(57)【要約】      （修正有）【課題】活性型タンパク質を製造、若しくはタンパク質を安定化する、方法の提供。【解決手段】遺伝子組換えによる活性型タンパク質の製造方法であって、以下の工程［１］〜［５］を含む方法。［１］（ａ）アーキア由来の高温誘導型シャペロニン、又は（ｂ）シャペロニン改変体、静電相互作用しうるアミノ酸配列領域が付加された（ｃ）目的タンパク質を遺伝子組換えにより生産する工程、［２］他のタンパク質から単離されていない目的タンパク質（ｃ）を、溶液中において、シャペロニン（ａ）及び／又は改変体（ｂ）と共存させて、静電相互作用を介した両者の結合体を得る工程、［３］結合体を含む溶液を加熱処理して、他のタンパク質を変性させる工程、［４］結合体と変性タンパク質とを含む溶液から、未変性の目的タンパク質（ｃ）を単離する工程、［５］工程［４］より得られた未変性の目的タンパク質（ｃ）から前記アミノ酸配列領域を切除する工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組換えによる活性型タンパク質の製造方法であって、以下の工程［１］〜［４］を含む方法：
［１］（ａ）アーキア由来の高温誘導型シャペロニン、又は
（ｂ）シャペロニン活性を有し、かつループ構造を有するＣ末端尾部が生理的ｐＨ下で負に荷電している前記シャペロニンの改変体
のループ構造を有するＣ末端尾部と静電相互作用しうるアミノ酸配列領域が付加された  （ｃ）目的タンパク質
を遺伝子組換えにより生産する工程；
［２］前記工程［１］により得られた、他のタンパク質から単離されていない前記目的タンパク質（ｃ）を、溶液中において、前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）と共存させることにより、前記静電相互作用を介した両者の結合体を得る工程；
［３］前記工程［２］により得られた、前記結合体を含む溶液を加熱処理することにより、他の前記タンパク質を変性させる工程；及び
［４］前記工程［３］により得られた、前記結合体と変性タンパク質とを含む溶液から、未変性の前記目的タンパク質（ｃ）を単離する工程。
【請求項２】
さらに、
［５］前記工程［４］により得られた、未変性の前記目的タンパク質（ｃ）から、前記アミノ酸配列領域を切除する工程
を含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
（ａ）アーキア由来の高温誘導型シャペロニン、又は
（ｂ）シャペロニン活性を有し、かつループ構造を有するＣ末端尾部が生理的ｐＨ下で負に荷電している前記シャペロニンの改変体
のループ構造を有するＣ末端尾部と静電相互作用しうるアミノ酸配列領域が付加された（ｃ）目的タンパク質
を安定化する方法であって、
［ｉ］前記目的タンパク質（ｃ）を、溶液中において、前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）と共存させることにより、前記静電相互作用を介した両者の結合体を得る工程
を含む方法。
【請求項４】
前記改変体（ｂ）のループ構造を有するＣ末端尾部が、２０〜３０個のアミノ酸からなり、２０％以上のアミノ酸が、アスパラギン酸及びグルタミン酸のいずれか、又はアスパラギン酸及びグルタミン酸のいずれかである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記改変体（ｂ）のループ構造を有するＣ末端尾部が、前記シャペロニン（ａ）のＣ末端側２０〜３０個の尾部とのアミノ酸配列同一性８０％以上を示す、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アミノ酸配列領域が、等電点９〜１２を示す、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記アミノ酸配列領域が、等電点２〜５を示す、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記工程［２］又は工程［ｉ］で使用する溶液のｐＨが、８．５〜１０．５である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記工程［２］又は工程［ｉ］で使用する溶液のｐＨが、３〜６である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記シャペロニン（ａ）が、配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記改変体（ｂ）が、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と配列同一性８０％以上である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）を遺伝子組換えにより、前記目的ポリペプチド（ｃ）と同一の宿主内において発現させることにより、前記工程［２］において、前記目的タンパク質（ｃ）を、前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）と共存させる、請求項１、２及び４〜１１のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記目的ポリペプチド（ｃ）と、前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）とを遺伝子組換えにより、同一の宿主内において発現させることにより、前記工程［ｉ］において、前記目的タンパク質（ｃ）を、前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）と共存させる、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の安定化方法。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法のために用いられる、前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）を含む組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法のために用いられる、前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法のために用いられる、前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）をコードするポリヌクレオチドを有するベクター。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性型タンパク質の製造方法若しくはタンパク質の安定化方法、並びにそれらの方法のために用いられるポリペプチド、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びそのポリヌクレオチドを有するベクター等に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、正しい三次元構造を取る（以下、「フォールディング」という）ことによって、本来の機能を発揮することができる。１９９０年頃までは、フォールディングは自発的に起こるものと考えられていた。その後、細胞内でのタンパク質のフォールディングにおいては、分子シャペロニンと称されるタンパク質群が関与していることが明らかにされた。用語「分子シャペロニン」（本明細書において、単に「シャペロニン」と称すこともある）は、分子シャペロンと呼ばれる大きな集団の中に含まれる１グループを指す。
