(57)【要約】【課題】  培地交換時にウェル内の細胞をウェル外へ流出させることなく、長期にわたり均一なスフェロイドをウェル内に高効率に保持できる細胞培養担体を提供する。【解決手段】  基材の上面に細胞を培養する複数のウェルを有し、前記ウェル開口部の直径が７０μｍ以上１０００μｍ以下、ウェル深さが１００μｍ以上１５００μｍ以下、かつ前記開口部直径に対する前記ウェル深さの比が１．５以上３．０以下である細胞培養担体。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材の上面に細胞を培養する複数のウェルを有する細胞培養担体であって、
前記ウェル開口部の直径が７０μｍ以上１０００μｍ以下、ウェル深さが１００μｍ以上１５００μｍ以下、かつ前記開口部直径に対する前記ウェル深さの比が１．５以上３．０以下であることを特徴とする細胞培養担体。
【請求項２】
前記ウェルの最底部と前記基材の下面との厚さが５０μｍ以上２００μｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養担体。
【請求項３】
前記ウェル最底部と前記基材下面との厚さが、前記ウェル深さの０．０３倍以上１倍以下であることを特徴とする請求項２に記載の細胞培養担体。
【請求項４】
前記細胞培養担体は、アルミナ、チタニア、ジルコニア、ハイドロキシアパタイト、イットリア、イットリウム・アルミニウム・ガーネット（YAG）、ガラス、プラスチックから選ばれる少なくとも１つの材質からなることを特徴とする請求項１乃至３に記載の細胞培養担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の培養などに用いられる細胞培養担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を医療や創薬研究に応用することへの注目が高まっている。そのためには、上記幹細胞を効率よく大量培養し、目的とする組織細胞に短期間で的確に分化・誘導する技術が重要であり、開発が求められている。
【０００３】
上記の幹細胞は、高い分化能を保持するためにスフェロイドと呼ばれる細胞凝集塊の形成することが望ましいが、シャーレに接着させる従来の培養方法では均一な大きさのスフェロイドを作ることが難しく、また高密度化が困難であった。この課題を解決すべく、細胞をスフェロイドとして培養できる細胞培養担体や、細胞培養技術の開発が進められている。
【０００４】
これまでに様々な形態の細胞培養担体が報告されているが、たとえば特許文献１では基板表面に複数のウェルが設けられた細胞培養担体を作製し、ウェル内で均一なスフェロイドを効率よく大量培養できることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−５０４２６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記特許文献１に記載された細胞培養担体は、スフェロイドの担体表面への接着が非常に弱く、培地交換などのピペッテイング操作でウェル内からスフェロイドが剥がれ、ウェルの外へ容易に流出してしまう問題があった。この傾向は、細胞を回収するという点では利点であるが、分化誘導のために長期間培養すると、培地交換毎に細胞数が減少し、最終的な回収率が低下する恐れがあるという技術的課題があった。
【０００７】
本発明は、上記技術的課題を解決するためになされたものであり、培地交換時にウェル内の細胞をウェル外へ流出させることなく、長期にわたり均一なスフェロイドをウェル内に高効率に保持できる細胞培養担体を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するためになされた本発明にかかる細胞培養担体は、基材の上面に細胞を培養する複数のウェルを有し、前記ウェル開口部の直径が７０μｍ以上１０００μｍ以下、ウェル深さが１００μｍ以上１５００μｍ以下、かつ前記開口部直径に対する前記ウェル深さの比が１．５以上３．０以下であることを特徴としている。
【０００９】
ウェル開口部とウェル深さがこのような関係である担体を用いることにより、培地交換時にウェル内からスフェロイドを流出するのを抑制することができる。また長期にわたり均一なサイズのスフェロイドをウェル内に高効率に保持することができる。
【００１０】
