(57)【要約】【課題】シリマリン含有水分散性組成物であって、シリマリンの生体吸収性の高い組成物を提供することを課題とする。【解決手段】シリマリン、シリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンからなる群から選択される１種又は２種以上と、ポリビニルピロリドンと、ダイフラクトースアンハイドライドＩＩＩ（ＤＦＡＩＩＩ）を含む、シリマリン類含有組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリマリン、シリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンからなる群から選択される１種又は２種以上と、ポリビニルピロリドンと、ダイフラクトースアンハイドライドＩＩＩ（ＤＦＡＩＩＩ）を含む、シリマリン類含有組成物。
【請求項２】
シリマリン、シリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンがマリアアザミ由来であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組成物中のシリマリン、シリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンからなる群から選択される１種又は２種以上の１質量部当たり、ダイフラクトースアンハイドライドＩＩＩ（ＤＦＡＩＩＩ）２〜３質量部を含む請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の組成物が、トップダウン法で調製されたシリマリン、シリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンからなる群から選択される１種又は２種以上を含むナノ化粒子を含む溶液を凍結乾燥させて得られるものである組成物。
【請求項５】
さらにラウリル硫酸ナトリウムを含有するものである請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の組成物を配合した飲食品または健康食品。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の組成物を配合した経口用医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体吸収性の良いシリマリン含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、フラボノイドやカテキン、植物性色素のようなポリフェノール化合物の機能性に着目して、これらを含有する組成物が多く開発されている。
シリマリンは、このようなポリフェノール化合物を含む天然成分のひとつであり、マリアアザミ（学名：Ｓｉｌｙｂｕｍ  ｍａｒｉａｎｕｍ（Ｌ）Ｇａｅｒｔｎ）と呼ばれる植物の種子から抽出されたエキスである。シリマリンは、その構成成分としてフラボノリグナンに分類されるシリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンを含むことが知られている。
【０００３】
シリマリンは肝臓機能強化や老化防止に有用であり、さらには紅斑、火傷、皮膚又は粘膜のジストロフィー状態、皮膚炎等の治療における治癒を促進し、外部環境からの刺激（放射線、風、太陽等）から皮膚を保護するのに有用であることが知られている（特許文献１）。また、シリマリンの皮脂分泌抑制効果（特許文献２）、表皮透過バリア強化効果（特許文献３）、乾癬及びアトピー性皮膚炎の治療効果（特許文献４）、表皮の扁平化改善効果（特許文献５）が知られている。
【０００４】
一方、シリマリンは、水にはほとんど溶解しないため、水系の組成物には配合し難いという課題点を有している。シリマリンを分散させた飲料の技術が開示されている（例えば、特許文献６参照）。また、シリマリンをリン脂質錯体とすることにより生体適性を有利にする技術が開示されている（例えば、特許文献１参照）。この脂質錯体はシリマリンフィトソーム（商品名）の名称で化粧品用途として一般に流通している。しかし、このシリマリンフィトソームは食品など経口投与では使用できない原料を用いており、食品用途や経口投与を目的とする医薬用途には不適である。
