(57)【要約】【課題】腐植抽出物質を含有し、育毛作用に優れた育毛剤を提供する。【解決手段】本発明の育毛剤は、ＦＴ−ＩＲ法における赤外線吸収スペクトルにおいて波数３３６２，２８７５，１６７５，１５５９，１３６０，１２００，１０４７及び８３５ｃｍ−１に赤外線吸収ピークを有するフルボ酸を含有する腐植抽出物を有効量含み、そして化粧品学的、皮膚病学的及び／又は薬学的に許容される添加剤あるいは食品添加物を含んでなる。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＴ−ＩＲ法における赤外線吸収スペクトルにおいて波数３３６２，２８７５，１６７５，１５５９，１３６０，１２００，１０４７及び８３５ｃｍ−１に赤外線吸収ピークを有するフルボ酸を含有する腐植抽出物を有効量含み、そして化粧品学的、皮膚病学的及び／又は薬学的に許容される添加剤あるいは食品添加物を含んでなる育毛剤。
【請求項２】
前記腐植抽出物は、図１に示す赤外線吸収スペクトルを示すフルボ酸を含有する、請求項１に記載の育毛剤。
【請求項３】
前記腐植抽出物は、ナフタレン環構造を有さないことを特徴とする、請求項１又は２に記載の育毛剤。
【請求項４】
前記腐植抽出物中のフルボ酸の平均分子量は、４，０００よりも小さい、請求項１〜３のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項５】
経皮投与用である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項６】
水剤、液剤、乳剤、乳液、エマルション、クリーム、粉体、又はクレイパックの形態である、請求項５に記載の育毛剤。
【請求項７】
経口投与用である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項８】
散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錠、ドロップ、水剤、シロップ、又はドリンク剤の形態である、請求項７に記載の育毛剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、育毛剤に関し、より詳細には腐植抽出物を含有する育毛剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
毛髪の成長は、毛母細胞の増殖と分化によって起こり、そして毛乳頭細胞によって調節されていることが知られている（非特許文献１）。毛乳頭細胞の集合体である毛乳頭は、毛髪の成長期に大きく成長することから、毛乳頭細胞の増殖が、太くてしっかりした毛髪を形成する重要な役割を果たしていると考えられる。
【０００３】
毛乳頭細胞の増加は、ＥＧＦやＦＧＦといった細胞増殖因子によって促進される、男性ホルモンの一種であり、動物試験等で細胞増殖抑制物質として知られているジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）の産生抑制等が考えられる。したがって、育毛促進方法として、従来、ＥＧＦ、ＦＧＦ等の細胞増殖因子を活性化させる方法、ＤＨＴ等の細胞増殖抑制物質を抑制させる方法等が検討されている。後述の実施例で陽性対照として使用した、抗アンドロゲン薬として知られるフィナステリド（Ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）は、ＥＧＦやＦＧＦの産生促進というよりも、５αリダクターゼ阻害剤として作用が強いため、阻害作用の結果として、毛乳頭細胞に含まれるアンドロゲンレセプターへ関与し、細胞増殖を示したと考えられている。ミノキシジルもまた、フィナステリドと同様の作用機序と思われる。
【０００４】
特許文献１には、腐植土抽出物を含むことを特徴とする育毛剤が開示されている。特許文献１でによれば、人体に優しく、かつ、使用感、保湿効果に優れた育毛剤を提供可能であるとされる。特許文献２には、腐植土抽出物質含有水性液を用いて増毛剤・育毛剤を製造することが開示されている。特許文献１及び特許文献２の実施例で使用された腐植土抽出液は、長崎県北高来郡森山町唐比西名で採取された腐植土の抽出物である。この腐植土抽出物が、後述の比較例２で使用した市販の育毛剤に含まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】勝岡憲生、「毛成長誘導の主役は毛乳頭細胞？毛包幹細胞？」、第７４回日本皮膚科学会東京支部学術大会（１）会長講演、（http://medical.radionikkei.jp/maruho_hifuka_pdf/maruho_hifuka-110825.pdf）
