(57)【要約】      （修正有）【課題】繊維性コラーゲンを生み出すＩ型コラーゲンの前駆体物質であるＩ型プロコラーゲンの産生を促進し、皮膚老化の根本的な解決が可能な新規経皮用コラーゲン産生促進剤、及びＩ型コラーゲンの産生促進方法の提供。【解決手段】平均分子量３，５００以下の加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分とする、経皮用コラーゲン産生促進剤。前記加水分解ヒアルロン酸の塩はナトリウム塩であることが好ましく、その強熱残分は１５〜２５％であることが好ましい、経皮用コラーゲン産生促進剤。前記促進剤を皮膚に塗布するＩ型コラーゲンの産生促進方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均分子量３，５００以下の加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分とする、
経皮用コラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
請求項１記載の経皮用コラーゲン産生促進剤において、
加水分解ヒアルロン酸の塩はナトリウム塩であり、
加水分解ヒアルロン酸および／またはナトリウム塩中の、強熱残分が１５％以上２５％以下であり、
経皮用コラーゲン産生促進剤が経皮用Ｉ型プロコラーゲン産生促進剤である、
経皮用コラーゲン産生促進剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩を皮膚に塗布することを特徴とする、
Ｉ型プロコラーゲンの産生促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、平均分子量３，５００以下の加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩を含む、経皮用コラーゲン産生促進剤、およびＩ型プロコラーゲンの産生促進方法に関する。 
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、美容成分として数多くの化粧品・食品に配合されている。例えば、食品用途としては、ヒアルロン酸を経口摂取することで、シワが改善されることが報告されている（特許文献１：特開２０１６−０５６２０１）。一方、化粧品用途としては肌の乾燥を防ぐ保湿成分として配合されている。しかしながら、ヒアルロン酸を塗布しても肌表面を覆うだけで、シワの改善やコラーゲン繊維の増加による肌の弾力回復など老化の根本的な解決には至っていなかった。
【０００３】
そこで、不飽和型のヒアルロン酸を有効成分とする化粧料（特許文献１：特開２０１４−２２７３５０）が検討され、ＩＶ型コラーゲンが合成されることが報告された。しかしながら、ＩＶ型コラーゲンは、基底膜の主成分であり、肌の弾力に寄与するコラーゲン繊維をつくりだすことのない「非繊維性コラーゲン」であるため、肌の弾力といった肌の美容・老化改善には関係がなく、前記課題を解決することはできなかった。   
【０００４】
したがって、繊維性コラーゲンを生み出すＩ型コラーゲンの前駆体物質である、Ｉ型プロコラーゲンの産生を促進することで、老化の根本的な解決ができることが期待できる。 
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１６−０５６２０１
【特許文献２】特開２０１４−２２７３５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の目的は、経皮用コラーゲン産生促進剤、およびＩ型コラーゲンの産生促進方法を提供するものである。   
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）平均分子量３，５００以下の加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分とする、
経皮用コラーゲン産生促進剤、
（２）（１）の経皮用コラーゲン産生促進剤において、
加水分解ヒアルロン酸の塩はナトリウム塩であり、
加水分解ヒアルロン酸および／またはナトリウム塩中の、強熱残分が１５％以上２５％以下であり、
経皮用コラーゲン産生促進剤が経皮用Ｉ型プロコラーゲン産生促進剤である、
経皮用コラーゲン産生促進剤、
（３）（１）又は（２）の加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩を皮膚に塗布することを特徴とする、
Ｉ型プロコラーゲンの産生促進方法
である。 
