(57)【要約】【課題】高速且つ高収率であると共に、発泡が抑制されたリグノセルロース由来化合物の製造方法を提供する。【解決手段】本発明のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法は、酵母に対し、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を添加しながら培養を行う流加培養により発酵を行う第１の発酵工程と、添加された前記糖化液が一定量に達したとき、前記糖化液の添加を停止し、回分培養により発酵を行う第２の発酵工程と、を備え、前記第１の発酵工程における前記酵母に対する前記糖化液の流加速度を、酵母の糖消費速度により調節し、前記酵母の糖消費速度が、前記酵母の糖消費速度が、残糖が発生しない最大の糖消費速度以上、酵母の最大糖消費速度以下であることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母に対し、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を添加しながら培養を行う流加培養により発酵を行う第１の発酵工程と、
添加された前記糖化液が一定量に達したとき、前記糖化液の添加を停止し、回分培養により発酵を行う第２の発酵工程と、
を備え、
前記第１の発酵工程における前記酵母に対する前記糖化液の流加速度を、酵母の糖消費速度により調節し、
前記酵母の糖消費速度が、残糖が発生しない最大の糖消費速度以上、酵母の最大糖消費速度以下であることを特徴とするリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
【請求項２】
前記酵母の糖消費速度を、排気ガス中の二酸化炭素濃度を測定し、算出する請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記第２の発酵工程において、培養液中のキシロース濃度が１ｇ／Ｌ以下になるとき、発酵を終了する請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記第２の発酵工程において、排気ガス中に二酸化炭素が検知されなくなるとき、発酵を終了する請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記第２の発酵工程において、培養液中の溶存酸素濃度を測定し、前記溶存酸素濃度が１０分前の測定値に対して１．２倍以上になるとき、発酵を終了する請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記糖化液中のフルフラール濃度が５００ｐｐｍ以上１５００ｐｐｍ以下であり、１．０×１０７ＣＦＵ／ｍＬ以上１．０×１０８ＦＵ／ｍＬ以下含む酵母液を用いて、前記酵母液に対する前記糖化液の体積比が２倍以上２５倍以下であるとき、
前記第１の発酵工程における発酵時間が１０時間以上１４時間以下であり、
前記第２の発酵工程における発酵時間が２２時間以上３８時間以下である請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記第１の発酵工程において、発酵開始時の培養液の液面より下から前記糖化液を添加する請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記第１の発酵工程において、前記培養液の液面が発酵槽の撹拌翼の底面から２０ｃｍ下から前記撹拌翼の天面から２０ｃｍ上までを通過するとき、撹拌を停止する請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を発酵するための装置であって、
少なくとも１つの泡探知機を有する発酵槽と、
前記泡探知機で探知された泡高さを指標として、前記発酵槽へのリグノセルロース系バイオマス由来の糖化液の流加速度を制御する制御装置と、
を備えることを特徴とする発酵装置。
【請求項１０】
さらに、前記発酵槽は、底面、又は発酵開始時の前記糖化液の液面より下の側面に配設された、前記糖化液を前記発酵槽へ送液するための配管を備える請求項９に記載の発酵装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法及び発酵装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化対策や、廃棄物の有効活用の観点から、植物資源を原料とするバイオマスの利用が注目されている。一般に、バイオマスからエタノール等の化合物を製造するための原料としては、サトウキビ等の糖質やトウモロコシ等のデンプン質が多く用いられている。しかしながら、これらの原料はもともと食料又は飼料として用いられており、長期的に工業用利用資源として活用することは、食料又は飼料用途との競合を引き起こし、原料価格の高騰を招く危険性がある。
【０００３】
従って、非食用バイオマスをエネルギー資源として活用する技術開発が進められている。非食用バイオマスとしては、地球上に最も多く存在するセルロースがあげられるが、その大部分は芳香族ポリマーのリグニンやヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロースとして存在する。
【０００４】
リグノセルロース系バイオマスを利用したエタノール生産では、一般に、前処理や酵素糖化処理によって獲得された糖を酵母等の微生物に嫌気発酵を行わせることでエタノールに変換させる。リグノセルロース系バイオマスからは多くのキシロースが獲得できるが、野生型の酵母はキシロースの資化能を持たないため、発酵工程には、遺伝子操作によってキシロース資化能力を付与させた酵母を使用することが多い。
【０００５】
リグノセルロース系バイオマスの前処理工程では、目的化合物であるグルコースやキシロースに加え、酵母の増殖や発酵を阻害する物質（以下、「発酵阻害物質」と称することがある。）であるフルフラール等も生産される。フルフラール等の発酵阻害物質による酵母の増殖や発酵の阻害を防ぐため、発酵前の処理として、活性炭による除去工程を加えることや、石灰を添加し６０℃程度まで加温しながら一定時間保持するオーバーライミングが有効であるが（例えば、非特許文献１参照）、高価な処理費が課題となっている。
【０００６】
また、発酵工程では発泡という課題がある。発酵槽に添加される糖液はオリゴ等などの糖質を含むため、発酵槽内の培養液は粘性が高く、発酵槽に糖を添加すると酵母により二酸化炭素ガスが合成されるため、発酵槽は発泡しやすい環境にある。しかし、菌株の流出や雑菌汚染は抑制すべき事象であることから、培養槽内の液面を低く保つ操作や消泡剤の添加、撹拌数の抑制等の対策がとられるが、これらは生産能力低下、試薬費の増加、及び収の低下を引き起こすため、製造コストの増加に繋がってしまう。
【０００７】
発酵方法としては回分培養、流加培養、連続培養の３種の方法がある。
回分培養は、酵母液に対して糖液を全量添加した後に培養を開始する方式である。発酵阻害物質がなく、糖源がグルコースである場合には、培養液中の糖濃度が高いため、他の培養方式に比べて発酵速度が速いという長所がある。しかし、糖液中に発酵阻害物質が存在すると、発酵開始時の発酵阻害物質濃度が高いために、他の培養方式に比べ発酵速度が遅くなるという課題がある。また、発酵初期は粘度が高く、発生ガス量も多くなるので、発泡が非常に多くなるという問題がある。
【０００８】
流加培養は、酵母液に糖液を添加しながら培養を行う方式であり、培養液中の糖濃度や発酵阻害物質濃度を低く保つ上で効果的である（例えば、非特許文献２参照。）。そのため、流加速度を適切に設定すれば、発酵阻害を抑制し、発酵速度を速くすることができる。しかし、回分培養に比べると発酵開始時の糖濃度が低くなるため、発酵速度が遅くなるという短所がある。また発泡に関しては、粘度や発生ガス量共に培養を通じて一定であるため、抑制することができる。
【０００９】
連続培養は、酵母液に対して糖液を添加しながら発酵液を抜くことで発酵液量を一定に保ち、連続的に反応を生じさせる方式である。流加培養同様、流加速度および液除去速度を適切に設定すれば、発酵阻害を抑制し、発酵速度を速くすることができる。発泡に関しても、流加培養同様抑制することができる。しかし、連続培養は培養液が完全に除去されることがないため、一度雑菌の汚染が生じると、培養終了まで雑菌による酵母への阻害を通じて発酵収率や発酵速度の低下が引き起こされてしまう。商業機では安定の運転から、連続培養を採用することは難しい。
【００１０】
特許文献１及び２には、流加培養を行った後に、回分培養を行うことにより、高濃度のアルコールを製造する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００８−２２８６９７号公報
【特許文献２】特開２０１０−２００６４７号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Alfredo M., et al., “Effects of Ca(OH)2 Treatments (“Overliming”) on the Composition and Toxicity of Bagasse Hemicellulose Hydrolysates,” BIOTECH. AND BIOENGI., Vol. 69, NO. 5, pp526-536, 2000.
