(57)【要約】      （修正有）【課題】飼料作物の品質の向上、またはより早く利用可能なバイオマスの強化ための、改善された飼料価値および管理の増大した柔軟性を有するアルファルファ植物を選択する方法の提供。【解決手段】飼料作物としての遺伝子導入アルファルファ植物は低減されたレベルの酸性デタージェントリグニン（ＡＤＬ）、低減されたレベルのグアイアシルリグニン（Ｇリグニン）、向上されたレベルの中性デタージェント繊維消化率（ＮＤＦＤ）、および野生型と比較可能な植物生長力を有し、結果として向上した農業適合性を有する、アルファルファ植物の個体群から、改良された飼料価値成分を有するアルファルファ植物を選択する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファルファ植物の個体群から、改良された飼料価値成分を有するアルファルファ植物を選択する方法であって、前記アルファルファ植物の個体群は組換えＤＮＡ分子を含み、前記組換えＤＮＡ分子の一部が配列番号１または配列番号２に対して相同的もしくは相補的であり、
（ａ）前記アルファルファ植物の個体群内の前記アルファルファ植物の各々からの下茎組織内の酸性デタージェントリグニン（ＡＤＬ）の濃度を測定することであって、前記ＡＤＬの濃度が、前記ＤＮＡ分子を含まないアルファルファ植物の下茎組織と比較して、１２％から約３１％減少される、測定することと、
（ｂ）前記下茎組織内のグアヤシルリグニン（Ｇリグニン）の濃度を測定することであって、前記Ｇリグニンが、前記ＤＮＡ分子を含まないアルファルファ植物の下茎組織と比較して、前記下茎組織内で約２５％以上減少される、測定することと、
（ｃ）前記下茎組織内の中性デタージェント繊維消化率（ＮＤＦＤ）成分を測定することであって、前記ＮＤＦＤ価が、前記ＤＮＡ分子を含まないアルファルファ植物の下茎組織と比較して、前記下茎組織内で１８％より多く増大される、測定することと、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）の前記改良された飼料価値成分を含むアルファルファ植物を選択することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）で選択された前記アルファルファ植物を栽培することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記組換えＤＮＡ分子が、植物維管束組織内の操作可能に結合したＤＮＡ分子の転写が可能なプロモーター分子を含み、前記操作可能に結合したＤＮＡ分子の一部が配列番号１または配列番号２に対して相同的もしくは相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アルファルファ植物の生長の生長力を測定し、さらに前記生長力が、前記組換えＤＮＡ分子を含まないアルファルファ植物と比較して、９０％以上であることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
干草または低水分サイレージが前記アルファルファ植物を栽培することで生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記干草または低水分サイレージが、前記改良された飼料価値成分について測定されることが、
（ａ）前記干草または低水分サイレージのサンプルのＡＤＬ濃度を測定することであって、前記ＡＤＬ濃度が、前記組換えＤＮＡ分子を含まないアルファルファ干草と比較して、８０％から９２％である、測定することと、
（ｂ）前記干草または低水分サイレージのサンプル内の中性デタージェント繊維消化率（ＮＤＦＤ）を測定することであって、前記ＮＤＦＤ価が、前記組換えＤＮＡ分子を含まないアルファルファ干草と比較して、１０７％から１２５％である、測定することと、を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アルファルファ植物を成熟まで栽培し、前記植物から後代のアルファルファ種子を採取することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
請求項６の方法で生産されたアルファルファ種子であり、前記種子が組換えＤＮＡ分子を含み、前記組換えＤＮＡ分子の一部が配列番号１または配列番号２に対して相同的もしくは相補的である、種子。
【請求項８】
請求項７の種子から栽培されたアルファルファ植物であって、前記植物が、前記組換えＤＮＡ分子を含まないアルファルファ植物の下茎組織および干草と比較して、下茎組織内に１２％から３１％減少されたＡＤＬ濃度、および前記植物から生産された干草内に８０％から９２％減少されたＡＤＬ濃度を含む、アルファルファ植物。
【請求項９】
請求項７の種子から栽培されたアルファルファ植物であって、前記植物が、前記組換えＤＮＡ分子を含まないアルファルファ植物の下茎組織または干草と比較して、下茎組織内に２５％以上減少されたＧリグニン濃度を含む、アルファルファ植物。
【請求項１０】
請求項７の種子から栽培されたアルファルファ植物であって、前記植物が、前記組換えＤＮＡ分子を含まないアルファルファ植物の下茎組織と比較して、下茎組織内に１２２％以上増大されたＮＤＦＤ価を含む、アルファルファ植物。
【請求項１１】
請求項７の種子から栽培されたアルファルファ植物であって、前記植物が、前記組換えＤＮＡ分子を含まないアルファルファ植物の干草と比較して、前記植物から生産された干草内に約１０７％から約１２５％またはそれ以上増大されたＮＤＦＤ価を含む、アルファルファ植物。
【請求項１２】
改良された飼料価値成分を有するアルファルファ干草であって、前記干草は組換えＤＮＡ分子を含み、前記組換えＤＮＡ分子の一部が配列番号１または配列番号２に対して相同的もしくは相補的であり、
（ａ）前記組換えＤＮＡ分子を含まないアルファルファ干草のＡＤＬ濃度の約８０％から約９２％のＡＤＬ濃度と、
（ｂ）前記組換えＤＮＡ分子を含まないアルファルファ干草と比較して、約２５％以上減少されたＧリグニン濃度と、
（ｃ）前記組換えＤＮＡ分子を含まないアルファルファ干草と比較して、１０７％から１２５％のＮＤＦＤ価と、をさらに含む、アルファルファ干草。
【請求項１３】
改良された飼料価値成分を含む処理済みアルファルファ生産物であって、前記生産物は組換えＤＮＡ分子を含み、さらに前記組換えＤＮＡ分子の一部が配列番号１または配列番号２に対して相同的もしくは相補的であり、
（ａ）前記組換えＤＮＡ分子を含まないアルファルファ生産物のＡＤＬ濃度の約８０％から約９２％のＡＤＬ濃度と、
（ｂ）前記組換えＤＮＡ分子を含まないアルファルファ生産物と比較して、約２５％以上減少されたＧリグニン濃度と、
（ｃ）前記組換えＤＮＡ分子を含まないアルファルファ生産物と比較して、１０７％から１２５％のＮＤＦＤ価と、をさらに含む前記理済みアルファルファ生産物。
【請求項１４】
前記低水分サイレージが、前記干草のサンプルのＡＤＬ濃度の測定を含む改良された前記飼料価値成分のために測定され、さらに前記ＡＤＬ濃度が、商品アルファルファと比較して下茎内で１５％から３０％、植物内で８％から１５％減少される、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
改善された飼料品質および良好な農業生産力を産出するため、１つ以上の遺伝子組換え事象が選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本願は、その開示全体が参照によってここに具体的に引用される、２０１２年６月２６日に出願された米国特許仮出願第６１／６６４，３５９号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は植物の遺伝子工学に関する。より具体的には、本発明は飼料作物の栄養価を改良するための方法に関する。
【０００３】
配列表の引用
２０１３年６月２５日に作成され、電子的に提出された、１８キロバイト（マイクロソフトウィンドウズ（登録商標）にて計測されるとおりのサイズ）であるファイル名「ＭＯＮＳ３３６ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」の配列表を、参照によって本明細書に引用する。
【背景技術】
【０００４】
本発明は遺伝子工学による方法および組成物を提供し、遺伝子導入アルファルファ植物は低減されたレベルの酸性デタージェントリグニン（ＡＤＬ）、低減されたレベルのグアイアシルリグニン（Ｇリグニン）、向上されたレベルの中性デタージェント繊維消化率（ＮＤＦＤ）、および野生型と比較可能な植物生長力を有し、結果として向上した農業適合性を有する。豆類、イネ科牧草類、コーンサイレージ、およびアブラナ属を含む飼料作物は、数ある中で、動物飼料に可消化繊維を提供するように世界中で生育されている。アルファルファおよび／またはアルファルファ牧乾草は米国において最も重要な乾草作物である。主にこん包乾草として与えられているが、サイレージ、切り乾草、キューブまたはペレットとして与えられてもよい。アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ（ムラサキウマゴヤシ））はマメ科牧草であり、乳牛用飼料の２３％〜３４％を構成してもよい。良質なアルファルファ乾草は非常に消化しやすく、高タンパク質、エネルギー、ビタミンおよびミネラルを提供する。良質なアルファルファはさらに、低セルロースおよびヘミセルロース、低リグニン、低繊維、ならびに高相対飼料価値を含有する。アルファルファ飼料価値はしばしばＮＤＦＤとして計測される。ＮＤＦＤを得るためにアルファルファ飼料を分析することで、牛がその飼料から得ることのできるエネルギー量の予測を提供し、アルファルファの繊維消化率を向上させる必要がある。例えば、１パーセント単位でＮＤＦＤが増加すると、結果として１日毎の飼料乾物摂取量（ｌｂ／ｄ）は０．３７ポンド増加し、４％脂肪補正乳（ＦＣＭ）生産高は０．５５ｌｂ／ｄ増加する。より高いＮＤＦＤを有する飼料を与えられた牛は、飼料からより多くの合計エネルギー量および栄養価を得ることができる。結果として、規定食に穀類をより少なく与えながらもエネルギー必要量を満たすことができる。飼料用豆類におけるより低いＮＤＦＤはしばしば飼料植物の成熟度に関連しており、これはリグニン濃度の増加を伴い、セルロース繊維の増加と関連している。
【０００５】
ＮＤＦＤに影響を与える要因に酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）の量が含まれる。ＡＤＦは飼料の細胞壁部を指し、飼料の最も消化しにくい部分であり、リグニン、セルロース、シリカおよび不溶性の窒素を含む。これらの値は家畜の飼料の消化率に関するために特に重要である。より高いＡＤＦを有する飼料はより低いＡＤＦを有する飼料よりも可消化エネルギーが低い。したがって、ＡＤＦレベルが増加するにつれて、可消化エネルギーレベルは低下する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は遺伝子工学による方法および組成物を提供し、遺伝子導入アルファルファ植物が、例えばＡＤＬおよびＧリグニンの低減濃度、少なくとも同等な生長力による下位茎におけるＮＤＦＤの向上されたレベル、および本発明のＤＮＡ分子を備えない非遺伝子導入コントロール植物と比較した農業適合性など、改良された飼料価値成分を得るために選択されていてもよい。低減リグニンを有するアルファルファ事象は、ＲＮＡｉ構築物を用いてリグニン生合成酵素ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン：カフェオイル−ＣｏＡ  ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）を下方制御することで生成される。全ての構造物は、本明細書に参照によって引用される、米国特許出願公開第２００５／０１７６６７０号に記載される安定化アンチセンス技術を用いた。低減リグニンアルファルファのために事象を選択する方法は、「成熟段階の１０％開花段階の前に刈るときに全植物消化率を８〜１５％増加させる、リグニン含有量の削減である。本方法はアルファルファ植物を個体群のアルファルファ植物から選択するが、そのアルファルファ植物の個体群は配列番号１および配列番号２に対して相同的または相補的である組換えＤＮＡ分子を備える。この方法は、アルファルファ植物の個体群の下位茎を検定し、このような組換えＤＮＡ分子を備えないアルファルファ植物と比較したときに：（１）酸性デタージェントリグニンの濃度が１２％〜３１％の間で低減される、酸性デタージェントリグニンの低減濃度、（２）その濃度が約２５％低減される、グアイアシルリグニンの低減濃度、（３）ＮＤＦＤ値が１８％より多く増加する、増分中性繊維消化率、を有する植物を選択することを含む。
【０００７】
本発明の一態様では、改良飼料価値成分を有する選択されたアルファルファ植物は、組換えＤＮＡ分子を備えないアルファルファ植物と実質的に等しい生長力を有する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、カフェオイルＣｏＡ  ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）、配列番号７に対する抑制構築物で形質転換された改良飼料価値成分を有する遺伝子導入アルファルファ植物を検定して選択する方法を提供し、配列番号１および配列番号２に対して相同的または相補的である組換えＤＮＡ分子の転写を制御する導管増強プロモーターをさらに備える。
