(57)【要約】【課題】優れた殺腫瘍細胞効果を有する新規の肝がんの治療剤を提供する。【解決手段】肝がんの治療剤は、ジフテリア毒素Ａをコードする核酸を含むベクターを有効成分として含有する。前記ベクターが前記ジフテリア毒素Ａをコードする核酸に作動可能に連結された肝がん細胞選択的プロモーターを含んでもよい。前記肝がんの治療剤は、ハイドロダイナミック遺伝子導入法により投与されてもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジフテリア毒素Ａをコードする核酸を含むベクターを有効成分として含有することを特徴とする肝がんの治療剤。
【請求項２】
前記ベクターが前記ジフテリア毒素Ａをコードする核酸に作動可能に連結された肝がん細胞選択的プロモーターを含む請求項１に記載の肝がんの治療剤。
【請求項３】
肝動脈から肝がんに直接的に投与される請求項１又は２に記載の肝がんの治療剤。
【請求項４】
ハイドロダイナミック遺伝子導入法により投与される請求項３に記載の肝がんの治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝がんの治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝がんは、肺がんや子宮頸がんと並び、主要な発生要因が明らかになっているがんの１つである。日本では、肝がん（特に、肝細胞がん）の約６０％がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の持続感染、約１５％がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の持続感染に起因すると試算されている。
また、国立研究開発法人国立がん研究センターの部位別がんの統計情報（２００６年１０月２０日調べ）によると、年齢別にみた肝がんの罹患率は、男性では４５歳、女性では５５歳から増加し始め、７０歳代に横ばいとなる。年齢別に見た死亡率も同様な傾向にある。また、同情報による最新の２０１４年の死亡数は、様々な癌種の中で、肝がんは男女計で第５位と現時点で予後の改善が得られておらず、また、罹患数と死亡数とに大きな差がなく、これは、肝がん罹患者の生存率が低いことと関連している。男性は２０１４年の死亡数が第４位、２０１２年の罹患数は第５位と性差を認め、女性の約２〜３倍である。
【０００３】
肝がんの治療方法としては、外科療法、局所療法（例えば、エタノール注入療法、マイクロ波凝固術、ラジオ波焼灼術等）、肝動脈塞栓術、放射線療法、肝動注化学療法、肝移植等が挙げられ、肝がんの部位、進行度や肝機能の低下度合をみて、慎重に治療法を決定する。
【０００４】
一方、本発明者らは、これまで、水圧で薬物、遺伝子、細胞等を特定の臓器又は組織内へと送達する方法、すなわちハイドロダイナミック法を開発してきた。
具体的には、遺伝子を導入する場合において、効率的な遺伝子発現を示すために必要な溶液量を減少するための工夫として、日常の診療手技として用いている血管内のカテーテル操作を応用し、臓器、組織選択的な核酸溶液注入を検討してきた。より具体的には、各臓器の血管、例えば、肝臓の各肝区域の静脈にカテーテルを挿入し、カテーテル先端のバルーンを膨張させ、血流をブロックして溶液注入を行うことで、対象領域選択的な遺伝子導入と溶液量の減少とを実現した。ハイドロダイナミック法を用いることによりブタ、イヌ、ヒヒの肝臓、筋肉を対象とした前臨床研究において、導入効率を担保しながら、注入溶液量を体重１０％容量から１．２５％容量まで減少することに成功した（例えば、非特許文献１〜５参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kamimura K et al., “Image-guided hydrodynamic gene delivery: Current status and future directions”, Pharmaceutics, vol.7, p213-223, 2015.
【非特許文献２】Kamimura K et al., “Image-guided hydrodynamic gene delivery to the liver: Toward clinical applications”, In Gene Therapy and Cell Therapy through the Liver-Current Aspects and Future Prospects. Part II. Gene Therapy; Springer: London, UK. 2015.
【非特許文献３】Kamimura K et al., “Image-guided, lobe-specific hydrodynamic gene delivery to swine liver”, Mol Ther, vol.17, no.3,  p491-499, 2009.
【非特許文献４】Kamimura K et al., “Parameters affecting image-guided, hydrodynamic gene delivery to swine liver”, Mol Ther Nucleic Acids, 2: e128, 2013.
