(57)【要約】      （修正有）【課題】ヌクレアーゼ安定性、細胞透過性、生物学的利用能または毒性などの１つまたは複数の強化された特性により特徴づけられるオリゴマー化合物の提供。【解決手段】式（I)で示される、新規な三環ヌクレオシド及びこれらから調製したオリゴマー化合物（Ｂｘは複素環塩基部分）。好ましくは、Ｂｘがウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンまたはグアニンである、化合物。2018109015.tif 000017【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ：
2018109015.tif 000014
（上式中、
−  Ｂｘは複素環塩基部分であり；
−  Ｔ１およびＴ２の一方はヒドロキシル（−ＯＨ）または保護ヒドロキシルであり、Ｔ１およびＴ２の他方はホスフェートまたは反応性リン基であり；
−  ｑ１およびｑ２はそれぞれ独立に、Ｈ、ＦまたはＣｌであり、
−  ｑ３、ｑ４およびｑ５の少なくとも１つは独立に、一般式−Ａ１−Ｘｈ−Ａ２−Ｙｎにより記載される基であり、ここで、
−  Ａ１はＣｋ−アルキル、Ｃｋ−アルケニルまたはＣｋ−アルキニルであり、ｋは０〜２０の範囲から選択される整数であり、
−  Ｘｈは−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＲ、−ＳＲまたは−ＮＲ２であり、各Ｒは独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アセチルおよび２−ヒドロキシエチルから選択され、ｈは０または１であり、
−  Ａ２はＣｉ−アルキル、Ｃｉ−アルケニルまたはＣｉ−アルキニルであり、ｉは０〜２０の範囲から選択される整数であり、
−  Ｙは−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、＝Ｏ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋、ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＳＣＮ、−ＣＯＲ、−ＣＯ２Ｒ、ＣＯＮＲ２、−Ｒから選択される、Ａ１および／またはＡ２上の任意の炭素原子に結合した置換基群であり、各Ｒは独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アセチルおよび２−ヒドロキシエチルから選択され、ｎは０、１、２、３、４、５または６であり、
−  ｋ＋ｉは少なくとも１に等しく、
−  ｑ３、ｑ４およびｑ５の残りのものは独立に、Ｈ、ＦまたはＣｌであり、
−  ｚ１およびｚ２の一方はＨであり、ｚ１およびｚ２の他方はＨ、−ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＣＨ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＦ３、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２、ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２またはＯＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２である）
により記載される三環ヌクレオシド。
【請求項２】
Ｂｘがウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンまたはグアニンである、請求項１に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項３】
Ｔ１がヒドロキシルまたは保護ヒドロキシルであり、Ｔ２がＨ−ホスホネートまたはホスホロアミダイトから選択される反応性リン基である、請求項１または２に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項４】
Ｔ１が４，４’−ジメトキシトリチルであり、Ｔ２がジイソプロピルシアノエトキシホスホロアミダイトまたは制御細孔ガラス面である、請求項１から３のいずれか一項に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項５】
ｑ３が一般式−Ａ１Ｘｈ−Ａ２−Ｙｎにより記載され、ｑ４およびｑ５が互いに独立に、Ｈ、ＦまたはＣｌである、請求項１から４のいずれか一項に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項６】
ｋが３〜１６の整数であり、ｈが０であり、ｉが０であり、ｎが１、２または３である、請求項１から５のいずれか一項に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項７】
ｋが１であり、ｈが１であり、Ｘが−Ｏ−、ＣＯＯ−、ＣＯＮＨ−またはＣＯＮＲ−であり、ｉが３〜１６の整数であり、ｎが１、２または３である、請求項１から５のいずれか一項に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項８】
ｎが１であり、ＹがＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＮＲ３＋およびＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、Ｒが上に定義される意味を有する、請求項６または７に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項９】
Ｙがω位にある、請求項８に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項１０】
ｉ＋ｋの和が３〜１６、具体的には３〜１２、より具体的には５〜１０の整数である、請求項１から９のいずれか一項に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項１１】
Ａ１がＣＨ２であり、ｈが１であり、Ｘｈが−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、Ａ２がＣ２〜Ｃ１６アルキルであり、ＹｎがＮＨ２であり、ｎが０または１である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項１２】
Ａ１がＣＨ２である、請求項１に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項１３】
ｋが０である、請求項１に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項１４】
2018109015.tif 000015
（式中、Ｂｘはウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンおよびグアニンから選択される）からなる群から選択される、三環ヌクレオシド。
【請求項１５】
少なくとも１種の請求項１から０のいずれか一項に記載の三環ヌクレオシドを含むオリゴマー化合物であって、８〜４０個のモノマーサブユニットを含むオリゴマー化合物。
【請求項１６】
各Ｂｘが独立に、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンまたはグアニンである、請求項１５に記載のオリゴマー化合物。
【請求項１７】
各ヌクレオシド間結合基が独立に、ホスホジエステルヌクレオシド間結合基またはホスホロチオエートヌクレオシド間結合基である、請求項１５または１６に記載のオリゴマー化合物。
【請求項１８】
式ＩＩを有する少なくとも２個の隣接した三環ヌクレオシドを有する第１の領域を含む、請求項１５から１７のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。
【請求項１９】
少なくとも２個の隣接したモノマーサブユニットを有する第２の領域を含む、請求項１８に記載のオリゴマー化合物であって、前記第２の領域中の各モノマーサブユニットが前記第１の領域の式ＩＩの前記三環ヌクレオシドとは異なる修飾ヌクレオシドであるオリゴマー化合物。
【請求項２０】
前記第１の領域と第２の領域との間に位置する第３の領域をさらに含む、請求項１９に記載のオリゴマー化合物であって、前記第３の領域中の各モノマーサブユニットが独立に、前記第１の領域の式ＩＩの各三環ヌクレオシドおよび前記第２の領域の各モノマーサブユニットとは異なるヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドである、オリゴマー化合物。
【請求項２１】
１〜５個の隣接したモノマーサブユニットの外部領域が両側に隣接した６〜１４個の隣接したモノマーサブユニットの内部領域を有する間隙があるオリゴマー化合物を含む、請求項１５から２０のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物であって、各外部領域の各モノマーサブユニットが式ＩＩの三環ヌクレオシドであり、前記内部領域の各モノマーサブユニットが独立に、ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドであるオリゴマー化合物。
【請求項２２】
2018109015.tif 000016
（式中、Ｔ３およびＴ４は上で概説される意味を有する）から選択される１個または数個のヌクレオチドブロックを含む、請求項１５から２１のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。
【請求項２３】
オリゴヌクレオチドの固相合成法への請求項１から０のいずれか一項に記載の三環ヌクレオシドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般式Ｉにより記載される三環アルキル置換ヌクレオシドおよびこれらから調製したオリゴマー化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンチセンス技術は、特異的遺伝子産物の発現を低下させるための有効な手段であるので、治療、診断および研究用途に有用となり得る。一般的に、アンチセンス技術の背後にある原理は、アンチセンス化合物（オリゴヌクレオチドまたはその類似体の配列）が標的核酸にハイブリダイズして、転写および／または翻訳などの遺伝子発現活動または機能を調節するというものである。特異的機構にもかかわらず、その配列特異性は、アンチセンス化合物を、標的検証および遺伝子機能化のための手段ならびに疾患の病因に関与する遺伝子の発現を選択的に調節する治療法として魅力的にする。
【０００３】
ヌクレアーゼ耐性、薬物動態または標的ＲＮＡに対する親和性などの特性を強化するために、化学修飾ヌクレオシドがアンチセンス化合物に日常的に組み込まれている。
【０００４】
化学修飾は、アンチセンス化合物の効力および有効性を改善し、経口送達もしくは皮下投与の可能性を改善、または副作用の可能性を低減してきた。アンチセンス化合物の効力を増加させる化学修飾により、毒性の可能性を低減する低用量の投与が可能になる。分解耐性を増加させる修飾により、体からのクリアランスが遅くなり、低頻度の投与が可能になる。
【０００５】
三環ヌクレオシドの合成（Ｓｔｅｆｆｅｎｓら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、１９９７、８０、２４２６〜２４３９）およびこれらのオリゴマー化合物への組み込みが文献（Ｓｔｅｆｆｅｎｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９７、１１９、１１５４８〜１１５４９；Ｓｔｅｆｆｅｎｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９９、１２１、３２４９〜３２５５；Ｒｅｎｎｅｂｅｒｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００２、１２４、５９９３〜６００２；Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．、２００６、１２、８０１４〜８０２３）で報告されている。完全修飾三環オリゴヌクレオチドは、未修飾オリゴデオキシヌクレオチドと比べてウシ胎児血清中で核酸分解に対してより安定であり、細胞アッセイにおいて、変異β−グロビンのスプライシング修復（Ｒｅｎｎｅｂｅｒｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００２、３０、２７５１〜２７５７）；またはシクロフィリンＡのエキソンスキッピング（Ｉｔｔｉｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４、３２、３４６〜３５３）などの生物学的アンチセンス効果をもたらすことが示された。
【発明の概要】
【０００６】
式Ｉを有する三環ヌクレオシドおよびこれらから調製したオリゴマー化合物が本明細書で提供される。より具体的には、式Ｉを有する三環ヌクレオシドが、オリゴマー化合物の１つまたは複数の位置での組み込みに有用である。特定の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴマー化合物は、ヌクレアーゼ安定性、細胞透過性、生物学的利用能または毒性などの１つまたは複数の強化された特性により特徴づけられる。特定の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴマー化合物は、標的ＲＮＡの一部にハイブリダイズし、標的ＲＮＡの正常な機能の喪失をもたらす。本明細書で提供されるオリゴマー化合物はまた、診断用途においてプライマーおよびプローブとしても有用である。特定の実施形態では、本明細書で提供される三環ヌクレオシドを含むオリゴマーは、未修飾ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーと比べて、有意に改善したリポソームなどのトランスフェクション試薬に頼らない地下室取り込みを示す。
【０００７】
特定の実施形態では、本明細書で提供される三環ヌクレオシドを含むオリゴマーは、未修飾ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーと比べて、有意に増加した熱安定性（二重鎖融解点）を示す。
【０００８】
変数を本明細書においてさらに詳細に個々に定義する。本明細書で提供される式Ｉを有する三環ヌクレオシドおよびオリゴマー化合物は、開示される実施形態および本明細書に定義される変数の全ての組み合わせを含むことを理解すべきである。
【０００９】
本発明の第１の態様によると、一般式Ｉ：
2018109015.tif 000002
（上式中、
−  Ｂｘは複素環塩基部分であり；
−  Ｔ１およびＴ２の一方はヒドロキシル（−ＯＨ）または保護ヒドロキシルであり、Ｔ１およびＴ２の他方はホスフェートまたは反応性リン基であり、Ｔ１は場合によりオリゴヌクレオチド合成のための固体支持体であり；
−  ｑ１およびｑ２はそれぞれ独立に、Ｈ、ＦまたはＣｌであり；
−  ｑ３、ｑ４およびｑ５の少なくとも１つは独立に、一般式−Ａ１−Ｘｈ−Ａ２−Ｙｎにより記載される基であり、ここで、
−  Ａ１はＣｋ−アルキル、Ｃｋ−アルケニルまたはＣｋ−アルキニルであり、ｋは０〜２０の範囲から選択される整数であり、
−  Ｘｈは−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＲ、−ＳＲまたは−ＮＲ２であり、各Ｒは独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アセチルおよび２−ヒドロキシエチルから選択され、ｈは０または１であり、
−  Ａ２はＣｉ−アルキル、Ｃｉ−アルケニルまたはＣｉ−アルキニルであり、ｉは０〜２０の範囲から選択される整数であり、
−  Ｙは−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、＝Ｏ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋、ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＳＣＮ、−ＣＯＲ、−ＣＯ２Ｒ、ＣＯＮＲ２、−Ｒから選択される、Ａ１および／またはＡ２上の任意の炭素原子に結合した置換基群であり、各Ｒは独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アセチルおよび２−ヒドロキシエチルから選択され、ｎは０、１、２、３、４、５または６であり、
−  ｋ＋ｉは少なくとも１に等しく、
−  ＲがＨである任意の−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−ＣＯ２Ｒ、ＣＯＮＲ２は場合により固相オリゴヌクレオチド化学で使用される保護基により保護されていてもよく；
−  ｑ３、ｑ４およびｑ５の残りのものは独立に、Ｈ、ＦまたはＣｌであり、
−  ｚ１およびｚ２の一方はＨであり、ｚ１およびｚ２の他方はＨ、−ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＣＨ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＦ３、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２、ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２またはＯＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２である）
により記載される三環ヌクレオシドが提供される。
【００１０】
有機化学の分野の当業者であれば、置換基としての酸素（＝Ｏ）の選択に関して、酸素原子が二重結合を介してＡ１またはＡ２上の任意の炭素原子に結合していることを理解する。本明細書の文脈中のＣｋ−アルキル、Ｃｋ−アルケニルまたはＣｋ−アルキニルは、直鎖中にｋ個の炭素原子を有する、それぞれアルキル、アルケニルまたはアルキニル部分を指す。Ａ２の指数ｉも同様に適用される。ｋが０であり、Ａ１が存在しない実施形態、およびｉが０であり、Ａ２が存在しない実施形態が理解される。ｎ個の置換基が存在する場合、これらはＡ１とＡ２の両方に存在することができる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、Ｂｘがピリミジン、置換ピリミジン、プリンまたは置換プリンである。いくつかの実施形態では、Ｂｘがウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンおよびグアニンから選択される。いくつかの実施形態では、Ｂｘが塩基ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンおよびグアニンの代わりにＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーに組み込むと、塩基対を形成することができる芳香族複素環部分である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、Ｔ１がヒドロキシルまたは保護ヒドロキシルであり、Ｔ２がＨ−ホスホネートまたはホスホロアミダイトから選択される反応性リン基である。いくつかの実施形態では、Ｔ１がトリホスフェート基であり、Ｔ２がＯＨである。いくつかの実施形態では、Ｔ１が４，４’−ジメトキシトリチルであり、Ｔ２がジイソプロピルシアノエトキシホスホロアミダイトである。いくつかの実施形態では、Ｔ１が制御細孔ガラス面である。この実施形態の特定の実施形態によると、Ｔ１が３’−Ｏ−スクシニル化ヌクレオシドがアミド官能基を介して結合した、オリゴヌクレオチド固相合成に使用される長鎖アルキルアミン制御細孔ガラス面または類似の固相支持体である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ｚ１およびｚ２の一方がＦ、ＯＣＨ３またはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３である。いくつかの実施形態では、ｚ１およびｚ２の一方がＦである。いくつかの実施形態では、ｚ１およびｚ２の一方がＦであり、他方がＨである。いくつかの実施形態では、ｚ１およびｚ２がそれぞれＨである。いくつかの実施形態では、ｚ１およびｚ２がそれぞれＦである。いくつかの実施形態では、ｚ１およびｚ２がそれぞれＨである。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ｑ１およびｑ２がＨである。いくつかの実施形態では、ｑ１およびｑ２の一方がＦであり、他方がＨである。