【０００９】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の方法によって選択されたアルファルファ植物またはその植物の子孫、もしくはその植物または子孫植物に由来する乾草またはサイレージを提供し、アルファルファ植物または植物製品は配列番号１および配列番号２に対して相同的または相補的であるＤＮＡ分子を備え、ＡＤＬおよびＧリグニンの低減濃度、下位茎におけるＮＤＦＤレベルの向上の結果である改良飼料価値成分を備える。
【００１０】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに示すために添付されている。本発明はこれら図面の１つ以上およびそれらに対応する説明を、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と合わせて参照することによって、よりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】抑制カフェオイルＣｏＡ  ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）を有し、非遺伝子導入事象に比べて８０％〜９１％の間のＡＤＬ濃度、１１０％〜１２５％の間のＮＤＦＤ値、およびより低いＧリグニン値を有するエリート遺伝子導入アルファルファ事象を図示し、黒で輪郭線を示す。
【図２】「スイートスポット」と定義される、改良飼料消化率および改良栄養価において百分率ＡＤＬ、ＮＤＦＤおよび生長力のレベルに基づく必要な性能基準を満たすＫＫ１７９−２について、エリート事象および低減リグニンアルファルファ事象を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
配列の簡単な説明
配列番号１−ＣＣｏＡＯＭＴゲノム１１３９９８７：１ＣＲ−Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ（ムラサキウマゴヤシ）ＣＣｏＡＯＭＴ−１：１：１（センス方向）の配列。
配列番号２−１１５０５３６：１ＣＲ−Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（タルウマゴヤシ）ＣＣｏＡＯＭＴ−１：１：２（アンチセンス方向）の配列。
配列番号３−センスとアンチセンスアームとの間のＲＮＡループの配列（３７４−５３０ｂｐ）。
配列番号４−ＲＮＡループの５’末端の配列（７−７３ｂｐ）。
配列番号５−１１４１２６６：１プロモーター（Ｐ）−Ｐｖ．Ｐａｌ２−１：１：１の配列。
配列番号６−１１４１２６７：１リーダー（Ｌ）−Ｐｖ．Ｐａｌ２−１：１：１の配列。
配列番号７−ｐＭＯＮ１０００５２  ＣＡＳ−Ｐｖ．Ｐａｌ２／／ＳＵＰ−ＣＣｏＡＯＭＴ／／ｎｏｓ；ＣＡＳ−ＣａＭＶ．３５Ｓ／／ｎｐｔ２／／ｎｏｓの配列。
【００１３】
本発明は改良の必要性を有する飼料作物の飼料価値を改良するために選択する方法を提供する。この方法の態様は、例えば、アルサイククローバ、イガマメ、ハギ属、クラクローバ、ラジノクローバ、ムラサキツメクサ、シロツメクサ、スイートクローバ、ミヤコグサ、レンゲミルクヴェッチ、クラウンベッチ、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、およびアルファルファを含むがこれに限定されないさまざまな飼料作物に適用することができる。
【００１４】
本発明にかかる方法は、組換えＤＮＡ構築物で形質転換されていないアルファルファ植物に比較して低酸性デタージェントリグニン（ＡＤＬ）、低グアイアシルリグニン（Ｇ−リグニン）、高中性デタージェント繊維消化率（ＮＤＦＤ）、および少なくとも実質的に同等か向上した生長力の選択基準を用いて、リグニン生合成経路内のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン：カフェオイル−ＣｏＡ  ３−Ｏメチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴまたはＣＣＯＭＴ）酵素の発現または活動を低下させる組換えＤＮＡ構築物と形質転換された遺伝子導入飼料作物アルファルファ植物を選択する方法を含んでもよいが、これに限定されない。本発明の方法における組み合わされた選択基準は、改良した飼料価値を有するアルファルファ植物の選択を可能とする。本発明は、植物、植物部位、植物種子、植物細胞、農産物、および飼料作物の栄養を選択ならびに改良することに関連する方法に関する。
【００１５】
本発明はまた、配列番号１（配列番号７のヌクレオチド６５８３〜６８８２）またはその相補体に対応するＤＮＡセグメントに連結するアルファルファ植物細胞の維管束組織内で機能するプロモーター分子を備えるＤＮＡ分子を提供する。本発明はまた、配列番号１を備え、配列番号３と連結し、配列番号２と連結し、その組み合わせが配列番号７の構築物の中で備えられるＤＮＡ分子を提供する）。本発明の別の態様では、配列番号１または配列番号２を備えるアルファルファの植物細胞、植物部位、乾草、または種子である。
【００１６】
本発明は経済的に重要な特徴が向上され、より向上した飼料価値を有する遺伝子導入植物に関する。より具体的には、本発明は、本発明のヌクレオチド配列、本発明の配列番号１または配列番号２を備え、非遺伝子導入制御植物に比べて向上した飼料価値を有する遺伝子導入植物に関する。
【００１７】
特定の実施例では、「向上した飼料価値」とは、低減されたＡＤＬおよびＧリグニンの濃度、少なくとも同等の生長力の結果として得られる下位茎部での向上したＮＤＦＤのレベル、および本発明のＤＮＡ分子を含まない非遺伝子導入制御植物に比較した農業適合性によって説明される。
【００１８】
本発明の植物は、子孫に組換えＤＮＡを遺伝してもよい。ここに用いられるように、「子孫」とは、祖先の植物に由来する組換えＤＮＡを備える任意の植物、種子、植物細胞、および／または再生植物部位を含む。遺伝子導入植物、子孫、および種子は、導入遺伝子のコピーを１つ、２つ、３つまたは４つ含んでいてもよい。本発明を実施する際に、特性純度（ｔｒａｉｔ  ｐｕｒｉｔｙ）を向上させるために遺伝子導入植物の交雑および子孫を隔離する中での導入遺伝子の選択を用いてもよい。親植物への戻し交配および非遺伝子導入植物との他配もまた考慮されており、栄養育種も同様である。さまざまな特性および作物に一般的に用いられる他の方法の説明は、いくつかの参照文献の１つ、例えば、Ｆｅｈｒ，ｉｎ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｗｉｌｃｏｘ  Ｊ．ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ（１９８７）にて見つけることができる。
【００１９】
ここに開示される方法にて用いられる植物および種子は、さらに１つ以上の追加の導入遺伝子を含有していてもよい。このような導入遺伝子は、向上した虫害抵抗性、向上した水使用効率、向上した収量性、向上した耐乾燥性、向上した種子品質、向上した栄養価、向上した第一胃非分解性タンパク質（ＲＵＰ）および／または向上した除草剤耐性を含むがこれに限られない所望の特性を与えるタンパク質またはＲＮＡ分子をコードする任意のヌクレオチド分子であってもよく、所望の特性はこのような追加の導入遺伝子を欠く飼料植物に対して計測される。
【００２０】
リグニン経路はフェニルアラニンからケイ皮酸に、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）によって変換することから始まる。２つ目の反応は４−ケイ皮酸ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）によって行われ、ケイ皮酸を４−クマル酸に変換する。これらの２つの酵素が、リグニン生合成を含むフェニルプロパノイド経路の核を形成する。経路における他の酵素としては、４−クマロイルシキマートまたはキナートをカフェオイルシキマートまたはキナートに変換するＣ３Ｈまたは４−クマル酸３−ヒドロキシラーゼ、ＨＣＴ、ヒドロキシシンナモイルＣｏＡ：２箇所で作用してＣ３Ｈの基材である４−クマロイルシキマート（またはキナート）の形成を４−クマロイルＣｏＡから触媒し、カフェオイルシキマート（またはキナート）に対して逆方向に作用してカフェオイルＣｏＡを得るヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼが挙げられる。ＣＣｏＡＯＭＴ（カフェオイル−ＣｏＡ  ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ）はカフェオイルＣｏＡをフェルロイルＣｏＡに変換し、他の反応に関連していてもよい。ＣＯＭＴ（コーヒー酸  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ）は５−ヒドロキシコニフェルアルデヒドに作用し、シナピルアルデヒドに変換する。フェルラ酸５−ヒドロキシラーゼ（Ｆ５Ｈ）はコニフェルアルデヒドを５−ヒドロキシコニフェルアルデヒドに変換する。さまざまな植物種からのリグニン生合成経路酵素遺伝子のＤＮＡ配列が米国特許出願公開第２００７／００７９３９８号に開示されており、ここに参照によって引用される。本発明のＤＮＡ配列は配列番号１〜７を含むがこれに限られない。
【００２１】
モノリグノールは、フェニルプロパノイドｐ−ヒドロキシフェニル（Ｈ）、グアイアシル（Ｇ）、およびシリンギル（Ｓ）リグニンの形態でそれぞれリグニンに組み込まれる。双子葉類のリグニンはたいていＧおよびＳの混合物であり、単子葉類のリグニンはこれら３つ全ての混合物である。
【００２２】
植物における非コードおよびコード配列の発現に必要なさまざまな遺伝エレメントを含有するＤＮＡ構築物が作成される。プロモーター、リーダー、イントロン、ポリ核酸をコードする輸送ペプチド、および３’転写性末端領域は全て、植物分子生物学における当業者によって、所望のレベルの発現または機能性を与えるべく機能的に連結可能な遺伝エレメントである。
【００２３】
本発明のＲＮＡ分子を発現するべく、維管束組織またはリグニンを蓄積する組織において活性の多種多様のプロモーターを用いてもよい。木部組織において活性のプロモーターは、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）プロモーター、ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）プロモーター、クマル酸３−ヒドロキシラーゼプロモーター、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＭＴ）プロモーター、４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）プロモーター（米国特許第６，８３１，２０８号）、シンナモイルＣｏＡ還元酵素（ＣＣＲ）プロモーター、およびシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）プロモーター（米国特許第７，４２９，６４９号）など、フェニルプロパノイド生合成経路に関連するプロモーターを含んでもよいが、これに限定されない。維管束プロモーターの典型的な例はＰＡＬプロモーターである。本発明の好ましい実施形態では、アルファルファにおけるＣＣｏＡＯＭＴ遺伝子の抑制を制御するのにインゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｅｓ）からのＰＡＬ２プロモーターを用いている。
【００２４】
ここで用いられる組換えＤＮＡ技術の検査法は周知であり、従来技術において一般的に採用されているものである。クローニング、ＤＮＡおよびＲＮＡ単離、増幅、および精製には標準的な技術が用いられる。ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを伴う酵素反応は、一般的に製造者の仕様にしたがって行われる。これらの方法およびさまざまなその他の方法は、ここではＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）として参照される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）にしたがって一般的に行われる。
【００２５】
対象のポリ核酸分子もまた、完全または部分的に、特にポリヌクレオチド配列に変更を行うことが望ましい場合に技術文献に記載される周知の方法で合成されてもよく、例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ  ４７：４１１−４１８（１９８２）およびＡｄａｍｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１（１９８３）を参照のこと。したがって、本発明のポリ核酸分子の全てまたは一部が完全合成であってもよく、選択された飼料作物において望ましい結果を提供するために必要に応じて変更されてもよい。
【００２６】