【非特許文献５】Kamimura K et al., “Safety assessment of liver-targeted hydrodynamic gene delivery in dogs”,  PLoS One, vol.9, issue 9, 24: e107203, 2014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の肝がんの治療方法のうち、外科療法及び局所療法は、腫瘍の数が少なく、腫瘍のサイズが小さい場合に選択される治療方法であり、腫瘍の数が多く、腫瘍のサイズが大きい場合には適用することが難しかった。また、肝障害が重度である患者には適用できず、またいずれの治療方法についても患者における体力面での負担が大きかった。
また、肝動脈塞栓術は、大きながんには効果的だが、小さながんには効果が少ない場合もあり、根治させることは難しい治療法であった。
また、肝臓は放射線に弱い臓器であるため、あまり放射線療法は行われていなかった。
また、肝がんを含む悪性腫瘍は抗がん剤に対して高感受性のがん細胞と抵抗性のがん細胞とから形成されており、その形態はヘテロジニアスな細胞の集合体である。そのため、肝動注化学療法では、抗がん剤が全てのがん細胞に効力であるわけではなく、抗がん剤耐性変異を有するがん細胞が残存し、根治させることは難しい治療法であった。
また、肝移植は、腫瘍が「１個の場合は５センチ以下、多発では３個以下でそれぞれ３センチ以内」の場合が目安となっており（ミラノ基準）、それを越えた場合には推奨されていなかった。
【０００７】
さらに、本発明者らが開発したハイドロダイナミック法は、肝がんの治療への適用は未だ検討されておらず、肝がんに対する有効な遺伝子治療法はこれまでに確立されていなかった。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、優れた殺腫瘍細胞効果を有する新規の肝がんの治療剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ジフテリア毒素Ａをコードする核酸を肝がん細胞に導入し発現させることで、肝がん細胞において効果的に細胞死を誘導できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る肝がんの治療剤は、ジフテリア毒素Ａをコードする核酸を含むベクターを有効成分として含有する。
前記ベクターが前記ジフテリア毒素Ａをコードする核酸に作動可能に連結された肝がん細胞選択的プロモーターを含んでもよい。
上記第１態様に係る肝がんの治療剤において、肝動脈から肝がんに直接的に投与されてもよい。
上記第１態様に係る肝がんの治療剤において、ハイドロダイナミック遺伝子導入法により投与されてもよい。
【発明の効果】
【００１１】
上記態様によれば、優れた殺腫瘍細胞効果を有する肝がんの治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】実施例１におけるベクター未導入のＨＬＥ細胞での経時的な細胞増殖率の変化を示すグラフである。
【図１Ｂ】実施例１におけるジフテリア毒素Ａを定常的に発現するベクター（ｐＢＳ−ＤＴＡ）を導入したＨＬＥ細胞での経時的な細胞増殖率の変化を示すグラフである。
【図１Ｃ】実施例１におけるジフテリア毒素ＡをＡＦＰ産生腫瘍細胞選択的に発現するベクター（ｐＡＦＰ−ＤＴＡ）を導入したＨＬＥ細胞での経時的な細胞増殖率の変化を示すグラフである。
【図１Ｄ】実施例１におけるベクター未導入のＨｕｈ７細胞での経時的な細胞増殖率の変化を示すグラフである。
【図１Ｅ】実施例１におけるｐＢＳ−ＤＴＡを導入したＨｕｈ７細胞での経時的な細胞増殖率の変化を示すグラフである。
【図１Ｆ】実施例１におけるｐＡＦＰ−ＤＴＡを導入したＨｕｈ７細胞での経時的な細胞増殖率の変化を示すグラフである。
【図２】実施例２におけるｐＢＳ−ｔｄＴｏｍａｔｏのみ、又はｐＢＳ−ｔｄＴｏｍａｔｏ及びｐＢＳ−ＤＴＡをハイドロダイナミック遺伝子導入法により導入したマウス肝臓でのＤＡＰＩによる核染色画像及びｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
≪肝がんの治療剤≫
本実施形態の肝がんの治療剤は、ジフテリア毒素Ａをコードする核酸を含むベクターを有効成分として含有する。
【００１４】
肝がんを含む悪性腫瘍は抗がん剤に対して高感受性のがん細胞と抵抗性のがん細胞とから形成されており、その形態はヘテロジニアスな細胞の集合体である。そのため、従来の肝がんの治療方法である肝動注化学療法では、抗がん剤が全てのがん細胞に効力であるわけではなく、抗がん剤耐性変異を有するがん細胞が残存し、根治させることは難しい治療法であった。
これに対し、本実施形態の肝がんの治療剤は、肝がんの部位、進行度や肝機能の低下度合に関係なく適用可能であり、優れた殺細胞効果を有する。
【００１５】
本明細書における「肝がん」は、肝臓にできた「原発性肝がん」及び別の臓器から転移した「転移性肝がん」を包含する。また、「原発性肝がん」は、肝臓の細胞ががんになる「肝細胞がん」、胆汁を十二指腸に流す管（すなわち、胆管）の細胞ががんになる「胆管細胞がん」、小児の肝がんである肝細胞芽腫、成人での肝細胞及び胆管細胞混合がん、未分化がん、胆管嚢胞腺がん、神経内分泌腫瘍等を包含する。日本では、原発性肝がんのうち肝細胞がんが９０％と大部分を占める。よって、中でも、本実施形態の治療剤が適用される肝がんとしては、肝細胞がんであることが好ましい。
【００１６】
＜ベクター＞
本実施形態におけるベクターは、ジフテリア毒素Ａをコードする核酸を含む。
本実施形態におけるベクターとしては、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては、導入対象（主に、ヒトを含む哺乳動物）由来の培養細胞内、又は導入対象（主に、ヒトを含む哺乳動物）の個体中の細胞内でタンパク質を発現するベクターであれば特に制限されず、プラスミドであってもよく、ウイルスベクターであってもよい。
前記プラスミドとしては、例えば、ｐＲＫ５（参考文献１：欧州特許第３０７２４７号明細書）、ｐＳＶ１６Ｂ（参考文献２：国際公開第９１／０８２９１号）、ｐＣＡＧＧＳ（参考文献３：Niwa K et al., “Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector”, Gene, vol.108, no.2, p193-199, 1991.）、ｐＶＬ１３９２（インビトロジェン社製）、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（各インビトロジェン社製、ストラジーン社製）、ｐＶＣ０３９６（参考文献４：特表平１１−５１１００９号公報）等が挙げられ、これに限定されない。
