(57)【要約】【課題】脳機能低下のメカニズムの研究、解明や、脳機能低下の予防若しくは改善剤の評価若しくはスクリーニング方法などに適用可能な魚類のモデル動物を育成する方法、並びに前記モデル動物の育成方法に好適に用いることができる飼料若しくは剤を提供する。【解決手段】脂肪分を高濃度で含有する、脳機能の低下した魚類の育成用飼料、若しくは魚類の脳機能の低下させるための剤、及び、脂肪分を高濃度で含有する飼料若しくは剤を魚類に摂取若しくは投与させ、脳機能の低下した魚類を育成する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪分を高濃度で含有する飼料又は剤を魚類に摂取又は投与させ、脳機能の低下した魚類を育成する方法。
【請求項２】
脂肪分を高濃度で含有する飼料又は剤を魚類に摂取又は投与させる、魚類の脳機能を低下させる方法。
【請求項３】
前記飼料又は剤の摂取又は投与期間が、４週以上１０週以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記飼料又は剤における、前記脂肪分の配合量が、20％（ｗ／ｗ）以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記魚類がゼブラフィッシュ（Danio rerio）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
脂肪分を高濃度で含有する、脳機能の低下した魚類の育成用飼料。
【請求項７】
脂肪分を高濃度で含有する、魚類の脳機能の低下させるための剤。
【請求項８】
前記飼料又は剤における、前記脂肪分の配合量が、20％（ｗ／ｗ）以上である、請求項６又は７に記載の飼料又は剤。
【請求項９】
前記魚類がゼブラフィッシュ（Danio rerio）である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の飼料又は剤。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法で育成した魚類に対して、脳機能の低下の予防若しくは改善剤の候補物質を摂取若しくは投与させ、
前記魚類の脳機能を評価し、
脳機能の低下の抑制、又は脳機能の向上若しくは改善が確認された場合に、摂取又は投与させた候補物質を脳機能の低下の予防又は改善剤として評価又は選択する、
脳機能の低下の予防又は改善剤の評価又はスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳機能の低下したモデル動物の育成方法に関する。また本発明は、前記方法に用いる飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゼブラフィッシュ（Danio rerio）は、成体の体長が4〜5cm程度のコイ科の小型淡水魚である。ゼブラフィッシュは、他の動物と比較して飼育が容易である。さらにゼブラフィッシュは、多産であり、世代交代期間が短く、遺伝子操作や機能解析が容易である、という遺伝学の研究に適した特徴も有する。また、ゼブラフィッシュの発生や器官形成のメカニズムの多くは、ヒトを含む高等脊椎動物との間で共通性が高い。そのためゼブラフィッシュは、医学、生理学、生物科学などの領域で実験動物（モデル動物）として広く用いられている。
また、金魚（Carassius auratus）や、メダカ（ミナミメダカ（Oryzias latipes）、キタノメダカ（Oryzias sakaizumii）など）も、ゼブラフィッシュと同様の特徴を有することから、各種領域でモデル動物として広く用いられている。
【０００３】
認知機能などの脳機能の研究には、マウスなどのげっ歯類の動物がモデル動物として用いられている。マウスの脳の構造については、ヒトと同様、大脳、中脳、延髄、海馬、扁桃体、線条体に相当する脳部位が存在する。さらに、アルツハイマー病に関連する遺伝子（APP、PSEN1、PSEN2、BACE1等）の存在も知られている。
さらに脳機能の研究では、マウスなどのげっ歯類の動物に代えて、ゼブラフィッシュや金魚などの魚類を用いた研究も進んでいる。このうちゼブラフィッシュは、マウスと同様、大脳、中脳、延髄、海馬、扁桃体、線条体に相当する脳部位が存在する。さらに、アルツハイマー病に関連する遺伝子も存在する。ゼブラフィッシュではこのような脳機能の特徴に加え、飼育が容易であり、多産であり、世代サイクルが短く（高いスループット性）、胚が透明であり、遺伝子組換えが容易である、という特徴を有する。よって、脳機能の研究において、モデル動物としての魚類の使用が期待されている。
【０００４】
近年、アミロイドβ、炎症、酸化ストレスなど、脳機能の低下に関するメカニズムの解明が行われ、それらをターゲットとした脳機能の低下の予防又は改善技術が提案されている。しかし、脳機能の低下のメカニズムが大変に複雑に制御されており、アミロイドβの蓄積と脳機能の低下とが必ずしも関連していないという報告もある。そのため、脳機能低下のメカニズムの解明にまで未だ至っていない。
【０００５】
このような状況下においても、脳機能の低下の予防又は改善剤の開発が進められている。そして、脳機能の低下の予防又は改善剤のin vivoでの有効性を確認する上で、脳機能を低下させたモデル動物が必要となる。これまでに、マウスやラットなどのげっ歯類で脳機能を低下させたモデル動物の育成方法が提案されている（特許文献１〜５参照）。しかし、魚類の脳機能を低下させたモデル動物の育成について報告されていない。
その一方で、脳機能に関する研究結果の１つとして、認知機能と肥満との関係性が明らかにされている。例えば、ＢＭＩ値の高いヒトでは、ＢＭＩ値が正常なヒトと比較して、認知症を発症するリスクが4倍高いことが報告されている（非特許文献１参照）。そして、高脂肪食をマウスに摂取させると、認知機能が低下することが報告されている（非特許文献２及び３参照）。
また、高脂肪食をゼブラフィッシュに摂取させた場合、肥満が誘導されることは報告されている（非特許文献４参照）。しかし、高脂肪食をゼブラフィッシュなどの魚類に摂取させることで脳機能が低下することについて、これまで報告がされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００５／０８０９７６号
【特許文献２】国際公開第２０１３／０４０６５０号
【特許文献３】特開２０１６−４０５４２号公報
【特許文献４】特開２００６−７５１５５号公報
【特許文献５】特開２００６−７５１５６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Neurology, 2011, vol. 77(16), p. 1538-1542
【非特許文献２】J. Neuroimmunology, 2010, vol. 219(1-2), p. 25-32
【非特許文献３】Behavioural Brain Research, 2014, vol. 267, p. 178-188
【非特許文献４】PLOS ONE, 2015, vol. 10, e0120142