本発明のＤＮＡ構築物は、当業者に周知のさまざまな従来の形質転換方法によって、所望の植物宿主のゲノムに導入されてもよい。植物細胞または組織の形質転換方法としては、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を介した形質転換法および遺伝子銃（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）または微粒子銃を介した形質転換法が挙げられるが、これに限定されない。アグロバクテリウムを介した形質転換を行うための適切な植物形質転換ベクターとしては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドに由来するもの、さらに、例えば、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら，Ｎａｔｕｒｅ３０３：２０９（１９８３）、Ｂｅｖａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：８７１１〜８７２１（１９８４）、Ｋｌｅｅら，Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３（７）：６３７〜６４２（１９８５）に記載のものが挙げられる。アグロバクテリウムのＴｉまたは発根（Ｒｉ）プラスミドに由来する植物形質転換ベクターに加えて、本発明のＤＮＡ構築物を植物細胞に挿入するのに他の方法を用いることもできる。ここで用いるように、「形質転換された」の表現は構築物などの外来ポリヌクレオチド分子が導入された細胞、組織、器官、または有機体を指す。好ましくは、導入されたポリヌクレオチド分子は、その導入されたポリヌクレオチド分子が後続子孫に遺伝するように、受容細胞、組織、器官、または有機体のゲノムＤＮＡと一体化される。「遺伝子導入」または「形質転換された」細胞または有機体は、細胞または有機体の子孫、および、交配において親としてこのような遺伝子導入植物を採用する育種プログラムから生成され、外来ポリヌクレオチド分子の存在の結果として変化した表現型を示す子孫をも含む。本発明のＤＮＡ分子を含有する植物形質転換構築物は任意の植物形質転換法によって植物に導入されてもよい。本発明の実施において植物発現構築物を植物ゲノムに導入することによって植物を形質転換する方法および材料は、任意の周知および実証されている方法を含んでいてもよく、例えば、全てがここに参照によって引用される、米国特許第５，３８４，２５３号に示されるエレクトロポレーション、米国特許第５，０１５，５８０号、米国特許第５，５５０，３１８号、米国特許第５，５３８，８８０号、米国特許第６，１６０，２０８号、米国特許第６，３９９，８６１号、および米国特許第６，４０３，８６５号に示される微粒子銃、米国特許第５，６３５，０５５号、米国特許第５，８２４，８７７号、米国特許第５，５９１，６１６号、米国特許第５，９８１，８４０号、および米国特許第６，３８４，３０１号に示されるアグロバクテリウムを介した形質転換、ならびに米国特許第５，５０８，１８４号に示されるプロトプラスト形質転換を含んでいてもよい。
【００２７】
本発明の一実施形態では、このような豆類はアルファルファ（ムラサキウマゴヤシ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａまたはＭｅｄｉｃａｇｏ  ｆａｌｃａｔａもしくはこれらの交配種）を含んでいてもよく、アルファルファに類似の、反芻動物用に飼料価値がより向上された改質可能な他の飼料豆類は、シロツメクサ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｒｅｐｅｎｓ）、ムラサキツメクサ（Ｔ．ｐｒｅｔｅｎｓｅ）、アルサイククローバ（Ｔ．ｈｙｂｒｉｄｕｍ）、スイートクローバ（Ｍｅｌｉｔｏｔｕｓ  ａｌｂａおよびＭ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ならびにサブタレニアンクローバ（Ｔ．ｓｕｂｔｅｒｒａｎｉｕｍ）、イガマメ（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ  ｖｉｃｉｉｆｏｌｉａ）、ネビキミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｕｌｉｇｉｎｏｓｉｓ）、ミヤコグサ（Ｌ．ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ）、レンゲミルクヴェッチ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｃｉｃｅｒ）、セリセア（Ｌｅｓｐｅｄｅｚａ  ｃｕｎｅａｔａ）、ヤハズソウ（Ｋｕｍｍｅｒｏｗｉａ  ｓｔｒｉａｔａ）、マルバヤハズソウ（Ｋ．ｓｔｉｐｕｌａｃｅａ）、樹木、潅木、および草本植物全般を含む。
【００２８】
以下の例は本発明の特定の好適な実施形態を示すのに挙げられる。当業者であれば、以下の例に開示される方法は本発明の実施においてよく機能すると本発明者らが見出した取り組みを表していると理解し、それによってその実施について好適な形態の例からなることを考慮できるであろう。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された具体的な実施形態において多くの変更が可能であり、本発明の精神および範疇を逸脱することなく、同様または類似の結果を得られることを理解するであろう。
【００２９】
以下の定義および方法は本発明をより明確にし、本発明の当事者を導くために提供される。特筆しない限り、表現は従来技術において当業者が用いる用法に従って理解されるものとする。
【００３０】
ここで用いられるように、「飼料作物」の表現はマメ科牧草を意味し、関連野生飼料種を含む、飼料作物と共に育種可能な全ての植物品種を含む。
【００３１】
アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）は動物飼料、特に乳牛によく用いられるマメ科牧草である。ここで用いるように、「アルファルファ」の表現は任意のウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）属を意味し、Ｍ．ｓａｔｉｖａ、Ｍ．ｍｕｒｅｘ、Ｍ．ｆａｌｃａｔａ、Ｍ．ｐｒｏｓｔｒａｔａ、およびＭ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａを含むが、これに限定されない。したがって、ここで用いるように、「アルファルファ」の表現は、栽培アルファルファ、二倍体アルファルファ、腺性アルファルファ、紫色の花をつけるアルファルファ、鎌アルファルファ、マダラアルファルファ、野生アルファルファ、または黄色の花をつけるアルファルファなどのように一般的に参照される任意のアルファルファを含む、任意の種類のアルファルファを意味する。
【００３２】
本発明はＤＮＡ分子およびその対応するヌクレオチド配列を提供する。ここで用いられるように、「ＤＮＡ」、「ＤＮＡ分子」、「ポリヌクレオチド分子」はゲノムまたは合成由来の二本鎖ＤＮＡ分子を指し、例えば、５’（上流）末端から３’（下流）末端までを読みとったデオキシリボヌクレオチド系の重合体またはポリヌクレオチド分子である。ここで用いるように、「ＤＮＡ配列」「ヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド配列」はＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。
【００３３】
「ＤＮＡ構築物」または「組換えＤＮＡ分子」は、受容有機体に新しい特性を与えるのにしばしば用いられる、操作可能な連結における異種ＤＮＡ遺伝エレメントの組み合わせを指す。ここで用いられるように、「組換え」の表現は自然では通常見つけることがなく、人の介入によって生成されたＤＮＡおよび／またはタンパク質および／または有機体の形態を指す。このような人による介入は組換えＤＮＡ分子および／または組換植物を提供することを可能にする。ここで用いられるように、「組換えＤＮＡ分子」は自然には一緒に発生しないＤＮＡ分子の組み合わせを含み、人の介入の結果として得られるＤＮＡ分子、例えば、互いに異種の少なくとも２つのＤＮＡ分子の組み合わせを含むＤＮＡ分子、および／または人工的に構成されて、自然に通常存在するポリヌクレオチド配列から離れたポリヌクレオチド配列を備えるＤＮＡ分子である。ここで用いられるように、「組換え植物」は自然に通常存在しない、人の介入の結果として得られる植物であって、導入遺伝子および／または 組換えＤＮＡ分子をそのゲノムに組み込んで含有する。本発明に用いられる「ＤＮＡ構築物」は少なくとも１つの発現カセット、植物細胞にて操作可能なプロモーター、および、本発明のポリヌクレオチドは、植物細胞、植物部位、外植片ならびに植物を含む遺伝子導入アルファルファにおける活動を維持するのに機能的に規定されるタンパク質、タンパク質の変異、またはタンパク質断片をコードする。ここで用いられるＤＮＡ構築物における少なくとも１つの発現カセットは、標的植物におけるトランスカフェオイル−ＣｏＡ  ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）コード配列をコードする少なくとも１つのポリペプチドの発現を抑制する、１つ以上のポリヌクレオチドを備えていてもよい。
【００３４】
ここで用いられるように、「備える」の表現は「含むがそれに限られない」を意味する。
【００３５】
ここで用いられるように、「相同的または相補的」の表現は、ここで提供するＤＮＡ分子のプラスセンスまたはマイナスセンス鎖との実質的な百分率配列同一性を一般的に示すポリヌクレオチド分子を指す。特に対象となるのは、ここで記載されるポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性、もしくはさらに大きな配列同一性、例えば９８％または９９％の配列同一性を有するＤＮＡ分子である。したがって、本発明のヌクレオチド配列はポリヌクレオチド分子断片の相補的ストレッチで二重鎖分子を選択的に形成する能力について用いられてもよい。直面する用途によって、交雑法の変動条件を採用して、目標配列に向けての変動する選択性の度合いを得るようにしてもよい。
【００３６】
内在性飼料植物遺伝子、カフェオイル−ＣｏＡ  ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）の発現を制御することができる本発明のポリヌクレオチド分子およびは、同一の機能を提供するポリヌクレオチド分子に対して実質的に相同的であり、本発明の範囲内に含まれる。
【００３７】
「操作可能に連結された」または「連結された」は、第１核酸分子が第２核酸分子と機能的な関係に配置されたときに、第１核酸分子が「操作可能に」第２核酸分子と連結されている場合を想定する。例えば、プロモーターがＤＮＡ分子の転写または発現に影響を与える場合に、プロモーターはＤＮＡ分子と操作可能に連結されている。一般的に、操作可能に結合されたＤＮＡ分子は隣接するが、機能的な連結に悪影響を及ぼすことなく、物理的な連結を分離させるように追加の分子をＤＮＡ構築物に含めてもよい。
【００３８】
「プロモーター」または「プロモーター領域」は調節エレメントとして機能するポリ核酸分子を指し、通常はＤＮＡコーディング配列の上流（５’）に存在し、ＲＮＡポリメラーゼの認識部位および／または正しい部位で転写を始めるのに必要な他の要因を提供することでメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の生成を制御することによって、コード配列の発現を制御する。ここで考慮されるように、プロモーターまたはプロモーター領域は、さまざまな調節配列とのＤＮＡライゲーション、ランダムまたは制御された突然変異誘発、ならびにエンハンサー分子の付加または複製によって派生されたさまざまなプロモーターを含む。ここに開示するプロモーター領域およびその生物学的に機能性の同等物は、ｍＲＮＡを生成する能力によって示されるとおり、適切な組換えベクターの一部として宿主に導入されるときにコード配列の転写を自身の制御の下で行わせる役割を果たす。プロモーターを備えるＤＮＡ構築物は、非コードＲＮＡ分子の転写を命令するのにも用いることができる。
【００３９】
「３’非翻訳配列」は構造ヌクレオチド配列の下流に位置するＤＮＡ配列であり、ｍＲＮＡ処理または遺伝子発現に影響を与えることができるポリアデニル化および他の調節シグナルをコードする配列を含む。ポリアデニル化信号は植物の中で機能し、ポリアデニル化ヌクレオチドをｍＲＮＡ前駆体の３’末端に追加させる。ポリアデニル化配列は天然遺伝子、多種多様の植物遺伝子、またはＴ−ＤＮＡから派生させることができる。
【００４０】
「形質転換」は、外因性ポリ核酸分子（例えば、ＤＮＡ構築物、組換えポリ核酸分子）を細胞またはプロトプラストに導入するプロセスを指し、外因性ポリ核酸分子は宿主細胞ゲノムまたはオルガネラゲノム（例えば、葉緑体またはミトコンドリア）に組み込まれるか、自律複製が可能である。「形質転換された」または「遺伝子導入」は、ＤＮＡ構築物または組換えＤＮＡ分子などの外来ポリ核酸が挿入された細胞、器官、または有機体を指す。「遺伝子導入」または「形質転換された」細胞または有機体は、その細胞または有機体の子孫、および、交配における親としてこのような「遺伝子導入」植物を採用した育種プログラムによって生成され、外来ポリ核酸分子が存在することによって変化した表現型を示す子孫をも含む。アグロバクテリウムを介した形質転換を用いて、アルファルファおよび植物細胞などを含む双子葉植物にＤＮＡを導入することは、従来技術において周知である。例えば、その全体が参照によって具体的に引用される、Ｆｒａｌｅｙら（１９８５）、Ｒｏｇｅｒｓら（１９８７）、および米国特許第５，５６３，０５５号に記載の方法を参照のこと。植物形質転換によってとは、植物ゲノムに外部の核酸配列を導入することを意味する。形質転換法としては、リン酸カルシウム法，ＤＥＡＥ−Ｂｅｔｒａｎ形質移入法、エレクトロポレーション、微量注入法、プロトプラスト融合、およびリポソームを介した形質移入法などが挙げられる。あるいは、ＣａＭＶなどの植物ウイルスをベクターとして用いて、植物細胞に外来の核酸を導入する、または微粒子を用いて高速弾道貫通を行ってもよい（Ｋｌｅｉｎら、１９８７）。植物細胞に核酸セグメントを導入する最も好ましい方法は、選択された核酸セグメントで形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を植物細胞または植物組織に感染させる方法である（Ｈｏｒｓｃｈら、１９８４）。アルファルファはＭｃＫｅｒｓｉｅら、１９９６のプロトコルによって形質転換された。アグロバクテリウムを介して、または他の生物学的、化学的、もしくは物理的な方法を用いたアルファルファ形質転換の方法も実行可能であり、本発明において用いられてもよい。適切なベクターを、そのベクターで細胞を形質転換するために生成して形質転換体を識別する方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、ＧｅｌｖｉｎおよびＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、およびより重要なのはＧｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．およびＴｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎに記載されるが、これらに限定されない。
