(57)【要約】【課題】癌の判定において、安定な内在性コントロールを用いた検出体系の確立を行い、腫瘍特定的な循環ｍｉＲＮＡを同定し、判定の有用性、正確性を高めるとともに、採取する試料量を減らす。【解決手段】対象から得られた血液試料中のＡｇｏ２と複合体を形成しているマイクロＲＮＡ（Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡ）の発現量を測定することを特徴とする癌の判定方法であって、詳細には、対象から得られた試料中のＡｇｏ２−ｍｉＲ−２１および／またはＡｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃの発現量を測定する際に、同試料中のＡｇｏ２−ｍｉＲ−４５１にて発現量を補正するとともに、プレクリア法にて試料中の挟雑物を除去することを特徴とする癌の判定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から得られた血液試料中のＡｇｏ２と複合体を形成しているマイクロＲＮＡ（Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡ）の発現量を測定することを特徴とする癌の判定方法。
【請求項２】
Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡが、
（１）細胞死により受動的に血液中に放出されるＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡ、および／または
（２）生きている細胞が能動的に放出するＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡ、および／または
（３）細胞死により受動的に血液中に放出され、かつ生きている細胞が能動的に放出するＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡ
である請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡがＡｇｏ２−ｍｉＲ−２１および／またはＡｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
血液試料中のＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡを同試料中のＡｇｏ２−ｍｉＲ−４５１の発現量にて、その発現量を補正することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡの発現量を測定する前に、プロテインＡ／Ｇアガロースを用いて試料中の非特異的な抗体および蛋白を除去することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１の発現量を測定し、対象における再発を含む癌の存在の判定、抗癌剤治療の効果の予測、あるいは抗癌剤の種類や投与量の決定を行うことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
対象における早期癌の検出または早期の再発の予測を行うことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃの発現量を測定し、癌転移の予測、転移巣に対する抗癌剤治療の効果の予測、あるいは抗癌剤の種類や投与量の決定を行うことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
血液試料中のＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡの発現量を測定するための手段を含む、癌の判定を行うためのキット。
【請求項１０】
Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡがＡｇｏ２−ｍｉＲ−２１および／またはＡｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃである請求項９記載のキット。
【請求項１１】
さらに血液試料中のＡｇｏ２−ｍｉＲ−４５１の発現量を測定するための手段を含む請求項９または１０記載のキット。
【請求項１２】
さらにプロテインＡ／Ｇアガロースを含む請求項９〜１１のいずれか１項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の判定に関する。詳細には、対象から得られた試料中のＡｇｏ２と複合体を形成しているマイクロＲＮＡの発現量を測定することによる癌の判定に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、癌を血液からスクリーニングするマーカーは、腫瘍マーカーと総称される。腫瘍マーカーとは、癌の進行とともに増加する生体因子を指し、血中に遊離してくるそれら生体因子を抗体にて検出するものが多い。多くの腫瘍マーカーは健康人であっても血液中に存在するので、腫瘍マーカー単独で癌の存在を診断できるものは少数である。癌患者の腫瘍マーカーを定期的に検査することは、再発の有無や病勢、手術で取りきれていない癌や画像診断で見えない程度の微小な癌の存在を知る上で、確実ではないが有用な方法である。しかしながら、通常は、腫瘍マーカーは進行した癌の動態を把握するのに使われるもので、早期診断に使える検査法ではない。従って、これらの生体因子ではなく腫瘍自体に起きている遺伝子変異を血中から検出する試みも行われているが、現在までに臨床応用に至っていない。現在、血液中から腫瘍由来の遺伝子変異を検出することはリキッド・バイオプシー（Liquid Biopsy）と総称され、世界中にて積極的に研究が行われている分野である。具体的には、遺伝子突然変異自体を検出する方法（非特許文献１）、腫瘍に特異的に起こるとされるシトシンのメチル化を検出する方法、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を検出する方法（非特許文献２）、腫瘍が産生する小胞体を検出する方法などが臨床応用に向けて開発応用が進められている（非特許文献３）。
【０００３】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ゲノム上にコードされ、多段階的な生成過程を経て最終的に２０から２５塩基長の微小ＲＮＡとなる機能性核酸である。この鎖長の短いｍｉＲＮＡは、機能性のｎｃＲＮＡ（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ：タンパク質へ翻訳されないＲＮＡの総称）に分類され、メッセンジャーＲＮＡに相補的に結合することにより、その発現を調節するという、生命現象において重要な役割を担っている（非特許文献４、５）。近年、ｍｉＲＮＡは血液中にも安定して存在していることが示され（非特許文献６）、またその血液中のｍｉＲＮＡ（循環ｍｉＲＮＡ）分布は臓器や疾患により異なった分布を示すことが示された（非特許文献７、８）。そして、血液中の特定のｍｉＲＮＡを検出することにより、大腸癌スクリーニングが可能であることも示唆されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】S. Misale et al., Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer. Nature 486, 532 (Jun 28, 2012)
【非特許文献２】Y. Toiyama et al., Serum miR-21 as a diagnostic and prognostic biomarker in colorectal cancer. Journal of the National Cancer Institute 105, 849 (Jun 19, 2013)
【非特許文献３】Y. Yoshioka et al., Ultra-sensitive liquid biopsy of circulating extracellular vesicles using ExoScreen. Nature communications 5, 3591 (2014)
【非特許文献４】R. C. Lee, V. Ambros, An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science 294, 862 (Oct 26, 2001)
【非特許文献５】V. Ambros, The functions of animal microRNAs. Nature 431, 350 (Sep 16, 2004)
【非特許文献６】J. Lu et al., MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature 435, 834 (Jun 9, 2005)
【非特許文献７】X. Chen et al., Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research 18, 997 (Oct, 2008)