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前述のように、ゼブラフィッシュは飼育が容易で、多産であり、世代交代期間が短く、遺伝子操作や機能解析が容易であるという遺伝学の研究にも適している。よって、ゼブラフィッシュ等の魚類に、脳機能の解明のためのモデル動物としての期待が寄せられている。
これまで、マウスなどのげっ歯類は、脳機能の解明のためのモデル動物としてその地位を確立している。しかしゼブラフィッシュ等の魚類は、脳機能の研究のためのモデル動物としては未成熟である。
【０００９】
そこで本発明は、脳機能低下のメカニズムの研究、解明や、脳機能低下の予防若しくは改善剤の評価若しくはスクリーニング方法などに適用可能な魚類のモデル動物を育成する方法を提供することを課題とする。
さらに本発明は、前記モデル動物の育成方法に好適に用いることができる飼料又は剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。そして、ゼブラフィッシュなどの魚類に高脂肪食を継続して摂取させることにより、脳機能が低下した魚類に育成（飼育）できることを見出した。この育成した魚類は、脳機能低下のメカニズムの研究、解明や、脳機能低下の予防又は改善剤の評価若しくはスクリーニング方法に好適に用いることができた。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
【００１１】
本発明は、脂肪分を高濃度で含有する飼料又は剤を魚類に摂取又は投与させ、脳機能の低下した魚類を育成する方法に関する。
また本発明は、脂肪分を高濃度で含有する飼料又は剤を魚類に摂取又は投与させる、魚類の脳機能を低下させる方法に関する。
【００１２】
また本発明は、脂肪分を高濃度で含有する、脳機能の低下した魚類の育成用飼料に関する。
また本発明は、脂肪分を高濃度で含有する、魚類の脳機能の低下させるための剤に関する。
【００１３】
さらに本発明は、前記方法で育成した魚類に対して、脳機能の低下の予防若しくは改善剤の候補物質を摂取若しくは投与させ、前記魚類の脳機能を評価し、脳機能の低下の抑制、又は脳機能の向上若しくは改善が確認された場合に、摂取若しくは投与させた候補物質を脳機能の低下の予防又は改善剤として評価又は選択する、脳機能の低下の予防又は改善剤の評価又はスクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の育成方法によれば、脳機能低下のメカニズムの研究、解明やその予防又は改善剤の評価又はスクリーニング方法などに適用可能な、魚類のモデル動物を提供できる。
さらに本発明の飼料又は剤は、脳機能が低下した魚類の育成方法に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】高脂肪食又は対照食の給餌から４週間後及び５週間後の各魚類群の、実施例において水槽に付加した電気刺激からの回避率を示すグラフである。
【図２】高脂肪食又は対照食の給餌から８週間後及び９週間後の各魚類群の、実施例において水槽に付加した電気刺激からの回避率を示すグラフである。
【図３】能動回避学習を説明するための概略図である。
【図４】実施例で作製した能動回避学習試験用装置を撮影した、図面代用写真である。図４（ａ）は試験装置の正面外観を撮影した図面代用写真であり、図４（ｂ）は試験装置の水槽の平面方向から撮影した図面代用写真であり、図４（ｃ）は水槽の中央に設けた中央ダムの形状を撮影した図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止若しくは遅延、又は個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。また、本明細書において「改善」とは、疾患、症状若しくは状態の好転若しくは緩和、疾患、症状若しくは状態の悪化の防止若しくは遅延、又は疾患、症状若しくは状態の進行の逆転、防止若しくは遅延をいう。
【００１７】
本発明において、脂肪分を高濃度で含有する飼料又は剤を魚類に摂取又は投与させることで、魚類の脳機能を低下させる。
前述のように、魚類の１種であるゼブラフィッシュなどの魚類に高脂肪食を摂取させると、肥満が誘導される。しかし魚類においては、マウスやラットなどのげっ歯類で報告されているような、肥満と脳機能との関連性については、報告がされていなかった。
このような状況下で本発明者らは鋭意検討を行った結果、後述の実施例でも示すように、高脂肪食を摂取させ、肥満傾向、又は肥満状態にあるゼブラフィッシュなどの魚類において、脳機能が低下することを初めて見出した。すなわち、ヒトと同様に魚類においても、生活習慣の悪化が脳機能の低下の原因の１つであることが初めて示された。
なお本明細書において「脳機能」とは、認知機能、脳機能関連タンパク質又はこれをコードする遺伝子の発現を指す。
【００１８】
本発明で使用する魚類は、適宜選択することができる。例えば、ゼブラフィッシュ、金魚、メダカ、ウナギ、ナマズ、コイ、フナ、ウグイ、ワカサギ、オイカワ、タイ、ハマチ、ブリ、ヒラメ、トラフグ、カツオ、マグロ、カンパチ、サケ、マス、タラ、ティラピア、ターボット、サバ、サンマ、フグ、スズキ、アジ、アユ、ウナギ、イワナ、ヤマメ、エビなどが挙げられる。
本発明では、省コスト及び省スペースでの飼育が可能である点、世代交代期間が短い点、様々な目的の科学研究用に従来から用いられている点、などから、金魚、メダカ又はゼブラフィッシュを用いることが好ましい。また、ヒトと同様の脳部位が存在する点、ヒト遺伝子との類似性が７０％程度と高く、アルツハイマー病に関連する遺伝子も既に解明されている点、脳の神経活動を可視化できる点、などから、ゼブラフィッシュを用いることが好ましい。
【００１９】
本明細書における「認知機能」とは、注意機能、記憶機能、学習機能、実行機能の総称をいう。この中でも、記憶機能及び学習機能を好ましく指し、能動回避学習機能をより好ましく指す。
本明細書において「学習」とは、体験などを通して経験を蓄えることをいう。そして経験によって、動物の行動が変容する。
また本明細書において「能動回避学習」とは、個体が記憶に基づいて意思決定を行い、その決定を行動に移すことをいう。「能動回避」とは具体的に、近い将来起こる身の危険が起こる環境下に個体が置かれた場合、その危険を察知し、いずれ起こる身の危険から予め回避する行動をいう。例えば、光の照射や、音若しくは振動の発生が電気刺激の合図とした条件下で、光、音若しくは振動を検知した場合、電気刺激を受けることなく、予め電気刺激から回避する行動が挙げられる。
ここで「能動回避」は、実際に身の危険が及んだ場合にその危険から逃避する「逃避行動」とは区別される。「逃避行動」とは例えば、実際に電気刺激などの外部刺激を受けた際に、その刺激から回避するためにとる行動をいう。
【００２０】
能動回避学習の評価について、図３に示す能動回避学習を説明するための概略図に基づいて具体的に説明する。しかし本発明はこれに制限するものではない。
