(57)【要約】      （修正有）【課題】多様な炎症性および免疫の疾患および障害の処置および診断において用いることができる組成物の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、及び／又は複数の特定の配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／又は更に異なる特定の配列を含む重鎖ＣＤＲ３、並びに／或いは更に異なる特定の配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、及び／又は更に異なる特定の配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は更に異なる特定のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体又はその断片。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、ならびに／あるいは配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、ヒトＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片。
【請求項２】
マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項３】
ヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項５】
配列番号１の重鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一である重鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項６】
配列番号２６、２７、２８および２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項７】
配列番号２６、２７、２８および２９からなる群より選択される重鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一である重鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項８】
配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項９】
配列番号２９の重鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一である重鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項１０】
配列番号２１、２２、２３および２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項１１】
配列番号２１、２２、２３および２４からなる群より選択される重鎖配列の重鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一である非ＣＤＲ領域を含む重鎖配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項１２】
ＩＧＨＶ１−２*０２（配列番号３）、ＩＧＨＶ１−２*０４（配列番号４）、ＩＧＨＶ１−２*０５（配列番号５）、ＩＧＨＶ１−２*０１（配列番号６）、およびＩＧＨＶ１−４６*０１（配列番号７）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物であるかまたは前
記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項１３】
抗体またはその断片が、ヒト遺伝子ＩＧＨＶ１−２*０１（配列番号３）の産物である
かまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域を含み、重鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、請求項３に記載の抗体またはその断片。
【請求項１４】
抗体またはその断片が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含み、重鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、請求項３に記載の抗体またはその断片。
【請求項１５】
アミノ酸改変が、３７位、４８位、５０位、６７位、６９位、７１位および７５位からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに従って示される、請求項１３または１４に記載の抗体またはその断片。
【請求項１６】
アミノ酸改変が、３７Ａ、４８Ｉ、５０Ｅ、６７Ａ、６９Ｌ、７１Ｖおよび７５Ｓからなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに従って示される、請求項１３または１４に記載の抗体またはその断片。
【請求項１７】
配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項１８】
配列番号８の軽鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一である軽鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項１９】
配列番号１４および３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項２０】
軽鎖可変領域配列が、配列番号１４または３０からなる群より選択される軽鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一である軽鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項２１】
配列番号１７および２５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項２２】
軽鎖配列が、配列番号１７および２５からなる群より選択される軽鎖配列の軽鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一である非ＣＤＲ領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項２３】
ＩＧＫＶ１−３３*０１（配列番号８）、ＩＧＫＶ１Ｄ−３３*０１（配列番号９）、ＩＧＫＶ１Ｄ−１２*０２（配列番号１０）、ＩＧＫＶ１Ｄ−１２*０１（配列番号１１）およびＩＧＫＶ１−１２*０２（配列番号１２）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産
物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項２４】
抗体またはその断片が、ヒト遺伝子ＩＧＫＶ１−３３*０１（配列番号８）の産物であ
るかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含み、軽鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、請求項３に記載の抗体またはその断片。
【請求項２５】
抗体またはその断片が、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含み、軽鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の対応する軽鎖可変フレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、請求項３に記載の抗体またはその断片。
【請求項２６】
アミノ酸改変が、５位および３４位からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに従って示される、請
求項２４または２５に記載のヒト化抗体またはその断片。
【請求項２７】
アミノ酸改変が、５Ｎおよび３４Ｓからなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに従って示される、請求項２４または２５に記載の抗体またはその断片。
【請求項２８】
（ａ）配列番号２２または配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖配列と、
（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖配列と
を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項２９】
（ａ）配列番号２７または配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列と、
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列と
を含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項３０】
重鎖ＣＤＲの少なくとも１つおよび／または軽鎖ＣＤＲの少なくとも１つが、少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項３１】
重鎖および／または軽鎖定常領域をさらに含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項３２】
ヒト重鎖定常領域が、ＩＧＨＧ１、非フコシル化ＩＧＨＧ１およびＩＧＨＧ４からなる、ヒト免疫グロブリンの群から選択される、請求項３１に記載の抗体またはその断片。
【請求項３３】
抗体が、非フコシル化ＩＧＨＧ１  Ｆｃ領域を有する、請求項１から３１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項３４】
抗体が、ヒトＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）からのＣＨ１と、Ｓ２２８Ｐ置換を有するヒトＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）からのヒンジと、ヒトＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）からのＣＨ２およびＣＨ３とを含むアイソタイプバリアントを含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項３５】
ヒトＴＬ１Ａと結合する、請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項３６】
ヒトＴＬ１Ａと結合し、マウス、ラットおよびカニクイザルＴＬ１Ａと交差反応性である、請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項３７】
ｈＴＬ１Ａと結合し、ＤＲ３およびＤｃＲ３の両方とのｈＴＬ１Ａの相互作用を阻害する、請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項３８】
アンタゴニスト抗体である、請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項３９】
中和抗体である、請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項４０】
抗体が、１価抗体である、請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項４１】
抗体が、全長抗体である、請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体またはその断
片。
【請求項４２】
抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、２重特異性単鎖Ｆｖ２量体、ダイアボディ、トリアボディおよび同じまたは異なる抗体と遺伝子的に融合したｓｃＦｖからなる群より選択される抗体断片である、請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項４３】
抗体が、親抗体のＦｃ領域と比べて少なくとも１つのアミノ酸改変を含むバリアントＦｃ領域を含み、バリアントＦｃ領域を含む抗体が、親抗体と比較してエフェクター機能の変更を示す、請求項１から３４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項４４】
７００ｐＭ以下の親和性（ＫD）でヒトＴＬ１Ａと結合する、請求項１から４３のいず
れか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項４５】
対応するキメラ抗体のＴＬ１Ａ結合親和性（ＫD）の少なくとも８５％を保持する、請
求項３に記載の抗体またはその断片。
【請求項４６】
対応するキメラ抗体と比較した場合に、等しいかまたはより高いＴＬ１Ａ結合親和性（ＫD）を有する、請求項３に記載の抗体またはその断片。
【請求項４７】
対応するキメラ抗体より３倍高い親和性でヒトＴＬ１Ａと結合する、請求項３に記載の抗体またはその断片。
【請求項４８】
抗体が、８０℃を超えるＦＡＢ断片耐熱温度を有する、請求項１から４３のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項４９】
請求項１から４３のいずれか一項に記載の抗体と同じエピトープと結合する、ヒトＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片。
【請求項５０】
請求項１から４３のいずれか一項に記載の抗体と結合する、可溶性ヒトＴＬ１Ａ上のエピトープ。
【請求項５１】
請求項１から４９のいずれか一項に記載の抗体またはその断片をコードする単離核酸。
【請求項５２】
配列番号３３もしくは３５の核酸配列を含む、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、および／または配列番号３６の核酸配列を含む、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む、請求項５１に記載の単離核酸。
【請求項５３】
請求項５１または５２に記載の単離核酸を含むベクター。
【請求項５４】
請求項５１もしくは５２に記載の単離核酸または請求項５３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５５】
核酸が発現され、抗体が生成されるように、請求項５４に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、ヒトＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を生成する方法。
【請求項５６】
請求項５１または５２に記載の単離核酸によりコードされる、ヒトＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片。
【請求項５７】
請求項１から４９のいずれか一項に記載の抗体またはその断片と、薬学的に許容される
担体とを含む組成物。
【請求項５８】
治療剤に連結した請求項１から４９のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を含むイムノコンジュゲート。
【請求項５９】
請求項５８に記載のイムノコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項６０】
別の医薬活性薬剤をさらに含む、請求項５７または５９に記載の組成物。
【請求項６１】
対象におけるＴＬ１Ａ媒介性障害を処置するための方法であって、対象に治療有効量の請求項１から４９のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を投与するステップを含む方法。
【請求項６２】
ＴＬ１Ａ媒介性障害が、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節リウマチ、ＭＳ、１型および２型糖尿病、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、アトピー性皮膚炎；例えば喘息およびアレルギー性肺炎症を含むアレルギー反応または状態；がん、アテローム動脈硬化症、感染、神経変性疾患、移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）ならびに循環器障害／疾患からなる群より選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
抗体が、ヒト重鎖定常領域ＩＧＨＧ１を有する抗体と比較して、非フコシル化ＩＧＨＧ１  Ｆｃ領域を有し、細胞傷害作用が増進している、請求項６１から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
医薬品としての請求項１から４９のいずれか一項に記載の抗体またはその断片の使用。
【請求項６５】
ＴＬ１Ａ媒介性障害の処置のための医薬品の調製における、請求項１から４９のいずれか一項に記載の抗体またはその断片の使用。
【請求項６６】
医薬品として用いるための、請求項１から４９のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項６７】
ＴＬ１Ａ媒介性障害を処置するための方法において用いるための、請求項１から４９のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項６８】
請求項１から４９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片、請求項５７もしくは５９に記載の組成物または請求項５８に記載のイムノコンジュゲートを含む、ＴＬ１Ａ媒介性障害の処置のための製造品。
【請求項６９】
請求項１から４９のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片、請求項５７もしくは５９に記載の組成物または請求項５８に記載のイムノコンジュゲートを含む、ＴＬ１Ａ媒介性障害の処置のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片に関する。より具体的には、本発明は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、ならびに／あるいは配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１Ａ）は、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーの一員、メンバー１５である。ＴＬ１Ａは、ＴＮＦＳＦ１５およびＶＥＧＩとしても知られ、結腸癌の成長をｉｎ  ｖｉｖｏで抑制する血管新生阻害剤として１９９９年に同定された（Ｚｈａｉ  Ｙら（１９９９）ＦＡＳＥＢ  Ｊ、１３（１）：１８１〜９）。このタンパク質は、単球、マクロファージ、リンパ球、粘膜固有層単核細胞、樹状細胞および形質細胞を含む内皮細胞および造血系列の活性化細胞において豊富に発現されるが、ＢまたはＴ細胞のいずれでも発現されない（Ｔａｎ  ＫＢら（１９９７）Ｇｅｎｅ、２０４：３５〜４６；Ｐｒｅｈｎ  ＪＬら（２００７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７８：４０３３〜４０３８）。これは、腎臓、肺、前立腺および胸腺でも発現される（Ｔａｎ  ＫＢら（１９９７）、既出）。これは、ＴＮＦＲＳＦ２５／ＤＲ３およびデコイ受容体ＴＲ６／ＤｃＲ３のリガンドであり、その発現は、ＴＮＦおよびＩＬ−１αにより誘導可能である。ＴＮＦＲＳＦ２５／ＤＲ３は、Ｔ細胞活性化中に上方制御されるデスドメイン含有受容体である。ＴＬ１Ａは、ＮＦ−カッパＢ活性化と、ＴＮＦＲＳＦ２５／ＤＲ３発現株化細胞におけるアポトーシスとを誘導し、Ｔ細胞において、ＴＬ１Ａは、ＩＬ−２応答性および炎症誘発性サイトカインの分泌をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で増加させる共刺激因子として働くことができる。ＴＬ１ＡとＤＲ３との相互作用は、免疫応答中のＴ細胞増殖を促進できる（Ｍｉｇｏｎｅ  ＴＳら（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１６（３）：４７９〜９２）。腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーの可溶性タンパク質である分泌型デコイ受容体（ＤｃＲ３）は、ＴＬ１Ａの活動を阻止する（Ｋｉｍ  ＳおよびＺｈａｎｇ  Ｌ（２００５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２９８：１〜８）。ＴＬ１Ａは、いくつかの疾患および障害における可能性のある治療標的として関与している。
【０００３】
アレルギーおよび喘息での肺炎症の主要な原因は、ＩｇＥレベルの上昇を伴うＣＤ４  Ｔ細胞のＴｈ２極性化と、ＮＫＴ細胞によるＩＬ−１３の生成である。ＴＬ１Ａは、ＮＫＴ細胞においてＩＬ−４およびＩＬ−１３生成を共刺激することによりアレルギー性肺炎症において主要な役割を果たす。ＴＬ１Ａ抗体またはドミナントネガティブＴＬ１Ａ変異体によりＴＬ１ＡとＤＲ３との相互作用を阻止することにより、肺炎症が廃止される（Ｆａｎｇ  Ｌら、（２００８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、２０５（５）：１０３７〜４８）。ＴＬ１Ａについてのデコイ受容体であるＤｃＲ３は、いくつかの肺および結腸癌ならびにいくつかの正常組織で発現され、よって、このことは、肺および結腸癌におけるＴＬ１Ａの役割を示唆している。さらに、ＴＬ１Ａは、血管新生抑制性であり、メタロプロテイナーゼおよびＩＬ−８遺伝子発現を誘導することも報告されている（Ｓｕ  ＷＢら、（２００６）Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、３１２：２６６〜２７７；Ｋａｎｇ  ＹＪら、（２００５）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、２９：２２９〜２３５）。ＴＬ１ＡおよびＤＲ３は、炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの生成を増加させ、細胞外基質分解酵素を誘導することによりプラーク安定性を減少させることにより、アテローム動脈硬化症の病態形成にも関与
することがある（Ｋａｎｇ  ＹＪら、（２００５）既出）。ＴＬ１Ａ／ＤＲ３が関節リウマチの病因に関与することを示唆する証拠もある（Ｂｏｓｓｅｎ  Ｃら、（２００６）Ｊ
Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８１（２０）：１３９６４〜１３９７１）。
【０００４】
ＴＬ１Ａの発現と炎症性腸疾患との間の関連は、研究者らにより同定されている（Ｐｒｅｈｎ  ＪＬら、（２００４）Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１２：６６〜７７；Ｂａｍｉａｓ  Ｇら、（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７１：４８６８〜４８７４）。重度の炎症性腸障害であるクローン病は、エフェクター（炎症誘発性）および制御性Ｔ細胞応答の不均衡を引き起こし、胃腸粘膜の炎症および疾患をもたらす遺伝的病因および環境因子を起源とすると考えられている。ＴＬ１Ａ／ＤＲ３経路は、クローン病などの腸疾患において重要な役割を果たすことが示されており（Ｐａｐａｄａｋｉｓ  ＫＡら、（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７４：４９８５〜４９９０；Ｂａｍｉａｓ  Ｇら、（２００３）既出）、よって、ＴＬ１Ａ／ＤＲ３経路の阻止は、この疾患での治療の機会を提供し得る。
【０００５】
デス受容体およびそれらのリガンドは、組織恒常性の維持およびプログラムされた細胞死の生理的制御において重要な役割を果たす。デスリガンドの結合は、受容体のオリゴマー形成、デスドメインとよばれる保存された細胞質シグナル伝達エレメントを介するアダプタータンパク質の動員、カスパーゼの活性化およびアポトーシスの誘導を誘導する（Ｙｏｕｎｇ  ＨＡら、（２００６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０３（２２）：８３０３〜８３０４）。Ｆａｓ／Ａｐｏ−１／ＣＤ９５、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２またはＤＲ３などのデス受容体は、アポトーシスの誘導因子として最初は特徴決定されたが、これらの受容体が、適応免疫応答の制御を含む非アポトーシス機能も有するという証拠が増えてきている。Ｂａｍｉａｓらは、ＴＬ１Ａが、粘膜固有層樹状細胞により発現され、ナイーブＣＤ４+  Ｔ細胞の増殖は増加させずに
メモリー細胞の増殖を増加させることにより機能し、ＩＬ−１２および／または低用量のＴ細胞受容体刺激と相乗作用してＩＦＮ−γ遺伝子発現を強く増強することを報告した（Ｂａｍｉａｓ  Ｇら、（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：８４４１〜８４４６）。腸でのＩＦＮ−γ発現は、炎症のマーカーと考えられており、クローン病を処置するための多くの方策は、免疫活性化状態を抑制するための広範な試みに依拠する。しかし、このようなアプローチ（ステロイド処置および免疫抑制薬）は、腸に特異的に焦点をあてておらず、よって、それ自体の合併症を有する。ＴＮＦ−αのアンタゴニストの使用に基づく標的化治療が、１９９０年代に導入されて成功したが、その結果は、ＴＬ１Ａまたはその受容体を特異的に指向する治療が、この衰弱性障害についての代替の標的化治療をもたらし得ることを示唆する。
【０００６】
クローン病についての現在の処置は、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体であるインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）；Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）およびアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）；Ａｂｂｏｔｔ）、ならびに抗炎症薬（例えばスルファサラジン）、コルチゾンまたはステロイド（例えばプレドニゾン）、免疫系抑制剤（例えば６−メルカプトプリン）および抗生物質を含む。しかし、他の利用可能な処置と比較して高い程度の特異性を有する処置選択肢は、インフリキシマブだけである（Ｙｏｕｎｇ  ＨＡら、（２００６）既出）。インフリキシマブは、全般的に耐容性が良好であるが、結核感染の再発、心不全、脱髄疾患の悪化、およびリンパ腫の発生率の増加を引き起こし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
よって、多様な炎症性および免疫の疾患および障害の処置および診断において用いることができる組成物に対して当技術分野において必要性がまだ存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、全般的に、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片、それらの調製のための方法およびＴＬ１Ａ媒介性障害を処置するための方法を含む使用に関する。ＴＬ１Ａと結合する本発明の抗体またはその断片は、多数の望ましい特性を示し、それらに限定されないが、なかでも炎症性腸疾患（例えば潰瘍性大腸炎およびクローン病）、関節リウマチ、多発性硬化症（ＭＳ）、アテローム動脈硬化症、移植片拒絶、中枢神経系損傷、乾癬、白血病またはリンパ腫（例えば慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ））、アテローム動脈硬化症ならびに肺および結腸癌を含む、炎症性疾患および／または自己免疫疾患を含む様々な疾患の処置に有用であり得る。ＴＬ１Ａと結合する本発明の抗体またはその断片は、多数の望ましい特性を示し、それらに限定されないが、なかでも炎症性腸疾患（例えば潰瘍性大腸炎およびクローン病）、関節リウマチ、多発性硬化症（ＭＳ）、アテローム動脈硬化症、移植片拒絶、中枢神経系損傷、乾癬、白血病またはリンパ腫（例えば慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ））、アテローム動脈硬化症ならびに肺および結腸癌、慢性閉塞性肺疾患ＣＯＰＤ、視神経炎、加齢黄斑変性、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、強皮症、全身性強皮症、慢性腎臓疾患、肝線維症、結核、特発性肺線維症、結核誘発性肺線維症、後腹膜線維症、肺線維症、嚢胞性線維症、心内膜心筋線維症、心房性線維症、縦隔線維症、骨髄線維症（骨髄）、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、腎原性全身性線維症、関節線維症を含む、炎症性疾患および／または自己免疫疾患を含む様々な疾患の処置に有用であり得る。
【０００９】
一態様では、本開示は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、ならびに／あるいは配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。さらなる態様では、本発明は、ＩＧＨＶ１−２*０２（配列番号３）、ＩＧＨＶ１−２*０４（配列番号４）、ＩＧＨＶ１−２*０５（配列番号５）、ＩＧＨＶ１−２*０１（配列番号６）、およびＩＧＨＶ１−４６*０１（配列番号７）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物であるかまたは前記
遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、ヒト遺伝子ＩＧＨＶ１−２*０２（配列番号３）の産物
であるかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む抗体またはその断片であって、重鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、抗体またはその断片を提供する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含む抗体またはその断片であって、重鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、抗体またはその断片を提供する。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。さらなる態様では、本発明は、ＩＧＫＶ１−３３*０１（配列番号８）、ＩＧＫＶ１Ｄ−３３*０１（配列番号９）、ＩＧＫＶ１Ｄ−１２*０２（配列番号１０）、ＩＧＫＶ１Ｄ−１２*０１（配列番号１１）およ
びＩＧＫＶ１−１２*０２（配列番号１２）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物
であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、ヒト遺伝子ＩＧＫＶ１−３３*０１（配列番号８）の産
物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む抗体またはその断片であって、軽鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、抗体またはその断片を提供する。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、配列番号１６、２１、２２、２３および２４からなる群より選択される重鎖配列を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。さらなる態様では、本発明は、配列番号１７および２５からなる群より選択される軽鎖配列を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、
