(57)【要約】【課題】ＴＲＰＡ１を活性化し、腸閉塞や便秘の予防又は改善に有用なＴＲＰＡ１活性化剤、腸閉塞の予防又は改善剤、便秘の予防又は改善剤を提供する。【解決手段】ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とするＴＲＰＡ１活性化剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とするＴＲＰＡ１活性化剤。
【請求項２】
ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とする腸閉塞の予防又は改善剤。
【請求項３】
ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とする便秘の予防又は改善剤。
【請求項４】
ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とするＴＲＰＡ１活性化用食品。
【請求項５】
ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とする腸閉塞の予防又は改善用食品。
【請求項６】
ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とする便秘の予防又は改善用食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＲＰＡ１活性化剤、腸閉塞の予防又は改善剤、便秘の予防又は改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＲＰＡ１（Transient receptor potential cation channel subfamily A member 1）は、一過性受容器電位（ＴＲＰ）イオンチャネルのスーパーファミリーに属する非選択性陽イオンチャネルであり、侵害受容ニューロンにおいて低温受容器（17℃）として見出された（非特許文献１）。その後、ＴＲＰＡ１は、マスタードオイルやそれに含まれるアリルイソチオシアネート（ＡＩＴＣ）、シナモン、ガーリック、メチルサリチレート、オイゲノール、アルコール類等に反応する化学受容体であること、更には低温と機械刺激、化学刺激に応答する痛み受容体であることが報告されている（非特許文献２、３、４及び５）。
【０００３】
腸閉塞は、イレウス（ileus）とも呼ばれ、腸管内容の肛門側への移動が障害される病態を指す。腸管が閉塞すると、閉塞部位の口側はガスや腸液により拡張し、静脈還流が障害される。その結果、腸管壁が浮腫を起こし、腸管腔へ水やナトリウムが漏出し、さらに腸管内圧が上昇し、動脈血流の障害も起こり、腸管の壊死・穿孔を引き起こす。症状としては、腸管の運動が消失すなわち麻痺することで、腹部膨満感や悪心、嘔吐、腹痛、排便・排ガスの途絶などが起こる。
腸閉塞を有する患者は、口から食物も薬物も摂取することはできず、静脈から水分を与えられ、鼻腔胃吸引チューブを用いて胃の減圧術が与えられる。斯かる治療法の不快感、不便さから、より負担の少ない方法が必要とされている。
【０００４】
ＴＲＰＡ１は、腸クロム親和性細胞（enterochromaffin cells）において、豊富に発現していることが知られているが、最近、術後イレウス（ＰＯＩ）に有用であるとされている大建中湯が、小腸の上皮細胞におけるＴＲＰＡ１の刺激を介して腸の血流を増加させることが報告されている。そして、ＰＯＩモデルマウスにおいて、ＴＲＰＡ１のアゴニストであるＡＩＴＣ等が小腸通過を改善すること、ＴＲＰＡ１欠損マウスにおいては、小腸における周期的な蠕動運動が抑制されることが見出され、ＴＲＰＡ１刺激は、胃腸の運動障害を改善することに対して有用であることが示唆されている（非特許文献６）。
したがって、ＴＲＰＡ１を活性化することにより、腸閉塞を予防又は改善することが期待される。
【０００５】
便秘（便秘症）は、下部消化管に生じる自律神経機能障害、腸管における水分の過吸収、腸粘液の分泌低下、運動障害、消化器心身症（例えば過敏性腸症候群）、排便反射機能の低下等によって、排出が困難または稀な状態をいい、狭窄や腫瘤等の物理的な通過障害に起因する器質性便秘と、腸管運動機能や直腸肛門部の排出機能低下等に起因する機能性便秘に分類される。
ロペラミドを投与した痙攣性便秘モデルマウス、及びクロニジンを投与した弛緩性便秘モデルマウスに対して、ＴＲＰＡ１のアゴニストであるＡＳＰ７６６３を経口投与すると、結腸の運動性が向上した。この現象は、ＴＲＰＡ１のアンタゴニストであるＨＣ−０３００３１を先に経口投与することで消失することから、ＴＲＰＡ１刺激は、痙攣性便秘及び弛緩性便秘に対して有用であることが示唆されている（非特許文献７）。
したがって、ＴＲＰＡ１を活性化することにより、便秘を予防又は改善することが期待される。
【０００６】
シソ科植物に多く含有されているタンニンの一種であるロズマリン酸は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の発症や進行を抑制する作用があること（特許文献１）、インスリン分泌促進作用があること（特許文献２）、花粉症の改善作用があること（非特許文献８）等が報告されている。
また、ロズマリン酸の代謝産物としてヒト尿中に排出されるジメチルロズマリン酸は、シクロオキシゲナーゼ２の誘導抑制活性を有し、抗炎症作用があることが報告されている（特許文献３）。
しかし、ロズマリン酸やジメチルロズマリン酸がＴＲＰＡ１を活性化することや、腸閉塞や便秘の予防又は改善に有用であることは全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−２５６２８２号公報
