(57)【要約】【課題】  抗体凝集体の形成を予測する方法を提供すること。【解決手段】  （１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と、被検抗体を含む試料と、被検抗体を認識する抗体に標識物質が直接又は間接に結合している標識抗体とを接触させることにより、オリゴペプチド結合担体と変性した抗体と標識抗体とが反応した複合体を形成させる工程、（２）工程（１）で形成した複合体中の標識物質を検出することにより、前記試料中の変性した抗体の量を測定する工程、（３）工程（２）において測定した変性した抗体の量に基づき、前記試料中の被検抗体の凝集体の形成を予測する工程を含む方法により前記課題を解決する。【選択図】  図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）から（３）の工程を含む、抗体の凝集体の形成を予測する方法。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と、
被検抗体を含む試料と、
被検抗体を認識する抗体に標識物質が直接又は間接に結合している標識抗体と
を接触させることにより、オリゴペプチド結合担体と変性した抗体と標識抗体とが反応した複合体を形成させる工程、
（２）工程（１）で形成した複合体中の標識物質を検出することにより、前記試料中の変性した抗体の量を測定する工程、
（３）工程（２）において測定した変性した抗体の量に基づき、前記試料中の被検抗体の凝集体の形成を予測する工程
【請求項２】
まずオリゴペプチド結合担体と被検抗体を含む試料とを接触させ、次いで標識抗体と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴペプチド結合担体が、さらにコラーゲンペプチドによりブロッキングされてなる担体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
担体が疎水性の高いプレートである、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
担体が磁性ビーズである、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項６】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と、
被検抗体を認識する抗体に直接又は間接に標識物質が結合している標識抗体と
を含む、抗体の凝集体形成を予測するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の凝集体形成を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品用途で用いる抗体は、通常当該抗体を発現可能な細胞を培養後、得られた培養液を遠心分離、濾過、カラムクロマトグラフィー等の精製操作を行ない、製造する。その際、得られた抗体の中には、製造時のストレス等により変性を受けることで生じる、当該抗体の凝集体が含まれている場合がある。抗体凝集体は免疫原性を有するおそれがある（非特許文献１）ため、特に医薬品用途で用いる場合、当該凝集体を精度よく検出する必要がある。また、製剤化した後の保存状態で凝集体が形成されることもあり、凝集体の形成の予測が求められている。抗体凝集体の形成メカニズムの一つとして、まず、部分的に立体構造が崩れたモノマーが形成され、それが核となり抗体凝集体が形成されると報告されている（非特許文献２及び３）。そのため、抗体凝集体形成の原因となる部分的に立体構造が崩れた抗体を検出することで、抗体凝集体の形成を予測することができると考えられる。
【０００３】
部分的に立体構造が崩れた抗体を検出する方法としては、抗体の高次構造の精密な解析手法、即ちＸ線結晶構造解析やＮＭＲを用いた方法が知られているが、これらの方法は非常に手間のかかる方法であり、製造時の純度管理等、迅速・簡便な測定が求められる用途には不向きである。近年、ストレス等により変性を受けた抗体を、その分子量を問わず、特異的に認識する分子が報告されている（特許文献１から３、並びに非特許文献４及び５）。しかしながら、これら文献に記載の前記分子を用いた変性抗体測定法は表面プラズモン共鳴を利用した方法であり、当該方法を実施するにはＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥヘルスケア製）等の高価な専用装置を必要とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開２０１４／１０３２０３号
【特許文献２】国際公開２０１４／１１５２２９号
【特許文献３】国際公開２００８／０５４０３０号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓ．Ｋ．Ｓｉｎｇｈ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１００，３５４−３８７，２０１１
