(57)【要約】【課題】  非標的核酸に対して微量な、かつ断片化した標的核酸の高感度検出方法を提供すること。【解決手段】  ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２の変異の存在を検出する方法、当該方法のためのフォワードプライマー、リバースプライマー、抑制オリゴヌクレオチド、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、およびミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、を含む組成物およびキット。該組成物およびキットは、さらにプローブ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを含むことができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２の変異の存在を検出する方法であって、
（１）下記ａ）〜ｄ）を含有する反応液を調製する工程；
ａ）被験試料、
ｂ）配列番号８で示される、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子のエキソン２を含む領域の塩基配列の５０位から２９０位の範囲で、それぞれ重複することなく設計されたフォワードプライマー、リバースプライマー及び抑制オリゴヌクレオチド、
ｃ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及び
ｄ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；
（２）反応液を温度サイクル反応に供する工程、及び
（３）反応後の反応液についてヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の配列の一部を有する増幅ＤＮＡ断片を検出する工程、を包含し、
ここで、前記抑制オリゴヌクレオチドは、野生型ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２に対応する塩基配列を含む領域とハイブリダイズさせた際にミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで切断されるミスマッチを生じ、かつコドン１２に対応する塩基配列に変異が生じた前記領域とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際には前記ポリペプチドで切断されるミスマッチを生じないオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、方法。
【請求項２】
反応液が、
配列番号８の塩基配列の５０位から１９０位の範囲で設計されたフォワードプライマー、
配列番号８の塩基配列の２１０位から２９０位の範囲で設計されたリバースプライマー、及び
配列番号８の塩基配列の１８０位から２３０位の範囲、かつ配列番号８の塩基配列の２０４位の変異を含む範囲で設計された抑制オリゴヌクレオチド、
を含有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
フォワードプライマー、及びリバースプライマーが２０〜３０塩基のオリゴヌクレオチドである請求項２記載の方法。
【請求項４】
抑制オリゴヌクレオチドが１０〜３０塩基のオリゴヌクレオチドである請求項２記載の方法。
【請求項５】
反応液が、
配列番号１〜４いずれか１つで示されるフォワードプライマー、
配列番号５で示されるリバースプライマー、及び
配列番号６で示される抑制オリゴヌクレオチド、
を含有することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項６】
ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが、耐熱性菌由来のポリペプチドもしくはその変異体である請求項１〜５いずれか記載の方法。
【請求項７】
ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号１２〜１６から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項６記載の方法。
【請求項８】
増幅ＤＮＡ断片の検出がサイクリング・プローブ法又はＴａｑＭａｎ法で行われることを特徴とする請求項１〜７いずれか記載の方法。
【請求項９】
配列番号８で示される、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子のエキソン２を含む領域の塩基配列の５０位から２９０位の範囲で、それぞれ重複することなく設計されたフォワードプライマー、リバースプライマー及び抑制オリゴヌクレオチドを含有する、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２の変異の存在を検出するためのキット；
ここで、前記抑制オリゴヌクレオチドは、野生型ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子由来の核酸のコドン１２に対応する塩基配列を含む領域とハイブリダイズさせた際にミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで切断されるミスマッチを生じ、かつコドン１２に対応する塩基配列に変異が生じた前記領域とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際には前記ポリペプチドで切断されるミスマッチを生じないオリゴヌクレオチドである。
【請求項１０】
さらに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを含有する請求項９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子におけるホットスポット、特にエキソン２のＧ１２Ｄ変異の存在を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝性および後天性の疾患は、塩基置換、欠失および挿入などの遺伝子変異と関連したものがあることが知られている。これらの変異の中には、疾患があることと直接関連するものもあれば、疾患の危険性および／または予後と相関するものもある。その中で、疾患の進行に伴って、野生型遺伝子が変異型遺伝子に変化していく疾患や、変異型遺伝子を有する細胞の増加がみられる疾患においては、当該変異遺伝子の存在を調べることが重要になってくる。当該遺伝子変異を伴う後天的な疾患と関連遺伝子変異の例としては、大腸がんとＫ−ｒａｓ遺伝子変異、肺がんとＥＧＦＲ遺伝子変異又はＫ−ｒａｓ遺伝子変異、肺扁平上皮がんとＤＤＲ２遺伝子変異、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子変異又はＢ−ｒａｆ遺伝子変異、胃がんとＫｉｔ遺伝子変異又はＰＤＧＦＲＡ遺伝子変異が挙げられる。
【０００３】
また、上記事例の逆の場合もありうる。例えば、遺伝子変異を伴う後天的な疾患を治療している過程において、今度は変異型遺伝子が減少し、野生型遺伝子が増加してくる状況をモニターリングする場合などである。微小残存病変検出などが例示される。
【０００４】
Ｋ−ｒａｓ（カーステン・ラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ；  ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２  Ｋｉｒｓｔｅｎ  ｒａｔ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒａｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ）は、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）結合タンパク質である。上皮成長因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；  ＥＧＦＲ）など上流からの刺激により、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）がＫ−ｒａｓ分子から離れ、代わりに細胞質からＧＴＰが結合することで活性型Ｋ−ｒａｓとなる。活性型Ｋ−ｒａｓは、ＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＲＡＬＧＤＳなどのエフェクタータンパク質と結合し、下流のシグナルカスケードを活性化する。一方、活性型Ｋ−ｒａｓは自身のもつＧＴＰ加水分解活性（ＧＴＰａｓｅ）により不活性型となる。Ｋ−ｒａｓ遺伝子が変異することによってＫ−ｒａｓタンパク質にアミノ酸置換が生じるとＫ−ｒａｓのＧＴＰａｓｅとしての機能が低下し、Ｋ−ｒａｓは恒常的な活性化状態となり、下流にシグナルを送り続ける。この過剰なシグナルが、発がんやがんの増殖に関与しているとされる。
【０００５】
上記抗体医薬を投与される患者の遺伝子型が変異型Ｋ−ｒａｓだった場合、野生型Ｋ−ｒａｓと比較して、無増悪生存期間中央値および生存期間中央値がいずれも有意に短縮されることが報告されている（非特許文献１）。また、患者の遺伝子型が変異型Ｋ−ｒａｓだった場合、化学療法の一種であるＦＯＬＦＯＸ療法［フォリン酸（ｆｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）の３剤併用療法］と抗ＥＧＦＲ抗体医薬を併用することにより、ＦＯＬＦＯＸの治療効果が減弱することが報告されている（非特許文献２）。学会の定める大腸がんの治療ガイドラインにおいて、Ｋ−ｒａｓ遺伝子変異の認められる患者には、これらの抗がん剤の投与は推奨されない（非特許文献３）。欧米のガイドラインでも同様である。このように、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の変異の有無は、適切な抗がん剤の選択において重要な情報である。