【特許文献２】特開２００５−１３９１３６号公報
【特許文献３】特開２００５−２７２３６２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Story et al. 2003, Cell 112, 819-829
【非特許文献２】Kwan et al. 2006, Neuron 50, 277-289
【非特許文献３】日本薬理学雑誌、第１２４巻、第２１９頁−第２２７頁、２００４年、社団法人  日本薬理学会発行
【非特許文献４】Fijita et al. 2010, IFSCC Congress 2010
【非特許文献５】Komatsu et al. 2012, Eur J Physio 463, 549-559
【非特許文献６】K. Tsuchiya et al. Neurogastroenterology & Motility (2016) DOI: 10.1111/nmo.12877
【非特許文献７】Kojima et al. 2014, European Journal of Pharmacology 723, 288-293
【非特許文献８】Osakabeet al., Biofactors. 2004 21,127-31
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＴＲＰＡ１を活性化し、腸閉塞や便秘の予防又は改善に有用なＴＲＰＡ１活性化剤、腸閉塞の予防又は改善剤、便秘の予防又は改善剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、ＴＲＰＡ１を活性化する素材について鋭意検討を行った結果、ロズマリン酸のヒト代謝産物であるジメチルロズマリン酸が、ＴＲＰＡ１を活性化する作用を有し、腸閉塞や便秘の予防又は改善に有用であることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の１）〜６）に係るものである。
１）ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とするＴＲＰＡ１活性化剤。
２）ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とする腸閉塞の予防又は改善剤。
３）ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とする便秘の予防又は改善剤。
４）ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とするＴＲＰＡ１活性化用食品。
５）ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とする腸閉塞の予防又は改善用食品。
６）ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とする便秘の予防又は改善用食品。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＴＲＰＡ１活性化剤は、ＴＲＰＡ１を効果的に活性化することができ、ＴＲＰＡ１チャネルの活性が低下することによって生じる疾患、例えば腸閉塞や便秘の予防又は改善に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において「ＴＲＰＡ１」とは、「Transient receptor potential cation channel subfamily A member 1」を意味する。ＴＲＰＡ１は、ヒトにおいてＴＲＰＡ１遺伝子によってコードされているタンパク質である。
【００１４】
本発明の「ロズマリン酸」はシソ科植物に多く含有されているタンニンの一種であり、下記式（Ａ）で示される。本発明の「ジメチルロズマリン酸」は、当該ロズマリン酸のヒト代謝産物であり（前記特許文献３）、下記式（Ｂ）で示される、３，３’−ジメチルロズマリン酸を意味する。
【００１５】
【化１】
2018177739.tif 000002
【００１６】
本発明において、ロズマリン酸は、市販品であってもよいし、常法に基づき化学合成すること（SYNTHESIS, 755-762 (1996)、Can. J. Chem., 75, 1783-1794 (1997)）、或いはロズマリン酸を含有するシソ科植物等の植物体又は培養細胞から抽出・精製することにより取得することができる（特開昭６２−３２８８９号公報）。
ジメチルロズマリン酸は、後記製造例に示すとおり、例えば下記の反応スキームに従って合成することができる。
【００１７】
【化２】
2018177739.tif 000003
【００１８】
本発明のロズマリン酸及びジメチルロズマリン酸には、光学異性体が存在する。本発明のロズマリン酸及びジメチルロズマリン酸は、これらのいずれかの光学異性体であっても、光学異性体の混合物であってもよい。本発明ではＲ体又は光学異性体混合物が好ましい。
【００１９】
本発明のロズマリン酸及びジメチルロズマリン酸は、その薬学的に許容される塩又は溶媒和物とすることができる。このような塩の好ましい例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩のようなアルカリ金属およびアルカリ土類金属塩、あるいは酸付加塩などが挙げられる。溶媒和物の好ましい例としては、水和物、アルコール和物あるいはアセトン和物などが挙げられる。
