(57)【要約】      （修正有）【課題】ＣＮＳにおけるアリールスルファターゼＡ欠乏症に罹患した対象を治療するための方法及び組成物の提供。【解決手段】ヒトインスリンレセプター抗体由来の内因性血液脳関門（ＢＢＢ）レセプターである、免疫グロブリン重鎖若しくは軽鎖及びアリールスルファターゼＡに対する抗体を含む二機能性融合抗体。【選択図】図１
2018019709.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬的有効量のアリールスルファターゼA活性を有する融合抗体を対象に全身投与することを含む、対象の中枢神経系のアリールスルファターゼA(ASA)欠乏症を治療するのに用いるための融合抗体であって、
(a)免疫グロブリン重鎖およびアリールスルファターゼAのアミノ酸配列を含む融合タンパク質、および(b)免疫グロブリン軽鎖を含み、血液脳関門(BBB)を通過する、融合抗体。
【請求項２】
アリールスルファターゼAのアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合している請求項１に用いるための融合抗体。
【請求項３】
スルファターゼ修飾因子タイプ1(SUMF1)により翻訳後修飾される請求項１記載の融合抗体。
【請求項４】
ホルミルグリシンを含む請求項１に用いるための融合抗体。
【請求項５】
該融合抗体がセレブロシドサルフェートエステルおよびスルファチドスフィンゴ脂質の加水分解を触媒する請求項１記載の方法。
【請求項６】
ASAが、独立した存在としてのその活性に比べて、分子ベースでその活性の少なくとも20％を維持する請求項１に用いるための融合抗体。
【請求項７】
ASAおよび免疫グロブリンがそれぞれ、独立した存在としてのその活性に比べて、分子ベースでその活性の少なくとも20％を維持する請求項１に用いるための融合抗体。
【請求項８】
少なくとも約100ugのアリールスルファターゼA酵素が50kg体重当たりで正規化した脳に送達される請求項１に用いるための融合抗体。
【請求項９】
医薬的有効量が少なくとも約10単位/Kg体重を含む請求項1に用いるための融合抗体。 
【請求項１０】
アリールスルファターゼA比活性が少なくとも10単位/mgである請求項１に用いるための融合抗体。
【請求項１１】
免疫グロブリン重鎖がIgGの免疫グロブリン重鎖である請求項１に用いるための融合抗体。
【請求項１２】
免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するCDR1、配列番号2のアミノ酸配列に対応するCDR2、または配列番号3のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む請求項1に用いるための融合抗体。
【請求項１３】
免疫グロブリン軽鎖がκまたはλクラスの免疫グロブリン軽鎖である請求項1に用いるための融合抗体。
【請求項１４】
免疫グロブリン軽鎖が、配列番号4のアミノ酸配列に対応するCDR1、配列番号5のアミノ酸配列に対応するCDR2、または配列番号6のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む請求項1に用いるための融合抗体。
【請求項１５】
免疫グロブリン重鎖およびアリールスルファターゼAのアミノ酸配列を含む融合タンパク質が配列番号10と少なくとも80％同一なアミノ酸配列を含む請求項1に用いるための融合抗体。
【請求項１６】
内因性BBBレセプター介在輸送系と結合することによりBBBを通過する請求項1に用いるための融合抗体。
【請求項１７】
インスリンレセプター、トランスフェリンレセプター、レプチンレセプター、リポタンパク質レセプター、およびインスリン様成長因子(IGF)レセプターからなる群から選ばれる内因性BBBレセプターを介してBBBを通過する請求項1に用いるための融合抗体。
【請求項１８】
インスリンレセプターと結合することによりBBBを通過する請求項1に用いるための融合抗体。
【請求項１９】
全身投与が、非経口的、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮的、または呼吸的である請求項1に用いるための融合抗体。
【請求項２０】
中枢神経系中のアリールスルファターゼA(ASA)欠乏が異染性白質ジストロフィー(MLD)である請求項1に用いるための融合抗体。
【請求項２１】
医薬的有効量のアリールスルファターゼA活性を有する融合抗体を対象に全身投与することを含む、対象の中枢神経系のアリールスルファターゼA欠乏症を治療するのに用いるための融合抗体であって、
(a) 配列番号10と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質、および(b)免疫グロブリン軽鎖を含む、血液脳関門(BBB)を通過する、融合抗体。
【請求項２２】
セレブロシドサルフェートエステルおよびスルファチドスフィンゴ脂質の加水分解を触媒する請求項21に用いるための融合抗体。
【請求項２３】
スルファターゼ修飾因子タイプ1(SUMF1)により翻訳後修飾される請求項21に用いるための融合抗体。
【請求項２４】
ホルミルグリシンを含む請求項21に用いるための融合抗体。
【請求項２５】
少なくとも約100ugのアリールスルファターゼA酵素が50kg体重当たりで正規化した脳に送達される請求項21に用いるための融合抗体。
【請求項２６】
医薬的有効量が少なくとも約10単位アリールスルファターゼA活性/Kg体重を含む請求項21に用いるための融合抗体。 
【請求項２７】
アリールスルファターゼA比活性が少なくとも10単位/mgである請求項21に用いるための融合抗体。
【請求項２８】
ASAが、独立した存在としてのその活性に比べて、分子ベースでその活性の少なくとも20％を維持する請求項21に用いるための融合抗体。
【請求項２９】
ASAおよび免疫グロブリンがそれぞれ、独立した存在としてのその活性に比べて、分子ベースでその活性の少なくとも20％を維持する請求項21に用いるための融合抗体。
【請求項３０】
全身投与が、非経口的、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮的、または呼吸的である請求項21に用いるための融合抗体。
【請求項３１】
免疫グロブリン重鎖がIgGの免疫グロブリン重鎖である請求項21に用いるための融合抗体。
【請求項３２】
免疫グロブリン軽鎖がκまたはλクラスの免疫グロブリン軽鎖である請求項21に用いるための融合抗体。
【請求項３３】
免疫グロブリン軽鎖が、配列番号4のアミノ酸配列に対応するCDR1、配列番号5のアミノ酸配列に対応するCDR2、または配列番号6のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む請求項21に用いるための融合抗体。
【請求項３４】
内因性BBBレセプター介在輸送系と結合することによりBBBを通過する請求項21に用いるための融合抗体。
【請求項３５】
インスリンレセプター、トランスフェリンレセプター、レプチンレセプター、リポタンパク質レセプター、およびIGFレセプターからなる群から選ばれる内因性BBBレセプターを介してBBBを通過する請求項21に用いるための融合抗体。
【請求項３６】
インスリンレセプターと結合することによりBBBを通過する請求項21に用いるための融合抗体。
【請求項３７】
中枢神経系中のアリールスルファターゼA(ASA)欠乏症が異染性白質ジストロフィー(MLD)である請求項21に用いるための融合抗体。
【請求項３８】
医薬的有効量のアリールスルファターゼA活性を有する融合抗体を対象に全身投与することを含む、対象の中枢神経系のアリールスルファターゼA(ASA)欠乏症を治療するのに用いるための融合抗体であって、
(a)免疫グロブリン軽鎖およびアリールスルファターゼAのアミノ酸配列を含む融合タンパク質、ここで、アリールスルファターゼAのアミノ酸配列は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合している；および(b)免疫グロブリン重鎖を含む、血液脳関門(BBB)を通過し、セレブロシドサルフェートエステルおよびスルファチドスフィンゴ脂質の2硫酸基の加水分解を触媒する、融合抗体。
【請求項３９】
スルファターゼ修飾因子タイプ1(SUMF1)により翻訳後修飾される請求項38に用いるための融合抗体。
【請求項４０】
該翻訳後修飾がシステインからホルミルグリシンへの変換を含む請求項38に用いるための融合抗体。
【請求項４１】
50kg体重当たりで正規化した少なくとも約100ugのアリールスルファターゼA酵素が脳に送達される請求項38に用いるための融合抗体。
【請求項４２】
医薬的有効量が少なくとも約10単位アリールスルファターゼA活性/Kg体重を含む請求項38に用いるための融合抗体。 
【請求項４３】
アリールスルファターゼA比活性が少なくとも10単位/mgである請求項38に用いるための融合抗体。
【請求項４４】
ASAが、独立した存在としてのその活性に比べて、分子ベースでその活性の少なくとも20％を維持する請求項38に用いるための融合抗体。
【請求項４５】
ASAおよび免疫グロブリンがそれぞれ、独立した存在としてのその活性に比べて、分子ベースでその活性の少なくとも20％を維持する請求項38に用いるための融合抗体。
【請求項４６】
免疫グロブリン重鎖がIgGの免疫グロブリン重鎖である請求項38に用いるための融合抗体。
【請求項４７】
免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するCDR1、配列番号2のアミノ酸配列に対応するCDR2、または配列番号3のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む請求項38に用いるための融合抗体。
【請求項４８】
免疫グロブリン軽鎖がκまたはλクラスの免疫グロブリン軽鎖である請求項38に用いるための融合抗体。
【請求項４９】
免疫グロブリン軽鎖が、配列番号4のアミノ酸配列に対応するCDR1、配列番号5のアミノ酸配列に対応するCDR2、または配列番号6のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む求項38に用いるための融合抗体。
【請求項５０】
内因性BBBレセプター介在輸送系と結合することによりBBBを通過する請求項38に用いるための融合抗体。
【請求項５１】
インスリンレセプター、トランスフェリンレセプター、レプチンレセプター、リポタンパク質レセプター、およびIGFレセプターからなる群から選ばれる内因性BBBレセプターを介してBBBを通過する請求項38に用いるための融合抗体。
【請求項５２】
インスリンレセプターと結合することによりBBBを通過する請求項38に用いるための融合抗体。
【請求項５３】
中枢神経系中のアリールスルファターゼA(ASA)欠乏症が異染性白質ジストロフィー(MLD)である請求項38に用いるための融合抗体。
【請求項５４】
(a)免疫グロブリン重鎖およびアリールスルファターゼAのアミノ酸配列を含む融合タンパク質、および(b)免疫グロブリン軽鎖を含む融合抗体であって、血液脳関門(BBB)を通過し、セレブロシドサルフェートエステルおよびスルファチドスフィンゴ脂質の2硫酸基の加水分解を触媒する、融合抗体。
【請求項５５】
アリールスルファターゼAのアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合している請求項54記載の融合抗体。
【請求項５６】
スルファターゼ修飾因子タイプ1(SUMF1)により翻訳後修飾される請求項54記載の融合抗体。
【請求項５７】
ホルミルグリシンを含む請求項54記載の融合抗体。
【請求項５８】
さらに、アリールスルファターゼAのアミノ酸配列と免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端の間にリンカーを含む請求項54記載の融合抗体。
【請求項５９】
アリールスルファターゼAの比活性が少なくとも10単位/mgである請求項54記載の融合抗体。
【請求項６０】
ASAが、独立した存在としてのその活性に比べて、その活性の少なくとも20％を維持する請求項54記載の融合抗体。
【請求項６１】
ASAおよび免疫グロブリンがそれぞれ、独立した存在としてのその活性に比べて、分子ベースでその活性の少なくとも20％を維持する請求項54記載の融合抗体。
【請求項６２】
免疫グロブリン重鎖がIgGの免疫グロブリン重鎖である請求項54記載の融合抗体。
【請求項６３】
免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するCDR1、配列番号2のアミノ酸配列に対応するCDR2、または配列番号3のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む請求項54記載の融合抗体。
【請求項６４】
免疫グロブリン軽鎖がκクラスの免疫グロブリン軽鎖である請求項54記載の融合抗体。
【請求項６５】
免疫グロブリン軽鎖がλクラスの免疫グロブリン軽鎖である請求項54記載の融合抗体。
【請求項６６】
免疫グロブリン軽鎖が、配列番号4のアミノ酸配列に対応するCDR1、配列番号5のアミノ酸配列に対応するCDR2、または配列番号6のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む求項54記載の融合抗体。
【請求項６７】
内因性BBBレセプター介在輸送系と結合することによりBBBを通過する請求項54記載の融合抗体。
【請求項６８】
インスリンレセプター、トランスフェリンレセプター、レプチンレセプター、リポタンパク質レセプター、およびIGFレセプターからなる群から選ばれる内因性BBBレセプターを介してBBBを通過する請求項54記載の融合抗体。
【請求項６９】
インスリンレセプターと結合することによりBBBを通過する請求項54記載の融合抗体。
【請求項７０】
治療的有効量の請求項54記載の融合抗体および医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項７１】
請求項54記載の融合抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７２】
配列番号14の核酸配列を含む請求項71記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７３】
請求項71記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７４】
配列番号14の核酸配列を含む請求項73記載のベクター。
【請求項７５】
請求項73記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７６】
該宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞である請求項75記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮出願No.61/566,497（2011年12月2日出願）の利益を主張する(この内容は本明細書の一部を構成する)。
【背景技術】
【０００２】
異染性白質ジストロフィー(MLD)は、スルファチドを分解するように作用するリソゾーム酵素であるアリールスルファターゼA(ASA)の欠乏により生じる遺伝性代謝疾患である。ASAレベルの不足は、例えば末梢組織および中枢神経系(CNS)における3-O-スルホガラクトシルセラミド（スルファチド）、スフィンゴ脂質の病的蓄積をもたらす。神経変性および精神遅滞（知的障害）を含む症状は、幼児期に現れ、脳の器質性損傷により早死をもたらし得る。典型的には、治療には、組換えASAによる静脈内酵素置換療法が含まれるだろう。しかしながら、組換えASAは、血液脳関門(BBB)を通過しないので、CNSの疾患に対する効果はほとんどない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
（発明の要約）
本明細書はアリールスルファターゼA(「ASA」)欠乏症に罹患した対象を治療するための方法および組成物について記載する。ある態様において、該方法は、治療的有効量の二機能性IgG（ここで、IgGは内因性BBBレセプター、例えばヒトインスリンレセプター(HIR)と結合する抗体である。）-ASA融合タンパク質を全身投与することによるCNSに対するASAの送達を可能にする。ある態様において、HIR Ab-ASA融合抗体は、インスリンレセプターの細胞外ドメインと結合し、ASA酵素活性を保持したまま血液脳関門(「BBB」)を通過してCNSに輸送される。HIR Abは、BBB状の内因性インスリンレセプターと結合し、脳内にASAを輸送する分子的トロイの木馬として働く。ある態様において、全身投与のためのHIR Ab-ASA融合抗体の全身的治療的有効量は、一部、本明細書に記載の末梢血からの該融合抗体の特異的CNS取り込み特性に基づく。
【０００４】
ある局面において、本発明は、対象の中秋神経系のASA欠乏症を治療する方法であって、対象に医薬的有効量のASA活性を有する融合抗体を全身投与することを含む方法を提供する。この局面のある態様において、(i)該融合抗体は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列、ASAのアミノ酸配列、および免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列を含み、(ii)該融合抗体はヒトインスリンレセプターの細胞外ドメインと結合し、スフィンゴ脂質のセレブロシド-硫酸基の加水分解を触媒し、(iii)ASAのアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合する。
【０００５】
ある態様において、少なくとも約100ugのASA酵素がヒト脳に送達される。ある態様において、該融合抗体の治療的有効量は少なくとも約0.5mg/Kg体重を含む。ある態様において、全身投与は、非経口的、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、動脈内、経皮的、または呼吸的である。
【０００６】
ある態様において、該融合抗体の脳への取り込みは、コントロール抗体の脳への取り込みより少なくとも2倍、3倍、4,倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍大きい。ある態様において、該融合抗体の脳への分布容量は、コントロール抗体の脳への取り込みより少なくとも2倍、3倍、4,倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍大きい。
【０００７】
ある態様において、該融合抗体はキメラ抗体である。
【０００８】
ある態様において、該融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、４以下の単アミノ酸突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列に対応するCDR1、６以下の単アミノ酸突然変異を含む配列番号2のアミノ酸配列に対応するCDR2、または３以下の単アミノ酸突然変異を含む配列番号3のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む（ここで、該単アミノ酸突然変異は、置換、欠失、または挿入である。）。
【０００９】
他の態様において、該融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、３以下の単アミノ酸突然変異を含む配列番号１のアミノ酸配列に対応するCDR1、６以下の単アミノ酸突然変異を含む配列番号2のアミノ酸配列に対応するCDR2、および３以下の単アミノ酸突然変異を含む配列番号3のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む。
【００１０】
他の態様において、該融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、配列番号１のアミノ酸配列に対応するCDR1、配列番号2のアミノ酸配列に対応するCDR2、または配列番号3のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む。
【００１１】
さらなる態様において、該融合抗体の免疫グロブリン重鎖の相補性決定領域は、配列番号１のアミノ酸配列に対応するCDR1、配列番号2のアミノ酸配列に対応するCDR2、および配列番号3のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む。
【００１２】
ある態様において、該融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、配列番号１のアミノ酸配列に対応するCDR1、配列番号2のアミノ酸配列に対応するCDR2、および配列番号3のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む（ここで、該アミノ酸配列は、1、2、3、4、5、または6の単アミノ酸突然変異を含む。）。
【００１３】
ある態様において、該融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、３以下の単アミノ酸突然変異を含む配列番号4のアミノ酸配列に対応するCDR1、５以下の単アミノ酸突然変異を含む配列番号5のアミノ酸配列に対応するCDR2、または５以下の単アミノ酸突然変異を含む配列番号6のアミノ酸配列に対応するCDR3（ここで、該単アミノ酸突然変異は、置換、欠失、または挿入である。）。