【００１５】
特定の実施形態では、三環ヌクレオシドがｑ３、ｑ４またはｑ５の位置に、場合により鎖上にカチオン基を有する３〜約１８個の炭素原子を有する１つの置換基を有する。アルキル置換基鎖長およびこのような修飾ヌクレオチドの置換および数の関数として、オリゴヌクレオチドの体内への輸送改善、および細胞取り込み改善をもたらすこのような置換基は、オリゴヌクレオチドへの組み込みに有用である。理論により拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、このような修飾オリゴヌクレオチドの観察された挙動が少なくとも部分的に、疎水性相互作用によるオリゴヌクレオチドの自己凝集により説明され得ると仮定している。
【００１６】
実施形態Ａ）：いくつかの実施形態では、置換基がＣ３〜Ｃ１６アルキル部分である、すなわち、ｋが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６であり、ｈが０であり、ｉが０であり、ｎが１、２または３である。そのサブグループでは、Ｃ３〜Ｃ１６アルキル部分がｑ３の位置にあり；ｑ４およびｑ５がＨであり、場合により、ｑ１およびｑ２の一方がＨであり、他方がＦまたはＣｌである、またはｑ１とｑ２の両方がＨである。その別のサブグループでは、１〜６個の置換基を有するＣ３〜Ｃ１６アルキル部分がｑ４またはｑ５の位置にあり、ｑ４およびｑ５の他方ならびにｑ３がＨであり、場合により、ｑ１およびｑ２の一方がＨであり、他方がＦまたはＣｌである、またはｑ１とｑ２の両方がＨである。
【００１７】
実施形態Ｂ）：いくつかの実施形態では、置換基が酢酸Ｃ３〜Ｃ１６アミドまたはエステルである、すなわち、ｋが１であり、ｈが１であり、ＸがＣＯＯ−、ＣＯＮＨ−またはＣＯＮＲ−であり、ｉが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６であり、ｎが１、２または３である。そのサブグループでは、酢酸Ｃ３〜Ｃ１６アミドまたはエステルがｑ３の位置にあり；ｑ４およびｑ５がＨであり、場合により、ｑ１およびｑ２の一方がＨであり、他方がＦまたはＣｌである、またはｑ１とｑ２の両方がＨである。その別のサブグループでは、酢酸Ｃ３〜Ｃ１６アミドまたはエステルがｑ４またはｑ５の位置にあり、ｑ４およびｑ５の他方ならびにｑ３がＨであり、場合により、ｑ１およびｑ２の一方がＨであり、他方がＦまたはＣｌである、またはｑ１とｑ２の両方がＨである。
【００１８】
実施形態Ｃ）：いくつかの実施形態では、置換基がＣ３〜Ｃ１６アルコキシ部分である、すなわち、ｋが０であり、ｈが１であり、Ｘが−Ｏ−であり、ｉが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６であり、ｎが１、２または３である。そのサブグループでは、Ｃ３〜Ｃ１６アルコキシ部分がｑ３の位置にあり；ｑ４およびｑ５がＨであり、場合により、ｑ１およびｑ２の一方がＨであり、他方がＦまたはＣｌである、またはｑ１とｑ２の両方がＨである。その別のサブグループでは、Ｃ３〜Ｃ１６アルコキシ部分がｑ４またはｑ５の位置にあり、ｑ４およびｑ５の他方ならびにｑ３がＨであり、場合により、ｑ１およびｑ２の一方がＨであり、他方がＦまたはＣｌである、またはｑ１とｑ２の両方がＨである。
【００１９】
実施形態Ｄ）：いくつかの実施形態では、ｑ３が一般式−Ａ１−Ｘｈ−Ａ２−Ｙｎにより記載される基であり、ｋおよびｉが独立に、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５であり、ｋとｉの和が少なくとも３かつ１７以下であり、ｈが１であり、ＸがＣＯＯ−、ＣＯＮＨ−、ＣＯＮＲ−、−Ｏ−およびＣＯから選択され、ｎが０、１、２または３である。そのサブグループでは、ｑ４およびｑ５がＨであり、場合により、ｑ１およびｑ２の一方がＨであり、他方がＦまたはＣｌである、またはｑ１とｑ２の両方がＨである。
【００２０】
実施形態Ｅ）：いくつかの実施形態では、ｑ４またはｑ５のいずれかが一般式−Ａ１−Ｘｈ−Ａ２−Ｙｎにより記載される基であり、ｋおよびｉが独立に、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５であり、ｋとｉの和が少なくとも３かつ１７以下であり、ｈが１であり、ＸがＣＯＯ−、ＣＯＮＨ、ＣＯＮＲ−、−Ｏ−およびＣＯから選択され、ｎが０、１、２または３である。そのサブグループでは、ｑ４およびｑ５の他方ならびにｑ３がＨであり、場合により、ｑ１およびｑ２の一方がＨであり、他方がＦまたはＣｌである、またはｑ１とｑ２の両方がＨである。
【００２１】
グループＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの実施形態をさらに定義すると、これらの実施形態のいずれか１つのサブグループは、ｎが１であり、置換基ＹがＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＮＲ３＋およびＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２（グアニジル）から選択されるカチオン置換基であり、Ｒが上で概説される意味を有することにより特徴づけられる。これらの実施形態のいくつかでは、カチオン置換基がヌクレオシド環から最も遠くにあるアルキル鎖のω位（末端Ｃ）に位置する（グループＡの実施形態のＡ１、グループＢ、Ｃ、ＤおよびＥの実施形態のＡ２）。
【００２２】
実施形態Ｆ）：いくつかの実施形態では、三環ヌクレオシドが以下のパラメータにより定義される１つの置換基を有する：ｋが０であり、ｈが１であり、Ｘｈが−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、Ａ２−Ｙが（ＣＨ２）ｍＣＨ３、（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＯＨ、（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＮＨ２または（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２であり、ｍが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６である。そのサブグループでは、前文で定義される置換基がｑ３の位置にあり；別のサブグループでは、前文で定義される置換基がｑ４またはｑ５の位置にある。ｑ３、ｑ４およびｑ５の他の全ての位置がＨである。場合により、ｑ１およびｑ２の一方がＨであり、他方がＦまたはＣｌである、またはｑ１とｑ２の両方がＨである。
【００２３】
単一置換基ｑ３を有する実施形態：いくつかの実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ４およびｑ５がＨであり、ｑ３が一般式−Ａ１−Ｘｈ−Ａ２−Ｙｎにより記載される基である。具体的な例をグループＧ、Ｈ、ＩおよびＪとして示す。
【００２４】
実施形態Ｇ）：いくつかの実施形態では、ｑ３が
−  −（ＣＨ２）ｍＣＨ３、−（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＯＨ、（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＮＨ２、（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、または
−  −ＣＯ（ＣＨ２）ｍＣＨ３、ＣＯ−（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＯＨ、ＣＯ（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＮＨ２もしくはＣＯ（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、
−  −ＣＯＯ（ＣＨ２）ｍＣＨ３、ＣＯＯ（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＯＨ、ＣＯＯ（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＮＨ２もしくはＣＯＯ（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、または
−  −ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＨ３、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＯＨ、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＮＨ２もしくはＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２
であり、ｍが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６である。そのサブグループでは、ｍが３、４、５、６、７または８である。
【００２５】
アルキル鎖の長さにより、ｑ３のこの特定の修飾を有するヌクレオシドが組み込まれたオリゴヌクレオチド化合物の送達、生物学的利用能または透過性の慎重な調節が可能になる。
【００２６】
実施形態Ｈ）：いくつかの実施形態では、ｑ３が一般式−Ａ１−Ｘｈ−Ａ２−Ｙｎにより記載される基であり、ここで、
−  Ａ１のｋは０であり、ｈは１であり、Ｘｈは−Ｏ−であり、Ａ２はＣ５−アルキルであり、Ｙｎのｎは０であり、したがって、ｑ３は−Ｏ−（ＣＨ２）４ＣＨ３である、または
−  ｋは０であり、ｈは１であり、Ｘｈは−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、Ａ２はＣ６−アルキルであり、ｎは０であり、したがって、ｑ３は−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）５ＣＨ３である、または
−  Ａ１はＣ２−アルキルであり、ｈは１であり、Ｘｈは−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、Ａ２はＣ６−アルキルであり、ｎは０であり、したがって、ｑ３は−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）５ＣＨ３である、または
−  ｋは０であり、ｈは１であり、Ｘｈは−Ｃ（＝Ｏ）−であり、Ａ２はＣ４−アルキルであり、ｎは０であり、したがって、ｑ３は−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）３ＣＨ３である、または
−  ｋは０であり、ｈは０であり、Ａ２はＣ８−アルキルであり、ｎは１であり、Ｙｎは−ＯＨであり、置換基−ＯＨはＡ２のＣ８−アルキルのω炭素原子に結合しており、したがって、ｑ３は−（ＣＨ２）７ＣＨ２ＯＨである、または
−  Ａ１は−ＣＨ２−であり、ｈは１であり、Ｘｈは−ＣＯ２Ｈであり、ｉおよびｎはそれぞれ０であり、したがって、ｑ３は−ＣＨ２−ＣＯＯＨである、または
−  Ａ１はＣＨ２であり、ｈは１であり、Ｘｈは−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、Ａ２はＣ２−アルキルであり、ｎは０であり、したがって、ｑ３は−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−ＣＨ２ＣＨ３である、または
−  Ａ１はＣＨ２であり、ｈは１であり、Ｘｈは−ＣＯＮＨ２であり、ｉおよびｎはそれぞれ０であり、したがって、ｑ３は−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２である、または
−  Ａ１はＣＨ２であり、ｈは１であり、Ｘｈは−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、Ａ２はＣ１６−アルキルであり、ｎは０であり、したがって、ｑ３はＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）１５ＣＨ３である、または
−  Ａ１はＣＨ２であり、ｈは１であり、Ｘｈは−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、Ａ２はＣ３−アルキルであり、ｎは１であり、Ｙｎは−ＮＨ２であり、置換基−ＮＨ２はＡ２のＣ３−アルキルのω炭素原子に結合しており、したがって、ｑ３はＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）３ＮＨ２である、または
−  Ａ１はＣＨ２であり、ｈは１であり、Ｘｈは−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、Ａ２はＣ３−アルキルであり、ｎは１であり、Ｙｎは−ＮＨ２であり、置換基−ＮＨ２はＡ２のＣ３−アルキルのω炭素原子に結合しており、したがって、ｑ３はＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）３ＮＨ２である、または
−  Ａ１はＣＨ２であり、ｈは１であり、Ｘｈは−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、Ａ２はＣ３−アルキルであり、ｎは１であり、Ｙｎは−ＯＨであり、置換基−ＯＨはＡ２のＣ３−アルキルのω炭素原子に結合しており、したがって、ｑ３はＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）３ＯＨである。
【００２７】
実施形態Ｉ）：いくつかの実施形態では、ｑ３が一般式−Ａ１−Ｘｈ−Ａ２−Ｙｎにより記載される基であり、ここで、Ａ１はＣＨ２であり、ｈは１であり、Ｘｈは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−であり、各Ｒは独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アセチルおよび２−ヒドロキシエチル、特にＨ、メチル、エチル、プロピルおよびブチルから選択される。そのサブグループでは、ｚ１、ｚ２、ｑ１、ｑ２、ｑ４およびｑ５がＨである。そのさらなるサブグループでは、ｑ３が−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯ（ＣＨ２）１２−１６ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＯ（ＣＨ２）１２−１６ＮＨ２または−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）３ＮＨ（Ｆｍｏｃ）の１つである。
【００２８】
実施形態Ｊ）：いくつかの実施形態では、ｑ３が−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯ（ＣＨ２）１２−１６ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＯ（ＣＨ２）１２−１６ＮＨ２または−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）３ＮＨ（Ｆｍｏｃ）の１つである。
【００２９】
そのさらなるサブグループでは、三環ヌクレオシドが、
2018109015.tif 000003
（式中、Ｂｘはウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンおよびグアニンから選択される）からなる群から選択される。
【００３０】
実施例１の化合物８、実施例２の化合物１３または実施例３の化合物１７、特に、
2018109015.tif 000004
（式中、Ｂｘはウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンおよびグアニンから選択される）により例示されるヌクレオシド前駆体化合物も本明細書で提供される。
【００３１】
実施形態Ｋ）：いくつかの実施形態では、ｋが０であり、ｈが１であり、Ｘｈが−ＣＲ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−であり、各Ｒが独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピルおよびブチルから選択され、Ａ２がＣｉ−アルキル、Ｃｉ−アルケニルまたはＣｉ−アルキニルであり、ｉが１〜２０の範囲の任意の整数から選択され、Ｙが−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＳＣＮ、−ＣＯＲ、−ＣＯ２Ｒ、ＣＯＮＲ２から選択される、Ａ２上の任意の炭素原子に結合した置換基群であり、各Ｒが独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピルおよびブチルから選択され、ｎが０、１、２、３、４、５または６である。
【００３２】
実施形態Ｌ）：いくつかの実施形態では、ｋが０であり、ｈが１であり、Ｘｈが−ＣＲ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−であり、各Ｒが独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピルおよびブチルから選択され、Ａ２がＣｉ−アルキル、Ｃｉ−アルケニルまたはＣｉ−アルキニルであり、ｉが１〜２０の範囲の任意の整数から選択され、Ｙが−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＳＣＮ、−ＣＯＲ、−ＣＯ２Ｒ、ＣＯＮＲ２から選択される、Ａ２上の任意の炭素原子に結合した置換基群であり、各Ｒが独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピルおよびブチルから選択され、ｎが０、１、２、３、４、５または６であり、ｚ１、ｚ２、ｑ１、ｑ２、ｑ４およびｑ５がＨである場合、ｑ３が−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯ（ＣＨ２）１２−１６ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＯ（ＣＨ２）１２−１６ＮＨ２または−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）３ＮＨ（Ｆｍｏｃ）の１つである、特に−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯ（ＣＨ２）１５ＣＨ３または−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）３ＮＨ（Ｆｍｏｃ）の１つである。
【００３３】
実施形態Ｍ）：いくつかの実施形態では、Ａ１がＣＨ２であり、ｈが１であり、Ｘｈが−ＣＲ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−であり、各Ｒが独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピルおよびブチルから選択され、Ａ２がＣｉ−アルキル、Ｃｉ−アルケニルまたはＣｉ−アルキニルであり、ｉが１〜２０の範囲の任意の整数から選択され、Ｙが−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＳＣＮ、−ＣＯＲ、−ＣＯ２Ｒ、ＣＯＮＲ２から選択される、Ａ２上の任意の炭素原子に結合した置換基群であり、各Ｒが独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピルおよびブチルから選択され、ｎが０、１、２、３、４、５または６である。
