(57)【要約】【課題】玉レタス品種「VI185-4」が有する特定の強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーを見出し、その強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーで識別される根腐病レース１強度耐病性レタス並びに該強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーを利用した根腐病レース１強度耐病性レタスの識別方法を提供することを目的とする。【解決手段】配列番号１〜５６に記載の強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカー、配列番号１〜２５からなる群から選択される少なくとも１の配列を有し、かつ配列番号２６〜５６からなる群から選択される少なくとも１の配列を有する根腐病レース１強度耐病性レタス及び該強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーを利用した根腐病レース１強度耐病性レタスの識別方法により解決する。【選択図】図１
2018019714.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レタス根腐病レース１に対して強度の耐病性を示す根腐病レース１強度耐病性レタスを識別するための強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカー。
【請求項２】
配列番号１〜２５からなる群から選択された少なくとも１の配列を有し、かつ配列番号２６〜５６からなる群から選択された少なくとも１の配列を有する、請求項１に記載の強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカー。
【請求項３】
強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーで識別できる根腐病レース１強度耐病性レタス。
【請求項４】
前記強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーが、配列番号１〜２５からなる群から選択された少なくとも１の配列を有し、かつ配列番号２６〜５６からなる群から選択された少なくとも１の配列を有する、請求項３に記載の根腐病レース１強度耐病性レタス。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーを用いて根腐病レース１強度耐病性レタスを識別することを特徴とする、強度耐病性レタスの識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レタス根腐病レース１に強度の耐病性を有するレタス及び強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカー並びに該強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーを利用した根腐病レース１強度耐病性レタスの識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レタス根腐病は土壌中に生息するフザリウムが病原となり起こる病害である。レタス根腐病には病原性型が存在し、レタスの特定品種に対する病原性が異なる系統のことを「レース」と呼んでいる。日本国内には、現在「レース１」、「レース２」、「レース３」の３つのレースが確認されている。その対策として、植物病害防除剤を圃場に散布する方法が提案されている。
【０００３】
例えば、特開２０１４−４３４２１号公報には、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)に属する細菌を原因とするレタス根腐病に対する拮抗能力を有するバチルス属（Bacillus）に属する細菌とそば殻又はそば殻堆肥とを含有する植物病害防除剤が開示されている（特許文献１）。
【０００４】
また、特開２００８−２１４２８２号公報には、メタン発酵消化液およびメタン発酵消化液を固液分離して得られた固形物部分を土壌や軽石などの栽培培地に施用処理することによって、土壌、河川その他の環境を汚染することなく作物病害菌を抑止する方法が開示されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−４３４２１号公報
【特許文献２】特開２００８−２１４２８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、レタスの広大な圃場を植物病害防除剤等で殺菌するのは、発病圃場の土壌消毒、防除剤の処理は労力やコストを要し、収益向上に不利な側面がある。そのため、土壌病害であるレタス根腐病対策には耐病性品種の栽培が最も有効と考えられる。
【０００７】
既存のレタス根腐病レース１耐病性品種は圃場の菌密度の影響を受け、高温期には罹病してしまうことが問題となっていた。加えて、既存品種の耐病性が安定していないことから、レタス根腐病レース１に対してより強度な耐病性を有した品種育成が望まれていた。
【０００８】
