(57)【要約】      （修正有）【課題】B. fragilisからの莢膜の多糖Ａ（PSA）の脂質付加形態を含む組成物、その単離および精製のための方法の提供。【解決手段】高温において、フェノールと水との混合物を用いて、B. fragilisからの莢膜複合体を水相中に抽出すること、エタノールを用いて多糖Ａ（PSA）を水相から沈降させること、高温において、２％酢酸を用いて、（ａ）界面活性剤の不在下において、および／または（ｂ）約９より低いｐＨにおいて沈澱を酸処理することを含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高温において、フェノールと水との混合物を用いて、B. fragilisからの莢膜複合体を水相中に抽出すること、
エタノールを用いて多糖Ａ（PSA）を水相から沈降させること、 
高温において、２％酢酸を用いて、
（ａ）界面活性剤の不在下において、および／または
（ｂ）約９より低いｐＨにおいて
沈澱を酸処理すること
を含む、方法。
【請求項２】
酸処理の後で、界面活性剤フリーの緩衝液中でのサイズ排除によりPSAを精製することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サイズ排除されたPSAの透析をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
抽出が６０〜７５℃において起こる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
抽出が約６８℃において起こる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
酸処理が、約９０℃において約３時間起こる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
デオキシコール酸ナトリウムの不在下において行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
B. fragilisが、B. fragilisの過剰発現株である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法により生成される、単離された脂質含有多糖Ａ（PSA-LT）を含む、組成物。
【請求項１０】
対象への経口投与のために処方される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
単離されたB. fragilisの非LPS脂質抱合多糖Ａ（PSA）を含む、組成物。
【請求項１２】
単離されたB. fragilisの非LPS脂質抱合PSAが、０．５〜２％の非LPS脂質（ｗ／ｗ）を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
対象への経口投与のために処方される、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
単離されたB. fragilis脂質抱合多糖Ａ、および約０．５％（ｗ／ｗ）またはそれより少ないLPSを含む、組成物であって、
単離されたB. fragilis脂質抱合多糖Ａを含む組成物が、２％酢酸で処置され、１６．５％のTris−トリシンSDS-PAGEゲル上で流され、硫酸亜鉛およびイミダゾールを用いてリバース染色された場合に、６０ｋＤより上のPSAのバンドおよび約５ｋＤにおける非LPS脂質のバンドを示す、前記組成物。
【請求項１５】
約５ｋＤにおける非LPS脂質のバンドよりも低い強度の、６および８ｋＤにおけるLPSのバンドを示す、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
対象への経口投与のために処方される、請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
炎症に関連する状態を発症するリスクを有する対象に、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１８】
状態が自己免疫疾患である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
自己免疫疾患が、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチまたはＩ型糖尿病である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
状態が喘息である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
状態が手術後癒着である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
組成物が、手術の前、間、および／または後に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
状態が膿瘍である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
抗生物質が対象に投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
状態が肥満である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
組成物が対象に経口で投与される、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、2011年7月12日に出願された米国仮出願第61/507074号、表題「LIPID-CONTAINING PSA COMPOSITIONS, METHODS OF ISOLATION AND METHODS OF USE THEREOF」の利益を主張し、その全内容は、本明細書において参照として援用される。
発明の分野
本発明は、B. fragilisから単離される莢膜多糖Ａ（PSA）の組成物、ならびにその単離および精製の方法ならびに／または使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Bacteroides fragilis（B. fragilis）NCTC9343の莢膜多糖Ａ（PSA）は、治療的および予防的適用を有する免疫調節物質であることが報告されている。米国特許第5,679,654号および同第5,700,787号；Tzianabos AO et al. (2000) J Biol Chem 275:6733-40。
【発明の概要】
【０００３】
発明の要旨
細菌Bacterioides fragilis（B. fragilis）の多糖である多糖Ａ（PSA）は、少なくとも部分的にそのＣＤ４＋制御性Ｔ細胞を活性化してサイトカインＩＬ−１０を産生させる能力により媒介される、強力な抗炎症能力を有する。
本発明は、B. fragilisにより生成される、脂質を含む、著しくより強力な形態のPSAの発見に基づく。この脂質は、微生物により、その外膜においてPSAを固定するために用いられる可能性がある。これまでに用いられている抽出技術は、この脂質抱合PSAをもたらさない。脂質は、典型的には、ネイティブなPSA-LT分子の２％（ｗ／ｗ）未満を含む。プロトンNMR分析は、脂質付加形態と非脂質付加形態とを区別しない。むしろ、本発明により、脂質付加形態の存在は、特定のゲル染色技術を用いてのみ可視化することができることが見出された。
【０００４】
本発明により、脂質は、穏和な加水分解（例えば希酢酸により）、およびその後の有機溶媒（例えばクロロホルム）による抽出を用いて、PSA-LTから取り除くことができることが示された。このPSAの加水分解形態は、PSAの脂質付加形態（すなわちPSA-LT）と比較して、著しく低下した活性を有し、その活性は、先に記載されたPSA（すなわち、PSAの非脂質付加形態）に匹敵するレベルである。したがって、本発明は、特に、増強されたＩＬ−１０誘導活性およびＴｒｅｇ成熟化活性を有する、PSAのより強力な形態（すなわちPSA-LT）を提供する。また、本発明により、PSA-LTは、限定されないが多発性硬化症（すなわちEAE動物モデル）および炎症性腸疾患などの炎症状態の動物モデルにおいて、元々記載されるPSAの非脂質付加形態よりも、著しくより保護的および治療的であることが見出された。
本発明は、したがって、特に、PSAの脂質付加形態を含む組成物、その単離および精製のための方法、ならびにin vitroおよびin vivoにおけるその使用の方法を提供する。
【０００５】
