(57)【要約】      （修正有）【課題】植物、植物細胞、種子、および子孫植物における遺伝子発現の調節に有用な新規の組換えＤＮＡ分子およびコンストラクトを提供する。【解決手段】遺伝子が植物において除草剤抵抗性を付与する、また、遺伝子が植物において病虫害抵抗性を付与する為の異種性の転写可能ＤＮＡ分子に作動可能に連結されている組換えＤＮＡ分子コンストラクトを含む遺伝子導入植物、植物細胞、植物部位、種子、および子孫植物、並びにそれらを使用する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＤＮＡ分子であって、
ａ）配列番号１６〜１８のいずれかに対し少なくとも８５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
ｂ）配列番号１６〜１８のいずれかを含むＤＮＡ配列；並びに
ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１６〜１８のいずれかの断片
からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含み；
前記ＤＮＡ配列が異種性の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されている、
組換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
前記ＤＮＡ配列が配列番号１６〜１８のいずれかのＤＮＡ配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記ＤＮＡ配列が配列番号１６〜１８のいずれかのＤＮＡ配列に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記異種性の転写可能なＤＮＡ分子が農学において重要な遺伝子である、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】
前記農学において重要な遺伝子が植物において除草剤抵抗性を付与する、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６】
前記農学において重要な遺伝子が植物において病虫害抵抗性を付与する、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項７】
請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を含む、コンストラクト。
【請求項８】
遺伝子導入植物細胞であって、
ａ）配列番号１６〜１８のいずれかに対し少なくとも８５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
ｂ）配列番号１６〜１８のいずれかを含むＤＮＡ配列；並びに
ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１６〜１８のいずれかの断片
からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を含み；
前記ＤＮＡ配列が異種性の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されている、
遺伝子導入植物細胞。
【請求項９】
前記遺伝子導入植物細胞が単子葉の植物細胞である、請求項８に記載の遺伝子導入植物細胞。
【請求項１０】
前記遺伝子導入植物細胞が双子葉の植物細胞である、請求項８に記載の遺伝子導入植物細胞。
【請求項１１】
遺伝子導入植物、またはその部位であって、
ａ）配列番号１６〜１８のいずれかに対し少なくとも８５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；
ｂ）配列番号１６〜１８のいずれかを含むＤＮＡ配列；並びに
ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１６〜１８のいずれかの断片
からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を含み；
前記ＤＮＡ配列が異種性の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されている、
遺伝子導入植物、またはその部位。
【請求項１２】
子孫植物が前記組換えＤＮＡ分子を含む、請求項１１に記載の遺伝子導入植物の子孫植物。
【請求項１３】
種子が前記組換えＤＮＡ分子を含む、請求項１１に記載の遺伝子導入植物の遺伝子導入種子。
【請求項１４】
転写可能なＤＮＡ分子を発現させる方法であって、
転写可能なＤＮＡ分子が発現される、請求項１１に記載の遺伝子導入植物を得て、前記植物を栽培することを含む、
方法。
【請求項１５】
遺伝子導入植物を作製する方法であって、
ａ）植物細胞を請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換して形質転換植物細胞を作製すること；および
ｂ）形質転換植物細胞から遺伝子導入植物を再生すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２０１２年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／７３９，７２０号の利益を主張し、その仮特許出願の全体は本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
配列表の組込み
２０１３年１２月１７日に作成された、３４５ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定）の「ＭＯＮＳ３２３ＷＯｓｅｑ．ｔｘｔ」という名称のファイルに含まれる配列表は、電子提出により本明細書と共に出願され、本明細書に参照により組み込まれる。
【０００３】
本発明は、植物分子生物学分野、植物遺伝子工学分野、および植物における遺伝子発現の調節に有用なＤＮＡ分子に関する。
【背景技術】
【０００４】
調節エレメントは、作動可能に連結された転写可能な（ｔｒａｎｓｃｒｉｂａｂｌｅ）ＤＮＡ分子の転写を調節することにより遺伝子活性を制御する遺伝因子である。そのようなエレメントには、プロモーター、リーダー、エンハンサー、イントロン、および３’非翻訳領域が含まれ、これらは植物分子生物学分野および植物遺伝子工学分野において有用である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、調節エレメントを含む植物およびコンストラクトで用いるための新規の調節エレメントを提供する。本発明はまた、調節エレメントを含む遺伝子導入植物細胞、植物、植物部位、および種子を提供する。一実施形態では、本発明は、転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結された本明細書で開示される調節エレメントを提供する。ある実施形態では、転写可能なＤＮＡ分子は、本明細書で提供される調節エレメント配列に対し異種性である。本明細書で開示される調節エレメント、例えば、調節エレメントを含むコンストラクト、並びに調節エレメントに対し異種である転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結された調節エレメントを含む遺伝子導入植物、植物細胞、植物部位、および種子を作製および使用するための方法もまた本明細書で提供される。
【０００６】
従って、一態様において、本発明は、ａ）配列番号１〜９８および配列番号１６８〜１７１のいずれかに対し少なくとも約８５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；ｂ）配列番号１〜９８および配列番号１６８〜１７１のいずれかを含むＤＮＡ配列；並びにｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１〜９８および配列番号１６８〜１７１のいずれかの断片からなる群から選択される、異種性の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含む、組換えＤＮＡ分子を提供する。「異種性の転写可能なＤＮＡ分子」とは、転写可能なＤＮＡ分子がＤＮＡ配列に対し異種であることを意味する。特定の実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、配列番号１〜９８および配列番号１６８〜１７１のいずれかのＤＮＡ配列に対し少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、異種性の転写可能なＤＮＡ分子は、植物において除草剤抵抗性または病虫害抵抗性を付与することが可能な遺伝子等の、農学において重要な遺伝子を含む。さらに他の実施形態では、本発明は、本明細書で提供される組換えＤＮＡ分子を含むコンストラクトを提供する。
【０００７】
別の態様では、ａ）配列番号１〜９８および配列番号１６８〜１７１のいずれかに対し少なくとも約８５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；ｂ）配列番号１〜９８および配列番号１６８〜１７１のいずれかを含むＤＮＡ配列；並びにｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１〜９８および配列番号１６８〜１７１のいずれかの断片からなる群から選択される、異種性の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含む、組換えＤＮＡ分子を含む、遺伝子導入植物細胞が本明細書で提供される。ある実施形態では、遺伝子導入植物細胞は、単子葉の植物細胞である。他の実施形態では、遺伝子導入植物細胞は、双子葉の植物細胞である。
【０００８】
さらに別の態様では、ａ）配列番号１〜９８および配列番号１６８〜１７１のいずれかに対し少なくとも約８５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列；ｂ）配列番号１〜９８および配列番号１６８〜１７１のいずれかを含むＤＮＡ配列；並びにｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１〜９８および配列番号１６８〜１７１のいずれかの断片からなる群から選択される、異種性の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含む、組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子導入植物、またはその部位が本明細書においてさらに提供される。特定の実施形態では、遺伝子導入植物は、出発遺伝子導入植物に対し任意の世代である子孫植物であり、組換えＤＮＡ分子を含む。成長した場合にそのような遺伝子導入植物を生じる組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子導入種子も、本発明により提供される。
【０００９】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有する遺伝子導入植物を得て、植物を栽培することにより、遺伝子導入植物内で、農学において重要な遺伝子等の転写可能なＤＮＡ分子を発現する方法を提供する。
【００１０】
また、植物細胞を本発明の組換えＤＮＡ分子で形質転換して形質転換植物細胞を生み出し、形質転換植物細胞を再生して遺伝子導入植物を生み出すことにより、遺伝子導入植物を得る方法も本明細書で提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】カスミヌカボ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｎｅｂｕｌｏｓａ）由来のプロモーターエレメントに対応する、様々なサイズの複数のプロモーター変異体のアラインメントを示す。具体的には、図１は、調節性発現エレメント群（ＥＸＰ）ＥＸＰ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号１）内に含有される２００５塩基対（ｂｐ）プロモーターＰ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１−１：１：５（配列番号２）と、Ｐ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１−１：１：５のプロモーター変異体とのアラインメントを示している。例えば、Ｐ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１−１：１：５の５’末端の欠失は、ＥＸＰ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号５）内に含有される９９９ｂｐ配列のプロモーターＰ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１−１：１：４（配列番号６）を生じた。図１に示される別のプロモーター変異体は、ＥＸＰ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１：１：９（配列番号７）内に含有される７６２ｂｐ配列のＰ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１−１：１：６（配列番号８）である。
【図２】ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ）由来のプロモーターエレメントに対応する、様々なサイズの複数のプロモーター変異体のアラインメントを示す。具体的には、図２は、調節性発現エレメント群ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：４（配列番号９）内に含有される４１１４ｂｐのプロモーターＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１−１：１：４（配列番号１０）と、Ｐ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１−１：１：４のプロモーター変異体とのアラインメントを示している。アラインメントには、２０１２ｂｐプロモーターＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１−１：１：５（配列番号１４）；１０００ｂｐプロモーターＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１−１：１：６（配列番号１７）；および７５５ｂｐプロモーターＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１−１：１：８（配列番号２２）が含まれる。
【図３】ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ）由来のプロモーターエレメントに対応する、様々なサイズの複数のプロモーター変異体のアラインメントを示している。具体的には、図３は、２０３３ｂｐプロモーターＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ２−１：１：４（配列番号２４）と、Ｐ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ２−１：１：４のプロモーター変異体とのアラインメントを示している。アラインメントには、２００４ｂｐプロモーターＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ２−１：１：６（配列番号２８）；１００１ｂｐプロモーターＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ２−１：１：５（配列番号３１）；および６９６ｂｐプロモーターＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ２−１：１：７（配列番号３３）が含まれる。
【図４】メダカソウ（Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のプロモーターエレメントに対応する、様々なサイズの複数のプロモーター変異体のアラインメントを示している。具体的には、図４は、２３７１ｂｐプロモーターＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ１−１：１：２（配列番号３５）と、Ｐ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ１−１：１：２の５’末端のプロモーター変異体とのアラインメントを示している。アラインメントには、１９９９ｂｐプロモーターＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ１−１：１：３（配列番号３９）；１０２２ｂｐプロモーターＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ１−１：１：５（配列番号４２）；および７６０ｂｐプロモーターＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ１−１：１：６（配列番号４４）が含まれる。
【図５】メダカソウ（Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のプロモーターエレメントに対応する、様々なサイズの複数のプロモーター変異体のアラインメントを示している。具体的には、図５は、２１００ｂｐプロモーターエレメント、Ｐ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２−１：１：４（配列番号４６）と、Ｐ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２−１：１：４のプロモーター変異体とのアラインメントを示している。アラインメントには、２０４３ｂｐプロモーターＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２−１：１：７（配列番号５０）；２００２ｂｐプロモーターＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２−１：１：５（配列番号５３）；１０２４ｂｐプロモーターＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２−１：１：６（配列番号５６）；および７４９ｂｐプロモーターＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２−１：１：８（配列番号６１）が含まれる。
【図６】ススキ（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｓｉｎｅｓｉｓ）由来のプロモーターエレメントに対応する、様々なサイズの複数のプロモーター変異体のアラインメントを示している。具体的には、図６は、５３５９ｂｐプロモーターエレメント、Ｐ−ＭＩＳｓｉ．Ｕｂｑ１−１：１：２（配列番号６３）と、Ｐ−ＭＩＳｓｉ．Ｕｂｑ１−１：１：２のプロモーター変異体とのアラインメントを示している。アラインメントには、２４２３ｂｐプロモーターＰ−ＭＩＳｓｉ．Ｕｂｑ１−１：１：１１（配列番号６７）；１４４７ｂｐプロモーターＰ−ＭＩＳｓｉ．Ｕｂｑ１−１：１：１０（配列番号７１）；８９９ｂｐプロモーターＰ−ＭＩＳｓｉ．Ｕｂｑ１−１：１：１３（配列番号７３）；６９１ｂｐプロモーターＰ−ＭＩＳｓｉ．Ｕｂｑ１−１：１：１４（配列番号７５）；および５０６ｂｐプロモーターＰ−ＭＩＳｓｉ．Ｕｂｑ１−１：１：９（配列番号７７）が含まれる。
