(57)【要約】【課題】タンパク質分泌生産が向上した糸状菌変異株、及び当該糸状菌を用いたタンパク質の製造方法の提供。【解決手段】チューブリンを機能低減又は機能喪失させた糸状菌変異株を培養し、培養物からタンパク質を採取する工程を含むタンパク質の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チューブリンを機能低減又は機能喪失させた糸状菌変異株を培養し、培養物からタンパク質を採取する工程を含むタンパク質の製造方法。
【請求項２】
糸状菌においてチューブリンを機能低減又は機能喪失させることを含む、糸状菌のタンパク質分泌生産性の向上方法。
【請求項３】
チューブリンの機能低減又は機能喪失が、チューブリンの発現を親株に比べて低下又は喪失させるものである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
チューブリンがαチューブリン及び／又はβチューブリンである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
チューブリンの機能低減又は機能喪失が、チューブリンをコードする遺伝子を欠失又は不活性化することによりなされる、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
チューブリンをコードする遺伝子がαチューブリン及び／又はβチューブリンをコードする遺伝子である請求項５記載の方法。
【請求項７】
αチューブリンをコードする遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかで示される請求項６記載の方法。
（ａ）配列番号１又は３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１又は３に示すヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１又は３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
βチューブリンをコードする遺伝子が、以下の（ｇ）〜（ｌ）のいずれかで示される請求項６記載の方法。
（ｇ）配列番号５、７、９、１１又は１３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号５、７、９、１１又は１３に示すヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号５、７、９、１１又は１３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
糸状菌が、アクレモニウム属、アスペルギルス属、クリソスポリウム属、フサリウム属、フミコーラ属、ミセリオフトラ属、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、ピロマイセス属、タラロマイセス属、サーモアスカス属、チエラビア属、又はトリコデルマ属糸状菌である請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
糸状菌がトリコデルマ属糸状菌である請求項９の記載の方法。
【請求項１１】
糸状菌がトリコデルマ・リーセイである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
チューブリンが機能低減又は機能喪失したトリコデルマ属糸状菌の変異株であって、親菌株と比較してタンパク質分泌生産性が向上した変異株。
【請求項１３】
チューブリンの機能低減又は機能喪失が、チューブリンの発現が親株に比べて低下又は喪失したものである、請求項１２記載の変異株。
【請求項１４】
チューブリンがαチューブリン及び／又はβチューブリンである、請求項１２又は１３記載の変異株。
【請求項１５】
チューブリンの機能低減又は機能喪失が、チューブリンをコードする遺伝子を欠失又は不活性化することによりなされる、請求項１２又は１３記載の変異株。
【請求項１６】
チューブリンをコードする遺伝子がαチューブリン及び／又はβチューブリンをコードする遺伝子である請求項１５記載の変異株。
【請求項１７】
αチューブリンをコードする遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかで示される請求項１６記載の変異株。
（ａ）配列番号１又は３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１又は３に示すヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１又は３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
βチューブリンをコードする遺伝子が、以下の（ｇ）〜（ｌ）のいずれかで示される請求項１６記載の変異株。
（ｇ）配列番号５、７、９、１１又は１３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号５、７、９、１１又は１３に示すヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号５、７、９、１１又は１３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
糸状菌がトリコデルマ・リーセイである請求項１２〜１８のいずれか１項記載の変異株。
【請求項２０】
チューブリンを機能低減又は機能喪失させた糸状菌変異株をセルラーゼ誘導物質の存在下で培養して得られる培養物をバイオマス糖化剤として用いる、バイオマスからの糖の製造方法。
【請求項２１】
チューブリンを機能低減又は機能喪失させた糸状菌変異株をセルラーゼ誘導物質の存在下で培養して得られる培養物をバイオマス糖化剤として用いる、バイオマスの糖化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌変異株及び該糸状菌を用いたタンパク質製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌は、高いタンパク質生産能力を有し、セルラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼなど分泌性タンパク質を培養液中に産生する微生物である。一般に糸状菌の培養液には、こうした複数種のタンパク質が含まれており、その中から目的の性質を有するプロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼなどのタンパク質成分を回収し、工業的に利用されている。
【０００３】
