(57)【要約】【課題】多数の細胞を一細胞レベルの分解能で遺伝子発現解析を行うために、一細胞捕捉部と核酸捕捉部の一対の構造を上下方向に複数配置したデバイスを使用する際に、細胞懸濁液に接触する細胞捕捉部以外の面に細胞が吸着し残留することによって、細胞内核酸を溶出させるための細胞膜破壊液を導入した際に前記残留細胞からの核酸も溶出され、この核酸が複数の核酸捕捉部に捕捉されることによる解析精度の低下が課題であった。【解決手段】基板と、該基板の一面に設けられた複数の一細胞捕捉孔と、該一細胞捕捉孔それぞれについて捕捉される一細胞から抽出される核酸を捕捉する核酸捕捉体を該基板内部に備えた核酸捕捉領域とを備えた二次元アレイと；前記基板の前記核酸捕捉領域に隣接して設けられ、前記核酸捕捉領域の溶液を排出する流路と；細胞懸濁液の導入時に前記基板上に配置される、前記複数の一細胞捕捉孔を内包する筒状構造体とを備え、前記一細胞捕捉孔への細胞捕捉後に前記筒状構造体が取り外される、一細胞内核酸捕捉デバイス。【選択図】図８
2018038285.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一細胞内核酸捕捉デバイスであって、
基板と、該基板の一面に設けられた複数の一細胞捕捉孔と、該一細胞捕捉孔それぞれについて捕捉される一細胞から抽出される核酸を捕捉する核酸捕捉体を該基板内部に備えた核酸捕捉領域とを備えた二次元アレイと、
前記基板の前記核酸捕捉領域に隣接して設けられ、前記核酸捕捉領域の溶液を排出する流路と、
細胞懸濁液の導入時に前記基板上に配置される、前記複数の一細胞捕捉孔を内包する筒状構造体と
を備え、前記一細胞捕捉孔への細胞捕捉後に前記筒状構造体が取り外される、一細胞内核酸捕捉デバイス。
【請求項２】
前記筒状構造体が前記基板上に配置されるときに、前記基板の前記一細胞捕捉孔が設けられた面と前記筒状構造体の先端の距離を制御する手段をさらに有する、請求項１に記載の一細胞内核酸捕捉デバイス。
【請求項３】
前記手段が前記筒状構造体に設けられた固定具である、請求項２に記載の一細胞内核酸捕捉デバイス。
【請求項４】
前記手段が前記筒状構造体の移動を制御する機構である、請求項２に記載の一細胞内核酸捕捉デバイス。
【請求項５】
前記核酸がｍＲＮＡである、請求項１に記載の一細胞内核酸捕捉デバイス。
【請求項６】
前記核酸捕捉体が磁性ビーズである、請求項１に記載の一細胞内核酸捕捉デバイス。
【請求項７】
一細胞内核酸解析システムであって、
基板と、該基板の一面に設けられた複数の一細胞捕捉孔と、該一細胞捕捉孔それぞれについて捕捉される一細胞から抽出される核酸を捕捉する核酸捕捉体を該基板内部に備えた核酸捕捉領域とを備えた二次元アレイと、
前記基板の一細胞捕捉孔が設けられた面に対し細胞懸濁液を導入する手段と、
前記基板の前記核酸捕捉領域に隣接して設けられ、前記核酸捕捉領域の溶液を排出する流路と、
前記基板の一細胞捕捉孔が設けられた面と反対側の面より負圧を印加する手段と、
前記複数の一細胞捕捉孔を内包する筒状構造体と、
細胞懸濁液の導入時に前記筒状構造体を前記基板上に配置し、前記一細胞捕捉孔への細胞捕捉後に前記筒状構造体を取り外す機構と
を備える、一細胞内核酸解析システム。
【請求項８】
前記筒状構造体が前記基板上に配置されるときに、前記機構が、前記基板の前記一細胞捕捉孔が設けられた面と前記筒状構造体の先端の距離を制御する、あるいは
前記筒状構造体が前記基板上に配置されるときに、前記筒状構造体が、前記基板の前記一細胞捕捉孔が設けられた面と前記筒状構造体の先端の距離を制御する固定具を有する、
請求項７に記載の一細胞内核酸解析システム。
【請求項９】
前記細胞懸濁液を導入する手段が、細胞懸濁液を分注する量を制御する手段を備える、請求項７に記載の一細胞内核酸解析システム。
【請求項１０】
複数の細胞を含む細胞懸濁液から各一細胞内の核酸を捕捉する方法であって、
請求項１に記載のデバイス又は請求項７に記載のシステムを準備する工程、
前記筒状構造体が前記基板上に配置された状態で、細胞懸濁液を前記筒状構造体に導入する工程、
前記基板の一細胞捕捉孔が設けられた面と反対側の面より負圧を印加することにより前記一細胞捕捉孔に細胞を捕捉する工程、
前記筒状構造体を取り外す工程、
前記捕捉された細胞を溶解し、核酸を核酸捕捉体に捕捉する工程
を含む、一細胞内核酸捕捉方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現解析、細胞機能解析、生体組織の解析方法及び病気の診断、創薬などの分野に関するものである。詳しくは、一細胞レベルで核酸（例えばｍＲＮＡ）を捕捉するためのデバイス及び方法、並びに一細胞レベルで核酸を解析するためのシステム及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、多数の細胞から構成される生体組織のゲノム解析や遺伝子発現解析、タンパク質解析を行う際に、一細胞レベルでのゲノムや遺伝子発現、タンパク質の違いに注目した解析の重要性が認識され始めている。従来の解析では、生体組織からサンプリングした多数の細胞から、生体分子であるＤＮＡやＲＮＡ、あるいはタンパク質を抽出して解析を行うため、サンプル中の平均的な解析を行っていた。そのため、ＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質の個々の細胞中の存在量が平均値から乖離していたとしても、評価することが困難であった。単一細胞解析はこのような平均化の問題を解決する解析方法として重要である。
【０００３】
単一細胞解析は、単一細胞毎の細胞中の生体分子を高精度に検出又は定量する技術である。単一細胞解析、特に生体分子としてｍＲＮＡ解析を行うためには、細胞を個別処理するために単離し、細胞中の計測対象となるｍＲＮＡを効率良く抽出し、ｃＤＮＡを合成(逆転写)し、必要に応じてＰＣＲ増幅して得られた産物を配列解析する必要がある。
【０００４】
単一細胞解析では、一細胞中に含まれる生体分子（特にｍＲＮＡ）は極微量であるため、効率の良い生体分子の捕捉方法が求められる。また、個々の細胞の遺伝子発現量は時間的・空間的にランダムに変動しているので、統計的に生物学的・医学的指標を最終データとして抽出するために、個々の細胞を多数計測する必要がある。さらに、解析に使用する試薬は、酵素など高価なものが多いため、使用試薬量を低減して、解析コストを低減する必要がある。
【０００５】
細胞を個別に処理するために単離する方法として、特許文献１又は特許文献２に記載のようにマイクロメッシュ又は複数の貫通孔が厚み方向に形成されたフィルタを用いた技術がある。
【０００６】
単一細胞解析では、一細胞中に含まれるｍＲＮＡは極微量であるため、効率の良いｍＲＮＡの捕捉方法が求められる。また、個々の細胞の遺伝子発現量は時間的、空間的にランダムに変動しているので、統計的に生物学的・医学的指標を最終データとして抽出するために、個々の細胞を多数計測する必要がある。さらに、解析に使用する試薬は、酵素など高価なものが多いため、使用試薬量を低減して、解析コストを低減する必要がある。
【０００７】
