(57)【要約】【課題】  本発明は、微生物群を用いた中鎖脂肪酸、特にカプリル酸及びカプリン酸の製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、特定の微生物群を短鎖脂肪酸及び電子供与体を含む培地で嫌気培養する工程、並びに培養物から中鎖脂肪酸を回収する工程を含む、中鎖脂肪酸を製造する方法に関する。本発明の方法によれば、安価な材料、特に食品廃棄物を原料として中鎖脂肪酸、特にカプリン酸を製造することができ、中鎖脂肪酸の低コストでの安定供給が可能となる。【選択図】図１
2018093839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号６に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号７に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号８に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号９に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、及び
配列番号１１に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物
を含有する微生物群、又は
配列番号１に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号２に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号３に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号４に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号１０に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、及び
配列番号１２に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物のうちの少なくとも１の微生物をさらに含有する前記微生物群を短鎖脂肪酸及び電子供与体を含む培地で嫌気培養する工程、並びに培養物から中鎖脂肪酸を回収する工程を含む、中鎖脂肪酸を製造する方法。
【請求項２】
配列番号５に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）微生物、
配列番号６に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）微生物、
配列番号７に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）微生物、
配列番号８に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）微生物、
配列番号９に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するデスルホバクテリア科（Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）微生物、及び
配列番号１１に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するオシリバクター属（Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ）微生物を含有する微生物群、又は
配列番号１に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するアネアロバキュルム属（Ａｎａｅｒｏｂａｃｕｌｕｍ）微生物、
配列番号２に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）微生物、
配列番号３に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号４に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するバクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）微生物
配列番号１０に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）微生物、及び
配列番号１２に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するスフィンゴバクテリア目（Ｓｐｈｉｎｇｏｃｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）微生物のうちの少なくとも１の微生物をさらに含有する前記微生物群を短鎖脂肪酸及び電子供与体を含む培地で嫌気培養する工程、並びに培養物から中鎖脂肪酸を回収する工程を含む、中鎖脂肪酸を製造する方法。
【請求項３】
電子供与体がエタノールである、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
培地が食品廃棄物及び／又はその加工物を含有する培地である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
中鎖脂肪酸がカプリル酸及び／又はカプリン酸である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物群を用いた中鎖脂肪酸の方法に関し、特に電子供与体と短鎖脂肪酸を含む培地で前記微生物群を嫌気培養する工程を含む、中鎖脂肪酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
中鎖脂肪酸すなわち炭素数が６〜１２の直鎖状飽和モノカルボン酸は、バイオ燃料又はバイオプラスチック原料への利用の他に、アルツハイマー型認知症を含む神経変性性疾患の予防・改善への利用、さらには家畜の感染症予防への利用等が提唱されている、産業上の利用価値の高い物質である。
【０００３】
中鎖脂肪酸は、工業的にはパーム油からの精製によって製造されている。しかし、原料であるパーム油自体の製造が多段階の工程を必要とすることに加え、パーム油からの中鎖脂肪酸の精製に２５０℃以上の高温処理が必要とされる等、パーム油を原料とする製造は高コストという問題を有している。さらに、アブラヤシが生育する赤道付近の熱帯地方の気象条件によってパーム油の原料価格は大きく変動することがあり、特に日本ではパーム油はほぼ完全に輸入に頼らざるを得ないために為替変動による要因も加わる等、パーム油を原料とする製造は価格安定性においても問題を有する。そのため、近年、パーム油等の天然資源に依らず、より安価な原料から中鎖脂肪酸を製造する方法の研究開発が進められている。
【０００４】