【００４１】
ここで用いるように、「導入遺伝子」の表現は宿主細胞のゲノムに人工的に組み込まれたポリヌクレオチド分子を指す。このような導入遺伝子は宿主細胞と異種であってもよい。「遺伝子導入植物」の表現は、このような導入遺伝子を備える植物を指す。「導入遺伝子」はさらに、特異的組換えまたは部位特異的変異による非天然ポリ核酸分子の挿入によって改変された天然の植物遺伝子の構成部位を含む。植物のゲノムに挿入された組換えＤＮＡ分子は導入遺伝子である。「導入遺伝子」は、宿主ゲノムに組み込まれた、または宿主細胞において自律複製が可能であり、１つ以上のコード配列を発現させることができるＤＮＡセグメントとして定義される。例示的な導入遺伝子は宿主細胞、または宿主細胞から再生された植物に、対応する形質転換されていない細胞または植物に関連する改良表現型を提供する。導入遺伝子は遺伝子形質転換によって直接的に植物に導入されてもよく、遺伝子導入子孫植物から遺伝されてもよい。
【００４２】
形質転換に用いられる本発明の「形質転換ベクター」は、それぞれが対象ポリヌクレオチド配列と操作可能に連結される天然または非天然植物プロモーターを備え、３’ＵＴＲ末端シグナルに操作可能に連結され、適切な宿主細胞において発現するための１つ以上の「発現カセット」を備えていてもよい。形質転換ベクターはまた、典型的にヌクレオチド配列または導入遺伝子の適切な翻訳に必要な配列を備える。ここで用いられるように、「導入遺伝子」の表現は宿主細胞のゲノムに人工的に組み込まれたポリヌクレオチド分子を指す。このような導入遺伝子は宿主細胞と異種であってもよい。「遺伝子導入植物」は、このような導入遺伝子を備える植物を指す。通常、コード領域は対象のタンパク質をコードするが、例えば、標的遺伝子配列の抑制または過剰発現において用いられるアンチセンスＲＮＡ、非翻訳ＲＮＡ、センスまたはアンチセンス方向における、マイクロＲＮＡ、非コーディングＲＮＡ、または合成ＲＮＡなどの、対象の機能的ＲＮＡをコードしてもよい。対象ヌクレオチド配列を備える発現カセットは、少なくとも１つの構成成分が少なくとも１つの他の構成成分に対して異種であることを意味するキメラであってもよい。ここで用いられるように、「キメラ」の表現は２つ以上の遺伝的に異なる源、すなわちある遺伝子または有機体からの第１分子および別の遺伝子または有機体からの第２分子から、生成されるＤＮＡ分子を指す。「形質転換構築物」は、遺伝子形質転換による宿主ゲノムへの導入に設計されたキメラＤＮＡ分子である。好適な形質転換構築物は、１つ以上の外因性遺伝子の発現を行うのに必要な全ての遺伝エレメントを備える。本発明の特定の実施形態では、形質転換構築物を宿主細胞に発現カセットの形態で導入することが望ましい場合がある。
【００４３】
「再生」は植物細胞（例えば、プロトプラスト、カルス、または外植片）から植物が生長するプロセスを指す。
【００４４】
「植物」の表現は全植物、シュート生長器官／構造（例えば、葉、茎および塊茎）、根、花および花器官／構造（例えば、苞葉、萼片、花びら、雄ずい、心皮、葯および胚珠）、種子（胚芽、胚乳、および種皮を含む）および果実（成熟胚珠）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織など）および細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞など）、ならびにその子孫を含む。植物は全植物、および種子、果実、葉、または根などの植物部位、植物組織、植物細胞または植物外植片などその他の植物材料、ならびにその子孫、さらに細胞における生物学的または細胞質構成成分またはプロセスを模倣する試験管内検査システムを指す。
【００４５】
本開示に用いられる「コントロール植物」は、遺伝子導入または遺伝子組換え植物における改良表現型を識別する目的で、遺伝子導入または遺伝子組換え植物と比較するために用いられる植物細胞、種子、植物構成成分、植物組織、植物器官、または全植物を指す。コントロール植物はいくつかの例では空のベクターまたはマーカー遺伝子を備えるが遺伝子導入または遺伝子組換え植物にて発現される本発明の組換えポリヌクレオチドを含まない遺伝子導入植物ラインであってもよい。コントロール植物は、他の場合、ネガティブ分離個体またはネガティブ同質遺伝子系統として知られる、組換えＤＮＡを含まないヘミ接合性遺伝子導入植物ラインの子孫であってもよい。一般的に、コントロール植物は、テストされる遺伝子導入または遺伝子組換え植物と同一ラインまたは種類の植物である。適切なコントロール植物は、ここで遺伝子導入植物を生成する上で用いられる親ラインの遺伝子的に改変されていないもしくは非遺伝子導入の植物を含んでいてもよい。
【００４６】
「遺伝子導入植物」は同一種、種類、または品種の野生植物において見つからない遺伝物質を含む植物を指す。遺伝物質は、導入遺伝子、挿入性突然変異誘発事象（例えばトランスポゾンまたはＴ−ＤＮＡ挿入性突然変異誘発によって）、アクティベーションタギング配列、変異配列、相同的組換え事象またはキメラ形成法によって改変された配列を含んでいてもよい。典型的には、外来遺伝物質は人間の操作によって植物に導入されているが、当業者が認識する任意の方法を用いることができる。遺伝子導入植物は発現ベクターまたはカセットを有していてもよい。「遺伝子導入植物」は植物、またはその植物もしくはその子孫に由来する任意の後続代の子孫植物であり、植物または子孫が非遺伝子導入植物には天然で存在しない導入された外因性ＤＮＡ分子を含む。遺伝子導入植物は形質転換される植物に天然の配列を付加的に含んでいてもよいが、遺伝子の発現レベルまたはパターンを改変するために、「外因性」遺伝子は１つ以上の異種調節またはその他のエレメントを用いて改変されている。
【００４７】
ここにて用いられる「野生型」または「野生型の」は、遺伝子的に組み換えられたり実験的な意味で処置されたりしていない植物細胞、種子、植物構成成分、植物部位、植物組織、植物器官、または全植物を指す。野生型細胞、種子、構成成分、部位、組織、器官、または全植物をコントロールとして用いて、例えば、ノックアウト、過剰発現、または異所的に発現されたなどしてポリペプチドの発現が改変された同一種、種類もしくは品種の細胞、組織または植物と、その特性改変の発現レベル、度合いおよび性質を比較してもよい。
【００４８】
Ｒ０遺伝子導入植物は遺伝子的に形質転換されている、または遺伝子的に形質転換された細胞植物から再生された植物を指す。
【００４９】
植物の「個体群」は、通常の条件下で異種交配してその個体群の中の対立遺伝子および遺伝子型の頻度の中で類似点を共有することができる同一種の有機体の局部群を指す。
【００５０】
ここに用いられるように、「カルス」の表現は繰り返しの細胞分裂および生長が可能であり、いくつかの種では全植物を形成するように誘発可能な未分化植物細胞の塊を指す。
【００５１】
ここで用いられるように、「体性組織」は生殖細胞または配偶子を含まない組織を指す。体性組織は生長組織および細胞からなる。
【００５２】
ここで用いられるように、「体細胞杯形成」は胚芽開始のプロセスおよび栄養または非配偶子細胞からの発育を指す。所定組織源からの胚芽は遺伝的に同一であるように仮定される。体細胞杯形成は細胞培養システムからの植物の再生において重要な経路であり、植物および合成種子の大規模製造に一般的に用いられる方法である（Ｓｔｕａｒｔら、１９８７）。体細胞（無性）杯形成において、胚芽様構造は体組織から形成された接合体胚と類似した方法で全植物に発達する。体細胞胚は、介在するカルスの製造なしで細胞または細胞の小さな群から生成することができる。体細胞杯はまた、中間カルス組織またはそのカルスから製造された細胞懸濁液から生成することができる。体細胞杯形成は所望の種または種類の植物を育種させる、従来技術において知られている数々の方法の１つである。育種方法として体細胞杯形成を好適に選択する多くの有利点がある。１つの有利点は、周知の望ましい表現型を有する植物を細胞の源として選択することができ、体細胞杯形成法に基づいて、これらの細胞を多くの遺伝子的に均一の胚にすばやく培養することができる。結果として得られた胚は、次に根および新芽を有する全植物に栽培することができる。したがって、この方法によれば、親と同一の所望の表現型を有する植物を、例えばここに参照によって引用される米国特許第５，１８７，０９２号に記載の他の育種法と比較可能な費用で、しばしばより早く、さらによりよい遺伝子均一性を有して量産することができる。
【００５３】
培養された細胞は固相担体または懸濁液の形態で生長されてもよい。いずれの場合でも、栄養分は培地の形態で細胞に与えてもよく、環境条件は制御される。さまざまなアミノ酸類、塩類、糖類、成長調節剤、およびビタミンからなる多くの種類の組織培養基が存在する。植物細胞の培養に好適なさまざまな種類の培地が以前に説明されている。これらの培地の例としてはＳｃｈｅｎｋおよびＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ処方（１９７２）で説明される培地が挙げられるがこれに限られない。胚発生カルス培養を、形質転換のための細胞の調製ならびにアルファルファなどの飼料植物の再生のために、特定の形質転換法と一緒に用いてもよい。ＳｃｈｅｎｋおよびＨｉｌｄｅｂｒａｎｔ培地処方（Ｓ＆Ｈ培地、１９７２）を形質転換および胚発生組織培養の維持に用いた。Ｓ＆Ｈ培地は、ほとんどの細胞の種類の成長において必要なさまざまな分類の材料（塩類、アミノ酸類、成長調節剤、糖類、バッファ）の混合物である。ｐＨが５．８のＳ＆Ｈ培地は、多量栄養素、微量栄養素、ビタミン、ホルモンで補われた鉄分、最終濃度が０．２μＭの２，４−Ｄ、および濃度０．５μＭのキネチンの混合物を提供する。選択的な条件下にて、主な体細胞胚は１２−１５週で視認可能になる。
【００５４】
ここで用いられるように、「外植片」は培養用にドナー植物から採取された組織片を指す。
【００５５】
「宿主細胞」は感染性因子によって侵された、または侵されることが可能な細胞として定義される。組換えＤＮＡの宿主細胞として作用する細菌細胞などのＤＮＡ（またはＲＮＡ）で形質転換された宿主細胞は、宿主細胞と共に再生された組換えＤＮＡを複製することができる。「宿主細胞」への参照は、複数のこのような宿主細胞を含む。組換えＤＮＡを導入するのに適切な宿主細胞として、植物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、人工細胞またはその組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。人工宿主細胞は、化学的に合成された染色体が細胞に移植されて人工細胞を生成した、自己複製が可能なもの（例えば合成細菌）を含むことができる。人工細菌性宿主細胞のゲノムは、自然成長の宿主細胞（例えば、酵母宿主細胞）内に組立てられてもよい。人工宿主細胞は生物の全ての性質を含む最小の人工ゲノムを作成する上で特に便利である。
【００５６】
「発現」の表現は、ポリペプチドを生成するために構造遺伝子などのＤＮＡ分子をコードすることによって行われる転写および翻訳を含む、細胞内プロセスの組み合わせを指す。
【００５７】
ここにて用いられる「抑制」の表現は、遺伝子の任意の発育または一時的な段階における、野生型またはコントロール植物、細胞もしくは組織の発現と比べて低い植物、植物細胞または植物における遺伝子の発現レベルを指す。抑制は、タンパク質の活動を結果として低下させる変異を抑制する、阻害剤の生成を抑制する、酵素が活動するのに必要な基質レベルを上昇、減少、または排除する、新しいタンパク質を生成する、もしくは、通常は沈黙遺伝子であるものを活性化して自然条件下では通常増加しない生成物を蓄積するために、数々のアプローチを用いて適用してもよい。抑制因子は異なる遺伝子における別の変異、同一遺伝子上の抑制因子であるが最初の変異からいくらか距離が離れた場所での変異、または非染色体性のＤＮＡにおける変化によって生成された細胞質の中の抑制因子であってもよい。遺伝子を抑制するには複数のアプローチがあり、例えば、植物内の標的遺伝子の発現を抑制するのにＲＮＡｉを介した遺伝子抑制を用いることができる。植物細胞において機能し、植物細胞内にて発現されたときにコントロールと比較して内在性タンパク質のレベルを抑制するＲＮＡ分子に転写されるポリヌクレオチドと操作可能に連結されているプロモーターを備える組換えＤＮＡ構築物であって、ＲＮＡ分子は、タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡにプロセスされるｄｓＲＮＡであるか、タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡであるか、ｓｉＲＮＡにプロセスされてタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡを標的とするｔａ−ｓｉＲＮＡであるか、あるいはコントロールと比較してｍｉＲＮＡ活性の抑制をもたらすＲＮＡ分子に転写され、ＲＮＡ分子はｍｉＲＮＡの分割阻害因子またはｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡデコイである（このようなＲＮＡｉを介した遺伝子抑制の取り組み例は、ここに参照によって引用される、米国特許出願公開第２００９／６１２８８０１９号に開示される）。「抑制」は、植物または細胞において少なくとも１つの遺伝子の破壊を有する植物または植物細胞を指し、破壊によって、コントロール細胞に比べて、その遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現または活性が低下する結果を得る。ノックアウトは、例えば、トランスポゾン、耕うん、および相同的組換えを含むゲノム破壊の結果物、アンチセンス構築物、センス構築物、ＲＮＡ沈黙構築物、またはＲＮＡ干渉であってもよい。遺伝子におけるＴ−ＤＮＡ挿入はその遺伝子の発現を消失させる遺伝子型改変の例である。