特許文献３には、前記課題を解決する手段として、個々の細胞を捕捉するための細胞捕捉部と、その下部に配置された核酸を捕捉するためのＤＮＡが固定されたビーズ若しくは多孔質膜で形成された核酸捕捉部と、前記２種の捕捉部を繋げる流路を備え、細胞捕捉部と流路と核酸捕捉部が上下方向に対を成し、この対が２次元的に複数配置された一細胞解析用のデバイスが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００９／０１６８４２
【特許文献２】ＷＯ２０１６／０３１９７１
【特許文献３】ＷＯ２０１４／１４１３８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
一細胞レベルでのＤＮＡ配列解析や遺伝子発現解析を同時に多数の細胞で低コストに行うためには、特許文献３で示す内壁に核酸を捕捉するＤＮＡが固定された多孔質膜や２次元的に配置した核酸捕捉ＤＮＡが固定されたビーズを使ったデバイスを用いることが有効である。
【００１０】
図１に、特許文献３に記載の単一細胞解析用デバイスの概略図を示す。細胞捕捉部１１０と核酸捕捉部１１１が上下に配置された構造体がアレイ状に配置された平面基板１１２と上記平面基板１１２を上下に挟んで上部反応領域１１４と下部反応領域１１５で構成される。平面基板１１２と下部反応領域１１５の間には細孔アレイシートで形成された流路１１３が配置されている。
【００１１】
細胞懸濁液は細胞インレット１００から上部反応領域１１４に導入され、下部アウトレット１０３から吸引することにより、細胞が細胞捕捉部１１０に捕捉される。次いで、上部インレット１０１より細胞膜破壊液であるＬｙｓｉｓ溶液を導入し、上部反応領域１１４をＬｙｓｉｓ溶液で満たし、細胞捕捉部１１０に捕捉された細胞膜を破壊し、細胞内の核酸を溶出させる。細胞内核酸を溶出させた後に、平面基板を挟んで電圧を印加し、溶出された核酸を上部反応領域１１４から下部反応領域１１５へ電気泳動で移動させる。この時、溶出された核酸は、核酸捕捉部１１１にて捕捉される。
【００１２】
特許文献３では、核酸捕捉部１１１に、各細胞捕捉部１１０に対して、それぞれ異なるタグ配列が修飾されたプローブが固定されている。このタグ配列により、サンプルの配列解析時にどの細胞捕捉部から回収された核酸なのか判別することが可能となるため、個々の単一細胞の核酸配列解析が可能となる。しかし、細胞懸濁液を上部反応領域に導入した際に、上部反応領域を構成する内壁１３０、１３１、１３２に細胞が非特異的に吸着し、残留することがある。細胞捕捉部以外の場所に細胞が残留すると、細胞内核酸を溶出する際に、前記残留細胞からも核酸が溶出され、複数の核酸捕捉部で捕捉されることになる。一つの細胞から溶出された核酸が複数の核酸捕捉部で捕捉されると、本来の核酸組成と異なる組成で配列解析を行うことになり、解析精度の低下を招くことがある。
【００１３】
上部反応領域内壁に、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）やポリエチレングリコール鎖などのポリマーをコーティングすることにより、細胞の非特異吸着を抑制することは可能であるが、より完全に抑制することが望まれている。
【００１４】
そこで本発明の目的は、同時に複数の細胞を一細胞レベルで核酸を解析する際に、細胞捕捉部以外の細胞からの核酸の影響を低減するために、細胞吸着領域を低減する手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するために、本発明に係るデバイス及びシステムは以下のような構成をとる。すなわち、本発明に係る一細胞内核酸捕捉デバイスは、基板と、該基板の一面に設けられた複数の一細胞捕捉孔と、該一細胞捕捉孔それぞれについて捕捉される一細胞から抽出される核酸を捕捉する核酸捕捉体を該基板内部に備えた核酸捕捉領域とを備えた二次元アレイと；前記基板の前記核酸捕捉領域に隣接して設けられ、前記核酸捕捉領域の溶液を排出する流路と；細胞懸濁液の導入時に前記基板上に配置される、前記複数の一細胞捕捉孔を内包する筒状構造体とを備えるものであり、ここで前記一細胞捕捉孔への細胞捕捉後に前記筒状構造体が取り外される。
【００１６】
また本発明に係る一細胞内核酸解析システムは、基板と、該基板の一面に設けられた複数の一細胞捕捉孔と、該一細胞捕捉孔それぞれについて捕捉される一細胞から抽出される核酸を捕捉する核酸捕捉体を該基板内部に備えた核酸捕捉領域とを備えた二次元アレイと；前記基板の一細胞捕捉孔が設けられた面に対し細胞懸濁液を導入する手段と；前記基板の前記核酸捕捉領域に隣接して設けられ、前記核酸捕捉領域の溶液を排出する流路と；前記基板の一細胞捕捉孔が設けられた面と反対側の面より負圧を印加する手段と；前記複数の一細胞捕捉孔を内包する筒状構造体と；細胞懸濁液の導入時に前記筒状構造体を前記基板上に配置し、前記一細胞捕捉孔への細胞捕捉後に前記筒状構造体を取り外す機構とを備える。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、同時に複数の細胞を一細胞レベルで生体分子（核酸）を解析する際に、一細胞捕捉孔以外への細胞の吸着を低減し、一細胞捕捉孔に捕捉された細胞以外の細胞からの核酸の影響を低減することが可能となる。結果として、本発明に係るデバイス、システム及び方法は、一細胞内核酸を効率的かつ確実に捕捉して、一細胞内核酸を高精度に解析することができ、遺伝子発現解析、細胞機能解析、生体組織の解析、病気の診断、創薬などの分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】従来の一細胞内核酸捕捉デバイスの断面図を示す。
【図２】一細胞内核酸捕捉チップの一例の概略図を示す。
【図３】磁性ビーズの概略図を示す。
【図４】核酸捕捉用プローブの概略図を示す。
【図５】一細胞内核酸捕捉デバイスの一例の概略図を示す。
【図６】一細胞内核酸解析システムの一例の概略図を示す。
【図７】分注カバー及び分注カバーを一細胞内核酸捕捉デバイスに配置した状態の概略図を示す。
【図８】細胞懸濁液を一細胞内核酸捕捉デバイスに導入する工程を示す。
【図９】一細胞内ｍＲＮＡ捕捉から遺伝子発現プロファイルを得るためまでの工程を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、生体組織から一細胞レベルの分解能で核酸（例えばｍＲＮＡ）のライブラリ（例えばｃＤＮＡライブラリ）を作製し、次世代ＤＮＡシーケンサ又は解析対象の遺伝子に特異的なプローブを利用したハイブリダイゼーションによって、一細胞レベルの分解能でその核酸の発現解析を行うことを最終目的として、複数の細胞を含むサンプルから一細胞内の核酸をそれぞれ高効率かつ高精度に捕捉するためのデバイス及び方法を提供する。
【００２０】
本発明において、「一細胞内核酸」とは、単一細胞内に含まれる生体分子である核酸を指し、複数の細胞を含むサンプル（細胞懸濁液）においてそれぞれの一細胞に由来する核酸である。同様に、「一細胞レベルの分解能」とは、複数の細胞を含むサンプルにおいて、それぞれの一細胞について、具体的には一細胞内核酸について解析する能力を意味する。
【００２１】
