(57)【要約】      （修正有）【課題】ＴＮＦＲ：Ｆｃを含有するポリペプチドの保存に適し、アルギニン及びシステインを全く含まずに（完全に除去して）調製することができ、高温で極めて安定している水性医薬組成物の提供。【解決手段】ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部分である単離ポリペプチドと、８０ｍＭ〜１３０ｍＭの濃度で存在する塩と、ナトリウム及び／又はカリウムのリン酸塩緩衝液であって、２０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度で存在する、水性緩衝液と、スクロースであって、３４ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する賦形剤と、を含む水性組成物であって、アルギニンもシステインも該組成物に存在しないことを特徴とする、水性組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部分である単離ポリペプチドと、
８０ｍＭ〜１３０ｍＭの濃度で存在する塩と、
ナトリウム及び／又はカリウムのリン酸塩緩衝液であって、２０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度で存在する、水性緩衝液と、
スクロースであって、３４ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する賦形剤と、
を含む水性組成物であって、アルギニンもシステインも該組成物に存在しないことを特徴とする、水性組成物。
【請求項２】
前記塩の濃度が９０ｍＭである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記塩が塩化ナトリウムである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記単離ポリペプチドがエタネルセプトである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部分である単離ポリペプチドと、
８０ｍＭ〜１３０ｍＭの濃度で存在し、ただし１００ｍＭの濃度では存在しない塩と、  コハク酸塩緩衝液である、水性緩衝液と、
トレハロース及びスクロースの群から選択される賦形剤又はそれらの組合せと、
を含む水性組成物であって、遊離アミノ酸が該組成物に存在しないことを特徴とする、水性組成物。
【請求項６】
前記塩の濃度が９０ｍＭである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記塩が塩化ナトリウムである、請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項８】
前記単離ポリペプチドがエタネルセプトである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記賦形剤が５ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するスクロースである、請求項５〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
水性緩衝液が１５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、請求項５〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
水性緩衝液が２０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度で存在する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
水性緩衝液が５０ｍＭの濃度で存在する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
１種又は複数種の賦形剤を更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記賦形剤が、ラクトース、グリセロール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルトース、イノシトール、グルコース、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、組換えヘマグルチニン、デキストラン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリエチレンイミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、プロリン、Ｌ−セリン、グルタミン酸、アラニン、グリシン、リジン、サルコシン、γ−アミノ酪酸、ポリソルベート−２０、ポリソルベート−８０、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリソルベート、ポリオキシエチレンコポリマー、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、トリメチルアミンＮ−オキシド、ベタイン、亜鉛イオン、銅イオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、マグネシウムイオン、３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸塩、スクロースモノラウリン酸塩、又はそれらの組合せである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物のｐＨがｐＨ６．０〜ｐＨ７．０である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと２２ｍＭのコハク酸塩と９０ｍＭのＮａＣｌと１０ｍｇ／ｍＬのスクロースとを含み、前記組成物のｐＨがｐＨ６．３である、請求項５〜１１及び１３〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と９０ｍＭの塩化ナトリウムと３４ｍｇ／ｍＬのスクロースとを含み、前記組成物のｐＨがｐＨ６．３である、請求項１〜４及び１３〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＮＦＲ：Ｆｃを含有するポリペプチドの保存に適したいくつかの選択されたアミノ酸を含まない（除去された）安定した水性医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療用ポリペプチド製剤はほとんどの場合において使用するまで保管されている。しかしながら、ポリペプチドは水性形態にて長期間、特にアルギニン等の安定剤の非存在下において保存する場合に不安定である。水性保存に依るものの代替法は凍結乾燥形態のポリペプチドの調製であるが、乾燥ポリペプチドの再構成により、凝集又は変性が起こる場合が多い。このポリペプチド凝集は免疫原性を生じ得ることから望ましくない。
【０００３】
Ｆｃドメインに融合したＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体（ＴＮＦＲ：Ｆｃ）の市販の可溶型がエタネルセプトとして知られている。エタネルセプト（商品名エンブレル（ＥＮＢＲＥＬ）（登録商標））はＴＮＦ阻害剤として作用することにより腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を妨げる。ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結したヒト７５ｋＤａ（ｐ７５）腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分からなるこの二量体融合ポリペプチドは現在、ポリペプチドの凝集を防ぐためにＬ−アルギニン及び／又はＬ−システインを凝集阻害剤として用いて配合されている（特許文献１を参照されたい）。
【０００４】
その一方で、アルギニンは人によっては深刻な副作用を引き起こす場合がある。アナフィラキシーと呼ばれる重度なアレルギー反応、及び吐き気、胃痙攣又は排便回数の増加を含む胃の不快感がアルギニン注射後に起こる場合もある。他の起こり得る副作用としては、低血圧、並びに血中の多くの化学物質及び電解質の変化、例えば高カリウム、高塩化物、低ナトリウム、低リン酸塩、高血中尿素窒素及び高クレアチニンレベルが挙げられる。理論上はアルギニンが、出血のリスクを増大させ、血糖値を増加し、カリウムレベルを増加し得るとともに、鎌状赤血球症の症状を悪化させ得る。
【０００５】
システインは非必須アミノ酸であり、シスチンが互いに結合した２つのシステイン分子からなることから、シスチンと密接に関連するものである。システインは不安定な栄養素であり、シスチンへと容易に変換される。体内における過剰なシスチンは、シスチン結晶が体内にて形成され、膀胱又は腎臓の結石を生じさせ得る奇病であるシスチン蓄積症を引き起こす場合がある。糖尿病及びシスチン尿症を患っている人はシステインサプリメントによる副作用を被り得ることも知られている。
【０００６】
特許文献２には、特許文献１において開示された同様の組成物にて使用されているアルギニンを塩に置き換えたアルギニン無含有ポリペプチド含有組成物が開示されている。この塩は提示されている実施例によると１４０ｍＭである（実施例１を参照されたい）。高温での安定化に関しては言及されていない。実際、特許文献２に開示されている組成物は２〜８℃にて液体として又は冷凍して保管されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】欧州特許第１４７８３９４号
【特許文献２】国際公開第２０１３／００６４５４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はＴＮＦＲ：Ｆｃポリペプチドの保管を可能にする新規の安定した液体配合物を提供することによりこれらの課題に対処している。驚くべきことに本発明者らによって、本明細書で開示される安定した水性組成物はアルギニン及びシステインを全く含まずに（完全に除去して）調製することができ、高温で極めて安定していることが観察されている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様
本発明の第１の態様は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部分である単離ポリペプチドを含む水性配合物中の或る特定量の塩が、５℃を超える高温でのタンパク質の安定性の増大をもたらすことができるという所見に基づくものである。さらに、塩濃度の選択は生理学的な体内塩濃度に近くなるように行われる。
【００１０】
したがって、本発明は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部分である単離ポリペプチドと、
８０ｍＭ〜１３０ｍＭの濃度で存在する塩と、
トレハロース及びスクロース並びにそれらの組合せの群から選択される賦形剤と、
を含む水性組成物であって、アルギニンもシステインも該組成物に存在しないことを特徴とする、水性組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】全てのサンプルについて見出される相対変性温度（Ｔｏｎｓｅｔ／℃）を、３３０ｎｍ〜３１０ｎｍの蛍光比を用いて見出される誤差バーとともに示す棒グラフを示す図である。
【図２Ａ】全ての配合物についての初期時間でのｐＨ及び重量オスモル濃度の測定値を含む棒グラフを示す図である。
【図２Ｂ】全ての配合物についての初期時間でのｐＨ及び重量オスモル濃度の測定値を含む棒グラフを示す図である。
【図３Ａ】全ての時間（０〜１４日）及び条件（−２０℃、２５℃、５０℃、３回の凍結／融解（−２０℃／２５℃）、及び撹拌しながら３日間）でのタンパク質濃度の測定値（２８０ｎｍでの吸光度）を示す図である。
【図３Ｂ】配合物Ｆ３についての６ヶ月までの時間（０、１ヶ月、３ヶ月、及び６ヶ月）及び条件（−２０℃、２〜８℃、２５℃、１回、２回及び４回の凍結／融解（−２０℃／２５℃））でのタンパク質濃度の測定値（２８０ｎｍでの吸光度）を示す図である。
【図４Ａ】全ての時間（０〜１４日）及び条件（−２０℃、２５℃、５０℃、３回の凍結／融解（−２０℃／２５℃）、及び撹拌しながら３日間）での濁度の測定値（３３０ｎｍでの吸光度）を示す図である。
【図４Ｂ（１）】配合物Ｆ３についての６ヶ月までの時間（０、１ヶ月、３ヶ月、及び６ヶ月）及び条件（−２０℃、２〜８℃、２５℃、１回、２回及び４回の凍結／融解（−２０℃／２５℃））での濁度の測定値（３３０ｎｍでの吸光度）を示す図である。
【図４Ｂ（２）】イノベーター（ｔ＝０及び３ヶ月、２５℃）と比較した配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８についての３ヶ月までの時間（０、１ヶ月、及び３ヶ月）及び条件（−２０℃、２〜８℃、２５℃、１回、２回及び４回の凍結／融解（−２０℃／２５℃））での濁度の測定値（３３０ｎｍでの吸光度）を示す図である。
【図５Ａ】Ｓｔａｎｄａｒｄｓ−Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｕｎｔ  Ｃａｌを用いて全ての条件：−２０℃、２５℃、５０℃、３回の凍結／融解（−２０℃／２５℃）、及び撹拌しながら３日間にて測定したＦ１、Ｆ２、Ｆ３及びＦ４（１、２、３及び４）についてのＨＩＡＣによる不可視粒子分析を示す図である。
【図５Ｂ】Ｓｔａｎｄａｒｄｓ−Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｕｎｔ  Ｃａｌを用いてｔ＝０、１ヶ月及び３ヶ月で−２０℃、２〜８℃、２５℃、１回及び２回の凍結／融解（−２０℃／２５℃での１×及び２×ＦｚＴｈ）にて測定した配合物Ｆ３についてのＨＩＡＣによる不可視粒子分析を示す図である。
【図５Ｃ（１）】Ｓｔａｎｄａｒｄｓ−Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｕｎｔ  Ｃａｌを用いて配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８についてはｔ＝０、１ヶ月及び３ヶ月、更に配合物Ｆ３についてはｔ＝６ヶ月、−２０℃及び２〜８℃にて測定したＨＩＡＣによる不可視粒子分析を示す図である。
【図５Ｃ（２）】配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８についてはｔ＝０、１ヶ月及び３ヶ月、更に配合物Ｆ３についてはｔ＝６ヶ月、２５℃並びにＦ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８について−２０℃／２５℃での凍結／融解（１×、２×、４×（１、２、４））にて測定したＨＩＡＣによる不可視粒子分析を示す図である。
【図６Ａ】全ての条件：時間０及び１４日で−２０℃、２５℃、５０℃、３回の凍結／融解（−２０℃／２５℃）及び撹拌しながら３日間にてインキュベートした際のクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。（Ａ）はＦ１サンプル、（Ｂ）はＦ２サンプル、（Ｃ）はＦ３サンプル、及び（Ｄ）はＦ４サンプルである。
【図６Ｂ（１）】全ての条件：−２０℃、２〜８℃、２５℃、−２０℃／２５℃で２回の凍結／融解にてインキュベートしたｔ＝３ヶ月での配合物Ｆ３についてのクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図６Ｂ（２）】全ての条件：−２０℃、２〜８℃、２５℃、−２０℃／２５℃で４回の凍結／融解にてインキュベートしたｔ＝６ヶ月での配合物Ｆ３についてのクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図６Ｃ】ｔ＝０及び−２０℃／２５℃条件での１回の凍結／融解後の配合物Ｆ５、Ｆ６及びＦ７、並びにイノベーター（対照）についてのクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図６Ｄ】ｔ＝０及び−２０℃／２５℃条件での１回の凍結／融解後の配合物Ｆ８、Ｆ９及びＦ１、並びにイノベーター（対照）についてのクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図６Ｅ（１）】ｔ＝１ヶ月で−２０℃、２〜８℃及び２５℃、並びに−２０℃／２５℃条件での２サイクルの凍結／融解後の配合物Ｆ１及びＦ５についてのクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図６Ｅ（２）】ｔ＝３ヶ月で−２０℃、２〜８℃及び２５℃、並びに−２０℃／２５℃条件での４サイクルの凍結／融解後の配合物Ｆ１及びＦ５についてのクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図６Ｆ（１）】ｔ＝１ヶ月で−２０℃、２〜８℃及び２５℃、並びに−２０℃／２５℃条件での２サイクルの凍結／融解後の配合物Ｆ６及びＦ８についてのクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図６Ｆ（２）】ｔ＝３ヶ月で−２０℃、２〜８℃及び２５℃、並びに−２０℃／２５℃条件での４サイクルの凍結／融解後の配合物Ｆ６及びＦ８についてのクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図７Ａ】あらゆる時点での−２０℃条件についての全ての配合物におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。ピーク百分率を測定し、表に示す。