【０００６】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子変異のホットスポットは公知であり、エキソン２のコドン１２とコドン１３、エキソン３のコドン５９とコドン６１、およびエキソン４のコドン１１７とコドン１４６である。これら変異がＫ−ｒａｓタンパク質の恒常的活性化、腫瘍細胞増殖速度の増加、下流の増殖シグナルの活性化誘導などを生じている（非特許文献１）。大腸がんでのＫ−ｒａｓ遺伝子変異の頻度は、ＣＯＳＭＩＣ（ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ）データベースによれば、Ｋ−ｒａｓ遺伝子３４．６％、Ｎ−ｒａｓ遺伝子３．７％、Ｈ−ｒａｓ遺伝子０．２％と報告され、Ｋ−ｒａｓエキソン２（コドン１２，コドン１３）の変異が多くを占めている。
【０００７】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子変異の有無を測定する方法として、ダイレクトシーケンス法、アレル特異的増幅法、ＳＵＲＶＥＹＯＲ法、次世代シーケンス法、ＢＥＡＭｉｎｇ法（ｂｅａｄｓ，  ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ，  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）などが知られている（非特許文献１）。
ダイレクトシーケンス法は簡便な方法であり、未知の変異も検出できる利点がある一方、検出感度が低い欠点がある。
アレル特異的増幅法は、一方のプライマーの３’末端を変異塩基に相補的になるよう設計する必要があり、プライマー設計の自由度が低く、変異箇所の周辺配列によってはプライマー設計が困難な場合がある。また、ＰＣＲ条件について、変異アレルは効率よく増幅するが、正常アレルの増幅効率は非常に悪いように厳密に設定する必要がある。
ＳＵＲＶＥＹＯＲ法はセロリ由来ミスマッチ二重鎖切断酵素（Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼ）を用いて変異を検出する方法である。ＰＣＲ増幅後、一本鎖核酸へ解離させ、再度アニーリングさせる際に生じた野生型と変異型のヘテロ二本鎖を両鎖とも切断し、生じた核酸断片長によって変異の有無を検出する。工数が多い欠点がある。
次世代シーケンス法は、がん細胞数が少ない初期病変組織でも検出可能な感度の高い方法であるが、コストと時間がかかること、初期病変では変異か測定エラーかの判別が難しい点がある。
ＢＥＡＭｉｎｇ法はＤｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ法の一種であり、油中水滴エマルジョン中に磁気ビーズとＤＮＡフラグメントコピーを１：１に封入し、ＰＣＲを行う方法である。末梢血液中を循環するがん細胞由来ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を高感度に検出することが可能である。工数が多い欠点がある。
【０００８】
また最近になって、耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼを用いた変異検出方法（特許文献１）が報告された。しかしながら、これらの方法でも野生型遺伝子の核酸増幅を抑制し、変異型遺伝子を選択的に増幅し、変異遺伝子の存在のみを正確に検出するにはまだまだ問題があった。
【０００９】
腫瘍組織における腫瘍細胞の遺伝子変異を検査する場合、これまでは生検（ｂｉｏｐｓｙ）を行うしか方法がなかった。しかしながら、生検操作は侵襲性が高く、連続的に生検を行うことが患者にとって負担であった。また、腫瘍組織は不均一であり、同一腫瘍中に正常細胞と複数種の腫瘍細胞が混在しているという問題点があった。転移がある場合には転移巣ごとに生検することが望ましいが、患者負担の観点からそれは実施困難であった。
【００１０】
患者への侵襲度が低い方法として、腫瘍細胞が血中へ放出する血中循環腫瘍細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ；  ＣＴＣ）および／または無細胞の血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ；  ｃｔＤＮＡ）を分析する方法がある。当該ｃｔＤＮＡは、血中循環無細胞ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ；  ｃｆＤＮＡ）の一種である。
【００１１】
ｃｔＤＮＡから腫瘍ゲノムを再構築できる可能性があるため、これまでの生検に代わる方法としてリキッドバイオプシー（ｌｉｑｕｉｄ  ｂｉｏｐｓｙ）とも呼ばれている（非特許文献４）。
【００１２】
このような理由から、ｃｔＤＮＡを検出する技術について需要が高まっている。しかしながら、血中には正常細胞由来ＤＮＡが大量に存在し、相対的にも絶対的にも微量しか存在しないｃｔＤＮＡを検出することは困難であった。
【００１３】
ｃｔＤＮＡは循環血液中では濃度が低く、さらに高度に断片化されており、多くは１６０ｍｅｒ以下となっている。
【００１４】
そのため、患者へ抗体医薬を投与する前に、Ｋ−ｒａｓ遺伝子型を迅速に、簡便に、感度高く判別すること、および患者への侵襲度が低い方法で検体採取種して判別する方法が求められてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１４２２６１号パンフレット
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】キャンサー  トリートメント  レビューズ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）、第４１巻、第８号、６５３〜６５９ページ（２０１５年）
【非特許文献２】ザ  ニュー  イングランド  ジャーナル  オブ  メディシン（Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第３６９巻、第１１号、１０２３〜１０３４ページ（２０１３年）
【非特許文献３】インターナショナル  ジャーナル  オブ  クリニカル  オンコロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Jｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Cｌｉｎｉｃａｌ  Oｎｃｏｌｏｇｙ）、第２０巻、第２号、２０７〜２３９ページ（２０１５年）
【非特許文献４】サイエンス  トランスレーショナル  メディシン（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第６巻、第２２４号、２２４ｒａ２４ページ（２０１４年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、非標的核酸に対して微量な、かつ断片化した標的核酸の高感度検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、ミスマッチ部位を認識・切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの特性、特にミスマッチの種類や位置と切断活性との相関を解析した。その結果、配列中の少なくとも１塩基が相違する２種の核酸について、相違する塩基の種類に制限されることなく、そのうちの任意の一方を切断できる方法を見出した。また、当該方法で大量の非標的核酸と希少な標的核酸の混在した試料を処理することで、非標的核酸を選択的に切断することが可能となり、希少な標的核酸を選択的に核酸増幅できる方法、さらに当該核酸増幅方法を用いた標的核酸の高感度検出方法を見出し、本発明を完成させた。
【００１９】
すなわち、本発明の第一の発明は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のエキソン２のコドン１２の変異の存在を検出する方法であって、
（１）下記ａ）〜ｄ）を含有する反応液を調製する工程；
ａ）被験試料、
ｂ）配列番号８で示される、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子のエキソン２を含む領域の塩基配列の５０位から２９０位の範囲で、それぞれ重複することなく設計されたフォワードプライマー、リバースプライマー及び抑制オリゴヌクレオチド、
ｃ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及び
ｄ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；
（２）反応液を温度サイクル反応に供する工程、及び
（３）反応後の反応液についてＫ−ｒａｓ遺伝子の配列の一部を有する増幅ＤＮＡ断片を検出する工程、を包含し、
ここで、前記抑制オリゴヌクレオチドは、野生型ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子由来の核酸のコドン１２に対応する塩基配列を含む領域とハイブリダイズさせた際にミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで切断されるミスマッチを生じ、かつコドン１２に対応する塩基配列に変異が生じた前記領域とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際には前記ポリペプチドで切断されるミスマッチを生じないオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、方法に関する。
【００２０】
本発明の第一の発明において、反応液が、さらにプローブを含有してもよい。
【００２１】
本発明の第一の発明において、反応液が、
配列番号８の塩基配列の５０位から１９０位の範囲で設計されたフォワードプライマー、
配列番号８の塩基配列の２１０位から２９０位の範囲で設計されたリバースプライマー、及び
配列番号８の塩基配列の１８０位から２３０位の範囲、かつ配列番号８の塩基配列の２０４位の変異を含む範囲で設計された抑制オリゴヌクレオチド、
を含有することを特徴とする方法であってもよい。
【００２２】
反応液が、さらに配列番号８の塩基配列の１９０位から２２０位の範囲で設計されたプローブを含有することを特徴とする方法であってもよい。
【００２３】
ここで、フォワードプライマー及びリバースプライマーは２０〜３０塩基のオリゴヌクレオチド、抑制オリゴヌクレオチドは１０〜２０塩基のオリゴヌクレオチド、およびプローブは７〜１４塩基のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００２４】