また、近年、化石資源を除いた再生可能な生物由来の有機性資源であるバイオマスが注目され、その中でもセルロースを分解することで糖を製造し、得られた糖から化学変換や微生物を用いた発酵技術により石油資源の代替物やバイオ燃料などの有用資源を製造する技術の開発が、世界中で行われている。
【０００４】
セルロース系バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース、リグニンを主成分として構成されるが、当該バイオマスを活用するには、セルロースやヘミセルロースを高効率に分解可能な糖化酵素の開発が必要となる。この場合に、多種のセルラーゼ及びキシラナーゼを生産する植物性多糖の分解菌として、トリコデルマ（Trichoderma）等の糸状菌が注目され（非特許文献１）。特に、トリコデルマは、セルラーゼおよびキシラナーゼを同時に生産することが可能であり、しかもその複合酵素を大量に生産することから、セルラーゼ生産の宿主として有用である（非特許文献２）。
【０００５】
チューブリンは、細胞骨格を形成する主要なタンパク線維である微小管や中心体を形成するタンパク質である。チューブリンには、α、β、γチューブリンの３種類が知られている。αチューブリン、βチューブリンは類似した構造を持ち、αとβはヘテロ二量体を形成し重合することでプロトフィラメントが形成される。このプロトフィラメントが並行に並ぶことで微小管が形成される。これに対し、γチューブリンは中心体の形成を担うことが知られている。
【０００６】
チューブリンは全ての真核細胞に存在し、高度に保存されている。また、同じ細胞内にも複数のイソ型が存在することが知られており、細胞内での所在が異なることで機能が異なっている。例えば、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)には、２個のαチューブリン様タンパク質、５個のβチューブリン様タンパク質が存在することが知られている（非特許文献３）。
菌類においても、チューブリンの機能は多岐に渡ることが報告されており、例えばアスペルギルス・ニデュランスにおいては、βチューブリンをコードするｂｅｎＡに変異が生じると核分裂が正常に行われなくなることが報告されている（非特許文献４）。また、アスペルギルス・ニデュランスのαチューブリンをコードするｔｕｂＡの遺伝子破壊は核分裂の阻害を引き起こすことが報告されており（非特許文献５）、さらに、αチューブリンをコードするｔｕｂＢは欠損しても生育には影響がないものの、二倍体核の形成の阻害が引き起こされることが報告されている（非特許文献６）。このように、菌類においてもチューブリンは細胞分裂や生殖に関与している。
【０００７】
しかしながら、チューブリンの機能低減や喪失が菌体外へのタンパク質分泌生産に関与することはこれまでに知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】近藤昭彦、天野良彦、田丸浩、「バイオマス分解酵素研究の最前線-セルラーゼ・ヘミセルラーゼを中心として-」、シーエムシー出版、10頁〜 19頁
【非特許文献２】小笠原渉、志田洋介、「化学と生物」 vol.50、公益社団法人  日本農芸化学会，50巻，8号，592頁〜 599頁，2012年08月
【非特許文献３】Martinez, D., et al. (2008). Nature Biotechnology 26, 553-560.
【非特許文献４】Oakley, B.R., Morris, N.R. (1981). Cell 24, 837-845.
【非特許文献５】Doshi, P. et al. (1991). Mol. Gen. Genet. 225, 129-141.
【非特許文献６】Kirk, K.E., and Morris, N.R. (1991). Genes Dev. 5, 2014-2023.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、タンパク質分泌生産が向上した糸状菌変異株、及び当該糸状菌を用いたタンパク質の製造方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、チューブリンの機能が喪失した糸状菌変異株でタンパク質分泌生産が向上し、当該菌株を用いることにより、効率的なタンパク質生産が可能となることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下に係るものである。
[１]チューブリンを機能低減又は機能喪失させた糸状菌変異株を培養し、培養物からタンパク質を採取する工程を含むタンパク質の製造方法。
[２]糸状菌においてチューブリンを機能低減又は機能喪失させることを含む、糸状菌のタンパク質分泌生産性の向上方法。
[３]チューブリンが機能低減又は機能喪失したトリコデルマ属糸状菌の変異株であって、親菌株と比較してタンパク質分泌生産性が向上した変異株。
[４]チューブリンを機能低減又は機能喪失させた糸状菌変異株をセルラーゼ誘導物質の存在下で培養して得られる培養物をバイオマス糖化剤として用いる、バイオマスからの糖の製造方法。
[５]チューブリンを機能低減又は機能喪失させた糸状菌変異株をセルラーゼ誘導物質の存在下で培養して得られる培養物をバイオマス糖化剤として用いる、バイオマスの糖化方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、セルラーゼやキシラナーゼ等のタンパク質の生産において分泌生産性が向上された糸状菌が提供され、当該糸状菌を用いることで、より効率のよいタンパク質生産が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Trichoderma reesei PC-3-7株とPC-3-7ΔtubB株とを結晶性セルロースを炭素源として培養した際のタンパク生産性を示す図。黒四角の実線がPC-3-7株、黒丸の破線がPC-3-7ΔtubB株を示す。値はPC-3-7株の最大生産量を100%としたときの相対値を示す。
【図２】Trichoderma reesei PCD-10株とPCD-10ΔtubB株とを結晶性セルロースを炭素源として培養した際のタンパク生産性を示す図。黒四角の実線がPCD-10株、黒丸の破線がPCD-10ΔtubB株を示す。値はPCD-10株の最大生産量を100%としたときの相対値を示す。
【図３】Trichoderma reesei PC-3-7株とPC-3-7ΔtubB株とを結晶性セルロースとグルコースを炭素源として培養した際のタンパク生産性を示す図。黒四角の実線がPC-3-7株、黒丸の破線がPC-3-7ΔtubB株を示す。値はPC-3-7株の最大生産量を100%としたときの相対値を示す。
