(57)【要約】      （修正有）【課題】少なくとも１つの免疫グロブリンドメイン又はそのフラグメントを含む免疫グロブリンコンストラクト；及び前記免疫グロブリンドメインに結合又は挿入される治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体の提供。【解決手段】組み換え抗体であって、組み換え抗体は、抗体の可変性ドメインの２つの隣接するフレームワーク領域の間に位置する治療用ポリペプチドを含む修飾した抗体の可変性ドメインを含み、治療用ポリペプチドは、随意に、抗体の可変性ドメインの相補性決定領域の1つ以上のアミノ酸を置換する、および組み換え抗体内の治療用ポリペプチドは、組み換え抗体がそれを必要とする被験体に投与された場合、疾患、障害または疾病を治療、予防、または改善するために機能的である、組み換え抗体を提供する。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体のライブラリ又はその結合フラグメントであって、抗体又はその結合フラグメントは超長ＣＤＲ３を含むことを特徴とする、ライブラリ。
【請求項２】
抗体又はそのフラグメントをコード化するポリヌクレオチドのライブラリであって、コード化された抗体又はそのフラグメントは、超長ＣＤＲ３を含むことを特徴とする、ライブラリ。
【請求項３】
超長ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸、長さが４０以上のアミノ酸、長さが４５以上のアミノ酸、長さが５０以上のアミノ酸、長さが５５以上のアミノ酸、又は長さが６０以上のアミノ酸であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項４】
超長ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸であることを特徴とする、請求項３に記載のライブラリ。
【請求項５】
超長ＣＤＲ３は、３以上のシステイン残基、４以上のシステイン残基、５以上のシステイン残基、６以上のシステイン残基、７以上のシステイン残基、８以上のシステイン残基、９以上のシステイン残基、１０以上のシステイン残基、１１以上のシステイン残基、又は１２以上のシステイン残基を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項６】
超長ＣＤＲ３は、３以上のシステイン残基を含むことを特徴とする、請求項５に記載のライブラリ。
【請求項７】
抗体又はその結合フラグメントは、システインモチーフを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項８】
システインモチーフは、配列番号４５−９９の何れか１つ又は配列番号１００−５６の何れか１つであることを特徴とする、請求項７に記載のライブラリ。
【請求項９】
超長ＣＤＲ３は、非ヒトＤＨ又はその誘導体を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項１０】
超長ＣＤＲ３は、ＪＨ配列又はその誘導体を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項１１】
超長ＣＤＲ３は、（ａ）非ヒトＶＨ配列又はその誘導体；（ｂ）非ヒトＤＨ配列又はその誘導体；及び／又は（ｃ）ＪＨ配列又はその誘導体を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項１２】
超長ＣＤＲ３は、ＶＨ配列とＤＨ配列の間に位置する、２乃至６以上のアミノ酸残基を含む、付加的なアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のライブラリ。
【請求項１３】
超長ＣＤＲ３は、非ウシ配列を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項１４】
非ウシ配列は、非抗体配列又はヒト配列であることを特徴とする、請求項１３に記載のライブラリ。
【請求項１５】
非ウシ配列は、超長ＣＤＲ３の少なくとも一部を置換することを特徴とする、請求項１３に記載のライブラリ。
【請求項１６】
非ウシ配列は、ホルモン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカイン、サイトカイン、トキシン、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項１２乃至１４の何れか１つに記載のライブラリ。
【請求項１７】
非ウシ配列は、サイトカインであることを特徴とする、請求項１６に記載のライブラリ。
【請求項１８】
サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）であることを特徴とする、請求項１７に記載のライブラリ。
【請求項１９】
超長ＣＤＲ３は、リンカーである付加的な配列を含むことを特徴とする、請求項１３に記載のライブラリ。
【請求項２０】
リンカーは、非抗体配列のＣ末端、Ｎ末端、又はＣ末端及びＮ末端の両方に結合されることを特徴とする、請求項１９に記載のライブラリ。
【請求項２１】
リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３９）であり、ここで、ｎは１と５の間の整数であることを特徴とする、請求項１９に記載のライブラリ。
【請求項２２】
超長ＣＤＲ３は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５モチーフを含み、ここで、Ｘ１は、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、又はバリン（Ｖ）であり、Ｘ２は、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ３は、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）であり、Ｘ４は、ヒスチジン（Ｈ）、トレオニン（Ｔ）、アルギニン（Ｒ）、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、又はロイシン（Ｌ）であり、Ｘ５はグルタミン（Ｑ）であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項２３】
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５モチーフは、配列番号１５９−１９１を含むグループから選択されることを特徴とする、請求項２１に記載のライブラリ。
【請求項２４】
超長ＣＤＲ３はさらに（ＸａＸｂ）ｚモチーフを含み、ここで、Ｘａは任意のアミノ酸残基であり、Ｘｂは、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、及びヒスチジン（Ｈ）から成るグループから選択された芳香族アミノ酸であり、並びに、ｚは１−４であることを特徴とする、請求項２２に記載のライブラリ。
【請求項２５】
（ＸａＸｂ）ｚモチーフは、ＹＸＹＸＹＸであることを特徴とする、請求項２４に記載のライブラリ。
【請求項２６】
超長ＣＤＲ３は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘｎ（ＸａＸｂ）ｚモチーフを含み、ここで、Ｘ１は、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、又はバリン（Ｖ）であり、Ｘ２は、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ３は、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）であり、Ｘ４は、ヒスチジン（Ｈ）、トレオニン（Ｔ）、アルギニン（Ｒ）、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、又はロイシン（Ｌ）であり、Ｘ５はグルタミン（Ｑ）であり、Ｘａは任意のアミノ酸残基であり、Ｘｂは、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、及びヒスチジン（Ｈ）から成るグループから選択された芳香族アミノ酸であり、ｎは２７−５４であり、及びｚは１−４であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項２７】
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５モチーフは、ＴＴＶＨＱ（配列番号１５９）又はＴＳＶＨＱ（配列番号１６０）であり、ここで、（ＸａＸｂ）ｚモチーフは、ＹＸＹＸＹＸであることを特徴とする、請求項２６に記載のライブラリ。
【請求項２８】
超長ＣＤＲ３は、ＴＳＶＨＱＥＴＫＫＹＱ（配列番号１５７）、ＶＨＱＥＴＫＫＹＱ（配列番号１５８）、ＣＴＴＶＨＱＸｎ（配列番号２２３）、ＣＴＳＶＨＱＸｎ（配列番号２２４）、ここで、ｎは１−８であり、ＴＴＶＨＱ（配列番号１５９）、ＴＳＶＨＱ（配列番号１６０）、ＶＨＱ、ＫＫＱ、ＶＹＱ、ＹＴＹＮＹＥＷ（配列番号２３５）、又はそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項２９】
超長ＣＤＲ３は、ＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｑを含み、ここで、Ｘ１はＴ、Ｓ、Ａ、又はＧであり、ここで、Ｘ２はＴ、Ｓ、Ａ、Ｐ、又はＩであり、Ｘ３はＶ又はＫであり、Ｘ４はＨ、Ｋ、又はＹであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項３０】
超長ＣＤＲ３は、ＣＸ１Ｘ２ＶＨＱを含み、ここで、Ｘ１はＴ、Ｓ、Ａ、又はＧであり、Ｘ２はＴ、Ｓ、Ａ、Ｐ、又はＩであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項３１】
超長ＣＤＲ３は、ＣＸ１Ｘ２ＶＸ３Ｑを含み、ここで、Ｘ１はＴ、Ｓ、Ａ、又はＧであり、Ｘ２はＴ、Ｓ、Ａ、Ｐ、又はＩであり、Ｘ３はＨ、Ｙ、又はＫであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項３２】
超長ＣＤＲ３は、ＣＸ１Ｘ２ＫＫＱを含み、ここで、Ｘ１はＴ、Ｓ、Ａ、又はＧであり、Ｘ２はＴ、Ｓ、Ａ、Ｐ、又はＩであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項３３】
超長ＣＤＲ３は、ＹＸ１ＹＸ２を含み、ここで、Ｘ２はＥ又はＤであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項３４】
超長ＣＤＲ３は、ＹＸ１ＹＸ２Ｙを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項３５】
超長ＣＤＲ３は、Ｙ（Ｅ／Ｄ）Ｘを含み、ＸはＨ、Ｗ、Ｎ、Ｆ、Ｉ、又はＹであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項３６】
超長ＣＤＲ３は、ＸＹ（Ｅ／Ｄ）を含み、ＸはＴ、Ｓ、Ｎ、又はＩであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項３７】
超長ＣＤＲ３は、Ｙ（Ｅ／Ｄ）Ｘ１ＸｎＷを含み、Ｘ１はＨ、Ｗ、Ｎ、Ｆ、Ｉ、又はＹであり、ｎは１−４であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項３８】
抗体又はその結合フラグメントは、キメラ、ヒト様設計、又はヒト化であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項３９】
超長ＣＤＲ３は、反芻動物のＣＤＲ３であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のライブラリ。
【請求項４０】
反芻動物は乳牛であることを特徴とする、請求項３９に記載のライブラリ。
【請求項４１】
請求項２乃至４０の何れか１つのポリヌクレオチドのライブラリを含む、ベクターのライブラリ。
【請求項４２】
請求項４１のベクターのライブラリを含む宿主細胞のライブラリ。
【請求項４３】
細胞は、バクテリア、昆虫、ウィルス、又はバクテリオファージであることを特徴とする、請求項４２に記載のライブラリ。
【請求項４４】
細胞は哺乳動物細胞であることを特徴とする、請求項４２に記載のライブラリ。
【請求項４５】
抗体又はその結合フラグメントは、細胞表面に提示されることを特徴とする、請求項４２に記載のライブラリ。
【請求項４６】
抗体又はその結合フラグメントは、細胞から分泌されることを特徴とする、請求項４２に記載のライブラリ。
【請求項４７】
抗体又はその結合フラグメントは、空間的にアドレス指定されたフォーマットに存在することを特徴とする、請求項４２に記載のライブラリ。
【請求項４８】
組み換え型抗体又はそのフラグメントであって、組み換え型抗体又はそのフラグメントの少なくとも一部は、超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に基づく又はそれに由来することを特徴とする、組み換え型抗体又はそのフラグメント。
【請求項４９】
（ａ）第１抗体配列であって、第１抗体配列の少なくとも一部は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する、第１抗体配列；（ｂ）非抗体配列；及び（ｃ）随意に、第２抗体配列であって、第２抗体配列の少なくとも一部は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する、第２抗体配列を含む、抗体又はそのフラグメント。
【請求項５０】
抗体は、キメラ、ヒト様設計、又はヒト化の抗体であることを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項５１】
抗体は、ウシ、ウシ化、ウシ様設計、又は完全にウシの抗体であることを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項５２】
抗体は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、（ｄｓＦｖ）２、低分子化抗体、柔軟な低分子化抗体、又は二重特異性のフラグメントを含むことを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項５３】
抗体は、分離した抗体であることを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項５４】
非抗体配列を更に含む、請求項４８に記載の抗体。
【請求項５５】
非抗体配列は哺乳動物由来であることを特徴とする、請求項４９又は５４に記載の抗体。
【請求項５６】
哺乳動物は、ウシ、ヒト、又は非ウシの哺乳動物であることを特徴とする、請求項５５に記載の抗体。
【請求項５７】
非抗体配列は、非ウシ動物由来であることを特徴とする、請求項４９又は５４に記載の抗体。
【請求項５８】
非ウシ動物はサソリ、トカゲ、又はカタツムリであることを特徴とする、請求項５７に記載の抗体。
【請求項５９】
トカゲはアメリカドクトカゲであることを特徴とする、請求項５８に記載の抗体。
【請求項６０】
非抗体配列は、成長因子、サイトカイン、ホルモン、又はトキシン由来であることを特徴とする、請求項４９又は５４に記載の抗体。
【請求項６１】
成長因子は、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、又はＦＧＦ２１であることを特徴とする、請求項６０に記載の抗体。
【請求項６２】
ＧＣＳＦは、ウシＧＣＳＦ又はヒトＧＣＳＦであることを特徴とする、請求項６１に記載の抗体。
【請求項６３】
サイトカインはベータ−インターフェロンであることを特徴とする、請求項６０に記載の抗体。
【請求項６４】
ホルモンは、エキセンジン−４、ＧＬＰ−１、ソマトスタチン、又はエリスロポエチンであることを特徴とする、請求項６０に記載の抗体。
【請求項６５】
トキシンは、Ｍｏｋａ１、ＶＭ−２４、ジコノチド、クロロトキシン、又はプロトキシン２であることを特徴とする、請求項６０に記載の抗体。
【請求項６６】
非抗体配列は合成配列であることを特徴とする、請求項４９又は５４に記載の抗体。
【請求項６７】
非抗体配列は、サイトカイン配列、リンホカイン配列、ケモカイン配列、成長因子配列、ホルモン配列、又はトキシン配列であることを特徴とする、請求項４９又は５４に記載の抗体。
【請求項６８】
非抗体配列は、ＩＬ−８配列、ＩＬ−２１配列、ＳＤＦ−１（アルファ）配列、ソマトスタチン配列、クロロトキシン配列、プロトキシン２配列、又はジコノチド配列であることを特徴とする、請求項４９又は５４に記載の抗体。
【請求項６９】
非抗体配列は、配列番号３１７−３３２を含むグループから選択されることを特徴とする、請求項４９又は５４に記載の抗体。
【請求項７０】
超長ＣＤＲ３は、乳牛の超長ＣＤＲ３に基づく又は由来することを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項７１】
抗体の少なくとも一部は、哺乳動物由来であることを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項７２】
第１抗体配列の少なくとも一部及び／又は第２抗体配列の少なくとも一部は、哺乳動物由来であることを特徴とする、請求項４９に記載の抗体。
【請求項７３】
哺乳動物は、ウシ、ヒト、又は非ウシの哺乳動物であることを特徴とする、請求項７１乃至７２の何れか１つに記載の抗体。
【請求項７４】
抗体は、長さが３以上のアミノ酸であることを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項７５】
超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に基づく又は由来する抗体の一部は、長さが２０以下のアミノ酸であることを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項７６】
超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に基づく又は由来する抗体の一部は、長さが３以上のアミノ酸であることを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項７７】
抗体は、超長ＣＤＲ３のストークドメイン、超長ＣＤＲ３のノブドメイン、又はそれらの組み合わせに基づく又は由来する１以上のアミノ酸残基を含むことを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項７８】
抗体は、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する１以上の保存モチーフを含むことを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項７９】
非抗体配列は、超長ＣＤＲ３の少なくとも一部を置換することを特徴とする、請求項５４に記載の抗体。
【請求項８０】
超長ＣＤＲ３の一部は、超長ＣＤＲ３のストークドメインの少なくとも一部、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部、又はそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項８１】
抗体は、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６の何れか１つから選択される配列を含むことを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項８２】
抗体は、配列番号１５７−２２４及び２３５−２９５から選択される配列に５０％以上相同である配列を含むことを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項８３】
抗体は、配列番号１５７−２３４から選択される第１配列、及び配列番号２３５−３０７及び配列番号３３３−３３６から選択される第２配列を含むことを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項８４】
組み換え型抗体又はそのフラグメントの一部は、単一の超長ＣＤＲ３配列の少なくとも一部に基づく又は由来することを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項８５】
組み換え型抗体又はそのフラグメントの一部は、２以上の異なる超長ＣＤＲ３配列の少なくとも一部に基づく又は由来することを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項８６】
超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ１Ｈ１２の超長ＣＤＲ３配列に基づく又は由来することを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項８７】
超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ１Ｈ１２の超長ＣＤＲ３配列に５０％以上相同する配列に基づく又は由来することを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項８８】
超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ５Ｂ８、ＢＬＶＣＶ１、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、又はＦ１８の超長ＣＤＲ３配列に基づく又は由来することを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項８９】
超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ５Ｂ８、ＢＬＶＣＶ１、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、又はＦ１８の超長ＣＤＲ３配列に５０％以上相同する配列に基づく又は由来することを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項９０】
第１及び第２の抗体配列は、長さが３以上のアミノ酸であることを特徴とする、請求項４９に記載の抗体。
【請求項９１】
超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部、及び／又は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、長さが２０以下のアミノ酸であることを特徴とする、請求項４９に記載の抗体。
【請求項９２】
超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部、及び／又は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、長さが３以上のアミノ酸であることを特徴とする、請求項４９に記載の抗体。
【請求項９３】
第１及び／又は第２の抗体配列は、超長ＣＤＲ３のストークドメイン、超長ＣＤＲ３のノブドメイン、又はそれらの組み合わせに基づく又は由来する１以上のアミノ酸残基を含むことを特徴とする、請求項４９に記載の抗体。
【請求項９４】
超長ＣＤＲ３のノブドメインに由来する１以上のアミノ酸残基は、セリン及び／又はシステインの残基であることを特徴とする、請求項７７又は９３に記載の抗体。
【請求項９５】
第１及び／又は第２の抗体配列は、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する１以上の保存モチーフを含むことを特徴とする、請求項４９に記載の抗体。
【請求項９６】
超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する１以上の保存モチーフは、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６の何れか１つから選択される配列を含むことを特徴とする、請求項７８又は９５に記載の抗体。
【請求項９７】
超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部、及び／又は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６の何れか１つから選択される配列を含むことを特徴とする、請求項４９に記載の抗体。
【請求項９８】
超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部、及び／又は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、配列番号１５７−２２４及び配列番号２３５−２９５の何れか１つから選択される配列に５０％以上相同する配列を含むことを特徴とする、請求項４９に記載の抗体。
【請求項９９】
超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部は、配列番号１５７−２３４の何れか１つから選択される配列を含むことを特徴とする、請求項４９に記載の抗体。
【請求項１００】
超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部は、配列番号１５７−２２４の何れか１つから選択される配列に５０％以上相同する配列を含むことを特徴とする、請求項４９に記載の抗体。
【請求項１０１】
超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、配列番号２３５−３０７及び配列番号３３３−３３６の何れか１つから選択される配列を含むことを特徴とする、請求項４９に記載の抗体。
【請求項１０２】
超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、配列番号２３５−２９５の何れか１つから選択される配列に５０％以上相同する配列を含むことを特徴とする、請求項４９に記載の抗体。
【請求項１０３】
超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部、及び／又は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、同じ超長ＣＤＲ３配列に由来することを特徴とする、請求項４９に記載の抗体。
【請求項１０４】
超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部、及び／又は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、２以上の異なる超長ＣＤＲ３配列に由来することを特徴とする、請求項４９に記載の抗体。
【請求項１０５】
第１及び／又は第２の抗体配列の超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ１Ｈ１２の超長ＣＤＲ３配列に基づく又は由来することを特徴とする、請求項４９に記載の抗体。
【請求項１０６】
第１及び／又は第２の抗体配列の超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ１Ｈ１２の超長ＣＤＲ３配列に５０％以上相同する配列に基づく又は由来することを特徴とする、請求項４９に記載の抗体。
【請求項１０７】
第１及び／又は第２の抗体配列の超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ５Ｂ８、ＢＬＶＣＶ１、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、又はＦ１８の超長ＣＤＲ３配列に基づく又は由来することを特徴とする、請求項４９に記載の抗体。
【請求項１０８】
第１及び／又は第２の抗体配列の超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ５Ｂ８、ＢＬＶＣＶ１、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、又はＦ１８の超長ＣＤＲ３配列に５０％以上相同する配列に基づく又は由来することを特徴とする、請求項４９に記載の抗体。
【請求項１０９】
超長ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸である超長ＣＤＲ３に基づく又は由来することを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項１１０】
超長ＣＤＲ３は、３以上のシステイン残基を含む超長ＣＤＲ３に基づく又は由来することを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項１１１】
超長ＣＤＲ３は、１以上のシステインモチーフを含む超長ＣＤＲ３に基づく又は由来することを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項１１２】
１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−９９を含むグループから選択されることを特徴とする、請求項１１１に記載の抗体。
【請求項１１３】
１以上のシステインモチーフは、配列番号１００−１５６を含むグループから選択されることを特徴とする、請求項１１２に記載の抗体。
【請求項１１４】
抗体は、長さが３５以上のアミノ酸である超長ＣＤＲ３に基づく又は由来することを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項１１５】
抗体は、３以上のシステイン残基を含む超長ＣＤＲ３に基づく又は由来することを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項１１６】
抗体は、１以上のシステインモチーフを含む超長ＣＤＲ３に基づく又は由来することを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項１１７】
抗体は、長さが３５以上のアミノ酸である超長ＣＤＲ３を含むことを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項１１８】
抗体は、３以上のシステイン残基を含む超長ＣＤＲ３を含むことを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項１１９】
抗体は、１以上のシステインモチーフを含む超長ＣＤＲ３を含むことを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項１２０】
超長ＣＤＲ３は重鎖ＣＤＲ３であることを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項１２１】
超長ＣＤＲ３は、非ヒトＤＨ配列に由来する又は基づくアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項１２２】
超長ＣＤＲ３は、ＪＨ配列に由来する又は基づくアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項１２３】
超長ＣＤＲ３は：
ａ．非ヒトＶＨ配列に由来する又は基づくアミノ酸配列；
ｂ．非ヒトＤＨ配列に由来する又は基づくアミノ酸配列；及び／又は
ｃ．ＪＨ配列に由来する又は基づくアミノ酸配列
を含むことを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項１２４】
超長ＣＤＲ３は、ＶＨ由来のアミノ酸配列とＤＨ由来のアミノ酸配列の間に位置する、少なくとも約２のアミノ酸残基を含む付加的なアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項４８又は４９に記載の抗体。
【請求項１２５】
抗体又はその結合フラグメントは、配列番号２４−４４から選択される配列を含み、該抗体又はその結合フラグメントは、配列番号２−２２のＤＮＡによってコード化されることを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項１２６】
抗体又はその結合フラグメントは、配列番号２３から選択される配列を含み、該抗体又はその結合フラグメントは、配列番号１のＤＮＡによってコード化されることを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項１２７】
超長ＣＤＲ３は、配列番号２４−４４から選択される配列を含むことを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項１２８】
超長ＣＤＲ３は、配列番号２３から選択される配列を含むことを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項１２９】
超長ＣＤＲ３は、配列番号２−２２に由来する又は基づくＤＮＡ配列によってコード化されることを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項１３０】
超長ＣＤＲ３は、配列番号１に由来する又は基づくＤＮＡ配列によってコード化されることを特徴とする、請求項４８に記載の抗体。
【請求項１３１】
第１リンカー配列を更に含む、請求項４８、４９、又は５４に記載の抗体。
【請求項１３２】
第２リンカー配列を更に含む、請求項１３１に記載の抗体。
【請求項１３３】
第１及び第２のリンカー配列は同じ配列を含むことを特徴とする、請求項１３２に記載の抗体。
【請求項１３４】
第１及び第２のリンカー配列は異なる配列を含むことを特徴とする、請求項１３２に記載の抗体。
【請求項１３５】
第１及び／又は第２のリンカー配列は、超長ＣＤＲ３の一部に基づく又は由来する部分に非抗体配列を結合することを特徴とする、請求項１３１又は１３２に記載の抗体。
【請求項１３６】
第１及び／又は第２のリンカー配列は、第１抗体配列に非抗体配列を結合することを特徴とする、請求項１３２に記載の抗体。
【請求項１３７】
第１及び／又は第２のリンカー配列は、第２抗体配列に非抗体配列を結合することを特徴とする、請求項１３２に記載の抗体。
【請求項１３８】
第１及び／又は第２のリンカー配列は、配列ＧＧＧＧＳを含むことを特徴とする、請求項１３２に記載の抗体。
【請求項１３９】
第１及び／又は第２のリンカー配列は、（ａ）ｎ＝１乃至５である配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ；（ｂ）配列ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；（ｃ）配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ；又は（ｄ）（ａ）−（ｃ）の組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１３２に記載の抗体。
【請求項１４０】
第１及び／又は第２のリンカー配列は同じ長さであることを特徴とする、請求項１３２に記載の抗体。
【請求項１４１】
第１及び／又は第２のリンカー配列は異なる長さであることを特徴とする、請求項１３２に記載の抗体。
【請求項１４２】
第１及び／又は第２のリンカー配列は長さが３以上のアミノ酸であることを特徴とする、請求項１３２に記載の抗体。
【請求項１４３】
第１及び／又は第２のリンカー配列は１以上のグリシン残基を含むことを特徴とする、請求項１３２に記載の抗体。
【請求項１４４】
第１及び／又は第２のリンカー配列は２以上の連続するグリシン残基を含むことを特徴とする、請求項１３２に記載の抗体。
【請求項１４５】
第１及び／又は第２のリンカー配列は１以上のセリン残基を含むことを特徴とする、請求項１３２に記載の抗体。
【請求項１４６】
第１及び／又は第２のリンカー配列は１以上の極性アミノ酸残基を含むことを特徴とする、請求項１３２に記載の抗体。
【請求項１４７】
１以上の極性アミノ酸残基は、セリン、トレオニン、アスパラギン、又はグルタミンから選択されることを特徴とする、請求項１４６に記載の抗体。
【請求項１４８】
極性アミノ酸残基は、非荷電の側鎖を含むことを特徴とする、請求項１４６に記載の抗体。
【請求項１４９】
１以上の切断部位を更に含む、請求項４８に記載の抗体。
【請求項１５０】
１以上の切断部位は、プロテアーゼのための認識部位を含むことを特徴とする、請求項１４９に記載の抗体。
【請求項１５１】
プロテアーゼは因子Ｘａであることを特徴とする、請求項１４９に記載の抗体。
【請求項１５２】
１以上の切断部位は、ＩＥＧＲのアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１４９に記載の抗体。
【請求項１５３】
１以上の切断部位は、第１抗体配列と非抗体配列の間にあることを特徴とする、請求項１４９に記載の抗体。
【請求項１５４】
１以上の切断部位は、第２抗体配列と非抗体配列の間にあることを特徴とする、請求項１４９に記載の抗体。
【請求項１５５】
１以上の切断部位及び１以上のリンカーを更に含む、請求項４９に記載の抗体。
【請求項１５６】
１以上の切断部位は、１以上のリンカーと非抗体配列の間にあることを特徴とする、請求項１５５に記載の抗体。
【請求項１５７】
１以上の切断部位は、第１抗体配列と１以上のリンカーの間にあることを特徴とする、請求項１５５に記載の抗体。
【請求項１５８】
１以上の切断部位は、第２抗体配列と１以上のリンカーの間にあることを特徴とする、請求項１５５に記載の抗体。
【請求項１５９】
抗体又はその結合フラグメントのライブラリであって、抗体又はその結合フラグメントは超長ＣＤＲ３を含むことを特徴とする、ライブラリ。
【請求項１６０】
抗体又はその結合フラグメントのライブラリであって、抗体又はその結合フラグメントは、請求項４８乃至１５８の何れか１つに記載の抗体又はその結合フラグメントを含むことを特徴とする、ライブラリ。
【請求項１６１】
抗体又はその結合フラグメントをコード化する配列を含む複数のポリヌクレオチドを含む核酸ライブラリであって、抗体又はその結合フラグメントは、超長ＣＤＲ３を含むことを特徴とする、核酸ライブラリ。
【請求項１６２】
抗体又はその結合フラグメントをコード化する配列を含む複数のポリヌクレオチドを含む核酸ライブラリであって、抗体又はその結合フラグメントは、請求項４８乃至１５８の何れか１つに記載の抗体又はその結合フラグメントを含むことを特徴とする、核酸ライブラリ。
【請求項１６３】
可変領域をコード化する核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、可変領域は超長ＣＤＲ３を含むことを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項１６４】
ポリヌクレオチドを含むベクターであって、ポリヌクレオチドは可変領域をコード化する核酸配列を含み、可変領域は超長ＣＤＲ３を含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項１６５】
ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ポリヌクレオチドは可変領域をコード化する核酸配列を含み、可変領域は超長ＣＤＲ３を含むことを特徴とする、宿主細胞。
【請求項１６６】
請求項４８乃至１５８の何れか１つに記載の抗体又はその結合フラグメントをコード化する核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１６７】
ポリヌクレオチドを含むベクターであって、ポリヌクレオチドは、請求項１４４乃至１７３の何れか１つに記載の抗体又はその結合フラグメントをコード化する核酸配列を含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項１６８】
ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ポリヌクレオチドは、請求項４８乃至１５８の何れか１つの抗体又はその結合フラグメントをコード化する核酸配列を含むことを特徴とする、宿主細胞。
【請求項１６９】
超長ＣＤＲ３又はそのフラグメントを含む抗体又はその結合フラグメントを生成する方法であって、該方法は、ポリヌクレオチド配列が発現され、超長ＣＤＲ３又はそのフラグメントを含む抗体又はその結合フラグメントが生成され得る条件下で、請求項１６８の宿主細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１７０】
宿主細胞培養物から超長ＣＤＲ３又はそのフラグメントを含む抗体又はその結合フラグメントを回収する工程を更に含むことを特徴とする、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
請求項４８乃至１５８の何れか１つの抗体又はそのフラグメント含む、医薬組成物。
【請求項１７２】
（ａ）超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に基づく又は由来する配列を含む抗体又はそのフラグメント；及び（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１７３】
治療剤を更に含む、請求項１７２又は１７３に記載の医薬組成物。
【請求項１７４】
治療剤は、抗体、小分子、有機化合物、ペプチド、タンパク質であることを特徴とする、請求項１７２又は１７３に記載の医薬組成物。
【請求項１７５】
必要とする被験体の疾患又は疾病を処置する方法であって、該方法は、本明細書に開示される抗体の何れかの治療上効果的な量を哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項１７６】
抗体は超長ＣＤＲ３配列及び非抗体配列を含むことを特徴とする、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
非抗体配列は、Ｍｏｋａ１、Ｖｍ２４、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ベータ−インターフェロン、ヒトＥＰＯ、ヒトＦＧＦ２１、ヒトＧＭＣＳＦ、ヒトインターフェロン−ベータ、ウシＧＣＳＦ、ヒトＧＣＳＦ、ＩＬ８、ジコノチド、ソマトスタチン、クロロトキシン、ＳＤＦ１（アルファ）、ＩＬ２１、プロトキシン２、及びその誘導体又は変異体を含むグループから選択されることを特徴とする、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
疾患又は疾病は、自己免疫疾患、異種免疫の疾患又は疾病、炎症性疾患、病原性の感染、血栓塞栓障害、呼吸器疾患又は疾病、代謝疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）障害、骨疾患、癌、血液障害、肥満症、糖尿病、骨粗鬆症、貧血、又は疼痛を含むグループから選択されることを特徴とする、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７９】
疾患又は疾病は、イオンチャネルの調節から利益を得ることを特徴とする、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１８０】
イオンチャネルは、カリウムイオンチャネル、ナトリウムイオンチャネル、又は酸感受性イオンチャネルを含むグループから選択されることを特徴とする、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
イオンチャネルは、Ｋｖ１．３イオンチャネル、Ｎａｖ１．７イオンチャネル、及び酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）を含むグループから選択されることを特徴とする、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１８２】
疾患又は疾病は、受容体の調節から利益を得ることを特徴とする、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１８３】
受容体は、ＧＬＰ１Ｒ、ＧＣＧＲ、ＥＰＯ受容体、ＦＧＦＲ、ＦＧＦ２１Ｒ、ＣＳＦＲ、ＧＭＣＳＦＲ、ＩＬ８Ｒ、ＩＬ２１Ｒ、及びＧＣＳＦＲを含むグループから選択されることを特徴とする、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
疾患又は疾病は乳腺炎であることを特徴とする、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１８５】
被験体は哺乳動物であることを特徴とする、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１８６】
哺乳動物はウシ又はヒトであることを特徴とする、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
配列番号２４及び配列番号２３を含むウシ抗体Ｆａｂフラグメントを含む、分離された結晶であって、結晶は、空間群Ｐ２１２１２１、及びａ＝７１．４オングストローム、ｂ＝１２７．６オングストローム、及びｃ＝１２７．９オングストロームの単位胞寸法を有することを特徴とする、分離された結晶。
【請求項１８８】
配列番号３４０及び配列番号３４１を含むウシ抗体Ｆａｂフラグメントを含む、分離された結晶であって、結晶は、空間群Ｐ２１２１２１、及びａ＝５４．６オングストローム、ｂ＝５３．７オングストローム、及びｃ＝３３０．５オングストロームの単位胞寸法を有することを特徴とする、分離された結晶。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１２年１月９日出願の米国仮特許出願第６１／５８４，６８０号、及び２０１２年７月１３日出願の米国仮特許出願第６１／６７１，６２９号の利益を主張するものであり、それらはその全体によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本明細書には、超長ＣＤＲ３の少なくとも一部を含む免疫グロブリンコンストラクト、該コンストラクト、該コンストラクトを含む医薬組成物及び薬物の製造方法、並びに、被験体の疾患又は疾病を予防、阻害、及び／又は処置するための前記コンストラクト及び組成物の使用方法が、記載される。
【背景技術】
【０００３】
抗体は、脊椎動物の免疫系が主として感染に対する防御のため夾雑物（抗原）に応じて形成する天然のタンパク質である。１世紀以上の間、抗体は、人工の条件下で動物に誘発され、疾患状態の治療又は診断における使用、或いは生物学的研究のために採取されてきた。個々の各抗体産生細胞は、化学的に定義された組成物を有する単一型の抗体を生成するが、抗原接種に応じて動物血清から直接得た抗体は、個々の抗体産生細胞の集合から作られる、異なる分子（例えば、ポリクローナル抗体）の集合を実際に含む。
【０００４】
幾つかのウシの抗体は、他の脊椎動物と比較して異常に長いＶＨ  ＣＤＲ３配列を有する。例えば、ＩｇＭの約１０％は、「超長（ｕｌｔｒａｌｏｎｇ）」ＣＤＲ３配列を含み、それは６１までのアミノ酸長となり得る。これら異常なＣＤＲ３は頻繁に、多数のシステインを有する。機能的なＶＨ遺伝子は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えと呼ばれるプロセスを通じて生じ、ここで、Ｄ領域は、ＣＤＲ３のかなりの割合をコード化する。超長配列をコード化する独特のＤ領域は、畜牛において同定されてきた。超長ＣＤＲ３は、畜牛ゲノムにおいて部分的にコード化され、ヒトと比較して、その抗体レパートリーの独特の特徴を提供する。Ｋａｕｓｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，７４０，７４７号及び第７，１９６，１８５号）は、プローブとして有用であると述べられた畜牛に特有の様々なウシの生殖系列Ｄ遺伝子配列、及びワクチンベクターとして有用であると述べられたウシのＶＤＪカセットを開示する。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、超長ＣＤＲ３を備えたライブラリを含む、超長ＣＤＲ３を有する抗体、及びその使用を提供する。
【０００６】
本開示はまた、抗体又はその結合フラグメントのライブラリを提供し、ここで、抗体又はその結合フラグメントは超長ＣＤＲ３を含む。
【０００７】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸、長さが４０以上のアミノ酸、長さが４５以上のアミノ酸、長さが５０以上のアミノ酸、長さが５５以上のアミノ酸、又は長さが６０以上のアミノ酸である。
【０００８】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸である。