例えば非特許文献１は、クロストリジウム  クルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）が優勢な微生物群を低グレードのバイオマス中で培養してカプロン酸（ヘキサン酸）及びカプリル酸（オクタン酸）を製造する方法を開示している。また非特許文献２は、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉを優勢に含む混合微生物を中空糸膜バイオフィルムリアクタ中で培養して、水素と二酸化炭素からカプロン酸及びカプリル酸を製造する方法を開示している。しかし、これらの製造方法の中鎖脂肪酸の生成量は必ずしも高いものではなく、また炭素数が１０個の中鎖脂肪酸であるカプリン酸（デカン酸）を製造するには至っていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｔｅｉｎｂｕｓｃｈ  ＫＪＪ  ｅｔ．ａｌ．，Ｅｎｅｒｇｙ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．，２０１０，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．２１６−２２４
【非特許文献２】Ｚｈａｎｇ  Ｆ．  ｅｔ．ａｌ．，Ｗａｔｅｒ  Ｒｅｓ．，２０１３，Ｖｏｌ．４７，ｐｐ．６１２２−６１２９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新たな微生物群を用いた中鎖脂肪酸、特にカプリル酸及び／又はカプリン酸の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、活性汚泥に対して嫌気条件下で集積培養を行うことで得られる微生物群が、酢酸及びエタノールからカプリル酸及び／又はカプリン酸を製造することができることを見いだし、下記の各発明を完成させた。
【０００８】
（１）配列番号５に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号６に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号７に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号８に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号９に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、及び
配列番号１１に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物
を含有する微生物群、又は
配列番号１に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号２に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号３に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号４に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号１０に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、及び
配列番号１２に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物のうちの少なくとも１の微生物をさらに含有する前記微生物群を短鎖脂肪酸及び電子供与体を含む培地で嫌気培養する工程、並びに培養物から中鎖脂肪酸を回収する工程を含む、中鎖脂肪酸を製造する方法。
（２）配列番号５に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）微生物、
配列番号６に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）微生物、
配列番号７に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）微生物、
配列番号８に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）微生物、
配列番号９に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するデスルホバクテリア科（Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）微生物、及び
配列番号１１に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するオシリバクター属（Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ）微生物を含有する微生物群、又は
配列番号１に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するアネアロバキュルム属（Ａｎａｅｒｏｂａｃｕｌｕｍ）微生物、
配列番号２に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）微生物、
配列番号３に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号４に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するバクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）微生物
配列番号１０に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）微生物、及び
配列番号１２に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するスフィンゴバクテリア目（Ｓｐｈｉｎｇｏｃｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）微生物のうちの少なくとも１の微生物をさらに含有する前記微生物群を短鎖脂肪酸及び電子供与体を含む培地で嫌気培養する工程、並びに培養物から中鎖脂肪酸を回収する工程を含む、中鎖脂肪酸を製造する方法。
（３）電子供与体がエタノールである、（１）又は（２）に記載の製造方法。
（４）培地が食品廃棄物及び／又はその加工物を含有する培地である、（１）〜（３）のいずれか一項に記載の製造方法。
