(57)【要約】【課題】条件付きＡｃｖｒ１突然変異遺伝子をもつ齧歯類を提供すること。【解決手段】誘導により、突然変異体エクソン表現型に変換する変異されたエクソンを含む条件付きＡｃｖｒ１対立遺伝子を含む遺伝子改変されたマウスであって、突然変異体エクソン表現型は、異所性骨形成を含む、遺伝子改変されたマウスが提供される。アンチセンス配向で部位特異的リコンビナーゼ認識部位によって隣接される突然変異体Ａｃｖｒ１エクソン５を含むマウスであって、マウスは、部位特異的リコンビナーゼ認識部位を認識する部位特異的リコンビナーゼをさらに含み、リコンビナーゼは、タモキシフェンへのマウスの曝露で誘導される、マウスが提供される。タモキシフェンへの曝露により、リコンビナーゼは、発現し、及びＲＲＳに隣接した突然変異体エクソン５に対して作用し、及びセンス配向で突然変異体エクソン５を置き、及び野生型エクソンを欠失させる。【選択図】  図１
2018108114.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１３日に出願されたＵＳ  ６１／７７８，８１４の非仮出願であり、全ての目的のためにその全体が参照により援用される。
【０００２】
コンピュータ読み取り可能な形態での配列表の参照
本出願は、２０１４年２月２１日に作製した、及び１ｋバイトのサイズのｔｘｔファイル４３９６１６ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ中の配列を含み、それは参照により援用される。
【０００３】
（技術分野）
Ａｃｖｒ１遺伝子の突然変異遺伝子を有する遺伝子改変された非ヒト動物；Ａｃｖｒ１遺伝子の条件突然変異体を含む核酸構築物；進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）の表現型的特徴を示す非ヒト動物。異所性骨形成を示す遺伝子改変されたマウス。子宮内でなく子宮外で発現される条件突然変異体ＡＣＲＶ１対立遺伝子を含む非ヒト動物。
【背景技術】
【０００４】
Ａｃｒｖ１は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のＩ型受容体である。ヒトＡｃｖｒ１遺伝子における、アミノ酸改変Ｒ２０６Ｈ突然変異を生じる突然変異を含む一定の突然変異は、疾患進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）と強く関連する（たとえば、米国特許出願公開第２００９／０２５３１３２号を参照されたい；また、Ｐｉｇｎｏｌｏ，  Ｒ．Ｊ．  （２０１１）  Ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ  Ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖａ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｓｐｅｃｔｓ，  Ｏｒｐｈａｎｅｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  ６：８０，１−６を参照されたい）。とりわけ、Ｒ２０６Ｈ突然変異は、活性化に対する受容体の感受性を増加させ、及びそれをサイレンシングに対してより抵抗性にすると考えられる。Ａｃｖｒ１におけるＲ２０６Ｈ突然変異を有するキメラマウスは、ＦＯＰ様表現型を発症する（たとえば、Ｃｈａｋｋａｌａｋａｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ａｎ  Ａｃｖｒ１  Ｒ２０６Ｈ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｈａｓ  ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖａ，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ
Ｒｅｓ．  ２７：１７４６−１７５６を参照されたい）。
【０００５】
Ａｃｖｒ１における一定の突然変異、たとえば結果としてＲ２０６Ｈ  Ａｃｖｒ１タンパク質突然変異になるものは、マウスにおける周産期致死である。突然変異が周産期致死である場合、非ヒト動物の生殖細胞系を介して突然変異を含むノックイン遺伝子を渡すことができない。たとえば、前述の研究は、示された突然変異をいくつかの細胞において有するが、生殖細胞系における突然変異を伝えることができないキメラマウスで仕事をすることを必要とした；したがって、生殖細胞系におけるＲ２０６Ｈ突然変異を含む安定な、及び有用なマウス系統は、確立されなかった。有用である子孫を作製するための、たとえばＡＣＲＶ１突然変異と関連する表現型、たとえばＦＯＰ、ＦＯＰ特徴または関連する障害の特徴または関連する障害を示す非ヒト動物を作製するための生殖細胞系における周産期または胚性致死であるＡＣＲＶ１突然変異を伝えることができる非ヒト動物に対する需要が残っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０２５３１３２号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐｉｇｎｏｌｏ，  Ｒ．Ｊ．、Ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ  Ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖａ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｓｐｅｃｔｓ，  Ｏｒｐｈａｎｅｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，（２０１１）６：８０，１〜６
【非特許文献２】Ｃｈａｋｋａｌａｋａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎ  Ａｃｖｒ１  Ｒ２０６Ｈ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｈａｓ  ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖａ，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓ．（２０１２）２７：１７４６〜１７５６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
遺伝子改変された非ヒト動物であって、Ａｃｖｒ１遺伝子の改変を含む核酸配列をこれらの生殖細胞系において含む、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。