（ａ）配列番号２２または２４のアミノ酸配列を含む重鎖配列と、
（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖配列と
を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、配列番号１３、２６、２７、２８および２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。さらなる態様では、本発明は、配列番号１４および３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、
（ａ）配列番号２７または２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と
を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片であって、前記抗体が、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含み、前記抗体が、Ｆｃ媒介性細胞傷害活性を有さない、抗体またはその断片を提供する。さらなる態様では、本発明は、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片であって、前記抗体が、ヒトＩＧＨＧ１  Ｆｃ領域を含み、前記抗体が、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）などの細胞傷害作用機序について有能である、抗体またはその断片を提供する。好ましい態様では、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片は、非フコシル化ＩＧＨＧ１  Ｆｃ領域を有し、ＡＤＣＣなどのＦｃ媒介性細胞傷害作用機序が増進している。
【００２０】
別の態様では、本発明は、ヒトＴＬ１Ａと結合し、マウス、ラットおよびカニクイザルＴＬ１Ａとも結合する交差反応性抗体またはその断片を提供する。「交差反応性抗体」は、１種、例えばヒトからの抗原と結合し、異なる種、例えばラットの対応する抗原とも結合する抗体を意味する。
【００２１】
別の態様では、本発明の開示は、対応するキメラ抗体と同様の親和性でＴＬ１Ａと結合する、例えば対応するキメラ抗体のＴＬ１Ａ結合親和性（ＫD）の少なくとも８５％を保
持するか、または対応するキメラ抗体と比較した場合に少なくとも等しいかもしくはより高いＴＬ１Ａ結合親和性（ＫD）を有する、ヒト化抗体またはその断片についても記載す
る。好ましい態様では、ヒト化抗体またはその断片は、対応するキメラ抗体と比較した場
合におよそ３倍高いＴＬ１Ａ結合親和性を有する。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、ｈＴＬ１Ａと結合し、ＤＲ３およびＤｃＲ３の両方とｈＴＬ１Ａの相互作用を阻害するヒト化抗体またはその断片についても記載する。
【００２３】
本発明の開示は、ＴＬ１Ａと結合する抗体およびその断片をコードする単離核酸、ベクターならびに前記核酸またはベクターを含む宿主細胞も提供する。抗ＴＬ１Ａ抗体またはその断片と薬学的に許容される担体とを含む組成物、および治療剤に連結した抗体またはその断片を含むイムノコンジュゲートも提供される。
【００２４】
本開示は、ＴＬ１Ａ媒介性障害を処置するための方法も提供する。一態様では、予備刺激されたＣＤ４  Ｔ細胞によるＴＬ１Ａ誘導ＩＦＮγ分泌のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて、抗ＴＬ１Ａ抗体またはその断片は、免疫複合体により刺激された単球により誘導されるＩＦＮγの生成を効率的に抑制した。別の態様では、アレルギー性喘息のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、抗ＴＬ１Ａ抗体は、喘息マウスの気管支肺胞洗浄液中の好酸球の数をおよそ４倍低減した。さらなる態様では、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を用いてマウスおよびトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によりラットで誘導された急性大腸炎のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、抗ＴＬ１Ａ抗体は、疾患の症状の低減に効果的であった。
【００２５】
本開示は、抗ＴＬ１Ａ抗体またはその断片と、希釈剤または賦形剤などの担体とを含む医薬組成物も提供する。
【００２６】
本開示は、抗体もしくはその断片、組成物またはイムノコンジュゲートを含む、ＴＬ１Ａ媒介性障害の処置のためのキットおよび製造品も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ２次抗体およびＴＭＢ基質を用いて検出された、ヒトＴＬ１Ａ−ｈｉｓ（図１Ａ）または無関係のタンパク質−ｈｉｓ（図１Ｂ）とのハイブリドーマ抗体の結合を示す図である。図１Ａは、被覆されたヒトＴＬ１Ａ−ｈｉｓに対するＥＬＩＳＡの４５０ｎｍでの吸光度を示し、図１Ｂは、無関係のタンパク質−ｈｉｓに対するＥＬＩＳＡの４５０ｎｍでの吸光度を示す。
【図２】阻止ＥＬＩＳＡにおける３つの異なる濃度の精製ハイブリドーマ抗ＴＬ１Ａ抗体の影響を示す図であり、ここで、ＴＬ１ＡとのヒトＴＮＦＲＳＦ２５の結合を、図２に示す抗体の存在下で評価した。吸光度は、４５０ｎｍにて読み取った。ｍＩｇＧ：マウスＩｇＧアイソタイプ対照。
【図３】親５Ｇ６候補は、活性化単球により生成される可溶性および膜結合型ＴＬ１Ａの影響を阻止する。図３Ａ：健常ドナーからのＰＢＭＣを免疫複合体で刺激し、次いで、蛍光抗体で染色した。単球を、大きい前方光散乱および高い側方散乱パラメータに基づいてゲートに通した。ヒストグラムプロットは、単球のゲートを通した集団のＰＥ蛍光を示す。灰色の影をつけたヒストグラムは、アイソタイプ対照を表し、空白のヒストグラムは、抗ＴＬ１Ａを用いる染色を表す。図３Ｂ：免疫複合体で刺激した健常ドナーＰＢＭＣからの精製ヒト単球の上清を採集し、ＥＬＩＳＡによりｓＴＬ１Ａタンパク質の存在について試験した。グラフは、記載する条件の上清で測定された補間ＴＬ１Ａ濃度を示す。「ＩＣ  ｓｔｉｍ」は、刺激した免疫複合体を意味する。「ＮＳ」は、刺激されないことを意味する。図３Ｃ：健常ドナーＰＢＭＣから精製したナイーブＣＤ４  Ｔ細胞を、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＣで刺激された自己単球とインキュベートした。親キメラ５Ｇ６抗体を、単球と同じときに、表に記載する濃度で加えた。ＮＡは、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８を加えなかったことを示す。培養物の上清は、ＥＬＩＳＡにより定量した。グラフは、記載する各条件についての補間ＩＦＮ−γ濃度を示す。
【図４】親５Ｇ６候補は、マウス、ラット、カニクイザルおよびヒトＴＬ１Ａと結合する。ヒト（ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ラット（ｒａｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、マウス（ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）およびカニクイザル（ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）配列に対応するＴＬ１Ａタンパク質の細胞外部分での５Ｇ６の結合は、免疫蛍光により決定した。グラフは、用いた５Ｇ６の濃度のｌｏｇに従う４５０ｎｍの吸光度を示す。
【図５】ヒト化５Ｇ６抗体は、予備刺激されたＣＤ４  Ｔ細胞によるＴＬ１Ａ誘導ＩＦＮ−γ分泌を阻止する。ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞を、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８および組換え可溶性ヒトＴＬ１Ａとインキュベートし、ヒト化５Ｇ６候補（ＶＨ３／ＶＬ１、ＶＨ４／ＶＬ１、ＶＨ５／ＶＬ１およびＶＨ２／ＶＬ２）を表に記載する濃度にて加えた。ＮＡは、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８を加えなかったことを示す。培養上清は、ＩＦＮ−γの濃度についてＥＬＩＳＡにより定量した。グラフ５Ａ〜５Ｄは、各培養条件についてのＩＦＮ−γ濃度を示す。各グラフは、１つのヒト化５Ｇ６候補の結果を示す。
【図６】ヒト化５Ｇ６抗体は、アレルギー性喘息のマウスモデルにおいて、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の細胞の数を低減した。マウスを、オボアルブミン攻撃により誘導した免疫応答の誘導後の第２８、３０および３３日に、５０ｍｇ／ｋｇでのヒト化５Ｇ６候補（ＶＨ５／ＶＬ１；フォーマットＩｇＧ４ヒンジ安定化）または等量の対照ヒトＩｇＧまたは５ｍｇ／ｋｇでのデキサメタゾン（陽性対照）で処置した。グラフは、各マウスについてのＢＡＬ液中の好酸球の数を示し、各群についての好酸球の平均数を算出した。標準偏差は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて算出し、*はｐ＜０．０５を示し、**はｐ＜０．０１を示す。
【図７】ヒト化５Ｇ６抗体による処置は、急性大腸炎のＤＳＳ誘導モデルにおける結腸の短縮を改善する。マウスを、３×週で、５０ｍｇ／ｋｇのヒト化５Ｇ６抗体（ＶＨ５／ＶＬ１；フォーマットＩｇＧ４ヒンジ安定化）または等量のアイソタイプ対照または５ｍｇ／ｋｇでのシクロスポリン（陽性対照）で処置した。グラフは、各マウスについての結腸全体の長さおよび群あたりの平均長さを示す。標準偏差は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて算出し、*はｐ＜０．０５を示し、**はｐ＜０．０１を示し、***はｐ＜０．００１を示す。
【図８】ヒト化５Ｇ６抗体による処置は、急性大腸炎のＴＮＢＳ誘導モデルにおける疾患重症度を改善する。ラットを、ＴＮＢＳ投与の２時間後に単回用量のヒト化５Ｇ６抗体（５０ｍｇ／ｋｇ）または等量のアイソタイプ対照でｉ．ｐ処置した。プレドニゾロンを陽性対照として投与した。疾患重症度は、癒着、狭窄、潰瘍および壁厚さについての結腸スコアを用いて評価し、平均スコアをヒストグラムに示す。標準偏差は、スチューデントのｔ検定を用いて算出し、*はｐ＜０．０５を示す。
【図９】ｈＴＬ１Ａとの５Ｇ６の結合は、ｈＤｃＲ３−ＦｃおよびｈＤＲ３−Ｆｃの両方により阻止される。ヒスチジンタグ付加ヒトＴＬ１Ａで、２μｇ／ｍｌにてＥＬＩＳＡプレートを被覆し、ヒトＤｃＲ３（白色のバー）、ＤＲ３（黒色のバー）または無関係の受容体（Ｃｔｒｌ−Ｆｃ、平行線を引いたバー）のいずれかの外部ドメインの１０μｇ／ｍｌのＦｃ融合体の存在下で２０μｇ／ｍｌ  ５Ｇ６とインキュベートした後に、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）を用いて検出した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本開示は、ＴＬ１Ａと結合する抗体およびその断片に関する。
【００２９】
用語「ＴＬ１Ａ」は、本明細書で用いる場合、ＴＬ１Ａのバリアント、アイソフォームおよび種ホモログを含む。したがって、本開示の抗体は、ヒトＴＬＡ１と結合することがあり、ヒト以外の種、例えばマウス、ラットまたはカニクイザルからのＴＬ１Ａと交差反応することがある。あるいくつかの実施形態では、抗体は、１または複数のヒトＴＬ１Ａタンパク質に完全に特異的であってよく、種またはその他の型の非ヒト交差反応性を示さないことがある。例示的なヒトＴＬ１Ａの完全アミノ酸配列は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受
託番号Ｏ９５１５０（ＴＮＦＳＦ１５＿ＨＵＭＡＮ；配列番号３８）を有する。ＴＬ１Ａは、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ様タンパク質１Ａ、ＶＥＧＩ、ＴＮＦγβとしても知られる。ヒトＴＬ１Ａには、Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅによりＧｅｎｅＩＤ：９９６６、およびＨＧＮＣによりＨＧＮＣ：１１９３１が割り当てられている。ＴＬ１Ａは、ＴＮＦＳＦ１５／ＴＬ１Ａと表される遺伝子によりコードされ得る。例示的なマウスＴＬ１Ａの完全アミノ酸配列は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ５ＵＢＶ８（ＴＮＦＳＦ１５＿ＭＯＵＳＥ；配列番号３９）を有する。マウスＴＬ１Ａには、Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅによりＧｅｎｅＩＤ：３２６６２３が割り当てられている。例示的なラットＴＬ１Ａの完全アミノ酸配列は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ８Ｋ３Ｙ７（ＴＮＦＳＦ１５＿ＲＡＴ；配列番号４０）を有する。ラットＴＬ１Ａには、Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅによりＧｅｎｅＩＤ：２５２８７８が割り当てられている。例示的なカニクイザルＴＬ１Ａ（ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の完全アミノ酸配列は、配列番号４１を有する。
【００３０】
本明細書における「ＴＬ１Ａ」の使用は、ＴＬ１Ａ、好ましくはヒトＴＬ１Ａの全ての既知またはまだ見出されていない対立遺伝子および多型を包含する。
【００３１】
用語「ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片」は、本明細書で用いる場合、８５０ｐＭ以下、好ましくは７００ｎＭ以下、より好ましくは３００ｎＭ以下、より好ましくは２６０ｎＭ以下、さらにより好ましくは２５０ｎＭ以下の親和性（ＫD）でＴＬ１Ａ、例え
ば単離形のヒトＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を含む。
【００３２】
用語「ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片」は、抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００３３】
用語「抗体」は、本明細書で言及する場合、抗体全体およびその任意の抗原結合断片または単鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合で相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖とを含む糖タンパク質またはその抗原結合断片のことをいう。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記する）と重鎖定常領域とで構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記する）と軽鎖定常領域とで構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とよばれる超可変性の領域にさらに細分化でき、ＣＤＲは、配列が超可変性であり、かつ／または抗原認識に関与し、かつ／またはより保存されたフレームワーク領域（ＦＲまたはＦＷ）とよばれる領域に散在している、構造が規定されたループを通常形成する。それぞれのＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＷで構成される：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４。ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４のアミノ酸配列は全て一緒に、本明細書で言及する場合、ＶＨまたはＶＬの「非ＣＤＲ領域」または「非拡張ＣＤＲ領域」を構成する。
【００３４】
用語「重鎖可変フレームワーク領域」は、本明細書で言及する場合、１または複数（例えば１、２、３および／または４つ）の重鎖フレームワーク領域配列（例えばフレームワーク１（ＦＷ１）、フレームワーク２（ＦＷ２）、フレームワーク３（ＦＷ３）および／またはフレームワーク４（ＦＷ４））を含み得る。好ましくは、重鎖可変領域フレームワークは、ＦＷ１、ＦＷ２および／またはＦＷ３、より好ましくはＦＷ１、ＦＷ２およびＦＷ３を含む。用語「軽鎖可変フレームワーク領域」は、本明細書で言及する場合、１または複数（例えば１、２、３および／または４つ）の軽鎖フレームワーク領域配列（例えばフレームワーク１（ＦＷ１）、フレームワーク２（ＦＷ２）、フレームワーク３（ＦＷ３）および／またはフレームワーク４（ＦＷ４））を含み得る。好ましくは、軽鎖可変領域フレームワークは、ＦＷ１、ＦＷ２および／またはＦＷ３、より好ましくはＦＷ１、ＦＷ
２およびＦＷ３を含む。
【００３５】
重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子との結合を媒介できる。
【００３６】
抗体は、定常領域により遺伝子的に決定される、アイソタイプともよばれるクラスに群分けされる。ヒト定常軽鎖は、カッパ（ＣΚ）およびラムダ（Ｃλ）軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）またはイプシロン（ε）として分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。よって、「アイソタイプ」は、本明細書で用いる場合、それらの定常領域の化学的および抗原的特徴により定義される免疫グロブリンのクラスおよび／またはサブクラスのいずれかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）、ＩｇＧ２（ＩＧＨＧ２）、ＩｇＧ３（ＩＧＨＧ３）、ＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）、ＩｇＡ１（ＩＧＨＡ１）、ＩｇＡ２（ＩＧＨＡ２）、ＩｇＭ（ＩＧＨＭ）、ＩｇＤ（ＩＧＨＤ）およびＩｇＥ（ＩＧＨＥ）である。いわゆるヒト免疫グロブリン偽ガンマＩＧＨＧＰ遺伝子は、配列決定されているが、スイッチ領域の変更によりタンパク質をコードしないさらなるヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子を表す（Ｂｅｎｓｍａｎａ  Ｍら、（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６（７）：３１０８）。スイッチ領域が変更されているにもかかわらず、ヒト免疫グロブリン偽ガンマＩＧＨＧＰ遺伝子は、全ての重鎖定常ドメイン（ＣＨ１〜ＣＨ３）およびヒンジについてのオープンリーディングフレームを有する。その重鎖定常ドメインについての全てのオープンリーディングフレームは、予測される構造特徴を有する全てのヒト免疫グロブリン定常ドメインと良好に整列されるタンパク質ドメインをコードする。このさらなる偽ガンマアイソタイプは、本明細書において、ＩｇＧＰまたはＩＧＨＧＰという。ヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインイプシロンＰ１およびＰ２偽遺伝子（ＩＧＨＥＰ１およびＩＧＨＥＰ２）などの他の偽免疫グロブリン遺伝子が、報告されている。ＩｇＧクラスは、治療目的のために最も一般的に用いられている。ヒトにおいて、このクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。マウスにおいて、このクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３を含む。
【００３７】
用語「マウス抗体」は、本明細書で用いる場合、可変領域配列および定常領域配列がマウスに由来する抗体を含む。
【００３８】
用語「キメラ抗体」は、本明細書で用いる場合、可変領域配列がある種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を含む。
【００３９】
用語「ヒト化抗体」または「ヒト化抗ＴＬ１Ａ抗体」は、本明細書で用いる場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体を含む。さらなるフレームワーク領域改変を、ヒトフレームワーク配列内および別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列内で作製してよい。
【００４０】
用語「中和抗体」は、例えば、ＴＬ１Ａとその受容体ＴＮＦＲＳＦ２５／ＤＲ３もしくはデコイ受容体ＴＮＦＲＳＦ２１／ＤＲ６との結合を阻止または実質的に低減し、よってＴＬ１Ａにより引き起こされるシグナル伝達経路を阻害または低減し、かつ／あるいは例えばリンパ球増殖、サイトカイン発現もしくはリンパ球生存などのＴＬ１Ａ媒介性細胞応答を阻害または低減することにより、ＴＬ１Ａの生物学的活性を阻害および／または中和できる抗体を含む。
【００４１】
用語「拮抗性抗体」または「アンタゴニスト抗体」は、本明細書において等価に用いられ、既出の中和抗体について記載したように、ＴＬ１Ａの生物学的シグナル伝達活性を阻害および／または中和できる抗体を含む。
【００４２】
用語「作動性抗体」または「アゴニスト抗体」は、本明細書において等価に用いられ、例えば、ＴＬ１Ａとその受容体ＴＮＦＲＳＦ２５／ＤＲ３もしくはデコイ受容体ＴＮＦＲＳＦ２１／ＤＲ６との結合を増加させ、よって、ＴＬ１Ａにより引き起こされるシグナル伝達経路を活性化または増強し、かつ／あるいは例えばリンパ球増殖、サイトカイン発現もしくはリンパ球生存などのＴＬ１Ａ媒介性細胞応答を活性化または増強することにより、ＴＬ１Ａの生物学的シグナル伝達活性を活性化および／または増強できる抗体を含む。
【００４３】
用語「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」は、本明細書で用いる場合、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを含む。Ｆａｂは、単離されたこの領域または全長抗体もしくは抗体断片の関係におけるこの領域のことをいうことがある。
【００４４】
用語「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」は、本明細書で用いる場合、第１定常領域免疫グロブリンドメインを除外した抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。よって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインと、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインと、これらのドメインからＮ末端側にあるフレキシブルヒンジとのことをいう。ＩｇＡおよびＩｇＭについて、Ｆｃは、Ｊ鎖を含むことがある。ＩｇＧについて、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインであるＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２およびＣγ３）と、Ｃガンマｌ（Ｃγｌ）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間のヒンジとを含む。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、残基Ｃ２２６またはＰ２３０をそのカルボキシル末端に含むと通常定義される（番号付けはＥＵ番号付けシステムに従う）。ヒトＩｇＧ１について、Ｆｃ領域は、本明細書において、残基Ｐ２３２をそのカルボキシル末端に含むと定義される（番号付けはＥＵ番号付けシステムに従う）（Ｅｄｅｌｍａｎ  ＧＭら、（１９６９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、６３（１）：７８〜８５）。Ｆｃは、単離されたこの領域またはＦｃポリペプチド、例えば抗体の関係におけるこの領域のことをいうことがある。
【００４５】
用語「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」は、本明細書において、抗体の第１定常ドメインと第２定常ドメインとの間のアミノ酸を含むフレキシブルポリペプチドを含む。「ヒンジ領域」は、本明細書で言及する場合、６〜６２アミノ酸長で、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧのみに存在し、２つの重鎖を橋かけするシステイン残基を包含する配列領域である。構造的には、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインは、ＥＵ位２２０にて終了し、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインは、ＥＵ位２３７の残基にて開始する。よって、ＩｇＧについて、抗体ヒンジは、本明細書において、２２１位（ＩｇＧ１におけるＤ２２１）〜２３１位（ＩｇＧ１におけるＡ２３１）を含むと定義される（番号付けはＥＵ番号付けシステムに従う）（Ｅｄｅｌｍａｎ  ＧＭら、既出）。
【００４６】
用語「親抗体」または「親免疫グロブリン」は、本明細書で用いる場合、バリアントを作製するために後で改変される、未改変の抗体を含む。前記親抗体は、自然に存在する抗体、または自然に存在する抗体のバリアントもしくは工学改変バージョンであり得る。親抗体は、抗体自体、親抗体を含む組成物または親抗体をコードするアミノ酸配列のことをいうことがある。「親抗ＴＬ１Ａ抗体」は、本明細書で用いる場合、ＴＬ１Ａと結合し、バリアントを作製するために改変される抗体または免疫グロブリンを意味する。「対応するマウス抗体」は、本明細書で用いる場合、ＴＬ１Ａと結合し、バリアントを作製するために改変できるマウス抗体または免疫グロブリン、具体的には本明細書で開示するマウス
抗体５Ｇ６を意味する。「対応するキメラ抗体」は、本明細書で用いる場合、ＴＬ１Ａと結合し、バリアントを作製するために改変できるキメラ抗体または免疫グロブリンを意味する。
【００４７】
用語「バリアント抗体」または「抗体バリアント」は、本明細書で用いる場合、親と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変により親抗体配列のものと異なる抗体配列を含む。バリアント抗体配列は、本明細書において、親抗体配列と好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。抗体バリアントは、抗体自体、抗体バリアントを含む組成物または抗体バリアントをコードするアミノ酸配列のことをいうことがある。
【００４８】
核酸またはその断片に言及する場合の用語「同一性」または「実質的同一性」または「実質的に同一」は、別の核酸（またはその相補鎖）と適当なヌクレオチド挿入または欠失を有して最適に整列させた場合に、以下に論じるように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧＡＰなどの配列同一性の任意のよく知られているアルゴリズムにより測定される、ヌクレオチド塩基の少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％においてヌクレオチド配列同一性があることを示す。
【００４９】
ポリペプチドに当てはめる場合、用語「実質的類似性」または「実質的に類似」は、２つのペプチド配列が、例えばデフォルトギャップ重みを用いるプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列させた場合に、少なくとも８０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存アミノ酸置換により異なる。
【００５０】
用語「アミノ酸改変」は、本明細書において、ポリペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含む。「アミノ酸置換」または「置換」は、本明細書において、親ポリペプチド配列中の特定の位置での別のアミノ酸へのアミノ酸の置き換えを意味する。例えば、置換Ｒ９４Ｋは、バリアントポリペプチド、この場合、９４位のアルギニンがリシンで置き換えられた重鎖可変フレームワーク領域バリアントのことをいう。前出の例について、９４Ｋは、９４位でのリシンへの置換を示す。本明細書における目的のために、複数の置換は、斜線により典型的に分けられる。例えば、Ｒ９４Ｋ／Ｌ７８Ｖは、置換Ｒ９４ＫおよびＬ７８Ｖを含む２重バリアントのことをいう。「アミノ酸挿入」または「挿入」は、本明細書で用いる場合、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。例えば、挿入−９４は、９４位での挿入を示す。「アミノ酸欠失」または「欠失」は、本明細書で用いる場合、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。例えば、Ｒ９４−は、９４位でのアルギニンの欠失を示す。
【００５１】
本明細書で用いる場合、用語「保存改変」または「保存配列改変」は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴に著しく影響しないかまたは前記特徴を著しく改変しないアミノ酸改変のことをいうことを意図する。このような保存改変は、アミノ酸置換、挿入および欠失を含む。改変は、本発明の抗体に、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野において知られる標準的な技術により導入できる。保存アミノ酸置換は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基でアミノ酸残基を置き換えるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有す
るアミノ酸を含む。よって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内またはフレームワーク領域内の１または複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができ、変化した抗体（バリアント抗体）を、保持された機能について試験できる。
【００５２】
用語「エピトープ」は、抗体が結合する抗原の領域のことをいう。エピトープは、構造的または機能的に定義できる。機能的エピトープは、一般的に、構造的エピトープの部分集合であり、相互作用の親和性に直接貢献する残基を有する。エピトープは、立体的であってもよく、つまり、非直鎖状アミノ酸で構成されてもよい。あるいくつかの実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面基である決定基を有してもよく、あるいくつかの実施形態では、特異的３次元構造特性および／または特異的電荷特性を有してよい。
【００５３】
全てのヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインについて、番号付けは、「ＥＵ番号付けシステム」に従う（Ｅｄｅｌｍａｎ  ＧＭら、（１９６９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ
Ｓｃｉ  ＵＳＡ、６３（１）：７８〜８５）。
【００５４】