（５）中鎖脂肪酸がカプリル酸及び／又はカプリン酸である、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、安価な原料から、特に食品廃棄物から中鎖脂肪酸、特にカプリン酸を製造することができ、中鎖脂肪酸の低コストでの安定供給が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】活性汚泥からの集積培養物に含まれる微生物群の１６Ｓ  ｒＤＮＡ増幅産物を、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、ＤＧＧＥ）により分離した後のゲルの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の第一の態様は、
配列番号５に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号６に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号７に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号８に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号９に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、及び
配列番号１１に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物
を含有する微生物群、又は
配列番号１に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号２に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号３に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号４に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号１０に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、及び
配列番号１２に示される塩基配列若しくはこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物のうちの少なくとも１の微生物をさらに含有する前記微生物群を短鎖脂肪酸及び電子供与体を含む培地で嫌気培養する工程、並びに培養物から中鎖脂肪酸を回収する工程を含む、中鎖脂肪酸を製造する方法に関する。
【００１２】
本発明の第１の態様において配列番号１〜１２に関して上記の通りに特定される微生物を微生物１〜１２と表すと、本発明の第１の態様は、微生物５〜９及び微生物１１を含有する微生物群を、又は微生物５〜９及び微生物１１に加えて微生物１〜４、微生物１０及び微生物１２の少なくとも１の微生物をさらに含有する微生物群を短鎖脂肪酸及び電子供与体を含む培地で嫌気培養する工程、並びに培養物から中鎖脂肪酸を回収する工程を含む、中鎖脂肪酸を製造する方法と表すことができる。
【００１３】
微生物１〜１２を含む微生物群は、下水を最終的に処理して公共用水域又は海域に放流するために設けられる終末処理場から採取される活性汚泥を微生物源とし、短鎖脂肪酸及び電子供与体、例えば酢酸及びエタノールを含有する培地を用いて嫌気的に培養するという集積培養を行うことで調製することが可能である。前記培地は、無機塩を主体としてペプトンや酵母エキス等の微生物の培養に一般的に用いられる培地成分を添加した合成培地であればよい。また、微生物１〜１２を含む微生物群は、配列番号１〜１２に示される各塩基配列をクエリーとし、微生物の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列が登録されているＤＮＡデータベース、例えばＤＤＢＪ、ＧｅｎＢａｎｋ等を対象としてＢＬＡＳＴ検索等の相同性検索を行うことで、各塩基配列と完全一致する塩基配列又は９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物を選択し、それらを混合することで調製することもできる。
【００１４】
本発明の第２の態様は、
配列番号５に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）微生物、
配列番号６に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）微生物、
配列番号７に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）微生物、
配列番号８に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）微生物、
配列番号９に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するデスルホバクテリア科（Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）微生物、及び
配列番号１１に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するオシリバクター属（Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ）微生物を含有する微生物群、又は
配列番号１に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するアネアロバキュルム属（Ａｎａｅｒｏｂａｃｕｌｕｍ）微生物、
配列番号２に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）微生物、
配列番号３に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物、
配列番号４に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するバクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）微生物
配列番号１０に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）微生物、及び
配列番号１２に示される塩基配列若しくはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するスフィンゴバクテリア目（Ｓｐｈｉｎｇｏｃｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）微生物のうちの少なくとも１の微生物をさらに含有する前記微生物群を短鎖脂肪酸及び電子供与体を含む培地で嫌気培養する工程、並びに培養物から中鎖脂肪酸を回収する工程を含む、中鎖脂肪酸を製造する方法に関する。
【００１５】
