片が再会合する効率については、赤色蛍光タンパク質に対するＭＢＰそれぞれの結合部位の位置関係やＭＢＰどうしに働くタンパク質間相互作用等の複雑な要因が影響するためである。つまり、従来、通常のＣｒｅリコンビナーゼを分割したＮ末断片、Ｃ末断片の結合配列として、このような配列が使用可能であるかは分かっていなかった。
【００１７】
図１（ｂ）に、各Ｃｒｅ−ＤＯＲコンストラクトの概要を示す。本発明者らは、これらの６＋２＝８種類の結合分子について、ＣｒｅのＮ末断片又はＣ末断片を含むフュージョンタンパク質をコードするベクターを作成した。この際、各ＭＢＰのＤＮＡ塩基配列はオリジナルの配列からコドン最適化された。本発明者らは、これらフュージョンタンパク質８種類×８種類＝６４通りからなる結合分子の全ての組み合わせについて、標的タンパク質となる各赤色蛍光タンパク質との結合性を調べた。そして、実験の末、最適な組み合わせのペアを特定するに至った。
【００１８】
具体的には、本発明者らは赤色蛍光タンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、及びｔｄＴｏｍａｔｏをそれぞれ発現させた際の機能性をみる実験を鋭意行った。これらの赤色蛍光タンパク質は、すべて同じ野生型ｄｓＲｅｄタンパク質に由来している。
図１（ｃ）に示すように、ｍＣｈｅｒｒｙとｍＲＦＰ１は単量体であるが、ｔｄＴｏｍａｔｏは２つのサブユニットがタンデムに並んだ二量体である。また、４量体のＤｓＲｅｄも存在する。
本発明者らは、これらの単量体であるｍＣｈｅｒｒｙ及びｍＲＦＰ１と、二量体であるｔｄＴｏｍａｔｏとで、ＭＢＰ１〜ＭＢＰ８について、異なる最適なペアを取得した。
ここで、以下、単量体であるｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１に対してよく機能するペアを用いたものを以下、Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ＲＦＰｓ、「Ｃｒｅ−ＤＯＭ」と表記する。
また、多量体であるｔｄＴｏｍａｔｏに対してよく機能するペアを用いたものを、以下、Ｃｒｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｔｄＴｏｍａｔｏ、「Ｃｒｅ−ＤＯＴ」と表記する。
【００１９】
以下、本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御方法及び遺伝子発現制御キットについて具体的且つ詳細に説明する。
【００２０】
本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御方法は、単量体の赤色蛍光タンパク質に対する結合分子をコードする配列表記載の配列番号１の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質のＮ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドを翻訳させ、赤色蛍光タンパク質に対する結合分子をコードする配列表記載の配列番号２の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質のＣ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドを翻訳させ、赤色蛍光タンパク質にそれぞれの結合分子が結合することで、翻訳されたＮ末断片と翻訳されたＣ末断片とを結合させ、遺伝子発現制御タンパク質を活性化させて、目的の遺伝子の発現を制御させることを特徴とする。
【００２１】
具体的には、本実施形態の遺伝子発現方法は、例えば、単量体である赤色蛍光タンパク質、サンゴ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）由来のｍＣｈｅｒｒｙ又はｍＲＦＰ１に対して、機能する結合ドメインを備えた結合分子のペアとして、上述のナノボディＭＢＰ６をコードする配列番号１の塩基配列と、遺伝子発現制御タンパク質としてＣｒｅリコンビナーゼのＮ末断片をコードするベクター等のベクターを翻訳させる。また、例えば、ナノボディＭＢＰ１をコードする配列番号２の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質のＣ末断片をコードする塩基配列とを含むベクターを翻訳させる。この上で、例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ又はｍＲＦＰ１に、それぞれの結合分子であるＭＢＰ６及びＭＢＰ１が結合することで、翻訳されたＮ末断片と翻訳されたＣ末断片とを結合させ、機能するＣｒｅリコンビナーゼとして活性化させて、目的の遺伝子の発現を制御させることができる。
【００２２】
また、本発明の実施の形態に係る配列番号１及び配列番号２の塩基配列は、コドン最適化されたことを特徴とする。
具体的には、配列番号１及び配列番号２の塩基配列は、例えば、トランスジェニック生物のコドンに合わせて最適化することが可能である。たとえば、本実施形態では、哺乳類の翻訳のコドンとなるよう最適化している。
【００２３】
また、本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御方法は、多量体の赤色蛍光タンパク質に対する結合分子をコードする配列表記載の配列番号３の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質のＮ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドを翻訳させ、赤色蛍光タンパク質に対する結合分子をコードする配列表記載の配列番号３の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質のＣ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドを翻訳させ、赤色蛍光タンパク質にそれぞれの結合分子が結合することで、翻訳されたＮ末断片と翻訳されたＣ末断片とを結合させ、遺伝子発現制御タンパク質を活性化させて、目的の遺伝子の発現を制御させることを特徴とする。
【００２４】
具体的には、本実施形態の遺伝子発現方法は、例えば、二量体であるサンゴ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．）由来のｔｄＴｏｍａｔｏに対して、機能する結合ドメインを備えた結合分子のペアとして、上述のＤＡＲＰｉｎ  ＭＢＰ８コードする配列表記載の配列番号３の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質としてＣｒｅリコンビナーゼのＮ末断片をコードする塩基配列とを含むベクターを翻訳させる。また、例えば、ＤＡＲＰｉｎ  ＭＢＰ８をコードする配列番号３の塩基配列とＣｒｅリコンビナーゼのＣ末断片をコードする塩基配列とを含むベクターを翻訳させる。また、例えば、ｔｄＴｏｍａｔｏに、結合分子であるＭＢＰ８が結合することで、翻訳されたＮ末断片と翻訳されたＣ末断片とを結合させ、機能するＣｒｅリコンビナーゼとして活性化させて、目的の遺伝子の発現を制御させることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明者らは、それぞれの配列は哺乳類細胞での発現を高めるため塩基配列にコドン最適化を行った。
具体的には、配列番号３の塩基配列についても、トランスジェニック生物のコドンに合わせて最適化することが可能である。たとえば、本実施形態においては哺乳類の翻訳のコドンとなるよう最適化している。
【００２６】
また、本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御方法は、遺伝子発現制御タンパク質は、部位特異的ＤＮＡ組換え酵素であることを特徴とする。
具体的には、本実施形態の遺伝子発現制御タンパク質として、例えば、部位特異的ＤＮＡ組換え酵素である、Ｃｒｅリコンビナーゼ等を用いることが可能である。このうち、Ｃｒｅリコンビナーゼは、ＤＮＡ組換え酵素で、３４塩基対のｌｏｘＰ配列のペアを認識して組換えを起こす。このｌｏｘＰ配列には方向性があり、２つのｌｏｘＰが同じ向きであればその間の配列が環状ＤＮＡとして切り出される。逆向きであれば、その間の配列の向きが入れかわる。また、ｌｏｘＰ配列にはｌｏｘ２２７２等の変異体があり、ｌｏｘＰ−ｌｏｘＰ、ｌｏｘ２２７２−ｌｏｘ２２７２はそれぞれ特異的に組換えを起こす。一方、ｌｏｘＰ−ｌｏｘ２２７２間では組換えを起こすことはないといった特長がある。
【００２７】
なお、本実施形態の部位特異的ＤＮＡ組換え酵素として、Ｃｒｅリコンビナーゼの他にも、再結合によって組換え活性を復活させることが可能なものであれば用いることが可能である。たとえば、ＦＬＰリコンビナーゼのような酵素において、再結合によって組換え活性を復活させるような分割方法があれば適用可能である。