ヒトカッパ免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＩＧＫＣ）について、番号付けは、「ＥＵ番号付けシステム」に従う（Ｅｄｅｌｍａｎ  ＧＭら、既出）。
【００５５】
ヒトラムダ免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６およびＩＧＬＣ７）について、番号付けは、Ｄａｒｉａｖａｃｈ  Ｐら、（１９８７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８４（２４）：９０７４〜８およびＦｒａｎｇｉｏｎｅ  Ｂら、（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ
ＵＳＡ、８２（１０）：３４１５〜９により記載されるように、「Ｋａｂａｔ番号付けシステム」に従う（Ｋａｂａｔ  ＥＡら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第５版−ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ出版第９１−３２４２号）。
【００５６】
用語「可変ドメイン」は、抗原結合を媒介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定義するドメインのことをいう。自然に存在する抗体では、抗原結合部位は、特異性を定義する２つの可変ドメイン（一方は重鎖（ＶＨ）中にあり、他方は軽鎖（ＶＬ）中にある）からなる。いくつかの場合では、特異性は、ラクダにおいて見出される重鎖抗体からの単一ドメイン抗体のように、２つのドメインの一方のみにもっぱら帰することがある。Ｖ領域は、通常、約１１０アミノ酸長であり、９〜１２アミノ酸長の「超可変領域」とよばれる非常に可変性のより短い領域で分けられた、１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれる比較的不変のアミノ酸配列の連続からなる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、ループを形成する３つの超可変領域により接続されたベータシート構造を全般的に採用する４つのＦＲを含む。各鎖中の超可変領域は、ＦＲにより接近して一緒にされ、他の鎖からの超可変領域と一緒に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ＥＡら、既出を参照されたい）。用語「超可変領域」は、本明細書で用いる場合、抗原結合を担う、抗体のアミノ酸残基のことをいう。超可変領域は、配列可変性が最高であり、かつ／または抗原認識に関与する「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を一般的に含む。全ての可変ドメインについて、番号付けは、Ｋａｂａｔに従う（Ｋａｂａｔ  ＥＡら、既出）。
【００５７】
いくつかのＣＤＲ定義を本明細書において用い、包含する。Ｋａｂａｔ定義は、配列可変性に基づき、最も一般的に用いられる（Ｋａｂａｔ  ＥＡら、既出）。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造ループの場所に言及する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣおよびＬｅｓｋ  ＡＭ
（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７）。ＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ定義との間の折衷案であり、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより用いられている（Ｍａｒｔｉｎ  ＡＣＲら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：９２６８〜７２；Ｍａｒｔｉｎ  ＡＣＲら、（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：１２１〜１５３；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ＪＴら、（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、１：１２６〜１３６；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  Ｍ．Ｊ．Ｅ．（編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１４１〜１７２中のＲｅｅｓ  ＡＲら、（１９９６））。接触による定義は最近導入され（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ＲＭら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２〜７４５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋにおいて入手可能な、入手可能な複合体構造の分析に基づく。ＩＭＧＴ（登録商標）、すなわちｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）によるＣＤＲの定義は、全ての免疫グロブリンおよび全ての種のＴ細胞受容体Ｖ領域についてＩＭＧＴ番号付けに基づく（ＩＭＧＴ（登録商標）、ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰら、（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２７（１）：２０９〜１２；Ｒｕｉｚ  Ｍら、（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（１）：２１９〜２１；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰ（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（１）：２０７〜９；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１）：３０７〜１０；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰら、（２００５）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（３）：１８５〜２０３；Ｋａａｓ  Ｑら、（２００７）Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ＆Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、６（４）：２５３〜６４）。
【００５８】
本発明において論じる全ての相補性決定領域（ＣＤＲ）は、好ましくはＩＭＧＴ（登録商標）に従って定義される。これらのＣＤＲのそれぞれについての可変ドメイン残基は、以下のとおりである（番号付けは、Ｋａｂａｔ  ＥＡら、既出に従う）：ＬＣＤＲ１：２７〜３２、ＬＣＤＲ２：５０〜５２、ＬＣＤＲ３：８９〜９７、ＨＣＤＲ１：２６〜３５、ＨＣＤＲ２：５１〜５７およびＨＣＤＲ３：９３〜１０２。ＶＬ領域の「非ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列：１〜２６（ＦＲ１）、３３〜４９（ＦＲ２）、５３〜８８（ＦＲ３）および９８〜およそ１０７（ＦＲ４）を含む。ＶＨ領域の「非ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列：１〜２５（ＦＲ１）、３６〜５０（ＦＲ２）、５８〜９２（ＦＲ３）および１０３〜およそ１１３（ＦＲ４）を含む。
【００５９】
本発明のＣＤＲは、上記の定義に基づき、以下の可変ドメイン残基を有する「拡張ＣＤＲ」を含むことがある：ＬＣＤＲ１：２４〜３６、ＬＣＤＲ２：４６〜５６、ＬＣＤＲ３：８９〜９７、ＨＣＤＲ１：２６〜３６、ＨＣＤＲ２：４７〜６５、ＨＣＤＲ３：９３〜１０２。これらの拡張ＣＤＲも、Ｋａｂａｔら、既出に従って番号付けされる。ＶＬ領域の「非拡張ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列：１〜２３（ＦＲ１）、３７〜４５（ＦＲ２）、５７〜８８（ＦＲ３）および９８〜およそ１０７（ＦＲ４）を含む。ＶＨ領域の「非拡張ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列：１〜２５（ＦＲ１）、３７〜４６（ＦＲ２）、６６〜９２（ＦＲ３）および１０３〜およそ１１３（ＦＲ４）を含む。
【００６０】
用語「全長抗体」は、本明細書で用いる場合、可変および定常領域を含む抗体の自然の生物学的な形を構成する構造を含む。例えば、ヒトおよびマウスを含むほとんどの哺乳動物では、ＩｇＧクラスの全長抗体は、４量体であり、２つの免疫グロブリン鎖の２つの同一の対からなり、各対は、１つの軽鎖および１つの重鎖を有し、各軽鎖は、免疫グロブリ
ンドメインＶＬおよびＣＬを含み、各重鎖は、免疫グロブリンドメインＶＨ、ＣＨ１（Ｃγ１）、ＣＨ２（Ｃγ２）およびＣＨ３（Ｃγ３）を含む。いくつかの哺乳動物、例えばラクダおよびラマでは、ＩｇＧ抗体は、２つの重鎖のみからなることがあり、各重鎖は、Ｆｃ領域に付いた可変ドメインを含む。
【００６１】
抗体断片は、それらに限定されないが、（ｉ）Ｆａｂ’およびＦａｂ’−ＳＨを含む、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）単一可変領域からなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ＥＳら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６）、（ｖ）２つの連結されたＦａｂ断片を含む２価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｖｉ）ＶＨドメインとＶＬドメインとが、２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成できるようにするペプチドリンカーで連結された単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ＲＥら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３〜４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ＪＳら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜８３）、（ｖｉｉ）２重特異性単鎖Ｆｖ２量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、（ｖｉｉｉ）遺伝子融合により構築された多価または多重特異性断片である「ダイアボディ」または「トリアボディ」（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ＩおよびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  Ｐ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４６１〜７９；ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜４８）および（ｉｘ）同じまたは異なる抗体と遺伝子的に融合されたｓｃＦｖ（Ｃｏｌｏｍａ  ＭＪおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５（２）：１５９〜１６３）を含む。
【００６２】
用語「エフェクター機能」は、本明細書で用いる場合、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用に起因する生化学的事象を含む。エフェクター機能は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用）およびＡＤＣＰ（抗体依存性細胞媒介性食作用）などのＦｃγＲ媒介性エフェクター機能、ならびにＣＤＣ（補体依存性細胞傷害作用）などの補体媒介性エフェクター機能を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ受容体または補体成分などのエフェクター分子についての抗体の親和性を変更、すなわち増進または低減、好ましくは増進することにより変更できる。エフェクター機能は、１または複数の細胞ベースまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて決定できる。このようなアッセイは、抗体に対する細胞の応答、例えば細胞生存、細胞死、細胞形態の変化または天然遺伝子もしくはレポーター遺伝子の細胞発現などの転写活性化をモニタリングすることを頻繁に含む。例えば、このようなアッセイは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰまたはＣＤＣを誘発する抗体の能力を測定してよい。いくつかのアッセイについて、標的細胞に加えて追加の細胞または構成要素、例えば血清補体または末梢血単球（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、マクロファージなどのようなエフェクター細胞を加えることが必要になることがある。エフェクター機能の増強は、変更された抗体のエフェクター機能を対照抗体と比較し、例えば、１または複数の上記のアッセイにより測定されるＡＤＣＣ、ＡＤＣＰまたはＣＤＣの増加を検出することにより決定できる。
【００６３】
結合親和性は、エフェクター分子結合部位を改変することにより一般的に変動され、この場合、対象の部位を置き、前記部位の少なくとも一部を適切な方法で改変することが適当である。エフェクター分子についての抗体の結合部位における変更は、全体的な結合親和性を著しく変更する必要はないが、相互作用の幾何学的配置を変更して、非生産的結合におけるようにエフェクター機序を無効にすることも構想される。エフェクター分子結合に直接関与しないがエフェクター機能の性能に関与する部位を改変することにより、エフェクター機能を変更することもさらに構想される。抗体のエフェクター機能を変更することにより、免疫応答の様々な態様を制御すること、例えば免疫系の様々な反応を増進また
は抑制することが可能になり、診断および治療において有益な効果を有する可能性がある。
【００６４】
本明細書で用いる場合、用語「ＴＬ１Ａ媒介性障害」は、なかでも炎症性腸疾患（例えば潰瘍性大腸炎およびクローン病）、関節リウマチ、多発性硬化症（ＭＳ）、アテローム動脈硬化症、移植片拒絶、中枢神経系損傷、乾癬、白血病またはリンパ腫（例えば慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ））、アテローム動脈硬化症ならびに肺および結腸癌、慢性閉塞性肺疾患ＣＯＰＤ、視神経炎、加齢黄斑変性、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、強皮症、全身性強皮症、慢性腎臓疾患、肝線維症、結核、特発性肺線維症、結核誘発性肺線維症、後腹膜線維症、肺線維症、嚢胞性線維症、心内膜心筋線維症、心房性線維症、縦隔線維症、骨髄線維症（骨髄）、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、腎原性全身性線維症、関節線維症を含む炎症性疾患および／または免疫疾患などの状態を含む。
【００６５】
本明細書で用いる場合、用語「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。好ましくは、対象はヒトである。
【００６６】
抗ＴＬ１Ａ抗体
第１の態様では、本発明は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、ならびに／あるいは配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む拡張重鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号５８のアミノ酸配列を含む拡張重鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号５９のアミノ酸配列を含む拡張重鎖ＣＤＲ３を含み、かつ／あるいは配列番号６０のアミノ酸配列を含む拡張軽鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号６１のアミノ酸配列を含む拡張軽鎖ＣＤＲ２および／または配列番号６２のアミノ酸配列を含む拡張軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【００６８】
好ましくは、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、ならびに／または配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。より好ましくは、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、ならびに配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。好ましくは、抗体またはその断片は、ヒトＴＬ１Ａと結合し、マウス、ラットおよびカニクイザルＴＬ１Ａと交差反応性である。
【００６９】
ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメイン（複数可）とは独立してＣＤＲ３ドメイン単独で同族抗原についての抗体の結合特異性を決定できること、および同じ結合特異性を有する複数の抗体を、共通のＣＤＲ３配列に基づいて予想通りに作製できることが当技術分野においてよく知られている。例えばＫｌｉｍｋａ  Ａら、（２０００）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａ
ｎｃｅｒ、８３（２）：２５２〜２６０（マウス抗ＣＤ３０抗体Ｋｉ−４の重鎖可変ドメインＣＤＲ３のみを用いるヒト化抗ＣＤ３０抗体の生成について記載している）；Ｂｅｉｂｏｅｒ  ＳＨら、（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３〜８４９（親マウスＭＯＣ−３１抗ＥＧＰ−２抗体の重鎖ＣＤＲ３配列のみを用いる組換え上皮糖タンパク質−２（ＥＧＰ−２）抗体について記載している）；Ｒａｄｅｒ  Ｃら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９５：８９１０〜８９１５（マウス抗インテグリンαｖβ３抗体ＬＭ６０９の重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ３ドメインを用いる一連のヒト化抗インテグリンαｖβ３抗体であって、それぞれのメンバー抗体が、ＣＤＲ３ドメインの外側に異なる配列を含み、親マウス抗体と同じエピトープに、親マウス抗体と同等以上の親和性で結合できる抗体について記載している）；Ｂａｒｂａｓ  Ｃら、（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１〜６２（ＣＤＲ３ドメインが抗原結合に最も著しく寄与することを開示する）を参照されたい。
【００７０】
したがって、本発明は、１または複数の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む、特に配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３および／または配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体およびその断片であって、抗体がＴＬ１Ａと結合できる、抗体およびその断片を提供する。いくつかの実施形態では、非ヒト抗体からの１または複数の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むこのような発明の抗体は、対応する親非ヒト抗体、例えばマウス抗体と（ａ）結合について競合でき、（ｂ）前記抗体と同じ機能的特徴を保持し、（ｃ）前記抗体と同じエピトープと結合し、かつ／または（ｄ）前記抗体と同様の結合親和性を有する。
【００７１】
さらなる態様では、抗体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列を含む。さらなる態様では、抗体またはその断片は、配列番号１の重鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一である重鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域を含む。
【００７２】
さらなる態様では、本発明は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列を含むＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。
【００７３】
さらなる態様では、本発明は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。別の態様では、本発明は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列と、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列とを含む。好ましくは、抗体またはその断片は、ヒトＴＬ１Ａと結合し、マウス、ラットおよびカニクイザルＴＬ１Ａと交差反応性である。
【００７４】
別の態様では、本発明は、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片のバリアントを提供する。よって、本発明は、例えばそれぞれ配列番号１３、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９または配列番号１４におけるような重鎖および軽鎖可変領域配列のいずれかの重鎖または軽鎖のいずれかの親抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である（少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する）重鎖および／または軽鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を有する抗体またはその断片を提供する。重鎖または軽鎖のいずれかの親抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域配列の非拡張ＣＤＲ領域のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である重鎖および／または軽鎖可変領域配列の非拡張ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を有する抗体またはその断片も、本発明により提供される。重鎖および／または軽鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域または非拡張ＣＤＲ領域のアミノ酸配列同一性は、好ましくは
少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、特に９６％、より特には９７％、さらにより特には９８％、最も特には９９％（例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％を含む）である。アミノ酸配列に関する同一性または相同性は、本明細書において、配列を整列させ、必要であればギャップを導入して最大限のパーセント配列同一性を達成した後の、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。よって、配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するために一般的に用いられる標準的な方法により決定できる。ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどのコンピュータプログラムを用いて、２つのポリペプチドを、それらのそれぞれのアミノ酸の最適な一致のために整列させる（一方もしくは両方の配列の全長にわたって、または一方もしくは両方の配列の予め決定された部分にわたって）。これらのプログラムは、デフォルトのオープニングペナルティおよびデフォルトのギャップペナルティを提供し、ＰＡＭ２５０（標準的スコア行列；Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第５巻、補遺３号中のＤａｙｈｏｆｆ  ＭＯら、（１９７８）を参照されたい）などのスコア行列をコンピュータプログラムとともに用いることができる。例えば、パーセント同一性は、同一の一致の総数に１００を乗じ、一致したひと続き内の長いほうの配列の長さと、２つの配列を整列させるために長いほうの配列に導入したギャップの数との和で除することにより算出できる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本開示は、よって、配列番号３、４、５、６もしくは７のフレームワーク領域配列と少なくとも６５％同一である重鎖可変フレームワーク領域配列ならびに／または配列番号８、９、１０、１１および１２のフレームワーク領域配列と少なくとも７５％同一である軽鎖可変フレームワーク領域配列を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号３のフレームワーク領域配列と少なくとも６９％同一である重鎖可変フレームワーク領域配列ならびに／または配列番号８のフレームワーク領域配列と少なくとも８０％同一である軽鎖可変フレームワーク領域配列を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。
【００７６】
別の態様では、本発明は、上記の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含み、ＩＧＨＶ１−２*０２
（配列番号３）、ＩＧＨＶ１−２*０４（配列番号４）、ＩＧＨＶ１−２*０５（配列番号５）、ＩＧＨＶ１−２*０１（配列番号６）、およびＩＧＨＶ１−４６*０１（配列番号７）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域、好ましくはヒト遺伝子ＩＧＨＶ１−２*０１（配列番号３）の
産物であるかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域をさらに含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。重鎖可変フレームワーク領域は、これらのヒト遺伝子の産物中に存在するかまたは前記遺伝子に由来する１または複数（例えば１、２、３および／または４つ）の重鎖フレームワーク領域配列（例えばフレームワーク１（ＦＷ１）、フレームワーク２（ＦＷ２）、フレームワーク３（ＦＷ３）および／またはフレームワーク４（ＦＷ４））を含むことがある。好ましくは、重鎖可変領域フレームワークは、ＩＧＨＶ１−２*０２（配列番号３）、ＩＧＨＶ１−２*０４（配列番号４）、ＩＧＨＶ１−２*０５（配列番号５）、ＩＧＨＶ１−２*０１（配列番号６）、およびＩＧＨＶ１−４６*０１（配列番号７）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物中に存在
するかまたは前記遺伝子に由来するＦＷ１、ＦＷ２および／またはＦＷ３、より好ましくはＦＷ１、ＦＷ２およびＦＷ３を含む。重鎖フレームワーク領域配列は、本明細書で用いる場合、ＦＷ１（１位〜２５位）、ＦＷ２（３６位〜４９位）、ＦＷ３（６６位〜９４位）およびＦＷ４（１０３位〜１１３位）（アミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔに示す番号付けシステムを利用して示す）を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本開示は、抗体またはその断片であって、前記抗体またはその断片が、ヒト遺伝子ＩＧＨＶ１−２*０１（配列番号３）の産物であるかまたは前記遺
伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域を含み、重鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、抗体およびその断片を提供する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含む抗体またはその断片であって、重鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、抗体およびその断片を提供する。
【００７９】
好ましくは、アミノ酸改変は、３７位、４８位、５０位、６７位、６９位、７１位および７５位からなる群より選択されるアミノ酸位置、より好ましくは３７位、４８位、５０位、６７位および７１位からなる群より選択されるアミノ酸位置、最も好ましくは３７位のアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに従って示される。具体的に、アミノ酸改変は、３７Ａ、４８Ｉ、５０Ｅ、６７Ａ、６９Ｌ、７１Ｖおよび７５Ｓからなる群より選択されるアミノ酸置換、好ましくはＶ３７Ａ、Ｍ４８Ｉ、Ｗ５０Ｅ、Ｖ６７Ａ、Ｍ６９Ｌ、Ｒ７１ＶおよびＩ７５Ｓからなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、Ｖ３７Ａが最も好ましいアミノ酸置換である（各群メンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ番号付けに従って示す）。
【００８０】
別の態様では、本発明は、ＩＧＫＶ１−３３*０１（配列番号８）、ＩＧＫＶ１Ｄ−３
３*０１（配列番号９）、ＩＧＫＶ１Ｄ−１２*０２（配列番号１０）、ＩＧＫＶ１Ｄ−１２*０１（配列番号１１）、およびＩＧＫＶ１−１２*０２（配列番号１２）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域、好ましくはヒト遺伝子ＩＧＫＶ１−３３*０１（配列番号８）の産物であるか
または前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。軽鎖可変領域フレームワーク領域は、これらのヒト遺伝子の産物中に存在するかまたは前記遺伝子に由来する１または複数（例えば１、２、３および／または４つ）の軽鎖フレームワーク領域配列（例えばフレームワーク１（ＦＷ１）、フレームワーク２（ＦＷ２）、フレームワーク３（ＦＷ３）および／またはフレームワーク４（ＦＷ４））を含むことがある。好ましくは、軽鎖可変領域フレームワークは、ＩＧＫＶ１−３３*０１（配列番号８）、ＩＧＫＶ１Ｄ−３３*０１（配列番号９）、ＩＧＫＶ１Ｄ−１２*０２（配列番号１０）、ＩＧＫＶ１Ｄ−１２*０１（配列番号１１）、およびＩＧＫＶ１−１２*０２（配列番号１２）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物中
に存在するかまたは前記遺伝子に由来するＦＷ１、ＦＷ２および／またはＦＷ３、より好ましくはＦＷ１、ＦＷ２およびＦＷ３を含む。軽鎖フレームワーク領域配列は、本明細書で用いる場合、ＦＷ１（１位〜２３位）、ＦＷ２（３５位〜４９位）、ＦＷ３（５７位〜８８位）およびＦＷ４（９８位〜１０８位）（アミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔに示す番号付けシステムを利用して示す）を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本開示は、ヒト遺伝子ＩＧＫＶ１−３３*０１（配列番号８