本発明の第２の態様において上記配列番号１〜１２に関して上記の通りに特定される微生物を微生物１’〜１２’と表すと、本発明の第２の態様は、微生物５’〜９’及び微生物１１’を含有する微生物群を、又は微生物５’〜９’及び微生物１１’に加えて微生物１’〜４’、微生物１０’及び微生物１２’の少なくとも１の微生物をさらに含有する微生物群を短鎖脂肪酸及び電子供与体を含む培地で嫌気培養する工程、並びに培養物から中鎖脂肪酸を回収する工程を含む、中鎖脂肪酸を製造する方法と表すことができる。
【００１６】
微生物１’〜１２’は、下水を最終的に処理して公共用水域又は海域に放流するために設けられる終末処理場から採取される活性汚泥を微生物源とし、短鎖脂肪酸及び電子供与体、例えば酢酸及びエタノールを含有する培地を用いて嫌気的に培養するという集積培養を行うことで調製することが可能である。前記培地は、無機塩を主体としてペプトンや酵母エキス等の微生物の培養に一般的に用いられる培地成分を添加した合成培地であればよい。また、微生物１’〜１２’を含む微生物群は、配列番号１〜１２に示される各塩基配列をクエリーとし、微生物の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列が登録されているＤＮＡデータベース、例えばＤＤＢＪ、ＧｅｎＢａｎｋ等を対象としてＢＬＡＳＴ検索等の相同性検索を行うことで、各塩基配列と完全一致する塩基配列又は９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する、目的の目、科又は属に分類される微生物を選択し、それらを混合することで調製することもできる。
【００１７】
配列番号５〜８に示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）微生物としては、配列番号５についてＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＦＲ８５００５７．１で登録されている１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するＣ．ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ、配列番号６についてＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＴ６２４６１２．１で登録されている１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するＣ．ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ  ＭＣＭ  Ｂ  ５５６株、配列番号７についてＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＲ０１８７４２．１で登録されている１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＬＺＬＪ００９、配列番号８についてＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＪＸ２６７０６５．１で登録されている１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．Ｅ０３４等を、それぞれ挙げることができる。
【００１８】
配列番号９に示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するデスルホバクテリア科（Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）微生物としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＦＪ５１６９８８．１で登録されている１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物を挙げることができる。
【００１９】
配列番号１１に示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するオシリバクター属（Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ）微生物としては、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＲ＿１１８１５６．１で登録されている１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するＯｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ  ＧＨ１株を挙げることができる。
【００２０】
配列番号１に示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するアネアロバキュルム属（Ａｎａｅｒｏｂａｃｕｌｕｍ）微生物としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＰ００３１９８．１で登録されている１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するＡｎａｅｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｍｏｂｉｌｅ  ＤＳＭ  １３１８１を挙げることができる。
【００２１】
配列番号２に示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）微生物としては、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＲ＿１１６５９４．１で登録されている１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｔｕｒａｅを挙げることができる。
【００２２】
配列番号３に示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＪＱ６０６９３８．１で登録されている１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するＢａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＬＡＥ−ｚｌ−Ｐ２５７を挙げることができる。
【００２３】
配列番号４に示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＲ６２６９２７．１で登録されている１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ  ９３４３を挙げることができる。
【００２４】
配列番号１０に示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）微生物としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＰ０１６８２７．１で登録されている１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  Ｄ７６株を挙げることができる。