【００５８】
「事象」の選択において、性質の原因である形質転換構築物は形質転換法を介してゲノムに導入される。数々の個々の形質転換体（事象）が通常それぞれの構築物について生成される。これらの事象は高性能を有するものを選択するように評価される。事象評価プロセスは、以下を含むいくつかの基準に基づいている：１）特性の導入遺伝子発現および表現型「有効性」、２）特性の分子的特徴付け、例えばきれいな単一の完全なインサートを示す事象の選択が、コピー数、インサート数、インサート複雑性、ベクター骨格の存在、および事象特異的分析の開発について分子分析を行うことによって見出され、さらなる開発に用いられるなど、３）特性の分離、特性の分離は単一遺伝子座の分離パターンにしたがう遺伝子導入事象を選択するようにテストされる。特性の分離の評価か直接的な取り組みで行われる、４）発育した事象の作物学、および５）遺伝子導入特性発現の安定性。個々の事象の大集団の評価およびさらなる徹底的な評価は、結果としてより成功する可能性を高める。遺伝子導入特性発現の安定性は、さまざまな世代、環境、およびさまざまな遺伝的背景においてテストすることで確認される。不安定な表現型有効性を示す事象は破棄される。一般的に、単一の優性遺伝子として遺伝された単一の完全なインサートを有し、メンデルの分離比にしたがう事象が、戻し交配および前方育種（ｆｏｒｗａｒｄ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ）などの商用的な特性統合戦略において用いられる。
【００５９】
「Ｇリグニン」は「グアイアシルリグニン」を指す。グアイアシルリグニンは主にコニフェリルアルコール単位からなり、グアイアシル−シリンギルリグニンはコニフェリルおよびシナピルアルコールからの単量体単位を含有する。一般的に、グアイアシルリグニンは軟材で発見され、グアイアシル−シリンギルリグニンは硬材に存在する。
【００６０】
「改良飼料価値」は、繊維含有量、消化率、および家畜が摂取可能な利用可能な炭水化物供給源などの飼料品質を指す。改良飼料価値またはアルファルファ品質は、開花１００％のアルファルファの百分率で表される相対飼料価値（ＲＦＶ）によって決められ、この分野において飼料価値の予測変数として用いられる。飼料価値に影響を与える構成要素は酸性デタージェントリグニン濃度およびＧリグニンならびに中性デタージェント繊維消化率である。これらの飼料価値構成要素の測定は本発明の態様である。
【００６１】
植物の「生長力」は、例えば植えた後の所定期間に亘る植物成長、葉量、生物量などの農業適合性の尺度である。
【００６２】
「酸性デタージェントリグニン」（ＡＤＬ）はリグニン含有量の推定値である。リグニンは飼料繊維（ＮＤＦ）の不消化成分であり、反芻動物によって可消化飼料繊維の限度を制限すると信じられている。
【００６３】
飼料の「中性デタージェント繊維消化率」（ＮＤＦＤ）含有量は飼料繊維の消化率の尺度であり、試験管内で計測することができ、近赤外線分光法（ＮＩＲＳ）を用いて予測することができる。ＮＤＦＤ値が高いと、飼料がより可消化である。
【００６４】
アルファルファ植物の「下位茎」は、葉を完全に取り除き、地表面から２．５”上で収穫されたアルファルファ植物の１５ｃｍ茎部として説明される。下位茎はアルファルファ植物の最も木化したところであり、最も消化しにくい。
【００６５】
アルファルファは一般的にアルファルファ「乾草」または「サイレージ」として収穫され、この２つの違いは水分率および粗タンパク質率に基づく。アルファルファサイレージは、可消化タンパク質が粗タンパク質の６０％〜７０％であるべきである。例えば、アルファルファサイレージでは、可消化タンパク質は粗タンパク質の６０％〜７０％であるべきである）。アルファルファは最もよく「乾草」として収穫されており、梱または堆積として保管することができるが、サイレージ、生草に加工されてもよく、刈取式（ｇｒｅｅｎｃｈｏｐ）として与えられてもよい。本発明の目的のために、「全植物」は「乾草」と等価物である。乾物基準では、ウシ家畜は乾草よりもサイレージを多く食べる。サイレージまたはヘイレージは、直接刈られたアルファルファから作られる。
【００６６】
ここで用いられるように、「第一胃非分解性タンパク質」または「ＲＵＰ」は飼料品質の尺度を指す。アルファルファの「栄養価」の飼料品質はＲＵＰ濃度の増加によって大きく向上し得る。飼料タンパク質はサイレージ発酵中に劣化するためにしばしば反芻類によって使用できない場合があり、それによってアルファルファにおけるＲＵＰ濃度の増加はその栄養価を改良する。
【００６７】
ここにて用いられるように、「ａ」または「ａｎ」は１つ以上を意味する。請求項で用いられるように、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と合わせて用いる場合、「ａ」または「ａｎ」は１つまたは１つより多くを意味してもよい。
【００６８】
ここで用いるように、請求項における「または（ｏｒ）」の表現は、代替物のみを指すように特筆するか、代替物が相互的に排他的であり、代替物のみおよび「および／または」を指す定義を開示が説明する場合でない限り、「および／または」を意味するように用いられる。ここで用いられるように、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は少なくとも２つ目以上を意味してもよい。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例は本発明の例示的な実施形態を示す。しかしながら、当業者であれば、本開示の観点から、本発明の概念、精神、および範疇を逸脱することなくこれらの実施形態に多くの変更を行うことができることを理解できるであろう。また、化学的および生理的の両方で関連する特定の薬剤をここで記載される薬剤の代理に用いてもよく、同一または同様の結果が得られることは明白である。全てのこのような当事者に明らかな類似の代用品および変更は、添付の請求項にて定義される本発明の精神、範疇および概念内にあると考えられる。
【００７０】
実施例１
アルファルファ形質転換植物用発現構築物
この実施例は遺伝子導入アルファルファ植物に再生可能なアルファルファ植物細胞核に組換えＤＮＡを移植する発現構築物の構築を例示する。表１に記載のエレメントを備える形質転換ベクターｐＭＯＮ１０００５２（ｐＦＧ１１８としても知られる）が、本発明の配列番号１および配列番号２として識別される配列を備えるカフェオイル−ＣｏＡ  ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）を抑制するべくアルファルファ組織へのアグロバクテリウムを介した形質転換を行うための組換えＤＮＡの調製での使用のために作製された。アルファルファ細胞、植物部位、または植物が本発明の配列番号７の発現カセットで形質転換され、なお、発現カセットはリグニン蓄積の部位におけるＣＣｏＡＯＭＴポリペプチドの制御された発現を可能とするインゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）からのＰｖ．ＰＡＬ２プロモーターを備える。発現カセットは、形質転換、または親植物を形質転換して子孫種子を収穫した後に育種させることで、植物に導入することができる。
【００７１】
【表１】
2018108079.tif 000002
【００７２】
エリート生殖質から選択されたアルファルファクローンＲ２３３６を、アグロバクテリウム菌株ＡＢＩを用いて、カフェオイル−ＣｏＡ  ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）のコード配列に相補的なＤＮＡセグメントを備えるＤＮＡ構築物、ｐＦＧ１１８（配列番号８、ｐＭＯＮ１０００５２）で形質転換した。ムラサキウマゴヤシからのリグニン生合成酵素ＣＣｏＡＯＭＴを下方制御することでリグニン遺伝子導入事象を生成するための全てのＲＮＡｉ構築物は、参照によってここに引用される米国特許出願公開第ＵＳ２００５／０１７６６７０号にて記載される安定化アンチセンス技術を利用した。形質転換構築物ｐＭＯＮ１０００５２において２つの異なるコード配列が用いられ、１つはＲＮＡループの５’末端を含有するＣＣｏＡＯＭＴ遺伝子（配列番号１）についてＲＮＡｉアームおよびループをコードし、他方の配列（配列番号２）はＣＣｏＡＯＭＴ酵素の発現を抑制または下方制御するためのアンチセンスアーム、ループ（３７４〜５３０ｂｐ）およびセンスアーム（５３１〜８３６ｂｐ）を含有する。ｐＭＯＮ１０００５２構築物では、ＣＣｏＡＯＭＴ遺伝子を抑制するために用いられた遺伝子の発現はインゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｕｓ）の単一ＰＡＬ２プロモーターの制御の下で調節された。アルファルファクローンＲ２３３６からの小葉または葉由来外植片の形質転換は、標準的なアグロバクテリウム法（ＷａｌｋｅｒおよびＳａｔｏ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔ，１：１０９−１２１，１９８１）を用いて行われた。ネオマイシンおよびカナマイシンに対する耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子が、形質転換された物質を選択するための選択可能マーカーとして用いられ、次にチカルシリン（２５０μｇ／ｍＬ）またはチメンチン（１５０μｇ／ｍＬ）が補給された新芽誘発媒体に移された。形質転換植物は約２０〜２４週で土壌に移された。新芽が形成されると、これらを根付かせ、最初はマジェンタボックスに入れられ、次に、５：１の比率の滅菌されたバーミキュライト：パーライト混合物と生物殺菌剤（ｂｉｏｆｕｎｇｉｃｉｄｅ）（Ｈｕｍｍｅｒｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１０−２０９３）を含有する同量のポッティングＰｒｏ−ｍｉｘ  ＰＧＸを含むポットに入れられ、２５〜２６℃で適度な光の下で維持された。植物は、マジェンタボックスカバー下または薄いプラスチックバッグで密封された密封状態で７〜１０日の期間で維持され、その間に植物が順応したために湿度は徐々に低下した。植物には汎用肥料が与えられた。植物が確立されると、従来の土壌混合物に移されて、温室に移された。
【００７３】
実施例２
カフェオイル−ＣｏＡ  ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）を抑制するための配列特定
この実施例は、リグニン生合成経路における酵素の発現を抑制するためのＤＮＡ構築物を発現する遺伝子導入アルファルファのフェノール酸分析を示す。酵素の発現を下方制御するべく、アルファルファ細胞は、カフェオイル−ＣｏＡ  ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）コード配列に相補的なＤＮＡセグメント（配列番号７）を備えるＤＮＡ構築物で形質転換された。結果として得られた遺伝子導入アルファルファ植物細胞、植物部位、または植物は、本発明の組換えＤＮＡ分子を備え、ＤＮＡ分子の一部は配列番号１または配列番号２に対して相同的または相補的である。
【００７４】
実施例３
低減酸性デタージェントリグニンを有するアルファルファ植物の選択方法
酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）を、ＧｏｅｒｉｎｇおよびＶａｎ  Ｓｏｅｓｔ（Ｆｏｒａｇｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，ＵＳＤＡ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｎｏ．３７９、１９７０）の標準プロトコルに変更を加えて計測した。Ｆ５７ＡＮＫＯＭフィルターバッグ（ＡＮＫＯＭ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｆａｉｒｐｏｒｔ、ＮＹ）に粉状のサンプル（０．３５ｇ）を入れ、ＡＮＫＯＭファイバーアナライザーにて、対応する溶液にて攪拌しながら１００℃で１時間加熱した。ほぼ沸騰している水で洗浄した後、サンプルを１０５℃で６時間乾燥し、その後にファイバー損失を判定するために重さを量った。残留物に対して、７２％（ｖ／ｖ）硫酸内で３時間定温放置して、充分に洗浄し、重量測定前に１０５℃で６時間乾燥するＡＤＦ判定によってＡＤＬ判定が行われた（Ｇｕｏら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ，１０（５）：４５７−４６４，２００１）。
【００７５】