【０００９】
遺伝子改変された非ヒト動物であって、Ａｃｖｒ１遺伝子の条件付き遺伝子改変を含む核酸配列をこれらの生殖細胞系において含み、遺伝子改変は、非ヒト動物を異所性骨形成への感受性を高くする、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。
【００１０】
遺伝子改変された非ヒト動物であって、条件突然変異体Ａｃｖｒ１エクソンを含む条件付き遺伝子改変を含む核酸配列をこれらの生殖細胞系に含み、条件突然変異体Ａｃｖｒ１エクソンの発現の誘導は、非ヒト動物に異所性骨形成に対する感染性を与える、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。一つの実施形態において、突然変異体Ａｃｖｒ１エクソンは、エクソン５である。特定の実施形態において、突然変異は、Ｒ２０２６Ｈ突然変異を伴うエクソン５を有するＡｃｖｒ１コードされたタンパク質を発現する。
【００１１】
突然変異体Ａｃｖｒ１対立遺伝子を条件つきで発現する非ヒト動物が提供される。種々の態様において、突然変異体Ａｃｖｒ１対立遺伝子は、対立遺伝子を発現する非ヒト動物に病理学的表現型を与える対立遺伝子である。種々の態様において、非ヒト動物は、部位特異的リコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ）と上流及び下流で隣接したＡｃｖｒ１対立遺伝子の突然変異体エクソンを含み、及び非ヒト動物は、ＳＲＲＳを認識するリコンビナーゼを含み、リコンビナーゼは、誘導性である。
【００１２】
（一つの実施形態において、ヘテロ接合体における；一つの実施形態において、ホモ接合体における）異所性骨化に感受性の高い非ヒト動物を生じさせる、促進する、または作製するＡｃｖｒ１対立遺伝子の改変を含む、非ヒト動物が提供される。
【００１３】
非ヒト動物であって、Ａｃｖｒ１対立遺伝子の条件突然変異を含み、突然変異体Ａｃｖｒ１対立遺伝子は、子宮において発現されず、及び周産期に発現されず、及び非ヒト動物は、条件付き方法で突然変異体Ａｃｖｒ１対立遺伝子を発現し、条件付き発現は、非ヒト動物にとって関心対象となる化合物の投与によって誘導される、非ヒト動物が提供される。
【００１４】
Ａｃｖｒ１遺伝子座であって、条件突然変異体エクソンを含む改変を含み、条件突然変異体エクソンは、実験的に誘導された誘導により発現される、Ａｃｖｒ１遺伝子座が提供される。
【００１５】
一つの態様において、遺伝子改変されたＡｃｖｒ１遺伝子座であって、ＳＲＲＳによって上流及び下流に隣接される突然変異体エクソンをアンチセンス配向で含む、遺伝子改変されたＡｃｖｒ１遺伝子座が提供される。一つの実施形態において、遺伝子座は、突然変異体エクソンに隣接するＳＲＲＳを認識する誘導性リコンビナーゼ遺伝子をさらに含む非ヒト動物において存在する。
【００１６】
一つの態様において、非ヒト動物であって、アンチセンス配向で突然変異体エクソンを含む改変されたＡｃｖｒ１遺伝子座を含み、突然変異体エクソンは、ＲＳＳＲを認識するリコンビナーゼによって作用されるときに、反転を指揮するように配向されているＲＳＳＲによって、上流及び下流に隣接される、非ヒト動物が提供される。一つの実施形態において、突然変異体エクソンは、反転によりＡｃｖｒ１遺伝子座の対応する野生型エクソンを置換する。一つの実施形態において、非ヒト動物は、誘導性リコンビナーゼ遺伝子をさらに含み、誘導性リコンビナーゼ遺伝子のリコンビナーゼは、ＲＳＳＲを認識する。特定の実施形態において、ＲＳＳＲは、ｌｏｘ部位またはその変異体であり、リコンビナーゼは、Ｃｒｅであり、及びリコンビナーゼは、タモキシフェンによって誘導可能である。特定の実施形態において、リコンビナーゼは、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２である。一つの実施形態において、非ヒト動物は、齧歯類、たとえばマウスまたはラットである。特定の実施形態において、齧歯類はラットであり、及び突然変異体Ａｃｖｒ１エクソンは、エクソン５である。
【００１７】
一つの態様において、遺伝子改変されたマウスであって、Ｒ２０６Ｈ突然変異をコードする突然変異体エクソン５（ｅ５）を含み、核酸構築物を含む突然変異体ｅ５は、アンチセンス配向で存在し、及び突然変異体ｅ５の反転を指揮するように配向されているＲＳＳＲによって、上流及び下流に隣接される；及びマウスは、センス配向にアンチセンス突然変異体ｅ５エクソンを反転させることができるリコンビナーゼをコードする誘導性リコンビナーゼ遺伝子を含む、遺伝子改変されたマウスが提供される。
【００１８】
一つの態様において、遺伝子改変されたマウスであって、マウスの生殖細胞系におけるＡｃｖｒ１遺伝子座にて核酸構築物を含み、核酸構築物は、Ａｃｖｒ１遺伝子の転写の方向に関して、センス配向で野生型ｅ５遺伝子及びアンチセンス配向で突然変異体ｅ５対立遺伝子を含む構築物を含み、野生型ｅ５対立遺伝子の上流は、アンチセンス突然変異体ｅ５の（Ａｃｖｒｉ遺伝子の転写方向に関して）すぐ下流に位置する第２のＲＳＳＲ（ＲＳＳＲ２）と適合性である第１のＲＳＳＲ（ＲＳＳＲ１）であり、ＲＳＳＲ１及びＲＳＳＲ２は、反転を指揮するように配向されている。構築物は、野生型ｅ５と突然変異体アンチセンスｅ５との間に配置される第３のＲＳＳＲ（ＲＳＳＲ３）をさらに含み、及び構築物は、ＲＳＳＲ３と適合性である第４のＲＳＳＲ（ＲＳＳＲ４）をさらに含み、及びそれは、（Ａｃｖｒ１遺伝子の配向の方向に関して）ＲＳＳＲ２の下流に位置し、ＲＳＳＲ３及びＲＳＳＲ４は、反転を指揮するように配向されている、遺伝子改変されたマウスが提供される。それぞれのＲＳＳＲ（１〜４）は、同じ誘導性リコンビナーゼによって認識される。
【００１９】
一つの実施形態において、誘導性リコンビナーゼは、マウスの生殖細胞系にある。
【００２０】
一つの実施形態において、ＲＳＳＲ部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識可能である。
【００２１】
一つの実施形態において、ＲＳＳＲ１及びＲＳＳＲ２は、ｌｏｘ２３７２部位であり；ＲＳＳＲ３及びＲＳＳＲ４は、ｌｏｘＰ部位であり、及び誘導性リコンビナーゼは、ＣｒｅＥＲＴ２である（たとえば、図１を参照されたい）。
【００２２】
一つの実施形態において、ＲＳＳＲ１及びＲＳＳＲ２は、ｌｏｘＰ部位であり；ＲＳＳＲ３及びＲＳＳＲ４は、ｌｏｘ２３７２部位であり、及び誘導性リコンビナーゼは、ＣｒｅＥＲＴ２である（たとえば、図１を参照されたい）。
【００２３】
一つの実施形態において、ＣｒｅＥＲＴ２は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座（たとえば、Ｇｔ（ＲＯＳＡ２６）ＳｏｒＣｒｅＥＲＴ２／＋に存在する。
