(57)【要約】      （修正有）【課題】優れた殺軟体動物性を備える殺軟体動物剤の提供。【解決手段】バチルス・チューリンゲンシスＴＫ−Ｅ６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７９８１菌株）が産生するＣｒｙタンパク質の一種であるパラスポリン２Ａｂ１（Ｃｒｙ４６Ａｂ１）及び／又はそのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、殺軟体動物作用を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）及び／又は下記（ｂ）のタンパク質を有効成分とする、殺軟体動物剤。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、殺軟体動物作用を有するタンパク質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、殺軟体動物剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
スクミリンゴガイやチャコウラナメクジ、カワヒバリガイなどの軟体動物は、農業や水系環境に悪影響を及ぼすため、効果的な駆除法が求められる。
【０００３】
スクミリンゴガイは１９８０年代に食用目的で日本に持ち込まれ、その後、養殖場などから逃げ出したものや放棄されたものなどが野生化してイネを加害し始めた。さらに、この貝からヒトにも寄生する広東住血線虫が見つかり、農作物ばかりでなく衛生環境にも害を与える生物として、駆除が望まれるようになって来ている。
スクミリンゴガイの水田における発生面積は、全国で統計が取られ始めた１９９３年には４万３千ヘクタールであったが、２０１２年には１１万ヘクタールになり、増加傾向は止まっていない。また、イネの被害面積は、最後に統計が取られた２００１年では九州地方を中心に１万ヘクタールにおよんでいる（発生面積は６万８千ヘクタール）。２００１年以降の被害データは取られていないが、生息域が年々広がっていることから被害面積も増加していると思われる。地球温暖化や休耕田の増加などスクミリンゴガイの繁殖に都合のよい条件が増え、被害も増加することが予想されるため、その効果的な駆除法の確立が急がれる。
【０００４】
スクミリンゴガイの駆除には化学農薬であるメタアルデヒド粒剤、ＩＢＰ粒剤やカルタップ粒剤などが使われているが、溶出や流失を伴うため水中での効果はあまり期待できない。また、合鴨や鯉といった天敵利用は、その管理が難しいためほとんど広まっていない。
【０００５】
チャコウラナメクジは１９５０年代に米軍物資に紛れ込んで侵入したと考えられている。やすり状の歯舌で葉や茎を削り取るように食害する。アブラナ科作物や家庭菜園での被害が大きい。チャコウラナメクジの防除は、誘引トラップによる捕殺やメタアルデヒド剤などを用いた誘殺が行われるが、効果はそれほど高くない。
【０００６】
カワヒバリガイは輸入シジミ類に混入し、中国や朝鮮半島から運ばれたと考えられている。農業水利施設の取水口や導水管に足糸で大量に付着し、詰まらせるなどの被害が報告されている。本種に対する有効な駆除法は、まだ無い。
【０００７】
以上のとおり、軟体動物は農業や水系環境に悪影響を及ぼすが、その効果的な駆除法は確立されていなかった。
【０００８】
次に、後述するとおり、本発明の殺軟体動物剤は、Ｃｒｙ４６Ａｂ１（あるいはそのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、殺軟体動物作用を有するタンパク質）を有効成分とするものである。
そこで、このＣｒｙ４６Ａｂ１に関連する従来の技術水準についても、以下に説明しておく。
【０００９】
まず、本発明者は、双翅目昆虫特異的な殺虫活性を有する細菌として、双翅目昆虫特異的な殺虫活性を有するバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ。以下、「Ｂｔ」と略記することがある）ＴＫ−Ｅ６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７９８１菌株）を提案した（特許文献１参照。）。
【００１０】
Ｂｔは、自然界では土壌や植物葉上などに広く生息しているグラム陽性の好気性桿菌である。近縁種には、一般的なモデル生物として扱われるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ。以下、「Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ」と略記することがある）、食中毒菌として知られているバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、ボウフラに殺虫性を示すバチルス・スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）などがいる。
【００１１】
Ｂｔは胞子形成期に、菌体内に胞子とともにクリスタルと呼ばれるタンパク質の結晶顆粒（本明細書において「顆粒」とは「微小粒状物」を指す。以下、同様。）を形成する。クリスタルの構成タンパク質は、Ｃｒｙと呼ばれる。Ｃｒｙタンパク質には、Ｃｒｙ毒素とＣｙｔ毒素、及びパラスポリン（ｐａｒａｓｐｏｒｉｎ）の３つがある。
【００１２】
Ｃｙｔ毒素は、約３０ｋＤａのタンパク質で脊椎動物、無脊椎動物を問わず、非特異的な活性をもっている。
Ｃｒｙ毒素は、１３０ｋＤａタイプのものと７０ｋＤａタイプのものがあり、高い選択毒性をもち殺虫性を示すものが見つかっている。Ｃｒｙ毒素の種類によって対象とする昆虫目が異なっている。殺虫活性の仕組みの詳しい作用機構は解明されていないが、Ｂｔ内で産出されたＣｒｙ毒素が、感受性昆虫に摂取された後、腸内のアルカリ性消化液によりクリスタルが部分分解され活性型毒素となり、毒素は中腸上皮細胞上にある受容体と結合、オリゴマー化され細胞膜に孔が形成され、消化管細胞に浸透圧の錯乱がおこり、細胞を破壊する。その結果、腸における栄養の吸収が困難となり、昆虫は衰弱して餓死するとされている。
【００１３】
パラスポリンは、Ｂｔ及び近縁の細菌が産生するＣｒｙタンパク質のうち、溶血活性を持たないが、ガン細胞に選択的な細胞損傷活性を示すものと定義され、もともとは殺虫性を示さないＢｔから発見された（非特許文献２、非特許文献３など参照。）。
パラスポリンは、アミノ酸配列の相同性により１〜６のグループがあり、それぞれ、Ｐａｒａｓｐｏｒｉｎ１（＝Ｃｒｙ３１Ａ），Ｐａｒａｓｐｏｒｉｎ２（＝Ｃｒｙ４６Ａ），Ｐａｒａｓｐｏｒｉｎ３（＝Ｃｒｙ４１Ａ），Ｐａｒａｓｐｏｒｉｎ４（＝Ｃｒｙ４５Ａ），Ｐａｒａｓｐｏｒｉｎ５（＝Ｃｒｙ６４Ａ），Ｐａｒａｓｐｏｒｉｎ６（＝Ｃｒｙ６３Ａ）と命名されている。
【００１４】
そして、上述したＢｔ．ＴＫ−Ｅ６が、Ｐａｒａｓｐｏｒｉｎ２Ａｂ１（＝Ｃｒｙ４６Ａｂ１）をコードする遺伝子（ｃｒｙ４６Ａｂ１）を有すること、そして、Ｃｒｙ４６Ａｂ１は、プロテイナーゼＫにより約３０ｋＤａの活性型となり、ＭＯＬＴ−４細胞に対して強い細胞損傷能を示すことが報告されている（非特許文献４参照。）。
【００１５】
しかし、現在まで、パラスポリンの殺軟体動物活性に関する報告はなく、Ｐａｒａｓｐｏｒｉｎ２Ａｂ１とアミノ酸配列の相同性が高いＰａｒａｓｐｏｒｉｎ２Ａａ１に関する報告においても、軟体動物に対する致死性に関する記述は見当たらない（非特許文献５など参照。）。