【図４】Trichoderma reesei PC-3-7株とPC-3-7ΔtubB株とを結晶性セルロースとキシランを炭素源として培養した際のタンパク生産性を示す図。黒四角の実線がPC-3-7株、黒丸の破線がPC-3-7ΔtubB株を示す。値はPC-3-7株の最大生産量を100%としたときの相対値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｌｉｐｍａｎ，ＤＪ．，Ｐｅａｒｓｏｎ．ＷＲ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１５】
本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列又は塩基配列におけるアミノ酸又は塩基の欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」とは、例えば、１〜１２個、好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜４個であり得る。また本明細書において、アミノ酸又は塩基の「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は数個のアミノ酸又は塩基の付加が含まれる。
【００１６】
本明細書において、別途定義されない限り、ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェントな条件」とは、配列同一性が約８０％以上若しくは約９０％以上のヌクレオチド配列を有する遺伝子の確認を可能にする条件である。「ストリンジェントな条件」としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Joseph Sambrook,David W.Russell,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001）記載の条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションの当業者は、プローブのヌクレオチド配列や濃度、長さ等に応じて、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより、ストリンジェントな条件を適切に作り出すことができる。一例を示せば、上記「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション条件としては、５×ＳＳＣ、７０℃以上が好ましく、５×ＳＳＣ、８５℃以上がより好ましく、洗浄条件としては、１×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、１×ＳＳＣ、７３℃以上がより好ましい。上記ＳＳＣ及び温度条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素を適宜組み合わせることにより、適切なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１７】
本明細書において、遺伝子の上流及び下流とは、それぞれ、対象として捉えている遺伝子又は領域の５’側及び３’側に続く領域を示す。別途定義されない限り、遺伝子の上流及び下流とは、遺伝子の翻訳開始点からの上流領域及び下流領域には限定されない。
【００１８】
＜糸状菌変異株の構築＞
本発明の糸状菌変異株は、チューブリンが機能低減又は機能喪失した糸状菌株である。
チューブリンは、細胞骨格を形成する主要なタンパク線維である微小管や中心体を形成するタンパク質であり、チューブリンの構成タンパクとして、αチューブリン、βチューブリン及びγチューブリンの３種類が知られている。αチューブリンとβチューブリンは類似した構造を持ち、両者はヘテロ二量体を形成し重合することでプロトフィラメントを形成する。またγチューブリンは中心体の形成を担うことが知られている。
本発明においては、特に指定する場合を除き、「チューブリン」には、α、β及びγチューブリンが包含されるが、好適にはα又はβチューブリンであり、より好適にはαチューブリンである。
【００１９】
例えば、トリコデルマ・リーセイにおけるαチューブリンは、ＮＣＢＩデータベースにて、Tubulin alpha chain 1（TRIREDRAFT_120830：配列番号２）、Tubulin alpha chain 2（TRIREDRAFT_120789：配列番号４）として登録され、βチューブリンは、Tubulin beta chain 1（TRIREDRAFT_21742：配列番号６）、Tubulin beta chain 2（TRIREDRAFT_122886：配列番号８）、またβチューブリンドメインを有するものとしてHypothetical protein（TRIREDRAFT_58421：配列番号１０）、Hypothetical protein（TRIREDRAFT_124181：配列番号１２）、WD40 repeat-like protein（TRIREDRAFT_65771：配列番号１４）が登録されている。
また、トリコデルマ・リーセイ以外の糸状菌におけるαチューブリンとしては、アスペルギルス・ニデュランスにおけるTubulin alpha-1 chain（NCBI-ProteinID: XP_657920）、Tubulin alpha-2 chain（NCBI-ProteinID: XP_680839）、ニューロスポラ・クラッサにおけるtubulin alpha-2（NCBI-ProteinID: XP_963223）、alpha tubulin（NCBI-ProteinID: XP_958904）、トリコデルマ・ハルジアナムのtubulin/FtsZ family protein（NCBI-ProteinID: KKO97118）が挙げられ、これらとトリコデルマ・リーセイのTubulin alpha chain 1（TRIREDRAFT_120830）とのアミノ酸配列の同一性は６８〜８９％であり、Tubulin alpha chain 2（TRIREDRAFT_120789）とのアミノ酸配列の同一性は６８〜９３％である。
また、βチューブリンとしては、アスペルギルス・ニデュランスにおけるTUBULIN BETA-1 CHAIN（NCBI-ProteinID: XP_658786）、TUBULIN BETA-2 CHAIN（NCBI-ProteinID: XP_664442）、ニューロスポラ・クラッサにおけるtubulin beta chain（NCBI-ProteinID: XP_957669）が挙げられ、これらとトリコデルマ・リーセイのTubulin beta chain 1（TRIREDRAFT_21742）とのアミノ酸配列の同一性は８４〜９１％であり、Tubulin beta chain 2（TRIREDRAFT_122886）とのアミノ酸配列の同一性は８２〜９１％である。
【００２０】
したがって、本発明におけるαチューブリンとしては、好適には以下が挙げられる。
