(57)【要約】【課題】ＡＤＡＭタンパク質の作用阻害剤を提供する。【解決手段】低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）又はその部分ペプチドにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又は低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）又はその部分ペプチドにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域を認識して結合する抗体を、ＡＤＡＭタンパク質の作用阻害剤として用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）又はその部分ペプチドにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又は低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）又はその部分ペプチドにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域を認識して結合する抗体である、ＡＤＡＭタンパク質の作用阻害剤。
【請求項２】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）又はその部分ペプチドにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又は低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）又はその部分ペプチドにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域を認識して結合する抗体である、出血性ヘビ毒による出血阻害剤。
【請求項４】
低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）又はその部分ペプチドにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる領域又は低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）又はその部分ペプチドにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる領域を認識して結合する抗体である、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤。
【請求項５】
低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）又はその部分ペプチドにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる領域又は低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）又はその部分ペプチドにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる領域を認識して結合する抗体である、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化によって促進される疾患の予防又は治療剤。
【請求項６】
ＡＤＡＭタンパク質の作用阻害方法であって、
ＬＲＰ５又はＬＲＰ６若しくはこれらの部分ペプチドを発現する生体外細胞において、ＬＲＰ５又はその部分ペプチドについては配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又はＬＲＰ６又はその部分ペプチドについては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域に対するＡＤＡＭタンパク質の結合を、前記第１の領域又は第２の領域を認識して結合する抗体を用いて阻害する工程、
を備える、方法。
【請求項７】
ＡＤＡＭタンパク質の作用阻害方法であって、
ＬＲＰ５又はＬＲＰ６若しくはこれらの部分ペプチドを発現する細胞を有する非ヒト動物において、ＬＲＰ５又はその部分ペプチドについては配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる領域又はＬＲＰ６又はその部分ペプチドについては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる領域に対するＡＤＡＭタンパク質の結合を、前記第１の領域又は第２の領域を認識して結合する抗体を用いて阻害する工程、
を備える、方法。
【請求項８】
Ｗｎｔシグナル伝達の阻害方法であって、
ＬＲＰ５又はＬＲＰ６若しくはこれらの部分ペプチドを発現する生体外細胞において、ＬＲＰ５又はその部分ペプチドについては配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又はＬＲＰ６又はその部分ペプチドについては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域に対するＡＤＡＭタンパク質の結合を、前記第１の領域又は第２の領域を認識して結合する抗体を用いて阻害する工程、
を備える、方法。
【請求項９】
Ｗｎｔシグナル伝達レベルの評価方法であって、
ＬＲＰ５又はＬＲＰ６若しくはこれらの部分ペプチドを発現する生体外細胞に対して、ＬＲＰ５又はその部分ペプチドについては配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又はＬＲＰ６又はその部分ペプチドについては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域を認識して結合する抗体を供給する工程と、
前記第１の領域及び／又は前記第２の領域に結合する抗体量を評価する工程と、
を備える、方法。
【請求項１０】
Ｗｎｔシグナル伝達の促進に関連する疾患又は病態の診断を補助する方法であって、
ＬＲＰ５又はＬＲＰ６若しくはこれらの部分ペプチドを発現する生体外細胞に対して、ＬＲＰ５又はその部分ペプチドについては配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又はＬＲＰ６又はその部分ペプチドについては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域を認識して結合する抗体を供給する工程と、
前記抗体の供給により阻害された前記第１及び／又は前記第２の領域に対するＡＤＡＭタンパク質の結合の阻害程度を評価する工程と、
を備える、方法。
【請求項１１】
ＡＤＡＭタンパク質の作用阻害剤のスクリーニング方法であって、
ＬＲＰ５又はＬＲＰ６若しくはこれらの部分ペプチドを発現する生体外細胞又は非ヒト動物に対して、１又は２以上の被検化合物を供給してＬＲＰ５又はその部分ペプチドについては配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又はＬＲＰ６又はその部分ペプチドについては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域に対するＡＤＡＭタンパク質の結合を阻害の程度を評価する工程、
を備える、方法。
【請求項１２】
Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤のスクリーニング方法であって、
ＬＲＰ５又はＬＲＰ６若しくはこれらの部分ペプチドを発現する生体外細胞又は非ヒト動物に対して、１又は２以上の被検化合物を供給してＬＲＰ５又はその部分ペプチドについては配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又はＬＲＰ６又はその部分ペプチドについては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域に対するＷｎｔシグナル伝達経路関連タンパク質の結合を阻害の程度を評価する工程、
を備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、抗ＡＤＡＭタンパク質基質抗体及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＤＡＭ（A Disintegrin And Metalloproteinase）ファミリータンパク質（以下、単に、ＡＤＡＭタンパク質という。）は、プロテアーゼであるが、多くの機能を持つタンパク質である。ＡＤＡＭタンパク質は、細胞表層タンパク質のｓｈｅｄｄｉｎｇ、細胞の形態変化、細胞シグナリングに関与することが知られている。ある種のＡＤＡＭは、がん細胞の浸潤や転移、出血に関わるとされている。例えば、ＡＤＡＭタンパク質の１つとして、出血性へび毒であるＶＡＰ１（Vascular Apoptosis-inducing protein）が知られている。ＶＡＰ１は、血管内皮細胞に特異的にアポトーシスを誘導する。
【０００３】