【００２４】
一つの態様において、遺伝子型Ａｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ＣＯＩＮ／＋；Ｇｔ（ＲＯＳＡ２６）ＳｏｒＣｒｅＥＲｔ２／＋を含む遺伝子改変されたマウスが提供される。
【００２５】
一つの態様において、遺伝子改変された齧歯類であって、子宮及び周産期において正常なＡｃｖｒ１エクソン５を発現し、リコンビナーゼでの遺伝子改変された齧歯類の処理により、マウスは、エクソン５によってコードされる突然変異を含むＡｃｖｒ１コードされたタンパク質を発現する、遺伝子改変された齧歯類が提供される。一つの実施形態において、突然変異は、Ｒ２０６Ｈ突然変異をコードするエクソン５突然変異である。
【００２６】
一つの態様において、成体齧歯類であって、Ｒ２０６Ｈ改変によって特徴づけられる突然変異体Ａｃｖｒ１遺伝子産物を発現し、マウスの細胞の少なくとも９９％は、Ｒ２０６Ｈ改変をコードする突然変異体Ａｃｖｒ１遺伝子を含む、成体齧歯類が提供される。
【００２７】
一つの態様において、遺伝子改変された齧歯類であって、Ｒ２０６Ｈ改変によって特徴づけられる突然変異体Ａｃｖｒ１遺伝子産物を含む遺伝子改変され、突然変異体Ａｃｖｒ１遺伝子は、遺伝子改変された齧歯類の細胞の少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれ以上で存在する、齧歯類が提供される。
【００２８】
一つの態様において、遺伝子改変された齧歯類であって、齧歯類は、リコンビナーゼへの曝露により、Ｒ２０６Ｈ改変を含むＡｃｖｒ１遺伝子座によってコードされるタンパク質を発現するその生殖細胞系におけるＡｃｖｒ１遺伝子座を含む、遺伝子改変された齧歯類が提供される。
【００２９】
一つの態様において、齧歯類であって、Ｒ２０６Ｈ突然変異を含む突然変異体タンパク質を発現し、マウスは、非キメラである、齧歯類が提供される。一つの実施形態において、齧歯類のキメラ現象の程度は、１％を超えない。
【００３０】
一つの態様において、マウスであって、マウスの生殖細胞系における改変されたＡｃｖｒ１遺伝子座から突然変異体タンパク質を発現し、マウスの全てのＡｃｖｒ１発現する細胞は、Ｒ２０６Ｈ改変を含むＡｃｖｒ１タンパク質をコードする改変されたＡｃｖｒ１遺伝子を含む、マウスが提供される。一つの実施形態において、マウスの全ての生殖細胞は、Ｒ２０６Ｈ改変を伴うＡｃｖｒ１タンパク質をコードする条件付き遺伝子改変を含む改変されたＡｃｖｒ１遺伝子座を含む。
【００３１】
一つの態様において、マウスであって、操作されたＡｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ＣＯＩＮ対立遺伝子を含む遺伝子改変され、ヒトＡＣＶＲ１  エクソン（ｅｘａｎ）５（イソ型００３）の第１のコドンは、改変され、Ｅをコードし、タンパク質レベルにて、ヒト化エクソンは、野生型マウスＡｃｖｒ１エクソン５（イソ型００１）と同一である、マウスが提供される。
【００３２】
一つの態様において、マウスであって、Ａｃｖｒ１遺伝子の条件付き遺伝子改変を含み、改変は、ＡＣＶＲ１アミノ酸１９８〜２０６を含むＡＣＶＲ１αヘリックスにおけるアミノ酸を変化させ、及びＡｃｖｒ１遺伝子座によってコードされるタンパク質の構成的活性化を生じる、マウスが提供される。
【００３３】
一つの実施形態において、条件付き遺伝子改変は、アミノ酸１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６及びそれらの組み合わせから選択されるアミノ酸にある。特定の実施形態において、アミノ酸は２０６であり、及び改変は、ヒスチジンのためのコドンを形成するヌクレオチド変化である。
【００３４】
一つの実施形態において、マウスは、条件付き遺伝子改変のヘテロ接合性である。一つの実施形態において、マウスは、条件付き遺伝子改変のホモ接合性である。
【００３５】
種々の態様において、非ヒト動物は、哺乳動物である。一つの実施形態において、哺乳動物は、齧歯類である。一つの実施形態において、齧歯類は、マウス、ラット及びハムスターからなる群より選択される。特定の実施形態において、齧歯類は、マウスである。
【００３６】
種々の態様において、遺伝子改変された非ヒト動物は、野生型Ａｃｖｒ１エクソン５の欠失を指揮し、及びアンチセンス配向からセンス配向に突然変異体エクソン５を置くように配置されている一連のＲＳＳＲを含む。
【００３７】
種々の態様において、遺伝子改変された非ヒト動物は、Ａｃｖｒ１遺伝子座における核酸構築物に作用して野生型エクソンを除去し、及び突然変異体エクソンでそれを置換する誘導性リコンビナーゼをさらに含む。一つの実施形態において、誘導性リコンビナーゼは、ＣｒｅＥＲＴ２である。
【００３８】
種々の態様において、遺伝子改変された非ヒト動物は、突然変異体Ａｃｖｒ１対立遺伝子の発現により、代替（野生型）対立遺伝子を発現することができる。
【００３９】
種々の態様において、突然変異体Ａｃｖｒ１対立遺伝子を発現する遺伝子改変された非ヒト動物は、異所性骨化障害のためのモデルである。一つの実施形態において、異所性骨化障害は、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）である。
【００４０】
種々の態様において、遺伝子改変された非ヒト動物であって、突然変異体エクソン５を含む突然変異体Ａｃｖｒ１対立遺伝子をタモキシフェンへの曝露により条件つきで発現し（たとえば、Ｒ２０６Ｈ突然変異を含むタンパク質を発現する）、非ヒト動物は、Ａｃｖｒ１遺伝子内で突然変異体エクソン５に野生型エクソン５を変換するタモキシフェン誘導性リコンビナーゼを含む、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
遺伝子改変された非ヒト動物であって、その生殖細胞系においてＡｃｖｒ１遺伝子のエクソンを野生型表現型から異所性骨化表現型へ変異する条件突然変異を含む、前記遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２）
遺伝子改変された非ヒト動物であって、その生殖細胞系において野生型Ａｃｖｒ１対立遺伝子を突然変異体Ａｃｖｒ１対立遺伝子に変換する条件つきで発現される構築物を含み、発現されたときに異所性骨化表現型を与える、前記遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３）
