(57)【要約】      （修正有）【課題】プロテアーゼ欠損糸状菌細胞における異種タンパク質の産生方法の提供。【解決手段】低下しているか又は排除された活性を有する少なくとも３つの内在性プロテアーゼ、及び、異種ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含むトリコデルマ細胞であって、トリコデルマ細胞が、少なくともｇａｐ２プロテアーゼ、及び、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ７、ｐｅｐ１及びｇａｐ１から選択される少なくとも２つの更なるプロテアーゼにおいて、低下しているか又は排除された活性を有し、異種ポリペプチドが、プロテアーゼが低下しているか又は排除された活性を有していない、対応する親のトリコデルマ細胞中でのポリペプチドの産生レベルに比べて少なくとも２倍高いレベルで産生される、トリコデルマ細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性が低下している少なくとも３つの内在性プロテアーゼ、及び異種ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む糸状菌細胞であって、ポリペプチドが、プロテアーゼの活性が低下していない、対応する親糸状菌細胞中でのポリペプチドの産生レベルよりも少なくとも２倍高いレベルで産生される糸状菌細胞。
【請求項２】
細胞がアスペルギルス細胞である場合に、全プロテアーゼ活性が、プロテアーゼの活性が低下していない、対応する親アスペルギルス細胞の全プロテアーゼ活性の５０%以下まで低下しているという条件である、請求項１記載の糸状菌細胞。
【請求項３】
全プロテアーゼ活性が、プロテアーゼの活性が低下していない、対応する糸状菌細胞の全プロテアーゼ活性の４９%以下、好ましくは３１%以下まで低下している、請求項１又は２記載の糸状菌細胞。
【請求項４】
内在性プロテアーゼをコードする少なくとも３つの遺伝子が、各々、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の糸状菌細胞。
【請求項５】
内在性プロテアーゼをコードする少なくとも４つの遺伝子が、各々、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の糸状菌細胞。
【請求項６】
菌細胞が、トリコデルマ菌細胞、マイセリオフトラ菌細胞、アスペルギルス菌細胞、ニューロスポラ菌細胞、ペニシリウム細胞、又はクリソスポリウム菌細胞である、請求項１〜５のいずれか一項記載の糸状菌細胞。
【請求項７】
菌細胞が、トリコデルマ・リーゼイである、請求項１〜６のいずれか一項記載の糸状菌細胞。
【請求項８】
細胞が、ｐｅｐ４プロテアーゼの野生型である、請求項６又は７記載の糸状菌細胞。
【請求項９】
細胞が、少なくとも以下の３つのプロテアーゼ：ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、及びｓｌｐ１又はｇａｐ１、ｓｌｐ１、及びｐｅｐ１において、プロテアーゼ活性が低下しているか又はプロテアーゼ活性を有さない、請求項６、７、又は８記載の糸状菌細胞。
【請求項１０】
細胞が、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ７、ｇａｐ１、及びｇａｐ２からなる群より選択される少なくとも３つ又は４つのプロテアーゼにおいて、プロテアーゼ活性が低下しているか又は検出可能でない、請求項６又は７記載の糸状菌細胞。
【請求項１１】
プロテアーゼ活性が低下しているか又は検出可能でない３つ又は４つのプロテアーゼをコードする遺伝子の各々が、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を含む、請求項１０記載の糸状菌細胞。
【請求項１２】
細胞が、少なくとも８つのプロテアーゼにおいて、プロテアーゼ活性が低下しているか又はプロテアーゼ活性を有さず、８つのプロテアーゼをコードする遺伝子の各々が、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を含み、８つのプロテアーゼが、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、及びｐｅｐ５である、請求項６又は７記載の糸状菌細胞。
【請求項１３】
細胞が、プロテアーゼ活性が低下しているか又は検出可能でない３〜６のプロテアーゼを含み、３〜６のプロテアーゼの各々が、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｇａｐ１、及びｇａｐ２からなる群より選択される、請求項６又は７記載の糸状菌細胞。
【請求項１４】
細胞が、対応するプロテアーゼ活性を低下させる変異を含む追加のプロテアーゼをコードする遺伝子を含み、追加のプロテアーゼが、ｐｅｐ７、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｐｐ１、ｇａｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５、ｓｌｐ６、ｓｌｐ７、及びｓｌｐ８からなる群より選択される、請求項６〜１３のいずれか一項記載の糸状菌細胞。
【請求項１５】
異種ポリペプチドが哺乳動物ポリペプチドである、請求項１〜１４のいずれか一項記載の糸状菌細胞。
【請求項１６】
哺乳動物ポリペプチドがグリコシル化されている、請求項１５記載の糸状菌細胞。
【請求項１７】
哺乳動物ポリペプチドが、抗体及びその抗原結合フラグメント、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ならびにインターロイキンからなる群より選択される、請求項１５記載の糸状菌細胞。
【請求項１８】
哺乳動物ポリペプチドが、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、及びインターフェロンα２ｂ（ＩＦＮα２ｂ）からなる群より選択される、請求項１５記載の糸状菌細胞。
【請求項１９】
菌細胞が、活性が低下しているＡＬＧ３をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項記載の糸状菌細胞。
【請求項２０】
ＡＬＧ３をコードする遺伝子が、対応する活性を低下又は排除する変異を含む、請求項１９記載の糸状菌細胞。
【請求項２１】
菌細胞が、α−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項記載の糸状菌細胞。
【請求項２２】
ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン及び、場合により、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項記載の糸状菌細胞。
【請求項２３】
ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインをコードする第１ポリヌクレオチド及び、場合により、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインをコードする第２ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２２記載の糸状菌細胞。
【請求項２４】
マンノシダーゼＩＩ及び／又はガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項記載の糸状菌細胞。
【請求項２５】
ポリペプチドの安定性を改善する方法であって、
ａ）請求項１〜２４のいずれか一項記載の糸状菌細胞を提供すること、及び
ｂ）異種ポリペプチドが発現するように細胞を培養すること、
を含み、
ここで、異種ポリペプチドは、プロテアーゼの活性が低下していない、対応する親糸状菌細胞において産生された異種ポリペプチドと比較して、増加した安定性を示す、方法。
【請求項２６】
異種ポリペプチドを作る方法であって、
ａ）請求項１〜２４のいずれか一項記載の糸状菌細胞を提供すること、
ｂ）異種ポリペプチドが発現するように細胞を培養すること、及び
ｃ）異種ポリペプチドを精製すること
を含む、方法。
【請求項２７】
糸状菌細胞が担体タンパク質をさらに含む、請求項２５又は請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
担体タンパク質がＣＢＨ１である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
培養が、プロテアーゼ阻害剤を含む培地中である、請求項２６〜２８のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
培養が、ＳＢＴ１及びキモスタチンより選択される１つ又は２つのプロテアーゼ阻害剤を含む培地中である、請求項２６〜２９のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、糸状菌細胞における異種タンパク質の産生のために有用な組成物及び方法に関する。
【０００２】
背景
真核生物のタンパク質、特に治療用タンパク質（例えば免疫グロブリンなど）の翻訳後修飾は、適切なタンパク質のフォールディング及び機能のためにしばしば必要である。標準的な原核生物発現系は、そのような修飾のために必要な適切な機構を欠くため、代替の発現系を、これらの治療的タンパク質の産生において使用しなければならない。真核生物タンパク質が翻訳後修飾を有さない場合でさえ、原核生物発現系は、しばしば、適切なフォールディングのために要求される必要なシャペロンタンパク質を欠く。酵母及び真菌は、タンパク質を発現させるための魅力的な選択肢である。なぜなら、それらは、単純な培地中で大規模に成長させることができ、それによって、低い産生コストを許す。酵母及び真菌は、哺乳動物細胞において見出される類似の機能を実施する翻訳後機構及びシャペロンを有する。さらに、ツールが、酵母細胞及び真菌細胞の比較的単純な遺伝子構成、ならびにより複雑な真核生物細胞（例えば哺乳動物細胞又は昆虫細胞など）を操作するために利用可能である（De Pourcq et al., Appl Microbiol Biotechnol, 87(5):1617-31）。これらの利点にもかかわらず、多くの治療的タンパク質が、依然として哺乳動物細胞において産生されており、それらは、天然ヒトタンパク質に最も似ている翻訳後修飾を伴う治療的タンパク質を産生するのに対し、酵母及び真菌により自然に産生される翻訳後修飾は、しばしば、哺乳動物細胞において見出されるものとは異なる。
【０００３】
この欠陥に対処するために、酵母及び真菌の新しい株が開発されており、それらは、天然ヒトタンパク質において見られるものにより密接に似ている翻訳後修飾を産生する。このように、より複雑なタンパク質を発現するために酵母細胞及び真菌細胞を使用することにおいて新たな興味があった。しかし、そのような長い時間にわたる哺乳動物細胞培養技術に関する産業の焦点のため、真菌細胞発現系（例えばトリコデルマなど）は、哺乳動物細胞培養ほど十分には確立されておらず、従って、哺乳動物タンパク質を発現させる際、欠点に苦しむ。
【０００４】
このように、必要性が、改善された糸状菌細胞（例えばトリコデルマ菌細胞など）のための技術分野において残っており、それは、異種タンパク質（例えば免疫グロブリンなど）を、好ましくは高レベルの発現で、安定的に産生することができる。
【０００５】
概要
本明細書において記載するのは、少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下しているか又は検出不可能であり、増加したレベルで産生される異種ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを有する糸状菌細胞（例えばトリコデルマ菌細胞など）を含む組成物である。さらに本明細書において記載するのは、異種ポリペプチドの安定性を改善する方法及びプロテアーゼ活性が低下していない異種ポリペプチドを作製する方法である。
【０００６】
このように、一局面は、少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下しているか又は検出不可能な糸状菌細胞を含み、そこでは、細胞は、さらに、プロテアーゼの活性が低下していない対応する親糸状菌細胞中でのポリペプチドの産生レベルよりも少なくとも２倍高いレベルで産生された異種ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む。特定の実施態様において、細胞がアスペルギルス細胞である場合、全プロテアーゼ活性は、プロテアーゼの活性が低下していない、対応する親アスペルギルス細胞の全プロテアーゼ活性の５０%以下まで低下する。他の実施態様において、糸状菌細胞の全プロテアーゼ活性は、プロテアーゼ活性が低下していない、対応する親糸状菌細胞の全プロテアーゼ活性の４９%以下、３１%以下まで低下する。
【０００７】
特定の実施態様において、少なくとも３つのプロテアーゼの発現レベルが、低下又は排除される。特定の実施態様において、３つのプロテアーゼをコードする遺伝子は、各々、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を含む。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、３つのプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、及びｓｌｐ１である。他の実施態様において、３つのプロテアーゼコード遺伝子は、ｇａｐ１、ｓｌｐ１、及びｐｅｐ１である。
【０００８】
特定の実施態様において、菌細胞は、４つの内在性プロテアーゼの活性が低下しているか又は検出不可能である；４つのプロテアーゼをコードする遺伝子は、各々、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を含む。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、４つのプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、及びｇａｐ１である。
【０００９】
先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、３つ又は４つのプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ７、ｇａｐ１、及びｇａｐ２より選択される。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、３つ又は４つのプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｇａｐ１、及びｇａｐ２より選択される。特定の実施態様において、３つ又は４つのプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、及びｔｓｐ１より選択される。
【００１０】
他の実施態様において、菌細胞は、５つの内在性プロテアーゼの活性が低下しているか又は検出不可能である；５つのプロテアーゼをコードする遺伝子は、各々、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を含む。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、５つのプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、及びｐｅｐ４である。他の実施態様において、５つのプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、及びｇａｐ２である。
【００１１】
特定の実施態様において、菌細胞は、６つの内在性プロテアーゼの活性が低下しているか又は検不出可能である；６つのプロテアーゼをコードする遺伝子は、各々、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を含む。特定の実施態様において、細胞は６つのプロテアーゼコード遺伝子を有し、それらの各々が、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を含み、６つのプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、及びｐｅｐ４である。
【００１２】
先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、菌細胞は、活性が低下しているか又は検出不可能な３〜６つのプロテアーゼを有し、３〜６のプロテアーゼの各々は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｇａｐ１、及びｇａｐ２より選択される。
【００１３】
先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、細胞は、７つのプロテアーゼコード遺伝子を有し、それらの各々が、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を含み、７つのプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、及びｐｅｐ３である。
【００１４】
先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、細胞は、８つのプロテアーゼコード遺伝子を有し、それらの各々が、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を含み、８つのプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、及びｐｅｐ５である。
【００１５】
先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、菌細胞は、活性が低下している追加のプロテアーゼを有し、追加のプロテアーゼをコードする遺伝子は、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を含み、追加のプロテアーゼコードは、ｐｅｐ７、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｐｐ１、ｇａｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５、ｓｌｐ６、ｓｌｐ７、及びｓｌｐ８より選択される。
【００１６】
先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、異種ポリペプチドは哺乳動物ポリペプチドである。特定の実施態様において、哺乳動物ポリペプチドはグリコシル化される。
【００１７】
特定の実施態様において、哺乳動物ポリペプチドは免疫グロブリン、抗体及びその抗原結合フラグメント、成長因子、インターフェロン、サイトカイン及びインターロイキンから選択される。特定の実施態様において、哺乳動物ポリペプチドは免疫グロブリン又は抗体である。特定の実施態様において、哺乳動物ポリペプチドはインシュリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、及びインターフェロンα２ｂ（ＩＦＮα２ｂ）から選択される。
【００１８】
先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、異種ポリペプチドは非哺乳動物ポリペプチドである。特定の実施態様において、非哺乳動物ポリペプチドは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼである。
【００１９】
先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、真菌細胞は、ＡＬＧ３（マンノシルトランスフェラーゼ酵素）の活性が低下しているか又は検出不可能である。特定の実施態様において、ＡＬＧ３をコードする遺伝子は、対応する活性を低下又は排除する変異を含む。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、菌細胞は、α−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【００２０】
先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、菌細胞は、活性が低下していることが望ましいプロテアーゼの発現を低下させる変異を有する。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、変異は、プロテアーゼをコードする遺伝子内の欠失である。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、変異は、プロテアーゼの触媒ドメインをコードする遺伝子の部分の欠失である。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、菌細胞は、プロテアーゼの触媒ドメインをコードする遺伝子の部分における点変異を有する。
【００２１】
他の実施態様において、１つ以上のプロテアーゼのプロテアーゼ活性の低下又は排除は、ｉ）１つのプロテアーゼあるいはｉｉ）ｐｅｐ型プロテアーゼ、トリプシン様セリンプロテアーゼ、ｇａｐ型プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｅ）、セドリシンプロテアーゼ、及びｓｌｐ型プロテアーゼからなる群より選択される２つ以上のプロテアーゼについて特異的なＲＮＡｉコンストラクトからもたらされる。特定の実施態様において、ＲＮＡｉコンストラクトは、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５、及び／又はｓｌｐ６について特異的である。
【００２２】
先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、菌細胞は、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン及びＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインをさらに含む。特定の実施態様において、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン及びＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、ポリヌクレオチドによりコードされる。特定の実施態様において、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインは、第１ポリヌクレオチドによりコードされ、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、第２ポリヌクレオチドによりコードされる。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、菌細胞は、マンノシダーゼＩＩ及び／又はガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。特定の実施態様において、菌細胞は、α１，２マンノシダーゼ、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ、マンノシダーゼＩＩ、及び／又はガラクトシルトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素を含み、前記酵素は、標的化ペプチド、例えば、対応する酵素の適切な局在化のための異種標的化ペプチドをさらに含む。特定の実施態様において、標的化ペプチドは、配列番号５８９〜５９４より選択される。
【００２３】
先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、菌細胞は、トリコデルマ菌細胞、マイセリオフトラ菌細胞、アスペルギルス菌細胞、ニューロスポラ4菌細胞、フザリウムもしくはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ）菌細胞、又はクリソスポリウム菌細胞である。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、菌細胞はトリコデルマ・リーゼイである。
【００２４】
先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、菌細胞は、ｐｅｐ４プロテアーゼについて野生型である。
【００２５】
別の局面は、以下により、異種ポリペプチドの安定性を改善する方法を含む：ａ）先行する実施態様のいずれかの糸状菌細胞を提供すること；及びｂ）異種ポリペプチドが発現するように細胞を培養すること、そこで、異種ポリペプチドは、プロテアーゼの活性が低下していない（例えば、プロテアーゼをコードする遺伝子の変異を含まないため）対応する親糸状菌細胞において産生された異種ポリペプチドと比較して、増加した安定性を有する。別の局面は、以下により、異種ポリペプチドを作製する方法を含む：ａ）先行する実施態様のいずれかの糸状菌細胞を提供すること；ｂ）異種ポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養すること、及びｃ）異種ポリペプチドを精製すること。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、糸状菌細胞は、さらに担体タンパク質を含む。特定の実施態様において、担体タンパク質はＣＢＨ１である。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、培養は、プロテアーゼ阻害剤を含む培地中である。特定の実施態様において、培養は、ＳＢＴ１及びキモスタチンより選択される１つ又は２つのプロテアーゼ阻害剤を有する培地中である。特定の実施態様において、方法に従って産生された異種ポリペプチドは、グリコシル化された哺乳動物ポリペプチドであり、ポリペプチドの全Ｎグリカンの少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、又は１００%（モル%）が、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎグリカンからなる。他の実施態様において、方法に従って産生された異種ポリペプチドは、グリコシル化された哺乳動物ポリペプチドであり、ポリペプチドの全Ｎグリカンの少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、又は１００%（モル%）が、複合体Ｎグリカンからなる。特定の実施態様において、方法に従って産生された異種ポリペプチドは、グリコシル化された哺乳動物ポリペプチドであり、ポリペプチドの全Ｎグリカンの少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、又は１００%（モル%）が、ハイブリッドＮグリカンからなる。特定の実施態様において、方法に従って産生された異種ポリペプチドは、グリコシル化された哺乳動物ポリペプチドであり、ポリペプチドの全Ｎグリカンの少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、又は１００%（モル%）が、Ｇ１又はＧ２  Ｎグリカンからなる。別の局面は、上に記載の通りの方法により入手可能な異種ポリペプチドを含む。
【００２６】
別の局面は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｇａｐ１、及びｇａｐ２より選択される少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下しているか又は検出不可能であるトリコデルマ菌細胞を含み、それにおいて、細胞は、さらに、対応する親トリコデルマ菌細胞におけるポリペプチドの産生レベルよりも少なくとも２倍のレベルで産生される哺乳動物のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む。
【００２７】
特定の実施態様において、少なくとも３つのプロテアーゼの発現レベルが、トリコデルマ菌細胞において低下又は排除される。特定の実施態様において、少なくとも３つのプロテアーゼをコードする遺伝子は、各々、トリコデルマ菌細胞において対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を含む。特定の実施態様において、トリコデルマ菌細胞は、プロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を伴う３つのプロテアーゼコード遺伝子を含み、それらはｇａｐ１、ｓｌｐ１、及びｐｅｐ１より選択される。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、トリコデルマ菌細胞中の哺乳動物ポリペプチドは、抗体、又はそれらの抗原結合フラグメント、又は免疫グロブリンであり、少なくとも３つのプロテアーゼが、ｐｅｐ１、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｇａｐ１、及びｇａｐ２より選択される。特定の実施態様において、トリコデルマ菌細胞は、４つのプロテアーゼコード遺伝子を含み、それらの各々が、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を含み、そのような変異を伴う４つのプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、及びｇａｐ１である。特定の実施態様において、トリコデルマ菌細胞は、５つのプロテアーゼコード遺伝子を有し、それらの各々が、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を含み、そのような変異を伴う５つのプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、及びｐｅｐ４である。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、トリコデルマ菌細胞中の哺乳動物ポリペプチドは、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、又はインターロイキンであり、活性が低下している３つのプロテアーゼが、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ７、及びｔｓｐ１より選択される。特定の実施態様において、トリコデルマ菌細胞は、５つのプロテアーゼコード遺伝子を含み、それらの各々が、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を含み、そのような変異を伴う５つのプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、及びｇａｐ２である。特定の実施態様において、トリコデルマ菌細胞は、６つのプロテアーゼコード遺伝子を有し、それらの各々が、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を含み、そのような変異を伴う６つのプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、及びｐｅｐ４である。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、トリコデルマ菌細胞は、７つのプロテアーゼコード遺伝子を有し、それらの各々が、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を含み、７つのプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、及びｐｅｐ３である。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、トリコデルマ菌細胞は、８つのプロテアーゼコード遺伝子を有し、それらの各々が、対応するプロテアーゼ活性を低下する変異を含み、そのような変異を伴う８つのプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、及びｐｅｐ５である。
【００２８】
先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、トリコデルマ菌細胞は、１つ以上の追加のプロテアーゼの活性が低下しているか又は検出不可能である。特定の実施態様において、トリコデルマ菌細胞における１つ以上の追加のプロテアーゼの発現レベルが、低下又は排除される。特定の実施態様において、トリコデルマ菌細胞における１つ以上の追加のプロテアーゼをコードする遺伝子は、各々、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を有する。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、１つ以上の追加のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ７、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｐｐ１、ｇａｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５、ｓｌｐ６、ｓｌｐ７、及びｓｌｐ８より選択される。
【００２９】
先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、トリコデルマ菌細胞は、ＡＬＧ３の活性が低下しているか又は検出不可能である。特定の実施態様において、トリコデルマ菌細胞においてＡＬＧ３をコードする遺伝子は、対応する活性を低下又は排除する変異を含む。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、トリコデルマ菌細胞は、α−１，２マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、変異は、トリコデルマ菌細胞において遺伝子の発現を低下又は排除する。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、変異は、トリコデルマ菌細胞における遺伝子の欠失である。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、変異は、トリコデルマ菌細胞においてプロテアーゼの触媒ドメインをコードする遺伝子の部分の欠失である。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、変異は、トリコデルマ菌細胞においてプロテアーゼの触媒ドメインをコードする遺伝子の部分における点変異である。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、トリコデルマ菌細胞は、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン及びＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインをさらに含む。特定の実施態様において、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン及びＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、トリコデルマ菌細胞のポリヌクレオチドによりコードされる。特定の実施態様において、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインは、第１ポリヌクレオチドによりコードされ、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、トリコデルマ菌細胞の第２ポリヌクレオチドによりコードされる。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、トリコデルマ菌細胞は、マンノシダーゼＩＩをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。特定の実施態様において、プロテアーゼは、各々、配列番号１、１７、３７、５８、６６、８２、９８、１１８、１２９、１６６、及び１８２より選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０%、少なくとも７５%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、少なくとも９６%、少なくとも９７%、少なくとも９８%、少なくとも９９%、又は１００%の配列同一性を有する。特定の実施態様において、トリコデルマ菌細胞における全プロテアーゼ活性は、プロテアーゼの活性が低下していない、対応するトリコデルマ親細胞の全プロテアーゼ活性の４９%以下、３１%以下まで低下する。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、細胞は、対応する親トリコデルマ菌細胞におけるポリペプチドの産生レベルよりも少なくとも２倍高いレベルで産生される哺乳動物ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドをさらに含む。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、哺乳動物ポリペプチドは、完全長バージョンにおいて、対応する親トリコデルマ菌細胞におけるポリペプチドの完全長バージョンの産生レベルよりも高いレベルで産生される。
【００３０】
別の局面は、以下により、異種ポリペプチドの安定性を改善する方法を含む：ａ）先行する実施態様のいずれかのトリコデルマ菌細胞を提供すること；及びｂ）異種ポリペプチドが発現するように細胞を培養すること、そこで、異種ポリペプチドは、プロテアーゼをコードする遺伝子の変異を含まない宿主細胞と比較して、増加した安定性を有する。別の局面は、以下により、異種ポリペプチドを作製する方法を含む：ａ）先行する実施態様のいずれかのトリコデルマ菌細胞を提供すること；ｂ）異種ポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養すること、及びｃ）異種ポリペプチドを精製すること。先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、糸状菌細胞は、担体タンパク質をさらに含む。特定の実施態様において、担体タンパク質はＣＢＨ１である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、アスパラギン酸プロテアーゼの親和性カラム精製から溶出した分画を示すＰＡＧＥゲルを描写する。
【図２】図２は、ＩｇＧとアスパラギン酸プロテアーゼとをインキュベートした結果を示すＰＡＧＥゲルを描写する。
【図３】図３は、単一プロテアーゼ欠失株Ｍ１８１及びＭ１９５の生成を示すサザンブロット分析を描写する。図３Ａは、親Ｍ１２７からのｐｅｐ１  ＯＲＦ：＞８kbの期待されるシグナル、形質転換体からの無シグナルを描写する。図３Ｂは、親Ｍ１２７からのｐｅｐ１  ５’隣接：＞８kbの期待されるシグナル、形質転換体からの４kbを描写する。図３Ｃは、親Ｍ１２７からのｐｅｐ１  ３’隣接：＞８kbの期待されるシグナル、形質転換体からの４．２kbを描写する。
【図４】図４に、ｐｅｐ１欠失株Ｍ１８２におけるリツキシマブ抗体の生成を示すサザンブロット分析を描写する。図４Ａは、親Ｍ１６９からのｐｅｐ１  ＯＲＦ：＞８kbの期待されるシグナル、形質転換体からの無シグナルを描写する。図４Ｂは、形質転換体からのｂａｒ：１．０＋１．７kbの期待されるシグナル、ｐＴＴｖ４１からの３．１kb、Ｍ１６９からの無を描写する。図４Ｃは、形質転換体からのｂａｒ：１．８＋２．８kbの期待されるシグナル、ｐＴＴｖ４１からの３．１kb、Ｍ１６９からの無を描写する。
【図５】図５は、ｐｅｐ１含有株及びΔｐｅｐ１株のアスパラギン酸プロテアーゼ精製からのピーク分画を示すタンパク質ゲルを描写する。
【図６】図６Ａ−Ｂは、ｐｅｐ２プロテアーゼをリツキシマブ産生株Ｍ１６９から欠失させることによって、形質転換体２０６Ａ（株Ｍ４５５）における（Ａ）軽及び（Ｂ）重鎖産生が改善されることを例示する免疫ブロットを描写する。１８kDの軽鎖フラグメント及び３８kDの重鎖フラグメントを表すバンドは、親株Ｍ１６９と比較し、株Ｍ４５５においてより強かった。
【図７】図７は、リツキシマブ産生株Ｍ１６９ならびにｐｅｐ２プロテアーゼ欠失形質転換体９８Ａ、１１６Ａ、１９８Ａ、２０１Ａ、及び２０６Ａ（Ｍ４５５）からの上清のプロテアーゼ活性を図表で描写する。形質転換体１１６Ａ、１９８Ａ、及び２０６Ａは、それらの親株Ｍ１６９と比較し、カゼインに対するプロテアーゼ活性が低下している。
【図８】図８は、ＭＡＢ０１重鎖及び天然ＩＧＦ−１に対するＰＥＰ３及びＰＥＰ７のプロテアーゼ活性の効果を示す免疫ブロットを描写する。図８Ａは、ｐＨ５．５でのＭＡＢ０１に対するプロテアーゼ活性の効果を描写する。図８Ｂは、ｐＨ４．５でのＭＡＢ０１に対するプロテアーゼ活性の効果を描写する。図８Ｃは、ｐＨ４．５での天然ＩＧＦ−１に対するプロテアーゼ活性の効果を描写する。
【図９】図９は、ＳＩＰペプチド親和性カラムから精製したプロテアーゼ含有分画を示すＰＡＧＥゲルを描写する。
【図１０】図１０は、ＭＡＢ０１重鎖に対するＳＩＰプロテアーゼ活性を示す免疫ブロットを描写する。
【図１１】図１１は、阻害剤を伴う及び伴わない、カゼインに対するプロテアーゼ活性を図表で描写する。
【図１２】図１２は、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、及びｇａｐ１プロテアーゼの各々の欠失後でのＭＡＢ０１重鎖及び軽鎖産生のレベルを示す免疫ブロットを描写する。図１２Ａは、ＭＡＢ０１重鎖産生を示す。図１２Ｂは、ＭＡＢ０１軽鎖産生を示す。
【図１３】図１３は、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、及びｇａｐ１プロテアーゼの各々の欠失後でのＭＡＢ０１重鎖及び軽鎖産生における倍改善を図表で描写する。各々のバーは、図１２に示したクローンのいくつかからの平均を表す。
【図１４】図１４は、ｇａｐ２欠失株Ｍ２４４からのＭＡＢ０１産生のレベルを示す免疫ブロットを描写する。図１４Ａは、ＭＡＢ０１重鎖（ＨＣ）の産生を示す。図１４Ｂは、ＭＡＢ０１軽鎖（ＬＣ）の産生を示す。
【図１５】図１５は、ＧＡＰ２プロテアーゼを含むピキア上清とのインキュベーション後でのＭＡＢ０１抗体のレベルを示す免疫ブロットを描写する。
【図１６】図１６は、ヒトＩｇＧ１のプロテアーゼ分解のレベルを示す免疫ブロットを描写する。
【図１７】図１７は、アミノベンザミジンカラムを用いた親和性精製（精製分画）からの及び上清サンプル（上清）からのＭＡＢ０２抗体ザイモグラムの結果を描写する。
【図１８】図１８は、Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１  ２重プロテアーゼ欠失株Ｍ２１９の生成を描写する。図１８Ａは、親Ｍ１９６からのｔｓｐ１  ＯＲＦ：６．４kbの期待されるシグナルを描写する。図１８Ｂは、形質転換体からのｔｓｐ１  ５’隣接：３．９kbの期待されるシグナル、Ｍ１９６からの＞８kb、ｐＴＴｖ７２からの３．９kbを描写する。図１８Ｃは、形質転換体からのｔｓｐ１  ３’隣接：２．８kbの期待されるシグナル、Ｍ１９６からの＞８kb、ｐＴＴｖ７２からの３．９kbを描写する。
【図１９】図１９は、Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１  ２重欠失株Ｍ１９４の生成を示すサザンブロット分析を描写する。図１９Ａは、親Ｍ１８１からのｔｓｐ１  ＯＲＦ：ｋｂの期待されるシグナルを描写する。図１９Ｂは、形質転換体からのｂａｒ：１．４＋２．５kbの期待されるシグナル、ｐＴＴｖ４２からの２．９kb、Ｍ１８１からの無を描写する。図１９Ｃは、形質転換体からのｂａｒ：１．９＋３．２kbの期待されるシグナル、ｐＴＴｖ４２からの２．９kb、Ｍ１８１からの無を描写する。
【図２０】図２０は、プロテアーゼ欠失上清及び親株Ｍ１２４の各々からの培養上清からの標準化されたプロテアーゼ活性のデータを図表で描写する。プロテアーゼ活性を、最初の５つの株においてｐＨ５．５で及び最後の３つの欠失株においてｐＨ４．５で測定した。プロテアーゼ活性は、緑色蛍光カゼインに対する。６プロテアーゼ欠失株は、野生型親株の６%だけを有する。７プロテアーゼ欠失株のプロテアーゼ活性は、６プロテアーゼ欠失株の活性よりも約４０%低かった。
【図２１】図２１Ａは、発酵上清からのアミノベンザミジン精製分画を用いたＭＡＢ０２ザイモグラムの結果を描写する。図２１Ｂは、発酵上清からのアミノベンザミジン精製分画のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル（７%）を描写する。
【図２２】図２２は、プロテアーゼを含むＳＢＴＩ親和性精製分画を用いたＭＡＢ０２ザイモグラムアッセイの結果を描写する。主要なタンパク質分解活性が白く見え、そこでは、プロテアーゼはＭＡＢ０２抗体を分解していた。濃縮分画３（ｃｆ３）及び未濃縮分画１−４（ｆ１−ｆ４）をザイモグラムゲル中に流した。
【図２３】図２３は、プロテアーゼを含むＳＢＴＩ親和性精製分画を示すＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルを描写する。濃縮分画ｃｆ３及びｃｆ４がゲル中に見られる。
【図２４】図２４に、ＳＢＴＩ精製プロテアーゼによるリツキシマブ重鎖分解のレベルを示す免疫ブロットを描写する。
【図２５】図２５は、スブチリシン含有ピキア上清を用いて一晩インキュベートした場合での抗体分解のレベルを示す免疫ブロットを描写する。図２５Ａは、リツキシマブ重鎖のプロテアーゼ分解を示す。図２５Ｂは、ＭＡＢ０１重鎖のプロテアーゼ分解を示す。
【図２６】図２６は、３重プロテアーゼ欠失株Ｍ２７７の生成を示すサザンブロット分析を描写する。図２６Ａは、親（Ｍ２１９、Ｍ２２８）だけからのｓｌｐ１  ＯＲＦ：６．５kbの期待されるシグナルを描写する。図２６Ｂは、親からのｓｌｐ１  ５’隣接：６．５kbの期待されるシグナル、形質転換体からの３．３kb、プラスミドコントロールｐＴＴｖ１２６からの４．４kbを描写する。図２６Ｃは、親からのｓｌｐ１  ３’隣接：６．５kbの期待されるシグナル、形質転換体からの２．３kb、プラスミドコントロールｐＴＴｖ１２６からの４．４kbを描写する。
【図２７】図２７は、プロテアーゼ欠失株上清の活性を示すＭＡＢ０２ザイモグラムアッセイを描写する。染色ゲル上の白い領域は、プロテアーゼ活性のエリアを示す。
【図２８】図２８は、野生型Ｍ１２４活性と比較した、プロテアーゼ欠失培養上清の全プロテアーゼ活性を図表で描写する。
【図２９】図２９は、４重プロテアーゼ欠失株Ｍ３０７の生成を示すサザンブロット分析を描写する。図２９Ａは、親（Ｍ２７７  ２Ａ  ＝  Ｍ３０６）だけからのｇａｐ１  ＯＲＦ：４kbの期待されるシグナルを描写する。図２９Ｂは、親からのｇａｐ１  ５’隣接：５．５kbの期待されるシグナル、形質転換体からの３．４kb、プラスミドコントロールｐＴＴｖ１１７からの４．１kbを描写する。図２９Ｃは、親からのｇａｐ１  ３’隣接：５．５kbの期待されるシグナル、形質転換体からの３．１kb、プラスミドコントロールｐＴＴｖ１１７からの４．１kbを描写する。
【図３０】図３０は、野生型Ｍ１２４株と比較した、３重及び４重欠失株における全プロテアーゼ活性を図表で描写する。
【図３１】図３１は、Ｍ３０４  ３重欠失株とＭ３７１  ４重欠失株の間での経時的なプロテアーゼ活性を図表で描写する。
【図３２−１】図３２は、５重プロテアーゼ欠失株Ｍ３６９の生成を示すサザンブロット分析を描写する。図３２Ａは、親（Ｍ３０７）からのｇａｐ２  ＯＲＦ：４．９kbの期待されるシグナルを描写する。図３２Ｂは、親からのｇａｐ２  ５’隣接：４．９kbの期待されるシグナル、形質転換体からの２．３kb、プラスミドコントロールｐＴＴｖ１４５からの２．３kbを描写する。図３２Ｃは、親からのｇａｐ２  ３’隣接：４．９kbの期待されるシグナル、形質転換体からの３．８kb、プラスミドコントロールｐＴＴｖ１４５からの３．８kbを描写する。
【図３２−２】図３２は、５重プロテアーゼ欠失株Ｍ３６９の生成を示すサザンブロット分析を描写する。図３２Ｄは、株Ｍ３８１（クローン１４）をもたらす、５重プロテアーゼ欠失株Ｍ３６９からのｐｙｒ４−の生成を示すサザンブロット分析を描写する。期待されるシグナルは、全ての株からのｇａｐ２  ５’隣接：１．５kb、プラスミドコントロールｐＴＴｖ１４５からの４．１kbである。図３２Ｅは、株Ｍ３８１（クローン１４）をもたらす、５重プロテアーゼ欠失株Ｍ３６９からのｐｙｒ４−の生成を示すサザンブロット分析を描写する。期待されるシグナルは、Ｍ３０７からのｇａｐ２  ３’隣接：３．６ｋｂ、Ｍ３６９＋ループアウトクローンからの２．７kb、プラスミドコントロールｐＴＴｖ１４５からの３．８kbである。
【図３３】図３３は、４プロテアーゼ欠失株Ｍ３０７、５プロテアーゼ欠失株Ｍ３６９、及び６プロテアーゼ欠失形質転換体１０Ｂ、４４Ｂ、９７Ａ、９７Ｂ、及び１２０Ａを用いて行った撹拌フラスコ培養から取った５日目上清のプロテアーゼ活性を図表で描写する。蛍光カゼインを、クエン酸緩衝液ｐＨ４．５中の希釈上清を用いてインキュベートし、プロテアーゼ活性を検出した。
【図３４−１】図３４は、６重プロテアーゼ欠失株Ｍ３９６及びＭ４００の生成を示すサザンブロット分析を描写する。図３４Ａは、Ｍ３０７及びＭ３６９からのｐｅｐ４  ＯＲＦ：６．３kbの期待されるシグナルを描写する。図３４Ｂは、Ｍ３０７及びＭ３６９からのｐｅｐ４  ＯＲＦ：６．３kbの期待されるシグナル、形質転換体からの無シグナルを描写する。
【図３４−２】図３４は、６重プロテアーゼ欠失株Ｍ３９６及びＭ４００の生成を示すサザンブロット分析を描写する。図３４Ｃは、Ｍ３０７及びＭ３６９からのｐｅｐ４  ５’隣接：６．３kbの期待されるシグナル、形質転換体からの４．８kb、ｐＴＴｖ１８１からの４．０kbを描写する。図３４Ｄは、Ｍ３０７及びＭ３６９からのｐｅｐ４  ３’隣接：６．３kbの期待されるシグナル、形質転換体からの２．１kb、ｐＴＴｖ１８１からの４．０kbを描写する。
【図３４−３】図３４は、６重プロテアーゼ欠失株Ｍ３９６及びＭ４００の生成を示すサザンブロット分析を描写する。図３４Ｅは、６重プロテアーゼ欠失株Ｍ３９６からのｐｙｒ４−の生成を示すサザンブロット分析を描写する。期待されるシグナルは、Ｍ３０７及びＭ３６９からのｐｅｐ４  ３’隣接：６．３kb、再精製した形質転換体からの２．１kb、ループアウトクローンからの４．９kbである。
【図３５】図３５は、上清プロテアーゼによりインビトロで作製されたリツキシマブ重鎖フラグメントの量を示す免疫ブロットを描写する。
【図３６】図３６は、ＳＢＴＩ処理培養及び未処理コントロールからの上清サンプルによる重鎖及び軽鎖の分解を示す免疫ブロットを描写する。図３６Ａは、重鎖の分解を示す。図３６Ｂは、軽鎖の分解を示す。
【図３７】図３７は、キモスタチン及びペプスタチンＡを用いて処理した培養物からの、又は未処理コントロール培養からの上清サンプルによる重鎖及び軽鎖の分解のレベルを示す免疫ブロットを描写する。図３７Ａは、軽鎖の分解を示す。図３７Ｂは、重鎖の分解を示す。
【図３８】図３８は、Ｔリーゼイ培養上清から抗体を精製するプロセスを描写する。
【図３９】図３９は、ｐｅｐ１プロテアーゼの欠失を含むＴリーゼイ細胞からの抗体重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の改善された安定性を示す免疫ブロットを描写する。３つのモデル抗体を、大型振盪フラスコ上清（Δｐｅｐ１及びＭ１２４）及び発酵上清（ｐＨ５．５；２８°Ｃ；２０g/L粕抽出物、６０g/Lラクトース）中でテストした。
【図４０】図４０は、ｔｓｐ１プロテアーゼの欠失を含むＴリーゼイ細胞からのリツキシマブ（Ｒｘ）重鎖の改善された産生を示す免疫ブロットを描写する。形質転換体１２−２Ａ及び１２−１６Ａは、親株と比較して、より多くの重鎖を明らかに示す。
【図４１】図４１は、３重プロテアーゼ欠失株Ｍ２７７からの上清を用いた一晩インキュベーション後の低下したＭＡＢ０１重鎖分解を示す免疫ブロットを描写する。５日目の培養上清中での一晩インキュベート後、プロテアーゼ欠失を有さない、コントロール株Ｍ１２４からの上清と比較し、３重プロテアーゼ欠失上清中に見出された２．５倍多い重鎖があった。７日間の培養上清中でインキュベートした場合、コントロール株Ｍ１２４からの上清と比較して、３重プロテアーゼ欠失上清中に見出された４倍多い重鎖があった。
【図４２】図４２は、モデルタンパク質の分解試験を描写する。６プロテアーゼ欠失株からの未希釈上清を、純粋なモデルタンパク質（０．０５μg/μl）中でのスパイクのためにｐＨ４．２で使用した。モデルタンパク質（０．０５μg/μl）を用いてスパイクした５０mMクエン酸ナトリウムｐＨ４．０を、緩衝液コントロールとして示す。スパイクされた上清及びコントロールを、２０時間にわたり３７℃でインキュベートした。各々のサンプルの１０μlを、１８%ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル中にロードした。ｈＧＨは２２kDに流れ、ＩＦＮα２ｂは１９．４kDに流れ、及びＩＧＦ１は７．５kDに流れた。
【図４３】図４３は、６プロテアーゼ欠失株からの上清中のＭＡＢ０１抗体重鎖の安定性テストを描写する。ＭＡＢ０１抗体は、未希釈上清中に０．０５μg/μlで存在していた。各々のサンプルの１０μlを、４〜２０%ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにロードした。重鎖は、ｐＨ４．２での６プロテアーゼ欠失株からの上清中での３７℃で２０時間のインキュベーション後に安定であった。重鎖は、抗重鎖ＩｇＧ  ＡＰコンジュゲート抗体（Sigma＃Ａ３１８８）（ＴＢＳＴ中で１：３０，０００に希釈）を用いて検出した。完全長重鎖は、ゲル上で、５０kDで流れた。
【図４４】図４４は、阻害剤、及びサプリメントを伴う及び伴わない、２４ウェル培養からのヒト成長ホルモンの４日目サンプルを描写する。各々の上清の１２μlをロードした。Ａｃｒｉｓからの一次抗体、カタログ＃ＡＭ００４０１ＰＵ−Ｎマウス抗ｈＧＨ抗体（ＴＢＳＴ中で２μg/mlまで希釈）及びBioRad（＃１７０−６５２０）ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡＰコンジュゲート二次抗体（１：１０，０００希釈）。ｈＧＨスタンダード（２００ng）、Abcamカタログ＃ａｂ５１２３２。完全長ｈＧＨタンパク質は、２２kDで流れた。
【図４５】図４５は、Ｔリーゼイ、ミセリオフトラ・サーモフィラ、ニューロスポラ・クラッサ、ペニシリウム・クリソゲヌム、アスペルギルス・オリゼ、Ａニデュランス、及びＡニガーのアスパラギン酸プロテアーゼの系統樹を描写する。アラインメントを、Clustal Omega（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）を用いて作製し、ツリーを、BLOSUM62を伴う平均距離を使用して算出した。
【図４６】図４６は、Ｔリーゼイ、ミセリオフトラ・サーモフィラ、ニューロスポラ・クラッサ、ペニシリウム・クリソゲヌム、アスペルギルス・オリゼ、Ａニデュランス、及びＡニガーのスブチリシンプロテアーゼの系統樹を描写する。アラインメントを、Clustal Omega（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）を用いて作製し、ツリーを、BLOSUM62を伴う平均距離を使用して算出した。「ｐｙｒ」はピロリシンを意味し、「ｐｒＫｓｆ３」はプロテイナーゼＫを意味し、サブファミリー３；ｐｒｔＡ、ｐｒｔＫ、ｐｒｔＪ、ｐｒｔＦ、及びｐｒｔＢＣＩは、Bryant et al.(2009) BMC Evolutionary Biology 9:168, doi:10.1186/1471-2148-9-168，図５及び追加ファイルｎｏ．８に記載される通りのサブファミリーを意味する。
【図４７】図４７は、Ｔリーゼイ、ミセリオフトラ・サーモフィラ、ニューロスポラ・クラッサ、ペニシリウム・クリソゲヌム、アスペルギルス・オリゼ、Ａニデュランス、及びＡニガーのグルタミン酸プロテアーゼの系統樹を描写する。アラインメントを、Clustal Omega（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）を用いて作製し、ツリーを、BLOSUM62を伴う平均距離を使用して算出した。
【図４８】図４８は、Ｔリーゼイ、ミセリオフトラ・サーモフィラ、ニューロスポラ・クラッサ、ペニシリウム・クリソゲヌム、アスペルギルス・オリゼ、Ａニデュランス、及びＡニガーのセドリシンプロテアーゼの系統樹を描写する。アラインメントを、Clustal Omega（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）を用いて作製し、ツリーを、BLOSUM62を用いた平均距離を使用して算出した。ｓｌｐ７はプロテアーゼセドリシンと似ているため、それはツリーに含まれる。アスペルギルス・フミガーツス配列を含め、セドリシン間の関係の決定を助ける。各々のプロテアーゼの前の略語ｓｅｄＡ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｅは、Reichard et al.(2006) APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Vol. 72, p. 1739-1748図４に基づき、Ａフミガーツスセドリシンを用いたそのＢＬＡＳＴ検索から、対応するプロテアーゼを回収した。
【図４９Ａ】図４９：Ａ：発現プラスミドｐＴＴｖ６７及びｐＴＴｖ９９ための模式図。ＭＡＢ０１重鎖はｐＴＴｖ６７ベクター内に含まれ、軽鎖はｐＴＴｖ９９ベクター内に含まれる。
【図４９Ｂ】図４９：Ｂ：発現ベクターｐＴＴｖ２２３ための模式図。ＭＡＢ０１の重鎖及び軽鎖は、ｐＴＴｖ２２３ベクター内に含まれる。
【図５０Ａ】図５０：Ａ：ウェスタンブロット分析  ｐＨ５．２におけるＭＡＢ０１産生株Ｍ５０７のフェドバッチ発酵中でのＭＡＢ０１軽鎖及び重鎖産生。使用した抗体は、重鎖に対するSigma  Ａ３１８８（左ブロット）及び軽鎖に対するSigma  Ａ３８１３（右ブロット）であり、両方が１：１０，０００希釈であった。サンプルコードは、日で発酵時間を表示する。０．１μlの上清を、両方のブロットにおける各々のレーン中にロードした。
【図５０Ｂ】図５０：Ｂ：ｐＨ５．５でのＭＡＢ０１産生株Ｍ５０７のフェドバッチ発酵中でのＭＡＢ０１軽鎖及び重鎖産生のウェスタンブロット分析。使用した抗体は、重鎖に対するSigma  Ａ３１８８（左へのブロット）及び軽鎖に対するSigma  Ａ３８１３（右へのブロット）であり、両方が１：１０，０００希釈であった。サンプルコードは、日で発酵時間を表示する。０．１μlの上清を、両方のブロットにおける各々のレーン中にロードした。
【図５１】図５１ウェスタンブロット分析  株Ｍ３０４における、ｐＨ５．５でのフェドバッチ発酵ｂｉｏ００５０３ｂ中でのＭＡＢ０１軽鎖及び重鎖産生。使用した抗体は、重鎖に対するSigma  Ａ３１８８及び軽鎖に対するSigma  Ａ３８１３であった。Ｍ３０４発酵ｂｉｏ００４７７ｂから８日目を、コントロールとして含んだ。サンプルコードは、日で発酵時間を表示する。０．１μlの上清を、両方のブロットにおいてロードした。最上部の免疫ブロットは重鎖であり、より低い免疫ブロットは軽鎖である。
【図５２】図５２．ｐＴＴｖ２０４  ＲＮＡｉ発現ベクター。
【図５３】図５３：ｓｌｐ２発現をノックダウンするＲＮＡｉを発現する株におけるＭＡＢ０１重鎖産生を検出する免疫ブロット。
【図５４】図５４Ａは、Ｍ４０１発酵の３日目サンプルからのＩＦＮ−α  ２ｂ発現レベルの定量化を描写する。１μl／２μl／４μlの上清を４〜２０%ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにロードした。免疫ブロッティングを、ＴＢＳＴ中で１μg/mlに希釈したAbcam（＃ａｂ９３８６）抗ＩＦＮ−α  ２ｂ抗体を用いて行った。BioRadからの二次抗体（＃１７０−６５２０）は、ＴＢＳＴ中で１：５０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡＰコンジュゲート二次抗体であった。タンパク質標準を、５０ng、１００ng、及び２００ngの完全長ＩＦＮ−α  ２ｂに対応して、ゲル上にロードした。デンシトメトリー定量化を、Totallab Quant TL100ソフトウェアを用いて行った。定量化のために、２μlサンプルが、最も代表的であった。完全長ＩＦＮ−α  ２ｂコントロール（１００ng）は１９．３kDで、担体結合ＩＦＮ−α  ２ｂは７０kDaに流れた。
【図５５】図５４Ｂは、Ｍ５７７及びＭ６５２発酵培養の３〜６日目サンプルについての免疫ブロット分析を描写する。０．２μlの成長上清を４〜２０%ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにロードした。免疫ブロッティングを、ＴＢＳＴ中で１μg/mlに希釈したAbcam（＃ａｂ９３８６）抗ＩＦＮ−α  ２ｂ抗体を用いて行った。BioRadからの二次抗体（＃１７０−６５２０）は、ＴＢＳＴ中で１：５０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡＰコンジュゲート二次抗体であった。完全長ＩＦＮ−α  ２ｂコントロール（１００ng）は１９．３kDで、担体結合ＩＦＮ−α  ２ｂは７０kDaに流れた。
【００３２】
図５５は、４日目（Ｍ５７７発酵）及び３日目（Ｍ６５２発酵）サンプルからの  ＩＦＮ−α  ２ｂ発現レベルの定量化を描写する。各々のサンプルの０．０５μｌ及び０．１μｌの上清を、４〜２０%ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにロードした。免疫ブロッティングを、ＴＢＳＴ中で１μg/mlに希釈したAbcam（＃ａｂ９３８６）抗ＩＦＮ−α  ２ｂ抗体を用いて行った。BioRadからの二次抗体（＃１７０−６５２０）は、ＴＢＳＴ中で１：５０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡＰコンジュゲート二次抗体であった。タンパク質標準を、５０ng、１００ng、及び２００ngの完全長ＩＦＮ−α  ２ｂに対応して、ゲル上にロードした。デンシトメトリー定量化を、Totallab Quant TL100ソフトウェアを用いて行った。定量化のために、０，１μlサンプルが、最も代表的であった。完全長ＩＦＮ−α  ２ｂコントロール（１００ng）は１９．３kDに、担体結合ＩＦＮ−α  ２ｂは７０kDaに流れた。
【００３３】
詳細な説明