従って本発明の目的は、従来の耐病性品種よりもさらに強度な耐病性育種素材である根腐病レース１強度耐病性レタス及び強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカー並びに当該強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーを利用した根腐病レース１強度耐病性レタスの識別方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するため、従来の耐病性品種よりもさらに強度な耐病性品種を探索したところ、明らかに強度な耐病性を有した品種「VP1148」を保有していた遺伝資源の中から発見した。そして、レタス根腐病レース１強度耐病性品種「VP1148」とレタス根腐病レース２強度耐病性系統「菊川102号選抜系統D199」を用いて、レタス根腐病レース１強度耐病性およびレタス根腐病レース２強度抵抗性を有した玉レタス品種「VI185-4」を作出した。
【００１０】
本発明は係る知見に基づきなされたものであり、レタス根腐病レース１に対して強度の耐病性を示す根腐病レース１強度耐病性レタスを識別するための強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーを提供するものである。
【００１１】
また、本発明は、強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーで識別できる根腐病レース１強度耐病性レタスを提供するものである。
【００１２】
さらに、本発明は、前記強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーを利用した根腐病レース１強度耐病性レタスの識別方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、従来の耐病性品種よりも強度な耐病性品種である根腐病レース１強度耐病性レタスを提供することができる。また、レタス根腐病レース１に対して強度の耐病性を有するレタスを識別することができるため、根腐病レース１強度耐病性レタスの作出に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】レース１およびレース２強度耐病性レタス「VI185-4」の育成図である。
【図２】「VI185-4」と「シナノグリーン」を交配親とした分離集団（F2）を用いた根腐病レース１耐病性検定の様子を示す図である。
【図３】レタス根腐病レース１菌株を用いた耐病性検定の地上部に関する耐病性指数を示す図である。
【図４】レタス根腐病レース１菌株を用いた耐病性検定の地下部に関する耐病性指数を示す図である。
【図５】「VI185-4」と「シナノグリーン」を交配親とした分離集団（F2）を用いた根腐病レース１耐病性検定結果を示す図である。
【図６】「VI185-4」と「シナノグリーン」を交配親とした分離集団（F2）を用いた連鎖地図である。
【図７】「VI185-4」と「シナノグリーン」を交配親とした分離集団（F2）を用いたレース１強度耐病性に関するQTL解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜レタス根腐病レース１強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカー＞
本発明に係るレタス根腐病レース１強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーとは、レタスの染色体上に存在する特定の領域であり、根腐病レース１強度耐病性という形質を判別できる機能を有する。すなわち、既知のレタス系統を用いて得られた後代系統において、レタス根腐病レース１強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーの存在の有無を確認することでレタス根腐病レース１強度耐病性を有する系統であるか否かを判断することができる。
【００１６】
本発明においてレタスとは、キク科アキノノゲシ属に属するいずれが含まれていてもよく、例えば玉レタス、リーフレタス、サラダ菜、ロメインレタス、茎レタスなどに属する植物が含まれるが、これらのものに限定されるものではない。
【００１７】
また、本発明において、レタス根腐病レース１強度耐病性とは、レタス根腐病レース１に対して耐病性を示すレース判別用品種になっている「コスタリカ４号」（Fujinaga et al. (2001) Journal of General Plant Pathology 67(3):205-206）よりも明らかに強度の耐病性を示す形質をさす。
【００１８】
本発明に係るレタス根腐病レース１強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーは、レタス品種「VI185-4 (VI)」から取得した3058個のマーカー及びレタス品種「シナノグリーン (SG)」から取得した4995個のマーカーを含む遺伝子連鎖地図と、レタス根腐病レース１強度耐病性データとを用いたQTL（Quantitative Trait Loci）解析によって新たに同定されたものである。QTL解析には、遺伝解析ソフト Windows QTL Cartographer 2.5_011 (henceforth, WinQTLCart）を使用し、Composite interval mapping（CIM）法を適用することができる。
【００１９】