遺伝子改変された非ヒト動物であって、Ａｃｖｒ１対立遺伝子内に構築物を含み、前記構築物は、アンチセンス配向で突然変異体Ａｃｖｒ１エクソン５を含み、前記突然変異体Ａｃｖｒ１エクソンは、部位特異的リコンビナーゼへの曝露により前記突然変異体Ａｃｖｒ１対立遺伝子の反転を指揮する部位特異的リコンビナーゼ認識部位によって、上流及び下流に隣接される、前記遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目４）
項目３の前記遺伝子改変された非ヒト動物であって、前記部位特異的リコンビナーゼの作用で前記野生型Ａｃｖｒ１エクソン５を欠失させるリコンビナーゼ認識部位をさらに含む、前記遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目５）
前記動物を異所性骨化への感受性を高くする突然変異体Ａｃｖｒ１エクソン５突然変異を含む成体非ヒト動物であって、前記突然変異体Ａｃｖｒ１エクソンは、前記動物の生殖細胞系に存在する、前記成体非ヒト動物。
（項目６）
項目１〜５の前記非ヒト動物であって、マウス、ラット及びハムスターからなる群より選択される齧歯類である、前記非ヒト動物。
（項目７）
アンチセンス配向でＲ２０６Ｈをコードする突然変異を含む突然変異体エクソン５を含む改変されたＡｃｖｒ１対立遺伝子を含む遺伝子改変されたマウスであって、前記突然変異体エクソン５は、アンチセンス配向であり、及びセンス配向に前記突然変異体エクソン５の反転を指揮するように配置されたリコンビナーゼ認識部位によって、上流及び下流に隣接され、前記リコンビナーゼ認識部位を認識するリコンビナーゼによる作用は、また前記改変されたＡｃｖｒ１対立遺伝子の野生型エクソン５を欠失させ、生じるマウスは、異所性骨化表現型を示す、前記遺伝子改変されたマウス。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】たとえば、ｌｏｘｐ及びｌｏｘ２３７２部位を使用してマウスＡｃｖｒ１エクソン５をヒトＲ２０６Ｈエクソンに変換するＡｃｖｒ１遺伝子座での条件付き対立遺伝子の設計を図示する。
【図２】Ａｃｖｒ１  Ｒ２０６Ｈ古典的ＦＯＰ突然変異体受容体遺伝子の条件付き対立遺伝子の設計を図示する。マウスエクソン５（イソ型００１におけるｅ５）は、ヒトエクソン５（ヒトＡＣＶＲ１イソ型００３における）で置換され；マウス突然変異体エクソンは、ＦＲＴ化選択カセット（ｈＵＢ−Ｎｅｏ）と共に、アンチセンス鎖に同時に導入され；ヒトｅ５は、東向きのｌｏｘＰ及びｌｏｘ２３７２と隣接し、及びもう一つのｌｏｘＰ及びＬｏｘ２３７２部位は、図１に模式的に詳述したように、Ｃｒｅへの曝露により、マウスｅ５（Ｒ２０６Ｈ）及びヒトｅ５の欠失の下流に置かれる。
【図３】結果として条件付き対立遺伝子で遺伝子改変されたマウスにおけるＦＯＰ様表現型になるＡｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ＣＯＩＮ  対立遺伝子の活性化を図示する。
【図４】タモキシフェン投与されたマウスにおいて誘導される条件付き対立遺伝子を含む遺伝子改変されたマウスにおける異所性骨形成を図示する；胸骨での異所性骨形成の実施例を白矢印で右パネルに示す。タモキシフェンの非存在下において（左パネル）、異所性骨形成は、検出されない。
【図５】タモキシフェン投与されたマウスにおいて誘導される条件付き対立遺伝子を含む遺伝子改変されたマウスにおける異所性骨形成のもう一つの例証を提供する；胸骨での異所性骨形成の実施例を白矢印で右パネルに示す。タモキシフェンの非存在下において（左パネル）、異所性骨形成は、検出されない。
【図６】タモキシフェン投与されたマウスにおいて誘導される条件付き対立遺伝子を含む遺伝子改変されたマウスにおける異所性骨形成のさらにもう一つの例証を提供する；胸骨での異所性骨形成の実施例を白矢印で右パネルに示す。タモキシフェンの非存在下において（左パネル）、異所性骨化は、検出されない。
【図７】対照マウス（左パネル、ＩＤ  ８４００９５）を図示する；及びタモキシフェンを投与したマウスにおいて誘導される条件付き対立遺伝子を含む遺伝子改変されたマウスにおける異所性骨形成（タモキシフェン＃２、ＩＤ：８４５２０２）；上部右パネルは、胸骨分節にて異所性骨形成を示す；底面右パネルは、股関節及び尾椎にて異所性骨形成を示す。
【図８】タモキシフェンを投与したマウスにおいて誘導される条件付き対立遺伝子を含む遺伝子改変されたマウスについて、胸骨分節（左パネル）及び尾椎（右パネル）での異所性骨形成を図示する（タモキシフェン＃３、ＩＤ：９１５５４６）。
【図９】タモキシフェンで誘導される条件付き対立遺伝子を含む遺伝子改変されたマウスにおける異所性骨形成の不存在を図示する（タモキシフェン＃４、ＩＤ：９０４０６７）。
【図１０】タモキシフェンの投与によって誘導される条件付き対立遺伝子を含む遺伝子改変されたマウスにおける胸骨分節（左パネル）での異所性骨形成を図示する（タモキシフェン＃５、ＩＤ：８４００９８）。
【図１１】タモキシフェンの投与によって誘導される条件付き対立遺伝子を含む遺伝子改変されたマウスにおける胸骨分節（左パネル）及び膝関節（右パネル）での異所性骨形成を図示する（タモキシフェン＃６、ＩＤ：８６３７１３）。
【図１２】Ａｃｖｒ１遺伝子における条件突然変異を含む遺伝子改変されたマウスの遺伝子型を同定する対立遺伝子喪失アッセイにおいて使用されるプライマー及びプローブを図示する；配列番号は、上から下に：フォワードプライマーについて上から下に配列番号：１、配列番号：２；逆プライマーについて上から下に配列番号：３、配列番号：４；プローブについて配列番号：５、配列番号：６である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）は、異所性骨形成の常染色体優性遺伝疾患である。発症したファミリーにおける連鎖研究は、ＦＯＰ遺伝子が染色体２ｑ２３〜２４にマップすることを明らかにし、ここではアクチビンＡ  Ｉ型受容体遺伝子（Ａｃｖｒ１）の活性化ドメインにおける６１７ＧからＡ突然変異（Ｒ２０６からＨ）が研究において調べた全ての罹患者において見いだされ（Ｓｈｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  Ａ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＢＭＰ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｖｒ１  ｃａｕｓｅｓ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ａｎｄ  ｓｐｏｒａｄｉｃ
ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖａ，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３８：５２５−５２７）、Ａｃｖｒ１（同上）の構成的活性化によって生じるＦＯＰと一致する。