また、本実施形態の遺伝子発現制御タンパク質として、部位特異的ＤＮＡ組換え酵素以外にも、生理活性を保つ分割方法が存在する各種酵素や毒性タンパク質等を用いることも可能である。たとえば、ルシフェラーゼには、このような分割方法が存在するため、適用可能である。また、プロテアーゼ、β−ラクタマーゼ、リコンビナーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、チミジンキナーゼ、又はコリスミ酸ムターゼ等についても、生理活性を保つ分割方法があれば、適用可能である。
【００２８】
また、本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御方法は、赤色蛍光タンパク質及び／又は遺伝子発現制御タンパク質は、細胞内局在性を変化可能に構成され、細胞内局在性の変化により、遺伝子発現制御タンパク質の活性を変化させることを特徴とする。
具体的には、後述の実施例２に示すように、本実施形態のＣｒｅ−ＤＯＲは、標的ＲＦＰの核局在化（図８Ａ〜図８Ｃ）に依存して機能する。具体的には、Ｃｒｅ−ＤＯＲは、ＲＦＰが核内に細胞内局在して作用した場合には活性が高くなる。逆に、Ｃｒｅ−ＤＯＲは、ＲＦＰが核外（サイトゾル）の細胞質内や細胞膜等の原形質膜に細胞内局在して作用した場合には活性が低くなる。このため、各種、核受容体等の細胞内局在性の移行方式を使用して、Ｃｒｅ−ＤＯＲの活性を変化させることが可能である。特に、図８Ｃで示すように、ＲＦＰが膜に集中する場合、Ｃｒｅ−ＤＯＲ活性は最小となる。
【００２９】
本実施形態では、細胞内局在性を変化可能にする移行方式として、ＲＦＰに細胞内局在を移動させるペプチドを付加してもよい。また、本実施形態のＣｒｅ−ＤＯＲを含む遺伝子発現制御タンパク質自体に、細胞内局在を移動させるペプチドを付加してもよい。この細胞内局在の移動は、ＲＦＰ又は遺伝子発現制御タンパク質に付加されたペプチドに対応して、細胞内の細胞周期、分化、シグナル応答等の各種状態変化により行われてもよい。
また、ＲＦＰ及び／又は遺伝子発現制御タンパク質について、光照射、薬剤付与、イオン濃度の変化、磁気や電場の変化等により、細胞内局在を選択的に変化させるような化学的な修飾を行ってもよい。この光照射としては、例えば、非特許文献４に記載のＬＥＸＹドメインをＲＦＰ又は遺伝子発現制御タンパク質に付加し、青色光を照射して細胞内局在を変化させてもよい。ＬＥＸＹドメインは、光誘起により核外移行させるように付加されるペプチドとなる。また、薬剤による細胞内局在の変化として、例えば、グルココルチコイド受容体（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＲ）をＲＦＰ又は遺伝子発現制御タンパク質に付加してもよい。この場合、薬剤として、ＧＲのリガンドであるＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｄｅｘ）を付与することで、ＧＲを含むタンパク質を核内移行させることが可能となる。
【００３０】
また、本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御キットは、配列番号１の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質のＮ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドと、配列番号２の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質のＣ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドとを含むことを特徴とする。
具体的には、Ｃｒｅ−ＤＯＭ用の遺伝子発現制御キットとして、例えば、Ｎ−ＣｒｅとＭＢＰ６とを含むベクターであるＮ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ６（第一ベクター）と、Ｃ−ＣｒｅとＭＢＰ１とを含むベクターであるＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ１（第二ベクター）を用いることが可能である。
【００３１】
また、本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御キットは、配列番号３の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質のＮ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドと、配列番号３の塩基配列と遺伝子発現制御タンパク質のＣ末断片をコードする塩基配列とを含むヌクレチオドとを含むことを特徴とする。
具体的には、Ｃｒｅ−ＤＯＴ用の遺伝子発現制御キットとして、例えば、Ｎ−ＣｒｅとＭＢＰ８とを含むベクターであるＮ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８（第一ベクター）、Ｃ−ＣｒｅとＭＢＰ８とを含むベクターであるＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８（第二ベクター）を用いることが可能である。
【００３２】
本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御キットは、発現させたい遺伝子の配列を遺伝子発現制御タンパク質による標的配列に対応して備えた塩基配列を含むヌクレチオドを更に備えることを特徴とする。
具体的には、本実施形態のＣｒｅ−ＤＯＭ又はＣｒｅ−ＤＯＴ用に、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの標的配列であるｌｏｘＰ内にプロモータと目的遺伝子を逆向きに配置し（不活性型）、Ｃｒｅの存在下で不可逆的に組換えを起こして活性化するＦＬＥＸスイッチを構成するようなベクター（第三ベクター）を用いて、遺伝子発現制御をみることが可能である。
【００３３】
また、本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御キットは、動物生体内への応用に関して、例えば、ＣｒｅリコンビナーゼのＮ末断片と赤色蛍光タンパク質に対する結合分子とをコードする遺伝子を発現する第一ベクター、ＣｒｅリコンビナーゼのＣ末断片と赤色蛍光タンパク質に対する結合分子とをコードする遺伝子を発現する第二ベクター、及び発現させたい遺伝子をＣｒｅリコンビナーゼによる発現スイッチ内に備えた第三ベクターとして提供されてもよい。
目的とする赤色蛍光タンパク質を発現する細胞に、これら３種類のベクターを投与することで、遺伝子発現調整キットによる遺伝子発現制御を実現することが可能となる。
【００３４】
なお、これら第一ベクター、第二ベクター、及び第三ベクターは、本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御キットにのみ用いられる、いわゆる「のみ品」であることが当業者に理解される。
また、上述の第一ベクター、第二ベクター、及び第三ベクターは、必ずしも別々のベクターとして提供されなくてもよい。たとえば、第一ベクター及び第二ベクターについて、Ｎ−Ｃｒｅ−ＭＢＰとＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰとを、自己開裂する２Ａペプチド（ｓｅｌｆ−ｃｌｅａｖａｇｅ  ２Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ）で連結することで、一つのベクターとしてまとめることも可能である。
【００３５】
本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御キットは、それぞれのヌクレチオドは、アデノ随伴ウィルスベクターを含むことを特徴とする。
具体的には、本実施形態の各ヌクレチオドは、例えば、高効率のアデノ随伴ウィルスベクターにより提供することが可能である。なお、アデノ随伴ウィルスベクターに限らず、各種のベクターを用いてコンストラクトしてもよい。この各種のベクターは、ウィルスベクター以外のベクターであってもよい。また、ベクターは、エレクトロポレーション及びナノ粒子を用いたような任意の手法を介して細胞に導入することが可能である。
【００３６】
また、本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御方法及び遺伝子発現制御キットの目的とする動物は、赤色蛍光タンパク質を発現するように遺伝子改変されたトランスジェニック生物である。この生物は、動物、植物、及び菌類等であってもよい。