【非特許文献２】Ｃ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３２，３７２−３８０，２０１４
【非特許文献３】Ｃ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３０，２１１−２１７，２０１４
【非特許文献４】Ｈ．Ｗａｔａｎａｂｅ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８９，３３９４−３４０４，２０１４
【非特許文献５】Ｈ．Ｗａｔａｎａｂｅ等，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８８，１００９５−１０１０１，２０１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、製造時のストレス等で変性した抗体を測定することで、凝集体の形成を迅速かつ簡便に予測可能な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、変性をもたらすストレスを抗体に与え続けると当該抗体の凝集体が形成することから、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と、被検抗体を認識する抗体に直接又は間接に標識物質が結合している標識抗体とを用いて、変性した抗体の量を測定することで、迅速かつ簡便に、被検抗体の凝集体形成が予測できることを見出した。また、かかる抗体の凝集体形成を予測する方法において、前記担体への非特異的吸着を抑制する上でコラーゲンペプチドが有用であることを見出した。さらに、前記担体として疎水性の高いプレート又は磁性ビーズが好適に用いられることも明らかにした。
また、かかる方法によれば、前記変性をもたらすストレスの種類に関わらず、抗体の凝集体形成を予測でき、特に既存のタンパク質物性解析装置では予測できない、加熱処理、凍結融解処理、又は撹拌処理によって生じる抗体の凝集体形成予測を、精度高く実施できることを見出した。
【０００８】
すなわち本発明の第一の態様は、  以下の（１）から（３）の工程を含む、抗体の凝集体の形成を予測する方法である。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と、
被検抗体を含む試料と、
被検抗体を認識する抗体に標識物質が直接又は間接に結合している標識抗体と
を接触させることにより、オリゴペプチド結合担体と変性した抗体と標識抗体とが反応した複合体を形成させる工程、
（２）工程（１）で形成した複合体中の標識物質を検出することにより、前記試料中の変性した抗体の量を測定する工程、
（３）工程（２）において測定した変性した抗体の量に基づき、前記試料中の被検抗体の凝集体の形成を予測する工程
また本発明の第二の態様は、まずオリゴペプチド結合担体と被検抗体を含む試料とを接触させ、次いで標識抗体と接触させる、前記第一の態様に記載の方法である。
【０００９】
また本発明の第三の態様は、前記オリゴペプチド結合担体が、さらにコラーゲンペプチドによりブロッキングされてなる担体である、前記第一又は第二の態様に記載の方法である。
【００１０】
また本発明の第四の態様は、担体が疎水性の高いプレートである、前記第一から第三いずれかの態様に記載の方法である。
【００１１】
また本発明の第五の態様は、担体が磁性ビーズである、前記第一から第三いずれかの態様に記載の方法である。
【００１２】
また本発明の第六の態様は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と、
被検抗体を認識する抗体に直接又は間接に標識物質が結合している標識抗体と
を含む、抗体の凝集体形成を予測するためのキットである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の抗体の凝集体形成を予測する方法は、製造時のストレス（例えば、酸、アルカリ、加熱、凍結融解、撹拌）等により変性を受けた抗体の凝集体形成予測を迅速・簡便に実施することができる。また本発明の方法によれば、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥヘルスケア製）等の高価な専用装置を必要とせず、比較的安価に、変性した抗体の凝集体形成予測ができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１の結果を示した図である。
【図２】実施例２の結果において、１％（ｗ／ｖ）コラーゲンペプチドをブロッキング剤として用いたときの結果を示した図である。
【図３】実施例２の結果において、２％（ｗ／ｖ）スキムミルクをブロッキング剤として用いたときの結果を示した図である。
【図４】実施例２の結果において、１００ｍＭエタノールアミンをブロッキング剤として用いたときの結果を示した図である。
【図５】実施例２の結果において、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡをブロッキング剤として用いたときの結果を示した図である。
【図６】実施例３の結果を示した図である。
【図７】実施例４の結果を示した図である。
