(57)【要約】      （修正有）【課題】油を含む培養液中でビフェニル誘導体を無害化処理することが可能な細菌及びその細菌を用いたビフェニル誘導体の処理方法の提供。【解決手段】特定の配列の塩基配列と９７％以上の相同性を有する塩基配列の１６ＳｒＤＮＡを含み、ビフェニル誘導体を捕獲することが可能なストレプトマイセス属に属する細菌。前記細胞が、好ましくはストレプトマイセス・エスピーであり、特に好ましくはＢ１２株、Ｂ１４株、Ｃ１７株又はＣ２０株である細菌であるビフェニル誘導体の処理方法。【選択図】図１１
2018019603.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のうちのいずれか一つに記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する塩基配列の１６ＳｒＤＮＡを含み、ビフェニル誘導体を捕獲することが可能なストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する細菌。
【請求項２】
請求項１に記載の細菌であって、
ストレプトマイセス  エスピー（Streptomyces sp.）Ｂ１２株（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５８）。
【請求項３】
請求項１に記載の細菌であって、
ストレプトマイセス  エスピー（Streptomyces sp.）Ｂ１４株（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５９）。
【請求項４】
請求項１に記載の細菌であって、
ストレプトマイセス  エスピー（Streptomyces sp.）Ｃ１７株（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２６０）。
【請求項５】
請求項１に記載の細菌であって、
ストレプトマイセス  エスピー（Streptomyces sp.）Ｃ２０株（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２６１）。
【請求項６】
ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する細菌であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のうちの少なくともいずれか一つに記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する塩基配列の１６ＳｒＤＮＡを含む細菌を準備し、
ビフェニル誘導体と油とを含む培養液で前記細菌を培養し、前記細菌に前記ビフェニル誘導体を捕獲させる
ビフェニル誘導体の処理方法。
【請求項７】
請求項６に記載のビフェニル誘導体の処理方法であって、
前記培養液は、さらに不溶性繊維質を含む
ビフェニル誘導体の処理方法。
【請求項８】
請求項７に記載のビフェニル誘導体の処理方法であって、
前記培養液は、ふすま及びおからの少なくとも一方を含む
ビフェニル誘導体の処理方法。
【請求項９】
請求項６から８のうちのいずれか一項に記載のビフェニル誘導体の処理方法であって、さらに、
前記ビフェニル誘導体を捕獲した前記細菌を乾燥させ、
乾燥させた前記細菌を焼却する
ビフェニル誘導体の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビフェニル誘導体を捕獲することが可能な細菌及びその細菌を用いたビフェニル誘導体の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＢｓは、ビフェニルの１個以上の水素原子を塩素原子で置換した化合物の総称であり、ビフェニル誘導体の一つである。ＰＣＢｓは、一般に、耐熱性、電気絶縁性、耐薬品性等に優れた性質を有するため、従来は、例えばトランスやコンデンサ等の電子部品の絶縁油に混合して用いられていた。
一方現在では、生体に対するＰＣＢｓの毒性が高いことが判明し、その使用が規制されている。しかしながら、ＰＣＢｓは化学的な安定性が高いため、既に使用されている製品を介して生体や環境へ悪影響を及ぼすことが懸念されている。
【０００３】
そこで、ＰＣＢｓ等のビフェニル誘導体を無害化処理する取り組みがなされている。特に近年では、環境への配慮から、微生物を用いてＰＣＢｓ等のビフェニル誘導体を分解する技術について検討されている（例えば特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−１７９８９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のように、ＰＣＢｓは親油性であり、既に用いられているＰＣＢｓも油中に溶解して存在していることが多い。一方で、微生物の培養環境は液体培地等の水性であり、実際に微生物が油中に含まれるＰＣＢｓを分解することは難しい。
