(57)【要約】【課題】食塩を含む飲食品の本来の風味を損なうことなく十分な塩味の飲食品に付与することができる塩味増強用の調味料を提供すること。【解決手段】飲食品の減塩処理に好適に利用できる塩味増強用の調味料の有効成分としてドコサヘキサエン酸及びコレステロール化合物の組合せを用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドコサヘキサエン酸とコレステロール化合物を有効成分として含むことを特徴とする塩味増強用調味料。
【請求項２】
ドコサヘキサエン酸とコレステロール化合物を含む水産物エキスを有効成分として含む請求項１に記載の塩味増強用調味料。
【請求項３】
水産物エキスのドコサヘキサエン酸とコレステロール化合物を含む脂溶性抽出物または脂溶性画分を有効成分として含む請求項１に記載の塩味増強用調味料。
【請求項４】
前記水産物がアサリである請求項２または３に記載の塩味増強用調味料。
【請求項５】
ドコサヘキサエン酸とコレステロール化合物の配合比（ドコサヘキサエン酸：コレステロール、質量基準）が１：１〜１：１０の範囲にある請求項１乃至４のいずれか１項に記載の塩味増強用調味料。
【請求項６】
旨味増強効果を更に有する請求項１乃至５のいずれかに記載の塩味増強用調味料。
【請求項７】
トリガラスープを用いた飲食品用である請求項６に記載の塩味増強用調味料。
【請求項８】
塩味増強用の有効成分を含む塩味増強用調味料の製造における、ドコサヘキサエン酸とコレステロール化合物の前記有効成分としての使用方法。
【請求項９】
水産物エキスのドコサヘキサエン酸とコレステロール化合物を含む脂溶性抽出物または脂溶性画分を有効成分として含む請求項９に記載の使用方法。
【請求項１０】
前記水産物がアサリである請求項９に記載の使用方法。
【請求項１１】
ドコサヘキサエン酸とコレステロール化合物の配合比（ドコサヘキサエン酸：コレステロール、質量基準）が１：１〜１：１０の範囲にある請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項１２】
旨味増強効果を更に有する請求項８乃至１１のいずれかに記載の使用方法。
【請求項１３】
トリガラスープを用いた飲食品用である請求項１２に記載の使用方法。
【請求項１４】
食塩を含む飲食品の製造にける該飲食品の減塩のための塩味増強用調味料の使用方法であって。
前記塩味増強用調味料が、請求項１乃至６のいずれかに１項に記載の塩味増強用調味料であることを特徴とする、
前記塩味増強用調味料の前記飲食品の減塩のための使用方法。
【請求項１５】
前記飲食品が、トリガラスープを用いて製造され、前記塩味増強用調味料がうま味増強効果を有する請求項１４に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚介類エキスからの成分を有効成分として含む塩味増強用調味料及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
食塩の過剰摂取は高血圧症の原因となり、更に、不整脈や心疾患、並びに肝臓疾患の原因となる得るものと考えられている。
そこで、食塩の過剰摂取を防ぐために、飲食品中の食塩含有量を低くする減塩が行われている。しかしながら、減塩による塩味の低下は、飲食品の本来の風味を損なう場合があり、飲食品に含まれる食塩の一部を代替して、減塩による塩味の低下を抑えるための種々の塩味増強剤が提案されている。
塩味増強法は塩化カリウムを食塩の代替として使用する方法が一般的であったが、塩化カリウムには苦味があり、また摂取量によっては高カリウム血症のおそれがある。そこで、食塩の代替として塩化カリウムを用いない種々の塩味増強剤が提案されている。
特許文献１には、減塩用としても利用できる長鎖高度不飽和脂肪酸及び／又はそのエステル体並びにステロール及び／又はステロールエステルから成る飲食品の呈味向上剤が開示されている。特許文献１には、長鎖高度不飽和脂肪酸としてドコサヘキサエン酸が、コレステロール類似体であるステロールとして、β−シトステロール、β−シトスタノール等の植物ステロール及び植物スタノールが例示されている。
特許文献２には、セスキテルペン及び炭素数１６〜１８の飽和又は不飽和の高級脂肪酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の柑橘系精油成分を含む、菓子類の塩味増強剤が開示されている。
