(57)【要約】      （修正有）【課題】長期間保存後もリゾチーム変性物の抗ノロウィルス活性を維持しうる製剤、及びその製造方法の提供。【解決手段】リゾチーム変性物及び／又はその塩と、デキストリンを含む、リゾチーム変性物含有粉末であって、４０℃、７５％ＲＨの条件下で４週間保存されたときの以下に規定される抗ノロウィルス活性が２．０以上であり、かつ前記保存前後における抗ノロウィルス活性の低下値が３．０以下であり、好ましくは、２．０以上である、リゾチーム変性物含有粉末。抗ノロウィルス活性：ノロウィルス液と、リゾチーム変性物を固形分換算で２質量％含有する上記リゾチーム変性物含有粉末水溶液とを等量混合して得られたノロウィルス混合液を２５℃で１分間放置した時の、放置前の感染価の対数から放置後の感染価の対数を引いた値。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リゾチーム変性物及び／又はその塩と、
デキストリンと
を含む、リゾチーム変性物含有粉末であって、
４０℃、７５％ＲＨの条件下で４週間保存されたときの下記に規定される抗ノロウィルス活性が２．０以上であり、かつ、
前記保存前後における抗ノロウィルス活性の低下値が３．０以下である、
リゾチーム変性物含有粉末。
抗ノロウィルス活性：ノロウィルス液と、リゾチーム変性物を固形分換算で２質量％含有する前記リゾチーム変性物含有粉末水溶液とを等量混合して得られたノロウィルス混合液を２５℃で１分間放置した時の、放置前の感染価の対数から放置後の感染価の対数を引いた値。
【請求項２】
請求項１に記載のリゾチーム変性物含有粉末において、
前記保存開始前の抗ノロウィルス活性が２．０以上である、リゾチーム変性物含有粉末。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のリゾチーム変性物含有粉末において、
前記リゾチーム変性物及び／又はその塩の含有量が固形分換算で３０質量％以上８０質量％以下である、リゾチーム変性物含有粉末。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のリゾチーム変性物含有粉末において、
前記リゾチーム変性物及び／又はその塩と、前記デキストリンとの質量比が、１：０．１〜１：１．２である、リゾチーム変性物含有粉末。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のリゾチーム変性物含有粉末において、
前記デキストリンが、ＤＥ２０以下のデキストリン及びシクロデキストリンから選択される少なくとも１つのものである、リゾチーム変性物含有粉末。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のリゾチーム変性物含有粉末において、
下記に規定される前記保存開始前のリゾチーム変性物含有粉末の蛍光強度が４，０００以上である、リゾチーム変性物含有粉末。
蛍光強度：前記保存開始前のリゾチーム変性物含有粉末を、リゾチーム変性物の濃度が固形分換算で０．０５質量％になり且つリン酸塩の濃度が０．２Ｍとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、得られる希釈液５ｍＬに８ｍＭの１，８−アニリノナフタレンスルホン酸のメタノール溶液２５μＬを添加し、得られる液を３０分間２５℃で反応させた後、該反応液について励起波長３９０ｎｍ（励起バンド幅１０ｎｍ）及び蛍光波長４７０ｎｍ（蛍光バンド幅１０ｎｍ）の条件にて測定された蛍光強度
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のリゾチーム変性物含有粉末において、
前記リゾチーム変性物が加熱変性物である、リゾチーム変性物含有粉末。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のリゾチーム変性物含有粉末を含有する、医薬製剤。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載のリゾチーム変性物含有粉末の製造方法において、
リゾチーム変性物及び／又はその塩と、
デキストリンと
を含有する混合液を乾燥する工程を含む、リゾチーム変性物含有粉末の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、長期間保存後も抗ノロウィルス活性を維持しうるリゾチーム変性物含有粉末、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ノロウィルスはヒトに対する感染力が高く、食中毒やウィルス性急性胃腸炎（感染症）を引き起こすことが知られている。現在、ノロウィルスには有効なワクチンがなく、一旦発症すると治療は輸液等の対症療法に限られてしまい、高齢者等では重症化する場合もある。
【０００３】
ノロウィルスの感染経路は主に経口感染である。そのため、食中毒や感染症の発生の予防及び発生後の拡大防止のためには、環境に存在するノロウィルスを不活化することが極めて重要である。
【０００４】
従来、アルコール製剤をはじめとすると多くの消毒薬は、ノロウィルスの不活化には無効とされ、不活化のためには、８５℃１分以上の加熱や次亜塩素酸ナトリウムによる処理が推奨されている。しかしながら、次亜塩素酸ナトリウムは、金属に対する腐食作用、皮膚に対する刺激作用、衣類等に対する漂白作用があるので実際上の使用は制限される。そのため、次亜塩素酸ナトリウムに代わるノロウィルス不活化剤の開発が望まれている。
【０００５】
一方、近年、抗菌剤分野において、リゾチーム又はその変性物を有効成分とした種々の製剤が報告されている。リゾチームは動植物界に広く分布し、哺乳動物の涙、唾液、尿、乳、鳥類の卵中の卵白、魚類の体表粘液、微生物、バクテリオファージＴ４等から取得可能である。なかでも卵白由来のリゾチーム又はその変性物は大量製造が可能であることから、抗菌剤の開発において特に利用されている。
【０００６】
例えば、特許文献１には、リゾチーム変性物を有効成分として用いることにより、優れたノロウィルス不活化剤を調製しうることが本出願人により報告されている。しかしながら、ノロウィルスが広範囲に渡り流行していることを踏まえると、優れた不活性化効果を有する抗ノロウィルス製剤の開発が依然として望まれているといえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第５８０６４３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような技術状況下、本発明者らは、リゾチーム変性物を有効成分とする種々の製剤を製造し、その抗ノロウィルス活性の経時的変化を観察した。その結果、リゾチーム変性物を長期間に渡り保存すると、その抗ノロウィルス活性が著しく低下する場合があることが明らかとなった。
【０００９】