また、シリマリンのアルコール溶液と、糖アルコール水溶液を混合し、これを凍結乾燥又は噴霧乾燥して溶解性を向上させる技術が開示されている（特許文献７）。またシリマリンを平均分子量が５００〜５０００のコラーゲンペプチドと乳化剤を含む安定なシリマリン分散溶液とする技術が開示されている（特許文献８）。
本発明者もシリマリンの水分散性を解決するため、シリマリンとヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）と、エリスリトール又はトレハロースを含有する組成物（特許文献９）や、シリマリンとヒドロキシプロピルメチルセルロースと、ダイフラクトースアンハイドライドＩＩＩ（ＤＦＡＩＩＩ）を含有する組成物（特許文献１０）がシリマリンとしての水分散性を改善することを見いだし、健康食品や医薬品として利用できることを提案している。
特に特許文献１０の組成物はボトムアップ法によってナノサイズのシリマリン粒子の分散物を得ている。これを凍結乾燥することによってシリマリンの水分散性と、シリマリンの生体利用性の高まった粉末組成物を得ている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１−１００１３２号公報
【特許文献２】特開２０００−１６９３３２号公報
【特許文献３】特開２０００−１６９３２８号公報
【特許文献４】特開平５−２８６８６４号公報
【特許文献５】特開２００４−９１３９７号公報
【特許文献６】特開２００２−３４５０５号公報
【特許文献７】特開２００５−５１９８６３号公報
【特許文献８】特開２０１１−１３６９１５号公報
【特許文献９】特開２０１６−５３０００号公報
【特許文献１０】特開２０１６−１５３３７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、前記の特許文献１０に開示したヒドロキシプロピルメチルセルロースとダイフラクトースアンハイドライドＩＩＩ（ＤＦＡＩＩＩ）を含有する組成物についてさらに研究を進めたところ、当該組成物製造工程で分散性に優れたシリマリンのナノサイズ粒子を得ることは容易であるが、一方、得られる微細化（ナノ化）懸濁液中の固形分が少ないという問題が判明した。これは大量生産には適さないということである。この主たる原因は、特許文献１０の製造方法がナノ粒子を製造するためにボトムアップ微細化法を採用したことにあると考えられた。また特許文献１０の組成物を使用してシリマリン高含有の固形製剤を調製するに当たり、粉末化工程が高コストとなることや、製造工程において高濃度の組成物溶液とすると、凝集沈殿が発生するという問題が出現した。さらに、この凝集沈殿物が目的とするシリマリンの生体吸収性の障害となることも判明した。
そこで、本発明者らは、これらの問題を解決するため、鋭意検討を行ったところ、特許文献１０に記載した組成物と異なる新たなシリマリンを含む優れた機能を有する複合組成を見いだし、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、シリマリンを含有する組成物であって、高濃度のシリマリンを含み、分散性を有し、シリマリンの生体吸収性の高い組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
１．シリマリン、シリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンからなる群から選択される１種又は２種以上と、ポリビニルピロリドンと、ダイフラクトースアンハイドライドＩＩＩ（ＤＦＡＩＩＩ）を含む、シリマリン類含有組成物。
２．シリマリン、シリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンがマリアアザミ由来であることを特徴とする１に記載の組成物。
３．組成物中のシリマリン、シリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンからなる群から選択される１種又は２種以上の１質量部当たり、ダイフラクトースアンハイドライドＩＩＩ（ＤＦＡＩＩＩ）２〜３質量部を含む１又は２に記載の組成物。
４．１〜３のいずれかに記載の組成物が、トップダウン法で調製されたシリマリン、シリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンからなる群から選択される１種又は２種以上を含むナノ化粒子を含む溶液を凍結乾燥させて得られるものである組成物。
５．さらにラウリル硫酸ナトリウムを含有するものである４に記載の組成物。
