(57)【要約】【課題】ＦＧＦ−７産生を促進し、ＶＥＧＦ産生を促進するＦＧＦ−７又はＶＥＧＦ産生促進剤、更にそのＦＧＦ−７又はＶＥＧＦ産生促進剤が配合されている、医薬品及び医薬部外品である配合物を提供すること。【解決手段】小麦発酵エキスを有効成分として含有するＦＧＦ−７産生促進剤。小麦発酵エキスを有効成分として含有するＶＥＧＦ産生促進剤。さらに、医薬品又は医薬部外品であるＦＧＦ−７産生促進剤又はＶＥＧＦ産生促進剤の配合物。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
小麦発酵エキスを有効成分として含有することを特徴とするＦＧＦ−７産生促進剤。
【請求項２】
小麦発酵エキスを有効成分として含有することを特徴とするＶＥＧＦ産生促進剤。
【請求項３】
小麦発酵エキスを有効成分として含有することを特徴とするＦＧＦ−７及びＶＥＧＦ産生促進剤。
【請求項４】
請求項１乃至３いずれかに記載のＦＧＦ−７又はＶＥＧＦ産生促進剤が配合されている、医薬品又は医薬部外品であることを特徴とする配合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＧＦ−７又はＶＥＧＦ産生促進剤に関し、更にその促進剤が配合されている、医薬品及び医薬部外品である配合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ミノキシジルが育毛素材としてよく知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
また、発毛障害にリポ多糖を用いることも知られている（例えば、特許文献２、請求項３及び６参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第２８１００４１号公報
【特許文献２】特開２０１１−１０５６８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、リポ多糖は、内毒素（菌体内に存在する毒素）とも呼ばれるように、過剰になると毒性が発現するとされており、多くを実用に供するのはためらわれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のＦＧＦ−７又はＶＥＧＦ産生促進剤は、小麦発酵エキスを有効成分として含有することを特徴とする。
【０００７】
また、本発明は前記ＦＧＦ−７又はＶＥＧＦ産生促進剤が配合されている、医薬品又は医薬部外品である配合物である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、実効性のある新たなＦＧＦ−７又はＶＥＧＦ産生促進剤及びその配合物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】細胞毒性試験（培養１日間）の結果を示すグラフである。
【図２】細胞毒性試験（培養３日間）の結果を示すグラフである。
【図３】ＦＧＦ−７産生量（培養１日間）を示すグラフである。
【図４】ＦＧＦ−７産生量（培養３日間）を示すグラフである。
【図５】ＶＥＧＦ産生量（培養１日間）を示すグラフである。
【図６】ＶＥＧＦ産生量（培養３日間）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、添付図面を参照しながら本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
［概略］
毛乳頭細胞を被験物質添加下で培養後、生細胞数を測定し、ＦＧＦ−７産生量を検証し、ＶＥＧＦ産生量を検証した。その結果、小麦発酵エキスにおいて、細胞毒性は見られず、むしろ細胞増殖促進が見られた。また、小麦発酵エキスにおいて、ＦＧＦ−７産生促進、及びＶＥＧＦ産生促進が認められた。
【００１１】
［試薬］
2-1）被験物質
Somacy（自然免疫応用技研, Somacy-FP100）（小麦発酵エキスに相当する。特許第４７７１３７９号公報、段落００１０「パントエア・アグロメランスを用い、小麦粉を主成分として含む培地で発酵及び培養させて得た植物発酵エキス」のこと。）
LPS（自然免疫応用技研, Pantoea agglomerans LPS 標品）（純粋ＬＰＳに相当する）
【００１２】
2-2）細胞
ヒト頭髪毛乳頭細胞 （TOYOBO, Code No.CA602t05a）
Lot No: 2868, 白色人種、51歳男性由来、頭頂部
【実施例１】
【００１３】
3-1）ヒト頭髪毛乳頭細胞の培養条件