）の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む抗体またはその断片であって、軽鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、抗体およびその断片を提供する。
【００８２】
さらなる態様では、抗体またはその断片は、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む。さらなる態様では、抗体またはその断片は、配列番号２の重鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一である軽鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域を含
む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１７および配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む抗体またはその断片を提供する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む抗体またはその断片を提供する。代わりに、軽鎖配列の軽鎖可変フレームワーク領域は、対応するマウス抗体の対応する軽鎖可変フレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む。
【００８５】
アミノ酸改変は、５位および３４位からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含んでよい（各群メンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ番号付けに従って示す）。特に、アミノ酸改変は、５Ｎおよび３４Ｓ、好ましくはＴ５ＮおよびＮ３４Ｓからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む（各群メンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ番号付けに従って示す）。特に好ましくは、いずれのアミノ酸改変も有さない配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖配列である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片は、ＩＧＨＶ１−２*０２（配列番号３）、ＩＧＨＶ１−２*０４（配列番号４）、ＩＧＨＶ１−２*０５（配
列番号５）、ＩＧＨＶ１−２*０１（配列番号６）、およびＩＧＨＶ１−４６*０１（配列番号７）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域と、ＩＧＫＶ１−３３*０１（配列番号８）、ＩＧＫＶ１
Ｄ−３３*０１（配列番号９）、ＩＧＫＶ１Ｄ−１２*０２（配列番号１０）、ＩＧＫＶ１Ｄ−１２*０１（配列番号１１）、およびＩＧＫＶ１−１２*０２（配列番号１２）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域、好ましくはヒト遺伝子ＩＧＨＶ１−２*０２（配列番号３）の産物であ
るかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域と、ヒト遺伝子ＩＧＫＶ１−３３*０１（配列番号８）の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレー
ムワーク領域とを含む。上記の異なるヒト遺伝子の産物中に存在するかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域、および／または上記の異なるヒト遺伝子の産物中に存在するかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変領域フレームワーク領域の組み合わせも、本発明に包含される。
【００８７】
ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子についての生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅにてインターネットで利用可能）、ならびにＫａｂａｔ  ＥＡら、既出；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ＩＭら、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜７９８およびＣｏｘ  ＪＰＬら、（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７〜８３６で見出すことができる。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子についての生殖系列ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースで見出すことができる。
【００８８】
別の態様では、本開示は、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片であって、重鎖ＣＤＲの少なくとも１つおよび／または軽鎖ＣＤＲの少なくとも１つが少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、抗体およびその断片を提供する。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発を行って、改変（複数可）を導入でき、抗体結合またはその他の対象の機能的特性に対する影響を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて評価できる。好ましくは、保存改変を導入する。改変（複数可）は、アミノ酸置換、付加または欠失であり得るが、好ましくは置換である。典型的に、５以下、好ましくは４以下、より好ましくは３以下、さらにより好ましくは２以下、最も好ましくは１以下のアミノ酸改変をＣＤＲ領域内で行う。
【００８９】
あるいくつかの実施形態では、フレームワーク配列を用いて可変領域を工学改変して、バリアント抗体を生成できる。本発明のバリアント抗体は、ＶＨおよび／またはＶＫ内のフレームワーク残基に対して改変を行って、例えば抗体の特性を改良するものを含む。典型的に、このようなフレームワーク改変を行って、抗体の免疫原性を低減する。例えば、あるアプローチは、１もしくは複数のフレームワーク残基を対応するマウス配列に「逆突然変異」させるか、または１もしくは複数のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「逆突然変異」させることである。
【００９０】
よって、さらなる態様では、本開示は、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片であって、抗体またはその断片の重鎖可変領域のフレームワーク領域配列の少なくとも１つが、対応するマウス抗体の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、抗体およびその断片を提供する。好ましくは、アミノ酸改変は、アミノ酸置換である。典型的に、７以下、好ましくは６以下、好ましくは５以下、好ましくは４以下、より好ましくは３以下、さらにより好ましくは２以下、最も好ましくは１以下のアミノ酸改変をフレームワーク領域内で行う。いくつかの実施形態では、本開示は、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片であって、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸改変が、３７位、４８位、５０位、６７位、６９位、７１位および７５位からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに従って示される、抗体およびその断片を提供する。重鎖可変領域のフレームワーク領域の好ましいアミノ酸置換は、３７位、４８位、５０位、６７位および７１位からなる群より選択されるアミノ酸位置である。重鎖可変領域のフレームワーク領域のより好ましいアミノ酸置換は、Ｖ３７Ａ、Ｍ４８Ｉ、Ｗ５０Ｅ、Ｖ６７Ａ、Ｍ６９Ｌ、Ｒ７１ＶおよびＩ７５Ｓからなる群より選択され、Ｖ３７Ａが重鎖可変領域のフレームワーク領域の最も好ましいアミノ酸置換である。
【００９１】
本開示は、また、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片であって、抗体またはその断片の軽鎖可変領域のフレームワーク領域配列の少なくとも１つが、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含み得る、抗体およびその断片を提供する。好ましくは、アミノ酸改変は、アミノ酸置換である。典型的に、２以下、より好ましくは１以下および最も好ましくは０のアミノ酸改変をフレームワーク領域内で行う。いくつかの実施形態では、本開示は、抗体またはその断片であって、軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域のアミノ酸改変が、５位および３４位からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換、ならびに／または３１位のアミノ酸位置での欠失を含む、抗体およびその断片を提供する。軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域のアミノ酸改変は、５Ｎおよび３４Ｓ、好ましくはＴ５ＮおよびＮ３４Ｓからなる群より選択される置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに従って示される。いくつかの実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、上記のとおりの重鎖可変領域配列のフレームワーク領域のアミノ酸改変と、上記のとおりの軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域のアミノ酸改変とを含むことがある。
【００９２】
本開示は、配列番号１３、２６、２７、２８および２９からなる群より選択され、好ましくは配列番号２６、２７、２８および２９からなる群より選択され、より好ましくは配列番号２７、２８および２９からなる群より選択され、さらにより好ましくは配列番号２７および２９からなる群より選択される重鎖可変領域を含むＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片も提供する。本開示は、配列番号１４および３０からなる群より選択され、より好ましくは配列番号１４である軽鎖可変領域を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片も提供する。いくつかの実施形態では、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片は、配列番号２６、２７、２８および２９からなる群より選択される重鎖可変領域と、配列番号１４および３０からなる群より選択される軽鎖可変領域とを含む。これらの重鎖およ
び軽鎖可変領域配列のそれぞれがＴＬ１Ａと結合できることに鑑みて、重鎖および軽鎖可変領域配列を「様々に組み合わせて」、本発明の抗ＴＬ１Ａ結合分子を創出できる。このような「様々に組み合わせた」抗体のＴＬ１Ａ結合は、例えば実施例に記載する結合アッセイを用いて試験できる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片は、配列番号２７および２９からなる群より選択される重鎖可変領域と、配列番号１４および３０からなる群より選択される軽鎖可変領域とを含む。より好ましい実施形態では、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。最も好ましくは、配列番号２７および２９からなる群より選択される重鎖可変領域と、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片である。
【００９４】
本開示は、配列番号１６、２１、２２、２３および２４からなる群より選択され、好ましくは配列番号２２、２３および２４からなる群より選択され、より好ましくは配列番号２２および２４からなる群より選択される重鎖配列を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。本開示は、配列番号１７および２５からなる群より選択され、より好ましくは配列番号１７である軽鎖配列を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片も提供する。いくつかの実施形態では、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片は、配列番号２１、２２、２３および２４からなる群より選択される重鎖配列と、配列番号１７および２５からなる群より選択される軽鎖配列とを含む。これらの重鎖および軽鎖可変領域配列のそれぞれがＴＬ１Ａと結合できることに鑑みて、重鎖および軽鎖可変領域配列を「様々に組み合わせて」、本発明の抗ＴＬ１Ａ結合分子を創出できる。このような「様々に組み合わせた」抗体のＴＬ１Ａ結合は、実施例に記載する結合アッセイを用いて試験できる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片は、配列番号２２および２４からなる群より選択される重鎖配列と、配列番号１７および２５からなる群より選択される軽鎖配列とを含む。より好ましい実施形態では、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖配列と配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖配列、または配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖配列と配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む。最も好ましくは、配列番号２２および２４からなる群より選択される重鎖配列と、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖配列とを含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片である。
【００９６】
本開示の一実施形態では、抗体またはその断片はヒト化抗体である。好ましくは、抗体またはその断片は、ヒト化モノクローナル抗体である。
【００９７】
本開示は、ＴＬ１Ａと結合する１価抗体またはその断片、すなわち単一抗原結合腕からなる抗体も提供する。本開示は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、２重特異性単鎖Ｆｖ２量体、ダイアボディ、トリアボディおよび同じまたは異なる抗体と遺伝子的に融合したｓｃＦｖからなる群より選択される、ＴＬ１Ａと結合する抗体の断片も提供する。好ましい断片は、ｓｃＦｖ、２重特異性単鎖Ｆｖ２量体およびダイアボディである。本開示は、ＴＬ１Ａと結合する全長抗体も提供する。
【００９８】
本開示は、重鎖および／または軽鎖定常領域、特にヒト重鎖および／またはヒト軽鎖定常領域をさらに含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片も提供する。ヒト重鎖定常領域は、ＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）、ＩｇＧ２（ＩＧＨＧ２）、ＩｇＧ３（ＩＧＨＧ３）、
ＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）、ＩｇＡ１（ＩＧＨＡ１）、ＩｇＡ２（ＩＧＨＡ２）、ＩｇＭ（ＩＧＨＭ）、ＩｇＤ（ＩＧＨＤ）またはＩｇＥ（ＩＧＨＥ）からなるヒト免疫グロブリンの群より選択でき、ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ、特にＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）が好ましい。ヒト軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域からなるヒト免疫グロブリンの群より選択でき、ヒトカッパ定常領域が好ましい。好ましい実施形態では、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片は、ヒトＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）重鎖定常ドメインとヒト軽鎖カッパ定常ドメインとを含む。
【００９９】
フレームワーク領域またはＣＤＲ領域内に作製する改変に加えてまたは前記改変の代わりに、本発明の抗体を、Ｆｃ領域内に改変を含むように工学的に改変して、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞傷害作用のような抗体の１または複数の機能特性を典型的に変更してよい。さらに、本発明の抗体を化学的に改変（例えば１または複数の化学的部分を抗体に付けることができる）またはそのグリコシル化を変更するように改変してよい。これらの実施形態のそれぞれは、以下にさらに詳細に記載する。以下に概説するＦｃ領域内の改変は、Ｆｃ領域中の残基のＥＵ番号付けに従う。一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域を、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変更、例えば増加または減少されるように改変する。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数を変更して、例えば軽鎖と重鎖の集合を容易にするか、または抗体の安定性を増加もしくは減少させる。別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させて、抗体の生物学的半減期を減少させる。より具体的には、抗体のブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合が天然のＦｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比べて損なわれるようにＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域中に１または複数のアミノ酸変異を導入する。このアプローチは、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載されている。別の実施形態では、抗体を改変して、その生物学的半減期を増加させる。様々なアプローチが可能である。例えば、Ｗａｒｄへの米国特許第６，２７７，３７５号に記載されるように、以下の変異の１または複数を導入できる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。代わりに、生物学的半減期を増加させるために、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号および第６，１２１，０２２号に記載されるように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得たサルベージ受容体結合エピトープを含有するようにＣＨ１またはＣＬ領域内で抗体を変更できる。さらなる実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えて、抗体のエフェクター機能（複数可）を変更することによりＦｃ領域を変更する。例えば、エフェクターリガンドに対する抗体の親和性が変更されるが、親抗体の抗原結合能力を抗体が保持するように、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１または複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。親和性が変更されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、ともにＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載されている。別の例では、抗体のＣ１ｑ結合が変更され、かつ／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）が低減もしくは廃止されるようにアミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１または複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。このアプローチは、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。別の例では、ＣＨ２ドメインのＮ末端領域中の２３１位〜２３８位のアミノ酸内の１または複数のアミノ酸残基を変更し、そのことにより、補体と結合する抗体の能力を変更する。このアプローチは、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴパンフレットＷＯ９４／２９３５１にさらに記載されている。なお別の例では、以下の位置での１もしくは複数のアミノ酸を改変することによりＦｃ領域を改変して、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させ、かつ／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させる：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、
２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９。このアプローチは、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴパンフレットＷＯ００／４２０７２にさらに記載されている。
【０１００】
本開示は、ヒト重鎖および／または軽鎖定常領域を含むＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片であって、ヒト重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）からのＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含むアイソタイプバリアントを含み、ヒンジ領域が、２２８位のセリンからプロリンへの置換を含む、抗体またはその断片も提供する。ＴＬ１Ａと結合する特に好ましい抗体またはその断片は、アイソタイプバリアントを含む抗体は、全長抗体である。ヒトＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）からのＣＨ１と、Ｓ２２８Ｐ置換を有するヒトＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）からのヒンジと、ヒトＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）からのＣＨ２およびＣＨ３とを含むアイソタイプバリアントを含む。アイソタイプバリアントは、ヒトＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）（これは、通常、天然のヒトＩｇＧ１である）からのヒト重鎖定常領域を含む、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片と比較して、すなわち改変された重鎖定常領域に関してアイソタイプバリアントから異なるだけである、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片と比較して、ＡＤＣＣのようなＦｃ媒介性細胞傷害作用機序を示さないことが見出されている。
【０１０１】
本開示は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片であって、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域に付いた成熟コア炭水化物構造がフコースを欠く（本明細書において、代わりに「非フコシル化」という）、抗体またはその断片も提供する。用語「成熟コア炭水化物構造」は、本明細書で用いる場合、以下に模式的に示す二分岐オリゴ糖に典型的な炭水化物構造ＧｌｃＮＡｃ（フコース）−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ−（Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ）2から全般的になるＦｃ領域に付いた加工コア炭水化物構造を含む：
【０１０２】
【化１】
2018126150.tif 000002
【０１０３】
この用語は、β１，２ＧｌｃＮＡｃ残基を欠くコア成熟炭水化物構造のＧ−１形を含む。しかし、好ましくは、コア炭水化物構造は、両方のβ１，２ＧｌｃＮＡｃ残基を含む。本明細書における成熟コア炭水化物構造は、全般的に、過剰マンノース化されていない。成熟コア炭水化物構造を、糖タンパク質のＦｃ領域に、通常はＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合を介して付ける。
【０１０４】
好ましくは、抗体は、ヒトＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）Ｆｃ領域を含み、ヒトＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）Ｆｃ領域に付いた成熟コア炭水化物構造は、フコースを欠く。より好ましくは、ヒトＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）Ｆｃ領域に付いた成熟コア炭水化物構造がフコースを欠く、ヒトＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）Ｆｃ領域を含む全長抗体である。ＷＯ０３／０３５８３５から、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域に付いた成熟コア炭水化物構造中のフコースの欠如は、ＡＤＣＣを増進し得ることが知られている。よって、さらなる実施形態では、本開示の抗体ま
たはその断片は、ヒトＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）Ｆｃ領域を含み、ヒトＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）Ｆｃ領域に付いた成熟コア炭水化物構造は、フコースを欠き、フコースを欠く抗体は、フコースを欠かない親抗体またはその断片と比較して、ＡＤＣＣの増進を示す。フコースを欠く抗体を作製する方法は、例えば（ａ）細胞内で発現されるタンパク質をフコース化する能力が低減される（またはフコース化できない）ようにフコース代謝が欠損している工学改変または変異宿主細胞の使用；（ｂ）フコース化を防止もしくは低減する条件下での細胞の培養；（ｃ）フコースの翻訳後除去（例えばフコシダーゼ酵素を用いて）；（ｄ）例えば非グリコシル化糖タンパク質の組換え発現後の所望の炭水化物の翻訳後付加；または（ｅ）フコース化されていない産物を選択するような糖タンパク質の精製である。好ましく用いられるものは、ＷＯ１０／０９５０３１の実施例１４に記載される方法、例えばＬｏｎｇｍｏｒｅら、（１９８２）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３６５〜９２またはＩｍａｉ−Ｎｉｓｈｉｙａら、（２００７）、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：８４に記載される方法である。
【０１０５】
本発明は、配列番号２７または配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列を含む抗体と同じエピトープと結合する、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片も提供する。本発明は、本発明が提供する抗体、特に配列番号２７または配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列を含む抗体が結合する、ＴＬ１Ａの特定の領域またはエピトープも提供する。ＴＬ１Ａポリペプチドのこの特定の領域またはエピトープは、本発明が提供する抗体のいずれか１つと組み合わせた、当技術分野において知られる任意の適切なエピトープマッピング方法により同定できる。このような方法の例は、ＴＬ１Ａに由来する様々な長さのペプチドを、本発明の抗体との結合について、抗体により認識されるエピトープの配列を含有する抗体と特異的に結合できる最小の断片を用いてスクリーニングすることを含む。ＴＬ１Ａペプチドは、合成により、またはＴＬ１Ａポリペプチドのタンパク質分解消化により生成できる。抗体と結合するペプチドは、例えば質量分析により同定できる。別の例では、ＮＭＲ分光法またはＸ線結晶学を用いて、本発明の抗体と結合するエピトープを同定できる。一端同定されると、本発明の抗体と結合するエピトープ断片を、所望により、免疫原として用いて、同じエピトープと結合するさらなる抗体を得ることができる。
【０１０６】
抗ＴＬ１Ａ抗体特性
例えばＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ウェスタンブロット、ＲＩＡおよびフローサイトメトリー分析を含む、例えばＴＬ１Ａに対する抗体の結合能力を評価するための標準的なアッセイは、当技術分野において知られている。適切なアッセイは、実施例に詳細に記載する。抗体の結合動態（例えばＫＤのような結合親和性）も、スキャッチャードまたはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム分析によるなどの当技術分野において知られる標準的なアッセイにより評価できる。相対的結合親和性Ｋiは、当技術分野におい
て知られる標準的な競合アッセイにより評価できる。
【０１０７】
さらなる態様では、本発明は、ＥＬＩＳＡまたはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）法により視覚化されるように、ヒト、マウス、ラットおよびカニクイザルＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。結合ＥＬＩＳＡを、実施例３に従って行って測定できる。
【０１０８】
さらなる態様では、本発明は、組換えまたは自然に生成されるヒトＴＬ１Ａと結合し、ＣＤ４  Ｔリンパ球による活性化およびサイトカイン分泌を防止する抗体またはその断片を提供する。例えば、本発明の抗体またはその断片は、免疫複合体刺激単球により誘導されるＩＮＦγの生成を抑制できる。ＣＤ４  Ｔリンパ球によるこのようなＴＬ１Ａ媒介性サイトカイン分泌を決定するためのアッセイは、実施例３および６に従って行って測定できる。
【０１０９】
さらなる態様では、本発明は、実施例５に詳細に記載するように、分析物として用いるヒト可溶性ＴＬ１Ａポリペプチド（配列番号１１６によりコードされる）を有するプロテインＡ結合ＣＭ５研究グレードセンサチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；ＢＲ−１０００−１４）上に抗体を捕捉することにより、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される、８５０ｐＭ以下、好ましくは７００ｎＭ以下、より好ましくは３００ｎＭ以下、より好ましくは２６０ｎＭ以下、さらにより好ましくは２５０ｎＭ以下の親和性（ＫD）でＴＬ１Ａ、特に単離形のＴＬ１Ａと結合