さらには、配列番号１〜４いずれか１つで示されるフォワードプライマー、配列番号５で示されるリバースプライマー、配列番号６で示される抑制オリゴヌクレオチド、および配列番号７、１０、または１１で示されるプローブが好適に使用できる。
【００２５】
また、本発明の第一の発明は、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド存在下で行うことができる。配列番号１２〜１６から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが好適に使用できる。
【００２６】
また、本発明の第一の発明において、標的核酸の検出はサイクリング・プローブ法又はＴａｑＭａｎ（登録商標）法で行うことができる。
【００２７】
本発明の第二の発明は、本発明の第一の発明のためのキットであって、配列番号８で示される、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子のエキソン２を含む領域の塩基配列の５０位から２９０位の範囲で、それぞれ重複することなく設計されたフォワードプライマー、リバースプライマー及び抑制オリゴヌクレオチドを含有する、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子のエキソン２のコドン１２の変異の存在を検出するためのキットに関する。
【００２８】
本発明の第二の発明において、さらにプローブ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを含有してもよい。
【発明の効果】
【００２９】
本発明により、非標的核酸に対して微量な、かつ断片化した標的核酸の高感度検出方法が提供される。また、当該核酸増幅方法と標的核酸の特異的リアルタイム検出方法を組み合わせることにより、希少な変異型遺伝子の高感度での検出を可能とする方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子コドン１２のグリシン野生型からアスパラギン酸変異型へ変異を検出した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明において、ミスマッチとは、二本鎖核酸中に存在するワトソン−クリック塩基対とは異なる塩基の対合、すなわちＧ（グアニン塩基）−Ｃ（シトシン塩基）、Ａ（アデニン塩基）−Ｔ（チミン塩基）またはＵ（ウラシル塩基）の塩基対結合以外の組み合わせの塩基結合を示す。
【００３２】
本発明において、標的核酸とは、変異が生じたヒトＫ−ｒａｓ遺伝子に由来する核酸を言う。本発明は、当該標的核酸を野生型のヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の塩基配列を有する核酸（以下、非標的核酸と称する）と区別することに有用である。特に本発明を限定するものではないが、本発明における標的核酸、非標的核酸にはＤＮＡが好適である。
【００３３】
特に限定はされないが、本発明における標的核酸としては、野生型ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の塩基配列に置換、欠失及び／又は挿入が生じた核酸が例示される。特に、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２または１３をコードする領域に１塩基置換が生じた核酸が好適である。
【００３４】
以下、さらに詳細に説明する。
１．本発明の構成要素
（１）ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子変異
本発明の方法における標的核酸は、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子変異のホットスポットの１つであるエキソン２のコドン１２に変異を有するに核酸である。配列表８に示される野生型ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子のエキソン２を含む領域の塩基配列において、塩基番号２０２〜２０５はコドン１２（グリシン）に対応している。このグリシンについて、セリン、システイン、アルギニン（配列表８の塩基配列の塩基番号２０３のグアニンがそれぞれアデニン、チミン、シトシンに置換）、アスパラギン酸、バリン、アラニン（配列表８の塩基配列の塩基番号２０４のＧがそれぞれアデニン、チミン、シトシンに置換）に変異したヒトＫ−ｒａｓ変異遺伝子が知られている。本発明の方法は、コドン１２がアスパラギン酸のコドンに変異したＧ１２Ｄ変異をコードする核酸の検出に有用である。当該変異の詳細は、下記の通りである。
ｒｅｆＳＮＰ；  ｒｓ１２１９１３５２９
ＧＲＣｈ３８．ｐ２において、ＮＣ＿００００１２．１２のＣｈｒ．  Ｐｏｓ．  ２５２４５３５０
ＮＭ＿００４９８５．４において、Ｐｏｓ．  ２２７  （ｇＧｔ→ｇＡｔ）
ＮＰ＿００４９７６．２において、Ｐｏｓ．  Ｇｌｙ１２Ａｓｐ  （Ｇ１２Ｄ）
ｄｂＳＮＰ；  ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＮＰ／ｓｎｐ＿ｒｅｆ．ｃｇｉ？ｒｓ＝１２１９１３５２９
【００３５】
本明細書において、上記標的核酸およびその周辺塩基配列は配列番号８に示した。Ｇ１２Ｄ変異においてアデニン（Ａ）に置換したグアニン（Ｇ）は、配列番号８の２０４位に相当する。
【００３６】
（２）プライマーセット
本発明の方法に使用するプライマーセットは、ＰＣＲ法によりヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡを増幅するためのプライマーセット（以下、「Ｋ−ｒａｓ増幅用プライマーセット」と記載する）を含む。当該プライマーセットは、一般的な核酸増幅反応条件下でヒトＫ−ｒａｓ遺伝子のエキソン２のコドン１２、１３に対応する塩基配列を含む領域のＤＮＡを増幅可能な１対のプライマーセットである。前記プライマーセットは、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の塩基配列と相同な塩基配列を有するフォワードプライマーと、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列を有するリバースプライマーとで構成される。両プライマーはヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の塩基配列に基づいて任意に設計することができる。なお、当該プライマーセットは標的核酸、非標的核酸のどちらも鋳型とすることができ、増幅ＤＮＡ断片を生じる。
【００３７】
前記のプライマーセットを構成するプライマーは、鋳型となるヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の塩基配列と実質的に相同もしくは相補的な塩基配列を有し、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成反応の起点として機能するオリゴヌクレオチドである。プライマーの鎖長は、好ましくは１０〜５０塩基、より好ましくは１５〜４０塩基、さらに好ましくは２０〜３０塩基である。
【００３８】
本発明の方法では、断片化されているｃｔＤＮＡを鋳型としてヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の変異を検出することを可能とするため、短鎖長のＤＮＡが増幅されるようにプライマーセットが設計される。当該プライマーセットは、好ましくは配列番号８で示される塩基配列の５０位から２９０位の範囲、より好ましくは１１１位から２４２位の範囲、さらに好ましくは１４１位から２４２位の範囲内で設計されたフォワードプライマーとリバースプライマーのセットが例示される。特に限定するものではないが、配列番号８の塩基配列の５０位から１９０位の範囲で設計されている、配列番号１〜４から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（以下、フォワードプライマーと称することがある）、および配列番号８の塩基配列の２１０位から２９０位の範囲で設計されている、配列番号５記載のオリゴヌクレオチド（以下、リバースプライマーと称することがある）の組み合わせが例示される。好適には、配列番号３記載のオリゴヌクレオチドと配列番号５記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせ、および配列番号４記載のオリゴヌクレオチドと配列番号５記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせが例示される。
【００３９】
本発明において、プライマーセットは得られる増幅産物の塩基長が１００ｂｐ〜１８０ｂｐの範囲となるよう設計される。
【００４０】
本発明の方法では、Ｋ−ｒａｓ増幅用プライマーセットに加えて、さらに後述の抑制オリゴヌクレオチドならびにミスマッチエンドヌクレアーゼの存在下に核酸増幅反応が実施される。さらに、プローブを含めることができる。抑制オリゴヌクレオチドおよびプローブは、上記Ｋ−ｒａｓ増幅用プライマーセットを用いたＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡ中の標的配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であればよく、特に限定はされないが、例えば抑制オリゴヌクレオチドは配列番号６、プローブは配列番号７、１０、または１１に示す塩基配列である。
【００４１】
なお、フォワードプライマー、リバースプライマー、抑制オリゴヌクレオチド、およびプローブは、互いにハイブリダイズしない配列になるよう設計することが望ましい。特に、ミスマッチエンドヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼＨによって認識され切断される塩基およびその周辺配列は特異的な配列になるよう設計することが望ましい。
【００４２】
（３）抑制オリゴヌクレオチド
本発明の方法は、標的核酸と、非標的核酸とを含有する試料中において、非標的核酸のみを選択的に切断することにより、標的核酸のみを効率的に増幅し、検出する方法である。すなわち、本発明では野生型のヒトＫ−ｒａｓ遺伝子に由来する核酸の選択的な切断が実施される。