特許文献３には、カレーリーフ及び／又はカレーリーフのオレオレジンの親水性溶媒抽出物を含有することを特徴とする塩味増強剤が開示されている。特許文献３には、かかる親水性溶媒抽出物が、リノール酸、オレイン酸及びパルミチン酸のいずれか一種以上の脂肪酸を含むことが開示されている。
特許文献４には、特定分子構造のジグリセライドの単独または２以上の混合物を含有する塩味増強剤または塩味様呈味改善剤が開示されている。
特許文献５には、細胞壁の少なくとも一部が破壊されており１４０メッシュ（１４０ｍｅｓｈ；ＵＳＡ）を通過するユリ科野菜の植物組織の微粉砕物と、メイラード反応生成物および含硫化合物類を含む風味成分と、を含有する塩味増強剤が開示されている。特許文献５には、植物組織の微粉砕物が、破壊された細胞壁から外部へ露出または流出した状態で存在するコレステロールやβ−シトステロール等のステロール類を含むことが記載されている。更に、特許文献５には、塩味増強効果を発揮する風味成分がタマネギなどのユリ科植物由来の含硫化合物類および加熱調理時に生じるメイラード反応生成物であり、これらの風味成分がステロール類に吸着保持される点についての開示がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１０／００４７８４号
【特許文献２】特開２０１５−８４６７５号公報
【特許文献３】特開２０１５−２７２７４号公報
【特許文献４】特開２０１４−２００２０９号公報
【特許文献５】国際公開第２０１３／１０３０３１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
食塩の代替品としての塩味増強剤は、飲食品中の食塩含有量の低減に効果的であるが、飲食品の有する本来の風味を損なう場合があった。更に、減塩飲食品に対しても、本来の風味を維持していることが求められるようになってきている。
本発明の目的は、食塩を含む飲食品の本来の風味を損なうことなく十分な塩味の飲食品に付与することができる塩味増強用の調味料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明にかかる塩味増強用調味料は、ドコサヘキサエン酸とコレステロール化合物を有効成分として含むことを特徴とする。
本発明にかかるドコサヘキサエン酸とコレステロール化合物の塩味増強用調味料の製造における使用方法は、ドコサヘキサエン酸とコレステロール化合物を塩味増強用調味料の有効成分として使用することを特徴とする。
本発明にかかる塩味を有する飲食品の製造にける該飲食品の減塩のための塩味増強用調味料の使用方法は、塩味増強用調味料が上記の塩味増強用調味料であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、塩味増強用の有効成分としてドコサヘキサエン酸とコレステロール化合物の組合せを用いることによって、食塩を含む飲食品の本来の風味を損なうことなく十分な塩味を飲食品に付与することを可能とする塩味増強用の調味料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】アサリエキスの精製スキームを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明者らは、飲食品の風味を損なうことなく十分な塩味を確保できる減塩効果を得ることができる塩味増強用の成分として利用可能な物質について鋭意検討した結果、アサリエキスの脂溶性成分に飲食品の風味を損なうことなく塩味増強効果を有する成分が含まれ、更に、この脂溶性成分に、飲食品の塩味に加えて旨味の増強作用も合わせ持つ成分としてドコサヘキサエン酸とコレステロール化合物の組合せが含まれるとの新たな知見を得た。
本発明は、上述した本発明者らの新たな知見に基づいて完成されたものである。すなわち、本発明者らがアサリエキスに塩味増強効果があることに着目したことによって、ドコサヘキサエン酸とコレステロール化合物の組合せによる塩味増強効果が初めて明らかとされ、これらの成分の組合せの塩味増強用の有効成分としての用途が確立され、本発明が完成された。
特許文献５には、ユリ科野菜の植物組織の粉砕物に、破壊された植物細胞の細胞壁から外部へ露出または流出したステロール類が含まれ、このステロール類が、塩味増強の有効成分としてのメイラード反応性生物や含硫化合物類の吸着や放出作用に寄与する点についての記載がある。しかしながら、特許文献５においては、ユリ科野菜の植物組織の粉砕物に含まれるステロール類の含有量についての開示はまったくない。従って、特許文献５はステロール類が塩味増強効果を発揮する有効成分として利用可能である点についてなんら開示も示唆もしていないことは明らかである。