【０００９】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、３以上のシステイン残基、４以上のシステイン残基、５以上のシステイン残基、６以上のシステイン残基、７以上のシステイン残基、８以上のシステイン残基、９以上のシステイン残基、１０以上のシステイン残基、１１以上のシステイン残基、又は１２以上のシステイン残基を含む。
【００１０】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、３以上のシステイン残基を含む。
【００１１】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、抗体又はその結合フラグメントは、システインモチーフを含む。
【００１２】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、システインモチーフは、配列番号４５−１５６から成るグループから選択される。上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、システインモチーフは、配列番号４５−９９から成るグループから選択される。上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、システインモチーフは、配列番号４５−１３５から成るグループから選択される。上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、システインモチーフは、配列番号１００−１３５から成るグループから選択される。上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、システインモチーフは、配列番号１３６−１５６から成るグループから選択される。
【００１３】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、非ヒトＤＨ又はその誘導体を含む。
【００１４】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＪＨ配列又はその誘導体を含む。
【００１５】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、非ヒトＶＨ配列又はその誘導体、非ヒトＤＨ配列又はその誘導体；及び／又は、ＪＨ配列又はその誘導体を含む。
【００１６】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＶＨ配列とＤＨ配列の間に位置する、２乃至６以上のアミノ酸残基を含む、付加的なアミノ酸配列を含む。
【００１７】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、非ウシ配列を含む。
【００１８】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、非ウシ配列は、非抗体配列又はヒト配列である。
【００１９】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、非ウシ配列は、超長ＣＤＲ３の少なくとも一部を置換する。
【００２０】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、非ウシ配列は、ホルモン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカイン、サイトカイン、トキシン、又はそれらの組み合わせである。
【００２１】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、非ウシ配列は、サイトカインである。
【００２２】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。
【００２３】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、リンカーである付加的な配列を含む。
【００２４】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、リンカーは、非抗体配列のＣ末端、Ｎ末端、又はＣ末端及びＮ末端の両方に結合される。
【００２５】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３９）であり、ここで、ｎは０と５の間の整数である。代替的に又は付加的に、リンカーは、（ＧＳＧ）ｎ（配列番号３４２）、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３７）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３８）である。
【００２６】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘｎモチーフ（配列番号４９４）を含み、ここで、Ｘ１は、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、又はバリン（Ｖ）であり、Ｘ２は、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ３は、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）であり、Ｘ４は、ヒスチジン（Ｈ）、トレオニン（Ｔ）、アルギニン（Ｒ）、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、又はロイシン（Ｌ）であり、Ｘ５はグルタミン（Ｑ）であり、ｎは２７−５４である。
【００２７】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５モチーフ（配列番号４９５）は、ＴＴＶＨＱ（配列番号１５９）又はＴＳＶＨＱ（配列番号１６０）である。
【００２８】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３はさらに（ＸａＸｂ）ｚモチーフ（配列番号４９６）を含み、ここで、Ｘａは、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、及びヒスチジン（Ｈ）から成るグループから選択された芳香族アミノ酸であり、Ｘｂは任意のアミノ酸残基であり、並びに、ｚは１−４である。
【００２９】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、（ＸａＸｂ）ｚモチーフ（配列番号４９６）は、ＹＸＹＸＹＸ（配列番号２９８）である。
【００３０】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘｎ（ＸａＸｂ）ｚモチーフ（配列番号４９７）を含み、ここで、Ｘ１は、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、又はバリン（Ｖ）であり、Ｘ２は、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ３は、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）であり、Ｘ４は、ヒスチジン（Ｈ）、トレオニン（Ｔ）、アルギニン（Ｒ）、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、又はロイシン（Ｌ）であり、Ｘ５はグルタミン（Ｑ）であり、Ｘａは、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、及びヒスチジン（Ｈ）から成るグループから選択された芳香族アミノ酸であり、Ｘｂは任意のアミノ酸残基であり、ｎは２７−５４であり、及びｚは１−４である。
【００３１】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５モチーフ（配列番号４９５）は、ＴＴＶＨＱ（配列番号１５９）又はＴＳＶＨＱ（配列番号１６０）であり、ここで、（ＸａＸｂ）ｚモチーフ（配列番号４９６）は、ＹＸＹＸＹＸ（配列番号２９８）である。
【００３２】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＴＳＶＨＱＥＴＫＫＹＱ（配列番号１５７）を含む。
【００３３】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＶＨＱＥＴＫＫＹＱ（配列番号１５８）を含む。
【００３４】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＣＴＴＶＨＱＸｎ（配列番号２２３）を含む。
【００３５】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＣＴＳＶＨＱＸｎ（配列番号２２４）を含み、ここで、ｎは１−８である。
【００３６】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＴＴＶＨＱ（配列番号１５９）を含む。
【００３７】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＴＳＶＨＱ（配列番号１６０）を含む。
【００３８】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＶＨＱ（配列番号２２５）を含む。
【００３９】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＫＫＱ（配列番号２２６）を含む。
【００４０】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＶＹＱ（配列番号２２７）を含む。
【００４１】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｑ（配列番号２２８）を含み、ここで、Ｘ１はＴ、Ｓ、Ａ、又はＧであり、ここで、Ｘ２はＴ、Ｓ、Ａ、Ｐ、又はＩであり、Ｘ３はＶ又はＫであり、Ｘ４はＨ、Ｋ、又はＹである。
【００４２】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＣＸ１Ｘ２ＶＨＱ（配列番号２３０）を含み、ここで、Ｘ１はＴ、Ｓ、Ａ、又はＧであり、Ｘ２はＴ、Ｓ、Ａ、Ｐ、又はＩである。
【００４３】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＣＸ１Ｘ２ＶＸ３Ｑ（配列番号２３２）を含み、ここで、Ｘ１はＴ、Ｓ、Ａ、又はＧであり、Ｘ２はＴ、Ｓ、Ａ、Ｐ、又はＩであり、Ｘ３はＨ、Ｙ、又はＫである。
【００４４】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＣＸ１Ｘ２ＫＫＱ（配列番号２３４）を含み、ここで、Ｘ１はＴ、Ｓ、Ａ、又はＧであり、Ｘ２はＴ、Ｓ、Ａ、Ｐ、又はＩである。
【００４５】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＹＴＹＮＹＥＷ（配列番号２３５）を含む。
【００４６】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＹＸ１ＹＸ２（配列番号２９６）を含み、ここで、Ｘ２はＥ又はＤである。
【００４７】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＹＸ１ＹＸ２Ｙ（配列番号２９７）を含む。
【００４８】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＹＥＸ（配列番号３００）を含み、ここで、ＸはＨ、Ｗ、Ｎ、Ｆ、Ｉ、又はＹである。
【００４９】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＹＤＸ（配列番号３０１）を含み、ここで、ＸはＨ、Ｗ、Ｎ、Ｆ、Ｉ、又はＹである。
【００５０】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＸＹＥ（配列番号３０２）を含み、ここで、ＸはＴ、Ｓ、Ｎ、又はＩである。
【００５１】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＸＹＤ（配列番号３０３）を含み、ここで、ＸはＴ、Ｓ、Ｎ、又はＩである。
【００５２】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、Ｙ（Ｅ／Ｄ）Ｘ１ＸｎＷ（配列番号３０４−３０５として開示される特定の実施形態を伴う配列番号４９８）を含み、ここで、Ｘ１はＨ、Ｗ、Ｎ、Ｆ、Ｉ、又はＹであり、ｎは１−４である。
【００５３】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、抗体又はその結合フラグメントは、キメラ、ヒト操作（ｈｕｍａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）、又はヒト化である。
【００５４】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、反芻動物のＣＤＲ３である。
【００５５】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、反芻動物は乳牛である。
【００５６】
本開示はまた、抗体又はその結合フラグメントをコード化するポリヌクレオチドのライブラリを提供し、ここで、コード化した抗体又はその結合フラグメントは、超長ＣＤＲ３を含む。
【００５７】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸、長さが４０以上のアミノ酸、長さが４５以上のアミノ酸、長さが５０以上のアミノ酸、長さが５５以上のアミノ酸、又は長さが６０以上のアミノ酸である。
【００５８】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸である。
【００５９】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、３以上のシステイン残基、４以上のシステイン残基、５以上のシステイン残基、６以上のシステイン残基、７以上のシステイン残基、８以上のシステイン残基、９以上のシステイン残基、１０以上のシステイン残基、１１以上のシステイン残基、又は１２以上のシステイン残基を含む。
【００６０】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、３以上のシステイン残基を含む。
【００６１】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、抗体又はその結合フラグメントは、システインモチーフを含む。
【００６２】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、システインモチーフは、配列番号４５−１５６から成るグループから選択される。上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、システインモチーフは、配列番号４５−９９から成るグループから選択される。上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、システインモチーフは、配列番号４５−１３５から成るグループから選択される。上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、システインモチーフは、配列番号１００−１３５から成るグループから選択される。上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、システインモチーフは、配列番号１３６−１５６から成るグループから選択される。
【００６３】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、非ヒトＤＨ又はその誘導体を含む。
【００６４】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＪＨ配列又はその誘導体を含む。
【００６５】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、非ヒトＶＨ配列又はその誘導体、非ヒトＤＨ配列又はその誘導体；及び／又は、ＪＨ配列又はその誘導体を含む。
【００６６】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＶＨ配列とＤＨ配列の間に位置する、２乃至６以上のアミノ酸残基を含む、付加的なアミノ酸配列を含む。
【００６７】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、非ウシ配列を含む。
【００６８】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、非ウシ配列は、非抗体配列又はヒト配列である。
【００６９】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、非ウシ配列は、超長ＣＤＲ３の少なくとも一部を置換する。
【００７０】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、非抗体配列は、ホルモン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカイン、サイトカイン、トキシン、又はそれらの組み合わせである。
【００７１】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、非ウシ配列は、サイトカインである。
【００７２】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。
【００７３】
上記下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、リンカーである付加的な配列を含む。
【００７４】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、リンカーは、非抗体配列のＣ末端、Ｎ末端、又はＣ末端及びＮ末端の両方に結合される。
【００７５】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３９）であり、ここで、ｎは０と５の間の整数である。代替的に、リンカーは、（ＧＳＧ）ｎ（配列番号３４２）、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３７）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３８）である。
【００７６】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５モチーフ（配列番号４９５）を含み、ここで、Ｘ１は、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、又はバリン（Ｖ）であり、Ｘ２は、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ３は、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）であり、Ｘ４は、ヒスチジン（Ｈ）、トレオニン（Ｔ）、アルギニン（Ｒ）、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、又はロイシン（Ｌ）であり、Ｘ５はグルタミン（Ｑ）である。
【００７７】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５モチーフ（配列番号４９５）は、ＴＴＶＨＱ（配列番号１５９）又はＴＳＶＨＱ（配列番号１６０）である。
【００７８】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３はさらに（ＸａＸｂ）ｚモチーフ（配列番号４９６）を含み、ここで、Ｘａは、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、及びヒスチジン（Ｈ）から成るグループから選択された芳香族アミノ酸であり、Ｘｂは任意のアミノ酸残基であり、ｚは１−４である。
【００７９】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、（ＸａＸｂ）ｚモチーフ（配列番号４９６）は、ＹＸＹＸＹＸ（配列番号２９８）である。
【００８０】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘｎ（ＸａＸｂ）ｚモチーフ（配列番号４９７）を含み、ここで、Ｘ１は、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、又はバリン（Ｖ）であり、Ｘ２は、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、又はアスパラギン（Ｎ）であり、Ｘ３は、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）であり、Ｘ４は、ヒスチジン（Ｈ）、トレオニン（Ｔ）、アルギニン（Ｒ）、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、又はロイシン（Ｌ）であり、Ｘ５はグルタミン（Ｑ）であり、Ｘａは、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、及びヒスチジン（Ｈ）から成るグループから選択された芳香族アミノ酸であり、Ｘｂは任意のアミノ酸残基であり、ｎは２７−５４であり、及びｚは１−４である。
【００８１】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５モチーフ（配列番号４９５）は、ＴＴＶＨＱ（配列番号１５９）又はＴＳＶＨＱ（配列番号１６０）であり、ここで、（Ｘａ−Ｘｂ）ｚモチーフ（配列番号４９６）は、ＹＸＹＸＹＸ（配列番号２９８）である。
【００８２】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＴＳＶＨＱＥＴＫＫＹＱ（配列番号１５７）を含む。
【００８３】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＶＨＱＥＴＫＫＹＱ（配列番号１５８）を含む。
【００８４】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＣＴＴＶＨＱＸｎ（配列番号２２３）を含む。
【００８５】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＣＴＳＶＨＱＸｎ（配列番号２２４）を含み、ここで、ｎは１−８である。
【００８６】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＴＴＶＨＱ（配列番号１５９）を含む。
【００８７】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＴＳＶＨＱ（配列番号１６０）を含む。
【００８８】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＶＨＱ（配列番号２２５）を含む。
【００８９】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＫＫＱ（配列番号２２６）を含む。
【００９０】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＶＹＱ（配列番号２２７）を含む。
【００９１】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｑ（配列番号２２８）を含み、ここで、Ｘ１はＴ、Ｓ、Ａ、又はＧであり、ここで、Ｘ２はＴ、Ｓ、Ａ、Ｐ、又はＩであり、Ｘ３はＶ又はＫであり、Ｘ４はＨ、Ｋ、又はＹである。
【００９２】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＣＸ１Ｘ２ＶＨＱ（配列番号２３０）を含み、ここで、Ｘ１はＴ、Ｓ、Ａ、又はＧであり、Ｘ２はＴ、Ｓ、Ａ、Ｐ、又はＩである。
【００９３】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＣＸ１Ｘ２ＶＸ３Ｑ（配列番号２３２）を含み、ここで、Ｘ１はＴ、Ｓ、Ａ、又はＧであり、Ｘ２はＴ、Ｓ、Ａ、Ｐ、又はＩであり、Ｘ３はＨ、Ｙ、又はＫである。
【００９４】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＣＸ１Ｘ２ＫＫＱ（配列番号２３４）を含み、ここで、Ｘ１はＴ、Ｓ、Ａ、又はＧであり、Ｘ２はＴ、Ｓ、Ａ、Ｐ、又はＩである。
【００９５】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＹＴＹＮＹＥＷ（配列番号２３５）を含む。
【００９６】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＹＸ１ＹＸ２（配列番号２９６）を含み、ここで、Ｘ２はＥ又はＤである。
【００９７】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＹＸ１ＹＸ２Ｙ（配列番号２９７）を含む。
【００９８】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＹＥＸ（配列番号３００）を含み、ここで、ＸはＨ、Ｗ、Ｎ、Ｆ、Ｉ、又はＹである。
【００９９】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＹＤＸ（配列番号３０１）を含み、ここで、ＸはＨ、Ｗ、Ｎ、Ｆ、Ｉ、又はＹである。
【０１００】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＸＹＥ（配列番号３０２）を含み、ここで、ＸはＴ、Ｓ、Ｎ、又はＩである。
【０１０１】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＸＹＤ（配列番号３０３）を含み、ここで、ＸはＴ、Ｓ、Ｎ、又はＩである。
【０１０２】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、Ｙ（Ｅ／Ｄ）Ｘ１ＸｎＷ（配列番号４９８）を含み、ここで、Ｘ１はＨ、Ｗ、Ｎ、Ｆ、Ｉ、又はＹであり、ｎは１−４である。
【０１０３】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、抗体又はその結合フラグメントは、キメラ、ヒト操作、又はヒト化である。
【０１０４】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、反芻動物のＣＤＲ３である。
【０１０５】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、反芻動物は乳牛である。
【０１０６】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、抗体又はその結合フラグメントは、空間的にアドレス指定されたフォーマット（ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ａｄｄｒｅｓｓｅｄ  ｆｏｒｍａｔ）に存在する。
【０１０７】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、抗体又はその結合フラグメントをコード化するポリヌクレオチドは、空間的にアドレス指定されたフォーマットに存在する。
【０１０８】
本開示はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのライブラリの何れかを含む、ベクターのライブラリを提供する。
【０１０９】
本開示はまた、本明細書に開示されるベクターの任意のライブラリを含む、宿主細胞のライブラリを提供する。
【０１１０】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、細胞は、バクテリア、ウィルス、又はバクテリオファージである。
【０１１１】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、抗体又はその結合フラグメントは、細胞表面に提示される。
【０１１２】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、抗体又はその結合フラグメントは、細胞から分泌される。
【０１１３】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、抗体又はその結合フラグメントは、空間的にアドレス指定されたフォーマットに存在する。
【０１１４】
本開示はまた、超長ＣＤＲ３を含む抗体又はその結合フラグメントを提供し、ここで、超長ＣＤＲ３は非ウシ配列を含む。
【０１１５】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸、長さが４０以上のアミノ酸、長さが４５以上のアミノ酸、長さが５０以上のアミノ酸、長さが５５以上のアミノ酸、又は長さが６０以上のアミノ酸である。
【０１１６】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸である。
【０１１７】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、３以上のシステイン残基、４以上のシステイン残基、５以上のシステイン残基、６以上のシステイン残基、７以上のシステイン残基、８以上のシステイン残基、９以上のシステイン残基、１０以上のシステイン残基、１１以上のシステイン残基、又は１２以上のシステイン残基を含む。
【０１１８】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、３以上のシステイン残基を含む。
【０１１９】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、抗体又はその結合フラグメントは、システインモチーフを含む。
【０１２０】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、システインモチーフは、配列番号４５−１５６から成るグループから選択される。上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、システインモチーフは、配列番号４５−９９から成るグループから選択される。上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、システインモチーフは、配列番号４５−１３５から成るグループから選択される。上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、システインモチーフは、配列番号１００−１３５から成るグループから選択される。上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、システインモチーフは、配列番号１３６−１５６から成るグループから選択される。
【０１２１】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、非ウシ配列は、非抗体配列又はヒト配列である。
【０１２２】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、非ヒトＤＨ又はその誘導体を含む。
【０１２３】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＪＨ配列又はその誘導体を含む。
【０１２４】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、非ヒトＶＨ配列又はその誘導体、非ヒトＤＨ配列又はその誘導体；及び／又は、ＪＨ配列又はその誘導体を含む。
【０１２５】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ＶＨ配列とＤＨ配列の間に位置する、２乃至６以上のアミノ酸残基を含む、付加的なアミノ酸配列を含む。
【０１２６】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、非ウシ配列は、超長ＣＤＲ３の少なくとも一部を置換する。
【０１２７】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、非ウシ配列は、ホルモン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカイン、サイトカイン、トキシン、又はそれらの組み合わせである。
【０１２８】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、非ウシ配列は、サイトカインである。
【０１２９】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、サイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。
【０１３０】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、抗体又はその結合フラグメントは、キメラ、ヒト操作、又はヒト化である。
【０１３１】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３は、反芻動物のＣＤＲ３である。
【０１３２】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、反芻動物は乳牛である。
【０１３３】
本開示はまた、本明細書に開示される任意の抗体又はその結合フラグメントをコード化するポリヌクレオチドを提供する。
【０１３４】
本開示はまた、本明細書に開示される抗体又はその結合フラグメントをコード化する任意のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【０１３５】
本開示はまた、本明細書に開示される任意のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１３６】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、細胞は、バクテリア、ウィルス、又はバクテリオファージである。
【０１３７】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、抗体又はその結合フラグメントは、細胞の表面に提示される。
【０１３８】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、抗体又はその結合フラグメントは、細胞から分泌される。
【０１３９】
本開示はまた、抗体又は結合フラグメントを生成する方法を提供し、該方法は、ポリヌクレオチド配列が発現され、超長ＣＤＲ３又はそのフラグメントを含む抗体又はその結合フラグメントが生成されるという条件下で、本明細書に開示される抗体の何れかをコード化するポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養する工程を含む。
【０１４０】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、方法はさらに、宿主細胞培養物から、超長ＣＤＲ３又はそのフラグメントを含む抗体又はその結合フラグメントを回収する工程を含む。
【０１４１】
本開示はまた、本明細書に開示される任意の抗体又はその結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。
【０１４２】
本開示はまた、必要とする哺乳動物を処置する方法を提供し、該方法は、本明細書に開示される任意の抗体の量を哺乳動物に投与する工程を含む。
【０１４３】
上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【０１４４】
幾つかの実施形態において、 組み換え抗体又はそのフラグメントが開示され、ここで、 組み換え抗体又はそのフラグメントの少なくとも一部は、超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に基づく、又はそれに由来する。
【０１４５】
幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３の少なくとも一部、及び非ウシ配列の少なくとも一部を含む、抗体又はその結合フラグメントが開示される。
【０１４６】
幾つかの実施形態において、（ａ）第１抗体配列であって、第１抗体配列の少なくとも一部は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する、第１抗体配列；（ｂ）非抗体配列；及び（ｃ）随意に、第２抗体配列であって、第２抗体配列の少なくとも一部は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する、第２抗体配列を含む、抗体又はそのフラグメントが開示される。
【０１４７】
本明細書に開示される抗体は、キメラ、ヒト操作、又はヒト化の抗体でもよい。本明細書に開示される抗体は、ウシ操作（ｂｏｖｉｎｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）、ウシ化、又は完全にウシの抗体でもよい。本明細書に開示される抗体は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、（ｄｓＦｖ）２、ミニボディ、フレックスミニボディ（ｆｌｅｘ  ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、又は二重特異性のフラグメントを含み得る。本明細書に開示される抗体は、分離した抗体でもよい。
【０１４８】
本明細書に開示される抗体はさらに、非抗体配列を含み得る。非抗体配列は哺乳動物由来でもよい。哺乳動物は、ウシ、ヒト、又は非ウシの哺乳動物でもよい。本明細書に開示される抗体は、非ウシ動物由来の非抗体配列を含み得る。非ウシ動物はサソリでもよい。非ウシ動物はトカゲでもよい。トカゲはアメリカドクトカゲでもよい。非抗体配列は成長因子由来でもよい。成長因子は、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、又はＦＧＦ２１でもよい。ＧＣＳＦはウシＧＣＳＦでもよい。代替的に、ＧＣＳＦはヒトＧＣＳＦでもよい。ＧＭＣＳＦ及び／又はＦＧＦ２１はヒト由来でもよい。非抗体配列はサイトカイン由来でもよい。サイトカインはベータ−インターフェロンでもよい。非抗体配列はホルモン由来でもよい。ホルモンは、エキセンジン−４、ＧＬＰ−１、ソマトスタチン、又はエリスロポエチンでもよい。ＧＬＰ−１及び／又はエリスロポエチンはヒト由来でもよい。非抗体配列はトキシン由来でもよい。トキシンは、Ｍｏｋａ１、ＶＭ−２４、ジコノチド、クロロトキシン、又はプロトキシン２（ＰｒｏＴｘＩＩ）でもよい。非抗体配列は、ＩＬ８、ジコノチド、ソマトスタチン、クロロトキシン、ＳＤＦ１（アルファ）、又はＩＬ２１でもよい。非抗体配列は、配列番号３１７−３３２の何れかに基づく、又はそれに由来する、アミノ酸配列を含み得る。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３の少なくとも一部を置換し得る。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３の配列に挿入され得る。非抗体配列は、抗体（例えば、超長ＣＤＲ３、可変領域、重鎖、軽鎖）の少なくとも一部に共役され得る。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３、リンカー、切断部位、非ウシ配列、非超長ＣＤＲ３抗体配列、又はそれらの組み合わせに付けられ得る。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３、リンカー、切断部位、非ウシ配列、非超長ＣＤＲ３抗体配列、又はそれらの組み合わせに隣接してもよい。
【０１４９】
本明細書に開示される抗体は、超長ＣＤＲ３を含み、乳牛の超長ＣＤＲ３に基づく又は由来し得る。本明細書に開示される抗体の少なくとも一部は、哺乳動物由来でもよい。本明細書に開示される抗体の第１抗体配列の少なくとも一部及び／又は第２抗体配列の少なくとも一部は、哺乳動物由来でもよい。哺乳動物は、ウシ、ヒト、又は非ウシの哺乳動物でもよい。
【０１５０】
本明細書に開示される抗体は、長さが３以上のアミノ酸を含み得る。本明細書に開示される抗体は、本明細書に開示される超長ＣＤＲ３に基づく又は由来し得る配列を含み得る。本明細書に開示される抗体は、超長ＣＤＲ３のストークドメインに基づく又は由来し得る１以上のアミノ酸残基を含み得る。本明細書に開示される抗体は、超長ＣＤＲ３のノブドメインに基づく又は由来し得る１以上のアミノ酸残基を含み得る。
【０１５１】
本明細書に開示される抗体の少なくとも一部は、本明細書に開示される超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に基づく又は由来し得る抗体の一部は、長さが２０以下のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に基づく又は由来し得る抗体の一部は、長さが３以上のアミノ酸でもよい。本明細書に開示される抗体は、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来し得る１以上の保存モチーフを含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する１以上の保存モチーフは、本明細書に開示されるストークドメイン保存モチーフの何れかを含み得る。
【０１５２】
本明細書に開示される超長ＣＤＲ３の一部は、超長ＣＤＲ３のストークドメインの少なくとも一部、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部、又はそれらの組み合わせを含み得る。
【０１５３】
本明細書に開示される抗体は、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６の何れか１つから選択される配列を含み得る。本明細書に開示される抗体は、配列番号１５７−２２４及び２３５−２９５から選択される配列に５０％以上相同である配列を含み得る
【０１５４】
本明細書に開示される抗体の何れかの一部は、単一の超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に基づく又は由来し得る。
【０１５５】
本明細書に開示される抗体の何れかの一部は、２以上の異なる超長ＣＤＲ３配列の少なくとも一部に基づく又は由来し得る。
【０１５６】
本明細書に開示される実施形態の何れかにおいて、超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ１Ｈ１２の超長ＣＤＲ３配列に基づく又は由来する。超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ１Ｈ１２の超長ＣＤＲ３配列に５０％以上相同し得る配列に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ５Ｂ８、ＢＬＶＣＶ１、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、又はＦ１８の超長ＣＤＲ３配列に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ５Ｂ８、ＢＬＶＣＶ１、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、又はＦ１８の超長ＣＤＲ３配列に５０％以上相同し得る配列に基づく又は由来し得る。
【０１５７】
本明細書に開示される抗体は、長さが３以上のアミノ酸を含む第１及び／又は第２の抗体配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部及び／又は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、長さが２０以下のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部及び／又は超長ＣＤＲ３の一部に由来する第２抗体配列の一部は、長さが３以上のアミノ酸でもよい。
【０１５８】
本明細書に開示される実施形態の何れかにおいて、第１及び／又は第２の抗体配列は、超長ＣＤＲ３のストークドメインに基づく又は由来する、１つ以上のアミノ酸残基を含む。第１及び／又は第２の抗体配列は、超長ＣＤＲ３のノブドメインに基づく又は由来する、１以上のアミノ酸残基を含み得る。超長ＣＤＲ３のノブドメインに由来する１以上のアミノ酸残基は、セリン及び／又はシステイン残基でもよい。第１及び／又は第２の抗体配列は、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来し得る１以上の保存モチーフを含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する１以上の保存モチーフは、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６の何れか１つから選択される配列を含み得る。
【０１５９】
本明細書に開示される実施形態の何れかにおいて、超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部及び／又は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６の何れか１つから選択される配列を含む。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部及び／又は超長ＣＤＲ３の一部に由来する第２抗体配列の一部は、配列番号１５７−２２４及び２３５−２９５の何れか１つから選択される配列に５０％以上相同し得る配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部は、配列番号１５７−２３４の何れか１つから選択される配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部は、配列番号１５７−２２４の何れか１つから選択される配列に５０％以上相同し得る配列を含み得る。
【０１６０】
本明細書に開示される実施形態の何れかにおいて、超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、配列番号２３５−３０７及び配列番号３３３−３３６の何れか１つから選択される配列を含む。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、配列番号２３５−２９５の何れか１つから選択される配列に５０％以上相同し得る配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部及び／又は超長ＣＤＲ３の一部に由来する第２抗体配列の一部は、同じ超長ＣＤＲ３に由来し得る。
【０１６１】
本明細書に開示される実施形態の何れかにおいて、超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部及び超長ＣＤＲ３の一部に由来する第２抗体配列の一部は、２以上の異なる超長ＣＤＲ３配列に由来する。第１及び／又は第２の抗体配列の超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ１Ｈ１２の超長ＣＤＲ３配列に基づく又は由来し得る。第１及び／又は第２の抗体配列の超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ１Ｈ１２の超長ＣＤＲ３配列に５０％以上相同し得る配列に基づく又は由来し得る。第１及び／又は第２の抗体配列の超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ５Ｂ８、ＢＬＶＣＶ１、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、又はＦ１８の超長ＣＤＲ３配列に基づく又は由来し得る。第１及び／又は第２の抗体配列の超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ５Ｂ８、ＢＬＶＣＶ１、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、又はＦ１８の超長ＣＤＲ３配列に５０％以上相同し得る配列に基づく又は由来し得る。
【０１６２】
本明細書に開示される実施形態の何れかにおいて、超長ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸であり得る、超長ＣＤＲ３に基づく又は由来する。超長ＣＤＲ３は、３以上のシステイン残基を含む超長ＣＤＲ３に基づく又は由来し得る。