従って、本発明の課題は、長期間保存後もリゾチーム変性物の抗ノロウィルス活性を維持しうる製剤、及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、今般、リゾチーム変性物及び／又はその塩と、デキストリンとを組合せて粉末化することにより、長期間保存後もリゾチーム変性物の抗ノロウィルス活性を効果的に維持しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明によれば、以下の（１）〜（９）が提供される。
（１）リゾチーム変性物及び／又はその塩と、
デキストリンと
を含む、リゾチーム変性物含有粉末であって、
４０℃、７５％ＲＨの条件下で４週間保存後の下記に規定される抗ノロウィルス活性が２．０以上である、リゾチーム変性物含有粉末。
抗ノロウィルス活性：ノロウィルス液と、リゾチーム変性物を固形分換算で２質量％含有する前記リゾチーム変性物含有粉末水溶液とを等量混合して得られたノロウィルス混合液を２５℃で１分間放置した時の、放置前の感染価の対数から放置後の感染価の対数を引いた値。
（２）（１）に記載のリゾチーム変性物含有粉末において、
前記保存開始前の抗ノロウィルス活性が２．０以上である、リゾチーム変性物含有粉末。
（３）（１）又は（２）に記載のリゾチーム変性物含有粉末において、
粉末化前のリゾチーム変性物の抗ノロウィルス活性が２．０以上である、リゾチーム変性物含有粉末。
（３）（１）又は（２）に記載のリゾチーム変性物含有粉末において、
前記リゾチーム変性物及び／又はその塩の含有量が固形分換算で３０質量％以上８０質量％以下である、リゾチーム変性物含有粉末。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載のリゾチーム変性物含有粉末において、
前記リゾチーム変性物及び／又はその塩と、前記デキストリンとの質量比が、１：０．１〜１：１．２である、リゾチーム変性物含有粉末。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載のリゾチーム変性物含有粉末において、
前記デキストリンが、ＤＥ２０以下のデキストリン及びシクロデキストリンから選択される少なくとも１つのものである、リゾチーム変性物含有粉末。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載のリゾチーム変性物含有粉末において、
下記に規定される前記保存開始前のリゾチーム変性物含有粉末の蛍光強度が４，０００以上である、リゾチーム変性物含有粉末。
蛍光強度：前記保存開始前のリゾチーム変性物含有粉末を、リゾチーム変性物の濃度が固形分換算で０．０５質量％になり且つリン酸塩の濃度が０．２Ｍとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、得られる希釈液５ｍＬに８ｍＭの１，８−アニリノナフタレンスルホン酸のメタノール溶液２５μＬを添加し、得られる液を３０分間２５℃で反応させた後、該反応液について励起波長３９０ｎｍ（励起バンド幅１０ｎｍ）及び蛍光波長４７０ｎｍ（蛍光バンド幅１０ｎｍ）の条件にて測定された蛍光強度
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載のリゾチーム変性物含有粉末において、
前記リゾチーム変性物が加熱変性物である、リゾチーム変性物含有粉末。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載のリゾチーム変性物含有粉末を含有する、医薬製剤。
（９）（１）〜（７）のいずれかに記載のリゾチーム変性物含有粉末の製造方法において、
リゾチーム変性物及び／又はその塩と、
デキストリンと
を含有する混合液を乾燥する工程を含む、リゾチーム変性物含有粉末の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、上述のようなリゾチーム変性物含有粉末を用いることにより、リゾチーム変性物の有する優れた抗ノロウィルス活性を長期間維持することができる。本発明は、従前より広く利用されているリゾチームを原料とすることから、ノロウィルスの不活性化を安全に実施する上で有利である。また、本発明は、リゾチーム変性物を安全かつ安定に保存しうることから、ノロウィルスの不活性化剤の製造及び使用において有利に利用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本発明において、格別に断らない限り、「部」は「質量部」を意味し、「％」は「質量％」を意味する。また、本明において、格別に断らない限り、「室温」とは、２０〜２５℃を意味する。
【００１４】
＜発明の特徴＞
本発明は、リゾチーム変性物及び／又はその塩と、デキストリンとを組み合わせて粉末化することにより、４０℃、７５％ＲＨの条件下で４週間保存後の抗ノロウィルス活性が２．０以上であり、上記保存前後における抗ノロウィルス活性の低下値が３．０以下であるリゾチーム変性物含有粉末を提供することを特徴としている。
【００１５】
本発明のリゾチーム変性物含有粉末の上記４０℃、７５％ＲＨの条件下で４週間保存後の抗ノロウィルス活性は、ノロウィルス液と、リゾチーム変性物を固形分換算で２質量％含有する上記リゾチーム変性物含有粉末水溶液とを等量混合して得られたノロウィルス混合液を２５℃で１分間放置した時の、放置前の感染価の対数から放置後の感染価の対数を引いた値とされる。本発明の抗ノロウィルス活性は、後述する実施例の記載に従い測定することができる。ここで、ノロウィルス液の濃度は、感染価１０６〜１０７ＰＦＵ／ｍＬであり、好ましくは感染価１０６ＰＦＵ／ｍＬである。
【００１６】
本発明のリゾチーム変性物含有粉末における上記抗ノロウィルス活性の下限は、上述の通り、２．０であり、好ましくは２．５であり、より好ましくは３．０であり、さらに好ましくは３．５であり、さらに一層好ましくは４．０である。また、本発明のリゾチーム変性物含有粉末の抗ノロウィルス活性の上限は、特に限定されないが、例えば、７．０であり、好ましくは６．０である。また、抗ノロウィルス活性の好適な範囲は、上述した上限および下限の組合せから選択することができ、２．０以上７．０以下、２．０以上６．０以下等が挙げられる。上述のような高レベルのノロウィルス活性を有するリゾチーム変性物含有粉末は、ノロウィルスの消毒ないし滅菌において有利に利用することができる。
【００１７】
また、本発明のリゾチーム変性物含有粉末によれば、長期の保存期間にわたり抗ノロウィルス活性を高レベルで維持することが可能である。本発明のリゾチーム変性物含有粉末について４０℃、７５％ＲＨの条件下で４週間の保存試験を行う場合、保存前後における抗ノロウィルス活性の低下値は３．０以下に維持することができる。ここで、「保存前後における抗ノロウィルス活性の低下値」とは、「上記保存試験の開始の時点のリゾチーム変性物含有粉末の抗ウィルス活性から、保存試験の終了時のリゾチーム変性物含有粉末の抗ウィルス活性を差し引いた値」を意味する。かかる保存前後における抗ノロウィルス活性の低下値の好ましい上限は、好ましくは２．５であり、より好ましくは２．０であり、さらに好ましくは１．５とされる。また、本発明の上記保存前後における抗ノロウィルス活性の低下値の下限は、好ましくは−２．５であり、より好ましくは−２．０であり、さらに好ましくは−１．５、さらに好ましくは０とされる。
