(57)【要約】【課題】細胞膜の損傷修復促進剤や、ディスフェルリン異常症の診断のためのデータを収集する方法を提供すること。【解決手段】細胞膜の損傷修復促進のために、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）活性化剤を用いる。また、ディスフェルリン異常症の診断のためのデータを収集するために、被験者の骨格筋から採取された生体試料におけるＡＭＰＫサブユニットの発現を検出し、ディスフェルリン異常症でないヒトの骨格筋から採取された生体試料におけるＡＭＰＫサブユニットの発現と比較・評価する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）活性化剤を有効成分として含有する、細胞膜の損傷修復促進剤。
【請求項２】
ＡＭＰＫ活性化剤が、アカデシン、メトホルミン、Ａ−７６９６６２（6,7-Dihydro-4-hydroxy-3-(2'-hydroxy[1,1'-biphenyl]-4-yl)-6-oxo-thieno[2,3-b]pyridine-5-carbonitrile）、フェンホルミン、ブホルミン、チエノピリドン、レスベラトロール、ヌートカトン、アディポネクチン、及びそれらの塩からなる群より選択される１又は２以上の物質である、請求項１に記載の損傷修復促進剤。
【請求項３】
ＡＭＰＫ活性化剤がアカデシンである、請求項１又は２に記載の損傷修復促進剤。
【請求項４】
細胞膜が骨格筋細胞の細胞膜である、請求項１〜３のいずれかに記載の損傷修復促進剤。
【請求項５】
以下の工程（ｉ）及び（ii）を含む、ディスフェルリン異常症の診断のためのデータを収集する方法。
（ｉ）被験者の骨格筋から採取された生体試料におけるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）のサブユニットの発現を検出する工程であって、前記サブユニットが、ＡＭＰＫのα１サブユニット、α２サブユニット、β１サブユニット、β２サブユニット、γ１サブユニット、γ２サブユニット、及びγ３サブユニットからなる群より選択される１又は２以上のサブユニットである、工程；
（ii）前記工程（ｉ）により検出されたサブユニットの発現と、ディスフェルリン異常症でないヒトの骨格筋から採取された生体試料におけるサブユニットの発現とを比較・評価する工程；
【請求項６】
サブユニットが、ＡＭＰＫのγ１サブユニットである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ディスフェルリン異常症が、三好型遠位型ミオパチー又は肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
ＡＭＰＫのα１サブユニット、α２サブユニット、β１サブユニット、β２サブユニット、γ１サブユニット、γ２サブユニット、及びγ３サブユニットからなる群より選択される１又は２以上のサブユニットに特異的に結合する抗体、又はその標識物を含む、ディスフェルリン異常症を診断するためのキット。
【請求項９】
サブユニットが、ＡＭＰＫのγ１サブユニットである、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
ディスフェルリン異常症が、三好型遠位型ミオパチー又は肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型である、請求項８又は９に記載のキット。
【請求項１１】
ＡＭＰＫのα１サブユニット、α２サブユニット、β１サブユニット、β２サブユニット、γ１サブユニット、γ２サブユニット、及びγ３サブユニットからなる群より選択される１又は２以上のサブユニットをコードするｍＲＮＡを特異的に検出するプライマー又はプローブ、若しくはそれらの標識物を含む、ディスフェルリン異常症を診断するためのキット。
【請求項１２】
サブユニットが、ＡＭＰＫのγ１サブユニットである、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
ディスフェルリン異常症が、三好型遠位型ミオパチー又は肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型である、請求項１１又は１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰ−activated protein kinase；ＡＭＰＫ）活性化剤を有効成分として含有する細胞膜の損傷修復促進剤や、被験者の骨格筋から採取された生体試料におけるＡＭＰＫのサブユニットの発現を検出する工程を含む、ディスフェルリン異常症の診断のためのデータを収集する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
成人期に発症する遺伝性筋疾患としては、種々の筋変性疾患、代謝性疾患、ミトコンドリア関連疾患、一部の炎症性疾患等が知られており、なかでも、筋変性疾患である筋ジストロフィー及び遠位型ミオパチーは罹患者数において比較的高い割合を占める。筋ジストロフィーは、筋線維の変性・壊死を主病変とし、臨床的には進行性の筋力低下と筋萎縮を呈する遺伝性疾患と定義されている。筋ジストロフィーには様々な病型が存在するが、特に成人発症で問題となるのは、腰帯部などの近位筋が好んで侵される肢帯型筋ジストロフィー（Limb-Girdle Muscular Dystrophy：以下、「ＬＧＭＤ」ということがある）である。現在までに、ＬＧＭＤに関連する２０以上の遺伝子が明らかにされており、遺伝形式及び原因遺伝子別に分類がなされているが、ＬＧＭＤの臨床的特徴は多様である（非特許文献１及び２）。一方、遠位型ミオパチーは、四肢遠位部優位の進行性筋力低下・萎縮を呈する筋変性疾患であり、三好型遠位型ミオパチー、縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー、及び眼咽頭遠位型ミオパチーの３つの主要な病型に分類されるが、より広汎なスペクトラムを持つ症候群であると考えられている（非特許文献３）。
【０００３】
１９９８年に、常染色体劣性遺伝性疾患である三好型遠位型ミオパチー（ＭＩＭ＃２５４１３０）の原因遺伝子として、ディスフェルリン（dysferlin）タンパク質をコードするＤＹＳＦ遺伝子が同定された（非特許文献４）。さらに、ＤＹＳＦ遺伝子は肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＭＩＭ＃２５３６０１；以下、「ＬＧＭＤ２Ｂ」という）の原因であることも明らかとなった（非特許文献５）。これらの異なる臨床像を呈する疾患群とＤＹＳＦ遺伝子変異との関連が明らかとなったことから、dysferlinopathy（ディスフェルリン異常症）という疾患概念が確立された。以下に述べるように、ディスフェルリン異常症の病態や発症メカニズムについては多くの研究がなされているが、ディスフェルリン異常症に対する有効な治療方法はいまだ確立されていない。
【０００４】
三好型遠位型ミオパチー及びＬＧＭＤ２Ｂは、下腿屈筋の障害が顕著であること、血清ＣＫ値の上昇が著しいこと、骨格筋病理においてジストロフィー性所見に加え細胞浸潤が顕著であること等の共通の臨床的・筋病理的特徴を有する。ディスフェルリン異常症が疑われる場合には、抗ディスフェルリン抗体を用いた筋病理組織の免疫組織染色や、生検筋のウェスタンブロット解析を行い、ディスフェルリンタンパク質の局在や発現レベルを評価する。患者において、ディスフェルリンタンパク質の発現が完全に欠損している場合にはディスフェルリン異常症の可能性が高いが（非特許文献５）、ディスフェルリンタンパク質の局在が異常である場合や、ディスフェルリンタンパク質の発現レベルが低下している場合には、ディスフェルリン異常症以外の疾患による二次的な異常の可能性も考えられる。このため、ディスフェルリン異常症の最終的な診断確定のためには遺伝子診断が必要となる。
【０００５】
現在までに、多数のＤＹＳＦ遺伝子変異陽性患者の臨床症状の解析の結果から、ＤＹＳＦ遺伝子変異と臨床症状との関連が明らかにされてきている（非特許文献６及び７）。また、２０１５年には、次世代シークエンサーを用いた研究により、ディスフェルリン異常症患者及び、それと表現型が類似した患者における遺伝学的背景が明らかにされた（非特許文献８）。これらの研究から、ディスフェルリン欠損の病態は、ＤＹＳＦ遺伝子自体の変異による一次性ディスフェルリン異常症だけではなく、カルパイン３（calpain 3）遺伝子変異などに起因する二次性のディスフェルリン異常症の病態にも関与していることが明らかにされている（非特許文献８）。以上のことから、ディスフェルリン異常症の研究は筋ジストロフィー全体の病態解明にも寄与するものと考えられる。
【０００６】
ＤＹＳＦ遺伝子は、２番染色体（２ｐ１３．３−ｐ１３．１）に存在し、５５エクソン、６，２４３ｂｐからなる巨大遺伝子である（非特許文献９）。また、ＤＹＳＦ遺伝子によってコードされるディスフェルリンタンパク質は、筋細胞の細胞膜に局在する約２３０ｋＤａの非常に大きな膜タンパク質であり、カルシウム依存性膜融合や筋線維修復等に重要な役割を果たしていると考えられている（非特許文献１０及び１１、及び図１）。また、骨格筋細胞においては、損傷を受けた細胞膜にディスフェルリンがパッチ状に凝集し、膜修復に関与することが知られている。さらに、近年、ＡＨＮＡＫ、カベオリン−３（Caveolin-3）、ビンキュリン（Vinculin）、ＭＧ５３／ＴＲＩＭ７２等が、ディスフェルリンと相互作用することが明らかにされ、これらのディスフェルリン結合タンパク質が筋細胞膜修復に関与する可能性が示唆されている（非特許文献１２〜１７）。なかでも、ＴＲＩＭ７２はジストロフィン欠損ｍｄｘマウス（デュシェンヌ型筋ジストロフィーモデルマウス）への投与により、骨格筋損傷の減少することが明らかにされており、筋ジストロフィーの治療に有効である可能性が示唆されている（非特許文献１８）。
【０００７】
以上のことから、新たなディスフェルリン結合タンパク質を同定することにより、ディスフェルリン異常症を含む様々な筋変性疾患における筋細胞膜修復機能障害の分子メカニズムの一端を解明できる可能性が考えられる。しかし、ディスフェルリンは非常に大きな膜タンパク質であり、様々な因子と複合体を形成すると考えられるため、免疫沈降等の通常のアプローチでは、ディスフェルリン結合タンパク質の全容を明らかにすることは困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nigro, V. & Piluso, G. Spectrum of muscular dystrophies associated with sarcolemmal-protein genetic defects. Biochimica et biophysica acta 1852, 585-593 (2015).
【非特許文献２】Nigro, V. & Savarese, M. Genetic basis of limb-girdle muscular dystrophies: the 2014 update. Acta myologica : myopathies and cardiomyopathies : official journal of the Mediterranean Society of Myology / edited by the Gaetano Conte Academy for the study of striated muscle diseases 33, 1-12 (2014).
【非特許文献３】Mastaglia, F.L., Lamont, P.J. & Laing, N.G. Distal myopathies. Current opinion in neurology 18, 504-510 (2005).
【非特許文献４】Liu, J., et al. Dysferlin, a novel skeletal muscle gene, is mutated in Miyoshi myopathy and limb girdle muscular dystrophy. Nat Genet 20, 31-36 (1998).
【非特許文献５】Bashir, R., et al. A gene related to Caenorhabditis elegans spermatogenesis factor fer-1 is mutated in limb-girdle muscular dystrophy type 2B. Nat Genet 20, 37-42 (1998).