したがって、一側面において、本発明は、高温においてフェノールと水との混合物を用いてB. fragilisからの莢膜複合体を水相中に抽出すること、エタノールを用いて多糖Ａ（PSA）を水相から沈降させること、高温において２％酢酸を用いて沈澱を酸処理することを含む方法を提供し、ここで該方法は、約９と等しいかまたはこれより低いｐＨにおいて行われる。いくつかの態様において、ｐＨは、約４〜約９、または約４〜約９未満の範囲である。
【０００６】
別の側面において、本発明は、高温においてフェノールと水との混合物を用いてB. fragilisからの莢膜複合体を水相中に抽出すること、エタノールを用いて多糖Ａ（PSA）を水相から沈降させること、高温において２％酢酸を用いて沈澱を酸処理することを含む方法を提供し、ここで該方法は、デオキシコール酸ナトリウムの不在下において行われる。
【０００７】
いくつかの態様において、各々の方法は、酸処理の後で、界面活性剤フリーの緩衝液中でのサイズ排除（size exclusion）によりPSAを精製する工程を、さらに含んでもよい。いくつかの態様において、各々の方法は、サイズ排除されたPSAの透析を、さらに含んでもよい。
いくつかの態様において、抽出は、６０〜７５℃において起こる。いくつかの態様において、抽出は、約６８℃において起こる。
いくつかの態様において、酸処理は、約９０℃において約３時間起こる。
いくつかの態様において、各々の方法は、デオキシコール酸ナトリウムの不在下において行われる。いくつかの態様において、各々の方法は、界面活性剤の不在下において行われる。
いくつかの態様において、B. fragilisは、限定されないが、株9343などのB. fragilisのPSA過剰発現株である。
【０００８】
別の側面において、本発明は、前述の方法のいずれかにより生成される単離された脂質含有多糖Ａ（PSA-LT）を含む組成物を提供する。単離された脂質抱合多糖Ａは、１または２以上の非LPS脂質を含む。いくつかの態様において、組成物は、対象への経口投与のために処方される。
【０００９】
別の側面において、本発明は、単離されたB. fragilisの非LPS脂質抱合多糖Ａ（PSA）を含む組成物を提供する。非LPS脂質は、PSAに共有的に抱合していてもよい。いくつかの態様において、単離されたB. fragilisの非LPS脂質抱合PSAは、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、または０．０１％（ｗ／ｗ）未満の、PSAに抱合した非LPS脂質を含む。いくつかの態様において、単離されたB. fragilisの非LPS脂質抱合PSAは、約０．１％〜２％（ｗ／ｗ）または約０．１％〜１％（ｗ／ｗ）の範囲の（約０．５％（ｗ／ｗ）を含む）非LPS脂質を含む。単離された脂質抱合多糖Ａは、１または２以上の非LPS脂質を含む。いくつかの態様において、組成物は、対象への経口投与のために処方される。
【００１０】
別の側面において、本発明は、単離されたB. fragilis脂質抱合多糖Ａ（PSA）、および約０．５％（ｗ／ｗ）またはそれより少ないLPSを含む、組成物を提供し、該組成物は、２％酢酸で処置され、１６．５％のTris−トリシンSDS-PAGEゲル上で流され、硫酸亜鉛およびイミダゾールを用いてリバース染色された場合に、単離されたB. fragilis脂質抱合多糖Ａを含み、６０ｋＤより上におけるバンド（PSA-LT）および約５ｋＤにおけるバンドを示す。単離されたB. fragilis脂質抱合多糖Ａは、１または２以上の非LPS脂質を含む。脂質は、PSA-LTの炭水化物部分に共有的に抱合していてもよい。いくつかの状況下において、PSA-LTの脂質と炭水化物部分との間の結合は、ヘビ毒ホスホジエステラーゼによる切断に対して感受性ではない。いくつかの態様において、組成物は、６および８ｋＤにおいて、約５ｋＤにおけるバンドよりも低い強度のLPSのバンドを示す。いくつかの態様において、組成物は、対象への経口投与のために処方される。
【００１１】
別の側面において、本発明は、単離されたB. fragilis脂質抱合多糖Ａを含む組成物を提供し、該組成物は、約９９％のPSA、約０．５％の非LPS脂質、および約０．５％のLPSを含む。
別の側面において、本発明は、単離されたB. fragilis脂質抱合多糖Ａを含む組成物を提供し、該組成物は、約９７％〜９９％のPSA、約０．５％〜２％の非LPS脂質、および約０．５％のLPSを含む。
【００１２】
別の側面において、本発明は、単離されたPSA-LTを含む組成物を提供し、該単離されたPSA-LTは、該組成物の約９９．５％（ｗ／ｗ）を含み、LPSは、該組成物の約０．５％（ｗ／ｗ）を表わす。
前述の側面の多様な態様において、組成物は、本質的に、核酸、タンパク質および／または他の細菌の混入物を含まない。
【００１３】
別の側面において、本発明は、炎症に関連する状態を有する対象に、前述のPSA-LT含有組成物のいずれかの有効量を投与することを含む方法を提供する。別の側面において、本発明は、炎症に関連する状態の再発の危険がある対象に、前述のPSA-LT含有組成物のいずれかの有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
いくつかの態様において、方法は、状態の再発の可能性を減少させるか、または将来的な再発の頻度を減少させる方法である。いくつかの態様において、方法は、かかる症状が、第１の兆候において存在するか、再発において存在するか、または慢性的に存在するかに関わらず、状態に関連する症状の重篤度を軽減する方法である。
【００１５】
いくつかの態様において、状態は自己免疫疾患である。自己免疫疾患は、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチまたはＩ型糖尿病であってもよい、
いくつかの態様において、状態は喘息である。いくつかの態様において、状態は肥満である。
いくつかの態様において、組成物は、吸入（例えば噴霧）により、経口投与により、または注射により、対象に投与することができる。いくつかの態様において、組成物は、対象に経口で投与される。
【００１６】
別の側面において、本発明は、手術後癒着を発症する危険がある対象に、前述のPSA-LT含有組成物のいずれかの有効量を投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、PSA-LT含有組成物は、手術の前、手術の間、手術の後、またはそれらの任意の組み合わせ（限定されないが、手術の前および手術の間を含む）により、投与される。
【００１７】
別の側面において、本発明は、膿瘍を有するか、またはこれを発症する危険がある対象に、前述のPSA-LT含有組成物のいずれかの有効量を投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、対象はまた、抗生物質などの抗菌剤を投与される。いくつかの態様において、PSA-LT含有組成物は、膿瘍の発症の前、および／または膿瘍に関連する症状の顕在化の前に投与される。いくつかの態様において、PSA-LT含有組成物は、膿瘍が検出または診断された後、および／または膿瘍に関連する症状が顕在化した後で、投与される。
【００１８】
なお別の側面において、本発明は、PSA-LTを含むことが疑われる組成物を、硫酸亜鉛およびイミダゾールでリバース染色されるTris−トリシンSDS-PAGEゲルを用いて分析することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、ゲルは、１６．５％のTris−トリシンSDS-PAGEゲルである。いくつかの態様において、組成物は、B. fragilisの画分などの細菌の画分である。いくつかの態様において、細菌の画分を、高温（hot）フェノール／水抽出、エタノール沈澱、穏和な酸処理（例えば４またはそれより高い、典型的には４〜５の範囲の酸性のｐＨにおいて）、および／またはサイズ排除に供した。いくつかの態様において、細菌の画分を含む組成物は、デオキシコール酸ナトリウムと接触させられなかった。いくつかの態様において、細菌の画分を含む組成物は、界面活性剤と接触させられなかった。いくつかの態様において、方法は、組成物中の非LPS脂質の存在を検出する方法である。いくつかの態様において、方法は、組成物中のPSA-LTを検出する方法である。PSA、LPSおよび／または非LPS脂質の存在は、当該方法を用いて検出してもよい。PSA、LPSおよび／または非LPS脂質の量は、当該方法を用いて測定してもよい。
【００１９】
