(57)【要約】【課題】導入された２つの遺伝子を安定的に発現するとともに、両遺伝子の発現量比が所望の範囲に制御された細胞、及びその作製方法を提供する。【解決手段】細胞のゲノム上に１箇所のみ存在するターゲットサイトに、上流側から順に第１プロモーター、第１遺伝子、第２プロモーター、第２遺伝子をこの順で部位特異的に導入するステップを備える。第１遺伝子及び第２遺伝子の導入ステップでは、細胞の種類に応じて第１プロモーターと前記第２プロモーターの種類を変更することにより、細胞における第１遺伝子と第２遺伝子の発現量比を制御する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１遺伝子と第２遺伝子とを安定的に発現する哺乳類由来の細胞の作製方法であって、
前記細胞のゲノム上に１箇所のみ存在するターゲットサイトに、上流側から順に第１プロモーター、前記第１遺伝子、第２プロモーター、前記第２遺伝子をこの順で部位特異的に導入するステップを備え、
前記第１遺伝子及び第２遺伝子の導入ステップでは、前記細胞の種類に応じて前記第１プロモーターと前記第２プロモーターの種類を変更することにより、前記細胞における前記第１遺伝子と第２遺伝子の発現量比を制御する細胞の作製方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記第１遺伝子及び第２遺伝子の導入ステップでは、前記第１遺伝子及び前記第２遺伝子が導入された場合に転写干渉が見られるときには前記第２プロモーターとして前記第１プロモーターよりも強いプロモーターを用い、前記第１遺伝子及び前記第２遺伝子が導入された場合に転写干渉が見られないときには前記第１プロモーターと前記第２プロモーターとして互いに同じプロモーター又は同じ強さのプロモーターを用いることを特徴とする細胞の作製方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、
前記細胞は、HEK293細胞、CHO-K1細胞又はU2OS細胞であることを特徴とする細胞の作製方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１つにおいて、
前記第１遺伝子及び第２遺伝子の導入ステップでは、第１プロモーター、前記第１遺伝子、第２プロモーター及び前記第２遺伝子をこの順で含む配列と、配列番号４のR4 attBサイトとを有する遺伝子発現用ベクターを、R4インテグラーゼを用いて前記ターゲットサイトである配列番号５のR4 attP配列に導入することを特徴とする細胞の作製方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１つにおいて、
前記細胞は、HEK293細胞又はU2OS細胞であり、
前記第１プロモーターと前記第２プロモーターの組み合わせは、CMVプロモーターとフルレングスCMVプロモーター、EF1αプロモーターとCMVプロモーター、又はEF1αプロモーターとフルレングスCMVプロモーターであることを特徴とする細胞の作製方法。
【請求項６】
ゲノム上に１箇所のみターゲットサイトを備えた哺乳類由来の細胞内で遺伝子を発現させるための発現ベクターであって、
第１プロモーター、第１遺伝子、第２プロモーター及び第２遺伝子がこの順で連続して配置されるとともに、前記ターゲットサイトと部位特異的組み換えが可能な配列を備え、
前記第２プロモーターは、前記第１プロモーターよりも強いプロモーターである発現ベクター。
【請求項７】
請求項６において、
前記第１プロモーターと前記第２プロモーターの組み合わせは、CMVプロモーターとフルレングスCMVプロモーター、EF1αプロモーターとCMVプロモーター、又はEF1αプロモーターとフルレングスCMVプロモーターであることを特徴とする発現ベクター。
【請求項８】
ゲノム上に遺伝子を導入可能なターゲットサイトを１箇所のみ備えた哺乳類由来の細胞であって、
前記ターゲットサイトには、上流側から順に第１プロモーター、第１遺伝子、第２プロモーター、第２遺伝子がこの順で挿入されており、
前記第１遺伝子及び前記第２遺伝子を安定的に発現しており、
前記第２プロモーターは、前記第１プロモーターよりも強いプロモーターである細胞。
【請求項９】
請求項８において、
HEK293細胞又はU2OS細胞の形質転換細胞であり、
前記第１プロモーターと前記第２プロモーターの組み合わせは、CMVプロモーターとフルレングスCMVプロモーター、EF1αプロモーターとCMVプロモーター、又はEF1αプロモーターとフルレングスCMVプロモーターであることを特徴とする細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示された技術は、導入された少なくとも２つの遺伝子が安定して発現する哺乳類由来細胞株の作製に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトやモデル生物の遺伝子を培養細胞に導入して、その遺伝子の発現産物の作用を調べることは、遺伝子機能の解析手法として頻繁に行われている。
【０００３】
非特許文献１には、ファージφC31由来のインテグラーゼを用いて発現ベクターに組み込まれた遺伝子を哺乳類細胞の特定位置に導入することが記載されている。この技術によれば、遺伝子の導入によって細胞に内在する遺伝子を破壊すること等を防ぐとともに、導入された遺伝子の発現量を制御しやすくなる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Bhaskar, S. et al., 2001. Site-specific genomic integration in mammalian cells mediated by phage φC31 integrase. Molecular and cellular biology, 21(12), 3926-3934.
【非特許文献２】Sasaki, Y. et al., 2004. Evidence for high specificity and efficiency of multiple recombination signals in mixed DNA cloning by the Multisite Gateway system. Journal of biotechnology, 107, 233-243.
