(57)【要約】      （修正有）【課題】ＰＣＲのセットアップに関与する増幅反応における疑陽性の結果を予防するための、特に熱不安定性特性を示す、穏やかな処理条件によって不活化されるエンドヌクレアーゼの提供。【解決手段】特定の配列又はそれと少なくとも７０％同一である配列を有し、ＦＹＣＧＣペンタペプチドモチーフの直近Ｎ末端であるアミノ酸残基が、負に荷電する残基によって置換されている前記エンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片、該酵素又は断片をコードする核酸分子、及び該酵素又は断片を用いて混入しているポリヌクレオチドを試料から取り除く方法。【選択図】図６ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片であって、前記エンドヌクレアーゼＩが配列番号４又はそれと少なくとも７０％同一である配列を有し、ＦＹＣＧＣペンタペプチドモチーフの直近Ｎ末端であるアミノ酸残基が負に荷電している残基によって置換されているエンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片。
【請求項２】
前記負に荷電している残基が、グルタミン酸、アスパラギン酸、４−フルオロ−ＤＬ−グルタミン酸、γ−カルボキシ−ＤＬ−グルタミン酸、及びＤ−２−アミノアジピン酸から成る群から選択される請求項１のエンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片。
【請求項３】
前記負に荷電している残基がグルタミン酸である請求項２のエンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片。
【請求項４】
Ｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａに由来する請求項１〜３のいずれか１項のエンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片。
【請求項５】
０．５ｍＭのＴＣＥＰの存在下で５０℃にて３０分間インキュベートすると実質的に不活化され、０．５ｍＭのＴＣＥＰの存在下で残留活性が評価される請求項１〜４のいずれか１項のエンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片。
【請求項６】
０．５Ｍの塩化ナトリウムの濃度にて、最適塩濃度で前記エンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片が示す触媒活性の６０％以上である触媒活性を有する請求項１〜５のいずれか１項のエンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片。
【請求項７】
試料から混入しているポリヌクレオチドを取り除く方法であって、前記方法が請求項１〜６のいずれか１項に記載のエンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片に試料を接触させることを含む方法。
【請求項８】
その中でポリヌクレオチドの消化を可能にする条件下でエンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片に試料を接触させ、次いで、エンドヌクレアーゼを不活化するのに十分な温度と時間にて、前記試料と前記エンドヌクレアーゼの混合物を不活化添加剤に接触させる請求項７の方法。
【請求項９】
前記試料が、組換えで作出した当該タンパク質を含有する調製物であり、好ましくは、前記タンパク質は酵素である請求項７又は８の方法。
【請求項１０】
前記試料が当該検体タンパク質を含有する請求項７又は８の方法。
【請求項１１】
前記試料が、細胞溶解物、組織試料又は体液に由来する請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記試料が抗体又は抗体断片を含む請求項７又は８の方法。
【請求項１３】
前記試料が、ＤＮＡ結合タンパク質又は溶液にて核酸と会合するタンパク質を含む請求項７又は８の方法。
【請求項１４】
前記試料が、ポリヌクレオチドの解析法、好ましくはＰＣＲ又はＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定にて使用され得る試薬溶液である請求項７又は８の方法。
【請求項１５】
前記不活化添加剤が、金属イオンキレート剤又はジスルフィド結合還元剤である請求項８〜１４のいずれか１項の方法。
【請求項１６】
前記剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン及びＮ−エチルマレイミドから成る群から選択される請求項１５の方法。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のエンドヌクレアーゼＩ若しくは酵素的に活性があるその断片をコードする、又は前記エンドヌクレアーゼＩ若しくは酵素的に活性があるその断片を含むタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のエンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片を単離する及び精製する方法であって、前記方法が、好適な宿主細胞にて前記エンドヌクレアーゼ又はその断片を発現させ、その後、前記宿主細胞及び／又は前記細胞が培養された培地からエンドヌクレアーゼを分離することを含む方法。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか１項のエンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片と第２のエンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片を含む組成物。
【請求項２０】
前記第２のエンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片が、配列番号５の配列又はそれと少なくとも８０％同一である配列を有する請求項１９の組成物。
【請求項２１】
前記第２のエンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片が、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅに由来する請求項２０の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に熱不安定性特性を示す、穏やかな処理条件によって不活化されるエンドヌクレアーゼに関する。本発明はまた、そのようなエンドヌクレアーゼを介した生物調製物からの混入しているポリヌクレオチドの除去も含む。本発明はまた、エンドヌクレアーゼの使用を介した核酸の増幅反応、特にポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）のセットアップに関与する増幅反応における疑陽性の結果の予防にも関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸及び特にゲノムＤＮＡは、試料にて粘性を作り出し、精製、下流の解析及び応用を妨害するので細胞培養、細胞溶解物及びタンパク質にて問題を引き起こすことが多い。ＤＮＡ及び核酸の除去は物理的に、化学的に又は酵素的に行うことができる。ＤＮＡ又はＲＮＡの酵素的除去はヌクレアーゼを添加することによって達成することができる。しかしながら、ＤＮＡはタンパク質又は酵素分解からそれを保護する他の分子に結合するので、ヌクレアーゼは複雑な生物試料ではＤＮＡを分解するのに失敗することが多い。タンパク質／ＤＮＡの相互作用を制限するので、下流のタンパク質精製を円滑にするために塩化ナトリウムを典型的な細胞溶解物に加えることが多い。残念ながら、ほとんどのヌクレアーゼは適度な塩濃度で高度に阻害されるようになり、又は不活性になり、酵素的除去が不十分になることが多い。従って、タンパク質、試薬又は生物試料から微量のＤＮＡをすべて除去することは厄介であることが多い。
【０００３】
細胞溶解物、タンパク質精製にて及び解析工程の前に核酸を酵素的に取り除くために、たとえば、ベンゾナーゼ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのヌクレアーゼ）、Ｏｍｎｉｃｌｅａｖｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）又はＤＮＡ分解酵素Ｉのような幾つかの市販の代替品が存在する。しかしながら、適度な熱処理によって不活化することができる選択肢はない。使用後、上記酵素を取り除くために、種々の樹脂、阻害剤又はカラム精製工程が通常必要とされる。使用後、ヌクレアーゼを除去するのに追加の試薬又は精製工程を必要とするので、これによって酵素法は使用するのにさらに厄介になる。これはさらに時間がかかり、当該タンパク質のさらに低い収率をもたらし得る。
【０００４】
タンパク質精製にて又は試薬から微量のＤＮＡを取り除く問題は、市販のポリメラーゼ及びマスターミックスにて見られることが多い外因性ＤＮＡにおいて明らかである。さらに、分子生物学の応用（たとえば、ＰＣＲ及び配列決定）及び分子診断のための試薬は、混入するＤＮＡ及びヌクレアーゼ双方が含まれてはならない。使用後、上記で記載されたヌクレアーゼを除去することに関連する困難さによって、ＤＮＡ技術において使用される試薬を処分するのにヌクレアーゼはあまり好適でなくなっている。
【０００５】
ＰＣＲのような核酸増幅法は、バイオテクノロジーで利用できる最も強力なツールの１つであり、少量の核酸しか含有しない試料から大量のコピー数の標的配列を調製するのを可能にする。ＰＣＲの場合、標的配列と遊離のヌクレオチドを含有する反応混合物に、二本鎖標的配列の各鎖に対して相補性のオリゴヌクレオチドプライマーを添加する。ＤＮＡポリメラーゼの存在下での熱サイクルは、プライマー間の配列の増幅を生じる。その後のＰＣＲサイクルで鋳型として作用するＰＣＲ工程によって創られた増幅断片の能力は、相当な量に標的配列の迅速な生産を生じる。
【０００６】
核酸の混入の有害な効果に対する特定の感度の増幅反応は、これらが反応にて２０コピー未満のＤＮＡ配列を定量する力を有するので、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法である。従って、最少レベルの核酸混入でさえ、ｑＰＣＲ法にて間違った結果を与え得る。加えて、これらの方法は、不可避の背景シグナルを上回る増幅した標的核酸からのシグナルの検出を必要とする。混入している核酸はこの背景シグナルに寄与することができるので、技法の感度を低下させる。そのようなものとして、混入する核酸を最少化することは、定量的ＰＣＲ実験の感度を最大化する。少数コピーの標的核酸が検出される実験、たとえば、定量的ＰＣＲに基づく病原体診断及び病原体負荷の定量では、定量的ＰＣＲの感度が最大化され、疑陽性が最少化されることが最重要である。高度に保存された細菌ＤＮＡの断片がｑＰＣＲ法によって標的とされる（たとえば、１６ＳｒＲＮＡ又は２3ＳｒＲＮＡ）細菌同定及び診断の分野では、ＤＮＡポリメラーゼ調製物（通常、細菌及び細菌発現系から得られる）から生じる核酸の混入は主要な問題である。従って、ＤＮＡポリメラーゼ調製物から細菌の核酸混入物を効率的に取り除く方法が必要とされる。特に求められるのは、下流の増幅反応に有害な影響を有することなく及びポリメラーゼを損傷することなく、これを達成することができる方法である。
【０００７】
標的配列に対して内部を切断するので混入しているＤＮＡの増幅を妨げるエンドヌクレアーゼを用いて、標的ＤＮＡ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼを添加する前に、個々のＰＣＲ反応混合物を処理することができることが提案されている（Furrer et al. Nature. Vol. 346 page 324, 1990）。この方法は、反応混合物が煮沸される除染の後、エンドヌクレアーゼを不活化するために３０分間の除染時間を必要とする。この煮沸工程のために、除染の後にＤＮＡポリメラーゼを加えることが必要である。当然、これは増幅前の混合物に持ち越し汚染を導入するさらなるリスクを表し、ＤＮＡポリメラーゼ自体の除染は除外される。
【０００８】
ＤＮＡを特異的に切断する熱不安定性のエンドヌクレアーゼ（ＤＮＡ分解酵素）が記載されている。ＷＯ９９／００７８８７は９４℃で２分間の後、実質的に不可逆的に不活化される、Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓから単離されたＤＮＡ分解酵素を開示している。この同じ酵素はまた６５℃で１５分間の後も、実質的に不可逆的に不活化される。しかしながら、これらの温度は特定の応用には高すぎ、混入するＲＮＡ及び一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を取り除く要求もある。
【０００９】
エンドヌクレアーゼＩは、配列とは無関係な方式でＲＮＡ及びＤＮＡ双方を切断することが知られる約２５ｋＤａの細胞周辺質又は細胞外の単量体酵素である。それは多数の異なるＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ及びＦｉｂｒｏｂａｃｔｅｒにて見いだされる。構造は、９つのβ鎖、５つの短い螺旋及び５つの長い螺旋を含有する混合α／βトポロジーを有する。それはプラスミド及びｓｓＤＮＡを切断することができる。それはホスホジエステル結合の３'側で切断する。