【図７Ｂ】あらゆる時点での２５℃条件についての全ての配合物におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。ピーク百分率を測定し、表に示す。
【図７Ｃ】あらゆる時点での５０℃条件についての全ての配合物におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。ピーク百分率を測定し、表に示す。
【図７Ｄ】３回の凍結／融解及び撹拌しながら３日間の条件についての全ての配合物におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。ピーク百分率を測定し、表に示す。
【図７Ｅ（１）】−２０℃、２〜８℃、２５℃でｔ＝３ヶ月、及び−２０℃／２５℃条件で２回の凍結／融解（２×ＦｘＴｈ）についての配合物Ｆ３におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図７Ｅ（２）】−２０℃、２〜８℃、２５℃でｔ＝６ヶ月、及び−２０℃／２５℃条件で４回の凍結／融解（２×ＦｘＴｈ）についての配合物Ｆ３におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図７Ｆ】２５℃でｔ＝０、１ヶ月、３ヶ月及び６ヶ月の配合物Ｆ３、並びにｔ＝３ヶ月及び２５℃でのイノベーターにおけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図７Ｇ（１）】２５℃でｔ＝０及び３ヶ月の配合物Ｆ３におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを、ｔ＝０でのイノベーター（対照）と比較して示す図である。
【図７Ｇ（２）】２５℃でｔ＝０及び３ヶ月の配合物イノベーターにおけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図７Ｈ】−２０℃、２〜８℃、２５℃でｔ＝０、１ヶ月及び３ヶ月、並びに−２０℃／２５℃条件で１回及び２回の凍結／融解（１×及び２×ＦｘＴｈ）についての配合物Ｆ３におけるサイズ排除ＨＰＬＣによるより長期の研究結果の表を提示している図である。
【図７Ｉ】ｔ＝０での配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９及びイノベーター（対照）におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図７Ｊ】−２０℃／２５℃での１サイクルの凍結／融解後の配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９及びイノベーターにおけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図７Ｋ（１）】−２０℃でｔ＝１ヶ月の配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図７Ｋ（２）】−２０℃でｔ＝３ヶ月の配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図７Ｌ（１）】２〜８℃でｔ＝１ヶ月の配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図７Ｌ（２）】２〜８℃でｔ＝３ヶ月の配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図７Ｍ（１）】２５℃でｔ＝１ヶ月の配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図７Ｍ（２）】２５℃でｔ＝３ヶ月の配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ８及びイノベーターにおけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図７Ｎ（１）】２５℃でｔ＝１ヶ月の配合物Ｆ１、Ｆ５及びＦ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図７Ｎ（２）】２５℃でｔ＝３ヶ月の配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ８及びイノベーターにおけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図７Ｏ】２５℃でｔ＝１ヶ月の配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５及びＦ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図７Ｐ】−２０℃／２５℃で２サイクルの凍結／融解後の配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図７Ｑ】配合物Ｆ３については６ヶ月まで、配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８については３ヶ月までの時点で−２０℃条件についての配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムの概要グラフを示す図である。ピーク百分率を測定し、表している（％プレピーク、％主ピーク及び％ポストピーク）。
【図７Ｒ】配合物Ｆ３については６ヶ月まで、配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８については３ヶ月までの時点で２〜８℃条件についての配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムの概要グラフを示す図である。ピーク百分率を測定し、表している（％プレピーク、％主ピーク及び％ポストピーク）。
【図７Ｓ】配合物Ｆ３については６ヶ月まで、配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８については３ヶ月までの時点で２５℃条件についての配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムの概要グラフを示す図である。ピーク百分率を測定し、表している（％プレピーク、％主ピーク及び％ポストピーク）。
【図７Ｔ】ｔ＝０並びに−２０℃／２５℃条件で１サイクル及び２サイクルの凍結／融解（１×及び２×ＦｘＴｈ）後の配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムの概要グラフを示す図である。ピーク百分率を測定し、表している（％プレピーク、％主ピーク及び％ポストピーク）。バーは以下の配合物順で示されている：各条件（すなわちｔ＝０、１×ＦｘＴｈ又は２×ＦｘＴｈ）に付きＦ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８。
【図７Ｕ】−２０℃、２〜８℃及び２５℃保存条件でのｔ＝０、１ヶ月、３ヶ月及び６ヶ月の配合物Ｆ３におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムの概要グラフを示す図である。
【図８Ａ】あらゆる時点での−２０℃条件についての全ての配合物における細胞ベースの効力アッセイの分析（参照標準の効力と比較した相対効力％）を含むグラフを示す図である。
【図８Ｂ】あらゆる時点での２５℃条件についての全ての配合物における細胞ベースの効力アッセイの分析（参照標準の効力と比較した相対効力％）を含むグラフを示す図である。
【図８Ｃ】あらゆる時点での５０℃条件についての全ての配合物における細胞ベースの効力アッセイの分析（参照標準の効力と比較した相対効力％）を含むグラフを示す図である。
【図８Ｄ】３回の凍結／融解（−２０℃／２５℃）及び撹拌しながら３日間の条件についての全ての配合物における細胞ベースの効力アッセイの分析（参照標準の効力と比較した相対効力％）を含むグラフを示す図である。
【図８Ｅ】下記の条件：時間０、１ヶ月、３ヶ月及び６ヶ月での−２０℃、２〜８℃、２５℃、並びに−２０℃／２５℃での１×、２×及び４×凍結／融解後の配合物Ｆ３における細胞ベースの効力アッセイの分析（参照標準の効力と比較した相対効力％）を含むグラフを示す図である。図面の隣にデータ表を提示している。
【図８Ｆ】２５℃で３ヶ月後のイノベーターと比較した、−２０℃、２〜８℃、２５℃で３ヶ月後（更にＦ３では６ヶ月後）、及び−２０℃／２５℃で４×凍結／融解後の配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８における細胞ベースの効力アッセイの分析（参照標準の効力と比較した相対効力％）を含むグラフを示す図である。図面の隣にデータ表を提示している。
【図９】初期時間でのｐＨ及び重量オスモル濃度の測定値を含む棒グラフを示す図である。
【図１０】全ての時間（０〜１４日）及び条件（−２０℃、２５℃、５０℃、３回の凍結／融解、及び撹拌しながら３日間）でのタンパク質濃度の測定値（２８０ｎｍでの吸光度）を示す図である。
【図１１】全ての時間（０〜１４日）及び条件（−２０℃、２５℃、５０℃、３回の凍結／融解、及び撹拌しながら３日間）での濁度の測定値（３３０ｎｍでの吸光度）を示す図である。
【図１２】Ｓｔａｎｄａｒｄｓ−Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｕｎｔ  Ｃａｌを用いて全ての条件：−２０℃、２５℃、５０℃、３回の凍結／融解及び撹拌しながら３日間で測定したＨＩＡＣによる不可視粒子分析を示す図である。
【図１３】全ての条件：時間０及び１４日で−２０℃、２５℃、５０℃、３回の凍結／融解及び撹拌しながら３日間にてインキュベートした際のクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。（Ａ）はＦ１サンプル及び（Ｂ）はＦ４サンプルである。
【図１４Ａ】あらゆる時点での−２０℃条件についての全ての配合物におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。ピーク百分率を測定し、表に示す。
【図１４Ｂ】あらゆる時点での２５℃条件についての全ての配合物におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。ピーク百分率を測定し、表に示す。
【図１４Ｃ】３回の凍結／融解及び撹拌しながら３日間の条件についての全ての配合物におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。ピーク百分率を測定し、表に示す。
【図１５Ａ】あらゆる時点での−２０℃条件についての全ての配合物における細胞ベースの効力アッセイの分析（参照標準の効力と比較した相対効力％）を含むグラフを示す図である。
【図１５Ｂ】あらゆる時点での２５℃条件についての全ての配合物における細胞ベースの効力アッセイの分析（参照標準の効力と比較した相対効力％）を含むグラフを示す図である。
【図１５Ｃ】３回の凍結／融解及び撹拌しながら３日間の条件についての全ての配合物における細胞ベースの効力アッセイの分析（参照標準の効力と比較した相対効力％）を含むグラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の第１の態様の詳細な説明
本発明は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部分である単離ポリペプチドと、
８０ｍＭ〜１３０ｍＭの濃度で存在する塩と、
トレハロース及びスクロース並びにそれらの組合せの群から選択される賦形剤と、
を含む水性組成物であって、アルギニンもシステインも該組成物に存在しないことを特徴とする、水性組成物に関する。
【００１３】
好ましくは、本組成物は遊離アミノ酸が該組成物に存在しないことを更に特徴とする。例えば本組成物は、アルギニン、システイン、プロリン、グリシン、メチオニン、ヒスチジン、セリン、バリン、リジン、グルタミン酸のいずれも含まない。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「組成物（"composition" or "compositions"）」という
用語は、それを必要とする個体に注入及び／又は投与するのに好適なように調製されたポリペプチドを含む配合物（複数種の場合もあり）を指し得る。「組成物」は「医薬組成物」と称されることもある。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は実質的に滅菌性であり、レシピエントに対して過度に毒性又は感染性の作用物質は全く含まない。さらに、本明細書で使用される場合、溶液又は水性組成物は、好適な溶媒（例えば水及び／又は他の溶媒、例えば有機溶媒）又は相溶性溶媒の混合物に溶解した１種又は複数種の化学物質を含有する流体（液体）調製物を意味し得る。さらに本明細書で使用される場合、「約」という用語はその値の指定値±２％を意味し、好ましくは「約」という用語は指定値（±０％）を正確に意味する。
【００１５】
本発明による組成物には、アルギニン又はシステイン（又は好ましくはプロリン、グリシン、メチオニン、ヒスチジン、セリン、バリン、リジン、グルタミン酸等の任意の他のアミノ酸）は単独では含まれていないか、又は組成物に添加されていないが、ポリペプチド自体はその鎖にアルギニン又はシステイン（又は好ましくはプロリン、グリシン、メチオニン、ヒスチジン、セリン、バリン、リジン、グルタミン酸等の任意の他のアミノ酸）アミノ酸残基を含有していてもよいことに留意されたい。
【００１６】
いくつかの実施形態では、発現するＦｃドメイン含有ポリペプチドは任意の標準的な方法により精製される。Ｆｃドメイン含有ポリペプチドが細胞内にて産生される場合、粒状残屑は、例えば遠心分離又は限外濾過により除去される。ポリペプチドが培地中に分泌される場合、このような発現系からの上清を初めに、標準的なポリペプチド濃縮フィルターを使用することで濃縮することができる。プロテアーゼ阻害剤を添加してタンパク質分解
を阻害してもよく、微生物の増殖を抑えるために抗生物質を含ませてもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン含有ポリペプチドは、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティークロマトグラフィー、及び／又は既知の若しくは未だ発見されていない精製法の任意の組合せを用いて精製される。例えばプロテインＡを使用することでヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づくＦｃドメイン含有ポリペプチドを精製することができる（Lindmark et al., 1983, J. Immunol. Meth. 62: 1-13）。
【００１７】
イオン交換カラムでの分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴ（商標）でのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム等）でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿等の他のポリペプチド精製法を必要に応じて利用してもよい。他のポリペプチド精製法を用いることができる。
【００１８】
好ましい実施形態では、塩濃度は８０ｍＭ〜１３０ｍＭ、好ましくは９０ｍＭ〜１３０ｍＭ、例えば１０５ｍＭ〜１３０ｍＭ、例えば約９０ｍＭ、１００ｍＭ又は１２５ｍＭである。塩濃度（好ましくはＮａＣｌ）は約９０ｍＭであるのが好ましい。濃度を問わず、塩は塩化ナトリウムであるのが好ましいが、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、次亜塩素酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫化水銀、クロム酸ナトリウム及び二酸化マグネシウム等の他の塩を使用してもよい。塩濃度のこの特定範囲によって、５０℃までの高温でも安定な本発明による組成物を得ることが可能になる。加えて、この範囲の値は従来技術において用いられる値（例えば１４０ｍＭ）よりもヒト体内の生理学的重量オスモル濃度に近く、そのため例えば皮下投与に使用するのにより適した組成物がもたらされる。
【００１９】
別の好ましい実施形態では、単離ポリペプチドはエタネルセプトである。エタネルセプトのＦｃコンポーネントには、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖２（ＣＨ２）ドメイン、定常重鎖３（ＣＨ３）ドメイン及びヒンジ領域が含まれるが、定常重鎖１（ＣＨ１）ドメインは含まれない。エタネルセプトはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）哺乳動物細胞発現系における組換えＤＮＡ技術により産生することができる。エタネルセプトは９３４のアミノ酸からなり、見掛けの分子量はおよそ１５０キロダルトンである（Physicians' Desk Reference, 2002, Medical Economics Company Inc．）。