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、平均分子量３，５００以下の加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩を含む、経皮用コラーゲン産生促進剤、およびＩ型プロコラーゲンの産生促進方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の経皮用コラーゲン産生促進剤を蛍光ラベル化して三次元皮膚モデルに浸透させた際の細胞断面図を共焦点レーザー顕微鏡で観察した図である。
【００１０】
【図２】図２は、本発明の経皮用コラーゲン産生促進剤を塗布した際の、塗布直後、２週間後、４週間後、８週間後のコラーゲンスコアを示したものである。
【００１１】
【図３】図３は、本発明の経皮用コラーゲン産生促進剤を用いた際のＩ型プロコラーゲン量の測定結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本発明において「％」は「質量％」を意味する。   
【００１３】
＜本発明の特徴＞本発明によれば、平均分子量３，５００以下の加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩を含むことにより、経皮用コラーゲン産生促進剤、およびＩ型プロコラーゲン産生促進方法を提供できる。特に、コラーゲンの中でもＩ型コラーゲンの産生を促進することができる。 
【００１４】
＜コラーゲン＞コラーゲンとは、主に脊椎動物の真皮、靭帯、骨、軟骨などを構成するタンパク質の１つであり、多細胞動物の細胞外基質の主成分である。体内に存在しているコラーゲンの総量は、ヒトでは、全タンパク質のほぼ３０％を占める程多い。また、コラーゲンには、Ｉ型からＶＩＩ型まで数多く分類されており、それぞれ繊維性のものや非繊維性のもの、分布している場所などが異なることが明らかになっている。したがって、目的に応じてどのコラーゲンを増加させるかを検討する必要がある。   
【００１５】
＜Ｉ型プロコラーゲン＞Ｉ型プロコラーゲンとは、体内に最も多く存在するコラーゲン繊維の主成分であるＩ型コラーゲンの前駆体である。したがって、Ｉ型プロコラーゲンの産生を促進することで、Ｉ型コラーゲンを効果的に増加させることができ、肌のたるみやしわ改善といった老化の根本解決につなげることができる。   
【００１６】
＜ヒアルロン酸および／またはその塩＞  本発明において、「ヒアルロン酸」とは、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとの２糖からなる繰り返し構成単位を１以上有する多糖類をいう。  また、「ヒアルロン酸の塩」としては、特に限定されないが、食品または薬学上許容しうる塩であることが好ましく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。特に、皮膚に塗布し、表皮に浸透した際の安全性が高いことから、ナトリウム塩であるとよい。  本発明の原料であるヒアルロン酸および／またはその塩としては、一般的に化粧品に用いられるものであれば、いずれのものでも良く、動物等の天然物（例えば鶏冠、さい帯、皮膚、関節液などの生体組織など）から抽出されたものでもよく、または、微生物もしくは動物細胞を培養して得られたもの（例えばストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法）、化学的もしくは酵素的に合成されたものなど、いずれも使用することができる。 
【００１７】
＜加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩＞  本発明は、平均分子量３，５００以下の加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩を含むものである。  本発明において、「加水分解ヒアルロン酸」とは、酸処理、アルカリ処理、又はヒアルロン酸分解酵素による酵素処理によって原料となるヒアルロン酸よりも低分子化されたヒアルロン酸をいう。特に、低分子化しやすく、抗原性を減少できる点で、酸処理により製造するとよい。   
【００１８】
＜加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩の平均分子量＞  本発明において、加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩を皮膚に塗布した際、表皮まで浸透してコラーゲンの産生促進効果を得るために、加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩の平均分子量は３，５００以下であり、さらに２，５００以下であると良い。  前記加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩の平均分子量が３，５００より大きい場合、ヒアルロン酸が表皮まで浸透せず、コラーゲンの産生促進効果が得られない。  なお、吸湿により、取り扱いがし難い場合があるので、平均分子量８００以上、さらに１，０００以上が良い。 