【００１８】
本発明のリゾチーム変性物含有粉末によれば、上記のような抗ノロウィルス活性を、長期間にわたり高レベルで維持することができる。したがって、上記保存試験の開始時期は、特に限定されないが、例えば、リゾチーム変性物含有粉末の製造から好ましくは２０年間以内、さらに好ましくは１５年間以内、さらに好ましくは１０年間以内、さらに好ましくは５年間以内、さらに好ましくは１年間以内、さらに好ましくは半年以内、さらに一層好ましくは製造直後とされる。
【００１９】
また、本発明のリゾチーム変性物含有粉末の上記保存開始前の蛍光強度は、抗ノロウィルス活性の指標とすることができる。本発明のリゾチーム変性物含有粉末の蛍光強度は、後述する原料となるリゾチーム変性物及び／又はその塩と同様、好ましくは４，０００以上であり、より好ましくは５，０００以上である。
【００２０】
上記のリゾチーム変性物含有粉末の蛍光強度の値は、以下に説明する手法により測定される。すなわち、リゾチーム変性物含有粉末を、リゾチーム変成物の濃度が固形分換算で０．０５質量％になり且つリン酸塩の濃度が０．２Ｍとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈して希釈液を得、該希釈液５ｍＬに８ｍＭの１，８−アニリノナフタレンスルホン酸のメタノール溶液２５μＬを添加し、得られる液を３０分間２５℃で反応させ、該反応液の蛍光強度について、励起波長３９０ｎｍ（励起バンド幅１０ｎｍ）及び蛍光波長４７０ｎｍ（蛍光バンド幅１０ｎｍ）の条件にて測定する。かかる方法により測定された蛍光強度の値が、のリゾチーム変性物含有粉末の蛍光強度とされる。なお、リゾチーム変性物の濃度が固形分換算で０．０５質量％であり、リン酸塩の濃度が０．２Ｍとなるようにリン酸緩衝液で希釈するとは、具体的には、例えばリゾチーム変性物を固形分換算で１質量％含有する水溶液の蛍光強度を測定する場合、前記水溶液５ｇと０．２５Ｍのリン酸緩衝液８０ｍＬを１００ｍＬのメスフラスコに入れた後、精製水で１００ｍＬにメスアップすることで調節されることをいう。なお、本発明の蛍光強度の測定方法のさらなる詳細は、後述する実施例の記載の従い、Canadian Institute of Food Science and Technology 1985 Vol.18 No.4 p.290-295の記載の方法に準じるものとする。
【００２１】
＜リゾチーム変性物及び／又はその塩＞
本発明のリゾチーム変性物含有粉末は、リゾチーム変性物及び／又はその塩を原料として製造されるものである。本発明において、「リゾチーム」とは、Ｎ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミン酸とのβ−１，４結合を加水分解する性質を有するタンパク質をいう。そして、本発明において、「リゾチーム変性物」とは、リゾチームのタンパク質としての立体構造が変化したものをいう。
【００２２】
リゾチームは、卵、動物の組織、体液、植物等生物界に広く存在し、基質特異性と構造から大きく以下の５種のファミリーに分類される。
１．リゾチーム（細菌型）
２．リゾチーム（ニワトリ型）
３．リゾチーム（グース型）
４．リゾチーム（ファージ型；Ｖタイプ）
５．リゾチーム（ＣＨ型）
【００２３】
本発明において、リゾチーム変性物及び／又はその塩の原料として、上記５種のリゾチームファミリーのいずれも使用することができる。これらのリゾチームのなかでも、原料であるリゾチームとして、卵白リゾチーム、ヒトリゾチーム等のリゾチーム（ニワトリ型）が好ましい。そして、ノロウィルスの不活化作用がより優れており、低コストでありかつ入手容易であることを勘案すれば、リゾチーム変性物及び／又はその塩は、卵白リゾチームに由来するものであることがより好ましい。
【００２４】
また、リゾチーム変性物の塩としては、食品添加物又は薬学的に許容可能である塩が挙げられ、より具体的には、塩酸、炭酸、リン酸、ホウ酸、へキサメタリン酸、硝酸、硫酸等の無機酸の塩、クエン酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、酢酸、グルタミン酸、グリセロリン酸、グルコン酸等の有機酸の塩が挙げられる。リゾチームの塩のなかでも、無機酸の塩が好ましく、広く使用されかつ安全性が確立している観点から、塩酸塩がより好ましい。なおここで、本発明の化合物及び／又は塩は、大気中に放置したり又は再結晶をすることにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となったりする場合があり、本発明には、そのような各種の水和物、溶媒和物及び結晶多形の化合物も包含する。
【００２５】
本発明のリゾチーム変性物含有粉末において、リゾチーム変性物及び／又はその塩を複数種類含有する場合、リゾチーム変性物及び／又はその塩の濃度（固形分換算）は、リゾチーム変性物及び／又はその塩の合計量の濃度（固形分換算）を意味する。またここで、固形分換算とは、乾燥固形分換算を意味する。リゾチーム変性物含有粉末中のリゾチーム変性物及び／又はその塩の含有割合は、リゾチーム変性物含有粉末の製造におけるリゾチーム変性物及び／又はその塩の仕込み量と、リゾチーム変性物含有粉末の生成量と基づき算出することができる。
【００２６】
（リゾチーム変性物及び／又はその塩の抗ノロウィルス活性）
本発明のリゾチーム変性物及び／又はその塩の抗ノロウィルス活性は、上述の保存前のリゾチーム変性物含有粉末の抗ノロウィルス活性と好ましくは同様である。また、リゾチーム変性物及び／又はその塩の抗ノロウィルス活性の値は、リゾチーム変性物含有粉末の抗ノロウィルス活性と同様の手法により測定される。
【００２７】
（リゾチーム変性物及び／又はその塩の蛍光強度）
本発明のリゾチーム変性物及び／又はその塩の蛍光強度は、リゾチーム変性物及び／又はその塩の表面疎水性の指標とすることができる。すなわち、本発明のゾチーム変性物及び／又はその塩の蛍光強度が高いほど、リゾチーム変性物及び／又はその塩の表面疎水性が高いといえる。リゾチーム変性物及び／又はその塩の表面疎水性が高いほど、抗ノロウィルス活性が高い傾向がある。また、蛍光強度を測定することにより、リゾチーム変性物及び／又はその塩が十分に加熱変性されていることを確認できる。
【００２８】
リゾチーム変性物及び／又はその塩の蛍光強度は、好ましくは保存開始前のリゾチーム変性物含有粉末と同様とされる。
【００２９】
（リゾチーム変性物の種類）
本発明において、リゾチーム変性物及び／又はその塩の製造の際に用いられる変性処理は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されない。従って、本発明のリゾチーム変性物及び／又はその塩としては、加熱処理物、酸処理物、アルカリ処理物、酵素処理物、有機溶剤処理物、界面活性剤処理物、酸化処理物、還元処理物、高圧力処理物、変性剤処理物、これらの組合せ等が挙げられる。なお、リゾチーム変性物の原料には、リゾチーム及び／又はその塩を分解処理したリゾチーム由来ペプチドも含まれる。
【００３０】