サンプル（３０ｍｇ）を５０℃で一晩乾燥してから、Ｔｅｆｌｏｎで覆われたねじ口を有するガラス製培養バイアル（１６×１５０ｍｍ）に測り入れた。サンプルは、氷酢酸に用意したての２５％（ｖ／ｖ）臭化アセチルを３ｍＬ加えた後に５０℃で４時間加熱した。サンプルを冷却した後、酢酸を３ｍＬ試験管に加え、５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した。上層のアリコート（５ｍＬ）を、１０ｍＬの２Ｍ  ＮａＯＨおよび１２ｍＬの酢酸が入った５０ｍＬのメスフラスコに定量的に移した。各フラスコにヒドロキシルアミン（０．５Ｍを１ｍＬ）を加え、酢酸で５０ｍＬに希釈した。各サンプルの吸収スペクトル（２５０〜３５０ｎＭ）を判定して、２８０ｎｍでの吸収極大を判定するのに用いた。次の回帰方程式を用いた：臭化アセチルリグニン（ｍｇ／ｍｌ）＝吸収度示度／Ｆ、なお、未熟組織ではＦ＝１７．２０であり、成熟組織ではＦ＝１７．１２であった。
【００７６】
チオ酸分解およびリグニン組成
３０ｍｇの乾燥粉砕サンプルが入った１５ｍＬのガラスバイアルに、チオ酸分解試薬［ジオキサン（ｖ／ｖ）中、２．５％三フッ化ホウ素エーテルおよび１０％エタンチオール］を３ミリリットル加えた。密封されたバイアルは次に、定期的（３０分毎）に手動で攪拌しながら４時間油浴（＞８０℃）に入れた。反応はバイアルを氷の上に置くことで停止された。内標準（２００μＬ）、水（３ｍＬ）、および飽和炭酸水素ナトリウム（ｐＨ〜３〜４まで）を加えた。この混合物はボルテックスされ、沈殿させられた。下層（リグニン分解生成物を含むメタンクロリド）を別のガラスバイアルに移した。水溶液層をさらに２回、メタンクロリドで抽出した。メタンクロリド層を混合して、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。アリコート（３ｍＬ）を窒素下にて乾燥した。乾燥された抽出リグニン単量体は２５マイクロリットル（μＬ）のピリジンおよび８０μＬのＮ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＭＳＴＦＡ）で誘導体化された。３７℃で３０分間定温放置した後、この反応生成物を０．５μＬ、ＧＣ／ＭＳで分析した。ＧＣ／ＭＳはＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ社製５８９０シリーズＩＩガスクロマトグラフと５９７１シリーズの質量選択検知器（カラム：ＨＰ−１、６０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ膜厚）上で行われ、質量スペクトルは６０〜６５０ｍ／ｚの走査範囲を有する電子衝撃方式（７０ｅＶ）で記録された。
【００７７】
実施例４
改良飼料価成分を有するアルファルファ植物 
アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）は米国において最も重要な飼料の１つである。アルファルファ繊維の消化率が上昇することで、飼料品質、飼料配合柔軟性が向上し、飼料価値が改良される。現在、栽培者および育種者は近赤外分光法（ＮＩＲＳ）に中継して、アルファルファの飼料品質特性を予測している。リグニンが下方制御されたアルファルファ植物の導入によって、ＮＩＲＳ法の分析および等式は新しい低リグニンアルファルファサンプルについて飼料品質特性を予測する上で正確となる。リグニン含有量および組成の予測のために、例えば、Ｋｌａｓｏｎリグニンを判定し、シリンギル（Ｓ−リグニン）対グアイアシル（Ｇ−リグニン）サブユニットの割当でＮＩＲ分析が用いられている（Ｂａｉｌｌｅｒｅｓら、２００２）。この実施例は生体外中性デタージェント繊維消化率（ＮＤＦＤ）およびリグニン分析（コーヒー酸  ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）およびカフェオイルＣｏＡ  ３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）が下方制御されたアルファルファのＡＤＬ、Ｋｌａｓｏｎ、合計チオ酸分解収量、Ｓ−リグニン、およびＧ−リグニンを報告する。
【００７８】
乾物（ＤＭ）の百分率としてのＡＤＬ量、および中性デタージェント繊維の百分率としてのＮＤＦＤは、下位茎および植物のサンプルについて別々に開発されたＮＩＲＳ等式を用いて、遺伝子導入アルファルファ（４０ＣＯＭＴおよび４０ＣＣｏＡＯＭＴが下方制御された植物）および２０の非遺伝子導入コントロールヌル型アルファルファ植物を用いて算出された。化学分析によってアルファルファ植物の下位茎にリグニンの合計量を生成した。なお、ＤＭに基づく百分率で示される、ＡＤＬ、Ｋｌａｓｏｎリグニン、合計チオ酸分解リグニン、Ｓ−リグニン、Ｇ−リグニンおよびＨ−リグニンについての計測が含まれた。
【００７９】
４０のＣＯＭＴ、４０のＣＣｏＡＯＭＴ、および２０のヌル型アルファルファ植物の下位茎サンプルは、収穫された合計１０のうち３つの場所に亘って、場所の組み合わせによって収集し、合計で２９００のフィールドサンプルに値した。ＮＩＲＳ分析の結果は、ＣＯＭＴおよびＣＣｏＡＯＭＴ遺伝子導入アルファルファ茎はより低いリグニンおよびより高い消化率を示した。この結果によってさらに、下方制御されたアルファルファのうちの相対値がＡＤＬおよびＫｌａｓｏｎリグニンと比較してチオ酸分解測定リグニンで異なることが明らかになった。合計のチオ酸分解収量がＮＤＦＤを最もよく予測するように見受けられた。特に、アルファルファ茎組織においてＳ−リグニンレベルがＮＤＦＤと高い相関性を有した。
【００８０】
表２は低減リグニンアルファルファ遺伝子導入事象、ＫＫ１７９−２について、非遺伝子導入アルファルファコントロール植物の百分率で示されるＡＤＬおよびＮＤＦＤ値の概要を、乾草（Ａ）および下位茎（Ｂ）に相当する、全植物におけるラウンドアップレディー（ＲＲ）事象と比較して示す。欄１はアルファルファ遺伝子導入事象ＫＫ１７９−２かラウンドアップレディー（ＲＲ）事象かを示す。欄２は非遺伝子導入アルファルファコントロール植物の百分率で示されるＡＤＬの平均量を示す。欄３は非遺伝子導入アルファルファコントロール植物の百分率でのＮＤＦＤ平均量を示す。
【表２】
2018108079.tif 000003
【００８１】
表３は、図２に示され、百分率ＡＤＬ、百分率Ｇリグニン、ＮＤＦＤの測定値、および生長力評価スコアに基づく性能基準で規定される低減リグニンアルファルファ事象について、「スイートスポット」選択を生成するのに用いられる生データ値を示す。欄１は個別のアルファルファ植物に関連付けられたグラフ識別番号を示す（図２に示す）。欄２は事象名称を示す。欄３は１〜１０で評価されて１０のスコアが最もよい生長力の結果を示す生長力評価スコアを含む。欄４は平均ＡＤＬ測定値を示す。欄５は非遺伝子導入ヌルコントロール植物との比較に基づく百分率ＡＤＬ測定値を示す。欄７は平均ＮＤＦＤの測定値を示す。欄８は非遺伝子導入ヌルコントロール植物との比較に基づく百分率ＮＤＦＤの測定値を示す。欄９は平均Ｇリグニンの測定値を示す。欄１０は非遺伝子導入ヌルコントロール植物との比較に基づく百分率Ｇリグニン測定値を示す。性能基準を満たすアルファルファ事象は以下のとおり分類された：性能基準を下回るアルファルファ乾草のＡＤＬおよびＮＤＦＤ値の事象と相対的に、下位茎における約１５〜３０％間でのＡＤＬ濃度低下、８０〜９１％間のＡＤＬ濃度、少なくとも２５％でのＧリグニンの低下、および１１０〜１２５％間のＮＤＦＤ値。
【００８２】
【表３−１】
2018108079.tif 000004
【００８３】
【表３−２】
2018108079.tif 000005
【００８４】
【表３−３】
2018108079.tif 000006
【００８５】
【表３−４】
2018108079.tif 000007
【００８６】
【表３−５】
2018108079.tif 000008
【００８７】
【表３−６】
2018108079.tif 000009
【００８８】
【表３−７】
2018108079.tif 000010
【００８９】
【表３−８】
2018108079.tif 000011
【００９０】
【表３−９】
2018108079.tif 000012
【００９１】
【表３−１０】
2018108079.tif 000013
【００９２】
【表３−１１】
2018108079.tif 000014
【００９３】
【表３−１２】
2018108079.tif 000015
【００９４】
【表３−１３】
2018108079.tif 000016
【００９５】
実施例５
ＡＤＬ、ＮＤＦＤ、および収量結果についてのデータ品質
線形モデルを用いる分析前にデータ品質チェックを行い、大きく削除されたスチューデント化残差を有する外れ値のプロットを識別した。この方法の２つのパスを用いて、第１パスで除外されたより大きい外れ値によって隠されているかもしれない第２パスのより微細な外れ値を検出した。この方法によって識別された外れ値は品質特性の分析から除外された。収量の分析については、ＣＶが２５％以上のプロットは分析から外された。目的変数の分析は、分散モデルの標準分析を用いて固定およびランダムの効果と混和して完了された。実際の統計的な計算はＳＡＳ／ＳＴＡＴソフトウェア、バージョン９．１．３を用いて行った。分散計算の分析はＰＲＯＣ  ＭＩＸＥＤを用いて行った。モデルは構築物および構築物内の事象を固定の効果として扱い、場所、場所の中のレップ、および構築物の相互作用による場所がランダム効果として扱われた。テストされる事象の他の属性は秋季休眠または非休眠生殖質（ＦＤ，ＮＤ）を含んだ。これらは全て固定効果として扱われた。クロス年（ｃｒｏｓｓ−ｙｅａｒ）分析では、年はランダム効果として扱われた。収穫刈り取りの変動する数字は異なる場所にて異なる年に行われた。収量は配置毎に各刈り取りについて分析された。クロス場所、クロス世代、およびクロス年分析において、収量は刈り取りに亘って合計され、プロット毎に合計収量を得た。実験設計はいくつかの事象について一致性ネガティブ分離個体（ｍａｔｃｈｅｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｇｒｅｇａｎｔｓ）を、およびプールされたヌル分離個体（ｐｏｏｌｅｄ  ｎｕｌｌ  ｓｅｇｒｅｇａｎｔ）を含んだ。これによって２つの分析を行うことが可能になった。最初の分析では、全ての事象がプールされたヌル分離個体と比較され、２つ目の分析では、事象は一致性ネガティブ分離個体と比較された。
【００９６】
実施例６
低減リグニンアルファルファ事象の下位茎におけるＡＤＬ測定
【表４】
2018108079.tif 000017
略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾物の％、
ＬＳＤ＝最小有意差、
ＦＤ＝秋季休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下でのより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【００９７】
【表５】
2018108079.tif 000018
略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾物の％、
ＬＳＤ＝最小有意差、
ＦＤ＝秋季休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下でのより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【００９８】
【表６】
2018108079.tif 000019
略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾物の％、
ＬＳＤ＝最小有意差、
ＦＤ＝秋季休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下でのより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【００９９】
【表７】
2018108079.tif 000020
略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾物の％、
ＬＳＤ＝最小有意差、
ＮＤ＝非休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下でのより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１００】
【表８】
2018108079.tif 000021
略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾物の％、
ＬＳＤ＝最小有意差、
ＮＤ＝非休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下でのより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１０１】
表４〜８は４つおよび２つの場所での秋季休眠（ＦＤ）および非休眠（ＮＤ）生殖質における下位茎ＡＤＬの２００９年データをそれぞれ示す。６つの事象ポジティブラインは、プールされたネガティブコントロールと比較して１２〜２６％の著しい（ｐ≦０．０５）ＡＤＬの低下を示し、リード事象ＫＫ１７９は１８〜２２％のＡＤＬの低下を示した。
【０１０２】
実施例７
低減リグニンアルファルファ事象の下位茎におけるＮＤＦＤ測定
【表９】
2018108079.tif 000022
略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾物の％））の不消化および徐々に消化可能な成分を表す、
