(57)【要約】【課題】効率よく核酸を抽出することができる核酸溶解吸着試薬を提供する。【解決手段】カオトロピック剤と、ゲノムＤＮＡと、を含み、核酸を溶解させ、溶解された核酸を表面が酸化シリコン層である核酸結合性固相担体に吸着させる、核酸溶解吸着試薬。【選択図】図３
2018038349.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カオトロピック剤と、ゲノムＤＮＡと、を含み、
核酸を溶解させ、溶解された核酸を表面が酸化シリコン層である核酸結合性固相担体に吸着させる、核酸溶解吸着試薬。
【請求項２】
請求項１において、
前記核酸溶解吸着試薬に含まれる前記ゲノムＤＮＡの濃度は、２ｎｇ／ｍＬ以上３００ｎｇ／ｍＬ以下である、核酸溶解吸着試薬。
【請求項３】
請求項１において、
前記核酸溶解吸着試薬に含まれる前記ゲノムＤＮＡの濃度は、２０ｎｇ／ｍＬ以上３００ｎｇ／ｍＬ以下である、核酸溶解吸着試薬。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記ゲノムＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡである、核酸溶解吸着試薬。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の核酸溶解吸着試薬と、
核酸が吸着した前記核酸結合性固相担体を洗浄する核酸洗浄試薬と、
洗浄された前記核酸結合性固相担体から核酸を分離して溶出させる核酸溶出試薬と、
を含む、核酸抽出試薬セット。
【請求項６】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の核酸溶解吸着試薬が収容された第１容器と、
核酸が吸着した前記核酸結合性固相担体を洗浄する核酸洗浄試薬が収容された第２容器と、
洗浄された前記核酸結合性固相担体から核酸を分離して溶出させる核酸溶出試薬が収容された第３容器と、
を含む、核酸抽出キット。
【請求項７】
カオトロピック剤およびゲノムＤＮＡを含む核酸溶解吸着試薬中において、核酸を溶解させ、溶解された核酸を、表面が酸化シリコンである核酸結合性固相担体に核酸を吸着させる工程と、
核酸が吸着した前記核酸結合性固相担体を核酸洗浄試薬中に配置し、核酸が吸着した前記核酸結合性固相担体を洗浄する工程と、
前記洗浄する工程の後に、核酸が吸着した前記核酸結合性固相担体を核酸溶出試薬中に配置し、前記核酸を溶出させる工程と、
を含む、核酸抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸溶解吸着試薬、核酸抽出試薬セット、核酸抽出キット、および核酸抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
菌やウィルス等の核酸を抽出し、その核酸を特異的に増幅して検出する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が知られている。ＰＣＲ法は、遺伝子検査に広く用いられている。しかし、ＰＣＲ法を日常的に臨床で用いる際には、検体に含まれる成分の影響でＰＣＲが阻害されるため、検体から阻害物質を排除して核酸を抽出精製・回収する処理が必要となる。
【０００３】
例えば特許文献１には、カオトロピック塩の存在下で、核酸を、シリカ表面を有する担体へ結合させ、生体材料（全血など）から核酸を抽出する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−１４６７８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、例えば、医療現場のインフルエンザに代表される感染症の診断において、罹患後、より初期段階（菌やウィルスの量が少ない段階）で感染を確認するためには、微量な菌やウィルスの核酸を、効率よく抽出することが求められている。
【０００６】
本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、効率よく核酸を抽出することができる核酸溶解吸着試薬を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、上記核酸溶解吸着試薬を含む核酸抽出試薬セットを提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、上記核酸溶解吸着試薬が収容された容器を含む核酸抽出キットを提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、効率よく核酸を抽出することができる核酸抽出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る核酸溶解吸着試薬は、
カオトロピック剤と、ゲノムＤＮＡと、を含み、
核酸を溶解させ、溶解された核酸を表面が酸化シリコン層である核酸結合性固相担体に吸着させる。
【０００８】
このような核酸溶解吸着試薬では、効率よく核酸を抽出することができる（詳細は、後述する「３．  実験例」参照）。