前述の概念および以下により詳細に議論されるさらなる概念の全ての組み合わせ（かかる概念は相互に相反しないことを前提とする）が、本明細書において開示される本発明の主題の一部であるものとして企図されることが理解されるべきである。特に、本開示の最後において現れる請求の範囲の主題の全ての組み合わせは、本明細書において開示される本発明の主題の一部であるものとして企図される。また、本明細書において明示的に使用される用語であって、参照として援用される任意の開示においても現れ得るものは、本明細書において開示される特定の概念に最も一致する意味を付与されるべきであることが、理解されるべきである。
図面は、必ずしも一定の縮尺に対するものではなく、むしろ、本明細書において議論される多様な概念を一般的に説明することに重きを置くことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、S400カラムの溶離プロフィールである。
【図２】図２は、精製されたPSA-LTのプロトン核磁気共鳴分光プロフィールである。
【図３】図３は、PSAの脂質付加（PSA24）および非脂質付加（PSA23）形態を用いる脾臓樹状細胞（ＤＣ）Ｔ細胞共培養系におけるＩＬ―１０産生のヒストグラムである。
【００２１】
【図４】図４は、PSAの脂質付加（PSA24）および非脂質付加（PSA23）形態、ならびにPSAの非脂質付加（PSA23）形態とそれに添加されたLPS（PSA23＋LPS）を用いる、脾臓樹状細胞（ＤＣ）Ｔ細胞共培養系におけるＩＬ―１０産生のヒストグラムである。
【図５】図５は、PSA-LT含有組成物の酸処理時間経過の結果を示すゲルの写真である。
【図６】図６は、脂質付加PSA（PSA24）と比較した、B. fragilisのLPSに対する酸処理の効果を示すゲルの写真である。
【００２２】
【図７】図７は、PSA-LT調製物（PSA26）における脂質の存在（矢印）を示すゲルの写真である。より高い分子量のPSA（ボックス内に示す）を、ゲルから切り出し、５％トリエチルアミンを用いて溶離させた。ゲルから抽出されたPSAは、脂質のバンドを示す（矢印でラベルしたもの）。
【図８】図８は、PSA-LT調製プロトコル、酸による加水分解、および／または有機溶媒溶解の関数としてのＩＬ―１０産生を示すヒストグラムである。
【図９】図９は、PSA-LT調製の間のＩＬ―１０産生に対するデオキシコール酸ナトリウムの効果を示すヒストグラムである。
【００２３】
【図１０】図１０は、デオキシコール酸ナトリウムに基づく抽出の後での脂質のバンド（バンド３）の喪失を示すゲルの写真である。他の図におけるもののように、この図におけるゲルは、硫酸亜鉛およびイミダゾールでリバース染色される１６．５％のTris−トリシン−SDS-PAGEゲルである。
【図１１】図１１は、実験的自己免疫性脳炎（EAE）動物モデル系における予後に対するPSAの非脂質付加（PSA） および脂質付加（PSA-LT）形態の効果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、B. fragilisの外膜へのPSA-LTの付着の態様を説明する模式図である。
【００２４】
【図１３】図１３は、先行技術の単離方法を用いて生成されたPSA含有組成物（PSA23）およびPSA-LT含有組成物（PSA24）の酸処理の時間経過の結果を示すゲルの写真である。特記すべきことに、PSA23の酸処理の後で、バンド３は存在しない。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、本明細書においてPSA-LTとして言及される、B. fragilisからの多糖Ａ（PSA）の脂質付加形態の、驚くべきかつ予想外の発見に基づく。本発明により、B. fragilisからPSAを単離および精製するための先行技術の方法は、不注意にかつ知らずに、ネイティブなPSAに抱合している脂質成分を取り除いたことが見出された。ネイティブなPSAの脂質付加形態は、in vitroおよびin vivoアッセイの両方により示されるように、先に単離および精製された非脂質付加形態よりも強力である。例において示されるように、PSAの脂質付加形態は、より良好にＩＬ―１０産生を誘導することができ（およびしたがって、Ｔｒｅｇ細胞とより良好に相互作用することができ）、実験的に誘導されたマウスの多発性硬化症の形態（すなわち実験的自己免疫脳炎、EAE）を、より良好に予防することができる。
【００２６】
したがって、本発明は、単離されたPSAの脂質付加形態（PSA-LT）を含む組成物、B. fragilisからPSA-LTを単離および精製する方法、ならびにvitroおよびin vivoにおいて単離されたPSA-LTを用いる方法を提供する。本発明は、単離されたPSA-LTが、完全に（または十分に）脂質付加され得ること、またはそれが部分的に脂質付加され得ることを企図する。脂質付加の程度は、単離方法（例えば酸による加水分解の程度を含む）に依存するであろう。また、本発明の組成物が、典型的には、複数のPSA-LT分子を含み、複数が、脂質付加の程度のバリエーションを示し得ることが、理解されるべきである。したがって、幾つかの場合において、本明細書において提供される特徴は、単一のPSA-LT分子ではなく、むしろ複数のPSA-LTを含む組成物に関する。
【００２７】
PSAおよびPSA-LTの構造
本発明は、部分的に、新たに発見されたB. fragilisからのPSAの脂質付加形態に関する。脂質付加形態は、PSA-LTとして言及される。この脂質付加形態は、多糖および１または２以上の脂質鎖（またはテイル）からなる。新たに発見された分子の炭水化物部分は、PSAとして言及される。これはまた、先に単離され分析されている多糖の形態である。この多糖が自然界において脂質抱合形態において存在することは、本発明の前には知られていなかった。
【００２８】
多糖Ａ（PSA）は、四糖の反復単位、すなわち、−３）α−Ｄ−AAT Galp−（１  →  ４）−［β−Ｄ−Galf−（１  →  ３）α−Ｄ−GalpNAc−（１  →  ３）−［４，６−ピルビン酸］−β−Ｄ−Galp−（１  →  を含む。それは、その遊離アミン基に対する正の電荷、およびその遊離カルボニル基に対する負の電荷により付与されるものとして、双性イオン的挙動を有する（反復する四糖単位一つごと）。その天然に存在する状態は、６０個を超える四糖反復単位からなり（例えば、いくつかの例においては、平均約１００、または約２００、または約３００個までの反復単位またはこれを含む）、それは、約１５０ｋＤの平均分子サイズ（約６０ｋＤ〜２０００ｋＤの範囲）を有する。
【００２９】
PSAの反復四糖単位は、以下の構造を有する：
【化１】
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【００３０】
本発明は、部分的に、PSAに抱合された脂質を維持する単離および精製方法を用いての、B. fragilisからのPSAの脂質付加形態の単離に基づく。本明細書においてPSA-LTとして言及されるPSAの脂質付加形態は、１または２以上の脂質鎖（または、本明細書において交換可能に用いられるように、テイルもしくは部分）に共有的に抱合したPSAの四糖反復単位構造を含む。脂質とPSAとの間の結合は、ヘビ毒から抽出されたホスホジエステラーゼを用いる切断に対して感受性ではない。脂質部分は、エステルまたはアミド架橋を介して、PSAに抱合していてもよい。PSA分子１つあたり、１または２以上の脂質鎖（またはテイル）が存在してもよい。
【００３１】
本発明はさらに、単離されたPSA-LTを含む組成物を提供する。本明細書においてPSA-LTに関して用いられる場合、用語「単離された」とは、PSA-LTが、その天然の環境（すなわちB. fragilis細胞）から物理的に分離されることを意図する。単離されたPSA-LTを含む組成物は、LPSおよび／または非脂質付加PSAを含む、他の成分を含んでもよい。いくつかの態様において、かかる組成物中に存在するLPSの量は、約０．５％（ｗ／ｗ）またはそれより少ない。
【００３２】
いくつかの態様において、本発明の組成物は、約９９％のPSA、０．５％の非LPS脂質、および約０．５％のLPSを含む。いくつかの例において、組成物は、かかる組成物の特徴づけが、PSAからの脂質の切断を必要とし得るにも関わらず（例えば、本明細書において記載されるゲル系において）、その脂質に抱合したPSA（すなわちPSA-LT）を含むことが理解されるべきである。当該分野においては理解されることであろうが、LPSは、リポ多糖を指す。本明細書において用いられる場合、非LPS脂質は、LPSではない脂質である。PSA、LPSおよび非LPS脂質の量は、本明細書において記載されるもののようなゲル系を用いて決定することができる。いくつかの態様において、組成物は、DNAおよびRNAおよびタンパク質などの核酸などの混入物を本質的に含まない。本明細書において用いられる場合、本質的に含まないとは、それらの混入物が、組成物の約０．１％（ｗ／ｗ）またはそれより少ないものを表わすことを意図する。いくつかの例において、かかる混入物は、検出不能であってもよい。