こうしたＡＤＡＭタンパク質の作用の阻害剤やそのスクリーニング方法については既に報告されている（特許文献１）。また、ＶＡＰ１は、Ｗｎｔシグナル伝達系の受容体である低比重リポタンパク質６（ＬＲＰ６）を切断することも明らかとなっている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−２４４８１４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】日本分子生物学会年会プログラム要旨集、2P、0078、２０１４年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に開示されるＡＤＡＭタンパク質の作用阻害剤は、プロテアーゼであるＡＤＡＭタンパク質の活性を阻害するものである。また、当該ＡＤＡＭタンパク質の作用阻害剤はある種の有機化合物である。しかしながら、こうしたＡＤＡＭタンパク質の作用阻害剤は、ＡＤＡＭタンパク質の他の機能も阻害することとなり、研究用途のみならず医薬用途を考慮すると必ずしも好適とはいえない。
【０００７】
一方、ＶＡＰ１が、ＬＲＰ６を切断することが報告されているものの、基質特異性の詳細は明らかになっていない。
【０００８】
本明細書は、かかる事情に鑑みて、ＡＤＡＭタンパク質が作用する基質における作用部位を特定し、当該作用部位に対するＡＤＡＭタンパク質の結合を阻害する阻害剤及びその利用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＶＡＰ１などのＡＤＡＭタンパク質の作用基質であるＬＲＰ６及びＬＲＰ５の細胞外領域の作用部位を初めて特定した。本明細書によれば、かかる知見に基づき以下の手段が提供される。
【００１０】
（１）低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）又はその部分ペプチドにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又は低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）又はその部分ペプチドにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域を認識して結合する抗体である、ＡＤＡＭタンパク質の作用阻害剤。
（２）前記抗体はモノクローナル抗体である、（１）に記載の阻害剤。
（３）低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）又はその部分ペプチドにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又は低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）又はその部分ペプチドにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域を認識して結合する抗体である、出血性ヘビ毒による出血阻害剤。
（４）低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）又はその部分ペプチドにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる領域又は低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）又はその部分ペプチドにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる領域を認識して結合する抗体である、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤。
（５）低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）又はその部分ペプチドにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる領域又は低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）又はその部分ペプチドにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる領域を認識して結合する抗体である、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化によって促進される疾患の予防又は治療剤。
（６）ＡＤＡＭタンパク質の作用阻害方法であって、
ＬＲＰ５又はＬＲＰ６若しくはこれらの部分ペプチドを発現する生体外細胞において、ＬＲＰ５又はその部分ペプチドについては配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又はＬＲＰ６又はその部分ペプチドについては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域に対するＡＤＡＭタンパク質の結合を、前記第１の領域又は第２の領域を認識して結合する抗体を用いて阻害する工程、
を備える、方法。
（７）ＡＤＡＭタンパク質の作用阻害方法であって、
ＬＲＰ５又はＬＲＰ６若しくはこれらの部分ペプチドを発現する細胞を有する非ヒト動物において、ＬＲＰ５又はその部分ペプチドについては配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる領域又はＬＲＰ６又はその部分ペプチドについては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる領域に対するＡＤＡＭタンパク質の結合を、前記第１の領域又は第２の領域を認識して結合する抗体を用いて阻害する工程、
を備える、方法。
（８）Ｗｎｔシグナル伝達の阻害方法であって、
ＬＲＰ５又はＬＲＰ６若しくはこれらの部分ペプチドを発現する生体外細胞において、ＬＲＰ５又はその部分ペプチドについては配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又はＬＲＰ６又はその部分ペプチドについては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域に対するＡＤＡＭタンパク質の結合を、前記第１の領域又は第２の領域を認識して結合する抗体を用いて阻害する工程、
を備える、方法。
（９）Ｗｎｔシグナル伝達レベルの評価方法であって、
ＬＲＰ５又はＬＲＰ６若しくはこれらの部分ペプチドを発現する生体外細胞に対して、ＬＲＰ５又はその部分ペプチドについては配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又はＬＲＰ６又はその部分ペプチドについては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域を認識して結合する抗体を供給する工程と、
前記第１の領域及び／又は前記第２の領域に結合する抗体量を評価する工程と、
を備える、方法。
（１０）Ｗｎｔシグナル伝達の促進に関連する疾患又は病態の診断を補助する方法であって、
ＬＲＰ５又はＬＲＰ６若しくはこれらの部分ペプチドを発現する生体外細胞に対して、ＬＲＰ５又はその部分ペプチドについては配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又はＬＲＰ６又はその部分ペプチドについては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域を認識して結合する抗体を供給する工程と、
前記抗体の供給により阻害された前記第１及び／又は前記第２の領域に対するＡＤＡＭタンパク質の結合の阻害程度を評価する工程と、
を備える、方法。
（１１）ＡＤＡＭタンパク質の作用阻害剤のスクリーニング方法であって、
ＬＲＰ５又はＬＲＰ６若しくはこれらの部分ペプチドを発現する生体外細胞又は非ヒト動物に対して、１又は２以上の被検化合物を供給してＬＲＰ５又はその部分ペプチドについては配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又はＬＲＰ６又はその部分ペプチドについては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域に対するＡＤＡＭタンパク質の結合を阻害の程度を評価する工程、
を備える、方法。
（１２）Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤のスクリーニング方法であって、
ＬＲＰ５又はＬＲＰ６若しくはこれらの部分ペプチドを発現する生体外細胞又は非ヒト動物に対して、１又は２以上の被検化合物を供給してＬＲＰ５又はその部分ペプチドについては配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又はＬＲＰ６又はその部分ペプチドについては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域に対するＷｎｔシグナル伝達経路関連タンパク質の結合を阻害の程度を評価する工程、
を備える、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】各種動物におけるＬＲＰ５におけるＡＤＡＭタンパク質の作用部位を示す図である。
【図２】各種動物におけるＬＲＰ６におけるＡＤＡＭタンパク質の作用部位を示す図である。
【図３】ヒトＡＤＡＭタンパク質間における触媒部位近傍の同一性を示す図である。
【図４】ヒトＡＤＡＭタンパク質間における触媒部位近傍の同一性を示す図である。
【図５】ＶＡＰ１によるＶＥ−カドヘリンとγカテニンの局在変化を示す図である。
【図６】ＶＡＰ１によるＬＲＰ６を活性化部位の切断部位を示す図である。
【図７】ＶＡＰ１によるＬＲＰ５の切断部位を示す図である。
【図８】ＶＡＰ１によるＬＲＰ６切断の細胞間接着部（細胞間ジャンクション）の崩壊への関与す図である。
【図９】ＶＡＰ１によるＬＲＰ６切断の生体での出血への関与を示す図である。