本発明は、少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下しているか又は無活性である糸状菌細胞における、組換え異種ポリペプチドを生成する改善された方法に関する。本発明は、糸状菌細胞において特定の組み合わせの内在性プロテアーゼの活性を低下させることによって、様々な組換え発現された異種タンパク質（例えば免疫グロブリン及び成長因子など）の発現及び安定性を増加させるという驚くべき発見に部分的に基づく。他が、不活性化された１つ以上のプロテアーゼを伴うトリコデルマ菌細胞を作製したが、それらは、いずれのプロテアーゼが、タンパク質（例えば哺乳動物タンパク質など）の特定の型の発現及び安定性の増加に最も関連しているかに関する指針を提供していない。例えば、ＷＯ２０１１／０７５６７７は、トリコデルマにおいてノックアウトすることができる特定のプロテアーゼを開示し、複数のプロテアーゼにおいて欠損しているトリコデルマ菌細胞でさえ開示している。しかし、ＷＯ２０１１／０７５６７７は、プロテアーゼのいずれが、哺乳動物タンパク質（例えば免疫グロブリン又は成長因子など）の発現及び安定性に対して悪い影響を有するのかに関する任意の指針を提供しない。なぜなら、任意の哺乳動物タンパク質の発現の例が、それにおいて記載されていないからである。さらに、ＷＯ２０１１／０７５６７７は、単一のプロテアーゼにおいて欠損している３つの異なる菌株の各々における単一の菌タンパク質の異種発現を開示している。このように、当業者は、各々の単一プロテアーゼを不活性化することが、異種タンパク質産生のために十分でありうることを教示するＷＯ２０１１／０７５６７７を読む可能性が高いであろう。Yoon et al.（2009, Appl.Microbiol Biotechnol 82: 691-701, 2010: Appl.Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-010-2937-0）は、アスペルギルス・オリザエにおける異種タンパク質産生のための５重及び１０重プロテアーゼ遺伝子破壊株の構築を報告した。１０プロテアーゼ破壊細胞は、高い数の破壊されたプロテアーゼ遺伝子にもかかわらず、３．８倍だけキモシンの産生収量を改善させる。Van den Hombergh et al.は、アスペルギルス・ニガーの３重プロテアーゼ遺伝子破壊株を報告した。データは、プロテアーゼ活性における低下を示すが、本明細書に記載の任意の哺乳動物タンパク質産生の例はない。
【００３４】
出願者らは、驚くべきことに、複数のプロテアーゼが、糸状菌細胞（例えばトリコデルマ菌細胞など）における、全プロテアーゼ活性の低下、異種タンパク質の産生を増加させること、及び発現後に異種タンパク質を安定化することに関連することを示している。特に、本発明者らは、これらのプロテアーゼを精製し、いずれが、異種タンパク質（例えば哺乳動物タンパク質など）を分解する際に最も関連する活性を有するかを決定することにより、（単にゲノム中にコードされているのとは対照的に）トリコデルマ菌細胞で実際に発現されるプロテアーゼを同定している。加えて、本発明者らは、特定のプロテアーゼ活性について責任のある遺伝子を欠失させることによって、全プロテアーゼ活性における実質的な低下が達成されていることが確認され、それは、そのような欠失を含む糸状菌細胞中で産生されるタンパク質の量及び品質の両方の点で、タンパク質安定化における増加に相関し、細胞中での完全長の異種タンパク質の産生における増加をもたらした。また、少なくとも３つのプロテアーゼ遺伝子の活性を低下させるように操作されたトリコデルマ菌細胞では、完全長の哺乳動物タンパク質（例えば抗体など）、治療用タンパク質、又は抗体変異体（例えばＦａｂ又は単一ドメイン抗体など）の産生における予想外の相乗的な増加がもたらされることが見出された。換言すると、産生された完全長の哺乳動物タンパク質の量は、１つ又は２つのプロテアーゼ遺伝子欠失だけを含むトリコデルマ菌細胞において産生された量の合計よりも大きかった。このように、ＷＯ２０１１／０７５６７７とは対照的に、本発明者らは、糸状菌細胞（例えばトリコデルマ菌細胞など）におけるインタクトな異種タンパク質の産生は、細胞における少なくとも３つのプロテアーゼの活性を低下又は排除することにより達成することができることを示している。
【００３５】
したがって、本開示の特定の局面は、少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下しているか又は無活性であることにより異種タンパク質の増加レベルを産生する糸状菌細胞を提供し、そこでは、細胞は、さらに、プロテアーゼの活性が低下していない対応する親糸状菌細胞中でのポリペプチドの産生レベルよりも少なくとも２倍高いレベルで産生された異種ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む。換言すると、異種タンパク質産生のレベルにおける所望の増加は、少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下していない糸状菌細胞における異種タンパク質の産生レベルを、そのような活性が低下していないが、しかし、その他の点では、増加レベルを示す細胞と同一である糸状菌細胞のものと比較することにより決定可能である。
【００３６】
本開示の他の局面は、以下により、異種ポリペプチドを改善する方法を提供する：ａ）少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下しているか又は無活性である、本開示の糸状菌細胞を提供すること（そこで、細胞は、異種ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドをさらに含む）；及びｂ）異種ポリペプチドが発現されるように細胞を培養すること（そこで、異種ポリペプチドは、プロテアーゼをコードする遺伝子の変異を含まない宿主細胞と比較して、増加した安定性を有する）。
【００３７】
本開示のさらに他の局面は、以下により、異種ポリペプチドを作製する方法を提供する：ａ）少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下しているか又は無活性である、本開示の糸状菌細胞を提供すること（そこで、細胞は、異種ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドをさらに含む）；ｂ）異種ポリペプチドが発現されるように宿主細胞を培養すること；及びｃ）異種ポリペプチドを精製すること。
【００３８】
本開示の特定の局面は、また、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｇａｐ１、及びｇａｐ２より選択された少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下しているか又は無活性であることにより哺乳動物ポリペプチドの増加レベルを産生するトリコデルマ菌細胞を提供し、そこでは、細胞は、さらに、プロテアーゼの活性が低下していない対応する親トリコデルマ菌細胞中でのポリペプチドの産生レベルよりも少なくとも２倍高いレベルで産生された哺乳動物ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む。換言すると、異種タンパク質産生のレベルにおける所望の増加は、少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下しているトリコデルマ菌細胞における異種タンパク質の産生レベルを、そのような活性が低下していないが、しかし、その他の点では、増加レベルを示す細胞と同一であるトリコデルマ菌細胞のものと比較することにより決定可能である。
【００３９】
本開示の他の局面は、以下により、哺乳動物ポリペプチドを改善する方法に関する：ａ）少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下している、本開示のトリコデルマ菌細胞を提供すること（そこで、細胞は、哺乳動物ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドをさらに含む）；及びｂ）哺乳動物ポリペプチドが発現されるように細胞を培養すること（そこで、哺乳動物ポリペプチドは、プロテアーゼをコードする遺伝子の変異を含まない宿主細胞と比較して、増加した安定性を有する）。
【００４０】
本開示のさらなる局面は、以下により、哺乳動物ポリペプチドを作製する方法を提供する：ａ）少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下している、本開示のトリコデルマ菌細胞を提供すること（そこで、細胞は、哺乳動物ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドをさらに含む）；ｂ）哺乳動物ポリペプチドが発現されるように宿主細胞を培養すること；及びｃ）哺乳動物ポリペプチドを精製すること。
【００４１】
定義
本明細書において使用する通り、「免疫グロブリン」は、一緒に共有結合的に共役し、抗原と特異的に組み合わせることが可能な重鎖及び軽鎖を含む多量体タンパク質を指す。免疫グロブリン分子は、分子のいくつかの型（例えばＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥなど）を含む、分子の大きなファミリーである。
【００４２】
本明細書において使用する通り、「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子、ならびに抗原に結合することが可能であるそのフラグメントに言及する。これらは、ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Winter et al. Nature 349: 293-99225, 1991；米国特許第４，８１６，５６７  ２２６号を参照のこと）；Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ａｂ）フラグメントならびにＦｖ分子；非共有結合的なヘテロ二量体［２２７、２２８］；単一鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（例えば、Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.85: 5897-83, 1988を参照のこと）；二量体及び三量体抗体フラグメントコンストラクト；ミニボディ（例えば、Pack et al. Biochem 31, 1579-84, 1992；及びCumber et al. J.Immunology 149B, 120-26, 1992を参照のこと）；ヒト化抗体分子（例えば、Riechmann et al. Nature 332, 323-27, 1988；Verhoeyan et al.Science 239, 1534-36, 1988；及びＧＢ  ２，２７６，１６９を参照のこと）；及びそのような分子から得られた任意の機能的フラグメント、ならびに非従来のプロセス（例えばファージディスプレイなど）によって得られた抗体を含む。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体を得る方法は、当技術分野において周知である。
【００４３】
本明細書において使用する通り、「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、複数の連続的な重合したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列である。本発明の目的のために、典型的には、ペプチドは、５０までのアミノ酸残基を含むそれらの分子であり、ポリペプチドは、５０を上回るアミノ酸残基を含む。ペプチド又はポリペプチドは、修飾アミノ酸残基、コドンによりコードされない自然に生じるアミノ酸残基、及び自然に生じないアミノ酸残基を含みうる。本明細書において使用する通り、「タンパク質」は、任意のサイズのペプチド又はポリペプチドを指す。
【００４４】
本発明のプロテアーゼ
本明細書に記載の本発明は、細胞において見出される少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下しているか又は検出不可能であることにより、異種ポリペプチド（例えば哺乳動物ポリペプチドなど）の増加レベルを産生する、糸状菌細胞（例えばトリコデルマ菌細胞など）に関する。異種ポリペプチドを発現する糸状菌細胞において見出されたそのようなプロテアーゼは、発現された組換えポリペプチドの有意な分解を通常は触媒する。このように、異種ポリペプチドを発現する糸状菌細胞におけるプロテアーゼの活性を低下又は排除することにより、発現されたポリペプチドの安定性が増加し、ポリペプチドの産生の増加レベル、及び、一部の状況において、産生されたポリペプチドの改善された品質（例えば、分化の代わりに完全長）をもたらす。
【００４５】
限定を伴わず、アスパラギン酸プロテアーゼ、トリプシン様セリンプロテアーゼ、スブチリシンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、及びセドリシンプロテアーゼを含むプロテアーゼ。そのようなプロテアーゼを同定し、糸状菌細胞から単離し、テストし、それらの活性における低下が、糸状菌細胞からの組換えポリペプチドの産生に影響を与えるか否かを決定しうる。プロテアーゼを同定及び単離するための方法は当技術分野において周知であり、限定を伴わず、親和性クロマトグラフィー、ザイモグラムアッセイ、及びゲル電気泳動を含む。同定されたプロテアーゼを、次に、組換えポリペプチド（例えば異種又は哺乳動物ポリペプチドなど）を発現する糸状菌細胞からの同定されたプロテアーゼをコードする遺伝子を欠失させることにより、及び、その欠失が、その細胞の全プロテアーゼ活性における、例えば、対応する親糸状菌細胞の全プロテアーゼ活性の４９%以下、又は３１%以下のレベルまでの減少；ならびに、例えば、対応する親糸状菌細胞における産生レベルよりも２倍高い、発現された組換えポリペプチドの産生のレベルにおける増加をもたらすか否かを決定することによりテストしうる。遺伝子を欠失させる、全プロテアーゼ活性を測定する、及び産生タンパク質のレベルを測定するための方法は、当技術分野において周知であり、本明細書に記載の方法を含む。「対応する親糸状菌細胞」は、プロテアーゼが低下又は排除された活性を有さない、対応する細胞を指す。
【００４６】
アスパラギン酸プロテアーゼ
アスパラギン酸プロテアーゼは、ポリペプチド及びタンパク質中のペプチド結合の加水分解のためにアスパラギン酸残基を使用する酵素である。典型的には、アスパラギン酸プロテアーゼは、酸性ｐＨで最適に活性であるそれらの活性部位において２つの高度に保存されたアスパラギン酸残基を含む。真核生物（例えばトリコデルマ菌など）からのアスパラギン酸プロテアーゼは、ペプシン、カテプシン、及びレニンを含む。そのようなアスパラギン酸プロテアーゼは、２つのドメイン構造を有し、それは、先祖遺伝子の重複から生じると考えられる。そのような重複事象と一致して、各々のドメインの全体的な折り畳みは類似しているが、２つのドメインの配列は、相違し始めている。各々のドメインは、触媒的なアスパラギン酸残基の１つに寄与する。活性部位は、アスパラギン酸プロテアーゼの２つのドメインにより形成された間隙中にある。真核生物アスパラギン酸プロテアーゼは、保存されたジスルフィド架橋をさらに含み、それは、アスパラギン酸プロテアーゼであるとしてポリペプチドの同定において補助することができる。
【００４７】
９つのアスパラギン酸プロテアーゼが、トリコデルマ菌細胞において同定されている：ｐｅｐ１（ｔｒｅ７４１５６）；ｐｅｐ２（ｔｒｅ５３９６１）；ｐｅｐ３（ｔｒｅ１２１１３３）；ｐｅｐ４（ｔｒｅ７７５７９）、ｐｅｐ５（ｔｒｅ８１００４）、及びｐｅｐ７（ｔｒｅ５８６６９）、ｐｅｐ８（ｔｒｅ１２２０７６）、ｐｅｐ１１（ｔｒｅ１２１３０６）、及びｐｅｐ１２（ｔｒｅ１１９８７６）。
【００４８】
Ｐｅｐ１
適したｐｅｐ１プロテアーゼの例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｐｅｐ１（配列番号１）、ヒポクレア・リクシイ  ｇｉ｜１１５５８４９８（配列番号２）、トリコデルマ・アスペレルム  ｇｉ｜４７０２７９９７（配列番号３）、トリコデルマ・アトロビリデ  ｊｇｉ｜Ｔｒｉａｔ２｜２９７８８７（配列番号４）、トリコデルマ・ビレンス  ｊｇｉ｜ＴｒｉｖｉＧｖ２９＿８＿２｜８１７７７（配列番号５）、アスペルギルス・フミガーツス  ｊｇｉ｜Ｔｒｉｒｅ２｜ａｆｍ：Ａｆｕ５ｇ１３３００（配列番号６）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｇｉ｜９４７３０４０８（配列番号７）、メタリジウム・アニソプリエ  ｇｉ｜３２２７１２７８３（配列番号８）、ジベレラ・ゼアエ  ｇｉ｜４６１２６７９５（配列番号９）、フザリウム・ベネナタム  ｇｉ｜１８４４８７１３（配列番号１０）、フザリウム・オキシスポラム  ｇｉ｜３４２８７９１７３（配列番号１１）、Ｇｒｏｓｍａｎｎｉａ  ｃｌａｖｉｇｅｒａ  ｇｉ｜３２０５９１３９９（配列番号１２）、ベルチシリウム・アルボアトルム  ｇｉ｜３０２４２２７５０（配列番号１３）、カエトミウム・グロボスム  ｇｉ｜１１６１８２９６４（配列番号１４）、ニューロスポラ・クラッサ  ｇｉ｜８５１１０７２３（配列番号１５）、ニューロスポラ・テトラスペルマ  ｇｉ｜３３６４６３９９０（配列番号１６）、マイセリオフトラ・サーモフィラ  ｇｉ３６７０３０９２４（配列番号４９１）、ペニシリウム・クリソゲナム  ｇｉ２５５９５３３２５（配列番号４９２）、アスペルギルス・ニガー  ｇｉ３５０６３９５３５（配列番号４９３）、アスペルギルス・ニジュランス  ｇｉ６７５４１４３６（配列番号４９４）、及びそれらのホモログを含む。
【００４９】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼ、典型的には、ｐｅｐ１プロテアーゼは、配列番号１〜１６、配列番号４９１〜４９４より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号１〜１６、配列番号４９１〜４９４より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【００５０】
一部の実施態様において、ｐｅｐ１はＴリーゼイ  ｐｅｐ１である。Ｔリーゼイ  ｐｅｐ１によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号１に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号１と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号１と１００%の同一性を有する。
【００５１】
Ｐｅｐ２
適したｐｅｐ２プロテアーゼの例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｐｅｐ２（配列番号１８２）、Ｔアトロビリデ  ｊｇｉ｜Ｔｒｉａｔ２｜１４２０４０（配列番号１８３）、Ｔビレンス  ｊｇｉ｜ＴｒｉｖｉＧｖ２９＿８＿２｜５３４８１（配列番号１８４）、コルジセプス・ミリタリス  ＣＭ０１  ｇｉ｜３４６３２６５７５（配列番号１８５）、ニューロスポラ・クラッサ  ｇｉ  ８５１１１３７０（配列番号４９５）、及びそれらのホモログを含む。
【００５２】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼ、典型的には、ｐｅｐ２プロテアーゼは、配列番号１８２〜１８５、配列番号４９５より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号１８２〜１８５、配列番号４９５より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【００５３】
一部の実施態様において、ｐｅｐ２はＴリーゼイ  ｐｅｐ２である。Ｔリーゼイ  ｐｅｐ２によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号１８２に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号１８２と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号１８２と１００%の同一性を有する。
【００５４】
Ｐｅｐ３
適したｐｅｐ３プロテアーゼの例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｐｅｐ３（配列番号１７）、Ｔアトロビリデ  ｊｇｉ｜Ｔｒｉａｔ２（配列番号１８）、Ｔビレンスｊｇｉ｜ＴｒｉｖｉＧｖ２９＿８＿２（配列番号１９）、ヒポクレア・リクシイ  ｇｉ｜１４５５８３１２５（配列番号２０）、トリコデルマ・アスペレルム  ｇｉ｜５１８６０１７５（配列番号２１）、アスペルギルス・ニガー  ｇｉ｜３１７０２５１６４（配列番号２２）、アスペルギルス・フミガーツス  ｇｉ｜１５９１２２５３４（配列番号２３）、アスペルギルス・ニガー  ｇｉ｜１３４０５４５７２（配列番号２４）、コルジセプス・ミリタリス，  ｇｉ｜３４６３１８６２０（配列番号２５）、グロメレラ・グラミニコラ  ｇｉ｜３１０８００１５６（配列番号２６）、フザリウム・オキシスポラム  ｇｉ｜３４２８７１２２１（配列番号２７）、グロスマンニア・クラビゲラ  ｇｉ｜３２０５９１１２１（配列番号２８）、ボトリオチニア・フケリアナ（Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ  ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ）  ｇｉ｜１２００２２０５（配列番号２９）、チエラビア・テレストリス  ｇｉ｜３４６９９７１０７（配列番号３０）、スクレロチニア・スクレロチオラム  ｇｉ｜１５６０５５９５４（配列番号３１）、カエトミウム・グロボスム  ｇｉ｜１１６１９７８２９（配列番号３２）、ニューロスポラ・テトラスペルマ  ｇｉ｜３３６４７２１３２（配列番号３３）、ニューロスポラ・クラッサ  ｇｉ｜８５１０２０２０（配列番号３４）、ネオサルトリア・フィシェリ  ｇｉ｜１１９４６７４２６（配列番号３５）、ペニシリウム・マルネッフェイ  ｇｉ｜２１２５３４７９２（配列番号３６）、Ｍサーモフィラ  ｇｉ３６７０２５９０９（配列番号４９６）、Ｐクリソゲヌム  ｇｉ２５５９４７２６４（配列番号４９７）、Ａオリゼ  ３９１８７０１２３（配列番号４９８）、及びそれらのホモログを含む。
【００５５】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼ、典型的には、ｐｅｐ３プロテアーゼは、配列番号１７〜３６、配列番号４９６〜４９８より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号１７〜３６、配列番号４９６〜４９８より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【００５６】
一部の実施態様において、ｐｅｐ３はＴリーゼイ  ｐｅｐ３である。Ｔリーゼイ  ｐｅｐ３によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号１７に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号１７と５０%上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号１７と１００%の同一性を有する。
【００５７】
Ｐｅｐ４
適したｐｅｐ４プロテアーゼの例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｐｅｐ４（配列番号３７）、Ｔビレンス  ｊｇｉ｜ＴｒｉｖｉＧｖ２９＿８＿２（配列番号３８）、Ｔアトロビリデ  ｊｇｉ｜Ｔｒｉａｔ２（配列番号３９）、トリコデルマ・アウレオビリデ  ｇｉ｜１９３７３５６０５（配列番号４０）、アスペルギルス・ニガー  ｇｉ｜１４５２３２９６５（配列番号４１）、アスペルギルス・フミガーツス  ｇｉ｜７０９９９５２０（配列番号４２）、アスペルギルス・クラバタス  ｇｉ｜１２１７０５７５６（配列番号４３）、ネクトリア・ハエマトコカ  ｇｉ｜３０２８９９２２６（配列番号４４）、グロメレラ・グラミニコラ  ｇｉ｜３１０７９６３１６（配列番号４５）、コルジセプス・ミリタリス  ｇｉ｜３４６３２２８４２（配列番号４６）、ジベレラ・ゼアエ  ｇｉ｜４６１３８５３５（配列番号４７）、メタリジウム・アニソプリエ  ｇｉ｜３２２７０８４３０（配列番号４８）、フザリウム・オキシスポラム  ｇｉ｜３４２８８２９４７（配列番号４９）、メタリジウム・アクリダム  ｇｉ｜３２２７００７４７（配列番号５０）、ベルチシリウム・ダヒリアエ  ｇｉ｜３４６９７３６９１（配列番号５１）、ボトリオチニア・フケリアナｇｉ｜１５４３０９８５７（配列番号５２）、カエトミウム・グロボスム  ｇｉ｜１１６２０３５０５（配列番号５３）、チエラビア・テレストリス  ｇｉ｜３４７００１５９０（配列番号５４）、マグナポルテ・オリゼ  ｇｉ｜３９９７３８６３（配列番号５５）、チュベル・メラノスポルム  ｇｉ｜２９６４１７６５１（配列番号５６）、ニューロスポラ・クラッサ  ｇｉ｜８５０９４５９９（配列番号５７）、Ｍサーモフィラ  ｇｉ３６７０３１８９２  ｇｉ２５５９４７２６４（配列番号４９９）、Ｐクリソゲヌム  ｇｉ２５５９３６７２９  ｇｉ２５５９４７２６４（配列番号５００）、Ａオリゼ  ｇｉ１６９７７０７４５  ｇｉ２５５９４７２６４（配列番号５０１）、Ａニデュランス  ｇｉ６７５２４８９１  ｇｉ２５５９４７２６４（配列番号５０２）、及びそれらのホモログを含む。
【００５８】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼ、典型的には、ｐｅｐ４プロテアーゼは、配列番号３７〜５７、配列番号４９９〜５０２より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号３７〜５７、配列番号４９９〜５０２より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【００５９】
一部の実施態様において、ｐｅｐ４はＴリーゼイ  ｐｅｐ４である。Ｔリーゼイ  ｐｅｐ４によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号３７に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号３７と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号３７と１００%の同一性を有する。
【００６０】
Ｐｅｐ５
適したｐｅｐ５遺伝子の例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｐｅｐ５（配列番号５８）、Ｔビレンス  ｊｇｉ｜ＴｒｉｖｉＧｖ２９＿８＿２（配列番号５９）、Ｔアトロビリデ  ｊｇｉ｜Ｔｒｉａｔ２｜２７７８５９（配列番号６０）、メタリジウム・アクリダム  ｇｉ｜３２２６９５８０６（配列番号６１）、フザリウム・オキシスポラム  ｇｉ｜１５６０７１４１８（配列番号６２）、コルジセプス・ミリタリス  ｇｉ｜３４６３２４８３０（配列番号６３）、ジベレラ・ゼアエ  ｇｉ｜４６１２４２４７（配列番号６４）、ベルチシリウム・ダヒリアエｇｉ｜３４６９７８７５２（配列番号６５）、Ｍサーモフィラ  ｇｉ３６７０１９７９８（配列番号５０３）、及びそれらのホモログを含む。
【００６１】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼ、典型的には、ｐｅｐ５プロテアーゼは、配列番号５８〜６５、配列番号５０３より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号５８〜６５、配列番号５０３より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【００６２】
一部の実施態様において、ｐｅｐ５はＴリーゼイ  ｐｅｐ５である。Ｔリーゼイ  ｐｅｐ５によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号５８に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号５８と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号５８と１００%の同一性を有する。
【００６３】
Ｐｅｐ７
適したｐｅｐ７遺伝子の例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｐｅｐ７（配列番号１８６）、トリコデルマ・アトロビリデ  ｊｇｉ｜Ｔｒｉａｔ２（配列番号１８７）、トリコデルマ・ビレンス  ｊｇｉ｜ＴｒｉｖｉＧｖ２９＿８＿２（配列番号１８８）、グロメレラ・グラミニコラ  ｇｉ｜３１０８００４８７（配列番号１８９）、メタリジウム・アクリダム  ｇｉ｜３２２７００５７７（配列番号１９０）、チエラビア・テレストリス  ｇｉ｜３４７００３２６４（配列番号１９１）、ポドスポラ・アンセリンｇｉ｜１７１６８０９３８（配列番号１９２）、カエトミウム・サーモフィラム  ｇｉ｜３４０９０５４６０（配列番号１９３）、ベルチシリウム・ダヒリアエｇｉ｜３４６９７５９６０（配列番号１９４）、マイセリオフトラ・サーモフィラ  ｇｉ｜３４７００９８７０，ｇｉ３６７０２６６３４（配列番号１９５）、ニューロスポラ・クラッサ  ｇｉ｜８５０９００７８（配列番号１９６）、マグナポルテ・オリゼ  ｇｉ｜３９９４８６２２（配列番号１９７）、カエトミウム・グロボスム  ｇｉ｜１１６１９１５１７（配列番号１９８）、マグナポルテ・オリゼ  ｇｉ｜３９９７０７６５（配列番号１９９）、Ａニデュランス  ｇｉ６７５２２２３２（配列番号５０４）、Ａニガー  ｇｉ３５０６３０４６４（配列番号５０５）、Ａオリゼ  ｇｉ３１７１３８０７４（配列番号５０６）、及びそれらのホモログを含む。
【００６４】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼ、典型的には、ｐｅｐ７プロテアーゼは、配列番号１８６〜１９９、配列番号５０４〜５０６より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号１８６〜１９９、配列番号５０４〜５０６より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【００６５】
一部の実施態様において、ｐｅｐ７はＴリーゼイ  ｐｅｐ７である。Ｔリーゼイ  ｐｅｐ７によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号１８６に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号１８６と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号１８６と１００%の同一性を有する。
【００６６】
Ｐｅｐ８
適したｐｅｐ８遺伝子の例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｐｅｐ８  ＥＧＲ４８４２４（配列番号５０７）、トリコデルマ・ビレンス  ＥＨＫ１９２３８（配列番号５０８）、トリコデルマ・アトロビリデ  ＥＨＫ４００４７（配列番号５０９）、ニューロスポラ・テトラスペルマ  ＥＧＯ５３３６７（配列番号５１０）、マイセリオフトラ・サーモフィラ  ＸＰ＿００３６５８８９７（配列番号５１１）、ニューロスポラ・クラッサ  ＸＰ＿９６５３４３（配列番号５１２）、メタリジウム・アニソプリエ  ＥＦＺ０３５０１（配列番号５１３）、チエラビア・テレストリス  ＸＰ＿００３６５６８６９（配列番号５１４）、フザリウム・オキシスポラム  ＥＧＵ７９７６９（配列番号５１５）、ａｎｄ  ジベレラ・ゼアエ  ＸＰ＿３８１５６６（配列番号５１６）、マグナポルテ・オリゼ  ＸＰ＿°°３７１４５４０．１（配列番号５１７）、Ｐクリソゲヌム  ＸＰ＿００２５５７３３１（配列番号５１８）、Ａオリゼ  ＸＰ＿００１８２２８９９．１（配列番号５１９）、Ａニデュランス  ＸＰ＿６６４０９１．１（配列番号５２０）、Ａニガー  ＥＨＡ２４３８７．１（配列番号５２１）、及びそれらのホモログを含む。
【００６７】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼ、典型的には、ｐｅｐ８プロテアーゼは、配列番号５０７〜５２１より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号５０７〜５２１より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【００６８】
一部の実施態様において、ｐｅｐ８はＴリーゼイ  ｐｅｐ８である。Ｔリーゼイ  ｐｅｐ８によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号５０７に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号５０７と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号５０７と１００%の同一性を有する。
【００６９】
Ｐｅｐ１１
適したｐｅｐ１１遺伝子の例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｐｅｐ１１  ＥＧＲ４９４９８（配列番号５２２）、トリコデルマ・ビレンス  ＥＨＫ２６１２０（配列番号５２３）、トリコデルマ・アトロビリデ  ＥＨＫ４１７５６（配列番号５２４）、フザリウム・プソイドグラミネアルム  ＥＫＪ７４５５０（配列番号５２５）、メタリジウム・アクリダム  ＥＦＹ９１８２１（配列番号５２６）、及びジベレラ・ゼアエ  ＸＰ＿３８４１５１（配列番号５２７）、Ｍサーモフィラ  ＸＰ＿００３６６７３８７．１（配列番号５２８）、Ｎクラッサ  ＸＰ＿９６０３２８．１（配列番号５２９）、及びそれらのホモログを含む。
【００７０】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼ、典型的には、ｐｅｐ１１プロテアーゼは、配列番号５２２〜５２９より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号５２２〜５２９より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【００７１】
一部の実施態様において、ｐｅｐ１１はＴリーゼイ  ｐｅｐ８である。Ｔリーゼイ  ｐｅｐ１１によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号５２２に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号５２２と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号５２２と１００%の同一性を有する。
【００７２】
Ｐｅｐ１２
適したｐｅｐ１２遺伝子の例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｐｅｐ１２  ＥＧＲ５２５１７（配列番号５３０）、トリコデルマ・ビレンス  ｐｅｐ１２  ＥＨＫ１８８５９（配列番号５３１）、トリコデルマ・アトロビリデ  ｐｅｐ１２  ＥＨＫ４５７５３（配列番号５３２）、フザリウム・プソイドグラミネアルム  ｐｅｐ１２  ＥＫＪ７３３９２（配列番号５３３）、ジベレラ・ゼアエ  ｐｅｐ１２  ＸＰ＿３８８７５９（配列番号５３４）、及びメタリジウム・アニソプリエ  ｐｅｐ１２  ＥＦＹ９５４８９（配列番号５３５）、Ｎクラッサ  ＸＰ＿９６４５７４．１（配列番号５３６）、Ｍサーモフィラ  ＸＰ＿００３６５９９７８．１（配列番号５３７）、及びそれらのホモログを含む。
【００７３】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼ、典型的には、ｐｅｐ１２プロテアーゼは、配列番号５３０〜５３７より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号５３０〜５３７より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【００７４】
一部の実施態様において、ｐｅｐ８はＴリーゼイ  ｐｅｐ１２である。Ｔリーゼイ  ｐｅｐ１２によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号５３０に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号５３０と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号５３０と１００%の同一性を有する。
【００７５】
トリプシン様セリンプロテアーゼ
トリプシン様セリンプロテアーゼは、トリプシンのものと類似の基質特異性を伴う酵素である。トリプシン様セリンプロテアーゼは、ポリペプチド及びタンパク質中のペプチド結合の加水分解のためにセリン残基を使用する。典型的には、トリプシン様セリンプロテアーゼは、正に荷電したアミノ酸残基に続くペプチド結合を切断する。真核生物（例えばトリコデルマ菌など）からのトリプシン様セリンプロテアーゼは、トリプシン１、トリプシン２、及びメソトリプシンを含む。そのようなトリプシン様セリンプロテアーゼは、一般的に、活性部位のセリン求核を作るために役立つ電荷リレーを形成する３つのアミノ酸残基（例えばヒスチジン、アスパラギン酸、及びセリンなど）の触媒トライアドを含む。真核生物のトリプシン様セリンプロテアーゼは、さらに、グリシン及びセリンの骨格アミド水素原子により形成される「オキシアニオンホール」を含み、それは、トリプシン様セリンプロテアーゼであるとして、ポリペプチドの同定を助けることができる。
【００７６】
１つのトリプシン様セリンプロテアーゼが、トリコデルマ菌細胞において同定されている：ｔｓｐ１（ｔｒｅ７３８９７）。下に考察している通り、ｔｓｐ１は、組換えポリペプチド（例えば免疫グロブリンなど）の発現に有意な影響を有することが実証されている。
【００７７】
実施例３において下に考察する通り、セリンプロテアーゼを、トリコデルマから精製し、哺乳動物タンパク質を分解する複数のプロテアーゼ活性を有することが示された。これらの活性の内、ｔｓｐ１は、トリプシン様セリンプロテアーゼとして同定された。ｔｓｐ１プロテアーゼ遺伝子を、次に、トリコデルマ菌細胞から欠失させ、ｔｓｐ１を欠失させることによって、全プロテアーゼ活性における有意な低下が達成され、細胞により産生された哺乳動物タンパク質の増加した安定性がもたらされることが実証された。
【００７８】
適したｔｓｐ１プロテアーゼの例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｔｓｐ１（配列番号６６）、トリコデルマ・アトロビリデ  ｊｇｉ｜Ｔｒｉａｔ２｜２９８１８７（配列番号６７）、ｊｇｉ｜ＴｒｉｖｉＧｖ２９＿８＿２（配列番号６８）、ヒポクレア・リクシイ  ｇｉ｜１４５５８３５７９（配列番号６９）、ヒポクレア・リクシイ  ｇｉ｜６３０２５０００（配列番号７０）、スクレロチニア・スクレロチオラム  ｇｉ｜１５６０５２７３５（配列番号７１）、ボトリオチニア・フケリアナ  ｇｉ｜１５４３１４９３７（配列番号７２）、ファエオスファエリア・ノドルム  ｇｉ｜１６９６０５８９１（配列番号７３）、レプトスファエリア・マクランス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍａｃｕｌａｎｓ）  ｇｉ｜３１２２１９０４４（配列番号７４）、ベルチシリウム・ダヒリアエｇｉ｜３７９９２７７３（配列番号７５）、コクリオボルス・カルボナム  ｇｉ｜１０７２１１４（配列番号７６）、メタリジウム・アクリダム  ｇｉ｜３２２６９５３４５（配列番号７７）、メタリジウム・アニソプリエ  ｇｉ｜４７６８９０９（配列番号７８）、ｇｉ｜４６４９６３（配列番号７９）、ジベレラ・ゼアエ  ｇｉ｜４６１３９２９９（配列番号８０）、メタリジウム・アニソプリエ（配列番号８１）、Ａニデュランス  ｇｉ６７５２３８２１（配列番号５３８）、及びそれらのホモログを含む。
【００７９】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼ、典型的には、ｔｓｐ１プロテアーゼは、配列番号６６〜８１、配列番号５３８より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号６６〜８１、配列番号５３８より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【００８０】
一部の実施態様において、ｔｓｐ１はＴリーゼイ  ｔｓｐ１である。Ｔリーゼイ  ｔｓｐ１によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号６６に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号６６と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号６６と１００%の同一性を有する。
【００８１】
スブチリシンプロテアーゼ
スブチリシンプロテアーゼは、スブチリシンのものと類似の基質特異性を伴う酵素である。スブチリシンプロテアーゼは、ポリペプチド及びタンパク質中のペプチド結合の加水分解のためにセリン残基を使用する。一般的に、スブチリシンプロテアーゼは、３つのアミノ酸（アスパラギン酸、ヒスチジン、及びセリン）の触媒トライアドを含むセリンプロテアーゼである。これらの触媒残基の配置は、バチルス・リケニホルミスからのプロトタイプスブチリシンと共有される。真核生物（例えばトリコデルマ菌など）からのスブチリシンプロテアーゼは、フリン、ＭＢＴＰＳ１、及びＴＰＰ２を含む。真核生物のトリプシン様セリンプロテアーゼは、さらに、オキシアニオンホール中にアスパラギン酸残基を含む。スブチリシンプロテアーゼｓｌｐ７は、また、セドリシンプロテアーゼｔｐｐ１に似ている。
【００８２】
７つのスブチリシンプロテアーゼが、トリコデルマ菌細胞において同定されている：ｓｌｐ１（ｔｒｅ５１３６５）；ｓｌｐ２（ｔｒｅ１２３２４４）；ｓｌｐ３（ｔｒｅ１２３２３４）；ｓｌｐ５（ｔｒｅ６４７１９）、ｓｌｐ６（ｔｒｅ１２１４９５）、ｓｌｐ７（ｔｒｅ１２３８６５）、及びｓｌｐ８（ｔｒｅ５８６９８）。
【００８３】
Ｓｌｐ１
適したｓｌｐ１プロテアーゼの例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｓｌｐ１（配列番号８２）、トリコデルマ・アトロビリデ  ｊｇｉ｜Ｔｒｉａｔ２（配列番号８３）、トリコデルマ・アトロビリデ  ｊｇｉ｜Ｔｒｉａｔ２（配列番号８４）、トリコデルマ・ビレンス  ｊｇｉ｜ＴｒｉｖｉＧｖ２９＿８＿２（配列番号８５）、ヒポクレア・リクシイ  ｇｉ｜１４５５８３５８１（配列番号８６）、メタリジウム・アクリダム  ｇｉ｜３２２６９４６３２（配列番号８７）、フザリウム・オキシスポラム  ｇｉ｜３４２８７７０８０（配列番号８８）、ジベレラ・ゼアエ  ｇｉ｜４６１３９９１５（配列番号８９）、エピクロエ・フェスツカエ（Ｅｐｉｃｈｌｏｅ  ｆｅｓｔｕｃａｅ）  ｇｉ｜１７０６７４４７６（配列番号９０）、ネクトリア・ハエマトコカ  ｇｉ｜３０２８９３１６４（配列番号９１）、ソルダリア・マクロスポア（Ｓｏｒｄａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒｅ）  ｇｉ｜３３６２６６１５０（配列番号９２）、グロメレラ・グラミニコラ  ｇｉ｜３１０７９７９４７（配列番号９３）、ニューロスポラ・テトラスペルマ  ｇｉ｜３３６４６９８０５（配列番号９４）、ニューロスポラ・クラッサ  ｇｉ｜８５０８６７０７（配列番号９５）、マグナポルテ・オリゼ  ｇｉ｜１４５６０８９９７（配列番号９６）、カエトミウム・グロボスム  ｇｉ｜１１６２０８７３０（配列番号９７）、Ｍサーモフィラ  ｇｉ３６７０２９０８１（配列番号５３９）、及びそれらのホモログを含む。
【００８４】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼ、典型的には、ｓｌｐ１プロテアーゼは、配列番号８２〜９７、配列番号５３９より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号８２〜９７、配列番号５３９より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【００８５】
一部の実施態様において、ｓｌｐ１はＴリーゼイ  ｓｌｐ１である。Ｔリーゼイ  ｓｌｐ１によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号８２に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号８２と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号８２と１００%の同一性を有する。
【００８６】
Ｓｌｐ２
適したｓｌｐ２プロテアーゼの例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｓｌｐ２（配列番号９８）、Ｔアトロビリデ  ｊｇｉ｜Ｔｒｉａｔ２（配列番号９９）、Ｔビレンス  ｊｇｉ｜ＴｒｉｖｉＧｖ２９＿８＿２（配列番号１００）、ヒポクレア・リクシイ  ｇｉ｜１１５１１１２２６（配列番号１０１）、アスペルギルス・フミガーツス  ｇｉ｜７０９９７９７２（配列番号１０２）、ネクトリア・ハエマトコカ  ｇｉ｜３０２９１５２４０（配列番号１０３）、ジベレラ・ゼアエ  ｇｉ｜４６１０５１２８（配列番号１０４）、イサリア・ファリノース（Ｉｓａｒｉａ  ｆａｒｉｎｏｓｅ）  ｇｉ｜６８１６５０００（配列番号１０５）、グロメレラ・グラミニコラ  ｇｉ｜３１０７９７８５４（配列番号１０６）、エピクロエ・フェスツカエ（Ｅｐｉｃｈｌｏｅ  ｆｅｓｔｕｃａｅ）  ｇｉ｜１７０６７４４９１（配列番号１０７）、メタリジウム・アクリダム  ｇｉ｜３２２６９７７５４（配列番号１０８）、アクレモニウム属  Ｆ１１１７７  ｇｉ｜１４７２２５２５４（配列番号１０９）、オフィオストマ・ピリフェルム  ｇｉ｜１５８０８８０７（配列番号１１０）、ニューロスポラ・テトラスペルマ  ｇｉ｜３３６４６３６４９（配列番号１１１）、カエトミウム・サーモフィラム  ｇｉ｜３４０９９２６００（配列番号１１２）、メタリジウム・フラボリリデ  ｇｉ｜２５４３５１２６５（配列番号１１３）、ポドスポラ・アンセリン  ｇｉ｜１７１６８０１１１（配列番号１１４）、マグナポルテ・オリゼｇｉ｜３９９４３１８０（配列番号１１５）、スクレロチニア・スクレロチオラム  ｇｉ｜１５６０５８５４０（配列番号１１６）、タラロマイセス・スティピタタス  ｇｉ｜２４２７９０４４１（配列番号１１７）、Ｍサーモフィラ  ｇｉ３６７０２１４７２（配列番号５４０）、Ａニガー  ｇｉ１４５２３７６４６（配列番号５４１）、Ａオリゼ  ｇｉ１６９７８０７１２（配列番号５４２）、Ｐクリソゲヌム  ｇｉ２５５９５５８８９（配列番号５４３）、Ａニデュランス  ｇｉ２５９４８９５４４（配列番号５４４）、Ｎクラッサ  ｇｉ８５０８４８４１（配列番号５４５）、及びそれらのホモログを含む。
【００８７】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼ、典型的には、ｓｌｐ２プロテアーゼは、配列番号９８〜１１７、配列番号５４０〜５４５より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号９８〜１１７、配列番号５４０〜５４５より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【００８８】
一部の実施態様において、ｓｌｐ２はＴリーゼイ  ｓｌｐ２である。Ｔリーゼイ  ｓｌｐ２によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号９８に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号９８と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号９８と１００%の同一性を有する。
【００８９】
Ｓｌｐ３
適したｓｌｐ３プロテアーゼの例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｓｌｐ２（配列番号１６６）、Ｔアトロビリデ  ｊｇｉ｜Ｔｒｉａｔ２（配列番号１６７）、Ｔビレンス  ｊｇｉ｜ＴｒｉｖｉＧｖ２９＿８＿２（配列番号１６８）、ヒポクレア・コニンギ  ｇｉ｜１２４２９５０７１（配列番号１６９）、プルプレオシリウム・リラシナム（Ｐｕｒｐｕｒｅｏｃｉｌｌｉｕｍ  ｌｉｌａｃｉｎｕｍ）  ｇｉ｜１３０７５０１６４（配列番号１７０）、メタリジウム・アニソプリエ  ｇｉ｜１６２１５６７７（配列番号１７１）、ヒルステラ・ロシリエンシス（Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ  ｒｈｏｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）  ｇｉ｜９０６５５１４８（配列番号１７２）、トリポクラジウム・インファタムｇｉ｜１８５４２４２９（配列番号１７３）、メタコルディセプス・クラミドスポリア（Ｍｅｔａｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａ）  ｇｉ｜１９１７１２１５（配列番号１７４）、コルジセプス・ミリタリス  ｇｉ｜３４６３２１３６８（配列番号１７５）、フザリウム属ｇｉ｜６２８０５１（配列番号１７６）、ニューロスポラ・テトラスペルマ  ｇｉ｜３３６４７１８８１（配列番号１７７）、カエトミウム・グロボスム  ｇｉ｜１１６１９７４０３（配列番号１７８）、ニューロスポラ・クラッサ  ｇｉ｜８５０８４８４１（配列番号１７９）、フザリウム・オキシスポラム  ｇｉ｜５６２０１２６５（配列番号１８０）、ジベレラ・ゼアエ  ｇｉ｜４６１１４２６８（配列番号１８１）、Ｍサーモフィラ  ｇｉ３６７０２６２５９（配列番号５４６）、Ａニデュランス  ｇｉ６７５３８７７６（配列番号５４７）、Ａオリゼ  ｇｉ１６９７７１３４９（配列番号２２２）、Ａニガー  ｇｉ４７０７２９（配列番号２２３）、及びそれらのホモログを含む。
【００９０】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼ、典型的には、ｓｌｐ３プロテアーゼは、配列番号１６６〜１８１、配列番号５４６〜５４７、配列番号２２２〜２２３より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号１６６〜１８１、配列番号５４６〜５４７、配列番号２２２〜２２３より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【００９１】
一部の実施態様において、ｓｌｐ３はＴリーゼイ  ｓｌｐ３である。Ｔリーゼイ  ｓｌｐ３によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号１６６に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号１６６と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号１６６と１００%の同一性を有する。
【００９２】
Ｓｌｐ５
適したｓｌｐ５プロテアーゼの例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｓｌｐ５（配列番号２００）、Ｔアトロビリデ  ｊｇｉ｜Ｔｒｉａｔ２（配列番号２０１）、Ｔビレンス  ｊｇｉ｜ＴｒｉｖｉＧｖ２９＿８＿２（配列番号２０２）、ヒポクレア・リクシイ  ｇｉ｜１１８１６１４４２（配列番号２０３）、フザリウム・オキシスポラム  ｇｉ｜３４２８８３５４９（配列番号２０４）、ジベレラ・ゼアエ  ｇｉ｜４６１３５７３３（配列番号２０５）、グロメレラ・グラミニコラ  ｇｉ｜３１０７９６３９６（配列番号２０６）、ネクトリア・ハエマトコカ  ｇｉ｜３０２９２７９５４（配列番号２０７）、コルジセプス・ミリタリス  ｇｉ｜３４６３１９７８３（配列番号２０８）、ニューロスポラ・クラッサ  ｇｉ｜８５０９４０８４（配列番号２０９）、ニューロスポラ・テトラスペルマ  ｇｉ｜３３６４６７２８１（配列番号２１０）、ベルチシリウム・ダヒリアエｇｉ｜３４６９７１７０６（配列番号２１１）、チエラビア・テレストリス  ｇｉ｜３４７００１４１８（配列番号２１２）、マグナポルテ・オリゼ  ｇｉ｜１４５６０５４９３（配列番号２１３）、Ｍサーモフィラ  ｇｉ３６７０３２２００（配列番号５４８）、Ｐクリソゲヌムｇｉ６２８１６２８２（配列番号５４９）、及びそれらのホモログを含む。
【００９３】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼ、典型的には、ｓｌｐ５プロテアーゼは、配列番号２００〜２１３、配列番号５４８〜５４９より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号２００〜２１３、配列番号５４８〜５４９より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【００９４】
一部の実施態様において、ｓｌｐ５はＴリーゼイ  ｓｌｐ５である。Ｔリーゼイ  ｓｌｐ５によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号２００に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号２００と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号２００と１００%の同一性を有する。
【００９５】
Ｓｌｐ６
適したｓｌｐ６プロテアーゼの例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｓｌｐ６（配列番号２１４）、Ｔアトロビリデ  ｊｇｉ｜Ｔｒｉａｔ２（配列番号２１５）、Ｔビレンス  ｊｇｉ｜ＴｒｉｖｉＧｖ２９＿８＿２（配列番号２１６）、ヒポクレア・ビレンス  ｇｉ｜２９４２１４２３（配列番号２１７）、ヒポクレア・リクシイ  ｇｉ｜１４５５８３１２７（配列番号２１８）、トリコデルマ・ハマタム  ｇｉ｜３０１４４６４３（配列番号２１９）、アスペルギルス・フミガーツス  ｇｉ｜２２９５（配列番号２２０）、アスペルギルス・テレウス  ｇｉ｜１１５３９１１４７（配列番号２２１）、アスペルギルス・オリゼ  ｇｉ｜１６９７７１３４９（配列番号２２２）、アスペルギルス・ニガー  ｇｉ｜４７０７２９（配列番号２２３）、グロメレラ・グラミニコラ  ｇｉ｜３１０７９４７１４（配列番号２２４）、ジベレラ・ゼアエ  ｇｉ｜４６１１４９４６（配列番号２２５）、フザリウム・オキシスポラム  ｇｉ｜３４２８７３９４２（配列番号２２６）、ネクトリア・ハエマトコカ  ｇｉ｜３０２８８４５４１（配列番号２２７）、ネオサルトリア・フィシェリ  ｇｉ｜１１９５００１９０（配列番号２２８）、ベルチシリウム・アルボアトルム  ｇｉ｜３０２４１３１６１（配列番号２２９）、グロメレラ・グラミニコラ  ｇｉ｜３１０７９０１４４（配列番号２３０）、Ｎクラッサ  ｇｉ８５０９００２０（配列番号５５０）、及びそれらのホモログを含む。
【００９６】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼ、典型的には、ｓｌｐ６プロテアーゼは、配列番号２１４〜２３０、配列番号５５０より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号２１４〜２３０、配列番号５５０より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【００９７】
一部の実施態様において、ｓｌｐ６はＴリーゼイ  ｓｌｐ６である。Ｔリーゼイ  ｓｌｐ６によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号２１４に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号２１４と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号２１４と１００%の同一性を有する。
【００９８】
Ｓｌｐ７
適したｓｌｐ７プロテアーゼの例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｓｌｐ７（配列番号２３１）、Ｔアトロビリデ  ｊｇｉ｜Ｔｒｉａｔ２（配列番号２３２）、Ｔビレンス  ｊｇｉ｜ＴｒｉｖｉＧｖ２９＿８＿２（配列番号２３３）、メタリジウム・アニソプリエ  ｇｉ｜３２２７１０３２０（配列番号２３４）、ネクトリア・ハエマトコカ  ｇｉ｜３０２９１５０００（配列番号２３５）、マイセリオフトラ・サーモフィラ  ｇｉ｜３４７００９０２０，  ｇｉ３６７０２４９３５（配列番号２３６）、ジベレラ・ゼアエ  ｇｉ｜４６１３７６５５（配列番号２３７）、チエラビア・テレストリス  ｇｉ｜３４６９９６５４９（配列番号２３８）、マグナポルテ・オリゼ  ｇｉ｜１４５６１０７３３（配列番号２３９）、Ａニデュランスｇｉ６７５４１９９１（配列番号５５１）、Ｐクリソゲヌム  ｇｉ２５５９３３７８６（配列番号５５２）、Ａニガー  ｇｉ３１７０３６５４３（配列番号５５３）、Ａオリゼ  ｇｉ１６９７８２８８２（配列番号５５４）、Ｎクラッサ  ｇｉ８５１０９９７９（配列番号５５５）、及びそれらのホモログを含む。
【００９９】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼ、典型的には、ｓｌｐ７プロテアーゼは、配列番号２３１〜２３９、配列番号５５１〜５５５より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号２３１〜２３９、配列番号５５１〜５５５より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【０１００】
一部の実施態様において、ｓｌｐ７はＴリーゼイ  ｓｌｐ７である。Ｔリーゼイ  ｓｌｐ７によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号２３１に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号２３１と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号２３１と１００%の同一性を有する。
【０１０１】
Ｓｌｐ８
適したｓｌｐ８プロテアーゼの例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｓｌｐ８（配列番号２４０）、Ｔアトロビリデ  ｊｇｉ｜Ｔｒｉａｔ２｜１９８５６８（配列番号２４１）、Ｔビレンス  ｊｇｉ｜ＴｒｉｖｉＧｖ２９＿８＿２｜３３９０２（配列番号２４２）、及びそれらのホモログを含む。
【０１０２】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号２４０〜２４２より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号２４０〜２４２より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【０１０３】
一部の実施態様において、ｓｌｐ８はＴリーゼイ  ｓｌｐ８である。Ｔリーゼイ  ｓｌｐ８によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号２４０に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号２４０と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号２４０と１００%の同一性を有する。
【０１０４】
グルタミン酸プロテアーゼ
グルタミン酸プロテアーゼは、ポリペプチド及びタンパク質中のペプチド結合を加水分解する酵素である。グルタミン酸プロテアーゼは、ペプスタチンＡに非感受性であり、そのため、時折、ペプスタチン非感受性酸性プロテアーゼとして言及される。グルタミン酸プロテアーゼは、以前に、アスパラギン酸プロテアーゼとグループ化され、しばしば、酸性プロテアーゼとして一緒に言及されたが、グルタミン酸プロテアーゼは、アスパラギン酸プロテアーゼとは非常に異なる活性部位残基を有することが最近見出されている。
【０１０５】
２つグルタミン酸プロテアーゼが、トリコデルマ菌細胞において同定されている：ｇａｐ１（ｔｒｅ６９５５５）及びｇａｐ２（ｔｒｅ１０６６６１）。
【０１０６】
Ｇａｐ１
適したｇａｐ１プロテアーゼの例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｇａｐ１（配列番号１１８）、Ｔアトロビリデ  ｊｇｉ｜Ｔｒｉａｔ２｜４０８６３（配列番号１１９）、Ｔビレンス  ｊｇｉ｜ＴｒｉｖｉＧｖ２９＿８＿２｜１９２６８４（配列番号１２０）、アスペルギルス・フラバス  ｇｉ｜２３８４９９１８３（配列番号１２１）、アスペルギルス・ニガー  ｇｉ｜１４５２５１５５５（配列番号１２２）、アスペルギルス・テレウス  ｇｉ｜１１５４９１５２１（配列番号１２３）、ｇｉ｜３７１５４５４３（配列番号１２４）、ｇｉ｜４８４２５５３１（配列番号１２５）、ｇｉ｜３５１８７３（配列番号１２６）、チエラビア・テレストリス  ｇｉ｜３４６９９７２４５（配列番号１２７）、ペニシリウム・クリソゲナム  ｇｉ｜２５５９４０５８６（配列番号１２８）、Ｍサーモフィラ  ｇｉ３６７０２６５０４（配列番号５７４）、Ａオリゼ  ｇｉ３１７１５０８８６（配列番号５７５）、Ｎクラッサ  ｇｉ８５０９７９６８（配列番号５７６）、Ａニガー  ｇｉ１３１０５６（配列番号５７７）、Ｐクリソゲヌム  ｇｉ２５５９３０１２３（配列番号５７８）、Ａニガー  ｇｉ１４５２３６９５６（配列番号５７９）、Ａオリゼ  ｇｉ１６９７７２９５５（配列番号５８０）、Ａニガー  ｇｉ１４５２４９２２２（配列番号５８１）、Ａニデュランス  ｇｉ６７５２５８３９（配列番号５８２）、Ａオリゼ  ｇｉ１６９７８５３６７（配列番号５８３）、Ｐクリソゲヌム  ｇｉ２５５９５５３１９（配列番号５８４）、Ｍサーモフィラ  ｇｉ３６７０１９３５２（配列番号５８５）、Ａオリゼ  ｇｉ３９１８６３９７４（配列番号５８６）、Ｍサーモフィラ  ｇｉ３６７０２４５１３（配列番号５８７）、及びそれらのホモログを含む。
【０１０７】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼ、典型的には、ｇａｐ１プロテアーゼは、配列番号１１８〜１２８、配列番号５７４〜５８７より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号１１８〜１２８、配列番号５７４〜５８７より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【０１０８】
一部の実施態様において、ｇａｐ１はＴリーゼイ  ｇａｐ１である。Ｔリーゼイ  ｇａｐ１によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号１１８に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号１１８と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号１１８と１００%の同一性を有する。
【０１０９】
Ｇａｐ２