このうち、トランスジェニック動物は、ショウジョウバエやイセエビやイカ等の無脊椎動物、ゼブラフィッシュ等の魚類、は虫類、及び哺乳類を含む。トランスジェニック哺乳類は、トランスジェニックげっ歯類、例えば、マウス、ラット、フェレット、モルモット、又はウサギ、トランスジェニックイヌ、トランスジェニックネコ、トランスジェニックヒツジ、トランスジェニックブタ、トランスジェニックウシ、トランスジェニックウマ、又は非ヒューマンのトランスジェニック霊長類であってもよい。
【００３７】
以上のように構成することで、以下のような効果を得ることが可能である。
従来から、特定の細胞の正確な機能を理解するために、生きている動物中での遺伝子発現の選択的調節が必要とされていた。また、遺伝学的にコード化された蛍光タンパク質は特定の種類の細胞を生体内で観察するために広く使用されていた。また、従来から、非常に多くの蛍光タンパク質が知られていた。しかし、それらの大半は、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ種のクラゲ由来のＧＦＰ、又はＤｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．種のサンゴ由来のＤｓＲｅｄの変異体であった。
また、従来技術１のように、ＧＦＰ依存転写調節因子及びＧＦＰ依存Ｃｒｅリコンビナーゼが報告されている。しかしながら、これらの適用は、緑色蛍光タンパク質とその変異体に制限されていた。ＧＦＰのアミノ酸配列及びタンパク質構造のために、ＧＦＰの変異体の蛍光タンパク質は抗体の結合性が類似しているものの、赤色蛍光タンパクはアミノ酸配列や抗体の結合性がＧＦＰとは大きく異なっていたためである。
これに対して、本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御方法及び遺伝子発現制御キットにおいては、標的タンパク質への結合タンパク質モチーフとしてナノボディとＤＡＲＰｉｎを使用して、機能するＲＦＰ依存ＣｒｅリコンビナーゼであるＣｒｅ−ＤＯＲ及びＣｒｅ−ＤＯＴを提供することができた。本実施形態のＣｒｅ−ＤＯＲ及びＣｒｅ−ＤＯＴは、標的タンパク質であるＲＦＰに対して高度な活性があり、他のタンパク質や薬剤についてのリーク活性が非常に低かった。よって、後述する実施例で示すように、赤色蛍光タンパク質を発現する培養細胞において、目的とする遺伝子発現制御を行うことが可能である。
【００３８】
また、本実施形態では、細胞を発現するＲＦＰ中で遺伝子発現を選択的に調整するために既存のＲＦＰトランスジェニック系統を利用する新方式を提供する。
上述の、赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びｄＴｏｍａｔｏ）は、生きた動物の特定の種類の細胞をマークするために広く用いられている。多くの遺伝子組み換えＲＦＰ株がマウス、ラット、又はより大きな動物について生成されている。また、植物では、葉緑素からの自己蛍光を回避することができるので、赤色蛍光タンパク質は有用である。
【００３９】
また、Ｃｒｅリコンビナーゼ及びＣｒｅ依存の遺伝子改変手段は急速に普及しているものの、新しい遺伝子組み換え動物株の作成には、現在でも多大な時間が必要である。
これに対して、本実施形態のＣｒｅ依存遺伝子発現制御方法を光遺伝学的又は薬理遺伝学的に用いることで、既存のＲＦＰ発現株を利用することができる。Ｃｒｅトランスジェニック系統の代用品として、これらを使用することができるだけでなく、ＲＦＰ発現細胞をマークするユニークな方法を提供することができる。
近年、ヒト以外のトランスジェニックの霊長類も徐々に増加している。ゲノム編集及び他の遺伝学的技術も急速に発展しているが、１つの新しいトランスジェニック霊長類の系統を確立するのには、まだ非常に多くの時間を要していた。
これに対して、本実施形態の遺伝子発現制御方法及び遺伝子発現制御キットは、同じトランスジェニック株を異なる目的に利用する効率的な方法を提供することができる。
【００４０】
また、本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御方法及び遺伝子発現制御キットは、コドン最適化された場合、脊椎動物を対象としている。脊椎動物は特に限定されるものではなく、例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物を含む。また、家畜動物種としては、実験動物であるマウス、ラット、ハムスター等の齧歯類も含む。
このため、本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御方法は、ヒトの治療の他に、動物の治療、家畜の発育増進等の対象とすることができる。
【００４１】
また、本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御方法及び遺伝子発現制御キットは、生体内の特定細胞において遺伝子発現の制御が可能となり、細胞の生理機能を明らかにすることに役立つだけでなく、ひいては病態の制御につながる可能性がある。
たとえば、ＲＦＰ蛍光タンパク質を発現させた各種疾病の細胞における遺伝子発現制御は、新たな治療法の開発につながる可能性がある。
【００４２】
また、本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御方法及び遺伝子発現制御キットにおいては、上述のように、ナノボディとＤＡＲＰｉｎを使用して、Ｃｒｅ−ＤＯＲを作成した。この際、単量体ｍＣｈｅｒｒｙ及び二量体のｔｄＴｏｍａｔｏの間で、効率的で機能的なＭＢＰ１〜ＭＢＰ８のペアが異なっていることを見いだし、Ｃｒｅ−ＤＯＭ及びＣｒｅ−ＤＯＴとして確立するに至った。
ここで、Ｃｒｅ−ＤＯＭはＣｒｅリコンビナーゼのＮ末断片に付加する結合ドメインとして配列１のナノボディ、ＣｒｅリコンビナーゼのＣ末断片に付加する結合ドメインとして配列２のナノボディを用いる。一方で、Ｃｒｅ−ＤＯＴは配列３から構成されるＤＡＲＰｉｎをＮ末、Ｃ末断片ともに結合ドメインとして用いる。つまり、Ｃｒｅ−ＤＯＴは配列３から構成されるＤＡＲＰｉｎをＮ末、Ｃ末断片ともに結合ドメインとして用いる。  
また、Ｃｒｅ−ＤＯＭは、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍＲＦＰ１を標的としてＣｒｅリコンビナーゼ活性を発揮するが、ｔｄＴｏｍａｔｏを標的としては機能しない。一方で、Ｃｒｅ−ＤＯＴはｔｄＴｏｍａｔｏを標的としてＣｒｅリコンビナーゼ活性を発揮するが、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１を標的としては機能しない。
【００４３】
このようなＭＢＰ１〜８のペアの機能特性は、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ｔｄＴｏｍａｔｏ、及びＤｓＲｅｄの間のオリゴマー化の違いを反映すると考えられる。
当業者において、同じＭＢＰ１〜８のペアでは１つの認識部位が構築されないために働かないと仮定することは合理的である。実際に、同じＭＢＰペアの標的としてｍＣｈｅｒｒｙ又はｍＲＦＰ１を使用した時、本発明者らはルシフェラーゼ活性が低いことを見いだした。
しかしながら、本発明者らは、同じＭＢＰペアであるＮ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８及びＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８の組み合わせが、ｔｄＴｏｍａｔｏに対しては非常に機能的なペアであるという予期しない効果を見いだした。ｔｄＴｏｍａｔｏは二量体タンパク質であるので、同じ認識部位が、１つの二量体中の２つの場所に露出されるため、これを認識することが推定される。つまり、Ｃｒｅ−ＤＯＴにおいて、Ｎ末、Ｃ末ともに同一の結合分子を採用する構成は、標的タンパク質がｔｄＴｏｍａｔｏのように同一の結合部位が複数露出する可能既のある多量体である場合においてのみ適用可能であり、従来技術１では想定していなかった。
これらの特徴は、単量体タンパク質のオリゴマー化状態を検知するために利用することが考えられる。また、単量体から二量体への凝集を契機とするＣｒｅリコンビナーゼの活性スイッチングの開発につながる可能性がある。
【００４４】
さらに、Ｃｒｅ−ＤＯＭ及びＣｒｅ−ＤＯＴの異なる機能特性により、蛍光タンパク質の単量体及び二量体の状態の状態変化を起こすことで、Ｃｒｅリコンビナーゼ活性を切り換えることが可能となる。
たとえば、従来、蛍光タンパク質のオリゴマー化状態を照射する光の周波数で変換することが可能な蛍光タンパクであるＤｒｏｎｐａが報告されている。Ｄｒｏｎｐａもそのオリジナルの四量体タンパク質に由来するので、ｍＣｈｅｒｒｙを使用して、同様のシステムを確立することが考えられる。これにより、Ｃｒｅリコンビナーゼ活性の光惹起によるスイッチングを達成することが可能となる。
【００４５】