まず、図３（ａ）に示すように、通路２を設けた中央仕切り（ダム）３にて２つの領域に区切られた試験水槽１に、試験動物（魚）４を１個体投入する。試験水槽１では、区切られた２つの領域それぞれに、ランプ５（５ａ、５ｂ）を設ける。そして、能動回避学習試験開始前に適当な馴化時間を設ける。
能動回避学習試験が開始するとまず、試験動物４がいる試験水槽１の領域に設けたランプ５ａを点灯させる（図３（ａ））。そして一定時間の経過後に、ランプ５ａの点灯と併せて、同じ領域に軽い電気刺激６（忌避刺激）を一定時間与える。このとき試験動物４は、他方の領域へ移動する（図３（ｂ））。あるいは、試験動物４が移動せず電気刺激６を受けた場合に、他方の領域へ移動する（図３（ｃ））。あるいは、試験動物４が移動せず電気刺激６を受ける（図３（ｄ））。所定の電気刺激６の付与後、ランプ５ａを消灯し、同時に電気刺激６も停止させる。
このような操作を繰り返すと、試験動物４は、ランプ５の点灯後に電気刺激６が発生することを学習及び記憶し、ランプ５が点灯した場合他方の領域へ移動し、電気刺激６を能動的に回避することができるようになる。このような記憶学習能力を各個体の行動パターンを解析することで、試験動物４の脳機能を評価する。
なお、図３（ｂ）に示すように試験動物４が電気刺激６の発生しない領域に移動した場合において、ランプ５ａが点灯した後、電気刺激６が与えられる前に他方の領域へ移動し、電気刺激６を避けることができた場合を「回避」と評価する。これに対して、図３（ｃ）に示すように、ランプ５ａが点灯した後電気刺激６を受けたが、電気刺激６の付与が終了する前に他方の領域へ移動した場合を「逃避」と評価する。そして、図３（ｄ）に示すように電気刺激６を受けても他方の領域に移動せず、電気刺激６を指定時間いっぱいに受けた場合を「能動回避及び逃避失敗」と評価する。そして、ランプ５の点灯が電気刺激６の合図と認識でき、能動回避行動を取れる個体は、認知機能、学習能力、並びに求心性、中枢、及び遠心性を含む神経系全体、のいずれかが優れ、脳機能の優れた個体として評価する。
また、図３では、試験開始時に試験動物４が水槽１の左側の領域に存在している状態を示しているが、試験開始時に試験動物４が右側の領域に存在していてもよい。この場合、点灯させるランプ５、及び電気刺激６を与える領域は、図３に示した状態とは逆となる。また、光照射に変えて、音や振動を発生させ、同様の試験を行ってもよい。
【００２１】
本明細書において「脳機能関連タンパク質」とは、脳機能の低下により発現量が変化するタンパク質の総称である。例えば、脳由来神経栄養因子（Brain-derived neurotrophic factor、以下「BDNF」ともいう）、アミロイドβタンパク質、タウタンパク質、糖代謝に関連するタンパク質、抗酸化能の低下に関連するタンパク質、酸化ストレスの亢進に関連するタンパク質、神経新生の低下に関連するタンパク質、炎症に関連するタンパク質、神経細胞死に関連するタンパク質、神経伝達に関連するタンパク質、等が挙げられる。
【００２２】
脳機能関連タンパク質の具体例を、その機能、及び脳機能の低下と発現量との関連性と併せて下記に示す。しかし本発明は、これらに制限するものではない。
（１）BDNF（脳機能と関連して、神経細胞の生存維持、神経突起の伸長促進、神経伝達物質の合成促進、記憶学習の形成に関与するタンパク質。脳機能が低下すると、BDNF及びこれをコードする遺伝子の発現量は低下する（Trends Neurosci., 2004, vol. 27(10), p. 589-594参照）。
（２）カスパーゼ９（caspase 9）（脳機能と関連して、生体防御機構の１つであるアポトーシス誘導に関与するタンパク質。脳機能が低下すると、カスパーゼ９及びこれをコードする遺伝子の発現量は増加する（Neurobiol. Dis., 2002, vol. 11(2), p. 341-354参照）。
（３）カスパーゼ３（caspase 3）（脳機能と関連して、生体防御機構の１つであるアポトーシス誘導に関与するタンパク質。脳機能が低下すると、カスパーゼ３及びこれをコードする遺伝子の発現量は増加する（Brain Res., 2001, vol. 898(2), p. 350-357参照）。）
（４）アセチルコリンエステラーゼ（acetylcholinesterase、以下、「AChE」ともいう）（脳機能と関連して、神経伝達を担うアセチルコリンの働きを阻害するタンパク質。脳機能が低下すると、AChE及びこれをコードする遺伝子の発現量は増加する（J. Pharmacol. Exp. Ther., 2003, vol. 306(3), p. 821-827. Epub 2003 Jun 12.参照）。
（５）アミロイドβ前駆体タンパク質ｂ（amyloid beta precursor protein b、以下、「APP b」ともいう）（アルツハイマー型認知症脳内で確認されるアミロイド斑の原因タンパク質、アミロイドβペプチド（以下、「Aβ」ともいう）の前駆体タンパク質（以下、「ＡＰＰ」ともいう）。脳機能が低下すると、APP b及びこれをコードする遺伝子の発現量は増加する（Nature, 2006, vol. 440(7082), p. 352-357参照）。
（６）ベータサイトAPP切断酵素１（beta-site APP-cleaving enzyme 1、以下、「BACE1」ともいう）（ＡＰＰの切断を担うタンパク質分解酵素（βセクレターゼ）。脳機能が低下すると、BACE1及びこれをコードする遺伝子の発現量は増加する（Neuron, 2004, vol. 41(1), p. 27-33参照）。
（７）プレセニリン１（presenilin 1、以下、「PS1」ともいう）（ＡＰＰの切断を担うタンパク質分解酵素（γセクレターゼ）の構成因子の１種で、ＡＰＰの切断を担うタンパク質。脳機能が低下すると、PS1及びこれをコードする遺伝子の発現量は増加する（J. Alzheimers Dis., 2017, vol. 58(4), p. 1035-1041, doi: 10.3233/JAD-161203参照）。
（８）プレセニリン２（presenilin 2、以下、「PS2」ともいう）（ＡＰＰの切断を担うタンパク質分解酵素（γセクレターゼ）の構成因子の１種で、ＡＰＰの切断を担うタンパク質。脳機能が低下すると、PS2及びこれをコードする遺伝子の発現量は増加する（J. Agric. Food Chem., 2017, vol. 65(49), p. 10719-10729. doi: 10.1021/acs.jafc.7b03941. Epub 2017 Nov 28参照）。
（９）エンドセリン変換酵素１（endothelin converting enzymes 1、以下「ECE1」ともいう）（Aβを分解するタンパク質。脳機能が低下すると、ECE1及びこれをコードする遺伝子の発現量は低下する（Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet., 2012. Vol. 159B(6), p. 696-709. doi: 10.1002/ajmg.b.32073. Epub 2012 Jun 12参照）。
