(57)【要約】【課題】  動物実験と同等の評価が可能で、尚且つ短時間で多検体のＩＬ−１２産生誘導活性の評価を可能にする安価な手法を構築すること。【解決手段】  Ｃａｃｏ−２細胞と免疫賦活効果を有する乳酸菌死菌体粉末、もしくはポジティブコントロールとなるＯＫ４３２を共培養後にＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法により逆転写したＤＮＡを鋳型にＩＬ−１２発現遺伝子プライマーを用いてＰＣＲを行い、アガロースゲル電気泳動で分離後、ＵＶ照射で可視化したＩＬ−１２発現遺伝子のバンド輝度を解析し、ＯＫ４３２との比活性で評価する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃａｃｏ−２細胞と免疫賦活効果を有する乳酸菌死菌体粉末を共培養後にＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法により逆転写したＤＮＡを鋳型にＩＬ−１２発現遺伝子プライマーを用いてＰＣＲを行い、アガロースゲル電気泳動で分離後、ＵＶ照射で可視化したＩＬ−１２発現遺伝子のバンド輝度を解析することでＩＬ−１２の産生誘導活性を評価することを特徴とした手法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は培養細胞を用いた免疫誘導活性を評価する手法に関する。
【背景技術】
【０００２】  食による健康寿命延伸が叫ばれ、発酵食品への注目が高まる中、機能性食品として腸内フローラを改善する細菌や酵母を摂取するプロバイオティクスをはじめ、最近では生体に直接作用して免疫機能をはじめとする様々な生理活性作用を発揮するバイオジェニックスという定義が提唱され、免疫賦活作用を有するセルフディフェンス素材としての機能性食品が注目されている。【０００３】  その一つである乳酸菌は、生菌死菌問わずプロバイオティクス、バイオジェニックスの双方から免疫賦活効果が高い素材として様々な研究がなされてきた。【０００４】  経口摂取された乳酸菌生菌体もしくは乳酸菌死菌体は小腸の腸管上皮細胞を刺激し、非常に強力な免疫賦活物質であるインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の産生を誘導する。さらにＩＬ−１２はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）を活性化させ、免疫系の調節作用を有するインターフェロンＹ（ＩＦＮ−Ｙ）の産生を誘導することから免疫賦活活性の指標とされてきた。【０００５】  今後乳酸菌など、特に免疫活性強化を目的とする機能性食品素材の開発にはＩＬ−１２産生誘導活性の有無が大きな意味を持つと考えられ、関心が集められている。【０００６】  その一方、ＩＬ−１２の測定が可能な機関は限られており、評価が困難という現状がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１３−０５１９０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  これまでＩＬ−１２の定量にはマウス等を用いた動物実験が主流であった。動物実験は開発された医学、医療の発展と応用に必要不可欠である。しかしながら限られた施設のみでしか解析出来ず、解析結果を得るまでに時間を要する。また個体差があるため、複数の動物を使用し平均値を取る必要がある。そのため解析費用が高価といった一面があった。【０００９】  本発明の目的は動物実験と同等の評価結果を得ることができ、且つ安価で短時間、さらに一度に多検体の評価が可能な新規測定方法を構築、提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  発明者らは誠意研究した結果、ヒト結腸腺癌由来培養細胞株であるＣａｃｏ−２細胞と乳酸菌死菌体粉末を共培養し、ＩＬ−１２の発現遺伝子を定量することで上記目的を達成できる発明を完成するに至った。即ち本発明は以下のとおりである。【００１１】  Ｃａｃｏ−２細胞と免疫賦活効果を有する乳酸菌死菌体粉末を共培養後にＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）法により逆転写したＤＮＡを鋳型にＩＬ−１２発現遺伝子プライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行い、アガロースゲル電気泳動で分離後、ＵＶ照射で可視化したＩＬ−１２発現遺伝子のバンド輝度を解析することでＩＬ−１２の産生誘導活性を評価することを特徴とした手法。【００１２】１．Ｃａｃｏ−２細胞
ヒト結腸腺癌由来であり、一般的な培養条件下で分化する。よく発達した細胞間結合（タイトジャンクション）を発現し、異物の侵入を防ぐ腸管上皮としてのバリア能に優れている。また、微絨毛を発現する性質から、結腸由来でありながら小腸に似た性質を持つ。実際の生体腸管での現象を反映し、簡便かつ大量に処理できる実験系が構築可能なことから、生体の腸管吸収モデルとして利用されていることが多い。【００１３】２．ＲＴ−ＰＣＲ法
ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、ＰＣＲによって遺伝子の発現を定性かつ定量的に解析できる方法である。その方法としてはＲＴ（逆転写：ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）とＰＣＲの二段階の過程を要する。ＲＮＡはＤＮＡポリメラーゼの鋳型とはならないため、ＰＣＲで増幅するために、まずＲＮＡをＤＮＡに変換する必要がある。逆転写酵素によりＲＮＡから変換されたＤＮＡはｃＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ、相補的の意味）と呼ばれ、ＰＣＲの鋳型となる。
次いで目的とする特定の遺伝子のプライマーセットと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅する。この手法は主にタンパク質をコードする遺伝子の一部もしくは全体の増幅や、細胞や臓器などで目的の遺伝子が働いているかどうか（遺伝子発現）を確認するために広く用いられている。【００１４】３．アガロースゲル電気泳動
ＰＣＲで増幅したＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動により増幅サイズに応じて分離が可能である。アガロースは寒天の主成分で、沸騰水近くの温度で溶解し、冷ますとゲル化する性質を持つ。ゲル化したアガロースゲルは網目状構造を持ち、核酸を分離するために最もよく利用される方法である。ＤＮＡを構成するヌクレオチドは塩基とリン酸基が分離して帯電しているが、二本鎖ＤＮＡでは各塩基の電荷は水素結合によって打ち消されている。よって分子全体ではリン酸基の電荷のみであり、その電荷量はヌクレオチド数（ＤＮＡの大きさ）に比例する。また二本鎖ＤＮＡは鎖状構造をとっているため、立体構造は泳動速度に影響を与えず、泳動速度の差は大きさの違いによってのみ生じる。核酸は負に帯電しているため、電気泳動では必ず陽極に向かって移動し、網目を通る速度は大きい分子のＤＮＡほど遅く、逆に小さいものほど早く移動する。
アガロースゲル作成時もしくは分離後の染色に使用するエチジウムブロマイドは二本鎖ＤＮＡに結合し、紫外線照射によりＤＮＡ量に比例して蛍光を発する。これによりＤＮＡをバンドとして可視化するだけでなく、ＤＮＡ量の確認も可能になる。
【発明の効果】
【００１５】  本発明ではＲＴ−ＰＣＲ法を用いるため、解析までの時間が１日で終了可能となった。さらに動物実験と比較して解析費用が大幅に削減されるだけでなく、本発明の評価結果とマウスを用いた動物実験結果は、ほぼ同じ傾向がみられたことから、同等の評価が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１の実験系において供試した乳酸菌死菌体粉末およびＯＫ４３２によるＩＬ−１２発現遺伝子量を測定し、比活性によりＩＬ−１２産生誘導活性を評価した結果を示した図である。
【図２】実施例１と同じ乳酸菌死菌体粉末およびＯＫ４３２を供試した比較例１の実験系におけるＩＬ−１２産生誘導活性の測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】  本発明に用いる免疫賦活物質は、乳酸菌に限らず、ＩＬ−１２産生誘導能を有するものであればよく、特に限定はされない。例えばペプチドグリカンやリポ多糖、βグルカンなどが挙げられる。
【００１８】  本発明に用いる培養細胞は、Ｃａｃｏ−２細胞に限らず培養可能な細胞株であればよく、特に限定はされない。例えばマクロファージ細胞などが挙げられる。
【００１９】  本発明におけるプライマーセットはＩＬ−１２に限らず、免疫調節や炎症反応などの生体防御機構を担うサイトカインであればよく、特に限定はされない。例えばＩＦＮ−ＹやＩＬ−８、ＴＮＦ−α、β−ディフェンシン（−１、−２、−３、−４）等が挙げられる。
【００２０】  本発明におけるＣａｃｏ−２細胞の培養は１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）（ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ）と０．２％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＳＩＧＭＡ）を用い、５％ＣＯ２飽和湿度の気相インキュベーターにて３７℃で培養した。
【００２１】  ウシ胎児血清は補体を不活性化するために５６℃で３０分間加熱処理して非働化して使用した。
【００２２】  Ｃａｃｏ−２細胞は上記条件で約３週間培養し、分化誘導した後に供試した。
【００２３】  本発明における免疫賦活物質は株式会社秋田今野商店より提供された乳酸菌死菌体粉末（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を用いた。
【００２４】  本発明におけるＲＮＡの抽出にはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、ｃＤＮＡの合成にはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いた。