また、本実施形態において、標的タンパク質への選択的結合を利用する機能的な分子を構築するために、ＤＡＲＰｉｎを使用することができるという、当業者に予期しない効果を示した。
【００４６】
また、本実施形態の遺伝子発現調整方法は、ＡＡＶ（アデノウィルス随伴）ベクターを使用して、本発明者らは、生体内で特定の遺伝子の選択的遺伝子発現を行うことが可能となる。
このように、生体内での特定の遺伝子の選択的発現制御を行うことで、例えば、脳の神経細胞のつながりを明らかにするコネクトミクス研究、細胞、組織移植治療の発展に貢献することができる。また、赤色蛍光タンパク質を部位特異的に発現させた動物を用いて遺伝子制御を行うことにより、ガン等の病気の新たな治療法につながる可能性がある。
【００４７】
なお、上述の実施の形態においては、標的タンパク質として同一の赤色蛍光タンパク質を用いる例について記載した。しかしながら、Ｎ−Ｃｒｅ及びＣ−Ｃｒｅにおいて、別々の標的タンパク質の結合分子の塩基配列を用いることも可能である。すなわち、一つの特定のナノボディ又はＤＡＲＰｉｎのような他の結合分子を作成した場合、内因性タンパク質発現において、興味のある複数の遺伝子の誘導を行うことも可能である。
たとえば、従来、ＧＦＰ依存Ｆｌｐ組換え酵素が報告されている。これに対して、１つの個体の中の２種類の細胞を操作するためにＧＦＰ依存Ｆｌｐと、Ｃｒｅ−ＤＯＲ又はＣｒｅ−ＤＯＴを同時に使用することが可能である。たとえば、プロトカドヘリン（Ｐｔｃｄ）は発生の際、及び大人の脳でさえ動的な発現パターンを示す。Ｃｒｅ−ＤＯＴ及びＰｔｃｄ−ｔｄＴｏｍａｔｏマウスにおいて、特定の時点で、１つの特定のＰｔｃｄを発現又は発現しないニューロンをトレースすることが可能である。
【００４８】
また、本実施形態のＣｒｅ−ＤＯＭ及びＣｒｅ−ＤＯＴは、非特許文献５に記載された、サンゴイソギンチャク（Ｅｎｔａｃｍａｅａ  ｑｕａｄｒｉｃｏｌｏｒ）由来の単量体の赤色蛍光タンパクであるｍＲｕｂｙを標的としては機能しない。これに対して、上述のような結合分子であるナノボディとＤＡＲＰｉｎの配列の一部変更や選択により、Ｃｒｅ−ＤＯＭ及びＣｒｅ−ＤＯＴと同様のｍＲｕｂｙ依存Ｃｒｅリコンビナーゼを作成することも可能である。これにより、本実施形態に係るＲＦＰとして、ｍＲｕｂｙを標的とするように構成することも可能である。また、上述のようなｍＲｕｂｙの単量体及び多量体の状態の状態変化によるスイッチング等も可能であると考えられる。なお、このように構成しない場合には、ｍＲｕｂｙは、本実施形態の標的とする単量体の赤色蛍光タンパク質から除かれてもよい。
【００４９】
また、膜から移動するタンパク質を標的タンパク質として、遺伝子発現制御タンパク質を機能させることも可能である。この標的タンパク質として、例えば、Ｎｏｔｃｈシグナル系を用いることが可能である。Ｎｏｔｃｈシグナルでは、Ｎｏｔｃｈドメインの細胞間の領域（ＮＩＣＤ）が、単一の膜貫通受容体タンパク質を構成しており、これが開裂され、核内へ移動される。また、アルツハイマー病の原因となるアミロイド・ベータタンパク質を標的タンパク質とすることも可能である。アミロイド・ベータは、γ−セクレターゼによってアミロイド前駆タンパク質が分割されることに由来して、生成される。別の分割断片、ＡＰＰ細胞内ドメイン（ＡＰＰ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ、ＡＩＣＤ）も核内に移行して、関連する遺伝子の発現を引き起こす。これらの特異的な結合を示すタンパク質は、シグナルがオンとなる細胞の特定遺伝子操作のため、同様に、標的タンパク質としてもよい。
【００５０】
なお、本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御方法及び遺伝子発現制御キットは、他の組成物等と併用することも可能である。また、他の組成物と同時に本発明の組成物を投与してもよく、また間隔を空けて投与してもよいが、その投与順序は特に問わない。
【実施例１】
【００５１】
以下で、本発明の実施の形態に係る遺伝子発現制御方法及び遺伝子発現制御キットについて、具体的な実験を基にして、実施例としてさらに具体的に説明する。しかしながら、この実施例は一例にすぎず、これに限定されるものではない。
【００５２】
〔材料及び手法〕
（ＤＮＡ構築）
ｍＣｈｅｒｒｙナノボディ（ＭＢＰ１〜６）のアミノ酸配列は、非特許文献３に述べられていたＬａＭ１〜６の配列を参考にして作成された。
ｍＣｈｅｒｒｙ  ＤＡＲＰｉｎ（ＭＢＰ７、ＭＢＰ８）のＤＮＡ塩基配列は、非特許文献５に述べられていた２ｍ２２、３ｍ１６０の配列を参考にして作成された。
これらのＤＮＡ塩基配列については、コドン最適化された上で合成され、ｐＡＡＶ−ＥＦ１ａＮ−ＣｒｅｔｒｃｉｎｔＧ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ：６９５７０）又はｐＡＡＶ−ＥＦ１ａＣ−ＣｒｅｉｎｔＧ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ：６９５７１）中へ挿入された。
図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄに、これらのＣｒｅ−ＤＯＲの各コンストラクトのうち、Ｎ−ＣｒｅとＭＢＰ６とを含むＮ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ６（ｐＡＡＶ−ＥＦ１ａ−Ｎ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ６−ＷＰＲＥ）、Ｃ−ＣｒｅとＭＢＰ１とを含むＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ１（ｐＡＡＶ−ＥＦ１ａ−Ｃ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ１−ＷＰＲＥ）、Ｎ−ＣｒｅとＭＢＰ８とを含むＮ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８（ｐＡＡＶ−ＥＦ１ａ−Ｎ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８−ＷＰＲＥ）、Ｃ−ＣｒｅとＭＢＰ８とを含むＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８（ｐＡＡＶ−ＥＦ１ａ−Ｃ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８−ＷＰＲＥ）のベクターのプラズミドのコンストラクトの構造を示す。
【００５３】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏルシフェラーゼ・アッセイ）
ＥＦ１ａドリブンのＲＦＰ（ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ｔｄＴｏｍａｔｏ）をコード化するプラズミド及びＣｒｅＮ末断片キメラ及びＣ末断片キメラのプラズミドが、ＦＬＥＸスイッチを構成するｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ＦＬＥＸ−ＮａｎｏＬｕｃをコードするプラズミドと共に、ＨＥＫ２９３細胞の中へのリン酸カルシウムによってトランスフェクトされた。この際、ＤＮＡ量の合計１００〜２００ｎｇが、９６穴プレートの単一のウェルへトランスフェクトされた。
細胞はトランスフェクション時に８０〜１００％コンフルーエントだった。細胞は２４〜４８時間後に、Ｎａｎｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼ・アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ製）に供された。
トランスフェクションは、すべて１：１：１（ＲＦＰ：Ｎ−ＣｒｅｔｒｃｉｎｔＧ：Ｃ−ＣｒｅｉｎｔＧ）のプラズミド・モル比で行われた。
本発明者らは、ルミネセンス（蛍光）を検知するためにＳｐａｒｋ１０Ｍマルチモード・マイクロプレート・リーダ（ＴＥＣＡＮ製）を使用した。
【００５４】
（ＡＡＶプロダクション及びインジェクション）
ＡＡＶベクターはＡＡＶヘルパーフリー・システム（アジレント・テクノロジーズ社、サンタクルーズ、ＣＡ、アメリカ）を使用して、作成され、公表された方法に基づいて精製された。簡潔にいうと、ＨＥＫ２９３細胞は、標準のリン酸カルシウム法を使用し、ｐＨｅｌｐｅｒ、ｐＡＡＶ−ＲＣ（セロタイプＤＪ、セルＢｉｏｌａｂｓ社、サンディエゴ（ＣＡ）、アメリカから購入された）と、発現が必要な遺伝子を含むＡＡＶベクター・プラズミドでトランスフェクトされた。３日後に、トランスフェクト細胞は、ａＣＳＦ（人工脳脊髄液、１２４ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１．２５ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、及び１０ｍＭグルコース）に集められサスペンドされた。４回の結氷融解サイクルの後、細胞溶解物は、４５°Ｃでｂｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼ（メルク、ダルムシュタット、ドイツ）で１５分反応された後、２回、１０分間、１６，０００ｇで遠心分離された。上澄は、ウイルス含んでいる溶液として使用された。精製されたウイルスの力価（タイター）を測定するために、上澄がａＣＳＦに溶かされた。