【０１６３】
本明細書に開示される実施形態の何れかにおいて、超長ＣＤＲ３は、１以上のシステインモチーフを含み得る超長ＣＤＲ３に基づく又は由来する。１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−１５６から成るグループから選択され得る。上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、システインモチーフは、配列番号４５−９９から成るグループから選択される。上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、システインモチーフは、配列番号４５−１３５から成るグループから選択される。上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、システインモチーフは、配列番号１００−１３５から成るグループから選択される。上記又は下記に言及された実施形態の各々又は何れかの幾つかの実施形態において、システインモチーフは、配列番号１３６−１５６から成るグループから選択される。
【０１６４】
本明細書に開示される抗体は、長さが３５以上のアミノ酸であり得る、超長ＣＤＲ３に基づく又は由来し得る。本明細書に開示される抗体は、３以上のシステイン残基を含む超長ＣＤＲ３に基づく又は由来し得る。本明細書に開示される抗体は、１以上のシステインモチーフを含み得る超長ＣＤＲ３に基づく又は由来し得る。
【０１６５】
本明細書に開示される抗体は、長さが３５以上のアミノ酸である超長ＣＤＲ３を含み得る。本明細書に開示される抗体は、３以上のシステイン残基を含む超長ＣＤＲ３を含み得る。本明細書に開示される抗体は、１以上のシステインモチーフを含む超長ＣＤＲ３を含み得る。
【０１６６】
本明細書に開示される実施形態の何れかにおいて、超長ＣＤＲ３は重鎖ＣＤＲ３でもよい。超長ＣＤＲ３は、非ヒトＤＨ配列に由来する又は基づくアミノ酸配列を含み得る。超長ＣＤＲ３は、ＪＨ配列に由来する又は基づくアミノ酸配列を含み得る。超長ＣＤＲ３は、非ヒトＶＨ配列に由来する又は基づくアミノ酸配列；非ヒトＤＨ配列に由来する又は基づくアミノ酸配列；及び／又はＪＨ配列に由来する又は基づくアミノ酸配列を含み得る。超長ＣＤＲ３は、ＶＨ由来のアミノ酸配列とＤＨ由来のアミノ酸配列の間に位置する、少なくとも約２のアミノ酸残基を含む付加的なアミノ酸配列を含み得る。
【０１６７】
本明細書に開示される抗体の何れかは、配列番号２４−４４から選択される配列に基づく又は由来する配列、配列番号２−２２のＤＮＡに基づく又は由来するＤＮＡ配列によってコード化される抗体又はその結合フラグメントを含み得る。
【０１６８】
本明細書に開示される抗体の何れかは、配列番号２３から選択される配列に基づく又は由来する配列、配列番号１のＤＮＡに基づく又は由来するＤＮＡ配列によってコード化される抗体又はその結合フラグメントを含み得る。
【０１６９】
本明細書に開示される超長ＣＤＲ３の何れかは、配列番号２４−４４から選択される配列に基づく又は由来する配列を含み得る。
【０１７０】
本明細書に開示される抗体の何れかは、配列番号２３から選択される配列に基づく又は由来する配列を含み得る。本明細書に開示される超長ＣＤＲ３の何れかは、配列番号２−２２に由来する又は基づき得るＤＮＡ配列によってコード化され得る。本明細書に開示される抗体の何れかは、配列番号１に由来する又は基づき得るＤＮＡ配列によってコード化され得る。
【０１７１】
本明細書に開示される抗体の何れかは、１以上のリンカーを含み得る。本明細書に開示される抗体の何れかは、第１リンカー配列を含み得る。本明細書に開示される抗体の何れかは、第２リンカー配列を含み得る。第１及び第２のリンカー配列は同じ配列を含み得る。第１及び第２のリンカー配列は異なる配列を含み得る。第１及び／又は第２のリンカー配列は同じ長さでもよい。第１及び／又は第２のリンカー配列は異なる長さでもよい。第１及び／又は第２のリンカー配列は長さが３以上のアミノ酸でもよい。
【０１７２】
第１及び／又は第２のリンカー配列は、超長ＣＤＲ３の一部に基づく又は由来する部分に非抗体配列を結合し得る。第１及び／又は第２のリンカー配列は、第１抗体配列に非抗体配列を結合し得る。第１及び／又は第２のリンカー配列は、第２抗体配列に非抗体配列を結合し得る。第１及び／又は第２のリンカー配列は、非抗体配列、超長ＣＤＲ３配列の一部、切断部位配列、非ウシ配列、抗体配列、又はそれらの組み合わせに隣接してもよい。
【０１７３】
第１及び／又は第２のリンカー配列は１以上のグリシン残基を含み得る。第１及び／又は第２のリンカー配列は２以上の連続するグリシン残基を含み得る。第１及び／又は第２のリンカー配列は１以上のセリン残基を含み得る。第１及び／又は第２のリンカー配列は１以上の極性アミノ酸残基を含み得る。１以上の極性アミノ酸残基は、セリン、トレオニン、アスパラギン、又はグルタミンから選択され得る。極性アミノ酸残基は、非荷電の側鎖を含み得る。第１及び／又は第２のリンカー配列は、ｎ＝１乃至５である配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４９９）；配列ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３７）；配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３８）；ｎが１以上である（ＧＳＧ）ｎの配列（配列番号３４２）；又はそれらの組み合わせを含み得る。
【０１７４】
本明細書に開示される抗体の何れかは、１以上の切断部位を含み得る。１以上の切断部位は、プロテアーゼのための認識部位を含み得る。プロテアーゼは因子Ｘａ又はトロンビンでもよい。１以上の切断部位は、ＩＥＧＲのアミノ酸配列（配列番号５１０）を含み得る。
【０１７５】
１以上の切断部位は、第１抗体配列と非抗体配列の間にあってもよい。１以上の切断部位は、第２抗体配列と非抗体配列の間にあってもよい。１以上の切断部位は、１以上のリンカーと非抗体配列の間にあってもよい。１以上の切断部位は、第１抗体配列と１以上のリンカーの間にあってもよい。１以上の切断部位は、第２抗体配列と１以上のリンカーの間にあってもよい。１以上の切断部位は、非抗体配列、超長ＣＤＲ３配列の一部、リンカー配列、抗体配列、又はそれらの組み合わせに隣接してもよい。
【０１７６】
幾つかの実施形態において、抗体又はその結合フラグメントのライブラリが開示され、ここで、抗体又はその結合フラグメントは超長ＣＤＲ３を含み得る。
【０１７７】
幾つかの実施形態において、抗体又はその結合フラグメントのライブラリが開示され、ここで、抗体又はその結合フラグメントは、本明細書に開示される抗体の何れかを含み得る。
【０１７８】
幾つかの実施形態において、抗体又はその結合フラグメントをコード化する配列を含む複数のポリヌクレオチドを含む核酸ライブラリが開示され、ここで、抗体又はその結合フラグメントは、超長ＣＤＲ３を含み得る。
【０１７９】
幾つかの実施形態において、抗体又はその結合フラグメントをコード化する配列を含む複数のポリヌクレオチドを含む核酸ライブラリが開示され、ここで、抗体又はその結合フラグメントは、本明細書に開示される抗体の何れかを含み得る。
【０１８０】
幾つかの実施形態において、可変領域をコード化する核酸配列を含むポリヌクレオチドが開示され、ここで、可変領域は超長ＣＤＲ３を含み得る。
【０１８１】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドを含むベクターが開示され、ここで、ポリヌクレオチドは可変領域をコード化する核酸配列を含み、可変領域は超長ＣＤＲ３を含み得る。
【０１８２】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞が開示され、ここで、ポリヌクレオチドは可変領域をコード化する核酸配列を含み、可変領域は超長ＣＤＲ３を含み得る。
【０１８３】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示される抗体の何れかの抗体又はその結合フラグメントをコード化する核酸配列を含むポリヌクレオチドが開示される。
【０１８４】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドを含むベクターが開示され、ここで、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される抗体の何れかの抗体又はその結合フラグメントをコード化する核酸配列を含む。
【０１８５】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞が開示され、ここで、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される抗体の何れかの抗体又はその結合フラグメントをコード化する核酸配列を含む。
【０１８６】
幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３又はそのフラグメントを含む抗体又はその結合フラグメントを生成する方法が開示され、該方法は、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養する工程を含み、ここで、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列が発現され、超長ＣＤＲ３又はそのフラグメントを含む抗体又はその結合フラグメントが生成され得る条件下で、本明細書に開示される抗体の何れかの抗体又はその結合フラグメントをコード化する核酸配列を含み得る。方法は、宿主細胞培養物から超長ＣＤＲ３又はそのフラグメントを含む抗体又はその結合フラグメントを回収する工程を含み得る。
【０１８７】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示される抗体の何れかを含む医薬組成物が開示される。医薬組成物は２つ以上の抗体を含み得、ここで、２つ以上の抗体の少なくとも１つは、超長ＣＤＲ３の少なくとも一部を含む。
【０１８８】
幾つかの実施形態において、（ａ）超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に基づく又は由来する配列を含む抗体又はそのフラグメント；及び（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物が開示される。
【０１８９】
幾つかの実施形態において、必要とする被験体の疾患又は疾病を処置する方法が開示され、該方法は、本明細書に開示される抗体の何れかの治療上効果的な量を哺乳動物に投与する工程を含む。幾つかの例において、本明細書に開示される抗体は超長ＣＤＲ３配列及び非抗体配列を含む。幾つかの例において、非抗体配列は、Ｍｏｋａ１、Ｖｍ２４、ヒトＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ベータ−インターフェロン、ヒトＥＰＯ、ヒトＦＧＦ２１、ヒトＧＭＣＳＦ、ヒトインターフェロン−ベータ、ウシＧＣＳＦ、ヒトＧＣＳＦ、ｂｅ  ＩＬ８、ジコノチド、ソマトスタチン、クロロトキシン、ＳＤＦ１（アルファ）、ＩＬ２１、及びその誘導体又は変異体を含むグループから選択される。非抗体配列は、配列番号３１７−３３２の何れかに基づく、又はそれに由来する、アミノ酸配列を含み得る。
【０１９０】
疾患又は疾病は、自己免疫疾患、異種免疫の疾患又は疾病、炎症性疾患、病原性の感染、血栓塞栓障害、呼吸器疾患又は疾病、代謝疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）障害、骨疾患、癌、血液障害、肥満症、糖尿病、骨粗鬆症、貧血、又は疼痛を含むグループから選択され得る。
【０１９１】
疾患又は疾病は、イオンチャネルの調節から利益を得る。イオンチャネルは、カリウムイオンチャネル、ナトリウムイオンチャネル、又は酸感受性イオンチャネルを含む群から選択され得る。イオンチャネルは、Ｋｖ１．３イオンチャネル、Ｎａｖ１．７イオンチャネル、及び酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）を含むグループから選択され得る。
【０１９２】
疾患又は疾病は、受容体の調節から利益を得る。受容体は、ＧＬＰ１Ｒ、ＧＣＧＲ、ＥＰＯ受容体、ＦＧＦＲ、ＦＧＦ２１Ｒ、ＣＳＦＲ、ＧＭＣＳＦＲ、ＩＬ８Ｒ、ＩＬ２１Ｒ、及びＧＣＳＦＲを含むグループから選択され得る。
【０１９３】
疾患又は疾病は乳腺炎でもよい。
【０１９４】
被験体は哺乳動物でもよい。哺乳動物はウシ又はヒトでもよい。
【０１９５】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示される抗体に基づく又は由来する結晶が開示される。結晶は空間群Ｐ２１２１２１を有し得る。幾つかの例において、結晶は、約４０乃至８０オングストロームの間、４５乃至約７５オングストロームの間、又は約５０乃至約７５オングストロームの間の「ａ」；約４０乃至１４０オングストロームの間、約５０乃至約１３０オングストロームの間、約５５乃至約１３０オングストロームの間の「ｂ」；及び約１００乃至約３５０オングストロームの間、１２０乃至約３４０オングストロームの間、約１２５乃至約３３０オングストロームの間の「ｃ」の単位胞寸法を有する。結晶は、ウシ抗体又はその一部を含み得る。結晶は、ウシ抗体に基づく又は由来するＦａｂフラグメントを含み得る。結晶は、分離した結晶でもよい。
【０１９６】
幾つかの実施形態において、配列番号２４及び配列番号２３を含むウシ抗体Ｆａｂフラグメントを含む、分離された結晶が開示され、ここで、結晶は、空間群Ｐ２１２１２１、及びａ＝７１．４オングストローム、ｂ＝１２７．６オングストローム、及びｃ＝１２７．９オングストロームの単位胞寸法を有する。
【０１９７】
幾つかの実施形態において、配列番号３４０及び配列番号３４１を含むウシ抗体Ｆａｂフラグメントを含む、分離された結晶が開示され、ここで、結晶は、空間群Ｐ２１２１２１、及びａ＝５４．６オングストローム、ｂ＝５３．７オングストローム、及びｃ＝３３０．５オングストロームの単位胞寸法を有する。
【０１９８】
超長ＣＤＲ３を含む抗体を利用する上記又は下記の開示（例えば、抗体、使用、又は方法）或いは実施形態の何れか又は全てにおいて、超長ＣＤＲ３を含む抗体は、例えば、超長ＣＤＲ３を含む上述の抗体の何れかを含んで使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
本開示の以下の詳細な説明と同様に、前述の概要は、添付の図面と合わせて読まれた時により良く理解されるであろう。本開示を説明するために、図に示されるのは、現在好ましい実施形態である。しかし、本開示は、示される正確な配置、例、及び手段に限定されないことを理解されたい。
【図１】ウシ抗体における新たな構造のドメインの同定を示す。図１のＡは、マウス、ヒト、及びウシのレパートリーの中のＣＤＲ  Ｈ３の長さの比較を示す。６０以上のアミノ酸の超長サブセットは、ウシの重鎖で一意的に見出される。図１のＢは、６つのウシ配列（Ｂ−Ｓ１乃至Ｂ−Ｓ４、及びＢ−Ｌ１並びにＢ−Ｌ２）と共に文献から、及び我々の深い配列結果（ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅｓｕｌｔ）からの、マウス（ｍｕ）、ヒト（ｈｕ）、又はウシの配列からの代表的なＣＤＲ  Ｈ３の配列（配列番号３４３−３５９、それぞれ、表示の順）を示す。すべての抗体可変領域におけるＣＤＲ  Ｈ３の境界を定義する、フレームワーク３の保存されたシステイン及びフレームワーク４のトリプトファンは、参考のため灰色である。ＣＤＲ  Ｈ３の長さを右に示す。ネズミ抗体は、Ｄ４４．１、抗ＨＥＬ抗体、９３Ｆ３、アルドラーゼ、及びＯＫＴ３、ヒトＣＤ３を標的とする治療抗体を含む。この抗体は、ＣＤＲ  Ｈ３に遊離システインを有している点で異常である。ヒト抗体は、Ｙｖｏ、クリオグロブリン、ＣＲ６２６１、抗インフルエンザＡヘマグルチニン、及びＰＧ９、最長のヒトＣＤＲ  Ｈ３の１つを有する抗ＨＩＶ抗体を含む。ウシ抗体は、文献における超長配列、及び比較のための短い配列を表わす。ＢＬＶ５Ｂ８及びＢＬＶ１Ｈ１２（太字（ｂｏｌｄ）で示される）は、我々の構造決定において使用された。比較的保存されたＴＴＶＨＱ（配列番号１５９）及びＣＰＤＧ（配列番号５００）モチーフは、太字である。図１のＣは、９３Ｆ３を「標準の」ＣＤＲ  Ｈ３（右）と比較した、ＢＬＶ１Ｈ１２（左）及びＢＬＶ５Ｂ８（中間）Ｆａｂの結晶構造を示す。極めて長い、２つのβ鎖のストークは、個々のウシＶＨ免疫グロブリンドメインから突き出て、異常な３つのジスルフィド結合ノブドメインで終了する。
【図２】超長ウシの抗体における構造多様性を示す。図２のＡは、ジスルフィドパターンにおける差を示す２つのノブの構造の比較を示す。ノブ及びそのジスルフィドパターンの二次元的表現に加えて、ＢＬＶ１Ｈ１２（左）及びＢＬＶ５Ｈ８（右）のノブの拡大図が示される。ジスルフィドは番号を付けられ、円で囲まれる。ノブ領域の配列は、下線のＤＨ２生殖系列遺伝子フラグメントと共に保存されたシステインを有し、以下に示される（それぞれ、配列番号３６０と３６１）。ジスルフィドパターンは各配列上に示される。図２のＢは、ＢＬＶ１Ｈ１２の可変領域の重ね合わせを示し、ＢＬＶ５Ｂ８は、ストークとノブの上方部以外の可変領域に構造的な相同性を示し、それは著しく相違する。図２のＣは、ノブ領域における、異なる形状及び荷電を示すＢＬＶ１Ｈ１２（左）及びＢＬＶ５Ｂ８（右）の表面並びに荷電の密度の画像を示す。
【図３】超長抗体形成のための遺伝的根拠を示す。図３のＡは、ＶＨＢＵＬ（超長抗体において使用される生殖系列可変領域）（配列番号３６２と３６３、それぞれ、表示の順）の同定を示す。リーダー配列は明るいグレーで示され、コード配列は上記のアミノ酸翻訳により示され、イントロンはイタリック体で示され、ストークの上昇する鎖の一部を形成する独特のＴＴＶＨＱ拡張（配列番号１５９）は太字で示される。 組み換えシグナル配列の７量体及び９量体は、下線で強調される。図３のＢは、ＶＨＢＵＬ領域が染色体２１上で見出されることを示す。部分的な畜牛の分裂中期の広がり（左）及び拡大した染色体２１（右上）は、ＢＡＣクローン３１８Ｈ２及び１４の７４Ｈ６の２色のＦＩＳＨによる、ＢＴＡ２１ｑ２４におけるＶＨＢＵＬ領域の一部を示す。ＢＴＡ２１の国際命名法は下で描かれる。図３のＣは、ＶＨＢＵＬ、ＤＨ２、及びＶλ１ｘを表わすウシ免疫グロブリンの遺伝子座の概略図を示し、それらは超長抗体において優先的に使用される。Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換えのプロセスは、機能的な超長重鎖及び軽鎖の遺伝子を形成するために遺伝子フラグメントを組み立てる。（左下）Ｖ−Ｄ−Ｊ領域はＢＬＶ１Ｈ１２Ｆａｂ構造上にマッピングされる。ＶＨＢＵＬは、上昇するβ鎖で始まるＴＴＶＨＱモチーフ（配列番号１５９）と同様に、ストークと相互に作用するＣＤＲ  Ｈ１及びＣＤＲ  Ｈ２の残基をコード化するという点で独特である。同様に、Ｖλ１ｘ軽鎖は、ストークと相互に作用するＣＤＲ  Ｌ１及びＣＤＲ  Ｌ２残基をコード化する。矢印は、可能な結合多様性の領域を示す。比較的長いＶ−Ｄ挿入は紫で示される。配列は、Ｎ−付加、遺伝子転換、又は別の機構から結果として生じたものであるかが不明である。それぞれ、配列番号５００と２９７として開示される「ＣＰＤＧ」と「ＹＸＹＸＹ」。（右下）下降する鎖のＹｘＹｘＹモチーフ（配列番号２９７）の位置と同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２のストークを有する、ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、及びＬ２の相互作用が詳しく記載される。
【図４】ウシの超長ＶＨＣＤＲ  Ｈ３の深い配列多様性を表わす。図４のＡは、ＩｇＭとＩｇＧのウシの超長ＣＤＲ  Ｈ３におけるシステインの数の分布を示す。図４のＢは、超長ＣＤＲ  Ｈ３の長さの分布を示す。免疫応答中に選択されたクローンの配列が、任意の与えられた長さでの割合に片寄ることができることに注目する。図４のＣは、超長ウシＶＨＣＤＲ  Ｈ３の代表的な配列（配列番号３６４−３６６、３５８、及び３６８−３８８、それぞれ、表示の順）を示す。ＶＨＢＵＬ領域の終末部は、Ｖ−Ｄ結合、ＤＨ２及びＪＨ（頂部）に結合多様性と共に示される。ＢＬＶＨ１２及びＢＬＶ５Ｂ８の配列は比較のために示され、その後、２０の超長ＣＤＲ  Ｈ３配列（下部）が示される。ＤＨ２と共に保存されたシステインが下線で強調される。すべての抗体可変領域におけるＣＤＲ  Ｈ３境界を定義する、保存されたシステイン及びトリプトファンは、参考のため灰色で強調される。ＣＰＤＧモチーフ（配列番号５００）は灰色の下線で強調され、ＹｘＹｘＹモチーフ（配列番号２９７）をコード化する、下降する鎖の領域は灰色の下線で強調される。
【図５】システイン突然変異が超長ＣＤＲ  Ｈ３多様性に起因することを示す。図５のＡは、超長ＣＤＲ  Ｈ３の深い配列の一致が、ＤＨ２と合致することを示す（位置合わせは、配列番号３８９−３９３を開示し、それぞれ、表示の順）。（２頭の雌牛からの）３つの深い配列ラン（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｕｎｓ）に関する共通配列が測定され、互いに及びＤＨ２と合致した。コンセンサス配列は、挿入／欠失の幾つかの領域を除いて十分に一致する。故に、単一のＤＨ遺伝子、又は高度に関連する遺伝子は、超長ＣＤＲ  Ｈ３抗体における配列の多様性を生成する。図５のＢは、ＳＨホットスポットを含む、システインに容易に突然変異することができる残基を示すＤＨ２遺伝子領域分析を示す。ヌクレオチド配列は、上記の及び以下の翻訳されたアミノ酸配列である（それぞれ、配列番号３９４と３９５）。ＳＨ及び／又は遺伝子転換のためＡＩＤによって認識されるＲＧＹＷホットスポットが、囲まれる。（Ｂ）における位置３、１５、１９、２１、２５、２７、３１、３３、３９、４３、４５、４９、５１、５７、６０、６４、７３、７５、７９、８１、８４、８８、９０、９３、９７、１０２、１０６、１１２、１１７、１２１、１２３、１２７、１２９、１３３、１３９、及び１４５でのヌクレオチドは、システインをコード化するコドンへの単一の突然変異において変えることができる。図５のＣは、親和性成熟グループがシステイン間の突然変異を示すことを示す。クローン的に関連する配列の様々なグループは、体細胞超変異のために同定され、分析された。３つのグループが、例（左側の標識１〜３）として示される。システインとの配列の差は灰色で強調される。各配列がクラスター中で表わされる頻度は右に示される。図５のＣは、配列番号３９６−４１０を開示し、それぞれ、表示の順である。
【図６】超長ＣＤＲ  Ｈ３結合抗原を有するウシ抗体を示す。図６のＡは、抗原特異性の、超長ＣＤＲ  Ｈ３抗体を同定するための免疫化の実験的なスキームを示す。重鎖可変領域ｍＲＮＡは分離され、ＲＴ  ＰＣＲによって増幅され、ＨＥＫ２９３細胞において生成されるＩｇＧの小さなライブラリを生成するため、不変式軽鎖と共に対となった。図６のＢは、ＢＶＤＶ（左）に対する１３２の超長ＣＤＲ  Ｈ３抗体のＥＬＩＳＡ、滴定アッセイ（右）における「ヒット」Ｂ８、Ｂ９、及びＨ１２の結合活性を示す。図６のＣは、ＢＬＶ１Ｈ１２及び生殖系列ＤＨ２領域の比較における、Ｂ８、Ｈ９、及びＨ１２の配列を示す。ＣＤＲ  Ｈ３の長さ（Ｌ）は右に示される。ＤＨ２と共に保存されたシステインが下線で強調される。図６のＣは、配列番号４１１−４１５を開示し、それぞれ、表示の順である。図６のＤは、Ｈ１２が細胞上でＮＳ２−３に結合することを示す。標識を付けた（ｆｌａｇ−ｔａｇｇｅｄ）ＢＶＤＶ  ＮＳ２−３タンパク質コンストラクトは、ＨＥＫ２９３Ａ細胞へとトランスフェクトされ、陽性の対照（左）、Ｈ１２抗体（中間）、及びＢ８（右）として抗Ｆｌａｇで染色された。トランスフェクトされていない細胞による結合アッセイは下部に示される。
【図７】新しい低分子フォールドへの超長ＣＤＲ  Ｈ３の多様化のためのモデルを表わす。図７のＡは、４つのシステインを有するＤＨ２ノブの概略図が左に示され、ＳＨ及び／又は遺伝子転換が右側上の多数の新たなシステインパターン及び新たなループに通じることを示す。図７のＢは、抗体多様性を生じさせるための機構を示す。ヒト及びマウス（左）において、Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換え及びＶＨ−ＶＬ対合を通じる組み合わせの多様性は、多数の異なる結合部位を生成し、それはその後、体細胞超変異により抗原暴露されることによってさらに最適化される。雌牛（右）において、組み合わせの多様性は厳しく制限される；しかし、システイン間の体細胞突然変異は、「ノブ」領域を作り変え、超長ＣＤＲ  Ｈ３において相当な構造多様性を生成することができる。これら抗体は、ＳＨによりさらに最適化され、ポア又はチャネルなど独特な標的に結合し得る。
【図８】本明細書に記載される免疫グロブリンコンストラクトを設計するための、ウシＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖領域のノブドメイン上へのウシＧ−ＣＳＦの結合を示す模式図を表わす。図８のＡは、ウシＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖領域及び軽鎖領域のリボンの略図を示す。囲まれた領域は、ストーク及びノブのドメインを含む超長ＣＤＲ３の伸長領域を強調する。図８のＢは、ウシＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖領域のノブドメインの一部に挿入される又はそれを交換する、成長因子（例えばウシＧ−ＣＳＦ）のリボンの略図を示す。図８のＣは、ウシＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖領域のノブドメインの一部に挿入される又はそれを交換する、トキシン（例えばＭｏｋａ１、ＶＭ−２４）のリボンの略図を示す。図８のＤは、ウシＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖領域のノブドメインの一部に挿入される又はそれを交換する、受容体リガンド（例えばＧＬＰ−１、エキセンジン−４）のリボンの略図を示す。図８のＥは、ウシＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖領域のノブドメインの一部に挿入される又はそれを交換する、ホルモン（例えばエリスロポイエチン）のリボンの略図を示す。図８のＦは、ウシＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖領域及び軽鎖領域を表わすカートゥーンを示す。図８のＧは、ウシＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖領域のノブドメインの一部に挿入される又はそれを交換する、成長因子（例えばウシＧ−ＣＳＦ）のカートゥーンを示す。図８のＨは、ウシＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖領域のノブドメインの一部に挿入される又はそれを交換する、トキシン（例えばＭｏｋａ１、ＶＭ−２４）のカートゥーンを示す。図８のＩは、ウシＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖領域のノブドメインの一部に挿入される又はそれを交換する、受容体リガンド（例えばＧＬＰ−１、エキセンジン−４）のカートゥーンを示す。左パネルは、ノブドメインの一部に挿入される又はそれを交換する受容体リガンドの両末端を示し；右パネルは、プロテアーゼによる処置後にノブドメインから放たれる受容体リガンドのＮ末端基を示す。図８のＪは、ウシＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖領域のノブドメインの一部に挿入される又はそれを交換する、ホルモン（例えばエリスロポイエチン）のカートゥーンを示す。成長因子、トキシン、受容体リガンド、及びホルモンの前記結合は、配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５０１）（Ａｂ−ペプチドＬ１）又はＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３７）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３８）（Ａｂ−ペプチドＬ２）のポリペプチドリンカーによるものであり得る。結合がリンカーによるものではない別のコンストラクト（Ａｂ−ペプチドＬ０）は、このカートゥーンに示されない。
【図９】Ａｂ−ｂＧＣＳＦ融合タンパク質に関する実例的なマウスＮＦＳ−６０細胞増殖活性を示す。図９のＡ−９のＢは、ウシＧ−ＣＳＦ及びヒトＧ−ＣＳＦのそれぞれの増殖活性を表わす。図９のＣは、Ｇ−ＣＳＦの欠如下で、ウシＢＬＶ１Ｈ１２抗体に関する増殖活性の欠失を表わす。図９のＤは、リンカー（Ａｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ０）の欠如下でノブドメインの一部に挿入される又はそれを交換する、ウシＧ−ＣＳＦの増殖活性を表わす。図９のＥは、ポリペプチドリンカーの配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５０１）（Ａｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ１）によりノブドメインの一部に挿入される又はそれを交換する、ウシＧ−ＣＳＦの増殖活性を表わす。図は、配列番号５０９を開示する。
【図１０】Ａｂ−ＧＣＳＦ融合タンパク質のヒト顆粒球前駆細胞増殖活性を示す。図１０のＡ−１０のＢは、ウシＧ−ＣＳＦ及びヒトＧ−ＣＳＦのそれぞれの増殖活性を表わす。図１０のＣは、Ｇ−ＣＳＦの欠如下で、ウシＢＬＶ１Ｈ１２抗体（Ａｂ）に関する増殖活性の欠失を表わす。図１０のＤは、リンカー（Ａｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ０）の欠如下でノブドメインの一部に挿入される又はそれを交換する、ウシＧ−ＣＳＦの増殖活性を表わす。図１０のＥは、ノブドメインの一部に挿入される又はそれを交換する、ウシＧ−ＣＳＦの増殖活性を表わし、前述のウシＧ−ＣＳＦとノブドメインは、ポリペプチドリンカーの配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５０１）により結合する（Ａｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ１）。図は、配列番号５０９を開示する。
【図１１】マウスにおけるＡｂ−ｂＧＣＳＦ融合タンパク質の薬物動態を表す。図は、配列番号５０９を開示する。
【図１２】注入後１０日目に染色され且つ数えられた血液であるマウス好中球上のＡｂ−ｂＧＣＳＦ融合タンパク質の増殖活性を提供する。図は、配列番号５０９を開示する。
【図１３】ピキア・パストリスにおけるＡｂ−ｂＧＣＳＦ融合タンパク質の発現及び精製を示す。図１３のＡは、本明細書に提供される免疫グロブリンコンストラクトのためのピキア属発現ベクターのマップを示す。図１３のＢは、免疫グロブリンコンストラクトＡｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ０及びＡｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ１の発現の誘導後のウェスタンブロットを提供する。図は、配列番号５０９を開示する。図１３のＣは、１００ｍＬの培養につき７０μｇまでの収量でピキア属に発現される、精製したＡｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ０及びＡｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを提供する。
【図１４】ｆｒｅｅ  ｓｔｙｌｅ  ＨＥＫ  ２９３細胞において本明細書に記載される、免疫グロブリンコンストラクトの発現のためのベクターを示す。図１４のＡは、遊離スタイルＨＥＫ  ２９３細胞における発現のためのＡｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ０重鎖のベクターを提供する。図１４のＢは、遊離スタイルＨＥＫ  ２９３細胞における発現のためのＡｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ１重鎖のベクターを提供する。図は、配列番号５０９を開示する。図１４のＣは、遊離スタイルＨＥＫ  ２９３細胞における発現のためのＡｂ−ｂＧＣＳＦ軽鎖のベクターを提供する。
【図１５】精製した抗体融合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図１５のＡは、ＨＥＫ  ２９３細胞からの、精製したＡｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ０及びＡｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図は、配列番号５０９を開示する。図１５のＢは、プロトキシン２の両末端に結合されたＧＧＧＧＳ（配列番号５０１）リンカーを含む免疫グロブリンコンストラクトＡｂ−プロトキシン２のＳＤＳ  ＰＡＧＥを提供する。
【図１６】免疫グロブリンコンストラクトＡｂ−Ｍｏｋａ１  Ｌ０（リンカー無し）及びＡｂ−Ｍｏｋａ１  Ｌ１（リンカー）の、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及び活性を提供する。図１６のＡは、免疫グロブリン融合タンパク質Ａｂ−Ｍｏｋａ１  Ｌ０及びＡｂ−Ｍｏｋａ１  Ｌ１のＳＤＳ  ＰＡＧＥを提供する。図は、配列番号５０１を開示する。図１６のＢは、Ｔ細胞活性化でのＢＬＶ１Ｈ１２−Ｍｏｋａ１融合タンパク質の阻害活性を提供する。
【図１７】ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）上にＢＬＶ１Ｈ１２−Ｍｏｋａ１融合タンパク質の阻害活性を提供する。図は、配列番号５０９を開示する。
【図１８】免疫グロブリンコンストラクトＡｂ−ＶＭ２４  Ｌ１（ＧＧＧＧＳ（配列番号５０１）リンカー）及びＡｂ−ＶＭ２４  Ｌ２（ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３７）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３８）のリンカー）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ及び活性を提供する。図１８のＡは、免疫グロブリン融合タンパク質Ａｂ−ＶＭ２４  Ｌ１及びＡｂ−ＶＭ２４  Ｌ２のＳＤＳ  ＰＡＧＥを提供する。図１８のＢは、Ｔ細胞活性化でのＢＬＶ１Ｈ１２−ＶＭ２４  Ｌ１融合タンパク質の阻害活性を提供する。図１８のＣは、Ｔ細胞活性化でのＢＬＶ１Ｈ１２−ＶＭ２４  Ｌ２融合タンパク質の阻害活性を提供する。
【図１９】免疫グロブリンコンストラクトＡｂ−ＧＬＰ−１及びＡｂ−エキセンジン−４のＳＤＳ  ＰＡＧＥを提供する。
【図２０】ＧＬＰ−１受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞上のＡｂ−ＧＬＰ−１、及びＡｂ−ＥＸ４の活性を提供する。
【図２１】ＴＦ１細胞上のＡｂ−ｈＥＰＯ融合タンパク質の増殖活性を提供する。
【図２２Ａ】超長ＣＤＲ３配列を表す。（頂部）生殖系列ＶＨＢＵＬ、ＤＨ２、及びＪＨからの翻訳。文献にて報告される５の全長の超長ＣＤＲ  Ｈ３は、４と８の間のシステインを含み、互いに高度に相同ではない；しかし、これらＣＤＲ  Ｈ３の第１システインが整列前に「固定」されると、ＤＨ２を有するシステイン残基の幾つかの保存を見出すことができる。７の配列の４つ（ＢＬＶ１Ｈ１２、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、及びＢＦ４Ｅ９）は、ＤＨ２と同じ位置に４のシステインを含むだけでなく、更にシステインを有する。ＢＬＶ５Ｂ８は、生殖系列ＤＨ２と同様に２つのシステインを有する。幾つかのシステイン保存により制限される相同性は、ＤＨ２の突然変異がこれら配列を生じさせ得ることを示唆する。Ｂ−Ｌ１及びＢ−Ｌ２は、ウシの脾臓の初期の配列に由来し、残りは、深い配列データから選択された超長ＣＤＲ  Ｈ３配列である。第１群は、同定された最長のＣＤＲ  Ｈ３を含み、クローン的に関連づけられたように思われる。＊は、１６７回表わされた配列を示し、それが機能のため強く選択されたことを示す。８つのシステイン配列の幾つかは、それらが複数回表わされた機能のために選択されたように思われ、括弧内に示される。様々な長さの他の代表的な配列は最後のグループに示される。ＣＤＲ  Ｈ３境界を定義するフレームワークシステイン及びトリプトファンの残基は、二重線で強調される。表２Ａ−Ｃに示されたＵＬ−７７（左端のカラム）を通じて配列ＢＬＶ１Ｈ１２が示され、特定の生殖系列配列に由来するアミノ酸残基のセグメントを同定するため、４のセグメントに分裂される。左から右に動くため、第１セグメントは、ＶＨ生殖系列に由来し、本開示の全体にわたってＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５モチーフ（配列番号４９５）として表わされる。第２セグメントは、本開示の全体にわたってＸｎ残基として指定された、一連のスペーサーアミノ酸残基である。第３セグメントは、生殖系列ＤＨ２領域に由来する一連のアミノ酸残基であり、第４セグメントは、生殖系列ＪＨ１領域に由来する一連のアミノ酸残基である。図２２Ａは、配列番号３６４、４１１、４１６、３５８、３５４−３５６、３５３、３５９、３５７、及び４１７−４９３を開示し、それぞれ、表示の順である。
【図２２Ｂ】超長ＣＤＲ３配列を表す。（頂部）生殖系列ＶＨＢＵＬ、ＤＨ２、及びＪＨからの翻訳。文献にて報告される５の全長の超長ＣＤＲ  Ｈ３は、４と８の間のシステインを含み、互いに高度に相同ではない；しかし、これらＣＤＲ  Ｈ３の第１システインが整列前に「固定」されると、ＤＨ２を有するシステイン残基の幾つかの保存を見出すことができる。７の配列の４つ（ＢＬＶ１Ｈ１２、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、及びＢＦ４Ｅ９）は、ＤＨ２と同じ位置に４のシステインを含むだけでなく、更にシステインを有する。ＢＬＶ５Ｂ８は、生殖系列ＤＨ２と同様に２つのシステインを有する。幾つかのシステイン保存により制限される相同性は、ＤＨ２の突然変異がこれら配列を生じさせ得ることを示唆する。Ｂ−Ｌ１及びＢ−Ｌ２は、ウシの脾臓の初期の配列に由来し、残りは、深い配列データから選択された超長ＣＤＲ  Ｈ３配列である。第１群は、同定された最長のＣＤＲ  Ｈ３を含み、クローン的に関連づけられたように思われる。＊は、１６７回表わされた配列を示し、それが機能のため強く選択されたことを示す。８つのシステイン配列の幾つかは、それらが複数回表わされた機能のために選択されたように思われ、括弧内に示される。様々な長さの他の代表的な配列は最後のグループに示される。ＣＤＲ  Ｈ３境界を定義するフレームワークシステイン及びトリプトファンの残基は、二重線で強調される。表２Ａ−Ｃに示されたＵＬ−７７（左端のカラム）を通じて配列ＢＬＶ１Ｈ１２が示され、特定の生殖系列配列に由来するアミノ酸残基のセグメントを同定するため、４のセグメントに分裂される。左から右に動くため、第１セグメントは、ＶＨ生殖系列に由来し、本開示の全体にわたってＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５モチーフ（配列番号４９５）として表わされる。第２セグメントは、本開示の全体にわたってＸｎ残基として指定された、一連のスペーサーアミノ酸残基である。第３セグメントは、生殖系列ＤＨ２領域に由来する一連のアミノ酸残基であり、第４セグメントは、生殖系列ＪＨ１領域に由来する一連のアミノ酸残基である。図２２Ｂは、配列番号３６４、４１１、４１６、３５８、３５４−３５６、３５３、３５９、３５７、及び４１７−４９３を開示し、それぞれ、表示の順である。
【図２２Ｃ】超長ＣＤＲ３配列を表す。（頂部）生殖系列ＶＨＢＵＬ、ＤＨ２、及びＪＨからの翻訳。文献にて報告される５の全長の超長ＣＤＲ  Ｈ３は、４と８の間のシステインを含み、互いに高度に相同ではない；しかし、これらＣＤＲ  Ｈ３の第１システインが整列前に「固定」されると、ＤＨ２を有するシステイン残基の幾つかの保存を見出すことができる。７の配列の４つ（ＢＬＶ１Ｈ１２、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、及びＢＦ４Ｅ９）は、ＤＨ２と同じ位置に４のシステインを含むだけでなく、更にシステインを有する。ＢＬＶ５Ｂ８は、生殖系列ＤＨ２と同様に２つのシステインを有する。幾つかのシステイン保存により制限される相同性は、ＤＨ２の突然変異がこれら配列を生じさせ得ることを示唆する。Ｂ−Ｌ１及びＢ−Ｌ２は、ウシの脾臓の初期の配列に由来し、残りは、深い配列データから選択された超長ＣＤＲ  Ｈ３配列である。第１群は、同定された最長のＣＤＲ  Ｈ３を含み、クローン的に関連づけられたように思われる。＊は、１６７回表わされた配列を示し、それが機能のため強く選択されたことを示す。８つのシステイン配列の幾つかは、それらが複数回表わされた機能のために選択されたように思われ、括弧内に示される。様々な長さの他の代表的な配列は最後のグループに示される。ＣＤＲ  Ｈ３境界を定義するフレームワークシステイン及びトリプトファンの残基は、二重線で強調される。表２Ａ−Ｃに示されたＵＬ−７７（左端のカラム）を通じて配列ＢＬＶ１Ｈ１２が示され、特定の生殖系列配列に由来するアミノ酸残基のセグメントを同定するため、４のセグメントに分裂される。左から右に動くため、第１セグメントは、ＶＨ生殖系列に由来し、本開示の全体にわたってＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５モチーフ（配列番号４９５）として表わされる。第２セグメントは、本開示の全体にわたってＸｎ残基として指定された、一連のスペーサーアミノ酸残基である。第３セグメントは、生殖系列ＤＨ２領域に由来する一連のアミノ酸残基であり、第４セグメントは、生殖系列ＪＨ１領域に由来する一連のアミノ酸残基である。図２２Ｃは、配列番号３６４、４１１、４１６、３５８、３５４−３５６、３５３、３５９、３５７、及び４１７−４９３を開示し、それぞれ、表示の順である。
【発明を実施するための形態】
【０２００】
本明細書には、抗体及びそのフラグメントが開示される。一般的に、抗体及びそのフラグメントは、超長ＣＤＲ３の少なくとも一部を含む。超長ＣＤＲ３の一部は、超長ＣＤＲ３配列に由来する又は基づき得る。超長ＣＤＲ３の一部は、超長ＣＤＲ３配列のストークドメインに由来する又は基づき得る。代替的に又は付加的に、超長ＣＤＲ３の一部は、超長ＣＤＲ３配列のノブドメインに由来する又は基づき得る。抗体及びそのフラグメントはさらに、１つ以上の治療用ポリペプチドを含み得る。治療用ポリペプチドは、超長ＣＤＲ３の一部に挿入され得る。治療用ポリペプチドは、超長ＣＤＲ３の一部のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基を置換し得る。治療用ポリペプチドは、超長ＣＤＲ３の一部の核酸配列において１つ以上のヌクレオチドを置換し得る。代替的に、治療用ポリペプチドは、超長ＣＤＲ３の一部に共役される又は結合され得る。本明細書に開示される抗体及びフラグメントは１つ以上のリンカーをさらに含む。加えて、本明細書に開示される抗体及びフラグメントは切断部位を更に含む。本明細書に開示される抗体及びフラグメントの一部は、超長ＣＤＲ３が由来する異なる動物又は種の抗体配列に基づく又は由来し得る。例えば、超長ＣＤＲ３は、ウシ抗体配列に由来する又は基づき得、抗体配列の追加及び別の一部は、非ウシ抗体配列に由来する又は基づき得る。抗体及びそのフラグメントのさらなる詳細は、本明細書に記載される。
【０２０１】
超長ＣＤＲ３タンパク質
本開示は、超長ＣＤＲ３配列又はその一部を含む抗体又は免疫グロブリンコンストラクトを提供する。
【０２０２】
実施形態において、本開示は、超長ＣＤＲ３を含む抗体を提供する。超長ＣＤＲ３は、長さ３５以上のアミノ酸（例えば、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上）でもよい。
【０２０３】
超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部、超長ＣＤＲ３のストークドメインの少なくとも一部、又はそれらの組み合わせを含み得る。ＣＤＲ３のノブドメインの位置は、超長ＣＤＲ３のノブドメインに由来する１以上の保存モチーフを含み得る。ＣＤＲ３のストークドメインの位置は、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する１以上の保存モチーフを含み得る。そのような抗体は、超長ＣＤＲ３内に少なくとも３つのシステイン残基（例えば、４以上、６以上、８以上）を含み得る。抗体は１つ以上のシステインモチーフを含み得る。抗体は超長ＣＤＲ３内に非抗体配列を含み得る。代替的に又は付加的に、抗体は非ウシ配列を含み得る。非ウシ配列は超長ＣＤＲ３配列に結合され得る。抗体はさらにリンカーを含み得る。リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４９９）のアミノ酸配列を含み得、ここで、ｎ＝１乃至５である。代替的に、リンカーは、（ＧＳＧ）ｎ（配列番号３４２）、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３７）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３８）のアミノ酸配列を含む。抗体は、超長ＣＤＲ３内に非ウシ配列を含み得る。抗体はさらに抗体配列を含み得、ここで、抗体配列は超長ＣＤＲ３配列を含まない。抗体はさらに抗体配列を含み得、ここで、超長ＣＤＲ３ペプチド配列への抗体ペプチド配列のアミノ酸配列同定は、約４０％以下（例えば、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、１０％以下、約５％以下、約３％以下、約１％以下）である。抗体は細胞毒性薬剤又は治療用ポリペプチドを含み得る。細胞毒性薬剤又は治療用ポリペプチドは、超長ＣＤＲ３に共役され得る。抗体は標的に結合し得る。標的はタンパク質標的でもよい。タンパク質標的は膜貫通型タンパク質標的でもよい。抗体は、ＢＬＶ１Ｈ１２及び／又はＢＬＶＣＶ１抗体の少なくとも一部を含み得る。代替的に又は付加的に、抗体は、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、ＢＬＶ５Ｂ８、及び／又はＦ１８抗体の少なくとも一部を含む。抗体は、ヒト抗体の少なくとも一部を含み得る。抗体は、キメラ、組み換え、設計された、合成、ヒト化、完全にヒト、又はヒト操作の抗体でもよい。抗体は２以上の異なる抗体の抗体配列を含み得る。２つ以上の異なる抗体は同じ種のものでもよい。例えば、種は、ウシ種、ヒト種、又はネズミ種でもよい。２つ以上の異なる抗体は同じタイプの動物のものでもよい。例えば、２つ以上の異なる抗体は雌牛のものでもよい。２つ以上の異なる抗体はヒトのものでもよい。代替的に、２つ以上の異なる抗体は異なる種のものである。例えば、２つ以上の異なる抗体は、ヒト種及びウシ種のものである。別の例において、２つ以上の異なる抗体は、ウシ種及び非ウシ種のものである。別の例において、２つ以上の異なる抗体は、ヒト種及び非ヒト種のものである。
【０２０４】
別の実施形態において、本開示は、超長ＣＤＲ３を含む抗体を提供し、ここで、ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸であり、非ヒト配列に由来する又は基づく。超長ＣＤＲ３配列は、畜牛（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）などの反芻動物を含む、超長ＣＤＲ３抗体を自然に生成する任意の種に由来し得る。抗体は、ＢＬＶ１Ｈ１２及び／又はＢＬＶＣＶ１抗体の少なくとも一部を含み得る。代替的に又は付加的に、抗体は、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、ＢＬＶ５Ｂ８、及び／又はＦ１８抗体の少なくとも一部を含む。代替的に、超長ＣＤＲ３配列は、ラクダ又はサメのＣＤＲ３配列に由来し得る。
【０２０５】