【００３３】
本発明は、in vitroおよびin vivoでの使用のための組成物を提供する。in vitroでは、組成物は、分析ツールまたはアッセイ標準として用いてもよい。in vivoでは、組成物は、免疫制御を必要とするヒトまたは他の対象において、用いても、または動物モデルなどのヒトの疾患の実験モデルにおいて用いてもよい。in vivoで用いられる場合、組成物は、薬学的に受容可能であり、これは、それらが対象中への投与のために好適であることを意図する。それらは、かかる対象において予防的または治療的に用いても、用いられなくともよい。
【００３４】
PSA-LT単離方法
方法は、B. fragilisからのPSA-LTを単離および精製するための、一般的なおよび特定の方法を提供する。これらの方法は、それがPSAを産生することを前提として、B. fragilisの任意の株に対して行うことができることが理解されるべきである。かかる株として、天然に存在する株または過剰発現株9343などの変異株が挙げられる。
【００３５】
PSAを単離および精製するために用いられる先行技術の方法は、多糖から脂質テイルを取り除くことが見出されている。本発明は、脂質テイルを残し、それにより、その先に単離された非脂質付加形態よりも機能的により強力なPSAの脂質付加形態を生じる方法を提供する。本発明の単離方法は、先行技術の単離方法と、多数の点において異なる。第１に、本発明の方法は、先行技術において行われたようにより後の工程ではなく、精製プロセスの初期の工程において、穏和な酸（例えば、約４、または４〜５の範囲のｐＨ）により加水分解を行う。第２に、本発明の方法は、中性溶液（Tris）中で、先行技術の方法において用いられたデオキシコール酸ナトリウム（DOC）の不在下において、分子ふるいクロマトグラフィーを行う。第３に、単離全体を通して、ｐＨは９またはそれより低く（例えば約４〜約９またはそれより低い）、殆どの工程において中性の範囲に維持される。
【００３６】
簡単に述べると、PSA-LTの単離および精製は、以下を含む：（１）嫌気条件下におけるB. fragilis（野生型またはPSAを産生する変異株であって、PSAを過剰発現する株を含むもの）の増殖、（２）B. fragilisからの莢膜複合体の単離、および（３）PSA-LTのエタノール沈澱、（４）穏和な酸処理。莢膜複合体は、例えば高温フェノール／水抽出を用いて単離することができる。PSA-LTのエタノール沈澱の前に、DNase、RNaseおよび／またはプロナーゼによる処理を行ってもよい。酸処理は、希酸（例えば２％酢酸）を用いて、高い温度において行ってもよい。高い温度は、８０〜１００℃、８５〜９５℃の範囲であってよく、いくつかの例においては、約９０℃である。処理は、１時間、２時間、３時間またはそれより長く続いてもよい。いくつかの例において、酸処理は、２％酢酸を用いて、９０℃で３時間行われる。
【００３７】
PSA-LTはさらに、沈澱からサイズ排除により精製される。例えば、沈澱を、限定されないがPBSなどの中性の緩衝液中に溶解して、S-400サイズ排除カラム上に適用してもよい。このサイズ排除の工程は、デオキシコール酸ナトリウムの不在下において行われ、いくつかの例においては、任意の界面活性剤の不在下において行う。PSA-LT含有画分を、次いでプールし、随意に分析し、透析する。最終透析物を、凍結乾燥してもよい。
純度は、本明細書においてより詳細に記載されるように、核NMRおよび／またはSDS PAGEゲルにより、評価することができる。
【００３８】
PSA-LTの分析および特徴づけ、ならびにPSAとの比較
Ａ．PSA-LTの構造的特徴づけ
図１は、２８０ｎｍにおける吸光度によりモニタリングされる、Tris緩衝化食塩水中でのS400カラムの溶離プロフィールを示す。上記のとおり、画分を、PSA-LTに対する抗体による寒天中での二重拡散法により試験する。
【００３９】
図２は、６００ｍＨｚでのNMRにおいて行われた精製PSA-LTのプロトン核磁気共鳴分光プロフィールである。この分子の炭水化物構造は、PSAについての公開されたスペクトルと正確に一致する。このことは、PSA-LTの炭水化物部分がPSAと同一であることを示す。脂質に起因するPSA-LTの非常に小さなパーセンテージ（ｍ／ｍ）は、この高分解能技術により観察されない。
【００４０】
図５は、硫酸亜鉛／イミダゾール染色によりリバース染色された１６．５％のTris−トリシンSDS-PAGEゲルを用いての、PSA-LTの酸処理の時間経過の結果を示す。この染色プロトコルは、同じゲル系におけるPSA-LTの炭水化物（すなわちPSA）部分および脂質部分の両方を観察することを可能にする。５ｍｇ／ｍｌのPSA-LT（Lot 26）４ｍｇを、２％酢酸で、９０℃において、多様な期間にわたり処置し、その後、ＮａＯＨで中和し、透析した。生じた生成物のうち１００マイクログラムを、上記のように、１６．５％のTris−トリシンSDS-PAGEゲル上に流し、リバース染色した。図は、加水分解時間が増大するとともに、LPSのバンド（約６および８ｋＤにおけるもの）の消失、ならびに約５ｋＤにおける脂質のバンド（バンド３とラベルされるもの）の出現を明らかに示す。
【００４１】
バンド３が、PSA-LTの加水分解生成物（ゲルの一番上）として発したものであるのか、LPS（約８ｋＤａおよび６ｋＤａにおけるバンド）として発したものであるのかを決定するために、本発明者らは、精製されたB. fragilisのLPSを採取し、本発明者らがPSA-LTを加水分解したのと同一の条件下において加水分解した。重要なことに、LPSの加水分解の後で、バンド３は現れなかったが、PSA-LTの加水分解の後では明確に存在した（Lot 24）（図６）
【００４２】
さらに、バンド３は、先行技術の単離方法を用いて調製されたPSA含有組成物、例えばLot 23などにおいては観察されなかった（PSA23、図１３）。図は、水中で１．３ｍｇ／ｍｌのPSA23の１ｍｇに対する酸処理（２％酢酸により９０℃におけるもの、およびＮａＯＨによる中和）の結果を示す。処理された画分のうち１００ｕｇを、１６．５％のTris−トリシンSDS-PAGEゲル上に流し、硫酸亜鉛／イミダゾールでリバース染色した。PSA-LTを含むPSA24調製物を、比較物として流した。
【００４３】
バンド３がPSA-LTの加水分解生成物であることを確認するために、図７中の左におけるゲルにおいて観察されたような高分子量PSA-LTを、さらに分析した。ボックスは、さらなる分析のためにゲルから切り出されたバンドを示す。図７の右側の列において観察されるように、ゲルから溶離した生成物を、次いで加水分解し、それを同じゲル系に流すことにより再び研究した。バンド３は、矢印により示すように、高分子量PSA-LTの加水分解の後で観察することができる。
【００４４】
Ｂ．PSA-LTの機能的特徴づけ
次いで、PSA-LTの免疫学的活性が、加水分解が起こる可能性がある先の精製プロセスにおける工程により影響を及ぼされたかを決定するために、実験を行った。PSA-LT（Lot 24）を、精製プロセス中の非常に初期に、最初のフェノール／水抽出工程からの水相の分離の直後の時点において、加水分解した。
【００４５】
PSA-LTを、その脾臓樹状細胞とＴ細胞との共培養中でＩＬ―１０産生を誘導する能力について試験した。このアッセイは、以下のように行った：（１）マウス抗ＣＤ１１ｃマイクロビーズ（Miltenyi Biotec cat#130-052-001）を用いて脾臓ＤＣを単離する；（２）マウスＴ細胞ＣＤ４サブセットカラムキット（R&D systems cat#MCD4C-1000）を用いてＣＤ４＋Ｔ細胞を単離する；（３）２×１０４のＣＤ１１ｃ＋ＤＣと１０５のＣＤ４＋Ｔ細胞とを混合し、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（BD Pharmingen cat#553057）を添加する；（４）培養物を次いで、１００μｇ／ｍｌのPSAで刺激し、細胞を５日間インキュベートする；ならびに（５）上清を収集し、ＩＬ−１０の存在についてELISAにより分析する。
【００４６】
図３は、この共培養系におけるＩＬ―１０産生に関して、PSA-LT（PSA24として示す）は、先行技術の方法により製造されたPSA（PSA 23として示す）よりも約３倍強力であることを示す。
PSA24は、少量の混入LPS（約０．５％、ｗ／ｗ）を有するので、本発明者らは、精製したB. fragilis LPSをPSA Lot 23（PSA23）に添加し、LPSを含有しないPSAのロットへのLPSの添加が、それが共培養系においてＩＬ−１０の産生を誘導する能力を増強しない（およびしたがってこれを再構成しない）ことを決定した。