【００２０】
単離ポリペプチドの濃度は好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬであり、更に好ましくは、濃度は約２５ｍｇ／ｍＬ又は約５０ｍｇ／ｍＬである。濃度は約５０ｍｇ／ｍＬであるのが好ましい。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、賦形剤は１０ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは３０ｍｇ／ｍＬ〜６５ｍｇ／ｍＬの濃度、より好ましくは６０ｍｇ／ｍＬの濃度のトレハロース二水和物形態のトレハロースである。別の好ましい実施形態では、賦形剤は５ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬの濃度のスクロースであり、スクロースは１０ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬの範囲で存在するのが好ましい。より好ましい実施形態では、スクロースの濃度は１０ｍｇ／ｍＬである。別のより好ましい実施形態では、スクロースの濃度は３４ｍｇ／ｍＬである。別の好ましい実施形態では、賦形剤はスクロースとトレハロースとの組合せであり、ここでの濃度はそれぞれ、５ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬの範囲である。賦形剤は約３４ｍｇ／ｍＬの濃度のスクロースであるのが好ましい。賦形剤は約１０ｍｇ／ｍＬの濃度のスクロースであるのがより好ましい。
【００２２】
本発明による組成物は水性緩衝液を更に含んでいてもよい。該水性緩衝液はリン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム若しくはクエン酸カリウム、マレイン酸、
酢酸アンモニウム、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（トリス）、酢酸塩、コハク酸塩、ジエタノールアミン、ヒスチジン、又はそれらの組合せであるのが好ましい。より好ましい実施形態では、該水性緩衝液はリン酸ナトリウムである。別のより好ましい実施形態では、該水性緩衝液はコハク酸塩である。別のより好ましい実施形態では、該水性緩衝液はヒスチジンである。組成物に緩衝液が単独で又は組み合わせて使用されるかに関わらず、その濃度は１５ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲であるのが好ましい。好ましい実施形態では、該濃度は２０ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは２５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であるのが好ましい。より好ましい実施形態では、該濃度は約２２ｍＭ又は約２５ｍＭである。別のより好ましい実施形態では、該濃度は約５０ｍＭである。好ましい緩衝液はリン酸ナトリウム及びコハク酸緩衝液であり、約２２ｍＭの濃度の後者（コハク酸緩衝液）が最も好ましいものである。
【００２３】
別の実施形態では、水性緩衝液の有無に関わらず、本発明による組成物は、該組成物において既に挙げられているもの（トレハロース又はスクロース）の他に１種又は複数種の賦形剤を更に含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物における１種又は複数種の賦形剤の濃度は約０．００１重量パーセント〜５重量パーセントであり、他の実施形態では、１種又は複数種の賦形剤の濃度は約０．１重量パーセント〜２重量パーセントである。賦形剤は当該技術分野において既知であり、既知の方法により製造され、市販の供給業者から入手可能である。該賦形剤は、ラクトース、グリセロール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルトース、イノシトール、グルコース、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＳＡ）、組換えヘマグルチニン（ＨＡ）、デキストラン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリエチレンイミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、プロリン、Ｌ−セリン、グルタミン酸、アラニン、グリシン、リジン、サルコシン、γ−アミノ酪酸、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ポリソルベート、ポリオキシエチレンコポリマー、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、トリメチルアミンＮ−オキシド、ベタイン、亜鉛イオン、銅イオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、マグネシウムイオン、３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸塩（ＣＨＡＰＳ）、スクロースモノラウリン酸塩、又はそれらの組合せであるのが好ましい。より好ましい実施形態では、賦形剤はポリソルベート２０であり、更に好ましい実施形態では、ポリソルベート２０は０．１％の濃度で存在する。別のより好ましい実施形態では、賦形剤はグリシンであり、更に好ましい実施形態では、グリシンは０．５％の濃度で存在する。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、組成物のｐＨはｐＨ６．０〜ｐＨ７．０であり、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８及び６．９から選択される任意のｐＨが可能である。より好ましい実施形態では、組成物のｐＨは約６．３である。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明による組成物は５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と１０ｍｇ／ｍＬのスクロースと１２５ｍＭの塩化ナトリウムとを含み、組成物のｐＨは６．３である。
【００２６】
別の特定の実施形態では、本発明による組成物は５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と１０ｍｇ／ｍＬのスクロースと１００ｍＭの塩化ナトリウムとを含み、組成物のｐＨは６．３である。
【００２７】
別の特定の実施形態では、本発明による組成物は５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと５
０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と６０ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物と０．１％のポリソルベート２０とを含み、組成物のｐＨは約ｐＨ６．２である。
【００２８】
更なる特定の実施形態では、本発明による組成物は５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと２５ｍＭのリン酸ナトリウムと３４ｍｇ／ｍＬのスクロースと９０ｍＭの塩化ナトリウムとを含み、組成物のｐＨは６．３である。
【００２９】
更なる特定の実施形態では、本発明による組成物は５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと２５ｍＭのリン酸ナトリウムと１０ｍｇ／ｍＬのスクロースと９０ｍＭの塩化ナトリウムと０．５％のグリシンとを含み、組成物のｐＨは６．３である。
【００３０】
更なる特定の実施形態では、本発明による組成物は５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと２２ｍＭのコハク酸塩と１０ｍｇ／ｍＬのスクロースと９０ｍＭの塩化ナトリウムとを含み、組成物のｐＨは６．３である。本組成物は更なるアミノ酸（エタネルセプトに含まれるものを除く）を含まない（除去されている）のが好ましい。本組成物はアルギニン、システイン、リジン、プロリン、グルタミン酸、セリン、メチオニンのいずれも含まないのが好ましい。
【００３１】
本明細書に開示の組成物を非経口、例えば皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、脳脊髄内、関節内、滑液嚢内及び／又は髄腔内投与することができる。
【００３２】
本発明による組成物に含まれる単離ポリペプチドの治療効果は当該技術分野において知られており、関節リウマチ、乾癬性関節炎、剛直性脊椎炎、肉芽腫症、クローン病、慢性閉塞性肺疾患、Ｃ型肝炎、子宮内膜症、喘息、悪液質、乾癬若しくはアトピー性皮膚炎、又は他の炎症性若しくは自己免疫関連の病気、障害若しくは病態の治療が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は障害を治療する（その症状を緩和する、その進行を止める又は遅らせる）のに十分な量（例えば治療的に有効な量）で投与することができる。
【００３３】
下記の実施例は本発明を説明するものであり、その範囲を限定するものとして解釈されない。
【００３４】
本発明の第１の態様の実施例
組成物の調製
下記の組成物を単純な混合により調製した：
【００３５】
原材料：
−２０℃で保存した、６２．５ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと１．２ｍｇ／ｍＬのトリスと４０ｍｇ／ｍＬのマンニトールと１０ｍｇ／ｍＬのスクロース（ｐＨ７．４）とを含むＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｕｎ  Ｍａｔｅｒｉａｌ。
【００３６】
ある一つのロットのエンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）市販配合物を対照サンプル（本明細書において「エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）」又は「イノベーター」と称される）として使用した。市販エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）配合物には、５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと２５ｍＭのリン酸Ｎａと２５ｍＭのアルギニンと１００ｍＭのＮａＣｌと１０ｍｇ／ｍＬのスクロース（ｐＨ６．３）とが含まれている。
【００３７】
エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）配合物と同じ配合物においてエタネルセプトを内部対照として使用した（５０．９ｍｇ／ｍＬのエタネルセプト、２５ｍＭのリン酸Ｎａ、２５ｍＭのアルギニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍｇ／ｍＬのスクロース（ｐＨ６．３））。この配合物をＦ１と呼んだ。
【００３８】
候補配合物：
Ｆ２：エタネルセプトの水性配合物（４９．４ｍｇ／ｍＬのエタネルセプト、２５ｍＭのリン酸Ｎａ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍｇ／ｍＬのスクロース（ｐＨ６．３））
Ｆ３：エタネルセプトの水性配合物（４９．５ｍｇ／ｍＬのエタネルセプト、２５ｍＭのリン酸Ｎａ、１２５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍｇ／ｍＬのスクロース（ｐＨ６．３））
Ｆ４：エタネルセプトの水性配合物（５０．９ｍｇ／ｍＬのエタネルセプト、５０ｍＭのリン酸Ｎａ、６０ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物（ｐＨ６．２）、０．１％のポリソルベート２０）
Ｆ５：エタネルセプトの水性配合物（５０．０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプト、２５ｍＭのリン酸Ｎａ、９０ｍＭのＮａＣｌ、３５ｍｇ／ｍＬのスクロース（ｐＨ６．３））
Ｆ６：エタネルセプトの水性配合物（５０．０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプト、２５ｍＭのリン酸Ｎａ、９０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．５％（５ｍｇ／ｍＬ）のグリシン（ｐＨ６．３））
Ｆ７：エタネルセプトの水性配合物（５０．０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプト、２８ｍＭのヒスチジン／ＨＣｌ、９０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍｇ／ｍＬのスクロース、６ｍｇ／ｍＬのグリシン（ｐＨ６．３））
Ｆ８：エタネルセプトの水性配合物（５０．０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプト、２２ｍＭのコハク酸塩、９０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍｇ／ｍＬのスクロース（ｐＨ６．３））。コハク酸緩衝液は２２ｍＭのコハク酸を用いて調製し、ＮａＯＨを添加してｐＨを６．３に調整した。
【００３９】
実施例１
内在性タンパク質の蛍光発光スペクトル及び静的光散乱
２６６ｎｍで励起する内在性タンパク質の蛍光発光スペクトルと、２６６ｎｍ及び４７３ｎｍの両方での静的光散乱データとを取得した。各サンプルをマイクロキュベットアレイ（ＭＣＡ）に充填し、Ｏｐｔｉｍ  １０００に入れて、コロイド安定性及び立体配座安定性の差を明らかにした。この研究では、熱勾配実験の温度を１℃毎１５℃から９５℃へと上昇させ、サンプルを各温度にて６０秒間保持し、熱平衡化させた。等温実験では、温度は６２℃に保持し、測定間に６０秒間保持して、サンプルを２００回繰り返して測定した。
【００４０】
サンプルに２６６ｎｍ及び４７３ｎｍのレーザー源を照射する時間は露光時間と称される。露光時間の選択は、蛍光発光の強度及びサンプルの光退色し易さ等の多くの因子によって変える。これらのサンプル全ての場合で１秒の露光時間を用いた。
【００４１】
露光時間を変えるのに併せて、検出器に入る光の量を制御する物理的スリットのサイズを変えることが可能である。この開口部のサイズを大きくすることで、測定される蛍光シグナルは増大するが、機器のスペクトル分解能が低減する。
【００４２】
Ｏｐｔｉｍ  １０００により実行される分析には一次及び二次という２つの逐次的なレベルのものが含まれる。Ｏｐｔｉｍ  １０００ソフトウェアは自動一次及び二次分析をもたらす。あらゆる自動データ適合ソフトウェアと同様に、自動関数が信頼性のある結果に反映されるよう入力データが良好な品質となるように細心の注意を払わなければならない。結果は全て熟練の分析家によって手動にて確認されている。
【００４３】
一次分析では生の蛍光発光データ及び光散乱データからスペクトルパラメータを抽出する：
Ｏｐｔｉｍは数学関数を用いることで、科学論文により一般的に用いられている予測波長（重心平均とも呼ばれる）等の一次レベル情報を与えることができる。これは平均発光
波長（又は質量中心）を調べるものであり、スペクトルデータにおける任意のノイズを除くのに良好なアプローチである。
散乱光の強度は２６０ｎｍ〜２７０ｎｍの積分強度（レイリー散乱ＵＶ励起光）から算出する。散乱効率は波長に大きく依存し、そのため波長が短ければ、光は溶液中の分子によってより効率的に散乱される。２６６ｎｍレーザーの散乱は、平均分子質量の小さい変化に対する非常に高感度なプローブである。
【００４４】
この研究では、３５０ｎｍと３３０ｎｍとの蛍光強度比を用いることで抗体の熱変性を調べており、２６６ｎｍ及び４７３ｎｍレーザーによる散乱光強度を用いることで熱により誘導されるサンプルの凝集を測定している。
【００４５】
二次分析は一次分析のパラメーターを取り、サンプルの溶融温度「Ｔｍ」及び凝集開始温度「Ｔａｇｇ」をそれらが存在する場合に求めるものである。溶融温度は温度の関数としてプロットされた一次データの変曲点として求められる。
【００４６】
凝集開始温度は散乱光強度がデータのノイズに対する閾値を超えて増大する温度として求められる。測定される最小温度から、測定される各散乱光強度の値をこれまでに測定された全ての値のデータセットに加える。各データ点において、分析が進むにつれて、線形適合を適用し、適合度を求める。データが直線から有意に逸脱している場合（ここで有意性はデータのノイズにより求められる）、これが凝集開始温度と規定される。逸脱していない場合、アルゴリズムをデータセットの次のデータ点まで進め、もう一度この逸脱について試験する。この方法は多様なタンパク質及び条件に対して試験を行うロバストなものである。大きな凝集が形成され沈殿が起こる極端な状況では、懸濁液中の粒子が入射レーザーの焦点体積から離れる場合、光散乱シグナルは実際に低下する場合がある。しかしながら、初期開始は何らかの沈殿が後に起こっても再現性を持って検出される。