ウイルスのタイターを測定するディジタルＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブを使用して次のプライマーペアにより行なわれた：ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、５'−ＶＩＣ−ＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＴＡＴ−ＭＧＢ−３'、フォーワード：５'−ＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡ−３'、リバース：５'−ＣＡＴＡＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＧＡＴＴＴ−３'。ヒト成長ホルモンｐｏｌｙＡ：５'−ＦＡＭＣＡＣＡＡＴＣＴＴＧＧＣＴＣＡＣＴＧ−ＭＧＢ−３'、フォーワード：５'−ＧＧＧＴＣＴＡＴＴＧＧＧＡＡＣＣＡＡＧＣＴ−３'、リバース：５'−ＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＧ−３'。また、ＡＡＶベクターは、実験の日まで、小さなアリコートとして−８０°Ｃで保存された。
【００５５】
〔結果〕
（ＲＦＰ依存Ｃｒｅリコンビナーゼをデザインするための効率的なＭＢＰペアのスクリーニング）
図３〜図５によると、本発明者らは、活性のあるＣｒｅリコンビナーゼへ結合する最適なＭＢＰペアを選択するために生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）のリポーター・アッセイを行なった。
図３は、Ｃｒｅ−ＤＯＲに効率的なＭＢＰペアをスクリーニングするためのルシフェラーゼ・アッセイの結果を示す。図３の（ａ）はｍＣｈｅｒｒｙ、（ｂ）はｍＲＦＰ１、（ｃ）はｔｄＴｏｍａｔｏ、（ｄ）はＲＦＰなし（Ｎｏ  ＲＦＰｓ）のコントロールについての結果である。左側のグラフは、横軸が各Ｎ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ１〜８とＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ１〜８とのペア、縦軸が相対発光強度（ＲＬＵ）を示す。このＲＬＵが、各ＲＦＰとＭＢＰ１〜ＭＢＰ８との結合性を示している。各ＲＦＰにおいて、右側の写真は、蛍光の強度を示す「ヒートマップ」であり、右側のバーに黒（Ｌｏｗ）〜白（Ｈｉｇｈ）の相対強度を示す。このヒートマップは、右側の濃度のバーで示されるような相対強度で描画される。また、従来技術１のＣｒｅ−ＤＯＧに関するデータを、濃度のバー右側にライン位置として示した。
【００５６】
図３によると、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍＲＦＰ１のヒートマップは類似した。本発明者らは、Ｃｒｅ−ＤＯＭとして、Ｎ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ６及びＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ１のペアを、最良のペアとして選択した。また、Ｎ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ１及びＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ１のペア、又はＮ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ２及びＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ２といった同じＭＢＰを採用したペアは、弱いリポーター活性を呈した。
他方では、ｔｄＴｏｍａｔｏのヒートマップは、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｍＲＦＰ１のそれとは非常に異なっていた。最良のペアは、Ｎ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８及びＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８のペアだった。このため、Ｃｒｅ−ＤＯＴとして、Ｎ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８及びＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８ペアを選択した。
【００５７】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｒｅ−ＤＯＭ及びＣｒｅ−ＤＯＴのリコンビナーゼ活性の特性）  次に、図４〜図５を参照して、選択されたそれぞれのＮ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ及びＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰの機能特性を、ルシフェラーゼ・アッセイで確認した実験の結果について説明する。
図４は、Ｃｒｅ−ＤＯＭとして選択されたＮ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ６及びＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ１のルシフェラーゼ・アッセイの結果を示す。
図４（ａ）の横軸は、ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｎ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ６、及びＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ１をそれぞれ加えた（＋）、又は、加えなかった（−）かについてを示し、縦軸は相対発光強度（ＲＬＵ）を示す。図４（ｂ）は、横軸は、各ＲＦＰ、ＥＧＦＰのコントロール、ＲＦＰなしのコントロールを示し、縦軸は、ＲＬＵを示す。図４（ｃ）は、Ｎ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ６及びＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ１の存在下において、核染色剤として一般的に用いられるＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２の薬剤を加えたコントロール、ＦＬＥＸスイッチを備えたｈｒＧＦＰのベクター、ＦＬＥＸスイッチを備えたＲＦＰｓのベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｄｓＲｅｄの混合物）を、それぞれ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、及びコントロールのＲＦＰなし（Ｎｏ  ＲＦＰｓ）を加えた上で蛍光をみた写真である。
【００５８】
図５は、Ｃｒｅ−ＤＯＴとして選択されたＮ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８及びＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８のルシフェラーゼ・アッセイの結果を示す。図５（ａ）の横軸は、ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｎ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８、及びＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８をそれぞれ加えた（＋）、又は、加えなかった（−）かについてを示し、ＲＬＵを示す。図５（ｂ）は、横軸は、各ＲＦＰ、ＥＧＦＰのコントロール、ＲＦＰなしのコントロールを示し、縦軸は、ＲＬＵを示す。図５（ｃ）は、Ｎ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８及びＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ８の存在下において、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２の薬剤のコントロール、ＦＬＥＸスイッチを備えたｈｒＧＦＰのベクター、ＦＬＥＸスイッチを備えたＲＦＰｓのベクターを、それぞれ、ｔｄＴｏｍａｔｏに加えた、又はコントロールのＮｏ  ＲＦＰｓで蛍光をみた写真である。