（Ａ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（Ｂ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質、
（Ｃ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質。
【００２１】
また、βチューブリンとしては、具体的には以下が挙げられる。
（Ｄ）配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（Ｅ）配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質、
（Ｆ）配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質。
【００２２】
配列番号２、４、６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列としては、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％又はより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
【００２３】
チューブリンは、微小管や中心体を形成するタンパク質であり、αチューブリンとβチューブリンはヘテロ二量体を形成し、これが重合することでプロトフィラメントを形成する。このプロトフィラメントが並行に並ぶことで微小管が形成される。本発明において、αチューブリンとしての機能を有するタンパク質、βチューブリンとしての機能を有するタンパク質とは、それぞれαチューブリン又はβチューブリンと同様に、ヘテロ二量体を形成し、重合してプロトフィラメントを形成する能力を有するタンパク質であることを意味する。
【００２４】
本発明において、チューブリンが機能低減又は機能喪失したとは、チューブリンの発現が親株に比べて低下又は喪失すること、好適にはα及びβチューブリンの何れか１以上の発現が親株に比べて低下又は喪失し、α及びβチューブリンのヘテロ二量体形成が阻害されること、さらに好ましくはαチューブリンの発現が親株に比べて低下又は喪失し、α及びβチューブリンのヘテロ二量体形成が阻害されることが挙げられる。
本発明において、チューブリンの「発現」とは、当該タンパク質をコードする遺伝子から、翻訳産物が産生され、且つ機能的な状態でその作用部位に局在することをいう。チューブリンの発現が低下又は喪失したとは、遺伝子レベル、転写レベル、転写後調節レベル、翻訳レベル、翻訳後修飾レベルでの改変により、結果として、糸状菌変異株の菌体内に存在するチューブリン量が、親株におけるそれに比べて有意に低下又は喪失した状態を意味する。
【００２５】
「チューブリンの発現が親株に比べて低下した」とは、糸状菌が有するチューブリンの発現量が親株に比べて低下していること、より具体的には親株と比較して、菌体内のチューブリンの発現量が、通常５０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下に低下し、それによりその活性もまた同様に低下していることを意味する。最も好ましくは、チューブリンの発現量が０％、すなわちチューブリンの発現喪失である。
尚、チューブリンの発現量の比較は、チューブリンのタンパク質の発現量に基づき実施される。
チューブリンの発現量は、ウェスタンブロッティングや免疫組織染色等の周知の免疫学的手法により測定することができる。
【００２６】
チューブリンの発現が親株に比べて低下又は喪失した糸状菌変異株は、好適には、親株の糸状菌の染色体ＤＮＡ上のチューブリン遺伝子を欠失又は不活性化することにより取得することができる。ここで、チューブリン遺伝子とは、ＯＲＦを含む転写領域及び当該遺伝子のプロモーター等の転写調節領域からなるＤＮＡを意味する。
本発明において、αチューブリン遺伝子としては、好適には以下が挙げられる：
（ａ）配列番号１又は３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１又は３に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１又は３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２７】
また、βチューブリン遺伝子としては、好適には以下が挙げられる：
（ｇ）配列番号５、７、９、１１又は１３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号５、７、９、１１又は１３に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号５、７、９、１１又は１３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２８】
チューブリン遺伝子の欠失又は不活性化は、当該遺伝子の塩基配列上の１つ以上の塩基に対する変異の導入、すなわち当該遺伝子の塩基配列の一部若しくは全部の欠失、当該塩基配列に対する別の塩基配列の置換若しくは挿入（この場合、チューブリンのアミノ酸配列は、親株と同一であってもよいし、異なっていてもよい）等が挙げられる。
【００２９】
塩基に対する変異を導入する領域としては、例えば、チューブリン遺伝子の転写領域、及び当該遺伝子のプロモーターやエンハンサー（転写活性化領域）などの転写調節領域を挙げることができ、好ましくは転写領域を挙げることができる。
【００３０】
チューブリン遺伝子の転写調節領域としては、例えば、染色体ＤＮＡ上におけるチューブリン遺伝子の転写領域の５’末端より上流側３０塩基までの領域を挙げることができる。チューブリン遺伝子の転写活性化領域としては、上流側−５００塩基から−１０００塩基に相当する領域を挙げることができる。
【００３１】
転写領域への塩基の変異の導入は、チューブリンの発現を低下又は喪失させる塩基の変異であれば、塩基の種類及び数に制限はないが、塩基の欠失としては、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、さらに好ましくは１００塩基以上、特に好ましくは２００塩基以上の転写領域の一部、最も好ましくは転写領域全部の欠失を挙げることができる。塩基の置換としては、転写領域の５’末端から１５０番目以内の塩基、好ましくは１００番目以内の塩基、より好ましくは５０番目以内の塩基、特に好ましくは３０番目以内の塩基、最も好ましくは２０番目以内の塩基を置換してナンセンスコドンを導入する置換を挙げることができる。塩基の挿入としては、転写領域の５’末端から１５０番目以内の塩基、好ましくは１００番目以内の塩基、より好ましくは５０番目以内の塩基、特に好ましくは３０番目以内の塩基、最も好ましくは２０番目以内の塩基の直後に、５０塩基以上、好ましくは１００塩基以上、より好ましくは２００塩基以上、さらに好ましくは５００塩基以上、特に好ましくは１ｋｂ以上のＤＮＡ断片を付加することを挙げることができる。塩基の付加の好ましい態様としては、ハイグロマイシン耐性遺伝子、オーレオバシジン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、又は当該糸状菌が有さないアセトアミダーゼ遺伝子等の栄養要求性遺伝子の導入を挙げることができる。