別の実施形態において、本開示は、超長ＣＤＲ３を含む抗体を提供し、ここで、ＣＤＲ３は非抗体配列を含む。非抗体配列は、限定されないがケモカイン、成長因子、ペプチド、サイトカイン、細胞表面タンパク質、血清タンパク質、トキシン、細胞外マトリックスタンパク質、凝固因子、分泌タンパク質等を含む、任意のタンパク質ファミリーに由来し得る。非抗体配列は、治療用ポリペプチドに由来し得る。非抗体配列はヒト又は非ヒト起源であり得る。非抗体配列は合成配列を含み得る。非抗体配列は、ペプチド又はドメインなどの非抗体タンパク質の一部を含み得る。超長ＣＤＲ３の非抗体配列は、アミノ酸の変化（例えば、置換）、挿入、又は欠失を含む、その天然の配列からの突然変異を含み得る。非抗体配列間の結合部での付加的なアミノ酸の設計は、抗体内の非抗体配列の適切なフォールディングを促進又は増強するために行われ得る。ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部、超長ＣＤＲ３のストークドメインの少なくとも一部、又はそれらの組み合わせを含み得る。ＣＤＲ３のノブドメインの位置は、超長ＣＤＲ３のノブドメインに由来する１以上の保存モチーフを含み得る。ＣＤＲ３のストークドメインの位置は、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する１以上の保存モチーフを含み得る。代替的に又は付加的に、抗体は少なくとも３以上のシステイン残基を含む。抗体は１つ以上のシステインモチーフを含み得る。抗体は、ＢＬＶ１Ｈ１２及び／又はＢＬＶＣＶ１抗体の少なくとも一部を含み得る。代替的に又は付加的に、抗体は、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、ＢＬＶ５Ｂ８、及び／又はＦ１８抗体の少なくとも一部を含む。
【０２０６】
別の実施形態において、本開示は、超長ＣＤＲ３及び非ウシ配列を含む抗体を提供する。超長ＣＤＲ３は反芻動物に由来し得る。反芻動物はウシでもよい。非ウシ配列は、非ウシの哺乳動物配列に由来する又は基づき得る。例えば、非ウシ配列は、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、イヌ、及び／又はヤギの配列に由来する又は基づき得る。超長ＣＤＲ３配列は非ウシ配列を含み得る。代替的に、非ウシ配列は超長ＣＤＲ３配列に結合される。非ウシ配列は、抗体配列の少なくとも一部に由来する又は基づき得る。抗体配列は、可変領域、不変領域、又はその組み合わせをコード化することができる。ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部、超長ＣＤＲ３のストークドメインの少なくとも一部、又はそれらの組み合わせを含み得る。ＣＤＲ３のノブドメインの位置は、超長ＣＤＲ３のノブドメインに由来する１以上の保存モチーフを含み得る。ＣＤＲ３のストークドメインの位置は、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する１以上の保存モチーフを含み得る。代替的に又は付加的に、抗体は少なくとも３以上のシステイン残基を含む。抗体は１つ以上のシステインモチーフを含み得る。
【０２０７】
別の実施形態において、本開示は超長ＣＤＲ３を含む抗体を提供し、ここで、ＣＤＲ３は長さが３５以上のアミノ酸であり、少なくとも３以上（例えば、４以上、６以上、及び８以上）のシステイン残基を含む。
【０２０８】
別の実施形態において、本開示は超長ＣＤＲ３を含む抗体を提供し、ここで、ＣＤＲ３は長さが３５以上のアミノ酸であり、少なくとも３以上のシステイン残基を含み、ここで、超長ＣＤＲ３は多特異性抗体の構成要素である。多特異性抗体は、二重特異性であり、又はより大きな原子価を含み得る。
【０２０９】
別の実施形態において、本開示は超長ＣＤＲ３を含む抗体を提供し、ここで、ＣＤＲ３は長さが３５以上のアミノ酸であり、少なくとも３以上のシステイン残基を含み、ここで、超長ＣＤＲ３は免疫複合体の構成要素である。
【０２１０】
別の実施形態において、本開示は超長ＣＤＲ３を含む抗体を提供し、ここで、ＣＤＲ３は長さが３５以上のアミノ酸であり、少なくとも３以上のシステイン残基を含み、ここで、超長ＣＤＲ３を含む抗体は膜貫通型タンパク質標的に結合する。そのような膜貫通型標的は、限定されないが、ＧＰＣＲ、イオンチャネル、輸送体、及び細胞表面受容体を含み得る。
【０２１１】
別の実施形態において、本開示は、超長ＣＤＲ３を含む抗体を提供し、ここで、超長ＣＤＲ３を含む抗体は、膜貫通型タンパク質標的に結合する。そのような膜貫通型標的は、限定されないが、ＧＰＣＲ、イオンチャネル、輸送体、及び細胞表面受容体を含み得る。ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部、超長ＣＤＲ３のストークドメインの少なくとも一部、又はそれらの組み合わせを含み得る。ＣＤＲ３のノブドメインの位置は、超長ＣＤＲ３のノブドメインに由来する１以上の保存モチーフを含み得る。ＣＤＲ３のストークドメインの位置は、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する１以上の保存モチーフを含み得る。代替的に又は付加的に、抗体は少なくとも３以上のシステイン残基を含む。抗体は１つ以上のシステインモチーフを含み得る。
【０２１２】
本明細書には、免疫グロブリンコンストラクトが提供され、該免疫グロブリンコンストラクトは、相補性決定領域３（ＣＤＲ３Ｈ）の少なくとも一部を含む哺乳動物免疫グロブリン重鎖；及び治療用ポリペプチドを含み、ここで、治療用ポリペプチドは、ＣＤＲ３Ｈの少なくとも一部に挿入される又はそれを置換する。免疫グロブリンコンストラクトは１つ以上のリンカーを含み得る。１つ以上のリンカーは、重鎖に治療用ポリペプチドを結合することができる。幾つかの実施形態において、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎのアミノ酸配列を含み、ここで、ｎ＝１乃至５である（配列番号４９９）。代替的に又は付加的に、リンカーは、（ＧＳＧ）ｎ（配列番号３４２）、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３７）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３８）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される免疫グロブリンコンストラクトが提供され、ここで、治療用ポリペプチドは、ホルモン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカイン、サイトカイン、及びそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態において、治療用ポリペプチドはサイトカインである。幾つかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、コロニー刺激因子ポリペプチドである。特定の実施形態において、コロニー刺激因子は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、果粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）又はそのフラグメント、或いはそれらの変異体である。実施形態において、コロニー刺激因子は哺乳動物のＧ−ＣＳＦ又はその誘導体或いは変異体である。特定の実施形態において、コロニー刺激因子はウシのＧ−ＣＳＦ又はその誘導体或いは変異体である。他の例において、治療用ポリペプチドは、Ｍｏｋａ１、Ｖｍ２４、ヒトＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ヒトＥＰＯ、ヒトＦＧＦ２１、ヒトＧＭＣＳＦ、又はヒトインターフェロン−ベータである。本明細書には、免疫グロブリンコンストラクトが提供され、該免疫グロブリンコンストラクトは、相補性決定領域３（ＣＤＲ３Ｈ）又はそのフラグメントにおいてノブドメインを含む哺乳動物免疫グロブリン重鎖；及びＣＤＲ３Ｈの前記ノブドメインに結合された治療用ポリペプチドを含み、ここで、哺乳動物免疫グロブリンはウシ免疫グロブリンである。幾つかの実施形態において、ウシ免疫グロブリンはＢＬＶ１Ｈ１２抗体である。本明細書に記載される免疫グロブリンコンストラクトの幾つかの実施形態において、ノブドメインの少なくとも一部は、治療用ポリペプチドにより置換される。ＣＤＲ３Ｈのノブドメインは、超長ＣＤＲ３Ｈのノブドメインに由来する１以上の保存モチーフを含み得る。免疫グロブリンコンストラクトはさらに、ＣＤＲ３Ｈにおいてストークドメインの少なくとも一部を含み得る。ＣＤＲＨ３のストークドメインの一部は、超長ＣＤＲ３３Ｈのストークドメインに由来する１以上の保存モチーフを含み得る。
【０２１３】
本明細書にはさらに、相補性決定領域３（ＣＤＲ３Ｈ）又はそのフラグメントにおけるストークドメイン；及び治療用ポリペプチドを含む、抗体又はそのフラグメントが提供される。幾つかの例において、相補性決定領域３（ＣＤＲ３Ｈ）はウシの超長ＣＤＲ３Ｈに由来する。治療用ポリペプチドは、本明細書に開示される治療用ポリペプチドの何れかでもよい。例えば、治療用ポリペプチドは、Ｍｏｋａ１、Ｖｍ２４、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ヒトＥＰＯ、ヒトＦＧＦ２１、ヒトＧＭＣＳＦ、又はヒトインターフェロン−ベータである。治療用ポリペプチドはストークドメインに結合することができる。幾つかの例において、抗体又はそのフラグメントはさらにリンカーを含む。リンカーは、治療用ポリペプチドをストークドメインに結合することができる。代替的に又は付加的に、抗体又はそのフラグメントはさらに、ＣＤＲ３Ｈにおいてノブドメインの少なくとも一部を含む。幾つかの例において、リンカーは治療用ポリペプチドをノブドメインに結合する。幾つかの例において、ノブドメインはストークドメインに結合される。ＣＤＲ３のノブドメインの位置は、超長ＣＤＲ３のノブドメインに由来する１以上の保存モチーフを含み得る。ＣＤＲ３のストークドメインは、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する１以上の保存モチーフを含み得る。
【０２１４】
幾つかの例において、抗体又はそのフラグメントが、本明細書で提供される。抗体又はそのフラグメントは、少なくとも１つの免疫グロブリンドメイン又はそのフラグメント；及び治療用ポリペプチド又はその誘導体或いは変異体を含み得る。治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は免疫グロブリンドメインに結合することができる。幾つかの例において、治療用ポリペプチドは、Ｍｏｋａ１、Ｖｍ２４、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ヒトＥＰＯ、ヒトＦＧＦ２１、ヒトＧＭＣＳＦ、ヒトインターフェロン−ベータ、又はそれらの誘導体或いは変異体である。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、又は免疫グロブリンＭである。免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリン重鎖領域又はそのフラグメントでもよい。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは哺乳動物抗体由来である。代替的に、免疫グロブリンドメインはキメラ抗体由来である。幾つかの例において、免疫グロブリンドメインは、設計された抗体又は組み換え抗体由来である。他の例において、免疫グロブリンドメインは、ヒト化、ヒト操作、又は完全にヒトの抗体に由来する。特定の実施形態において、哺乳動物抗体はウシ抗体である。他の実施形態において、哺乳動物抗体はヒト抗体である。他の実施形態において、哺乳動物抗体はネズミ抗体である。幾つかの例において、免疫グロブリンドメインは、相補性決定領域３（ＣＤＲ３Ｈ）又はそのフラグメントにおいてノブドメインを含む重鎖領域である。治療用ポリペプチドはノブドメインに結合することができる。代替的に又は付加的に、免疫グロブリンドメインは、相補性決定領域３（ＣＤＲ３Ｈ）又はそのフラグメントにおいてストークドメインを含む重鎖領域である。幾つかの例において、治療用ポリペプチドはストークドメインに結合される。幾つかの例において、抗体又はそのフラグメントはさらにリンカーを含む。リンカーは、免疫グロブリンドメイン又はそのフラグメントに治療用ポリペプチドを結合することができる。ＣＤＲ３のノブドメインは、超長ＣＤＲ３のノブドメインに由来する１以上の保存モチーフを含み得る。ＣＤＲ３のストークドメインは、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する１以上の保存モチーフを含み得る。
【０２１５】
本明細書には、免疫グロブリンコンストラクトが提供され、該免疫グロブリンコンストラクトは、少なくとも１つの免疫グロブリンドメイン又はそのフラグメント；及び、前記免疫グロブリンドメインに結合されるＧ−ＣＳＦポリペプチド又はその誘導体或いは変異体を含む。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、又は免疫グロブリンＭである。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリン重鎖領域又はそのフラグメントである。実施形態において、免疫グロブリンドメインは、哺乳動物抗体又はキメラ抗体由来である。他の例において、免疫グロブリンドメインは、ヒト化、ヒト操作、又は完全にヒトの抗体に由来する。特定の実施形態において、哺乳動物抗体ウシは抗体である。幾つかの実施形態において、哺乳動物抗体はヒト抗体である。他の実施形態において、哺乳動物抗体はネズミ抗体である。実施形態において、免疫グロブリンドメインは、相補性決定領域３（ＣＤＲ３Ｈ）又はそのフラグメントにおいてノブドメインを含む重鎖領域である。実施形態において、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドはノブドメインに結合される。免疫グロブリンドメインは、相補性決定領域３（ＣＤＲ３Ｈ）又はそのフラグメントにおいてストークドメインを含む重鎖領域であり得る。Ｇ−ＣＳＦポリペプチドはストークドメインに付けられ得る。ＣＤＲ３のノブドメインは、超長ＣＤＲ３のノブドメインに由来する１以上の保存モチーフを含み得る。ＣＤＲ３のストークドメインは、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する１以上の保存モチーフを含み得る。
【０２１６】
特定の実施形態において、免疫グロブリンコンストラクトが提供され、該免疫グロブリンコンストラクトは、少なくとも１つの免疫グロブリンドメイン又はそのフラグメント；及び、前記免疫グロブリンドメインに結合されたＧ−ＣＳＦポリペプチド又はその誘導体或いは変異体を含み、ここで、前記Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、ウシのＧ−ＣＳＦポリペプチド又はその誘導体或いは変異体である。特定の実施形態において、本明細書には、本明細書に提供される免疫グロブリンコンストラクト、及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が提供される。特定の実施形態において、必要とする哺乳動物の疾患を予防又は処置するための方法が提供され、該方法は、前記哺乳動物に本明細書に記載される医薬組成物を投与する工程を含む。免疫グロブリンドメインは、相補性決定領域３（ＣＤＲ３Ｈ）又はそのフラグメントにおいてノブドメインを含む重鎖領域であり得る。Ｇ−ＣＳＦポリペプチドはノブドメインに付けられ得る。免疫グロブリンドメインは、相補性決定領域３（ＣＤＲ３Ｈ）又はそのフラグメントにおいてストークドメインを含む重鎖領域であり得る。Ｇ−ＣＳＦポリペプチドはストークドメインに付けられ得る。ＣＤＲ３のノブドメインは、超長ＣＤＲ３のノブドメインに由来する１以上の保存モチーフを含み得る。ＣＤＲ３のストークドメインは、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する１以上の保存モチーフを含み得る。
【０２１７】
幾つかの実施形態において、次のものを含む抗体又はそのフラグメントが開示される：（ａ）第１抗体配列であって、第１抗体配列の一部は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する、第１抗体配列；及び（ｄ）非抗体配列。抗体又はそのフラグメントはさらに第２抗体配列を含み、ここで、第２抗体配列の少なくとも一部は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する。第１抗体配列及び／又は第２抗体配列の超長ＣＤＲ３は、反芻動物に由来し得る。反芻動物は雌牛でもよい。本明細書に開示される抗体の第１抗体配列の少なくとも一部及び／又は第２抗体配列の少なくとも一部は、哺乳類由来でもよい。哺乳動物はウシでもよい。代替的に、哺乳動物はヒトなどの非ウシ哺乳動物である。第１及び／又は第２の抗体配列は、長さが３以上のアミノ酸でもよい。アミノ酸は連続するアミノ酸でもよい。代替的に、アミノ酸は連続しないアミノ酸である。第１及び／又は第２の抗体配列は、長さが３以上のアミノ酸を含むウシ抗体配列を含み得る。ウシ抗体は、ＢＬＶＨ１２、ＢＬＶ５Ｂ８、ＢＬＶＣＶ１、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、又はＦ１８抗体でもよい。第１及び／又は第２の抗体配列は、長さが３以上のアミノ酸を含むヒト抗体配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部及び／又は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、長さが２０以下のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部及び／又は超長ＣＤＲ３の一部に由来する第２抗体配列の一部は、長さが３以上のアミノ酸でもよい。第１及び／又は第２の抗体配列は、超長ＣＤＲ３のノブドメインに由来する、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、又は４０以上のアミノ酸残基を含み得る。超長ＣＤＲ３のノブドメインに由来する１以上のアミノ酸残基は、セリン及び／又はシステイン残基でもよい。第１及び／又は第２の抗体配列は、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、又は１０以上のアミノ酸残基を含み得る。第１及び／又は第２の抗体配列は、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する、１以上、２以上、３以上、４以上、又は５以上の保存モチーフを含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する１以上の保存モチーフは、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６の何れか１つから選択される配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部及び／又は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６の何れか１つから選択される配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部及び／又は超長ＣＤＲ３の一部に由来する第２抗体配列の一部は、配列番号１５７−２２４及び２３５−２９５の何れか１つから選択される配列に５０％以上相同する配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部は、配列番号１５７−２３４の何れか１つから選択される配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部は、配列番号１５７−２２４の何れか１つから選択される配列に５０％以上相同する配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部は、配列番号２２５−２２７の何れか１つから選択される配列に５０％以上相同する配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、配列番号２３５−３０７及び配列番号３３３−３３６の何れか１つから選択される配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、配列番号２３５−２９５の何れか１つから選択される配列に５０％以上相同し得る配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部及び／又は超長ＣＤＲ３の一部に由来する第２抗体配列の一部は、同じ超長ＣＤＲ３に由来し得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部及び超長ＣＤＲ３の一部に由来する第２抗体配列の一部は、２以上の異なる超長ＣＤＲ３配列に由来し得る。第１及び／又は第２の抗体配列の超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ１Ｈ１２の超長ＣＤＲ３配列に基づく又は由来し得る。第１及び／又は第２の抗体配列の超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ５Ｂ８、ＢＬＶＣＶ１、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、又はＦ１８の超長ＣＤＲ３配列に基づく又は由来し得る。抗体は、１つ以上のリンカー配列をさらに含み得る。
【０２１８】
本開示はまた、重鎖ポリペプチドを含む抗体を提供し、ここで、重鎖ポリペプチドは、超長ＣＤＲ３配列の少なくとも一部を含む。重鎖ポリペプチドは、配列番号２４−４４の何れか１つのポリペプチド配列に基づく又は由来する、ポリペプチド配列を含み得る。重鎖ポリペプチドは、配列番号２−２２の何れか１つのＤＮＡ配列に基づく又は由来する、ＤＮＡ配列によってコード化されるポリペプチド配列を含み得る。重鎖ポリペプチドを含む抗体も提供され、ここで、重鎖ポリペプチドは超長ＣＤＲ３配列を含み、重鎖ポリペプチド配列は、配列番号２４−４４の何れか１つによって提供されるポリペプチド配列に十分に類似する。重鎖ポリペプチド配列は、配列番号２４−４４の何れか１つによって提供されるポリペプチド配列に十分に類似すると考えられ得、ここで、重鎖ポリペプチド配列は、配列番号２４−４４の何れか１つによって提供されるヌクレオチド配列に６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上に同一である核酸配列を共有する。抗体はさらに軽鎖ポリペプチドを含み得る。軽鎖ポリペプチドは、配列番号２３のポリペプチド配列に基づく又は由来する、ポリペプチド配列を含み得る。軽鎖ポリペプチドは、配列番号１のＤＮＡ配列に基づく又は由来するＤＮＡ配列によってコード化されたポリペプチド配列を含み得る。軽鎖ポリペプチドをさらに含む抗体も提供され、ここで、軽鎖ポリペプチドは超長ＣＤＲ３配列を含み、軽鎖ポリペプチド配列は、配列番号２３によって提供されるポリペプチド配列に十分に類似する。軽鎖ポリペプチド配列は、配列番号１によって提供されるポリペプチド配列に十分に類似すると考えられ得、ここで、軽鎖ポリペプチド配列は、配列番号１の何れか１つによって提供されるヌクレオチド配列に、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上に同一である核酸配列を共有する。抗体は動物において治療活性を有し得る。抗体は被験体の感染症において治療活性を有し得る。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、組み換え抗体、設計された抗体、又は合成抗体を含み得る。抗体は、哺乳動物抗体を含み得る。抗体は、ウシ抗体を含み得る。抗体は、Ｇ−ＣＳＦポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体を含み得る。抗体は、哺乳動物のＧ−ＣＳＦポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体を含み得る。抗体は、ウシのＧ−ＣＳＦ、又はその誘導体或いは変異体を含み得る。幾つかの実施形態において、治療用製剤の医薬組成物は、本明細書に記載の抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む。特定の実施形態において、抗体は、本明細書に記載の抗体又は医薬組成物の治療上効果的な量と共に、必要とする被験体を処置する方法に使用される。幾つかの実施形態において、核酸分子又はその補体は、本明細書に記載の治療用免疫グロブリンをコード化する。
【０２１９】
遺伝子配列
本開示は、超長ＣＤＲ３配列又はその一部を含む抗体をコード化する遺伝子配列（例えば、遺伝子、核酸、ポリヌクレオチド）を提供する。本開示は、ノブドメインを含む抗体及び／又は超長ＣＤＲ３配列のノブドメインをコード化する遺伝子配列（例えば、遺伝子、核酸、ポリヌクレオチド）を提供する。別の実施形態において、本開示は、抗体又は本明細書に記載の免疫グロブリンコンストラクトをコード化する遺伝子配列を提供する。
【０２２０】
本開示はまた、超長ＣＤＲ３又はその一部をコード化する遺伝子配列（例えば、遺伝子、核酸、ポリヌクレオチド）を提供する。本開示はまた、ノブドメイン及び／又は超長ＣＤＲ３のノブドメインをコード化する遺伝子配列（例えば、遺伝子、核酸、ポリヌクレオチド）を提供する。
【０２２１】
実施形態において、本開示は、超長ＣＤＲ３を含む抗体をコード化する遺伝子配列を提供する。超長ＣＤＲ３は、長さ３５以上のアミノ酸（例えば、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上）でもよい。超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部、超長ＣＤＲ３のストークドメインの少なくとも一部、又はそれらの組み合わせを含み得る。そのような抗体は、超長ＣＤＲ３内に少なくとも３つのシステイン残基（例えば、４以上、６以上、８以上）を含み得る。抗体は１つ以上のシステインモチーフを含み得る。抗体は超長ＣＤＲ３内に非抗体配列を含み得る。代替的に又は付加的に、抗体は非ウシ配列を含み得る。抗体はさらに抗体配列を含み得る。抗体は、細胞毒性薬剤又は治療用ポリペプチドを含み得る。細胞毒性薬剤又は治療用ポリペプチドは、超長ＣＤＲ３に共役され得る。抗体は標的に結合し得る。標的は、膜貫通型タンパク質標的などのタンパク質標的でもよい。
【０２２２】
別の実施形態において、本開示は、超長ＣＤＲ３を含む抗体をコード化する遺伝子配列を提供し、ここで、ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸であり、非ヒト配列に由来する又は基づく。超長ＣＤＲ３をコード化する遺伝子配列は、畜牛などの反芻動物を含む、超長ＣＤＲ３抗体を自然に生成する任意の種に由来し得る。代替的に、超長ＣＤＲ３配列は、ラクダ又はサメのＣＤＲ３配列に由来し得る。
【０２２３】
別の実施形態において、本開示は、超長ＣＤＲ３を含む抗体をコード化する遺伝子配列を提供し、ここで、ＣＤＲ３は非抗体タンパク質配列を含む。非抗体タンパク質配列をコード化する遺伝子配列は、限定されないが、ケモカイン、成長因子、ペプチド、サイトカイン、細胞表面タンパク質、血清タンパク質、トキシン、細胞外マトリックスタンパク質、凝固因子、分泌タンパク質等を含む、任意のタンパク質ファミリーに由来し得る。非抗体配列は、治療用ポリペプチドに由来し得る。非抗体配列は、ヒト又は非ヒト起源のものでもよい。非抗体配列はサイトカイン配列を含み得る。非抗体配列は、ペプチド又はドメインなどの非抗体タンパク質の一部を含み得る。超長ＣＤＲ３の非抗体タンパク質配列は、アミノ酸の変化（例えば、置換）、挿入、又は欠失を含む、その天然の配列からの突然変異を含み得る。非抗体配列間の結合部での付加的なアミノ酸の設計は、抗体内の非抗体配列の適切なフォールディングを促進又は増強するために行われ得る。ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部、超長ＣＤＲ３のストークドメインの少なくとも一部、又はそれらの組み合わせを含み得る。代替的に又は付加的に、抗体は少なくとも３以上のシステイン残基を含む。抗体は１つ以上のシステインモチーフを含み得る。
【０２２４】
別の実施形態において、本開示は、超長ＣＤＲ３及び非ウシ配列を含む抗体をコード化する遺伝子配列を提供する。超長ＣＤＲ３は、反芻動物に由来し得る。反芻動物はウシでもよい。非ウシ配列は、非ウシの哺乳動物配列に由来する又は基づき得る。例えば、非ウシ配列は、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、イヌ、及び／又はヤギの配列に由来する又は基づき得る。非ウシ配列は超長ＣＤＲ３の中にあってもよい。代替的に、非ウシ配列は、超長ＣＤＲ３配列に結合される又は付けられる。非ウシ配列は、抗体配列の少なくとも一部に由来する又は基づき得る。抗体配列は、可変領域、不変領域、又はその組み合わせをコード化することができる。ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部、超長ＣＤＲ３のストークドメインの少なくとも一部、又はそれらの組み合わせを含み得る。代替的に又は付加的に、抗体は少なくとも３以上のシステイン残基を含む。抗体は１つ以上のシステインモチーフを含み得る。
【０２２５】
別の実施形態において、本開示は超長ＣＤＲ３を含む抗体をコード化する遺伝子配列を提供し、ここで、ＣＤＲ３は長さが３５以上のアミノ酸であり、少なくとも３以上（例えば、４以上、６以上、及び８以上を含む）のシステイン残基を含む。
【０２２６】
別の実施形態において、本開示は超長ＣＤＲ３を含む抗体をコード化する遺伝子配列を提供し、ここで、ＣＤＲ３は長さが３５以上のアミノ酸であり、少なくとも３以上のシステイン残基を含み、ここで、超長ＣＤＲ３は多特異性抗体の構成要素である。多特異性抗体は、二重特異性であり、又はより大きな原子価を含み得る。
【０２２７】
別の実施形態において、本開示は超長ＣＤＲ３を含む抗体をコード化する遺伝子配列を提供し、ここで、ＣＤＲ３は長さが３５以上のアミノ酸であり、少なくとも３以上のシステイン残基を含み、ここで、超長ＣＤＲ３は免疫複合体の構成要素である。
【０２２８】
別の実施形態において、本開示は超長ＣＤＲ３を含む抗体をコード化する遺伝子配列を提供し、ここで、ＣＤＲ３は長さが３５以上のアミノ酸であり、少なくとも３以上のシステイン残基を含み、ここで、超長ＣＤＲ３を含む抗体は膜貫通型タンパク質標的に結合する。そのような膜貫通型標的は、限定されないが、ＧＰＣＲ、イオンチャネル、輸送体、及び細胞表面受容体を含み得る。
【０２２９】
別の実施形態において、本開示は、超長ＣＤＲ３を含む抗体をコード化する遺伝子配列を提供し、ここで、超長ＣＤＲ３を含む抗体は、膜貫通型タンパク質標的に結合する。
そのような膜貫通型標的は、限定されないが、ＧＰＣＲ、イオンチャネル、輸送体、及び細胞表面受容体を含み得る。ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部、超長ＣＤＲ３のストークドメインの少なくとも一部、又はそれらの組み合わせを含み得る。代替的に又は付加的に、抗体は少なくとも３以上のシステイン残基を含む。抗体は１つ以上のシステインモチーフを含み得る。
【０２３０】
実施形態において、本開示は、次のものを含む抗体又はそのフラグメントをコード化する遺伝子配列を提供する：（ａ）第１抗体配列であって、第１抗体配列の一部は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する、第１抗体配列；及び（ｄ）非抗体配列。抗体又はそのフラグメントはさらに第２抗体配列を含み、ここで、第２抗体配列の少なくとも一部は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する。第１抗体配列及び／又は第２抗体配列の超長ＣＤＲ３は、反芻動物に由来し得る。反芻動物は雌牛でもよい。本明細書に開示される抗体の第１抗体配列の少なくとも一部及び／又は第２抗体配列の少なくとも一部は、哺乳類由来でもよい。哺乳動物はウシでもよい。代替的に、哺乳動物はヒトなどの非ウシ哺乳動物である。第１及び／又は第２の抗体配列は、長さが３以上のアミノ酸でもよい。アミノ酸は連続するアミノ酸でもよい。代替的に、アミノ酸は連続しないアミノ酸である。第１及び／又は第２の抗体配列は、長さが３以上のアミノ酸を含むウシ抗体配列を含み得る。ウシ抗体は、ＢＬＶＨ１２、ＢＬＶ５Ｂ８、ＢＬＶＣＶ１、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、又はＦ１８抗体でもよい。第１及び／又は第２の抗体配列は、長さが３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、又は７０以上のアミノ酸を含むヒト抗体配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部及び／又は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、長さが２０以下のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部及び／又は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、長さが３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、又は２０以上のアミノ酸でもよい。第１及び／又は第２の抗体配列は、超長ＣＤＲ３のノブドメインに由来する、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、又は４０以上のアミノ酸残基を含み得る。超長ＣＤＲ３のノブドメインに由来する１以上のアミノ酸残基は、セリン及び／又はシステイン残基でもよい。第１及び／又は第２の抗体配列は、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、又は１０以上のアミノ酸残基を含み得る。第１及び／又は第２の抗体配列は、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する、１以上、２以上、３以上、４以上、又は５以上の保存モチーフを含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する１以上の保存モチーフは、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６の何れか１つから選択される配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部及び／又は超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６の何れか１つから選択される配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部及び／又は超長ＣＤＲ３の一部に由来する第２抗体配列の一部は、配列番号１５７−２２４及び２３５−２９５の何れか１つから選択される配列に５０％以上相同する配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部は、配列番号１５７−２３４の何れか１つから選択される配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部は、配列番号１５７−２２４の何れか１つから選択される配列に５０％以上相同する配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部は、配列番号２２５−２２７の何れか１つから選択される配列に５０％以上相同する配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、配列番号２３５−３０７及び配列番号３３３−３３６の何れか１つから選択される配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第２抗体配列の一部は、配列番号２３５−２９５の何れか１つから選択される配列に５０％以上相同し得る配列を含み得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部及び／又は超長ＣＤＲ３の一部に由来する第２抗体配列の一部は、同じ超長ＣＤＲ３に由来し得る。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に由来する第１抗体配列の一部及び超長ＣＤＲ３の一部に由来する第２抗体配列の一部は、２以上の異なる超長ＣＤＲ３配列に由来し得る。第１及び／又は第２の抗体配列の超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ１Ｈ１２の超長ＣＤＲ３配列に基づく又は由来し得る。第１及び／又は第２の抗体配列の超長ＣＤＲ３の一部は、ＢＬＶ５Ｂ８、ＢＬＶＣＶ１、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、又はＦ１８の超長ＣＤＲ３配列に基づく又は由来し得る。抗体は、１つ以上のリンカー配列をさらに含み得る。
【０２３１】
本開示はまた、例えば配列番号２−２２の何れか１つによって提供されるようなＣＤＲ３配列を含む超長ＣＤＲ配列を含む、抗体をコード化する遺伝子配列などの、分離された遺伝子配列（例えば、遺伝子、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド）を提供する。また、配列番号２−２２の何れか１つによって提供されるＣＤＲ３配列に十分に類似する、超長ＣＤＲ３核酸配列が提供される。ＣＤＲ３配列は、配列番号２−２２の何れか１つによって提供されるＣＤＲ３配列に十分に類似すると考えられ得、ここで、ＣＤＲ３配列は、配列番号２−２２の何れか１つによって提供されるＣＤＲ３配列に８０％、８５％  ９０％  ９５％、又はそれ以上に同一である核酸配列を共有し、且つ、厳重なハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２−２２の何れか１つにハイブリダイズする。
【０２３２】
本開示はまた、重鎖ポリペプチドを含む抗体をコード化する遺伝子配列などの、分離された遺伝子配列（例えば、遺伝子、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド）を提供し、ここで、重鎖ポリペプチドは、超長ＣＤＲ３配列の少なくとも一部を含む。重鎖ポリペプチドは、配列番号２４−４４の何れか１つのポリペプチド配列を含み得る。重鎖ポリペプチドは、配列番号２−２２の何れか１つのＤＮＡによってコード化されるポリペプチド配列を含み得る。また、重鎖ポリペプチドを含む抗体をコード化する遺伝子配列などの分離された遺伝子配列（例えば、遺伝子、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド）が提供され、ここで、重鎖ポリペプチドは超長ＣＤＲ３配列を含み、重鎖ポリペプチド配列は、配列番号２４−４４の何れか１つによって提供されるポリペプチド配列に十分に類似する。重鎖ポリペプチド配列は、配列番号２４−４４の何れか１つによって提供されるポリペプチド配列に十分に類似すると考えられ得、ここで、重鎖ポリペプチド配列は、配列番号２４−４４の何れか１つによって提供されるヌクレオチド配列に６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上に同一である核酸配列を共有し、又は、厳重なハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２４−４４の何れか１つにハイブリダイズする。抗体をコード化する遺伝子配列などの、分離された遺伝子配列（例えば、遺伝子、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド）はさらに、軽鎖ポリペプチドを含む。軽鎖ポリペプチドは、配列番号２３のポリペプチド配列を含み得る。軽鎖ポリペプチドは、配列番号１のＤＮＡによってコード化されるポリペプチド配列を含み得る。また、軽鎖ポリペプチドをさらに含む抗体をコード化する遺伝子配列などの分離された遺伝子配列（例えば、遺伝子、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド）が提供され、ここで、軽鎖ポリペプチドは超長ＣＤＲ３配列を含み、軽鎖ポリペプチド配列は、配列番号２３によって提供されるポリペプチド配列に十分に類似する。軽鎖ポリペプチド配列は、配列番号１によって提供されるポリペプチド配列に十分に類似すると考えられ得、ここで、軽鎖ポリペプチド配列は、配列番号１によって提供されるヌクレオチド配列に６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又はそれ以上に同一である核酸配列を共有し、又は、厳重なハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１にハイブリダイズする。
【０２３３】
ライブラリ及びアレイ
本開示は、超長ＣＤＲ３配列を含む抗体の集合、ライブラリ、及びアレイを提供する。幾つかの実施形態において、集合、ライブラリ、又はアレイのメンバーは、配列多様性を示し得る。
【０２３４】
実施形態において、本開示は、超長ＣＤＲ３配列を含む抗体のライブラリ又はアレイを提供し、ここで、ライブラリ又はアレイの少なくとも２のメンバーは、超長ＣＤＲ３配列におけるシステインの少なくとも１つの位置において異なる。構造多様性は、超長ＣＤＲ３配列におけるシステインの異なる数（例えば、４以上、６以上、及び８以上などの少なくとも３以上のシステイン残基）を通じて、及び／又は異なるジスルフィド結合形成、従って異なるループ構造を通じて増強され得る。
【０２３５】
別の実施形態において、本開示は、超長ＣＤＲ３配列を含む抗体のライブラリ又はアレイを提供し、ここで、ライブラリ又はアレイの少なくとも２のメンバーは、超長ＣＤＲ３におけるシステイン間に位置する少なくとも１つのアミノ酸の点で異なる。この点において、ライブラリ又はアレイのメンバーは、ＣＤＲ３の同じ部分にシステインを含み得、結果として類似した全体的な構造フォールド（ｆｏｌｄｓ）を生じるが、異なるアミノ酸側鎖によって細かな違いが引き起こされる。そのようなライブラリ又はアレイは、親和性成熟に有用であり得る。
【０２３６】
別の実施形態において、本開示は、超長ＣＤＲ３配列を含む抗体のライブラリ又はアレイを提供し、ここで、超長ＣＤＲ３配列の少なくとも２つは、長さにおいて異なる（例えば、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、及び６０以上などの長さのように３５以上のアミノ酸）。アミノ酸及びシステインの含有量は、ライブラリ又はアレイのメンバーの間で変えられ得る、又は変えられないこともある。超長ＣＤＲ３配列の異なる長さは、例えば、変えられた長さの結果として、空間的な違いのため、独特な結合部位を提供し得る。
【０２３７】
別の実施形態において、本開示は、超長ＣＤＲ３配列を含む抗体のライブラリ又はアレイを提供し、ここで、ライブラリの少なくとも２のメンバーは、超長ＣＤＲ３を含む抗体を構築するために使用されるヒトフレームワークの点で異なる。
【０２３８】
別の実施形態において、本開示は、超長ＣＤＲ３配列を含む抗体のライブラリ又はアレイを提供し、ここで、ライブラリ又はアレイの少なくとも２のメンバーは、超長ＣＤＲ３の一部を含む非抗体タンパク質配列を有するという点で異なる。前記ライブラリ又はアレイは、ケモカイン、成長因子、ペプチド、サイトカイン、細胞表面タンパク質、血清タンパク質、トキシン、細胞外マトリックスタンパク質、凝固因子、分泌タンパク質、ウィルスタンパク質又は細菌タンパク質等を含む、多数の非抗体タンパク質配列を含み得る。非抗体タンパク質配列は、ヒト又は非ヒト起源のものでもよく、ペプチド又はドメインなどの非抗体タンパク質の一部で構成され得る。超長ＣＤＲ３の非抗体タンパク質配列は、アミノ酸の変化（例えば、置換）、挿入、又は欠失を含む、その天然の配列からの突然変異を含み得る。超長ＣＤＲ３内の非抗体配列間の結合部での付加的なアミノ酸の設計は、抗体内の非抗体配列の適切なフォールディングを促進又は増強するために行われ得る。
【０２３９】
別の実施形態において、本開示は、超長ＣＤＲ３配列を含む抗体のライブラリ又はアレイを提供し、ここで、ライブラリ又はアレイの少なくとも２のメンバーは、非ウシ配列を有するという点で異なる。非ウシ配列は、非ウシの哺乳動物配列に由来する又は基づき得る。例えば、非ウシ配列は、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、イヌ、及び／又はヤギの配列に由来する又は基づき得る。非ウシ配列は超長ＣＤＲ３の中にあってもよい。代替的に、非ウシ配列は、超長ＣＤＲ３配列に連結される又は結合される。非ウシ配列は、抗体配列の少なくとも一部に由来する又は基づき得る。抗体配列は、可変領域、不変領域、又はその組み合わせをコード化することができる。
【０２４０】
別の実施形態において、本開示は、超長ＣＤＲ３配列を含む抗体のライブラリ又はアレイを提供し、ここで、ライブラリ又はアレイの少なくとも２のメンバーは、超長ＣＤＲ３に共役する細胞毒性薬剤又は治療用ポリペプチドを有するという点で異なる。細胞毒性薬剤又は治療用ポリペプチドは、限定されないが、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、トキシン（例えば、細菌、菌類、植物、又は動物由来の酵素学的に活性なトキシン、又はそのフラグメント）、又は放射性同位体（例えば放射性複合体）を含み得る。細胞毒性薬剤又は治療用ポリペプチドは、非抗体配列によってコード化することができる。
【０２４１】
別の実施形態において、本開示は、超長ＣＤＲ３配列を含む抗体のライブラリ又はアレイを提供し、ここで、ライブラリ又はアレイの少なくとも２のメンバーは、標的に結合するという点で異なる。標的はタンパク質標的でもよい。タンパク質標的は膜貫通型タンパク質標的でもよい。そのような膜貫通型標的は、限定されないが、ＧＰＣＲ、イオンチャネル、輸送体、及び細胞表面受容体を含み得る。
【０２４２】
本開示のライブラリ又はアレイは、当該技術分野において周知の様々なフォーマットで存在し得る。ライブラリ又はアレイは、アドレス指定可能なライブラリ又はアドレス指定可能なアレイでもよい。ライブラリ又はアレイは、ディスプレイ提示型式に存在し、例えば、抗体配列は、ファージ、リボソーム、ｍＲＮＡ、酵母菌、又は哺乳動物細胞上で発現され得る。
【０２４３】
細胞
本開示は、超長ＣＤＲ３配列又はその一部を含む抗体をコード化する遺伝子配列を含む細胞を提供する。本開示は、ノブドメインの少なくとも一部又は超長ＣＤＲ３配列のノブドメインの少なくとも一部を含む抗体をコード化する遺伝子配列を含む細胞を提供する。
【０２４４】
本開示は、超長ＣＤＲ３又はその一部をコード化する遺伝子配列（例えば、遺伝子、核酸、ポリヌクレオチド）を含む細胞を提供する。本開示はまた、ノブドメイン及び／又は超長ＣＤＲ３のノブドメインをコード化する遺伝子配列（例えば、遺伝子、核酸、ポリヌクレオチド）を含む細胞を提供する。
【０２４５】
実施形態において、本開示は、超長ＣＤＲ３を含む抗体を発現する細胞を提供する。細胞は、原核生物又は真核生物でもよく、超長ＣＤＲ３を含む抗体は、細胞表面上で発現され得る、又は培地に分泌され得る。細胞表面上で提示された時、抗体は、Ｃ末端又は脂質結合部位にて膜貫通ドメインなどの、プラスミド膜への挿入のためのモチーフを優先的に含む。細菌細胞に関して、超長ＣＤＲ３を含む抗体は、ペリプラズムへ分泌され得る。細胞が真核生物の場合、それらは、超長ＣＤＲ３を含む抗体をコード化する遺伝子配列により一時的にトランスフェクトされ得る。代替的に、安定した細胞株又は安定したプールは、当業者に周知の方法によって、超長ＣＤＲ３を含む抗体をコード化する遺伝子配列をトランスフェクトする又は形質導入することにより、生成され得る。細胞は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって、又は遺伝子コード化薬物抵抗性に関する選択を通じて、選択することができる。超長ＣＤＲ３配列を含む抗体を生成するのに役立つ細胞は、大腸菌のような原核細胞、酵母菌ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅ及びピキア・パストリスのような真核細胞、昆虫細胞（例えばＳｆ９、Ｈｉ５）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−１のようなサル細胞、又はＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、ＳＰ−１のようなヒト細胞を含む。
【０２４６】
ライブラリ方法
本開示は、超長ＣＤＲ３配列を含む抗体を含むライブラリを作る方法を提供する。空間的にアドレス指定したライブラリのライブラリを作る方法は、ＷＯ２０１０／０５４００７に記載される。酵母、ファージ、大腸菌、又は哺乳動物細胞においてライブラリを作る方法は、当該技術分野にて周知である。