【０００６】
以上のような事情に鑑み、本発明の目的は、油を含む培養液中でビフェニル誘導体を無害化処理することが可能な細菌及びその細菌を用いたビフェニル誘導体の処理方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明の一形態に係る細菌は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のうちのいずれか一つに記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する塩基配列の１６ＳｒＤＮＡを含み、ビフェニル誘導体を捕獲することが可能なストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する細菌である。
上記細菌によれば、油を含む培養液中であってもビフェニル誘導体を捕獲することができる。
【０００８】
具体的には、上記細菌は、ストレプトマイセス  エスピー（Streptomyces sp.）Ｂ１２株（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５８）である。
あるいは、上記細菌は、ストレプトマイセス  エスピー（Streptomyces sp.）Ｂ１４株（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５９）である。
あるいは、上記細菌は、ストレプトマイセス  エスピー（Streptomyces sp.）Ｃ１７株（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２６０）である。
あるいは、上記細菌は、ストレプトマイセス  エスピー（Streptomyces sp.）Ｃ２０株（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２６１）である。
【０００９】
本発明の他の形態に係るビフェニル誘導体の処理方法は、
ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する細菌であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のうちの少なくともいずれか一つに記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する塩基配列の１６ＳｒＤＮＡを含む細菌を準備するステップと、
ビフェニル誘導体と油とを含む培養液で上記細菌を培養し、上記細菌に上記ビフェニル誘導体を捕獲させるステップと、を含む。
上記処理方法によれば、上記細菌が油を含む培養液中であってもビフェニル誘導体を捕獲することができる。
【００１０】
上記培養液は、さらに不溶性繊維質を含んでいてもよい。
不溶性繊維質は、上記細菌の栄養源となるとともに、ビフェニル誘導体を吸着させることができ、細菌のビフェニル誘導体を捕獲する作用を高めることができる。
【００１１】
また、上記培養液は、ふすま及びおからの少なくとも一方を含んでいてもよい。
不溶性繊維質源としてふすま及びおからを用いることにより、細菌のビフェニル誘導体を捕獲する作用をより一層高めることができる。
【００１２】
上記処理方法は、さらに、
上記ビフェニル誘導体を捕獲した上記細菌を乾燥させるステップと、
乾燥させた上記細菌を焼却するするステップと、を含んでいてもよい。
これにより、ビフェニル誘導体を捕獲した細菌の重量を減少させ、焼却処分による環境負荷を低減させることができる。
【発明の効果】
【００１３】
以上のように、本発明によれば、油を含む培養液中でビフェニル誘導体を無害化処理することが可能な細菌及びその細菌を用いたビフェニル誘導体の処理方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の細菌（ストレプトマイセス  エスピー（Streptomyces sp.）Ｂ１２株）を同定するための系統樹である。
【図２】本発明の細菌（Streptomyces sp.Ｂ１４株）を同定するための系統樹である。
【図３】本発明の細菌（Streptomyces sp.Ｃ１７株）を同定するための系統樹である。
【図４】本発明の細菌（Streptomyces sp.Ｃ２０株）を同定するための系統樹である。