【０００９】
本発明に係る核酸溶解吸着試薬において、
前記核酸溶解吸着試薬に含まれる前記ゲノムＤＮＡの濃度は、２ｎｇ／ｍＬ以上３００ｎｇ／ｍＬ以下であってもよい。
【００１０】
このような核酸溶解吸着試薬では、標的核酸がＤＮＡである場合に、より確実に、効率よく核酸を抽出することができる（詳細は、後述する「３．  実験例」参照）。
【００１１】
本発明に係る核酸溶解吸着試薬において、
前記核酸溶解吸着試薬に含まれる前記ゲノムＤＮＡの濃度は、２０ｎｇ／ｍＬ以上３００ｎｇ／ｍＬ以下であってもよい。
【００１２】
このような核酸溶解吸着試薬、標的核酸がＲＮＡである場合に、より確実に、効率よく核酸を抽出することができる（詳細は、後述する「３．  実験例」参照）。
【００１３】
本発明に係る核酸溶解吸着試薬において、
前記ゲノムＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡであってもよい。
【００１４】
このような核酸溶解吸着試薬では、より確実に、効率よく核酸を抽出することができる（詳細は、後述する「３．  実験例」参照）。
【００１５】
本発明に係る核酸抽出セットは、
本発明に係る核酸溶解吸着試薬と、
核酸が吸着した前記核酸結合性固相担体を洗浄する核酸洗浄試薬と、
洗浄された前記核酸結合性固相担体から核酸を分離して溶出させる核酸溶出試薬と、
を含む。
【００１６】
このような核酸抽出試薬セットでは、本発明に係る核酸溶解吸着試薬を含むため、効率よく核酸を抽出することができる。
【００１７】
本発明に係る核酸抽出キットは、
本発明に係る核酸溶解吸着試薬が収容された第１容器と、
核酸が吸着した前記核酸結合性固相担体を洗浄する核酸洗浄試薬が収容された第２容器と、
洗浄された前記核酸結合性固相担体から核酸を分離して溶出させる核酸溶出試薬が収容された第３容器と、
を含む。
【００１８】
このような核酸抽出試薬キットでは、本発明に係る核酸溶解吸着試薬を含むため、効率よく核酸を抽出することができる。
【００１９】
本発明に係る核酸抽出方法は、
カオトロピック剤およびゲノムＤＮＡを含む核酸溶解吸着試薬中において、核酸を溶解させ、溶解された核酸を、表面が酸化シリコンである核酸結合性固相担体に核酸を吸着させる工程と、
核酸が吸着した前記核酸結合性固相担体を核酸洗浄試薬中に配置し、核酸が吸着した前記核酸結合性固相担体を洗浄する工程と、
前記洗浄する工程の後に、核酸が吸着した前記核酸結合性固相担体を核酸溶出試薬中に配置し、前記核酸を溶出させる工程と、
を含む。
【００２０】
このような核酸抽出方法では、効率よく核酸を抽出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本実施形態に係る核酸抽出キットを模式的に示す断面図。
【図２】本実施形態に係る核酸抽出方法を説明するためのフローチャート。
【図３】ヒトゲノムＤＮＡ有無に対するＣｔ値を示すグラフ。
【図４】ヒトゲノムＤＮＡ有無に対するＣｔ値を示すグラフ。
【図５】ヒトゲノムＤＮＡの添加量に対するＣｔ値を示すグラフ。
【図６】ヒトゲノムＤＮＡの添加量に対するＣｔ値を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の好適な実施形態について、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００２３】
１．  核酸抽出キット
まず、本実施形態に係る核酸抽出キットについて、図面を参照しながら説明する。図１は、本実施形態に係る核酸抽出キット１００を模式的に示す断面図である。
【００２４】
核酸抽出キット１００は、本発明に係る核酸抽出試薬セット（図示の例では核酸抽出試薬セット１０）を含む。核酸抽出試薬セット１０は、核酸を抽出するための試薬セットである。核酸抽出試薬セット１０は、本発明に係る核酸溶解吸着試薬（図示の例では核酸溶解吸着試薬１１）と、第１核酸洗浄試薬１２と、第２核酸洗浄試薬１３と、第３核酸洗浄試薬１４と、核酸溶出試薬１５と、を含む。さらに、核酸抽出キット１００は、核酸結合性固相担体２０と、容器３０，３１，３２，３３，３４，３５と、筐体４０と、を含む。抽出される対象となる核酸（標的核酸、検体に含まれる核酸）は、ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）であってもよいし、ＲＮＡ（ｒｉｂｏ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）であってもよい。
【００２５】
１．１．  核酸溶解吸着試薬
核酸溶解吸着試薬１１は、核酸を溶解させ、溶解された核酸を核酸結合性固相担体２０に吸着させるための試薬である。核酸溶解吸着試薬１１は、液体の状態で、容器３０に収容されている。核酸溶解吸着試薬１１は、例えば、核酸溶解吸着液である。核酸溶解吸着試薬１１は、例えば、カオトロピック剤と、界面活性剤と、緩衝剤と、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）と、溶媒と、を含む。
【００２６】