【００１７】
前記ウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０等由来のウイルスベクターが挙げられ、これに限定されない。また、ウイルスベクターは、ウイルス遺伝子を完全又はほぼ完全に欠失する複製欠失ウイルスベクターであることが好ましい。
【００１８】
（ジフテリア毒素Ａ）
「ジフテリア毒素（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  Ｔｏｘｉｎ；ＤＴ、ＤＴＸ）」とは、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）が菌体外へ産生するタンパク質性の細菌毒素である。また、ＤＴＸは、フラグメントＡ（ＤＴＡ）及びフラグメントＢ（ＤＴＢ）の２つのドメインからなり、全体の分子量は約５８ｋ程度である。ＤＴＡは、触媒領域（Ｃ）からなり、毒素本体の役割を有する。一方、ＤＴＢはレセプター領域（Ｒ）及び膜貫通領域（Ｔ）からなり、細胞表面上の受容体と結合し、ＤＴＡを細胞内に取り込む役割を有する。
ＤＴＸの作用機序としては、まず、毒素受容体であるヒトＨＢ−ＥＧＦ前駆体（膜結合型）にＤＴＢが結合しエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれる。その後ＤＴＡが細胞質内に膜透過し、ペプチド鎖伸長因子（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ２：  ＥＦ−２）をＡＤＰリボシル化する。その結果、ＥＦ−２は不活性化され、タンパク質合成が阻害されて細胞死が誘導される。
本明細書における「ジフテリア毒素Ａ（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  Ｔｏｘｉｎ  Ａ：ＤＴＡ）」とは、上記フラグメントＡ（ＤＴＡ）を意味する。本実施形態におけるベクターは、ＤＴＡをコードする核酸を含み、ＤＴＢをコードする核酸を実質的に含まないため、当該ベクターが導入された細胞のみにおいてタンパク質合成障害を受ける。また、本実施形態におけるベクターは、ＤＴＢを実質的に含まないことから、当該ベクターが導入された細胞が死細胞となり、ＤＴＡが細胞外に放出されても、周囲の細胞内に取り込まれず、周囲の細胞には影響を及ぼすことはない。よって、本実施形態の治療剤は、当該ベクターを肝がん細胞に選択的に導入及び発現することで、がん特異的な遺伝子治療効果を期待することができる。
ここで、「ＤＴＢをコードする核酸を実質的に含まない」とは、ＤＴＢをコードする核酸を全く含まない、又は、ＤＴＢをコードする核酸を細胞表面上の受容体への結合能を発揮しない程度しか含まないことを意味する。
【００１９】
本実施形態において、ＤＴＡをコードする核酸としては、例えば、下記（ａ）の塩基配列を含む配列からなる核酸等が挙げられる。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列
【００２０】
配列番号１は、ＤＴＡをコードする核酸の塩基配列のうち、最小の触媒領域（Ｃ）を含む塩基配列である。
また、本実施形態におけるＤＴＡをコードする核酸としては、上記（ａ）の塩基配列のみからなる核酸であってもよい。また、本実施形態におけるＤＴＡをコードする核酸としては、上記（ａ）の塩基配列からなる核酸のホモログ又はオルソログであってもよい。
【００２１】
また、本実施形態におけるＤＴＡをコードする核酸は、下記（ｂ）〜（ｄ）の塩基配列を含む配列からなり、且つ、タンパク質合成抑制活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠損、置換又は付加されている塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００２２】
ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよい塩基の数としては、１〜３０個が好ましく、１〜１５個がより好ましく、１〜１０個が特に好ましく、１〜５個が最も好ましい。
【００２３】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム，０．３Ｍ クエン酸溶液，ｐＨ７．０）、０．１重量％ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５℃以上７０℃以下で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００２４】
また、本実施形態におけるＤＴＡをコードする核酸の塩基配列は、導入対象となる動物種（主に、ヒトを含む哺乳動物）における発現のためにコドン最適化されていてもよい。一般に、コドン最適化とは、ネイティブのアミノ酸配列を維持しつつ、ネイティブの配列の少なくとも１つのコドンを、導入される動物種の遺伝子においてより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、導入される動物種における増強された発現のために核酸配列を改変するプロセスを指す。種々の種が、特定のアミノ酸の特定のコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス(動物間のコドン使用頻度における差異)は、ｍＲＮＡの翻訳効率と相関する場合が多く、これは、翻訳されているコドンの特性及び特定のｔＲＮＡの利用可能性にとりわけ依存すると考えられている。細胞中の選択されたｔＲＮＡの優勢は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために個別化され得る。コドン使用頻度表は、例えば、www.kazusa.or.jp/codon/（２０１７年４月４日に訪問）に掲載されている「Codon  Usage  Database」において容易に入手可能であり、これらの表を用いて、コドンを最適化することができる（参考文献５：Nakamura Y et al., “Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:status for the year 2000”, Nucl Acids Res, vol.28, no.1, p292, 2000.）。特定の生物種における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムについても、例えば、Gene Forge（Aptagen社;Jacobus、PA）等において入手可能である。本実施形態において、ＤＴＡをコードする核酸の塩基配列中の１つ又は複数のコドンは、導入対象となる動物種において、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