【図５】上記Streptomyces sp.Ｂ１２株の形態学的な特徴を示す写真である。
【図６】上記Streptomyces sp.Ｂ１４株の形態学的な特徴を示す写真である。
【図７】上記Streptomyces sp.Ｃ１７株の形態学的な特徴を示す写真である。
【図８】上記Streptomyces sp.Ｃ２０株の形態学的な特徴を示す写真である。
【図９】本発明のビフェニル誘導体の処理方法を示すフローチャートである。
【図１０】本発明のＰＣＢｓの処理システムを示す模式的な図である。
【図１１】本発明の実施例に係る試験例２の結果を示すグラフである。
【図１２】本発明の実施例に係る試験例３の結果を示すグラフである。
【図１３】本発明の実施例に係る試験例４の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［本発明の概要］
本発明は、ビフェニル誘導体を捕獲することが可能な新規の細菌、及びその細菌を用いたビフェニル誘導体の無害化処理方法を提供する。本発明の無害化処理は、ビフェニル誘導体を分解するのではなく、細菌がビフェニル誘導体を捕獲することを特徴とする。
【００１６】
［ビフェニル誘導体］
ビフェニル誘導体とは、ビフェニルを母体とし、ビフェニルに官能基の導入、酸化、還元、原子の置き換えなどの改変がなされた化合物をいう。ビフェニル誘導体は、一般に安定性が高く、生分解性が低い。
ビフェニル誘導体の具体例としては、後述するＰＣＢｓ、アルキルビフェニル等が挙げられる。
【００１７】
［ＰＣＢｓ］
ＰＣＢｓは、上述のように、ビフェニルの１個以上の水素原子を塩素原子で置換した化合物の総称であり、一般式は、C12H(10−n)Cln (1≦n≦10)で表される。以下の式（１）に、ＰＣＢｓの構造式を示す。
【化１】
2018019603.tif 000003
具体的には、ＰＣＢｓとしては、３，４，４'，５−テトラクロロビフェニール、３，３'，４，４'−テトラクロロビフェニール、３，３'，４，４'，５−ペンタクロロビフェニール、２，３，３'，４，４'−ペンタクロロビフェニール、２，３，４，４'，５−ペンタクロロビフェニール、２，３'，４，４'，５−ペンタクロロビフェニール、２'，３，４，４'，５−ペンタクロロビフェニール等を挙げることができる。
ＰＣＢｓは、通常ＰＣＢ単体の混合物として市販されている。その具体例としては、鐘淵化学（株）のＫＣ−２００（２塩化ビフェニル）、ＫＣ−３００（３塩化ビフェニル）、ＫＣ−４００（４塩化ビフェニル）、ＫＣ−５００（５塩化ビフェニル）、ＫＣ−６００（６塩化ビフェニル）、ＫＣ−１０００（ＫＣ５００／トリクロロベンゼン＝６０／４０（質量比）の混合物）や、三菱モンサント（株）のアロクロール１２５４（５４％ Ｃｈｌｏｒｉｎｅ）等が挙げられる。
これらのＰＣＢｓは、例えばトランスやコンデンサの絶縁油中に溶解して存在している。
【００１８】
［アルキルビフェニル］
アルキルビフェニルは、ビフェニルの１個以上の水素原子をアルキル基で置換した化合物の総称である。具体的には、２，２'，５，５'−テトラメチルビフェニル、４，４'−ジメチルビフェニル、３，３'，５，５'−テトラメチルビフェニル、３，３'，４，４'−テトラメチルビフェニル等を挙げることができる。以下の式（２）に、一例として４，４'−ジメチルビフェニルの構造式を示す。
【化２】
2018019603.tif 000004
【００１９】
［ビフェニル誘導体を捕獲することが可能な細菌］
本発明のビフェニル誘導体を捕獲することが可能な細菌は、ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する細菌であって、以下の４菌株を含む。
（１）配列番号１に記載の塩基配列の１６ＳｒＤＮＡ、又は当該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列の１６ＳｒＤＮＡを含むStreptomyces sp. Ｂ１２株（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５８）（以下、Ｂ１２株と称する）
（２）配列番号２に記載の塩基配列の１６ＳｒＤＮＡ、又は当該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列の１６ＳｒＤＮＡを含むStreptomyces sp. Ｂ１４株（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２５９）（以下、Ｂ１４株と称する）