毛乳頭細胞（東洋紡, Code No.CA602t05a）は、付属の毛乳頭細胞専用培地（東洋紡, Code No.TMTPGM-250）を用い、CO2インキュベーター（5% CO2、37℃）内で培養した。培養に使用したフラスコはI型コラーゲンコートして使用した（Type I collagen coated 96
well Cell Culture Plate (コーニング, Cat. No. NCO3538)）。細胞の継代には付属の毛乳頭細胞専用サブカルチャーセット（東洋紡, Code No.CA090K）を用いて細胞をフラスコより剥離し使用した。
【００１４】
3-2）被験物質調整
各被験物質と使用した溶媒、ストック濃度を以下に示す。ＬＰＳ、小麦発酵エキスともに水溶性なので培地に直接溶解し使用した。小麦発酵抽出物には、1％のＬＰＳが含有されているため、最終濃度［0.004％；ＬＰＳ換算で0.4μg/ml、図面には「0.4」と表記した］、［0.02％；ＬＰＳ換算で2μg/ml、図面には「2」と表記した］、［0.1％；ＬＰＳ換算で10μg/ml、図面には「10」と表記した］になるようにした。
【００１５】
ＦＧＦ−７産生促進の陽性対照であるアデノシン(和光, Cat.No. 016-10493)はDMSO（ジメチルスルホキシド, ナカライテスク, 13445-74）を溶媒として100mMストック溶液を作成、それを終濃度100μＭとなるように試験培地に添加した（細胞毒性試験においては0.1％DMSO試験区を使用した）。
【００１６】
ＶＥＧＦ産生促進の陽性対照であるミノキシジル(Sigma-Aldrich, Cat.No.M4145-25MG)は50% エタノールを用いて濃度15mMのストック溶液を作成し、それを終濃度30μＭとなるように試験培地に添加した。この時の溶媒（エタノール）濃度は0.1％であり、低濃度エタノールは試験に影響しないと判断しミノキシジルの比較対照区は無添加区とした。
【００１７】
3-3）細胞毒性試験
細胞毒性試験：細胞を5×103 cells/0.1ｍｌ/ウェルでtypeIコラーゲンコート96ウェルプレートに播種した。CO２インキュベーター内（5％CO２、37℃）で、1日間培養後（５０％コンフルエントを確認する）、被験物質（７段階濃度）を含む培地に置換、その後、３日間培養し、細胞の増殖性（viability）を生細胞数測定試薬SF（ナカライテスク, Cat.No. 07553）で比較検討した。ｎ＝５（５反復）にて実施した。培養終了後、培養上清を除去、PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で細胞を洗浄後、生細胞数測定試薬SFを１０％含む培地を添加（100μL/ウェル）した。添加後、３０分、９０分後に培養上清の吸光度（測定波長450nm、参照波長595nm）を測定した。９０分、３０分の値から1時間あたりの吸光度変化量を算出し、無添加群の細胞増殖率を100％とした場合の各サンプルの割合を求めた。
【００１８】
3-4）細胞賦活試験・ＦＧＦ-７、ＶＥＧＦ産生測定
細胞を1.2×104 cells/0.3ｍｌ/ウェルで48ウェルプレテート(greinerbio-one, Cat. No. 677180)に播種する。CO２インキュベーター内（5％CO２、37℃）で、1日間培養後、被験物質を含む培地に置換する。その後、１日間及び３日間培養し、それぞれの細胞の増殖性を生細胞数測定試薬SFで比較検討した。ｎ＝５（５反復）にて実施した。その際、培養上清（３日間培養）を回収し測定まで-80℃保存した。培養上清中のＦＧＦ-７、ＶＥＧＦ産生量をELISA kit(abcam、Code No. ab100519)にて測定した（後述）。
【００１９】
3-4-1)  FGF-7の測定
測定時に氷上で解凍し、FGF-7ELISA  Kitにて培養上清中のFGF-7量を測定した。予備検討により培養上清を希釈せず、原液を測定することとした。詳細のプロトコールを以下に示す。
【００２０】
［プロトコール］
(1). FGF-7標準原液（50ｎg/ml）をもとに、反応緩衝液を用いて400、 133.3、 44.44、 14.81、 4.94、 1.65、 0.55ｐg/mlのFGF-7標準溶液を調製する。
(2). FGF-7標準溶液および検体（培養上清）100μLをFGF-7固相化マイクロプレートの各ウェルに添加し、室温にて2時間３０分反応した（一次反応）。
(3). ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で4回洗浄する。
(4). ビオチン標識抗FGF-7抗体溶液を各ウェルに100μLずつ添加し、室温で60分間反応させる（二次反応）。
(5). ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で4回洗浄する。
