(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトＩｇＧに対する親和性が向上した核酸アプタマーの提供。【解決手段】式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で表される構造から選択される潜在的二次構造を有する、ヒトＩｇＧに対して結合活性を有する核酸アダプター。2018126117.tif 000017（Ｎ１〜Ｎ５は、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ又はＴで、Ｎ２とＮ３、Ｎ４とＮ５は相補的；（ｉ）ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）（３番目のＵを除く）、（ｉｉ）ＡＮ１ＣにおけるＮ１及びＣ、（ｉｉｉ）Ｎ２〜Ｎ５は各々独立にリボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基、２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基等；（ｉ）の３番目のＵは２’−フルオロリボヌクレオチド残基；（ｉｉ）のＡは糖修飾ヌクレオチド残基）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）からなる群より選択される潜在的二次構造を有する、ヒトＩｇＧに対して結合活性を有する核酸アプタマー。
【化１】
2018126117.tif 000016
［式中、Ｎ１〜Ｎ５は、それぞれ独立に、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選択されるヌクレオチド残基であり、
Ｎ２及びＮ３は、互いに相補的なヌクレオチド残基であり、
Ｎ４及びＮ５は、互いに相補的なヌクレオチド残基であり、
（ｉ）ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における各ヌクレオチド残基（但し、３番目のＵを除く）、（ｉｉ）ＡＮ１ＣにおけるＮ１及びＣ、並びに（ｉｉｉ）Ｎ２〜Ｎ５の各ヌクレオチド残基は、それぞれ独立に、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基、２’−フルオロリボヌクレオチド残基、及び２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基であり、
ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における３番目のＵは、２’−フルオロリボヌクレオチド残基であり、
ＡＮ１ＣにおけるＡは、糖修飾ヌクレオチド残基である。
実線は、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選択されるヌクレオチド残基が任意の長さで連結していることを示し、破線は、相補的な結合（塩基対合）能を潜在的に有することを示す。］
【請求項２】
前記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）において、ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）が、ＧＧＵＧＣＵである、請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項３】
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、核酸アプタマー。
（ａ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、１８位のＡが糖修飾ヌクレオチド残基で置換されている配列からなる、ヒトＩｇＧに対して結合活性を有する核酸アプタマー。
（ｂ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、１８位のＡが糖修飾ヌクレオチド残基で置換されており、１８位のＡ以外の１個又は複数個のヌクレオチド残基が、それぞれ独立に、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基、２’−フルオロリボヌクレオチド残基、及び２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基で置換されている配列からなる、ヒトＩｇＧに対して結合活性を有する核酸アプタマー。
【請求項４】
前記糖修飾ヌクレオチド残基が、ＬＮＡ残基、及び２’−Ｏ−ＭＣＥリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸アプタマー。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸アプタマーが固定化された固相担体。
【請求項６】
請求項５に記載の固相担体を含む、ヒトＩｇＧ精製用カラム。
【請求項７】
請求項５に記載の固相担体にヒトＩｇＧを吸着させ、前記の吸着したヒトＩｇＧを溶出液により溶出させることを含む、ヒトＩｇＧの精製方法。
【請求項８】
１個又は複数個の機能性物質が結合した、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸アプタマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸アプタマー、固相担体、ヒトＩｇＧ精製用カラム、及びヒトＩｇＧの精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＧは血清の主要なタンパク質の１つで、免疫系において異物を認識し排除に導くという重要な役割を担っている。この特性を活かして各種疾患の治療薬や診断薬、また試薬への応用研究が広くおこなわれている。またＩｇＧは、抗原と特異的に結合する性質を利用して、免疫学的測定をはじめ、細胞やタンパク質の機能解析、遺伝子の発現スクリーニングなど各種生化学実験の必須の道具として使われている。
【０００３】
ＩｇＧは２本のＨ鎖と２本のＬ鎖がジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）で結合したＹ字形の構造をしている。ＩｇＧをタンパク質分解酵素であるパパインで分解すると、定常部位からなるＦｃフラグメントと抗原結合部位を含むＦａｂフラグメントに分けることができる。また、ＩｇＧにはサブクラスが存在し、ヒトＩｇＧの場合はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の４種類が存在する。
【０００４】
ＩｇＧは、血清やハイブリドーマ細胞培養上清液から、抗体精製用カラムを用いて精製される。一般に、第一段階の精製にはリガンドとしてＰｒｏｔｅｉｎ  Ａが使用される。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）が産生する分子量４２ｋＤａのタンパク質で、ＩｇＧのＦｃ領域に強く結合する。しかしながら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａは高価であり、またＰｒｏｔｅｉｎ  Ａを用いた精製条件ではＩｇＧが変性する場合もあるため、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａの性能を上回る新規のＩｇＧ用分離剤が求められている。
【０００５】
一方、核酸アプタマーは、特異的に標的物質に結合する能力を持った核酸分子である。核酸アプタマーは、抗体に代わる、抗原と特異的に結合する分子として注目されており、医薬、診断薬、試薬等への応用が期待されている。ヒトＩｇＧに対する結合活性を有する核酸アプタマーも報告されており（特許文献１）、ヒトＩｇＧの精製、標識化、薬物結合リンカー等への応用が想定されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００７／００４７４８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ヒトＩｇＧの精製等に使用するためには、ヒトＩｇＧに対する親和性がより高い核酸アプタマーが求められる。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、ヒトＩｇＧに対する親和性が向上した核酸アプタマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討した結果、国際公開第２００７／００４７４８号に記載の核酸アプタマー（以下、「’７４８アプタマー」という。）において、特定のヌクレオチド残基に糖修飾を行うことにより、ヒトＩｇＧに対する結合活性が顕著に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）からなる群より選択される潜在的二次構造を有する、ヒトＩｇＧに対して結合活性を有する核酸アプタマー。
【００１１】
【化１】
2018126117.tif 000002