リゾチーム変性物の中でも、ノロウィルスの不活化効果の点から、リゾチーム及び／又はその塩を加熱変性したもの（以下、単に「加熱変性物」ともいう。）が好ましい。加熱変性物は、非加熱のリゾチーム及び／又はその塩に比して短時間でノロウィルスを不活化させることができ、本発明において特に有利に利用することができる。
【００３１】
＜デキストリン＞
本発明のデキストリンは、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、酸又は酵素加水分解等の公知手法により各種穀物由来のデンプンから製造してもよく、市販品であってもよい。本発明のデキストリンの例としては、加水分解の度合いや構造により種々の分解物が挙げられ、より具体的には、アミロデキストリン、エリトロデキストリン、アクロデキストリン、マルトデキストリン、シクロデキストリン等が挙げられる。
【００３２】
（デキストリンの種類）
1つの態様によれば、本発明のデキストリンは、保存中に褐変を防止する観点から、ＤＥ２０以下であることが好ましく、ＤＥ１０以下であることがより好ましい。また、本発明のデキストリンのＤＥのより好適な範囲としては、２以上２０以下、４以上２０以下、２以上１０以下又は４以上１０以下である。ここで、デキストリンのＤＥとは、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔの略称で、デキストリンの加水分解の程度を意味し、次の式で表される。
ＤＥ＝直接還元糖（グルコース換算）／固形分×１００
デキストリンのＤＥはウィルシュテッター・シューデル法により求めた値とする。
【００３３】
また、別の態様によれば、本発明のデキストリンは、抗ノロウィルス活性の維持し易さの観点から、シクロデキストリンであることが好ましく、α―シクロデキストリン、β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンであることがより好ましい。
【００３４】
＜リゾチーム変性物含有粉末の組成／性状＞
本発明のリゾチーム変性物含有粉末は、上述のような、リゾチーム変性物及び／又はその塩とデキストリンとを配合することにより取得することができる。
【００３５】
（リゾチーム変性物及び／又はその塩の含有量）
本発明のリゾチーム含有粉末におけるリゾチーム変性物及び／又はその塩の含有量は、所望の抗ノロウィルス活性等を勘案して当業者が適宜設定してよいが、リゾチーム変性物及び／又はその塩の含有量の好適な下限としては、固形分換算で、３０質量％、３５質量％、４０質量％、４５質量％又は５０質量％である。また、リゾチーム変性物及び／又はその塩の含有量の好適な上限としては、８０質量％、７５質量％、７０質量％、６５質量％又は６０質量％である。また、リゾチーム変性物及び／又はその塩の含有量の好適な範囲は、上述した上限および下限の組合せから選択することができ、３０質量以上８０質量％以下、３５質量以上７５質量％以下等が挙げられる。リゾチーム変性物及び／又はその塩の含有量が上記好適な範囲内であることにより、抗ノロウィルス活性を維持した粉末が得られやすい。
【００３６】
（デキストリンの含有量）
本発明のリゾチーム含有粉末におけるデキストリンの含有量の好適な下限としては、固形分換算で、５質量％、１５質量％、２０質量％、２５質量％、３０質量％又は３５質量％である。また、デキストリンの含有量の好適な上限としては、７０質量％、６０質量％、５５質量％、５０質量％、４５質量％又は３５質量％である。また、デキストリンの含有量の好適な範囲は、上述した上限および下限の組合せから選択することができ、５質量％以上７０質量％以下、１５質量％以上６０質量以下等が挙げられる。デキストリン含有量を上記好適な範囲内とすることは、抗ノロウィルス活性を長期間維持する上で有利である。
【００３７】
（配合比）
また、本発明のリゾチーム変性物含有粉末において、リゾチーム変性物及び／又はその塩と、デキストリンとの質量比（リゾチーム変性物及び／又はその塩：デキストリン）は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、抗ノロウィルス活性を維持し易い観点から、好ましくは１：０．１〜１：３であり、より好ましくは１：０．３〜１：２．５であり、さらに好ましくは１：０．４〜１：２である。
【００３８】
（リゾチーム変性物含有粉末の水分含有量）
また、本発明のリゾチーム変性物含有粉末は、抗ノロウィルス活性の維持し易さの観点からは乾燥しており、水分含有量は低いことが好ましい。リゾチーム変性物含有粉末における水分含有量は通常、１０質量％以下であることが好ましく、８質量％以下であることがより好ましく、７質量％以下であることがより好ましく、６質量％以下であることがさらに好ましい。また、リゾチーム変性物含有粉末における水分含有量の好適な範囲は、０．１質量％以上１０質量％以下、０．２質量％以上８質量％以下、０．３質量％以上６質量％以下、又は０．４質量％以上５質量％以下である。リゾチーム変性物含有粉末の水分含量は、当業者に公知の方法であるKarl-Fischer法を用いて測定するものとする。
【００３９】
（追加成分）
本発明のリゾチーム変性物含有粉末には、本発明の効果を妨げない限り、食品添加物又は薬学上許容可能な添加剤等を所望により配合してもよい。かかる追加成分としては、クエン酸、クエン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミン等のｐＨ調整剤、トコフェロール酢酸エステル等の酸化防止剤、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシエチルセルロース等の増粘剤、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等の界面活性剤等が挙げられる。
【００４０】
＜リゾチーム変性物含有粉末の製造方法＞
本発明のリゾチーム変性物含有粉末は、リゾチーム変性物及び／又はその塩を準備し、リゾチーム変性物及び／又はその塩とデキストリンとを配合して混合物を得、当該混合物を乾燥することにより取得することができる。
【００４１】
（リゾチーム変性物及び／又はその塩の準備工程）
本発明の製造方法では、まず、リゾチーム変性物及び／又はその塩を準備する。リゾチーム変性物及び／又はその塩は、市販品を用いてもよいが、リゾチーム及び／又はその塩に公知の変性方法を施すことにより取得することが好ましい。かかる変性方法としては、加熱処理、酸処理、アルカリ処理、酵素処理、有機溶剤処理、界面活性剤処理、酸化処理、還元処理、高圧力処理等を挙げることができるが、好ましくは加熱処理である。加熱変性物は、非加熱のリゾチーム及び／ 又はその塩に比して短時間でノロウィルスを不活化させることができる。
【００４２】
加熱処理は、リゾチーム及び／又はその塩の変性が適度に行われていれば加熱条件を特に限定するものではないが、リゾチーム及び／又はその塩を５０℃以上１３０℃以下、好ましくは６０℃以上、より好ましくは７０℃以上で加熱することが好ましい。
【００４３】