６．１〜５のいずれかに記載の組成物を配合した飲食品または健康食品。
７．１〜５のいずれかに記載の組成物を配合した経口用医薬品。 
【発明の効果】
【０００８】
本発明の組成物は、経口投与した場合、シリマリン、シリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンなどの成分の吸収性が向上し、血中濃度の持続性が高い。
また本発明の組成物は、水分散性が高く、水に対して２５質量％以上の濃度で分散し、沈殿を生じずに分散する。また、本発明の組成物を配合した飲食品や医薬品は、吸収性が高いため、従来のシリマリンと同様の薬理効果や作用を発揮させる組成物を得るためのシリマリン配合量を減らすことができ、経済的にも有用である。 
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例の組成物、比較例の組成物、シリマリン原末の溶出試験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、シリマリン、シリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンからなる群から選択される１種又は２種以上と、ポリビニルピロリドンと、ダイフラクトースアンハイドライドＩＩＩ（ＤＦＡＩＩＩ）を含む、シリマリン類含有組成物に関する発明である。本発明の組成物は、トップダウン法によってシリマリン、シリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンからなる群から選択される１種又は２種以上と、ポリビニルピロリドンと、ＤＦＡＩＩＩが複合体化して存在するものと予想される。なお本願明細書において、シリマリン、シリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンをシリマリン類という場合がある。
なお「トップダウン法」及び「ボトムアップ法」の用語は、ナノテクノロジー分野で一般的に使用されている用語であって、ナノ化粒子を調製するに当たり、前者は目的とする大きな粒子を細かく破砕して調製する方法であり、後者は目的とする物質の溶液などから自立的にナノ粒子を構築する手法を意味している。
シリマリン（Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ；ＣＡＳ  Ｎｏ．６５６６６−０７−１）は、キク科マリアアザミ（学名シリバム・マリアナムＳｉｌｙｂｕｍ  ｍａｒｉａｎｕｍ  Ｇａｅｒｔｎ、別名オオアザミ、オオヒレアザミ、ミルクアザミ；ＣＡＳ  Ｎｏ．８４６０４−２０−６）から抽出されるフラボノリグナンの総称であり、分子式Ｃ２５Ｈ２２Ｏ１０で表される、シリビン（Ｓｉｌｙｂｉｎ；ＣＡＳ  Ｎｏ．２２８８８−７０−６）、シリジアニン（Ｓｉｌｙｄｉａｎｉｎ；ＣＡＳ  Ｎｏ．２９７８２−６８−１）、シリクリスチン（Ｓｉｌｙｃｈｒｉｓｔｉｎ；ＣＡＳ  Ｎｏ．３３８８９−６９−９）、イソシリビン（Ｉｓｏｓｉｌｙｂｉｎ；ＣＡＳ  Ｎｏ．７２５８１−７１−６）などを含有している組成物である（天然薬物事典、奥田拓男編、廣川書店、昭和６１年３月３日発行参照）。
【００１１】
本発明においては、シリマリンを含む植物体から抽出した抽出物に含有されるこれらのフラボノリグナンを含有している組成物を従来技術と同様、シリマリンと呼ぶ。例えば、シリマリンを含む植物体から抽出した抽出物としては、マリアアザミ抽出物がある。シリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンなどの成分を、本発明においてはシリマリン類と総称する。
またシリマリンは前記の通りフラボノリグナンの混合物であり、シリマリンとしての植物抽出物や植物中の含有量は、分光光度計による測定に基づいた方法（Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｎ．Ｆｏｒｓｃｈ，１８，６９６，１９６８．）、薄層クロマトグラフィーによる方法（Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｎ．Ｆｏｒｓｃｈ，２４，４６６，１９７４．）、高速液体クロマトグラフィーによる方法（Ｔｉｔｔｅｌ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１３５，４９９，１９７７．、Ｔｉｔｔｅｌ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１５３，２２７，１９７８．、Ｑｕｅｒｃｉａ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｆｒｉｇｅｒｉｏ  Ａ．（Ｅｄ）．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８３，ｐ１．）により測定可能である。これらの測定法の中でも、分光光度計による測定に基づいた方法の一つである２，４−ジニトロヒドラジン分析は、ドイツ薬局方に報告されており、広く用いられている。