【０２４７】
本開示はまた、超長ＣＤＲ３配列を含む抗体のライブラリをスクリーニングする方法を提供する。
【０２４８】
定義
用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び例示的実施形態の記載に照らして（特に、以下の請求項に照らして）使用される同様の指示物は、本明細書に他に示されない又は内容によって明確に否定されない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は単に、範囲に含まれる各別々の値を個別に指す省略表現方法として機能するように意図される。本明細書に他に示されない限り、各個別の値は、あたかもそれが別々に本明細書に列挙されるかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に他に示されない又は内容によって明確に否定されない限り、本明細書に記載の全ての方法は、任意の適切な順で実行することが出来る。本明細書に提供される、全ての例、又は例示的な言語（例えば、「〜など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、例示的実施形態をより良く解明するように単に意図されるものであり、他に請求される例示的実施形態の範囲に対する制限を提起しない。本明細書中の言語は、例示的実施形態の実行に不可欠な任意の請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきでない。
【０２４９】
本明細書にて互換的に使用される「超長ＣＤＲ３」又は「超長ＣＤＲ３配列」は、ヒト抗体配列由来ではないＣＤＲ３又はＣＤＲ３配列を含む。
【０２５０】
超長ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸、例えば、長さが４０以上のアミノ酸、長さが４５以上のアミノ酸、長さが５０以上のアミノ酸、長さが５５以上のアミノ酸、又は長さが６０以上のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３の長さは、非抗体配列を含み得る。超長ＣＤＲ３は、ノブドメインの少なくとも一部及び／又はノブドメインを含み得る。超長ＣＤＲ３は、例えば、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、又はホルモン配列を含む非抗体配列を含み得る。好ましくは、超長ＣＤＲ３は、重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ−Ｈ３又はＣＤＲＨ３）である。好ましくは、超長ＣＤＲ３は、反芻動物（例えばウシ）配列に基づく又は由来する配列である。超長ＣＤＲ３は、少なくとも３以上のシステイン残基、例えば、４以上のシステイン残基、６以上のシステイン残基、又は８以上のシステイン残基を含み得る。超長ＣＤＲ３は、１つ以上のシステインモチーフを含み得る。超長ＣＤＲ３は、配列番号２３−４４に由来する又は基づく、又は配列番号２−２２に由来する又は基づくＤＮＡ配列によってコード化されるアミノ酸配列を含む。超長ＣＤＲ３を含む可変領域は、配列番号２３−４４に由来する又は基づく、又は配列番号２−２２に由来する又は基づくＤＮＡ配列によってコード化されるアミノ酸配列を含み得る。そのような配列は、ウシの生殖系列ＶＨ遺伝子配列に由来する又は基づき得る。超長ＣＤＲ３は、非ヒトＤＨ遺伝子配列に由来する又は基づく配列を含み得る（例えば、Ｋｏｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４７：  ２１１９−２１２８を参照）。超長ＣＤＲ３は、ＪＨ配列に由来する又は基づく配列を含み得る（例えば、Ｈｏｓｓｅｉｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６：  ８４３−８５２を参照）。実施形態において、超長ＣＤＲ３は、非ヒトＶＨ配列に由来する又は基づく配列、及び／又はＪＨ配列に由来する又は基づく配列、並びに随意に、例えばＶＨ由来の配列とＤＨ由来の配列の間に２乃至６以上のアミノ酸を含む付加的な配列を含み得る。別の実施形態において、超長ＣＤＲ３は、配列番号２３−４４に由来する又は基づく配列に約５０％以上相同する配列を含み得る。例えば、超長ＣＤＲ３は、配列番号２３−４４に由来する又は基づく配列に、約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又はそれ以上相同する配列を含み得る。別の実施形態において、超長ＣＤＲ３は、配列番号２３−４４に由来する又は基づく配列に対して５つ以上のアミノ酸を整列させる配列を含み得る。例えば、超長ＣＤＲ３は、配列番号２３−４４に由来する又は基づく配列に対して、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、又はそれ以上のアミノ酸を整列させる配列を含み得る。別の実施形態において、超長ＣＤＲ３は、配列番号２３−４４に由来する又は基づく配列に対して５以上の連続するアミノ酸を含む配列を含み得る。例えば、超長ＣＤＲ３は、配列番号２３−４４に由来する又は基づく配列に対して５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、又はそれ以上の連続するアミノ酸を含む配列を含み得る。別の実施形態において、超長ＣＤＲ３は、配列��号２−２２に由来する又は基づくＤＮＡ配列に約５０％以上相同する配列を含み得る。例えば、超長ＣＤＲ３は、配列番号２−２２に由来する又は基づくＤＮＡ配列に、約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又はそれ以上相同する配列を含み得る。別の実施形態において、超長ＣＤＲ３は、配列番号２−２２に由来する又は基づくＤＮＡ配列に対して５以上の核酸を整列させる配列を含み得る。例えば、超長ＣＤＲ３は、配列番号２−２２に由来する又は基づく配列に対して、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、８０、１００、１２０、１４０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、又はそれ以上のアミノ酸を整列させる配列を含み得る。別の実施形態において、超長ＣＤＲ３は、配列番号２−２２に由来する又は基づくＤＮＡ配列に対して５以上の連続する核酸を含む配列を含み得る。例えば、超長ＣＤＲ３は、配列番号２−２２に由来する又は基づくＤＮＡ配列に対して、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、８０、１００、１２０、１４０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、又はそれ以上の連続するアミノ酸を含む配列を含み得る。別の実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ノブドメイン配列に由来する又は基づく配列に約５０％以上相同する配列を含み得る。例えば、超長ＣＤＲ３は、ノブドメイン配列に由来する又は基づく配列に、約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又はそれ以上相同する配列を含み得る。別の実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ノブドメイン配列に由来する又は基づく配列に対して５つ以上のアミノ酸を整列させる配列を含み得る。例えば、超長ＣＤＲ３は、ノブドメイン配列に由来する又は基づく配列に対して、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、又はそれ以上のアミノ酸を整列させる配列を含み得る。別の実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ノブドメイン配列に由来する又は基づく配列に対して５以上の連続するアミノ酸を含む配列を含み得る。超長ＣＤＲ３は、ノブドメイン配列に由来する又は基づく配列に対して、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、又はそれ以上の連続するアミノ酸を含む配列を含み得る。別の実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ノブドメイン配列に由来する又は基づく配列に約５０％以上相同する配列を含み得る。例えば、超長ＣＤＲ３は、ノブドメイン配列に由来する又は基づく配列に、約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又はそれ以上相同する配列を含み得る。別の実施形態において、超長ＣＤＲ３は、ノブドメイン配列に由来する又は基づく配列に対して５以上のアミノ酸を整列させる配列を含み得る。例えば、超長ＣＤＲ３は、ノブドメイン配列に由来する又は基づく配列に対して、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、又はそれ以上のアミノ酸を整列させる配列を含み得る。別の実施形態において、超長��ＤＲ３は、ストークドメイン配列に由来する又は基づく配列に対して５以上の連続するアミノ酸を含む配列を含み得る。超長ＣＤＲ３は、ストークドメイン配列に由来する又は基づく配列に対して、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、又はそれ以上の連続するアミノ酸を含む配列を含み得る。本明細書に開示される抗体は、本明細書に開示される超長ＣＤＲ３の何れかの配列に由来する又は基づく超長ＣＤＲ３の少なくとも一部を含み得る。超長ＣＤＲ３又はその一部分の配列は、１以上の非ウシの抗体ベースのヌクレオチド及び／又はアミノ酸を含むために修飾又は変更され得る。超長ＣＤＲ３又はその一部の配列における修飾及び／又は変更は、発現された抗体の１つ以上の特徴を改善し得る。例えば、修飾及び／又は変化は、抗体の発現、フォールディング、半減期、活性、及び／又は可溶性を改善し得る。
【０２５１】
本明細書に開示される、様々なポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び抗体などの「分離された」生体分子は、その自然環境の少なくとも１つの構成要素から同定され、並びに分離及び／又は再生された生体分子を指す。
【０２５２】
「アンタゴニスト」は、ポリペプチドの活性（例えば、生物活性）を部分的又は完全に閉鎖、阻害、又は中和する任意の分子を指す。また、「アンタゴニスト」に包含されるものは、ポリペプチドをコード化するｍＲＮＡの転写又は翻訳を完全に又は部分的に阻害する分子である。適切なアンタゴニスト分子は、例えば、アンタゴニスト抗体又は抗体フラグメント；本来のポリペプチドのフラグメント又はアミノ酸配列変異体；ペプチド；アンチセンスオリゴヌクレオチド；有機小分子；及びポリペプチドアンタゴニスト又はアンタゴニスト抗体をコード化する核酸を含む。「１つの」アンタゴニストへの言及は、１つのアンタゴニスト又は２以上の異なるアンタゴニストの組み合わせを包含する。
【０２５３】
「アゴニスト」は、ポリペプチドの生物活性を部分的に又は完全に模倣する任意の分子を指す。また、「アゴニスト」に包含されるものは、ポリペプチドをコード化するｍＲＮＡの転写又は翻訳を刺激する分子である。適切なアゴニスト分子は、例えば、アゴニスト抗体又は抗体フラグメント；本来のポリペプチド；本来のポリペプチドのフラグメント又はアミノ酸配列変異体；ペプチド；アンチセンスオリゴヌクレオチド；有機小分子；及びポリペプチドアゴニスト又は抗体をコード化する核酸を含む。「１つの」アゴニストへの言及は、１つのアゴニスト又は２つ以上の異なるアゴニストの組み合わせを包含する。
【０２５４】
「分離された」抗体は、その自然環境の構成要素から同定され、並びに分離及び／又は回収したものを指す。自然環境の汚染物質成分は、抗体の診断的又は治療的使用に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質又は非タンパク質性の溶質を含み得る。好ましい実施形態において、抗体は、（１）（例えばローリー法によって測定されるように）９５重量％を上回る抗体、及び好ましくは９９重量％を上回る抗体に、（２）（例えば、スピニングカップシーケネイターの使用により）Ｎ末端又は内在的なアミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに十分な純度に、又は（３）（例えば、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（商標）ブルー、又は好ましくは銀染色を使用して）還元条件又は非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質に精製されるであろう。分離された抗体は、抗体の自然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないため、 組み換え細胞内にインサイツで抗体を含む。同様に、分離された抗体は、 組み換え細胞の周囲の培地に抗体を含む。分離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製され得る。
【０２５５】
「分離された」核酸分子は、抗体核酸の自然源に通常関係している少なくとも１つの汚染物質核酸分子から同定及び分離される核酸分子を指す。分離された核酸分子は、自然に見出される形態又はセッティング以外で存在する。それ故、分離された核酸分子は、自然細胞に存在するため、その核酸分子と区別される。しかし、分離された核酸分子は、例えば、核酸分子が自然細胞の位置と異なる染色体位置にある場合、抗体を発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
【０２５６】
Ｋａｂａｔにおけるような可変性ドメイン残基のナンバリング又はアミノ酸位置のナンバリング、及びその変形は、「Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  （１９９１）」における抗体の寄せ集めの重鎖可変性ドメイン又は軽鎖可変性ドメインに使用されるナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを使用して、実際の直線のアミノ酸配列は、可変性ドメインのＦＲ又はＣＤＲの省略、又はそれらへの挿入に対応する、より少数の又は付加的なアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変性ドメインは、重鎖ＦＲ残基８２の後のＨ２の残基５２及び挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従った残基８２ａ、８２ｂ、８２ｃなど）の後に、単一のアミノ酸挿入物（例えば、Ｋａｂａｔに従った残基５２ａ）を含み得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、「標準の」Ｋａｂａｔナンバリングを行った配列を有する抗体の配列の相同領域にあるアライメントによって、与えられた抗体について測定され得る。
【０２５７】
「十分に類似した」又は「十分に同じ」は、２つの数値（一般的に、一方は本明細書に開示された抗体に関連し、他方は参照／比較の抗体に関連する）の間の十分に高度な類似を指し、その結果、当業者は、２つの値の間の差を、前記値（例えばＫｄ値）により測定される生物学的特徴の枠の中ではほとんどない又は生物学的及び／又は統計学的有意性ではないと考えるであろう。前記２つの値の間の差は、参照／比較の抗体に関する値に応じて、好ましくは約５０％未満、好ましくは約４０％未満、好ましくは約３０％未満、好ましくは約２０％未満、好ましくは約１０％未満である。
【０２５８】
「結合親和性」は一般的に、分子（例えば抗体）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えば抗原）の間の非共有相互作用の総計の強度を指す。他に示されない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば抗体及び抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する、内因性の結合親和性を指す。パートナーＹに対する分子Ｘの親和性は一般的に、解離定数によって表わすことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当該技術分野で既知の一般の方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般的に、ゆっくり抗原に結合し、容易に解離する傾向があり、一方で高親和性抗体は一般的に、より速く抗原に結合し、より長く結合したまま残る傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法は、当該技術分野で既知であり、その何れかが、本開示の目的のために使用することができる。
【０２５９】
「オン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、Ｂｉａｃｏｒｅ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ａ１００，  Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）−２０００，  Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）−３０００，  Ｂｉａｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．）カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｉｎｃ．）などの表面プラズモン共鳴技術により、及び供給者の指示によって測定され得る。
【０２６０】
「ベクター」は、連結された別の核酸を運ぶことができる核酸分子を指す。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、それは、付加的なＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状の二本鎖ＤＮＡのループを指す。ベクターの別のタイプはファージベクターである。ベクターの別のタイプはウィルスベクターであり、ここで、付加的なＤＮＡセグメントはウィルスゲノムへライゲートされ得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞の中で自己増殖ができる（例えば、エピソームの哺乳動物ベクター及び細菌の複製起点を有する細菌ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソームの哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムへ統合することができ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが操作可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）結合される遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターは、「組み換え発現ベクター」（又は単に「組み換えベクター」）として本明細書において称される。一般的に、組み換えＤＮＡ技術における有用な発現ベクターは大抵、プラスミドの形態にある。従って、プラスミドが共通して使用されるベクターの形態であるため、「プラスミド」及び「ベクター」は時に、互換的に使用され得る。
【０２６１】
「遺伝子」は、ポリペプチド、前駆物質、又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の生産に必要なコード化配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。全体またはフラグメントの所望の活性又は機能的な特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、信号伝達、免疫原性等）が保持される限り、ポリペプチドは、完全なコード化配列、又はコード化配列の任意の部分によってコード化することができる。用語はまた、構造遺伝子のコード領域を包含し、且つ、５’と３’の末端の何れかにて約１ｋｂ以上の距離にわたって両末端上のコード領域に隣接して位置付けられる配列を包含する。コード領域の５’に位置づけられ、ｍＲＮＡに存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’又は下流に位置づけられ、ｍＲＮＡに存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡ及びゲノムの形態の両方を包含する。遺伝子のゲノムの形態又はクローンは、「イントロン」又は「介在領域」又は「介在配列」と称される、非コード化配列により阻止されるコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）へ転写される遺伝子のセグメントであり；イントロンは、エンハンサーなどの調節要素を含むことができる。イントロンは、核又は一次転写産物から取り除かれる又は「切り出され（ｓｐｌｉｃｅｄ  ｏｕｔ）」；イントロンはそれ故、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写に存在しない。初期のポリペプチドにおいてアミノ酸の配列又は順を明白にするため、ｍＲＮＡは翻訳中に機能する。イントロンを含むことに加えて、遺伝子のゲノムの形態はまた、ＲＮＡ転写物上に存在する配列の５’及び３’の末端の両方に位置づけられる配列を含み得る。これらの配列は、「フランキング」配列及び領域と称される（これらフランキング配列は、ｍＲＮＡの転写上に存在する、非翻訳配列に対して５’又は３’に位置づけられる。５’フランキング領域は、遺伝子の転写を制御する又は影響を及ぼすプロモーター及びエンハンサーなどの調節配列を含み得る。３’フランキング領域は、転写の終了、転写後の開裂、及びポリアデニル化に導く配列を含み得る。
【０２６２】
「ポリヌクレオチド」、又は「核酸」は、本明細書で互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾したヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらのアナログ、或いは、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼにより又は合成反応によりポリマーへ組み込まれ得る任意の基質であってもよい。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチド及びそれらのアナログなどの、修飾したヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組立の前又は後に与えられ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって阻止され得る。ポリヌクレオチドは、標識による共役などにより、合成後にさらに修飾され得る。他のタイプの修飾は、例えば、「キャップ」、アナログを有する自然に生じるヌクレオチドの１以上の置換、例えば、非荷電の連結（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等）及び荷電した連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有するものなどのヌクレオチド間の修飾、ペンダント部分を含むもの、例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等）、インターカレータを有するもの（例えば、アクリジン、ソラレン等）、キレート剤を含むもの（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）、アルキル化剤を含むもの、修飾した連結を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸等）、同様に、ポリヌクレオチドの未修飾の形態を含む。さらに、通常は糖に存在するヒドロキシル基の何れかは、例えば、ホスホン酸基、リン酸基によって置換され、標準保護基によって保護され、又は、付加的なヌクレオチドへの付加的な連結を調製するために活性化され、或いは、固体又は半固体の支持体に共役され得る。５’及び３’末端のＯＨは、１乃至２０の炭素原子のアミンまたは有機キャッピング基部分によりリン酸化され又は置換され得る。他のヒドロキシルも、標準の保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドはまた、一般的に当該技術分野で既知のリボース又はデオキシリボースの糖のアナログの形態を含み得、例えば、２’−Ｏメチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−、又は２’−アジド−リボース、炭素環式の糖アナログ、アルファ−アノマーの糖、アラビノース、キシロース、又はリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、及びメチルリボシドなどの塩基性のヌクレオチドアナログを含む。１つ以上のホスホジエステル連結が、代替的な連結基によって置換され得る。これら代替的な連結基は、限定されないが、リン酸塩が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオアート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオアート」））、（Ｏ）ＮＲ２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（「ギ酸アセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）」）によって置換される実施形態を含み、ここで、各Ｒ又はＲ’は、独立してＨであるか、或いはエーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、又はアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）を随意に含む置換又は非置換のアルキル（１−２０Ｃ）である。ポリヌクレオチドにおけるすべての連結が同じである必要はない。前述の記載は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む、本明細書に言及される全てのポリヌクレオチドに適用する。
【０２６３】
「オリゴヌクレオチド」は、一般的に、しかし必ずしもそうである必要はないが、長さが約２００未満のヌクレオチドである、短い、一般的に一本鎖の、一般的に合成のポリヌクレオチドを指す。用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、相互に排他的ではない。ポリヌクレオチドに関する上記の記載は、オリゴヌクレオチドに等しく且つ完全に適用可能である。
【０２６４】
「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、プローブが、典型的に核酸の複合混合物において、その標的サブ配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。厳蜜な条件は配列依存性であり、異なる状況下で異なる。より長い配列は、より高温で特にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範な規準は、「Ｔｉｊｓｓｅｎ，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，  “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”  （１９９３）」に見出される。一般的に、厳蜜な条件は、定義されたイオン強度ｐＨでの特異的な配列に関し、熱融解点（Ｔｍ）よりも５−１０℃低い温度となるように選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする、（定義されたイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度の下の）温度である（標的配列がＴｍにて過剰に存在し、プローブの５０％が平衡状態で占められるため）。厳蜜な条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の追加により達成され得る。選択的又は特異的なハイブリダイゼーションでは、陽性のシグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２倍、好ましくは１０倍である。典型的な厳重なハイブリダイゼーション条件は、以下のとおりであり得る：５０％のホルムアミド、５ｘＳＳＣ、及び１％のＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、又は５ｘＳＳＣ、１％のＳＤＳ、６５℃でのインキュベーションであり、０．２ｘＳＳＣにおける洗浄による、並びに６５℃での０．１％のＳＤＳ。
【０２６５】
細胞、核酸、タンパク質、抗体、又はベクターへの言及に使用された時、「組み換え」は、細胞、核酸、タンパク質、又はベクターが、異種の核酸又はタンパク質の導入、本来の核酸又はタンパク質の変更によって修飾され、又は、細胞が修飾された細胞由来であることを示す。例えば、組み換え細胞は、天然（組み換え無し）の形態の細胞では見られない遺伝子を発現する、又は例えば天然では生じないフラグメントとして或いはスプライス変異体としてなど、天然の遺伝子を過剰に、又はそうでなければ異常に発現する。本明細書の用語「組み換え核酸」によって、一般的に、通常は自然に見出されない形態で、例えばポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼを使用する、核酸の操作によって、独自にインビトロで形成される核酸を意味する。このように、異なる配列の操作可能な結合が達成される。故に、線形形式にある分離された核酸、又は、通常は結合されないＤＮＡ分子をライゲートすることによりインビトロで形成される発現ベクターは共に、本開示の目的のため組み換えであると考慮される。一旦、組み換え核酸が作られ、宿主細胞又は生物体に導入されると、例えば、インビトロの操作よりも宿主細胞のインビボでの細胞機構を使用して、組み換えを使用しない方法で複製するであろう；しかし、以前は組み換えを使用する方法で作られたが、その後組み換えを使用しない方法で複製された、そのような核酸は、本明細書に開示される目的のため組み換えであると未だに考えられる。同様に、「組み換えタンパク質」は、組み換え技術を使用して、例えば、本明細書に表われるような組み換え核酸の発現を通じて作られるタンパク質である。
【０２６６】
ペプチド又はポリペプチド配列に関して「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を並べてキャップを導入し、必要であれば、最大パーセントの配列同一性を達成するため、及び任意の保存的置換を配列同一性の一部として考慮せずに、特異的なペプチド又はポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージを指す。パーセントアミノ酸配列同一性を測定するためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇＡｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当業者内にある様々な方法で達成することができる。当業者は、比較されている配列の全体にわたる最大のアライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含むアライメントを測定するための、適切なパラメーターを測定することができる。
【０２６７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」、及び「タンパク質フラグメント」は、アミノ酸残基のポリマーを指すよう互換的に使用され得る。用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、自然発生のアミノ酸ポリマー及び非自然発生のアミノ酸ポリマーと同様に、対応する自然発生のアミノ酸のヒト操作の化学的模倣体である、アミノ酸ポリマーに適用する。
【０２６８】
「アミノ酸」は、自然発生及び合成のアミノ酸を指し、同様に、自然発生のアミノ酸と同じように機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣体も指す。自然発生のアミノ酸は、後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタマート、及びＯ−フォスフォセリンと同様に、遺伝コードによってコード化されたものである。アミノ酸アナログは、自然発生のアミノ酸、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）に結合する、アルファ炭素と同じ基礎的な化学構造を有する化合物を指す。前記アナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、自然発生のアミノ酸と同じ基礎的な化学構造を保持することができる。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なるが、自然発生のアミノ酸と同様に機能する構造を有する、化学化合物を指す。
【０２６９】
「保存的に修飾した変異体」は、アミノ酸と核酸配列の両方に適用する。「アミノ酸変異体」はアミノ酸配列を指す。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾した変異体は、同一又は本質的に同一の配列をコード化する核酸を指し、又はここで、核酸は、アミノ酸配列をコード化せず、本質的に同一又は関連する（例えば、自然に隣接する）配列を指す。遺伝コードの縮退のため、多くの機能的に同一の核酸は、大半のタンパク質をコード化する。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵはすべてアミノ酸アラニンをコード化する。故に、アラニンがコドンによって特定されるすべての位置で、コドンは、コード化されたポリペプチドを変えず、記載される対応するコドンを別のものに変えることができる。そのような核酸変異体は、保存的に修飾した変異体の一種である「サイレント変異体（ｓｉｌｅｎｔ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）」である。ポリペプチドをコード化する、本明細書におけるすべての核酸配列は、核酸のサイレント変異体について記載する。当業者は、特定のコンテキストにおいて、核酸における各コドン（メチオニンについては通常単なるコドンであるＡＵＧ、及びトリプトファンについては通常単なるコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一の分子をもたらすために改変され得ることを理解する。従って、ポリペプチドをコード化する核酸のサイレント変異体は、実際のプローブ配列ではなく、発現産物に関して記載された配列に潜在する。アミノ酸配列に関して、当業者は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失、又は追加が、１つのアミノ酸を変更、追加、又は削除し、或いは、コード化した配列におけるアミノ酸のごく一部が「保存的に修飾した変異体」であり、そこでは、変更が、化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらすことを、理解するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野において周知である。保存的に修飾したそのような変異体は、本明細書に開示される多形性の変異体、異種間の同族体、及び対立遺伝子に加わり、及びそれらを除外しない。典型的に、保存的置換は次のものを含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び、８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （１９８４）を参照）。
【０２７０】
「抗体」（Ａｂ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、類似した構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は特異性抗原に結合特異性を示し得る一方で、免疫グロブリンは、一般的に抗原特異性を欠く、抗体及び他の抗体のような分子の両方を含み得る。後者のポリペプチドは、例えば、リンパシステムにより低レベルで、及び髄腫により増加したレベルで生成される。
【０２７１】
「抗体」、「免疫グロブリン」、及び「免疫グロブリンコンストラクト」は、最も広い意味で互換的に使用され、モノクローナル抗体（例えば、完全な又は無傷のモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、それらが所望の生物活性を示す限り、二重特異性抗体）を含み、また、特定の抗体フラグメント（本明細書おいてより詳しく記載されるような）を含み得る。用語「抗体」は、完全な抗体又はその一部を指し得る。抗体は、少なくとも１つの抗体配列を含むペプチドを指し得る。抗体配列は、抗体配列の５つ以上のアミノ酸を含み得る。例えば、抗体配列は、抗体配列の６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上のアミノ酸を含み得る。５以上のアミノ酸は、抗体配列の連続するアミノ酸でもよい。代替的に、５以上のアミノ酸は、抗体配列の連続しないアミノ酸である。例えば、５以上のアミノ酸は、抗体配列内に保存モチーフを含み得る。例えば、５以上のアミノ酸は、超長ＣＤＲ３配列内に保存モチーフを含み得る。抗体は、ヒト、ヒト化、完全なヒト、及び／又は親和性成熟したものでもよい。抗体はキメラ抗体でもよい。抗体は、組み換え、設計された、又は合成の抗体でもよい。抗体は、ウシ、ウシ操作の、完全なウシ、及び／又は親和性成熟したものでもよい。ウシ操作の抗体は、ウシ抗体配列に由来する１つ以上のヌクレオチド又はペプチドを含み得る。完全なウシ抗体は、ウシ抗体配列に基づく１以上のヌクレオチド又はペプチドを伴う、非ウシの抗体配列から置換した１以上のヌクレオチド又はペプチドを含み得る。生成された組み換えなど、部分的又は全体的に合成であるかにもかかわらず、抗体は免疫グロブリン及び免疫グロブリン部分を指すこともあり、抗原結合部位を形成するのに十分な免疫グロブリン分子の可変領域の一部を含んでいる、その任意の部分を含む。従って、抗体又はその一部は、免疫グロブリン抗原結合部位に相同する又はほぼ相同する結合ドメインを有する任意のタンパク質を含む。例えば、抗体は、２つの重鎖（提示されたＨ及びＨ’である）及び２つの軽鎖（提示されたＬ及びＬ’である）を含む抗体を指し得、ここで、各重鎖は、抗原結合部位を形成するのに十分な、完全な免疫グロブリン重鎖又はその一部でもよく（例えば、重鎖は限定されないが、ＶＨ、鎖ＶＨ−ＣＨ１鎖、及びＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３鎖を含む）、各軽鎖は、抗原結合部位を形成するのに十分な、完全な軽鎖又はその一部でもよい（例えば、軽鎖は限定されないが、ＶＬ鎖及びＶＬ−ＣＬ鎖を含む）。各重鎖（Ｈ及びＨ’）は、１つの軽鎖（それぞれＬ及びＬ’）と対になる。典型的に、抗体は最小で、可変性の重（ＶＨ）鎖及び／又は可変性の軽（ＶＬ）鎖のすべて又は少なくとも一部を含む。抗体はまた、不変領域のすべて又は一部を含むことができる。例えば、完全な抗体は、Ｂ細胞を分泌する抗体、及び合成的に生成される同じドメインを有する抗体によって生成された抗体など、２つの完全な重鎖（例えば、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３又はＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）並びに２つの完全な軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）を有する抗体である。加えて、「抗体」は、非共有的に、可逆的に、及び特異的な方法で、対応する抗原に結合することができる、免疫グロブリンファミリーのタンパク質、又は有能な免疫グロブリンのフラグメントを含むポリペプチドを指す。典型的な抗体構造単位は、四量体を含む。各四量体は、ジスルフィド結合によって結合される、同一の２組のポリペプチド鎖（各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤ）で構成される。認識された免疫グロブリン遺伝子は、無数の免疫グロブリン可変部領域遺伝子と同様に、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμの不変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κ又はλの何れかとして分類される。重鎖は、次に免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを定義する、γ、μ、α、δ、又はεとして分類される。各鎖のＮ末端は、抗原認識の主な要因である約１００乃至１１０以上のアミノ酸の可変領域を定義する。用語、可変性の軽鎖（ＶＬ）及び可変性の重鎖（ＶＨ）は、軽鎖及び重鎖のそれぞれの領域を指す。幾つかの例において、本明細書で提供される抗体は、鳥類の抗体、爬虫類の抗体、両生類の抗体、昆虫の抗体、又はそれらのキメラ的な組み合わせから、少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。抗体は、キメラ抗体から少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含有し得る。キメラ抗体は、２つ以上の異なる種（例えば、マウスとヒト、ウシとヒト）に由来し得る。抗体は、設計された、組み換え、又は合成の抗体から少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含み得る。幾つかの例において、設計された、組み換え、又は合成の抗体は、研究所で作られた、又は細胞から採取した抗体遺伝子を使用して生成される。抗体遺伝子は、１以上の哺乳動物に由来し得る。例えば、抗体遺伝子はヒト由来である。抗体遺伝子はウシ由来でもよい。代替的に又は付加的に、本明細書に開示される抗体は、ヒト化、ヒト操作の、又は完全なヒトの抗体から、少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。抗体は２以上の異なる抗体の抗体配列を含み得る。２つ以上の異なる抗体は同じ種のものでもよい。例えば、種は、ウシ種、ヒト種、又はネズミ種でもよい。２つ以上の異なる抗体は同じタイプの動物のものでもよい。例えば、２つ以上の異なる抗体は雌牛のものでもよい。２つ以上の異なる抗体はヒトのものでもよい。代替的に、２つ以上の異なる抗体は異なる種のものである。例えば、２つ以上の異なる抗体は、ヒト種及びウシ種のものである。別の例において、２つ以上の異なる抗体は、ウシ種及び非ウシ種のものである。別の例において、２つ以上の異なる抗体は、ヒト種及び非ヒト種のものである。２つ以上の異なる抗体は、異なる動物由来でもよい。例えば、２つの異なる動物は、ヒト及びウシである。異なる動物は同じ種に由来し得る。例えば、異なる動物は雌牛と水牛でもよい。
【０２７２】
「可変性の」は、可変性ドメイン（可変領域とも呼ばれる）の特定の部分が、抗体間の配列において広く異なり、その特定の抗原のため個々の特定の抗体の結合及び特異性に使用されるという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変性ドメインの至る所で平等に分配されない。それは、軽鎖及び重鎖の可変性ドメインの両方において、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントにおいて集中される。ＣＤＲは、可変領域配列内で本明細書に示されるような、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及びＩＭＧＴとして指定されたものを含む。可変性ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。本来の重鎖及び軽鎖の可変性ドメインは各々、大部分がβ−シート構成を採用し、３つのＣＤＲによって結合され、ループ接合を形成し、幾つかの場合においてはβ−シート構造の一部を形成する、４つのＦＲ領域を含む。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接して共に保持され、他の鎖のＣＤＲにより、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  （１９９１）を参照）。不変ドメインは、抗体を抗原に結合することに直接関係しないが、抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【０２７３】
抗体のパパイン分解は、各々が単一の抗原結合部位を備える「Ｆａｂ」フラグメント、及び名称が容易に結晶化する能力を反映する残留物「Ｆｃ」フラグメントと呼ばれる２つの同じ抗原結合フラグメントを生成する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、さらに抗原を架橋結合することができる、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントをもたらす。
【０２７４】
「Ｆｖ」は、抗原認識と抗原結合部位を含む抗体フラグメントを指す。２重鎖のＦｖ種において、この領域は、非共有結合の群集において１つの重鎖及び１つの軽鎖の可変性ドメインの二量体から成る。単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１つの重鎖及び１つの軽鎖の可変性ドメインは、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合することができ、その結果、軽鎖及び重鎖は、２重鎖のＦｖ（ｓｃＦｖ）種におけるものと類似した「二量体の」構造に関連し得る。ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するため、個々の可変性ドメインの３つのＣＤＲが相互に作用するのは、この構成の中である。総じて、６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変性のドメインでさえ（又は、抗原に特異的なわずか３つのＣＤＲしか含まないＦｖの半分）、抗原を認識して結合する能力を有するが、親和性は全体の結合部位よりも低い。
【０２７５】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の不変ドメイン及び重鎖の第１不変ドメイン（ＣＨＩ）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域から１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での少数の残基の追加により、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、不変領域のシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’に関する、本明細書における明示である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは本来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として生成される。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られる。
【０２７６】
任意の脊椎動物種の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、不変ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる、２つの明らかに異なるタイプの１つに割り当てることができる。
【０２７７】