【００１０】
熱不安定性であるエンドヌクレアーゼはＡｌｔｅｒｍａｒｋら(FEBS Journal; 2007, 274: 252 to 263)によって当該技術で記載されている。彼らは、低温細菌Ｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａから単離したエンドヌクレアーゼＩ（ＶｓＥｎｄＡ、配列番号１）を記載している。この酵素は、中温細菌Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  （ＶｃＥｎｄＡ、配列番号３）から単離されたエンドヌクレアーゼＩで見られる同一条件下でのほぼ１００％活性に比べて５０℃の温度で２０％未満の活性（この酵素の最適な活性に比べて）の酵素活性を有することが分かった。さらに、７０℃での不可逆的に折り畳み構造がほどける比率はＶｃＥｎｄＡについてよりもＶｓＥｎｄＡについての方が高かった。
【００１１】
細菌Ｖ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ及びＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの穏やかな塩性特性のために上述のＶｓＥｎｄＡ及びＶｃＥｎｄＡは高い塩分濃度の溶液にて酵素的にさらに活性があることが報告されている。Ｎｉｉｒａｎｅｎら(FEBS Journal; 2008, 275: 1593 to 1605)は、触媒定数（Ｋcat）はＶｃＥｎｄＡ及びＶｓＥｎｄＡ酵素についてそれぞれ０．２５Ｍ及び０．５Ｍの塩濃度でピークとなることを示している。
【００１２】
温和な温度で不活化することができ、調製物におけるタンパク質又は他の当該分子の活性に有害に影響しないエンドヌクレアーゼは生物調製物から混入しているポリヌクレオチドを取り除く高度に効果的で効率的な方法を提供する。理想的には、エンドヌクレアーゼの添加の後、ＤＮＡ／タンパク質の相互作用を制限し、純粋なタンパク質試料を作出するために、塩化ナトリウムを調製物に添加することが多いので、このエンドヌクレアーゼは高レベルの塩分濃度を含有する調製物を認容することもできる。しかしながら、これらの特性を持つ現在利用可能なエンドヌクレアーゼはない。
【００１３】
温度の変化によって反転されないヌクレアーゼの不活化は、室温で実施され得る又は室温成分を伴うサイクルを含むさらなる方法で使用されるべきである調製物にとって特に重要である。単純な熱不安定性、すなわち、既存の酵素よりも低い温度で折り畳み構造がほどけることは不十分である。温和な条件下、たとえば低温のもとでの不活化は、有用な酵素を提供するために、当初の合成にて正しく折り畳まれたタンパク質の理に適った収率と組み合わせる必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
驚くべきことに本発明者らは、ＶｓＥｎｄＡ酵素のアミノ酸配列における単一の点突然変異が、高い塩分濃度の調製物においてさえ酵素的に活性を保ったままで、さらに、温和な条件下で不活化することができる酵素を生じることを見いだした。その置換が驚くべき且つ有利な特性を持つ酵素を生じる残基は４４位で見られるセリン残基である。このセリン残基は、高度に保存されたペンタペプチドモチーフ（フェニルアラニン−チロシン−システイン−グリシン−システイン又はＰｈｅ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ又はＦＹＣＧＣ）の直近Ｎ末端に存在する。野生型（ｗｔ）のＶｓＥｎｄＡの配列を配列番号１によって表し、図１に示す。番号付け（４４）は細胞質から細胞周辺質への移動の間に切断されるＮ末端シグナルペプチドを含む。シグナル配列は図３及び図４では示されず、その結果、これらの図における番号付けは調整されている。
【００１５】
Ａｌｔｅｒｍａｒｋら(Biological Crystallography; 2006, D62, 1387 to 1391)の知見から、このセリン残基は埋められた塩化物イオンとの錯体の一部を形成することが見つけ出されている。このセリン残基は、エンドヌクレアーゼＩ酵素が由来する細菌の種に応じて様々な位置で見いだすことができる（たとえば、ＶｃＥｎｄＡにおける同等のセリン残基は４２位に見いだされ、Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓに由来するエンドヌクレアーゼＩの同等のセリン残基は４１位に見いだされる）。Ｖｉｂｒｉｏ属の種々の細菌に由来するエンドヌクレアーゼの配列の検討から、配列の４０〜５０位で塩化物イオンと相互作用するアミノ酸は必ずしもセリンとは限らないことが分かった。Ｖ．ｆｕｒｎｉｓｓｉｉに由来するエンドヌクレアーゼでは、たとえば、同等のアミノ酸はスレオニンである。
【００１６】
本発明者らは、負に荷電した残基又は別の極性残基によるこのセリン残基の置換が上記特性を有する酵素をもたらすことを見いだした。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
従って、本発明によれば、エンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片が提供され、前記エンドヌクレアーゼＩは、配列番号１の配列又はそれと少なくとも６０％同一である配列を有するが、ＦＹＣＧＣペンタペプチドモチーフの直近Ｎ末端であるアミノ酸残基が負に荷電した又は極性である残基によって置換されており、前記エンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片が、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在下にて３０℃で１５分間インキュベートすると実質的に（不可逆的に）不活化される。
【００１８】
或は、本発明は、エンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片を提供し、前記エンドヌクレアーゼＩは、配列番号１の配列又はそれと少なくとも６０％同一である配列を有するが、ＦＹＣＧＣペンタペプチドモチーフの直近Ｎ末端であるアミノ酸残基が負に荷電した又は極性である残基によって置換されており、前記エンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片が、１０ｍＭのＤＴＴ又は１０ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）のいずれかの存在下にて４℃で６時間インキュベートすると実質的に（不可逆的に）不活化される。適当な不活化の条件は、温度の反映、インキュベートの時間及び添加される化学不安定化剤の濃度であることが十分に理解される。上記条件は、本発明の酵素及び条件のさらなるセットを定義する試験を提供し、完全なアッセイプロトコールは実施例にて記載される。
【００１９】
代わりに検討すると、本発明は、１０ｍＭのＤＴＴの存在下にて３０℃で１５分間インキュベートすると、又は１０ｍＭのＴＣＥＰの存在下にて４℃で６時間インキュベートすると実質的に（不可逆的に）不活化されるエンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片を初めて提供する。
【００２０】
従って、不活化を提供する条件は変化し得る一方で、好ましい置換の性質は同一なので、代わりに検討すると、本発明は、エンドヌクレアーゼＩ、又は配列番号１若しくは４に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％若しくは９８％同一である酵素的に活性があるその断片を提供するが、ＦＹＣＧＣペンタペプチドモチーフの直近Ｎ末端であるアミノ酸残基が負に荷電した又は極性である残基によって置換されている。
【００２１】
負に荷電した残基又は極性の残基は遺伝的にコードされてもよいし、遺伝的にコードされなくてもよい。好ましくは、導入されるアミノ酸は負に荷電する。アミノ酸及び特にその側鎖官能基の文脈における極性及び荷電は当該技術でよく理解されており、通常、正常な生理的条件下で評価される。
【００２２】
ＦＹＣＧＣペンタペプチドモチーフの直近Ｎ末端であるアミノ酸残基の「置換」によって、この残基が異なるアミノ酸、通常遺伝的にコードされるが、遺伝的にコードされないことも考えられるアミノ酸又はアミノ酸誘導体によって置き換えられることを意味する。好ましくは、通常セリンである残基が、負に荷電したアミノ酸、たとえば、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸、又は別の極性のアミノ酸、たとえば、スレオニン、アスパラギン若しくはグルタミンによって置き換えられる。或は、前記アミノ酸残基は、負に荷電した又は極性である非遺伝的なアミノ酸によって置き換えられる。好ましい遺伝的にコードされないアミノ酸は、たとえば、４−フルオロ−ＤＬ−グルタミン酸、γ−カルボキシ−ＤＬ−グルタミン酸、及びＤ−２−アミノアジピン酸のようなグルタミン酸誘導体である。最も好ましい実施形態では、ＦＹＣＧＣペンタペプチドモチーフの直近Ｎ末端であるアミノ酸残基はグルタミン酸によって置き換えられる。
【００２３】
好ましい実施形態では、本発明のエンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性がある断片は、０．５ｍＭのＴＣＥＰの存在下にて５０℃で３０分間インキュベートすると実質的に不活化され、残留活性は０．５ｍＭのＴＣＥＰの存在下で評価され、好ましくはエンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片は、これらの条件下で不可逆的に不活化される。
【００２４】
さらなる態様では、本発明は、上述のエンドヌクレアーゼの使用を含む、試料から混入しているポリヌクレオチドを取り除く方法を含む。方法は通常、上記で定義したようなエンドヌクレアーゼに試料を接触させることを含む。
【００２５】
好ましい実施形態では、試料は、当該タンパク質、たとえば、組換えで作出した当該タンパク質、たとえば、酵素を含有する調製物である。或は、当該タンパク質は出発物質から精製することが望まれる検体又は他のタンパク質であり得る。調製物は、細胞溶解物又は組織試料又は体液であってもよく、又はそれに由来してもよい。
【００２６】
当該タンパク質は抗体又は抗体断片であり得る。タンパク質（たとえば、抗体）は診断法又は治療法に有用であってもよい。従って、上述の方法は、診断用又は治療用のタンパク質が混入するポリヌクレオチドを含まないので、投与に安全であり得ることを保証するために使用され得る。
【００２７】
当該タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質又は溶液中で核酸と会合する他のタンパク質であり得る。特に、核酸から当該タンパク質を分離するのに塩が好都合に使用され得るそのようなタンパク質は、塩の存在下で機能する本発明のエンドヌクレアーゼの観察された能力を与えられる。
【００２８】
本発明のエンドヌクレアーゼは、５０ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは約５００ｍＭの塩（たとえば、塩化ナトリウム又は塩化カリウム）濃度にて特に効果的であり得る。多数のヌクレアーゼは細胞溶解物及び精製緩衝液に通常添加される高い塩化ナトリウム濃度で阻害され、本発明のエンドヌクレアーゼの塩認容性は特別な利点である。好ましくは、本発明のエンドヌクレアーゼは、０．５Ｍの塩化ナトリウム又は塩化カリウムにて最適な触媒活性（本明細書で評価される）を有し、又はこの塩濃度にて最適な塩濃度で示されるものの６０％未満、好ましくは７５％未満である活性を有する。「最適な塩濃度」は、酵素が最高の触媒活性を有する塩化ナトリウムの濃度である。代わりに検討すると、本発明のエンドヌクレアーゼは、塩化ナトリウムの濃度が０．３５〜０．６５Ｍ、好ましくは０．４５〜０．５５Ｍ、さらに好ましくは約０．５Ｍである場合、最適な触媒活性を有する。
【００２９】
別の実施形態では、生物調製物は、たとえば、ポリヌクレオチド解析法、たとえば、ＰＣＲ、ＤＮＡ／ＲＮＡの配列決定又はマイクロアレイにて使用される試薬溶液である。試薬溶液は、非タンパク質の成分又は混合物、たとえば、ＰＣＲのマスターミックス又は緩衝液を含んでもよく又はそれから成ってもよい。上述のエンドヌクレアーゼを使用して試薬からポリヌクレオチド混入物を取り除き、失活させ、次いで当該ポリヌクレオチドを含有する試料に前記試薬を添加するので、前記試薬の添加を介して試料に導入される混入物の可能性を低減し得る。
【００３０】
本発明は、ポリヌクレオチドによる混入を防ぐこと及び制限すること、特に増幅試薬及び酵素における外来ポリヌクレオチドによる疑陽性の結果を減らし、バックグランド（陽性の非鋳型対照）を減らすことにて有用性を有する。
【００３１】
本発明のエンドヌクレアーゼは、増幅反応における内在性ＤＮＡの排除又は低減に使用するのに好適である。これは、エンドヌクレアーゼの不活化温度が低ければ低いほど、増幅工程の間にそれを不活化するのが容易であり、不活化工程で使用される所与の温度で達成することができる不活化の程度が大きいからである。
【００３２】