【００１２】
シリマリンをマリアアザミの果実から高純度で単離する方法として、７０〜８０％の純度で単離する方法や９０〜９６％の純度で単離する方法（特公昭６３−４１３９６号公報）が既に報告されている。シリマリンは通常マリアアザミの種実からエタノール、酢酸エチル、アセトンなどにより抽出し、スプレードライにより乾燥粉末として得られる抽出物原料として市販されている。本発明に使用するシリマリンはこのようにして調製されて、市販されているシリマリンをそのまま用いることができる。また、マリアアザミからシリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンなどのシリマリンの構成成分を濃縮した抽出物及びそれらを単離、精製して化合物として用いることができる。
本発明におけるシリマリンを含む植物体は、葉、茎、芽、花、木質部、木皮部（樹皮）などの地上部、根、塊茎などの地下部、種子、樹脂などのすべての部位が使用可能である。
本発明におけるシリマリン及びそれを含む植物体は、それら自体を乾燥させた乾燥物及び、それらを各種溶媒を用いて溶解した溶解物として使用できる。例えば、水又はエタノール、メタノールなどのアルコール類、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの多価アルコール、エーテル、アセトン、酢酸エチルなどの有機溶媒を用いて溶解した溶解物をシリマリンの原料として使用できる。
【００１３】
本発明におけるシリマリン原料の植物体は、天然乾燥、熱風乾燥、凍結乾燥させたり、醗酵させたりしたものをそのまま使用することができる。また植物抽出物を調製する場合は常法に従って、抽出、濃縮、粉末化などの処理を行って得ることができる。
【００１４】
［ポリビニルピロリドン］
ポリビニルピロリドン（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ、ＰＶＰ、ポビドンともいう）は、Ｎ−ビニル−２−ピロリドンの重合した高分子化合物であり、１当量質量は２．５００−２．５０００．０００ｇ・ｍｏｌ-1を示す。ポリビニルピロリドンは、化粧品や、錠剤（医薬品または食品）の賦形剤や結合剤などとして使われる高分子化合物である。ＰＶＰは水やアルコール、酢酸、クロロホルム、アミン類など多くの極性溶剤に溶解し、ほかの高分子との相溶性も優れている。さらに分散性、保護コロイド性、可溶化性、被膜形成性、接着性などの特性を持ち合わせている。本発明においては、市販されているＰＶＰであればどのようなものであっても使用可能であるが、高分子成分を含むものが好ましい。市販品としては、例えば第一工業製薬株式会社製の、ピッツコール  Ｋ−１７Ｌ、ピッツコール  Ｋ−３０Ｌ、ピッツコール  Ｋ−３０ＡＬ、ピッツコール  Ｋ−  ６０Ｌ、ピッツコール  Ｋ−９０Ｌ、ピッツコール  Ｋ−１２０Ｌ、ピッツコール  Ｋ−３０粉末、ピッツコール  Ｋ−５０粉末、ピッツコール  Ｋ−８０粉末、ピッツコール  Ｋ−８５粉末、ピッツコール  Ｋ−９０、ドイツＢＡＳＦ社製のポビドンＫ２５、Ｋ３０、Ｋ９０などを例示することができる。
ポリビニルピロリドンは、シリマリン、シリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンからなる群から選択される１種又は２種以上の微細化工程において、シリマリン等のナノ粒子の凝集沈殿を抑制している。
ポリビニルピロリドンは、シリマリン、シリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンからなる群から選択される１種又は２種以上の微細化（ナノ化）工程にシリマリン類１質量部に対して０．３〜１．５質量部、好ましくは０．５〜１．０質量部配合する。
【００１５】
［ダイフラクトースアンハイドライドＩＩＩ（以下ＤＦＡＩＩＩ）］