重鎖の不変ドメインのアミノ酸配列に依存し、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。５つの主要なクラスの免疫グロブリンが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、並びにそれらの幾つかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）に分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに相当する、重鎖不変ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユット構造及び三次元配置は、周知である。
【０２７８】
「抗体フラグメント」は、無傷の抗体の一部のみを含み、ここで、一部は、無傷の抗体に存在する時、好ましくはその一部に通常関連する機能の少なくとも１つ、好ましくはその大半又は全てを保持する。抗体フラグメントの例は、抗体フラグメントから形成される、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単一鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体（例えば、（ｄｓ  Ｆｖ）２）、Ｆｄ及びＦｄ’フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、直線状の抗体、単一鎖抗体分子、ミニボディ、フレックスミニボディ、二重特異性フラグメント、及び多重特異性抗体を含む（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ  ２０７：  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （２００３）；  Ｃｈａｐｔｅｒ  １；  ｐ  ３−２５，  Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖを参照）。他の既知のフラグメントは、限定されないが、ｓｃＦａｂフラグメントを含む（Ｈｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （２００７），  ７：１４）。１つの実施形態において、抗体フラグメントは、無傷の抗体の抗原結合部位を含み、故に抗原を結合する能力を保持する。別の実施形態において、抗体フラグメント（例えば、Ｆｃ領域を含むもの）は、ＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能、及び補体結合などの、無傷の抗体に存在する時にＦｃ領域に通常関連する生物学的機能の少なくとも１つを保持する。１つの実施形態において、抗体フラグメントは、無傷の抗体に十分に類似するインビボの半減期を有する一価抗体である。例えば、そのような抗体フラグメントは、フラグメントにインビボの安定性を与えることができるＦｃ配列に結合される、抗原結合アームを含み得る。別の例に関して、抗体フラグメント又は抗体部分は、完全ではないが、抗原結合部位（例えば、１以上のＣＤＲ）を形成するのに十分な抗体の可変領域の少なくとも一部を含む、完全な抗体の任意の部分を指し、故に、完全な抗体の結合特異性及び／又は活性を保持し；抗体フラグメントは、完全な抗体の酵素処理により精製される抗体の誘導体、同様に合成的に（例えば組み換えにより）生成された誘導体を含む。
【０２７９】
「ｄｓＦｖ」は、ＶＨ−ＶＬ対を安定させる、設計された分子間のジスルフィド結合を伴うＦｖを指す。
【０２８０】
「Ｆｄフラグメント」は、抗体重鎖の可変性ドメイン（ＶＨ）及び１つの不変領域ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体のフラグメントを指す。
【０２８１】
「Ｆａｂフラグメント」は、パパインによる完全な免疫グロブリンの消化から結果として生じる完全な抗体の一部を含む抗体フラグメント、又は合成的に（例えば組み換えにより）生成される同じ構造を有するフラグメントを指す。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖（ＶＬ及びＣＬ部分を含む）、及び重鎖（ＶＨ）の可変領域ドメイン並びに重鎖（ＣＨ１）の１つの不変領域ドメイン部分を含む別の鎖を含む；それは、組み換えにより生成され得る。
【０２８２】
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、ｐＨ４．０−４．５でペプシンによる免疫グロブリンの消化から結果として生じる抗体フラグメント、又は、同じ構造を有する、合成的に（例えば組み換えにより）生成された抗体を指す。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２つのＦａｂフラグメントを含むが、各重鎖部分が追加の小数のアミノ酸を含む場合、２つのフラグメントを結合するジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含む；それは、組み換えにより生成され得る。
【０２８３】
「Ｆａｂ’フラグメント」は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの２分の１（１つの重鎖及び１つの軽鎖）を含むフラグメントを指す。
【０２８４】
「Ｆｄ’フラグメント」は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの１つの重鎖部分を含む抗体のフラグメントを指す。
【０２８５】
「Ｆｖ’フラグメント」は、抗体分子のＶＨ及びＶＬドメインのみを含むフラグメントを指す。
【０２８６】
「ｓｃＦｖフラグメント」は、任意の順でポリペプチドリンカーによって共有結合される、可変性の軽鎖（ＶＬ）及び可変性の重鎖（ＶＨ）を含む抗体フラグメントを指す。リンカーは、２つの可変性ドメインが相当な干渉無しに架橋されるような長さである。典型的なリンカーは、可溶性を増加させるため全体に分散される幾つかのＧｌｕ又はＬｙｓの残基を有する（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ残基である。
【０２８７】
二重特異性抗体は二量体のｓｃＦｖである；二重特異性抗体は典型的にｓｃＦｖより短いペプチドリンカーを有し、それらは優先的に二量体化する。
【０２８８】
「ＨｓＦｖ」は、通常Ｆａｂフラグメントに存在する不変ドメインが、ヘテロ二量体のコイルドコイルドメインにより置換された抗体フラグメントを指す（例えば、Ａｒｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ７：３１２：２２１−２２８を参照）。
【０２８９】
「超可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」、同様に「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）」又は「ＣＤＲ」は、配列において超可変性であり、及び／又は構造上定義されたループを形成する、抗体可変性ドメインの領域を指し得る。一般的に、抗体は６つの超可変性領域又はＣＤＲ領域を含み；３つはＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）にあり、残り３つはＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある。多くの超可変領域又はＣＤＲの図解が使用され、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ）は、配列の可変性に基づき、最も共通して使用される（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  （１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、構造的なループの位置を代わりに言及する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７  （１９８７））。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ及びＣｈｏｔｈｉａの構造的なループ（Ｃｈｏｔｈｉａ「ＣＤＲ」）の間の損い（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）を表わし、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭの抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」超可変領域は、利用可能な複合結晶構造の分析に基づく。これら超可変領域の各々の残基は以下に記載される。（例えば、図１及び太字、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲについてはイタリック体の文字、及び１２．３のＩＣＩ抗体に関するＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲについては下線で強調した文字）。
【０２９０】
【表１】
2018140992.tif 000003
【０２９１】
Ｌｅｆｒａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ，  Ｒｅｓ．  ３７；  Ｄ１００６−Ｄ１０１２  （２００９）に記載されるように、ＩＭＧＴは、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを指し、例えば、抗体についてＩＭＧＴが指定したＣＤＲを含む（例えば、１２．３  １Ｃ１抗体に関して図１及び括弧書きした文字も参照）。
【０２９２】
超可変領域は、以下のような「拡張超可変領域」を含み得る：ＶＬにおいて２４−３６又は２４−３４（Ｌ１）、４６−５６又は５０−５６（Ｌ２）、及び８９−９７（Ｌ３）、ＶＨにおいて２６−３５（Ｈ１）、５０−６５又は４９−６５（Ｈ２）、及び９３−１０２、９４−１０２又は９５−１０２。可変性ドメイン残基は、これらの定義の各々に関して前述のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，に従って番号付けされる。
【０２９３】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書に定義されるような超可変領域残基以外の可変性ドメイン残基である。「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ベータシート内に位置するフレームワーク残基を含む抗体可変領域ドメイン内のドメインである；ＦＲ領域は、それらのアミノ酸配列に関して、超可変領域よりも比較的多く保存される。
【０２９４】
「モノクローナル抗体」は、十分に均質の抗体の集団からの抗体を指し、つまり、例えば、集団を含む個々の抗体は同一であり、及び／又はモノクローナル抗体の生成中に生じ得る可能な変異体を除いて、同じエピトープを結合し、そのような変異体は、一般的に少量で存在する。そのようなモノクローナル抗体は典型的に、標的を結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、ここで、標的を結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスによって得られた。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、又は組み換えＤＮＡクローンのプールなど、複数のクローンからの独特なクローンの選択でもよい。選択された標的結合配列はさらに、例えば、標的への親和性を改善するため、標的結合配列をヒト化するため、細胞培養においてその生産を改善するため、インビボでその免疫原性を減少させるため、多重特異性抗体を生成するために変えられることがあり、変えられた標的結合配列を含む抗体はまた、本開示のモノクローナル抗体であることを、理解されたい。異なる決定要素（例えば、エピトープ）に対して導かれる異なる抗体を典型的に含む、ポリクローナル抗体調製とは対照的に、モノクローナル抗体調製の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定要素に対して導かれる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製は、それらが典型的に他の免疫グロブリンに汚染されていないという点で有利である。モディファイアー「モノクローン」は、抗体の十分に均質な集団から得られるような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されることはない。例えば、本開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、様々な技術によって作られ得る：例えば、ハイブリドーマ方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５  （１９７５）；  Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  １９８８）；  Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ：  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１，  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８１））、組み換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：６２４−６２８  （１９９１）；  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：５８１−５９７  （１９９１）；  Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３８（２）：２９９−３１０  （２００４）；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３４０（５）：１０７３−１０９３  （２００４）；  Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２  （２００４）；及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２  （２００４）��、及び、ヒト免疫グロブリン座又はヒト免疫グロブリン配列をコード化する遺伝子の一部又は全てを有する動物においてヒト又はヒト様の抗体を生成するための技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３；ＷＯ１９９６／３４０９６；ＷＯ１９９６／３３７３５；ＷＯ１９９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：２５５１  （１９９３）；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２：２５５−２５８  （１９９３）；  Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，  ７：３３  （１９９３）；米国特許第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，５９１，６６９号；第５，５４５，８０７号；ＷＯ１９９７／１７８５２；米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；及び第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １０：  ７７９−７８３  （１９９２）；  Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６８：  ８５６−８５９  （１９９４）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６８：  ８１２−８１３  （１９９４）；  Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １４：  ８４５−８５１  （１９９６）；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １４：  ８２６  （１９９６）；及びＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３：  ６５−９３  （１９９５））。
【０２９５】
非ヒト（例えばマウス、ウシ）抗体の「ヒト化」又は「ヒト操作」の形態は、例えば、最小の配列が非ヒト免疫グロブリンに由来する物を含む、ヒト免疫グロブリン配列で表わされるアミノ酸を含むキメラ抗体である。例えば、ヒト化抗体は、幾つかの超可変領域残基及び恐らくは幾つかのＦＲ残基が非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体におけるアナログの部位の残基によって置換されるヒト化抗体でもよい。代替的に、ヒト化又はヒト操作の抗体は、幾つかの残基がヒト抗体におけるアナログの部位の残基により置換される非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体でもよい（例えば、米国特許第５，７６６，８８６号を参照）。ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域の残基が、所望の特異性、親和性、及び容量を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域の残基により置換される、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。幾つかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置換される。更に、ヒト化抗体は、例えば、ケモカイン、成長因子、ペプチド、サイトカイン、細胞表面タンパク質、血清タンパク質、トキシン、細胞外マトリックスタンパク質、凝固因子、又は分泌タンパク質配列などの非抗体配列を含む、レシピエント抗体、又はドナー抗体に見出されない残基を含み得る。これら修飾は、抗体パフォーマンスをさらに洗練するため行われ得る。ヒト化抗体は、例えば、修飾した抗体可変性ドメインを調製する方法を含む、米国特許第５，７６６，８８６号に記載されるような、ヒト操作抗体を含む。ヒト化抗体は、少なくとも１つの、及び典型的に２つの可変性ドメインのほぼ全てを含むことができ、そこでは、非ヒト免疫グロブリンのものに対応する超可変ループの全て又はほぼ全て、及びＦＲの全て又はほぼ全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、典型的にヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン不変領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を随意に含み得る。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５  （１９８６）；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９  （１９８８）；  及び  Ｐｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２：５９３−５９６  （１９９２）を参照。以下の評論記事及びその中で引用される文献：Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ａｎｎ．  Ａｌｌｅｒｇｙ，  Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １：  １０５−１１５  （１９９８）；  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８  （１９９５）；  Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ５：４２８−４３３  （１９９４）も参照。
【０２９６】
「ハイブリッド抗体」は、異なる抗原決定基領域を有する抗体からの重鎖及び軽鎖の対が共に組み立てられ、その結果、２つの異なるエピトープ又は２つの異なる抗原が認識され、結果として生じる四量体によって結合することができる、免疫グロブリン分子を指す。
【０２９７】
「キメラ」抗体（免疫グロブリン）は、特定の種に由来する又は特定の抗体のクラス或いはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一である又はそれに相同する、重鎖及び／又は軽鎖の一部を有し、一方で鎖の残りは、他の種に由来する又は特定の抗体のクラス或いはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一である又はそれに相同するが、それらが所望の生物活性を示す場合に限る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５  （１９８４）を参照）。ヒト化抗体は、キメラ抗体の部分集合を指す。
【０２９８】
「単一鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」の抗体フラグメントは、抗体のＶＨ及びＶＬのドメインを含み得、ここで、これらドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合に所望される構造を形成することを可能にする、ＶＨ及びＶＬのドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖのレビューについては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ｖｏｌ．  １１３，  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ２６９−３１５  （１９９４）を参照。
【０２９９】
「抗原」は、抗体が選択的に結合することができる、予め定義した抗原を指す。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、又は他の自然発生或いは合成の化合物でもよい。好ましくは、標的抗原はポリペプチドである。
【０３００】
本明細書で互換的に使用される「エピトープ」又は「抗原決定基」は、特定の抗体によって認識される及び特異的に結合される抗原の一部を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、タンパク質の三次フォールディング（ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｆｏｌｄｉｎｇ）によって並置される、接触アミノ酸及び非接触アミノ酸の両方から形成することができる。接触アミノ酸から形成されたエピトープは、タンパク質の変質後に典型的に保持され、一方で三次フォールディングによって形成されたエピトープは、タンパク質の変質後に典型的に無くなる。エピトープは典型的に、独特な空間の構造において少なくとも３つの、より通常には少なくとも５又は８−１０のアミノ酸を含む。抗体は、抗原上に同じ又は異なるエピトープに結合し得る。抗体は、異なるエピトープビンにおいて特徴付けられ得る。抗体が、別の抗体（例えば、参照の抗体又は標準抗体）と同じ又は異なるエピトープに結合するかどうかは、アッセイ（例えば、競合結合測定法）における抗体間の競合によって測定され得る。
【０３０１】
抗体の競合は、試験下の免疫グロブリンが参照の抗体の共通抗原への特異的結合を阻害するアッセイによって測定され得る。例えば、多数のタイプの競合結合測定法が知られ、例えば：固相の直接的又は間接的放射免疫アッセイ法（ＲＩＡ）、固相の直接的又は間接的酵素免疫検定法又は酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、ＥＬＩＳＡアッセイを含むサンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：２４２−２５３  （１９８３）を参照）；固相の直接的ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：３６１４−３６１９  （１９８６）を参照）；固相の直接的標識化アッセイ、固相の直接的標識化サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８８）を参照）；Ｉ−１２５標識を使用する固相の直接的標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２５（１）：７−１５  （１９８８）を参照）；固相の直接的ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６−５５２  （１９９０））；及び直接的標識化ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ３２：７７−８２  （１９９０））である。競合結合アッセイは、例えば、結合相互作用の動力学解析のためのＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）装置を伴う、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して行なわれ得る。そのようなアッセイにおいて、未知のエピトープ特異性の超長ＣＤＲ３を含む抗体は、コンパレーター抗体（例えば、本明細書に記載されるようなＢＡ１又はＢＡ２の抗体）に対する結合のための競争力のために評価され得る。アッセイは、非標識化の試験免疫グロブリン及び標識化した参照の免疫グロブリンの何れかを有する固体表面又は細胞に結合される精製抗原の使用を含み得る。競争阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面又は細胞に結合される標識の量を測定することにより、測定され得る。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。アッセイ（競争する抗体）は、参照の抗体と同じエピトープに結合する抗体、及び、生じる立体障害について参照の抗体によって結合されるエピトープに十分に近接した隣接するエピトープに結合する抗体を含み得る。通常、競争する抗体が過剰に存在する場合、それは、競争抗体について少なくとも５０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％、又は約１００％まで、参照の抗体の共通抗原への特異的な結合を阻害する。
【０３０２】
抗体が「選択的に結合する」又は「特異的に結合する」ことは、未関連のタンパク質を含む、代替的な物質を伴うものよりも頻繁且つ容易に、大きな持続時間、大きな親和性、又は上記の幾つかの組み合わせと共に、抗体が抗原或いはエピトープに反応する又は関連することを意味する。「選択的に結合する」又は「特異的に結合する」は、例えば、抗体が、少なくとも約０．１ｍＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約０．１μＭ以上、又は少なくとも約０．０１μＭ以上のＫＤを伴うタンパク質に結合することを意味し得る。異なる種における相同タンパク質間の配列の同一性のため、特異的結合は、１より多くの種において与えられた抗原を認識する抗体を含むことができる。
【０３０３】
抗体とタンパク質又はペプチドの相互作用に関して使用された時の「非特異的結合」及び「バックグラウンド結合」は、特定構造の存在に依存しない相互作用を指す（例えば、抗体は、エピトープなどの特定構造よりも一般的にタンパク質に結合している）。
【０３０４】
「二重特異性抗体」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、フラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変性ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変性ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間で対にすることを可能にするには短すぎるリンカーの使用によって、ドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対になり、且つ２つの抗原結合部位を生成することを強いられる。二重特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：６４４４−６４４８  （１９９３）においてより十分に記載される。
【０３０５】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生成された抗体のものに相当するアミノ酸配列を持ち、及び／又は本明細書に開示されるようなヒト抗体を作るための技術の何れかを使用して作られたものを指す。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
【０３０６】
「親和性成熟した」抗体は、親抗体と比較して変更を伴わない、抗原に関する抗体の親和性の改善において結果として生じる、その１以上のＣＤＲにおける１以上の変更を伴うものを指す。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原についてのナノモル又はさらにピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当該技術分野で既知の手順によって生成される。「Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３  （１９９２）」は、ＶＨ及びＶＬドメインのシャフリングによる親和性成熟について記載する。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム変異導入法は、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３  （１９９４）；  Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５  （１９９５）；  Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５５：１９９４−２００４  （１９９５）；  Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５４（７）：３３１０−９  （１９９５）；  及びＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２６：８８９−８９６  （１９９２）に記載される。
【０３０７】
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（本来の配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因するそれらの生物活性を指し、抗体のアイソタイプに応じて変わる。抗体エフェクター機能の例は：Ｃｌｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）のダウンレギュレーション；及び、Ｂ細胞活性化を含む。
【０３０８】
「抗体依存性細胞媒介細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」は、細胞毒性の形態を指し、そこでは、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合される、分泌されたＩｇが、これら細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を有する標的細胞に明確に結合して、その後、細胞毒性を有する標的細胞を死滅させることを可能にする。抗体は細胞傷害性細胞を「備え」、前述の死滅に必ず必要とされる。ＡＤＣＣを媒介するための一次細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩを発現し、一方で単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩのみを発現する。造血細胞に関するＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２  （１９９１）の４６４ページの表３に要約される。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロのＡＤＣＣアッセイを行ってもよい。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的に又は付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボ、例えば、「Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６  （１９９８）」に開示されるものなどの動物モデルにおいて評価され得る。
【０３０９】
「エフェクター細胞」は、１以上のＦｃＲを発現し、且つエフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、且つＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞、及び好中球を含み；ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、本来のソース、例えば血液から分離され得る。
【０３１０】
「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体について記載する。好ましいＦｃＲは、本来の配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩのサブクラスの受容体を含むものであり、これらの受容体の対立遺伝子の変異体及びこれら受容体の代替的にスプライスした形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、それらは、主としてその細胞質のドメインにおいて異なる、類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質のドメインにおいて免疫受容体のチロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質のドメインにおいて免疫受容体のチロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。（Ｍ．  ｉｎ  Ｄａｅｒｏｎ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５：２０３−２３４  （１９９７）のレビューを参照）。ＦｃＲは、「Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２  （１９９１）；  Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４  （１９９４）；  及び  ｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  １２６：３３０−４１  （１９９５）」においてレビューされる。将来的に同定されるべきものを含む他のＦｃＲは、本明細書における用語「ＦｃＲ」によって包含される。用語はまた、胎児への母性ＩｇＧの移動の原因であり（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１７：５８７  （１９７６）  ａｎｄ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：２４９  （１９９４））、且つ免疫グロブリンの恒常性を調節する、新生児受容体、ＦｃＲｎを含む。例えば、ＦｃＲへの改善された又は縮小された結合を伴う抗体変異体が、記載されてきた（例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ９（２）：  ６５９１−６６０４  （２００１）を参照）。
【０３１１】
ＦｃＲｎへの結合を測定する方法が知られている（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ  １９９７，  Ｈｉｎｔｏｎ  ２００４を参照）。インビボのヒトＦｃＲｎへの結合、及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又はトランスフェクトしたヒト細胞株、又はＦｃ変異体ポリペプチドと共に投与される霊長類において、アッセイすることができる。
【０３１２】
「補体依存性細胞障害」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。
古典的補体経路の活性化は、それらの同種抗原に結合される抗体（適切なサブクラスの）に補体系（Ｃｌｑ）の第１構成要素の結合によって開始される。補体活性化を評価するため、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３  （１９９６）に記載されるようなＣＤＣアッセイが実行され得る。
【０３１３】
変更されたＦｃ領域アミノ酸配列及び増加或いは減少したＣｌｑ結合能を有するポリペプチド変異体が、記載されてきた（例えば、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４：  ４１７８−４１８４  （２０００）も参照）。
【０３１４】
「Ｆｃ領域を含むポリペプチド」は、Ｆｃ領域を含む、抗体又はイムノアドヘシン（下記の定義を参照）などのポリペプチドを指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムに従った残基４４７）は、例えば、ポリペプチドの精製中に、又はポリペプチドをコード化する核酸の組み換え設計により、除去され得る。
【０３１５】
「ブロッキング」抗体、又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物活性を阻害又は減少させるものを指す。好ましいブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、十分に又は完全に、抗原の生物活性を阻害する。
【０３１６】
「アゴニスト」抗体は、対象のポリペプチドの機能的な活性の少なくとも１つを（例えば、部分的又は完全に）模倣する抗体を指す。
【０３１７】
「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク、又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する、ＶＬ又はＶＨのフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークを指す。ヒト免疫グロブリンフレームワーク、又はヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み、又は、先在するアミノ酸配列の変化を含み得る。先在するアミノ酸の変化が存在する場合、好ましくは５以下、好ましくは４以下、又は３以下の先在するアミノ酸の変化が、存在する。
【０３１８】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨのフレームワーク配列の選択において、最も共通して生じるアミノ酸残基を表わすフレームワークを指す。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨの配列の選択は、可変性ドメイン配列のサブグループ由来である。一般的に、配列のサブグループは、「Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．  （１９９１），  ｖｏｌｓ．  １−３」におけるようなサブグループである。１つの実施形態において、ＶＬに関して、サブグループは、前述のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，におけるようなサブグループカッパＩである。１つの実施形態において、ＶＨに関して、サブグループは、前述のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，におけるようなサブグループＩＩＩである。
【０３１９】
「障害」又は「疾患」は、本明細書に開示される物質／分子（例えば、本明細書に開示されるような超長ＣＤＲ３を含む抗体）又は方法による処置から利益を得る、任意の状態を指す。これは、哺乳動物を問題となっている障害にかける病理学的状態を含む、慢性及び急性の障害又は疾患を含む。
【０３２０】
「処置」は、処置されている個体又は細胞の自然経過を変更しようとする試みにおける臨床的介入を指し、予防処置のため又は臨床病理学の間の何れかで実行され得る。望ましい治療効果は、疾患の発生又は再発の予防、症状の緩和、疾患の病理学的、再起、兆候、その疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的影響の減少、転移の予防、疾患進行の速度の減少、病状の回復又は軽減、及び寛解又は改善した予後を含む。幾つかの実施形態において、本明細書に開示される抗体は、疾患又は障害の進行を遅らせるために使用される。
【０３２１】
「個体」（例えば「被験体」）は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物は、限定されないが、家畜（雌牛など）、スポーツ動物（ｓｐｏｒｔ  ａｎｉｍａｌ）、ペット（ネコ、イヌ、及びウマなど）、霊長類、マウス、及びラットを含む。
【０３２２】
処置の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）、並びにサル；家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌｓ）；及び、イヌ、ネコ、畜牛、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ等の、動物園、スポーツ、研究用、又はペットの動物を含む哺乳動物として分類される、任意の動物を指す。幾つかの実施形態において、哺乳動物は、ヒト、げっ歯類、又はサルから選択される。
【０３２３】
「薬学的に許容可能な」は、連邦政府又は州政府の規制機関によって承認される或いは承認可能なもの、米国の薬局方、又はヒトを含む動物に使用するための他の一般に認識される薬局方に記載されるものを指す。
【０３２４】
「薬学的に許容可能な塩」は、薬学的に許容可能であり、親化合物の所望の薬理活性を持つ化合物の塩を指す。
【０３２５】
「薬学的に許容可能な賦形剤、担体、又はアジュバント」は、本開示の少なくとも１つの抗体と共に、被験体に投与することが出来る賦形剤、担体、又はアジュバントを指し、それは、その薬理活性を破壊せず、治療用の量の化合物を送達するのに十分な用量で投与された時に無毒である。
【０３２６】
「薬学的に許容可能なビヒクル」は、本開示の少なくとも１つの抗体と共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は担体を指す
【０３２７】
「予後を提供する」、「予後情報」、又は「予兆情報」は、例えば、被験体の将来の健康状態（例えば、予期された罹患率又は死亡率、癌を患う可能性、及び転移の危険性）にて、癌（例えば、本開示の診断法によって測定されるような）の存在の影響力を考慮して、被験体の腫瘍における癌細胞の存在を含む情報を提供することを指す。
【０３２８】
「処置する」、「処置」、「処置すること」、「軽減する」、又は「軽減すること」などの用語は、１）診断された病理学的な疾病又は障害を治療し、減速し、それらの症状を減少し、及び／又はそれらの進行を停止する治療的手段、及び２）標的化した病理学的な疾病又は障害の進行を予防及び／又は遅くする予防又は再発防止の手段の両方を指す。故に、処置を必要とする人は、既に障害を持つ人；障害を持つ傾向のある人；及び、障害が予防されるべき人を含む。
【０３２９】
「診断書を提供すること」又は「診断情報」は、例えば、癌細胞の存在を含む、患者が疾患又は疾病を有しているかを測定すること、及び／又は、疾患又は疾病を表現型のカテゴリ、又は疾患又は疾病の予後又はそれらの処置（一般的な処置又は任意の特定の処置の何れか）の可能な反応に関する有意性を有する任意のカテゴリに分類することに役立つ、任意の情報を指す。同様に、診断は、限定されないが、被験体が疾病（腫瘍など）をもつおそれがあるかどうか、被験体の腫瘍が癌幹細胞を含むかどうかにを含む診断情報、例えば高い危険性の腫瘍又は低い危険性の腫瘍としての腫瘍の性質又は分類に関連する情報、予後に関連する情報、及び／又は適切な処置の選択に役立つ情報の、任意の種類を提供することを指す。処置の選択は、特定の化学療法剤、又は手術或いは放射などの他の治療法の選択、或いは治療を差し控えるべきか進めるべきかについての選択を含み得る。
【０３３０】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨのフレームワーク配列の選択において、最も共通して生じるアミノ酸残基を表わすフレームワークを指す。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨの配列の選択は、可変性ドメイン配列のサブグループ由来である。一般的に、配列のサブグループは、「Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．  （１９９１），  ｖｏｌｓ．  １−３」におけるようなサブグループである。１つの実施形態において、ＶＬに関して、サブグループは、前述のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，おけるようなサブグループカッパＩである。１つの実施形態において、ＶＨに関して、サブグループは、前述のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，におけるようなサブグループＩＩＩである。
【０３３１】
本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変性のドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変性ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークを指す。ヒト免疫グロブリンフレームワーク、又はヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み、又は、アミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施形態において、アミノ酸の変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施形態において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と、配列において同一である。
【０３３２】
「抗原結合部位」は、１つ以上の相補性決定領域によって形成された表面を指す。抗体分子は、２つの抗原結合部位を有し、各々が、重鎖可変領域の一部及び軽鎖可変領域の一部を含む。抗原結合部位は、ＣＤＲに加えて、可変領域ドメインの他の部分を含むことができる。
【０３３３】
「抗体軽鎖」又は「抗体重鎖」はそれぞれ、ＶＬ又はＶＨを含むポリペプチドを指す。ＶＬは、低分子化遺伝子Ｖ（可変性）及びＪ（結合部）によりコード化され、ＶＨは低分子化遺伝子Ｖ、Ｄ（多様性）、及びＪによってコード化される。ＶＬ又はＶＨの各々は、フレームワーク領域と同様にＣＤＲも含む。この適用において、抗体軽鎖及び／又は抗体重鎖は時に、総じて「抗体鎖」と称されることがある。これら用語は、当業者が容易に認識するため、ＶＬ又はＶＨの基本構造を妨害しない突然変異を含む抗体鎖を包含する。
【０３３４】
「本来の抗体」は、変化する構造を伴う自然発生の免疫グロブリン分子を指す。例えば、本来のＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合される２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変性の重ドメイン又は重鎖可変性ドメインとも称され、３つの不変領域（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を伴う、可変領域（ＶＨ）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変性の軽ドメイン又は軽鎖可変性ドメインとも称され、不変の軽（ＣＬ）ドメインを伴う、可変領域（ＶＬ）を有する。抗体の軽鎖は、その不変領域のアミノ酸配列に基づき、カッパ（Ｋ）及びラムダ（Ｋ）と呼ばれる２つのタイプの１つに割り当てられることもある。