従って、本発明のエンドヌクレアーゼを使用して、増幅反応混合物又はその個々の成分に存在する非標的のポリヌクレオチド、たとえば、ポリメラーゼを分解する。それによって非特異的な増幅を減らし得る又は回避し得る。
【００３３】
本発明のエンドヌクレアーゼは低温で不活化することができるので、好ましい一実施形態では、エンドヌクレアーゼを使用して当該タンパク質又は当該試薬を含有する溶液から混入しているポリヌクレオチドを取り除くが、その際、前記タンパク質又は試薬はそれ自体、約３７℃の温度（エンドヌクレアーゼが酵素的に活性である）で熱不安定性である。
【００３４】
本発明のエンドヌクレアーゼの不活化は通常、不活化添加剤とのエンドヌクレアーゼのインキュベートを含むであろう。不活化添加剤はエンドヌクレアーゼを不安定化する、すなわち、所与の温度で折り畳み構造がほどけることに対してそれをさらに感受性にする。エンドヌクレアーゼＩは配位したＭｇ2+及び複数のジスルフィド結合を含有し、熟練者は、酵素のこれらの又は他の特性を標的として酵素を不安定化することができる試薬に気付くであろう。
【００３５】
エンドヌクレアーゼ内部の配位したＭｇ2+イオンのために、Ｍｇ2+イオンの濃度はエンドヌクレアーゼの活性に重要である。この理由で、１〜２０ｍＭの間、好ましくは５〜１０ｍＭの間のＭｇ2+又はＭｎ2+のイオン濃度が本発明の方法では使用され得る。ＰＣＲ又はタンパク質精製の緩衝液は通常、塩化マグネシウムの形態で５ｍＭの濃度のＭｇ2+イオンを有する。
【００３６】
不活化添加剤は、たとえば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属イオンのキレート剤であってもよい。不活化添加剤は、ジスルフィド結合還元剤（すなわち、タンパク質における２以上のシステイン残基間のジスルフィド結合を阻害する及び／又は壊す剤）。であってもよい。そのような剤の例には、ＤＴＴ、２−メルカプトエタノール（β−メルカプトエタノールとしても知られる）、２−メルカプトエチルアミン・ＨＣｌ、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシ）ホスフィン）及びＮ−エチルマレイミドが挙げられるが、これらに限定されない。ＴＣＥＰ及びＤＴＴが好ましい。ＴＣＥＰは特に好ましい。熟練者は、不活化を改善するが、その下流の反応に有害ではないその必要性にとって適当なジスルフィド結合還元剤の濃度を決定することができる。たとえば、０．０５〜５０ｍＭの間の濃度でＤＴＴを不活化工程に好都合に組み入れることができる。
【００３７】
好ましくは、本発明の方法におけるエンドヌクレアーゼの不活化は、０．５〜５０ｍＭの間、さらに好ましくは１〜２０ｍＭの間、たとえば、５〜２０ｍＭの間での不活化添加剤（たとえば、ＤＴＴ）の濃度で生じる。
【００３８】
従って、好ましくは、不活化添加剤は少なくとも１ｍＭの濃度で存在する。
【００３９】
実施例にて示すように、不活化に必要とされる条件は、インキュベートの温度及び時間及び不活化添加剤の濃度の自由自在な組み合わせに相当する。従って、不活化は、４０℃にて１ｍＭのＴＣＥＰと共に５〜１０分間のインキュベート後、又は３０℃にて１０ｍＭのＤＴＴと共に１５分間で達成され得る。処理される生物調製物の性質に応じて及びその後のその使用に応じて、条件のどの組み合わせが適当であるかは熟練者には明らかであろう。本発明のエンドヌクレアーゼは熱不安定性であるが、それを不活化するために必ずしも酵素を加熱しなくてもよいことが前述から十分に理解されるべきである。
【００４０】
従って、さらなる態様では、本発明は、その中でポリヌクレオチドの消化を可能にする条件下で本発明のエンドヌクレアーゼに試料を接触させることと、次いで前記エンドヌクレアーゼを不活化するのに十分な温度で十分な時間、前記試料とエンドヌクレアーゼの混合物を不活化添加剤と接触させることとを含む、試料から核酸（混入物）を取り除く方法を提供する。
【００４１】
２つの接触工程は通常インキュベートであり、本明細書で、特に実施例で記載される。試料にて核酸の消化を達成するのに好適なインキュベート条件は当該技術で既知であり、１０〜５０℃、たとえば、３５〜３７℃前後で５〜３０分間、たとえば、１０〜２０分間、好ましくは約１５分のインキュベートを好都合に含み得る。
【００４２】
本明細書の他で記載されるように、不活化のためのインキュベート条件は相当に変化することができ、１０℃未満の温度でのインキュベートは１〜２４時間であってもよく、１０〜３０℃の温度でのインキュベートは１０分間〜２時間であってもよく、３０℃を上回る（たとえば、３０〜７０℃、さらに好ましくは４０℃）の温度でのインキュベートは通常５〜３０分間であろう。本明細書の実施例で示すように、不活化添加剤の濃度及び選択もインキュベートの時間／温度に影響するであろう。不活化添加剤は好ましくは前述の低いインキュベート温度にて使用されるであろう。
【００４３】
代わりに検討すると、本発明のこの態様は、増幅反応混合物又は試薬から核酸混入物を取り除くことにおける本発明のエンドヌクレアーゼの使用を提供する。
【００４４】
さらなる態様では、本発明は、核酸増幅反応における持ち越し汚染による疑陽性の結果を防ぐ又は減らす方法を提供し、前記方法は、本発明のエンドヌクレアーゼを用いて増幅反応混合物に存在する持ち越し汚染した非標的のポリヌクレオチド、又はその個々の成分を分解することを含む。
【００４５】
本発明のエンドヌクレアーゼを用いてＤＮＡポリメラーゼ調製物から核酸混入物を取り除くことができると共に、それを用いてＤＮＡポリメラーゼを含む増幅反応混合物から核酸混入物を取り除くことができる。本発明のエンドヌクレアーゼの低い不活化温度は、除染の後のエンドヌクレアーゼの不活化がポリメラーゼに対する有害な影響なしで達成することができることを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
用語「核酸増幅反応」は、核酸の標的配列のコピー数を増やす試験管内の手段を指す。好ましくは、方法には「熱サイクル」、すなわち、高温のサイクルが関与するだろう。増幅方法には、ＰＣＲ及びその改変、３ＳＲ、ＳＤＡ、ＬＡＲ又はＬＣＲ及びＬＡＭＰ及びそれらの改変が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＣＲ、ＬＡＭＰ及びＬＣＲ及びそれらの改変は熱サイクル法である。方法は、標的配列のコピー数の線形の又は指数関数的な増加を生じる得る。「改変」には、リアルタイム増幅、定量的な及び半定量的な増幅、競合増幅等が包含されるが、これらに限定されない。
【００４７】
標的の核酸は、選択される増幅方法に応じてＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。たとえば、逆転写工程と組み合わせると、標的はＲＮＡ配列である見なすことができるけれども、ＰＣＲでは標的はＤＮＡである。３ＳＲはＲＮＡ標的配列を直接増幅する。
【００４８】
用語「増幅反応混合物」は、標的核酸を増幅するのに使用される種々の試薬を含む、一般に水性である溶液を指す。これらには、酵素、水性緩衝液、塩及びヌクレオシド三リン酸が含まれる。その用語は、増幅反応を上手く実施するのに必要な成分をすべて含有する混合物及び不完全であるので必要とされる成分の一部（たとえば、少なくとも２、３又は４）しか含有しない混合物を指す。用語「完全な」によって前置きされるのであれば、反応混合物は増幅に必要な成分をすべて含有する。
【００４９】
用語「持ち越し汚染」は、反応混合物に偶然又は気付かずに導入される核酸、特に前の増幅反応から持ち越された標的配列を記載するのに使用される。
【００５０】
用語「疑陽性の結果」は、検討中の核酸試料が標的配列を含有するが、増幅産物が持ち越し汚染に由来することを示すと思われる結果を指す。明らかに、本発明が提供する混入するＤＮＡの減少は法医学及び診断の分野で特に有利である。本発明の方法は、核酸増幅の特異性及び感度を高めることを可能にする。
【００５１】
用語「エンドヌクレアーゼ」は、ポリヌクレオチド骨格におけるホスホジエステル結合を加水分解し、ヌクレオチド配列に特異的ではない酵素を指す。本発明の「エンドヌクレアーゼＩ」はｄｓ及びｓｓのポリヌクレオチド、ＤＮＡ及びＲＮＡを切断することができる。
【００５２】
用語「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの任意の鎖を指す。これらのポリヌクレオチドはＲＮＡ又はＤＮＡであることができ、二本鎖又は一本鎖のいずれかであることができる。鎖は線形又は超らせんでもあり得る。
【００５３】
用語「塩」は、酸及び塩基の中和反応から生じるイオン性化合物を指す。関心のある塩は、ＤＮＡ／タンパク質の相互作用を制限し、エンドヌクレアーゼの添加後、さらに純粋なタンパク質試料を作出するために一般に使用されるものであり、当業者はこれらの塩を知っているであろう。塩又は特定の重要性は塩化ナトリウム及び塩化カリウムである。
【００５４】
「実質的に不活化される」によって、酵素が少なくとも９５％不活化され、好ましくは９８％不活化され、さらに好ましくは酵素が１００％不活化されることを意味する。不活化の比率は、好適な緩衝液（たとえば、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ）において不活化されたエンドヌクレアーゼ又は不活化されないエンドヌクレアーゼのいずれかと共にＤＮＡ試料（たとえば、５００ｂｐのＰＣＲ産物）を３７℃で３時間インキュベートし、電気泳動によって臭化エチジウムのアガロースゲル上で反応生成物を分離し、関連するＤＮＡバンドの蛍光の相対強度をＵＶ光のもとで測定することによって好都合に測定することができる。不活化されたエンドヌクレアーゼ又は不活化されないエンドヌクレアーゼの相対活性を測定するために代わりの方法が熟練者によって考案され得る。たとえば、ＤＮＡ試料を含有するＳＹＢＲ緑色の蛍光における相対的な変化が使用され得る。さらなる方法は、Ｋｕｎｉｔｚのアッセイ（Ｋｕｎｉｔｚ，Ｍ；１９５０，Ｓ．Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，３３：３６３及びＷＯ２０１１／０１００９４）及びＹａｍａｍｏｔｏによって考案された改変されたＫｕｎｉｔｚのアッセイ（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ；１９７１，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，２２８：９５及びＷＯ  ２０１１／０１００９４）である。好適な方法は本明細書の実施例にて記載される。
【００５５】
「不可逆的な不活化」の恩恵は、エンドヌクレアーゼの触媒機能を温度の変化によって取り戻すことはできないので依然として不活化されたエンドヌクレアーゼを含有し得る処理された試料を、当該核酸を消化することなくその核酸と接触することが関与するさらなる処理又は応用で使用することができることである。従って、エンドヌクレアーゼがその活性を取り戻すことはなく、実質的に残留活性はなく、具体的には５％未満、好ましくは２％未満が残り、最も好ましくは検出可能なエンドヌクレアーゼ活性は残らない。本発明の酵素はそのような「不可逆的な」不活化が可能である（そのような不活化を提供する条件は本明細書で記載される）ので、不活化は好ましくは不可逆的な不活化である。それが不活化添加剤、たとえば、金属イオンキレート剤又は還元剤の継続する存在に依存するとしても不活化は不可逆的であると見なすことができる。
【００５６】
熱変化耐性の（「不可逆的な」）不活化を含む不活化は、上記で定義されたように不活化添加剤に依然として接触するエンドヌクレアーゼを必要とし得る。文脈から明瞭ではない限り、本明細書で記載される残留活性は、不活化添加剤、たとえば、０．１、好ましくは少なくとも０．２Ｍの添加剤、たとえば、ＴＣＥＰの継続する存在を前提とし；さらに弱い還元剤（たとえば、ＤＴＴ）はさらに高い濃度、たとえば、少なくとも０．５又は１ｍＭを必要とし得る。通常、１０ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ以下が必要とされる又は存在する。
【００５７】
特定の応用については、不活化添加剤が存在しない又は本質的に存在しない場合でさえ不活性であるエンドヌクレアーゼＩを有することが望ましくてもよい。不活化剤を除去する方法は当該技術で既知であり、それには透析及び脱塩カラム又は緩衝液交換カラムの使用が含まれる。本発明の酵素は適切に処理されれば、この程度に不活化することができる。好適な条件は実施例８に記載されている。適切な条件は、（ｉ）使用される不活化添加剤の選択、（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに添加される不活化添加剤の濃度、（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼが加熱される不活化温度（不活化添加剤の存在下で）、（ｉｖ）不活化温度でエンドヌクレアーゼがインキュベートされる時間、（ｖ）不活化温度から冷却された後、エンドヌクレアーゼが保存される温度（不活化添加剤の存在下で）、及び（ｖｉ）エンドヌクレアーゼが保存温度でインキュベートされる時間に左右されるであろう。
【００５８】
たとえば、不活化添加剤の濃度の上昇のような不活化に好都合なパラメータの一部に対する変更は、不可逆的な不活化が生じるためには、たとえば、不活化添加剤の存在下でエンドヌクレアーゼが保存温度で保存される必要がある時間のような他のパラメータに影響を及ぼし得ることを熟練者は十分に理解するであろう。