ＦＤ＝秋季休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０のデルタ値を用いた低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０のデルタ値を用いた高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下でのより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１０３】
３つの場所での秋季休眠（ＦＤ）生殖質における６つの低減リグニン事象についての下位茎ＮＤＦＤ。事象ポジティブ植物は、プールされたネガティブコントロールと比較すると下位茎ＮＤＦＤの著しい（ｐ≦０．０５）増加を示し、１８〜３５％に亘った。
【表１０】
2018108079.tif 000023
略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾物の％））の不消化および徐々に消化可能な成分を表す、
ＦＤ＝秋季休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０のデルタ値を用いた低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０のデルタ値を用いた高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下でのより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１０４】
【表１１】
2018108079.tif 000024
略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾物の％））の不消化および徐々に消化可能な成分を表す、
ＮＤ＝非休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０のデルタ値を用いた低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０のデルタ値を用いた高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下でのより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１０５】
【表１２】
2018108079.tif 000025
略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾物の％））の不消化および徐々に消化可能な成分を表す、
ＦＤ＝秋季休眠、
ＮＤ＝非休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０のデルタ値を用いた低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０のデルタ値を用いた高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下でのより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１０６】
【表１３】
2018108079.tif 000026
略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾物の％））の不消化および徐々に消化可能な成分を表す、
ＮＤ＝非休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０のデルタ値を用いた低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０のデルタ値を用いた高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下でのより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１０７】
表１０〜１３は、４つおよび２つの場所での秋季休眠（ＦＤ）および非休眠（ＮＤ）生殖質における下位茎ＮＤＦＤについての２００９年データを、それぞれ示す。６つの事象ポジティブ低減リグニンアルファルファ事象において、プールされたネガティブコントロールと比較すると２２〜３６％のＮＤＦＤにおける著しい（ｐ≦０．０５）増加を示し、リード事象ＫＫ１７９ではＮＤＦＤに２２〜２８％の増加を示した。
【０１０８】
実施例８
低減リグニンアルファルファ事象についての生長力評価
【表１４】
2018108079.tif 000027
【０１０９】
実施例９
低減リグニンアルファルファ事象についての全植物におけるＡＤＬ測定
【表１５】
2018108079.tif 000028
略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾物の％、
ＬＳＤ＝最小有意差、
ＦＤ＝秋季休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下におけるより大きい絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１１０】
【表１６】
2018108079.tif 000029
略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾物の％、
ＬＳＤ＝最小有意差、
ＮＤ＝非休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下におけるより大きい絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１１１】
【表１７】
2018108079.tif 000030
略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾物の％、
ＬＳＤ＝最小有意差、
ＦＤ＝秋季休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下におけるより大きい絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１１２】
表１５および１７に、４つの場所に亘る２００９年の全植物ＡＤＬデータを示す。６つの低減リグニンポジティブ事象は、両方の秋季休眠生殖質についてプールされたネガティブコントロールと比較したときに８〜１９％のＡＤＬにおける著しい（ｐ≦０．０５）低下を示した。事象ＫＫ１７９は秋季休眠生殖質１および２でそれぞれ９．８％および９．４％のＡＤＬ低下を有した。
【０１１３】
【表１８】
2018108079.tif 000031
略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾物の％、
ＬＳＤ＝最小有意差、
ＮＤ＝非休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下におけるより大きい絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１１４】
表１６および１８に、２つの場所に亘る２００９年の全植物ＡＤＬデータを示す。非休眠生殖質における６つの低減リグニンポジティブ事象は、プールされたネガティブコントロールと比較すると１０〜１６％のＡＤＬにおける著しい（ｐ≦０．０５）低下を示した。６つの事象のうちの５つで、プールされたネガティブコントロールと比較して１０〜１８％のＡＤＬの著しい低下を示した。事象ＫＫ１７９は、非休眠生殖質１および２においてＡＤＬがそれぞれ１２．３％および１０．９％低下した。
【０１１５】
【表１９】
2018108079.tif 000032
略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェントリグニン、乾物の％、
ＦＤ＝秋季休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下にてより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１１６】
【表２０】
2018108079.tif 000033
略語：
ＡＤＬ＝酸性デタージェンとリグニン、乾物の％、
ＮＤ＝非休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下にてより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１１７】
表１９および２０は、業務用チェックと比較した、低減リグニンアルファルファ事象ＫＫ１７９についての全植物ＡＤＬデータを示す。ＫＫ１７９事象は、業務用チェックの４つの秋季休眠のうちの３つと比較したときにＡＤＬの著しい（ｐ≦０．１）低下を示し、６．８〜１６．７％であった（表１９、４つの場所からのデータ）。非休眠背景生殖質（ＮＤ生殖質１）におけるＫＫ１７９事象は、全ての４つの非休眠業務用チェックにおいてＡＤＬの低下（ｐ≦０．２）を７．６〜１０．６％で示した（表２０、２つの場所からのデータ）。非休眠背景生殖質２におけるＫＫ１７９事象は、全ての４つの非休眠業務用チェックに比べてＡＤＬが全体的な低下（ｐ≦０．２）を示し、業務用チェック４（２つの場所からのデータ）と比較して８．８％の著しい（ｐ≦０．１）低下を示した。
【０１１８】
実施例１０
低減リグニンアルファルファ事象についての全植物におけるＮＤＦＤ測定
【表２１】
2018108079.tif 000034
略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾物の％））における不消化および徐々に消化可能の成分を示す、
ＦＤ＝秋季休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下にてより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１１９】
【表２２】
2018108079.tif 000035
略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾物の％））における不消化および徐々に消化可能の成分を示す、
ＮＤ＝非休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下にてより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１２０】
【表２３】
2018108079.tif 000036
略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾物の％））における不消化および徐々に消化可能の成分を示す、
ＦＤ＝秋季休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下にてより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１２１】
表２１および２３に、２００９年の４つの場所に亘る全植物ＮＤＦＤデータを示す。秋季休眠生殖質における６つの低減リグニンポジティブ事象が、プールされたネガティブコントロールと比較したときにＮＤＦＤにおいて７〜１６％の著しい（ｐ≦０．０５）増加を示した。事象ＫＫ１７９は、秋季休眠生殖質１および２においてＮＤＦＤにそれぞれ７．５％および９．２％の増加を示した。
【０１２２】
【表２４】
2018108079.tif 000037
略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾物の％））における不消化および徐々に消化可能の成分を示す、
ＮＤ＝非休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下にてより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１２３】
表２２および２４に、２００９年の２つの場所に亘る全植物ＮＤＦＤデータを示す。非休眠生殖質における６つの低減リグニンポジティブ事象は、プールされたネガティブコントロールと比較したときにＮＤＦＤにおいて８〜１５％の著しい（ｐ≦０．１）増加を示した。事象ＫＫ１７９は非休眠生殖質１および２にてＮＤＦＤにそれぞれ１４．０％と１１．５％の増加を示した。
【０１２４】
【表２５】
2018108079.tif 000038
略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾物の％））における不消化および徐々に消化可能の成分を示す、
ＦＤ＝秋季休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下にてより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１２５】
【表２６】
2018108079.tif 000039
略語：
ＮＤＦＤ＝中性デタージェント繊維消化率、ＮＤＦの％（ＮＤＦ＝中性デタージェント繊維。植物細胞壁（セルロース、ヘミセルロース、リグニン（単位＝乾物の％））における不消化および徐々に消化可能の成分を示す、
ＮＤ＝非休眠、デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０を用いたデルタ値の高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下にてより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１２６】