【０３３５】
「組み合わせのライブラリ」は、構築ブロックの入れ替えに基づいて化合物の集合を生成するため、交換可能な化学的な「構築ブロック」の異なる組み合わせを反応させることにより形成される、化合物の集合を指す。抗体の組み合わせのライブラリについて、構築ブロックは、抗体が形成される構成要素Ｖ、Ｄ、及びＪの領域（又は修飾形態）である。本明細書の目的のため、用語「ライブラリ」及び「集合」は互換的に使用される。
【０３３６】
「組み合わせの抗体ライブラリ」は、抗体（又はＦａｂなどのその一部）の集合を指し、ここで、抗体は、Ｖ、Ｄ、及びＪの遺伝子セグメント、特にヒトのＶ、Ｄ、及びＪの生殖系列セグメントの組み合わせによって生成される核酸分子によってコード化される。本明細書における組み合わせのライブラリは典型的に、少なくとも５０の異なる抗体（又は抗体の一部或いはフラグメント）のメンバー、典型的に５０、１００、５００、１０３、１×１０３、２×１０３、３×１０３、４×１０３、５×１０３、６×１０３、７×１０３、８×１０３、９×１０３、１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４、１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、又はそれ以上の異なるメンバーを含む。抗体又はその一部の、結果として生じるライブラリ又は集合は、標的タンパク質への結合又は機能的な活性の調節のためにスクリーニングすることができる。
【０３３７】
「ヒトの組み合わせの抗体ライブラリ」は、抗体又はその一部の集合を指し、それにより、各メンバーは、本明細書に記載されるように生成されるヒト生殖系列セグメントを含む核酸によってコード化される、抗原結合部位を形成するために、ＶＬ及びＶＨ鎖、又はその十分な部分を含む。
【０３３８】
「可変性の生殖系列セグメント」は、Ｖ、Ｄ、及びＪのグループ、サブグループ、遺伝子、又はその対立遺伝子を指す。遺伝子セグメント配列は、既知のデータベースからアクセス可能である（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ），  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍＲ  （ＩＭＧＴ），  ｔｈｅ  Ｋａｂａｔ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ’ｓ  ＶＢａｓｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  （Ｌｅｆｒａｎｃ  （２００３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ，  ３１：３０７−３１０；  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  （２００７），  ｐｐ．  １０４−１０７を参照）。表３−５は、典型的なヒト可変性生殖系列セグメントを記載する。典型的なＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖκ、Ｊκ、Ｖλ、及び／又はＪλの配列、生殖系列セグメントは、配列番号１０−４５１及び８６８にて述べられる。本明細書における目的のため、生殖系列セグメントは、方法の実行を許容するため本明細書に提供される配列の寄せ集めの規則に合わせて修飾される、その修飾された配列を含む。例えば、生殖系列遺伝子セグメントは、配列番号１０−４５１、８６８に述べられるヌクレオチドの配列の何れかと比較して、５’又は３’の末端にて１つのアミノ酸の欠失又は挿入を含むものを含む。
【０３３９】
「寄せ集め」、「寄せ集める」、「組み合わせる」、「組み合わせ」、「再配置する」、「再配列」、又はそれらの他の類似の用語或いは文法上の変形は、生殖系列セグメントが、遺伝子を表わす核酸配列へ順序づけられる又は組み立てられるプロセスを指す。例えば、可変性重鎖生殖系列セグメントが組み立てられ、その結果、ＶＨセグメントは、ＪＨセグメントに対して５’であるＤＨセグメントに対して５’であり、それにより、ＶＨ鎖をコード化する核酸配列を結果として生じる。可変性軽鎖生殖系列セグメントが組み立てられ、その結果、ＶＬセグメントはＪＬセグメントに対して５’であり、それにより、ＶＬ鎖をコード化する核酸配列を結果として生じる。不変の遺伝子セグメントも、ＶＨ又はＶＬの鎖をコード化する核酸の３’末端上で組み立てることができる。
【０３４０】
「連結した」、「連結」、又は生殖系列セグメントに関するその他の文法上の変形は、生殖系列セグメントの結合を指す。連結は、直接的又は間接的なものでもよい。生殖系列セグメントは、セグメント間にヌクレオチドを加えることなく直接連結することができ、又は、付加的なヌクレオチドは、インフレームのセグメント全体を与えるために加えることができ、或いは、ヌクレオチドは、結果として生じるインフレームのセグメントを与えるために削除することができる。リンカーヌクレオチドの選択が行われ、その結果、結果として生じる核酸分子がインフレームに存在し、機能的且つ生産的な抗体をコード化することが理解される。
【０３４１】
ヒト生殖系列の連結に関して「インフレーム」又は「インフレームで連結した」は、５’開始コドン（ＡＴＧ）を伴う結果として生じるインフレームの核酸分子を与え、それにより「生産的」又は機能的な完全なポリペプチドを生成するため、連結された結合部にあるヌクレオチド生殖系列セグメントにおいて、挿入及び／又は欠失が存在することを意味する。生殖系列セグメントから挿入又は削除されるヌクレオチドの選択は、特に様々なＶＤ、ＤＪ、及びＶＪセグメントを結合する結合部にて、Ｖ（Ｄ）Ｊ結合生成のため本明細書における方法で提供される規則と一致する。例えば、生殖系列セグメントが組み立てられ、その結果、ＶＨセグメントは、ＪＨセグメントに対して５’であるＤＨセグメントに対して５’である。ＶＨとＤＨを結合する結合部、及びＤＨとＪＨのセグメントを結合する結合部にて、ヌクレオチドは、個々のＶＨ、ＤＨ、又はＪＨのセグメントから挿入又は削除することができ、その結果、結合されたＶＤＪセグメントを含む、結果として生じる核酸分子は、５’開始コドン（ＡＴＧ）と共にインフレームにある。
【０３４２】
抗体の一部は、抗原結合部位を形成するのに十分なアミノ酸を含む。
【０３４３】
「リーディングフレーム」は、ＤＮＡ又はＲＮＡにおける３つのヌクレオチドコドンの、接触する且つ重複しないセットを指す。３つのコドンが１つのアミノ酸をコード化するので、与えられたヌクレオチド配列について３つの可能なリーディングフレーム、リーディングフレーム１、２、又は３が存在する。例えば、配列ＡＣＴＧＧＴＣＡは、リーディングフレーム１についてはＡＣＴ  ＧＧＴ  ＣＡ、リーディングフレーム２についてはＡ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  Ａ、及びリーディングフレーム３についてはＡＣ  ＴＧＧ  ＴＣＡである。一般的に、本明細書に記載の方法の実行のため、核酸配列が組み合わされ、その結果、Ｖ配列はリーディングフレーム１を有する。
【０３４４】
「停止コドン」は、翻訳中のタンパク質合成における停止を合図する３つのヌクレオチド配列、又は、アンバー停止コドン（ＵＡＧ又はＴＡＧ）、オーカー停止コドン（ＵＡＡ又はＴＡＡ）、及びオパール停止コドン（ＵＧＡ又はＴＧＡ）を含む、その配列をコード化する任意の配列（例えば、ＲＮＡ停止コドン配列をコード化するＤＮＡ配列）を指す。停止コドンは、すべての細胞又はすべての生体において翻訳の停止を合図する必要はない。例えば、アンバーサプレッサー株及び部分的アンバーサプレッサー株などのサプレッサー株宿主細胞において、翻訳は、少なくとも時々、１つ以上の停止コドン（例えば、アンバーサプレッサー株についてアンバー停止コドン）を通じて行われる。
【０３４５】
「可変性重」（ＶＨ）鎖又は「可変性軽」（ＶＬ）鎖（ＶＨドメイン又はＶＬドメインとも称される）は、抗体の可変性ドメインを構築するポリペプチド鎖を指す。本明細書における目的のため、ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ、並びにその寄せ集めが、ＶＨ鎖をコード化する核酸を結果としてもたらすため、重鎖生殖系列セグメントが指定される。軽鎖生殖系列セグメントは、ＶＬ又はＪＬとして指定され、カッパ及びラムダの軽鎖（Ｖκ及びＪκ；Ｖλ及びＪλ）を含み、その寄せ集めは、ＶＬ鎖をコード化する核酸を結果として生じる。軽鎖はカッパ又はラムダの軽鎖の何れかであるが、Ｖκ及びＪλの寄せ集めによるカッパ／ラムダの組み合わせを含まないことが理解される。
【０３４６】
「縮重コドン」は、親ヌクレオチド配列におけるコドンと同じアミノ酸を特定する、３つのヌクレオチドコドンを指す。当業者は、遺伝コードの縮重に精通しており、縮重コドンを同定することができる。
【０３４７】
集合におけるメンバーに関して「多様性」は、集合における独特なメンバーの数を指す。従って、多様性は、その集合の同族性のポリペプチドメンバーにおける、異なるアミノ酸配列又は核酸配列の数をそれぞれ指す。例えば、１０４の多様性を有するポリヌクレオチドの集合は、同族性のポリヌクレオチドメンバー中に１０４の異なる核酸配列を含む。１つの例において、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの提供された集合は、少なくとも約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、又はそれ以上の多様性を有する。
【０３４８】
「配列多様性」は、核酸配列類似物の提示を指し、配列アライメント、多様性スコア、及び／又は配列クラスタリングを使用して決定される。任意の２つの配列は、並行して配列を置き、且つ配列の長さに沿ってすべての位置でヌクレオチド内の差を分析することにより、配列することができる。配列アライメントは、核酸及び／又はタンパク質の配列を比較するため、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、ＮＣＢＩツールを使用して、インシリコで評価することができる。配列アライメントのためのＢＬＡＳＴの使用は、当業者に周知である。Ｂｌａｓｔ検索アルゴリズムは、２つの配列を比較し、各一致（Ｂｌａｓｔスコア）の統計的有意差を計算する。互いに最も類似する配列は、高いＢｌａｓｔスコアを有し、一方で最も変更される配列は、低いＢｌａｓｔスコアを有する。
【０３４９】
「ポリペプチドドメイン」は、構造的及び／又は機能的に識別可能又は定義可能であるポリペプチド（３以上の配列、一般的に５又は７以上のアミノ酸）の一部を指す。ポリペプチドドメインの典型は、１以上の構造モチーフで構築されるポリペプチド（例えば、ループ領域により接続されるアルファヘリックス及び／又はベータ鎖の組み合わせ）の中に独立して折り畳まれる構造を形成することができ、及び／又は、酵素活性又は抗原結合などの特定の機能的な活性によって認識されるポリペプチドの一部である。ポリペプチドは、１つの、典型的には１より多くの、異なるドメインを有することができる。例えば、ポリペプチドは、１つ以上の構造ドメイン及び１つ以上の機能ドメインを有することができる。１つのポリペプチドドメインは、構造と機能に基づいて区別することができる。ドメインは、アミノ酸の接触する直鎖状配列を包含することができる。代替的に、ドメインは、複数の接触しないアミノ酸部分を包含することができ、それは、ポリペプチドのアミノ酸の直鎖状配列に沿って接触しない。典型的に、ポリペプチドは複数のドメインを含む。例えば、抗体分子の各重鎖及び各軽鎖は、長さが約１１０のアミノ酸である、複数の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含む。
【０３５０】
「Ｉｇドメイン」は、各々がループによって接続されるアミノ酸の逆平行ベータ鎖を含む２つのβ−プリーツシートを含む、免疫グロブリン（Ｉｇ）と呼ばれる、構造によって区別される、当業者などによって認識されるドメインを指す。Ｉｇフォールドにおける２つのベータシートは、疎水的相互作用及び保存された鎖内のジスルフィド結合によって、共に挟まれる。抗体鎖の内の個々の免疫グロブリンドメインはさらに、機能に基づいて区別され得る。例えば、軽鎖は、１つの可変領域ドメイン（ＶＬ）及び１つの不変領域ドメイン（ＣＬ）を含み、その一方で重鎖は、１つの可変領域ドメイン（ＶＨ）、及び３又は４の不変領域ドメイン（ＣＨ）を含む。ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、及びＣＨのドメインはそれぞれ、免疫グロブリンドメインの例である。
【０３５１】
抗体に関して「可変性ドメイン」は、異なる抗体の中で変異するアミノ酸の配列を含む、抗体重鎖又は軽鎖の特異的なＩｇドメインを指す。各軽鎖及び各重鎖は、１つの可変領域ドメイン（ＶＬ、及びＶＨ）を有する。可変性ドメインは抗原特異性を提供し、故に抗原認識の原因となる。各可変領域は、抗原結合部位ドメイン及びフレームワーク領域（ＦＲ）の一部であるＣＤＲを含む。
【０３５２】
「不変領域ドメイン」は、可変領域ドメインよりも比較的より多く抗体の中で保存されるアミノ酸の配列を含む、抗体重鎖又は軽鎖におけるドメインを指す。各軽鎖は、単一の軽鎖不変領域（ＣＬ）ドメインを有し、各重鎖は、１つ以上の重鎖不変領域（ＣＨ）ドメインを含み、それは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４を含む。完全なＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧのアイソタイプは、ＣＨ１、ＣＨ２  ＣＨ３、及びヒンジ領域を含み、その一方でＩｇＥとＩｇＭは、ＣＨ１、ＣＨ２  ＣＨ３、及びＣＨ４を含む。ＣＨ１とＣＬのドメインは、抗体分子のＦａｂアームに伸びて、故に、抗原との相互作用及び抗体アームの回転に起因する。抗体の不変領域は、限定されないが、例えば様々な細胞、生体分子、及び組織との相互作用を通じて抗体が特異的に結合する、抗原、病原微生物、及びトキシンの除去などの、エフェクター機能を供給することができる。
【０３５３】
「抗原結合部位を形成するのに十分な抗体又はその一部」は、抗体又はその一部が、全部で６のＣＤＲを含む対応する完全な抗体の結合特異性の少なくとも一部を保持するのに十分なＶＨ及びＶＬの、少なくとも１又は２、典型的には３、４、５、又は全部で６のＣＤＲ含むことを意味する。一般的に、十分な抗原結合部位は、少なくとも重鎖のＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）を必要とする。それは典型的にはさらに、軽鎖のＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を必要とする。本明細書に記載されるように、当業者は、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａのナンバリングに基づいてＣＤＲを同定することができる（例えば、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２，  及び  Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７を参照）。例えば、Ｋａｂａｔナンバリングに基づき、ＣＤＲ−ＬＩは残基Ｌ２４−Ｌ３４に相当し；ＣＤＲ−Ｌ２は残基Ｌ５０−Ｌ５６に相当し；ＣＤＲ−Ｌ３は残基Ｌ８９−Ｌ９７に相当し；ＣＤＲ−Ｈ１は、長さに依存して残基Ｈ３１−Ｈ３５、３５ａまたは３５ｂに相当し；ＣＤＲ−Ｈ２は残基Ｈ５０−Ｈ６５に相当し；及び、ＣＤＲ−Ｈ３は残基Ｈ９５−Ｈ１０２に相当する。
【０３５４】
「ペプチド模倣体」は、ポリペプチドの活性を模倣するペプチドを指す。例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）ペプチド模倣体は、ＥＰＯ受容体の結合及び活性化のためなど、Ｅｐｏの活性を模倣するペプチドである。
【０３５５】
「アドレス指定する（ａｄｄｒｅｓｓ）」は、集合における場所についての独特な識別子を指し、それによってアドレス指定されたメンバー（例えば抗体）を同定することができる。アドレス指定された部分は、その場所又は位置によって同定することができるものである。アドレス指定は、マイクロプレートのウェルなどの表面上の位置によって達成することができる。例えば、Ｆ９である微小ウェルプレートにおけるタンパク質のアドレス指定は、タンパク質が微小ウェルプレートの列Ｆ、カラム９に位置づけられることを意味する。アドレス指定はまた、バーコード又は他の記号論によりコード化されたタグ、化学的タグ、電子的タグ、そのようなＲＦタグ、色分けされたタグ、又は他のそのような識別子などの、他の識別子によって達成することができる。
【０３５６】
「アレイ」は、３以上のメンバーを含む、抗体などの要素の集合を指す。
【０３５７】
「空間のアレイ」は、メンバーが分離される、又はアレイにおいて異なる空間を占領するアレイを指す。従って、空間のアレイは一種のアドレス可能なアレイである。空間のアレイの例は、プレートの各ウェルがアレイにおけるアドレスである、マイクロタイタープレートを含む。空間のアレイは任意の配列を含み、ここで、複数の異なる分子、例えばポリペプチドが、保持され、提示され、位置付けられ、置かれ、又は支持される。アレイは、４８ウェル、９６ウェル、１４４ウェル、１９２ウェル、２４０ウェル、２８８ウェル、３３６ウェル、３８４ウェル、４３２ウェル、４８０ウェル、５７６ウェル、６７２ウェル、７６８ウェル、８６４ウェル、９６０ウェル、１０５６ウェル、１１５２ウェル、１２４８ウェル、１３４４ウェル、１４４０ウェル、又は１５３６ウェルのプレート、チューブ、スライド、チップ、フラスコ、又は他の適切な研究器具などのマイクロタイタープレートを含み得る。更に、アレイはまた複数のサブアレイを含み得る。複数のサブアレイは、１より多くの配列がポリペプチドの位置を決めるために使用されるアレイを包含する。例えば、多数の９６ウェルプレートは、複数のサブアレイおよび単一のアレイを構成することができる。
【０３５８】
「アドレス指定可能なライブラリ」又は「空間的にアドレス指定されたライブラリ」は、集合の各メンバーがそのアドレス指定によって識別可能である、抗体などの、核酸分子又はタンパク質薬剤などの分子の集合を指す。
【０３５９】
「アドレス指定可能なアレイ」は、アレイのメンバーが、それらのアドレス、マイクロタイタープレートのウェルなどの空間のアレイにおける位置により、又は、固相支持体上で、又は、色、蛍光、電子信号（即ち、対象の分子の相互作用を十分に変更しないＲＦ、マイクロ波、又は他の周波数）、バーコード又は他の記号論、化学的又は他のそのような標識によって識別可能であるものを指す。従って、一般的に、アレイのメンバーは、固相の表面の識別可能な位置に位置づけられ、又は、微粒子又は他の微粒子の支持体（本明細書においてビーズと称される）に結合され、溶液中で懸濁され、又は表面に広がるなど、識別可能な標識に直接又は間接的に結合され、又は他にそれらに関連付けられる。
【０３６０】
「アドレス指定可能な組み合わせの抗体ライブラリ」は、メンバー抗体が識別可能であり、空間のアレイ中又は固形支持体の上の位置などの同じ識別子、又は化学的或いはＲＦタグを有するすべての抗体が、同じ抗原に結合し、且つ一般的にアミノ酸配列においてほぼ同じである、抗体の集合を指す。本明細書における目的のため、「アドレス指定可能な配置された組み合わせの抗体ライブラリ」への言及は、抗体メンバーがアレイにおいてアドレス指定されることを意味する。
【０３６１】
「インシリコ」は、コンピュータを使用して実行される研究及び実験を指す。インシリコの方法は、限定されないが、分子間相互作用などの、分子の構造及び／又はプロセスの、分子モデリング研究、有生分子ドッキング実験、及びバーチャル表示を含む。本明細書における目的のため、ライブラリの抗体メンバーは、コンピュータに入力し、合成のため核酸分子のリストを出力するためそれらをインフレームに加えるものの中から、構成要素Ｖ、Ｄ、及びＪの生殖系列セグメントを選択するコンピュータプログラムを使用して設計され得る。故に、本明細書で提供される集合又はライブラリ中の抗体の構成要素の組み換えは、そうするための規則を含むソフトウェアに合わせて各ビルディングブロックのヌクレオチド配列を組み合わせることにより、インシリコで行なうことができる。プロセスは、コンピュータなしで手動で行なわれるが、コンピュータは速度の利便性を提供する。
【０３６２】
「データベース」は、データ項目の収集を指す。本明細書における目的のため、データベースへの言及は典型的に、抗体遺伝子及び配列についての配列及び構造の情報の収集を提供する、抗体データベースに関するものである。典型的な抗体データベースは、限定されないが、ＩＭＧＴ（登録商標）、ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  を含む（ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ；  例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  ９：２６３−２７５），  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ），  ｔｈｅ  Ｋａｂａｔ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ’ｓ  ＶＢａｓｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  （Ｌｅｆｒａｎｃ  （２００３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３１：３０７−３１０；  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  （２００７），  ｐｐ．  １０４−１０７を参照）。データベースはまた、任意の所望の配列を含むようにユーザーによって作られ得る。データベースは、配列が所望のフォーマット（例えば、特定のリーディングフレームにおいて；停止コドンを欠く；シグナル配列を欠く）において入力されるように作られ得る。データベースはまた、抗体配列に加えて配列を含むように作られ得る。
【０３６３】
「スクリーニング」は、抗体又はその一部の活性又は特性の測定に基づいた、抗体及び／又はその一部の集合又はライブラリからの、抗体又はその一部の同定又は選択を指す。スクリーニングは、例えば、抗体の標的タンパク質への直接的な結合（例えば、結合親和性）を評価するアッセイ、又は、標的タンパク質の活性の調節を評価する機能的アッセイによることを含む、様々な方法の何れかで実行され得る。
【０３６４】
「標的タンパク質に対する活性」は、標的タンパク質の機能的な活性の結合特異性及び／又は調節、又は、標的タンパク質に対する抗体又はその一部の活性を反映する他の測定法（ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）を指す。
【０３６５】
「標的タンパク質」又は「タンパク質標的」は、抗体又はその一部によって明確に認識される候補タンパク質又はペプチドを指し、及び／又は、その活性は、抗体又はその活性により調節される。活性の調節は、標的タンパク質の活性又は発現の増加、減少、刺激、又は予防を含み得る。標的タンパク質は、抗体認識のためのエピトープを含む、任意のペプチド又はタンパク質を含む。標的タンパク質は、発現又は活性により、疾患又は障害の病因に関係するタンパク質を含む。典型的な標的タンパク質が本明細書に記載される。幾つかの実施形態において、標的タンパク質は、膜貫通型タンパク質標的である。膜貫通型タンパク質標的は、限定されないが、ＧＰＣＲ、イオンチャネル、輸送体、及び細胞表面受容体を含み得る。イオンチャネルは、カリウムイオンチャネル、ナトリウムイオンチャネル、カルシウムイオンチャネル、及び電位依存性チャネルでもよい。幾つかの例において、本明細書に開示される抗体は、Ｋｖ１．３イオンチャネル、Ｎａｖ１．７イオンチャネル、又は酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）を調節する。本明細書に開示される抗体は、ＧＬＰ１Ｒ、ＧＣＧＲ、ＥＰＯ受容体、ＦＧＦＲ、ＦＧＦ２１Ｒ、ＣＳＦＲ、ＧＭＣＳＦＲ、及びＧＣＳＦＲなどの細胞表面受容体を調節し得る。付加的な標的タンパク質は、限定されないが、サイトカイン、キナーゼ、インターフェロン、ホルモン、及び成長因子を含む。標的タンパク質は、哺乳動物又は非哺乳動物由来でもよい。標的タンパク質はヒト由来でもよい。代替的に、標的タンパク質はウシ由来である。
【０３６６】
「ヒット（Ｈｉｔ）」は、スクリーニングアッセイにおいて活性を有すると同定され、識別され、又は選択された抗体又はその一部を指す。
【０３６７】
スクリーニングに関して「反復性の」は、「ヒット」が、その活性が反復前と比較して最適化又は改善されると同定されるまで、スクリーニングが、２、３、４、５、又はそれ以上の回数など、複数回繰り返されることを意味する。
【０３６８】
「ハイスループット」は、多くの分子又は化合物、一般的に１０、１００、１０００の化合物の操作を許容する、大規模な方法又はプロセスを指す。例えば、精製とスクリーニングの方法は、ハイスループットで与えられ得る。ハイスループット方法は手動で実行され得る。しかし、一般的に、ハイスループット方法は、自動化、ロボット工学、又はソフトウェアに関係する。
【０３６９】
Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）は、例えば、配列同一性に基づき、タンパク質又はＤＮＡのデータベースを別々に検索するため、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）によって開発された検索アルゴリズムである。例えば、ｂｌａｓｔｎは、ヌクレオチド配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）に対するヌクレオチドクエリー配列を比較するプログラムである。ＢｌａｓｔＰは、タンパク質配列データベースに対するアミノ酸クエリー配列を比較するプログラムである。
【０３７０】
ＢＬＡＳＴビットスコアは、各アラインした配列に関連した隙間の数及び置換から計算された値である。スコアが高いほど、アライメントがより有意となる。
【０３７１】
「ヒトタンパク質」は、全ての対立遺伝子変異体及びその保存的な変異体を含む、ヒトのゲノムに存在する、ＤＮＡなどの核酸分子によってコード化されたタンパク質を指す。修飾がヒトタンパク質の野生型又は顕著な配列に基づく場合、タンパク質の変異体又は修飾は、ヒトタンパク質である。
【０３７２】
「自然発生のアミノ酸」は、ポリペプチドに生じる２０のＬアミノ酸を指す。残基は、ヒトにおけるその同族のｍＲＮＡコドンを有する荷電したｔＲＮＡ分子の特異的認識によってタンパク質に組み込まれる、自然に見出されるそれらの２０のα−アミノ酸である。
【０３７３】
「非自然発生のアミノ酸」は、遺伝学的にコード化されないアミノ酸を指す。例えば、非天然アミノ酸は、天然のアミノ酸に類似する構造を有するが、天然のアミノ酸の構造及び反応性を模倣するように構造上修飾された有機化合物である。非自然発生のアミノ酸は故に、例えば、アミノ酸又は２０の自然発生のアミノ酸のアナログを含み、限定されないが、アミノ酸のＤ−イソステレオマーを含む。典型的な非天然アミノ酸は、当業者に既知である。
【０３７４】
「核酸」は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びそれらの混合物を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらのアナログを含む。核酸は一本鎖又は二本鎖でもよい。蛍光又は放射標識などの検知可能な標識などにより随意に標識付けされる、プローブ又はプライマーを言及する場合、一本鎖の分子が考慮される。そのような分子は典型的に、標的が統計的に独特であるような長さ、又は、ライブラリのプロービング又はプライミングのため、低いコピー数（典型的に５未満、一般的に３未満）である。一般的に、プローブ又はプライマーは、対象の遺伝子に相補的又は同一の配列の少なくとも１４、１６、又は３０の接触するヌクレオチドを含む。プローブとプライマーは、長さが１０、２０、３０、５０、１００、又はそれ以上の核酸でもよい。
【０３７５】
「ペプチド」は、長さが２乃至４０のアミノ酸であるポリペプチドを指す。
【０３７６】
本明細書で提供されるアミノ酸の様々な配列に生じるアミノ酸は、それらの既知の３文字又は１文字の略語に従って同定される（表１）。様々な核酸フラグメントに生じるヌクレオチドは、当該技術分野で慣例的に使用される、標準の１文字の提示と共に明示される。
【０３７７】
「アミノ酸」は、アミノ基とカルボン酸基を含む有機化合物である。ポリペプチドは２つ以上のアミノ酸を含む。本明細書における目的のため、アミノ酸は、２０の自然発生のアミノ酸、非天然アミノ酸、及びアミノ酸アナログ（即ち、α−炭素が側鎖を有するアミノ酸）を含む。
【０３７８】
「アミノ酸残基」は、そのペプチド結合でのポリペプチドの化学的消化（加水分解）後に形成されたアミノ酸を指す。本明細書に記載されるアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体にあると推定される。所望の機能特性がポリペプチドによって保持される限り、そのように明示される「Ｄ」異性体における残基は、任意のＬアミノ酸残基に置換され得る。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２４３：  ３５５２−３５５９  （１９６９）に記載され、及び３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  □§§  １．８２１−１．８２２を適用される標準のポリペプチド命名法と一致して、アミノ酸残基の略語が以下のように示される：
【０３７９】
【表２】
2018140992.tif 000004
【０３８０】
式によって本明細書に表わされる全てのアミノ酸残基配列が、カルボキシル末端に対するアミノ末端の従来の方向において左右の方向付けを有することに注意すべきである。加えて、句「アミノ酸残基」は、一致の表（表１）に記載されるアミノ酸、及び、引用により本明細書に組み込まれる３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  §§  １．８２１−１．８２２に言及されるものなどの修飾した及び珍しいアミノ酸を含むと広く定義される。更に、アミノ酸残基配列の始め又は終わりにあるダッシュは、１つ以上のアミノ酸残基の更なる配列、ＮＨ２などアミノ末端基、又は、ＣＯＯＨなどのカルボキシル末端基へのペプチド結合を示すことに、注意すべきである。任意の保護基、アミノ酸、及び他の化合物の略語は、他に示されない限り、それらの共通の使用に合わせて、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅの略語と認識される（（１９７２）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １１：１７２６を参照）。各自然発生のＬアミノ酸は、標準の３文字表記（又は１文字表記）或いは接頭辞「Ｌ−」を伴う標準の３文字表記（又は１文字表記）によって同定され；接頭辞「Ｄ−」は、アミノ酸の立体異性体がＤであることを示す。
【０３８１】
「免疫複合体」は、限定されないが、細胞毒性薬剤、非抗体ペプチド、又は治療用ポリペプチドを含む、１つ以上の異種の分子に共役される抗体を指す。免疫複合体は非抗体配列を含み得る。非抗体配列は抗体に共役され得る。代替的に、非抗体配列は抗体配列の中にあってもよい。
【０３８２】
「非抗体ペプチド」は、非抗体抗体配列によってコード化されたペプチドを指す。例えば、非抗体ペプチドは、ホルモン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカイン、サイトカイン、又はペプチドトキシンでもよい。
【０３８３】
本明細書で使用されるように、用語「治療用ポリペプチド」、「治療用ペプチド」、及び「治療用免疫グロブリンコンストラクト」は、必要とする被験体の１以上の疾患、障害、又は疾病の処置、予防、又は緩和における、実証された又は可能な使用を有する１以上のペプチド、同様に関連するペプチドを意味する。治療用ペプチドは、本出願後、１以上の疾患、障害、又は疾病の処置、予防、又は緩和における使用を有すると見出されるペプチドを含む。関連するペプチドは、治療用ペプチドの治療活性の幾つか又は全てを保持する、治療用ペプチドのフラグメント、治療用ペプチド変異体、及び治療用ペプチド誘導体を含む。当業者に知られるように、一般原則として、修飾は、ペプチドの特性及び活性を変更、又は部分的に抑止しないペプチドに行われ得る。幾つかの例において、修飾は、治療活性の増加を結果としてもたらす。用語「治療用ポリペプチド」又は「治療用ペプチド」は、本明細書に定義及び／又は開示される治療用ペプチドへの修飾を包含する。特定の実施形態において、治療用ポリペプチドは、ホルモン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカイン、サイトカイン、ペプチドトキシン、及びそれらの組み合わせから選択される。治療用ポリペプチドは、非抗体配列によってコード化されたペプチドでもよい。
【０３８４】
ポリペプチドの誘導体又は変異体は、誘導体又は変異体のアミノ酸配列が本来のペプチドと少なくとも５０％の同一性を有する場合、ペプチドと「同族性」又は「相同である」を共有すると述べられる。特定の実施形態において、誘導体又は変異体は、ペプチド又はアミノ酸残基の誘導体と同じ数を有するペプチドのフラグメントの何れかと同じく、少なくとも７５％である。特定の実施形態において、誘導体又は変異体は、ペプチド又はアミノ酸残基の誘導体と同じ数を有するペプチドのフラグメントの何れかと同じく、少なくとも８５％である。特定の実施形態において、誘導体のアミノ酸配列は、ペプチド又はアミノ酸残基の誘導体と同じ数を有するペプチドのフラグメントのかと同じく、少なくとも９０％である。幾つかの実施形態において、誘導体のアミノ酸配列は、ペプチド又はアミノ酸残基の誘導体と同じ数を有するペプチドのフラグメントのかと同じく、少なくとも９５％である。特定の実施形態において、誘導体又は変異体は、ペプチド又はアミノ酸残基の誘導体と同じ数を有するペプチドのフラグメントの何れかと同じく、少なくとも９９％である。
【０３８５】
本明細書に開示される代替的な要素又は実施形態のグループ分けは、制限として解釈されるものではない。各グループのメンバーは、個々に、或いは、グループの他のメンバー又は本明細書で見出される他の要素との任意の組み合わせと共に、言及され、且つ請求される。グループの１以上のメンバーは、利便性及び／又は特許性の理由のためのグループに含まれ、又はそこから削除され得ることが予想される。任意のそのような包含又は欠失が生じる場合、本明細書は、修飾されるようなグループを含むと認められ、故に、添付の請求項に使用されるすべてのマーカッシュグループの記載を満たす。
【０３８６】
特定の実施形態が本明細書に記載され、典型的な実施形態を実行するために発明者に知られる最良の様式を含む。もちろん、これら記載の実施形態に関する変形は、前述の記載を読んだ後、当業者に明らかとなろう。発明者は、当業者がそのような変形を適切なものとして利用することを予測し、本明細書に具体的に記載されるよりも他に実行される実施形態を意図する。従って、本開示は、準拠法によって許容されるように、本明細書に添付される請求項に詳述された内容の全ての変更及び等価物を含む。さらに、他に示されない又は内容により明確に否定されない限り、全ての可能な変形における上記の要素の任意の組み合わせは、本開示によって包含される。
【０３８７】
更に、多数の言及が特許及び刊行物に行われてきた。上記の引用された参照の各々は、その全体において引用によって個別に本明細書に組み込まれる。
【０３８８】
本明細書に開示される特異的な実施形態は、言語を使用する、言語から成る、又は言語から本質的に成る請求項にさらに限定される。請求項において使用される時、出願された通り又は補正を加えた通りの何れかで、推移の用語「から成る」は、請求項にて具体化されない任意の要素、工程、又は成分を排除する。推移の用語「から本質的に成る」は、明確化した物質又は工程、及び基礎の及び新規な特徴に実質的に影響しないものに対して請求項の範囲を限定する。そうして請求された例示的な実施形態は本質的に又は明らかに記載され、本明細書にて可能となる。
【０３８９】
終わりに、本明細書に開示される例示的な実施形態が、本開示の原則の例証であることを理解されたい。利用され得る他の修正は、本開示の範囲内にある。故に、一例として、限定されないが、本例示的な実施形態の代替的な構成は、本明細書の教示に従って利用され得る。従って、本例示的な実施形態は、前に示され且つ記載されるものに限定されない。
【０３９０】
一般的な方法
本開示は、組み換え遺伝学の分野におけるルーチン手技に依存する。本開示における使用の一般的な方法を開示する基礎的なテキストは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｄ  ｅｄ．  （２００１）；  Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９９０）；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９４）を含む。
【０３９１】
核酸について、大きさは、キロベース（ｋｂ）又はベースペア（ｂｐ）のいずれかで与えられる。これらは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、シーケンス解析した核酸、又は公表されたＤＮＡ配列に由来した推定である。タンパク質について、大きさは、キロ−ダルトン（ｋＤ）又はアミノ酸残基数で与えられる。タンパク質の大きさは、ゲル電気泳動、シーケンス解析したタンパク質、由来するアミノ酸配列、又は公表されたタンパク質配列から推定される。
【０３９２】
市販で入手可能でないオリゴヌクレオチドは、「Ｖａｎ  Ｄｅｖａｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２：６１５９−６１６８  （１９８４）」に記載されるように、自動シンセサイザーを使用して、「Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２２：１８５９−１８６２  （１９８１）」に記載される固相ホスホラミダイトトリエステル法によって化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、未変性のポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は、「Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｒｅａｎｉｅｒ，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍ．，  ２５５：１３７−１４９  （１９８３）」に記載されるような陰イオン交換クロマトグラフィーの何れかによる。クローン化遺伝子及び合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、「Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  １６：２１−２６  （１９８１）」の二本鎖テンプレートを配列するための連鎖終止反応法を使用したクローン化の後に確認することができる。
【０３９３】
本開示の組み換えポリペプチドをコード化する核酸は、複製及び／又は発現のため原核細胞又は真核細胞への形質転換の前に、中介のベクターにクローン化され得る。中介のベクターは、プラスミド又はシャトルベクターなどの原核生物ベクターでもよい。
【０３９４】
超長ＣＤＲ３配列を有する抗体
現在まで、畜牛は、超長ＣＤＲ３配列が同定された唯一の種である。しかし、他の種、例えば他の反芻動物はまた、超長ＣＤＲ３配列と共に抗体を持つこともある。
【０３９５】
畜牛において同定された超長ＣＤＲ３配列を含む典型的な抗体可変領域配列は、次のように指定されたものを含む：ＢＬＶ１Ｈ１２（配列番号２２を参照）、ＢＬＶ５Ｂ８（配列番号２３を参照）、ＢＬＶ５Ｄ３（配列番号２４を参照）、及びＢＬＶ８Ｃ１１（配列番号２５を参照）（例えば、Ｓａｉｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９：  ２４２０−２４２６；  ａｎｄ  Ｓａｉｎｉ  ａｎｄ  Ｋａｕｓｈｉｋ  （２００２）  Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５５：  １４０−１４８を参照）；ＢＦ４Ｅ９（配列番号２６を参照）及びＢＦ１Ｈ１（配列番号２７を参照）（例えば、Ｓａｉｎｉ  ａｎｄ  Ｋａｕｓｈｉｋ  （２００２）  Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５５：  １４０−１４８を参照）；及び、Ｆ１８（配列番号２８を参照）（例えば、Ｂｅｒｅｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９：  １８９−１９９を参照）。
【０３９６】
実施形態において、ウシ抗体が同定される及び／又は生成される。多数の技術が、抗体を同定及び／又は生成するために存在する。
【０３９７】
本開示の抗体は、所望の活性を伴う抗体のための組み合わせのライブラリの、ハイスループットスクリーニングを含むスクリーニングによって分離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、且つ所望の結合特性を持つ抗体のためそのようなライブラリをスクリーニングするための様々な方法が、当該技術分野で既知である。そのような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７  （Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．，  ２００１）においてレビューされ、且つ、例えば、ｔｈｅ  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４；  Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：  ６２４−６２８  （１９９１）；  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：  ５８１−５９７  （１９９２）；  Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５  （Ｌｏ，  ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．，  ２００３）；  Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３８（２）：  ２９９−３１０  （２００４）；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３４０（５）：  １０７３−１０９３  （２００４）；  Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１（３４）：  １２４６７−１２４７２  （２００４）；及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：  １１９−１３２  （２００４）に更に記載される。ヒットが得られるまで、そのようなスクリーニングは反復され得る。
【０３９８】
特定のファージディスプレイ方法において、ＶＨとＶＬの遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローン化され、「Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２：  ４３３−４５５  （１９９４）」に記載されるように抗原結合ファージのためその後にスクリーニングされ得るファージライブラリにおいて無作為に再結合される。ファージは典型的に、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント又は抗原結合性フラグメントの何れかとして、抗体フラグメントを提示する。免疫化したソースのライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なく免疫原に高親和性抗体を提供する。ウシ抗体のファージディスプレイライブラリは、超長ＣＤＲ３配列を含むウシ抗体遺伝子配列のソースでもよい。
【０３９９】
典型的に、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を減らすためにヒト化され、その間に親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持する。一般的に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲがヒト抗体配列に由来する、１つ以上の可変性ドメインを含む。ヒト化抗体はまた随意に、ヒト不変領域の少なくとも一部を含む。幾つかの実施形態において、ヒト化抗体における幾つかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復する或いは改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）の対応する残基により置換される。
【０４００】
ヒト化抗体及びそれらを作る方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，  Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １３：１６１９−１６３３  （２００８）において評価され、且つ、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９  （１９８８）；  Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３  （１９８９）；  米国特許第５，８２１，３３７号，  第７，５２７，７９１号，  第６，９８２，３２１号，  及び第７，０８７，４０９号；  Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４  （２００５）  （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植について記載する）；  Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２８：４８９−４９８  （１９９１）  （“再表面加工”を記載する）；  Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０  （２００５）  （“ＦＲ再組み換え”を記載する）；及びＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８  （２００５）；  Ｋｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ８３：２５２−２６０  （２０００）  （ＦＲシャフリングのための“誘導された選択”手法を記載する）；及びＳｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第５，７６６，８８６号に更に記載される。
【０４０１】
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが：「最良適合」方法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１：２２９６  （１９９３）を参照）；軽鎖又は重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト化抗体の共通配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：４２８５  （１９９２）；  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５１：２６２３  （１９９３）を参照）；ヒト成熟化（身体的に突然変異した）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，  Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １３：１６１９−１６３３  （２００８）を参照））；及び、ＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：１０６７８−１０６８４  （１９９７）及びＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：２２６１１−２２６１８  （１９９６）を参照）を含む。