【００１６】
なお、本発明者は、Ｃｒｙ４６Ａｂ１が双翅目昆虫殺虫活性を有することを発見し、用途発明として特許出願している（特願２０１６−２１６２３８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特許第４７５３１０８号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Bernardi D, Salmeron E, Horikoshi RJ, Bernardi O, Dourado PM, Carvalho RA, et al. (2015) "Cross-Resistance between Cry1 Proteins in Fall Armyworm (Spodoptera frugiperda) May Affect the Durability of Current Pyramided Bt Maize Hybrids in Brazil", PLoS ONE 10(10): e0140130. doi:10.1371/journal.pone.0140130
【非特許文献２】Mizuki, E. et al. "Parasporin, a Human Leukemic Cell-Recognizing Parasporal Protein of Bacillus thuringiensis", Clin. Diagn. Lab. Immunol., 7, 625-634 (2000)
【非特許文献３】Ito, A. et al. " A Bacillus thuringiensis Crystal Protein with Selective Cytocidal Action to Human Cells", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY (2004) 279, 21282-21286
【非特許文献４】Hayakawa, T. et al. "Parasporin-2Ab, a Newly Isolated Cytotoxic Crystal Protein from Bacillus thuringiensis", CURRENT MICROBIOLOGY Vol. 55 (2007), pp. 278-283
【非特許文献５】Kitada, S. et al. " Cytocidal Actions of Parasporin-2, an Anti-tumor Crystal Toxin from Bacillus thuringiensis ", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY (2006) 281, 26350-26360
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
上記に見るように、軟体動物は農業や水系環境に悪影響を及ぼすが、その効果的な駆除法は確立されていない。
そこで、本発明は、優れた殺軟体動物性を備える殺軟体動物剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、上記課題を解決するため、以下の構成を備える。
すなわち、本発明に係る殺軟体動物剤は、下記（ａ）及び／又は下記（ｂ）のタンパク質を有効成分とする。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、殺軟体動物作用を有するタンパク質
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係る殺軟体動物剤は強い殺軟体動物性を発揮する。
【００２２】
また、本発明に係る殺軟体動物剤の有効成分であるタンパク質は、Ｂｔ菌体内で不溶性のタンパク質顆粒として生産させることができる。そのため、水田等に散布しても溶解せずに、拡散し難い顆粒として留まるので、溶解や流出による希釈や損失がないという利点もある。また、顆粒であるために軟体動物が餌として摂取しやすい。
【００２３】
本発明に係る殺軟体動物剤の有効成分であるタンパク質は、従来のＢｔ菌における３ドメイン型のＣｒｙ毒素とは構造が異なり、Ｃｒｙファミリー間の保存配列が見られるｂｌｏｃｋ領域をもたず、アミノ酸配列の類似性も低い。
従って、構造の相違により、殺活性機構も従来と異なると推測される。
【００２４】
なお、本発明に係る殺軟体動物剤の有効成分であるタンパク質は、Ｃｒｙ４６Ａｂ１（＝Ｐａｒａｐｏｒｉｎ２Ａｂ１）であり、ガン細胞に特異的な細胞損傷作用を示すが、生物に対する殺活性はないと思われていたものであり、また、Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６が生産するクリスタル中のタンパク質には含まれていないため、その強い殺軟体動物性を発見することは極めて困難であったといえる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例１で使用したプラスミド（ｐＨＹ３００ＰＬＫ）の構造を示す図である。
【図２】実施例１で使用したプラスミド（ｐＰｃｙｔ１Ａ）の構造を示す図である。
【図３】実施例１、比較例１，２のそれぞれについて、本培養前と本培養２４時間後の培養液中の菌体の様子を位相差顕微鏡で観察した結果を示す写真である。
【図４】実施例１、比較例１，２のそれぞれについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図５】実施例１、比較例１，２のそれぞれについて、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明に係る殺軟体動物剤について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。
【００２７】
本発明に係る殺軟体動物剤は、下記（ａ）及び／又は下記（ｂ）のタンパク質（以下、「本発明に係る殺軟体動物活性タンパク質」ということがある）を有効成分とする。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｃｒｙ４６Ａｂ１）
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、殺軟体動物作用を有するタンパク質
【００２８】
本発明に係る殺軟体動物活性タンパク質は、当該タンパク質をコードする遺伝子を用い、周知の遺伝子組換え技術により製造することができる。
【００２９】
具体的には、例えば、以下の工程により製造することができる。
（１）本発明に係る殺軟体動物活性タンパク質をコードする遺伝子を調製する。
（２）発現ベクターに上記遺伝子を導入したプラスミドを構築する。
（３）宿主細胞を上記プラスミドで形質転換して組換え宿主細胞を形成する。
（４）上記組換え宿主細胞を培養して本発明に係る殺軟体動物活性タンパク質を産生させる。
（５）上記殺軟体動物活性タンパク質を回収・確認する。
【００３０】
まず、遺伝子の調製（上記（１））について説明する。