【図７】スキザクリウム・スコパリウム（Ｓｃｈｉｚａｃｈｙｉｕｍ  ｓｃｏｐａｒｉｕｍ）由来のプロモーターエレメントに対応する、様々なサイズの複数のプロモーター変異体のアラインメントを示している。具体的には、図７は、２８３１ｂｐプロモーターエレメント、Ｐ−ＳＣＨｓｃ．Ｕｂｑ１−１：１：１２（配列番号７９）と、Ｐ−ＳＣＨｓｃ．Ｕｂｑ１−１：１：１２とのプロモーター変異体とのアラインメントを示している。アラインメントには、２０３３ｂｐプロモーターＰ−ＳＣＨｓｃ．Ｕｂｑ１−１：１：１１（配列番号８３）；１０４６ｂｐプロモーターＰ−ＳＣＨｓｃ．Ｕｂｑ１−１：１：１０（配列番号８５）；および５４７ｂｐプロモーターＰ−ＳＣＨｓｃ．Ｕｂｑ１−１：１：１４（配列番号８７）が含まれる。
【図８】ソルガストラム・ヌタンス（Ｓｏｒｇｈａｓｔｒｕｍ  ｎｕｔａｎｓ）由来のプロモーターエレメントに対応する、様々なサイズの複数のプロモーター変異体のアラインメントを示している。具体的には、図８は、２２１８ｂｐプロモーターエレメント、Ｐ−ＳＯＲｎｕ．Ｕｂｑ１−１：１：４（配列番号８９）と、Ｐ−ＳＯＲｎｕ．Ｕｂｑ１−１：１：４のプロモーター変異体とのアラインメントを示している。アラインメントには、１９６４ｂｐプロモーターＰ−ＳＯＲｎｕ．Ｕｂｑ１−１：１：５（配列番号９３）；１０２３ｂｐプロモーターＰ−ＳＯＲｎｕ．Ｕｂｑ１−１：１：６（配列番号９６）；および７２４ｂｐプロモーターＰ−ＳＯＲｎｕ．Ｕｂｑ１−１：１：７（配列番号９８）が含まれる。
【図９】本発明の発現カセットの配置を示している。
【００１２】
配列の簡潔な説明
配列番号：１、５、７、９、１３、１６、１８、１９、２１、２３、２７、３０、３２、３４、３８、４１、４３、４５、４９、５２、５５、５８、６０、６２、６６、７０、７２、７４、７６、７８、８２、８４、８６、８８、９２、９５、９７、９９、１０３、１０６、１０８、１１０、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２６、１２８、１３２、１３４、１３８、１４０、１４４、１４８、１５０および１６８は、イントロン配列に作動可能に５’連結されたリーダー配列に作動可能に５’連結されたプロモーター配列を含む調節性発現エレメント群（ＥＸＰ）のＤＮＡ配列である。
【００１３】
配列番号：２、６、８、１０、１４、１７、２２、２４、２８、３１、３３、３５、３９、４２、４４、４６、５０、５３、５６、６１、６３、６７、７１、７３、７５、７７、７９、８３、８５、８７、８９、９３、９６、９８、１００、１０４、１０７、１０９、１１１、１１７、１１９、１２１、１２３、１２９、１３５、１４１、１４５、１５１および１６９はプロモーター配列である。
【００１４】
配列番号：３、１１、２５、３６、４７、６４、６８、８０、９０、１０１、１１２、１２４、１３０、１３６、１４２、１４６、１５２および１７０はリーダー配列である。
【００１５】
配列番号：４、１２、１５、２０、２６、２９、３７、４０、４８、５１、５４、５７、５９、６５、６９、８１、９１、９４、１０２、１０５、１１３、１１５、１２５、１２７、１３１、１３３、１３７、１３９、１４３、１４７、１４９、１５３および１７１はイントロン配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、植物において遺伝子調節活性を有するＤＮＡ分子を提供する。これらのＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は、配列番号１〜９８および配列番号１６８〜１７１として提供される。これらのＤＮＡ分子は、例えば、植物組織における作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現に影響を与え、その結果、遺伝子導入植物における作動可能に連結された導入遺伝子の遺伝子発現を制御することを可能にする。本発明はまた、ＤＮＡを調節、作製、および使用する方法を提供する。本発明はまた、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有する遺伝子導入植物細胞、植物、植物部位、および種子を含む組成物、並びにそれを調製および使用するための方法を提供する。
【００１７】
以下の定義および方法は、本発明をより正確に定義し、本発明の実施において当業者を導くために提供される。特に記載がない限り、用語は当業者による慣例的用法に従って理解されるものとする。
【００１８】
ＤＮＡ分子
本明細書で使用される場合、用語「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」とは、細胞起源または合成起源の二重鎖ＤＮＡ分子、すなわち、デオキシリボヌクレオチド塩基の重合体を指す。本明細書で使用される場合、用語「ＤＮＡ配列」とは、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される命名法は、連邦規則集第３７巻§１．８２２による、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９９８）における表、付録２、表１および表３に記載される命名法に一致する。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「組換えＤＮＡ分子」は、人の介在無しには同時に自然発生しないであろうＤＮＡ分子の組み合わせを含むＤＮＡ分子である。例えば、組換えＤＮＡ分子は、互いに異種性の少なくとも２つのＤＮＡ分子で構成されるＤＮＡ分子、天然に存在するＤＮＡ配列から逸脱したＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、または遺伝子形質転換により宿主細胞のＤＮＡ内に組み込まれたＤＮＡ分子であり得る。
【００２０】
本明細書で使用される場合、用語「配列同一性」とは、２本の最適に整列されたＤＮＡ配列がどの程度まで同一であるかを指す。最適な配列アラインメントは、適切な内部ヌクレオチドの挿入、欠失、またはギャップを伴って、２本のＤＮＡ配列（例えば、参照配列および別のＤＮＡ配列）を手動で整列させて、配列アラインメント内のヌクレオチド一致の数を最大にすることによって作成される。本明細書で使用される場合、用語「参照配列」とは、配列番号１〜９８および配列番号１６８〜１７１として提供されるＤＮＡ配列を指す。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「パーセント配列同一性」または「パーセント同一性」または「％同一性」とは、同一性分率に１００を乗じたものである。参照配列と最適に整列されたＤＮＡ配列の「同一性分率」は、最適なアラインメント内でのヌクレオチド一致の数を、参照配列内のヌクレオチドの総数（例えば、完全長の参照配列全体内のヌクレオチドの総数）で除算したものである。従って、本発明の一実施形態は、配列番号１〜９８および配列番号１６８〜１７１として本明細書で提供される参照配列に対し最適に整列された場合に、参照配列に対し、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約８６％の同一性、少なくとも約８７％の同一性、少なくとも約８８％の同一性、少なくとも約８９％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、または少なくとも約１００％の同一性を有する、ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を提供する。
【００２２】
調節エレメント
プロモーター、リーダー、エンハンサー、イントロン、および転写終結領域（または３’ＵＴＲ）等の調節エレメントは、生細胞における遺伝子の全体的な発現において不可欠の役割を果たす。本明細書で使用される用語「調節エレメント」は、遺伝子調節活性を有するＤＮＡ分子を指す。本明細書で使用される用語「遺伝子調節活性」は、例えば、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写および／または翻訳に影響を与えることにより、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現に影響を与える能力を指す。植物において機能するプロモーター、リーダー、エンハンサー、およびイントロン等の調節エレメントは、従って、遺伝子工学による植物の表現型の調節に有用である。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「調節性発現エレメント群」または「ＥＸＰ」配列は、エンハンサー、プロモーター、リーダー、およびイントロン等の作動可能に連結された調節エレメントの群を指し得る。従って、調節性発現エレメント群は、例えば、イントロン配列に作動可能に５’連結された、リーダー配列に作動可能に５’連結されたプロモーターから構成され得る。
【００２４】
調節エレメントは、それらの遺伝子発現パターン、例えば、恒常的発現または時間、空間、発生、組織、環境、生理、病態、細胞周期、および／もしくは化学応答性の発現、並びにこれらの組み合わせ等の正および／または負の効果によって、並びに量的または質的な指標によって、特徴付けされ得る。本明細書で使用される場合、「遺伝子発現パターン」は、作動可能に連結されたＤＮＡ分子の、転写ＲＮＡ分子への、あらゆるパターンの転写である。転写ＲＮＡ分子は、翻訳されて、タンパク質分子を生成し得るか、またはアンチセンスＲＮＡ、もしくは二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等の他の調節ＲＮＡ分子を与え得る。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質発現」は、転写ＲＮＡ分子の、タンパク質分子への、あらゆるパターンの翻訳である。タンパク質発現は、その時間的、空間的、発生的、または形態学的な質によって、並びに量的または質的な指標によって特徴付けられ得る。
【００２６】
プロモーターは、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調節するための調節エレメントとして有用である。本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」は、一般的に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、および転写を開始するためのトランス作動性転写因子等の他のタンパク質の、認識および結合に関与するＤＮＡ分子を指す。プロモーターは、遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に由来し得る。交互に（Ａｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ）、プロモーターは、合成的に作製されたまたは操作されたＤＮＡ分子であり得る。プロモーターはまた、キメラであり得る。キメラプロモーターは、２つ以上の異種ＤＮＡ分子の融合によって作製される。本発明の実施において有用なプロモーターには、配列番号：２、６、８、１０、１４、１７、２２、２４、２８、３１、３３、３５、３９、４２、４４、４６、５０、５３、５６、６１、６３、６７、７１、７３、７５、７７、７９、８３、８５、８７、８９、９３、９６、９８および１６９が含まれ、その断片または変異体も含まれる。本発明の特定の実施形態では、本明細書に記載の、そのようなＤＮＡ分子およびそのあらゆる変異体または誘導体は、さらに、プロモーター活性を含む、すなわち、遺伝子導入植物等の宿主細胞内でプロモーターとして作動可能であるものとして定義される。さらに特定の実施形態では、断片は、それが由来する出発プロモーター分子に所有されるプロモーター活性を示すものとして定義され得、あるいは、断片は、基底レベルの転写を与え、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体を認識および結合するためのＴＡＴＡボックスまたは等価なＤＮＡ配列で構成される、「最小プロモーター」を含み得る。
【００２７】
一実施形態では、本明細書で開示されるプロモーター配列の断片が提供される。プロモーター断片は、上記のプロモーター活性を含み得、単独または、キメラプロモーターの構築等における他のプロモーターおよびプロモーター断片との組み合わせにおいて、有用であり得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるプロモーター活性を有するＤＮＡ分子の、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２２５、少なくとも約２５０、少なくとも約２７５、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約９００、もしくは少なくとも約１０００個の連続ヌクレオチドまたはより長い連続ヌクレオチドを含む、プロモーターの断片が提供される。出発プロモーター分子からそのような断片を作製する方法は、当該技術分野において周知である。
【００２８】
例えば内部欠失または５’欠失等の、配列番号：２、６、８、１０、１４、１７、２２、２４、２８、３１、３３、３５、３９、４２、４４、４６、５０、５３、５６、６１、６３、６７、７１、７３、７５、７７、７９、８３、８５、８７、８９、９３、９６、９８および１６９として提供されるプロモーターのいずれかに由来する成分を、例えば、発現に対し正もしくは負の効果を有するエレメントを除去する；発現に対し正もしくは負の効果を有するエレメントを重複させる；および／または発現に対し組織特異的もしくは細胞特異的な効果を有するエレメントを重複もしくは除去することにより、当該技術分野において周知の方法を用いて作製することで、発現を向上または変化させることができる。ＴＡＴＡボックスエレメントまたはその等価なＤＮＡ配列および下流配列が除去された３’欠失で構成される、配列番号：２、６、８、１０、１４、１７、２２、２４、２８、３１、３３、３５、３９、４２、４４、４６、５０、５３、５６、６１、６３、６７、７１、７３、７５、７７、７９、８３、８５、８７、８９、９３、９６、９８および１６９として提供されるプロモーターのいずれかに由来する成分を用いることで、例えば、エンハンサーエレメントを作製することができる。さらなる欠失をつくることで、発現に対し正もしくは負の；組織特異的な；細胞特異的な；または時期特異的な（例えば、限定はされないが、概日リズム）効果を有するあらゆるエレメントを除去することができる。配列番号：２、６、８、１０、１４、１７、２２、２４、２８、３１、３３、３５、３９、４２、４４、４６、５０、５３、５６、６１、６３、６７、７１、７３、７５、７７、７９、８３、８５、８７、８９、９３、９６、９８および１６９として提供されるプロモーターのいずれか、並びにそれに由来する断片またはエンハンサーを用いることで、配列番号：２、６、８、１０、１４、１７、２２、２４、２８、３１、３３、３５、３９、４２、４４、４６、５０、５３、５６、６１、６３、６７、７１、７３、７５、７７、７９、８３、８５、８７、８９、９３、９６、９８および１６９として提供されるプロモーターのいずれか、並びに他のエンハンサーおよびプロモーターに作動可能に連結されたそれに由来する断片またはエンハンサーで構成されるキメラ調節エレメント成分を作製することができる。
【００２９】
本発明によれば、プロモーターまたはプロモーター断片は、ＴＡＴＡボックスおよび他の既知の転写因子結合部位モチーフ等の既知のプロモーターエレメント、すなわち、ＤＮＡ配列特徴の存在について解析され得る。そのような既知のプロモーターエレメントの同定は、元のプロモーターに似た発現パターンを有するプロモーターの変異体を設計するために、当業者により用いられ得る。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「リーダー」とは、遺伝子の非翻訳５’領域（５’ＵＴＲ）に由来し、転写開始部位（ＴＳＳ）およびタンパク質コード配列開始部位の間のＤＮＡセグメントとして一般的に定義される、ＤＮＡ分子を指す。交互に（Ａｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ）、リーダーは、合成的に作製された、または操作されたＤＮＡエレメントであり得る。リーダーは、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調節するための５’調節エレメントとして用いることができる。リーダー分子は、異種プロモーターと、またはそれらの元のプロモーターと一緒に用いられ得る。従って、本発明のプロモーター分子は、それらの元のリーダーに作動可能に連結され得、または、異種リーダーに作動可能に連結され得る。本発明の実施に有用なリーダーには、配列番号：３、１１、２５、３６、４７、６４、６８、８０、９０および１７０またはその断片もしくは変異体が含まれる。特定の実施形態では、そのようなＤＮＡ配列は、宿主細胞（例えば、遺伝子導入植物細胞）内でリーダーとして機能することが可能であると定義され得る。一実施形態では、そのようなＤＮＡ配列は、リーダー活性を含むものと解読され得る。
【００３１】
配列番号：３、１１、２５、３６、４７、６４、６８、８０、９０および１７０として提供されるリーダー配列（５’ＵＴＲ）は、調節エレメントから構成され得、または、作動可能に連結されたＤＮＡ分子の転写もしくは翻訳に影響を与え得る二次構造をとり得る。配列番号：３、１１、２５、３６、４７、６４、６８、８０、９０および１７０として提供されるリーダー配列を本発明に従って用いることで、作動可能に連結されたＤＮＡ分子の転写または翻訳に影響を与えるキメラ調節エレメントを作製することができる。さらに、配列番号：３、１１、２５、３６、４７、６４、６８、８０、９０および１７０として提供されるリーダー配列を用いることで、作動可能に連結されたＤＮＡ分子の転写または翻訳に影響を与えるキメラリーダー配列を作製することができる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「イントロン」とは、遺伝子のゲノムコピーから単離または同定され得、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳前プロセシングの間にスプライシングされる領域として一般的に定義され得る、ＤＮＡ分子を指す。交互に（Ａｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ）、イントロンは、合成的に作製された、または操作されたＤＮＡエレメントであり得る。イントロンは、作動可能に連結された遺伝子の転写に影響を与えるエンハンサーエレメントを含有し得る。イントロンは、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調節するための調節エレメントとして用いられ得る。コンストラクトはイントロンを含んでいてもよく、イントロンは、転写可能なＤＮＡ分子に対し異種であっても異種でなくてもよい。当該技術分野におけるイントロンの例としては、イネアクチンイントロンおよびトウモロコシＨＳＰ７０イントロンが挙げられる。
【００３３】