【非特許文献３】Keith E. Shearwin et al, 2005. Transcriptional interference - a crash course. Trends Genet., 21(6), 339-345
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、相互関係を有するタンパク質や、２種類以上のサブユニットから構成される多量体タンパク質の機能解析を行うために、１つの細胞に複数の遺伝子を導入し、細胞内でこれらの遺伝子を発現させることが行われている。非特許文献２には、部位特異的反応を利用して複数の遺伝子を簡便に連結して発現ベクターを構築する技術が記載されている。非特許文献１、２に記載された技術を用いれば、細胞のゲノムの特定箇所に複数の遺伝子を導入することができる。
【０００６】
ところが、このように、複数の遺伝子を並べて導入する場合、下流側に位置する遺伝子の発現量が上流側に位置する遺伝子に比べて著しく低くなる「転写干渉」と呼ばれる現象が起きることがある（非特許文献３参照）。例えば２つの遺伝子を含む発現ベクターを用いて遺伝子を導入する場合、転写干渉が生じると２つの遺伝子間で発現量比を所望の値にすることが非常に難しくなる。
【０００７】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、その目的は、導入された２つの遺伝子を安定的に発現するとともに、両遺伝子の発現量比が所望の範囲に制御された細胞、及びその作製方法を提供することにある
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書に開示された細胞の作製方法は、第１遺伝子と第２遺伝子とを安定的に発現する哺乳類由来の細胞の作製方法であって、前記細胞のゲノム上に１箇所のみ存在するターゲットサイトに、上流側から順に第１プロモーター、前記第１遺伝子、第２プロモーター、前記第２遺伝子をこの順で部位特異的に導入するステップを備え、前記第１遺伝子及び第２遺伝子の導入ステップでは、前記細胞の種類に応じて前記第１プロモーターと前記第２プロモーターの種類を変更することにより、前記細胞における前記第１遺伝子及び第２遺伝子の発現量比を制御する。
【０００９】
本明細書に開示された発現ベクターは、ゲノム上に１箇所のみターゲットサイトを備えた哺乳類由来の細胞内で遺伝子を発現させるための発現ベクターであって、第１プロモーター、第１遺伝子、第２プロモーター及び第２遺伝子がこの順で連続して配置されるとともに、前記ターゲットサイトと部位特異的組み換えが可能な配列を備え、前記第２プロモーターは、前記第１プロモーターよりも強いプロモーターである。
【００１０】
本明細書に開示された細胞は、ゲノム上に遺伝子を導入可能なターゲットサイトを１箇所のみ備えた哺乳類由来の細胞であって、前記ターゲットサイトには、上流側から順に第１プロモーター、第１遺伝子、第２プロモーター、第２遺伝子がこの順で挿入されており、前記第１遺伝子及び前記第２遺伝子を安定的に発現しており、前記第２プロモーターは、前記第１プロモーターよりも強いプロモーターである。
【発明の効果】
【００１１】
本明細書に開示された細胞の作製方法及び作製された細胞によれば、導入された２つの遺伝子の発現量比を所望の範囲に制御しうる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、第１の実施形態に係る細胞の作製方法を示すフローチャート図である。
【図２】図２は、第１の実施形態に係る細胞の作製方法で用いられるプロモーターの一例を示す図である。
【図３】図３は、第１の実施形態に係る発現ベクターの構築方法を示す図である。
【図４】図４は、デスティネーションベクターの一例であるpJTI R4 DESTの構成を示すベクターマップ図である。
【図５】図５は、２つの遺伝子を安定して発現する細胞の作製方法を模式的に示す図である。
【図６】図６は、第２の実施形態に係る発現ベクターの構築方法を示す図である。
【図７】図７は、発現ベクターの構築方法において用いられるドナーベクターpDONR221-P1P5rの構成を示すベクターマップ図である。
【図８】図８は、発現ベクターの構築方法において用いられるドナーベクターpDONR221-P5P2の構成を示すベクターマップ図である。
【図９】図９は、１種類の遺伝子が導入されたHEK293細胞（すなわち293細胞）を示す顕微鏡写真図である。
【図１０】図１０は、２種類の遺伝子が導入された293細胞を示す顕微鏡写真図である。
【図１１】図１１は、作製された293-A細胞株〜293-K細胞株についてmRNAの定量結果を示す図である。
【図１２】図１２は、１種類の遺伝子が導入されたCHO-K1細胞（すなわちCHO細胞）を示す顕微鏡写真図である。
【図１３】図１３は、２種類の遺伝子が導入されたCHO細胞を示す顕微鏡写真図である。
【図１４】図１４は、作製されたCHO-A細胞株〜CHO-K細胞株についてmRNAの定量結果を示す図である。
【図１５】図１５は、１種類の遺伝子が導入されたU2OS細胞を示す顕微鏡写真図である。
【図１６】図１６は、２種類の遺伝子が導入されたU2OS細胞を示す顕微鏡写真図である。
【図１７】図１７は、作製されたU2OS-A細胞株〜U2OS-I細胞株についてmRNAの定量結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
−発明に至る経緯−
非特許文献１、２に記載された方法において、細胞に導入された遺伝子は、ゲノム上の複数の特定位置（偽att Pサイト）に組み込まれる。これらの方法では、複数の偽att Pサイトのうち、どこに遺伝子が導入されるのかを制御することができない。遺伝子の発現量は、当該遺伝子が組み込まれたゲノム上の位置によって変わるので、非特許文献１、２に記載された技術を用いて２つの遺伝子の発現量比を所望の範囲に制御することは非常に困難であると考えられた。また、これらの方法によって、性質が均一な細胞を得ようとすると、別途スクリーニング工程が必要になる場合がある。
【００１４】
このため、本願発明者らは、ゲノム上の１箇所にのみ部位特異的に遺伝子を導入することができるシステム（図５参照）を用いることを考えた。このシステムを用いることで、導入された遺伝子の発現量のばらつきが少なく、且つ均一な性質の安定発現細胞が得られると期待された。
【００１５】
しかし、当該システムを用いた場合でも、２つの遺伝子を同時に細胞に導入すると転写干渉が見られることが分かった。
【００１６】
一方で、細胞の種類によっては、転写干渉が見られない場合もある。
【００１７】