【非特許文献２】Mohammad J. T., et al., “Conversion of dilute-acid hydrolyzates of spruce and birch to ethanol by fed-batch fermentation,” BIORES. TECH., 69, pp59-66, 1999.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
特許文献１及び２では、糖濃度をモニタリングすることで流加培養を制御しているが、使用する糖液は糖質又はデンプン質であり、リグノセルロース系バイオマスではない。さらに、糖濃度による酵母のフィードバック制御については考慮されているが、発酵阻害物質による発酵抑制については考慮されていない。また、二酸化炭素等の発生ガス量による発泡については記載されていない。
【００１４】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、高速且つ高収率であると共に、発泡が抑制されたリグノセルロース由来化合物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］酵母に対し、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を添加しながら培養を行う流加培養により発酵を行う第１の発酵工程と、添加された前記糖化液が一定量に達したとき、前記糖化液の添加を停止し、回分培養により発酵を行う第２の発酵工程と、を備え、前記第１の発酵工程における前記酵母に対する前記糖化液の流加速度を、酵母の糖消費速度により調節し、前記酵母の糖消費速度が、残糖が発生しない最大の糖消費速度以上、酵母の最大糖消費速度以下であることを特徴とするリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法。
［２］前記酵母の糖消費速度を、排気ガス中の二酸化炭素濃度を測定し、算出する［１］に記載の製造方法。
［３］前記第２の発酵工程において、培養液中のキシロース濃度が１ｇ／Ｌ以下になるとき、発酵を終了する［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記第２の発酵工程において、排気ガス中に二酸化炭素が検知されなくなるとき、発酵を終了する［１］〜［３］のいずれか一つに記載の製造方法。
［５］前記第２の発酵工程において、培養液中の溶存酸素濃度を測定し、前記溶存酸素濃度が１０分前の測定値に対して１．２倍以上になるとき、発酵を終了する［１］〜［４］のいずれか一つに記載の製造方法。
［６］前記糖化液中のフルフラール濃度が５００ｐｐｍ以上１５００ｐｐｍ以下であり、１．０×１０７ＣＦＵ／ｍＬ以上１．０×１０８ＣＦＵ／ｍＬ以下含む酵母液を用いて、前記酵母液に対する前記糖化液の体積比が２倍以上２５倍以下であるとき、前記第１の発酵工程における発酵時間が１０時間以上１４時間以下であり、前記第２の発酵工程における発酵時間が２２時間以上３８時間以下である［１］〜［５］のいずれか一つに記載の製造方法。
［７］前記第１の発酵工程において、発酵開始時の培養液の液面より下から前記糖化液を添加する［１］〜［６］のいずれか一つに記載の製造方法。
［８］前記第１の発酵工程において、前記培養液の液面が発酵槽の撹拌翼の底面から２０ｃｍ下から前記撹拌翼の天面から２０ｃｍ上までを通過するとき、撹拌を停止する［１］〜［７］のいずれか一つに記載の製造方法。
［９］リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を発酵するための装置であって、少なくとも１つの泡探知機を有する発酵槽と、前記泡探知機で探知された泡高さを指標として、前記発酵槽へのリグノセルロース系バイオマス由来の糖化液の流加速度を制御する制御装置と、を備えることを特徴とする発酵装置。
［１０］さらに、前記発酵槽は、底面、又は発酵開始時の前記糖化液の液面より下の側面に配設された、前記糖化液を前記発酵槽へ送液するための配管を備える［９］に記載の発酵装置。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、高速且つ高収率であると共に、発泡が抑制されたリグノセルロース由来化合物の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】（Ａ）発酵阻害物質濃度が低いときの糖化液における酵母の糖消費速度と流加速度との関係を示すグラフである。（Ｂ）発酵阻害物質濃度がやや高いときの糖化液における酵母の糖消費速度と流加速度との関係を示すグラフである。（Ｃ）発酵阻害物質濃度が高いときの糖化液における酵母の糖消費速度と流加速度との関係を示すグラフである。
【図２】本発明の第一実施形態に係るリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置の概略構成を示す図である。
【図３】本発明の第二実施形態に係るリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置の概略構成を示す図である。
【図４】本発明の第三実施形態に係るリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置の概略構成を示す図である。
【図５】本発明の第一実施形態に係る発酵装置の概略構成を示す図である。
【図６】本発明の第二実施形態に係る発酵装置の概略構成を示す図である。
【図７】参考例１における試薬培地を用いた回分培養及び流加培養での経時的なエタノール生産量を示すグラフである。
【図８】参考例２における酵素糖化液を用いた回分培養及び流加培養での経時的なエタノール生産量を示すグラフである。
【図９】実施例１における酵素糖化液を用いた流加培養及び流加培養＋回分培養での経時的なエタノール生産量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書において、「リグノセルロース系バイオマス」としては、主に、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンを含有するものであり、例えば針葉樹、広葉樹、建築廃材、林地残材、剪定廃材、稲藁、籾殻、麦藁、木材チップ、木材繊維、化学パルプ、古紙、合板等の農林産物資源、サトウキビバガス、サトウキビ茎葉、コーンストーバー等の農林産物廃棄物、農林産物加工品及び大型藻類、微細藻類等の植物組織等が挙げられ、これらに限定されない。これらのリグノセルロース系バイオマスは単独であってもよく、混合物であってもよい。
【００１９】
本明細書において、「ヘミセルロース」には、キシロースなどの５つの炭素を構成単位とする五炭糖とよばれるものやマンノース、アラビノース、ガラクツロン酸などの６つの炭素を構成単位とする六炭糖とよばれるもの、さらにグルコマンナンやグルクロノキシランなどのような複合多糖等が含まれる。よって、ヘミセルロースは加水分解を受けると、炭素５つからなる五炭糖の単糖やその単糖が複数個連結された五炭糖のオリゴ糖、炭素６つからなる六炭糖の単糖やその単糖が複数個連結された六炭糖のオリゴ糖、五炭糖の単糖と六炭糖の単糖が複数個連結されたオリゴ糖を生ずる。
「セルロース」には、６つの炭素を構成単位とする六炭糖が含まれる。よって、セルロースは加水分解を受けると、炭素６つからなる六炭糖の単糖やその単糖が複数個連結された六炭糖のオリゴ糖を生ずる。
一般に、ヘミセルロース又はセルロースから生ずる単糖又はオリゴ糖の構成比率や生成量は、前処理方法や原料として用いた農林産物資源、農林産物廃棄物、農林産物加工品及び大型藻類、微細藻類等の植物組織等の種類によって異なる。
【００２０】
本明細書において、「リグノセルロース系バイオマス由来化合物」とは、リグノセルロース系バイオマスを分解して得られた単糖及びオリゴ糖を、酵母が摂取することにより生成された化合物を意味する。例えば、エタノール、ブタノール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、グリセロール等のアルコール、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸、乳酸等の有機酸、イノシン、グアノシン等のヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸等のヌクレオチド、カダベリン等のジアミン化合物等が挙げられる。発酵によって得られた化合物が乳酸等のモノマーである場合は、重合によりポリマーに変換することもある。
【００２１】
以下、図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、各図において、説明に関連しない部分は図示を省略する場合がある。
【００２２】
＜＜リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法＞＞
＜第一実施形態＞