カオトロピック剤とは、水溶液中でカオトロピックイオンを生じ、疎水性分子の水溶性を増加させる作用を有する物質である。水溶液中にカオトロピック剤が存在することによって、水溶液中の核酸は、水に囲まれて存在するよりも、固体に吸着して存在するほうが熱力学的に安定となるため、核酸結合性固相担体２０の表面に吸着する。カオトロピック剤は、例えば、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウムなどである。グアニジンチオシアン酸塩は、特に、タンパク質変性作用が大きいので、カオトロピック剤として好適に用いることができる。核酸溶解吸着試薬１１に含まれるカオトロピック剤の濃度は、例えば、４０質量％以上８０質量％以下である。
【００２７】
界面活性剤は、細胞膜を破壊させる機能を有する。さらに、界面活性剤は、細胞中に含まれるタンパク質を変性させる機能を有する。界面活性剤は、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００等のトリトン系界面活性剤やＴｗｅｅｎ２０等のツイーン系界面活性剤のような非イオン性界面活性剤、Ｎ−ウラロイルサルコシンナトリウム（ＳＤＳ）等の陰イオン性界面活性剤などである。核酸溶解吸着試薬１１に含まれる界面活性剤の濃度は、例えば、０．５質量％以上５質量％以下である。
【００２８】
緩衝剤は、核酸溶解吸着試薬１１のｐＨを調整する機能を有する。核酸溶解吸着試薬１１のｐＨは、例えば、６以上８以下である。緩衝剤は、例えば、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ：ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）である。核酸溶解吸着試薬１１に含まれる緩衝剤の濃度は、例えば、０．１質量％以上１質量％以下である。
【００２９】
ゲノムＤＮＡは、効率よく核酸を抽出する機能を有する。ゲノムＤＮＡとは、生物の全染色体を構成するＤＮＡである。好ましくは、ゲノムＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡである。ヒトゲノムＤＮＡとは、人体の全染色体を構成するＤＮＡである。ゲノムＤＮＡの塩基対（塩基数）は、抽出される対象となる核酸（標的核酸）の塩基対よりも多い。ゲノムＤＮＡの塩基対は、例えば、１０万以上であり、好ましくは１０００万以上であり、より好ましくは１億以上であり、さらに好ましくは１０億以上である。
【００３０】
核酸溶解吸着試薬１１に含まれるゲノムＤＮＡの濃度は、標的核酸がＲＮＡの場合、例えば、２０ｎｇ／ｍＬ以上３００ｎｇ／ｍＬ以下である。核酸溶解吸着試薬１１に含まれるゲノムＤＮＡの濃度は、標的核酸がＤＮＡの場合、２ｎｇ／ｍＬ以上３００ｎｇ／ｍＬ以下であり、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ以上３００ｎｇ／ｍＬ以下である。ゲノムＤＮＡの濃度を上記の範囲とすることにより、より効率よく核酸を抽出することができる。
【００３１】
溶媒は、例えば、水である。溶媒は、さらに、アルコール（エタノール）を含んでいてもよい。溶媒がエタノールを含む場合、核酸溶解吸着試薬１１は、例えば、カオトロピック剤と界面活性剤と緩衝剤と添加剤とを含む水溶液に対して、３０ｖ／ｖ％以上７０ｖ／ｖ％以下のエタノールを添加して調製される。
【００３２】
１．２．  第１核酸洗浄試薬
第１核酸洗浄試薬１２は、核酸が吸着した核酸結合性固相担体２０を、洗浄するための試薬である。第１核酸洗浄試薬１２は、液体の状態で、容器３１に収容されている。第１核酸洗浄試薬１２は、例えば、第１核酸洗浄液である。第１核酸洗浄試薬１２は、例えば、カオトロピック剤と、溶媒と、を含む。
【００３３】
カオトロピック剤としては、例えば、「１．１．  核酸溶解吸着試薬」で挙げたものを用いる。例えば、カオトロピック剤としてグアニジン塩酸塩を用いると、核酸結合性固相担体２０に吸着した核酸の吸着を維持または強化しつつ、核酸結合性固相担体２０を洗浄することができる。第１核酸洗浄試薬１２に含まれるカオトロピック剤の濃度は、例えば、４０質量％以上８０質量％以下である。
【００３４】
溶媒は、例えば、水である。溶媒は、さらに、エタノールを含んでいてもよい。溶媒がエタノールを含む場合、第１核酸洗浄試薬１２は、例えば、カオトロピック剤を含む水溶液に対して、３０ｖ／ｖ％以上７０ｖ／ｖ％以下のエタノールを添加して調製される。
【００３５】
なお、第１核酸洗浄試薬１２は、「１．１．  核酸溶解吸着試薬」で挙げた界面活性剤を含んでいてもよい。第１核酸洗浄試薬１２のｐＨは、例えば、６以上８以下である。
【００３６】
１．３．  第２核酸洗浄試薬
第２核酸洗浄試薬１３は、核酸が吸着した核酸結合性固相担体２０を、洗浄するための試薬であり、例えば、第１核酸洗浄試薬１２によって洗浄された核酸結合性固相担体２０を、さらに洗浄するための試薬である。第２核酸洗浄試薬１３は、液体の状態で、容器３２に収容されている。第２核酸洗浄試薬１３は、例えば、第２核酸洗浄液である。第２核酸洗浄試薬１３は、例えば、エタノールである。エタノールは、核酸溶出試薬１５に、カオトロピック剤の持ち込まれることを抑制することができる。カオトロピック剤は、抽出された核酸に対してＰＣＲを行う場合に、ＰＣＲの阻害の原因となる。