【図８】実施例５の結果のうち、酸処理又はアルカリ処理したヒト抗体を対象とし、本発明で用いる変性ヒト抗体測定法にて当該抗体の安定性を評価した結果を示した図である。
【図９】実施例５の結果のうち、酸処理又はアルカリ処理したヒト抗体を対象とし、市販の装置にて当該抗体の安定性を評価した結果を示した図である。
【図１０】実施例５の結果のうち、加熱処理、凍結融解処理又は撹拌処理したヒト抗体を対象とし、本発明で用いる変性ヒト抗体測定法にて当該抗体の安定性を評価した結果を示した図である。
【図１１】実施例５の結果のうち、加熱処理、凍結融解処理又は撹拌処理したヒト抗体を対象とし、市販の装置にて当該抗体の安定性を評価した結果を示した図である。
【図１２】実施例６の結果を示した図であり、加熱処理したヒト抗体を対象とし、本発明の方法にて測定した結果を示した図である。
【図１３】実施例６の結果を示した図であり、加熱したヒト抗体を対象とし、市販の細胞計数装置にて当該抗体の凝集体量を測定した結果を示した図である。
【図１４】実施例６の結果を示した図であり、加熱したヒト抗体を対象とし、市販のバイオ医薬品凝集性評価システムにて当該抗体の凝集体量を測定した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明における抗体の凝集体形成を予測する方法は、以下の（１）（２）に示す工程を含む方法により、変性した抗体の量を測定し、その量に基づき、抗体の凝集体形成を予測する方法である。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と、
被検抗体を含む試料と、
被検抗体を認識する抗体に標識物質が直接又は間接に結合している標識抗体と
を接触させることにより、オリゴペプチド結合担体と変性した抗体と標識抗体とが反応した複合体を形成させる工程、
（２）工程（１）で形成した複合体中の標識物質を検出することにより、前記試料中の変性した抗体の量を測定する工程。
【００１７】
本発明において、変性した抗体とは、酸、アルカリ、加熱、凍結融解、撹拌等によるストレスで抗体の全構造又は一部構造が変化したものをいう。その抗体の由来には特に限定はなく、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ等に由来する抗体があげられ、特にヒトに由来する抗体が好ましい。なおその抗体の種類に特に限定はなく、一例としてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４があげられる。また、その抗体は、完全な形の抗体の他、抗体のＦｃ領域を有する限り、他の動物に由来する抗体（例えば、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体）に由来する配列（ＣＤＲ等）を含むキメラ抗体、ヒト化抗体であってもよい。さらに、その抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、本発明の方法に供する試料としては、変性、未変性の如何を問わず、前記被検抗体を含むものであれば特に制限はなく、通常、抗体を含む溶液であり、特にヒト抗体を含むものが好ましい。また、その溶液としても、変性した抗体と下記オリゴペプチドとの結合を阻害しない限り、特に制限はない。
【００１８】
本発明において、変性した抗体を認識するオリゴペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含んでいればよく、配列番号１に記載のアミノ酸配列のみからなるものを用いてもよいし、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に後述の担体と結合させるためのリンカーペプチドといった数アミノ酸残基から数十アミノ残基を付加したオリゴペプチドを用いてもよい。本発明に用いられる変性した抗体を認識するオリゴペプチドの長さとしては、変性した抗体を認識する限り特に制限はないが、通常５０から２５アミノ酸であり、好ましくは４０から２５アミノ酸であり、より好ましくは３０から２５アミノ酸であり、特に好ましくは２５アミノ酸（配列番号１に記載のアミノ酸配列のみからなる）である。また、オリゴペプチドは、通常天然アミノ酸がペプチド結合により連結されて構成されるものであるが、本発明において非天然型のアミノ酸を含むものであってもよく、また修飾が施されているものであってもよい。
【００１９】
本発明において、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むオリゴペプチドを固定化させる担体に特に限定はなく、例えば、プレート（複数の凹部が形成されたプレート（ウェルプレート、マイクロプレート等）も含む）、ビーズ、ゲルが挙げられる。また、担体の材料としては、プラスチック（例えば、ポリスチレン等のスチレン系樹脂、ポリ塩化ビニル等のビニル系重合体、ポリメチル（メタ）アクリレート等のアクリル系樹脂、ポリエチレン等のポリオレフィン系樹脂、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系樹脂、ポリカーボネート樹脂）、金属（金、銀、アルミ、ステンレス等）、酸化物（ガラス、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）等）、寒天が挙げられる。
