(57)【要約】      （修正有）【課題】宿主細胞内に人工的な内部共生体を含む、真核宿主細胞の提供。【解決手段】人の介入により真核細胞に導入され、それが少なくとも５回の細胞分裂を通してその真核細胞の娘細胞へ伝達される単細胞生物を含む、真核細胞、およびそのような単細胞生物を真核細胞に導入する方法に関する。本発明は、娘細胞において維持される表現型を真核細胞に導入する単細胞生物を提供する。本発明はさらに、走磁性細菌を内包した真核細胞を提供する。【選択図】図１
2018108107.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞内に人工的な内部共生体を含む、真核宿主細胞。
【請求項２】
真核宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
哺乳動物宿主細胞がネズミ細胞である、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
哺乳動物宿主細胞がヒト細胞である、請求項２に記載の細胞。
【請求項５】
人工的な内部共生体が遺伝子修飾されている、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
真核細胞内に走磁性細菌を含む、真核細胞。
【請求項７】
走磁性細菌が、マグネトスピリラム・マグネティカム(Magnetospirillum magneticum)
ＡＭＢ−１株、Ｍ．マグネトタクチウム(M. magnetotactium)、Ｍ．グリフィスワルデン
ス(M. gryphiswaldense)、Ｍ．ポリモルファム(M. polymorphum)、マグネトスピリラム属菌種ＭＳＭ−４、マグネトスピリラム属菌種ＭＳＭ−６、マグネトコッカス・マリナス(Magnetococcus marinus)、およびマグネトコッカス属菌種ＭＣ−１株からなる群から選択される菌株からのものである、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
走磁性細菌が遺伝子修飾されている、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項６に記載の細胞。
【請求項１０】
哺乳動物細胞がネズミ細胞である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１２】
ヒト細胞が癌細胞である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
ヒト細胞がＩＰＳ細胞である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１４】
真核細胞を磁気操作する方法であって、請求項６に記載の細胞を磁界にさらすことを含む方法。
【請求項１５】
真核細胞を検出する方法であって、請求項６に記載の細胞を磁界にさらすことを含む方法。
【請求項１６】
人工的な内部共生体を作製する方法であって、走磁性細菌を真核宿主細胞に導入することを含む方法。
【請求項１７】
真核宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物宿主細胞がネズミ細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物宿主細胞がヒト細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ヒト細胞が癌細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ヒト細胞がＩＰＳ細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
走磁性細菌が、マグネトスピリラム・マグネティカム(Magnetospirillum magneticum)
ＡＭＢ−１株、Ｍ．マグネトタクチウム(M. magnetotactium)、Ｍ．グリフィスワルデン
ス(M. gryphiswaldense)、Ｍ．ポリモルファム(M. polymorphum)、マグネトスピリラム属菌種ＭＳＭ−４、マグネトスピリラム属菌種ＭＳＭ−６、マグネトコッカス・マリナス(Magnetococcus marinus)、およびマグネトコッカス属菌種ＭＣ−１株からなる群から選択される菌株から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
走磁性細菌が遺伝子修飾された細菌である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引照
[1]  本発明は、U.S. Patent Application Serial No 13/374,799, 表題“人工的な内
部共生体を含む宿主細胞”, 2012年1月13日出願に基づく優先権を主張し、その開示内容
全体を、あらゆる目的で全体として本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
[2]  本発明は一般に、内部共生(endosymbiosis)、人工的な内部共生体(endosymbiont)、および走磁性細菌の分野に関する。特に、本発明は、走磁性細菌を含む人工的な内部共生体などの単細胞生物、それらの単細胞生物を宿した真核細胞、およびそれらの単細胞生物を真核細胞に導入する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
[3]  ミトコンドリア、葉緑体、および他の膜結合型の細胞小器官は、遺伝性の機能性
、たとえば光合成能を真核細胞に付与する。そのような細胞小器官（それらの環状ＤＮＡ痕跡により同定される）は、内部共生に由来すると考えられる。
【０００４】
[4]  種々の真核細胞に存在しない広範な機能性をもつ細菌が現存する。たとえば、1975年にBlakemoreは、地磁気に沿って配向および遊泳する走磁性細菌(magnetotactic bacteria)（ＭＴＢ）を同定した(Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science 24: 377-379 (1975) (それを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。これらの走磁性細菌は、脂質膜により封じ込められたマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）またはグレイジャイト(greigite)（Ｆｅ３Ｓ４）から構成されるマグネトソーム(magnetosome)と呼ばれる磁性構造体を産生する（同書）。それらの最初の発見（同書）以来、多数のＭＴＢ種が同定されている。
【０００５】
[5]  走磁性細菌は、物質に選択的に結合させて物質を分離するために用いられている(U.S. Patent No. 4,677,067 (それを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。
さらに、外部タグにより細胞に磁気機能性を付加する試みがなされた(Swiston, A.J., Cheng, C., Soong, H.U., Irvine, D.J., Cohen, R.J., Rubner, M.F. Surface Functionalization of Living Cells with Multilayer Patches. Nano Lett. 8(12): 4446-53 (2008) (それを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。細菌性マグネタイトは細胞
融合により赤血球にも導入されており(Matsunaga, T., Kamiya, S., (1988), In: Atsumi, K., Kotani, M., Ueno, S., Katila T., Williamsen, S.J. (eds) 6th International Conference on Biomagnetisms (1987). Tokyo Denki University Press, Tokyo, pp. 50-51 (それを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))、またＭＴＢはファゴサイトーシスにより顆粒球および単球に導入されている(Matsunaga, T., Hashimoto, K., Nakamura, N., Nakamura, K., Hashimoto, S. Phagocytosis of bacterial magnetite by leucocytes. Applied Microbiology and Biotechnology 31(4): 401-405 (1989) (それを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。しかし、これらの改変はいずれも娘細胞へ遺伝できない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】U.S. Patent No. 4,677,067
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science 24: 377-379 (1975)
【非特許文献２】Swiston, A.J., Cheng, C., Soong, H.U., Irvine, D.J., Cohen, R.J., Rubner, M.F. Surface Functionalization of Living Cells with Multilayer Patches. Nano Lett. 8(12): 4446-53 (2008)
【非特許文献３】Matsunaga, T., Kamiya, S., (1988), In: Atsumi, K., Kotani, M., Ueno, S., Katila T., Williamsen, S.J. (eds) 6th International Conference on Biomagnetisms (1987). Tokyo Denki UniversityPress, Tokyo, pp. 50-51
【非特許文献４】Matsunaga, T., Hashimoto, K., Nakamura, N., Nakamura, K., Hashimoto, S. Phagocytosis of bacterial magnetite by leucocytes. Applied Microbiology and Biotechnology 31(4): 401-405 (1989)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
[6]  本発明の目的は、人の介入により真核細胞に導入された単細胞生物を内包し、そ
れがその真核細胞の娘細胞へ少なくとも５回の細胞分裂を通して伝達され、かつ単細胞生物により導入された所期の機能性が娘細胞において維持されるのに十分なコピー数を娘細胞において維持する、真核細胞を提供することである。さらに本発明の目的は、娘細胞へ遺伝しうる人工的な内部共生体を内包した真核宿主細胞を提供することである。また、本発明の目的は、人工的な内部共生体を真核宿主細胞の細胞質ゾルに導入する方法を提供することである。本発明の他の目的は、遺伝性の磁性表現型を備えた真核細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
[7]  本発明は、単細胞生物、たとえば人工的な内部共生体を含む、真核細胞、および