【００３７】
第２核酸洗浄試薬１３は、さらに、Ｔｒｉｓなどの緩衝剤、ＮａＣｌなどの塩を含んでいてもよい。第２核酸洗浄試薬１３が緩衝剤と塩とを含む場合、第２核酸洗浄試薬１３は、例えば、エタノールに対して、５０ｖ／ｖ％以上９０ｖ／ｖ％以下の緩衝剤と塩とを含む水溶液を添加して調製される。当該水溶液に含まれる緩衝剤の濃度は、例えば０．１質量％以上１質量％以下であり、当該水溶液に含まれる塩の濃度は、例えば０．３質量％以上３質量％以下である。
【００３８】
なお、第２核酸洗浄試薬１３は、カオトロピック剤を含んでいてもよいが、第３核酸洗浄試薬１４および核酸溶出試薬１５に、カオトロピック剤の持ち込みを無くすためには、第２核酸洗浄試薬１３は、カオトロピック剤を含んでいないことが好ましい。第２核酸洗浄試薬１３のｐＨは、例えば、６以上８以下である。
【００３９】
１．４．  第３核酸洗浄試薬
第３核酸洗浄試薬１４は、核酸が吸着した核酸結合性固相担体２０を、洗浄するための試薬であり、例えば、第２核酸洗浄試薬１３によって洗浄された核酸結合性固相担体２０を、さらに洗浄するための試薬である。第３核酸洗浄試薬１４は、液体の状態で、容器３３に収容されている。第３核酸洗浄試薬１４は、例えば、第３核酸洗浄液である。第３核酸洗浄試薬１４は、例えば、緩衝剤と、溶媒と、を含む。
【００４０】
緩衝剤は、第３核酸洗浄試薬１４のｐＨを調整する機能を有する。第３核酸洗浄試薬は、酸性である。第３核酸洗浄試薬１４のｐＨは、例えば、２以上４．５以下である。緩衝剤は、第３核酸洗浄試薬１４のｐＨを４．７未満にすることができれば、特に限定されないが、例えば、クエン酸などである。第３核酸洗浄試薬１４に含まれる緩衝剤の濃度は、例えば、１ｍＭ以上１０ｍＭ以下である。
【００４１】
溶媒は、例えば、水であり、エタノールなどのアルコールを含まない。これにより、核酸溶出試薬１５に、エタノールが持ち込まれることを抑制することができる。また、クエン酸等の緩衝剤は、核酸溶出試薬１５に、エタノールが持ち込まれることを抑制する機能を有する。エタノールは、抽出された核酸に対してＰＣＲを行う場合に、ＰＣＲの阻害の原因となる。
【００４２】
なお、第３核酸洗浄試薬１４は、「１．１．  核酸溶解吸着試薬」で挙げた界面活性剤を含んでいてもよい。第３核酸洗浄試薬１４が界面活性剤を含む場合、第３核酸洗浄試薬１４は、緩衝剤を含む水溶液に対して、０．０１ｖ／ｖ％以上０．１ｖ／ｖ％以下の界面活性剤を含む水溶液を添加して調製される。
【００４３】
１．５．  核酸溶出試薬
核酸溶出試薬１５は、洗浄された核酸結合性固相担体２０から核酸を分離（脱離）して溶出させるための試薬である。核酸溶出試薬１５は、液体の状態で、容器３４に収容されている。核酸溶出試薬１５は、例えば、核酸溶出液である。核酸溶出試薬１５は、水（例えば水を煮沸消毒した減菌水）である。核酸溶出試薬１５は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（例えば、５ｍＭ、ｐＨ８．５）などの緩衝剤を含んでいてもよい。核酸溶出試薬１５のｐＨは、例えば、６以上９以下であり、弱アルカリ性が好ましく、ｐＨ８．５が最適である。
【００４４】
１．６．  核酸結合性固相担体
核酸結合性固相担体２０は、核酸を吸着、すなわち可逆的な物理吸着により保持することが可能な物質である。核酸結合性固相担体２０は、液体２２にとともに、容器３５に収容されている。液体２２は、特に限定されないが、例えば、水である。液体２２は、塩化ナトリウムや塩化リチウム等の塩を含んでいてもよい。これにより、液体２２の比重を調整することができ、磁気ビーズの沈降を防止する（磁気ビーズの沈降速度を遅くする）ことができる。なお、図示はしないが、核酸結合性固相担体２０は、液体２２にとともにではなく、単独で容器３５に収容されていてもよい。
【００４５】
核酸結合性固相担体２０の形状は、例えば、微粒子状である。核酸結合性固相担体２０は、容器３５内に複数設けられている。核酸結合性固相担体２０の数は、特に限定されない。核酸結合性固相担体２０は、例えば、核酸を吸着したまま容器内を所望の方向へ移動させるため、磁性を有することが好ましい。核酸結合性固相担体２０は、例えば、表面が酸化シリコンである磁気ビーズである。具体的には、核酸結合性固相担体２０は、金属粒子の表面に二酸化シリコン（シリカ）層がコーティングされた磁気ビーズである。
【００４６】
１．７．  容器
容器３０，３１，３２，３３，３４，３５は、それぞれ、核酸溶解吸着試薬１１、核酸洗浄試薬１２，１３，１４、核酸溶出試薬１５、および核酸結合性固相担体２０を収容している。容器３０，３１，３２，３３，３４，３５は、それぞれ、容器本体と、容器本体に係合する蓋と、を有している。容器３０，３１，３２，３３，３４，３５は、内容物を収容し、かつ密閉することができれば、その形状および材質は、特に限定されない。
【００４７】
１．８．  筐体