具体的に、上述したQTL解析により、ロッドスコア（LOD score）が所定の閾値以上となる領域を上記遺伝子連鎖地図に2箇所見いだした。レタスでは、参照ゲノム配列が公開されており (https://genomevolution.org/coge/OrganismView.pl?oid=36218)、その情報によれば、1g7連鎖群の強度耐病性と相関の高い領域(qR1-LG7)は、上記URL中における配列データ(Genome:Lactuca sativa cv Salinas V8 Dataset:Dovetail_09Sept_Map_inspected_12-07-2015.1.v8.lg.fasta chromosome: Dovetail_09Sept_Map_inspected_12-07-2015_1_v8_lg_7)の約85Mbから100Mbに相当し、1g8g1連鎖群の強度耐病性と相関の高い領域(qR1-LG8)は、配列データ (Genome:Lactuca sativa cv Salinas V8 Dataset:Dovetail_09Sept_Map_inspected_12-07-2015.1.v8.lg.fasta chromosome: Dovetail_09Sept_Map_inspected_12-07-2015_1_v8_lg_8) の約1Mbから70Mbに相当する。
【００２０】
この領域には、レタス根腐病レース１強度耐病性を発現させる形質の原因遺伝子（群）が存在することが示唆される。上記の領域には、表１及び表２に示す56種類のマーカーが含まれている。なお、表１及び表２において、マーカー名とは、本発明者らが独自に取得したマーカーに付された名称である。
【００２１】
【表１】
2018019714.tif 000003
【００２２】
【表２】
2018019714.tif 000004
【００２３】
レタス根腐病レース１強度耐病性の発現には「qR1-LG7」および「qR1-LG8」の両領域を必要とすると考えられる。従って、本発明における「根腐病レース１抵抗性レタス」とは、「qR1-LG7」の領域に存在するレタス根腐病レース１強度耐病性を発現させる形質の原因遺伝子（群）を有し、かつ「qR1-LG8」の領域に存在するレタス根腐病レース１強度耐病性を発現させる形質の原因遺伝子（群）を有するものを指す。
【００２４】
表１及び表２に示した塩基配列は、レタス根腐病レース１強度耐病性を有するレタス品種の染色体上に特有に認められる核酸領域であり、この核酸領域をレタス根腐病レース１強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーとして使用することができる。
【００２５】
但し、上記1g7連鎖群および1g8g1連鎖群の当該領域に含まれる、「VI185-4」と他のレタス品種との間に多様性の認められる核酸領域であれば、表１及び表２に示される配列以外であっても、レタス根腐病レース１強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーとして使用することができる。
【００２６】
＜レタス品種「VI185-4」および「シナノグリーン」におけるマーカーの同定＞
本発明では、上述したように、レタス品種「VI185-4」から取得した3058個のマーカー、およびレタス品種「シナノグリーン」から取得した4995個のマーカーからレタス根腐病レース１強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーを特定した。ここでは、これら計8053個のマーカーの取得方法について説明する。
【００２７】
上記の8053個のマーカーは、レタス品種「VI185-4」およびレタス品種「シナノグリーン」のゲノムDNAの配列を、全ゲノム領域の広範囲にわたって取得し、両品種のゲノム配列の差異を見出すことができる。
【００２８】
また、レタス根腐病レース１強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーは、上記の8053個のマーカーおよび耐病性検定データを用いたQTL解析によって見出すことができる。
【００２９】
レタス品種「VI185-4」、レタス品種「シナノグリーン」および、その後代系統 (F2) からのゲノム配列情報の取得は、RAD-seq (Restriction Site Associated DNA Sequence)によって行うことができる。RAD-seqは、全ゲノムのうち、数パーセントの領域に限定して解読するための手法であり、全ゲノムリシーケンシング法と比較して低コストで、ゲノムワイドな配列情報を取得することができる。同様の手法として、GBS（Genotyping by sequencing）がある。配列情報の取得は、これらいずれの方法であってもよい。
【００３０】
配列決定に使用するDNAシーケンサーは、次世代シーケンサー (ハイスループットシーケンサーとも呼ばれる) であれば、理論的にどのメーカーのものでも構わないが、例えば、イルミナ社のシーケンサーでシーケンシングすることができる。また一般的にRAD-seqは、イルミナ社のシーケンサー（Illumina Hiseq4000システム、Illumina Hiseq2500システムなど）で行うことが、現時点においては、データの精度、コストパフォーマンスの点から望ましい。
【００３１】
＜RAD-seqによるゲノム配列データの取得＞
「VI185-4」「シナノグリーン」「後代系統 (F2)」からゲノムDNAを抽出する。次に抽出したDNAを2種の制限酵素によって断片化し、生じたDNAの両端にアダプターDNAを結合させる。その後、アダプター配列に対応する、PCRプライマーを用いてDNAを増幅する。このDNAを対象にシーケンシングを行う。次にその詳細について説明する。