一実施形態において、本発明のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法は、酵母に対し、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を添加しながら培養を行う流加培養により発酵を行う第１の発酵工程と、添加された前記糖化液が一定量に達したとき、前記糖化液の添加を停止し、回分培養により発酵を行う第２の発酵工程と、を備え、前記第１の発酵工程における前記酵母に対する前記糖化液の流加速度を、酵母の糖消費速度により調節し、前記酵母の糖消費速度が、前記酵母の糖消費速度が、残糖が発生しない最大の糖消費速度以上、酵母の最大糖消費速度以下である。
【００２３】
本実施形態の製造方法によれば、高速且つ高収率を達成できると共に、発泡が抑制されたリグノセルロース系バイオマス由来化合物を得ることができる。
【００２４】
［第１の発酵工程］
本実施形態の製造方法において、まず、酵母を発酵槽に添加する。続いて、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液の流加速度を調節しながら発酵槽へ添加し、撹拌しながら発酵を行う。前記糖化液の発酵槽への添加は、連続的に行ってもよく、一定の間隔をおいて断続的に行ってもよい。発酵温度は、２５℃〜５０℃が好ましく、２８℃〜３５℃がより好ましく、３２℃が特に好ましい。また、発酵時間は続く第２の発酵工程と合わせて、２４時間〜１２０時間が好ましく、２４時間〜９６時間がより好ましく、２４時間〜７２時間がさらに好ましい。
【００２５】
使用する酵母としては、キシロース資化能力を有する酵母であればよい。また、酵母は酵母を含む培養液をそのまま使用してもよく、又は、酵母を含む培養液を遠心分離により濃縮したもの、乾燥状態のもの等を適宜使用してよい。
使用する酵母の量は、酵母の増殖速度、発酵槽の大きさ、最終的に発酵に用いる糖化液の量を元に算出すればよい。
【００２６】
使用する糖化液としては、リグノセルロース系バイオマスを原料として、前処理及び糖化処理等して得られたものであればよい。前処理及び糖化処理については、後述の［前処理工程］及び［糖化工程］において、詳細に説明する。また、糖化液中、酵母が分解可能な糖としては、主にグルコース及びキシロース等の単糖が挙げられる。
【００２７】
本明細書において、「糖化液」とは、リグノセルロース系バイオマスを原料として、前処理及び糖化処理等して得られたものを意味し、糖化装置から発酵槽に供給されるものを示す。また、「培養液」とは、前記発酵槽に供給された前記糖化液を酵母とともに培養し、エタノール等のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を生成している状態のものを意味する。また、「発酵液」とは、前記発酵槽における培養が終了し、リグノセルロース系バイオマス由来化合物が含まれ、続く精製工程等に用いられるものを意味する。
【００２８】
（発酵阻害物質）
糖化液には、セルロース、ヘミセルロース、単糖（例えば、グルコース、キシロース等）、及びオリゴ糖の少なくともいずれかの糖以外にも、種々の副生成物が含まれている。それら副生成物が発酵工程に悪影響を及ぼさない物質であれば、最後の精製工程において除去すればよいので大きな問題とはならない。しかしながら、前処理の方法によっては、悪影響を及ぼす発酵阻害物質が含まれる。
【００２９】
本明細書において、「発酵阻害物質」とは、発酵工程で発酵反応を妨害する物質のことである。代表的な発酵阻害物質としては、糖の過分解物、弱酸、リグニン又はリグニン由来の芳香族化合物、接着剤又は塗料由来の化合物が挙げられる。この中で、接着剤又は塗料などの人工的な薬品に由来する化合物は、それらの処理が施されていない自然由来のリグノセルロース系バイオマスを使用することにより、ある程度回避可能である。しかし、リグノセルロース系バイオマスを原料とする限り、糖の過分解物、弱酸、リグニン由来の芳香族化合物の生成は回避することが困難である。ここで、発酵阻害物質がリグニンのような不溶性固体であり、セルロース、ヘミセルロース、単糖、及びオリゴ糖のうち少なくともいずれかが可溶性である場合には、通常の固液分離によって除去することが可能な場合もある。しかしながら、発酵阻害物質も有用物も可溶性である場合には、通常の固液分離が適用できない。
すなわち、本実施形態において、主に処理対象とする発酵阻害物質は、実質的にセルロース、ヘミセルロース、単糖、及びオリゴ糖の少なくともいずれかの糖との混合溶液を形成しているものであり、通常の固液分離では分離できない、又は、分離し難い状態のものを指す。そのような発酵阻害物質としては、例えば、酢酸、ギ酸、レブリン酸、糖の過分解物であるフルフラール、５−ヒドロキシメチルフルフラール（５−ＨＭＦ）、リグニン由来の芳香族化合物であるバニリン、アセトバニリン、グアヤコール等が挙げられる。これら発酵阻害物質のうち、代表的な発酵阻害物質はフルフラール及び５−ＨＭＦである。
【００３０】
上記のフルフラール又は５−ＨＭＦによる酵母における発酵阻害機構について、以下に説明する。フルフラール又は５−ＨＭＦは、酵母の解糖系やアルコール脱水素（ＡＤＨ）を阻害することで、酵母の増殖速度や酵母による発酵速度が低下し、さらに、フルフラール又は５−ＨＭＦの濃度が高い場合には、酵母は死滅に至ることが知られている（参考文献：Alemeida et al., J Chem. Technol. Biotechnol., 82, 320-349, 2007.）。しかし、酵母もこれら発酵阻害物質の分解能を保有しており、好気条件下では、酸素、水によりカルボン酸の一種である２−フロイック酸に変化し、さらにＡＴＰにより２−フロリル−ＣｏＡに変化することでＴＣＡ回路において活用される。一方、嫌気条件下でフルフラールを無毒化するためには、ＮＡＤＨが必要である。フルフラールはＮＡＤＨによりフルフリルアルコールに還元され、さらにフルフリルアルコールを細胞外に排出されることが知られている（参考文献：Nieces  et al., Front. Bioengi. Biotechnol., 18, 2015.）。
本発明者らは、上記の酵母における発酵阻害機構及び発酵阻害物質の分解機構に着目し、流加培養により糖化液中の発酵阻害物質（主に、フルフラール）の濃度を低く抑えることで、酵母による発酵阻害物質及び糖の分解を同時に行い、さらに回分培養を組み合わせることで、発酵阻害物質が低減された、又は含まれない糖化液中の糖を酵母により分解させて発酵速度を速めることにより、本発明を完成させるに至った。
【００３１】
（流加速度）
酵母に対する糖化液の流加速度は、酵母の糖消費速度により調節する。図１の（Ａ）〜（Ｃ）は、発酵阻害物質濃度の異なる糖化液における酵母の糖消費速度と流加速度との関係を示すグラフである。図１の（Ａ）は発酵阻害物質濃度が低いときのグラフであり、（Ｂ）は発酵阻害物質濃度がやや高いときのグラフであり、（Ｃ）は発酵阻害物質濃度が高いときのグラフである。なお、図１の（Ａ）〜（Ｃ）は、酵母に対する糖化液の流加速度及び酵母の糖消費速度について、仮説を元に作成した概念図である。
酵母における分解の優先順位としては、発酵阻害物質、グルコース、グルコース以外の糖（例えば、キシロース等）の順番である。以下、説明を簡略化するために、グルコース以外の単糖の代表例としてキシロースを挙げて説明する。
【００３２】
図１の（Ａ）において、流加速度が（１）の範囲であるとき、酵母により糖及び発酵阻害物質が分解されている。また、流加速度が（１）と（２）の間の点であるとき、酵母により糖及び発酵阻害物質が分解され、流加培養において、高収率を達成し得る糖消費速度の最大値、すなわち、残糖が発生しない最大の糖消費速度となる。
本明細書において、「残糖」とは、酵母による分解が行われず、培養液中に残留する糖を意味する。ここでいう糖は、酵母が分解可能な単糖等の糖であり、グルコース、キシロース等を含む。
【００３３】
また、流加速度が（２）の範囲であるとき、酵母により糖化液中のグルコース及び発酵阻害物質は分解されるが、供給される糖化液中のキシロース濃度が酵母のキシロースの消費能力を上回り、キシロースが低濃度残留している状態である。また、（２）と（３）の間のグラフの頂点のとき、酵母は糖消費速度の最大値を迎える。
さらに、流加速度が（３）の範囲であるとき、酵母により発酵阻害物質は分解されるが、供給される糖化液中のグルコース濃度が酵母のグルコースの消費能力を上回り、グルコースが残留することで、カタボライト抑制によりキシロースの残留量が増加している状態である。また、流加速度が（３）と（４）の間の点であるとき、酵母により発酵阻害物質は分解されるが、グルコースが残留する最小の糖消費速度、すなわち、発酵阻害が生じない最大の糖消費速度となる。
【００３４】
一般的に、「カタボライト抑制」とは、ある化合物を微生物が代謝して代謝生成物を生成したとき、その代謝生成物がその物質代謝経路若しくは他の経路の酵素合成を抑制したり、酵素活性を抑制して、経路の活性を抑制する現象を意味する。本実施形態においては、主にグルコースの代謝生成物により、その他の糖（主に、キシロース）を分解するための酵素合成を抑制したり、酵素活性を抑制して、グルコース以外の糖（主に、キシロース）の代謝経路を抑制する現象を示す。