筐体４０は、容器３０，３１，３２，３３，３４，３５を収容している。筐体４０は、容器３０，３１，３２，３３，３４，３５を収容することができれば、その形状および材質は、特に限定されない。
【００４８】
核酸溶解吸着試薬１１は、例えば、以下の特徴を有する。
【００４９】
核酸溶解吸着試薬１１では、カオトロピック剤と、ゲノムＤＮＡと、を含む。そのため、核酸溶解吸着試薬１１では、効率よく核酸を抽出することができる（詳細は、後述する「３．  実験例」参照）。これにより、検体中のより微量な核酸を抽出して回収することができるようになり、例えば、ウィルスの増幅初期段階で感染症を発見し、初期段階に治療を開始することで、重篤化を防ぐことができる。また、少量の検体しか採取できない場合でも、精度の高い検査が可能となる。
【００５０】
核酸溶解吸着試薬１１では、例えば、２ｎｇ／ｍＬ以上３００ｎｇ／ｍＬ以下のゲノムＤＮＡを含む。そのため、核酸溶解吸着試薬１１では、標的核酸がＤＮＡである場合に、より確実に、効率よく核酸を抽出することができる（詳細は、後述する「３．  実験例」参照）。
【００５１】
核酸溶解吸着試薬１１では、例えば、２０ｎｇ／ｍＬ以上３００ｎｇ／ｍＬ以下のゲノムＤＮＡを含む。そのため、核酸溶解吸着試薬１１では、標的核酸がＲＮＡである場合に、より確実に、効率よく核酸を抽出することができる（詳細は、後述する「３．  実験例」参照）。
【００５２】
核酸溶解吸着試薬１１では、ゲノムＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡある。そのため、核酸溶解吸着試薬１１では、より確実に、効率よく核酸を抽出することができる（詳細は、後述する「３．  実験例」参照）。
【００５３】
核酸抽出試薬セット１０では、核酸溶解吸着試薬１１と、核酸洗浄試薬１２，１３，１４と、核酸溶出試薬１５と、を含む。そのため、核酸抽出試薬セット１０では、効率よく核酸を抽出することができる。
【００５４】
核酸抽出キット１００では、核酸溶解吸着試薬１１が収容された容器３０と、核酸洗浄試薬１２，１３，１４がそれぞれ収容された容器３１，３２，３３と、核酸溶出試薬１５が収容された容器３４と、を含む。そのため、核酸抽出キット１００では、効率よく核酸を抽出することができる。
【００５５】
なお、上記の例では、３つの（３種類の）核酸洗浄試薬１２，１３，１４を含む例について説明したが、本発明に係る核酸抽出試薬セットおよび核酸抽出キットは、核酸洗浄試薬１２，１３，１４の全てを含んでいなくてもよい。図示はしないが、例えば、本発明に係る核酸抽出試薬セットおよび核酸抽出キットは、第１核酸洗浄試薬１２および第２核酸洗浄試薬１３の一方を含んでいなくてもよい。また、本発明に係る核酸抽出試薬セットおよび核酸抽出キットは、４つ以上の核酸洗浄試薬を含んでいてもよい。
【００５６】
２．  核酸抽出方法
次に、本実施形態に係る核酸抽出方法について、図面を参照しながら説明する。図２は、本実施形態に係る核酸抽出方法を説明するためのフローチャートである。以下では、一例として、上述した核酸抽出キット１００を用いた核酸抽出方法について説明する。
【００５７】
まず、核酸溶解吸着試薬１１中において、核酸を溶解させ、溶解された核酸を核酸結合性固相担体２０に核酸を吸着させる（ステップＳ１、溶解吸着工程）。具体的には、核酸溶解吸着試薬１１を、容器３０から取り出し、図示せぬ容器（以下、「第１抽出容器」という）に移す。次に、第１抽出容器に、核酸を含む検体（検体溶液）を導入して攪拌する。これにより、核酸を、核酸溶解吸着試薬１１中に溶解させることができる。次に、核酸結合性固相担体２０を、容器３５から取り出し、第１抽出容器に導入して攪拌する。これにより、核酸結合性固相担体２０に、溶解された核酸を吸着させることができる。次に、例えば、第１抽出容器の側壁に磁石を近づけて核酸結合性固相担体２０が第１抽出容器からこぼれないように、上清を破棄する。
【００５８】
次に、核酸が吸着した核酸結合性固相担体２０を第１核酸洗浄試薬１２中に配置し、核酸を吸着した核酸結合性固相担体２０を洗浄する（ステップＳ２、第１洗浄工程）。具体的には、第１核酸洗浄試薬１２を、容器３１から取り出して第１抽出容器に導入し、核酸結合性固相担体２０を第１核酸洗浄試薬１２中に配置させた後、攪拌する。これにより、核酸結合性固相担体２０を第１核酸洗浄試薬１２によって洗浄することができる。次に、例えば、第１抽出容器の側壁に磁石を近づけて核酸結合性固相担体２０が第１抽出容器からこぼれないように、上清を破棄する。なお、第１洗浄工程は、複数回繰り返し行われてもよい。
【００５９】
次に、核酸が吸着した核酸結合性固相担体２０を第２核酸洗浄試薬１３中に配置し、核酸を吸着した核酸結合性固相担体２０を洗浄する（ステップＳ３、第２洗浄工程）。具体的には、第２核酸洗浄試薬１３を、容器３２から取り出して第１抽出容器に導入し、核酸結合性固相担体２０を第２核酸洗浄試薬１３中に配置した後、攪拌する。これにより、核酸結合性固相担体２０を第２核酸洗浄試薬１３によって洗浄することができる。次に、例えば、第１抽出容器の側壁に磁石を近づけて核酸結合性固相担体２０が第１抽出容器からこぼれないように、上清を破棄する。なお、第２洗浄工程は、複数回繰り返し行われてもよい。