本発明において、「核酸の捕捉」とは、細胞内に含まれる核酸分子を抽出して、他の細胞成分と分離することを意味し、好ましくはそのような核酸分子を固定することを意味する。また、「遺伝子発現解析」とは、遺伝子発現に関連する核酸を解析することであって、具体的には、サンプル（細胞、組織切片など）における核酸、例えばターゲットとなる被検核酸の発現を定量的に分析すること、サンプルにおける被検核酸の発現分布を分析すること、サンプルにおける特定の位置と被検核酸発現量との相関データを得ることを意味する。
【００２２】
本発明において捕捉又は解析する対象となる核酸は、細胞内に含まれる核酸であれば特に限定されるものではなく、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及びそれらの断片などが含まれる。
【００２３】
一態様において、本発明に係る、細胞懸濁液に含まれる複数の細胞を一細胞ずつ捕捉し、捕捉された一細胞それぞれから核酸を抽出して捕捉するためのデバイス（「一細胞内核酸捕捉デバイス」という）は、
基板と、該基板の一面に設けられた複数の一細胞捕捉孔と、該一細胞捕捉孔それぞれについて捕捉される一細胞から抽出される核酸を捕捉する核酸捕捉体を該基板内部に備えた核酸捕捉領域とを備えた二次元アレイと、
前記基板の前記核酸捕捉領域に隣接して設けられ、前記核酸捕捉領域の溶液を排出する流路と、
細胞懸濁液の導入時に前記基板上に配置される、前記複数の一細胞捕捉孔を内包する筒状構造体と
を備えるものであり、前記一細胞捕捉孔への細胞捕捉後に前記筒状構造体が取り外される。
【００２４】
二次元アレイは、基板に形成され、基板の一面には複数の一細胞捕捉孔が設けられ、基板内部には核酸捕捉領域が設けられている。このような二次元アレイは、特許文献３などに記載の通り、当該技術分野において公知である。
【００２５】
例えば基板は、当該技術分野で一般的に使用されている材料で作製されたものであれば特に限定されるものではない。その材料としては、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等の合金；シリコン；ガラス、石英ガラス、溶融石英、合成石英、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト及び感光性ガラス等のガラス材料；ポリエステル樹脂、ポリスチレン、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂（Acrylonitrile Butadiene Styrene樹脂）、ジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）、サイクリックポリオレフィン、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂及び塩化ビニル樹脂等のプラスチック；アガロース、デキストラン、セルロース、ポリビニルアルコール、ニトロセルロース、キチン、キトサンが挙げられる。基板に用いる材料は、疎水性材料であることが好ましく、それにより細胞や試薬などの吸着を低減することができる。
【００２６】
基板の一面に一細胞捕捉孔を設け、基板内部に核酸捕捉体を備えた核酸捕捉領域を設ける方法も公知である。核酸の捕捉効率を上げるためには、核酸捕捉体を備えた核酸捕捉領域として、表面積の大きい材料を用いることが好ましく、例えば、多数のビーズが充填された構造、多孔質構造、メッシュ構造などを採用することが好ましい。核酸捕捉体としてビーズを用いる場合には、樹脂材料（ポリスチレンなど）、酸化物（ガラスなど）、金属（鉄など）、セファロース、及びこれらの組み合わせなどからビーズを作製することができる。操作の簡便性から、磁性ビーズを使用することが好ましい。このような核酸捕捉体が核酸捕捉領域から漏出しないように細孔シートなどを配置してもよい。
【００２７】
一細胞捕捉孔の大きさは、捕捉しようとする細胞のサイズよりも小さく、かつ後述するように基板の面に対して負圧を印加することができる程度の大きさを備えている必要がある。例えば２〜１０μｍ、好ましくは２〜８μｍとすることができるが、捕捉対象の細胞の種類に応じて適宜変更する。基板上の一細胞捕捉孔の配置及び間隔もまた捕捉対象の細胞の種類に応じて適宜変更することができ、各孔への単一細胞の捕捉を確実にかつ促進するために、一細胞捕捉孔は一定の間隔で規則的に配置したり、又は互い違いに配置することができる。
【００２８】
核酸捕捉体は、捕捉対象の核酸の種類に応じて適当なプローブ、好ましくは核酸分子と特異的に結合するプローブを有することができる。例えば、核酸がｍＲＮＡである場合には、ポリＴ配列を含むＤＮＡプローブを用いることができる。ポリＴ配列を含むＤＮＡプローブ、すなわちオリゴ（ｄＴ）は、常法により合成することができ、オリゴ（ｄＴ）の重合度は、ｍＲＮＡのポリＡ配列とハイブリダイズして、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）が固定された核酸捕捉体に捕捉しうる重合度であればよい。例えば、１０〜３０塩基、１０〜２０塩基、１０〜１５塩基程度とすることができる。核酸が非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ又はゲノムＤＮＡである場合には、ランダム配列からなるＤＮＡプローブ、特定の標的配列に対して相補的な配列を有するＤＮＡプローブを用いることができる。また別法として、核酸の代わりにタンパク質や低分子化合物などの生体分子を捕捉することを目的とする場合には、これらの生体分子と特異的に結合する第１の結合性分子（抗体、アプタマー等）と、第１の結合性分子に結合した第１のＤＮＡプローブを利用することができる。上記結合性分子とサンドイッチ状態で上記生体分子と結合する第２の結合性分子（上記結合性分子と同じ種類の分子であることが好ましく、例えば抗体、アプタマー等である）と、第２の結合性分子に結合した第２のＤＮＡプローブを添加し、ターゲットとなる生体分子が存在する場合には、上記ＤＮＡプローブと第２のＤＮＡプローブとがライゲーションし、その生体分子に特異的なリングプローブが形成される。この方法は近接ライゲーション法（Proximity Ligation Method）と呼ばれ（例えば、Malin Jarvius et al. Molecular & Cellular Proteomics 6 (9) p.1500, 2007）、タンパク質に対応したＤＮＡライブラリの構築に有用である。
【００２９】
プローブは、当技術分野で公知の任意の方法により核酸捕捉体に固定する。例えばビーズ表面、多孔質膜の表面又は内部などに、共有結合、イオン結合、物理吸着、生物学的結合（例えば、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジンとの結合、抗原と抗体との結合など）を利用してプローブを固定することができる。また、スペーサー配列を介してプローブを核酸捕捉体に固定することも可能である。前記近接ライゲーションを用いた生体分子としてタンパク質や低分子化合物を処理する場合、前記第１の結合性分子を前記捕捉体に固定することも可能である。
【００３０】
なお、二次元アレイや基板には、他の物質（核酸やタンパク質など）が吸着しないように、表面コーティングを行うことが好ましい。
【００３１】