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−３２７９７８（育毛剤）
【特許文献２】特許第３５０７３４７（腐植土抽出物質含有水性液）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
腐植は、一般に、約１億年前の多くの栄養素が含まれた肥沃な土壌が石油や石炭に変性することなく、有機物として残存したものである。より詳細には、前記時代に生息した植物が、氷河期に入ると地下に埋没し、バクテリア等の微生物によってピートモスに変化し、その上に新しい有機物が積み重なって、再度、バクテリア等で分解され、時間の経過とともに堆積層を形成したものである。腐植は、土壌中で植物残渣や微生物遺体の中の炭水化物及びタンパク質が微生物によって分解され、さらにその分解産物が縮合してできたフルボ酸やフミン酸といった無定形有機高分子重合体や、多種類のミネラルを含有する。フミン酸は、アルカリに可溶であって酸に不溶な赤褐色ないし黒褐色無定形高分子有機酸であり、フルボ酸は、アルカリ及び酸に可溶な無定形高分子有機酸である。
【０００８】
フルボ酸やフミン酸のような無定形重合高分子有機酸は、腐植の産地の土壌やその生成年代期等の要因によって変化する。腐植の効能もまた、無定形重合高分子有機酸の構造や物性の相違によって変化すると考えられる。
【０００９】
そこで、本発明の課題は、腐植抽出物質を含有し、育毛作用に優れた育毛剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を鋭意検討した結果、多種多様な分子構造と置換基を有するフルボ酸の中でも特定の赤外線吸収に基づく構造を有するフルボ酸には、従来、フィナステリドのように育毛作用を発揮し、さらに、従来公知の腐植抽出物含有育毛剤と対比しても優れた育毛作用に発揮することを発見し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、ＦＴ−ＩＲ法における赤外線吸収スペクトルにおいて波数３３６２，２８７５，１６７５，１５５９，１３６０，１２００，１０４７及び８３５ｃｍ−１に赤外線吸収ピークを有するフルボ酸を含有する腐植抽出物を有効量含み、そして化粧品学的、皮膚病学的及び／又は薬学的に許容される添加剤あるいは食品添加物を含んでなる育毛剤を提供する。本明細書において、「育毛剤」は、育毛効果のほかに発毛効果を含む意味で使用される。
【００１１】
前記腐植抽出物は、より特定的には、図１に示す赤外線吸収スペクトルを示すフルボ酸を含有する。
【００１２】
前記腐植抽出物は、ナフタレン環構造を有さないことが好ましい。
【００１３】
前記腐植抽出物中のフルボ酸の平均分子量は、４，０００よりも小さいことが好ましい。
【００１４】
本発明の育毛剤は、例えば経皮投与用である。
【００１５】
前記経皮投与用の育毛剤の形態は、例えば水剤、液剤、乳剤、乳液、エマルション、クリーム、粉体、又はクレイパックである。
【００１６】
本発明の育毛剤は、例えば経口投与用である。
【００１７】
前記経口投与用の育毛剤の形態は、例えば散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錠、ドロップ、水剤、シロップ、又はドリンク剤である。
【発明の効果】
【００１８】
特定の赤外線吸収波長によって規定されるフルボ酸を含有する腐植抽出物を含有することを特徴とする本発明の育毛剤によれば、フィナステリドのように育毛作用が発揮され、しかも、その効能は腐植抽出物を含有する公知の腐植物質含有育毛剤よりも顕著に高い。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１で使用した腐植抽出物（製品名：ヒューミクル（登録商標））のフルボ酸分画のＡＴＲ法に基づくＦＴ−ＩＲ吸収スペクトルの図である。
【図２】比較例３で使用した段戸産の標準フルボ酸及び標準フミン酸のＡＴＲ法に基づくＦＴ−ＩＲ吸収スペクトル図である。
【図３】実施例１で使用した腐植抽出物の４％水溶液の３次元蛍光スペクトル図である。
【図４】比較例３で使用した段戸産フルボ酸の水溶液（濃度１０μｇ／ｍＬ）及び段戸産フミン酸の水溶液（濃度１０μｇ／ｍＬ）の３次元蛍光スペクトル図である。