【非特許文献８】A. Turchinovich, L. Weiz, A. Langheinz, B. Burwinkel, Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research 39, 7223 (Sep 1, 2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特定の循環ｍｉＲＮＡを検出する技術を臨床応用するには、解決しなければならない問題点が存在する。１つは、安定な内在性コントロールを用いた検出体系の確立を行うことである。２つ目は腫瘍特定的な循環ｍｉＲＮＡを同定することである。３つ目は検出を行う際の試料量を減らすことである。また、現在までの報告では、循環ｍｉＲＮＡ検出の際には以下の概念を考慮して検出を行っていないことも問題となる。循環ｍｉＲＮＡはＲＮＡ分解酵素に対し安定であるとされている。それは主に２つの特徴的形態によるものと考えられている。１つは、エクソソームなどの細胞外小胞と言われる膜小胞に包まれた形での存在（ＥＶ−ｍｉＲＮＡ）と、もう１つは、ＲＮＡ結合蛋白であるアルゴネイチャーファミリーとの複合体形成（特にＡｇｏ２タンパクとの複合体、Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡ）よる安定化である。現在までに得られた知見では、ＥＶ−ｍｉＲＮＡは生きている癌細胞から能動的に放出され、Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡは死んだ癌細胞から受動的に放出されるという現象が報告されている（H. Valadi et al., Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature cell biology 9, 654 (Jun, 2007)およびS. A. Melo et al., Cancer exosomes perform cell-independent microRNA biogenesis and promote tumorigenesis. Cancer cell 26, 707 (Nov 10, 2014)）。この分泌形態の差は非常に重要であると考えられる。何故ならば、例えば、化学療法中の採血にて、血漿中ＥＶ−ｍｉＲＮＡの存在は、生体内に残存する生きている癌細胞の存在を意味し、血漿中Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡの存在は、がん細胞の死を反映、すなわち、化学療法の奏功度を反映する可能性があるからである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明者らは、まず、ＥＶ−ｍｉＲＮＡとＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡに対する検討を行い、生きている癌細胞由来のｍｉＲＮＡと死んだ癌細胞由来のｍｉＲＮＡの同定を試みた。また、併せて、微量の血漿にて検出を行える技術の開発も行った。
【０００７】
本発明者らは鋭意研究を行い、癌マーカーとしてＥＶ−ｍｉＲＮＡでなく、検出、測定が容易なＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡのみを用いることができることを見出した。Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１とＡｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃを選定し、コントロールとしてＡｇｏ２−ｍｉＲ−４５１を用いる癌の判定系を開発することに成功した。また、本発明者らは、プロテインＡ／Ｇアガロースを用いて、予め試料中の非特異的な抗体および蛋白を除去することにより、極めて微量の試料量（１０〜６０μＬの血漿試料）であっても癌を判定できることを示した。以上のことから本発明者らは本発明を完成させた。
【０００８】
本発明は以下に関する：
（１）対象から得られた血液試料中のＡｇｏ２と複合体を形成しているマイクロＲＮＡ（Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡ）の発現量を測定することを特徴とする癌の判定方法。
（２）Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡが、
・細胞死により受動的に血液中に放出されるＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡ、および／または
・生きている細胞が能動的に放出するＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡ、および／または
・細胞死により受動的に血液中に放出され、かつ生きている細胞が能動的に放出するＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡ
である（１）記載の方法。
（３）Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡがＡｇｏ２−ｍｉＲ−２１および／またはＡｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃである（１）または（２）記載の方法。
（４）血液試料中のＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡを同試料中のＡｇｏ２−ｍｉＲ−４５１の発現量にて、その発現量を補正することを特徴とする（１）〜（３）のいずれか記載の方法。
（５）Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡの発現量を測定する前に、プロテインＡ／Ｇアガロースを用いて試料中の非特異的な抗体および蛋白を除去することを特徴とする（１）〜（４）のいずれか記載の方法。
（６）Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１の発現量を測定し、対象における再発を含む癌の存在の判定、抗癌剤治療の効果の予測、あるいは抗癌剤の種類や投与量の決定を行うことを特徴とする（１）〜（５）のいずれか記載の方法。
（７）対象における早期癌の検出または早期の再発の予測を行うことを特徴とする（６）記載の方法。
（８）Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃの発現量を測定し、癌転移の予測、転移巣に対する抗癌剤治療の効果の予測、あるいは抗癌剤の種類や投与量の決定を行うことを特徴とする（１）〜（７）のいずれか記載の方法。
（９）血液試料中のＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡの発現量を測定するための手段を含む、癌の判定を行うためのキット。
（１０）Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡがＡｇｏ２−ｍｉＲ−２１および／またはＡｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃである（９）記載のキット。
（１１）さらに血液試料中のＡｇｏ２−ｍｉＲ−４５１の発現量を測定するための手段を含む（９）または（１０）記載のキット。
（１２）さらにプロテインＡ／Ｇアガロースを含む（９）〜（１１）のいずれか記載のキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、微量の試料（血漿であれば１０−６０μＬ）にて癌の判定が可能である。本発明において、従来の知見とは異なり、血液中に存在するＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡには２つの形態が認められることが示された。すなわち、細胞死により受動的に血液中に放出されるものと生きている細胞が能動的に放出するものの２種類が認められることが示された。よって、検出、測定が容易なＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡのみを用いて癌を判定することが可能となった。本発明において、Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡの発現量を測定する際に、ｍｉＲ−４５１が内在性コントロールとして用いることにより、癌の判定を正確に行うことができる。本発明において、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１が上記２つの形態を有していることがわかった。したがって、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１を測定することは、抗がん剤治療の効果を予測するだけでなく、再発の予測や、がんの診断に有用である。本発明において、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃも癌マーカーとして有用である。Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃは、特に転移巣に多く発現しているため、転移巣に対する抗がん剤治療の効果を予測するマーカーとして有益である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１−Ａ】図１−Ａは、ＷＳＴアッセイを用いて測定した細胞増殖および細胞の生物学的活性を示す。培養４８時間目に５−ＦＵを添加した。
【図１−Ｂ】図１−Ｂは、ＨＴ２９細胞株の培地中のｍｉＲ−３１およびｍｉＲ−３１の相対量を、定量的逆転写ＰＣＲにて評価した結果を示す図である。播種から２４時間後に得られたスレッショルドサイクル値（ΔＣｔ）の変化に基づいて、発現比を変化倍率で表す。培養４８時間目に５−ＦＵを添加した。
【図１−Ｃ】図１−Ｃは、コントロールについて、発現比をＷＳＴ吸光度の比で割って、相対発現インデックスを計算した結果を示す図である。培養４８時間目に５−ＦＵを添加した。
【図１−Ｄ】図１−Ｄは、５−ＦＵ処理細胞について、発現比をＷＳＴ吸光度の比で割って相対発現インデックスを計算した結果を示す図である。培養４８時間目に５−ＦＵを添加した。
【図２】図２は、Ａｇｏ２−免疫沈降およびＥＶ単離による培地中のｍｉＲＮＡ分析手順を示す図である。
【図３−Ａ】図３−Ａは、Ａｇｏ２−免疫沈降法およびＥＶ単離法を用いて各ｍｉＲＮＡの発現状態の関連性を調べた結果を示す図である。
【図３−Ｂ】図３−Ｂは、１００μｌの血漿から単離されたＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡおよびＥＶ−ｍｉＲＮＡのΔＣｔ値のスキャッターダイヤグラムである。すべての試料について、添加したｃｅｌ−ｍｉＲ−３９を正規化コントロールとして使用した。
【図３−Ｃ】図３−Ｃは、Ａｇｏ２−免疫沈降のみ、ＥＶ単離のみ、および両方法にて検出された１０種類の最も豊富なｍｉＲＮＡを示す表である。
【図４−Ａ】図４−Ａは、原発性腫瘍および対応する肝臓転移部位のグローバルｍｉＲＮＡ発現状態の関連性を、ＲＮＡマイクロアレイにより調べた結果を示す図である。ＣＴ１、ＣＴ２およびＬＴ１、ＬＴ２は、それぞれ、患者１および患者２から得たＣＲＣ（大腸癌）および肝臓転移標本を示す。