【０００３】
シャペロニンは複数のサブユニットからなる複合体として機能し、このシャペロニン複合体は、６０ｋＤａの球状タンパク質一つが十分に収まる程度の大きさの、空洞部（キャビティ）と呼ばれる空間を分子内に有する。シャペロニン複合体は、この空洞部に様々なタンパク質の折り畳み中間体又は変性タンパク質等を一時的に収容することができ、タンパク質の折り畳み構造が正常に形成されると、ＡＴＰの分解と共役してその折り畳まれたタンパク質を空洞部外へと放出する。
【０００４】
細胞内は、一般に、タンパク質が適切なフォールディングを行う上では過酷な環境である。特に、遺伝子組換え法によりタンパク質を強制発現させた場合などには、細胞内のタンパク質濃度が高くなっており、フォールディングの途中で凝集（封入体）が生じやすい。このため、産業上有用なタンパク質を遺伝子組換え法により得ようとする際に、活性型タンパク質として得ることが困難な場合がある。
【０００５】
タンパク質を遺伝子組換え技術により得ようとする際の障害としては、他にも、例えば、目的タンパク質が宿主に対して何らかの毒性を示すこと、又は目的タンパク質が可溶性タンパク質として発現したしても、宿主由来プロテアーゼにより分解されてしまうこと、等が挙げられる。
【０００６】
これらの問題を解決するためには、従来、目的タンパク質ごとに適切な発現条件を、試行錯誤を経て見出す必要があった。
【０００７】
これらの問題を、このように個別具体的にではなく、根本的に解決しようとする手段として、目的タンパク質とシャペロニンサブユニットとを連結した融合タンパク質を利用する方法が提案されている（特許文献１及び２）。
【０００８】
しかし、これらの方法においては、目的タンパク質とシャペロニンサブユニットとを連結した融合タンパク質をコードする融合遺伝子を発現ベクターに組み込む必要があり、サイズが大きくなるために宿主内で不安定化する傾向があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００２／０５２０２９号
【特許文献２】特開２０１０−２４６５２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、活性型タンパク質を製造、若しくはタンパク質を安定化する、新しい方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、アーキア由来の高温誘導型シャペロニンのループ構造を有するＣ末端尾部が生理的ｐＨ下で負又は正に荷電していることに着目した。本発明者らは、このループ構造を有するＣ末端尾部と静電相互作用しうるアミノ酸配列領域が人工的に付加された目的タンパク質を遺伝子組換えにより産生し、これをアーキア由来高温誘導型シャペロニンと共存させることにより両者の結合体を形成することができ、目的タンパク質を安定化できることを見出した。本発明者らは、さらに、このことを利用すれば、目的タンパク質を活性型のまま効率的に遺伝子組換え法により産生することができることを見出した。
【００１２】
本発明は、上記の知見に基づき、さらなる試行錯誤を経て完成されたものであり、下記の態様を含む。
【００１３】
［項１］
遺伝子組換えによる活性型タンパク質の製造方法であって、以下の工程［１］〜［４］を含む方法：
［１］（ａ）アーキア由来の高温誘導型シャペロニン、又は
（ｂ）シャペロニン活性を有し、かつループ構造を有するＣ末端尾部が生理的ｐＨ下で負又は正に荷電している前記シャペロニンの改変体
のループ構造を有するＣ末端尾部と静電相互作用しうるアミノ酸配列領域が付加された
（ｃ）目的タンパク質
を遺伝子組換えにより生産する工程；
［２］前記工程［１］により得られた、他のタンパク質から単離されていない前記目的タンパク質（ｃ）を、溶液中において、前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）と共存させることにより、前記静電相互作用を介した両者の結合体を得る工程；
［３］前記工程［２］により得られた、前記結合体を含む溶液を加熱処理することにより、他の前記タンパク質を変性させる工程；及び
［４］前記工程［３］により得られた、前記結合体と変性タンパク質とを含む溶液から、未変性の前記目的タンパク質（ｃ）を単離する工程。
［項２］
さらに、
［５］前記工程［４］により得られた、未変性の前記目的タンパク質（ｃ）から、前記アミノ酸配列領域を切除する工程
を含む、項１に記載の製造方法。
［項３］
（ａ）アーキア由来の高温誘導型シャペロニン、又は
（ｂ）シャペロニン活性を有し、かつループ構造を有するＣ末端尾部が生理的ｐＨ下で負又は正に荷電している前記シャペロニンの改変体
のループ構造を有するＣ末端尾部と静電相互作用しうるアミノ酸配列領域が付加された（ｃ）目的タンパク質
を安定化する方法であって、
［ｉ］前記目的タンパク質（ｃ）を、溶液中において、前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）と共存させることにより、前記静電相互作用を介した両者の結合体を得る工程
を含む方法。
［項４］
前記改変体（ｂ）のループ構造を有するＣ末端尾部が、２０〜３０個のアミノ酸からなり、２０％以上のアミノ酸が、アスパラギン酸及びグルタミン酸のいずれか、又はアスパラギン酸及びグルタミン酸のいずれかである、項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
［項５］
前記改変体（ｂ）のループ構造を有するＣ末端尾部が、前記シャペロニン（ａ）のループ構造を有するＣ末端側２０〜３０個の尾部とのアミノ酸配列同一性８０％以上を示す、項４に記載の方法。
［項６］
前記アミノ酸配列領域が、等電点９〜１２を示す、項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