（１０）グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β（glycogen synthase kinase 3 beta、以下、「GSK3β」ともいう）（脳機能と関連してタウタンパク質のリン酸化を行うタンパク質。脳機能が低下すると、GSK3β及びこれをコードする遺伝子の発現量は増加する（J. Neurochem., 2008, vol. 104(6), p. 1433-1439. Epub 2007 Dec 18参照）。
（１１）シナプス後肥厚部タンパク質９５（Postsynaptic density protein 95、以下、「PSD95」ともいう）（脳機能と関連してポストシナプスのマーカーとして用いられ、神経新生の指標ともなるタンパク質。脳機能が低下すると、PSD95及びこれをコードする遺伝子の発現量は低下する（J. Neurosci. Res., 2010, vol. 88(3), p. 469-477. doi: 10.1002/jnr.22227参照）。
（１２）アログラフト炎症因子１（allograft inflammatory factor 1-like、以下、「Iba-1」ともいう）（脳機能と関連した炎症を惹起するタンパク質。脳機能が低下すると、Iba-1及びこれをコードする遺伝子の発現量は増加する（Brain Res., 2016, vol. 1644, p. 149-160. doi: 10.1016/j.brainres.2016.05.013. Epub 2016 May 10参照）。
（１３）転写因子Nrf2（脳機能と関連し、酸化ストレス防御機構において中心的な役割を担う転写因子。脳機能が低下すると、Nrf2及びこれをコードする遺伝子の発現量は低下する（Mol. Neurobiol., 2011, vol. 44(2), p. 192-201. doi: 10.1007/s12035-011-8181-5. Epub 2011 Apr 19参照）。
（１４）シナプトフィジン（synaptophysin、以下、「syp」ともいう）（脳機能と関連してプレシナプスのマーカーとして用いられ、神経新生の指標ともなるタンパク質。脳機能が低下すると、syp及びこれをコードする遺伝子の発現量は低下する（Neurobiol. Aging, 2001, vol. 22(6), p. 993-1005参照）。
【００２３】
（１５）CD74（脳機能と関連して、免疫応答、Aβ産生の抑制に関与するタンパク質。脳機能が低下するとCD74及びこれをコードする遺伝子の発現量は低下する（Mol. Ther, 2015, vol. 23(11), p. 1712-1721; Mol Neurodegener, 2009, vol. 4:41参照）。
（１６）PTGDSb.2（脳機能と関連して、Aβ蓄積の抑制に関連するタンパク質。脳機能が低下すると、PTGDSb.2及びこれをコードする遺伝子の発現量は低下する（Recent Pat. Food Nutr. Agric., 2015, vol. 7(2), p. 83-91; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2007, vol. 104(15), p. 6412-6417参照）。
（１７）プレイオトロフィン（pleiotrophin、以下「PTN」ともいう）（脳機能と関連して、神経再生に関連するタンパク質。脳機能が低下するとPTN及びこれをコードする遺伝子の発現量は低下する（Mol. Neurobiol., 2016, vol. 53, p. 2435-2450; J. Cell Sci., 2014, vol. 127(Pt 11), p. 2554-2564参照）。
（１８）SLC1a2b（脳機能と関連して、アストロサイトにおけるグルタミン酸の取り込みに関連するタンパク質。脳機能が低下するとSLC1a2b及びこれをコードする遺伝子の発現量は低下する（J. Alzheimers Dis., 2011, vol. 26(3), p. 447-455参照）。
（１９）SLC1a3b（脳機能と関連して、アストロサイトにおけるグルタミン酸の取り込みに関与する関連するタンパク質。脳機能が低下するとSLC1a3b及びこれをコードする遺伝子の発現量は低下する（Neurobiol. Aging., 2004, vol. 25(2), p. 149-157; Cell Mol. Neurobiol., 2016, vol. 36(6), p. 851-864参照）。
【００２４】
ヒトを含めた哺乳類において、脳機能が低下すると、脳内はアポトーシス、炎症、及びAβの産生が亢進し、神経新生や神経伝達が抑制されるとの報告がされている（例えば、Neurology, 2011, vo. 76(18), p. 1568-1574; Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2014, vol. 387(8), p. 777-787; Neurobiol Dis., 2014, vol. 67, p. 79-87; J. Neurochem., 2009, vol. 108(4), p. 860-866など参照）。
このような知見に対して、後述の実施例でも示すように、本発明の育成方法により育成した魚類においても、脳機能が低下した哺乳類で確認されている上記の現象が起きている可能性が示唆された。
【００２５】
生活習慣の悪化に伴い脳機能が低下したげっ歯類の検討では、高脂肪食を長期間（32週〜1年）程度摂取させた場合では、Aβの産生が亢進することが知られている（例えば、J. Neurochem., 2009, vol. 108(4), p. 860-866; Neurobiol. Aging., 2014, vol. 35(8), p. 1821-1832など参照）。しかし、アルツハイマー病モデルとして利用されているAPP/PS1 knock-in mouse（J. Neurochem., 2009, vol. 108(4), p. 860-866参照）においてでさえも、高脂肪食を４週間程度給餌しただけではAβ産生は亢進しないことが知られている。
これに対して、後述の実施例で示すように、高脂肪食をゼブラフィッシュなどの魚類に給餌させた場合、４週間程度という短期間でAβの産生の亢進が示唆された。よって、本発明の育成方法によれば、より高効率に、かつ短期間で、生活習慣の悪化に伴った脳機能が低下したモデル動物を育成できる可能性が示唆された。
【００２６】
本発明において、魚類に摂取させる飼料又は剤に配合する脂肪分に特に制限はないが、飽和脂肪酸を主成分とする脂肪分が好ましい。具体例としては、動物油（豚脂・牛脂・バター）、植物油（コーン油、亜麻仁油、バター、オリーブ油、菜種油、ヒマワリ油、キャノーラ油、ひまわり油、マーガリン等が挙げられる。本発明において、これら脂肪分のうち１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