【非特許文献６】Takahashi, T., et al. Dysferlin mutations in Japanese Miyoshi myopathy: relationship to phenotype. Neurology 60, 1799-1804 (2003).
【非特許文献７】Takahashi, T., et al. Clinical features and a mutation with late onset of limb girdle muscular dystrophy 2B. J Neurol Neurosurg Psychiatry 84, 433-440 (2013).
【非特許文献８】Izumi, R., et al. Genetic profile for suspected Dysferlinopathy identified by targeted next-generation sequencing. Neurology. Genetics 1, e36 (2015).
【非特許文献９】Aoki, M., et al. Genomic organization of the Dysferlin gene and novel mutations in Miyoshi myopathy. Neurology 57, 271-278 (2001).
【非特許文献１０】Britton, S., et al. The third human FER-1-like protein is highly similar to dysferlin. Genomics 68, 313-321 (2000).
【非特許文献１１】Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature 423, 168-172 (2003).
【非特許文献１２】Kobayashi, K., Izawa, T., Kuwamura, M. & Yamate, J. Dysferlin and animal models for dysferlinopathy. J Toxicol Pathol 25, 135-147 (2012).
【非特許文献１３】Huang, Y., et al. AHNAK, a novel component of the dysferlin protein complex, redistributes to the cytoplasm with dysferlin during skeletal muscle regeneration. Faseb j 21, 732-742 (2007).
【非特許文献１４】Matsuda, C., et al. The sarcolemmal proteins dysferlin and caveolin-3 interact in skeletal muscle. Hum Mol Genet 10, 1761-1766 (2001).
【非特許文献１５】de Morree, A., et al. Proteomic analysis of the dysferlin protein complex unveils its importance for sarcolemmal maintenance and integrity. PLoS One 5, e13854 (2010).
【非特許文献１６】Cai, C., et al. Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53, caveolin-3, and dysferlin. Journal of Biological Chemistry 284, 15894-15902 (2009).
【非特許文献１７】Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol 11, 56-64 (2009).
【非特許文献１８】Weisleder, N., et al. Recombinant MG53 protein modulates therapeutic cell membrane repair in treatment of muscular dystrophy. Sci Transl Med 4, 139ra185 (2012).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、新規ディスフェルリン結合タンパク質を同定して、細胞膜修復におけるその役割を解明することにより、該ディスフェルリン結合タンパク質を標的とした細胞膜の損傷修復促進剤や、ディスフェルリン異常症の診断のためのデータを収集する方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ディスフェルリンは、７つのＣ２ドメイン（Ｃ２Ａ〜Ｃ２Ｇ）、２つのＤｙｓＦドメイン（ＤｙｓＦＣ及びＤｙｓＦＮ）、及び３つのＦｅｒドメインを持つ（Ｆｅｒ、ＦｅｒＡ、及びＦｅｒＢ）を有するタンパク質である（図２）。Ｃ２ドメインはリン脂質に結合するドメインであり、特に、Ｃ２Ａドメインはカルシウム依存的にリン脂質に結合することが知られている（文献「Therrien, C., Dodig, D., Karpati, G. & Sinnreich, M. Mutation impact on dysferlin inferred from database analysis and computer-based structural predictions. J Neurol Sci 250, 71-78 (2006).」参照）。従来のディスフェルリン結合タンパク質に関する研究は、このＣ２ドメインに焦点を当てて行われており、Ｃ２ドメイン以外の領域と結合する因子についてはこれまで全く研究されていなかった。
【００１１】
一方、ディスフェルリンの３番目のＣ２ドメイン（Ｃ２Ｃドメイン）と４番目のＣ２ドメイン（Ｃ２Ｄドメイン）とに挟まれた領域（以下、「第II領域」ともいう）には、機能ドメインであるＤｙｓＦが存在する（図２）。このことから、本発明者らは、骨格筋細胞の膜修復機構において、ディスフェルリンが、その第II領域と他の機能性タンパク質との結合を介して、巨大な足場タンパク質として働いているという独自の仮説を立てた。このような仮説に基づいて、本発明者らは、ディスフェルリン第II領域と結合する因子を探索することによって、ディスフェルリン異常症の治療標的となり得る、新規ディスフェルリン結合タンパク質を同定することができるのではないかと考えた。
【００１２】
そこで、本発明者らは、ディスフェルリン第II領域を結合させたアフィニティビーズを作製し、このアフィニティビーズを用いてディスフェルリン第II領域と相互作用するタンパク質を探索した。その結果、新規ディスフェルリン結合タンパク質として、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼγ１（ＡＭＰＫγ１）、及びprotein phosphatase 1 catalytic subunit alpha（ＰＰＰ１ＣＡ）を同定することに成功した。
【００１３】
ＡＭＰＫγ１は、ＡＭＰＫ複合体を形成するサブユニットの一つである。また、ＰＰＰ１ＣＡは、ＡＭＰＫ複合体のサブユニットＡＭＰＫαの脱リン酸化を介して、ＡＭＰＫ複合体の活性調節に関与することが知られている。これらのことから、本発明者らは、筋細胞の膜修復機構において、ＡＭＰＫ複合体及びその活性化が何らかの役割を果たしている可能性があると考え、（１）ディスフェルリン異常症モデルマウスにおけるＡＭＰＫ複合体の発現レベル及び局在の変化、（２）マウス骨格筋におけるＡＭＰＫ複合体の局在に及ぼす膜損傷の影響、（３）マウス筋芽細胞の膜修復機能に及ぼすＡＭＰＫのγ１、α１、又はα２サブユニットのノックダウンの影響、及び、（４）ディスフェルリン異常症患者由来の筋芽細胞（ｌｉｎｅ１０７細胞）の膜修復機能に及ぼすＡＭＰＫ活性化剤（ＡＩＣＡＲ）の影響を調べた。
【００１４】
そして、実験の結果、（１）ディスフェルリン異常症モデルマウスの骨格筋組織においては、正常マウスと比較して、ＡＭＰＫγ１の発現レベルが低下すること、（２）マウス筋細胞においては、膜損傷の直後からＡＭＰＫγ１が損傷部位に集積すること、（３）ＡＭＰＫγ１及びα１サブユニットのノックダウンによりマウス筋芽細胞の膜修復機能が低下すること、（４）ｌｉｎｅ１０７細胞の膜修復機能がＡＩＣＡＲ処理により改善することを明らかにした。これらの結果から、本発明者らは、ディスフェルリン異常症の筋細胞における膜修復機能異常に、ＡＭＰＫ（特に、ＡＭＰＫγ１）の発現の低下が関与する可能性があること、さらに、ＡＭＰＫを活性化させることによりディスフェルリン異常症の筋細胞において低下した膜修復機能を改善できる可能性があることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち本発明は、（１）ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）活性化剤を有効成分として含有する、細胞膜の損傷修復促進剤や、（２）ＡＭＰＫ活性化剤が、アカデシン、メトホルミン、Ａ−７６９６６２（6,7-Dihydro-4-hydroxy-3-(2'-hydroxy[1,1'-biphenyl]-4-yl)-6-oxo-thieno[2,3-b]pyridine-5-carbonitrile）、フェンホルミン、ブホルミン、チエノピリドン、レスベラトロール、ヌートカトン、アディポネクチン、及びそれらの塩からなる群より選択される１又は２以上の物質である、上記（１）に記載の損傷修復促進剤や、（３）ＡＭＰＫ活性化剤がアカデシンである、上記（１）又は（２）に記載の損傷修復促進剤や、（４）細胞膜が骨格筋細胞の細胞膜である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の損傷修復促進剤に関する。
【００１６】
また、本発明は、（５）（ｉ）被験者の骨格筋から採取された生体試料におけるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）のサブユニットの発現を検出する工程であって、前記サブユニットが、ＡＭＰＫのα１サブユニット、α２サブユニット、β１サブユニット、β２サブユニット、γ１サブユニット、γ２サブユニット、及びγ３サブユニットからなる群より選択される１又は２以上のサブユニットである、工程；（ii）前記工程（ｉ）により検出されたサブユニットの発現と、ディスフェルリン異常症でないヒトの骨格筋から採取された生体試料におけるサブユニットの発現とを比較・評価する工程；の工程（ｉ）及び（ii）を含む、ディスフェルリン異常症の診断のためのデータを収集する方法や、（６）サブユニットがＡＭＰＫのγ１サブユニットである、上記（５）記載の方法や、（７）ディスフェルリン異常症が、三好型遠位型ミオパチー又は肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型である、上記（５）又は（６）に記載の方法や、（８）ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）のα１サブユニット、α２サブユニット、β１サブユニット、β２サブユニット、γ１サブユニット、γ２サブユニット、及びγ３サブユニットからなる群より選択される１又は２以上のサブユニットに特異的に結合する抗体、又はその標識物を含む、ディスフェルリン異常症を診断するためのキット、（９）サブユニットが、ＡＭＰＫのγ１サブユニットである、上記（８）に記載のキットや、（１０）ディスフェルリン異常症が、三好型遠位型ミオパチー又は肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型である、上記（８）又は（９）に記載のキットや、（１１）ＡＭＰＫのα１サブユニット、α２サブユニット、β１サブユニット、β２サブユニット、γ１サブユニット、γ２サブユニット、及びγ３サブユニットからなる群より選択される１又は２以上のサブユニットをコードするｍＲＮＡを特異的に検出するプライマー又はプローブ、若しくはそれらの標識物を含む、ディスフェルリン異常症を診断するためのキットや、（１２）サブユニットが、ＡＭＰＫのγ１サブユニットである、上記（１１）に記載のキットや、（１３）ディスフェルリン異常症が、三好型遠位型ミオパチー又は肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型である、上記（１１）又は（１２）に記載のキットに関する。