【００５９】
例として、本発明者らは、１０ｍＭのＴＣＥＰを加え、エンドヌクレアーゼを５０℃で６０分間加熱し、その後２日間室温で保存（そのときＴＣＥＰを取り除く）すれば、不活化剤の非存在下でさえ、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅを不活性にし得ることを見いだした。
【００６０】
或は、１ｍＭのＴＣＥＰをエンドヌクレアーゼに加え、エンドヌクレアーゼを再び５０℃で６０分間加熱するが、保存温度を３７℃に高めると、不可逆的な不活化に必要な保存時間が１日に減る。
【００６１】
最初に温度を高めることなくそのような不活化を達成することは可能である。たとえば、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅについては、１０ｍＭのＴＣＥＰと共に３７℃で１日又は室温で４日間保存することによって不活化が達成され得る。これらの場合、本発明者らは、ＴＣＥＰを透析によって取り除いた場合でさえ、酵素は不活性のままであることを見いだした。
【００６２】
上述の不活化条件の変動は本発明のエンドヌクレアーゼが提供する自由度を示す。当該試料が不活化添加剤によって影響を受けないことが知られていれば、当業者は不活化の時間を減らし及び温度を下げるために試料中に添加剤を保持することを選択し得る。他方、当業者が不活化添加剤を取り除くことを望むのであれば、彼又は彼女は試料を不活化添加剤と共にさらに長い時間インキュベートし得る又はさらに高い不活化温度を適用し得る。
【００６３】
実質的な不活化は、不活化添加剤の存在下で３０℃又は約３０℃、たとえば、２８〜３２℃の温度での１５分以内のインキュベートで生じる。本発明のエンドヌクレアーゼは低い温度で又は短い時間で実質的に不活化し得るが、本発明によれば、ＤＴＴの存在下にて約３０℃での約１５分間の加熱が好ましくは酵素を実質的に不活化するのに十分である。これら２つのパラメータの一方の調整が他方を調整することによることに対して相殺できることは熟練者に容易に明らかであろう。たとえば、不活化温度を高めることはインキュベートの持続時間を減らすのを可能にし得る。逆にインキュベートの持続時間を増やすことは使用されるさらに低い不活化温度を可能にし得る。当然、当業者に容易に明らかでもあり、実施例にて示されるように、本発明のエンドヌクレアーゼが本発明の方法で使用される場合、１５分より長いインキュベートの持続時間を使用してもよく、約３０℃より高い不活化温度を使用してもよい。
【００６４】
エンドヌクレアーゼの不活化の温度及び時間は、典型的なＰＣＲ又はタンパク質精製の緩衝液（たとえば、２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５ｍＭのＭｇＣｌ2）を模倣する溶液にてエンドヌクレアーゼをインキュベートすることによって評価されるべきである。エンドヌクレアーゼは、およそ０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬの間、好ましくは１〜５０Ｕ／μＬ、たとえば、２５〜３０Ｕ／μＬの間で存在すべきである。好適なプロトコールは実質的にて記載されている。
【００６５】
反応混合物は好ましくは、当該試料又は当該タンパク質が安定であるｐＨである。７．０〜９．５の間、好ましくは約８．５のｐＨが本発明のエンドヌクレアーゼの酵素活性に関して特に好適である。８．５のｐＨは典型的なＰＣＲ又はタンパク質精製の緩衝液にも適合する。
【００６６】
有利なことに、本発明の熱不安定性エンドヌクレアーゼは、完全な増幅反応混合物にて完全に機能的であり、標準の試験管内の増幅の反応物質及び条件に適合する。酵素はまた、普通ｆｇ又はｐｇレベルの、しかし、好ましくは１ｎｇまでの好適な量の混入しているポリヌクレオチド又は持ち越し汚染を反応混合物から取り除くことが可能であるべきである。好ましくは、エンドヌクレアーゼは、３７℃にて６０分以内に、さらに好ましくは３０分以内に、最も好ましくは１５分以内に持ち越し汚染をすべて分解することができる。
【００６７】
本発明の範囲に含まれるのはまた、本発明のエンドヌクレアーゼの酵素的に活性のある断片であり、触媒活性は切り詰め変異体及び他の変異体にて保持することができることが十分に理解される。実施例はエンドヌクレアーゼ活性の好適なアッセイを提供する。
【００６８】
本発明は、ＶｓＥｎｄＡに対する好ましいＳ４４Ｅ突然変異によって例示され、さらに一般的には、ＶｓＥｎｄＡの修飾型が本発明のエンドヌクレアーゼの好ましい実施形態である。セリンは、Ｇｌｕ（Ｅ）以外の残基、特にＧｌｕの遺伝的にコードされないホモログ又はスレオニン、アスパラギン又はグルタミンによって置き換えられてもよい。他のエンドヌクレアーゼＩ配列におけるセリン４４と同等な残基が置換されてもよい。ＶｓＥｎｄＡにおけるセリン４４と同等な残基は、図３及び図４の配列の配列比較にて他の種について示される。以下の表は、種々のＶｉｂｒｉｏ種の配列同一性の比率（表１）及び配列番号１（ＶｓＥｎｄＡ）による他の細菌の選択（表２）を示す。これらの表及び相当する図におけるエンドヌクレアーゼは本発明の教示に従って修飾するのに好ましいエンドヌクレアーゼであり、得られる酵素は本発明の好ましいエンドヌクレアーゼである。
【００６９】
【表１】
2018038414.tif 000003
【表２】
2018038414.tif 000004
【００７０】
好ましくは、本発明のエンドヌクレアーゼはＶｉｂｒｉｏのエンドヌクレアーゼ又はそれに由来する。さらに特に好ましい、本発明に従って修飾されたエンドヌクレアーゼは、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ（ＶｃＥｎｄＡ）に由来し、ペンタペプチドモチーフに隣接するセリンがグルタミン酸によって置き換えられる。
【００７１】
好ましいエンドヌクレアーゼは、Ｎ末端のシグナルペプチドを欠くものであり、すなわち、配列番号４によって表され、又は配列番号４と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９８％同一である配列によって表される。本発明の成熟エンドヌクレアーゼはシグナルペプチドを欠くので、文脈で明らかではない限り、配列番号１に対する本明細書での参照は、配列番号４に対する参照とも見なすことができる。配列番号４は図３及び図４の双方にて言及される最初の配列である。
【００７２】
本発明の好ましいエンドヌクレアーゼは、配列番号１、３、４又は５の配列を有するが、ＦＹＣＧＣペンタペプチドモチーフの直近Ｎ末端であるアミノ酸残基が負に荷電した又は極性の残基、好ましくは負に荷電した残基で置換されている。４４位のセリンがグルタミン酸によって置き換えられている配列番号１又は４のエンドヌクレアーゼが最も好ましい。
【００７３】
本発明のさらに好ましいエンドヌクレアーゼは、Ｖｉｂｒｉｏ種から入手可能なエンドヌクレアーゼＩの配列を有するが、ＦＹＣＧＣペンタペプチドモチーフの直近Ｎ末端であるアミノ酸残基が負に荷電した又は極性の残基、好ましくは負に荷電した残基で置換されている。
【００７４】
本明細書で議論されるように、同定されたペンタペプチドモチーフの残基Ｎ末端を置き換えるアミノ酸は疎水性であるべきではない。修飾された酵素、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ａ（アラニン）を調製したが、収率はＳ４４Ｅで達成されたものの約５％に過ぎず、それは非常に不安定で直ちに触媒活性すべてを喪失した。
【００７５】
本発明に係る配列同一性比率は、初期設定のパラメータ（ＤＮＡギャップ開放ペナルティ＝１５．０；ＤＮＡギャップ伸長ペナルティ＝６．６６；ＤＮＡマトリクス＝同一性；タンパク質ギャップ開放ペナルティ＝１０．０；タンパク質ギャップ伸長ペナルティ＝０．２；タンパク質マトリクス＝Ｇｏｎｎｅｔ；タンパク質／ＤＮＡエンドギャップ＝−１；タンパク質／ＤＮＡギャップＤＩＳＴ＝４）を用いた広く利用可能なアルゴリズム（たとえば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ２多重配列比較プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌＷ２）を用いた）を用いて算出することができる。
【００７６】
エンドヌクレアーゼにおけるＦＹＣＧＣペンタペプチドモチーフの直近Ｎ末端であるアミノ酸残基（すなわち、塩化物イオンとの錯体の一部を形成する極性残基）の正確な位置は、たとえば、図３及び図４で表されるもののような配列比較を生じるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ２のような標準の配列比較法を用いて容易に特定することができる。配列が完全に保存さえたＦＹＣＧＣモチーフを欠くのであれば、配列比較のこれらの技法を用いて配列番号１におけるセリン４４と同等の残基を特定するのはまだ可能である。
【００７７】
本発明のエンドヌクレアーゼ及びその断片をコードする核酸分子は本発明のさらなる態様を構成し、配列番号２及びそれと少なくとも８０又は９０％同一の配列が好ましい。
【００７８】
本発明はまた、核酸を増幅する方法における除染剤としての上述された特定のエンドヌクレアーゼの使用も提供する。本明細書で記載される除染方法での上述された特定のエンドヌクレアーゼの使用は本発明の特に好ましい実施形態を表す。
【００７９】
上述されたようなエンドヌクレアーゼ又は酵素的に活性があるその断片を単離する及び精製する方法は本発明のさらなる態様を表す。従って、この態様では、本発明はそのような方法を提供し、前記方法は、好適な宿主細胞（たとえば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞）にて前記エンドヌクレアーゼ又はその断片を発現させ、その後、前記宿主細胞及び／又は前記細胞が培養された培地からエンドヌクレアーゼを分離することを含む。前記エンドヌクレアーゼ又はその断片の発現は、前記エンドヌクレアーゼ又はその断片をコードする発現ベクターを好適な宿主細胞の中に組み入れることによって達成することができる。これらの発現カセット及び核酸分子を含む宿主細胞は本発明によって包含される。
【００８０】
当該技術で既知の及び文献にて広く記載されたタンパク質の精製法のいずれか又はその任意の組み合わせを用いて、エンドヌクレアーゼ酵素を宿主細胞／培養培地から分離してもよく又は単離してもよい。そのような技法には、たとえば、沈殿、限外濾過、透析、種々のクロマトグラフィ法、たとえば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、電気泳動、遠心等が挙げられ得る。
【００８１】
同様に、当該技術で周知の技法、たとえば、均質化、凍結融解等を用いて宿主細胞の抽出物を調製してもよく、この抽出物から本発明のエンドヌクレアーゼを精製することができる。
【００８２】
イオン交換クロマトグラフィ及びアフィニティクロマトグラフィの組み合わせに基づく、たとえば、セファロースカラム、たとえば、Ｒｅｄセファロース（スウェーデンのＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）又はＢｌｕｅセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカラムに基づく精製プロトコールを容易に用いて酵素を単離し得ることが分かっている。
【００８３】
さらに詳しくは、抽出物をイオン交換クロマトグラフィに供してＮａＣｌ勾配によってタンパク質を溶出し得る。エンドヌクレアーゼ活性を含有する分画を透析し、ＮａＣｌによる最終溶出の前にアフィニティクロマトグラフィにかけてもよい。
【００８４】
本発明のエンドヌクレアーゼの収率は非常に良好なので、代わりに検討すると、本発明は、ペンタペプチドモチーフＦＹＣＧＣの直近Ｎ末端の残基を負に荷電した残基又は極性の残基によって置換することを含む組換えで発現させたエンドヌクレアーゼＩの収率を高める方法を提供する。このように修飾され得る好適なエンドヌクレアーゼは本明細書で記載され、たとえば、図３及び図４にて例示される。好適な発現方法は上記で記載されている。
【００８５】
本発明はまた、本発明に係る少なくともエンドヌクレアーゼを含むキットも提供する。キットはまた核酸増幅反応を実施するために必要な試薬、緩衝液、酵素等の一部又はすべても含有し得る。さらに詳しくは、キットは、ヌクレオチド三リン酸（鎖置換増幅のためのαチオール基を含有するαＡＴＰ（ｄＡＴＰαＳ）を含む）、オリゴヌクレオチドプライマー、好ましくは約３０℃で機能することが可能であるもの、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは熱不安定性ポリメラーゼ、たとえば、Ｔａｑポリメラーゼ又はＢｓｔポリメラーゼ（及びそのホットスタート型）又は、ＬＡＲの場合、ＤＮＡリガーゼ（好ましくは、熱不安定性リガーゼ、たとえば、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）、又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓから単離される米国特許第６，２８０，９９８号にて開示されたもの、及び制限酵素（好ましくはＢｓｏＢ１のような熱不安定性の制限酵素）を含有し得る。エンドヌクレアーゼは、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、鎖置換ポリメラーゼ、又はＬＣＲリガーゼと一緒に１つの区画にて提供され得る。