【００１４】
他の態様において、該融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、３以下の単アミノ酸突然変異を含む配列番号4のアミノ酸配列に対応するCDR1、５以下の単アミノ酸突然変異を含む配列番号5のアミノ酸配列に対応するCDR2、および５以下の単アミノ酸突然変異を含む配列番号6のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む。
【００１５】
他の態様において、該融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、配列番号4のアミノ酸配列に対応するCDR1、配列番号5のアミノ酸配列に対応するCDR2、または配列番号6のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む。
【００１６】
さらなる態様において、該融合抗体の免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域は、配列番号4のアミノ酸配列に対応するCDR1、配列番号5のアミノ酸配列に対応するCDR2、および配列番号6のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む。
【００１７】
ある態様において、該融合抗体の免疫グロブリン軽鎖は、配列番号4のアミノ酸配列に対応するCDR1、配列番号5のアミノ酸配列に対応するCDR2、または配列番号6のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む（ここで、該アミノ酸配列は、1、2、3、4、5、または6の 単アミノ酸突然変異を含む。）。
【００１８】
ある態様において、該融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、配列番号１のアミノ酸配列に対応するCDR1、配列番号2のアミノ酸配列に対応するCDR2、および配列番号3のアミノ酸配列に対応するCDR3を含み、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号4のアミノ酸配列に対応するCDR1、配列番号5のアミノ酸配列に対応するCDR2、および配列番号6のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む。
【００１９】
ある態様において、該融合抗体の免疫グロブリン重鎖は、配列番号7と少なくとも90％同一であり、該軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列は、配列番号8と少なくとも90％同一である。
【００２０】
ある態様において、該融合抗体の免疫グロブリン重鎖は配列番号7を含み、軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列は配列番号8を含む。
【００２１】
さらなる態様において、ASAは、配列番号９と少なくとも90％(例えば、95％または100％)同一なアミノ酸配列を含む。
【００２２】
他の態様において、該融合抗体の免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列は、配列番号7と少なくとも90％同一であり、該軽鎖免疫グロブリンのアミノ酸配列は、配列番号8と少なくとも90％同一であり、ASAのアミノ酸配列は、配列番号９と少なくとも95％同一であるかまたは配列番号9を含む。
【００２３】
さらに他の態様において、該融合抗体の免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列は配列番号7を含み、免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列は配列番号8を含み、ASAのアミノ酸配列は配列番号9を含む。
【００２４】
さらなる局面において、本発明は、対象の中枢神経系のASA欠乏症の治療方法であって、対象に医薬的有効量のASA活性を有する融合抗体を全身投与することを含む、
(i)該融合抗体が、(a)配列番号10と少なくとも95％同一な融合タンパク質、および(b)免疫グロブリン軽鎖を含み、(ii)該融合抗体が、ヒトインスリンレセプターの細胞外ドメインと結合し、スルファチドスフィンゴミエリン中の結合の加水分解を触媒する、方法を提供する。
【００２５】
ある態様において、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列およびアリールスルファターゼAを含む融合タンパク質は、配列番号10と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一なアミノ酸配列を含む。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、態様の中枢神経系のASA欠乏症の治療方法であって、医薬的有効量のASA活性を有する融合抗体を全身投与することを含む、
(i) 該融合抗体が免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列およびASAを含む融合タンパク質を含むか、または免疫グロブリン軽鎖およびASAのアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含み、該融合抗体がヒトインスリンレセプターの細胞外ドメインと結合し、該融合抗体がスルファチドスフィンゴミエリン中の結合の加水分解を触媒し、(ii)ASAのアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖のカルボキシ末端と共有結合する、方法を提供する。
【００２７】
ある態様において、中枢神経系におけるASA欠乏症は異染性白質ジストロフィー(MLD)である。
【００２８】
ある態様において、本発明は、(a)免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列およびアリールスルファターゼAを含む融合タンパク質、および(b)免疫グロブリン軽鎖を含む融合抗体であって、血液脳関門(BBB)を通過し、セレブロシドサルフェートエステルおよびスルファチドスフィンゴ脂質の２硫酸基の加水分解を触媒する、融合抗体を提供する。
【００２９】
ある態様において、アリールスルファターゼAのアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合する。
【００３０】
ある態様において、該融合抗体は、スルファターゼ修飾因子タイプ1(SUMF1)により翻訳後修飾される。
【００３１】
ある態様において、該融合抗体はホルミルグリシンを含む。
【００３２】
ある態様において、該融合タンパク質は、さらにアリールスルファターゼAのアミノ酸配列と免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端の間にリンカーを含む。
【００３３】
ある態様において、該融合抗体のアリールスルファターゼA比活性は少なくとも約10単位/mgである。
【００３４】
ある態様において、該ASAは、独立した存在としてのその活性に比べてその活性の少なくとも20％を保持する。ある態様において、該ASAおよび該免疫グロブリンはそれぞれ、独立した存在としてのその活性に比べて分子ベースでその活性の少なくとも20％を保持する。
【００３５】
ある態様において、該免疫グロブリン重鎖はIgGの免疫グロブリン重鎖である。ある態様において、該免疫グロブリン重鎖は、配列番号１のアミノ酸配列に対応するCDR1、配列番号2のアミノ酸配列に対応するCDR2、または配列番号3のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む。
【００３６】
ある態様において、該免疫グロブリン軽鎖は、κクラスの免疫グロブリン軽鎖である。ある態様において、該免疫グロブリン軽鎖はλクラスの免疫グロブリン軽鎖である。ある態様において、該免疫グロブリン軽鎖は、配列番号4のアミノ酸配列に対応するCDR1、配列番号5のアミノ酸配列に対応するCDR2、または配列番号6のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む。
【００３７】
ある態様において、該融合抗体は、内因性BBBレセプター介在輸送系と結合することによりBBBを通過する。ある態様において、該融合抗体は、インスリンレセプター、トランスフェリンレセプター、レプチンレセプター、リポタンパク質レセプター、およびthe IGFレセプターからなる群から選ばれる内因性BBBレセプターを介してBBBを通過する。ある態様において、該融合抗体は、インスリンレセプターと結合することによりBBBを通過する。
【００３８】
ある態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載の融合抗体、および医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００３９】
ある態様において、本発明は、本明細書に記載の融合抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。ある態様において、該単離されたポリヌクレオチドは、配列番号14の核酸配列を含む。
【００４０】
ある態様において、本発明は、本明細書に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。ある態様において、本発明が提供する該ベクターは、配列番号14の核酸配列を含む。
【００４１】
ある態様において、本発明は、本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞を提供する。ある態様において、該宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である。
【００４２】
本明細書に記載のすべての刊行物、特許、および特許出願は、各刊行物、特許、および特許出願が本明細書の一部を構成することを具体的に個々に記載しているのと同程度に、本明細書の一部を構成する。
【００４３】
本発明の新規な特徴を特許請求の範囲に詳細に記載する。本発明の特徴と利点は、本発明の原理を利用した具体的態様を記載した以下の詳細な説明および以下に添付した図面を参照することでよりよく理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】該融合抗体が、分子的トロイの木馬(TH)として働く内因性BBBレセプター(R)の細胞外ドメインに対する抗体、およびASA、リソゾーム酵素(E)を含む、「分子的トロイの木馬」の模式図。BBBの裏側の脳細胞の中に入ると、該融合抗体のASA部分はスルファチド（S）を分解可能な生成物（ｐ）に変換する。
【図２】典型的なHIR Ab-ASA融合抗体は、成熟ASAのアミノ末端とHIR Abの重鎖のCH3領域のカルボキシル末端との融合により形成される。
【図３】ヒト肝臓cDNAからPCRにより生成されるヒトASA cDNA(左レーン)およびASA特異的プライマーのアガロースゲルのエチジウムブロミド染色（表２）。中および右レーン：PhiX174 HaeIII消化DNA標準およびLambda HindIII消化DNA標準。
【図４】重鎖（HC）融合遺伝子、軽鎖（LC）遺伝子、DHFR遺伝子、およびneo遺伝子をコードする４つの独立したタンデム発現カセットをコードする遺伝子操作したタンデムベクター(TV-HIRMAb-ASA)。
【図５】ヒトインスリンレセプターの細胞外ドメインに対する典型的なヒトインスリンレセプター抗体由来の免疫グロブリン重鎖可変領域のアミノ酸配列。下線を付した配列は、それぞれシグナルペプチド、CDR1、CDR2、およびCDR3である。ヒトIgG1から得た重鎖定常領域をイタリック体で示す。
【図６】ヒトインスリンレセプターの細胞外ドメインに対する典型的なヒトインスリンレセプター抗体由来の免疫グロブリン軽鎖可変領域のアミノ酸配列。下線を付した配列は、それぞれシグナルペプチド、CDR1、CDR2、およびCDR3である。ヒトκ軽鎖由来の定常領域をイタリック体で示す。
【図７】ヒトインスリンレセプターの細胞外ドメインに対する典型的なヒトインスリンレセプター抗体の重鎖および軽鎖のCDR1、CDR2、およびCDR3アミノ酸配列を示す表。
【図８】最初の18アミノ酸シグナルペプチドを含まない（成熟ASA）アリールスルファターゼA(ASA)のアミノ酸配列(Swiss-Prot P15289)。
【図９】典型的なヒトインスリンレセプター抗体重鎖と成熟ヒトASAの融合物のアミノ酸配列。下線を付した配列は、順にIgGシグナルペプチド、CDR1、CDR2、CDR3、および重鎖のカルボキシ末端とASAのアミノ末端を結合するペプチドリンカー(Ser-Ser-Ser)である。イタリック体の配列は、ヒトIgG1から得た重鎖定常領域に対応する。太字の配列はヒトASAに対応する。
【図１０】分子量標準、精製HIRMAb(レーン1)、および精製HIRMAb-ASA融合タンパク質(レーン2)のSDS-PAGE。(A)還元SDS-PAGEゲル。(B)非還元SDS-PAGEゲル。
【図１１】抗ヒト(h) IgG一次抗体(左パネル)または抗ヒトASA一次抗血清(右パネル)のウエスタンブロット。HIRMAb-ASA融合タンパク質の免疫応答性をキメラHIRMAbと比較する。HIRMAb-ASA融合タンパク質およびHIRMAbは、抗hIgGウエスタンにおいて同一の軽鎖を有する。HIRMAb-ASA融合重鎖は抗hIgG抗体および抗ヒトASA抗体の両方と反応するが、HIRMAb重鎖は抗hIgG抗体のみと反応する。
【図１２】キメラHIRMAbまたはHIRMAb-ASA融合タンパク質とHIR細胞外ドメイン(ECD)との結合は飽和可能である。分子量の差を正規化した後のHIR ECDと結合するHIRMAb-ASAのED50はキメラHIRMAbの結合のED50と同等である。
【図１３】パラ-ニトロカテコールサルフェート(NCS)を基質として用いる分光光度分析を用いて、HIRMAb-ASA融合タンパク質のASA比活性を2用量の該融合タンパク質(0.3および1.0ug)で定量する。
【図１４】静脈内投与後のアカゲザルにおけるHIRMAb-ASA融合タンパク質の血漿中濃度（濃度を注射用量(ID)/mL(A)のパーセントまたはng/mL(B)で表す）。
【図１５】[125I]-HIRMAb-ASA融合タンパク質を静脈内注射後２時間のアカゲザルの脳スキャンは、霊長類脳全体に該融合タンパク質が広範囲に分布することを示す（灰白質での取り込みは白質に比べて高かった）。
【００４５】
（発明の詳細な説明）
血液脳関門(BBB)は、全身投与したASA(例えば組換えASA)の中枢神経系への送達に対する大きな障壁である。本明細書に記載の方法および組成物は、治療的に有意なレベルのASA活性をBBBを通過してCNSに送達するのに重要な３因子に対処する：
1)内因性BBB輸送体を用いる輸送によりASAがBBBを通過するのを可能にするASAの修飾；2)BBB輸送をもたらすのに必要な修飾後のASA活性の保持による全身投与した修飾ASAのCNSへの取り込み量と速度。本明細書に記載の方法および組成物の種々の局面は、介在配列有りまたは無しで、ヒトインスリンレセプターの細胞外ドメインに対する免疫グロブリン（重鎖または軽鎖）と融合したASA(すなわち、ASA活性を有するタンパク質)を含むヒトインスリンレセプター(HIR)抗体(Ab)-ASA融合タンパク質を得、(2)CNSおよび該比活性における取り込みに基づいて融合抗体の治療的有効全身用量を確立することによりこれら因子に対処する。
【００４６】
したがって、本発明は、医薬的有効量の、ASA活性を有し、内因性BBBレセプター輸送体、例えばヒトインスリンレセプターの細胞外ドメインと選択的に結合する二機能性HIR Ab-ASA融合抗体を対象に全身投与することにより、中枢神経系のASA欠乏症を治療するための組成物および方法を提供する。
【００４７】
（定義）
本明細書で用いている「治療（処置）」または「治療する（こと）」は、治療的利益および/または予防的利益を達成することを含む。治療的利益は、治療する基礎疾患または病状の根絶または改善を意味する。例えば、MLDを有する個体において、治療的利益は、該疾患の進行の部分的または完全な停止、または該疾患の部分的または完全な逆転を含む。また、治療的利益は、患者がまだ該病状に罹患しているかもしれないという事実にもかかわらず、患者に改善が認められるように基礎病状に関連する生理学的症状または精神的症状の１またはそれ以上の根絶または改善により達成される。治療の予防的利益は、病状の予防、病状の進行の遅延(例えばリソゾーム貯蔵障害の進行の遅延)、または病序が発生する可能性の減少を含む。本明細書で用いている「治療する」または「治療」には予防を含む。
【００４８】
本明細書で用いている用語「有効量」は全身投与したときにCNSに有益または望ましい結果、例えば有益または望ましい臨床結果、または認知、記憶、気分の改善、または他の望ましいCNSの結果を得るのに充分な量でありうる。また有効量は、予防効果をもたらす量、例えば病的または望ましくない病状の発現を遅延し、減少させ、または排除する量である。そのような病状には、限定されるものではないが、精神遅滞、難聴、および神経変性が含まれる。有効量は１またはそれ以上の投与で投与することができる。治療に関して、本発明の組成物の「有効量」は、疾患、例えば神経疾患の進行を緩和、改善、安定化、逆転するか、または遅らせるのに充分な量である。「有効量」は、単独、または病気または疾患を治療するのに用いる１またはそれ以上の薬剤と組み合わせて用いる本発明のあらゆる組成物のものである。本発明の意義の範囲内において治療剤の「有効量」は、患者の担当医または担当獣医師が決定する。そのような量は、当業者が容易に確定し、本発明に従って投与するときの有効量であろう。治療的有効量に影響を及ぼす因子には、投与するHIR Ab-ASA融合抗体のASA比活性、その吸収プロフィール（例えばその脳への取り込み速度）、該疾患の発生からの経過時間、ならびに治療する個体の年齢、健康状態、他の病状の存在、および栄養状態が含まれる。さらに、患者が受け得る他の薬物療法は、投与する治療薬の治療的有効量の決定に影響を与える。
【００４９】
本明細書で用いている「対象」または「個体」は、動物、例えば哺乳動物である。ある態様において、「対象」または「個体」は、ヒトである。ある態様において、対象は MLDに罹患している。
【００５０】
ある態様において、HIRMAb-ASA融合抗体を含む医薬組成物は「末梢に投与される」かまたは「末梢投与される」。本明細書で用いているこれら用語は、薬剤、例えば治療剤の、CNSに直接投与しない、すなわち、薬剤を血液脳関門の非脳側と接触させるあらゆる投与の形を表す。本明細書で用いている「末梢投与」には、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮的、吸入、経口腔、舌下、または経鼻が含まれる。
【００５１】
本明細書において、「医薬的に許容される担体」または「医薬的に許容される賦形剤」は、それ自身は該組成物を投与される個体に有害な抗体の産生を誘導しないあらゆる担体を表す。そのような担体は当業者によく知られている。医薬的に許容される担体/賦形剤の詳細な考察は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、Gennaro、AR、ed.、20th edition、2000: Williams and Wilkins PA、USA.に記載されている。典型的な医薬的に許容される担体には、塩、例えば鉱酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など、並びに有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などが含まれうる。例えば、本発明の組成物は、液体形で提供することができ、界面活性剤（例えば0.01〜1％のポリソルベート-80）または炭水化物添加物（例えば、マンニトール、ソルビトール、またはトレハロース）を含むかまたは含まない種々のpH（5〜8）の生理食塩水ベースの水性溶液を用いて製剤化することができる。一般に用いられる緩衝液は、ヒスチジン、酢酸塩、リン酸塩、またはクエン酸塩である。
【００５２】
「組換え宿主細胞」または「宿主細胞」は、挿入に用いる方法、例えば直接取り込み、形質導入、f-交配、または組換え宿主細胞を製造するための当該分野で知られた他の方法に関わらず、外因性ポリヌクレオチドを含む細胞を表す。該外因性ポリヌクレオチドは、非統合ベクター、例えばプラスミドとして維持するか、または宿主ゲノム中に統合することができる。
【００５３】
本明細書において、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを表すために互換性に用いる。すなわち、ポリペプチドに関する説明は、ペプチドの説明およびタンパク質の説明と等価に適用する（逆も同じ）。該用語は、天然のアミノ酸ポリマー、および１またはそれ以上のアミノ酸残基が非天然アミノ酸、例えばアミノ酸類似体であるアミノ酸ポリマーに適用する。本明細書で用いている該用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合により結合している完全長タンパク質（すなわち抗原）を含むあらゆる長さのアミノ酸鎖を含む。