そのような単細胞生物を真核細胞に導入する方法に関する。１態様において、単細胞生物は真核細胞に所期の機能性を付与する。１態様において、単細胞生物は娘細胞へ遺伝しうる人工的な内部共生体である。他の態様において、人工的な内部共生体は走磁性細菌である。１態様において、走磁性細菌は真核細胞に磁気機能性を提供する。本発明の人工的な内部共生体は、少なくとも１つの遺伝子を欠失、付加および／または変異させることにより改変でき、これにより人工的な内部共生体は内部共生またはバイオトロフィー(biotrophy)に有用な形質を獲得する。人工的な内部共生体において変異、付加および／または欠失される遺伝子は、鞭毛アセンブリーの構成要素をコードする遺伝子、ならびに必須高分子、たとえばアミノ酸、ヌクレオチド、ビタミンおよび補因子を合成するための酵素をコードする遺伝子であってもよい。特定の態様において、ＭＴＢは抗生物質耐性遺伝子または他の選択マーカーを発現するようにさらに改変されてもよい。
【００１０】
[8]  若干の態様において、本発明の真核細胞は哺乳動物、たとえばマウス、ラット、
ウサギ、ハムスター、ヒト、ブタ、ウシまたはイヌのものである。他の態様において、人工的な内部共生体は宿主細胞から後代宿主である娘細胞へ伝達される。他の態様において、本発明方法はさらに、真核細胞由来の少なくとも１つの遺伝子を欠失、挿入および／または変異させることを含む。
【００１１】
[9]  本発明の単細胞生物を、当業者に知られている多数の方法により真核細胞に導入
することができ、これにはマイクロインジェクション、自然ファゴサイトーシス、誘導ファゴサイトーシス、マクロピノサイトーシス（macropinocytosis）、他の細胞内在化プロセス、リポソーム融合、赤血球ゴースト融合、またはエレクトロポレーションが含まれるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】[10]  図１は、寒天プラグに懸濁したｇｆｐ＋ＡＭＢについて１．５Ｔ計測器を用いてイメージング特性を最適化して解析した、Ｔ１パルスシーケンスで作成した約１０８ＭＴＢ／ｍＬまでの対数目盛濃度にわたるポジティブコントラストを示す。
【図２】[11]  図２は、２細胞胚期の２個の細胞のうちの１つにｇｆｐ＋ＡＭＢをマイクロインジェクションした胞胚期のマウス胚を示す。胚は、生細胞イメージングのための環境管理チャンバーにより囲まれたＬｅｉｃａ  ＳＰ２  ＡＯＢＳスペクトル共焦点倒立顕微鏡を用いて２０倍、０．７ＮＡ対物レンズおよび光学ズーム３倍でイメージングされている。パネルＡは微分干渉コントラスト(differential interference contrast)（ＤＩＣ）イメージを示し、パネルＢは同じイメージのグレイスケール蛍光捕獲を示す。
【図３】[12]  図３は、共焦点顕微鏡検査により測定した４つのマウス胚の総胚ＧＦＰ蛍光の経時変化を示す。それぞれの胚の２細胞期からの２個の細胞のうちの１つにｇｆｐ＋ＡＭＢをマイクロインジェクションし、それぞれの胚の総ＧＦＰ蛍光を、マイクロインジェクション後２４時間目に８細胞期から開始して測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
[13]  本発明を例により説明するが、それらは限定のためのものではない。この開示において“an”または“one（１）”または“some（ある）”態様（単数または複数）とい
う記述は必ずしも同一態様についてのものではなく、そのような記述はすべて少なくとも１つを意味することを留意すべきである。
【００１４】
[14]  本発明は、単細胞生物を内包した真核細胞、たとえば宿主細胞の細胞質ゾル中に人工的な内部共生体を内包した宿主細胞、および単細胞生物を真核細胞に導入する方法に関する。１態様において、単細胞生物は遺伝子改変された人工的な内部共生体である。若干の態様において、単細胞生物は走磁性細菌（ＭＴＢ）である。
【００１５】
定義
[15]  本明細書中で用いる用語“ＡＭＢ”は、マグネトスピリラム・マグネティカム(Magnetospirillum magneticum)ＡＭＢ−１株を表わす。
【００１６】
[16]  本明細書中で用いる用語“人工的な内部共生体”は、人の介入により真核細胞の細胞質ゾルに導入される、または導入された、単細胞生物を表わし、それはその真核細胞の娘細胞へ少なくとも５回の細胞分裂を通して伝達されており、または伝達可能であり、かつ人工的な内部共生体により導入された表現型が娘細胞において維持されるのに十分なコピー数を娘細胞において維持する。
【００１７】
[17]  本明細書中で用いる用語“細胞のライフサイクル”は、真核細胞の成長、複製および分裂を伴なう一連の事象を表わす。それは、細胞が休止しているＧ０、細胞のサイズが拡大するＧ１およびＧ２、細胞がそれのＤＮＡを倍増するＳ、ならびに細胞が有糸分裂を行なって分裂するＭとして知られる５期に分けられる。
【００１８】
[18]  本明細書中で用いる用語“細胞質ゾル”は、細胞の膜結合型の下部構造内に含まれない部分の細胞質を表わす。
[19]  本明細書中で用いる用語“娘細胞”は、細胞の分裂により形成される細胞を表わす。
【００１９】
[20]  本明細書中で用いる用語“必須分子”は、宿主細胞が成長または生存のために必要とする分子を表わす。
[21]  本明細書中で用いる用語“遺伝子修飾した”は、希望する細胞の性質または特性が変化するように細胞のＤＮＡを改変することを表わす。
【００２０】
[22]  本明細書中で用いる用語“宿主細胞”は、その中に人工的な内部共生体が滞在できる真核細胞を表わす。
[23]  本明細書中で用いる用語“リポソーム仲介による”は、１以上の脂質層に封入された水性コアからなる人工的な顕微的ベシクルが人工的な内部共生体を宿主細胞へ運ぶために用いられることを表わす。
【００２１】
[24]  本明細書中で用いる用語“マグネトソーム”は、マグネタイト（すなわち、Ｆｅ３Ｏ４）またはグレイジャイト（Ｆｅ３Ｓ４）の粒子が個々の粒子または鎖状の粒子として鞘または膜により封じ込められたものを表わす。
【００２２】
[25]  本明細書中で用いる用語“走磁性細菌”または“ＭＴＢ”は、マグネトソームをコードする遺伝子をもつ細菌を表わす。
[26]  本明細書中で用いる用語“哺乳動物”は、温血脊椎動物を表わし、それらはすべて体毛をもち、それらの幼体に哺乳する。
【００２３】
[27]  本明細書中で用いる用語“マイクロインジェクション”は、人工的な内部共生体を宿主細胞に注入することを表わす。
[28]  本明細書中で用いる用語“タグ付きの人工的な内部共生体”は、内部共生体の表面にリガンドをもつ人工的な内部共生体を表わす。
【００２４】
[29]  本明細書中で用いる用語“親細胞”は、分裂して２個以上の娘細胞を形成する細胞を表わす。
[30]  本明細書中で用いる用語“受容体仲介による”は、宿主細胞の表面にある分子構造体または部位が人工的な内部共生体またはタグ付きの人工的な内部共生体と結合し、続いてその人工的な内部共生体が内在化することを表わす。
【００２５】
人工的な内部共生体
[31]  本発明の単細胞生物には、真核細胞内で生存でき、かつその単細胞生物により導入された表現型が娘細胞において維持されるようなコピー数を維持する、細菌が含まれる。若干の態様において、単細胞生物は人がそれ以上介入しなければ真核細胞を殺さない。若干の態様において、単細胞生物は、単細胞生物の導入後に真核細胞が獲得するある機能性をもつ。若干の態様において、単細胞生物の機能性は磁性、栄養素の産生、脱塩作用、光合成、または過酷な環境攻撃に対する耐容性である。磁性には、反磁性および常磁性が含まれる。若干の態様において、真核細胞はその機能性を少なくとも４８時間維持する。若干の態様において、単細胞生物はその真核細胞の娘細胞において少なくとも３回の細胞分裂、または少なくとも４回の細胞分裂、または少なくとも５回の細胞分裂、または少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０回の細胞分裂を通して、表現型を安定に維持できる。他の態様において、単細胞生物は真核細胞の娘細胞において少なくとも３〜５回の分裂、または５〜１０回の分裂、または１０〜１５回の分裂、または１５〜２０回の分裂を通して、表現型を安定に維持できる。
【００２６】
[32]  本発明のある態様において、本発明の単細胞生物を遺伝子修飾する。細菌を遺伝子修飾するための方法は当技術分野で周知である。一般に、細菌は、真核宿主細胞におけるそれらの生存性を改善するために、および／または真核細胞に対する単細胞生物の毒性を低下させるために、および／または真核細胞に有用な表現型を付与するために、遺伝子修飾されるであろう。１態様において、単細胞生物が真核宿主細胞においてもはや鞭毛タンパク質を発現しないように、単細胞生物の鞭毛タンパク質を修飾する。他の態様において、単細胞生物はもはや必須分子を合成できないように修飾され、その分子は好ましくは真核宿主細胞により供給される。ある態様において、単細胞生物をそれの細胞サイクルが
真核宿主細胞の細胞サイクルと同調するように遺伝子修飾し、これによりその表現型を娘細胞へ付与するのに十分なレベルに単細胞生物のコピー数を維持できる。
【００２７】
[33]  本発明の態様には、プロテオバクテリア門(Proteobacteria)である単細胞生物が含まれる。本発明の態様には、α−プロテオバクテリアである単細胞生物が含まれる。１６Ｓ  ｒＲＮＡに基づく現在の分類体系方式では、α−プロテオバクテリアはプロテオバクテリア門内の綱として認識され、７つの主要な亜群または目に下位分類される（カウロバクター目(Caulobacterales)、リゾビウム目(Rhizobiales)、ロドバクター目(Rhodobacterales)、ロドスピリルム目(Rhodospirillales)、リケッチア目(Rickettsiales)、スフィンゴモナス目(Sphingomonadales)、パルブルアーキュラ目(Parvularculales)）。(Gupta, R.S. Phylogenomics and signature proteins for the alpha Proteobacteria and its main groups. BMC Microbiology, 7:106 (2007) (それを全体としてあらゆる目的で本明
細書に援用する))。
【００２８】
[34]  α−プロテオバクテリア内の主要群の全体をカバーする多数のα−プロテオバクテリアゲノムが配列決定され、α−プロテオバクテリア内の種々の高等分類群（たとえば、科、目など）の識別特徴である遺伝子またはタンパク質のユニークなセットを同定するために使用できる情報が提供された。(同書 (それを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。
【００２９】
[35]  本発明の態様には、走磁性細菌（“ＭＴＢ”）である単細胞生物が含まれる。1975年のBlakemoreによるそれらの最初の発見(Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science 24: 377-379 (1975) (それを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))以来、多数のＭＴＢ種が当業者に知られており、微生物の一群をなしている(Faivre, D. & Schueler, D. Magnetotactic bacteria and magnetosomes. Chemistry Reviews 108: 4875-4898 (2008) (それを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。ＭＴＢはプロテ
オバクテリアおよびニトロスピラ(Nitrospira)門内の種々の亜群中に同定されており、大部分の系統型(phylotype)がα−プロテオバクテリアに属する。現在、１６Ｓ  ｒＲＮＡ