【００３２】
まず、1つめの制限酵素でDNAを断片化し、制限酵素除去のためにDNAの精製を行った後に、制限酵素処理により生じた切断面に1つめのアダプターDNAを結合させる。ここで使用される制限酵素は、例えば、PstI、EcoRI、HindIII、PacI、NlaIII等を使用することができる。次に未反応のアダプター等を除くためにDNAを精製する。またDNAの精製は、エタノール沈殿法、PEG沈殿法、市販のDNA精製キット、DNA精製試薬等によって行うことができる。次に、2つの制限酵素による処理を行い、それにより生じた切断面に2つめのアダプターDNAを結合させる。さらに未反応のアダプター等を除くためにDNAを精製する。
【００３３】
この工程で使用されるアダプターDNAは、上述した制限酵素処理によって得られたゲノムDNA断片の両端に結合できるポリヌクレオチドであり、後のPCRによる増幅反応および塩基配列決定反応に使用されるプライマーの結合配列を含む必要がある。
【００３４】
次に、両末端にアダプターが付加されたゲノムDNA断片を増幅する。DNAアダプター配列に対応するプライマーを使用することで上記ゲノムDNA断片を増幅することができる。なお、ゲノムDNA断片の増幅反応としては、PCRによって行うことができる。
【００３５】
次に増幅されたDNA断片をアガロース電気泳動でサイズ分画し、200-400bp前後のサイズのDNAをアガロースゲルから切り出し精製する。
【００３６】
上記の増幅されたDNA断片に対し、次世代シーケンサー (またはハイスループットシーケンサーとも呼ばれる) を用いて配列決定反応を行うことで、対象とする実験個体の部分ゲノム配列情報を取得することができる。ここで、塩基配列決定反応に使用される次世代シーケンサーは限定されないが、イルミナ社の次世代シーケンサーを用いた解析プラットフォーム上で行われることが望ましい。
【００３７】
次世代シーケンサーを用いた配列決定反応から、上記の200-400bp前後の断片化DNAの末端配列、約100bpの塩基配列データが、その配列決定の精度を示すデータと共に無作為に得られる。塩基配列データには、人工的に付加したアダプター配列が含まれるため、これを除去する。また配列データには、比較的決定精度の低い配列も含めて出力されるため、決定精度が定めた閾値に達しない塩基配列も同様に除去を行う。この作業をクオリティコントロールという。
【００３８】
次に、クオリティコントロールを終えた無作為に読まれた各配列が、レタスゲノム配列のどの領域に相当するかを明らかにする。レタスの場合には、参照ゲノム配列が存在するため、任意の塩基配列とその参照ゲノム配列上の任意の領域とを比較し、両者の間で一定の相同性が認められるゲノム領域を探し出すことで、任意の塩基配列が、ゲノム上のどの領域に由来した配列であるかを明らかにすることができる。この作業をマッピングという。この工程にはマッピングソフトウェアBWAによって行うことができる。ただし、この工程には、他のマッピングソフトウェアを用いてもよい。これをシーケンシングによって得られた全配列に対し行うことで、解読対象の部分的ゲノム配列を得ることができる。
【００３９】
これらの作業によって得られた部分的ゲノム配列を系統間で比較することで、多型情報を得ることができる。具体的には、レタス品種「VI185-4」、レタス品種「シナノグリーン」両品種のゲノム配列を全ての位置において比較し、塩基配列に差異が認められた場合は、それを多型と見なす。その結果、配列番号１〜５６、に示した56種類のレタス根腐病レース１強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーを含む8053個のマーカーを同定することができる。
【００４０】
次に、同じくシーケンシングにより得られた「VI185-4」と「シナノグリーン」の後代系統 (F2) 96個体の部分的ゲノム配列情報を用い、上記8053個のマーカーに対する、各F2個体の遺伝型情報を得る。この遺伝型情報を元にして、遺伝地図作成ソフトウェアWinQTLCartを使用し、連鎖地図を作成する。さらに、後代系統 (F2)のレタス根腐病レース１耐病性検定のデータを加え、QTL解析ソフトウェアMAPMAKER/EXPおよびWinQTLCartを使用し、QTL解析を行えば、強度耐病性に連鎖性が認められる領域として、「VI185-4」の1g7連鎖群の強度耐病性と相関の高い領域(qR1-LG7)、1g8g1連鎖群の強度耐病性と相関の高い領域(qR1-LG8)を見出すことができる。また、この領域周辺に含まれる、表１及び表２に示されるマーカー（配列番号：１〜配列番号：５６）が、レタス根腐病レース１強度耐病性に連鎖するDNAマーカーとして見出すことができる。
【００４１】
＜レタス根腐病レース１強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーの利用＞
表１及び表２に示されるマーカー（配列番号：１〜配列番号：５６）は、レタス根腐病レース１強度耐病性品種に特有に存在している。そのため、レタス根腐病レース１強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーを利用することで、レタス根腐病レース１強度耐病性が未知であるレタス系統（例えば、後代系統）について耐病性を示す系統であるか判断することができる。ここで、レタス根腐病レース１強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーの利用とは、当該マーカーの存在の有無を検出する行為を指している。