【００４３】
遺伝子改変されたマウスであって、異所性骨形成によって特徴づけられる障害、たとえばＦＯＰを生じる改変を含むＡｃｖｒ１タンパク質を発現する、遺伝子改変されたマウスが提供される。改変Ａｃｖｒ１タンパク質を発現するマウスは、キメラでないマウス、たとえばゲノムが改変されたＡｃｖｒ１タンパク質を発現するマウスにおいて異所性骨形成を生じるＡｃｖｒ１タンパク質の（条件付き）改変を有するマウスを含む。
【００４４】
Ａｃｖｒ１タンパク質、たとえばＦＯＰ関連Ｒ２０６Ｈ突然変異における一定の突然変異は、突然変異と関連する胚性または周産期致死のためにマウスの生殖細胞系において作製するのは不可能ではなくとも困難である。野生型エクソンの条件付き反転及び除去及び突然変異体エクソンでの野生型エクソンの置換を提供するＣＯｎｄｉｔｉｏｎａｌ−ｂｙ−ＩＮｖｅｒｓｉｏｎ（ＣＯＩＮ）設計を含む、遺伝子改変されたマウスが提供される。このＣＯＩＮ設計は、欠失される野生型エクソンの次に置かれる反転した突然変異体エクソンをコードする核酸配列の配置による条件付き対立遺伝子を形成することができる。リコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）の選択を介して、反転した突然変異体エクソンは、野生型エクソンが欠失するのに対して、それをリーディングフレームに置くように反転される。このＣＯＩＮアプローチは、野生型及び突然変異体エクソンを囲む不適合性のＲＳＳ（たとえば、ｌｏｘ２３７２及びｌｏｘｐ）の配置に依存する。したがって、このＣＯＩＮアプローチは、ＣＯＩＮ対立遺伝子が選択されたリコンビナーゼ（群）によって作用されない限り、（周産期／胚性）致死突然変異の発現を可能にしない。このＣＯＩＮアプローチのもう一つの利点は、選択されたリコンビナーゼへの曝露による野生型エクソンの永続的な除去であり、及びしたがって、反転された繰り返しは、反転後のゲノムに残らない。これは、残りのリコンビナーゼ部位が不適合性である（たとえば、ｌｏｘ２３７２及びｌｏｘＰ）ために、それが再反転の可能性をなくすので有益である。この例において、また、野生型マウスエクソンのヒト化は、反転された反復配列を最小限にし、したがって、クローニング工程を容易にし、及びターゲティングの間と後の再構成の懸念を緩和する。
【００４５】
ＣＯＩＮ対立遺伝子を有するマウスがリコンビナーゼ含むマウスに対して繁殖される場合、（周産期／胚性）致死突然変異は、子宮における子孫において発現するだろうし、したがって、研究することができる対立遺伝子を発現する動物を作製する目標を失敗させる。したがって、ＣＯＩＮ対立遺伝子を有するマウスは、未制御のリコンビナーゼを含むマウスと繁殖させられない。その代わりに、マウスには、これがＴ２突然変異で改変されたか（Ｃｒｅ−ＥＲＴ２マウス）、またはＣｒｅ−ＥＲＴ２対立遺伝子を含むように改変されたＣｒｅ−ＥＲタンパク質を含むマウスと繁殖させる。Ｃｒｅ−ＥＲＴ２タンパク質は、Ｃｒｅタンパク質を不活性にするＴ２突然変異を含むエストロゲン受容体配列で改変されたＣｒｅタンパク質である（Ｉｎｄｒａ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂａｓａｌ  ｌａｙｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ：  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔａｍｏｘｉｆｅｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｃｒｅ−ＥＲＴ  ａｎｄ
Ｃｒｅ−ＥＲＴ２  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２７（２２）：４３２４−４３２７；  Ｆｅｉｌ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｒｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  Ｍｕｔａｔｅｄ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２３７：７５２−７５７；  米国特許第７，１１２，７１５号を参照されたい）。したがって、本明細書において記述したようにＣｒｅ応答性のＲＳＳと共に構築され、及びＣｒｅ−ＥＲＴ２対立遺伝子を含む条件付き対立遺伝子を含むマウスは、マウスがＣｒｅ活性を誘導するためにタモキシフェンに曝露されない限り、及びそれまで、野生型対立遺伝子を発現するだろう。このように、これらの生殖細胞系における突然変異体Ａｃｖｒ１対立遺伝子を含むが、マウスがタモキシフェンに曝露されない限り、及びそれまで、突然変異体Ａｃｖｒ１タンパク質を発現しないマウスが作製される。タモキシフェンへの曝露の後、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２融合タンパク質は、活性化され、及び条件付き対立遺伝子は、突然変異体対立遺伝子に変換し、及び種々の実施形態において、突然変異体対立遺伝子への変換は、不可逆的であり、野生型対立遺伝子の欠失を伴う。この様式で、そうでなければ致死Ａｃｖｒ１突然変異を含むマウス系統は、本質的に無限に維持することができ、所望のときはいつでも所望の遺伝的病変を生じ、及び表現型を伴う。種々の実施形態において、Ａｃｖｒ１  ＣＯＩＮ対立遺伝子を含む遺伝子改変されたマウスは、ＣＯＩＮ対立遺伝子を含むようにマウスＥＳ細胞を改変すること、及びタモキシフェン誘導性Ｃｒｅ−ＥＲＴまたはＣｒｅ−ＥＲＴ２をコードする遺伝子を含むように同じＥＳ細胞を改変すること、及びＣＯＩＮ対立遺伝子及び改変されたＣｒｅ遺伝子を含むマウスを作製するドナー細胞としてＥＳ細胞を使用することによって作製される。本明細書において引用した参照の全ては、参照により本明細書に援用される。
【００４６】
遺伝性生殖細胞系である条件付きＡＣＶＲ１対立遺伝子の操作