配列類似性によりα−プロテオバクテリアとして分類される培養可能なＭＴＢ株には、Blakemoreが1975年に最初に分離した株が含まれる；マグネトスピリラム・マグネトタクチウム(Magnetospirillum magnetotactium) (以前は、アクアスピリラム・マグネトタクチウム(Aquasprillium magnetotactium))、Ｍ．グリフィスワルデンス(M. gryphiswaldense)、Ｍ．マグネティカム(M. magneticum)ＡＭＢ−１株（“ＡＭＢ”）、Ｍ．ポリモルファム(M. polymorphum)、マグネトスピリラム属菌種ＭＳＭ−４およびＭＳＭ−６、マグネトコッカス・マリナス(Magnetococcus marinus)、海洋ビブリオＭＶ−１およびＭＶ−２株、海洋スピリラムＭＭＳ−１株、ならびにマグネトコッカス属菌種ＭＣ−１株、その他。ＡＭＢを含めて多数のＭＴＢを純培養物として入手できる。純培養におけるＡＭＢの倍増時間は約８時間であり、一般的な哺乳動物のものに近い。
【００３０】
[36]  標準ＭＴＢ増殖培地はコハク酸を主炭素源として用いるが、ＭＴＢはフマレート、タルトレート、マレート、ラクテート、ピルベート、オキサロアセテート、マロネート、Ｐ−ヒドロキシブチレートおよびマレエートを唯一の炭素源として増殖させることができる。これらの代謝産物は真核細胞の内側に存在する。微好気性、通性嫌気性、および嫌気性のＭＴＢ株が同定された。ミオグロビンなどのタンパク質により捕捉され、細胞の特定の位置、たとえばミトコンドリアに濃縮されるため、真核細胞の細胞質ゾル中の酸素濃度は低く、したがってＭＴＢの増殖に必要な微好気性または通性嫌気性の環境が真核細胞には既に存在する。
【００３１】
[37]  ＭＴＢはそれらが合成する磁性粒子であるマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）またはグレイジャイト（Ｆｅ３Ｓ４）のいずれかにより分類することもできる。マグネタイト産生
菌は微好気性または通性嫌気性であり、マグネトソーム合成のために若干の酸素源を必要とし、生理的温度付近に最適増殖温度をもつ。
【００３２】
[38]  若干の態様において、本発明の単細胞生物を遺伝子修飾する。ＭＴＢの遺伝子操作のための分子生物学ツールが、最も多くはＡＭＢおよびＭ．グリフィスワルデンスＭＳＲ−１株において開発された(概説：Jogler, C. and Schtiler, D. in Magnetoreception
and Magnetosomes in Bacteria, New York, Springer, 2007 p 134-138 (それを全体と
してあらゆる目的で本明細書に援用する))。ＡＭＢのゲノムはあらゆるＭＴＢのうち最初に配列決定されたものであるので、別途明記しない限り、本明細書中のＭＴＢ遺伝子という表記はすべて、このゲノムを表わす。他の２つのマグネトスピリラム属菌株およびマグネトコッカス属菌種ＭＣ−１株も最近、配列決定された。これらの株、または現時点で培養可能もしくは培養不可能な、配列決定されたもしくは配列決定されていない、既知もしくは未知の、他のＭＴＢ株に由来する遺伝子を、本発明に使用できる。
【００３３】
[39]  ＭＴＢにおけるマグネトソーム形成に関与する遺伝子は、マグネトソームアイランド（ＭＡＩ）として知られるゲノムアイランドにクラスター形成する。Ｍ．グリフィスワルデンスにおいては、１３０ｋｂのＭＡＩが一般に４つのポリシストロン型オペロン(polycistronic operon)構造をもつ：ｍａｍＡＢオペロンは１７の同定されたＯＲＦをもち、１６．４ｋｂにわたって広がる；ｍａｍＧＦＤＣオペロンは４つの同定されたＯＲＦをもち、２．１ｋｂであり、ｍａｍＡＢの１５ｋｂ上流にある；ｍｍｓ６オペロンは６つの同定されたＯＲＦをもち、３．６ｋｂであり、ｍａｍＧＦＤＣの３６８ｂｐ上流にある；ｍａｍＸＹオペロンは４つの同定されたＯＲＦをもち、ｍａｍＡＢの約３０ｋｂ下流に位置する；およびモノシストロン性ｍａｍＷ遺伝子がある。ＭＡＩには、タンパク質：ＭａｍＷ、Ｍｇｌ４５７、Ｍｇｌ４５８、Ｍｇｌ４５９、Ｍｍｓ６、Ｍｇｌ４６２、ＭａｍＧ、ＭａｍＦ、ＭａｍＤ、ＭａｍＣ、ＭａｍＨ、ＭａｍＩ、ＭａｍＥ、ＭａｍＪ、ＭａｍＫ、ＭａｍＬ、ＭａｍＭ、ＭａｍＮ、ＭａｍＯ、ＭａｍＰ、ＭａｍＡ、ＭａｍＱ、ＭａｍＲ、ＭａｍＢ、ＭａｍＳ、ＭａｍＴ、ＭａｍＵ、およびＭｇｌ５０５が同定され、これらの多くにはマグネトソーム形成における特異的な機能が与えられている。ＭＡＩの外側にある４つの遺伝子がマグネトソーム形成に関連づけられている：ｍａｍＹ、ｍｔｘＡ、ｍｍｓＦおよびｍａｍＸ。保存されたＭＡＩ類が他のＭＴＢに見出され、それらはゲノムのオーガナイゼーションおよびサイズに若干の相異がある。
【００３４】
[40]  若干の態様において、単細胞生物にゲノム修飾を行なう。そのような修飾は、定方向修飾、ランダム変異形成、またはその組合わせであってもよい。天然の内部共生体は新たな代謝可能性のドナーであり、宿主から栄養要求を誘導する。
【００３５】
[41]  共生体の自然な宿主定着は７段階で起きる：１）伝播、２）侵入、３）宿主防御への対抗、４）ポジショニング、５）宿主に対する利点の供与、６）宿主環境における生存、および７）レギュレーション。
【００３６】
[42]  若干の態様において、単細胞生物と真核細胞の間に相互栄養依存性（バイオトロフィー）が樹立される可能性がある。１態様において、単細胞生物は必須分子を合成する酵素をコードする遺伝子の欠失を少なくとも１つ含み、その際、その必須分子は真核宿主細胞により産生される。必須分子にはアミノ酸、ビタミン、補因子、およびヌクレオチドを含めることができるが、これらに限定されない。たとえば、バイオトロフィーは単細胞生物がアミノ酸を製造する能力をノックアウトすることにより達成でき、その場合それはその宿主から得られるであろう。グリシンは哺乳動物細胞にきわめて多量に存在し、かつ細菌のアミノ酸生合成における最終産物であるので、妥当な選択である；少なくとも他の２２の可能性がある。酵素セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼは、アミノ酸製造のための３−ホスホグリセリン酸生合成経路の終点でセリンをグリシンに変換する。１態
様において、単細胞生物は、遺伝子ａｍｂ２３３９（酵素セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする）が遺伝子修飾されたＡＭＢである。遺伝子を変異またはノックアウトさせるための多数の方法が当業者に知られており、これにはインビトロ変異形成、相同組換えによる目的遺伝子へのＤＮＡのターゲティッド挿入、または遺伝子（またはオペロン；細菌の大部分の遺伝子はオペロンにクラスター形成しているからである）の欠失が含まれ、あるいはエンドヌクレアーゼの使用はゲノム中に存在するターゲットの周辺にのみ適切な部位を提供した。
【００３７】
[43]  他の態様において、宿主細胞に対する単細胞生物の栄養依存性は、単細胞生物が種々の代謝産物、補因子、ビタミン、ヌクレオチドまたは他の必須分子を合成する能力を排除することによっても樹立できた。
【００３８】
[44]  本発明の若干の態様において、ＭＴＢは運動性および／または分泌に関連する遺伝子に変異および／または欠失をもつ。ＭＴＢは鞭毛を備えており、本発明の若干の態様において、ＭＴＢは鞭毛と関連する分子機械をコードする少なくとも１つの遺伝子に、その磁性細菌が機能的鞭毛を生成しないような欠失および／または変異をもつ。さらに、多くのＭＴＢはヒドロキサメート型およびカテコール型のシデロフォア(siderophore)類な
ど多様な化合物を分泌し、それらは宿主に対して有害であるかまたは宿主から免疫応答を誘発する可能性がある。配列決定されたＡＭＢにおいて、４５５９のＯＲＦのうち８３の遺伝子が細胞の運動性および分泌に関係づけられた。鞭毛アセンブリーは下記の遺伝子産物で構成されることが知られている：ａｍｂ０４９８、ａｍｂ０５００、ａｍｂ０５０１、ａｍｂ０５０２、ａｍｂ０５０３、ａｍｂ０５０４、ａｍｂ０５０５、ａｍｂ０６１０、ａｍｂ０６１４、ａｍｂ０６１５、ａｍｂ０６１６、ａｍｂ０６１７、ａｍｂ０６１８、ａｍｂ０６１９、ａｍｂ０６２８、ａｍｂｌ２８９、ａｍｂ１３８９、ａｍｂ２５５８、ａｍｂ２５５９、ａｍｂ２５７８、ａｍｂ２５７９、ａｍｂ２８５６、ａｍｂ３４９３、ａｍｂ３４９４、ａｍｂ３４９５、ａｍｂ３４９６、ａｍｂ３４９８、ａｍｂ３８２４、およびａｍｂ３８２７。鞭毛は、少なくとも下記の遺伝子産物から構成される走化性機構により制御される：ａｍｂ０３２２、ａｍｂ０３２３、ａｍｂ０３２４、ａｍｂ０３２５、ａｍｂ０３２６、ａｍｂｌ８０６、ａｍｂｌ９６３、ａｍｂｌ９６６、ａｍｂ２３３３、ａｍｂ２６３５、ａｍｂ２６４０、ａｍｂ２６４８、ａｍｂ２６５２、ａｍｂ２８２６、ａｍｂ２９３２、ａｍｂ３００２、ａｍｂ３００３、ａｍｂ３００４、ａｍｂ３００７、ａｍｂ３１０２、ａｍｂ３３２９、ａｍｂ３５０１、ａｍｂ３５０２、ａｍｂ３６５４、ａｍｂ３８７９、およびａｍｈ３８８０。
【００３９】
[45]  １態様において、抗生物質耐性をコードする遺伝子を単細胞生物のゲノムに挿入する。抗生物質を含有する培地で培養された真核細胞は、生存のためにその単細胞生物を要求するであろう。ネオマイシン耐性は２つのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子のいずれか一方により付与され、それは真核細胞に一般に用いられる抗生物質であるゲネチシン(geneticin)（Ｇ４１８）に対しても耐性をもたらす。ハイグロマイシン
Ｂ(hygromycin B)耐性は、ハイグロマイシンＢをリン酸化により不活性化するキナーゼによって付与される。ピューロマイシン(puromycin)は哺乳動物細胞培養のために一般に用
いられる抗生物質であり、耐性はピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼをコードするｐａｃ遺伝子により付与される。外部からの抗生物質濃度制御により、単細胞生物のコピー数を細胞内調節することができる。外部因子に対する耐性または耐容性をこの因子の化学修飾により達成する他のいずれのシステムも採用できる。真核細胞に対する間接的な栄養上の利点も、ＭＴＢおよび磁気培養法を用いて樹立できる。この態様においては、磁界を樹立して、ＭＴＢを内包した真核細胞を優位にする。これは、培養マトリックスに付着する手段を提供することによるか、あるいは必要な増殖因子または培地因子へのアクセスのいずれかであってもよい。
【００４０】
[46]  他の態様において、遺伝子修飾により、特定の宿主細胞タイプについて宿主防御機序に対するＭＴＢゲノムの細胞内安定性を増強する。真核細胞の多くの内部共生体および内部寄生体、たとえば昆虫のプロテオバクテリア系−内部共生体、たとえばブフネラ属(Buchnera)、ウィッグルスワルチア属(Wigglesworthia)およびウォルハチア属(Wolhachia)；嫌気性繊毛虫のメタン生成−内部共生体；珪藻類ロパロディア属(Rhopalodia)におけ
る窒素固定共生体；無腸チューブワーム（オラビウス属(Olavius)またはジナニドリルス
属(Jnanidrillus)）の化学合成性−内部共生体集合体、海綿類のシアノバクテリア−内部共生体、棘皮動物門(Echinodermata)の現存する５つの綱すべての内部共生体、植物の根