［式中、Ｎ１〜Ｎ５は、それぞれ独立に、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選択されるヌクレオチド残基であり、
Ｎ２及びＮ３は、互いに相補的なヌクレオチド残基であり、
Ｎ４及びＮ５は、互いに相補的なヌクレオチド残基であり、
（ｉ）ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における各ヌクレオチド残基（但し、３番目のＵを除く）、（ｉｉ）ＡＮ１ＣにおけるＮ１及びＣ、並びに（ｉｉｉ）Ｎ２〜Ｎ５の各ヌクレオチド残基は、それぞれ独立に、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基、２’−フルオロリボヌクレオチド残基、及び２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基であり、
ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における３番目のＵは、２’−フルオロリボヌクレオチド残基であり、
ＡＮ１ＣにおけるＡは、糖修飾ヌクレオチド残基である。
実線は、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選択されるヌクレオチド残基が任意の長さで連結していることを示し、破線は、相補的な結合（塩基対合）能を潜在的に有することを示す。］
［２］前記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）において、ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）が、ＧＧＵＧＣＵである、［１］に記載の核酸アプタマー。
［３］以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、核酸アプタマー。
（ａ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、１８位のＡが糖修飾ヌクレオチド残基で置換されている配列からなる、ヒトＩｇＧに対して結合活性を有する核酸アプタマー核酸アプタマー。
（ｂ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、１８位のＡが糖修飾ヌクレオチド残基で置換されており、１８位のＡ以外の１個又は複数個のヌクレオチド残基が、それぞれ独立に、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基、２’−フルオロリボヌクレオチド残基、及び２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基で置換されている配列からなる、ヒトＩｇＧに対して結合活性を有する核酸アプタマー。
［４］前記糖修飾ヌクレオチド残基が、ＬＮＡ残基、又は２’−Ｏ−ＭＣＥリボヌクレオチド残基である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の核酸アプタマー。
［５］［１］〜［４］のいずれか一項に記載の核酸アプタマーが固定化された固相担体。
［６］［５］に記載の固相担体を含む、ヒトＩｇＧ精製用カラム。
［７］［５］に記載の固相担体にヒトＩｇＧを吸着させ、前記の固相担体に吸着させたヒトＩｇＧを溶出液により溶出させることを含む、ヒトＩｇＧの精製方法。
［８］１個又は複数個の機能性物質が結合した、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の核酸アプタマー。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ヒトＩｇＧに対する親和性が向上した核酸アプタマー、及び当該核酸アプタマーの利用技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】表面プラズモン共鳴解析によって得られた、表１に記載の核酸アプタマーとヒトＩｇＧ１との結合の様子を示すセンサーグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［定義］
本明細書において、塩基がアデニン（Ａ）であるヌクレオチド残基、塩基がグアニン（Ｇ）であるヌクレオチド残基、塩基がシトシン（Ｃ）であるヌクレオチド残基、塩基がウラシル（Ｕ）であるヌクレオチド残基、及び塩基がチミン（Ｔ）であるヌクレオチド残基は、それぞれ、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、及びＴと表すことがある。なお、「ヌクレオチド残基」とは、１分子のヌクレオチドから誘導される、核酸分子中の構成単位を意味する。ヌクレオチド残基は、天然ヌクレオチド（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド等）から誘導されるものに限定されず、天然ヌクレオチドの糖部分、塩基部分及びリン酸基部分のいずれかが修飾された人工ヌクレオチドから誘導されるものも包含する。
【００１５】
本明細書において、「糖修飾ヌクレオチド残基」とは、糖部分に修飾（糖修飾）を有するヌクレオチド残基を意味する。糖修飾ヌクレオチド残基としては、リボースの２’位におけるヒドロキシ基が水素原子以外の置換基で置換されているヌクレオチド残基（２’置換型ヌクレオチド残基）、リボース環を構成する炭素原子の一部が架橋されたヌクレオチド残基（架橋型ヌクレオチド残基）等を挙げることができる。
２’置換型ヌクレオチド残基における置換基としては、−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］（−Ｏ−［２−（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｅｔｈｙｌ］：−Ｏ−ＭＣＥ）基（−Ｏ−Ｃ２Ｈ４Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ３））、フルオロ基（−Ｆ）、−Ｏ−メチル（−Ｏ−Ｍｅ）基（−Ｏ−ＣＨ３）、−Ｏ−アシル基（−Ｏ−ＣＨＯ）、アミノ基（−ＮＨ２）、−Ｏ−メトキシエチル（−Ｏ−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ：−Ｏ−ＭＯＥ）基（−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＯＣＨ３）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
架橋型ヌクレオチド残基としては、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）、ＥＮＡ（登録商標）（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等を挙げることができるが、これらに限定されない。ＢＮＡとしては、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ；２’，４’−ＢＮＡ）、３’−ａｍｉｎｏ−２’，４’−ＢＮＡ、５’−ａｍｉｎｏ−２’，４’−ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣ、２’，４’−ＢＮＡＮＣ等を挙げることができるが、これらに限定されない。ＬＮＡは、リボースの２’位の炭素原子と４’位の炭素原子とが−Ｏ−ＣＨ２−を介して架橋した構造を有する。３’−ａｍｉｎｏ−２’，４’−ＢＮＡは、２’，４’−ＢＮＡの３’位の炭素原子に結合する酸素原子が、−ＮＨ−で置換された構造を有する。５’−ａｍｉｎｏ−２’，４’−ＢＮＡは、２’，４’−ＢＮＡの５’位の炭素原子に結合する酸素原子が、−ＮＨ−で置換された構造を有する。２’，４’−ＢＮＡＣＯＣは、リボースの２’位の炭素原子と４’位の炭素原子とが、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−で架橋された構造を有する。２’，４’−ＢＮＡＮＣは、リボースの２’位の炭素原子と４’位の炭素原子とが、−Ｏ−ＮＲＣＨ２−（Ｒは水素原子又はアルキル基（例、メチル基））で架橋された構造を有する。また、ＥＮＡ（登録商標）は、リボースの２’位の炭素原子と４’位の炭素原子とが、−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−で架橋された構造を有する。
【００１６】
本明細書において、「２’−フルオロリボヌクレオチド残基」とは、リボースの２’位におけるヒドロキシ基がフッ素原子で置換されたヌクレオチド残基を意味する。
本明細書において、「２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基」とは、リボースの２’位におけるヒドロキシ基が−Ｏ−Ｍｅ基で置換されたヌクレオチド残基を意味する。
本明細書において、「ＬＮＡ残基」とは、ＬＮＡから誘導されるヌクレオチド残基を意味する。