流路もまた、当該技術分野で公知であり、核酸捕捉領域に隣接するのであれば、基板又は二次元アレイと一体化して設けてもよいし、又は別々に作製した後で接続してもよい。この流路から、核酸捕捉領域の溶液を排出する。
【００３２】
筒状構造体は、複数の一細胞捕捉孔を内包する大きさ及び形状を有するものである。筒状構造体の形状は、筒状（棒状であり中心がくり抜かれた形状）であれば特に限定されるものではなく、上面から見て、例えば四角形（図７（ｂ））、角丸四角形、円形、楕円形、三角形などの形状とすることができる。細胞懸濁液の導入の容易性から、筒状構造体の断面は、テーパード形状（上部が広く、下部が狭い）であることが好ましい。筒状構造体の大きさについて、筒の内径はすべての一細胞捕捉孔を内包できる程度の大きさである。一細胞捕捉孔以外の基板の表面に細胞が吸着する可能性をできる限り低減するため、すべての一細胞捕捉孔を内包できる最小のサイズであることが好ましい。また、筒の長さは基板上の反応領域の高さに合わせて調節される。筒状構造体の材質も特に限定されるものではなく、基板の作製に使用される材料、例えばポリプロピレン樹脂を同様に使用することができ、疎水性材料であることが好ましく、それにより細胞などの吸着を低減することができる。
【００３３】
本発明に係るデバイスは、筒状構造体が基板上に配置されるときに、基板の一細胞捕捉孔が設けられた面と筒状構造体の先端の距離を制御する手段をさらに有することが好ましい。これにより、基板の破損や負圧印加による細胞捕捉の不具合を避けることができる。例えば、この手段は、筒状構造体に設けられた固定具、例えば突起とすることができ、固定具によって筒状構造体を基板上の所定の位置に固定することが可能となる。さらに又はあるいは、この手段は、筒状構造体の移動を制御する機構、例えば上下駆動機構とすることができる。この機構は、筒状構造体の取り外しにも有用である。
【００３４】
筒状構造体は、細胞懸濁液を導入する際に基板上に配置してもよいし、あるいは予め基板上に配置されていてもよい。基板上に設けられた複数の一細胞捕捉孔を内包するように配置される。この筒状構造体は、細胞懸濁液の導入後、細胞を一細胞捕捉孔へ捕捉した後に取り外される。
【００３５】
上記構成を有する本発明のデバイスは、筒状構造体を備えるため、一細胞捕捉孔に捕捉されずに筒状構造体に吸着した細胞を簡便に取り除き、捕捉孔以外の反応領域に細胞を吸着することを低減することができ、そのような吸着した細胞から溶出した核酸（ｍＲＮＡなど）が核酸捕捉領域に混入する影響を低減することができる。すなわち、複数の細胞を含むサンプル（細胞懸濁液）から、一細胞由来の核酸をそれぞれ別個の核酸捕捉領域に確実に捕捉することが可能となる。
【００３６】
別の態様において、本発明に係る一細胞内核酸解析システムは、
基板と、該基板の一面に設けられた複数の一細胞捕捉孔と、該一細胞捕捉孔それぞれについて捕捉される一細胞から抽出される核酸を捕捉する核酸捕捉体を該基板内部に備えた核酸捕捉領域とを備えた二次元アレイと、
前記基板の一細胞捕捉孔が設けられた面に対し細胞懸濁液を導入する手段と、
前記基板の前記核酸捕捉領域に隣接して設けられ、前記核酸捕捉領域の溶液を排出する流路と、
前記基板の一細胞捕捉孔が設けられた面と反対側の面より負圧を印加する手段と、
前記複数の一細胞捕捉孔を内包する筒状構造体と、
細胞懸濁液の導入時に前記筒状構造体を前記基板上に配置し、前記一細胞捕捉孔への細胞捕捉後に前記筒状構造体を取り外す機構と
を備える。
【００３７】
細胞懸濁液を導入する手段は、当該技術分野で公知であり、特に限定されるものではない。例えば、細胞懸濁液を収容し分注する収容分注器を用いることができる。またこの手段は、細胞懸濁液を分注する量を制御する手段（例えば、分注用加圧器など）を備えていてもよい。この手段を用いて細胞懸濁液ができる限り基板以外の面に接しないように分注制御することによって、筒状構造体又は反応領域の内壁に吸着する細胞をさらに低減することが可能となる（図８（ｃ’）及び（ｄ’））。
【００３８】
負圧を印加する手段は、当技術分野で公知であり、例えばシリンジ、ポンプ、吸引装置などを用いることができる。基板の一細胞捕捉孔が設けられた面と反対側の面より負圧を印加することによって、一細胞捕捉孔への細胞の捕捉を行うことができる。そして、負圧の印加を継続すると、一細胞捕捉孔に捕捉された細胞が保持されたまま基板又は二次元アレイの洗浄を行うことができ、並びに／あるいは核酸捕捉領域への核酸の捕捉を効率的かつクロストークなく行うことができる。
【００３９】
本発明に係る一細胞内核酸解析システムはさらに、試薬導入手段、温度調節手段、光学観察手段、移動ステージなどを有してもよい。
【００４０】
上記構成を有する本発明のシステムは、筒状構造体を備えるため、一細胞捕捉孔に捕捉されずに筒状構造体に吸着した細胞を簡便に取り除き、捕捉孔以外の反応領域に細胞を吸着することを低減することができ、そのような吸着した細胞から溶出した核酸（ｍＲＮＡなど）が核酸捕捉領域に混入する影響を低減することができる。すなわち、複数の細胞を含むサンプル（細胞懸濁液）から、一細胞由来の核酸をそれぞれ別個の核酸捕捉領域に確実に捕捉することが可能となる。
【００４１】
また別の態様において、本発明に係る、複数の細胞を含む細胞懸濁液（サンプル）から各一細胞内の核酸を捕捉する方法（「一細胞内核酸捕捉方法」ともいう）は、
本発明に係る上記デバイス又はシステムを準備する工程、
前記筒状構造体が前記基板上に配置された状態で、細胞懸濁液を前記筒状構造体に導入する工程、
前記基板の一細胞捕捉孔が設けられた面と反対側の面より負圧を印加することにより前記一細胞捕捉孔に細胞を捕捉する工程、
前記筒状構造体を取り外す工程、
前記捕捉された細胞を溶解し、核酸を核酸捕捉体に捕捉する工程
を含む。
【００４２】
細胞懸濁液（サンプル）は、複数の細胞を含むサンプルであれば特に限定されるものではない。細胞懸濁液（サンプル）の由来となる生体も特に限定されるものではなく、脊椎動物（例えば哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類、両生類など）、無脊椎動物（例えば昆虫、線虫、甲殻類など）、原生生物、植物、真菌、細菌、ウイルスなどの任意の生体に由来するサンプルを用いることができる。細胞懸濁液（サンプル）は、本発明に係るデバイス、システム又は方法において使用する際に、流路を流れる形態である必要がある。そのため、当初の形態が固形サンプル（例えば組織切片など）である場合には、固形サンプルを溶媒に溶解又は懸濁させることにより細胞懸濁液とすることが好ましい。また、当初の形態が気体サンプル（例えば空気、呼気など）である場合には、気体サンプルに含まれる細胞を溶媒に懸濁させることにより細胞懸濁液とすることが好ましい。細胞懸濁液の調製方法は、当該技術分野において慣用的に行われており、当業者であれば容易に理解することができる。
【００４３】
筒状構造体が基板上に配置された状態で、測定対象の複数の細胞を含む細胞懸濁液を筒状構造体に導入する。その際、筒状構造体又は反応領域の内壁に細胞が吸着することを避けるため、細胞懸濁液の分注量を制御することが好ましい。続いて、基板の一細胞捕捉孔が設けられた面と反対側の面より負圧を印加することにより、細胞懸濁液に含まれる複数の細胞が、それぞれ１個ずつ一細胞捕捉孔に捕捉される。次に、筒状構造体を取り外して、筒状構造体の内壁に吸着した細胞も取り除く。