【００４３】
本発明では、非標的核酸とハイブリダイズさせた際にミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによって切断されるミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際には前記のミスマッチを生じないオリゴヌクレオチド（以下、抑制オリゴヌクレオチドと称することがある）と、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとを用いる。ここで、「ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによって切断されるミスマッチを生じない」とは、抑制オリゴヌクレオチドを標的核酸とハイブリダイズさせた際にミスマッチを生じないこと、前記ポリペプチドで切断できないミスマッチを生じること、又は前記ポリペプチドで切断されるミスマッチならびに当該ミスマッチの切断を妨害する別の（１又は数個の）ミスマッチを生じること、を包含する。
【００４４】
以上のような性質を備えた抑制オリゴヌクレオチドを設計して使用することにより、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによる非標的核酸の選択的な切断が可能となる。抑制オリゴヌクレオチドは、標的核酸と非標的核酸の塩基配列の違い、使用するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの性質に基づいて任意に設計することができる。また、抑制オリゴヌクレオチドは、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子のセンス鎖、アンチセンス鎖のどちらの配列を参照して設計してもよい。抑制オリゴヌクレオチドは、前記のプライマーセットが設計された位置の間で、かつ両プライマーの設計位置とは重複しないように設計される。
【００４５】
本発明の方法で使用する抑制オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡで構成されるが、その一部をヌクレオチドアナログやＲＮＡとしてもよい。すなわち、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドにより非標的核酸を特異的に切断せしめるという機能を示す限りにおいて特に限定はされない。
【００４６】
ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子上の特定の変異の存在を検出が望まれる場合、野生型ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の当該変異部位とハイブリダイズした場合にミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで切断されるミスマッチを生じ、かつ変異を有するヒトＫ−ｒａｓ遺伝子とハイブリダイズさせた際には前記のミスマッチを生じるが前記ポリペプチドで切断できない抑制オリゴヌクレオチドを作製して使用される。前記のとおり、「ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで切断されるミスマッチを生じない抑制オリゴヌクレオチド」は、（１）変異を有するヒトＫ−ｒａｓ遺伝子と完全に相補的な配列、（２）変異を有するヒトＫ−ｒａｓ遺伝子との間で、使用されるミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによって切断されないミスマッチを生じる配列、並びに（３）変異を有するヒトＫ−ｒａｓ遺伝子との間で、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで切断されるミスマッチと、それに加えて当該切断を阻害しうる１以上のミスマッチを生じる配列、から選択される塩基配列に基づいて設計することができる。
【００４７】
本発明の方法に使用される抑制オリゴヌクレオチドの鎖長には特に限定はないが、通常は７塩基以上のものが使用され、好ましくは７〜４０塩基、より好ましくは１０〜３０塩基、特に好ましくは１１〜２５塩基の範囲である。さらに、本発明を特に限定するものではないが、このオリゴデオキシヌクレオチドの３’末端は、このオリゴデオキシヌクレオチドからのＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を抑制するための修飾を施されていてもよい。例えば、アミノ化などの修飾が例示される。
【００４８】
後述の実施例１記載の、配列番号６で示される抑制オリゴヌクレオチドは、コドン１２がＧＧＴ（グリシンに対応）である野生型のヒトＫ−ｒａｓ遺伝子とハイブリダイズした場合にはＧ−Ｇミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡを形成する。一方、コドン１２がＧＡＴ（アスパラギン酸に対応）に変異したヒトＫ−ｒａｓ遺伝子とはＧ−Ａミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡを形成する。この抑制オリゴヌクレオチドと、Ｇ−Ｇミスマッチを切断しかつＧ−Ａミスマッチを切断しないミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとを組み合わせることにより、野生型ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子を選択に切断することが可能となる。
【００４９】
（４）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
本明細書において、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとは、７５℃以上の温度で３０分間処理した後であっても活性を保持するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの事を言う。当該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性、及び／又はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性をさらに有していてもよい。
【００５０】
本発明に使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲに使用可能なものであればよく、すでに多くの種類の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが市販されている。本発明を特に限定するものではないが、本発明に使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、高度好熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼが例示される。高度好熱菌とは７５℃以上の環境下でも生育できる菌の事を指す。高度好熱菌としては、例えば、真正細菌ではＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、及びＴｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓのようなＴｈｅｒｍｕｓ属の真正細菌、古細菌ではＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｓｅｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのようなＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属の古細菌、並びにＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｌｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｃｕｌｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＫＳ−１、及びＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓのようなＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属の古細菌が挙げられる。なお、本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、２種以上の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの混合物を用いても良い。
【００５１】
（５）ミスマッチエンドヌクレアーゼ
本明細書において、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド（以下、ミスマッチエンドヌクレアーゼと称することがある）とは、二本鎖核酸中のミスマッチ部位を切断する活性を有するヌクレアーゼのことをいう。前記のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性は、ミスマッチ塩基対を形成するヌクレオチドに隣接するリン酸ジエステル結合を切断する活性の他、ミスマッチ塩基対から１〜５塩基対、好ましくは１〜３塩基対離れたヌクレオチドに隣接するリン酸ジエステル結合を切断する活性を包含する。本発明においてミスマッチエンドヌクレアーゼは、特定のミスマッチ塩基対を特異的に認識して二本鎖核酸を切断する活性を有するもの（例えばＧＴミスマッチを特異的に認識するものや、ＧＴミスマッチ及びＧＧミスマッチを特異的に認識するもの等）であってもよい。また、本発明において耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸中のミスマッチ部位を切断する活性の他に、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖核酸と二本鎖核酸のジャンクション部分、ダブルフラップ構造、レプリケーションフォーク構造、Ｄ−ループ構造、及び／又はニックが入ったホリデイジャンクション構造を認識して核酸を切断する活性を有していても良い。また、本明細書において耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼとは、５０℃以上の温度において二本鎖核酸中のミスマッチ部位を切断する活性を示すヌクレアーゼのことをいい、本発明においては耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼの使用が好ましい。