【００２０】
後記実施例で示すように、ロズマリン酸の代謝産物であるジメチルロズマリン酸は、ＴＲＰＡ１を活性化する。すなわち、ＴＲＰＡ１遺伝子導入により、ＴＲＰＡ１が機能的に発現している形質転換細胞（ＴＲＰＡ１発現細胞）とジメチルロズマリン酸とを接触させた場合、細胞内の陽イオン量の流入を増大するという、ＴＲＰＡ１を活性化する作用を有する。
したがって、ジメチルロズマリン酸、その前駆体であるロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物（以下、「本発明の化合物」とも称する）は、ＴＲＰＡ１活性化剤となり、ＴＲＰＡ１活性化のため、或いはＴＲＰＡ１活性化剤を製造するために使用できる。
【００２１】
前述のとおり、術後イレウスのモデルマウスにおいて、ＴＲＰＡ１のアゴニストが小腸通過を改善し、ＴＲＰＡ１欠損マウスにおいては、小腸における周期的な蠕動運動が抑制されることから、ＴＲＰＡ１刺激は、胃腸の運動障害を改善することに対して有用であると考えられている（前記非特許文献６）。
また、ロペラミドを投与した痙攣性便秘モデルマウス、及びクロニジンを投与した弛緩性便秘モデルマウスに対して、ＴＲＰＡ１のアゴニストであるＡＳＰ７６６３を経口投与すると、結腸の運動性が向上した。この現象は、ＴＲＰＡ１のアンタゴニストであるＨＣ−０３００３１を先に経口投与することで消失することから、ＴＲＰＡ１刺激は、痙攣性便秘及び弛緩性便秘に対して有用であると考えられている（前記非特許文献７）。
したがって、ＴＲＰＡ１活性化剤は、腸閉塞の予防又は改善剤、便秘の予防又は改善剤として、腸閉塞や便秘の予防又は改善のために使用することができると考えられる。
【００２２】
本発明において、「ＴＲＰＡ１の活性化」とは、受容体であるＴＲＰＡ１を活性化することを指す。具体的には、ＴＲＰＡ１が本来的に有する作用、例えばイオン流束の調節能（例えば、細胞外から細胞内へのカルシウムイオン、ナトリウムイオンなどの陽イオンの輸送能など）、膜電位の調節能（例えば、電流の発生能など）を活性化することを意味する。
【００２３】
本発明において、「腸閉塞」とは、腸管内容の肛門側への移動が障害される病態を指す。腸閉塞は、腸が捻じれたり、腸管内部に腫瘍などができたりして塞がれてしまう機械性腸閉塞と、神経の異常や炎症などの影響で腸の蠕動運動がなくなり、内容物が腸内に停滞する機能性腸閉塞に分類されるが、本発明においてはその何れでも良い。
本発明において、「便秘」とは、便の排出が困難または稀な状態をいい、狭窄や腫瘤等の物理的な通過障害に起因する器質性便秘と、腸管運動機能や直腸肛門部の排出機能低下等に起因する機能性便秘に分類されるが、本発明においてはその何れでも良い。
【００２４】
本発明において、ＴＲＰＡ１活性化のため、腸閉塞や便秘の予防又は改善のための「使用」は、ヒトを含む動物への投与又は摂取であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
【００２５】
なお、本明細書において「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止若しくは遅延、又は個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。また、「改善」とは、疾患、症状若しくは状態の好転、疾患、症状若しくは状態の悪化の防止若しくは遅延、又は疾患、症状若しくは状態の進行の逆転、防止若しくは遅延をいう。
【００２６】
本発明のＴＲＰＡ１活性化剤、腸閉塞の予防又は改善剤、便秘の予防又は改善剤は、ヒトを含む動物に摂取又は投与した場合に、ＴＲＰＡ１活性化効果、腸閉塞の予防又は改善効果、便秘の予防又は改善効果を発揮する医薬品、医薬部外品、サプリメント又は食品となり、或いはこれらへ配合するための素材又は製剤となり得る。
また、本発明の食品には、一般飲食品のほか、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品、機能性表示食品、サプリメントが包含される。
【００２７】
本発明の化合物を含む上記医薬品（医薬部外品を含む）は、任意の投与形態で投与され得るが、経口投与が好ましい。投与に際しては、有効成分を経口投与、直腸内投与、注射等の投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。
【００２８】
このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００２９】
また、本発明の化合物を配合した上記食品の形態は、清涼飲料水、茶系飲料、コーヒー飲料、果汁飲料、炭酸飲料、ゼリー、ウエハース、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品や栄養食等の各種食品の他、さらには、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、トローチ剤等の固形製剤）の栄養補給用組成物が挙げられる。なかでも、錠剤が好ましく、チュアブル錠がより好ましい。
種々の形態の食品を調製するには、本発明の化合物を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００３０】
上記の医薬品（医薬部外品を含む）や食品中の本発明の化合物の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、更に好ましくは１質量％以上であり、また、好ましくは９５質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、更に好ましくは７０質量％以下である。また、好ましくは０．０１〜９５質量％、より好ましくは０．１〜９０質量％、更に好ましくは１〜７０質量％である。