植物では、コンストラクト内にいくつかのイントロンを含むことにより、イントロンを欠くコンストラクトと比較して、ｍＲＮＡおよびタンパク質の蓄積の増加がもたらされる。この作用は、遺伝子発現の「イントロン媒介増強」（ｉｎｔｒｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：ＩＭＥ）と名付けられている。植物において発現を刺激することが知られているイントロンが、トウモロコシ遺伝子（例えば、ｔｕｂＡ１、Ａｄｈ１、Ｓｈ１、およびＵｂｉ１）内で、イネ遺伝子（例えば、ｔｐｉ）内で、並びにペチュニア（例えば、ｒｂｃＳ）、ジャガイモ（例えば、ｓｔ−ｌｓ１）およびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（例えば、ｕｂｑ３およびｐａｔ１）由来のもののような双子葉類植物遺伝子内で、同定されている。イントロンのスプライス部位内の欠失または変異は遺伝子発現を低減させることが示されており、これは、スプライシングがＩＭＥに必要であり得ることを示している。しかし、双子葉類植物におけるＩＭＥがシロイヌナズナ（Ａ．  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のｐａｔ１遺伝子のスプライス部位内の点変異により示されているため、スプライシングそれ自体は必要ではない。１個の植物における同一のイントロンの多重使用は、不利益を示すことが示されている。それらの場合、適切な組換えＤＮＡエレメントを構築するための基本的な調節領域の集合を有することが必要である。
【００３４】
本発明の実施において有用なイントロンには、配列番号：４、１２、１５、２０、２６、２９、３７、４０、４８、５１、５４、５７、５９、６５、６９、８１、９１、９４および１７１が含まれる。配列番号：４、１２、１５、２０、２６、２９、３７、４０、４８、５１、５４、５７、５９、６５、６９、８１、９１、９４および１７１として提供されるイントロンのいずれかに由来する成分は、シス調節エレメントの内部欠失もしくは重複を含み得；並びに／または、イントロン／エクソンスプライスジャンクションを含む５’ＤＮＡ配列および３’ＤＮＡ配列の変化を用いることで、プロモーター＋リーダーもしくはキメラプロモーター＋リーダーおよびコード配列に作動可能に連結された場合に、発現もしくは発現の特異性を向上させることができる。イントロン／エクソン境界配列を調節する際、メッセンジャーＲＮＡの最終転写物へのプロセシングの間に望まれない開始コドンが形成される可能性を排除するために、スプライス部位（ＧＴ）の５’末端の直前でのヌクレオチド配列ＡＴまたはヌクレオチドＡの使用、およびスプライス部位（ＡＧ）の３’末端のそれぞれ直後でのヌクレオチドＧまたはヌクレオチド配列ＴＧの使用を避けることは、有益であり得る。イントロンの５’または３’末端スプライスジャンクション部位の周囲のＤＮＡ配列は、従って、このように調節され得る。イントロン、並びに本明細書に記載されるように、および当該技術分野において公知の方法によって変化されたイントロン変異体を、実施例に記載されるように、実験に基づいて試験することで、作動可能に連結されたＤＮＡ分子の発現に対するイントロンの影響を決定することができる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「３’転写終結分子」、「３’非翻訳領域」または「３’ＵＴＲ」は、本明細書において、ｍＲＮＡ分子の３’部位の非翻訳領域への転写の間に用いられるＤＮＡ分子を指す。ｍＲＮＡ分子の３’非翻訳領域は、特異的な切断および３’ポリアデニル化（ポリＡ尾部としても知られている）によって生じ得る。３’ＵＴＲは、転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結され、転写可能なＤＮＡ分子の下流に位置し得、ポリアデニル化シグナルおよび転写、ｍＲＮＡプロセシング、または遺伝子発現に影響を与えることが可能な他の制御シグナルを含み得る。ポリＡ尾部は、ｍＲＮＡの安定性および翻訳の開始において機能すると考えられている。当該技術分野における３’転写終結分子の例は、ノパリンシンターゼ３’領域；コムギｈｓｐ１７  ３’領域、エンドウマメルビスコ小サブユニット３’領域、ワタＥ６  ３’領域、およびコイキン（ｃｏｉｘｉｎ）３’ＵＴＲである。
【００３６】
３’ＵＴＲは、典型的には、特定のＤＮＡ分子の組換え発現において有益な用途が見出されている。弱い３’ＵＴＲはリードスルーを生じる可能性があり、このリードスルーは、隣接する発現カセット内に位置するＤＮＡ分子の発現に影響を与え得る。転写終結を適切に調節することによって、下流に位置するＤＮＡ配列（例えば、他の発現カセット）へのリードスルーを阻止することができ、さらに、ＲＮＡポリメラーゼの効率的な再利用を可能にして遺伝子発現を向上させることができる。効率的な転写の終結（ＤＮＡからのＲＮＡポリメラーゼＩＩの放出）は、転写の再開に前もって必要であり、それ故、転写レベル全体に直接的に影響を与える。転写終結の後、成熟ｍＲＮＡは合成部位から放出され、鋳型は細胞質に運ばれる。真核生物ｍＲＮＡはインビボにおいてポリ（Ａ）形態として蓄積されるが、これが、常法による転写終結部位の検出を困難にしている。しかし、バイオインフォマティクス法による機能的且つ効率的な３’ＵＴＲの予測は、効率的な３’ＵＴＲの容易な予測を可能にするであろう保存されたＤＮＡ配列が存在しないために、困難である。
【００３７】
実用的な見地から、発現カセット内に用いられる３’ＵＴＲが以下の特徴を有することは、概して有益である。３’ＵＴＲは、効率的且つ効果的に導入遺伝子の転写を終結し、１個のトランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）内に複数の発現カセットが存在する場合のように、別の発現カセットを含み得るいかなる隣接ＤＮＡ配列、またはＴ−ＤＮＡが挿入されている隣接する染色体ＤＮＡへの転写物のリードスルーを阻止することが可能であるべきである。３’ＵＴＲは、ＤＮＡ分子の発現を駆動するために用いられるプロモーター、リーダー、エンハンサー、およびイントロンによって付与される転写活性の低減を引き起こすべきではない。植物バイオテクノロジーでは、３’ＵＴＲはしばしば、形質転換植物から抽出された逆転写されたＲＮＡの増幅反応を刺激するために用いられ、（１）植物染色体に組み込まれた後の発現カセットの転写活性または発現を評価するため；（２）植物ＤＮＡ内の挿入のコピー数を評価するため；および（３）育種後に得られた種子の接合状態を評価するために、用いられる。３’ＵＴＲはまた、挿入されたカセットの完全性を特徴付けするための、形質転換植物から抽出されたＤＮＡの増幅反応にも用いられる。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「エンハンサー」または「エンハンサーエレメント」とは、シス作動性調節エレメント（別名シスエレメント）を指し、これは、発現パターン全体の一側面を与えるが、通常、単独では、作動可能に連結されたＤＮＡ配列の転写を駆動するのに不充分である。プロモーターと異なり、エンハンサーエレメントは通常、転写開始部位（ＴＳＳ）もＴＡＴＡボックスも等価なＤＮＡ配列を含まない。プロモーターまたはプロモーター断片は、作動可能に連結されたＤＮＡ配列の転写に影響を与える一つまたは複数のエンハンサーエレメントを天然に含み得る。エンハンサーエレメントは、キメラプロモーターシスエレメントを作製するためにプロモーターに融合される場合があり、これは、遺伝子発現の調節全体の一側面を与える。
【００３９】
多くのプロモーターエンハンサーエレメントは、ＤＮＡ結合タンパク質と結合し、および／または、ＤＮＡトポロジーに影響を与えることで、ＲＮＡポリメラーゼの鋳型ＤＮＡへの接近を選択的に可能にするもしくは制限する、または転写開始部位での二重らせんの選択的な開口を促進する、局所的な高次構造を生み出すと考えられている。エンハンサーエレメントは、転写を制御する転写因子と結合する働きをし得る。いくつかのエンハンサーエレメントは２つ以上の転写因子と結合し、転写因子は、２つ以上のエンハンサードメインと、異なる結合性をもって相互作用し得る。エンハンサーエレメントは、いくつかの手法によって同定することができ、例えば、欠失解析（すなわち、５’末端から、またはプロモーターに対し内部の一つまたは複数のヌクレオチドを欠失させる）；デオキシリボヌクレアーゼＩフットプリント法、メチル化干渉法、電気泳動移動度シフトアッセイ、ライゲーションを介したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるインビボゲノムフットプリント法、および他の従来のアッセイを用いるＤＮＡ結合タンパク質解析；またはＢＬＡＳＴ等の従来のＤＮＡ配列比較法を用いる、既知のシスエレメントモチーフもしくはエンハンサーエレメントを標的配列もしくは標的モチーフとして用いるＤＮＡ配列類似性解析が挙げられる。エンハンサードメインの微細構造は、一つまたは複数のヌクレオチドの変異誘発（または置換）によって、または当該技術分野において既知の他の常法によって、さらに研究することができる。エンハンサーエレメントは、化学合成によって、またはそのようなエレメントを含む調節エレメントからの単離によって得ることができ、エンハンサーエレメントは、後の操作を容易にするために有用な制限酵素部位を含有する追加の隣接ヌクレオチドを伴って合成することができる。従って、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調節するための本明細書で開示される方法による、エンハンサーエレメントの設計、構築、および使用は、本発明に包含される。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「キメラ」とは、第一のＤＮＡ分子を第二のＤＮＡ分子に融合することにより作製された、第一ＤＮＡ分子も第二ＤＮＡ分子もその立体配置で通常は含有されていない、すなわち、互いに融合していないであろう、単一のＤＮＡ分子を指す。キメラＤＮＡ分子は、従って、天然において他に通常は含有されない、新規のＤＮＡ分子である。本明細書で使用される場合、用語「キメラプロモーター」は、ＤＮＡ分子のそのような操作によって作製されたプロモーターを指す。キメラプロモーターは、２つ以上のＤＮＡ断片を組み合わせてもよく、例えば、プロモーターとエンハンサーエレメントとの融合物であってもよい。従って、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調節するための本明細書で開示される方法によるキメラプロモーターの設計、構築、および使用は、本発明に包含される。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「変異体」とは、第一のＤＮＡ分子と、組成においては類似しているが、同一でない、第二のＤＮＡ分子（例えば、調節エレメント）を指し、ここで、第二のＤＮＡ分子は、第一のＤＮＡ分子の、通常の機能性、すなわち、例えばより高いまたはより低いまたは等しい転写活性または翻訳活性を介した、同一または類似の発現パターンをなお維持している。変異体は、第一のＤＮＡ分子の短縮型もしくは切断型であり得、並びに／または、異なる制限酵素部位および／もしくは内部欠失、置換、および／もしくは挿入を有するＤＮＡ配列等の第一ＤＮＡ分子のＤＮＡ配列の変化型であり得る。調節エレメントの「変異体」は、細菌および植物細胞の形質転換の間にまたはその結果として起こる変異から生じる変異体も包含する。本発明では、配列番号１〜９８および配列番号１６８〜１７１として提供されるＤＮＡ配列を用いることで、元の調節エレメントのＤＮＡ配列と、組成においては類似しているが、同一ではなく、一方で、元の調節エレメントの通常の機能性、すなわち、同一または類似の発現パターンをなお維持している、変異体が作製され得る。本発明のそのような変異体の作製は、本開示に照らし合わせて、当該技術分野の通常の技量の十分に範囲内であり、本発明の範囲内に包含される。
【００４２】
キメラ調節エレメントは、制限酵素消化およびライゲーション、ライゲーション非依存的クローニング、増幅中のＰＣＲ産物のモジュール構築、または調節エレメントの直接的な化学合成、並びに当該技術分野において公知の他の方法等の、当該技術分野において公知の種々の方法によって作動可能に連結され得る、種々の構成エレメントを含むように設計することができる。得られた種々のキメラ調節エレメントは、同一の構成エレメント、またはその変異体から構成され得るが、構成部分が作動可能に連結されることを可能にする一つまたは複数の隣接ＤＮＡ配列を含む一つまたは複数のＤＮＡ配列において異なっている。本発明では、配列番号１〜９８および配列番号１６８〜１７１として提供されるＤＮＡ配列は、調節エレメント参照配列を提供し得、参照配列を含む構成エレメントは、当該技術分野において公知の方法によって連結され得、一つもしくは複数のヌクレオチドの置換、欠失、および／もしくは挿入、または細菌および植物細胞の形質転換において天然に発生する変異を含み得る。
【００４３】
特定の導入遺伝子の所望の発現態様に対する本明細書に記載の改変、重複、または欠失の有効性は、本明細書の実施例に記載されるアッセイ等の安定且つ一過的な植物アッセイにおいて、結果を確認するために実験的に試験され得、これは、出発ＤＮＡ分子における成された変化および変化の目的に応じて変動し得る。
【００４４】
コンストラクト
本明細書で使用される場合、用語「コンストラクト」は、あらゆる供給源に由来する、ゲノムの組込みまたは自律増殖が可能である、少なくとも１つのＤＮＡ分子が機能的に作動するように別のＤＮＡ分子に連結されている（すなわち、作動可能に連結されている）ＤＮＡ分子を含む、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ、または直鎖もしくは環状のＤＮＡまたはＲＮＡ分子等の、あらゆる組換えＤＮＡ分子を意味する。本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、形質転換、すなわち、宿主細胞への異種のＤＮＡまたはＲＮＡの導入を目的として用いられ得る、あらゆるコンストラクトを意味する。コンストラクトは、典型的には、一つまたは複数の発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、一つまたは複数の調節エレメント、典型的には少なくとも１つのプロモーターおよび３’ＵＴＲに作動可能に連結された少なくとも１つの転写可能なＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子を指す。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結された」とは、第一のＤＮＡ分子が第二のＤＮＡ分子に連結されていることを指し、ここで、第一および第二のＤＮＡ分子は、第一のＤＮＡ分子が第二のＤＮＡ分子の機能に影響を与えるように配置されている。２つのＤＮＡ分子は、単一の連続ＤＮＡ分子の一部であってもそうでなくてもよく、隣接していてもしていなくてもよい。例えば、プロモーターは、そのプロモーターが細胞における目的の転写可能なＤＮＡ分子の転写を調節するならば、転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されている。例えば、リーダーは、ＤＮＡ配列の転写または翻訳に影響を与えることが可能である場合、ＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。
【００４６】
本発明のコンストラクトは、一実施形態では、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞によって与えられるトランスファー分子と共に、植物細胞のゲノムへのＴ−ＤＮＡの組込みを可能にする、Ｔ−ＤＮＡを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）から単離されたＴｉプラスミドの右側境界領域（ＲＢまたはＡＧＲｔｕ．ＲＢ）および左側境界領域（ＬＢまたはＡＧＲｔｕ．ＬＢ）を有する、二重腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミド境界コンストラクトとして提供され得る（例えば、米国特許第６，６０３，０６１号を参照）。コンストラクトは、細菌細胞における複製機能および抗生物質選択を与えるプラスミド骨格ＤＮＡセグメント、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）複製開始点（例えば、ｏｒｉ３２２）、広域宿主複製開始点（例えば、ｏｒｉＶまたはｏｒｉＲｉ）、およびスペクチノマイシンもしくはストレプトマイシンに対する抵抗性を与えるＴｎ７アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）をコードする選択マーカー（例えば、Ｓｐｅｃ／Ｓｔｒｐ）、またはゲンタマイシン（Ｇｍ、Ｇｅｎｔ）選択マーカー遺伝子のコード領域を含有し得る。植物の形質転換において、宿主菌株は多くの場合、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＢＩ、Ｃ５８、またはＬＢＡ４４０４であるが；植物形質転換の当業者に公知の他の菌株は本発明において機能することができる。
【００４７】
転写可能なＤＮＡ分子が、タンパク質として翻訳され発現される機能的ｍＲＮＡ分子に転写されるように、コンストラクトを構築し細胞に導入する方法は、当該技術分野において公知である。本発明の実施において、コンストラクトおよび宿主細胞を調製および使用するための従来の組成および方法は、当業者に周知である。高等植物における核酸の発現に有用な典型的なベクターは、当該技術分野において周知であり、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミド由来のベクターおよびｐＣａＭＶＣＮトランスファーコントロールベクターが含まれる。
【００４８】
本明細書で提供されるいずれの調節エレメントをも含む種々の調節エレメントが、コンストラクト内に含まれ得る。そのような調節エレメントはいずれも、他の調節エレメントとの組み合わせで提供され得る。そのような組み合わせは、所望の制御特徴を生み出すように設計または改変することができる。一実施形態では、本発明のコンストラクトは、３’ＵＴＲに作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結された少なくとも１つの調節エレメントを含む。
【００４９】
本発明のコンストラクトは、本明細書で提供される、または当該技術分野において公知の、いかなるプロモーターまたはリーダーを含んでいてもよい。例えば、本発明のプロモーターは、異種の非翻訳５’リーダー（例えば、熱ショックタンパク質遺伝子由来のもの）に作動可能に連結されていてもよい。あるいは、本発明のリーダーは、異種プロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写物プロモーター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ））に作動可能に連結されていてもよい。
【００５０】
発現カセットは、特に、葉緑体、白色体、もしくは他の色素体細胞小器官；ミトコンドリア；ペルオキシソーム；液胞；または細胞外部位に対する、作動可能に連結されたタンパク質の細胞内標的化に有用であるペプチドをコードする輸送ペプチドコード配列も含み得る。多くの葉緑体局在タンパク質は、核遺伝子から前駆物質として発現され、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）によって葉緑体に標的化される。そのような単離葉緑体タンパク質の例としては、限定はされないが、リブロース−１，５，−二リン酸カルボキシラーゼ、フェレドキシン、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、光収穫複合体タンパク質Ｉおよびタンパク質ＩＩ、チオレドキシンＦ、並びにエノールピルビルシキミ酸リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）の小サブユニット（ＳＳＵ）を伴う単離葉緑体タンパク質が挙げられる。葉緑体輸送ペプチドは、例えば、米国特許第７，１９３，１３３号に記載されている。非葉緑体タンパク質は、非葉緑体タンパク質をコードする導入遺伝子に作動可能に連結された異種ＣＴＰの発現によって、葉緑体に標的化され得ることが示されている。