【００３４】
実施形態Ｎ）：いくつかの実施形態では、Ａ１がＣＨ２であり、ｈが１であり、Ｘｈが−ＣＲ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−であり、各Ｒが独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピルおよびブチルから選択され、Ａ２がＣｉ−アルキル、Ｃｉ−アルケニルまたはＣｉ−アルキニルであり、ｉが１〜２０の範囲の任意の整数から選択され、Ｙが−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＳＣＮ、−ＣＯＲ、−ＣＯ２Ｒ、ＣＯＮＲ２から選択される、Ａ２上の任意の炭素原子に結合した置換基群であり、各Ｒが独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピルおよびブチルから選択され、ｎが０、１、２、３、４、５または６であり、ｚ１、ｚ２、ｑ１、ｑ２、ｑ４およびｑ５がＨである場合、ｑ３が−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯ（ＣＨ２）１２−１６ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＯ（ＣＨ２）１２−１６ＮＨ２または−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）３ＮＨ（Ｆｍｏｃ）の１つである、特に−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）３ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯ（ＣＨ２）１５ＣＨ３または−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）３ＮＨ（Ｆｍｏｃ）の１つである。
【００３５】
実施形態Ｏ）：いくつかの実施形態では、ｑ３、ｑ４およびｑ５の１つがＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、ＣＨ２ＣＯＯ（ＣＨ２）３−６ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＯ（ＣＨ２）３−７ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯ（ＣＨ２）３−７ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３−６ＣＨ３、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３−７ＯＨ、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３−７ＣＨ２ＮＨ２またはＣＯＮＨ（ＣＨ２）３−７ＣＨ２ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４およびｑ５の少なくとも１つがＦであり、ｑ３、ｑ４およびｑ５の１つが一般式の式−Ａ１−Ｘｈ−Ａ２−Ｙｎにより記載される基である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ｑ３およびｚ１がＦであり、ｑ４およびｑ５の一方が一般式の式−Ａ１−Ｘｈ−Ａ２−Ｙｎにより記載される基である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ｑ３が一般式−Ａ１−Ｘｈ−Ａ２−Ｙｎにより記載される基から選択され、ｚ１、ｚ２、ｑ１、ｑ２、ｑ４およびｑ５の１つがＦである。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ｑ３が一般式−Ａ１−Ｘｈ−Ａ２−Ｙｎ（Ａ１はＣＨ２であり、ｈは１であり、Ｘｈは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−であり、各Ｒは独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アセチルおよび２−ヒドロキシエチル、特にＨ、メチル、エチル、プロピルおよびブチルから選択され、ｚ１、ｚ２、ｑ１、ｑ２、ｑ４およびｑ５の１つはＦである）により記載される基である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ｑ３、ｑ４およびｑ５の中の２つが一般式の式−Ａ１−Ｘｈ−Ａ２−Ｙｎにより記載される基である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ｑ３が一般式の式−Ａ１−Ｘｈ−Ａ２−Ｙｎにより記載される基であり、ここで、Ａ１はＣＨ２であり、ｈは１であり、Ｘｈは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−であり、各Ｒは独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アセチルおよび２−ヒドロキシエチル、特にＨ、メチル、エチル、プロピルおよびブチルから選択され、ｑ４またはｑ５の一方は上に定義される一般式の式−Ａ１−Ｘｈ−Ａ２−Ｙｎにより記載される基であり、他方はＨである。
【００４２】
本発明の第２の態様によると、式ＩＩ：
2018109015.tif 000005
を有する少なくとも１種の三環ヌクレオシドを含むオリゴマー化合物が提供され、ここで、式ＩＩの各三環ヌクレオシドについて独立に、
−  Ｂｘは複素環塩基部分であり；
−  Ｔ３およびＴ４の一方は式ＩＩの三環ヌクレオシドをオリゴマー化合物に結合させるヌクレオシド間結合基であり、Ｔ３およびＴ４の他方はヒドロキシル、保護ヒドロキシル、５’もしくは３’末端基または三環ヌクレオシドをオリゴマー化合物に結合させるヌクレオシド間結合基であり；
−  ｑ１およびｑ２はそれぞれ独立に、Ｈ、ＦまたはＣｌであり；
−  ｑ３、ｑ４およびｑ５の少なくとも１つは独立に、一般式−Ａ１−Ｘｈ−Ａ２−Ｙｎにより記載される基であり、ここで、
−  Ａ１はＣｋ−アルキル、Ｃｋ−アルケニルまたはＣｋ−アルキニルであり、ｋは０〜２０の範囲から選択される整数であり、
−  Ｘｈは−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＲ、−ＳＲまたは−ＮＲ２であり、各Ｒは独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アセチルおよび２−ヒドロキシエチルから選択され、ｈは０または１であり、
−  Ａ２はＣｉ−アルキル、Ｃｉ−アルケニルまたはＣｉ−アルキニルであり、ｉは０〜２０の範囲から選択される整数であり、
−  Ｙは−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、＝Ｏ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋、ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＳＣＮ、−ＣＯＲ、−ＣＯ２Ｒ、ＣＯＮＲ２、−Ｒから選択される、Ａ１および／またはＡ２上の任意の炭素原子に結合した置換基群であり、各Ｒは独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アセチルおよび２−ヒドロキシエチルから選択され、ｎは０、１、２、３、４、５または６であり、
−  ｋ＋ｉは少なくとも１に等しく、
−  ｑ３、ｑ４およびｑ５の残りのものは独立に、Ｈ、ＦまたはＣｌであり、
−  ｚ１およびｚ２の一方はＨであり、ｚ１およびｚ２の他方はＨ、−ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＣＨ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＦ３、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２、ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２またはＯＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２であり、
−  前記オリゴマー化合物は８〜４０個のモノマーサブユニットを含む。
【００４３】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、Ｂｘがピリミジン、置換ピリミジン、プリンまたは置換プリンである。いくつかの実施形態では、Ｂｘがウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンおよびグアニンから選択される。いくつかの実施形態では、Ｂｘが塩基ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンおよびグアニンの代わりにＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーに組み込むと、塩基対を形成することができる芳香族複素環部分である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、式ＩＩの各三環ヌクレオシドについて、ｚ１およびｚ２の一方がＦ、ＯＣＨ３またはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３である。いくつかの実施形態では、式ＩＩの各三環ヌクレオシドについて、ｚ１およびｚ２の一方がＦである。いくつかの実施形態では、式ＩＩの各三環ヌクレオシドについて、ｚ１およびｚ２がそれぞれＦである。いくつかの実施形態では、式ＩＩの各三環ヌクレオシドについて、ｚ１およびｚ２の一方がＦであり、他方がＨである。いくつかの実施形態では、式ＩＩの各三環ヌクレオシドについて、ｚ１およびｚ２がそれぞれＨである。
【００４５】
いくつかの実施形態では、式ＩＩの各三環ヌクレオシドについて、ｑ１およびｑ２がそれぞれＨである。いくつかの実施形態では、式ＩＩの各三環ヌクレオシドについて、ｑ１およびｑ２の一方がＦであり、他方がＨである。いくつかの実施形態では、式ＩＩの各三環ヌクレオシドについて、ｑ１およびｑ２がそれぞれＦである。
【００４６】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、各ヌクレオシド間結合基が独立に、ホスホジエステルヌクレオシド間結合基またはホスホロチオエートヌクレオシド間結合基である。いくつかの実施形態では、本質的に各ヌクレオシド結合基がホスホロチオエートヌクレオシド間結合基である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物が、式ＩＩを有する少なくとも２個の隣接した三環ヌクレオシドを有する第１の領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物が、式ＩＩを有する少なくとも２個の隣接した三環ヌクレオシドを有する第１の領域と、少なくとも２個の隣接したモノマーサブユニットを有する第２の領域とを含み、第２の領域中の各モノマーサブユニットが前記第１の領域の式ＩＩの三環ヌクレオシドとは異なる修飾ヌクレオシドである。この実施形態の別の代替によると、オリゴマー化合物が、前記第１の領域と第２の領域との間に位置する第３の領域を含み、第３の領域中の各モノマーサブユニットが独立に、第１の領域の式ＩＩの各三環ヌクレオシドおよび第２の領域の各モノマーサブユニットとは異なるヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドである。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物が、１〜５個の隣接したモノマーサブユニットの外部領域が両側に隣接した６〜１４個の隣接したモノマーサブユニットの内部領域を有する間隙があるオリゴマー化合物を含み、各外部領域の各モノマーサブユニットが式ＩＩの三環ヌクレオシドであり、内部領域の各モノマーサブユニットが独立に、ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、前記内部領域が約８〜約１４個の連続したβ−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、前記内部領域が約９〜約１２個の連続したβ−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物に含まれる式ＩＩの各三環ヌクレオシドが上記実施形態グループＡから選択される。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物に含まれる式ＩＩの各三環ヌクレオシドが上記実施形態グループＢから選択される。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物に含まれる式ＩＩの各三環ヌクレオシドが上記実施形態グループＣから選択される。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物に含まれる式ＩＩの各三環ヌクレオシドが上記実施形態グループＤから選択される。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物に含まれる式ＩＩの各三環ヌクレオシドが上記実施形態グループＥから選択される。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物に含まれる式ＩＩの各三環ヌクレオシドが上記実施形態グループＦから選択される。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物に含まれる式ＩＩの各三環ヌクレオシドが上記実施形態グループＧから選択される。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物に含まれる式ＩＩの各三環ヌクレオシドが上記実施形態グループＨから選択される。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物に含まれる式ＩＩの各三環ヌクレオシドが上記実施形態グループＩから選択される。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物に含まれる式ＩＩの各三環ヌクレオシドが上記実施形態グループＪから選択される。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物に含まれる式ＩＩの各三環ヌクレオシドが上記実施形態グループＫから選択される。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物に含まれる式ＩＩの各三環ヌクレオシドが上記実施形態グループＬから選択される。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物に含まれる式ＩＩの各三環ヌクレオシドが上記実施形態グループＭから選択される。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物に含まれる式ＩＩの各三環ヌクレオシドが上記実施形態グループＮから選択される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、式ＩＩの各三環ヌクレオシドについて、ｑ３がＣ１〜Ｃ２０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ１〜Ｃ２０アルケニル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ２０アルキニル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキニル、Ｃ１〜Ｃ２０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルコキシ、アミノ、置換アミノ、チオールまたは置換チオールである。いくつかの実施形態では、式ＩＩの各三環ヌクレオシドについて、ｑ４およびｑ５の一方がＨであり、ｑ４およびｑ５の他方がＣ１〜Ｃ２０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ１〜Ｃ２０アルケニル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ２０アルキニル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキニル、Ｃ１〜Ｃ２０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルコキシ、アミノ、置換アミノ、チオールまたは置換チオールである。
【００５１】
いくつかの実施形態では、式ＩＩの各三環ヌクレオシドについて、ｑ３がＣ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、アミノ、置換アミノ、チオールまたは置換チオールである。いくつかの実施形態では、式ＩＩの各三環ヌクレオシドについて、ｑ４およびｑ５の一方がＨであり、ｑ４およびｑ５の他方がＣ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、アミノ、置換アミノ、チオールまたは置換チオールである。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー化合物が、
2018109015.tif 000006
（式中、Ｔ３およびＴ４は上で概説される意味を有する）からなる群から選択される１個または数個のヌクレオチドブロックを含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、式ＩＩの各三環ヌクレオシドについて、ｑ３、ｑ４およびｑ５の中の少なくとも２つが一般式の式−Ａ１−Ｘｈ−Ａ２−Ｙｎにより記載される基である。
【００５４】
本発明のさらに別の態様によると、本発明の第１の態様による三環ヌクレオシドの使用を含む、オリゴヌクレオチドの固相合成法が提供される。本発明のこの態様によると、本発明の第１の態様によるヌクレオシド、任意の反応性ＯＨ、ＮＨ２、または本明細書のどこかに配置される保護基により保護されている他の反応基が、例えば、ホスホロアミダイト活性化構築ブロックとして使用され、発生期のオリゴマー鎖に組み込まれる。このような目的に有用な方法および試薬は当業者に知られており、本明細書で提供される例により例示される。
【００５５】
特定の実施形態では、１〜５個の隣接したモノマーサブユニットの外部領域が両側に隣接した６〜１４個の隣接したモノマーサブユニットの内部領域を含み、各外部領域の各モノマーサブユニットが式ＩＩの三環ヌクレオシドであり、内部領域の各モノマーサブユニットが独立に、ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドである間隙があるオリゴマー化合物が提供される。特定の実施形態では、内部領域が約８〜約１４個の連続したβ−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを含む。特定の実施形態では、内部領域が約９〜約１２個の連続したβ−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを含む。
【００５６】