【００５９】
図４、図５によれば、各ペア及び標的タンパク質の全てが揃わないとＨＥＫ２９３細胞のＦＬＥＸスイッチは誘導されないことが示された。
また、標的タンパク質、Ｎ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ又はＣ−Ｃｒｅ−ＭＢＰの除去は、リポーター活性を損失させた。
具体的には、図４によれば、Ｃｒｅ−ＤＯＭとして選択されたＣｒｅリコンビナーゼのＮ−末断片又はＣ−末断片は、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１のナノボディに結合されることが分かった。すなわち、Ｎ−Ｃｒｅ及びＣ−Ｃｒｅと単量体のＲＦＰとの結合により、機能するＣｒｅリコンビナーゼへの再結合が生じていた。
同様に、図５によれば、Ｃｒｅ−ＤＯＴとして選択されたＣｒｅリコンビナーゼのＮ−末断片又はＣ−末断片も、ｔｄＴｏｍａｔｏのＤＡＲＰｉｎに結合された。
すなわち、Ｎ−Ｃｒｅ及びＣ−Ｃｒｅと二量体のＲＦＰとの結合により、機能するＣｒｅリコンビナーゼへの再結合が生じていた。
【００６０】
結果として、本実施例のベクターにより、赤色蛍光タンパク質を発現する培養細胞において、目的とする遺伝子発現制御を行うことに成功した。
また、Ｃｒｅ−ＤＯＭはｍＣｈｅｒｒｙ及びｍＲＦＰ１を標的としてＣｒｅリコンビナーゼ活性を発揮するが、ｔｄＴｏｍａｔｏを標的としては機能しなかった。
一方で、Ｃｒｅ−ＤＯＴはｔｄＴｏｍａｔｏを標的としてＣｒｅリコンビナーゼ活性を発揮するが、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１を標的としては機能しなかった。
【実施例２】
【００６１】
〔材料及び手法〕
（動物）
動物に関する実験手順はすべて、自治医科大学の動物実験委員会、及び岡山大学の動物実験委員会によって承認された。オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、日本チャールス・リバー株式会社（神奈川、日本）から購入された。また、ＧＲＰＲ−ｍＲＦＰ１トランスジェニックラットは、坂本浩隆博士によって作出された（未発表）。ＧＲＰＲ−ｍＲＦＰ１トランスジェニックラットは、ＧＲＰＲニューロン特異的にｍＲＦＰ１を発現する。このＧＲＰＲニューロンは、ガストリン放出ペプチド受容体（ｇａｓｔｒｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＧＲＰＲ）を発現する特定のニューロンである。
これらのマウス及びラットは、厳密に１２時間の明／暗サイクル（光期間は０７：３０〜１９：３０、暗期間は１９：３０〜７：３０）、室温（２２±２℃）及び湿度（５５±１５％）に厳密に保たれた。食料と水は適宜摂取可能にされた。
【００６２】
（光照射と薬剤投与）
光照射により惹起されたＣｒｅ−ＤＯＭ、Ｃｒｅ−ＤＯＴの活性調節の確認のため、青色光と、後述するＬＥＸＹドメインとを用いたアッセイを行った。ＬＥＤ平面パネルライト（ＴＨ２−１００Ｘ１００ＢＬ；ＣＣＳ社、京都、日本）を用いて、一様な青色光照射（４６５ｎｍ、３．７Ｗ／ｍ2）を照射した。
薬剤を用いたＣｒｅ−ＤＯＭ、Ｃｒｅ−ＤＯＴの活性調節の確認には、後述するＤｅｘを用いた。Ｄｅｘは、メルク（ダルムシュタット、ドイツ）から購入された。Ｄｅｘは、１ｍＭストック用液からエタノールに溶かされ、プラスミド・トランスフェクション直後に、培地により１μＭに薄められた。
【００６３】
（ＤＮＡコンストラクション）
Ｃｒｅ−ＤＯＲのｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）での働きを確認するため、Ｎ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ、Ｃ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ、ＦＬＥＸ−ｐａｌＧＦＰ、及び標的ＲＦＰをコード化するＡＡＶベクターを生成した。ここで、ｐａｌＧＦＰは、膜移行性ＧＦＰ（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ＧＦＰ）の一例であり、ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｉｏｎシグナルがタグ付けされたＧＦＰである。ｐａｌＧＦＰをコードするベクターは、タカヒロ・ヨシダ博士（京都大学）の好意により提供された。ｐａｌＧＦＰにより、ニューロンの神経繊維が効果的にトレースされた。これらのＡＡＶベクターは、上述の実施例１と同様に、ｐＡＡＶ−ＥＦ１ａ−Ｎ−ＣｒｅｔｒｃｉｎｔＧ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ：６９５７０）又はｐＡＡＶ−ＥＦ１ａ−Ｃ−ＣｒｅｉｎｔＧ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ：６９５７１）を用いてコンストラクトした。
また、各ＲＦＰについて、細胞内局在化シグナルを付加したベクターも作成した。これらの細胞内局在化シグナル用のペプチドのアミノ酸配列は、従来の配列（ＣＡＡＸ  ｍｏｔｉｆ、ＮＥＳ、及びＮＬＳ）を用いた。また、各ＲＦＰについて、選択的な細胞内局在の移行を行わせるため、ＬＥＸＹドメイン及びＧＲ（グルココルチコイド受容体）のペプチドのアミノ酸配列を付加したベクターも作成した。
【００６４】
（定位的ＡＡＶ注入）
定位的ＡＡＶ注入手術は、定位固定装置を使用して、アバチン（２００ｍｇ／ｋｇ体重）によって麻酔下で注射された。ＡＡＶベクター（Ｃｒｅ−ＤＯＭ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス用アッセイ：各１×１０12ｖｇ／ｍｌ、５００ｎｌ。Ｃｒｅ−ＤＯＭ  ＧＲＰＲ−ｍＲＦＰ１ラット用アッセイ：各３×１０11ｖｇ／ｍｌ、３μｌ。Ｃｒｅ−ＤＯＴアッセイ：各４×１０11ｖｇ／ｍｌ、５００ｎｌ）が、１０週のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右半球Ｍ１皮質（ブレグマから前方に０．７ｍｍ、右側に１．７ｍｍ、腹側から０．８ｍｍ）、又はＧＲＰＲ−ｍＲＦＰ１ラットの右半球視索前野（ブレグマから後方に０．８ｍｍ、右側に０．３ｍｍ、腹側に８．０ｍｍ）に注射された。
【００６５】
（免疫組織化学及び蛍光顕微鏡法）
ウイルス注射の４週間後、アバチンによりマウスを麻酔し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒド、続いて、ヘパリン処理生理食塩水（２０Ｕ／ｍｌ）で経心灌流した。脳は摘出され、４％パラホルムアルデヒド溶液中にて、オーバーナイトで後固定され、沈降するまで０．１Ｍリン酸緩衝液中の３０％ショ糖溶液に移された。クライオスタット（ＣｒｙｏＳｔａｒ  ＮＸ７０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、アメリカ合衆国）を用いて一連の４０μｍ切片を得た。脳切片は蛍光顕微鏡（ＩＸ７３、オリンパス、東京、日本）でマウントされ試験された。
【００６６】
（統計解析）
統計解析は、ウィンドウズ（登録商標）用のＧｒａｐｈＰａｄプリズム６（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、サンディエゴ、ＣＡ、アメリカ合衆国）を使用して行われた。スチューデントｔ検定によって、平均とＳＥＭがシンプルに比較された。また、平均とＳＥＭの多重比較は、一元配置ＡＮＯＶＡ分析に続いてＴｕｋｅｙ検定によって行われた。０．０５未満の確率（Ｐ値）は、これらの研究において重要であると考慮された。
【００６７】
〔結果〕
（マウス脳内でのＣｒｅ−ＤＯＭの機能確認）
図６Ａ〜図６Ｆによると、本発明者らは、Ｃｒｅ−ＤＯＲのｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）での働きを確認するため、まず、単量体型ＲＦＰ依存的Ｃｒｅ（Ｃｒｅ−ＤＯＭ）のマウス脳内での機能確認のアッセイを行った。この際、Ｎ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ、Ｃ−Ｃｒｅ−ＭＢＰ、ＦＬＥＸ−ｐａｌＧＦＰ、及び標的ＲＦＰをコード化するＡＡＶベクターを用いた。また、Ｍ１皮質錐状体細胞からの延伸する軸索を観察した。