【図５】実施例１、並びに比較例１〜４において、Ｘ軸に腐植抽出物の濃度（対数目盛）を、そしてＹ軸にヒト毛乳頭細胞の増殖率をプロットした図である。増殖率１００％は、コントロール（試験品添加無し）を意味する。図５から、本発明の育毛剤（実施例１）は、人工的に合成されたフルボ酸製品（比較例１）、腐植抽出物を含む既存の育毛剤製品（比較例２）や腐植抽出物標準品（比較例３及び４）よりも高い毛乳頭細胞増殖率を示すことがわかる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。本発明の育毛剤は、ＦＴ−ＩＲ法における赤外線吸収スペクトルにおいて波数３３６２，２８７５，１６７５，１５５９，１３６０，１２００，１０４７及び８３５ｃｍ−１に赤外線吸収ピークを有するフルボ酸を含有する腐植抽出物を有効量含む。
【００２１】
本発明の育毛剤には、腐植抽出物の中でも、上記した特定の赤外線吸収ピークを有する腐植抽出物を使用することを必須とする。腐植抽出物は、上記の赤外線吸収特性を有するものであれば、その由来を問わない。
【００２２】
上記赤外線吸収ピークを有する腐植抽出物を含んだ腐植を水（例えば蒸留水、イオン交換水、逆浸透圧水等）と混合することにより、腐植抽出物が水内に抽出される。その際、腐植を、水１００重量部に対して通常、５〜３５重量部、好ましくは１５〜２５重量部、特に好ましくは、１７〜１８重量部の割合で混合する。上記混合物を、室温で、通常、２４〜９６時間、好ましくは４８〜７２時間日間放置する。上記放置中、適宜、混合物を撹拌してもよい。次いで、上記混合物の上澄液又は濾液を腐植抽出物とする。液状の腐植抽出物のｐＨは、通常、３．０である。この液状の腐植抽出物を乾固して、粉末としてもよい。
【００２３】
上記腐植抽出物中のフルボ酸の平均分子量は、通常、４，０００よりも小さく、好ましくは３，５００以下であり、特に好ましくは３，０００以下であり、さらに好ましくは３，０００〜１，０００である。
【００２４】
前記腐植抽出物は、市販のものでもよく、日本では例えば株式会社スタイルアンドバリュージャパンより製品名「ヒューミクル（登録商標）ＨＣフルボ酸パウダー」として入手可能である。ヒューミクルの成分分析結果（試料湿重量中の含有量）を、表１に示す。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
ヒューミクルの４％水溶液の全有機炭素（ＴＯＣ）の測定、及びフルボ酸分画の全有機炭素（ＴＯＣ）測定の結果から、ヒューミクル中の炭素のほぼ全量が有機炭素で占められ、そして有機炭素のほぼ全量がフルボ酸を構成していることが確認された。そして、ヒューミクル中のフルボ酸含有量は、約３％と推定された。
【００２７】
ヒューミクルのアルカリ（０．１Ｎ水酸化ナトリウム）及び酸（塩酸、ｐＨ２）可溶成分を抽出することにより、フルボ酸を分画した。ヒューミクル又はフルボ酸分画の物性試験方法とその分析結果を以下に示す。
【００２８】
（１）３次元分光蛍光光度法
ヒューミクルの４％水溶液の３次元励起−蛍光スペクトル（測定装置ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−８２００）を図３に示す。比較のため、愛知県段戸森林土壌から抽出精製されたフルボ酸及びフミン酸（いずれも、日本腐植物質学会から「日本腐植物質学会  標準資料」として頒布されている、以下、それぞれ、段戸産フルボ酸及び段戸産フミン酸という）の３次元蛍光スペクトルを図４に示す。ヒューミクル及び段戸産フルボ酸の３次元励起−蛍光スペクトルには、フルボ酸由来の蛍光の特徴である、励起２５０ｎｍ付近−蛍光４３０ｎｍ付近のピーク及び、励起３２０ｎｍ付近−蛍光４３０ｎｍ付近のピークが出現している。
【００２９】
（２）ＧＰＣ−ＵＶ／ＴＣ分析
ＧＰＣ−ＵＶ／ＴＣ分析法は、水中溶存有機物を分子の大きさや排除の程度によって高速に分離し、分離した溶存分子をＵＶ検出器及びＴＣ検出器（Ｔｏｔａｌ  Ｃａｒｂｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）でモニタリングする手法である。以下ＧＰＣ−ＴＣ装置：
ＧＰＣ：Ｓｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ  ＳＹＳＴＥＭ  ２１
分離カラム  ＴＯＳＯ  ＨＷ−５０Ｓ
溶離液  ３０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４