【００４２】
検出するための方法としては、当該マーカーを含む核酸断片を特異的に増幅する方法を利用する方法、当該マーカーを含む核酸領域をDNAプローブによって検出する方法、当該マーカーを含む核酸領域およびその近傍の塩基配列を決定する方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
＜植物材料＞
図１は「VI185-4」の育成図である。本系統のレース１強度耐病性は「VP1148」から、レース2強度抵抗性は「菊川102号選抜系統D199」から人工交配により導入したことを示す。植物材料として、長野県野菜花き試験場で育成したレタス品種「VI185-4」と「シナノグリーン」を使用した。「VI185-4」と「シナノグリーン」との交配から得られたF2世代の96個体を解析に用いた。自家受粉したF3世代を用いて、耐病性に関するF2個体の遺伝子型を推定した。
【００４４】
＜耐病性検定＞
フザリウム (Fusarium oxysporum f. sp. lactucae races 1 )レタス根腐病レース１菌株を使用した。Potato Dextrose 寒天培地で培養した菌体を液体培地に植菌し、暗条件、25℃で3日間前培養した。ふすまとバーミキュライトを2:3の割合で混合し、水分を含ませた培土に前培養した菌体を植菌し、この培土と無菌土壌とを土壌比1:19で混合することによって菌培土を調製した。この方法により、レタス根腐病レース１菌株を耐病性品種「コスタリカ４号」の多くの個体が発病する程度に強度な接種とした。種子（親系統および各F3世代の20粒）を菌培土に直接播種した。実生は、自然日長で15〜35℃のガラス温室で生育させた。発芽から約1ヶ月後、苗を地上部(Shoot)と地下部(Root)それぞれについて調査した。
【００４５】
図２は「VI185-4」と「シナノグリーン」を交配親とした分離集団（F2）を用いた根腐病レース１耐病性検定における接種培地での生育状況を示す。分離集団（F2）では、枯死した罹病性個体から強度耐病性個体まで耐病性の形質が分離した。
【００４６】
図３はレタス根腐病レース１菌株を用いた耐病性検定の地上部に関する耐病性指数を示す。図４はレタス根腐病レース１菌株を用いた耐病性検定の地下部に関する耐病性指数を示す。いずれも、０：無病徴、１：微発病（地上部：わずかに萎凋する、地下部：主根先端の導管に褐変が見られる）、２：中発病（地上部：明らかに萎凋する、地下部：胚軸の導管まで褐変が見られる）、３：激甚発病（地上部：枯死または生育停止、地下部：枯死または地上部の導管近くまで褐変が見られる）の４段階に分けて評価した。
【００４７】
発病度は、以下の式を用いて計算した。
【００４８】
発病度＝（（３×激甚発病個体数）＋（２×中発病個体数）＋（１×微発病））×１００／（３×全調査個体数）
【００４９】
表３は、レタス根腐病レース１菌株を耐病性品種「コスタリカ４号」の多くの個体が発病するほどに強度に接種した場合の遺伝資源を用いたレタス根腐病レース１耐病性検定結果である。罹病性品種は激しく発病し、レース判別用品種のレタス根腐病レース１に対して耐病性を示す「コスタリカ４号」も多くの個体が激しく発病しているような条件下において、「VP1148」および「VI185-4」の発病は軽度となっていたことが判明した。
【００５０】
【表３】
2018019714.tif 000005
【００５１】
図５は、「VI185-4」と「シナノグリーン」を交配親とした分離集団（F2）を用いた根腐病レース１耐病性検定結果を示す図である。図の横軸は発病度を示す。分離集団（F2）では、罹病性個体から強度耐病性個体まで耐病性の形質が分離した。
【００５２】
＜DNA抽出およびRAD-seqライブラリーの作成＞
VI185-4、シナノグリーンおよび96個体のF2世代のゲノムDNAをNucleo-Spin Plant II抽出キット（Machery-Nagel、Duren、Germany）を用いて抽出した。抽出した各ゲノムDNAを200ng / 22.25μlとなるよう調製し、制限酵素PacI（New England Biolabs社 、Beverly、MA、USA）で37℃、2時間処理した。その後、DNA精製キットAMPureXP (BeckmanCoulter, USA) を用いてDNAを精製した。精製したDNA断片にPacI配列アダプター（5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAT-3’)とT4 DNA Ligase（New England Biolabs社）を加え、16℃で2時間反応させた。その後、AMPureXPを用いて未結合のアダプターDNAの除去を行った。アダプターを結合させたDNA断片を制限酵素NlaIII（New England Biolabs社）で37℃、2時間処理した。その後、DNAの精製を行った。NlaIIIで処理したゲノムDNA断片にNlaIII配列アダプター（5’-TGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATG-3’)とT4 DNA Ligase（New England Biolabs社）を加え、16℃で2時間反応させた。その後、未結合のアダプターDNAの除去を行った。