【０００９】
本発明にかかる塩味増強用の調味料は、ドコサヘキサンエン酸（以下「ＤＨＡ」と略称する）とコレステロール化合物の組合せを塩味増強用の有効成分として含む。従って、ＤＨＡとコレステロール化合物は、塩味増強用の調味料の製造における塩味増強用の有効成分として使用することができる。
更に、本発明にかかる塩味増強用の調味料は、食塩を含む飲食品の製造における塩味増強用の成分として使用することができる。
塩味増強用の有効成分としてＤＨＡとコレステロール化合物の組合せにより飲食品に含まれる食塩の一部を代替することによって、飲食品の風味を損なうことなく十分な塩味を確保して飲食品の減塩を行うことが可能となる。
更に、本発明にかかるＤＨＡとコレステロール化合物の組合せによれば、減塩における十分な塩味の確保とともに、食塩を含む飲食品の風味、特に旨味を増強することも可能となる。
本発明にかかる塩味増強用の調味料は、ＤＨＡとコレステロール化合物を組み合わせて製造することができる。
コレステロール化合物は、動物性ステロールの一種であり、コレステロール化合物には、天然または合成コレステロール、天然または合成コレステロール誘導体及びコレステロール類縁体が含まれる。コレステロール誘導体としては、コレステロール骨格を有し、側鎖にオレフィン構造を有するコレステロール誘導体の少なくとも１種を好ましく用いることができる。この側鎖にオレフィン構造を有するコレステロール誘導体としては、後述する実施例１における画分Fr.2-C1-B中にＤＨＡとともに含まれるアサリエキス由来のコレステロール誘導体を挙げることができる。
本発明においては、ＤＨＡとの組み合わせによって目的とする塩味増強効果を発揮できるコレステロール化合物の少なくとも１種を、ＤＨＡと組み合わせて塩味増強用の調味料の有効成分として用いることができる。
コレステロール誘導体としては、後述する実施例１における画分Fr.2-C1-B中にＤＨＡとともに含まれるアサリエキス由来のコレステロール誘導体のように、塩味増強効果を有する水産物エキス、特に水産物エキスの脂溶性抽出物や脂溶性画分にＤＨＡとともに含まれるコレステロール誘導体を好適に利用することができる。コレステロール誘導体や類縁体が、ＤＨＡとの組み合わせにおいて目的とする塩味増強効果を発揮できるかどうかについては、後述する実施例における味覚センサでの評価により確認することができる。水産物エキス中にＤＨＡとともに見出されるコレステロール誘導体または類縁体から、味覚センサでの評価によってＤＨＡとの組み合わせにおいて塩味増強効果を発揮するものを選択して、本発明の塩味増強用の調味料の有効成分として用いることができる。
【００１０】
本発明にかかる塩味増強用の調味料のＤＨＡの含有量は０．５〜５０質量％の範囲から選択され、コレステロール化合物の含有量は０．１〜５質量％の範囲から選択されることが好ましい。
ＤＨＡとコレステロール化合物の配合比（ＤＨＡ：コレステロール化合物：質量基準）は、目的とする塩味増強効果を得ることができるように設定すればよく、特に限定されないが、１：１〜１：１０の範囲から選択することが好ましい。
更に、本発明に係る塩味増強用調味料中におけるＤＨＡとコレステロール化合物の合計量は、１０〜５００ｍｇ／ｇの範囲から選択されることが好ましい。
ＤＨＡ及びコレステロール化合物としては、種々の原料から公知の方法で製造されたものや市販されているものから、本発明において目的とする塩味増強効果が得られるものを選択して用いることができる。
【００１１】
一方、ＤＨＡとコレステロール化合物の組合せを含む成分として、これらの組合せを含む水産物エキスからの抽出物や各種画分を用いることができる。
水産物エキスを得るための水産物としては、ＤＨＡとコレステロール化合物を含むエキスを調製可能である水産物であればよい。例えば、後述の実施例１に記載の方法に従ってＤＨＡとコレステロール化合物を含むことを確認することによって、エキス調製用の水産物を選択することができる。
水産物エキスとしては、市販の水産物エキスあるいは公知の方法で調製された水産物エキスからＤＨＡ及びコレステロール化合物を含むエキスを選択して用いることもできる。
水産物エキスの水産物からの抽出方法は、本発明において目的とする水産物エキスを得ることができる方法であれば特に限定されない。例えば、水産物を必要に応じて裁断や粉砕等の加工方法により、抽出用材料に加工し、水または熱水で抽出し、減圧濃縮等により水差物エキスを得る濃縮方法が利用できる。