【００８６】
キットは、本発明に関連する手順を実施する方法に関する指針としての資料を含有し得る。特に不活化条件に関する指針が提供される。好適な条件は本明細書の他で記載されるが、キット又は酵素と共に提供され得るさらなる一般例として、表３は、Ｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａに由来し、Ｓｅｒ４４Ｇｌｕの突然変異伴ったエンドヌクレアーゼ（ＶｓＥｎｄ＿Ｓ４４Ｅ）の不活化に好適である不活化添加剤の存在下で提案されたインキュベート条件を提供する。
【００８７】
【表３】
2018038414.tif 000005
【００８８】
本発明はまた、本発明のエンドヌクレアーゼと核酸増幅及び方法を実施するのに必要な１以上の試薬、たとえば、上述の成分を含む組成物も提供する。通常、そのような組成物は水性であり、トリス、ＨＥＰＥＳ等のような標準の緩衝液によって緩衝化されるであろう。
【００８９】
さらなる態様では、本発明は、第２のエンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片と一緒に本明細書で定義されるようなエンドヌクレアーゼＩ又は活性がある断片を含む組成物を提供する。好ましくは、第２のエンドヌクレアーゼＩ又は酵素的に活性があるその断片は配列番号５の配列又はそれと少なくとも８０％同一である配列を有する。第２の酵素は、それをさらに容易に不活化する突然変異を、たとえば、ネイティブのＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅの配列に組み入れ得る。そのような組み合わせは、組成物が全体としてさらに大きな範囲のｐＨ及び／又は塩濃度及び／又は温度で有効なエンドヌクレアーゼ活性を提供するのを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
本発明は今や、以下の図面を参照して非限定の実施例によって説明されるであろう。
【図１】Ｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ（ＶｓＥｎｄＡ）及びＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＥｎｄＡ（ＶｃＥｎｄＡ）に由来するエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列（シグナルペプチドを含む）、それぞれ配列番号１及び配列番号３の配列比較を示す図である。
【図２】Ｓｅｒ４４Ｇｌｕの変異を伴うＶｓＥｎｄＡ（ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ）の核酸配列及びアミノ酸配列（シグナルペプチドを含む）、それぞれ配列番号２及び配列番号６を示す図である。
【図３】様々な属の種からの細菌に由来する野生型エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列（シグナルペプチドを除く）の配列比較データを示す図である。
【図４】Ｖｉｂｒｉｏ属の種々の細菌に由来する野生型エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列（シグナルペプチドを除く）の配列比較データを示す図である。
【図５】それぞれｐＰＩＣ９Ｋ−ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ及び野生型の発現カセットを含有するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞におけるＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体（Ｓｅｒ４４Ｇｌｕの変異を伴うＶｓＥｎｄＡエンドヌクレアーゼ）及び野生型ＶｓＥｎｄＡ酵素（配列番号１）の発現レベルを示す図である。
【図６】１ｍＭのＤＴＴの存在下及び非存在下における４０℃（６ａ）及び５０℃（６ｂ）でのＶｓＥｎｄＡ及びＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの不活化の速度を示す図である。
【図７】１ｍＭの以下の不活化添加剤：ＤＴＴ、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）及び２−メルカプトエタノールの１つの存在下における４０℃でのＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの不活化の速度を示す図である。
【図８】５０℃（図８ａ）、４０℃（図８ｂ）、３０℃（図８ｃ）又は２５℃（図８ｄ）の温度にて１５、３０又は６０分間、１ｍＭ、１０ｍＭ又は２０ｍＭの濃度でのＤＴＴの存在下で不活化されているＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ及び野生型ＶｓＥｎｄＡのエンドヌクレアーゼの活性を示すアガロースゲルの写真である。結果を酵素なし（陰性対照）又は６Ｕの野生型ＶｓＥｎｄＡ（陽性対照）のいずれかに対して比較した。
【図９】１ｍＭ、１０ｍＭ又は２０ｍＭの濃度でのＤＴＴ（図９ａ）又はＴＣＥＰ（図９ｂ）の存在下で４℃にて６又は１８時間インキュベートしたＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ及び野生型ＶｓＥｎｄＡのエンドヌクレアーゼの活性を示すアガロースゲルの写真である。結果を酵素なし（陰性対照）又は６Ｕの野生型ＶｓＥｎｄＡ（陽性対照）のいずれかに対して比較した。
【図１０】ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体を用いた市販のＡｃｃｕＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（図９ａ）又はＧｏＴａｑ（登録商標）ホットスタートポリメラーゼ（図９ｂ）からの添加されたＤＮＡの除去の程度を示す図である。
【図１１】ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体を用いた市販のＭａｘｉｍａ  ｑＰＣＲマスターミックスからの添加されたＤＮＡの除去の程度を示す図である。
【図１２】０．５Ｍの塩化ナトリウム（図１１ａ）又は１Ｍの塩化ナトリウム（図１１ｂ）を含有する溶液にてＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体を用いた市販のＴＥＭＰａｓｅＤＮＡポリメラーゼからの添加した細菌のゲノムＤＮＡの除去の程度を示す図である。
【図１３】種々の塩化ナトリウム溶液（０Ｍ、０．２５Ｍ、０．５Ｍ、０．７５Ｍ、及び１．０Ｍ）にてＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体を用いた組換えで発現させたタンパク質を含有する大腸菌の細胞溶解物溶液からの添加した細菌のゲノムＤＮＡの除去の程度を示す図である。
【図１４】高い塩分濃度の溶液におけるＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体の最適な活性を示す図である。活性は、様々な濃度の塩化ナトリウム及び塩化カリウムを伴った２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５、５ｍＭの塩化マグネシウム中で調べた。得られた最大活性を１００％に設定した。
【図１５】種々の温度でのＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体の活性を示す図である。活性は、５ｍＭの塩化マグネシウム及び０．５Ｍの塩化ナトリウムを含有する２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５中で調べた。
【図１６】市販のベンゾナーゼ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ヌクレアーゼと比較したときの、ｐＨ及び塩化ナトリウムの様々なレベルでのＤＮＡを分解するＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体の能力を示す図である。反応は、７．５、８．０又は８．５のｐＨ及び０．２５Ｍ若しくは０．５Ｍ（図１６ａ）又は０．７５Ｍ若しくは１．０Ｍ（図１６ｂ）の塩化ナトリウム濃度にて実施した。反応混合物は、５ｍＭの塩化マグネシウムを伴った１００μＬのトリス／ＨＣｌ緩衝液、５０μｇのウシ胸腺ＤＮＡ及び３００ＵのＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４又はベンゾナーゼを含有した。反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。ＥＤＴＡを含有する負荷緩衝液を用いて反応を止め、１％アガロースゲル上で流した。
【図１７】ＤＮＡ結合タンパク質を含有する大腸菌細胞溶解物におけるＤＮＡを分解するＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体の能力を示す図である。様々な塩化ナトリウム濃度にてＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅを大腸菌細胞溶解物に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。対照は塩化ナトリウムを含有しない。
【００９１】
その中で配列番号１は、シグナルペプチドを含む、野生型のＶｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａのエンドヌクレアーゼＩのｃＤＮＡヌクレオチド配列の翻訳された部分のアミノ酸配列である。配列番号２は、シグナルペプチドを含む、Ｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａのエンドヌクレアーゼＩ（ＴＣＣからＧＡＧへの変異を伴ったＶｓＥｎｄＡ）のｃＤＮＡヌクレオチド配列である。配列番号３は、シグナルペプチドを含む、野生型Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａのエンドヌクレアーゼＩのｃＤＮＡヌクレオチド配列の翻訳された部分のアミノ酸配列である。配列番号４は、シグナルペプチドを含まない、野生型のＶｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａのエンドヌクレアーゼＩのｃＤＮＡヌクレオチド配列の翻訳された部分のアミノ酸配列である。配列番号５は、シグナルペプチドを含まない、野生型Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａのエンドヌクレアーゼＩのｃＤＮＡヌクレオチド配列の翻訳された部分のアミノ酸配列である。配列番号６は、シグナル配列を含む、変異体Ｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａのエンドヌクレアーゼＩ（４４位にてセリン残基がグルタミン酸残基で置換されたＶｓＥｎｄＡ）のアミノ酸配列である。配列番号７〜配列番号２０は、表２及び図３に記載されたような様々な属の種からの細菌に由来する、シグナルペプチドを含まないエンドヌクレアーゼＩのアミノ酸配列である。配列番号２１〜配列番号３０は、表１及び図４に記載されたようなＶｉｂｒｉｏ属の種々の細菌に由来する、シグナルペプチドを含まないエンドヌクレアーゼＩのアミノ酸配列である。
【実施例】
【００９２】
実施例１：クローニング及び変異誘発
Ｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａのエンドヌクレアーゼＩの遺伝子を、その遺伝子を含有するベクターからＰＣＲで増幅し、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ用のｐＰＩＣ９Ｋ発現ベクターにクローニングした。Ｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａのエンドヌクレアーゼＩのネイティブなシグナル配列を除外したので、発現プラスミドによってコードされたα接合因子に続くＶｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａのエンドヌクレアーゼＩのアミノ酸配列はＡＰＰＳＳＦだった。
【００９３】
ＡｇｉｌｅｎｔのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）変異誘発キットを用い、製造元の指示書に従って残基４４にてセリン（Ｓｅｒ）からグルタミン酸（Ｇｌｕ）へとＶ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａのエンドヌクレアーゼＩ（ＶｓＥｎｄＡ）を変異させた。切り詰めたＶｓＥｎｄＡ配列を含有するｐＰＩＣ９Ｋベクターを鋳型として用いた。変異誘発反応の後の正しい配列はＤＮＡ配列決定によって検証した。
実施例２：発現及び精製
【００９４】