【００４７】
全ての静的光散乱データの場合、サンプルが溶液から沈殿して見えるかどうかに関わらず、全てのデータ点が包含されている。異なる反復実験における同じサンプルでも沈殿する場合もあれば沈殿しない場合もあるが、それぞれの場合で凝集プロセスの開始は再現性がある。
【００４８】
結論
全てのサンプル間のＴａｇｇ及びＴｏｎｓｅｔデータは両方とも非常に類似していることが見出された。
Ｆ１緩衝液では、生成物は６３．７±０．３℃の蛍光のＴｏｎｓｅｔ及び６６．８±０．３℃のＴａｇｇを有することが見出された。
Ｆ２緩衝液では、生成物は６３．２±０．１℃の蛍光のＴｏｎｓｅｔ及び６５．９±０．１℃のＴａｇｇを有することが見出された。
Ｆ３緩衝液では、生成物は６３．４±０．３℃の蛍光のＴｏｎｓｅｔ及び６５．６±０．４℃のＴａｇｇを有することが見出された。
Ｆ４緩衝液では、生成物は６３．３±０．１℃の蛍光のＴｏｎｓｅｔ及び６４．８±０．１℃のＴａｇｇを有することが見出された。
Ｆ５緩衝液では、生成物は６４．５±０．４℃の蛍光のＴｏｎｓｅｔ及び６３．０±０．６℃のＴａｇｇを有することが見出された。
Ｆ６緩衝液では、生成物は６３．９±０．５℃の蛍光のＴｏｎｓｅｔ及び６４．５±０．２℃のＴａｇｇを有することが見出された。
Ｆ７緩衝液では、生成物は６１．０±０．７℃の蛍光のＴｏｎｓｅｔ及び６３．６±０．１℃のＴａｇｇを有することが見出された。
Ｆ８緩衝液では、生成物は６４．０±０．０℃の蛍光のＴｏｎｓｅｔ及び６６．２±０．８℃のＴａｇｇを有することが見出された。
エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）イノベーター自体は６３．４±０．１℃の蛍光のＴｏｎｓｅｔ及び６５．６±０．１℃のＴａｇｇを有することが見出された。
【００４９】
したがってデータから、全てのサンプル間のコロイド安定性及び立体配座安定性の両方における高度の類似性が示される。
【００５０】
図１に配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８及びイノベーター（対照）についての結果を示し、その傾向はＦ５＞Ｆ８＞Ｆ６＞Ｆ１＞エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）＞Ｆ７である。
【００５１】
熱勾配実験の後に等温実験を行った。分析及び熱勾配結果の検討により、全てのサンプルのＴａｇｇ値が約６４℃であると考えられ、そのため６２℃、すなわちＴａｇｇ直下であるが、サンプルが妥当な期間内で立体配座変化及びコロイド変化を受けるのに十分近い温度を等温実験に選択した。
【００５２】
蛍光について見出されたＴｏｎｓｅｔ値は６３．２℃〜６３．７℃、平均は６３．４℃であり、標準偏差は０．３℃と比較的低く、このことから５つのサンプル（Ｆ１〜Ｆ４及びエンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）液体配合物）間における高度な比較可能性（comparability：同等性）が示された。
【００５３】
全てのサンプルの安定性もまた、ほとんど同等のものであるとみなすことができる。
【００５４】
実施例２
短期ストレス安定性研究
アプローチ
短期（２週間）安定性研究を、より長期の研究を実施する前に考え得る配合物を評価するために行った。さらに６ヶ月までの長期安定性研究をＦ３配合物について行い、３ヶ月までの長期安定性研究をＦ５、Ｆ６及びＦ８配合物について行った。
【００５５】
９つの配合物を試験した：
【００５６】
【表１】
2018109064.tif 000002
【００５７】
撹拌及び凍結融解ストレスに加えて２種の高温（２５℃及び５０℃）及び１つのリアルタイム温度に曝した後のｔ＝０、３日、７日及び１４日での各配合物の安定性を評価した。
【００５８】
Ｆ３配合物の場合、−２０℃凍結／２５℃融解に供した１回、２回及び４回の凍結融解サイクルによる凍結融解ストレスに加えて、０、１ヶ月、３ヶ月及び６ヶ月の時点での３種の温度（２〜８℃、−２０℃及び２５℃）に曝した後の安定性を評価した。
【００５９】
Ｆ５、Ｆ６及びＦ８配合物の場合、−２０℃凍結／２５℃融解に供した１回、２回及び４回の凍結融解サイクルによる凍結融解ストレスに加えて、０、１ヶ月及び３ヶ月の時点での３種の温度（２〜８℃、−２０℃及び２５℃）に曝した後の安定性を評価した。
【００６０】
８つの分析アッセイのパネルを用いて、各配合物の安定性を評価した。
ｐＨ（ｔ＝０のみ）
重量オスモル濃度（ｔ＝０のみ）
タンパク質濃度（Ａ２８０ｎｍ）
濁度（Ａ３３０ｎｍ）
ＨＩＡＣ
還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシーブルー染色剤）
サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）
細胞ベースの効力
【００６１】
ｐＨ及び重量オスモル濃度
図２Ａ及び図２Ｂに初期時間でのｐＨ及び重量オスモル濃度の測定値を含む棒グラフを示す。それぞれの条件でサンプルを構成する前に全ての配合物について測定されたこれらの値は標的ｐＨ又は重量オスモル濃度の理論値の範囲内にあった。
【００６２】
タンパク質濃度／Ａ２８０
図３Ａは、全ての時間（０〜１４日）及び条件（−２０℃、２５℃、５０℃、３回の凍結／融解（３×ＦｚＴｈ）、及び撹拌しながら３日間）でのタンパク質濃度の測定値（２８０ｎｍでの吸光度）を示す。得られたデータはあらゆる時点及び条件で全てのサンプルについて標的値の範囲内及びアッセイの変動性の範囲内に保たれていた。
【００６３】
図３Ｂは、配合物Ｆ３についての時間０、１ヶ月、３ヶ月、及び６ヶ月並びに条件（−２０℃、２〜８℃、２５℃、１回、２回及び４回の凍結／融解（１×、２×及び４×ＦｚＴｈ））でのタンパク質濃度の測定値（２８０ｎｍでの吸光度）を示す。標的値（５０ｍｇ／ｍＬ）からのタンパク質濃度の僅かな増大が観察されるが、依然３ヶ月までは全ての条件においてアッセイ変動性の範囲内に保たれている。この図３Ｂを構成するデータを下記表に提示する：
【００６４】
【表２】
2018109064.tif 000003
【００６５】
下記表にｔ＝０、並びに−２０℃、２〜８℃及び２５℃でｔ＝３ヶ月、並びに−２０℃／２５℃で４サイクルの凍結融解後の配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ８及びイノベーター（対照、２５℃のみｔ＝０及びｔ＝３）について得られたデータをまとめている。タンパク質濃度は全ての配合物について標的値（５０ｍｇ／ｍＬ）であるか又はその付近である。
【００６６】
【表３】
2018109064.tif 000004
【００６７】
時間＝３ヶ月での配合物Ｆ５、Ｆ６及びＦ８（２８０ｎｍでの吸光度）についてのタンパク質濃度の測定値はＦ１を含めたこれらの配合物全てにおいて全ての条件で標的値に保たれていた（図には示していない）。
【００６８】
濁度／Ａ３３０
図４Ａは、全ての時間（０〜１４日）及び条件（−２０℃、２５℃、５０℃、３回の凍結／融解（３×ＦｚＴｈ）、及び撹拌しながら３日間）での濁度の測定値（３３０ｎｍでの吸光度）を示す。この結果によると、濁度の有意な増大が５０℃条件にて検出され、Ｆ３が経時的に最も低い増大を呈した。−２０℃、２５℃、凍結融解又は撹拌ではいずれの配合物でも有意な変化は観察されなかった。
【００６９】
図４Ｂ（１）に時間ｔ＝０、１ヶ月及び３ヶ月並びに条件（−２０℃、２〜８℃、２５℃、１回の凍結／融解（１×及び２×ＦｚＴｈ（−２０／２５℃））での配合物Ｆ３についての濁度の測定値（３３０ｎｍでの吸光度）を示している。図４Ｂ（１）に見られるように、濁度の僅かな増大が２５℃での３ヶ月の保存に供したサンプルについて観察された。３ヶ月後でも−２０℃、２〜８℃で保存した、また２回の凍結融解サイクルに供したサンプルについては変化が観察されなかった。この図４Ｂ（１）を構成するデータを下記表に提示する：
【００７０】
【表４】
2018109064.tif 000005
【００７１】
下記表にｔ＝０及びｔ＝３ヶ月、並びに−２０℃／２５℃での１サイクル、２サイクル及び４サイクルの凍結融解後の配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、並びにｔ＝０及び２５℃でのイノベーター（対照）について得られたデータをまとめている。配合物Ｆ１、Ｆ５及びＦ８は濁度に主な変化を呈さなかった。Ｆ６は２５℃で保存した場合に最も高い濁度の変動を呈した。
【００７２】
【表５】
2018109064.tif 000006
【００７３】
上述のように、配合物Ｆ５、Ｆ８又はＦ１については全ての条件にてｔ＝０と比較して１ヶ月又は３ヶ月後でも更なる濁度の有意な増大は観察されなかった（図４Ｂ（２））。
【００７４】
ＨＩＡＣ（液体粒子カウンタ）
方法：
ＨＩＡＣ  ９７０３  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを実験に使用した。ＨＩＡＣはサンプラー、粒子カウンタ及びＲｏｙｃｏセンサからなるものである。Ｒｏｙｃｏセンサは２μｍ〜１００μｍの粒子をサイジング及びカウントすることが可能である。この機器は１００００個／ｍＬ以下の粒子をカウントすることができる。
サンプル容量（ｍＬ）：０．２
流量ｍＬ／分：１０
稼動回数（１サンプル当たり）：４（最初の稼動は除く）
【００７５】
手順：
初めに希釈せずにサンプルを分析したが、サンプルの粘度が高かったため、より正確な
結果を得るには、サンプルを希釈する必要があることが分かった。
サンプルを１時間室温に置いた。
サンプルを適切な配合物緩衝液にて１：３に希釈して、脱気して（１．５時間）、測定前に慎重に混合した。
Ｓｔａｎｄａｒｄｓ−Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｕｎｔ  Ｃａｌ：システムの適合性の確認を、ＥＺＹ−Ｃａｌの５μｍ及び１５μｍ粒度対照標準を用いて行った。対照標準は最初に分析し、センサの分解能を検証した。
【００７６】
図５Ａは、Ｓｔａｎｄａｒｄｓ−Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｕｎｔ  Ｃａｌを用いて全ての条件：−２０℃、２５℃、５０℃、３回の凍結／融解（３×ＦｚＴｈ）、及び撹拌しながら３日間にて測定したＨＩＡＣによる不可視粒子分析を示す。
【００７７】
図５Ａに見られるように、不可視粒子数の有意な増大が５０℃条件でのＦ１、Ｆ２及びＦ４について測定され、Ｆ２は７日と早くから最も高い増大を示した。
【００７８】
−２０℃、２５℃、３×ＦｚＴｈ又は３日の室温での撹拌後ではいずれの配合物でも有意な変化は観察されなかった。Ｆ３配合物はｔ＝０対照と比較して全ての条件及び時点での保存後でも不可視粒子の変化を呈さなかった。
【００７９】
図５Ｂは、Ｓｔａｎｄａｒｄｓ−Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｕｎｔ  Ｃａｌを用いてｔ＝０、１ヶ月及び３ヶ月で−２０℃、２〜８℃、２５℃、１回及び２回の凍結／融解（−２０℃／２５℃での１×及び２×ＦｚＴｈ）にて測定した配合物Ｆ３についてのＨＩＡＣによる不可視粒子分析を示す。図５Ｂに見られるように、３ヶ月での２５℃条件について不可視粒子数の更なる僅かな増大が観察されている。−２０℃条件が３ヶ月で不可視粒子の最大の増大を呈している。ｔ＝０から３ヶ月後の時点での２〜８℃又は２サイクルの凍結融解後では変化は観察されていない。１ヶ月では−２０℃条件で不可視粒子数の更なる僅かな増大が観察されている。
【００８０】
この図５Ｂを構成するデータを下記表に提示する：
【００８１】
【表６】
2018109064.tif 000007
【００８２】
図５Ｃ（１）及び（２）に、Ｓｔａｎｄａｒｄｓ−Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｕｎｔ  Ｃａｌを用いてｔ＝０、１ヶ月及び３ヶ月で−２０℃、２〜８℃（図５Ｃ（１））、２５℃、１回、２回、３回及び４回の凍結／融解（−２０℃／２５℃での１×、２×、３×及び４×ＦｚＴｈ）（図５Ｃ（２））にて測定された配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８についてのＨＩＡＣによる不可視粒子分析を示している。
【００８３】
この図５Ｃ（１）を構成するデータを下記表に提示する：
【００８４】
【表７】
2018109064.tif 000008
【００８５】
図５Ｃ（２）に、Ｓｔａｎｄａｒｄｓ−Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｕｎｔ
Ｃａｌを用いてｔ＝０、ｔ＝１ヶ月及びｔ＝３ヶ月、並びに−２０℃／２５℃での１回、２回及び４回の凍結／融解（１×、２×及び４×ＦｚＴｈ）にて配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８について測定されたＨＩＡＣによる不可視粒子分析を示している。
【００８６】
この図５Ｃ（２）を構成するデータを下記表に提示する：
【００８７】
【表８】
2018109064.tif 000009
【００８８】
図５Ｃに見られるように、ｔ＝０から３ヶ月後の時点の２〜８℃ではＦ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８について不可視粒子数の有意な変化は観察されなかった。加えて、Ｆ１及びＦ６は２５℃で同様に働き、３ヶ月まで経時的に不可視粒子が増大した。Ｆ８では２５℃で経時的な有意な変化はなく、そのことからこの配合物の安定性が示されている。
【００８９】
２５℃で３ヶ月後の対照サンプル（イノベーター製品）について不可視粒子数の有意な変化は観察されなかった。イノベーター製品はＦ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８と比較して経時的に最大の粒子数を呈した（下記表を参照されたい）。
【００９０】
【表９】
2018109064.tif 000010
【００９１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
図６Ａは、全ての条件：時間０及び１４日で−２０℃、２５℃、５０℃、３回の凍結／融解及び撹拌しながら３日間にてインキュベートした際のクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。（Ａ）はＦ１サンプル、（Ｂ）はＦ２サンプル、（Ｃ）はＦ３サンプル、及び（Ｄ）はＦ４サンプルである。
【００９２】
あらゆる時点での５０℃条件について全ての配合物にて有意な変化が観察され、１４日サンプルはおそらく、存在する付加的なＨＭＷバンド（約２５０ｋＤａ超）により明らか
なように共有結合的に修飾された高分子量（ＨＭＷ）種と、全ての配合物について５０℃で３日と早くから存在していた低分子量（ＬＭＷ）分解種（５０ｋＤａ未満）とを示していた。
【００９３】
他の全ての条件及び時点について参照標準と比較していずれの配合物でも変化は観察されなかった。
【００９４】
図６Ｂ（１）は、全ての条件：−２０℃、２〜８℃、２５℃、−２０℃／２５℃で２回の凍結／融解にてインキュベートしたｔ＝３ヶ月での配合物Ｆ３についてのクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【００９５】
２５℃で３ヶ月後には、約１００ｋＤａ及び約１４０ｋＤａでの追加のバンドの出現、並びに約５０ｋＤａ及び約３０ｋＤａでのＬＭＷ（低分子量）分解バンドの強度の増大を含む変化が観察された。
【００９６】
２サイクルの凍結融解（−２０℃／２５℃）後には、約３０ｋＤａ及び約５０ｋＤａのバンドの暗化を含む変化が観察された。
【００９７】
図６Ｂ（２）は、全ての条件：−２０℃、２〜８℃、２５℃、−２０℃／２５℃で４回の凍結／融解にてインキュベートしたｔ＝６ヶ月での配合物Ｆ３についてのクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【００９８】
２５℃で６ヶ月後にはＦ３に、約１００ｋＤａでの追加のバンドの出現、並びに約５０ｋＤａ及び約３０ｋＤａでのＬＭＷ分解バンドの強度の増大を含む変化が観察されている。
【００９９】
図６Ｃは、ｔ＝０及び−２０℃／２５℃条件での１回の凍結／融解後の配合物Ｆ５、Ｆ６及びＦ７、並びにイノベーター（対照）についてのクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０１００】
ｔ＝０での配合物Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７及びイノベーター（対照）は参照標準と同等のものである。
【０１０１】
−２０℃／２５℃で１サイクルの凍結融解後の配合物Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７は参照標準と同等のものである。
【０１０２】
図６Ｄは、ｔ＝０及び−２０℃／２５℃条件での１回の凍結／融解後の配合物Ｆ８、Ｆ９及びＦ１、並びにイノベーター（対照）についてのクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０１０３】