熱変性の方法としては、リゾチーム及び／又はその塩を溶媒に溶解させて加熱するとよく、加熱時間は、リゾチーム加熱温度に応じて決定することができ、１分以上７２０分以下であってもよい。なお、前記溶媒は、リゾチーム及び／又はその塩を溶解することができる溶媒であれば限定されないが、例えば、水や、水を含む有機溶媒であってもよい。
【００４４】
また、リゾチームの上記変性工程において、前記リゾチーム溶液のｐＨは５．０以上であり、好ましくは５．５以上である。また、リゾチーム溶液のｐＨは６．５以下であることがより好ましい。後述する３段階の加熱変性方法においても、第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程において、リゾチーム溶液のｐＨは、上述の通り、５．０以上にして加熱変性は行われる。
【００４５】
また、必要に応じて、酸（例えば、塩酸、酢酸等の、無機酸又は有機酸）、アルカリ（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の無機塩基）又は緩衝液（例えば、酢酸緩衝液）を使用して、リゾチーム溶液を上記範囲のｐＨ に調整してもよい。例えば、リゾチームがリゾチームの塩（例えば塩化リゾチーム）である場合、酸、アルカリ又は緩衝液を使用して、水溶液のｐＨを上記範囲のｐＨに調整したうえで、加熱変性を行うことが好ましい。
【００４６】
（３段階加熱変性法）
好ましい態様によれば、上記加熱変性物を得る工程は、波長６６０ｎｍ の光の透過率が７０％ 超（ 好ましくは８０％ 以上、より好ましくは９０％ 以上、通常１００％以下） であり、ｐＨ が５．０以上７．０以下であり、かつ、リゾチーム及び／ 又はその塩の濃度が固形分換算で０．５ 質量％以上７質量％ 以下であるリゾチームの水溶液を、該水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％ になるまで加熱する第１の加熱工程（ 以下、単に「第１ の加熱工程」ともいう。） と、前記第１ の加熱工程の後に、該水溶液の波長６６０ｎ ｍ の光の透過率が７０％ 未満の極小値まで加熱した後、７０％ になるまで該水溶液を加熱する第２の加熱工程（ 以下、単に「第２ の加熱工程」ともいう。） と、前記第２の加熱工程の後に、前記水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％ を超える状態で該水溶液をさらに加熱する第３の加熱工程（ 以下、単に「第３の加熱工程」ともいう。） と、を含む。上記第１ の加熱工程、第２の加熱工程及び第３ の加熱工程により、リゾチーム変性物を得ることができる。以下、その詳細について説明する。
【００４７】
[第１の加熱工程]
第１の加熱工程によって、波長６６０ｎｍ の光の透過率が７０％超である水溶液における該光の透過率が低下して７０％ になることは、該水溶液の透過率が低下することを意味し、例えば、目視にて該水溶液の白濁を確認することができる。
【００４８】
すなわち、第１の加熱工程では、前記水溶液中のリゾチームの立体構造及び／ 又はリゾチームの表面の表面疎水性が上昇し、疎水性部分が引き合い凝集して、前記水溶液中のリゾチームの溶解性が低下する結果、該水溶液の波長６６０ｎｍ の光の透過率が７０％ 超から７０％ に低下すると推測される。
【００４９】
リゾチームの立体構造を確実に変化させることができ、かつ、リゾチームの凝集を防止して、ノロウィルスの不活化作用を高めることができる点で、第１の加熱工程において、水溶液中のリゾチームの濃度は１質量％ 以上であることが好ましく、一方、５質量％ 以下であることが好ましい。
【００５０】
リゾチーム及び／ 又はその塩の水溶液を構成する溶媒は水であるが、リゾチーム及び／又はその塩の水への溶解性に影響しない範囲で水と混和する有機溶媒を使用してもよい。リゾチーム及び／ 又はその塩の水溶液を構成する溶媒における水の割合は通常８０質量％以上１００質量％ 以下である。また、リゾチーム及び／ 又はその塩の水溶液を構成する溶媒が、水と混和する有機溶媒を含む場合、リゾチーム及び／ 又はその塩の水溶液を構成する溶媒における該有機溶媒の割合は通常１質量％ 以上２０質量％ 以下である。
【００５１】
前記有機溶媒としては、水と混和する有機溶媒であればよく、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等のアルコール系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、１ 、４−ジオキサン等が挙げられ、これらを単独で又は２ 種以上を組み合わせて使用することができる。
【００５２】
[第２の加熱工程]
第２の加熱工程において、第１の加熱工程で得られた水溶液の波長６６０ｎ ｍ の光の透過率が７０％から７０％ 未満（ 好ましくは６０％ 未満、より好ましくは５０％ 未満、通常０％以上） の極小値まで加熱した後、７０％になるまで加熱することにより、第１ の加熱工程で得られた水溶液の光の透過率がさらに低下し（その結果、目視にて水溶液の白濁及び／又は沈殿を確認することができる。） 、その後、該透過率が増加に転じて、該白濁及び／又は沈殿が次第に消失すること（その結果、目視で次第に透明になっていくことを確認することができる。）を確認することができる。
【００５３】
すなわち、第２の加熱工程では、前記水溶液中のリゾチームの立体構造がさらに変化し、リゾチームの表面疎水性がさらに高まるにつれて、リゾチームの水溶性が一旦低下した後に高まる結果、水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％になると推測される。
【００５４】
第２の加熱工程においてリゾチームの表面疎水性がさらに高まるにつれて、リゾチームの水溶性が一旦低下した後で高まるメカニズムは明らかでないが、第２の加熱工程によって、第１の加熱工程において凝集したリゾチーム同士が結合して線状の凝集体に変化し、この凝集体が前記水溶液に溶解するため、前記水溶液中のリゾチームの溶解性が上昇するためであると推測される。
【００５５】
第２の加熱工程は第１の加熱工程の後に引き続いて行うことができる。すなわち、第２の加熱工程は第１の加熱工程と連続的に行うことができる。
【００５６】
[第３の加熱工程]
第３の加熱工程では、前記水溶液中のリゾチームの立体構造がさらに変化し、リゾチームの水溶性を維持した状態で、リゾチームの表面疎水性がさらに高められる結果、水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７０％を超える値を維持することができると推測される。
【００５７】
より具体的には、第３ の加熱工程においては、該水溶液中に白濁及び／ 又は沈殿が生じない（該水溶液の透過率（透明性）が維持されている）ことが好ましい。
【００５８】
前記水溶液中のリゾチームの立体構造をより確実に変化させることができる点で、第３の加熱工程は、該水溶液の波長６６０ｎｍの光の透過率が７５％以上になるまで加熱することがより好ましく、８０％以上になるまで加熱することがより好ましい（通常１００％以下である）。
【００５９】