上述のとおり、Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６は、ｃｒｙ４６Ａｂ１遺伝子を有している。なお、ｃｒｙ４６Ａｂ１の塩基配列は、近畿大学生物理工学部分子生化学研究室内で決定された（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ１３６９１４）（配列番号２）。
そこで、プライマーを用いて、ｃｒｙ４６Ａｂ１又はその変異遺伝子のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとし、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより、標的ＤＮＡ断片（本発明に係る殺軟体動物活性タンパク質をコードする遺伝子）を増幅させることができる。
プライマーは、標的ＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて適宜設計すればよい。
【００３１】
なお、ｃｒｙ４６Ａｂ１の変異遺伝子は、従来公知の手法によりｃｒｙ４６Ａｂ１に変異を導入することで得ることができる。
例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎTM−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社製））などを用いて変異導入を行うことができる。
【００３２】
次に、発現ベクターへの遺伝子の導入（上記（２））について説明する。
本発明に係る殺軟体動物活性タンパク質をコードする遺伝子を導入する発現ベクターは、少なくとも、プロモーター領域と、その下流に配置されるターミネーター領域を備える。
【００３３】
プロモーター領域は、例えば、宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター等、宿主が枯草菌の場合、ＳＰＯプロモーター、ａｐｒＥプロモーター等が挙げられる。
【００３４】
ターミネーター領域は、例えば、大腸菌の場合、ρ因子非依存的転写終結ではＧ−Ｃ塩基対に富んだ逆位反復配列と、それに続くＴの連続配列から成り、逆位反復配列におけるステム−ループ構造の形成によりＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鎖から外れて転写を終わらせる。ρ因子依存的転写終結ではステム−ループ構造があまり大きくないので、ρ因子がＲＮＡポリメラーゼを外す手助けをして転写を終わらせる。
【００３５】
プロモーター領域とターミネーター領域とは、制限酵素認識部位を介して連結されている。この連結箇所を制限酵素で切断し、その間に、本発明に係る殺軟体動物活性タンパク質をコードする遺伝子を導入することで、目的のプラスミドを構築することができる。
【００３６】
プロモーター領域には、プロモーターの近傍にリボソーム結合部位（ＳＤ配列）が含まれる。
発現ベクターには、プロモーター領域とターミネーター領域の他、形質転換体選択のためのマーカー遺伝子が含まれていることが好ましい。
【００３７】
本発明者は、ｃｙｔ１Ａのプロモーター領域とｃｒｙ４Ａのターミネーター領域をＳｐｈＩ部位を介して連結したＢｔ細胞用発現ベクターｐＰｃｙｔ１Ａについて報告しているが（武部聡ら、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞用発現ベクターｐＰｃｙｔ１Ａの構築、近畿大学先端技術総合研究所紀要（１０），ｐｐ．２９−３６，２００５年）、この発現ベクターは、本発明において好適に用いることができる。
【００３８】
次に、宿主細胞の形質転換（上記（３））について説明する。
宿主細胞としては、上記プラスミドにより形質転換され、目的のタンパク質を発現させることができるものであれば、特に限定されない。
例えば、本発明の技術分野において通常使用される細菌（大腸菌、枯草菌、バチルス・チューリンゲンシス等）又はその変異株（例えば、殺軟体動物活性タンパク質を生産しないバチルス・チューリンゲンシス株）などが挙げられる。
【００３９】
上記プラスミドの宿主細胞への導入は、例えば、大腸菌の場合、塩化カルシウム法や電気穿孔法等、枯草菌の場合、電気穿孔法やプロファージ等により行うことができる。
【００４０】
特に、上記Ｂｔ細胞用発現ベクターｐＰｃｙｔ１Ａに殺軟体動物活性タンパク質をコードする遺伝子を導入し、クリスタルを生産しないＢｔ細胞に導入することで、効率良く目的の殺軟体動物活性タンパク質を発現させることができる。
【００４１】
上記組換え宿主細胞を培養することで、本発明に係る殺軟体動物活性タンパク質を産生させることができる（上記（４））。
例えば、抗生物質テトラサイクリン２０μｇ／ｍＬを含む胞子形成培地（例えば、ＳＳＭ培地）に上記組換え宿主細胞を植菌し、３０℃において振盪培養すると２４時間後以降に菌体内に胞子とともに殺軟体動物活性タンパク質顆粒が形成される。
【００４２】
次いで、細胞培養により産生したタンパク質を回収し、検出・確認する（上記（５））。
タンパク質の回収は、従来公知の方法、例えば、細胞培養後、破砕し、公知の分離方法により分離することによって行うことができる。
分離方法としては、例えば、遠心分離、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられる。分離操作上必要であれば、タンパク質を可溶化しても良い。本発明に係る殺軟体動物活性タンパク質は水に不溶であるが、アルカリ条件下では可溶化し、水溶液になる。
【００４３】
また、タンパク質の検出・確認の方法としては、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティングなどが挙げられる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を用いて、本発明について詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４５】
〔実験材料〕
＜菌株＞
以下の菌株を用いた。
（１）Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６
近畿大学生物理工学部分子生化学研究室にて単離された菌株である（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７９８１）。
（２）バチルス・チューリンゲンシス亜種クルスターキー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｋｕｒｓｔａｋｉ）  ＣＲＹ（−）Ｂ
クリスタル非生産株であり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＧＳＣ）より入手した菌株である（ＢＧＳＣＮｏ．４Ｄ１１）。
以下、「Ｂｔｋ  ＣＲＹ（−）Ｂ」と略記することがある。
【００４６】
＜プラスミド＞
以下のプラスミドを用いた。
（１）ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ。以下、「Ｅ．ｃｏｌｉ」と略記することがある）とＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの両方へＤＮＡ形質導入できるタカラバイオ社のシャトルベクターである（図１参照。）。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓと同様にＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓへのＤＮＡ形質導入も可能である。