【図４−Ｂ】５９種類の選択されたｍｉＲＮＡのクラスター解析の結果を示す図である。ｍｉＲＮＡの発現は、正常組織よりも腫瘍組織において２倍よりも高いものであった。ヒトマップは、腫瘍組織と正常組織の間の発現比を示す。ＣＮ１、ＣＮ２およびＬＮ１、ＬＮ２は、それぞれ、患者１および患者２から得た正常大腸粘膜組織および正常肝臓組織を示す。
【図４−Ｃ】図４−Ｃは、ＨＴ２９細胞株の培地中のｍｉＲ−２００ｃの発現状態を、定量的逆転写ＰＣＲにて調べた結果を示す図である。播種から２４時間後に得られたΔＣｔ値に基づいた発現比を変化倍率で表す。
【図４−Ｄ】図４−Ｄは、培地中のｍｉＲ−２００ｃに関する相対発現インデックス（ＷＳＴ吸光度の比にて発現比を割ったもの）を示す図である。コントロールの相対発現インデックスを、生細胞由来のｍｉＲＮＡ、５−ＦＵ処理細胞由来のｍｉＲＮＡ、および５−ＦＵ処理後の細胞溶解によるｍｉＲＮＡの総量と見なす。５−ＦＵ処理期間は播種から４８時間以降であった。
【図５】図５は、プレクリア法の手順を示す図である。（Ａ）血漿をプロテインＡ／Ｇアガロースビーズとともにインキュベートする。（Ｂ）ビーズに非特異的に結合した溶解物をプレクリアする。（Ｃ）プレクリアされた溶解物。（Ｄ）Ａｇｏ２抗体を添加し、一緒にインキュベートすて、抗原―抗体複合体を形成させ、次いで、プロテインＡ／Ｇアガロースビーズを添加してこれらの複合体を免疫沈降させる。（Ｅ）ｍｉＲＮＡをビーズ−Ａｇｏ２複合体から分離し、逆転写ＰＣＲにて分析する。
【図６−Ａ】図６−Ａは、循環Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡの検出におけるプレクリア法の効果を示す図である。定量的ＰＣＲによってＡｇｏ２−免疫沈降物からＡｇｏ２−ｍｉＲ−４５１を回収した。すべての試料について、添加したｃｅｌ−ｍｉ−３９を正規化コントロールとして用いた。ｍｉＲＮＡレベルの相対倍率変化としてデータを示す。
【図６−Ｂ】図６−Ｂは、フロースルーから得られた１回目のＡｇｏ２−免疫沈降および２回目のＡｇｏ２−免疫沈降から回収されたｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、およびｍｉＲ−４５１の発現レベルを示す図である。抗−β−アクチン抗体をネガティブコントロールとして用いた。図は、３系の独立した実験の平均値および標準偏差を示す。
【図６−Ｃ】図６−Ｃは、Ａｇｏ２−免疫沈降から回収されたｍｉＲ−４５１に関するスキャッタープロットおよび相関係数、および血漿体積を示す図である。各体積に浮いて３系の独立した実験を行った。ｍｉＲＮＡレベルの相対倍率変化としてデータを示す。
【図６−Ｄ】図６−Ｄは、３０μｌの血漿を用いてＡｇｏ２−免疫沈降法およびＥＶ単離法により得られた各ｍｉＲＮＡのＣｔ値のスッキャッターダイヤグラムである。各プロットは３系の独立した実験の平均値を示す。
【図７】図７Ａは、血漿中の抗体およびプロテインＡ／Ｇアガロースゲルに結合する非特異的タンパクの評価を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。左から右へ、未処理血漿、Ａｇｏ２抗体のみ、未処理プロテインＡ／Ｇアガロース、プレクリアされた血漿、プレクリア工程後のプロテインＡ／Ｇアガロース、およびＡｇｏ２−免疫沈降物（１回目および２回目）である。Ａｇｏ２−免疫沈降のフロースルーを用いた。図７Ｂは、種々の血漿体積においてプレクリア法を行った後のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。上パネルはヒトＩｇＧのイムノブロッティングである。下パネルは、Ａｇｏ２−免疫沈降に適切な血漿体積を評価するためのＤＳＤ−ＰＡＧＥである。全部で２０μｌのプロテインＡ／Ｇアガロースゲルを１０〜１００μｌの血漿とともにインキュベートした。
【図８】図８Ａは、コントロール対象（ＣＳ，ｎ＝２０）および大腸癌患者（ＣＲＣ，  ｎ＝３９）から得られた血漿中のＡｇｏ２−ｍｉＲ−４５１、−２１および−２００ｃのＣｔ値を示す図である。図８Ｂは、ＣＳおよびステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶのＣＲＣから得られた血漿中のｍｉＲ−４５１に対するＡｇｏ２−ｍｉＲ−２１のΔＣｔ値（ΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）値）を示す図である。縦軸は、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−４５１に対して正規化されたＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡのΔＣｔ値を示す。図中のボックスは四分位数間領域を示し、各ボックスに引いた横線はメジアン値を示す。Wilcoxson検定を用いて統計学的有意差を決定した。ＮＳは統計学的に有意でないことを示す。点線は各Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡに関するカットオフ値を示す。点線よりも下のΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）値を異常値と見なす。図８Ｃは、１１人のＣＲＣの術前（Ｐｒｅ）および原発性腫瘍切除１年後（Ｐｏｓｔ）に得られた血漿中のＡｇｏ２−ｍｉＲ−２１のΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）値を示す図である。図８Ｄは、ＣＳおよびステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶのＣＲＣから得られた血漿中のｍｉＲ−４５１に対するＡｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃのΔＣｔ値（ΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）値）を示す図である。縦軸は、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−４５１に対して正規化されたＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡのΔＣｔ値を示す。図中のボックスは四分位数間領域を示し、各ボックスに引いた横線はメジアン値を示す。Wilcoxson検定を用いて統計学的有意差を決定した。ＮＳは統計学的に有意でないことを示す。点線は各Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡに関するカットオフ値を示す。点線よりも下のΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）値を異常値と見なす。図８Ｅは、１１人のＣＲＣの術前（Ｐｒｅ）および原発性腫瘍切除１年後（Ｐｏｓｔ）に得られた血漿中のＡｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃのΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）値を示す図である。
【図９】図９Ａは、切除不能肝転移にて化学療法施行された患者の治療経過におけるＡｇｏ２−ｍｉＲ２１およびＡｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃの発現レベルを示す図である。図９Ｂは、大腸癌治癒切除後の補助化学療法患者の治療経過におけるＡｇｏ２−ｍｉＲ２１およびＡｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃの発現レベルを示す図である。図９Ｃは、一次治療がほとんど奏功せずに経過した切除不能肝転移を伴う患者の治療経過におけるＡｇｏ２−ｍｉＲ２１およびＡｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃの発現レベルを示す図である。図９Ｄは、切除不能肝転移にて化学療法を施行された患者の治療経過におけるＡｇｏ２−ｍｉＲ２１およびＡｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃの発現レベルを示す図である。○の中の数字は化学療法のコース番号である。縦軸のＡｇｏ２−ｍｉＲ２１およびＡｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃは、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−４５１のΔＣｔの値に対して正規化されたＡｇｏ２ｓ−ｍｉＲＮＡのΔＣｔ値を示す。○の中の数字の下の矢印（図９Ｄの第７コースの矢印以外）は、血液試料を採取した時点を示す。図中影の部分は縮小期であることを示す。Ｂｅｖａはベバシズマブ、ＦＯＬＦＯＸ６は改変ＦＯＬＦＯＸ６療法、ＳＯＸはオキサリプラチン療法を伴うＴＳ１である。
【図１０】図１０は、各種癌患者の血漿中のｍｉＲ−４５１に対するＡｇｏ２−ｍｉＲ−２１のΔＣｔ値を示す。図中のボックスは四分位数間領域を示し、各ボックスに引いた横線はメジアン値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、１の態様において、対象から得られた試料中のＡｇｏ２タンパクと複合体を形成しているマイクロＲＮＡの発現量を測定することを特徴とする癌の判定方法に関する。対象はヒトであれば特に限定されない。例えば、癌にかかっているヒト、あるいは癌にかかっている虞のあるヒトであってもよい。
【００１２】
癌の判定とは、対象における癌の状態を調べることをいい、例えば対象中の癌の存在の有無を調べること、抗癌剤治療の効果を予測すること、癌の再発を予測することなどを含む。
【００１３】
Ａｇｏ２タンパクは公知であり、ＲＮＡ結合タンパクであるアルゴネイチャーファミリーに属している。多くの種類のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ）が知られている。Ａｇｏ２タンパクとマイクロＲＮＡとの複合体も知られており、複合体を形成することによって循環ｍｉＲＮＡが安定化されることがわかっている。本明細書において、Ａｇｏ２タンパクとマイクロＲＮＡとの複合体を、Ａｇｏ２−ｍｉＲまたはＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡと表記する。例えば、Ａｇｏ２タンパクとｍｉＲ−２１との複合体を、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１と表記する。