粒菌属(Rhizobia)内部共生体、種々の内部共生性藻類、プロテウスアメーバ(Ameoba proteus)のレジオネラ様Ｘ細菌(Legionella-like X bacteria)−内部共生体、多数のサルモネラ属(Salmonella)菌種、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)などは、しばしばシンビオソーム(symbiosome)と呼ばれる膜結合型の空胞(vacuole)内に存在する；一方、若干の種、たとえばブロッホマニア属(Blochmannia)、リケッチア、赤痢菌属(Shigella)、腸管組織侵入性大腸菌(enteroinvasive Escherichia coli)、およびリステリア属(Listeria)などは、細胞質ゾルに生息する能力をもつ。Ｄｏｔ−Ｉｃｍ  ＩＶ型分泌システムは、ファゴサイトーシスにより獲得された多数の腸内細菌によって、エンドサイトーシス経路を回避して宿主細胞内に留まるために利用される。このシステムは、Ｌ．ニューモフィラ(L. pneumophila)において十分に研究され、下記のタンパク質からなる：ＤｏｔＡ〜ＤｏｔＰ、ＤｏｔＵ、ＤｏｔＶ、ＩｃｍＦ、ＩｃｍＱ〜ＩｃｍＴ、ＩｃｍＶ、ＩｃｍＷおよびＩｃｍＸ。線虫の発光性内部共生体であるフォトラブダス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)において、ＲＴＸ様毒素、プロテアーゼ、ＩＩＩ型分泌システムおよび鉄取込みシステムをコードする遺伝子が細胞内安定性および複製を支持することが示された。遺伝子ｂａｃＡおよび調節システムＢｖｒＲＳは、根粒菌属と植物の間の共生、および哺乳動物細胞におけるブルセラ・アホルタス(Brucella ahortus)の生存を維持するために必須である。ＰｒｆＡレギュロン(regulon)は、若干のリステリア属菌種がファゴソームから逃れて細胞質ゾルに生息するのを可能にする。細胞内ＭＴＢの望ましい細胞位置（たとえば、シンビオソームまたは細胞質ゾル）により、宿主環境で生存および増殖するためにＭＴＢにおいてどの遺伝子が発現する（ゲノムから直接、または安定ベクターにより）のが要求されるかが決定されるであろう。内因性プラスミドｐＭＧＴはＭＴＢにおいて安定性が高く、多数の他の広域ベクター（ｌｎｃＱ、ＩｎｃＰ、ｐＢＢＲｌなどのもの）がＭＴＢにおいて安定に複製できる。
【００４１】
[47]  他の態様において、細菌発育阻止遺伝子（単数または複数）、シデロフォア遺伝子（単数または複数）、代謝要求遺伝子（単数または複数）、自殺遺伝子（単数または複数）、ライフサイクル調節遺伝子（単数または複数）、トランスポーター遺伝子（単数または複数）などの遺伝子のノックイン、およびファゴソーム遺伝子（単数または複数）からの回避により、単細胞生物を遺伝子修飾する。他の態様において、単細胞生物をランダムに変異させ、続いて宿主細胞内への組込みの増強についてスクリーニングする。ランダム変異形成は、変異原化合物による処理、ＵＶ線照射、または当業者に知られている他の方法により達成できる。
【００４２】
[48]  他の態様において、真核細胞防御に対抗するために、種々の寄生体または内部共生体に由来する遺伝子を用いてトランスジェニック修飾（単数または複数）を行なう。他の態様において、真核細胞内の単細胞生物の集団を本来の宿主機序（栄養素利用能、増殖制御など）の利用および抗生物質濃度のバランスにより調節する。
【００４３】
[49]  他の態様において、マグネトソームを産生するように天然の内部共生体または細胞内寄生体を遺伝子修飾する。昆虫の内部共生体、たとえばブフネラ属(Buchnera)、ウィッグルスワルチア属(Wigglesworthia)およびウォルハチア属(Wolhachia)；嫌気性繊毛虫のメタン生成−内部共生体；珪藻類ロパロディア属(Rhopalodia)における窒素固定共生体；無腸チューブワーム（オラビウス属(Olavius)またはジナニドリルス属(Jnanidrillus)）の化学合成性−内部共生体集合体、海綿類のシアノバクテリア−内部共生体、棘皮動物門(Echinodermata)の現存する５つの綱すべての内部共生体、植物の根粒菌属(Rhizobia)内部共生体、種々の内部共生性藻類、プロテウスアメーバ(Ameoba proteus)のレジオネラ様Ｘ細菌(Legionella-like X bacteria)−内部共生体、多数のサルモネラ属(Salmonella)菌種、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)は、α−プロテオバクテリアに属し、マグネトソームを産生するように遺伝子工学的に処理することができる。他の態様において、既存の細胞小器官を１以上のマグネトソーム遺伝子が発現するように遺伝子修飾して、人工的な内部共生体を作製できる。たとえば、それら自身の遺伝子材料を宿したミトコンドリア、プラスチド、ヒドロゲノソーム(hydrogenosome)、アピコプラスト(apicoplast)、または他の細胞小器官を遺伝子改
変することができる。
【００４４】
[50]  好ましい態様において、真核細胞を培養した際に磁性粒子を産生する単細胞生物はＭＴＢであり、それは遺伝子修飾されていてもよく、遺伝子修飾されていなくてもよい。
【００４５】
真核細胞
[51]  本発明は、真核細胞内に遺伝性の単細胞生物を含む真核細胞、および単細胞生物を宿主細胞に導入する方法を提供する。
【００４６】
[52]  若干の態様において、真核細胞は植物細胞である。若干の態様において、真核細胞は単子葉植物または双子葉植物であり、それらにはトウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、コメ、ダイズ、ラッカセイ、エンドウマメ、レンズマメおよびアルフアルファ、ワタ、ナタネ、アブラナ、コショウ、ヒマワリ、バレイショ、タバコ、トマト、ナス、ユーカリ、樹木、観賞植物、多年生植物、または飼料作物が含まれるが、これらに限定されない。他の態様において、真核細胞は藻類であり、それにはクロレラ属(Chlorella)、クラミドモナス属(Chlamydomonas)、セネデスムス属(Scenedesmus)、イソクリシス属(Isochrysis)、デュナリエラ属(Dunaliella)、テトラセルミス属(Tetraselmis)、ナンノクロロプシス属(Nannochloropsis)、またはプロトテカ属(Prototheca)が含まれるが、これらに限定されない。若干の態様において、真核細胞は真菌細胞であり、それには酵母菌属(Saccharomyces)、クルイベロミセス属(Klyuveromyces)、カンジダ属(Candida)、ピキア属(Pichia)、デバリオミセス属(Debaromyces)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、ヤロウィア属(Yarrowia)、ジゴサッカロミセス属(Zygosaccharomyces)、またはシゾサッカロミセス（分裂酵母菌）属(Schizosaccharomyces)の真菌が含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
[53]  若干の態様において、本発明の真核細胞は動物細胞である。若干の態様において、真核細胞は哺乳動物、たとえばマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヒト、ブタ、ウシまたはイヌのものである。マウスは他の哺乳動物、最も特別にはヒトのモデルとして、日常的に機能する。(たとえば下記を参照：Hanna, J., Wernig, M., Markoulaki, S., Sun, C., Meissner, A., Cassady, J.P., Beard, C., Brambrink, T., Wu, L., Townes, T.M., Jaenisch, R. Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin. Science 318: 1920-1923 (2007); Holtzman, D.M., Bales, K.R., Wu, S., Bhat, P., Parsadanian, M., Fagan, A., Chang, L.K., Sun, Y., Paul, S.M. Expression of human apolipoprotein E reduces amyloid-β deposition in a mouse model of Alzheimer’s disease. J. Clin. Invest. 103(6): R15-R21 (1999); Warren, R.S., Yuan, H., Matli, M.R., Gillett, N.A., Ferrara, N. Regulation by vascular endothelial growth factor of human colon cancer tumorigenesis in a mouse model of experimental liver metastasis. J. Clin. Invest. 95: 1789-1797 (1995) (これら３つの刊行物それぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。
【００４８】
[54]  若干の態様において、真核細胞はヒトの癌細胞である。当業者に周知の多数の癌細胞株があり、それには一般的な上皮性の腫瘍細胞株、たとえばＣｏｃｏ−２、ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＣＦ７、非上皮性の腫瘍細胞株、たとえばＨＴ−１０８０およびＨＬ６０、ＮＣＩ６０細胞株パネルが含まれる(たとえば下記を参照：Shoemaker, R., The NCI60 human tumor cell line anticancer drug screen. Nature Reviews Cancer 6, 813-823 (2006) (それを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。さらに、当業者は原発性ヒト腫瘍からの癌細胞の採取に精通している。
【００４９】
[55]  他の態様において、真核細胞は幹細胞である。当業者は多様な幹細胞タイプに精通しており、それには胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、表皮神経堤幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、間葉系幹細胞、成体嗅覚幹細胞、および精巣細胞が含まれる。
【００５０】
[56]  ある態様において、真核細胞はヒト宿主の循環系にみられる細胞である。たとえば、赤血球、血小板、形質細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞など、およびその前駆細胞。ひとまとめにして、これらの細胞を本発明の循環系宿主細胞と定義する。本発明をこれらの循環系細胞のいずれかについて使用できる。ある態様において、真核細胞はＴ細胞である。他の態様において、真核細胞はＢ細胞である。ある態様において、真核細胞は好中球である。ある態様において、真核細胞は巨核球である。
【００５１】
[57]  他の態様において、真核細胞に由来する少なくとも１つの遺伝子を遺伝子改変する。若干の態様において、ターゲット宿主細胞に特異的な、当業者に既知の適切な分子生物学的手法を用いて真核細胞を遺伝子修飾して単細胞生物に対する真核細胞の依存性を形成することにより、ある必須高分子について人工的な内部共生体と真核細胞の間に相互栄養依存性（バイオトロフィー）を樹立することができ、こうしてバイオトロフィーのための環境圧が樹立される。他の態様において、単細胞生物が種々の代謝産物、補因子、ビタミン、ヌクレオチド、または他の必須分子を合成する能力を排除するように真核細胞を遺伝子改変することにより、真核細胞に対する単細胞生物の栄養依存性を樹立することができる。そのような態様において、必須分子は単細胞生物により提供できる。他の態様において、アミノ酸産生のための３−ホスホグリセリン酸生合成経路の終点でセリンをグリシンに変換する酵素セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする真核細胞遺伝子を修飾することができる。
【００５２】
単細胞生物を真核細胞に導入する方法
[58]  本発明の単細胞生物を、当業者に既知である多数の方法により真核細胞に導入することができ、これにはマイクロインジェクション、自然ファゴサイトーシス、誘導ファゴサイトーシス、マクロピノサイトーシス、他の細胞取込みプロセス、リポソーム融合、赤血球ゴースト融合、エレクトロポレーション、受容体仲介法などが含まれるが、これらに限定されない。(参照：Microinjection and Organelle Transplantation Techniques, Celis et al. Eds.; Academic Press: New York, 1986 およびそれに含まれる参考文献 (それを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。