さらに、第３の加熱工程は、第３の加熱工程で得られた水溶液を０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したものとエタノールとを質量比で１：１の割合で混合したときに波長６６０ｎｍの光の透過率が８５％以上になるまで加熱することが好ましく、９０％以上になるまで加熱することがより好ましい（ 通常１００％ 以下である） 。
【００６０】
第３の加熱工程で得られた水溶液を０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過したものとエタノールとを質量比で１：１の割合で混合したときに波長６６０ｎｍの光の透過率が８５％ 以上になることは、上記定義で規定される蛍光強度が４，０００以上であるリゾチーム変性物が得られた指標とすることができる。
【００６１】
第３の加熱工程は第２の加熱工程の後に引き続いて行うことができる。すなわち、第３の加熱工程は第１の加熱工程及び第２の加熱工程と連続的に行うことができる。
【００６２】
第３の加熱工程において、前記透過率が７０％を超える状態で加熱された（透明化した） 水溶液は、室温（例えば２５℃）に戻しても該透過率を維持することができる（透明性を維持することができる）。その原因としては、該水溶液中に含まれるリゾチーム等の形態（立体構造）が室温でも維持されているためであると推測される。
【００６３】
リゾチーム変性物の製造において、高い収率を達成することができ、かつ、該水溶液を第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程でそれぞれ規定される透過率に調整できる点で、第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程における該水溶液の中心品温を７０℃ 以上となるように加熱することが好ましく、加熱時間が短いため製造時間を短縮できる点で、８０℃ 以上がより好ましく、９０℃ 以上がさらに好ましい（１３０℃ 以下であってもよく、約１００℃以下であってもよい）。なお、第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程における加熱時間は、加熱温度及び処理量に応じて各工程で規定する透過率を満たすように適宜決定することができる。
【００６４】
第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程を同じ加熱温度で連続して行う場合、第１の加熱工程における加熱時間及び第２の加熱工程における及び第３の加熱工程における加熱時間は、合計で中心品温が７０℃ 以上７５℃ 以下の場合は１２５分間以上７２０分間以下、中心品温が７５℃ 超８０℃ 以下の場合は８０分間以上４３５分間以下、中心品温が８０℃ 超８５℃ 以下の場合は７０分間以上３０５分間以下、中心品温が８ ５℃ 超９０℃ 以下の場合は５０分間以上２４０分間以下、中心品温が９０℃超９５℃ 以下の場合は４０分間以上１８５分間以下、中心品温が９５℃ 超１００℃ 以下の場合は２ ５分間以上１２０分間以下、中心品温が１００℃ 超の場合は１０分間以上１２０分間以下であることが好ましい。
【００６５】
（リゾチーム変性物及び／又はその塩とデキストリンとの配合工程）
次に、本発明の製造方法では、上述のようにして得られたリゾチーム変性物及び／又はその塩、デキストリン、並びに所望の追加成分を共に配合して混合物を得る。なお、かかる配合工程は、上述のリゾチーム変性物及び／又はその塩の準備工程前、すなわち変性前のリゾチーム及び／又はその塩を用いて行うこともできるが、ノロウィルス不活化効果が得られやすい観点から、準備工程後に行われることが好ましい。
【００６６】
上記配合方法は、特に限定されず、一般的な方法や任意の攪拌装置を用いて行なってよい。例えば、リゾチーム変性物及び／又はその塩、デキストリン並びに所望の追加成分を同時に又は別々に容器内に添加し、混合してもよい。混合の際には、均一な混合の観点から、容器内に溶媒を添加して混合することが好ましい。この際、リゾチーム変性物及び／又はその塩、デキストリン、所望の追加成分、溶媒の添加、混合の順序は特に限定されないが、抗ノロウィルス活性の維持し易さの観点から、リゾチーム変性物及び／又はその塩の溶液に、デキストリン及び所望の追加成分を同時に又は別々に添加し、混合することが特に好ましい。
【００６７】
リゾチーム変性物及び／又はその塩、並びにデキストリンの配合量及び割合は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、所望のリゾチーム変性物含有粉末の組成及び配合比に従い決定することができる。
【００６８】
上記溶媒は水が通常であるが、リゾチーム変性物及び／又はその塩の水への溶解性に影響しない範囲で水と混和する有機溶媒を使用してもよい。リゾチーム変性物及び／又はその塩の水溶液を構成する溶媒における水の割合は通常８０質量％以上１００質量％以下である。また、リゾチーム変性物及び／又はその塩の水溶液を構成する溶媒が、水と混和する有機溶媒を含む場合、リゾチーム変性物及び／又はその塩の水溶液を構成する溶媒における該有機溶媒の割合は通常１質量％以上２０質量％以下である。
【００６９】
有機溶媒としては、水と混和する有機溶媒であればよく、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等のアルコール系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、１、４−ジオキサン等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００７０】
リゾチーム変性物及び／又はその塩、並びにデキストリンの混合する際の温度は、特に限定されないが、例えば、０℃以上５０℃以下で行うことができる。
【００７１】
また、後述する乾燥工程における溶液のｐＨは、ノロウィルスの不活化効果を維持する観点から、５．０未満であると好ましく、さらに１．７以上〜５．０未満であることが好ましい。かかるｐＨの調整は、所望により追加成分としてｐＨ調節成分を添加することにより簡易に行うことができる。
【００７２】
（乾燥工程）
そして、本発明によれば、リゾチーム変性物及び／又はその塩とデキストリンとを配合して得られた混合物を乾燥することにより、リゾチーム変性物含有粉末を得ることができる。本発明の乾燥方法は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、常法に則り、噴霧乾燥、凍結乾燥等の手法を用いて行うことができるが、抗ノロウィルス活性の維持し易さの観点から、噴霧乾燥により調製することが好ましい。
【００７３】
なお、本発明の製造方法では、上記の各工程の前後において、精製工程、粒度調整工程、成型工程等を公知手法により実施してもよく、本発明にはかかる態様も包含される。
【００７４】
＜剤型／用途＞
（剤型）