【００１４】
従来から、ＥＶ−ｍｉＲＮＡは生きている癌細胞から能動的に放出され、Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡは死んだ癌細胞から受動的に放出されることが報告されていた（H. Valadi et al., Nature cell biology 9, 654 (Jun, 2007)、S. A. Melo et al., Cancer cell 26, 707 (Nov 10, 2014)）。しかし、本発明において、（１）細胞死により受動的に血液中に放出されるＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡ、（２）生きている細胞が能動的に放出するＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡのほか、（１）と（２）の両方の性質を持つＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡが血液中に認められた。
【００１５】
（１）の性質を持つＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡは、細胞毒性剤を添加して細胞を培養した培養液中のΔＣｔ値が経時的に増加するものである。（２）の性質を持つＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡは、細胞毒性剤を添加しないで細胞を培養した培養液中のΔＣｔ値が経時的に増加するものである。（１）と（２）の両方の性質を持つＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡは、細胞毒性剤を添加して細胞を培養した培養液中および細胞毒性剤を添加しないで細胞を培養した培養液中の双方においてΔＣｔ値が増加するものである。
【００１６】
細胞毒性剤が５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）である場合、（１）の性質を持つＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡは，相対発現インデックスが指数関数的に増加するＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡであると定義してもよい。（２）の性質を持つＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡは現在までに確認されていないが、細胞毒性剤が投与されない通常の培養条件にて、相対発現インデックスが指数関数的に増加するＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡである。（１）と（２）の両方の性質を持つＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡは、細胞毒性剤存在下でも、細胞毒性剤が投与されない通常の培養条件でも、相対発現インデックスが指数関数的に増加するＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡと定義してもよい。
【００１７】
上で説明したように、Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡとＥＶ−ｍｉＲＮＡは分泌形態が異なるので、これらの発現を解析することによって、例えば、化学療法中の採血にて、生体内の生きている癌細胞の存在と癌細胞の死を解析することにより、癌の判定を多角的かつ詳細に行うことができると考えられる。しかしながら、ＥＶ−ｍｉＲＮＡは検出、測定が困難であるという問題がある。
【００１８】
本発明において、上記（１）のみの性質を持つＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡ、および上記（１）と（２）の性質を併せ持つＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡの存在が確認された。しかも、Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡは、膜小胞に包まれた形で存在するＥＶ−ｍｉＲＮＡよりも検出、測定が簡単である。したがって、本発明において、検出、測定が簡単なＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡだけを用いて多角的かつ詳細な癌の判定が可能となった。
【００１９】
（１）の性質を有するＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡは、例えば抗がん剤治療の効果の予測において重要である。抗がん剤治療中での（１）のみの性質を有するＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡのプラトーな状態は、不応を示唆し、画像にて病勢進行を確認する前に判定が可能である。例えば（２）の性質を有するＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡが血液などの体液中に正常範囲を超えて存在する場合は、生きている癌細胞の存在をも示唆する。すなわち、（２）の性質を有するＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡは、画像に認められる前段階での再発の予測や、早期がんの診断に有用である。（１）と（２）の両方の性質を持つＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡは、例えば抗がん剤治療の効果の予測、画像に認められる前段階での再発の予測、早期がんの診断などに有用である。
【００２０】
本発明の癌の判定方法およびキットにおいて、（１）の性質を持つＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡを用いてもよく、（２）の性質を持つＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡを用いてもよく、（１）と（２）の両方の性質を持つＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡを用いてもよい。これらのＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡを単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
【００２１】
（１）の性質を持つＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡと（２）の性質を持つＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡを併用して癌を判定することができる。また、（１）の性質と（２）の性質の両方を有するＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡを用いて癌を判定することもできる。あるいは、（１）と（２）の両方の性質を持つＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡと、（１）の性質を持つＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡを組み合わせて癌の判定をすることができる。あるいは（１）と（２）の両方の性質を持つＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡと、（２）の性質を持つＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡを組み合わせて癌の判定をすることができる。このように性質の異なるＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡを組み合わせて用いることにより、癌の判定を多角的、詳細かつ正確に行うことができる。
【００２２】
本発明の方法において使用される好ましいＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡとしては、（１）および（２）の両方の性質を持つＡｇｏ２−ｍｉＲ−２１、および（１）の性質を有するＡｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃが挙げられるが、これらのＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡに限定されない。
【００２３】
Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１は、上記（１）、（２）の両方の性質を有するので、癌の存在を知る上で極めて有用なマーカーである。Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１の発現量を測定することにより、対象における癌の存在（再発を含む）の判定、抗癌剤治療の効果の予測、あるいは抗癌剤の種類や投与量の決定を行うことができる。Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１の発現量を測定することにより、対象における早期癌の検出または早期の再発の予測を行うこともできる。
【００２４】
上述のごとく、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１は上記（２）の性質も有する。このことはＡｇｏ２−ｍｉＲ−２１が血中に正常範囲を超えて存在する場合は、生きている癌細胞の存在をも示唆する。すなわち、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１は、画像に認められる前段階での再発の予測や、早期がんの診断に有用である。