［項７］
前記アミノ酸配列領域が、等電点２〜５を示す、項１〜５のいずれか一項に記載の方法。［項８］
前記工程［２］又は工程［ｉ］で使用する溶液のｐＨが、８．５〜１０．５である、項６に記載の方法。
［項９］
前記工程［２］又は工程［ｉ］で使用する溶液のｐＨが、３〜６である、項７に記載の方法。
［項１０］
前記シャペロニン（ａ）が、配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなる、項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
［項１１］
前記改変体（ｂ）が、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と配列同一性８０％以上である、項１０に記載の方法。
［項１２］
前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）を遺伝子組換えにより、前記目的ポリペプチド（ｃ）と同一の宿主内において発現させることにより、前記工程［２］において、前記目的タンパク質（ｃ）を、前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）と共存させる、項１、２及び４〜１１のいずれか一項に記載の製造方法。
［項１３］
前記目的ポリペプチド（ｃ）と、前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）とを遺伝子組換えにより、同一の宿主内において発現させることにより、前記工程［ｉ］において、前記目的タンパク質（ｃ）を、前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）と共存させる、項３〜１１のいずれか一項に記載の安定化方法。
［項１４］
項１〜１１のいずれか一項に記載の方法のために用いられる、前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）を含む組成物。
［項１５］
項１〜１３のいずれか一項に記載の方法のために用いられる、前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）をコードするポリヌクレオチド。
［項１６］
項１〜１３のいずれか一項に記載の方法のために用いられる、前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）をコードするポリヌクレオチドを有するベクター。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、活性型タンパク質を製造、若しくはタンパク質を安定化する、新しい方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＧＦＰを単独で熱処理した場合と、ＣｐｋＢと共存させた状態で同様に熱処理した場合におけるＧＦＰ残存活性を示したグラフである。
【図２】Ｓ１−ＧＦＰを単独で熱処理した場合と、ＣｐｋＢと共存させた状態で同様に熱処理した場合におけるＧＦＰ残存活性を示したグラフである。
【図３】Ｓ２−ＧＦＰを単独で熱処理した場合と、ＣｐｋＢと共存させた状態で同様に熱処理した場合におけるＧＦＰ残存活性を示したグラフである。
【図４】Ｓ３−ＧＦＰを単独で熱処理した場合と、ＣｐｋＢと共存させた状態で同様に熱処理した場合におけるＧＦＰ残存活性を示したグラフである。
【図５】夾雑物存在下におけるＳ１−ＧＦＰＣｐｋＢによる安定化効果を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた結果を示す写真である。
【図６】夾雑物存在下におけるＳ３−ＧＦＰのＣｐｋＢによる安定化効果を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた結果を示す写真である。
【図７】夾雑物存在下における４ＯＴＡ−Ｓ１のＣｐｋＢによる安定化効果を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた結果を示す写真である。
【図８】夾雑物存在下におけるＳ１−ＧＦＴＡのＣｐｋＢによる安定化効果を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた結果を示す写真である。
【図９】磁気ビーズに固定したＣｐｋＢによるＧＦＰの安定化を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．  活性型タンパク質の製造方法
本発明の活性型タンパク質の製造方法は、遺伝子組換えによる方法であって、以下の工程［１］〜［４］を含む方法である：
［１］（ａ）アーキア由来の高温誘導型シャペロニン、又は
（ｂ）シャペロニン活性を有し、かつループ構造を有するＣ末端尾部が生理的ｐＨ下で負又は正に荷電している前記シャペロニンの改変体
のループ構造を有するＣ末端尾部と静電相互作用しうるアミノ酸配列領域（静電相互作用タグ）が付加された
（ｃ）目的タンパク質
を遺伝子組換えにより生産する工程；
［２］前記工程［１］により得られた、他のタンパク質から単離されていない前記目的タンパク質（ｃ）を、溶液中において、前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）と共存させることにより、前記静電相互作用を介した両者の結合体を得る工程；
［３］前記工程［２］により得られた、前記結合体を含む溶液を加熱処理することにより、他の前記タンパク質を変性させる工程；及び
［４］前記工程［３］により得られた、前記結合体と変性タンパク質とを含む溶液から、未変性の前記目的タンパク質（ｃ）を単離する工程。
【００１７】
１．１  アーキア由来の高温誘導型シャペロニン（ａ）
本発明で用いる、アーキア由来の高温誘導型シャペロニン（ａ）は、高温領域におけるシャペロニン活性を有し、かつループ構造を有するＣ末端尾部が生理的ｐＨ下で負又は正に荷電していることを特徴とする。
【００１８】
シャペロニンの主要な活性は、一般に、細胞内で新たに合成されたポリペプチド、又は何らかの理由で変性したタンパク質の凝集を阻止することである。具体的には、ＡＴＰを補助因子としてタンパク質の正常なフォールディング及び／又は安定化を行う活性を指す。このため、シャペロニン活性とは、ＡＴＰａｓｅ活性に依存するタンパク質の巻き戻し活性を指す。
【００１９】