適したｇａｐ２プロテアーゼの例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｇａｐ２（配列番号１２９）、Ｔアトロビリデ  ｊｇｉ｜Ｔｒｉａｔ２｜２９８１１６（配列番号１３０）、Ｔビレンス  ｊｇｉ｜ＴｒｉｖｉＧｖ２９＿８＿２｜３０３３１（配列番号１３１）、ｊｇｉ｜ＴｒｉｖｉＧｖ２９＿８＿２｜２２５１３１（配列番号１３２）、アスペルギルス・フラバス  ｇｉ｜２３８４９９１８３（配列番号１３３）、アスペルギルス・ニガー  ｇｉ｜１４５２５１５５５（配列番号１３４）、アスペルギルス・ニジュランス  ｇｉ｜６７９０１０５６（配列番号１３５）、アスペルギルス・クラバタス  ｇｉ｜１２１７１１９９０（配列番号１３６）、アスペルギルス・フミガーツス  ｇｉ｜７０９８６２５０（配列番号１３７）、ペニシリウム・マルネッフェイ  ｇｉ｜２１２５３４１０８（配列番号１３８）、タラロマイセス・スティピタタス  ｇｉ｜２４２７８９３３５（配列番号１３９）、グロスマンニア・クラビゲラ  ｇｉ｜３２０５９１５２９（配列番号１４０）、ネオサルトリア・フィシェリ  ｇｉ｜１１９４７４２８１（配列番号１４１）、ペニシリウム・マルネッフェイ  ｇｉ｜２１２５２７２７４（配列番号１４２）、ペニシリウム・クリソゲナム  ｇｉ｜２５５９４０５８６（配列番号１４３）、ｇｉ｜１３１０５６（配列番号１４４）、Ｍサーモフィラ  ｇｉ３６７０３０２７５（配列番号５８８）、及びそれらのホモログを含む。
【０１１０】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼ、典型的には、ｇａｐ２プロテアーゼは、配列番号１２９〜１４４、配列番号５８８より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号１２９〜１４４、配列番号５８８より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【０１１１】
一部の実施態様において、ｇａｐ２はＴリーゼイ  ｇａｐ２である。Ｔリーゼイ  ｇａｐ２によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号１２９に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号１２９と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号１２９と１００%の同一性を有する。
【０１１２】
セドリシンプロテアーゼ
セドリシンプロテアーゼは、ポリペプチド及びタンパク質中のペプチド結合の加水分解のためにセリン残基を使用する酵素である。セドリシンプロテアーゼは、一般的に、セリン、グルタミン酸、及びアスパラギン酸の固有の触媒トライアドを含む。セドリシンプロテアーゼは、また、オキシアニオンホール中にアスパラギン残基を含む。真核生物（例えばトリコデルマ菌など）からのセドリシンプロテアーゼは、トリペプチジルペプチダーゼを含む。
【０１１３】
適したｔｐｐ１プロテアーゼの例は、限定を伴わず、トリコデルマ・リーゼイｔｐｐ１（配列番号１４５）、Ｔアトロビリデ  ｊｇｉ｜Ｔｒｉａｔ２｜１８８７５６（配列番号１４６）、Ｔビレンス  ｊｇｉ｜ＴｒｉｖｉＧｖ２９＿８＿２｜２１７１７６（配列番号１４７）、アスペルギルス・フミガーツス  ｇｉ｜７０９９３１６８（配列番号１４８）、アスペルギルス・オリゼ  ｇｉ｜１６９７７６８００（配列番号１４９）、アスペルギルス・ニガー  ｇｉ｜１４５２３６３９９（配列番号１５０）、アスペルギルス・クラバタス  ｇｉ｜１２１７０８７９９（配列番号１５１）、アスペルギルス・ニガー  ｇｉ｜１４５２３９８７１（配列番号１５２）、アスペルギルス・クラバタス  ｇｉ｜１２１７１４５４１（配列番号１５３）、アスペルギルス・テレウス  ｇｉ｜１１５３８７６４５（配列番号１５４）、アスペルギルス・フミガーツス  ｇｉ｜７０９８２０１５（配列番号１５５）、スクレロチニア・スクレロチオラム  ｇｉ｜１５６０４５８９８（配列番号１５６）、ボトリオチニア・フケリアナ  ｇｉ｜１５４３２１７５８（配列番号１５７）、ネオサルトリア・フィシェリ  ｇｉ｜１１９４９９７７４（配列番号１５８）、タラロマイセス  ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ  ｇｉ｜２４２７９８３４８（配列番号１５９）、ペニシリウム・マルネッフェイ  ｇｉ｜２１２５４１５４６（配列番号１６０）、ジベレラ・ゼアエ  ｇｉ｜４６１１４４６０（配列番号１６１）、フザリウム・オキシスポラム  ｇｉ｜３４２８９０６９４（配列番号１６２）、グロスマンニア・クラビゲラ（Ｇｒｏｓｍａｎｎｉａ  ｃｌａｖｉｇｅｒａ）  ｇｉ｜３２０５９２９３７（配列番号１６３）、ベルチシリウム・アルボアトルム  ｇｉ｜３０２４０６１８６（配列番号１６４）、ベルチシリウム・ダヒリアエｇｉ｜３４６９７１４４４（配列番号１６５）、Ａフミガタス  ＣＡＥ５１０７５．１（配列番号５５６）、Ａオリゼ  ＸＰ＿００１８２０８３５．１（配列番号５５７）、Ｐクリソゲヌム  ＸＰ＿００２５６４０２９．１（配列番号５５８）、Ａニデュランス  ＸＰ＿６６４８０５．１（配列番号５５９）、Ｐクリソゲヌム  ＸＰ＿００２５６５８１４．１（配列番号５６０）、Ｍサーモフィラ  ＸＰ＿００３６６３６８９．１（配列番号５６１）、Ｎクラッサ  ＸＰ＿９５８４１２．１（配列番号５６２）、Ａニガー  ＸＰ＿００１３９４１１８．１（配列番号５６３）、Ａフミガタス  ＣＡＥ１７６７４．１（配列番号５６４）、Ａニガー  ＸＰ＿００１４００８７３．１（配列番号５６５）、Ａフミガタス  ＣＡＥ４６４７３．１（配列番号５６６）、Ａオリゼ  ＸＰ＿００２３７３５３０．１（配列番号５６７）、Ａニデュランス  ＸＰ＿６６０６２４．１（配列番号５６８）、Ｐクリソゲヌム  ＸＰ＿００２５６２９４３．１（配列番号５６９）、Ａフミガタス  ＣＡＥ１７６７５．１（配列番号５７０）、Ａフミガタス  ＥＡＬ８６８５０．２（配列番号５７１）、Ｎクラッサ  ＸＰ＿９６１９５７．１（配列番号５７２）、Ａオリゼ  ＢＡＢ９７３８７．１（配列番号５７３）、及びそれらのホモログを含む。
【０１１４】
したがって、特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼ、典型的には、ｔｐｐ１プロテアーゼは、配列番号１４５〜１６５、配列番号５５６〜５７３より選択されるアミノ酸配列と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。一部の実施態様において、プロテアーゼは、配列番号１４５〜１６５、配列番号５５６〜５７３より選択されるアミノ酸配列と１００%の同一性を有する。
【０１１５】
一部の実施態様において、ｔｐｐ１はＴリーゼイ  ｔｐｐ１である。Ｔリーゼイ  ｔｐｐ１によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号１４５に示す。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼは、配列番号１４５と５０%以上の同一性（例えば、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、９９．５%以上）を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施態様において、プロテアーゼは配列番号１４５と１００%の同一性を有する。
【０１１６】
相同プロテアーゼ
本開示の他の実施態様は、本開示のプロテアーゼに相同であるプロテアーゼの活性を低下させることに関する。本明細書において使用する「相同性」は、参照配列と第２配列の少なくともフラグメントの間での配列類似性を指す。ホモログは、当技術分野において公知の任意の方法により、好ましくは、参照配列を、配列の単一の第２配列もしくはフラグメントと又は配列のデータベースと比較するためのＢＬＡＳＴツールを使用することにより同定しうる。下に記載の通り、ＢＬＡＳＴでは、パーセント同一性及び類似性に基づいて配列を比較する。
【０１１７】
用語「同一の」又はパーセント「同一性」は、２つ以上の核酸又はアミノ酸配列の文脈において、同じである２つ以上の配列又はサブ配列を指す。２つの配列は、比較ウィンドウ、又は以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して又は手動アラインメント及び目視検査により測定された通りの指定領域にわたる最大一致について比較及び整列化した場合、２つの配列が同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する場合、「実質的に同一」である（即ち、特定の領域にわたり、又は、特定されない場合、全体配列にわたり、２９%の同一性、場合により３０%、４０%、４５%、５０%、５５%、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、９９%、又は１００%の同一性）。場合により、同一性が、少なくとも約５０ヌクレオチド（又は１０アミノ酸）の長さである領域にわたり、あるいは１００〜５００もしくは１０００以上のヌクレオチド（又は２０、５０、２００、もしくはそれ以上のアミノ酸）の長さである領域にわたり存在する。
【０１１８】
配列比較のために、典型的には、１つの配列が参照配列として作用し、それと、テスト配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、テスト配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要である場合、サブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用することができる、又は、代替パラメータを指定することができる。配列比較アルゴリズムは、次に、プログラムパラメータに基づき、参照配列と比べたテスト配列についてのパーセント配列同一性を算出する。２つの配列を同一性について比較する場合、配列が連続的である必要はないが、しかし、任意のギャップが、全体的なパーセント同一性を低下させうるペナルティを保有しうる。ｂｌａｓｔｎについて、デフォルトパラメータは、Ｇａｐオープニングペナルティ＝５及びＧａｐエクステンションペナルティ＝２である。ｂｌａｓｔｐについて、デフォルトパラメータは、Ｇａｐオープニングペナルティ＝１１及びＧａｐエクステンションペナルティ＝１である。
【０１１９】
「比較ウィンドウ」は、本明細書において使用する通り、しかし、限定しないが、２０〜６００、通常は、約５０〜約２００、より通常は、約１００〜約１５０を含む、連続位置の数の任意の１つのセグメントへの参照を含み、それにおいて、配列は、２つの配列を最適に整列化した後、連続位置の同じ数の参照配列と比較されうる。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントを、例えば、Smith and Waterman (1981)の局所ホモロジーアルゴリズムにより、Needleman and Wunsch (1970) J Mol Biol 48(3):443-453のホモロジーアラインメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(8): 2444-2448の類似性方法についての検索により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）、又は手動アラインメント及び目視検査により［例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(Ringbou Ed)を参照のこと］行うことができる。
【０１２０】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するために適しているアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、それらは、Altschul et al.(1997) Nucleic Acids Res 25(17): 3389-3402及びAltschul et al.(1990) J. Mol Biol 215(3)-403-410においてそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアが、National Center for Biotechnology Informationを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を同定することを含み、それは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合、特定の正の値の閾値スコアＴと一致する又は満たす。Ｔは、近隣ワードスコア閾値として言及される（Altschul et al.、上記を参照）。これらの初期の近隣ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各々の配列に沿って両方向に伸張される。累積スコアを、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（マッチ残基の対についての報酬スコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用し、累積スコアを算出する。各々の方向におけるワードヒットの伸張は、以下の場合に停止している：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ下落する；累積スコアが、１つ以上の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積に起因して、ゼロ以下に行く；あるいは、いずれかの配列の末端に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及びスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）では、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムでは、デフォルトとして、３のワード長、１０の期待値（Ｅ）、及びBLOSUM62スコアリングマトリクス［Henikoff and Henikoff, (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89(22): 10915-10919を参照のこと］、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較を使用する。
【０１２１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、また、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば、Karlin and Altschul, (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90(12): 5873-5877を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの測定値は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、それは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に生じうる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸へのテスト核酸の比較における最小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列に類似すると考えられる。
【０１２２】
上に記述する配列同一性のパーセンテージ以外で、２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であるという別の指標は、下に記載の通り、第１核酸によりコードされるポリペプチドが、第２核酸によりコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応性であることである。このように、ポリペプチドは、実質的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換だけにより異なる場合、第２ポリペプチドと典型的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、下に記載の通り、２つの分子又はそれらの相補体が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるというさらに別の指標は、同じプライマーを使用して、その配列を増幅することができることである。
【０１２３】
本明細書において開示する通り、本発明のプロテアーゼは、また、上に開示したプロテアーゼ遺伝子によりコードされるプロテアーゼの保存的に改変された変異体であるプロテアーゼを含みうる。「保存的に改変された変異体」は、本明細書において使用する通り、コードされたアミノ酸配列への個々の置換、欠失、又は付加を含み、それらは、化学的に類似のアミノ酸を用いたアミノ酸の置換をもたらす。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表が、当技術分野において周知である。そのような保存的に改変された変異体は、本開示の多型変異体、種間ホモログ、及び対立遺伝子への付加であり、これらを除外しない。以下の８つのグループが、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照のこと）。
【０１２４】
図４５〜４８は、選択された糸状菌のアスパラギン酸、スブチリシン、グルタミン酸、及びセドリシンプロテアーゼの系統樹を描写する。
【０１２５】
本発明のプロテアーゼの活性を低下させる方法
本開示のさらなる態様は、異種ポリペプチド（例えば哺乳動物ポリペプチドなど）を発現する糸状菌細胞において見出されたプロテアーゼの活性を低下することに関する。
【０１２６】
糸状菌細胞において見出されたプロテアーゼの活性は、当業者に公知の任意の方法により低下することができる。
【０１２７】
一部の実施態様において、プロテアーゼの活性の低下は、例えば、プロモーター改変又はＲＮＡｉにより、プロテアーゼの発現を低下させることにより達成される。
【０１２８】
他の実施態様において、プロテアーゼの活性の低下は、プロテアーゼをコードする遺伝子を改変することにより達成される。そのような改変の例は、限定を伴わず、ノックアウト変異、切断変異、点変異、ミスセンス変異、置換変異、フレームシフト変異、挿入変異、重複変異、増幅変異、転座変異、又は逆位変異を含み、それは対応するプロテアーゼ活性における低下をもたらす。目的のプロテアーゼコード遺伝子における少なくとも１つの変異を生成する方法が、当技術分野において周知であり、限定を伴わず、ランダム変異誘発及びスクリーニング、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、挿入変異誘発、化学的変異誘発、及び照射を含む。
【０１２９】
特定の実施態様において、プロテアーゼコード遺伝子の部分を改変する（例えば触媒ドメインをコードする領域、コード領域、又はコード領域の発現のために要求される制御配列など）。遺伝子のそのような制御配列は、プロモーター配列又はその機能的部分、即ち、遺伝子の発現に影響を及ぼすために十分である部分でありうる。例えば、プロモーター配列が不活性化され、無発現をもたらしうる、又は、より弱いプロモーターを、天然プロモーター配列について置換し、コード配列の発現を低下させうる。可能な改変のための他の制御配列は、限定を伴わず、リーダー配列、プロペプチド配列、シグナル配列、転写ターミネーター、及び転写アクチベータを含む。
【０１３０】
組換えポリペプチドを発現する糸状菌細胞中に存在する本開示のプロテアーゼコード遺伝子は、また、遺伝子の発現を排除又は低下するための遺伝子欠失技術を利用することにより改変してもよい。遺伝子欠失技術は、遺伝子の部分的又は完全な除去を可能にし、それにより、それらの発現を排除する。そのような方法において、遺伝子の欠失は、その遺伝子に隣接する５’及び３’領域を連続的に含むように構築されたプラスミドを使用した相同組換えにより達成されうる。
【０１３１】
組換えポリペプチドを発現する糸状菌細胞中に存在する本開示のプロテアーゼコード遺伝子を、また、その遺伝子、あるいは遺伝子の転写又は翻訳のために要求されるその制御配列において１つ以上のヌクレオチドを導入、置換、及び／又は除去することにより改変してもよい。例えば、ヌクレオチドを、停止コドンの導入、開始コドンの除去、又はオープンリーディングフレームのフレームシフトのために、挿入又は除去してもよい。そのような改変は、当技術分野において公知の方法（限定を伴わず、部位特異的変異誘発及びｐｅＲ生成された変異誘発を含む）により達成されうる（例えば、Botstein and Shortie, 1985, Science 229: 4719;Lo et al., 1985, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 2285；Higuchi et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 7351；Shimada, 1996, Meth. Mol. Bioi. 57: 157; Ho et al., 1989, Gene 77: 61；Horton et al., 1989, Gene 77: 61；及びSarkar and Sommer, 1990, BioTechniques 8: 404を参照のこと）。
【０１３２】
加えて、組換えポリペプチドを発現する糸状菌細胞中に存在する本開示のプロテアーゼをコードする遺伝子を、遺伝子破壊技術により、遺伝子中に、相同性の領域の重複を作製し、重複領域間にコンストラクトＤＮＡを組み込む、その遺伝子に相同な核酸フラグメントを含む破壊的な核酸コンストラクトを挿入することにより改変してもよい。そのような遺伝子破壊が、挿入されたコンストラクトが、その遺伝子のプロモーターをコード領域から分離する又はコード配列を遮断し、非機能的な遺伝子産物がもたらされる場合、遺伝子発現を排除することができる。破壊コンストラクトは、単純に、遺伝子に相同な５’及び３’領域により伴われた選択可能なマーカー遺伝子でありうる。選択可能なマーカーは、破壊された遺伝子を含む形質転換体の同定を可能にする。
【０１３３】
組換えポリペプチドを発現する糸状菌細胞中に存在する本開示のプロテアーゼコード遺伝子は、また、遺伝子変換のプロセスにより改変してもよい（例えば、Iglesias and Trautner, 1983, Molecular General Genetics 189: 5 73-76を参照のこと）。例えば、遺伝子変換において、遺伝子に対応するヌクレオチド配列を、インビトロで変異誘発し、欠陥ヌクレオチド配列を産生し、それを、次に、トリコデルマ株中に形質転換し、欠陥遺伝子を産生する。相同組換えにより、欠陥ヌクレオチド配列は、内在性遺伝子を置換する。欠陥ヌクレオチド配列は、また、欠陥遺伝子を含む形質転換体の選択のためのマーカーを含むことが望ましいであろう。
【０１３４】
組換えポリペプチドを発現する糸状菌細胞中に存在する本開示のプロテアーゼコード遺伝子は、また、遺伝子のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を使用し、確立されたアンチセンス技術により改変されうる（例えば、Parish and Stoker, 1997, FEMS Microbiology Letters 154: 151-157を参照のこと）。特に、糸状菌細胞による遺伝子の発現は、遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を導入することにより、低下又は不活化されうるが、それは、株において転写されうる、及び、細胞中で産生されたｍＲＮＡにハイブリダイズすることが可能である。相補的なアンチセンスヌクレオチド配列がｍＲＮＡにハイブリダイズすることを許す条件下で、翻訳されたタンパク質の量は、このように、低下又は排除される。
【０１３５】
また、組換えポリペプチドを発現する糸状菌細胞中に存在する本開示のプロテアーゼをコードする遺伝子は、また、確立されたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術により改変されうる（例えば、ＷＯ  ２００５／０５６７７２及びＷＯ  ２００８／０８００１７を参照のこと）。
【０１３６】
組換えポリペプチドを発現する糸状菌細胞中に存在する本開示のプロテアーゼコード遺伝子は、また、当技術分野において周知の方法（限定を伴わず、化学的変異誘発を含む）を使用して、ランダム又は特異的変異誘発により改変されうる（例えば、Hopwood, The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology (J.R. Norris and D.W. Ribbons, eds.) pp.363-433, Academic Press, New York, 25 1970を参照のこと）。遺伝子の改変は、糸状菌細胞を、変異誘発及び遺伝子の発現が低下又は不活化された変異体細胞についてのスクリーニングに供することにより実施されうる。変異誘発は、特異的又はランダムでありうるが、例えば、適した物理的又は化学的変異誘発剤の使用、適したオリゴヌクレオチドの使用、ＤＮＡ配列をｐｅＲ生成変異誘発に供すること、又はそれらの任意の組み合わせにより実施されうる。物理的及び化学的変異誘発剤の例は、限定を伴わず、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ｎｉｔｒｏｓｏｇａｕｎｉｄｉｎｅ）（ＮＴＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸、及びヌクレオチド類似体を含む。そのような薬剤を使用する場合、変異誘発は、典型的には、トリコデルマ細胞をインキュベートし、適した条件下で選んだ変異誘発剤の存在において変異誘発し、次に、遺伝子の発現が低下している又は無発現である変異体について選択することにより実施される。
【０１３７】
特定の実施態様において、本開示のプロテアーゼコード遺伝子における少なくとも１つの変異又は改変は、検出可能なプロテアーゼ活性を有さない改変プロテアーゼをもたらす。他の実施態様において、本開示のプロテアーゼコード遺伝子における少なくとも１つの改変は、対応する非改変プロテアーゼと比較して、少なくとも２５%少ない、少なくとも５０%少ない、少なくとも７５%少ない、少なくとも９０%、少なくとも９５%、少なくとも１００%、少なくとも２００%、少なくとも３００%、少なくとも４００%、少なくとも５００%、少なくとも６００%、少なくとも７００%、少なくとも８００%、少なくとも９００%、少なくとも１，０００%、又はより高いパーセンテージ少ないプロテアーゼ活性を有する改変プロテアーゼをもたらす。
【０１３８】
特定の実施態様において、例えば、トリコデルマ細胞において、本開示のプロテアーゼコード遺伝子における少なくとも１つの変異又は改変が、対応する親トリコデルマ細胞の全プロテアーゼ活性の４９%以下（典型的には少なくとも２つの異なるプロテアーゼ遺伝子における変異を伴う）、又は３１%以下（典型的には少なくとも３つの異なるプロテアーゼ遺伝子における変異を伴う）、又は１３%以下（典型的には少なくとも４つの異なるプロテアーゼ遺伝子における変異を伴う）、又は１０%以下（典型的には少なくとも５つの異なるプロテアーゼ遺伝子に変異を伴う）、又は６．３%以下（典型的には少なくとも６の異なるプロテアーゼ遺伝子に変異を伴う）、又は５．５%以下（典型的には少なくとも７の異なるプロテアーゼ遺伝子に変異を伴う）への全プロテアーゼ活性の低下をもたらす。
【０１３９】
本発明の異種ポリペプチド
本明細書における本発明は、さらに、細胞において見出されるプロテアーゼの活性を低下させることにより、そのような異種ポリペプチドを発現する糸状菌細胞における異種ポリペプチドの産生を増加させることに関する。
【０１４０】
本明細書において使用する通り、「異種ポリペプチド」は、本開示の糸状菌細胞において自然に見出されない（即ち、内在性の）、又は、そのポリペプチドの内在性バージョンと比較して、糸状菌細胞において上昇したレベルで発現されるポリペプチドを指す。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは哺乳動物ポリペプチドである。他の実施態様において、異種ポリペプチドは非哺乳動物ポリペプチドである。
【０１４１】
哺乳動物ポリペプチド
本開示の哺乳動物ポリペプチドは、目的の生物学的活性を有する任意の哺乳動物ポリペプチドでありうる。本明細書において使用する通り、「哺乳動物ポリペプチド」は、哺乳動物において天然に発現されるポリペプチド、哺乳動物において天然に発現されるポリペプチドから由来するポリペプチド、又はそのフラグメントである。哺乳動物ポリペプチドは、また、生物学的活性を保持するペプチド及びオリゴペプチドを含む。本開示の哺乳動物ポリペプチドは、また、組み合わせて、コード産物を形成する２つ以上のポリペプチドを含みうる。本開示の哺乳動物ポリペプチドは、融合ポリペプチドをさらに含むことができ、それは、少なくとも２つの異なるポリペプチドから得られた部分的又は完全アミノ酸配列の組み合わせを含む。哺乳動物ポリペプチドは、また、開示された哺乳動物ポリペプチド及びハイブリッド哺乳動物ポリペプチドのいずれかの自然に生じる対立遺伝子の及び操作されたバリエーションを含みうる。
【０１４２】
哺乳動物ポリペプチドは、天然グリコシル化ポリペプチド又は天然非グリコシル化ポリペプチドでありうる。
【０１４３】
適した哺乳動物ポリペプチドの例は、限定を伴わず、免疫グロブリン、抗体、抗原、抗菌ペプチド、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、サイトカイン、インターロイキン、イムノモジュレーター（ｉｍｍｕｎｏｄｉｌａｔｏｒｓ）、神経伝達物質、受容体、レポータータンパク質、構造タンパク質、及び転写因子を含む。
【０１４４】
適した哺乳動物ポリペプチドの特定の例は、限定を伴わず、免疫グロブリン、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、モノクローナル抗体、ハイブリッド抗体、Ｆ（ａｂ  ’）２抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）抗体フラグメント、Ｆｖ分子、単鎖Ｆｖ抗体、二量体抗体フラグメント、三量体抗体フラグメント、機能的抗体フラグメント、イムノアドヘシン、インスリン様成長因子１、成長ホルモン、インシュリン、インターフェロンα２ｂ、線維芽細胞成長因子２１、ヒト血清アルブミン、ラクダ抗体及び／又は抗体フラグメント、単一ドメイン抗体、多量体単一ドメイン抗体、ならびにエリスロポエチンを含む。
【０１４５】
適した哺乳動物タンパク質の他の例は、限定を伴わず、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、デオキシヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、βガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グルクロノイルエステラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、リパーゼ、オキシダーゼ、ホスホリパーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、ウロキナーゼ、アルブミン、コラーゲン、トロポエラスチン、及びエラスチンを含む。
【０１４６】
非哺乳動物ポリペプチド
本開示の非哺乳動物ポリペプチドは、目的の生物学的活性を有する任意の非哺乳動物ポリペプチドでありうる。本明細書において使用する通り、「非哺乳動物ポリペプチド」は、非哺乳動物生物（例えば菌細胞など）において天然に発現されるポリペプチド、非哺乳動物において天然に発現されるポリペプチドから由来するポリペプチド、又はそのフラグメントである。非哺乳動物ポリペプチドは、また、生物学的活性を保持するペプチド及びオリゴペプチドを含む。本開示の非哺乳動物ポリペプチドは、また、組み合わせて、コード産物を形成する２つ以上のポリペプチドを含みうる。本開示の非哺乳動物ポリペプチドは、融合ポリペプチドをさらに含むことができ、それは、少なくとも２つの異なるポリペプチドから得られた部分的又は完全アミノ酸配列の組み合わせを含む。非哺乳動物ポリペプチドは、また、開示された非哺乳動物ポリペプチド及びハイブリッド非哺乳動物ポリペプチドのいずれかの自然に生じる対立遺伝子の及び操作されたバリエーションを含みうる。
【０１４７】
適した非哺乳動物ポリペプチドの例は、限定を伴わず、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、及びキシラナーゼを含む。
【０１４８】
異種ポリペプチド産生
目的の異種ポリペプチドは、当技術分野において公知の方法を使用して、異種ポリペプチドの産生のための栄養培地中で細胞を培養することにより、活性が低下している少なくとも３つのプロテアーゼを含む、本開示の糸状菌細胞により産生される。例えば、細胞は、適した培地中で、ポリペプチドが発現及び／又は単離されることを許す条件下で実施される実験室又は工業的発酵槽における振盪フラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、フェドバッチ、又は固体発酵）により培養してもよい。培養は、当技術分野において公知の方法を使用して、炭素源及び窒素源ならびに無機塩を含む適した栄養培地中で起こる。適した培地は、商業的な供給業者から入手可能である、又は（例えば、American Type Culture Collectionのカタログにおいて）公開された組成に従って調製してもよい。分泌されたポリペプチドを、培地から直接的に回収することができる。ポリペプチドが分泌されない場合、それは細胞溶解物から得てもよい。
【０１４９】
活性が低下している少なくとも３つのプロテアーゼを含む本開示の糸状菌細胞により産生された目的の異種ポリペプチドを、異種ポリペプチドについて特異的である、当技術分野において公知の方法を使用して検出してもよい。これらの検出方法は、限定を伴わず、特異的抗体の使用、高速液体クロマトグラフィー、キャピラリークロマトグラフィー、酵素産物の形成、酵素基質の消失、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを含みうる。例えば、酵素アッセイを使用し、酵素の活性を決定しうる。酵素活性を決定するための手順は、当技術分野において、多くの酵素について公知である（例えば、O. Schomburg and M. Salzmann (eds.), Enzyme Handbook, Springer-Verlag, New York, 1990を参照のこと）。
【０１５０】
結果として得られた異種ポリペプチドは、当技術分野において公知の方法により単離されうる。例えば、目的の異種ポリペプチドを、限定を伴わず、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、及び沈殿を含む、従来の方法により培養培地から単離してもよい。単離された異種ポリペプチドは、次に、さらに、当技術分野において公知の種々の手順（限定を伴わず、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動手順（例えば、調製用の等電点電気泳動（ＩＥＦ）、示差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出（例えば、Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照のこと）により精製されうる。
【０１５１】
異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの調製
本開示の異種ポリヌクレオチドの配列は、当技術分野において公知の任意の適した方法（限定を伴わず、直接的な化学合成又はクローニングを含む）により調製される。直接的な化学合成について、核酸のポリマーの形成は、典型的には、成長するヌクレオチド鎖の末端５’ヒドロキシル基への３’ブロック及び５’ブロックされたヌクレオチドモノマーの逐次付加を含み、それにおいて、各々の付加は、加えられたモノマーの３’位置上での成長鎖の末端５’ヒドロキシル基の求核攻撃により影響され、それは、典型的には、リン誘導体（例えばホスホトリエステル、ホスホルアミダイト、又は同様のものなど）である。そのような方法論は、当業者に公知であり、関連するテキスト及び文献において記載されている［例えば、Matteucci et al., (1980) Tetrahedron Lett 21: 719-722；米国特許第４，５００，７０７号；第５，４３６，３２７号；及び第５，７００，６３７号］。また、所望の配列は、適切な制限酵素を使用してＤＮＡを分割し、ゲル電気泳動を使用してフラグメントを分離し、当業者に公知の技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば、米国特許第４，６８３，１９５号）の利用などを介して、ゲルから所望の核酸配列を回収することにより、自然供給源から単離されうる。
【０１５２】
本開示の各々の異種ポリヌクレオチドを、発現ベクター中に組み入れることができる。「発現ベクター」又は「ベクター」は、宿主細胞に形質導入、形質転換、又は感染させ、それにより、細胞に天然であるもの以外の、あるいは、細胞に天然ではない様式において、細胞に核酸及び／又はタンパク質の発現を起こさせる化合物及び／又は組成物を指す。「発現ベクター」は、宿主細胞により発現されるべき核酸（通常はＲＮＡ又はＤＮＡ）の配列を含む。場合により、発現ベクターは、また、宿主細胞（例えばウイルス、リポソーム、タンパク質コーティング、又は同様のもの）中への核酸の侵入を達成するのを助けるための材料を含む。本開示における使用のために熟慮される発現ベクターは、核酸配列を、任意の好ましい又は要求される作動エレメントと共に挿入することができるものを含む。さらに、発現ベクターは、宿主細胞中に移し、その中で複製させることができるものでなければならない。好ましい発現ベクターは、プラスミド、特に、十分に文書化されている、及び、核酸配列の転写のために好ましい又は要求される作動エレメントを含む制限部位を伴うものである。そのようなプラスミド、ならびに他の発現ベクターが、当技術分野において周知である。
【０１５３】
個々のポリヌクレオチドの組み入れは、例えば、発現ベクター（例えば、プラスミド）中の特定部位を切断するための制限酵素（例えばＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｈａＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩなど）の使用を含む、公知の方法を通じて達成されうる。制限酵素は、切断された発現ベクターの末端に相補的な配列を伴う末端を有する、又は、有するように合成されるポリヌクレオチドにアニールしうる一本鎖末端を産生する。アニーリングを、適切な酵素（例えば、ＤＮＡリガーゼ）を使用して実施する。当業者により理解される通り、発現ベクター及び所望のポリヌクレオチドの両方が、しばしば、同じ制限酵素を用いて切断され、それにより、発現ベクターの末端及びポリヌクレオチドの末端が互いに相補的であることを確実にする。また、ＤＮＡリンカーを使用し、発現ベクター中への核酸配列の連結を促進してもよい。
【０１５４】
一連の個々のポリヌクレオチドを、当技術分野（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号）において公知である方法を利用することにより組み合わせることができる。
【０１５５】
例えば、所望のポリヌクレオチドの各々を、最初に、別々のＰＣＲにおいて生成することができる。その後、特異的なプライマーを設計し、ＰＣＲ産物の末端が相補的配列を含むようにする。ＰＣＲ産物を混合、変性、及び再アニーリングする場合、それらの３’末端に一致配列を有する鎖が重なり、互いについてのプライマーとして作用することができる。ＤＮＡポリメラーゼによるこの重なりの伸長によって、本来の配列が一緒に「スプライシング」される分子が産生される。このように、一連の個々のポリヌクレオチドが、一緒に「スプライシング」され、その後、宿主細胞中に同時に形質導入されうる。このように、複数のポリヌクレオチドの各々の発現が影響を受ける。
【０１５６】
個々のポリヌクレオチド、又は「スプライスされた」ポリヌクレオチドは、次に、発現ベクター中に組み入れられる。本開示は、ポリヌクレオチドが発現ベクター中に組み入れられるプロセスに関して限定されない。当業者は、発現ベクター中にポリヌクレオチドを組み入れるために必要な工程に精通している。典型的な発現ベクターは、リボソーム結合部位、例えば、長さ３〜９ヌクレオチド及び大腸菌における開始コドンの上流３〜１１ヌクレオチドに位置付けられるヌクレオチド配列と共に、１つ以上の調節領域により先行される所望のポリヌクレオチドを含む。Shine and Dalgarno (1975) Nature 254(5495): 34-38及びSteitz (1979) Biological Regulation and Development (ed.Goldberger, R. F.), 1: 349-399 (Plenum, New York)を参照のこと。
【０１５７】
用語「作動可能に連結された」は、本明細書において使用される通り、制御配列が、ＤＮＡ配列又はポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に置かれ、制御配列がポリペプチドの発現を導くようにする構成を指す。
【０１５８】
調節領域は、例えば、プロモーター及びオペレーターを含むそれらの領域を含む。プロモーターを所望のポリヌクレオチドに作動可能に連結し、それにより、ポリヌクレオチドの転写をＲＮＡポリメラーゼ酵素を介して開始する。オペレーターは、プロモーターに隣接する核酸の配列であり、それはタンパク質結合ドメインを含み、そこに、リプレッサータンパク質が結合することができる。リプレッサータンパク質の非存在において、転写は、プロモーターを通じて開始する。存在する場合、オペレーターのタンパク質結合ドメインに特異的なリプレッサータンパク質が、オペレーターに結合し、それにより、転写を阻害する。この方法において、転写の制御は、使用される特定の調節領域及び対応するリプレッサータンパク質の存在又は非存在に基づいて達成される。例は、ラクトースプロモーター（Ｌａｄリプレッサータンパク質が、ラクトースと接触した場合、立体構造を変化させ、それにより、Ｌａｄリプレッサータンパク質がオペレーターに結合することを防止する）及びトリプトファンプロモーター（トリプトファンと複合体を形成した場合、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質は、オペレーターに結合する立体構造を有する；トリプトファンの非存在において、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質は、オペレーターに結合しない立体構造を有する）を含む。別の例はｔａｃプロモーターである（de Boer et al., (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80(1):21-25を参照のこと）。当業者により理解される通り、これらの及び他の発現ベクターを、本開示において使用してもよく、本開示はこの点において限定されない。
【０１５９】
任意の適切な発現ベクターを使用し、所望の配列を組み入れてもよいが、容易に入手可能な発現ベクターは、限定を伴わず、プラスミド、例えばｐＳＣｌＯｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＢＲｌＭＣＳ−３、ｐＵＲ、ｐＥＸ、ｐＭＲｌ００、ｐＣＲ４、ｐＢＡＤ２４、ｐＵＣ１９、ｐＲＳ４２６；ならびにバクテリオファージ、例えばＭ１３ファージ及びλファージなどを含む。無論、そのような発現ベクターは、特定の宿主細胞についてだけ適しうる。当業者は、しかし、任意の特定の発現ベクターが、任意の所与の宿主細胞について適しているか否かを、ルーチン実験を通じて容易に決定することができる。例えば、発現ベクターは、宿主細胞中に導入することができ、次に、生存及びベクター中に含まれる配列の発現についてモニターされる。また、参照を、関連テキスト及び文献に作ることができ、それらは、発現ベクター及び任意の特定の宿主細胞へのそれらの適合性を記載している。
【０１６０】
本発明の目的のために適した発現ベクター（本明細書に記載の所望の異種ポリペプチド、酵素、及び１つ以上の触媒ドメインの発現を含む）は、構成的又は誘導性プロモーターに作動可能に連結された所望の異種ポリペプチド、酵素、又は触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。そのようなポリヌクレオチドに作動可能に連結するのに特に適したプロモーターの例は、以下の遺伝子からのプロモーターを含む：ｇｐｄＡ、ｃｂｈ１、アスペルギルス・オリゼのＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・アワモリのｇｌａＡ、リゾムコル・ミエヘイのリパーゼ、アスペルギルス・オリゼのアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼのトリオースホスフェートイソメラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスのアセトアミダーゼ、アスペルギルス・オリゼのアセトアミダーゼ、フザリウム・オキシスポラムのトリプシン様プロテアーゼ、真菌エンドα−Ｌ−アラビナーゼ（ａｂｎＡ）、真菌α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＡ（ａｂｆＡ）、真菌α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＢ（ａｂｆＢ）、真菌キシラナーゼ（ｘｌｎＡ）、真菌フィターゼ、真菌ＡＴＰシンテターゼ、真菌サブユニット９（ｏｌｉＣ）、真菌トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）、真菌アルコール脱水素酵素（ａｄｈＡ）、真菌α−アミラーゼ（ａｍｙ）、真菌アミログルコシダーゼ（ｇｌａＡ）、真菌アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、真菌グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ｇｐｄ）、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、酵母ラクターゼ、酵母３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、酵母トリオースリン酸イソメラーゼ、細菌α−アミラーゼ、細菌Ｓｐｏ２、及びＳＳＯ。そのような適した発現ベクター及びプロモーターの例が、また、ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０７０９５６に記載されており、その全内容が、参照により本明細書において組み入れられる。
【０１６１】
本発明の糸状菌細胞により産生された異種ポリペプチドを含む医薬的組成物
別の局面において、本発明は、少なくとも３つのプロテアーゼの活性低下を有し、異種ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドをさらに含む、本開示の糸状菌細胞により産生され、医薬的に許容可能な担体と一緒に製剤化される、１つ以上の目的の異種ポリペプチド（例えば哺乳動物ポリペプチドなど）を含む、組成物（例えば、医薬的組成物）を提供する。本発明の医薬的組成物は、また、組み合わせ治療において投与する、即ち、他の薬剤と組み合わせることができる。例えば、組み合わせ治療は、少なくとも１つの他の治療的薬剤と組み合わせ、目的の哺乳動物ポリペプチドを含むことができる。
【０１６２】
本明細書において使用する通り、「医薬的に許容可能な担体」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合性のある同様のものを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）のために適している。投与の経路に依存して、活性化合物、即ち、目的の哺乳動物ポリペプチドを、酸及び化合物を不活化しうる他の自然条件の作用から化合物を保護するための材料を用いてコートしてもよい。
【０１６３】
本発明の医薬的組成物は、１つ以上の医薬的に許容可能な塩を含みうる。「医薬的に許容可能な塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持する塩を指し、任意の望ましくない毒物学的効果を与えない（例えば、Berge, S.M., et al.(1977) J. Pharm.Sci. 66: 1-19を参照のこと）。そのような塩の例は、酸付加塩及び塩基付加塩を含む。酸付加塩は、非毒性無機酸（例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸、及び同様のものなど）から、ならびに非毒性有機酸（例えば脂肪族モノ及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸、及び同様のものなど）から由来するものを含む。塩基付加塩は、アルカリ土類金属（例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、及び同様のものなど）から、ならびに非毒性有機アミン（例えばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン、及び同様のものなど）から由来するものを含む。
【０１６４】
本発明の医薬的組成物は、また、医薬的に許容可能な酸化防止剤を含みうる。医薬的に許容可能な抗酸化剤の例は、以下を含む：（１）水溶性抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、及び同様のものなど）；（２）油溶性抗酸化剤（例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール、及び同様のものなど）；及び（３）金属キレート剤（例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸、及び同様のものなど）。
【０１６５】
本発明の医薬的組成物において用いてもよい適した水性及び非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及び同様のものなど）、及びそれらの適した混合物、植物油（例えばオリーブ油など）、及び注射可能な有機エステル（例えばオレイン酸エチルなど）を含む。適切な流動性は、例えば、コーティング材料（例えばレシチンなど）の使用により、分散剤の場合においては、要求される粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。
【０１６６】
これらの組成物は、また、補助剤（例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤など）を含んでもよい。微生物の存在の防止は、滅菌手順により、ならびに、種々の抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸、及び同様のものなど）の包含により、確実にされうる。また、等張剤（例えば糖、塩化ナトリウム、及び同様のものなど）を組成物中に含むことが望ましいであろう。また、注射可能な医薬的形態の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど）の包含によりもたらされうる。
【０１６７】
医薬的に許容可能な担体は、滅菌注射可能溶液又は分散剤の即時調製のための滅菌水溶液又は分散剤及び滅菌粉末を含む。医薬的に活性な物質のためのそのような媒質及び薬剤の使用は、当技術分野において公知である。任意の従来の媒質又は薬剤が活性化合物と不適合である場合を除き、本発明の医薬的組成物中でのその使用が熟慮される。補助活性化合物を、また、組成物中に組み入れることができる。
【０１６８】
治療的組成物は、典型的には、製造及び保存の条件下で無菌及び安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高い薬物濃度に適した他の秩序構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど、ならびに同様のもの）、及びそれらの適した混合物を含む溶媒又は分散媒質でありうる。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えばレシチンなど）の使用により、分散の場合においては、要求される粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、多価アルコール（例えばマンニトール、ソルビトールなど）、又は塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期吸収を、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤（例えばモノステアリン酸塩及びゼラチン）を含むことによりもたらすことができる。
【０１６９】
無菌注射可能溶液は、活性化合物を、要求される量中で、適切な溶媒中に、要求に応じて、上に列挙した成分の１つ又は組み合わせを伴い組み入れること（無菌精密濾過が続く）により調製することができる。一般的に、分散剤は、活性化合物を、基礎分散媒質及び上に列挙するものからの要求される他の成分を含む無菌媒体中に組み入れることにより調製する。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合において、特定の調製方法は真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）であり、それによって、活性成分プラス以前に無菌濾過したその溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末がもたらされる。
【０１７０】
単一投与形態を産生するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置されている被験者、及び特定の投与様式に依存して変動しうる。単一投与形態を産生するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般的に、治療的効果を産生する組成物の量でありうる。一般的に、１００%のうち、この量は、医薬的に許容可能な担体との組み合わせにおいて、活性成分の約０．０１パーセントから約９９パーセント、好ましくは約０．１パーセントから約７０パーセント、最も好ましくは活性成分の約１パーセントから約３０パーセントの範囲でありうる。
【０１７１】
投与計画を調整し、最適な所望の応答（例えば、治療的応答）を提供する。例えば、単一ボーラスを投与してもよく、いくつかに分割された用量を経時的に投与してもよく、あるいは、用量を、治療的状況の緊急性により示される通り、比例的に低下又は増加させてもよい。投与の容易さ及び投与量の均一性のために投与単位形態において非経口組成物を製剤化することが特に有利である。投与単位形態は、本明細書において使用する通り、処置される被験者のための単位投与量として適した物理的に分離した単位を指す；各々の単位は、要求される医薬的担体と関連する所望の治療的効果を産生するように算出された活性化合物の所定量を含む。本発明の投与単位形態のための仕様は、（ａ）活性化合物のユニークな特徴及び達成される特定の治療的効果、ならびに（ｂ）個人における感受性の処置のためのそのような活性化合物を配合する当技術分野に固有の限界により指示され、直接的に依存する。
【０１７２】
目的の哺乳動物ポリペプチドの投与のために、特に、哺乳動物ポリペプチドが抗体である場合、投与量は、宿主体重の約０．０００１〜１００mg/kg、より通常には０．０１〜５mg/kgの範囲である。例えば、投与量は、０．３mg/kg体重、１mg/kg体重、３mg/kg体重、５mg/kg体重、もしくは１０mg/kg体重又は１〜１０mg/kg体重の範囲内でありうる。例示的な処置計画は、１週間毎に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、１ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、又は３〜６ヶ月毎に１回の投与を伴う。抗体についての特定の投与計画は、静脈内投与を介した１mg/kg体重又は３mg/kg体重を含みうるが、抗体は以下の投与スケジュールの１つを使用して与えられる：（ｉ）６投与量について４週間毎、次に３ヶ月毎；（ｉｉ）３週間毎；（ｉｉｉ）３mg/kg体重１回、それに続く１mg/kg体重、３週間毎。
【０１７３】
あるいは、目的の哺乳動物のポリペプチドを、徐放製剤として投与することができ、その場合において、より低い頻度の投与が要求される。投与量及び頻度は、患者において投与される物質の半減期に依存して変動する。一般的に、ヒト抗体は最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び非ヒト抗体が続く。投与量及び投与頻度は、処置が予防的又は治療的であるかに依存して変動しうる。予防的適用において、比較的低い投与量を、比較的低頻度の間隔で長期間にわたり投与する。一部の患者は、彼らの残りの人生にわたり処置を受け続ける。治療用途において、比較的短い間隔での比較的高い投与量が、疾患の進行が低下又は終結するまで、好ましくは、患者が、疾患の症状の部分的又は完全な寛解を示すまで、時折要求される。その後、患者に予防計画を投与することができる。
【０１７４】
本開示の医薬的組成物における活性成分の実際の投与量レベルを、変動させてもよく、患者への毒性を伴わず、特定の患者、組成物、及び投与様式についての所望の治療的応答を達成するために効果的である活性成分の量を得るようにする。選択される投与量レベルは、種々の薬物動態学的な因子（用いられる本発明の特定の組成物、又はそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与の経路、投与の時間、用いられる特定の化合物の排出速度、治療の持続期間、他の薬物、用いられる特定の組成物との組み合わせにおいて使用される化合物及び／又は材料、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態及び以前の病歴、ならびに医学分野において周知の同様の因子を含む）に依存する。
【０１７５】
本開示の免疫グロブリンの「治療的に効果的な投与量」は、好ましくは、疾患症状の重症度における減少、疾患症状のない期間の頻度及び持続時間における増加、又は疾患の罹患に起因する機能障害もしくは身体障害の防止をもたらす。例えば、腫瘍の処置について、「治療的に効果的な投与量」は、好ましくは、細胞成長又は腫瘍成長を、未処置の被験者と比べて、少なくとも約２０%、より好ましくは少なくとも約４０%、さらにより好ましくは少なくとも約６０%、さらにより好ましくは少なくとも約８０%だけ阻害する。腫瘍成長を阻害する化合物の能力を、ヒト腫瘍における効力を予測する動物モデル系において評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、インビトロでのそのような阻害を阻害する化合物の能力を、当業者に公知のアッセイにより検証することにより評価することができる。治療的化合物の治療的に効果的な量は、腫瘍サイズを減少させる、又は、その他の点では、被験者における症状を寛解することができる。当業者は、被験者のサイズ、被験者の症状の重症度、及び選択された特定組成物又は投与の経路などの因子に基づいてそのような量を決定することができるであろう。
【０１７６】
本開示の組成物は、１つ以上の投与の経路を介して、当技術分野で公知の種々の方法の１つ以上を使用して投与することができる。当業者により理解される通り、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に依存して変動する。本発明の結合部分のための特定の投与の経路は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、又は他の非経口の投与の経路（例えば、注射又は注入による）を含む。語句「非経口投与」は、本明細書において使用する通り、経腸及び局所投与以外の投与様式を意味し、通常は注射により、限定を伴わず、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、及び胸骨内注射及び注入を含む。
【０１７７】
あるいは、本開示に従った哺乳動物ポリペプチドは、非注射経路、例えば局所、表皮、又は粘膜の投与経路など（例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下、又は局所）を介して投与することができる。
【０１７８】
活性化合物は、迅速な放出に対して化合物を保護する担体、例えば、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などを用いて調製することができる。生物分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる（例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸など）。そのような製剤の調製のための多くの方法が、特許を取得している又は当業者に一般的に公知である。（例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと）。
【０１７９】
治療的組成物は、当技術分野において公知の医療デバイスを用いて投与することができる。例えば、特定の実施態様において、本発明の治療的組成物は、無針皮下注射デバイス（例えば米国特許第５，３９９，１６３号；第５，３８３，８５１号；第５，３１２，３３５号；第５，０６４，４１３号；第４，９４１，８８０号；第４，７９０，８２４号；又は第４，５９６，５５６号に開示されているデバイスなど）を用いて投与することができる。周知のインプラント及び本発明において有用なモジュールの例は、以下を含む：米国特許第４，４８７，６０３号（薬物を制御速度で分注するための移植可能な微量注入ポンプを開示している）；米国特許第４，４８６，１９４号（皮膚を通じて薬物を投与するための治療デバイスを開示している）；米国特許第４，４４７，２３３号（厳密な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示している）；米国特許第４，４４７，２２４号（継続的な薬物送達のための変動流量の移植可能な注入装置を開示している）；米国特許第４，４３９，１９６号（マルチチャンバー区画を有する浸透薬物送達系を開示している）；及び米国特許第４，４７５，１９６号（浸透薬物送達系を開示している）。
【０１８０】
特定の実施態様において、本開示に従った哺乳動物ポリペプチドの使用は、治療的抗体を用いて処置することができる任意の疾患の処置のためである。
【０１８１】
本発明の糸状菌細胞