【００２５】
Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃは、特に転移巣に多く発現しているため、癌転移の予測、転移巣に対する抗癌剤治療の効果の予測、あるいは抗癌剤の種類や投与量の決定を行うためのマーカーとして有益である。
【００２６】
Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１を単独で用いてもよく、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃを単独で用いてもよく、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１とＡｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃを組み合わせて用いてもよい。
【００２７】
本発明の方法において、内在性コントロールとして何を用いるかが重要である。体液中に安定して存在しているＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡを内在性コントロールとして用いることが好ましい。本発明において、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−４５１を内在性コントロールとして用いることが特に好ましいが、これに限定されない。
【００２８】
本発明の方法により判定される癌の種類は、例えば食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌、肝細胞癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓がん、腎細胞癌、消化管間質腫瘍、中皮腫、脳腫瘍、頭頚部癌、喉頭がん、口腔癌、口腔底癌、歯肉癌、舌癌、頬粘膜癌、唾液腺癌、副鼻腔癌、上顎洞癌、前頭洞癌、篩骨洞癌、蝶型骨洞癌、甲状腺がん、肺癌、骨肉腫、膀胱癌、前立腺がん、精巣腫瘍、睾丸がん、陰茎癌、乳がん、子宮体がん、子宮頚がん、卵巣がん、皮膚癌、横紋筋肉腫、白血病、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明の方法に供される試料としては、血液、リンパ液、脳髄液などの体液が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法に供される好ましい試料は血液であり、血漿がより好ましい。本発明において、Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡの発現量を測定する前に、プロテインＡ／Ｇアガロースを用いて試料中の非特異的な抗体および蛋白を除去することにより、分析に供する試料量を減らすことができる（「プレクリア法」という）。プレクリア法を用いれば、約１０μｌの血漿中のＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡの発現量を測定することができる。
【００３０】
本発明は、さらなる態様において、血液試料中のＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡの発現量を測定するための手段を含む、癌の判定を行うためのキットに関する。Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡや試料については上で説明したとおりである。好ましいＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡはＡｇｏ２−ｍｉＲ−２１および／またはＡｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃである。Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡの発現量を測定するための手段としては、Ａｇｏ２に特異的な抗体、定量的逆転写ＰＣＲを行うための材料などが例示される。これらの抗体や材料は当業者が容易に選択し、入手し、あるいは調製することができるものである。通常は、本発明のキットには取扱説明書が添付される。
【００３１】
本発明のキットは、血液試料中のコントロールとしてのＡｇｏ２−ｍｉＲ−４５１の発現量を測定するための手段を含んでいてもよい。
【００３２】
本発明のキットは、Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡの発現量を測定する前に試料中の非特異的な抗体および蛋白を除去するために、プロテインＡ／Ｇアガロースを含んでいてもよい。
【００３３】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００３４】
Ｉ．実験方法および材料
実験に使用した主な方法および材料を以下に説明する。
（１）血液採取および血漿の調製
ＥＤＴＡコレクションチューブ（EDTA collection tube）を用いて末梢血を集め、その直後に血漿を単離した。全血を、４℃において３０００ｒｐで１０分間遠心分離した。全血から血漿を分離し、４℃において３０００ｒｐで１０分間遠心分離して血漿上清を得た。さらに１４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その後０．２２μｍのフィルター（Merck Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Germany）で濾過することにより、細胞残渣または大型の細胞外小胞を試料から除去した。
【００３５】
（２）細胞培養物のアッセイ
ヒト大腸癌細胞株ＨＴ２９をAmerican Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)から購入し、exosome-depleted-１０％ウシ胎児血清を補充したMcCoy培地（System Biosciences, CA, USA）にて、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。ディッシュ中の培地１０ｍｌにつき１００万個の細胞を播き、２４時間ごとに７５０μｌの細胞培養上清を採取した。細胞残渣を除去するために、採取した上清を１４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．２２μｍのフィルターで濾過した。採取から４８時間後に、５−ＦＵ濃度が０．５μＭとなるように５−ＦＵ溶液を含む１ｍｌの培地を各ディッシュに添加した。１０万個の細胞を含む１００μｌの培地を９６ウェルプレートに播き、０、２４、４８、７２および９６時間後に１０μｌのCell Proliferation Reagent WST-1 (Roche Diagnostics)を添加して１時間後に吸光度を測定した。４８時間目の測定後、５−ＦＵ濃度が０．５μＭとなるように５−ＦＵ溶液を含む１ｍｌの培地を添加した。
【００３６】
（３）免疫沈降
Pierce Classic IP kit (Thermo Scientific)を用いて、抗−ヒトＡｇｏ２モノクローナル抗体（WAKO, Osaka Japan, 4G8; Cat. 015-22031）にて細胞外ｍｉＲＮＡの免疫沈降行った。簡単に説明すると、血漿試料（１０〜１００μｌ）にＰＢＳを添加して体積を２００μｌとし、抗体と結合していないPierce Protein A/G（２０μｌ）を添加して、回転させながら一晩インキュベートした（プレクリア工程）。遠心分離（１０００ｒｐｍで１分間）してフロースル−（flow-through）を集めた後、プレクリアされた血漿試料を、１μｇ（１μｌ）の抗−ヒトＡｇｏ２モノクローナル抗体とともに、回転させながら室温で１時間インキュベートした。ネガティブコントロールとして、１μｇの抗−β−アクチンモノクローナル抗体（Sigma-Aldrich）を用いた。馴化培地アッセイにおいて、プレクリア工程を行わずに、抗−ヒトＡｇｏ２抗体とともに２００μｌの培地をインキュベートした。免疫複合体を捕獲するために、新たな２０μｌのPierce Protein A/Gアガロースとともに、試料を回転させながら室温で１時間インキュベートした。遠心分離後、フロースルーを捨てるか、あるいは２回目のＡｇｏ２免疫沈降のために取っておいた。２００μｌのＴＢＳＴで樹脂を３回洗浄し、２００μｌのQiazol reagent（QIAGEN）を添加し、５分間放置した。遠心分離して溶出液を集めた後、さらに５００μｌのQiazol reagentを添加して全体積を７００μｌとした。
【００３７】
（４）細胞外小胞（ＥＶ）の単離
exoRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)を用いて、製造者の説明書に従って２００μｌの血漿または培地から細胞外小胞を単離した。
【００３８】
（５）ｍｉＲＮＡの単離および逆転写
miRNeasy Serum/Plasma kit (Qiagen)を用いて、製造者の説明書に従ってＡｇｏ２免疫沈降産物およびＥＶ単離産物から全ｍｉＲＮＡを単離した。正規化コントロールとして３．５μｌのｃｅｌ−ｍｉＲ−３９（１．６ｘ１０８コピー／μｌ）およびキャリアＲＮＡとして２μｌの酵母ＲＮＡ（０．１μｇ／μｌ）を試料に添加し、次いで、クロロホルムを添加した。製造者の説明書に従ってmiScript II RT Kit (Qiagen)を用い、抽出された４μｌのＲＮＡ鋳型を用いて、ｃＤＮＡの合成を行った。
【００３９】
（６）定量的リアルタイムＰＣＲ
miScript Primer Assays (Qiagen)を用いて、各ｍｉＲＮＡの発現レベルを分析した。遺伝子特異的プライマー、miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen)およびLightCycler 480 (Roche Diagnostics)を用いて定量的リアルタイムＰＣＲを行った。ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９のサイクルスレッショルド（cycle threshold, Ct）値（外部リファレンス）を差し引くことによってｍｉＲＮＡ試料の定量値を計算した。２系の反応で得たＣｔ値を平均した。標的ｍｉＲＮＡのＣｔ値から添加したｃｅｌ−ｍｉＲ−３９コントロールのＣｔ値を差し引くことによりΔＣｔを計算した。コントロール試料のΔＣｔ値からリファレンス試料のΔＣｔ値を差し引くことによりΔΔＣｔを計算した。各ｍｉＲＮＡの変化倍率を決定した。