本明細書において、「２’−Ｏ−ＭＣＥリボヌクレオチド残基」とは、リボースの２’位におけるヒドロキシ基が−Ｏ−ＭＣＥ基で置換されたヌクレオチド残基を意味する。
２’−フルオロリボヌクレオチド残基、２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基、ＬＮＡ残基、及び２’−Ｏ−ＭＣＥリボヌクレオチド残基の構造を以下に示す。
【００１７】
【化２】
2018126117.tif 000003
【００１８】
本明細書において、「潜在的二次構造」とは、生理条件下で安定に存在し得る核酸分子の二次構造をいう。潜在的二次構造は、ｍｆｏｌｄ等の二次構造予測ソフトウェアを用いて予測することができる。
【００１９】
本明細書において、「機能性物質」とは、何らかの化学活性又は生理活性を有する物質を意味する。機能性物質が有する活性は、特に限定されず、触媒活性、発光活性、蛍光活性、放射活性、酵素活性、結合活性、薬理活性、毒性等を例示することができるが、これらに限定されない。
【００２０】
本明細書において、ＩｇＧとは、免疫グロブリンＧを意味し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を包含する。
【００２１】
本明細書において、「ヒトＩｇＧに対して結合活性を有する」とは、ヒトＩｇＧに特異的に結合することができることを意味する。
【００２２】
［核酸アプタマー］
１実施形態において、本発明は、下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）からなる群より選択される潜在的二次構造を有する、ヒトＩｇＧ１に対して結合活性を有する核酸アプタマーを提供する。
【００２３】
【化３】
2018126117.tif 000004
［式中、Ｎ１〜Ｎ５は、それぞれ独立に、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選択されるヌクレオチド残基であり、
Ｎ２及びＮ３は、互いに相補的なヌクレオチド残基であり、
Ｎ４及びＮ５は、互いに相補的なヌクレオチド残基であり、
（ｉ）ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における各ヌクレオチド残基（但し、３番目のＵを除く）、（ｉｉ）ＡＮ１ＣにおけるＮ１及びＣ、並びに（ｉｉｉ）Ｎ２〜Ｎ５の各ヌクレオチド残基は、それぞれ独立に、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基、２’−フルオロリボヌクレオチド残基、及び２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基であり、
ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における３番目のＵは、２’−フルオロリボヌクレオチド残基であり、
ＡＮ１ＣにおけるＡは、糖修飾ヌクレオチド残基である。
実線は、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選択されるヌクレオチド残基が任意の長さで連結していることを示し、破線は、相補的な結合（塩基対合）能を潜在的に有することを示す。］
【００２４】
本実施形態の核酸アプタマー（以下、「本核酸アプタマー」という。）は、ヒトＩｇＧに対して結合活性を有する核酸アプタマーである。好ましくは、本核酸アプタマーは、ヒトＩｇＧ１に対して結合活性を有する核酸アプタマーである。また、本核酸アプタマーは、ＩｇＧ１のＦｃ部分に対して高い結合活性を有し得る。
【００２５】
本核酸アプタマーは、’７４８アプタマーの特定のヌクレオチド残基を、糖修飾ヌクレオチド残基で置換した核酸アプタマーであり、’７４８アプタマーよりもＩｇＧ、特にＩｇＧ１に対して高い結合活性を有し得る。Ｂｉａｃｏｒｅを用いた表面プラズモン共鳴法によるカイネティクス解析により算出される、本核酸アプタマーとヒトＩｇＧ１との解離定数（ＫＤ）は、２６ｎＭ未満であり得、２５ｎＭ以下であることが好ましく、２０ｎＭ以下であることがより好ましく、１８ｎＭ以下であることがさらに好ましい。
【００２６】
本核酸アプタマーは、下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）からなる群より選択される潜在的二次構造を有する。
【００２７】
【化４】
2018126117.tif 000005
［式中、Ｎ１〜Ｎ５は、それぞれ独立に、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選択されるヌクレオチド残基であり、
Ｎ２及びＮ３は、互いに相補的なヌクレオチド残基であり、
Ｎ４及びＮ５は、互いに相補的なヌクレオチド残基であり、
（ｉ）ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における各ヌクレオチド残基（但し、３番目のＵを除く）、（ｉｉ）ＡＮ１ＣにおけるＮ１及びＣ、並びに（ｉｉｉ）Ｎ２〜Ｎ５の各ヌクレオチド残基は、それぞれ独立に、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基、２’−フルオロリボヌクレオチド残基、及び２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基であり、
ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における３番目のＵは、２’−フルオロリボヌクレオチド残基であり、
ＡＮ１ＣにおけるＡは、糖修飾ヌクレオチド残基である。
実線は、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選択されるヌクレオチド残基が任意の長さで連結していることを示し、破線は、相補的な結合（塩基対合）能を潜在的に有することを示す。］
【００２８】
一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）中、Ｎ１〜Ｎ５は、それぞれ独立に、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選択されるヌクレオチド残基である。Ｎ２及びＮ３は、互いに相補的なヌクレオチド残基であり、Ｎ４及びＮ５は、互いに相補的なヌクレオチド残基である。
Ｎ１は、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵであることが好ましく、Ａ又はＧであることがより好ましく、Ａであることがさらに好ましい。
Ｎ２は、Ａであることが好ましい。また、Ｎ３は、Ｕ又はＴであることが好ましく、Ｕであることがより好ましい。
Ｎ４は、Ｃであることが好ましい。また、Ｎ５は、Ｇであることが好ましい。
【００２９】
一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）中、ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における（Ｃ／Ａ）は、Ｃであることが好ましい。また、ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における（Ｕ／Ｔ）は、Ｕであることが好ましい。ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）は、ＧＧＵＧＣＵ又はＧＧＵＧＡＵであることが好ましく、ＧＧＵＧＣＵであることがより好ましい。
【００３０】
一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）中、（ｉ）ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における各ヌクレオチド残基（但し、３番目のＵを除く）、並びに（ｉｉ）ＡＮ１ＣにおけるＮ１及びＣ、（ｉｉｉ）Ｎ２〜Ｎ５の各ヌクレオチド残基は、それぞれ独立に、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基、２’−フルオロリボヌクレオチド残基、及び２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基である。
【００３１】
（ｉ）ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）において、１番目、２番目、及び４番目のＧは、それぞれ独立に、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基、及び２’−フルオロリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基であることが好ましい。
ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における１番目のＧは、リボヌクレオチド残基であることがより好ましい。
ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における２番目のＧは、リボヌクレオチド残基、及び２’−フルオロリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基であることがより好ましく、リボヌクレオチド残基であることがさらに好ましい。
ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における４番目のＧは、リボヌクレオチド残基、及び２’−フルオロリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基であることがより好ましく、リボヌクレオチド残基であることがさらに好ましい。
【００３２】
また、ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における５番目の（Ｃ／Ａ）は、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基、及び２’−フルオロリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基であることが好ましく、デオキシリボヌクレオチド残基であることがより好ましい。
【００３３】
また、ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における６番目の（Ｕ／Ｔ）は、リボヌクレオチド残基、２’−フルオロリボヌクレオチド残基、及び２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基であることが好ましく、２’−フルオロリボヌクレオチド残基であることがより好ましい。
【００３４】
（ｉｉ）ＡＮ１Ｃにおいて、Ｎ１は、リボヌクレオチド残基、及びデオキシリボヌクレオチド残基であることが好ましく、デオキシリボヌクレオチド残基であることがより好ましい。
ＡＮ１ＣにおけるＣは、２’−フルオロリボヌクレオチド残基であることが好ましい。
【００３５】
（ｉｉｉ）Ｎ２〜Ｎ５の各ヌクレオチド残基において、Ｎ２は、リボヌクレオチド残基、及びデオキシリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基であることが好ましく、リボヌクレオチド残基であることがより好ましい。
また、Ｎ３は、デオキシリボヌクレオチド残基、及び２’−フルオロリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基であることが好ましく、２’−フルオロリボヌクレオチド残基であることがより好ましい。
また、Ｎ４は、デオキシリボヌクレオチド残基、２’−フルオロリボヌクレオチド残基、及び２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基であることが好ましく、デオキシリボヌクレオチド残基であることがより好ましい。
また、Ｎ５は、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基、及び２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基であることが好ましく、リボヌクレオチド残基であることがより好ましい。
【００３６】
ＧＧＵＧ（Ｃ／Ａ）（Ｕ／Ｔ）における３番目のＵは、２’−フルオロリボヌクレオチド残基である。
【００３７】
ＡＮ１ＣにおけるＡは、糖修飾ヌクレオチド残基である。本核酸アプタマーでは、ＡＮ１ＣにおけるＡを、糖修飾ヌクレオチド残基とすることにより、’７４８アプタマーと比較して、ヒトＩｇＧに対する結合活性を顕著に向上させることができる。
ＡＮ１ＣにおけるＡが有する糖修飾は、２’置換型ヌクレオチド残基及び架橋型ヌクレオチド残基のいずれであってもよい。２’置換型ヌクレオチド残基である場合、リボースの２’位に導入可能な置換基としては、−Ｏ−ＭＣＥ基、フルオロ基、−Ｏ−Ｍｅ基、−Ｏ−アシル基、アミノ基、−Ｏ−ＭＯＥ基等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、架橋型ヌクレオチド残基である場合、ＢＮＡ残基及びＥＮＡ（登録商標）残基等を挙げることができるが、これらに限定されない。なお、ＢＮＡ残基である場合、ＬＮＡ、３’−ａｍｉｎｏ−２’，４’−ＢＮＡ、５’−ａｍｉｎｏ−２’，４’−ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣ、２’，４’−ＢＮＡＮＣ等を用いることができる。
【００３８】
好ましい糖修飾ヌクレオチド残基としては、ＬＮＡ残基、及び２’−Ｏ−ＭＣＥリボヌクレオチド残基を挙げることができる。
【００３９】
一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）中、実線は、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選択されるヌクレオチド残基が任意の長さで連結していることを示し、破線は、相補的な結合（塩基対合）能を潜在的に有することを示す。
一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）中、Ｎ２−Ｎ３の塩基対を含むステム構造（Ｓ１）、及びＮ４−Ｎ５の塩基対を含むステム構造（Ｓ２）において、実線部分を構成する塩基対の数は、１〜１０塩基対程度であることが好ましい。ステム構造（Ｓ１）において、実線部分を構成する塩基対の数は、１〜４塩基対であることがより好ましく、２塩基対であることがさらに好ましい。また、ステム構造（Ｓ２）において、実線部分を構成する塩基対の数は、１〜４塩基対であることがより好ましく、１塩基対であることがさらに好ましい。
一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）中、ループ構造は、３個以上のヌクレオチド残基から構成されることが好ましく、４個のヌクレオチド残基で構成されることがより好ましい。ループ構造を構成するヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド残基であることが好ましく、ループ構造を構成する全てのヌクレオチド残基が、デオキシリボヌクレオチド残基であることがより好ましい。
【００４０】
本核酸アプタマーの長さは、約４０ヌクレオチド残基以下であることが好ましく、約３０ヌクレオチド残基以下であることがより好ましく、約２５ヌクレオチド残基以下であることがさらに好ましい。また、本実施形態の核酸アプタマーの長さは、約１８ヌクレオチド残基以上であることが好ましく、約２０ヌクレオチド残基以上であることがより好ましい。この範囲であると、ヒトＩｇＧに対する結合活性を有するのに十分な長さであり、かつ化学合成及び大量生産が容易である。
【００４１】
一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で表される構造の好ましい例を、下記一般式（Ｉ’）〜（ＩＩＩ’）、（Ｉ’’）〜（ＩＩＩ’’）、及び（Ｉ’’’）〜（ＩＩＩ’’’）に示す。
【００４２】
【化５】
2018126117.tif 000006
［式中、Ｎ１〜Ｎ５、実線及び破線は、一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）と同義である。］
【００４３】
【化６】
2018126117.tif 000007
［式中、Ｎ１、実線及び破線は、一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）と同義である。］
【００４４】
【化７】
2018126117.tif 000008
［式中、実線及び破線は、一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）と同義である。］
【００４５】
一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で表される構造の好ましい例としては、下記一般式（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）を挙げることもできる。
【００４６】
【化８】
2018126117.tif 000009
［式中、Ｎ１〜Ｎ５、実線及び破線は、一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）と同義である。
Ｎ６及びＮ７は、それぞれ独立に、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選択されるヌクレオチド残基であり、互いに相補的なヌクレオチド残基である。
Ｎ６及びＮ７は、それぞれ独立に、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基、２’−フルオロリボヌクレオチド残基、及び２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基である。］