【００２５】
配列番号１２に示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有するスフィンゴバクテリウム目（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）微生物としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＨＭ９７５５３１．１で登録されている１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物を挙げることができる。
【００２６】
本発明の第１の態様及び第２の態様はいずれも、前記微生物群を短鎖脂肪酸及び電子供与体を含む培地で嫌気培養する工程を含む。
【００２７】
本工程における培地としては、前記微生物群が生育して脂肪酸の鎖伸長反応を行うことができる培地であればよく、例えば無機塩を主体としてペプトンや酵母エキス等の微生物の培養に一般的に用いられる培地成分を添加した合成培地、また食品廃棄物、好ましくはこれをホモジナイズ処理等して液状化したものを挙げることができる。ここで食品廃棄物とは、食品製造業から排出される動植物性残渣、及び食品流通業、外食産業又は一般家庭から排出される売れ残り、食べ残し、調理くず等を含む、そのままではヒトの食用に用いられない有機廃棄物をいう。培地のｐＨは、適当な酸又はアルカリを用いて弱酸性〜弱アルカリ性に調節されることが好ましい。
【００２８】
本工程における培地は、短鎖脂肪酸及び電子供与体を含む。短鎖脂肪酸としては、例えば酢酸、プロピオン酸、酪酸又は吉草酸を挙げることができ、好ましくは酢酸である。電子供与体は、脂肪酸の鎖伸長反応において電子供与体として機能する物質であればよく、例えば水素、エタノール又は乳酸、好ましくはエタノールを挙げることができる。
【００２９】
短鎖脂肪酸及び電子供与体は、微生物群の増殖を妨げない範囲の濃度で培地に存在すればよく、短鎖脂肪酸は培地１Ｌあたり概ね０．１〜５．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．３〜２．０ｗ／ｖ％、より好ましくは０．６〜１．０ｗ／ｖ％であればよく、また電子供与体は培地１Ｌあたり概ね０．１〜５．０ｖ／ｖ％、好ましくは０．５〜４．０ｖ／ｖ％、より好ましくは１．０〜２．５ｖ／ｖ％であればよい。短鎖脂肪酸及び電子供与体は、培地成分として添加されたものでもよく、食品廃棄物を培地として利用したときは食品廃棄物からの持ち込みであってもよく、あるいは本発明に係る微生物群又はそれ以外の微生物の増殖に伴って培地中で生産されるものであってもよい。
【００３０】
本発明にいう「嫌気培養」とは、集積培養を含め、培養系において遊離酸素分子及び溶存酸素分子が極めて少ないか又は実質的に存在しない状態（嫌気状態）での培養を意味するが、ＮＯ２−、ＮＯ３−その他の、他の元素と結合した状態の酸素原子の存在を排除するものではない。
【００３１】
嫌気状態は、液体培地及び培養容器内に存在する遊離酸素分子及び溶存酸素分子を適当な酸素吸着剤等を用いて吸着除去するか、窒素ガス等の不活性化ガスで置換除去する等して準備することができ、また容器を密封する又は上記のような処理を継続して行う等して、培養中も維持することができる。
【００３２】
本発明における培養は、嫌気状態で行う他は特別な培養条件は必要ではなく、３７℃前後の一般的な温度で１４〜３０日間ほど、培地を穏やかに撹拌しながら行うことが好ましい。
【００３３】
本発明の第１の態様及び第２の態様はいずれも、培養物から中鎖脂肪酸を回収する工程を含む。本発明において生成され、回収される中鎖脂肪酸には炭素数が６〜１０の中鎖脂肪酸が含まれ、特にカプリル酸（オクタン酸）及び／又はカプリン酸（デカン酸）が、とりわけカプリル酸及びカプリン酸が生成され、回収される。
【００３４】
中鎖脂肪酸の回収は、培養液から不溶物や微生物残渣等を遠心処理で取り除いた上清を対象とし、溶媒抽出、各種クロマトグラフィー法その他の、中鎖脂肪酸の回収方法又は精製方法として公知の方法によって、行うことができる。本発明において好ましい回収工程は、培養液をポアサイズが５μｍ程度の適当な濾過膜で濾過して得られる濾液に対して、中空糸膜を用いた液相抽出を行って中鎖脂肪酸を回収する工程である。
【００３５】
回収された中鎖脂肪酸は、公知の方法によって必要に応じてさらに精製する等して、医薬、食品、飼料等に利用することができる。
【００３６】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００３７】
＜実施例１＞
（１）集積培養
１２５ｍｌバイアル瓶に表１に示された組成の培地Ａを４０ｍＬ、微量元素液Ｂを１ｍＬ加え、さらに炭素源として酢酸を８ｇ／Ｌ、プロピオン酸を１．０ｇ／Ｌ、酪酸を１．０ｇ／Ｌとなるように、及び純エタノール１０ｍＬをそれぞれ加えて、集積培養培地を調製した。
【表１】
2018093839.tif 000003
【００３８】
終末処理場から採取した活性汚泥液（４０００ｍｇ／Ｌ  ＭＬＳＳ）４ｍＬを上記バイアル瓶中の集積培養培地に接種後、バイアル瓶に純窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去し、ブチル栓とアルミキャップで蓋をして３０℃、１２０ｒｐｍの条件で１２日間嫌気培養した。バイアル瓶からシリンジを用いて嫌気条件下で培養液４ｍＬを採取し、嫌気条件下にある新しい集積培養培地／バイアル瓶に接種してさらに嫌気培養を継続した。この継代嫌気培養を計５回連続で行って、集積培養物を得た。
【００３９】
（２）酢酸及びエタノールからの中鎖脂肪酸の製造
１ｍＬの微量元素液Ｂ、酵母エキス１０ｇ、エタノール１５ｍＬ、及び酢酸ナトリウム７．５ｇを水に溶解して１Ｌとした液体培地（ｐＨ７に調整）１０ｍＬを５０ｍＬ容バイアル瓶に入れ、バイアル瓶に純窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去し、ブチル栓とアルミキャップで蓋をして嫌気条件下とした後、（１）の集積培養物０．４ｍＬを接種して、３７℃、１８０ｒｐｍの条件で４日間、前培養を行った。
【００４０】
上記液体培地４０ｍＬを１２５ｍＬ容バイアル瓶に入れ、上記と同様に嫌気条件下とした後に、前培養液４ｍＬを接種し、３７℃、１２０ｒｐｍの条件で３０日間、経時的に培養液をサンプリングしながら嫌気条件下で混合培養を行った。
【００４１】