【００３１】
本発明の化合物を医薬品や食品として、或いは医薬品や食品に配合して使用する場合のヒトへの投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人１人当たりの１日の投与量は、通常、ジメチルロズマリン酸又はロズマリン酸として、好ましくは０．０１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上、更に好ましくは１００ｍｇ以上であり、また、好ましくは８００００ｍｇ以下、より好ましくは１５０００ｍｇ以下、更に好ましくは５０００ｍｇ以下である。また、好ましくは０．０１〜８００００ｍｇ、より好ましくは１〜１５０００ｍｇ、更に好ましくは１００〜５０００ｍｇである。
また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数ヶ月間継続して投与することが好ましい。
【００３２】
投与又は摂取対象としては、ＴＲＰＡ１の活性化、腸閉塞又は便秘の予防又は改善を必要とする若しくは希望するヒトを含む動物であれば特に限定されないが、腸管の運動が消失すなわち麻痺することで、腹部膨満感や悪心、嘔吐、腹痛、排便・排ガスの途絶などの症状を有するヒト、便秘症のヒトへの投与又は摂取が有効である。
【００３３】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とするＴＲＰＡ１活性化剤。
＜２＞ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とする腸閉塞の予防又は改善剤。
＜３＞ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とする便秘の予防又は改善剤。
＜４＞ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とするＴＲＰＡ１活性化用食品。
＜５＞ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とする腸閉塞の予防又は改善用食品。
＜６＞ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を有効成分とする便秘の予防又は改善用食品。
【００３４】
＜７＞ＴＲＰＡ１活性化剤を製造するためのロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上の使用。
＜８＞腸閉塞の予防又は改善剤を製造するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上の使用。
＜９＞便秘の予防又は改善剤を製造するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上の使用。
＜１０＞ＴＲＰＡ１活性化用食品を製造するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上の使用。
＜１１＞腸閉塞の予防又は改善用食品を製造するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上の使用。
＜１２＞便秘の予防又は改善用食品を製造するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上の使用。
【００３５】
＜１３＞ＴＲＰＡ１活性化に使用するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上。
＜１４＞腸閉塞の予防又は改善に使用するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上。
＜１５＞便秘の予防又は改善に使用するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上。
【００３６】
＜１６＞ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取するＴＲＰＡ１活性化方法。
＜１７＞ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する腸閉塞の予防又は改善方法。
＜１８＞ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される１種以上を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する便秘の予防又は改善方法。
【００３７】
＜１９＞＜１＞及び＜７＞のＴＲＰＡ１活性化剤、＜２＞及び＜８＞の腸閉塞の予防又は改善剤、＜３＞及び＜９＞の便秘の予防又は改善剤、＜４＞及び＜１０＞のＴＲＰＡ１活性化用食品、＜５＞及び＜１１＞の腸閉塞の予防又は改善用食品、＜６＞及び＜１２＞の便秘の予防又は改善用食品における、前記有効成分の含有量は、総量中好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、更に好ましくは１質量％以上であり、また、好ましくは９５質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、更に好ましくは７０質量％以下である。また、好ましくは０．０１〜９５質量％、より好ましくは０．１〜９０質量％、更に好ましくは１〜７０質量％である。