表２５および２６は業務用チェックと比較した低減リグニンアルファルファ事象ＫＫ１７９についての植物ＮＤＦＤデータを含んでいる。ＫＫ１７９事象は、４．２〜１６．８％の４秋季休眠業務用チェックと比較して、ＮＤＦＤにおいて増加（ｐ≦０．２）を示した。ＫＫ１７９事象は、４つ全ての非休眠業務用チェック（ＮＤ生殖質１）と比較して、ＮＤＦＤにおいて９．８〜１９．４％の範囲の増加（ｐ≦０．２）を示した（表２６、２の場所からのデータ）。ＫＫ１７９事象は４つの非休眠業務用チェック（ＮＤ生殖質２）と比較してＮＤＦＤにおいて増加（ｐ≦０．２）を示し、８．８〜１６．３％であった（表２６、２つの場所からのデータ）。
【０１２７】
実施例１１
低減リグニンアルファルファ事象についての場所に亘る収量分析
【表２７】
2018108079.tif 000040
略語：
収量＝植物毎に基づいて計算されたグラムでの収量、
ＦＤ＝秋季休眠、
ＮＤ＝非休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの間の百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０のデルタ値を用いた低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０のデルタ値を用いた高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下におけるより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１２８】
表２７におけるデータは、プールされたネガティブコントロールと比較した、秋季休眠（ＦＤ）および非休眠（ＮＤ）生殖質における６つの低減リグニン事象について場所に亘る収量分析を示す。プールされたネガティブコントロールと比較して、ＫＫ１７９について収量における著しい低下は検知されなかった。
【０１２９】
【表２８】
2018108079.tif 000041
略語：
収量＝植物毎に基づいて計算されたグラムでの収量、
ＦＤ＝秋季休眠、
ＮＤ＝非休眠、
デルタ＝事象平均とコントロール平均との差（事象−コントロール）、
％差＝事象とコントロールとの間の百分率差（デルタ／コントロール＊１００）、
デルタＬＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０のデルタ値を用いた低信頼区間、
デルタＵＣＩ＠９０％＝アルファレベル０．１０のデルタ値を用いた高信頼区間、
Ｐ値＝帰無仮説下におけるより大きな絶対値差分の見込み（有効性のための両側検定）。
【０１３０】
アルファルファの繊維消化率を改善させることは、栽培者にリスクを管理して高品質アルファルファ乾草／ヘイレージを収穫する能力を提供する。６１の事象が２００７年に最初に調査され、２００８年に６つのエリート事象について複数年、複数場所でのプロットを行った。これらの結果は、１０％開花段階での中性デタージェント画分によって測定された飼料消化率（ＮＤＦＤ）に著しい増加を示した。
【０１３１】
複数場所トライアルは２００８年に２つの休眠背景にて植えられた。データは２００８年および２００９年に２つの季節に亘って収集された。全ての６つの事象について、ポジティブ選択対ヌルコントロールとで全植物の消化率における著しい増加（６．７〜１６％）を休眠組み合わせによって観測した。フィールド性能は分子分析と共にリード事象ＫＫ１７９を識別し、２つの休眠、秋季休眠（ＦＤ）および非休眠生殖質グループに亘って著しい消化率の増加を示した。ＫＫ１７９は、プールされたヌルコントロールと比較すると消化率（ＮＤＦＤ）において７．５〜１４％の増加を、業務用チェックと比較すると消化率において２〜１９％の増加を、および複数年に亘って下位茎において２０〜２８％の増加（プールされたヌルコントロールと比較して）を示した。全植物のＫＫ１７９リグニンレベル（ＡＤＬ）はプールされたヌルコントロールと比較して約１０〜１２％で低下して、下位茎においては複数年に亘って１８〜２２％の低下（プールされたヌルコントロールと比較して）となった。ＫＫ１７９では、プールされたヌルコントロールと比較して収量における著しい低下は検知されなかった。
【０１３２】
実施例１２
アルファルファ管理実施
植え付け（Ａｌｆａｌｆａ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅ、２０１１）：アルファルファをシーディングして北部諸州で植えるのは春の季節から晩夏にかけてが好適な季節であり、苗立ちが成功する機会を増大させる。アルファルファの春のシーディングは、春霜によって損傷する可能性がなくなり次第、開始することができる。晩夏でのシーディングについては、冬の間の生き残りを促進するためにアルファルファは発芽後少なくとも６週間生長させられる。これによって、植物のクラウンが冬の生き残りと春の再成長のための根の蓄えを貯蔵することが可能となる。
【０１３３】
品質に影響する要因（ＯｒｌｏｆｆおよびＭａｒｂｌｅ、１９９７）：アルファルファ管理は刈り取りおよび収穫の実施を含み、栽培者がアルファルファ乾草の栄養価を促すことができる主要な方法であり、飼料収量および立ち木の寿命に重大な影響を及ぼす。栄養的な視点からは、高栄養価のアルファルファ飼料品質は、乾草の飼料価値に関連するために家畜源クラスによる。飼料品質は飼料摂取率および消化率の直接的な機能である。飼料品質が向上すると、飼料摂取率および消化率が増加する。アルファルファ管理実施はアルファルファ乾草品質に影響を与える。刈り取り時の成熟度はアルファルファ管理において最も重要な要因の１つである。成熟度が進むと、収量は増加する。収量とは逆に、飼料品質はアルファルファ植物の成熟度が進むにつれて低下するため、収穫管理は収量の最大限化と品質の最大限化との間の妥協で行われる。また、飼料品質はアルファルファ品種選択、乾草作成作業、および環境インプット、例えば季節的な光、湿度、温度、および光周期または日長の変動によっても影響される。
【０１３４】
収穫管理（ＯｒｌｏｆｆおよびＭａｒｂｌｅ、１９９７）：アルファルファをいつ刈り取り、どのように刈り取るかは、収量、品質、および立ち木持続性における主要要因である。多年生植物として、アルファルファはそのクラウンおよび根に炭水化物をいくらか貯蔵する。刈り取られた後、このプロセスはおよそ２〜３週間、もしくはアルファルファ植物が６〜８インチの高さになるまでかかる。この時点から、植物は根の蓄えを補充し始める。根およびクラウンにおける炭水化物の蓄えは植物の成熟と共に、完全開花のときまで増加する。栽培者はアルファルファが完全開花まで到達すると最大の収量を得ることができるが、最も多い収量は時々５０％開花程度で得られる。第１および第２刈り取りの間、もしくは第２と第３の刈り取りの間の間隔は、一般的に３０〜５０日間である。時間は気候条件およびアルファルファの品種による。頻繁に刈り取りすぎると結果として生長力が低下し、しばしば、雑草の侵入を招く。アルファルファの収穫をスケジューリングする別の方法は、アルファルファの成長段階を活用して刈り取りに適切なときおよび季節毎の刈り取り回数を示す。アルファルファの収穫は特定の成長段階（例えば、発芽、遅れた発芽、１０％開花など）で行われてもよい。この方法は環境および品種の違いの影響を考慮し、結果としてより定常的で予測可能な飼料収量および品質を得る。
【０１３５】
刈り取り（Ａｌｆａｌｆａ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅ、２０１１）：最大収量は、３インチ高さで刈り取り、再成長期間として推奨される２〜３週間の時間、またはアルファルファが６〜８インチの高さに達するまで待つことで得られる。この時点から、植物はそのクラウンおよび根での炭水化物貯蔵を補充し始める。アルファルファの刈り取り高さの現在の推奨は高品質の飼料および立ち木寿命を維持しながら収量を最大化するように設計されている。飼料栽培者は飼料をしばしば３インチ以上の高さで刈り取る。しかしながら、季節毎に３回または４回収穫されるアルファルファ飼料は、３インチ以上で刈り取るよりも１インチ高さで刈り取られたときのほうがより多い合計飼料を生産した（ＫｕｓｔおよびＳｍｉｔｈ、１９６１、ＳｍｉｔｈおよびＮｅｌｓｏｎ、１９６７）。これらの実施は、アルファルファ植物がストレス下、または根の炭水化物レベルが低いときに刈り取った結果として飼料収量の利点として得られる（Ｓｈｅａｆｆｅｒら、１９８８）。
【０１３６】
第１刈り取り
秋に植えられたか以前に苗立ちされたアルファルファ植物の最初の刈り取りの時期は、ほとんどの植物に花芽が形成されたとき、または新しいクラウン新芽が１〜２インチよりも大きく成長していないときに通常合わされる。開花は日長によって制御されるため、最初の生長はしばしば花の形成前に収穫する準備ができており、通常は４月下旬または５月初めに発生する。最初の生長は早い傾向があり、高さが大きく増加倒伏が生じやすく、したがって倒伏が起きる前に収穫することが推奨される。春におけるアルファルファの生長は主にクラウン芽からのものであり、気温および利用可能な根エネルギー貯蔵物に依存する。最初の収穫の後の新芽生長はクラウンおよび腋花芽の両方に由来する。アルファルファが非常に短く刈り取られた場合（１インチ以下）、ほとんどの腋花芽は除去されて新しい新芽はクラウン芽から出なければならない（ＷｉｅｄｅｒｈｏｌｔおよびＳｃｈｎｅｉｄｅｒ、２００７）。春に植えられたシードリング立ち木は少なくとも５０％の茎が花形成する、または倒伏が明らかでない限りは収穫されるべきではない。収穫の遅らせることは苗の根のさらなる成長を可能とする。
【０１３７】
第２および後続刈り取り
第２および後続の刈り取りは、茎の１０％〜２５％が花をつけたときに行われる。アルファルファが生長の芽の段階から２５％開花段階まで進むのに約５〜１０日を要する。一般的に、アルファルファの再生長期間は２８〜３５日毎に好適な刈り取り段階に到達する。暑い、乾燥した天気の間は、植物は再成長期間の３０日より前、および植物が高さ１０インチに達する前に豊富に花をつける可能性がある。このような場合、最後に収穫として刈り取ってから３５〜４０日経った後に短い成長を放牧するか刈り取るのが最もよい。一度植物が広範囲に亘って花をつけると、これらの特定の茎はそれ以上の生長をせず、継続的に存在することによって好適な条件が発生しても新しく生長するのを遅らせる傾向がある。
【０１３８】
秋の刈り取り管理
秋の刈り取り管理については、植物が最初の枯らし霜（２４°Ｆ）前に炭水化物を作るために４〜６週間の再成長が必要であり、１０〜１４インチの成長が推奨される。いくつかの霜の後、しかし葉がしおれて落ち始める前に、この生長分を収穫して飼料の品質を維持して残余を減らすべきであり、このことはペストコントロールをも補助する。
【０１３９】
農業的実施およびサンプル収集：このプロットに用いられる最適な農業的実施は肥料管理、雑草制御、昆虫制御、および湿度を含んだ。若い移植植物に対する変動データを回避するために、フィールドでの移植の最初の生長はデータ収集せずに刈り取った。残りのデータ収集のための標的標成熟度は１０％開花であった。このレベルの成熟度は、事象の並べ替えを補助する茎の木化を可能とする。植物組織は、サンプルをなくさないように、および刈り取り高さを均一に保つべく、手バサミを用いて収集される。全ての収穫についての均一の刈り取り高さは地表レベルから２．５”上がったところであった。これは業務用飼料収穫における典型的な高さである。全ての場所は最適生長および冬の生き残り用に管理された。プロット内の変動を排除するために昆虫および雑草制御は必要に応じて行われた。列内の植物間隔は１５”であり、列間は３０”であった。
【０１４０】
参照文献
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Ｓｈｅａｆｆｅｒ，  Ｃ．Ｃ．，  Ｇ．Ｄ．  Ｌａｃｅｆｉｅｌｄ，  ａｎｄ  Ｖ．Ｌ．  Ｍａｒｂｌｅ．  １９８８．  Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｓｃｈｅｄｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｓｔａｎｄｓ．  Ｐ．  ４１１−４３７．  Ｉｎ  Ａ．Ａ．  Ｈａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄ．）  Ａｌｆａｌｆａ  ａｎｄ  ａｌｆａｌｆａ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ．  Ａｇｒｏｎ．  Ｍｏｎｏｇｒ．  ２９．  ＡＳＡ，  ＣＳＳＡ，  ＳＳＳＡ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ．
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Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ，  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，  Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ａｌｆａｌｆａ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ，  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，  Ｓｏｉｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，  ｃｏｐｙ  ｒｉｇｈｔ  ２０１１．
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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