【００５４】
用語「アミノ酸」は、天然および非天然のアミノ酸、および天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を表す。天然にコードされたアミノ酸には、20種類の一般的アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）、ならびにピロリジンおよびセレノシステインがある。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基と結合するα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを表す。そのような類似体は、修飾R基（例えばノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。
【００５５】
本明細書において、アミノ酸は、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionが推奨する一般的に知られている3文字記号または1文字記号により表すことができる。同様に、ヌクレオチドはその一般的に受け入れている1文字コードにより表すことができる。
【００５６】
用語「核酸」はデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド、およびそのポリマー（1本鎖または2本鎖）を表す。特記しない限り、該用語は、参照核酸と同じ結合特性を有し、天然ヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を含む。特記しない限り、該用語は、アンチセンス技術に用いるDNAの類似体であるPNA(ペプチド核酸)を含むオリゴヌクレオチド類似体(ホスホロチオエート、ホスホロアミデートなど)も表す。特記しない限り、特定の核酸配列は、その保存的に修飾された変異体（限定されるものではないが、縮重コドン置換を含む）、および相補配列、および明記した配列も暗に含む。具体的には、縮重コドン置換は、１またはそれ以上の選択した（またはすべての）コドンの第3部位が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換される配列の縮重により達成することができる(Batzer et al.、Nucleic Acid Res. 19:5081(1991); Ohtsuka et al.、J. Biol. Chem. 260:2605-2608(1985)；およびCassol et al.(1992); Rossolini et al.、Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994))。
【００５７】
用語「単離（された）」および「精製（された）」は、その天然環境から本質的または実質的に除去されるか、または濃縮された物質を表す。例えば、単離核酸は、通常それと隣接する核酸もしくは試料中の他の核酸または成分（タンパク質、脂質など）から分離されたものでありうる。別の例では、ポリペプチドは、その天然環境から実質的に除去されるかまたは濃縮されると精製される。核酸およびタンパク質の精製および単離方法は当該分野でよく知られている。
血液脳関門
【００５８】
ある局面において、本発明は、内因性BBBレセプター/輸送体を用いるレセプター介在輸送により血液脳関門(BBB)を通過することができる免疫グロブリンと融合したASAを利用する組成物および方法を提供する。標的化のための好ましい内因性輸送体はBBB上のインスリンレセプターである。BBBインスリンレセプターは、循環インスリンの脳への輸送、およびある種のペプチド模倣物のモノクローナル抗体(MAb)、例えばHIRMAbを仲介する。内因性リガンドまたはペプチド模倣物MAbを用いて標的化することができる他の内因性輸送体は、BBBトランスフェリンレセプター、BBBインスリン様成長因子レセプター、BBBレプチンレセプター、またはBBB低密度リポタンパク質レセプターが含まれる。該組成物および方法は、末梢血から血液脳関門を通過してASAをCNSに輸送するのに有用である。本明細書で用いている「血液脳関門」は、脳の毛細血管内皮細胞膜内の密着結合（tight junction）により形成される、分子の脳内への輸送を制限する極めて密着した障壁を生じる、末梢循環と脳および脊髄の間の障壁を表す。BBBは、分子量60Daの尿素と同様の低分子を制限することができるほどに密着している。脳内の血液脳関門、脊髄内の血液脊髄関門、および網膜内の血液網膜関門は、中枢神経系(CNS)内の隣接毛細血管関門であり、まとめて血液脳関門またはBBBと呼ばれる。
【００５９】
BBBは、脳およびCNSに対する新たな神経療法剤、診断薬、および研究手段を制限する。最も高分子の治療薬、例えば組換えタンパク質、アンチセンス薬、遺伝子医薬品、精製抗体、またはRNA干渉(RNAi)ベースの薬剤は、薬理学的に有意な量でBBBを通過しない。一般的に、低分子薬はBBBを通過することができると推測されるが、実際にはBBBを通過して輸送されないため、脳で活性を示すのはすべての低分子薬の＜2％である。分子は、薬理学的に有意な量がBBBを通過するには、脂溶性で、分子量が400ダルトン(Da)未満なければならず、低分子の大部分がこれら２つの分子特性を持たない。しがたって、ほとんどの可能性のある治療用、診断用、または研究用分子は、薬理学的に有意な量でBBBを通過しない。BBBを迂回するために、脳室内（ICV）注入、脳内（IC）投与、および対流強化拡散法(CED)などの侵襲的経頭蓋ドラッグデリバリー戦略が用いられる。脳に対する経頭蓋ドラッグデリバリーは、高価で侵襲性なうえ、ほとんど効果が無い。ICV経路は、ASAを脳実質ではなく脳の上衣表面のみに送達するが、これはICV経路で投与した薬剤に典型的である。酵素、例えばASAのIC投与は、脳内へのタンパク質の拡散効率が非常に低いため、局所送達のみをもたらす。CEDは、脳の白質路を介する選択的な液の流れをもたらし、脱髄およびアストログリオーシスを引き起こす。
【００６０】
本明細書に記載の方法は、これらの侵襲性が高く、一般に不満足なBBBを迂回する方法の代替法を提供し、本明細書に記載のHIRMAb-ASA融合抗体組成物の全身投与後に、機能的ASAが末梢血からBBBを通過してCNS内に入るのを可能にする。本明細書に記載の方法は、BBB上のインスリンレセプター(例えば、ヒトインスリンレセプター)の発現を利用し、目的とする二機能性HIRMAb-ASA融合抗体を末梢血からCNSに輸送する。
【００６１】
内因性レセプター
血中のある内因性低分子、例えばグルコースまたはアミノ酸は、水溶性であり、ある種のBBB担体系における担体介在輸送（CMT）によりBBBを透過することができる。例えば、グルコースはGLUT1グルコース輸送体によりCMTを介してBBBを透過する。治療的アミノ酸、例えばL-DOPAを含むアミノ酸は、LAT1大中性アミノ酸輸送体によりCMTを介してBBBを透過する。同様に、血中のある種の内因性高分子、例えば、インスリン、トランスフェリン、インスリン様成長因子、レプチン、または低密度リポタンパク質は、ある種のBBBレセプター系を介するレセプター介在トランスサイトーシス(RMT)によりBBBを透過することができる。例えば、インスリンは、インスリンレセプターによりRMTを介してBBBを透過する。トランスフェリンは、トランスフェリンレセプターによりRMTを介してBBBを透過する。インスリン様成長因子は、インスリン様成長因子レセプターによりRMTを介してBBBを透過する。レプチンは、レプチンレセプターによりRMTを介してBBBを透過する。低密度リポタンパク質は、低密度リポタンパク質レセプターによる輸送を介してBBBを透過することができる。
【００６２】
BBBは、種々の大分子の血中から脳への輸送を可能にする特異的レセプター（インスリンレセプターを含む）を有することが示されている。特に、インスリンレセプターは、本明細書に記載のHIR Ab-ASA融合抗体の輸送体として適切である。本明細書に記載のHIR-ASA融合抗体は、ヒトインスリンレセプターの細胞外ドメイン(ECD)と結合する。
【００６３】
インスリンレセプター、およびその細胞外インスリン結合ドメイン(ECD)は、構造的および機能的に当該分野で広く特徴付けられている。例えば、Yip et al(2003)、J Biol. Chem、278(30):27329-27332；およびWhittaker et al.(2005)、J Biol Chem、280(22):20932-20936参照。ヒトインスリンレセプターのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、GenBank受託番号：NM_000208からわかる。
【００６４】
インスリンレセプター介在輸送系に結合する抗体
ASAをCNSに送達するための非侵襲性アプローチの一つは、ASAをインスリンレセプターのECDと選択的に結合する抗体と融合させることである。それにより、BBB上に発現したインスリンレセプターは、BBBを通過するASAの輸送のためのベクターとして働くことができる。ある種のECD特異抗体は、内因性リガンドを模倣し、特異的レセプター系による輸送を介して細胞膜障壁を通過する。そのようなインスリンレセプター抗体は、図１に模式的に記載した分子的「トロイの木馬」または「TH」として働く。ASAそれ自身は、通常、血液脳関門(BBB)を通過しない。しかしながら、ASAがTHと融合すると、該酵素は、脳のBBBおよび脳細胞膜に発現するIRなどの内因性BBBレセプターにより輸送されることにより、BBBおよび脳の細胞膜を通過することができる（図１）。
【００６５】
すなわち、抗体と他の大分子は通常、脳から排除されるにも関わらず、それらは、BBBに発現したレセプター、例えばインスリンレセプターの細胞外ドメインに対する特異性を有すると、脳実質に分子を送達するための有効なビークルとなりうる。ある態様において、HIR Ab-ASA融合抗体は、ヒトBBB HIRの外表面エピトープと結合し、この結合により、該融合抗体がヒトBBBインスリンレセプターにより仲介される輸送反応を介してBBBを通過するのを可能にする。
【００６６】
用語「抗体」は、天然または部分的もしくは完全に合成的に製造された免疫グロブリンを表す。該用語は、抗原結合ドメインであるかまたはそれとホモローガスな結合ドメインを有するあらゆるポリペプチドまたはタンパク質も含む。CDR移植抗体もこの用語により予期される。
【００６７】
「天然抗体」および「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一軽(L)鎖および２つの同一重(H)鎖からなる約150,000ダルトンのヘテロ４量体の糖タンパク質である。各軽鎖は、典型的には、共有ジスルフィド結合により重鎖と結合し、ジスルフィド結合の数は種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖および軽鎖も、規則的間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、その一方の末端に可変ドメイン（「VH」）、次いで多くの定常ドメイン（「CH」）を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（「VL」）および他の末端に定常ドメイン（「CL」）を有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第1定常ドメインと一列に並び、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと一列に並ぶ。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメイン間に接合部分を形成すると考えられる。
【００６８】
用語「可変ドメイン」は、ファミリーメンバー間（すなわち、異なるアイソフォームまたは異なる種間）で配列が大きく異なる。抗体に関して、用語「可変ドメイン」は、各特定抗体のその特定抗原に対する特異性を有し、結合するのに用いる抗体の可変ドメインを表す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布するのではない。それは、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン両方の超可変領域と呼ばれる3つの部分に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、「フレームワーク」または「FR」と呼ばれる。非修飾重鎖および軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその部分を形成する、ループを形成する３つの超可変領域により結合した、主にβシート構造をとるそれぞれ４つのFR(それぞれ、FR1、FR2、FR3、およびFR4)を含む。各鎖の超可変領域は、FRによって近接し、他の鎖の超可変領域とまとまって、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed. Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1991)、647-669頁参照)。定常ドメインは、抗体と抗原の結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与などの種々のエフェクター機能を有する。
【００６９】
本明細書において用語「超可変領域」は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を表す。超可変領域は、抗原と相補的に直接結合する、それぞれCDR1、CDR2、およびCDR3として知られる３つの「相補性決定領域」または「CRR」由来のアミノ酸残基を含む。
【００７０】
軽鎖可変ドメインにおいて、CDRは、典型的には、ほぼ残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)、および89-97(CDRL3)に対応し、重鎖可変ドメインにおいて、CDRは、典型的には、ほぼ残基31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)、および95-102(CDRH3)（Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed. Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1991))、および/または「超可変ループ」由来の残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基26-32(L1)、50-52(L2)、および and 91-96(L3)、および重鎖可変ドメインの残基26-32(H1)、53-55(H2)、および96-101(H3)に対応する（Chothia and Lesk、J. Mol. Biol. 196:901 917(1987))。
【００７１】
本明細書において、「可変フレームワーク領域」または「VFR」は、抗原結合ポケットまたはグルーブの部分を形成し、および/または抗原と接触することができるフレームワーク残基を表す。ある態様において、該フレームワーク残基は、抗原結合ポケットまたはグルーブの部分であるループを形成する。該ループ中のアミノ酸残基は、抗原と接触してもしなくてもよい。ある態様において、VFRのループアミノ酸は、抗体、抗体重鎖、または抗体軽鎖の三次元構造の検討により決定される。該三次元構造は、ループを形成し、および/または抗体可変ドメイン中の抗原との接触をもたらすと思われる溶媒接触可能アミノ酸位置について分析することができる。溶媒接触可能位置のいくつかは、アミノ酸配列の多様性を容認することができ、他のもの（例えば構造的位置）の多様性はわずかでありうる。抗体可変ドメインの三次元構造は、結晶構造またはタンパク質モデリングから導くことができる。ある態様において、VFRは、重鎖可変ドメインのアミノ酸位置71〜78に対応するアミノ酸位置を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり、Kabat et al.、1991に従って定義される。ある態様において、VFRは、CDRH2とCDRH3の間に位置するフレームワーク領域3の部分を形成する。VFRは、標的抗原と接触するように良い位置にあるループを形成するか、または抗原結合ポケットの部分を形成することができる。
【００７２】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは種々のクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンにはIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、およびIgA2に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメイン(Fc)は、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構造はよく知られている。
【００７３】
あらゆる脊椎動物種由来の抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて「κ」および「λ」と呼ばれる２つの明確に異なるタイプに割り当てることができる。
【００７４】
本明細書に記載の抗体または融合抗体に関して、用語「選択的に結合する」（「selectively bind」、「selectively binding」、「specifically binds」、または「specifically binding」）は、抗体または融合抗体のその標的抗原との結合を表し、その解離定数(Kd)は約10〜6Mまたはそれ以下、すなわち、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、または10-12Mである。
【００７５】
本明細書において用語「抗体」は、抗原と特異的に結合する能力を保持する抗体の１またはそれ以上の断片も意味すると理解されよう(一般的には、Holliger et al.、Nature Biotech. 23(9) 1126-1129(2005)参照)。そのような抗体の非限定的例には、(i)VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなる一価断片であるFab断片；(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合した２つのFab断片を含む二価断片であるF(ab')2断片；(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFd断片；(iv)抗体の単腕のVLおよびVHドメインからなるFv断片；(v)VHドメインからなるdAb断片(Ward et al.,(1989) Nature 341:544 546)；および(vi)単離された相補性決定領域(CDR)が含まれる。さらに、Fv断片の２つのドメインVLおよびVHは、別の遺伝子によりコードされるが、組換え法を用いて合成リンカーにより結合し、VLおよびVH領域が対となって一価分子を形成し１本鎖タンパク質とすることができる(一本鎖Fv(scFv)として知られる)（例えば、Bird et al.(1988) Science 242:423 426； and Huston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 5883；およびOsbourn et al.(1998) Nat. Biotechnol. 16:778参照)。そのような一本鎖抗体も、用語抗体に含まれるものとする。特異的scFvのあらゆるVHおよびVL配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域cDNAまたはゲノム配列と結合させて、完全なIgG分子または他のアイソタイプをコードする発現ベクターを作製することができる。VHおよびVLを用いて、タンパク質化学または組換えDNA技術により、免疫グロブリンのFab、Fv、または他の断片を製造することもできる。他の形の一本鎖抗体、例えばディアボディも含まれる。
【００７６】
「F(ab')2」および「Fab'」部分は、免疫グロブリン(モノクローナル抗体)をプロテアーゼ、例えばペプシンおよびパパインで処理して製造することができ、これには２つのH鎖のおのおののヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合近くで免疫グロブリンを消化することにより生じる抗体断片が含まれる。例えば、パパインは２本のH鎖のおのおののヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の上流でIgGを開裂させ、VL(L鎖可変領域)およびCL(L鎖定常領域)からなるL鎖、およびVH(H鎖可変領域)およびCHγ1(H鎖の定常領域中のγ1領域)からなるH鎖断片がジスルフィド結合を介してそれらのC末端領域と結合している２つのホモローガスな抗体断片を製造する。これら２つのホモローガスな各抗体断片はFab'と呼ばれる。ペプシンは、２本のH鎖のおのおののヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の下流でIgGを開裂させ、２つの上記Fab'がヒンジ領域で結合している断片よりわずかに大きな抗体断片を製造する。この抗体断片をF(ab')2と呼ぶ。