【００３８】
＜２０＞＜１６＞〜＜１８＞において、成人１人当たりの１日の投与量は、ロズマリン酸又はジメチルロズマリン酸として、好ましくは０．０１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上、更に好ましくは１００ｍｇ以上であり、また、好ましくは８００００ｍｇ以下、より好ましくは１５０００ｍｇ以下、更に好ましくは５０００ｍｇ以下である。また、好ましくは０．０１〜８００００ｍｇ、より好ましくは１〜１５０００ｍｇ、更に好ましくは１００〜５０００ｍｇである。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
製造例  ジメチルロズマリン酸の合成
（１）試薬
３−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）乳酸ナトリウム（１）（ラセミ混合物）は東京化成より、フェルラ酸（３）は和光純薬工業より、それぞれ購入して使用した。
【００４０】
（２）α−ヒドロキシ−３−メトキシ−４−（２−プロピレニロキシ）ベンゼンプロパン酸２−プロピレニルエステル（２）の合成
【００４１】
【化３】
2018177739.tif 000004
【００４２】
３−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）乳酸ナトリウム（１）（５００ｍｇ、２．１４ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（８８５ｍｇ、６．４１ｍｍｏｌ）を５０ｍＬナスフラスコにとり、アルゴン置換した後、超脱水アセトン  ７．１ｍＬを加え、分散させた。その後、臭化アリル（２．７７ｍＬ、３２．０ｍｍｏｌ）を加え、Ｎ２置換後ｒｅｆｌｕｘ条件下に２０時間撹拌した。
反応終了後、ろ過、ろ過残渣を塩化メチレン（２５ｍＬ）で洗浄し、ろ液と洗浄液を併せ、減圧濃縮を行った。これに塩化メチレン  ２０ｍＬとＨ２Ｏ  ２０ｍＬを加え、分層後、塩化メチレン層を回収した。水層は、さらに塩化メチレン  ５ｍＬで３回抽出し、回収した。回収した塩化メチレン層を併せて、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧濃縮した（９８８．２ｍｇ）。
これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、標題化合物（２）の精製品５１３ｍｇ（無色、油状、収率８２％）を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件は、以下の通り。
【００４３】
＜シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件＞
カラム： Universal Premium L (30μm, 60Å, 3.0x16.5cm, 40g) [YAMAZEN]
インジェクトカラム：INJECT COLUMN S [YAMAZEN]
溶離液：ヘキサン / 酢酸エチル = 95 / 5 (4min) 95 / 5 (11min) 74 / 26 (14min) 74 / 26
流速：20mL / min、分取時間：29min、分取容量：12mL / 本、48本分取
分取各Fr.をTLCにて確認後、目的Fr.（fr.43-53）を減圧濃縮、乾燥。
【００４４】
（３）３−メトキシ−４−（２−プロピレニロキシ）フェニル―２−プロピレン酸（４）の合成
【００４５】
【化４】
2018177739.tif 000005
【００４６】
フェルラ酸（３）（５００ｍｇ、２．５８ｍｍｏｌ）に、超脱水エタノール  １７ｍＬを加え、溶解させた。その後、臭化アリル（２６７μＬ、３．０９ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（４２７ｍｇ、３．０９ｍｍｏｌ）を順次加え、Ｎ２置換後ｒｅｆｌｕｘ条件下に５．５時間撹拌した。ＴＬＣにより反応進行を確認しつつ、室温まで放冷し、水酸化カリウム（４３４ｍｇ、７．７４ｍｍｏｌ）を加え、さらに１６時間撹拌した。
反応終了後、減圧濃縮し、再度Ｈ２Ｏ  ２５ｍＬに溶解後、２Ｎ塩酸および濃塩酸を添加して、ｐＨ＝０とした。これを酢酸エチル（２５ｍＬ）で５回抽出した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥、減圧濃縮した（６８７．５ｍｇ）。
これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、標題化合物（４）の精製品２２１．４ｍｇ（無色、油状、収率３７％）を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件は、以下の通り。
【００４７】
＜シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件＞
カラム： Universal Premium L (30μm, 60Å, 3.0x16.5cm, 40g) [YAMAZEN]
インジェクトカラム：INJECT COLUMN M [YAMAZEN]
溶離液：
1%酢酸 in ヘキサン / 1%酢酸 in 酢酸エチル = 100 / 0 (4min) 100 / 0 (11min) 84 / 16 (24min) 84 / 16 (0min) 80 / 20 (7min) 80 / 20