本発明で使用する魚類の飼料又は剤の総量に対する前記脂肪分の配合量は適宜決定できる。例えば、飼料又は剤の総量中、前記脂肪分の配合量は、10％（ｗ／ｗ）以上が好ましく、15％（ｗ／ｗ）以上がより好ましく、20％（ｗ／ｗ）以上がより好ましい。また、その上限値は、50％（ｗ／ｗ）が好ましく、40％（ｗ／ｗ）がより好ましく、30％（ｗ／ｗ）がより好ましい。さらに、前記脂肪分の含有量の数値範囲は、10〜50％（ｗ／ｗ）が好ましく、15〜40％（ｗ／ｗ）がより好ましく、20〜30％（ｗ／ｗ）がより好ましい。
なお、脂肪分を配合する飼料は、魚類用の通常の飼料を使用することができる。また、脂肪分を高濃度で含有する剤は、脂肪分と好ましくは薬学的に許容される担体を含む製剤として、常法に従い調製することができる。
【００２７】
脂肪分を高濃度で含有する飼料又は剤の魚類への摂取又は投与量は、個体の状態、体重、性別、年齢、素材の活性、投与又は摂取経路、投与又は摂取スケジュール、製剤形態又はその他の要因により適宜決定することができる。前記飼料又は剤は、１日１回〜数回に分け、又は任意の期間及び間隔で、前記飼料を魚類に摂取又は投与されることが好ましい。
前記飼料又は剤の摂取量は、15mg/g体重/日以上が好ましく、18mg/g体重/日以上が好ましく、20mg/g体重/日以上がより好ましい。また、その上限値は35mg/g体重/日以下が好ましく、30mg/g体重/日以下がより好ましく、25mg/g体重/日以下がさらに好ましい。さらに、前記飼料又は剤の摂取又は投与量の数値範囲は、15〜35mg/g体重/日が好ましく、18〜30mg/g体重/日がより好ましく、20〜25mg/g体重/日がさらに好ましい。
【００２８】
また本発明では、前記飼料又は剤を魚類に摂取又は投与させてから４週程度で、脳機能を低下させることができる。
げっ歯類を使用して脳機能を低下させたモデル動物を育成する場合、通常１６週から３２週の時間を要する（例えば、J. Neurochem., 2010 vol. 114, p. 1581-1589; Neurobio. Aging, 2014, vol. 35, p. 1821-1832等参照）。
これに対して、本発明によれば、げっ歯類の動物を用いた従来の方法よりも短期間で（例えば、１／２〜１/４程度の期間で）、脳機能の低下を誘導したモデル動物を育成できる。脳機能を低下させる観点から、前記飼料又は剤の魚類への摂取又は投与期間は、４週以上が好ましく、６週以上が好ましく、８週以上がより好ましい。また、その上限値は１０週が好ましく、９週がより好ましい。ゼブラフィッシュなどの場合、卵から成魚まで飼育する必要があるため、飼育期間が短いほど、労力の削減につながる。ここで、前記飼料又は剤の摂取又は投与を開始する際の魚類の月齢は、２〜７か月齢が好ましく、３〜６か月齢がより好ましい。
【００２９】
本発明で育成した魚類は、脳機能の低下の予防又は改善剤の評価又はスクリーニング方法に好適に用いることができる。
本発明の評価又はスクリーニング方法ではまず、脂肪分を高濃度で含有する飼料又は剤と、脳機能の低下の予防又は改善剤の候補物質を、モデル動物とする魚類に摂取又は投与させる。あるいは、脂肪分を高濃度で含有する飼料又は剤を摂取又は投与させ、脳機能の低下が確認されたモデル動物とする魚類に、脳機能の低下の予防又は改善剤の候補物質を摂取又は投与させる。そして、一定期間モデル動物を飼育し、モデル動物の脳機能を常法により評価する。その結果、脳機能の低下の抑制、又は脳機能の向上若しくは改善が見られた場合に、投与又は摂取させた候補物質を脳機能低下の予防剤又は脳機能の改善剤として評価又は選択する。
【００３０】
本発明の評価又はスクリーニング方法を具体的に説明すると、脳機能として能動回避学習機能を評価する場合、モデル動物とする魚類に候補物質を摂取させることにより能動回避行動が取れる場合、摂取又は投与させた候補物質を脳機能の低下の予防又は改善剤として評価又は選択することができる。
脳機能として脳機能関連タンパク質又はこれをコードする遺伝子の発現を評価する場合、モデル動物とする魚類に候補物質を摂取又は投与させることにより、脳機能の低下に伴い発現量が低下するタンパク質又はこれをコードする遺伝子の発現量の低下が抑制された場合、摂取又は投与させた候補物質を脳機能の低下の予防又は改善剤として評価又は選択することができる。あるいは、脳機能の低下に伴い発現量が増加するタンパク質又はこれをコードする遺伝子の発現量の増加が抑制された場合、摂取又は投与させた候補物質を脳機能の低下の予防又は改善剤として評価又は選択することができる。
なお本発明の評価又はスクリーニング方法は、生活習慣の悪化に伴う脳機能の低下に対して予防又は改善効果を示す、脳機能の低下の予防又は改善剤の評価又はスクリーニングに好適に適用できる。
【００３１】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、飼料、剤、及び使用を開示する。
【００３２】
＜１＞脂肪分を高濃度で含有する飼料又は剤を魚類に摂取又は投与させ、脳機能の低下した魚類を育成する方法。
＜２＞脂肪分を高濃度で含有する飼料又は剤を魚類に摂取又は投与させる、魚類の脳機能を低下させる方法。
＜３＞脂肪分を高濃度で含有する、脳機能の低下した魚類の育成用飼料。
＜４＞脂肪分を高濃度で含有する、魚類の脳機能の低下させるための剤。
＜５＞魚類の脳機能の低下させるための剤としての、脂肪分の使用。
＜６＞魚類の脳機能の低下させるための剤の製造のための、脂肪分の使用。
＜７＞脂肪分を、魚類の脳機能の低下させるための剤として使用する方法。
＜８＞魚類の脳機能を低下させる方法に用いる、脂肪分。
【００３３】
＜９＞前記魚類が金魚、メダカ又はゼブラフィッシュ、好ましくはゼブラフィッシュである、前記＜１＞〜＜８＞のいずれか１項に記載の方法、飼料、剤、又は使用。
＜１０＞前記脂肪分が、飽和脂肪酸を主成分とする脂肪分、より好ましくはラード、コーンオイル、亜麻仁油、バター、オリーブ油、菜種油、ヒマワリ油、キャノーラ油、ひまわり油、及びマーガリンからなる群より選ばれる少なくとも１種、である、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項に記載の方法、飼料、剤、又は使用。
＜１１＞前記飼料又は剤における、前記脂肪分の配合量が、10％（ｗ／ｗ）以上、好ましくは15％（ｗ／ｗ）以上、より好ましくは20％（ｗ／ｗ）以上、であり、50％（ｗ／ｗ）以下、好ましくは40％（ｗ／ｗ）以下、より好ましくは30％（ｗ／ｗ）以下、である、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項に記載の方法、飼料、剤、又は使用。
＜１２＞前記飼料又は剤の摂取量が、15mg/mg体重/日以上、好ましくは18mg/mg体重/日以上、より好ましくは20mg/mg体重/日以上、であり、35mg/mg体重/日以下、好ましくは30mg/mg体重/日以下、より好ましくは25mg/mg体重/日以下、である、前記＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の方法、飼料、剤、又は使用。