【００４７】
図８において示すように、PSA-LT 24は、ＤＣとＴ細胞との共培養系におけるＩＬ―１０産生を誘導することにおいて、極めて活性であった。PSA-LT（Lot 26、およびこの図においてPSA26-PDとして示す）は、任意の加水分解の工程の前に、同様に活性であった。加水分解していないPSA-LT（Lot 26）のS400クロマトグラフィーによるさらなる精製の後で、この材料を、PSA-LT（Lot 24）の初期の加水分解と同じ条件下において加水分解した。精製プロセスにおいて初期に加水分解したPSA-LTと対照的に、プロセスの後期に加水分解されたPSA-LTは、共培養系においてＩＬ−１０を誘導するその能力の大部分を喪失した。加水分解されたPSA-LT（Lot 26）をクロロホルムで直接抽出した場合、統計学的に有意なＩＬ−１０誘導能力の喪失は存在しなかった。最後に、後期のPSA-LT（Lot 26）を加水分解してクロロホルム抽出した場合、全ての残りのＩＬ−１０誘導能力が失われた。したがって、PSA-LTの脂質画分は、加水分解により著しく取り除かれるが、有機溶媒によっては取り除かれない。しかし、加水分解の後で、材料は、有機溶媒中で可溶性であり、このことは、PSAと脂質との間に加水分解可能な共有結合が存在することを示す。PSA-LTが初めに加水分解されていない限り、PSA-LTに対する直接的なクロロホルム抽出がＩＬ−１０誘導能力を取り除かなかったという事実は、脂質成分が共有的に付着していることを示す。脂質がNMRにおいて観察されないという事実は、PSA-LTの加水分解の後でのバンド３の発見と組み合わせて、脂質が、PSA-LTの全体的な質量のうちの極めて小さい割合であり、多糖の還元性の末端において共有的に架橋した脂質を表わす可能性が最も高いことを示す。かかる脂質は、グラム陰性細菌により、多糖の膜挿入物のために用いられる場合がある。
【００４８】
PSAのための本発明者らの先の単離プロセスと比較した、PSA-LTのための本発明者らの精製プロトコルにおける別の主要な差異は、デオキシコール酸ナトリウム（DOC）含有緩衝液中でのクロマトグラフィー工程の除去である。DOCとの接触の結果としての活性の差異を、図９において示す。Lot 24 PSA-LTを、DOC含有緩衝液中に、本発明者らのPSAの精製において用いられるｐＨ９の条件下において懸濁した。DOCのｐＨは８．０であったが、ｐＨを、ＮａＯＨにより速やかにｐＨ９まで上げ、希ＨＣｌにより再び戻した。大規模な透析の後で、Lot 24は、ＤＣとＴ細胞との共培養系においてＩＬ−１０を誘導するその能力を喪失した。図１０において、PSA-LT（Lot 24）の加水分解の後で観察されたバンド３は、DOC処置されたLot 24の加水分解の後ではもはや観察されなかった。DOCを含む工程の除去は、全ての先のプロトコルからの主要な解離を表わし、PSA-LTの調製のために現在用いられる方法を、PSAの調製のために用いられる方法と区別する。
【００４９】
Ｃ．多発性硬化症の動物モデル（EAE）においてPSAと比較したPSA-LTのin vivoでの効力
上のデータは、PSAと比較した場合の、PSA-LTによる、ＤＣとＴ細胞との共培養におけるＩＬ−１０の誘導の著しいin vitroでの増強を示す。このin vitroでのＩＬ―１０産生の増強が、in vivoでの潜在的な治療利益を表わすか否かを決定するために、本発明者らは、PSA-LT（Lot 24）をPSA（Lot 23）と比較した（図１１）。６週齢のメスのナイーブなC57 BL/6マウスの群を、１００μｇのPSA-LT、PSAまたはリン酸緩衝化食塩水（PBS）のいずれかにより、EAE誘導の６日前に開始して３日毎に処置した。マウスを、２００μｌのフロイント完全アジュバント（Sigma）中の２５０μｇのMOG33-55（Peptides International）により、皮下でチャレンジした。チャレンジの後０日目および２日目において、マウスは、２５０ｎｇの百日咳菌毒素（List Biological Laboratories）の腹腔内注射を受けた。疾患を、確立した０〜５の尺度においてスコアづけし、５は進行した神経性疾患である。マウスを、疾患の進行について毎日モニタリングおよびスコアづけした。PBSで処置された対照と比較した場合、PSAを与えられた動物は、疾患の重篤度において統計学的に有意な軽減を有した；しかし、PSA-LTを与えられた動物は、疾患の重篤度のさらにより著しい軽減を有し、EAEの発症に対してほぼ完全な保護を有した。
これらの研究は、ヒト疾患の非常に重要な動物モデルにおいて、PSAと比較した場合に、PSA-LTの決定的な増強された保護能力を示す。
【００５０】
検出の方法
本発明は、PSA-LTの存在を検出する、およびいくつかの例においては試料または組成物中のPSA-LTの量を定量するための方法を提供する。これらの方法は、本明細書において記載されるTris−トリシンSDS-PAGEゲル系を使用する。試料を、かかる１６．５％のTris−トリシンSDS-PAGEゲル上に流し、次いで、硫酸亜鉛およびイミダゾールでリバース染色する。約５ｋＤにおけるバンドの存在により、PSA-LTの存在が示される。６０ｋＤより上の主要なバンドは、PSA（脂質付加または非脂質付加バージョン）を表わす。
【００５１】
この系を用いて分析される組成物は、本明細書において記載されるように、例えば、フェノール／水抽出、エタノール沈澱、穏和な酸加水分解、およびサイズ排除の後で得ても、または、それらは他の方法において得ても、および／または調製してもよい。
【００５２】
使用の方法
本発明は、本明細書において提供される組成物のin vitroおよびin vivoでの使用の多様な方法を提供する。in vitroでの使用として、分析ツールとして（例えばB. fragilis の存在のマーカーとして）、およびアッセイ標準または対照として（例えばPSA-LTの陽性マーカーとして）の使用が挙げられる。
【００５３】
in vivoでの使用として、限定されないが、ヒト対象を含むものが挙げられる。例えば、in vivoでの使用として、免疫応答を調節するための、本発明の組成物の非ヒト対象への投与が挙げられる。
【００５４】
本発明は、一般に、異常な免疫応答を有するかまたはこれを発症する可能性がある対象において、免疫応答を調節する方法を提供する。典型的には、異常な免疫応答は、増強された免疫応答であり、組成物は、免疫応答を下方調節するように作用する。増強された免疫応答は、典型的には、限定されないが自己免疫疾患などの炎症状態である。
【００５５】
従って、本発明の組成物は、自己免疫疾患を有するかまたはこれを発症する危険がある対象において免疫応答を調節（および典型的には下方調節）するために用いることができる。当業者には理解されるであろうが、自己免疫疾患を有する対象は、典型的には、自己免疫疾患に関連する１または２以上の「イベント」または再発を経験する。例えば、炎症性腸疾患を有する対象は、症状の存在または増大した症状の重篤度により特徴づけられる時間的に分離した疾患の発作を経験する場合がある。本発明は、かかる対象において、かかる将来的な疾患の再発の可能性を減少させるため、または疾患に関連する症状（例えば疼痛、熱、不快感、疲労など）の重篤度を軽減するために、組成物を用いてもよいことを企図する。したがって、組成物は、かかる再発の前に投与してもよく、この様式において、随意に規則的な頻度において、慢性的に投与してもよい。例として、１日１回、２、３、４、５もしくは６日に１回、または１週間に１回などが挙げられる。本発明はまた、かかる対象に、再発の間に、症状の重篤度を軽減するか、または再発の時間を短縮するために、組成物を投与してもよいことを企図する。
【００５６】
自己免疫疾患は、当該分野において公知である。自己免疫疾患の例として、限定されないが、以下が挙げられる：多発性硬化症、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、Ｉ型糖尿病、ブドウ膜炎、セリアック病、悪性貧血、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーヴス病、全身エリテマトーデス、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、ギラン・バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、巨細胞性動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫性肝炎、川崎病、混合性結合組織病、オード（Ord）甲状腺炎、多発性関節炎、原発性胆汁性硬化症、ライター症候群、高安動脈炎、白斑、温式自己免疫性溶血性貧血、ウェゲナー肉芽腫症、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患およびサルコイドーシス。