本願発明者らは、上記の検討に基づいて、導入された２つの遺伝子間で発現量比が所望の範囲に制御された細胞を得ることができる方法に、独自に想到した。
【００１８】
−実施形態−
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用物あるいはその用途を制限することを意図するものではない。
【００１９】
（第１の実施形態）
＜安定発現細胞の作製方法＞
図１〜図５を用いて、第１の実施形態に係る細胞の作製方法と、当該方法により作製された細胞とを説明する。本実施形態では、図５に示すように、部位特異的組み換えを用いて、細胞のゲノム上に１箇所のみ設けられたターゲティングサイトに、２つの遺伝子を含むＤＮＡ配列を導入するシステムを用いる。
【００２０】
本実施形態の方法は、第１遺伝子と第２遺伝子とを安定的に発現する哺乳類由来の細胞の作製方法である。本方法では、R4インテグラーゼ等の酵素を用いて、哺乳類由来の細胞のゲノム上のインテグラーゼの認識サイトを含むターゲティングサイトに、上記遺伝子を導入する。哺乳類由来であれば使用する細胞の起源は特に限定されないが、ヒト胎児腎由来のHEK293細胞（以下、「293細胞」と略記）、チャイニーズハムスター卵巣由来のCHO-K1細胞（以下、「CHO細胞」と略記）又はヒト骨肉腫由来のU2OS細胞等の細胞株であれば、ターゲットサイトが導入された市販品を利用できるので、好ましい。
【００２１】
ただし、用途に応じてこれら以外の細胞株や、初代培養細胞のゲノムにR4 attP配列等の部位特異的組み換えが可能なターゲットサイトを導入した細胞を用いてもよい。R4等、インテグラーゼの認識サイトを含むターゲットサイトの導入は、例えばBP反応を行うインテグラーゼを用いて行うことができる。
【００２２】
本実施形態の方法は、ターゲットサイトに、上流側から順に第１プロモーター、第１遺伝子、第２プロモーター、第２遺伝子を含む配列をこの順で部位特異的に導入するステップを備えている。遺伝子を導入する際には、第１プロモーター、第１遺伝子、第２プロモーター、第２遺伝子をこの順で含む配列がクローニングサイトに導入された発現ベクターを用いる。
【００２３】
本実施形態の方法では、第１遺伝子及び第２遺伝子を細胞に導入する際に、当該細胞の種類に応じて第１遺伝子用の第１プロモーターと、第２遺伝子用の第２プロモーターの種類を変更することにより、細胞における第１遺伝子と第２遺伝子の発現量比を所望の範囲に制御可能である。以下、本実施形態の方法をより詳細に説明する。
【００２４】
図１は、第１の実施形態に係る細胞の作製方法を示すフローチャート図である。
【００２５】
同図のステップS１に示すように、本実施形態の方法においては、細胞のターゲットサイトに上流側から「第１プロモーター−第１遺伝子−第２プロモーター−第２遺伝子」のDNA配列を導入した場合に、転写干渉が発生するか否かを確認する。
【００２６】
具体的には、まず「第１プロモーター−第１遺伝子」、「第２プロモーター−第２遺伝子」及び「第１プロモーター−第１遺伝子−第２プロモーター−第２遺伝子」のそれぞれのDNA配列がターゲットサイトに導入された細胞を作製する。
【００２７】
そして、「第１プロモーター−第１遺伝子」が導入された細胞における第１遺伝子の発現量を１とした場合の「第１プロモーター−第１遺伝子−プロモーター−第２遺伝子」が導入された細胞における第１遺伝子の発現量をAとし、「第２プロモーター−第２遺伝子」が導入された細胞における第２遺伝子の発現量を１とした場合の「第１プロモーター−第１遺伝子−第２プロモーター−第２遺伝子」が導入された細胞における第２遺伝子の発現量をBとするとき、統計上有意にA＞Bとなっていれば、転写干渉が発生していると判断する。
【００２８】
本ステップでは、公知のリアルタイムPCRを用いて測定された細胞内でのmRNA量を遺伝子の発現量として用いる。なお、転写干渉が生じるか否かが既知である場合には、本ステップを省略してもよい。
【００２９】
次に、ステップS１で転写干渉が発生していると判断された場合、第２プロモーターとして第１プロモーターよりも強いプロモーターを選択し、「第１プロモーター−第１遺伝子−第２プロモーター−第２遺伝子」が導入された発現ベクターを用いて細胞を形質転換する。
【００３０】
ここで、プロモーターの強さは、当該細胞のターゲットサイトにプロモーターと１つの遺伝子とで構成された配列を単独で組み込んだ場合の、細胞内での当該遺伝子のmRNA量に基づいて判断するものとする。従って、プロモーターの強さは形質転換される細胞の種類によっても変わりうる。
【００３１】
本ステップで用いられる第１プロモーターと第２プロモーターの組み合わせとしては、例えばサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター（配列番号１）とフルレングスCMVプロモーター（配列番号２）、EF1αプロモーターとCMVプロモーター、EF1αプロモーターとフルレングスCMVプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。なお、EF1αプロモーターは、CMVプロモーター及びフルレングスCMVプロモーターよりも弱いプロモーターである。
【００３２】
図２に示すように、フルレングスCMVプロモーターは、CMVプロモーターの下流側に、転写開始点を含む９２塩基分の配列（下線部分）が付加されたプロモーターである。このように、強力なプロモーターと、当該プロモーターのうちの転写活性を有する一部からなるプロモーターとの組み合わせであれば、プロモーターの強さを予測しやすいので、より好ましい。一方で、塩基配列が全く異なるプロモーターを適切に組み合わせる場合には、第１遺伝子と第２遺伝子の発現量の比率をより所望の値に近づけることが可能となる。公知のプロモーターであっても、形質転換される細胞の種類によって遺伝子の発現促進効果が異なる場合があるので、プロモーターの強弱を判断する際には、実際にプロモーターを付加した遺伝子を導入して遺伝子の発現量を確認することが好ましい。
【００３３】
次に、ステップS２で転写干渉が見られない場合は、第１プロモーターと第２プロモーターとして互いに同じプロモーター、又は同等の強さを有するプロモーターを選択し、「第１プロモーター−第１遺伝子−第２プロモーター−第２遺伝子」が導入された発現ベクターを用いて細胞を形質転換する。
【００３４】
以上の方法によれば、293細胞やU2OS細胞など、転写干渉が見られる細胞では、転写干渉の影響を効果的に緩和して、下流側に導入された第２遺伝子の発現量を増加させることができる。このため、例えば、第１遺伝子の発現量と第２遺伝子の発現量との比率を所望の値に制御しやすくなる。
【００３５】