なお、前記ウェルの最底部と前記基材の下面との厚さが５０μｍ以上２００μｍ以下であることが望ましい。
【００１１】
このような厚さにすることにより、細胞培養担体を細胞培養モジュールに組み込んだ際に、基材下面から吸引することにより、ウェル内に細胞を効率よく納めることができ、さらにウェル内の通液時の圧力損失を抑えることができ、スフェロイドに与える抵抗を減らせるため、より均一で球形の細胞塊を得ることができる。
【００１２】
前記ウェル最底部と前記基材下面との厚さが、前記ウェル深さの０．０３倍以上１倍以下であるが望ましい。
【００１３】
ウェル最底部と基材下面の厚さが、ウェル深さとの比がこのような関係であることにより、スフェロイドにかかる大きな圧力を抑制することができるため、スフェロイドの崩壊を防ぎ、均一なサイズのスフェロイドを高効率で得ることができる。
【００１４】
前記細胞培養担体は、アルミナ、チタニア、ジルコニア、ハイドロキシアパタイト、イットリア、イットリウム・アルミニウム・ガーネット（YAG）、ガラス、プラスチックから選ばれる少なくとも１つの材質からなることが望ましい。
【発明の効果】
【００１５】
培地交換等の水流により細胞培養担体のウェル内からスフェロイドが流出するのを抑制し、長期間にわたりスフェロイドをウェル内に保持することができる。ウェル内で均一なサイズのスフェロイドを高効率で得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の細胞培養担体を示す概念図（斜視図）である。
【図２】図２は、図１のＩ−Ｉ断面図である。
【図３】図３は、本発明の細胞培養担体を用いて細胞を培養した際の細胞培養担体に接着した細胞のマイクロスコープ写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明にかかる細胞培養担体の実施形態ついて、図１及び図２に基づいてより詳細に説明する。
図示するように、この実施形態の細胞培養担体１は、上面２に複数のウェル３を有している。前記ウェル３は、ウェル開口部の直径aが７０μｍ以上１０００μｍ以下、ウェルの深さｂが１００μｍ以上１５００μｍ以下であり、かつ前記ウェル開口部の直径ａに対する前記ウェルの深さの比（ｂ／ａ）が１．５以上３．０以下に形成されている。
【００１８】
このように、細胞培養担体１に形成されたウェル３が特定の開口径及び深さを有するため、ウェル内で培養されている細胞がウェル開口部からの培地の流れを受けたとしても、ウェル内に留まることができ、容易にウェル外へ流出するのを防ぐことができる。これにより、細胞をウェル内に長期間留まらせることができるため、均一なサイズのスフェロイドを高効率で保持することができる。
【００１９】
具体的には、ウェル開口部の直径が７０μｍ未満であると、形成できるスフェロイドは直径７０μｍ未満と小さく、増殖するとウェル内が狭いために満杯になりやすく、隙間なく過密になるとウェル外にはみ出して隣接するウェルと合体したり、ウェルから回収できなくなり好ましくなく、１０００μｍを超える場合にはウェルに合わせた大きさのスフェロイドでは中止部まで酸素が供給できずに性能が劣化し死滅する恐れがあり、細胞播種数を減らしてスフェロイドを小さくすると、空間の自由度が高くなるため形状の制御が困難になり好ましくない。
また、ウェルの深さが１００μｍ未満であると、培地の流れにより容易にウェル外へ流出するため、好ましくなく、１５００μｍを超える場合は、ウェルからのピペッティングでの細胞回収が困難になるため好ましくない。
【００２０】
さらにウェル開口部の直径に対するウェル深さの比が１．５未満であると、培地の流れにより容易にウェル外へ流出するため、好ましくなく、３．０を超える場合は、ピペッティングでのウェルからの細胞回収が困難になるであるため、好ましくない。
【００２１】
また、ウェル最底部５と基材下面４との厚さｃが５０μｍ以上２００μｍ以下に形成されることが好ましい。
これにより、細胞培養担体１を細胞培養モジュールに組み込んだ際に、基材下面から吸引することにより、ウェル内に細胞を効率よく納めることができ、さらにウェル内の通液時の圧力損失を抑えることができ、スフェロイドに与える抵抗を減らせるため、より均一で球形の細胞塊を得ることができる。