＜１３＞前記飼料又は剤の摂取又は投与期間が、４週以上、好ましくは６週以上、より好ましくは８週以上、であり、１０週以下、より好ましくは９週以下、である、前記＜１＞〜＜１２＞のいずれか１項に記載の方法、飼料、剤、又は使用。
＜１４＞前記飼料又は剤の摂取又は投与を開始する際の魚類の月齢が、２〜７か月齢、好ましくは３〜６か月齢、である、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項に記載の方法、飼料、剤、又は使用。
【００３４】
＜１５＞前記脳機能が、好ましくは注意機能、記憶機能、学習機能、及び実行機能からなる群より選ばれる少なくとも１種の機能、より好ましくは記憶機能及び学習機能からなる群より選ばれる少なくとも１種の機能、より好ましくは能動回避学習機能、である、前記＜１＞〜＜１４＞項に記載の飼料、剤、方法、又は使用。
＜１６＞前記脳機能の低下が、脳機能関連タンパク質（好ましくは、BDNF、カスパーゼ９、カスパーゼ３、AChE、APP b、BACE1、PS1、PS2、ECE1、GSK3β、PSD95、Iba-1、Nrf2、syp、CD74、PTGDSb.2、PTN、SLC1a2b、及びSLC1a3bからなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質）又はこれをコードする遺伝子の発現量と関連している、前記＜１＞〜＜１５＞項に記載の飼料、剤、方法、又は使用。
＜１７＞魚類用の通常の飼料又は剤において脂肪分の配合量を増やして前記飼料又は剤を調製する、前記＜１＞〜＜１６＞項に記載の飼料、剤、方法、又は使用。
＜１８＞生活習慣の悪化、好ましくは肥満傾向又は肥満状態、に伴い、脳機能が低下する、前記＜１＞〜＜１７＞項に記載の飼料、剤、方法、又は使用。
【００３５】
＜１９＞前記＜１＞、＜２＞及び＜９＞〜＜１７＞のいずれか１項に記載の方法で育成した魚類に対して、脳機能の低下の予防若しくは改善剤の候補物質を摂取若しくは投与させ、
前記魚類の脳機能を評価し、
脳機能の低下の抑制、又は脳機能の向上若しくは改善が確認された場合に、摂取若しくは投与させた候補物質を脳機能の低下の予防又は改善剤として評価又は選択する、
脳機能の低下の予防又は改善剤の評価又はスクリーニング方法。
＜２０＞前記脳機能として能動回避学習機能を評価し、前記候補物質を摂取若しくは投与させることにより能動回避行動が取れる場合、摂取若しくは投与させた候補物質を脳機能の低下の予防又は改善剤として評価又は選択する、前記＜１９＞項に記載の評価又はスクリーニング方法。
＜２１＞前記脳機能として脳機能関連タンパク質又はこれをコードする遺伝子の発現を評価し、前記候補物質を摂取若しくは投与させることにより、脳機能の低下に伴い発現量が低下するタンパク質又はこれをコードする遺伝子の発現量の低下が抑制された場合、摂取若しくは投与させた候補物質を脳機能の低下の予防又は改善剤として評価又は選択する、前記＜１９＞項に記載の評価又はスクリーニング方法。
＜２２＞前記脳機能として脳機能関連タンパク質又はこれをコードする遺伝子の発現を評価し、前記候補物質を摂取若しくは投与させることにより、脳機能の低下に伴い発現量が増加するタンパク質又はこれをコードする遺伝子の発現量の増加が抑制された場合、摂取若しくは投与させた候補物質を脳機能の低下の予防又は改善剤として評価又は選択する、前記＜１９＞項に記載の評価又はスクリーニング方法。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３７】
調製例  高脂肪食餌の調製
下記表１に示す成分組成のゼブラフィッシュ用飼料（商品名：おとひめB2、日清丸紅飼料社製）と、温浴にて溶解させたラードとを混合し、高脂肪食餌を調製した（ゼブラフィッシュ用飼料の含有量：８０％（ｗ／ｗ）、ラードの含有量：２０％（ｗ／ｗ））。
【００３８】
【表１】
2018126137.tif 000002
【００３９】
試験例  高脂肪食給餌が脳機能へ及ぼす影響の解析
明期１４時間、暗期１０時間を１サイクルとし、水温を２６〜２８℃に設定し、循環式水質浄化システムを用いて、ゼブラフィッシュの成魚を約３ヵ月齢となるまで飼育した。飼育後、ゼブラフィッシュ８匹を１群（１タンク）とし、平均体重が等しくなるように群分けを行い、対照食群と高脂肪食群の２群のゼブラフィッシュを準備した。
【００４０】
対照食群には市販のゼブラフィッシュ用飼料（商品名：おとひめB2、日清丸紅飼料社製）を、高脂肪食群には前記調製例で調製した高脂肪食餌を、５ｍｇ／匹／回、１日２回（朝・夕）給餌し、全量を摂食させた（摂取量：25mg/g体重/日）。
なお、ゼブラフィッシュの飼育には１．７Ｌタンクを用いた。ゼブラフィッシュの飼育は、前記給餌スケジュールで４週間から１１週間行った。
【００４１】
（１）行動パターンの解析
T. Aoki, et al., Neuron, 2013, vol. 78(5), p. 881-894に記載の装置を参考に、能動回避学習試験用装置を作製した。作製した装置の水槽の平面図を図４（ａ）〜（ｃ）に示す。図４（ａ）は、試験装置の正面外観を撮影した図面代用写真である。図４（ｂ）は、試験装置の水槽の平面方向から撮影した図面代用写真である。図４（ｃ）は、水槽の中央に設けた中央ダムの形状を撮影した図面代用写真である。
【００４２】
水槽の大きさは、内寸縦100mm、横200mm、高さ100mmであり、水槽の中央に水槽を左右に隔てる高さ60mmの中央ダム１３を設置した。なおこのダムには、隔てられた左右の領域を行き来可能な通路部（高さが35mmに低下する凹状構造）を設けた。
試験時はここに飼育水約900mLを入れ、水深を45mmとした。なお中央ダムの通路部の水深は10mmになる。また、左右に隔てられたそれぞれの水槽部の側面には、赤色フィルター（他色に交換可能）により赤色に発光するLEDランプ１５を設けた。さらに別の側面には、電気刺激(交流2.5V)を与えるためのステンレス板（電極版）１６を設置した。このような構成とすることで、それぞれの水槽部で独立して赤色光と電気刺激を発生できる。
水槽内に投入された魚の挙動や位置は、水槽上部に設置されたカメラと、これを解析並びに制御するシステム（Lime Light-3若しくはLime Light-4（Actimetrics））にて把握できる。さらに、魚の検出感度（背景とのコントラスト）を確保する為、面発光するLEDトレス台に試験水槽（底面は白色半透明）を設置し、底面全体照明とした。
【００４３】
高脂肪食餌又は対照食餌の給餌から４週間後、５週間後、８週間後、及び９週間後の各魚類群に対して、能動回避システムを利用した行動パターンの解析を行った。
一つの水槽で同時に試験する個体は１匹とし、必要に応じ複数の水槽にて同時に試験を行った。前記試験装置の水槽にゼブラフィッシュを移した直後から、下記に示す、能動回避システムを利用した試験を開始した。
１試験は２セッションからなる。１セションは２０分の馴化無刺激時間と、その後の６０回のトライアルからなる。
１トライアルは、ゼブラフィッシュが存在する側の領域への赤色光刺激最大１０秒間と、その後の同領域への赤色光刺激及び電気刺激最大１０秒間、並びにその後の７．５秒〜２２．５秒の中からランダムに設定される平均１５秒のインターバル（無刺激時間）からなる。