ＵＶ吸収（２２０ｎｍ）検出器：ＧＬ７４５０（ＧＬ  サイエンス製）
ＴＣ検出器：ＬＣＴ−１００（東レエンジニアリング製）
を用いて、ヒューミクル及び段戸産フルボ酸の分子量を測定した。
【００３０】
両者のＴＣクロマトグラムでは、段戸産フルボ酸のピーク位置が５１分であるのに対して、ヒューミクル４％溶解液では５４分であった。ピーク位置の保持時間を、使用した分離カラムの多糖類やＰＥＧ（ポリエチレングリコール）の排除特性で換算すると、段戸フルボ酸の分子量は、約４，０００であり、ヒューミクル溶解液中の有機物の分子量は、約１，０００〜３，０００と推定された。
【００３１】
ピークトップとなった保持時間でのＴＣ出力値（ｍＶ）とＵＶ（２２０ｎｍ）吸収での出力値（ｍＶ）、及びＵＶ出力値／ＴＣ出力値（単位有機物量（炭素量）当たりＵＶ吸収の強さ）を表２に示す。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
表２から、ヒューミクル溶解液のＵＶ／ＴＣ値は、段戸産フルボ酸溶解液のものにほぼ近い。有機物の分子構造に由来する紫外吸光（２２０ｎｍ）に類似性があることは、両者の分子構造の骨格や官能基の種類に類似性があることを示している。
【００３４】
（３）フーリエ変換赤外分光光度計法（ＦＴ−ＩＲ）
前記フルボ酸分画のＡＴＲ法（Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｔｏｔａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ、全反射吸収法）にて赤外線吸収スペクトルを取得した。具体的には、前記フルボ酸分画をＤａｘ−８樹脂（Ｓｐｅｌｃｏ社製）に施用し、そこに吸着した有機物をアルカリ性溶液で脱着した。脱着した有機物を、さらにイオン交換樹脂に通して不要な塩類を取り除いた。得られた試料をＡＴＲ法に基づくＦＴ−ＩＲ分光分析（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ６５）に供した。
【００３５】
腐植抽出物（ヒューミクル）に含有されるフルボ酸の赤外線吸収スペクトルを図１に示す。比較のため、段戸産のフルボ酸及びフミン酸の赤外線吸収スペクトルを図２に示す。図１（ヒューミクル）及び図２（段戸産フルボ酸）から主要な赤外線吸収ピークをそれぞれ抽出し、その結果を波数で表３に示す。
【００３６】
【表３】
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【００３７】
ヒューミクルに含有されるフルボ酸及び段戸産フルボ酸は、共通して１２００ｃｍ−１にカルボキシル基（Ｃ−Ｏ）吸収ピークを有するが、そのレベルは、ヒューミクルの方が段戸産フルボ酸よりも小さい。ヒューミクル中のフルボ酸が段戸産フルボ酸のスペクトルと明確に相違する点は、１５５９、１０４７及び８３５ｃｍ−１にトリ置換ベンゼンタイプのシグナルが観測され、そして３３６２及び１３６０ｃｍ−１にフェノールあるいはアルコールタイプのシグナルが観測されることである。
【００３８】
赤外分光分析の結果は、ヒューミクル中のフルボ酸が段戸産フルボ酸よりもカルボキシル基が少なく、トリ置換ベンゼンタイプのフェノール化合物の構造を多いことを示唆する。発明を限定する意図ではないが、この分子構造の違いが、後述の実施例と比較例に示すように、毛乳頭細胞の増殖率の相違に反映したと考えられる。すなわち、本発明で特定する特定の赤外線吸収スペクトル特性を有する中のフルボ酸を含有する腐植抽出物が有効量添加された育毛剤は、腐植物質を含む従来の育毛剤よも優れた効能を有する。
【００３９】
本発明の経皮用育毛剤には、上記の腐植抽出物以外に、化粧品学的、皮膚病学的及び／又は薬学的に許容される添加剤として汎用されるものが添加される。例えば、水；エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，４−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、ペンチレングリコール、イソプレングリコール、グルコース、マルトース、フルクトース、キシリトール、ソルビトール、マルトトリオース、エリスリトール等の多価アルコール；メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、イソブチルアルコール等の低級アルコール；オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類；オリーブ油、トウモロコシ油、ツバキ油、マカデミアナッツ油、アボカド油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油等の油脂；カルナバロウ、キャンデリラロウ、ミツロウ、ラノリン等のロウ類；ソルビトール、マンニトール、グルコース、ショ糖、ラクトース、トレハロース等の糖類；カラギーナン、キサンタンガム、ゼラチン、ペクチン、アガロース、アルギン酸塩、デキストリン、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アラビアガム、カラヤガム、トラガントガム、タマリンドガム等の増粘剤；フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸、サリチル酸とその塩類、ソルビン酸とその塩類、デヒドロ酢酸とその塩類、クロルクレゾール、ヘキサクロロフェン等の防腐剤；ラウロイル硫酸ナトリウム、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等の非イオン界面活性剤、アルキルサルフェート塩、ノルマルドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンドデシルモノメチルアンモニウムクロライド等の陽イオン界面活性剤；ステロイド系及び非ステロイド系抗炎症剤；ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ等のビタミン類やジカプリル酸ピリドキシン、ジパルミチン酸ピリドキシン、ジパルミチン酸アスコルビル、モノパルミチン酸アスコルビル、モノステアリン酸アスコルビル等のビタミン誘導体；フラボノイド、カロテノイド等の抗酸化剤；スクワラン、スクワレン、流動パラフィン等の高級脂肪族炭化水素類；セラミド、セレブロシド、スフィンゴミエリン等のスフィンゴ脂質；コレステロール、フィトステロール等のステロール類；メチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、メチルシクロポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、オクタメチルシクロペンタシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、メチルハイドロジェンポリシロキサン等のシリコーン類；パラアミノ安息香酸、パラアミノ安息香酸モノグリセリンエステル、アントラニル酸メチル、ホモメンチル−Ｎ−アセチルアントラニレート、パラメトキシケイ皮酸オクチル、エチル−４−イソプロピルシンナメート等の紫外線吸収剤；ベントナイト、スメクタイト、バイデライト、ノントロナイト、サポナイト、ヘクトライト、ソーコナイト、スチーブンサイト等の鉱物；ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛等の無機顔料；赤色２０２号、黄色４号、青色４０４号等の着色料；香料；香油等が挙げられる。
【００４０】
本発明の経皮用育毛剤の形態の例は、水剤、液剤、乳剤、乳液、エマルション、クリーム、粉体、及びクレイパックである。皮膚への直接の効果を引き出すために、経皮用育毛剤は、水剤、液剤、乳剤、乳液、エマルション、又はクリームの形態が好ましい。
【００４１】
本発明の経皮用育毛剤は、シャンプー、リンス、リンスインシャンプー等の頭髪用入浴剤；ヘアミスト、ヘアスプレー、ヘアフォーム、ヘアリキッド等の頭髪用化粧品に含有させ、これらの入浴剤や化粧品にさらに育毛作用を付加してもよい。
【００４２】
本発明の経皮用育毛剤中の腐植抽出物（フルボ酸を約３％含有）の含有量は、有効量であればよく、通常、０．００１〜２０重量％でよく、好ましくは０．０１〜２０重量％であり、さらに好ましくは０．０５〜１５重量％であり、特に好ましくは０．１〜１０重量％である。
【００４３】
本発明の経皮用育毛剤の１回当たりの適用量もまた、年齢、発毛状況、個人差等に応じて有効量であればよい。
【００４４】
本発明の経口用育毛剤は、汎用の食品添加物を添加してもよい。例えば、経口投与の形態に応じて、汎用の賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、ビタミン、キサンチン誘導体、アミノ酸、ｐＨ調整剤、清涼化剤、懸濁化剤、粘稠剤、溶解補助剤、抗酸化剤、コーティング剤、可塑剤、界面活性剤、水、アルコール類、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料、香料、着色剤等を発明の効果を損なわない質的及び量的範囲で添加することが可能である。