【００４４】
必要な場合には、適当な溶媒、緩衝液等を流して基板の一面に対して導入し、前記二次元アレイ上を洗浄する。細胞が一細胞捕捉孔に捕捉されたまま、基板に吸着した不要な細胞及び成分を洗浄することができる。
【００４５】
そして、細胞溶解試薬を導入して捕捉された細胞を溶解し、核酸を二次元アレイの核酸捕捉体に捕捉する。例えば、当技術分野で公知の細胞溶解試薬を用いて細胞を溶解し、細胞に含まれる核酸を抽出することができる。例えば、プロテイナーゼＫのようなタンパク質分解酵素、チオシアン酸グアニジン・グアニジン塩酸といったカオトロピック塩、Ｔｗｅｅｎ及びＳＤＳといった界面活性剤、あるいは市販の細胞溶解用試薬を用いて、細胞を溶解し、それに含まれる核酸、すなわちＤＮＡ及びＲＮＡを溶出することができる。核酸としてｍＲＮＡを捕捉する場合には、ＤＮＡをＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）により分解してからＲＮＡのみを捕捉するようにしてもよい。
【００４６】
本発明に係る一細胞内核酸捕捉方法は、本発明に係るデバイス又はシステムを用いることにより、複数の細胞を含むサンプル（細胞懸濁液）から個々の一細胞捕捉孔に一細胞のみを捕捉し、捕捉された細胞から、一細胞由来の核酸を高効率かつ確実に捕捉することができる。
【００４７】
以下、図面を参照しながら本発明の具体的な実施の形態を説明する。
【００４８】
［実施例１］
本実施例では、サンプルである複数の細胞から一細胞内の生体分子として核酸を捕捉し遺伝子発現解析するための、本発明の構成を有するデバイス及びシステムを説明する。
【００４９】
図２に一細胞内核酸捕捉チップ２００の概略図を示す。図２（ａ）に一細胞内核酸捕捉チップ２００の平面図を、図２（ｂ）に図２（ａ）一細胞内核酸捕捉チップ２００のＡ−Ａ断面図を示す。一細胞内核酸捕捉チップ２００として、ジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）製基板２０１の形状を、射出成形及びレーザ加工により作製した、一細胞捕捉孔２０２と核酸捕捉孔２０３が上下に配置された捕捉槽２０４を２次元アレイ状に配置した構成を持つチップを使用した。捕捉槽２０４はｘｙ方向に２００μｍ間隔に配置され、１つの一細胞内核酸捕捉チップ２００に計１６個の捕捉槽２０４が配置されている。
【００５０】
１つの捕捉槽には、図２（ｂ）上方に一細胞捕捉孔２０２が、下方に核酸捕捉孔２０３が設けられている。核酸捕捉孔２０３には、直径１μｍの磁性ビーズ２０５が充填されている。一細胞捕捉孔２０２の開口直径を３μｍ、核酸捕捉孔２０３の開口直径を７０μｍとした。磁性ビーズ２０５が図２（ｂ）下方から漏出しないように、５００ｎｍ程度の開口を持ったアルミナ製の細孔シート２０６を配置した。ＰＤＭＳ製基板２０１と細孔シート２０６はプラズマ接着によって接着した。ここで、ＰＤＭＳ製基板２０１の代わりに他の樹脂(ポリカーボネート、サイクリックポリオレフィン、ポリプロピレンなど)を用いた射出成形により得られた樹脂チップを用いてもよく、あるいはナノインプリント技術や半導体プロセスを用いたものを使用することもできる。また、本実施例では磁性ビーズを使用したが、これ以外に、樹脂材料（ポリスチレンなど）、酸化物（ガラスなど）、金属（鉄など）、セファロース、及びこれらの組み合わせなどからビーズを作製することができる。
【００５１】
図３に核酸捕捉用の磁性ビーズ２０５の概略図を示す。磁性ビーズ２０５の周りにはストレプトアビジン３０７が多数修飾されており、ストレプトアビジン３０７を介して５’末端にビオチン３０８が結合した核酸捕捉用プローブ３０９が結合している。
【００５２】
図４に核酸捕捉用プローブ３０９の一例の概略図を示す。５’末端にビオチン３０８が結合した核酸捕捉用プローブ３０９は、５’末端方向から、ＰＣＲ増幅用共通配列（Ｆｏｒｗａｒｄ）４１０、細胞認識用タグ配列４１１、及び核酸捕捉配列４１２で構成される。ここでは核酸捕捉配列としてオリゴ（ｄＴ）を用いた。オリゴ（ｄＴ）用いることでｍＲＮＡのポリＡ配列とハイブリダイズして、サンプル細胞のｍＲＮＡを捕捉することが可能となる。オリゴ（ｄＴ）の重合度として、ｍＲＮＡのポリＡ配列とハイブリダイズして、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）を含むプローブが固定された磁性ビーズ２０５に捕捉しうる重合度であればよい。例えば、１０〜３０塩基、１０〜２０塩基、１０〜１５塩基程度とすることができる。また、本実施例では捕捉する核酸をｍＲＮＡとしたが、例えば捕捉する核酸がｍｉｃｒｏＲＮＡやゲノムＤＮＡである場合には、核酸捕捉配列として、ランダム配列、ターゲット被検核酸の一部に相補的な配列を用いることができる。ＰＣＲ増幅用共通配列４１０を核酸捕捉用プローブ３０９へ導入することで、後続のＰＣＲ増幅工程においてこの配列を共通プライマーとして利用することができる。また、細胞認識用タグ配列４１１は各核酸捕捉孔で異なる配列を持つことが望ましい。細胞認識用タグ配列４１１を構成する塩基数が５塩基である場合、４５＝１０２４の位置又は領域（例えば４５＝１０２４個の単一細胞）を認識することが可能となり、最終的に得られる次世代シーケンサの配列データが、どの細胞（又は位置若しくは領域）由来であるかを認識することが可能となる。このタグ配列については特許文献３に詳細が記載されている。
【００５３】
図５に一細胞内核酸捕捉チップ２００を組込んだ一細胞内核酸捕捉デバイス５００の一例の概略図を示す。図５（ａ）に断面図を、図５（ｂ）に平面図を示す。一細胞内核酸捕捉デバイス５００には、細胞懸濁液、試薬、洗浄バッファを導入する上部反応領域５０１、溶液を吸引、排出する吸引口５０２、下部反応領域５０３、内壁５０４から構成される。本実施例では一細胞内核酸捕捉デバイス５００の材質としてアクリル樹脂を使用したが、それ以外の樹脂、金属であっても良い。但し、核酸捕捉やｃＤＮＡ合成反応の阻害となる材質を避けることが好ましい。例えば、アルミなどはｃＤＮＡ合成反応の阻害となるために避ける必要がある。細胞懸濁液、試薬、洗浄バッファのデッドボリュームを低減するために、上部反応領域５０１は一細胞内核酸捕捉チップ２００の直上に位置することが望ましい。
【００５４】
図６に一細胞内核酸解析システムの一例の概略図を示す。一細胞内核酸捕捉デバイスを含めた送液ユニット６００、試薬分注ユニット６０１、一細胞内核酸捕捉デバイスの温度調整を行う温調ユニット６０２、一細胞内核酸捕捉チップ２００の光学観察を行う光学観察ユニット６０３、一細胞内核酸捕捉デバイス５００を所望の位置に移動させる移動ステージユニット６０４、細胞懸濁液を導入するサンプル分注ユニット６０５から構成される。
【００５５】
送液ユニット６００は以下のように構成されている。一細胞内核酸捕捉デバイスの吸引口５０２にＰＥＥＫ製吸引チューブ６０６を介してシリンジ６２２が接続されている。シリンジ６２２により一細胞内核酸捕捉チップ２００に負圧を印加し、一細胞捕捉孔側表面の溶液を吸引することが可能となる。
【００５６】