【００３５】
また、流加速度が（４）の範囲であるとき、供給される糖化液中の発酵阻害物質濃度が酵母の発酵阻害物質の消費能力を上回り、発酵阻害物質による発酵阻害が生じ、グルコース及びキシロース等の糖が分解される量が急激に減ることにより、残糖が大量に発生している状態である。
【００３６】
図１（Ａ）において、流加速度が（１）と（２）の間の点における糖消費速度と、（３）と（４）の間の点における糖消費速度とが同じである場合（「（１）と（２）の間の点における糖消費速度」＝「（３）と（４）の間の点における糖消費速度」）を例示しているが、糖化液に含まれる糖や発酵阻害物質の濃度によって、「（１）と（２）の間の点における糖消費速度」＞「（３）と（４）の間の点における糖消費速度」となる場合もあり、「（１）と（２）の間の点における糖消費速度」＜「（３）と（４）の間の点における糖消費速度」となる場合もある。
よって、「（１）と（２）の間の点における糖消費速度」＝「（３）と（４）の間の点における糖消費速度」である場合、図１（Ａ）に示すように、流加速度の最適範囲は、（２）及び（３）の範囲である。
一方、「（１）と（２）の間の点における糖消費速度」＞「（３）と（４）の間の点における糖消費速度」である場合、図示していないが、流加速度の最適範囲は、（２）の範囲と、（３）の範囲の内、（２）と（３）の間のグラフの頂点となる流加速度から、（１）と（２）の間の点における糖消費速度と同じ値の糖消費速度となる流加速度までの範囲とを合わせた範囲となる。
また、「（１）と（２）の間の点における糖消費速度」＜「（３）と（４）の間の点における糖消費速度」である場合、図示していないが、流加速度の最適範囲は、（２）の範囲と、（３）の範囲と、さらに、（４）の範囲の内、（３）と（４）の間の点となる流加速度から、（１）と（２）の間の点における糖消費速度と同じ値の糖消費速度となる流加速度までの範囲とを合わせた範囲となる。
【００３７】
よって、上記の通り、酵母に対する糖化液の流加速度と酵母の糖消費速度とが対応関係にあることから、本実施形態における流加速度は、対応する酵母の糖消費速度を元に調節される。
従って、発酵阻害物質が低い場合において、流加速度に対応する酵母の糖消費速度の下限値としては、図１（Ａ）における（１）と（２）の間の点における糖消費速度以上、すなわち、残糖が発生しない最大の糖消費速度以上であることが好ましい。  
また、流加速度に対応する酵母の糖消費速度の上限値としては、図１（Ａ）における（２）と（３）の間のグラフの頂点における糖消費速度以下、すなわち、酵母の最大糖消費速度以下であることが好ましい。
前記糖消費速度が上記下限値及び上限値に挟まれる範囲となるように流加速度を調節することによって、流加培養を用いる第１の発酵工程において、残糖、又は未分解の発酵阻害物質が発生しても、後に続く回分培養を用いる第２の発酵工程において、前記残糖、又は前記未分解の発酵阻害物質を消費することができるため、第１の発酵工程及び第２の発酵工程を通して、酵母による糖消費速度を速く保つことができ、効率的に発酵工程を行うことができる。
【００３８】
また、図１の（Ｂ）において、流加速度が（１）及び（２）の範囲であるときは、図１の（Ａ）と同様であるが、供給される糖化液中のグルコース濃度が酵母のグルコースの消費能力を上回り、グルコースが残留することで、カタボライト抑制によりキシロースの残留量が増加する前に、発酵阻害物質による発酵阻害が生じるため、流加速度が（３）の範囲であるときが存在せず、すぐに流加速度が（４）の範囲となっている。
よって、発酵阻害物質がやや高い場合において、流加速度に対応する酵母の糖消費速度としては、図１（Ｂ）における（１）と（２）の間の点における糖消費速度以上、すなわち、残糖が発生しない最大の糖消費速度以上、酵母の最大糖消費速度以下であることが好ましい。
【００３９】
また、図１の（Ｃ）において、流加速度が（１）の範囲であるときは、図１の（Ａ）と同様であるが、供給される糖化液中のキシロース濃度が酵母のキシロースの消費能力を上回り、キシロースが低濃度残留する前に、発酵阻害物質による発酵阻害が生じるため、流加速度が（２）及び（３）の範囲であるときが存在せず、すぐに流加速度が（４）の範囲となっている。
よって、発酵阻害物質が高い場合において、流加速度に対応する酵母の糖消費速度としては、図１（Ｃ）における（１）と（４）の間のグラフの頂点における糖消費速度、すなわち、酵母の最大糖消費速度であることが好ましい。
【００４０】
したがって、発酵阻害物質濃度を全て包含する形として、本実施形態における流加速度は、対応する酵母の糖消費速度により調節されるものであって、前記酵母の糖消費速度が、残糖が発生しない最大の糖消費速度以上、酵母の最大糖消費速度以下であることが好ましい。
上述の速度に調節することにより、高速且つ高収率でリグノセルロース系バイオマス由来化合物を得ることができる。
【００４１】
糖消費速度の測定方法としては、特別な限定はなく、直接的又は間接的な方法により行ってよい。直接的に行う方法としては、例えば、バイオセンサーを用いる方法等が挙げられる。間接的に行う方法としては、例えば、培養液の糖濃度を屈折式ブリックス（Ｂｒｉｘ）計を始めとする屈折率計、振動式密度計、粘度計等を用いて測定する方法等が挙げられる。また、その他の間接的に行う方法としては、ガス分析計（例えば、レーザガス分析計、ガスクロマトグラフ等）等を用いて、排気ガス中の二酸化炭素濃度を測定し、糖消費速度を算出する方法等が挙げられる。これは、例えば、リグノセルロース系バイオマス化合物としてエタノールを製造する場合において、１分子のグルコースから、２分子のエタノールと２分子の二酸化炭素とが生成されるため、二酸化炭素の発生量からグルコース消費量を計算することができる。
中でも、糖消費速度の測定方法としては、ガス分析計（例えば、レーザガス分析計、ガスクロマトグラフ等）等を用いて、排気ガス中の二酸化炭素濃度を測定し、糖消費速度を算出する方法が好ましい。この方法を用いることで、糖濃度を測定する方法と比較して、短時間で正確な制御を行うことができる。さらに、この方法は、オンラインで素早く糖消費速度を算出することができるため、連続的に行われる発酵工程において、原料の違いや前処理条件の変化による糖濃度や発酵阻害物質濃度の変化に応じて、即座に流加速度を修正するができ、発酵速度の最大化を実現できる。
【００４２】
［第２の発酵工程］
続いて、添加された前記糖化液が一定量に達したとき、前記糖化液の添加を停止し、回分培養により撹拌しながら発酵を行う。発酵温度は、２５℃〜５０℃が好ましく、２８℃〜３５℃がより好ましく、３２℃が特に好ましい。
【００４３】
本実施形態の製造方法において、「一定量」とは、発酵槽を十分に満たす量であって、発酵槽の大きさにより、適宜調節可能な量である。通常、発酵槽の容量の８０％以上９５％以下であればよい。
【００４４】
第２の発酵工程において、回分培養による発酵を終了する判断基準としては、例えば、キシロースの消費速度がグルコースの消費速度よりも遅いことから、キシロース濃度を測定することによって判断する方法等が挙げられる。キシロース濃度の測定方法としては、例えば、高速液体クロマトグラフを用いる方法、Ｄ−キシロース測定キット（ＢＩＯＣＯＮ社製）を用いる方法等が挙げられる。これらの機器は、発酵工程中継続してキシロース濃度をモニターできるようにフローセル方式若しくは発酵槽内に直接設置する方式にて備えることができる。
回分培養による発酵を終了する判断基準となる培養液中のキシロース濃度としては、１．０ｇ／Ｌ以下であることが好ましく、０．５ｇ／Ｌ以下であることがより好ましい。
キシロース濃度が上記範囲にあることにより、培養液中の糖が十分に消費されており、高収率で所望のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を得ることができる。
【００４５】
また、その他の回分培養による発酵を終了する判断基準としては、例えば、上述の通り、１分子のグルコースから、２分子のエタノールと２分子の二酸化炭素とが生成されることから、二酸化炭素濃度を測定することによって判断する方法等が挙げられる。二酸化炭素濃度の測定方法としては、例えば、ガス分析計（例えば、レーザガス分析計、ガスクロマトグラフ等）等を用いる方法等が挙げられる。
回分培養による発酵を終了する判断基準となる培養液中の二酸化炭素濃度としては、ガス分析計（例えば、レーザガス分析計、ガスクロマトグラフ等）等を用いて検知されなくなる程度の低濃度以下であることが好ましい。
二酸化炭素濃度が上記範囲にあることにより、培養液中の糖が十分に消費されており、高収率で所望のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を得ることができる。
【００４６】