１トライアル中の一連の刺激は、刺激を与えた領域から他方の領域へゼブラフィッシュが移動した場合、その時点で停止した。これに対して、刺激を与えてもゼブラフィッシュが移動しない場合は、刺激付与の最長時間（２０秒）経過後に、刺激の付与を停止した。
赤色光刺激に用いた赤色照明については、白色LEDランプ１５の光を、赤色フィルターを通して赤色光とした。電気刺激は交流電流であり、電極板１６間の電圧を2.5V、抵抗は約1.4kΩとした。
ゼブラフィッシュの位置の把握、プログラムの実走、及び一連の刺激出力は、ＰＣ（図示せず）とこれに接続した観察用カメラ（図４（ａ）の中央上部の四角い装置）を用いて自動制御により行った。
【００４４】
トライアルごとの各個体の行動パターンの判定は、赤色光刺激のみを受けた場合に別の領域に移動し、電気刺激を受けなかったトライアルを「回避」と判定した（図３（ｂ）参照）。これに対して、電気刺激を受けた場合に別の領域へ移動したトライアルを「逃避」と判定した（図３（ｃ）参照）。さらに、電気刺激を受けても別の領域へ移動できなかったトライアルを「失敗」と判定した（図３（ｄ）参照）。
試験終了時にはセッションごとの、総横断回数（中央ダム１３で隔てた２つの領域を行き来した回数）、回避トライアル回数を記録した。評価は、（１セッション内の回避判定のトライアル回数）／（総トライアル数（６０回））で求められる数値（回避率）で行った。この数値が高いほど、成績良し（脳機能が優れている）とした。回避率は、ランプ点灯時以外の横断回数（各トライアル間に横断した回数）にて共分散分析を行った。
【００４５】
高脂肪食餌又は対照食餌の給餌から４週間後及び５週間後の各魚類群の前記能動回避試験での回避率を示す結果をまとめたグラフを図１に示す。ここで図１において、「Cont」は対照食群を示し、「HFD」は高脂肪食群を示す。さらに「4-1」は給餌から４週間後に行った前記試験の第１セッションを示し、「4-2」は給餌から４週間後に行った前記試験の第２セッションを示し、「5-1」は給餌から５週間後に行った前記試験の第１セッションを示し、「5-2」は給餌から５週間後に行った前記試験の第２セッションを示す。
【００４６】
図１に示すように、高脂肪食餌を４週間給餌することで、前記試験の第１セッションにおける対照食群（Cont4-1）と高脂肪食群（HFD4-1）における回避率の比較(図１（Ａ）)、及び第２セッションにおける対照食群（Cont4-2）と高脂肪食群（HFD4-2）の回避率の比較（図１（Ｂ））を行ったところ、高脂肪食群において回避率が低下の向きを示すことを確認した。さらに、より短期的な記憶の指標としている第１セッションから第２セッションまでの20分間での回避率の増加率（第２セッションの回避率−第１セッションの回避率）（図１（Ｃ））においても高脂肪食群において回避率の増加率が低下の向きを示すことを確認した。
【００４７】
さらに、長期的な記憶の指標としている、給餌から４週間後の第１セッションと、給餌から５週間後の第１セッション及び第２セッションにおける回避率を比較したところ（図１（Ｄ））、対照食群及び高脂肪食群ともに、給餌から４週間後の第１セッションと比較して給餌から５週間後の第１セッション及び第２セッションにおける回避率がともに増加し、対照食と比較して高脂肪食群においては回避率が低下した。（図１（Ｄ））。
また同試験において、前記高脂肪食餌及び対照食餌に代えて、既に記憶学習機能を改善することが報告されているホスファチジルセリンを含有する食餌を給餌したゼブラフィッシュ（図１において、「PS」とする）を評価したところ、高脂肪食と比較して対照食群と同程度まで回避率が回復することを確認した（図１（Ｄ））。
【００４８】
また、高脂肪食餌又は対照食餌の給餌から８週間後、９週間後の各魚類群の前記能動回避試験での回避率を示す結果をまとめたグラフを図２に示す。ここで図２において、「Cont」は対照食群を示し、「HFD」は高脂肪食群を示す。さらに「8-1」は給餌から８週間後に行った前記試験の第１セッションを示し、「8-2」は給餌から８週間後に行った前記試験の第２セッションを示し、「9-1」は給餌から９週間後に行った前記試験の第１セッションを示し、「9-2」は給餌から９週間後に行った前記試験の第２セッションを示す。
図２に示すように、高脂肪食を８週間給餌した場合、初回の学習機会である第１セッションにおける対照食群（Cont8-1）と高脂肪食群（HFD8-1）における回避率に差が認められなかった（図２（Ａ））が、第２セッションにおける対照食群（Cont8-2）と高脂肪食群（HFD8-2）の回避率を比較すると、高脂肪食を給餌することで回避率が低下することを確認した（図２（Ｂ））。さらに、短期的な記憶の指標としている第１セッションから第２セッションまでの20分間での回避率の増加率（図２（Ｃ））も、高脂肪食の給餌により低下することが確認された。
さらに、長期的な記憶の指標としている、給餌から８週間後の第１セッションと、給餌から９週間後の第１セッション及び第２セッションにおける回避率を比較したところ、対照食群及び高脂肪食群ともに、給餌から８週間後の第１セッションと比較して給餌から９週間後の第１セッション及び第２セッションにおける回避率がともに増加し、対照食と比較して高脂肪食群においては回避率が低下した（図２（Ｄ））。特に給餌から４週間又は５週間給餌した場合と比較して、対照食群と高脂肪食群の回避率に群間差が認められた。
【００４９】
以上のように、高脂肪食を８週間又は９週間という長期間給餌することで、短期的な記憶及び長期的な記憶ともに影響を与えることを確認した。そして、このような作用は、高脂肪食を４週間又は５週間という短期間給餌した場合よりも強いことを確認した。
【００５０】
（２）体脂肪測定
高脂肪食又は対照食の給餌から１１週間後に、トリカインによる過剰麻酔によりゼブラフィッシュを安楽殺した後、実体顕微鏡下で開頭し、終脳を回収し、RNAlater（-20℃）中にて保存した。
そして、胴体部の体脂肪測定をCT解析により行った。CT解析は、実験動物用３ＤマイクロX線CT RmCT（リガク社製）及び小型動物用画像ファイリングソクトウェア（i-VIEW-R）を用いて行った。なお、測定範囲は第３腹椎から肛門までを対象枠として設定し、脂肪面積を解析した。そして、解析した脂肪面積を、解剖時に測定した体重で割り、体重１ｇあたりの脂肪面積（mm3/g）を算出した。
その結果を表２に示す。
【００５１】
【表２】
2018126137.tif 000003
【００５２】
表２に示すように、高脂肪食を給餌することで、体脂肪が増加していた。
【００５３】
（３）脳内遺伝子発現解析
（３−１）定量的PCR
高脂肪食又は対照食の給餌から１１週間後に、RNA later（商品名、Qiagen社製）500μＬに保存した前記終脳から、RNeasy Lipid Tissue Mini Kit（商品名、Qiagen社製）を用いて添付プロトコルに従いTotal  RNAの抽出を行った。得られたRNAサンプルは−８０℃で保存した。