進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）のマウスモデルを操作するために、ヒトＡｃｖｒ１のＲ２０６Ｈ「古典的ＦＯＰ」突然変異（Ｓｈｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６））を対応するマウス遺伝子、Ａｃｖｒ１内に操作した。この突然変異は、マウスにおいて非条件つきですでにモデル化されているが、生じるキメラマウス（ターゲットされたＥＳ細胞の胚盤胞マイクロインジェクションから生じる）は、おそらく胚性または周産期致死のために、生殖細胞系を介して突然変異を伝えることができなかった（Ｃｈａｋｋａｌａｋａｌ，  Ｓ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ａｎ  Ａｃｖｒ１  Ｒ２０６Ｈ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｈａｄ  ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖａ，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓ．  ２７：１７４６−１７５６）。この表現型についての知識の前に、及び発生の間のＡｃｖｒ１の重大な役割を明らかにするＡｃｖｒ１ホモ接合性欠損のマウスの表現型に基づいて（Ｍｉｓｈｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖｉｎ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ−２  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ２１２：３１４−３２６）、ＦｌＥｘ（Ｓｃｈｎｕｔｇｅｎ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ａ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ
ｌｅｖｅｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２１：５６２−５６５）及びＣＯＩＮ（米国特許第７，２０５，１４８号）方法論に対するバリエーションを利用して、マウスにおいて条件付き様式でＡｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］突然変異を操作することを決定した。
【００４７】
ＦｌＥｘは、ＦｌＥｘ配列と呼ばれる−一対の突然変異体Ｌｏｘ部位を用い、これは、同じリコンビナーゼ‐Ｃｒｅ‐によって認識されるが、互いに応答しないために、及びＡ−Ｂ／［Ａ−Ｂ］配置において並べられ、「［Ａ−Ｂ］」は、アレイに隣接したＤＮＡ配列の反転を可能にするように、「Ａ−Ｂ」に関して逆の鎖にある。その公開された実施形態において、ＦｌＥｘは、部位ＬｏｘＰ及びＬｏｘ５１１を利用した。しかし、Ｃｒｅの存在下において、低レベルの改変がＬｏｘＰとＬｏｘ５１１との間で起こることは、あまり知られていない。したがって、Ｌｏｘ部位変異体の異なる組み合わせを試験して、及びこれらの２つの部位は、任意の交差反応性を示さなかったので、ＬｏｘＰ−Ｌｏｘ２３７２の組み合わせを本明細書において記述した条件付き対立遺伝子のために選択した。ＦｌＥｘのさらなる特徴は、それぞれの配列内に‐すなわち、それぞれの配列のＬｏｘＰとＬｏｘ２３７２部位の間に‐含まれる配列が、Ｃｒｅによる作用によって欠失するだろうことである。本発明の対立遺伝子（Ａｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ＣＯＩＮ対立遺伝子）の操作では、ＦｌＥｘのこれらの２つの特性を考慮にいれる。条件付き対立遺伝子の一つの実施形態を図２に図示す。
【００４８】
マウスＡｃｖｒ１は、さまざまなスプライスバリアント（たとえば、２０１、２０２、００１、００３、００４）を示す。ＦＯＰにおいて変異されるエクソン５は、Ａｃｖｒ１の全てのタンパク質をコードするスプライスバリアントによって共有される。一つの実施形態において、遺伝子改変されたマウスは、２０１、２０２、００１、００３及び００４からなる群より選択されるイソ型のエクソン５の改変を含む。
【００４９】
Ａｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ＣＯＩＮ対立遺伝子をアンチセンス鎖におけるマウスＡｃｖｒ１のＲ２０６をコードするエクソン（ＥＮＳＭＵＳＥ００００１０２１３０１）の突然変異体バージョンを置くことによって操作した。その結果、それはＡｃｖｒ１の転写物に組み込まれない。エクソン５によってコードされる配列は、Ａｃｖｒ１機能に必要とされるので、これは、また野生型エクソンの５配列をコードするエクソンが設計に組み込まれることを必要とした（エクソン５は、Ａｃｖｒ１の全てのタンパク質をコードするスプライスバリアントによって共有される）。さらにまた、エクソンが補助的なイントロン配列を伴わずにそれ自体として認識されないので、エクソンの上流及び下流の両方を、突然変異体及び野生型Ｒ２０６をコードするエクソンの両方に組み込まれなければならなかった。しかし、そうすると、大きな反転された反復を生じさせるだろうし、及びこのようなＤＮＡ構造は、ターゲティングベクターを構築するために必要とされる遺伝子操作工程の間、並びにターゲティング後の両方において、インビボで、改変を本質的に起こしやすくする（Ｈｏｌｋｅｒｓ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｎｏｎｓｐａｃｅｄ  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ＤＮＡ  ｒｅｐｅａｔｓ  ａｒｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４０：１９８４−１９９９）。さらにまた、Ｒ２０６をコードするエクソンの野生型マウス配列及びそれと関連する上流及び下流のイントロン配列が無傷で保持され、及び突然変異体エクソンに先行する場合、この野生型領域は、相同アームとして作用することができ、及びマウスＥＳ細胞におけるターゲティングの間に利用することができ、これによりターゲットされた対立遺伝子からの変異されたエクソンの排除を生じる。したがって、全てのこれらの懸念に対処するために、Ａｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ＣＯＩＮ対立遺伝子を以下のような様式で設計した：
【００５０】
（ａ）大きな反転された反復を回避する。これを達成するために、関連した上流及び下流のイントロン配列と同様にＲ２０６をコードするエクソン（ＥＮＳＭＵＳＥ００００１０２１３０１）をヒトＡＣＶＲ１から対応する領域と置換した。
【００５１】
（ｂ）Ｒ２０６をコードするエクソン（ＥＮＳＭＵＳＥ００００１０２１３０１）の野生型マウス配列をタンパク質レベルにて保存する。エクソンＥＮＳＭＵＳＥ００００１０２１３０１及びＥＮＳＥ００００１００９６１８によってそれぞれコードされるマウス及びヒトタンパク質配列が１つのアミノ酸だけ異なることを考慮して、ヒトＥＮＳＥ００００１００９６１８エクソン配列をエクソンＥＮＳＭＵＳＥ００００１０２１３０１のマウスタンパク質配列と一致するように変化させた。