（３）配列番号３に記載の塩基配列の１６ＳｒＤＮＡ、又は当該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列の１６ＳｒＤＮＡを含むStreptomyces sp. Ｃ１７株（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２６０）（以下、Ｃ１７株と称する）
（４）配列番号４に記載の塩基配列の１６ＳｒＤＮＡ、又は当該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列の１６ＳｒＤＮＡを含むStreptomyces sp. Ｃ２０株（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２６１）（以下、Ｃ２０株と称する）
さらに、本発明の細菌は、上記（１）〜（４）の４菌株と近縁種の細菌であって、ビフェニル誘導体を捕獲することが可能な細菌でもよい。具体的には、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のうちのいずれか一つに記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する塩基配列の１６ＳｒＤＮＡを含み、ビフェニル誘導体を捕獲することが可能なStreptomyces属に属する細菌も、本発明の細菌に含まれる。
【００２０】
［Ｂ１２株、Ｂ１４株、Ｃ１７株及びＣ２０株の分離・同定］
Ｂ１２株、Ｂ１４株、Ｃ１７株及びＣ２０株の４菌株は、植物根圏土壌から複数の菌株を分離し、分離された菌株に対してビフェニル誘導体の無害化処理についてのスクリーニング等を行うことで得られた。
得られた４菌株について種属の同定を行うため、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列を決定した。この塩基配列に基づいて遺伝子解析を行い、既知種の塩基配列との間の距離に基づいて系統樹を作成した。作成した系統樹を図１〜図４に示す。
図１及び以下の表１に示すように、Ｂ１２株は、Streptomyces aureusの近縁種であることが確認された。
図２及び以下の表１に示すように、Ｂ１４株は、Streptomyces graminifoliiに属することが確認された。
図３及び以下の表１に示すように、Ｃ１７株は、Streptomyces prunicolorの近縁種であることが確認された。
図４及び以下の表１に示すように、Ｃ２０株は、Streptomyces rishiriensisの近縁種であると考えられるが、正確な帰属分類群は不明である。
【００２１】
［Ｂ１２株、Ｂ１４株、Ｃ１７株及びＣ２０株の性質］
表１に、Ｂ１２株、Ｂ１４株、Ｃ１７株及びＣ２０株の各菌株の形態学的性質（巨視的観察、微視的観察）、生理・生化学的性質を示す。また、Ｂ１２株の形態学的な特徴を示す写真を図５Ａ〜図５Ｃに、Ｂ１４株の形態学的な特徴を示す写真を図６Ａ〜図６Ｃに、Ｃ１７株の形態学的な特徴を示す写真を図７Ａ〜図７Ｃに、Ｃ２０株の形態学的な特徴を示す写真を図８Ａ〜図８Ｃに、それぞれ示す。
【００２２】
【表１】
2018019603.tif 000005
【００２３】
これらの菌株は、いずれもバイオセーフティレベルは１であり、安全で取り扱いが比較的容易である。
また、表１の生理・生化学的性質の項に示すように、Ｂ１２株とＢ１４株は、いずれも硝酸還元反応で陽性を示した。この結果から、これらの２菌株は、酸素が不足している環境下でも硝酸を還元して生存が可能であると考えられる。
なお、表１に記載の各菌株の性質は一例であって、これに限定されない。
【００２４】
［ビフェニル誘導体の処理方法］
図９は、本発明のビフェニル誘導体の処理方法を示すフローチャートである。
同図に示すように、本発明のビフェニル誘導体の処理方法は、細菌を準備するステップ（Ｓ１１）と、細菌を培養するステップ（Ｓ１２）と、細菌を乾燥させるステップ（Ｓ１３）と、乾燥させた細菌を焼却するステップ（Ｓ１４）と、を含む。なお、適宜細菌を乾燥させるステップ（ＳＴ１３）以降を省略することも可能である。以下、各ステップについて説明する。
【００２５】
まず、本発明の細菌を準備する（Ｓ１１）。本処理方法で用いる細菌は、上述のＢ１２株、Ｂ１４株、Ｃ１７株及びＣ２０株、並びにこれらの近縁種のうちの少なくとも１つを含む。すなわち、本処理方法で用いる細菌は、ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する細菌であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のうちの少なくともいずれか一つに記載の塩基配列と９７％以上の相同性を有する塩基配列の１６ＳｒＤＮＡを含む細菌である。本処理方法では、上記の細菌を１種用いてもよいし、又は複数種混合して用いてもよい。