更に、水産物エキスからＤＨＡ及びコレステロール化合物を含む脂溶性成分を抽出あるいは分画して得られる抽出物や画分においては、ＤＨＡ及びコレステロール化合物の含有割合が高められており、かつ水溶性成分等の不要な成分が除かれているので、塩味増強用の有効成分として好ましく利用できる。
水産物エキスを調製するための水産物としては、ＤＨＡとコレステロール化合物とを含み、目的とする塩味増強効果を有するエキスを得ることができるものであれば特に限定されてない。このような水産物としては、カツオ、マグロ等などのサバ科回遊魚、カニなどの甲殻類、昆布などの海藻類等を挙げることができる。これらの中では、魚貝類、特にアサリ、シジミ、ホタテ等の貝類が好ましい。
水産物エキスにおけるＤＨＡの含有量は１〜３００ｐｐｍの範囲から選択することができ、またコレステロール化合物の含有量は０．５〜７０ｐｐｍの範囲から選択することができる。
水産物エキスとしては、ＤＨＡ及びコレステロール化合物をこれらの合計量で、１．５ｐｐｍ〜３７０ｐｐｍ、更には５〜３００ｐｐｍの範囲で含み、これらの比（ＤＨＡ：コレステロール化合物；質量基準）が１：１〜１：１０の範囲にある水産物エキスが好ましい。また、ＤＨＡとコレステロール化合物の合計の含有割合の下限は５ｐｐｍがより好ましく、その上限は３００ｐｐｍであることがより好ましい。
例えば、ＤＨＡ及びコレステロール化合物をこれらの合計量で、１０〜５００ｐｐｍの範囲で含み、これらの比（ＤＨＡ：コレステロール化合物；質量基準）が１：１〜１：１０の範囲にあるアサリエキスを、塩味増強用の有効成分として好ましく用いることができる。
更に、水産物エキスを原料として用いるＤＨＡ及びコレステロール化合物を含む脂溶性成分の調製には、脂溶性成分と水溶性成分が分離可能であり、ＤＨＡ及びコレステロール化合物を含む脂溶性成分からなる抽出物または画分が取得できる方法が利用できる。
水産物エキスからの脂溶性成分の抽出または分画用の方法としては、エタノールやクロロホルムなどの有機溶媒を用いた分配、もしくは超臨界二酸化炭素抽出法により脂溶性画分を抽出する方法、または、合成樹脂からなる吸着剤、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等を用いた精製方法もしくは蒸留等による濃縮方法等を挙げることができる。
水産物エキスからの脂溶性抽出物または画分としては、ＤＨＡ及びステロール化合物を含み、かつ呈味に影響を与える遊離アミノ酸や有機酸などの水溶性呈味成分を含まない脂溶性抽出物または画分が好ましい。
また、後述の実施例２の表３に示すように、ＤＨＡ及びコレステロール化合物に加えて、パルミチン酸及びＥＰＡを含む脂溶性画分は、塩味及び旨味増強に加えて適度な甘味を提供でき、塩味増強用の有効成分として好ましく利用できる。従って、水産物エキスの脂溶性画分を取得し、これらの成分の含有を確認することによって、この取得した脂溶性画分が本発明にかかる塩味増強用の調味料の有効成分として利用できることを確認することができる。
更に、ＤＨＡ及びコレステロール化合物に加えて、パルミチン酸及びＥＰＡを含み、パルミチン酸：ＥＰＡ：ＤＨＡの割合（質量比）が、２：１：２である脂溶性画分を塩味増強用の有効成分としてより好ましく利用できる。
脂溶性成分からなる抽出物または画分としては、ＤＨＡを０．５〜５０質量％の範囲で、コレステロール化合物を０．１〜５質量％の範囲で含む水産物エキスの脂溶性抽出物または脂溶性画分が好ましい。
更に、水産物エキスの脂溶性抽出物または脂溶性画分は、ＤＨＡ及びコレステロール化合物をこれらの合計量で、１〜５０質量％の範囲で含み、これらの比（ＤＨＡ：コレステロール化合物；質量基準）が１：１〜１：１０の範囲にある水産物エキスの脂溶性抽出物または脂溶性画分が好ましい。
例えば、ＤＨＡ及びコレステロール化合物をこれらの合計量で、１〜５０質量％の範囲で含み、これらの比（ＤＨＡ：コレステロール化合物；質量基準）が１：１〜１：１０の範囲にあるアサリエキスからの脂溶性成分からなる抽出物を、塩味増強用の有効成分として好ましく用いることができる。
【００１２】
本発明にかかる塩味増強用の調味料は、ＤＨＡとコレステロール化合物のみを用いて、あるいは、必要に応じて担体、希釈剤及び添加剤の少なくとも１種と、ＤＨＡとコレステロール化合物の組合せを用いて調製することができる。担体、希釈剤及び添加剤としては、ＤＨＡとコレステロール化合物の組合せによる塩味増強効果を損なわず、かつ、添加する飲食品の風味を損なわないものが選択される。
担体としては、例えば、澱粉、デキストリン、等の澱粉類、乳糖、トレハロース等の糖類、小麦粉等、食品用のバインダー等を挙げることができる。