ｔ＝０及び−２０℃／２５℃での１サイクルの凍結融解後の配合物Ｆ８、Ｆ９、Ｆ１は参照標準と同等のものである。
【０１０４】
図６Ｅ（１）は、ｔ＝１ヶ月で−２０℃、２〜８℃及び２５℃、並びに−２０℃／２５℃条件での２サイクルの凍結／融解後の配合物Ｆ１及びＦ５についてのクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０１０５】
１ヶ月の時点の全ての条件での配合物Ｆ１及びＦ５は参照標準と同等のものである。
【０１０６】
配合物Ｆ５について更なる約１００ｋＤａバンドの僅かな痕跡が２５℃で１ヶ月後に示
されている。
【０１０７】
図６Ｅ（２）は、ｔ＝３ヶ月で−２０℃、２〜８℃及び２５℃、並びに−２０℃／２５℃条件での４サイクルの凍結／融解後の配合物Ｆ１及びＦ５についてのクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０１０８】
２５℃で３ヶ月後のＦ１と比較した上での２５℃で３ヶ月後のＦ５について約１００ｋＤａ、約５０ｋＤａ及び約３０ｋＤでの非常に微かなバンドの出現の僅かな痕跡もこれらの更なるバンドを実証している。
【０１０９】
図６Ｆ（１）は、ｔ＝１ヶ月で−２０℃、２〜８℃及び２５℃、並びに−２０℃／２５℃条件での２サイクルの凍結／融解後の配合物Ｆ６及びＦ８についてのクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０１１０】
１ヶ月後の−２０℃及び２〜８℃での配合物Ｆ６及びＦ８は、−２０℃／２５℃での２サイクルの凍結／融解を含め、参照標準と同等のものであることが分かっている。
【０１１１】
２５℃で１ヶ月後の配合物Ｆ６はいくつかの更なる低分子量分解バンドの痕跡とともに主バンドのほぼ完全な喪失を示している。
【０１１２】
図６Ｆ（２）は、ｔ＝３ヶ月で−２０℃、２〜８℃及び２５℃、並びに−２０℃／２５℃条件での２サイクルの凍結／融解後の配合物Ｆ６及びＦ８についてのクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０１１３】
２５℃で３ヶ月後のＦ６について１５０ｋＤのバンドの消失及びいくつかのＬＭＷ分解バンドの出現を含む有意な変化が観察されている。約５０ｋＤａ及び約３０ｋＤでの非常に微かなバンドの出現のほんの僅かな痕跡がＦ６及びＦ８の両方に示されている。
【０１１４】
ＳＥ  ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
条件：
カラム：ＴＳＫＧｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ３０００  ４．６×３００ｍｍ、４μｍ（Tosoh、１８６７５）  ＣＶ＝２．５ｍＬ
カラム温度：２５℃
移動相：０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量：０．３５ｍＬ／分
実行時間：２０分
サンプル充填量：３７．６μｇ
オートサンプラー温度：４℃
【０１１５】
図７は、あらゆる時点での全ての条件：−２０℃（７Ａ）、２５℃（７Ｂ）、５０℃（７Ｃ）、３回の凍結／融解及び撹拌しながら３日間（７Ｄ）についての全ての配合物におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。ピーク百分率を測定し、表に示す。
【０１１６】
あらゆる時点で５０℃条件について全ての配合物において有意な変化が観察され、Ｆ２は３日と早くからプレピーク凝集体の劇的な増大とともに全体として最も悪く働くものであった（それぞれ２６．３％及び２２．７％）。Ｆ１及びＦ３は５０℃で３日後にプレピーク凝集の比較的より緩やかな増大を示していたが（それぞれ１１．９％及び９．３％）、１４日後、４つ全ての配合物についてプレピーク凝集体が５０％を超えて増大した。
【０１１７】
また２５℃条件では、７日後に全ての配合物について主ピーク面積％及び％プレピーク
の両方における僅かな変化が起こり、％プレピークは１４日で更に増大し、Ｆ４はこの条件にて全体としてプレピーク凝集体の最大の増大（０．５％）を示し、Ｆ３は凝集の最小の増大を示した。
【０１１８】
撹拌及び凍結融解又は−２０℃で最大１４日間の保存の条件に曝した場合、いずれの配合物でも有意な変化は観察されなかった。
【０１１９】
図７Ｅ（１）は、−２０℃、２〜８℃、２５℃でｔ＝３ヶ月、及び−２０℃／２５℃条件で２回の凍結／融解（２×ＦｘＴｈ）についての配合物Ｆ３におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【０１２０】
他の全ての条件と比較した上での３ヶ月２５℃に曝したこの配合物について有意なプレピーク凝集及びポストピーク分解が観察されている。
【０１２１】
図７Ｅ（２）は、−２０℃、２〜８℃、２５℃でｔ＝６ヶ月、及び−２０℃／２５℃条件で４回の凍結／融解（４×ＦｘＴｈ）についての配合物Ｆ３におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【０１２２】
６ヶ月後の他の全ての条件及び４サイクルの凍結融解後と比較した上での６ヶ月２５℃に曝したこの配合物について有意なプレピーク凝集及びポストピーク分解が観察されている。
【０１２３】
図７Ｆは、２５℃でｔ＝０、１ヶ月、３ヶ月及び６ヶ月の配合物Ｆ３、並びに２５℃で３ヶ月後の配合物イノベーターにおけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【０１２４】
配合物Ｆ３は１ヶ月及び３ヶ月の時点と比較してプレピーク凝集体及びポストピーク凝集体の更なる増大を示している。
【０１２５】
２５℃で３ヶ月のイノベーターは２５℃で６ヶ月を含む他の全ての試験条件でのＦ３と比較して全体として最大の％プレピークを示している。
【０１２６】
図７Ｇ（１）は、２５℃でｔ＝０及び３ヶ月の配合物Ｆ３におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを、ｔ＝０でのイノベーター（対照）と比較して示す図である。
【０１２７】
ｔ＝０でのイノベーター（対照）は、全体として２５℃で３ヶ月後のＦ３よりも有意に高いプレピーク凝集体を呈するが、より低いポストピーク分解体を呈している。
【０１２８】
図７Ｇ（２）は、２５℃でｔ＝０及び３ヶ月の配合物イノベーターにおけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【０１２９】
イノベーターについてはｔ＝０でのイノベーターと比較して２５℃で３ヶ月後にプレピーク凝集体及びポストピーク分解体の両方の増大が観察されている。
【０１３０】
図７Ｈは、−２０℃、２〜８℃、２５℃でｔ＝０、並びに−２０℃／２５℃条件で１回及び２回の凍結／融解（１×及び２×ＦｘＴｈ）についての配合物Ｆ３におけるサイズ排除ＨＰＬＣによるより長期の研究結果の表を提示している。
【０１３１】
配合物Ｆ３はプレピーク凝集体の有意な更なる増大（２５℃でｔ＝１ヶ月から０．９％）及びポストピーク分解体の僅かな更なる増大（１ヶ月からのＬＭＷ−１ピークの０．１％の更なる増大）を示している。
【０１３２】
図７Ｉは、ｔ＝０での配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９及びイノベーター（対照）におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【０１３３】
これらの配合物は全てｔ＝０で同様のクロマトグラフプロファイルを示す。
【０１３４】
ｔ＝０での配合物Ｆ９はＦ１、Ｆ６、Ｆ６、Ｆ７及びＦ８よりも僅かに高いプレピークを呈している。
【０１３５】
ｔ＝０でのイノベーター（対照）はｔ＝０でのＦ１、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８及びＦ９と比較していずれも有意に高い％プレピーク及びポストピークを呈している。
【０１３６】
図７Ｊは、−２０℃／２５℃での１サイクルの凍結／融解後の配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８及びＦ９におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【０１３７】
配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７及びＦ８は１サイクルの凍結融解後でも同等であり、Ｆ９は僅かに高い％プレピークを示している（但し、ｔ＝０から更に増大はしていない）。
【０１３８】
下記表にｔ＝０及び−２０℃／２５℃条件での１サイクルの凍結／融解（１×ＦｘＴｈ）後の配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８及びＦ９、並びにイノベーター（対照）におけるサイズ排除ＨＰＬＣによるより長期の研究結果を提示している。
【０１３９】
【表１０】
2018109064.tif 000011
【０１４０】
対照（イノベーター）はｔ＝０でＦ１、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８及びＦ９と比較して最大の％プレピーク凝集体を呈している。
【０１４１】
図７Ｋ（１）は、−２０℃でｔ＝１ヶ月の配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【０１４２】
−２０℃の保存条件で１ヶ月後では配合物間に有意差は示されていない。配合物Ｆ５に
ついてはほんの僅かなより小さいポストピークが観察されている。
【０１４３】
図７Ｋ（２）は、−２０℃でｔ＝３ヶ月の配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【０１４４】
−２０℃の保存条件で３ヶ月後ではＦ１、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８について配合物間に有意差は示されていない。他の全ての配合物と比較してＦ３については−２０℃で３ヶ月後により高いプレピーク及びポストピークが観察された。
【０１４５】
図７Ｌ（１）は、２〜８℃でｔ＝１ヶ月の配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【０１４６】
２〜８℃の保存条件で１ヶ月後では配合物間に有意差は示されていない。配合物Ｆ５についてはほんの僅かなより小さいポストピークが観察されている。
【０１４７】
図７Ｌ（２）は、２〜８℃でｔ＝３ヶ月の配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【０１４８】
２〜８℃の保存条件で３ヶ月後では配合物間に有意差は示されていない。他の全ての配合物と比較してＦ３については２〜８℃で３ヶ月後により高いプレピーク及びポストピークが観察された。
【０１４９】
図７Ｍ（１）は、２５℃でｔ＝１ヶ月の配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【０１５０】
２５℃条件で１ヶ月後にＦ６において主ピークの完全な喪失がポストピークへの分解をもたらすことを含む劇的な変化が観察されている。２５℃で１ヶ月後でも他の全ての配合物（Ｆ１、Ｆ５、Ｆ８）においては有意な変化は観察されていない。
【０１５１】
図７Ｍ（２）は、２５℃でｔ＝３ヶ月の配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ８及びイノベーターにおけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【０１５２】
２５℃の保存条件で３ヶ月後ではＦ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ８について配合物間に有意差は示されておらず、Ｆ５については僅かに小さいポストピークが観察されている。イノベーターによって、２５℃で３ヶ月後のＦ３について最大のプレピーク及びポストピークが観察されることが実証される。Ｆ６は主ピークの完全な喪失を含むプロファイルの劇的な変化を呈している。
【０１５３】
図７Ｎ（１）は、２５℃でｔ＝１ヶ月の配合物Ｆ１、Ｆ５及びＦ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【０１５４】
図７Ｎ（２）は、２５℃でｔ＝３ヶ月の配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ８及びイノベーターにおけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【０１５５】
２５℃の保存条件で３ヶ月後ではＦ１、Ｆ３、Ｆ５及びＦ８配合物の間に有意差はない。イノベーターは他の全ての配合物と比較した上での有意なプレピーク凝集体及びポストピーク分解体を示している。
【０１５６】
図７Ｏは、２５℃でｔ＝１ヶ月の配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５及びＦ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【０１５７】
配合物Ｆ３は２５℃で１ヶ月後に最大の％プレピーク凝集体を呈している。
【０１５８】
図７Ｐは、−２０℃／２５℃で２サイクルの凍結／融解後の配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【０１５９】
−２０℃／２５℃で２サイクルの凍結融解後では配合物間に有意差は示されていない。配合物Ｆ５についてほんの僅かに小さいポストピークが観察されている。
【０１６０】
下記表に−２０℃、２〜８℃及び２５℃の保存条件でのｔ＝０、１ヶ月及び３ヶ月、並びに−２０℃／２５℃条件での１サイクル、２サイクル及び４サイクルの凍結／融解（１×、２×及び４×ＦｘＴｈ）後の配合物Ｆ１におけるサイズ排除ＨＰＬＣによるより長期の研究結果を提示している。
【０１６１】
【表１１】
2018109064.tif 000012
【０１６２】
下記表に−２０℃、２〜８℃及び２５℃の保存条件でのｔ＝０、１ヶ月及び３ヶ月、並びに−２０℃／２５℃条件での１サイクル、２サイクル及び４サイクルの凍結／融解（１×、２×及び４×ＦｘＴｈ）後の配合物Ｆ５におけるサイズ排除ＨＰＬＣによるより長期の研究結果を提示している。
【０１６３】
【表１２】
2018109064.tif 000013
【０１６４】
下記表に−２０℃、２〜８℃及び２５℃の保存条件でのｔ＝０、１ヶ月及び３ヶ月、並びに−２０℃／２５℃条件での１サイクル、２サイクル及び４サイクルの凍結／融解（１
×、２×及び４×ＦｘＴｈ）後の配合物Ｆ６におけるサイズ排除ＨＰＬＣによるより長期の研究結果を提示している。
【０１６５】
【表１３】
2018109064.tif 000014
【０１６６】
下記表に−２０℃、２〜８℃及び２５℃の保存条件でのｔ＝０、１ヶ月及び３ヶ月、並びに−２０℃／２５℃条件での１サイクル、２サイクル及び４サイクルの凍結／融解（１×、２×及び４×ＦｘＴｈ）後の配合物Ｆ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣによるより長期の研究結果を提示している。
【０１６７】
【表１４】
2018109064.tif 000015
【０１６８】
図７Ｑ、図７Ｒ及び図７Ｓは、配合物Ｆ３については６ヶ月まで、配合物Ｆ１、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８については３ヶ月までの時点で条件：−２０℃（図７Ｑ）、２〜８℃（７Ｒ）及び２５℃（７Ｓ）についての配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムの概要グラフを示す。ピーク百分率を測定し、表している（％プレピーク、％主ピーク及び％ポストピーク）。
【０１６９】
図７Ｔは、ｔ＝０並びに−２０℃／２５℃条件で１サイクル及び２サイクルの凍結／融解（１×及び２×ＦｘＴｈ）後の配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムの概要グラフを示す。ピーク百分率を測定し、表している（％プレピーク、％主ピーク及び％ポストピーク）。バーは以下の配合物順で示されてい
る：各条件（すなわちｔ＝０、１×ＦｘＴｈ又は２×ＦｘＴｈ）に付きＦ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８。
【０１７０】
下記表に２５℃の保存条件でのｔ＝０の配合物イノベーターにおけるサイズ排除ＨＰＬＣによるより長期の研究結果を提示している。
【０１７１】
【表１５】
2018109064.tif 000016
【０１７２】
下記表に−２０℃、２〜８℃及び２５℃の保存条件でのｔ＝０、１ヶ月、３ヶ月及び６ヶ月、並びに−２０℃／２５℃条件での１サイクル、２サイクル及び４サイクルの凍結／融解（１×、２×及び４×ＦｘＴｈ）後の配合物Ｆ３におけるサイズ排除ＨＰＬＣによるより長期の研究結果を提示している。
【０１７３】
【表１６】
2018109064.tif 000017
【０１７４】
結果を図７Ｕに示す。Ｆ３は６ヶ月でプレピーク凝集体の更なる有意な増大（２５℃でｔ＝３ヶ月から１．１％の増大）、及びポストピーク分解体の更なる僅かな増大（３ヶ月からポストピークの２．１％の更なる増大）を示している。
【０１７５】
細胞ベースの効力アッセイ