本発明において、シャペロニン活性は、具体的には以下のようにして評価することができる。シャペロニン活性を測定しようとするシャペロニン又はその改変体を、ＡＴＰ存在下で、目的タンパク質と共存させる。その共存の前後において、目的タンパク質の７５℃下での活性半減期を測定する。共存後の半減期／共存前の半減期の計算値が、１．５を超えていれば、シャペロニン活性があるとみなす。目的タンパク質毎に測定をせずとも、シャペロニン活性を測定しようとするシャペロニン又はその改変体を、ＧＦＰと共存させ、その共存の前後において、ＧＦＰの７５℃下での活性半減期を測定し、上記と同様に共存後の半減期／共存前の半減期を算出し、この計算値が１．５を超えているものを一律に、シャペロニン活性を有するものとしてもよい。
【００２０】
アーキアとしては、特に限定されず、本発明で用いるシャペロニン（ａ）が、高温領域におけるシャペロニン活性を有していることが重要であり、その点では、好熱性アーキア又は超好熱性アーキアが好ましい。
【００２１】
具体的なアーキアとしては、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ及びＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ等が挙げられる。
【００２２】
具体的なアーキア由来の高温誘導型シャペロニンとしては、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ由来のＣｐｋＢ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＰｆ−ＣＰＮ及びＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＳｓｏｌ＿０７９０及びＣｐｎγ等が挙げられる。
【００２３】
例えば、ＣｐｋＢは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．株ＫＳ−１の、シャペロニンαサブユニットと、アミノ酸配列がほぼ同一である（配列同一性８３％）。
【００２４】
ＣｐｋＢは、Ｃ末端の１０アミノ酸の等電点が３．１であり、例えば大腸菌由来のシャペロニンＧｒｏＥＬのＣ末端の１０アミノ酸の等電点が約５．５であることと比較して、非常に低いといえる。
【００２５】
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ由来のＣｐｋＢのアミノ酸配列は、配列番号１で表わされる。
【００２６】
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＣｐｎγは、わずかに正に荷電しているＣ末端領域を有する。具体的には、そのアミノ酸配列はＩＡＡＡＰＡＫＱＱＰＱＰＱＱＰＮＰＹＬＧ（配列番号２）であり、等電点は約８．６である。
【００２７】
１．２  シャペロニン改変体（ｂ）
本発明においては、シャペロニン（ａ）の代わりに、又はシャペロニン（ａ）と共に、シャペロニン活性を有し、かつループ構造を有するＣ末端尾部が生理的ｐＨ下で負又は正に荷電しているシャペロニン（ａ）の改変体（シャペロニン改変体（ｂ））を用いることもできる。
【００２８】
シャペロニン活性においては、一般に、Ｃ末端側の３０アミノ酸の領域が、目的タンパク質への結合とリフォールディングに重要であることが報告されている（Ｇａｏ  Ｌｅ、「Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ Ｆｏｒ Ｔｈｅｒｍｏ− ａｎｄ Ｃｏｌｄ−Ｓｔｒｅｓｓ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ａｒｃｈａｅｏｎ, Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ Ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ」、［ｏｎｌｉｎｅ］、２０１３年５月３１日、関西学院大学リポジトリ、［平成２８年８月１６日検索］、インターネット（ＵＲＬ：http://kgur.kwansei.ac.jp/dspace/bitstream/10236/11602/1/52-33.pdf））。この知見を含め、技術常識を参照することで、改変体（ｂ）を適宜作製することができる。
【００２９】
改変体（ｂ）のループ構造を有するＣ末端尾部は、好ましくは、２０〜３０個のアミノ酸からなる。この場合、このＣ末端尾部と静電相互作用しうる、目的タンパク質に付加するアミノ酸配列領域を設計しやすいという利点がある。
【００３０】
改変体（ｂ）のループ構造を有するＣ末端尾部は、好ましくは、２０％以上のアミノ酸が、アスパラギン酸又はグルタミン酸のいずれかであり、より好ましくは、３０％以上のアミノ酸が、アスパラギン酸又はグルタミン酸のいずれかであり、さらに好ましくは、３５％以上のアミノ酸が、アスパラギン酸又はグルタミン酸のいずれかである。この場合、このＣ末端尾部と静電相互作用しうる、目的タンパク質に付加するアミノ酸配列領域を設計しやすいという利点がある。
【００３１】
改変体（ｂ）のループ構造を有するＣ末端尾部は、好ましくは、基礎となるシャペロニン（ａ）のＣ末端側２０〜３０個の尾部とのアミノ酸配列同一性８０％以上、特に９０％以上、を示す。
【００３２】
改変体（ｂ）のループ構造を有するＣ末端尾部は、より好ましくは、基礎となるシャペロニン（ａ）のＣ末端側２０〜３０個の尾部とのアミノ酸配列同一性８０％以上、特に９０％以上、を示す。
【００３３】
改変体（ｂ）のループ構造を有するＣ末端尾部は、さらに好ましくは、基礎となるシャペロニン（ａ）のＣ末端側２０〜３０個の尾部とのアミノ酸配列同一性８０％以上、特に９０％以上、を示す。
【００３４】
なお、本発明において、アミノ酸配列同一性は、ＢＬＡＳＴによって計算する。アライメントの際には、アミノ酸の挿入又は欠失に対応するギャップを考慮するものとする。
【００３５】
改変体（ｂ）は、好ましくは、基礎となるシャペロニン（ａ）のアミノ酸配列と配列同一性８０％以上であり、より好ましくは、同配列同一性が９０％以上であり、さらに好ましくは、同配列同一性が９５％以上である。
【００３６】
改変体（ｂ）が基礎とするシャペロニン（ａ）のアミノ酸配列としては、好ましくは配列番号１で表わされるアミノ酸配列が挙げられる。
【００３７】
１．３  静電相互作用タグが付加されてなる目的タンパク質（ｃ）
静電相互作用タグが付加されてなる目的タンパク質（ｃ）は、シャペロニン（ａ）又はシャペロニン改変体（ｂ）のループ構造を有するＣ末端尾部と静電相互作用しうるアミノ酸配列領域（静電相互作用タグ）が付加された、目的タンパク質である。
【００３８】