本発明のリゾチーム変性物含有粉末は、必要に応じて種々の剤型をとることができ、例えば、錠剤、カプセル等の固形剤としてもよく、用事調製して液剤としてもよい。リゾチーム変性物含有粉末を水やアルコール媒体等の液体と混合して液剤として使用することは、リゾチーム変性物含有粉末の飛散防止の観点から好ましい。液剤とする場合、その粘度は使用方法に応じて適宜定めることができる。例えば、噴霧可能な粘度の液剤とし、トリガースプレーヤー、スクイズ容器、エアゾル容器等のスプレー容器に充填することにより、手指、食品、調理器具、住居環境、嘔吐物、排泄物等へ噴霧することにより、ノロウィルスの不活化を手軽に行うことができ、ノロウィルス不活化剤を含む液剤に、不活化の対象物（例えば、手指、食品、医療機器、医療器具、調理器具、住居環境）を浸すことにより、ノロウィルスの不活化を手軽に行うこともできる。また、リゾチーム変性物含有粉末を含む液剤を湿潤させたシートとして使用することができる。さらに、ローション、クリーム等とすることにより皮膚外用剤として使用することができ、これにより、ノロウィルスが手指に付着してもその場で不活化し、ノロウィルスが経口感染することを防止することができる。
【００７５】
また、本発明のリゾチーム変性物含有粉末を固形剤とする場合、例えば、予め経口摂取しておくことにより、ノロウィルスが口に入ったとしても、それを不活化して感染を防止することができ、また、ノロウィルスによる感染症が発症した場合にも体内のノロウィルスを不活化する治療剤として使用することができる。以上の通り、本発明のリゾチーム変性物含有粉末は医薬として利用することができる。従って、本発明の別の態様によれば、リゾチーム変性物含有粉末を含んでなる医薬製剤が提供される。また、好ましい態様によれば、上記医薬製剤は、ノロウィルスによる感染症の治療剤であり、さらに好ましくは、ノロウィルスに起因する胃腸炎の治療剤である。なおここで、「治療」には、確立された病態を治療することだけでなく、将来確立される可能性のある病態を予防することをも含む。
【００７６】
また、本発明の別の態様によれば、医薬製剤として使用するための、上記酸性化粉末が提供される。また、本発明のさらに別の態様によれば、医薬製剤の製造における、上記酸性化粉末が提供される。また、上記いずれかの態様において、上記医薬製剤は、好ましくはノロウィルスによる感染症の治療剤であり、より好ましくはノロウィルスに起因する胃腸炎の治療剤である。
【００７７】
（ノロウィルスの不活化方法）
本発明によれば、リゾチーム変性物含有粉末を用いて、ノロウィルスが存在する適用対象又は環境において、ノロウィルスを効果的に不活性化することが可能となる。従って、本発明の一つの態様によれば、ノロウィルスの不活化方法であって、それを必要する生体又は区画に、有効量のリゾチーム変性物含有粉末を適用することを含む方法が提供される。また、本発明のノロウィルスの不活化方法は、好ましくはノロウィルスによる感染症の治療方法とされる。
【００７８】
適用対象が生体の場合、生体は、好ましくは哺乳動物、例えば、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウシ、霊長類等とされ、好ましくはヒトとされ、特に好ましくはノロウィルスによる感染症の患者とされる。
【００７９】
また、上記適用対象が区画の場合は、ノロウィルスが存在しうる限り特に限定されず、住居、食品工場、公共施設、工場、病院等の種々の環境の一区画が挙げられる。
【００８０】
リゾチーム変性物含有粉末の適用方法は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、適用対象に応じて適宜選択することができる。適用対象が生体である場合、適用方法としては、例えば、経口投与、坐薬投与、噴霧、塗布、点滴、静脈注射等の投与方法が挙げられる。また、適用対象が区画である場合には、適用方法としては、噴霧、塗布等の方法が挙げられる。
【００８１】
また、リゾチーム変性物含有粉末の有効量は、適用対象の種類、性質、状態や、適用場所、適用方法等に応じて当業者により適宜決定することができる。
【実施例】
【００８２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
【００８３】
例１：リゾチーム変性物含有粉末の調製
（リゾチーム変性物の調製）
卵白（鶏卵卵白）リゾチーム（キユーピー株式会社製）を蒸留水に溶解し、濃度２質量％の溶液１００ｍＬを得、該溶液を、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６．０に調整後、１００℃で３０分間加熱処理し、氷冷することにより、リゾチーム変性物含有溶液を調製した。
前記加熱処理においては、上述した第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程として記載された、反応液の透過率の変化が確認された。なお、本実施例では、第１の加熱工程、第２の加熱工程及び第３の加熱工程を連続して行っており、前記加熱時間は第１、第２及び第３の加熱工程における加熱時間の合計である。
【００８４】
（粉末サンプルの調製）
サンプル１
得られたリゾチーム変性物含有溶液１００ｍＬと、蒸留水に対しα−シクロデキストリン（株式会社シクロケム）が２質量％となるように溶かした溶液を１：１の割合で混合し、リゾチーム変性物とデキストリンをそれぞれ１質量％ずつ含む溶液を調整した。その後、凍結乾燥法で粉末化し、リゾチーム変性物含有粉末を得た。
【００８５】
サンプル２〜５
デキストリンとして、β−シクロデキストリン（株式会社シクロケム）、γ−シクロデキストリン（株式会社シクロケム）、ＤＥ４のデキストリン（パインデックス＃１００、松谷工業株式会社）又はＤＥ２５のデキストリン（パインデックス＃１００、松谷工業株式会社）を用いる以外、サンプル１と同様の手法により、サンプル２〜５のリゾチーム変性物含有粉末を調製した。
【００８６】
サンプル６
サンプル１の調製中に得られたリゾチーム変性物含有溶液に、デキストリンを加えることなく直ちに凍結乾燥処理することにより、サンプル６の粉末を調製した。
【００８７】
サンプル７
デキストリンに代えて、加工澱粉（ミラスパース、株式会社光洋商会）を用いる以外、サンプル１と同様の手法によりサンプル７の粉末を調製した。
【００８８】
（リゾチーム変性物含有粉末の蛍光強度）
上記サンプル１及び４〜６のリゾチーム変性物含有粉末について、当該粉末製造後、後述する保存試験前に、各蛍光強度を、Canadian Institute of Food Science and Technology 1985 Vol.18 No.4 p.290-295に記載された方法に従い測定した。具体的には、各リゾチーム含有粉末を用い、リゾチーム変性物が固形分換算で０．０５質量％になり且つリン酸塩の濃度が０．２Ｍとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈した。ここで、リン酸緩衝液は、リン酸二水素ナトリウム及びリン酸水素二ナトリウムで調製したものを使用した。次に、得られた希釈液５ｍＬに８ｍＭの１，８−アニリノナフタレンスルホン酸のメタノール溶液２５μＬを添加し、３０分間２５℃で反応させた。次に、得られた反応液の蛍光強度について、日本分光株式会社製、型名ＦＰ−８５００蛍光分光光度計を用いて、励起波長３９０ｎｍ（励起バンド幅１０ｎｍ）、蛍光波長４７０ｎｍ（蛍光バンド幅１０ｎｍ）、レスポンス０．５ｓｅｃ、感度Ｌｏｗ（約２７０±１０Ｖ）（電源周波数（５０／６０Ｈｚ））、ペリスタシッパＳＨＰ−８２０型使用の条件で測定した。なお、試験サンプルの蛍光強度は、上記０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の蛍光強度をブランク値とし、ブランク値を差し引いた値とした。