サンプリングした培養液に対して、６００ｎｍの吸光度を測定して菌の増殖をモニタリングした。また、培養液を遠心分離（１０分、８０００×ｇ）した上清に対して、Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＣＲ−１０２（Ｈ）カラムを用いたＨＰＬＣ分析を行い、培地中の揮発性脂肪酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸及び吉草酸）並びにエタノールの各濃度を測定した。さらに、前記上清にＢＦ３−メタノールを加えてエステル交換反応を行った後に、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて中鎖脂肪酸濃度を測定した。ＧＣの分析条件は、測定器：ＧＣ−２０１４、検出器：ＦＩＤ、カラム：Ｊ＆Ｗ  ＤＢ−５  ｍｓ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ、キャリアガス：流速１．５７ｍＬ／分のＮ２、検出器温度：３００℃、及びインジェクター温度：２７５℃である。
【００４２】
混合培養終了後の培養液中の脂肪酸含有量、及び集積培養物に代えてカプリル酸を生産することが知られているＣ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ  ＮＢＲＣ１２０１６株を用いて同様の条件で培養を行ったときの培養液中の脂肪酸含有量を表２に示す。混合培養、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ単独培養はいずれも、３０日間の培養で初発酢酸（７．２ｇ／Ｌ）及び初発エタノール（１７．７ｍＬ／Ｌ）を完全に消費し、中鎖脂肪酸を生産した。混合培養ではカプリル酸（Ｃ８）が０．１４ｇ／Ｌ、カプリン酸（Ｃ１０）が０．０５ｇ／Ｌ生産されたのに対し、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉの単独培養ではカプリル酸（Ｃ８）は０．０６ｇ／Ｌ生産されたものの、カプリン酸（Ｃ１０）は検出されなかった。
【表２】
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【００４３】
（３）食品廃棄物からの中鎖脂肪酸の製造
家庭から集められた食品残渣をブレンダーを用いて粉砕し、ふるいにかけて粗い物質を除去した濾液を得た。濾液を水道水で希釈し、５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７に調整した後、オートクレーブ処理して、食品残渣培地を調製した。食品残渣培地のＣＯＤは約１３ｇ／Ｌであり、酢酸（３ｇ／Ｌ）、乳酸（２．８ｇ／Ｌ）、リンゴ酸（０．８ｇ／Ｌ）、プロピオン酸（２ｇ／Ｌ）等の揮発性脂肪酸を含んでいた。
【００４４】
また、乳製品加工工場から食品廃棄物として回収したチーズホエーを水道水で５倍希釈し、５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７に調整した後、オートクレーブ処理して、チーズホエー培地を調製した。チーズホエー培地のＣＯＤは約４ｇ／Ｌであった。
【００４５】
１２５ｍＬ容バイアル瓶に食品残渣培地又はチーズホエー培地４０ｍＬ及び２５ｍＬのエタノールを入れ、窒素ガスを１０分間導入して酸素を除去し、ブチル栓とアルミキャップで蓋をして嫌気条件下とした後に、前記（２）の前培養液４ｍＬを接種し、３７℃、１２０ｒｐｍの条件で３０日間、経時的に培養液をサンプリングしながら混合培養を行った。培養液中の揮発性脂肪酸及び中鎖脂肪酸の各濃度を前述のＨＰＬＣ分析及びＧＣ分析によって測定した。
【００４６】
混合培養終了後の各培養液中の脂肪酸含有量を表３に示す。食品残渣、ホエーのいずれを用いた場合も中鎖脂肪酸、特にカプリル酸（Ｃ８）及びカプリン酸（Ｃ１０）の生産が確認された。
【表３】
2018093839.tif 000005
【００４７】
＜試験例＞微生物群集構造解析
実施例１の（２）に示した混合培養の開始日（０ｄａｙ）と開始から２０日後（２０ｄａｙ）に採取した培養液から、Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、製造業者のプロトコルに従って、ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ濃度がＰＣＲ反応に適した５０〜１００ｎｇ／μＬの範囲になるまで抽出ＤＮＡを希釈後、表４に示した反応液を調製して、集積培養物に含まれる微生物の１６Ｓ  ｒＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ反応を行い、長さ４００ｂｐ弱の増幅産物を得た。
【表４】
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【００４８】
増幅産物について、尿素を変性剤として用いたＤＧＧＥを、表５に示す泳動条件で行った。
【表５】
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【００４９】
泳動後のゲルの写真を図１に示す。右のレーンはマーカーであり、各バンドの位置は上からそれぞれ変性剤濃度４０％、４４％、４９％、５３．４％に相当する。電気泳動後のゲルから、０ｄａｙと２０ｄａｙにおいて共通する主要なバンド（図１の１〜８）及び２０ｄａｙにおいてより明確なバンド（図１の９〜１２）を切り出し、それぞれに含まれる増幅ＤＮＡの塩基配列（配列番号１〜１２）を決定した。さらに、決定された塩基配列それぞれをクエリーとして、ＢＬＡＳＴ解析を行ったところ、各クエリー配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡとこれを有する微生物が特定された。表６に、図１のバンド１〜１２に対応する配列番号１〜１２について、使用したＤＧＧＥゲルにおいて変性剤濃度勾配がリニアであると仮定したときの各バンドの位置に対応する変性剤濃度（％）、配列番号１〜１２の各塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する１６Ｓ  ｒＤＮＡのＧｅｎＢａｎｋ又はＮＣＢＩのアクセッション番号、ＢＬＡＳＴ検索による同一性（％）及び当該１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する微生物名を纏めて表す。
【表６】
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【００５０】
本出願人は、上記実施例１の（１）において記載された集積培養物について、国立大学法人室蘭工業大学工学研究科応用理化学系学科（〒０５０−８５８５北海道室蘭市水元町２７番１号）内において自己寄託し、維持・保存している。本出願人は、日本国特許法施行規則第２７条の３各号に該当する場合、各法令の遵守を条件に、第三者に前記集積培養物を分譲することを保証する。
【図１】
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【配列表】
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