希釈剤としては、例えば、水等を挙げることができる。
添加剤としては、例えば、エタノール、モノグリセライド等の界面活性剤等を挙げることができる。
担体、希釈剤及び添加剤のすくなくとも１種の塩味増強用の調味料への配合割合（質量基準）は、ＤＨＡとコレステロール化合物の有効成分としての配合割合（質量基準）が確保でき、かつ、これらを添加する目的が達成できる範囲から選択すればよく、特に限定されない。
本発明にかかる塩味増強用の調味料は、飲食品の本来の風味を損なうことなく減塩時の塩味を増強することができ、更に、飲食品の風味、特に旨味を増強することもできる。先に挙げた水産物エキスの脂溶性成分は、旨味の増強効果を得る上で好ましい成分である。
【００１３】
本発明の塩味増強用の調味料を適用可能な飲食品は、減塩の必要のある食塩を含む飲食品であれば特に制限されない。
このような飲食品としては、例えば、コンソメスープや鶏がらスープ等を挙げることができる。
更に、本発明にかかる塩味増強用の調味料の塩味及び旨味の両方を増強する効果は、トリガラスープを用いた飲食品に対してより一層顕著であり、本発明にかかる塩味増強用の調味料はトリガラスープを用いた飲食品における塩味増強用として特に好ましい。
トリガラスープを用いた飲食品としては、例えばラーメン、水餃子、中華スープ等の中華料理、中華風の飲食品、中華系加工食品等を挙げることができる。
【００１４】
本発明にかかる塩味増強用の調味料の飲食品への配合割合は、目的とする塩味増強効果、あるいは塩味及び旨味の両方の増強効果が得られるように設定することができ、特に限定されない。例えば、食塩濃度０．５〜１．５質量％の飲食品に対して、本願発明にかかる塩味増強用の調味料を、例えば、０．０５〜５．０ｐｐｍのＤＨＡ及びコレステロール化合物の組合せからなる有効成分の配合割合となるように添加することにより、十分な塩味増強効果あるいは塩味及び旨味の両方の増強効果を得ることができる。
【実施例】
【００１５】
以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明する。
（実施例１）
（アサリエキスの精製）
図１にアサリエキス（マルハニチロ（株）製）の精製スキームを示す。各分画処理において得られた各画分に「Fr.」で示す画分番号を付した。
各工程には以下の方法を用いた。
・エタノール沈殿処理
アサリエキス（２６００ｇ）をメカニカルスターラーでかき混ぜながら、エタノール（６．５Ｌ）を加えて、１０分間、室温でかき混ぜた。デカンテーションして得られた上清を減圧吸引濾過し、そのろ液を減圧濃縮により黄色のエタノール沈殿処理上清粉末（２８４ｇ、収率１０．９％）を得た。
・ＨＰ−２０カラム分離
エタノール沈殿処理上清部（２８４ｇ）に蒸留水（１４２０ｇ）加えて溶解し、それをＨＰ−２０カラム（三菱化学（株））（１ｋｇ、φ７５ｍｍ×３００ｍｍ）にアプライし、蒸留水（１０Ｌ）、５０容量％エタノール水（１０Ｌ）、１００％エタノール（１０Ｌ）を順に流し、それぞれで得られた画分Fr. 2-A（２６４ｇ、収率９２．９％）、画分Fr. 2-B（１７ｇ、収率６．３％）及び画分Fr. 2-C（０．９４ｇ、収率０．３％）を得た。
・固液分離
画分Fr. 2-Cは濃縮時に不溶の固形物が認められたため、ろ紙ろ過によりエタノールに可溶な褐色オイル状物質を分取し、画分Fr.2-C1（０．７９ｇ，収率８４％）として得た。
・順相シリカゲルカラム分離
画分Fr. 2-C1（１４７．３ｍｇ）をシリカゲルカラム（HI-FLASH COLUMN size：Ｌ、２６×１００ｍｍ、Silica gel  ４０μｍ、３０ｇ）にアプライし、ヘキサン-酢酸エチル＝５：１（１０ｍＬ／１ｆｒ．，ｆｒ．１−ｆｒ．４０）→ヘキサン-酢酸エチル＝１：１（１０ｍＬ／１ｆｒ．，ｆｒ．４１−９０）→エタノール（１５０ｍＬ）で溶離し、６画分（Ａ−Ｆ）に分画（表１）した。ＴＬＣは、Merck HPTLC Si60F254を用いて、ヨウ素呈色、リンモリブデン酸ナトリウム呈色液により、発色した。
【００１６】
【表１】
2018093732.tif 000002
【００１７】
上記の方法における固液分離後に得られた画分Fr. 2-C1、2-C1-A〜2-C1-Fについて、味覚センサ（ＡＩＳＳＹ社製）による分析を行った。
なお、コントロールとしては、市販の鶏がらスープの素（味の素（株））（１０ｇ）をMilli-Q水（６００ｍＬ）に溶解させた溶液を用いた。
評価項目は、甘味、塩味、酸味、苦味、旨味の５項とした。