【００４０】
（７）ｍｉＲＮＡ  ＰＣＲアレイによる血漿中のＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡのグローバル発現およびＥＶ−ｍｉＲＮＡのグローバル発現の網羅的解析
miScript miRNA PCR Arrays (Qiagen)を用いてＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡとＥＶ−ｍｉＲＮＡのグローバル発現比を評価した。均一な試料体積を維持するために、１００μｌの血漿を２５μｌずつに分け、Ａｇｏ２免疫沈降に４回供した。溶出工程において、１７５μｌのQiazaol試薬を各Ａ／Ｇアガロース樹脂に添加し、溶出液を混合した。添加したｃｅｌ−ｍｉＲ−３９をコントロールとして添加してｍｉＲＮＡ単離を行って、１．５μｌの抽出したＲＮＡ鋳型を用いて逆転写を行った。miScript PreAMP PCR KitをmiScript PreAMP Human miRNome Primer Mix (Qiagen)と併用して前増幅工程を行った。LightCycler 480を用いてmiScript miRNA PCR Array Human miRNomeを行い、標的ｍｉＲＮＡのＣｔから添加したｃｅｌ−ｍｉＲ−３９コントロールのＣｔ値を差し引くことにより、ΔＣｔを計算した。検出されなかったｍｉＲＮＡのＣｔ値を４５以上とした。
【００４１】
（８）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティング
プレクリア工程に供したＡ／Ｇアガロース樹脂、Ａｇｏ２免疫沈降物、２回目の免疫沈降物を２００μｌのＴＢＳＴで３回洗浄し、５０μｌのレーンマーカーローディングバッファー（３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８；１％  ＳＤＳ；１０％  グリセロール；２０ｍＭ  ＤＴＴ）にて１００℃で１０分間溶出させた。次いで、５μｌの血漿、１μｌのＡｇｏ２抗体または１０μｌのプレクリアされた血漿を、レーンマーカーローディングバッファー中で別々に溶出させた。タンパクをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて展開し、フッ化ポリビニリデン膜に移した。その後、ゲルをOriole Fluorescent Stain (Bio Rad)とともにインキュベートし、次いで、膜をヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Bethyl Laboratories, Inc）とともに室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、膜をＨＲＰ−結合二次抗体とともにインキュベートした。ＥＣＬをブロットの発色に使用した。
【００４２】
（９）原発性腫瘍、肝臓転移部位、および対応する正常組織におけるｍｉＲＮＡ発現のｍｉＲＮＡマイクロアレイによる網羅的解析
製造元のプロトコールに従ってmiRNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いて凍結標本から全ｍｉＲＮＡを単離し、Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)にて分析した。SurePrint G3 Human miRNA Microarray Kit Release 21.0 (Agilent Technologies)は、２５４９種類のヒトマイクロＲＮＡプローブを含んでいた。各プローブの発現レベルは、２０スポット分のバックグラウンドを差し引いた生の強度の合計とした。スポットとして検出されなかった標的ｍｉＲＮＡについて発現レベル０．１とした。データを９０ｔｈパーセンタイルに対して正規化し、すべての試料において検出されなかった標的ｍｉＲＮＡを除外した。
【００４３】
（１０）統計学的解析
ＪＭＰソフトウェア（version 10.0; SAS Institute Inc. Cary, NC, USA）を用いて統計学的解析を行った。ｍｉＲＮＡ発現レベルをＣｔおよびΔＣｔで表した。相対発現比を平均値±標準偏差（ＳＤ）で表した。Pearson product-moment correlation coefficient (r2)を決定し、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−４５１に関するΔＣｔと血漿体積との相関関係を調べた。Ward法を用いてｍｉＲＮＡマイクロアレイに関するヒエラルキークラスター解析を行った。血漿試料中のＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡのＣｔ値とΔＣｔ値の相違を比較することに加えて、Wilcoxon signed-rank testを用いて、対になった血漿試料中のＡｇｏ２−ｍｉＲ−２１とＡｇｏ２−ｍｉｒ−２００ｃの発現を比較した。すべてのＰ−値はtwo-sided testの結果であり、０．０５未満のＰ−値を統計学的に有意と見なした。
【００４４】
その他の実験方法および手技は当業者に知られたものを用いた。
【００４５】
ＩＩ．実験結果
１．細胞毒性剤の存在下における細胞外ｍｉＲＮＡ放出機構の評価
最初に２種類の形態の循環ｍｉＲＮＡを細胞外液から検出可能かどうかの検討を、ＨＴ２９  ＣＲＣ細胞株を用いて行った。バイオマーカーとしてはｍｉＲ−２１とｍｉＲ−３１を用いた。ＨＴ２９  ＣＲＣ細胞株は細胞質内に豊富にｍｉＲ−２１とｍｉＲ−３１を有しており、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）処理群は播種から４８時間後に５ＦＵの添加を行った。水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ）アッセイを用いてＨＴ２９細胞の増殖の評価を行った（図１Ａ）。
【００４６】
細胞培養液は、培養後２４、４８、７２、９６時間毎に採取を行い、その中のＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡｓはＡｇｏ２抗体を用いた免疫沈降（Ａｇｏ２−免疫沈降）を用いた手法により、ＥＶ−ｍｉＲＮＡはexoRNeasy Serum/Plasma kitを用いて精製した後に、各々定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）にて測定した（図２）。
【００４７】
細胞培養液内における４８、７２、９６時間後のｍｉＲ−２１とｍｉＲ−３１発現量は播種後２４時間にて採取された細胞培養液内の発現量を基準とした相対比（hold changes based on the change in threshold cycle value ［ΔＣｔ］）を用いて比較検討を行った（図１Ｂ）。Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡやＥＶ−ｍｉＲＮＡｓが生きた細胞から能動的に細胞外に放出されているかどうかを検討するために、相対発現インデックス（Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡの発現相対比またはＥＶ−ｍｉＲＮＡの発現相対比をＷＳＴ吸光度の相対比で割った値）を算出した（図１Ｃ）。
【００４８】
コントロール群では、相対発現インデックスはそのまま生きた細胞から能動的に細胞外に放出されるｍｉＲＮＡ量を表す。そして、５−ＦＵ処理群においては、その相対発現インデックスは細胞死によって受動的に細胞外に放出されるｍｉＲＮＡ量を反映する。５−ＦＵ処理群においては、ｍｉＲ−３１における相対発現インデックス（ＲＥＩ）はＡｇｏ２、ＥＶ共に継時的に増加を示し、Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡもＥＶ−ｍｉＲＮＡのどちらも細胞死により細胞外に放出されることが示された。対照的に、コントロール群では、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１のＲＥＩのみが継時的に細胞外培養液において増加傾向を示し、ＥＶ−ｍｉＲ−２１はわずかに増加を示し、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−３１、ＥＶ−ｍｉＲ−３１のＲＥＩは実験経過全体を通して増加を示さなかった。このコントロール群におけるＡｇｏ２−ｍｉＲ−２１のＲＥＩ増加は生きた細胞から能動的に放出されたことを示唆する。
【００４９】
これらの結果から、細胞外へのｍｉＲＮＡ放出メカニズムは、ｍｉＲＮＡの種類やｍｉＲＮＡ複合体の種類によって異なる可能性が示唆された。そして、大腸癌に対しては、特にＡｇｏ２−ｍｉＲ−２１は細胞死による受動的な放出だけでなく、生きた細胞から能動的に細胞外へ放出されており、バイオマーカーとして重要である可能性が示唆された。
【００５０】
２．循環ｍｉＲＮＡの分類
血漿から異なった形態の循環ｍｉＲＮＡを検出する前に、健常人血漿内におけるＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡとＥＶ−ｍｉＲＮＡの包括的な検討を、ｍｉＲＮＡ  ＰＣＲアレイを用いて行った。なお、Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡとＥＶ−ｍｉＲＮＡの解析は図２の方法を用いた。本解析により、血漿内ｍｉＲＮＡはきれいに３群に分類することが可能であった。すなわち、（ｉ）Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡ（Ａｇｏ２免疫沈降法によってのみ捕捉され、ＥＶ単離によって捕捉されるものは無視できる）、（ｉｉ）ＥＶ−ｍｉＲＮＡ（ＥＶ単離によってのみ捕捉され、Ａｇｏ２免疫沈降法によって捕捉されるものは無視できる）、（ｉｉｉ）両方の形態（両方の方法によって検出される）（図３）。
【００５１】