【００１９】
＜平均分子量の測定方法＞  本発明で用いる加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩の平均分子量は、常法に則り、ＨＰＬＣ測定により求められる。  より具体的には、各ＨＰＬＣ測定により得られたヒアルロン酸および／またはその塩の各ピークの分子量（例えば２糖であれば分子量４００）にピーク面積を乗じた値を算出し、このピーク毎に算出した値を積算する。さらに、この積算した値を全体のピーク面積で除することによって、平均分子量を算出することができる。 
【００２０】
＜加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩中の強熱残分＞  本発明において、コラーゲンの産生促進効果を向上させるために、加水分解ヒアルロン酸の塩はナトリウム塩であるとよい。  加水分解ヒアルロン酸および／またはナトリウム塩中の強熱残分は、皮膚に塗布した際の刺激性が低減しやすく、本発明の経皮用コラーゲン産生促進剤の安定性が向上しやすいことから、１５％以上２５％以下であり、さらに、１５％以上２０％以下であるとよい。
ここで、強熱残分は、加水分解ヒアルロン酸および／またはナトリウム塩中の無機物の含量をいう。
【００２１】
＜強熱残分の測定方法＞
本発明において、強熱残分は、食品衛生検査指針理化学編に示された硫酸添加灰化法によって測定する。
あらかじめ恒量にした灰化容器（Ｗ０）に、試料を精密に量る（Ｗ１）。試料に濃硫酸を加え、加温して全体を炭化膨潤させたのち、ゆっくりと加熱して過剰の硫酸を追い出す。灰化容器を電子炉に入れて５５０℃でほとんど炭素分のなくなるまで灰化する。冷却後、再び数滴の濃硫酸で湿らせ、８００℃で灰化する。灰化後、灰化容器を取り出し、アルミトレイなどの上で温度が２００℃近くになるまで放冷してデシケーターに移し、室温に戻ったのち秤量する。同じ操作を恒量（Ｗ２）になるまで繰り返す。灰分含有率を硫酸灰分として算出する。
【００２２】
算出方法は以下式（１）に従って行う。
式（１）  硫酸灰分（ｇ／１００ｇ）＝（Ｗ２−Ｗ０）／（Ｗ１−Ｗ０）×１００
【００２３】
＜動粘度＞
本発明に用いる加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩は、加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩を皮膚に塗布した際、表皮まで浸透してコラーゲンの産生促進効果を得られやすいことから、５質量％水溶液の動粘度が２．０ｍｍ２／ｓ以下であるとよい。
【００２４】
＜動粘度の測定方法＞
本発明において、ヒアルロン酸および／またはその塩の５質量％水溶液の動粘度は、ウベローデ粘度計（柴田科学器械工業株式会社製）を用いて測定することができる。この際、流下秒数が２００〜１０００秒になるような係数のウベローデ粘度計を選択する。また、測定は３０℃の恒温水槽中で行ない、温度変化のないようにする。ウベローデ粘度計により測定された前記水溶液の流下秒数と、ウベローデ粘度計の係数との積により、動粘度（単位：ｍｍ２／ｓ）を求めることができる。
【００２５】
＜０．１質量％水溶液のｐＨ＞  本発明において、加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩を０．１％水溶液に調整した時のｐＨは５．０〜７．０であるとよい。 
【００２６】
＜かさ密度＞
本発明に用いる加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩は、かさ密度が０．１０ｇ／ｃｍ３よりも大きいとよく、さらに０．１５ｇ／ｃｍ３よりも大きいとよい。
本発明において、「かさ密度」は、「第十六改正日本薬局方、３．粉体物性測定法、３．０１  かさ密度およびタップ密度測定法」に記載の方法に準じて測定された値をいう。
【００２７】
＜塩素含量＞
本発明に用いる加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩は、塩素含量が１．０質量％以下であるとよい。
【００２８】
＜硫黄含量および塩素含量の測定方法＞
本発明において、塩素含量は、モール法で測定した値から算出することによって測定することができる。
【００２９】
＜平均粒子径＞
本発明に用いる加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩は、平均粒子径が１０μｍ以上３５μｍ以下であるとよく、さらに１５μｍ以上３０μｍ以下であるとよい。
【００３０】
＜平均粒子径の測定方法＞