試薬分注ユニット６０１は、試薬や洗浄バッファを収容、分注する試薬収容分注器６０７、試薬や洗浄バッファを分注させるために試薬収容分注器６０７を特定の時間加圧するための分注用加圧器６０８で構成される。試薬収容分注器６０７はポリプロピレン樹脂とガラス製のキャピラリから構成され、試薬や洗浄バッファが収容されているポリプロピレン樹脂製の収容部上部から一定の圧力、時間で加圧されると、キャピラリの先端から試薬や洗浄バッファが分注される。各試薬収容分注器６０７には、個別に加圧することが可能である。本実施例では試薬収容分注器６０７を温調していないが、試薬の劣化を防ぐため（特に低い温度（４℃など）で）温調しても良い。
【００５７】
温調ユニット６０２は、一細胞内核酸捕捉デバイス５００内の温度を４℃から８５℃まで調整可能にするため、ペルチェとヒータを組み合わせた構成とした。より具体的には、ペルチェ素子の表面に熱伝導の良い金属（例えば銅）を熱伝導の良い接着剤で接着し、前記金属内部にヒータを導入した構成とした。前記金属を熱伝導シートを介して一細胞内核酸捕捉デバイス５００に接続した。
【００５８】
光学観察ユニット６０３は、後述するサンプルである細胞に標識した蛍光体ＧＦＰ（Ｅｘ／Ｅｍ＝４８８／５０７ｎｍ）を励起するためのハロゲンランプを使った光源６０９、集光レンズ６１０、光学フィルタ６１１、ダイクロイックミラー６１２、対物レンズ６１３、光学フィルタ６１４、結像レンズ６１５、ＣＣＤカメラ６１６から構成される。光源６０９からの光は集光レンズ６１０によって並行光束に変換され、４８０ｎｍを中心波長とするバンドパスフィルタである光学フィルタ６１１によって４８０ｎｍ周辺波長が除外され、５００ｎｍ以下を反射するダイクロイックミラー６１２によって反射され、対物レンズ６１３によって集光され、一細胞内核酸捕捉デバイス５００内の一細胞内核酸捕捉チップ２００に捕捉された細胞に照射される。前記照射された細胞からの蛍光は、対物レンズ６１３によって集光され、ダイクロイックミラー６１２を透過し、５００ｎｍ以下をカットする光学フィルタ６１４によって背景光が除去され、結像レンズ６１５によってＣＣＤカメラ６１６に結像される。本実施例では落射式蛍光顕微鏡の構成を用いたが、細胞を直接観察する落射式明視野、暗視野顕微鏡の構成でも良い。
【００５９】
移動ステージユニット６０４は自動移動ステージから構成されており、前記移動ステージの上に温調ユニット６０２と一細胞内核酸捕捉デバイス５００が設置されている。温調ユニット６０２の温度の影響を受けないように、前記移動ステージと温調ユニット６０２の間には断熱材を介して接続してある。移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉デバイス５００を試薬分注器６０７から試薬を分注できる位置、サンプル分注ユニット６０５からサンプルを分注できる位置、光学観察ユニット６０３を用いて細胞を計測する位置に移動させることが可能となる。
【００６０】
サンプル分注ユニット６０５はサンプル分注器６１７とサンプルを分注させるためにサンプル分注器６１７を特定の時間加圧するための分注用加圧器６１８、分注カバー６１９から構成されている。サンプルである細胞懸濁液はサンプル分注器６１７に収容されており、サンプル分注器６１７上部から分注用加圧器６１８によって、一定の圧力、時間で加圧されると、サンプル分注器先端から細胞懸濁液が分注される。分注カバー６１９には、分注カバー自身を上下させる上下駆動機構６２０が接続されている。
【００６１】
図７に分注カバー６１９の概略図を示す。図７（ａ）に断面図を、図７（ｂ）に上面図を示す。図７（ｃ）に、分注カバーを一細胞内核酸捕捉デバイスに配置した状態を示す。図７（ｂ）の上面図には、細胞懸濁液を一細胞内核酸捕捉デバイス５００に導入する際の一細胞捕捉孔２０２の位置関係を示す。分注カバー６１９の形状は、ポリプロピレン樹脂製の四角錐の先端をカットした筒状である。分注カバー先端から所定の高さに突起６２１が設置されている。分注カバー６１９先端部の内側の大きさは、大きくなるほど一細胞内核酸捕捉チップ２００の一細胞捕捉孔以外の表面に細胞が吸着する可能性が大きくなる。そのため、全ての一細胞捕捉孔が内包できる最小のサイズであることが望ましい。
【００６２】
［実施例２］
本実施例では、本発明の構成を有するデバイス及びシステムを用いて、サンプルである複数の細胞を含む細胞懸濁液から各細胞を捕捉する手順を説明する。
【００６３】
サンプルである細胞懸濁液８２３を一細胞内核酸捕捉デバイス５００に導入する工程を図８に示す。まず、２０個程度以下の細胞を５００μＬの１×ＰＢＳで細胞を傷つけないように洗浄し、できる限りＰＢＳが残らないように溶液を除去し、１×ＰＢＳバッファを１０μＬ加えた細胞懸濁液を調製した。細胞にはあらかじめ蛍光体ＧＦＰが組込まれている。
【００６４】
前記細胞懸濁液８２３をサンプル分注器６１７に充填する。移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉デバイス５００を分注カバー６１９の直下に移動させ、上下駆動機構６２０によって一細胞内核酸捕捉チップ２００の上部に接触させる（図８（ａ））。この時、突起６２１と一細胞内核酸捕捉デバイス５００の上面が接触することにより、分注カバー６１９の先端が一細胞内核酸捕捉チップ２００上部表面に挿し込み過ぎによる破損を防ぐことができる。分注カバー６１９の先端を一細胞内核酸捕捉チップ２００上部表面に接触させることが望ましいが、細胞懸濁液が分注カバー６１９の先端と一細胞内核酸捕捉チップ２００上部表面の隙間から漏れ出さない程度であれば、多少隙間があっても良い。分注カバー６１９の先端と一細胞内核酸捕捉チップ２００上部表面との距離を突起６２１で制御したが、上下駆動機構６２０で所定の距離のみ移動させることにより、前記距離を制御しても良い。
【００６５】
あるいは、一細胞内核酸捕捉デバイス５００には、予め分注カバー６１９がセットされていてもよい（例えば、図７（ｃ）に示す状態）。この場合には、分注カバーを配置する手順（図８の（ａ））を省略することができる。
【００６６】
分注カバー６１９先端が一細胞内核酸捕捉チップ２００上部表面に接触した後に、分注用加圧器６１８より圧力を印加し、サンプル分注器６１７より細胞懸濁液８２３を分注カバー６１９内部に滴下する（図８（ｂ））。このとき、細胞懸濁液８２３を導入する量（分注量）を制御し、分注カバー６１９又は上部反応領域の内壁に吸着する細胞を低減することがさらに好ましい（図８（ｃ’））。細胞懸濁液８２３滴下後に、吸引口５０２よりシリンジ６２２を引くことにより吸引動作を行い、細胞懸濁液を一細胞内核酸捕捉チップ２００内に吸引する（図８（ｃ）及び（ｃ’））。細胞８２４の大きさは１０μｍ程度であるため、細胞８２４は一細胞捕捉孔２０２を通過できず、上記捕捉孔で捕捉される。細胞懸濁液が一細胞内核酸捕捉チップ２００上部表面にほとんど残留していない状態まで、吸引動作を行う。次いで、分注カバー６１９を上下駆動機構６２０で上昇させ、一細胞内核酸捕捉デバイス５００より取り外す（図８（ｄ）及び（ｄ’））。前記細胞懸濁液導入方法により、一細胞内核酸捕捉デバイス５００の内壁５０４に細胞が吸着されることを防ぐことができる。
【００６７】