【００２５】
また、本実施形態において、ＤＴＡをコードする核酸としては、例えば、下記（ｅ）のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質をコードする核酸等が挙げられる。
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
【００２６】
配列番号２は、ＤＴＡのアミノ酸配列のうち、最小の触媒領域（Ｃ）を含むアミノ酸配列である。
また、本実施形態におけるＤＴＡをコードする核酸としては、上記（ｅ）のアミノ酸配列のみからなるタンパク質をコードする核酸であってもよい。
【００２７】
また、本実施形態におけるＤＴＡをコードする核酸は、下記（ｆ）又は（ｇ）のアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、タンパク質合成抑制活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
【００２８】
ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、１〜１５個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個が特に好ましい。
【００２９】
（プロモーター）
本実施形態におけるベクターは、ＤＴＡをコードする核酸に作動可能に連結された自己のプロモーター（天然においてＤＴＡをコードする遺伝子が作動可能に連結しているプロモーター）を含んでいてもよい。又は、自己のプロモーターを含まない場合若しくは自己のプロモーター以外のプロモーターをさらに含む場合、ＤＴＡをコードする核酸に作動可能に連結された任意の適切なプロモーターを含んでいてもよい。
前記プロモーターとしては、導入対象となる細胞において、機能するプロモーターであればよく、具体的には、例えば、構成的プロモーター、肝細胞又は肝細胞に由来する細胞株において選択的に発現するプロモーター（以下、「肝細胞選択的プロモーター」と称する場合がある。）、がん細胞において選択的に発現するプロモーター（以下、「がん細胞選択的プロモーター」と称する場合がある。）等が挙げられる。
【００３０】
なお、本明細書において「作動可能に連結」とは、遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター又は一連の転写因子結合部位）と発現させたい遺伝子（本実施形態においては、ＤＴＡをコードする核酸）との間の機能的連結を意味する。ここで、「発現制御配列」とは、その発現させたい遺伝子（本実施形態においては、ＤＴＡをコードする核酸）の転写を指向するものを意味する。また、「機能的連結」とは、発現させた遺伝子（本実施形態においては、ＤＴＡをコードする核酸）をその制御下で発現できるように連結されている状態を意味する。
【００３１】
前記構成的プロモーターとは、細胞又は個体の生育条件とは無関係に制御下にある遺伝子を発現させるプロモーターを意味する。前記構成的プロモーターとしては、例えば、ウイルス性プロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター等が挙げられる。
【００３２】
前記ウイルス性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＣＭＶ極初期プロモーター）（参考文献６：米国特許第５１６８０６２号明細書）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のプロモーター（例えば、ＨＩＶ長末端リピート等）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター（例えば、ＲＳＶ長末端リピート等） 、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＳＶプロモーター（Ｌａｐ２プロモーター又はヘルペスチミジンキナーゼプロモーター等）（参考文献７：Wagner E K et al., “Uninfected cell polymerase efficiently transcribes early but not late herpes simplex virus type 1 mRNA”, Proc Natl Acad Sci, vol.78, no.10, p6139-6143, 1981.） 、ＳＶ４０又はエプスタイン  バール  ウイルス由来のプロモーター、アデノ随伴ウイルスプロモーター（例えば、ｐ５プロモーター等）等が挙げられる。
【００３３】
前記ハウスキーピング遺伝子プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子プロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、β２−マイクログロブリン遺伝子プロモーター、ＨＰＲＴ  １（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １）遺伝子プロモーター等が挙げられる。
【００３４】
前記肝細胞選択的プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）のプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンのプロモーター、α胎児型タンパク質のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼのプロモーター、ＩＧＦ−ＩＩのプロモーター、因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）のプロモーター、ＨＢＶベーシックコアタンパク質（すなわち、ＢＣＰ）のプロモーター及びそのＰｒｅＳ２プロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）のプロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）−ＡｐｏＣＩＩのハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、マウスアルブミン遺伝子のエンハンサーエレメント（Ｅａｌｂ）と組み合わせたＡＡＴプロモーター、アポリポタンパク質Ｅのプロモーター、低密度リポタンパク質のプロモーター、ピルビン酸キナーゼのプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼのプロモーター、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）のプロモーター、アポリポタンパク質Ｈ（ＡｐｏＨ）のプロモーター、トランスフェリンのプロモーター、トランスチレチンのプロモーター、α−フィブリノゲン及びβ−フィブリノゲンのプロモーター、α−１−アンチキモトリプシンのプロモーター、α−２−ＨＳ糖タンパク質のプロモーター、ハプトグロビンのプロモーター、セルロプラスミンのプロモーター、プラスミノーゲンのプロモーター、補体タンパク質（ＣＩｑ、ＣＩｒ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ９、補体のＩ因子及びＨ因子）のプロモーター、補体Ｃ３活性因子のプロモーター、ヘモペキシンのプロモーター、α−１−酸糖タンパク質のプロモーターが挙げられる。