【図１０】各種動物におけるＬＲＰ５／６の切断活性化に関する領域の欠失を示す図である。
【図１１】ヒトＡＤＡＭ８とＡＤＡＭ１２組み換え体によるＬＲＰ６の切断を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書の開示は、ＡＤＡＭタンパク質の作用阻害剤及びその利用に関する。本発明者によれば、本発明者が特定したＡＤＡＭタンパク質の作用基質における作用部位を特定できた。当該作用部位に対するＡＤＡＭタンパク質の結合を阻害することで、ＡＤＡＭタンパク質が当該部位に結合することで発揮する作用を阻害する阻害剤（以下、本阻害剤ともいう。）を提供できる。また、作用基質はＷｎｔの受容体でもあるＬＲＰ５及びＬＲＰ６である。したがって、ＡＤＡＭタンパク質がこれらの作用基質に対して結合するのを阻害することで、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害することができる。このため、本阻害剤は、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤としても作用することができる。
【００１３】
なお、従来のＷｎｔシグナルを阻害する抗体は、ＬＲＰの細胞表面に露出しているプロペラドメインを認識していた。これに対して、本阻害剤は、ＬＲＰ６等のプロペラドメインＬＤＬＡドメインとの連結部位を作用部位として当該作用部位に対するＡＤＡＭタンパク質タンパク質の結合を阻害するものである。後述する実施例では、ヒトＬＲＰ６の細胞外ドメイン全体の組み換え体に対するモノクローン抗体(MAB1505, R&Dシステムズ) 、ヒトＬＲＰ６の細胞外ドメイン全体の組み換え体に対するポリクローン抗体（AF1505, R&Dシステムズ）、及びＬＲＰ６に結合するタンパク質である、ヒトＲＡＰ (Receptor-associated protein) 組み換え体 (エンゾ・ライフサイエンシズ)では、ＶＡＰ１作用を阻害することができないことを確認している。
【００１４】
以下、本明細書に開示される本阻害剤及びその利用について詳細に説明する。なお、本明細書において、ＡＤＡＭタンパク質は、A Disintegrin And Metalloproteinase ファミリータンパク質に分類されるタンパク質である。ＡＤＡＭタンパク質は、血小板凝集阻害タンパク質ディスインテグリン様配列（Ｄドメイン）とその上流にある蛇毒メタロプロテアーゼ様配列（Ｍドメイン）を有している。ＡＤＡＭタンパク質は、細胞表層タンパク質のシェディング酵素である場合もある。本明細書におけるＡＤＡＭタンパク質は、膜型ＡＤＡＭタンパク質であるＡＤＡＭ１〜４１、ＤＡＭＴＳ１〜ＡＤＡＭＴＳ２０及びＡＤＡＭＤＥＣ１などの各種ＡＤＡＭタンパク質のほか、ＶＡＰ１やＶＡＰ２Ｂなどの各種の蛇毒メタロプロテアーゼであるＡＤＡＭタンパク質ホモログを含むＡＤＡＭタンパク質ファミリーに属するタンパク質である。ＶＡＰ１は、ニシダイヤガラガラへび由来のホモ二量体Ｐ−III型蛇毒メタプロテアーゼである。ＶＡＰ２Ｂは、単量体Ｐ−III型蛇毒メタプロテアーゼである。蛇毒メタプロテアーゼは、ヒトＡＤＡＭタンパク質の細胞外ドメインと４０％以上の同一性を有するほか、基本骨格を規定するアミノ酸残基が概して保存されている。例えば、ヒトのＡＤＡＭタンパク質としては、ＡＤＡＭ２、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２８、３０、３３、ＡＤＡＭＴＳ１〜ＡＤＡＭＴＳ２０、ＡＤＡＭＤＥＣ１が挙げられる。なかでも、プロテアーゼ活性を有するヒトＡＤＡＭタンパク質としては、ＡＤＡＭ７、８、９、１０、１２、１５、１７、１９、２０、２１、２８、３０、３３、ＡＤＡＭＴＳ１〜ＡＤＡＭＴＳ２０、ＡＤＡＭＤＥＣ１が挙げられる。
【００１５】
また、本明細書において、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）とは、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）のほか、種々のリガンドの細胞内取り込みやシグナル伝達に関連すると考えられるタンパク質であって、当業者において周知である。例えば、ヒトＬＲＰ５及びＬＲＰＰ６のアミノ酸配列等は、アクセッション番号：NP_002326及びNP_002327としてＮＣＢＩなどのデータベースにおいて開示されている。
【００１６】
本明細書において、Ｗｎｔシグナル経路とは、細胞外分泌糖タンパク質であるＷｎｔを介するシグナル伝達経路をいう。Ｗｎｔのアミノ酸配列等は、例えば、ヒトWnt-1は、アクセッション番号：NP_005421として、ヒトＷｎｔ−３ａは、アクセッション番号：NP_149122として、データベースに開示されている。
【００１７】
（ＡＤＡＭタンパク質の作用阻害剤）
本阻害剤は、ＬＲＰ５又はその部分ペプチドにおける特定領域、及び／又は、ＬＲＰ６又はその部分ペプチドにおける特定領域を認識して結合する抗体を有効成分とすることができる。以下、かかる結合性を有する抗体を本抗体ともいう。
【００１８】
本抗体は、ＬＲＰ５又はその部分ペプチドにおける配列番号１で表されるアミノ酸配列、すなわち、VE-E/D-V/I-SLEEF（配列番号１）からなる第１の領域を認識して結合することができる。本抗体が第１の領域を認識して結合することにより、第１の領域に対してＡＤＡＭタンパク質が結合して、第１の領域においてＬＲＰ５を切断するのを阻害し、ひいては、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害することができる。
【００１９】
ＬＲＰ５における第１の領域は、ＬＲＰ５の細胞外領域にある。ＬＲＰ５の細胞外領域が切断されると、Ｗｎｔシグナル伝達経路が活性化することが知られている（マオ、Ｊ他、２００１）。ＬＲＰ５における第１の領域は、図１に示すように、ヒト、チンパンジー、アカゲサル、マウス、ラット、イヌ及びウシ等の各種の哺乳類由来のＬＲＰ５において共通して存在している。
【００２０】
この第１の領域中、例えば、ＡＤＡＭタンパク質であるＶＡＰ１等が切断するのは、図１に示すように、例えば、ヒトでは、１２０６Ｅと１２０７Ｖとの間である。この切断部位による切断により、ＬＲＰ５の活性化を抑制している４つの全てのβ−プロペラドメインをＬＲＰ５から除去され、その結果、ＬＲＰ５は活性化することになる。なお、図１において示すＡＤＡＭタンパク質による切断部位はこれに限定するものではない。
【００２１】
また、本抗体は、ＬＲＰ６又はその部分ペプチドにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列、すなわち、VKELNLQEY（配列番号２）からなる第２の領域を認識して結合することができる。本抗体が第２の領域を認識して結合することにより、第２の領域に対してＡＤＡＭタンパク質が結合して、第２の領域においてＬＲＰ６を切断するのを阻害し、ひいては、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害することができる。
【００２２】
ＬＲＰ６における第２の領域は、ＬＲＰ６の細胞外領域にある。ＬＲＰ６の細胞外領域が切断されると、Ｗｎｔシグナル伝達経路が活性化することが知られている（マオ、Ｊ他、２００１）。ＬＲＰ６における第２の領域は、図２に示すように、ヒト、チンパンジー、アカゲサル、マウス、ラット、イヌ及びウシ等の各種の哺乳類由来のＬＲＰ６において共通して存在している。
【００２３】
この第２の領域中、例えば、ＡＤＡＭタンパク質であるＶＡＰ１等が切断するのは、図２に示すように、例えば、ヒトでは、１１９６Ｅと１１９７Ｌと間である。この切断部位による切断により、ＬＲＰ６の活性化を抑制している４つの全てのβ−プロペラドメインをＬＲＰ６から除去し、その結果、ＬＲＰ６は活性化することになる。なお、図２において示すＡＤＡＭタンパク質による切断部位はこれに限定するものではない。
【００２４】
ＬＲＰ５の部分ペプチドとは、少なくとも前記第１の領域を含むＬＲＰ５の部分ペプチドであって、ＬＲＰ５に対する本抗体の結合能の少なくとも５０％以上、また例えば、６０％以上、また例えば７０％以上、さらに例えば、８０％以上、また例えば、９０％以上を有する部分ペプチドであればよい。全長タンパク質の部分ペプチドは、遺伝子工学的にあるいは酵素による処理によっても適宜調製することができ、本抗体との結合能は、抗体を抗原−抗体反応を検出するＥＬＩＳＡやウェスタンブロットなど各種の周知の方法で評価することで、適切な部分ペプチドを取得できる。ＬＲＰ６の部分ペプチドについても同様に取得できる。
【００２５】
本抗体は、第１の領域のみを認識して結合するものであってもよいし、第２の領域のみを認識して結合するものであってもよいし、両者を認識するものであってもよい。抗体の有する識別能は、種々の抗原を用いることで評価することができるため、意図する結合特性を有する抗体を適宜取得することができる。なお、第１の領域を認識して結合する抗体とは、第１の領域の全てを認識することを必ず要するものでもなく、第１の領域の少なくとも一部を認識して結果として第１の領域に結合するものであればよい。第２の領域を認識して結合する抗体についても同様である。
【００２６】
本抗体は、既に説明したように、その作用の一態様は、ＡＤＡＭタンパク質がその作用基質に作用することを阻害するものである。この場合において、本抗体の推測される主たる機能は、ＡＤＡＭタンパク質の作用基質であるＬＲＰ５及び６における作用部位に結合して、ＡＤＡＭタンパク質による作用（すなわち、ＬＲＰ５及び６の細胞外領域の切断及び除去）を阻害することである。
【００２７】