【００１７】
さらに、本発明の実施の他の形態として、ＡＭＰＫ活性化剤を、細胞膜の損傷修復促進を必要とする対象（患者）に投与する工程を備えた、細胞膜の損傷修復機能の異常又は低下を伴う症状若しくは疾患を予防又は治療する方法や、細胞膜の損傷修復機能の異常又は低下を伴う症状若しくは疾患の予防又は治療剤として使用するためのＡＭＰＫ活性化剤や、細胞膜の損傷修復機能の異常又は低下を伴う症状若しくは疾患の予防又は治療における使用のためのＡＭＰＫ活性化剤や、細胞膜の損傷修復機能の異常又は低下を伴う症状若しくは疾患の予防又は治療剤を製造するためのＡＭＰＫ活性化剤の使用や、細胞膜の損傷修復促進剤として使用するためのＡＭＰＫ活性化剤や、細胞膜の損傷修復促進における使用のためのＡＭＰＫ活性化剤や、細胞膜の損傷修復促進剤を製造するためのＡＭＰＫ活性化剤の使用を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明において、骨格筋細胞の細胞膜に局在するディスフェルリンが、ＡＭＰＫ複合体やＰＰＰ１ＣＡと結合する足場タンパク質として機能すること、さらに、ＡＭＰＫ複合体を活性化させることにより、ディスフェルリン異常症における骨格筋細胞の膜修復可能性の低下が改善できる可能性がはじめて明らかにされた。これらの結果は、ＡＭＰＫ複合体の活性化物質が、細胞膜の損傷修復促進剤として有効であることを示すとともに、骨格筋組織又は細胞におけるＡＭＰＫ複合体の発現レベルを指標として、ディスフェルリン異常症の診断のためのデータを収集することが可能であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】筋細胞膜における、ディスフェルリンと他の関連タンパク質との関係を示す図である。ジストロフィンを中心として形成される糖タンパク質複合体は、骨格筋の基底膜から細胞膜をつなぎ、物理的な強度を維持している。ディスフェルリンは筋細胞膜上に局在しているとされ、カベオリン−３やカルパイン３等のタンパク質と結合することが知られている。
【図２】ディスフェルリンタンパク質の構造を示す図である。ディスフェルリンタンパク質は、７つのＣ２ドメイン（Ｃ２Ａ〜Ｃ２Ｇ）、３つのＦｅｒドメイン、及び２つのＤｙｓＦドメインを持つ。また、ディスフェルリンタンパク質のＣ末端付近には膜貫通ドメイン（Transmembrane domain）が存在する。本研究においては、Ｃ２ＣドメインとＣ２Ｄドメインに挟まれた、ＦｅｒＡ、ＦｅｒＢ、ＤｙｓＦＮ、及びＤｙｓＦＣを含む領域を「第II領域」と呼ぶ。さらに、第II領域のうちのＮ末端側の、ＦｅｒＡドメインを含む領域を「第II−１領域」と呼び、第II領域のうちのＣ末端側の、ＦｅｒＡ、ＦｅｒＢ、ＤｙｓＦＮ、及びＤｙｓＦＣを含む領域を「第II−２領域」と呼ぶ。
【図３】ディスフェルリン結合タンパク質の同定について示す図である。図３ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色により、ディスフェルリン第II領域、第II−１領域、第II−２領域の組換えポリペプチドの発現が確認されたことを示す図である。図３ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞抽出液を用いて、ディスフェルリン第II領域、第II−１領域、第II−２領域の組換えポリペプチドと結合するタンパク質を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色を行った結果を示す図である。図中、「Ｍ」はサイズマーカー（BenchMark Protein Ladder、Life technologies社製）を、「ＭＢＰ」はＭＢＰタグコントロールを、「ＭＢＰ−ＤＹＳＦ−II」はＭＢＰタグが付加されたディスフェルリン第II領域ポリペプチドを、「ＭＢＰ−ＤＹＳＦ−II−１」はＭＢＰタグが付加されたディスフェルリン第II−１領域ポリペプチドを、「ＭＢＰ−ＤＹＳＦ−II−２」はＭＢＰタグが付加されたディスフェルリン第II−２領域ポリペプチドをそれぞれ示す。ＭＢＰタグコントロールと、各組換えポリペプチドにおけるバンドを比較して、図３ｂの四角で囲まれたバンドを切り出し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより質量分析を行った。その結果、ＨＳＰ７０、ＰＰＰ１ＣＡ、及びＡＭＰＫγ１を、ディスフェルリン第II領域の結合タンパク質として同定した。
【図４】ディスフェルリン欠損マウスの骨格筋細胞における、ＡＭＰＫ複合体の局在を示す図である。図４ａは、正常マウス（ＳＷＲ/Ｊ）及びディスフェルリン欠損マウス（ＳＪＬ／Ｊマウス）の骨格筋組織におけるＡＭＰＫγ１の発現を、免疫染色により調べた結果を示す。正常マウス及びディスフェルリン欠損マウスにおいて、ＡＭＰＫγ１は主に細胞質に局在するが、その一部は細胞膜にも局在する。また、ディスフェルリン欠損マウスの骨格筋組織におけるＡＭＰＫγ１の染色シグナルは、正常マウスと比較して、弱いものであった。図４ｂは、正常マウス（ＳＷＲ/Ｊ）及びディスフェルリン欠損マウス（ＳＪＬ／Ｊマウス）の骨格筋組織におけるＡＭＰＫα１の発現を、免疫染色により調べた結果を示す。ＡＭＰＫα１は主に細胞質に局在するが、その一部は細胞膜にも局在する。図中、白線は５０μｍを示す。
【図５】細胞膜損傷部位へのＡＭＰＫγ１の集積を示す図である。ＡＭＰＫγ１−ＧＦＰを導入したマウス短趾屈筋をレーザーで損傷させ、その間のＡＭＰＫγ１の動態をライブイメージングにより観察した。一番左側の３つの図中、矢印で示す線は、レーザーによる膜損傷部位を示す。また、ＦＭ４−６４は損傷部位に集積するマーカーである。ＡＭＰＫγ１は、筋組織が損傷を受けてから１０秒〜２分後まで損傷部位（矢印で示される部位）に集積した。図中、白線は１０μｍを示す。
【図６】ＡＭＰＫγ１のノックダウンにより膜修復機能が低下することを示す図である。図６ａは、コントロール細胞及び２種類のｓｉＲＮＡ（＃１及び２）でＡＭＰＫγ１をノックダウンした細胞における、ＡＭＰＫγ１発現レベルをウェスタンブロットにより確認した結果を示す。ＧＡＰＤＨは内部標準として用いた。図６ｂは、内部標準により、コントロール細胞及びＡＭＰＫγ１ノックダウン細胞（＃１及び２）のＡＭＰＫγ１発現量を定量化した結果を示す。図６ｃは、蛍光色素ＦＭ１−４３の存在下で、コントロール細胞及びＡＭＰＫγ１ノックダウン細胞の細胞膜をレーザーにより損傷させて、それぞれの細胞におけるＦＭ１−４３集積の程度をライブイメージングにより観察した結果を示す。ＡＭＰＫγ１ノックダウン細胞では、コントロール細胞と比較して、有意なＦＭ１−４３の集積亢進が認められた。図中、黒丸はレーザー照射部位を、白線は１０μｍをそれぞれ示す。図６ｄは、蛍光色素ＦＭ１−４３の存在下で細胞膜を損傷させた後の（０〜１２０秒後）、コントロール細胞及びＡＭＰＫγ１ノックダウン細胞中の蛍光強度の変化（ΔＦ／Ｆ０）を示す。データは平均値±標準誤差で示し、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を行った。図中、＊はＰ＜０．０５を示す。
【図７】細胞膜損傷部位へのＡＭＰＫα１及びＡＭＰＫα２の集積を示す図である。ＡＭＰＫγ１−ＧＦＰを導入したマウス短趾屈筋をレーザーで損傷させ、その間のＡＭＰＫγ１の動態をライブイメージングにより観察した。一番左側の２つの図中、矢印が示す線は、レーザーによる膜損傷部位を示す。ＡＭＰＫγ１は、筋組織が損傷を受けてから１０秒〜２分後まで損傷部位（矢印で示される部位）に集積した。白線は１０μｍを示す。
【図８】ＡＭＰＫα１のノックダウンにより細胞膜修復機能が低下することを示す図である。図８ａは、コントロール細胞及び２種類のｓｉＲＮＡ（＃１及び２）でＡＭＰＫα１をノックダウンした細胞における、ＡＭＰＫα１発現レベルをウェスタンブロットにより確認した結果を示す。ＧＡＰＤＨは内部標準として用いた。図８ｂは、内部標準により、コントロール細胞及びＡＭＰＫα１ノックダウン細胞（＃１及び２）のＡＭＰＫα１発現量を定量化した結果を示す。図８ｃは、蛍光色素ＦＭ１−４３の存在下で、コントロール細胞及びＡＭＰＫγ１ノックダウン細胞の細胞膜をレーザーにより損傷させて、それぞれの細胞におけるＦＭ１−４３集積の程度をライブイメージングにより観察した結果を示す。ＡＭＰＫγ１ノックダウン細胞では、コントロール細胞と比較して、有意なＦＭ１−４３の集積亢進が認められた。図中、矢印のすぐ先はレーザー照射部位を、白線は１０μｍをそれぞれ示す。図８ｄは、蛍光色素ＦＭ１−４３の存在下で細胞膜を損傷させた後の（０〜１２０秒後）、コントロール細胞及びＡＭＰＫγ１ノックダウン細胞中の蛍光強度の変化（ΔＦ／Ｆ０）を示す。データは平均値±標準誤差で示し、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を行った。図中、＊はＰ＜０．０５を示す。図８ｅは、コントロール細胞及び２種類のｓｉＲＮＡ（＃１及び２）でＡＭＰＫα２をノックダウンした細胞における、ＡＭＰＫα２発現レベルをウェスタンブロットにより確認した結果を示す。ＧＡＰＤＨは内部標準として用いた。図８ｆは、内部標準により、コントロール細胞及びＡＭＰＫα２ノックダウン細胞（＃１及び２）のＡＭＰＫα２発現量を定量化した結果を示す。図８ｇは、蛍光色素ＦＭ１−４３の存在下で細胞膜を損傷させた後の（０〜１２０秒後）、コントロール細胞及びＡＭＰＫα２ノックダウン細胞中の蛍光強度の変化（ΔＦ／Ｆ０）を示す。データは平均値±標準誤差で示し、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を行った。図中、＊はＰ＜０．０５を示す。
【図９】正常ヒト細胞（ＫＭ１５５）及びディスフェルリン異常症患者細胞（ｌｉｎｅ１０７）における、カルシウムイオノフォアによるＡＭＰＫαのリン酸化を示す図である。ＫＭ１５５及びｌｉｎｅ１０７に、１μＭのイオノマイシンを添加して３分間インキュベートし、リン酸化ＡＭＰＫαの発現をウェスタンブロットにより調べた。
【図１０】ディスフェルリン異常症患者細胞の膜修復機能がＡＭＰＫ活性化剤により改善することを示す図である。図１０ａは、正常ヒト細胞（ＫＭ１５５）及びディスフェルリン異常症患者細胞（ｌｉｎｅ１０７）における、ディスフェルリン、ＡＭＰＫα、及びリン酸化ＡＭＰＫαの発現をウェスタンブロットにより調べた結果を示す図である。ＫＭ１５５と比較して、ｌｉｎｅ１０７細胞ではディスフェルリン発現レベルの低下が認められた。また、ｌｉｎｅ１０７細胞にＡＭＰＫ活性化剤（ＡＩＣＡＲ）を添加すると、リン酸化ＡＭＰＫαの発現が増加した。図１０ｂは、内部標準（ＧＡＰＤＨ）により、ＫＭ１５５細胞及びｌｉｎｅ１０７細胞におけるディスフェルリン発現量を定量化した結果を示す。図１０ｃは、蛍光色素ＦＭ１−４３の存在下で細胞膜を損傷させた後の（０〜１２０秒後）、ＫＭ１５５及びｌｉｎｅ１０７細胞中の蛍光強度の変化（ΔＦ／Ｆ０）を示す。データは平均値±標準誤差で示し、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を行った。図中、＊はＰ＜０．０５を示す。ｌｉｎｅ１０７細胞におけるＦＭ１−４３集積の程度は、ＫＭ１５５と比較して有意に高かった。図１０ｄは、内部標準（ＧＡＰＤＨ）により、ＫＭ１５５細胞と、無処理又はＧＡＰＤＨ処理を行ったｌｉｎｅ１０７細胞とにおける、リン酸化ＡＭＰＫαの発現量を定量化した結果を示す。図１０ｅは、蛍光色素ＦＭ１−４３の存在下で、無処理又はＡＩＣＡＲ処理を行ったｌｉｎｅ１０７細胞の細胞膜をレーザーにより損傷させて、それぞれの細胞におけるＦＭ１−４３集積の程度をライブイメージングにより観察した結果を示す。図１０ｆは、蛍光色素ＦＭ１−４３の存在下で細胞膜を損傷させた後の（０〜１２０秒後）、無処理又はＡＩＣＡＲ処理を行ったｌｉｎｅ１０７細胞中の蛍光強度の変化（ΔＦ／Ｆ０）を示す。