第１遺伝子と第２遺伝子の間、及び第２遺伝子の下流側にそれぞれ遺伝子の転写を停止させるポリAシグナル（-AATAAA-）を配置する。あるいは、ポリAシグナルに代えてこれと同等の効果を生じさせる配列を配置してもよい。
【００３６】
また、第２遺伝子とポリAシグナルの間（第２遺伝子の下流側近傍）にWPRE配列（配列番号３）などの転写増強配列を配置しておくことにより、第２遺伝子の発現量をさらに増加させることができ、転写干渉の影響をより低減することが可能となる。
【００３７】
この一方で、CHO細胞のように、転写干渉が見られない細胞では、第１プロモーターと第２プロモーターの強さを揃えることにより、第１遺伝子の発現量と第２遺伝子の発現量との比率を所望の値に制御することができる。
【００３８】
従って、本実施形態の方法を用いれば、複数のサブユニットからなるタンパク質の機能解析や、タンパク質同士の相互作用等の研究等に適した細胞を作製することができる。また、ゲノム上に１箇所のみ設けられたターゲットサイトに２つの遺伝子を導入することにより、遺伝子の導入後に第１遺伝子及び第２遺伝子を所望の量及び割合で発現する細胞を選択するステップを省略することができるので、短期間で作業を完了することができる。
【００３９】
また、初代培養細胞等、ガン化しにくい細胞を用いれば、遺伝子治療等、研究目的以外に利用できる細胞を作製することも可能である。
【００４０】
第１遺伝子及び第２遺伝子は特に限定されない。第１遺伝子及び第２遺伝子は、目的に応じて、解析したいタンパク質の全長又は一部をコードする配列を有していてもよく、siRNAやマイクロRNAなど、タンパク質に翻訳されない配列を有していてもよい。また、第１遺伝子及び第２遺伝子はゲノムDNAであってもよいし、cDNAであってもよい。
【００４１】
また、少なくとも細胞に導入される遺伝子は少なくとも２種類であり、３種類以上の遺伝子が１つのターゲットサイトに導入されていてもよい。この場合、転写干渉が見られる細胞については、上流側（5'側）から下流側（3'側）に向かうにつれてより強力なプロモーターを配置することで、転写干渉の影響を緩和してもよい。例えば、「EF1α-第１遺伝子-CMVプロモーター-第２遺伝子-フルレングスCMVプロモーター-第３遺伝子」の配列を有する発現ベクターを構築した上で、３種類の遺伝子を細胞に導入してもよい。
【００４２】
＜発現ベクターの構築方法＞
Jump-Inシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を使用する場合の発現ベクターの構築方法の一例を簡単に説明する。
【００４３】
図３は、第１の実施形態に係る発現ベクターの構築方法を示す図である。
【００４４】
図３に示すように、公知の方法を用いてプロモーターエントリークローン１１と、第１遺伝子のエントリークローン１３と、第２遺伝子のエントリークローン１５と、デスティネーションベクター１７とを準備する。
【００４５】
プロモーターエントリークローン１１では、ポリAシグナル（図中「pA」と表記）と第２プロモーターとがR4r配列とR3r配列との間に挿入されている。
【００４６】
エントリークローン１３は、L1配列とL4配列との間に第１遺伝子が挿入されたベクターである。また、エントリークローン１５は、L3配列とL2配列との間に第２遺伝子が挿入されたベクターである。
【００４７】
図３及び図４に示すように、デスティネーションベクター１７として、R4 attB配列（配列番号４）と、第１プロモーターと、R1配列と、クロラムフェニコール耐性遺伝子（CmＲ）と、ccdB遺伝子と、R2配列と、ポリAシグナルと、細胞の選択用薬剤のプロモーターとを有するベクターを用いることができる。
【００４８】
試験管内でプロモーターエントリークローン１１、遺伝子のエントリークローン１３、１５及びデスティネーションベクター１７をLRクロナーゼ（製品名：「LRクロナーゼII酵素ミックス」、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）と共に混合し、部位特異的組み換え反応（LR反応）により第１遺伝子及び第２遺伝子を含む発現ベクター１９を生成させる。LR反応では、L1配列とR1配列、R4r配列とL4配列、R3r配列とL3配列、L2配列とR2配列とがそれぞれ特異的に組み換わる。これらの図４は、デスティネーションベクター１７の一例である、pJTI R4 DEST（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を示すベクターマップ図である。
【００４９】
LR反応の反応生成物をccdB遺伝子産物に耐性を持たない大腸菌のコンピテントセルに導入し、培養することで、発現ベクター１９を持つ大腸菌を得ることができる。
【００５０】
発現ベクター１９には、R4 attB配列（配列番号４）及び選択用薬剤用プロモーターの他に、第１プロモーター、第１遺伝子、ポリAシグナル、第２プロモーター、第２遺伝子及びポリAシグナルが順に配置された配列が挿入されている。発現ベクター１９が導入された細胞株を選択するための選択用薬剤としては、ブラストサイジン等の抗生物質を用いることができる。
【００５１】
図３に示すように、プロモーターエントリークローン１１として、例えばポリAシグナルとCMVプロモーター（「CMV」と表記）とを有するプロモーターエントリークローン２１、ポリAシグナルとフルレングスCMVプロモーター（「CMV Long」と表記）を有するプロモーターエントリークローン２３、WPRE配列とポリAシグナルとCMVプロモーターとを有するプロモーターエントリークローン２５、WPRE配列とポリAシグナルとフルレングスCMVプロモーターとを有するプロモーターエントリークローン２７をそれぞれ準備しておく。
【００５２】
また、デスティネーションベクター１７として、例えばCMVプロモーター及びポリAシグナルを有するデスティネーションベクター２９、フルレングスCMVプロモーター及びポリAシグナルを有するデスティネーションベクター３１、EF1αプロモーター及びポリAシグナルを有するデスティネーションベクター３３、CMVプロモーター、WPRE配列、ポリAシグナルを有するデスティネーションベクター３５、フルレングスCMVプロモーター、WPRE配列、ポリAシグナルを有するデスティネーションベクター３７、EF1αプロモーター、WPRE配列、ポリAシグナルを有するデスティネーションベクター３９をそれぞれ準備しておく。
【００５３】
＜発現ベクターの細胞への導入＞
図５は、２つの遺伝子を安定して発現する細胞の作製方法を模式的に示す図である。
【００５４】