【００３２】
糸状菌の染色体ＤＮＡ上のチューブリン遺伝子に塩基の変異を導入する方法としては、例えば、相同組換えを利用した方法を挙げることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、塩基が欠失、置換又は挿入された変異遺伝子を、チューブリン遺伝子の上流領域及び下流領域の間に挿入することにより、薬剤耐性遺伝子又は栄養要求性遺伝子を有したＤＮＡ断片を作成し、当該ＤＮＡ断片を利用して、塩基の欠失等を導入したい宿主細胞内のチューブリン遺伝子の遺伝子配座にて相同組換えを起こす方法を挙げることができる。
【００３３】
相同組換えを利用した具体的な方法としては、ｉ）当該相同組換え用ＤＮＡ断片を常法により親株の糸状菌に導入した後、薬剤耐性又は栄養要求性を指標にして相同組換えによって染色体ＤＮＡ上に当該相同組換え用プラスミドが組込まれた形質転換株を選択し、ｉｉ）得られた形質転換株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う。この際のプライマーは当該遺伝子の塩基が欠失、置換又は挿入された場所が増幅されるように設計されている。当該遺伝子の本来の長さが増幅されず、塩基の欠失、置換又は挿入を反映した長さが増幅された株を選択し、ｉｉｉ）最終的にサザン解析にて染色体ＤＮＡの当該遺伝子座にのみ変異型遺伝子が導入されており、それ以外の場所には導入されていない株を取得することができる。
【００３４】
親株の染色体ＤＮＡ上のチューブリン遺伝子に塩基の変異を導入する方法としては、他にもバクテリオファージや接合を利用する方法を挙げられる。
【００３５】
また、本発明の糸状菌変異株は、親株の糸状菌を突然変異処理法に付した後、チューブリンの発現が親株と比較して低下又は喪失した菌株を選択することによっても得ることが出来る。突然変異処理法としては、具体的には、N-メチル−N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（NTG）、エチルニトロソウレア、紫外線による処理（新版  微生物実験法、1999年、126-134頁、講談社サイエンティフィック）、放射線の照射等が挙げられる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も変異原として用いることができる。
【００３６】
また、チューブリン遺伝子に変異を導入せずにチューブリンの発現を低下させることもできる。このような方法としては、例えば、タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を分解する活性を有する核酸、或いは当該転写産物からタンパク質への翻訳を抑制する核酸の導入が挙げられる。このような核酸としては、当該タンパク質をコードするｍＲＮＡの塩基配列と相補的又は実質的に相補的な塩基配列或いはその一部を含む核酸が挙げられる。
【００３７】
チューブリンをコードするｍＲＮＡの塩基配列と実質的に相補的な塩基配列とは、対象糸状菌体内の生理的条件下において、当該ｍＲＮＡの標的配列に結合してその翻訳を阻害し得る程度の相補性を有する塩基配列を意味し、具体的には、例えば、当該ｍＲＮＡの塩基配列と完全相補的な塩基配列（すなわち、ｍＲＮＡの相補鎖の塩基配列）と、オーバーラップする領域に関して、約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９７％以上の同一性を有する塩基配列である。
【００３８】
より具体的には、チューブリンをコードするｍＲＮＡの塩基配列と相補的又は実質的に相補的な塩基配列としては、上述の（ａ）〜（ｌ）で示したポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３９】
好適なチューブリンをコードするｍＲＮＡとしては、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１又は１３に示される塩基配列を含むトリコデルマ・リーセイのαチューブリン又はβチューブリンをコードするｍＲＮＡを挙げることが出来る。
【００４０】
「チューブリンをコードするｍＲＮＡの塩基配列と相補的又は実質的に相補的な塩基配列の一部」とは、チューブリンのｍＲＮＡに特異的に結合することができ、且つ当該ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を阻害し得るものであれば、その長さや位置に特に制限はないが、配列特異性の面から、標的配列に相補的又は実質的に相補的な部分を少なくとも１０塩基以上、好ましくは約１５塩基以上、より好ましくは約２０塩基以上含むものである。
【００４１】
具体的には、チューブリンをコードするｍＲＮＡの塩基配列と相補的又は実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸として、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのものが好ましく例示される。
（ｉ）チューブリンをコードするｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡ
（ｉｉ）チューブリンをコードするｍＲＮＡに対するsｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）
（ｉｉｉ）チューブリンをコードするｍＲＮＡに対するリボザイム
【００４２】
本発明における親株としては、チューブリンを発現する糸状菌であれば、限定されず、真菌門（Eumycota）及び卵菌門（Oomycota）に属する糸状菌が挙げられる。具体的には、上記糸状菌としては、トリコデルマ（Trichoderma）属、アルペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属、ニューロスポラ（Neurospora）属、フサリウム（Fusarium）属、クリソスポリウム（Chrysosporium）属、フミコーラ（Humicola）属、エメリセラ（Emericella）属、ハイポクレア（Hypocrea）属、アクレモニウム（Acremonium)属、クリソスポリウム（Chrysosporium）属、ミセリオフトラ（Myceliophthora）属、ピロマイセス（Piromyces）属、タラロマイセス（Talaromyces）属、サーモアスカス（Thermoascus）属、チエラビア（Thielavia）属等の糸状菌が挙げられるが、好ましくはトリコデルマ属の糸状菌である。