【００６８】
図６Ａは、本実施例の機能確認における、野生型マウスの大脳皮質Ｍ１領域に４種類のウイルスベクターを注入する模式図を示す。本アッセイでは、４種類のウイルスが、皮質のＭ１領域に同時に注入された。右枠内が注入部位（Ｍ１）、左枠内がＭ１領域の神経細胞がその軸索を延ばす脳梁（ｃｏｒｐｕｓ  ｃａｌｌｏｓｕｍ、ｃｃ）を示す。Ｍ１領域に存在する錐体細胞は脳梁を通って反対側のＭ１領域に軸索を伸ばしていることが知られている。
図６Ｂは、Ｃｒｅ−ＤＯＭの作用機序について説明する概念図である。ｍＲＦＰ１により活性化されたＣｒｅ−ＤＯＭによって、ｐａｌＧＦＰに特異的な発現が引き起こされる。
図６Ｃは、ウイルス注入部位、及び当該注入部位の投射先でのｐａｌＧＦＰ発現の確認を行った結果である。具体的には、図６Ｃは、ベクターの注入から４週間後における、注入されたマウスのＭ１皮質及び脳梁の蛍光画像を示す。アローヘッドは、ｐａｌＧＦＰとｍＲＦＰ１の共同局在化を示す。図内のスケールバーは５０μｍを示す。標的のｍＲＦＰ１を発現するベクターをＣｒｅ−ＤＯＭベクターに注入したところ、注入されたマウスは、Ｍ１皮質の中でリポーターｐａｌＧＦＰの明瞭な発現を示した。
図６Ｄは、図６ＣのＧＦＰ発現の定量化データである。具体的には、対側性の脳梁の軸索密度の定量分析を行った（それぞれ、ｎ＝４、３）。この結果、Ｃｒｅ−ＤＯＭ＋ｍＲＦＰ１とＣｒｅ−ＤＯＭ＋ｍＲｕｂｙマウスの間で、有意差を示した。データは、平均±ＳＥＭを示す。統計解析として、スチューデントのｔ検定を行った（「＊＊」は、Ｐ＜０．０１）。これらのｐａｌＧＦＰ発現は、Ｃｒｅ−ＤＯＭベクター及びｍＲｕｂｙ発現ベクターを注入したマウスでは、観察されなかった。
【００６９】
次に、本発明者らは、ＧＲＰＲニューロン特異的にｍＲＦＰ１を発現するＧＲＰＲ−ｍＲＦＰ１トランスジェニックラットにおいて、ｍＲＦＰ１を発現するニューロンの選択的遺伝子発現を確認した。
図６Ｅは、ｍＲＦＰ１を発現するニューロンの選択的遺伝子発現での機能確認模式図の模式図である。このアッセイでは、ｍＲＦＰ１を発現するＧＲＰＲ−ｍＲＦＰ１トランスジェニックラットの視床下部の視索前野（ｐｒｅｏｐｔｉｃ  ａｒｅａ、ＰＯＡ）に３種類のウイルスベクターが注入される。
図６Ｆは、ＧＲＰＲ−ｍＲＦＰ１トランスジェニックラット脳内でのＣｒｅ−ＤＯＭ機能確認のアッセイの写真である。本発明者らがＣｒｅＤＯＭベクターをＰＯＶに注入した際、注入されたラットはｍＲＦＰ１を発現するニューロン中でｈｒＧＦＰの選択的遺伝子発現を示した。
【００７０】
（マウス脳内でのＣｒｅ−ＤＯＴの機能確認）
さらに、本発明者らは、二量体型ＲＦＰ依存的Ｃｒｅ（Ｃｒｅ−ＤＯＴ）の生体内での選択的遺伝子発現を確認するため、マウス脳内での機能確認アッセイを行った。
本発明者らは、標的としてｎｌｓ−ｔｄＴｏｍａｔｏを発現するベクターをＣｒｅ−ＤＯＴベクターに注入した。ｎｌｓ−ｔｄＴｏｍａｔｏは、核移行シグナル（ＮＬＳ）が付加された核内移行型のｔｄＴｏｍａｔｏである。ｔｄＴｏｍａｔｏは非常に強い蛍光強度をもつため、本アッセイにおいては、漏れ緑色蛍光による誤り検知の可能性を除外するために、ｎｌｓ−ｔｄＴｏｍａｔｏを使用した。
【００７１】
図７Ａは、野生型のマウスにｔｄＴｏｍａｔｏを注入して、Ｃｒｅ−ＤＯＴのアッセイを行う模式図である。４種類のウイルスがＭ１皮質に注入される。これは、図６Ａと同様である。
図７Ｂは、ｔｄＴｏｍａｔｏによって活性化されたＣｒｅ−ＤＯＴによって、ｐａｌＧＦＰに特異的な発現が引き起こされる概念図である。これも、図６Ｂと同様である。
図７Ｃは、野生型マウスの大脳皮質Ｍ１領域及び脳梁の蛍光画像である。本発明者らは、対側性の脳梁を通過する軸索を観察した。Ｍ１領域の錐体ニューロンは、脳梁まで軸索を伸張している。図内のスケールバーは、５０μｍを示す。ベクターを注入されたマウスは、Ｍ１皮質の中でリポーターｐａｌＧＦＰの明瞭な発現を示した。
【００７２】
図７Ｄは、Ｃｒｅ−ＤＯＴが標的として認識しない単量体のｍＲｕｂｙを用いた比較例の対照実験の模式図である。４種類のウイルスが、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのＭ１皮質に注入される。
図７Ｅは、図７Ｄの対照実験のＭ１皮質及び対側性の脳梁の蛍光画像である。スケールバーは、５０μｍである。図７Ｃと比較すると、ｐａｌＧＦＰは、殆ど観察されないことを確認した。
図７Ｆは、反対側の脳梁における軸索密度の定量分析（各ｎ＝３）を示す。統計解析はスチューデントのｔ検定により行った。各グラフは平均±ＳＥＭを表わす。また、統計解析はスチューデントのｔ検定（「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１を示す）により行った。この軸索の定量分析によれば、Ｃｒｅ−ＤＯＴ＋ｎｌｓ−ｔｄＴｏｍａｔｏと、Ｃｒｅ−ＤＯＴ＋ｍＲｕｂｙマウスとでは、明確な差を示した。
【００７３】
（Ｃｒｅ−ＤＯＲの細胞内局在変化による機能変化確認）
Ｃｒｅリコンビナーゼは、細胞の核内で活性を生じる。また、上述したように、標的ＲＦＰの特異的結合が、再結合したＣｒｅリコンビナーゼを安定させる。このため、標的ＲＦＰの細胞内局在変化はＣｒｅ−ＤＯＲリコンビナーゼの活性に影響する場合がある。この仮説を調べるために、本発明者らは、いくつかの細胞内局在化シグナルのペプチドを付加したｍＲＦＰ１及びｔｄＴｏｍａｔｏを作成し、標的ＲＦＰの細胞内局在変化によるＣｒｅ−ＤＯＭ、Ｃｒｅ−ＤＯＴの機能変化について調べた。
【００７４】
図８は、ｍＣｈｅｒｒｙ，ｔｄＴｏｍａｔｏに付加した細胞内局在化シグナルのペプチドのアミノ酸配列の模式図である。ＣＡＡＸは膜移行シグナル、ＮＥＳは核外移行シグナル、ＮＬＳは核内移行シグナルをそれぞれ示す。
図８Ｂは、図８Ａのシグナル配列付加によるｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏの細胞内局在変化を示す蛍光画像である。スケールバーは、５０μｍを示す。これらの細胞内局在化シグナルを付与することで、明確な細胞内局在変化が観察された。
図８Ｃは、細胞内局在性の異なるＲＦＰによる、Ｃｒｅ−ＤＯＭ又はＣｒｅ−ＤＯＴのルシフェラーゼ・アッセイの結果である。つまり、各グラフは、図８Ｂのそれぞれに対して、Ｃｒｅ−ＤＯＭ、Ｃｒｅ−ＤＯＴを機能させたときのＣｒｅ活性の変化を示す。また、各グラフは、平均±ＳＥＭを示す。これらのＲＦＰ変異体を標的として、Ｃｒｅ−ＤＯＭ又はＣｒｅ−ＤＯＴについてルシフェラーゼ・アッセイを行った結果、標的ＲＦＰの細胞内局在変化により、明確な有意差を生じた。つまり、これらのルシフェラーゼ・アッセイの定量分析によれば、標的ＲＦＰの膜、核外、核内の細胞内局在の違いにより、リコンビナーゼ活性が著しく異なっていた。
【００７５】
（青色光を用いたＣｒｅ−ＤＯＭ、Ｃｒｅ−ＤＯＴの活性調節）
上述のＲＦＰの細胞内局在変化アッセイの結果は、標的ＲＦＰの細胞内局在変化を変化させることができれば、Ｃｒｅ−ＤＯＲ活性を制御することができることを示唆する。この仮説を確認するため、本発明者らは、光駆動性ドメインを用いたＣｒｅ−ＤＯＭ、Ｃｒｅ−ＤＯＴの活性調節を確認した。本実施例では、光駆動性ドメインの一例であるＬＥＸＹドメインを用いた。また、本アッセイでは、ＮＬＳ及びＬＥＸＹドメインを付与したｎｌｓ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＬＥＸＹ及びｎｌｓ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＬＥＸＹのベクターを作成して用いた。
【００７６】
図９Ａは、ＬＥＸＹドメインを用いたＲＦＰの核外移行の概念図を示す。ＬＥＸＹドメインは、エンバク（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）の青色光受容体タンパク質フォトトロピン（Ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｉｎ）１（ＡｓＬＯＶ２）由来の遺伝子改変ＬＯＶ２ドメインからなる。このＬＯＶ２ドメインでは、ＡｓＬＯＶ２のＣ末のＪαヘリックスが、ＮＥＳのモチーフに変更されている。このＮＥＳは、暗所ではＡｓＬＯＶ２の中心部にしっかりとパックされ、不活性である。また、青色光が照射されると、Ｊαヘリックスの変性が惹起され、ＮＥＳが露出される。これにより、標的のＲＦＰが核外に移行される。
【００７７】
図９Ｂは、青色光照射（４６０ｎｍ、３．７Ｗ／ｍ2）有り（Ｂｌｕｅ  Ｌｉｇｔ）、又は照射無し（Ｎｏ  Ｌｉｇｈｔ）の状態における、ｎｌｓ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＬＥＸＹと、核マーカーであるヒストン（Ｈｉｓｔｏｎｅ  ２Ｂ）の蛍光画像を示す。スケールバーは、５０μｍである。ｎｌｓ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＬＥＸＹは、暗所で核内に細胞内局在した。これに対して、青色光照射により、核外への細胞内局在化が引き起こされた。