【００３５】
前記がん細胞選択的プロモーターとは、がん細胞において選択的にプロモーター活性を有することが一般的に知られているプロモーターであればよく、特別な限定はない。前記がん細胞選択的プロモーターとしては、例えば、Ｅ２Ｆプロモーター、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）のプロモーター、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモーター、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）プロモーター、Ｈ１９プロモーター（参考文献８：Brannan C I et al., “The Product of the H19 Gene May Function as an RNA”, Mol and Cell Biol, vol.10, no.1, p28-36, 1990、参考文献９：米国特許第５９５５２７３号明細書、参考文献１０：米国特許第６３０６８３３号明細書）、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）プロモーター、チロシナーゼプロモーター；サイクリン依存性キナーゼインヒビター４ａのプロモーター； アポトーシス関連システインプロテアーゼであるカスパーゼ８のプロモーター；ｒａｓ会合（ＲａＩＧＤＳ／ＡＦ−６）ドメインファミリー１タンパク質アイソフォーム１ａのプロモーター；Ｈ−カドヘリンであるカドヘリン１３（参考文献１１：Yu J et al., “Methylation profiling of twenty promoter-CpG islands of genes which may contribute to hepatocellular carcinogenesis”, BMC Cancer, 2:29, 2002.）、肝がんの生物学的マーカーであるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）のプロモーター、肝細胞がん選択的に発現されるＣＲＧ−Ｌ２遺伝子のプロモーター（参考文献１２：特表２００７−５０８０３６号公報）等の肝がん細胞選択的プロモーター等が挙げられる。
【００３６】
中でも、本実施形態のベクターにおいて、ＤＴＡをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターとしては、がん細胞選択的プロモーターであることが好ましく、肝がん細胞選択的プロモーターであることがより好ましい。本実施形態のベクターは、ＤＴＡをコードする核酸に作動可能に連結された肝がん細胞選択的プロモーターを含むことで、本実施形態のベクターを経口的、静脈内注射等の間接的投与により全身に投与する場合において、ベクターが正常細胞に導入されても、発現されず細胞障害を引き起こすことを防ぐことができる。
【００３７】
（その他の因子）
本実施形態のベクターは、上記プロモーターの他に、さらに、導入対象となる動物（主に、ヒトを含む哺乳動物）の細胞中で作動可能に連結されたマーカー遺伝子、又は種々の調節エレメント等を含んでいてもよい。調節エレメントとしては、例えば、ターミネーター及びエンハンサー等が挙げられる。使用される発現ベクターの種類及び調節エレメントの種類は、導入対象となる動物種及び導入方法に応じて適宜選択すればよい。
【００３８】
＜その他構成成分＞
本実施形態の治療剤は、治療的に有効量の上述のベクターの他に、さらに、薬学的に許容されうる担体又は希釈剤を含む。薬学的に許容されうる担体又は希釈剤は、賦形剤、稀釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味料、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、添加剤等が挙げられる。これら担体の１種以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、又はシロップ剤等の形態の治療剤を調製することができる。
【００３９】
本明細書において、「薬学的に許容されうる」とは、導入対象である動物（主に、ヒトを含む哺乳動物）に適切に投与された場合に、概して、副作用を起こさない程度を意味する。
【００４０】
また、担体としてコロイド分散系を用いることもできる。コロイド分散系は、上述のベクターの生体内安定性を高める効果や、肝臓又は肝細胞へ、上述のベクターの移行性を高める効果が期待される。コロイド分散系としては、例えばポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル、リポソームを包含する脂質を挙げることができ、肝臓又は肝細胞へ、上述のベクターを効率的に輸送する効果のある、リポソームや人工膜の小胞が好ましい。
【００４１】
本実施形態の治療剤における製剤化の例としては、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に使用されるものが挙げられる。
又は、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用されるものが挙げられる。更には、薬理学的に許容される担体又は希釈剤、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。
【００４２】
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
【００４３】