(6). ストレプトアビジン溶液100μLを各ウェルに添加し、室温で４５分反応する。
(7). 酵素基質溶液100μLを各ウェルに添加し、遮光・室温下で３０分間静置する（発色反応）。
(8). 反応停止溶液を各ウェルに50μlずつ添加し、プレートミキサーで1分間混和後、プレートリーダーで各ウェルの吸光度を測定する（測定波長450 nm）。
(9). 標準曲線から、検体中のFGF-7濃度を算出する。
【００２１】
3-4-2)  ＶＥＧＦ量の測定
回収した培養上清を測定まで-80℃保存しておく。測定時に氷上で解凍し、VEGF ELISA  Kitにて培養上清中のVEGF量を測定した。予備検討により培養上清を希釈せず、原液を測定することとした。詳細のプロトコールを以下に示す。
【００２２】
［プロトコール］
(1). VEGF標準原液（2000ｐg/ml）をもとに、反応緩衝液を用いて1000、 500、 250、 125、 62.5、 31.2、 15.6ｐg/mlのVEGF標準溶液を調製する。
(2). VEGF標準溶液および検体（培養上清）200μLを50μＬの希釈溶液を各ウェルに添加したVEGF固相化マイクロプレートに添加し、室温にて2時間反応した（一次反応）。
(3). ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で3回洗浄する。
(4). 西洋ワサビペルオキシダーゼ結合VEGF抗体溶液を各ウェルに200μLずつ添加し、室温で2時間反応させる（二次反応）。
(5). ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で3回洗浄する。
(6). 基質溶液200μLを各ウェルに添加し、室温で20分反応する。
(7). 反応停止溶液を各ウェルに50μlずつ添加し、プレートミキサーで1分間混和後、プレートリーダーで各ウェルの吸光度を測定する（測定波長450 nm）。
(8). 標準曲線から、検体中のVEGF濃度を算出する。
【００２３】
3-5）有意差検定
比較試験区間では有意差検定を行った。検定はDunnett's testにより行い*P<0.05（帰無仮説が5％未満）、**Ｐ<0.01（帰無仮説が1％未満）のものを有意差ありと判断し、図中に記載した。
【００２４】
［結果と考察］
4-1）細胞毒性試験
図１及び図２は、被験物質であるＬＰＳ及び小麦発酵エキスにおける細胞毒性試験の結果を示す図である。図１に示すように、1日培養でLPS１０で有意に毒性（増殖抑制）を示し、小麦発酵エキス１０で有意に増殖促進を示した。同様に、図２に示すように、3日目培養でLPS１０、４で有意に毒性（増殖抑制）を示し、小麦発酵エキス２で有意に増殖促進を示した。これらの結果から、ＬＰＳでは細胞毒性が見られるのに対して、小麦発酵エキスにおいては細胞毒性が見られないことが分かる。
【００２５】
4-2）FGF-7、VEGF産生量
図３及び図４は、FGF-7産生量の結果を示す図である。陽性コントロールのアデノシン、小麦発酵エキス（２，１０）ともに培養1日目、3日目で有意なFGF-7産生促進作用が認められた。また、ＬＰＳでは濃度を上げても、その濃度に依存するFGF-7産生促進作用が認められないのに対して、小麦発酵エキスでは濃度を上げると、その濃度に依存するFGF-7産生促進作用が認められる。
【００２６】
図５及び図６は、VEGF産生量の結果を示す図である。培養1日目で陽性コントロールであるミノキシジルと両物質ともに産生促進作用が認められたが、培養3日目ではミノキシジルと小麦発酵エキス（２，１０）に有意なVEGFの産生作用が認められた。ここでも、ＬＰＳでは濃度を上げても、その濃度に依存するVEGF産生促進作用が認められないのに対して、小麦発酵エキスでは濃度を上げると、その濃度に依存するVEGF産生促進作用が認められる。
【００２７】
これらの結果から、同じようにＬＰＳを有効成分としていても、純粋ＬＰＳと異なり、小麦発酵エキスは、濃度に依存するFGF-7産生促進作用及びVEGF産生促進作用を有することが分かる。したがって、小麦発酵エキスの濃度を調整することによってFGF-7産生促進作用及びVEGF産生促進作用の程度を容易に調整することができる。さらに、小麦発酵エキスの濃度を高くすることによって高いFGF-7産生促進作用及びVEGF産生促進作用を奏することができる。
【００２８】
また、この結果から、本発明が配合されている、医薬品及び医薬部外品には、発毛効果があることは明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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