【００５２】
本発明を特に限定するものではないが、本発明に使用される耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のポリペプチドＰＦ００１２（国際公開第２０１４／１４２２６１号パンフレット、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿５７７７４１、本発明の配列表の配列番号１２）、当該ポリペプチドＰＦ００１２の７７番目のトリプトファン残基がフェニルアラニンに置換されてなるアミノ酸配列を有するポリペプチドＷ７７Ｆ変異体（国際公開第２０１４／１４２２６１号パンフレット、本発明の配列表の配列番号１３）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ由来のミスマッチエンドヌクレアーゼＮｕｃＳ（配列番号１４）、ＰＦ００１２のホモログであるＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のポリペプチドＭＪ＿０２２５（国際公開第２０１４／１４２２６１号パンフレット、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿２４７１９４、本発明の配列表の配列番号１５）、及びＰＦ００１２のホモログであるＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ由来のポリペプチドＴＥＲＭＰ＿０１８７７（国際公開第２０１４／１４２２６１号パンフレット、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＹＰ＿００４０７２０７５、配列表の配列番号１６）が例示される。
【００５３】
本発明を特に限定するものではないが、前記ポリペプチドやそのホモログ、それらの変異体が本発明に使用できる。前記ポリペプチドのアミノ酸配列において１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有するポリペプチド（ただし、ポリペプチドＷ７７Ｆ変異体において７７番目のアミノ酸残基を除く）、及び前記ポリペプチドのアミノ酸配列に対して５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、またさらに好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明における耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼとして好適である。なお、該置換、欠失、挿入、及び／又は付加は、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性が保持される変異であることを条件とする。
【００５４】
このようなミスマッチエンドヌクレアーゼは、後述する種々の用途、例えば特異的ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡを排除しその他のＤＮＡを増幅、検出する方法に好適である。
ここで、ミスマッチエンドヌクレアーゼの活性は、ミスマッチ塩基対を含有する二本鎖核酸を基質として測定することができる。具体的には、ミスマッチ塩基対を含有する二本鎖核酸を調製した後、ミスマッチエンドヌクレアーゼに対して過剰量の当該二本鎖核酸をミスマッチエンドヌクレアーゼと反応させ、単位時間当たりの切断核酸量を測定することで活性測定が実施される。切断された二本鎖核酸は、電気泳動などにより切断を受けなかった核酸と分離して定量することが可能である。切断を受けた場合にのみ蛍光強度の増加が検出できるように蛍光物質と消光物質とで二重に標識した二本鎖核酸を使用すれば、反応溶液中の蛍光強度を適当な時間ごとに測定することにより活性を簡便に測定することができる。また、基質となる二本鎖核酸の中のミスマッチ塩基対の塩基を変えることで、特定のミスマッチ塩基対に対する切断活性を調べることも可能である。
【００５５】
本発明の方法において、上記抑制オリゴヌクレオチドは、ミスマッチ塩基の認識・切断に最適なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドと組み合わせて使用される。特に限定はされないが例えば、前記耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼが好適に使用できる。
【００５６】
本発明の好適な態様においては、並行して行われる核酸増幅や検出のために耐熱性菌由来のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを用いることが好ましい。特に限定はされないが、例えばＰＣＲのような熱サイクル中でも安定に活性を保持するものが好ましく、５０℃以上、さらに好ましくは、７０℃以上、より好ましくは９０℃以上でも失活しないポリペプチドが使用できる。
【００５７】
（６）その他
前述のとおり、本発明の方法は一般的なＰＣＲの反応条件で実施することができる。反応用緩衝液、２価陽イオン、１価陽イオン、界面活性剤等は、使用する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの特性に基づいて設定することができる。
【００５８】
本発明の方法は、酸性高分子物質存在下で実施することができる。当該酸性高分子物質は、それが共存することによって、当該ポリペプチドのミスマッチ認識・切断活性を制御する効果が確認されている。当該効果は、試料中の核酸量が少ない場合において、より効果を発揮する。当該酸性高分子物質としては、ポリアニオンであるものが好ましい。また糖骨格を有する酸性多糖あるいは直鎖炭素鎖を有する酸性多糖が好ましい。酸性高分子物質としては、フコース硫酸含有多糖、デキストラン硫酸、カラギーナン、ヘパリン、ラムナン硫酸、デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂ）、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチン、ポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリビニル硫酸、ポリスチレン硫酸、およびそれらの塩、あるいは標的核酸及び非標的核酸とは異なる核酸からなる群より選択された１種以上を使用することができる。
【００５９】
本発明の方法は、さらに、増殖細胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ；  ＰＣＮＡ）を組み合わせて実施してもよい。核酸増幅反応に有効なＰＣＮＡが知られており（例えば国際公開第２００７／００４６５４号パンフレット等）、反応液に添加して使用することができる。
【００６０】
２．本発明の標的核酸の選択的検出方法
以上に示したプライマーセット、抑制オリゴヌクレオチド、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド（好ましくは耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド）、並びに被験試料を含む反応液を調製し、核酸増幅反応が起こる条件下、すなわちポリメラーゼ連鎖反応が進行する条件下で保温する。この際に生成した非標的核酸由来のＤＮＡ断片は抑制オリゴヌクレオチドとミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの作用により切断されることから、反応液中には標的核酸由来のＤＮＡ断片のみが蓄積される。こうして、反応液中のＤＮＡ断片の生成を確認することにより、被験試料中の変異ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の存在／非存在を知ることができる。反応液中のＤＮＡ断片は、例えば電気泳動法をはじめとする公知の方法で検出することができるが、適切な標識プローブを利用して、反応液中のＤＮＡ断片の増加を経時的に調べることができる。
【００６１】
本発明の方法における増幅ＤＮＡ断片を検出する工程としては、ダイレクトシーケンス法やインターカーレーターによる高解像度融解曲線解析（ＨＲＭ：Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｃｕｒｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）法などのエンドポイント検出、および配列特異的プローブを使用するサイクリング・プローブ法（例えば国際公開第２００３／０７４６９６号）やＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ法（例えば国際公開第９２／０２６３８号）などのリアルタイム検出が例示される。好ましくは、ＰＣＲ法と組み合わせることができるサイクリング・プローブ法やＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ法による検出である。特に好ましくは、サイクリング・プローブ法による検出である。
【００６２】
上記サイクリング・ブローブ法で検出する場合には、当該検出系にリボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドを共存させる。ＰＣＲと並行して検出を行う観点から、当該リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドは、耐熱性のものが好ましい。特に限定はされないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ由来、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来、又はＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ由来のリボヌクレアーゼＨが好適に使用できる。