【００２０】
本発明における担体としては、より具体的に、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法で用いられるウェルプレートや、ガラスビーズ、磁性ビーズ、金属粒子、シリカビーズ、ジルコニアビーズ、セルロースゲル、アガロースゲル、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標、親水性ビニル系重合体にヘキシル基、ブチル基、フェニル基又はオリゴエチレングリコール基を導入したポリマー等、東ソー製）等のポリマーゲルが挙げられる。
【００２１】
なお、担体としてウェルプレート等のプレートを用いる場合、疎水性の高いプレートを用いると非特異吸着がより抑えられる（変性した抗体に対する結合能が低いという）点で好ましい。ここで、「疎水性が高い」とは、通常水接触角度が６０度以上であり、好ましくは７０度以上、より好ましくは８０度以上、さらに好ましくは８５度以上、特に好ましくは９０度以上である（なお、水接触角度とは、大気中、室温における水滴に対する静的接触角度のことを意味する）。また、本発明におけるプレートの好ましい一例として、ポリソープ（登録商標）処理が施されたポリスチレン製プレート（ＰｏｌｙＳｏｒｐプレート、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）が挙げられる（特開２０１４−２２４７１０号公報によれば、ＰｏｌｙＳｏｒｐプレートの水接触角は８８．１度である）。
【００２２】
また、本発明の方法をより簡単かつ迅速に実施すべく、ＡＩＡ−６００ＩＩやＡＩＡ−ＣＬ２４００（いずれも東ソー製）等の自動酵素免疫測定装置を用いる場合、担体として磁性ビーズが好適に用いられる。
【００２３】
本発明で用いるオリゴペプチドを結合した担体（オリゴペプチド結合担体）は、前記オリゴペプチドを前述した担体に化学的又は物理的に固定化することで得られる。本発明にかかるオリゴペプチドの前記担体への固定化方法としては特に制限はなく、例えば、物理吸着、静電的相互作用、疎水的相互作用、架橋剤等を利用する方法が挙げられる。本発明にかかるオリゴペプチドの固定化時の濃度は、担体の材質、形状、固定化の方法等に合わせて適宜調整すればよく、例えば、５から５０μｇ／ｍＬの濃度が挙げられ、好ましくは１０から４０μｇ／ｍＬである。
【００２４】
また、オリゴペプチド固定化後の担体に対しブロッキング剤によるブロッキング操作を行なうと、非特異吸着が抑えられ、測定時のバックグラウンドも抑えられるため、好ましい。特に、後述の実施例２に示す通り、コラーゲンペプチドをブロッキング剤として用いると、測定時のバックグラウンドがより抑えられる点で好ましい。コラーゲン以外にも、糖タンパク質を含有するブロッキング剤、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  ＴＭ  （ＴＢＳ）  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）等がブロッキング剤として使用できる。
【００２５】
コラーゲンペプチドは、コラーゲンを加水分解して得られるものであれば、その由来（例えば、ブタ、ウシ、魚）に特に制限はない。なお加水分解の程度にも特に制限はなく、常法に従い、例えばコラーゲンをパパイン、ペプシン又はトリプシンといったタンパク質加水分解酵素の共存下、例えば５０℃で１８０分間加熱等すればよい。また、その重量平均分子量についても特に制限はないが、通常２０００から１００００、好ましくは３０００から５０００である。さらに、コラーゲンペプチドの使用量としては、溶液状態において好ましくは０．５から１０重量％、より好ましくは１から５重量％である。また、コラーゲンペプチドを溶解させるための液としても特に制限はなく、各種緩衝液（例えば、ｐＨ８から１０の緩衝液（炭酸緩衝液、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等））を利用し、ブロッキング剤として調製することができる。
【００２６】
本発明において、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み変性した抗体を認識するオリゴペプチドが担体に結合しているオリゴペプチド結合担体と、被検抗体を含む試料と、被検抗体を認識する抗体に標識物質が直接又は間接に結合している標識抗体との接触の順序には特に限定はない。すべて同時に接触させてもよく、またオリゴペプチド結合担体と、被検抗体を含む試料とを先に接触させてもよい。また被検抗体を含む試料と標識抗体とを先に接触させてもよい。好ましくは、オリゴペプチド結合担体と、被検抗体を含む試料とを先に接触させ、次いで標識抗体を接触させるものである。以下、その方法に沿って説明する。
【００２７】