ＤＦＡとは、２個のフラクトースが、互いに２点ずつで結合したアンヒドロ化環状二糖である。従来、カラメルなどに存在することが知られていたが、工業的には、イヌリンをイヌリン分解酵素、例えば、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｈ６５−７株が産生するイヌリンフラクトトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．９３）により発酵させたり、レヴァンをＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ  ＧＳ−９が産生するレヴァンフルクトトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１０）により発酵させたりすることにより製造することができる。二分子のフラクトースの結合様式の差異により、誘導体が５種類存在し、それぞれ、ＤＦＡＩ、ＤＦＡＩＩ、ＤＦＡＩＩＩ、ＤＦＡＩＶ、ＤＦＡＶと称される。本発明においてはＤＦＡＩＩＩ（ｄｉ−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｅ−１，２´：２，３´ｄｉａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、ＤＦＡＩＶ（ｄｉ−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｅ−２，６´：６，２´ｄｉａｎｈｙｄｒｉｄｅ）が好ましく使用される。
本発明において用いるＤＦＡＩＩＩは、精製されたものが好ましいが、未精製のＤＦＡＩＩＩであっても良い。
【００１６】
ＤＦＡＩＩＩは、本発明の組成物を水へ再分散させるために作用する。再分散を好ましく行うために、シリマリン類１質量部に対して２〜３質量部を配合する。
【００１７】
本発明の組成物においては、シリマリン、シリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンからなる群から選択される１種又は２種以上と、ポリビニルピロリドン、ＤＦＡＩＩＩのほかに界面活性剤を配合しても良い。界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）を例示できる。
【００１８】
本発明においては、シリマリン、シリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンからなる群から選択される１種又は２種以上を含む原料粉末とポリビニルピロリドンを含む水溶液を混合し、この溶液をトップダウン方式の粉砕装置で水不溶性シリマリン類を粉砕してナノ粒子化する。トップダウン法によるナノ粒子化にあたっては、市販されているボールミルやビーズミルなどの所謂ナノ化粉砕機能を有する装置であれば使用可能である。このような装置としては、「マルチビーズショッカー多細胞破砕機（安井器械株式会社製）」を例示できる。その他のトップダウン法の粉砕装置としては「ＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ（株式会社シンマルエンタープライゼス）」や「ナノ・ゲッター（アシザワ・ファインテック株式会社）」などを例示できる。 
【００１９】
本発明の組成物を得るためには、シリマリン、シリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンからなる群から選択される１種又は２種以上とポリビニルピロリドンを含む水溶液を混合し、これを前記のナノ粒子化装置でシリマリン類をトップダウン方式で粉砕する。
得られた粉砕後の溶液を、凍結乾燥など各種手段を用いて乾燥すると本発明の組成物を得ることができる。乾燥操作はどのような手法でも良いが、凍結乾燥法が特に好ましい。乾燥物を回収し、本発明の組成物とする。
この組成物は、水への分散性がよく、分散したときの分散粒子は１マイクロメートル未満のいわゆるナノサイズとなる。また、水に分散しても凝集して沈殿しないという特性を有している。
【００２０】
本発明の組成物は、シリマリン類の安定等の観点から、公知の酸化防止剤（ラジカル捕捉剤）を含んでいてもよい。
ラジカル捕捉剤は、ラジカルの発生を抑えるとともに、生成したラジカルをできる限り速やかに捕捉し、連鎖反応を断つ役割を担う添加剤である（出典：「油化学便覧  第４版」、日本油化学会編  ２００１）。