【００４５】
本発明の経口用育毛剤の形態は、例えば、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錠、ドロップ、水剤、シロップ、及びドリンク剤のような通常の食品とは異なる経口投与剤に加工される。
【００４６】
本発明の経口用育毛剤中の腐植抽出物（フルボ酸を約３％含有）の含有量は、有効量であればよく、通常、０．１〜７０重量％でよく、好ましくは０．１〜３０重量％であり、より好ましくは０．１〜１５重量％である。
【００４７】
本発明の経口用育毛剤の１日当たりの摂取量もまた、年齢、発毛状況、個人差等に応じて有効量であればよい。
【実施例】
【００４８】
以下に、本発明の実施例及び比較例を示すことにより、本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
〔実施例１、比較例１〜４〕
本発明の育毛剤が育毛作用を有するか否かを、毛乳頭細胞の実験モデル系である毛乳頭細胞増殖効果試験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で調べた。具体的には、毛乳頭細胞へ本発明の育毛剤を添加し、ＭＴＴアッセイによって毛乳頭細胞の細胞増殖促進率を測定し、さらに毛乳頭細胞増殖率を算出した。
【００５０】
１．育毛剤試験品の準備
実施例１として、米国ユタ産の腐植の水性抽出物を乾固した腐植抽出物製品「ヒューミクル」（株式会社スタイルアンドバリュージャパン製）を用意した。ヒューミクルに含まれるフルボ酸分画の物性は、上記したとおりである。
【００５１】
また、本発明の育毛剤の効果を評価するための陽性対照として、従来、育毛作用の知られているフィナステリドを用意した。また、コントロール（陰性対照）として、培地（試験品添加無し）を採用した。さらに、本発明を満たさない腐植物質を含む育毛剤と本発明の育毛剤とを対比するために、以下に示す腐植抽出物を含む製品、及び標準フルボ酸を用意した。
比較例１：果物や植物の発酵により得られたフルボ酸１００％のＭ社製健康飲料
比較例２：長崎県北高来郡森山町唐比西産の腐植抽出物（フルボ酸）を含んだN社製清涼飲料水
比較例３：段戸産フルボ酸（腐植酸標準物質、日本腐植物質学会製）
比較例４：琵琶湖産フルボ酸（腐植酸標準物質、日本腐植物質学会製）
【００５２】
２．ヒト頭髪毛乳頭細胞の基礎培養
試験用細胞には、ヒト頭髪毛乳頭細胞（タカラバイオ社製）を用いた。培養フラスコ（培養面積７５ｃｍ２）にヒト頭髪毛乳頭細胞培地及びヒト頭髪毛乳頭細胞懸濁液を培養液中の細胞の最終濃度が２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、全量１０ｍＬとなるように添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、ＣＯ２  ５％）で、７日培養して必要細胞数を確保した。
【００５３】
３．試験品溶液の調製
実施例１及び比較例１〜４の育毛剤試験品を、それぞれ、試験品濃度が１２５、３１．２５、７．８１、１．９５、０．４８、又は０．１２μｇ／ｍｌとなるように、順次、毛乳頭細胞培地で希釈した。陽性対照のＦｉｎａｓｔｅｒｉｄｅは、３ｎｇ／ｍＬとなるように希釈した。
【００５４】
４．細胞増殖能評価試験
４．１  ヒト頭髪毛乳頭細胞の培養
培養したヒト頭髪毛乳頭細胞をＴｒｙｐｓｉｎ処理により培養フラスコから回収し、細胞数をカウントした。細胞を毛乳頭細胞培地で懸濁し、細胞濃度が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。調製した細胞懸濁液を試験プレート（９６ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｔｅ）に０．２ｍＬずつ、各ｗｅｌｌに添加し、室温で２０分静置した。ＣＯ２インキュベーター（３７℃、ＣＯ２  ５％）にて１８時間の前培養した。前培養後、試験プレート各ウェルの培地と調製した試験品溶液を置き換え、さらにＣＯ２インキュベーター（３７℃、ＣＯ２  ５％）にて７２時間培養した。７２時間後、ＭＴＴアッセイによる生存率を確認した。※独立３回にて試験結果を算出した。
【００５５】