また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレアーゼＨを含む市販の製品、例えばＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を使用することもできる。
【００６３】
サイクリング・プローブ法では標的核酸を非標的核酸と区別して検出することが可能である。このような検出に使用可能なプローブ（キメラオリゴヌクレオチドプローブ）は公知の方法、例えば国際公開第２０１２／０１４９８８号パンフレットに開示された方法により設計することができる。当該キメラオリゴヌクレオチドプローブは、ＲＮＡ部分を挟んで一方が蛍光物質で、もう一方がその蛍光物質の発する蛍光を消光する物質（クエンチャー）で標識されているものが好適である。当該物質の組合せとしては、６−ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とＤＡＢＣＹＬ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ−４’−ｓｕｌｆｏｎｅ）、ＲＯＸ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）とＤＡＢＣＹＬ、６−ＦＡＭとＥｃｌｉｐｓｅ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＲＯＸとＥｃｌｉｐｓｅ、ＴＥＴ（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とＤＡＢＣＹＬ、ＴＥＴとＥｃｌｉｐｓｅ、６−ＦＡＭとＢＨＱ（登録商標、ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、ＲＯＸとＢＨＱ、ＴＥＴとＢＨＱ等が好適に使用できる。
【００６４】
該プローブの修飾は、プローブの５’末端を蛍光物質で、３’末端をクエンチャーで標識してもよいし、あるいはプローブの５’末端をクエンチャーで、３’末端を蛍光物質で標識してもよい。当該プローブの修飾は、プローブの塩基長、キメラプローブ中のＲＮＡの位置、ミスマッチ塩基の位置、およびバックグラウンドノイズの低さなどに応じて適宜選択することができる。
【００６５】
これらのプローブは、抑制オリゴヌクレオチドと同様に、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の塩基配列を参照しながら、前記のプライマーセットが設計された位置の間で、かつ両プライマーの設計位置とは重複しないように設計される。プローブを抑制オリゴヌクレオチドと重複する位置で設計することは差し支えない。本発明を特に限定するものではないが、配列番号７、１０、または１１に示されるサイクリング・プローブが本発明に好適である。
【００６６】
ＰＣＲを利用する本発明の検出方法においては、さらに陽性対照核酸の増幅と検出を組み合わせてもよい。前記陽性対照核酸は、試料中に最初から存在する検出の対象となる遺伝子と異なる遺伝子の核酸（例えば、ハウスキーピング遺伝子など）が好ましい。試料中に最初から存在する遺伝子を陽性対照核酸とする場合は、当該遺伝子の任意の領域を増幅させるためのプライマーセットと検出用プローブを組み合わせて使用する。また、人工核酸を調製して試料にあらかじめ添加してもよく、例えば、標的核酸及び非標的核酸の増幅領域と同じ領域あるいは標的核酸及び非標的核酸の増幅領域とは異なる領域の核酸であってもよい。あらかじめ試料に既知量を添加した人工核酸を陽性対照核酸とする場合は、標的核酸及び非標的核酸の増幅領域と同じプライマーで増幅可能であれば共通のプライマー対を使用し、標的核酸及び非標的核酸の増幅領域とは異なる領域であれば当該領域増幅用のプライマーセットを使用する。当該陽性対照核酸を検出するためのプローブは、これらの陽性対照核酸を選択的に検出できるものを使用する。本発明の標的核酸の検出と同時にこれらの陽性対照核酸の検出を行うことにより、本発明の検出系での増幅に異常かないかどうかの確認、並びに増幅曲線の比較による標的核酸の初期量の半定量的な解析が可能となる。
【００６７】
本発明の検出方法は、酸性高分子物質存在下で実施することができる。当該酸性高分子物質の効果は、サンプルの核酸量が少ない場合において、より効果を発揮する。当該酸性高分子物質としては、前述の本発明の非標的核酸の選択的切断方法の説明で例示されたものが好適に使用できる。本発明の方法は、さらにＰＣＮＡを組み合わせて実施してもよい。
【００６８】
本発明の検出方法は、例えば血中循環腫瘍ＤＮＡの検出や母親の血液中に含有されている少量の胎児ＤＮＡ配列の検出にも有用である。
【００６９】
本発明を特に限定するものではないが、前記の特定の塩基配列を有する核酸としては、腫瘍マーカーとして利用される一塩基多型変異、癌治療用薬剤による治療効果と相関する一塩基多型変異、及び細胞の癌化との相関が知られている一塩基多型変異からなる群より選択された少なくとも１つの一塩基多型変異を含む核酸が好ましい。ＳＮＰｓには、腫瘍細胞に高頻度で認められるものや、癌治療用薬剤による治療効果や発癌との相関が知られているものがある。このような後天的遺伝子変異としては、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子、Ｂ−ｒａｆ遺伝子、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子の変異が例示される。ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の体細胞変異は、結腸直腸癌、肺腺癌、甲状腺癌等において高頻度で認められる。ＥＧＦＲ遺伝子の体細胞変異は、様々な固形腫瘍において高頻度で認められる。ゲフィチニブやエルロチニブ等のＥＧＦＲ阻害剤による癌の治療は、癌組織のＥＧＦＲ遺伝子が特定の一塩基多型変異を有する場合に有効である可能性が高いことが知られている。一方、癌組織のヒトＫ−ｒａｓ遺伝子が一塩基多型変異を有する場合には、ＥＧＦＲ阻害剤への抵抗性を示す可能性が高いことが知られている。また、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子やＢ−ｒａｆ遺伝子の体細胞変異は、結腸直腸癌、悪性黒色腫、甲状腺乳頭癌、非小細胞肺癌、肺腺癌等において高頻度で認められる。
【００７０】
３．本発明の組成物
本発明の検出方法のための組成物としては、
ｂ）配列番号８で示される塩基配列の５０位から２９０位の範囲で、それぞれ重複することなく設計されたフォワードプライマー、リバースプライマー及び抑制オリゴヌクレオチド；
ここで、前記抑制オリゴヌクレオチドは、野生型ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子由来の核酸のコドン１２に対応する塩基配列を含む領域とハイブリダイズさせた際にミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで切断されるミスマッチを生じ、かつコドン１２に対応する塩基配列に変異が生じた前記領域とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際には前記ポリペプチドで切断されるミスマッチを生じないオリゴヌクレオチドである、
ｃ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ又はその変異体、及び
ｄ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド又はその変異体、
を含有する組成物が例示される。
【００７１】
本発明の組成物においては、特に限定はされないが、実施例記載のＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ＿Ｆ３とＲ１のプライマー対、又はＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ＿Ｆ４とＲ１のプライマー対とＳ＿ＫＲＡＳ＿Ｇ１２  抑制オリゴヌクレオチドの組み合わせが好ましく、当該組み合わせにさらにＤ＿ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ検出プローブを組み合わせてもよい。
【００７２】
当該組成物は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが作用を示し得る反応液を調製するための各種成分（緩衝成分、二価陽イオン、４種のｄＮＴＰ、界面活性剤等）を含有することができる。さらに酸性高分子物質を含んでいてもよい。当該酸性高分子物質としては、前述の本発明の非標的核酸の選択的切断方法の説明で例示されたものが好適に使用できる。
【００７３】
本発明の組成物は、さらに増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を含んでいてもよい。
【００７４】
また、ＰＣＲにより標的核酸の検出を実施する本発明の標的核酸の選択的検出方法に使用される組成物は、リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチド又はその変異体、キメラオリゴヌクレオチドであるサイクリング・プローブ、あるいはＴａｑＭａｎプローブを含んでいてもよい。特にミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドは、野生型ポリペプチドあるいは変異型ポリペプチドのいずれから選択してもよい。特に限定はされないが、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとしてＰｆｕ由来ＮｕｃＳタンパク質の変異体が好適である。さらに陽性対照核酸検出用のプライマー対とキメラオリゴヌクレオチドプローブあるいはＴａｑＭａｎプローブを組み合わせてもよい。
【００７５】
４．本発明のキット
本発明の標的核酸の選択的増幅方法及び／又は標的核酸の選択的検出方法のためのキットとしては、
ｂ）配列番号８で示される塩基配列の５０位から２９０位の範囲で、それぞれ重複することなく設計されたフォワードプライマー、リバースプライマー及び抑制オリゴヌクレオチド；