オリゴペプチド結合担体と被検抗体を含む試料とを接触させる際の条件としては、上述のオリゴペプチドと当該試料中の変性した抗体が結合できる条件であればよく、通常、０から４５℃の温度下での接触であり、好ましくは４から３７℃の温度下であり、より好ましくは２５℃から３７℃の温度下での接触である。また、接触させる時間としても特に制限はなく、オリゴペプチド結合担体の種類、試料中の抗体の濃度等により、適宜調整され得るが、通常５分から６時間であり、好ましくは１０分から２時間、より好ましくは２０分から１時間である。
【００２８】
また、この接触後、オリゴペプチドに結合できなかった抗体等を除去するため、本発明の方法においては洗浄工程を設けてもよい。その洗浄に用いられる洗浄液としては、オリゴペプチドと変性した抗体との結合を阻害せず、担体等に非特異的に吸着した抗体を洗浄できるものであればよく、例えば、緩衝液（ｐＨ６から８）、より具体的には、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液が挙げられる。また、これらの緩衝液においては、塩類、界面活性化剤、タンパク質、糖、アミノ酸などの双性イオン化合物等を適宜含有していてもよい。また、市販の免疫反応用試薬キットに含まれる洗浄液（例えば、Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ洗浄液、東ソー製）も好適に用いられる。
【００２９】
次に、上記接触を経て形成された複合体と、被検抗体を認識する抗体に標識物質が結合している標識抗体とを接触させることにより、オリゴペプチド結合担体と変性した抗体と標識抗体とからなる複合体を形成させる。
【００３０】
この工程において用いられる被検抗体を認識する抗体としては、当該抗体を認識し得る抗体であればよく、アイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ等）、形態（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディー）について特に制限はない。
【００３１】
本発明で用いる被検抗体を認識する抗体に直接又は間接に結合する標識物質は、抗原抗体反応を利用した測定の分野で通常用いられる物質の中から適宜選択すればよく、一例として、フルオレセイン等の蛍光物質や、アルカリホスファターゼ等の酵素、放射性物質があげられる。
【００３２】
また、被検抗体を認識する抗体と標識物質との結合は、後述の当該物質の検出における簡便さから、通常リンカー（例えば、ＮＨＳエステル、マレイミド）等を介した架橋反応により行われるが、標識物質を結合させた二次抗体を用いて行うこともできる。ここで、二次抗体とは、被検抗体を認識する抗体に特異的な結合性を示す抗体である。そして、この特異的な結合性を利用することにより、当該二次抗体を介し、被検抗体を認識する抗体に標識物質を間接的に結合させることができる。また、この標識物質が結合された二次抗体を用いる場合には、オリゴペプチド結合担体及び変性した抗体と複合体を形成した後に、当該二次抗体を介して被検抗体を認識する抗体に標識物質を結合させてもよい。
【００３３】
また、この方法において、オリゴペプチド結合担体及び変性した抗体からなる複合体と、前述の標識抗体とを接触させる際の条件としては、これらが結合できる条件であればよく、通常、０から４０℃の温度下での接触であり、好ましくは４から３７℃の温度下であり、より好ましくは２５から３７℃の温度下での接触である。また、接触させる時間としても特に制限はなく、前記複合体及び標識抗体の濃度等により、適宜調整され得るが、通常５分から６時間であり、好ましくは１０分から２時間、より好ましくは２０分から１時間である。さらに、この接触後においても、前記複合体に結合できなかった標識抗体等を除去するため、洗浄工程を設けてもよく、その工程においても上述の洗浄液が好適に用いられる。
【００３４】
次に、本発明の方法においては、上記接触を経て形成された複合体中の標識物質を検出することにより、試料中の変性した抗体の量を測定する。
【００３５】
本発明において標識物質の検出とは、標識物質に由来した信号の検出を意味し、その検出は、当該技術分野の公知の方法にしたがって行なうことができる。例えば、標識物質として蛍光物質を用いる場合には、それが発する蛍光をプレートリーダー等を用いて検出及び定量することができる。また、標識物質として酵素を用いる場合には、当該酵素の作用によって分解して発色、発光等する基質を添加することにより、その発色、発光等をプレートリーダー等を用いて検出及び定量することができる。また、標識物質として放射性物質を用いる場合には、当該物質の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により検出及び定量することができる。
【００３６】
本発明においては、後述の実施例に示す通り、このようにして検出される標識物質に由来した信号の強度（吸光度、蛍光強度等）と、試料中の変性した抗体の量とは、高い相関性を示す。そのため、濃度既知の変性した抗体を含む標準試料を用いて本発明の方法を実施し、被検抗体を含む試料を用いて得られる測定値との間の相関データを取得し、当該相関データに基づき当該被検試料に存在する変性した抗体の量を測定（定量）することができる。なお相関データとは、例えば検量線である。