データは平均値±標準誤差で示し、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を行った。図中、＊はＰ＜０．０５を示す。ＡＩＣＡＲを添加したｌｉｎｅ１０７細胞においては、無処理のｌｉｎｅ１０７細胞と比較して、膜損傷後のＦＭ１−４３の集積の程度が有意に低下した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の損傷修復促進剤としては、ＡＭＰＫ活性化剤を有効成分として含有し、細胞膜の損傷修復機能を改善及び／又は向上させるものであれば特に制限されない。本発明の損傷修復促進剤は、細胞膜が損傷を受けた際に、ディスフェルリンとの相互作用を介して損傷部位に凝集するＡＭＰＫ複合体を活性化させることによって、細胞膜修復を促進することができる。上記ＡＭＰＫ活性化剤としては、ＡＭＰＫが有する触媒（リン酸化する）作用を活性化できるものであれば特に制限されず、例えば、アカデシン（5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide、ＡＩＣＡＲとも呼ばれる）、メトホルミン、Ａ−７６９６６２（6,7-Dihydro-4-hydroxy-3-(2'-hydroxy[1,1'-biphenyl]-4-yl)-6-oxo-thieno[2,3-b]pyridine-5-carbonitrile）、フェンホルミン、ブホルミン、チエノピリドン、レスベラトロール、ヌートカトン、アディポネクチン、及びそれらの塩からなる群より選択される１又は２以上の物質を好適に挙げることができる他、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）阻害剤（例えば、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン、アログリプチン、Ｌ−スレオ−イソロイシルピロリジド、Ｌ−アロ−イソロイシルチアゾリジド、若しくはＬ−アロ−イソロイシルピロリジド、又はそれらの塩）やグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体作動薬（例えば、リラグルチド、セマグルチド、タスポグルチド、アルビグルチド、タスポグルチド、デュラグルチド、若しくはエキセナチドＬＡＲ、又はそれらの塩）を挙げることができる（文献「Kimberly A Coughlan, et al. AMPK activation: a therapeutic target for type 2 diabetes?. Diabetes Metab Syndr Obes 2014」参照）。ＡＭＰＫ活性化剤における塩としては、特に制限されず、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；シュウ酸塩、マロン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩等の有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、リジン塩、アルギニン塩、ヒスチジン塩等のアミノ酸塩などを挙げることができる。上記ＡＭＰＫ活性化剤としては、アカデシン、メトホルミン、Ａ−７６９６６２及びそれらの塩からなる群より選択される１又は２以上の物質であることが好ましく、アカデシン及び／又はメトホルミン塩酸塩であることがより好ましく、アカデシンであることがさらに好ましい。
【００２１】
本発明の損傷修復促進剤は、細胞（好ましくは、骨格筋細胞、心筋細胞、末梢血単球細胞等の野生型個体においてディスフェルリンを発現する細胞）膜の損傷修復を促進する作用を有する。このため、本発明の損傷修復促進剤は、細胞膜の損傷修復機能の異常又は低下を伴う症状又は疾患の予防又は改善（治療）剤に有利に適用することができる。かかる細胞膜の損傷修復機能の異常又は低下を伴う症状又は疾患としては、具体的には、三好型遠位型ミオパチー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型等のディスフェルリン異常症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、ベッカー型先天性筋緊張症、エメリー−ドレフュス型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、眼咽頭筋ジストロフィー、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、多発筋炎、ギラン−バレー症候群、アンダーセン−タウィル症候群、ベスレムミオパチー、球脊髄性筋萎縮症、カルニチン欠損、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損、セントラルコア病、中心核ミオパチー、シャルコー−マリー−トゥース病、先天性筋無力症候群、先天性筋強直性ジストロフィー（ウォーカー−ワールブルグ症候群）、コーリ病（脱分枝酵素欠損症）、デジュリーヌ−ソッタス病、皮膚筋炎、遠位筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー（筋強直性ジストロフィー）、内分泌性ミオパチー、エーレンバーグ病（先天性パラミオトニア）、フィンランド型遠位型ミオパチー、フォーブズ病、フリードライヒ運動失調症、福山型先天性筋ジストロフィー、糖原病２型、３型、５型、７型、９型、１０型、１１型、Ｇｏｗｅｒｓ−Ｌａｉｎｇ遠位型ミオパチー、遺伝性封入体筋炎、甲状腺機能亢進性ミオパチー、甲状腺機能低下性ミオパチー、封入体筋炎、遺伝性ミオパチー、インテグリン欠損型先天性筋ジストロフィー、ケネディ病（球脊髄性筋萎縮症）、乳酸デヒドロゲナーゼ欠損症、ランバート−イートン筋無力症候群、肢帯型筋ジストロフィー、マックアードル病、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー、ミトコンドリアミオパチー、運動ニューロン疾患、筋・眼・脳病、重症筋無力症、ミオアデニレートデアミナーゼ欠乏症、筋原線維性ミオパチー、筋型ホスホリラーゼ欠損症、先天性筋緊張症（トムセン病）、筋細管ミオパチー、筋強直性ジストロフィー、ネマリンミオパチー、野中型遠位型ミオパチー、先天性パラミオトニア、ピアソン症候群、周期性四肢麻痺、ホスホフルクトキナーゼ欠損症（垂井病）、ホスホグリセレートキナーゼ欠損症、ホスホグリセレートムターゼ欠損症、ホスホリラーゼ欠損症、ポンペ病（酸マルターゼ欠損症）、進行性外眼筋麻痺、ウェランダー型遠位型ミオパチー、ＺＡＳＰ関連性ミオパチー等の筋原生疾患を挙げることができる。
【００２２】
また、上記本発明の損傷修復促進剤は、常法によって適宜の製剤とすることができ、例えば、薬学的に許容し得る担体若しくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、防腐剤、結合剤をさらに含有することもできる。さらに、本発明の損傷修復促進剤を、それを必要とする患者に投与する場合の投与経路としては、例えば、経口、筋肉内、皮下、直腸内、経粘膜、腸内、骨髄内、鞘内、直接心室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内注射を挙げることができる。投与経路は、対象の年齢や病状、併用する他の薬剤などを考慮して適宜選択することができる。
【００２３】
本発明の損傷修復促進剤を、それを必要とする患者に投与する場合の投与量としては、有効成分の種類、病状の重さ、治療方針、患者の年齢、体重、性別、全般的な健康状態、及び患者の遺伝的背景に応じて、当業者が適宜選択することができる。例えば、本発明の損傷修復促進剤としてメトホルミン塩酸塩を投与する場合、その投与量や投与方法は、２型糖尿病治療におけるメトホルミン塩酸塩の投与量に準拠して選択することができる。具体的には、成人患者に対して５００ｍｇ／日のメトホルミン塩酸塩の投与から開始し、該患者における効果を確認しながら、５００〜２，２５０ｍｇ／日、好ましくは１，０００〜２，０００ｍｇ／日、より好ましくは７５０〜１，５００ｍｇ／日のメトホルミン塩酸塩を投与することができる。また、メトホルミン塩酸塩の投与は、１日２〜３回に分けて、食前又は食後に経口投与により行うことができる。
【００２４】
本発明のディスフェルリン異常症の診断のためのデータを収集する方法としては、（ｉ）被験者の骨格筋から採取された生体試料におけるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）のサブユニットの発現を検出する工程であって、前記サブユニットが、α１サブユニット、α２サブユニット、β１サブユニット、β２サブユニット、γ１サブユニット、γ２サブユニット、及びγ３サブユニットからなる群より選択される１又は２以上のサブユニットである工程；（ii）前記工程（ｉ）により検出されたサブユニットの発現と、ディスフェルリン異常症でないヒトの骨格筋から採取された生体試料におけるサブユニットの発現とを比較・評価する工程；の工程（ｉ）及び（ii）を含むものであれば制限されないが、特に、工程（ｉ）においてＡＭＰＫのγ１サブユニットの発現を検出する方法であることが好ましい。ここで「ディスフェルリン異常症」とは、ディスフェルリンをコードするＤＹＳＦ遺伝子変異の変異によって引き起こされる神経筋疾患を意味し、例えば、三好型遠位型ミオパチー、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型等を好適に挙げることができる。なお、本発明におけるデータを収集する方法は、医師による診断を補助する方法であって、医師による診断行為を含まない。
【００２５】
上記データを収集する方法において使用される「生体試料」としては、被験者又はディスフェルリン異常症でないヒトの骨格筋から採取された試料であれば、外科的処置により採取されたものであっても、生検により部分的に採取されたものであってもよい。上記「被験者」とは、ディスフェルリン異常症を発症している又は発症しているかどうか不明なヒトや、ディスフェルリン異常症かどうか識別が困難な筋原性疾患を発症しているヒトを意味し、また、「ディスフェルリン異常症でないヒト」とは、健常者や医師等当業者が通常用いる基準に照らして明らかにディスフェルリン異常症を発症していないと判断されるヒトを意味する。上記「骨格筋」としては、特に制限されないが、例えば、外側広筋、内側広筋、大腿直筋、中間広筋、上腕二頭筋、前脛骨筋、後脛骨筋、腓腹筋、ヒラメ筋、三角筋、広背筋、胸鎖乳突筋、肋間筋等を好適に挙げることができる。本発明において、生体試料は、凍結処理が施された凍結組織、病理組織学的処理が施された病理組織のいずれであってもよい他、採取された骨格筋組織から単離された細胞若しくはその培養細胞、又はそれらの細胞抽出液であってもよい。上記「被験者の骨格筋から採取された生体試料」と上記「ディスフェルリン異常症でないヒトの骨格筋から採取された生体試料」とは、同一の処置が施されたものであることが好ましい。
【００２６】
本発明のデータを収集する方法において「発現を検出する」とは、ＡＭＰＫ複合体を形成する、α１サブユニット、α２サブユニット、β１サブユニット、β２サブユニット、γ１サブユニット、γ２サブユニット、及びγ３サブユニットからなる群より選択される１又は２以上のサブユニット（以下、これらを総称して「ＡＭＰＫサブユニット」という場合がある）のタンパク質若しくはｍＲＮＡの、存在の有無を確認すること、定量すること、及び／又は可視化することをいう。上記工程（ｉ）において検出対象とされるＡＭＰＫサブユニットとしては、特に制限されないが、少なくともγ１サブユニットを含むものであることが好ましく、γ１サブユニットとα１サブユニット、α２サブユニット、β１サブユニット、β２サブユニット、γ２サブユニット、及びγ３サブユニットからなる群より選択される１又は２以上のサブユニットとの組合せであることがさらに好ましい。
【００２７】