【００５３】
[59]  １態様において、単細胞生物を宿主細胞の細胞質へのマイクロインジェクションにより宿主細胞に導入する。多様なマイクロインジェクション法が当業者に知られている。マイクロインジェクションは、利用できる伝達法のうち最も効率的なものであり（本質的に１００％）、細胞タイプの制限がない(同書; Xi, Z. & Dobson, S. Characterization of Wolbachia transfection efficiency by using microinjection of embryonic cytoplasm and embryo homogenate. Appl. Environ. Microbiol. 71(6): 3199-3204 (2005); Goetz, M., Bubert, A., Wang, G., Chico-Calero, I., Vazquez-Boland, J.A., Beck, M., Slaghuis, J., Szalay, A. A., Goebel, W. Microinjection and growth of bacteria in the cytosol of mammalian host cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:12221-12226 (2001) (これら３つの刊行物それぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。
【００５４】
[60]  天然のファゴサイトーシス細胞はＭＴＢを含めた細菌を取り込むことが示された(Burdette, D.L., Seemann, J., Orth, K. Vibrio VopQ induces PI3-kinase independent autophagy and antagonizes phagocytosis. Molecular microbiology 73: 639 (2009); Wiedemann, A., Linder, S., Grassi, G., Albert, M., Autenrieth, I., Aepfelbacher, M. Yersinia enterocolitica invasin triggers phagocytosis via β1 integrins, CDC42Hs and WASp in macrophages. Cellular Microbiology 3: 693 (2001); Hackam, D.J., Rotstein, O.D., Schreiber, A., Zhang, W., Grinstein, S. Rho is required for the initiation of calcium signaling and phagocytosis by Fcγ receptors in macrophages. J. of Exp. Med. 186(6): 955-966 (1997); Matsunaga, T., Hashimoto, K., Nakamura, N., Nakamura, K., Hashimoto, S. Phagocytosis of bacterial magnetite by leucocytes. Applied Microbiology and Biotechnology 31(4): 401-405 (1989) (これら４つの刊行物それぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。
【００５５】
[61]  この方法はスケールを変更できるが、特定の細胞タイプ（たとえば、マクロファージ）に限定される。しかし、最近の研究により、非ファゴサイトーシス細胞タイプを多様な因子：培地および化学的因子、生物学的因子（たとえば、バキュロウイルス、タンパク質因子、遺伝子ノックインなど）と共に培養した場合、細菌をエンドサイトーシスするように誘導できることが示された。(たとえば下記を参照：Salminen, M., Airenne, K.J., Rinnankoski, R., Reimari, J., Valilehto, O., Rinne, J., Suikkanen, S., Kukkonen, S., Yla-Herttuala, S., Kulomaa, M.S., Vihinen-Ranta, M. Improvement in nuclear entry and transgene expression of baculoviruses by disintegration of microtubules in human hepatocytes. J. Virol. 79(5): 2720-2728 (2005); Modalsli, K.R., Mikalsen, S., Bukholm, G., Degre, M. Microinjection of HEp-2 cells with coxsackie B1 virus RNA enhances invasiveness of Shigella flexneri only after prestimulation with UV-inactivated virus. APMIS 101: 602-606 (1993); Hayward, R.D. & Koronakis, V. Direct nucleation and bundling of actin by the SipC protein of invasive Salmonella. The EMBO Journal 18: 4926-4934 (1999); Yoshida, S., Katayama, E., Kuwae, A., Mimuro, H., Suzuki, T., Sasakawa, C. Shigella deliver an effector protein to trigger host microtubule destabilization, which promotes Rac1 activity and efficient bacterial internalization. The EMBO Journal 21: 2923-2935 (2002); Bigildeev et al. J. Exp Hematol., 39: 187 (2011); Finlay, B.B. & Falkow, S. Common themes in microbial pathogenicity revisited. Microbiol. and Mol. Biol. Rev. 61: 136-169 (1997) (これら６つの刊行物それぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。
【００５６】
[62]  関連する方法であるマクロピノサイトーシスまたは“細胞飲作用(cell drinking)”は、多数の細菌およびウイルスが細胞内侵入のために利用する方法である(Zhang (2004) In: Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD) [オンラインデータベース]; Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), NCBI; 2004-2011 (これら２つの刊行物それぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。細菌を取り込むように細胞を誘導するために利用できる多様なプロトコルがある。幾つかの作用物、たとえば核酸、タンパク質、薬物および細胞小器官がリポソームに封入され、細胞へ送達された(Ben-Haim, N., Broz, P., Marsch, S., Meier, W., Hunziker, P. Cell-specific integration of artificial organelles based on functionalized polymer vesicles. Nano Lett. 8(5): 1368-1373 (2008); Lian, W., Chang, C., Chen, Y., Dao, R., Luo, Y., Chien, J., Hsieh, S., Lin, C. Intracellular delivery can be achieved by bombarding cells or tissues with accelerated molecules or bacteria without the need for carrier particles. Experimental Cell Research 313(1): 53-64 (2007); Heng, B.C. & Cao, T. Immunoliposome-mediated delivery of neomycin phosphotransferase for the lineage-specific selection of differentiated/committed stem cell progenies: Potential advantages over transfection with marker genes, fluorescence-activated and magnetic affinity cell-sorting. Med. Hypotheses 65(2): 334-336 (2005); Potrykus (1990) Ciba Found Symp, Vol. 1 54: 198 (これら４つの刊行物それぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。この方法は経費が少なく、比較的簡単であり、スケールを変更できる。さらに、リポソーム取込みはインキュベーション条件の操作、リポソーム電荷の変更、受容体仲介、および磁気増強によって向上させることができる。(たとえば下記を参照：Pan et al. Int. J. Pharm. 358: 263 (2008); Sarbolouki, M.N. & Toliat, T. Storage stability of stabilized MLV and REV liposomes containing sodium methotrexate (acqueous & lyophilized). J. Pharm. Sci. Techno., 52(10): 23-27 (1998); Elorza, B., Elorza, M.A., Sainz, M.C., Chantres, J.R. Comparison of particle size and encapsulation parameters of three liposomal preparations. J. Microencapsul. 10(2): 237-248 (1993); Mykhaylyk, O., Sanchez-Antequera, Y., Vlaskou, D., Hammerschmid, E., Anton, M., Zelphati, O. and Plank, C. Liposomal Magnetofection. Methods Mol. Bio., 605: 487-525 (2010) (これら４つの刊行物それぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。
【００５７】