する抗体またはその断片を提供する。好ましい態様では、本発明は、対応するキメラ抗体のＴＬ１Ａ結合親和性（ＫD）の少なくとも８５％を保持するヒト化抗体またはその断片
を提供する。好ましくは、ヒト化抗体またはその断片は、対応するキメラ抗体のＴＬ１Ａ結合親和性（ＫD）の少なくとも９０％、より好ましくは対応するキメラ抗体の結合親和
性（ＫD）の少なくとも９５％を保持する。好ましくは、ヒト化抗体またはその断片は、
対応するキメラ抗体と等価な親和性でヒトＴＬ１Ａと結合する。「等価な親和性」は、対応するキメラ抗体のＴＬ１Ａ結合親和性の±１０％の範囲内である親和性の値を意味する。より好ましくは、本発明は、対応するキメラ抗体より高い親和性でヒトＴＬ１Ａと結合するヒト化抗体またはその断片を提供する。好ましくは、ヒト化抗体またはその断片は、対応するキメラ抗体より２倍高い親和性、より好ましくは対応するキメラ抗体より３倍高い親和性でヒトＴＬ１Ａと結合する。本発明の好ましい態様では、実施例５に詳細に記載するように、分析物として用いるヒト可溶性ＴＬ１Ａポリペプチド（配列番号１１６によりコードされる）を有するプロテインＡ結合ＣＭ５研究グレードセンサチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；ＢＲ−１０００−１４）上に抗体を捕捉することにより、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される、９００ｐＭ以下、７００ｐＭ以下、好ましくは５００ｐＭ以下、より好ましくは３００ｎＭ以下、より好ましくは２６０ｐＭ以下、さらにより好ましくは２５０ｐＭ以下の結合親和性（ＫD）を有する、ヒトＴＬ１Ａと結合するヒト化抗体またはその断片が提供される
。
【０１１０】
本発明のさらなる態様は、良好な熱安定性を有する、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を提供する。好ましい実施形態では、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片は、７０℃を超え、好ましくは７５℃を超え、さらにより好ましくは８０℃を超えるＦＡＢ断片耐熱温度を有する。ＦＡＢ断片耐熱性の分析のために示差走査熱量分析測定を用い、前記測定では、全長ＩｇＧの関係におけるＦＡＢ断片の中間融解温度が同定される。これらの種類の熱量測定は、当業者に知られており、実施例５にさらに記載するように、例えばＧａｒｂｅｒ  ＥおよびＤｅｍａｒｅｓｔ  ＳＪ（２００７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、３５５：７５１〜７に従って行うことができる。
【０１１１】
核酸、ベクターおよび宿主細胞
本開示は、ＴＬ１Ａと結合する抗体およびその断片をコードする単離核酸、ベクターおよび核酸またはベクターを含む宿主細胞も提供する。核酸は、細胞全体、細胞溶解物または部分的に精製もしくは実質的に精製された形で存在することがある。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド分け、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野においてよく知られている他のものを含む標準的な技法により、他の細胞構成成分または他の混入物、例えば他の細胞性核酸またはタンパク質から精製分離された場合に、「単離」または「実質的に純粋に」されている。例えばＦ．Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましい実施形態では、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。
【０１１２】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学技法を用いて得ることができ、例えば抗体の軽鎖および重鎖をコードするかまたはＶＨおよびＶＬセグメントをコードするｃＤＮＡは、標準的ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技法により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリー（例えばファージディスプレイ技法を用いて）から得られる抗体について、抗体をコードする１または複数の核酸をライブラリーから回収できる。外因性核酸を宿主細胞に導入する方法は、当技術分野においてよく知られており、用いる宿主により変動する。技法は、それらに限定されないが、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、塩化カルシウム処理、ポリエチレンイミン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルスまたはファージ感染、リポソームへのポリヌクレオチド（複数可）の封入、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを含む。哺乳動物細胞の場合、トランスフェクションは一過性または安定性のいずれかであってよい。
【０１１３】
本発明の好ましい核酸分子は、配列番号４２、４３、４４、４５および４６からなる群より選択される重鎖配列、ならびに／または配列番号４７および４８からなる群より選択される軽鎖配列をコードするものである。本発明の好ましい核酸分子は、配列番号３１、３２、３３、３４および３５からなる群より選択される重鎖可変領域、ならびに／または配列番号３６および３７からなる群より選択される軽鎖可変領域をコードするものである。
【０１１４】
本発明の好ましい核酸分子は、配列番号１の重鎖可変領域および／または配列番号２の軽鎖可変領域をコードするもの、例えば配列番号６３の核酸配列を含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、および／または配列番号６４の核酸配列を含む軽鎖可変領域をコードするＤＮＡである。本発明のより好ましい核酸分子は、配列番号２７もしくは２９の重鎖可変領域および／または配列番号１４の軽鎖可変領域をコードするもの、例えば配列番号３３もしくは３５の核酸配列を含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、および／または配列番号３６の核酸配列を含む軽鎖可変領域をコードするＤＮＡであり、これらが最も好ましい。
【０１１５】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が一旦得られると、これらのＤＮＡ断片を、標準的な組換えＤＮＡ技法によりさらに操作して、例えば可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子またはＦａｂ断片遺伝子もしくはｓｃＦｖ遺伝子のような上記の断片に対応する断片遺伝子に変換できる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域またはフレキシブルリンカーのようななどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結している。用語「作動可能に連結する」は、この文脈で用いる場合、２つのＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように２つのＤＮＡ断片をつなぐことを意味する。ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子にＶＨをコードするＤＮＡを作動可能に連結することにより、全長重鎖遺伝子に変換できる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において知られており（例えばＫａｂａｔ  ＥＡら、既出を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）、ＩｇＧ２（ＩＧＨＧ２）、ＩｇＧ３（ＩＧＨＧ３）、ＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）、ＩｇＡ１（ＩＧＨＡ１）、ＩｇＡ２（ＩＧＨＡ２）、ＩｇＭ（ＩＧＨＭ）、ＩｇＤ（ＩＧＨＤ）またはＩｇＥ（ＩＧＨＥ）定常領域であり得るが、最も好ましくはＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）定常領域であ
る。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子について、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結できる。ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子にＶＬをコードするＤＮＡを作動可能に連結することにより、全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換できる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において知られており（例えばＫａｂａｔ
ＥＡら、既出を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。好ましい実施形態では、軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域、好ましくはカッパ定常領域であり得る。ｓｃＦｖ遺伝子を創出するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片を、フレキシブルリンカーをコードする、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作動可能に連結して、ＶＬおよびＶＨ領域がフレキシブルリンカーによりつながれた連続単鎖タンパク質としてＶＨおよびＶＬ配列が発現できるようにする（例えばＢｉｒｄ  ＲＥら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ＪＳら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ
Ｊら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４を参照されたい）。抗体の抗体断片生成のために様々な技法が開発されている。伝統的に、これらの断片は、インタクト抗体のタンパク質分解消化により導かれた（例えばＭｏｒｉｍｏｔｏ  Ｋら、（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４：１０７〜１１７およびＢｒｅｎｎａｎ  Ｍら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１〜３を参照されたい）。しかし、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞により直接生成できる。例えば、抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリーから単離できる。代わりに、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収でき、化学的にカップリングさせてＦ（ａｂ’）2断片を形成できる（Ｃａｒｔｅｒ  Ｐら、（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６３〜１６７）。別のアプローチによると、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離できる。抗体断片の生成のための他の技法は、当業者にとって明らかである。別の実施形態では、選択される抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。例えばＷＯ１９９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号および米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に例えば記載される「直鎖抗体」であってもよい。
【０１１６】
本発明の抗体をコードする核酸は、タンパク質を発現するためにベクター、好ましくは発現ベクターに組み込むことができる。様々な発現ベクターをタンパク質発現のために利用できる。発現ベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターを含み得る。発現ベクターは、宿主細胞型と適合するように構築される。よって、本発明において用いることができるベクター、好ましくは発現ベクターは、それらに限定されないが、哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞、酵母においておよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ系においてタンパク質発現を可能にするものを含む。当技術分野において知られるように、抗体を発現するために本発明において用いることができる様々な発現ベクターが市販または他の方法で入手可能である。
【０１１７】
発現ベクターは、典型的に、制御もしくは調節配列、選択マーカー、任意の融合パートナーおよび／またはさらなるエレメントに作動可能に連結したタンパク質を含む。本明細書において「作動可能に連結」とは、核酸が別の核酸配列と機能的関係にあることを意味する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０））に記載される。一般的に、これらの発現ベクターは、抗体をコードする核酸に作動可能に連結した転写および翻訳調節核酸を含み、タンパク質を発現するために用いる宿主細胞にとって典型
的に適当である。一般に、転写および翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含み得る。これもまた当技術分野において知られるように、発現ベクターは、選択遺伝子またはマーカーを典型的に含有して、発現ベクターを含有する形質転換宿主細胞の選択を可能にする。選択遺伝子は当技術分野において知られており、用いる宿主細胞により変動する。例えば、典型的に、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に与える。好ましい選択可能マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅を用いるｄｈｆｒ−宿主細胞において用いるため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を含む。
【０１１８】
クローニングまたは本明細書におけるベクター中でのＤＮＡの発現のために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核生物細胞である。この目的のために適切な原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性生物を含む真正細菌、例えばＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えばＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓおよびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢａｃｉｌｌｉ、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、例えばＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓを含む。適切なＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）を含む。原核生物に加えて、糸状菌または酵母のような真核微生物は、適切なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは一般的なパン酵母は、下等真核宿主微生物のうちで最も一般的に用いられる。しかし、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｒｉｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ＷａＩｔＨ（ＡＪＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｍａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓまたはＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２２２６）を含むＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えばＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ；およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、ＴｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍまたはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓもしくはＡ．ｎｉｇｅｒのようなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主を含む糸状菌のなどのいくつかの他の属、種および株が一般的に利用可能であり、有用である。
【０１１９】
本発明の抗体の発現のために適切な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例は、プラリル（ｐｌａｒｉｌ）および昆虫細胞を含む。多数のバキュロウイルス株およびバリアント、並びにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ  ａｕｇｙｐｔｉ（カ）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（カ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉなど宿主からの対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えばＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１バリアントおよびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株が公共で利用可能であり、このようなウイルスは、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために用いることができる。ワタ、トウモロコシ、バレイショ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物も宿主と
して利用できる。
【０１２０】
本発明の組換え抗体の発現のための宿主細胞は、好ましくは哺乳動物宿主細胞であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ  ＧおよびＣｈａｓｉｎ  ＬＡ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ、７７：４２１６〜４２２０に記載されるｄｈｆｒ-ＣＨＯ細胞を含む、例えばＫａｕｆｍａｎ  ＲＪおよびＳｈ
ａｒｐ  ＰＡ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、１５９：６０１〜６２１に記載されるようにＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに用いられる）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞とともに用いるために、別の好ましい発現系は、ＷＯ８７／０４４６２（Ｗｉｌｓｏｎ）、ＷＯ８９／０１０３６（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ）およびＥＰ３３８８４１（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ）に開示されるＧＳ遺伝子発現系である。組換え抗体遺伝子を哺乳動物宿主細胞に導入した場合、抗体は、宿主細胞中での抗体の発現を可能にするためまたはより好ましくは宿主細胞が成長する培養培地への抗体の分泌を可能にするために十分な期間、宿主細胞を培養することにより生成される。ＴＬ１Ａと結合する抗体を生成するために有用な宿主細胞は、様々な培地で培養できる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、最少必須培地（ＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ
ＧｍｂＨ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）など市販で入手可能な培地は、宿主細胞の培養のために適切である。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培養培地から回収できる。
【０１２１】
抗体は、融合パートナーに作動可能に連結して、発現されたタンパク質の標的化、精製、スクリーニング、ディスプレイなどができるようにしてよい。融合パートナーは、リンカー配列により抗体配列に連結してよい。リンカー配列は、少数、典型的に１０未満のアミノ酸を一般的に含むが、より長いリンカーも用いてよい。典型的に、リンカー配列は、フレキシブルで分解に対して耐性であるように選択される。当業者により認識されるように、多様な配列のいずれもリンカーとして用いることができる。例えば、一般的なリンカー配列は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳを含む。融合パートナーは、抗体および任意の付随する融合パートナーを所望の細胞の場所または細胞外培地に向ける標的化またはシグナル配列であってよい。当技術分野において知られるように、あるいくつかのシグナル配列は、タンパク質を成長培地または細胞の内膜と外膜との間にある細胞膜周辺腔に分泌されるように標的化させることがある。融合パートナーは、精製および／またはスクリーニングを可能にするペプチドまたはタンパク質をコードする配列であってもよい。このような融合パートナーは、それらに限定されないが、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）（例えばＨ６およびＨ１０または固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）系（例えばＮｉ+2親和性カラム）とともに用いるための他のタグ）、ＧＳＴ融合、ＭＢＰ融合、Ｓｔｒｅｐタグ、細菌酵素ＢｉｒＡのＢＳＰビオチン化標的配列、および抗体が標的にするエピトープタグ（例えばｃ−ｍｙｃタグ、ｆｌａｇタグなど）を含む。当業者により認識されるように、このようなタグは、精製、スクリーニングまたはその両方のために有用であり得る。
【０１２２】
抗体の構築および生成
ＴＬ１Ａポリペプチドに対して作製された抗体は、よく知られており日常的なプロトコールを用いて、動物の免疫化、すなわち動物、好ましくは非ヒト動物へのポリペプチドの投与によりにより得ることができる。例えばＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｅｉｒ  ＤＭ（編）、第４巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８６）を参照されたい。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダまたはブタなど
の多くの温血動物を免疫できる。しかし、マウス、ウサギ、ブタおよびラット、特にマウスは、一般的に最も適切である。抗体は、当業者に知られる組換えＤＮＡ技法によっても生成できる。さらに、抗体は、自然に存在する抗体の酵素または化学的切断により生成できる。本発明のヒト化抗体は、非ヒト動物（例えばマウス）からのＶＨおよび／またはＶＬ領域からの１もしくは複数のＣＤＲまたはその一部を、ヒトＶＨおよび／またはＶＬ領域からの１または複数のフレームワーク領域に移行することにより構築できる。場合によって、このようにＶＨおよび／またはＶＬ領域中に存在するヒトフレームワーク残基は、抗体の免疫原性を減少させ、かつ／または結合親和性を維持するために必要または所望される場合に、対応する非ヒト（例えばマウス）残基で置き換えることができる。場合によって、ＣＤＲ中に存在する非ヒトアミノ酸残基は、ヒト残基で置き換えてよい。本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上記のようにして調製した非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づいて調製できる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象の非ヒトハイブリドーマから得て、非マウス（例えばヒト）免疫グロブリン配列を含有するように、標準的な分子生物学的技法を用いて工学改変できる。例えば、キメラ抗体を創出するために、当技術分野において知られる方法を用いて、マウス可変領域をヒト定常領域に連結できる（例えばＣａｂｉｌｌｙらへの米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。ヒト化抗体を創出するために、当技術分野において知られる方法を用いて、マウスＣＤＲ領域をヒトフレームワークに挿入できる（例えばＷｉｎｔｅｒへの米国特許第５，２２５，５３９号、Ｑｕｅｅｎらへの米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照されたい）。
【０１２３】
重鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子を、可能性のあるアクセプター分子可変領域とマウス抗体の重鎖可変領域との間の相同性を考慮して選択して、本発明のヒト化抗体を構築してよい。生殖系列候補ヒトアクセプター分子は、可能性のある免疫原性を低減するので好ましい。生殖系列データベースは、重鎖ＦＷ３領域の端および部分的にＣＤＲ３配列内まで通して読んだ抗体配列でつくられている。ＦＷ４領域の選択のために、選択された生殖系列分子に由来する成熟抗体配列のデータベースを検索できるか、またはヒトドナーからの選択された生殖系列分子に由来する抗体配列を用いることができる。ヒトアクセプター分子は、マウスドナー分子と同じ重鎖クラスから好ましく選択され、マウスドナー分子の可変領域と同じ基準構造クラスのものである。重鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子の選択のための２次的な考慮は、マウスドナー分子とヒトアクセプター分子との間のＣＤＲ長における相同性を逃れる。ヒトアクセプター抗体分子は、Ｖ−ＢＡＳＥデータベースでの相同性検索により選択されることが好ましいが、Ｋａｂａｔおよび公共ＮＣＢＩデータベースなどの他のデータベースも用いてよい。
【０１２４】
軽鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子を、可能性のあるアクセプター分子可変領域とマウス抗体の軽鎖可変領域との間の相同性を考慮して選択して、本発明のヒト化抗体を構築してよい。生殖系列候補ヒトアクセプター分子は、可能性のある免疫原性を低減するので好ましい。生殖系列データベースは、重鎖ＦＷ３領域の端および部分的にＣＤＲ３配列内まで通して読んだ抗体配列でつくられている。ＦＷ４領域の選択のために、選択された生殖系列分子に由来する成熟抗体配列のデータベースを検索できるか、またはヒトドナーからの選択された生殖系列分子に由来する抗体配列を用いることができる。ヒトアクセプター分子は、マウスドナー分子と同じ軽鎖クラスから好ましく選択され、マウスドナー分子の可変領域と同じ基準構造クラスのものである。軽鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子の選択のための２次的な考慮は、マウスドナー分子とヒトアクセプター分子との間のＣＤＲ長における相同性を含む。ヒトアクセプター抗体分子は、Ｖ−ＢＡＳＥデータベースでの相同性検索により選択されることが好ましいが、Ｋａｂａｔおよび公共ＮＣＢＩデータベースなどの他のデータベースも用いてよい。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、以下の実施例５を含んで本明細書に記載する。
【０１２５】
本発明は、ＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を生成する方法であって、核酸が発現され、抗体が生成されるように、ＴＬ１Ａと結合する抗体もしくはその断片をコードする単離核酸またはＴＬ１Ａと結合する抗体もしくはその断片をコードする単離核酸を含むベクターを含む宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。好ましくは、抗体は、単離される。宿主細胞、核酸およびベクターについて、上記のものを用いることができる。核酸の発現は、例えば、当技術分野においてよく知られ（例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ  Ｓ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）、上でさらに概説する組換えＤＮＡ技法と遺伝子トランスフェクション方法との組み合わせにより得ることができる。例えば抗体またはその抗体断片を発現するために、部分または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、標準的な分子生物学的技法を用いて得て（例えばＰＣＲ増幅または対象の抗体を発現するハイブリドーマを用いるｃＤＮＡクローニング）、ＤＮＡを発現ベクターのようなベクターに挿入できる。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いる発現宿主細胞に適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入できるか、またはより典型的には、両方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子を発現ベクターに、標準的な方法により挿入する（例えば抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しないならば平滑端ライゲーション）。本明細書に記載する抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用いて任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を創出でき、このことは、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨ１セグメント（複数可）に作動可能に連結し、ＶＫセグメントがベクター内のＣＫセグメントに作動可能に連結するように、所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域を予めコードする発現ベクターに本明細書に記載する抗体の軽鎖および重鎖可変領域を挿入することによる。
【０１２６】
抗ＴＬ１Ａ抗体の特徴決定および精製