特定の実施形態では、細胞を本明細書で提供される５’修飾ヌクレオシドを含むオリゴマー化合物または本明細書で提供される５’修飾ヌクレオシドを含む少なくとも１種のオリゴマー化合物を含む二本鎖組成物と接触させるステップを含む遺伝子発現を阻害する方法であって、前記オリゴマー化合物が約８〜約４０個のモノマーサブユニットを含み、標的ＲＮＡと相補的である方法が提供される。特定の実施形態では、細胞が動物である。特定の実施形態では、細胞がヒトである。特定の実施形態では、標的ＲＮＡがｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡから選択される。特定の実施形態では、標的ＲＮＡがｍＲＮＡである。特定の実施形態では、標的ＲＮＡがヒトｍＲＮＡである。特定の実施形態では、標的ＲＮＡが切断され、それによってその機能を阻害する。特定の実施形態では、方法が、標的ＲＮＡのレベルを検出するステップをさらに含む。
【００５７】
特定の実施形態では、１種または複数の細胞または組織を本明細書で提供されるオリゴマー化合物または二本鎖組成物と接触させるステップを含む遺伝子発現を阻害するインビトロ法が提供される。
【００５８】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴマー組成物または二本鎖組成物が、１種または複数の細胞、組織または動物を本明細書で提供されるオリゴマー化合物または二本鎖組成物の１つと接触させるステップを含む遺伝子発現を阻害するインビボ法に使用するために使用される。
【００５９】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴマー組成物および二本鎖組成物が、医学療法に使用される。
【００６０】
特定の実施形態では、式ＩＩの各三環ヌクレオシドについて、ｑ３、ｑ４、ｑ５の置換基位置の１つに−Ａ１−Ｘｈ−Ａ２−Ｙｎとして一般的に定義される置換基群を配置することにより、オリゴマーの生体内分布、細胞取り込みまたは送達が強化される。特定の実施形態では、式ＩＩの各三環ヌクレオシドについて、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｚ１またはｚ２の置換基位置の１つに置換基群Ｆを配置することにより、例えば、限定されないが、安定性、ヌクレアーゼ耐性、結合親和性、特異性、吸収、細胞分布、細胞取り込み、電荷、薬力学および薬物動態などの、オリゴマー化合物の１つまたは複数の特性が強化される。特定の実施形態では、式ＩＩの各三環ヌクレオシドについて、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｚ１またはｚ２の置換基位置の１つにＦを配置することにより、結合親和性が強化されることが期待される。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
式Ｉを有する新規な三環ヌクレオシドおよびこれらから調製したオリゴマー化合物が本明細書で提供される。式Ｉを有する三環ヌクレオシドは、それだけに限らないが、ヌクレアーゼ耐性、細胞移入、細胞内送達、体内、特に血液中での輸送、医薬製剤化の容易さおよび薬物代謝などの、組み込まれたオリゴマー化合物の１つまたは複数の特性を強化するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴマー化合物が、標的ＲＮＡの一部にハイブリダイズし、標的ＲＮＡの正常な機能の喪失をもたらす。特定の実施形態では、インビトロおよびインビボで、メッセンジャーＲＮＡなどの標的ＲＮＡを減少させるためにアンチセンスオリゴマー化合物に組み込むことができる式Ｉを有する三環ヌクレオシドが提供される。一態様では、標的ＲＮＡの機能の低下または喪失が、多数の経路を介した遺伝子発現の阻害に有用である。このような経路には、例えば、ｍＲＮＡの転写および／または翻訳の立体障害ならびに単鎖または二本鎖オリゴマー化合物を通したｍＲＮＡの切断が含まれる。本明細書で提供されるオリゴマー化合物はまた、診断用途においてプライマーおよびプローブとしても有用であることが期待される。
【００６２】
特定の実施形態では、各二本鎖組成物が、
−  第１のオリゴマー化合物が第２のオリゴマー化合物と相補的であり、第２のオリゴマー化合物が核酸標的と相補的である第１のオリゴマー化合物および第２のオリゴマー化合物を含み、
−  第１および第２のオリゴマー化合物の少なくとも一方が式ＩＩの少なくとも１種の三環ヌクレオシドを含み；
−  前記組成物が場合により１個または複数の末端基を含む
二本鎖組成物が提供される。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、最大で２４個、特に最大で２０個の炭素原子を含有する飽和直鎖または分岐炭化水素基を指す。アルキル基の例としては、限定されないが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｎ−ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシルなどが挙げられる。アルキル基は、典型的には１〜約２０個の炭素原子、より典型的には１〜約１２個の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ１２アルキル）を含み、１〜約６個の炭素原子がより好ましい。本明細書で使用される「低級アルキル」という用語は、１〜約６個の炭素原子を含む。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「アルケニル」という用語は、最大で２４個、特に最大で２０個の炭素原子を含有し、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分岐炭化水素鎖基を指す。アルケニル基の例としては、限定されないが、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イル、１，３−ブタジエンなどのジエンなどが挙げられる。アルケニル基は、典型的には２〜約２０個の炭素原子、より典型的には２〜約１２個の炭素原子を含み、２〜約６個の炭素原子がより好ましい。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「アルキニル」という用語は、最大で２４個、特に最大で２０個の炭素原子を含有し、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分岐炭化水素基を指す。アルキニル基の例としては、限定されないが、エチニル、１−プロピニル、１−ブチニルなどが挙げられる。アルキニル基は、典型的には２〜約２０個の炭素原子、より典型的には２〜約１２個の炭素原子を含み、２〜約６個の炭素原子がより好ましい。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」という用語は、アルキル基と酸素原子との間に形成される基であって、酸素原子がアルコキシ基を親分子に結合させるために使用される基を指す。アルコキシ基の例としては、限定されないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ネオペントキシ、ｎ−ヘキソキシなどが挙げられる。本明細書で使用されるアルコキシ基は、場合によりさらなる置換基群を含んでもよい。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「アミノアルキル」という用語は、アミノ置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基を指す。基のアルキル部分が親分子との共有結合を形成する。アミノ基は任意の位置に位置することができ、アミノアルキル基はアルキルおよび／またはアミノ部分でさらなる置換基群により置換されてもよい。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「保護基」という用語は、限定されないが、ヒドロキシル、アミノおよびチオール基を含む反応基を合成手順中に望ましくない反応から保護することが当技術分野で知られている不安定な化学的部分を指す。保護基は、典型的には他の反応性部位での反応中に部位を選択的に保護するために使用され、その後、除去して未保護基のままにまたはさらなる反応に利用可能にしておくことができる。当技術分野で知られている保護基は、一般的にＧｒｅｅｎｅ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、２００７に記載されている。
【００６９】
基を、前駆体として本明細書で提供されるオリゴマー化合物に選択的に組み込むことができる。例えば、アミノ基をアジド基として本明細書で提供される化合物に入れて、これを合成の所望の時点でアミノ基に化学変換することができる。一般的に、基は、適当な時に最終的な基に変換するために、保護されるまたは親分子の他の領域を修飾する反応に不活性である前駆体として存在する。さらなる代表的な保護または前駆体基は、Ａｇｒａｗａｌら、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；ニュージャージー、１９９４、２６、１〜７２に論じられている。
【００７０】
ヒドロキシル保護基の例としては、限定されないが、アセチル、ｔ−ブチル、ｔ−ブトキシメチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、ｐ−クロロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、ｐ−ニトロベンジル、ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル（ＡＣＥ）、２−トリメチルシリルエチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（ＴＯＭ）、ベンゾイルホルメート、クロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ピバロイル、ベンゾイル、ｐ−フェニルベンゾイル、９−フルオレニルメチルカルボネート、メシレート、トシレート、トリフェニルメチル（トリチル）、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、トリメトキシトリチル、１（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル（ＦＰＭＰ）、９−フェニルキサンチン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）および９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）が挙げられる。より一般的に使用されているヒドロキシル保護基には、限定されないが、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、ベンゾイル、メシレート、トシレート、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、９−フェニルキサンチン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）および９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）が含まれる。
【００７１】
アミノ保護基の例としては、限定されないが、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル（Ｔｅｏｃ）、１−メチル−１−（４−ビフェニリル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）などのカルバメート保護基；ホルミル、アセチル、トリハロアセチル、ベンゾイルおよびニトロフェニルアセチルなどのアミド保護基；２−ニトロベンゼンスルホニルなどのスルホンアミド保護基；ならびにフタルイミドおよびジチアスクシノイルなどのイミンおよび環状イミド保護基が挙げられる。
【００７２】
チオール保護基の例としては、限定されないが、トリフェニルメチル（トリチル）、ベンジル（Ｂｎ）などが挙げられる。
【００７３】
本明細書に記載される化合物は、１個または複数の不斉中心を含有するので、絶対立体化学の点から（Ｒ）または（Ｓ）として定義され得るエナンチオマー、ジアステレオマーおよび他の立体異性形態がもたらされる。全てのこのような可能な異性体ならびにそのラセミ体および光学的に純粋な形態が本明細書に含まれる。本明細書において現れる任意の炭素−炭素二重結合の配置は、便宜上選択されているだけで、文脈上明言しない限り、特定の配置に限定することを意図していない。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、場合により１個または複数のさらなる置換基群を含んでもよい。「置換基」および「置換基群」という用語は、典型的に、所望の特性を強化するまたは他の所望の効果をもたらすために他の基または親化合物に付加される基を含むことを意図している。置換基群は、保護されていても未保護であってもよく、親化合物の１つの利用可能な部位に付加しても多くの利用可能な部位に付加してもよい。置換基群はまた、他の置換基群でさらに置換されていてもよく、親化合物に直接またはアルキルもしくはヒドロカルビル基などの結合基を介して結合してもよい。
【００７５】
本明細書で修正可能な置換基群には、限定されないが、ハロゲン、酸素、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル（−Ｃ（Ｏ）Ｒａａ）、カルボキシル（−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａａ）、脂肪族基、脂環式基、アルコキシ、置換オキシ（−Ｏ−Ｒａａ）、アリール、アラルキル、複素環基、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アミノ（−Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ））、イミノ（＝ＮＲｂｂ）、アミド（−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ）または−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｏ）Ｒａａ）、アジド（−Ｎ３）、ニトロ（−ＮＯ２）、シアノ（−ＣＮ）、イソシアノ（−ＮＣ）、シアナト（−ＯＣＮ）、イソシアナト（−ＮＣＯ）、チオシアナト（−ＳＣＮ）；イソチオシアナト（−ＮＣＳ）；カルバミド（−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ）または−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｏ）ＯＲａａ）、ウレイド（−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ））、チオウレイド（−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ））、グアニジニル（−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（＝ＮＲｂｂ）−Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ））、アミジニル（−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ）または−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（＝ＮＲｂｂ）（Ｒａａ））、チオール（−ＳＲｂｂ）、スルフィニル（−Ｓ（Ｏ）Ｒｂｂ）、スルホニル（−Ｓ（Ｏ）２Ｒｂｂ）およびスルホンアミジル（−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ）または−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｓ（Ｏ）２Ｒｂｂ）が含まれる。各Ｒａａ、ＲｂｂおよびＲｃｃは独立に、Ｈ、場合により結合した化学官能基群または限定されないが、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂肪族、アルコキシ、アシル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、脂環式、複素環およびヘテロアリールアルキルを含む好ましい一覧を有するさらなる置換基群である。本明細書に記載される化合物の中の選択された置換基は、再帰的な程度に存在する。
【００７６】
本文脈において、「再帰的置換基」は、置換基がそれ自身の別の例を列挙し得ることを意味する。このような置換基の再帰的性質のために、理論上、多数が任意の所与の請求項に存在し得る。医化学および有機化学の分野の当業者であれば、このような置換基の総数が、意図した化合物の所望の特性により合理的に限定されることを理解する。このような特性には、例として、限定されないが、分子量、溶解度またはｌｏｇＰなどの物理特性、意図した標的に対する活性などの適用特性、および合成の容易さなどの実用特性が含まれる。
【００７７】
再帰的置換基は、本発明の意図した態様である。医化学および有機化学の分野の当業者であれば、このような置換基の汎用性を理解する。再帰的置換基が本発明の請求項に存在する程度に、総数は上に示されるように決定される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるアルキル、アルケニルまたはアルキニル基が、独立に−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、＝Ｏ、ＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＨＲ、−ＮＲ２、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＳＣＮ、−ＣＯＲ、−ＣＯ２Ｒ、ＣＯＮＲ２、−Ｒから選択される１個、２個または３個のさらなる置換基群を含有し、Ｒがメチル、エチル、プロピル、ブチル、アセチルおよび２−ヒドロキシエチルから選択される。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるアルキル、アルケニルまたはアルキニル基は、さらなる置換基群を含有せず、炭素および水素原子のみからなる。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「核酸塩基」という用語は、それだけに限らないが、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む、未修飾または天然核酸塩基を指す。本明細書で使用される場合、「複素環塩基部分」という用語は、未修飾または天然核酸塩基ならびに修飾または非天然核酸塩基およびその合成模倣物（例えば、フェノキサジンなど）を指す。特定の実施形態では、複素環塩基部分は、核酸の複素環塩基と水素結合することができる１個もしくは複数の原子または原子の群を含有する任意の複素環系である。
【００８１】
特定の実施形態では、複素環塩基部分には、限定されないが、本明細書に定義される５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ））、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン、ユニバーサル塩基、疎水性塩基、乱雑塩基（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  ｂａｓｅ）、サイズ拡大塩基ならびにフッ化塩基などの修飾核酸塩基が含まれる。
【００８２】