なお、トリガラスープのように、脂質を多く含んだサンプルを連続的に測定する場合、先のサンプルでの測定が、次のサンプルの測定に影響を与える場合がある。そこで、先のサンプルの測定終了、味覚センサのサンプルとの接触部分を洗浄し、次に、食塩濃度を０．６質量％に調製した食塩水を測定して、０．６質量％食塩濃度に相当する塩味応答があり、かつその他の４味は無応答である場合を測定のエンドポイントとし、次のサンプルの測定に使用した。検討の結果、洗浄液と味覚センサとの接触状態を５分間維持した後、洗浄液を流し出すことで、味覚センサの測定値が初期値の復元することを確認した。
味覚センサによる評価は以下の通りある。
＜評価＞
上記で得られた各画分を、これらの収率に合わせてスープに添加して評価した。添加する画分については、エタノールに溶解してメンブレンフィルター(DISMIC13 PTFE、０．４５μｍ）でろ過をし、その後、エタノールを加えて共沸操作を３回して、減圧乾固した。添加時は、添加濃度に合わせてエタノールに再溶解した。
鶏がらスープの素（味の素製、１０ｇ）を常温のMilli-Q水（６００ｍＬ）に溶解し、基本のスープを作成した。それを１００ｍＬずつ６つに分けて、味覚センサ（ＡＩＳＳＹ社製）による分析を行った。味覚センサによる分析結果を表２に示す。
【００１８】
【表２】
2018093732.tif 000003
【００１９】
表２に示す通り、味覚センサでは画分Fr. 2-C1-Bが、塩味及び旨味の増強効果を示した。味覚センサにおける測定値において、ポイントが０．２以上ある場合には、統計的にサンプル間に有意差があるとされている。
従って、表１に示す結果から、脂溶性画分に塩味増強効果を有していることが想定された。
【００２０】
（実施例２）
実施例１の結果に基づいて、順相シリカゲルカラム分離前の画分Fr. 2-C1について、コレステロール誘導体の同定、定量ならびに脂肪酸組成の定量を以下の方法により行った。
（１）コレステロール誘導体の同定及び定量
検体（６ｍｇ）に内部標準（５−α−cholesterolヘキサン溶液：１．０４８ｍｇ／ｍＬ）（０．２５ｍＬ）と２Ｍ水酸化カリウム−エタノール溶液（０．５ｍＬ）を加え、８０℃、３０分間加熱し、けん化した。それに、石油エーテル（２ｍＬ）と水（１ｍＬ）を加えて分配操作をし、水層部分を石油エーテル（２ｍＬ×２）で抽出した。有機層部分を合わせて水洗（２ｍＬ×３）し、窒素気流下で濃縮した。濃縮したサンプルをヘキサン（１ｍＬ）で溶解し、ガスクロマトグラフ（カラム：５％−ＳＥ−３０、注入口および検出器３００℃、注入量：５μＬ）で定量した。
また、GC-MS等の常法による分析の結果、コレステロール誘導体として、以下の２種の化合物が含まれていることが確認された。
【００２１】
【化１】
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【００２２】
【化２】
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【００２３】
（２）脂肪酸組成の測定
（２−１）前処理（メチルエステル化）
全長約１３ｃｍのねじ口試験管に試料（２００ｍｇ）と０．５Ｍ水酸化ナトリウムメタノール溶液（１．５ｍＬ）を加え、窒素置換した後、ブロックヒーターにより１００℃で９分間加熱した。放冷後、三フッ化ホウ素ナトリウム錯体・メタノール溶液（２ｍＬ）を加えてボルテックス攪拌３分後、蒸留水（３ｍＬ）を加えて３０秒手動攪拌を行った。静置後、上層（ヘキサン層）を取り、無水硫酸ナトリウムで乾燥したものを分析用の試料として用い、ガスクロマトグラフィー分析に供した。
（２−２）分析
脂肪酸組成分析には以下の装置を用いた。なお、各脂肪酸の含有量は総ピーク面積中の組成比（％）（質量基準）として算出した。
・分析条件
・分析機器：ガスクロマトグラフィー（Hewlett Packard社、HP6890series）
・カラム：DB-WAX（J&W社）
・オーブン：初期温度１７０℃、初期時間５分、昇温速度１７０〜２１０℃：１．５℃／分、２１０℃、１５分間
・フロント注入口：温度２５０℃、トータル流量：１１０ｍＬ／分、圧力１３０ｋＰａ
・検出器：FID、Air流量：４５０ｍＬ／分、He流量：４０ｍＬ／分、メークアップHe流量：４８．９ｍＬ／分
・サンプル注入量：１μＬ（ヘキサン溶液）
画分Fr. 2-C1のコレステロール誘導体及び多価不飽和脂肪酸の含量の定量結果を表３に示す。また、脂肪酸組成の分析結果を表４に示す。
【００２４】
【表３】
2018093732.tif 000006
【００２５】
【表４】
2018093732.tif 000007