【００４７】
一般式（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）中、Ｎ１〜Ｎ５は、一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）と同義であり、好ましい例としては、一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で例示したものと同様のものを例示することができる。
【００４８】
一般式（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）中、Ｎ６及びＮ７は、それぞれ独立に、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴからなる群より選択されるヌクレオチド残基であり、Ｎ６及びＮ７は、互いに相補的なヌクレオチド残基である。
Ｎ６は、Ｃ、Ｕ、又はＴであることが好ましく、Ｃであることがより好ましい。
Ｎ７は、Ｇ又はＡでであることが好ましく、Ｇであることがより好ましい。
【００４９】
Ｎ６及びＮ７は、それぞれ独立に、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基、２’−フルオロリボヌクレオチド残基、及び２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基である。
Ｎ６は、デオキシリボヌクレオチド残基、２’−フルオロリボヌクレオチド残基、及び２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基であることが好ましく、デオキシリボヌクレオチド残基であることがより好ましい。
Ｎ７は、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基、及び２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基であることが好ましく、リボヌクレオチド残基であることがより好ましい。
【００５０】
一般式（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）中、実線及び破線は、一般式（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）と同義である。
一般式（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）中、Ｎ２−Ｎ３の塩基対を含むステム構造（Ｓ１）、並びにＮ４−Ｎ５及びＮ６−Ｎ７の塩基対を含むステム構造（Ｓ２）において、実線部分を構成する塩基対の数は、０〜１０塩基対程度であることが好ましい。ステム構造（Ｓ１）において、実線部分を構成する塩基対の数は、１〜４塩基対であることがより好ましく、２塩基対であることがさらに好ましい。また、ステム構造（Ｓ２）において、実線部分を構成する塩基対の数は、０〜３塩基対であることがより好ましく、０塩基対であることがさらに好ましい。
一般式（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）中のループ構造については、一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で例示したものと同様のものを例示することができる。
【００５１】
一般式（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）で表される構造の好ましい例を、下記一般式（Ｉａ’）〜（ＩＩＩａ’）、（Ｉａ’’）〜（ＩＩＩａ’’）、及び（Ｉａ’’’）〜（ＩＩＩａ’’’）に示す。
【００５２】
【化９】
2018126117.tif 000010
［式中、Ｎ１〜Ｎ７、実線及び破線は、一般式（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）と同義である。］
【００５３】
【化１０】
2018126117.tif 000011
［式中、Ｎ１、実線及び破線は、一般式（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）と同義である。］
【００５４】
【化１１】
2018126117.tif 000012
［式中、実線及び破線は、一般式（Ｉａ）〜（ＩＩＩａ）と同義である。］
【００５５】
本核酸アプタマーの好適な例としては、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、１８位のＡが糖修飾ヌクレオチド残基で置換されている配列からなる、核酸アプタマーを挙げることもできる。糖修飾ヌクレオチド残基としては、上記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の説明で挙げたものと同様のものを例示することができる。
【００５６】
また、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、１８位のＡ以外のヌクレオチド残基は、それぞれ独立に、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基、２’−フルオロリボヌクレオチド残基、及び２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基で、置換されていてもよい。配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、１８位のＡ以外の置換され得るヌクレオチド残基の数は、１〜５個であってよく、１〜３個であることが好ましく、１個又は２個であることがより好ましい。
【００５７】
例えば、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、１位及び２位のＧは、それぞれ独立に、リボヌクレオチド残基、又は２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基で、置換されていてもよい。
例えば、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、５位のＧは、２’−フルオロリボヌクレオチド残基で、置換されていてもよい。
例えば、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、７位のＧは、デオキシリボヌクレオチド残基、又は２’−フルオロリボヌクレオチド残基で、置換されていてもよい。
例えば、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、８位のＣは、リボヌクレオチド残基、又は２’−フルオロリボヌクレオチド残基で、置換されていてもよい。
例えば、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、９位のＵは、デオキシリボヌクレオチド残基、又は２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基で、置換されていてもよい。
例えば、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、１０位、１１位、２２位及び２３位のＣは、２’−フルオロリボヌクレオチド残基、又は２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基で、置換されていてもよい。
例えば、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、１２位のＧ及び１３〜１５位のＡは、リボヌクレオチド残基、又は２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基で、置換されていてもよい。
例えば、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、１６位及び１７位のＧは、デオキシリボヌクレオチド残基、又は２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基で、置換されていてもよい。
例えば、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、１９位のＡは、リボヌクレオチド残基で、置換されていてもよい。
上記の置換例は、国際公開公報第２００７／００４７４８号において、ヒトＩｇＧに対する結合活性が確認されたものである。
【００５８】
本核酸アプタマーの好適な例としては、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される核酸アプタマーを例示することができる。
（ａ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、１８位のＡが糖修飾ヌクレオチド残基で置換されている配列からなる、ヒトＩｇＧに対して結合活性を有する核酸アプタマー。