【００３７】
上述の通り、本発明で用いる変性抗体測定法では、試料中の変性した抗体の量に基づき、前記標識物質に由来した信号（発光、蛍光等）が変化する。したがって、当該信号に基づき、抗体の凝集体形成を予測できる。前述した方法で測定した変性抗体の量に基づき予測する方法に特に制限はなく、例えば、前記工程（２）において変性した抗体が有意に検出されなければ、試料中の抗体の安定性は極めて高いと評価でき、凝集体は形成しないと予測できる。また、被検抗体を含む試料を用いて得られる測定値を、それと同濃度の変性した抗体のみを含む試料を用いて同様に測定して得られた測定値と比較して、通常３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下（例えば、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下）であれば、試料中の抗体は安定性が高いと評価でき、凝集体は形成しないと予測できる。また、後述の実施例に示す通り、ストレス（加熱）を与える前と比較して、ストレスを与えた後の測定値が有意に変わらなければ、試料中の抗体のストレスに対する安定性は極めて高く凝集体は形成しないと予測できる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例に基づき、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１）  変性ヒト抗体測定（その１）
（１）本実施例においては、ヒト抗体として抗ＣＤ２０抗体を用いた。そして、１０ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ２０抗体溶液をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１ｍｇ／ｍＬに希釈したものを１００ｍＭ  グリシン緩衝液（ｐＨ２．０）で一晩透析することで、変性したヒト抗体を含む溶液（以下、「変性ヒト抗体溶液」とも称する）を調製した。
【００４０】
（２）（１）で調製した変性ヒト抗体溶液と、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、２Ａ１と表記）との反応性を、以下に示すＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。なお、２Ａ１は、有機合成化学の手法により調製した。
（２−１）４％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドを９６穴マイクロプレート（ＰｏｌｙＳｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に３００μＬ／ｗｅｌｌで塗布し、３７℃で２時間放置後、２Ａ１を２μｇ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２時間放置することで、前記ポリペプチドを前記ウェルへ固定化した。
（２−２）１％（ｗ／ｖ）コラーゲンペプチド（魚鱗又は魚皮由来のコラーゲン又はゼラチンの加水分解産物、重量平均分子量：３０００から５０００のコラーゲンペプチド、製品名：イクオスＨＤＬ、新田ゼラチン製）を含む炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を３００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２時間放置することで、ブロッキング処理を行なった。
【００４１】
（２−３）洗浄緩衝液Ａ（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、（１）で調製した変性ヒト抗体溶液を各ウェルに添加し、２５℃で１時間反応させた。
（２−４）反応終了後、洗浄緩衝液Ａで洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ−Ｔｗｅｅｎ  ２０）で１０ｎｇ／ｍＬに希釈したアルカリ性ホスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（ジャクソンイムノリサーチ製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（２−５）２５℃で１時間反応させ、洗浄緩衝液Ａで洗浄後、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、２５℃で３０分反応させた。
（２−６）ＡＰＳｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加して発色反応を止めた後、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ製）で５９５ｎｍの吸光度を測定した。
【００４２】