ＡＭＰＫサブユニットのタンパク質の発現を検出する方法としては、ＡＭＰＫサブユニットタンパク質の一部又は全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、例えば、免疫染色法、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法、免疫沈降法、ＨＰＬＣ／ＭＳ（質量分析）法、ＣＥ／ＭＳ法、ＭＳ／ＭＳ法、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法、ライブイメージング法などを挙げることができるが、なかでも、免疫染色法及びウェスタンブロット法を好適に挙げることができる。免疫染色法は、抗体を用いて目的分子を染色する方法であればよく、例えば、実体顕微鏡や位相差顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡などを用いて観察し検出することができる。免疫組織染色においては、ＡＭＰＫサブユニットに対する標識された一次抗体を用いて、又はＡＭＰＫサブユニットに対する一次抗体及び標識された二次抗体を用いて、生体試料から作製された病理組織を染色することにより検出することもできる。一次抗体や二次抗体の標識としては、検出可能な標識物質であればよく、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Rhodamine、Alexa fluor（登録商標、インビトロジェン社製）などの蛍光物質や、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素、ビオチンなどのタンパク質、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）などのハプテン、金コロイド、放射性同位体元素などを挙げることができる。ペルオキシダーゼ標識は、ＤＡＢ（ジアミノベンジジ）法、ニッケルＤＡＢ法で検出することもでき、アルカリホスファターゼ標識はＮＢＴ／ＢＣＩＰ反応で検出することもできる。また、他にＴＳＡ法（tyramide signal amplification）やビオチン・アビジン反応を利用した増感法なども適宜組み合わせて使用することができる。上記ウェスタンブロット法としては、生体試料からタンパク質を抽出して、ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分画し、ＰＶＤＦ又はニトロセルロースメンブレンに転写し、抗体により検出する方法を挙げることができ、メンブレンに付着したタンパク質をＡＭＰＫサブユニットに対する標識された一次抗体を用いて、又はＡＭＰＫサブユニットに対する一次抗体及び標識された二次抗体を用いて検出することができる。免疫染色法、ウェスタンブロット法等に用いる抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよく、市販のものを使用できる他、常法により作製することもできる。
【００２８】
また、ＡＭＰＫサブユニットのｍＲＮＡを検出する方法としては、ＡＭＰＫサブユニットをコードするｍＲＮＡ又はその逆転写物（ｃＤＮＡ）の一部若しくは全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、例えば、生体試料中の細胞から全ＲＮＡを抽出・精製し、ＡＭＰＫサブユニットをコードするｍＲＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたノーザンブロッティング法で検出する方法や、生体試料中の細胞における全ＲＮＡを抽出・精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、ＡＭＰＫサブユニットをコードするｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマー対を用いた、競合的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等の定量ＰＣＲ法で検出する方法や、細胞における全ＲＮＡを精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、ビオチンやジゴキシゲニンなどでｃＤＮＡをラベルし、蛍光物質が標識されたビオチンに対する親和性の高いアビジンやジゴキシゲニンを認識する抗体などで間接的にＡＭＰＫサブユニットをコードするｃＤＮＡを標識した後、ガラス、シリコン、プラスチックなどのハイブリダイゼーションに使用可能な支持体上に固定化された、ＡＭＰＫサブユニットをコードするｃＤＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたマイクロアレイで検出する方法等を挙げることができる。これらの方法に用いられるプローブやプライマーは、ＡＭＰＫサブユニットをコードする遺伝子の配列情報に基づいて適宜設計し、適当なオリゴヌクレオチド合成装置を用いて適宜作製することができる。
【００２９】
本発明のデータを収集する方法において「比較・評価する」とは、被験者の骨格筋から採取された生体試料におけるＡＭＰＫサブユニットのタンパク質又はかかるサブユニットをコードするｍＲＮＡの発現と、ディスフェルリン異常症でないヒトの骨格筋から採取された生体試料における対応するタンパク質又はｍＲＮＡの発現とを比較して、発現量の変化又は局在の変化が認められるかを判定することをいう。上記データを収集する方法において、例えば、被験者の骨格筋から採取された生体試料におけるＡＭＰＫγ１サブユニットのタンパク質又はかかるサブユニットをコードするｍＲＮＡの発現量が、ディスフェルリン異常症でないヒトの骨格筋から採取された生体試料における該タンパク質の発現量よりも低下しているというデータが得られた場合には、上記被験者はディスフェルリン異常症を発症している可能性が高い、又は発症リスクがあると判定することができる。
【００３０】
本発明はさらに、ディスフェルリン異常症を診断するためのキットにも関する。本発明のキットは、ＡＭＰＫのα１サブユニット、α２サブユニット、β１サブユニット、β２サブユニット、γ１サブユニット、γ２サブユニット、及びγ３サブユニットからなる群より選択される１又は２以上のサブユニットのタンパク質若しくはかかるサブユニットをコードするｍＲＮＡを検出することができる物質を含むものであれば特に制限されない。ＡＭＰＫサブユニットタンパク質を検出することができる物質としては、ＡＭＰＫサブユニットタンパク質の一部又は全部を特異的に検出できる物質であれば特に制限されないが、例えば、ＡＭＰＫサブユニットタンパク質に結合する抗体を好適に挙げることができ、γ１サブユニットと結合する抗体をさらに好適に挙げることができる。また、ＡＭＰＫサブユニットｍＲＮＡを検出することができる物質としては、ＡＭＰＫサブユニットをコードするｍＲＮＡ又はその逆転写物（ｃＤＮＡ）の一部若しくは全部を特異的に検出できる物質であれば特に制限されないが、例えば、前記ｍＲＮＡに相補的な塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドからなるプローブや該ヌクレオチドを固相化したマイクロアレイ、前記ｃＤＮＡの塩基配列からなるヌクレオチド又はその一部配列を含むヌクレオチドをターゲットとしたリアルタイムＰＣＲ法に用いられるプライマーセットを挙げることができる。本発明のキットは、さらに、希釈剤、洗浄用緩衝液、標準物質、基質試薬等の他、ディスフェルリン異常症の診断のためのデータを収集し得る旨が記載された取扱説明書を含んでいてもよく、簡便に検査できるよう構成されたものが好ましい。
【００３１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、実施例に記載の全ての実験は、東北大学遺伝子組換え実験安全専門委員会及び動物実験専門委員会の承認を得た後、国立大学法人東北大学における動物実験等に関する規定に沿って行った。
【実施例】
【００３２】
１．材料と方法
１−１  細胞株及び培養液
１）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（SV40 large T antigenを発現するヒト腎臓上皮由来細胞株）、及びＣ２Ｃ１２細胞株（マウス筋芽細胞株）を、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）より入手した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株及びＣ２Ｃ１２細胞株は、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン、及び必須アミノ酸液を含むＲＰＭＩ１６４０培養液（Ｗａｋｏ社製、１８９−０２０２５）を用い、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２、３７℃条件下で培養した（以下、かかる培養液を単に「ＤＭＥＭ培養液」という）。
２）ＲＨ−３０細胞株（不活性型ｐ５３を発現するヒト横紋筋肉腫細胞株）は、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン、及び必須アミノ酸液を含むＲＰＭＩ１６４０培養液（GIBCO社製）を用い、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２、３７℃条件下で培養した（以下、かかる培養液を単に「ＲＰＭＩ１６４０培養液」という）。
３）ｌｉｎｅ１０７細胞（ディスフェルリン異常症患者由来の筋芽細胞株）、及びＫＭ１５５細胞（健常者由来の筋芽細胞株）は、Jain Foundationより供与された（文献「Philippi, S., et al. Dysferlin deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy. PLoS Curr 4, RRN1298 (2012).」参照）。ｌｉｎｅ１０７細胞及びＫＭ１５５細胞は、２０％ウシ胎児血清、２．５ｎｇ／ｍＬ ＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor、Invitrogen社製）０．１μＭデキサメタゾン（Sigma-Aldrich社製）、及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含む１ ｖｏｌ １９９培地（Invitrogen社製）／４ ｖｏｌ ＤＭＥＭを用いて、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２、３７℃条件下で培養した。なお、以下の表１に示す通り、ｌｉｎｅ１０７細胞では、１つのアレルはスプライシング異常により、もう１つのアレルはミスセンスによりＤＹＳＦ遺伝子の機能異常が引き起こされる。これらの変異により、ｌｉｎｅ１０７細胞では、ディスフェルリンの２９９番目のグリシン（Ｇ）がアルギニン（Ｒ）に置換された変異ディスフェルリンタンパク質（Ｇ２９９Ｒ）が発現する。
【００３３】
【表１】
2018177685.tif 000002
【００３４】
１−２  ディスフェルリン第II、第II−１、及び第II−２領域の発現ベクターの構築
ヒトディスフェルリンタンパク質アイソフォーム１（配列番号１９）の第４８１〜第１１４０番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド（以下、「ディスフェルリン第II領域」ということがある）、前記第II領域中のＮ末端側の領域である第４８１〜第７８０番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド（以下、便宜上「ディスフェルリン第II−１領域」ということがある）、又は前記第II領域中のＣ末端側の領域である第６６１〜第１１４０番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド（以下、便宜上「ディスフェルリン第II−２領域」ということがある）をそれぞれコードする遺伝子領域を、ヒト臓器３０種のｃＤＮＡクローン（Human Universal QUICK-Clone cDNA II、Clonetech社製）を鋳型としたＰＣＲにより増幅した（図２参照）。得られた増幅産物を、制限酵素ＺｈｏＩ又はＳａｌＩと、ＮｏｔＩとで処理し、ＭＢＰベクター（Clontech社製）のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）に挿入することにより、ＭＢＰタグを付加したディスフェルリン第II領域、第II−１領域、及び第II−２領域ポリペプチドを発現する３種の発現ベクターを構築した。上記ＰＣＲに用いたプライマーセットは表２に示す。