ＳａｃＩを用いてｐＰＩＣ９Ｋ−ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅベクターを線形化し、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ発現キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のマニュアルに記載されたようにＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ１１５にて形質転換した。Ｐｉｃｈｉａ発現キットに記載されたように、Ｖ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａＳ４４ＥのエンドヌクレアーゼＩ（ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ）を振盪フラスコにて本質的に発現させた。ＢＭＧＹ培地にてＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅを含有するＧＳ１１５株の前培養物５０ｍＬを３０℃で一晩培養した。細胞を遠心し、２５０ｍＬのＢＭＭＹに再浮遊させ、２０℃にて７２時間発現を行った。０．５％の最終濃度でメタノールを２４時間ごとに加えた。遠心によって細胞を取り除き、上清を精製のための出発材料として用いた。カチオン交換クロマトグラフィを用いてＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅを精製した。２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５ｍＭのＭｇＣｌ2にて平衡化したＳＰ−セファロースＦＦ（１．６／３）カラムに５ｃｍ／分の流量を用いて上清（２５０ｍＬ）を適用した。上記緩衝液中２５０ｍＬの０．４ＭのＮａＣｌでカラムを洗浄した。２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５ｍＭのＭｇＣｌ2＋１ＭのＮａＣｌを用いてＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの溶出を行った。ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ活性を含有する分画をプールし、最終的に濃縮した。
実施例３：ヌクレアーゼ活性の測定
【００９５】
ヌクレアーゼ活性は、Ｋｕｎｉｔｚ (Kunitz, M., 1950, Crystalline Deoxyribonuclease, II, Digestion of Thymus Nucleic Acid.  The Kinetics of Reaction. J. Gen. Physiol., 33, 363-377) の手順に従ってアッセイしてもよい。これの改変された組成を用いてヌクレアーゼ活性を測定している。最終容量１ｍＬの２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2中５μｇのウシ胸腺ＤＮＡに１０μＬの酵素調製物を加える。混合物を３７℃でインキュベートし、吸収の上昇を２６０ｎｍにて測定する。１Ｕ＝１分当たりの０．０１ＯＤ260の上昇。
【００９６】
試験を行い、それによってＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体の活性を種々の温度で（還元剤の非存在で）評価した。図１５は、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅが約３５℃で最適な活性を有するが、広い温度範囲（１０℃及び５０℃にて２０％の活性）にわたって機能することを示す。
実施例４：野生型（ＶｓＥｎｄＡ）に対するＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの発現レベルの比較
【００９７】
ｐＰＩＣ９Ｋ−ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの発現カセットを含有するＧＳ１１５株の５０ｍＬの前培養物を、野生型の発現カセットを含有する株と比較した。ＢＧＭＹ培地にて３０℃で２つの株を一晩培養した。細胞を遠心し、２５０ｍＬのＢＭＭＹに再浮遊させ、２０℃にて７２時間発現を行った。０．５％の最終濃度でメタノールを２４時間ごとに加え、記載されたようにヌクレアーゼ活性を測定した。
【００９８】
図５は、細胞上清にてＵ／ｍＬで測定した活性のある発現された酵素という点で、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにて野生型ＶｓＥｎｄＡ酵素よりも高い発現レベルを提供することを示す。図の説明では、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体は「Ｓ４４Ｅ」に短縮され、野生型ＶｓＥｎｄＡは「ｗｔ」に短縮されている。
【００９９】
上記（実施例２にて）記載されたように精製した後、表４に示すようにＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの比活性はＶｓＥｎｄＡよりも約２０％高いことが確定する。
【表４】
2018038414.tif 000006
実施例５：ＶｓＥｎｄＡと比べたＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの温度安定性
【０１００】
野生型（ＶｓＥｎｄＡ）酵素の半減期は７０℃でおよそ２時間及び６０℃で５時間である（データは示さず）。
【０１０１】
２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び±１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する緩衝液にて酵素、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ及びＶｓＥｎｄＡを２００，０００Ｕ／ｍＬの濃度に希釈した。６×１００μＬの容量を異なるエッペンドルフチューブに移した。試料を４０℃又は５０℃で０〜４０分間インキュベートし、その後、順次氷上に置いた。実施例３に記載されたような改変Ｋｕｎｉｔｚアッセイを用いて残っている活性を測定した。図６に示すデータから、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ及びＶｓＥｎｄＡの双方について、ＤＴＴの添加が熱不活化に必要とされることは明らかである。ＤＴＴの添加の際、酵素はさらに速い速度で不活化する。図の説明では、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体は「Ｓ４４Ｅ」に短縮され、野生型ＶｓＥｎｄＡは「ｗｔ」に短縮されている。
実施例６：様々な還元剤を用いた温度不活化
【０１０２】
ＤＴＴ、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）及び２−メルカプトエタノールを含むある範囲の不活化添加剤を用いて不活化されるＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの能力を４０℃の温度で調べた。
【０１０３】
図７に示すデータを図６ａのものと比べると、不活化添加剤はすべて不活化を促進すると判定することができる。ＤＴＴ及びＴＣＥＰは、２−メルカプトエタノールに比べて不活化添加剤としてさらに有効であることが分かった。図の説明では、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体は「Ｓ４４Ｅ」に短縮され、野生型ＶｓＥｎｄＡは「ｗｔ」に短縮されている。
実施例７：熱不活化実験
【０１０４】
温度安定性を調べ、熱を用いてＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅを完全に不活化することが可能であるかどうかを判定するために、熱不活化酵素の存在下で精製したＰＣＲ産物の完全性を評価した。それは温度の低下の際、不活化が可逆的であるか、又は不可逆てきであるかどうかを調べることができるので、実施例３に記載された改変Ｋｕｎｉｔｚアッセイに比べて、これはさらに感度のよいアッセイを提供する。
【０１０５】
２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2緩衝液における酵素（ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ又は野生型、ＶｓＥｎｄＡ、１３０Ｕ／μＬ）を総容量５０μＬでエッペンドルフチューブに移した。新しく作製したジチオスレイトール（ＤＴＴ）を１、１０又は２０ｍＭの最終濃度で加えた。種々の温度にて１５、３０又は６０分間試料を熱不活化した。不活化工程の後、チューブを氷上に置いた。
【０１０６】
２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５ｍＭのＭｇＣｌ2、及び０．５ＭのＮａＣｌから成る緩衝液における５００ｎｇの５００ｂｐのＰＣＲ産物に５μＬの熱不活化酵素を添加することによって残留活性の測定のためのアッセイを実施した。試料を３７℃で３時間インキュベートした。不活化のために酵素調製物にＤＴＴを加えた場合、それは残留活性のアッセイにおいても存在した。
【０１０７】
最終的に、ＰＣＲ産物の分解を測定するには、試料を１％アガロースゲル上で解析した。陰性対照（酵素なし）及び陽性対照（６Ｕのｗｔ酵素を含有する）を上記反応と同じ方法で処理した。
【０１０８】
図８は、５０℃、４０℃、３０℃及び２５℃にて野生型、ＶｓＥｎｄＡ酵素と比べたＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体の熱不活化実験を要約する。陰性対照は無傷のＰＣＲ産物を示すのに対して陽性対照は約１％の残留酵素の影響を説明する。５０℃では、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体酵素は１ｍＭのＤＴＴの存在下にて１５分後完全に不活化されることが見いだされた一方で、野生型は部分的にしか不活化されなかった。４０℃では、ＶｓＥｎｄＡ酵素を部分的に不活化するのに必要とされる１０ｍＭに比べて、１ｍＭのＤＴＴは１５分後ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体を部分的に不活化することができた。２５℃では、２０ｍＭ以下の濃度でのＤＴＴは６０分後、ＶｓＥｎｄＡ酵素を完全には不活化できなかった一方で、１０ｍＭのＤＴＴが６０分後、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体を完全に不活化できたということは、置換の効果を実証している。ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体酵素を３０℃で完全に不活化するには少なくとも１０ｍＭのＤＴＴの添加が必要である。図の説明では、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体は「Ｓ４４Ｅ」に短縮され、野生型ＶｓＥｎｄＡは「ｗｔ」に短縮されている。
【０１０９】
さらなる熱不活化の実験では、上述と同じ対照を用いて、１ｍＭ、１０ｍＭ又は２０ｍＭのいずれかの濃度にてＤＴＴ又はＴＣＥＰのいずれかの存在下で４℃においてＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体を野生型ＶｓＥｎｄＡ酵素と比較した。図９に示すように、この低温においてさえ、１０ｍＭのＤＴＴ又はＴＣＥＰの存在は６時間後、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体を完全に不活化することができた。比較して、２０ｍＭのＤＴＴでさえ１８時間のインキュベート後、野生型ＶｓＥｎｄＡ酵素を不活化することができなかった。ＴＣＥＰは、この温度にて１０ｍＭの濃度で１８時間のインキュベート後、又は２０ｍＭの濃度で６時間のインキュベート後、ＶｓＥｎｄＡ酵素を完全に不活化することが示された。実施例８：熱不活化実験−ＴＣＥＰの非存在下での残留活性
【０１１０】
本実施例では、我々は、不活化添加剤が取り除かれた後、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの不活化が依然として観察される条件を決定した。
【０１１１】
本実施例は、不活化添加剤、ＴＣＥＰを検討し、不活化が生じた後、Ｐｕｒ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析チューブ（Ｓｉｇｍａ）を用いてＴＣＥＰを取り除くことを除いて実施例７と同様に行った。２日間の透析の間に緩衝液を１回交換した。実施例７に記載したように１％アガロースゲルを用いて残留活性の測定を行った。
【０１１２】
この試験で決定された最適な不活化パラメータの選択を表５に提示する。
【表５】
2018038414.tif 000007
表５−ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの不活化を達成するのに必要とされるパラメータ。パラメータ（ｉ）：エンドヌクレアーゼに添加された不活化添加剤ＴＣＥＰの濃度（ｍＭ）、パラメータ（ｉｉ）：（不活化添加剤の存在下で）エンドヌクレアーゼが加熱される不活化温度（℃）、パラメータ（ｉｉｉ）：不活化温度でエンドヌクレアーゼが加熱される時間（分）、パラメータ（ｉｖ）：不活化温度から冷却された後、（不活化添加剤の存在下で）エンドヌクレアーゼが保存される温度（℃、又は室温についての「ＲＴ」）、及びパラメータ（ｖ）：保存温度でエンドヌクレアーゼがインキュベートされる時間（日）。パラメータ（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）についての「ＮＡ」は、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅが不活化温度に加熱されない場合に適用される。