発酵における撹拌により酸素が培養液中に供給されることにより、培養液中の１分子のグルコースと６分子の酸素とから６分子の二酸化炭素と６分子の水分子が生成されることが知られている。そのため、グルコースが枯渇すると上記の酸素消費反応が生じなくなり、酸素が消費されず溶存酸素濃度が上昇する。よって、その他の回分培養による発酵を終了する判断基準としては、例えば、培養液中の溶存酸素濃度を測定する方法等が挙げられる。溶存酸素濃度の測定方法としては、例えば、滴定法（例えば、ウインクラー法、ウインクラーアジ化ナトリウム変法）、隔膜電極法（例えば、ガルバニ電極法、ポーラログラフ法）、蛍光法等が挙げられる。
回分培養による発酵を終了する判断基準となる培養液中の溶存酸素濃度としては、１０分前の測定値に対して、１．２倍以上であることが好ましく、２．０倍以上であることがより好ましい。
溶存酸素濃度が上記範囲にあることにより、培養液中の糖が十分に消費されており、高収率で所望のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を得ることができる。
【００４７】
上述の回分培養による発酵を終了する判断基準は、いずれか一つを測定し、発酵を終了するタイミングを判断してもよく、二つ以上を測定し、複合的に発酵を終了するタイミングを判断してもよい。
【００４８】
また、本実施形態の製造方法において、前記第１の発酵工程及び前記第２の発酵工程それぞれにおける発酵時間は、使用する糖化液中に含まれる発酵阻害物質（特に、フルフラール）の含有量、酵母液の量及び糖化液の量によって、適宜調整することができる。例えば、糖化液中のフルフラール濃度が５００ｐｐｍ以上１５００ｐｐｍ以下であり、１．０×１０７ＣＦＵ／ｍＬ以上１．０×１０８ＣＦＵ／ｍＬ以下含む酵母液を用いて、前記酵母液に対する前記糖化液の体積比が２倍以上２５倍以下であるとき、前記第１の発酵工程における発酵時間が１０時間以上１４時間以下であることが好ましく、前記第２の発酵工程における発酵時間が２２時間以上３８時間以下であることが好ましい。
【００４９】
本実施形態の製造方法において、第１の発酵工程の前に、前処理工程及び糖化工程を備えていてもよい。また、第２の発酵工程の後に、精製工程を備えていてもよく、精製工程については、発酵液の活用方法によって、適宜選択できる。例えば、エタノールを得ることを目的とした場合は、発酵液を精製する工程として蒸留工程を設けることができる。
【００５０】
［前処理工程］
前処理工程は、続く糖化工程において、糖化反応を効率的に行うためにリグノセルロース系バイオマスを前処理する工程である。
前処理方法としては、例えば、蒸気のみでの蒸煮法、イオン液体を用いる方法、ミルを用いる粉砕法などが挙げられる。また、前処理工程において、必要に応じて、適宜酸又はアルカリを混合させてもよい。酸としては、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸等の中から選ばれ、これらを単独で又は組み合わせて用いてもよい。中でも工業利用には安価で手に入りやすい硫酸が特に好ましい。アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等が挙げられ、これらを単独で又は組み合わせて用いてもよい。事前処理に用いる反応容器には特に限定はないが、耐酸性又は耐アルカリ性を有する加熱圧力容器、若しくは、耐酸性又は耐アルカリ性を有する容器をオートクレーブのような加熱圧力装置に入れて処理する形態が考えられる。
【００５１】
［糖化工程］
糖化工程は、続く発酵工程において、発酵を効率的に行うために、前処理済みリグノセルロース系バイオマスを糖化する工程である。
糖化工程において、前処理済リグノセルロース系バイオマス及び酵素を混合し、糖化する。糖化温度は、４５℃〜７０℃が好ましく、４５℃〜５５℃がより好ましく、５０℃が特に好ましい。また、糖化時間は１２時間〜１２０時間が好ましく、２４時間〜９６時間がより好ましく、２４時間〜７２時間がさらに好ましい。
【００５２】
本明細書において、酵素とは、リグノセルロース系バイオマスを単糖又はオリゴ糖単位に分解する酵素を意味し、リグノセルロース系バイオマスを単糖又はオリゴ糖にまで分解するものであればよく、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの各活性を持つものであればよい。
セルラーゼは、セルロースをグルコース等の単糖又はオリゴ糖に分解するものであればよく、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）及びβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）の各活性の少なくとも１つの活性を有するものを挙げることができ、これらの各活性を有する酵素混合物であることが、酵素活性の観点から好ましい。
同じくヘミセルラーゼは、ヘミセルロースをキシロース等の単糖又はオリゴ糖に分解するものであればよく、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ及びアラビノフラノシダーゼの各活性の少なくとも１つの活性を有するものを挙げることができ、これらの各活性を有する酵素混合物であることが、酵素活性の観点から好ましい。
これらセルラーゼ及びヘミセルラーゼの起源は限定されることはなく、糸状菌、担子菌、細菌類等のセルラーゼ及びヘミセルラーゼを用いることができる。
【００５３】
［精製工程］
精製工程は、第２の発酵工程において得られた発酵液に含まれるリグノセルロース系バイオマス化合物を精製するための工程である。
精製方法としては、リグノセルロース系バイオマス化合物がアルコール類である場合は、例えば、前記発酵液を蒸留する方法等が挙げられる。また、リグノセルロース系バイオマス化合物がアミノ酸類である場合は、例えば、イオン交換法、活性炭を用いた異物の吸着除去法等が挙げられる。
【００５４】
［リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置］
図２は、本発明の第一実施形態に係るリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置の概略構成を示す図である。なお、以下の説明で用いる図は、本発明の特徴を分かり易くするために、便宜上、要部となる部分を拡大して示している場合があり、各構成要素の寸法比率等が実際と同じであるとは限らない。
本実施形態の製造装置１０は、糖化槽１２と発酵槽１１とが配管により配設されている。また、前記糖化槽１２において得られた糖化液を前記発酵槽１１へ送液する配管１３と、前記発酵槽１１において得られた発酵液を続く精製装置に送役する配管１６とが配設されている。さらに、発酵槽１１は、ガス分析計１４、糖濃度分析計１５及び溶存酸素分析計２３を備えている。ガス分析計１４、糖濃度分析計１５及び溶存酸素分析計２３は、必須の構成ではなく、いずれも備えていなくてもよく、少なくともいずれか一つを備えていてもよく、図２に示すように全て備えていてもよい。
また、図２に示すように、配管１３及び１６は、ガス分析計１４、糖濃度分析計１５及び溶存酸素分析計２３を備えていてもよい。
さらに、制御装置１８がガス分析計１４、糖濃度分析計１５、溶存酸素分析計２３、ポンプ１７ａ及びポンプ１７ｂに接続している。
糖化槽１２の前には、前処理装置が配設されていてもよい。また、発酵槽１１の後に続く設備は、発酵液の用途に応じて、適宜選択することができる。例えば、蒸留塔、分離ろ過膜、遠心分離機等の精製装置が配設されていてもよい。
【００５５】
糖化槽１２は、酵素、前処理済みリグノセルロース系バイオマスを含み、単糖を生成する糖化反応を行うための槽であり、特別な制限はない。例えば、撹拌型、通気撹拌型、気泡塔型、流動層型、充填層型などを挙げられ、これらに限定されない。糖化槽１２の温度は、４０℃〜７０℃が好ましく、４５℃〜５５℃がより好ましく、５０℃が特に好ましい。また、糖化反応時間は１２時間〜１２０時間が好ましく、２４時間〜９６時間がより好ましく、２４時間〜７２時間がさらに好ましい。糖化槽１２内の温度を一定に保つために、糖化槽３の外側に温水循環式のジャケットなど温度調整装置を備えていることが好ましい。
【００５６】
発酵槽１１は、糖化槽１２から得られた糖化液に、酵母を植菌し、発酵するための槽であって、特別な限定はない。発酵槽としては、例えば、撹拌型、通気撹拌型、気泡塔型、流動層型、充填層型等を挙げられ、これらに限定されない。発酵槽１１の温度は、２５℃〜５０℃が好ましく、２８℃〜３５℃がより好ましく、３２℃が特に好ましい。また、発酵時間は、２４時間〜１２０時間が好ましく、２４時間〜９６時間がより好ましく、２４時間〜７２時間がさらに好ましい。
また、図２に示すように発酵槽１１はガス分析計１４及び糖濃度分析計１５を備えているが、ガス分析計１４及び糖濃度分析計１５のうちいずれか一つを備えていてもよく、両方ともに備えていてもよい。
【００５７】
ガス分析計１４は、排気ガス中の二酸化炭素濃度を測定するための分析計であって、特別な限定はない。ガス分析計としては、例えば、レーザガス分析計、ガスクロマトグラフ等を挙げられ、これらに限定されない。これらの機器は、発酵工程中継続して二酸化炭素濃度をモニターできるようにフローセル方式若しくは発酵槽１１内に直接設置する方式にて備えることができる。