Ｅ．ｃｏｌｉのプラスミドｐＡＣＹＣ１７７とストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）のプラスミドｐＡＭα１由来のＤＮＡより構築されている。薬剤耐性マーカーはアンピシリン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子であり、Ｅ．ｃｏｌｉ中では両者が発現するが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中ではテトラサイクリン耐性遺伝子のみが発現する。
ＢａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＢａｎＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｔＰＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＰｖｕＩ、ＸｂａＩの制限酵素切断部位を１ヵ所ずつ持っている。
【００４７】
（２）ｐＰｃｙｔ１Ａベクター
ｐＨＹ３００ＰＬＫのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位にＢｔｉ由来のｃｙｔ１Ａプロモーター領域とｃｒｙ４Ａターミネーター領域を制限酵素ＳｐｈＩ認識部位でつないだ断片を挿入した、Ｂｔ細胞用発現ベクターである（図２参照。）。
ｃｙｔ１Ａプロモーター領域は配列番号３の塩基配列からなり、ｃｒｙ４Ａターミネーター領域は配列番号４の塩基配列からなる。
上記プロモーターはσ35、σ28の２つの認識配列を持っており、転写活性が高くなる時期の異なる２つのプロモーターの働きにより、長い間ｍＲＮＡの細胞内濃度を高く維持できると考えられる。
また、上記ターミネーターは、どの読み枠においても終始コドンが入ることを確認し、本来のｃｒｙ４Ａの終始コドンより上流から、ステムループ構造の下流までを用いた。
上記プロモーター、ターミネーター部位は、公知の手法に従い、ＰＣＲにより調製し、制限酵素消化後にｐＨＹ３００ＰＬＫにクローニングした。
ＳｐｈＩ部位に外来遺伝子のＯＲＦを挿入することで転写できる。ｃｙｔ１ＡのＳＤ配列により、ＳｐｈＩ部位内にあるＡＴＧから翻訳される。
これにより、Ｂｔ細胞内で胞子形成期にタンパク質を大量に発現させることができる。
【００４８】
＜試薬＞
用いた試薬を下表１に示す。
【００４９】
【表１】
2018177656.tif 000002
【００５０】
＜培地＞
以下に示す培地を用いた。
（１）ＬＢ培地（Luria bertani medium）
Ｂａｃｔｏ（商標）  トリプトン                  １０．０ｇ
Ｂａｃｔｏ（商標）  酵母エキス                  ５．０ｇ
ＮａＣｌ                                        １０．０ｇ
寒天                                            １５．０ｇ
にｓＨ2Ｏ（滅菌水。以下、同様。）を１０００ｍＬとなるまで加え、オートクレーブした。
ただし、ＬＢ液体培地作製の場合は寒天を加えない。
【００５１】
＜アガロースゲル電気泳動＞
（１）１％アガロースゲル
アガロース                                      ０．２５ｇ
０．５×ＴＢＥ緩衝液                            ２５ｍＬ
からなる。
（２）０．５×ＴＢＥ緩衝液（泳動用緩衝液）
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン          ５．４ｇ
ホウ酸                                          ２．７５ｇ
エチレンジアミン４酢酸・２Ｎａ                  ０．３７５ｇ
にｓＨ2Ｏを加えて１０００ｍＬにした。
【００５２】
（２）ＳＳＭ培地（Schaeffer's sporulation medium）
ニュートリエントブロス（Nutrient Broth）      ８．０ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                            ０．２５ｇ
ＫＣｌ                                          １．０ｇ
にＨ2Ｏを１０００ｍＬとなるまで加え、オートクレーブした。
その後、
１ｍＭ  ＦｅＳＯ4                              １．０ｍＬ
１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2                            １．０ｍＬ
１ｍＭ  ＣａＣｌ2                              １．０ｍＬ
を加えた（これらの試薬はいずれもフィルター滅菌済み）。
【００５３】
＜抗生物質＞
テトラサイクリンストック２０ｍｇ／ｍＬを用いた。溶媒はエタノールであり、−３０℃で保存した。
【００５４】
＜可溶化緩衝液＞
（１）５０ｍＭ炭酸バッファー
３０ｍＭのＮａ2ＣＯ3及び２０ｍＭのＮａＨＣＯ3からなる（ｐＨ１０．５）。
【００５５】
＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞
（１）１２％分離ゲル
３０％アクリルアミド／ビス混合液                ４．０ｍＬ
ｓＨ2Ｏ                                        ３．４ｍＬ
ＷＩＤＥ  ＲＡＮＧＥゲル調製用緩衝液            ２．５ｍＬ
１０％ペルオキソ二硫酸アンモニウム              ０．１ｍＬ
テトラメチルエチレンジアミン                    ０．００６ｍＬ
からなる。
【００５６】
（２）３％濃縮ゲル
３０％アクリルアミド／ビス混合液                ０．２ｍＬ
ｓＨ2Ｏ                                        １．２８ｍＬ
ＷＩＤＥ  ＲＡＮＧＥゲル調製用緩衝液            ０．５ｍＬ
１０％ペルオキソ二硫酸アンモニウム              ０．０２ｍＬ
テトラメチルエチレンジアミン                    ０．００２ｍＬ
からなる。
【００５７】
（３）グリシンバッファー
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン            ３．０ｇ
グリシン                                        １４．４ｇ
ＳＤＳ                                          １．０ｇ
にｓＨ2Ｏを１０００ｍＬとなるまで加えて調製した。
【００５８】
（４）２×サンプルバッファー
１Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）            ０．９１ｍＬ
ＳＤＳ                                          ０．４ｇ
グリセロール                                    ２．０ｍＬ
２−メルカプトエタノール                        １．２ｍＬ
ブロモフェノールブルー                          １ｍｇ
にｓＨ2Ｏを１０００ｍＬとなるまで加えて調製した。
【００５９】
＜ウエスタンブロット＞
（１）一次抗体
Ｃｒｙ４６Ａｂ１のアミノ酸配列から１９アミノ酸残基（配列番号１の第１９５〜２１３番目）を化学合成したペプチドをウサギに免役して作製したポリクローナル抗体（シグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社）
【００６０】
（２）二次抗体
抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギポリクローナル抗体（ＨＲＰ標識）（フナコシ）を用いた。
【００６１】
（３）５×転写バッファー
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン          １２１ｇ
グリシン                                        ５７０ｇ
ＳＤＳ                                          ２０ｇ
にｓＨ2Ｏを４０００ｍＬとなるまで加えて調製した。
【００６２】
（４）０．５×転写バッファー
５×転写バッファー                              ９０ｍＬ
メタノール                                      １８０ｍＬ
ｓＨ2Ｏ                                        ６３０ｍＬ
からなる。
【００６３】
（５）ブロッキングバッファー
１０×ブロッキングバッファー                    ４．０ｍＬ
１０×マレイン酸                                ４．０ｍＬ
ｓＨ2Ｏ                                        ３２ｍＬ
からなる。
【００６４】
（６）洗浄バッファー
１０×洗浄バッファー                            ２０ｍＬ
ｓＨ2Ｏ                                        １８０ｍＬ
からなる。
【００６５】
（７）検出バッファー
１０×検出バッファー                            ４．０ｍＬ
ｓＨ2Ｏ                                        ３６ｍＬ
からなる。
【００６６】
（８）染色液
クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）Ｒ２５０を用いた。
【００６７】
（９）脱色液
酢酸                                            １０ｍＬ
メタノール                                      ５０ｍＬ
ｓＨ2Ｏ                                        ４００ｍＬ
からなる。
【００６８】
＜生物検定の使用生物＞
（１）スクミリンゴガイ
和歌山県岩出市郊外の水田において採取した。
（２）チャコウラナメクジ
近畿大学生物理工学部キャンパス内で採取した。
（３）ヒメダカ
市中ペットショップより購入した。
【００６９】
〔実施例１〕
＜遺伝子の調製＞
（１）ｃｒｙ４６Ａｂ１の塩基配列の決定
ｃｒｙ４６Ａｂ１の塩基配列は近畿大学生物理工学部研究室で決定された（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ１３６９１４）。ｃｒｙ４６Ａｂ１のＯＲＦ（９１５ｂｐ、終止コドンを含む）（配列番号２）から推測されるタンパク質は、３０４アミノ酸残基、３３ｋＤａの大きさである。
【００７０】
（２）プライマー設計
ｃｒｙ４６Ａｂ１の塩基配列に基づき、次の通り、プライマーを設計した。
センス鎖プライマー：５’−ＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＣＣＣＡＡＧＴＡＡＣＡＧＧ−３’（配列番号５）
アンチセンス鎖プライマー：５’−ＧＣＡＴＧＣＴＡＡＴＣＣＡＡＴＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＡＴＴＴＧＴ−３’（配列番号６）
センス鎖プライマーは、ｃｒｙ４６Ａｂ１のＯＲＦの開始コドン（ＡＴＧ）を含む２６ｎｔの５’側にＳｐｈＩ部位（ＧＣＡＴＧＣ）を付加し、間に２塩基（ＡＡ）挿入してフレームを合わせたものである。
また、アンチセンス鎖プライマーは、ｃｒｙ４６Ａｂ１のＯＲＦの終止コドン（ＴＡＡ）より上流２５ｎｔの相補鎖の５’にＳｐｈＩ部位を付加したものである。
【００７１】
（３）ＰＣＲ
Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６のゲノム画分（巨大プラスミドを含む）を鋳型とし、上記プライマーを用いてＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）で３０サイクル行った。
反応液は、
１０×ＥｘＴａｑバッファー                      ５μｌ
ｄＮＴＰ  （２５０μＭ  ｅａｃｈ）              ４μｌ
２．０μＭ  センス鎖プライマー                  ５μｌ
２．０μＭ  アンチセンス鎖プライマー            ５μｌ
５０μｇ／ｍＬ  鋳型ＤＮＡ                      ２μｌ
ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μｌ）                        ０．２５μｌ
にＨ2Ｏを５０μｌとなるまで加えて調製した。
【００７２】
＜上記遺伝子の発現ベクターへの導入＞
ＰＣＲ産物を大腸菌用ＴＡクローニングベクター「ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ」（プロメガ株式会社製）に連結し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。この菌を培養して調製したプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ−ｃｒｙ４６Ａｂ１におけるｃｒｙ４６Ａｂ１のＯＲＦの塩基配列を調べ、変異等がないことを確認した。このプラスミドを制限酵素ＳｐｈＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動（１％ゲル濃度、０．５×ＴＢＥ緩衝液（ｐＨ８．０））により、ｃｒｙ４６Ａｂ１のＯＲＦ断片を分離、回収して挿入断片とした。ベクターｐＰｃｙｔ１ＡはＳｐｈＩで消化した後、脱リン酸酵素Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｓｈｒｉｍｐ）（ＳＡＰ）（タカラ社製）により、５’末端の脱リン酸処理を行った。このベクターにｃｒｙ４６Ａｂ１ＯＲＦの挿入断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラ社製）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。