【００４３】
前記トリコデルマ属の糸状菌としては、トリコデルマ・リーセイ、トリコデルマ・ロンジブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）トリコデルマ・ハリジアウム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）及びトリコデルマ・ヴィリデ（Trichoderma viride）等が挙げられるが、好ましくはトリコデルマ・リーセイであり、より好ましくはトリコデルマ・リーセイＰＣＤ−１０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−８１７２）及びトリコデルマ・リーセイＰＣ−３−７株（ＡＴＣＣ６６５８９）である。
【００４４】
親株である糸状菌は、野生型株であってもよく、当該野生型株から人工的に育種された株でもよく、そのゲノム中の塩基配列が置換、付加、欠失又は修飾された変異型株（変異体）又は突然変異体であってもよい。
【００４５】
本発明の糸状菌変異株の好適な例としては、トリコデルマ・リーセイＰＣＤ−１０株又はトリコデルマ・リーセイＰＣ−３−７株のαチューブリン遺伝子を相同的組換えにより欠失させ、αチューブリンの発現を喪失させることにより得られる糸状菌が挙げられ、具体的には、後述する実施例に開示したＰＣ−３−７ΔｔｕｂＢ株とＰＣＤ−１０ΔｔｕｂＢ株を挙げることができる。
【００４６】
斯くして構築された本発明の糸状菌変異株は、菌体内のチューブリンが機能低減又は喪失していることに起因して、タンパク質の分泌生産性が親株よりも向上する。また、セルラーゼの生産において親株よりもグルコースによる阻害が抑えられ、グルコースが培地中に高濃度で存在している場合においても、セルラーゼの生産性低下が抑えられる。
【００４７】
＜タンパク質の製造＞
本発明の糸状菌変異株を培養することにより、培養液中にタンパク質を生成、蓄積させることができ、当該培養物からタンパク質を採取することにより、タンパク質を製造することができる。糸状菌は培養液中において複数種のタンパク質を産生することから、本発明により製造されるタンパク質は、複数種のタンパク質の混合物であってもよい。
ここで、タンパク質としては、例えばセルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、エキソグルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、マンナーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、ガラクターゼ、アミラーゼ等が挙げられる。
【００４８】
例えば、セルラーゼ又はキシラナーゼを製造する場合は、本発明の糸状菌変異株を、セルロース、ソホロース、セロオリゴ糖（セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、セロヘキサオース等）のセルラーゼ誘導物質の存在下で培養し、培養物からセルラーゼ又はキシラナーゼを採取することにより製造することができる。
【００４９】
また、本発明により製造されるタンパク質は、糸状菌が本来分泌生産しない異種のタンパク質であってもよい。この場合は、本発明の糸状菌変異株に対して、異種タンパク質をコードする遺伝子を挿入することで組換え糸状菌を作製し、この組換え糸状菌を培養することで異種タンパク質を含むタンパク質を得ることができる。更に、分泌生産効率を向上させるために、所望のタンパク質をコードする遺伝子を修飾することも可能である。具体的に修飾とは、分泌シグナルペプチドが所望のタンパク質に機能的に付加されるように遺伝子を修飾することである。分泌シグナルペプチドは、所望のタンパク質のアミノ末端に付加されることが望ましい。分泌シグナルペプチドが付加されることにより、分泌生産能力を向上させることができる。
【００５０】
タンパク質の製造に使用される培地は、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなど、本発明の糸状菌の増殖並びに各種タンパク質の生産に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。
【００５１】
炭素源としては、本発明の糸状菌変異株が資化できる炭素源であればいずれでもよく、具体的には、上記したセルラーゼ誘導物質の他、グルコース、フラクトースのような糖質、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などを挙げることができる。これらは単独で、又は複数を組み合わせて使用することができる。
【００５２】
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アミン等の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物のような天然窒素源などをあげることができる。
【００５３】
無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カリウムなどをあげることができる。
【００５４】
ビタミンとしては、ビオチンやチアミンなどをあげることができる。さらに必要に応じて本発明の糸状菌が生育に要求する物質を添加することができる。
【００５５】
培養は、好ましくは振とう培養や通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、且つ好ましくは５０℃以下、より好ましくは４２℃以下、より好ましくは３５℃以下である。また、好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは２０〜４２℃、より好ましくは２５〜３５℃である。
培養時のｐＨは３〜９、好ましくは４〜５である。培養時間は、１０時間〜１０日間、好ましくは２〜７日間である。
【００５６】
培養終了後、培養物を回収し、必要に応じて超音波や加圧等による菌体破砕処理を行い、ろ過や遠心分離等によって固液分離した後、限外ろ過、塩析、透析、クロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより目的のタンパク質を取得できる。なお、分離精製の程度は特に限定されない。培養上清やその粗分離精製物自体をタンパク質として利用することもできる。
【００５７】
＜バイオマスの糖化＞
本発明の糸状菌変異株をセルラーゼ誘導物質の存在下で培養して得られる培養物をバイオマス糖化剤とし、これとセルロース又はキシラン含有物質（バイオマス）を水性媒体中に共存させ、撹拌または振とうしながら加温することにより、バイオマスを分解または糖化し、単糖を製造することができる。