同図に示すように、上述の方法によってクローニングされた発現ベクター１９を用いて第１遺伝子及び第２遺伝子を安定的に発現する細胞を作製する。Jump-Inシステムを用いる場合、例えば、リポフェクション等の公知の方法を用いて発現ベクター１９を、R4インテグラーゼ発現用のベクターと共に細胞に導入する。これにより、発現ベクター１９中のR4 attB配列と細胞のゲノム１０中のR4 attP配列との間で部位特異的組み換え反応が生じ、細胞のゲノム１０上のターゲットサイトに第１遺伝子及び第２遺伝子を含む配列が導入される。
【００５５】
ここで、R4配列及び選択用薬剤耐性遺伝子（ブラストサイジン耐性遺伝子；図中「BSD」と表記）を持つ細胞（R4プラットフォーム細胞株）として、293細胞、CHO細胞又はU2OS細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を利用することができる。この場合、ブラストサイジンを含む培地で細胞を培養することにより、ゲノムの組み換えが起こった細胞のみを選択することができる。
【００５６】
以上の方法によれば、簡便且つ短時間で２遺伝子発現用のベクターの構築でき、２種類の遺伝子の発現量比が制御された細胞を作製することができる。ただし、細胞の作製方法はこの方法に限定されない。例えば、インテグラーゼによる部位特異的組み換え反応の代わりにこれら以外の部位特異的組み換え反応を用いてもよい。
【００５７】
なお、プロモーターの例として挙げたCMVプロモーターやフルレングスCMVプロモーターには、遺伝子の転写促進機能に影響が無い範囲（例えば１〜３塩基）で配列番号１、２に示す塩基配列から塩基置換や欠失、又は塩基の付加があってもよい。WPRE配列についても、遺伝子の発現増強効果に影響が無い範囲（例えば１〜３塩基）で配列番号３に示す塩基配列から塩基置換や欠失、又は塩基の付加があってもよい。
【００５８】
（第２の実施形態）
図６は、第２の実施形態に係る発現ベクターの構築方法を示す図である。
【００５９】
同図に示すように、本実施形態に係る方法では、発現ベクター１９を構築するためのLR反応を２段階に分けて行なう点が、第１の実施形態に係る方法と異なっている。
【００６０】
本方法では、まずL1配列とL2配列との間に第１遺伝子が導入されたエントリークローン４１と、L1配列とL2配列との間に第２遺伝子が導入されたエントリークローン４３とを準備する。
【００６１】
また、L1配列、第２プロモーター、R1配列、クロラムフェニコール耐性遺伝子（CmR）と、ccdB遺伝子と、R2配列と、ポリAシグナルと、R5r配列とをこの順で有するデスティネーションベクター４５と、L5配列、第１プロモーター、R1配列、クロラムフェニコール耐性遺伝子と、ccdB遺伝子と、R2配列と、ポリAシグナルと、L2配列とをこの順で有するデスティネーションベクター４７とを準備する。
【００６２】
次いで、エントリークローン４１とデスティネーションベクター４５との間で部位特異的組み換え反応（1st LR反応）を生じさせることにより、プロモーター−遺伝子エントリークローン４９を作製する。また、エントリークローン４３とデスティネーションベクター４７との間で部位特異的組み換え反応（1st LR反応）を生じさせることにより、プロモーター−遺伝子エントリークローン５１を作製する。
【００６３】
次に、R4 attB配列と、R1配列と、クロラムフェニコール耐性遺伝子と、ccdB遺伝子と、R2配列と、細胞の選択用薬剤のプロモーターとを有するデスティネーションベクター５３を準備する。続いて、プロモーター−遺伝子エントリークローン４９、５１及びデスティネーションベクター５３をLRクロナーゼと共に混合し、部位特異的組み換え反応（2nd LR反応）を生じさせることにより、発現ベクター１９（図中に示す「２遺伝子発現クローン」）を作製することができる。
【００６４】
図６に示す例では、上述のデスティネーションベクター４５として、デスティネーションベクター５７、５９、６１、６３の４種類が挙げられており、デスティネーションベクター４７として、デスティネーションベクター６５、６７、６９、７１が挙げられている。これらのベクターを適宜組み合わせて用いることで、所望の配列を有する発現ベクター１９を作製することができる。
【００６５】
この方法によれば、一段階のLR反応によって発現ベクター１９が得られにくい場合であっても、各段階のLR反応を確実に行うことで、所望の構成を有する発現ベクター１９を得ることが可能となる。
【実施例】
【００６６】
以下、本明細書に開示された方法により、２つの遺伝子の発現量比が制御された細胞が作製できることを確認した。本実施例では、Jump-Inシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いた。
【００６７】
なお、以下で製品名又はカタログ番号を記載した材料、試薬等は、特記しない限りいずれもサーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製である。
【００６８】
＜シグナル配列付き蛍光タンパク質クローンの構築＞
遺伝子の発現量を測定するために、レポーター遺伝子として、蛍光タンパク質であるEmerald Green Fluorescent Protein（EmGFP）及びmonomeric Red Fluorescent Protein（mRFP1）をコードする遺伝子を用いた。EmGFP及びmRFP1は、それぞれ図３等に示す第１遺伝子及び第２遺伝子に相当する。
【００６９】
PCRの鋳型としては、それぞれ「Vivid Color pcDNA 6.2/C-EmGFP-GW/TOPO Expression Vector」（Cat.No.K35920；サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）、「pENTR-L1-SDK-mRFP1-L6」（"Sasaki, Y. et al., 2008. Journal of Biotechnology 136 103-112"参照）を使用した。シグナル配列として、EmGFPのC末端側には膜貫通ドメインPDGFR-TM（製品名：「pDisplay Mammalian Expression Vector」由来、Cat.No.V660-20）が、mRFP1のC末端側には核移行シグナル3X Nuclear targeting sequences（製品名：「pEF/myc/nuc」由来、Cat.No.V891-20）がそれぞれ付加されるように塩基配列を付加した。
【００７０】
なお、上述のシグナル配列の付加は、遺伝子が導入された細胞内での遺伝子発現を視認しやすくするために行った操作であり、実際に２遺伝子発現クローンを作製する際に必須な操作ではない。