本実施形態の治療剤が注射剤である場合、無菌組成物は、例えば、注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。また、注射用の水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等が挙げられ、適当な溶解補助剤（例えば、アルコール（具体的には、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等））、又は非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０等）と併用してもよい。
【００４４】
また、油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が挙げられ、溶解補助剤として、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）、又は酸化防止剤をさらに配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００４５】
また、注射剤は、非水性の希釈剤（例えば、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類等）、懸濁剤、又は乳濁剤として調製することもできる。このような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤等の配合により行うことができる。注射剤は、用事調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって、無菌の固体組成物とし、使用前に注射用蒸留水又は他の溶媒に溶解して使用することができる。
【００４６】
本実施形態の治療剤は、単独で用いてもよく、その他の肝がんの治療に用いられる抗がん剤と組み合わせて用いてもよい。
【００４７】
前記抗がん剤としては、例えば、アルキル化剤、各種代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、その他の抗がん剤、抗腫瘍性植物成分、ＢＲＭ（生物学的応答性制御物質）、細胞接着阻害剤、マトリックス・メタロプロテアーゼ阻害剤、ホルモン、ビタミン、抗菌性抗生物質、化学療法剤等が挙げられる。
【００４８】
＜投与方法＞
本実施形態の治療剤は、被検動物の年齢、性別、体重、症状、治療方法、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節される。
前記被検動物としては、哺乳動物であることが好ましい。前記哺乳動物としては、特別な限定はなく、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等が挙げられ、中でも、ヒトであることが好ましい。
【００４９】
本実施形態の治療剤に含まれる上述のベクターの投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり１０μｇ以上２０ｇ以下、好ましくは１００μｇ以上１０ｇ以下、より好ましくは５００μｇ以上５ｇ以下であると考えられる。
非経口的に投与する場合である場合は、その１回の投与量は症状、投与方法によっても異なるが、例えば通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り１μｇ以上１０ｇ以下、好ましくは１０μｇ以上８ｇ以下、より好ましくは１００μｇ以上６ｇ以下を体重の１％容量（約６００ｍＬ程度）の希釈剤に分散させて、ハイドロダイナミック遺伝子導入法により投与するのが好適であると考えられる。
【００５０】
投与回数としては、１週間平均当たり、１回〜数回投与することが好ましい。
投与形態としては、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、鼻腔内的、腹腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、経口的等の間接的投与（全身投与）、又は肝臓の腫瘍部位に直接的投与（局所投与）する等、当業者に公知の方法が挙げられる。
また、前記間接的投与（全身投与）方法である場合には、上述のベクターは、ＤＴＡをコードする核酸に作動可能に連結されたがん細胞選択的プロモーター（好ましくは、肝がん細胞選択的プロモーター）を含むことが好ましい。これにより、正常細胞に当該ベクターが導入されても、ＤＴＡは発現せず、タンパク質合成抑制効果が発揮されないため、生体への安全性が高い。
また、前記直接的投与（局所投与）方法としては、針、カテーテル、又はその他の輸送チューブを利用して、肝動脈から肝がん（肝臓の腫瘍部位）に直接的に投与する方法（例えば、血管カテーテルを用いたハイドロダイナミック遺伝子導入法等）等が挙げられる。この時、Ｘ線、ソノグラム、又は光ファイバーシステム等の映像装置を肝臓の腫瘍部位の位置確認と針又はカテーテルの注入とに使用してもよい。
中でも、投与形態としては、肝動脈から肝がん（肝臓の腫瘍部位）への直接的投与が好ましく、ハイドロダイナミック遺伝子導入法による投与がより好ましい。
通常、肝臓は門脈から７０〜８０％、肝動脈から２０〜３０％の割合で栄養が供給される。一方、肝臓における腫瘍は肝動脈のみから栄養が供給される。そのため、カテーテル等を利用して、肝動脈から肝がん（肝臓の腫瘍部位）へ治療剤を直接的に投与することで、肝がん細胞に対し選択的にベクターを導入することができる。
【００５１】
また、ハイドロダイナミック遺伝子導入法による投与については、公知の方法（上述の非特許文献１〜５）に基づいて、行えばよい。
具体的には、まず、被検動物（好ましくは、ヒト）の体重の約１％容量の希釈剤に有効量の上述のベクターを含む治療剤を分散させる。次いで、顎静脈又は脚の付け根の静脈等から肝動脈を通って肝がん（肝臓の腫瘍部位）に血管カテーテルを挿入する。次いで、カテーテル先端のバルーンを膨張させ、血流をブロックし、コンピュータ制御システム等により注入力を制御しながら、治療剤含有溶液を肝臓の腫瘍部位に注入し、水圧により肝がん細胞にベクターを導入させる。
ハイドロダイナミック遺伝子導入法は、ウイルス又は化学物質を使用せずに、水圧で肝がん細胞にベクターを導入できるため、発癌性及び免疫応答等に関する生物学的な安全性が高い方法である。また、操作が比較的簡便であり、遺伝子導入効率が高い方法である。また、ハイドロダイナミック遺伝子導入法において、コンピュータ制御システム等により注入力を制御することで、高い再現性を実現できる。
また、ハイドロダイナミック遺伝子導入法により、本実施形態の治療剤と、抗がん剤、抗線維化効果を有する薬剤又は免疫細胞等とを同時に注入することで、より高い治療効果が期待できる。
【００５２】
前記抗がん剤としては、例えば、アルキル化剤、各種代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、その他の抗腫瘍剤、抗腫瘍性植物成分、ＢＲＭ（生物学的応答性制御物質）、細胞接着阻害剤、マトリックス・メタロプロテアーゼ阻害剤、ホルモン、ビタミン、抗菌性抗生物質又は化学療法剤等が挙げられる。