抗体についてのスクリーニングを、ＴＬ１Ａとの結合を測定するためのアッセイおよび／またはＴＬ１Ａとその受容体であるＴＮＦＲＳＦ２５との結合を阻止する能力を測定するためのアッセイを用いて行うことができる。結合アッセイの例は、特に、プレート上に固定化されたＴＬ１ＡとヒトＦｃとの融合タンパク質を用い、融合タンパク質と結合した抗ＴＬ１Ａ抗体を検出するためのコンジュゲート２次抗体を採用するＥＬＩＳＡである。阻止アッセイの例は、ヒトＣＤ４細胞上のＴＮＦＲＳＦ２５へのＴＬ１Ａ融合タンパク質結合の阻止を測定する、フローサイトメトリーに基づくアッセイである。蛍光標識２次抗体を用いて、細胞と結合するＴＬ１Ａ融合タンパク質の量を検出する。このアッセイは、上清中の抗体が、ＴＮＦＲＳＦ２５とリガンド融合タンパク質との結合を阻止するにつれてのシグナルの低減を求める。阻止アッセイのさらなる例は、プレートを被覆するＴＬ１Ａリガンド融合タンパク質が媒介するナイーブヒトＴ細胞の共刺激の阻止を、チミジン取り込みを測定することにより測定するアッセイである。抗ＴＬ１Ａ抗体の機能的活性を評価するためのアッセイとして、例えば実施例３および６に記載するＣＤ４  Ｔリンパ球によるサイトカイン分泌の低減を用いることができる。
【０１２７】
本発明の抗体は、当業者に知られる様々な方法で単離または精製できる。標準的な精製方法は、大気圧またはＦＰＬＣおよびＨＰＬＣのようなシステムを用いて高圧で行う、イオン交換、疎水性相互作用、親和性、サイズ分けまたはゲルろ過および逆相を含むクロマトグラフィー技法を含む。精製方法は、電気泳動、免疫学的、沈降、透析および等電点電気泳動の技法も含む。タンパク質濃縮とともに限外ろ過およびダイアフィルトレーション技法も有用である。ＴＬ１Ａ抗体を精製するために、選択された宿主細胞を、例えばモノクローナル抗体精製のためにスピナーフラスコ中で成長させることができる。上清をろ過し、濃縮した後に、プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて親和性クロマトグラフィーを行う。溶出された抗体をゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーにより確認して、純度を確認できる。本発明の好ましい抗体は、よって、ＴＬ１Ａと結合する単離および／または精製抗体である。
【０１２８】
イムノコンジュゲート
別の態様では、本発明は、細胞毒、薬物（例えば免疫抑制剤）または放射性毒素のような治療剤に連結した、ＴＬ１Ａと結合するＴＬ１Ａ抗体またはその断片を提供する。このようなコンジュゲートは、本明細書において、「イムノコンジュゲート」という。１または複数の細胞毒を含むイムノコンジュゲートは、「免疫毒素」という。細胞毒または細胞傷害性薬剤は、細胞に有害な（例えば死滅させる）任意の薬剤を含む。例は、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにそれらの類似体またはホモログを含む。治療剤は、例えば、代謝拮抗薬（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロフォスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣならびにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））および有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）も含む。本発明の抗体と連結できる治療用細胞毒の他の例は、デュオカルマイシン、カリチアマイシン、マイタンシンおよびオーリスタチン、ならびにそれらの誘導体を含む。カリチアマイシン抗体コンジュゲートの例は、市販で入手可能である（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｏｍｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）。細胞毒は、本発明の抗体と、当技術分野において利用可能なリンカー技法を用いて連結できる。細胞毒と抗体とをコンジュゲートするために用いられているリンカーの型の例は、それらに限定されないが、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチド含有リンカーを含む。例えばリソソーム区画内の低ｐＨによる切断に感受性またはカテプシン（例えばカテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）のような腫瘍組織において優先的に発現されるプロテアーゼのようなプロテアーゼによる切断に感受性であるリンカーを選択できる。細胞毒の型、リンカーおよび治療剤と抗体をコンジュゲートする方法についてのさらなる議論について、Ｓａｉｔｏ  Ｇら、（２００３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９〜２１５；Ｔｒａｉｌ  ＰＡら、（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８〜３３７；Ｐａｙｎｅ  Ｇ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、３：２０７〜２１２；Ａｌｌｅｎ  ＴＭ（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２：７５０〜７６３；Ｐａｓｔａｎ  ＩおよびＫｒｅｉｔｍａｎ  ＲＪ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ、３：１０８９〜１０９１；Ｓｅｎｔｅｒ  ＰＤおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ  ＣＪ、（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５３：２４７〜２６４も参照されたい。本発明の抗体は、放射活性同位体に連結して、ラジオイムノコンジュゲートともよばれる細胞傷害性放射性医薬品を作製することもできる。診断または治療用に用いるために抗体とコンジュゲートできる放射活性同位体の例は、それらに限定されないが、ヨウ素131、インジウム111、イットリウム90およびルテニウム177を含む。ラジオイムノコンジュゲートを調製するため
の方法は、当技術分野において確立されている。ラジオイムノコンジュゲートの例は、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）（ＥＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢｅｘｘａｒ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含んで市販で入手可能であり、同様の方法を用いて、本発明の抗体を用いてラジオイムノコンジュゲートを調製できる。本発明の抗体イムノコンジュゲートを用いて所定の生物学的応答を改変でき、薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば、薬物部
分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってよい。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素もしくはジフテリア毒素のような酵素活性毒素またはその活性断片；腫瘍壊死因子もしくはインターフェロン−γのようなタンパク質；あるいは例えばリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）もしくは他の増殖因子のような生物学的応答改変物質を含むことがある。
【０１２９】
このような治療剤を抗体に連結する技法はよく知られており、例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３〜５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）中のＡｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３〜５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）中のＨｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５〜５０６（１９８５）中のＴｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ
Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３〜１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）中の「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ
Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」ならびにＴｈｏｒｐｅ  ＰＥおよびＲｏｓｓ  ＷＣ（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９〜５８を参照されたい。
【０１３０】
別の態様では、本発明は、細胞毒、薬物（例えば免疫抑制剤）または放射性毒素のような治療剤と一緒に投与される、ＴＬ１Ａと結合するＴＬ１Ａ抗体またはその断片を提供する。
【０１３１】
医薬組成物
別の態様では、本発明は、本発明の抗体またはその断片と薬学的に許容される担体とを含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。このような組成物は、１もしくは組み合わせ（例えば２以上の異なる）抗体、および／または本発明のイムノコンジュゲート、および／または上記のような細胞毒、薬物（例えば免疫抑制剤）もしくは放射性毒素のような治療剤を含むことがある。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープと結合するか、または相補的な活性を有する抗体の組み合わせ（またはイムノコンジュゲート）を含み得る。本発明の医薬組成物は、併用治療において投与することもでき、すなわち他の薬剤と組み合わせることができる。例えば、併用治療は、少なくとも１つの他の抗炎症剤または免疫抑制剤と組み合わせた本発明のＴＬ１Ａ抗体を含み得る。
【０１３２】
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」は、任意のそして全ての生理的に適合する溶剤、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば注射または注入による）のために適切である。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体またはイムノコンジュゲートをある材料中にコーティングして、化合物を不活性化できる酸およびその他の自然の状態から化合物を保護してよい。薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液または分散液および滅菌注射用液または分散液の即時調製用の滅菌粉末
を含む。医薬活性物質のためのこのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野において知られている。任意の従来の媒体または作用物質が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるこれらの使用が構想される。補助的活性化合物も組成物に組み込むことができる。
【０１３３】
別の態様では、本発明は、治療剤に連結したＴＬ１Ａと結合する抗体またはその断片を含むイムノコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。用いることができるイムノコンジュゲートおよび治療剤については、上で記載している。
【０１３４】
別の態様では、本発明は、別の医薬活性薬剤をさらに含む本発明の抗体またはその断片を含む組成物を提供する。好ましくは、別の医薬活性薬剤は、ａ）ＴＬ１Ａに対する別のアンタゴニスト、ｂ）抗炎症剤、ｃ）免疫抑制剤、例えばＴＮＦαアンタゴニスト、コルチゾンもしくはステロイドなど）および／またはｄ）抗アレルギー剤の１または複数である。
【０１３５】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤も含んでよい。薬学的に許容される抗酸化剤の例は、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどのような水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアルコール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどのような脂溶性抗酸化剤；および（３）クエン酸、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような金属キレート化剤を含む。本発明の医薬組成物において採用できる適切な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物、オリーブ油のような植物油ならびにオレイン酸エチルのような注射用有機エステルを含む。適当な流動性は、例えばレシチンのようなコーティング材料の使用、分散液の場合に、要求される粒径の維持および界面活性剤の使用により維持できる。これらの組成物は、保存剤、湿潤化剤、乳化剤および分散剤のような補助剤も含有してよい。微生物の存在は、上記の滅菌化手順および様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの添加の両方により確実に防止できる。糖、塩化ナトリウムなどのような等張化剤を組成物に含めることが望ましいこともある。さらに、注射用医薬形の吸収の延長を、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる作用物質を含めることによりもたらしてもよい。
【０１３６】
治療用およびその他の使用
本発明の抗体は、ＴＬ１Ａ媒介性障害の診断および処置を含む、多数のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの診断および治療用の利用性がある。例えば、これらの分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏで培養中の細胞に、または例えばｉｎ  ｖｉｖｏでヒト対象に投与して、様々なＴＬ１Ａ媒介性障害を処置、防止および診断できる。好ましい対象はヒトであり、ＴＬ１Ａ活性により媒介される障害（ＴＬ１Ａ媒介性障害）を有する患者を含む。本発明の中和抗体は、患者のＴＬ１Ａ共刺激状態とは独立して、患者を処置するために効果的であり得る。より好ましい対象はヒトであり、高レベルのＴＬ１Ａを発現する患者を含む。
【０１３７】
本発明の目的のための「患者」は、ヒトおよびその他の動物の両方、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを含む。よって、本発明の抗体は、ヒト治療および獣医学的用途の両方を有する。本発明における用語「処置」または「処置する」は、疾患または障害についての治療的処置および予防的または抑制的措置を含むことを意味する。よって、例えば疾患の発症前の抗体投与の成功は、疾患の処置をもたらす。別の例として、疾患の症状と闘うための疾患の臨床的顕性化の後の抗体の投与の成功は、疾患の処置を含む。「処置
」および「処置する」は、疾患を根絶するための疾患の出現の後の抗体の投与も包含する。臨床症状の可能性のある減少およびおそらく疾患の改善を伴う、発症後および臨床症状が生じた後の抗体の投与の成功は、疾患の処置を含む。「処置を必要とする」者は、疾患または障害を既に有する哺乳動物、および疾患または障害を防止しようとする哺乳動物を含む、疾患または障害を有しやすい哺乳動物を含む。
【０１３８】
特定の実施形態では、抗体をｉｎ  ｖｉｖｏで用いて、様々なＴＬ１Ａ媒介性障害を処置、防止または診断する。よって、本発明は、対象におけるＴＬ１Ａ媒介性障害を処置するための方法であって、対象に治療有効量の抗体またはその断片を投与するステップを含む方法を提供する。例示的なＴＬ１Ａ媒介性障害は、それらに限定されないが、炎症性疾患および／または自己免疫疾患、例えば潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節リウマチ、ＭＳ、１型および２型糖尿病、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、アトピー性皮膚炎；例えば喘息およびアレルギー性肺炎症を含むアレルギー反応または状態；がん、アテローム動脈硬化症、感染、神経変性疾患、移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および循環器障害／疾患を含む。本発明は、対象におけるＴＬ１Ａ媒介性障害を処置するための方法であって、対象に治療有効量の抗体またはその断片を投与することを含む方法を提供する。例示的なＴＬ１Ａ媒介性障害は、それらに限定されないが、炎症性疾患および／または自己免疫疾患、例えば潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節リウマチ、ＭＳ、１型および２型糖尿病、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、アトピー性皮膚炎；例えば喘息およびアレルギー性肺炎症を含むアレルギー反応または状態；がん、アテローム動脈硬化症、感染、神経変性疾患、移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および循環器障害／疾患、慢性閉塞性肺疾患ＣＯＰＤ、視神経炎、加齢黄斑変性、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、強皮症、全身性強皮症、慢性腎臓疾患、肝線維症、結核、特発性肺線維症、結核誘発性肺線維症、後腹膜線維症、肺線維症、嚢胞性線維症、心内膜心筋線維症、心房性線維症、縦隔線維症、骨髄線維症（骨髄）、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、腎原性全身性線維症、関節線維症を含む。好ましくは、ＴＬ１Ａ媒介性障害は、なかでも炎症性腸疾患（例えば潰瘍性大腸炎およびクローン病）、関節リウマチ、ＭＳおよびアテローム動脈硬化症を含む、炎症性疾患および／または自己免疫疾患を含む。
【０１３９】
本発明の抗体を用いて処置される好ましいＴＬ１Ａ媒介性障害は、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節リウマチおよび喘息からなる群より選択される。本発明の抗体を用いて処置される特に好ましいＴＬ１Ａ媒介性障害は、炎症性腸疾患である。
【０１４０】
ＴＬ１Ａ媒介性障害における抗ＴＬ１Ａ抗体の機能的活性を評価するための動物モデルは、喘息について実施例７に、ＩＢＤについて実施例８および９に記載する。
【０１４１】
一実施形態では、本発明の抗体を用いて、ＴＬ１Ａのレベル、または細胞膜表面上にＴＬ１Ａを含有する細胞のレベルを検出でき、前記レベルは、よって、ある疾患症状につながることができる。代わりに、抗体を用いて、ＴＬ１Ａ機能を阻害または阻止でき、前記機能は、よって、ある疾患症状の防止または改善につながることができ、そのことにより、ＴＬ１Ａが疾患のメディエーターとして関わる。このことは、試料および対照試料を、ＴＬ１Ａ抗体と、抗体とＴＬ１Ａとの間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより達成できる。抗体とＴＬ１Ａとの間で形成された任意の複合体を検出し、試料および対照において比較する。本発明の抗体とＴＬ１Ａとの特異的結合に鑑みて、本発明の抗体を用いて細胞の表面上のＴＬ１Ａ発現を特異的に検出でき、例えば前記抗体を用いてＴＬ１Ａの発現レベルが低いまたは高い患者を検出できる。本発明の抗体を用いて、免疫親和性精製によりＴＬ１Ａを精製することもできる。
【０１４２】
別の実施形態では、本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの治療または診断用の使用に
付随する結合活性について初期に試験できる。例えば、本発明の組成物は、フローサイトメトリー分析を用いて試験できる。
【０１４３】
本開示は、医薬品としての抗体またはその断片の使用、およびＴＬ１Ａ媒介性障害の処置のための医薬品の調製における抗体またはその断片の使用をさらに提供する。さらなる実施形態では、本開示は、医薬品として用いるための抗体またはその断片を提供する。本開示は、ＴＬ１Ａ媒介性障害を処置するための方法において用いるための抗体またはその断片も提供する。ＴＬ１Ａ媒介性障害は、上記のものである。本発明の抗体またはその断片は、患者のＤＲ３共刺激状態とは独立して、ＴＬ１Ａ媒介性障害を処置するために特に有用であり得る。好ましい実施形態では、抗体またはその断片は、患者が高レベルのＴＬ１Ａを発現するＴＬ１Ａ媒介性障害を処置するために用いることができる。
【０１４４】
以前に記載するように、本発明の抗ＴＬ１Ａ抗体は、１または複数の他の治療剤、例えば細胞傷害性薬剤、放射毒性薬剤または免疫抑制剤と共投与できる。抗体は、薬剤と連結できる（上記のようなイムノコンジュゲートとして）か、または薬剤と分けて投与できる。後者の場合（別の投与）、抗体は、薬剤の前、後もしくは薬剤と同時に投与できるか、または他の既知の治療、例えば抗がん治療、例えば放射線照射と共投与できる。
【０１４５】
抗体の投与のために、投与量は、約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ宿主体重まで、より通常は０．０１から１０ｍｇ／ｋｇ宿主体重までの範囲である。例示的な処置計画は、週１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、１カ月に１回、３カ月ごとに１回または３〜６カ月ごとに１回の投与を必要とする。抗体は、複数の機会に通常投与される。単独投与間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３カ月ごと、または毎年であり得る。間隔は、患者において標的抗原に対する抗体の血中レベルを測定することにより示されるように不定期的でもあり得る。いくつかの方法では、投与量は、約１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法では約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように調整される。代わりに、抗体は、持続放出製剤として投与でき、この場合、要求される投与頻度がより低い。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変動する。投与の投与量および頻度は、処置が予防的または治療的であるかに依存して変動できる。予防的用途では、比較的低い投与量が、長期間にわたって比較的頻繁でない間隔で投与される。残りの寿命にわたって処置を受け続ける患者もいる。治療的用途では、疾患の進行が低減または終結するまで、比較的短い間隔での比較的高い用量が時折要求される。
【０１４６】
本発明の医薬組成物中の活性成分、すなわち抗体の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性にならずに、特定の患者、組成物および投与方法について所望の治療応答を達成するために効果的な活性成分の量を得るように変動できる。選択された投与量レベルは、採用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、採用される特定の抗体の排出速度、処置持続期間、採用される特定の組成物と組み合わせて用いる他の薬物、化合物および／または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康および以前の医療履歴などの、医療の分野においてよく知られている因子を含む様々な薬物動態因子に依存する。
【０１４７】
「治療有効量の」本発明のＴＬ１Ａ抗体は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、無疾患症状期間の頻度および持続期間の増加、ならびに／または疾患の苦痛による障害もしくは機能障害の防止をもたらす。ＴＬ１Ａ媒介性障害の処置についての化合物の能力は、ヒトにおける効力を予測できる動物モデル系において評価できる。代わりに、組成物のこの特性は、細胞成長を阻害する化合物の能力を調べることにより評価でき、このような阻害は、当業者に知られるアッセイによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定できる。当業者は、このような量を、対象のサイズ、対象の症状の重症度および選択される特定の組成物または投
与経路のような因子に基づいて決定できる。
【０１４８】
本発明の抗体または組成物は、１または複数の投与経路により、当技術分野において知られる様々な方法の１または複数を用いて投与できる。当業者により認識されるように、投与の経路および／または方法は、所望の結果に依存して変動する。好ましい投与経路は、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または例えば注射もしくは注入による他の非経口投与経路を含む。より好ましい投与経路は、静脈内または皮下である。「非経口投与」との句は、本明細書で用いる場合、通常注射による、経腸および局所投与以外の投与の方法を意味し、限定することなく、静脈内、筋内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入を含む。代わりに、本発明の抗体は、局所、表皮または粘膜投与経路、例えば鼻内、口腔、膣、直腸、舌下または局所によるような非経口でない経路により投与できる。
【０１４９】
製造品およびキット
本開示の別の実施形態では、ＴＬ１Ａ媒介性障害の処置のための、本発明の抗体もしくはその断片、組成物またはイムノコンジュゲートを含む製造品が提供される。製造品は、容器と、容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書を含むことがある。適切な容器は、例えば瓶、バイアルまたはシリンジを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から形成してよい。容器は、状態を処置するために効果的であり得る組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有することがある（例えば容器は、皮下注射針が突き刺すことができるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本明細書に記載する抗体であってよい。ラベルまたは添付文書は、組成物を、がんのような所望の状態を処置するために用いることができることを示してよい。一実施形態では、ラベルまたは添付文書は、抗体を含む組成物を用いてＴＬ１Ａ媒介性障害を処置できることを示してよい。
【０１５０】
さらに、製造品は、（ａ）組成物を含有する第１容器であって、組成物が、本明細書の抗体を含む第１容器と、（ｂ）組成物を含有する第２容器であって、組成物が、抗体以外の治療剤を含む第２容器とを含むことがある。本開示の本実施形態の製造品は、第１および第２組成物を組み合わせて用いて、ＴＬ１Ａ媒介性疾患または障害を処置できることを示す添付文書をさらに含んでよい。このような治療剤は、先行する項において記載する任意の補助治療であってよい（例えば血栓溶解剤、血小板凝集抑制薬、化学療法剤、血管新生抑制薬、抗ホルモン化合物、心臓保護剤および／またはサイトカインを含む、哺乳動物における免疫機能の調節物質）。代わりにまたはさらに、製造品は、注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝食塩水、リンゲル液およびブドウ糖液のような薬学的に許容される緩衝液を含む第２（または第３）容器をさらに含んでよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針およびシリンジを含む、商業的および使用者の視点から望まれる他の物質をさらに含んでよい。
【０１５１】
本発明の抗体、組成物またはイムノコンジュゲートと使用説明書とを含むキットも本発明の範囲内である。キットは、免疫抑制剤、細胞傷害性薬剤もしくは放射毒性剤、または１もしくは複数の本発明のさらなる抗体（例えば、第１抗体とは異なるＴＬ１Ａ抗原中のエピトープと結合する、相補的活性を有する抗体）のような一以上のさらなる試薬をさらに含有できる。
【０１５２】
さらなる記載なしで、当業者は、先行する記載および以下の説明的な実施例を用いて、本開示の薬剤を利用して、特許請求の範囲に記載される方法を実施できると考えられる。以下の実行実施例は、本開示の実施を容易にするために与えられ、残りの本開示をいずれの様式でも限定すると解釈されない。
【実施例１】
【０１５３】
マウス抗ヒトＴＬ１Ａ抗体の作製およびスクリーニング
組換えヒトＴＬ１Ａ−Ｆｃタンパク質を生成するために、ヒトＴＬ１Ａ遺伝子についてのｃＤＮＡをＳｏｕｒｃｅ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、ＵＫ；クローン番号：ＩＲＡＴｐ９７０Ｇ０２１１５Ｄ）から購入した。このｃＤＮＡを鋳型として用いて、ヒトＴＬ１Ａのプロセシングされた分泌バージョン（配列番号１１６）のコード領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、プライマーＧｌｎＰｒ９９４およびＧｌｎＰｒ９９５（それぞれ配列番号１１９および１２０）を用いて行った。プライマーＧｌｎＰｒ９９４は、細胞外領域の５’にＢａｍＨＩ制限部位を付加し、天然シグナルペプチドを切断する。プライマーＧｌｎＰｒ９９５は、細胞外領域の３’にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を付加する。フランキング制限部位ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてアンプリコンを切断し、Ｆｃ融合構築物を発現するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐｃＤＮＡ３．１（−）プラスミドに基づく改変哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にクローニングした。発現ベクターは、米国特許第５，９２４，９３９号に記載されるＩｇドナーアクセプター断片（第１イントロン）を有するヒトＣＭＶプロモーター、ＯｒｉＰ配列（Ｋｏｏｎｓ  ＭＤら、（２００１）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７５（２２）：１０５８２〜９２）、ＳＶ４０エンハンサーおよびＫｉｍ  Ｄら、（２００３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１９（５）：１６２０〜２により記載されるようなガストリンターミネーターと融合したＳＶ４０ポリＡを含有する。発現カセットは、Ｆｃ融合タンパク質のオープンリーディングフレームの上流のコザック領域と、その後のシグナルペプチドとを含有し、簡便なクローニングのためにＢａｍＨＩ制限部位で終結する。融合タンパク質のＦｃ領域は、簡便なクローニングのためにＨｉｎｄＩＩＩ制限部位で開始し、その後に小型グリシン−セリンリンカーが続く。Ｆｃ領域の上流の元の構築物を遊離させるために、ベクターを、ＢａｍＨＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）で切断し、ＣＩＰ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて処理し、ゲル精製した。ヒトＴＬ１Ａの細胞外領域をコードする挿入断片を主鎖にライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を形質転換して、Ｆｃ融合発現構築物（配列番号１１７）を導いた。配列番号１１７の最初の２０アミノ酸は、シグナル配列に相当し、これは、最終Ｆｃ融合発現構築物に存在しなかった。
【０１５４】