組換え体の中からｃｒｙ４６Ａｂ１ＯＲＦが正方向（ベクターのプロモーターの向きとＯＲＦの転写方向が一致）に挿入されたクローンを選抜し、その組換えプラスミドをｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１とした。
【００７３】
＜組換え宿主細胞の形成＞
ｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１をもつ大腸菌ＤＨ５αをＬＢ培地（７５μｇ／ｍＬアンピシリンを含む）３ｍＬに植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。この培養液からｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１を抽出し、電気穿孔法によりクリスタル非生産株のＢｔｋ  ＣＲＹ（−）Ｂ（ＢＧＳＣ  Ｎｏ．４Ｄ１１）に導入した。テトラサイクリン耐性を獲得した菌をＬＢ培地（２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む）で一晩培養し、培養液にグリセロールを１５％になるように添加したものをグリセロールストックとして−８０℃に保存した。
【００７４】
＜菌体の培養によるタンパク質の産生＞
上記ｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１／Ｂｔｋ  ＣＲＹ（−）Ｂのグリセロールストック（−８０℃）をＬＢ寒天培地（２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む）に画線し、３０℃で２４時間培養した。
【００７５】
次いで、以下の通り、前培養を行った。
すなわち、形成されたシングルコロニーを、ＬＢ培地（２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む）５ｍＬ（Ｌ字管）に植菌し、３０℃で５０ｒｐｍｌ６時間モノード振盪培養した。
【００７６】
次いで、以下の通り、本培養を行った。
すなわち、１Ｌ容スクリューフラスコ（ひだ付きフラスコ）にＳＳＭ培地１００ｍＬ（２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む）を作製し、前培養液全量（５ｍＬ）を加えて４００ｒｐｍで３０℃、２４時間振盪培養した。菌体が胞子を形成しているのを検鏡で確認した後、ファルコンチューブ（５０ｍＬ）２本に分注し、集菌（３，０００ｒｐｍ，４℃，１０分）した。
【００７７】
＜タンパク質の回収及び試料液の作製＞
上記集菌後、菌体を１ｍＭペファブロックＳＣ／ｓＨ2Ｏ１０ｍＬに懸濁し、ソニケーターＳＯＮＩＦＥＲ４５０Ｄ（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて超音波破砕した。菌体が破砕されていることを検鏡で確認した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，４℃，１０分）を行い、沈殿（不溶タンパク質と胞子を含む）を得た。これを１ｍＭペファブロックＳＣを含むＷａｓｈＩ（２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）１０ｍＬに完全に懸濁した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，４℃，１０分）で回収する洗浄を３回繰り返し、さらに、１ｍＭペファブロックＳＣを含むＷａｓｈＩＩ（０．５Ｍ  ＮａＣｌ）１０ｍＬに完全に懸濁した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，４℃，１０分）で回収する洗浄を３回繰り返した。
その後、沈殿を１ｍＭペファブロックＳＣ／ｓＨ2Ｏ１ｍＬに懸濁したものを試料液として、−３０℃で冷凍保存した。
【００７８】
＜試料液の可溶化及び濃度測定＞
目的のＣｒｙ４６Ａｂ１は水には不溶であるが、アルカリ条件下では可溶化し、水溶液になる。
そこで、上記試料液５０μｌに５０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ１０．５）１５０μｌを加え、３７℃で１時間保温した。その後、遠心分離（室温，１５，０００ｒｐｍｌ０分）し、上清（可溶化したタンパク質を含む）を新しいチューブに移した。
【００７９】
２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ標準溶液を、５０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ１０．５）を用いて希釈し、０，５０，１００，２００，３００，４００，５００μｇ／ｍＬのＢＳＡ標準溶液を作製した。それぞれ２０μｌをエッベンチューブに取り、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを１ｍＬ加えてよく混合し、波長５９５ｎｍにおける吸光度を測定して検量線を作製した。
可溶化したタンパク質を４μｌ取り、５０ｍＭ炭酸バッファーを１６μｌ加え、さらに、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを１ｍＬ加えてよく混合した。波長５９５ｎｍにおける吸光度を測定し、ＢＳＡの検量線から試料液の可溶化タンパク質濃度を求めた。
【００８０】
＜タンパク質の検出及び確認＞
ｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１／Ｂｔｋ  ＣＲＹ（−）Ｂが胞子形成期に菌体内につくる不溶性タンパク質画分にＣｒｙ４６Ａｂ１が含まれることを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗Ｃｒｙ４６Ａｂ１抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、以下の通り検出・確認した。
【００８１】
（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（ａ）電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの作成
ＡＴＴＯ社製ラピダス・ミニスラブ電気泳動装置（ＡＥ−６５００）を用い１２％分離ゲル、３％濃縮ゲルのポリアクリルアミドゲルを作製した。
【００８２】
（ｂ）サンプル調製
Ｃｒｙ４６Ａｂ１試料液を炭酸バッファーによるアルカリ可溶化処理後、処理液全体（遠心分離前液）、遠心分離（室温，１５，０００ｒｐｍｌ０分）後の上清、沈殿の各サンプルに分けた。
各サンプルに含まれるタンパク質量が５μｇになるように計算し、５０ｍＭ炭酸バッファーを加えて液全量を１０μｌにした。各サンプルに２×サンプルバッファーを１０μｌ加え、５分間煮沸した後、全量をＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いた。