【００２６】
続いて、ビフェニル誘導体と油とを含む培養液で上記細菌を培養し、上記細菌にビフェニル誘導体を捕獲させる（Ｓ１２）。
【００２７】
本ステップで用いる培養液は、典型的には、放線菌を培養するための既知の液体培地を含む。このような液体培地としては、例えば、ＩＳＰ培地Ｎｏ．２（イースト・麦芽培地）、ＩＳＰ培地Ｎｏ．３（オートミール培地）、ＩＳＰ培地Ｎｏ．４（スターチ・無機塩培地）、ＩＳＰ培地Ｎｏ．５（グリセリン・アスパラギン培地）、ＩＳＰ培地Ｎｏ．９（無機塩培地）、Ｒ２Ａ培地、ＳＣＤ（大豆たんぱく）培地等を挙げることができる。また、本ステップの培養液は、これらの液体培地を１又は複数種含んでいてもよい。
本発明の培養液は、さらに不溶性繊維質を含んでいてもよい。不溶性繊維質は、水に溶けにくい難消化性の成分をいい、例えばセルロース、ヘミセルロース、リグニン、キチン等を挙げることができる。不溶性繊維質は、細菌の栄養源となり得るとともに、ビフェニル誘導体を吸着する作用を有する。不溶性繊維質源としては、例えば、ふすま、おから、米ぬか、コーンコブミール等を挙げることができる。このような材料は、不溶性繊維質を豊富に含むとともに、産業廃棄物等として廃棄されることもあり安価に入手することができる。
さらに、本発明の培養液は、不溶性繊維質源としてふすま及びおからの少なくとも一方を含んでいてもよい。これらの材料は、ビフェニル誘導体の吸着作用が高く、特に好適に用いることができる。
【００２８】
本発明の培養液に対する油の濃度は、例えば、２．５％（v/v）以下とすることができる。
さらに、培養液に含まれる油は、絶縁油であってもよい。絶縁油は、日本工業規格（JIS C 2320、1999年改正）で規格化された電気絶縁油とすることができる。これにより、トランスやコンデンサ等の電子機器に用いられ、絶縁油に混入しているＰＣＢｓを絶縁油と分離する処理を行うことなく処理することができる。また、上記油は、絶縁油以外であってもよい。
なお、本発明の培養液は、上記以外の成分を含んでいてもよく、例えば絶縁油が収容されていた電子機器の筐体を洗浄するために用いられた界面活性剤等を含んでいてもよい。
【００２９】
本ステップにおける培養条件は、培養液に対する上記細菌の接種量やビフェニル誘導体の量、培養液の成分等の条件によって適宜調整でき、例えば室温（１０〜４０℃程度）で１２時間〜７日間、好ましくは１２時間〜４８時間、振盪培養することができる。
【００３０】
続いて、ビフェニル誘導体を捕獲した細菌を乾燥させる（ＳＴ１３）。これにより、菌体の含む水分量を減少させ、菌体の重量を減少させることができる。
本ステップでは、例えば、細菌を培養液から分離し、分離した細菌を乾燥する。細菌の分離は、例えば遠心分離や濾過により行うことができる。乾燥方法は、常圧乾燥、凍結乾燥、減圧条件下での乾燥等を適用することができる。また、乾燥条件も特に限定されず、例えば乾燥温度を１００〜１５０℃程度、乾燥時間を数分〜数時間とすることができる。
なお、本発明では、細菌がビフェニル誘導体を捕獲することができるため、細菌を分離した培養液はビフェニル誘導体をほとんど含まないものとすることができる。ＰＣＢｓは一般廃棄物としての処理に濃度の規制（０．５ｐｐｍ未満）が設けられているが、本発明の処理方法によれば、細菌を分離した後の廃液を、一般廃棄物として処理することが可能となる。
【００３１】
最後に、乾燥させた細菌を焼却する（ＳＴ１４）。本実施形態では、細菌を乾燥させ減量してから焼却処分するため、環境への負荷を軽減することができる。
焼却条件は、例えば２００℃以上とすることができるが、特に限定されない。
【００３２】
以上のような処理方法により、油を含む培養液を用いた場合であっても、細菌によって効率よくビフェニル誘導体を無害化処理することができる。すなわち、ビフェニル誘導体が油に溶解している場合であっても、細菌を含む培養液中にこの油を添加することでビフェニル誘導体を無害化処理することができ、油とビフェニル誘導体とを分離処理する必要がない。さらに、細菌がビフェニル誘導体を分解するのではなく菌体中に取り込んで捕獲するため、上述のように、細菌から分離した培養液の処理を容易にすることができる。
さらに、細菌を乾燥させてから焼却処分することで、環境負荷を軽減することができる。
このような処理は、以下のような処理システムによって実現することができる。
【００３３】
［ビフェニル誘導体（ＰＣＢｓ）の処理システム］
図１０は、本発明の一実施形態に係るＰＣＢｓの処理システムを示す模式的な図である。
同図に示すように、処理システム１００は、洗浄槽１と、微生物反応槽２と、分離槽３と、廃液回収槽４とを備える。
【００３４】