本抗体が阻害するＡＤＡＭタンパク質は、特に限定するものではないが、既述のとおりにＡＤＡＭタンパク質に包含される各種タンパク質が挙げられる。すなわち、公知のＡＤＡＭ１〜４１、ＤＡＭＴＳ１〜ＡＤＡＭＴＳ２０及びＡＤＡＭＤＥＣ１などの各種ＡＤＡＭタンパク質のほか、ＶＡＰ１やＶＡＰ２Ｂなどの各種の蛇毒メタロプロテアーゼであるＡＤＡＭタンパク質ホモログである。
【００２８】
例えば、ヒトのＡＤＡＭタンパク質としては、ＡＤＡＭ２、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２８、３０、３３、ＡＤＡＭＴＳ１〜ＡＤＡＭＴＳ２０、ＡＤＡＭＤＥＣ１が挙げられる。なかでも、プロテアーゼ活性を有するヒトＡＤＡＭタンパク質としては、ＡＤＡＭ７、８、９、１０、１２、１５、１７、１９、２０、２１、２８、３０、３３、ＡＤＡＭＴＳ１〜ＡＤＡＭＴＳ２０、ＡＤＡＭＤＥＣ１が挙げられる。
【００２９】
こうしたＡＤＡＭタンパク質のうち、例えば、ＶＡＰ１、ヒトＡＤＡＭ８及びヒトＡＤＡＭ１２並びにこれらのＡＤＡＭタンパク質の触媒部位ＡＤＡＭ８の触媒部位（ヒトＡＤＡＭ８のアミノ酸配列の第３２０位〜３４５位）のアミノ酸配列と一定以上の同一性を有する他のＡＤＡＭタンパク質を本阻害剤の阻害対象として好適なＡＤＡＭタンパク質として挙げることができる。以下に、ヒトＡＤＡＭ８等の触媒活性部位と他のＡＤＡＭタンパク質との触媒部位との同一性解析結果を、図３及び図４に示す。
【００３０】
図３に示すように、ヒトＡＤＡＭ８の触媒部位のアミノ酸配列を基準とすると、ヒトＡＤＡＭ１２の触媒部位のアミノ酸配列の同一性は６９％であり、ＶＡＰ１の触媒部位のアミノ酸配列の同一性は７７％である。後段の実施例により、ヒトＡＤＡＭ８、ヒトＡＤＡＭ１２及びＶＡＰ１は、いずれも、ＬＲＰ６をその活性化部位で切断できることが確認されている。また、ＶＡＰ１の触媒部位と基準とすると、ヒトＡＤＡＭ８の触媒部位のアミノ酸配列の同一性は７７％であり、ヒトＡＤＡＭ１２の触媒部位のアミノ酸配列の同一性は５４％であり、ヒトＡＤＡＭ１２の触媒部位と基準とすると、ヒトＡＤＡＭ８の触媒部位のアミノ酸配列の同一性は６９％であり、ＶＡＰ１の触媒部位のアミノ酸配列の同一性は５４％であった。
【００３１】
図３に示すヒトＡＤＡＭタンパク質は、いずれもがん悪性化での発現上昇や転移・浸潤への関与が報告されているが、図３に示すアミノ酸配列の同一性から、本抗体は、図３に示すＡＤＡＭタンパク質についても同様にＡＤＡＭタンパク質の阻害剤として機能すると考えられる。
【００３２】
また、図４には、ＡＤＡＭ９、２０、２１、３０、１０及び１７の各触媒部位と、ＡＤＡＭ８、ＶＡＰ１及びＡＤＡＭ１２との一致アミノ酸残基数、同一性（％）及びアミノ酸残基の類似性を示している。図４に示すＡＤＡＭタンパク質は、必ずしもＡＤＡＭ８等の触媒活性部位とは高いアミノ酸配列の同一性を有してはいないが、ＡＤＡＭ１２やＶＡＰ１とは高い同一性を有するほか、図３に示すＡＤＡＭタンパク質の触媒部位と対比すると高度に保存されたアミノ酸残基も有することから、本抗体は、こうしたＡＤＡＭタンパク質の阻害剤としても機能すると考えられる。
【００３３】
なお、ＡＤＡＭタンパク質作用阻害剤として用いる場合の標的としてのＡＤＡＭタンパク質は、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ１２及びＶＡＰ１のいずれかのアミノ酸配列とアライメントしたとき、これらのいずれかの触媒部位のアミノ酸配列と、例えば、３０％以上の同一性、また例えば、３５％以上の同一性、また例えば、４０％以上の同一性、また例えば、４５％以上の同一性、また例えば、５０％以上の同一性、また例えば、５５％以上の同一性、また例えば、６０％以上の同一性、また例えば、６５％以上の同一性、また例えば、７０％以上の同一性、また例えば、７５％以上の同一性、また例えば、８０％以上の同一性、また例えば、８５％以上の同一性、さらに例えば９０％以上の同一性、また例えば、９５％以上の同一性、さらに例えば、９７％以上の同一性、さらにまた例えば、９８％以上の同一性、例えば、９９％以上の同一性を有して、本発明者が特定した作用部位に結合する活性を有しているタンパク質が挙げられる。
【００３４】
なお、本抗体を、ＡＤＡＭタンパク質作用阻害剤として用いる場合の標的としてのＡＤＡＭタンパク質は、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ１２及びＶＡＰ１のいずれかのアミノ酸配列とアライメントしたとき、これらのいずれかの触媒部位のアミノ酸配列と、例えば、３０％以上の同一性、また例えば、３５％以上の同一性、また例えば、４０％以上の同一性、また例えば、４５％以上の同一性、また例えば、５０％以上の同一性、また例えば、５５％以上の同一性、また例えば、６０％以上の同一性、また例えば、６５％以上の同一性、また例えば、７０％以上の同一性、また例えば、７５％以上の同一性、また例えば、８０％以上の同一性、また例えば、８５％以上の同一性、さらに例えば９０％以上の同一性、また例えば、９５％以上の同一性、さらに例えば、９７％以上の同一性、さらにまた例えば、９８％以上の同一性、例えば、９９％以上の同一性のアミノ酸配列を有し、本発明者が特定した作用部位に結合する活性を有しているＡＤＡＭタンパク質が挙げられる。
【００３５】
また、本抗体を、ＡＤＡＭタンパク質作用阻害剤として用いる場合の標的としてのＡＤＡＭタンパク質は、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ１２及びＶＡＰ１のいずれかのアミノ酸配列とアライメントしたとき、これらのいずれかのアミノ酸配列と、例えば、３０％以上の同一性、また例えば、３５％以上の同一性、また例えば、４０％以上の同一性、また例えば、４５％以上の同一性、また例えば、５０％以上の同一性、また例えば、５５％以上の同一性、また例えば、６０％以上の同一性、また例えば、６５％以上の同一性、また例えば、７０％以上の同一性、また例えば、７５％以上の同一性、また例えば、８０％以上の同一性、また例えば、８５％以上の同一性、さらに例えば９０％以上の同一性、また例えば、９５％以上の同一性、さらに例えば、９７％以上の同一性、さらにまた例えば、９８％以上の同一性、例えば、９９％以上の同一性のアミノ酸配列を有し、本発明者が特定した作用部位に結合する活性を有しているＡＤＡＭタンパク質が挙げられる。
【００３６】
なお、本明細書において塩基配列又はアミノ酸配列の同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２種以上のタンパク質あるいは２種以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性 ”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるＢＬＡＳＴ (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
【００３７】
こうしたＡＤＡＭタンパク質のアミノ酸配列は、必要に応じてＮＣＢＩなどのデータベースから取得できる。例えば、ヒトＡＤＡＭ８は、アクセッション番号：NP_001100として、ヒトＡＤＡＭ１２は、アクセッション番号：NP_003465として、ヒトＡＤＡＭ２８は、アクセッション番号：NP_055080として、及びヒトＡＤＡＭ３３はアクセッション番号：NP_079496として取得できる。
【００３８】
本抗体は、本願出願時における公知技術において、特異的に任意の抗原（本明細書においては、例えば、ＬＲＰ５の第１の領域など）に対して結合能を有するインタクトな抗体又は当該結合能を有する抗原結合部分を含む部分ということができる。本抗体は、本願出願時における技術常識のほか以下に示す内容に基づいて各種態様を採ることができる。
【００３９】
抗体の「抗原結合部分」とは、特異的に任意の抗原（例えば、ＬＲＰ５の第１の領域など）に結合する能力を保持するインタクトな抗体の１つ以上のフラグメントを意味する。「抗原結合部分」は、特に限定するものではなく、Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結された２つのＦａｂフラグメント（一般的に重鎖および軽鎖から１つ）を含む二価フラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント；および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）など各種形態のフラグメント又はその組合せを含むことができる。また、抗原結合部分は、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価分子を形成する一本のタンパク質鎖として作製可能とする人工ペプチドリンカーにより連結することができる。
【００４０】
このほか、抗原結合部分は、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖに組み込まれていてもよい。
【００４１】
本抗体の由来生物種は特に限定するものではないが、適用する生物体や目的によっても異なるが、ヒト抗体、マウス抗体、ヤギ抗体等とすることができる。なお、ヒト抗体というときには、抗体のフレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来している可変領域を有する抗体を含むことを意味している。さらに、抗体が定常領域を含むとき、定常領域は、また、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖細胞系列配列または突然変異型のヒト生殖細胞系列配列に由来することを意味している。また、２以上の生物種に由来するフラグメントに基づく抗体をキメラ抗体ということができる。
【００４２】
本抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体であれば、抗原に対して安定した結合性能を発揮することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の取得は、当業者において周知である。例えば、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合させた遺伝子導入非ヒト動物（例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子導入マウス）から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマにより製造される。
【００４３】
また、本抗体は、例えば、組換えヒト抗体などの組換え抗体であってもよい。組換えヒト抗隊は、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を遺伝子導入または染色体導入された動物（例えば、マウス）またはそれから製造されたハイブリドーマから単離された抗体；ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体；組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体；およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部または一部の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む他の手段により製造、発現、作製または単離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体はフレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来している可変領域を有する。
【００４４】
本抗体は、例えば、以下のように製造することができる。すなわち、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列とリンカー用配列を含むペプチドを人工合成したのち、キャリアータンパク質（KLH(Keyhole limpet hemocyanin)）とコンジュゲートさせ、抗原とする。ＳＰＦウサギに２週ごとに４回抗原を注射し、８週目に採決し、ＥＬＩＳＡにより活性を確認後、全採血する。血液を凝固させたあと、血清を回収する。抗血清から抗体は、当業者に周知の方法によって取得することができる。
【００４５】
本抗体は、こうして取得された抗体が第１の領域及び／又は第２の領域を認識して結合する結合能を有している限り、その変異体であってもよい。例えば、出発物質としての抗体の少なくとも一部、例えば、全長重鎖および／または軽鎖配列、ＶＨおよび／またはＶＬ配列またはそれに結合した定常領域に変異を導入するなどの修飾することにより、新たな抗体を取得することもできる。また、取得した抗体に対していわゆるペグ鎖を導入するなどもできる。こうした抗体の改変の手法自体は、当業者において周知である。
【００４６】
なお、本製造方法において用いる抗体作製のための抗原化合物やハイブリドーマも本開示の一態様である。また、本抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドも本開示の一態様である。係るポリヌクレオチドは、本抗体のアミノ酸配列の解析によって及び／又はハイブリドーマから得られる抗体コード領域の塩基配列解析によって得ることができる。さらに、係るポリヌクレオチドを意図した宿主細胞において発現可能に保持する発現ベクタ−も本発明の一態様である。なお、発現ベクターは、宿主の種類に応じて当業者に周知の適切な形態のほか、プロモーター、ターミネーター等の制御領域も適宜選択することができる。ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡであり、また例えば、ｃＤＮＡである。
【００４７】
（出血性ヘビ毒による出血阻害剤）
本抗体は、出血性ヘビ毒による出血阻害剤の有効成分としても用いることができる。本発明者らは、ＶＡＰ１の作用を本抗体によって阻害し結果として出血が抑制されたことを確認している。したがって、本抗体は、出血性ヘビ毒の種類に特定されず、ＬＲＰ５及びＬＲＰ６の切断除去による出血に対して広く適用される。
【００４８】
（Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤等）
本抗体は、ＬＲＰ５及びＬＲＰ６の細胞外領域を除去してこれらのタンパク質を活性化することを阻害する。この結果、本抗体は、当該活性化によるＷｎｔシグナル伝達経路の活性化を阻害する阻害剤として機能することができる。Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化は、広く動物において遺伝子発現、細胞増殖、細胞運動、細胞極性に関わっていることが知られている。このため、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤は、それ自体研究用途として有用である。
【００４９】
本抗体は、ＡＤＡＭタンパク質が共通して作用するＬＲＰ５及びＬＲＰ６の切断部位をブロックするように第１の領域及び／又は第２の領域に結合することができる。また、本抗体は、ＬＲＰ５及びＬＲＰ６を結合対象とするものであって、当該結合を切断又は妨げることができる全てのタンパク質（すなわち、ＡＤＡＭタンパク質に限らない）によるＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤として機能することができる。例えば、ＬＲＰ５及びＬＲＰ６の細胞外領域の切断及び除去によるＷｎｔシグナル伝達経路に関与するタンパク質としては、補体プロテアーゼ（Ｃ１ｓなど）、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ-２など）、ＢＡＣＥ（βセクレターゼ）等が挙げられる。
【００５０】
（Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化によって促進される疾患の予防又は治療剤）
本抗体は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化によって促進される疾患の予防又は治療剤（以下、単に、本治療剤ともいう。）として用いることができる。本抗体は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害できるからである。
【００５１】
ここで、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化によって促進される疾患としては、例えば、以下の疾患が挙げられる。
（１）癌
例えば、大腸癌（例えば、結腸直腸癌腫（ＣＲＣ））、黒色腫、乳癌、肝臓癌、肺癌、胃癌、悪性髄芽腫および他の原発性ＣＮＳ悪性神経外胚葉腫瘍、横紋筋肉腫、消化管由来腫瘍（食道、胃、膵臓および胆管系の癌、前立腺および膀胱癌が挙げられるが、これらに限定されない。なお、本開示を限定するものではないが、仮足の先端部分にＡＤＡＭタンパク質が発現して癌の浸潤を促進すると推測されている。
（２）骨関連障害
例えば、骨折の場合、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）が健常対象と比較して異常におよび／または病理学的に高い障害および骨ミネラル密度（ＢＭＤ）が健常対象と比較して異常におよび／または病理学的に低い障害又は疾患、骨硬化症、Ｖａｎ  Ｂｕｃｈｅｍ症候群、骨過成長障害およびＳｉｍｐｓｏｎ−Ｇｏｌａｂｉ−Ｂｅｈｍｅｌ症候群（ＳＧＢＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。
（３）炎症（とくに、喘息）
ＡＤＡＭ３３は喘息のリスクファクターであり、ＡＤＡＭ３３及びＡＤＡＭ８が喘息患部で高発現している。Ｗｎｔシグナルが喘息患部で活性化されており、Ｗｎｔ阻害剤で抑制されることが報告されている。
（４）糖尿病性血管症（とくに糖尿病性網膜症）
ＡＤＡＭ９、１５ノックアウトで糖尿病モデル動物の血管新生が抑制されることが報告されている。また、患部でＷｎｔシグナルの活性化が起こっていることが報告されている。
（５）動脈硬化（とくに冠動脈硬化）
ＡＤＡＭ８のＳＮＰが喫煙と同程度の心筋梗塞のリスクファクターであることが報告されている。ＬＲＰ６のＳＮＰが心筋梗塞のリスクファクターであることが報告されている。
（６）そのほか
多発性嚢胞腎
【００５２】
本治療剤は、公知の薬学的に許容される担体とともに製剤化された組成物の形態を採ることができる。このような組成物は、１種又は２種以上の本抗体を有効成分として含むことができる。
【００５３】
本明細書において使用される“薬学的に許容される担体”は、生理学的に適合するあらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。担体は（例えば、注射または注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与に適しているべきである。投与経路に依存して、活性化合物を、化合物を不活性にし得る酸および他の天然条件の作用から化合物を保護するために物質でコーティングし得る。
【００５４】