【００７１】
＜２遺伝子発現クローンの構築＞
２遺伝子発現クローン（図３に示す発現ベクター１９）の構築には、「MultiSite Gateway Pro（for Flexible Cloning of up to Four DNA Fragments into a Gateway Destination Vector）」（Cat. No.12537-104）を使用した（「Gateway」は登録商標）。
【００７２】
シグナル配列付きEmGFPを、３種類のベクター（製品名：「pcDNA 3.1/V5-His-TOPO」（Cat.No.K4800-01）、「pcDNA 3.3-TOPO TA」（Cat.No.K8300-01）、「pcDNA 3.4-TOPO TA」（Cat.No.A14697）に公知の方法によりクローニングした。クローニングした３種類のベクターを鋳型とし、GatewayシステムのattB配列（すなわち、attB1、attB5）を付加したプライマーを用いてCMVプロモーターからポリAシグナルまでの塩基配列を、PCRにより増幅した。
【００７３】
続いて、得られた増幅産物attB1-CMVプロモーター-EmGFP-(WPRE)-pA-attB5に含まれるattB1、attB5配列と、図７に示すドナーベクター（製品名：「pDONR221-P1P5r」）に含まれるattP1、attP5r配列との間での部位特異的組み換え反応（BP反応）により、「pENTR-L1-CMVプロモーター-EmGFP-(WPRE)-pA-R5r」の配列を含むエントリークローンを構築した。BP反応は、クロナーゼ（製品名：「Gateway BP Clonase II Enzyme Mix」（Cat.No.11789-020））を用い、GatewayシステムのattB配列を両端に持つPCR産物を１５ng、ドナーベクターを１５０ng 使用して行った（「CLONASE」は登録商標）。２５℃で１時間BP反応を行った後、反応液を３７℃、１０分間Proteinase Kを用いて処理し、クロナーゼを失活させた。続いて、大腸菌（製品名：「MAX Efficiency DH10B Competent Cells」（Cat.No.18297-010））に上述のBP反応の生成物を取り込ませてから、５０μg/mLのカナマイシンを含むLB寒天培地で培養することにより、形質転換された大腸菌を選別した。
【００７４】
シグナル配列付きmRFP1についても、EmGFPと同様の方法でクローニングした後、PCRを行い、attB5-CMVプロモーター-mRFP1-(WPRE)-pA-attB2の配列を含む増幅産物を得た。この増幅産物と図８に示すドナーベクター（製品名：「pDONR221-P5P2」）との間にBP反応を生じさせることにより、エントリークローンpENTR-L5-CMVプロモーター-mRFP1-(WPRE)-pA-L2を構築した。
【００７５】
なお、本ステップにおいて、EmGFPの上流側に配置されたプロモーター（第１プロモーター）として、CMVプロモーター又はフルレングスCMVプロモーターを含むエントリークローンを作製し、mRFP1の上流側に配置されたプロモーターとして、CMVプロモーター又はフルレングスCMVプロモーターを含むエントリークローンを作製した。
【００７６】
次に、EmGFP、mRFP1を含む上記２種類のエントリークローン中のattL配列及びattR配列と、図４に示すJump-Inシステム用のデスティネーションベクター（製品名：「pJTI R4 DEST」に含まれるattR配列との間での部位特異的組み換え反応（LR反応）により、２遺伝子発現クローン（発現ベクター１９）を構築した。LR反応は、クロナーゼ（製品名：「Gateway LR Clonase II Enzyme Mix」（Cat.No.12538-020））を用い、エントリークローンを１０fmoleずつ、デスティネーションベクターを２０fmole 使用して行った。２５℃で１６時間反応後、Proteinase処理を３７℃で１０分間行ってクロナーゼを失活させた。次いで、大腸菌（製品名：「MAX Efficiency DH10B Competent Cells」）に上述のLR反応の生成物を取り込ませてから、５０μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地で培養することにより、形質転換された大腸菌の選別を行った。
【００７７】
本ステップで構築した２遺伝子発現クローンには、いずれもR4 attB配列（配列番号４）が含まれている。
【００７８】
＜細胞培養＞
発現用ベクターを導入するための細胞として、293細胞（製品名：「Jump-In GripTite HEK293細胞」（Cat.No.A14150））、CHO細胞（製品名：「Jump-In CHO-K1」（Cat.No.A14148））及びU2OS細胞（製品名：「Jump-In U2OS細胞」）を用いた。これらの細胞株は、R4インテグラーゼの存在下で２遺伝子発現クローンに含まれるR4 attB配列と部位特異的組み換え反応を起こすR4 attP配列（配列番号５）をゲノム上に１箇所のみ備えている。
【００７９】
293細胞及びCHO細胞の培養には、製品名「DMEM, high glucose, GlutaMAX Pyruvate」（Cat.No. 10569-010） に１０％の仔ウシ血清（製品名：「Fetal Bovine Serum, Dialyzed」（Cat.No. 26400-044））、１％の抗生物質（製品名：「Penicillin-Streptmycin」（Cat.No.15140-122））、１％のアミノ酸液（製品名：「MEM Non-Essential Amino Acid Solution」（Cat.No.11140-050））及び２５mMのHEPESバッファ（Cat.No.15630-080）をそれぞれ添加した培地を用いた。
【００８０】
U2OS細胞の培養には、L-グルタミン含有培地（製品名：「McCoy's 5A (Modified) Medium」（Cat.No.16600-082））に１０％の仔ウシ血清（製品名：「Fetal Bovine Serum, Dialyzed」）、１％の抗生物質（製品名：「Penicillin-Streptmycin」）をそれぞれ添加した培地を用いた。培養は３７℃、CO2濃度５％の条件で行った。
【００８１】
＜細胞への遺伝子導入と安定発現細胞プールの作製＞
293細胞、CHO細胞、U2OS細胞への遺伝子導入には、トランスフェクション試薬（製品名：「Lipofectamine LTX Reagent with PLUS Reagent」 （Cat.No. A12621））を用いた。