[63]  赤血球仲介による伝達は、リポソーム融合と類似し、試験されたすべての細胞タイプにわたって高い効率および有効性をもつことが示された(Microinjection and Organelle Transplantation Techniques; Celis et al. Eds.; Academic Press: New   York, 1986 (それを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。一般に、浸透圧ショック法またはエレクトロポレーション法により赤血球に装填する(Schoen, P., Chonn, A., Cullis, P.R., Wilschut, J., and Schuerrer, P. Gene transfer mediated by fusion protein hemagglutinin reconstituted in cationic lipid vesicles. Gene Therapy 6: 823-832 (1999); Li, L.H., Hensen, M.L., Zhao, Y.L., Hui, S.W. Electrofusion between heterogeneous-sized mammalian cells in a pellet: potential applications in drug delivery and hybridoma formation. Biophysical Journal 71:479-486 (1996); Carruthers, A., & Melchior, D.L. A rapid method of reconstituting human erythrocyte sugar transport proteins. Biochem. 23: 2712-2718 (1984) (これら３つの刊行物それぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。あるいは、造血前駆細胞に単細胞生物を装填し、それらを誘導して単細胞生物を内包した赤血球に分化および増殖させることにより、赤血球に間接的に装填することができる。
【００５８】
[64]  エレクトロポレーションは因子を細胞へ送達するために一般に用いられる安価な方法である。(Potrykus, I. Gene transfer methods for plants and cell cultures. Ciba Found Symp 154, 198-208; discussion 208-112 (1990); Wolbank, S. et al. Labeling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking. Cell Tissue Bank 8, 163-177 (2007) (これら２つの刊行物それぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。
【００５９】
[65]  他の態様において、自然に細菌をエンドサイトーシスする真核細胞（たとえば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ））を用いる。１態様において、改変した単細胞細菌をＣＨＯ培養物に直接添加する。ＭＴＢを感染させる前に、ＣＨＯ細胞を標準法により、１０％ウシ胎仔血清培地を含むＨａｍのＦ−１２培地で培養する。感染後、培地にさらに鉄（４０〜８０μＭ）をリンゴ酸第２鉄またはＦｅＣｌ３として補充する。多数の他の細胞タイプが細菌をエンドサイトーシスまたはより特異的にファゴサイトーシスによって内在化する；内部共生体または寄生体は、細胞への侵入のためにそれら自身の方法をもっており、これらの自然なプロセスを人工的な内部共生体の内在化のために利用して、いわゆるシンビオソームを作製することができる。他の態様において、ある細胞からのシンビオソームを他の細胞タイプ（すなわち、人工的な内部共生体のエンドサイトーシスを行なうことができない細胞）へ、マイクロシンジェクション、細胞小器官移植、およびキメラ手法を用いて移植することができる。これらの宿主細胞を、個々の細胞タイプについて一般的な培地および手法で培養する。
【００６０】
[66]  １態様において、単細胞生物をリポソーム仲介法により宿主細胞に導入する。ＭＴＢより大きなミトコンドリアおよびクロロプラストが、リポソームに封入された場合、効率的に真核細胞に導入された。(Bonnett, H. T. Planta 131, 229 (1976); Giles, K.;
Vaughan, V.; Ranch, J.; Emery, J. Liposome-mediated uptake of chloroplasts by plant protoplasts. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant 16(7) 581-584 (これら２つの刊行物それぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。多数のリポソーム融合のプロトコルおよび作用剤を入手でき、当業者が過度の実験なしに使用できる。(たとえば下記を参照：Ben-Haim, N., Broz, P., Marsch, S., Meier, W., Hunziker, P. Cell-specific integration of artificial organelles based on functionalized polymer vesicles. Nano Lett. 8(5): 1368-1373 (2008); Lian, W., Chang, C., Chen, Y., Dao, R., Luo, Y., Chien, J., Hsieh, S., Lin, C. Intracellular delivery can be achieved by bombarding cells or tissues with accelerated molecules or bacteria without the need for carrier particles. Experimental Cell Research 313(1): 53-64 (2007); Heng, B.C. & Cao, T. Immunoliposome-mediated delivery of neomycin phosphotransferase for the lineage-specific selection of differentiated/committed stem cell progenies: Potential advantages over transfection with marker genes, fluorescence-activated and magnetic affinity cell-sorting. Med. Hypotheses 65(2): 334-336 (2005); Potrykus (1990) Ciba Found Symp, Vol. 1 54: 198 (これら４つの刊行物それぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。
【００６１】
[67]  本明細書に開示する発明は、以下の実験の詳細からより良く理解されるであろう。ただし、考察する具体的方法は、後記の特許請求の範囲にさらに完全に記載される本発明の説明にすぎないことは、当業者に容易に認識されるであろう。
【実施例】
【００６２】
実施例１．  ネズミ細胞へのｇｆｐ＋ＡＭＢのマイクロインジェクション
Ａ．  ｇｆｐ＋ＡＭＢの構築
[68]  ｅＧＦＰの発現ベクター、すなわち、シャイン・ダルガーノ配列をｇｆｐ遺伝子の上流に含むもの、およびシャイン・ダルガーノ配列を含まないものを、潜在広宿主域ベクター(cryptic broad host range vector)ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２中へクローニングした(Kovach, M.E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene 166, 175-176, (1995) (それを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。ＡＭＢ（ＡＴＣＣ  ７００２６４）をこの構築体で形質転換した。(Matsunaga, T. et al. Complete genome sequence of the facultative anaerobic magnetotactic bacterium Magnetospirillum sp. strain AMB-1. DNA Res. 12, 157-166 (2005); Burgess J.G., et al. Evolutionary relationships among Magnetospirillum strains inferred from phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences. J. Bacteriol. 175: 6689-6694 (1993); Matsunaga T, et al. Gene transfer in magnetic bacteria: transposon mutagenesis and cloning of genomic DNA fragments required for magnetosome synthesis. J. Bacteriol. 174: 2748-2753 (1992); Kawaguchi R, et al. Phylogeny and 16s rRNA sequence of Magnetospirillum sp. AMB-1, an aerobic magnetic bacterium. Nucleic Acids Res. 20: 1140, (1992) (これら４つの刊行物それぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。
【００６３】
[69]  形質転換は、ドナー大腸菌株を用いるコンジュゲーションにより、下記の記載に従って達成された：Goulian, M. van der Woude, M.A. A simple system for converting
lacZ to gfp reporter fusions in diverse bacteria. Gene 372, 219-226 (2006); Scheffel, A. Schueler, D. The Acidic Repetitive Domain of the Magnetospirillum gryphiswaldense MamJ Protein Displays Hypervariability but Is Not Required for Magnetosome Chain Assembly. J Bacteriol. September; 189(17): 6437-6446 (2007) (これら２つの刊行物それぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する)。この交配反応物を１０日間、規定した微好気性条件下でＤＡＰの非存在下に培養して、陽性の形質転換体を選択した。
【００６４】
[70]  コンジュゲーション後、シャイン・ダルガーノ配列を含む、または含まないｇｆｐ＋ＡＭＢ形質転換体は、良好にＧＦＰ蛍光を示した。シャイン・ダルガーノ配列を含む形質転換体は、この配列を含まない形質転換体より高いレベルのＧＦＰ蛍光を示した。得られた蛍光は、１００倍拡大、４８８ｎｍ励起で観察した際に、ｇｆｐ＋ＡＭＢ細胞から離脱しなかった。
【００６５】
[71]  ｇｆｐ＋ＡＭＢの磁性をＭＲＩにより分析した。ｇｆｐ＋ＡＭＢを寒天プラグに懸濁し、１．５Ｔ計測器を用いてイメージング特性を最適化して解析した。図１は、Ｔ１パルスシーケンスで作成した約１０８ＭＴＢ／ｍＬまでの対数目盛濃度にわたるポジティブコントラストを示す。信号強度は濃度と比例していた。
【００６６】
Ｂ．ネズミ胚細胞内へのマイクロインジェクション