流速：20mL / min、分取時間：46min、分取容量：12mL / 本、77本分取
分取各Fr.をTLCにて確認後、目的Fr.（fr.48-75）を減圧濃縮、乾燥。
【００４８】
（４）α−[[３−[３−メトキシ−４−（２−プロピレニロキシ）フェニル]−１−オキソ−２−プロピレニル]オキシ]-３−メトキシ−４−（２−プロピレニロキシ）ベンゼンプロパン酸２−プロピレニルエステル（５）の合成
【００４９】
【化５】
2018177739.tif 000006
【００５０】
化合物（２）（１００ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）に、塩化メチレン  １．７ｍＬを加え、溶解させた。その後、化合物（４）（１０４ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（６．３ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）を順次加え、−２０℃に冷却した後、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（８８．２ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を加えた。Ｎ２置換後室温で２４時間撹拌した後、析出した尿素をろ過除去、酢酸エチル洗浄し、減圧濃縮した（２８８．５ｍｇ）。
これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、標題化合物（５）の精製品１５１．８ｍｇ（白色、ワックス状）を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件は、以下の通り。
【００５１】
＜シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件＞
カラム： Universal Premium L (30μm, 60Å, 3.0x16.5cm, 40g) [YAMAZEN]
インジェクトカラム：INJECT COLUMN S [YAMAZEN]
溶離液：
ヘキサン / 酢酸エチル = 87 / 13 (4min) 87 / 13 (11min) 66 / 34 (14min) 66 / 34
流速：20mL / min、分取時間：29min、分取容量：12mL / 本、48本分取
分取各Fr.をTLCにて確認後、目的Fr.（fr.34-36）を減圧濃縮、乾燥。
【００５２】
（５）３，３’−ジメチルロズマリン酸（Ｂ）の合成
【００５３】
【化６】
2018177739.tif 000007
【００５４】
化合物（５）（８７．３ｍｇ、０．１７２ｍｍｏｌ）をＮ２雰囲気下のグローブボックス中で５０ｍＬナスフラスコに採り、超脱水テトラヒドロフラン  ８．６ｍＬおよびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）錯体（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４）（１９．８ｍｇ、１７．２μｍｏｌ）、モルホリン（４５０μＬ、５．１５ｍｍｏｌ）を順次加えた。反応混合物は、Ｎ２雰囲気下、室温で１８時間撹拌した。
反応終了後、減圧濃縮した後、１Ｎ塩酸２０ｍＬで酸性化し、これを酢酸エチル（２０ｍＬ）で３回抽出した。酢酸エチル層は併せて、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した（１１７．０ｍｇ）。これを、分取ＴＬＣにて精製し、標題化合物（Ｂ）の精製品６１．４ｍｇ（白色、粉末状、収率９２％）を得た。分取ＴＬＣの条件は、以下の通り。
なお以下の実施例では、合成したジメチルロズマリン酸をジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）で適宜希釈して評価に供した。
＜分取TLCの条件＞
TLC： PLC Silica gel 60 F254 (1mm, 20x20cm, #1.13895.0001) [Merck]
展開溶媒：クロロホルム / アセトン/ 88%ギ酸 = 75 / 16.5 / 8.5   200mL
脱離液：クロロホルム / アセトン / 88%ギ酸 = 75 / 16.5 / 8.5  15mL
【００５５】
【表１】
2018177739.tif 000008
【００５６】
実施例１  ＴＲＰＡ１活性化作用の評価
（１）ヒトＴＲＰＡ１遺伝子発現用ベクターの作製
ヒト十二指腸由来細胞株（Ｈｕｔｕ−８０細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）から抽出したｔｏｔａｌＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡを鋳型にして、公開されているヒトＴＲＰＡ１遺伝子配列を参考に合成した、下記に示す塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて、下記の条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
【００５７】
＜プライマーセット＞
フォワードプライマー；5’-CACCATGAAGCGCAGCCTGAGGAAGATGTG-3’（配列番号１） 
リバースプライマー；5’-GAGGAGCTAAGGCTCAAGATGGTGTG -3’ （配列番号２）
＜ＰＣＲ条件＞
a）PCR溶液組成
cDNA（Template）                                15μL