【００８２】
先のステップで作製された発現クローンと、R4インテグラーゼを発現させるベクター（「Jump-In TI Gateway Vector Kit」（Cat.No. A10896）に含まれる「pJTI R4 Int」）を重量比１：１で細胞に混合導入 （co-transfection）した。細胞へのベクター導入から２４時間後に細胞を継代し、ブラストサイジン（１０μg/mL）を含む培地で２週間選抜した。形成したコロニーを試薬（製品名：「TrypLE Express (1X), Phenol Red」（Cat.No.12605-010））を用いて剥離、混合してブラストサイジンを含む培地でさらに２週間継代培養し、安定発現細胞プールを作製した。
【００８３】
なお、各遺伝子の発現量の基準となる細胞株を得るため、及び細胞の種類による転写干渉の有無を確認するために、EmGFP及びmRFP1の一方のみをコードする塩基配列を含む発現ベクターを上述と同様の方法で作製し、この発現ベクターを293細胞、CHO細胞、U2OS細胞のそれぞれに導入した。
【００８４】
以上の方法により、１種類の遺伝子が導入された293細胞である、293-A細胞株、293-B細胞株、293-C細胞株、293D細胞株、293-E細胞株及び293-F細胞株を得た。また、EmGFP及びmRFP1をコードする遺伝子が導入された293細胞である、293-G細胞株（比較例１）、293-H細胞株（比較例２）、293-I細胞株（実施例１）、293-J細胞株（比較例３）、293-K細胞株（比較例４）を得た。
【００８５】
同様の方法により、１種類の遺伝子が導入されたCHO細胞である、CHO-A細胞株、CHO-B細胞株、CHO-C細胞株、CHO-D細胞株、CHO-E細胞株、CHO-F細胞株を得た。また、EmGFP及びmRFP1をコードする遺伝子が導入されたCHO細胞である、CHO-G細胞株（実施例２）、CHO-H細胞株（比較例５）、CHO-I（比較例６）、CHO-J（実施例３）、CHO-K（実施例４）を得た。
【００８６】
さらに、１種類の遺伝子が導入されたU2OS細胞である、U2OS-A細胞株、U2OS-B細胞株、U2OS-C細胞株、U2OS--D細胞株を得た。また、EmGFP及びmRFP1をコードする遺伝子が導入されたU2OS細胞である、U2OS-E細胞株（比較例７）、U2OS-F細胞株（比較例８）、U2OS-G（実施例５）、U2OS-H（比較例９）、U2OS-I細胞株（比較例１０）を得た。
【００８７】
得られた細胞株の蛍光画像を、倒立型顕微鏡（製品名：「IX71」、オリンパス株式会社製）を用いて撮影した。
【００８８】
＜定量PCR（リアルタイムPCR）＞
得られた細胞株の安定発現細胞プールをPBSバッファを用いて洗浄した後、トリプシン処理し、４℃で遠心処理して回収した。次いで、RNA抽出キット（製品名：「PureLink RNA Mini Kit」（Cat.No.12183020））を用いて回収された細胞プールからトータルRNAを抽出し、逆転写反応用キット（製品名：「High-Capacity RNA-to-cDNA Kit」（Cat.No.4387406））を用いて逆転写反応を行った。定量PCR用酵素としては「PowerUp SYBR Green Master Mix」（Cat.No.A25741）を用い、PCR反応は専用のキットである「ViiA 7 Real-Time PCR System」により行った。
【００８９】
293細胞及びU2OS細胞から得られた細胞株のmRNA量のデータは、細胞プールに含まれる細胞数の多寡を補正するために、ハウスキーピング遺伝子であるGAPDHの値を用いてそれぞれ標準化した。EmGFP、mRFP1及びGAPDHのmRNAを検出するために、以下のプライマーを用いた。
EmGFP： forward 5’-GAGCTGAAGGGCATCGACTT-3’  （配列番号６）
reverse 5’-ATGTTGTGGCGGGTCTTGAAG-3’  （配列番号７）
mRFP1： forward 5’-TACGACGCCGAGGTCAAGA-3’  （配列番号８）
reverse 5’-CCACGATGGTGTAGTCCTCGTT-3’  （配列番号９）
ヒトGAPDH： forward 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3’  （配列番号１０）
reverse 5’-GCCCCACTTGATTTTGGAG-3’  （配列番号１１）
【００９０】
＜測定結果＞
図９は、１種類の遺伝子が導入された293細胞を示す顕微鏡写真図である。同図左側の写真は、293-A細胞株〜293-C細胞株に対して、水銀ランプを光源として特定の波長の励起光を当て、蛍光タンパク質から放出される蛍光をフィルターを通して撮影したものである。図９右側の写真は、ハロゲンランプを光源として、細胞株を透過した光を撮影したものである。
【００９１】
また、図１０は、２種類の遺伝子が導入された293細胞を示す顕微鏡写真図である。同図では、各細胞株について、緑色蛍光を撮影した画像（左図）と、赤色蛍光を撮影した画像（中央図）と、透過光を撮影した画像とを示している。
【００９２】
図１１は、作製された293-A細胞株〜293-K細胞株についてmRNAの定量結果を示す図である。同図において、各細胞株におけるEmGFPの発現量は、CMVプロモーターを有するEmGFP遺伝子が導入された293-A細胞株での発現量を１とした値により表されている。各細胞株におけるmRFP1の発現量は、CMVプロモーターを有するmRFP1遺伝子が導入された293-D細胞株での発現量を１とした値により表されている。
【００９３】
図１２は、１種類の遺伝子が導入されたCHO細胞を示す顕微鏡写真図である。同図では、CHO-A細胞株〜CHO-C細胞株について、緑色蛍光を撮影した画像（左図）と、フィルターを用いずに撮影した画像（右図）とを示している。また、図１２では、CHO-D細胞株〜CHO-F細胞株について、赤色蛍光を撮影した画像（左図）と、透過光を撮影した画像（右図）とを示している。
【００９４】
図１３は、２種類の遺伝子が導入されたCHO細胞を示す顕微鏡写真図である。同図では、各細胞株について、緑色蛍光を撮影した画像（左図）と、赤色蛍光を撮影した画像（中央図）と、透過光を撮影した画像とを示している。
【００９５】
図１４は、作製されたCHO-A細胞株〜CHO-K細胞株についてmRNAの定量結果を示す図である。同図において、各細胞株におけるEmGFPの発現量は、CHO-A細胞株での発現量を１とした値により表されている。各細胞株におけるmRFP1の発現量は、CHO-D細胞株での発現量を１とした値により表されている。