【００５８】
糖濃度分析計１５は、培養液中の糖濃度を測定するための分析計であって、特別な限定はない。糖濃度分析計としては、例えば、屈折式ブリックス（Ｂｒｉｘ）計を始めとする屈折率計、振動式密度計、粘度計等が挙げられ、これらに限定されない。これらの機器は、発酵工程中継続して糖濃度をモニターできるようにフローセル方式若しくは発酵槽１１内に直接設置する方式にて備えることができる。
【００５９】
溶存酸素分析計２３は、培養液中の溶存酸素濃度を測定するための分析計であって、特別な限定はない。溶存酸素分析計としては、例えば、ガルバニ式溶存酸素分析計、ポーラログラフ式溶存酸素分析計等が挙げられ、これらに限定されない。これらの機器は、発酵工程中継続して溶存酸素濃度をモニターできるようにフローセル方式若しくは発酵槽１１内に直接設置する方式にて備えることができる。
【００６０】
制御装置１８は、ガス分析計１４又は糖濃度分析計１５での測定結果から糖消費速度を算出し、糖消費速度が上述の［第１の発酵工程］で示した範囲となるようにモニタリングしながらポンプ１７ａを制御することにより、発酵槽１１に送液される糖化液の流加速度を制御するためのものである。さらに、制御装置１８は、ガス分析計１４、糖濃度分析計１５、又は溶存酸素分析計２３での測定結果から、キシロース濃度、二酸化炭素濃度、又は溶存酸素濃度が上述の［第２の発酵工程］で示した範囲となったとき、回分培養による発酵を終了することを判断し、撹拌翼による撹拌を停止し、ポンプ１７ｂを制御することにより、続く精製装置等に送液される発酵液の送液速度を制御するためのものである。
制御装置１８は、例えば、図２に示すように、制御用コンピュータ及びコントローラーから構成されるもの等が挙げられる。
【００６１】
図２に示す本実施形態のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置を用いて、リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造する方法を以下に説明する。
まず、前処理装置を用いて、リグノセルロース系バイオマスを物理的又は化学的な処理を施し、形状を微細化する、又はオリゴ糖に分解する等して糖化酵素処理しやすい状態にする。続いて、前処理済みのリグノセルロース系バイオマスを糖化槽１２へ送液し、糖化酵素を用いて、グルコースやキシロース等の単糖又はより小さなオリゴ糖に分解させる。続いて、糖化槽１２から発酵槽１１へ糖化液の一部を送液し、酵母を添加する。続いて、糖化液を連続的に送液する。このとき、制御装置１８を用いて、ガス分析計１４又は糖濃度分析計１５で測定された値を元に糖消費速度を算出し、糖消費速度が上述の［第１の発酵工程］で示した範囲となるようにモニタリングしながら、ポンプ１７ａを制御することにより、発酵槽１１に送液される糖化液の流加速度を制御し、発酵を行う。続いて、発酵槽１１が一定量の糖化液（通常、発酵槽１１の容量の８０％以上９５％以下）で満たされたら、糖化液の送液を停止し、さらに発酵を行う。続いて、制御装置１８を用いて、ガス分析計１４、糖濃度分析計１５、又は溶存酸素分析計２３で測定された値から、キシロース濃度、二酸化炭素濃度、又は溶存酸素濃度が上述の［第２の発酵工程］で示した範囲となったとき、発酵を終了することを判断し、撹拌翼による撹拌を停止する。続いて、制御装置１８を用いて、ポンプ１７ｂを制御することにより、得られた発酵液の送液速度を制御し、前記発酵液に含まれる所望のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を分離又は精製するために、必要に応じて、蒸留塔等の精製装置へ送液される。
【００６２】
＜第二実施形態＞
一実施形態において、本発明のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法は、前記第１の発酵工程において、発酵開始時の培養液の液面より下から前記糖化液を添加する。
【００６３】
本実施形態の製造方法によれば、水しぶきによる空気の巻き込みや糖化液自体の溶存酸素濃度による培養液中の酸素濃度の増加を抑制することができることができる。
また、発酵工程において、好気条件下では、添加された糖が酵母の菌体合成に使われてしまう。そのため、高発酵収率を達成するためには嫌気条件下に保つことが重要となる。本実施形態の製造方法によれば、培養液を嫌気条件下に保つことができ、発酵収率を向上させることができる。
【００６４】
上述の［第１の発酵工程］において、通常、まず少量の糖化液及び酵母を投入し、混合した後に、糖化液の連続的な添加を開始し、流加培養による発酵を行う。ここでいう少量の糖化液とは、発酵開始時に投入された酵母の量に対し、酵母が糖化液に含まれるグルコース、キシロース及び発酵阻害物質全てを分解可能である程度にグルコース、キシロース及び発酵阻害物質を含む糖化液の量を意味する。よって、使用する糖化液中のグルコース、キシロース及び発酵阻害物質の濃度によって、初期投入する糖化液の量は適宜調節することができる。
【００６５】
本実施形態の製造方法において、初期投入した少量の糖化液及び酵母を含む培養液の液面より下から糖化液を送液することにより、空気との接触を防ぎ、空気の巻き込みを防ぐことができる。培養液の液面より下とは、例えば、発酵槽の底面から糖化液を送液してもよく、液面より下にあたる側面から糖化液を送液してもよい。
【００６６】
［リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置］
図３は、本発明の第二実施形態に係るリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置の概略構成を示す図である。本実施形態の製造装置２０は、配管１３が発酵槽１１の底面に配設されている点で、図２に示す製造装置１０と相違し、その他の構成は製造装置１０と同じである。
なお、以下の図３〜７において、図２に示す構成要素と同一のものについては同じ符号を用いている。
【００６７】
配管１３は、図２と同様に、糖化槽１２において得られた糖化液を発酵槽１１へ送液するための配管であって、特別な限定はない。図３において、配管１３は発酵槽１１の底面に配設されているが、発酵開始時の糖化液の液面より下の側面に配設されていてもよい。
図３に示す製造装置２０は、糖化液の添加が発酵槽１１の底面から送液される以外は、図２に示す製造装置１０と同様の方法により、リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造することができる。
【００６８】
＜第三実施形態＞
一実施形態において、本発明のリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造方法は、前記第１の発酵工程において、前記培養液の液面が発酵槽の撹拌翼の底面から２０ｃｍ下から前記撹拌翼の天面から２０ｃｍ上までを通過するとき、撹拌を停止する。
【００６９】
本実施形態の製造方法によれば、発酵槽内の培養液の液面が発酵槽の撹拌翼と同じ高さになり空気を巻き込むことを予防することができる。さらに、培養液を嫌気雰囲気下に保つことができ、発酵収率を向上させることができる。
【００７０】
上述の［第１の発酵工程］において、撹拌前に初期投入した糖化液と酵母を含む培養液の液面が発酵槽の撹拌翼の底面よりも下である場合、連続的に糖化液を添加していくことで、経時的に培養液の液面が上昇していく。そして、その液面が、好ましくは撹拌翼の底面から２０ｃｍ下から前記撹拌翼の天面から２０ｃｍ上まで、より好ましくは撹拌翼の底面から１５ｃｍ下から前記撹拌翼の天面から１５ｃｍ上まで、さらに好ましくは撹拌翼の底面から１０ｃｍ下から前記撹拌翼の天面から１０ｃｍ上までを通過するとき、発酵槽の撹拌翼による撹拌を停止させる。
本実施形態の製造方法において、糖化液の添加は、上述の＜第二実施形態＞に示す通り、発酵槽内の培養液の液面より下から行ってもよい。
【００７１】
［リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置］
図４は、本発明の第三実施形態に係るリグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置の概略構成を示す図である。本実施形態の製造装置３０は、フローセル流量計１９を備え、前記フローセル流量計１９及び発酵槽１１の撹拌翼が制御装置１８と接続している点で、図２に示す製造装置１０と相違し、その他の構成は製造装置１０と同じである。また、製造装置３０において、図３に示す製造装置２０と同様に、配管１３が発酵槽１１の底面に配設されていてもよい。
【００７２】
フローセル流量計１９は、発酵槽１１の外側面に配設されており、発酵槽１１内の液量及び液面の高さを計測するためのものであって、公知のものを用いればよい。フローセル流量計１９は、制御装置１８と接続している。よって、製造装置３０における制御装置１８は、発酵槽内の培養液の液面を経時的にモニタリングするものである。さらに、制御装置１８は発酵槽１１の撹拌翼に接続しており、撹拌を制御するものである。発酵槽内の培養液の液面が、好ましくは撹拌翼の底面から２０ｃｍ下から前記撹拌翼の天面から２０ｃｍ上まで、より好ましくは撹拌翼の底面から１５ｃｍ下から前記撹拌翼の天面から１５ｃｍ上まで、さらに好ましくは撹拌翼の底面から１０ｃｍ下から前記撹拌翼の天面から１０ｃｍ上までを通過するとき、制御装置１８は撹拌翼による撹拌を停止する。