本治療剤は１つ以上の薬学的に許容される塩を含み得る。“薬学的に許容される塩”は所望の親化合物の生物学的活性を保持するが、望ましくない毒性作用を付与しない塩を意味する。このような塩の例は酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は無毒性の無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸など、ならびに無毒性の有機酸、例えば、脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などに由来するものを含む。塩基付加塩はアルカリ土金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど、ならびに無毒性の有機アミン、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどに由来するものを含む。
【００５５】
本治療剤は、薬学的に許容される抗酸化剤を含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例は：水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガレート、アルファ−トコフェロールなど；および金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などを含む。
【００５６】
また、本治療剤は、適当な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれの適当な混合物、植物油、例えば、オリーブ油、および注入可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルを含む。適当な流動性は、例えば、コーティング剤、例えば、レシチンの使用、分散物の場合、必要な粒径の維持および界面活性剤の使用により維持することができる。
【００５７】
本治療剤は、この他、アジュバント、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤を含み得る。微生物存在の防止は上記殺菌手順ならびに種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含により確保され得る。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを組成物に包含させることが望ましいこともある。加えて、注射可能な医薬形態の吸収の延長は吸収を遅らせる薬物、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの包含により実現され得る。
【００５８】
本治療剤における本抗体量は、有効量、治療用途や製剤形態によって適宜設定されるが、例えば、約０．０１％から約９９％、約０．１％から約７０％または約１％から約３０％の範囲とすることができる。
【００５９】
本治療剤の投与量は、治療用途、有効量、投与経路、性別、疾患の程度等によって適宜設定される。概して、抗体の投与に関して、用量は約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、さらに通常、０．０１から５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。例えば、用量は０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重または１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。典型的な処置レジメンは１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１月に１回、３月に１回または３から６月に１回の投与を必要とする。
【００６０】
本治療剤は、１つ以上の当分野で既知の種々の方法を使用して、１つ以上の投与経路により投与することができる。投与様式および／または投与経路は所望の結果に依存して変化することが、当業者に理解される。例えば、本治療剤の投与経路は、注射または注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口経路の投与を含む。本明細書において使用されるフレーズ“非経口投与”は通常、注入による経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管的、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入が含まれるが、これらに限定されない。本治療剤は、また、例えば、局所、上皮または粘膜経路の投与、例えば、鼻腔内、経口的、経膣的、経直腸的、舌下的または局所的により投与することができる。
【００６１】
（ＡＤＡＭタンパク質の作用阻害方法）
本明細書に開示されるＡＤＡＭタンパク質の作用阻害方法は、ＬＲＰ５又はＬＲＰ６若しくはこれらの部分ペプチドを発現する生体外細胞において、ＬＲＰ５又はその部分ペプチドについては配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又はＬＲＰ６又はその部分ペプチドについては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域に対するＡＤＡＭタンパク質の結合を本抗体を用いて阻害する工程、を備えることができる。かかる作用阻害方法によれば、各種動物の生体外細胞において、ＬＲＰ５及びＬＲＰ６に
に対するＡＤＡＭタンパク質の作用を阻害することができる。
【００６２】
また、ＡＤＡＭタンパク質の作用阻害方法は、非ヒト動物に対して本抗体を投与することにより、ＬＲＰ５及びＬＲＰ６に対するＡＤＡＭタンパク質の作用を阻害することができる。
【００６３】
これらの作用阻害方法において、ＡＤＡＭタンパク質の作用の阻害の程度は、例えば、ＡＤＡＭタンパク質の作用によって切断除去されるＬＲＰ５又はＬＲＰ６の細胞外領域をウエスタンブロット等で評価してもよいし、細胞間接着部の崩壊を観察することによってもよいし、あるいは生体における出血程度を評価することによってもよい。さらには、細胞におけるアクチンリッチ仮足の形成程度を観察することなどによっても行うことができる。
【００６４】
ＡＤＡＭタンパク質の作用阻害方法を、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害方法としても実施できる。ＬＲＰ５の第１の領域及びＬＲＰ６の第２の領域を認識して結合する本抗体により、補体プロテアーゼ（Ｃ１ｓなど）、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ-２など）、ＢＡＣＥ（βセクレターゼ）などによるＷｎｔシグナル伝達経路を阻害することができるからである。Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害の程度は、例えば、カドヘリンまたはカテニンの細胞膜から細胞質への移行を観察すること、あるいはそれを細胞分画後にＥＬＩＳＡで評価すること、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６の細胞内リン酸化を抗リン酸化抗体を用いて評価すること等によって評価することができる。
【００６５】
（Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化レベルの評価方法）
本明細書に開示されるＷｎｔシグナル伝達経路の活性化レベルの評価方法は、ＬＲＰ５又はＬＲＰ６若しくはこれらの部分ペプチドを発現する生体外細胞に対して、ＬＲＰ５又はその部分ペプチドについては配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又はＬＲＰ６又はその部分ペプチドについては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域を認識して結合する抗体を供給する工程と、前記第１の領域及び／又は前記第２の領域に結合する抗体量を評価する工程と、を備えることができる。この評価方法によれば、細胞表層における抗体量を評価することで、当該細胞のＷｎｔシグナル伝達経路の状態を評価することができる。すなわち、細胞表層のＬＲＰ５及びＬＲＰ６の第１の領域及び第２の領域に結合した本抗体の量は、Ｗｎｔシグナル伝達経路が活性化されていない、すなわち、抑制された状態にあることを意味するほか、ＡＤＡＭタンパク質やその他のＷｎｔシグナル伝達経路関連タンパク質によって活性化されうる状態にあることを意味している。
【００６６】
細胞表層のＬＲＰ５及びＬＲＰ６に結合した本抗体の量はＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、フローサイトメトリ等によって検出し評価することができる。
【００６７】
（Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化に関連する疾患又は病態の診断を補助する方法）