5x PrimeStar GXL Buffer                         10μL
dNTPs mixture（2.5mM）                           4μL
PrimeStar GXL DNA Polymerase（タカラバイオ）     1μL
Forward Primer（10μM）                          1μL
Reverse Primer（10μM）                          1μL
Water                                           18μL
b）温度とサイクル条件
95℃  2min
↓
98℃  10sec  33 cycles
70℃   2min
【００５８】
得られたＰＣＲ産物をＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商品名、ロッシュ社製）用いて精製した。精製したＰＣＲ産物と、ｐｃＤＮＡ３．１  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（商品名、インビトロジェン社製）を用いて、ヒトＴＲＰＡ１遺伝子発現用ベクターを作製した。
【００５９】
（２）ヒトＴＲＰＡ１発現細胞の作製
１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン社製）を用いて、ヒト子宮頸癌由来細胞株（ＨｅＬａ細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）の培養を行った。ＨｅＬａ細胞をＴ−７５細胞培養用フラスコに５×１０５ｃｅｌｌｓ／Ｆｌａｓｋで播種した。培養３日後、前記（１）で作製したヒトＴＲＰＡ１遺伝子発現用ベクター（８μｇ）をＴｒａｎｓＩＴ−ＨｅＬａＭＯＮＳＴＥＲ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いて細胞にトランスフェクションし、１日培養した。
Ｄｅｔａｃｈｉｎ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ社製）で細胞をはがし、９６ｗｅｌｌ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ｂｏｔｔｏｍ  ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ社製）に１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／９０μＬ／ｗｅｌｌの細胞密度で播き、さらに１日培養した。
【００６０】
（３）細胞内カルシウムイオン流入活性の測定
細胞内カルシウムイオン流入活性の測定は、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｋｉｔ  ＩＩ−  ｆｌｕｏ  ４（商品名、ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて行った。Ｆｌｕｏ４−ＡＭを含有したＬｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを前記（２）で作製したヒトＴＲＰＡ１発現細胞に９０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、３７℃で蛍光プレートリーダーＦＤＳＳ３０００（商品名、浜松ホトニクス社製）を用いて蛍光強度（励起波長：４８８ｎｍ、蛍光波長：５２４ｎｍ）を２秒毎に測定した。測定開始３０秒後に検体として前記製造例で調製したジメチルロズマリン酸溶液を測定キットの希釈ｂｕｆｆｅｒで希釈し、その希釈溶液を２０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３００秒まで２秒毎に蛍光強度変化を測定した。また、ＴＲＰＡ１活性化の陽性対照として、ＴＲＰＡ１の作動薬であるＡｌｌｙｌ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＡＩＴＣ）を終濃度１μＭで添加した。
検体のＴＲＰＡ１活性は、検体溶液添加前の蛍光強度（Ｆ０）と、検体添加後の蛍光強度の極大値（Ｆｍａｘ）との比率として算出した。
【００６１】
検体を添加した場合のカルシウムイオン流入率を、溶媒添加時と比較しＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔを用いて検定した。ジメチルロズマリン酸（ＭｅＲＡ）を添加した場合の結果を表２に示す。
【００６２】
【表２】
2018177739.tif 000009
【００６３】
表２より、陽性対照であるＡＩＴＣ（ＴＲＰＡ１の作動薬）と同様、ジメチルロズマリン酸はカルシウムイオン流入を有意に増加させた。
以上の結果から、ジメチルロズマリン酸を適用することにより、ＴＲＰＡ１活性が有意に活性化される。これは、ジメチルロズマリン酸が、ＴＲＰＡ１活性の活性化に有効であることを示している。さらに、ＴＲＰＡ１活性を活性化する作用を有するジメチルロズマリン酸は、腸閉塞又は便秘の予防又は改善に有効であることを示している。
なお、前述のとおり、ジメチルロズマリン酸は、ロズマリン酸の体内代謝産物であることから、前駆体であるロズマリン酸もＴＲＰＡ１活性の活性化、腸閉塞又は便秘の予防又は改善に有効であると考えられる。
【配列表】
2018177739000001.app