【００７７】
Fab断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第1定常ドメイン(CH1)も含む。Fab'断片は、抗体ヒンジ領域由来の１またはそれ以上のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端に数個の残基を加えることによりFab断片と異なる。Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するFab'を示す。F(ab')2抗体断片は、最初は間にヒンジシステインを有するFab'断片のペアとして製造された。他の抗体断片の化学結合も知られている。
【００７８】
「Fv」は、完全抗原認識および抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、１個の重鎖可変ドメインと１個の軽鎖可変ドメインが密接に非共有結合したダイマーからなる。この構造において、各可変ドメインの３個の超可変領域は、VH-VLダイマーの表面の抗原結合部位を規定するよう相互作用する。まとめて、６個の超可変領域は、抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、１個の可変ドメイン（または抗原特異的な３個の超可変領域のみを含むFvの半分）でも、完全な結合部位より親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
【００７９】
「一本鎖Fv」または「sFv」抗体断片は、抗体のVH、VL、またはVHおよびVLドメインの両方を含む（ここで、量ドメインは１本鎖ポリペプチドで存在する）。ある態様において、Fvポリペプチドは、さらにVHドメインとVLドメインの間にポリペプチドリンカーを含み、sFvが抗原を結合するための望ましい構造を形成することができる。sFVの総説は、例えばPluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、Vol. 113、Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag、New York、pp. 269 315(1994)参照。
【００８０】
「キメラ」抗体は、異なる哺乳動物由来の抗体を含む。哺乳動物は、例えばウサギ、マウス、ラット、ヤギ、またはヒトでありうる。異なる哺乳動物の組み合わせには、ヒトおよびマウス供給源由来の断片の組み合わせが含まれる。
【００８１】
ある態様において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体(MAb)、典型的には、マウスモノクローナル抗体のヒト化により得られるキメラヒト-マウス抗体。そのような抗体は、例えば、抗原チャレンジに応じて特異的ヒト抗体を産生するように「操作」されたトランスジェニックマウスから得られる。この技術において、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の要素を、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含む胚性幹細胞株由来のマウス系統に導入する。該トランスジェニックマウスは、ヒト抗体に特異的なヒト抗体を合成することができ、該マウスを用いてヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生することができる。
【００８２】
ヒトで用いるためには、HIR Abは、ヒトに投与したときに顕著な免疫原性を示さないように充分なヒト配列を含むことが好ましい（例えば、約80％ヒトおよび約20％マウス、または約85％ヒトおよび約15％マウス、または約90％ヒトおよび約10％マウス、または約95％ヒトおよび5％マウス、またはヒト約95％以上およびマウス約5％以下、または100％ヒト）。HIR MAbのより高度にヒト化した形も操作することができ、ヒト化HIR AbはネズミHIR Abと同等の活性を有し、本発明の態様において用いることができる。例えば、米国特許出願公開公報No.20040101904（2002年11月27日出願）、および20050142141（2005年2月17日出願）。本発明に用いるための充分なヒト配列を有するヒトBBBインスリンレセプターに対するヒト化抗体は、例えばBoado et al.(2007)、Biotechnol Bioeng、96(2):381-391に記載されている。
【００８３】
典型的態様において、HIR抗体またはそれ由来のHIR-ASA融合抗体は、図7(配列番号1〜3)に記載のHC CDRの少なくとも１の配列に対応するCDRまたはその変異体を含む免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、1、2、3、4、5、または6個以下の単アミノ酸突然変異を有する配列番号1のアミノ酸配列に対応するHC CDR1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個以下の単アミノ酸突然変異を有する配列番号2のアミノ酸配列に対応するHC CDR2、または1、または2個以下の単アミノ酸突然変異を有する配列番号3のアミノ酸配列に対応するHC CDR3（ここで、単アミノ酸突然変異は置換、欠失、または挿入である。）。
【００８４】
他の態様において、HIR AbまたはHIR Ab-ASA融合Abは、配列番号7(図5に示す)と少なくとも50％同一(すなわち、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95％同一、または100％以下の他のあらゆるパーセントの同一)なアミノ酸配列を有する免疫グロブリン HCを含む。
【００８５】
ある態様において、HIR AbまたはHIR Ab-ASA融合Abは、図7(配列番号4-6)の記載のLC CDRの少なくとも１の配列に対応するCDRまたはその変異体を含む免疫グロブリン軽鎖を含む。例えば、1、2、3、4、または5個以下の単アミノ酸突然変異を有する配列番号4のアミノ酸配列に対応するLC CDR1；1、2、3、または4個以下の単アミノ酸突然変異を有する配列番号5のアミノ酸配列に対応するLC CDR2；1、2、3、4、または5個以下の単アミノ酸突然変異を有する配列番号6に対応するLC CDR3。
【００８６】
他の態様において、HIR AbまたはHIR Ab-ASA融合Abは、配列番号8(図6に示す)と少なくとも50％同一(すなわち、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95％同一、または100％以下のあらゆる他のパーセントの同一)なアミノ酸配列を有する免疫グロブリン LCを含む。
【００８７】
他の態様において、HIR AbまたはHIR Ab-ASA融合Abは、上記HIR重鎖およびHIR軽鎖のいずれかに対応する重鎖および軽鎖の両方を含む。
【００８８】
本発明で用いているHIR抗体は、グリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい。該抗体がグリコシル化されている場合は、抗体の機能に有意な影響を与えないあらゆるグリコシル化パターンを用いることができる。グリコシル化は、抗体を産生する細胞に典型的なパターンで起こり得、細胞種毎に異なり得る。例えば、マウスミエローマ細胞が産生するモノクローナル抗体のグリコシル化パターンは、遺伝子導入したチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞が産生するモノクローナル抗体のグリコシル化パターンとは異なりうる。ある態様において、該抗体は、遺伝子導入したチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞が産生するパターンでグリコシル化される。
【００８９】
当業者は、現在の技術は、標的抗原、例えばヒトインスリンレセプターのECDまたはその単離されたエピトープと結合する、候補HIR Absまたは既知HIR Absの多くの配列変異体を容易に産生し（例えばin vitro)、スクリーニングするのを可能にすると認識するだろう。例えば、抗体配列変異体の超高スループットスクリーニングについては、Fukuda et al.(2006)、「In vitro evolution of single-chain antibodies using mRNA display」、Nuc. Acid Res.、34(19)(オンライン公開)参照。Chen et al.(1999)、「In vitro scanning saturation mutagenesis of all the specificity determining residues in an antibody binding site」、Prot Eng、12(4)：349-356も参照。インスリンレセプター ECDは例えばColoma et al.(2000) Pharm Res、17:266-274に記載のごとく精製することができ、既知HIR AbsのHIR AbsおよびHIR Ab配列変異体のスクリーニングに用いることができる。
【００９０】
したがって、ある態様において、目的とするレベルのヒト配列を有する遺伝子操作HIR AbをASAと融合し、二機能性分子である組換え融合抗体を産生する。HIR Ab-ASA融合抗体は、末梢投与後に、(i)ヒトインスリンレセプターの細胞外ドメインと結合し、(ii)スルファチド中の結合の加水分解を触媒し、(iii)BBB HIRの輸送を介してBBBを通過することができ、脳内に入るとASA活性を保持する。
【００９１】
アリールスルファターゼA(ASA)
組換えASAの全身投与(例えば静脈内注射による)は、MLDに罹患した患者のCNS中のASA欠乏を救済することができない。BBBは、末梢投与後に組換えASAがCNSにおいて顕著な治療効果を示すのを妨げる。しかしながら、ASAが(例えば共有結合リンカーにより)HIR Abと融合すると、この酵素は、非侵襲性経路で投与、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、または経口投与後に血中からCNSに入ることができる。HIR Ab-ASA融合抗体の投与は、末梢血から脳内にASA活性を送達することができる。本明細書は、CNSにおけるASA欠乏を治療するのに治療的に有効なHIR Ab-ASA融合抗体の全身用量の決定について記載する。本明細書に記載するように、HIR Ab-ASA融合抗体の適切な全身用量は、HIR Ab-酵素融合抗体のCNS取り込み特性および酵素活性の定量に基づいて確立される。スルファチドは、中枢神経系の希突起神経膠細胞において主として合成される硫酸化ガラクトシルセラミドである。本明細書で用いている、ASA(例えば、GenBank受託番号NP_000478に記載のヒトASA配列；Swiss-Prot P15289)は、セレブロシド3-サルフェートのセレブロシドとサルフェートへの加水分解を触媒することができるあらゆる天然または人工酵素を表す。
【００９２】
ASAは、ASA酵素活性を発現するために特異的翻訳後修飾を必要とするスルファターゼのファミリーのメンバーである。ASA酵素の活性は、ホルミルグリシン生成酵素(FGE)とも呼ばれるスルファターゼ修飾因子タイプ1(SUMF1)により(シグナルペプチドを含む完全ASAタンパク質の)Cys-69がホルミルグリシン残基に変換された後に活性化される。ある態様において、ASAを含む該融合抗体は、スルファターゼ修飾因子タイプ1(SUMF1)により翻訳後修飾される。ある態様において、翻訳後修飾は、システインのホルミルグリシンへの変換が含まれる。ある態様において、該融合抗体は、ホルミルグリシン残基を含むASAを含む。
【００９３】
ある態様において、ASAは、Swiss-Prot P15289に記載の507アミノ酸のタンパク質であるヒトASAのアミノ酸配列、またはその、18アミノ酸シグナル配列を欠く489アミノ酸サブ配列（配列番号9(図8)に対応する）と少なくとも50％同一(すなわち、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95％同一、または100％以下のあらゆるパーセントで同一)なアミノ酸配列を有する。ヒトASAの構造と機能の関係は良く確立されており、例えば、von Bulow et al.(2006)、「Crystal structure of an enzyme-substrate complex provides insight into the interaction between human arylsulfatase A and its substrates during catalysis」、J. Mol. Biol.、305: 26-277、2001に記載されている。特に、ASAの機能に重要な残基には、例えば、Cys-69、Lys-123、Ser-150、His-229、およびLys-302が含まれる。
【００９４】
ある態様において、ASAは、配列番号9(図8に示す)と少なくとも50％同一(すなわち、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100％以下のあらゆるパーセントで同一)なアミノ酸配列を有する。配列番号9などの標準的ASA配列の配列変異体は、例えば、特定ドメインに対応する完全配列または特異的サブ配列の無作為な突然変異生成により作製することができる。あるいはまた、部位指向性突然変異生成は、上記のようなASA機能に重要であることが知られている残基の突然変異を避けながら反復的に行うことができる。さらに、ASA配列の複数の変異体の生成において、突然変異トレランス予測プログラムを用いて、完全に無作為な突然変異生成により生じるであろう非機能的配列変異体の数を大きく減らすことができる。タンパク質機能に対するタンパク質配列中のアミノ酸置換の効果を予測するための種々のプログラム（例えば、SIFT、PolyPhen、PANTHER PSEC、PMUT、およびTopoSNP)は、例えば、Henikoff et al.(2006)、「Predicting the Effects of Amino Acid Substitutions on Protein Function」,Annu. Rev. Genomics Hum. Genet.、7:61-80に記載されている。ASA配列変異体のASA活性/ASA活性の保持を、当該分野で知られたp-ニトロカテコールサルフェート(NCS)分光光度ASAアッセイによりスクリーニングすることができる。ASA活性の１単位は、定義した基質濃度および反応条件で37℃で1umole基質/分の加水分解と定義される。したがって、当業者は、非常に多数の操作可能なASA配列変異体を、上記の当該分野で常套的な方法によりASA配列変異体のきわめて広範な「ライブラリー」を作製しスクリーニングすることにより得ることができる。
【００９５】
配列同一性パーセントは、常套的方法により決定される。例えば、Altschul et al.、Bull. Math. Bio. 48:603(1986)、およびHenikoff およびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915(1992)参照。簡単には、２つのアミノ酸配列を一列に並べ、10のギャップ開始ペナルティ、１のギャップ伸張ペナルティ、およびHenikoff およびHenikoff(上記)の「BLOSUM62」スコアリングマトリックスを用いてアラインメントスコアを最適化する。次に、同一パーセントを計算する（[同一マッチの総数]/[より長い配列の長さ＋2つの配列を一列に並べるためのより長い配列に導入したギャップ数])(100)。
【００９６】
当業者は、２つのアミノ酸配列を一列に並べるのに利用可能な多くの確立されたアルゴリズムがあることを理解している。Pearson およびLipmanの「FASTA」類似性検索アルゴリズムは、本明細書に記載のアミノ酸配列と別のペプチドのアミノ酸配列が共有する同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質アラインメント法である。FASTAアルゴリズムは、Pearson and Lipman、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444(1988)、およびPearson、Meth. Enzymol. 183:63(1990)に記載されている。簡単には、FASTAでは、最初に、保存的アミノ酸置換、挿入、または欠失を考慮せずに、同一性の最高密度（ktup変数が１の場合）または同一性のペア（ktup=2の場合)を有するクエリー配列(例えば配列番号9または配列番号16)と被験配列が共有する領域を同定することにより配列類似性を特徴付ける。次に、同一性の最高密度を有する１０領域を、アミノ酸置換マトリックスを用いるすべての対になったアミノ酸の同一性を比較することにより再度スコア付けし、最高スコアに寄与する残基のみを含むように該領域の末端を「切り取る」。「カットオフ」値より大きなスコアを有する領域がある場合は（配列長およびktup値に基づいて予め決定した式により計算した)、切り取った最初の領域を試験し、該領域を結合してギャップを有する近似アラインメントを形成することができるか否かを決定する。最終的に、２つのアミノ酸配列の最高スコア領域を、アミノ酸の挿入および欠失を可能にするNeedleman-Wunsch-Sellersアルゴリズム(Needleman およびWunsch、J. Mol. Biol. 48:444(1970)； Sellers、SIAM J. Appl. Math. 26:787(1974))の修飾を用いて一列に並べる。FASTA分析の具体的パラメータは以下の通りである、ktup=1、ギャップ開始ペナルティ=10、ギャップ伸長ペナルティ=1、および置換マトリックス=BLOSUM62。これらパラメータは、Pearson、Meth. Enzymol. 183:63(1990)のAppendix 2に記載のスコアリングマトリックスファイル「SMATRIX」を修飾することによりFASTAプログラムに導入することができる。
【００９７】
本発明は、本明細書に記載のアミノ酸配列と比較して保存的アミノ酸変化を有するタンパク質も含む。一般的アミノ酸のうち、例えば「保存的アミノ酸置換」は、下記群のそれぞれの中のアミノ酸間の置換により示される：(1)グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、(2)フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、(3)セリンおよびトレオニン、(4)アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩、(5)グルタミンおよびアスパラギン、および(6)リジン、アルギニン、およびヒスチジン。BLOSUM62表は、タンパク質配列断片の約2,000部分多重アラインメント由来のアミノ酸置換マトリックスであり、関連タンパク質の500群以上の高度に保存された領域を表す(Henikoff およびHenikoff、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915(1992))。したがって、BLOSUM62置換頻度を用いて、本発明のアミノ酸配列内に導入することができる保存的アミノ酸置換を定義する。化学特性（上記）のみに基づいてアミノ酸置換を設計することができるが、用語「保存的アミノ酸置換」は、好ましくは、BLOSUM62値が-1より大きい置換を表す。例えば、アミノ酸置換がBLOSUM62値0、1、2、または3で特徴づけられるときに保存的であるという。この系によれば、好ましい保存的アミノ酸置換は、BLOSUM62値、少なくとも1(例えば、1、2または3)で特徴づけられるが、より好ましい保存的アミノ酸置換はBLOSUM62値、少なくとも2(例えば、2または3)で特徴づけられる。
【００９８】
アミノ酸配列が、本発明の組成物および方法において機能的である十分な生物学的タンパク質活性を保持するかぎり、該配列がさらなる残基、例えばさらなるN-またはC-末端アミノ酸を含み、本質的に本明細書に記載の配列の一つに示されることも理解されよう。
【００９９】
組成物
本明細書に記載の二機能性HIR Ab-ASA融合抗体は、その別個の構成タンパク質の活性、すなわち、HIR AbのIR ECDとの結合およびASAの酵素活性、を高い割合で保持することが分かった。本明細書に記載のあらゆるタンパク質をコードするcDNAおよび発現ベクターの構築、およびその発現および精製も当業者のよく理解するところであり、本明細書、例えば実施例１〜３、およびBoado et al(2007)、Biotechnol Bioeng 96:381-391、米国特許出願No. 11/061,956、および米国特許出願No. 11/245,710に詳述されている。
【０１００】