特定の実施形態では、複素環塩基部分には、限定されないが、１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン、１，３−ジアザフェノチアジン−２−オンおよび９−（２−アミノエトキシ）−１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｇ−クランプ）などの三環ピリミジンが含まれる。複素環塩基部分には、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環で置換されたもの、例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンも含まれる。さらなる複素環塩基部分には、限定されないが、当業者に知られているものが含まれる（例えば、米国特許第３６８７８０８号明細書；Ｓｗａｙｚｅら、Ｔｈｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６章、１４３〜１８２頁、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．編、２００８）；Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０、８５８〜８５９；Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３；Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３、２７３〜３０２を参照されたい）。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「糖部分」という用語は、フラノース環を有する天然糖または修飾フラノース環を有する非天然糖ならびにフラノース環が例えば、モルホリノもしくはヘキシトール環系などの環系で置換された糖代替物（ｓｕｇａｒ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）またはペプチド核酸に使用されるものなどの非環状糖代替物を指す。オリゴマー化合物の調製に有用な糖部分の実例としては、限定されないが、β−Ｄ−リボース、β−Ｄ−２’−デオキシリボース、置換糖（２’、５’およびビス置換糖など）、４’−Ｓ−糖（４’−Ｓ−リボース、４’−Ｓ−２’−デオキシリボースおよび４’−Ｓ−２’−置換リボースなど）、三環修飾糖（２’−Ｏ−ＣＨ２−４’または２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−４’架橋リボース由来三環糖など）ならびに糖代替物（例えば、リボース環がモルホリノ、ヘキシトール環系または開いた非環系で置換された場合など）が挙げられる。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」という用語は、核酸塩基−糖の組み合わせを指す。このような核酸塩基の２つの最も一般的なクラスがプリンおよびピリミジンである。
【００８５】
本明細書で使用される場合、ヌクレオチドという用語は、修飾もしくは未修飾ホスフェートヌクレオシド間結合基または非ホスフェートヌクレオシド間結合基をさらに含むヌクレオシドを指す。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドについては、ヌクレオシド間結合基は、糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。ホスフェートおよび非ホスフェートヌクレオシド間結合基は、隣接ヌクレオシドを互いに共有結合して直鎖ポリマー化合物を形成するために日常的に使用されている。
【００８６】
本明細書で使用される「ヌクレオチド模倣物」という用語は、オリゴマー化合物に、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルホリノ（−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−により結合された）などの糖および結合代替基を組み込んだモノマーを含むことが意図されている。一般に、各位置の複素環塩基は、核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持されるが、糖および結合は天然基と同様に機能するが、１つまたは複数の強化した特性を有することが期待される代替基で置換される。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド模倣物」という用語は、オリゴマー化合物の１つまたは複数の位置で糖および塩基を置換するために使用される構造を含むことが意図されている。ヌクレオシド模倣物の例としては、限定されないが、複素環塩基部分がフェノキサジン部分で置換されたヌクレオシド（例えば、グアノシン塩基とハイブリダイズすると、４個の水素結合を形成するＧ−クランプとも呼ばれる、９−（２−アミノエトキシ）−１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン基））および例えば、モルホリノ、シクロヘキセニルまたはビシクロ［３．１．０］ヘキシルなどの基による糖部分のさらなる置換が挙げられる。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオシド」という用語は、オリゴマー合成を使用してオリゴマー化合物に組み込むことができる全ての様式の修飾ヌクレオシドを含むことが意図されている。この用語は、本明細書の他で記載されている代替基の使用と対照的に、修飾立体化学的配置、１つまたは複数の置換、および基の除去などのヌクレオシドになされる修飾を含むことが意図されている。この用語は、フラノース糖（または４’−Ｓ類似体）部分を有するヌクレオシドを含み、複素環塩基を含むことができる、または脱塩基ヌクレオシドであり得る。代表的な修飾ヌクレオシドの１つのグループには、限定されないが、置換ヌクレオシド（２’、５’および／または４’置換ヌクレオシドなど）、４’−Ｓ−修飾ヌクレオシド（４’−Ｓ−リボヌクレオシド、４’−Ｓ−２’−デオキシリボヌクレオシドおよび４’−Ｓ−２’−置換リボヌクレオシドなど）、二環修飾ヌクレオシド（例えば、糖部分が２’−Ｏ−ＣＨＲａ−４’架橋基を有し、ＲａがＨ、アルキルまたは置換アルキルである二環ヌクレオシドなど）、および塩基修飾ヌクレオシドが含まれる。糖は、例えば、５’置換をさらに含む二環修飾ヌクレオシドまたは２’置換基をさらに含む５’もしくは４’置換ヌクレオシドなどの列挙されるこれらの修飾の２つ以上で修飾され得る。修飾ヌクレオシドという用語はまた、塩基および糖修飾ヌクレオシドなどのこれらの修飾の組み合わせも含む。他の修飾が当技術分野で知られており、また本明細書に記載される修飾ヌクレオシドについての可能な修飾として想起されるので、これらの修飾は例示であり、網羅的なものではないことが意図されている。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「モノマーサブユニット」という用語は、β−Ｄ−リボヌクレオシド、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシド、置換ヌクレオシド（２’、５’およびビス置換ヌクレオシド）、４’−Ｓ−修飾ヌクレオシド（４’−Ｓ−リボヌクレオシド、４’−Ｓ−２’−デオキシリボヌクレオシドおよび４’−Ｓ−２’−置換リボヌクレオシドなど）、二環修飾ヌクレオシド（糖部分が２’−Ｏ−ＣＨＲａ−４’架橋基を有し、ＲａがＨ、アルキルまたは置換アルキルである二環ヌクレオシドなど）、他の修飾ヌクレオシドを含む修飾ヌクレオシド、ヌクレオシド模倣物、糖代替物を有するヌクレオシド、ならびに本明細書で提供される三環ヌクレオシドなどのモノマーサブユニットを含む、ある好ましい一覧を有する、オリゴマー合成に修正可能な全ての様式のモノマーサブユニットを含むことが意図されている。
【００９０】
多くの他の単環、二環および三環環系が当技術分野で知られており、本明細書で提供されるオリゴマー化合物に組み込むためのヌクレオシドを修飾するために使用することができる糖代替物として適している（例えば、総説：Ｌｅｕｍａｎｎ、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｊ．Ｂｉｏｏｒｇ．＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００２、１０、８４１〜８５４参照）。このような環系は、種々の追加の置換を受けて、その活性をさらに強化することができる。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「反応性リン」という用語は、例えば、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含むヌクレオシド間結合を形成するのに有用であるオリゴマー化合物にさらに結合させることができるモノマーサブユニットに共有結合した基を含むことが意図されている。このような反応性リン基は、当技術分野で知られており、それだけに限らないが、ホルホロアミダイト、Ｈ−ホスホネート、ホスフェートトリエステルおよびリン含有キラル補助剤を含むＰＩＩＩまたはＰＶ原子価状態のリン原子を含有する。特定の実施形態では、反応性リン基は、ジイソプロピルシアノエトキシホスホロアミダイト（−Ｏ＊−Ｐ［Ｎ［（ＣＨ（ＣＨ３）２］２］Ｏ（ＣＨ２）２ＣＮ）およびＨ−ホスホネート（−Ｏ＊−Ｐ（＝Ｏ）（Ｈ）ＯＨ）（Ｏ＊はモノマーについてマーカッシュ群から提供される）から選択される。好ましい合成固相合成は、反応性ホスファイトとしてホルホロアミダイト（ＰＩＩＩ化学）を利用する。中間体ホスファイト化合物を、その後既知の方法を使用してホスフェートまたはチオホスフェート（ＰＶ化学）に酸化して、ホスホジエステルまたはホスホロチオエートヌクレオシド間結合を得る。追加の反応性ホスフェートおよびホスファイトは、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ３０９（ＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９２、４８、２２２３〜２３１１）に開示されている。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、複数の結合したヌクレオシドを含む化合物を指す。特定の実施形態では、複数のヌクレオシドの１つまたは複数が修飾されている。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つもしくは複数のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）および／またはデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）を含む。
【００９３】
「オリゴヌクレオシド」という用語は、リン原子を有さないヌクレオシド間結合により連結された一連のヌクレオシドを指す。この種のヌクレオシド間結合は、短鎖アルキル、シクロアルキル、混合ヘテロ原子アルキル、混合ヘテロ原子シクロアルキル、１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子含有および１つまたは複数の短鎖複素環を含む。これらのヌクレオシド間結合には、限定されないが、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、アセチル、ホルムアセチル（ｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、アルケニル、スルファメート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート、スルホンアミド、アミドならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を有するその他が含まれる。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「オリゴマー化合物」という用語は、結合したモノマーサブユニットの連続した配列を指す。各結合したモノマーサブユニットは通常、複素環塩基部分を含むが、モノマーサブユニットにはまた脱塩基モノマーサブユニットなどの複素環塩基部分を含まないものも含まれる。オリゴマー化合物中の、本質的に全てではない場合、少なくともいくつかおよび一般的にはほとんどの複素環塩基が、核酸分子、通常は予め選択されたＲＮＡ標的にハイブリダイズすることができる。そのため、「オリゴマー化合物」という用語は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体およびオリゴヌクレオシドを含む。この用語はまた、１つもしくは複数のヌクレオシド模倣物およびまたは糖代替基を有するヌクレオシドを有するポリマーも含む。
【００９５】
特定の実施形態では、オリゴマー化合物が、独立に、天然ヌクレオシド、非天然ヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、ヌクレオシド模倣物、および糖代替物基を有するヌクレオシドから選択される複数のモノマーサブユニットを含む。特定の実施形態では、オリゴマー化合物が単鎖である。特定の実施形態では、オリゴマー化合物が、二本鎖二重鎖を含む二本鎖である。特定の実施形態では、オリゴマー化合物が、１つまたは複数の共役基および／または末端基を含む。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド間結合」または「ヌクレオシド間結合基」という用語は、それだけに限らないが、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートなどのリン含有ヌクレオシド間結合基、ならびにホルムアセチルおよびメチレンイミノなどの非リン含有ヌクレオシド間結合基を含む当技術分野で知られている全ての様式のヌクレオシド間結合基を含むことが意図されている。ヌクレオシド間結合はまた、リン原子が必ずしも存在しない、アミド−３（３’−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−５’）、アミド−４（３’−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−５’）およびメチルホスホネートなどの中性非イオン性ヌクレオシド間結合も含む。
【００９７】
特定の実施形態では、修飾、例えば、非天然ヌクレオシド間結合を含有する１つまたは複数のヌクレオシド間結合を有する本明細書で提供されるオリゴマー化合物を調製することができる。２つの主要なクラスのヌクレオシド間結合は、リン原子の存在または不在により定義される。リン原子を有する修飾ヌクレオシド間結合には、限定されないが、通常の３’−５’結合を有するホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホロアミデート（３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含む）、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、ならびに１つまたは複数のヌクレオチド間結合が３’−３’、５’−５’または２’−２’結合である逆極性を有するものが含まれる。逆極性を有するオリゴヌクレオチドは、３’−末端側ヌクレオチド間結合に単一の３’−３’結合、すなわち、脱塩基であり得る単一の逆ヌクレオシド残基（核酸塩基が欠損しているまたはその代わりに水酸基を有する）を含むことができる。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。
【００９８】
特定の実施形態では、１つまたは複数の非リン含有ヌクレオシド間結合を有する本明細書で提供されるオリゴマー化合物を調製することができる。このようなオリゴマー化合物には、限定されないが、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、あるいは１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環ヌクレオシド間結合により形成されるものが含まれる。これらには、シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を有するその他を有するものが含まれる。
【００９９】
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、限定されないが、その特定のものは本出願と所有者が共通であり、その各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５０３４５０６号明細書；第５１６６３１５号明細書；第５１８５４４４号明細書；第５２１４１３４号明細書；第５２１６１４１号明細書；第５２３５０３３号明細書；第５２６４５６２号明細書；第５２６４５６４号明細書；第５４０５９３８号明細書；第５４３４２５７号明細書；第５４６６６７７号明細書；第５４７０９６７号明細書；第５４８９６７７号明細書；第５５４１３０７号明細書；第５５６１２２５号明細書；第５５９６０８６号明細書；第５６０２２４０号明細書；第５６０８０４６号明細書；第５６１０２８９号明細書；第５６１８７０４号明細書；第５６２３０７０号明細書；第５６６３３１２号明細書；第５６３３３６０号明細書；第５６７７４３７号明細書；第５６７７４３９号明細書；第５６４６２６９号明細書および第５７９２６０８号明細書が含まれる。
【０１００】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴマー化合物を、１つまたは複数の共役基の共有結合により修飾することができる。一般に、共役基は、結合したオリゴマー化合物の１つまたは複数の特性を修飾する。このようなオリゴヌクレオチド特性には、限定されないが、薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞取り込み、電荷およびクリアランスが含まれる。共役基は、化学分野で日常的に使用されており、オリゴマー化合物などの親分子に直接または任意の結合部分もしくは結合基を介して結合される。共役基の好ましい一覧には、限定されないが、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび染料が含まれる。
【０１０１】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴマー化合物を、１つまたは複数の末端基を５’または３’−末端基に共有結合することにより修飾することができる。末端基を、オリゴマー化合物の末端の１つで任意の他の位置で結合させることもできる。本明細書で使用される場合、「５’−末端基」、「３’−末端基」、「末端基」という用語およびこれらの組み合わせは、それだけに限らないが、オリゴマー化合物の追跡を可能にする（蛍光標識または他のレポーター基）、オリゴマー化合物の薬物動態または薬力学を改善する（例えば、取り込みおよび／または送達など）、あるいはオリゴマー化合物の１つまたは複数の他の望ましい特性を強化する（ヌクレアーゼ安定性または結合親和性を改善するための基）などの種々の目的のために、それぞれオリゴマー化合物の５’および３’−末端を含む末端の一方または両方に配置することができる、当業者に知られている有用な基を含むことが意図されている。特定の実施形態では、５’および３’−末端基には、限定されないが、修飾または未修飾ヌクレオシド；独立に、修飾されているまたは未修飾の２つ以上の結合したヌクレオシド；共役基；キャップ基；ホスフェート部分；および保護基が含まれる。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「ホスフェート部分」という用語は、ホスフェートならびに修飾ホスフェートを含む末端ホスフェート基を指す。ホスフェート部分は、いずれの末端に位置することもできるが、５’−末端ヌクレオシドが好ましい。一態様では、末端ホスフェートが未修飾であり、式−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）ＯＨを有する。別の態様では、末端ホスフェートは、ＯおよびＯＨ基の１つまたは複数がＨ、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）またはアルキル（ＲはＨ、アミノ保護基または未置換もしくは置換アルキルである）で置換されるように修飾される。特定の実施形態では、５’およびまたは３’末端基が、それぞれ独立に、未修飾である（ジもしくはトリ−ホスフェート）または修飾されている１〜３個のホスフェート部分を含むことができる。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「リン部分」という用語は、式：