本発明に好適な酸化防止剤（ラジカル捕捉剤）としては、シリマリンの変色を防止する観点から、例えば、アスコルビン酸とその誘導体、を挙げることができる。
【００２１】
アスコルビン酸とその誘導体、及びそれらの塩としては、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸Ｎａ、Ｌ−アスコルビン酸Ｋ、Ｌ−アスコルビン酸Ｃａ、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルのマグネシウム塩、Ｌ−アスコルビン酸硫酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウム塩、Ｌ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド、Ｌ−アスコルビン酸パルミチン酸エステル、テトライソパルミチン酸Ｌ−アスコルビル等が挙げられる。これらのうち、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸Ｎａ、Ｌ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド、Ｌ−アスコルビン酸パルミチン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルのマグネシウム塩、Ｌ−アスコルビン酸硫酸エステル２ナトリウム塩、テトライソパルミチン酸Ｌ−アスコルビルが特に好ましい。
また、本発明の分散組成物には、本発明の効果を損なわない限りにおいて、本発明の分散組成物の用途に応じて、例えば、種々の薬効成分、防腐剤、着色剤など、通常、その用途で使用される他の添加物を併用することができる。
【００２２】
本発明の組成物は、上記の乾燥した粉末でも良いし、取り扱いの利便性を考慮して、造粒することもできる。
本発明の組成物の水における分散粒子は、その体積平均粒子径が１μｍ以下であり、好ましくは４００ｎｍ以下である。分散粒子の平均粒子径とは、水相に分散するシリマリン類を含む組成物の分散粒子全体の平均粒子径を意味する。
分散粒子の粒子径は、市販の粒度分布計等で計測して確認することができる。
粒度分布測定法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。
本発明の組成物は、シリマリンの吸収性が良いため、従来のシリマリン含有組成物に比して、飲食品や医薬品、化粧品、健康食品への配合量を減らすことができる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例、比較例、試験例によりさらに具体的に説明する。
実施例：シリマリン含有組成物の調製
シリマリンとして市販のシリマリン原末であるシリマリンＥＴ（インデナジャパン社）を用いた。
（１）製造方法
本発明の組成物を製造するにあたって、上記したビーズミルとしてマルチビーズショッカー（安井器械株式会社製）を用い、トップダウン方式の粉砕処理を行った。
精製水６０ｍＬ中にポリビニルピロリドンとしてＰｏｖｉｄｏｎｅ  Ｋ３０（ＢＡＳＦ製）を１．２ｇおよびラウリル硫酸ナトリウムを０．１２ｇ溶解させ、湿式粉砕時の分散媒とした（これを以下ＰＶＰ／ＳＬＳ溶液という）。
コニカルチューブ内にジルコニアビーズ（直径０．２ｍｍ）６０ｇを入れ、次いでシリマリンを６００ｍｇ入れ、上記ＰＶＰ／ＳＬＳ溶液１５ｍＬを入れる。このチューブを３本分用意しマルチビーズショッカー（安井器械株式会社製）にて粉砕処理した（条件：２７００ｒｐｍ、粉砕時間１２ｍｉｎ、０℃）。
１）処理回数による効果
マルチビーズショッカーによる粉砕処理を「２７００ｒｐｍ、粉砕１ｍｉｎ、冷却１ｍｉｎ×１２サイクル」１回処理から２０回処理まで行い、トップダウン方式による粉砕処理回数粒子径の変化を確認した。「ＥＬＳＺ‐１０００（大塚電子株式会社）」を用いて測定した粒子径を下記表１に示す。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
すべての粒子径を１００ｎｍ以下とすることは困難であった。２０回処理品で１００ｎｍ以下３０％であった。また１２回処理以降の粒度はほぼ変わらないという傾向が見られた。
マルチビーズショッカー処理終了後、３本のコニカルチューブ内容物を全量１５０μｍの篩に空け、４５ｍＬの水で洗浄し、ビーズ除去シリマリン分散液１００ｍＬを得た。
【００２６】