【００９６】
図１５は、１種類の遺伝子が導入されたU2OS細胞を示す顕微鏡写真図である。同図では、U2OS-A細胞株〜U2OS-C細胞株について、緑色蛍光を撮影した画像（左図）と、透過光を撮影した画像（右図）とを示している。また、図１５では、U2OS-D細胞株について、赤色蛍光を撮影した画像（左図）と、透過光を撮影した画像（右図）とを示している。
【００９７】
図１６は、２種類の遺伝子が導入されたU2OS細胞を示す顕微鏡写真図である。同図では、各細胞株について、緑色蛍光を撮影した画像（左図）と、赤色蛍光を撮影した画像（中央図）と、透過光を撮影した画像とを示している。
【００９８】
図１７は、作製されたU2OS-A細胞株〜U2OS-I細胞株についてmRNAの定量結果を示す図である。同図において、各細胞株におけるEmGFPの発現量は、U2OS-A細胞株での発現量を１とした値により表されている。各細胞株におけるmRFP1の発現量は、U2OS-D細胞株での発現量を１とした値により表されている。
【００９９】
なお、図９〜図１７では、CMVプロモーター（配列番号１）を「CMV」、フルレングスCMVプロモーター（配列番号２）を「CMV long」、EmGFPのcDNA配列を「GFP」、mRFP1のcDNA配列を「RFP」、ウシ成長ホルモン由来のポリAシグナルを「BGHpA」、チミジンキナーゼ由来のポリAシグナルを「TkpA」と表記している。
【０１００】
まず、図９〜図１１に示す293-A細胞株〜293-C細胞株の比較及び293-D細胞株〜293-F細胞株の比較から、293細胞においてはCMVプロモーターよりもフルレングスCMVプロモーターの方が強力なプロモーターであることが確認できた。また、WPRE配列を付加することで、遺伝子の発現が増幅されることも確認できた。
【０１０１】
また、EmGFP用及びmRFP1用のプロモーターとして共にCMVプロモーターを用いた293-G細胞株（比較例１）では、EmGFPの発現量が293-A細胞株での発現量の０．８５倍であるのに対し、mRFP1の発現量が293-D細胞株の０．１６倍と非常に小さくなっていることから、HEK293細胞において転写干渉が生じていることが確認できた。293-D細胞株（比較例３）の結果から、転写干渉は、EmGFP用及びmRFP1用のプロモーターを共にフルレングスCMVプロモーターにした場合でも見られることが分かった。
【０１０２】
比較例１〜４に係る細胞株と293-I細胞株（実施例１）との比較から、転写干渉が見られる293細胞では、下流側の遺伝子用のプロモーターとして、上流側の遺伝子用のプロモーターよりも強いプロモーターを選択することにより、EmGFPの発現量とmRFP1の発現量とを１：１に近い値にすることができ、転写干渉の影響を低減もしくは解消することができることが確かめられた。
【０１０３】
一方、図１２〜図１４に示すCHO-A細胞株〜CHO-C細胞株の比較及びCHO-D細胞株〜CHO-F細胞株の比較から、CHO細胞においても、CMVプロモーターよりもフルレングスCMVプロモーターの方が強力なプロモーターであることが確認でき、WPRE配列を付加することで、遺伝子の発現がさらに増幅されることが確認できた。
【０１０４】
また、CHO-G細胞株（実施例２）ではEmGFPの発現量がCHO-A細胞株での発現量の１．５７倍であるのに対し、mRFP1の発現量がCHO-D細胞株での発現量の１．６８倍と比較的大きかった。この結果から、CHO細胞では、転写干渉が生じないことが分かった。
【０１０５】
実施例２〜４及び比較例５、６に係る細胞株の比較から、CHO細胞のように転写干渉が生じない細胞では、上流側の遺伝子用のプロモーターと下流側の遺伝子用のプロモーターを同一にすることで、EmGFPの発現量とmRFP1の発現量とを揃えることができることが確かめられた。また、比較例５、６のように上流側の遺伝子用のプロモーターと下流側の遺伝子用のプロモーターに強弱がある場合には、強いプロモーターにより転写が活性化される遺伝子の発現量が、弱いプロモーターにより転写が活性化される遺伝子の発現量の発現量よりも大きくなることが分かった。
【０１０６】
次に、図１５〜図１７に示すU2OS-A細胞株〜U2OS-C細胞株の比較から、U2OS細胞においても、CMVプロモーターよりもフルレングスCMVプロモーターの方が強力なプロモーターであることが確認でき、WPRE配列を付加することで、遺伝子の発現がさらに増幅されることが確認できた。
【０１０７】
また、上流側の遺伝子用のプロモーターと下流側の遺伝子用のプロモーターが同じであるU2OS-E細胞株（比較例７）、U2OS-H（比較例９）及びU2OS-I（比較例１０）ではいずれもmRFP1の相対的な発現量がEmGFPの相対的な発現量の１／６以下となっていることから、U2OS細胞では、転写干渉の影響が非常に大きいことが確認できた。
【０１０８】
そして、U2OS-G細胞株（実施例５）の結果から、下流側の遺伝子用のプロモーターを上流側の遺伝子用のプロモーターよりも強くすることにより、転写干渉の影響を効果的に低減できることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
以上説明したように、本明細書に開示された細胞の作製方法、発現ベクター及び作製された細胞は、細胞工学や遺伝子工学等における研究用途、医薬の研究開発用途、遺伝子治療用途など、種々の用途に利用される。
【符号の説明】
【０１１０】
１０      ゲノム
１１、２１、２３、２５、２７      プロモーターエントリークローン
１３、１５、４１、４３      エントリークローン
１７、２９、３１、３３、３５、３７、３９      デスティネーションベクター
１９      発現ベクター
５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１    デスティネーションベクター
【図１】
2018038333.tif 000003
【図２】
2018038333.tif 000004
【図３】
2018038333.tif 000005
【図４】
2018038333.tif 000006
【図５】
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【図６】
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【図７】
2018038333.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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