2018109015.tif 000007
（式中、
ＲｘおよびＲｙはそれぞれ独立に、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル基、チオール、保護チオール基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、保護アミノまたは置換アミノであり；
ＲｚはＯまたはＳである）
を有する基を指す。
【０１０４】
オリゴマー合成中に安定性を維持するために、ホスホロアミダイトまたはＨ−ホスホネートなどのモノマーとして、保護リン部分が好ましい。オリゴマー化合物への組み込み後、リン部分は脱保護基を含むことができる。
【０１０５】
本明細書に含まれるリン部分を、オリゴマー化合物の調製に使用することができるモノマーに結合することができ、モノマーはＯ、Ｓ、ＮＲｄまたはＣＲｅＲｆ（式中、Ｒｄは限定されないが、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたは置換アシルを含み、ＲｅおよびＲｆはそれぞれ独立に、限定されないが、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシを含む）を使用して結合され得る。このような結合したリン部分には、限定されないが、ホスフェート、修飾ホスフェート、チオホスフェート、修飾チオホスフェート、ホスホネート、修飾ホスホネート、ホスホロアミデートおよび修飾ホスホロアミデートが含まれる。
【０１０６】
天然オリゴヌクレオチドと比べた、相対的な化学修飾オリゴマー化合物が相補的核酸鎖に結合する能力は、前記化学修飾オリゴマー化合物とその相補的未修飾標的核酸のハイブリダイゼーション複合体の融解温度を得ることにより測定される。二重螺旋の特徴的物理特性である融解温度（Ｔｍ）は、５０％の螺旋対コイル（ハイブリダイズしていない）形態が存在する摂氏度の温度を示す。Ｔｍ（一般的に結合親和性とも呼ばれる）は、ＵＶスペクトルを使用してハイブリダイゼーションの形成および破壊（融解）を決定することにより測定される。ハイブリダイゼーション中に起こる塩基の積み重ねは、ＵＶ吸収の減少（淡色性）を伴う。結果として、ＵＶ吸収の減少は高いＴｍを示す。
【０１０７】
化学修飾ヌクレオシドをアンチセンス化合物に組み込むことにより、アンチセンス化合物：ＲＮＡ標的二重鎖の相対的二重安定性を調節することができることが当技術分野で知られている。糖修飾ヌクレオシドは、アンチセンス化合物とその標的ＲＮＡのＴｍを調節する最も効率的な手段を提供する。Ｃ３’−エンド（ノーザン、ＲＮＡ様糖の歪み）配置の糖の集団を増加させるまたはロックする糖修飾ヌクレオシドは、相補的ＲＮＡ標的に対するアンチセンス化合物の１修飾当たりのＴｍ上昇を主にもたらす。Ｃ２’−エンド（サザン、ＤＮＡ様糖の歪み）配置の糖の集団を増加させるまたはロックする糖修飾ヌクレオシドは、相補的ＲＮＡ標的に対するアンチセンス化合物の１修飾当たりのＴｍ低下を主にもたらす。所与の糖修飾ヌクレオシドの糖の歪みは、ヌクレオシドが相補的ＲＮＡに対するアンチセンス化合物のＴｍを上昇または低下させる能力を指示する唯一の因子ではない。例えば、糖修飾ヌクレオシドトリシクロＤＮＡは、主にＣ２’−エンド配置であるが、１修飾当たり１．９〜３℃の相補的ＲＮＡに対するＴｍ上昇を与える。Ｃ３’−エンド配置を採用しない糖修飾高親和性ヌクレオシドの別の例は、α−Ｌ−ＬＮＡ（本明細書でさらに詳細に説明する）である。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「Ｔｍ」（融解温度）は、二重鎖核酸の２本鎖が分離する温度である。Ｔｍはしばしば、相補的ＲＮＡ分子に対するアンチセンス化合物の二重鎖安定性の尺度として使用される。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、核酸塩基に関連する「相補性」は、別の核酸塩基と塩基対形成することができる核酸塩基を指す。例えば、ＤＮＡでは、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と相補的である。例えば、ＲＮＡでは、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）と相補的である。特定の実施形態では、相補的核酸塩基は、その標的核酸の核酸塩基と塩基対形成することができるアンチセンス化合物の核酸塩基を指す。例えば、アンチセンス化合物の特定の位置の核酸塩基が、標的核酸の特定の位置の核酸塩基と水素結合することができる場合、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置がその核酸塩基対で相補的であるとみなされる。特定の修飾を含む核酸塩基、またはより広義には複素環塩基部分は、カウンターパート核酸塩基と対形成する能力を維持することができるので、なお相補性が可能である。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、核酸塩基に関連する「非相補的」は、互いに水素結合を形成しないしあるいはハイブリダイゼーションを支持しない核酸塩基の対を指す。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、結合したヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、オリゴマー化合物または核酸に関する「相補的」は、核酸塩基、またはより広義には複素環塩基を通して別のオリゴマー化合物または核酸にハイブリダイズするオリゴマー化合物の能力、相補性を指す。特定の実施形態では、アンチセンス化合物およびその標的は、各分子中の十分な数の対応する位置が互いに結合してアンチセンス化合物と標的との間で安定な会合を可能にすることができる核酸塩基で占められている場合に、互いに相補的である。当業者であれば、オリゴマー化合物が会合したままである能力を排除しないで、ミスマッチを含めることが可能であることを認識する。そのため、ミスマッチである（すなわち、標的の対応するヌクレオチドと相補的な核酸塩基でない）最大で約２０％のヌクレオチドを含むことができるアンチセンス化合物が本明細書で記載される。好ましくは、アンチセンス化合物は、約１５％以下、より好ましくは約１０％以下、最も好ましくは５％以下のミスマッチを含有する、またはミスマッチを含有しない。残りのヌクレオチドは、相補的核酸塩基である、またはハイブリダイゼーションを破壊しない（例えば、ユニバーサル塩基）。当業者であれば、本明細書で提供される化合物が、標的核酸と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％相補的であることを認識するだろう。
【０１１２】
オリゴマー化合物の配列が、特異的にハイブリダイズ可能になるためにその標的核酸の配列と１００％相補的である必要はないことが当技術分野で理解される。さらに、オリゴマー化合物は、介在性または隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように１つまたは複数のセグメントを超えてハイブリダイズすることができる（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）。特定の実施形態では、オリゴマー化合物が、標的化される標的核酸配列内の標的領域との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％の配列相補性を含むことができる。例えば、オリゴマー化合物の１８〜２０個の核酸塩基が標的領域と相補的であり、それゆえ、特異的にハイブリダイズするオリゴマー化合物は、９０％の相補性を示すだろう。この例では、残りの非相補的核酸塩基は、クラスター形成するまたは相補的核酸塩基に散在することができ、互いにも相補的核酸塩基とも隣接している必要はない。よって、標的核酸と完全な相補性の２つの領域が隣接した４個の非相補的核酸塩基を有する１８核酸塩基長のオリゴマー化合物は、標的核酸と７７．８％の全体的相補性を有するので、この範囲に入るだろう。オリゴマー化合物と標的核酸の領域の相補性％は、当技術分野で知られているＢＬＡＳＴプログラム（基本的局所的アラインメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０、２１５、４０３〜４１０；ＺｈａｎｇおよびＭａｄｄｅｎ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１９９７、７、６４９〜６５６）を使用して日常的に決定することができる。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」は、相補的オリゴマー化合物（例えば、アンチセンス化合物およびその標的核酸）の対形成を指す。特定の機構に限定されないが、対形成の最も一般的な機構は、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（核酸塩基）間の、ワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型水素結合であり得る、水素結合を伴う。例えば、天然塩基アデニンは、水素結合の形成を通して対形成する天然核酸塩基チミジンおよびウラシルと相補的な核酸塩基である。天然塩基グアニンは、天然塩基シトシンおよび５−メチルシトシンと相補的な核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは種々の状況下で起こり得る。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「標的核酸」は、アンチセンス化合物によってその発現、量または活性を調節することができる任意の核酸分子を指す。特定の実施形態では、標的核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。特定の実施形態では、標的ＲＮＡはｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、プリマイクロＲＮＡ、プレマイクロＲＮＡ、成熟マイクロＲＮＡ、プロモーター指向性ＲＮＡ（ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＲＮＡ）または天然アンチセンス転写産物である。例えば、標的核酸は、その発現が特定の障害または疾患状態に関連する細胞遺伝子（もしくは遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、または感染因子からの核酸分子であり得る。特定の実施形態では、標的核酸は、ウイルスまたは細菌核酸である。
【０１１５】
アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー（ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ｓｐｌｉｃｅｒ）、プライマー、プローブ、および標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズする他のオリゴマー化合物などのオリゴマー化合物が本明細書にさらに含まれる。よって、これらのオリゴマー化合物を、単鎖、二本鎖、環状またはヘアピンオリゴマー化合物の形態で導入することができ、これらの化合物は、内部もしくは末端バルジまたはループなどの構造要素を含有してもよい。いったん系に導入したら、本明細書で提供されるオリゴマー化合物は１つまたは複数の酵素または構造タンパク質の作用を誘発して標的核酸の修飾をもたらすことができる。あるいは、オリゴマー化合物は、占有率に基づく方法を通して活性標的核酸を阻害するので、標的核酸の活性を妨害することができる。
【０１１６】
このような酵素の１つの非限定的例には、ＲＮアーゼＨ、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼがある。「ＤＮＡ様」の単鎖オリゴマー化合物がＲＮアーゼＨを誘発することが当技術分野で知られている。そのため、ＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチド媒介阻害の効率を大いに強化する。同様の役割がＲＮアーゼＩＩＩおよび酵素のリボヌクレアーゼＬファミリーの酵素などの他のリボヌクレアーゼについても仮定されている。
【０１１７】
ある形態のオリゴマー化合物は単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであるが、多くの種で、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子などの二本鎖構造の導入が遺伝子またはその関連する遺伝子産物の機能の強力かつ特異的アンチセンス媒介低下を誘導することが示されている。この現象は植物と動物の両方で起こり、ウイルス防御およびトランスポゾンサイレンシングとの進化的関連を有すると考えられている。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、化合物の所望の活性を保持しているが、望ましくない毒物学的効果を与えない塩を指す。「薬学的に許容される塩」という用語は、無機または有機酸および塩基を含む、薬学的に許容される非毒性酸または塩基から調製した塩を含む。
【０１１９】
本明細書に記載されるオリゴマー化合物の薬学的に許容される塩は、当技術分野で周知の方法により調製され得る。薬学的に許容される塩の総説については、ＳｔａｈｌおよびＷｅｒｍｕｔｈ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ、２００２）を参照されたい。アンチセンスオリゴヌクレオチドのナトリウム塩が有用であり、ヒトへの治療的投与に十分に許容される。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載されるオリゴマー化合物がナトリウム塩の形態である。
【０１２０】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴマー化合物が、約８〜約８０個のモノマーサブユニット長を含む。当業者であれば、これが８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９もしくは８０個のモノマーサブユニット長またはその中の任意の範囲のオリゴマー化合物を具体化することを認識するだろう。
【０１２１】
オリゴマー化合物は、溶液相法と対照的に、固体支持体法を使用して日常的に調製される。固体支持体法を利用するオリゴマー化合物の調製に一般的に使用される商業的に入手可能な機器は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含むいくつかの販売業者により販売されている。当技術分野で知られているこのような合成のための任意の他の手段を追加でまたは代わりに使用してもよい。自動化合成技術を含む適当な固相技術は、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９１に記載されている。
【０１２２】
ＤＮＡおよび関連する類似体の合成に対してＲＮＡおよび関連する類似体の合成は、ＲＮＡ干渉およびマイクロＲＮＡの試みが増加するにつれて増加してきた。現在商業的に使用されている主要なＲＮＡ合成戦略には、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−［１（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］（ＦＰＭＰ）、２’−Ｏ−［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ｉＰｒ）３（ＴＯＭ）および５’−Ｏ−シリルエーテル−２’−ＡＣＥ（５’−Ｏ−ビス（トリメチルシロキシ）シクロドデシルオキシシリルエーテル（ＤＯＤ）−２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル（ＡＣＥ）が含まれる。現在ＲＮＡ産物を提供している主要な会社のいくつかの現在の一覧には、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、Ａｍｅｒｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．およびＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．が含まれる。１つの会社、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓは、特にＴＯＭおよびＴＢＤＭＳ化学とのカップリング時間を短縮すると宣伝されているＲＮＡ合成活性剤を市販している。商業的ＲＮＡ合成に使用されている主要な基には、ＴＢＤＭＳ：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル；ＴＯＭ：２’−Ｏ−［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル；ＤＯＤ／ＡＣＥ：（５’−Ｏ−ビス（トリメチルシロキシ）シクロドデシルオキシシリルエーテル−２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル；およびＦＰＭＰ：５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−［１（２−フルオロフェニル）−４−エトキシピペリジン−４−イル］がある。特定の実施形態では、上記ＲＮＡ合成戦略の各々を本明細書で使用することができる。特定の実施形態では、上記ＲＮＡ合成戦略を、例えば、ある戦略からの５’−保護基と別の戦略からの２’−Ｏ−保護を使用して、ハイブリッド様式で一緒に行うことができる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、「適当な標的セグメント」を選択されたタンパク質の発現を調節する追加のオリゴマー化合物についてのスクリーニングに使用することができる。「モジュレータ」は、タンパク質をコードする核酸分子の発現を低下または上昇させ、適当な標的セグメントと相補的な少なくとも８個の核酸塩基部分を含むオリゴマー化合物である。スクリーニング法は、タンパク質をコードする核酸分子の適当な標的セグメントを１種または複数の候補モジュレータと接触させるステップと、タンパク質をコードする核酸分子の発現を低下または上昇させる１種または複数の候補モジュレータを選択するステップとを含む。いったん単数または複数の候補モジュレータがペプチドをコードする核酸分子の発現を調節する（例えば、低下または上昇させる）ことができることが示されたら、モジュレータを本明細書において、ペプチドの機能のさらなる調査試験に、または研究、診断もしくは治療剤として使用するために使用することができる。マイクロＲＮＡを標的化したオリゴマー化合物の場合、候補モジュレータを、これらがマイクロＲＮＡ標的ＲＮＡまたはタンパク質の発現を上昇させる程度により評価することができる（マイクロＲＮＡの活性との干渉が、マイクロＲＮＡの１つまたは複数の標的の発現上昇をもたらすため）。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「発現」は、遺伝子が最終的にタンパク質をもたらす過程を指す。発現には、それだけに限らないが、転写、スプライシング、転写後修飾および翻訳が含まれる。
【０１２５】