今回の実験によって、ｍｉＲ−４５１はＡｇｏ２−ｍｉＲ−４５１複合体として存在し、ＥＶ−ｍｉＲ−４５１として存在するのはごくわずかであることが示された。対照的に、ｍｉＲ−ｌｅｔ−７ｄのほとんどはＥＶ−ｍｉＲＮＡとして検出された（図３Ｃ）。
【００５２】
３．転移巣に関連するｍｉＲＮＡの同定
次に、Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡまたはＥＶ−ｍｉＲＮＡが化学療法（抗がん剤）中の薬剤効果判定のバイオマーカーとなりうるかどうかを検討するために、まず、大腸癌転移巣において特徴的に発現しているｍｉＲＮＡの同定を試みた。このためにｍｉＲＮＡマイクロアレイを用い、原発巣と肝転移巣組織におけるｍｉＲＮＡ発現の網羅的解析を行った。
【００５３】
ｍｉＲＮＡマイクロアレイによるｍｉＲＮＡ発現解析は、２名の肝転移を伴うステージＩＶ大等顔患者の原発巣組織、正常大腸粘膜組織、肝転移巣組織、正常肝組織から得られたＲＮＡを用いて行った。本研究で使用したｍｉＲＮＡマイクロアレイは２５４９種類のヒトｍｉＲＮＡの網羅的解析が可能である。この解析により原発巣と肝転移巣のｍｉＲＮＡ発現に強い相関を認めた（図４Ａ）。２５４９種類のヒトｍｉＲＮＡの中で、５９種類のｍｉＲＮＡが正常組織よりも癌組織（原発巣・肝転移巣）にて２倍以上の発現を認めた。この５９種類のｍｉＲＮＡを用いてクラスター解析を行ったところ、ｍｉＲ−２００ｃが肝転移巣に高発現していることが示された（図４Ｂ）。したがって、ｍｉＲ−２００ｃをバイオマーカー候補に選び、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃとＥＶ−ｍｉＲ−２００ｃの細胞外放出メカニズムの検討を、ＨＴ２９細胞株を用いて行った（図４Ｃ）。５−ＦＵ処置群では、Ａｇｏ２−とＥＶ−ｍｉＲ−２００ｃの細胞培養液内の濃度は経時的に上昇し、コントロール群では、Ａｇｏ２−とＥＶ−ｍｉＲ−２００ｃは継時的増加を示さなかった。このことは、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃとＥＶ−ｍｉＲ−２００ｃの双方は、細胞死による受動的放出のみにより細胞外に放出されることが示唆された。
【００５４】
以上の一連の研究結果から、Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡに的を絞り、臨床応用への検出技術の開発を目標とした。また、大腸癌に対して、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１とＡｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃを用いて検討を行うこととした。
【００５５】
４．循環Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡ検出のための新たな方法の開発
次に、実臨床にて再現性のある安定したＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡの検出技術の開発を試みた。血漿内に存在する抗体や蛋白は結果的にＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡがＡ／Ｇアガロースビーズに結合することを妨げることが推測される。これらの血漿内に存在する抗体や蛋白の悪影響を少なくするために、Ａｇｏ２抗体による免疫沈降（Ａｇｏ２−ＩＰ）を行う前に、Ａ／Ｇアガロースビーズによる非特異的な抗体や蛋白除去を行い、Ａｇｏ２−ＩＰの効率化を試みた（プレクリア法、図５）。
【００５６】
このプレクリア法を最適化するために、ｍｉＲ−４５１をターゲットにして健常人から得られた血漿にて検討を行った。プレクリア法は、Ａｇｏ２−ＩＰにおけるｍｉｒ−４５１の相対発現レベルを改善し、慣用的なＡｇｏ２−ＩＰ法（「ノン−プレクリア法」という）と比較してフロースルー内のｍｉＲ−４５１を明らかに減少させた（図６Ａ）。次いで、使用血漿量を１０〜６０μＬとして実験を行い、臨床サンプルでの使用血漿量の検討を行った（図６Ｂ）。
【００５７】
これらの結果はまた、ヒトＩｇＧイムノブロットとＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認も行った（図７）。血漿３０μｌまでにおいて、ｍｉＲ−４５１の相対発現レベルと血漿量の間に強い相関を認めた（ｒ２＝０．９０３）（図６Ｃ）。血漿３０μｌでのプレクリア法によるＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡの検出と、通常の方法でのＥＶ−ｍｉＲＮＡの検出（血漿２００μｌ）を比較したところ、ｍｉＲ−４５１はｍｉＲＮＡマイクロアレイの結果と同様に、Ａｇｏ２に認められた（図６Ｄ）。したがって、臨床サンプルでの血漿使用量は３０μｌで十分と考えられた。現在までの報告では、循環ｍｉＲＮＡを検出するために必要な血漿（血清）量は８０から４００μｌと報告されている。この方法は従来に報告されている最少量の１／２以下で検出可能である。加えて、血漿中Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡの検出の際に、血漿中Ａｇｏ２−ｍｉＲ−４５１は安定して存在しており、内在性コントロールとして最適であると考えられたため、以後の実験において、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−４５１を内在性コントロールとして解析を進めた。
【００５８】
５．血液試料中のＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡを用いた大腸癌患者の予測
Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１と−２００ｃが大腸癌患者の血液内で増加しているかどうかの検討を、４０例の大腸癌患者の治療前に得られた血液と２０例のコントロール患者の血液を用いて解析を行った。ここでいうコントロール患者とは、治癒切除後の大腸癌患者で画像上再発が認められない状態の患者をいう。Ａｇｏ２−ｍｉＲ−４５１の増幅状態をもって血液の状態に関するコントロールにした場合、４０例のうち１例においてＡｇｏ２−ｍｉＲ−４５１の増幅が不良であった。このため、この１例は以下の解析から除外した。図８Ａは実測のＣｔ値である。Ａｇｏ２−ｍｉＲ−４５１の平均値は大腸癌患者３９例とコントロール２０例の間に有意差は認められなかった（コントロール患者と大腸癌患者の平均Ｃｔ値は、それぞれ２９．９（９５％信頼区間（ＣＩ）は２８．４〜３１．４）および３０．５（９５％ＣＩは２９．５〜３１．５）であった。
【００５９】
反対に、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１の平均値は、大腸癌患者３９例がコントロール２０例に比して明らかに低かった（大腸癌患者とコントロール患者の平均Ｃｔ値は、それぞれ３１．４（９５％ＣＩは３１．０〜３１．９）および３３．０（９５％ＣＩは３２．０〜３４．０）であった、Ｐ＝０．００９７）。また、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃの平均値は大腸癌患者３９例とコントロール２０例の間に有意差は認められなかった（平均Ｃｔ値はそれぞれ３９．９（９５％ＣＩは３９．５〜４０．２）および４１．６（９５％ＣＩは４０．１〜４３．１））。
【００６０】
次に、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−４５１、−２１、−２００ｃのΔＣｔをｃｅｌ−ｍｉＲ−３９を用いて算出を行い、それをさらにＡｇｏ２−ｍｉＲ−４５１のΔＣｔにて補正したものをΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）と定義する。Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１と−２００ｃのΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）を算出した。図８Ｂと８Ｄに示すように、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１と−２００ｃのΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）は、大腸癌患者にて明らかに減少を示した。すなわち、コントロール患者と比較して、大腸癌患者から得られた血漿中のＡｇｏ２−ｍｉＲ−２１および−２００ｃの量は増加した。また、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１と−２００ｃのΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）を１１例の大腸癌患者の手術前後の血液にて検討を行った（図８Ｃおよび８Ｅ）。Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１と−２００ｃの血液中に存在する量は明らかに術前に多く、術後に減少する傾向が認められた。
【００６１】
コントロール患者のＡｇｏ２−ｍｉＲ−２１のΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）の平均値は３．１２（９５％ＣＩは１．８１〜４．４２）であり、大腸癌患者のΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）の平均値は０．９６（９５％ＣＩは０．２７〜１．６５）であったので、今回の研究では、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１のΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）が２．００以上を正常値とした。同様に、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃのΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）の正常値は１０．００以上とした。これは、コントロール患者のＡｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃのΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）の平均値は１１．６７（９５％ＣＩは９．７２〜１３．６２）であり、大腸癌患者のΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）の平均値は９．３８（９５％ＣＩは８．５１〜１０．２）であることに由来する。