アプローチ：
より短い時点（０、３日、７日及び１４日）については、
サンプルを２つのバッチ（ｔ＝０及びｔ＝３日後、並びにｔ＝７日及びｔ＝１４日後の時点）にて試験した。
対照サンプルを６日間の試験日の各日にて試験したことを除いて、全てのサンプルをバイオアッセイにて単回分析によって１回試験した。
Ａ２８０ｎｍでの吸光度測定値を取り、一次希釈物の正確な濃度及びその後のサンプル
希釈を決定した。
アッセイ全体の性能が許容可能なものであった。１０６の用量応答曲線（５３のプレートに由来する）の内３つがウェル間変動性アッセイ基準を満たすのにマスキングされた最大２つの異なる濃度で１つのウェルを有する必要があった。
ウェル間の変動性  ％ＣＶ≦２０％
アッセイウィンドウ（Ｄ／Ａ）≧６
Ｒ２≧０．９８
【０１７６】
４７の試験サンプルの相対効力を１回測定し、対照は６回の異なる時間にて測定した。対照の平均相対効力は１００．２％であり、９５％  ＣＩは９６．９％〜１０３．６％であった。
対照の６回の独立した測定値についてのアッセイ変動性（％ＧＣＶ）は３．２％であった。この方法の低いアッセイ変動性によって、単回の測定値から得られた試験サンプルの相対効力値が許容可能なものであったことが実証された。
単回の測定値に基づくと、大部分の試験サンプルは１００％に近い相対効力（参照標準のものと同等である）を有していた。
試験サンプルは高温（５０℃）にて３日間保存すると効力を失い始め、より後期の時点となるに従って効力は低下した。
【０１７７】
より長い時点（３ヶ月及び６ヶ月）については、
サンプルを１つのバッチ（ｔ＝６ヶ月（Ｆ３）及びｔ＝３ヶ月（他の全てのサンプル及び条件）を含む）にて試験した。
全てのサンプルを１人の分析家によるバイオアッセイにて１回試験した。使用する参照標準はＥ１６  ＡＤＳ  Ｌｏｔ  ＤＣ−４１６８−８５である。
Ａ２８０ｎｍでの吸光度測定値を取り、一次希釈物の正確な濃度及びその後のサンプル希釈を決定した。
アッセイ全体の性能が許容可能なものであった。全ての用量応答曲線（６プレートに由来する１２の用量応答曲線）は任意のウェルをマスキングすることなくウェル間変動性アッセイ基準を満たしている。ＴＭＥ  ０４９８−０１に規定されるアッセイ許容基準は下記のとおりである：
ウェル間変動性  ％ＣＶ≦２０％
アッセイウィンドウ（Ｄ／Ａ）≧６
Ｒ２≧０．９８
アッセイにおける用量応答曲線についてのアッセイウィンドウは約４〜４．５の範囲であった。用量応答曲線の重要なパラメータ（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）は全て、履歴データの正常範囲内である。より小さいアッセイウィンドウ（＞３）がアッセイ精度を含むことなく（comprise）、そのためこのアッセイの結果が許容されるものであったことがこれまでに分かっている。
【０１７８】
この場合、データはＳｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．２を用いて分析し、アッセイ許容基準を検証し、必要に応じてウェルをマスキングした。
【０１７９】
細胞ベースのバイオアッセイの結果：
図８は、あらゆる時点での全ての条件：−２０℃（８Ａ）、２５℃（８Ｂ）、５０℃（８Ｃ）、３回の凍結／融解及び撹拌しながら３日間（８Ｄ）についての全ての配合物における細胞ベースの効力アッセイの分析（参照標準の効力と比較した相対効力％）を含むグラフを示す。
【０１８０】
効力の差（参照標準の効力と比較して）が５０℃条件で全ての配合物において検出され、全ての試験サンプルが３日と早くから効力を失い、５０℃での１４日の保存により有意
に増大した。
【０１８１】
Ｆ３は５０℃で１４日後に最高の効力を示し、４２．２％の相対効力が保たれていた。
【０１８２】
全ての配合物について相対効力は凍結融解及び室温での撹拌の条件に加えて−２０℃、２５℃及び５０℃で１００％近くに保たれていた。
【０１８３】
図８Ｅは、下記の条件：ｔ＝０、ｔ＝１ヶ月、ｔ＝３ヶ月及びｔ＝６ヶ月での−２０℃、２〜８℃、２５℃、並びに−２０℃／２５℃での１×、２×及び４×凍結／融解後の配合物Ｆ３における細胞ベースの効力アッセイの分析（参照標準の効力と比較した相対効力％）を含むグラフを示す。図面の隣にデータ表を提示している。
【０１８４】
６ヶ月までの全ての条件、及び−２０℃／２５℃での４サイクルの凍結融解後の配合物Ｆ３は参照標準と同等の％相対効力を示し、アッセイ変動性内に保たれている（≦２０％）。最小の％相対効力値（８９．５％）が２５℃で３ヶ月後のＦ３について測定された。
【０１８５】
図８Ｆは、２５℃で３ヶ月後のイノベーターと比較した、−２０℃、２〜８℃、２５℃で３ヶ月後（更にＦ３では６ヶ月後）、及び−２０℃／２５℃で４×凍結／融解後の配合物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６及びＦ８における細胞ベースの効力アッセイの分析（参照標準の効力と比較した相対効力％）を含むグラフを示す。図面の隣にデータ表を提示している。
【０１８６】
全ての条件においてイノベーターと比較してＦ１、Ｆ３、Ｆ５及びＦ８間で％相対効力に有意差は観察されていない。全てのサンプルが参照標準と同等の相対効力を有していた。２５℃で３ヶ月後のＦ６は残存効力を有していなかった。
【０１８７】
全てのサンプルは参照標準と同等の相対効力を有していた。
【０１８８】
【表１７】
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【０１８９】
配合物Ｆ５（５０ｍＭのリン酸Ｎａ、９０ｍＭのＮａＣｌ、３４ｍｇ／ｍＬのスクロース（ｐＨ６．３））及びＦ８（５０ｍＭのコハク酸塩／ＮａＯＨ、９０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍｇ／ｍＬのスクロース（ｐＨ６．３））が、上記表に示されるように、行った分析による全体として最高の安定性及び相対効力に基づきリード配合物として特定され、このことからＦ８がＦ１（イノベーター液体配合物）と同等又はそれより良好に、またＦ３及びＦ６配合物よりも良好に働くことが示された。
【０１９０】
本発明の第１の態様の項目
１．  ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部分である単離ポリペプチドと、
９０ｍＭ〜１３０ｍＭの濃度で存在する塩と、
トレハロース及びスクロースの群から選択される賦形剤又はそれらの組合せと、
を含む水性組成物であって、アルギニンもシステインも該組成物に存在しないことを特徴とする、水性組成物。
２．  塩の濃度が１０５ｍＭ〜１３０ｍＭである、項目１に記載の組成物。
３．  塩の濃度が１２５ｍＭである、項目１又は２に記載の組成物。
４．  塩が塩化ナトリウムである、項目１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
５．  単離ポリペプチドがエタネルセプトである、項目１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
６．  賦形剤が２０ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬの濃度のトレハロースである、項目１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
７．  賦形剤が５ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬの濃度のスクロースである、項目１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
８．  水性緩衝液を更に含む、項目１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
９．  水性緩衝液がリン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム若しくはクエン酸カリウム、コハク酸、マレイン酸、酢酸アンモニウム、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（トリス）、酢酸塩、ジエタノールアミン、ヒスチジン、又はそれらの組合せである、項目８に記載の組成物。
１０．  水性緩衝液が２０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で存在する、項目８又は９に記載の組成物。
１１．  １種又は複数種の賦形剤を更に含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
１２．  賦形剤が、ラクトース、グリセロール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルトース、イノシトール、グルコース、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、組換えヘマグルチニン、デキストラン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリエチレンイミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、プロリン、Ｌ−セリン、グルタミン酸、アラニン、グリシン、リジン、サルコシン、γ−アミノ酪酸、ポリソルベート−２０、ポリソルベート−８０、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリソルベート、ポリオキシエチレンコポリマー、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、トリメチルアミンＮ−オキシド、ベタイン、亜鉛イオン、銅イオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、マグネシウムイオン、３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸塩、スクロースモノラウリン酸塩、又はそれらの組合せである、項目１１に記載の組成物。
１３  ．組成物のｐＨがｐＨ６．０〜ｐＨ７．０である、項目１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
１４．  ５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と１０ｍｇ／ｍＬのスクロースと１２５ｍＭの塩化ナトリウムとを含み、組成物のｐＨが６．３である、項目１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
１５．  ５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と６０ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物と０．１％のポリソルベート２０とを含み、組成物のｐＨが６．２である、項目１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
１６．  ５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と９０ｍＭの塩化ナトリウムと２４ｍｇ／ｍＬのスクロースとを含み、組成物のｐＨが６．３である、項目１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
１７．  ５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と９０ｍ
Ｍの塩化ナトリウムと１０ｍｇ／ｍＬのスクロースと５ｍｇ／ｍＬのグリシンとを含み、組成物のｐＨが６．３である、項目１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
１８．  ５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと２２ｍＭのコハク酸塩と９０ｍＭのＮａＣｌと１０ｍｇ／ｍＬのスクロースとを含み、該組成物のｐＨがｐＨ６．３である、項目１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【０１９１】
本発明の第２の態様
本発明の第２の態様は、ＴＮＦＲ：Ｆｃを含有するポリペプチドの保存に適したいくつかの選択されたアミノ酸及びいくつかの選択された塩を含まない安定した水性医薬組成物に関する。
【０１９２】
本発明の第２の態様は、下記に述べられている技術的特徴による水性配合物が５℃を超える高温でのタンパク質の安定性の増大をもたらすことができるという所見に基づくものである。
【０１９３】
そのため本発明の第２の態様は、
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部分である単離ポリペプチドと、
単糖又は二糖と、
水性緩衝液と、
を含む水性組成物であって、該組成物には、アルギニン、システイン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、次亜塩素酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫化水銀、クロム酸ナトリウム及び二酸化マグネシウムから選択される塩のいずれも含まれていないことを特徴とする、水性組成物に関する。
【０１９４】
本発明の第２の態様の詳細な説明
本発明は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部分である単離ポリペプチドと、
単糖又は二糖と、
水性緩衝液と、
を含む水性組成物であって、該組成物には、アルギニン、システイン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、次亜塩素酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫化水銀、クロム酸ナトリウム及び二酸化マグネシウムから選択される塩のいずれも含まれていないことを特徴とする、水性組成物に関する。
【０１９５】
本発明のこの第２の態様で使用される場合、「組成物」という用語は、それを必要とする個体に注入及び／又は投与するのに好適なように調製されたポリペプチドを含む配合物（複数種の場合もあり）を指し得る。「組成物」は「医薬組成物」と称されることもある。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は実質的に滅菌性であり、レシピエントに対して過度に毒性又は感染性の作用物質は全く含まない。さらに、本発明のこの第２の態様で使用される場合、溶液又は水性組成物は、好適な溶媒（例えば水及び／又は他の溶媒、例えば有機溶媒）又は相溶性溶媒の混合物に溶解した１種又は複数種の化学物質を含有する流体（液体）調製物を意味し得る。さらに本明細書で使用される場合、「約」という用語はその値の指定値±２％を意味し、好ましくは「約」という用語は指定値（±０％）を正確に意味する。
【０１９６】
本発明のこの第２の態様による組成物にはアルギニン又はシステインは単独では含まれていないか、又は組成物に添加されていないが、ポリペプチド自体はその鎖にアルギニン又はシステインアミノ酸残基を含有していてもよいことに留意されたい。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、発現するＦｃドメイン含有ポリペプチドは任意の標準的な方法により精製される。Ｆｃドメイン含有ポリペプチドが細胞内にて産生される場合、粒状残屑は、例えば遠心分離又は限外濾過により除去される。ポリペプチドが培地中に分泌される場合、このような発現系からの上清を初めに、標準的なポリペプチド濃縮フィルターを使用することで濃縮することができる。プロテアーゼ阻害剤を添加してタンパク質分解を阻害してもよく、微生物の増殖を抑えるために抗生物質を含ませてもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン含有ポリペプチドは、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティークロマトグラフィー、及び／又は既知の若しくは未だ発見されていない精製法の任意の組合せを用いて精製される。例えばプロテインＡを使用することでヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づくＦｃドメイン含有ポリペプチドを精製することができる（Lindmark et al., 1983, J. Immunol. Meth. 62: 1-13）。
【０１９８】
イオン交換カラムでの分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴ（商標）でのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム等）でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿等の他のポリペプチド精製法を必要に応じて利用してもよい。他のポリペプチド精製法を用いることができる。
【０１９９】