本発明において、加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩の平均粒子径は、レーザー回折式測定法で測定された。具体的には、分散媒としてエタノールを用い、ＳＡＬＤ−２０００Ｊ（島津製作所社製）を用いて測定された。
【００３１】
＜ヒアルロン酸分解酵素＞
本発明に用いる加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩は、抗原性をより低減できる点で、ヒアルロン酸分解酵素を含有しないとよい。
「ヒアルロン酸分解酵素を含有しない」とは、前記加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩におけるヒアルロン酸分解酵素の含有量が１質量％以下であることをいう。
【００３２】
＜経皮用コラーゲン産生促進剤における加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩の配合量＞  本発明の経皮用コラーゲン産生促進剤において、有効成分である前記加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩の配合量は、粉末の場合９０％以上であるとよく、水溶液の場合、０．０１％以上１５％以下であるとよい。  また、本発明のコラーゲン産生促進剤を化粧料や医薬部外品に配合する場合、前記コラーゲン産生促進剤の配合量は、加水分解ヒアルロン酸の固形分換算で０．０１％以上１％以下であるとよい。   
【００３３】
＜その他の成分＞本発明の経皮用コラーゲン産生促進剤において、その他の成分として、一般的に化粧料や医薬部外品に配合される原料を適宜配合することができる。例えば、油性成分、界面活性剤、乳化剤、保湿剤、増粘剤、防腐・殺菌剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、美白剤等が挙げられる。 
【実施例】
【００３４】
次に、本発明を実施例に基づき、さらに説明する。なお、本発明はこれに限定するものではない。 
【００３５】
［調製例１］＜加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩の調整＞１）加水分解工程攪拌機およびジャケットを装備した５０Ｌ容タンクに希塩酸２５Ｌを投入して平均分子量１０万以下の原料ヒアルロン酸を加水分解した。５０〜８０℃で５〜２０時間保持して、加水分解を実施し、加水分解液を得た。 
【００３６】
３）ｐＨ調整工程（第一段階）品温を４５℃以下に降温させて、前記加水分解液に水酸化ナトリウム水溶液を添加し、中和した。 
【００３７】
４）脱塩工程得られた中和液を電気透析装置を用いて脱塩を行った。 
【００３８】
得られた溶液を凍結乾燥（アルバック社凍結乾燥機（ＤＦＲ−５Ｎ−Ｂ））によって乾燥させ、調製例１の淡黄色微粉末の加水分解ヒアルロン酸ナトリウム４．５ｋｇを調整した。 
【００３９】
得られた調製例１の加水分解ヒアルロン酸ナトリウムについて上述に記載の各種物性を測定し、表１に示した。 
【００４０】
[表１]
2018177643.tif 000002
【００４１】
調製例１の加水分解ヒアルロン酸ナトリウムの平均分子量は、ＨＰＬＣの測定により行った。 
【００４２】
＜ＨＰＬＣ測定条件＞  ＨＰＬＣ分析装置：商品名「アライアンスＰＤＡシステム」，日本ウォーターズ株式会社製  使用カラム：ゲル濾過カラム  分析サンプル：ヒアルロン酸の０．１％（ｗ／ｖ）水溶液  カラム温度：４０℃  流速：１ｍＬ／分  ヒアルロン酸の０．１％（ｗ／ｖ）水溶液の注入量：２０μＬ    移動相：リン酸バッファー（ＮａＣｌ含有） 
【００４３】
ここで、ｂ値は、物質が有する色の色相（ｈｕｅ）を規定する値であり、ｂ値が大きいほど黄味が強いことを示し、一方、ｂ値が小さいほど青味が強いことを示す。
【００４４】
Ｌ値は、物質が有する色の明度（ｌｉｇｈｔｎｅｓｓ）を規定する値であり、０〜１００の間の数値で表される。Ｌ値が１００である場合最も明るい状態（完全な白色）を示し、一方、Ｌ値が０である場合最も暗い状態（完全な黒色）を示す。
【００４５】
ｂ値およびＬ値は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７３０−１９９５によって規定される色差表示方法によって、Ｌａｂ系色度座標で表示されることができる。表１に記載したｂ値およびＬ値は、市販の色差計により測定した。
【００４６】
＜調製例２＞平均分子量８，０００の加水分解ヒアルロン酸ナトリウム（商品名「ヒアロオリゴ」、キユーピー株式会社製）を用意した。 
【００４７】
［試験例１］＜皮膚への浸透試験＞ヒアルロン酸の有無、およびヒアルロン酸の分子量による皮膚への浸透の程度を評価した。結果を図１に示す。 
【００４８】