本発明は、ASAと融合したBBBを通過することができる本明細書に記載のHIR Abを含む二機能性 HIR Ab-ASA融合抗体であって、HIR Abが血液脳関門を通過することができ、各ASAが分離した存在としてのその活性に比べて平均少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99、または100％を保持する、該抗体を開示する。ある態様において、本発明は、HIR AbおよびASAがそれぞれ、独立した存在としてのそれらの活性に比べて少なくとも平均約50％の活性を保持するHIR Ab-ASA融合抗体を提供する。ある態様において、本発明は、HIR AbおよびASAがそれぞれ、独立した存在としてのそれらの活性に比べて少なくとも平均約60％の活性を保持するHIR Ab-ASA融合抗体を提供する。ある態様において、本発明は、HIR AbおよびASAがそれぞれ、独立した存在としてのそれらの活性に比べて少なくとも平均約70％の活性を保持するHIR Ab-ASA融合抗体を提供する。ある態様において、本発明は、HIR AbおよびASAがそれぞれ、独立した存在としてのそれらの活性に比べて少なくとも平均約80％の活性を保持するHIR Ab-ASA融合抗体を提供する。ある態様において、本発明は、HIR AbおよびASAがそれぞれ、独立した存在としてのそれらの活性に比べて少なくとも平均約90％の活性を保持するHIR Ab-ASA融合抗体を提供する。ある態様において、HIR Abは、独立した存在としてのその活性に比べて、少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99、または100％の活性を保持し、ASAは、独立した存在としてのその活性に比べて、少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99、または100％の活性を保持する。したがって、本発明は、構成HIR AbおよびASAがそれぞれ該融合抗体の部分として、独立したタンパク質としてのその活性、すなわち、それぞれHIRとの結合およびASA活性と比べて、少なくとも平均約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99、または100％の活性を保持する、BBBを通過することができる二機能性 HIR Ab-ASA融合抗体を含む組成物を開示する。HIR Ab ASA融合抗体は、本明細書に記載のあらゆるHIR抗体 およびASAを含む融合タンパク質を表す。
本明細書に記載のHIR Ab-ASA融合抗体において、該抗体とASAの間の共有結合は、HIR Ab-ASA融合抗体がIRのECDと結合し、血液脳関門を通過することができ、ASAがその活性の治療的に有用な部分を保持しているかぎり、HIR抗体のカルボキシまたはアミノ末端とASAのアミノまたはカルボキシ末端でありうる。ある態様において、共有結合は、該抗体のHCとASAの間、または該抗体のLCとASAの間である。以下のあらゆる適切な結合を用いることができる：例えば、軽鎖のカルボキシ末端とASAのアミノ末端、重鎖のカルボキシ末端とASAのアミノ末端、軽鎖のアミノ末端とASAのアミノ末端、重鎖のアミノ末端とASAのアミノ末端、軽鎖のカルボキシ末端とASAのカルボキシ末端、重鎖のカルボキシ末端とASAのカルボキシ末端、軽鎖のアミノ末端とASAのカルボキシ末端、または重鎖のアミノ末端とASAのカルボキシ末端。ある態様において、該結合は、HCのカルボキシ末端とASAのアミノ末端である。
【０１０１】
ASAは標的抗体（例えば、MAb、HIR-MAb)とリンカーを介して融合または共有結合することができる。末端アミノ酸間の結合は、融合アミノ酸配列の部分を形成する介在ペプチドリンカー配列により達成することができる。該ペプチド配列リンカーは、長さが0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10アミノ酸、または10アミノ酸以上でありうる。ある態様において、ある好ましい態様において、該ペプチドリンカーは、長さが20以下、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸である。ある態様において、ある好ましい態様において、該ペプチドリンカーは、長さが少なくとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10アミノ酸である。ある態様において、ASAは、標的抗体と直接結合し、長さが0アミノ酸である。ある態様において、ASAと標的抗体を連結するリンカーがない。
【０１０２】
ある態様において、該リンカーは、グリシン、セリン、および/またはアラニン残基のあらゆる組み合わせまたは順番を含む。ある場合には、該リンカー中のグリシン、セリン、およびアラニン残基の混合率は、該リンカー中の残基の総数の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、または95％である。 ある好ましい態様において、該リンカー中のグリシン、セリン、およびアラニン残基の混合率は、該リンカー中の残基の総数の少なくとも50％、60％、70％、75％、80％、90％、または95％である。ある態様において、アミノ酸(天然または合成アミノ酸を含む)のあらゆる数の組み合わせを該リンカーに用いることができる。ある態様において、３個のアミノ酸リンカーを用いる。ある態様において、該リンカーは、配列Ser-Ser-Serを有する。ある態様において、２個のアミノ酸リンカーは、グリシン、セリン、および/またはアラニン残基のあらゆる組み合わせまたは順番を含む(例えば、Gly-Gly、Ser-Gly、Gly-Ser、Ser-Ser. Ala-Ala、Ser-Ala、またはAla-Serリンカー)。ある態様において、２個のアミノ酸リンカーは、１グリシン、セリン、および/またはアラニン残基と別のアミノ酸からなる(例えば、Ser-X、ここで、Xはあらゆる既知のアミノ酸である。)。さらに他の態様において、２-アミノ酸リンカーは、gly、ser、またはalaを除くあらゆる２個のアミノ酸(例えば、X-X)からなる。
【０１０３】
本明細書は、ある態様において、長さが２アミノ酸以上のリンカーを開示する。そのようなリンカーは、さらに本明細書に記載のごとく、グリシン、セリン、および/またはアラニン残基をあらゆる組み合わせまたは順序で含みうる。ある態様において、該リンカーは、 １グリシン、セリン、および/またはアラニン残基と他のアミノ酸からなる(例えば、Ser-nX、ここで、Xはあらゆる既知のアミノ酸である。ｎはアミノ酸の数である。)。さらに他の態様において、該リンカーは、あらゆる２個のアミノ酸(例えば、X-X)からなる。ある態様において、該あらゆる２個のアミノ酸は、あらゆる組み合わせまたは順序のGly、Ser、またはAlaであり、それらの間に介在するアミノ酸の変数内である。ある態様の１例において、該リンカーは、少なくとも１のGlyからなる。ある態様の１例において、該リンカーは少なくとも１のSerからなる。ある態様の１例において、該リンカーは、少なくとも１のAlaからなる。ある態様において、該リンカーは少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のGly、Ser、および/またはAla残基からなる。好ましい態様において、該リンカーは、反復配列中に、あらゆる組み合わせまたは数のGlyおよびSer（例えば、(Gly4Ser)3、または他の変化）を含む。
【０１０４】
本発明に用いるリンカーは、当該分野で知られたあらゆる方法を用いて設計することができる。例えば、融合タンパク質の操作において最適なアミノ酸リンカーを決定するための複数の公的に利用可能なプログラムがある。タンパク質の配列および該リンカーの望ましい長さを利用者が入力することにより最適リンカーのアミノ酸配列を自動的に作製する公的に利用可能なコンピュータープログラム(例えば、該リンカープログラム) を本発明の方法および組成物に用いることができる。しばしば、そのようなプログラムは、タンパク質サブドメイン結合天然リンカーの観察される傾向を用い、タンパク質操作に用いるための最適タンパク質リンカーを予測することができる。ある場合には、そのようなプログラムは、最適リンカーを予測する他の方法を用いる。本発明のためのリンカーを予測するのに適したプログラムの例は、当該分野で知られている。例えば、Xue et al.(2004) Nucleic Acids Res. 32、W562-W565(機能的融合タンパク質を構築するためのリンカー配列の設計を助けるLINKERプログラムとのインターネットリンクをもたらすWeb Server版) ； George およびHeringa,(2003)、Protein Engineering、15(11):871-879(リンカープログラムとのインターネットリンクをもたらし、タンパク質リンカーの合理的設計について記載する)； Argos,(1990)、J. Mol. Biol. 211:943-958； Arai et al.(2001) Protein Engineering、14(8):529-532； Crasto およびFeng,(2000) Protein Engineering 13(5):309-312参照。  
【０１０５】
該ペプチドリンカー配列はプロテアーゼ開裂部位を含むことができるが、これはASAの活性の必須要件ではなく、実際に、本発明のこれらの態様の利点は、二機能性 HIR Ab-ASA融合抗体がBBBを通過すると、開裂せずに輸送および活性に部分的または完全に活性であることである。図9は、HCがカルボキシ末端で３アミノ酸の「ser-ser-ser」リンカーを介してASAのアミノ末端と融合しているHIR Ab-ASA融合抗体アミノ酸配列の典型的態様を示す(配列番号10)。ある態様において、融合ASA配列は、図９に示すように18アミノ酸のシグナルペプチドを欠く。
【０１０６】
ある態様において、HIR Ab-ASA融合抗体はHCとLCの両方を含む、ある態様において、HIR Ab-ASA融合抗体は一価抗体である。他の態様において、HIR Ab-ASA融合抗体は本明細書の実施例に記載の二価抗体である。
【０１０７】
HIR Ab-ASA融合抗体の部分として用いるHIR Abは、グリコシル化または非グリコシル化であり得る。ある態様において、該抗体は、例えば、CHO細胞中で合成により生成されるグリコシル化パターンにグリコシル化される。
【０１０８】
本明細書において「活性」には、生物学的活性(例えば、BBBを通過する活性およびまたは治療的活性)、HIR AbのIR ECDに対する結合親和性またはASAの酵素活性が含まれる。
【０１０９】
BBBを通過するHIR Ab-ASA融合抗体の輸送は、標準的方法によりHIR AbのみがBBBを通過する輸送と比べることができる。例えば、モデル動物、例えば、哺乳動物、例えば霊長類によるHIR Ab-ASA融合抗体の薬物動態および脳への取り込みを用いることができる。同様に、ASA活性を測定するための標準モデルを用いてASAのみおよびHIR Ab-ASA融合抗体の部分としての機能を比較することもできる。例えば、ASA対HIR Ab-ASA融合抗体の酵素活性を証明する実施例４を参照。IR ECDに対する結合親和性を、HIR Ab-ASA融合抗体対HIR Abのみについて比較することができる。本明細書の実施例４を参照。 
【０１１０】
本発明には、本明細書に記載の１またはそれ以上のHIR Ab-ASA融合抗体および医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物も含まれる。医薬的に許容される担体/賦形剤の完全な考察は、Remington's Pharmaceutical Sciences、Gennaro、AR、ed.、20th edition、2000: Williams and Wilkins PA、USAに記載されている。本発明の医薬組成物には、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内注射； 経口、直腸、口腔、肺、経皮的、鼻内を含むあらゆる末梢経路、または他のあらゆる末梢投与経路による投与に適した組成物が含まれる。
【０１１１】
本発明の組成物は、注射用、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、または腹腔内投与用の医薬組成物として特に適している。本発明の水性組成物は、有効量の本発明組成物を含み、医薬的に許容される担体または水性媒質に溶解または分散させることができる。用語「医薬的にまたは薬理学的に許容される」は、動物、例えばヒトに適切に投与したときに有害、アレルギー、または他の不都合な反応を生じない分子的存在および組成物を表す。本明細書において、「医薬的に許容される担体」には、あらゆるすべての溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などが含まれる。そのような媒質および薬剤の医薬活性物質としての使用は当該分野でよく知られている。いかなる常套的媒質または薬剤も活性成分と不適合性である場合を除き、その治療的組成物への使用が予期される。補助的活性成分も該組成物に組み込むことができる。
【０１１２】
注射可能な組成物のための典型的医薬的に許容される担体は、塩、例えば、鉱酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など、および有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などを含むことができる。例えば、本発明の組成物は、界面活性剤、例えば0.01〜1％のポリソルベート-80、または炭水化物添加剤、例えばマンニトール、ソルビトール、またはトレハロースを用いるかもしくは用いることなく異なるpH（５〜８）の生理食塩水ベースの水性溶液に製剤化し、液体形で提供することができる。一般的に用いる緩衝剤には、ヒスチジン、酢酸塩、リン酸塩、またはクエン酸塩が含まれる。通常の保存および使用条件下で、これら調製物は、微生物の成長を防ぐための保存料を含むことができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、該組成物に吸収遅延剤、例えばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを用いることによりもたらすことができる。
【０１１３】
ヒト投与用の調製物は、FDAが要求する安定性、発熱、一般的安全性、および純度基準および他の規制機関の基準に適合する。活性化合物は、一般的に、非経口的投与用に製剤化、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、病巣内、または腹腔内経路を介する注射用に製剤化することができる。活性要素または成分を含む水性組成物の製造は、本発明の開示に照らして当業者が知ることができる。典型的には、そのような組成物は、注射剤（液体溶液または液体懸濁液）として製造することができ；注射前に液体を加えると溶液または懸濁液を製造するのに用いるのに適した個体形も製造することができ；また、該製剤を乳化させることもできる。
【０１１４】
無菌注射可能溶液は、適切な溶媒中の必要量の活性化合物を必要に応じて上記の種々の他の成分と組み合わせ、次いで濾過滅菌することにより製造される。一般的には、分散剤は、種々の無菌の活性成分を基本的分散媒質および上記の必要な他の成分を含む無菌ビークルに組み込むことにより製造される。無菌注射可能溶液を製造するための無菌粉末の場合は、製造方法には、活性成分およびあらゆるさらなる所望の成分の粉末をその種々の予め無菌濾過した溶液から生成する真空乾燥および凍結乾燥技術が含まれる。
【０１１５】
製剤化した溶液剤は、投与製剤と適合するように、本明細書に記載の基準に基づく医薬活性量で全身投与することができる。該製剤は、種々の剤形、例えば上記注射可能溶液の形で容易に投与されるが、薬剤放出カプセルなども用いることができる。
【０１１６】
投与する医薬組成物の適切な品質、治療回数、および単位用量は、本明細書に記載のHIR Ab-ASA融合抗体のCNS取り込み特性に応じ、治療する対象、対象の状態、および目的とする効果に応じて変化しうる。いずれにしても、投与に関与する人は、個体対象に対する適切な用量を決定することができる。
【０１１７】
非経口的投与、例えば静脈内または筋肉内注射用に製剤化した化合物に加え、限定されるものではないが以下を含む本発明の他の代替投与法も用いることができる： 皮膚内投与(U.S. Pat. No. 5,997,501； 5,848,991； および5,527,288参照)、肺投与(U.S. Pat. Nos. 6,361,760； 6,060,069； および6,041,775参照)、バッカル投与(U.S. Pat. Nos. 6,375,975； および6,284,262参照)、経皮的投与(U.S. Pat. No. 6,348,210； および6,322,808) およびtransmucosal投与(See U.S. Pat. No. 5,656,284参照)。そのような投与方法は当該分野でよく知られている。例えば、経鼻溶液またはスプレー、エアロゾル、または吸入剤を用いて本発明の鼻内投与を用いることもできる。経鼻溶液剤は、通常、滴剤またはスプレー剤で鼻腔に投与するよう設計された水性溶液である。経鼻溶液剤は、多くの面で鼻分泌物と同様であるように製造される。すなわち、水性経鼻溶液剤は、通常、等張でわずかに緩衝されてpH5.5〜6.5に維持される。さらに、該製剤は、必要であれば、眼科用製剤に用いるものと同様の抗菌保存料および適切な薬剤安定化剤を含みうる。種々の市販の経鼻製剤が知られており、これには抗生物質および抗ヒスタミン剤などが含まれ、喘息予防に用いられる。
【０１１８】
他の投与方法に適したさらなる製剤には坐剤およびペッサリーが含まれる。直腸ペッサリーまたは坐剤を用いることもできる。坐剤は、通常、直腸または尿道に挿入するための通常の状態で投薬される種々の重量および形の固体剤形である。挿入後に坐剤は腔内液中で軟化し、融解し、または溶解する。坐剤用の従来の結合剤および担体は、一般的にはポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドなどを含み、そのような坐剤は、あらゆる適切な範囲、例えば0.5％〜10％、好ましくは1％〜2％の範囲の活性成分を含む混合物から形成することができる。
【０１１９】
経口用製剤は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常用いる賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液剤、サスペンジョン剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤または粉末剤の形をとる。ある特定の態様において、経口医薬組成物は、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体を含むか、またはハードまたはソフトシェルゼラチンカプセル中に封入されるか、圧縮して錠剤とするか、または食事療法の食品に直接組み込むことができる。経口的治療的投与用の活性化合物に賦形剤を組み込み、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、サスペンジョン剤、シロップ剤、 ウエハースなどの形で用いることができる。そのような組成物および製剤は、少なくとも0.1％の活性化合物を含むことができる。該組成物および製剤の割合は、もちろん変化し、通常、単位重量の約2〜約75％または約25〜60％であり得る。そのような治療的に有用な組成物の活性化合物の量は、適切な用量が得られるような量である。
【０１２０】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは以下のものも含むことができる：結合剤、例えば、ガムトラガカント、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチン；賦形剤、例えばリン酸二カルシウム；崩壊剤、例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸など；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；および甘味料、例えば、ショ糖、ラクトース、またはサッカリン；または香味剤、例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油、またはチェリー香味料。単位剤形がカプセル剤である場合は、上記物質に加えて液体担体を含むことができる。種々の他の物質は、コーティングとして、または用量単位の物理的形を修飾するために存在することができる。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤をセラック、糖、またはその両方でコートすることができる。エリキシルのシロップは、活性化合物、甘味料としてショ糖、保存料としてメチレンおよびプロピルパラベン、色素、および香味剤、例えばチェリーまたはオレンジ香味料を含みうる。ある態様において、経口医薬組成物は、胃の環境から活性成分を保護するために腸溶コートすることができる。腸溶コーティング法および製剤は当該分野でよく知られている。
【０１２１】
方法