静電相互作用タグは、目的タンパク質（ｃ）とシャペロニン（ａ）又はシャペロニン改変体（ｂ）のループ構造を有するＣ末端尾部との相互作用が、目的タンパク質（ｃ）とシャペロニン（ａ）又はシャペロニン改変体（ｂ）との結合体が形成される程度にまで強いものであればよい。この点において、静電相互作用タグは、シャペロニン（ａ）又はシャペロニン改変体（ｂ）のループ構造を有するＣ末端尾部が負に荷電している場合、好ましくは、等電点９〜１２を示し、より好ましくは、等電点１０〜１２を示す。あるいは、当該Ｃ末端尾部が正に荷電している場合、好ましくは、等電点２〜５を示し、より好ましくは、等電点２〜４を示す。
【００３９】
静電相互作用タグは、特に限定されず、幅広く選択することができるが、例えば、取扱性の点等から、アミノ酸数が３〜１５個であれば好ましく、４〜１０個であればより好ましい。静電相互作用タグは、天然由来の平均的なアミノ酸配列と比較すると、負に荷電している場合、アルギニン及び／又はリジンを相対的により豊富に含んでいればよい。また、正に荷電している場合、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を相対的により豊富に含んでいればよい。そのような配列は、上記の等電点等も考慮しながら、適宜設計することができる。
【００４０】
静電相互作用タグは、目的タンパク質（ｃ）の分子表面に存在していることが好ましい。より具体的には、目的タンパク質（ｃ）とシャペロニン（ａ）又はシャペロニン改変体（ｂ）との結合体形成を生じさせる溶液中における、目的タンパク質（ｃ）の分子表面に存在していることが好ましい。
【００４１】
静電相互作用タグは、最終的に目的タンパク質（ｃ）から切除することができれば、目的タンパク質のみを得ることができ、有利であるため、選択的な切除が可能な様式によって目的タンパク質と連結していることが好ましい。そのような結合様式としては、特に限定されず、例えば、限定分解的プロテアーゼの認識部位を介した連結が挙げられる。限定分解的プロテアーゼとしては、特に限定されず、幅広く使用できる。例えば、Ｇｅｎｅｎａｓｅ  Ｉ、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ及びＧａｃｔｏｒ  Ｘａ等が挙げられる。限定分解的プロテアーゼの認識部位としては、例えば、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（Ｇｅｎｅｎａｓｅ）、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ／Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ）等が挙げられる。
【００４２】
目的タンパク質としては、特に限定されず、幅広く選択することができるが、シャペロニン（ａ）又はシャペロニン改変体（ｂ）の空洞部に捕捉される必要があるため、その分子量が、５ｋＤａ〜１００ｋＤａであることが好ましく、５〜８０ｋＤａであることがより好ましく、５ｋＤａ〜６０ｋＤａであることがさらに好ましい。
【００４３】
１．４  工程［１］
工程［１］においては、定法に従って、遺伝子組換えにより目的タンパク質（ｃ）を生産すればよい。
【００４４】
宿主としては、特に限定されず、幅広く選択することができる。例えば、大腸菌、アーキア、及び酵母等が挙げられる。
【００４５】
１．５  工程［２］
工程［２］においては、前記工程［１］により得られた、他のタンパク質から単離されていない前記目的タンパク質（ｃ）を、溶液中において、シャペロニン（ａ）及び／又はシャペロニン改変体（ｂ）と共存させることにより、静電相互作用を介した両者の結合体を得る。
【００４６】
本発明によれば、宿主において生産された目的タンパク質（ｃ）を、精製することなく、例えば細胞破砕等の簡便な方法において溶液中に他のタンパク質と混在した状態で得て、この溶液をそのまま用いることができる。具体的には、宿主細胞を適切な緩衝液中でソニケーション等により破砕し、その細胞破砕液を遠心分離することによって、目的タンパク質（ｃ）を含む粗細胞質画分を得ることができる。この粗細胞質画分を溶液中において、シャペロニン（ａ）及び／又はシャペロニン改変体（ｂ）と共存させることによって、工程［２］を行うことができる。
【００４７】
あるいは、目的ポリペプチド（ｃ）を遺伝子組換えにより、シャペロニン（ａ）及び／又は改変体（ｂ）と同一の宿主内において発現させ、上記と同様に細胞破砕液又は粗細胞質画分等を得ることにより、目的タンパク質（ｃ）を、前記シャペロニン（ａ）及び／又は前記改変体（ｂ）と共存させることもできる。
【００４８】
特に限定されないが、シャペロニン（ａ）又は改変体（ｂ）のループ構造を有するＣ末端尾部が負に荷電している場合、工程［２］で用いる溶液のｐＨが、８．５〜１０．５である場合に、静電相互作用を介した両者の結合体がより効率的に得られる。この点で、溶液のｐＨが、９．０〜１０．０であればより好ましく、９．０〜９．５であればさらに好ましい。
【００４９】
また、特に限定されないが、シャペロニン（ａ）又は改変体（ｂ）のループ構造を有するＣ末端尾部が正に荷電している場合、工程［２］で用いる溶液のｐＨが、３〜６である場合に、静電相互作用を介した両者の結合体がより効率的に得られる。この点で、溶液のｐＨが、４〜５であればより好ましく、４〜４．５であればさらに好ましい。
【００５０】
特に限定されないが、工程［２］で用いる溶液は、ＡＴＰを含有していることが好ましい。ＡＴＰ濃度は特に限定されず、幅広く適宜設定することができるが、１ｍＭ〜５ｍＭであれば好ましく、２ｍＭ〜５ｍＭであればより好ましく、２ｍＭであればさらに好ましい。
【００５１】
シャペロニン（ａ）及び／又はシャペロニン改変体（ｂ）は、必要に応じて、担体に結合していてもよい。担体としては、例えば、磁気ビーズ等が挙げられる。シャペロニン（ａ）及び／又はシャペロニン改変体（ｂ）が磁気ビーズに固定化されていると、シャペロニン（ａ）及び／又はシャペロニン改変体（ｂ）と目的タンパク質（ｃ）との結合体を磁力により集積又は回収等することができるといった有利な効果が得られる。
【００５２】
１．６  工程［３］
工程［３］においては、工程［２］により得られた、前記結合体を含む溶液を加熱処理することにより、他の前記タンパク質を変性させる。
【００５３】
加熱処理の温度は、大部分の宿主由来のタンパク質を変性させることができればよく、特に限定されず、またタンパク質の種類に応じて異なる。一例として、５０℃〜９０℃、６０〜８０℃等が挙げられる。
【００５４】
かかる加熱処理によって、宿主由来のタンパク質を変性させ、溶液中で沈殿させることができる。一方、目的タンパク質（ｃ）は、シャペロニン又はその改変体の空洞部内に保持されているため、それ自体が耐熱性のものでなかったとしても変性しない。
【００５５】