ここで、前記抑制オリゴヌクレオチドは、野生型ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子由来の核酸のコドン１２に対応する塩基配列を含む領域とハイブリダイズさせた際にミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで切断されるミスマッチを生じ、かつコドン１２に対応する塩基配列に変異が生じた前記領域とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際には前記ポリペプチドで切断されるミスマッチを生じないオリゴヌクレオチドである、
ｃ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼポリペプチド又はその変異体、及び
ｄ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド又はその変異体、
を含有するキットが例示される。
【００７６】
本発明のキットにおいては、特に限定はされないが、実施例記載のＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ＿Ｆ３とＲ１のプライマー対、又はＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ＿Ｆ４とＲ１のプライマー対とＳ＿ＫＲＡＳ＿Ｇ１２  抑制オリゴヌクレオチドの組み合わせが好ましく、当該組み合わせにさらにＤ＿ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ検出プローブを組み合わせてもよい。
【００７７】
本発明のキットは、反応液を調製するための各種の成分を含むことができる。さらに酸性高分子物質を含んでいてもよく、適当な濃度に調製された水溶液が好適に使用できる。当該酸性高分子物質としては、前述の本発明の非標的核酸の選択的切断方法の説明で例示されたものが好適に使用できる。
【００７８】
本発明のキットは、さらに増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を含んでいてもよい。
【００７９】
また、ＰＣＲにより標的核酸の検出を実施する本発明の標的核酸の選択的検出方法に使用されるキットは、リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチド又はその変異体、キメラオリゴヌクレオチドであるサイクリング・プローブ、あるいはＴａｑＭａｎプローブを含んでいてもよい。特にミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドは、野生型ポリペプチドあるいは変異型ポリペプチドのいずれから選択してもよい。特に限定はされないが、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のポリペプチドＰＦ００１２（国際公開第２０１４／１４２２６１号パンフレット、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿５７７７４１、本発明の配列表の配列番号１０）または当該ポリペプチドＰＦ００１２の７７番目のトリプトファン残基がフェニルアラニンに置換されてなるアミノ酸配列を有するポリペプチドＷ７７Ｆ変異体（国際公開第２０１４／１４２２６１号パンフレット、本発明の配列表の配列番号１１）が好適に使用される。さらに陽性対照核酸検出用のプライマー対とキメラオリゴヌクレオチドプローブあるいはＴａｑＭａｎプローブを組み合わせてもよい。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８１】
実施例１  ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子コドン１２の変異解析１
本発明の方法を用いたヒトＫ−ｒａｓ遺伝子コドン１２の点突然変異検出について検討した。本実施例では、標的核酸にはヒトＫ−ｒａｓ遺伝子コドン１２の点突然変異体のうちアスパラギン酸変異体を選択した。以下、この変異型遺伝子をＧ１２Ｄ変異ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子と記載する。非標的核酸には、当該遺伝子の野生型（コドン１２がグリシンに対応）を含むＨｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（タカラバイオＵＳＡ社製）を用いた。
（１）プライマー、プローブ、鋳型核酸の準備
ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ＿００００１２．１２で公開されているＨｕｍａｎ  Ｋ−ｒａｓ遺伝子情報（Ｒｅｇｉｏｎ：  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（２５２０４７８９．．２５２５２０９３））から配列番号１〜４記載の塩基配列をそれぞれ有するＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ＿Ｆ１〜Ｆ４  プライマー、及び配列番号５記載のＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ＿Ｒ１プライマーを化学合成した。また、配列番号７記載の塩基配列を有し、５’末端がＦＡＭ、３’末端がＢＨＱ１で標識されたキメラオリゴヌクレオチドプローブであるＤ＿ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄを合成した。当該プローブはＧ１２Ｄ変異ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子を特異的に検出することができる。さらに、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の前記ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ＿Ｆ１とＲ１プライマーの塩基配列に挟まれた領域の塩基配列を含むＤＮＡであって、コドン１２の点突然変異により当該コドンがＧＧＴ（グリシン）からＧＡＴ（アスパラギン酸）になった人工合成ＤＮＡも作製した。この人工合成ＤＮＡは、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ２０（タカラバイオ社製）のＴ−ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ部位に常法により挿入した。このようにして調製したプラスミドは、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ  ＤＮＡと命名し、変異型遺伝子として用いた。
【００８２】
（２）抑制オリゴヌクレオチドの調製
ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子コドン１２を含む領域にハイブリダイズ可能な、配列番号６記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作製した。当該オリゴヌクレオチドは、その３’末端からポリメラーゼ伸長反応が起こらないように、３’末端のヒドロキシ基がアミノ基で修飾されている。このオリゴヌクレオチドを抑制オリゴヌクレオチド  Ｓ＿ＫＲＡＳ＿Ｇ１２と命名した。前記オリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号８（上記Ｈｕｍａｎ  Ｋ−ｒａｓ遺伝子情報のうち、Ｒｅｇｉｏｎ：  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（２５２４５５５３．．２５２４５２５４）の部分に相当）記載の塩基配列を有する野生型ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子由来の核酸とハイブリダイズすると配列番号８の２０４番目のＧの位置でＧ−Ｇのミスマッチを生じる。一方、配列番号９記載の塩基配列を有するＧ１２Ｄ変異ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子由来の核酸とハイブリダイズした場合には、配列番号９の２０４番目のＡの位置でＡ−Ｇのミスマッチが生じる。
【００８３】
（３）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの調製
国際公開第２０１４／１４２２６１号パンフレットに記載された、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のミスマッチ特異的二本鎖切断活性を有するＰＦ００１２ポリペプチドのＷ７７Ｆ変異体（配列番号１３）を、同文献の調製例１〜３及び実施例１記載の方法で調製した。以下、このポリペプチドをＮｕｃＳタンパク質と称する。
【００８４】
（４）野生型遺伝子増幅抑制の確認
Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡならびにＫ−ｒａｓＧ１２Ｄ  ＤＮＡを５０，０００コピー：５００コピー（＝１００：１）、５０，０００コピー：５０コピー（＝１０００：１）および５０，０００コピー：５コピー（＝１０，０００：１）の割合で混合したＤＮＡサンプルを調製した。また対照にはＨｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡのみを使用した。Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ５０，０００コピーのＤＮＡ量としては、約１８５ｎｇになる。
【００８５】
野生型遺伝子増幅抑制を伴う特異的変異検出は、以下のようにして行った。すなわち、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて、上記の各ＤＮＡサンプル、２５０ｎＭのＮｕｃＳタンパク質、各０．２μＭのＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ＿Ｆ１及びＲ１プライマー、０．２μＭのＳ＿ＫＲＡＳ＿Ｇ１２  抑制オリゴヌクレオチド、０．２μＭのＤ＿ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ  キメラオリゴヌクレオチドプローブ、並びに最終濃度５６μｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウム、を含む最終容量２５μｌの反応液を調製した。