【００３５】
【表２】
2018177685.tif 000003
【００３６】
１−３  ディスフェルリン第II、第II−１、及び第II−２領域結合ビーズの作製
定法に従って、上記「１−２」で構築した３種の発現ベクターを大腸菌（E. coli）に導入し、ＭＢＰタグを付加したディスフェルリン第II、第II−１、及び第II−２領域ポリペプチドを発現させた。得られた大腸菌の細胞抽出液に、抗ＭＢＰ抗体結合ビーズ（Anti-MBP Magnetic Beads、NEW ENGLAND Biolabs社製）を加え、ローテーターを使用して４℃で２時間インキュベートした。インキュベート後のビーズを、ＮＥ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．５］、０．３５Ｍ 塩化ナトリウム、０．１％ ＮＰ−４０、Protease inhibitor cocktail）で２回洗浄し（４℃、２，０００ｒｐｍ、２分間遠心）、次に、１．２Ｍ 塩化ナトリウム洗浄緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．５］、１．２Ｍ 塩化ナトリウム）で２回洗浄した（４℃、２，０００ｒｐｍ、２分間遠心）。さらに、ＰＢＳで１回洗浄して（４℃、２，０００ｒｐｍ、２分間遠心）、３種のビーズ（ディスフェルリン第II結合ビーズ、ディスフェルリン第II−１結合ビーズ、及びディスフェルリン第II−２領域結合ビーズ）を作製した。
【００３７】
１−４  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞抽出液の調製
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１５ｃｍディッシュで７０〜８０％コンフルエントになるまで培養し、ＮＥ緩衝液で一度洗浄した後に回収した。回収した細胞を遠心して上清を除去し、得られたペレットにＮＥ緩衝液を３〜４ｍＬ加えた後に、超音波破砕した。破砕したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、上清を回収した。回収した上清に、ＲＮａｓｅＩ（１０ｍｇ／ｍＬ）、ＤＮａｓｅＩ（１０ｍｇ／ｍＬ）、及びBenzonase（５０Ｕ／ｍＬ）を加え、タンパク質低吸着性フィルター（Φ０．４５μｍ）で濾過し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞抽出液を調製した。
【００３８】
１−５  ディスフェルリン第II、第II−１、及び第II−２領域結合ビーズと、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞抽出液とのインキュベーション
上記「１−４」で調製した細胞抽出液に、上記「１−３」で作製した３種のビーズをそれぞれ加え、ローテーターを使用して４℃で３〜４時間インキュベートした。インキュベート後のビーズを１，２００ｒｐｍで２分間遠心した後に、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム洗浄緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．５］、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．１％ ＮＰ−４０）で３回洗浄した（４℃、１，８００ｒｐｍ、２分間）。上清を除去した後に、さらに、ＰＢＳを加えて２回洗浄した（４℃、１，８００ｒｐｍ、２分間）。
【００３９】
１−６  ディスフェルリン第II、第II−１、及び第II−２領域と結合するタンパク質の溶出
洗浄後の各ビーズに溶出緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ．７．５］、１．２Ｍ ＮａＣｌ）を加え、チューブを３〜４回転倒攪拌した後に、遠心して（４℃、１５，０００ｒｐｍ、２分間）、それぞれの上清を回収した。次に、得られた上清を、遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ４、MERCK MILLIPORE社製）を用いて脱塩・濃縮し、ディスフェルリン第II、第II−１、又は第II−２領域に結合するタンパク質を含む溶液を調製した。
【００４０】
１−７  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上記「１−６」で調製した溶液に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）用サンプルバッファー（２Ｘ）を等量混合して９５℃で３分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを作製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルをポリアミドゲル（５−２０％SuperSep Ace、Ｗａｋｏ社製）にアプライし、２００Ｖ定電圧、６０分間条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【００４１】
１−８  質量分析
上記「１−７」のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のポリアミドゲルを、Silver Stain MS Kit（Ｗａｋｏ社製）を用いた銀染色した。銀染色により検出されたバンドを含むゲルを切り出し、定法に従って、脱色、システイン残基の還元処理、及びアルキル化処理を行った後、トリプシンによりゲル内消化を行った。消化されたペプチド断片を抽出して脱塩処理し、質量分析用試料を調製した。続いて、定法に従って、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ/ＭＳ装置（DiNa HPLC system、KYA TECH Corporation社製、QSTAR XL、Applied Biosystems社製）による上記質量分析用試料の解析を行った。得られた質量分析データからMascot search（MS/MS Ion Search）によりタンパク質を同定した。
【００４２】
１−９  ウェスタンブロット
また、上記「１−７」のＳＤＳ−ＰＡＧＥの後のポリアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（Polyvinylidene difluoride、Millipore社製）にセミドライ法により転写させ、５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．６］、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）、又は５％ スキムミルク／ＴＢＳＴ溶液を用いてブロッキングした。次に、４種類の一次抗体（抗ＡＭＰＫγ1ウサギポリクローナル抗体［ａｂ３２５０８、１：２００倍希釈、ａｂｃａｍ社製］、抗ＡＭＰＫαウサギポリクローナル抗体［＃２５３２、１：１，０００倍希釈、ＣＳＴ社製］、抗リン酸化ＡＭＰＫα［Ｔｈｒ１７２］ウサギポリクローナル抗体［＃２５３１、１：１，０００倍希釈、ＣＳＴ社製］、及び抗ディスフェルリンマウスモノクローナル抗体［NCL-Hamlet、１：５００倍希釈、Novocastra社製］）存在下、４℃で一晩インキュベートした。メンブレンをＴＢＳＴ溶液で３回洗浄した後、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（♯７０７４、１：２，０００倍希釈、ＣＳＴ社製）、又はＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（♯７０７６、１：２，０００倍希釈、ＣＳＴ社製）存在下、室温で１時間インキュベートした。メンブレンをＴＢＳＴ溶液で３回洗浄した後、ＥＣＬ（enhanced chemiluminescence）prime試薬（GE Healthcare社製）による化学発光を行った。当該発光の検出は、ＬＡＳ−３０００イメージリーダー（富士フィルム社製）を用いて行った。
【００４３】
１−１０  免疫組織染色法
摘出した腓腹筋を、コルクの上にトラガントガム固定し、液体窒素で冷却したメチルブタン内で瞬間凍結させた。１０μｍの厚さの凍結切片を作製し、染色まで−８０℃で冷凍保存した。凍結切片サンプルを、４％パラホルムアルデヒド溶液中で２０分固定し、ＰＢＳで３回洗浄した後、ブロッキング溶液（５％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ)を用いて室内で１時間ブロッキングを行った。次いで、２種類の一次抗体（抗ディスフェルリンマウスモノクローナル抗体［NCL-Hamlet、１：５００倍希釈、Novocastra社製］、及び抗ＡＭＰＫγ1ウサギモノクローナル抗体［ａｂ３２３８２、１：５００倍希釈、ａｂｃａｍ社製］）存在下、４℃で一晩インキュベートした。凍結切片サンプルを、ＰＢＳで３回洗浄した後、Alexa Fluor 488標識抗マウスＩｇＧ抗体（Life Technologies社製）及びAlexa Fluor 555標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Life Technologies社製）存在下、室温で１時間インキュベートした。凍結切片サンプルをＰＢＳで３回洗浄し、Vectashieldマウンティングメディウム（Vector Labs社製）を用いて封入した。蛍光画像は、蛍光顕微鏡（BZ-X700、キーエンス社製）を用いて４０倍の倍率で取得した。
【００４４】
１−１１  カルシウムイオノフォア
カルシウムイオノフォア（イオノマイシン、Ｗａｋｏ社製）をＤＭＳＯ中に溶解し、１ｍｍｏＬ／Ｌのイオノマイシンストック溶液を調整した。かかるストック溶液を、ＤＭＥＭ培養液を用いて１０μｍｏＬ／Ｌの濃度に調整し、イオノマイシンの濃度が最終的に１μｍとなるように、培養プレートに加えた。３７℃で３分間培養した後、培養細胞からのタンパク質の抽出を行った。
【００４５】
１−１２  ＲＮＡ干渉
以下の表３に示すSilencer Select siRNAs（Life Technologies社製）を、リポフェクション試薬（lipofectamine RNAiMAX、Life Technologies社製）を用いて、Ｃ２Ｃ１２細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションは、リポフェクション試薬に添付の使用説明書に従って行った。
【００４６】
【表３】
2018177685.tif 000004
【００４７】
１−１３  ＧＦＰ融合ＡＭＰＫサブユニット発現ベクターの作製
ＡＭＰＫを構成する３種のサブユニットをコードする遺伝子（ＡＭＰＫγ１、ＡＭＰＫα１、及びＡＭＰＫα２遺伝子；加齢学研究所の菅野新一郎先生より供与された）を、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Clonetech社製）のＭＣＳに挿入することにより、ＧＦＰ融合ＡＭＰＫサブユニット発現ベクター（ＧＦＰ融合ＡＭＰＫγ１発現ベクター、ＧＦＰ融合ＡＭＰＫα１発現ベクター、及びＧＦＰ融合ＡＭＰＫα２発現ベクター）を作製した。
【００４８】
１−１４  分離筋束内の膜修復関連タンパク質のライブイメージング