本明細書における本発明は、また、異種ポリペプチドを発現する、及び異種ポリペプチドの分解を触媒する細胞において見出される少なくとも３つのプロテアーゼの活性を低下又は排除することにより、糸状菌細胞において異種ポリペプチド（例えば哺乳動物ポリペプチドなど）の産生のレベルを増加させることに関する。異種ポリペプチドを発現する糸状菌細胞において見出されるプロテアーゼの活性を低下又は排除することによって、発現された組換えポリペプチドの安定性が増加し、異種ポリペプチドの産生の増加レベルをもたらす。糸状菌細胞において見出されたプロテアーゼの活性は、例えば、プロテアーゼをコードする遺伝子を改変することにより、低下されうる。
【０１８２】
「糸状菌細胞」は、亜目（真菌類及び卵菌類）の全ての糸状形態からの細胞を含む（Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKにより定義される通り）。糸状菌細胞は、一般的に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖類から構成される菌子体壁により特徴付けられる。栄養成長は菌糸伸長により、炭素異化は偏性好気性である。対照的に、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエなど）による栄養成長は単細胞葉状体の出芽により、炭素異化は発酵性でありうる。
【０１８３】
任意の糸状菌細胞は、それが、核酸の配列を用いて形質転換された及び／又はプロテアーゼ活性を減少させるために改変もしくは変異された後に生存可能なままである限り、本開示において使用してもよい。好ましくは、糸状菌細胞は、必要な核酸配列の形質導入、タンパク質（例えば、哺乳動物タンパク質）のその後の発現、又は結果として得られた中間体により悪影響を受けない。
【０１８４】
適した糸状菌細胞の例は、限定を伴わず、アクレモニウム株、アスペルギルス株、フザリウム株、フミコーラ株、ムコール株、ミセリオフトラ株、ニューロスポラ株、ペニシリウム株、シタリジウム株、チエラビア株、トリポクラジウム株、又はトリコデルマ株からの細胞を含む。特定の実施態様において、糸状菌細胞は、トリコデルマ種、アクレモニウム株、アスペルギルス株、アウレオバシジウム株、クリプトコッカス株、クリソスポリウム株、クリソスポリウム・ラクノウェンス株、フィロバシディウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）株、フザリウム株、ジベレラ株、マグナポルテ株、ムコール株、ミセリオフトラ株、ミロセシウム株、ネオカリマスティクス株、ニューロスポラ株、ペシロミセス株、ペニシリウム株、ピロミセス株、シゾフィラム株、タラロマイセス株、サーモアスクス株、チエラビア株、又はトリポクラジウム株からである。
【０１８５】
本開示のアスペルギルス菌細胞は、限定を伴わず、アスペルギルス・アクレアータス、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・クラバタス、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・ホエチダス、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・ジャポニカ、アスペルギルス・ニジュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、又はアスペルギルス・テレウスを含みうる。
【０１８６】
本開示のニューロスポラ菌細胞は、限定を伴わず、ニューロスポラ・クラッサを含みうる。
【０１８７】
特定の実施態様において、糸状菌細胞は、アスペルギルス細胞ではない。
【０１８８】
特定の実施態様において、糸状菌細胞は、トリコデルマ（Ｔリーゼイ）、ニューロスポラ（Ｎクラッサ）、ペニシリウム（Ｐクリソゲヌム）、アスペルギルス（Ａニデュランス、Ａニガー、及びＡオリゼ）、マイセリオフトラ（Ｍサーモフィラ）、及びクリソスポリウム（Ｃラクノウェンス）からなる群より選択される。
【０１８９】
特定の実施態様において、糸状菌細胞は、トリコデルマ菌細胞である。本開示のトリコデルマ菌細胞は、野生型トリコデルマ株又はその変異体に由来しうる。適したトリコデルマ菌細胞の例は、限定を伴わず、トリコデルマ・ハルジアナム、トリコデルマ・コニンギ、トリコデルマ・ロンギブラキアタム、トリコデルマ・リーゼイ、トリコデルマ・アトロビリデ、トリコデルマ・ビレンス、トリコデルマ・ビリデ；及びそれらの代替の性的形態（即ち、ヒポクレア）を含む。
【０１９０】
糸状菌細胞の遺伝子を破壊し、糸状菌細胞を培養するための一般的な方法が、例えば、ペニシリウムについては、Kopke et al.(2010) Application of the Saccharomyces cerevisiae FLP/FRT recombination system in filamentous fungi for marker recycling and construction of knockout strains devoid of heterologous genes. Appl Environ Microbiol.76(14): 4664-74. doi:10.1128/AEM.00670-10において、アスペルギルスについては、Maruyama and Kitamoto (2011), Targeted Gene Disruption in Koji Mold Aspergillus oryzae, in James A. Williams (ed.), Strain Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 765, DOI 10.1007/978-1-61779-197-0_27において；ニューロスポラについては、Collopy et al.(2010) High-throughput construction of gene deletion cassettes for generation of Neurospora crassa knockout strains. Methods Mol Biol. 2010; 638: 33-40. doi: 10.1007/978-1-60761-611-5_3において；及びマイセリオフトラ又はクリソスポリウムについては、ＰＣＴ／ＮＬ２０１０／００００４５及びＰＣＴ／ＥＰ９８／０６４９６において開示されている。
【０１９１】
糸状菌細胞の構成成分
本開示の特定の局面は、少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下しているか又は検出不可能である、及び、増加したレベルで、例えば、少なくとも２倍増加したレベルで産生される異種ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを有する糸状菌細胞に関する。本開示の他の局面は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ７、ｇａｐ１、及びｇａｐ２より選択される少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下しているか又は検出不可能であるトリコデルマ菌細胞に関し、そこでは、細胞は、さらに、対応する親トリコデルマ菌細胞におけるポリペプチドの産生レベルよりも少なくとも２倍高いレベルで産生される哺乳動物ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む。特定の実施態様において、糸状菌細胞又はトリコデルマ菌細胞は、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、又はそれより多いプロテアーゼの活性が低下しているか又は無活性である。
【０１９２】
プロテアーゼの低下発現
本開示の糸状菌細胞又はトリコデルマ菌細胞における少なくとも３つのプロテアーゼの活性の低下は、プロテアーゼの低下又は排除された発現の結果でありうる。一部の実施態様において、少なくとも３つのプロテアーゼの低下又は排除された発現は、触媒ドメイン、コード領域、又はプロテアーゼの各々をコードする遺伝子のコード領域の発現のために要求される制御配列の改変の結果である。他の実施態様において、プロテアーゼの低下又は排除された発現は、遺伝子、プロテアーゼの各々をコードする遺伝子の転写もしくは翻訳のために要求されるその制御配列における１つ以上のヌクレオチドを導入、置換、及び／又は除去することの結果である。
【０１９３】
さらなる実施態様において、プロテアーゼの低下又は排除された発現は、プロテアーゼの各々をコードする遺伝子中に、相同性の領域の複製を作製し、コンストラクトＤＮＡを重複領域間に組み入れる遺伝子の各々に相同な核酸フラグメントを各々が含む破壊核酸コンストラクトを挿入することの結果である。他の実施態様において、プロテアーゼの低下又は排除された発現は、プロテアーゼの各々をコードする遺伝子の遺伝子変換の結果である。さらに他の実施態様において、プロテアーゼの低下又は排除された発現は、プロテアーゼの各々をコードする遺伝子の各々について特異的であるアンチセンスポリヌクレオチド又はＲＮＡｉコンストラクトによる結果である。一実施態様において、ＲＮＡｉコンストラクトは、アスパラギン酸プロテアーゼ（例えばｐｅｐ型プロテアーゼなど）、トリプシン様セリンプロテアーゼ（例えばｔｓｐ１など）、グルタミン酸プロテアーゼ（例えばｇａｐ型プロテアーゼなど）、ブチリシンプロテアーゼ（例えばｓｌｐ型プロテアーゼなど）、又はセドリシンプロテアーゼ（例えばｔｐｐ１又はｓｌｐ７プロテアーゼなど）をコードする遺伝子について特異的である。一実施態様において、ＲＮＡｉコンストラクトは、ｓｌｐ型プロテアーゼをコードする遺伝子について特異的である。一実施態様において、ＲＮＡｉコンストラクトは、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５、又はｓｌｐ６をコードする遺伝子について特異的である。一実施態様において、ＲＮＡｉコンストラクトは、２つ以上のプロテアーゼについて特異的である。一実施態様において、２つ以上のプロテアーゼは、ｐｅｐ型プロテアーゼのいずれか１つ、トリプシン様セリンプロテアーゼのいずれか１つ、ｓｌｐ型プロテアーゼのいずれか１つ、ｇａｐ型プロテアーゼのいずれか１つ、及び／又はセドリシンプロテアーゼのいずれか１つである。一実施態様において、２つ以上のプロテアーゼは、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５、及び／又はｓｌｐ６である。一実施態様において、ＲＮＡｉコンストラクトは、表２２．２の核酸配列の任意の１つを含む。
【０１９４】
一部の実施態様において、プロテアーゼをコードする遺伝子は、各々、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除する変異を含む。他の実施態様において、変異は、プロテアーゼの各々の発現を低下又は排除する。さらなる実施態様において、変異は、対応するプロテアーゼ活性を低下又は排除するノックアウト変異、切断変異、点変異、ミスセンス変異、置換変異、フレームシフト変異、挿入変異、重複変異、増幅変異、転座変異、逆位変異である。
【０１９５】
一部の実施態様において、変異は、プロテアーゼコード遺伝子の欠失である。他の実施態様において、変異は、プロテアーゼの触媒ドメインをコードするプロテアーゼコード遺伝子の部分の欠失である。さらに他の実施態様において、変異は、プロテアーゼの触媒ドメインをコードするプロテアーゼコード遺伝子の部分における点変異である。
【０１９６】
プロテアーゼ遺伝子の組み合わせ
本開示の糸状菌細胞又はトリコデルマ菌細胞は、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、以上のアスパラギン酸プロテアーゼ、トリプシン様セリンプロテアーゼ、スブチリシンプロテアーゼ、及び／又はグルタミン酸プロテアーゼを含みうる。特定の実施態様において、プロテアーゼは、ｐｅｐ型プロテアーゼ遺伝子、ｇａｐ型プロテアーゼ遺伝子、又はｓｌｐ型プロテアーゼ遺伝子によりコードされる。一部の実施態様において、ｐｅｐ型プロテアーゼ遺伝子は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、及びｐｅｐ１２より選択される。他の実施態様において、ｇａｐ型プロテアーゼ遺伝子は、ｇａｐ１、及びｇａｐ２より選択される。さらなる実施態様において、ｓｌｐ型プロテアーゼ遺伝子は、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、及びｓｌｐ７より選択される；又はｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５、ｓｌｐ６、ｓｌｐ７、及びｓｌｐ８より選択される。特定の好ましい実施態様において、ｓｌｐ型プロテアーゼ遺伝子はｓｌｐ１である。
【０１９７】
他の実施態様において、プロテアーゼは、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ７、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５、ｓｌｐ６、ｓｌｐ７、ｓｌｐ８、ｇａｐ１、ｇａｐ２、及びｔｐｐ１より選択される遺伝子によりコードされる。一部の実施態様において、糸状菌細胞、例えば、トリコデルマ細胞は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ７、ｇａｐ１、及びｇａｐ２より選択される少なくとも３つ又は少なくとも４つのプロテアーゼコード遺伝子の低下又は無発現レベルを有する。特定の実施態様において、糸状菌細胞、例えば、トリコデルマ細胞は、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、及びｓｌｐ１より選択される少なくとも３つのプロテアーゼコード遺伝子の低下又は無発現レベルを有する。他の実施態様において、糸状菌細胞、又は、トリコデルマ細胞は、ｇａｐ１、ｓｌｐ１、及びｐｅｐ１より選択される少なくとも３つのプロテアーゼコード遺伝子の低下又は無発現レベルを有する。一部の実施態様において、糸状菌細胞、例えば、トリコデルマ細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、及びｇａｐ１の低下又は無発現レベルを有する。一部の実施態様において、糸状菌細胞、例えば、トリコデルマ細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、及びｐｅｐ４の低下又は無発現レベルを有する。一部の実施態様において、糸状菌細胞、例えば、トリコデルマ細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、及びｓｌｐ１の低下又は無発現レベルを有する。一部の実施態様において、糸状菌細胞、例えば、トリコデルマ細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ１、及びｓｌｐ３の低下又は無発現レベルを有する。一部の実施態様において、糸状菌細胞、例えば、トリコデルマ細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ１、ｓｌｐ３、及びｐｅｐ３の低下又は無発現レベルを有する。一部の実施態様において、糸状菌細胞、例えば、トリコデルマ細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ１、ｓｌｐ３、ｐｅｐ３、及びｐｅｐ２の低下又は無発現レベルを有する。一部の実施態様において、糸状菌細胞、例えば、トリコデルマ細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ１、ｓｌｐ３、ｐｅｐ３、ｐｅｐ２、及びｐｅｐ５の低下又は無発現レベルを有する。一部の実施態様において、糸状菌細胞、例えば、トリコデルマ細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ１、ｓｌｐ３、ｐｅｐ３、ｐｅｐ２、ｐｅｐ５、及びｔｓｐ１の低下又は無発現レベルを有する。一部の実施態様において、糸状菌細胞、例えば、トリコデルマ細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ１、ｓｌｐ３、ｐｅｐ３、ｐｅｐ２、ｐｅｐ５、ｔｓｐ１、及びｓｌｐ７の低下又は無発現レベルを有する。一部の実施態様において、糸状菌細胞、例えば、トリコデルマ細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ１、ｓｌｐ３、ｐｅｐ３、ｐｅｐ２、ｐｅｐ５、ｔｓｐ１、ｓｌｐ７、及びｓｌｐ８の低下又は無発現レベルを有する。一部の実施態様において、糸状菌細胞、例えば、トリコデルマ細胞は、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ１、ｓｌｐ３、ｐｅｐ３、ｐｅｐ２、ｐｅｐ５、ｔｓｐ１、ｓｌｐ７、ｓｌｐ８、及びｇａｐ２の低下又は無発現レベルを有する。
【０１９８】
特定の実施態様において、糸状菌細胞は、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、又はそれ以上の、低下したプロテアーゼ活性を伴うプロテアーゼを有し、それにおいて、野生型活性を伴う対応するプロテアーゼは、各々が、配列番号１−１６；１７−３６；３７−５７；５８−６５；６６−８１；８２−９７；９８−１１７；１１８−１２８；１２９−１４４；１６６−１８１；１８２−１８５；又は配列番号４９１−５８８のアミノ酸配列と少なくとも７０%、少なくとも７５%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、少なくとも９６%、少なくとも９７%、少なくとも９８%、少なくとも９９%、又は１００%同一であるアミノ酸配列を有する。糸状菌細胞が、１つ以上のプロテアーゼにおいて低下したプロテアーゼ活性を伴うトリコデルマ菌細胞である実施態様において、野生型活性を伴う対応するプロテアーゼは、各々が、配列番号１、１７、３７、５８、６６、８２、９８、１１８、１２９、１６６、もしくは１８２；又は配列番号５０７、配列番号５２２、もしくは配列番号５３０のアミノ酸配列と少なくとも７０%、少なくとも７５%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、少なくとも９６%、少なくとも９７%、少なくとも９８%、少なくとも９９%、又は１００%同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１９９】
異種ポリペプチド
本開示の糸状菌細胞又はトリコデルマ菌細胞は、異種ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは哺乳動物ポリペプチドである。他の実施態様において、異種ポリペプチドは非哺乳動物ポリペプチドである。
【０２００】
糸状菌細胞が、哺乳動物ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む実施態様において、哺乳動物ポリペプチドは、非グリコシル化哺乳類ポリペプチド、グリコシル化哺乳動物ポリペプチド、又はそれらの組み合わせ（限定を伴わず、免疫グロブリン、抗体、成長因子、及びインターフェロンを含む）でありうる。一部の実施態様において、哺乳動物ポリペプチドは免疫グロブリン又は抗体である。糸状菌細胞が免疫グロブリン又は抗体をコードする組換えポリヌクレオチドを含む実施態様において、糸状菌細胞、例えば、トリコデルマ菌細胞は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ７、ｇａｐ１、及びｇａｐ２より選択される少なくとも３つ又は少なくとも４つのプロテアーゼコード遺伝子の低下又は無発現を有しうる。特定の好ましい実施態様において、細胞、例えば、トリコデルマ菌細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｔｓｐ１、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ２、ｐｅｐ５、及びｇａｐ２の低下又は無発現を有する。特定の好ましい実施態様において、細胞、例えば、トリコデルマ菌細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、及びｇａｐ１の低下又は無発現を有する。他の実施態様において、細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、及びｐｅｐ４の低下発現を有する。他の実施態様において、細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、及びｓｌｐ３の低下発現を有する。他の実施態様において、細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、及びｔｓｐ１の低下発現を有する。他の実施態様において、細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｔｓｐ１、及びｐｅｐ１の低下発現を有する。他の実施態様において、細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｔｓｐ１、ｐｅｐ１、及びｇａｐ１の低下発現を有する。他の実施態様において、細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｔｓｐ１、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、及びｐｅｐ４の低下発現を有する。他の実施態様において、細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｔｓｐ１、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、及びｐｅｐ３の低下発現を有する。他の実施態様において、細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｔｓｐ１、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、及びｐｅｐ２の低下発現を有する。他の実施態様において、細胞は、免疫グロブリン又は抗体をコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｔｓｐ１、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３、ｐｅｐ２、及びｐｅｐ５の低下発現を有する。
【０２０１】
他の実施態様において、糸状菌細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、又はインターロイキンをコードする組換えポリヌクレオチドを含む。糸状菌細胞、例えば、トリコデルマ菌細胞が、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン、又はインターロイキンをコードする組換えポリヌクレオチドを含む実施態様において、糸状菌細胞は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ７、及びｔｓｐ１より選択される少なくとも３つ又は少なくとも４つのプロテアーゼコード遺伝子の低下又は無発現を有しうる。特定の実施態様において、細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン、又はインターロイキンをコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、及びｇａｐ２の低発現を有する。特定の実施態様において、細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン、又はインターロイキンをコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ７、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｔｓｐ１、及びｇａｐ２の低下発現を有する。他の実施態様において、細胞、例えば、トリコデルマ菌細胞が、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン、又はインターロイキンをコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、及びｐｅｐ４の低下発現を有する。さらなる実施態様において、細胞は、成長因子をコードする組換えポリヌクレオチドを含み、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、及びｐｅｐ５より選択されるｐｅｐ型プロテアーゼ遺伝子の低下発現を有する。特定の好ましい実施態様において、成長因子はＩＧＦ−１である、又はインターフェロンはインターフェロンα２ｂである。特定の実施態様において、細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン、又はインターロイキンをコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｇａｐ１、及びｐｅｐ４の低下発現を有する。特定の実施態様において、細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン、又はインターロイキンをコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、及びｓｌｐ７の低下発現を有する。特定の実施態様において、細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン、又はインターロイキンをコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ７、及びｓｌｐ２の低下発現を有する。特定の実施態様において、細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン、又はインターロイキンをコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ７、ｓｌｐ２、及びｐｅｐ２の低下発現を有する。特定の実施態様において、細���は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン、又はインターロイキンをコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ７、ｓｌｐ２、ｐｅｐ２、及びｐｅｐ３の低下発現を有する。特定の実施態様において、細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン、又はインターロイキンをコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ７、ｓｌｐ２、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、及びｐｅｐ５の低下発現を有する。特定の実施態様において、細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン、又はインターロイキンをコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ７、ｓｌｐ２、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、及びｓｌｐ１の低下発現を有する。特定の実施態様において、細胞は、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、ヒト血清アルブミン、又はインターロイキンをコードする組換えポリヌクレオチドを含み、プロテアーゼコード遺伝子ｐｅｐ１、ｇａｐ１、ｐｅｐ４、ｓｌｐ７、ｓｌｐ２、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ５、ｓｌｐ１、及びｔｓｐ１の低下発現を有する。
【０２０２】
特定の実施態様において、哺乳動物ポリペプチドは、低下したプロテアーゼ活性を伴わない、対応する親糸状菌細胞におけるポリペプチドの産生レベルよりも、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、又はそれより大きい倍の高いレベルで産生される。他の実施態様において、哺乳動物ポリペプチドは、完全長バージョンにおいて、対応する親糸状菌細胞におけるポリペプチドの完全長バージョンの産生レベルよりも高いレベルで産生される。
【０２０３】
糸状菌細胞が、非哺乳動物ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む実施態様において、非哺乳動物ポリペプチドは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼでありうる。糸状菌細胞が、非哺乳動物ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む実施態様において、糸状菌細胞は、ｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、ｐｅｐ８、ｐｅｐ１１、ｐｅｐ１２、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｇａｐ１、及びｇａｐ２より選択される、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つのプロテアーゼコード遺伝子の発現が低下しているか又は検出不可能である。特定の実施態様において、非哺乳動物ポリペプチドは、対応する親糸状菌細胞におけるポリペプチドの産生レベルよりも、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、又はそれより大きい倍の高いレベルで産生される。他の実施態様において、非哺乳動物ポリペプチドは、完全長バージョンにおいて、対応する親糸状菌細胞におけるポリペプチドの完全長バージョンの産生レベルよりも高いレベルで産生される。
【０２０４】
追加のプロテアーゼの低下活性
一部の実施態様において、本開示の糸状菌細胞又はトリコデルマ菌細胞は、また、１つ以上の追加のプロテアーゼの活性が低下している。特定の実施態様において、１つ以上の追加のプロテアーゼの発現レベルが、低下される。特定の好ましい実施態様において、１つ以上の追加のプロテアーゼをコードする遺伝子は、各々、対応するプロテアーゼ活性を低下させる変異を含む。１つ以上の追加のプロテアーゼコード遺伝子は、ｐｅｐ７、ｔｐｐ１、ｇａｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５、ｓｌｐ６、ｓｌｐ７、又はｓｌｐ８でありうる。
【０２０５】
特定の実施態様において、糸状菌細胞がアスペルギルス細胞である場合、全プロテアーゼ活性は、プロテアーゼの活性が低下していない、対応する親アスペルギルス細胞中での全プロテアーゼ活性の５０%以下まで低下される。
【０２０６】
特定の実施態様において、全プロテアーゼ活性は、本開示の細胞（例えば、トリコデルマ細胞）において、プロテアーゼ活性が低下していない、対応する親糸状菌細胞における全プロテアーゼ活性の４９%以下、３１%以下、１３%以下、１０%以下、６．３%以下、又は５．５%以下まで低下する。
【０２０７】
追加の組換え改変
特定の実施態様において、本開示の糸状菌細胞又はトリコデルマ菌細胞は、また、ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリチルマンノシルトランスフェラーゼの活性が低下している。ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリチルマンノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１３０）は、ドリチル−リン酸Ｄ−マンノースからのα−Ｄ−マンノシル残基を膜脂質連結オリゴ糖中に移す。典型的には、ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリチルマンノシルトランスフェラーゼ酵素は、ａｌｇ３遺伝子によりコードされる。このように、特定の実施態様において、糸状菌細胞は、ＡＬＧ３の活性が低下しており、それは、ａｌｇ３遺伝子によりコードされる活性である。一部の実施態様において、ａｌｇ３遺伝子は、対応するＡＬＧ３活性を低下させる変異を含む。特定の実施態様において、ａｌｇ３遺伝子、糸状菌細胞から欠失させる。
【０２０８】
他の実施態様において、本開示の糸状菌細胞又はトリコデルマ菌細胞は、α−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。α−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞において内在性でありうる、又は、それは宿主細胞に異種でありうる。これらのポリヌクレオチドは、効果的なエキソ−α−２−マンノシダーゼ切断を伴わず、ゴルジからＥＲに移された高マンノースグリカンを発現する糸状菌細胞について特に有用である。α−１，２−マンノシダーゼは、グリコシドヒドロラーゼファミリー４７（ｃａｚｙ．ｏｒｇ／ＧＨ４７＿ａｌｌ．ｈｔｍｌ）に属するマンノシダーゼＩ型酵素でありうる。特定の実施態様において、α−１，２−マンノシダーゼは、ｃａｚｙ．ｏｒｇ／ＧＨ４７＿ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ．ｈｔｍｌにリストされている酵素である。特に、α−１，２−マンノシダーゼは、糖タンパク質を切断するＥＲ型酵素（例えばＥＲ−α−マンノシダーゼＩ  ＥＣ３．２．１．１１３酵素のサブファミリー中の酵素など）でありうる。そのような酵素の例は、ヒトα−２−マンノシダーゼ１Ｂ（ＡＡＣ２６１６９）、哺乳動物ＥＲマンノシダーゼの組み合わせ、又は糸状菌酵素、例えばα−１，２−マンノシダーゼ（ＭＤＳ１）（Ｔリーゼイ  ＡＡＦ３４５７９；Maras M et al J Biotech.77, 2000, 255）などを含む。ＥＲ／ゴルジ発現のために、マンノシダーゼの触媒ドメインは、典型的には、標的化ペプチド（例えばＨＤＥＬ、ＫＤＥＬ、又はＥＲもしくは初期ゴルジタンパク質の一部など）と融合される、又は、動物もしくは植物のマンノシダーゼＩ酵素の内在性ＥＲ標的化構造を伴い発現される。例えば、Callewaert et al.2001 Use of HDEL-tagged Trichoderma reesei mannosyl oligosaccharide 1,2-a-D-mannosidase for N-glycan engineering in Pichia pastoris. FEBS Lett 503: 173-178を参照のこと。
【０２０９】
さらなる実施態様において、本開示の糸状菌細胞又はトリコデルマ菌細胞は、また、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン及びＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含む。そのような触媒ドメインは、非哺乳動物細胞において複合体Ｎグリカンを発現するために有用である。ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｌｃＮＡｃ−ＴＩ；  ＧｎＴＩ；  ＥＣ  ２．４．１．１０１）は、反応ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン＋３−（α−Ｄ−マンノシル）−β−Ｄ−マンノシル−Ｒ＜＝＞ＵＤＰ＋３−（２−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル）−α−Ｄ−マンノシル）−β−Ｄ−マンノシル−Ｒを触媒し、式中、Ｒは、グリカンアクセプターにおけるＮ連結オリゴ糖の残部を表す。ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインは、この反応を触媒することが可能であるＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ酵素の任意の部分である。ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｌｃＮＡｃ−ＴＩＩ；  ＧｎＴＩＩ；  ＥＣ  ２．４．１．１４３）は、反応ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン＋６−（α−Ｄ−マンノシル）−β−Ｄ−マンノシル−Ｒ＜＝＞ＵＤＰ＋６−（２−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル）−α−Ｄ−マンノシル）−β−Ｄ−マンノシル−Ｒを触媒し、式中、Ｒは、グリカンアクセプターにおけるＮ連結オリゴ糖の残部を表す。ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、この反応を触媒することが可能であるＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ酵素の任意の部分である。適したＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン及びＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインの例を、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０７０９５６号において見出すことが可能である。ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン及びＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、単一のポリヌクレオチドによりコードされうる。特定の実施態様において、単一のポリヌクレオチドは、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン及びＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含む融合タンパク質をコードする。あるいは、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインは、第１ポリヌクレオチドによりコードされうる。ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインは、第２ポリヌクレオチドによりコードされうる。
【０２１０】
糸状菌細胞又はトリコデルマ菌細胞がＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン及びＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含む実施態様において、細胞は、また、マンノシダーゼＩＩをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。マンノシダーゼＩＩ酵素は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５のＭＡＮ５構造を切断することが可能であり、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３を生成し、ＧｎＴＩＩの触媒ドメインの作用と組み合わせた場合、Ｇ０を生成する；さらに、ガラクトシルトランスフェラーゼの触媒ドメインの作用を用いて、Ｇ１及びＧ２を生成する。特定の実施態様において、マンノシダーゼＩＩ型酵素はグリコシドヒドロラーゼファミリー３８（ｃａｚｙ．ｏｒｇ／ＧＨ３８＿ａｌｌ．ｈｔｍｌ）に属する。そのような酵素の例は、ヒト酵素ＡＡＣ５０３０２、キイロショウジョウバエ酵素（Van den Elsen J.M. et al (2001) EMBO J. 20: 3008-3017）、ＰＤＢ参照１ＨＴＹに従った３Ｄ構造を伴うもの、及びＰＤＢ中の触媒ドメインを参照した他を含む。ＥＲ／ゴルジ発現のために、マンノシダーゼの触媒ドメインは、典型的には、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０７０９５６号においてリストされた又は配列番号５８９−５９４の標的化ペプチドを使用して、Ｎ末端標的化ペプチドと融合される。マンノシダーゼＩＩ型マンノシダーゼの触媒ドメインを用いた形質転換後、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３、ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３、又はＧ０を効果的に産生する株が選択される。
【０２１１】
先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、糸状菌細胞は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【０２１２】
先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、糸状菌細胞は、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。一般的には、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＣＡＺｙグリコシルトランスフェラーゼファミリー７（ｃａｚｙ．ｏｒｇ／ＧＴ７＿ａｌｌ．ｈｔｍｌ）に属する。有用なβ４ＧａｌＴ酵素の例は、β４ＧａｌＴ１、例えば、ウシＢｏｓ  ｔａｕｒｕｓ酵素ＡＡＡ３０５３４．１（Shaper N. L. et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.83 (6), 1573-1577 (1986)）、ヒト酵素（Guo S. et al. Glycobiology  2001, 11: 813-20）、及びハツカネズミ酵素ＡＡＡ３７２９７（Shaper, N.L. et al.1998 J. Biol.Chem. 263 (21), 10420-10428）を含む。糸状菌細胞が、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、本発明の特定の実施態様において、糸状菌細胞は、また、ＵＤＰ−Ｇａｌ４エピメラーゼ及び／又はＵＤＰ−Ｇａｌトランスポーターをコードするポリヌクレオチドを含む。糸状菌細胞が、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、本発明の特定の実施態様において、宿主細胞を培養する場合、ラクトースを、グルコースの代わりに炭素源として使用してもよい。培養培地は、ｐＨ４．５〜７．０の間又は５．０〜６．５の間でありうる。糸状菌細胞が、ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびに、場合により、ＵＤＰ−Ｇａｌ４エピメラーゼ及び／又はＵＤＰ−Ｇａｌトランスポーターをコードするポリヌクレオチドを含む、本発明の特定の実施態様において、二価陽イオン（例えばＭｎ２＋、Ｃａ２＋、又はＭｇ２＋など）を細胞培養培地に加えてもよい。
【０２１３】
先行する実施態様と組み合わせてもよい特定の実施態様において、宿主細胞におけるα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼの活性のレベルは、野生型宿主細胞における活性のレベルと比較して、低下される。特定の実施態様において、糸状菌は、野生型糸状菌細胞における発現のレベルと比較して、ｏｃｈｌ遺伝子の発現の低下レベルを有する。
【０２１４】
別の局面は、糸状菌細胞においてＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎグリカン［即ち、Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ］を産生する方法を含み、異種ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド及び、野生型糸状菌細胞における活性のレベルと比較して、ａｌｇ３マンノシルトランスフェラーゼの活性のレベルが低下している糸状菌細胞を提供すること、及び、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを産生するために糸状菌細胞を培養することの工程を含み、そこで、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンは、糸状菌細胞により分泌される中性Ｎグリカンの少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、又は１００%（モル%）を構成する。特定の実施態様において、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎグリカンは、異種ポリペプチドの全Ｎグリカンの少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、又は１００%（モル%）を表す。
【０２１５】
別の局面は、糸状菌細胞において複合体Ｎグリカン（即ち、末端ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３構造を含むＮグリカン）、例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２｛即ち、Ｇ０、即ち、ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ｝グリカンを産生する方法を含み、異種ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド及び、野生型糸状菌細胞における活性のレベルと比較して、ａｌｇ３マンノシルトランスフェラーゼの活性のレベルが低下している糸状菌細胞を提供すること、ならびに、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインをコードするポリヌクレオチド及びＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ならびに、複合体Ｎグリカン、例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを産生するために糸状菌細胞を培養することの工程を含み、そこで、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンは、糸状菌細胞により分泌される中性Ｎグリカンの少なくとも５%、少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、又は１００%（モル%）を構成する。特定の実施態様において、複合体Ｎグリカン、例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカンは、ポリペプチドの全Ｎグリカンの少なくとも５%、少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、又は１００%（モル%）を表す。特定の実施態様において、前記の複合体ＮグリカンはＧｌｃＮＡｃＭａｎ３及び／又はＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３である。
【０２１６】
別の局面は、糸状菌細胞においてＧ１もしくはＧ２  Ｎグリカン又はそれらの混合物、例えば、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２｛即ち、Ｇ１、即ち、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ｝又はＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ｝及び／又はＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２｛即ち、Ｇ２、即ち、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３（Ｇａｌβ４  ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ｝グリカンを産生する方法を含み、異種ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド及び、野生型糸状菌細胞における活性のレベルと比較して、ａｌｇ３マンノシルトランスフェラーゼの活性のレベルが低下している糸状菌細胞を提供すること、ならびに、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインをコードするポリヌクレオチド、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインをコードするポリヌクレオチド、及びＧａｌＴ触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ならびに、Ｇ１もしくはＧ２  Ｎグリカン又はそれらの混合物を産生するために糸状菌細胞を培養することの工程を含み、そこで、Ｇ１グリカンは、糸状菌細胞により分泌される中性Ｎグリカンの少なくとも５%、少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、又は１００%（モル%）を構成する、あるいは、そこで、そこで、Ｇ２グリカンは、糸状菌細胞により分泌される中性Ｎグリカンの少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、又は１００%（モル%）を構成する。特定の実施態様において、Ｇ１グリカンは、ポリペプチドの全Ｎグリカンの少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、又は１００%（モル%）を構成する。特定の実施態様において、Ｇ２グリカンは、ポリペプチドの全Ｎグリカンの少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、又は１００%（モル%）を構成する。
【０２１７】
特定の実施態様において、複合体Ｎグリカンを産生する方法は、異なるグリカンの混合物を生成する。複合体Ｎグリカン又はＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２は、そのようなグリカン混合物の少なくとも５%、少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%）、又は少なくとも９０%もしくはそれ以上を構成しうる。特定の実施態様において、ポリペプチドのＮグリカンの少なくとも５%、少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%）、又は少なくとも９０%もしくはそれ以上が、そのようなグリカン混合物からなる。特定の実施態様において、複合体ならびにＧ１及び／又はＧ２  Ｎグリカンを産生する方法は、異なるグリカンの混合物を生成する。複合体Ｎグリカン、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇ１及び／又はＧ２が、そのようなグリカン混合物の少なくとも５%、少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%）、又は少なくとも９０%もしくはそれ以上を構成しうる。特定の実施態様において、ポリペプチドのＮグリカンの少なくとも５%、少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%）、又は少なくとも９０%もしくはそれ以上が、そのようなグリカン混合物からなる。
【０２１８】
特定の実施態様において、ハイブリッドＮグリカンを産生する方法が望ましい。本明細書において使用する通り、用語「ハイブリッド」は、非置換の末端マンノース残基（高マンノース型グリカン中に存在する通り）及びＮアセチルグルコサミン連結を伴う置換マンノース残基（例えば、ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３［Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ）の両方を含むグリカンを意味する。そのような実施態様において、Ｍａｎ５｛即ち、Ｍａｎα３［Ｍａｎα３（Ｍａｎα６）Ｍａｎα６］Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ｝を発現する糸状菌細胞（例えばＴリーゼイ株など）を、異種ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド及びＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドを用いて形質転換し、糸状菌細胞を培養し、ハイブリッドＮグリカンを産生し、そこで、ハイブリッドＮグリカンは、糸状菌細胞により分泌される中性Ｎグリカンの少なくとも５%、少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、又は１００%（モル%）を構成する。特定の実施態様において、ポリペプチドのＮグリカンの少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも６０%、少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、又は１００%（mol%）は、ハイブリッドＮグリカンからなる。
【０２１９】
Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、複合体、ハイブリッド、Ｇ１、及びＧ２  Ｎグリカンを、アミノ酸、ペプチド、及びポリペプチドより選択される分子に付着させる。特定の実施態様において、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、複合体、ハイブリッド、Ｇ１、及びＧ２  Ｎグリカンを、異種ポリペプチドに付着させる。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、グリコシル化タンパク質である。特定の実施態様において、グリコシル化ポリペプチドは、哺乳動物ポリペプチドである。特定の実施態様において、哺乳動物ポリペプチドは、抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２２０】
特定の実施態様において、グリコシルトランスフェラーゼ、又は例えば、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、もしくはＧａｌＴ又はグリコシルヒドロラーゼ、例えば、α−１，２−マンノシダーゼもしくはマンノシダーゼＩＩは、触媒ドメインに連結されたた標的化ペプチドを含む。用語「連結された」は、本明細書において使用する通り、ポリペプチドの場合においてアミノ酸残基の２つのポリマー又はポリヌクレオチドの場合においてヌクレオチドの２つのポリマーが、互いに直接的に隣接して共役されている、又は同じポリペプチドもしくはポリヌクレオチド内にあるが、しかし、介在するアミノ酸残基又はヌクレオチドをにより分離されていることを意味する。「標的化ペプチド」は、本明細書において使用する通り、糸状菌細胞内の小胞体（ＥＲ）又はゴルジ装置（ゴルジ）に組換えタンパク質を局在化することが可能である組換えタンパク質の連続したアミノ酸残基の任意の数を指す。標的化ペプチドは、触媒ドメインへのＮ末端又はＣ末端でありうる。特定の実施態様において、標的化ペプチドは、触媒ドメインへのＮ末端である。特定の実施態様において、標的化ペプチドは、ＥＲ又はゴルジ膜への直接的な結合を提供する。標的化ペプチドの構成成分は、ＥＲ又はゴルジ装置中に通常属する任意の酵素に由来しうる。そのような酵素は、マンノシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、２型ゴルジタンパク質、ならびにＭＮＮ２、ＭＮＮ４、ＭＮＮ６、ＭＮＮ９、ＭＮＮ１０、ＭＮＳ１、ＫＲＥ２、ＶＡＮ１、及びＯＣＨ１酵素を含む。適した標的化ペプチドは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０７０９５６号に記載されている。一実施態様において、ＧｎＴＩ又はＧｎＴＩＩの標的化ペプチドは、ヒトＧｎＴＩＩ酵素である。他の実施態様において、標的化ペプチドは、トリコデルマＫｒｅ２、Ｋｒｅ２様、Ｏｃｈ１、Ａｎｐ１、及びＶａｎ１から由来する。一実施態様において、標的化ペプチドは、配列番号５８９〜５９４の群より選択される。
【０２２１】
本発明の糸状菌細胞の使用
本明細書における本発明は、さらに、少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下しているか又はプロテアーゼ活性が無く、異種ポリペプチド（例えば哺乳動物ポリペプチドなど）をコードする組換えポリヌクレオチドを含み、異種ポリペプチドの安定性を改善するために及び異種ポリペプチドを作るために、増加したレベルで産生される、本開示の糸状菌細胞（例えばトリコデルマ菌細胞など）のいずれかを使用する方法に関する。タンパク質の安定性を測定する及び異種ポリペプチドを作るための方法は周知であり、及び、限定を伴わず、本開示において記載の全ての方法及び技術を含む。
【０２２２】
したがって、本開示の特定の実施態様は、以下により、異種ポリペプチドを改善する方法に関する：ａ）少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下しているか又は無活性である、本開示の糸状菌細胞を提供すること（そこで、細胞は、異種ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドをさらに含む）；及びｂ）異種ポリペプチドが発現されるように細胞を培養すること（そこで、異種ポリペプチドは、プロテアーゼをコードする遺伝子の変異を含まない宿主細胞と比較して、増加した安定性を有する）。本開示の他の実施態様は、以下により、哺乳動物ポリペプチドの安定性を改善する方法に関する：ａ）少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下しているか又は無活性である、本開示のトリコデルマ菌細胞を提供すること（そこで、細胞は、哺乳動物ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドをさらに含む）；及びｂ）哺乳動物ポリペプチドが発現されるように細胞を培養すること（そこで、哺乳動物ポリペプチドは、プロテアーゼをコードする遺伝子の変異を含まない宿主細胞と比較して、増加した安定性を有する）。糸状菌細胞又はトリコデルマ菌細胞は、「本発明の糸状菌細胞」と表題の付けられたセクションにおいて記載の任意の細胞でありうる。ポリペプチドの安定性を測定し、糸状菌細胞及びトリコデルマ菌細胞を培養するための方法は、当技術分野において周知であり、限定を伴わず、本開示において記載の全ての方法及び技術を含む。
【０２２３】
特定の実施態様において、異種ポリペプチド又は哺乳動物ポリペプチドの安定性は、対応する親糸状菌細胞又はトリコデルマ菌細胞において発現された異種ポリペプチド又は哺乳動物ポリペプチドと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍又はそれより大きな倍でより高く増加する。
【０２２４】
本開示の他の実施態様は、以下により、異種ポリペプチドを作製する方法に関する：ａ）少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下しているか又は無活性である、本開示の糸状菌細胞を提供すること（そこで、細胞は、異種ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドをさらに含む）；ｂ）異種ポリペプチドが発現されるように宿主細胞を培養すること；及びｃ）異種ポリペプチドを精製すること。本開示のさらなる実施態様は、以下により、哺乳動物ポリペプチドを作製する方法に関する：ａ）少なくとも３つのプロテアーゼの活性が低下しているか又は無活性である、本開示のトリコデルマ菌細胞を提供すること（そこで、細胞は、哺乳動物ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドをさらに含む）；ｂ）哺乳動物ポリペプチドが発現されるように宿主細胞を培養すること；及びｃ）哺乳動物ポリペプチドを精製すること。糸状菌細胞又はトリコデルマ菌細胞は、「本発明の糸状菌細胞」と表題の付けられたセクションにおいて記載の任意の細胞でありうる。糸状菌細胞及びトリコデルマ菌細胞を培養し、ポリペプチドを精製する方法は、当技術分野において周知であり、限定を伴わず、本開示において記載の全ての方法及び技術を含む。
【０２２５】
特定の実施態様において、糸状菌細胞又はトリコデルマ菌細胞を、ｐＨ３．５〜７；ｐＨ３．５〜６．５；ｐＨ４〜６；ｐＨ４．３〜５．７；ｐＨ４．４〜５．６；及びｐＨ４．５〜５．５より選択されるｐＨ範囲で培養する。特定の実施態様において、抗体を産生するために、糸状菌細胞又はトリコデルマ菌細胞を、ｐＨ４．７〜６．５；ｐＨ４．８〜６．０；ｐＨ４．９〜５．９；及びｐＨ５．０〜５．８より選択されるｐＨ範囲で培養する。
【０２２６】
一部の実施態様において、異種ポリペプチドは哺乳動物ポリペプチドである。他の実施態様において、異種ポリペプチドは非哺乳動物ポリペプチドである。
【０２２７】
特定の実施態様において、哺乳動物ポリペプチドは、免疫グロブリン、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、モノクローナル抗体、ハイブリッド抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）抗体フラグメント、Ｆｖ分子、単一鎖Ｆｖ抗体、二量体抗体フラグメント、三量体抗体フラグメント、機能的な抗体フラグメント、単一ドメイン抗体、多量体単一ドメイン抗体、イムノアドヘシン、インスリン様成長因子１、成長ホルモン、インスリン、及びエリスロポエチンより選択される。他の実施態様において、哺乳動物タンパク質は免疫グロブリン又はインスリン様成長因子１である。さらに他の実施態様において、哺乳動物タンパク質は抗体である。さらなる実施態様において、哺乳動物ポリペプチドの収量は、少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５グラム／リットルである。特定の実施態様において、哺乳動物ポリペプチドは、抗体、場合により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４である。さらなる実施態様において、抗体の収量は、少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５グラム／リットルである。さらなる他の実施態様において、哺乳動物ポリペプチドは、成長因子又はサイトカインである。さらなる実施態様において、成長因子又はサイトカインの収量は、少なくとも０．１、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５グラム／リットルである。さらなる実施態様において、哺乳動物ポリペプチドは抗体であり、抗体は、追加のアミノ酸残基を伴わない自然抗体Ｃ末端及びＮ末端の少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、又は少なくとも９８%を含む。他の実施態様において、哺乳動物ポリペプチドは抗体であり、抗体は、任意のＣ末端又はＮ末端アミノ酸残基を欠かない自然抗体Ｃ末端及びＮ末端の少なくとも７０%、少なくとも８０%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、又は少なくとも９８%を含む。