図９Ｃは、Ｃｒｅ−ＤＯＭの活性変化を示すグラフである。具体的には、ｎｌｓ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＬＥＸＹを標的とするＣｒｅ−ＤＯＭ活性のルシフェラーゼ・アッセイの定量分析の結果を示す。各グラフは、青色光照射無し（Ｎｏ  ＢＬ）、有り（ＢＬ）おける、平均±ＳＥＭを示す（各ｎ＝２４及び１２）。統計解析は、スチューデントのｔ検定により行った（「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１を示す）。結果として、青色光照射により、Ｃｒｅ−ＤＯＭの活性が、有意に強く抑制された。
【００７８】
図９Ｄは、青色光照射（４６０ｎｍ、３．７Ｗ／ｍ2）有り（Ｂｌｕｅ  Ｌｉｇｔ）、又は照射無し（Ｎｏ  Ｌｉｇｈｔ）の状態における、ｎｌｓ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＬＥＸＹの蛍光画像を示す。スケールバーは、５０μｍである。このｎｌｓ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＬＥＸＹも、暗所で核内に細胞内局在した。しかし、青色光照射により、核外への局在化が引き起こされた。
図９Ｅは、Ｃｒｅ−ＤＯＴの活性変化を示すグラフである。具体的には、ｎｌｓ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＬＥＸＹを標的とするＣｒｅ−ＤＯＴ活性のルシフェラーゼ・アッセイの定量分析の結果を示す。各グラフは、青色光照射の青色光照射無し（Ｎｏ  ＢＬ）、有り（ＢＬ）における、平均±ＳＥＭを示す（各ｎ＝２４及び１２）。統計解析はスチューデントのｔ検定により行った（「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１を示す）。結果として、青色光照射により、Ｃｒｅ−ＤＯＴの活性も強く抑制された。
【００７９】
これらの定量分析により、青色光有り（ＢＬ（＋））、無し（ＢＬ）において、リコンビナーゼ活性が著しく異なることを確認した。
【００８０】
（薬剤を用いたＣｒｅ−ＤＯＭ、Ｃｒｅ−ＤＯＴの活性調節）
次に、本発明者らは、化学的なリガンドとなるような薬剤を用いて、Ｃｒｅ−ＤＯＲ活性をコントロール可能であることを確認した。具体的には、本発明者らは、ＲＦＰのリガンドに引き起こされた核局在化を達成する一例として、核内受容体であるＧＲと、このリガンドであるＤｅｘを用いた。ここでは、ＧＲドメインを付与したｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＲ及びｔｄＴｏｍａｔｏ−ＧＲのベクターを作成して用いた。
【００８１】
図１０Ａは、ＧＲとＤｅｘ添加によるｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏの核内移行を示す概念図である。ＧＲは核内受容体の一種であり、リガンドＤｅｘを受け取ると、その細胞内局在化を変更させ、核内移行させる。
図１０Ｂは、Ｄｅｘ（１μＭ、１時間）の投与の有り（＋Ｄｅｘ）、無し（Ｎｏ  Ｄｅｘ）に対する、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＲの蛍光画像を示す。スケールバーは、５０μｍである。ヒストン（Ｈｉｓｔｏｎｅ  ２Ｂ）は、核内マーカーである。ｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＲは、リガンドであるＤｅｘが投与されていない（無し）の場合、核外の細胞質に集中することを示した。対照的に、Ｄｅｘが投与されている（有り）の場合、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＲは、核への細胞内局在化の移動が引き起こされた。
図１０Ｃは、Ｄｅｘ投与によるＣｒｅ−ＤＯＭの活性変化を示す。具体的には、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＲを標的として、Ｄｅｘ投与無し（Ｄｅｘ（−））、投与有り（Ｄｅｘ（＋））なしのＣｒｅ−ＤＯＭ活性のルシフェラーゼ・アッセイの結果（各ｎ＝１２）を示すグラフである。各グラフは、平均±ＳＥＭを表わす。統計解析はスチューデントのｔ検定により行った（「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１）。結果として、ＤｅｘがＣｒｅ−ＤＯＭ活性を有意に強く増加させたことを示した。
【００８２】
図１０Ｄは、Ｄｅｘ（１μＭ、１時間）の投与の有り（＋Ｄｅｘ）、無し（Ｎｏ  Ｄｅｘ）に対する、ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＧＲの蛍光画像を示す。スケールバーは、５０μｍである。ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＧＲも、Ｄｅｘが投与されていない（無し）の場合、核外の細胞質に集中した。対照的に、Ｄｅｘが投与されている（有り）の場合、ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＧＲも、核への細胞内局在化の移動が引き起こされた。
図１０Ｅは、Ｄｅｘ投与によるＣｒｅ−ＤＯＴの活性変化を示すグラフである。具体的には、ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＧＲを標的として、Ｄｅｘ投与無し（Ｄｅｘ（−））、投与有り（Ｄｅｘ（＋））なしのＣｒｅ−ＤＯＴ活性のルシフェラーゼ・アッセイの結果（各ｎ＝１２）を示すグラフである。各グラフは、平均±ＳＥＭを表わす。統計解析はスチューデントのｔ検定により行った（「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１）。結果として、ＤｅｘがＣｒｅ−ＤＯＴ活性も、有意に強く増加させたことを示した。
【００８３】
これらの定量分析により、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＲ又はｔｄＴｏｍａｔｏ−ＧＲを標的とした際のリコンビナーゼ活性が、Ｄｅｘの投与の有無で有意に異なることを確認した。
【００８４】
（結論）
本実施例において、本発明者らは、結合蛋白質モチーフとしてナノボディとＤＡＲＰｉｎを標的タンパク質に使用することにより、ＲＦＰ（Ｃｒｅ−ＤＯＲ）に依存する機能的なＣｒｅリコンビナーゼを生成した。これらのＣｒｅ−ＤＯＲは、単量体及び二量体のＲＦＰ依存のＣｒｅであるＣｒｅ−ＤＯＭ及びＣｒｅ−ＤＯＴから構成される。
本発明者らは、生体内で、Ｃｒｅ−ＤＯＭ及びＣｒｅ−ＤＯＴが標的の単量体／二量体のＲＦＰにおいて活性があることを確認し、標的ＲＦＰなしの際の活性が非常に低くなる（低リーク）ことを確認した。
また、本実施例において、ＲＦＰを発現するトランスジェニック動物の有用性も証明された。加えて、本発明者らは、Ｃｒｅ−ＤＯＲの活性が、標的ＲＦＰの細胞内局在変化によって影響を受けることを確認した。
また、本発明者らは、ＡｓＬＯＶ２ドメイン及びグルココルチコイド受容体による細胞内局在の移動により、Ｃｒｅ−ＤＯＲ活性の光惹起及び薬剤投与によるコントロールを実現できた。
また、本実施例により、細胞を発現するＲＦＰの中で遺伝子発現を選択的に調整するために、既存のＲＦＰトランスジェニック系統を利用する新規方式について、マウスとラットの生体内実験で実証した。本実施例によれば、特に動物の中で同じトランスジェニック系統を異なる目的に使用する、効率的な方法を提供することを示した。また、本実施例により、Ｃｒｅのトランスジェニック系統の代用品として使用できるだけでなく、ＲＦＰを発現する細胞をマークするユニークな方法を提供することができる。
また、本発明者らは、Ｃｒｅ−ＤＯＲが標的ＲＦＰタンパク質の核局在化に依存することを明らかにした。特に、標的ＲＦＰが原形質膜（図８Ｃ）に集中する場合、Ｃｒｅ−ＤＯＲ活性は最小となっていた。
【００８５】
なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明によれば、赤色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック生物について、新規の遺伝子発現制御方法及び遺伝子発現制御キットを提供でき、産業上利用可能である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【配列表】
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