【００６０】
次に、核酸が吸着した核酸結合性固相担体２０を第３核酸洗浄試薬１４中に配置し、核酸を吸着した核酸結合性固相担体２０を洗浄する（ステップＳ４、第３洗浄工程）。具体的には、第３核酸洗浄試薬１４を、容器３３から取り出して第１抽出容器に導入し、核酸結合性固相担体２０を第３核酸洗浄試薬１４中に配置した後、攪拌する。これにより、核酸結合性固相担体２０を第３核酸洗浄試薬１４によって洗浄することができる。次に、例えば、第１抽出容器の側壁に磁石を近づけて核酸結合性固相担体２０が第１抽出容器からこぼれないように、上清を破棄する。
【００６１】
次に、核酸が吸着した核酸結合性固相担体２０を核酸溶出試薬１５中に配置し、核酸を溶出させる（ステップＳ５、溶出工程）。具体的には、核酸溶出試薬１５を、容器３４から取り出して第１抽出容器に導入し、核酸結合性固相担体２０を核酸溶出試薬１５中に配置した後、攪拌する。これにより、核酸が吸着した核酸結合性固相担体２０から核酸を分離させて、核酸を核酸溶出試薬１５中に溶出させることができる。次に、例えば、第１抽出容器の側壁に磁石を近づけて核酸結合性固相担体２０が第１抽出容器からこぼれないように、核酸を含む上清を第２抽出容器（第１抽出容器とは異なる容器）に回収する。
【００６２】
以上の工程により、核酸を抽出し回収することができる。なお、第１洗浄工程および第２洗浄工程の一方を、省略してもよい。
【００６３】
３．  実験例
以下に実験例を示し、本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実験例によって何ら限定されるものではない。
【００６４】
３．１．  実験方法
３．１．１．  核酸の抽出方法
（１）標的核酸がＲＮＡの場合
６２質量％のグアニジンチオシアン酸塩と、１．９質量％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と、０．５８質量％のＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）と、を含む水溶液に対して、１００％エタノールを５０ｖ／ｖ％添加して、核酸溶解吸着試薬を調整した。
【００６５】
６１質量％のグアニジン塩酸塩を含む水溶液に対して、１００％エタノールを５７ｖ／ｖ％添加して、第１核酸洗浄試薬を調整した。
【００６６】
０．３８質量％のＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）と、０．７７質量％のＮａＣｌとを含む水溶液に対して、１００％エタノールを７０ｖ／ｖ％添加して、第２核酸洗浄試薬を調整した。
【００６７】
４．９ｍＭのクエン酸（ｐＨ４．０）を含む水溶液に対して、２０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む水溶液を０．０５ｖ／ｖ％添加して、第３核酸洗浄試薬を調整した。
【００６８】
減菌水を、核酸溶出試薬とした。
【００６９】
第１エッペンに、上記の核酸溶解吸着試薬７００μＬを導入し、さらに標的核酸であるＲＮＡを含む検体容器１４０μＬを導入して、１５秒間攪拌（ボルテックス）した後、沈降（スピンダウン）させた。標的核酸としては、培養したインフルエンザＡウィルス（ＩｎｆＡ）から得たものを使用した。次に、第１エッペンに、表面がシリカでコーティングされた磁気ビーズ（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ）を含む液体２５μＬを添加し、１０分間攪拌した後、沈降させた。次に、第１エッペンを磁気スタンドにセットし、磁気ビーズが集まったら、上清を破棄した（溶解吸着工程）。
【００７０】
次に、上記の第１核酸洗浄試薬４５０μＬを第１エッペンに加え、５秒間攪拌した後、沈降させた。次に、第１エッペンを磁気スタンドにセットし、磁気ビーズが集まったら、上清を破棄した（第１洗浄工程）。第１洗浄工程を、２回行った。
【００７１】
次に、上記の第２核酸洗浄試薬４５０μＬを第１エッペンに加え、５秒間攪拌した後、沈降させた。次に、第１エッペンを磁気スタンドにセットし、磁気ビーズが集まったら、上清を破棄した（第２洗浄工程）。第２洗浄工程を、２回行った。
【００７２】
次に、上記の第３核酸洗浄試薬３５０μＬを第１エッペンに加え、５秒間攪拌した後、沈降させた。次に、第１エッペンを磁気スタンドにセットし、磁気ビーズが集まったら、上清を破棄した（第３洗浄工程）。
【００７３】
次に、上記の核酸溶出試薬２７．５μＬを第１エッペンに加え、５秒間攪拌した後、第１エッペンを９５℃設定のチューブヒーターに入れて２分間静置した。次に、５秒間攪拌した後、沈降させた。次に、第１エッペンを磁気スタンドにセットし、磁気ビーズが集まったら、上清を第２エッペン（第１エッペンとは異なるエッペン）に回収した（溶出工程）。
【００７４】
（２）標的核酸がＤＮＡの場合