【００５２】
（ｃ）導入されたヒト配列は、Ｃｒｅとの作用によりその全体が除去される。したがって、Ａｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］突然変異体遺伝子が転写される‐「条件付き」状態において、ヒト配列は残らず、及びそれ故、任意の生じる表現型は、外来配列の存在に起因することができない。
【００５３】
より具体的には、ｍｍｕＡｃｖｒ１のヌクレオチド５８４７４０４６〜５８４７４３６８によって閉ざされる領域（すなわち、マウス染色体２のヌクレオチド５８４７４０４６〜５８４７４３６８）は、ｈｓａＡＣＶＲ１エクソンＥＮＳＥ００００１００９６１８を含む導入された配列が、生じる改変されたＡｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ＣＯＩＮ遺伝子座の一部として転写されるような様式で、ｈｓａＡＣＶＲ１のヌクレオチド１５８６３０４８〜１５８６３０８０３（すなわち、ヒト染色体２のヌクレオチド１５８６３０４８〜１５８６３０８０３）と置換される。加えて、ヒトエクソンＥＮＳＥ００００１００９６１８の最初のアミノ酸のコード配列は、タンパク質レベルにてマウスエクソンＥＮＳＭＵＳＥ００００１０２１３０１によってコードされるものと正確に同じタンパク質配列に対応するように、アスパラギン酸（Ｄ）からグルタミン酸（Ｅ）に置換された。（この導入されたヒト配列は、以下ｈｓａ＿ｅ５＋として呼ばれる。）したがって、ＣＯＩＮエレメント（変異されたエクソンＥＮＳＭＵＳＥ００００１０２１３０１及び関連する上流及び下流のイントロン配列‐以下を参照されたい）の反転の前に、生じる遺伝子座、Ａｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ＣＯＩＮは、野生型として機能するはずである。
【００５４】
Ｒ２０６Ｈ突然変異は、ＣＧＣ（アルギニンをコードする）からＣＡＣ（ヒスチジンをコードする）までヌクレオチド５８４７４１９〜５８４７４２００によって定義されるコドンを変化させることによって、対応する位置においてエクソンＥＮＳＭＵＳＥ００００１０２１３０１を変異することによってモデル化した。生じる突然変異体エクソンを、隣接するイントロン配列上流及び下流に沿って、３’からｈｓａ＿ｅ５＋に、及びｍｍｕＡｃｖｒ１のアンチセンス鎖に配置し、また小さい欠失を作製し、及びＬＯＡプローブを収容するためにｍｍｕＡｃｖｒ１のヌクレオチド５８４７３７７５〜５８４７３８７９を置換した（Ｇｏｍｅｚ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｑ−ＰＣＲ  ａｓ  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ
ｕｓｉｎｇ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｗｈｏｌｅ  ＢＡＣ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３６：ｅ１１７；  Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２１：６５２−６５９）。（この導入された変異されたマウス配列は、以下ｍｍｕ＿ｅ５Ｒ２０６Ｈ＋として呼ばれる。）
【００５５】
ｍｍｕ＿ｅ５Ｒ２０６Ｈ＋のＣｒｅ依存的反転及びｈｓａ＿ｅ５＋の同時の欠失を可能にするために、ＦｌＥｘ様Ｌｏｘ配列の組み合わせを以下のように使用した：
【００５６】
（ａ）ｈｓａ＿ｅ５＋は、ＬｏｘＰ部位の後にあり、及びその後にＬｏｘ２３７２部位が続いた。この点において、ｈｓａ＿ｅ５＋は、５’  ＬｏｘＰ−Ｌｏｘ２３７２  ＦｌＥｘ様配列と共に含まれる。
【００５７】
（ｂ）ｍｍｕ＿ｅ５Ｒ２０６Ｈ＋は、その後に３’  ＬｏｘＰ−Ｌｏｘ２３７２  ＦｌＥｘ様配列が続くが、この配列は、それが５’  ＬｏｘＰ−Ｌｏｘ２３７２  ＦｌＥｘ様配列に鏡像配置にあるように、操作される。これにより、Ｃｒｅによるセンス鎖内のｍｍｕ＿ｅ５Ｒ２０６Ｈ＋の永続的な反転が可能になる。
【００５８】
生じる対立遺伝子、Ａｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ＣＯＩＮがＣｒｅに曝露されたときに、ｈｓａ＿ｅ５＋が欠失し、及びｍｍｕ＿ｅ５Ｒ２０６Ｈ＋がセンス鎖に反転するだろう。結果として、Ａｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］がＡｃｖｒ１の代わりに発現されるだろう。
【００５９】
遺伝子改変されたマウスは、対立遺伝子喪失アッセイを用いる遺伝子型であった（たとえば、上記Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）を参照されたい）。プライマー及びプローブを図１２（表５）に示した。
【００６０】
Ａｃｖｒ１Ｒ２０６ＨＣＯＩＮ／＋マウスの表現型
Ａｃｖｒ１Ｒ２０６ＨＣＯＩＮ／＋マウスは、表現型的に正常であるが、Ｒ２０６Ｈ条件突然変異の活性化の後、ＦＯＰを発症する。
【００６１】
非条件付き、単純なノックインＡｃｖｒ１Ｒ２０６Ｈキメラマウスでの公開された結果（Ｃｈａｋｋａｌａｋａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）並びにＦＯＰが常染色体優性遺伝疾患であるという事実に基づいて（総説については、（Ｐｉｇｎｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）を参照されたい）、以下であると推測した：
【００６２】
（ａ）非条件付きＡｃｖｒ１Ｒ２０６Ｈ対立遺伝子（Ｃｈａｋｋａｌａｋａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）とは異なり、Ａｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ＣＯＩＮがターゲットされたＥＳ細胞は、ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）、すなわちターゲットされたＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウスを生じるだろう（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２５：９１−９９）。
【００６３】