（３）比較対象として（１）の操作を行なわない未変性のヒト抗体溶液について、（２）と同様な方法のＥＬＩＳＡ法で測定した。種々の濃度の変性／未変性ヒト抗体溶液を添加したときの吸光度（５９５ｎｍ）測定結果を図１に示す。図中、白三角は未変性ヒト抗体溶液の結果であり、黒丸が変性ヒト抗体溶液の結果である。溶液中に含まれる変性ヒト抗体の濃度が上昇すると、吸光度も上昇していることから、本実施例の方法により、溶液中に含まれる変性ヒト抗体の濃度に基づく測定ができることがわかる。また未変性ヒト抗体溶液を測定した結果、濃度に関係なくほぼ一定の吸光度を示したことから、本実施例の方法は変性ヒト抗体を特異的に測定できることがわかる。
【００４３】
（実施例２）  ブロッキング剤の検討
実施例１（２−１）のプレートとして、２Ａ１を固定化したプレート又は２Ａ１を固定化しないプレートを、実施例１（２−２）のブロッキング処理で用いるブロッキング剤として、２％（ｗ／ｖ）スキムミルク（製品名：Ｓｋｉｍ  Ｍｉｌｋ、Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、１００ｍＭエタノールアミン（製品名：２−エタノールアミン、和光純薬工業株式会社製）又は０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、製品名：Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を、それぞれ用いた他は、実施例１と同様な方法で種々の濃度の変性ヒト抗体溶液を測定した。
【００４４】
結果を図２から図５に示す。これら図面において、黒棒は２Ａ１をウェルに固定化したときの、白棒は２Ａ１をウェルに固定化しなかったときの、それぞれの結果を示す。コラーゲンペプチドをブロッキング剤として用いたときは、プレートへの２Ａ１の固定化により吸光度が有意に上昇し、かつ変性ヒト抗体の濃度により吸光度が変化した（図２）。一方、スキムミルク、エタノールアミン、ＢＳＡをブロッキング剤として用いたときは、２Ａ１の固定化による吸光度の有意な上昇は確認できなかった（図３から図５）。このことから、２Ａ１を結合した担体を調製する際、用いるブロッキング剤としては、コラーゲンペプチドが好ましいことがわかる。
【００４５】
（実施例３）  固相の検討（その１）
実施例１（２−１）のプレートとして、２Ａ１を固定化しない、ＰｏｌｙＳｏｒｐプレート、ＭｅｄｉＳｏｒｐプレート、ＭａｘｉＳｏｒｐプレート、及びＭｕｌｔｉＳｏｒｐプレート（いずれもＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いた他は、実施例１と同様な方法で種々の濃度の変性ヒト抗体溶液を測定し、プレートへの抗体の非特異吸着について分析した。得られた結果を図６に示す。図中、黒ひし形がＰｏｌｙＳｏｒｐプレートを、白四角がＭｅｄｉＳｏｒｐプレートを、白三角がＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、黒丸がＭｕｌｔｉＳｏｒｐプレートを、それぞれ用いたときの結果を示す。なお各プレートの疎水性は、高いものから低いものに向かって、ＰｏｌｙＳｏｒｐ、ＭｅｄｉＳｏｒｐ、ＭａｘｉＳｏｒｐ、ＭｕｌｔｉＳｏｒｐの順である。
【００４６】
（実施例４）  固相の検討（その２）
実施例１（２−２）のブロッキング処理を行なわなかった他は、実施例３と同様な方法で種々の濃度の変性ヒト抗体溶液を測定し、プレートへの抗体の非特異吸着について分析した。得られた結果を図７に示す。図中、黒ひし形がＰｏｌｙＳｏｒｐプレートを、白四角がＭｅｄｉＳｏｒｐプレートを、白三角がＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、黒丸がＭｕｌｔｉＳｏｒｐプレートを、それぞれ用いたときの結果を示す。
【００４７】
図７に示した結果から明らかな通り、プレートの疎水性が高いほど（高いものから低いものに向かって、ＰｏｌｙＳｏｒｐ、ＭｅｄｉＳｏｒｐ、ＭａｘｉＳｏｒｐ、ＭｕｌｔｉＳｏｒｐの順である）、変性ヒト抗体溶液を添加したときの吸光度の上昇が抑えられていることがわかる。このことから、２Ａ１を結合する担体としてプレートを用いる場合、非特異吸着の低い、疎水性の高いプレートが好ましいことがわかる。また、図６に示した結果から明らかな通り、コラーゲンペプチドでブロッキング処理することで、ブロッキング処理を行なわないとき（図７）と比較し、変性ヒト抗体溶液を添加したときの吸光度の上昇がさらに抑えられていることがわかる。特に疎水性の高いプレートであるＰｏｌｙＳｏｒｐプレートを用いたときは、変性ヒト抗体濃度が高い溶液（１０μｇ／ｍＬ）を添加しても吸光度の上昇を十分に抑制されていることも明らかになった。
【００４８】
（実施例５）  変性ヒト抗体測定（その２）
（１）実施例１（１）の変性ヒト抗体溶液の調製を下記（ａ）から（ｅ）のいずれかの条件で処理して調製した他は、実施例１と同様な方法で変性ヒト抗体溶液を測定した。
（ａ）酸処理／アルカリ処理