この組換えプラスミドは、哺乳動物細胞でのヒトＴＬ１Ａ−Ｆｃ融合タンパク質の発現と、シグナルペプチドにより駆動される細胞培養培地への分泌とを可能にした。組換えタンパク質生成のために、上記の組換えベクターを懸濁馴化ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）に、ｊｅｔＰＥＩ（商標）トランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓ．Ａ．、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ；流通業者：Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてトランスフェクトした。細胞培養上清を５日後に回収し、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上で操作されるプロテインＡ親和性精製カラム（ＨｉＴｒａｐプロテインＡセファロースカラム；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてさらに精製した。
【０１５５】
ｈｉｓタグを有する分泌型組換えヒトＴＬ１Ａタンパク質を生成するために、分泌型ヒトＴＬ１ＡのプロセシングされたバージョンをコードするＤＮＡ配列を、Ｎ末端６×Ｈｉｓリンカーを付加するプライマーＧｌｎＰｒ１５４２およびＧｌｎＰｒ１５４３（それぞれ配列番号１２１および１２２）を用いてＰＣＲ増幅した。プライマーＧｌｎＰｒ１５４
４（配列番号１２３）およびＧｌｎＰＲ１５４３を用いる２回目のＰＣＲは、シグナルペプチドと、クローニングのために簡便なフランキング制限部位（５’：ＮｈｅＩ；３’：ＸｈｏＩ）とを付加する。ＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）で切断し、その後、同じ酵素およびＣＩＰｅｄを用いて切断した上記の改変ｐｃＤＮＡ３．１（−）プラスミドにクローニングした。この制限消化により、発現ベクターに元々存在していたＦｃ融合タンパク質全体のオープンリーディングフレームが遊離される。Ｔｏｐ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞でのライゲーションおよび形質転換の後に、制限消化およびＮ末端ｈｉｓタグを有する分泌型ＴＬ１Ａ（配列番号１１８）についての発現構築物の配列決定により、最終プラスミドを選択した。配列番号１１８の最初の２０アミノ酸は、シグナル配列に相当し、これは、最終Ｎ末端ｈｉｓタグ発現構築物に存在しなかった。
【０１５６】
この組換えプラスミドは、哺乳動物細胞でのヒトＴＬ１Ａ−ｈｉｓタンパク質の発現と、細胞培養培地への分泌とを可能にした。タンパク質生成のために、組換えベクターを懸濁馴化ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）に、ｊｅｔＰＥＩ（商標）トランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓ．Ａ．、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ；流通業者：Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてトランスフェクトした。細胞培養上清をトランスフェクションの５日後に回収し、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上で操作されるＮｉ2+−ＮＴＡ親和性精製カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｎｉ2+−ＮＴＡセファロースカラム；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて精製した。組換えヒトＴＬ１Ａ−ＦｃおよびＴＬ１Ａ−ｈｉｓタンパク質の緩衝液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に交換した。ＰＢＳ中に溶解した組換えヒトＴＬ１Ａ−Ｆｃタンパク質を、等容量のＳｔｉｍｕｎｅアジュバント（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と混合し、乳化液を調製した。乳化液を０．５ｍＬインスリンシリンジ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移し、ＢＡＬＢ／ｃ動物（Ｈａｒｌａｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、５０μｇの乳化タンパク質を用いて後肢の肉趾、尾の基部および首に皮下免疫した。免疫化は、同じ量の抗原および同じ注射経路を用いて２週間後に反復した。
【０１５７】
免疫化マウス血清中の循環抗ヒトＴＬ１Ａ抗体の存在は、組換えヒトＴＬ１Ａ−ｈｉｓタンパク質で被覆したプレートを用いる直接ＥＬＩＳＡにより評価した。異なるマウス血清の系列希釈（１：１０0から１：１０9まで）をプレートに加え、結合した抗体を、ヤギ抗マウスＨ＋Ｌ全分子−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて検出した。アジュバントを含まずに５０μｇの抗原を用いる最後の皮下ブースター注射を、最良の抗ヒトＴＬ１Ａ  ＩｇＧ血清力価を示す動物において行い、３日後に屠殺した。
【０１５８】
動物を安楽死させ、鼠径、腋窩、上腕、膝窩および坐骨リンパ節を回収して、リンパ節の構造を、ＤＮＡｓｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｃｈｗｅｉｚ）ＡＧ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびコラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｃｈｗｅｉｚ）ＡＧ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）溶液中で２本の２５Ｇ針を用いて壊すことにより、単細胞懸濁液を調製した。単細胞懸濁液を、骨髄腫株化細胞Ｘ６３ＡＧ８．６５３（マウスＢＡＬＢ／ｃ骨髄腫株化細胞；ＡＴＣＣ受託番号：ＣＲＬ１５８０；Ｋｅａｒｎｅｙ  ＪＦら、（１９７９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３（４）：１５４８〜１５５０）と、７：１の比率（融合パートナー対採集されたリンパ節細胞）で、ポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｃｈｗｅｉｚ）ＡＧ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用
いて融合した。融合細胞を、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、５０μＭβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）および１％増殖因子（ハイブリドカイン、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ／Ｕｐｔｉｍａ、Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を補ったＤＭＥＭ−１０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中にマウスマクロファージを含有する、９６ウェル平底プレートに播種した。
【０１５９】
融合からのおよそ８００のウェルを、ヒトＴＬ１Ａを認識し、受容体に対するヒトＴＬ１Ａの結合を阻止するマウスＩｇＧの存在について、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。陽性ウェルを増殖させ、２回のサブクローニングに供した。細胞を回収し、重鎖および軽鎖をクローニングして配列決定した。
【実施例２】
【０１６０】
ハイブリドーマ細胞からの抗ＴＬ１Ａ抗体のＶＨおよびＶＬ鎖のクローニングおよび配列決定
陽性選択したそれぞれのハイブリドーマについて、トータルＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡに逆転写し、ＶＨおよびＶＬ遺伝子をそれぞれＰＣＲにより増幅した。これらのＰＣＲ産物を、レスキューベクター（ｐＤｒｉｖｅベクター；ＱＩＡＧＥＮ  ＡＧ、Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にライゲーションして、個別のＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定および選択したハイブリドーマの単クローン性または多クローン性の決定を可能にした。このベクターにより、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含有するＬＢ寒天プレート上での青／白の選択が可能になった（ＬａｃＺαペプチドによるＸ−ｇａｌの分解のために、挿入断片を有さないコロニーは青色であった）。陽性（白）細菌クローンから組換えプラスミドを調製し、ベクター主鎖に特異的な標準的ＤＮＡ配列決定プライマー（Ｍ１３ｒｅｖ、Ｍ１３ｆｗｄ、Ｔ７またはＳＰ６）を用いて配列決定した。ＤＮＡ配列を、最終的に、哺乳動物細胞での対象の抗体の組換え発現のために発現ベクターにサブクローニングした。
【０１６１】
ＲＮＡ単離
トータルＲＮＡを、２〜１０×１０6細胞から、ＱＩＡＧＥＮからのＲＮｅａｓｙミニ
キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＡＧ、Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を製造者のプロトコールに従って用いて単離した。試料を、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（ＷＩＴＥＣ  ＡＧ、Ｌｉｔｔａｕ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて定量した。
【０１６２】
ワンステップＲＴ−ＰＣＲ
上記のトータルＲＮＡ調製物を、ｃＤＮＡにさらに逆転写し、ＶＨおよびＶＬ断片をＰＣＲにより、縮合プライマーの２つの異なる混合物（それぞれ１つがマウス免疫グロブリン重鎖可変断片および可変重鎖接合領域の全ての異なるサブファミリーの回収、または全てのマウス免疫グロブリン軽鎖カッパ可変断片および可変軽鎖カッパ接合領域の回収を可能にした）を用いて増幅した。逆転写および増幅のために用いたプライマーは、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｂａｌｇａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により合成され、ＨＰＬＣ精製された（表１〜４）。逆転写およびＰＣＲ増幅はともに、ＱＩＡＧＥＮワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＡＧ、Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて同時に行った。この技法は特異的プライマーを用いたので、それぞれ
のｍＲＮＡ試料を、次いで、２重に処理して、ＶＨまたはＶＬ断片のいずれかの個別の逆転写および増幅を可能にした。ＲＮアーゼフリー水に３０μｌの最終容量で溶解した２μｇのトータルＲＮＡを、１０μｌのＱＩＡＧＥＮワンステップＲＴ−ＰＣＲ緩衝液の５×ストック溶液、２μｌのｄＮＴＰミックス（１０ｍＭの濃度）、３μｌのプライマーミックス（１０μＭの濃度）および２μｌのＱＩＡＧＥＮワンステップＲＴ−ＰＣＲ酵素ミックスと混合した。最終混合物を、次いで、ＰＣＲチューブに入れ、以下の設定を用いてＰＣＲサーモサイクラー（ＢｉｏＲａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒバージョン４．００６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＡＧ、Ｒｅｉｎａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でサイクルにかけた：
５０℃にて３０分
９５℃にて１５分
４０サイクル：９４℃にて３０秒
５５℃にて３０秒
７２℃にて１分
７２℃にて１０分
４℃にて保持
【０１６３】
ｐＤｒｉｖｅクローニング
ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルに泳動させた。ＤＮＡ電気泳動の後に、対象の断片（およそ４５０ｂｐ）をアガロースゲルから切り出し、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＮｕｃｌｏＳｐｉｎ抽出ＩＩキット２５０（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてさらに抽出した。ＤＮＡ配列決定のために、抽出したＰＣＲ産物を上記のレスキューベクター（ｐＤｒｉｖｅベクター、ＱＩＡＧＥＮ  ＡＧ、Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を形質転換した。
【０１６４】
ミニプレップ抽出
陽性コロニーを、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ方形ウェルブロックプレート（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中に播種し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補った１．５ｍｌのＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で３７℃にて１晩（振とう２５０ＲＰＭ）培養した。次の日に、ＤＮＡミニプレップ抽出を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎマルチ８プラスミドキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて行った。
【０１６５】
配列決定および配列分析
試料を、ＤＮＡ配列決定のために、ＤＮＡ配列決定サービス業者であるＦａｓｔｅｒｉｓ（Ｐｌａｎ−ｌｅｓ−Ｏｕａｔｅｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に送った。標準的なプライマーであるＭ１３ｒｅｖ、Ｍ１３ｆｗｄ、Ｔ７、ＳＰ６を用いた（表５）。ＤＮＡ配列を分析するために、クローンマネージャ９プロフェッショナル版（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＆Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＮＣ、ＵＳＡ）およびＢｉｏＥｄｉｔ配列アラインメントエディタ（Ｈａｌｌ，ＴＡ（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４１：９５〜９８）を用いた。
【０１６６】
組換えキメラ抗体発現のための発現ベクターのクローニング
哺乳動物細胞での組換え発現のために、単離マウスＶＨおよびＶＬ断片を、アセンブリベースのＰＣＲ法を用いて、キメラ免疫グロブリンとしてフォーマットした。これらのキメラ抗体は、マウス重鎖可変ドメインがヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（γ１、ヒンジ、γ２およびγ３領域）と融合した重鎖と、マウス軽鎖可変ドメインがヒトカッパ定常ドメイン（Ｃκ）と融合した軽鎖とからなる。ＰＣＲにより集合させたマウス可変およびヒト
定常部分を、その後、実施例１にて言及したが、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパリーダーペプチドを採用してタンパク質分泌を駆動したことが異なるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの改変ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターに基づく改変哺乳動物発現ベクターにクローニングした。免疫グロブリン候補のタンパク質生成のために、等量の重鎖および軽鎖ベクターＤＮＡを、懸濁馴化ＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５７３）に同時トランスフェクトした。細胞培養上清を５日後に回収し、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム上で操作されるプロテインＡ親和性精製カラム（ＨｉＴｒａｐプロテインＡセファロースカラム）（ともにＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから）を用いて精製した。
【０１６７】
【表１】
2018126150.tif 000003
【０１６８】
【表２】
2018126150.tif 000004
【０１６９】
【表３】
2018126150.tif 000005
【０１７０】
【表４】
2018126150.tif 000006
【０１７１】
【表５】
2018126150.tif 000007
【実施例３】
【０１７２】
抗ヒトＴＬ１Ａ抗体の生物学的特徴決定
ＴＬ１Ａ特異的抗体検出ＥＬＩＳＡ
ハイブリドーマおよび組換え抗体候補による抗体力価、特異性および生成を、直接ＥＬＩＳＡにより決定した。簡単に述べると、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ  ＵＳＡ、流通業者ＶＷＲ  ＡＧ、Ｎｙｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をＰＢＳ中２μｇ／ｍｌでの１００μｌの組換えヒトＴＬ１Ａ−ｈｉｓで被覆した（ＴＬ１Ａ−ｈｉｓタンパク質の作製について実施例１を参照されたい）。プレートを４℃にて１晩インキュベートし、次いで、ＰＢＳ２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて室温（ＲＴ）にて１時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、ハイブリドーマ上清または精製抗体を加えた。プレートをＲＴにて３０分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で９回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＨ＋Ｌ検出抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を１：１０００の希釈で加えた。ヒトＦｃを有する組換えキメラ抗体（実施例２を参照されたい）を検出するために、ＨＲＰ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を１：１０００の希釈で検出抗体として用いた。プレートを３０分間室温（ＲＴ）にてインキュベートし、ＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０で９回洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＡＧ、Ｒｅｉｎａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をプレートに加え、２から６分後にＨ2ＳＯ4を加えることにより反応を停止した。吸光度を次いで４５０ｎｍにてマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、ＵＳＡ；流通業者：ＷＩＴＴＥＣ  ＡＧ、Ｌｉｔｔａｕ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で読み取った。図１は、様々なクローンの親ハイブリドーマ上清が、ヒトＴＬ１Ａ−ｈｉｓ被覆タンパク質を認識し、無関係のｈｉｓタグ付加タンパク質を認識しないことを示す。
【０１７３】
ＴＮＦＲＳＦ２５阻止ＥＬＩＳＡ
組換えヒトＴＮＦＲＳＦ２５受容体タンパク質（ＴＮＦＲＳＦ２５）を以下のようにして作製した：ヒトＴＮＦＲＳＦ２５についてのｃＤＮＡ（クローン名：ＩＲＣＭｐ５０１２Ｆ０８１２Ｄ）をＳｏｕｒｃｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）から購入し、ヒトＴＮＦＲＳＦ２５の細胞外部分（アミノ酸２５〜１９９）（番号付けはＵｎｉｐｒｏｔ  Ｑ９３０３８配列に従う）を、フランキング制限部位とともに増幅した。Ｎ端末８−Ｈｉｓタグ配列を包含する得られたＰＣＲ産物を、その後、ＣＭＶプロモーター、ウシ成長ホルモンポリアデニル化およびマウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドを有して組換えタンパク質の分泌を駆動する、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からの改変バージョンのｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。組換えタンパク質生成のために、組換えベクターを懸濁馴化ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）に、ｊｅｔＰＥＩ（商標）トランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓ．Ａ．、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ；流通業者：Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてトランスフェクトした。細胞培養上清を５日後に回収し、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上で操作されるプロテインＡ親和性精製カラム（ＨｉＴｒａｐプロテインＡセファロースカラム；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて精製した。
【０１７４】
作製された抗ＴＬ１Ａ抗体がＴＬ１ＡとＴＮＦＲＳＦ２５受容体との結合を阻止できるかを決定するために、阻止ＥＬＩＳＡを開発した。９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳＡ；流通業者ＶＷＲ  ＡＧ、Ｎｙｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をＰＢＳ中２μｇ／ｍｌでの１００μｌの組換えヒトＴＬ１Ａ−Ｆｃ（実施例１を参照さ
れたい）または組換えタグ未付加ＴＬ１Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）で被覆した。プレートを４℃にて１晩インキュベートし、次いで、ＰＢＳ２％ＢＳＡを用いてＲＴにて１時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、ハイブリドーマ上清または精製抗体をプレートに加えた。５分後に、５０μｌの組換えヒトＴＮＦＲＳＦ２５−Ｆｃ−ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を４μｇ／ｍｌにて各ウェルに加えた。プレートをＲＴにて６０分間インキュベートし、次いでＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０で９回洗浄し、マウス抗ポリヒスチジン−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を１：２０００の希釈で加えた。プレートをＲＴにて３０分間インキュベートし、ＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０で９回洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
ＡＧ、Ｒｅｉｎａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をプレートに加え、６分後にＨ2Ｓ
Ｏ4を加えることにより反応を停止した。吸光度を次いで４５０ｎｍにてマイクロプレー
トリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、ＵＳＡ；流通業者：ＷＩＴＴＥＣ  ＡＧ、Ｌｉｔｔａｕ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で読み取った。図２は、精製された抗体がＴＬ１ＡとＴＮＦＲＳＦ２５との間の相互作用を用量依存的様式で阻止できることを示す。
【０１７５】
予備刺激されたＣＤ４  Ｔ細胞によるＴＬ１Ａ誘導ＩＦＮ−γ分泌の阻害
ＩＬ−１２およびＩＬ−１８サイトカインにより予備刺激されたＣＤ４  Ｔ細胞は、ＴＨ１表現型に向かって極性化し、ＩＦＮ−γを分泌する。ＴＬ１Ａは、予備刺激されたＣＤ４  Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ生成を増強することが示されている。我々は、よって、キメラ５Ｇ６抗体が、ＩＦＮ−γ生成のこのＴＬ１Ａ依存性増加を阻止できるかを試験した。
【０１７６】
末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）からヒトＣＤ４  Ｔ細胞を精製するために、ヒト白血球を含有するフィルタを、Ｌａ  Ｃｈａｕｘ−ｄｅ−Ｆｏｎｄｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄの血液採取センター（Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓａｎｇｕｉｎｅ  ｅｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  ｄｅ  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｅ、ｒｕｅ  Ｓｏｐｈｉｅ−Ｍａｉｒｅｔ  ２９、ＣＨ−２３００）から回収した。細胞を、１０Ｕ／ｍＬのリケミン（Ｄｒｏｓｓａｐｈａｒｍ  ＡＧ、Ｌｕｃｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有する６０ｍＬのＰＢＳを逆に流すことによりフィルタから取り出した。ＰＢＭＣを、次いで、製造者の使用説明に従って５０ｍＬ  Ｂｌｏｏｄ−Ｓｅｐ−Ｆｉｌｔｅｒチューブ（流通業者：Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて精製した。細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、次いで、製造者の使用説明に従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ（Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのナイーブＣＤ４  Ｔ細胞精製キットを用いるＣＤ４精製のために用いた。
【０１７７】
５Ｇ６抗体が自然に生成されるＴＬ１Ａの効果を阻害できるかを決定するために、５Ｇ６抗体を試験した。ＩＬ−１２およびＩＬ−１８で予備刺激されたＣＤ４  Ｔ細胞を、免疫複合体（ＩＣ）で予め活性化された単球とインキュベートして、ＩＦＮ−γの生成を測定した。単球は、製造者の使用説明に従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ（Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からの単球単離キットＩＩを用いてＰＢＭＣ（上記を参照されたい）から単離した。単球ＩＣ刺激は、次のようにして行った。５０μｇ／ｍＬにて２時間、室温にてＰＢＳ中のｃｈｒｏｍｐｕｒｅヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、ＵＫ）で、１２ウェル細胞培養プレート（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を被覆した。プレートを、次いで、ＰＢＳで洗浄し、マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と１時間、室温にてインキュベートした。被覆されたプレートをＰＢＳで１回洗浄した後に、精製単球を播種した。３７℃にて、５％ＣＯ2インキュベータ中で
の４８〜７２時間のインキュベーション後にＩＣ刺激単球を採集した。
【０１７８】
フローサイトメトリー分析のために、１０μｇ／ｍＬでの抗ＴＬ１Ａ−ＰＥ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ、Ｌｕｃｅｒｎａ  Ｃｈｅｍ．ＡＧ、Ｌｕｃｅｒｎａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにより流通）またはウサギアイソタイプ対照（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で、Ｖ底９６ウェルマイクロタイタープレート（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で４℃にて３０分間、ＩＣ刺激単球を染色した。希釈緩衝液（ＦＡＣＳ緩衝液）は、２％胎仔ウシ血清（ＦＣＳ、Ａｍｉｍｅｄ、Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにより流通）および１０％  Ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補ったＰＢＳであった。インキュベーション後に、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を各ウェルに加え、プレートを３００ｇにて３分間遠心分離した。上清を捨て、ＦＡＣＳ緩衝液中で０．２μｇ／ｍＬの１００μＬのＰＥ−抗ウサギ２次抗体溶液に試料を再懸濁した。試料を４℃にて２０分間インキュベートした。プレートを上記のようにして洗浄し、３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に試料を再懸濁し、ＦＡＣＳＣｙａｎフローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓ．Ａ．、Ｎｙｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に迅速に設置した。可溶性ＴＬ１Ａ定量のために、ＩＣ刺激単球培養からの上清を異なる時点（２０、４８および７２時間）にて採集し、製造者の推奨に従ってヒトＴＬ１ＡディベロップメントＥＬＩＳＡキット（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を用いて、ｓＴＬ１Ａを定量した。
【０１７９】
単球−Ｔ細胞同時培養のために、ＩＣ刺激単球（１０4）およびＣＤ４精製Ｔ細胞（１
０5）を、３７℃にてＣＯ2インキュベータ中で、８ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および２００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１８（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＬａｂＦｏｒｃｅ  ＡＧ、Ｎｕｎｎｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにより流通）とともに、平底９６ウェルプレート（ＴＰＰ）に播種した。培養の上清を７２時間後に採集し、ＩＦＮ−γを上記のようにして定量した。
【０１８０】