【０２２８】
哺乳動物ポリペプチドが細胞培養から精製される特定の実施態様において、哺乳動物ポリペプチドを含む培養は、産生されたポリペプチドの質量の５０%未満、４０%未満、３０%未満、２０%未満、又は１０%未満である質量パーセンテージを構成するポリペプチドフラグメントを含む。特定の好ましい実施態様において、哺乳動物ポリペプチドは抗体であり、ポリペプチドフラグメントは、重鎖フラグメント及び／又は軽鎖フラグメントである。哺乳動物ポリペプチドが抗体及び細胞培養から精製された抗体である他の実施態様において、抗体を含む培養は、産生された抗体の質量の５０%未満、４０%未満、３０%未満、２０%未満、又は１０%未満である質量パーセンテージを構成する遊離の重鎖及び／又は軽鎖を含む。ポリペプチドフラグメントの質量パーセンテージを決定する方法は、当技術分野において周知であり、ＳＤＳ−ゲルからのシグナル強度を測定することを含む。
【０２２９】
さらなる実施態様において、非哺乳動物ポリペプチドは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ。キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、及びキシラナーゼより選択される。
【０２３０】
開示する方法のいずれかの特定の実施態様において、方法は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、あるいは５つ以上のプロテアーゼ阻害剤を提供するさらなる工程を含む。特定の実施態様において、プロテアーゼ阻害剤は、哺乳動物ポリペプチドと同時発現されるペプチドである。他の実施態様において、阻害剤は、アスパラギン酸プロテアーゼ、トリプシン様セリンプロテアーゼ、スブチリシンプロテアーゼ、及びグルタミン酸プロテアーゼより選択されるプロテアーゼファミリーからの少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つのプロテアーゼを阻害する。
【０２３１】
開示する方法のいずれかの特定の実施態様において、糸状菌細胞又はトリコデルマ菌細胞は、また、担体タンパク質を含む。本明細書において使用する通り、「担体タンパク質」は、糸状菌細胞又はトリコデルマ菌細胞に内在性であり、それらにより高度に分泌されたタンパク質の部分である。適した担体タンパク質は、限定を伴わず、ＴリーゼイのマンナナーゼＩ（Ｍａｎ５Ａ、又はＭＡＮＩ）、ＴリーゼイのセロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ、又はＣＢＨＩＩ）（例えば、Paloheimo et al Appl. Environ. Microbiol. 2003 December; 69(12): 7073-7082を参照のこと）、又はＴリーゼイのセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）を含む。一部の実施態様において、担体タンパク質はＣＢＨ１である。他の実施態様において、担体タンパク質は、ＣＢＨ１コア領域及びＣＢＨ１リンカー領域の部分を含む切断Ｔリーゼイ  ＣＢＨ１タンパク質である。一部の実施態様において、担体、例えばセロビオヒドロラーゼ又はそのフラグメントなどを、抗体軽鎖及び／又は抗体重鎖に融合する。一部の実施態様において、担体、例えばセロビオヒドロラーゼ又はそのフラグメントなどを、インスリン様成長因子１、成長ホルモン、インシュリン、インターフェロンα２ｂ、線維芽細胞増殖因子２１、又はヒト血清アルブミンに融合する。一部の実施態様において、担体−抗体融合ポリペプチドは、Ｋｅｘ２切断部位を含む。特定の実施態様において、Ｋｅｘ２、又は他の担体切断酵素は、糸状菌細胞に内在性である。特定の実施態様において、担体切断酵素は、糸状菌細胞に異種性であり、例えば、酵母から由来する別のＫｅｘ２タンパク質又はＴＥＶプロテアーゼである。特定の実施態様において、担体切断酵素が過剰発現される。
【０２３２】
本発明を、その特定の具体的な実施態様と併せて記載してきたが、先の記載が、本発明の範囲を例示し、限定しないことを意図することを理解すべきである。本発明の範囲内の他の局面、利点、及び改変は、本発明に関係する当業者には明かであろう。
【０２３３】
記載されている本発明、以下の実施例を、限定の方法ではなく、例示の方法により与え、対象発明を例示する。
【０２３４】
実施例
実施例１  −  トリコデルマ・リーゼイにおけるアスパラギン酸プロテアーゼの同定
この実施例は、抗体の重鎖及び軽鎖を分解するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔリーゼイ）培養上清からのアスパラギン酸プロテアーゼの能力を実証する。
【０２３５】
アスパラギン酸プロテアーゼ精製
Ｔリーゼイ上清中のプロテアーゼ活性がアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤ペプスタチンＡを用いて阻害されうることが見出された。従って、ペプスタチンＡ（Sigma  ＃Ｐ２０３２）を、ジアミノジプロピルアミンリンカーを介してアガロースビーズに付着させ、精製用の親和性樹脂として使用した。Ｔリーゼイのフェドバッチ発酵上清（１５ml）を使用し、プロテアーゼを、５０mM酢酸ナトリウム、０．２M  ＮａＣｌ、ｐＨ３．０を含む３５mlの緩衝液中の樹脂にバッチ結合させた。カラムを、同じ結合緩衝液を用いて洗浄し、結合タンパク質を、溶出緩衝液（５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）を用いて溶離した。０．５mlの分画を収集した。全体で、４２μgのプロテアーゼを精製した。ピーク分画は、０．０４μg/μlのタンパク質を含んだ。各々の分画の３０μlを、βメルカプトエタノールを含む６μlのＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液と混合した。サンプルを、広範囲の前染色分子量マーカー（BioRad）と共に、４〜１５%ＰＡＧＥゲル（BioRad mini-protean TGXプレキャストゲル）にロードする前に９５℃で５分間にわたり加熱した。ゲルは、３０分間にわたり１００ＶでＳＤＳ  ＰＡＧＥ泳動緩衝液中に流し、次に、GelCode（Thermo Scientific）ブルー染色を用いて染色した。
【０２３６】
４２kDの２重バンドをペプスタチンＡ親和性カラム中で精製し（図１）、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルから切り出し、配列決定グレード改変トリプシン（Promega  ＃Ｖ５１１１）を用いたゲル内トリプシン消化に供した。結果として得られたペプチドを、次に、ゲルから抽出し、C18 ZipTip（Millipore  ＃ＺＴＣ１８Ｍ０９６）により精製した。精製ペプチドを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより、QSTAR Pulsar, ESI−ハイブリッド四極子−TOF（AB Sciex）上で分析した。
【０２３７】
この分析では、非常に類似の分子量を有する４つのアスパラギン酸プロテアーゼの同定がもたらされた。同定されたプロテアーゼは、ｐｅｐ１（Ｔｒｅ７４１５６；４２．７ｋＤ、４２%配列カバー率）、ｐｅｐ２（Ｔｒｅ５３９６１；４２．４kD、１５%配列カバー率）、ｐｅｐ３（Ｔｒｅ１２１１３３；４９kD、６%配列カバー率）、及びｐｅｐ５（Ｔｒｅ８１００４；４５kD、９%配列カバー率）を含んだ。これらのアスパラギン酸プロテアーゼは、ＰＡＧＥゲル中で類似の分子量で流れた。それらのアミノ酸配列の類似性は、５１%〜６４%の間である。
【０２３８】
ピーク分画（Ｆ３）からのタンパク質（０．８μg）を、クエン酸ナトリウム緩衝液（５０mM、ｐＨ５．５）中のＩｇＧ（５０μg/ml）を用いて、３７℃で２０時間にわたりインキュベートした（図２）。タンパク質を、１０μＭペプスタチンＡの存在又は非存在のいずれかにおいてインキュベートした。抗体混合物を、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液と合わせ、９５℃で５分間にわたり加熱した。これらのサンプルを、次に、４〜１５%  ＰＡＧＥゲル（BioRad mini-protean TGXプレキャストゲル）中に、広範囲の前染色分子量マーカー（BioRad）と共にロードした。ゲルを、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ泳動緩衝液中で３０分間にわたり１００Vで流した。ＩｇＧは、ゲル上で流される前に還元しなかった。完全サイズのＩｇＧは、２００kDaマーカーの真上に流れる。図２における非還元ゲル中に見ることができる通り、アスパラギン酸プロテアーゼは、ＩｇＧの軽度の分解を産生することができた。さらに、ＩｇＧ分解は、ペプスタチンＡにより阻害された。アスパラギン酸プロテアーゼ活性は、酸性ｐＨよりも、ｐＨ５．５でより限定的であったが、そこでは、それらは最大活性を有していた。
【０２３９】
ｐｅｐ１欠失の分析
アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ１プロテアーゼを、次に、テストし、Ｔリーゼイにおけるその存在量を決定した。これは、ｐｅｐ１欠失株Ｍ１８２由来の上清サンプルからアスパラギン酸プロテアーゼを精製することにより実施した。Ｍ１８２  ｐｅｐ１欠失株は、また、リツキシマブ抗体を産生する。
【０２４０】
基本株Ｍ１２４において作製されたＭ１８１  ｐｅｐ１欠失株は、大型振盪フラスコ培養中で、Ｍ１２４コントロールフラスコと共に成長させた。培養物を、４g/Lラクトース、２g/L粕抽出物、及び１００mM  ＰＩＰＰＳ，  ｐＨ５．５を伴う３００mlのＴｒＭＭ中で成長させた。３つの異なるモデル抗体を、親株の発酵培養上清中での比較として、ｐｅｐ１欠失株及びその親株Ｍ１２４の撹拌フラスコ培養上清（クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５中で２mg/ml希釈）中でインキュベートした（０．０５μg/μl最終濃度）。抗体を含む５日目の培養物からの上清サンプル（３０μl）を、４〜１５%ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル中にロードし、ＴＢＳＴ中で１：３０，０００に希釈した、抗重鎖ＡＰコンジュゲート抗体（Sigma＃Ａ３１８８）又は抗軽鎖抗体ＡＰコンジュゲート（Sigma＃Ａ３８１３）を用いた免疫ブロッティングのためにニトロセルロースに移した。１８時間にわたり一晩抗体とインキュベートした場合、Δｐｅｐ１上清は、Ｍ１２４コントロール株又は発酵上清（ｐＨ５，５；２８℃；２０g/L粕抽出物、６０g/Lラクトース）と比較し、重鎖タンパク質でより少なく分解した（図３９）。重鎖は、軽鎖と比較し、分解により感受性であった。最も大きな安定化効果が、リツキシマブ及びＭＡＢ０１の重鎖について明白であった。重鎖において、２つの別個の分解産物が、〜４８kD及び〜３８kDで見ることができる（図３９）。コントロールと比較し、Δｐｅｐ１上清中の軽鎖タンパク質の安定性におけるわずかな改善があった（図３９）。
【０２４１】
ｐｅｐ１欠失プラスミドの生成
ｐｅｐ１についての第１欠失コンストラクト（ＴｒｅＩＤ７４１５６）を、成功裏の組込み、及び、それによる、その後のプロテアーゼ遺伝子欠失のための選択マーカーのリサイクル後にトリコデルマ・リーゼイゲノムからの選択マーカーの除去を可能にするように設計した。このアプローチにおいて、マーカーのリサイクル、即ち、欠失コンストラクトからのｐｙｒ４遺伝子の除去は、酵母のために開発された、いわゆるブラスターカセットに似ている（Hartl, L. and Seiboth, B., 2005, Curr Genet 48: 204-211；及びAlani, E. et al., 1987, Genetics 116: 541-545）。類似のブラスターカセットが、また、ヒポクレア・ジェコリナ（アナモルフ：Ｔリーゼイ）を含む糸状菌について開発されている（Hartl, L. and Seiboth, B., 2005, Curr Genet 48:204-211）。
【０２４２】
ＴｒｅＩＤ番号は、Joint Genome Instituteトリコデルマ・リーゼイｖ２．０ゲノムデータベースから特定のプロテアーゼ遺伝子の識別番号を指す。欠失プラスミドの構築のためのプライマーを、「目により」又はＰｒｉｍｅｒ３ソフトウェア（Primer3 website, Rozen and Skaletsky (2000) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology.Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386）を使用して設計した。
【０２４３】
ｐｙｒ４をマーカー遺伝子として使用したブラスターカセットの原理は、以下の通りである：ｐｙｒ４は、Ｔリーゼイのオロチジン−５’−一リン酸（ＯＭＰ）デカルボキシラーゼ（Smith, J.L., et al., 1991, Current Genetics 19:27-33）をコードし、ウリジン合成のために必要とされる。ＯＭＰデカルボキシラーゼ活性について欠損した株は、ウリジン添加を伴わずに、最少培地上で成長することができない（即ち、ウリジン栄養要求性である）。ＯＭＰデカルボキシラーゼ活性を欠く変異株（ｐｙｒ４−株）の生成における５フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）の利用は、ＯＭＰデカルボキシラーゼによる５−ＦＯＡの毒性中間体５フルオＵＭＰへの変換に基づく。従って、変異ｐｙｒ４遺伝子を有する細胞は、５−ＦＯＡに耐性があるが、しかし、加えて、また、ウリジンについて栄養要求性である。５−ＦＯＡ耐性は、原則として、また、別の遺伝子（ｐｙｒ２、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）における変異からもたらされ、従って、この選択を用いて得られた自然発生変異体は、ｐｙｒ４遺伝子を用いて変異体を補完することにより、ｐｙｒ４−遺伝子型について検証する必要がある。一旦変異すると、ｐｙｒ４遺伝子は、Ｔリーゼイにおける栄養要求性選択マーカーとして使用することができる。本発明者らのブラスターカセットにおいて、ｐｙｒ４にはｐｙｒ４の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の３０８bpダイレクトリピートが続き、欠失させるべき遺伝子の５’及び３’隣接領域により囲まれる。欠失カセットの組込みは、ｐｙｒ４機能を介して選択される。ｐｙｒ４マーカーの除去を、次に、５−ＦＯＡの存在において、２つの相同領域（５’ＵＴＲのダイレクトリピート）間の組換えにより強制し、選択マーカーからループアウトをもたらし、遺伝子欠失の連続ラウンドにおいて同じブラスターカセット（ｐｙｒ４ループアウト）の利用を可能にする。ループアウト後、５’ＵＴＲの３０８ｂｐ配列だけが、遺伝子座中に残る。
【０２４４】
このように、ｐｙｒ４選択マーカー及び５’ダイレクトリピートフラグメント（ｐｙｒ４５’ＵＴＲの３０８bp）を、プラスミドｐＡＲＯ５０２（Ｔリーゼイｐｙｒ４のゲノムコピーを含む）をテンプレートとして使用したＰＣＲにより産生した。ＰＣＲ増幅を、Phusionポリメラーゼ及びＨＦ緩衝液又はＧＣ緩衝液のいずれかを用いて、あるいはDynazyme EXTポリメラーゼを用いて実施した。反応条件は、増幅されているフラグメントに基づいて変動した。両方のフラグメントが、酵母における相同組換えを使用して、ループアウトカセットを伴うプラスミドをクローン化するために必要とされる４０bp重複配列を含んだ（下を参照のこと）。可能な追加のクローニング工程を可能にするために、ＡｓｃＩ消化部位を、ｐｙｒ４マーカーと５’ダイレクトリピートの間に、ＮｏｔＩ部位を、完全ブラスターカセットを囲むように置いた。
【０２４５】
５’隣接領域の１０６６bp及び３’隣接領域の１０３７bpを、ｐｅｐ１欠失プラスミドの基礎として選択した。フラグメントを、ＰＣＲにより産生した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。隣接領域の増幅において使用されるテンプレートＤＮＡは、Ｔリーゼイ野生型株ＱＭ６ａ（ＡＴＣＣ１３６３１）からであった。
【０２４６】
クローニングにおいて使用した酵母相同組換え系のために、ベクターのための重複配列及び選択マーカーを、適切なＰＣＲプライマーに置いた。コンストラクトにおいてマーカースイッチを可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位を、隣接領域と選択マーカーの間に導入した。ＰｍｅＩ制限部位を、Ｔリーゼイ中への形質転換前のベクター配列の除去のために、ベクターと隣接領域の間に置いた。ベクター骨格ｐＲＳ４２６を、制限酵素（ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ）を用いて消化した。制限フラグメントを、次に、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。
【０２４７】
欠失プラスミドを構築するために、ベクター骨格ならびに適切なマーカー及び隣接領域フラグメントを、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（株Ｈ３４８８／ＦＹ８３４）中に形質転換した。酵母形質転換プロトコールは、Ｃｏｌｏｔ及びＣｏｌｌｏｐｙのニューロスポラノックアウトワークショップ材料において記載された相同酵母組換えのための方法（Ｄａｒｔｍｏｕｔｈニューロスポラゲノムプロトコールのウェブサイト）、及びＧｉｅｔｚ実験室プロトコール（University of Manitoba, Gietz実験室のウェブサイト）に基づいた。酵母形質転換体からのプラスミドＤＮＡを、大腸菌中への形質転換によりレスキューした。数個のクローンを培養し、プラスミドＤＮＡを単離し、消化し、正確な組換えについて、標準的な実験方法を使用してスクリーニングした。正確な挿入サイズを伴う数個のクローンを配列決定し、保存した。
【０２４８】
ｐｅｐ１についての第１欠失プラスミド（プラスミドｐＴＴｖ４１、表１．１）では、別の選択マーカー、ｂａｒ、ストレプトマイセス属のホスフィノトリシンＮアセチルトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：  ＡＦ０１３６０２．１，Sweigard et al, 1997, Fungal Genet Newsl 44:52-53）を保有する合成コンストラクトを使用した。隣接領域及びマーカーフラグメントをＰＣＲにより産生し、上に記載の酵母組換え方法を使用してプラスミドに組み込んだ。第２のｐｅｐ１欠失プラスミド（ｐＴＴｖ７１、表１．１）をクローン化するために、ｂａｒマーカーを、欠失プラスミドｐＴＴｖ４１から、ＮｏｔＩ消化を用いて除去し、酵母相同組換え系を使用して、上に記載のｐｙｒ４ブラスターカセットにより置換した。ｐｅｐ１についてのこれらの欠失プラスミド（ｐＴＴｖ４１及びｐＴＴｖ７１）は、ｐｅｐ１遺伝子座における１８７４bpの欠失をもたらし、ＰＥＰ１の完全コード配列をカバーする。
【０２４９】
【表１】
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【０２５０】
ｐｅｐ１欠失株Ｍ１８１及びＭ１９５の生成
選択マーカーのリサイクルを許し、その後のプロテアーゼ遺伝子の迅速な欠失を許すために、ｐｅｐ１を、上に記載のｐｙｒ４ブラスターカセットを使用して、Ｍ１２７（基本株Ｍ１２４のｐｙｒ４−変異体）から欠失させた。ベクター配列を除去するために、プラスミドｐＴＴｖ７１（Δｐｅｐ１−ｐｙｒ４）を、ＰｍｅＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、アガロースゲルから、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。ｐｅｐ１欠失カセットの約５μgを使用し、株Ｍ１２７を形質転換した。プロトプラストの調製及びｐｙｒ４選択のための形質転換を、本質的に、Penttila et al.（1987, Gene 61:155-164）及びGruber et al.（1990, Curr.Genet.18:71-76）における方法に従って行った。
【０２５１】
２００クローンを、選択的ストリークとして採取した。選択的ストリークとして速く成長する２４の形質転換体を、表１．２にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより、正確な組込みについて、標準的な実験室方法を使用してスクリーニングした。７つの推定破壊株を、単一細胞クローンにまで精製した。ｐｅｐ１の欠失は、標準的な実験室方法を使用し、これらのクローンからのサザン分析により検証した（図３Ａ）。サザン分析用のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ単離用のEasy-DNAキット（Invitrogen）を用いて抽出した。サザン分析を、本質的に、Sambrook et al.(1989, Molecular Cloning: A laboratory manual.2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press)における相同ハイブリダイゼーション用のプロトコールに従い、放射性標識（３２Ｐ）、HexaLabel Plus、又はDecaLabel Plusキット（Fermentas）を使用して実施した。サザン消化スキームは、Windows 95用のSci Ed Central（Clone Manager 5 for Windows 95）又はGeneious Pro 5.3.6ソフトウェア（Geneiousウェブサイト）のいずれかを使用して設計された。サザン分析では、また、クローンの４つが、単一組込み体であることが検証された（図３Ｂ及び３Ｃ）。３つのクローンが、欠失カセットの複数の又は不正確な組込みを示し、廃棄された。２つの純粋なクローンを、株番号Ｍ１８１（９−２０Ａ−１）及びＭ１９５（９−３５Ａ−１）を用いて命名した。
【０２５２】
リツキシマブ産生ｐｅｐ１欠失株Ｍ１８２の生成
ベクター配列を除去するために、プラスミドｐＴＴｖ４１（Δｐｅｐ１−ｂａｒ）を、ＰｍｅＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、アガロースゲルから、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。ｐｅｐ１欠失カセットの約５μgを使用し、株Ｍ１６９（調和リツキシマブ抗体を発現する）を形質転換した。プロトプラストの調製及び形質転換を、Penttila et al.(1987)及びAvalos et al.(1989)に記載されている方法に従って行った。
【０２５３】
約１００クローンを、選択的ストリークとして採取した。選択的ストリークとして速く成長する２４の形質転換体を、（表１．２にリストするプライマーを使用した）ＰＣＲにより、正確な組込みについて、標準的な実験室方法を使用してスクリーニングした。８つの推定破壊株を、単一細胞クローンにまで精製した。ｐｅｐ１の欠失は、Ｍ１８１及びＭ１９５について上に記載の標準的な実験室方法を使用し、５つのクローンからのサザン分析により検証した（図４Ａ）。サザン分析では、また、クローンの４つが、単一組込み体であることが検証された（図４Ｂ及び４Ｃ）。１つのクローンが、欠失カセットの複数の又は不正確な組込みを示し、廃棄された。１つの純粋なクローン（１１−１Ａ）を、株番号Ｍ１８２を用いて命名した。
【０２５４】
【表２】
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【０２５５】
リツキシマブ産生ｐｅｐ１欠失株Ｍ１８２の分析
Ｍ１８２株を、２０g/l粕抽出物、６０g/lラクトース、及び８．１g/lカザミノ酸を添加したトリコデルマ最少培地（ＴｒＭＭ）中で、ｐＨ５．５及び２８℃で成長させた。７マイクログラムのアスパラギン酸プロテアーゼを、１５mlの上清から回収した。精製分画を４〜１５%ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル（BioRad mini-protean TGXプレキャストゲル）上で流した場合、親株において以前に見られた４２kD分子量のバンドが消失した（図５）。約４０kDのかすかなバンドを見ることができた。４０kDのバンドは、マイナーなアスパラギン酸プロテアーゼに対応しうる。第２精製は、ｐｅｐ１が存在していた培養上清から行われた。Ｍ１６９株はリツキシマブを産生し、ｐｅｐ１プロテアーゼ欠失を含まなかった。株を、２０g/l粕抽出物、６０g/lラクトース、及び８．１g/lカザミノ酸を添加したトリコデルマ最少培地中で、ｐＨ５．５及び２８℃で成長させた。１７μgのアスパラギン酸プロテアーゼを１５mlの上清から精製し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上で４２kDバンドを示した（図５）。この分析に従い、約１０μgのｐｅｐ１プロテアーゼが、培養上清１５ml当たりで産生される。それは、全アスパラギン酸プロテアーゼの約６０%及び上清中の全タンパク質含量のわずか約０．０４%である。このデータは、ｐｅｐ１がＴリーゼイにおいて最も豊富に存在するアスパラギン酸プロテアーゼであることを実証する。
【０２５６】
他のアスパラギン酸プロテアーゼの分析
ｐｅｐ２の欠失は、抗体の重鎖産生及び低下した全プロテアーゼ活性におけるわずかな改善を示した（図６及び７）。
【０２５７】
従って、ｐｅｐ３及びｐｅｐ５は、特にｐｅｐ１／ｔｓｐ１／ｓｌｐ１  ３重欠失株において欠失させるべき次の重要なプロテアーゼである。なぜなら、それらは、依然として、３重欠失株上清中の残存プロテアーゼ活性の半分まで貢献するからである。
【０２５８】
ｐｅｐ２欠失プラスミドの生成
アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ２（ＴｒｅＩＤ００５３９６１）についてのｐＴＴｖ９６欠失プラスミドを、本質的に、上のｐＴＴｖ４１  ｐｅｐ１欠失プラスミドについて記載される通りに構築した。５’隣接領域の９２０bp及び３’隣接領域の１０８１bpを、ｐｅｐ２欠失プラスミドの基礎として選択した。隣接領域フラグメントを、表１．３にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより産生した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。隣接領域のＰＣＲにおいて使用されるテンプレートＤＮＡは、Ｔリーゼイ野生型株ＱＭ６ａからであった。ｂａｒカセットを、ｐＴＴｖ４１から、ＮｏｔＩ消化を用いて得た。ベクター骨格は、上のｐＴＴｖ４１についての通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であった。プラスミドを、上のｐＴＴｖ４１について記載の酵母相同組換え方法を使用して構築した。ｐｅｐ２についてのこの欠失プラスミド（ｐＴＴｖ９６）は、ｐｅｐ２遺伝子座における１４３７bpの欠失をもたらし、ＰＥＰ２の完全コード配列をカバーする。
【０２５９】
【表３】
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【０２６０】
リツキシマブ産生ｐｅｐ２欠失株Ｍ４５５の生成
ベクター配列を除去するために、プラスミドｐＴＴｖ９６（Δｐｅｐ２−ｂａｒ）を、ＰｍｅＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、アガロースゲルから、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。ｐｅｐ２欠失カセットの約６μgを使用し、株Ｍ１６９（調和リツキシマブ抗体を発現する）を形質転換した。プロトプラストの調製及び形質転換を、上のＭ１８２について記載の通りに、ｂａｒ選択を使用して行った。
【０２６１】
２００を超えるクローンを、選択的ストリークとして採取した。２９の形質転換体が、第２ストリークとして十分に成長した。選択的ストリークとして速く成長する最良の１０の形質転換体を、正確な組込みについて、表１．４にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより、標準的な実験室方法を使用してスクリーニングした。欠失カセットは、分析させた１０個のクローンの内９個に正しく組み込まれていた。オープンリーディングフレームは、ＰＣＲにより分析した１０の形質転換体の９において欠失していた。５つの破壊株を、単一細胞クローンにまで精製した。１つの純粋な形質転換体（２０６Ａ）を、株番号Ｍ４５５を用いて命名した。
【０２６２】
【表４】
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【０２６３】
リツキシマブ産生ｐｅｐ２欠失株の分析
Ｍ４５５株、４つの他のＰＥＰ２欠失形質転換体、及び親リツキシマブ産生株Ｍ１６９を、振盪フラスコ培養において、２０g/l粕抽出物、４０g/lラクトース、１００mM  ＰＩＰＰＳ、及び８．１ｇ／ｌカザミノ酸を添加したトリコデルマ最少培地（ＴｒＭＭ）中で、ｐＨ５．５及び２８℃で成長させた。リツキシマブ産生に対する効果を分析するために、５日目の培養サンプルからの上清の３０μlを、免疫ブロッティングに供した。重鎖を、ＴＢＳＴ中で１：１０，０００に希釈した抗重鎖ＡＰコンジュゲート抗体（Sigma＃Ａ３１８８）を用いて検出した。軽鎖を、抗カッパ軽鎖ＡＰコンジュゲート抗体（Sigma＃Ａ３８１３）を用いて検出した。重鎖産生におけるわずかな改善が、形質転換体２０６Ａにおいて見られた（図６）。重鎖はフラグメント化されたが、しかし、全長及び３８kDフラグメントは、親株よりもわずかに改善された。加えて、全プロテアーゼ活性は、製造者のプロトコールに従って、スクシニル化カゼイン（QuantiCleaveプロテアーゼアッセイキット、Pierce  ＃２３２６３）を用いて測定した。形質転換体２０６Ａ／Ｍ４５５は、親株Ｍ１６９の活性と比較して、プロテアーゼ活性における最も大きな減少を示した（図７）。上清中の全プロテアーゼ活性は、Ｍ４５５について１０%だけ低下した。
【０２６４】
ピキア発現アスパラギン酸プロテアーゼの分析
ピキアから発現されたＴリーゼイアスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ３（ｔｒｅ１２１１３３）及びｐｅｐ７（ｔｒｅ５８６６９）を、また、ＭＡＢ０１抗体及びＩＧＦ−１の分解を測定することにより、インビトロでテストした。ｐｅｐ３及びｐｅｐ７によるＭＡＢ０１及びＩＧＦ−１の分解を、免疫ブロット法により分析した。アスパラギン酸プロテアーゼを、ピキア上清中で産生した。ピキア上清を１×濃度に希釈し、次に、５０mMクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）と混合した。ＭＡＢ０１は、各々の反応液に加え、最終濃度が０．０５μg/μlになるようにした。ＩＧＦ−１は、各々の反応に加え、最終濃度が０．３０μg/μlになるようにした。各々の反応混合物の１０μlを、次に、試料採取し、βメルカプトエタノールを伴うＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液の３μlに加えた。サンプルを、オールブループレシジョンプラス前染色分子量マーカー（BioRad）と一緒に４〜１５%ＰＡＧＥゲル（BioRad mini-protean TGXプレキャストゲル）中にロードされる前に、９５℃で５分間にわたり加熱した。ＰＡＧＥゲルを、３０分間にわたり２００Ｖで流した。ゲル中のタンパク質を、次に、ニトロセルロースフィルター中に１００Ｖで１時間にわたりエレクトロトランスファーした。タンパク質を含むニトロセルロースフィルターを、次に、０．１%ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）を伴うＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水中の５%ミルク粉末を用いて、室温での１時間振盪でブロックした。ブロックした膜を、次に、抗体を用いてプローブした。ＭＡＢ０１を含む膜を、ＴＢＳＴ中で１：３０，０００に希釈した抗ＩｇＧ重鎖抗体ＡＰコンジュゲート（Sigma  ＃Ａ３１８８）を用いてプローブした。ＩＧＦ−１サンプルを、一次抗ＩＧＦ−１抗体（ＴＢＳＴ中の１：２０００）及び抗ＩｇＧ  ＡＰコンジュゲート二次抗体（ＴＢＳＴ中の１：５０００）を使用して分析した。全ての抗体インキュベーションを、１時間にわたり室温で、シェーカー上で行った。膜を、次に、ＴＢＳＴの３回交換で、各々２０分間にわたりシェーカー上で洗浄した。膜を、ＢＣＩＰ／ＮＢＴアルカリホスファターゼ基質（Promega＃Ｓ３７７１）を用いて、最大５分間にわたり発色させた。図８に示す通り、ｐｅｐ３プロテアーゼは、３７℃での一晩のインキュベーション後、ｐＨ５．５で低いＭＡＢ０１分解活性を有したが、しかし、活性はｐＨ４．５でより高かった。ｐｅｐ７プロテアーゼは、ｐＨ４．５で最小の抗体分解活性だけを有した。
【０２６５】
ＳＩＰペプチドを使用した追加のアスパラギン酸プロテアーゼの単離
いくつかの追加のアスパラギン酸プロテアーゼを、Ｔリーゼイ  Ｍ２７７  ３重プロテアーゼ欠失株（ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１）から単離した。Ｍ２７７株は、異種タンパク質を発現しない。Ｍ２７７欠失株を、下の実施例４に記載の通りに生成した。株を、２０g/l粕抽出物、６０g/lラクトース、及び９g/lカザミノ酸を添加したトリコデルマ最少培地中で、ｐＨ５．５及び２８℃で成長させた。アスパラギン酸プロテアーゼを、ＳＩＰペプチド（Ａｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−（ＡＨＰＰＡ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＮＨ２）を使用した親和性精製により単離した（Kataoka Y. et al. 2005 FEBS Letters 579, pp 2991-2994）。ＳＩＰペプチドを、製造者により提供されたプロトコールを使用して、ＮＨＳ活性化アガロース樹脂（Pierce  ＃２６１９６）にコンジュゲートした。ＳＩＰ親和性樹脂を使用し、プロテアーゼを精製した。Ｔリーゼイ  Ｍ２７７株からの発酵上清（１５ml）を次に使用し、プロテアーゼを、樹脂に、５０mM酢酸ナトリウム、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．０を含む３５ml緩衝液（発酵条件ｐＨ５．５；２８℃；９g/lカザミノ酸；２０g/L粕抽出物；６０g/Lラクトースから）中でバッチ結合させた。カラムを、同じ結合緩衝液を用いて洗浄し、結合したタンパク質を、溶出緩衝液（５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）を用いて除去した。０．５mlの分画を次に収集した。
【０２６６】
各々の精製分画の３０μlを、次に、４〜１５%ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル（BioRad mini-protean TGXプレキャストゲル）上に流し、一晩ＧｅｌＣｏｄｅブルー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて染色した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルは、約４２kDａの優勢バンド及び約２５ｋＤのかすかなバンドを示した（図９）。ゲルからのバンドを次にカットし、配列決定グレード改変トリプシン（Promega  ＃Ｖ５１１１）を用いたゲル内トリプシン消化に供した。結果として得られたペプチドをゲルから抽出し、C18 ZipTip（Millipore  ＃ＺＴＣ１８Ｍ０９６）により精製した。精製したペプチドを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより、QSTAR Pulsar、ESIハイブリッド４重極TOF（AB Sciex）上で分析した。この分析は、ＰＥＰ２、ＰＥＰ３、ＰＥＰ４、及びＰＥＰ５がＧＡＰ１及びＳＬＰ２と共にサンプル中に存在することを明らかにした。約２５kDのかすかなバンドが、グルタミン酸プロテアーゼＧＡＰ１に対応すると考えられる。
【０２６７】
ＳＩＰ精製プロテアーゼを、次に、ＭＡＢ０１抗体重鎖を分解するそれら能力についてテストした。精製したＳＩＰプロテアーゼを、ＭＡＢ０１を用いて、クエン酸ナトリウム緩衝液中の最終濃度０．０５μg/μlで、３７℃で一晩インキュベートした。サンプルを、ｐＨ４．０及びｐＨ５．５で、ならびにＳＩＰ阻害剤ペプチドの存在及び非存在の両方においてインキュベートした。反応を、後に試料採取した。収集したサンプルを、ＴＢＳＴ中で１：３０，０００に希釈した抗ＩｇＧ重鎖抗体ＡＰコンジュゲート（Sigma  Ａ３１８８）を用いた免疫ブロッティングにより分析した。免疫ブロットの結果は、プロテアーゼが、ｐＨ４．０でインキュベートされた場合、ＭＡＢ０１重鎖に対して高いプロテアーゼ活性を、ｐＨ５．５では低下した活性を有することを示した（図１０）。加えて、アスパラギン酸プロテアーゼ活性及びグルタミン酸プロテアーゼ活性の両方が、ＳＩＰペプチドを用いたインキュベーションにより阻害された（図１０）。
【０２６８】
ＳＩＰ精製アスパラギン酸プロテアーゼの分析
プロテアーゼ活性を、次に、プロテアーゼ阻害剤の存在及び非存在の両方において、カゼインに対してテストした。カゼインに対するプロテアーゼ活性を、EnzChekプロテアーゼアッセイキット（Molecular probes  ＃Ｅ６６３８、緑色蛍光カゼイン基質）を使用してテストした。作業用ストック溶液を、ストックを５０mMクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５中で１０μg/mlに希釈することにより調製した。精製したプロテアーゼ分画（１０μl）を、４０μlのクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５を用いて希釈した。希釈した基質の１００μlを、９６ウェルサンプルプレート中の希釈したプロテアーゼ分画と合わせた。プレートを次にカバーし、３７℃で１〜３時間にわたり保った。蛍光読み取りを、１、２、及び３時間目に、Varioskan蛍光プレートリーダー（Thermo Scientific）を用いて、４８５nmの励起及び５３０nmの発光を使用して取った。
【０２６９】
ＳＩＰ阻害剤ペプチド、ペプスタチンＡ、ＬＩＰペプチド、ＳＢＴＩ、及びキモスタチンを阻害剤として使用した。ＳＩＰ阻害剤ペプチドは、アスパラギン酸プロテアーゼ及びグルタミン酸プロテアーゼの両方を阻害した；ペプスタチンＡはアスパラギン酸プロテアーゼだけを阻害した；ＬＩＰペプチドは、グルタミン酸プロテアーゼだけを阻害した；ＳＢＴＩはＳＬＰ２及びＰＥＰ４を阻害し、キモスタチンはＳＬＰ２を阻害した。ＳＩＰ、ＬＩＰ、及びペプスタチンＡを濃度６０μMで使用し、ＳＢＴＩを濃度２００μg/mlで使用した。アスパラギン酸プロテアーゼとグルタミン酸プロテアーゼを区別するために、ペプスタチンＡを阻害剤として使用した。なぜなら、それはグルタミン酸プロテアーゼを阻害しないからである。
【０２７０】
カゼイン消化を試験した場合、ＳＩＰプロテアーゼ活性の大部分が、ペプスタチンＡにより阻害された（図１１）。カゼイン分解試験からの結果は、精製分画中のｐＨ５．５での活性の大部分が、アスパラギン酸プロテアーゼから来ることを示唆した。ＬＩＰペプチドは、ＧＡＰ１プロペプチドであり、ＳＩＰ阻害剤と比較して、プロテアーゼ活性をわずかに低く阻害した。ＳＢＴＩ及びキモスタチンは、精製サンプル中でＳＬＰ２プロテアーゼを阻害することができた。
【０２７１】
これらの結果は、ＳＩＰ分画中に存在する４つのアスパラギン酸プロテアーゼ（ＰＥＰ２、ＰＥＰ３、ＰＥＰ４、及びＰＥＰ５）があるという結論を支持する。
【０２７２】
実施例２  −  グルタミン酸プロテアーゼの同定
この実施例は、抗体重鎖及び軽鎖を分解するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔリーゼイ）培養上清からのグルタミン酸プロテアーゼの能力を実証する。
【０２７３】
ｇａｐ１欠失の分析
Ｔリーゼイゲノムにおいて４つのグルタミン酸プロテアーゼ配列が存在することが以前に決定されている。最も豊富なグルタミン酸プロテアーゼは、転写プロファイリングにより決定された通り、ｇａｐ１（ｔｒｅ６９５５５）である。したがって、ｇａｐ１プロテアーゼを、実施例１に記載の通り、ＳＩＰペプチド親和性クロマトグラフィーからのＴリーゼイ上清から精製した。
【０２７４】
ｇａｐ１欠失を、次に、Ｔリーゼイ  ＭＡＢ０１抗体産生株Ｍ２４４（Δｐｅｐ１）を使用して生成した。
【０２７５】
ｇａｐ１欠失プラスミドの生成
グルタミン酸プロテアーゼｇａｐ１（ＴｒｅＩＤ６９５５５）についての欠失ｐＴＴｖ１１７プラスミドを、本質的に、実施例１においてｐｅｐ１欠失プラスミドｐＴＴｖ４１について記載の通りに構築した。５’隣接領域の１０００bp及び３’隣接領域の１１００bpを、ｇａｐ１欠失プラスミドの基礎として選択した。隣接領域フラグメントを、表２．１にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより産生した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。隣接領域のＰＣＲにおいて使用したテンプレートＤＮＡは、Ｔリーゼイ野生型株ＱＭ６ａからであった。ｐｙｒ４ブラスターカセットを、ｐＴＴｖ７１から、ＮｏｔＩ消化を用いて得た。ベクター骨格は、実施例１における通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であった。プラスミドを、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築した。ｇａｐ１についてのこの欠失プラスミド（ｐＴＴｖ１１７）は、ｇａｐ１遺伝子座における１０３７bpの欠失をもたらし、ＧＡＰ１の完全コード配列をカバーする。
【０２７６】
【表５】
2018038419.tif 000006
【０２７７】
ＭＡＢ０１産生Δｐｅｐ１Δｇａｐ１  ２重欠失株Ｍ２９６の生成
第２プロテアーゼ欠失のためのＭＡＢ０１抗体産生株を生成するために、ｐｅｐ１欠失株Ｍ１８１（実施例１）を、ＭＡＢ０１軽及び重鎖コンストラクト（ｐＴＴｖ９８＋ｐＴＴｖ６７）を用いて、選択にハイグロマイシン及びアセトアミドを使用して形質転換した。このＭＡＢ０１株は、ｐｅｐ１欠失を伴い、番号Ｍ２４４を用いて命名した。ｐｅｐ１遺伝子座からのｐｙｒ４ブラスターカセットの除去は、本質的に、（２重プロテアーゼ欠失株Ｍ２１９の生成において）Ｍ１９５について下の実施例３に記載の通りに行った。このｐｙｒ４−株を、番号Ｍ２８５を用いて命名し、その後のプロテアーゼ欠失のための親として使用した。
【０２７８】
ベクター配列を除去するために、プラスミドｐＴＴｖ１１７（Δｇａｐ１−ｐｙｒ４）を、ＰｍｅＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、アガロースゲルから、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。ｇａｐ１欠失カセットの約５μgを使用し、株Ｍ２８５（ＭＡＢ０１抗体株Ｍ２４４のｐｙｒ４−、Δｐｅｐ１株Ｍ１８１に基づく）を形質転換した。プロトプラストの調製及び形質転換を、ｐｙｒ４選択を使用し、本質的に、実施例１においてｐｅｐ１欠失株Ｍ１８１及びＭ１９５について記載の通りに行った。
【０２７９】
形質転換プレートからのコロニーを、選択的ストリークとして採取した。選択的ストリークとして速く成長するクローンを、表２．２にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより、正確な組込みについて、標準的な実験室方法を使用してスクリーニングした。推定破壊株を、単一細胞クローンにまで精製した。
【０２８０】
【表６】
2018038419.tif 000007
【０２８１】
ＭＡＢ０１産生Δｐｅｐ１Δｇａｐ１  ２重欠失株の分析
２重欠失株（Δｐｅｐ１Δｇａｐ１）を、４０g/lラクトース、２０g/l粕抽出物、及び９g/lカザミノ酸を添加し、１００mM  ＰＩＰＰＳを用いてｐＨ５．５に緩衝化した、３００mlのトリコデルマ最少培地を含む２リットル振盪フラスコ培養において成長させた。Δｇａｐ１株を、次に、ＭＡＢ０１重鎖及び軽鎖産生についてテストした（図１２）。Δｇａｐ１株を、ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、及びｓｌｐ３の各々において欠失を有する株と比較した。Δｐｅｐ１株Ｍ２４４をコントロールとして使用した。サンプルは、７日目の大型振盪フラスコ培養からであった。サンプルを、抗ＩｇＧ重鎖（Sigma  ＃Ａ３１８８）又は抗軽鎖（Sigma  ＃Ａ３８１２）抗体ＡＰコンジュゲートを用いた免疫ブロッティングを介して分析した（図１２）。ｇａｐ１欠失は、Ｍ２４４コントロール株と比較して、重鎖産生における２倍の改善及び軽鎖産生における１．６倍の改善をもたらした（図１３）。
【０２８２】
ｇａｐ２欠失の分析
Ｍ１９４トリコデルマ・リーゼイ株から生成した転写プロファイリングデータに基づき、２番目に豊富なグルタミン酸プロテアーゼをｇａｐ２（ｔｒｅ１０６６６１）として同定した。このように、ｇａｐ２プロテアーゼを、また、ｐＴＴＶ１４５欠失コンストラクトを使用して、Ｍ２４４（Δｐｅｐ１）株から欠失させた。
【０２８３】
ｇａｐ２欠失プラスミドの生成
グルタミン酸プロテアーゼｇａｐ２（ＴｒｅＩＤ１０６６６１）についてのｐＴＴｖ１４５欠失プラスミドを、本質的に、実施例１におけるｐｅｐ１欠失プラスミドｐＴＴｖ４１について記載される通りに構築した。５’隣接領域の１０２１bp及び３’隣接領域の１０１０bpを、ｇａｐ２欠失プラスミドの基礎として選択した。このプラスミドにおいて、ｐｙｒ４ブラスターカセットのダイレクトリピートフラグメントを、ｐｙｒ４の５’ＵＴＲから、ｇａｐ２の５’隣接領域の末端からの３２０bpダイレクトリピートに変化させ、ＡｓｃＩ部位をｐｙｒ４と５’ダイレクトリピートの間に加えなかった。この型のブラスターカセットは、切除後、任意の追加配列を欠失遺伝子の遺伝子座に残さないはずである。フラグメントを、表２．３にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより産生した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。隣接領域のＰＣＲにおいて使用されるテンプレートＤＮＡは、Ｔリーゼイ野生型株ＱＭ６ａからであった。ｐｙｒ４マーカー遺伝子を、ｐＨＨＯ５から、ＮｏｔＩ消化を用いて得た。ベクター骨格は、実施例１における通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であった。プラスミドを、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築した。ｇａｐ２についてのこの欠失プラスミド（ｐＴＴｖ１４５）は、ｇａｐ２遺伝子座における９４４bpの欠失をもたらし、ＧＡＰ２の完全コード配列をカバーする。
【０２８４】
【表７】
2018038419.tif 000008
【０２８５】
ＭＡＢ０１産生Δｐｅｐ１Δｇａｐ２  ２重欠失株Ｍ３６０の生成
第２プロテアーゼ欠失のためのＭＡＢ０１抗体産生株を生成するために、ｐｅｐ１欠失株Ｍ１８１（実施例１）を、ＭＡＢ０１軽及び重鎖コンストラクト（ｐＴＴｖ９８＋ｐＴＴｖ６７）を用いて、選択にハイグロマイシン及びアセトアミドを使用して形質転換した。ｐｅｐ１遺伝子座からのｐｙｒ４ブラスターカセットの除去は、本質的に、（２重プロテアーゼ欠失株Ｍ２１９の生成において）Ｍ１９５について下の実施例３に記載の通りに行った。このｐｙｒ４−株を、番号Ｍ２８５を用いて命名し、その後のプロテアーゼ欠失のための親として使用した。
【０２８６】
ベクター配列を除去するために、プラスミドｐＴＴｖ１４５（Δｇａｐ２−ｐｙｒ４）を、ＰｍｅＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、アガロースゲルから、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。ｇａｐ２欠失カセットの約５μgを使用し、株Ｍ２８５（ＭＡＢ０１抗体株Ｍ２４４のｐｙｒ４−、Δｐｅｐ１株Ｍ１８１に基づく）を形質転換した。プロトプラストの調製及び形質転換を、ｐｙｒ４選択を使用し、本質的に、実施例１において株Ｍ１８１及びＭ１９５について記載の通りに行った。
【０２８７】
形質転換プレートからのコロニーを、選択的ストリークとして採取した。選択的ストリークとして速く成長するクローンを、表２．４にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより、正確な組込みについて、標準的な実験室方法を使用してスクリーニングした。推定破壊株を、単一細胞クローンにまで精製した。
【０２８８】
【表８】
2018038419.tif 000009
【０２８９】
ＭＡＢ０１産生Δｐｅｐ１Δｇａｐ２  ２重欠失株の分析
いくつかの欠失形質転換体を産生した。これらの形質転換体からの培養上清を４〜１５%ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上で流し、次に、ＭＡＢ０１抗体重鎖を、抗重鎖ＡＰコンジュゲート抗体（Sigma  ＃Ａ３１８８）を用いた免疫ブロッティングにより分析し、軽鎖を、抗軽鎖ＡＰコンジュゲート抗体（Sigma  ＃Ａ３８１２）を用いて検出した。免疫ブロットの結果は、ｇａｐ２を欠失させることによって、ＭＡＢ０１重鎖及び軽鎖産生における数倍の増加がもたらされたことを示す（図１４）。
【０２９０】
ピキア発現ｇａｐ２の分析
トリコデルマ・リーゼイのｇａｐ２を含むピキア上清を、インビトロで試験した。ｇａｐ２を含む上清及びＭＡＢ０１抗体を、ｐＨ４．０、４．５、５．０、及び５．５に調整したクエン酸ナトリウム緩衝液中に希釈し、２０時間にわたり３７℃でインキュベートした。サンプルを、０分で及び２０時間後に取った。ＭＡＢ０１重鎖産生を、抗ＩｇＧ重鎖（Sigma  ＃Ａ３１８８）抗体ＡＰコンジュゲートを使用した免疫ブロッティングにより分析した。免疫ブロットの結果は、ｇａｐ２が重鎖ＭＡＢ０１に対する最大のタンパク質分解活性をｐＨ４．０で有したことを示す（図１５）。ｇａｐ２プロテアーゼ活性はｐＨ５．５で低かったが（図１５）、４日間にわたって、それは重鎖に対して有意な活性を実証することができた。ｇａｐ２プロテアーゼは、分解産物（約２５kD）を産生したが、それが、重鎖ヒンジ領域においてタンパク質分解活性を有することを示す。
【０２９１】
実施例３  −  セリンプロテアーゼの同定
この実施例は、抗体重鎖及び軽鎖を分解するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔリーゼイ）からのセリンプロテアーゼの能力を実証する。
【０２９２】
セリンプロテアーゼ精製
セリンプロテアーゼは、抗体分解酵素として同定されたプロテアーゼの主要なファミリーを含む。したがって、セリンプロテアーゼをトリコデルマ上清から精製した。セリンプロテアーゼを、発酵培養上清から、ｐアミノベンズアミジンセファロース４ファーストフロー樹脂（GE healthcare  ＃  １７−５１２３−１０）を用いて、最初に親和精製した。１５mlの発酵培養上清を、樹脂に、３５mlの結合緩衝液（０．０５M  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、０．５M ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中でバッチ結合した。同じ結合緩衝液を用いてカラムを充填及び洗浄した後、カラムを、０．０５Mグリシン、ｐＨ３．０を用いて溶出した。分画を、次に、１M  Ｔｒｉｓ  ＨＣＬ、ｐＨ８．８を用いて中和した。
【０２９３】
合計で、１．７mgのタンパク質を親和性カラムから精製した。ピーク分画を、４〜１５%のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で流した場合、いくつかの主要なバンド（〜１１０kD、５３kD、３９kD、２９kD）及びより多くのマイナーなバンドが見られた。ピーク分画のタンパク質混合物（Ｆ４）を、次に、クエン酸ナトリウム緩衝液（５０mM、ｐＨ５．５）中で、３７℃で２０時間にわたりＦ４のサンプルをヒトＩｇＧ１とインキュベートすることにより、プロテアーゼ活性についてテストした。サンプルを、セリンプロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ（５mM）の存在及び非存在の両方においてインキュベートした。インキュベートしたサンプルを、次に、ＴＢＳＴ中で１：３０，０００に希釈した抗ＩｇＧ重鎖ＡＰコンジュゲート抗体（Sigma  ＃Ａ３１８８）及び抗ＩｇＧ軽鎖ＡＰコンジュゲート抗体（Sigma  ＃Ａ３８１２）を用いた免疫ブロッティングにより分析した。免疫ブロットの結果は、Ｆ４精製タンパク質分画がＩｇＧを徹底的に分解することを示した（図１６）。加えて、ＰＭＳＦを用いた処理は、分解の大部分を阻害することができたが、ＩｇＧ分解について責任のあるＦ４分画中のプロテアーゼ活性が、優勢にセリンプロテアーゼ活性であることを示した。
【０２９４】
精製分画中のいずれのタンパク質がプロテアーゼ活性を示すかを同定するために、ピーク分画をＩｇＧ（０．５mg/ml  ＭＡＢ０２）ＳＤＳ  ＰＡＧＥザイモグラムゲル（１２%）上で流した。精製分画及び未精製上清サンプルを、変性条件下のザイモグラムゲル上で流した。ゲルを流した後、ゲル中のタンパク質を、ゲルを１%トリトンＸ−１００中でインキュベートし、ＳＤＳを除去することにより再生した。ザイモグラムゲルは、次に、反応緩衝液（５０mMクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５）中で一晩インキュベートすることを許し、プロテアーゼがゲル中でＩｇＧを分解することができるようにした。ゲルを、次に、GelCodeブルーを用いて染色し、ＩｇＧ染色の範囲を明らかにした。活性プロテアーゼは、無染色を伴う明かなバンドを産生した（図１７）。
【０２９５】
ＩｇＧゲルザイモグラム上で約２９kD及び６５kDで目に見える２つの明らかなバンドがあった。しかし、２９kDでのバンドがずっと多く優勢であったが、それが、サンプル中のセリンプロテアーゼ活性の大半について責任がありうることを示唆する。これらのバンドは、未精製上清サンプル中の２つだけの目に見えるものであったが、精製分画中でより顕著であった（図１７）。プロテアーゼサンプルを、ＰＭＳＦ（公知のセリンプロテアーゼ阻害剤）で前処理した場合、明かな白色バンドは、灰色に見えた又は目に見えなかったが、バンドがセリンプロテアーゼ酵素に対応することを示した（図１７）。
【０２９６】
２９kDセリンプロテアーゼＴＳＰ１の同定
ＭＡＢ０２なしで同等に行ったＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルから、２９kDバンドをゲルからカットし、配列決定グレード改変トリプシン（Promega  ＃Ｖ５１１１）を用いたゲル内トリプシン消化に供した。精製分画において、２９kDバンドが明確なタンパク質バンドとして見られた。この明確なバンドを次に単離した。結果として得られたペプチドをゲルから抽出し、C18 ZipTip（Millipore  ＃ＺＴＣ１８Ｍ０９６）により精製した。精製したペプチドを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより、QSTAR Pulsar、ESIハイブリッド４重極TOF（AB Sciex）上で分析した。結果として得られた質量分析は、トリプシン様セリンプロテアーゼＴＳＰ１（ｔｒｅ７３８９７、３５%配列カバー率）として２９kDバンドを明らかに同定した。
【０２９７】
ｔｓｐ１欠失の分析
ＴＳＰ１をコードする遺伝子（ｔｓｐ１）を次にリツキシマブ抗体産生株Ｍ１６９から欠失させ、Ｍ１８３（Δｔｓｐ１）を作製した。振盪フラスコ培養を、Ｍ１６９及びｔｓｐ１欠失株の形質転換体を用いて作り、リツキシマブ発現に対する効果を測定した。培養物を、４g/Lラクトース、２g/L粕抽出物、及び１００mM  ＰＩＰＰＳ、ｐＨ５．５を伴う３００mlのＴｒＭＭ中で成長させた。５日目からの上清サンプル（３０μl）を４〜１５%ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにロードし、ＴＢＳＴ中で１：１０，０００に希釈した抗重鎖ＡＰコンジュゲート抗体（Sigma＃Ａ３１８８）を用いた免疫ブロッティングのためにニトロセルロースに移した。２つのｔｓｐ１欠失株の形質転換体は、親コントロール株と比較して、リツキシマブ重鎖発現における明らかな増加を示した（図４０）。
【０２９８】
第１プロテアーゼ遺伝子ｐｅｐ１（ＴｒｅＩＤ７４１５６）のための欠失コンストラクトを、実施例１において上に記載の通りに設計した。
【０２９９】
ｔｓｐ１欠失プラスミドの生成
アルカリトリプシン様セリンプロテアーゼｔｓｐ１（ＴｒｅＩＤ７１３２２／ＴｒｅＩＤ７３８９７，Dienes et al, 2007, Enz Microb Tech 40: 1087-1094）についての欠失プラスミドを、本質的に、実施例１におけるｐｅｐ１欠失プラスミドについて記載される通りに構築した。５’隣接領域の９５３bp及び３’隣接領域の９２６bpを、ｔｓｐ１欠失プラスミドの基礎として選択した。ｐｅｐ１について、ｔｓｐ１についての第１欠失プラスミド（ｐＴＴｖ４２）では、ｂａｒを選択マーカーとして使用した。隣接領域フラグメントを、表３．１にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより産生した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。隣接領域のＰＣＲにおいて使用されるテンプレートＤＮＡは、Ｔリーゼイ野生型株ＱＭ６ａからであった。ｂａｒマーカーを、ｐＴＴｖ４１（実施例１）から、ＮｏｔＩ消化を用いて得た。ベクター骨格は、実施例１における通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であった。プラスミドを、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築した。
【０３００】
第２のｔｓｐ１欠失プラスミド（ｐＴＴｖ７２）をクローン化するために、ｂａｒマーカーを、欠失プラスミドｐＴＴｖ４２から、ＮｏｔＩ消化を用いて除去した。ｐｙｒ４ブラスターカセットを、ｐＴＴｖ７１（実施例１）から、ＮｏｔＩ消化を用いて得て、ＮｏｔＩカットｐＴＴｖ４２に連結し、標準的な実験室方法を使用して大腸菌中に形質転換した。数個の形質転換体を培養し、プラスミドＤＮＡを単離及び消化し、標準的な方法を使用して、ｐｙｒ４ブラスターカセットの正確な連結及び方向をスクリーニングした。正確なインサートサイズ及び方向を伴う１つのクローンを配列決定し、保存した。ｔｓｐ１についてのこれらの欠失プラスミド（ｐＴＴｖ４２及びｐＴＴｖ７２）は、ｔｓｐ１遺伝子座における１２５２ｂｐの欠失をもたらし、ＴＳＰ１の完全コード配列をカバーする。
【０３０１】
【表９】
2018038419.tif 000010
【０３０２】
ｐｅｐ１ｔｓｐ１  ２重欠失株Ｍ２１９の生成
選択マーカーとしてｐｙｒ４を再利用するために、ｐｅｐ１欠失株Ｍ１９５からのｐｙｒ４ブラスターカセットの除去を行った。胞子を、２０g/lグルコース、２g/lプロテオースペプトン、１ml/l  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５mMウリジン、及び１．５g/l  ５−ＦＯＡ、ｐＨ４．８を含む最少培地プレート上に広げた。５−ＦＯＡ耐性コロニーを５〜７日後に０．９%ＮａＣｌに採取し、ボルテックスで徹底的に懸濁し、綿を詰めたピペットチップを通して濾過した。クローンを単一細胞クローンに精製するために、濾液を上に記載のプレート上に再び広げた。精製したクローンを、３９g/lジャガイモデキストロースアガロースを含むプレート上で胞子形成させた。これらのクローンを、胞子を最少培地プレート（２０g/lグルコース、１ml/l  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）上にプレーティングすることにより、ウリジン栄養要求性についてテストし、そこでは成長が観察されず、選択されたクローンがｐｙｒ４−であったことを示す。全てのクローンを、ブラスターカセットの除去について、（表３．２にリストしたプライマーを使用した）ＰＣＲによりさらにテストし、正確であることが示された。２重プロテアーゼ欠失株（Ｍ２１９）を生成するために使用したクローン（９−３５Ａ−１Ａ−ａ）を、株番号Ｍ１９６（Δｐｅｐ１、ｐｙｒ４−）を用いて命名した。
【０３０３】
ベクター配列を除去するために、プラスミドｐＴＴｖ７２（Δｔｓｐ１−ｐｙｒ４）を、ＰｍｅＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、アガロースゲルから、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。ｔｓｐ１欠失カセットの約５μgを使用し、Ｍ１９６（Δｐｅｐ１、ｐｙｒ４−）を形質転換した。プロトプラストの調製及び形質転換を、ｐｙｒ４選択を使用し、本質的に、実施例１においてｐｅｐ１欠失株Ｍ１８１及びＭ１９５について記載の通りに行った。
【０３０４】
１００を超えるコロニーを採取し、４８を、表３．２にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより、欠失カセットの正確な組込みについて、及び、また、ｔｓｐ１  ＯＲＦの欠失について、標準的な実験室方法を使用してスクリーニングした。４つの推定Δｔｓｐ１クローンを、単一細胞クローンにまで精製した。ｔｓｐ１の欠失は、Ｍ１８１及びＭ１９５について実施例１に記載の標準的な実験室方法を使用し、これらのクローンからのサザン分析により検証した（図１８Ａ）。サザン分析は、また、４つの形質転換体（２つの形質転換体からの２つの並列クローン、クローン１６−５ＡＡ、１６−５ＢＡ、１６−１１ＡＡ、１６−１１ＢＡ、図１８Ｂ及び１８Ｃ）だけが、単一組込み体であることを示した。他のクローンが、ゲノム中のどこか他で追加コピーを保有することが決定され、廃棄された。形質転換体中のｔｓｐ１  ＯＲＦについて図１８において見られるかすかなシグナルがｔｓｐ１遺伝子から生じうることを排除するために、ｔｓｐ１  ＯＲＦの欠失を、表３．２中のプライマーを使用したＰＣＲにより確認した。ｔｓｐ１  ＯＲＦについてのシグナルは得られなかった。ｐｙｒ４ブラスターカセットの除去において（及び３重欠失株Ｍ２７７を生成するために）使用したクローン（１６−５ＡＡ）を、株番号Ｍ２１９（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１）を用いて命名した。