【００５１】
転写可能なＤＮＡ分子
本明細書で使用される場合、用語「転写可能なＤＮＡ分子」は、タンパク質コード配列を有するＤＮＡ分子および遺伝子抑制に有用な配列を有するＲＮＡ分子を生み出すＤＮＡ分子を含むがこれらに限定されない、ＲＮＡ分子に転写可能なあらゆるＤＮＡ分子を指す。ＤＮＡ分子の種類には、限定はされないが、同一植物由来のＤＮＡ分子、別の植物由来のＤＮＡ分子、異なる生物由来のＤＮＡ分子、または遺伝子のアンチセンスメッセージを含有するＤＮＡ分子、もしくは人工、合成、もしくは他の改変型の導入遺伝子をコードするＤＮＡ分子等の合成ＤＮＡ分子が含まれ得る。本発明のコンストラクト内への組込みのための例示的な転写可能なＤＮＡ分子には、例えば、ＤＮＡ分子が組み込まれる種以外の種に由来するＤＮＡ分子もしくは遺伝子、または同一種に由来するもしくは同一種に存在するが、古典的な育種技術ではなく遺伝子工学的手法によって受容細胞に組み込まれる遺伝子が含まれる。
【００５２】
「導入遺伝子」とは、少なくとも宿主細胞ゲノム内でのその場所に関して宿主細胞に対し異種である転写可能なＤＮＡ分子、および／または現世代もしくは任意の前世代の細胞内の宿主細胞ゲノムに人工的に組み込まれた転写可能なＤＮＡ分子を指す。
【００５３】
本発明の、プロモーター等の調節エレメントは、調節エレメントに対し異種である転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。本明細書で使用される場合、用語「異種の」とは、２つ以上のＤＮＡ分子の組み合わせにおいて、そのような組み合わせが天然には通常存在しない場合を指す。例えば、２つのＤＮＡ分子は、異なる種由来であり得、および／または、２つのＤＮＡ分子は、異なる遺伝子（例えば、同一種由来の異なる遺伝子もしくは異なる種由来の同一遺伝子）由来であり得る。従って、調節エレメントは、そのような組み合わせが天然に通常存在しない場合（すなわち、調節エレメントに作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子が自然に生じない場合）、作動可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子に対して異種である。
【００５４】
転写可能なＤＮＡ分子は、一般的に、その転写物の発現が望まれるあらゆるＤＮＡ分子であり得る。そのような転写物の発現は、得られたｍＲＮＡ分子の翻訳、ひいてはタンパク質発現をもたらし得る。あるいは、例えば、転写可能なＤＮＡ分子は、特定の遺伝子またはタンパク質の発現減少を最終的に引き起こすように設計され得る。一実施形態では、これは、アンチセンス方向に配向された転写可能なＤＮＡ分子を用いることにより達成され得る。当業者はそのようなアンチセンス技術の使用を熟知している。いかなる遺伝子もこのように負に調節され得、一実施形態では、転写可能なＤＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子の発現による特定の遺伝子の抑制を目的に設計され得る。
【００５５】
従って、本発明の一実施形態は、コンストラクトが遺伝子導入植物細胞のゲノムに組み込まれた場合に、転写可能なＤＮＡ分子の転写を所望のレベルにまたは所望のパターンに調節するために、異種性の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結された、配列番号１〜９８および配列番号１６８〜１７１として提供される組換えＤＮＡ分子等の、本発明の調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子である。一実施形態では、転写可能なＤＮＡ分子は遺伝子のタンパク質コード領域を含み、別の実施形態では、転写可能なＤＮＡ分子は遺伝子のアンチセンス領域を含む。
【００５６】
農学において重要な遺伝子
転写可能なＤＮＡ分子は、農学において重要な遺伝子であり得る。本明細書で使用される場合、用語「農学において重要な遺伝子」は、特定の植物組織、細胞、または細胞型で発現された場合に、所望の特徴を与える転写可能なＤＮＡ分子を指す。農学において重要な遺伝子の産物は、植物の形態、生理、成長、発生、収穫量、穀粒組成（ｇｒａｉｎ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）、栄養プロファイル、疾患もしくは病虫害抵抗性、および／もしくは環境もしくは薬剤耐性に対し影響を及ぼすために植物内で機能し得、または、植物を餌にする害虫の食事において殺害虫剤として機能し得る。本発明の一実施形態では、本発明の調節エレメントは、調節エレメントが農学において重要な遺伝子である転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されるように、コンストラクトに組み込まれる。そのようなコンストラクトを含有する遺伝子導入植物では、農学において重要な遺伝子の発現は、有益な農学的特性を与え得る。有益な農学的特性には、例えば、限定はされないが、除草剤抵抗性、昆虫防除、産生量改良、耐病性、病原体耐性、植物の成長および発生の改良、デンプン含量の改良、油分の改良、脂肪酸含量の改良、タンパク質含量の改良、果実熟成の改良、動物およびヒトの栄養増強、生体高分子の生産、環境ストレス耐性、医薬品ペプチド、加工品質の改良、風味の改良、雑種種子生産の有用性、繊維生産の改良、並びに望ましいバイオ燃料の生産が含まれ得る。
【００５７】
当該技術分野において公知の農学において重要な遺伝子の例としては、除草剤抵抗性（米国特許第６，８０３，５０１号；同第６，４４８，４７６号；同第６，２４８，８７６号；同第６，２２５，１１４号；同第６，１０７，５４９号；同第５，８６６，７７５号；同第５，８０４，４２５号；同第５，６３３，４３５号；および同第５，４６３，１７５号）、収穫量増加（米国特許第ＵＳＲＥ３８，４４６号；同第６，７１６，４７４号；同第６，６６３，９０６号；同第６，４７６，２９５号；同第６，４４１，２７７号；同第６，４２３，８２８号；同第６，３９９，３３０号；同第６，３７２，２１１号；同第６，２３５，９７１号；同第６，２２２，０９８号；および同第５，７１６，８３７号）、昆虫防除（米国特許第６，８０９，０７８号；同第６，７１３，０６３号；同第６，６８６，４５２号；同第６，６５７，０４６号；同第６，６４５，４９７号；同第６，６４２，０３０号；同第６，６３９，０５４号；同第６，６２０，９８８号；同第６，５９３，２９３号；同第６，５５５，６５５号；同第６，５３８，１０９号；同第６，５３７，７５６号；同第６，５２１，４４２号；同第６，５０１，００９号；同第６，４６８，５２３号；同第６，３２６，３５１号；同第６，３１３，３７８号；同第６，２８４，９４９号；同第６，２８１，０１６号；同第６，２４８，５３６号；同第６，２４２，２４１号；同第６，２２１，６４９号；同第６，１７７，６１５号；同第６，１５６，５７３号；同第６，１５３，８１４号；同第６，１１０，４６４号；同第６，０９３，６９５号；同第６，０６３，７５６号；同第６，０６３，５９７号；同第６，０２３，０１３号；同第５，９５９，０９１号；同第５，９４２，６６４号；同第５，９４２，６５８号、同第５，８８０，２７５号；同第５，７６３，２４５号；および同第５，７６３，２４１号）、真菌病耐性（米国特許第６，６５３，２８０号；同第６，５７３，３６１号；同第６，５０６，９６２号；同第６，３１６，４０７号；同第６，２１５，０４８号；同第５，５１６，６７１号；同第５，７７３，６９６号；同第６，１２１，４３６号；同第６，３１６，４０７号；および同第６，５０６，９６２号）、ウイルス耐性（米国特許第６，６１７，４９６号；同第６，６０８，２４１号；同第６，０１５，９４０号；同第６，０１３，８６４号；同第５，８５０，０２３号；および同第５，３０４，７３０号）、線虫耐性（米国特許第６，２２８，９９２号）、細菌病耐性（米国特許第５，５１６，６７１号）、植物の成長および発生（米国特許第６，７２３，８９７号および同第６，５１８，４８８号）、デンプン生産（米国特許第６，５３８，１８１号；同第６，５３８，１７９号；同第６，５３８，１７８号；同第５，７５０，８７６号；同第６，４７６，２９５号）、油生産の改良（米国特許第６，４４４，８７６号；同第６，４２６，４４７号；および同第６，３８０，４６２号）、高い油収量（米国特許第６，４９５，７３９号；同第５，６０８，１４９号；同第６，４８３，００８号；および同第６，４７６，２９５号）、脂肪酸含量の改良（米国特許第６，８２８，４７５号；同第６，８２２，１４１号；同第６，７７０，４６５号；同第６，７０６，９５０号；同第６，６６０，８４９号；同第６，５９６，５３８号；同第６，５８９，７６７号；同第６，５３７，７５０号；同第６，４８９，４６１号；および同第６，４５９，０１８号）、高いタンパク質収量（米国特許第６，３８０，４６６号）、果実熟成（米国特許第５，５１２，４６６号）、動物およびヒトの栄養増強（米国特許第６，７２３，８３７号；同第６，６５３，５３０号；同第６，５４１２，５９号；同第５，９８５，６０５号；および同第６，１７１，６４０号）、生体高分子（米国特許第ＵＳＲＥ３７，５４３号；同第６，２２８，６２３号；および同第５，９５８，７４５号、および同第６，９４６，５８８号）、環境ストレス耐性（米国特許第６，０７２，１０３号）、医薬品ペプチドおよび分泌性ペプチド（米国特許第６，８１２，３７９号；同第６，７７４，２８３号；同第６，１４０，０７５号；および同第６，０８０，５６０号）、加工特性の改良（米国特許第６，４７６，２９５号）、消化性の改良（米国特許第６，５３１，６４８号）、低ラフィノース（米国特許第６，１６６，２９２号）、工業用酵素の生産（米国特許第５，５４３，５７６号）、風味の改良（米国特許第６，０１１，１９９号）、窒素固定（米国特許第５，２２９，１１４号）、雑種種子生産（米国特許第５，６８９，０４１号）、繊維生産（米国特許第６，５７６，８１８号；同第６，２７１，４４３号；同第５，９８１，８３４号；および同第５，８６９，７２０号）並びにバイオ燃料生産（米国特許第５，９９８，７００号）に関する遺伝子が挙げられる。
【００５８】
あるいは、農学において重要な遺伝子は、内在性遺伝子の遺伝子発現の標的化された調節を引き起こすＲＮＡ分子をコードすることにより、例えば、アンチセンス（例えば米国特許第５，１０７，０６５号を参照）；阻害性ＲＮＡ（「ＲＮＡｉ」、例えば、米国特許出願公開第２００６／０２００８７８号および同第２００８／００６６２０６号、並びに米国特許出願第１１／９７４，４６９号に記載される、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、トランス作動性ｓｉＲＮＡ、および段階的ｓＲＮＡ（ｐｈａｓｅｄ  ｓＲＮＡ）を介する機構による遺伝子発現の調節を含む）；またはコサプレッションを介する機構によって、上記の植物の特徴または表現型に影響を及ぼすことができる。ＲＮＡは、所望の内在性ｍＲＮＡ産物を切断するように操作された触媒ＲＮＡ分子（例えば、リボザイムまたはリボスイッチ；例えば、米国特許第２００６／０２００８７８号を参照）であってもよい。転写可能なＤＮＡ分子が遺伝子抑制を引き起こすことが可能な分子に転写されるようにコンストラクトを構築しそれを細胞に導入するための方法は、当該技術分野において公知である。
【００５９】
植物細胞における転写可能なＤＮＡ分子の発現を用いることで、植物細胞を餌とする植物有害生物、例えば、甲虫類有害生物から単離された組成物および線虫有害生物から単離された組成物を抑制することもできる。植物有害生物としては、限定はされないが、節足動物有害生物、線虫有害生物、および真菌または微生物有害生物が挙げられる。
【００６０】
選択マーカー
選択マーカー導入遺伝子を本発明の調節エレメントと共に用いてもよい。本明細書で使用される場合、用語「選択マーカー導入遺伝子」は、遺伝子導入植物、組織または細胞内でのその発現、またはその欠如が、いくつかの方法でスクリーニングまたはスコア化することができる、あらゆる転写可能なＤＮＡ分子を指す。本発明の実施において用いられる、選択マーカー遺伝子、並びにそれらの関連する選択およびスクリーニング技術は、当該技術分野において公知であり、例えば、限定はされないが、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、抗生物質耐性を付与するタンパク質、および除草剤抵抗性を付与するタンパク質をコードする転写可能なＤＮＡ分子が挙げられる。
【００６１】
細胞形質転換
本発明はまた、転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結された一つまたは複数の調節エレメントを含む形質転換細胞および形質転換植物を作製する方法に関する。
【００６２】
用語「形質転換」は、受容宿主へのＤＮＡ分子の組込みを指す。本明細書で使用される場合、用語「宿主」は、細菌、真菌、または植物のあらゆる細胞、組織、器官、または子孫を含む、細菌、真菌、または植物を指す。特に重要な植物の組織および細胞には、プロトプラスト、カルス、根、塊茎、種子、茎、葉、実生、胚、および花粉が含まれる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「形質転換された」とは、コンストラクト等の外来ＤＮＡ分子が導入された細胞、組織、器官、または生物を指す。導入されたＤＮＡ分子は、導入されたＤＮＡ分子が後の子孫に遺伝されるように、受容細胞、受容組織、受容器官、または受容生物のゲノムＤＮＡに組み込まれ得る。「遺伝子導入」または「形質転換」細胞または生物には、細胞または生物の子孫、およびそのような遺伝子導入生物を交雑における親として使用する育種計画から生み出され、外来ＤＮＡ分子の存在によりもたらされる変化した表現型を示す子孫も含まれ得る。導入されたＤＮＡ分子はまた、導入されたＤＮＡ分子が後の子孫に遺伝されないように、一過的に受容細胞に導入され得る。用語「遺伝子導入（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」は、一つまたは複数の異種ＤＮＡ分子を含有する細菌、真菌、または植物を指す。
【００６４】
ＤＮＡ分子を植物細胞に導入するための、当業者に周知の多くの方法が存在する。プロセスは、一般的に、適切な宿主細胞を選択し、宿主細胞をベクターで形質転換し、形質転換された宿主細胞を得るという段階を含む。本発明の実施に際して植物コンストラクトを植物ゲノムに導入することにより植物細胞を形質転換するための方法および材料は、周知の実証済みの方法のいずれかを含み得る。適切な方法としては、限定はされないが、特に、細菌感染（例えば、アグロバクテリウム属）、バイナリーＢＡＣベクター、ＤＮＡの直接送達（例えば、ＰＥＧを介した形質転換、乾燥／阻害を介したＤＮＡの取り込み、エレクトロポレーション、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌、およびＤＮＡをコートされた粒子の加速によるもの）が挙げられる。
【００６５】
宿主細胞は、植物細胞、藻細胞、藻類、真菌細胞、真菌、細菌細胞、または昆虫細胞等の、いかなる細胞または生物であってもよい。特定の実施形態では、宿主細胞および形質転換細胞には、作物から得られた細胞が含まれ得る。
【００６６】
遺伝子導入植物は、後に、本発明の遺伝子導入植物細胞から再生され得る。従来の育種法または自家受粉を用いることにより、種子をこの遺伝子導入植物から生産してもよい。そのような種子、およびそのような種子から成長して得られた子孫植物は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有するため、遺伝子導入型である。
【００６７】
本発明の遺伝子導入植物は、自家受粉させることで、本発明のホモ接合性遺伝子導入植物（組換えＤＮＡ分子についてホモ接合性）の種子を生産することができ、または非遺伝子導入植物または異なる遺伝子導入植物と交雑することで、本発明のヘテロ接合性遺伝子導入植物（組換えＤＮＡ分子についてヘテロ接合性）の種子を生産することができる。そのようなホモ接合性遺伝子導入植物およびヘテロ接合性遺伝子導入植物は共に、本明細書において「子孫植物」と称される。子孫植物は、元の遺伝子導入植物の子孫であり本発明の組換えＤＮＡ分子を含有する、遺伝子導入植物である。本発明の遺伝子導入植物を用いて生産された種子を、収穫および使用することで、本発明のコンストラクトを含み農学において重要な遺伝子を発現する本発明の遺伝子導入植物の世代（すなわち、子孫植物）を育てることができる。様々な作物に一般的に使用される育種法の説明は、数冊の参考書のうちの１冊に見出すことができ、例えば、Ａｌｌａｒｄ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ，  Ｕ．  ｏｆ  ＣＡ，  Ｄａｖｉｓ，  ＣＡ，  ５０−９８  （１９６０）；  Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃｒｏｐ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，  Ｌｏｎｇｍａｎ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹ，  ３６９−３９９  （１９７９）；  Ｓｎｅｅｐ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｉｋｓｅｎ，  Ｐｌａｎｔ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，  Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ  （ｅｄ），  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  （１９７９）；  Ｆｅｈｒ，  Ｓｏｙｂｅａｎｓ：  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ，  １６：２４９    （１９８７）；  Ｆｅｈｒ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｖａｒｉｅｔｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  （Ｖｏｌ．  １）およびＣｒｏｐ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｓｏｙｂｅａｎ  （Ｖｏｌ．２），  Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖ．，  Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．，  ＮＹ，  ３６０−３７６  （１９８７）を参照されたい。
【００６８】
形質転換植物は、目的の一つまたは複数の遺伝子の存在、並びに本発明の調節エレメントによって与えられた発現レベルおよび／または発現プロファイルについて解析され得る。当業者は、形質転換植物の解析に利用可能な多数の方法を承知している。例えば、植物解析のための方法としては、限定はされないが、サザンブロットまたはノーザンブロット、ＰＣＲに基づくアプローチ、生化学的解析、表現型スクリーニング法、現地評価、および免疫診断アッセイが挙げられる。転写可能なＤＮＡ分子の発現は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）（アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）試薬、および製造会社によって記載された方法、およびＴａｑＭａｎ（登録商標）のＴｅｓｔｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘを用いて決定されたＰＣＲサイクル時間を用いて、測定することができる。あるいは、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）（サード・ウェイブ・テクノロジーズ社（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、マディソン、ウィスコンシン州）試薬、および製造会社によって記載された方法を用いることで、導入遺伝子発現を評価することができる。