実施例９：ＤＮＡポリメラーゼ調製物からの混入しているＤＮＡの除去
【０１１３】
典型的なポリメラーゼ緩衝液における市販のＤＮＡポリメラーゼから混入している細菌のゲノムＤＮＡを取り除くＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの能力を調べた。１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、１１１ｍＭのＫＣｌ、５．６ｍＭのＭｇＣｌ2から成る緩衝液にて３７℃で１５分間、０．１４Ｕ／μＬのＡｃｃｕｓｔａｒｔ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｔｅｍｐａｓｅ（ＶＷＲ）又はＧｏＴａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を２８Ｕ／μＬのＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅで処理した。３７℃での１５分間のインキュベートの後、ＤＴＴを１０ｍＭの最終濃度で加え、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体を不活化するために４０℃で３０分間試料をインキュベートした。最終的にプライマー、プローブ及びｄＮＴＰを加え、ポリメラーゼ反応混合物における成分の最終濃度は、１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、２０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2から構成される緩衝液にて２５ｍＵ／μＬのＤＮＡポリメラーゼ、３００ｎＭの各プライマー、２００ｎＭのプローブ、１００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及び２００μＭのｄＵＴＰだった。
【０１１４】
以下の対照：（ａ）ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの代わりに緩衝液を含有する試料、（ｂ）緩衝液と大腸菌のゲノムＤＮＡを含有する試料、（ｃ）ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの不活化の前に大腸菌のゲノムＤＮＡが加えられた試料、及び（ｄ）ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの不活化の後に大腸菌のゲノムＤＮＡが加えられた試料が含められた。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３５００Ｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）における２０μＬの反応物中でｑＰＣＲを行ったが、熱サイクル条件はＤＮＡポリメラーゼの製造によって推奨されたとおりであった。
【０１１５】
ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅは、調べてポリメラーゼすべてから混入している細菌のゲノムＤＮＡを取り除くことができた。図１０は、Ａｃｃｕｓｔａｒｔポリメラーゼ及びＧｏＴａｑポリメラーゼのＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ処理の効果を説明する。図の説明では、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体は「Ｓ４４Ｅ」に短縮されている。混入している細菌のＤＮＡのレベルは低下し、添加された大腸菌のゲノムＤＮＡは取り除かれた。ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ処理の後、ポリメラーゼ機能の損傷はない又は最小限に抑えられる。
実施例１０：ＰＣＲマスターミックスからの混入しているＤＮＡの除去
【０１１６】
市販の定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のマスターミックスは、微量の混入している細菌のゲノムＤＮＡを含有することが示されている。本実施例では、市販のｑＰＣＲのマスターミックスから細菌のゲノムＤＮＡ混入物を取り除くＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの能力を調べた。Ｍａｘｉｍａ  ｑＰＣＲのマスターミックス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）又はＥｘｐｒｅｓｓ  ｑＰＣＲスーパーミックスユニバーサル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２５Ｕ／μＬのＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅで３７℃にて１５分間処理した。Ｓ４４Ｅ＿Ｅｎｄ  Ｉは１０ｍＭのＤＴＴ（１−４ジチオスレイトール）を加え、４０℃で３０分間インキュベートすることによって不活化した。ポリメラーゼからの混入しているＤＮＡの除去に対するＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ処理の効果を調べるために、以下の対照：（ａ）ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの代わりに緩衝液を含有する試料、（ｂ）緩衝液の前に大腸菌のゲノムＤＮＡを加えた試料、（ｃ）緩衝液の後に大腸菌のゲノムＤＮＡを加えた試料、（ｄ）ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの不活化の前に大腸菌のゲノムＤＮＡを加えた試料、及び（ｅ）ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの不活化の後に大腸菌のゲノムＤＮＡを加えた試料と一緒にＳ４４Ｅ＿Ｅｎｄ  Ｉで処理した試料の１つを解析した。最終的にプライマー及びプローブをそれぞれ３００ｎＭ及び２００ｎＭの最終濃度で加えた。プライマー及びプローブは、Ｃｏｒｌｅｓｓら (J Clin. Microbiol. 2000, 38(5):1747-52)によって記載されたように大腸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を標的とした。熱サイクル条件は以下のとおりである：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、その後、９５℃で３０秒間と６０℃で３０秒間と７２℃で３０秒間を４５サイクル。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＭｘ３５００Ｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて２０μＬの反応物でｑＰＣＲを実施した。
【０１１７】
図１１で説明するように、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４ＥはＭａｘｉｍａ  ｑＰＣＲマスターミックスにおける混入している細菌のゲノムＤＮＡのレベルを下げることができる。図の説明では、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体は「Ｓ４４Ｅ」に短縮されている。さらに、大腸菌ＤＮＡが添加されたマスターにＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅを加えることは、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ処理した（非添加の）マスターミックスと同じＱＣ値を生じる。Ｓ４４Ｅ＿Ｅｎｄ  Ｉはマスターミックスに含有された細菌ＤＮＡの混入物の一部を取り除くこともできる。ポリメラーゼ反応はＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの処理によって影響されない。従って、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅは混入しているＤＮＡを取り除くことができ、完全に不活化されることができ、不活化されたＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅはポリメラーゼの性能を損傷しない。同様の結果はＥｘｐｒｅｓｓ  ｑＰＣＲスーパーミックスユニバーサル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でも得られた（データは示さず）。
実施例１１：高い塩分濃度のポリメラーゼ溶液からの細菌のゲノムＤＮＡの除去
【０１１８】
ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの不活化を容易に達成することができるので、ヌクレアーゼ活性が混じってはならないタンパク質の精製にＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ処理は特に有用である。さらに、ＤＮＡ結合タンパク質の精製では、タンパク質調製物に塩を加えてＤＮＡ／タンパク質の相互作用を制限することができるので、塩によって活性があるヌクレアーゼの使用は好都合である。本実施例では、我々は、０．５Ｍ及び１．０Ｍの塩化ナトリウムの溶液にてＤＮＡポリメラーゼからＤＮＡの混入物を取り除くＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの能力を調べた。
【０１１９】
２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2及び０．５Ｍ又は１．０ＭのＮａＣｌにおけるＴＥＭＰアーゼホットスタートポリメラーゼ（ＶＷＲ）を２５Ｕ／μＬのＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅで３７℃にて１５分間処理した。以下の対照：（ａ）ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの代わりに緩衝液を含有する試料、（ｂ）緩衝液の前に２０ｐｇの大腸菌のゲノムＤＮＡを加えた試料、及び（ｃ）ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの不活化の前に２０ｐｇの大腸菌のゲノムＤＮＡを加えた試料を上記試料と一緒に解析した。１０ｍＭのＤＴＴを加え、４０℃で３０分間インキュベートすることによってＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅを不活化した。不活化工程の後、製造元の指示書に従って、７ＫのカットオフのＺｅｂａ（商標）Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて試料の緩衝液をポリメラーゼ緩衝液に変えた。最終的にプライマーとプローブを加え、ポリメラーゼ緩衝液の構成成分は以下のとおりである：１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１００のμＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及び２００μＭのｄＵＴＰ、３００ｎＭの各プライマー及び２００ｎＭの各プローブ。熱サイクル条件は以下のとおりである：９５℃で１５分間、その後、９５℃で３０秒間と６０℃で３０秒間を４５サイクル。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＭｘ３５００Ｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて２０μＬの反応物でｑＰＣＲを実施した。
【０１２０】
図１２は、０．５Ｍ及び１．０Ｍの塩化ナトリウムを含有するポリメラーゼ溶液におけ
るＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの処理を説明する。図の説明では、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体は「Ｓ４４Ｅ」に短縮されている。これらの図は、ポリメラーゼ溶液から添加された大腸菌ＤＮＡを取り除くＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体の能力が高い塩分濃度に影響されなかったことを示している。
【０１２１】
別の試験では、様々な塩化ナトリウム及び塩化カリウムの濃度の範囲にわたってＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体の能力を評価した。図１４は、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅが約０．５Ｍの塩化ナトリウムで最適な活性を有するが、広い範囲の塩化ナトリウム及び塩化カリウムの濃度で効果があることを説明する。