工程［３］は、工程［２］で使用した溶液中に目的タンパク質（ｃ）とシャペロニン又はその改変体との結合体を存在させたまま行ってもよいし、その溶液とは異なる溶液中に該結合体を存在させた状態で行ってもよい。
【００５６】
１．７  工程［４］
工程［４］においては、工程［３］により得られた、前記結合体と、宿主由来の変性タンパク質とを含む溶液から、未変性の目的タンパク質（ｃ）を単離する。
【００５７】
より具体的には、目的タンパク質（ｃ）とシャペロニン又はその改変体との結合体から、目的タンパク質（ｃ）を放出させる。そのための手段としては、特に限定されず、幅広く選択することができる。例えば、該結合体を含む溶液中にＡＴＰを添加することにより、シャペロニン又はその改変体の作用により目的タンパク質（ｃ）を放出させることができる。
【００５８】
１．８  工程［５］
工程［５］においては、工程［４］により得られた、未変性の前記目的タンパク質（ｃ）から、アミノ酸配列領域を切除する。
【００５９】
選択的な切除が可能な様式によってアミノ酸配列領域が目的タンパク質と連結していると好ましい。例えば、限定分解的プロテアーゼの認識部位を介して両者が連結している場合には、その特定のプロテアーゼを作用させることによって、選択的にアミノ酸配列領域を切除できる。
【００６０】
２．  目的タンパク質を安定化する方法
本発明のタンパク質の安定化方法は、
（ａ）アーキア由来の高温誘導型シャペロニン、又は
（ｂ）シャペロニン活性を有し、かつループ構造を有するＣ末端尾部が生理的ｐＨ下で負又は正に荷電しているシャペロニンの改変体
のループ構造を有するＣ末端尾部と静電相互作用しうるアミノ酸配列領域が付加された（ｃ）目的タンパク質
を安定化する方法であって、
［ｉ］目的タンパク質（ｃ）を、溶液中において、シャペロニン（ａ）及び／又は改変体（ｂ）と共存させることにより、静電相互作用を介した両者の結合体を得る工程
を含む方法である。
【００６１】
この安定化方法においては、工程［ｉ］において、目的タンパク質（ｃ）とシャペロニン（ａ）及び／又は改変体（ｂ）との結合体を形成することにより、目的タンパク質（ｃ）をシャペロニン（ａ）及び／又は改変体（ｂ）の空洞部内に収容し、これにより、目的タンパク質（ｃ）の安定化が図られる。
【００６２】
具体的には、例えば、目的タンパク質（ｃ）を熱、有機溶媒及び界面活性剤等から守ることができる。
【００６３】
３．  組成物
本発明の組成物は、上記１．又は２．のいずれかの方法のために用いられる、シャペロニン（ａ）及び／又は改変体（ｂ）を含む組成物である。
【００６４】
４．  ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、上記１．又は２．のいずれかの方法のために用いられる、シャペロニン（ａ）及び／又は改変体（ｂ）をコードするポリヌクレオチドである。
【００６５】
５．  ベクター
本発明のベクターは、上記１．又は２．のいずれかの方法のために用いられる、シャペロニン（ａ）及び／又は改変体（ｂ）をコードするポリヌクレオチドを有するベクターである。
【００６６】
本発明のベクターは、具体的には、上記１．又は２．のいずれかの方法において使用される宿主に適した発現ベクターであり、そのようなベクターは、適宜設計することができる。この設計の際には、宿主に応じた適切なプロモーターの選択等を行う。
【００６７】
特に限定されないが、例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼとＴ７プロモーターを用いたｐＥＴシステムを利用することができ、この場合は宿主として、Ｌ８−ＵＶ５  ｌａｃプロモーターの支配下にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が組み込まれたバクテリオファージλＤＥ３の溶原菌を宿主として用いる必要がある。
【００６８】
本発明のベクターは、目的タンパク質（ｃ）をもさらに発現するようなベクターであってもよい。この場合、好ましくは、シャペロニン（ａ）及び／又は改変体（ｂ）をコードするポリヌクレオチドと、目的タンパク質（ｃ）をコードするポリヌクレオチドとは、それぞれ別々のプロモーターの制御化にある。
【００６９】
従来、目的タンパク質を安定化する目的で、目的タンパク質とシャペロニンサブユニットとを連結した融合タンパク質をコードする融合遺伝子を発現ベクターに組み込む技術が提案されていたが、サイズが大きくなるために宿主内で不安定化する傾向があった。本発明のベクターは、同一プロモーターの制御下に置くポリヌクレオチドのサイズを相対的に小さくできるため、有利である。
【実施例】
【００７０】
以下、本発明を実施例及び比較例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００７１】
実験例１：ＣｐｋＢと結合するペプチドタグのデザイン
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ由来のＣｐｋＢは、Ｃ末端の１０アミノ酸の等電点が３．１であり、例えば大腸菌由来のシャペロニンＧｒｏＥＬのＣ末端の１０アミノ酸の等電点が約５．５であることと比較して、非常に低いといえる。
【００７２】
そこで、本発明者らは、ＣｐｋＢは基質認識の過程において、タンパク質中の正電荷をＣ末端側で認識しているのではないかとの仮説を立て、これを検証することとした。
【００７３】
電荷を有するアミノ酸、極性を有するアミノ酸、及び疎水性を有するアミノ酸を含む、複数のシグナル・タグを作製し、イン・シリコ・ドッキング・シミュレーションを行って、ＣｐｋＢ二量体とより強く相互作用するものを選別した。ＡｕｔｏＤｏｃｋ  ４．２．６（Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  ＣＡ，Ｕ．Ｓ．）を用いて解析を行った。各タグについて得られた結合エネルギー（ΔＧｂｉｎｄ  （ｋｃａｌ/ｍｏｌ））を、等電点（ｐＩ）と合わせて表１に示す。
【００７４】
【表１】
2018038395.tif 000002
【００７５】
その結果、正電荷を有するタグほど、より低い結合エネルギーを示すことが判った。負電荷を有するタグは、正の結合エネルギーを示す一方で、極性又は疎水性を示すタグは、いずれも中間程度の結合エネルギーを有していた。
【００７６】
中でも、ＧＫＧＫＫ（以下、「Ｓ１」）とＧＧＲＲＧＲ（以下、「Ｓ２」）とが、それぞれ一番目、二番目に低い結合エネルギーを有していた。また、正の結合エネルギーを示したＧＧＤＤＧＤ（以下、「Ｓ３」）を以降の実施例に対する比較例として使用することにした。
【００７７】
実験例２：Ｃｐｎγと結合するペプチドタグのデザイン