本発明のこの第２の態様の好ましい実施形態では、単離ポリペプチドはエタネルセプトである。エタネルセプトのＦｃコンポーネントには、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖２（ＣＨ２）ドメイン、定常重鎖３（ＣＨ３）ドメイン及びヒンジ領域が含まれるが、定常重鎖１（ＣＨ１）ドメインは含まれない。エタネルセプトはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）哺乳動物細胞発現系における組換えＤＮＡ技術により産生することができる。エタネルセプトは９３４のアミノ酸からなり、見掛けの分子量はおよそ１５０キロダルトンである（Physicians' Desk Reference, 2002, Medical Economics Company Inc．）。
【０２００】
単離ポリペプチドの濃度は好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬであり、更に好ましくは、濃度は約２５ｍｇ／ｍＬ又は約５０ｍｇ／ｍＬである。
【０２０１】
本発明のこの第２の態様の別の好ましい実施形態では、単糖又は二糖はトレハロース及びスクロースから選択される。トレハロースは、好ましくはトレハロース二水和物の形態で２０ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは６０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するのが好ましい。スクロースは１０ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは６０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するのが好ましい。本発明の第２の態様の別の好ましい実施形態では、賦形剤はスクロースとトレハロースとの組合せである。
【０２０２】
本発明のこの第２の態様の別の好ましい実施形態では、本組成物の水性緩衝液はリン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム又はクエン酸カリウム、マレイン酸、酢酸アンモニウム、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（トリス）、酢酸塩、ジエタノールアミン、及びそれらの組合せから選択される。組成物に緩衝液が単独で又は組み合わせて使用されるかに関わらず、その濃度は２０ｍＭ〜１５０ｍＭであるのが好ましく、濃度は約５０ｍＭであるのがより好ましく、より好ましい水性緩衝液はリン酸ナトリウムである。
【０２０３】
本発明のこの第２の態様の別の実施形態では、本発明による組成物は１種又は複数種の賦形剤を更に含んでいてもよい。本発明のこの第２の態様のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物における１種又は複数種の賦形剤の濃度は約０．００１重量パーセ
ント〜５重量パーセントであり、本発明のこの第２の態様の他の実施形態では、１種又は複数種の賦形剤の濃度は約０．１重量パーセント〜２重量パーセントである。賦形剤は当該技術分野において既知であり、既知の方法により製造され、市販の供給業者から入手可能である。該賦形剤は、ラクトース、グリセロール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルトース、イノシトール、グルコース、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＳＡ）、組換えヘマグルチニン（ＨＡ）、デキストラン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリエチレンイミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、プロリン、Ｌ−セリン、グルタミン酸、アラニン、グリシン、リジン、サルコシン、γ−アミノ酪酸、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ポリソルベート、ポリオキシエチレンコポリマー、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、トリメチルアミンＮ−オキシド、ベタイン、亜鉛イオン、銅イオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、マグネシウムイオン、３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸塩（ＣＨＡＰＳ）、スクロースモノラウリン酸塩、又はそれらの組合せであるのが好ましい。より好ましい実施形態では、賦形剤はポリソルベート２０であり、更に好ましい実施形態では、ポリソルベート２０は０．１％の濃度で存在する。
【０２０４】
本発明のこの第２の態様の別の好ましい実施形態では、組成物のｐＨはｐＨ６．０〜ｐＨ７．０であり、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８及び６．９から選択される任意のｐＨが可能である。より好ましい実施形態では、組成物のｐＨは約６．２である。
【０２０５】
本発明のこの第２の態様の特定の実施形態では、本組成物は５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と６０ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物とを含み、該組成物のｐＨはｐＨ６．２である。
【０２０６】
本発明のこの第２の態様の特定の実施形態では、本組成物は５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と６０ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物と０．１％のポリソルベート２０とを含み、該組成物のｐＨはｐＨ６．２である。
【０２０７】
本発明のこの第２の態様の特定の実施形態では、本組成物は５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と６０ｍｇ／ｍＬのスクロースとを含み、該組成物のｐＨはｐＨ６．２である。
【０２０８】
本発明のこの第２の態様の特定の実施形態では、本組成物は５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と６０ｍｇ／ｍＬのスクロースと０．１％のポリソルベート２０とを含み、該組成物のｐＨはｐＨ６．２である。
【０２０９】
本明細書のこの第２の態様に開示の組成物を非経口、例えば皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、脳脊髄内、関節内、滑液嚢内及び／又は髄腔内投与することができる。
【０２１０】
本発明のこの第２の態様による組成物に含まれる単離ポリペプチドの治療効果は当該技術分野において知られており、関節リウマチ、乾癬性関節炎、剛直性脊椎炎、肉芽腫症、クローン病、慢性閉塞性肺疾患、Ｃ型肝炎、子宮内膜症、喘息、悪液質、乾癬若しくはアトピー性皮膚炎、又は他の炎症性若しくは自己免疫関連の病気、障害若しくは病態の治療が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は障害を治療する（その症状を緩和する、その進行を止める又は遅らせる）のに十分な量（例えば治療的に有効な量）で投与する
ことができる。
【０２１１】
下記の実施例は本発明の第２の態様を説明するものであり、その範囲を限定するものとして解釈されない。
【０２１２】
本発明の第２の態様の実施例
組成物の調製
下記の組成物を単純な混合により調製した：
【０２１３】
原材料：
−２０℃で保存した、６２．５ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと１．２ｍｇ／ｍＬのトリスと４０ｍｇ／ｍＬのマンニトールと１０ｍｇ／ｍＬのスクロース（ｐＨ７．４）とを含むＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｕｎ  Ｍａｔｅｒｉａｌ。
【０２１４】
参照配合物（本明細書では「Ｅｎｂｒｅｌ」と呼ばれる）：
エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）市販配合物のロットを対照サンプルとして使用した。市販配合物には、５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと２５ｍＭのリン酸Ｎａと２５ｍＭのアルギニンと１００ｍＭのＮａＣｌと１０ｍｇ／ｍＬのスクロース（ｐＨ６．３）とが含まれている。
【０２１５】
候補配合物：
Ｆ１：エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）配合物と同じ配合物においてエタネルセプトを内部対照として使用した（５０．９ｍｇ／ｍＬのエタネルセプト、２５ｍＭのリン酸Ｎａ、２５ｍＭのアルギニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍｇ／ｍＬのスクロース（ｐＨ６．３））。
Ｆ２：エタネルセプトの水性配合物（４９．４ｍｇ／ｍＬのエタネルセプト、２５ｍＭのリン酸Ｎａ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍｇ／ｍＬのスクロース（ｐＨ６．３））
Ｆ３：エタネルセプトの水性配合物（４９．5ｍｇ／ｍＬのエタネルセプト、２５ｍＭの
リン酸Ｎａ、１２５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍｇ／ｍＬのスクロース（ｐＨ６．３））
Ｆ４：エタネルセプトの水性配合物（５０．９ｍｇ／ｍＬのエタネルセプト、５０ｍＭのリン酸Ｎａ、６０ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物（ｐＨ６．２）、０．１％のポリソルベート２０）
【０２１６】
いくつかの実験では、市販ロットのエンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）も参照として使用している（上記を参照されたい）。
【０２１７】
実施例１
内在性タンパク質の蛍光発光スペクトル及び静的光散乱
２６６ｎｍで励起する内在性タンパク質の蛍光発光スペクトルと、２６６ｎｍ及び４７３ｎｍの両方での静的光散乱データとを取得した。各サンプルをマイクロキュベットアレイ（ＭＣＡ）に充填し、Ｏｐｔｉｍ  １０００に入れて、コロイド安定性及び立体配座安定性の差を明らかにした。この研究では、熱勾配実験の温度を１℃毎１５℃から９５℃へと上昇させ、サンプルを各温度にて６０秒間保持し、熱平衡化させた。等温実験では、温度は６２℃に保持し、測定間に６０秒間保持して、サンプルを２００回繰り返して測定した。
【０２１８】
サンプルに２６６ｎｍ及び４７３ｎｍのレーザー源を照射する時間は露光時間と称される。露光時間の選択は、蛍光発光の強度及びサンプルの光退色し易さ等の多くの因子によって変える。これらのサンプル全ての場合で１秒の露光時間を用いた。
【０２１９】
露光時間を変えるのに併せて、検出器に入る光の量を制御する物理的スリットのサイズを変えることが可能である。この開口部のサイズを大きくすることで、測定される蛍光シグナルは増大するが、機器のスペクトル分解能が低減する。
【０２２０】
Ｏｐｔｉｍ  １０００により実行される分析には一次及び二次という２つの逐次的なレベルのものが含まれる。Ｏｐｔｉｍ  １０００ソフトウェアは自動一次及び二次分析をもたらす。あらゆる自動データ適合ソフトウェアと同様に、自動関数が信頼性のある結果に反映されるよう入力データが良好な品質となるように細心の注意を払わなければならない。結果は全て熟練の分析家によって手動にて確認されている。
【０２２１】
一次分析では生の蛍光発光データ及び光散乱データからスペクトルパラメータを抽出する：
Ｏｐｔｉｍは数学関数を用いることで、科学論文により一般的に用いられている予測波長（重心平均とも呼ばれる）等の一次レベル情報を与えることができる。これは平均発光波長（又は質量中心）を調べるものであり、スペクトルデータにおける任意のノイズを除くのに良好なアプローチである。
散乱光の強度は２６０ｎｍ〜２７０ｎｍの積分強度（レイリー散乱ＵＶ励起光）から算出する。散乱効率は波長に大きく依存し、そのため波長が短ければ、光は溶液中の分子によってより効率的に散乱される。２６６ｎｍレーザーの散乱は、平均分子質量の小さい変化に対する非常に高感度なプローブである。
【０２２２】
この研究では、３５０ｎｍと３３０ｎｍとの蛍光強度比を用いることで抗体の熱変性を調べており、２６６ｎｍ及び４７３ｎｍレーザーによる散乱光強度を用いることで熱により誘導されるサンプルの凝集を測定している。
【０２２３】
二次分析は一次分析のパラメーターを取り、サンプルの溶融温度「Ｔｍ」及び凝集開始温度「Ｔａｇｇ」をそれらが存在する場合に求めるものである。溶融温度は温度の関数としてプロットされた一次データの変曲点として求められる。
【０２２４】
凝集開始温度は散乱光強度がデータのノイズに対する閾値を超えて増大する温度として求められる。測定される最小温度から、測定される各散乱光強度の値をこれまでに測定された全ての値のデータセットに加える。各データ点において、分析が進むにつれて、線形適合を適用し、適合度を求める。データが直線から有意に逸脱している場合（ここで有意性はデータのノイズにより求められる）、これが凝集開始温度と規定される。逸脱していない場合、アルゴリズムをデータセットの次のデータ点まで進め、もう一度この逸脱について試験する。この方法は多様なタンパク質及び条件に対して試験を行うロバストなものである。大きな凝集が形成され沈殿が起こる極端な状況では、懸濁液中の粒子が入射レーザーの焦点体積から離れる場合、光散乱シグナルは実際に低下する場合がある。しかしながら、初期開始は何らかの沈殿が後に起こっても再現性を持って検出される。
【０２２５】
全ての静的光散乱データの場合、サンプルが溶液から沈殿して見えるかどうかに関わらず、全てのデータ点が包含されている。異なる反復実験における同じサンプルでも沈殿する場合もあれば沈殿しない場合もあるが、それぞれの場合で凝集開始プロセスは再現性がある。
【０２２６】
結論
全てのサンプル間のＴａｇｇ及びＴｏｎｓｅｔデータは両方とも非常に類似していることが見出された。
Ｆ１緩衝液では、生成物は６３．７±０．３℃の蛍光のＴｏｎｓｅｔ及び６６．８±０．３℃のＴａｇｇを有することが見出された。
Ｆ２緩衝液では、生成物は６３．２±０．１℃の蛍光のＴｏｎｓｅｔ及び６５．９±０．１℃のＴａｇｇを有することが見出された。
Ｆ３緩衝液では、生成物は６３．４±０．３℃の蛍光のＴｏｎｓｅｔ及び６５．６±０．４℃のＴａｇｇを有することが見出された。
Ｆ４緩衝液では、生成物は６３．３±０．１℃の蛍光のＴｏｎｓｅｔ及び６４．８±０．１℃のＴａｇｇを有することが見出された。
エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）イノベーター自体は６３．４±０．１℃の蛍光のＴｏｎｓｅｔ及び６５．６±０．１℃のＴａｇｇを有することが見出された。
【０２２７】
したがってデータから、全てのサンプル間のコロイド安定性及び立体配座安定性の両方における高度の類似性が示される。
【０２２８】
蛍光について見出されたＴｏｎｓｅｔ値は６３．２℃〜６３．７℃、平均は６３．４℃であり、標準偏差は０．３℃と比較的低く、このことから５つのサンプル（Ｆ１〜Ｆ４及びエンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）液体配合物）間における高度な比較可能性が示された。
【０２２９】
Ｆ４配合物は、全ての実験にて示されているように、立体配座安定性及びコロイド安定性に関してエンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）液体配合物と立体配座的に非常に類似していると考えられる。
【０２３０】
実施例２
短期ストレス安定性研究
アプローチ
短期（２週間）安定性研究を、より長期の研究を実施する前に考え得る配合物を評価するために行った。
【０２３１】
４つの配合物を試験した：
【０２３２】
【表１８】
2018109064.tif 000019
【０２３３】
撹拌及び凍結融解ストレスに加えて２種の高温（２５℃及び５０℃）及び１つのリアルタイム温度に曝した後のｔ＝０、３日、７日及び１４日での各配合物の安定性を評価した。
【０２３４】
８つの分析アッセイのパネルを用いて、各配合物の安定性を評価した。
ｐＨ（ｔ＝０のみ）
重量オスモル濃度（ｔ＝０のみ）
タンパク質濃度（Ａ２８０ｎｍ）
濁度（Ａ３３０ｎｍ）
ＨＩＡＣ
還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシーブルー染色剤）
サイズ排除ＨＰＬＣ
細胞ベースの効力
【０２３５】
ｐＨ及び重量オスモル濃度
図９に初期時間でのｐＨ及び重量オスモル濃度の測定値を含む棒グラフを示す。それぞれの条件でサンプルを構成する前に全ての配合物について測定されたこれらの値は標的ｐＨ又は重量オスモル濃度の理論値の範囲内にあった。
【０２３６】
タンパク質濃度／Ａ２８０