本発明は、本明細書に記載のごとく治療的有効量のHIR Ab-ASA融合抗体を全身投与することによりBBBを通過してCNSに有効量のASAを送達する方法を開示する。HIR Ab-ASA融合抗体を送達するための適切な全身用量は、本明細書に記載の、CNS取り込み特性およびASA比活性に基づく。ASA不足に罹患した対象に対するHIR Ab-ASA融合抗体の全身投与は、CNSにASAを非侵襲的に送達するための有効なアプローチである。
HIR-ASA融合抗体の量、すなわち、HIR Ab-ASA融合抗体の治療的有効全身用量は、一部、本明細書に記載の投与するHIR-ASA融合抗体のCNS取り込み特性、CNSに取り込まれる全身投与した用量の割合に依存する。
【０１２２】
ある態様において、全身投与したHIR Ab-ASA融合抗体の1％(すなわち、約0.3％、0.4％、0.48％、0.6％、0.74％、0.8％、0.9％、1.05、1.1、1.2、1.3％、1.5％、2％、2.5％、3％、または約0.3％〜約3％のあらゆる％) が、BBBを通過して末梢血から取り込まれて脳に送達される。ある態様において、全身投与したHIR Ab-ASA融合抗体の少なくとも0.5％,(すなわち、約0.3％、0.4％、0.48％、0.6％、0.74％、0.8％、0.9％、1.05、1.1、1.2、1.3％、1.5％、2％、2.5％、3％、または約0.3％〜約3％のあらゆる％)が、全身投与後２時間以内、すなわち、1.8、1.7、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、0.9、0.8、0.6、0.5、または約0.5〜約２時間のあらゆる他の時間で脳に送達される。
【０１２３】
したがって、ある態様において、本発明は、BBBを通過するHIR Ab-ASA融合抗体の量が少なくとも3ng ASAタンパク質/mg対象脳中タンパク質、例えば、3、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、40、50ng ASAタンパク質/mg対象脳中タンパク質または3〜50ng ASAタンパク質/mg対象脳中タンパク質のあらゆる他の値となる治療的有効量のHIR Ab-ASA融合抗体の全身投与方法を提供する。
【０１２４】
ある態様において、対象脳に送達されるASA活性の総単位数は、少なくとも0.5ミリ単位/グラム脳、例えば、少なくとも0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5または約0.5〜5ミリ単位 送達ASA活性/グラム脳のあらゆる他のすべてのASA単位数である。
ある態様において、医薬的有効全身用量には、少なくとも50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500単位 ASA活性/脳、または約50〜2500単位ASA活性/脳のあらゆる他の全身用量が含まれる。
【０１２５】
他の態様において、医薬的有効全身用量は、少なくとも約10単位 ASA活性/kg体重、少なくとも約10、12、15、18、25、30、50、75、100、150、200、250単位 ASA活性/kg体重、または約5〜250単位 ASA活性/kg体重のあらゆる他のASA単位数である。
【０１２６】
当業者は、一部、ASA比活性に依存すると理解するだろう。ある態様において、HIR Ab-ASA融合抗体のASA比活性は、少なくとも10 U/mgタンパク質、少なくとも約10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50 U/mgタンパク質、または約10単位/mg〜約50単位/mgのあらゆる他の比活性値である。
【０１２７】
すなわち、HIR Ab-ASA融合抗体の比活性および治療する対象の体重を十分考慮して、HIR Ab-ASA融合抗体の全身用量は、少なくとも5mg、例えば、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、100、125mg U/mgタンパク質、または約5mg〜約125mg U/mgタンパク質のあらゆる他の値である。 
【０１２８】
本明細書において用語「全身投与」または「末梢投与」は、CNSに直接投与しない、すなわち、BBBの物理的透過または崩壊を伴わないあらゆる投与方法を含む。「全身投与」は、限定されるものではないが、静脈内、動脈内 筋肉内、皮下、腹腔内、鼻内、口腔、経皮的、直腸、経肺胞(吸入)、または経口投与を含む。本明細書に記載のあらゆる適切なHIR Ab-ASA融合抗体を用いることができる。
【０１２９】
本明細書に記載のASA欠乏症は、異染性白質ジストロフィーとして知られる１またはそれ以上の病状を含む。ASA欠乏症は、身体(心臓、肝臓、脳など)で生じるスルファチドの増加を特徴とする。  
【０１３０】
本発明の組成物、例えばHIR Ab-ASA融合抗体は、組み合わせ療法の部分として投与することができる。該組み合わせ療法は、本発明の組成物を、ASA欠乏症に罹患した患者に通常みられる症状を治療または軽減するための別の療法と組み合わせて投与することを含む。本発明の組成物を別のCNS疾患のための方法または組成物と組み合わせて用いる場合は、本発明の組成物とさらなる方法または組成物のあらゆる組み合わせを用いることができる。すなわち、例えば、本発明の組成物を別のCNS疾患治療薬と組み合わせて用いる場合は、二つを、同時に、連続的に、重複する期間、同様の、同じ、または異なる頻度などで投与することができる。ある場合には、本発明の組成物を１またはそれ以上の他のCNS疾患治療剤と組み合わせて含む組成物を用いることができる。
【０１３１】
ある態様において、該組成物、例えばHIR Ab-ASA融合抗体は、同じ製剤または別の組成物で別の投薬を受けた患者に同時投与される。例えば、HIR Ab-ASA融合抗体を別の融合タンパク質とともに製剤化し、ASA以外の組換えタンパク質がヒト血液脳関門を通過して送達されるように設計することもできる。さらに、該融合HIR Ab-ASA融合抗体は他の大分子または小分子と組み合わせて製剤化することができる。
実施例
【０１３２】
以下の具体例は、単に例示であって、本開示の残りの部分を何ら限定するものではない。さらに詳述することなく、当業者は、本明細書の記載に基づいて本発明を最大限に利用することができると考えられる。本明細書に記載のすべての刊行物は、本明細書の一部を構成する。URLまたは他のそのような識別子またはアドレスを参照する場合、そのような識別子は変化しうるし、該インターネット上の特定の情報は移り変わりうるが、等価な情報はインターネットを検索することにより見出すことができると理解される。これに対する参照は、そのような情報の利用可能性および公共への普及を示す。
【実施例１】
【０１３３】
HIR Ab-GUSB融合タンパク質の発現および機能的分析
Sly症候群とも呼ばれるMPS-VII において突然変異したリソゾーム酵素はβ-グルクロニダーゼ(GUSB)である。MPS-VIIは、脳のグルコソアミノグリカンの蓄積をもたらす。GUSB酵素はBBBを通過しないので、MPS-VIIの酵素置換療法(ERT)は脳の治療に有効ではないようである。BBBを通過するヒトGUSBを再操作する努力において、HIR Ab-GUSB融合タンパク質プロジェクトを開始した。 
【０１３４】
22アミノ酸シグナルペプチドおよび18アミノ酸のカルボキシル末端プロペプチドを含むヒトGUSBタンパク質(NP_000172)のアミノ酸 Met1-Thr651に対応するヒトGUSB cDNAは、逆転写(RT)ポリメラーゼ鎖反応(PCR)およびカスタムオリゴデキソイヌクレオチド(ODNs)によりクローニングされた。PCR生成物を1％アガロースゲル電気泳動で決定し、ヒトGUSB cDNAに対応する〜2.0 kbの予期される主な１本のバンドを単離した。クローニングしたヒトGUSBを真核性発現プラスミドに挿入し、このGUSB発現プラスミドをpCD-GUSBと名付けた。該プラスミドの完全発現カセットを双方向性DNAシーケンシングにより確認した。pCD-GSUBを用いる６ウェルフォーマット中のCOS細胞のトランスフェクションは、7日間の順化培地中で高GUSB酵素活性をもたらし(表1、実験A)、機能的ヒトGUSB cDNAの成功裡の操作を証明した。GUSB酵素活性は、市販されている4-メチルウベリフェリルβ-L-グルクロニド(MUGlcU)を用いる蛍光分析アッセイにより測定した。この基質をGUSBで4-メチルウンベリフェロン(4-MU)に加水分解し、4-MUを、放射波長450nmおよび励起波長365nmで蛍光光度計により蛍光分析的に検出する。既知量の4-MUを用いて標準曲線を構築した。該アッセイは、37℃、pH=4.8で60分間インキュベーションして行い、グリシン-炭酸塩緩衝液(pH=10.5)を加えて終了した。
【０１３５】
HIR Abの重鎖(HC)のカルボキシル末端を、22アミノ酸 GUSBシグナルペプチドおよび18アミノ酸カルボキシル末端GUSBプロペプチドを欠くヒトGUSBのアミノ末端と融合する融合タンパク質を発現する新規pCD-HC-GUSBプラスミド発現プラスミドを操作した。GUSB cDNAをpCD-GUSBをテンプレートに用いるPCRによりクローニングした。フォワードPCRプライマーは、オープンリーディングフレームを維持し、HIR Ab HCのCH3領域のカルボキシル末端と、22アミノ酸シグナルペプチドを欠くGUSBのアミノ末端の間にSer-Serリンカーを導入するための「CA」ヌクレオチドを導入する。GUSBリバースPCRプライマーは、成熟ヒトGUSBタンパク質の末端Thrの直後に終止コドン「TGA」を導入する。pCD-HC-GUSBの発現カセットのDNAシーケンシングは、714ntサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、9 nt Kozak部位(GCCGCCACC)、3,228nt HC-GUSB融合タンパク質オープンリーディングフレーム、および370ntウシ成長ホルモン(BGH)転写終止配列を含む4,321ヌクレオチド(nt)を含んでいた。該ペプチドは、19アミノ酸 IgGシグナルペプチド、443アミノ酸 HIRMAb HC、2アミノ酸リンカー(Ser-Ser)、および酵素シグナルペプチドおよびカルボキシル末端プロペプチドを欠く611アミノ酸ヒトGUSBからなる1,075アミノ酸タンパク質をコードした。該GUSB配列は、ヒトGUSB(NP_000172)のLeu23-Thr633と100％同一であった。グリコシル化を欠く重鎖融合タンパク質の予測分子量は119,306Daであり、予測等電点(pI)は7.83であった。
【０１３６】
COS細胞を6ウェルクラスターディッシュに播き、pCD-LCおよびpCD-HC-GUSBで二重にトランスフェクトした。pCD-LCは、キメラHIR Abの軽鎖(LC)をコードする発現プラスミドである。トランスフェクションは、Lipofectamine（リポフェクタミン）2000を用い、ug DNA：uL Lipofectamine 2000比1:2.5で行い、順化無血清培地を3および7日に回収した。しかしながら、COS細胞をpCD-HC-GUSBおよびpCD-LC発現プラスミドで二重トランスフェクションした後にGUSB酵素活性の特異的増加はみられなかった(表1、実験B)。しかしながら、ヒトIgG-特異的ELISAにより測定した培地のIgGはわずか23±2 ng/mLであり、該培地中の低いGUSB活性は、HIRMAb-GUSB融合タンパク質の分泌の低さに起因するかもしれない。したがって、COS細胞のトランスフェクションを10xT500プレートにスケールアップし、HIRMAb-GUSB融合タンパク質をプロテインAアフィニティクロマトグラフィにより精製した。IgGウエスタンブロッティングは、融合タンパク質重鎖のサイズの予期した増加を示した。しかしながら、HIRMAb-GUSB融合タンパク質のGUSB酵素活性は、6.1±0.1 nmol/hr/ugタンパク質と低かった。対照的に、ヒト組換えGUSBの該比活性は2,000 nmol/hr/ugタンパク質である[Sands et al(1994)Enzyme replacement therapy for murine mucopolysaccharidosis type VII. J Clin Invest 93、2324-2331]。これらの結果は、HIR Ab-GUSB融合タンパク質のGUSB酵素活性がGUSBとHIR AbのHCのカルボキシル末端の融合後に＞95％失われたことを示した。HIR Ab-GUSB融合タンパク質のHIRの細胞外ドメイン(ECD)との結合親和性をELISAで試験した。HIR ECDで不可逆的にトランスフェクションしたCHO細胞を無血清培地(SFM)中で増殖させ、HIR ECDを小麦胚芽凝集素アフィニティカラムで精製した。HIR ECDを96ウェルディッシュに播き、HIR AbおよびHIR Ab-GUSB融合タンパク質とHIR ECDとの結合を、ビオチン化ヤギ抗ヒトIgG(H+L)二次抗体、次いで、アビジンおよびビオチン化パーオキシダーゼを用いて検出した。50％最大結合をもたらすタンパク質の濃度、ED50を非線形回帰分析により決定した。HIRレセプターアッセイは、 611アミノ酸 GUSBのHIRMAb重鎖のカルボキシル末端との融合後にHIRに対する親和性の減少がみられないことを示した。HIR ECDとHIR Abとの結合ED50は0.77±0.10 nMであり、HIR Ab-GUSB融合タンパク質の結合ED50は0.81±0.04 nMであった。
【０１３７】
簡単には、GUSBとHIR Ab HCのカルボキシル末端の融合は、該融合タンパク質とHIRとの結合親和性の損失をもたらさなかった。しかしながら、該融合タンパク質のGUSB酵素活性は＞95％低下した。
HIR AbとGUSBの融合タンパク質を成功裡に生成するために、GUSBシグナルペプチドを含む成熟ヒトGUSBのカルボキシル末端をHIR AbのHCのアミノ末端と融合する新たなアプローチを実施した。この融合タンパク質をGUSB-HIR Abと呼んだ。第一工程は、この新融合タンパク質をコードする新たな発現プラスミドを操作することであり、このプラスミドをpCD-GUSB-HCと呼んだ。pCD-GUSB-HCプラスミドは、19アミノ酸シグナルペプチドを欠くHIRMAbの重鎖(HC)のアミノ末端を、22アミノ酸 GUSBシグナルペプチドを含み18アミノ酸 カルボキシル末端 GUSBプロペプチドを欠くヒトGUSBのカルボキシル末端と融合させた融合タンパク質を発現する。pCD-GUSBベクターを、22アミノ酸 GUSBシグナルペプチドを含みGUSB カルボキシル末端に18アミノ酸プロペプチドを欠くGUSBタンパク質を発現するGUSB cDNAのPCR増幅のテンプレートに用いた。pCD-GUSB中のGUSB 18アミノ酸カルボキシル末端プロペプチドを、部位指向性突然変異誘発(SDM)により除去した。後者は、GUSBのThr633残基の3’隣接領域のAfeI部位を生じ、pCD-GUSB-AfeIと呼んだ。次に、カルボキシル末端プロペプチドをAfeI およびHindIII(GUSBの3’-非コーディング領域に位置する)で除去した。19アミノ酸 IgGシグナルペプチドを欠き、HIRMAb HC終止コドンを含むHIRMAb HCオープンリーディングフレームを、HIRMAb HC cDNAをテンプレートに用いるPCRにより作製した。PCRで作製したHIRMAb HC cDNAをpCD-GUSB-AfeIのAfeI-HindIII部位に挿入しpCD-GUSB-HCを形成した。GUSBのカルボキシル末端とHIRMAb HCのアミノ末端の間のSer-Serリンカーを、HIRMAb HC cDNAのクローニングに用いるためのPCRプライマーによりAfeI部位内に導入した。pCD-GUSB-HC発現カセットのDNAシーケンシングは、22アミノ酸 GUSBシグナルペプチド、611アミノ酸 GUSB、2アミノ酸リンカー(Ser-Ser)、および443アミノ酸 HIRMAb HCからなる1,078アミノ酸タンパク質を発現するプラスミドを示した。GUSB配列は、ヒトGUSB(NP_000172)のMet1-Thr633と100％同一であった。
【０１３８】
pCD-LC およびpCD-GUSB-HC発現プラスミドを用いる6ウェルフォーマット中のCOS細胞の二重トランスフェクションは、７日の順化培地中でpCD-LCおよびpCD-HC-GUSBプラスミドによる二重トランスフェクションに比べてより高いGUSB酵素活性を生じた(表1、実験C)。しかしながら、ELISAで測定した７日の順化培地中の培地ヒトIgG濃度はわずか13±2 ng/mLであり、GUSB-HIRMAb融合タンパク質もCOS細胞による分泌は乏しかった。COS細胞のトランスフェクションを10xT500プレートにスケールアップし、GUSB-HIRMAb融合タンパク質をプロテインAアフィニティクロマトグラフィにより精製した。SDS-PAGEは、融合タンパク質重鎖サイズの予期した増加を示した。精製GUSB-HIRMAb融合タンパク質のGUSB酵素活性は226±8 nmol/hr/ugタンパク質と高く、これはHIRMAb-GUSB融合タンパク質の特異的GUSB酵素活性より37倍高かった。しかしながら、HIRレセプターアッセイは、GUSBとHIRMAb重鎖のアミノ末端の融合後にHIRに対する親和性の顕著な低下があることを示した（レセプター結合親和性の95％の低下を示した）。HIR ECDに対するHIR Ab結合のED50は、0.25±0.03 nMであり、HIR Ab-GUSB融合タンパク質の結合のED50は4.8±0.4 nMであった。
【０１３９】
まとめると、GUSBとHIR Ab HCのアミノ末端の融合は、該融合タンパク質のGUSB酵素活性の保持をもたらしたが、GUSB-HIR Ab融合タンパク質のHIRに対する結合は95％低下をもたらした。対照的に、GUSBとHIR Ab HCのカルボキシル末端の融合は、HIR Ab-GUSB融合タンパク質のHIRに対する結合親和性の損失をもたらさなかった。しかしながら、この融合タンパク質のGUSB酵素活性は＞95％低下した。これらの知見は、IgG-酵素融合タンパク質の二機能性が保持される、すなわち、IgG部分の同種抗原に対する高い結合親和性および高い酵素活性が保持されるように、リソゾーム酵素のIgG分子との融合に関する当該分野における予期し得ない性質を示す。
【０１４０】
表1．トランスフェクション後のCOS細胞中のGUSB酵素活性[平均±SE(n=3ディッシュ/ポイント)]
2018019709.tif 000003
【実施例２】
【０１４１】
ヒトHIR Ab重鎖-ASA融合タンパク質発現ベクターの構築
異染性白質ジストロフィー(MLD)において突然変異したリソゾーム酵素は、アリールスルファターゼA(ASA)である。MLDは、脳中、特にミエリン鞘中のスルファチドの蓄積をもたらす。ASA酵素はBBBを通過しないので、MLDの酵素置換療法は脳の治療に効果がないようである。ASAをHIR Abと融合し、BBBを通過し、酵素活性を示すことができる二機能性分子を開発した。ある態様において、成熟ASAのアミノ末端をHIR Abの各重鎖のカルボキシル末端と融合する(図2)。
【０１４２】
ASAをHIR Abと融合したときにASAの酵素活性が保持されるか否かは不明であった。上記IgG-GUSB融合タンパク質の経験は、当該分野における予期し得ない性質、およびIgG-酵素融合タンパク質の構築後にIgG部分または該リソゾーム酵素部分のいずれかの生物活性が失われる可能性を示す。ASA酵素は、該タンパク質の翻訳後修飾（アミノ末端付近のCys残基(配列番号10のCys-515)が小胞体内で翻訳後修飾を受ける）があるまで触媒的に活性になり、ASAがHIR Abと融合したときにそのプロセスが損なわれるか否か不明であったため、ASAを用いる状況はより一層複雑である。ASAは、スルファターゼのファミリーのメンバーであり、該酵素の活性は、小胞体中で、スルファターゼ修飾因子タイプ1(SUMF1)（ホルミルグリシン生成酵素(FGE)とも呼ばれる）により特定のCys残基をホルミルグリシン残基に変換した後に活性化される[Takakusaki et al、Coexpression of formylglycine-generating enzyme is essential for synthesis and secretion of functional arylsulfatase in a mouse model of metachromatic leukodystrophy. Human Gene Ther. 16(2005) 929-936]。内部システインのホルミルグリシン残基へのこの変換がなければ該酵素は不活性である。例えば、融合タンパク質のHIRに対する高い結合親和性を保持するために、ASAをHIR AbのHCのカルボキシル末端と融合すると、IgG重鎖は、宿主細胞内で翻訳され、次いで融合タンパク質のASA部分のホールディング後に、三次元構造にホールディングされる。HIR Ab HC-AS融合タンパク質のASA部分が、小胞体中のASA修飾因子により認識され、活性化され、HIR Ab-ASA融合タンパク質の完全なASA酵素活性の発現をもたらす三次元構造にホールディングされるか否かについては不明であった。
【０１４３】