【００２６】
表３に示す結果から、画分Fr. 2-C1には、１質量％のコレステロール誘導体、５質量％のＤＨＡ及び２質量％のＥＰＡが含まれていた。表４に示す脂肪酸組成から、脂肪酸の総量に対してＤＨＡ含量が最も高く（２３．３％）、ついでパルミチン酸（１９．７％）、ＥＰＡ（９．４％）の含有量が高かった。
【００２７】
（実施例３）
実施例２の分析結果から、画分Fr. 2-C1に含まれるＤＨＡ及びコレステロール誘導体は遊離の形をとっており、２点識別試験を用いた評価を行い、これらの化合物が呈味増強に寄与しているかどうかについて検討した。
（１）官能評価による検討
塩味増強と旨味増強効果を有する成分が画分Fr. 2-C1に含まれていることが実施例１の結果から明らかとなり、更に、この画分Fr. 2-C1にＤＨＡ及びコレステロール化合物が含まれていることが実施例２の結果から明らかとなった。そこで、これら化合物を単一成分として使用した際に呈味増強に関与しているかどうかを、二点識別試験を用いて判別した。
・サンプル調製法
・・コントロール
鶏がらスープの素（商品名：鶏がらスープの素、味の素株式会社）（５ｇ）に対し、ミリポア社の超純水製造装置Milli-Qにより製造した超純水（３００ｍＬ）を加え、コントロール調製用の鶏がらスープを得た。この鶏がらスープにエタノール（４８０μＬ）を加えてコントロールとして用いた。
・コレステロール添加サンプル
上記の鶏がらスープ（３００ｍＬ）に対し、コレステロール（和光純薬工業株式会社製）の１００ｐｐｍエタノール溶液（４８０μＬ）を添加してコレステロール添加サンプルを得た。
・ＤＨＡ添加サンプル
上記の鶏がらスープ（３００ｍＬ）に対し、ＤＨＡ（シグマアルドリッチ社製）の１００ｐｐｍエタノール溶液（４８０μＬ）を添加してＤＨＡ添加サンプルを得た。
なお、各サンプルは室温とし、各サンプルの容量は２０ｍＬに統一した。
・二点識別試験による官能評価
評価方法は以下の通りである。
パネラーに対して、コントロール、並びにコレステロール添加サンプル及びＤＨＡ添加サンプルをその内容について伏せて２種の試験サンプルとして提供し、普通に飲むように要請して、甘味、塩味及び旨味のそれぞれについて、コントロールと比較して試験サンプルの方が強く感じたか、あるいは変わらないかについて評価させた。
パネラーによる回答結果を表５−１および表５−２に示す。
【００２８】
【表５】
2018093732.tif 000008
【００２９】
以上の結果から、コレステロール添加サンプル及びＤＨＡ添加サンプルのいずれについてもコントロールに対して呈味増強に関する差は見られなかった。すなわち、この一連の結果からは、画分Fr. 2-C1に含まれる遊離ＤＨＡ及び遊離コレステロールはそれぞれ単独において塩味増強効果を見出すことはできなかった。
【００３０】
（実施例４）
実施例３の結果を受けて、図１で示す画分Fr. 2-C1について、実施例３と同様にして二点識別試験を実施し、塩味を含む呈味の増強効果を検証した。
・サンプル調製法
・・コントロール
鶏がらスープの素（商品名：鶏がらスープの素、味の素株式会社）（５ｇ）に対し、ミリポア社の超純水製造装置Milli-Qにより製造した超純水（３００ｍＬ）を加え、コントロール調製用の鶏がらスープを得た。この鶏がらスープにエタノール（２０μＬ）を加えてコントロールとして用いた。
・・画分Fr. 2-C1添加サンプル
上記の鶏がらスープ（３００ｍＬ）に対し、画分Fr. 2-C1の１質量％エタノール溶液（２０μＬ）を添加して画分Fr. 2-C1添加サンプルとした。
なお、各サンプルは室温とし、各サンプルの容量は２０ｍＬに統一した。
・二点識別試験による官能評価
評価方法は以下の通りである。
パネラーに対して、コントロールと、画分Fr. 2-C1添加サンプルをその内容について伏せて試験サンプルとして提供し、普通に飲むように要請して、甘味、塩味及び旨味のそれぞれについて、コントロールと比較して試験サンプルの方が強く感じたか、あるいは変わらないかについて評価させた。
得られた画分Fr. 2-C1の二点識別評価結果（ｎ＝２５）を表６に示す。
【００３１】
【表６】
2018093732.tif 000009
【００３２】
（実施例５）
画分Fr. 2-A、2-B、2-C及び2-C1について、以下の成分分析を行った。
＜遊離アミノ酸分析＞
画分Fr. 2-A（９．０ｍｇ）、Fr.2-C（６．０ｍｇ）及びFr.2-C1（４．４ｍｇ）をそれぞれ精秤した。