４．２  ＭＴＴアッセイ
培養終了後のプレートの培地を捨て、新たにＭＴＴ試薬含有培地（１ｍｇＭＴＴ／ｍＬ培地）を０．１ｍＬずつ各Ｗｅｌｌに添加した。ＣＯ２インキュベーター（３７℃、ＣＯ２  ５％）にて３時間培養し、呈色反応を行った。ＭＴＴ可溶化溶液（イソプロパノール）を０．１ｍＬずつ各ｗｅｌｌに添加し、生細胞に取り込まれたＭＴＴを抽出した。マイクロプレートリーダーを使用してＭＴＴ抽出液の吸光度を５７０ｎｍで測定した。下記式に示すように、コントロール（試験品未処理細胞）の吸光度を１００とした場合の百分率で細胞増殖率を算出した。
【数１】
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【００５６】
４．３  試験データ及び統計解析
得られたデータについて、分散分析を行い、等分散が確認された場合には統計解析として対応のないｔ検定を実施し、対照区との比較を実施した。試験結果を表４及び図５に示す。
【００５７】
【表４】
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【００５８】
陽性対照である濃度（３ｎｇ／ｍｌ）のフィナステリドは、コントロール（細胞増殖率１００％）に対して、１０６．８±０．６％の毛乳頭細胞増殖率を示し、毛乳頭細胞増加活性が確認された。
【００５９】
それに対して、本発明の育毛剤（実施例１）は、濃度０．４８〜１２５μｇ／ｍｌにおいて、１０７．４〜１１６．２％の細胞増殖率を示した。特に、実施例１の濃度１．９５μｇ／ｍｌでの毛乳頭細胞増殖率１１６．２％は、陽性対照に対して１．０９倍（＝１１６．２／１０６．８）上回る増殖活性を示した。
【００６０】
次に、比較例３（段戸酸フルボ酸）及び比較例４（琵琶湖酸）は、日本腐植学会標準品のフルボ酸である。比較例３及び４を実施例１と対比すると、比較３及び４は、フルボ酸濃度０．４８〜１２５μｇ／ｍｌにおいて実施例１と似た傾向を示したが、その細胞増殖率は、９９．８〜１０６．７％（比較例３）及び９６．４〜１０２．７％（比較例４）と、実施例１よりも劣った。
【００６１】
比較例１は、本発明に使用する腐植抽出物と違って、果物や植物を出発材料として人工的に合成したフルボ酸である。比較例２は、特許文献１及び２の実施例で使用された長崎県北高来郡森山町唐比西産の腐植抽出物と推定される。これらの比較例１及び２を、実施例１と対比すると、比較例１及び２の細胞増殖率は、それぞれ、８６．１〜１０４．４％、及び９４．２〜１０１．２％と実施例１よりも明らかに劣った。
【００６２】
以上の結果から、特定の腐植抽出物を含む本発明の育毛剤は、毛乳頭細胞増殖活性が知られているフィナステリド、腐植抽出物標準品、及び腐植抽出物を含む既存の育毛剤製品よりも高い毛乳頭細胞増殖活性があることが判明した。したがって、本発明の育毛剤は、優れた育毛作用を有する育毛剤としての産業上の利用性が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年8月25日(2017.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＴ−ＩＲ法における赤外線吸収スペクトルにおいて波数３３６２，２８７５，１６７５，１５５９，１３６０，１２００，１０４７及び８３５ｃｍ−１に赤外線吸収ピークを有し、４，０００よりも小さい平均分子量を有するフルボ酸を含有する腐植抽出物を有効量含み、そして化粧品学的、皮膚病学的及び／又は薬学的に許容される添加剤あるいは食品添加物を含んでなる育毛剤。
【請求項２】
前記腐植抽出物は、図１に示す赤外線吸収スペクトルを示すフルボ酸を含有する、請求項１に記載の育毛剤。
【請求項３】
前記腐植抽出物は、ナフタレン環構造を有さないことを特徴とする、請求項１又は２に記載の育毛剤。
【請求項４】
経皮投与用である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項５】
水剤、液剤、乳剤、乳液、エマルション、クリーム、粉体、又はクレイパックの形態である、請求項４に記載の育毛剤。
【請求項６】
経口投与用である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の育毛剤。
【請求項７】
散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錠、ドロップ、水剤、シロップ、又はドリンク剤の形態である、請求項６に記載の育毛剤。