(57)【要約】【課題】機能性原料としてのＬＰＳ、またこれを配合した飼料、食品、化粧品中の特定のＬＰＳの量を、環境中に存在する他のＬＰＳと区別して定量する方法を提供すること。【解決手段】個々のＬＰＳの糖鎖の違いに着目し、特定のＬＰＳの糖鎖に対するモノクローナル抗体を取得し、当該モノクローナル抗体を使うＥＬＩＳＡ法を構築することで、特定のＬＰＳを他のＬＰＳと識別しつつ定量する方法を開発した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
受領番号がＮＩＴＥ  ＡＰ−０２３４０又はＮＩＴＥ  ＡＰ−０２３４１であることを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項２】
請求項１記載のハイブリドーマにより産生されることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項２記載のモノクローナル抗体を用いることによってエンテロバクター・アスブリエのリポ多糖を定量することを特徴とするリポ多糖の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陰性細菌の細胞壁構成成分である、リポ多糖（ＬＰＳ）を識別、定量、又は捕獲するためのハイブリドーマ、モノクローナル抗体、及び該抗体を利用したＬＰＳの定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポ多糖（ＬＰＳ）は、グラム陰性細菌の細胞表層に局在する物質である。構造的にはリピドＡと呼ばれる脂質に２−ケト−３−デオキシオクトン酸がつき、その次にＲコア多糖、Ｏ抗原多糖と呼ばれる糖鎖が結合している。ＬＰＳの構造は、由来するグラム陰性細菌によって異なり、特に多糖部分では、糖の種類と繰り返し回数が菌種によって異なる（非特許文献１）。ＬＰＳは、自然免疫活性化作用を持ち、歴史的には炎症を誘導する物質とされていた。しかし近年の研究から、ＬＰＳは環境中に普遍的に存在し、経口・経皮で自然摂取されるＬＰＳが生体の免疫力を高める生理的作用があることが明らかとなった（非特許文献２）。このため種々のグラム陰性細菌に由来するＬＰＳが、機能性物質として、飼料、健康食品、化粧品に配合されるに至っている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】C Alexander、外１名、「Chemical Structure of Lipid A-The Primary Immunomodulatory Center of Bacterial Lipopolysaccharides リピドＡの化学構造―細菌リボ多糖の主要な免疫調節活性の中心」、Trends in Glycoscience and Glycotechnology、2002年3月、14(76)、p.69-86
【非特許文献２】H Inagawa、外２名、”Oral administration of lipopolysaccharides for the prevention of various diseases: benefit and usefulness.”、Anticancer Research、2011年7月、31(7)、p.2431-2463
【非特許文献３】自然免疫応用技研社、”糖脂質ＬＰＳ”[online]、［平成28年9月5日検索］、インターネット<http://www.macrophi.co.jp/seihin/index.htm>
【非特許文献４】T Nakamura、外７名、”Intracellular serine-protease zymogen, factor C, from horseshoe crab hemocytes Its activation by synthetic lipid A analogues and acidic phospholipids”、European Journal of Biochemistry、1988年、176、p.89-94
【非特許文献５】E Harlow、外１名、”Antibodies: A laboratorymanual”、Cold Spring Harbor Laboratory、1988年、Chapter 6、p.141-142
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように、ＬＰＳが健康産業上に活用されるようになった背景から、特定のＬＰＳを、環境中にも存在する他のＬＰＳと識別しつつ定量する技術が必要となっている。一般的に、ＬＰＳの定量には、カブトガニの血球ライセートがＬＰＳと反応し、凝固することを応用したリムルス法が用いられる（非特許文献４）。しかし、リムルス法は、ＬＰＳのリピドＡ部分の反応性を利用する方法であるため、特定のＬＰＳを識別することはできない。
【０００５】
ところで特定の物質を高い特異性をもって認識しうる物質のひとつにモノクローナル抗体がある（非特許文献５）。モノクローナル抗体を使う特異性の高い抗原抗体反応と、発色・発光酵素を共役させれば、特定の抗原の量を正確に定量することが可能であり、この特異的定量方法は酵素免疫測定法（Enzyme Linked Immuno Solvent Assay：ＥＬＩＳＡ）と呼ばれている。