上記「１−１３」で作製した３種のＧＦＰ融合ＡＭＰＫサブユニット発現ベクターを、エレクトロポレーション（ニードル幅 ３ｍｍ、８６Ｖ、５０ｍｓパルス幅、パルス３回×２、０．０１−０．０４Ａ、Pulse Generator、CUY21EDIT、Ｂｅｘ社製）により、４週齢のＣ５７ＢＬ６/Ｊマウス（日本クレア社製）の短趾屈筋に導入した。導入から７日後のマウスを頸椎脱臼により安楽死させ、短趾屈筋を採取し、細胞膜損傷修復アッセイを行った。アッセイは、以前の報告に従って行った（文献「Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature 423, 168-172 (2003).」参照）。２種類の損傷マーカー試薬（ＦＭ１−４３試薬及びＦＭ４−６４試薬［Life Technologies社製］）をＤ−ＰＢＳで希釈した。ＦＭ１−４３試薬又はＦＭ４−６４試薬存在下で、短趾屈筋を二光子レーザー（Sa-Ti/820nm、Chameleon、30W、Coherent社製）により損傷させ、４８８、５９４又は８２０ｎｍの波長の光による励起を行った。高感度拡張検出器ユニット（ＬＳＭ ＢｉＧ、Zeiss社製）を取り付けた正立型多光子レーザー顕微鏡（NL0710、Zeiss社製）を用いて、筋束内の筋細胞のライブイメージングを行った。
【００４９】
１−１５  ＡＭＰＫ活性化剤
ディスフェルリン異常症由来の不死化骨格筋細胞株を、ＡＭＰＫ活性化剤であるＡＩＣＡＲ（Sigma-Aldrich社製）存在下で培養し、膜修復に対する影響を確認した。ＡＩＣＡＲの使用濃度は、文献「Lanner, J.T., et al. AICAR prevents heat-induced sudden death in RyR1 mutant mice independent of AMPK activation. Nat Med 18, 244-251 (2012).」、「Ljubicic, V., Khogali, S., Renaud, J.M. & Jasmin, B.J. Chronic AMPK stimulation attenuates adaptive signaling in dystrophic skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol 302, C110-121 (2012).」、及び「Pernicova, I. & Korbonits, M. Metformin--mode of action and clinical implications for diabetes and cancer. Nat Rev Endocrinol 10, 143-156 (2014).」を参考にして、１ｍＭとした。また、ＡＩＣＡＲのＡＭＰＫ活性効果を最大限に引き出すため、ディスフェルリン異常症由来の不死化骨格筋細胞株を、血清非存在下のＤＭＥＭ培養液中で一晩培養した後、ＡＩＣＡＲを添加し、その後１〜９時間の間に、二光子レーザー（Sa-Ti/820nm、Chameleon、30W、Coherent社製）によるレーザー膜損傷を行った。
【００５０】
１−１６  免疫組織染色
ＡＭＰＫの細胞内局在を確認するために、ディスフェルリンを欠損するＳＪＬ/Ｊマウス（ＤＹＳＦ遺伝子の４つ目のＣ２ドメイン部位コード領域に１７１塩基長のインフレーム欠失を有するマウス、日本クレア社製）の免疫組織染色を、上記「１−１０」の方法に従って行った。また、コントロールとしてＳＷＲ/Ｊマウス（日本クレア社製）を用いた。なお、以前の報告（文献「Suzuki, N., et al. Expression profiling with progression of dystrophic change in dysferlin deficient mice (SJL). Neurosci Res 52, 47-60 (2005).」参照）に基づいて、実験には組織学的変化の乏しい３ヶ月齢のＳＪＬ/Ｊマウスを用いた。
【００５１】
１−１７  統計解析
データは平均値±標準誤差で示した。一元又は二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）後、多群の比較にはノンパラメトリック検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）を行った。Ｐ＜０．０５を有意とした。すべての解析は統計解析ソフト（ＪＭＰ、SAS Institute社製）を用いた。
【００５２】
２．結果
２−１  ディスフェルリン結合タンパク質の同定
ディスフェルリンの第II領域は、２つのＦｅｒドメイン（ＦｅｒＡ及びＦｅｒＢ）と、２つのＤｙｓＦドメイン（ＤｙｓＦＣ及びＤｙｓＦＮ）を有するが、これまでこの領域の機能については全く注目されていなかった。本発明者らは、骨格筋細胞の膜修復機構において、ディスフェルリンが、その第II領域と他の機能性タンパク質との結合を介して、巨大な足場タンパク質として働いているという独自の仮説を立てた。そして、本研究では、ディスフェルリン第II領域を結合させたアフィニティビーズを作製し、このビーズを用いてディスフェルリン結合タンパク質の同定を試みた。
かかるアフィニティビーズを作製するために、ＭＢＰタグを付加したディスフェルリン第II領域、第II−１領域、及び第II−２領域ポリペプチドを大腸菌に発現させ、想定される分子量の位置にバンドが検出されることを確認した（図３ａの矢印参照）。これらのポリペプチドを用いて作製した３種のアフィニティビーズ（ディスフェルリン第II結合ビーズ、第II−１結合ビーズ、及び第II−２領域結合ビーズ）に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒト腎細胞）抽出液を加えて、ディスフェルリン第II、第II−１、及び第II−２領域と相互作用する分子を抽出し、質量分析を行った。ここで本発明者らは、以下のように考えた結果、ディスフェルリンを発現する筋細胞ではなく、ディスフェルリンを発現しない腎細胞を用いてスクリーニングを行うこととした。
１）筋細胞以外の細胞種を使用することによって、これまでに知られていなかったより多くのディスフェルリン結合タンパク質候補をスクリーニングできる可能性があること：
２）筋細胞においては、微量のディスフェルリン結合タンパク質は既にディスフェルリンとの複合体を形成しているために、上記ビーズとは結合できない可能性があること：
３）ディスフェルリンを発現しない腎細胞では、そのような微量のディスフェルリン結合タンパク質がフリーの状態で存在しており、より効率的に上記ビーズと結合することができる可能性があること：
以上の実験の結果、新規ディスフェルリン結合タンパク質として、ＡＭＰＫγ１及びＰＰＰ１ＣＡを同定した（図３ｂ参照）。
【００５３】
２−２  筋委縮とＡＭＰＫ複合体に関する従来の知見
ＡＭＰＫは、エネルギー代謝を担うタンパク質キナーゼである（文献「Hardie, D.G. AMPK--sensing energy while talking to other signaling pathways. Cell Metab 20, 939-952 (2014).」参照）。ＡＭＰＫは、触媒作用を有するαサブユニットと、調節作用を有するβ及びγサブユニットから構成されるヘテロ三量体である。また、それぞれのサブユニットには異なる遺伝子によってコードされる７種のアイソフォーム（α1、α２、β１、β２、γ１、γ２、及びγ３）が存在する。ＡＭＰＫαは、ＰＰ１（ＰＰＰ１ＣＡ、ＰＰＰ１ＣＢ）、ＰＰＰ２ＣＡによる脱リン酸化によって、酵素活性が調節されることが知られている。また、本研究においても、ＡＭＰＫγ１とＰＰＰ１ＣＡとがともにディスフェルリンと結合することが明らかとなった。さらに、筋萎縮の病態において、ＡＭＰＫシグナリングの関与を示唆する複数の報告がある（文献「Ljubicic, V., Burt, M. & Jasmin, B.J. The therapeutic potential of skeletal muscle plasticity in Duchenne muscular dystrophy: phenotypic modifiers as pharmacologic targets. FASEB J 28, 548-568 (2014).」、及び「Ljubicic, V. & Jasmin, B.J. AMP-activated protein kinase at the nexus of therapeutic skeletal muscle plasticity in Duchenne muscular dystrophy. Trends Mol Med 19, 614-624 (2013).」参照）。以上のことから、ディスフェルリン異常症の病態にＡＭＰＫ複合体とその活性化が関わっている可能性が考えられた。そこで、本発明者らは、ディスフェルリンとＡＭＰＫ複合体の関係、及び膜修復機構におけるＡＭＰＫ複合体の役割について、さらに解析を進めた。
【００５４】
２−３  ＡＭＰＫ複合体の局在
最初に、ディスフェルリン遺伝子異常がＡＭＰＫファミリーの局在に及ぼす影響を、ＳＪＬ/Ｊマウスを用いて検討した。ＳＪＬ/Ｊマウスは、ディスフェルリン遺伝子の４つ目のＣ２ドメイン部位に１７１ｂｐのインフレーム欠失を有しており、ディスフェルリンタンパク質の発現量が低下することが確認されている（文献「Suzuki, N., et al. Expression profiling with progression of dystrophic change in dysferlin deficient mice (SJL). Neurosci Res 52, 47-60 (2005).」参照）。本研究では、組織学的な変化が乏しい３ヶ月齢のＳＪＬ/ＪマウスにおけるＡＭＰＫ複合体の局在を調べた。また、コントロールとしてディスフェルリン変異が無く、遺伝的バックグラウンドが近いＳＷＲ/Ｊマウスを用いた。図４に免疫染色の結果を示す。ＳＪＬ/Ｊマウスにおけるディスフェルリンの染色像は、ＳＷＲ/Ｊマウスと比較して減弱していた。また、ＳＷＲ/Ｊマウスでは、ＡＭＰＫγ１は主に細胞質に局在するが、一部細胞膜にも存在していた（図４ａ）。一方、ＳＪＬ/Ｊマウスでは、ＳＷＲ/Ｊマウスと比較して、ＡＭＰＫγ１を発現する筋線維が減少していた。また、ＳＪＬ/ＪマウスにおけるＡＭＰＫαの局在は主に細胞質で認められたが、一部細胞膜にも局在が認められた。ＡＭＰＫαはＡＭＰＫγ１と同様の分布を示した（図４ｂ）。
【００５５】
２−４  膜修復機能へのＡＭＰＫγ１の関与
次に、骨格筋におけるＡＭＰＫγ１の膜修復機能を調べるために、エレクトロポレーションによりＣ５７/ＢＬ６Ｊマウスの短趾屈筋にＡＭＰＫγ１−ＧＦＰを導入し、ＦＭ４−６４試薬の存在下で筋束内の筋細胞のライブイメージングを行った。この結果、定常時には、ＡＭＰＫγ１は、骨格筋の細胞質に存在していることが明らかとなった（図５）。これは、図４の結果を裏付けるものである。一方、レーザー膜損傷を行った場合には、損傷部位（赤線）にＦＭ４−６４が集積したことから、膜損傷が起こっていることが確認された。また、レーザー膜損傷を行った場合、損傷部位を取り囲むようにＡＭＰＫγ１−ＧＦＰが集積することが観察された（図５下段）。ＡＭＰＫγ１−ＧＦＰの集積は、損傷後１０秒以内に起こり、その後３分以上維持されることが分かった（図５）。
【００５６】
さらに、ＲＮＡ干渉によりＡＭＰＫγ１発現をノックダウンしたＣ２Ｃ１２細胞を作製した（図６ａ及びｂ）。また、コントロール細胞として、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡを上記ノックダウン細胞と同様の手法によりトランスフェクションした細胞を作製した。ＦＭ１−４３試薬の存在下で、上記ＡＭＰＫγ１ノックダウンＣ２Ｃ１２細胞のレーザー膜損傷を行ったところ、コントロール細胞と比較して、蛍光色素が細胞内に拡がっていることが観察された（図６ｃ）。また、ＦＭ１−４３試薬の細胞内流入の程度を、細胞内の蛍光強度を定量することにより数値化した結果、ＡＭＰＫγ１ノックダウンＣ２Ｃ１２細胞において、ＦＭ１−４３試薬の細胞内流入が有意に増加していることが示された（図６ｄ）。これらの結果から、ＡＭＰＫγ１の発現が減少すると細胞膜修復機能が低下することが明らかになった。
【００５７】
２−５  膜修復機能へのＡＭＰＫα１の関与