＜試薬の調製＞具体的には、まず、調製例１および調製例２の分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムをフルオレセインにより蛍光ラベル化して、ＰＢＳ溶液に１％になるように配合し、実施例１の経皮用コラーゲン産生促進剤および比較例２を調製した。比較例１は、純水を用いた。 
【００４９】
＜皮膚への浸透観察＞次に、３次元皮膚モデルキット（ＥＰＩ−６０６Ｘキット：倉敷紡績(株)製）をセットしたフランツ拡散セルに、実施例１、比較例１、及び比較例２の経皮用コラーゲン産生促進剤を１０００μＬアプライし、５時間浸透させた。アプライした試料液を抜き取り、細胞表面をＰＢＳ溶液で４〜５回洗浄した。メスで細胞をカットし、ドライアイス・アセトン法にて凍結した。切片を作成し、ＨＥ染色を顕微鏡、蛍光観察は共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。なお、ＨＥ染色は４０倍、蛍光観察は６３倍で観察した。 
【００５０】
図１より、平均分子量３，５００以下の加水分解ヒアルロン酸および／またはその塩を含む経皮用コラーゲン促進剤を塗布した場合のみ、前記促進剤が表皮まで浸透することが確認できた。したがって、本発明の経皮用コラーゲン産生促進剤を塗布すると、有効成分である加水分解ヒアルロン酸が表皮細胞に働きかける可能性が示唆された。 
【００５１】
［試験例２］  ＜コラーゲンスコアの測定＞ヒアルロン酸の有無が、真皮中のコラーゲン密度を示すコラーゲンスコアに及ぼす影響を評価した。結果を表１および図２に示す。 
【００５２】
具体的には、調製例１の加水分解ヒアルロン酸ナトリウムを０．１％含む実施例２の経皮用コラーゲン産生促進剤（水溶液）を一日２回塗布し、塗布直後、２、４、８週間後のコラーゲンスコアを測定した。測定方法は、超音波真皮画像装置ＤｅｒｍａＬａｂ（Ｃｏｒｔｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて、前腕部に２ｃｍ×２ｃｍの印をつけ、各試料につき、その枠の四隅および中心の５箇所の測定を行った。（気温２２℃、湿度５０％）なお、コラーゲンスコアの値が大きいほど、コラーゲンが豊富で真皮コラーゲンの状態が良いといえる。 
【００５３】
［表２］
2018177643.tif 000003
【００５４】
表２および図２より、本発明の経皮用コラーゲン産生促進剤を塗布することによりコラーゲンスコアの減少を抑制できることから、真皮中のコラーゲン量の減少を抑制できることが理解できる。 
【００５５】
＜試験例３＞＜３次元皮膚モデルでのＩ型プロコラーゲンの産生促進評価＞３次元皮膚モデルキット（ＥＦＴ−４１２：倉敷紡績(株)製）を用いて、ヒアルロン酸の有無がＩ型プロコラーゲンの産生促進に及ぼす影響を評価した。結果を表３および図３に示す。
【００５６】
＜経皮用コラーゲン産生促進剤の調製＞
実施例３の経皮用コラーゲン産生促進剤  ０．７１ｍｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液：調製例１の加水分解ヒアルロン酸ナトリウム８μｇ／ｍＬをＰＢＳ溶液３０μＬ中に２ｍＬ添加した。
比較例３：ＰＢＳ溶液を使用した。
【００５７】
＜３次元皮膚モデルへの添加試験とＩ型プロコラーゲン量の測定＞
実施例３の経皮用コラーゲン産生促進剤、および比較例３のＰＢＳ溶液をそれぞれ３０μＬ／ｗｅｌｌ添加して、３７℃、５％ ＣＯ２下で４８時間インキュベートした。
真皮部分の培地（真皮細胞の上清）を回収して、ＥＬＩＳＡ（Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ１ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ （ＰＩＰ） ＥＩＡ ｋｉｔ、ＴａＫａＲａ社製）を用いて、Ｉ型プロコラーゲン量を測定した。
【００５８】
［表３］
2018177643.tif 000004
【００５９】
表３および図３より、本発明の経皮用コラーゲン産生促進剤により、Ｉ型プロコラーゲンの産生が促進されていることが理解できる。 
【００６０】
［実施例４］＜化粧水＞実施例１の経皮用コラーゲン産生促進剤を含む、化粧水を調製した。
2018177643.tif 000005
【００６１】
[実施例５]＜クリーム＞調製例１の加水分解ヒアルロン酸ナトリウム（粉末）を含む、クリームを調製した。
2018177643.tif 000006
【００６２】
[実施例６]＜美容液＞実施例１の経皮用コラーゲン産生促進剤を含む、美容液を調整した。
2018177643.tif 000007
【図１】
2018177643.tif 000008
【図２】
2018177643.tif 000009
【図３】
2018177643.tif 000010