【０００６】
そこで、本発明者らは、個々のＬＰＳの糖鎖の違いに着目し、特定のＬＰＳの糖鎖に対するモノクローナル抗体を取得し、当該モノクローナル抗体を使うＥＬＩＳＡを構築することで、特定のＬＰＳを他のＬＰＳと識別しつつ定量することが可能になると考えた。
【０００７】
本発明は、機能性原料としてのＬＰＳ，またこれを配合した飼料、食品、化粧品中の特定のＬＰＳの量を、環境中に存在する他のＬＰＳと区別して定量する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１に係る本発明のハイブリドーマは、受領番号が、ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２３４０又はＮＩＴＥ  ＡＰ−０２３４１であることを特徴とする。
【０００９】
また請求項２に係る本発明のモノクローナル抗体は、請求項１記載のハイブリドーマにより産生されることを特徴とする。
【００１０】
また、請求項３に係る本発明の定量方法は、請求項２記載のモノクローナル抗体を用いることによってエンテロバクター・アスブリエのリポ多糖を定量することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば特定のＬＰＳを有効成分とする原料、当該ＬＰＳ原料を配合した食品、化粧品中の特定のＬＰＳ含量を正確に測定できることから、当該ＬＰＳ原料やＬＰＳ配合製品の品質管理が容易になるほか、当該ＬＰＳの効果・効能を明確にすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、添付図面を参照しながら本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
【実施例１】
【００１４】
エンテロバクター・アスブリエＬＰＳ（以下、「ＬＰＳa４６」という。）特異的なモノクローナル抗体の樹立
（１）スクリーニングのためのＥＬＩＳＡ
９６ウエルイムノプレートに、ＬＰＳａ４６（１μｇ／ｍＬ）をウエルあたり５０μＬずつ分注し、室温、一夜インキュベーションした。翌日、ウエルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファーで３回洗浄し、ハイブリドーマの培養上清またはコントロール上清をウエルあたり５０μＬずつ分注し、室温で６０分インキュベーションした。その後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファーでウエルを３回洗浄し、ＨＲＰコンジュゲイティッド抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ（１０，０００倍希釈）をウエルあたり５０μＬずつ分注し、室温、３０分インキュベーションした。その後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファーでウエルを３回洗浄し、ＯＰＤＡをウエルあたり５０μＬ分注し、室温の暗室内で１０分インキュベーションした。その後、Ｈ３ＰＯ４（１Ｍ）をウエルあたり１００μＬ分注し、プレートリーダーで４９２ｎｍの波長の発色を測定した。
【００１５】
（２）抗原の調製
培養後のエンテロバクター・アスブリエの菌体を生理食塩水で２回洗った後水に懸濁し、９０℃、２０分間加熱した。その後、１バイアルあたり約１×１０8個の菌体が含まれるように分注し凍結乾燥した。
【００１６】
（３）免疫
上記（２）のように調整した菌体を、フロインドコンプリートアジュバンドと混和して乳化させ、ＢＡＬＢ／ｃマウス１匹に対して約１×１０8個を尾根部筋肉内に注射（免疫）した（合計３匹）。さらに同じ抗原（上記（２）のように調整した菌体）をフロインドインコンプリートアジュバンドと混和して乳化させ、二週間間隔で２回、マウス１匹に対して約１×１０8個を皮下に注射（追加免疫）した。その後、マウスの腹腔に最終免疫を実施した。
【００１７】
（４）試血および抗体活性測定
初回および追加免疫から一定期間経過した後、マウスより試血して、上記（１）のＥＬＩＳＡにより、抗体活性の測定を実施した。
【００１８】
（５）リンパ球および抗血清の採取
最終免疫より３日後に脾臓を採取、リンパ球を分離後、−８０℃で凍結保存した。同時に、採血を実施し、血清を分離後に−４０℃で凍結保存した。得られた抗血清は、スクリーニング時の陽性コントロールとして用いた。
【００１９】
（６）細胞融合〜培養
上記（５）で得られたリンパ球とマウスミエローマを５０％ポリエチレングリコール存在下で細胞融合を実施した。融合細胞はＨＡＴ培地に分散させ、９６ウエルマイクロプレート８枚に分注し、３７℃炭酸ガスインキュベーターで培養した。細胞融合から６日目にＨＴ培地に交換後、さらに培養を続けた。
【００２０】
（７）一次スクリーニング〜培養
細胞融合から８日後、９６ウエルマイクロプレートの各ウエルから培養上清をサンプリングし、上記（１）のＥＬＩＳＡにより一次スクリーニングを実施した。その結果、陽性となったウエルを、２４ウエルマイクロプレートに拡大培養した。
【００２１】
（８）二次スクリーニング、細胞の一時凍結保存、および評価