洗浄槽１は、ＰＣＢｓを含有する絶縁油が収容されていた電子機器の筐体Ｅ１，Ｅ２を洗浄する。電子機器は、典型的にはトランス、コンデンサ等である。筐体Ｅ１，Ｅ２は、絶縁油の大部分が抜かれた状態で洗浄槽１に運ばれ、洗浄槽１において、わずかに残っている絶縁油が洗浄される。一例として、筐体Ｅ１，Ｅ２全体の容積に対し、残留している絶縁油は２％（v/v）程度とすることができる。洗浄には、例えば界面活性剤が用いられる。
【００３５】
微生物反応槽２は、洗浄槽１で洗浄されたＰＣＢｓを含む油を含む培養液で上記細菌を培養し、当該細菌にＰＣＢｓを捕獲させる。すなわち、微生物反応槽２では、上記処理方法のＳＴ１２が行われる。この場合の培養液は、絶縁油の他に、洗浄槽１で用いられた界面活性剤を含んでいてもよい。また、培養液は、洗浄後の筐体Ｅ１，Ｅ２に直接注入されてもよいし、培養液が筐体Ｅ１，Ｅ２とは別の培養容器に注入され、当該培養容器に、洗浄後筐体Ｅ１，Ｅ２内に残留している液を混合してもよい。
【００３６】
分離槽３は、ＰＣＢｓを捕獲した細菌Ｓを培養液Ｌから分離する。細菌Ｓの分離は、例えば遠心分離や濾過等により行うことができる。分離された細菌Ｓは、例えば乾燥され、焼却処分される。
【００３７】
廃液回収槽４は、細菌Ｓから分離された培養液Ｌを廃液として回収する。回収された培養液Ｌは、ＰＣＢｓの分析後、ＰＣＢｓの濃度等に応じて処理される。上述のように、本実施形態の処理方法では、細菌ＳがＰＣＢｓを捕獲するため、培養液ＬにおけるＰＣＢｓの残留濃度を０．５ｐｐｍ未満とすることができ、一般廃棄物として処理することができる。
【００３８】
以下、実施例を示し、本実施形態をより詳細に説明するが、本発明は実施例の記載に限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
［試験例１：不溶性繊維質源の検討］
まず、予備的な検討として、ＩＳＰ培地Ｎｏ．９に異なる不溶性繊維質源を加えた培養液を準備し、各不溶性繊維質源を加えた培養液にＣ２０株及びＢ１２株のいずれかを接種して、これらの細菌が増殖するか否か検討した。
不溶性繊維質源としては、米ぬか、ふすま、コーンコブミール、及びおからの４種類を準備した。各不溶性繊維質源は、培養液中に１％（w/v）（乾燥重量）となるように添加した。
培養液量は５ｍＬ、培養温度は２８℃、細菌の初期接種量は１〜２ｍｍ径のコロニー１個とした。
上記培養条件下で９６時間程度培養した後、目視にて細菌の増殖状態を確認した。増殖状態は、培養液の濁りやコロニーの数等によって判定した。この結果、いずれの不溶性繊維質源でもＣ２０株及びＢ１２株は増殖したが、特におからとふすまを添加した培養液でよく増殖しており、次いで米ぬか、コーンコブミールの順に増殖していた。
上記結果に基づいて、次試験からは不溶性繊維質源としておからを選択することとした。
【００４０】
［試験例２：絶縁油添加条件下での細菌の作用の検討］
続いて、絶縁油及びアルキルビフェニルを加えた培養液にＣ２０株を接種して培養し、絶縁油添加条件下でのＣ２０株の作用を検討した。
培養液は、おからを添加していない放線菌培地（ＩＳＰ培地Ｎｏ．２、Ｒ２Ａ培地、及びＳＣＤ培地を各２５％（v/v）ずつ混合した液体培地）と、おからを添加した無機塩おから液体培地（ＩＳＰ培地Ｎｏ．９におからを１％（w/v）（乾燥重量）添加した液体培地）の２群を準備した。
上記２群の培養液サンプル各々をさらに４つに分け、それぞれ異なる濃度の絶縁油を添加した。絶縁油の添加濃度は、０％（v/v）、０．５％（v/v）、１％（v/v）、１．５％（v/v）とした。
上記８群の各々を、Ｃ２０株を接種したサンプルと接種していないサンプルの２つに分けた。Ｃ２０株の初期接種量は、１〜２ｍｍ径のコロニー１個とした。
各サンプルの培養液量は５ｍＬとし、いずれのサンプルにも総添加濃度が１０ｐｐｍとなるようにアルキルビフェニルを添加した。本試験例のアルキルビフェニルは、２，２'，５，５'−テトラメチルビフェニル、４，４'−ジメチルビフェニル、３，３'，５，５'−テトラメチルビフェニル、３，３'，４，４'−テトラメチルビフェニルの４種を２．５ｐｐｍずつ含むものとした。
培養条件は、暗所で２８℃、１７０ｒｐｍ回転振盪培養、７日間とした。
【００４１】
上記条件による培養後、濾過によって細菌と培養液とを分離し、分離された各培養液中のアルキルビフェニルをＧＣ／ＭＳを用いて分析した。ＧＣ／ＭＳにより検出された各培養液のアルキルビフェニルのシグナル強度に基づいて、培養後のアルキルビフェニルの残留濃度を算出した。なお、以下の説明において、培養後、細菌と分離した培養液を「分離後培養液」と称する。
【００４２】