【０３０５】
ＭＡＢ０１産生Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１  ２重欠失株Ｍ２５２の生成
ベクター配列を除去するために、プラスミドｐＴＴｖ４２（Δｔｓｐ１−ｂａｒ）を、ＰｍｅＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、アガロースゲルから、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。ｔｓｐ１欠失カセットの約５μgを使用し、株Ｍ１８１（Δｐｅｐ１、実施例１）を形質転換した。プロトプラストの調製及び形質転換を、ｂａｒ選択を使用し、本質的に、実施例１においてｐｅｐ１欠失株Ｍ１８２について記載の通りに行った。
【０３０６】
形質転換プレート上で成長しているコロニーを、選択的ストリークとして採取した。選択的ストリークとして速く成長するクローンを、表３．２にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより、正確な組込みについて、標準的な実験室方法を使用してスクリーニングした。推定破壊株を、単一細胞クローンにまで精製した。ｔｓｐ１の欠失は、Ｍ１８１及びＭ１９５について実施例１に記載の標準的な実験室方法を使用し、これらのクローンからのサザン分析により検証した（図１９Ａ）。全てのクローンが、また、単一組込み体であることが検証された（図１９Ｂ及び１９Ｃ）。１つの２重プロテアーゼ欠失クローン（１３−１７２Ｄ）を、番号Ｍ１９４を用いて命名した。
【０３０７】
【表１０】
2018038419.tif 000011
【０３０８】
２重プロテアーゼ欠失株Ｍ１９４を使用し、下のＭＡＢ０１抗体発現株Ｍ２４７及びＭ２５２を生成した。株Ｍ２４７の構築は、Ｍ１９４を、ＭＡＢ０１重鎖及び軽鎖コンストラクト（ｐＴＴｖ１０１＋ｐＴＴｖ１０２）を用いて形質転換することにより行った。株Ｍ２５２を、Ｍ１９４を、ＭＡＢ０１重鎖及び軽鎖コンストラクト（ｐＴＴｖ９９＋ｐＴＴｖ６７）を用いて形質転換することにより構築した。両方の形質転換が、ハイグロマイシン及びアセトアミド選択に基づいた。
【０３０９】
ＭＡＢ０１産生Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１  ２重欠失株Ｍ２５２の分析
ＭＡＢ０１抗体を産生する２重欠失株（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１）は、発酵槽で成長させた場合、４３%完全長抗体を伴い、２６１mg/L抗体を産生することが示された。株のプロテアーゼ活性を、次に、株を、２０g/l粕抽出物、６０g/lラクトース、９g/lカザミノ酸を添加したトリコデルマ最少培地中で、ｐＨ５．５及び２２℃で成長させることによりテストした。この株中のカゼインに対する全プロテアーゼ活性は、野生型Ｍ１２４株よりも２．０倍少ないことが決定された（図２０）。
【０３１０】
６５kDセリンプロテアーゼＳＬＰ１の同定
約６５kDの活性を産生するプロテアーゼは、その低い発現レベル及びいくつかの高度に発現されたタンパク質へのサイズにおける近接に起因して、同定することがより困難であった。高度に発現されたタンパク質は、以前に、ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ、ＣＩＰ２、及びキシラナーゼ４であると同定された。改善を作り、６５kDプロテアーゼを、高度に発現されたタンパク質からより良好に分離した。改善は、ザイモグラム用のより低いゲルパーセンテージ（７%）ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル及びサンプルをより長い時間を流すための標準的なＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルを使用することを含み、５４kD分子量マーカーがゲルの底にあるようにした。加えて、Ｔリーゼイリツキシマブ抗体形質転換体からの発酵上清を、また、使用し、セリンプロテアーゼを精製した。リツキシマブ抗体の形質転換体は株Ｍ１６９であり、それはリツキシマブを産生し、プロテアーゼ欠失を欠く。株を、２０g/l粕抽出物及び６０g/lラクトースを添加したトリコデルマ最少培地中で、ｐＨ５．５及び２８℃で成長させた。この培養中で産生されたＣＢＨＩは、セルロース結合ドメインを欠く；従って、それは約１０kDより小さい。しかし、Ｍ１６９は、６５kDプロテアーゼに対応する明確なバンドを示さなかった（図２１）。こうして、一般的な領域をカットし、配列決定グレード改変トリプシン（Promega  ＃Ｖ５１１１）を用いたゲル内トリプシン消化に供した。結果として得られたペプチドをゲルから抽出し、C18 ZipTip（Millipore  ＃ＺＴＣ１８Ｍ０９６）により精製した。精製したペプチドを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより、QSTAR Pulsar、ESIハイブリッド４重極TOF（AB Sciex）上で分析した。
【０３１１】
ペプチド分析は、２番目に高いスコアリングタンパク質がプロテアーゼｔｒｅ５１３６５であることを示した。トップスコアリングタンパク質はキシラナーゼ４であったが、それは、サンプル中の混入物であった。ｔｒｅ５１３６５スブチリシンプロテアーゼは、現在ＳＬＰ１と呼ばれ、３つの別々の精製から、３つの非依存的なサンプル中で見出された。最良のスコアリングのサンプル中で、６つのペプチドが見出され、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより配列決定した。配列カバー率は８%であった。なぜなら、天然プロテアーゼ遺伝子は、９３kDプロテアーゼを構成する８８２のアミノ酸をコードするからである。ゼラチンザイモグラフィーにおいて、〜９０kDの弱いバンドが、６５kDまで下のスミアリングと一緒に見ることができたが、ＳＬＰ１プロテアーゼ自体がタンパク質分解を受けるが、しかし、その活性の大部分を保持していることを示唆する。
【０３１２】
ｓｌｐ１欠失プラスミドの生成
ＳＬＰ１（ｓｌｐ１）をコードする遺伝子を、次に、ＭＡＢ０１抗体産生株Ｍ２４４において欠失させた（Δｐｅｐ１）。
【０３１３】
スブチリシン様プロテアーゼｓｌｐ１（ＴｒｅＩＤ５１３６５）についての欠失プラスミドを、本質的に、実施例１におけるｐｅｐ１欠失プラスミドｐＴＴｖ４１について記載された通りに構築した。５’隣接領域の１０９４bp及び３’隣接領域の１２４７bpを、ｓｌｐ１欠失プラスミドの基礎として選択した。フラグメントを、表３．３にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより産生した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。隣接領域のＰＣＲにおいて使用されるテンプレートは、Ｔリーゼイ野生型株ＱＭ６ａからであった。ｐｙｒ４ブラスターカセットを、ｐＴＴｖ７１（実施例１）から、ＮｏｔＩ消化によって得た。ベクター骨格は、実施例１における通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であった。プラスミドを、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築した。ｓｌｐ１についてのこの欠失プラスミド（ｐＴＴｖ１２６）は、ｓｌｐ１遺伝子座における２９５１bp欠失をもたらし、ＳＬＰ１の完全コード配列をカバーする。
【０３１４】
【表１１】
2018038419.tif 000012
【０３１５】
ＭＡＢ０１産生Δｐｅｐ１Δｓｌｐ１欠失株Ｍ２９８及びＭ２９９の生成
第２プロテアーゼ欠失のためのＭＡＢ０１抗体産生株を生成するために、ｐｅｐ１欠失株Ｍ１８１（実施例１中）を、ＭＡＢ０１軽及び重鎖コンストラクト（ｐＴＴｖ９８＋ｐＴＴｖ６７）を用いて、ハイグロマイシン及びアセトアミドを選択において使用して形質転換した。ｐｅｐ１遺伝子座からのｐｙｒ４ブラスターカセットの除去は、本質的に、（２重プロテアーゼ欠失株Ｍ２１９の生成において）上のＭ１９５について記載の通りに行った。このｐｙｒ４−株を、番号Ｍ２８５を用いて命名し、その後のプロテアーゼ欠失のための親として使用した。
【０３１６】
ベクター配列を除去するために、プラスミドｐＴＴｖ１２６（Δｓｌｐ１−ｐｙｒ４）を、ＰｍｅＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、アガロースゲルから、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。ｓｌｐ１欠失カセットの約５μgを使用し、Ｍ２８５（ＭＡＢ０１抗体株Ｍ２４４のｐｙｒ４−、Δｐｅｐ１株Ｍ１８１に基づく）を形質転換した。プロトプラストの調製及び形質転換を、ｐｙｒ４選択を使用し、本質的に、実施例１においてｐｅｐ１欠失株Ｍ１８１及びＭ１９５について記載の通りに行った。
【０３１７】
形質転換プレート上で成長しているコロニーを、選択的ストリークとして採取した。選択的ストリークとして速く成長するクローンを、表３．４にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより、正確な組込みについて、標準的な実験室方法を使用してスクリーニングした。推定破壊株を、単一細胞クローンにまで精製した。
【０３１８】
【表１２】
2018038419.tif 000013
【０３１９】
ＭＡＢ０１産生Δｐｅｐ１Δｓｌｐ１  ２重欠失株Ｍ２９８／Ｍ２９９の分析
Ｍ２４４株におけるｓｌｐ１の欠失は、重及び軽鎖産生における期待される改善を示した（図１２及び１３）。ｓｌｐ１欠失株（Δｐｅｐ１Δｓｌｐ１）を、４０g/lラクトース、２０g/l粕抽出物、及び９g/lカザミノ酸を添加し、１００mM  ＰＩＰＰＳを用いてｐＨ５．５に緩衝化した、３００mlのトリコデルマ最少培地を含む２リットル振盪フラスコ培養において成長させた。上の実施例２に記載の通り、培養上清を、４〜１５%  ＰＡＧＥゲル上に流し、免疫ブロットし、ＭＡＢ０１重及び軽鎖を検出した。重鎖が、Ｍ２４４親株の産生レベルより２．８倍高いレベルで産生された（図１３）。軽鎖が、Ｍ２４４親株の産生レベルより１．８倍高いレベルで産生された（図１３）。
【０３２０】
追加のセリンプロテアーゼの同定
追加の抗体分解セリンプロテアーゼを、他の親和性リガンドを使用して同定した。大豆トリプシン阻害剤（ＳＢＴＩ）は、抗体重鎖及び軽鎖を効果的に安定化する。従って、抗体を切断することについて責任のあるプロテアーゼを阻害することができる。このように、これらのプロテアーゼを同定するために、親和性精製を、アガロース（Sigma  ＃Ｔ０６３７）に共役したＳＢＴＩを用いて実施した。
【０３２１】
Ｔリーゼイ株Ｍ４４を使用し、プロテアーゼを同定した。Ｍ４４株は、異種タンパク質発現を伴わない野生型株である。Ｍ４４株を、２０g/l粕抽出物及び６０g/lラクトースを添加したトリコデルマ最少培地中で、ｐＨ５．５及び２８℃で成長させた。２１７時間のサンプルからのＭ４４培養上清の２０mlサンプルを、ＳＢＴＩアガロース親和性樹脂（１ml）と、３０mlの結合緩衝液（５０mM  Ｔｒｉｓ、０．５M  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）（ｐＨ５．５；２８℃；２０g/L粕抽出物、６０g/Lラクトース）中でインキュベートした。上清結合緩衝液の混合物を、５０mlコニカルチューブ中で合わせ、室温で１時間にわたり撹拌した。混合物を、次に、ガラスカラムに加え、２００mlの結合緩衝液を用いて洗浄した。５０mlの高塩緩衝液（１M  ＮａＣｌ）を次に使用し、非特異的な相互作用をさらに除去した。最後に、カラムを、１００mlの本来の結合／洗浄緩衝液を用いて再び洗浄した。カラムを、次に、５０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ５．０中の０．８MベンズアミジンＨＣｌを用いて溶出した。分画を０．５ml容積中に収集し、標準としてのウシ免疫グロブリンを用いた、BioRad Bradford試薬を使用したタンパク質アッセイに供した。
【０３２２】
収集した全ての分画から、１９０μgのタンパク質を、ＳＢＴＩ親和性カラムから精製した。ピーク分画を、１０kD分子量カットオフを伴うVivaspin限外濾過スピンフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ−ｓｔｅｄｉｍ）中で洗浄し、ベンズアミジン阻害剤を除去し、分画を濃縮した。濃縮分画（ｃｆ３及びｃｆ３）及び非濃縮分画（ｆ１−ｆ４）を、ＭＡＢ０２ザイモグラムゲル（上に記載の通り）上及び分析のための通常のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上にロードした。ザイモグラムの結果は、２つの目に見えるタンパク質分解活性があることを示す（図２２）。最も優勢なバンドが４０ｋＤ周囲で目に見え、よりかすかなバンドが約２６ｋＤ周囲で目に見えた（図２２）。ザイモグラムゲル中で、より暗い染色タンパク質バンドが、白色ザイモグラム活性バンドに隣接した。これを、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上にロードした濃縮分画と比較すると、これらの２重バンドは、３８kD周囲で目に見えた（図２３）。ＰＡＧＥゲルは４〜１５%勾配ゲルであり、ザイモグラムゲルは１２%であった。そのため、相対的なサイズは、わずかに異なりうる。ＰＡＧＥゲル上で、タンパク質バンドが２６kDのエリア中に明らかにみることができ、それは、第２のよりかすかなザイモグラム活性はのサイズに対応した。
【０３２３】
ｃｆ３の精製プロテアーゼのタンパク質分解活性をさらに分析するために、分画を、リツキシマブ抗体重鎖を分解するその能力についてテストした。ｃｆ３の５μlサンプルを、クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５中で、０．０５μg/mlリツキシマブと共にインキュベートした。インキュベートしたサンプルを、次に、ＴＢＳＴ中で１：３０，０００希釈した抗ヒトＩｇＧ重鎖特異的ＡＰコンジュゲート抗体（Sigma  ＃Ａ３１８８）を使用した免疫ブロッティングにより分析した。免疫ブロットの結果は、プロテアーゼがリツキシマブ抗体重鎖を直ちに分解したことを示す。完全長リツキシマブ重鎖は、５０kDを少し超えて流れ、最初の分解産物は約４５kDであった（図２４）。加えて、一晩のインキュベーションによって、３８kDの追加産物が生成された（図２４）。
【０３２４】
ザイモグラム活性について責任のあるプロテアーゼを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳペプチド配列決定後に同定した。タンパク質を含むゲル切片を、図２３に示すＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルから切り出し、配列決定グレード改変トリプシン（Promega  ＃Ｖ５１１１）を用いたゲル内トリプシン消化に供した。結果として得られたペプチドをゲルから抽出し、C18 ZipTip（Millipore  ＃ＺＴＣ１８Ｍ０９６）により精製した。精製したペプチドを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより、QSTAR Pulsar、ESIハイブリッド４重極TOF（AB Sciex）上で分析した。
【０３２５】
トップスコアリングプロテアーゼヒットは、スブチリシン様プロテアーゼ、ｓｌｐ２（ｔｒｅ１２３２４４）であった。ｓｌｐ２からの２つのペプチドを見出し、配列決定し、全配列長の６%をカバーした。完全長ｓｌｐ２プロテアーゼは５８kDであるが、しかし、活性プロテアーゼはサイズにおいてより小さくなりうるのが通常である。
【０３２６】
また、隣接領域において見出された他のプロテアーゼがあった。より低い２６kD領域の分析によって、トリプシンセリン様プロテアーゼｔｓｐ１（ｔｒｅ７３８９７）が同定された。これは、観察されたかすかなザイモグラム活性に対応した。上に記載の通り、このプロテアーゼを、アミノベンズアミジン親和性精製を介して同定した。
【０３２７】
また、全ＳＢＴＩ親和性精製分画を、溶液中でトリプシン消化し、サンプルの全プロテアーゼ含量を決定した。他の同定されたプロテアーゼは、ｔｒｅ１２３８６５プロテアーゼｓｌｐ７（６０kD）；ｔｒｅ７７５７９プロテアーゼｐｅｐ４（４２kD）；及びｔｒｅ５８６９８プロテアーゼｓｌｐ８（４１kD）を含んだ。
【０３２８】
トリコデルマ・リーゼイのブチリシンプロテアーゼｓｌｐ５、ｓｌｐ６、及びｓｌｐ７を、抗体リツキシマブ及びＭＡＢ０１重鎖に対するそれらの活性の研究のために、ピキア上清中に過剰産生させた（図２５）。リツキシマン（ｒｉｔｕｘｉｍａｎ）モック上清を、ｓｌｐ５及びｓｌｐ６を含む上清と比較した（図２５Ａ）。ＭＡＢ０１モック上清を、ｓｌｐ７を含む上清と比較した（図２５Ｂ）。リツキシマブ及びＭＡＢ０１を、プロテアーゼを含むピキア上清に加え、一晩３７℃でインキュベートした。サンプルを取り、抗重鎖ＡＰコンジュゲート抗体を用いた免疫ブロッティングにより分析した。この分析によって、ｓｌｐ６プロテアーゼが、モックコントロール上清と比較して、リツキシマブ重鎖に対する重度の分解活性及びＭＡＢ０１の軽度の分解を示すことが明らかになった（図２５）。
【０３２９】
ｓｌｐ２及びｓｌｐ３欠失プラスミドの生成
上の結果に基づき、ｓｌｐ２及びｓｌｐ３プロテアーゼ遺伝子を、各々、ＭＡＢ０１抗体産生株Ｍ２４４から欠失させた。
【０３３０】
スブチリシン様プロテアーゼｓｌｐ２（ＴｒｅＩＤ１２３２４４）及びｓｌｐ３（ＴｒｅＩＤ１２３２３４）についての欠失プラスミドを、本質的に、実施例１におけるｐｅｐ１欠失プラスミドｐＴＴｖ４１について記載される通りに構築した。５’隣接領域の１０００bp及び３’隣接領域の１１００bpを、ｓｌｐ２欠失プラスミドの基礎として選択した。ｓｌｐ３について、５’隣接領域の１０００bp及び３’隣接領域の１１００bpを選択した。フラグメントを、表３．５にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより産生した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。隣接領域のＰＣＲにおいて使用されるテンプレートは、Ｔリーゼイ野生型株ＱＭ６ａからであった。ｐｙｒ４ブラスターカセットを、ｐＴＴｖ７１（実施例１）から、ＮｏｔＩ消化を用いて得た。ベクター骨格は、実施例１における通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であった。プラスミドを、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築した。ｓｌｐ２についての欠失プラスミド（ｐＴＴｖ１１５）は、ｓｌｐ２遺伝子座における２１１４ｂｐの欠失をもたらし、ＳＬＰ２の完全コード配列をカバーする。ｓｌｐ３についての欠失プラスミド（ｐＴＴｖ１１６）は、ｓｌｐ３遺伝子座における１５９７bpの欠失をもたらし、ＳＬＰ３の完全コード配列をカバーする。
【０３３１】
【表１３】
2018038419.tif 000014
【０３３２】
ＭＡＢ０１産生Δｐｅｐ１Δｓｌｐ２及びΔｐｅｐ１Δｓｌｐ３欠失株Ｍ２９２及びＭ２９５の生成
第２プロテアーゼ欠失のためのＭＡＢ０１抗体産生株を生成するために、ｐｅｐ１欠失株Ｍ１８１（実施例１中）を、ＭＡＢ０１軽及び重鎖コンストラクト（ｐＴＴｖ９８＋ｐＴＴｖ６７）を用いて、選択にハイグロマイシン及びアセトアミドを使用して形質転換した。ｐｅｐ１遺伝子座からのｐｙｒ４ブラスターカセットの除去は、本質的に、（２重プロテアーゼ欠失株Ｍ２１９の生成において）上のＭ１９５について記載の通りに行った。このｐｙｒ４−株を、番号Ｍ２８５を用いて命名し、その後のプロテアーゼ欠失のための親として使用した。
【０３３３】
ベクター配列を除去するために、プラスミドｐＴＴｖ１１５（Δｓｌｐ２−ｐｙｒ４）及びｐＴＴｖ１１６（Δｓｌｐ３−ｐｙｒ４）を、ＰｍｅＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、アガロースゲルから、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。いずれかの欠失カセットの約５μgを使用し、Ｍ２８５（ＭＡＢ０１抗体株Ｍ２４４のｐｙｒ４−、Δｐｅｐ１株Ｍ１８１に基づく）を別々に形質転換した。プロトプラストの調製及び形質転換を、ｐｙｒ４選択を使用し、本質的に、実施例１においてｐｅｐ１欠失株Ｍ１８１及びＭ１９５について記載の通りに行った。
【０３３４】
形質転換プレート上で成長しているコロニーを、選択的ストリークとして採取した。選択的ストリークとして速く成長するクローンを、表３．６にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより、正確な組込みについて、標準的な実験室方法を使用してスクリーニングした。推定破壊株を、単一細胞クローンにまで精製した。純粋なクローンは、反復精製工程後でさえ得られなかった。
【０３３５】
【表１４】
2018038419.tif 000015
【０３３６】
ＭＡＢ０１産生Δｐｅｐ１Δｓｌｐ２及びΔｐｅｐ１Δｓｌｐ３  ２重欠失株Ｍ２９２及びＭ２９５の分析
Ｍ２９２株（Δｐｅｐ１Δｓｌｐ２）及びＭ２９５株（Δｐｅｐ１Δｓｌｐ３）を、それらの姉妹形質転換体と共に、４０g/lラクトース、２０g/l粕抽出物、及び９g/lカザミノ酸を添加し、１００mM  ＰＩＰＰＳを用いてｐＨ５．５に緩衝化した、３００mlのトリコデルマ最少培地を含む２リットル振盪フラスコ培養において成長させた。培養上清を４〜１５%  ＳＤＳ  ＰＡＧＥ上で流し、免疫ブロット分析を実施し、ＭＡＢ０１重鎖及び軽鎖を検出した。結果は、両方の欠失がＭＡＢ０１安定性を改善したことを示す（図１２及び１３）。Δｓｌｐ２欠失は、親Ｍ２４４株と比較して、撹拌フラスコ培養中でのＭＡＢ０１重鎖発現を７日目に約２．４倍だけ改善した（図１３）。Δｓｌｐ３欠失は、Ｍ２４４親株と比較して、大型撹拌フラスコ中でのＭＡＢ０１重鎖発現を約１．５倍だけ及びＭＡＢ０１軽鎖発現を約１．７倍だけ改善した（図１３）。さらに、Δｓｌｐ３及びΔｇａｐ１と比較した場合、Δｓｌｐ２は、Ｍ２４４親株におけるＭＡＢ０１重鎖発現と比べて、ＭＡＢ０１重鎖発現における最高倍の増加を示した（図１３）。
【０３３７】
ｓｌｐ２を、Ｍ３０６複数欠失株（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１）から欠失させた場合、ｓｌｐ２の欠失は、親株と比較して、胞子形成における低下及びより遅い成長をもたらした。
【０３３８】
実施例４  −  トリコデルマ複数プロテアーゼ欠失株
この実施例は、実施例１〜３において上に同定したプロテアーゼ遺伝子の複数の変異を含むトリコデルマ・リーゼイ（Ｔリーゼイ）からの増加した抗体産生及び安定性を実証する。
【０３３９】
３重欠失株Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１の生成
３重欠失Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１を有するＴリーゼイ株を生成し、抗体産生における改善についてテストした。株を、また、プロテアーゼ欠失のさらなるラウンドのために使用した。
【０３４０】
３重プロテアーゼ欠失株Ｍ２７７の生成
マーカーフリー３重プロテアーゼ欠失株を生成するために、ｐｙｒ４マーカーのループアウトを、株Ｍ２１９に、本質的に、上に記載の通りに、ｐｙｒ４を単一プロテアーゼ欠失株Δｐｅｐ１からループアウトするために適用した。３つの連続的な５−ＦＯＡ選択工程を行い、選択されたクローンが、単一細胞から生じていることを確実にした。最終的なクローンを、（表３．１にリストしたプライマーを使用した）ＰＣＲにより、ｐｙｒ４のループアウトについて検証した；特定のシグナルは、ｐｙｒ４のループアウト部分とアニールするプライマーを用いて見られなかった。ループアウトを、５mMウリジンを伴う又は伴わない最少培地プレート上にクローンをプレーティングすることによりさらに検証した。３重プロテアーゼ欠失株を生成するために使用したクローンを、株番号Ｍ２２８（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１、ｐｙｒ４−）を用いて命名した。
【０３４１】
第３プロテアーゼ遺伝子、スブチリシン様プロテアーゼｓｌｐ１（ＴｒｅＩＤ５１３６５）についての欠失プラスミドｐＴＴｖ１２６を上に記載する（表３．３）。この欠失プラスミドは、ｓｌｐ１遺伝子座における２９５１ｂｐの欠失をもたらし、ＳＬＰ１の完全コード配列をカバーする。
【０３４２】
ベクター配列を除去するために、プラスミドｐＴＴｖ１２６（Δｓｌｐ１−ｐｙｒ４ループアウト）を、ＰｍｅＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、アガロースゲルから、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Qiagen）を使用して精製した。ｓｌｐ１欠失カセットの約５μgを使用し、上のＭ２２８（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１、ｐｙｒ４−）を形質転換した。プロトプラストの調製及び形質転換を、本質的に、株Ｍ１８１及びＭ１９５について実施例１に記載の通りに、ｐｙｒ４選択を使用して行った。
【０３４３】
２００クローンを、第１ストリークとして採取した。これらのストリークの４８を、表４．１にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより、正確な組込みについて、標準的な実験室方法を使用してスクリーニングした。５つの推定３重プロテアーゼ破壊株（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１）を、単一細胞クローンにまで精製した。ｓｌｐ１の欠失は、５つのクローンのサザン分析により検証した（図２６Ａ）。サザン分析を、実施例１に記載の通りに実施した。サザン分析では、また、クローンの３つが、単一組込み体であることが検証された（図２６Ｂ及び２６Ｃ）。２つの他のクローンが、ゲノム中のどこか他で追加コピーを保有することが示され、廃棄された。ｐｙｒ４ブラスターカセットの除去において使用した（及び上の４重プロテアーゼ欠失株Ｍ３０７を生成するための）クローンを、株番号Ｍ２７７（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１）を用いて命名した。
【０３４４】
【表１５】
2018038419.tif 000016
【０３４５】
ＭＡＢ０１産生３重プロテアーゼ欠失株Ｍ３０４の生成
第３プロテアーゼ欠失のためのＭＡＢ０１抗体産生株を生成するために、ｐｅｐ１／ｔｓｐ１  ２重プロテアーゼ欠失株Ｍ１９４（実施例３）を、ＭＡＢ０１軽及び重鎖コンストラクト（ｐＴＴｖ９８＋ｐＴＴｖ６７）を用いて、選択にハイグロマイシン及びアセトアミドを使用して形質転換した。このＭＡＢ０１株は、ｐｅｐ１／ｔｓｐ１  ２重欠失を伴い、番号Ｍ２５２を用いて命名した。ｐｅｐ１遺伝子座からのｐｙｒ４ブラスターカセットの除去は、本質的に、（２重プロテアーゼ欠失株Ｍ２１９の生成において）Ｍ１９５について実施例３に記載の通りに行った。このｐｙｒ４−株を、番号Ｍ２８４を用いて命名し、その後のプロテアーゼ欠失のための親として使用した。
【０３４６】
Ｍ２８４への第３プロテアーゼ欠失を、ｓｌｐ１欠失コンストラクトｐＴＴｖ１２８を使用して得た。このコンストラクトは、ｓｌｐ１遺伝子座に標的化された天然ＫＥＸ２過剰発現カセットを含む。形質転換を、本質的に、ｐｙｒ４選択を使用し、株Ｍ１８１及びＭ１９５について実施例１に記載のプロトコールに従って行った。結果として得られた株は、３重プロテアーゼ欠失株Ｍ３０４を産生するＭＡＢ０１である。
【０３４７】
ＭＡＢ０１産生３重プロテアーゼ欠失株Ｍ３０４の分析
３重プロテアーゼ欠失（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１）ＭＡＢ０１抗体産生株Ｍ３０４が、ＭＡＢ０１抗体を、収量３．５g/Lで、培養（ｐＨ５．５；２８→２２℃；６０g/L粕、３０g/Lグルコース、６０g/Lラクトース＋ラクトースフィード）中で産生することを示し、産物の品質は完全長ＩｇＧの８４%までであった（下の実施例６を参照のこと）。株のプロテアーゼ活性を、また、株を、６０g/l固形粕、３０g/lグルコース、及び６０g/lラクトースを添加したトリコデルマ最少培地中で、ｐＨ５．５で成長させることによりテストした。培養を３０℃で成長させ、次に、産生期のために２２℃にシフトした。フェドバッチ培養を、ラクトースフィードを用いて行った。この株中のカゼインに対する全プロテアーゼ活性は、野生型株Ｍ１２４と比較して、約３．２倍少ないことが決定された（図２０）。
【０３４８】
単一、２重、及び３重欠失株の比較
単一プロテアーゼ欠失（Δｐｅｐ１）株Ｍ１８１（実施例１を参照のこと）、２重プロテアーゼ欠失（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１）株Ｍ２１９（実施例３を参照のこと）、及び３重プロテアーゼ欠失（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１）株Ｍ２７７からの培養上清の相対プロテアーゼ活性を比較した。これらの欠失株を、野生型株Ｍ１２４と比較した。３つのプロテアーゼ欠失株を、４０g/lラクトース、２０g/l粕抽出物、及び１００mM  ＰＩＰＰＳを含む３００mlのＴｒＭＭを伴う２リットル振盪フラスコ中で、ｐＨ５．５で成長させた。サンプルを、３、５、７、及び１０日目に取った。Ｍ１２４、Ｍ１８１、Ｍ２１９、及びＭ２７７からの７日目の培養上清サンプルを、各々、クエン酸ナトリウム緩衝液（５０mM、ｐＨ５．５）中で１：２に希釈し、３０μlを、ＭＡＢ０２を含む１２%ザイモグラムＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上にロードした。ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルを、１００Ｖで４５分間にわたり流した。ゲルを、次に、反応緩衝液（５０mMクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５）を用いて数回洗浄する前に、２．５%ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で１時間にわたりインキュベートした。ザイモグラムゲルを、次に、反応緩衝液中で一晩振盪しながら放置した。翌朝、ゲルを、GelCode Blue染色試薬を用いて染色した。ＭＡＢ０２抗体が分解された領域は、白い斑点として青く染色されたゲル上に現れた。
【０３４９】
２つのプロテアーゼ活性が、コントロールＭ１２４及びＭ１８１Δｐｅｐ１サンプル中で見られた（図２７）。最も優勢な活性が、６５〜９０kDの間で見られ、それはｓｌｐ１に対応する。よりかすかな活性が約２８kDで見られ、それはｔｓｐ１に対応する。期待した通り、Ｍ２１９Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１株は２８kDでザイモグラムバンドを産生しなかった。同様に、Ｍ２７７Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１株はいずれのザイモグラム活性も産生しなかった。ｓｌｐ１の活性サイズは変動するように見える。なぜなら、それは、それが６５kDまで切断された場合、依然として活性であったが、その成熟サイズが９０kDであるからである。サイズの変動を図２７に見ることができる。
【０３５０】
Ｍ１８１、Ｍ２１９、及びＭ２７７欠失株の上清培養からのスクシニル化カゼインに対する全プロテアーゼ活性を、また、３日目、５日目、７日目のサンプルから測定した。上清を、最初に、アッセイする前に、５０mMクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５中で２mg／mlの全タンパク質まで希釈した。５０μlの希釈した上清を９６ウェルプレート中にロードし、５０μlのスクシニル化カゼインを加え、反応を開始させた。カゼインの代わりに緩衝液を用いたバックグラウンドコントロールを、各々のサンプルについて使用した。カゼインの添加後、プロテアーゼ反応を、１時間にわたり３７℃で進行することを許した。反応を展開するために、５０μlのＴＮＢＳＡ試薬をウェル毎に加え、プレートを１６時間にわたり３７℃でインキュベートした。４５０nmでの吸光度を、プレート全体について測定した。非特異的なバックグラウンドシグナルを、特定のプロテアーゼ活性の測定値から減算する。図２８に示す通り、３つのプロテアーゼ欠失株からの上清サンプルは、Ｍ１２４野生型株よりも少ないプロテアーゼ活性を含んだ。
【０３５１】
Ｍ２７７及びＭ１２４培養（５及び７日目）からの上清を、５０mMクエン酸ナトリウム緩衝液中で６mg/mlまで希釈した。これらの希釈された上清に、ＭＡＢ０１抗体を最終濃度０．０５μg/μlまでスパイクした。これらの反応物を、３７℃で一晩インキュベートした。反応物は、ゼロ時間、１時間、及び一晩のインキュベーションで試料採取した。２０μlサンプルを４〜１５%ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル中にロードし、２００ボルトで４０分間にわたり流した。ゲルを、１００ボルトで１時間にわたり、ニトロセルロースに免疫ブロッティングのために移した。膜を、ＴＢＳＴ中の５%ミルクを用いて、１時間にわたりブロックした。ＭＡＢ０１の重鎖を、ＴＢＳＴ中で１：３０，０００に希釈した抗重鎖ＡＰコンジュゲート抗体（Sigma＃Ａ３１８８）を用いて検出した。膜を、ＴＢＳＴを用いて洗浄した後、ブロットを、ＡＰ基質（Promega）を用いて展開した。一晩インキュベートしたサンプルを比較すると、重鎖がＭ１２４株上清中でより多く分解したことが明らかに明白であった。Ｍ１２４は、プロテアーゼ欠失を含まない。３つのプロテアーゼ欠失を用いて、Ｍ２７７株は有意に安定したＭＡＢ０１重鎖を産生した。５日目に、２．５倍より多い重鎖が、一晩インキュベーション後のＭ２７７上清中にあった。７日目の上清を用いて、目に見える４倍より多い重鎖があった（図４１）。
【０３５２】
４重欠失株Ｍ３０７
４重欠失Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１を有するＭ３０７株を生成し、プロテアーゼ欠失のさらなるラウンドのために使用した。
【０３５３】
４重プロテアーゼ欠失株Ｍ３０７の生成
マーカーフリー４重プロテアーゼ欠失株を生成するために、ｐｙｒ４ブラスターカセットの除去を、株Ｍ２７７に、本質的に、実施例３に記載の通りに、単一プロテアーゼ欠失株Ｍ１９５（Δｐｅｐ１）からのｐｙｒ４ブラスターカセットの除去のために適用した。３つの連続的な５−ＦＯＡ選択工程を行い、選択されたクローンが、単一細胞から生じていることを確実にした。最終クローンを、ブラスターカセットの除去について、表４．２にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより、標準的な実験室方法を用いて検証した。特定のシグナルは、ｐｙｒ４の除去部分とアニールするプライマーを用いて、見られなかった。除去を、５mMウリジンを伴う又は伴わない最少培地プレート上にクローンをプレーティングすることによりさらに検証した。成長は、ウリジン添加を伴わないプレート上では観察されなかった。４重プロテアーゼ欠失株を生成するために使用したクローンを、株番号Ｍ３０６（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１、ｐｙｒ４−）を用いて命名した。
【０３５４】
第４プロテアーゼ遺伝子、グルタミン酸プロテアーゼｇａｐ１（ＴｒｅＩＤ６９５５５）のための欠失プラスミドｐＴＴｖ１１７を、実施例２に記載する（表２．１）。この欠失プラスミドは、ｇａｐ１遺伝子座における１０３７bpの欠失をもたらし、ＧＡＰ１の完全コード配列をカバーする。
【０３５５】
ベクター配列を除去するために、プラスミドｐＴＴｖ１１７（Δｇａｐ１−ｐｙｒ４）を、ＰｍｅＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、アガロースゲルから、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。ｇａｐ１欠失カセットの約５μgを使用し、上のＭ３０６（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１、ｐｙｒ４−）を形質転換した。プロトプラストの調製及び形質転換を、本質的に、株Ｍ１８１及びＭ１９５について実施例１に記載の通りに、ｐｙｒ４選択を使用して行った。
【０３５６】
１５０クローンを、第１ストリークとして採取した。これらのストリークの４８を、表４．２にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより、正確な組込みについて、標準的な実験室方法を使用してスクリーニングした。８つの推定４重プロテアーゼ破壊株（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１）を、単一細胞クローンにまで精製した。ｇａｐ１の欠失は、８つのクローンのサザン分析により検証した（図２９Ａ）。サザン分析を、実施例１に記載の通りに実施した。サザン分析では、また、クローンの３つが、単一組込み体であることが検証された（図２９Ｂ及び２９Ｃ）。５つの他のクローンが、ゲノム中のどこか他で追加コピーを保有することが示され、廃棄された。ｐｙｒ４ブラスターカセットの除去において（及び上の５重プロテアーゼ欠失株Ｍ３６９を生成するために）使用したクローンを、株番号Ｍ３０７（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１）を用いて命名した。
【０３５７】
【表１６】
2018038419.tif 000017
【０３５８】
ＭＡＢ０１産生４重プロテアーゼ欠失株Ｍ３７１の生成
ＭＡＢ０１抗体産生を伴う４重プロテアーゼ欠失株を生成するために、株Ｍ３０４からのｓｌｐ１遺伝子座からのｐｙｒ４ブラスターカセットの除去を、本質的に、（２重プロテアーゼ欠失株Ｍ２１９の生成における）Ｍ１９５について実施例３に記載の通りに行った。このｐｙｒ４−株を、番号Ｍ３１７を用いて命名し、その後のプロテアーゼ欠失のための親として使用した。
【０３５９】
Ｍ３１７への第４プロテアーゼ欠失を、上のｇａｐ１欠失コンストラクトｐＴＴｖ１１７を使用することにより得た。形質転換を、本質的に、株Ｍ１８１及びＭ１９５について、ｐｙｒ４選択を使用した、実施例１に記載のプロトコールに従って行った。結果として得られた株は、ＭＡＢ０１を産生する４重プロテアーゼ欠失株Ｍ３７１である。
【０３６０】
４重プロテアーゼ欠失株の分析
４重欠失菌株Ｍ３０７からの培養上清の全プロテアーゼ活性を次に測定し、３重欠失株Ｍ２７７及び野生型株Ｍ１２４からの培養上清と比較した。各々の株を、４０g/lラクトース、２０g/l粕抽出物、及び１００mM  ＰＩＰＰＳを含む３００mlのＴｒＭＭを伴う２リットル振盪フラスコ中で、ｐＨ５．５で成長させた。７日目の上清サンプルを、全プロテアーゼアッセイのために取った。上清の全タンパク質濃度を、標準としてウシ免疫グロブリンを用いたＢＣＡアッセイを使用して測定した。上清を、クエン酸ナトリウム緩衝液中で、ｐＨ５．５で１：２に連続的に希釈した。希釈した上清を、蛍光標識したカゼイン基質に加え、３７℃でインキュベートした。蛍光を、１時間後、４８５nmの励起及び５３０nmの発光で測定した。結果は、３重欠失株Ｍ２７７のプロテアーゼ活性の割合が、野生型株Ｍ１２４より３倍少なく、４重欠失株Ｍ３０７は、野生型株Ｍ１２４よりも８倍少ないことを示した（図３０）。
【０３６１】
加えて、図２０は、Ｍ１８８単一欠失株、Ｍ２１９  ２重欠失株、Ｍ２７７  ３重欠失株、及びＭ３０７  ４重欠失株からのカゼインに対する全プロテアーゼ活性を、野生型Ｍ１２４株と比較し、まとめたものである。ｐｅｐ１単一欠失は、プロテアーゼ活性を１．７倍だけ低下させ、ｐｅｐ１／ｔｓｐ１  ２重欠失は、プロテアーゼ活性を２倍だけ低下させ、ｐｅｐ１／ｔｓｐ１／ｓｌｐ１  ３重欠失は、プロテアーゼ活性を３．２倍だけ低下させ、ｐｅｐ１／ｔｓｐ１／ｓｌｐ１／ｇａｐ１  ４重欠失は、プロテアーゼ活性が７．８倍だけ低下させた（野生型Ｍ１２４株と比較して）（図２０）。
【０３６２】
ＭＡＢ０１抗体産生株Ｍ３７１は、４重欠失Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１を含む。株を発酵槽中で成長させ、３重欠失ＭＡＢ０１産生株と同じ条件下で比較した。バッチ培養を、ＭＡＢ０１を産生し、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、及びｇａｐ１プロテアーゼ欠失ならびにｋｅｘ２過剰発現を伴うＭ３７１株を用いて実施した。株を、４０g/l固形粕、４０g/lグルコース、及び４０g/lラクトースを添加したトリコデルマ最少培地中で、ｐＨ５．５で成長させた。培養を３０℃で成長させ、次に、産生期のために２２℃にシフトした。バッチ培養を、ＭＡＢ０１を産生し、ｐｅｐ１、ｔｓｐ１、及びｓｌｐ１プロテアーゼ欠失ならびにｋｅｘ２過剰発現を伴うＭ３０４株を用いて実施した。株を、４０g/l固形粕、４０g/lグルコース、及び４０g/lラクトースを添加したトリコデルマ最少培地中で、ｐＨ５．５で成長させた。培養を３０℃で成長させ、次に、産生期のために２２℃にシフトした。
【０３６３】
算出した完全長抗体の収量は、６日目のサンプルからのｇａｐ１欠失株において２０%より高かった。同じ条件下で、４重欠失株は１．９g/L（８９７mg/L完全長抗体）を産生し、３重欠失株は１．３g/L（７３１mg/L完全長抗体）を産生した。発酵槽の上清から、カゼインに対する全プロテアーゼ活性を測定した。上清サンプルを、クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５中で希釈し、全タンパク質濃度が、全てのサンプルについて０．１５mg/mlであるようにした。この希釈した上清に、１０μg/mlのＢＯＤＩＰＹカゼインを加え、プロテアーゼアッセイを開始した。培養の各々の日からのサンプルを、２つの異なる株間で比較した。結果は、５日目のｇａｐ１欠失株における３０%まで少ない全プロテアーゼ活性があったことを示す（図３１）。６日目に、プロテアーゼ活性は２０%低かったが、それは、その日の抗体収量における２０%改善と相関する。
【０３６４】
５重欠失株
５重欠失Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２を有するＭ３６９株を生成し、プロテアーゼ欠失のさらなるラウンドのために使用した。
【０３６５】
５重プロテアーゼ欠失株Ｍ３６９の生成
マーカーフリー５重プロテアーゼ欠失株を生成するために、ｐｙｒ４ブラスターカセットの除去を、株Ｍ３０７に、単一プロテアーゼ欠失株Ｍ１９５（Δｐｅｐ１）からのｐｙｒ４ブラスターカセットの除去のために、本質的に、実施例３に記載の通りに適用した。３つの連続的な５−ＦＯＡ選択工程を行い、選択されたクローンが、単一細胞から生じていることを確実にした。最終クローンを、ブラスターカセットの除去について、表４．３にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより、標準的な実験室方法を用いて検証した。特定のシグナルは、ｐｙｒ４ブラスターカセットの除去部分とアニールするプライマーを用いて、見られなかった。除去を、５mMウリジンを伴う又は伴わない最少培地プレート上にクローンをプレーティングすることによりさらに検証した。成長は、ウリジン添加を伴わないプレート上では観察されなかった。５重プロテアーゼ欠失株を生成するために使用したクローンを、株番号Ｍ３２１（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１、ｐｙｒ４−）を用いて命名した。
【０３６６】
第５プロテアーゼ遺伝子、グルタミン酸プロテアーゼｇａｐ２（ＴｒｅＩＤ１０６６６１）についての欠失プラスミドｐＴＴｖ１４５を、実施例２に記載する（表２．３）。この欠失プラスミドは、ｇａｐ２遺伝子座における９４４bpの欠失をもたらし、ＧＡＰ２の完全コード配列をカバーする。
【０３６７】
ベクター配列を除去するために、プラスミドｐＴＴｖ１４５（Δｇａｐ２−ｐｙｒ４ループアウト）を、ＰｍｅＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、アガロースゲルから、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。ｇａｐ２欠失カセットの約５μgを使用し、上のＭ３２１（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１、ｐｙｒ４−）を形質転換した。プロトプラストの調製及び形質転換を、本質的に、株Ｍ１８１及びＭ１９５について実施例１に記載の通りに、ｐｙｒ４選択を使用して行った。
【０３６８】
１００クローンを、第１ストリークとして採取した。全ての２０の成長するストリークを、表４．３にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより、正確な組込みについて、標準的な実験室方法を使用してスクリーニングした。１０の推定５重プロテアーゼ破壊株（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２）を、単一細胞クローンにまで精製し、ＰＣＲにより再スクリーニングした。１つの精製クローンだけが、ｇａｐ２  ＯＲＦについて陰性であった。ｇａｐ２欠失は、クローンのサザン分析により検証した（図３２Ａ）。サザン分析を、実施例１に記載の通りに実施した。サザン分析は、また、クローンが、ゲノム中のどこか他で欠失カセットの追加コピーを保有する、又はその遺伝子座において一部の内部再配列を有することを示した（図３２Ｂ及び３２Ｃ）。これは、得られた５重プロテアーゼ欠失クローンだけであったため、それを、さらなる使用のために選択した（図３２Ｄ及び３２Ｅ）。クローン１４は、ｐｙｒ４ブラスターカセットの除去のために使用し、下の６重プロテアーゼ欠失株Ｍ３９６及びＭ４００を生成するためのクローンであった（図３２Ｅ）。このクローンを、株番号Ｍ３６９（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２）を用いて命名した。
【０３６９】
【表１７】
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【０３７０】
５重プロテアーゼ欠失株の分析
Ｍ３６９株からのプロテアーゼ活性を、その親株Ｍ３０７に対して測定した。ｇａｐ２プロテアーゼ欠失は、カゼインに対する２３%少ないプロテアーゼ活性をもたらした（図３３）。
【０３７１】
６重欠失株
欠失Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４を有する６重プロテアーゼ欠失株を生成し、プロテアーゼ欠失のさらなるラウンドのために使用した。
【０３７２】
ｐｅｐ４欠失プラスミドの生成
第６プロテアーゼ遺伝子、アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ４（ＴｒｅＩＤ７７５７９）についての欠失プラスミドｐＴＴｖ１８１を、本質的に、実施例１におけるΔｐｅｐ１プラスミドｐＴＴｖ７１について記載される通りに構築した。５’隣接領域の９５９ｂｐ及び３’隣接領域の９９２bpを、ｐｅｐ４欠失プラスミドの基礎として選択した。ｐｅｐ１については、ｐｅｐ４についての第１欠失プラスミド（ｐＴＴｖ４３、表４．４）は、別の選択マーカーｂａｒを保有し、それは、ｐｙｒ４ブラスターカセットを用いて置換された。ブラスターカセットを、ｐＴＴｖ７１から、ＮｏｔＩ消化を用いて得て、ＮｏｔＩカットｐＴＴｖ４３に連結し、次に、標準的な方法を使用して、大腸菌中に形質転換した。数個の形質転換体を培養し、プラスミドＤＮＡを単離及び消化し、標準的な実験室方法を使用して、ｐｙｒ４ブラスターカセットの正確な連結及び方向についてスクリーニングした。正確な挿入サイズ及び方向を伴う１つのクローンを配列決定し、保存した（ｐＴＴｖ７３、表４．４）。ブラスターカセットをもう一度わずかに変化させた：ｐｙｒ４の除去において使用したダイレクトリピートフラグメントを、ｐｙｒ４  ５’ＵＴＲの３０８bpからｐｅｐ４  ５’隣接領域の末端からの３００bpダイレクトリピートに変化させた（ｐＴＴｖ１４５、ｇａｐ２−ｐｙｒ４における通り）。これは、ｐＴＴｖ７３から既存のｐｙｒ４ブラスターカセットを、ＮｏｔＩ消化を用いて除去することにより作った。ｐｙｒ４遺伝子を、ＰＣＲにより、ｐＴＴｖ７３をテンプレートとして使用し、表４．４中のプライマーを使用して増幅した。クローニングにおいて使用した酵母相同組換え系について、ベクターについての重複配列を適切なＰＣＲプライマーに置いた。コンストラクトにおいてマーカースイッチを可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位を、ｐｙｒ４選択マーカーの両側に導入し、及び、追加のクローニング工程のために、ＡｓｃＩ部位を、ｐｅｐ４  ５’ダイレクトリピートと３’隣接の間に導入した。ブラスターカセットのこの型は、任意の追加配列を、切除後に、欠失遺伝子の遺伝子座に残さないはずである。３００bpのｐｅｐ４  ５’ダイレクトリピートを、ＰＣＲにより、Ｔリーゼイ野生型株ＱＭ６ａをテンプレートとして使用して増幅した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。組換えから得られたクローンの数個を培養し、プラスミドＤＮＡを単離及び消化し、標準的な方法を使用して正確な組換えについてスクリーニングした。ｐｅｐ４についてのこれらの欠失プラスミド（ｐＴＴｖ４３、ｐＴＴｖ７３、及びｐＴＴｖ１８１、表４．４）は、ｐｅｐ４遺伝子座における１４１３bpの欠失をもたらし、ＰＥＰ４の完全コード配列をカバーする。
【０３７３】
【表１８】
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【０３７４】
６重プロテアーゼ欠失株Ｍ３９６及びＭ４００の生成
マーカーフリー６重プロテアーゼ欠失株を生成するために、ｐｙｒ４マーカーの除去を、株Ｍ３６９に、本質的に、実施例３に記載の通りに、株Ｍ１９５（Δｐｅｐ１）からのｐｙｒ４ブラスターカセットの除去のために適用した。３つの連続的な５−ＦＯＡ選択工程を行い、選択されたクローンが、単一細胞から生じていることを確実にした。最終クローンを、表４．５にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより、標準的な実験室方法を用いて検証した。ブラスターカセットの成功裏の除去に対応するシグナルが、全てのクローンについて得られた。除去を、５ｍＭウリジンを伴う又は伴わない最少培地プレート上にクローンをプレーティングすることによりさらに検証した。成長は、ウリジン添加を伴わないプレート上では観察されなかった。６つの推定ｐｙｒ４−クローンのサザン分析によって、３クローンについてのブラスターカセットの除去を検証した。また、サザン分析は、これらの３つのクローンが、親Ｍ３６９におけるｇａｐ２隣接について見られた余分なシグナルを喪失していることを明らかにした。従って、これらのクローンは、ｇａｐ２遺伝子座において期待されるゲノム組織化を有するはずである。６重プロテアーゼ欠失株を生成するために使用したクローンを、株番号Ｍ３８１（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２、ｐｙｒ４−）を用いて命名した。
【０３７５】
ベクター配列を除去するために、プラスミドｐＴＴｖ１８１（Δｐｅｐ４−ｐｙｒ４ループアウト）を、ＰｍｅＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、アガロースゲルから、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。ｐｅｐ４欠失カセットの約５μgを使用し、Ｍ３８１（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２、ｐｙｒ４−）を形質転換した。プロトプラストの調製及び形質転換を、本質的に、株Ｍ１８１及びＭ１９５について実施例１に記載の通りに、ｐｙｒ４選択を使用して行った。
【０３７６】
２００を超える形質転換体を、第１ストリークとして採取した。３２の成長するストリークを、ＰＣＲ（表４．５にリストするプライマーを使用して）により、正確な組込みについてスクリーニングした。７つクローンが期待されるシグナルを与え、単一細胞クローンにまで精製し、表４．５にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより再スクリーニングした。ｐｅｐ４の欠失は、Ｍ１８１及びＭ１９５について実施例３に記載の標準的な実験室方法を使用し、５つのクローンからのサザン分析により検証した（図３４Ａ及び３４Ｂ）。サザン分析は、また、全ての形質転換体（図３４Ｃ及び３４Ｄ）が、単一組込み体であることを示した。形質転換体中のｐｅｐ４  ＯＲＦについてのＰＣＲスクリーニングにおいて見られるかすかなシグナルがｐｅｐ４遺伝子から生じうることを排除するために、３つのクローンをさらに単一細胞工程を介して精製し、サザンブロットハイブリダイゼーション及びＰＣＲにより再分析した。。ｐｅｐ４  ＯＲＦについてのシグナルは、株の純度を示すいずれの分析からも得られなかった。ｐｙｒ４ブラスターカセットの除去のために（及び７重プロテアーゼ欠失株の生成において）使用したクローン２５−１２０Ａを、株番号Ｍ３９６を用いて、再精製したクローン２５−１２０Ａ−ａを、株番号Ｍ４００を用いて命名した。
【０３７７】
【表１９】
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【０３７８】
４、５、及び６重プロテアーゼ欠失株におけるプロテアーゼ活性の分析
４重プロテアーゼ欠失株Ｍ３０７、５重プロテアーゼ欠失株Ｍ３６９、及び６重プロテアーゼ欠失株の形質転換体を、振盪フラスコ培養中で培養した。上清サンプルを、２０g/L粕及び４０g/Lラクトースを伴い、１００mM  ＰＩＰＰＳを用いてｐＨ４．８で緩衝化したＴｒＭＭ中で成長させた大型撹拌フラスコ培養から取った。ｐＨは５日目に〜４．２５であった。テストした６つのプロテアーゼ欠失形質転換体は、最終的な株ではなかったが、そのため、胞子の純度に起因する特定の変動があった。これらは最良の形質転換体の一部であったが、しかし、さらなる胞子精製をその後に行った。５日目の上清を、５０mMクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５中で１：３に希釈した。この希釈した上清に、BODIPY FLカゼイン（１０μg/ml）を加え、一緒に３７℃で４時間にわたりインキュベートした。プロテアーゼ活性アッセイを、製造者のプロトコール（enzCheckプロテアーゼアッセイキット＃Ｅ６６３８，Molecular Probes）において記載される通りに行った。プロテアーゼ活性の結果を、図３３において見ることができる。
【０３７９】
５重プロテアーゼ欠失株Ｍ３６９を酸性条件下で成長させた場合、プロテアーゼ活性における小さな低下があった。株におけるｇａｐ２の欠失は、カゼインに対するプロテアーゼ活性における２３%低下を提供した。６重プロテアーゼ欠失株において、アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ４を、試験した５つの形質転換体において欠失させた。最良の形質転換体は、その親株Ｍ３６９と比較して、３５%低下を示した。
【０３８０】
７重欠失株の生成
欠失Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３を有する７重プロテアーゼ欠失株を生成し、プロテアーゼ欠失のさらなるラウンドのために使用した。
【０３８１】
ｐｅｐ３欠失プラスミドの生成
第７プロテアーゼ遺伝子、アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ３（ＴｒｅＩＤ１２１１３３）についての第１欠失プラスミドｐＴＴｖ１８８を、本質的に、実施例１においてΔｐｅｐ１プラスミドｐＴＴｖ４１について記載の通りに構築した。５’隣接領域の１２１５ｂｐ及び３’隣接領域の１０８２bpを、ｐｅｐ３欠失プラスミドの基礎として選択した。上のｇａｐ２（ｐＴＴｖ１４５）及びｐｅｐ４（ｐＴＴｖ１８１）欠失プラスミドに関して、このプラスミドにおいて、ダイレクトリピートフラグメントは、ｐｅｐ３  ５’隣接領域の末端から３００bpストレッチである。フラグメントを、表４．６にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより産生した。上のｐＴＴｖ１８１（Δｐｅｐ４−ｐｙｒ４）について、コンストラクトにおいてマーカースイッチを可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位を、ｐｙｒ４選択マーカーの両側に導入し、及び、追加のクローニング工程のために、ＡｓｃＩ部位を、ｐｅｐ３  ５’ダイレクトリピートと３’隣接の間に導入した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。隣接領域のＰＣＲにおいて使用されるテンプレートは、Ｔリーゼイ野生型株ＱＭ６ａであった。ｐｙｒ４マーカー遺伝子を、ｐＴＴｖ１８１から、ＮｏｔＩ消化を用いて得た。ベクター骨格は、実施例１における通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であった。プラスミドを、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築した。
【０３８２】
アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ３（ＴｒｅＩＤ１２１１３３）についての第２欠失プラスミドｐＴＴｖ１９２を、上のプラスミドｐＴＴｖ１８８を骨格として使用して構築した。この第２プラスミドは、天然ＫＥＸ２（ＴｒｅＩＤ１２３１５６）過剰発現カセットを保有し、アスペルギラス・ニジュランスからのアセトアミダーゼ（ＡｍｄＳ）遺伝子を選択マーカーとして使用する。ｐｙｒ４ブラスターカセットを、ｐＴＴｖ１８８から、ＮｏｔＩ−ＡｓｃＩ  ２重消化を用いて除去した。ｃＤＮＡ１プロモーター（テンプレート：ｐＴＨＮ３プラスミドＤＮＡ）、天然ｋｅｘ２（テンプレート：Ｔリーゼイ  ＱＭ６ａゲノムＤＮＡ）、ｔｒｐＣターミネーター（テンプレート：ｐＨＨＯ２プラスミドＤＮＡ）、及びＡｍｄＳマーカー（テンプレート：ｐＨＨＯ１プラスミドＤＮＡ）についてのフラグメントを、表４．６にリストしたプライマーを使用したＰＣＲにより産生した。上のｐＴＴｖ１８８について、コンストラクトにおいてマーカースイッチを可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位を、ＡｍｄＳ選択マーカーの両側に導入した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。プラスミドを、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築した。
【０３８３】
アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ３（ＴｒｅＩＤ１２１１３３）についての第３欠失プラスミドｐＴＴｖ２０５を、上のプラスミドｐＴＴｖ１９２を骨格として使用して構築した。ＡｍｄＳマーカーを、ｐＴＴｖ１９２から、ＮｏｔＩ消化を用いて除去した。新たなｐｙｒ４ブラスターカセット（ＫＥＸ２過剰発現カセット後に位置付けられる）についてのフラグメントを、表４．６にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより産生した。このブラスターカセットにおいて、ダイレクトリピートは、ｐｅｐ３  ３’隣接領域の開始から３００bpストレッチであり、ｐｙｒ４遺伝子の前に位置付けられる。上のｐＴＴｖ１９２について、コンストラクトにおいてマーカースイッチを可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位を、ｐｙｒ４ブラスターカセットの両側に導入した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。プラスミドを、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築した。
【０３８４】
ｐｅｐ３についてのこれらの欠失プラスミド（ｐＴＴｖ１８８、ｐＴＴｖ１９２、及びｐＴＴｖ２０５、表４．６）は、ｐｅｐ３遺伝子座における２５９０bpの欠失をもたらし、ＰＥＰ３の完全コード配列をカバーする。
【０３８５】
【表２０】
2018038419.tif 000021
【０３８６】
７重プロテアーゼ欠失株の生成
マーカーフリー７重プロテアーゼ欠失株を生成するために、ｐｙｒ４マーカーの除去を、６重欠失株Ｍ３６９に、本質的に、実施例３に記載の通りに、株Ｍ１９５（Δｐｅｐ１）からのｐｙｒ４ブラスターカセットの除去のために適用した。４つの連続的な５−ＦＯＡ選択工程を行い、選択されたクローンが、単一細胞から生じていることを確実にした。
【０３８７】
最終クローンを、表４．７にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより、標準的な実験室方法を用いて検証した。ブラスターカセットの成功裏の除去に対応するシグナルが得られた。ブラスターカセットの除去を、５mMウリジンを伴う又は伴わない最少培地プレート上にクローンをプレーティングすることによりさらに検証した。成長は、ウリジン添加を伴わないプレート上では観察されなかった。４つの推定ｐｙｒ４−クローンのサザン分析によって、全てのクローンについてのブラスターカセットの除去を検証した（図３４Ｅ）。７重プロテアーゼ欠失株を生成するために使用したクローン（２５−１２０Ａ−６２）を、株番号Ｍ４０２（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４、ｐｙｒ４−）を用いて命名した。
【０３８８】
２つの並列した形質転換を行った；ｐＴＴｖ１８８からの欠失コンストラクトを伴う１つ（標準的なｐｅｐ３欠失）及びｐＴＴｖ２０５を伴う他（ＫＥＸ２過剰発現が含まれる）。ベクター配列を除去するために、プラスミドｐＴＴｖ１８８及びｐＴＴｖ２０５を、ＰｍｅＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、アガロースゲルから、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。いずれかの欠失カセットの約５μgを使用し、Ｍ４０２（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４、ｐｙｒ４−）を形質転換した。プロトプラストの調製及び形質転換を、本質的に、株Ｍ１８１及びＭ１９５について実施例１に記載の通りに、ｐｙｒ４選択を使用して行った。
【０３８９】