次いで、一細胞内核酸捕捉デバイスを移動ステージユニット６０４によって光学観察ユニット６０３直下に移動させる。細胞には予め蛍光体ＧＦＰ（Ｅｘ／Ｅｍ＝４８８／５０７ｎｍ）が標識されているため、光学観察ユニット６０３を用いて蛍光観察することにより、どの一細胞捕捉孔に細胞が捕捉されたのか確認することができる。細胞が吸引される状況を観察したい場合には、分注カバー６１９内部に細胞懸濁液を滴下した後に、分注カバー６１９を上下駆動ユニット６２０から取外し、移動ステージユニット６０４によって光学観察ユニット６０３直下に一細胞内核酸捕捉デバイス５００を移動させ、吸引動作を行う必要がある。前記観察を行う場合、細胞懸濁液液面高さが吸引動作により変化することでフォーカスがずれるため、前記液面高さの変化に合わせて対物レンズ６１３と一細胞内核酸捕捉デバイス５００の距離を移動ステージユニット６０４で調製する必要がある。
【００６８】
分注カバー６１９の使用により、一細胞捕捉孔以外への細胞の吸着を低減し、一細胞捕捉孔への単一細胞の捕捉をより完全に行い、一細胞由来の核酸を確実に核酸捕捉領域に捕捉することができる。
【００６９】
［実施例３］
本実施例では、本発明の構成を有するデバイス又はシステムを用いて、捕捉された細胞から一細胞内の生体分子として核酸を捕捉し、一細胞レベルの分解能で遺伝子発現解析を行う方法を説明する。
【００７０】
細胞内ｍＲＮＡ捕捉から次世代（大規模）シーケンサで遺伝子発現プロファイルを得るためまでの工程を説明する。主な工程は、図９に示すように、細胞膜破壊とｍＲＮＡ捕捉（図９（ａ））、核酸捕捉孔の洗浄（図９（ｂ））、１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ（ｃＤＮＡ）の合成（図９（ｃ））、核酸捕捉孔の洗浄（図９（ｄ））、ｍＲＮＡの分解（図９（ｅ））、２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄの合成（図９（ｆ））、ＰＣＲ反応による増幅（図９（ｇ））、増幅産物の精製（図９（ｈ））、ｅｍＰＣＲ（又はブリッジ増幅）と次世代ＤＮＡシーケンサによる解析（図９（ｉ））から成る。
【００７１】
より具体的には以下の工程を行う。ＲｅａｌＴｉｍｅ  ｒｅａｄｙ  Ｌｙｓｉｓバッファ（Ｒｏｃｈｅ）３９．５μＬ、Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）３９．５μＬ、Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）０．５μＬで調整したＬｙｓｉｓ溶液が充填された試薬収容分注器６０７の直下に移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉デバイス５００を移動させ、分注用加圧器６０８によって所定の圧力と時間で試薬収容分注器６０７を加圧し、Ｌｙｓｉｓ溶液を一細胞内核酸捕捉デバイス５００に導入する。シリンジ６２２を引いて吸引動作（負圧印加）を行い、一細胞内核酸捕捉チップ２００に対して垂直な流れを発生させ、一細胞内核酸捕捉チップ２００の各捕捉槽２０４に前記Ｌｙｓｉｓ溶液を通過させる。細胞は前記Ｌｙｓｉｓ溶液によって溶解され、細胞内に存在したｍＲＮＡが溶出する。溶出したｍＲＮＡは、吸引動作によって発生した、一細胞内核酸捕捉チップ２００に対する垂直方向の流れによって一細胞捕捉孔２０２から核酸捕捉孔２０３へ向かって流れ続ける。この過程でｍＲＮＡは磁性ビーズ２０５に固定された核酸捕捉用プローブ３０９の核酸捕捉配列４１２であるオリゴ（ｄＴ）部分に捕捉される（図９（ａ））。
【００７２】
次いで、洗浄バッファである１×ＰＢＳバッファが充填された試薬収容分注器６０７の直下に移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉デバイス５００を移動させ、分注用加圧器６０８によって所定の圧力と時間で試薬収容分注器６０７を加圧し、洗浄バッファを一細胞内核酸捕捉デバイス５００に導入する。シリンジ６２２を引いて吸引動作を行い、核酸捕捉孔２０３を洗浄し、ｍＲＮＡ以外の生体物質、Ｌｙｓｉｓ溶液を洗い流す（図９（ｂ））。
【００７３】
５×Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄバッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４μＬ、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（逆転写酵素、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４μＬ、ＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４μＬとを混和した逆転写溶液が充填された試薬収容分注器６０７の直下に移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉デバイス５００を移動させ、分注用加圧器６０８によって所定の圧力と時間で試薬収容分注器６０７を加圧し、１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ合成試薬を一細胞内核酸捕捉デバイス５００に導入する。シリンジ６２２を引いて吸引動作（負圧印加）を行い、一細胞内核酸捕捉チップ２００に対して垂直な流れを発生させ、一細胞内核酸捕捉チップ２００の各捕捉槽２０４に前記溶液を通過させる。前記溶液が、まだ一細胞内核酸捕捉チップ２００上部表面に残存している状態でシリンジ６２２による溶液吸引動作を停止し、温調ユニット６０２によって一細胞内核酸捕捉デバイス５００内温度を３７℃に上げて１０分間静置した後に、５０℃に上げて４５分間保つことによって逆転写反応を完了させ、ｍＲＮＡと相補的配列を有する１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した（図９（ｃ））。
【００７４】
ｃＤＮＡ鎖を合成した後に、温調ユニット６０２によって一細胞内核酸捕捉デバイス５００内温度を８５℃に上げて９０秒間保ち逆転写酵素を失活させた。逆転写酵素失活後に一細胞内核酸捕捉デバイス５００内温度を４℃に冷却後、洗浄バッファである１×ＰＢＳバッファが充填された試薬収容分注器６０７の直下に移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉デバイス５００を移動させ、分注用加圧器６０８によって所定の圧力と時間で試薬収容分注器６０７を加圧し、洗浄バッファを一細胞内核酸捕捉デバイス５００に導入する。シリンジ６２２を引いて吸引動作（負圧印加）を行い、一細胞内核酸捕捉チップ２００に対して垂直な流れを発生させ、一細胞内核酸捕捉チップ２００の各捕捉槽２０４に前記溶液を通過させ、核酸捕捉孔２０３を洗浄する（図９（ｄ））。
【００７５】
洗浄した一細胞内核酸捕捉チップ２００を一細胞内核酸捕捉デバイス５００から取り外し、樹脂製のチューブ（一般に用いられる０．２ｍＬや１．５ｍＬ容量などのチューブ）を挿入し、ＲＮａｓｅＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１μＬ、１０×ＲＮａｓｅＨバッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１μＬを混和したＲＮａｓｅＨ溶液をそれぞれの前記チューブに導入し、前記チューブを３７℃３０分間静置することで、ｍＲＮＡを分解した（図９（ｅ））。