ヒトアリールスルファターゼA(ARSA)のcDNAを、ヒトASA mRNA(GenBank受託番号NM_000487)のヌクレオチド配列由来のオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)を用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により生成した。シグナルペプチドのArg19-Ala-507を欠くヒトASAをコードするcDNAを、表２に記載のODNおよび市販のヒト肝臓ポリA＋RNAを用いる逆転写(RT) PCRにより生成した。フォワード(FOR)ODNプライマーは、5’隣接領域に、TV発現ベクター中にヒトIgG1のCH3領域を有するオープンリーディングフレーム(orf)を維持し、ヒトIgG1-CH3とASA cDNAの間にSer-Serリンカーを導入するための「CC」を有する。リバース(REV) ODNは、ASA orfの末端と相補的であり、終止コドンTGAを有する。RT-PCRを完結し、次いで、ASA orf cDNAに対応する〜1.5kbの予期した１本のバンドをアガロースゲル電気泳動により検出し(図3、レーン1)、ゲルを精製した。フォワードODNおよびリバースODNの両方をホスホリル化し、発現ベクター中に直接挿入する。ASA cDNAを、前駆体TV、pUTV-1のHpaI部位にT4 DNAリガーゼを用いて挿入し、図４に示すTV-HIRMAb-ASAを形成した。pUTV-1をHpaIにより線状にし、アルカリホスファターゼで消化して自己結合を防いだ。TV-HIRMAb-ASAは、HIRMAb-ASA融合タンパク質の軽鎖(LC)および重鎖(HC)の両方の遺伝子、次いでネズミジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子を含むタンデムベクターである。HIRMAb-ASA融合タンパク質の軽鎖および重鎖の遺伝子は、CMVプロモーターにより誘導され、orfsにウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化配列が続く。DHFR遺伝子は、SV40プロモーターの影響下にあり、B型肝炎ウイルス(HBV)ポリアデニル化終止配列を有する。TV-HIRMAb-ASAプラスミドのDNA配列は、Midland(Midland、TX)で合成したカスタムODNを用いてMWG Biotech、Inc.(Huntsville、AL)で行った双方向性DNAシーケンシングにより確認した。ASAモノマーの各HCのカルボキシル末端との融合を図２に示す。該プラスミドの完全発現カセットを両鎖のシーケンシングにより確認した。
【０１４４】
表２．シグナルペプチドを欠くヒトアリールスルファターゼA(ASA)のRT-PCRクローニングおよびヒトASA mRNA配列(GenBank NM_000487)由来HIRMAb-ASA 発現ベクターの操作に用いるオリゴデオキシヌクレオチドプライマー
ASA FWD：ホスフェート-CCCGTCCGCCCAACATCGTGCT   (配列番号NO.11)
ASA REV：ホスフェート-TCAGGCATGGGGATCTGGGCAATG (配列番号NO.12)
【０１４５】
LC遺伝子、HC-ASA遺伝子、およびDHFR遺伝子の発現カセットを含む9,999ヌクレオチド(nt)を含むTV-HIRMAb-ASAプラスミドのDNAシーケンシング(図4)。該プラスミドは、5’末端で始めて、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、9nt完全Kozak部位、GCCGCCACC(配列番号13のnt1〜9)、LCの705ntオープンリーディングフレーム(orf)(配列番号13のnt10〜714)、次いでウシ成長ホルモン(BGH)ポリA配列、次いで、リンカー配列、次いでタンデムCMVプロモーター、次いで完全Kozak部位(配列番号14のnt1〜9)、次いで2,862nt HIRMAb HC-AS融合タンパク質orf(配列番号14のnt10〜2871)、次いでタンデムBGHポリA配列、次いでSV40プロモーター、次いで完全Kozak部位(配列番号15のnt1〜9)、次いで564ntのDHFR orf(配列番号15のnt10〜573)、次いでB型肝炎ウイルスポリA配列からなった(図4)。TVは、20アミノ酸シグナルペプチドを含む214アミノ酸 HIRMAb LC(配列番号8)；HIRMAb HCおよびASAの953アミノ酸タンパク質融合タンパク質 (配列番号10)をコードした。該融合タンパク質HCは、19アミノ酸 IgGシグナルペプチド、442アミノ酸 HIRMAb HC、3アミノ酸リンカー(Ser-Ser-Ser)、および酵素シグナルペプチドを欠く489アミノ酸ヒトASAからなった。グリコシル化を欠く重鎖融合タンパク質の予測分子量は100,637Daであり、予測等電点(pI)は6.43であった。HC融合タンパク質のASAドメインのアミノ酸配列は、該融合タンパク質のASAドメイン内にT391S多型があるのを除き、ヒトASA(NP_000478)のアミノ酸21〜509の配列と100％同一である。この残基はトレオニン(TまたはThr)残基であることが多いが、セリン(SまたはSer)残基であることも知られている。T391S多型はASAの酵素活性に影響がない(S. Regis et al、Contribution of arylsulfatase A mutations located on the same allele to enzyme activity reduction and metachromatic leukodystrophy severity、Hum.Genet. 110: 351-355、2002)。
【実施例３】
【０１４６】
チャイニーズハムスター卵巣細胞のTV-HIRMAb-ASAによる安定なトランスフェクション
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を、1 x HT添加物(ヒポキサンチンおよびチミジン)を含む無血清HyQ SFM4CHOユーティリティ培地(HyClone)中で増殖させた。CHO細胞(5 x 106生細胞)を、5μg PvuI線状化TV-HIRMAb-ASAプラスミドDNAを用いてエレクトロポーレーションした。次に、細胞-DNAサスペンジョンを氷上で10分間インキュベートした。細胞を、CHO細胞用のBioRadプリセットプロトコール、すなわち、15msecおよび160ボルトのパルスの方形波でエレクトロポーレーションした。エレクトロポーレーション後、細胞を氷上で10分間インキュベートした。細胞サスペンジョンを4 x 96ウェルプレートに125 μl/ウェル(10,000細胞/ウェル)で播いた。１試験あたり合計10エレクトロポーレーションを4,000ウェルに実施した。
【０１４７】
エレクトロポーレーション(EP)後、CHO細胞を、37℃および8％CO2のインキュベーター中に置いた。TV中のneo遺伝子の存在に応じて、トランスフェクションした細胞株を最初にG418にて選択した。TV-HIRMAb-ASAはDHFRの遺伝子も含み(図4)、トランスフェクションした細胞は20nMメトトレキセート(MTX)およびHT枯渇培地を用いても選択した。EP後約21日間で可視的クローンが検出されたら、順化培地をELISAによるヒトIgG用にサンプリングした。ELISAにおいて高ヒトIgGシグナルのウェルを、96ウェルプレートから1mLのHyQ SFM4CHO-Utilityを入れた24ウェルプレートに移した。24ウェルプレートを37℃および8％CO2のインキュベーターに戻した。翌週、24ウェルプレート中のクローンについてIgG ELISAを行った。これを、6ウェルプレートからT75フラスコ、最終的にオービタルシェーカー上の60mLおよび125mLの正方形プラスチックボトルで反復した。この段階で、最終MTX濃度は80nMであり、培地中のHIRMAb-ASA融合タンパク質の尺度である培地IgG濃度は、細胞密度106/mLで＞10mg/Lであった。
【０１４８】
希釈クローニング(DC)で選択したクローンをインキュベーター中のオービタルシェーカーから取り出し、無菌フードに移した。細胞を、5％透析ウシ胎児血清(d-FBS)およびペニシリン/ストレプトマイシンを含むF-12K培地で500mLに希釈し、40 x 96ウェルプレートの4,000ウェルに１細胞/ウェル（CPW）の細胞密度で播くことができるよう最終希釈液を8細胞/mLとした。細胞サスペンジョンを調整したら、無菌フード内で125uLアリコートを８チャンネルピペッターまたは精密ピペッターシステムを用いて96ウェルプレートの各ウェルに分配した。該プレートを37℃および8％CO2のインキュベーターに戻した。1細胞/ウェルに希釈した細胞は血清なしに生存することができない。第6日または第7日に、DCプレートをインキュベーターから取り出し、無菌フードに移し、5％透析ウシ胎児血清(d-FBS)含有F-12K培地125μlを各ウェルに加えた。この選択培地は、5％d-FBS、30nM MTXおよび0.25mg/mLジェネチシンを含有した。最初の1CPWを接種後21日目に、4,000ウェルの各ウェルからアリコートをロボット装置を用いてヒトIgG ELISA用に取り出した。DCプレートをインキュベーターから取り出し、無菌フードに移し、8チャンネルピペッターまたは精密ピペッター装置を用いて100μlの培地を96ウェルプレートの各ウェルから取り出し、新たな無菌サンプル96ウェルプレート内に移した。
【０１４９】
最初の1CPWを接種後20日目に、40 x 96ウェルイムノアッセイプレートに0.1M NaHCO3中の一次抗体、マウス抗ヒトIgGの1μg/mL溶液100uLを接種した。プレートを4℃の冷蔵庫中で一夜インキュベートする。翌日、ELISAプレートを1x TBSTで５回洗浄し、次いで、100uLの二次抗体の1ug/mL溶液およびブロッキング緩衝液を加えた。プレートを1x TBSTで５回洗浄した。1mg/mLの0.1Mグリシン緩衝液中4-ニトロフェニルホスフェートジ(2-アミノ-2-エチル-1,3-プロパンジオール)塩100uLを96ウェルイムノアッセイプレートに加える。プレートをマイクロプレートリーダーで測定した。該アッセイは、4,000ウェル/実験のIgGアウトプットデータをもたらした。最高値を示す24〜48ウェルをさらに増殖させるために選んだ。
【０１５０】
1 CPW DCから最高値を示す24ウェルプレートを無菌フードに移し、6ウェルディッシュ、T75フラスコ、およびオービタルシェーカー上の125 mL正方形プラスチックボトルにて徐々にサブクローニングした。このプロセス中、細胞の遠心分離の最終段階で血清をゼロに減少させ、SFM中に再浮遊させた。
【０１５１】
上記方法を二回目の0.5〜1細胞/ウェル(CPW)の希釈クローニングで反復した。この段階で、ウェルの約40％が何らかの細胞増殖を示し、増殖を示すすべてのウェルがヒトIgGも分泌した。これらの結果は、これらの方法では、１ウェル当たり平均１個の細胞のみが接種され、CHO細胞株が１個の細胞に由来することを確認した。
【０１５２】
HIR Ab-ASA融合タンパク質は、安定にトランスフェクションしたCHO細胞により、細胞密度1〜2ｘ106細胞/mLで培地濃度10〜20mg/Lの高い量で培地に分泌された。宿主細胞を該融合タンパク質遺伝子およびSUMF1をコードする遺伝子で二重トランスフェクションしていないにも関わらず、安定にトランスフェクションしたCHO細胞によるHIR Ab-ASA融合タンパク質の高い生産がみられた。ASA遺伝子でトランスフェクションした細胞では、トランスフェクションした宿主細胞による順化培地へのASAの分泌を検出するためにSUMF1補助因子で同時トランスフェクションする必要があった[Takakusaki et al、Coexpression of formylglycine-generating enzyme is essential for synthesis and secretion of functional arylsulfatase in a mouse model of metachromatic leukodystrophy. Human Gene Ther. 16(2005) 929-936]。ASAおよびIgG-ASA融合タンパク質を操作する予期し得ない利点は、SUMF1の同時トランスフェクションを必要とせずに宿主細胞が該融合タンパク質を分泌することである。
【０１５３】
CHO由来HIRMAb-ASA融合タンパク質をプロテインAアフィニティクロマトグラフィにより精製した。HIRMAb-ASA融合タンパク質の純度は、それぞれ図10Aおよび10Bに示す還元および非還元SDS-PAGEにより確認した。HCおよびLCタンパク質のみを、HIRMAb単独またはHIRMAb-ASA融合タンパク質について検出する。該融合タンパク質の同一性は、ヒトIgG(図11、左パネル)またはヒトASA(図11、右パネル)に対する一次抗体を用いるウエスタンブロッティングにより確認した。HIRMAb-ASA重鎖および軽鎖の分子量(MW)およびHIRMAb重鎖および軽鎖のMWを、MW標準品の移動に基づく直線回帰により評価する。HIRMAb-ASA融合重鎖のサイズ119kDaは、ASAの58kDa HIRMAb重鎖との融合によりHIRMAbの重鎖のサイズ58kDaより大きい61kDaである。該軽鎖のサイズ25kDaは、HIRMAb-ASA融合タンパク質およびHIRMAb抗体と同一である（両タンパク質は同じ軽鎖を用いるため）。図2に示すヘテロ四量体のHIRMAb-ASA融合タンパク質の推定MWは、ウエスタンブロットのSDS-PAGE中の移動に基づいて288kDaである。
【実施例４】
【０１５４】
二機能性IgG-ASA融合タンパク質のHIR結合およびASA活性の分析
融合タンパク質のHIR細胞外ドメイン(ECD)に対する親和性はELISAで決定した。HIR ECDで不可逆的にトランスフェクションしたCHO細胞を無血清培地(SFM)中で増殖させ、次いでHIR ECDを、先にColoma et al.(2000) Pharm Res、17:266-274に記載のごとく、小麦胚芽凝集素アフィニティカラムで精製した。HIR ECDをNunc-Maxisorb 96ウェルディッシュに接種し、HIR AbまたはHIR Ab-ASA融合タンパク質のHIR ECDに対する結合を、ビオチン化ヤギ抗ヒトIgG(H+L)二次抗体、次いでアビジンおよびビオチン化パーオキシダーゼ(Vector Labs、Burlingame、CA)を用いて検出した。50％最大結合をもたらすHIR AbまたはHIR Ab-ASA融合タンパク質の濃度、ED50を非線形回帰分析により決定した。HIRに対する結合のED50は35±9ng/mLであり、HIR Ab-ASA融合タンパク質のHIRに対する結合のED50は106±33 ng/mLである(図12)。HIR AbのMWは150kDaであり、HIR Ab-ASA融合タンパク質のMWは288kDaである。したがって、MWの差を正規化後、キメラHIR AbまたはHIR Ab-ASA融合タンパク質のHIR ECDとの結合はそれぞれED50が0.23±0.06 nM および0.34±0.11 nMであり同等であった(図12)。これらの知見は、ASA分子のIgGの両重鎖のカルボキシル末端との融合にも関わらず、HIR Ab-ASA融合タンパク質のHIRとの結合親和性は保持されることを示す。
【０１５５】
ASA酵素活性は、Sigma Co(St Louis、MO)から入手可能なp-ニトロカテコールサルフェート(NCS)を用いる分光光度アッセイにて測定した。この基質は、ASAによってp-ニトロカテコール(NC)に加水分解され、515nmで分光光度法により検出される。標準曲線は既知量のNC(Sigma)を用いて作製した。該アッセイは、0.25M酢酸ナトリウム/1M NaCl/0.25mMピロリン酸ナトリウム/0.1％ウシ血清アルブミン中、37℃、pH=5.0で10分間インキュベーションすることにより行った。0.2 mLの1M NaOHを加えてインキュベーションを終了した。１単位＝1umol/min。該酵素活性を融合タンパク質の量および時間について線形化し(図13)、および平均酵素活性は20±1 umol/min/mgタンパク質または20単位/mgタンパク質であった。同じアッセイを用いる組換えヒトASAのASA酵素比活性は60単位/mgタンパク質である[Matzner et al(2008): Non-inhibitory antibodies impede lysosomal storage reduction during enzyme replacement therapy of a lysosomal storage disease. J. Mol. Med. 86: 433-442]。しかしながら、ASAをIgG-AS融合タンパク質として再操作後のASAの有効MWは144kDaであるが、ASAのMWは60kDaである。したがって、MW差を正規化後の有効ASA比活性は50単位/mgタンパク質であり、組換えASAと同等である。したがって、ASAのHIR AbのHCのカルボキシル末端との融合は、IgG-GUSB融合タンパク質でみられた結果と対照的に、ASA酵素の酵素活性に対する影響が最小限であった(表1)。ASAは、ASA酵素活性の発現に特異的翻訳後修飾を必要とするスルファターゼのファミリーのメンバーであるため、CHO由来HIR Ab-ASA融合タンパク質の高いASA酵素活性は驚くべきことである。ASA酵素の活性は、スルファターゼ修飾因子タイプ1(SUMF1)（ホルミルグリシン生成酵素(FGE)ともいう）によりCys-59をホルミルグリシン残基に変換した後に活性化される。安定にトランスフェクションしたCHO細胞により産生されるHIRMAb-ASA融合タンパク質におけるASA酵素活性の保持は、HIRMAb重鎖との融合にも関わらずASA酵素が宿主細胞内で活性化されることを示す。
【実施例５】
【０１５６】
ASAおよび標的抗体を結合するアミノ酸リンカー
成熟ヒトASAは、3-アミノ酸リンカーのSer-Ser-SerによりHIR AbのHCのカルボキシル末端と融合する(図9中の下線)。リンカーの種々のバリエーションがSer-Ser-Serリンカーの代わりに用いられる。3-アミノ酸リンカーは保持されるかもしれないが、アミノ酸配列は代わりのアミノ酸に変化する（例えば、Gly-Gly-Gly、またはSer-Gly-Ser、またはAla-Ser-Gly、または20天然アミノ酸の種々の組み合わせ）。すなわち、該リンカーは２、１、または０アミノ酸に減少する。０アミノ酸リンカーの場合は、ASAのアミノ末端は、HIR AbのHCのカルボキシル末端と直接融合する。あるいはまた、該リンカーの長さは、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または20アミノ酸に拡張される。そのようなリンカーは当該分野でよく知られており、融合タンパク質の操作において最適なアミノ酸リンカーを決定するための多くの公に利用可能なプログラムがある。しばしば用いられるリンカーには、反復配列におけるGlyおよびSerの種々の組み合わせ、例えば(Gly4Ser)3、または他のバリエーションが含まれる。
【実施例６】
【０１５７】
MLD繊維芽細胞におけるHIR Ab-ASA融合タンパク質の取り込みおよび生物活性
MLD繊維芽細胞をCoriell Institute for Medical Research(Camden、NJ)から得、Lab-Tekチャンバースライドプレート中で10％FBS含有DMEMを用いて＞50％コンフルエントになるまで一夜増殖させた。培地を吸引し、ウェルをPBSで良く洗浄し、次いで、細胞を10ug/mLのHIRMAb-ASA融合タンパク質含有無血清新鮮DMEMで処理した。37℃で24時間インキュベーションした後、培地を吸引し、ウェルを冷PBSで充分に洗浄し、次いで細胞を-20℃で20分間100％冷メタノールで固定した。PBSで洗浄した後、プレートを10％ロバ血清でブロックし、次いで10 ug/mLのヤギ抗ASA抗体およびヒトリソゾーム結合膜タンパク質(LAMP)-1に対するマウスMAb 10 ug/mlで同時標識した。陰性コントロール抗体は、同濃度のヤギまたはマウスIgGであった。二次抗体は、それぞれ5ug/mLのAlexa Fluor-488 結合ロバ抗マウスIgG(緑色チャンネル)およびAlexa Fluor-594結合ロバ抗ヤギIgG(赤色チャンネル)であった。洗浄したスライドを4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)含有Vectashieldマウンティング媒質を用いてマウントした。共焦点顕微鏡検査をLeica TCS SP2 AOBS倒立蛍光顕微鏡を用いて行った。光学切片(1um、解像度300nm)を、各試料のz-平面を通して連続的に得た。細胞内のLAMP1免疫応答性を緑色チャンネルで検出し、ASA免疫応答性を赤色チャンネルで検出する。MLD繊維芽細胞中に豊富なASA免疫応答性がみられ、標的細胞がHIRMAb-ASA融合タンパク質を取り込むことを示す。ASAおよびLAMP1免疫応答性の重複が観察され、HIRMAb-ASA融合タンパク質が該細胞のリソゾームコンパートメントにトリアージ(triage)されることを意味する。アイソタイプコントロール抗体で標識した細胞中には免疫応答性がなく、このことは細胞内LAMP1およびASA免疫応答性が標的タンパク質に特異的であることを示す。
【０１５８】
共焦点顕微鏡検査により検出した細胞内ASA免疫応答性は完全なHIRMAb-ASA融合タンパク質を示す。これは、ウエスタンブロッティング法により証明された。MLD繊維芽細胞をHIRMAb-ASA融合タンパク質と4時間インキュベーションした後、培地を除去し、細胞を充分に洗浄し、細胞外融合タンパク質を除去した。細胞をドデシル硫酸ナトリウム(SDS)試料用緩衝液で溶解し、細胞抽出物をヒトASAに対する一次抗体を用いるウエスタンブロット法により分析した。図11（右パネル）に示す重鎖融合タンパク質と同様に、HIRMAb-ASA融合タンパク質の重鎖がMLD繊維芽細胞に検出された。