６２質量％のグアニジンチオシアン酸塩と、１．９質量％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と、０．５８質量％のＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）と、を含む水溶液を、核酸溶解吸着試薬とした。
【００７５】
水３０ｍＬにエタノール７０ｍＬを加えた７０ｖ／ｖ％エタノールを、第２核酸洗浄試薬とした。標的核酸がＤＮＡの場合は、第１核酸洗浄試薬に相当する試薬を用いず、第１洗浄工程に相当する洗浄工程を行わなかった。
【００７６】
４．９ｍＭのクエン酸（ｐＨ４．０）を含む水溶液に対して、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の水溶液を０．０５ｖ／ｖ％添加して、第３核酸洗浄試薬を調整した。
【００７７】
減菌水を、核酸溶出試薬とした。
【００７８】
第１エッペンに、上記の溶解吸着試薬７５０μＬを導入し、さらに標的核酸であるＤＮＡを含む検体容器１００μＬを溶解吸着試薬に混合して、１５秒間攪拌した後、沈降させた。標的核酸としては、培養した百日咳から得たものを使用した。次に、第１エッペンに、表面がシリカでコーティングされた磁気ビーズ（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ）を含む液体４０μＬを添加し、１０分間攪拌した後、沈降させた。次に、第１エッペンを磁気スタンドにセットし、磁気ビーズが集まったら、上清を破棄した（溶解吸着工程）。
【００７９】
次に、上記の第２核酸洗浄試薬９００μＬを第１エッペンに加え、５秒間攪拌した後、沈降させた。次に、第１エッペンを磁気スタンドにセットし、磁気ビーズが集まったら、上清を破棄した（第２洗浄工程）。
【００８０】
次に、上記の第３核酸洗浄試薬９００μＬを第１エッペンに加え、５秒間攪拌した後、沈降させた。次に、第１エッペンを磁気スタンドにセットし、磁気ビーズが集まったら、上清を破棄した（第３洗浄工程）。
【００８１】
次に、上記の核酸溶出試薬１００μＬを第１エッペンに加え、１０分間攪拌した後、第１エッペンを９５℃設定のチューブヒーターに入れて２分間静置した。次に、５秒間攪拌した後、沈降させた。次に、第１エッペンを磁気スタンドにセットし、磁気ビーズが集まったら、上清を第２エッペン（第１エッペンとは異なるエッペン）に回収した（溶出工程）。
【００８２】
３．１．２．  リアルタイムＰＣＲの条件
（１）標的核酸がＲＮＡの場合
上記の方法で抽出して回収したＲＮＡを含む抽出液２μＬを、ＰＣＲを行うための溶液（マスターミックス）８μＬに添加して、１０μＬの反応液を調製した。反応液の組成を下記に示す。
【００８３】
＜反応液の組成＞
フォワードプライマー（２０μＭ）              ０．４μＬ
リバースプライマー（２０μＭ）                ０．４μＬ
蛍光標識プローブ（１０μＭ）                  ０．２μＬ
逆転写酵素／ポリメラーゼ                      ０．２μＬ
反応混合液（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ）        ５．０μＬ
水                                            １．８μＬ
抽出液                                        ２．０μＬ
【００８４】
なお、蛍光標識プローブとして、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた。また、逆転写酵素／ポリメラーゼとして、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｎ社製のＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｐｌａｔｉｎｕｍを用いた。また、反応混合液は、バッファーとｄＮＴＰを含む液体である。
【００８５】
リアルタイムＰＣＲは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＯｎｅ−Ｓｔｅｐ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。リアルタイムＰＣＲでは、上記の反応液を、５０℃で３０分間加熱した後、９５℃で２分間加熱し、次に、反応液に温度サイクルを付与した。温度サイクルは、９５℃で１５秒間の加熱と、５５℃で３０秒間加熱と、を１サイクルとするものであり、反応液に５０サイクルの温度サイクルを付与した。
【００８６】
（２）標的核酸がＤＮＡの場合
上記の方法で抽出して回収したＤＮＡを含む抽出液２μＬを、ＰＣＲを行うための溶液（マスターミックス）８μＬに添加して、１０μＬの反応液を調製した。反応液の組成を下記に示す。
【００８７】
＜反応液の組成＞
フォワードプライマー（２０μＭ）              ０．４μＬ
リバースプライマー（２０μＭ）                ０．４μＬ
蛍光標識プローブ（１０μＭ）                  ０．２μＬ