【００２５】  以下、本発明について実施例を用いて詳細に説明する。
【実施例１】
【００２６】培養細胞を用いたＲＴ−ＰＣＲ法による免疫誘導活性評価試験
細胞数が２．５×１０５個となるようにφ６０シャーレ（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）に播種後２４時間培養した細胞に、乳酸菌死菌体粉末を１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように１×ＰＢＳに溶解後、０．２μｍシリンジフィルター（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて滅菌ろ過した試料溶液を、１ｍｇ／ｍｌ（乳酸菌死菌体粉末相当量）となるように投与後、３７℃、５％ＣＯ２飽和湿度の気相インキュベーター（パナソニック  ヘルスケア）にて３時間共培養した。その後シャーレから培地を除去し、トリプシン溶液（０．２５％トリプシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳ）を加えて同インキュベーター内で５分インキュベート後、細胞をシャーレから剥離して１．５ｍｌチューブに回収した。【００２７】  乳酸菌死菌体粉末の代わりにＯＫ４３２を用いて同様に共培養を行い、ポジティブコントロールとした。ＯＫ４３２は中外製薬株式会社の溶血性連鎖球菌菌体製剤の抗ガン剤として知られている医薬品で、正式製品名はＰｉｃｉｂａｎｉｌ（ピシバニール）。【００２８】  遠心分離（３０００ｒｐｍ、３分）で培地を除去した後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコールに準じてＲＮＡを抽出し、濃度を測定した。【００２９】  ｃＤＮＡの合成はＳｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）のプロトコールに準じて行った。【００３０】  合成したｃＤＮＡの目的領域を増幅させるためにＰＣＲ（ＢｉｏＲａｄ）を行った。増幅確認用試薬は表１の通りに調整し、ＰＣＲ条件は表２の通り９４℃２分間を１サイクル、次に９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で３０秒間を１サイクルとして４０サイクル、その後４℃で１分間を１サイクル行い、２５℃で保持した。本発明で用いたプライマーは表３に示す。インターナルコントロールとしてβ−ａｃｔｉｎの発現量を測定し、ＩＬ−１２発現遺伝子量を補正した。【００３１】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【００３２】  ＰＣＲで増幅したＤＮＡは、０．０２％のエチジウムブロマイドを添加した１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、増幅サイズに応じて分離した。ＵＶトランスイルミネーター（ＢｉｏＤｏｃ−Ｉｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）上で撮影したゲル画像の目的バンド輝度を解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ）にて数値化し、ポジティブコントロール（ＯＫ４３２）との比活性として表した。【００３３】  図１に実施例１における各試料のＩＬ−１２産生誘導活性を示す。【００３４】  供試した乳酸菌死菌体粉末はＯＫ４３２に比べ２．１３倍のＩＬ−１２産生誘導活性が認められた。
【比較例１】
【００３５】マウスを用いた動物実験による免疫誘導活性評価試験
７週齢のＢＡＬＡ／ｃマウスに同サンプルを菌体重量換算で１０μｇ／ｍｌ投与し、常法に従った。活性評価はＩＬ−１２産生量およびポジティブコントロールとなるＯＫ４３２との比活性で評価した。
【００３６】  図２に比較例１における各試料のＩＬ−１２産生誘導活性を示す。
【００３７】  供試した乳酸菌死菌体粉末はマウスを用いた動物実験においてもＯＫ４３２の１．５４倍のＩＬ−１２産生誘導活性が認められた。
【００３８】  ＲＴ−ＰＣＲ法と動物実験におけるＯＫ４３２との比活性による評価結果を表４にまとめた。両実験系ともに、供試した乳酸菌死菌体粉末はＯＫ４３２よりも高いＩＬ−１２産生誘導活性が認められ、比活性による評価では同様の傾向を示したことから、本発明の手法による評価が可能であることが示唆された。さらにＲＴ−ＰＣＲ法を用いることで動物実験よりも迅速且つ安価な評価が可能となり、安定した培養が可能な細胞株を用いることで、多検体評価の際にも高い再現性も得ることができると示唆された。
【００３９】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月26日(2018.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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