本明細書に開示される診断補助方法は、ＬＲＰ５又はＬＲＰ６若しくはこれらの部分ペプチドを発現する生体外細胞に対して、ＬＲＰ５又はその部分ペプチドについては配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又はＬＲＰ６又はその部分ペプチドについては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域を認識して結合する抗体を供給する工程と、前記第１の領域及び／又は前記第２の領域に結合する抗体量を評価する工程と、を備え得ることができる。この方法によれば、抗体量に基づいて細胞におけるＷｎｔシグナル伝達経路の活性化レベルを評価することができる。活性化レベルにより、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化に関連する疾患の、予兆、改善、予後、治療効果の判断などの診断を補助することができる。なお、抗体量は、既述のとおり周知の方法で測定することができる。
【００６８】
（ＡＤＡＭタンパク質の作用阻害剤のスクリーニング方法）
本明細書に開示されるスクリーニング方法は、ＬＲＰ５又はＬＲＰ６若しくはこれらの部分ペプチドを発現する生体外細胞又は非ヒト動物に対して、１又は２以上の被検化合物を供給してＬＲＰ５又はその部分ペプチドについては配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又はＬＲＰ６又はその部分ペプチドについては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域に対するＡＤＡＭタンパク質の作用の阻害の程度を評価する工程、を備えることができる。このスクリーニング方法によれば、被検化合物の添加によってＡＤＡＭタンパク質によるＬＲＰ５及びＬＲＰ６の作用部位における切断除去が阻害される程度、すなわち、ＡＤＡＭタンパク質の作用の阻害の程度を評価することで、有用な阻害剤候補をスクリーニングできる。なお、ＡＤＡＭタンパク質の作用の阻害の程度は、ＡＤＡＭタンパク質の作用の阻害方法と同様にして実施することができる。
【００６９】
被験化合物としては、抗体などのタンパク質、アプタマー、低分子化合物等、特に限定されない。
【００７０】
（Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害剤のスクリーニング方法）
また、本明細書に開示される別のスクリーニング方法は、ＬＲＰ５又はＬＲＰ６若しくはこれらの部分ペプチドを発現する生体外細胞又は非ヒト動物に対して、１又は２以上の被検化合物を供給してＬＲＰ５又はその部分ペプチドについては配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる第１の領域又はＬＲＰ６又はその部分ペプチドについては配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる第２の領域に対するＷｎｔシグナル伝達経路関連タンパク質の結合の阻害の程度を評価する工程を備えることができる。このスクリーニング方法によれば、被検化合物の添加によってＷｎｔシグナル伝達経路関連タンパク質によるＬＲＰ５及びＬＲＰ６の作用部位における切断除去が阻害される程度、すなわち、Ｗｎｔシグナル伝達経路関連タンパク質の作用の阻害の程度を評価することで、有用な阻害剤候補をスクリーニングできる。なお、被験化合物、シグナル伝達経路関連タンパク質の作用の阻害の程度は、ＡＤＡＭタンパク質の作用の阻害方法と同様にして実施することができる。
【実施例】
【００７１】
以下、本明細書に開示される実施形態の具体例等について説明するが、本明細書の開示は、以下の実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００７２】
（材料と方法）
１．試薬
ＶＡＰ１とＶＡＰ２は、参考文献のように精製した（増田ほか、1998）。 要約すると、ガラガラヘビCrotalus atrox（シグマアルドリッチ、セントルイーズ、MO、USA）の素毒から、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーと陰イオン・イオン交換クロマトグラフィーによって分離された。ヒトリコンビナントＬＲＰ６-Ｆｃタグ、ヒトＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ１２、ＶＥ-カドヘリンとマウスＬＲＰ６-Ｈｉｓタグ、ＬＲＰ５-Ｈｉｓタグは、R&Dシステム社（ミネアポリス、MN、USA）から購入した。
【００７３】
２．細胞培養
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ベクトンディッキンソン社（フランクリンレイク、NJ、USA）から購入した。 ＦＧＦは参考文献に記述されるように、精製された。ＨＵＶＥＣは１０％ウシ胎児血清、ＦＧＦを含むＭＣＤＢ１０５培地（シグマアルドリッチ、セントルイーズ、MO、USA）で３７℃で培養された。マウスＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞（エンツォ・ライフサイエンス社、Farmingdale、USA）は３７℃で１０％ウシ胎児血清を含むＭＣＤＢ１０５培地で培養された。
【００７４】
３．質量分析
切断断片と対照は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された。ゲルは、ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔＴＭ銀染色試薬（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、MA、USA）で染色されたあと、断片バンドに切り分けられた。バンドは、ゲル内消化をし、 ＤＴＴとヨードアセトアミドによる処置の後、５０mMの重炭酸アンモニウム中で０．０１g/mLトリプシンで３７℃一晩処理した。 消化物は、液体クロマトグラムＵｌｔｉｍａｔｅ３０００（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、MA、USA）と質量分析計ＬＴＱ−ＸＬ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）を用いたＬＣ／ＭＳ分析された。結果は、ＬＣ／ＭＳ分析で、３回確かめられた。
【００７５】
４．ウェスタンブロット
収集された細胞は、各々の溶解バッファで溶解した。 サンプルは、ＳＤＳ電気泳動の後、ＰＶＤＦ膜に転写された。ＴＢＳＴバッファ中、５％脱脂乳でブロッキングした後に、膜は抗ヒトＬＲＰ６ポリクローンヤギ抗体（R&Dシステム社、ミネアポリス、MN、USA）の示された量でインキュベートした。膜はＴＢＳＴで洗浄し、１／４０００の抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（サンタクルス・バイオテクノロジー社、ダラス、テキサス、USA）でインキュベートした。反応したバンドは化学発光（ECLプライム、GE Healthecare、リトル・チャルフォント、英国）によって検出した。
【００７６】
５．蛍光免疫染色
細胞は４％のパラホルムアルデヒドで固定され、１％脱脂乳でブロッッキングされ、０．１％のサポニンで透過処理し、１／２００の抗ＶＥ−カドヘリン抗体（BECKMAN COULTER）または１／２００の抗-γ-カテニン抗体（Novus Biologicals、ミネアポリス、MN、USA）で一晩インキュベートした。細胞は３回ＴＢＳで洗い、Ａｌｅｘａ４８８を結合した抗マウスＩｇＧ抗体（インビトロゲン、カールズバッド、CA、USA）でインキュベートした。染色像は、倒立蛍光顕微鏡（IX83、オリンパス、東京）で観察した。
【００７７】
６．中和抗体実験
ＬＲＰ６のＶＡＰ１−切断部位近傍のペプチド（VKELNLQEY）に対して常法に従いウサギ抗血清が作製された。ポリクローナル抗体と対照ウサギ血清は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａを用いて抗血清から常法に従い精製された。ＨＵＶＥＣを１．３５ｍｇ/ｍｌの各々の抗体で１時間インキュベート後、１４０ｎｇ/ｍｌ のＶＡＰ１で１時間処理された。
【００７８】
７．出血実験
ＬＲＰ６切断部抗血清または対照血清２０μl と、５μg ＶＡＰ１は、雄マウスの剃った背の皮膚の左右対称な２点に各々皮内注射された。１時間後に、マウスは処理され、皮膚は慎重に取り出された。その後、皮膚の内面の出血量が測定された。 出血斑の出血インデックスは、デンシトメトリー（CSアナライザー、ATTO、東京、日本）による赤色密度の総和として計算された。
【００７９】
８．統計解析
データ（平均±標準エラー）は、スチューデントのｔ検定を使って分析された。出血分析での2グループ解析は、ペアードｔ検定によって評価された。Ｐ値は０．０５以下を有意差ありとした。
【実施例２】
【００８０】
（ＶＡＰ１によるＶＥ−カドヘリンとγカテニンの局在変化の誘導）
ヘビ出血ＡＤＡＭ毒素ＶＡＰ１は、培養血管内皮細胞の細胞間解離を誘導するかどうについて実験した。細胞間解離のメカニズムを解明するために、細胞間接着因子へのＶＡＰ１の作用を調査した。ＶＡＰ１処置によって、ＶＥ−カドヘリンは細胞間接着部から消えて、局在が細胞質へ移動した（図５Ａ）。ここで、ＶＥ−カドヘリンはＡＤＡＭ１０によって切断され遊離されることがあることが報告されている（シュルツ、2008）。そこでＶＥ−カドヘリンがＶＡＰ１によって切断されて、除去されるかどうかを調査した。
【００８１】
細胞のＶＥ−カドヘリンの量はＶＡＰ１インキュベーションによって変わらなかった（図５B）。そして、ＶＡＰ１はヒトＶＥ−カドヘリン（図５Ｃ）の組み換え型タンパク質を切断しなかった。したがって、ＶＥ−カドヘリンはＶＡＰ１によって直接切断されないと考えられた。そこで、我々はＶＡＰ１処理された培養血管内皮細胞におけるカテニン類を観察した。今回の臍帯静脈血管内皮細胞の実験条件では、β-カテニンは細胞間接着部に存在せず、γカテニンが存在した（図５Ｄ）。ＶＡＰ１は細胞間接着部の細胞膜から細胞質へγ-カテニン移動を誘導した（図５Ｄ）。したがって、ＶＡＰ１はＶＥ−カドヘリンとγ-カテニンの局在変化を誘導できることが実証された。