抽出した各サンプルのTotal RNAのRNA濃度をそろえ、65℃、10分間の熱処理後、Capacity  RNA-to-cDNA（商品名、Applied  Biosystems社製）を用いて、添付プロトコルに従いcDNAの合成行った。得られたcDNAサンプルは−２０℃で保存した。
合成したcDNAを鋳型とし、TaqMan  Fast  Universal  PCR  Master  Mix（商品名、Applied  Biosystems社製）又はFast  SYBR（登録商標）Green  Master  Mix（Applied  Biosystems社製）を用いて、Viia7（Life Technologies）にて、脳機能に関連する遺伝子について定量的PCRを行った。
【００５４】
解析した遺伝子と、定量に用いたプライマーセットの詳細を以下に示す。
・BDNF：プライマーセット（Forward primer：ATAGTAACGAACAGGATGG、配列番号１)
（Reverse primer：GCTCAGTCATGGGAGTCC、配列番号２)
・caspase 9：Taqmanプライマープローブセット（Dr03121787_m1）
・AChE：Taqmanプライマープローブセット（Dr03093481_m1）
・APP b：Taqmanプライマープローブセット（Dr03080308_m1）
・BACE1：Taqmanプライマープローブセット（Dr03438714_m1）
・PS1：Taqmanプライマープローブセット（Dr03131346_m1）
・PS2：Taqmanプライマープローブセット（Dr03138298_m1）
・ECE1：Taqmanプライマープローブセット（Dr03130191_m1）
・GSK3β：Taqmanプライマープローブセット（Dr03138268_m1）
・PSD95：プライマーセット（Forward primer：GAGGATGTGATGCATGAGGATG、配列番号３）
（Reverse primer：TGTGTCCAGATGCGGAGAGT、配列番号４）
・Iba-1：Taqmanプライマープローブセット（Dr03112910_m1）
・EF1a：Taqmanプライマープローブセット（Dr03432748_m1）
【００５５】
得られた解析結果は、Ef1αの発現量を基準として補正し、各遺伝子の相対的mRNA発現量として示した。その結果を表３〜１３に示す。
【００５６】
【表３】
2018126137.tif 000004
【００５７】
【表４】
2018126137.tif 000005
【００５８】
【表５】
2018126137.tif 000006
【００５９】
【表６】
2018126137.tif 000007
【００６０】
【表７】
2018126137.tif 000008
【００６１】
【表８】
2018126137.tif 000009
【００６２】
【表９】
2018126137.tif 000010
【００６３】
【表１０】
2018126137.tif 000011
【００６４】
【表１１】
2018126137.tif 000012
【００６５】
【表１２】
2018126137.tif 000013
【００６６】
【表１３】
2018126137.tif 000014
【００６７】
表３〜１３に示すように、高脂肪食群では、BDNF遺伝子及びPSD-95遺伝子の発現量は低下した。また、caspase9遺伝子、AChE遺伝子、APP b遺伝子、BACE1遺伝子、PS1遺伝子、PS2遺伝子、ECE1遺伝子、GSK3β遺伝子、及びIba-1遺伝子については、高脂肪食を給餌することで、発現量が亢進していた。
【００６８】
（３−２）次世代シーケンス解析
前記（３−１）で抽出したRNAの中から、高脂肪食群及び対照食群からそれぞれ4サンプル選択し、下記に示す遺伝子の発現量の測定を次世代シーケンス解析により行った。
個体の選択は、前記（１）の行動パターン解析（能動回避学習試験）の結果と、前記（３−１）の定量的PCRの結果を用いて選抜した。
【００６９】
RNA100ngを、TruSeq RNA Sample Preparation Kits v2（Cata10g#RS‐ 122-2001, Illumina lnc,）を用いてライブラリー調製を行った。その際、RNAの断片化には、Covaris M220を用いた。またライブラリータイプはPaired-endライブラリーとした。
調製済みライブラリーはIllumina Hiseq2500（リード長：101bp、取得データ量4Gb以上）で解析を行った。
【００７０】
得られた結果（解析対象遺伝子数：22,697遺伝子）はデータ変換 log2(FPKM +1)、正規化方法 Quantile Normalizationを用いて解析した。
その結果、対照食群と高脂肪食群との間で遺伝子の発現量の変化が2倍以上となった遺伝子は224遺伝子であった。さらに、発現量が2倍以上で、かつ有意差（p<0.05, T-test）を持って変化した遺伝子が97遺伝子存在した。その中でも特に、脳機能との関連性を示す遺伝子の解析結果を表１４〜１９に示す。
【００７１】
【表１４】
2018126137.tif 000015
【００７２】
【表１５】
2018126137.tif 000016
【００７３】
【表１６】
2018126137.tif 000017
【００７４】
【表１７】
2018126137.tif 000018
【００７５】
【表１８】
2018126137.tif 000019
【００７６】
【表１９】
2018126137.tif 000020
【００７７】
表１４〜１９に示すように、高脂肪食群では、CD74遺伝子、PTGDSb.2遺伝子、PTN遺伝子、SLC1a2b遺伝子、及びSLC1a3b遺伝子の発現量は低下した。
【００７８】
以上の結果から明らかなように、ゼブラフィッシュなどの魚類に脂肪分を高濃度で含有する飼料又は剤を摂取若しくは投与することで、生活習慣の悪化に伴う脳機能の低下が誘導された。また、脳機能の低下の作用機序として、APP分解・産生・蓄積促進、Aβ分解抑制の関与が推察され、脳内でのAβ蓄積が示唆された。
従って、ゼブラフィッシュなどの魚類に脂肪分を高濃度で含有する飼料や剤を投与若しくは摂取することで、アルツハイマー様の脳内状態を再現できる可能性も示唆された。
【符号の説明】
【００７９】
１  試験水槽
２  通路
３  中央仕切り（ダム）
４  試験動物（魚類）
５  ランプ
５ａ  点灯させたランプ
５ｂ  点灯させていないランプ
６  電気刺激
【００８０】
１３  中央ダム
１５  LEDランプ
１６  ステンレス板（電極版）
【図１】
2018126137.tif 000021
【図２】
2018126137.tif 000022
【図３】
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【図４】
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【配列表】
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