【００８３】
（２）ウエスタンブロットによるＣｒｙ４６Ａｂ１の検出
（ａ）一次抗体の作製
（シグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社の「シンプル抗体作製サービス」）
Ｃｒｙ４６Ａｂ１のアミノ酸配列のうちＮ−末端から１９５番目のアルギニンから２１３番目のアラニンまで（配列番号１の第１９５〜２１３番目）の１９アミノ酸残基を化学合成し、ウサギに免疫した。１週間ごとに３回抗原を投与し、最終投与から２週間後に採血した。
【００８４】
（ｂ）メンブレン前処理
ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）メンブレンをメタノールに１０分間浸し、親水化した。
【００８５】
（ｃ）メンブレンへのタンパク質転写
Ｃｒｙ４６Ａｂ１試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質のＰＶＤＦメンブレンへの転写をミニトランスブロット（登録商標）セル装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてウェット式転写で行った。ゲルと同サイズにカットしたメンブレン、ろ紙をゲルとスポンジとともに０．５×転写バッファーに浸し平衡化した。転写装置の陽極側からスポンジ、ろ紙、メンブレン、ゲル、ろ紙、スポンジの順にセットした。４５Ｖ，１００ｍＡ，４℃，１６時間通電し、転写を行った。転写後のＰＶＤＦメンブレンをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）Ｒ２５０に浸し、揺らしながら２分以上染色した。その後、染色液を脱色液３０ｍＬに交換し、ＰＶＤＦメンブレンのバックグラウンド部分が十分に脱色されるまで、３回脱色液を交換して脱色を行った。最後に純水でメンブレンを十分にすすぎ、脱色反応を止めた。このメンブレンを写真に撮り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動像とした。
【００８６】
（ｄ）ブロッキング
脱色したＰＶＤＦメンブレンをハイブリ・バッグ（コスモ・バイオ社製）に入れ、さらにブロッキングバッファー２０ｍＬを入れて３０分間揺らしながらメンブレンのブロッキングを行った。
【００８７】
（ｅ）一次抗体反応
ブロッキング後、一次抗体２０μｌをバッグ内のバッファーに加え、３０分揺らしながら反応させた。バッグ内の液を除いた後、余剰の一次抗体を除くため洗浄バッファー３０ｍＬをバッグ内に加え、１０分間揺らして液を捨てる洗浄作業を３回繰り返した。
【００８８】
（ｆ）二次抗体反応
一次抗体反応の洗浄作業終了後、バッグ内にブロッキングバッファー２０ｍＬを入れ、二次抗体２μｌを加えて３０分間揺らしながら反応させた。バッグ内の液を除いた後、余剰の二次抗体を除くため洗浄バッファー３０ｍＬをバッグ内に加え、１０分間揺らして液を捨てる洗浄作業を３回繰り返した。メンブレンをバッグから取り出して検出バッファー４０ｍＬに浸し、１０分揺らしながら反応させた。
【００８９】
（ｇ）Ｃｒｙ４６Ａｂ１の検出
検出バッファーから取り出したＰＶＤＦメンブレン全体にＣＤＰ−ＳＴＡＲ  ２００μｌをかけ、ハイブリ・バッグに入れて空気を抜いて密閉した。暗所でＸ線フィルム用カセッテにハイブリ・バッグに密封したＰＶＤＦメンブレンとの化学発光用フィルムＨｙｐｅｒｆｉｌｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を重ねて入れ、１０分感光させた。フィルムを取り出して現像液に８分間浸け揺らし現像した。水道水で現像液を洗い流し、定着液に５分間浸けた。フィルムの余白部分の色が抜けたことを確認し、水道水で洗浄した。
【００９０】
＜生物検定＞
（スクミリンゴガイを用いた検定）
１ウェルに１７ｍｌ入る６穴プレートにスクミリンゴガイ稚貝（殻長３ｍｍ）を１０匹ずつ入れイオン交換水５００μｌを加えた。
試料液をイオン交換水で希釈し、２倍希釈系列を作製した。これを１ウェルあたり５００μｌ加え、計１ｍｌにした。
ネガティブコントロールとして調製サンプルを入れないウェルを用意した。
各ウェルについて、４８時間後の致死数を数えた。
【００９１】
（チャコウラナメクジを用いた検定）
試料液をイオン交換水で希釈して２倍希釈系列を作製し、これをナメクジ用飼料に混合し、検体（ナメクジ）に与えた。
毒素液（固体懸濁液）の水分は飼料（粉末）に吸収されるので、用いた液量から毒素量を計算し、毒の強さは半数致死量（Ｌｅｔｈａｌ  Ｄｏｓｅ，５０％）（ＬＤ５０）で表記する。
ナメクジ用飼料はテトラフィン（金魚のエサ、Ｔｅｔｒａ社製）とビール酵母粉末（日本ガーリック株式会社製）を１：１（重量比）で混合し、乳鉢ですりつぶしたものを用いた。
また、ナメクジは貝殻をもたず、体長も一定しないので、アッセイに用いる検体は重さで大きさをそろえた。
アッセイ法の手順は、以下のとおりである。
１．プラスティックカップを必要数量用意する。
２．カップ（約３０ｍＬ）の底に水で濡らした濾紙を敷く。
３．キャベツを適当な大きさ（一辺３ｃｍ程度の四角形）にハサミで切り、濾紙の上に置く。
４．ナメクジ用飼料を極小スプーンで大盛り１杯キャベツの上に置き、真ん中にくぼみをつくる（希釈試料液を入れるため）。
５．くぼみに希釈液を５０μＬ入れる。５分くらい置いておくと、飼料にしみ込む。
６．ナメクジ（体重０．２ｇ）を各アッセイ容器に１匹ずつ入れる。
７．容器にパラフィルムでフタをし、暗がりに置く。
８．３日後（７２時間）まで一日ごとに観察し、致死数をカウントする。
【００９２】
（ヒメダカを用いた検定）
２４穴プレートの１ウェルに、採取後１日間エアレーションしておいたイオン交換水と希釈した希釈試料液を加え計１ｍＬになるよう調製した。ネガティブコントロールとしてイオン交換水のみを入れたウェルを用意した。
各ウェルに鮮化後７日目、体長４〜５ｍｍのヒメダカ１匹ずつを入れ、２４時間後に死魚数を測定した。
【００９３】
〔比較例１〕
ｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１／Ｂｔｋ  ＣＲＹ（−）Ｂの代わりに、ｃｒｙ４６Ａｂ１遺伝子の供与菌であるＢｔ．ＴＫ−Ｅ６を用いたこと以外は実施例１と同様にして、菌体の培養によるタンパク質の産生、タンパク質の回収及び試料液の作製、試料液の可溶化及び濃度測定並びにタンパク質の検出及び確認の各実験を行った。
【００９４】
〔比較例２〕
ｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１／Ｂｔｋ  ＣＲＹ（−）Ｂの代わりに、ｃｒｙ４６Ａｂ１を持たないｐＰｃｙｔ１Ａ／Ｂｔｋ  ＣＲＹ（−）Ｂを用いたこと以外は実施例１と同様にして、菌体の培養によるタンパク質の産生、タンパク質の回収及び試料液の作製、試料液の可溶化及び濃度測定並びにタンパク質の検出及び確認の各実験を行った。
【００９５】
〔結果及び考察〕
＜顕微鏡観察の結果及び考察＞
実施例１、比較例１，２における本培養前と、本培養２４時間後の培養液中の菌体の様子を位相差顕微鏡で観察した結果は、図３に示す通りであった。
【００９６】