【００５７】
重要な態様において、自己免疫疾患は多発性硬化症である。他の重要な態様において、自己免疫疾患は、限定されないが潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む炎症性腸疾患である。
いくつかの例において、本発明の組成物は、まだ自己免疫疾患（その症状を含む）を顕在化していないが、既知の遺伝的または家族性の素因に基づいてかかる疾患を発症する危険がある対象に投与してもよい。かかる対象は、当該疾患に苦しむ１または２以上の家族のメンバーを有する場合がある。
【００５８】
いくつかの例において、本発明の組成物は、移植片対宿主病を有するかまたはこれを発症する危険がある対象に投与される。投与は、器官または組織（血液または血液製剤を含む）の対象中への移植の前、その間および／またはその後に起こってもよい。
なお他の例において、組成物は、炎症に関連する状態を有するかまたはこれを発症する危険がある対象に投与してもよい。
【００５９】
例として、組成物は、喘息を有する対象に投与してもよい。当該分野においては理解されるであろうが、喘息を有する対象は、典型的には、呼吸障害により特徴づけられる喘息の発作またはイベントを経験する。本発明は、本明細書において記載される組成物を、急性に（例えば単回の大用量）、または慢性に（例えば繰り返しの小用量）、喘息の対象に投与してもよいことを企図する。したがって、いくつかの例において、発作の発生を予防するため、発作の頻度を減少させるため、および／または発作の重篤度を和らげるために、喘息の発作の前に組成物を投与してもよい。いくつかの例において、発作の間に、その重篤度を軽減するため、および／またはその持続期間を短縮するために、組成物を投与してもよい。
【００６０】
別の炎症に関連する状態は、手術後癒着である。本発明は、手術後癒着を有するかまたはこれを発症する危険がある対象への本明細書において記載される組成物の投与を企図する。組成物は、かかる癒着の発生を予防するため、および／またはそれらの重篤度を軽減するために、手術の前、その間および／またはその直後に投与することができる。組成物は、手術の後に繰り返して投与してもよく、これは、例えば、手術の後１週間、２週間、３週間、１か月または数か月にわたり、毎日、２日に１回、３日に１回などを含む。
【００６１】
別の炎症に関連する状態は、膿瘍であり、これは、限定されないが、腸内容物の腹膜中への漏出により起こり得るもののような腹部膿瘍を含む。これらの場合において、処置されている対象はまた、抗生物質などの抗菌剤を投与されてもよい。
【００６２】
別の炎症に関連する状態は、肥満であり、したがって、本発明はまた、肥満である対象における本明細書において記載される組成物の投与を企図する。かかる対象は、典型的には、３０またはそれより高い肥満度指数（BMI）を有するものとして定義される。いくつかの例において、組成物は、２０より高いまたは２５より高いBMIを有する対象に投与してもよい。組成物は、かかる対象においてさらなる体重増加を予防すること、および／または体重減少を誘導することを意図される。
【００６３】
対象は、本発明の組成物の投与から利益を受けるであろう、または本発明の組成物を投与され得る、任意の対象を意図する。重要な態様において、対象は、ヒト対象である。対象はまた、イヌもしくはネコなどの愛玩動物、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジなどの農業家畜、マウス、ラット、ウサギ、サルなどの研究動物、または動物園において維持されているかもしくは他に捕われているものなどの動物であってもよい。
【００６４】
多様な投与経路が利用可能である。選択される特定の様式は、無論、処置されている特定の状態、処置されている状態の重篤度、および治療効力のために必要とされる投与量に依存するであろう。本発明の方法は、一般的に言えば、医学的に受容可能な任意の投与の様式を用いて実施することができ、これは、臨床的に受容することができない有害効果を引き起こすことなく活性化合物の有効レベルをもたらす任意の様式を意味する。かかる投与の様式として、経口、直腸、局所、鼻、吸入または非経口の経路が挙げられる。用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内または注入を含む。
【００６５】
処方物
投与される場合、本発明の活性剤は、薬学的に受容可能な組成物または調製物として処方される。かかる組成物または調製物は、慣用的に、薬学的に受容可能なキャリア、塩の濃縮物、緩衝化剤、保存剤、他の免疫調節因子、および随意に他の治療成分を含んでもよい。本明細書において用いられる、および以下により完全に記載される用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、１または２以上の適合性の固体または液体の充填剤、希釈剤または封入物質であって、ヒトまたは他の動物への投与のために好適であるものを意味する。用語「キャリア」とは、天然または合成の、有機または無機の成分であって、適用を容易にするために活性成分が組み合わされるものを表わす。医薬組成物の成分はまた、所望の薬学的効力を実質的に損なう相互作用が存在しない様式において、本発明の活性剤と混合することができる。
【００６６】
医薬組成物は、単位投与形態において便利に提示することができ、製薬の分野において周知の方法のいずれにより調製してもよい。全ての方法は、PSA-LT（および／またはPSA-LTを含む組成物）を、１または２以上の補助成分を構成するキャリアと組み合わせる工程を含む。一般に、組成物は、PSA-LT組成物を、液体のキャリア、微細に分割された固体のキャリア、または両方と、均質に、および緊密に組み合わせ、次いで、必要である場合は、製品を成形することにより調製される。経口投与のために好適な組成物は、カプセル、錠剤、ロゼンジなどの、各々が予め決定された量の活性成分を含む、別々の単位として提示してもよい。他の組成物として、シロップ、エリキシルまたは乳液などの、水性の液体または非水性の液体中の懸濁液が挙げられる。
【００６７】
活性成分は、それ自体で（ニートで）投与しても、または薬学的に受容可能な塩の形態において投与してもよい。医薬中で用いられる場合、塩は、薬学的に受容可能なものであるが、薬学的に受容可能でない塩は、その薬学的に受容可能な塩を調製するために便利に用いることができ、したがって、本発明の範囲から除外されない。かかる薬理学的および薬学的に受容可能な塩として、限定されないが、以下の酸から調製されるものが挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、薬学的に受容可能な塩は、カルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などの、アルカリ金属またはアルカリ土類金属として調製してもよい。
【００６８】
好適な緩衝化剤として：酢酸および塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；ならびにリン酸および塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）が挙げられる。好適な保存剤として、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）が挙げられる。
【００６９】
非経口投与のために好適な組成物は、便利に、多糖の無菌の水性調製物を含み、これは、レシピエントの血液と等張であってよい。使用することができる受容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の、硬化油が、溶媒または懸濁媒として、慣用的に使用される。この目的のために、合成のモノ−またはジグリセリドを含む任意の無刺激性（bland）の硬化油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が、注射可能物の調製において用途を見出す。皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内などの投与のために好適なキャリア処方物は、Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Publishing Company, Easton, Pa.）において見出すことができる。
【００７０】