より具体的には、アルキル化剤として、例えば、ナイトロジェンマスタード、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド、クロラムブチル等のアルキル化剤；カルボコン、チオテパ等のアジリジン系アルキル化剤；ディブロモマンニトール、ディブロモダルシトール等のエポキシド系アルキル化剤；カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ニムスチンハイドロクロライド、ストレプトゾシン、クロロゾトシン、ラニムスチン等のニトロソウレア系アルキル化剤、ブスルファン、トシル酸インプロスルファン、ダカルバジン等が挙げられる。
【００５３】
各種代謝拮抗剤としては、例えば、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、チオイノシン等のプリン代謝拮抗剤；フルオロウラシル、テガフール、テガフール・ウラシル、カルモフール、ドキシフルリジン、ブロクスウリジン、シタラビン、エノシタビン等のピリミジン代謝拮抗剤；メトトレキサート、トリメトレキサート等の葉酸代謝拮抗剤、及び、それらの塩若しくは複合体等が挙げられる。
【００５４】
抗腫瘍性抗生物質としては、例えば、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ペプロマイシン、ダウノルビシン、アクラルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ＴＨＰ−アドリアマイシン、４’−エピドキソルビシン、エピルビシン等のアントラサイクリン系抗生物質抗腫瘍剤；クロモマイシンＡ３ 、アクチノマイシンＤ等、及び、それらの塩若しくは複合体が挙げられる。
【００５５】
その他抗腫瘍剤しては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、タモキシフェン、カンプトテシン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセクラトン、シゾフィラン、ピシバニール、ウベニメクス、クレスチン等、及び、それらの塩若しくは複合体が挙げられる。また、プロカルバジン、ピポブロマン、ネオカルチノスタチン、ヒドロキシウレア等も挙げることができる。
抗腫瘍性植物成分としては、例えば、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン等のビンカアルカロイド類；エトポシド、テニポシド等のエピポドフィロトキシン類、及び、それらの塩若しくは複合体が挙げられる。
ＢＲＭとしては、例えば、腫瘍壊死因子、インドメタシン等、及び、それらの塩若しくは複合体が挙げられる。
細胞接着阻害剤としては、例えば、ＲＧＤ配列を有する物質、及び、その塩若しくは複合体が挙げられる。
マトリックス・メタロプロテアーゼ阻害剤としては、例えば、マリマスタット、バチマスタット等、及び、それらの塩若しくは複合体が挙げられる。
ホルモンとしては、例えば、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プラステロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、オキシメトロン、ナンドロロン、メテノロン、ホスフェストロール、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、メドロキシプロゲステロン等、及び、それらの塩若しくは複合体が挙げられる。
ビタミンとしては、例えば、ビタミンＣ、ビタミンＡ等、及び、それらの塩若しくは複合体が挙げられる。
【００５６】
前記抗線維化効果を有する薬剤としては、例えば、ピルフェニドン、ニンテダニブ等が挙げられ、これらに限定されない。
【００５７】
また、前記免疫細胞を用いた治療法としては、例えば、α・βＴ細胞療法、γ・δＴ細胞療法等の活性化自己リンパ球療法；樹状細胞ワクチン療法等が挙げられ、これらに限定されない。「活性化自己リンパ球療法」とは、患者の血液等からＴ細胞を体外に取り出し、培養して数を増やし、攻撃力を強めた後に、再び患者の体内に戻す治療法である。また、「樹状細胞ワクチン療法」とは、患者の血液等から樹状細胞を体外に取り出し、肝がん細胞に特異的に発現する抗原タンパク質を人工的に取り込ませて発現させ、当該抗原タンパク質を細胞膜上に発現する樹状細胞を再び患者の体内に戻す治療法である。
【００５８】
＜治療方法等＞
本発明の一実施形態は、肝がんの治療のための上述の肝がんの治療剤を提供する。
また、本発明の一実施形態は、治療的に有効量の上述のベクター、並びに薬学的に許容されうる担体又は希釈剤を含む肝がんの治療剤を提供する。
また、本発明の一実施形態は、上述の肝がんの治療剤を製造するための上述のベクターの使用を提供する。
また、本発明の一実施形態は、上述のベクターの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、肝がんの治療方法を提供する。
また、本発明の一実施形態は、上述のベクターの有効量を、治療を必要とする患者にハイドロダイナミック遺伝子導入方法により投与することを含む、肝がんの治療方法を提供する。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６０】
［実施例１］インビトロ試験系におけるジフテリア毒素Ａ発現プラスミドによる抗腫瘍細胞効果及びプロモーター選択性の確認試験
（１）ジフテリア毒素Ａ発現プラスミドの構築
ジフテリア毒素Ａをコードする核酸をｐＢＳ（＋）プラスミド（アジレント・テクノロジー社製）のＴ３プロモーターの下流に繋いで、ジフテリア毒素Ａを定常的に発現するベクター（以下、「ｐＢＳ−ＤＴＡ」と称する場合がある。）を構築した。ジフテリア毒素Ａをコードする塩基配列を配列番号１に、ジフテリア毒素Ａのアミノ酸配列を配列番号２に、ｐＢＳ−ＤＴＡの塩基配列を配列番号３に示す。
また、ジフテリア毒素Ａをコードする核酸をｐＤＲＩＶＥ−ＡＦＰ／ｈＡＦＰプラスミド（インビボゲン社製）のｈＡＦＰプロモーターの下流に繋いで、ジフテリア毒素ＡをＡＦＰ発現細胞にてのみ選択的に発現するベクター（以下、「ｐＡＦＰ−ＤＴＡ」と称する場合がある。）を構築した。ｈＡＦＰプロモーターの塩基配列を配列番号４に、ｐＡＦＰ−ＤＴＡの塩基配列を配列番号５に示す。
【００６１】
（２）肝がん細胞へのベクターの導入