比較例１，２における顕微鏡観察では、いずれの菌も、本培養前には胞子は無く、本培養２４時間後に菌体内に胞子の形成を確認できた。また、本培養における菌体数の増加はほとんど見られなかった。
【００９７】
実施例１において、ｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１／Ｂｔｋ  ＣＲＹ（−）Ｂの本培養２４時間後の菌体内には胞子の他に黒い固まり（インクルージョンボディ）が認められた。このインクルージョンボディは、比較例１（Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６）において、本培養２４時間後の菌体内で形成されたクリスタルより小さかった。この大きさの違いは形成するＣｒｙタンパク質の種類によるものと考えられる。すなわち、ｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１／Ｂｔｋ  ＣＲＹ（−）Ｂが産生するＣｒｙはＣｒｙ４６Ａｂ１のみであるのに対し、Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６ではＣｒｙ３２グループが多数発現する。この違いが大きさに現れたとみている。
【００９８】
一方、比較例２（ｐＰｃｙｔ１Ａ／Ｂｔｋ  ＣＲＹ（−）Ｂ）において、本培養２４時間後の菌体内には、胞子は形成されていたが、インクルージョンボディは観察されなかった。
従って、実施例１において見られたインクルージョンは、Ｃｒｙ４６Ａｂ１由来のものと考えられる。
【００９９】
＜タンパク質の検出及び確認の結果及び考察＞
（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
実施例１、比較例１，２について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の分画を行った結果は、図４に示すとおりである。
【０１００】
図４下部に示す通り、レーン１〜５は実施例１に関し、レーン１は本培養２４時間後の菌体を超音波破砕して得た不溶画分の全体、レーン２は可溶化処理後の上清、レーン３は可溶化処理後の上清を１００倍に希釈したもの、レーン４は可溶化処理後の上清を１０００倍に希釈したもの、レーン５は可溶化処理後の沈殿を示す。
レーン６−８は比較例１に関し、レーン６は本培養２４時間後の菌体を超音波破砕して得た不溶画分の全体、レーン７は可溶化処理後の上清、レーン８は可溶化処理後の沈殿を示す。
レーン９−１１は比較例２に関し、レーン９は本培養２４時間後の菌体を超音波破砕して得た不溶画分の全体、レーン１０は可溶化処理後の上清、レーン１１は可溶化処理後の沈殿を示す。
【０１０１】
実施例１（ｐＰｃｙｔ１Ａ−ｃｒｙ４６Ａｂ１／Ｂｔｋ  ＣＲＹ（−）Ｂ）における不溶画分の可溶化処理後上清サンプルでは、Ｃｒｙ４６Ａｂ１の分子量３３ｋＤａの位置にバンドが見られた（レーン２）。このサンプルの１００倍希釈液でも薄いバンドが確認できたが、１０００倍希釈液では確認できなかった（レーン３，４）。
【０１０２】
比較例１（Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６）における不溶画分可溶化処理後沈殿サンプル（レーン８）でも分子量３３ｋＤａの位置にバンドが見られるが、このバンドについては、後述の通り、ウエスタンブロットにおいてＣｒｙ４６Ａｂ１抗体が認識しなかったためＣｒｙ４６Ａｂ１ではないと推測される。
また、比較例２（ｐＰｃｙｔ１Ａ／Ｂｔｋ  ＣＲＹ（−）Ｂ）では、可溶化後上清及び、沈殿のいずれにも３３ｋＤａのタンパク質は見られなかった。
【０１０３】
実施例１で、不溶化画分の可溶化処理後上清サンプル及び１００倍希釈液（レーン２、３）の９０ｋＤａ付近に見られるバンドは、Ｃｒｙ４６Ａｂ１がオリゴマー化したものと考えられる。
比較例１で、２５ｋＤａ、３３ｋＤａ、４５ｋＤａ、９０ｋＤａの位置に見られるバンドは（レーン６−８）、胞子由来のタンパク質であると考えられる。また、レーン６，７の１５０ｋＤａ付近に見られるバンドはクリスタル由来の分子量１４４ｋＤａのＣｒｙ３２である。
【０１０４】
（２）ウエスタンブロットによるＣｒｙ４６Ａｂ１の検出
ウエスタンブロットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した３３ｋＤａのタンパク質がＣｒｙ４６Ａｂ１であるのかを確かめるために行った。
結果は図５に示すとおりである。なお、各レーンについては、図５下部に示しているとおりであり、図４と同様である。
【０１０５】
目的とするＣｒｙ４６Ａｂ１タンパク質は分子量３３ｋＤａで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと同様にウエスタンブロットでもバンドが確認できた。不溶タンパク質可溶化後上清・沈殿のサンプルでも同様にバンドを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥと同様に、全体液、可溶タンパク質可溶化後上清・沈殿で９０ｋＤａ付近のバンドが確認でき、また懸濁液と可溶化処理後沈殿では１００ｋＤａ以上の分子量で、バンドが確認された。これらのタンパク質はＣｒｙ４６Ａｂ１抗体が認識したため、Ｃｒｙ４６Ａｂ１がオリゴマー化したものではないかと考えられる。
比較例１（Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６）においては、上述の通り、不溶画分可溶化処理後沈殿サンプル（レーン８）において分子量３３ｋＤａの位置にバンドが見られたが、ウエスタンブロットでは同様のバンドが確認できなかったことから、Ｂｔ．ＴＫ−Ｅ６の不溶タンパク質にはＣｒｙ４６Ａｂ１が含まれていないと判断される。
【０１０６】
＜生物検定の結果＞
実施例１について、スクミリンゴガイに対する生物検定の結果を下表２に示す。
【０１０７】
【表２】
2018177656.tif 000003
【０１０８】
表２より、Ｃｒｙ４６Ａｂ１のスクミリンゴガイに対するＬＣ５０は０．２９４μｇ／ｍＬ（０．２２２−０．３８４）であった（カッコ内数値は９５％信頼限界）。
【０１０９】
実施例１について、チャコウラナメクジに対する生物検定の結果を下表３に示す。
【０１１０】
【表３】
2018177656.tif 000004
【０１１１】
表３より、Ｃｒｙ４６Ａｂ１を１．０３μｇ以上用いるとチャコウラナメクジに対する致死効果が現れ、体重０．２ｇに対してＬＤ５０は１．９４μｇであった。
【０１１２】
実施例１について、ヒメダカに対する生物検定の結果を下表４に示す。
【０１１３】
【表４】
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【０１１４】
表４より、ヒメダカの検定では、３８５ｎｇ／ｍＬ以下でも殺活性はみられなかった。従って、ヒメダカに対しては、食毒性の致死効果はないといえる。
【０１１５】
このように、本発明に係る殺軟体動物活性タンパク質は、軟体動物の駆除に有効であり、他方、メダカなどの魚類への影響（致死作用）は認められなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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