ここで、ウェル最底部とは、ウェルの最も深い部分を指す。例えば、図２に示すような形状の場合は、点Ｄを最底部とする。なお、ウェルの形状については、円筒状、円錐状、中央部が凹んだ湾曲形状、半球状等特に限定されるものではないが、細胞が凝集しやすく、スフェロイドが真球に近い形状をとりやすくなるため、中央部が凹んだ湾曲形状または半球状がより好ましい。
【００２２】
また、ウェル最底部と基材下面との厚さｃが、ウェル深さｂに対し０．０３倍以上１倍以下に形成することが好ましい。これにより、細胞培養担体を細胞培養モジュールに組み込んだ際、ウェル内の通液時の圧力損失を抑えることができる。すなわち、スフェロイドにかかる大きな圧力を抑制することができるため、スフェロイドの崩壊を防ぎ、均一なサイズのスフェロイドを高効率で得ることができる。
【００２３】
細胞培養担体１は、アルミナ、ジルコニア、チタニア、ハイドロキシアパタイト、イットリア、イットリウム・アルミニウム・ガーネット（ＹＡＧ）から選ばれる１つ以上のセラミックス、ガラス、またはプラスチックからなることが好ましい。特に生体安全性が確認されている、アルミナ、ジルコニア、ハイドロキシアパタイト、チタニアがより好ましい。特にジルコニアまたはアルミナが好ましい。
さらに前記細胞培養担体１は、前記材料を用いて作製される平均気孔径０．０１μｍ以上０．３μｍ以下、気孔率３０％以上５０％以下の多孔質体であることが特に好ましく、これによりウェル内の細胞にも培養液を十分供給できる。
【実施例】
【００２４】
（実施例１）  
２４ウェルプレートのウェルに、直径a３００μm、深さｂ４５０μm、底部厚みｃ３００μm（アスペクト比：１．５）のマイクロウェルが配列したアルミナ製の細胞培養担体を入れた。ここにフィーダーフリー環境で培養した人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を１×１０６個播種し、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を添加した専用培地（ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ８）で３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で培養した。培養1日後にＹ−２７６３２無添加の培地に交換後、Ｙ−２７６３２無添加の培地に１日毎に交換を行いながら、２週間培養した。担体にｉＰＳを播種後、１，３，７日後にマイクロスコープにて観察し、ウェル内に凝集塊の存在するウェル数を数えた。
その結果、培養１日目のウェル内には細胞凝集体が100％充填されており、その後７日間で92％まで維持されていた。
【００２５】
（比較例1）
２４ウェルプレートのウェルに、直径ａ３００μm、深さｂ３００μm、底部厚みｃ３００μm（アスペクト比：１）のマイクロウェルが配列したアルミナ製の細胞培養担体を入れた。ここにフィーダーフリー環境で培養した人工多能性幹細胞(ｉＰＳ)を１×１０６個播種し、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を添加した専用培地（ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ８）で３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で培養した。培養1日後にＹ−２７６３２無添加の培地に交換後、１日毎にＹ−２７６３２無添加の培地交換を行いながら、2週間培養した。担体にｉＰＳを播種後、１，２，３，７，１４日後にマイクロスコープにて観察し、ウェル内に凝集塊の存在するウェル数を数えた。
その結果、培養1日目のウェル内には細胞凝集体が１００％充填されていたが、その後７日間培養すると、培地交換毎に細胞がウェルから乖離し、充填率は８１％まで減少した。
【００２６】
【表１】
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【符号の説明】
【００２７】
１  細胞培養担体
２  基材上面
３  ウェル
４  基材下面
５  ウェル最底部
ａ  ウェル開口部直径
ｂ  ウェル深さ
ｃ  ウェル最底部と基材下面との厚さ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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