【０１２２】
さらなる試験では、様々な塩化ナトリウム濃度及びｐＨレベルの範囲でのウシ胸腺ＤＮＡを分解することにおけるＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体の酵素活性を市販のベンゾナーゼ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ヌクレアーゼの活性と比較した。図１６は、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅがベンゾナーゼに比べて広い範囲のｐＨレベル及び塩化カリウムでＤＮＡを分解することを説明する。
【０１２３】
さらなる試験では、様々な塩化ナトリウム濃度の範囲で大腸菌細胞溶解物からのＤＮＡを分解するＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体の酵素活性を評価した。図１７は、０．２５Ｍ〜１．０Ｍの塩化ナトリウム濃度にてＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体は活性があることを説明する。
実施例１２：タンパク質精製調製物からＤＮＡを取り除くためのＳ４４Ｅ  ＥｎｄＡの使用
【０１２４】
ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅは、タンパク質精製スキームにて、特にヌクレアーゼ活性及び混入するＤＮＡが混じってはならないＤＮＡ結合タンパク質の精製にて有用であり得たので、我々は、組換えで発現させたＤＮＡ結合タンパク質を含有する大腸菌抽出物からゲノムＤＮＡを取り除くＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの能力を調べた。
【０１２５】
本実施例における組換えで発現させたタンパク質は、ウラシル含有ＤＮＡからのウラシルの除去を触媒するタラ由来のウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（タラＵＮＧ）だった。タラＵＮＧを含有する大腸菌細胞を回収し、洗浄し、リゾチームを含有するトリス／ＨＣｌ緩衝液（２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％グリセロール）にて超音波処理によって溶解した。細胞抽出物を遠心し、上清を回収した。上清のｐＨを８．５に調整した後、以下の濃度：０Ｍ、０．２５Ｍ、０．５Ｍ、０．７５Ｍ又は１．０ＭのＮａＣｌを加えた。１０ｍＭでＭｇＣｌ2を加えた後、５０Ｕ／μＬのＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅによって３７℃で３０分間処理した。次いで１０ｍＭのＤＴＴを加え、４０℃で３０分間インキュベートすることによってＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅを不活化した。未処理の対照も含めた。ＴＥＭＰアーゼホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（ＶＷＲ）を含有し、実施例１０にて前述したのと同じＰＣＲ緩衝液組成及び熱サイクル条件による５０μＬのＰＣＲ反応物にＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ処理した上清（１μＬ）を加えた。
【０１２６】
図１３に示すように、有意な量のＤＮＡが依然として溶解物に残っているが、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅは０．５Ｍ以上のＮａＣｌを含有する試料では大腸菌ゲノムＤＮＡのほとんど（＞９９．５％）を取り除くことができた。相対的に低い塩分濃度（０Ｍ及び０．２５Ｍ）の試料では、Ｃｑ値は、未処理の試料及びＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ処理の試料の双方にについて同じであることが分かる。このことは、試料内のＤＮＡがタンパク質と相互作用し、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ酵素及びポリメラーゼの双方に利用できなくしていることを示唆している。比較して、高いＮａＣｌ濃度（０．５Ｍ、０．７５Ｍ及び１．０Ｍ）では、未処理の試料とＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ変異体を含有する試料との間にはＤＮＡレベルの明瞭な差異が見られるということは、ＮａＣｌがＤＮＡをＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ及びポリメラーゼの双方に利用可能にすることを示唆している。本実施例はＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅが、組換えで発現させたＤＮＡ結合タンパク質を含有する細胞抽出物からＤＮＡを除去するのに理想的であることを実証している。塩の添加は、タンパク質／ＤＮＡの相互作用を低減し、塩によって活性があるＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４ＥにとってＤＮＡを利用可能にさせる。さらに、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅは容易に不可逆的に不活化することができ、それは、ヌクレアーゼ活性を含まないことを一般に必要とするＤＮＡ結合タンパク質の調製物として重要である特徴である。
実施例１３：ＰＣＲの品質に対する不活化添加剤ＴＣＥＰの効果
【０１２７】
本実施例では、我々は、ＴＥＭＰアーゼポリメラーゼ及びＴＥＭＰアーゼキイ緩衝液のＰＣＲ効率に対する効果を示す。
【０１２８】
種々の濃度のＴＣＥＰをＰＣＲストリップに加え、その後、ＰＣＲ成分の残りを加えた。２３Ｓのプライマー／プローブのセットについての鋳型として大腸菌のｇＤＮＡ（１００ｆｇ）を用いた。試料はすべて２つ組で実行し、ｑＰＣＲ反応物はすべて２μＬの総容量を有した。ＴＥＭＰアーゼキイ緩衝液及び「Ａｒｃｔｉｃ緩衝液」（最終濃度：１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．３，１０ｍＭのＫＣｌ及び５ｍＭのＭｇＣｌ2）中のＴＥＭＰアーゼポリメラーゼ（ＶＷＲ）を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｒｉｌｌｉａｎｔＩＩＩマスターミックス（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と同様に調べた。
【０１２９】
本試験の結果は、２．５ｍＭ以下のＴＣＥＰ濃度はＰＣＲの効率に顕著な効果を有さないことを示している（データは示さず）。
実施例１４：Ｔａｑポリメラーゼの浄化におけるＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ不活化の安定性
【０１３０】
ＴＣＥＰの存在は、不活化手順を実施した後、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅを不活性に保つために必要であり得る。この理由で、我々はＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの不活化を維持するＴＣＥＰの長期の能力を評価した。
【０１３１】
２μＬのＴＥＭＰアーゼキイ緩衝液、０．８μＬのｄＮＴＰ／ｄＵＴＰ（２．５／５ｍＭ）、０．２μＬのＴＥＭＰアーゼ（５Ｕ／μＬ）、１μＬのＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ保存緩衝液／ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ（１０Ｕ／μＬ）及び１μＬの水を含む緩衝液を１７．５×容積で混合し、３７℃で２５分間インキュベートした。ＤＮＡの除染工程の後、１×ｒｘ当たり１μＬの５０ｍＭのＴＣＥＰを加え、３７℃で２５分間インキュベートすることによってＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅを不活化した。不活化の後、ミックスを４℃で１４日間保存した（８．３ｍＭのＴＣＥＰの有効濃度）。その後、処理したミックスをｑＰＣＲストリップにて分散し、１４μＬに溶解した大腸菌の２３Ｓプライマー／プローブ及び鋳型（２００ｆｇの大腸菌ＤＮＡ又は鋳型なし）に加えた。各ＰＣＲミックスの総容量は２０μＬだった。この希釈によってＴＣＥＰの濃度を確実に２．５ｍＭに低下させ、それは実施例３の結果からＰＣＲの効率に影響しないことが分かった。ｑＰＣＲを実行する前に、再活性化されたＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅが原因で生じる鋳型の喪失を検出するためにストリップを４℃にて４時間保存した。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＭｘ３５００Ｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にてｑＰＣＲを実施し，熱サイクル条件は以下のとおりだった：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、その後、９５℃、６０℃で３０秒間と７２℃で３０秒間を４５サイクル。
【０１３２】
結果は、８．３ｍＭの濃度にて不活化添加剤ＴＣＥＰの存在下で保存した場合、４℃で少なくとも２週間の期間にわたってＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅの有意な再活性化はないことを示している（データは示さず）。
実施例１５：種々の塩化ナトリウム濃度及びｐＨを伴った緩衝液中のＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４ＥとＶｃＥｎｄＡ（野生型）の混合物の性能
【０１３３】
ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅは８．５の最適ｐＨ及び４２５ｍＭの最適塩化ナトリウム濃度を有する。Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅから得られ、ここではＶｃＥｎｄＡと呼ばれる、野生型Ｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ−由来のエンドヌクレアーゼ（ＶｓＥｎｄＡ）のホモログは、７．５の最適ｐＨ及び１７５ｍＭの最適塩化ナトリウム濃度を伴った広いｐＨ範囲を有する。従って、我々は、それが、好都合な不活化特性と一緒に広いｐＨ及び塩化ナトリウム濃度の機能範囲を持つヌクレアーゼ産物を生じるかどうかを判定するためにＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４ＥとＶｃＥｎｄＡを組み合わせた。ここで我々は、市場にある第１級の非特異的なヌクレアーゼであるベンゾナーゼの性能に対して、種々のｐＨ及び塩化ナトリウム濃度のトリス緩衝液中でのこの酵素組成物の性能を調べた。
【０１３４】
表６に示すマトリクスで描いたように様々なｐＨ及び塩化ナトリウム濃度の組み合わせと共に合計２０の５ｍＭのＭｇＣｌ2を含有する２５ｍＭのトリス緩衝液を作った。
【表６】
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【０１３５】
酵素を１：１（ｗ／ｗ）で混合することによってＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４ＥとＶｃＥｎｄＡの混合物を作り、２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８にて活性を測定した。５０μｇのウシ胸腺ＤＮＡを含有する１００μＬの緩衝液に３００Ｕの酵素を加え、反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。ＥＤＴＡを含有する負荷色素を加えることによって反応を止め、試料を１％アガロースゲルに負荷した。
【０１３６】
結果は、０Ｍ〜１Ｍの間の塩化ナトリウム濃度の範囲でＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４Ｅ／ＶｃＥｎｄＡ組成物の活性の有意な低下はないことを示した。比較して、ベンゾナーゼは０．２５Ｍにて及び上記で活性に若干の損失を示した（データは示さず）。加えて、ＶｓＥｎｄＡ＿Ｓ４４ＥとＶｃＥｎｄＡを含む組成物は、２０ｍＭのＤＴＴ又はＴＣＥＰと共に４℃で６時間保存した後、完全な不活化を示したが、野生型のＶｓＥｎｄＡとＶｃＥｎｄＡを含む組成物はこれらの条件下で類似の不活化特性を示さなかった（データは示さず）。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７】
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【配列表】
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