２４ウエルマイクロプレートに移して３日間拡大培養させた後、マイクロプレートの各ウエルから培養上清をサンプリングし、上記（１）のＥＬＩＳＡにより二次スクリーニングを実施した。この段階で、培養上清中の抗体のアイソタイプを確認した。また培養上清が、ＬＰＳa４６以外の３種のＬＰＳ（パントエア・アグロメランスＬＰＳ、パントエア・バガンスＬＰＳ、大腸菌ＬＰＳ）に対し、陰性であることを上記（１）のＥＬＩＳＡにより確認した。
【００２２】
（９）クローニング
選択されたウエルの細胞は、限界希釈法にてクローニングを実施した。
【００２３】
（１０）クローニング後の一次スクリーニング〜培養
クローニングから約１週間後、上記（１）のＥＬＩＳＡによりスクリーニングを実施した。陽性を示したウエルの中から、１コロニー／ウエルで、形状の良い細胞を２４ウエルマイクロプレートに移して拡大培養させた。
【００２４】
（１１）クローニング後の二次スクリーニング
２４ウエルマイクロプレートに移して３日間拡大培養させた後、マイクロプレートの各ウエルから培養上清をサンプリングし、上記（１）のＥＬＩＳＡにより二次スクリーニングを実施し、最終的に６種のクローンを選択した。
【００２５】
（１２）拡大培養〜凍結保存
確立されたクローンは、ＧＩＴ培地で７５ｃｍ2のフラスコにコンフルエントになるまで拡大培養させ、遠心分離後、凍結保存用培地（ＧＩＴ：ＦＢＳ：ＤＭＳＯ＝７：２：１、無菌ろ過）約３ｍＬに分散させ、凍結保存した。
【実施例２】
【００２６】
本発明のモノクローナル抗体を用いて、ＬＰＳa４６標品の定量性について検討した。抗体としては、上記実施例１で得られたハイブリドーマ培養液を限外ろ過にて１／１０に濃縮したものを使用した。固相化抗体としてＮＩＴＥ  ＡＰ−０２３４０から得られる２１−５Ａ（アイソタイプＧ２ｂ）を、一次抗体としてＮＩＴＥ  ＡＰ−０２３４１から得られる３９−６Ｇ（アイソタイプＧ３）を選んだ。二次抗体は、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ３特異的山羊免疫グロブリン（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ・Ｃａｔ．Ｎｏ．１１００−０４）を用いた。
【００２７】
９６ウエルイムノプレートに、固相化抗体２１−５Ａ（ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２３４０培養液濃縮液の４００倍希釈液）をウエルあたり５０μＬずつ分注し、４℃で一夜インキュベーションした。翌日、抗体溶液を捨てて、ブロッキング溶液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ）をウエルあたり２００μＬずつ分注し、室温で３０分以上インキュベーションした。その後、Ｔ−ＴＢＳバッファーでウエルを３回洗浄し、段階希釈したＬＰＳａ４６溶液をウエルあたり５０μＬずつ分注し、室温で１時間インキュベーションした。その後、Ｔ−ＴＢＳでウエルを３回洗浄し、一次抗体３９−６Ｇ（ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２３４１培養液濃縮液の１００倍希釈液）をウエルあたり５０μＬ分注し、室温で１時間インキュベーションした。その後、Ｔ−ＴＢＳでウエルを３回洗浄し、二次抗体をウエルあたり５０μＬ分注し、室温で１時間インキュベーションした。その後、Ｔ−ＴＢＳでウエルを５回洗浄し、発色基質（１ｍｇ／ｍＬ：ｐ−ＮＰＰ）をウエルあたり１００μＬ分注し、室温で１時間インキュベーションし、プレートリーダーで吸光度値（４０５ｎｍの吸光度値から７００ｎｍの吸光度値を引いた値）を測定した。
【００２８】
この結果、ＬＰＳa４６が６．２５ｎｇ／ｍＬ以上の濃度であれば定量的に測定できることが示された。
【００２９】
図１は、本発明のモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡによる、ＬＰＳa４６標品の測定結果を示す。ＬＰＳａ４６の６．２５ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲において、４パラメーターのロジスティック曲線で描ける濃度依存的な吸光度値（４０５ｎｍの吸光度値から７００ｎｍの吸光度値を引いた値）の上昇が認められた。すなわち、本発明のモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡにより、ＬＰＳa４６標品として標準曲線が描けるので、未知のサンプル中のＬＰＳa４６の量を定量することが可能である。
【実施例３】
【００３０】
予めリムルス法によってＬＰＳ濃度が決定されたＬＰＳa４６を含む化粧品用ＬＰＳa４６原料の３ロットをサンプルとし、精製したＬＰＳa４６を標準品として実施例２のＥＬＩＳＡに準じて、ＬＰＳ濃度の測定を実施した。その結果を表１に示す。ＥＬＩＳＡによる測定値は、リムルス法による測定値と一致することが示された。
【００３１】
【表１】
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【図１】
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