（ｂ）非条件付きＡｃｖｒ１Ｒ２０６Ｈ／＋キメラマウス（Ｃｈａｋｋａｌａｋａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）とは異なり、Ｆ０  Ａｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ＣＯＩＮ／＋マウスは、表現型的に正常だろうし、及びＡｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ＣＯＩＮ対立遺伝子を次世代に伝えるだろう。
【００６４】
（ｃ）センス鎖へのＲ２０６Ｈ突然変異を有する突然変異体エクソンの反転‐Ｃｒｅリコンビナーゼによって媒介される作用−により、Ａｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ＩＮＶ／＋遺伝子型に変換された細胞は、突然変異体Ａｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］対立遺伝子、並びに野生型対立遺伝子を発現してＦＯＰ患者における状況を反映するだろう。同様に、生じるＡｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ＩＮＶ／＋マウスは、ＦＯＰ様症状を次第に発症するはずである。
【００６５】
これらの推測の全てが生まれた。たとえば、ＥＳ細胞クローン１６４９Ｃ−Ａ２は、そのクローンを使用して発生した１９匹のマウスから１６匹のＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を生じた（表１）。
【００６６】
【表１】
2018108114.tif 000003
【００６７】
さらにまた、これらのマウスは、識別可能な表現型を有せず、及び繁殖し、及びＡｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ＣＯＩＮ／＋  Ｆ１世代マウスの父親になることができた（表２）。
【表２−１】
2018108114.tif 000004
【表２−２】
2018108114.tif 000005
【００６８】
表現型の観点からは、Ａｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ＣＯＩＮ／＋マウスは、正常に見え、及び識別可能な表現型を示さない。同じことが、Ａｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ＣＯＩＮ／＋；Ｇｔ（ＲＯＳＡ２６）ＳｏｒＣｒｅＥＲｔ２／＋マウスに当てはまり、それはまた、Ａｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ＣＯＩＮ対立遺伝子に加えて、Ｇｔ（ＲＯＳＡ２６）Ｓｏｒ遺伝子座にノックインされたＣｒｅＥＲＴ２導入遺伝子を有する。これは、活性化のためにタモキシフェンに依存的であるもの、Ｃｒｅの不活性バージョンの広範な発現を可能にする（Ｆｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２３７：７５２−７５７）。これにより、特定の時点でＣｒｅの活性化が可能になり、及びそれ故、従来のＡｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ノックインで経験される胚性致死を回避することを可能にするだけでなく、対応するマウスにおけるＡｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］発現の活性化の時を選択する権限を研究者に与える。
【００６９】
Ａｃｖｒ１［Ｒ２０６Ｈ］ＣＯＩＮ／＋；Ｇｔ（ＲＯＳＡ２６）ＳｏｒＣｒｅＥＲｔ２／＋マウスがタモキシフェンへの曝露の後にＦＯＰを発症するかどうか調査するために、我々は小さいコホートを作製して、及びおよそ１歳にて始めて、タモキシフェンでそれを処理した（表３）；この年齢までに、マウスがこれらの発症を完了したことは、顕著であり、及びしたがって、モデリングまたは発症関連機構は、効果を現さず、及びしたがって、病理学的プロセスに寄与することができない。タモキシフェンの送達は、トウモロコシ油中の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を使用して、腹膜への注射によった。注射は、８日間毎日行った。３匹のマウス（表３のマウス１、２及び３）において、筋肉の小さい断片を切除して傷害を誘導した。
【００７０】
【表３】
2018108114.tif 000006
【００７１】
タモキシフェン処理したマウスの１匹を除いて全てが異所性骨化を発症し、ＦＯＰにおいて観察されたことを反映した（表４）。疾患プロセスに寄与するかもしれない特異的細胞型（群）は、ＣｒｅＥＲｔ２の発現が広範である（それがＧｔ（ＲＯＳＡ２６）Ｓｏｒ遺伝子座から発現されるという事実によって与えられる特性）という事実のためにこの実験において決定されなかったが、この研究の重要な態様の１つは、これがＦＯＰの発達上の態様を除去し（これらは、ＦＯＰ患者が経験する生活の質における破壊的な喪失に寄与しないので、ＦＯＰの病態にとって最も重要なものではない）、及びＦＯＰ病態の主要な出産後の特徴である異所性骨形成が発達過程から独立していることを示すことである。
【００７２】
【表４】
2018108114.tif 000007
【００７３】
異所性骨化を、タモキシフェンに曝露された本明細書において記述したように遺伝子改変されたマウスの画像において示してある（異所性骨化を示す）。本明細書において記述したように遺伝子改変されたが、タモキシフェンに曝露されないマウスは、異所性骨化を示さない。たとえば、図３、図４、図５、図６、図７、図８、図１０及び図１１を参照されたい。異所性骨化は、さまざまな体の範囲に示される。図９に示したように、１匹のマウスは、明白な異所性骨形成を示さなかった。
【図１】
2018108114.tif 000008
【図２】
2018108114.tif 000009
【図３】
2018108114.tif 000010
【図４】
2018108114.tif 000011
【図５】
2018108114.tif 000012
【図６】
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【図７】
2018108114.tif 000014
【図８】
2018108114.tif 000015
【図９】
2018108114.tif 000016
【図１０】
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【図１１】
2018108114.tif 000018
【図１２】
2018108114.tif 000019
【配列表】
2018108114000001.app
【外国語明細書】
2018108114000001.pdf