形質転換体を、第１ストリークとして採取した。成長するストリークを、ＰＣＲ（表４．７にリストするプライマーを使用して）により、正確な組込みについてスクリーニングした。期待されるシグナルを与えるクローンを、単一細胞クローンにまで精製し、表４．７にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより再スクリーニングした。
【０３９０】
ｐｅｐ３の欠失は、実施例１に記載する方法を使用し、選択されたクローンからのサザン分析により検証した。選んだクローンを、ｐｙｒ４ブラスターカセットの除去のために、及び、８重プロテアーゼ欠失株の生成において使用した（図３４Ｅ）。
【０３９１】
【表２１】
2018038419.tif 000022
【０３９２】
８重欠失株の生成
欠失Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５を有する８重プロテアーゼ欠失株を生成する。
【０３９３】
ｐｅｐ５欠失プラスミドの生成
第８プロテアーゼ遺伝子、アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ５（ＴｒｅＩＤ８１００４）についての第１欠失プラスミドを、本質的に、実施例１におけるΔｐｅｐ１プラスミドｐＴＴｖ４１について記載される通りに構築したが、しかし、追加の第２選択マーカーカセット（ｂａｒ、実施例１）を、ｐｙｒ４遺伝子の後に置き、２重選択マーカーブラスターカセットを伴う欠失プラスミドを作製した。２重マーカー系によって、ａ）例えば、初期耐性マーカーとしてのｂａｒ（又はｈｐｈ、ハイグロマイシン耐性用のカセット）の利用及びより速い選択；ｂ）ｐｙｒ４＋株の形質転換（形質転換前にｐｙｒ４−を生成する必要性を伴わない）；ならびにｃ）５フルオロオロチン酸を使用した形質転換体からの両方のマーカーの除去（標準的なｐｙｒ４ブラスターカセットの除去におけるのと同様）及びマーカーフリー、ｐｙｒ４−株をもたらす、内在性ｐｙｒ４の同時変異誘発が可能になる。
【０３９４】
アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ５（ＴｒｅＩＤ８１００４）についての第２欠失プラスミドｐＴＴｖ２２９を、上のプラスミドｐＴＴｖ２０２を骨格として使用して構築した。ｐｙｒ４−ｂａｒ  ２重マーカーを、ｐＴＴｖ２０２から、ＮｏｔＩ消化を用いて除去した。ｐｙｒ４マーカー遺伝子を、ｐＴＴｖ１８１から、ＮｏｔＩ消化を用いて得た。プラスミドｐＴＴｖ２２９のクローニングを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを室温で使用した、標準的な連結を用いて行った。連結混合物の一部を、大腸菌中に、エレクトロポレーションを用いて形質転換した。数個のクローンを培養し、プラスミドＤＮＡを単離し、消化し、標準的な実験室方法を使用して、正確な連結についてスクリーニングした。マーカーの正確な連結及び方向を、配列決定によりさらに検証した。ｐｅｐ５についてのこれらの欠失プラスミド（ｐＴＴｖ２０２及びｐＴＴｖ２２９、表４．８）は、ｐｅｐ５遺伝子座における１６８７bpの欠失をもたらし、ＰＥＰ５の完全コード配列をカバーする。
【０３９５】
５’隣接領域の１３４８bp及び３’隣接領域の１１６４bpを、ｐｅｐ５欠失プラスミドの基礎として選択した。ｐｅｐ５の５’隣接の末端から３００bpストレッチを、ダイレクトリピートフラグメントとして使用した。これらのフラグメントならびに第２選択マーカーカセットｂａｒ（実施例１）を、表４．８にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより増幅した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。完全な２重マーカーカセットの除去を可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位を、２重マーカーカセットの両側に導入し、ＡｓｉＳＩ部位を、２つの選択マーカーの間に導入した。ＡｓｃＩ部位を、ｐｅｐ５の５’ダイレクトリピートと３’隣接の間に導入した。ベクター骨格は、実施例１における通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であった。ｐｙｒ４選択マーカーを、ｐＴＴｖ１８１（上のΔｐｅｐ４−ｐｙｒ）から、ＮｏｔＩ消化を用いて得た。プラスミドを、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築した。ｐｅｐ５についてのこの欠失プラスミド（ｐＴＴｖ２０２、表４．８）は、ｐｅｐ５遺伝子座における１６８７ｂｐの欠失をもたらし、ＰＥＰ５の完全コード配列をカバーする。
【０３９６】
【表２２】
2018038419.tif 000023
【０３９７】
８重プロテアーゼ欠失株の生成
マーカーフリー８重プロテアーゼ欠失株を生成するために、ｐｙｒ４マーカーの除去を、７重欠失株Ｍ４８６（３４−１４Ａ−ａ、Ｍ４０２中のｐＴＴｖ２０５）に、本質的に、実施例３に記載の通りに、株Ｍ１９５（Δｐｅｐ１）からのｐｙｒ４ブラスターカセットの除去のために適用した。４つの連続的な５−ＦＯＡ選択工程を行い、選択されたクローンが、単一細胞から生じていることを確実にした。
【０３９８】
最終クローンを、表４．９にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより、標準的な実験室方法を用いて検証した。ブラスターカセットの成功裏の除去に対応するシグナルが、クローンの大部分について得られた。ブラスターカセットの除去を、５mMウリジンを伴う又は伴わない最少培地プレート上にクローンをプレーティングすることによりさらに検証した。成長は、ウリジン添加を伴わないプレート上では観察されなかった。推定ｐｙｒ４−クローンのサザン分析によって、ブラスターカセットの除去を検証した。
【０３９９】
ベクター配列を除去するために、プラスミドｐＴＴｖ２２９を、ＰｍｅＩ＋ＸｂａＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、アガロースゲルから、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。欠失カセットの約５μgを使用し、８重プロテアーゼ欠失株（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３、ｐｙｒ４−）のクローンを形質転換した。プロトプラストの調製及び形質転換を、本質的に、株Ｍ１８１及びＭ１９５について実施例１に記載の通りに、ｐｙｒ４選択を使用して行った。
【０４００】
形質転換体を、第１ストリークとして採取した。成長するストリークを、ＰＣＲ（表４．９にリストするプライマーを使用して）により、正確な組込みについてスクリーニングした。期待されるシグナルを与えるクローンを、単一細胞クローンにまで精製し、表４．９にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより再スクリーニングする。ｐｅｐ５の欠失を、サザン分析により、選択したクローンから、実施例１に記載の方法を使用して検証する。
【０４０１】
【表２３】
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【０４０２】
実施例５  −  プロテアーゼ阻害剤を用いた、改善された抗体産生
この実施例は、トリコデルマ・リーゼイ産生株において完全長抗体の産生を増加させるプロテアーゼ阻害剤の能力を実証する。
【０４０３】
重鎖が、トリプシンプロテアーゼ及びキモトリプシンプロテアーゼにより切断されるとの知識に基づき、これら２つの酵素クラスの阻害剤を、インビトロ及び抗体産生Ｔリーゼイ株を利用した培養実験の両方において、抗体分解に対してテストした。阻害剤の大豆トリプシン阻害剤（ＳＢＴＩ）及びキモスタチンをテストした。なぜなら、それらは、抗体重鎖を安定化することが、インビトロ実験において以前に示されているためである。
【０４０４】
インビトロ阻害剤処理
キモスタチン及びＳＢＴＩを、培養上清を用いてインビトロで分析した。フェドバッチ発酵槽培養物からの上清を、クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５（ｐＨ５．５；２８℃；２０g/L粕抽出物、６０g/Lラクトース）を用いてで６mg/mlに希釈した。フェドバッチ培養を、Ｔリーゼイ野生型株Ｍ４４を用いて実施し、それは異種タンパク質発現を含まない。株を、２０g/l粕抽出物及び６０g/lラクトースを添加したトリコデルマ最少培地中で、ｐＨ５．５及び２８℃で成長させた。
【０４０５】
この希釈した上清に、０．０５μg/μlリツキシマブ、１００μMキモスタチン、１mg/mＳＢＴＩ、又は両方の阻害剤の組み合わせを、全容積５０μl中に加え、０、１、及び１９時間で試料採取し、リツキシマブ抗体重鎖の早期及び後期分解を評価した。結果として得られた重鎖産物を、ＴＢＳＴ中で１：３０，０００に希釈した抗重鎖ＡＰコンジュゲート抗体（Sigma＃Ａ３１８８）を使用した免疫ブロットにより分析した（図３５）。重鎖から生成された初期の分解産物は、約４２kDａ及び３８kDａであり、それらは未処理のコントロールレーンにおいて１時間で見られた（図３５）。追加のフラグメントを１９時間後に生成したが、２つの主要な産物が残った。キモスタチン処理は、４２kDａフラグメントの最初の産生を阻害したが、ＳＢＴＩ処理は、３８kDフラグメントを形成から阻害した（図３５）。２つの化合物を組み合わせることによって、最初の重鎖分解の約９６%及び１９時間後の分解の約７５%が阻害された（図３５）。これらの結果は、２つの阻害剤がリツキシマブ抗体重鎖を効果的に安定化することができたことを実証する。
【０４０６】
阻害剤を用いたＴリーゼイ培養の処理
阻害剤の有効性を、また、リツキシマブ抗体産生株を用いてテストし、それはＶＡＬＥＫＲリンカー配列及びｐｅｐ１欠失を含む。この株を、三通りに、小さなフラスコ中で、キモスタチン、ＳＢＴＩ、又はペプスタチンＡの存在又は非存在の両方において成長させた。小さな振盪フラスコは、５０mlのＴｒＭＭプラスラクトース（４０g/l）、粕抽出物（２０g/l）、及びｐＨ５．５の１００mM  ＰＩＰＰＳを伴う緩衝液を含んだ。ＳＢＴＩ阻害剤を、１００μg/ml又は５００μg/mlのいずれかの最終濃度で培養に加えた。キモスタチンを１００μMで使用し、ペプスタチンＡを１０μMで使用した。３つの阻害剤の各々を、２、３、４、及び５日目に毎日培養に加えた。
【０４０７】
培養の成長を、ｐＨにより、２日目から７日目まで毎日経過観察した。ＳＢＴＩで成長させた培養物について、未処理のコントロールと比較して、培養物のｐＨにおける有意差はなかった。ＰＩＰＰＳ緩衝化培養において、ｐＨは、初期ｐＨ５．５から６日後にｐＨ４．８まで下に減少した。キモスタチン及びペプスタチンＡを用いて、培養を７日目までモニターした。７日目、コントロールボトルについての平均ｐＨは４．６であり、キモスタチン処理培養についての平均ｐＨは４．９あり、及び、ペプスタチンＡ処理培養の平均ｐＨは５．０であった。このように、キモスタチン及びペプスタチンＡを用いて処理した培養について、成長における小さな低下があった。
【０４０８】
培養上清サンプル（３０μl）を、また、３、４、及び５日目に、抗体産生の分析のために収集した。分析を、抗ＩｇＧ重鎖抗体ＡＰコンジュゲート（Sigma  ＃Ａ３１８８）及び抗軽鎖抗体ＡＰコンジュゲート（Sigma  ＃Ａ３８１２）を使用した免疫ブロットにより実施した。各々の抗体を、ＴＢＳＴ中で１：３０，０００に希釈した。完全長リツキシマブ重鎖は約５１kDであり、リツキシマブ軽鎖ＣＨＢＩ融合体は約１００kDであり、遊離リツキシマブ軽鎖は約２８kDである。
【０４０９】
ＳＢＴＩを用いて処理した培養上清サンプルでの免疫ブロット分析の結果を、図３６に示す。試料採取した全ての日に、未処理培養中よりも、ＳＢＴＩ処理培養中に存在する、より多くの完全長リツキシマブ重鎖及び３８kD分解産物があった。５日目、リツキシマブ重鎖産生は、未処理培養中よりも、ＳＢＴＩ処理培養中で数倍高かった（図３６Ａ）。このように、ＳＢＴＩの使用は、リツキシマブ重鎖産生の改善に正の効果を有した。全体的なリツキシマブ軽鎖生産におけるマイナーな改善が、特に、担体結合軽鎖を用いてあった（図３６Ｂ）。
【０４１０】
キモスタチン及びペプスタチンＡを用いて処理した培養上清サンプルの免疫ブロット分析の結果を、図３７に示す。キモスタチン処理培養は、ＳＢＴＩを用いて見られるものと同様の結果を示した（図３７）。リツキシマブ重鎖は、５日目に安定化された（図３７Ｂ）。未処理コントロール培養と比較した場合、キモスタチンは、産生された完全長リツキシマブ重鎖の量を増加させたが、３８kDでの主要な分解産物が依然として見られた。
【０４１１】
全体的に、ＳＢＴＩ処理は、キモスタチン処理よりも高いタンパク質産生を促進する際により効果的であったように見える。しかし、キモスタチン処理は、フラグメントに対してより高い完全長リツキシマブ重鎖の比率を産生した。図３７Ｂに見られる通り、第３キモスタチン培養サンプルは、１０%重鎖フラグメントと比較して、約９０%完全長リツキシマブ重鎖を示した。このように、ＳＢＴＩ及びキモスタチン処理の組み合わせは、より高い抗体産生の収量を達成するために非常に有益であろう。
【０４１２】
実施例６  −  Ｔリーゼイ抗体産生
この実施例では、実施例１〜４において上に記載のＴリーゼイプロテアーゼ欠失株において産生された抗体の量を定量化する。
【０４１３】
抗体精製
表６．１にリストするＴリーゼイプロテアーゼ欠失株の各々からの培養上清を、０．４５μmシリンジフィルターを通して濾過し、精製の前に、１／５０容積の１Mリン酸ナトリウム、ｐＨ７を加えることにより結合緩衝液の組成に調整した。親和性カラムをAKTA Purifierに接続し、精製を、製造者の指示に従って実施した。以下のクロマトグラフィー条件を使用した：流速１ml/分；検出２８０nm；注射ループ、５ml；緩衝液Ａ、２０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ７；緩衝液Ｂ、０．１Mグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７。緩衝液Ａを用いたイソクラティック実行を、溶出の開始まで行い、それは５mlの緩衝液Ｂを用いて行った。カラムを、少なくとも５mlの緩衝液Ａを用いて、各々の分析の前に平衡化した。１mlの培養上清を、定量的な実行のために注射した。０．５ml分画を、４０μlの０．５M  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９を含むチューブ中に、溶出工程の間に収集した。抗体を２つの分画中に急速に溶出させ、それを１mlの１つのサンプル中にプールした。各々のサンプルシリーズ（発酵）の間で最も高いピーク面積を伴うサンプルから、５〜１０ml注射容積を用いた１実行を実施し、ゲル濾過分析のためのより濃縮されたサンプルを得た。
【０４１４】
定量化のために、抗体標準の一連の希釈物を調製し、分析されるサンプルと同様に、HiTrap Protein Gカラムに１ml容積で流した。２８０nmで測定したピーク面積の標準曲線（１０〜５００μg）を確立し、培養上清から単離したＭＡＢ０１又はリツキシマブ抗体の定量化のために使用した。精製サンプルの品質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりチェックした。
【０４１５】
Ｐｒｏｔ  Ｇ精製サンプルのゲル濾過プロファイル
各々の精製ＭＡＢ０１及びリツキシマブ抗体の２５０μlサンプルを、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（２５mM  Ｔｒｉｓ、１４０mMＮａＣｌ、及び３mM  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）中で、AKTA Purifier HPLCシステムに接続されたSuperdex 200 10/300 GLゲル濾過カラム（Amersham Biosciences）に流した。流速０．７５ml/分であり、吸光度を２８０nmで測定した。分画（０．７５ml）を全実行の間に収集した。１つのピークだけを示した分画を、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で濃縮し、特徴を評価した（図３８）。溶出した各々のピークのパーセンテージを、ピーク面積を、２８０nmで測定したサンプルの全面積を用いて割ることにより算出した。
【０４１６】
抗体精製プロセスを、図３８に示す。
【０４１７】
抗体定量化
Ｔリーゼイプロテアーゼ欠失株により産生された抗体の量を、表６．１にまとめる。
【０４１８】
【表２４】
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2018038419.tif 000026
【０４１９】
表６．１において、抗体（ｍＡｂ）の全量は、培養上清から精製したタンパク質の量である。タンパク質精製後、抗体を、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて流し、完全長組み立て抗体の量を測定した。この量を、次に、「完全ｍＡｂ」として言及した。
【０４２０】
表６．１に示す通り、Ｍ３０４  ３重欠失株（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１）では、３５００mg/Lの全ＩｇＧの抗体収量が達成され、２５００mg/Lが、完全長ＭＡＢ０１抗体に正確に組み立てられた。これは、完全長抗体の７１%に対応する。完全長抗体のパーセンテージにおける改善は、ＳＬＰ１欠失の結果であった。Ｍ３０４株とは対照的に、Ｍ２４７  ２重欠失株（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１）では、完全長抗体の４３%産生収量が達成された（ｐＨ５，５；２２℃；９g/lカザミノ酸；２０g/L粕抽出物、６０g/Lラクトース）。このように、Δｓｌｐ１欠失の追加によって、産物の品質が有意に（２５%だけ）改善することを直接的に見ることができる。
【０４２１】
Ｍ５０７  ＭＡＢ０１の産生株における抗体品質改善
２つのＭＡＢ０１産生株を産生した（３プロテアーゼ欠失バックグラウンドにおけるＭ３０４及び７プロテアーゼ欠失バックグラウンドにおけるＭ５０７）。Ｍ３０４株を、重鎖及び軽鎖についての別々のカセットを用いて構築した（図４９）。重鎖をｃｂｈ１遺伝子座中に、軽鎖をｅｇｌ１遺伝子座中に組込んだ。Ｍ５０７株を、重鎖及び軽鎖の両方を含むタンデムカセットをＣＢＨＩ遺伝子座中に組込むことにより作製した（図４９）。ＭＡＢ０１タンデムベクターは、重鎖及び軽鎖を反対方向に方向付ける。軽鎖ではＮＶＩＳＫＲ切断部位を使用し、重鎖ではＤＧＥＴＶＶＫＲ切断部位を使用する。Ｍ３０４株は、欠失された３つのプロテアーゼｐｅｐ１、ｔｓｐ１、及びｓｌｐ１を有する。Ｍ５０７株は、欠失された７つのプロテアーゼｐｅｐ１、ｔｓｐ１、ｓｌｐ１、ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３を有する。両方の株が、ｋｅｘ２プロテアーゼを過剰発現する。
【０４２２】
ＭＡＢ０１双方向タンデムベクターｐＴＴｖ２２３を、標準的なプロトプラスト形質転換を使用し、ｋｅｘ２過剰発現を伴う７重プロテアーゼ欠失株Ｍ４８６に形質転換した。形質転換体をアセトアミド−トリトンプレート上で選択し、第１ストリークを、ｃｂｈ１遺伝子座へのＡｍｄＳマーカーの５’及び３’組込みについてＰＣＲスクリーニングした。２重陽性形質転換体を、単胞子培養を通じて精製し、胞子ストックを、アンピシリンを用いて添加したＰＤプレート上に生成した。
【０４２３】
Ｍ３０４及びＭ５０７株を、３０g/lグルコース、６０g/l粕、６０g/lラクトースを伴う発酵槽中で培養し、２８℃でのラクトース供給を伴い、後に培養中で２２℃にシフトした。Ｍ５０７株を、ｐＨ５．２（培養ｂｉｏ００５４１ｂ）及びｐＨ５．５（培養ｂｉｏ００５４３ｂ）で培養した。Ｍ３０４株を、ｐＨ５．５（培養ｂｉｏ００５０３ｂ）で成長させた。Ｍ３０４発酵ｂｉｏ００４７７ｂサンプルを、ｂｉｏ００５０３ｂ免疫ブロットにおけるコントロールとして含めた。ｂｉｏ００４７７ｂ培養を、ｂｉｏ００５０３ｂについて記載される通りの同じ培地及び条件で行った。
【０４２４】
Ｍ５０７株を、ｐＨ５．２及びｐＨ５．５の両方で培養し、抗体産生に対するｐＨの効果を試験した。ｐＨ５．２発酵からの上清サンプルを、ウェスタンブロットにより分析し、図５０Ａに示し、ｐＨ５．５発酵からのサンプルを図５０Ｂに示した。産生された抗体は、両方のＭ５０７培養において、かなり類似して見えた。いくらかより多い軽鎖が、ｐＨ５．２条件においてあった。両方の培養において、重鎖フラグメントがあった。Ｍ３０４株をｐＨ５．５で培養し、その結果を図５１において見ることができる。産生された完全長重鎖の量は、７日目の後にＭ３０４株において下落する。重鎖の量は、９日目の後にＭ５０７株において下がる。株間における他の差は、産生された軽鎖の量であった。Ｍ３０４は、有意により多くを産生した。
【０４２５】
３つの発酵実行からのプロテインＧ精製免疫グロブリン濃度を、表６．２に見ることができる。Ｍ３０４株についての最も高い全抗体濃度は、９日目での３．１g/lであった。Ｍ５０７株についての最も高い濃度は、１０日目での、ｐＨ５．２での３．０g/l及びｐＨ５．５での２．８g/lであった。サイズ排除クロマトグラフィー後、完全長抗体の量を、各々のサンプルについて算出した（表６．３）。最も高い完全サイズ抗体の量は、８日目（ｐＨ５．２）及び９日目（ｐＨ５．５）のＭ５０７発酵の両方について２．０g/lであった。Ｍ３０４は、完全長抗体の類似した２．０g/lレベルを８日目に産生した。
【０４２６】
【表２５】
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【０４２７】
Ｍ３０４株とＭ５０７株の間の差は、培養の時間経過にわたって産生された完全長抗体のパーセンテージを考慮した場合に明らかになる。完全長抗体のパーセンテージは、株Ｍ３０４と比較して、Ｍ５０７を用いてより高かった。ｐＨ５．５で成長させたＭ５０７株は、最も高い品質の抗体を産生し、７８%までが７日目に完全長であった。Ｍ３０４は６日目に６８%に達したが、しかし、次に、産物の品質は、Ｍ５０７と比較して減少する。Ｍ５０７産物は、９日目まで、７３%完全長であった。
【０４２８】
【表２６】
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【０４２９】
【表２７】
2018038419.tif 000029
【０４３０】
プロテアーゼ活性測定
上清中のプロテアーゼ活性を、同じ条件下で成長させたＭ３０４株とＭ５０７株の間で比較した。Ｔｒｉａｂ６２及びＴｒｉａｂ６７培養を、ｐＨ５．５で、３０g/lグルコース、６０g/lラクトース、２０g/l全粕、２０g/l粕抽出物中で、２８℃でのラクトースフィードを伴い成長させ、後に培養中で２２℃にシフトした。
【０４３１】
タンパク質濃度を、２〜７日目からの全ての上清サンプルから決定した。全ての上清を、クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５に希釈し、全てのサンプルが、０．６２５mg/mlの全タンパク質濃度を有するようにした。全ての希釈された上清の１００μlを、サンプル当たり３つの複製ウェルを使用し、黒色の９６ウェルプレート中に加えた。クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５中で作られたカゼインＦＬ希釈ストック（１０μg/ml）の１００μlを、各々の上清を含むウェルに加えた。プレートを、ビニル袋中に覆って、３７℃で培養した。ウェルからの蛍光を、２、３、及び４時間後に測定した。読み取りは、４８５nmの励起及び５３０nmの発光を用いたVarioskan蛍光プレートリーダー上で行った。
【０４３２】
７重プロテアーゼ欠失株Ｍ５０７からの上清中のプロテアーゼ活性は、Ｍ３０４（３プロテアーゼ欠失）よりも２〜２．５倍低かった（表６．５を参照のこと）。欠失された酸性プロテアーゼ（ｇａｐ１、ｇａｐ２、ｐｅｐ４、ｐｅｐ３）が、この改善に寄与する。７重欠失株における一般的なプロテアーゼ活性は、カゼイン基質を用いて著しくより低い。このデータは、一般的に、パーセンテージ完全長抗体を用いて見られた結果と相関する。より低いプロテアーゼ活性は、より高い品質の抗体に導く。
【０４３３】
【表２８】
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【０４３４】
実施例７  −  非抗体タンパク質の産生
モデルタンパク質ＩＧＦ１、ｈＧＨ、及びＩＦＮα２ｂのプロテアーゼ安定性を、それらを、６重プロテアーゼ欠失株（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４）Ｍ４００からの上清中にスパイクすることにより分析した。上清を、大型振盪フラスコ培養ＣＡＨ１５から収集した。振盪フラスコ培養ＣＡＨ１５からの未希釈上清を、精製モデルタンパク質を用いて、ペプスタチンＡ（５０μM）及びＳＢＴＩ（０．２mg/ml）阻害剤を伴い及び伴わず、２０時間にわたり３７℃でインキュベートした。５日間培養上清のｐＨは、約４．２であった。０．０５μg/μlのモデルタンパク質を含む反応を、２０時間後に採取した。モデルタンパク質（０．０５μg/μl）を用いてスパイクした５０mMクエン酸ナトリウムｐＨ４．０を、緩衝液コントロールとして使用した。
【０４３５】
各々の反応から、１０μlを１８%ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル中にロードし、２００Ｖで３０分間にわたり流した。ゲル中のタンパク質を、次に、免疫ブロッティングのためにニトロセルロースに移した。ニトロセルロース膜を、１時間にわたり室温で、ＴＢＳＴ緩衝液中の５%ミルクを用いてブロックした。個々のブロットを、それらの特異的な一次抗体を用いてプローブし、適切なモデルタンパク質を、１時間わたり室温で、シェーカー上で検出した。マウス抗ＩＧＦ１抗体（R&D systems  ＃ｍａｂ２９１）を、ＴＢＳＴ中で希釈した２μg/mlで使用した。マウス抗ｒｈＧＨ抗体（Abcam  ＃ａｂ５１２３２）を、ＴＢＳＴ中で希釈した２μg/mlで使用した。マウス抗ＩＦＮα２ｂ抗体（Abcam  ＃ａｂ９３８６）を、ＴＢＳＴ中で希釈した１μg/mlで使用した。ブロット膜を、ＴＢＳＴを用いて簡単に洗浄した後、二次抗体を、１時間にわたり室温で振盪させながら加えた。二次ヤギ抗マウスＡＰコンジュゲート抗体（BioRad  ＃１７０−６５２０）を、ＴＢＳＴ中で１：１０，０００に希釈した。
【０４３６】
上清中で一晩インキュベートした場合、完全長タンパク質が、ｈＧＨ、ＩＦＮα２ｂ、及びＩＧＦ１について観察されたが、大部分が分解さているように見えた（図４２）。ヒト成長ホルモン及びＩＦＮα２ｂについての優勢な分解産物があった（約１５ｋＤ）。しかし、これらの３つのモデルタンパク質は、上清を、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤ペプスタチンＡを用いて処理した後、著しく安定化された。この阻害剤は、プロテアーゼ活性の大部分について責任のある重要なプロテアーゼを遮断した。ＳＢＴＩは、産物安定性について、小さな利益だけを提供した。ＳＢＴＩについての最適なｐＨは、実験において使用されるよりも高いが（ｐＨ４．２対最適ｐＨ８．０）、このように、それらの標的プロテアーゼへのこれらの阻害剤の結合は、最も効率的ではないであろう。
【０４３７】
ペプスタチンＡは、アスパラギン酸プロテアーゼを効果的に阻害する。ペプスタチンＡを用いた親和性精製試験から、上清中の残りのアスパラギン酸プロテアーゼは、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、及びｐｅｐ５であることは公知である。従って、残りの２又は３つのアスパラギン酸プロテアーゼを欠失させた場合、上清にはアスパラギン酸プロテアーゼ活性はほとんどないであろう。これらのモデルタンパク質の産生のために、アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ２、ｐｅｐ３、及びｐｅｐ５が、主要なプロテアーゼであると考えられうる。
【０４３８】
この同じスパイク実験を、ＭＡＢ０１を用いて行い、阻害剤を伴い及び伴わず、６プロテアーゼ欠失上清中でのその安定性を研究した（図４３）。サンプルを、上に記載の通りに取り、抗重鎖ＡＰコンジュゲート抗体（Sigma＃Ａ３１８８）を用いて免疫ブロットした。２０時間のインキュベーション後、有意な重鎖分解はなかった。阻害剤を使用したことに明らかな利益はなかった。抗体は、このｐＨ４．２上清中で安定であった。より酸性の条件（例えばｐＨ４．５など）下でのＭＡＢ０１の産生は、産生収量を改善する又は生じうる重鎖切断の量を少なくとも減少させる可能性が高いであろう。
【０４３９】
いずれの阻害剤がｈＧＨの産生を最良に安定化させうるのかを評価するために、これらの株の２４ウェル培養を実施した。Ｍ３６９ヒト成長ホルモン株（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２）を、単一成分と又は以下の組み合わせと共に成長させた：トリプシン及びスブチリシン阻害剤ＳＢＴＩ、酸性プロテアーゼ阻害剤ペプチドＳＩＰ、酸性プロテアーゼ阻害剤ペプチドＬＩＰ、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤ペプスタチンＡ遊離ペプチド、アガロースビーズに固定化したペプスタチンＡ、ライマメからのトリプシン及びスブチリシン阻害剤ＢＢＩ、スブチリシン阻害剤キモスタチン、及びＢＳＡ。３つの非依存的なウェルを、コントロールウェルのために選び、そこでは阻害剤又はサプリメントを加えなかった。これらの２つの株を、硫酸アンモニウムを伴わないクエン酸二アンモニウム、１００mM  ＰＩＰＰＳ、２０g/L粕抽出物、４０g/Lラクトースを伴い、ｐＨ４．５に調整したＴｒＭＭの３ml中で成長させた。２４ウェルプレートを、８００rpm、８５%湿度、及び２８℃で振盪した。培養物を６日間にわたり成長させ、空気透過性膜を用いてカバーした。
【０４４０】
阻害剤を、最初に１日目に、次に、３日目に開始して毎日加えた。１００μlのサンプルを培養ウェルから取り、３日目に開始した。菌糸体を５分間にわたり１３ｋでスピンダウンし、上清を収集した。培養上清から、１２μlを４〜２０%ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル中にロードし、免疫ブロッティングを、ニトロセルロース上で、ＴＢＳＴ中に１：１０，０００に希釈したマウス抗ｈＧＨ抗体（２μg/ml）及びヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡＰコンジュゲート二次抗体を用いて行った。
【０４４１】
４日目に、ヒト成長ホルモンが、全ての３つのコントロールレーンにおける培養上清中で依然として見ることができた（図４４）。コントロールレーンの２つが、かすかなバンドを示し、１つのコントロールレーンが、薄いバンドを示す。阻害剤及びサプリメントの効果が、直ちに観察された。大きな効果を有した阻害剤／サプリメントを、赤色でハイライトし、最良の効果を伴うものに星を付けている。ペプスタチンＡは、成長ホルモン産生に対する負の効果を有した。５又は２０μMで使用した場合、ｈＧＨの産生は存在しないように思われた。それは、産生に特定の毒性効果を有するように見える。ペプスタチンをアガロースビーズ上に固定化した場合にだけ、この効果は否定された。最良の処理の１つは、ペプスタチンＡビーズプラス０．２mg/mlＳＢＴＩであった（図４４中のブロット上の第３の星を参照のこと）。ＳＢＴＩ（０．２mg/ml）だけを用いて、改善した産生があったが、しかし、アスパラギン酸プロテアーゼの作用により産生されるように見える、１８kDに存在する大きな分解バンドがあった。期待した通り、この分解産物は、ペプスタチンＡビーズ又はＳＩＰペプチド阻害剤の添加により低下した。ＳＩＰペプチドは、単独で２０又は５０μＭで使用した場合でさえ、有益であった。ＳＩＰペプチドを使用した場合にｈＧＨ量における顕著な増加があったが、しかし、最も大きな改善が、ＳＢＴＩ又はＢＳＡとの組み合わせにおいて使用された場合に生じた。キモスタチン５μm及び２５μMを使用した場合、それは、また、観察された完全長産物の量を改善した。培養を、ＢＳＡ（０．２５%）単独を用いて添加することによって、産生が助けられるが、しかし、大きな分解産物を形成することから防止しなかった。
【０４４２】
発現レベルを、２００ngのコントロールサンプルと比べて推定すると、コントロールウェルは、３〜６mg/Lの間のｈＧＨを産生し、ＢＳＡ（０．２５%）／ＳＩＰ（５０μM）／ＳＢＴＩ（０．２mg/ml）処理は２４．５mg/Lを産生し、ＳＩＰ（５０μM）／ＳＢＴＩ（０．２mg/ml）処理は２６．６mg/Lを産生し、ペプスタチンＡビーズ／ＳＢＴＩ（０．２mg/ml）添加は２４．５mg/LのｈＧＨをもたらした。従って、阻害剤及び添加剤の組み合わせを使用することは、最良に働き、産生レベルを少なくとも４倍だけ増加させた。決定的なパラメータは、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤を混合物中に含むことであった。
【０４４３】
実施例８  −  ＰＥＰ７欠損Ｔリーゼイの生成
アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ７（ＴｒｅＩＤ５８６６９）についての欠失プラスミドを、本質的に、実施例１におけるｐｅｐ１プラスミドｐＴＴｖ４１について記載される通りに構築する。５’隣接領域の１０６２ｂｐ及び３’隣接領域の１１２１ｂｐを、ｐｅｐ７欠失プラスミドの基礎として選択する。フラグメントを、表８．１にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより産生した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。隣接領域のＰＣＲにおいて使用されるテンプレートは、Ｔリーゼイ野生型株ＱＭ６ａからである。ｐｙｒ４ブラスターカセットを、ｐＴＴｖ７１（実施例１）から、ＮｏｔＩ消化を用いて得る。ベクター骨格は、実施例１における通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６である。プラスミドを、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築する。ｐｅｐ７についてのこの欠失プラスミドは、ｐｅｐ７遺伝子座における欠失をもたらし、ＰＥＰ７の完全コード配列をカバーする。
【０４４４】
【表２９】
2018038419.tif 000031
【０４４５】
実施例９  −  ＳＬＰ５欠損Ｔリーゼイの生成
アスパラギン酸プロテアーゼｓｌｐ５（ＴｒｅＩＤ６４７１９）についての欠失プラスミドを、本質的に、実施例１におけるｐｅｐ１欠失プラスミドｐＴＴｖ４１について記載される通りに構築する。５’隣接領域の１０４４bp及び３’隣接領域の１００３bpを、ｓｌｐ５欠失プラスミドの基礎として選択する。フラグメントを、表９．１にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより産生した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。隣接領域のＰＣＲにおいて使用されるテンプレートは、Ｔリーゼイ野生型株ＱＭ６ａからである。ｐｙｒ４ブラスターカセットを、ｐＴＴｖ７１（実施例１）から、ＮｏｔＩ消化を用いて得る。ベクター骨格は、実施例１における通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６である。プラスミドを、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築する。ｓｌｐ５についてのこの欠失プラスミドは、ｓｌｐ５遺伝子座における欠失をもたらし、ＳＬＰ５の完全コード配列をカバーする。
【０４４６】
【表３０】
2018038419.tif 000032
【０４４７】
実施例１０  −  ＳＬＰ６欠損Ｔリーゼイの生成
アスパラギン酸プロテアーゼｓｌｐ６（ＴｒｅＩＤ１２１４９５）についての欠失プラスミドを、本質的に、実施例１におけるｐｅｐ１欠失プラスミドｐＴＴｖ４１について記載される通りに構築する。５’隣接領域の１１９２bp及び３’隣接領域の１１１４bpを、ｓｌｐ６欠失プラスミドの基礎として選択する。フラグメントを、表１０．１にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより産生する。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離する。隣接領域のＰＣＲにおいて使用されるテンプレートは、Ｔリーゼイ野生型株ＱＭ６ａからである。ｐｙｒ４ブラスターカセットを、ｐＴＴｖ７１（実施例１）から、ＮｏｔＩ消化を用いて得る。ベクター骨格は、実施例１における通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６である。プラスミドを、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築する。ｓｌｐ６についてのこの欠失プラスミドは、ｓｌｐ６遺伝子座における欠失をもたらし、ＳＬＰ６の完全コード配列をカバーする。
【０４４８】
【表３１】
2018038419.tif 000033
【０４４９】
実施例１１  −  ＳＬＰ７欠損Ｔリーゼイの生成
ｓｌｐ７欠失プラスミドの生成
セリンプロテアーゼｓｌｐ７（ｔｒｅ１２３８６５）についての欠失プラスミドｐＴＴｖ２６９を、本質的に、実施例１におけるｐｅｐ１欠失プラスミドｐＴＴｖ４１について記載される通りに構築した（選択のために使用したマーカーが、ｐＴＴｖ１９４からのｐｙｒ４−ｈｇｈであったことを除く）。
【０４５０】
５’隣接領域の９４９bp及び３’隣接領域の１０２５bpを、ｓｌｐ７欠失プラスミドｐＴＴｖ２６９の基礎として選択した。これらのフラグメントを、表１１．１にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより増幅した。隣接領域のＰＣＲにおいて使用されるテンプレートは、Ｔリーゼイ野生型株ＱＭ６ａからであった。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。ｐｙｒ４−ｈｇｈカセットを、ｐＴＴｖ１９４（Δｐｅｐ４−ｐｙｒ４−ｈｇｈ）から、ＮｏｔＩ消化を用いて得た。マーカーカセットの除去を可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位を、カセットの両側に導入した。ベクター骨格は、実施例１における通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であった。プラスミドｐＴＴｖ２６９を、５’隣接、３’隣接、ｐｙｒ４−ｈｇｈマーカー、及びベクター骨格を用いて、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築した。ｓｌｐ７についてのこの欠失プラスミド（ｐＴＴｖ２６９、表１１．１）は、ｓｌｐ７遺伝子座における２０１９bpの欠失をもたらし、ＳＬＰ７の完全コード配列をカバーする。
【０４５１】
【表３２】
2018038419.tif 000034
【０４５２】
実施例１２  −  ＳＬＰ８欠損Ｔリーゼイの生成
ｓｌｐ８欠失プラスミドの生成
スブチリシン様プロテアーゼｓｌｐ８（ｔｒｅ５８６９８）についての欠失プラスミドｐＴＴｖ３３０を、本質的に、実施例１におけるｐｅｐ１欠失プラスミドｐＴＴｖ４１について記載される通りに構築した（選択のために使用したマーカーが、２重マーカーｐｙｒ４−ｈｐｈであったことを除く）。
【０４５３】
５’隣接領域の９７５bp及び３’隣接領域の１０３８bpを、ｓｌｐ８欠失プラスミドの基礎として選択した。ｓｌｐ８の５’隣接の末端から２９８bpストレッチを、ダイレクトリピートフラグメントとして使用した。これらのフラグメントを、表１２．１にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより増幅した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。ｐｙｒ４−ｈｇｈカセットを、ｐＴＴｖ２１０（Δｓｅｐ１−ｐｙｒ４−ｈｐｈ）から、ＮｏｔＩ消化を用いて得た。完全な２重マーカーカセットの除去を可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位を、２重マーカーカセットの両側に導入した。ＡｓｃＩ部位を、ｓｌｐ８の５’ダイレクトリピートと３’隣接の間に導入した。ベクター骨格は、実施例１における通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であった。プラスミドを、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築した。ｓｌｐ８についてのこの欠失プラスミド（ｐＴＴｖ３３０、表１２．１）は、ｓｌｐ８遺伝子座における１４３３bpの欠失をもたらし、ＳＬＰ８の完全コード配列をカバーする。
【０４５４】
【表３３】
2018038419.tif 000035
【０４５５】
実施例１３  −  プロテアーゼホモログ
Ｔリーゼイのｐｅｐ１、ｐｅｐ２、ｐｅｐ３、ｐｅｐ４、ｐｅｐ５、及びｐｅｐ７；ｔｓｐ１；ｓｌｐ１、ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５、ｓｌｐ６、ｓｌｐ７、及びｓｌｐ８；ｇａｐ１及びｇａｐ２；ならびにｔｐｐ１のホモログを、他の生物から同定した。
【０４５６】
ＢＬＡＳＴ検索を、トリコデルマ・リーゼイのプロテアーゼのアミノ酸配列をクエリーとして使用した、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）の非冗長アミノ酸データベースを使用して行った。あるいは、ＦＡＳＴＡ検索を、European Bioinformatics Institute（ＥＢＩ）のUniProt Knowledgebaseを用いて行った。トリコデルマ・ビレンス及びトリコデルマ・アトロビリデのＢＬＡＳＴ検索を、DOE Joint Genome Instituteのウェブサイト（それぞれトリコデルマ・ビレンスＧｖ２９−８  ｖ２．０及びトリコデルマ・アトロビリデｖ２．０）を使用して行った。ＢＬＡＳＴ検索からの配列ヒットを、ＥＢＩにより提供されるClustalW2アラインメントツールを使用して整列させた。系統樹を、また、配列アラインメントを使用して生成した。
【０４５７】
図４５は、選択された糸状菌のアスパラギン酸プロテアーゼの系統樹を描写する。
【０４５８】
図４６は、選択された糸状菌のスブチリシンプロテアーゼの系統樹を描写する。
【０４５９】
図４７は、選択された糸状菌のグルタミン酸プロテアーゼの系統樹を描写する。
【０４６０】
図４８は、選択された糸状菌のセドリシンプロテアーゼの系統樹を描写する。
【０４６１】
実施例１４  −  ９重プロテアーゼ欠失株の生成
欠失Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５Δｐｅｐ２を有する９重プロテアーゼ欠失株の生成
新たなｐｅｐ２欠失プラスミドの生成
アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ２（ｔｒｅ００５３９６１）についての第１欠失プラスミドｐＴＴｖ２１３を、本質的に、実施例１におけるΔｐｅｐ１プラスミドｐＴＴｖ４１について記載される通りに構築したが、しかし、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）を保有する追加の第２選択マーカーカセットを、ｐｙｒ４遺伝子の後に置き、２重選択マーカーブラスターカセットを伴う欠失プラスミドを作製した。２重マーカー系によって、ａ）例えば、初期耐性マーカーとしてのｈｐｈの利用及びより速い選択；ｂ）ｐｙｒ４＋株の形質転換（形質転換前にｐｙｒ４−を生成する必要性を伴わない）；ならびにｃ）５フルオロオロチン酸を使用した形質転換体からの両方のマーカーの除去（標準的なｐｙｒ４ブラスターカセットの除去におけるのと同様）及びマーカーフリー、ｐｙｒ４−株をもたらす、内在性ｐｙｒ４の同時変異誘発が可能になる。２重マーカーに加えて、第１欠失プラスミドは、また、天然ＫＥＸ２のための過剰発現カセット（ｔｒｅ１２３５６１；プロモーターｃＤＮＡ１、ターミネーターｃｂｈ２）を含んだ。
【０４６２】
アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ２（ｔｒｅ００５３９６１）についての第２欠失プラスミドｐＴＴｖ２３２を、上のプラスミドｐＴＴｖ２１３を骨格として使用して構築した。ｋｅｘ２過剰発現カセット（ｐｃＤＮＡ１−ｋｅｘ２−ｔｃｂｈ２）を、ＡｓｃＩ消化を伴うｐＴＴｖ２１３から除去した。プラスミドｐＴＴｖ２３２のクローニングを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを室温で使用した、標準的な連結（自己連結）を用いて行った。連結混合物の一部を、大腸菌中に、エレクトロポレーションを用いて形質転換した。数個のクローンを培養し、プラスミドＤＮＡを単離し、消化し、標準的な実験室方法を使用して、正確な連結についてスクリーニングした。正確な連結を、配列決定によりさらに検証した。
【０４６３】
アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ２（ｔｒｅ００５３９６１）についての第３欠失プラスミドｐＴＴｖ２４６を、上のプラスミドｐＴＴｖ２３２を骨格として使用して構築した。ｐｙｒ４−ｈｐｈ  ２重マーカーを、ｐＴＴｖ２３２から、ＮｏｔＩ消化を用いて除去した。ｐｙｒ４マーカー遺伝子を、ｐＴＴｖ１８１（上のΔｐｅｐ４−ｐｙ４ｒ）から、ＮｏｔＩ消化を用いて得た。プラスミドｐＴＴｖ２４６のクローニングを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを室温で使用した、標準的な連結を用いて行った。連結混合物の一部を、大腸菌中に、エレクトロポレーションを用いて形質転換した。数個のクローンを培養し、プラスミドＤＮＡを単離し、消化し、標準的な実験室方法を使用して、正確な連結についてスクリーニングした。マーカーの正確な連結及び方向を、配列決定によりさらに検証した。
【０４６４】
５’隣接領域の１０００bp及び３’隣接領域の１０２０bpを、ｐｅｐ２欠失プラスミドの基礎として選択した。ｐｅｐ２の５’隣接の末端から３００bpストレッチを、ダイレクトリピートフラグメントとして使用した。これらのフラグメントならびに第２選択マーカーカセット（ｈｐｈ）、ｃＤＮＡ１プロモーター、天然ｋｅｘ２遺伝子、及びｃｂｈ２ターミネーターを、表１４．１にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより増幅した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。ｐｙｒ４選択マーカーを、ｐＴＴｖ１８１（上のΔｐｅｐ４−ｐｙｒ４）から、ＮｏｔＩ消化を用いて得た。ｐＴＴｖ２１３において完全な２重マーカーカセットの除去を可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位を、２重マーカーカセットの両側に導入し、ＳｗａＩ部位を、２つの選択マーカーの間に導入した。ＡｓｃＩ部位を、ｋｅｘ２過剰発現カセットの両側に（ｐｅｐ２の５’ダイレクトリピートと３’隣接の間に）導入した。ベクター骨格は、実施例１における通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であった。プラスミドｐＴＴｖ２１３を、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築した。ｐｅｐ２についてのこれらの欠失プラスミド（ｐＴＴｖ２１３、ｐＴＴｖ２３２、及びｐＴＴｖ２４６、表１４．１）は、ｐｅｐ２遺伝子座における１５８０bpの欠失をもたらし、ＰＥＰ２の完全コード配列をカバーする。
【０４６５】
【表３４】
2018038419.tif 000036
【０４６６】
ｐｅｐ２（ｔｒｅ５３９６１）を伴う９重プロテアーゼ欠失株の生成；Ｍ５７４
マーカーフリー９重プロテアーゼ欠失株を生成するために、ｐｙｒ４マーカーの除去を、８重欠失株Ｍ５０４（３８−４８Ａ、Ｍ４９６中のｐＴＴｖ２２９）に、本質的に、実施例３に記載の通りに、株Ｍ１９５（Δｐｅｐ１）からのｐｙｒ４ブラスターカセットの除去のために適用した。連続的な５−ＦＯＡ選択工程を行い、選択されたクローンが、単一細胞から生じていることを確実にした。
【０４６７】
最終クローンを、表１４．２にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより、標準的な実験室方法を用いて検証した。ブラスターカセットの成功裏の除去に対応するシグナルが、クローンの大部分について得られた。ブラスターカセットの除去を、５mMウリジンを伴う又は伴わない最少培地プレート上にクローンをプレーティングすることによりさらに検証した。成長は、ウリジン添加を伴わないプレート上では観察されなかった。９重プロテアーゼ欠失株の生成において使用した、結果として得られた株を、株番号Ｍ５２１を用いて命名した。
【０４６８】
ベクター配列を除去するために、プラスミドｐＴＴｖ２４６（Δｐｅｐ２−ｐｙｒ４）を、ＭｓｓＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、アガロースゲルから、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。欠失カセットの約５μgを使用し、８重プロテアーゼ欠失株Ｍ５２１（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５、ｐｙｒ４−）のクローンを形質転換した。プロトプラストの調製及び形質転換を、本質的に、株Ｍ１８１及びＭ１９５について実施例１に記載の通りに、ｐｙｒ４選択を使用して行った。
【０４６９】
形質転換体を、第１ストリークとして採取した。成長するストリークを、ＰＣＲ（表１４．２にリストするプライマーを使用して）により、正確な組込みについてスクリーニングした。期待されるシグナルを与えるクローンを、単一細胞クローンにまで精製し、表１４．２にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより再スクリーニングした。ｐｅｐ２の欠失は、実施例１に記載の方法を使用し、選択されたクローン（データ示さず）からのサザン分析により検証した。クローン４１−４５Ｇを、株番号Ｍ５７４を用いて命名した。
【０４７０】
【表３５】
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【０４７１】
欠失Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５Δｐｅｐ１２を有する９重プロテアーゼ欠失株の生成
ｐｅｐ１２欠失プラスミドの生成
アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ１２（ｔｒｅ１１９８７６）についての第１欠失プラスミドｐＴＴｖ２０９を、本質的に、実施例１におけるΔｐｅｐ１プラスミドｐＴＴｖ４１について記載される通りに構築したが、しかし、追加の第２選択マーカーカセット、ストレプトマイセス属のホスフィノトリシンＮアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｂａｒ）を保有する合成コンストラクトを、ｐｙｒ４遺伝子の後に置き、２重選択マーカーブラスターカセットを伴う欠失プラスミドを作製した。２重マーカー系によって、ａ）例えば、初期耐性マーカーとしてのｂａｒの利用及びより速い選択；ｂ）ｐｙｒ４＋株の形質転換（形質転換前にｐｙｒ４−を生成する必要性を伴わない）；ならびにｃ）５フルオロオロチン酸を使用した形質転換体からの両方のマーカーの除去（標準的なｐｙｒ４ブラスターカセットの除去におけるのと同様）及びマーカーフリー、ｐｙｒ４−株をもたらす、内在性ｐｙｒ４の同時変異誘発が可能になる。
【０４７２】
アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ１２（ｔｒｅ１１９８７６）についての第２欠失プラスミドｐＴＴｖ２４５を、上のプラスミドｐＴＴｖ２０９を骨格として使用して構築した。ｐｙｒ４−ｂａｒ  ２重マーカーを、ｐＴＴｖ２０９から、ＮｏｔＩ消化を用いて除去した。新たなｐｙｒ４マーカー遺伝子を、ｐＴＴｖ１８１（上のΔｐｅｐ４−ｐｙｒ４）から、ＮｏｔＩ消化を用いて得た。プラスミドｐＴＴｖ２４５のクローニングを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを室温で使用した、標準的な連結を用いて行った。連結混合物の一部を、大腸菌中に、エレクトロポレーションを用いて形質転換した。数個のクローンを培養し、プラスミドＤＮＡを単離し、消化し、標準的な実験室方法を使用して、正確な連結についてスクリーニングした。マーカーの正確な連結及び方向を、配列決定によりさらに検証した。
【０４７３】
５’隣接領域の１０１９bp及び３’隣接領域の８９５ｂｐを、ｐｅｐ１２欠失プラスミドの基礎として選択した。ｐｅｐ１２の５’隣接の末端から３００bpストレッチを、ダイレクトリピートフラグメントとして使用した。これらのフラグメントを、表１４．３にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより増幅した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。２重マーカー（ｐｙｒ４−ｂａｒ）を、ｐＴＴｖ２０２（Δｐｅｐ５−ｐｙｒ４−ｂａｒ）から、ＮｏｔＩを用いて消化した。完全な２重マーカーカセットの除去を可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位を、２重マーカーカセットの両側に導入した。ＡｓｃＩ部位を、ｐｅｐ１２の５’ダイレクトリピートと３’隣接の間に導入した。ベクター骨格は、実施例１における通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であった。プラスミドｐＴＴｖ２０９を、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築した。ｐｅｐ１２についてのこれらの欠失プラスミド（ｐＴＴｖ２０９及びｐＴＴｖ２４５、表１４．３）は、ｐｅｐ１２遺伝子座における２１９８ｂｐの欠失をもたらし、ＰＥＰ１２の完全コード配列をカバーする。
【０４７４】
【表３６】
2018038419.tif 000038
【０４７５】
ｐｅｐ１２（ｔｒｅ１１９８７６）を伴う９重プロテアーゼ欠失株の生成；Ｍ５７５
マーカーフリー９重プロテアーゼ欠失株を生成するために、ｐｙｒ４マーカーの除去を、８重欠失株Ｍ５０４（３８−４８Ａ、Ｍ４９６中のｐＴＴｖ２２９）に、本質的に、実施例３に記載の通りに、株Ｍ１９５（Δｐｅｐ１）からのｐｙｒ４ブラスターカセットの除去のために適用した。連続的な５−ＦＯＡ選択工程を行い、選択されたクローンが、単一細胞から生じていることを確実にした。
【０４７６】
最終クローンを、表１４．４にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより、標準的な実験室方法を用いて検証した。ブラスターカセットの成功裏の除去に対応するシグナルが、クローンの大部分について得られた。ブラスターカセットの除去を、５ｍＭウリジンを伴う又は伴わない最少培地プレート上にクローンをプレーティングすることによりさらに検証した。成長は、ウリジン添加を伴わないプレート上では観察されなかった。９重プロテアーゼ欠失株の生成において使用した、結果として得られた株を、株番号Ｍ５２１を用いて命名した。
【０４７７】
ベクター配列を除去するために、プラスミドｐＴＴｖ２４５（Δｐｅｐ１２−ｐｙｒ４）を、ＭｓｓＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、アガロースゲルから、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。欠失カセットの約５μgを使用し、８重プロテアーゼ欠失株Ｍ５２１（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５、ｐｙｒ４−）のクローンを形質転換した。プロトプラストの調製及び形質転換を、本質的に、株Ｍ１８１及びＭ１９５について実施例１に記載の通りに、ｐｙｒ４選択を使用して行った。
【０４７８】
形質転換体を、第１ストリークとして採取した。成長するストリークを、ＰＣＲ（表１４．４にリストするプライマーを使用して）により、正確な組込みについてスクリーニングした。期待されるシグナルを与えるクローンを、単一細胞クローンにまで精製し、表１４．４にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより再スクリーニングした。ｐｅｐ１２の欠失は、実施例１に記載の方法を使用し、選択されたクローン（データ示さず）からのサザン分析により検証した。クローン４２−４５Ｂを、株番号Ｍ５７５を用いて命名した。
【０４７９】
【表３７】
2018038419.tif 000039
【０４８０】
実施例１５  −  １０重プロテアーゼ欠失株の生成
欠失Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５Δｐｅｐ２Δｐｅｐ１１を有する１０重プロテアーゼ欠失株の生成
ｐｅｐ１１欠失プラスミドの生成
アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ１１（ｔｒｅ１２１３０６）についての欠失プラスミドｐＴＴｖ３１２を、本質的に、実施例１におけるｐｅｐ１欠失プラスミドｐＴＴｖ４１について記載される通りに構築した。
【０４８１】
５’隣接領域の９５６bp及び３’隣接領域の９４３bpを、ｐｅｐ１１欠失プラスミドの基礎として選択した。ｐｅｐ１１の５’隣接の末端から３０７bpストレッチを、ダイレクトリピートフラグメントとして使用した。これらのフラグメントを、表１５．１にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより増幅した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。ｐｙｒ４カセットを、ｐＴＴｖ１８１（上のΔｐｅｐ４−ｐｙｒ４）から、ＮｏｔＩ消化を用いて得た。マーカーカセットの除去を可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位を、カセットの両側に導入した。ＡｓｃＩ部位を、ｐｅｐ１１の５’ダイレクトリピートと３’隣接の間に導入した。ベクター骨格は、実施例１における通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であった。プラスミドを、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築した。ｐｅｐ１１についてのこの欠失プラスミド（ｐＴＴｖ３１２、表１５．１）は、ｐｅｐ１１遺伝子座における２６２４bpの欠失をもたらし、ＰＥＰ１１の完全コード配列をカバーする。
【０４８２】
【表３８】
2018038419.tif 000040
【０４８３】
ｐｅｐ１１（ｔｒｅ１２１３０６）を伴う１０重プロテアーゼ欠失株の生成；Ｍ６５８
マーカーフリー１０重プロテアーゼ欠失株を生成するために、ｐｙｒ４マーカーの除去を、９重欠失株Ｍ５０４（４１−４５Ｇ、Ｍ５２１中のｐＴＴｖ２４６）に、本質的に、実施例３に記載の通りに、株Ｍ１９５（Δｐｅｐ１）からのｐｙｒ４ブラスターカセットの除去のために適用した。連続的な５−ＦＯＡ選択工程を行い、選択されたクローンが、単一細胞から生じていることを確実にした。
【０４８４】
最終クローンを、表１５．２にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより、標準的な実験室方法を用いて検証した。ブラスターカセットの成功裏の除去に対応するシグナルが、クローンの大部分について得られた。ブラスターカセットの除去を、５ｍＭウリジンを伴う又は伴わない最少培地プレート上にクローンをプレーティングすることによりさらに検証した。成長は、ウリジン添加を伴わないプレート上では観察されなかった。１０重プロテアーゼ欠失株の生成において使用した、結果として得られた株を、株番号Ｍ５９７を用いて命名した。
【０４８５】
ベクター配列を除去するために、プラスミドｐＴＴｖ３１２（Δｐｅｐ１１−ｐｙｒ４）を、ＭｓｓＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、アガロースゲルから、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。欠失カセットの約５μgを使用し、９重プロテアーゼ欠失株Ｍ５９７（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５Δｐｅｐ２、ｐｙｒ４−）のクローンを形質転換した。プロトプラストの調製及び形質転換を、本質的に、株Ｍ１８１及びＭ１９５について実施例１に記載の通りに、ｐｙｒ４選択を使用して行った。
【０４８６】
形質転換体を、第１ストリークとして採取した。成長するストリークを、ＰＣＲ（表１５．２にリストするプライマーを使用して）により、正確な組込みについてスクリーニングした。期待されるシグナルを与えるクローンを、単一細胞クローンにまで精製し、表１５．２にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより再スクリーニングした。ｐｅｐ１１の欠失は、実施例１に記載の方法を使用し、選択されたクローン（データ示さず）からのサザン分析により検証した。クローン４７−６２Ｂを、株番号Ｍ６３２を用いて命名した。追加の単一細胞の精製工程をＭ６３２株に適用し、１０重プロテアーゼ欠失株Ｍ６５８を得た。
【０４８７】
【表３９】
2018038419.tif 000041
【０４８８】
実施例１６  −  ｔｐｐ１欠失プラスミドの生成
トリペプチジルペプチダーゼｔｐｐ１（ｔｒｅ８２６２３）についての欠失プラスミドｐＴＴｖ３３１を、本質的に、実施例１におけるｐｅｐ１欠失プラスミドｐＴＴｖ４１について記載される通りに構築した（選択のために使用したマーカーが、２重マーカーｐｙｒ４−ｈｐｈであったことを除く）。
【０４８９】
５’隣接領域の１２４５bp及び３’隣接領域の１０２５bpを、ｔｐｐ１欠失プラスミドの基礎として選択した。ｔｐｐ１の５’隣接の末端から３１１bpストレッチを、ダイレクトリピートフラグメントとして使用した。これらのフラグメントを、表１６．１にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより増幅した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。ｐｙｒ４−ｈｐｈカセットを、ｐＴＴｖ２１０（Δｓｅｐ１−ｐｙｒ４−ｈｐｈ）から、ＮｏｔＩ消化を用いて得た。完全な２重マーカーカセットの除去を可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位を、２重マーカーカセットの両側に導入した。ＡｓｃＩ部位を、ｔｐｐ１の５’ダイレクトリピートと３’隣接の間に導入した。ベクター骨格は、実施例１における通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であった。プラスミドを、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築した。ｔｐｐ１についてのこの欠失プラスミド（ｐＴＴｖ３３１、表１６．１）は、ｔｐｐ１遺伝子座における２１５２bpの欠失をもたらし、ＴＰＰ１の完全コード配列をカバーする。