得られたDNA断片を鋳型として、PacIアダプター認識プライマー（5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACG-3’：Nは任意の塩基配列をインデックス配列として利用）とNlaIIIアダプター認識プライマー（5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGT-3’：Nは任意の塩基配列をインデックス配列として利用）とQ5 DNA polymerase（New England Biolabs社）を加え、PCR（98℃で2分間、その後、98℃10秒間、55℃20秒間、72℃30秒間を18サイクル、その後、72℃で5分間、10℃で保存）でDNA断片を増幅した。その後、PCR産物を1%アガロースゲルで電気泳動を行い、DNAをサイズ毎に分離後、200-400bpの範囲に含まれるDNAをアガロースゲルから切り出し、精製した。これをRAD-seqライブラリーとした（Matsumura et al. (2014) PloS one 9(1):e87138）。
【００５３】
＜DNAシーケンシング＞
RAD-seqライブラリーは、Illumina Hiseq2500システム（Illumina社製）によってペアエンドシークエンシング法（100bp×2）で配列決定した。
【００５４】
<DNA多型データの取得>
シーケンシングによって得られたレタス品種「VI185-4」、レタス品種「シナノグリーン」両品種のゲノム配列を次世代シークエンス解析用ソフト「CLC Genomics Workbench」を用いて比較した（Matsumura et al. (2014) PloS one 9(1):e87138）。比較から、「VI185-4」と「シナノグリーン」のゲノムの広範囲にわたる8053個のDNA多型マーカーを同定した。
【００５５】
＜F2個体のジェノタイピング＞
シーケンシングにより得られた「VI185-4」と「シナノグリーン」の後代系統 (F2) 96個体の部分的ゲノム配列情報を用い、各々の個体において上記8053個のマーカーに対する遺伝型が決定された。この遺伝型情報を元にして、WinQTLCartを使用し連鎖地図を作成した。図６は「VI185-4」と「シナノグリーン」の多型情報を利用して作製した連鎖地図である。作図には1124個の共優性マーカーを用いた。
【００５６】
＜QTL解析＞
次に、後代系統 (F3)のレタス根腐病レース１強度耐病性の検定データを加えQTL解析を行った。QTL解析は、WinQTLCartを用いたCIMによって実施された。P = 0.01でのゲノム全体の有意な閾値は、同じプログラムを用いた順列試験の1,000回の実行によって計算された。ロッドスコア（LOD score）が所定の閾値（図７，地上部のデータでは4.2、地下部のデータでは5.5）以上となる領域、つまり強度耐病性に連鎖性が認められる領域として、「VI185-4」の1g7連鎖群の強度耐病性と相関の高い領域(qR1-LG7)、1g8g1連鎖群の強度耐病性と相関の高い領域(qR1-LG8)が見出された（図６、図７）。レタスゲノムVersion8の情報を参照すると、1g7連鎖群の強度耐病性と相関の高い領域(qR1-LG7)は、約85Mbから100Mbであり、1g8g1連鎖群の強度耐病性と相関の高い領域(qR1-LG8)は、約1Mbから70Mbであった。
【００５７】
この解析からレタス根腐病レース１耐病性と相関の高いゲノム領域が明らかとなり、この領域周辺に含まれる、表１及び表２に示されるマーカー（配列番号：１〜配列番号：５６）が、レタス根腐病レース１強度耐病性形質に連鎖するDNAマーカーとして見出された。
【００５８】
＜レタス根腐病レース１強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーの検定＞
前述した方法と同様の手順で、レタス根腐病レース１に対して強度耐病性1品種(VP1148)、耐病性21品種、罹病性22品種、合計44品種のRAD-seqライブラリーを作製した。Illumina Hiseq seriesを用いてペアエンドシークエンシング法（100bp×2）で配列決定し、表１及び表２のマーカー（配列番号：１〜配列番号：５６）の有無を調べた。
【００５９】
表４は強度耐病性1品種(VP1148)、耐病性21品種、罹病性22品種、合計44レタス品種の部分的ゲノム配列情報を対象に表１及び表２の強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカー（配列番号：１〜配列番号：５６）の有無を調べた結果である。表中、「○」は強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーを有していたことを意味し、「×」は強度耐病性ゲノム領域識別用DNAマーカーが存在していなかったことを意味する。表４に示すように、表１及び表２に示すマーカー全てがVI185-4 (およびその祖先系統) と既存の罹病性および耐病性品種とを識別できることが明らかとなった。一方、レタス根腐病レース１強度耐病性品種(VP1148)以外の43全ての品種において、いずれのマーカーの存在も確認されなかった。
【００６０】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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