画分Fr. 2-Aには、０．０２Ｍ塩酸（１０００μＬ）を加え、得られた溶液（１００μＬに対し０．０２Ｍ塩酸（９００μＬ）を更に加え、希釈液を得た。こうして得られた希釈液（４００μＬ）を採取し、０．０２Ｍ塩酸（８００μＬ）を加え、およそ３００倍に希釈して、分析用希釈液を得た。
画分Fr. 2-Cには、０．０２Ｍ塩酸（６００μＬ）を加え、画分Fr. 2-C1には３質量％スルホサルチル酸（５００μＬ）を加えて、それぞれおよそ１００倍に希釈して、分析用希釈液を得た。
調製した各分析用希釈液に対して、フィルター濾過を行った。得られたろ液をアミノ酸分析用のサンプルとし、アミノ酸分析用バイアルに２００μＬずつ採取し、全自動アミノ酸分析器（JEOL社製、JLC-500/V2）に供し、遊離アミノ酸分析を行った。
【００３３】
＜構成アミノ酸分析＞
画分Fr. 2-A（２６．１ｍｇ）、2-B（２２．６ｍｇ）及び2-C（７．２ｍｇ）をそれぞれ精秤し、各試料をそれぞれ６Ｍ塩酸（５ｍＬ）とともに分解管へ洗いこんだ。１１０℃、２２時間加熱して、各試料を加水分解した。加水分解反応終了後、各反応液をそれぞれチューブへ移し、遠心エバポレーターに供し、試料を完全に濃縮乾固させた。得られた各固体をそれぞれ０，０２Ｍ塩酸（１０ｍＬ）でメスアップ（画分Fr. 2-Cのみ５ｍＬ）して分析用希釈液を得た。
画分Fr. 2-Aについては、メスアップした溶液（１００μＬ）を採取し、０．０２Ｍ塩酸（９００μＬ）を加えることで１０倍希釈を行い、次いで、こうして得られた１０倍希釈液（３００μＬ）を採取し、０．０２Ｍ塩酸（６００μＬ）を加えて更に希釈し、分析用希釈液を得た。
それぞれの分析用希釈液をフィルター濾過を行った。得られた各ろ液をアミノ酸分析用のサンプルとして用いた。得られた各分析用サンプルをアミノ酸分析用バイアルに２００μＬずつ採取し、全自動アミノ酸分析器（JEOL社製、JLC-500/V2）に供し、構成アミノ酸分析を行った。
【００３４】
＜有機酸分析＞
画分Fr. 2-A（５８ｍｇ）、2-B（４３ｍｇ）、2-C（６．０ｍｇ）及び2-C1（４．４ｍｇ）をそれぞれ精秤した。
褐色油状物質の４．４ｍｇを画分Fr. 2-C1の分析用試料として用いた。
一方、超純水を画分Fr. 2-A及びFr. 2-Bのそれぞれに対して１０００μＬ添加し、Fr. 2-C及びFr. 2-C1のそれぞれに対して５００μＬ添加した。得られた各希釈液のそれぞれに対してテルモ株式会社製１ｍＬシリンジとADVANTEC社製  DISMIC-13HP PTEFを用いてフィルター濾過を行い、有機酸分析用のサンプルを得た。
・分析条件
・測定機器：ベックマン  キャピラリー電気泳動装置（PA-800 Plus）
・キャピラリー：フーズドシリカキャピラリー（内径：７５ｍｍ×有効長５０ｃｍ）
・泳動液：アニオン分析キット（１０ｍＬの泳動液に３００ｍｇのデキストリンを加えた。）
・泳動電圧：−２５ｋＶ
・キャピラリー温度：２５℃
・検出波長：２５４ｎｍ
＜分析結果＞
遊離アミノ酸と構成アミノ酸、有機酸、ナトリウム含量の分析結果を表７にそれぞれ示す。
【００３５】
【表７】
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【００３６】
画分Fr. 2-AはHP-20の水溶出画分であるため、アミノ酸含量が高かったものと考えられた。画分Fr. 2-BはHP-20のエタノール５０％画分であるが、構成アミノ酸分析結果より、ほとんどがタンパク質であることが推定され、また、有機酸が全くふくまれていないことも明らかとなった。
画分Fr. 2-Cには遊離アミノ酸、有機酸ともに少量含まれている程度で、画分Fr. 2-C1も同様であった。
以上の結果から、各画分を以下のように特徴付けることができた。
・画分Fr. 2-A
遊離アミノ酸及び有機酸含量が多い画分
・画分Fr. 2-B
タンパク質あるいはペプチド含量が多い画分
・画分Fr. 2-C及び画分Fr. 2-C1
水溶性化合物がほとんど含まれていない脂溶性画分
また、原子吸光光度法によるナトリウム含量の分析の結果、画分Fr. 2-Aには多量のナトリウムが含まれているのに対し、画分Fr. 2-Bにはほとんどナトリウムが含まれていないことが明らかとなった。このことから、脂溶性画分としての画分Fr. 2-C及び画分Fr. 2-C1に、ナトリウムが多量に含まれている可能性は低く、官能評価により確認した画分Fr. 2-C1の塩味増強効果は、ＤＨＡとの組合せによるコレステロール誘導体のみの効果であることが示唆された。
【図１】
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