適当な標的セグメントを、本明細書で提供されるそれぞれの相補的オリゴマー化合物と組み合わせて安定な二本鎖（二重鎖）オリゴヌクレオチドを形成してもよい。このような二本鎖オリゴヌクレオチド部分は、アンチセンス機構を介して標的発現を調節し、翻訳ならびにＲＮＡプロセシングを制御することが当技術分野で示されている。さらに、二本鎖部分を化学修飾に供してもよい（Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９１、８０６〜８１１；ＴｉｍｍｏｎｓおよびＦｉｒｅ、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９５、８５４；Ｔｉｍｍｏｎｓら、Ｇｅｎｅ、２００１、２６３、１０３〜１１２；Ｔａｂａｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２８２、４３０〜４３１；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、１５５０２〜１５５０７；Ｔｕｓｃｈｌら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１９９９、１３、３１９１〜３１９７；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２００１、４１１、４９４〜４９８；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、２００１、１５、１８８〜２００）。例えば、このような二本鎖部分は、二重鎖のアンチセンス鎖と標的の伝統的なハイブリダイゼーションによって標的を阻害し、それによって標的の酵素的分解を誘引することが示されている（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２、２９５、６９４〜６９７）。
【０１２６】
本明細書で提供されるオリゴマー化合物を、創薬および標的検証の分野にも適用することができる。特定の実施形態では、タンパク質と疾患状態、表現型または状態との間に存在する関係を解明するための創薬努力への本明細書で同定されるオリゴマー化合物および標的の使用が本明細書で提供される。これらの方法は、試料、組織、細胞または生物を本明細書で提供される１種または複数のオリゴマー化合物と接触させるステップと、処理後のある時点で標的の核酸またはタンパク質レベルならびに／あるいは関連する表現型のまたは化学的エンドポイントを測定するステップと、場合により測定値と無処理試料または本明細書で提供されるさらなるオリゴマー化合物で処理した試料と比較するステップとを含む、標的ペプチドを検出または調節するステップを含む。これらの方法を、他の実験と並行でまたは組み合わせて行って、標的検証の工程のために未知遺伝子の機能を決定する、あるいは特定の疾患、状態もしくは表現型の治療または予防のための標的としての特定の遺伝子産物の妥当性を決定することもできる。特定の実施形態では、治療に使用するためのオリゴマー化合物が提供される。特定の実施形態では、治療は標的メッセンジャーＲＮＡを減少させることである。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「用量」という用語は、単回投与で提供される医薬剤の特定量を指す。特定の実施形態では、用量が２回以上のボーラス、錠剤または注射で投与され得る。例えば、特定の実施形態では、皮下投与が望まれる場合、所望の用量は、単回注射によって容易に収容されない体積を要する。このような実施形態では、２回以上の注射を使用して所望の用量を達成してもよい。特定の実施形態では、用量が個体の注射部位反応を最小化するために２回以上の注射で投与され得る。
【０１２８】
特定の実施形態では、非修飾ＤＮＡよりも高い標的ＲＮＡに対する親和性を有し得る化学修飾オリゴマー化合物が本明細書で提供される。特定のこのような実施形態では、今度は高親和性が、低用量のこのような化合物の投与を可能にする効力の増加、毒性の可能性の減少、治療指数の改善および治療の全体的なコストの減少をもたらす。
【０１２９】
ヌクレオシド修飾のＲＮＡｉ活性に対する効果は、既存の文献（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２００１、４１１、４９４〜４９８；Ｎｉｓｈｉｋｕｒａら、Ｃｅｌｌ、２００１、１０７、４１５〜４１６；およびＢａｓｓら、Ｃｅｌｌ、２０００、１０１、２３５〜２３８）にしたがって評価される。
【０１３０】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴマー化合物を、診断、治療、予防のために、ならびに研究試薬およびキットとして利用することができる。さらに、絶妙な特異性で遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドが特定の遺伝子の機能を解明するため、または生物学的経路の種々の構成員の機能を識別するためにしばしば当業者によって使用される。特定の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴマー化合物を、細胞および組織内で発現している遺伝子の一部または補足物全体の発現パターンを解明するための層別および／または組み合わせ解析における手段として、単独でまたは他のオリゴマー化合物もしくは他の治療と組み合わせて利用することができる。オリゴマー化合物を、遺伝子増幅または検出をそれぞれ支持する条件下で、プライマーおよびプローブとして有効に使用することもできる。これらのプライマーおよびプローブは、タンパク質をコードする核酸分子の特異的検出を要する方法、および検出のためまたはさらなる試験に使用するための核酸分子の増幅に有用である。本明細書で提供されるオリゴマー化合物、特にプライマーおよびプローブと核酸のハイブリダイゼーションは、当技術分野で知られている手段により検出することができる。このような手段には、酵素とオリゴヌクレオチドの抱合、オリゴヌクレオチドの放射標識、または任意の他の適当な検出手段が含まれ得る。試料中の選択されたタンパク質のレベルを検出するためにこのような検出手段を使用するキットも調製され得る。
【０１３１】
１つの非限定的例として、本明細書で提供されるオリゴマー化合物の１種または複数で処理した細胞または組織内の発現パターンを、オリゴマー化合物で処理していない対照細胞または組織と比較し、生成したパターンは、例えば、調査する遺伝子の疾患関連性、シグナル伝達経路、細胞局在、発現レベル、サイズ、構造または機能に関係するので、これを遺伝子発現の異なるレベルについて分析する。これらの分析を、刺激または未刺激細胞で、ならびに発現パターンに影響を及ぼす他の化合物およびまたはオリゴマー化合物の存在または不在下で行うことができる。
【０１３２】
当技術分野で知られている遺伝子発現解析の方法の例としては、ＤＮＡアレイまたはマイクロアレイ（ＢｒａｚｍａおよびＶｉｌｏ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２０００、４８０、１７〜２４；Ｃｅｌｉｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２０００、４８０、２〜１６）、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の逐次解析）（Ｍａｄｄｅｎら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ、２０００、５、４１５〜４２５）、ＲＥＡＤＳ（消化されたｃＤＮＡの制限酵素増幅）（ＰｒａｓｈａｒおよびＷｅｉｓｓｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９９、３０３、２５８〜７２）、ＴＯＧＡ（全遺伝子発現解析）（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２０００、９７、１９７６〜８１）、プロテインアレイおよびプロテオミクス（Ｃｅｌｉｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２０００、４８０、２〜１６；Ｊｕｎｇｂｌｕｔら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１９９９、２０、２１００〜１０）、発現配列タグ（ＥＳＴ）配列決定（Ｃｅｌｉｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２０００、４８０、２〜１６；Ｌａｒｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０００、８０、１４３〜５７）、減算ＲＮＡフィンガープリント法（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  ＲＮＡ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ）（ＳｕＲＦ）（Ｆｕｃｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０００、２８６、９１〜９８；Ｌａｒｓｏｎら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、２０００、４１、２０３〜２０８）、減算クローニング、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）（ＪｕｒｅｃｉｃおよびＢｅｌｍｏｎｔ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０００、３、３１６〜２１）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（Ｃａｒｕｌｌｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．、１９９８、３１、２８６〜９６）、ＦＩＳＨ（蛍光インサイツハイブリダイゼーション）技術（ＧｏｉｎｇおよびＧｕｓｔｅｒｓｏｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９９、３５、１８９５〜９０４）および質量分析法（Ｔｏ，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ、２０００、３、２３５〜４１）が挙げられる。
【０１３３】
本開示を入手した当業者であれば、本明細書で開示される方法を実施するための本質的に任意の実行可能な長さの隣接配列の結合したモノマーサブユニットを含む、オリゴマー化合物を調製することができるだろう。このようなオリゴマー化合物は、本明細書で提供される少なくとも１つ、好ましくは複数の三環ヌクレオシドを含み、それだけに限らないが、ヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、糖代替物基を含むヌクレオシドおよびヌクレオシド模倣物を含む他のモノマーサブユニットを含んでもよい。
【０１３４】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴマー化合物を記載するように利用することができるが、以下の実施例は例示するために役立つにすぎず、限定することを意図していない。
【０１３５】
例えば、ｑ１、ｑ４、Ｔ１もしくはＴ２、またはＢｘ、またはＡ１、Ａ２、Ｘ、ｈもしくはｎについて与えられる選択肢のいずれかなどの単一の分離できる特徴についての選択肢が、本明細書において「実施形態」として割り付けられている場合はいつでも、このような選択肢を自由に組み合わせて本明細書に開示される本発明の別々の実施形態を形成してもよいことを理解すべきである。
【実施例】
【０１３６】
実施例（一般的方法）
１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルをそれぞれ３００ＭＨｚおよび７５ＭＨｚ  Ｂｒｕｋｅｒ分光計で記録した。
【０１３７】
ヌクレオシドホスホロアミダイトの合成
本明細書ならびにそれだけに限らないが、米国特許第６４２６２２０号明細書および国際公開第０２／３６７４３号パンフレットなどの当技術分野で示されている手順にしたがって、ヌクレオシドホスホロアミダイトの調製を行う。
【０１３８】
オリゴマー化合物の合成
本発明により使用するオリゴマー化合物は、固相合成を通して簡便にかつ日常的に製造することができる。
【０１３９】
オリゴマー化合物：未置換および置換ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴマー化合物を、ヨウ素による酸化を用いる標準的なホスホロアミダイト化学を使用して、自動化ＤＮＡ合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３９４）で合成することができる。
【０１４０】
特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（Ｐ＝Ｓ）を、以下を除いてホスホジエステルヌクレオシド間結合と同様に合成する：ホスファイト結合を酸化するために３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシドのアセトニトチル中１０％ｗ／ｖ溶液を利用して硫化を行う。硫化反応ステップ時間を１８０秒に増加し、通常のキャップ化ステップを先行させる。ＣＰＧカラムからの切断および５５℃での濃水酸化アンモニウム中でのデブロッキング（１２〜１６時間）後、１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ溶液から３倍体積超のエタノールで沈殿させることによりオリゴマー化合物を回収する。ホスフィネートヌクレオシド間結合は、米国特許第５５０８２７０号明細書に記載されているように調製することができる。アルキルホスホネートヌクレオシド間結合は、米国特許第４４６９８６３号明細書に記載されているように調製することができる。３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートヌクレオシド間結合は、米国特許第５６１０２８９号明細書または第５６２５０５０号明細書に記載されているように調製することができる。ホスホロアミダイトヌクレオシド間結合は、米国特許第５２５６７７５号明細書または米国特許第５３６６８７８号明細書に記載されているように調製することができる。アルキルホスホノチオエートヌクレオシド間結合は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２号明細書および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６号明細書（それぞれ、国際公開第９４／１７０９３号パンフレットおよび国際公開第９４／０２４９９号パンフレットとして公開されている）に記載されているように調製することができる。３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミデートヌクレオシド間結合は、米国特許第５４７６９２５号明細書に記載されているように調製することができる。ホスホトリエステルヌクレオシド間結合は、米国特許第５０２３２４３号明細書に記載されているように調製することができる。ボラノホスフェートヌクレオシド間結合は、米国特許第５１３０３０２号明細書および第５１７７１９８号明細書に記載されているように調製することができる。
【０１４１】
限定されないが、ＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドとも称されるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、ＭＤＨ結合オリゴヌクレオシドとも称されるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、アミド−３結合オリゴヌクレオシドとも称されるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、およびアミド−４結合オリゴヌクレオシドとも称されるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシドを含む１種または複数の非リン含有ヌクレオシド間結合を有するオリゴマー化合物、ならびに例えば、交互のＭＭＩおよびＰ＝ＯまたはＰ＝Ｓ結合を有する混合骨格オリゴマー化合物は、米国特許第５３７８８２５号明細書、第５３８６０２３号明細書、第５４８９６７７号明細書、第５６０２２４０号明細書および第５６１０２８９号明細書に記載されているように調製することができる。
【０１４２】
ホルムアセタールおよびチオホルムアセタールヌクレオシド間結合は、米国特許第５２６４５６２号明細書および第５２６４５６４号明細書に記載されているように調製することができる。エチレンオキシドヌクレオシド間結合は、米国特許第５２２３６１８号明細書に記載されているように調製することができる。
【０１４３】
オリゴマー化合物の単離および精製
制御細孔ガラス固体支持体または他の支持媒体からの切断および５５℃で１２〜１６時間の濃水酸化アンモニウム中でのデブロッキング後に、３倍体積超のエタノールによる１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃからの沈殿により、限定されないが、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドを含むオリゴマー化合物を回収する。合成したオリゴマー化合物をエレクトロスプレー質量分析（分子量測定）およびキャピラリーゲル電気泳動により分析する。合成で得られたホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の相対量を、−１６ａｍｕ産物（＋／−３２＋／−４８）に対する補正分子量の比により決定する。いくつかの試験のために、オリゴマー化合物を、Ｃｈｉａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１、２６６、１８１６２〜１８１７１に記載されているようにＨＰＬＣによって精製する。ＨＰＬＣ精製材料により得られる結果は、非ＨＰＬＣ精製材料により得られる結果と概して類似である。
【０１４４】
実施例１：化合物１０の調製
2018109015.tif 000008
化合物１を、Ｓｔｅｆｆｅｎｓら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、１９９７、８０、２４２６〜２４３９により公開されている手順にしたがって調製し、アノマー混合物（α：β＝４：１）として得た。ヨード酢酸エチルによるアルキル化によって、４種の異性体の混合物として化合物２が得られ、これをその後−７８℃でＬｉＨＤＭＳおよびＴＢＤＭＳ−Ｃｌで処理することによってシリルエノールエーテルに変換した。この段階で、アノマー混合物をカラムクロマトグラフィーにより分離した。３のα−アノマーをＥｔ２Ｚｎで処理すると、約３０％の対応するエピマーシクロプロパンと共に４が約４０％収率で得られた。次いで、化合物４をＴＭＳ−トリフレートによる処理によってグリカール５に変換した。過シリル化チミンによる５のＮＩＳ媒介ヌクレオシド化により、ヨードヌクレオシド６が立体特異的に得られ、これをその後Ｂｕ３ＳｎＨによるラジカル還元により三環ヌクレオシド７に脱ヨード化した。ピリジン中ＨＦによるシリル保護基の除去によって化合物８が得られ、これをその後トリチル化およびホスフィチル化すると所望のホスホロアミダイト１０が得られた。全ての構造をスペクトル分析により確認した。
【０１４５】
実施例２：
化合物１５の調製
2018109015.tif 000009
化合物７を実施例１に示すように調製した。ＫＯＨによる７の塩基性加水分解により酸１１が得られ、これをＦｍｏｃ保護アミノプロパノールおよび縮合剤ＥＤＣによる処理によって化合物１２に変換した。シリル保護基の除去、引き続くトリチル化およびホスフィチル化により、所望のホスホロアミダイト１５が得られた。全ての構造をスペクトル分析により確認した。
【０１４６】
実施例３
化合物１９の調製
化合物１１を実施例２に示すように調製し、ヘキサデカノールおよび縮合剤としてのＥＤＣにより化合物１６にエステル化した。ＨＦによる脱シリル化、引き続くＤＭＴ−Ｃｌによるトリチル化およびホスフィチル化により、所望のホスホロアミダイト１９が得られた。全ての構造をスペクトル分析により確認した。
2018109015.tif 000010
【０１４７】
実施例４
化合物２１の調製