【実施例３】
【００８２】
（ＶＡＰ１によるＬＲＰ６活性化部位の切断）
ＶＡＰ１がカテニンの局在変化を誘導したことから、我々はＷｎｔ受容体のＬＲＰ６を調べた。β-プロペラ領域を除去されたＬＲＰ６は、Ｗｎｔ経路シグナリングの常時活性型であることが知られている。そこで我々はＶＡＰ１に、ＬＲＰ６の切断活性があるかどうかを調べた。ＬＲＰ６を多く持っているNIH3T3細胞で、ＶＡＰ１とのインキュベーションにより、ＬＲＰ６が消失した（図６Ａ）。また、ＶＡＰ１はヒトＬＲＰ６の細胞外領域の組み換え体タンパク質を１４０kDaと６０kDaの断片に切断した。ほとんどすべてのＡＤＡＭタイプのヘビの毒メタロプロテアーゼにおいてもっとも感度が高い基質であることが知られているフィブリノゲーンαチェーンよりも速く、ＶＡＰ１はＬＲＰ６を切断した（図６Ｂ）。 同様に、ＶＡＰ１は、マウスＬＲＰ６組み換え体も切断し、１４０kDaの断片を生産した（図６Ｃ）。 そして、より多くの量を必要とするが、ＶＡＰ２（もう一つの出血ＡＤＡＭ毒素）もＬＲＰ６を切断した（データ非掲載）。
【００８３】
１４０kDaと６０kDaの断片の質量分析により、ＶＡＰ１が第４β-プロペラドメイン（第４−ＥＧＦドメインを含まない）（図６Ｄ）のＣ末端である glu1196-leu1197でＬＲＰ６を切断したことが示された。断片の配列から予測された分子量は、電気泳動での見た目の分子量に一致している。 切断部位のＰ１’位アミノ酸は疎水性アミノ酸（ロイシン）であり、それはＶＡＰ１の３次元構造のＳ１’の疎水的なポケットと一致している。このＬＲＰ６切断部位は、ＶＡＰ１が、ＬＲＰ６の活性を抑制する４つの全てのβ-プロペラドメインをＬＲＰ６から取り外すことを意味する（マオ、Bほか、2001;ブレナンほか、2004）。
【００８４】
残った細胞外ＬＤＬＡ領域は、ＬＲＰ６の先端を失った常時活性型のミュータントにおいて活性を促進する領域であることが知られている（マオ、Bほか（2001）;ブレナンほか、2004;チェンほか2014）。したがって、ＡＤＡＭ毒素ＶＡＰ１は常時活性型になるとされる部位でＬＲＰ６を切断することが示唆された。
【実施例４】
【００８５】
（ＶＡＰ１によるＬＲＰ５の切断）
細胞外領域を欠失したＬＲＰ５変異体も、ＷＮＴ経路の常時活性型であることが知られている（マオ、Jほか（2001）。そこで我々はＡＤＡＭ毒素が、ＬＲＰ６と同様に、ＬＲＰ５を切断するかどうかを調べた。ＶＡＰ１はマウス組み換え体ＬＲＰ５を切断したが、ＬＲＰ５を切断するのにＬＲＰ６より多い量を必要とした（図７Ａ）。ＬＲＰ６と同様に、１４０kDの断片が得られた（図７Ｂ）。この１４０kDaの質量分析の結果、ＶＡＱＨＬＴＧＩＨＡＶＥＥのペプチドが検出され、ＶＡＰ１がglu1206-val1207でＬＲＰ５を切断することが示唆された。それはＶＡＰ１のＬＲＰ６−切断部位と同じドメイン構造上の位置である（図７Ｃ）。Ｐ１’位アミノ酸はＬＲＰ６における場合と同じように疎水性アミノ酸であり、金属プロテアーゼの性質と一致する。
【００８６】
ＶＡＰ１−切断部位のＰ２’とＰ１アミノ酸においては、ＬＲＰ５とＬＲＰ６の間に共通の関係は見られなかった（図７Ｄ）。Ｐ３’位アミノ酸であるＬＲＰ５/６のロイシンは、ＶＡＰ１の３５６−ロイシンと３２４−イソロイシンからなる潜在的Ｓ３’ポケットの疎水性部分と矛盾しない（図７Ｅ）。欠失したＬＲＰ５もＷＮＴ経路の常時活性型であるので（マオ、Jほか（2001））、より多くの量は必要とするが、このＡＤＡＭ毒素はＬＲＰ６だけでなくＬＲＰ５も活性化させる能力を持っていると考えられる。
【実施例５】
【００８７】
（ＶＡＰ１によるＬＲＰ６切断の細胞間接着部（細胞間ジャンクション）の崩壊への関与）
ＬＲＰ６の切断がＶＡＰ１によって誘導された細胞反応に関与しているかどうか調べるために、我々はＶＡＰ１によるＬＲＰ６切断に対しての抑制抗体を作った。抗ＬＲＰ６切断部抗体は、ＶＡＰ１によるＬＲＰ６の切断と１４０kDa断片の生産を有意に妨げた（図８ＡＢ）。阻害抗体は、位相差顕微鏡による観察においてＶＡＰ１による内皮細胞の細胞間接着の解離を妨げた（図８Ｃ）。同時に、ＶＡＰ１によって誘導された細胞間ジャンクションのＶＥ−カドヘリンの消失も、抗体によって阻害された（図８Ｃ）。これらは、ＶＡＰ１によるＬＲＰ６切断が細胞間ジャンクションの崩壊に関与していることを示唆する。なお、対照抗体として、ヒトＬＲＰ６の細胞外ドメイン全体の組み換え体に対するモノクローン抗体 (MAB1505, R&Dシステムズ) を用いたところ、図８に示すように、有意な断片生成、細胞間接着の解離の抑制は観察されなかった。同様に、ヒトＬＲＰ６の細胞外ドメイン全体の組み換え体に対するポリクローン抗体（AF1505, R&Dシステムズ）、及びＬＲＰ６に結合するタンパク質である、ヒトＲＡＰ (Receptor-associated protein) 組み換え体 (エンゾ・ライフサイエンシズ)を用いても、同様の結果が得られた。
【実施例６】
【００８８】
（ＶＡＰ１によるＬＲＰ６切断の生体での出血への関与）
我々は、生体でＶＡＰ１によって誘導される出血にＬＲＰ６切断が関係しているかどうかを調査した。切断抑制抗体は、ＶＡＰ１の皮内注射において、対照抗体と比較して出血を有意に妨げた（図９）。これは、ＶＡＰ１による生体内で出血にＬＲＰ６切断が関与することを示唆している。
【実施例７】
【００８９】
（各種動物におけるＬＲＰ５／６の切断活性化に関する領域の欠失）
ＬＲＰ５／６の切断活性化がヘビＡＤＡＭ毒素による出血に関係しているとすると、ヘビ毒抵抗性の動物の間で、出血耐性に都合がいいようにＬＲＰ５／６が変異している種が存在するかもしれない。 出血耐性は、毒蛇、フクロネズミ（オポッサム）、マングース、ハリネズミ、ジリス、ネズミ、ラクダなどで報告されている（ノグチ、1909; ガランほか、2004; マドセンとノグチ、1907;ハリソンほか2006）。ＮＣＢＩデータベースを調査した結果、人間、マウス、モルモットを含む多くの動物で、ＬＲＰ５／６が第１およびまたは第２β-プロペラ領域でしばしば欠失が見られた（図１０ＡＢ）。
【００９０】
ＡＤＡＭ毒素を持っていないパイソンとグリーンアノール・トカゲの、ゲノムから予測されたＬＲＰ５／６には、欠失したアイソフォームは見つからなかった。タスマニアンデビル（それはフクロネズミと共に有袋類に属する）も欠失したアイソフォームは見つからなかった。蛇咬傷における出血耐性動物では、キングコブラは出血ＡＤＡＭ毒素を持ち、ＡＤＡＭ毒素に対する出血抵抗性を示すことが報告されている（Chanhomeほか、2003）。キングコブラでは、ＬＰＲ６のＶＡＰ１切断部位が欠失していた（図１０Ａ）。グレイ・ショートテイル・フクロネズミでは、予測されたＬＰＲ６の３つのアイソフォームのうち2つのアイソフォームで、細胞外ＬＤＬＡドメインが欠失していた（図１０Ａ）。
【００９１】
キングコブラＬＰＲ６もＬＤＬＡ領域が欠失している。ＬＤＬＡ領域は、ＬＰＲ６欠失変異体における常時活性化に貢献している（マオ、Bほか、2001;ブレナンほか、2004;チェンほか2014）。ＬＰＲ５に関しては、ネズミ、ヒトコブラクダ、ヨーロッパハリネズミで、ＬＰＲ５のＬＤＬＡ領域の1つが欠失している（図１０Ｂ）。サーティーンラインド・ジリスでは、ＬＰＲ５のＶＡＰ１切断部が非相同配列に置換していた（図１０Ｂ）。レッサーハリネズミでは、ＬＰＲ５のＶＡＰ１切断部位の20アミノ酸ばかりだけが欠失していた（図１０Ｂ）。上記を要約すると、ヘビ毒耐性と関連したこれらの動物はＶＡＰ１切断部位やＬＤＬＡ領域を失った特徴的な欠失ＬＲＰ５／６を持っていた。興味深いことには、これらの動物がＬＰＲ６とＬＰＲ５の両方ではなく、どちらか一方がその領域を欠失していた。これらの動物以外では、ＬＰＲ５／６の特徴的欠失は、ヤギのような穏やかな蛇毒出血耐性を示すものや（マドセンとノグチ（1907））、トラ、クマ、オランウータンのような出血耐性についてよく知られていないものでも見られた。
【実施例８】
【００９２】
（ヒトＡＤＡＭ８とＡＤＡＭ１２組み換え体によるＬＰＲ６の切断）
ＶＡＰ１のＬＰＲ６切断活性化が、ヒトを含む動物のＡＤＡＭファミリーの間での共通な性質である可能性を知るために、我々は、ＶＡＰ１と高い相同性のアミノ酸配列を持っているヒトＡＤＡＭ８とＡＤＡＭ１２の組み替え体を用いた。ヒトＡＤＡＭ８とＡＤＡＭ１２組み換え体の両方ともＬＰＲ６を切断し、ＶＡＰ１の場合と同じサイズの１４０kDaの断片を作った（図１１ＡＢ）。このとき、ＶＡＰ１と比較すると活性は非常に弱かった。１４０kDaの断片の質量分析の結果、ＶＡＰ１と同じ切断部位断片IAQLSDIHEVKEが、ＡＤＡＭ８とＡＤＡＭ１２で検出された。それはこのＬＰＲ６切断とＷＮＴ信号の活性化が、ヘビＡＤＡＭ毒素とヒトなどの哺乳類のＡＤＡＭの間の共通の機能であることを示唆している。
【図１】
2018154608.tif 000002
【図２】
2018154608.tif 000003
【図３】
2018154608.tif 000004
【図４】
2018154608.tif 000005
【図５】
2018154608.tif 000006
【図６】
2018154608.tif 000007
【図７】
2018154608.tif 000008
【図８】
2018154608.tif 000009
【図９】
2018154608.tif 000010
【図１０】
2018154608.tif 000011
【図１１】
2018154608.tif 000012
【配列表】
2018154608000001.app