２）ＤＦＡＩＩＩ添加による効果
上記の粒子径測定結果に基づき２０回粉砕を次の試験用の試料として用い、ＤＦＡＩＩＩ添加効果を評価した。ＤＦＡIIIをシリマリンと等量、２倍量上記の分散液に加え、−８０℃、１０ｍｉｎの予備凍結ののち、凍結乾燥処理した。
この凍結乾燥処理品を水に懸濁させ、１００ｍＬとし、この溶液中のシリマリンの再分散性を確認した。再分散は、「ＥＬＳＺ−１０００（大塚電子株式会社）」を用いて粒子径を測定することで確認した。
再分散溶液のシリマリンの粒子径を下記の表２に示す。なお得られた粉末は速やかに水に再分散した。この組成物は、水に対して２５質量％以上の濃度で分散し、沈殿を生じなかった。なお組成物の成分分析は可能であったが、トップダウン法によるシリマリンナノ粒子の構造を特定することは走査型電子顕微鏡観察では困難だった。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
表２に示すように、ＤＦＡIIIをシリマリン量の２倍量添加した場合、乾燥前と同様のナノサイズの粒子径、粒度分布を示した。すなわち本発明の組成物は、極めてシリマリンの再分散性が高いものであった。
１）、２）の結果から、マルチビーズショッカー処理２０回、ＤＦＡＩＩＩ添加量をシリマリンの２倍量として調製した凍結乾燥粉末を本発明の実施例品として、以下に説明する動物試験によって評価を行った。
【００２９】
比較例の調製
上記実施例の組成物で使用したポリビニルピロリドンに代えてヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）を用いて比較例の試料を調製した。ＨＰＭＣは、特許文献１０に記載されているボトムアップ法によるシリマリンナノ粒子を調製する際に、最も優れた効果を示した高分子物質である。
精製水４５ｍＬ中にＨＰＭＣを１．８ｇ溶解させ、湿式粉砕時の分散媒とした。
コニカルチューブ内にジルコニアビーズ（直径０．２ｍｍ）６０ｇを入れ、次いでシリマリンを６００ｍｇ入れ、上記ＨＰＭＣ  ＰＶＰ／ＳＬＳ溶液１５ｍＬを入れる。このチューブを３本分用意しマルチビーズショッカー（安井器械株式会社製）にて粉砕処理した（条件：２７００ｒｐｍ、粉砕時間１２分、０℃）。
コニカルチューブ内にジルコニアビーズ（直径０．２ｍｍ）６０ｇを入れ、次いでシリマリンを６００ｍｇ入れ、上記ＨＰＭＣ溶液１５ｍＬを入れた。このチューブを３本分用意しマルチビーズショッカー（安井器械株式会社製）にて粉砕処理した。
得られた粉砕液の粒子径を「ＥＬＳＺ−１０００（大塚電子株式会社）」により測定した。
なお、マルチビーズショッカーによる粉砕処理は、２７００ｒｐｍ、粉砕１ｍｉｎ、冷却１ｍｉｎ×１２サイクルで行った。平均粒子径が若干大きいものの、３回の処理で実施例と同程度の粒子径の懸濁液サンプルが得られた。
マルチビーズショッカー処理終了後、３本のコニカルチューブ内容物を全量１５０μｍの篩に空け、４５ｍＬの水で洗浄し、比較例のビーズ除去シリマリン分散液１００ｍＬを得た。
得られた懸濁液は、粉末化基剤としてＤＦＡＩＩＩをシリマリンと等量加え、凍結乾燥処理した。凍結乾燥処理品を水に懸濁させ、再分散性を確認したところ、懸濁液と同等の水再分散性が確認された。
【００３０】
＜試験例＞
１．シリマリン溶出試験
調製したシリマリンナノ粒子の溶出性は、日局１６パドル法に準じ、恒温水槽式溶出試験機を用いて評価した。サンプル濃度は、飽和溶解度以下となるよう設定し、３７℃に加温した蒸留水にヌレ性を向上させるためＴｗｅｅｎ８０を０．１％添加した試験液９００ｍＬに分散させた。パドルの撹拌速度は１００ｒｐｍとし、経時的にサンプリングを行った。
・溶出試験条件                            
試験液          蒸留水＋０．１％Ｔｗｅｅｎ８０                    
液量            ９００ｍＬ                   
撹拌速度        １００ｒｐｍ                     
温度            ３７℃                
仕込み量        シリマリン量として４０ｍｇ
採取時間        ２，５，１０，１５，２０，３０，４５，６０ｍｉｎ      
【００３１】
・ＨＰＬＣ条件                                          
カラム          Ｌｕｎａ  ５μｍ  Ｃ１８（２）  １００Ａ