[72]  ｇｆｐ＋ＡＭＢを１７０の２細胞期マウス胚それぞれの１個の細胞にマイクロインジェクションした。５６５ｎｍにおける光学濃度により推定して細胞当たり約１０５  ｇｆｐ＋ＡＭＢまでの対数目盛にわたる６種類の濃度をインジェクションした。マイクロインジェクション後の細胞の致死率はインジェクションした種々の濃度にわたって一定であった。最高濃度（１０５ＭＴＢ／細胞）をインジェクションした細胞の蛍光をオーバーレイするイメージおよび微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）イメージを比較した。インジェクションしなかった対照は低いレベルの自発蛍光を示した。特定時点での８細胞期の胚の異なる水平面における切片を比較した。それぞれの胚において、インジェクションした細胞に由来する４個すべての細胞が有意の蛍光を示したのに対し、インジェクションしなかった内部対照に由来する４個の細胞はいずれも有意の蛍光を示さなかった。
【００６７】
[73]  インジェクション後、胚を３日間発生させた。それぞれの濃度レベルで、胚は完全に３日目まで生存して２５６細胞の胞胚期にまで発生し、移植に十分なほど健全にみえた。それぞれの胞胚期にある多数の細胞が有意の蛍光を示し、これは真核宿主細胞を含む胚が胞胚期にまで発生するのに伴なう多数回の細胞分裂を越えて人工的な内部共生体が娘細胞へ伝達されたことを証明する。そのような胞胚のひとつを図２に示す；パネルＡは胞胚の微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）イメージを示し、パネルＢは同じイメージのグレイスケール蛍光捕獲を示す；胞胚全体の多数の細胞に蛍光が示される。
【００６８】
[74]  共焦点顕微鏡検査を用いて、胚全体の総ＧＦＰ蛍光を胚の８細胞期から開始して種々の時点で経時測定することにより、４つの個々の胚全体におけるＧＦＰの総発現を定量した。図３は、胚の蛍光の経時変化を示す。これは、人工的な内部共生体のコピー数が娘細胞において少なくとも７世代の間、維持され、したがって胚が２細胞期から２５６細胞の胞胚期まで経過するのに伴って宿主細胞の蛍光性表現型が維持されたことを示す。
【００６９】
[75]  これらの結果は、マイクロインジェクションにより送達された場合、ｇｆｐ＋ＡＭＢは直ちには排除または分解されず、かつ３日間の実験経過中、発生中の胚に対して有毒でなかったことを証明する。マイクロインジェクションされた胚は正常に分裂し、これはｇｆｐ＋ＡＭＢが病原性マーカーを示さないこと、または有毒化合物を分泌しないことを示唆する。それらは多数回の細胞分裂を越えて娘細胞へ伝達され、細胞質に内包され、点状に良好に分散し、かつ娘宿主細胞内でコピー数を維持し、したがって宿主細胞の蛍光性表現型が娘細胞において少なくとも７世代を通して維持された。これらの結果は、ＡＭＢを安定に細胞内に維持でき、それらが娘細胞に少なくとも７回の細胞分裂にわたって伝達されることを証明する。
【００７０】
実施例２．  ファゴサイトーシスによるＡＭＢの侵入
[76]  受容体仲介によるもの：ｉｎｌＡＢ遺伝子をＬ．モノサイトゲネス(L. monocytogenes)ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ  １９１１４）から増幅し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−５，１０７、すなわちｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２のゲンタマイシンコグネイト(Kovach, M.E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene 166, 175-176, (1995))に挿入し、ｇｆｐ＋ｉｎｌＡＢ＋ＡＭＢを作製する。このｇｆｐ＋ｉｎｌＡＢ＋ＡＭＢを、一般的な上皮性の腫瘍細胞株Ｃｏｃｏ−２、ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＣＦ７、非上皮性の腫瘍細胞株、たとえばＨＴ−１０８０およびＨＬ６０、ならびにネズミ幹細胞を含めた、真核宿主細胞と共培養する。蛍光顕微鏡検査およびＦＡＣＳを用いて内在化および細胞内位置をモニターおよび定量する。
【００７１】
[77]  ＡＭＢにおけるポア形成性溶血素（ｈｌｙＡ）の発現は、Ｌ．モノサイトゲネスゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ  １９１１４）からのｈｌｙＡの増幅により達成される。増幅したｈｌｙＡをｐＢＢＲ１ＭＣＳ−３（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２のテトラサイクリンコグネイト）に挿入し、次いでこれを用いてｇｆｐ＋ＡＭＢを形質転換する。得られたＡＭＢ株を、自然ファゴサイトーシス可能なネズミマクロファージ細胞株Ｊ７７４に曝露する。ゲンタマイシン処理を用いて、内在化しなかった細菌を排除し、ｈｌｙＡ−ＡＭＢを陰性対照として用いる。蛍光顕微鏡検査を用いてＡＭＢの細胞内動態および位置をモニターする。
【００７２】
[78]  細菌がファゴソームに閉じ込められたままである場合、Ｌ．モノサイトゲネスが細胞質ゾル内へ逃れる際に関与することが示唆されている２つの遺伝子ｐｌｃＡおよびｐｌｃＢを導入する。(Smith, G. A., Marquis, H., Jones, S., Johnston, N. C., Portnoy, D. A., Goldfine, H. Infection and immunity 63: 4231 (1995); Camilli, A.; Goldfine, H.; Portnoy, D. A. The Journal of Experimental Medicine 173: 751 (1991) (これら２つの刊行物それぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。細菌が首尾よく逃れたけれども増殖できない場合、ｈｐｔを導入する。(Goetz, M., Bubert, A., Wang, G., Chico-Calero, I., Vazquez-Boland, J. A., Beck, M.; Slaghuis, J., Szalay, A. A., Goebel, W. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 12221 (2001); Chico-Calero, I., Suarez, M., Gonzalez-Zorn, B., Scortti, M., Slaghuis, J., Goebel, W., Vazquez-Boland, J. A. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 431 (2002) (これら２つの刊行物それぞれを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。Ｌ．モノサイトゲネスにおいて、ｈｐｔは細胞質ゾルからグルコース−６−ホスフェートを取り込むのに関与するトランスポーターをコードする。Ｌ．モノサイトゲネスに由来する他の遺伝子が宿主内での増殖の維持に関与することが示唆されており（ｇｌｎＡおよびｇｌｔＡＢおよびａｒｇＤ）、これらを必要に応じて系統的に導入する。(Joseph, B., Przybilla, K., Stuhler, C., Schauer, K., Slaghuis, J., Fuchs, T. M., Goebel, W. Journal of Bacteriol. 188: 556 (2006) (それを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。
【００７３】
実施例３．  ＡＭＢ増殖の調節
[79]  胚性幹細胞におけるＡＭＢ増殖の調節は、下記に従って調節できる。コレオプテリシン−Ａ(Coleoptericin-A)（ＣｏｌＡ）を、ココクゾウ(Sitophilus oryzae)総ｃＤＮＡから増幅する。シトフィルス（象虫）属の甲虫におけるＣｏｌＡの発現は、これらの甲虫との自然発生した緊密な共生関係をもちバクテリオサイト(bacteriocyte)と呼ばれる特定の細胞中に存在するγ−プロテオバクテリウムの力価を調節する。(Login, F.H., Balmain, S., Vallier, A., Vincent-Monegat, C., Vigneron, A., Weiss-Gayet, M., Rochat, D., Heddi, A. Antimicrobial peptides keep insect endosymbionts under control. Science 334(6054): 362-365 (2011) (それを全体としてあらゆる目的で本明細書に援用する))。
【００７４】
[80]  ｇｆｐ＋ＡＭＢを含むネズミ胚性幹細胞を、神経分化プロトコルを用いて処理する。ＭＴＢ発現レベルを、ｑＰＣＲおよび蛍光顕微鏡検査を用いて定量する。増幅したｃｏｌＡを次いでｇｆｐ＋ＡＭＢ胚性幹細胞において発現させる。最適なＣｏｌＡ発現レベルをもたらすプロモーターを選択する。
【００７５】
実施例４．  ｇｆｐ＋ＡＭＢを含むネズミ細胞の磁性表現型
[81]  ｇｆｐ＋ＡＭＢを導入したネズミの腹水および充実性腫瘍に由来するマクロファージ細胞株Ｊ７７４．２からの細胞を磁性カラムに適用し、カラムに保持させた。Ｊ７７４．２ネズミ細胞は磁気により濃縮され、磁気により採集されたので、これらの結果は、ｇｆｐ＋ＡＭＢの導入後にそれらが磁気により検出され、磁気により操作されたことを証明する。
【００７６】
実施例５．  ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるＧｆｐ＋ＡＭＢ
[82]  Ｇｆｐ＋ＡＭＢ、Ｇｆｐ＋ＩｎｌＡ／Ｂ＋ＡＭＢ、およびＧｆｐ＋Ｐｌａ１＋ＡＭＢをそれぞれ、細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に由来するヒト乳癌細胞に導入した。ＧＦＰ蛍光は、Ｇｆｐ＋ＡＭＢ、Ｇｆｐ＋ＩｎｌＡ／Ｂ＋ＡＭＢ、およびＧｆｐ＋Ｐｌａ１＋ＡＭＢそれぞれの導入後４８時間目に、９０％を超えるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において検出された。Ｇｆｐ＋ＡＭＢにおけるＧＦＰ蛍光は、これらのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においてｇｆｐ＋ＡＭＢの導入後に少なくとも１３日間、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の第４継代で観察され、この場合ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞集団はそれぞれの継代間で３〜４回倍増した。ＧＦＰ蛍光は、ｇｆｐ＋ＡＭＢを導入したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の細胞分裂プロセスで形成された両方の娘細胞において観察された。
【００７７】
[83]  ｇｆｐ＋ＡＭＢの導入後に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）  Ｒｅｄ  ＤＮＤ−９９色素およびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染色（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）で染色した。緑色のＧＦＰ蛍光が個々のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞内に局在した状態で観察された。
【００７８】