また、ＫＲＡＳ_Ｇ１２Ｄ_Ｆ１及びＲ１プライマーとは異なるプライマーセットの反応液：すなわち、ＫＲＡＳ_Ｇ１２Ｄ_Ｆ１をそれぞれ０．２μＭのＫＲＡＳ_Ｇ１２Ｄ_Ｆ２、ＫＲＡＳ_Ｇ１２Ｄ_Ｆ３、又はＫＲＡＳ_Ｇ１２Ｄ_Ｆ４に置き換えた、上記組成と同じ反応液を調製した。なお、ＫＲＡＳ_Ｇ１２Ｄ_Ｆ１、ＫＲＡＳ_Ｇ１２Ｄ_Ｆ２、ＫＲＡＳ_Ｇ１２Ｄ_Ｆ３、ＫＲＡＳ_Ｇ１２Ｄ_Ｆ４のそれぞれとＫＲＡＳ_Ｇ１２Ｄ_Ｒ１の組合せによって増幅されるヒトＫ−ｒａｓ遺伝子由来ＤＮＡの鎖長はそれぞれ１００、１２８、１５０、１７８ｂｐである。
【００８６】
リアルタイムＰＣＲは、サーマルサイクラーＴＰ８００（タカラバイオ社製）で行った。ＰＣＲの反応条件は、９５℃  １０秒の初期変性処理の後、９５℃  ５秒、５５℃  １０秒、７２℃  ２０秒を１サイクルとする４５サイクル反応で行い、経時的に蛍光強度を観察した。この時、対照として、ＮｕｃＳタンパク質を添加しない反応液群を作製し、同様の測定を行った。その結果を図１に示す。
【００８７】
すなわち、図１はＧ１２Ｄ変異ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子を検出した結果であり、縦軸は蛍光高度を示し、横軸はＰＣＲサイクル数を示す。蛍光曲線は、それぞれ野生型遺伝子５０，０００コピーに対する変異型遺伝子のコピー数（０、５、５０及び５００コピー）を示す。ＮｕｃＳタンパク質を添加してＰＣＲを実施した反応液では、５０，０００コピーの野生型遺伝子に対し５コピーの変異型遺伝子が混在するサンプルにおいても蛍光値の上昇、すなわちキメラオリゴヌクレオチドプローブの切断が確認された。一方、ＮｕｃＳタンパク質を含まない反応液では、Ｄ＿ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ  キメラオリゴヌクレオチドプローブの切断による蛍光値の上昇は見られなかった。すなわち、野生型遺伝子の混在のために変異型遺伝子の増幅が抑制されていることが示された。
【００８８】
この結果より、本発明により提供される抑制オリゴヌクレオチドとミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド（ＮｕｃＳタンパク質）とを組み合わせることにより、大過剰の野生型遺伝子の混在化でも目的の点突然変異型遺伝子を高感度に検出できることが確認できた。また、増幅断片長が１００ｂｐ〜１８０ｂｐのいずれのサイズにおいても高感度で検出できることが確認できた。
【００８９】
実施例２  ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子コドン１２の変異解析２
実施例１と同様にＧ１２Ｄ変異ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の検出について検討した。本実施例では、標的核酸と非標的核酸がともに断片化されたものについて検討した。
（１）標的核酸と非標的核酸を含む断片化混合物の調製
実施例１で調製した２４ｎｇ／μｌ濃度のＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ  ＤＮＡ  １３０μｌ及び１００ｎｇ／μｌ濃度のＨｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  １３０μｌを、それぞれＣｏｖａｒｉｓＭ２２０とＭｉｃｒｏＴＵＢＥ  ＡＦＡ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓｎａｐ−Ｃａｐを用いて断片化した。断片化条件は、Ｐｅａｋ  Ｉｎｃｉｄｅｎｔ  Ｐｏｗｅｒ  ５０Ｗ、Ｄｕｔｙ  Ｆａｃｔｏｒ  ２０％、Ｃｙｃｌｅｓ  ｐｅｒ  Ｂｕｒｓｔ  ２００、処理時間３５０秒、温度２０℃である。当該処理により１００ｂｐ〜４００ｂｐの範囲の断片が得られた。
【００９０】
（２）野生型遺伝子増幅抑制の確認
上記（１）で調製したＨｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ断片化物ならびにＫ−ｒａｓＧ１２Ｄ  ＤＮＡ断片化物を５０，０００コピー：５００コピー（＝１００：１）、５０，０００コピー：５０コピー（＝１０００：１）および５０，０００コピー：５コピー（＝１０，０００：１）の割合で混合したＤＮＡサンプルを調製した。また対照にはＨｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡのみを使用した。
【００９１】
野生型遺伝子増幅抑制を伴う変異型遺伝子の特異的検出は、実施例１記載の方法と同様にして行った。その結果、いずれのプライマー対の組み合わせでも、Ｇ１２Ｄ変異ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子を検出できることを確認した。特にＫＲＡＳ_Ｇ１２Ｄ_Ｆ３及びＲ１プライマー対の組み合わせ、ならびにＫＲＡＳ_Ｇ１２Ｄ_Ｆ４及びＲ１プライマー対の組み合わせは、断片化された鋳型ＤＮＡであっても、５０，０００コピー：５コピー（＝１０，０００：１）まで検出することができた。
【００９２】
この結果より、本発明の抑制オリゴヌクレオチド、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド（ＮｕｃＳタンパク質）を組み合わせることにより、断片化された大過剰の野生型遺伝子と微量の変異型遺伝子の混合物からも目的の点突然変異型遺伝子を高感度に検出できることが確認できた。
【００９３】
実施例３  ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子コドン１２の変異解析３
本実施例では、実施例１、２で使用されたキメラオリゴヌクレオチドプローブについて蛍光物質と消光物質の位置を入れ替えた場合について検討した。すなわち、５’末端に消光物質、３’末端に蛍光物質を配置したキメラオリゴヌクレオチドプローブでの検出を試みた。消光物質はＢＨＱ１あるいはＥｃｌｉｐｓ（エポック社製）の２通りを使用した（それぞれ配列番号１０、１１）。
また、キメラオリゴヌクレオチドプローブ以外のコンポーネント（プライマーセット、抑制オリゴヌクレオチド）、ＤＮＡサンプルを含む反応液組成、ＰＣＲ条件は実施例１と同様にして反応を行った。
【００９４】
その結果、蛍光物質と消光物質の位置を入れ替えた場合であっても、消光物質やプライマーセットの種類に関わらず、実施例１同様にＧ１２Ｄ変異ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子を効率よく検出できることを確認した。この結果より、本発明の方法がプローブの構造に関わらず、再現性の高い検出結果を与えることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の高感度変異検出方法により、増幅断片長のサイズに影響されない、大量に存在する野生型遺伝子の増幅を排除し、希少な変異型遺伝子を特異的に増幅し、検出することができる。当該方法は、遺伝子工学、生物学、医学等幅広い分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
SEQ ID NO: 1: KRAS G12D_F_1 primer
SEQ ID NO: 2: KRAS G12D_F_2 primer
SEQ ID NO: 3: KRAS G12D_F_3 primer
SEQ ID NO: 4: KRAS G12D_F_4 primer
SEQ ID NO: 5: KRAS G12D_R_1 primer
SEQ ID NO: 6: S_KRAS_G12 suppression oligonucleotide. 3'-end is modified by amino linker (NH2).
SEQ ID NO: 7: D-KRAS_G12D probe. 5'-end is added FAM and 3'-end is added BHQ1. nucleotide position 4 is RNA.
SEQ ID NO: 8: DNA fragment containing K-ras codon 12 wild type. nucleotide position 159-280 is exon 2. nucleotide position 203-205 is codon 12.
SEQ ID NO: 9: DNA fragment containing K-ras codon 12 mutant type. nucleotide position 159-280 is exon 2. nucleotide position 203-205 is codon 12.
SEQ ID NO: 10: D-KRAS_G12D probe. 5'-end is added BHQ1 and 3'-end is added FAM nucleotide position 4 is RNA.
SEQ ID NO: 11: D-KRAS_G12D probe. 5'-end is added Eclips and 3'-end is added FAM nucleotide position 4 is RNA.
SEQ ID NO: 12: The amino acid sequence of PF0012 from Pyrococcus furiosus
SEQ ID NO: 13: The amino acid sequence of PF0012 W77F mutant
SEQ ID NO: 14: The amino acid sequence of NucS from Thermococcus kodakarensis
SEQ ID NO: 15: The amino acid sequence of TERMP_01877 from Thermococcus barophilus
SEQ ID NO: 16: The amino acid sequence of MJ_0225 from Methanocaldococcus jannaschii
【図１】
2018038341.tif 000002
【配列表】
2018038341000001.app