【００８９】
結果は、表１に示される通りであり、十分に加熱変性されていることが確認できた。
【表１】
2018177708.tif 000002
【００９０】
例２：リゾチーム変性物含有粉末の抗ノロウィルス活性保存試験１
（保存試験）
各サンプルの抗ノロウィルス活性の経時変化を以下に記載の保存試験によって評価した。具体的には、まず、製造直後にサンプル１〜７の抗ノロウィルス活性を測定した。次に、恒温恒湿容器内で４０℃、７５％ＲＨの条件下で４週間保存した後、サンプル１〜７の抗ノロウィルス活性を再度測定した。上記保存前後の抗ノロウィルス活性の測定は、以下の手法に従い実施した。
【００９１】
（抗ノロウィルス活性測定）
（１）６ウェルプレートに、マウスマクロファージ株化細胞（ＲＡＷ２６４．７細胞）をコンフルエントの６０〜８０％まで培養した。
（２）マウスマクロファージ株化細胞（ＲＡＷ２６４．７細胞）をコンフルエントまで培養し、コンフルエントになった細胞にノロウィルス液１ｍＬを接種し、２日間、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。この場合、ノロウィルス液として、Ｍｕｒｉｎｅ  ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  １（ＭＮＶ−１）（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｎ  Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｎ  Ｓｔａｉｎｌｅｓｓ  Ｓｔｅｅｌ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ）を使用した。
【００９２】
培養後、細胞が剥がれているのを目視で確認し、凍結融解を４回繰り返して細胞を破壊し、細胞中のウィルスを放出させた。その後、５０ｍＬ遠沈管に分注し、遠心分離（８，０００ｇ、２０分）を行い、感染価（ＰＦＵ／ｍＬ）が１０６〜１０７ＰＦＵ／ｍＬ程度のノロウィルス液を得た。このノロウィルス液は、−８０℃で保存し、解凍して使用した。
【００９３】
（３）次に、各サンプルを水に溶解し、リゾチーム変性物を固形分換算で２．０質量％含有する水溶液を調製した。この水溶液に、（２）で得たノロウィルス液を等質量加え、これを評価用サンプル液（ノロウイルス混合液）とした。
【００９４】
各評価用サンプル液を、室温で所定の反応時間（０分又は１分）で放置し、ノロウィルスを反応させた。
反応後、各評価用サンプル液を１０ｘ倍希釈し、希釈サンプル液とした。ここで、ｘは整数であり、後述する（８）において目視でプラーク数をカウントできる数とする。即ち、（８）で、プラーク数が１０〜１００程度となるように希釈倍率を調整した。
【００９５】
（４）（１）のプレートにおいて培養液を全量撤去し、所定時間放置後希釈した希釈サンプルを５００μＬ／ｗｅｌｌで２ウェルずつ接種した。
【００９６】
（５）マウスマクロファージ株化細胞（ＲＡＷ２６４．７細胞）が乾かないように振とうしながら、室温で１時間インキュベートし、ノロウィルスをマウスマクロファージ株化細胞に感染させた。
【００９７】
（６）プレート上の５００μＬ／ｗｅｌｌの接種液を全量除去し、１．５％ Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅ Ａｇａｒｏｓｅ−ＤＭＥＭ（３７℃）を２ｍｌ／ｗｅｌｌで重層し、それが固まった後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２日間培養した。
【００９８】
（７）２日間培養後のプレートに染色液である０．０３％ニュートラルレッド溶液を２ｍＬ／ｗｅｌｌで重層し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１時間インキュベートした。
【００９９】
（８）（７）のインキュベート後に０．０３％ニュートラルレッド溶液の全量を撤去し、目視でプラーク数をカウントした。得られたプラーク数と希釈倍率から感染価（ＰＦＵ／ｍＬ）を算出した。
【０１００】
（９）また、以下の式から、保存試験前後のサンプル１〜７の抗ノロウィルス活性を算出した。
抗ノロウィルス活性＝Ｌｏｇ１０(１分間放置前のノロウィルス混合液の感染価)−Ｌｏｇ１０(１分間放置後のノロウィルス混合液の感染価)
【０１０１】
結果は、表２に示される通りであった。デキストリン又はシクロデキストリンを含有するサンプル１〜５は保存後の抗ノロウィルス活性は２．０以上であり、抗ノロウィルス活性を維持しうることが確認された。一方で、デキストリンを添加していないサンプル６および加工澱粉を添加したサンプル７は保存後の抗ノロウィルス活性が２．０未満であり抗ノロウィルス活性が著しく低下した。
なお、保存試験前（保存前）のサンプル１〜７はすべて抗ノロウィルス活性を３．０〜４．５有していた。
【０１０２】
【表２】
2018177708.tif 000003
【０１０３】
（リゾチーム変性物含有粉末の水分含有量測定）
【０１０４】
保存試験後のサンプル１及び４〜６の水分含量をKarl-Fischer法に基づいて測定したところ、いずれも５質量％であった。
【０１０５】
例３：リゾチーム変性物含有粉末の抗ノロウィルス活性保存試験２
（リゾチーム変性物含有粉末の調製）
まず、例１と同様にリゾチーム変性物を調製し、得られたリゾチーム変性物含有溶液に対して、表３に記載の配合比率となるようにデキストリン粉末を溶解した。続いて、前記デキストリンを溶解した溶液を噴霧乾燥法により粉末化し、リゾチームとデキストリンとの配合割合が、２：１、５：１又は１０：１のリゾチーム変性物含有粉末を得、サンプル８〜１０とした。
なお、得られたサンプル８〜１０の蛍光強度を上述した手法により測定したところ、その結果は、表３に示すとおりであり、十分に加熱変性されていることが確認できた。
【０１０６】
（抗ノロウィルス活性測定）
次にリゾチーム変性物含有粉末を用い、例２と同様の手法により、抗ノロウィルス活性を測定した。結果は、表３に示される通りであった。デキストリンの配合割合が、リゾチーム変性物の１／１０であっても、抗ノロウィルス活性を維持しうることが確認された。なお、保存試験前（保存前）のサンプル８〜１０はすべて抗ノロウィルス活性３．０〜４．５を有していた。
【０１０７】
【表３】
2018177708.tif 000004
【０１０８】
また、保存試験後のサンプル８〜１０の水分含量をKarl-Fischer法に基づいて測定したところ、いずれも７質量％以下であった。