（ｂ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列において、１８位のＡが糖修飾ヌクレオチド残基で置換されており、１８位のＡ以外の１個又は複数個のヌクレオチド残基が、それぞれ独立に、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基、２’−フルオロリボヌクレオチド残基、及び２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基で置換されている配列からなる、ヒトＩｇＧに対して結合活性を有する核酸アプタマー。
上記(ｂ)において、「複数個」は、２〜５個であることができ、２〜４個であることが好ましく、２個又は３個であることがより好ましい。
【００５９】
上記（ａ）及び（ｂ）において、糖修飾ヌクレオチド残基としては、上記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の説明で挙げたものと同様のものを例示することができるが、ＬＮＡ残基、及び２’−Ｏ−ＭＣＥヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基であることが好ましい。
そのような本核酸アプタマーの具体例としては、以下の（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択される核酸アプタマーを例示することができる。
（ｃ）配列番号４又は８に記載のヌクレオチド配列からなる核酸アプタマー。
（ｄ）配列番号４又は８に記載のヌクレオチド配列において、１８位のＡ以外の１個又は複数個のヌクレオチド残基が、それぞれ独立に、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基、２’−フルオロリボヌクレオチド残基、及び２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基で置換されている配列からなる、ヒトＩｇＧに対して結合活性を有する核酸アプタマー。
上記(ｄ)において、「複数個」は、２〜５個であることができ、２〜４個であることが好ましく、２個又は３個であることがより好ましい。
【００６０】
本核酸アプタマーはまた、上記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される２以上の核酸アプタマーの連結物であってもよい。前記連結物において、各核酸アプタマーは、直接連結していてもよく、リンカー等を介して連結していてもよい。リンカーとしては、ヌクレオチド鎖（例、１〜約２０ヌクレオチド残基）、非ヌクレオチド鎖（例、−（ＣＨ２）ｎ−リンカー、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー、ＴＥＧリンカー、ペプチドを含むリンカー、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー、−ＯＰＯ３−結合を含むリンカー）等を挙げることができる。上記連結物にいて、連結する核酸アプタマーの数は、特に限定されないが、例えば２〜４個を例示することができる。
【００６１】
本核酸アプタマーはまた、ヒトＩｇＧに対する結合活性等を高めるため、１個又は複数個のヌクレオチド残基の塩基が、改変（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、５位ピリミジン改変、８位プリン改変、環外アミンでの改変、４−チオウリジンでの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルでの置換等が挙げられる。なお、上記において、「複数個」は、２〜５個であることができ、２〜４個であることが好ましく、２又は３個であることがより好ましい。
【００６２】
本核酸アプタマーはまた、ヌクレアーゼ及び加水分解に対して耐性であるように、１個又は複数個のヌクレオチド残基のリン酸基が改変されていてもよい。例えば、Ｐ（＝Ｏ）Ｏ基が、Ｐ（＝Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（＝Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、Ｐ（＝Ｏ）ＮＲ２（アミデート）、Ｐ（＝Ｏ）Ｒ、Ｒ（＝Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ若しくはＣＨ２（ホルムアセタール）、又は３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）等で置換されていてもよい［Ｒ及びＲ’は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよいアルキル基（例、メチル基、エチル基）である］。各ヌクレオチド残基間の連結基は、−Ｏ−、−Ｎ−または−Ｓ−連結を介して隣接するヌクレオチド残基に結合し得る。なお、上記において、「複数個」は、２〜５個であることができ、２〜４個であることが好ましく、２又は３個であることがより好ましい。
【００６３】
改変はまた、キャッピングのような３’及び５’の改変を含んでいてもよい。改変はさらに、ポリエチレングリコールやその他の脂質を末端に付加することにより行ってもよい。このような改変については、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号、同第５，７５６，７０３号を参照することができる。
【００６４】
本核酸アプタマーは、ホスホロアミダイト法等の公知の核酸合成法により化学合成することができる。
【００６５】
本核酸アプタマーは、ヒトＩｇＧに対する結合活性が高いため、ヒトＩｇＧ抗体精製用分離剤としてのリガンド、ヒトＩｇＧと機能性物質とを結合するリンカー、ヒトＩｇＧの固定化剤等として有用である。また、本核酸アプタマーは、ヒトＩｇＧ１に対する結合活性が特に高いため、ヒトＩｇＧ１抗体精製用分離剤としてのリガンド、ヒトＩｇＧ１と機能性物質とを結合するリンカー、ヒトＩｇＧ１の固定化剤等として特に有用である。
【００６６】
［固相担体］
１実施形態において、本発明は、本核酸アプタマーが固定化された固相担体を提供する。
【００６７】
本核酸アプタマーの固定化に用いることができる固相担体は、特に限定されず、核酸分子の固定化に一般的に用いられる担体を使用することができる。担体としては、例えば、基板、樹脂、プレート（例、マルチウェルプレート）、フィルター、カートリッジ、カラム、多孔質材、ビーズ等を挙げることができる。
基板としては、例えば、ＤＮＡチップやプロテインチップなどに使われているもの等を挙げることができる。例えば、ニッケル−ＰＴＦＥ（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）基板、ガラス基板、アパタイト基板、シリコン基板、アルミナ基板などで、これらの基板にポリマーコーティング、自己組織化単分子膜形成分子（例、チオール化合物、有機シラン化合物、ホスホン酸誘導体）などでの処理を施したもの等を挙げることができる。
樹脂としては、例えば、抗体精製クロマトグラフィーや抗体をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーなどで使われるカラム充填樹脂、バッチ法で抗体を精製若しくは固定化するための樹脂等を挙げることができる。また、樹脂としては、種々の濃度のアガロース粒子や高度架橋されたアガロース粒子、シリカ粒子、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの共重合体、ポリスチレン架橋ジビニルベンゼン粒子、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋した粒子、セルロースファイバー、アリルデキストランとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマー、単分散系合成ポリマー、単分散系親水性ポリマー、セファロース、及びトヨパール等、並びにこれらの樹脂に各種官能基を結合させた樹脂等もまた挙げることができる。
【００６８】
本核酸アプタマーの固相担体への固定化方法は、特に限定されず、固相担体の種類に応じて、核酸分子の固定化に一般的に用いられる方法を用いることができる。例えば、親和性物質（例、ビオチン及びストレプトアビジン、相補配列（ポリＡ及びポリＴ等）、グルタチオンセファロース若しくはヒスチジン及び抗体、等）を利用する方法や、所定の官能基を本核酸アプタマーに導入し、次いで当該所定の官能基を利用して固相担体に固定化する方法等が挙げられる。所定の官能基としては、カップリング反応に供することが可能な官能基であればよく、例えば、アミノ基、チオール基、ヒドロキシ基、カルボキシル基等を挙げることができる。
【００６９】
本実施形態の固相担体（以下、「本固相担体」という。）は、例えば、ヒトＩｇＧの精製、ヒトＩｇＧの検出・定量、ヒトＩｇＧの固定化等に使用することができる。また、本固相担体は、ヒトＩｇＧ１の精製、ヒトＩｇＧ１の検出・定量、ヒトＩｇＧ１の固定化等に特に好適に使用し得る。