【００７６】
ｍＲＮＡ分解後に前記チューブにＴｒｉｓ−ｔｗｅｅｎバッファ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１％Ｔｗｅｅｎ溶液）５０μＬを導入し、一細胞内核酸捕捉チップ２００を洗浄し、マグネットを使用して磁性ビーズ２０５のみ前記チューブ内に残し、前記Ｔｒｉｓ−ｔｗｅｅｎバッファ  １μＬで再懸濁した。前記チューブに１０×Ｐｌａｔｎｕｍバッファ１μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ１μＬ、５０ｍＭ  ＭｇＳＯ４０．４μＬ、各１０μＭの遺伝子特異的配列プライマー２．５μＬ、Ｐｌａｔｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｈ．Ｆ．０．１μＬ、滅菌水５μＬを混和した２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ合成試薬１０μＬを加えてＰＣＲ装置で９８℃１０秒、４３℃１分、６８℃３分の順に反応を行い２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄの合成を行った（図９（ｆ））。本実施例では、遺伝子特異的配列プライマーとしてＰＣＲ増幅用共通配列（Ｒｅｖｅｒｓｅ）が付加された２０種（ＡＴＰ５Ｂ、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＨＭＢＳ、ＨＰＲＴ１、ＲＰＬ４、ＲＰＬＰ１、ＲＰＳ１８、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＳ２０、ＡＬＤＯＡ、Ｂ２Ｍ、ＥＥＦ１Ｇ、ＳＤＨＡ、ＴＢＰ、ＶＩＭ、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ２、ＲＰＬＰ２７、及びＯＡＺ１）の遺伝子特異的配列を持ったＤＮＡプローブを使用した。遺伝子特異的配列として、ターゲット遺伝子のポリＡテールから１０９±８塩基上流部分の２０±５塩基を使用した。
【００７７】
前記２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ合成を行ったチューブを４℃に保管した状態でマグネットを近接させ、磁性ビーズ２０５のみ前記チューブ内に残した状態で２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ合成試薬を取り除く。次いで前記チューブを４℃に、またマグネットに近接した状態で、Ｔｒｉｓ  ｔｗｅｅｎバッファ５０μＬで２回前記磁性ビーズを洗浄し、最後にＴｒｉｓ  ｔｗｅｅｎバッファ１μＬで前記ビーズを懸濁した。前記チューブ内の前記磁性ビーズを洗浄した後に、Ｇｆｌｅｘ（ＴａＫａＲａ）７μＬ、ＰＣＲ増幅用共通配列（Ｆｏｒｗａｒｄ）を持つプライマー２μＬ、ＰＣＲ増幅用共通配列（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を持つプライマー２μＬ、Ｇｆｌｅｘ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）０．３μＬ、滅菌水３μＬを混和したＰＣＲ用試薬１４．３μＬを前記チューブに導入する。前記チューブを３０秒間９４℃に保ち、９４℃３０秒間→５５℃３０秒間→６８℃３０秒間の３段階工程を４０サイクル繰り返し、最後に６８℃３分間保った後に、４℃に冷却してＰＣＲ増幅工程を行った（図９（ｇ））。前記工程により、２０種のターゲット遺伝子の目的部分が増幅されるが、いずれもＰＣＲ産物サイズは２００±８塩基とほぼ均一となる。
【００７８】
ＰＣＲ反応の後に、溶液中に含まれるフリーのＰＣＲ増幅用共通配列プライマーや酵素などの残留試薬を除去する目的で、前記工程で増幅した増幅産物をＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した（図９（ｈ））。前記精製した溶液をｅｍＰＣＲ増幅又はブリッジ増幅に適用した後に、各社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｏｌｉｄ／Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｈｉｇｈ  Ｓｅｑ）など）の次世代ＤＮＡシーケンサに適用して解析する（図９（ｉ））。
【００７９】
本実施例によって、一細胞捕捉孔以外の領域への細胞の非特異吸着が低減できるため、前記非特異吸着細胞から溶出されるｍＲＮＡの影響を低減し、解析精度向上を図ることができる。
【００８０】
本実施例では、ｍＲＮＡ分解（図９（ｅ））以降の工程を別のチューブに一細胞内核酸捕捉チップ２００を移して行ったが、図９（ｇ）のＰＣＲ反応による増幅までを一細胞内核酸捕捉デバイス５００内で行い、前記一細胞内核酸捕捉デバイスからの反応液を回収して、図９（ｈ）増幅産物の精製以降の反応を別チューブで行っても良い。
【符号の説明】
【００８１】
１００  細胞インレット
１０１  上部インレット
１０２  上部アウトレット
１０３  下部アウトレット
１１０  細胞捕捉部
１１１  核酸捕捉部
１１２  平面基板
１１３  流路
１１４  上部反応領域
１１５  下部反応領域
１３０  内壁（細胞吸着領域）
１３１  内壁（細胞吸着領域）
１３２  内壁（細胞吸着領域）
２００  一細胞内核酸捕捉チップ
２０１  基板
２０２  一細胞捕捉孔
２０３  核酸捕捉孔
２０４  捕捉槽
２０５  磁性ビーズ
２０６  細孔シート
３０７  ストレプトアビジン
３０８  ビオチン
３０９  核酸捕捉用プローブ
４１０  ＰＣＲ増幅用共通配列
４１１  細胞認識用タグ配列
４１２  核酸捕捉配列
５００  一細胞内核酸捕捉デバイス
５０１  上部反応領域
５０２  吸引口
５０３  下部反応領域
５０４  内壁
６００  送液ユニット
６０１  試薬分注ユニット
６０２  温調ユニット
６０３  光学観察ユニット
６０４  移動ステージユニット
６０５  サンプル分注ユニット
６０６  吸引チューブ
６０７  試薬収容分注器
６０８  分注用加圧器
６０９  光源
６１０  集光レンズ
６１１  光学フィルタ
６１２  ダイクロイックミラー
６１３  対物レンズ
６１４  光学フィルタ
６１５  結像レンズ
６１６  ＣＣＤカメラ
６１７  サンプル分注器
６１８  分注用加圧器
６１９  分注カバー
６２０  上下駆動機構
６２１  突起
６２２  シリンジ
８２３  細胞懸濁液
８２４  細胞
【図１】
2018038285.tif 000003
【図２】
2018038285.tif 000004
【図３】
2018038285.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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