セルロース又はキシラン含有物質としては、前述のセルラーゼ誘導物質として挙げたものを利用することができる。
バイオマスの分解又は糖化において、反応液のｐＨおよび温度は、セルラーゼ又はキシラナーゼが失活しない範囲内であればよく、一般的に、常圧で反応を行う場合、温度は５〜９５℃、ｐＨは１〜１１の範囲で行われる。
バイオマスの分解又は糖化の工程は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。
【００５８】
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞チューブリンを機能低減又は機能喪失させた糸状菌変異株を培養し、培養物からタンパク質を採取する工程を含むタンパク質の製造方法。
＜２＞糸状菌においてチューブリンを機能低減又は機能喪失させることを含む、糸状菌のタンパク質分泌生産性の向上方法。
＜３＞チューブリンの機能低減又は機能喪失が、チューブリンの発現を親株に比べて低下又は喪失させるものである、＜１＞又は＜２＞の方法。
＜４＞チューブリンがαチューブリン及び／又はβチューブリンである、＜１＞〜＜３＞のいずれかの方法。
＜５＞チューブリンの機能低減又は機能喪失が、チューブリンをコードする遺伝子を欠失又は不活性化することによりなされる、＜１＞〜＜３＞のいずれかの方法。
＜６＞チューブリンをコードする遺伝子がαチューブリン及び／又はβチューブリンをコードする遺伝子である＜５＞の方法。
＜７＞αチューブリンをコードする遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかで示される＜６＞の方法。
（ａ）配列番号１又は３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１又は３に示すヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１又は３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜８＞βチューブリンをコードする遺伝子が、以下の（ｇ）〜（ｌ）のいずれかで示される＜６＞の方法。
（ｇ）配列番号５、７、９、１１又は１３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号５、７、９、１１又は１３に示すヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号５、７、９、１１又は１３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜９＞糸状菌が、アクレモニウム属、アスペルギルス属、クリソスポリウム属、フサリウム属、フミコーラ属、ミセリオフトラ属、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、ピロマイセス属、タラロマイセス属、サーモアスカス属、チエラビア属、又はトリコデルマ属糸状菌である＜１＞〜＜８＞のいずれかの方法。
＜１０＞糸状菌がトリコデルマ属糸状菌である＜９＞の方法。
＜１１＞糸状菌がトリコデルマ・リーセイである＜１０＞の方法。
【００５９】
＜１２＞チューブリンが機能低減又は機能喪失したトリコデルマ属糸状菌の変異株であって、親菌株と比較してタンパク質分泌生産性が向上した変異株。
＜１３＞チューブリンの機能低減又は機能喪失が、チューブリンの発現が親株に比べて低下又は喪失したものである、＜１２＞の変異株。
＜１４＞チューブリンがαチューブリン及び／又はβチューブリンである、＜１２＞又は＜１３＞の変異株。
＜１５＞チューブリンの機能低減又は機能喪失が、チューブリンをコードする遺伝子を欠失又は不活性化することによりなされる、＜１２＞又は＜１３＞の変異株。
＜１６＞チューブリンをコードする遺伝子がαチューブリン及び／又はβチューブリンをコードする遺伝子である＜１５＞の変異株。
＜１７＞αチューブリンをコードする遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかで示される＜１６＞の変異株。
（ａ）配列番号１又は３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１又は３に示すヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１又は３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つαチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜１８＞βチューブリンをコードする遺伝子が、以下の（ｇ）〜（ｌ）のいずれかで示される＜１６＞の変異株。
（ｇ）配列番号５、７、９、１１又は１３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号５、７、９、１１又は１３に示すヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号５、７、９、１１又は１３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つβチューブリンとしての機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜１９＞糸状菌がトリコデルマ・リーセイである＜１２＞〜＜１８＞のいずれかの変異株。
＜２０＞チューブリンを機能低減又は機能喪失させた糸状菌変異株をセルラーゼ誘導物質の存在下で培養して得られる培養物をバイオマス糖化剤として用いる、バイオマスからの糖の製造方法。
＜２１＞チューブリンを機能低減又は機能喪失させた糸状菌変異株をセルラーゼ誘導物質の存在下で培養して得られる培養物をバイオマス糖化剤として用いる、バイオマスの糖化方法。
【００６０】
＜２２＞タンパク質が、セルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、エキソグルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、マンナーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、ガラクターゼ及びアミラーゼから選ばれる１種以上である＜１＞〜＜１１＞のいずれかの方法。
＜２３＞タンパク質が、セルラーゼ及び／又はキシラナーゼである＜２２＞の方法。
＜２４＞糸状菌変異株を、セルロース、ソホロース及びセロオリゴ糖（セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、セロヘキサオース等）から選ばれるセルラーゼ誘導物質の存在下で培養し、培養物からセルラーゼ又はキシラナーゼを採取する＜２３＞の方法。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００６２】