【００６９】
本発明は本発明の植物の部分も提供する。植物の部分としては、限定はされないが、葉、茎、根、塊茎、種子、胚乳、胚珠、および花粉が挙げられる。本発明の植物の部分は、生育可能な、生育不能な、再生可能な、および／または再生不可能な、植物の部分であり得る。本発明はまた、本発明のＤＮＡ分子を含む形質転換植物細胞を含み、それを提供する。本発明の形質転換植物細胞または遺伝子導入植物細胞は、再生可能な、および／または再生不可能な植物細胞を含む。
【００７０】
本発明は、指示がない限り例として提供され本発明の限定を意図するものではない、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解され得る。以下の実施例で開示される手法が、本発明の実施に際して十分に機能することが本発明者によって発見された手法であることは、当業者に理解されるはずである。しかし、本開示に照らし合わせて、多くの変更が、開示された特定の実施形態に成されることが可能であり、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることがなお可能であり、従って、添付の図面に記載されるまたは示される全ての事項が、例示として解釈されるべきであり、限定的な意味に解釈されるべきでないことは、当業者に理解されるはずである。
【実施例】
【００７１】
実施例１
調節エレメントの同定およびクローニング
新規のユビキチン調節エレメント、または調節性発現エレメント群（ＥＸＰ）配列を、単子葉類のコヌカグサ（カスミヌカボ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｎｅｂｕｌｏｓａ））、ダンチク（ｇｉａｎｔ  ｒｅｅｄ）（ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ  ｄｏｎａｘ））、ブルーグラマ（メダカソウ（Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ））、チャイニーズ・ブルーグラス（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｓｉｌｖｅｒｇｒａｓｓ）（ススキ（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｓｉｎｅｓｉｓ））、リトル・ブルーステム（Ｌｉｔｔｌｅ  ｂｌｕｅｓｔｅｍ）（スキザクリウム・スコパリウム（Ｓｃｈｉｚａｃｈｙｉｕｍ  ｓｃｏｐａｒｉｕｍ））、イエロー・インディアングラス（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｉｎｄｉａｎｇｒａｓｓ）（ソルガストラム・ヌタンス（Ｓｏｒｇｈａｓｔｒｕｍ  ｎｕｔａｎｓ））およびジュズダマ属（ジュズダマ・ハトムギ（Ｃｏｉｘ  ｌａｃｒｙｍａ−ｊｏｂｉ））のゲノムＤＮＡから同定および単離した。
【００７２】
ユビキチン１転写物配列を上記の種のそれぞれから同定した。ユビキチン１転写物のそれぞれの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を用いて、作動可能に連結された、プロモーター、リーダー（５’ＵＴＲ）、および第一イントロンを含む、同定されたユビキチン遺伝子のための対応する調節エレメントを増幅するためのプライマーを設計した。プライマーを、製造業者のプロトコルに従って構築したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）（クロンテック・ラボラトリーズ株式会社、マウンテンヴュー、カリフォルニア州）ライブラリーと共に用いて、対応するゲノムＤＮＡ配列の５’領域をクローニングした。ユビキチン調節エレメントは、上記のように、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）ライブラリーを用いて、単子葉類のアワ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ）、エノコログサ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｖｉｒｉｄｉｓ）、およびテオシント（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｍｅｘｉｃａｎａ）（テオシント（Ｔｅｏｓｉｎｔｅ））からも単離した。さらに、ユビキチン調節エレメントを、ユビキチン４、６、および７の遺伝子と相同である公開配列を用いて、単子葉類のモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）から単離した。
【００７３】
同定した配列を用い、バイオインフォマティクス的解析を行って、増幅されたＤＮＡ内の調節エレメントを同定した。この解析の結果を用い、調節エレメントをＤＮＡ配列内で限定し、調節エレメントを増幅するようプライマーを設計した。標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件を用い、独特な制限酵素部位を含有するプライマー並びにカスミヌカボ（Ａ．  ｎｅｂｕｌｏｓａ）、ダンチク（Ａ  ｄｏｎａｘ）、メダカソウ（Ｂ．  ｇｒａｃｉｌｉｓ）、ススキ（Ｍ．  ｓｉｎｅｓｉｓ）、スキザクリウム・スコパリウム（Ｓ．  ｓｃｏｐａｒｉｕｍ）、ソルガストラム・ヌタンス（Ｓ．  ｎｕｔａｎｓ）、およびジュズダマ・ハトムギ（Ｃ．  ｌａｃｒｙｍａ−ｊｏｂｉ）から単離されたゲノムＤＮＡを用いて、各調節エレメントに対応するＤＮＡ分子を増幅した。得られたＤＮＡ断片をベースとなる植物発現ベクターにライゲーションし配列決定した。次に、調節エレメントの転写開始部位（ＴＳＳ）およびイントロン／エクソンスプライスジャンクションの解析を、形質転換した植物プロトプラストを用いて行った。簡潔に説明すると、プロトプラストを、異種性の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されたクローン化ＤＮＡ断片を含む植物発現ベクターで形質転換し、５’  ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ、バージョン２．０（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア  ９２００８）を用い、それにより生成されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物の配列を解析することにより、調節エレメントＴＳＳおよびイントロン／エクソンスプライスジャンクションを確認した。
【００７４】
同定したＥＸＰのＤＮＡ配列は、以下の表１に列挙される、配列番号：１、５、７、９、１３、１６、１８、１９、２１、２３、２７、３０、３２、３４、３８、４１、４３、４５、４９、５２、５５、５８、６０、６２、６６、７０、７２、７４、７６、７８、８２、８４、８６、８８、９２、９５、９７、９９、１０３、１０６、１０８、１１０、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２６、１２８、１３２、１３４、１３８、１４０、１４４、１４８、１５０および１６８として本明細書に提供される。プロモーター配列は、配列番号：２、６、８、１０、１４、１７、２２、２４、２８、３１、３３、３５、３９、４２、４４、４６、５０、５３、５６、６１、６３、６７、７１、７３、７５、７７、７９、８３、８５、８７、８９、９３、９６、９８、１００、１０４、１０７、１０９、１１１、１１７、１１９、１２１、１２３、１２９、１３５、１４１、１４５、１５１および１６９として本明細書に提供される。リーダー配列は、配列番号：３、１１、２５、３６、４７、６４、６８、８０、９０、１０１、１１２、１２４、１３０、１３６、１４２、１４６、１５２および１７０として本明細書に提供される。イントロン配列は、配列番号：４、１２、１５、２０、２６、２９、３７、４０、４８、５１、５４、５７、５９、６５、６９、８１、９１、９４、１０２、１０５、１１３、１１５、１２５、１２７、１３１、１３３、１３７、１３９、１４３、１４７、１４９、１５３および１７１として本明細書に提供される。
【表１】
2018108101.tif 000002
2018108101.tif 000003
2018108101.tif 000004
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2018108101.tif 000011
2018108101.tif 000012
【００７５】
表１に示されるように、例えば、カスミヌカボ（Ａ．  ｎｅｂｕｌｏｓａ）から単離された成分を有するＥＸＰ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号１）と名付けられた調節性ＥＸＰ配列は、イントロンエレメントＩ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１−１：１：３（配列番号４）に作動可能に５’連結された、リーダーエレメントＬ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１（配列番号３）に作動可能に５’連結された、プロモーターエレメントＰ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１−１：１：５（配列番号２）を含む。他のＥＸＰ配列は、表１に要約されるように、同様に連結されている。
【００７６】
表１、配列表、および図１〜８に示されるように、例えば、Ｐ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１−１：１：５（配列番号２）、Ｐ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１−１：１：４（配列番号１０）、または他の種由来の他の各々のプロモーターのより短いプロモーター断片を含む、カスミヌカボ（Ａ．  ｎｅｂｕｌｏｓａ）、ダンチク（Ａ  ｄｏｎａｘ）、メダカソウ（Ｂ．  ｇｒａｃｉｌｉｓ）、ススキ（Ｍ．  ｓｉｎｅｓｉｓ）、スキザクリウム・スコパリウム（Ｓ．  ｓｃｏｐａｒｉｕｍ）、およびソルガストラム・ヌタンス（Ｓ．  ｎｕｔａｎｓ）由来のプロモーター配列の変異体を操作し、例えば、Ｐ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１−１：１：４（配列番号６）およびＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１−１：１：５（配列番号１４）、並びに他のプロモーター断片を得た。
【００７７】
表１には、テオシント（Ｚ．  ｍａｙｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｅｘｉｃａｎａ）由来のゲノムＤＮＡの増幅用に設計された同一のプライマーセットを用いて単離された３つの対立遺伝子多型も列挙されている。テオシント（Ｚ．  ｍａｙｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｅｘｉｃａｎａ）のＥＸＰ配列の対立遺伝子多型は、他のＤＮＡ配列の種々の領域内でいくらかの同一性を共有するＤＮＡ配列から構成されるが、挿入、欠失、およびヌクレオチドミスマッチが、それぞれのＥＸＰ配列のそれぞれのプロモーター、リーダーおよび／またはイントロン内で明らかであり得る。ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：６（配列番号１２２）およびＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：１０（配列番号１２６）と名付けられたＥＸＰ配列は、テオシント（Ｚ．  ｍａｙｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｅｘｉｃａｎａ）Ｕｂｑ１遺伝子調節性発現エレメント群の第一の対立遺伝子（対立遺伝子−１）を表し、その２つのＥＸＰ配列の間の唯一の差異は、３’イントロンスプライスジャンクションの配列５’−ＡＧ−３’に続くそれぞれのイントロンの最後の３’ヌクレオチドに生じる。ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：７（配列番号１２８）およびＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：１２（配列番号１３２）と名付けられたＥＸＰ配列は、テオシント（Ｚ．  ｍａｙｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｅｘｉｃａｎａ）Ｕｂｑ１遺伝子調節性発現エレメント群の第二の対立遺伝子（対立遺伝子−２）を表し、その２つのＥＸＰ配列の間の唯一の差異は、３’イントロンスプライスジャンクションの配列５’−ＡＧ−３’に続くそれぞれのイントロンの最後の３’ヌクレオチドに生じる。ＥＸＰ配列であるＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：８（配列番号１３４）およびＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：１１（配列番号１３８）は、テオシント（Ｚ．  ｍａｙｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｅｘｉｃａｎａ）Ｕｂｑ１遺伝子調節性発現エレメント群の第三の対立遺伝子（対立遺伝子−３）を表し、その２つのＥＸＰ配列の間の唯一の差異は、３’イントロンスプライスジャンクションの配列５’−ＡＧ−３’に続くそれぞれのイントロンの最後の３’ヌクレオチドに生じる。
【００７８】
実施例２
ＧＵＳ発現カセット単位複製配列を用いたトウモロコシプロトプラストにおける調節エレメント駆動性ＧＵＳの解析
以下に示される一連の実験において、トウモロコシの葉のプロトプラストを、ＥＸＰ配列を含有する植物発現ベクターに由来し、β−グルクロニダーゼ導入遺伝子（ＧＵＳ）の発現を駆動するＤＮＡ単位複製配列で形質転換し、ＧＵＳの発現が公知の構成的プロモーターによって駆動される葉のプロトプラストに対して比較した。
【００７９】
第一の一連の実験において、葉組織に由来するトウモロコシのプロトプラスト細胞を、植物発現ベクターを含むＧＵＳ発現カセットの増幅から生産された単位複製配列で上記のように形質転換して、ＥＸＰ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号１）、ＥＸＰ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号５）、ＥＸＰ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１：１：９（配列番号７）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号１３）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：９（配列番号１６）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：１１（配列番号２０）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ２：１：８（配列番号２６）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ２：１：９（配列番号２９）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ２：１：１０（配列番号３１）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ１：１：６（配列番号３７）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号４０）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号４２）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２：１：１４（配列番号５１）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２：１：１６（配列番号５７）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２：１：１７（配列番号５９）、ＥＸＰ−ＭＩＳｓｉ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号６９）、ＥＸＰ−ＭＩＳｓｉ．Ｕｂｑ１：１：１０（配列番号７１）、ＥＸＰ−ＭＩＳｓｉ．Ｕｂｑ１：１：１１（配列番号７３）、ＥＸＰ−ＭＩＳｓｉ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号７５）、ＥＸＰ−ＳＣＨｓｃ．Ｕｂｑ１：１：９（配列番号７７）、ＥＸＰ−ＳＣＨｓｃ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号８３）、ＥＸＰ−ＳＣＨｓｃ．Ｕｂｑ１：１：１０（配列番号８５）、ＥＸＰ−ＳＯＲｎｕ．Ｕｂｑ１：１：６（配列番号９１）、ＥＸＰ−ＳＯＲｎｕ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号９４）、ＥＸＰ−ＳＯＲｎｕ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号９６）、ＥＸＰ−ＳＥＴｉｔ．Ｕｂｑ１：１：５（配列番号１０２）、ＥＸＰ−ＳＥＴｉｔ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号１０５）、ＥＸＰ−ＳＥＴｉｔ．Ｕｂｑ１：１：６（配列番号１０７）、ＥＸＰ−Ｓｖ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号１０９）、ＥＸＰ−Ｓｖ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号１１５）、ＥＸＰ−Ｓｖ．Ｕｂｑ１：１：１０（配列番号１１７）、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：６（配列番号１２１）、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：７（配列番号１２７）、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：８（配列番号１３３）、Ｅｘｐ−Ｓｂ．Ｕｂｑ４：１：２（配列番号１３９）、およびＥｘｐ−Ｓｂ．Ｕｂｑ６：１：２（配列番号１４３）のうちの１つによって駆動される導入遺伝子（ＧＵＳ）の発現を、公知の構成的プロモーターのそれと比較した。発現カセット単位複製配列が生産される増幅鋳型を含む各ＥＸＰ配列を、当該技術分野において公知の方法を用いて、以下の表２の「単位複製配列の鋳型」の項目の下に示される植物発現ベクターにクローニングした。得られた植物発現ベクターは、３’ＵＴＲ  Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３（配列番号１５７）もしくはＴ−Ｔａ．Ｈｓｐ１７−１：１：１（配列番号１５８）に作動可能に５’連結された、プロセシング可能なイントロン（「ＧＵＳ−２」、配列番号１５４）、または連続したＧＵＳコード配列（「ＧＵＳ−１」、配列番号１５３）を含有���る、ＧＵＳのコード配列に作動可能に５’連結されたＥＸＰ配列で構成される発現カセットを含む。当業者に公知の方法を用い、以下の表２に示されるプラスミドコンストラクトの鋳型を用いて、単位複製配列を作製した。簡潔に説明すると、５’オリゴヌクレオチドプライマーをプロモーター配列にアニーリングするように設計し、３’ＵＴＲの３’末端にアニーリングする３’オリゴヌクレオチドプライマーを、各発現カセットの増幅に用いた。各単位複製配列の鋳型を含むプロモーター配列内の様々な位置にアニーリングするように設計した様々なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、連続的な５’欠失を発現カセットを含むプロモーター配列に導入し、様々なＥＸＰ配列を得た。