上述のように、ＡＭＰＫ複合体においてＡＭＰＫγ１は調節因子として働いている。このため、本発明者らは、ＡＭＰＫ複合体において触媒サブユニットとして機能しているＡＭＰＫα1又はα２が膜修復機能に関わっている可能性があると考えた。そこで、ＡＭＰＫγ１と同様の実験により、ＡＭＰＫα１及びα２の膜修復機能を検討した。Ｃ５７/Ｂ６Ｊマウス分離筋束内にＡＭＰＫα−ＧＦＰを発現させて、レーザー膜損傷を行い、ライブイメージングで蛍光を観察した。その結果、ＡＭＰＫα1及びα２はともに膜損傷部位に集積することが分かった。また、ＡＭＰＫγ１と同様に、ＡＭＰＫα1及びα２の集積は損傷後１０秒以内に起こり、３分以上続くことが分かった（図７）。次に、Ｃ２Ｃ１２細胞において、ＡＭＰＫα１及びα２をそれぞれノックダウンし（図８ａ、ｂ、ｅ、及びｆ）、ＦＭ１−４３試薬存在下で、レーザー膜損傷を行った。その結果、ＡＭＰＫα１ノックダウン細胞では、コントロール細胞と比較して、有意な膜修復機能の低下が確認された（図８ｃ及びｄ）。一方、ＡＭＰＫα２ノックダウン細胞では、一部の時間帯で有意差がみられるにとどまった（図８ｇ）。これらの結果から、触媒サブユニットとしては、ＡＭＰＫα１がより強く膜修復機能に関わっていることが示された。
【００５８】
発明者らは、ＡＭＰＫ複合体による膜修復機構には、膜損傷時に細胞内に流入するカルシウムイオンによるＡＭＰＫ複合体のリン酸化と、それに伴うＡＭＰＫ複合体の膜損傷部位への局在変化や膜修復機能の励起が関与するのではないか考えた。そこで、カルシウムイオノフォアを用いてｌｉｎｅ１０７細胞及びＫＭ１５５細胞にカルシウム過剰細胞内流入を引き起こし、ＡＭＰＫのリン酸化の変化をウェスタンブロティング法で評価した（図９）。その結果、ｌｉｎｅ１０７細胞及びＫＭ１５５細胞において、カルシウムイオノフォアによりＡＭＰＫがリン酸化されることを確認した。また、２つの細胞間でＡＭＰＫのリン酸化の程度に有意差は認められなかった（図９）。
【００５９】
２−６  ＡＭＰＫの活性化がｌｉｎｅ１０７細胞に及ぼす影響
以上の結果から、ＡＭＰＫ複合体が骨格筋細胞膜修復に関与することが明らかになった。そこでディスフェルリン異常症患者由来細胞で見られる膜修復異常が、ＡＭＰＫの活性調節により改善するか否かを検討した。まず、ｌｉｎｅ１０７細胞及びＫＭ１５５細胞におけるディスフェルリンタンパク質発現量を評価した結果、ｌｉｎｅ１０７細胞では、ＫＭ１５５細胞と比較して、ディスフェルリンタンパク質発現量が著しく少ないことが確認された（図１０ａ及びｂ）。次に、ｌｉｎｅ１０７細胞では、ＫＭ１５５と比較して、レーザー膜損傷後の蛍光タンパク質流入量が有意に増加していることが確認された（図１０ｃ）。
【００６０】
ＡＭＰＫ複合体は、αサブユニットのセリン１７２基質のリン酸化によって、生理的活性が得られる（文献「Salminen, A., Kaarniranta, K. & Kauppinen, A. Age-related changes in AMPK activation: Role for AMPK phosphatases and inhibitory phosphorylation by upstream signaling pathways. Ageing Res Rev 28, 15-26 (2016).」）。そこで、ＡＭＰＫの活性化がｌｉｎｅ１０７細胞に及ぼす影響を検討した。実験には、ＡＭＰＫを活性化させる薬剤として5-Aminoimidazole 4-carboxamide ribonucleotide（ＡＩＣＡＲ)を、先行研究と同様の濃度（１ｍＭ）で使用した（文献「Egawa, T., et al. AICAR-induced activation of AMPK negatively regulates myotube hypertrophy through the HSP72-mediated pathway in C2C12 skeletal muscle cells. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 306, E344-354 (2014).」及び「Zhou, G., et al. Role of AMP-activated protein kinase in mechanism of metformin action. The Journal of clinical investigation 108, 1167-1174 (2001).」参照）。ｌｉｎｅ１０７細胞を血清飢餓状態で培養した後に、ＡＩＣＡＲを添加した結果、ＡＭＰＫのリン酸化の割合が平常時に比べて約３倍に増加した（図１０ｄ）。また、ｌｉｎｅ１０７細胞では、ＡＩＣＡＲを添加することによりレーザー膜損傷による蛍光タンパク質の拡散が抑制されることが観察された（図１０ｅ及びｆ）。
【００６１】
３．考察
筋細胞膜の修復機構に関与する分子の全容は解明されておらず、同定されていないディスフェルリン結合タンパク質が存在していると考えられる。ＴＲＩＭ７２に関する論文（文献「Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol 11, 56-64 (2009).」、「Weisleder, N., et al. Recombinant MG53 protein modulates therapeutic cell membrane repair in treatment of muscular dystrophy. Sci Transl Med 4, 139ra185 (2012).」、及び「Alloush, J. & Weisleder, N. TRIM proteins in therapeutic membrane repair of muscular dystrophy. JAMA Neurol 70, 928-931 (2013).」）が示すように、ディスフェルリン結合タンパク質の同定がディスフェルリン異常症の治療に結びつく可能性がある。ある特定のタンパク質と結合する別のタンパク質を同定する方法としては、タグ付きタンパク質を用いた免疫沈降法による解析方法が一般的であり、このような方法を用いて、既にいくつかのディスフェルリン結合タンパク質が同定されている。しかしながら、結合タンパク質の存在量が少ない場合や、ディスフェルリンのように非常に大きな膜タンパク質と結合するタンパク質を探索する場合には、このような方法による同定は困難である。
【００６２】
実際に、これまでに本発明者らも、抗ディスフェルリン抗体による免疫沈降と、培養細胞の抽出物を用いたウェスタンブロットとを組み合わせてディスフェルリン結合タンパク質の同定を試みたが、ディスフェルリン結合タンパク質を同定することはできなかった。これは、培養細胞中に存在するディスフェルリン結合タンパク質の量が少ないことが原因と考えられた。そこで、本研究では、ディスフェルリン分子が持つ特定のドメイン（具体的には、ディスフェルリンタンパク質において、機能が未知のＤｙｓＦドメイン及びＦｅｒドメインを含む、３番目と４番目のＣ２ドメインに挟まれた、「第II領域」と名付けた部分）に着目して、ディスフェルリン結合タンパク質の同定を試みた。
【００６３】
このようなアプローチの結果、新規ディスフェルリン結合タンパク質として、ＡＭＰＫγ１及びＰＰＰ１ＣＡを同定することに成功した。ここで、ＡＭＰＫγ１はＡＭＰＫ複合体を形成するサブユニットの一つであり、また、ＡＭＰＫ複合体は筋萎縮に対する有効な治療ターゲットとして注目されていること、さらに、ジストロフィン（Dystrophin）異常症のモデル動物ではＡＭＰＫ活性化により運動機能が改善することが報告されていることから（文献「Lanner, J.T., et al. AICAR prevents heat-induced sudden death in RyR1 mutant mice independent of AMPK activation. Nat Med 18, 244-251 (2012).」、「Ljubicic, V. & Jasmin, B.J. AMP-activated protein kinase at the nexus of therapeutic skeletal muscle plasticity in Duchenne muscular dystrophy. Trends Mol Med 19, 614-624 (2013).」、及び「Garbincius, J.F. & Michele, D.E. Dystrophin-glycoprotein complex regulates muscle nitric oxide production through mechanoregulation of AMPK signaling. Proc Natl Acad Sci U S A 112, 13663-13668 (2015).」）、本研究ではディスフェルリン異常症におけるＡＭＰＫ複合体の役割について解析を進めた。また、ＡＭＰＫγ１ノックアウトマウスでは、赤血球膜の脆弱性から貧血となり巨大脾腫をきたすという報告があるが（文献「Foretz, M., et al. The AMPKgamma1 subunit plays an essential role in erythrocyte membrane elasticity, and its genetic inactivation induces splenomegaly and anemia. FASEB J 25, 337-347 (2011).」）、ＡＭＰＫγ１ノックアウトによる骨格筋への影響は詳細に調べられていないことからも、ＡＭＰＫ複合体と骨格筋の膜修復機能と関連について検証することは意義があると考えられた。
【００６４】
特に、ＡＭＰＫ複合体の発現量、局在、及び活性化が、ディスフェルリンによって影響を受けるかどうかは興味深い点であった。本研究の結果から、ＡＭＰＫγ１が細胞質に局在することが明らかとなった。また、本研究で使用したＳＪＬ/Ｊマウスは、ディスフェルリンの４番目のＣ２ドメインに変異を有していることから、第II領域に結合するＡＭＰＫγ１の発現や局在はＳＪＬ/Ｊマウスでは変化しない可能性が考えられた。しかし、免疫染色の結果、ＳＪＬ/Ｊマウスの骨格筋組織では、コントロールマウス（ＳＷＲ/Ｊマウス）と比較して、ＡＭＰＫγ１のタンパク質発現が減少していることが示された（図４）。
本研究により、ＡＭＰＫ複合体がディスフェルリンとともに骨格筋の膜修復機構において重要な働きを担っていることが明らかになった。そして、ＡＭＰＫ活性化剤の投与実験の結果から、ＡＭＰＫを活性化することでディスフェルリン変異を有する細胞における膜修復機能が改善することが示された。本研究では、ＡＭＰＫ活性化剤としてＡＩＣＡＲ（アカデシンとも呼ばれる）を使用したが、Ａ−７６９６６２（6,7-Dihydro-4-hydroxy-3-(2'-hydroxy[1,1'-biphenyl]-4-yl)-6-oxo-thieno[2,3-b]pyridine-5-carbonitrile）、メトホルミン等の他の公知のＡＭＰＫ活性化剤も同様に、ディスフェルリン変異症における膜修復機能の改善に有効であると推測される。なかでも、メトホルミンは２型糖尿病治療の第一選択として長年使用されていること、さらに、経口投与によりヒト骨格筋のＡＭＰＫを活性化することが報告されていることから（文献「Musi, N., et al. Metformin increases AMP-activated protein kinase activity in skeletal muscle of subjects with type 2 diabetes. Diabetes 51, 2074-2081 (2002).」参照）、ディスフェルリン異常症の治療・改善のための利用が強く期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
ディスフェルリン異常症は治療法が全くない疾患である。本発明においては、これまで注目されてこなかったディスフェルリンの第II領域（Ｃ２ＣドメインとＣ２Ｄドメインとに挟まれた領域）のポリペプチド断片を用いることにより、ＡＭＰＫγ１及びＰＰＰ１ＣＡがディスフェルリン結合タンパク質であることが明らかにされた。さらに、ディスフェルリン異常症患者においては筋細胞におけるＡＭＰＫγ１発現が低下する可能性があること、また、ディスフェルリン異常症患者における筋細胞の膜修復機能の低下が、ＡＭＰＫ活性化剤によって改善する可能性があることが明らかにされた。本発明は、ディスフェルリン異常症の治療及び／又は診断のために有用であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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