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＣｐｎγは、Ｃ末端の２０アミノ酸の等電点が約８．６であり、例えば大腸菌由来のシャペロニンＧｒｏＥＬのＣ末端の１０アミノ酸の等電点が約５．５であることと比較して、非常に高いといえる。
【００７８】
そこで、本発明者らは、ＣｐｎγのＣ末端領域は、負電荷アミノ酸を有するペプチドタグと電気的に相互作用するのではないかとの仮説を立て、これを検証することとした。具体的には、負電荷アミノ酸を有する様々なペプチドタグをデザインし、実験例１と同様に、イン・シリコ・ドッキング・シミュレーションを行って、Ｃｐｎγとの相互作用をそれぞれ評価した。結果を表２に示す。
【００７９】
【表２】
2018038395.tif 000003
【００８０】
これらの結果より、負電荷アミノ酸を有するペプチドタグがＣｐｎγのＣ末端領域と相互作用することが示唆された。
【００８１】
実施例１：各種ペプチドタグを付加することによるＧＦＰの安定化
ＡＴＧコドン側にＨｉｓタグを付加した組換えＧＦＰ（約３０ｋＤａ）のＨｉｓタグのすぐ先に、Ｓ１、Ｓ２及びＳ３をそれぞれ個別に付加した。これらの組換え体を、それぞれ、Ｓ１−ＧＦＰ、Ｓ２−ＧＦＰ及びＳ３−ＧＦＰと表記する。なお、当該コンストラクションは、ｐＥＴ２１ａをベースに行った。これらのベクターを以降、それぞれ、ｐＥＴ２１ａ−Ｓ１−ｈｉｓｔａｇ−ＧＦＰ、ｐＥＴ２１ａ−Ｓ２−ｈｉｓｔａｇ−ＧＦＰ及びｐＥＴ２１ａ−Ｓ３−ｈｉｓｔａｇ−ＧＦＰと表記する。また、タグとしてＨｉｓタグのみが付いた組換えＧＦＰタンパク質（以下、単に「ＧＦＰ」と表記することがある）を発現するベクター（ｐＥＴ２１ａ−ｈｉｓｔａｇ−ＧＦＰ）も用意した。
【００８２】
これらのベクターを、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬに導入し、ＬＢ培地中で２５℃において、タンパク質発現を誘導した。ＯＤ６６０が約０．２となった時点で、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加することにより遺伝子発現を誘導した。２５℃で１０時間培養後、細胞を回収し、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．０；バッファーＡ）に再懸濁させた。ソニケーションによって細胞を破砕し、遠心分離（１３，２００ｐｐｍ、１５分間）によって上清を回収した。この上清をＮｉ−ＮＴＡカラム（ＱＩＡＧＥＮ）にアプライし、２００ｍＭイミダゾールを含むバッファーＡを用いて溶出した。得られた溶出液をさらに陽イオン交換クロマトグラフィー［ＭｏｎｏＱ  ＨＲ  ５／５（ＧＥヘルスケア）］を通し、ＮａＣｌ直線グラジエント（０〜０．５Ｍ）をかけて溶出した。
【００８３】
これらのＧＦＰ、及びＳ１〜Ｓ３−ＧＦＰを、７５℃、総量２０μｌのＨＫＭバッファー（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．０）にて数分間、処理した。この際、２０ｎｍｏｌのＣｐｋＢと共存させる条件と、共存させない条件との２通り行った。共存時、各種組換えＧＦＰとＣｐｋＢ（モノマー）とのモル比は、１：１となるように調整した。ＧＦＰ活性を、ＥｎＶｅｓｉｏｎ（登録商標）２０１４  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ（パーキンエルマー）を用いて、蛍光観察により評価した（蛍光５３５ｎｍ；励起４８５ｎｍ）。
【００８４】
ＧＦＰ（図１）、並びにＳ１−ＧＦＰ（図２）、Ｓ２−ＧＦＰ（図３）及びＳ３−ＧＦＰ（図４）を、それぞれ単独で熱処理した場合と、ＣｐｋＢと共存させた状態で同様に熱処理した場合におけるＧＦＰ残存活性を、図に示す。各図中において、白い棒グラフがＣｐｋＢ非共存下での残存活性を評価したものであり、黒い棒グラフがＣｐｋＢ共存下での残存活性を評価したものである。
【００８５】
それぞれ単独で熱処理した場合は、いずれも４分以内に活性が失活した。具体的には、半減期は、それぞれ、順に、１．９６分、１．９２分、１．９５分及び１．９９分であった。
【００８６】
タグのないＧＦＰをＣｐｋＢと共存させた状態で同様に熱処理した場合には、半減期が３．６１秒まで増加した。Ｓ１−ＧＦＰとＳ２−ＧＦＰは、ＣｐｋＢ共存時、半減期がそれぞれ８．８７分と７．３１分となり、タグのないＧＦＰと比較すると、それぞれ半減期が約２．５倍と約２倍にまで増加した。一方、Ｓ３−ＧＦＰは、ＣｐｋＢ共存時、半減期が３．２６分となり、これはタグのないＧＦＰのものよりも短かった。
【００８７】
実施例２：各種ペプチドタグを付加することによる４ＯＴＡ及びＧＦＡＴの安定化
実施例１と同様の方法で、より分子量の大きい、４ＯＴＡ（ヘキサマーで約６０ｋＤａ）及びＧＦＴA（モノマーで約６８ｋＤａ）について試験を行った。なお、４ＯＴＡについては、Ｎ末端側の活性ドメインを阻害しないようにするため、Ｃ末端側にＳ１タグを付加した（４ＯＴＡ−Ｓ１）。ＧＦＴＡについては、Ｎ末端側にＳ１タグを付加した（Ｓ１−ＧＦＴＡ）。
【００８８】
その結果、４ＯＴＡに関しては、ＣｐｋＢ非共存時の半減期が２．３９分であり、共存時には５．７１分にまで増加した。さらに、Ｓ１タグ付加時には、ＣｐｋＢ共存時の半減期が８．３３分にまで増加した。
【００８９】
また、ＧＦＴAに関しては、ＣｐｋＢ非共存時の半減期が２．１３分であり、共存時には３．５９分にまで増加した。さらに、Ｓ１タグ付加時には、ＣｐｋＢ共存時の半減期が４．６７分にまで増加した。
【００９０】
実施例３：夾雑物存在下における目的タンパク質の安定化
実施例１及び２と同様、Ｓ１−ＧＦＰ、Ｓ３−ＧＦＰ、４ＯＴＡ−Ｓ１及びＳ１−ＧＦＴＡを大腸菌内で発現させ、細胞を１０ｍｌのＨＫＭバッファーにてソニケーションで破砕した。１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行い、上清を粗細胞質画分として回収した。それぞれの粗細胞質画分１μｌ（ｐＥＴ２１ａ−Ｓ１−ｈｉｓｔａｇ−ＧＦＰ及びｐＥＴ２１ａ−Ｓ３−ｈｉｓｔａｇ−ＧＦＰを導入した細胞についてはタンパク質濃度４７０μｇ／ｍｌに調整；ｐＥＴ２１ａ−４ＯＴＡ−ｈｉｓｔａｇ−Ｓ１を導入した細胞についてはタンパク質濃度１６０μｇ／ｍｌに調整；ｐＥＴ２１ａ−Ｓ１−ＧＦＰ−ｈｉｓｔａｇを導入した細胞についてはタンパク質濃度９６０μｇ／ｍｌに調整）を、精製した２μｌのＣｐｋＢを含む液（４６０μｇ／ｍｌ）と混ぜ、７５℃にて、１０ｍＭのＡＴＰを含有するＨＫＭバッファーにて、所定時間（Ｓ１−ＧＦＰ及びＳ３−ＧＦＰについては２０分間；４ＯＴＡ−Ｓ１については４０分間；Ｓ１−ＧＦＴＡについては１０分間）インキュベーションした。