【表２】
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2018108101.tif 000015
【００８０】
表２の単位複製配列の鋳型に列挙されるプラスミドコンストラクトは、表２に列挙されたＥＸＰ配列を含む導入遺伝子発現カセットを増幅するための鋳型として機能した。比較用のＧＵＳ導入遺伝子単位複製配列を作製するために用いた対照プラスミドは、構成的ＥＸＰ配列であるＥＸＰ−Ｏｓ．Ａｃｔ１：１：９（配列番号１６２）およびＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｔａ．Ｌｈｃｂ１＋Ｏｓ．Ａｃｔ１：１：１（配列番号１６１）を用いて、前述のように構築した。導入遺伝子発現用に設計されていない空ベクターを負の対照として用いて、バックグラウンドＧＵＳおよびルシフェラーゼ発現を評価した。
【００８１】
また、同時形質転換およびデータの正規化に用いる２つのプラスミドを、当該技術分野において公知の方法を用いて構築した。各プラスミドは、構成的ＥＸＰ配列によって駆動される特定のルシフェラーゼコード配列を含有していた。植物ベクターｐＭＯＮ１９４３７は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ノパリンシンターゼ遺伝子（Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３、配列番号１５８）由来の３’ＵＴＲに作動可能に５’連結された、ホタル（ポティヌス・ピュラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ））ルシフェラーゼコード配列（ルシフェラーゼ：１：３、配列番号１５６）に作動可能に５’連結された、イントロン、（ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：１、配列番号１６３）に作動可能に５’連結された、構成的プロモーターを有する発現カセットを含む。植物ベクターｐＭＯＮ６３９３４は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ノパリンシンターゼ遺伝子（Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３、配列番号１５８）由来の３’ＵＴＲに作動可能に５’連結された、ウミシイタケ（ｓｅａ  ｐａｎｓｙ）（ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））ルシフェラーゼコード配列（ＣＲ−Ｒｅｎ．ｈＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃｉｆｅ−０：０：１、配列番号１５７）に作動可能に５’連結された、構成的ＥＸＰ配列（ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ−Ｌｈｃｂ１、配列番号１６４）を有する発現カセットを含む。
【００８２】
当該技術分野において周知のＰＥＧに基づく形質転換法を用いて、トウモロコシの葉のプロトプラストを形質転換した。プロトプラスト細胞を、ｐＭＯＮ１９４３７プラスミドＤＮＡ、ｐＭＯＮ６３９３４プラスミドＤＮＡ、および表２に示される単位複製配列で形質転換し、完全な暗闇の中で一晩インキュベートした。上記のように形質転換された細胞の溶解調製物の一定分量を２つの異なる小ウェルトレーに入れることにより、ＧＵＳおよびルシフェラーゼの両方の測定を行った。１つのトレーをＧＵＳ測定用に用い、第二のトレーを用いて、ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州；例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｎｏｔｅｓ  Ｍａｇａｚｉｎｅ，  Ｎｏ：  ５７，  １９９６，  ｐ．０２を参照）を用いるデュアルルシフェラーゼアッセイを行った。各ＥＸＰ配列について１つまたは２つの形質転換を行い、各形質転換実験から得たいくつかの試料から各ＥＸＰ配列の平均発現値を決定した。２つの形質転換実験の１つ当たり、各ＥＸＰ配列コンストラクト形質転換の４つのレプリケート、あるいは、各ＥＸＰ配列単位複製配列の３つのレプリケートを用いて、試料測定を行った。平均ＧＵＳ発現レベルおよび平均ルシフェラーゼ発現レベルを表３に示す。この表では、ホタルルシフェラーゼの値（例えば、ｐＭＯＮ１９４３７の発現からの）は「ＦＬｕｃ」とラベルされたカラムに示され、ウミシイタケルシフェラーゼの値は、「ＲＬｕｃ」とラベルされたカラムに示される。
【表３】
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【００８３】
各ＥＸＰ配列の相対活性を比較するため、ＧＵＳ値をＧＵＳのルシフェラーゼ活性に対する比として表し、ＥＸＰ−Ｏｓ．Ａｃｔ１：１：１およびＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｔａ．Ｌｈｃｂ１＋Ｏｓ．Ａｃｔ１：１：１の観察された発現レベルに対して正規化した。以下の表４は、トウモロコシプロトプラストにおける、ＥＸＰ−Ｏｓ．Ａｃｔ１：１：１およびＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｔａ．Ｌｈｃｂ１＋Ｏｓ．Ａｃｔ１：１：１に駆動される発現に対して正規化したＧＵＳ／ＲＬｕｃ発現比を示している。以下の表５は、トウモロコシプロトプラストにおける、ＥＸＰ−Ｏｓ．Ａｃｔ１：１：１およびＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｔａ．Ｌｈｃｂ１＋Ｏｓ．Ａｃｔ１：１：１に駆動される発現に対して正規化したＧＵＳ／ＦＬｕｃ発現比を示している。
【表４】
2018108101.tif 000017
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【表５】
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【００８４】
表９および表１０に示すように、全てのＥＸＰ配列がトウモロコシ細胞におけるＧＵＳ導入遺伝子発現を駆動することが可能であった。平均ＧＵＳ発現は、ＥＸＰ−Ｏｓ．Ａｃｔ１：１：９と比較して、全てのＥＸＰ配列においてより高かった。ＥＸＰ配列、ＥＸＰ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号１）、ＥＸＰ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号５）、ＥＸＰ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１：１：９（配列番号７）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号１３）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：９（配列番号１８）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：１１（配列番号２１）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ２：１：８（配列番号２７）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ２：１：９（配列番号３０）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ２：１：１０（配列番号３２）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ１：１：６（配列番号３８）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号４１）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２：１：１４（配列番号５２）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２：１：１６（配列番号５８）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２：１：１７（配列番号６０）、ＥＸＰ−ＭＩＳｓｉ．Ｕｂｑ１：１：１０（配列番号７２）、ＥＸＰ−ＳＣＨｓｃ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号８４）、ＥＸＰ−ＳＣＨｓｃ．Ｕｂｑ１：１：１０（配列番号８６）、ＥＸＰ−ＳＯＲｎｕ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号９５）、ＥＸＰ−ＳＯＲｎｕ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号９７）、ＥＸＰ−ＳＥＴｉｔ．Ｕｂｑ１：１：５（配列番号１０３）、ＥＸＰ−ＳＥＴｉｔ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号１０６）、ＥＸＰ−ＳＥＴｉｔ．Ｕｂｑ１：１：６（配列番号１０８）、ＥＸＰ−Ｓｖ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号１１０）、ＥＸＰ−Ｓｖ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号１１６）、ＥＸＰ−Ｓｖ．Ｕｂｑ１：１：１０（配列番号１１８）、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：６（配列番号１２２）、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：８（配列番号１３４）、ＥＸＰ−Ｓｂ．Ｕｂｑ４：１：２（配列番号１４０）、およびＥＸＰ−Ｓｂ．Ｕｂｑ６：１：２（配列番号１４４）は、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｔａ．Ｌｈｃｂ１＋Ｏｓ．Ａｃｔ１：１：１のＧＵＳ発現レベルを超えるＧＵＳ発現レベルを示した。
【００８５】
第二の一連の実験において、ＥＸＰ配列ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：７（配列番号１２８）を含むＧＵＳ発現カセット単位複製配列を、ＧＵＳ発現について、対照単位複製配列であるＰＣＲ０１４５９４２（ＥＸＰ−Ｏｓ．Ａｃｔ１：１：９、配列番号１６２）およびＰＣＲ０１４５９４４（ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：１、配列番号１６１）と比較した。ＥＸＰ配列ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：７によって駆動されるＧＵＳ発現は、２つの対照のＧＵＳ発現よりも多かった。以下の表６は、各単位複製配列について決定された平均ＧＵＳ値および平均ルシフェラーゼ値を示している。以下の表７は、トウモロコシプロトプラストにおける、ＥＸＰ−Ｏｓ．Ａｃｔ１：１：９およびＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：１により駆動される発現に対して正規化した、ＧＵＳ／ＲＬｕｃ発現比およびＧＵＳ／ＦＬｕｃ発現比を示している。
【表６】
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【表７】
2018108101.tif 000022
【００８６】
単位複製配列からのＧＵＳ発現を駆動する調節エレメントの有効性は、サトウキビの葉のプロトプラストにおいて同様に研究することができる。例えば、サトウキビプロトプラストを、ＧＵＳ導入遺伝子の発現を駆動するＥＸＰ配列を含有する植物発現ベクター由来のＤＮＡ単位複製配列で形質転換し、既知の構成的プロモーターによりＧＵＳの発現が駆動される葉のプロトプラストと比較してもよい。
【００８７】
実施例３
ＧＵＳ発現カセット単位複製配列を用いた、コムギプロトプラストにおけるＧＵＳを駆動する調節エレメントの解析
コムギの葉のプロトプラストを、ＧＵＳ導入遺伝子の発現を駆動するＥＸＰ配列を含有する植物発現ベクターに由来するＤＮＡ単位複製配列で形質転換し、既知の構成的プロモーターによりＧＵＳの発現が駆動される葉のプロトプラストと比較した。
【００８８】
先の実施例（実施例２）に記載した方法論を用い、上記実施例２のトウモロコシにおけるアッセイに使用したものと同じＧＵＳ発現カセット単位複製配列を用いて、葉組織由来のコムギプロトプラスト細胞を、当該技術分野において公知の方法を用いて、植物発現ベクターを含むＧＵＳ発現カセットの増幅から生産された単位複製配列で形質転換し、表３に列挙されるＥＸＰ配列により駆動される導入遺伝子（ＧＵＳ）の発現を、既知の構成的プロモーターのそれと比較した。コムギプロトプラストの形質転換に用いた対照ＧＵＳ発現カセット単位複製配列およびルシフェラーゼプラスミドもまた、先の実施例に示され、実施例２の上記表３に示されたものと同一であった。同様に、負の対照を、上記のようにＧＵＳおよびルシフェラーゼのバックグラウンドの決定に用いた。コムギの葉のプロトプラストを、上記実施例２に記載されるように、ＰＥＧに基づく形質転換法を用いて、形質転換した。表８は、形質転換されたコムギの葉のプロトプラスト細胞で見られた平均ＧＵＳ活性および平均ＬＵＣ活性を列挙しており、表９および表１０は、構成的ＥＸＰ対照と比較した、コムギプロトプラストにおける正規化したＧＵＳ／ＦＬｕｃ発現比およびＧＵＳ／ＲＬｕｃ発現比を示している。
【表８】
2018108101.tif 000023
【表９】
2018108101.tif 000024
【表１０】
2018108101.tif 000025
【００８９】
上記表９および表１０に示されるように、全てのＥＸＰ配列が、コムギ細胞においてＧＵＳ導入遺伝子発現を駆動することが可能であった。全てのＥＸＰ配列が、コムギ細胞においてＥＸＰ−Ｏｓ．Ａｃｔ１：１：９のＧＵＳ発現よりも高いレベルでＧＵＳ発現を駆動した。ＥＸＰ配列ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号１３）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：９（配列番号１８）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：１１（配列番号２１）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ２：１：１０（配列番号３２）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２：１：１４（配列番号５２）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２：１：１６（配列番号５８）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２：１：１７（配列番号６０）、ＥＸＰ−ＭＩＳｓｉ．Ｕｂｑ１：１：１０（配列番号７２）、ＥＸＰ−ＳＯＲｎｕ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号９５）、ＥＸＰ−ＳＥＴｉｔ．Ｕｂｑ１：１：５（配列番号１０３）、ＥＸＰ−ＳＥＴｉｔ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号１０６）、ＥＸＰ−ＳＥＴｉｔ．Ｕｂｑ１：１：６（配列番号１０８）、ＥＸＰ−Ｓｖ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号１１０）、ＥＸＰ−Ｓｖ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号１１６）、ＥＸＰ−Ｓｖ．Ｕｂｑ１：１：１０（配列番号１１８）、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：６（配列番号１２２）、およびＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：８（配列番号１３４）は、コムギ細胞においてＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｔａ．Ｌｈｃｂ１＋Ｏｓ．Ａｃｔ１：１：１によって駆動されたＧＵＳ発現以上のＧＵＳ発現レベルを示した。
【００９０】
第二の一連の実験において、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：１１（配列番号２１）を含む単位複製配列ＧＵＳ発現カセットを、対照であるＥＸＰ−Ｏｓ．Ａｃｔ１：１：９（配列番号１６２）およびＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：１（配列番号１６１）と比較した。以下の表１１は、各単位複製配列について決定した平均ＧＵＳ値および平均ルシフェラーゼ値を示している。以下の表１２は、コムギプロトプラストにおける、ＥＸＰ−Ｏｓ．Ａｃｔ１：１：９およびＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：１により駆動される発現に対して正規化したＧＵＳ／ＲＬｕｃ発現比を示している。
【表１１】
2018108101.tif 000026
【表１２】
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【００９１】
上記表１２に示されるように、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：１１（配列番号２１）によって駆動されるＧＵＳ発現は、構成的対照であるＥＸＰ−Ｏｓ．Ａｃｔ１：１：９およびＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：１の両方よりも大きかった。
【００９２】
実施例４
トウモロコシおよびコムギのプロトプラストにおけるＧＵＳを駆動する調節エレメントの解析
トウモロコシおよびコムギの葉のプロトプラストを、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動するＥＸＰ配列を含有する植物発現ベクターで形質転換し、ＧＵＳの発現が既知の構成的プロモーターによって駆動される葉のプロトプラストにおけるＧＵＳ発現と比較した。