＜実施例１＞遺伝子破壊菌株の作製
（1） 遺伝子破壊用プラスミドDNAの構築
pUC118（タカラバイオ）のHincII制限酵素切断点にTrichoderma reesei由来のtubB遺伝子(TRIREDRAFT_120830)の上流から下流（配列番号20）を挿入したプラスミドpUC-tubBを鋳型とし、表1に示したフォワードプライマー1（配列番号15）とリバースプライマー1（配列番号16）にてPCRすることで約5.2kbp断片（A）を増幅した。またAspergillus nidurans由来のアセトアミダーゼamdSの（配列番号17）を鋳型として表1に示したフォワードプライマー2（配列番号18）とリバースプライマー2（配列番号19）を用いてPCRすることで約3.1kbp断片（B）を増幅した。得られたDNA断片（A）及び（B）はIn−Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ）のプロトコルに従って処理し、tubBの遺伝子中にamdS遺伝子が挿入されたプラスミドを構築した。このプラスミドをコンピテントセルE. coli DH5α Competent Cells（タカラバイオ）へと形質転換し、アンピシリン耐性株として得られた形質転換体の中から、コロニーPCRにより目的の遺伝子が挿入されたプラスミドを保持する菌株を選別した。選別した形質転換体はアンピシリン添加LB培地を用いて培養後（37℃、1日間）、得られた菌体からプラスミドをHigh Pure Plasmid Isolation kit（ロシュ）を用いて回収、精製した。ここで得られたベクターをpUC-ΔtubB-amdSと名付けた。
【００６３】
（2）形質転換体の作製
Trichoderma reesei PC-3-7株(ATCC66589)、及びPCD-10株(FERM P-8172)に対して上記（1）で構築したベクターの形質転換を行った。導入はプロトプラストPEG法（Biotechnol Bioeng. 2012 Jan;109(1):92-99.）で行った。形質転換体はアセトアミドを単一窒素源とした選択培地（2％ グルコース、1.1M ソルビトール、2％ アガー、0.2％ KH2PO4（pH5.5）、0.06％ CaCl2・2H2O、0.06％ CsCl2、0.06％ MgSO4・7H2O、0.06％ アセトアミド、0.1％Trace element1；％はいずれもw／v％）にて選抜した。Trace element1の組成は以下のとおりである：0.5g FeSO4・7H2O、0.2g CoCl2、0.16g MnSO4・H2O、0.14g ZnSO4・7H2Oを蒸留水にて100mLにメスアップした。得られた形質転換体の中から、相同組換えによりtubB遺伝子の位置にamdSが挿入され遺伝子破壊が起きているものをコロニーPCRにより選別した。遺伝子破壊が生じた形質転換体をそれぞれPC-3-7ΔtubB、PCD-10ΔtubBと名付けた。
【００６４】
【表１】
2018019622.tif 000002
【００６５】
＜実施例２＞形質転換体の培養検討１
形質転換体のタンパク質生産性の評価は以下に示すように行った。前培養として500mLフラスコに培地を50mL仕込み、1x105個／mLとなるようTrichoderma reesei PC-3-7、PCD-10と実施例１で作製した、PC-3-7ΔtubB、PCD-10ΔtubBのそれぞれの胞子を植菌し、28℃、220rpmにて振とう培養した（プリス社製PRXYg-98R）。培地組成は以下の通りである。1％ グルコース、0.14％ （NH4）2SO4、0.2％ KH2PO4、0.03％ CaCl2・2H2O、0.03％ MgSO4・7H2O、0.1％ Bacto Peptone(BD Difco)、0.05％ Bacto Yeast extract(BD Difco)、0.1％ Tween 80、0.1％ Trace element2、50mM 酒石酸バッファー（pH4.0）。Trace element2の組成は以下の通りである。6mg H3BO3、26mg （NH4）6Mo7O24・4H2O、100mg FeCl3・6H2O、40mg、CuSO4・5H2O、8mg MnCl2・4H2O、200mg ZnCl2を蒸留水にて100mLにメスアップする。
2日間の前培養後、ジャーファーメンターとしてBTR-25NA1S-8M（バイオット）を用いて本培養を行った。上記前培養液を10％（v／v％）植菌し、5日間培養を行った。炭素源としては結晶性セルロースであるAvicel PH-101 (Sigma- Aldrich)を10%の濃度で使用し、その他の培地成分は以下のものを使用した。0.42％ （NH4）2SO4、0.2％KH2PO4、0.03％ CaCl2・2H2O、0.03％ MgSO4・7H2O、0.1％ Bacto Peptone、0.05％Bacto Yeast extract、0.1％ Tween 80、0.1％ Trace element2、0.2％ Antifoam PE-L。ジャーファーメンターの設定は以下の通りである。温度：28℃、通気量：0.5 vvm、pH：4.5 （5％ アンモニア水で調整）、撹拌数はDO=3.0 ppmを一定に保つよう変動。培養は5日間行った。
【００６６】
＜実施例３＞形質転換体の培養検討２
他の炭素源を用いた際の形質転換体のタンパク質生産性の評価は以下に示すように行った。本検討に関しては、PC-3-7、及びPC-3-7ΔtubBに関して評価を行った。前培養は実施例２と同様に行った。本培養は、ジャーファーメンターとしてBMZ-01KP2（バイオット）を用いて行い、炭素源として10% Avicel PH-101＋2.5% glucose、または10% Avicel PH-101＋2% Xylan from Beechwood(東京化成工業)を用いた。それ以外は実施例２と同様の条件で行った。
【００６７】
＜実施例５＞ タンパク質濃度測定
タンパク質の濃度はbradford法にて測定した。bradford法では、Quick Startプロテインアッセイ（BioRad）を使用し、ウシγグロブリンを標準タンパク質とした検量線をもとにタンパク質濃度を計算した。
タンパク質濃度の測定結果は図１から図４に示した。どの条件においてもtubB遺伝子を破壊した形質転換体が親株よりも高いタンパク質生産性を示したことから、tubB遺伝子破壊のタンパク質生産への有効性が示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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