【００７０】
また、本固相担体は、異常ＩｇＧ又はＩｇＧの過剰発現が原因の疾患（例、リウマチ、腎炎、キャッスルマン病、ヴェーゲナー肉芽腫症、糸球体硬化症、糸球体疾患、多発性動脈炎、紫斑病、エリテマトーデス、臓器移植における拒絶反応等）の治療に利用することもできる。例えば、送液ポンプを用いて患者の血管から吸引した血液を、本固相担体（例、カートリッジ）に接触させ、所定の量のＩｇＧを吸着除去した後、浄化された血液を患者に戻す。この場合、抗血液凝固剤を添加して血液が固まらないようにすることも有益である。ＩｇＧの除去量は透過血液量及び本固相担体の吸着容量によって調節することができる。本固相担体は中性溶出液を用いて洗浄し、加熱又は紫外線照射などにより滅菌することで、再生することができる。本固相担体を血液の浄化に利用する場合、使用方法の詳細や治療効果に関しては、透析療法やＰｒｏｔｅｉｎ  Ａを用いたＩｇＧ除去剤であるＰｒｏｓｏｒｂａ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ社製）及びＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂａ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ社製）を用いた血液浄化法を参考に行うことができる。
【００７１】
［ヒトＩｇＧ精製用カラム］
１実施形態において、本発明は、本固相担体を含む、ヒトＩｇＧ精製用カラムを提供する。本実施形態のカラムは、ヒトＩｇＧ１精製用カラムとして好適である。
【００７２】
本実施形態のヒトＩｇＧ精製用カラムは、本固相担体を、適切な容器に充填することにより作製することができる。本実施形態のカラムに使用する場合、本固相担体における担体は樹脂を用いることが好ましい。本固相担体を充填する容器は、特に限定されず、抗体精製用カラム等に一般的に使用されるカラム用容器を用いることができる。容器としては、例えば、カラム用のガラス製容器、樹脂製容器、金属製容器等を挙げることができる。
【００７３】
［ヒトＩｇＧの精製方法］
１実施形態において、本発明は、本固相担体にヒトＩｇＧを吸着させ、前記の吸着したヒトＩｇＧを溶出液により溶出させることを含む、ヒトＩｇＧの精製方法を提供する。本実施形態の精製方法において、ヒトＩｇＧはヒトＩｇＧ１であってよい。
【００７４】
本固相担体へのヒトＩｇＧの吸着は、ヒトＩｇＧを含む試料を本固相担体に接触させることにより行うことができる。本固相担体に固定化された本核酸アプタマーは、ヒトＩｇＧに対する高い結合活性を有するため、ヒトＩｇＧを含む試料を本固相担体に接触させると、試料中のヒトＩｇＧが本核酸アプタマーに結合し、本固相担体にヒトＩｇＧを吸着させることができる。
【００７５】
本実施形態の方法で使用可能な試料は、特に限定されず、ヒトＩｇＧを含む試料であればよい。試料としては、例えば、ヒト又はヒトＩｇＧ遺伝子を導入した動物の血液、ヒトの血漿、血清、血液、血漿、血清、又は腹水等、ヒト抗体産生細胞（例、ハイブリドーマ）の培養上清等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００７６】
例えば、ヒトＩｇＧを含む試料を、本固相担体と接触させ、適宜攪拌等行いながら１〜６０分程度室温放置することで、ヒトＩｇＧを本固相担体に吸着させることができる。あるいは、上記実施形態のヒトＩｇＧ精製用カラム等に、ヒトＩｇＧを含む試料を導入することで、ヒトＩｇＧを本固相担体に吸着させることができる。ヒトＩｇＧを含む試料をカラムに導入する際の流速は、特に限定されないが、例えば、流速０．１〜２０ｍＬ／分程度を挙げることができる。なお、試料は、本固相担体と接触させる前に、適宜希釈してもよい。希釈液は、特に限定されないが、例えば、塩化ナトリウム及び塩化マグネシウムを含む溶液を用いることができる。
【００７７】
本固相担体にヒトＩｇＧを吸着させた後、不純物を取除くために洗浄液で本固相担体を洗浄してもよい。洗浄液には、例えば、塩化ナトリウム及び塩化マグネシウムを含む溶液を用いることができる。
【００７８】
本固相担体に吸着したヒトＩｇＧの溶出は、中性溶液を用いて行うことができる。溶出に用いる中性溶出液は、特に限定されるないが、例えば、ｐＨ６〜９程度、好ましくはｐＨ６．５〜８．５程度、より好ましくはｐＨ７〜８程度のものを挙げることができる。中性溶液は、カリウム塩（例、塩化カリウム、酢酸カリウム、蟻酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、亜硫酸カリウム、過塩素酸カリウム、クエン酸カリウム、リンゴ酸カリウム、シュウ酸カリウム、シアン化カリウム）、マグネシウム塩（例、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、蟻酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウム）、カルシウム塩（例、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、蟻酸カルシウム、硫酸カルシウム、シュウ酸カルシウム）、アンモニウム塩（例、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、蟻酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、亜硫酸アンモニウム、過塩素酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、シアン化アンモニウム、シュウ酸アンモニウム）、キレート剤（例、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸塩（例、クエン酸ナトリウム）、リンゴ酸塩（例、リンゴ酸ナトリウム）、シュウ酸塩（例、シュウ酸ナトリウム）、エチレンジアミン、アセチルアセトナトリウム、ＥＧＴＡ、変性剤又は表面活性剤（グアニジン、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ２０、ＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）等を含むものであってよいが、コストの面からは塩化カリウムを含むものが好ましい。塩化カリウム溶液を用いる場合、濃度としては１００〜１０００ｍＭを挙げることができ、２００〜８００ｍＭであることが好ましく、３００〜６００ｍＭであることがより好ましい。ＥＤＴＡ溶液を用いる場合、濃度としては、１〜１００ｍＭを挙げることができ、５〜５０ｍＭであることが好ましく、１０〜２０ｍＭであることがより好ましい。
【００７９】
ヒトＩｇＧの溶出後、本固相担体の洗浄を行ってもい。洗浄液としては、例えば、尿素、強塩基（例、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム）、弱塩基（例、アンモニア）、強酸（例、塩酸、硝酸、硫酸、トリフルオロ酢酸）、弱酸（例、酢酸、蟻酸）を含む溶液が挙げられる。尿素溶液を用いる場合、濃度は、例えば、１〜１０Ｍを例示することができる。強塩基及び弱塩基の溶液を用いる場合、０．０１〜１０Ｎが好ましいが、０．０１〜１Ｎがより好ましく、０．０１〜０．１Ｎがさらに好ましい。強酸及び弱塩基の溶液を用いる場合、０．０１〜１０Ｎが好ましいが、０．０１〜１Ｎがより好ましく、０．０１〜０．１Ｎがさらに好ましい。
【００８０】
また、ヒトＩｇＧの溶出後、本固相担体の加熱処理を行ってもよい。かかる工程により、本固相担体の再生、滅菌が可能である。加熱処理としては、例えば、約５０〜約１００℃、好ましくは約６０〜約９０℃、より好ましくは約６５〜約８５℃での、数分間、例えば１〜３０分間、好ましくは１〜２０分間、より好ましくは５〜１５分間の処理が挙げられる。加熱処理は尿素（例、１〜１０Ｍ）中で行うことが可能である。
【００８１】
本発明はまた、精製ヒトＩｇＧの製造方法を提供する。本発明の製造方法は、ヒトＩｇＧを含む試料を調整し、当該試料を本固相抗体と接触させてヒトＩｇＧを本固相抗体に吸着させ、前記吸着したヒトＩｇＧを溶出液により溶出させることにより、実施することができる。
【００８２】
［その他の用途］
本発明はまた、１実施形態において、１個又は複数個の機能性物質が結合した本核酸アプタマーも提供する。本核酸アプタマーへの機能性物質の結合は、公知の方法で行うことができる。本核酸アプタマーと機能性物質との間の結合は、共有結合及び非共有結合のいずれであってもよく、リンカー等を介した結合であってもよい。複数個の機能性物質を本核酸アプタマーに結合する場合、同種の機能性物質を複数個結合してもよく、異種の機能性物質を複数個結合してもよい。なお、「複数個」は、特に限定されないが、２〜５個であることができ、２〜４個であることが好ましく、２又は３個であることがより好ましい。
【００８３】