１０ｍｇ／ｍＬのヒトモノクローナル抗体溶液をグリシン緩衝液（ｐＨ２、ｐＨ３）、クエン酸緩衝液（ｐＨ４、ｐＨ５）、リン酸緩衝液（ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ７．４）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）又は炭酸緩衝液（ｐＨ１０）で希釈して調製した０．５ｍｇ／ｍＬのヒトモノクローナル抗体溶液１００μＬを３７℃で一晩放置することで処理した。
（ｂ）加熱処理
０．５ｍｇ／ｍＬのヒトモノクローナル抗体溶液１００μＬを４℃、２５℃、３７℃又は５０℃で一晩放置することで処理した。
（ｃ）凍結融解処理
０．５ｍｇ／ｍＬのヒトモノクローナル抗体溶液１００μＬを凍結（凍結温度：−３０℃又は液体窒素（−１９６℃））し３７℃で融解させる操作を１０回行なうことで処理した。
（ｄ）撹拌処理、スターラー
０．５ｍｇ／ｍＬのヒトモノクローナル抗体溶液６００μＬをスターラーを用い２５℃で一晩撹拌することで処理した。
（ｅ）撹拌処理、振とう器
０．５ｍｇ／ｍＬのヒトモノクローナル抗体溶液３００μＬを振とう器を用い２５℃で一晩振とうすることで処理した。
【００４９】
（２）比較対象として、（１）で調製した変性ヒト抗体溶液を市販のタンパク質物性解析装置（Ｏｐｔｉｍ２、Ａｖａｃｔａ製）に供し、変性開始温度を測定した。結果を図８〜１１に示す。なお本発明で用いた変性ヒト抗体測定法での測定結果（図８及び図１０）は、吸光度が低い（すなわち変性ヒト抗体量が低い）ほどタンパク質（抗体）の安定性が高いことを示す。一方、市販の装置（Ｏｐｔｉｍ２）での測定結果（図９及び図１１）は、変性開始温度が高いほどタンパク質（抗体）の安定性が高いことを示す。
【００５０】
ヒト抗体を酸処理又はアルカリ処理した場合（図８及び９）、本発明で用いた変性ヒト抗体測定方法と市販の装置を用いた方法、ともに前記処理によりヒト抗体の安定性が低下している。このことから、本発明で用いる変性ヒト抗体測定法と市販の装置を用いた方法との間に相関性があることがわかる。一方、ヒト抗体を加熱処理、凍結融解処理、又は撹拌処理した場合、市販の装置を用いた方法では変性開始温度の変化がほとんどなかった（図１１）が、本発明で用いる変性ヒト抗体測定法では５０℃での加熱、凍結融解（−３０℃）、凍結融解（液体窒素）、及びスターラーでの撹拌により変性ヒト抗体量が有意に上昇（すなわちヒト抗体の安定性が低下）した（図１０）。このことから、本発明で用いる変性ヒト抗体測定法は、市販の装置による変性開始温度測定法と比較し、変性ヒト抗体量（すなわちヒト抗体の安定性低下）をより精度高く測定することができることが明らかになった。
【００５１】
（実施例６）  本発明の方法を用いた抗体凝集体形成の予測
（１）実施例１（１）の変性ヒト抗体溶液の調製を、０．５ｍｇ／ｍＬのヒトモノクローナル抗体溶液２０００μＬを４℃又は５０℃で一晩放置することで処理して調製した他は、実施例１と同様な方法で変性ヒト抗体溶液を測定した。
（２）比較対象として、（１）と同様にして、但し処理時間を１〜２５日として調製した変性ヒト抗体溶液を市販の細胞計数装置（コールターカウンターＺシリーズ、ベックマン・コールター製）に供し、抗体凝集体に相当する３μｍから１０μｍの粒子数を処理時間１日から２５日まで継時的に測定した。
（３）さらに比較対象として、（１）と同様にして、但し処理時間を１〜２１日として調製した変性ヒト抗体溶液を市販のバイオ医薬品凝集性評価システム（Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  Ｓｉｚｅｒ、島津製作所製）に供し、抗体凝集体に相当する０．０４μｍから２０μｍの粒子濃度を処理時間１日から２１日まで継時的に測定した。
【００５２】
結果を図１２〜１４に示す。図１２は本発明の方法を用いて、処理抗体を測定した結果である。図１３は市販の細胞計数装置を用いて、処理抗体を測定した結果である。図１４は市販のバイオ医薬品凝集性評価システムを用いて、処理抗体を測定した結果である。本発明の方法では処理を１晩行なった段階で４℃と５０℃で測定値に差が見られ、変性ヒト抗体を確認することができ、その結果、凝集体の形成を予測することができた（図１２）。一方、市販の細胞計測装置及びバイオ医薬品凝集性評価システムで４℃と５０℃で測定値に差が見られたのは処理１０日以降であった（図１３及び図１４）。このことから、本発明の方法は従来の装置を用いた方法と比較し、迅速に凝集体の形成を予測できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
以上説明したように、本発明によれば、ストレス（例えば、酸、アルカリ、加熱、凍結融解、撹拌）等により変性を受けた抗体による凝集体形成を迅速・簡便に予測することできる。また本発明の方法によれば、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥヘルスケア製）等の高価な専用装置を必要とせず、比較的に安価に変性した抗体の凝集体形成予測ができる。したがって、本発明は、ヒト抗体を含む医薬品の品質管理等において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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