図１１は、本試験例の結果を示すグラフである。横軸は各サンプルを示し、縦軸は分離後培養液の総アルキルビフェニルの濃度（ｐｐｍ）を示す。また、各棒グラフ上の数値も分離後培養液の総アルキルビフェニルの濃度（ｐｐｍ）を示す。
同図に示すように、Ｃ２０株を接種したサンプル（細菌有り）の結果と、Ｃ２０株を接種していないネガティブコントロール（細菌無し）の結果とを比較すると、Ｃ２０株を接種したサンプルにおいて分離後培養液のアルキルビフェニルの濃度が著しく減少した。この結果から、Ｃ２０株が、培養液中のアルキルビフェニルの濃度を大きく減少させる作用を有することが確認された。
なお、ネガティブコントロールのアルキルビフェニルの濃度も処理前と比較して減少しているが、これは、アルキルビフェニルが培養容器の壁面やおから等に吸着されたものと考えられる。
また、Ｃ２０株を接種し絶縁油を添加した各サンプルでは、おからの有無にかかわらず培養液中のアルキルビフェニルの濃度が大幅に減少した。例えば、おからを添加していない放線菌培地のサンプルのうち、絶縁油を０．５％添加したサンプルではアルキルビフェニルの濃度が０．２０ｐｐｍであり、絶縁油を１％添加したサンプルでは上記濃度が０．３５ｐｐｍであり、いずれも０．５ｐｐｍ未満であった。これにより、Ｃ２０株は、絶縁油存在下において、おからを添加せずともアルキルビフェニルを十分に処理できることが確認された。
さらに、Ｃ２０株を接種し絶縁油を添加したサンプルのうち、放線菌培地と無機塩おから培地の両群を比較すると、無機塩おから培地の群の方が分離後培養液のアルキルビフェニルの濃度が低い傾向が確認された。また、放線菌培地群では絶縁油の濃度が高くなるに従いアルキルビフェニルの残留濃度が高くなるが、無機塩おから培地群では、絶縁油の濃度が高くなってもアルキルビフェニルの残留濃度は非常に微量のままであった。この結果から、培養液中におからを添加することにより、絶縁油中のアルキルビフェニルをより効率よく処理できることが確認された。
【００４３】
［試験例３：おからを加えた培養液を用いて処理可能な絶縁油の濃度の検討］
さらに、異なる濃度の絶縁油、おから及びアルキルビフェニルを加えた培養液を用いて、おからの作用及び処理可能な絶縁油の濃度について検討した。
培養液は、おからを添加した無機塩おから液体培地（ＩＳＰ培地Ｎｏ．９におからを１％（w/v）添加した液体培地）を準備した。この液体培地を４群に分け、それぞれ異なる濃度の絶縁油を添加した。絶縁油の添加濃度は、０％（v/v）、１．２５％（v/v）、２．５％（v/v）、５％（v/v）とした。
さらに、上記４群の各々を、Ｃ２０株を接種したサンプルと接種していないサンプルの２つに分けた。Ｃ２０株の初期接種量は１〜２ｍｍ径のコロニー１個とした。
各サンプルの培養液量は５ｍＬとし、いずれのサンプルにも総添加濃度が１０ｐｐｍとなるように試験例２と同様の４種類のアルキルビフェニルを添加した。
培養条件は、暗所で２８℃、１７０ｒｐｍ回転振盪培養、７日間とした。
上記条件による培養後、試験例２と同様に分離後培養液のアルキルビフェニルの残留濃度を算出した。
【００４４】
図１２は、本試験例の結果を示すグラフである。横軸は各サンプルを示し、縦軸は総アルキルビフェニルの濃度（ｐｐｍ）を示す。また、積み上げ棒グラフの上部は容器壁面に付着したアルキルビフェニルの濃度を示し、下部は分離後培養液に含まれるアルキルビフェニルの濃度を示す。
同図に示すように、絶縁油を添加しない場合は、おからのみでも、分離後培養液のアルキルビフェニルの濃度を０．５ｐｐｍ未満まで減少させることができた。
しかしながら、絶縁油を１．２５％（v/v）以上添加した細菌非接種群では、いずれも分離後培養液にアルキルビフェニルが０．５ｐｐｍ以上残留しており、アルキルビフェニルの濃度を十分に減少させることができなかった。これにより、１．２５％（v/v）以上の油を含む場合、おからのみによるアルキルビフェニルの処理は難しいことが確認された。
一方で、細菌接種群では、絶縁油を１．２５％（v/v）以上添加した場合でも、分離後培養液のアルキルビフェニル濃度を０．５ｐｐｍ未満まで減少させることができた。具体的には、絶縁油を１．２５％（v/v）添加したサンプルのアルキルビフェニル濃度は０．０１ｐｐｍであり、２．５％（v/v）添加したサンプルのアルキルビフェニル濃度は０．０６ｐｐｍであった。この結果から、細菌及びおからの作用により、１．２５％（v/v）以上の油を含む培養液を用いてもアルキルビフェニルの処理が十分可能であることが確認された。
なお、絶縁油を５％（v/v）添加した場合は、データのバラつきが大きく正確な評価が難しいが、やはり細菌非接種群よりも細菌接種群の方が分離後培養液のアルキルビフェニル濃度を減少させるという傾向が見られた。
【００４５】
［試験例４：細菌のアルキルビフェニル捕獲作用の検証］