上記のような医薬調製物は、有効量において投与される。治療的適用のために、それは一般に、医学的に望ましい結果を達成するために十分な量である。一般に、治療有効量は、処置されている特定の状態の発症を遅延させるか、その進行を阻害するか、またはそれを完全に停止させる（状態の再発の可能性、頻度および／または重篤度を減少させることを含む）ために必要な量である。一例として、有効量は、処置または予防されている障害の症状（例えば疼痛、熱など）を軽減、緩和、またはその発症を遅延させるために役立つ量であってよい。有効量は、投与の様式、処置されている特定の状態、および所望される予後に依存するであろう。それはまた、状態のステージ、状態の重篤度、処置されている対象の年齢および身体的状態、併用治療がある場合はその性質、処置の持続期間、投与の具体的な経路、ならびに医師の知識および専門的意見内の同様の要因にも依存するであろう。予防的適用については、それは、予防されている特定の状態の発症を遅延させるか、その進行を阻害するか、またはそれを完全に停止させるために十分な量であって、症状の発症を予防するために必要とされる量により測定することができる。
【００７１】
一般に、本発明の活性化合物の用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、および最も好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの、１日に１回または２回以上の用量の投与において、１日または２日間以上にわたるものであってよい。１〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量、および好ましくは１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量、さらにより好ましくは１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量が好適であると期待される。好ましい量は、当業者により、剤の最適投与レベルを決定するための標準的な習慣に従って決定され得る。一般に、最大用量が、健全な医学的判断により用いられる最も高い安全用量であることが好ましい。
いくつかの例において、ヒト対象のための合計の日用量は、約５０〜１００マイクログラムの範囲のPSA-LTであってよい。
【００７２】
医薬調製物は、単独で、または他の化合物と組み合わせて投与することができる。一態様において、医薬調製物は、以下からなる群より選択される抗生物質を含む１または２以上の抗菌剤との組合せにおいて与えられる：ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、アンピシリン、アモキシシリン、バカンピシリン、シクラシリン、エピシリン、ヘタシリン、ピバンピシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、カルベニシリン、チカルシリン、アブロシリン（avlocillin）、メズロシリン、ピペラシリン、アムジノシリン、セファレキシン、セフラジン、セファドロキシル、セファクロル、セファゾリン、セフロキシムアキセチル、セファマンドール、セフォニシド、セフォキシチン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフメノキシム、セフトリアキソン、モキサラクタム、セフォテタン、セフォペラゾン、セフタジジム、イミペネム、クラブラン酸、チメンチン、スルバクタム、ネオマイシン、エリスロマイシン、メトロニダゾール、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、バンコマイシン、トリメトプリム・スルファメトキサゾール、アミノグリコシド、キノロン、テトラサイクリンおよびリファンピン。
以下の例は、説明を目的として含められるものであり、本発明の範囲を限定することを意図されない。
【００７３】
例
例１．PSA-LTの単離の要約（Lot 24、PSA24）。
B. fragilisを、嫌気条件において増殖させた。B. fragilisからの莢膜複合体を、高温フェノール／水抽出により単離した。PSA-LTを、DNAse、RNAseおよびプロナーゼ処理の後で、エタノールにより沈降させた。沈澱を、次いで、２％酢酸により９０℃において３時間、酸処理した。PSA-LTを、S-400サイズ排除カラムにおいてPBS中でさらに精製した。画分を、分析およびプールし、次いで透析および凍結乾燥した。PSAの純度を、本明細書において記載されるとおり、核磁気共鳴分光法およびSDS PAGEゲルにより評価した。
【００７４】
例２．PSA-LTの特異的単離（Lot 24、PSA24）。
PSA-LTの単離および精製プロセスを、以下により詳細に提供する。
多糖Ａ（PSA）を過剰発現するB. fragilis株9343を、血液寒天プレート上にプレーティングし、一晩３７℃で増殖させた。密にコロニー形成したプレートを、５００ｍｌのペプトン酵母ブロスのスターター培養中に継代培養した。スターター培養物を、同じ培地の１６リットルの培養中へ播種し、ｐＨを５ＭのＮａＯＨで中性まで滴定した。嫌気ガス混合物を、密封した培養中にバブリングした。
【００７５】
ｐＨ７に維持された一晩の培養の後で、細菌を、グラム染色によりチェックし、継代培養した。８，０００×ｇにおいて２０分間の遠心分離により生物を収集した。細菌ペレットを、食塩水で２回洗浄し、約１リットルの細菌ペレットを得た。
【００７６】
細菌ペレットを、６８℃の融解した結晶性フェノール中に、フェノールの最終濃度が約３７％ｖ／ｖとなるように懸濁し（フェノール／水調製物を生じる）、３０分間６８℃において混合し、その後、４℃で４８時間撹拌した。フェノール／水調製物を、ガラスボトル中に分注し、これを次いで、１５００ｒｐｍにおいて遠心分離した。上の水層を採取した。採取した水相中に含有される残りのフェノールを全て、等容積のエチルエーテルで抽出した。エーテル相を、次いで、分液漏斗を用いて取り除き、水相中の残りのエーテルを全て蒸発させ、フェノール／水調製物からの最終の水相を得た。
【００７７】
水相を、水に対して、５日間にわたり４℃において、複数回の交換を行いながら透析し、その後、それがほぼ乾燥する（約５ｍｌの水が残る）まで凍結乾燥させた。マグネシウム、カルシウムおよびアジ化ナトリウムを含む０．０５ＭのTris（合計容積６１ｍｌ）を、凍結乾燥生成物に添加して、合計容積を約６６ｍｌとした。
【００７８】
溶解した生成物に、DNase（０．０７ｍｇ／ｍｌ）およびRNAase（０．３３ｍｇ／ｍｌ）を含む１０ｍｌのTris緩衝液を添加した。全懸濁液を、０．４５マイクロンのフィルターを通して濾過し、濾過物を３７℃で撹拌した。新しい酵素を同様の濃度において混合物に添加して２時間撹拌することにより、DNase／RNAase処理を繰り返した。
混合物のｐＨを、次いで、２ＭのＮａＯＨで７．５まで上昇させ、１０ｍｌのTris／マグネシウム／カルシウム溶液中の２５ｍｇのプロナーゼを添加して、混合物を２４時間３７℃で撹拌した。この工程を繰り返した。
【００７９】
混合物に４℃において５容積のエタノールを添加することにより、PSA-LTを沈降させた。溶液を、次いで、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離して、PSA-LTをペレットにした。上清を取り除き、ペレットを３９２ｍｌのタイプ１のＨ２Ｏ中に再懸濁した。
次いで、８ｍｌの酢酸を溶液に添加し、それを３時間９０℃で加熱することにより、酸処理を行った。溶液を、次いで少し冷却し、ＮａＯＨで中和し、４℃まで冷却した。
【００８０】
繰り返しの遠心分離の後で、沈澱を廃棄し、上清を、２回の交換を行いながら、１６リットルのタイプ１のＨ２Ｏに対して４℃で透析した。凍結乾燥により容積を約５０ｍｌまで減少させた。２０ｍｌのアリコートを、ＰＢＳ中に懸濁した５×２００ｃｍのS400のカラム上でのクロマトグラフィーに供し、画分を収集した。画分を、寒天中での、脂質付加されたPSAおよび非脂質付加PSAの両方と反応する抗体による二重拡散法により試験し、PSA-LTがどこで溶離するかを決定した。PSA-LTは、図１において示されるように、画分４６〜８８において見出された。これらのアリコートを、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収について試験し、PSA-LT含有画分が、ＵＶ吸収可能な材料を有さなかったことを決定した。
【００８１】
PSA-LTを含有する画分を、次いでプールし、Minitan濃縮装置（concentrator）（Millipore）において、１０，０００ｍｗのカットオフメンブレンを用いて、１００ｍｌの伝導率が５０μＳより低くなるまで、タイプ１のＨ２Ｏに対して濃縮および透析した。
PSA-LTを、次いで凍結乾燥した。合計のPSAの回収物は、７３９ｍｇであった。