【００７３】
図４に示す製造装置３０は、制御装置１８がフローセル流量計１９の計測結果を元に、発酵槽１１内の培養液の液面が撹拌翼付近を通過する際に撹拌を停止する制御を行う以外は、図２に示す製造装置１０と同様の方法により、リグノセルロース系バイオマス由来化合物を製造することができる。
【００７４】
＜＜発酵装置＞＞
＜第一実施形態＞
一実施形態において、本発明の発酵装置は、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を発酵するための装置であって、少なくとも１つの泡探知機を有する発酵槽と、前記泡探知機で探知された泡高さを指標として、前記発酵槽へのリグノセルロース系バイオマス由来の糖化液の流加速度を制御する制御装置と、を備える。
【００７５】
本実施形態の発酵装置によれば、流加培養における発泡を抑制することができる。
発泡は菌の流出につながり、従来では、発酵槽内の液面を低く保つ操作、又は消泡剤の添加、撹拌数の抑制等の対策を行っており、生産能力低下、試薬費の増加や収率低下を引き起こすため、製造コストの増加につながることが課題であった。また、発泡の主な要因としては、酵母による二酸化炭素ガスの合成等が挙げられ、発酵槽内の培養液は粘性が高く、合成された二酸化炭素よる発泡が起きやすい環境となっている。
本実施形態の発酵装置は、酵母による二酸化炭素の合成量が少ない流加培養による発酵に好適に用いられるため、優れた発泡抑制効果を有する。また、本実施形態の発酵装置は、泡高さを指標として流加速度を制御することによりさらに発泡を抑制することができ、上記従来法において課題であった製造コストの低下につながる。
【００７６】
図５は、本発明の第一実施形態に係る発酵装置の概略構成を示す図である。本実施形態の発酵装置１００は、ガス分析計１４及び糖濃度分析計１５の代わりに、泡探知機２２を備える点で、図４に示す製造装置３０における発酵槽１１と相違し、その他の構成は製造装置３０における発酵槽１１と同じである。また、発酵装置１００において、図２に示す製造装置１０における発酵槽１１と同様に、ガス分析計１４、糖濃度分析計１５及び溶存酸素分析計２３を備えていてもよい。
【００７７】
泡探知機２２は、発酵槽内の培養液の液面に発生した泡の高さ（泡高さ）を探知するためのものであって、特別な限定はなく、公知のものを用いればよい。泡探知機２２は制御装置１８に接続している。よって、発酵装置１００における制御装置１８は、発酵槽１１内の培養液の液面の泡高さをモニタリングするものである。さらに、制御装置１８はポンプ１７ａに接続しており、前記泡探知機２２で探知された泡高さを指標として、流加速度を制御するものである。制御装置１８は、発酵槽内の培養液の液面に泡が発生していない場合は、流加速度が速くするように制御し、一方、発酵槽内の培養液の液面に発生された泡高さが、好ましくは３０ｃｍ以上、より好ましくは１５ｃｍ以上、さらに好ましくは５ｃｍ以上になるとき、流加速度が遅くなるように制御する。
また、制御装置１８は、発酵槽１１にガス分析計１４及び糖濃度分析計１５のうち少なくともいずれか一つを備える場合、上述の図１に示す製造装置１０と同様に、酵母の糖消費速度による流加速度の制御と組み合わせて、発泡を抑制しながら酵母による最適な糖消費速度となるように、制御を行ってもよい。
また、制御装置１８は、発酵槽１１にガス分析計１４、糖濃度分析計１５及び溶存酸素分析計２３のうち少なくともいずれか一つを備える場合、上述の図１に示す製造装置１０と同様に、ガス分析計１４、糖濃度分析計１５及び溶存酸素分析計２３の測定値から、キシロース濃度、二酸化炭素濃度、又は溶存酸素濃度が上述の［第２の発酵工程］で示した範囲となったとき、発酵を終了することを判断するように、制御を行ってもよい。
また、制御装置１８は、発酵槽１１内の培養液の液面が撹拌翼の底面より下にある場合、上述の製造装置３０における制御装置１８と同様に、液面が、好ましくは撹拌翼の底面から２０ｃｍ下から前記撹拌翼の天面から２０ｃｍ上までを通過するとき、撹拌翼による撹拌を停止するように制御してもよい。
【００７８】
図５に示す本実施形態の発酵装置を用いて、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を発酵する方法を以下に説明する。
まず、糖化装置から発酵槽１１へ糖化液の一部を送液し、酵母を添加する。続いて、糖化液を連続的に送液する。このとき、制御装置１８を用いて、泡探知機２２で探知された泡高さをモニタリングしながら、ポンプ１７ａを制御することにより、発酵槽１１に送液される糖化液の流加速度を制御し、培養液の発泡が抑制しながら発酵を行う。続いて、発酵槽１１が一定量の糖化液（通常、発酵槽１１の容量の８０％以上９５％以下）で満たされたら、糖化液の送液を停止し、さらに発酵を行う。続いて、発酵終了後、制御装置１８を用いて、ポンプ１７ｂを制御することにより、得られた発酵液の送液速度を制御し、前記発酵液に含まれる所望のリグノセルロース系バイオマス由来化合物を分離又は精製するために、必要に応じて、蒸留塔等の精製装置へ送液される。
【００７９】
＜第二実施形態＞
一実施形態において、本発明の発酵装置は、さらに、前記発酵槽は、底面、又は発酵開始時の前記糖化液の液面より下の側面に配設された、前記糖化液を前記発酵槽へ送液するための配管を備える。
【００８０】
本実施形態の発酵装置によれば、流加培養における発泡を抑制することができる。また、水しぶきによる空気の巻き込みや糖化液自体の溶存酸素濃度による培養液中の酸素濃度の増加を抑制することができることができる。さらに、培養液を嫌気雰囲気下に保つことができ、発酵収率を向上させることができる。
【００８１】
図６は、本発明の第二実施形態に係る発酵装置の概略構成を示す図である。本実施形態の発酵装置２００は、配管１３が発酵槽１１の底面に配設されている点で、図５に示す発酵装置１００と相違し、その他の構成は発酵装置１００と同じである。また、発酵装置２００において、図２に示す製造装置１０における発酵槽１１と同様に、ガス分析計１４及び糖濃度分析計１５を備えていてもよい。
【００８２】
配管１３は、図５と同様に、糖化装置において得られた糖化液を発酵槽１１へ送液するための配管であって、特別な限定はない。図６において、配管１３は発酵槽１１の底面に配設されているが、発酵開始時の糖化液の液面より下の側面に配設されていてもよい。
図６に示す発酵装置２００は、糖化液の添加が発酵槽１１の底面から送液される以外は、図５に示す発酵装置１００と同様の方法により、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を発酵することができる。
【実施例】
【００８３】
以下、具体的実施例により、本発明についてより詳細に説明する。ただし、本発明は以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
【００８４】
［参考例１］
２本の５００ｍＬ容量の三角フラスコに、出芽酵母（キシロース資化の遺伝子操作済み）を６．０×１０７ＣＦＵ／ｍＬ含む酵母液を１０ｍＬずつ添加した。続いて、ＹＰＤＸ培地（３％グルコース及び２％キシロースが含有）１９０ｍＬを培養開始０時間の時点で全量添加し培養を行ったもの（以下、「回分培養」と呼ぶことがある。）と、前記ＹＰＤＸ培地１９０ｍＬを４８時間かけて定速で添加しながら培養したもの（以下、「流加培養」と呼ぶことがある。）と、を準備した。流加培養では、送液ポンプとして、ＫＮＦ  Ｌａｂ社製のＳＩＭＤＯＳ０２  ＦＥＭ１．０２ＫＴ．１８Ｓを用いた。また、培養装置としては、Ｂｉｏｓｈａｋｅｒ  ＢＲ−４３ＦＬ（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いた。撹拌条件としては、撹拌数６０ｒｐｍ、３２℃の条件で、４８時間培養を行った。培養開始から１２時間毎に、回分培養及び流加培養それぞれから少量のサンプルを採取し、ＨＰＬＣ（島津製作所製、検出器：ＲＩＤ−１０Ａ、カラムオーブン：ＣＴＯ−２０Ａ）を用いて、培養液中に含まれるエタノールを検出した。結果を図７に示す。
【００８５】
図７から、発酵阻害物質の存在しない環境下では、回分培養のほうが流加培養よりも発酵速度が速いことが明らかとなった。
【００８６】
［参考例２］
ＹＰＤＸ培地の代わりに、希硫酸前処理を行ったリグノセルロース系バイオマスの酵素糖化液（３％グルコース、２％キシロース及び０．０６％フルフラール含有）を１８０ｍＬずつ用い、６．０×１０７ＣＦＵ／ｍＬ含む酵母液を２０ｍＬずつ用いた以外、参考例１と同様の方法を用いて、回分培養及び流加培養を行った。結果を図８に示す。
【００８７】
図８から、発酵阻害物質の存在する環境下では、流加培養のほうが回分培養よりも発酵速度が速いことが明らかとなった。これは、回分培養では著しく発酵阻害が生じるためであると推察できた。