化合物１１を実施例２に示すように調製し、単独保護１，３−ジアミノプロパンおよび縮合剤としてのＥＤＣにより化合物２０に変換した。ＨＦによる脱シリル化により化合物２１が得られた。全ての構造をスペクトル分析により確認した。
2018109015.tif 000011
【０１４８】
実施例５
オリゴマー化合物の調製
そのいくつかが本明細書で示されている当技術分野で周知の合成手順後、ＤＭＴホスホロアミダイトなどの実施例に示されているホスホロアミダイト化合物の１つまたは複数（化合物１０、化合物１５または化合物１９参照）を使用して、少なくとも１種の三環ヌクレオシドを有するオリゴマー化合物を調製する。
【０１４９】
実施例６
Ｔｍ試験のためのオリゴマー化合物の調製
標準的自動化ＤＮＡ合成プロトコル後、Ｔｍ試験のために１種または複数の三環ヌクレオシドを含むオリゴマー化合物を調製した。固体支持体からの切断後、オリゴマー化合物を、標準的手順を使用してイオン交換ＨＰＬＣにより精製し、ＬＣＭＳにより分析した。ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかと二重鎖化した際の、修飾１０ｍｅｒオリゴマー化合物のＴｍを、未修飾１０ｍｅｒＤＮＡオリゴヌクレオチドと比較した。
【０１５０】
吸光度対温度を測定するために、Ｃａｒｙ  Ｗｉｎ  ＵＶサーマルプログラムを備えるＣａｒｙ  １００  Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用してＴｍを測定した。Ｔｍの実験のために、オリゴマー化合物を、ｐＨ７の１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭホスフェート、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡの緩衝液中１．２μＭの濃度で調製した。８５℃で測定した濃度は、等体積の選択したオリゴマー化合物および相補的ＲＮＡまたはＤＮＡの混合後に１．２μＭであった。二重鎖を５分間で９０℃に加熱し、次いで、室温に冷却することにより、オリゴマー化合物を相補的ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズした。二重鎖溶液をキュベット中１５℃で始めて温度が８５℃になるまで０．５℃／分の速度で加熱しながら、分光光度計を使用してＴｍ測定値をとった。非自己相補配列を使用したファントホッフ計算（Ａ２６０対温度曲線）（二重鎖に関連する最小吸光度および非二重鎖単鎖に関連する最大吸光度を手動でプログラムに組み込む）を使用して、Ｔｍ値を測定した。
【０１５１】
配列番号  配列（５’から３’）  ΔＴｍ／ｍｏｄ(℃)  ΔＴｍ／ｍｏｄ(℃)
対ＤＮＡ              対ＲＮＡ
A01      AACTGTCACG                     0             0
A02      AACTGTbCACG                    -0.9          +0.4
A03      AACTGTdCACG                    +0.5          +2.1
A04      AACTbGTCACG                    +0.1          +2.4
A05      AACTdGTCACG                    +0.4          +2.4
A06      AACTbGTbCACG                   -0.7          +0.5
A07      AACTcGTcCACG                   -1.0          +1.3
A08      AACTdGTdCACG                   -0.6          +1.2
A09      AACTeGTeCACG                   -13.0         -10.2
A10      AACTfGTfCACG                   -2.0          +1.3
A11      AaAaCaTaGaTaCaAaCaGa           +1.3          +2.1
A12      AaAaCaTaGaTdCaAaCaGa           -2.8          -0.6
A13      AaAaCaTdGaTaCaAaCaGa           -3.8          -2.6
A14      AaAaCaTbGaTbCaAaCaGa           +1.1          +2.0
A15      AaAaCaTcGaTcCaAaCaGa           +1.1          +2.0
A16      AaAaCaTdGaTdCaAaCaGa           +1.1          +2.3
未修飾オリゴマー化合物Ａ０１のＴｍは、ＤＮＡまたはＲＮＡと二重鎖化するとそれぞれ４７．９℃および４８．３℃である。各ヌクレオシド間結合基はホスホジエステルである。添字を伴わない各ヌクレオシドは、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドであり、添字「ａ」〜添字「ｆ」を伴う各ヌクレオシドは、以下に定義される。
【０１５２】
2018109015.tif 000012
実施例７
ＨｅＬａ細胞への取り込み試験のためのオリゴマー化合物の調製
Ｈｅｌａ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ａｍｉｍｅｄ）、１００ユニット／ｍｌペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中３７℃で培養した。トランスフェクション実験のために、１×１０５個の細胞を、６ウェルプレートに２連で播種し、その半分はトランスフェクション２４時間前にカバーガラスを含有していた。次いで、培地を、配列５’−Ｔ−ｔ−Ｔ−ｔ−Ｔ−ｔ−Ｔ−ｔ−Ｔ−ｔ−ＦＡＭ−３’（Ｔはデオキシチミジンであり、ｔはｔｃｅｅＴ（実施例６の添字ｂ）、ｔｃｈｄＴ（実施例６の添字ｅ）またはｔｃＴ（実施例６の添字ａ）であり、ＦＡＭは６−カルボキシフルオレセインである）を有するオリゴヌクレオチドのＤＭＥＭ＋／＋（ＦＣＳ、Ｐ／Ｓ）中溶液（１０μＭ最終濃度）と交換した。
【０１５３】
トランスフェクション培地を３７℃で４８時間後に取り出し、細胞を２×１ｍｌＰＢＳで洗浄し、１ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ＋／＋に再懸濁した。パラホルムアルデヒド（１ｍｌ、ＰＢＳ中３．７％）の溶液を１０分間使用し、引き続いてＰＢＳ（２×１ｍｌ）により洗浄し、Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００（０．２％、Ｐｒｏｍｅｇａ）により細胞膜を１０分間透過処理し、ＰＢＳ（２×１ｍｌ）で洗浄することにより、カバーガラス上への細胞の固定を行った。カバーガラスを数滴のポリビニルアルコール（Ｍｏｗｉｏｌ）および核染色４０，６０−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で処理した。細胞をトランスフェクション４８時間後に蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ６０００Ｂ、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ；ソフトウェア：Ｌｅｉｃａ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅ）により分析した。
【０１５４】
2018109015.tif 000013
顕微鏡写真がｔｃｈｄＴ（実施例６の添字ｅ）を含有するオリゴヌクレオチドで処理した細胞のサイトゾルで強いフルオレセイン蛍光を示す一方で、ｔｃｅｅＴ（実施例６の添字ｂ）またはｔｃＴ（実施例６の添字ａ）を含有するオリゴヌクレオチドを使用した場合には、蛍光は観察されない。
【０１５５】
実施例８
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への取り込み試験のためのオリゴマー化合物の調製
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ａｍｉｍｅｄ）、１００ユニット／ｍｌペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中３７℃で培養した。トランスフェクション実験のために、２×１０５個の細胞を、６ウェルプレートに２連で播種し、その半分はトランスフェクション２４時間前にカバーガラスを含有していた。次いで、培地を、配列５’−Ｔ−ｔ−Ｔ−ｔ−Ｔ−ｔ−Ｔ−ｔ−Ｔ−ｔ−ＦＡＭ−３’（Ｔはデオキシチミジンであり、ｔは未修飾デオキシチミジン、ｔｃｅｅＴ（実施例６の添字ｂ）、ｔｃｈｄＴ（実施例６の添字ｅ）またはｔｃＴ（実施例６の添字ａ）であり、ＦＡＭは６−カルボキシフルオレセインである）を有するオリゴヌクレオチドのＤＭＥＭ＋／＋（ＦＣＳ、Ｐ／Ｓ）中溶液（１０μＭ最終濃度）と交換した。トランスフェクション培地を３７℃で４８時間後に取り出し、細胞を２×１ｍｌＰＢＳで洗浄し、１ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ＋／＋に再懸濁した。パラホルムアルデヒド（１ｍｌ、ＰＢＳ中３．７％）の溶液を１０分間使用し、引き続いてＰＢＳ（２×１ｍｌ）により洗浄し、Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００（０．２％、Ｐｒｏｍｅｇａ）により細胞膜を１０分間透過処理し、ＰＢＳ（２×１ｍｌ）で洗浄することにより、カバーガラス上への細胞の固定を行った。カバーガラスを数滴のポリビニルアルコール（Ｍｏｗｉｏｌ）および核染色４０，６０−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で処理した。細胞をトランスフェクション４８時間後に蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ６０００Ｂ、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ；ソフトウェア：Ｌｅｉｃａ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅ）により分析した。
【０１５６】
顕微鏡写真がｔｃｈｄＴ（実施例５の添字ｅ）を含有するオリゴヌクレオチドで処理した細胞のサイトゾルで強いフルオレセイン蛍光を示す一方で、ｔｃｅｅＴ（実施例５の添字ｂ）またはｔｃＴ（実施例５の添字ａ）を含有するオリゴヌクレオチドを使用した場合には、蛍光は観察されない。
【配列表】
2018109015000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月12日(2018.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。 
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月18日(2018.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ：
2018109015.tif 000018
（上式中、
−  Ｂｘは複素環塩基部分であり；
−  Ｔ１およびＴ２の一方はヒドロキシル（−ＯＨ）または保護ヒドロキシルであり、Ｔ１およびＴ２の他方はホスフェートまたは反応性リン基であり；
−  ｑ１、ｑ２、ｑ４およびｑ５はそれぞれ独立に、Ｈ、ＦまたはＣｌであり、
−  ｑ３は独立に、一般式−Ａ１−Ｘｈ−Ａ２−Ｙｎにより記載される基であり、ここで、
−  Ａ１はＣｋ−アルキル、Ｃｋ−アルケニルまたはＣｋ−アルキニルであり、ｋは０〜２０の範囲から選択される整数であり、
−  Ｘｈは−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＲ、−ＳＲまたは−ＮＲ２であり、各Ｒは独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アセチルおよび２−ヒドロキシエチルから選択され、ｈは０または１であり、
−  Ａ２はＣｉ−アルキル、Ｃｉ−アルケニルまたはＣｉ−アルキニルであり、ｉは０〜２０の範囲から選択される整数であり、
−  Ｙは−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、＝Ｏ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋、ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＳＣＮ、−ＣＯＲ、−ＣＯ２Ｒ、ＣＯＮＲ２、−Ｒから選択される、Ａ１および／またはＡ２上の任意の炭素原子に結合した置換基群であり、各Ｒは独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アセチルおよび２−ヒドロキシエチルから選択され、ｎは０、１、２、３、４、５または６であり、
−  ｋ＋ｉは少なくとも１に等しく、
−  ｑ３、ｑ４およびｑ５の残りのものは独立に、Ｈ、ＦまたはＣｌであり、
−  ｚ１およびｚ２の一方はＨであり、ｚ１およびｚ２の他方はＨ、−ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＯＣＨ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＦ３、ＯＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２、ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２またはＯＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２である）
により記載される三環ヌクレオシド。
【請求項２】
Ｂｘがウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンまたはグアニンである、請求項１に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項３】
Ｔ１がヒドロキシルまたは保護ヒドロキシルであり、Ｔ２がＨ−ホスホネートまたはホスホロアミダイトから選択される反応性リン基である、請求項１または２に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項４】
Ｔ１が４，４’−ジメトキシトリチルであり、Ｔ２がジイソプロピルシアノエトキシホスホロアミダイトまたは制御細孔ガラス面である、請求項１から３のいずれか一項に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項５】
ｋが３〜１６の整数であり、ｈが０であり、ｉが０であり、ｎが１、２または３である、請求項１から４のいずれか一項に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項６】
ｋが１であり、ｈが１であり、Ｘが−Ｏ−、ＣＯＯ−、ＣＯＮＨ−またはＣＯＮＲ−であり、ｉが３〜１６の整数であり、ｎが１、２または３である、請求項１から４のいずれか一項に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項７】
ｎが１であり、ＹがＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＮＲ３＋およびＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択され、Ｒが上に定義される意味を有する、請求項５または６に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項８】
Ｙがω位にある、請求項７に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項９】
ｉ＋ｋの和が３〜１６、又は３〜１２、又は５〜１０から選択される整数である、請求項１から８のいずれか一項に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項１０】
Ａ１がＣＨ２であり、ｈが１であり、Ｘｈが−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、Ａ２がＣ２〜Ｃ１６アルキルであり、ＹｎがＮＨ２であり、ｎが０または１である、請求項１から９のいずれか一項に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項１１】
Ａ１がＣＨ２である、請求項１に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項１２】
ｋが０である、請求項１に記載の三環ヌクレオシド。
【請求項１３】
2018109015.tif 000019
（式中、Ｂｘはウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンおよびグアニンから選択される）からなる群から選択される、三環ヌクレオシド。
【請求項１４】
少なくとも１種の請求項１から１３のいずれか一項に記載の三環ヌクレオシドを含むオリゴマー化合物であって、８〜４０個のモノマーサブユニットを含むオリゴマー化合物。
【請求項１５】
各Ｂｘが独立に、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニンまたはグアニンである、請求項１４に記載のオリゴマー化合物。
【請求項１６】
各ヌクレオシド間結合基が独立に、ホスホジエステルヌクレオシド間結合基またはホスホロチオエートヌクレオシド間結合基である、請求項１４または１５に記載のオリゴマー化合物。
【請求項１７】
式ＩＩを有する少なくとも２個の隣接した三環ヌクレオシドを有する第１の領域を含む、請求項１４から１６のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。
【請求項１８】
少なくとも２個の隣接したモノマーサブユニットを有する第２の領域を含む、請求項１７に記載のオリゴマー化合物であって、前記第２の領域中の各モノマーサブユニットが前記第１の領域の式ＩＩの前記三環ヌクレオシドとは異なる修飾ヌクレオシドであるオリゴマー化合物。
【請求項１９】
前記第１の領域と第２の領域との間に位置する第３の領域をさらに含む、請求項１８に記載のオリゴマー化合物であって、前記第３の領域中の各モノマーサブユニットが独立に、前記第１の領域の式ＩＩの各三環ヌクレオシドおよび前記第２の領域の各モノマーサブユニットとは異なるヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドである、オリゴマー化合物。
【請求項２０】
１〜５個の隣接したモノマーサブユニットの外部領域が両側に隣接した６〜１４個の隣接したモノマーサブユニットの内部領域を有する間隙があるオリゴマー化合物を含む、請求項１４から１９のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物であって、各外部領域の各モノマーサブユニットが式ＩＩの三環ヌクレオシドであり、前記内部領域の各モノマーサブユニットが独立に、ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドであるオリゴマー化合物。
【請求項２１】
2018109015.tif 000020
（式中、Ｔ３およびＴ４は上で概説される意味を有する）から選択される１個または数個のヌクレオチドブロックを含む、請求項１４から２０のいずれか一項に記載のオリゴマー化合物。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチドの固相合成法への請求項１から１３のいずれか一項に記載の三環ヌクレオシドの使用。
【外国語明細書】
2018109015000001.pdf