ＩＣ刺激単球は、膜上でＴＬ１Ａ（ｍＴＬ１Ａ）を発現した（図３Ａ）が、より実質的には可溶性因子（ｓＴＬ１Ａ）として発現し（図３Ｂ）、同時培養したＣＤ４  Ｔ細胞によりＩＦＮ−γの強い生成を誘導した（図３Ｃ）。５Ｇ６抗体は、ＩＣ刺激単球により誘導されるＩＦＮ−γの生成を完全に抑制し、ｍＴＬ１ＡおよびｓＴＬ１Ａの両方により媒介される効果を有効に阻止することが示された。
【実施例４】
【０１８１】
親５Ｇ６候補は、マウス、ラット、カニクイザルおよびヒトＴＬ１Ａと結合する
多様な種からのＴＬ１Ａの細胞外部分に対する親５Ｇ６抗体（ヒトＦｃとのキメラ抗体として生成）の反応性を、ＥＬＩＳＡにより試験した。ヒト（ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ラット（ｒａｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、マウス（ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）およびカニクイザル（ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）配列に対応するＴＬ１Ａタンパク質の細胞外部分（それぞれ配列番号３８、３９、４０および４１）を、高結合９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳＡ；流通業者ＶＷＲ  ＡＧ、Ｎｙｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に、ＰＢＳ中で４℃にて２μｇ／ｍＬの濃度にて一晩固定化した。プレートを、２％ＢＳＡアルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてＲＴにて１時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、５Ｇ６抗体の用量希釈物をプレートに加えた。プレートをＲＴにて６０分間インキュベートし、ＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０で６回洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＡＧ、Ｒｅｉｎａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をプレートに加えた。６分後にＨ2ＳＯ4を加えることにより反応を停止し、異なるＴＬ１Ａタンパク質に対する５Ｇ６の結合を、１：１０００の希釈で加えたＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ  ２次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて明らかにした。プレートを、マイクロプレー
トリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、ＵＳＡ；流通業者：ＷＩＴＴＥＣ  ＡＧ、Ｌｉｔｔａｕ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により４５０ｎｍでの吸光度について読み取った。図４は、５Ｇ６が、用量依存的な様式で、試験した全ての種からのＴＬ１Ａタンパク質を認識したことを示す。
【実施例５】
【０１８２】
マウスモノクローナル抗体５Ｇ６のヒト化
ヒトアクセプターフレームワーク、逆突然変異ならびにヒトＣＤＲグラフト化アクセプターフレームワークの結合特性を実質的に保持および／または改善する変異の選択を含む、抗ヒトＴＬ１Ａマウス抗体５Ｇ６のヒト化について本明細書に記載する。
【０１８３】
再整形した可変領域の設計
相同性一致を用いて、５Ｇ６  ＣＤＲにグラフトするヒトアクセプターフレームワークを選択した。データベース、例えばヒトおよびマウスの免疫グロブリン遺伝子座からの生殖系列可変遺伝子のデータベース（ＩＭＧＴデータベース、既出）もしくはＶＢＡＳＥ２（Ｒｅｔｔｅｒ  Ｉら、（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３、データベース版Ｄ６７１〜Ｄ６７４）もしくはＫａｂａｔデータベース（Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｇら、（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２１４〜２１８）または出版物（例えばＫａｂａｔ  ＥＡら、既出）を用いて、マウス重鎖および軽鎖Ｖ領域（それぞれ配列番号１および２）が属するヒトサブファミリーを同定し、アクセプター分子として用いるために最もよくフィットするヒト生殖系列フレームワークを決定できる。アクセプターとして用いるためのこれらのサブファミリー内での重鎖および軽鎖可変配列（ＶＨおよびＶＬ）の選択は、配列相同性および／またはグラフト後に６つのＣＤＲの適当な相対的提示を保存する助けとなるＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域の構造の一致に基づくことができる。
【０１８４】
例えば、ＩＭＧＴデータベースを用いることにより、５Ｇ６重鎖可変ドメインフレームワークとヒト重鎖可変ドメインサブファミリー１のメンバーとの間の良好な相同性が示される。ＣＤＲおよびフレームワーク配列両方の最高の相同性および同一性は、生殖系列配列：ＩＧＨＶ１−２*０２（配列番号３）、ＩＧＨＶ１−２*０４（配列番号４）、ＩＧＨＶ１−２*０５（配列番号５）、ＩＧＨＶ１−２*０１（配列番号６）、およびＩＧＨＶ１−４６*０１（配列番号７）について観察され、これらは全て、ＣＤＲ３までの配列全体
について６７％を超える配列同一性を有した。ＩＧＨＶ１−２*０２およびＩＧＨＶ１−
２*０４は、６９．４％の配列同一性を示し、ＩＧＨＶ１−２*０１およびＩＧＨＶ１−４６*０１は、それぞれ６８．４および６７．３％の配列同一性を示した。
【０１８５】
同じアプローチを用いて、５Ｇ６軽鎖可変ドメイン配列は、ヒト軽鎖可変ドメインカッパサブファミリー１のメンバーと良好な相同性を示した。ＣＤＲおよびフレームワーク配列両方の最高の相同性および同一性は、以下の生殖系列配列について観察された：ＩＧＫＶ１−３３*０１（配列番号８）およびＩＧＫＶ１Ｄ−３３*０１（配列番号９）は、最も高い同一性（ともに８０．０％の同一性を有する）を示し、ＩＧＫＶ１Ｄ−１２*０２（
配列番号１０）、ＩＧＫＶ１Ｄ−１２*０１（配列番号１１）およびＩＧＫＶ１−１２*０２（配列番号１２）からなる別の群（これらは全て同程度の配列同一性（７５．８％）を示した）が僅差で続いた。
【０１８６】
ヒト化プロセスの開始点として、ヒトＩＧＨＶ１−２*０１（配列番号３）およびＩＧ
ＫＶ１−３３*０１（配列番号８）可変ドメインを、５Ｇ６  ＣＤＲへのアクセプターと
して選択した。ヒトガンマ１アイソタイプの第１ヒト化抗体を調製した（以下を参照されたい）。抗体は、ヒト−マウスハイブリッド重鎖可変ドメインおよびヒト−マウスハイブリッド軽鎖可変ドメインを包含した。前記ハイブリッド重鎖可変ドメインは、生殖系列Ｃ
ＤＲ１および２がそれぞれ５Ｇ６重鎖ＣＤＲ１および２と置き換えられたヒト重鎖可変ドメインＩＧＨＶ１−２*０１に基づいた。ヒトアクセプターフレームワークと最良に一致
するＪＨセグメント配列を、上記のＩＭＧＴ検索から同定した。ヒトＩＧＨＶ１−２*０
１フレームワーク領域、５Ｇ６マウスＣＤＲおよびヒトアクセプターと最良に一致するＪＨを有する、得られたヒト−マウスハイブリッド重鎖可変配列を、本明細書において、配列番号１３を有する重鎖可変ドメインＶＨ１という。同様に、この第１ヒト化抗体候補について用いたヒト−マウスハイブリッド軽鎖可変ドメインは、ヒトＩＧＫＶ１−３３*０
１フレームワーク領域、５Ｇ６マウスＣＤＲおよびヒトアクセプターと最良に一致するＪＫを有し、本明細書において、配列番号１４を有する軽鎖可変ドメインＶＬ１という。ＶＨ１およびＶＬ１を包含する第１ヒト化抗体は、本明細書において、ＶＨ１／ＶＬ１抗体と略記する。
【０１８７】
第１ヒト化抗体プロトタイプの生成
ＶＨ１およびＶＬ１についてのコードＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）を、ｓｃＦｖフォーマットにおいてＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成して、そのことにより、単一ｃＤＮＡ配列が両方の可変ドメイン（配列番号１５）を包含することを可能にした。個別の可変ドメインｃＤＮＡは、このｓｃＦｖ構築物からＰＣＲにより引き出し、ＰＣＲアセンブリ技法を用いて、それらのそれぞれの定常ドメインｃＤＮＡ配列（複数可）の上流でさらに組み立てた。最後に、完全重鎖および軽鎖ｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを有する改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）に基づく独立ベクターにライゲーションした。軽鎖特異的ベクターは、対象の軽鎖可変ドメインｃＤＮＡをカッパ軽鎖定常ドメインｃＤＮＡの前にＢａｍＨＩおよびＢｓｉＷＩ制限酵素部位を用いてライゲーションすることにより、ヒトカッパアイソタイプ軽鎖の発現を可能にしたが、重鎖特異的ベクターは、工学改変して、対象の重鎖可変ドメインｃＤＮＡを、ヒトＩＧＨＧ１  ＣＨ１、ＩＧＨＧ１ヒンジ領域、ＩＧＨＧ１  ＣＨ２およびＩＧＨＧ１  ＣＨ３定常ドメインをコードするｃＤＮＡ配列の前に、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限酵素部位を用いてライゲーションできるようにした。重鎖および軽鎖両方の発現ベクターにおいて、分泌は、ＢａｍＨＩ部位を含有するマウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドにより駆動した。ＢｓｉＷＩ制限酵素部位は、カッパ定常ドメイン中にあり、ＳａｌＩ制限酵素部位は、ＩＧＨＧ１
ＣＨ１ドメイン中で見出される。
【０１８８】
ＶＨ１／ＶＬ１抗体（配列番号１６の重鎖および配列番号１７の軽鎖を有する）は、等量の重鎖および軽鎖ベクターを懸濁馴化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）カタログ番号：ＣＲＬ−１０８５２）にポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて同時トランスフェクトすることにより一過的に生成した。典型的に、１ｍｌあたり０．８〜１．２百万細胞の密度の１００ｍｌの懸濁された細胞に、５０μｇの重鎖をコードする発現ベクターと５０μｇの軽鎖をコードする発現ベクターとを含有するＤＮＡ−ＰＥＩ混合物をトランスフェクトする。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが宿主細胞に導入されると、細胞を４〜５日の期間さらに培養して、０．１％プルロニック酸、４ｍＭグルタミンおよび０．２５μｇ／ｍｌジェネテシンを補った培養培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ２９３、ＨＥＫ２９３血清フリー培地；Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）への分泌を可能にすることにより、抗体を生成する。
【０１８９】
ＶＨ１／ＶＬ１抗体を、無細胞上清から、組換えプロテインＡストリームライン媒体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて精製し、アッセイの前にリン酸塩緩衝食塩水に緩衝液交換した。
【０１９０】
表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）による動的結合親和性定数
動的結合親和性定数（ＫＤ）を、プロテインＡ捕捉抗体上で、組換えヒスチジンタグ付加ＴＬ１Ａを分析物として用いて測定した。測定は、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ−ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で室温にて行い、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ；ｖ４．１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）を用いて分析した。
【０１９１】
ＣＭ５研究グレードセンサチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ；ＢＲ−１０００−１４）を、３５μｌの１：１Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）／１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）溶液（ｖ／ｖ；５μｌ／分の流速；流路１および２にて）を注入することにより活性化した。プロテインＡ（ｒｅｆ．Ｐ７８３７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、酢酸緩衝液ｐＨ４．５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、ＢＲ−１００３−５０；ｐＩよりも１ｐＨ単位低い）中で５０μｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈し、その後、予め活性化したＣＭ５センサチップ上に、３５μｌを両方の流路１および２に注入することにより（５μｌ／分）（これは、およそ１５００応答単位（ＲＵ）に相当する）固定化した。プロテインＡ−ＣＭ５センサチップを、次いで、３５μｌのエタノールアミン溶液を注入することにより（５μｌ／分）不活性化した。最後に、１０μｌのグリシン溶液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、ｒｅｆ．ＢＲ−１００３−５４；１０ｍＭ；ｐＨ１．５）を２回注入して、架橋されていないプロテインＡ分子を遊離させた。
【０１９２】
親和性測定のために、１×ＰＢＳ緩衝液中で貯蔵したキメラおよびヒト化抗体を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、ｒｅｆ．ＢＲ−１００１−８８；０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ  ３ｍＭ、０．００５％サーファクタントＰ２０、ｐＨ７．４）中で希釈した後に、プロテインＡ
ＣＭ５チップの流路２に、約１８０ＲＵに達するまで注入した（３０μｌ／分）。この捕捉ステップの後に、組換えヒスチジンタグ付加ヒトＴＬ１Ａを異なる濃度（１．２５〜１２５ｎＭ）にて流路１および２（流路１は参照として用いる）に３０μｌ／分の流速で注入した。それぞれの結合事象の後に、表面を、グリシン緩衝液ｐＨ１．５を２０秒間注入することにより（３０μｌ／分）再生した。
【０１９３】
測定（センサーグラム：ｆｃ２〜ｆｃ１）は、物質移動ありの１：１分析物モデルと最もよくフィットした。それぞれの測定の開始時のプロテインＡ捕捉抗体における実験的な変動を説明するために、Ｒｍａｘ値を全てのフィットにおいてローカルに設定した。解離時間は、少なくとも３００〜６００秒程度であった。測定を２重に行い、参照のためのゼロ濃度試料を含めた。カイ２値は、各点での実験データと参照データとの間の差の２乗和を表すが、残差のプロットは、フィットにおけるそれぞれの点の実験データと参照データとの間の差を示す。カイ２および残差の両方の値を用いて、実験データと個別の結合モデルとの間のフィットの質を評価した。
【０１９４】
グラフト化ヒトフレームワークの逆突然変異
５Ｇ６マウス抗体からのＣＤＲの単純なグラフト化によりヒトＴＬ１Ａと結合しない候補が得られたので（表６）、ヒト残基がマウス残基で置換される突然変異誘発を開始した。このプロセスは逆突然変異とよばれ、モノクローナル抗体のヒト化において最も予測不可能な手順である。これは、親和性を保存し、同時にヒト化抗体における免疫原性の可能性を最小限にするために、保持する必要があるマウス抗体からの重要なフレームワーク残基の同定および選択を必要とする。
【０１９５】
ＣＤＲ高次構造および／または可変ドメイン間充填に最も影響を与え得る残基を同定するために、可変ドメインのＶＨ１−ＶＬ１対の３Ｄモデルを、自動化モードに設定した構造相同性モデル化サーバＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ（Ａｒｎｏｌｄ  Ｋら、（２００６）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２２（２）：１９５〜２０１；ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）を用いて算出した。モデル分析により、ＣＤＲ領域および／または重鎖−軽鎖可変ドメイン充填に対する影響の推定に基づく位置の部分集合を選択できた。この位置の部分集合は、可変重鎖位置：３７、４８、５０、６７、６９、７１および７５、ならびに可変軽鎖位置：５および３４（Ｋａｂａｔ番号付け）からなった。
【０１９６】
上記の選択された位置にて逆突然変異を有するさらなるヒト化候補を、遺伝子合成および標準的な突然変異誘発法を用いて調製した。ＶＨ２およびＶＬ２の両方の可変ドメインを包含する単一ｃＤＮＡ配列（配列番号１８）を合成し、さらなる突然変異誘発のための開始点として用いた。抗体発現および精製は、上記の方法に従った。ヒト化抗体候補を、それらの結合親和性について、以前に記載するようにしてＳＰＲによりアッセイした。
【０１９７】
これらの単一または組み合わせの置換に基づく選択されたヒト化抗体の結合特性（ＫＤ）を、表６に示す。ヒト化バリアントのうち、ＶＨ３／ＶＬ１抗体がＴＬ１Ａ抗原について最高の親和性を有し、５Ｇ６キメラ抗体よりも低いＫＤを示した。
【０１９８】
示差走査熱量分析による、選択されたヒト化抗ＴＬ１Ａ抗体の耐熱性
ヒト化抗体の耐熱性を、示差走査熱量分析（ＤＳＣ）を用いて測定した。モノクローナル抗体融解プロファイルは、それらのアイソタイプの特徴である（Ｇａｒｂｅｒ  ＥおよびＤｅｍａｒｅｓｔ  ＳＪ（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３５５：７５１〜７）が、ＦＡＢ断片の中間融解温度は、全長ＩｇＧの関係においてさえ容易に同定できる。ＦＡＢ部分のこのような中間融解温度を用いて、ヒト化候補のモノクローナル安定性をモニタリングした。
【０１９９】
熱量測定を、ＶＰ−ＤＳＣ示差走査微小熱量計（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）で行った。セル容量は０．１２８ｍｌであり、加熱速度は２００℃／ｈであり、過圧は６５ｐ．ｓ．ｉに維持した。全ての抗体を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１ｍｇ／ｍｌの濃度にて用いた。抗体のモル熱容量は、抗体を除いた同一の緩衝液を含有する２重の試料との比較により見積もった。部分モル熱容量および融解曲線を、標準的な手順を用いて分析した。サーモグラムをベースライン補正し、濃度を標準化した後に、ソフトウェアＯｒｉｇｉｎ  ｖ７．０において非２状態モデルを用いてさらに分析した。
【０２００】
ヒト化バリアントＶＨ５／ＶＬ１  ＦＡＢ断片は、８３．８℃の単一の移行とともに、密に折りたたまれたＦＡＢ断片について通常観察される協同的アンフォールディングと一貫する形状および振幅を示し、工学改変プロセスが、ＦＡＢ安定性をうまく保持したことを示した。全体的に、ヒト化バリアントは、良好な熱安定性を示した。
【０２０１】
【表６】
2018126150.tif 000008
【実施例６】
【０２０２】
５Ｇ６ヒト化候補は、予備刺激されたＣＤ４  Ｔ細胞によるＴＬ１Ａ誘導ＩＦＮ−γ分泌を阻止できる
５Ｇ６抗体のヒト化候補を試験して、これらがＩＦＮ−γ生成におけるＴＬ１Ａ依存性の増加を阻害できるかを決定した。
【０２０３】
ヒトＣＤ４  Ｔ細胞を、末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）から、上の実施例３に記載するようにして精製した。全ての細胞培養は、１０％熱不活性化胎仔ウシ血清（ＦＣＳ、Ａｍｉｍｅｄ、Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにより流通）、非必須アミノ酸（ＰＡＡ、Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにより流通）、ウルトラグルタミン（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ピルビン酸ナトリウム（ＰＡＡ）およびペニシリン／ストレプトマイシンミックス（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補ったロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ−１６４０、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）で行った。ＣＤ４精製Ｔ細胞（１０5細胞
／ウェル）を、８ｎｇ／ｍＬでのＩＬ−１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｈａｍｂｕｒｇ  Ｇｅｒｍａｎｙ）、２００ｎｇ／ｍＬでのＩＬ−１８（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＬａｂＦｏｒｃｅ  ＡＧ、Ｎｕｎｎｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにより流通）（予備刺激因子）およびＮ末端ｈｉｓタグを有するヒト可溶性ＴＬ１Ａ（配列番号１１８によりコードされる）と７２時間、１００、１０、１および０．１μｇ／ｍＬ（図５中の表を参照されたい）の濃度で同時に加えた阻止５Ｇ６ヒト化抗体候補（ＶＨ３／ＶＬ１−配列番号２２および１７、ＶＨ４／ＶＬ１−配列番号２３および１７、ＶＨ５／ＶＬ１−配列番号２４および１７ならびにＶＨ２／ＶＬ２−配列番号２１および２５）の存在下でインキュベートした。アイソタイプ対照は、１００μｇ／ｍＬにて平底９６ウェル細胞培養プレート（ＴＰＰ  ＡＧ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に加えた。上清を７２時間後に採集し、ＩＦＮ−γを製造者の使用説明に従ってＯｐｔＥＩＡキット（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いるＥＬＩＳＡにより定量した。図５は、ヒト化抗ＴＬ１Ａ抗体が、ＩＦＮ−γの生成を実質的に阻害できたことを示す。
【実施例７】
【０２０４】
５Ｇ６ヒト化抗体は、アレルギー性喘息のマウスモデルにおいて効果的である
喘息は、マウスで自発的に発生しないので、マウスにおいてこの疾患を調査するために、喘息様反応を気道において誘導する必要がある。様々な急性アレルゲン負荷モデルが開発されているが、本実施例において、良好なヘルパーＴ細胞２（Ｔｈ２）偏向免疫応答を発生するので、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた（Ｂｏｙｃｅ  ＪＡおよびＡｕｓｔｉｎ  ＫＦ（２００５）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、２０１：１８６９〜７３）。ニワトリ卵に由来するオボアルブミンは、頑強なアレルギー性肺炎症をマウスにおいて誘導し、よってアレルギー性喘息のマウスモデルにおいて頻繁に用いられるアレルゲンである（Ｋｕｍａｒ  ＲＫら、（２００８）Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ、９：４８５〜９４）。
【０２０５】
本実施例では、以下の免疫化プロトコールを用いてアレルギー性喘息を誘導した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、第０日および第１４日にて、１ｍｇの水酸化アルミニウムと水酸化マグネシウムとの懸濁物（Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に吸着させた１００μｇのオボアルブミン（ニワトリ卵白からのアルブミン、グレードＶ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のｉ．ｐ．注射により感作した。第２８、３０および３３日に、マウスを、５０ｍｇ／ｋｇのヒト化５Ｇ６抗体（ＶＨ５／ＶＬ１；フォーマットＩｇＧ４ヒンジ安定化；配列番号１２４および１７）または等量の対照ヒトＩｇＧでｉ．ｐ．処置した。陽性対照として、デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を５ｍｇ／ｋｇで用いた。処置の４時間後に、３０ｍｇ／ｋｇのキシラジンおよび１５０ｍｇ／ｋｇのケタミン（Ｇｒａｅｕｂ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからのＸｙｌａｚｏｌおよびＫｅｔａｓｏｌ）を用いてマウスに麻酔をかけ、１０μｇのオボアルブミンを鼻内注入した。３日後に、マウスを屠殺し、気管にカニューレを挿入した後に、２ｍｌの冷ＰＢＳを肺に注入することにより気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。ＢＡＬ液中の細胞を計数し、ＣＤ１１ｃおよびＳｉｇｌｅｃ  Ｆ細胞表面マーカーを用いるフローサイトメトリーにより好酸球を検出した。
【０２０６】
結果を図６に示し、ここでは、ヒト化抗体５Ｇ６での処置が、喘息マウスのＢＡＬ液中の好酸球の数のおよそ４倍の低減をもたらしたことが観察できる。
【実施例８】
【０２０７】
５Ｇ６ヒト化抗体は、マウスにおけるＤＳＳ誘導急性大腸炎の処置に効果的である
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の多くの異なる動物モデルが開発されており、これらはＩＢＤの病態形成への様々な因子の関与を調査し、治療の選択肢を評価するための価値のあるツールである。デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導大腸炎モデルは、単純であり、ヒトＩＢＤ、特に潰瘍性大腸炎との多くの類似点を有することから、広く用いられている炎症性腸疾患のモデルである（Ｐｅｒｓｅ  ＭおよびＣｅｒａｒ  Ａ（２０１２）Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０１２；７１８６１７；Ｗｉｒｔｚ  Ｓら、（２００７）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ、２：５４１〜６）。
【０２０８】
ＩＢＤにおけるヒト化５Ｇ６抗体（ＶＨ５／ＶＬ１；フォーマットＩｇＧ４ヒンジ安定化；配列番号１２４および１７）の可能性のある効果を評価するために、試験群の飲用水中で５日間、２％のＤＳＳ（ＭＷ  ３６〜５０ｋＤａ；ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を投与することにより、急性大腸炎の状態をＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて誘導した。対照群には、未処理水道水を与えた。ＤＳＳ曝露の後に、試験群のマウスに７日間水道水を与えた。マウスを、３×／週で、５０ｍｇ／ｋｇのヒト化５Ｇ６抗体または等量のアイソタイプ対照でｉ．ｐ処置した。陽性対照として、シクロスポリン（Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を５ｍｇ／ｋｇで用いた。マウスを毎日、体重減少および便の堅さについてモニタリングした。第１２日に全てのマウスを屠殺し、結腸全体の長さを測定した。図７に示すように、ヒト化抗体５Ｇ６での
マウスの処置が、ＤＳＳにより誘導される結腸の短縮の低減をもたらしたことが観察できる。
【実施例９】
【０２０９】
５Ｇ６ヒト化抗体は、ラットにおけるＴＮＢＳ大腸炎の処置において効果的である
ラットにおける腸炎症は、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の直腸内投与により誘導できる。結果として得られる局所潰瘍および炎症には、ハプテン改変自己タンパク質または管腔抗原に対するＴ細胞媒介性応答が関与すると考えられている（Ｗｉｒｔｚ
Ｓら、既出）。症状は、下痢、潜血および体重減少を含む。
【０２１０】
ＩＢＤにおけるヒト化５Ｇ６抗体（ＶＨ５／ＶＬ１；フォーマットＩｇＧ４ヒンジ安定化；配列番号１２４および１７）の可能性のある効果を評価するために、処置群の麻酔をかけたラットの結腸中に６４ｍｇ／ｋｇ（４ｍｌ／ｋｇ）にてＴＮＢＳ溶液（５０％ＴＮＢＳ：５０％  ２００プルーフエタノール；１６ｍｇ／ｍｌ  ＴＮＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃９２８２２）を直腸内投与することにより、大腸炎の状態をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて誘導した。対照群には、ＴＮＢＳ溶液を与えなかった。ＴＮＢＳ投与の２時間後に、単回用量のヒト化５Ｇ６抗体（５０ｍｇ／ｋｇ）または等量のアイソタイプ対照でラットをｉ．ｐ処置した。陽性対照として、プレドニゾロン（Ｓｉｇｍａ）を、ＴＮＢＳ投与の２時間後およびその後５日間毎日、１０ｍｇ／ｋｇの用量にて経口投与した。第７日にラットを屠殺し、以下の評点システムを用いて結腸スコアとして疾患重症度を評価した：
１）癒着：なし＝０、最小限＝１、いくつかの腸ループを巻き込む＝２
２）狭窄：なし＝０、軽度＝２、重度、隣接拡張＝３
３）潰瘍：なし＝０、線状潰瘍形成＜１ｃｍ＝１、２つの線状潰瘍＜１ｃｍ＝２、より多くの潰瘍形成部位または１つの大きい潰瘍＝３
４）壁厚さ：１ｍｍ未満＝０、１〜３ｍｍ＝１、＞３ｍｍ＝２
【０２１１】
図８に示すように、ヒト化抗体５Ｇ６でのラットの処置が、ＴＮＢＳにより誘導される疾患パラメータの低減をもたらしたことが観察できる。
【実施例１０】
【０２１２】
ｈＴＬ１Ａとの５Ｇ６ヒト化抗体の結合は、ｈＤｃＲ３−ＦｃおよびｈＤＲ３−Ｆｃの両方により阻止される
上で論じたように、ＴＬ１Ａは、ＴＮＦＲＳＦ２５／ＤＲ３およびデコイ受容体ＤｃＲ３についてのリガンドである。ＤＲ３は、Ｔ細胞活性化中に上方制御されるデスドメイン含有受容体であり、ＤＲ３とのＴＬ１Ａの相互作用は、免疫応答中のＴ細胞増殖を促進できる（Ｍｉｇｏｎｅ  ＴＳら、既出）。腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーの可溶性タンパク質である分泌型デコイ受容体（ＤｃＲ３）は、ＴＬ１Ａの作用を阻止する（Ｋｉｍ  ＳおよびＺｈａｎｇ  Ｌ既出）。
【０２１３】
５Ｇ６ヒト化抗体が受容体ＤＲ３および／またはデコイ受容体ＤｃＲ３とのｈＴＬ１Ａの相互作用に干渉できるかを評価するために、２μｇ／ｍｌのｈｉｓタグ付加ヒトＴＬ１ＡでＥＬＩＳＡプレートを被覆し、２０μｇ／ｍｌの５Ｇ６ヒト化抗体（ＶＨ５／ＶＬ１；フォーマットＩｇＧ４ヒンジ安定化；配列番号１２４および１７）と、ヒトＤｃＲ３、ＤＲ３（ともにＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）または無関係の受容体（Ｃｔｒｌ−Ｆｃ）のいずれかの外部ドメインの１０μｇ／ｍｌのＦｃ融合体の存在下でインキュベートし、その後、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）を用いて検出した。図９で観察できるように、ｈＴＬ１Ａとの５Ｇ６ヒト化抗体の結合は、ｈＤｃＲ３−ＦｃおよびｈＤＲ３−Ｆｃの両方により阻止される。このことから、ｈＴＬ１Ａと結合する５Ｇ６ヒト化抗体が、ｈＴＬ１ＡとＤＲ３およびＤｃＲ３の両方との相互作用を阻害するこ
とが確認される。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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