【００６２】
６．化学療法加療中の大腸癌患者から得られた血漿中のＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡの動向
Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１と−２００ｃを化学療法加療中の４人の大腸癌患者の血液（各コースの化学療法施行前に採取された血液から得られた血漿）を用いて解析を行った。
【００６３】
図９Ａは、切除不能肝転移にて化学療法施行された患者の治療経過および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）値、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１と−２００ｃの血漿中の経過を示す。本患者は最初の４ヶ月間は１次治療の化学療法が奏功ののちに治療抵抗性となった例である。治療経過をＣＥＡの変動に合わせ、３つに分類する：縮小期（１日目〜４８日目）、定常期（４９日目〜１１３日目）、そして進行期（１１３日目〜１６８日目）。縮小期では、化学療法は奏功している。Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃのΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）は、定常期（４９日目〜１１３日目）ではカットオフ値１０．００よりも低く（異常値）、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１のΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）は２コース投与後に正常値よりも減少（すなわち異常値）となり、化学療法に反応を示している。定常期では、ＣＥＡは病勢が安定していることを示しているが、Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡのΔＣｔは、４回目の投与では治療に反応していることを示しているが、５回目の投与後にはΔＣｔは上昇を示し、すなわち、その治療レジメンに対し不応となったことが示唆された。進行期では、ＣＥＡが上昇したのに対し、Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡのΔＣｔは変動をほとんど認めなかった。すなわち、癌細胞がその化学療法で破壊されていないことが示唆された。
【００６４】
図９Ｂは、大腸癌治癒切除後の補助化学療法患者の治療経過およびＣＥＡ値、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１と−２００ｃの血漿中の経過を示す。一回目の投与後に、Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡｓのΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）は減少した（すなわち、血漿内のＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡｓの量は増加、画像上は見えないが、何らかの癌細胞が存在し、化学療法により崩壊したことが示唆された）。しかしながら、２回目の投与では、Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡのΔＣｔは上昇した（すなわち、血漿内のＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡｓの量は減少）。これらから、癌細胞がないか、または抵抗性を得た可能性が示唆された。実際には、肝転移をＣＴにて２９日目に確認した。このため、２回目にて、ＦＯＬＦＯＸ６に対する不応の可能性が示唆された。その後にベバシズマブ（bevacizumab）を導入することにより、再びＣＥＡが減少し、Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡのΔＣｔは減少した（すなわち、血漿内のＡｇｏ２−ｍｉＲＮＡｓの量は増加、画像上は見えないが、何らかの癌細胞が存在し、化学療法により崩壊したことが示唆された）。これらから、その化学療法はまだ奏功していることが示唆された。
【００６５】
図９Ｃは、一次治療がほとんど奏功せずに経過した切除不能肝転移を伴う患者の治療経過およびＣＥＡ値、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１と−２００ｃの血漿中の経過を示す。本患者は、最初の４ヶ月間は一次治療の化学療法が奏功の後に治療抵抗性となった例である。治療経過はＣＥＡ値により２つに分けることができる：定常期（１日目〜８４日目）と進行期（８５日目〜１２６日目）。Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１のΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）は初回投与直前から異常値を示している。このＡｇｏ２−ｍｉＲ−２１は能動的排出による結果であることが示唆される。化学療法施行後は異常値境界を示したまま経過した。一方、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃのΔＣｔは一回目の投与後に異常値を示しただけで、その後は正常値を維持しており、癌に対し奏功したのは最初の数回の化学療法のみであることが示唆された。
【００６６】
図９Ｄは、切除不能肝転移にて化学療法を施行された患者の治療経過および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）値、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１と−２００ｃの血漿中の経過を示す。本患者は原発巣切除後にＣＥＡの上昇を認めたが、化学療法導入後すみやかに奏功した例である。Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１と−２００ｃのΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）は原発巣切除時と化学療法開始時とで差を認めていなかったが、化学療法開始後にＡｇｏ２−ｍｉＲ−２１のΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）は１度だけ異常値を示したが、その後正常値のまま経過した。Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２００ｃのΔＣｔ（ｍｉＲ−４５１）は観察期間中正常値のまま経過しており、本症例では、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１と−２００ｃはモニタリングマーカーとしては不適であることが示唆された。
【００６７】
状況の異なる３症例の経過を提示した。Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡｓのΔＣｔには一定の傾向が認められる。すなわち、化学療法が奏功している状態では、Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡのΔＣｔは減少を示し、その化学療法に対し不応となれば、Ａｇｏ２−ｍｉＲＮＡのΔＣｔはプラトーまたは上昇を示すことが認められた。
【００６８】
大腸癌以外の癌患者の血液の解析を行った（図１０）。この結果、Ａｇｏ２−ｍｉＲ−２１は大腸癌以外の癌患者の血液でも増加傾向を示しており、重要な癌マーカーであることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明は、癌の診断薬の分野および癌の研究試薬の分野などにおいて有用である。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図１−Ｃ】
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【図１−Ｄ】
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【図２】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【図３−Ｃ】
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【図４−Ａ】
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【図４−Ｂ】
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【図４−Ｃ】
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【図４−Ｄ】
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【図５】
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【図６−Ａ】
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【図６−Ｂ】
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【図６−Ｃ】
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【図６−Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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