【００９１】
熱処理後、遠心分離を行い不溶性タンパク質を除いた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【００９２】
Ｓ１−ＧＦＰ（図５）、Ｓ３−ＧＦＰ（図６）、４ＯＴＡ−Ｓ１（図７）及びＳ１−ＧＦＴＡ（図８）のそれぞれについての結果を図に示す。各図において、白い三角及び黒い三角は、ＣｐｋＢ及びタグ付きタンパク質をそれぞれ示す。レーンのうち、「Ｍ」は分子マーカー、「Ｃ」は熱処理前の大腸菌細胞破砕液、「１」はＣｐｋＢ不存在下で熱処理を行った後の可溶性画分、「２」は、ＣｐｋＢ存在下で熱処理を行った後の可溶性画分を、それぞれ電気泳動させたものである。
【００９３】
ＣｐｋＢ不存在下で熱処理を行った後の可溶性画分を電気泳動した際に、Ｓ１タグの付いたＧＦＰのバンドが確認できた（図５）。一方、Ｓ３タグの付いたＧＦＰについては、バンドが確認できなかった（図６）。これらの結果から、Ｓ１タグがＣｐｋＢと強い相互作用を示すことが確認できた。
【００９４】
また、Ｓ１−ＧＦＰについては、バンドの濃さが４ＯＴＡ−Ｓ１（図７）及びＳ１−ＧＦＴＡ（図８）に比べてより濃厚であった。この結果は、Ｓ１−ＧＦＰとＣｐｋＢとの相互作用が、４ＯＴＡ−Ｓ１又はＳ１−ＧＦＴＡとＣｐｋＢとの相互作用のいずれよりもより強いものであったことを示唆している。
【００９５】
実施例４：磁気ビーズに固定したＣｐｋＢによるＧＦＰの安定化
磁気ビーズはサーモサイエンティフィック社のＰｉｅｒｃｅ  ＴＭ  ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓを使用した。ＣｐｋＢ溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）と磁気ビーズを室温で平衡化させた。３００μｌの磁気ビーズを１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブに入れて磁気スタンドに設置し、磁気ビーズを回収して上清は廃棄した。氷冷した１ｍＭ塩酸１ｍｌをチューブに加え、ボルテックスミキサーで穏やかに１５秒間混合した。磁気スタンドで磁気ビーズを回収して上清は廃棄した。３００μｌのＣｐｋＢ（０．１ｍｇ／ｍｌ）溶液をチューブに添加し、３０秒間ボルテックスミキサーで混合した。チューブを室温で2時間または1晩インキュベートした。磁気スタンドで磁気ビーズを回収した。磁気ビーズに０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．０）１ｍｌを加え、チューブを１５秒間ボルテックスミキサーで混合後、磁気スタンドで磁気ビーズを回収して上清は廃棄した。この操作をもう一度繰り返した。超純水１ｍｌを磁気ビーズに加え、１５秒間ボルテックスミキサーで混合した。磁気スタンドで磁気ビーズを回収して上清は廃棄した。磁気ビーズに１ｍｌのクエンチングバッファー（３Ｍエタノールアミン、ｐＨ９．０）を加え、チューブを30秒間ボルテックスミキサーで混合した。チューブを室温で２時間、回転装置上でインキュベートした。磁気スタンドで磁気ビーズを回収して上清は廃棄した。１ｍｌの精製水をチューブに加えてよく混合し、磁気スタンドで磁気ビーズを回収して上清は廃棄した。チューブに１ｍｌの保存用バッファーを加えて混合し、磁気スタンドで磁気ビーズを回収して上清は廃棄した。この手順を2回繰り返した。磁気ビーズに３００μｌの保存用バッファーを加えてよく混和し、使用するまで４℃で保存した。この試料を磁気ビーズ固定化ＣｐｋＢとして使用した。
【００９６】
ｐＥＴ２１ａ−Ｓ１−ｈｉｓｔａｇ−ＧＦＰを、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬに導入し、ＬＢ培地中で３７℃において、５ｍｌ培養した。ＯＤ６６０が約０．２となった時点で、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加することにより遺伝子発現を誘導した。２５℃で１０時間培養後、細胞を回収し、５００μｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．０；バッファーＡ）に再懸濁させた。ソニケーションによって細胞を破砕し、遠心分離（１３，２００ｒｐｍ、１５分間）によって上清を回収した。
【００９７】
この上清をＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．０；バッファーＡ）でタンパク質濃度が２ｍｇ／ｍｌになるように調整した。このうち４０μｌを分取し１００μｌ相当の磁気ビーズ固定化ＣｐｋＢに加えた。１Ｍ  ＨＫＭバッファー（ｐＨ９．５）を５μｌ（1／１０量）添加した。振とうしながら７５℃で５分インキュベートし、２０ｍＭ  ＡＴＰを５μｌ添加し（最終濃度２ｍＭ)、７５℃で２０分振とうしながらインキュベートした。磁気スタンドで磁気ビーズ固定化ＣｐｋＢを除き、上清を新しいエッペンドルフチューブに移した。
【００９８】
遠心により、沈殿を完全に除き、上清を分取した。このうち２０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）により分析した。
【００９９】
Ｓ１−ＧＦＰの結果は図９の左側、タグがないＧＦＰの結果は図９の右側に示す。          
【０１００】
磁気ビーズ固定化ＣｐｋＢ不存在下で熱処理を行わない場合のＳ１−ＧＦＰの残存率を１００％としたとき、磁気ビーズ固定化ＣｐｋＢ存在下で熱処理を行った後の残存率は６４％、磁気ビーズ固定化ＣｐｋＢ不存在下で熱処理を行った後の残存率は１６％であった。
【０１０１】
磁気ビーズ固定化ＣｐｋＢ不存在下で熱処理を行わない場合のタグなしＧＦＰの残存率を１００％としたとき、磁気ビーズ固定化ＣｐｋＢ存在下で熱処理を行った後の残存率は３９％、磁気ビーズ固定化ＣｐｋＢ不存在下で熱処理を行った後の残存率は１２％であった。
【０１０２】
これらの結果から、磁気ビーズ固定化ＣｐｋＢのタンパク質安定化効果は、タグなしＧＦＰの場合と比較してＳ１−ＧＦＰでより強く発現することが確認できた。
【図１】
2018038395.tif 000004
【図２】
2018038395.tif 000005
【図３】
2018038395.tif 000006
【図４】
2018038395.tif 000007
【図５】
2018038395.tif 000008
【図６】
2018038395.tif 000009
【図７】
2018038395.tif 000010
【図８】
2018038395.tif 000011
【図９】
2018038395.tif 000012
【配列表】
2018038395000001.app