LPSの混入の程度は、SDS PAGEゲル系におけるPro Q LPS染色により決定し、約０．５％であることを決定した。多糖の純度および構造は、プロトン核磁気共鳴分光法により、６００ｍＨｚの分光計において決定した。
【００８２】
均等物
幾つかの本発明の態様が、本明細書において記載され説明されるが、当業者は、機能を実施するため、および／または結果を得るため、および／または本明細書において記載される利点の１または２以上のための多様な他の手段および／または構造を、容易に想起するであろうし、かかるバリエーションおよび／または改変の各々は、本明細書において記載される本発明の態様の範囲内であるものとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書において記載される全てのパラメーター、寸法、材料および配置は、例示であることを意味され、実際のパラメーター、寸法、材料および配置は、本発明の教示が用いられる特定の適用に依存するであろうことを、容易に理解するであろう。当業者は、本明細書において記載される特定の本発明の態様に対する多くの均等物を、慣用的な実験のみを用いて、認識するか、または確認することができるであろう。したがって、前述の態様が単に例として表わされるものであること、および、添付の請求の範囲およびそれらに対する均等物の範囲内において、本発明の態様は、具体的に記載および請求されるものとは別の方法で実施してもよいことが、理解されるべきである。本開示の本発明の態様は、本明細書において記載される各々の個々の特徴、系、物品、材料、キットおよび／または方法に対して向けられる。さらに、２または３以上のかかる特徴、系、物品、材料、キットおよび／または方法の任意の組み合わせは、かかる特徴、系、物品、材料、キットおよび／または方法が互いに不一致でない場合は、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
【００８３】
本明細書において記載され用いられる全ての定義は、辞書による定義、参照として援用される文書における定義、および／または定義される用語の通常の意味に対して優先することが理解されるべきである。
本明細書において開示される全ての参照文献、特許および特許出願は、それについて各々が引用される主題に関して、参照として援用され、これらは、いくつかの場合においては、当該文書の全体を包含してもよい。
本明細書において、および請求の範囲において用いられる不定冠詞「a」および「an」は、明らかに反対であることが示されない限りにおいて、「少なくとも１」を意味することが理解されるべきである。
【００８４】
本明細書において、および請求の範囲において用いられる句「および／または」は、そのように抱合された要素、すなわち、いくつかの場合において接続語的に存在し、他の場合においては離接語的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味することが、理解されるべきである。「および／または」により列記される複数の要素は、同じ様式において解釈されるべきであり、すなわち、そのように結合した「１または２以上の」要素である。「および／または」の節により具体的に同定される要素の他に、他の要素が随意に存在してもよく、これは、具体的に同定されたそれらの要素と関連していても関連していなくともよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」についての言及は、「含む」などのオープンエンドの言語と結合して用いられる場合、一態様においては、Ａのみ（随意にＢ以外の要素を含む）を指してもよく；別の態様においては、Ｂのみ（随意にＡ以外の要素を含む）を指してもよく；さらに別の態様においては、ＡおよびＢの両方（随意に他の要素を含む）を指してもよい、など。
【００８５】
本明細書において、および請求の範囲において用いられる場合「または」は、上で定義される「および／または」と同じ意味を有するものと理解されるべきである。例えば、列記中で項目を分離する場合、「または」または「および／または」は、包括的であるもの、すなわち、少なくとも１の包含として解釈されるべきであるが、また、１より多くの数の要素または要素の列記、および随意に、さらなる列記されない項目を含む。「〜の１つのみ（only one of）」もしくは「〜の正確に１つ（exactly one of）」、または請求の範囲において用いられる場合は「からなる（consisting of）」などの、逆であることを明らかに示される用語のみが、多数の要素または要素の列記のうちの正確に１つの要素の包含を指すであろう。一般的に、本明細書において用いられる用語「または」は、「いずれか（either）」、「〜の１つ（one of）」、「〜の１つのみ（only one of）」または「〜の正確に１つ（exactly one of）」などの排他性の用語により先行される場合、排他的な代替物（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるべきである。「〜から本質的になる（consisting essentially of）」は、請求の範囲において用いられる場合、特許法の分野において用いられるその通常の意味を有するべきである。
【００８６】
本明細書において、および請求の範囲において用いられる場合、１または２以上の要素の列記への言及における句「少なくとも１」は、要素の列記中の要素の任意の１または２以上から選択される１または２以上の要素を意味するものと理解されるべきであるが、必ずしも、要素の列記中の具体的に列記される各々のおよび全ての要素の少なくとも１つを含まず、要素の列記中の要素の任意の組み合わせを除外しない。この定義はまた、句「少なくとも１」が言及する要素の列記中に具体的に同定される要素以外の要素が随意に存在してもよいことを可能にし、これは、具体的に同定されるこれらの要素に関連しても関連しなくてもよい。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１」（あるいは、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１」、あるいは、同等に、「Ａおよび／またはＢの少なくとも１」）は、一態様において、少なくとも１の、随意に１より多くを含む、Ａであって、Ｂが存在しない（および随意にＢ以外の要素を含む）ものを指してもよく；別の態様において、少なくとも１の、随意に１より多くを含む、Ｂであって、Ａが存在しないもの（および随意にＡ以外の要素を含む）ものを指してもよく；さらに別の態様において、少なくとも１の、随意に１より多くを含む、Ａ、および少なくとも１の、随意に１より多くを含む、Ｂ（および随意に他の要素を含む）を指してもよい、など。
【００８７】
また、明らかに逆であることが示されない限りにおいて、本明細書において請求される任意の方法であって、１より多くの工程または動作を含むものにおいて、当該方法の工程または動作は、必ずしも、
当該方法の工程または動作が列挙される順序に限定されない。
【００８８】
請求の範囲において、ならびに上の明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「担持する（carrying）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」、「含む（involving）」、「保持する（holding）」、「〜からなる（composed of）」などの全ての移行句は、オープンエンドであるものと、すなわち、それを含むがそれに限定されないことを意味するものと理解されるべきである。米国特許庁の特許審査手続きの便覧、セクション2111.03において記載されるとおり、移行句「〜からなる（consisting of）」および「〜から本質的になる（consisting essentially of）」のみが、それぞれ、クローズド、またはセミクローズドの移行句であるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年2月2日(2018.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高温において、フェノールと水との混合物を用いて、B. fragilisからの莢膜複合体を水相中に抽出すること、
エタノールを用いて多糖Ａ（PSA）を水相から沈降させること、 
高温において、２％酢酸を用いて、
（ａ）界面活性剤の不在下において、および／または
（ｂ）約９より低いｐＨにおいて
沈澱を酸処理すること
を含む、方法。
【外国語明細書】
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