液相            Ａ：トリクロロ酢酸（ｐＨ２．５）、Ｂ：メタノール  
保持時間        ２２．５ｍｉｎ                                 
流速            １．０ｍＬ／ｍｉｎ                              
注入量          ５０μＬ
検出波長        ２８８ｎｍ  
【００３２】
・方法                                                  
サンプルをシリマリン量として前述の量を９００ｍＬの試験液に分散させ、所定の時間にサンプリングした。分取したサンプルを孔径０．２０μｍフィルターに通し、サンプル５００μＬとＤＭＳＯ  ５００μＬを混和後、ＨＰＬＣにより定量した。
【００３３】
試験結果を図１に示した。
実施例、比較例ともシリマリン原末と比較し、高い溶出性を示した。初期溶出速度も向上し、実施例の１００ｎｍサンプルは開始２分で約８７％の溶出が認められた。一方比較例は初期溶出性が緩やかであった。
【００３４】
２．生体吸収性試験
実施例、比較例、シリマリン原末を用いた経口投与による吸収性試験を実施した。
１）試験動物
雄性のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ  ラット（７週齢、１群４〜５匹）を使用し、搬入後７日間馴化飼育を行った。
【００３５】
２）試験試料
実施例：シリマリンＥＴ：ＰＶＰ：ＳＬＳ：ＤＦＡIII
＝２８．１７％：１４．０８％：１．４１％：５６．３４％
比較例：シリマリンＥＴ：ＨＰＭＣ：ＤＦＡIII
＝３３．３３％：３３．３３％：３３．３３％
シリマリン原末：シリマリンＥＴ１００％
動物への投与直前に各試料のシリマリンが２００ｍｇ／ｋｇ／１０ｍＬとなるよう秤量し、蒸留水で懸濁液を調製した。
【００３６】
３）試験方法
動物は馴化７日目に体重を測定し、体重層別法により群分けし、夕刻より絶食を行った（体重２７０〜２９５ｇ）。絶食は１６時間以上となるよう調整した。
Ａ．試験試料の投与
各試料のシリマリンが２００ｍｇ／ｋｇ／１０ｍＬとなるよう秤量し、蒸留水にて懸濁液としたものを投与物として調製し、ラットをイソフルラン吸入麻酔により非覚醒状態にし、経口ゾンデを用いて胃内投与した。
投与後は自由飲水とした。
【００３７】
Ｂ．採血
投与後、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間にイソフルラン吸入麻酔により非覚醒状態にし、尾静脈より２００μＬの血液を採取した。採取した血液を遠心処理（１０，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）し、血漿を得た。
【００３８】
Ｃ．血液中のシリビン分析
採取した血漿１５μＬを分取し、β−グルクロニダーゼ（３，０００ｕｎｉｔ／ｍＬ）を溶解させた酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）４５μＬと混和し、３７℃で１時間インキュベートした。
その後、アセトニトリル１５μＬと混和後、遠心処理（３，０００ｒｐｍ、２ｍｉｎ）し、上澄み３０μＬ分取し、アセトニトリル６０μＬと混和した後、ＨＰＬＣによりシリビン量を定量した。
【００３９】
・ＨＰＬＣ条件
カラム  ：Ｋｉｎｅｔｅｘ  ５μ  Ｃ１８  １００Ａ  ４０℃
液相    ：リン酸緩衝液（ｐＨ５．４５）：アセトニトリル＝６５：３５
流速    ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
注入量  ：２０μＬ
検出波長：２８８ｎｍ          
【００４０】
４）結果
血漿中のシリビン量の経時変化から、ＡＵＣ、Ｔｍａｘ、Ｃｍａｘを求めた。なお測定結果は、シリマリン原末投与群に対するダネットの検定法により有意差検定を行った（有意水準０．０５）。結果を下記の表３に示す。
【００４１】
【表３】
2018177704.tif 000005
【００４２】
表３に示すとおり実施例の組成物は、シリマリン原末に対して約２．５倍のＡＵＣを示す極めて吸収性の高い組成物であった。これはシリマリンがナノサイズの粒子となっていることに由来すると考えられた。ポリビニルピロリドンをＨＰＭＣに置換した比較例の組成物も高い吸収性を示したが、実施例の組成物には及ばなかった。
【図１】
2018177704.tif 000006