処理前のアルキルビフェニルと処理後のアルキルビフェニルのＧＣ／ＭＳの分析結果から、本発明の細菌の捕獲及び蓄積作用について検討した。
具体的には、処理前の培養液中のアルキルビフェニルのＧＣ／ＭＳの分析結果と、処理後の濾過液及び菌体残渣のアルキルビフェニルとのＧＣ／ＭＳの分析結果をそれぞれ比較した。
培養液は、おからを添加していない放線菌培地（ＩＳＰ培地Ｎｏ．２、Ｒ２Ａ培地、及びＳＣＤ培地を各２５％（v/v）ずつ混合した液体培地）を準備した。培養液量は８ｍＬとした。
菌体は、Ｃ２０株を使用し、初期接種量は１〜２ｍｍ径のコロニー１個とした。
本試験例のアルキルビフェニルは、２，２'，５，５'−テトラメチルビフェニル、４，４'−ジメチルビフェニル、３，３'，５，５'−テトラメチルビフェニル、３，３'，４，４'−テトラメチルビフェニルの４種を２．５ｐｐｍずつ含むものとした。
培養条件は、暗所で２８℃、１７０ｒｐｍ回転振盪培養、７日間とした。
上記条件による培養後、濾過によって得られた分離後培養液（濾過液）中のアルキルビフェニルを抽出し、ＧＣ／ＭＳを用いて分析した。さらに、濾紙に残った菌体残渣を抽出し、アルキルビフェニルをＧＣ／ＭＳを用いて分析した。
分離後培養液からアルキルビフェニルを抽出するために、培地の３倍量に相当するヘキサン２４ｍｌで、液−液分配抽出を行い、試料液を得た。その試料液をＧＣ/ＭＳにより分析した。
菌体残渣からアルキルビフェニルを抽出するために、乳鉢による菌体の磨砕後、ヘキサン２４ｍｌで液−液分配抽出を行い、試料液を得た。菌体残渣を抽出した試料液をさらに、２倍に希釈しＧＣ／ＭＳにより分析した。
【００４６】
図１３Ａ〜Ｃは、本試験例に係る処理前の培養液、処理後の分離後培養液、及び処理後の菌体残渣のＧＣ／ＭＳの分析結果を示すグラフである。横軸は分析時間を示し、縦軸はシグナル強度を示す。シグナル強度１〜４は、それぞれ２，２'，５，５'−テトラメチルビフェニル、４，４'−ジメチルビフェニル、３，３'，５，５'−テトラメチルビフェニル、３，３'，４，４'−テトラメチルビフェニルを示す。
分離後培養液のＧＣ／ＭＳによる分析結果（図１３Ｂ）に示されるように、分離後培養液においてアルキルビフェニルを示すシグナルが減少していた。また、分離後培養液にはビフェニル等の中間生成物を示すシグナルはほとんど検出されなかった。
さらに、菌体残渣のＧＣ／ＭＳによる分析結果（図１３Ｃ）に示されるように、処理後の菌体を破砕・抽出すると、菌体残渣中においてアルキルビフェニルが高濃度で検出された（図１３Ｃ）。これにより、処理後のアルキルビフェニルは、細菌に捕獲され、菌体内に蓄積されていることがわかった。
【００４７】
なお、以上の実施例では、細菌として主にＣ２０株を用いた試験例を例示したが、Ｂ１２株、Ｂ１４株及びＣ１７株でも同様の結果が得られた。
【００４８】
［考察］
以上の実施例の結果から、本発明の細菌及び処理方法により、油を含む培養液を用いた場合であってもビフェニル誘導体を十分に無害化処理できることが確認された。
上述のように、ビフェニル誘導体は親油性であり油に溶解する一方で、細菌は水性の培養液中で増殖する。このため、培養液に油が添加される場合、ビフェニル誘導体は油滴中に包含され、細菌は油滴中のビフェニル誘導体にアプローチしにくい。
しかしながら、本発明の細菌は、油滴中に包含されたビフェニル誘導体を処理することができ、ビフェニル誘導体を捕獲する作用が非常に強いと考えられる。
さらに、培養液中におから等の不溶性繊維質を添加することで、不溶性繊維質が栄養源となって細菌の増殖が促進されるとともに、不溶性繊維質がビフェニル誘導体を含む油滴を吸着すると考えられる。このため、油を含む培養液中でもビフェニル誘導体に対して細菌がアプローチしやすくなり、ビフェニル誘導体の捕獲作用をより強力に発揮できると考えられる。
【図１】
2018019603.tif 000006
【図２】
2018019603.tif 000007
【図３】
2018019603.tif 000008
【図４】
2018019603.tif 000009
【図５】
2018019603.tif 000010
【図６】
2018019603.tif 000011
【図７】
2018019603.tif 000012
【図８】
2018019603.tif 000013
【図９】
2018019603.tif 000014
【図１０】
2018019603.tif 000015
【図１１】
2018019603.tif 000016
【図１２】
2018019603.tif 000017
【図１３】
2018019603.tif 000018
【配列表】
2018019603000001.app