肝がんの細胞株として、未分化型ヒト肝細胞がん由来細胞株であるＨＬＥ細胞、及び、分化型ヒト肝細胞がん由来細胞株であるＨｕｈ７細胞を用いた。それぞれ ×１０ 細胞／ウェルとなるように６ウェルプレートに播種し、コンフルエントになるまで予め培養した。次いで、（１）で構築したベクターを、４０μｇ／ｍＬとなるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）と混合し、１５０μＬずつそれぞれ細胞に添加して、細胞へ導入した。
【００６２】
（３）細胞増殖率の測定
ベクターの導入から０、２４、４８、及び７２時間後の細胞数を計測し、ベクターの導入直後（０時間後）の細胞数を基準として、細胞増殖率を算出した。結果を図１Ａ〜図１Ｆに示す。
【００６３】
図１Ａ〜図１Ｆから、ベクター未導入のＨＬＥ細胞及びＨｕｈ７細胞では経時的に細胞が増殖していた。
これに対し、ｐＢＳ−ＤＴＡを導入したＨＬＥ細胞及びＨｕｈ７細胞では経時的な細胞増殖が抑制されていた。これは、ジフテリア毒素Ａにより細胞のタンパク合成が停止されることにより細胞死が誘導されたためであると推察された。
一方、ｐＡＦＰ−ＤＴＡを導入したＨＬＥ細胞では経時的に細胞が増殖しており、細胞増殖の抑制が見られなかったが、ｐＡＦＰ−ＤＴＡを導入したＨｕｈ７細胞では経時的な細胞増殖が抑制されていた。これは、ＨＬＥ細胞はＡＦＰを産生しない肝がん細胞であるのに対し、Ｈｕｈ７細胞はＡＦＰを産生する肝がん細胞であることに起因しているものと推察された。これらのことから、ｐＡＦＰ−ＤＴＡはＡＦＰを産生する細胞でのみ選択的に発現していることが確かめられた。
【００６４】
［実施例２］インビボ試験系におけるジフテリア毒素Ａ発現プラスミドによるタンパク質合成阻害効果の確認試験
（１）ジフテリア毒素Ａ発現プラスミドの構築
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、ｐＢＳ−ＤＴＡを構築した。また、赤色の蛍光を発する蛍光物質であるｔｄＴｏｍａｔｏ（励起波長５５４ｎｍ、蛍光波長５８１ｎｍ）を定常的に発現するベクター（以下、「ｐＢＳ−ｔｄＴｏｍａｔｏ」と称する場合がある。）も準備した。
【００６５】
（２）ハイドロダイナミック遺伝子導入法を用いたマウス肝臓へのベクターの導入
次いで、ハイドロダイナミック遺伝子導入法を用いて、マウス肝臓に１０μｇ／ｍＬのｐＢＳ−ｔｄＴｏｍａｔｏのみ含有溶液を２ｍＬ、又は、１０μｇ／ｍＬのｐＢＳ−ｔｄＴｏｍａｔｏ及び１０μｇ／ｍＬのｐＢＳ−ＤＴＡ含有溶液を２ｍＬ導入した。マウス肝臓へのハイドロダイナミック遺伝子導入法としては、公知の方法（参考文献１３：「Kamimura K et al., “In Advances and challenges in the delivery of oligonucleotide-based therapies”, 2014 Ch12, Hydrodynamic Gene Delivery, Future Science: London, UK, 2015.」、参考文献１４：「Zhang G et al., “Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery”, Gene Ther, vol.11, p675-682, 2004.」等）に基づいて行った。
具体的には、マウスの尾静脈から体重あたり１０％容量のベクター含有溶液（すなわち、体重２０ｇのマウスに対して２ｍＬのベクター含有溶液）を５〜７秒で注入した。
なお、ハイドロダイナミック遺伝子導入法によってベクターが肝細胞へ導入される原理としては、まず、注入されたベクター含有溶液は、心臓でうっ滞し、下大静脈側へ逆流し、肝部下大静脈から肝静脈へと流入する。溶液は、既存の門脈血流と拮抗しながら、肝類洞に到達する。溶液の注入速度と流入量とによって生ずるハイドロダイナミック力が肝臓を膨張し、類洞内皮細胞を引き伸ばし、肝細胞の表面に孔を開けることによってベクターを肝細胞内に押し込む、と考えられる。さらに、比較的大量に肝細胞内に注入されたベクターの一部は、細胞核に到達し、導入遺伝子の産物（本実施例では、ｔｄＴｏｍａｔｏ及びＤＴＡ）が発現されると考えられる。また、マウス等の小動物では、肝細胞の表面の孔は、数分で閉じることから注入された遺伝子が細胞内に蓄積されると考えられている。また、膨張した肝臓のサイズは２４時間以内に元に復することも知られている。
【００６６】
（３）マウス肝臓の観察
次いで、導入から５〜１０時間後にマウスから肝臓を摘出し、組織切片を作製した。次いで、得られた組織切片について、ＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）（励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ、同仁堂化学製）を用いて核染色体を染色した。次いで、蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ−Ｚｅｉｓｓ社製、ＬＳＭ５Ｐａｓｃａｌ  Ｅｘｃｉｔｅｒ）を用いて、組織切片のＤＡＰＩ及びｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光を観察した。結果を図２に示す。なお、図２において、「ＨＧＤ」とは、Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙの略称であり、ハイドロダイナミック遺伝子導入法を示す。
【００６７】
図２から、ｐＢＳ−ｔｄＴｏｍａｔｏのみを導入したマウス肝臓では、ｔｄＴｏｍａｔｏの赤色の蛍光が観察された。一方、ｐＢＳ−ｔｄＴｏｍａｔｏ及びｐＢＳ−ＤＴＡを導入したマウス肝臓ではｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光がほとんど見られなかった。これは、ｐＢＳ−ＤＴＡが導入されたマウス肝細胞において、ＤＴＡが発現されたことでタンパク質合成阻害が生じ、ｔｄＴｏｍａｔｏの発現量が減少したためであると推察された。
【００６８】
以上のことから、ジフテリア毒素Ａを用いた肝がんの遺伝子治療の有効性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本実施形態の治療剤は、肝がんの部位、進行度や肝機能の低下度合に関係なく適用可能であり、優れた殺細胞効果を有する。また、肝がんと肝硬変との合併症例において、本実施形態の治療剤と抗線維化効果を有する薬剤とを併用することにより、高い治療効果が期待される。また、本実施形態の治療剤と免疫細胞療法とを融合することにより、高い治療効果が期待される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【配列表】
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