図１０は、全ての時間（０〜１４日）及び条件（−２０℃、２５℃、５０℃、３回の凍結／融解（３×ＦｚＴｈ）、及び撹拌しながら３日間）でのタンパク質濃度の測定値（２８０ｎｍでの吸光度）を示す。得られたデータはあらゆる時点及び条件で全てのサンプルについて標的値の範囲内及びアッセイの変動性の範囲内に保たれていた。
【０２３７】
濁度／Ａ３３０
図１１は、全ての時間（０〜１４日）及び条件（−２０℃、２５℃、５０℃、３回の凍結／融解（３×ＦｚＴｈ）、及び撹拌しながら３日間）での濁度の測定値（３３０ｎｍでの吸光度）を示す。この結果によると、濁度の有意な増大が５０℃条件にて検出され、Ｆ３が経時的に最も低い増大を呈した。−２０℃、２５℃、凍結融解又は撹拌ではいずれの配合物でも有意な変化は観察されなかった。
【０２３８】
ＨＩＡＣ（液体粒子カウンタ）
方法：
ＨＩＡＣ  ９７０３  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを実験に使用した。ＨＩＡＣはサンプラー、粒子カウンタ及びＲｏｙｃｏセンサからなるものである。Ｒｏｙｃｏセンサは２μｍ〜１００μｍの粒子をサイジング及びカウントすることが可能である。この機器は１００００個／ｍＬ以下の粒子をカウントすることができる。
【０２３９】
手順：
初めに希釈せずにサンプルを分析したが、サンプルの粘度が高かったため、より正確な結果を得るには、サンプルを希釈する必要があることが分かった。
サンプルを１時間室温に置いた。
サンプルを適切な配合物緩衝液にて１：３に希釈して、脱気して（１．５時間）、測定前に慎重に混合した。
Ｓｔａｎｄａｒｄｓ−Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｕｎｔ  Ｃａｌ：システムの適合性の確認を、ＥＺＹ−Ｃａｌの５μｍ及び１５μｍ粒度対照標準を用いて行った。対照標準は最初に分析し、センサの分解能を検証した。
【０２４０】
図１２は、Ｓｔａｎｄａｒｄｓ−Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｕｎｔ  Ｃａｌを用いて全ての条件：−２０℃、２５℃、５０℃、３回の凍結／融解（３×ＦｚＴｈ）、及び撹拌しながら３日間にて測定したＨＩＡＣによる不可視粒子分析を示す。
【０２４１】
不可視粒子数の有意な増大が５０℃条件でのＦ１、Ｆ２及びＦ４について測定され、Ｆ２は７日と早くから最も高い増大を示した。
【０２４２】
−２０℃、２５℃、３×ＦｚＴｈ又は３日の室温での撹拌後ではいずれの配合物でも有意な変化は観察されなかった。
【０２４３】
Ｆ４はｔ＝０対照と比較して全ての条件及び時点での保存後でも不可視粒子の変化を呈さなかった。
【０２４４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
図１３は、全ての条件：時間０及び１４日で−２０℃、２５℃、５０℃、３回の凍結／融解及び撹拌しながら３日間にてインキュベートした際のクマシーを用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。（Ａ）はＦ１サンプル及び（Ｄ）はＦ４サンプルである。
【０２４５】
あらゆる時点での５０℃条件について全ての配合物にて有意な変化が観察され、１４日サンプルはおそらく、存在する付加的なＨＭＷバンド（約２５０ｋＤａ超）により明らかなように共有結合的に修飾された高分子量（ＨＭＷ）種と、全ての配合物について５０℃で３日と早くから存在していた低分子量（ＬＭＷ）分解種（５０ｋＤａ未満）とを示していた。
【０２４６】
他の全ての条件及び時点について参照標準と比較していずれの配合物でも変化は観察されなかった。
【０２４７】
ＳＥ  ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
条件：
カラム：ＴＳＫＧｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ３０００  ４．６×３００ｍｍ、４μｍ（Tosoh、１８６７５）  ＣＶ＝２．５ｍＬ
カラム温度：２５℃
移動相：０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量：０．３５ｍＬ／分
実行時間：２０分
サンプル充填量：３７．６μｇ
オートサンプラー温度：４℃
【０２４８】
図１４は、あらゆる時点での以下の条件：−２０℃（１４Ａ）、２５℃（１４Ｂ）、３回の凍結／融解及び撹拌しながら３日間（１４Ｃ）についての全ての配合物におけるサイズ排除ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。ピーク百分率を測定し、表に示す。
【０２４９】
２５℃条件が全ての配合物について７日後の％主ピーク面積及び％プレピークの両方において僅かな変化をもたらし、％プレピークは１４日で更に増大し、Ｆ４はプレピーク凝集体の最大の増大（０．５％）を示しているが、この増大は考慮に値するほど有意ではない。
【０２５０】
撹拌及び凍結融解又は−２０℃で最大１４日間の保存の条件に曝した場合、いずれの配合物でも有意な変化は観察されなかった。
【０２５１】
細胞ベースの効力アッセイ
アプローチ：
サンプルを２つのバッチ（ｔ＝０及びｔ＝３日後、並びにｔ＝７日及びｔ＝１４日後の時点）にて試験した。
対照サンプルを６日間の試験日の各日にて試験したことを除いて、全てのサンプルを１人の分析家によるバイオアッセイにて１回試験した。
Ａ２８０ｎｍでの吸光度測定値を取り、一次希釈物の正確な濃度及びその後のサンプル希釈を決定した。
アッセイ全体の性能が許容可能なものであった。１０６の用量応答曲線（５３のプレートに由来する）の内３つがウェル間変動性アッセイ基準を満たすのにマスキングされた最
大２つの異なる濃度で１つのウェルを有する必要があった。
ウェル間の変動性  ％ＣＶ≦２０％
アッセイウィンドウ（Ｄ／Ａ）≧６
Ｒ２≧０．９８
【０２５２】
４７の試験サンプルの相対効力を１回測定し、対照は６回の異なる時間にて測定した。対照の平均相対効力は１００．２％であり、９５％  ＣＩは９６．９％〜１０３．６％であった。
対照の６回の独立した測定値についてのアッセイ変動性（％ＧＣＶ）は３．２％であった。この方法の低いアッセイ変動性によって、単回の測定値から得られた試験サンプルの相対効力値が許容可能なものであったことが実証された。
単回の測定値に基づくと、大部分の試験サンプルは１００％に近い相対効力（参照標準のものと同等である）を有していた。
【０２５３】
細胞ベースのバイオアッセイの結果：
図１５は、あらゆる時点での全ての条件：−２０℃（１５Ａ）、２５℃（１５Ｂ）、３回の凍結／融解及び撹拌しながら３日間（１５Ｃ）についての全ての配合物における細胞ベースの効力アッセイの分析（参照標準の効力と比較した相対効力％）を含むグラフを示す。
【０２５４】
図１５に示すように、全ての配合物について相対効力は凍結融解及び室温での撹拌の条件に加えて−２０℃及び２５℃で１００％近くに保たれていた。
【０２５５】
本発明の第２の態様の項目
１．  ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトｐ７５腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部分である単離ポリペプチドと、
単糖又は二糖と、
水性緩衝液と、
を含む水性組成物であって、該組成物には、アルギニン、システイン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、次亜塩素酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫化水銀、クロム酸ナトリウム及び二酸化マグネシウムから選択される塩のいずれも含まれていないことを特徴とする、水性組成物。
２．  単離ポリペプチドがエタネルセプトである、請求項１に記載の組成物。
３．  単糖又は二糖がトレハロース及びスクロース、並びにそれらの組合せから選択される、項目１又は２に記載の組成物。
４．  トレハロースが２０ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、項目３に記載の組成物。
５．  スクロースが１０ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、項目３に記載の組成物。
６．  水性緩衝液がリン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム若しくはクエン酸カリウム、マレイン酸、酢酸アンモニウム、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（トリス）、酢酸塩、ジエタノールアミン、又はそれらの組合せから選択される、項目１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
７．  水性緩衝液が２０ｍＭ〜１５０ｍＭの濃度で存在する、項目６に記載の組成物。
８．  １種又は複数種の賦形剤を更に含む、項目１〜７のいずれか一項に記載の組成物。９．  賦形剤が、ラクトース、グリセロール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルトース、イノシトール、グルコース、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、組換えヘマグルチニン、デキストラン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリエチレンイミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ポリエチレングリコール、エチレン
グリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、プロリン、Ｌ−セリン、グルタミン酸、アラニン、グリシン、リジン、サルコシン、γ−アミノ酪酸、ポリソルベート−２０、ポリソルベート−８０、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリソルベート、ポリオキシエチレンコポリマー、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、トリメチルアミンＮ−オキシド、ベタイン、亜鉛イオン、銅イオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、マグネシウムイオン、３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸塩、スクロースモノラウリン酸塩、又はそれらの組合せである、項目８に記載の組成物。１０  ．組成物のｐＨがｐＨ６．０〜ｐＨ７．０である、項目１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
１１．  ５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と６０ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物とを含み、組成物のｐＨがｐＨ６．２である、項目１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
１２．  ５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と６０ｍｇ／ｍＬのスクロースとを含み、組成物のｐＨがｐＨ６．２である、項目１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
１３．  ５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と６０ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物と０．１％のポリソルベート２０とを含み、組成物のｐＨがｐＨ６．２である、項目１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
１４．  ５０ｍｇ／ｍＬのエタネルセプトと５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と６０ｍｇ／ｍＬのスクロースと０．１％のポリソルベート２０とを含み、組成物のｐＨがｐＨ６．２である、項目１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【図１】
2018109064.tif 000020
【図２Ａ】
2018109064.tif 000021
【図２Ｂ】
2018109064.tif 000022
【図３Ａ−１】
2018109064.tif 000023
【図３Ａ−２】
2018109064.tif 000024
【図３Ｂ】
2018109064.tif 000025
【図４Ａ−１】
2018109064.tif 000026
【図４Ａ−２】
2018109064.tif 000027
【図４Ｂ（１）】
2018109064.tif 000028
【図４Ｂ（２）】
2018109064.tif 000029
【図５Ａ−１】
2018109064.tif 000030
【図５Ａ−２】
2018109064.tif 000031
【図５Ｂ】
2018109064.tif 000032
【図５Ｃ（１）】
2018109064.tif 000033
【図５Ｃ（２）】
2018109064.tif 000034
【図６Ａ−１】
2018109064.tif 000035
【図６Ａ−２】
2018109064.tif 000036
【図６Ｂ（１）】
2018109064.tif 000037
【図６Ｂ（２）】
2018109064.tif 000038
【図６Ｃ】
2018109064.tif 000039
【図６Ｄ】
2018109064.tif 000040
【図６Ｅ（１）】
2018109064.tif 000041
【図６Ｅ（２）】
2018109064.tif 000042
【図６Ｆ（１）】
2018109064.tif 000043
【図６Ｆ（２）】
2018109064.tif 000044
【図７Ａ】
2018109064.tif 000045
【図７Ｂ】
2018109064.tif 000046
【図７Ｃ】
2018109064.tif 000047
【図７Ｄ】
2018109064.tif 000048
【図７Ｅ（１）】
2018109064.tif 000049
【図７Ｅ（２）】
2018109064.tif 000050
【図７Ｆ】
2018109064.tif 000051
【図７Ｇ（１）】
2018109064.tif 000052
【図７Ｇ（２）】
2018109064.tif 000053
【図７Ｈ】
2018109064.tif 000054
【図７Ｉ】
2018109064.tif 000055
【図７Ｊ】
2018109064.tif 000056
【図７Ｋ（１）】
2018109064.tif 000057
【図７Ｋ（２）】
2018109064.tif 000058
【図７Ｌ（１）】
2018109064.tif 000059
【図７Ｌ（２）】
2018109064.tif 000060
【図７Ｍ（１）】
2018109064.tif 000061
【図７Ｍ（２）】
2018109064.tif 000062
【図７Ｎ（１）】
2018109064.tif 000063
【図７Ｎ（２）】
2018109064.tif 000064
【図７Ｏ】
2018109064.tif 000065
【図７Ｐ】
2018109064.tif 000066
【図７Ｑ】
2018109064.tif 000067
【図７Ｒ】
2018109064.tif 000068
【図７Ｓ】
2018109064.tif 000069
【図７Ｔ】
2018109064.tif 000070
【図７Ｕ】
2018109064.tif 000071
【図８Ａ】
2018109064.tif 000072
【図８Ｂ】
2018109064.tif 000073
【図８Ｃ】
2018109064.tif 000074
【図８Ｄ】
2018109064.tif 000075
【図８Ｅ】
2018109064.tif 000076
【図８Ｆ】
2018109064.tif 000077
【図９】
2018109064.tif 000078
【図１０−１】
2018109064.tif 000079
【図１０−２】
2018109064.tif 000080
【図１１−１】
2018109064.tif 000081
【図１１−２】
2018109064.tif 000082
【図１２−１】
2018109064.tif 000083
【図１２−２】
2018109064.tif 000084
【図１３】
2018109064.tif 000085
【図１４Ａ】
2018109064.tif 000086
【図１４Ｂ】
2018109064.tif 000087
【図１４Ｃ】
2018109064.tif 000088
【図１５Ａ】
2018109064.tif 000089
【図１５Ｂ】
2018109064.tif 000090
【図１５Ｃ】
2018109064.tif 000091
【外国語明細書】
2018109064000001.pdf
2018109064000002.pdf
2018109064000003.pdf
2018109064000004.pdf