【０４９０】
【表４０】
2018038419.tif 000042
【０４９１】
実施例１７  −  ｐｅｐ８欠失プラスミドの生成
アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ８（ｔｒｅ１２２０７６）についての別の欠失プラスミドｐＴＴｖ３１９を、本質的に、実施例１におけるｐｅｐ１欠失プラスミドｐＴＴｖ４１について記載される通りに構築した。
【０４９２】
アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ８（ｔｒｅ１２２０７６）についての第２欠失プラスミドｐＴＴｖ３２８を、上のプラスミドｐＴＴｖ３１９を骨格として使用して構築した。ｐｙｒ４マーカーを、ｐＴＴｖ３１９から、ＮｏｔＩ消化を用いて除去した。ｐｙｒ４−ｈｐｈカセットを、ｐＴＴｖ２１０（Δｓｅｐ１−ｐｙｒ４−ｈｐｈ）から、ＮｏｔＩ消化を用いて得た。プラスミドｐＴＴｖ３２８のクローニングを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを室温で使用した、標準的な連結を用いて行った。連結混合物の一部を、大腸菌中に、エレクトロポレーションを用いて形質転換した。数個のクローンを培養し、プラスミドＤＮＡを単離し、消化し、標準的な実験室方法を使用して、正確な連結についてスクリーニングした。マーカーの正確な連結及び方向を、配列決定によりさらに検証した。
【０４９３】
５’隣接領域の１０９５bp及び３’隣接領域の９８８bpを、ｐｅｐ８欠失プラスミドの基礎として選択した。ｐｅｐ８の５’隣接の末端から３２４bpストレッチを、ダイレクトリピートフラグメントとして使用した。これらのフラグメントを、表１７．１にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより増幅した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。ｐＴＴｖ３１９において使用されるｐｙｒ４選択マーカーを、ｐＴＴｖ１８１（上のΔｐｅｐ４−ｐｙｒ４）から、ＮｏｔＩ消化を用いて得た。ｐｙｒ４マーカーカセットの除去を可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位を、カセットの両側に導入した。ＡｓｃＩ部位を、ｐｅｐ８の５’ダイレクトリピートと３’隣接の間に導入した。ベクター骨格は、実施例１における通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であった。プラスミドｐＴＴｖ３１９を、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築した。ｐｅｐ８についてのこれらの欠失プラスミド（ｐＴＴｖ３１９及びｐＴＴｖ３２８、表１７．１）は、ｐｅｐ８遺伝子座における１５４３bpの欠失をもたらし、ＰＥＰ８の完全コード配列をカバーする。
【０４９４】
【表４１】
2018038419.tif 000043
【０４９５】
アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ８（ｔｒｅ１２２０７６）についての第３欠失プラスミドｐＴＴｖ２６６を、本質的に、実施例１におけるｐｅｐ１欠失プラスミドｐＴＴｖ４１について記載される通りに構築した（選択のために使用したマーカーが、ｐＴＴｖ１９４からのｐｙｒ４−ｈｇｈであったことを除く）。
【０４９６】
５’隣接領域の１０９５bp及び３’隣接領域の９８８bpを、ｐｅｐ８欠失プラスミドｐＴＴｖ２６６の基礎として選択した。これらのフラグメントを、表１７．２にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより増幅した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。ｐＴＴｖ２６６において使用されるｐｙｒ４−ｈｇｈ選択マーカーを、ｐＴＴｖ１９４（上のΔｐｅｐ４−ｐｙｒ−ｈｇｈ）から、ＮｏｔＩ消化を用いて得た。ｐｙｒ４−ｈｇｈマーカーカセットの除去を可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位を、カセットの両側に導入した。ベクター骨格は、実施例１における通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であった。プラスミドｐＴＴｖ２６６を、５’隣接、３’隣接、ｐｙｒ４−ｈｇｈマーカー、及びベクター骨格を用いて、実施例１において記載の酵母相同組換え方法を使用して構築した。ｐｅｐ８についての欠失プラスミド（ｐＴＴｖ２６６、表１７．２）は、ｐｅｐ８遺伝子座における１５４３bpの欠失をもたらし、ＰＥＰ８の完全コード配列をカバーする。
【０４９７】
【表４２】
2018038419.tif 000044
【０４９８】
実施例１８  −  インターフェロン産生株におけるプロテアーゼ欠失の生成
ＩＦＮ−α  ２ｂ産生５重プロテアーゼ欠失株の生成
５重プロテアーゼ欠失株のためのＩＦＮ−α  ２ｂ産生株を生成するために、Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２  ５重プロテアーゼ欠失株Ｍ３６９を、ＩＦＮ−α  ２ｂ発現カセット（ｐＴＴｖ１７３）を用いて、ハイグロマイシンを選択において使用して形質転換した。このＩＦＮ−α  ２ｂ株は、Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２の５重プロテアーゼ欠失を伴い、番号Ｍ４０１を用いて命名した。
【０４９９】
ＩＦＮ−α  ２ｂ産生５重プロテアーゼ欠失株Ｍ４０１の分析
ＩＦＮ−α  ２ｂの発現レベルを試験するために、５重プロテアーゼ欠失（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２）ＩＦＮ−α  ２ｂ産生株Ｍ４０１を、培養条件ｐＨ４，５；２８→２２℃；３０g/lグルコース、６０g/lラクトース、２０g/l全粕、及び２０g/l粕抽出物において培養した。ＩＦＮ−α  ２ｂの発現レベルを分析するために、３日目の培養サンプルを、定量的免疫ブロッティングに供した（図５４Ａ）。サンプルを、ＩＦＮ−α  ２ｂ標準曲線との比較により分析し、デンシトメトリー定量化を、Totallab Quant TL100ソフトウェアを用いて行った。免疫ブロッティングを、ＴＢＳＴ中で１μg/mlに希釈したAbcam（＃ａｂ９３８６）抗ＩＦＮ−α  ２ｂ抗体を用いて行った。BioRadからの二次抗体（＃１７０−６５２０）は、ＴＢＳＴ中で１：５０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡＰコンジュゲート二次抗体であった。タンパク質標準を、５０ng、１００ng、２００ng、及び４００ngのＩＦＮ−α  ２ｂに対応してゲルにロードした。分析は、Ｍ４０１が５１．９mg/Lまでの収量でＩＦＮ−α  ２ｂを産生し、産物の５２%が担体分子から切断されることを示した。
【０５００】
ＩＦＮ−α  ２ｂ産生８重プロテアーゼ欠失株Ｍ５７７の生成
８重プロテアーゼ欠失株のためのＩＦＮ−α  ２ｂ産生株を生成するために、Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５  ８重プロテアーゼ欠失株Ｍ５０４を、ＩＦＮ−α  ２ｂ発現カセット（ｐＴＴｖ２５４）を用いて、選択にアセトアミドを使用して形質転換した。このＩＦＮ−α  ２ｂ株は、Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５の８重プロテアーゼ欠失を伴い、番号Ｍ５７７を用いて命名した。
【０５０１】
ＩＦＮ−α  ２ｂ産生８重プロテアーゼ欠失株Ｍ５７７の分析
ＩＦＮ−α  ２ｂの発現レベルを試験するために、８重プロテアーゼ欠失（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５）ＩＦＮ−α  ２ｂ産生株Ｍ５７７を、条件ｐＨ４，５；２８→２２℃；２%酵母抽出物、４%セルロース、８%セロビオース、及び４%ソルボースにおいて培養した。ＩＦＮ−α  ２ｂの発現を試験するために、Ｍ５７７発酵サンプルを、免疫ブロッティングに供した（図５４Ｂ）。ＩＦＮ−α  ２ｂの発現レベルを分析するために、４日目の培養サンプルを、定量的免疫ブロッティングに供した（図５５）。サンプルを、ＩＦＮ−α  ２ｂ標準曲線との比較により分析し、デンシトメトリー定量化を、Totallab Quant TL100ソフトウェアを用いて行った。免疫ブロッティングを、ＴＢＳＴ中で１μg/mlに希釈したAbcam（＃ａｂ９３８６）抗ＩＦＮ−α  ２ｂ抗体を用いて行った。BioRadからの二次抗体（＃１７０−６５２０）は、ＴＢＳＴ中で１：５０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡＰコンジュゲート二次抗体であった。タンパク質標準を、５０ng、１００ng、及び２００ngのＩＦＮ−α  ２ｂに対応してゲルにロードした。分析は、Ｍ５７７が１７８０ｍｇ／Ｌまでの収量でＩＦＮ−α  ２ｂを産生し、産物の６６．５%が担体分子から切断されることを示した。８重プロテアーゼ欠失株Ｍ５７７は、５重プロテアーゼ欠失株Ｍ４０１よりも３４倍より多いＩＦＮ−α  ２ｂを産生した。
【０５０２】
ＩＦＮ−α  ２ｂ産生９重プロテアーゼ欠失株Ｍ６５２の生成
９重プロテアーゼ欠失株のためのＩＦＮ−α  ２ｂ産生株を生成するために、Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５Δｐｅｐ２  ９重プロテアーゼ欠失株Ｍ５７４を、ＩＦＮ−α  ２ｂ発現カセット（ｐＴＴｖ１７３）を用いて、ハイグロマイシンを選択に使用して形質転換した。Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５Δｐｅｐ２の９重プロテアーゼ欠失を伴うこのＩＦＮ−α  ２ｂ株を、番号Ｍ６５２を用いて命名した。
【０５０３】
ＩＦＮ−α  ２ｂ産生９重プロテアーゼ欠失株Ｍ６５２の分析
ＩＦＮ−α  ２ｂの発現レベルを試験するために、８重プロテアーゼ欠失（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５Δｐｅｐ２）ＩＦＮ−α  ２ｂ産生株Ｍ６５２を、条件ｐＨ４，５；２８→２２℃；２%酵母抽出物、４%セルロース、８%セロビオース、及び４%ソルボースにおいて培養した。ＩＦＮ−α  ２ｂの発現を試験するために、Ｍ６５２発酵サンプルを、免疫ブロッティングに供した（図５４Ｂ）。ＩＦＮ−α  ２ｂの発現レベルを分析するために、３日目の培養サンプルを、定量的免疫ブロッティングに供した（図５５）。サンプルを、ＩＦＮ−α  ２ｂ標準曲線との比較により分析し、デンシトメトリー定量化を、Totallab Quant TL100ソフトウェアを用いて行った。免疫ブロッティングを、ＴＢＳＴ中で１μg/mlに希釈したAbcam（＃ａｂ９３８６）抗ＩＦＮ−α  ２ｂ抗体を用いて行った。BioRadからの二次抗体（＃１７０−６５２０）は、ＴＢＳＴ中で１：５０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡＰコンジュゲート二次抗体であった。タンパク質標準を、５０ng、１００ng、及び２００ngのＩＦＮ−α  ２ｂに対応してゲルにロードした。分析は、Ｍ６５２が１９２８ｍｇ／Ｌまでの収量でＩＦＮ−α  ２ｂを産生し、産物の８５%が担体分子から切断されることを示した。９重プロテアーゼ欠失株Ｍ６５２は、８重プロテアーゼ欠失Ｍ５７７よりもわずかに多く、５重プロテアーゼ欠失株Ｍ４０１よりも３７倍より多いＩＦＮ−α  ２ｂを産生した。
【０５０４】
ｐｅｐ８（ｔｒｅ１２２０７６）をインターフェロン産生株Ｍ５７７から欠失させた、９重プロテアーゼ欠失株Ｍ６７０の生成
欠失カセットを除去するために、プラスミドｐＴＴｖ２６６（Δｐｅｐ８−ｐｙｒ４−ｈｇｈ）を、ＰｍｅＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。欠失カセットの約５μgを使用し、８重プロテアーゼ欠失株Ｍ５７７（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５）を形質転換した。Ｍ５７７株は、インターフェロンα２ｂを産生する。プロトプラストの調製及び形質転換を、本質的に、実施例１に記載の通りに、ハイグロマイシンを選択に使用して行った。
【０５０５】
形質転換体を採取し、選択プレート上にストリークした。成長するストリークを、ＰＣＲ（表１８．１にリストするプライマーを使用して）により、正確な組込みについてスクリーニングした。期待されるシグナルを与えるクローンを、単一細胞クローンにまで精製し、表１８．１にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより再スクリーニングした。クローン８２−９を、株番号Ｍ６７０を用いて命名した。
【０５０６】
【表４３】
2018038419.tif 000045
【０５０７】
ｐｅｐ１１欠失プラスミドの生成
アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐ１１（ｔｒｅ１２１３０６）についての欠失プラスミドｐＴＴｖ２６８を、本質的に、実施例１におけるｐｅｐ１欠失プラスミドｐＴＴｖ４１について記載される通りに構築した（選択のために使用したマーカーが、ｐＴＴｖ１９４からのｐｙｒ４−ｈｇｈであったことを除く）。
【０５０８】
５’隣接領域の９５６bp及び３’隣接領域の９５７bpを、ｐｅｐ１１欠失プラスミドｐＴＴｖ２６８の基礎として選択した。これらのフラグメントを、表１８．２にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより増幅した。産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲルから、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。ｐｙｒ４−ｈｇｈカセットを、ｐＴＴｖ１９４（Δｐｅｐ４−ｐｙｒ−ｈｇｈ）から、ＮｏｔＩ消化を用いて得た。マーカーカセットの除去を可能にするために、ＮｏｔＩ制限部位を、カセットの両側に導入した。ベクター骨格は、実施例１における通りに、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であった。プラスミドを構築した。プラスミドｐＴＴｖ２６８を、５’隣接、３’隣接、ｐｙｒ４−ｈｇｈマーカー、及びベクター骨格を用いて、実施例１に記載の酵母相同組換え方法を使用して構築した。ｐｅｐ１１についてのこの欠失プラスミド（ｐＴＴｖ２６８、表１８．２）は、ｐｅｐ１１遺伝子座における欠失をもたらし、ＰＥＰ１１の完全コード配列をカバーする。
【０５０９】
【表４４】
2018038419.tif 000046
【０５１０】
ｐｅｐ１１（ｔｒｅ１２１３０６）をインターフェロン産生株Ｍ５７７から欠失させた、９重プロテアーゼ欠失株Ｍ６７２の生成
欠失カセットを除去するために、プラスミドｐＴＴｖ２６８（Δｐｅｐ１１−ｐｙｒ４−ｈｇｈ）を、ＰｍｅＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。欠失カセットの約５μgを使用し、８重プロテアーゼ欠失株Ｍ５７７（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５）を形質転換した。Ｍ５７７株は、インターフェロンα２ｂを産生する。プロトプラストの調製及び形質転換を、本質的に、実施例１に記載の通りに、ハイグロマイシン選択を使用して行った。
【０５１１】
形質転換体を採取し、選択プレート上にストリークした。成長するストリークを、ＰＣＲ（表１８．３にリストするプライマーを使用して）により、正確な組込みについてスクリーニングした。期待されるシグナルを与えるクローンを、単一細胞クローンにまで精製し、表１８．３にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより再スクリーニングした。クローン３３−９を、株番号Ｍ６７２を用いて命名した。
【０５１２】
【表４５】
2018038419.tif 000047
【０５１３】
ｓｌｐ７（ｔｒｅ１２３８６５）をインターフェロン産生株Ｍ５７７から欠失させた、９重プロテアーゼ欠失株Ｍ６７３の生成
欠失カセットを除去するために、プラスミドｐＴＴｖ２６９（Δｓｌｐ７−ｐｙｒ４−ｈｇｈ）を、ＰｍｅＩを用いて消化し、正確なフラグメントを、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用して精製した。欠失カセットの約５μgを使用し、８重プロテアーゼ欠失株Ｍ５７７（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３Δｐｅｐ５）を形質転換した。Ｍ５７７株は、インターフェロンα２ｂを産生する。プロトプラストの調製及び形質転換を、本質的に、実施例１に記載の通りに、ハイグロマイシン選択を使用して行った。
【０５１４】
形質転換体を採取し、選択プレート上にストリークした。成長するストリークを、ＰＣＲ（表１８．４にリストするプライマーを使用して）により、正確な組込みについてスクリーニングした。期待されるシグナルを与えるクローンを、単一細胞クローンにまで精製し、表１８．４にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより再スクリーニングした。クローン５−６４を、株番号Ｍ６７３を用いて命名した。
【０５１５】
【表４６】
2018038419.tif 000048
【０５１６】
実施例１９  −  Ｇ０産生株Ｍ６２７及びＭ６２９の生成
ベクターｐＴＴｇ１５６及びｐＴＴｇ１７３を、２重選択マーカーカセット（ｐｙｒ４発現カセットに加えた、ｐｋｉ１プロモーターとｃｂｈ２ターミネーターの間のハイグロマイシン耐性マーカー遺伝子（ｈｐｈ））を、中間体ベクターｐＴＴｇ１４５及びｐＴＴｇ１４６に加えることにより構築した。中間体を、酵母組換えクローニングにより構築し、マーカーカセットを、ＮｏｔＩ消化及び連結による従来のクローニングにより、加えた。
【０５１７】
中間体ベクター用のフラグメントの生成戦略を、下の表１９．１上に提示する。フラグメント生成のために使用したプライマーを、下の表１９．２上にリストする。一旦、ｐＴＴｇ１４５及びｐＴＴｇ１４６用のフラグメントを、表１９．１上の計画に従って構築したら、それらを、相同組換えによるプラスミド組み立てのために酵母サッカロマイセス・セレビシエＦＹ８３４にエレクトロポレーションした。酵母細胞を、＋３０℃における２〜３日間培養のために、ＳＣ−ｕｒａにプレーティングした。コロニーを、次に、プレートからプールし、プラスミドプールを、フェノール／クロロホルム抽出方法を用いて精製した。プラスミドプールを、コンピテント大腸菌細胞に、エレクトロポレーションにより形質転換した。エレクトロポレーションした細胞を、ＬＢ＋ａｍｐ選択プレートにプレーティングし、３７℃で一晩培養し、コロニーをＰＣＲによりスクリーニングした。陽性クローンを、次に、新鮮なプレートに、純粋培養としてストリークし、単一コロニーを、液体ＬＢ＋ａｍｐ培地中で培養し、潜在的な中間体ベクターｐＴＴｇ１４５及びｐＴＴｇ１４６を、標準的なプロトコールに従って精製した。プラスミドを制限分析により分析し、配列を配列決定により検証した。
【０５１８】
マーカーカセットを、次に、ベクターに、ｐＴＴｇ１６３からの従来のＮｏｔＩ消化ならびにＮｏｔＩ線状化中間体ｐＴＴｇ１４５及びｐＴＴｇ１４６中への連結により加えた。
【０５１９】
【表４７】
2018038419.tif 000049
【０５２０】
【表４８】
2018038419.tif 000050
【０５２１】
７重プロテアーゼ欠失を伴うトリコデルマ・リーゼイＭＡＢ０１発現株Ｍ５０７を、ａｌｇ３遺伝子座に標的化したｐＴＴｇ１５６及びｐＴＴｇ１７３のＰｍｅＩフラグメントを用いて形質転換した。形質転換体の変動量（構造に依存して１００〜１７０）を、選択プレート上に採取した。Phire Plant Direct PCRキット（Finnzymes F-130）を用いたＰＣＲスクリーニングに基づき、５’及び３’組込みに関する陽性結果を伴うクローンを、単一胞子プレーティングならびに組込み及びａｌｇ３欠失についての再スクリーニングのために選択した（ｐＴＴｇ１５６形質転換からの５クローン、ｐＴＴｇ１７３形質転換からの３クローン）。スクリーニングのために使用したプライマーを、下の表１９．３上にリストする。
【０５２２】
ＰＣＲ−スクリーニング株を、最後に、撹拌フラスコ培養及びグリカン分析に供した。最終株を、Ｍ６２９（ｐＴＴｇ１７３形質転換体）及びＭ６２７（ｐＴＴｇ１５６形質転換体）として名付けた。
【０５２３】
【表４９】
2018038419.tif 000051
【０５２４】
株Ｍ６２７及びＭ６２９のＷＳＧ発酵ならびにグリカン分析
Ｔリーゼイ株Ｍ６２７及びＭ６２９を、４%  ＷＳＧ、２%グルコース、４%セロビオース、６%ラクトースｐＨ５．５中で発酵させ、試料採取を３〜６日目に実施した。抗体力価を表１９．４に示す。
【０５２５】
Ｎグリカン分析のために、ＭＡＢ０１を、Protein G HP MultiTrap 96ウェルフィルタープレート（GE Healthcare）を使用して、製造者の指示に従って、培養上清から精製した。抗体濃度を、ＭＡＢ０１標準曲線に対するＵＶ吸光度を介して決定した。
【０５２６】
Ｎグリカンを、ＥｔＯＨ沈殿及びＳＤＳ変性抗体から、PNGase F（ProZyme Inc.）を使用し、２０mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．３中で、３７℃での一晩の反応において放出させた。放出されたＮグリカンを、Hypersep C-18及びHypersep Hypercarb（Thermo Scientific）を用いて精製し、MALDI-TOF MSを用いて分析した。結果を表１９．６に示す。株Ｍ６２７及びＭ６２９において、Ｇ０レベルは２４．３%〜４１．７%の間の範囲であり、Ｇ０は株Ｍ５０７において見られなかった。
【０５２７】
株Ｍ６２７及びＭ６２９の撹拌フラスコ中でのＷＳＧ培養及びグリカン分析
Ｔリーゼイ株Ｍ６２７及びＭ６２９を、撹拌フラスコ中で、ＴｒＭＭ、４%ラクトース、２%  ＳＧＥ、１００mM  ＰＩＰＰＳ、ｐＨ５．５中で、＋２８℃で培養させた。試料採取を５日目に実施した。
【０５２８】
Ｎグリカン分析のために、ＭＡＢ０１を、Protein G HP MultiTrap 96ウェルフィルタープレート（GE Healthcare）を使用して、製造者の指示に従って、培養上清から精製した。Protein G溶出液中の抗体濃度を、ＭＡＢ０１標準曲線に対するＵＶ吸光度を介して決定した（表１９．５）。培養液中の力価は測定しなかった。
【０５２９】
Ｎグリカン放出を上の通りに実施した。結果を表１９．７に示す。Ｇ０レベルは、Ｍ６２７及びＭ６２９についてそれぞれ２１．１%及び５６．９%であった。
【０５３０】
【表５０】
2018038419.tif 000052
【０５３１】
【表５１】
2018038419.tif 000053
【０５３２】
【表５２】
2018038419.tif 000054
【０５３３】
【表５３】
2018038419.tif 000055
【０５３４】
実施例２０  −  異なるプロモーターを伴うＧＬＣＮＡＣＭＡＮ５産生株の生成
異なるプロモーターを伴うＧｎＴＩのためのベクターを、表２０．１に記載する。ベクターを、Ｔリーゼイのｅｇｌ２遺伝子座中に標的化した。
【０５３５】
【表５４】
2018038419.tif 000056
【０５３６】
材料及び方法
表２０．１のベクターのためのフラグメントの生成方法を、表２０．２に提示し、フラグメント生成のために使用したプライマーを、表２０．３上にリストする。フラグメントをＰＣＲにより増幅し、産物をアガロースゲルから精製した。消化したｐＴＴｇ１５２ベクターをゲルから精製した。全てのＰＣＲ増幅を、高忠実度のPhusionポリメラーゼ（Finnzymes）を用いて作製した。ｐＴＴｇ１５３−ｐＴＴｇ１７１ためのフラグメントを、相同組換えによりプラスミド組立てのために酵母サッカロマイセス・セレビシエＦＹ８３４にエレクトロポレーションした。酵母細胞を、＋３０℃における２〜３日間培養のために、ＳＣ−ｕｒａにプレーティングした。コロニーを、次に、プレートからプールし、プラスミドプールを、ルーチンの通りにフェノール／クロロホルム抽出方法を用いて精製した。プラスミドプールを、コンピテント大腸菌細胞に、エレクトロポレーションにより形質転換した。エレクトロポレーションした細胞を、ＬＢ＋ａｍｐ選択プレートにプレーティングし、＋３７℃で一晩培養し、コロニーをＰＣＲによりスクリーニングした。陽性コロニーを、次に、純粋培養として新鮮なプレートにストリークし、単一コロニーを、液体ＬＢ＋ａｍｐ培地中で培養し、及び、潜在的ベクターｐＴＴｇ１５３−ｐＴＴｇ１７１を、標準的なプロトコールに従って精製した。プラスミドを制限分析により分析し、配列を配列決定により検証した。
【０５３７】
【表５５】
2018038419.tif 000057
【０５３８】
【表５６】
2018038419.tif 000058
【０５３９】
７重プロテアーゼ欠失を伴うトリコデルマ・リーゼイＭＡＢ０１発現株Ｍ５０７を、ｅｇｌ２遺伝子座に標的化したベクターｐＴＴｇ１５３−ｐＴＴｇ１７１のＰｍｅＩフラグメントを用いて形質転換した。変動量の形質転換体を、選択的プレート上に採取した。Phire Plant Direct PCRキット（Finnzymes F-130）を用いたＰＣＲスクリーニングに基づき、５’及び３’組込みに関する陽性結果を伴うクローンを、単一胞子プレーティングならびに組込み及びｅｇｌ２欠失についての再スクリーニングのために選択した。ＰＣＲ−スクリーニング株を、最後に、撹拌フラスコ培養及びグリカン分析に供した。
【０５４０】
ＧｎＴＩ及びプロモーターコンストラクトを用いて形質転換した株Ｍ５０７の撹拌フラスコ培養
表２０．１及び２０．２のベクターを用いて形質転換した株Ｍ５０７を、撹拌フラスコにおいて、ＴｒＭＭ、４%ラクトース、２%ＳＧＥ、１００mM  ＰＩＰＰＳ、ｐＨ５．５中で、＋２８℃で培養し、試料採取を５日目に実施した。不活性ＧｎＴＩコンストラクトをテストし、Ｔリーゼイの成長へのＧｌｃＮＡｃＭａｎ５グリカンの可能な効果を決定した。
【０５４１】
Ｎグリカン分析のために、ＭＡＢ０１を精製し、濃度を決定し、Ｎグリカンを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて、上に記載の通りに分析した。ＭＡＢ０１のＮ−グリカン分析は、ＧｎＭａｎ５レベルが全グリカンの８〜７９．２%の範囲であることを示した（表２０．４ならびに２０．５Ａ及びＢ）。不活性ＧｎＴＩは、期待通り、野生型グリコシル化を産生した。
【０５４２】
【表５７】
2018038419.tif 000059
【０５４３】
【表５８】
2018038419.tif 000060
【０５４４】
ＧｎＴＩコンストラクトを用いて形質転換した株Ｍ５０７の発酵槽培養
Ｔリーゼイ株Ｍ７０２、Ｍ７０４、Ｍ７０６、Ｍ７１０、Ｍ７１２、Ｍ７１６、及びＭ５０７を、４%ＷＳＧ、２%Ｇｌｃ、４%セロビオース、６%ラクトース、ｐＨ５．５中で発酵させ、試料採取を３〜６日目に実施した。抗体力価を表２０．６に示す。Ｎグリカンを脱離し、上に記載の通り、ＰＮＧａｓｅ  Ｆを使用して分析した。
【０５４５】
ＭＡＢ０１のＮグリカン分析は、ＧｎＭａｎ５レベルが全グリカンの１．８〜６８．５%の範囲であることを示した（表２０．７  Ａ、Ｂ、及びＣ）。不活性ＧｎＴＩは、期待通りに、野生型グリコシル化を産生し、コントロール株Ｍ５０７が産生した通りである。
【０５４６】
【表５９】
2018038419.tif 000061
【０５４７】
【表６０】
2018038419.tif 000062
【０５４８】
実施例２１  −  異なる標的化ペプチドを用いたＧＬＣＮＡＣＭＡＮ５産生株の生成
プラスミドの生成
異なるゴルジ標的化ペプチド（ｐＴＴｖ２７４、ｐＴＴｖ２７５、ｐＴＴｖ２７６、ｐＴＴｖ２７８、ｐＴＴｖ２７９、ｐＴＴｖ２８０）を伴うＧＮＴ１株を生成する際に使用したプラスミドは、全て、３８アミノ酸Ｎ末端切断を伴うヒトＧＮＴ１（Ｐ２６５７２）を含む共通の親プラスミドｐＴＴｖ２６５に基づいた。ｐＴＴｖ２６５の系図を、表２１．１にまとめる。
【０５４９】
【表６１】
2018038419.tif 000063
【０５５０】
プラスミドの生成の段階的な記載
プラスミドｐＴＴｖ７７は、Ｔリーゼイゲノムへの標的化組込みのためのｅｇｌ２（ｔｒｅ１２０３１２）５’及び３’隣接領域及び遺伝子発現のためのｃｂｈ１プロモーターを含む。ゲノムへのプラスミドｐＴＴｖ７７の組込みは、ｅｇｌ２遺伝子座における２４５６ｂｐ欠失をもたらす。ｅｇｌ２遺伝子座からの１０２０bp及び１０２４bp領域を、５’及び３’隣接について増幅した。ｃｂｈ１遺伝子座からの２１７６bpを、プロモーターフラグメントのために増幅した。ＰＣＲ反応において使用したテンプレートは、ＴリーゼイのゲノムＤＮＡであった。ＰＣＲ反応において使用したプライマーを表２１．２に示す。選択マーカーｐｙｒ４ブラスターカセットは、上に記載のｐＴＴｖ７１からのＮｏｔＩフラグメントであり、ベクター骨格は、上に記載のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化したｐＲＳ４２６であった。全てのフラグメントを、標準的な実験室方法を使用して精製し、プラスミドを、酵母組換え方法により、実施例において記載の通りにクローン化した。大腸菌へのプラスミドレスキュー後、数個のクローンを、正確な組換えについて検証した。保存したクローンを、配列決定により検証した。
【０５５１】
【表６２】
2018038419.tif 000064
【０５５２】
プラスミドｐＴＴｖ２５６は、プラスミドｐＴＴｖ７７に基づく。プラスミドｐＴＴｖ２５６において、プロモーターｃｂｈ１をｇｐｄＡに変化させた。ｐＴＴｖ２５６をクローン化するために、プラスミドｐＴＴｖ７７を、ＦｓｅＩ／ＰａｃＩを用いて消化し、ｃｂｈ１プロモーターを放出した。新たなプロモーター、ＡニデュランスのｇｐｄＡを、プラスミドから、ＦｓｅＩ／ＰａｃＩ消化を用いて放出した。フラグメントの精製及びクローニングを、標準的な実験室方法を使用して実施した。数個のクローンを、正確な連結について検証した。保存したクローンを、配列決定により検証した。
【０５５３】
プラスミドｐＴＴｖ２６４は、プラスミドｐＴＴｖ２５６に基づく。ｐＴＴｖ２６４において、選択マーカーを、ｐｙｒ４ブラスターカセットからｈｙｇＲ選択マーカーに変化させた。ｐＴＴｖ２６４をクローン化するために、プラスミドｐＴＴｖ２５６を、ＮｏｔＩを用いて消化し、ｐｙｒ４ブラスターカセットを放出した。マーカーｈｙｇＲを、テンプレートとして改変ｐＲＬＭｅｘ３０を使用し、表２１．３に示すプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。全てのフラグメントを、標準的な実験室方法を使用して精製し、プラスミドを、酵母組換え方法により、実施例において記載の通りにクローン化した。大腸菌へのプラスミドレスキュー後、数個のクローンを、正確な組換えについて検証し、保存したクローンを、配列決定により検証した。
【０５５４】
【表６３】
2018038419.tif 000065
【０５５５】
プラスミドｐＴＴｖ２６５は、上に記載のプラスミドｐＴＴｖ２６４に基づく。ｐＴＴｖ２６５において、１１４の核酸（３８のアミノ酸）のＮ末端切断を伴うヒトＧＮＴ１を、ｇｐｄＡプロモーター下に加えた。ｐＴＴｖ２６５をクローン化するために、プラスミドｐＴＴｖ２６４を、ＰａｃＩを用いて線状化した。ヒトＧＮＴ１を、ＰＣＲにより、完全長ヒトＧＮＴ１遺伝子を保有する合成プラスミドｐＴＴｖ１１から増幅した（Ｐ２６５７２、ｐＴＴｖ１１は、また、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０７０９５６号に記載されている）。増幅において使用したプライマーを表２１．４に示す。全てのフラグメントを、標準的な実験室方法を使用して精製した。プラスミドを、上に記載の酵母組換え方法によりクローン化した。大腸菌へのプラスミドレスキュー後、数個のクローンを、正確な組換えについて検証し、保存したクローンを、配列決定により検証した。
【０５５６】
【表６４】
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【０５５７】
ｐＴＴｖ２６５を構築するためのプラスミドｐＴＴｖ１１におけるヒトＮ末端３８アミノ酸切断ＧｎＴＩアミノ酸配列。
【０５５８】
【化１】
2018038419.tif 000067
【０５５９】
プラスミドｐＴＴｖ２７４、ｐＴＴｖ２７５、ｐＴＴｖ２７６、ｐＴＴｖ２７８、ｐＴＴｖ２７９、及びｐＴＴｖ２８０は、全て、上に記載のプラスミドｐＴＴｖ２６５に基づいた。これらのプラスミドにおいて、異なるゴルジ標的化ペプチドは、Ｎ末端切断ヒトＧＮＴ１遺伝子に先行するように加えられた。これらのプラスミドをクローン化するために、ｐＴＴｖ２６５を、ＰａｃＩを用いて線状化した。異なるゴルジ標的化ペプチドを、表２１．５Ａに示すプライマーを使用したＰＣＲにより増幅した。ＧＮＴ２（ｐＴＴｖ２７４）のためのテンプレートＤＮＡは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０７０９５６号からのコドン調和ヒトＧＮＴ２遺伝子を保有する合成プラスミドであった。他のゴルジ標的化ペプチド（ｐＴＴｖ２７６、ｐＴＴｖ２７８、ｐＴＴｖ２７９、ｐＴＴｖ２８０）のためのテンプレートは、ＴリーゼイゲノムＤＮＡであった。ＫＲＥ２（ｐＴＴｖ２７５）を、表２１．５Ａ中のアニーリングプライマーを使用したＰＣＲにより産生した。全てのフラグメントを、標準的な実験室方法を使用して精製し、プラスミドを、酵母組換え方法により、実施例において記載の通りにクローン化した。大腸菌へのプラスミドレスキュー後、各々のクローニングからの数個のクローンを、正確な組換えについて検証し、保存したクローンを、配列決定により検証した。
【０５６０】
【表６５】
2018038419.tif 000068
【０５６１】
【表６６】
2018038419.tif 000069
【０５６２】
ＧＮＴ１についての異なるゴルジ標的化ペプチドを用いた株の生成
形質転換のためのフラグメントを、プラスミドｐＴＴｖ２７４（ＧＮＴ２）、ｐＴＴｖ２７５（ＫＲＥ２）、ｐＴＴｖ２７６（ＫＲＥ２様）、ｐＴＴｖ２７８（ＯＣＨ１）、ｐＴＴｖ２７９（ＡＮＰ１）、及びｐＴＴｖ２８０（ＶＡＮ１）（表２１．５Ａ及び２１．５Ｂ）から、ＰｍｅＩを用いて放出した。全てのフラグメントを、個別にＭＡＢ０１発現株Ｍ５０７に形質転換し、プロトプラスト形質転換を、本質的に、実施例に記載の通り、ハイグロマイシン選択のために行った。
【０５６３】
選択的ストリーク上で十分に成長しているクローンを、ｅｇｌ２遺伝子座中への５’及び３’組込みについてスクリーニングした。２重組込み陽性クローンを、追加で、ｅｇｌ２  ＯＲＦの喪失についてスクリーニングした。所望の結果を与えるクローンを、単一胞子プレーティングを通じて精製し、単一胞子由来クローンを、純粋な組込み株であるように、ＰＣＲにより検証した。結果として得られた株を、下の表２１．６にリストする。
【０５６４】
【表６７】
2018038419.tif 000070
【０５６５】
株Ｍ５０７、Ｍ６０７、Ｍ６１０、Ｍ６１５、Ｍ６２０、Ｍ６２２、及びＭ６８５の発酵ならびにグリカン分析。
【０５６６】
Ｔリーゼイ株Ｍ５０７、Ｍ６０７、Ｍ６１０、Ｍ６１５、Ｍ６２０、Ｍ６２２、及びＭ６８５を、４%全粕、２%グルコース、４%セロビオース、６%ラクトース、ｐＨ５．５中で発酵させ、試料採取を、３〜６日目に実施した。抗体力価を表２１．７に示す。Ｎグリカンを脱離し、上に記載の通りに、ＰＮＧａｓｅ  Ｆを使用して分析した。
【０５６７】
ＭＡＢ０１のＮグリカン分析は、ＧｎＭａｎ５レベルが、全グリカンの４〜６６%の範囲であることを示した（表２１．８Ａ、Ｂ、及びＣ）。コントロール株Ｍ５０７は、期待した通り、野生型グリコシル化を示した。
【０５６８】
【表６８】
2018038419.tif 000071
【０５６９】
【表６９】
2018038419.tif 000072
【０５７０】
実施例２２  −  ｓｌｐ２のＲＮＡｉ及び欠失を介したｓｌｐ遺伝子のサイレンシング
３つのサイレンシングコンストラクトを、ｓｌｐ２（ｔｒｅ１２３２４４）の発現をノックダウンするために構築した。これらのＲＮＡｉコンストラクトは、ｇｐｄＡプロモーター、ｐｅｐ２（ｔｒｅ５３９６１）プロテアーゼ遺伝子座への標的化組込み、及び３’ｐｅｐ２ダイレクトリピートを伴うｐｙｒ４ループアウトマーカーを含む。２つの短い１９bpの標的配列及び大きな４４８ｂｐの配列を、このベクターに挿入し、ｐＴＴｖ２１７、ｐＴＴｖ２１８、及びｐＴＴｖ２６３をそれぞれ作製した。これらのベクターは、ＳＬＰ２の発現をノックダウンし、そのプロテアーゼ活性を低下させるために設計した。ＲＮＡｉベクターを、ＭＡＢ０１産生株Ｍ５０７のｐｙｒ４−バージョン中に形質転換した。ｐＴＴｖ２０４ベクターを図５２に示す。
【０５７１】
ｐＴＴｖ２０４  ＲＮＡｉ発現ベクターを、ＡｓｉＳＩ制限酵素を用いて線状化した。プライマーＴ８４６及びＴ８４７を一緒にアニールし、酵母組換えを介してｐＴＴｖ２０４ベクター中に組込んだ。プライマーを表２２．１に示す。１９塩基対の標的配列が、結果として得られたｐＴＴｖ２１７ベクター中に含まれる。プライマーＴ８４８及びＴ８４９を一緒にアニールし、線形化ｐＴＴｖ２０４ベクター中に組込み、ｐＴＴｖ２１８  ＲＮＡｉベクターを作製した。このベクターは、１９塩基対の標的配列を含む。プライマーを表２２．１に示す。標的配列を表２２．２に示す。
【０５７２】
ｐＴＴｖ２６３ベクターを２ピース中で作製し、ｐＴＴｖ２０４ベクター中に組込んだ。プライマーＴ９６５及びＴ９６７を使用し、ｓｌｐ２遺伝子中の５８塩基対のイントロン配列を含む５０６塩基対のセンスフラグメントを増幅した。ｐＴＴｖ２０４ベクターを、ＡｓｉＳＩ制限酵素を用いて開き、５０６センスフラグメントをベクター中に酵母組換えを介して組込んだ。プライマーＴ１００６及びＴ１００７を使用し、４４８塩基対のアンチセンスフラグメントを増幅した。アンチセンスフラグメントを、ＦｓｅＩ及びＡｓｃＩ制限酵素を用いて消化した。センスフラグメントを含むベクターを、また、ＦｓｅＩ及びＡｓｃＩを用いて消化した。ベクター及びアンチセンスフラグメントを一緒に連結し、ベクターｐＴＴｖ２６３を作製した。プライマーを表２２．１にリストする。標的配列を表２２．２に示す。
【０５７３】
ｐＴＴｖ２１７、ｐＴＴｖ２１８、ｐＴＴｖ２６３  ＲＮＡｉベクターを、ＰｍｅＩを用いて消化し、発現カセットを放出した。フラグメントを、アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、正確なフラグメントを、ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて、標準的な実験室方法を使用して単離した。発現カセットの約５μgを使用し、ＭＡＢ０１抗体発現株Ｍ５０７（ｐｙｒ４−バージョン）を形質転換した。プロトプラストの調製及び形質転換を、本質的に、株Ｍ１８１及びＭ１９５について実施例１に記載の通りに、ｐｙｒ４選択を使用して行った。
【０５７４】
ｐＴＴｖ２１７ベクター中の短い標的配列を、ｓｌｐ２だけに特異的に影響を与えるように設計した。ｐＴＴｖ２１８標的配列は、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５、及びｓｌｐ６に相同であった。ｐＴＴｖ２６３ベクター中の大きな４４８ｂｐ標的配列は、いくつかのスブチリシンに影響を与えることを意味した。これらのベクター中の標的配列を、表２２．２にリストする。結果として得られたノックダウン株Ｍ６６５、Ｍ６６６、及びＭ６６７を、小規模培養において培養した。
【０５７５】
いくつかのｐＴＴｖ２１７、ｐＴＴｖ２１８、及びｐＴＴｖ２６３形質転換体を２４ウェル培養中で成長させ、コントロール株Ｍ５０７に対して、それらのＭＡＢ０１産生を比較した。株を、硫酸アンモニウムを伴わないクエン酸二アンモニウム、１００mM  ＰＩＰＰＳ、２%粕抽出物、４%ラクトースを伴うＴｒＭＭ（ｐＨ５．５）中で成長させた。二通りのウェルを、各々の形質転換体のために使用した。６日目に取った２４ウェル培養からのサンプルを、免疫ブロッティングのために使用した。上清を、クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５を用いて希釈し、各々の上清の０．５μlを４〜１５%Criterionゲル中にロードすることができるようにした。ＬＳＢ＋ＢＭＥと混合し、９５℃で５分間にわたり加熱した。タンパク質を、ニトロセルロースに、Criterionブロッターを用いて、１００ボルトで３０分間にわたり移した。ニトロセルロース膜を、ＴＢＳＴ中の５%ミルクを用いて、１時間にわたりブロックした。重鎖を、ＴＢＳＴ中で１：１０，０００に希釈した抗重鎖ＡＰコンジュゲート抗体（Sigma＃Ａ３１８８）を用いて検出した。検出抗体を用いた１時間のインキュベート後、ブロットを、ＴＢＳＴを用いて洗浄し、膜を、ＡＰ基質（Promega）を用いて展開した。
【０５７６】
結果を、図５３において見ることができる。２１７．１２Ｇ形質転換体は、Ｍ５０７又は第２形質転換体２１７．１２Ｅと比較して、わずかに高い量の重鎖を産生した。最も顕著な改善が、ｐＴＴｖ２１８形質転換体を用いて観察された。３つの形質転換体が、コントロールよりも有意に高かった。２１８．２５Ｆが、明らかに際立っていた。ｐＴＴｖ２６３形質転換の結果は、より変動的であった。２つの形質転換体は、ほとんど抗体重鎖を産生しなかった。形質転換体２６３．１１０Ｆは、コントロールの２倍の重鎖を産生するように見えた。
【０５７７】
複数のプロテアーゼを標的化するコンストラクトは、重鎖発現を改善することにより、より成功した。全体的に、ｐＴＴｖ２１８形質転換体は、Ｍ５０７コントロールよりも一貫して良好であった。ｐＴＴｖ２６３形質転換体の２つにおいて見られた産生の欠如は、ＲＮＡｉが十分に働きすぎることを示した。ｓｌｐ２遺伝子を欠失した場合、株の成長が苦しみ、このように、抗体発現も低下した。２６３．３６Ａ及び２６３．１２４Ｃ形質転換体は、非常に不十分に成長し、ほとんどｓｌｐ２を発現しなかった。これは、振盪フラスコ及びｑＰＣＲ試験により確認した。
【０５７８】
振盪フラスコ培養からの乾燥重量の測定値を、表２２．５において見ることができる。株を、硫酸アンモニウムを伴わないクエン酸二アンモニウム、１００mM  ＰＩＰＰＳ、２%粕抽出物、４%ラクトースを伴うＴｒＭＭ（ｐＨ５．５）中で成長させた。二通りのフラスコを、各々の形質転換体のために使用した。２６３．１２４Ｃ形質転換体は、成長に困難を有した。一般的に、ＲＮＡｉを発現する全ての株において、成長における小さな低下があった。この効果は、より低いＳＬＰ２発現レベルに関連しうる。
【０５７９】
ｓｌｐ２発現が実際にＲＮＡｉの発現により低下したことを確認するために、ｑＰＣＲ試験を、振盪フラスコ試験の菌糸体を用いて行った。ＲＮＡを、振盪フラスコ培養の菌糸体から精製し、ｃＤＮＡを合成し、ｑＰＣＲ分析を作った。ｓｌｐ２、ｓｌｐ３、ｓｌｐ５、ｓｌｐ６、及びｇｐｄ１発現を、遺伝子特異的プライマーを用いてモニターした。変化（倍）を、コントロール株に対して測定した。発現を、ｇｐｄ１を用いて標準化した。
【０５８０】
２６３．１２４Ｃ形質転換体は、ｓｌｐ２の最も大きな下方調節を示した（表２２．６）。大型ＲＮＡｉは、それがオフ近くになるポイントまで、ｓｌｐ２遺伝子の３６倍下方調節を誘導した。他の形質転換体は、１．２〜２．５倍の範囲のずっとより軽度のノックダウン活性を示した。より軽度のノックダウンがより好ましい。なぜなら、株は、より良好に成長し、抗体の良好なレベルを産生することができるからである。
【０５８１】
２つの形質転換体を用いて、どの他のサブチリシンがＲＮＡｉ発現により影響を受けたかを、より密接に見た。２６３．１２４Ｃ形質転換体において、ｓｌｐ３及びｓｌｐ６が、また、それぞれ６及び２．３倍だけノックダウンされることが明白であった。より軽度のノックダウン株２１８．２５Ｆを用いて、ｓｌｐ２及びｓｌｐ３の両方が、１．７倍及び１．８倍だけ低下した発現を示した。
【０５８２】
Ｓｌｐ２欠失を含む８重欠失株Ｍ６４６の生成
Ｍ６４６  ｓｌｐ２欠失株を、ｐＴＴｖ１１５欠失カセットをＭ５６４（Ｍ５０７のｐｙｒ４−バージョン）中に形質転換することにより作った。Ｍ５６４  ｐｙｒ４−株を、本質的に、実施例３に記載の通り、株Ｍ１９５（Δｐｅｐ１）からのｐｙｒ４ブラスターカセットの除去のために作製した。連続的な５−ＦＯＡ選択工程を行い、選択されたクローンが、単一細胞から生じていることを確実にした。
【０５８３】
ｓｌｐ２隣接及びｐｙｒ４マーカーを含む欠失カセットを、ベクターから、ＰｍｅＩ消化を介して除去し、正確なフラグメントを、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を使用してアガロースゲルから精製した。欠失カセットの約５μgを使用し、ＭＡＢ０１産生株Ｍ５６４（Δｐｅｐ１Δｔｓｐ１Δｓｌｐ１Δｇａｐ１Δｇａｐ２Δｐｅｐ４Δｐｅｐ３、ｐｙｒ４−）を形質転換した。プロトプラストの調製及び形質転換を、本質的に、株Ｍ１８１及びＭ１９５について実施例１に記載の通りに、ｐｙｒ４選択を使用して行った。
【０５８４】
形質転換体を、第１ストリークとして採取した。成長するストリークを、ＰＣＲ（表２２．３にリストするプライマーを使用して）により、正確な組込み及びｓｌｐ２  ＯＲＦの喪失についてスクリーニングした。期待されるシグナルを与えるクローンを、単一細胞クローンにまで精製し、表２２．３にリストするプライマーを使用したＰＣＲにより再スクリーニングした。正確なクローン株を、株Ｍ６４６として命名した。
【０５８５】
株Ｍ５０７、Ｍ６６５、Ｍ６６６、Ｍ６６７、及びＭ６４６の発酵
Ｍ５０７株を、発酵槽培養シリーズＦＴＲ１０４において、Ｍ６６５、Ｍ６６６、Ｍ６６７、及びＭ６４６と同じ条件下で培養した。Ｍ６４６は、ｓｌｐ２欠失株であった。Ｍ６６５、Ｍ６６６、及びＭ６６７は、ＲＮＡｉサイレンシングを伴う株であった。ＦＴＲ１０４培養物を、トリコデルマ最少培地（ＴｒＭＭ）プラス２０g/L酵母抽出物、４０g/Lセルロース、８０g/Lセロビオース、及び４０g/Lソルボース中で、ｐＨ５．５で成長させた。温度を、４８時間後に２８℃から２２℃にシフトした。培養物を６日間にわたり成長させた。トリコデルマ最少培地は、５g/L硫酸アンモニウム物、５g/Lリン酸二水素カリウム、１ml/L微量元素、４．１mlの１M塩化カルシウム（１L当たり）、及び２．４mlの１M硫酸マグネシウム（培地の１L当たり）を含む。
【０５８６】
全抗体濃度を３〜６日目から決定した。６日目に、Ｍ６６７株は３．８１g/Lに達した（表２２．８を参照のこと）。５日後、抗体の発現は、Ｍ５０７、Ｍ６６５、及びＭ６６６培養において下落した。６日目に、Ｍ５０７株は２．２g/Lを産生し、Ｍ６６５は２．７g/Lに達し、Ｍ６６６は２．８g/Lを作った。このように、小さなＲＮＡｉ標的配列を伴う株は、Ｍ５０７よりもわずかに多くの抗体を産生しし、サイレンシングはそれらの株において働いていることを示す。ＳＬＰ２欠失を伴う株Ｍ６４６は、他の株よりもより遅く成長した。ＳＬＰ２欠失株は、６日目に、２g/Lをわずかに上回り産生した。
【０５８７】
株Ｍ５０７、Ｍ６６５、Ｍ６６６、及びＭ６６７の発酵
２１７．１２Ｇ（Ｍ６６５）、２１８．２５Ｆ（Ｍ６６６）、及び２６３．１１０Ｆ（Ｍ６６７）を、３０g/lグルコース、６０g/lラクトース、２０g/lＷＳＧ、２０g/lＳＧＥプラスラクトースフィードを伴う１Ｌ発酵槽中で、ｐＨ５．５で成長させ、２８℃で開始し、後に培養物中で２２℃にシフトした。ＭＡＢ０１重鎖及び軽鎖発現を、各日に収集した培養物の上清サンプルからの免疫ブロットによりアッセイした。上清を、ｐＨ５．５のクエン酸緩衝液中で希釈し、０．１μlを１ウェル当たりにロードすることができるようにする。ＬＳＢ＋ＢＭＥを加え、一緒に５分間にわたり９５℃で加熱した。サンプルを、４〜１５%Criterion  ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル中にロードした。タンパク質を、ニトロセルロースに、Criterionブロッターを用いて、１００ボルトで３０分間にわたり移した。ニトロセルロース膜を、ＴＢＳＴ中の５%ミルクを用いて、１時間にわたりブロックした。重鎖は、ＴＢＳＴ中で１：１０，０００に希釈した抗重鎖（Sigma  ＃Ａ３１８８）及び抗軽鎖（Sigma  ＃Ａ３８１３）ＡＰコンジュゲート抗体を用いて検出した。検出抗体を用いた１時間のインキュベート後、ブロットを、ＴＢＳＴを用いて洗浄し、膜を、ＡＰ基質（Promega）を用いて展開した。
【０５８８】
全抗体発現をプロテインＧ精製後に測定し、値を、２つのコントロール株からの結果と共に、表２２．４において提示する。Ｍ５０７株を、ＳＢＴＩ阻害剤を伴い及び伴わず、同じ条件下で培養した。Ｍ６６７株におけるＭＡＢ０１の発現レベルは、Ｍ５０７の親株で測定されたものよりも高かった。９日目に、例えば、発現レベルは、Ｍ６６７について２倍高かった。Ｍ６６７を用いて観察された発現レベルは、ＳＢＴＩの添加を伴い行われた培養に似ていた。Ｍ６６５株及びＭ６６６株は、コントロールよりわずかに低い又は類似のレベルを産生した。標準的なＭ５０７株と比較して、抗体発現における明らかな２倍の増加があった。
【０５８９】
表２２．４においてリストされている培養をからのプロテアーゼ活性を、どのように全プロテアーゼ活性が、ＲＮＡｉによる影響を受けたかを決定するために測定した。基質としてのカゼインを用いたプロテアーゼ活性測定を、表２２．９において見ることができる。全ての上清サンプルからの全タンパク質濃度を測定した。全てのサンプルについての全タンパク質濃度を、クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５中で、０．６２５mg/mlに、培養の全ての日について標準化した。
【０５９０】
全ての希釈上清の１００μlを、９６ウェルプレート中に加えた。１サンプル当たり３つの複製ウェルを作った。クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５中で作った１００μlのカゼインＦＬ希釈株（１０μg/ml）を加えた。バイアルからのカゼインストック溶液は、２００μlのＰＢＳ中に希釈した１０００μg/mlであった。各々のサンプルについて、バックグラウンドコントロールが、１００μlの希釈上清及び１００μlのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を伴い、含まれた。上清及び基質を含むインキュベートプレートを、ビニル袋中に３７℃で覆った。蛍光を、４時間のインキュベーション後、プレート中で測定した。読み取りは、４８５nmの励起及び５３０nmの発光を用いた蛍光プレートリーダー上で行った。
【０５９１】
Ｍ６６５株の上清中のプロテアーゼ活性は、全体的に最も低かった。培養を通じて、それは、Ｍ５０７のほぼ半分であった。大型ヘアピンベクターＭ６６７活性も低かったが、しかし、それは５日目後に減少し始め、１０日目に最も低かった。これは、Ｍ６６７株についての抗体産生が１０日目に最も高かったところであった。培養の終了時、Ｍ６６５及びＭ６６７の両方の培養上清が、Ｍ５０７コントロールと比較して、半分のプロテアーゼ活性を有していた。Ｍ５０７培養にＳＢＴＩプロテアーゼ阻害剤を添加した場合、プロテアーゼ活性は、また、６日目から８日目まで下落し、Ｍ５０７株より低いままであった。培養の終了時での低プロテアーゼ活性は、なぜＭ６６７株が、Ｍ５０７株と比較して、抗体を２倍産生するのかを説明する。
【０５９２】
【表７０】
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【０５９３】
【表７１】
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【０５９４】
【表７２】
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【０５９５】
【表７３】
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【０５９６】
【表７４】
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【０５９７】
【表７５】
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【０５９８】
【表７６】
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【０５９９】
【表７７】
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【０６００】
【表７８】
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【０６０１】
実施例２３  −  抗体フラグメント発現トリコデルマ・リーゼイ株の生成
７つのトリコデルマ・リーゼイ株を生成し、表２３にリストする通りの異なるプロテアーゼ欠失バックグラウンドを形成する抗体フラグメント（Ｆａｂ、多量体単一ドメイン抗体（ｓｄ−Ａｂ’ｓ）、及びｓｃＦｖ）を発現させた。この目的のために適用した遺伝子発現カセットの構築は、セロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）遺伝子の調節エレメント（プロモーター及びターミネーター）に基づいた。ＣＢＨＩタンパク質の触媒ドメインを改変し、イントロン配列を除去し、融合パートナーとして使用し、抗体フラグメントの発現及び分泌を増強した。Ｋｅｘ２プロテアーゼについての認識モチーフを融合パートナーの間に挿入し、ＣＢＨＩ担体タンパク質からの抗体フラグメントの同時分泌放出を促進した。発現カセットは相同領域により隣接され、トリコデルマ・リーゼイのｃｂｈ１遺伝子座への標的組込みを許した。全体のコンストラクトを、クローニングベクター中に保存した。
【０６０２】
形質転換のための隣接した発現カセットを調製するために、対応するフラグメントを、ＰｍｅＩ制限消化により、それぞれのベクター骨格から放出し、illustra GFX PCR DNA及びGel Band Purification Kit（GE Healthcare）を使用して精製した。
【０６０３】
表２３にリストする通り、Ｔリーゼイプロテアーゼ欠失株を、ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換を使用して、精製された発現カセットを用いて形質転換した。形質転換体を、それらを、選択薬剤としてのハイグロマイシンＢ又は唯一の窒素源としてのアセトアミドをそれぞれ含む培地上にプレーティングすることにより、ハイグロマイシンＢ耐性又はアセトアミダーゼ原栄養性について選択した。４８までの形質転換体を、各々、ｃｂｈ１遺伝子座への発現カセットの相同組込みについて、コンストラクトの５’隣接領域フラグメント外のフォワードプライマー及び改変ＣＢＨＩ触媒ドメイン内のリバースプライマー（５’組込み）ならびにそれぞれハイグロマイシンＢ又はアセトアミダーゼ選択マーカー内のフォワードプライマー及び３’隣接領域フラグメント外のリバースプライマー（３’組込み）を使用して、ＰＣＲによりスクリーニングした。各々の形質転換から、５〜７の非依存的な形質転換体（それらについて、ＰＣＲスクリーニングによって、ｃｂｈ１遺伝子座へのコンストラクトの正確な組込みが証明された）が、単一胞子精製について選択され、単核クローンを得た。破壊カセットの適切な組込みを、上に記載ののと同じプライマーの組み合わせを使用したＰＣＲにより再確認し、親ＣＢＨＩ遺伝子座の非存在を、ｃｂｈ１オープンリーディングフレームに標的化したプライマーの組み合せを使用することにより検証した。破壊カセットの正確な組込みを、加えて、サザンハイブリダイゼーションを適用して、全てのクローンについて検証した。単核クローンのゲノムＤＮＡならびに親株を、非依存的に、２つの異なる制限酵素の組み合わせを用いて消化し、ｃｂｈ１遺伝子の５’及び３’隣接に対してプローブし、期待した通りのｃｂｈ１遺伝子座の改変を確認した。
【０６０４】
抗体フラグメント（Ｆａｂ、単一ドメイン抗体、及びｓｃＦｖ）の発現及び力価分析
抗体フラグメントの発現は、セロビオヒドロラーゼＩプロモーターにより促進された。株を、バッチ発酵において、７日間にわたり、２%酵母抽出物、４%セルロース、８%セロビオース、４%ソルボース、５g/L  ＫＨ２ＰＯ４、及び５g/L（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む培地中で成長させた。培養ｐＨをｐＨ５．５に制御し（ＮＨ４ＯＨを用いて調整）、温度を２８℃に一定に保った。発酵を、培養容積１Ｌを伴う、４つの並列２Lガラス容器リアクター（DASGIP）中で行った。培養上清サンプルを、実行の経過の間に取り、−２０℃で保存した。サンプルを、これらの培養の全経過から毎日収集し、産生レベルを、親和性液体クロマトグラフィーにより、全ての分子について分析した。各々の抗体フラグメントについて、最大力価、株ＩＤ、及びプロテアーゼ欠失バックグラウンドを表２３に示す。
【０６０５】
【表７９】
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【０６０６】
力価の決定
Ｍａｂ及びｓｄＡｂ
Ｍａｂ及びｓｄＡｂ濃度を、ＨＰＬＣ−プロテインＡクロマトグラフィーにより定量化し、それは、ＵＶ検出を用いた親和性クロマトグラフィーに基づく。Ｇクラスのヒト免疫グロブリンのＦｃドメイン（サブタイプクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＧ３を除く）は、固定相に共有結合的に連結されたプロテインＡに特異的に結合する。ＦｃドメインへのプロテインＡの結合親和性は、ｐＨ依存的である。ｐＨ７．５での結合後、モノクローナル抗体を、ｐＨ２．０の酸性条件下で溶出し、２８０nmで検出した。
【０６０７】
Ｆａｂ
Ｆａｂ濃度を、ＨＰＬＣ−抗ラムダクロマトグラフィーにより定量化し、それは、ＵＶ検出を用いた親和性クロマトグラフィーに基づく。ヒトＦａｂグロブリンのラムダ鎖は、固定相に共有結合的に連結されたラクダ由来の抗ラムダリガンドに特異的に結合する。ｐＨ７．５での結合後、モノクローナル抗体を、ｐＨ１．４の酸性条件下で溶出し、２８０nmで検出した。
【０６０８】
ｓｃＦＶ２
ｓｃＦＶ２濃度を、AktaTM avantシステムを使用したHiTrap Protein L精製及びその後のＵＶ検出により定量化した。ｓｃＦＶ２のカッパ軽鎖部分は、固定相に共有結合的に連結されたプロテインＬリガンドに特異的に結合する。ｐＨ７．２での結合後、ｓｃＦＶ２を、０．１mM  ＨＣｌを伴う酸性条件下で溶出し、２８０nmで検出した。
【０６０９】
ｓｃＦＶ１−Ｈｉｓ
ｓｃＦｖ１−Ｈｉｓ濃度を、AktaTM avantシステムを使用したHisTrap HP精製及びその後のＵＶ検出により定量化した。タンパク質のヒスチジンタグは、Ｎｉセファロースに特異的に結合する。結合後、タンパク質を、５００mMイミダゾールを使用して溶出し、２８０nmで検出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３４−３】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年11月2日(2017.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低下しているか又は排除された活性を有する少なくとも３つの内在性プロテアーゼ、及び異種ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含むトリコデルマ細胞であって、トリコデルマ細胞が、少なくとも配列番号１２９のｇａｐ２プロテアーゼ、及び配列番号１８２のｐｅｐ２、配列番号１７のｐｅｐ３、配列番号３７のｐｅｐ４、配列番号５８のｐｅｐ５、配列番号５０７のｐｅｐ８、配列番号５２２のｐｅｐ１１、配列番号５３０のｐｅｐ１２、配列番号６６のｔｓｐ１、配列番号８２のｓｌｐ１、配列番号９８のｓｌｐ２、配列番号１６６のｓｌｐ３、配列番号２３１のｓｌｐ７、配列番号１のｐｅｐ１及び配列番号１１８のｇａｐ１のリストから選択される少なくとも２つのさらなるプロテアーゼにおいて低下しているか又は排除された活性を有し、異種ポリペプチドが、プロテアーゼが低下しているか又は排除された活性を有していない、対応する親のトリコデルマ細胞中でのポリペプチドの産生レベルに比べて少なくとも２倍高いレベルで産生される、トリコデルマ細胞。
【請求項２】
異種ポリペプチドが、哺乳動物ポリペプチドである、請求項１記載のトリコデルマ細胞。
【請求項３】
哺乳動物ポリペプチドが、グリコシル化されている、請求項２記載のトリコデルマ細胞。
【請求項４】
哺乳動物ポリペプチドが、抗体及びその抗原結合フラグメント、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、及びインターロイキンからなる群より選択される、請求項２記載のトリコデルマ細胞。
【請求項５】
哺乳動物ポリペプチドが、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、及びインターフェロンα２ｂ（ＩＦＮα２ｂ）からなる群より選択される、請求項２記載のトリコデルマ細胞。
【請求項６】
さらに、菌細胞が、活性が低下しているか又は排除されたＡＬＧ３（ドリチル−Ｐ−Ｍａｎ：Ｍａｎ（５）ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ドリチルマンノシルトランスフェラーゼ）を含む、請求項１〜５のいずれか一項記載のトリコデルマ細胞。
【請求項７】
さらに、菌細胞が、α−１，２−マンノシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか一項記載のトリコデルマ細胞。
【請求項８】
さらに、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン、及び、場合により、ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか一項記載のトリコデルマ細胞。
【請求項９】
さらに、マンノシダーゼＩＩ及び／又はガラクトシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜８のいずれか一項記載のトリコデルマ細胞。
【請求項１０】
ポリペプチドの安定性を改善する方法であって、
ａ）請求項１〜９のいずれか一項記載のトリコデルマ細胞を提供すること、及び
ｂ）異種ポリペプチドが発現するように細胞を培養すること、
を含み、
ここで、異種ポリペプチドは、プロテアーゼの活性が低下していない、対応する親トリコデルマ細胞において産生された異種ポリペプチドと比較して、増加した安定性を示す、方法。
【請求項１１】
異種ポリペプチドを作る方法であって、
ａ）請求項１〜９のいずれか一項記載のトリコデルマ細胞を提供すること、
ｂ）異種ポリペプチドが発現するように細胞を培養すること、及び
ｃ）異種ポリペプチドを精製すること
を含む、方法。
【外国語明細書】
2018038419000001.pdf