【００９３】
ＥＸＰ−Ｃｌ．Ｕｂｑ１０（配列番号１６８）によって駆動される導入遺伝子の発現を、既知の構成的プロモーターからの発現と比較した。上記ＥＸＰ配列を、以下の表１３に示される植物発現ベクターにクローン化し、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ノパリンシンターゼ遺伝子（Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３、配列番号１６１）またはコムギＨｓｐ１７遺伝子（Ｔ−Ｔａ．Ｈｓｐ１７−１：１：１、配列番号１６２）に由来する３’ＵＴＲに作動可能に５’連結された、ジャガイモ光誘導性組織特異的ＳＴ−ＬＳ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｘ０４７５３）に由来するプロセシング可能なイントロンを含有するＧＵＳレポーター（ＧＵＳ−２と称する、配列番号１６０）または連続ＧＵＳコード配列（ＧＵＳ−１、配列番号１５９）にＥＸＰ配列が作動可能に５’連結された、ベクターを得た。
【表１３】
2018108101.tif 000028
【００９４】
また、同時形質転換およびデータの正規化に用いる２つのプラスミドを、当該技術分野において公知の方法を用いて構築した。各プラスミドは、構成的ＥＸＰ配列によって駆動される特定のルシフェラーゼコード配列を含有していた。植物ベクターｐＭＯＮ１９４３７は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ノパリンシンターゼ遺伝子（Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３、配列番号１５８）由来の３’ＵＴＲに作動可能に５’連結された、ホタル（ポティヌス・ピュラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ））ルシフェラーゼコード配列（ルシフェラーゼ：１：３、配列番号１５６）に作動可能に５’連結された、イントロン、（ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：１、配列番号１６３）に作動可能に５’連結された、構成的プロモーターを有する発現カセットを含む。植物ベクターｐＭＯＮ６３９３４は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ノパリンシンターゼ遺伝子（Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３、配列番号１５８）由来の３’ＵＴＲに作動可能に５’連結された、ウミシイタケ（ｓｅａ  ｐａｎｓｙ）（ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））ルシフェラーゼコード配列（ＣＲ−Ｒｅｎ．ｈＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃｉｆｅ−０：０：１、配列番号１５７）に作動可能に５’連結された、構成的ＥＸＰ配列（ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ−Ｌｈｃｂ１、配列番号１６４）を有する発現カセットを含む。
【００９５】
当該技術分野において周知のＰＥＧに基づく形質転換法を用いて、トウモロコシの葉のプロトプラストを形質転換した。プロトプラスト細胞を、ｐＭＯＮ１９４３７プラスミドＤＮＡ、ｐＭＯＮ６３９３４プラスミドＤＮＡ、および表１３に示されるプラスミドで形質転換し、完全な暗闇の中で一晩インキュベートした。ＧＵＳおよびルシフェラーゼの両方の測定は、上記実施例２に記載される測定と同様に行った。各ＥＸＰ配列について１つまたは２つの形質転換を行い、各形質転換実験から得たいくつかの試料から各ＥＸＰ配列の平均発現値を決定した。２つの形質転換実験の１つ当たり、各ＥＸＰ配列コンストラクト形質転換の４つのレプリケート、あるいは、各ＥＸＰ配列コンストラクトの３つのレプリケートを用いて、試料測定を行った。平均ＧＵＳ発現レベルおよび平均ルシフェラーゼ発現レベルを表１４に示す。この表では、ホタルルシフェラーゼの値（例えば、ｐＭＯＮ１９４３７の発現からの）は「ＦＬｕｃ」とラベルされたカラムに示され、ウミシイタケルシフェラーゼの値は、「ＲＬｕｃ」とラベルされたカラムに示される。
【表１４】
2018108101.tif 000029
【００９６】
以下の表１５は、トウモロコシプロトプラストにおける、ＥＸＰ−Ｏｓ．Ａｃｔ１：１：９およびＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：１により駆動される発現に対して正規化したＧＵＳ／ＦＬｕｃ発現比およびＧＵＳ／ＲＬｕｃ発現比を示している。
【表１５】
2018108101.tif 000030
【００９７】
上記表１５に示されるように、ＥＸＰ−Ｃｌ．Ｕｂｑ１０（配列番号１６８）は、ＧＵＳの発現を駆動することは可能であったが、両方の構成的対照の発現よりも低いレベルでであった。
【００９８】
また、上記のトウモロコシの葉のプロトプラストの形質転換と同様に、上記表１３に列挙されるプラスミドを用いて、コムギの葉のプロトプラスト細胞を形質転換した。平均ＧＵＳ値および平均ルシフェラーゼ値を以下の表１６に示す。以下の表１７は、トウモロコシプロトプラストにおける、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：１により駆動される発現に対して正規化したＧＵＳ／ＦＬｕｃ発現比およびＧＵＳ／ＲＬｕｃ発現比を示している。
【表１６】
2018108101.tif 000031
【表１７】
2018108101.tif 000032
【００９９】
上記表１７に示されるように、ＥＸＰ−Ｃｌ．Ｕｂｑ１０（配列番号１６８）は、コムギプロトプラスト細胞において、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：１（配列番号１６０）の発現と同様のレベルでＧＵＳを発現した。
【０１００】
実施例５
遺伝子導入型トウモロコシにおけるＧＵＳを駆動する調節エレメントの解析
トウモロコシ植物を、ＧＵＳ導入遺伝子の発現を駆動するＥＸＰ配列を含有する植物発現ベクターで形質転換し、得られた植物をＧＵＳタンパク質発現について解析した。ユビキチンＥＸＰ配列を、当該技術分野において公知の方法を用いて植物バイナリー形質転換プラスミドコンストラクトにクローニングした。
【０１０１】
得られた植物発現ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の右側境界領域、イネ脂質輸送タンパク質遺伝子（Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ−１：１：１、配列番号１５９）由来の３’ＵＴＲに作動可能に５’連結された上記のプロセシング可能なイントロンＧＵＳ−２を有するＧＵＳのコード配列に作動可能に連結されたＥＸＰ配列をアッセイするための第一の発現カセット；除草剤グリフォセートに対する耐性を付与する形質転換植物細胞の選択に用いられる第二の導入遺伝子選択カセット（イネアクチン１プロモーターにより駆動される）、並びにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の左側境界領域を含有する。得られたプラスミドを用いて、トウモロコシ植物を形質転換した。表１８は、表１にも記載されている、プラスミド命名、ＥＸＰ配列および配列番号を列挙している。
【表１８】
2018108101.tif 000033
【０１０２】
植物は、例えば米国特許出願公開第２００９／０１３８９８５号に記載されるアグロバクテリウム属を介した形質転換を用いて形質転換した。
【０１０３】
組織化学的なＧＵＳ解析を形質転換植物の定性的発現解析に用いた。全組織切片を、ＧＵＳ染色溶液Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−グルクロニド）（１ｍｇ／ｍｌ）と一緒に適切な時間インキュベートし、すすいで、青色着色を目で検査した。ＧＵＳ活性を、選択された植物の器官および組織を用いる、直接的な目視検査または顕微鏡下での検査によって、定性的に決定した。Ｒ０植物を、受粉の２１日後に（２１ＤＡＰ）、根および葉、および葯、ひげ、並びに発生中の種子および胚における発現について検査する。
【０１０４】
定量分析において、全タンパク質を形質転換されたトウモロコシ植物の選択された組織から抽出した。５０μｌの総反応体積で、蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）と一緒に、１マイクログラムの全タンパク質を用いた。反応産物４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）は、ヒドロキシル基がイオン化される高ｐＨにおいて蛍光が最大になる。塩基性溶液である炭酸ナトリウムを添加することにより、蛍光性産物を定量化するための、アッセイの停止およびｐＨの調整を同時に行う。Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−３（堀場製作所；京都、日本）を用い、スリット幅を励起２ｎｍおよび蛍光３ｎｍに設定したＭｉｃｒｏｍａｘ  Ｒｅａｄｅｒを用いて、３６５ｎｍの励起、４４５ｎｍの蛍光で、蛍光を測定した。
【０１０５】
各形質転換において観察された平均Ｒ０  ＧＵＳ発現を以下の表１９および表２０に示す。
【表１９】
2018108101.tif 000034
【表２０】
2018108101.tif 000035
【０１０６】
Ｒ０トウモロコシ植物において、葉および根におけるＧＵＳ発現レベルは、ユビキチンＥＸＰ配列間で異なっていた。全てのＥＸＰ配列が安定に形質転換された植物においてＧＵＳ導入遺伝子発現を駆動する能力を示したが、各ＥＸＰ配列は他と比較して独特な発現パターンを示した。例えば、ＥＸＰ配列、ＥＸＰ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号１）、ＥＸＰ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号５）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号１３）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：９（配列番号１８）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ２：１：８（配列番号２７）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ２：１：９（配列番号３０）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ１：１：６（配列番号３８）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号４１）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２：１：１４（配列番号５２）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２：１：１５（配列番号５５）、ＥＸＰ−ＭＩＳｓｉ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号７６）、ＥＸＰ−ＳＯＲｎｕ．Ｕｂｑ１：１：６（配列番号９２）、ＥＸＰ−ＳＯＲｎｕ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号９５）、ＥＸＰ−ＳＥＴｉｔ．Ｕｂｑ１：１：１０（配列番号９９）、ＥＸＰ−Ｓｖ．Ｕｂｑ１：１：１１（配列番号１１４）、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：１２（配列番号１３２）、およびＥＸＰ−Ｓｂ．Ｕｂｑ７：１：２（配列番号１５０）は、ＥＸＰ−Ｓｖ．Ｕｂｑ１：１：１２（配列番号１２０）、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：１０（配列番号１２６）、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：１１（配列番号１３８）、ＥＸＰ−Ｓｂ．Ｕｂｑ４：１：２（配列番号１４０）、およびＥＸＰ−Ｓｂ．Ｕｂｑ６：１：３（配列番号１４８）と比較して、Ｖ３およびＶ７発生期の根においてより低レベルのＧＵＳ発現を示した。ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号１３）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：９（配列番号１８）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号４１）、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：１１（配列番号１３８）、およびＥＸＰ−Ｓｂ．Ｕｂｑ６：１：３（配列番号１４８）について、より遅い根の発生期（ＶＴ）において、より高レベルのＧＵＳ発現が観察された。ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：１０（配列番号１４０）によって駆動される根での発現は、Ｖ３で発現を示さなかったが、Ｖ７で高く、その後ＶＴ期で低下した。ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：１１（配列番号１５０）によって駆動される根での発現は、Ｖ３期から、Ｖ７期、ＶＴを通じて、発生の全体を通じて、同様のレベルに維持された。ＥＸＰ−Ｃｌ．Ｕｂｑ１０（配列番号１６８）によって駆動されるＧＵＳの発現は、Ｖ４期からＶ７期まで比較的一様であったが、ＶＴ期にＶ４およびＶ７の発現のおよそ半分に低下した。
【０１０７】
ＧＵＳ発現レベルは葉組織においても劇的な違いを示した。ＥＸＰ配列の、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：１０（配列番号１２６）、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：１２（配列番号１３２）およびＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：１１（配列番号１３８）は、３つ全ての発生期（Ｖ３、Ｖ７およびＶＴ）にわたって観察される最高レベルのＧＵＳ発現を示した。ＥＸＰ配列のＥＸＰ−Ｓｂ．Ｕｂｑ４：１：２（配列番号１４０）は、発生のＶ３期からＶＴ期まで発現の減少を示した。ＥＸＰ配列の、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号１３）およびＥＸＰ−Ｓｂ．Ｕｂｑ７：１：２（配列番号１５０）は、発生のＶ３期およびＶＴ期においてより高レベルのＧＵＳ発現を示し、Ｖ７期における成長中により低レベルの発現を示した。ＥＸＰ配列の、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ２：１：９（配列番号３０）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号４１）、およびＥＸＰ−ＭＩＳｓｉ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号７６）は、３つ全ての期にわたってＧＵＳ発現を維持し、一方、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ２：１：８（配列番号２７）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ１：１：６（配列番号３８）、およびＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２：１：１５（配列番号５５）は、ＶＴ期に発現の僅かな減少を示した。ＥＸＰ−Ｃｌ．Ｕｂｑ１０（配列番号１６８）によって駆動された発現は、Ｖ４期およびＶＴ期においては同様であったが、Ｖ７期にＶ４およびＶＴのレベルの約半分に低下した。
【０１０８】
生殖組織（葯およびひげ）に関しても同様に、各ＥＸＰ配列に独特な異なる発現パターンが観察された。例えば、ＥＸＰ配列のＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号１３）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：９（配列番号１８）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２：１：１４（配列番号５２）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２：１：１５（配列番号５５）、ＥＸＰ−ＳＯＲｎｕ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号９５）、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：１０（配列番号１２６）、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：１２（配列番号１３２）、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：１１（配列番号１３８）、およびＥＸＰ−Ｓｂ．Ｕｂｑ７：１：２（配列番号１５０）について、葯およびひげにおいて高レベルの発現が観察された。ＥＸＰ配列のＥＸＰ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号１）、ＥＸＰ−ＳＯＲｎｕ．Ｕｂｑ１：１：６（配列番号９２）、ＥＸＰ−Ｓｖ．Ｕｂｑ１：１：１１（配列番号１１４）、ＥＸＰ−Ｓｖ．Ｕｂｑ１：１：１２（配列番号１２０）、ＥＸＰ−Ｓｂ．Ｕｂｑ４：１：２（配列番号１４０）、ＥＸＰ−Ｓｂ．Ｕｂｑ６：１：３（配列番号１４８）、およびＥＸＰ−Ｃｌ．Ｕｂｑ１０（配列番号１６８）によって駆動された発現は、各ＥＸＰ配列に関して、葯において高かったが、ひげにおいてより低く、一方、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ１：１：６（配列番号３８）によって駆動された発現は、葯における発現と比較して、ひげにおいてより高かった。
【０１０９】