[84]  導入後２４時間目および７２時間目に、プレーティングしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびプレーティングした対照ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をホルマリンおよびグルタルアルデヒド中に固定し、続いてＰＢＳで洗浄した。細胞を次いでプルシアンブルーで染色し、倍率４０倍で顕微鏡検査した。鉄染色はｇｆｐ＋ＡＭＢを導入したいくつかのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にみられたが、ｇｆｐ＋ＡＭＢを導入しなかった対照ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にはみられなかった。鉄染色を示す細胞の割合は、ｇｆｐ＋ＡＭＢ導入後７２時間目のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とｇｆｐ＋ＡＭＢ導入後２４時間目のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞との間で類似していた。
【００７９】
[85]  ｇｆｐ＋ＡＭＢの導入後４８時間目に、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳに再懸濁した。これらの細胞の１試料をスライドガラスチャンバーに入れた。磁石をチャンバーの側面に配置し、細胞の動きを倍率２０倍の顕微鏡下で観察した。ｇｆｐ＋ＡＭＢを導入したＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞は磁石に向かう動きを示したが、ｇｆｐ＋ＡＭＢを導入しなかった対照ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞は示さなかった。これらの細胞の他の試料を小試験管に入れ、それらを１時間、磁石にテープで固定した。ｇｆｐ＋ＡＭＢを導入しなかった対照ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞は試験管の底に沈降した。しかし、ｇｆｐ＋ＡＭＢを導入したＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞は試験管の磁石側に整列した。
【００８０】
[86]  これらの結果は、ｇｆｐ＋ＡＭＢがヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から直ちには排除されなかったことを示す。それらは少なくとも１２回の細胞分裂を越えて娘細胞へ伝達され、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞内でリソソームおよび核の両方の外側に位置していた。これらの結果はまた、ｇｆｐ＋ＡＭＢの導入後、少なくとも４８時間、示されたｇｆｐ＋ＡＭＢを内包するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が磁気により検出され、磁気により操作されたことを証明する；それらは磁気により動き、磁気によりある位置へターゲティングし、磁気により濃縮され、磁気により採集されたからである。さらに、ｇｆｐ＋ＡＭＢの導入後、少なくとも７２時間、それらのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は観察可能な量の鉄を含有していた。
【００８１】
実施例６．  ヒトの誘導多能性幹細胞におけるＧｆｐ＋ＡＭＢ
[87]  ＧＦＰ蛍光は、ヒトの誘導多能性幹（“ＩＰＳ”）細胞において、ｇｆｐ＋ＡＭＢをＩＰＳ細胞に導入した後、少なくとも８日間、ＩＰＳ細胞の第２継代で観察された。これらの結果は、ｇｆｐ＋ＡＭＢがヒトＩＰＳ細胞から直ちには排除されず、娘細胞へ伝達されたことを示す。
【００８２】
[88]  本明細書中で考察および引用するすべての刊行物、特許および特許出願を全体として本明細書に援用する。開示した発明は特定の方法、プロトコルおよび材料に限定されないことが理解される；それらは変更できるからである。本明細書中で用いる用語は特定の態様を記載するためのものにすぎず、特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するためのものではないことも理解される。
【００８３】
[89]  当業者は、本明細書に記載する具体的態様に対する多数の均等物を認識し、あるいは日常的な程度の実験を用いて確認できるであろう。そのような均等物は特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図１】
2018108107.tif 000003
【図２】
2018108107.tif 000004
【図３】
2018108107.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月19日(2018.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞内に走磁性細菌を含む、真核細胞であって、
該真核細胞は少なくとも５回の細胞分裂を行い、該走磁性細菌は、該真核細胞の娘細胞へ、少なくとも５回の該真核細胞の細胞分裂を通して伝達される、上記真核細胞。
【請求項２】
走磁性細菌が、マグネトスピリラム・マグネティカム(Magnetospirillum magneticum)ＡＭＢ−１株、Ｍ．マグネトタクチウム(M. magnetotactium)、Ｍ．グリフィスワルデンス(M. gryphiswaldense)、Ｍ．ポリモルファム(M. polymorphum)、マグネトスピリラム属菌種ＭＳＭ−４、マグネトスピリラム属菌種ＭＳＭ−６、マグネトコッカス・マリナス(Magnetococcus marinus)、およびマグネトコッカス属菌種ＭＣ−１株からなる群から選択される菌株からのものである、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
走磁性細菌が遺伝子修飾されている、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５】
哺乳動物細胞がネズミ細胞である、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項４に記載の細胞。
【請求項７】
ヒト細胞が癌細胞である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
ヒト細胞がＩＰＳ細胞である、請求項６に記載の細胞。
【請求項９】
真核細胞を磁気操作する方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞を磁界にさらすことを含む方法。
【請求項１０】
真核細胞を検出する方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞を磁界にさらすことを含む方法。
【請求項１１】
人工的な内部共生体を作製する方法であって、走磁性細菌を真核宿主細胞に導入することを含み、該真核宿主細胞は少なくとも５回の細胞分裂を行い、該人工的な内部共生体は、該真核宿主細胞の娘細胞へ、少なくとも５回の該真核宿主細胞の細胞分裂を通して伝達される、上記方法。
【請求項１２】
真核宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物宿主細胞がネズミ細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物宿主細胞がヒト細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト細胞が癌細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ヒト細胞がＩＰＳ細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
走磁性細菌が、マグネトスピリラム・マグネティカム(Magnetospirillum magneticum)ＡＭＢ−１株、Ｍ．マグネトタクチウム(M. magnetotactium)、Ｍ．グリフィスワルデンス(M. gryphiswaldense)、Ｍ．ポリモルファム(M. polymorphum)、マグネトスピリラム属菌種ＭＳＭ−４、マグネトスピリラム属菌種ＭＳＭ−６、マグネトコッカス・マリナス(Magnetococcus marinus)、およびマグネトコッカス属菌種ＭＣ−１株からなる群から選択される菌株から選択される、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
走磁性細菌が遺伝子修飾された細菌である、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
[89]  当業者は、本明細書に記載する具体的態様に対する多数の均等物を認識し、あるいは日常的な程度の実験を用いて確認できるであろう。そのような均等物は特許請求の範囲に含まれるものとする。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］宿主細胞内に人工的な内部共生体を含む、真核宿主細胞。
［態様２］真核宿主細胞が哺乳動物細胞である、態様１に記載の細胞。
［態様３］哺乳動物宿主細胞がネズミ細胞である、態様２に記載の細胞。
［態様４］哺乳動物宿主細胞がヒト細胞である、態様２に記載の細胞。
［態様５］人工的な内部共生体が遺伝子修飾されている、態様１に記載の細胞。
［態様６］真核細胞内に走磁性細菌を含む、真核細胞。
［態様７］走磁性細菌が、マグネトスピリラム・マグネティカム(Magnetospirillum magneticum)ＡＭＢ−１株、Ｍ．マグネトタクチウム(M. magnetotactium)、Ｍ．グリフィスワルデンス(M. gryphiswaldense)、Ｍ．ポリモルファム(M. polymorphum)、マグネトスピリラム属菌種ＭＳＭ−４、マグネトスピリラム属菌種ＭＳＭ−６、マグネトコッカス・マリナス(Magnetococcus marinus)、およびマグネトコッカス属菌種ＭＣ−１株からなる群から選択される菌株からのものである、態様６に記載の細胞。
［態様８］走磁性細菌が遺伝子修飾されている、態様７に記載の細胞。
［態様９］真核細胞が哺乳動物細胞である、態様６に記載の細胞。
［態様１０］哺乳動物細胞がネズミ細胞である、態様９に記載の細胞。
［態様１１］哺乳動物細胞がヒト細胞である、態様９に記載の細胞。
［態様１２］ヒト細胞が癌細胞である、態様１１に記載の細胞。
［態様１３］ヒト細胞がＩＰＳ細胞である、態様１１に記載の細胞。
［態様１４］真核細胞を磁気操作する方法であって、態様６に記載の細胞を磁界にさらすことを含む方法。
［態様１５］真核細胞を検出する方法であって、態様６に記載の細胞を磁界にさらすことを含む方法。
［態様１６］人工的な内部共生体を作製する方法であって、走磁性細菌を真核宿主細胞に導入することを含む方法。
［態様１７］真核宿主細胞が哺乳動物細胞である、態様１６に記載の方法。
［態様１８］哺乳動物宿主細胞がネズミ細胞である、態様１７に記載の方法。
［態様１９］哺乳動物宿主細胞がヒト細胞である、態様１７に記載の方法。
［態様２０］ヒト細胞が癌細胞である、態様１９に記載の方法。
［態様２１］ヒト細胞がＩＰＳ細胞である、態様１９に記載の方法。
［態様２２］走磁性細菌が、マグネトスピリラム・マグネティカム(Magnetospirillum magneticum)ＡＭＢ−１株、Ｍ．マグネトタクチウム(M. magnetotactium)、Ｍ．グリフィスワルデンス(M. gryphiswaldense)、Ｍ．ポリモルファム(M. polymorphum)、マグネトスピリラム属菌種ＭＳＭ−４、マグネトスピリラム属菌種ＭＳＭ−６、マグネトコッカス・マリナス(Magnetococcus marinus)、およびマグネトコッカス属菌種ＭＣ−１株からなる群から選択される菌株から選択される、態様１６に記載の方法。
［態様２３］走磁性細菌が遺伝子修飾された細菌である、態様１６に記載の方法。
【外国語明細書】
2018108107000001.pdf