機能性物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、単糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド等を挙げることができる。機能性物質としてはまた、例えば、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物、毒素、薬物送達媒体等も挙げることができる。
【００８４】
親和性物質としては、例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、標的相補配列に対して親和性を有するポリヌクレオチド、抗体、グルタチオンセファロース、ヒスチジン等を挙げることができる。標識用物質としては、例えば、蛍光物質、発光物質、放射性同位体等を挙げることができる。酵素としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等を挙げることができる。薬物としては、例えば、抗癌剤等を挙げることができる。毒素としては、例えば、リシン毒素、リア毒素等を挙げることができる。薬物送達媒体としては、例えば、リポソーム、ミクロスフェア、ポリエチレングリコール、コレステロール、ペプチド等を挙げることができる。
【００８５】
本核酸アプタマー（機能性物質が結合したものを含む）は、例えば、医薬又は試薬（例、診断薬、検査薬（実験用試薬を含む））として使用され得る。医薬又は診断薬としては、例えば、異常ＩｇＧ及び／若しくはＩｇＧの過剰発現が原因の疾患（例、リウマチ、腎炎、キャッスルマン病、ヴェーゲナー肉芽腫症、糸球体硬化症、糸球体疾患、多発性動脈炎、紫斑病、エリテマトーデス、臓器移植における拒絶反応）、ＩｇＧ産生に関連した疾患（例、Ｂ細胞リンパ腫）等の、自己免疫疾患を含むＩｇＧ関連疾患、又は癌等の治療又は診断（例、病態把握、治療効果のモニタリング）に利用可能である。
【００８６】
試薬としては、例えば、ヒトＩｇＧを検出・定量するための試薬として利用可能である。また、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的染色法、セルソーティング法等の方法における、二次抗体の代わりとして利用することもできる。なお、ヒトＩｇＧはヒトＩｇＧ１であってよい。
【００８７】
また、本核酸アプタマーは、ヒトＩｇＧに機能性物質を結合させるためのリンカーとして使用することもできる。例えば、１個又は複数個の機能性物質を結合させた本核酸アプタマーを、ヒトＩｇＧに接触させることにより、本核酸アプタマーを介して、機能性物質をヒトＩｇＧに結合させることができる。本核酸アプタマーを介して、機能性物質が結合されたヒトＩｇＧは、例えば、医薬、診断薬、試薬等として利用可能である。そのような、１個又は複数個の機能性物質が結合した本核酸アプタマーを結合させたヒトＩｇＧもまた、本発明により提供される。なお、ヒトＩｇＧはヒトＩｇＧ１であってよい。
【実施例】
【００８８】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８９】
［実施例１］修飾ＲＮＡアプタマーの作製
配列番号１１に記載の配列（２３Ｆ２３）を基にして、表１に記載のＲＮＡアプタマーを化学合成により作製した。配列番号１１に記載の配列は、国際公開第２００７／００４７４８号に記載の核酸アプタマーのうち、最もヒトＩｇＧ１に対する結合活性が高い配列である。表１の配列中、（）内は、ヌクレオチド残基の種類を示す。（ＯＨ）はリボヌクレオチド残基、（Ｈ）はデオキシリボヌクレオチド残基、（Ｆ）は２’−フルオロリボヌクレオチド残基、（Ｍ）は２’−Ｏ−ＭＣＥリボヌクレオチド基、（Ｌ）はＬＮＡ残基を表す。
【００９０】
【表１】
2018126117.tif 000013
【００９１】
［実施例２］結合活性の評価
表１に記載のＲＮＡアプタマーについて、ヒトＩｇＧ１に対する結合活性を表面プラズモン共鳴法により調べた。
測定にはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥヘルスケア）を用いた。センサーチップにはストレプトアビジンセンサーチップ（Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＳＡ  ＢＲ−１００５−３１、ＧＥヘルスケア）を用いた。これに、５’末端にビオチンが結合している１６残基のＰｏｌｙ  ｄＴを結合させた。
リガンドとなるＲＮＡアプタマーには、３’末端に１６残基のＰｏｌｙ  Ａを付加したものを用いた。１００ｎＭのＲＮＡアプタマー  ランニングバッファー溶液を、流速３０μＬ／分、２５℃で１分間、フローセル内のセンサーチップに反応させ、ｄＴとＡとの結合により、ＲＮＡアプタマーをセンサーチップに固定した。その固定化量は、１９０ＲＵ程度とした。
アナライト用のＩｇＧ１は、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１，Ｍｙｅｌｏｍａ，ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）  ４００１２０（メルクミリポア）を用いた。２０ｎＭのＩｇＧ１ランニングバッファー溶液を、センサーチップを含むフローセルに１分間インジェクションし、その後の１５０秒間で徐々に解離させた。センサーチップの再生は、６Ｍ尿素を３０μＬ／分で３０秒間インジェクションすることによって行った。
各ＲＮＡアプタマーの結合活性は、表１に記載の順序で連続測定を行った。ただし、２３Ｆ２３については、最初と最後のサンプルとして２回測定を行った。
なお、ランニングバッファーの組成は、以下のとおりである：１４５ｍＭ  ＮａＣｌ，５．４ｍＭ  ＫＣｌ，０．８ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６），０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０。
【００９２】
図１に、各ＲＮＡアプタマーのセンサーグラムを示す。ＮＣＲ−４及びＮＣＲ−９は、２３Ｆ２３と比較して、ＩｇＧ１に対する結合活性が向上した。一方、他の修飾ＲＮＡアプタマーは、２３Ｆ２３よりも結合活性が低下した。
【００９３】
表２に、図１の［Ａ］及び［Ｂ］の点でのＲＵ値から、解離の傾きを評価した結果を示す。
【００９４】
【表２】
2018126117.tif 000014
【００９５】
表２の結果から、ＮＣＲ−４及びＮＣＲ−９は、２３Ｆ２３と比較して、解離の傾きも向上していることが確認された。
【００９６】
［実施例３］カイネティクス解析
実施例２において、結合活性が確認されたＮＣＲ−４及びＮＣＲ−９について、ヒトＩｇＧ１に対する結合のカイネティクス解析を行った。解析にはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００を用い、センサーチップ、アナライト、及びランニングバッファーには実施例２と同様のものを使用した。リガンドとなるＲＮＡアプタマーには２３Ｆ２３、ＮＣＲ−４及びＮＣＲ−９を用い、実施例２と同様のものを使用した。
【００９７】
ＲＮＡアプタマーのセンサーチップへの固定化を実施例２と同様に行い、その固定化量は３０ＲＵ程度とした。
０，１．５６２５，３．１２５，６．２５，１２．５，２５ｎＭのＩｇＧ１ランニングバッファー溶液を、センサーチップを含むフローセルに２００秒間インジェクションし、その後の２００秒間で徐々に解離させた。センサーチップの再生は、実施例２と同様に行った。２３Ｆ２３、ＮＣＲ４、ＮＣＲ９の順序で連続測定を行い、前記連続測定を３セット連続で行った。
センサーグラムに対するフィッティングカーブの算出は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ３．０を用いて作成したグローバルフィッティングカーブ（１：１  Ｂｉｎｄｉｎｇモデル）により算出した。
【００９８】
表３に、カイネティクス解析の結果を示す。
【００９９】
【表３】
2018126117.tif 000015
【０１００】
表３の結果から、ＮＣＲ−４及びＮＣＲ−９は、２３Ｆ２３と比較して、ヒトＩｇＧ１に対する親和性が向上していることが確認された。また、ＮＣＲ−４とＮＣＲ−９とを比較すると、ＮＣＲ−４の方がよりヒトＩｇＧ１に対する親和性が向上していた。
【０１０１】
上記実施例においてヒトＩｇＧ１に対する親和性の向上が確認されたＮＣＲ−４及びＮＣＲ−９は、いずれも２３Ｆ２３の１８位残基を糖修飾したものである。このことから、２３Ｆ２３の１８位残基を糖修飾することにより、ヒトＩｇＧ１に対する親和性を向上できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明によれば、ヒトＩｇＧに対する親和性が向上した核酸アプタマー、及び当該核酸アプタマーの利用技術が提供される。本発明により提供される核酸アプタマーは、ヒトＩｇＧの精製、ヒトＩｇＧの検出・定量、ヒトＩｇＧの固定化等に利用することができる。
【図１】
2018126117.tif 000018
【配列表】
2018126117000001.app