【実施例７】
【０１５９】
ASAのヒト脳へのレセプター介在送達
異染性白質ジストロフィーまたはMLDは、リソゾーム酵素、アリールスルファターゼA(ASA)をコードする遺伝子の異常によって生じるリソゾーム蓄積疾患である。ASA非存在下では、オリゴデンドロサイト、ニューロン、およびアストロサイト、および星状膠細胞を含む脳の細胞に、ある種のスルホ糖脂質が蓄積する(Eckhardt M.、The role and metabolism of sulfatide in the nervous system、Mol Neurobiol、37: 93-103、2008)。脳におけるスルファチド糖脂質の蓄積は、歩行困難および運動失調、痙性四肢麻痺、発作、および最終的には除脳状態による死を含むMLDの臨床症状をもたらす。ASA mRNAのヌクレオチド配列およびヒトASAタンパク質のアミノ酸配列は知られている(C. Stein et al、Cloning and expression of human arylsulphatase A、J. Biol. Chem. 264: 1252-1259、1989)。この配列は、MLDの酵素置換療法(ERT)のための組換えASAの製造を可能にする。チャイニーズハムスター卵巣で産生されるASAは、60単位/mg酵素の比活性を有する(U. Matzner et al、Enzyme replacement improves nervous sytem pathology and function in a mouse model for metachromatic leukodystrophy、Human Mol. Genet.、14: 1139-1152、2005)。ASA比活性は、p-ニトロカテコールサルフェート(NCS)分光光度アッセイにより検出される(H. Baum et al、The assay of arylsulphatase A and B in human urine、Clin. Chim. Acta 4: 453-455、1959)(ここで、1単位＝1umol/min)(E. Shapira and H.L. Nadler、Purification and some properties of soluble human liver arylsulphatases、Arch. Biochem. Biophys.、170: 179-187、1975)。脳の重度のニューロパシーの治療における組換えASAを用いるMLDのERTの問題は、ASAは他の大分子医薬と同様に、BBBを通過しないことである。MLDマウスに対する大用量40mg/kgのIV投与は、マウス脳における免疫応答性ASAの増加をもたらさず、MLDマウスの脳におけるスルファチド含有量の減少をもたらさない(U. Matzner et al、Enzyme replacement improves nervous system pathology およびfunction in a mouse model for metachromatic leukodystrophy、HUman Mol. Genet.、14: 1139-1152、2005)。BBBを通過するASAの輸送がないために、大用量の該酵素を全身投与後に脳内のASAを増加させることができない。したがって、組換えASAを用いるMLD患者のERTは、脳に対する有益な効果がないことがわかった（C.i. Dali and A.M. Lund、Intravenous enzyme replacement therapy for metachromatic leukodystrophy (MLD)、Abstracts of American College Medical Genetics Annual Meeting、abstract No. 195、2009）。MLDマウスの脳内にASAを直接脳室内(ICV)注入することによりBBBを迂回するため、該酵素を４週間にわたり脳室内に注入した(S. Stroobants et al、Intracerebroventricular enzyme infusion corrects central nervous system pathology and dysfunction in a mouse model of metachromatic leukodystrophy、Human Molec. Genet.、20: 2760-2769、2011)。ICV注入後のASAの脳中組織半減期は＜10分間であったが、IV投与後の末梢組織におけるASAの組織半減期は4日間であった(U. Matzner et al、Enzyme replacement improves nervous system pathology およびfunction in a mouse model for metachromatic leukodystrophy、Human Mol. Genet.、14: 1139-1152、2005)。ICV注射は緩徐な静脈内注射と同様であるため、薬剤が脳室コンパートメントから末梢静脈循環に急速に移動するため、ICV注入後の脳からのASAの急速な流出が予期される。それにも関わらず、脳内へのASAの注入は、MLDマウスのリソゾーム蓄積疾患を是正することがわかった。
【実施例８】
【０１６０】
サル脳へのASAのレセプター介在送達
MLD患者、特に幼児の組換えASAの慢性ICV注入による治療は、脳内カニューレを設置する脳外科的介入が必要であるため問題がある。しかしながら、ICV注入送達によるより大きな制約は、ICV注射後の該酵素の脳実質内への透過が制限されることである。該酵素が脳室腔から末梢血に急速に移動することにより、脳の上衣表面と接触するものを超える脳組織内への該酵素の拡散が制限される。MLD患者の脳へのASAの送達に対する好ましいアプローチは、レセプター介在輸送(RMT)を介してBBBを通過するよう再操作された形のASAの静脈内注入によるものである。HIRMAb-ASA融合タンパク質はヒトインスリンレセプターに対する高親和性結合を保持することにより、スルファターゼがBBBを透過し、内因性BBBインスリンレセプターのRMTを介して血液から脳に入るのを可能にする。HIRMAb-スルファターゼ融合タンパク質の脳への取り込みは、以下に記載するようにアカゲザルの脳100グラム当たり注射用量（ID)の1.1％である。該融合タンパク質の脳への取り込みがこのレベルであれば、50kgのヒトにおける2.5mg/kgのIgG-ASA融合タンパク質の静脈内注射は、1,375ug融合タンパク質/脳の脳濃度をもたらす。ASAは該融合タンパク質の約半分を構成するため、ASA酵素の脳濃度は687ug/脳であり、ヒトの脳は約1000グラムであるから687ng/グラムと等価であり、１グラムの脳は100mgのタンパク質を含むので、6.9ng/mg脳タンパク質と等価である。ヒト脳中の免疫応答性ASA濃度は100ng/mgタンパク質であるから、外来性ASAのこの脳への取り込みレベルは、ヒト脳中のASAの正常濃度の＞6％を回復させる(C. Sevin et al、Intracerebral adeno-associated virus-mediated gene transfer in rapidly progressive forms of metachromatic leukodystrophy、Human Molec. Genet.、15: 53-64、2006)。リソゾーム蓄積疾患患者における、正常のわずか1〜2％の細胞酵素活性をもたらす酵素置換療法は、該疾患の兆候および症状を生じない(J. Muenzer and A. Fisher、Advances in the treatment of mucopolysaccharidosis type I、N. Engl J Med、350: 1932-1934、2004)。MLDに関して、人口の約7％がASA偽欠乏症の患者であり、臨床的に正常であるが、正常ASA酵素活性のわずか3％しかない(Penzien JM、et al.(1993) Compound heterozygosity for metachromatic leukodystrophy        and arylsulphatase A pseudodeficiency alleles is not associated with progressive neurological disease. Am J Hum Genet 52:557-564)。これらのことは、全身用量2.5mg/kgのHIRMAb-ASA融合タンパク質を静脈内注入後に、ヒト脳の臨床的に重要なASA酵素置換法が可能であることを示す。
【０１６１】
生存サルにおけるHIRMAb-ASA融合タンパク質のin vivoの脳への取り込みおよび薬物動態を、放射性標識融合タンパク質を用いて評価した。HIRMAb-ASA融合タンパク質を[125I]-Bolton-Hunter試薬で放射性標識した。比活性は4.5uCi/ugであり、トリクロロ酢酸(TCA)沈殿性は99％であった。標識前に、該融合タンパク質を、0.01M酢酸ナトリウム/140mM NaCl/pH=5.5/0.001％Tween-80 およびAmicon Ultra-15遠心濾過単位で緩衝液交換した。標識HIRMAb-ASA融合タンパク質を、Sephadex G-25の1x28cmカラムおよび0.01M酢酸ナトリウム/140 mM NaCl/pH=5.5/0.001％Tween-80の溶出緩衝液を用いてゲル濾過して精製した。成熟雄アカゲザル（8.2kg）を開発業務受託機関で検討した。該動物の左大腿静脈に30秒間かけて、2042uCiの[125I]-HIRMAb-ASA融合タンパク質を静脈内(IV)注射した。HIRMAb-ASA融合タンパク質の注射用量（ID）は55ug/kgであった。該動物を筋肉内ケタミン投与により麻酔した。薬剤を静脈内投与後2、5、15、30、60、90、および120分に大腿静脈血漿を採取し、10％冷トリクロロ酢酸(TCA)により沈殿する血漿放射活性および総血漿[125I]放射活性(DPM/mL)を測定した。該融合タンパク質のTCA沈殿可能血漿濃度を図14に％注射用量(ID)/mL血漿(図14A)またはng/mL融合タンパク質(図14B)で示す。TCAで沈殿可能な総血漿放射活性の割合は、IV注射後2、5、15、30、60、90、および120分でそれぞれ98±1％、97±1％、88±1％、65±1％、45±2％、43±2％、および42±2％であった。TCA沈殿可能放射活性の血漿プロフィールを2指数方程式に適合させ、クリアランスの２指数のインターセプト(A1、A2)および勾配(k1、k2)を用いて、表３に示す薬物動態（PK）パラメータを得た。[125I]-HIRMAb-ASA融合タンパク質は血液から急速に除去され、平均滞留時間(MRT)は59±12分間であり、中央コンパートメント容量(Vc)より５倍大きい全身分布容量(Vss)および高い全身クリアランス速度(CL)は3.9±0.2 mL/min/kgであった(表3)。濃度曲線下血漿面積(AUC)は、120分間または定常期の予測AUC（AUCss）を示す(表3)。
【０１６２】
表3. HIRMAb-ASA融合タンパク質の薬物動態パラメータ
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【０１６３】
霊長類の脳および末梢器官によるHIRMAb-ASA融合タンパク質の取り込みを測定した。融合タンパク質の静脈内注射後120分に動物を安楽死し、主要器官（心臓、肝臓、脾臓、肺、骨格筋、および大網脂肪) の試料を取り出し、計量し、放射活性を測定するために処理した。頭蓋を開けて脳を取り出した。前頭葉皮質灰白質、前頭葉皮質白質、小脳灰白質、小脳白質、および脈絡叢を放射活性測定用に取り出した。アカゲザルにおけるHIRMAb-ASA融合タンパク質の器官への取り込み（％注射用量(ID)/100グラム湿器官重量で示す）を脳および末梢器官ごとに表４に示す。血漿からのHIRMAb-ASA融合タンパク質の除去について記載した主要器官は肝臓および脾臓である（表４）。HIRMAb-ASA融合タンパク質の脳への取り込みは、1.1±0.1 ％ID/100グラム脳である(表4)。
【０１６４】
表4. アカゲザルにおけるHIRMAb-ASA融合タンパク質の器官への取り込み
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【０１６５】
HIRMAb-ASA融合タンパク質の脳による局所的取り込みは、該融合タンパク質を静脈内注射後２時間に脳をスキャンして確認した。安楽死後２時間に新鮮な脳を取り出して冠状平板に切り、次いで急速に液体窒素で凍結した。凍結切片(20 um)を-15℃でクリオスタットで切り、切片を風乾し、最高７日間X線フィルムに暴露し、次いでX線フィルムを現像した。該フィルムをスキャンし、画像をフォトショップに保存し、NIH画像ソフトウエアで着色した。霊長類脳のフィルムオートラジオグラフィは、脳全体にHIRMAb-ASA融合タンパク質が広く分布していることを示し、白質での取り込みより灰白質での取り込みが高かった（図15）。エマルジョンオートラジオグラフィ、および暗視野および明視野の光学顕微鏡検査は、該融合タンパク質がBBBを通過し、脳実質内の脳細胞に均質に分布することを示した。
【０１６６】
HIRMAb-ASA融合タンパク質の脳血管系を通した脳実質内への正味の輸送を、キャピラリーデプレッション（capillary depletion）法により確認した。キャピラリーデプレッション法は、血管後コンパートメントから脳の血管組織を分離する(Triguero et al、1990)。脳の毛細血管特異的酵素、例えば、γ-グルタミルトランスペプチダーゼまたはアルカリホスファターゼの比活性の測定値に基づいて、血管後上清は、脳血管系の＞95％が涸渇する(Triguero D、Buciak J、Pardridge WM 1990.  Capillary depletion method for quantification of blood-brain barrier transport of circulating peptides and plasma protein. J. Neurochem.、54: 1882-1888)。血管コンパートメントと血管後コンパートメントを分離するため、脳を組織グラインダーを用いて8mL冷PBS中でホモゲナイズした。ホモジネートに9.4 mL冷40％テキストロース(70kDa)を添加し、該ホモジネートのアリコートを放射活性測定用に得た。該ホモジネートを固定アングルローターで3200gにて４℃10分間遠心分離した。脳の微小血管系をペレットとして定量的に沈殿させ、血管後上清は、キャピラリー涸渇脳実質の指標である。血管ペレットおよび上清の3H放射活性をホモジネートと同時にカウントした。分布容量(VD)を、脳分画の総[125I]放射活性(DPM/グラム脳)を120分の末端血漿の総[125I]放射活性(DPM/uL血漿)で割った比から３分画のそれぞれについて決定した。10％冷TCAで沈殿可能であった血管後上清中の放射活性の割合を決定した。血漿試料および組織試料の125I放射活性をガンマーカウンターで分析した。注射後２時間の脳ホモジネート中のHIRMAb-ASA融合タンパク質のVD（526±23 uL/グラム）は、非特異的ヒトIgG1アイソタイプコントロール抗体の脳VD（20±6 ul/グラム）に比べて高かった(表5)。該IgG1アイソタイプコントロール抗体の脳VDは、脳の血液容量内に隔離された、BBBを通過しない分子の脳への取り込みを示す。HIRMAb-ASA融合タンパク質の高い脳VDは、該融合タンパク質が脳血管系により隔離されるか、またはBBBを透過して脳実質に入ることを示す。血管後上清中のHIRMAb-ASA融合タンパク質のVD（341±33 uL/グラム）は、脳の血管ペレット中のHIRMAb-ASA融合タンパク質のVD（277±30 uL/グラム）より大きく(表5)、HIRMAb-ASA融合タンパク質の大部分がBBBを横切り、脳実質を透過したことを示す。血管後上清放射活性のTCA沈殿物が95.2±1.4％であったことから、血管後上清中の放射活性は完全にHIRMAb-ASA融合タンパク質であり標識された代謝物ではないことを示す(表5)。
【０１６７】
表5. HIRMAb-ASA融合タンパク質の脳への取り込みに対するキャピラリーデプレッション分析
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【０１６８】
[125I]-HIRMAb-ASA融合タンパク質のIV注射後120分における血漿放射活性は、42±2％TCA-沈殿可能物であったが、脳の血管後上清の放射活性は95±1％TCA-沈殿可能物であった。この知見は、血管から脳に分布する放射活性は完全なHIRMAb-ASA融合タンパク質であり、放射標識された代謝物はみられないことを意味する。キャピラリーデプレッション法の結果は、エマルジョンオートラジオグラフィの結果を確認し、該融合タンパク質が脳微小血管系のBBBを通過し、脳実質の脳細胞に送達されることを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年10月6日(2017.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)免疫グロブリン重鎖およびアリールスルファターゼA(ASA)モノマーのアミノ酸配列を含む融合タンパク質、および
(b)免疫グロブリン軽鎖
を含む融合抗体であって、血液脳関門(BBB)を通過し、セレブロシドサルフェートエステルおよびスルファチドスフィンゴ脂質の2硫酸基の加水分解を触媒する、融合抗体。
【請求項２】
アリールスルファターゼAのアミノ酸配列が免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端と共有結合している請求項1記載の融合抗体。
【請求項３】
スルファターゼ修飾因子タイプ1(SUMF1)により翻訳後修飾される請求項1記載の融合抗体。
【請求項４】
ホルミルグリシンを含む請求項1記載の融合抗体。
【請求項５】
さらに、アリールスルファターゼAのアミノ酸配列と免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列のカルボキシ末端の間にリンカーを含む請求項1記載の融合抗体。
【請求項６】
アリールスルファターゼAの比活性が少なくとも約10単位/mgである請求項1記載の融合抗体。
【請求項７】
ASAが、独立した存在としてのその活性に比べて、その活性の少なくとも20％を維持する請求項1記載の融合抗体。
【請求項８】
ASAおよび免疫グロブリンがそれぞれ、独立した存在としてのその活性に比べて、分子ベースでその活性の少なくとも20％を維持する請求項1記載の融合抗体。
【請求項９】
免疫グロブリン重鎖がIgGの免疫グロブリン重鎖である請求項1記載の融合抗体。
【請求項１０】
免疫グロブリン重鎖が配列番号１のアミノ酸配列に対応するCDR1、配列番号2のアミノ酸配列に対応するCDR2、または配列番号3のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む請求項1記載の融合抗体。
【請求項１１】
免疫グロブリン軽鎖がκクラスの免疫グロブリン軽鎖である請求項1記載の融合抗体。
【請求項１２】
免疫グロブリン軽鎖がλクラスの免疫グロブリン軽鎖である請求項1記載の融合抗体。
【請求項１３】
免疫グロブリン軽鎖が、配列番号4のアミノ酸配列に対応するCDR1、配列番号5のアミノ酸配列に対応するCDR2、または配列番号6のアミノ酸配列に対応するCDR3を含む請求項1記載の融合抗体。
【請求項１４】
内因性BBBレセプター介在輸送系と結合することによりBBBを通過する請求項1記載の融合抗体。
【請求項１５】
インスリンレセプター、トランスフェリンレセプター、レプチンレセプター、リポタンパク質レセプター、およびIGFレセプターからなる群から選ばれる内因性BBBレセプターを介してBBBを通過する請求項1記載の融合抗体。
【請求項１６】
インスリンレセプターと結合することによりBBBを通過する請求項1記載の融合抗体。
【請求項１７】
治療的有効量の請求項1記載の融合抗体および医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１８】
請求項1記載の融合抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号14の核酸配列を含む請求項18記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項18記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２１】
配列番号14の核酸配列を含む請求項20記載のベクター。
【請求項２２】
請求項20記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２３】
該宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞である請求項22記載の宿主細胞。
【外国語明細書】
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【配列表】
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