ポリメラーゼ                                  ０．２μＬ
バッファー                                    ２．０μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                          ０．２５μＬ
水                                            ４．５５μＬ
抽出液                                        ２．０μＬ
【００８８】
なお、蛍光標識プローブとして、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＴａｑＭａｎプローブを用いた。また、ポリメラーゼとしては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＰｌａｔｉｎｕｍを用いた。また、バッファーは、ｐＨ９．０のＴｒｉｓ（２５０ｍＭ）と、ＫＣｌ（１２５ｍＭ）と、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）と、を含む。
【００８９】
リアルタイムＰＣＲでは、上記の反応液を９５℃で２分間加熱し、次に、反応液に温度サイクルを付与した。温度サイクルは、９５℃で５秒間の加熱と、７０℃で２０秒間加熱と、を１サイクルとするものであり、反応液に５０サイクルの温度サイクルを付与した。
【００９０】
３．２．  第１実験
上記の方法で抽出して回収した核酸を含む抽出液に対して、リアルタイムＰＣＲにより核酸（標的核酸であるＲＮＡまたはＤＮＡ）の回収効率を評価した。上記の溶解吸着試薬に、ヒトゲノムＤＮＡを２００ｎｇ添加したもの（「ｇＤＮＡ有」）と、ヒトゲノムＤＮＡを添加してないもの（「ｇＤＮＡ無」）と、で比較した。
【００９１】
図３は、核酸がＲＮＡの場合の、ヒトゲノムＤＮＡ有無に対するＣｔ値を示すグラフである。図４は、核酸がＤＮＡの場合の、ヒトゲノムＤＮＡ有無に対するＣｔ値を示すグラフである。Ｃｔ値とは、リアルタイムＰＣＲにおいて蛍光強度が一定の値を示したときの温度サイクル数であり、Ｃｔ値が小さいほど、核酸を多く回収できていることを示している。
【００９２】
図３および図４に示すように、ＲＮＡおよびＤＮＡのどちらにおいても、ｇＤＮＡ有の方がｇＤＮＡ無に比べて、Ｃｔ値が小さかった。したがって、ヒトゲノムＤＮＡを含む核酸溶解吸着試薬は、ヒトゲノムＤＮＡを含まない核酸溶解吸着試薬に比べて、効率よく核酸を抽出できることがわかった。例えば、ヒトゲノムＤＮＡは、標的核酸より塩基対が多いため、標的核酸を絡みとって核酸結合性固相担体の表面に付着させることができ、効率よく核酸を抽出することがきると推論されるが、当該推論を裏付ける実験は行っていない。
【００９３】
３．３．  第２実験
上記の方法で抽出して回収した核酸（標的核酸であるＲＮＡまたはＤＮＡ）を含む抽出液に対して、リアルタイムＰＣＲにより核酸の回収効率を評価した。具体的には、ヒトゲノムＤＮＡの添加量による影響を評価した。より具体的には、標的核酸がＲＮＡの場合は、核酸溶解吸着試薬７００μＬに対して、ヒトゲノムＤＮＡの添加量を、０．０２ｎｇ（０．０２８６ｎ／ｍＬ）、０．２ｎｇ（０．２８６ｎ／ｍＬ）、２ｎｇ（２．８６ｎ／ｍＬ）、２０ｎｇ（２８．６ｎ／ｍＬ）、２００ｎｇ（２８６ｎｇ／ｍＬ）、およびゼロ（添加なし）と振った。また、標的核酸がＤＮＡの場合は、核酸溶解吸着試薬７５０μＬに対して、ヒトゲノムＤＮＡの添加量を、２ｎｇ（２．６７ｎ／ｍＬ）、２０ｎｇ（２６．７ｎ／ｍＬ）、２００ｎｇ（２６７ｎ／ｍＬ）、２０００ｎｇ（２６７０ｎ／ｍＬ）、およびゼロ（添加なし）と振った。
【００９４】
図５は、核酸がＲＮＡの場合の、ヒトゲノムＤＮＡの添加量に対するＣｔ値を示すグラフである。図５より、ヒトゲノムＤＮＡの添加量を、２０ｎｇ以上２００ｎｇ以下とすることにより、より効率よく核酸を抽出できることがわかった。
【００９５】
図６は、核酸がＤＮＡの場合の、ヒトゲノムＤＮＡの添加量に対するＣｔ値を示すグラフである。図６より、ヒトゲノムＤＮＡの添加量を、２ｎｇ以上２００ｎｇ以下、好ましくは２０ｎｇ以上２００ｎｇ以下とすることにより、効率よく核酸を抽出できることがわかった。
【００９６】
本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【００９７】
１０…核酸抽出試薬セット、１１…核酸溶解吸着試薬、１２…第１核酸洗浄試薬、１３…第２核酸洗浄試薬、１４…第３核酸洗浄試薬、１５…核酸溶出試薬、２０…核酸結合性固相担体、２２…液体、３０，３１，３２，３３，３４，３５…容器、４０…筐体、１００…核酸抽出キット
【図１】
2018038349.tif 000003
【図２】
2018038349.tif 000004
【図３】
2018038349.tif 000005
【図４】
2018038349.tif 000006
【図５】
2018038349.tif 000007
【図６】
2018038349.tif 000008