発生中の種子（２１ＤＡＰの胚および胚乳）における発現は、ＥＸＰ配列間で異なっていた。ＥＸＰ配列の、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：１０（配列番号１２６）、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：１２（配列番号１３２）、およびＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：１１（配列番号１３８）は、発生中の種子の胚および胚乳組織においてＧＵＳの高い発現を駆動した。胚乳における発現レベルは、ＧＵＳがＥＸＰ配列の、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号１３）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ１：１：９（配列番号１８）、ＥＸＰ−ＡＲＵｄｏ．Ｕｂｑ２：１：８（配列番号２７）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２：１：１４（配列番号５２）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ２：１：１５（配列番号５５）、ＥＸＰ−ＳＯＲｎｕ．Ｕｂｑ１：１：６（配列番号９２）、ＥＸＰ−ＳＯＲｎｕ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号９５）、ＥＸＰ−Ｓｖ．Ｕｂｑ１：１：１２（配列番号１２０）、ＥＸＰ−Ｓｂ．Ｕｂｑ４：１：２（配列番号１４０）、およびＥＸＰ−Ｃｌ．Ｕｂｑ１０（配列番号１６８）によって駆動された場合に、胚における発現レベルよりも約２倍以上高かった。ＧＵＳの発現は、ＥＸＰ−Ｓｂ．Ｕｂｑ７：１：２（配列番号１５０）によって駆動された場合、胚乳においてよりも、胚において３倍高かった。ＧＵＳ発現レベルは、ＥＸＰ配列のＥＸＰ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号１）、ＥＸＰ−ＡＧＲｎｅ．Ｕｂｑ１：１：８（配列番号５）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ１：１：６（配列番号３８）、ＥＸＰ−ＢＯＵｇｒ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号４１）、ＥＸＰ−ＭＩＳｓｉ．Ｕｂｑ１：１：７（配列番号７６）、ＥＸＰ−ＳＥＴｉｔ．Ｕｂｑ１：１：１０（配列番号９９）、およびＥＸＰ−Ｓｂ．Ｕｂｑ６：１：３（配列番号１４８）によって駆動された場合、胚および胚乳において相対的に等しかった。
【０１１０】
各ＥＸＰ配列は、安定に形質転換されたトウモロコシ植物において、導入遺伝子発現を駆動する能力を示した。しかし、各ＥＸＰ配列は、独特であり、所望の結果を達成するために必要な組織発現戦略に応じて特定の導入遺伝子の発現を最良に提供するＥＸＰ配列を選択する機会を提供する、各組織の発現パターンを有した。本実施例は、相同遺伝子から単離されたＥＸＰ配列が形質転換植物において必ずしも等しく振舞わないこと、および発現は各ＥＸＰ配列の特性の実験的調査を通じてのみ決定することができ、プロモーターが由来する遺伝子相同性に基づいて予測することはできないことを示している。
【０１１１】
実施例６
調節エレメント由来のエンハンサー
エンハンサーは、配列番号：２、６、８、１０、１４、１７、２２、２４、２８、３１、３３、３５、３９、４２、４４、４６、５０、５３、５６、６１、６３、６７、７１、７３、７５、７７、７９、８３、８５、８７、８９、９３、９６、９８および１６９として提供されるプロモーター等の、本明細書で提供されるプロモーターエレメントに由来する。エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントに作動可能に５’もしくは３’連結された場合、またはプロモーターに作動可能に連結されたさらなるエンハンサーエレメントに作動可能に５’もしくは３’連結された場合に、導入遺伝子の発現を強化もしくは調節できる、または、特定の細胞型もしくは植物器官においてもしくは発生もしくは概日リズムにおける特定の時点で導入遺伝子の発現を提供できる、一つまたは複数のシス調節エレメントから構成され得る。エンハンサーは、上記の通り本明細書で提供されるプロモーターからの転写開始を可能にするプロモーターから、ＴＡＴＡボックスまたは機能的に類似したエレメントおよびあらゆる下流ＤＮＡ配列を取り除いたものであり、ＴＡＴＡボックスまたは機能的に類似したエレメントおよびＴＡＴＡボックスの下流のＤＮＡ配列が取り除かれたその断片を含む。
【０１１２】
エンハンサーエレメントは、本明細書で提供されるプロモーターエレメントに由来し得、当該技術分野において公知の方法を用いて、プロモーターエレメントに作動可能に５’もしくは３’連結されるように、またはプロモーターに作動可能に連結されたさらなるエンハンサーエレメントに作動可能に５’もしくは３’連結されるようにクローン化され得る。あるいは、エンハンサーエレメントは、当該技術分野において公知の方法を用いて、プロモーターエレメントに作動可能に５’もしくは３’連結された、またはプロモーターに作動可能に連結されたさらなるエンハンサーエレメントに作動可能に５’もしくは３’連結された、１コピーまたは複数コピーのエンハンサーエレメントに作動可能に連結されるように、クローン化される。エンハンサーエレメントはまた、異なる属の生物に由来するプロモーターエレメントに作動可能に５’もしくは３’連結されるように、または同じもしくは異なる属の生物に由来するプロモーターに作動可能に連結された他の属の生物もしくは同じ属の生物に由来するさらなるエンハンサーエレメントに作動可能に５’もしくは３’連結されるように、クローン化されることで、キメラ調節エレメントを生じ得る。ＧＵＳ発現植物形質転換ベクターは、先の実施例に記載されるコンストラクトと同様の当該技術分野において公知の方法を用いて構築され、得られた植物発現ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の右側境界領域、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のノパリンシンターゼ３’ＵＴＲ（Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３、配列番号１５８）またはイネ脂質輸送タンパク質遺伝子（Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ−１：１：１、配列番号１６０）由来の３’ＵＴＲに作動可能に連結された、プロセシング可能なイントロンを有する（ＧＵＳ−２、配列番号１５５）もしくはイントロンを有さない（ＧＵＳ−１、配列番号１５４）ＧＵＳコード配列に作動可能に連結された、トウモロコシ（Ｚ．  ｍａｙｓ）のＨＳＰ７０熱ショックタンパク質に由来するイントロン（Ｉ−Ｚｍ．ＤｎａＫ−１：１：１配列番号１６５）、または本明細書に提供されるイントロンのいずれか、またはあらゆる他のイントロンに作動可能に連結された、調節エレメントまたはキメラ調節エレメントから構成される、調節エレメントまたはキメラ調節エレメントを試験するための第一の発現カセット；除草剤グリフォセート（イネアクチン１プロモーターによって駆動）または抗生物質カナマイシン（イネアクチン１プロモーターによって駆動）に対する耐性を付与する形質転換植物細胞の選択に用いられる第二の導入遺伝子選択カセット、並びにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の左側境界領域を含有する。得られたプラスミドは、上記方法による、または当該技術分野において公知の他のアグロバクテリウム属を介した方法もしくはパーティクル・ガン法による、トウモロコシ植物または他の属の植物の形質転換に用いられる。あるいは、トウモロコシまたは他の属の植物に由来するプロトプラスト細胞は、トランジェントアッセイを行うための当該技術分野におい���公知の方法を用いて形質転換される。
【０１１３】
一つまたは複数のエンハンサーを含む調節エレメントによって駆動されるＧＵＳ発現を、安定または一過的な植物アッセイにおいて評価して、導入遺伝子の発現に対するエンハンサーエレメントの影響を決定する。一つもしくは複数のエンハンサーエレメントに対する調節または一つまたは複数のエンハンサーエレメントの重複を、経験的な実験法、および各調節エレメント成分を用いることで観察される結果として生じる遺伝子発現調節に基づいて、行う。得られる調節エレメントまたはキメラ調節エレメント内での一つまたは複数のエンハンサーの相対位置の変更は、調節エレメントまたはキメラ調節エレメントの転写活性または特異性に影響を及ぼし得、トウモロコシ植物または他の属の植物内での所望の導入遺伝子発現プロファイルのために最良のエンハンサーを特定するために、実験により決定される。
【０１１４】
実施例７
植物由来プロトプラストを用いたＧＵＳ活性のイントロン増強の解析
導入遺伝子の最適な発現のためのベクタートランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）エレメント配置内でのイントロンおよび立体配置を実験的に選択するための、実験法、および無イントロン発現ベクター対照との比較に基づいて、イントロンを選択する。例えば、グリフォセートに対する耐性を付与するＣＰ４等の除草剤耐性遺伝子の発現では、除草剤を施用する際に収穫量の減少を防ぐために、生殖組織および栄養組織内で導入遺伝子が発現されることが望ましい。この例におけるイントロンは、構成的プロモーターに作動可能に連結された場合に、特に遺伝子導入植物の生殖細胞および生殖組織内で、除草剤抵抗性を付与する導入遺伝子の発現を増強し、それにより、除草剤を散布された際に、遺伝子導入植物に栄養性耐性および生殖性耐性の両方を与えるその能力に基づいて、選択されるであろう。ほとんどのユビキチン遺伝子において、５’ＵＴＲは、イントロン配列が埋め込まれたリーダーを含む。そのため、そのような遺伝子に由来する調節エレメントは、プロモーター、リーダー、およびイントロンを含む完全５’ＵＴＲを用いてアッセイされる。様々な発現プロファイルを達成するため、または導入遺伝子の発現レベルを調節するため、そのような調節エレメントに由来するイントロンを、除去する、または異種のイントロンと置換することができる。
【０１１５】
配列番号：４、１２、１５、２０、２６、２９、３７、４０、４８、５１、５４、５７、５９、６５、６９、８１、９１、９４および１７１として本明細書で提供されるイントロンは、ゲノムＤＮＡ内でエクソン配列およびイントロン配列を特定するための、発現された配列タグクラスターまたはｃＤＮＡコンティグとの比較において、ゲノムＤＮＡコンティグを用いて、特定される。さらに、５’ＵＴＲまたはリーダー配列は、遺伝子配列が、一つまたは複数のイントロンによって中断されているリーダー配列をコードする場合の条件下で、一つまたは複数のイントロンのイントロン／エクソンスプライスジャンクションを定義するためにも用いられる。イントロンは、例えば、図９に示される発現カセットで示されるように、当該技術分野において公知の方法を用いて、調節エレメントおよびリーダー断片に作動可能に３’連結されるように、且つ、第二のリーダー断片またはコード配列のどちらかに作動可能に５’連結されるように、植物形質転換ベクターにクローン化される。
【０１１６】
従って、例えば、第一の可能な発現カセット（図９の発現カセット立体配置１）は、３’ＵＴＲエレメント［Ｅ］に作動可能に連結された、コード領域［Ｄ］に作動可能に連結された、試験イントロンエレメント［Ｃ］に作動可能に５’連結された、リーダーエレメント［Ｂ］に作動可能に５’連結された、プロモーターエレメントまたはキメラプロモーターエレメント［Ａ］で構成される。あるいは、第二の可能な発現カセット（図９の発現カセット立体配置２）は、３’ＵＴＲエレメント［Ｋ］に作動可能に連結された、コード領域［Ｊ］に作動可能に連結された、第二リーダーエレメントまたは第一リーダーエレメントの第二断片［Ｉ］に作動可能に５’連結された、試験イントロンエレメント［Ｈ］に作動可能に５’連結された、第一リーダーエレメントまたは第一リーダーエレメント断片［Ｇ］に作動可能に５’連結された、プロモーターエレメントまたはキメラプロモーターエレメント［Ｆ］で構成される。さらに、第三の可能な発現カセット（図９の発現カセット立体配置３）は、３’ＵＴＲエレメント［Ｑ］に作動可能に連結された、コード配列エレメントの第二断片［Ｐ］に作動可能に５’連結された、イントロンエレメント［Ｏ］に作動可能に５’連結された、コード配列エレメントの第一断片［Ｎ］に作動可能に５’連結された、リーダーエレメント［Ｍ］に作動可能に５’連結された、プロモーターエレメントまたはキメラプロモーターエレメント［Ｌ］で構成される。発現カセット立体配置３は、コード配列の第一断片と第二断片との間でフレームシフトを起こさずに完全なオープンリーディングフレームを生み出すような、イントロンのスプライシングを可能にするように設計されている。
【０１１７】
前述の通り、メッセンジャーＲＮＡの最終転写物へのプロセシングの間に望まれない開始コドンが形成される可能性を排除するために、スプライス部位（ＧＴ）の５’末端の直前でのヌクレオチド配列ＡＴまたはヌクレオチドＡの使用、およびスプライス部位（ＡＧ）の３’末端のそれぞれ直後でのヌクレオチドＧまたはヌクレオチド配列ＴＧの使用を避けることは、好ましい場合がある。イントロンの５’または３’末端スプライスジャンクション部位の周囲のＤＮＡ配列は、このように調節され得る。
【０１１８】
イントロンは、トランジェントアッセイまたは安定な植物アッセイにおいて、発現を増強する能力による増強作用についてアッセイされる。イントロン増強のトランジェントアッセイにおいて、ベースとなる植物ベクターは、当該技術分野において公知の方法を用いて構築される。イントロンは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のノパリンシンターゼ３’ＵＴＲ（Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３、配列番号１５８）に作動可能に連結された、プロセシング可能なイントロン（ＧＵＳ−２、配列番号１５５）を有する、またはイントロンを有さない（ＧＵＳ−１、配列番号１５４）、ＧＵＳコード配列に作動可能に連結された、試験イントロンエレメント（例えば、配列番号：４、１２、１５、２０、２６、２９、３７、４０、４８、５１、５４、５７、５９、６５、６９、８１、９１、９４および１７１のうちの１つ）に作動可能に５’連結された、リーダーエレメント、Ｌ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−１：１：１５（配列番号１６７）に作動可能に５’連結された、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、Ｐ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ−１：１：９（配列番号１６６）等の構成的プロモーターで構成される、発現カセットを含むベースとなる植物ベクターにクローニングされる。トウモロコシまたは他の属の植物組織に由来するプロトプラスト細胞は、上記実施例２の前述のように、ベースとなる植物ベクターおよびルシフェラーゼ対照ベクターで形質転換され、活性についてアッセイされる。発現を増強するイントロンの相対活性を比較するために、ＧＵＳ値はルシフェラーゼ活性に対するＧＵＳの比として表され、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）のＨＳＰ７０熱ショックタンパク質に由来するイントロン、Ｉ−Ｚｍ．ＤｎａＫ−１：１：１（配列番号１６５）等の既知のイントロンスタンダードに作動可能に連結された構成的プロモーターを含むコンストラクトによって与えられるレベル、並びにプロモーターに作動可能に連結されたイントロンを有さない構成的プロモーターを含むコンストラクトによって与えられるレベルと比較される。
【０１１９】
配列番号：４、１２、１５、２０、２６、２９、３７、４０、４８、５１、５４、５７、５９、６５、６９、８１、９１、９４および１７１として提供されるイントロンの安定な植物アッセイにおいて、ＧＵＳ発現植物形質転換ベクターは、先の実施例に記載されたコンストラクトと同様に構築され、得られる植物発現ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の右側境界領域、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のノパリンシンターゼ３’ＵＴＲ（Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３、配列番号１５８）に作動可能に連結された、プロセシング可能なイントロンを有する（ＧＵＳ−２、配列番号１５５）、またはイントロンを有さない（ＧＵＳ−１、配列番号１５４）、ＧＵＳコード配列に作動可能に連結された、本明細書で提供される試験イントロンエレメントに作動可能に５’連結された、リーダーエレメント、Ｌ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−１：１：１５（配列番号１６７）に作動可能に５’連結された、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、Ｐ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ−１：１：９（配列番号１６６）等の構成的プロモーターで構成される、イントロンを試験するための第一の発現カセット；グリフォセート（イネアクチン１プロモーターによって駆動）または抗生物質カナマイシン（イネアクチン１プロモーターによって駆動）に対する耐性を付与する形質転換植物細胞の選択に用いられる第二の導入遺伝子選択カセット、並びにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の左側境界領域を含有する。得られたプラスミドは、上記方法による、または当該技術分野において公知のアグロバクテリウム属を介した方法による、トウモロコシ植物または他の属の植物の形質転換に用いられる。単一コピーまたは低コピー数の形質転換体が、試験イントロンを有さない以外は試験ベクターと同一の植物形質転換ベクターで形質転換した単一コピーまたは低コピー数の形質転換植物との比較のために選択され、試験イントロンがイントロン媒介増強作用を与えるかどうかが決定される。
【０１２０】
配列番号：４、１２、１５、２０、２６、２９、３７、４０、４８、５１、５４、５７、５９、６５、６９、８１、９１、９４および１７１として提供されるいかなるイントロンも、発現を増強し得るイントロンを有する断片の発現または重複を減少させ得る、イントロン配列内の断片の除去等のいくつかの方法で、改変され得る。さらに、特定の細胞型または組織および生物への発現特異性に影響を与え得るイントロン内のＤＮＡ配列は、重複または変化または除去されることで、導入遺伝子の発現および発現パターンに影響を与え得る。さらに、本明細書で提供されるイントロンは、意図していない転写物が、異なる、より長い、または切断されたタンパク質として、不適切にスプライシングされたイントロンから発現されることを引き起こし得る、あらゆる可能な開始コドン（ＡＴＧ）を除去するように改変され得る。イントロンが実験的に試験された後、またはイントロンが実験法に基づいて改変された後、イントロンは、導入遺伝子を増強しない限り、あらゆる属の単子葉類植物または双子葉類植物であり得る安定に形質転換された植物において、導入遺伝子の発現を増強するために用いられる。イントロンはまた、作動可能に連結された導入遺伝子の発現の増強もしくは減弱または特異性を与えない限り、藻類、真菌、または動物細胞等の他の生物においても、発現を増強するために用いられ得る。
【０１２１】
本発明の原理が例示および説明されたが、本発明がそのような原理から逸脱することなく配置および詳細において変更可能であることは、当業者には明らかであるはずである。特許請求の範囲の精神および範囲に含まれる全ての変更形態が特許請求される。本明細書で引用された全ての刊行物および公開特許文献は、各々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることを具体的且つ個々に示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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【配列表】
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