【００８８】
［実施例１］
２本の５００ｍＬ容量の三角フラスコに、出芽酵母（キシロース資化の遺伝子操作済み）を６．０×１０７ＣＦＵ／ｍＬ含む酵母液を１０ｍＬずつ添加した。続いて、希硫酸前処理を行ったリグノセルロース系バイオマスの酵素糖化液（３％グルコース、２％キシロース及び０．０６％フルフラール含有）１９０ｍＬを４８時間かけて定速で添加し培養を行ったもの（以下、「流加培養」と呼ぶことがある。）と、前記酵素糖化液１９０ｍＬを１２時間かけて定速で添加し（前記流加培養の４倍の流加速度で前記酵素糖化液を添加し）、残りの３６時間は前記酵素糖化液の添加を行わずに培養を行ったもの（以下、「流加培養＋回分培養」と呼ぶことがある。）と、を準備した。流加培養では、送液ポンプとして、ＫＮＦ  Ｌａｂ社製のＳＩＭＤＯＳ０２  ＦＥＭ１．０２ＫＴ．１８Ｓを用いた。流加培養＋回分培養における流加培養では、送液ポンプとして、Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ社製のＣｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ（登録商標）  Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ  ７７５２１−５０を用いた。撹拌条件としては、撹拌数６０ｒｐｍ、３２℃の条件で、４８時間培養を行った。培養開始から１２時間毎に、流加培養及び流加培養＋回分培養それぞれから少量のサンプルを採取し、ＨＰＬＣ（島津製作所製、検出器：ＲＩＤ−１０Ａ、カラムオーブン：ＣＴＯ−２０Ａ）を用いて、培養液中に含まれるエタノールを検出した。結果を図９に示す。
【００８９】
図９から、発酵阻害物質の存在する環境下では、流加培養＋回分培養のほうが流加培養よりも発酵速度が速いことが明らかとなった。これは、流加培養＋回分培養では流加培養のみよりも基質濃度が高くなるためであると推察できた。
【００９０】
以上のことから、流加培養及び回分培養を組み合わせることで、高速でエタノールが得られることが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明によれば、高速且つ高収率であると共に、発泡が抑制されたリグノセルロース由来化合物の製造方法を提供することができる。
【符号の説明】
【００９２】
１０、２０、３０…リグノセルロース系バイオマス由来化合物の製造装置、１１…発酵槽、１２…糖化槽、１３，１６…配管、１４…ガス分析計、１５…糖濃度分析計、１７ａ、１７ｂ…ポンプ、１８…制御装置、１９…フローセル流量計、２２…泡探知機、２３…溶存酸素分析計、１００、２００…発酵装置。
【図１】
2018019613.tif 000002
【図２】
2018019613.tif 000003
【図３】
2018019613.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年12月5日(2016.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシロース資化能力を有する酵母に対し、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を発酵槽に添加しながら培養を行う流加培養により発酵を行う第１の発酵工程と、
添加された前記糖化液が一定量に達したとき、前記糖化液の添加を停止し、回分培養により発酵を行う第２の発酵工程と、
を備え、
前記第１の発酵工程における前記酵母に対する前記糖化液の流加速度を、前記酵母の糖消費速度により調節し、
前記酵母の糖消費速度が、培養液中に残留するグルコース及びキシロースが発生しない最大の糖消費速度以上（ただし、培養液中に残留するグルコース及びキシロースが発生しない糖消費速度の範囲を除く）、酵母の最大糖消費速度以下であることを特徴とするエタノールの製造方法。
【請求項２】
前記第１の発酵工程において、前記発酵槽に設けた泡検知機で探知された泡高さを指標として、前記発酵槽へのリグノセルロース系バイオマス由来の糖化液の流加速度を制御する請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記酵母の糖消費速度を、排気ガス中の二酸化炭素濃度を測定し、算出する請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記第２の発酵工程において、培養液中のキシロース濃度が１ｇ／Ｌ以下になるとき、発酵を終了する請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記第２の発酵工程において、排気ガス中に二酸化炭素が検知されなくなるとき、発酵を終了する請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記第２の発酵工程において、培養液中の溶存酸素濃度を測定し、前記溶存酸素濃度が１０分前の測定値に対して１．２倍以上になるとき、発酵を終了する請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記糖化液中のフルフラール濃度が５００ｐｐｍ以上１５００ｐｐｍ以下であり、１．０×１０７ＣＦＵ／ｍＬ以上１．０×１０８ＦＵ／ｍＬ以下含む酵母液を用いて、前記酵母液に対する前記糖化液の体積比が２倍以上２５倍以下であるとき、
前記第１の発酵工程における発酵時間が１０時間以上１４時間以下であり、
前記第２の発酵工程における発酵時間が２２時間以上３８時間以下である請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記第１の発酵工程において、発酵開始時の培養液の液面より下から前記糖化液を添加する請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記発酵槽が撹拌翼を備える場合に、前記第１の発酵工程において、前記培養液の液面が前記発酵槽の前記撹拌翼の底面から２０ｃｍ下から前記撹拌翼の天面から２０ｃｍ上までを通過するとき、撹拌を停止する請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、エタノールの製造方法に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］キシロース資化能力を有する酵母に対し、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を発酵槽に添加しながら培養を行う流加培養により発酵を行う第１の発酵工程と、添加された前記糖化液が一定量に達したとき、前記糖化液の添加を停止し、回分培養により発酵を行う第２の発酵工程と、を備え、前記第１の発酵工程における前記酵母に対する前記糖化液の流加速度を、前記酵母の糖消費速度により調節し、前記酵母の糖消費速度が、培養液中に残留するグルコース及びキシロースが発生しない最大の糖消費速度以上（ただし、培養液中に残留するグルコース及びキシロースが発生しない糖消費速度の範囲を除く）、酵母の最大糖消費速度以下であることを特徴とするエタノールの製造方法。
［２］前記第１の発酵工程において、前記発酵槽に設けた泡検知機で探知された泡高さを指標として、前記発酵槽へのリグノセルロース系バイオマス由来の糖化液の流加速度を制御する［１］に記載の製造方法
［３］前記酵母の糖消費速度を、排気ガス中の二酸化炭素濃度を測定し、算出する［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記第２の発酵工程において、培養液中のキシロース濃度が１ｇ／Ｌ以下になるとき、発酵を終了する［１］〜［３］のいずれか一つに記載の製造方法。
［５］前記第２の発酵工程において、排気ガス中に二酸化炭素が検知されなくなるとき、発酵を終了する［１］〜［４］のいずれか一つに記載の製造方法。
［６］前記第２の発酵工程において、培養液中の溶存酸素濃度を測定し、前記溶存酸素濃度が１０分前の測定値に対して１．２倍以上になるとき、発酵を終了する［１］〜［５］のいずれか一つに記載の製造方法。
［７］前記糖化液中のフルフラール濃度が５００ｐｐｍ以上１５００ｐｐｍ以下であり、１．０×１０７ＣＦＵ／ｍＬ以上１．０×１０８ＣＦＵ／ｍＬ以下含む酵母液を用いて、前記酵母液に対する前記糖化液の体積比が２倍以上２５倍以下であるとき、前記第１の発酵工程における発酵時間が１０時間以上１４時間以下であり、前記第２の発酵工程における発酵時間が２２時間以上３８時間以下である［１］〜［６］のいずれか一つに記載の製造方法。
［８］前記第１の発酵工程において、発酵開始時の培養液の液面より下から前記糖化液を添加する［１］〜［７］のいずれか一つに記載の製造方法。
［９］前記発酵槽が撹拌翼を備える場合に、前記第１の発酵工程において、培養液の液面が前記発酵槽の前記撹拌翼の底面から２０ｃｍ下から前記撹拌翼の天面から２０ｃｍ上までを通過するとき、撹拌を停止する［１］〜［８］のいずれか一つに記載の製造方法。