【０４０２】
超長ＣＤＲ３配列を有する抗体はまた、ＣＤＲ３領域への、サイトカイン、治療用ポリペプチド、又は成長因子などの非抗体配列を含み得る。結果として生じる抗体は、疾患又は疾病の処置又は予防に効果的となり得る。例えば、超長ＣＤＲ３を含む抗体は腫瘍転移を阻害する。幾つかの実施形態において、サイトカイン、治療用ポリペプチド、又は成長因子は、少なくとも１つの細胞集団に対する抗増殖性効果を持つと示され得る。代替的に又は付加的に、結果として生じる抗体は、標的（例えば、タンパク質標的、膜貫通型タンパク質標的）の発現又は活性を調節する。例えば、超長ＣＤＲ３を含む抗体は、イオンチャネルを阻害又は遮断する。非抗体配列は、ホルモン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカイン、サイトカイン、ペプチドトキシン、及びそれらの組み合わせでもよい。そのようなサイトカイン、治療用ポリペプチド、トキシン、リンホカイン、成長因子、又は他の造血因子は、果粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、λ−インターフェロン）、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、トロンボポイエチン、幹細胞因子、及びエリスロポイエチン（ＥＰＯ）を含む。本開示の抗体及び／又は医薬組成物に使用される付加的な成長因子は：アンジオジェニン、骨形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質−２、骨形態形成タンパク質−３、骨形態形成タンパク質−４、骨形態形成タンパク質−５、骨形態形成タンパク質−６、骨形態形成タンパク質−７、骨形態形成タンパク質−８、骨形態形成タンパク質−９、骨形態形成タンパク質−１０、骨形態形成タンパク質−１１、骨形態形成タンパク質−１２、骨形態形成タンパク質−１３、骨形態形成タンパク質−１４、骨形態形成タンパク質−１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、脳由来の神経栄養因子、繊毛のニュートロフィックファクター、繊毛のニュートロフィックファクター受容体、サイトカイン誘導の好中球走化因子１、サイトカイン誘導の好中球、走化性因子２、サイトカイン誘導の好中球走化因子２、内皮細胞成長因子、エンドセリン１、表皮成長因子、上皮の由来の好中球誘引物質、線維芽細胞成長因子４、線維芽細胞成長因子５、線維芽細胞成長因子６、線維芽細胞成長因子７、線維芽細胞成長因子８、線維芽細胞成長因子８ｂ、線維芽細胞成長因子８ｃ、線維芽細胞成長因子９、線維芽細胞成長因子１０  線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）、線維芽細胞成長因子酸性、線維芽細胞成長因子塩基性、グリア細胞株由来のニュートロフィックファクター受容体−１、グリア細胞株由来のニュートロフィックファクター受容体−２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質−１、増殖関連タンパク質−２、増殖関連タンパク質−３、ヘパリン結合表皮成長因子、肝���胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ケラチノサイト成長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体−１、神経成長因子神経成長因子受容体、ニュートロフィン−３、ニュートロフィン−４、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来の成長因子、血小板由来の成長因子Ａ鎖、血小板由来の成長因子ＡＡ、血小板由来の成長因子ＡＢ、血小板由来の成長因子Ｂ鎖、血小板由来の成長因子ＢＢ、血小板由来の成長因子受容体−１、血小板由来の成長因子受容体−２、前Ｂ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子受容体、形質転換増殖因子−１、形質転換増殖因子−２、形質転換増殖因子−１、形質転換増殖因子−１．２、形質転換増殖因子−２、形質転換増殖因子−３、形質転換増殖因子−Ｓ、潜在性の形質転換増殖因子−１、形質転換増殖因子−１結合タンパク質Ｉ、形質転換増殖因子−１結合タンパク質ＩＩ、形質転換増殖因子−１結合タンパク質ＩＩＩ、Ｉ型腫瘍壊死因子受容体、ＩＩ型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体、血管内皮成長因子、及び、キメラタンパク質並びにその生物学的又は免疫学的に活性なフラグメントを含む。幾つかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、哺乳動物Ｇ−ＣＳＦ、成長ホルモン、レプチン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、λ−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１０、ｍｏｋａ１（例えば、Ｍｏｋａ、ｍｏｋａｔｏｘｉｎ−１）、又はＶＭ−２４である。幾つかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、エキセンジン−４（Ｅｘ−４）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２１）、ＩＬ８、ジコノチド、ソマトスタチン、クロロトキシン、ＳＤＦ１（アルファ）、ＩＬ２１、又はそれらの誘導体又は変異体である。Ｇ−ＣＳＦはウシＧ−ＣＳＦでもよい。Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＦＧＦ２１、β−インターフェロン、及びＧＬＰ−１は、ヒト由来でもよい。
【０４０３】
非抗体配列は、配列番号３１７−３３２の何れかに基づく又はそれに由来する、アミノ酸配列を含み得る。非抗体配列は、配列番号３１７−３３２の何れかに、５０％、６０％、７０％  ８０％、９０％、９５％、９７％、９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
非抗体配列は、配列番号３１７−３３２の、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上のアミノ酸残基を含む、アミノ酸配列を含み得る。アミノ酸残基は連続していてもよい。代替的に、アミノ酸残基は連続しない。非抗体配列は、配列番号３１７−３３２の何れかの少なくとも一部を含み得る。
【０４０４】
本明細書に開示される抗体は、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生動物、魚、昆虫、バグ、又はクモ形類動物の配列に基づく又は由来する１以上の配列を含み得る。哺乳動物は、限定されないが、雌牛、野牛、水牛、ヒト、マウス、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、又はウサギを含む。鳥類は、限定されないが、ニワトリ、ガチョウ、ハト、ワシ、スズメ、及びピジョンを含むが、これらに限定されない。は虫類は、トカゲ、アリゲイター、ヘビ、及びカメを含むが、これらに限定されない。両生類は、カエル、サンショウウオ、ヒキガエル、及びイモリを含むが、これらに限定されない。魚は、マグロ、サケ、クジラ、及びサメを含むが、これらに限定されない。昆虫、バグ、及びクモ形類動物は、ハエ、蚊、クモ、及びサソリを含むが、これらに限定されない。非抗体配列は、ウシ又はヒトの配列に基づく又は由来し得る。代替的に、非抗体配列は、トカゲ、カタツムリ、ヘビ、又はサソリの配列に基づく又は由来する。トカゲはアメリカドクトカゲでもよい。カタツムリはコーンスネールでもよい。
【０４０５】
幾つかの実施形態において、非抗体配列は、超長ＣＤＲ３配列の末端に結合される。例えば、非抗体配列は、超長ＣＤＲ３ヌクレオチド配列の５’末端又は３’末端に結合することができる。別の例において、非抗体配列は、超長ＣＤＲ３ペプチド配列のＮ末端又はＣ末端に結合することができる。
【０４０６】
別の実施形態において、非抗体配列は、超長ＣＤＲ３配列内に挿入される。例えば、非抗体配列は、超長ＣＤＲ３配列のストークドメインの間に挿入される。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３配列のストークドメイン内に挿入され得る。別の例において、非抗体配列は、超長ＣＤＲ３配列のストークドメインとノブドメインの間に挿入される。代替的に、非抗体配列は、超長ＣＤＲ３配列のノブドメイン内に挿入される。
【０４０７】
幾つかの実施形態において、非抗体配列は、超長ＣＤＲ３配列の少なくとも一部を置換する。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３ペプチド配列の、約１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、又は５５以上のアミノ酸を置換することができる。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３ペプチド配列の、約１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上を置換することができる。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部を置換することができる。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３ペプチド配列のノブドメインの、約５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上のアミノ酸を置換することができる。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３ペプチド配列のノブドメインの、約１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上を置換することができる。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３のストークドメインの少なくとも一部を置換することができる。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３ペプチド配列のストークドメインの、約１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、又は２０以上のアミノ酸を置換することができる。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３ペプチド配列のストークドメインの、約１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上を置換することができる。アミノ酸は連続するアミノ酸でもよい。代替的に、アミノ酸は連続しないアミノ酸である。超長ＣＤＲ３は、１つ以上の保存モチーフを含み得る。保存モチーフは、本明細書に開示されるようなストークドメイン保存モチーフでもよい。代替的に、保存モチーフは、本明細書に開示されるようなノブドメイン保存モチーフでもよい。
【０４０８】
幾つかの実施形態において、非抗体配列は、超長ＣＤＲ３配列の少なくとも一部を置換する。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３のヌクレオチド配列の、約５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、４０以上、５０以上、５５以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、１１０以上、１２０以上、１３０以上、１４０以上、１５０以上、１６０以上、又は１７０以上のヌクレオチドを置換することができる。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３ヌクレオチド配列の、約１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上を置換することができる。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部を置換することができる。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３のヌクレオチド配列のノブドメインの、約５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、４０以上、５０以上、５５以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、１１０以上、１２０以上、１３０以上、１４０以上のヌクレオチドを置換することができる。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３ヌクレオチド配列のノブドメインの、約１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上を置換することができる。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３のストークドメインの少なくとも一部を置換することができる。非抗体配列は、超長ＣＤＲヌクレオチド配列のストークドメインの、約５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上のヌクレオチドを置換することができる。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３ヌクレオチド配列のストークドメインの、約１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上を置換することができる。ヌクレオチドは、連続するヌクレオチドでもよい。代替的に、ヌクレオチドは、連続しないヌクレオチドである。超長ＣＤＲ３は、１つ以上の保存モチーフを含み得る。保存モチーフは、本明細書に開示されるようなストークドメイン保存モチーフでもよい。代替的に、保存モチーフは、本明細書に開示されるようなノブドメイン保存モチーフでもよい。
【０４０９】
超長ＣＤＲ３配列及び非抗体配列を含む抗体はさらに、超長ＣＤＲ３配列と非抗体配列の間の１つ以上の切断部位を含み得る。１以上の切断部位は、非抗体ペプチド配列のＮ末端の前にあってもよい。例えば、切断部位は、非抗体ペプチド配列のＮ末端、及び超長ＣＤＲ３ペプチド配列のＣ末端に挿入される。代替的に、１以上の切断部位は、非抗体ペプチド配列のＣ末端の後ろにある。例えば、切断部位は、非抗体ペプチド配列のＣ末端、及び超長ＣＤＲ３ペプチド配列のＮ末端に挿入される。１以上の切断部位は、非抗体ペプチド配列のＮ末端及びＣ末端の両端部に位置し得る（ｆｌａｎｋ）。１以上の切断部位は、非抗体ヌクレオチド配列の上流にあってもよい。例えば、１以上の切断部位は、非抗体ヌクレオチド配列の５’末端、及び超長ＣＤＲ３ヌクレオチド配列の３’末端にあってもよい。１以上の切断部位は、非抗体ヌクレオチド配列の下流にあってもよい。例えば、１以上の切断部位は、非抗体ヌクレオチド配列の３’末端、及び超長ＣＤＲ３ヌクレオチド配列の５’末端にあってもよい。１以上の切断部位は、非抗体ヌクレオチド配列の５’末端及び３’末端の両端部に位置し得る。１以上の切断部位は直接、非抗体配列の端部に位置し得る。例えば、切断部位配列と非抗体配列の間にゼロヌクレオチド又はアミノ酸が存在する。代替的に、１以上の切断部位は間接的に、非抗体配列の端部に位置し得る。例えば、切断部位ヌクレオチド配列と非抗体ヌクレオチド配列の間に１つ以上のヌクレオチドが存在する。切断部位ヌクレオチド配列と非抗体ヌクレオチド配列の間に、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１２以上、１５以上、２０以上のヌクレオチドが存在し得る。別の例において、切断部位ペプチド配列と非抗体ペプチド配列の間に１つ以上のアミノ酸が存在する。切断部位ペプチド配列と非抗体ペプチド配列の間に、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１２以上、１５以上、２０以上のアミノ酸が存在し得る。切断部位は、超長ＣＤＲ３配列、リンカー配列、非抗体配列、非ウシ配列、又はそれらの組み合わせに基づく又は由来する配列に隣接し得る。切断部位は、超長ＣＤＲ３配列に基づく又は由来する配列とリンカー配列の間に存在し得る。切断部位は、超長ＣＤＲ３配列に基づく又は由来する配列と非抗体配列の間に存在し得る。開裂部位は、リンカー配列と非抗体配列の間に存在し得る。切断部位はプロテアーゼのためのものでよい。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼ、又はメタロプロテアーゼでもよい。プロテアーゼは、限定されないが、因子Ｘａプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、スブチリシン様プロテアーゼ、アクチニジン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カテプシン、Ｍｉｒ１−ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、キモシン、レニン、カテプシンＤ、ペプシン、プラスメプシン、ネペンセシン、メタロエキソペプチダーゼ、及びメタロエンドペプチダーゼを含み得る。切断部位は因子Ｘａ又はトロンビンでもよい。例えば、切断部位はＩＥＧＲのアミノ酸配列（配列番号５１０）を含み得る。代替的に、切断部位はヌクレアーゼのためのものである。超長ＣＤＲ３配列及び非抗体配列を含む抗体は、１以上のプロテアーゼによって切断され得る。１以上のプロテアーゼによる抗体の切断は、抗体の超長ＣＤＲ３領域から非抗体ペプチドの１以上の末端の放出を結果としてもたらすことができる。例えば、抗体の切断は、超長ＣＤＲ３領域から非抗体ペプチドのＮ末端の放出を結果としてもたらす。代替的に、抗体の切断は、超長ＣＤＲ３領域から非抗体ペプチドのＣ末端の放出を結果としてもたらす。
【０４１０】
非抗体配列は、１以上のリンカーを介して超長ＣＤＲ３配列に結合され得る。非抗体配列は、超長ＣＤＲ３配列と共に挿入され得る。幾つかの例において、２以上のリンカーは、非抗体配列を超長ＣＤＲ３配列に結合するために使用される。２以上のリンカーは同じ配列を含み得る。代替的に、２以上のリンカーは異なる配列を含む。１以上のリンカー配列は同じ長さでもよい。１以上のリンカー配列は異なる長さでもよい。１以上のリンカー配列は、長さが３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、又は１０以上のアミノ酸でもよい。１以上のリンカー配列は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、又は１０以上のグリシン残基を含み得る。１以上のリンカー配列は、２以上、３以上、４以上、又は５以上の連続するグリシン残基を含み得る。第１及び／又は第のリンカー配列は１以上のセリン残基を含み得る。１以上のリンカー配列は、１以上、２以上、３以上、４以上、又は５以上の連続する極性アミノ酸を含み得る。極性アミノ酸残基は、セリン、トレオニン、アスパラギン、又はグルタミンから選択され得る。極性アミノ酸残基は、非荷電の側鎖を含み得る。リンカーは、非抗体ペプチド配列のＮ末端、Ｃ末端、又はＮ末端及びＣ末端の両方に付けられ得る。リンカーは、非抗体ヌクレオチド配列の５’末端、３’末端、又は５’末端及び３’末端の両方に付けられ得る。幾つかの実施形態において、リンカーはアミノ酸残基を含み得る。典型的なアミノ酸リンカー構成要素は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、又はペンタペプチドを含む。典型的なジペプチドは：バリン−シトルリン（ｖｃ又はｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆ又はａｌａ−ｐｈｅ）を含む。典型的なトリペプチドは：グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）及びグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）を含む。代替的に、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎのアミノ酸配列（配列番号４９９）を含み、ここで、ｎ＝１乃至５である。リンカーは、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３７）又はＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３８）のアミノ酸配列を含み得る。アミノ酸リンカー構成要素を含むアミノ酸残基は、シトルリンなどの、アナログを含む小さなアミノ酸及び非自然発生のアミノ酸と同様に、自然に生じるものを含む。アミノ酸リンカー構成要素は、特定の酵素、例えば、腫瘍関連のプロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ、及びＤ、又はプラスミンプロテアーゼにより、酵素切断に関する選択性において設計及び最適化され得る。
【０４１１】
超長ＣＤＲ３は、単一の超長ＣＤＲ３配列に基づく又は由来し得る。代替的に、超長ＣＤＲ３は、２以上の超長ＣＤＲ３配列に基づく又は由来する。２以上の超長ＣＤＲ３配列は、同じ動物由来でもよい。代替的に、２以上の超長ＣＤＲ３配列は、２以上の異なる動物由来である。
【０４１２】
超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のストークドメインの少なくとも一部を含み得る。本明細書に開示される抗体は、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、又は１０以上のアミノ酸を含み得る。本明細書に開示される抗体は、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく、２０以下、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下のアミノ酸を含み得る。アミノ酸は連続するアミノ酸でもよい。代替的に、アミノ酸は連続しないアミノ酸である。本明細書に開示される抗体は、超長ＣＤＲ３のストークドメインの配列に５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、又は１００％相同する配列を含み得る。超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく、１以上の保存モチーフを含み得る。本明細書に開示される抗体は、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく、１以上、２以上、３以上、４以上、又は５以上の保存モチーフを含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６の何れか１つから選択される配列を含み得る。本明細書に開示される抗体は、配列番号１５７−２２４及び２３５−２９５の何れか１つから選択される配列に５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、又は１００％以上相同する配列を含み得る。本明細書に開示される抗体は、配列番号２２５−２２７の何れか１つから選択される配列に５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、又は１００％以上相同する配列を含み得る。
【０４１３】
超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、ＣＴ（Ｔ／Ｓ）ＶＨＱモチーフ（配列番号５０２）を含み得る。代替的に、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、ＣＴ（Ｔ／Ｓ）ＶＨＱＸｎモチーフ（配列番号５０３）を含む。幾つかの例においては、ｎは、１〜８の間、１〜７の間、１〜６の間、１〜５の間、１〜４の間、又は１〜３の間である。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、ＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｑのモチーフ（配列番号２２８）を含み得る。Ｘ１は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＧの残基でもよい。Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｐ、又はＩの残基でもよい。Ｘ３は、Ｖ又はＫの残基でもよい。Ｘ４は、Ｈ、Ｋ、又はＹの残基でもよい。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、Ｘ１Ｘ２ＶＨＱモチーフ（配列番号２２９）を含み得る。Ｘ１は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＧの残基でもよい。Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｐ、又はＩの残基でもよい。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、ＣＸ１Ｘ２ＶＨＱモチーフ（配列番号２３０）を含み得る。Ｘ１は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＧの残基でもよい。Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｐ、又はＩの残基でもよい。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、Ｘ１Ｘ２ＶＸ３Ｑモチーフ（配列番号２３１）を含み得る。Ｘ１は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＧの残基でもよい。Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｐ、又はＩの残基でもよい。Ｘ３は、Ｈ、Ｙ、又はＫの残基でもよい。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、ＣＸ１Ｘ２ＶＸ３Ｑモチーフ（配列番号２３２）を含み得る。Ｘ１は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＧの残基でもよい。Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｐ、又はＩの残基でもよい。Ｘ３は、Ｈ、Ｙ、又はＫの残基でもよい。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、Ｘ１Ｘ２ＫＫＱモチーフ（配列番号２３３）を含み得る。Ｘ１は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＧの残基でもよい。Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｐ、又はＩの残基でもよい。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、ＣＸ１Ｘ２ＫＫＱモチーフ（配列番号２３４）を含み得る。Ｘ１は、Ｔ、Ｓ、Ａ、又はＧの残基でもよい。Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｐ、又はＩの残基でもよい。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、ＹＸ１ＹＸ２モチーフ（配列番号２９６）を含み得る。Ｘ１は、Ｔ、Ｓ、Ｎ、又はＩの残基でもよい。Ｘ２は、Ｅ又はＤの残基でもよい。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、ＹＸ１ＹＸ２Ｙモチーフ（配列番号２９７）を含み得る。Ｘ１は、Ｌ、Ｓ、Ｔ、又はＲの残基でもよい。Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ｎ、又はＩの残基でもよい。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、ＹＸ１ＹＸ２ＹＸ３モチーフ（配列番号２９８）を含み得る。Ｘ１は、Ｌ、Ｓ、Ｔ、又はＲの残基でもよい。Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ｎ、又はＩの残基でもよい。Ｘ３は、Ｅ又はＤの残基でもよい。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、ＹＸ１ＹＸ２ＹＸ３Ｘ４モチーフ（配列番号２９９）を含み得る。Ｘ１は、Ｌ、Ｓ、Ｔ、又はＲの残基でもよい。Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ｎ、又はＩの残基でもよい。Ｘ３は、Ｅ又はＤの残基でもよい。Ｘ４は、Ｈ、Ｗ、Ｎ、Ｆ、Ｉ、又はＹの残基でもよい。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、Ｙ（Ｅ／Ｄ）Ｘモチーフ（配列番号５０４）を含み得る。Ｘは、Ｈ、Ｗ、Ｎ、Ｆ、Ｉ、又はＹの残基でもよい。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、ＸＹ（Ｅ／Ｄ）モチーフ（配列番号５０５）を含み得る。Ｘは、Ｔ、Ｓ、Ｎ、又はＩの残基でもよい。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、Ｙ（Ｅ／Ｄ）Ｘ１ＸｎＷモチーフ（配列番号４９８）を含み得る。Ｘ１は、Ｈ、Ｗ、Ｎ、Ｆ、Ｉ、又はＹの残基でもよい。幾つかの例において、ｎは、１〜４の間、１〜３の間、又は１〜２の間である。超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、Ｙ（Ｅ／Ｄ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｗモチーフ（配列番号５０６）を含み得る。Ｘ１は、Ｈ、Ｗ、Ｎ、Ｆ、Ｉ、又はＹの残基でもよい。Ｘ２は、Ｙ、Ｈ、Ｇ、又はｎの残基でもよい。Ｘ３は、Ｖ、Ｉ、又はＡの残基でもよい。Ｘ４は、Ｄ、Ｎ、Ｔ、又はＥの残基でもよい。Ｘ５は、Ａ、Ｓ、Ｖ、又はＴの残基でもよい。
【０４１４】
本明細書に開示される抗体は、配列番号１５７−２３４の何れかから選択される超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく第１保存モチーフ、及び、配列番号２３５−３０７及び配列番号３３３−３３６の何れかから選択される超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく第２保存モチーフを含み得る。本明細書に開示される抗体は、ＣＴ（Ｔ／Ｓ）ＶＨＱＸｎ（配列番号５０３）、ＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｑ（配列番号２２８）、Ｘ１Ｘ２ＶＨＱ（配列番号２２９）、ＣＸ１Ｘ２ＶＨＱ（配列番号２３０）、Ｘ１Ｘ２ＶＸ３Ｑ（配列番号２３１）、ＣＸ１Ｘ２ＶＸ３Ｑ（配列番号２３２）、Ｘ１Ｘ２ＫＫＱ（配列番号２３３）、及びＣＸ１Ｘ２ＫＫＱ（配列番号２３４）を含むグループから選択される、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく第１保存モチーフ、及び、ＹＸ１ＹＸ２（配列番号２９６）、ＹＸ１ＹＸ２Ｙ（配列番号２９７）、ＹＸ１ＹＸ２ＹＸ３（配列番号２９８）、ＹＸ１ＹＸ２ＹＸ３Ｘ４（配列番号２９９）、Ｙ（Ｅ／Ｄ）Ｘ（配列番号５０４）、ＸＹ（Ｅ／Ｄ）（配列番号５０５）、Ｙ（Ｅ／Ｄ）Ｘ１ＸｎＷ（配列番号４９８）、及びＹ（Ｅ／Ｄ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｗ（配列番号５０６）を含むグループから選択される、超長ＣＤＲ３のストークドメインに由来する又は基づく第２保存モチーフを含み得る。
【０４１５】
超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部を含み得る。本明細書に開示される抗体は、超長ＣＤＲ３のノブドメインに由来する又は基づく、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、又は１０以上のアミノ酸を含み得る。本明細書に開示される抗体は、超長ＣＤＲ３のノブドメインに由来する又は基づく、２０以下、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下のアミノ酸を含み得る。アミノ酸は連続するアミノ酸でもよい。代替的に、アミノ酸は連続しないアミノ酸である。本明細書に開示される抗体は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの配列に５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、又は１００％相同する配列を含み得る。超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のノブドメインに由来する又は基づく、１以上の保存モチーフを含み得る。本明細書に開示される抗体は、超長ＣＤＲ３のノブドメインに由来する又は基づく、１以上、２以上、３以上、４以上、又は５以上の保存モチーフを含み得る。ノブドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、本明細書に開示されるようなシステインモチーフを含み得る。代替的に又は付加的に、ノブドメインに由来する又は基づく１以上の保存モチーフは、Ｃ（Ｐ／Ｓ）ＤＧモチーフ（配列番号５０７）を含む。
【０４１６】
本明細書に開示される抗体は、哺乳動物に基づく又は由来する配列を含み得る。哺乳動物はウシでもよい。代替的に、哺乳動物はヒトなどの非ウシ哺乳動物である。抗体配列は、長さが３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、１１０以上、１２０以上、１３０以上、１４０以上、１５０以上、１６０以上、１７０以上、１８０以上１９０以上、２００以上、２２０以上、２３０以上、２６０以上、２７０以上、２８０以上、２９０以上、又は３００以上のアミノ酸でもよい。アミノ酸は連続するアミノ酸でもよい。代替的に、アミノ酸は連続しないアミノ酸である。
【０４１７】
抗体配列は、長さが３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、１１０以上、１２０以上、１３０以上、１４０以上、１５０以上、１６０以上、１７０以上、１８０以上１９０以上、２００以上、２２０以上、２３０以上、２４０以上、２５０以上、２６０以上、２７０以上、２８０以上、２９０以上、又は３００以上のアミノ酸を含む、ウシ抗体配列を含み得る。ウシ抗体は、ＢＬＶＨ１２、ＢＬＶ５Ｂ８、ＢＬＶＣＶ１、ＢＬＶ５Ｄ３、ＢＬＶ８Ｃ１１、ＢＦ１Ｈ１、又はＦ１８抗体でもよい。抗体配列は、長さが３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、１１０以上、１２０以上、１３０以上、１４０以上、１５０以上、１６０以上、１７０以上、１８０以上、１９０以上、２００以上、２２０以上、２３０以上、２４０以上、２５０以上、２６０以上、２７０以上、２８０以上、２９０以上、又は３００以上のアミノ酸を含む、ヒト抗体配列を含み得る。アミノ酸は連続するアミノ酸でもよい。代替的に、アミノ酸は連続しないアミノ酸である。
【０４１８】
超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に基づく又は由来する抗体配列は、長さが２０以下、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、又は５以下のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に基づく又は由来する抗体配列は、長さが３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、又は１５以上のアミノ酸でもよい。アミノ酸は連続するアミノ酸でもよい。代替的に、アミノ酸は連続しないアミノ酸である。
【０４１９】
超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に基づく又は由来する抗体配列は、それが基づく又は由来する超長ＣＤＲ３のヌクレオチド配列において、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、又は１００以上の核酸の修飾又は変更を含み得る。修飾及び／又は変更は、置換、欠失、及び／又は挿入を含み得る。置換は、１つの核酸を別の核酸に置換する工程を含み得る。核酸は、天然の核酸又は非天然の核酸でもよい。
【０４２０】
超長ＣＤＲ３の少なくとも一部に基づく又は由来する抗体配列は、それが基づく又は由来する超長ＣＤＲ３のペプチド配列において、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、５０以上、又は６０以上のアミノ酸の修飾又は変更を含み得る。修飾及び／又は変更は、置換、欠失、及び／又は挿入を含み得る。置換は、１つのアミノ酸を別のアミノ酸に置換する工程を含み得る。アミノ酸は、それが置換されるアミノ酸に類似する１以上の特徴を含み打つ。特徴は、限定されないが、大きさ、極性、疎水性、酸性度、側鎖、及び結合形成を含み得る。アミノ酸は、天然のアミノ酸又は非天然のアミノ酸でもよい。
【０４２１】
特定の実施形態において、本明細書に記載される抗体の半減期は、抗体に組み込まれる、共役されない治療用ペプチド又は共役されない非抗体ペプチドの半減期よりも大きい。幾つかの実施形態において、本明細書に提供される抗体の半減期は、被験体に投与された時、４時間より長い。特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体の半減期は、被験体に投与された時、４時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日よりも長い。幾つかの例において、被験体は哺乳動物である。幾つかの実施形態において、被験体はマウス又はウシである。他の例において、被験体はヒトである。特定の実施形態において、抗体を含む医薬組成物は、１日１回、２日ごと、３日ごと、４日ごと、７日ごと、１０日ごと、１４日ごと、２１日ごと、２８日ごと、２か月ごと、又は３か月ごとに被験体に投与される。
【０４２２】
抗体は、免疫原性を減少させるために修飾又は変更され得る。例えば、部分的なウシ又は非ウシの抗体である配列は、ヒトに対する免疫原性を減少させるために修飾又は変更され得る。
【０４２３】
非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を減らすためにヒト化され得、その間に親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持する。一般的に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、１つ以上の可変性ドメインを含む。ヒト化抗体はまた随意に、ヒト不変領域の少なくとも一部を含む。幾つかの実施形態において、ヒト化抗体における幾つかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復する或いは改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）の対応する残基により置換される。
【０４２４】
本明細書に開示されるような超長ＣＤＲ３を含む抗体は、好ましくはモノクローナルである。また、本開示の範囲内に、本明細書に提供されるような超長ＣＤＲ３を含む抗体の、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、及びＦ（ａｂ’）２のフラグメントが包含される。これら抗体フラグメントは、酵素の消化など従来の手段によって生成され、又は組み換え技術によって生成され得る。そのような抗体フラグメントは、キメラである又はヒト化され得る。これらフラグメントは、以下に述べられた診断及び治療の目的に役立つ。
【０４２５】
モノクローナル抗体は、ほぼ均質な抗体、例えば、少量で存在し得る、突然変異を自然に生じる可能性があることを除いては同一の集団を含む個々の抗体の集団から得られる。故に、修飾因子「モノクローナル」は、別々の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。
【０４２６】
本明細書に開示されるような超長ＣＤＲ３を含む抗体は、「Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５  （１９７５）」に最初に記載されるハイブリドーマ細胞ベースの方法を使用して作られ、又は組み換えＤＮＡ方法によって作られ得る。
【０４２７】
ハイブリドーマ細胞は、永久増殖細胞株（通常、ミエローマ細胞株）を有する所望の抗体を生成するＢ細胞を融合させることにより生成され得、その結果、結果として生じる融合細胞は、特定の抗体を分泌する永久増殖細胞株となる。同じ原理によって、ミエローマ細胞は最初に、生殖系列抗体Ｖ領域をコード化する核酸によりトランスフェクトすることができ、生殖系列Ｖ領域の発現のためにスクリーニングされ得る。タンパク質分解性の軽鎖発現の最高水準を有するそれらミエローマ細胞は、所望の標的タンパク質特異性を有する抗体をもたらすＢ細胞にその後融合される場合がある。融合細胞は、２つのタイプの抗体を生成する：１つは、組み換え生殖系列Ｖ領域（重又は軽の何れか）に操作可能に結合された内因性の抗体鎖（重又は軽の何れか）を含む異種抗体であり、もう１つは、親のＢ細胞が分泌する同じ抗体（例えば、内因性の重鎖及び軽鎖の両方）である。操作しやすく結合された異種の重鎖及び軽鎖は、クロマトグラフィーなどの従来方式によって分離され得、同定は、標的タンパク質結合分析、生殖系列ポリペプチドの独特なタグを同定するアッセイ、又は、本開示の他のセクションに記載されるエンドペプチダーゼ活性のアッセイによって確認することができる。幾つかの場合、異種抗体は、２つのタイプの抗体中に多くある主なタイプである場合、そのような分離は必要とされないこともある。
【０４２８】
ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、融合していない親のミエローマ細胞の増殖又は生存を阻害する１以上の物質を含む適切な培地にて増殖され、成長され得る。例えば、親のミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培地は典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培養液）を含み、その物質は、ＨＧＰＲＴが不十分な細胞の増殖を防ぐ。
【０４２９】
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの産生を支持し、ＨＡＴ培養液などの培地に感受性があるものである。これらの中で、ミエローマ細胞株は、「Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．  ＵＳＡ」から入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１のマウス腫瘍、及び「ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  Ｍｄ．  ＵＳＡ」から入手可能なＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来するもの等の、マウス骨髄腫株でもよい。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマの細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されてきた（Ｋｏｚｂｏｒ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３３：３００１  （１９８４）；  Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ．  ５１−６３  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７））。
【０４３０】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地は、超長ＣＤＲ３を含む抗体の産生のために分析される。例えば、ハイブリドーマ細胞によってもたらされたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、又は、酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロの結合分析によって測定され得る。
【０４３１】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、「Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０７：２２０  （１９８０」のスキャチャード解析によって測定され得る。
【０４３２】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体をもたらすハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈手順によってサブクローン化され、標準方法によって増殖させた（Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  ｐｐ．  ５９−１０３  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８６））。この目的に適切な培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物の腹水腫瘍のようにインビボで増殖し得る。
【０４３３】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又は親和クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製法によって、培地、腹水、又は血清から適切に分離される。
【０４３４】
本明細書に開示されるような超長ＣＤＲ３を含む抗体は、所望の活性を伴う合成抗体クローンについてスクリーニングするための組み合わせのライブラリを使用することにより、作られ得る。例えば、合成抗体クローンは、ファージ被覆タンパク質に融合される抗体可変領域（例えば、ｓｃＦｖ又はＦａｂ）の様々なフラグメントを提示するファージを含む、ファージライブラリをスクリーニングすることにより選択される。そのようなファージライブラリは、例えば、所望の抗原に対する親和クロマトグラフィーによってピックアップされ得る（ｐａｎｎｅｄ）。所望の抗原に結合することができる抗体フラグメントを発現するクローンは、抗原に吸着され、故に、ライブラリにおいて非結合クローンから分離され得る。結合クローンはその後、抗原から溶出され得、抗原吸着／溶出の付加的なサイクルによりさらに集積され得る。本明細書に開示されるような超長ＣＤＲ３を含む抗体の何れかは、対象のファージクローンについて選択するための適切な抗原スクリーニング手順を設計し、その後、対象のファージクローンからのＶＨ及びＶＬ（例えばｓｃＦｖ又はＦａｂから）配列、及び「Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．  （１９９１），  ｖｏｌｓ．  １−３」に記載される適切な不変領域（Ｆｃ）配列を使用した、超長ＣＤＲ３クローンを含む完全長の抗体の構築によって、得られ得る。
【０４３５】
抗体の抗原結合ドメインは、両方が３つの超可変ループ又は相補性決定領域（ＣＤＲ）に存在し、それぞれ軽（ＶＬ）鎖及び重（ＶＨ）鎖から由来する、２つの可変性の（Ｖ）領域から形成される。可変性ドメインは、「Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２：  ４３３−４５５  （１９９４）」に記載されるように、ＶＨ及びＶＬが短く柔軟なペプチドを通じて共有結合される単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ、単一鎖の抗体（ＳＣＡ）とも称される）フラグメント、又は、各々不変ドメインに融合され、非共有結合的に相互作用するＦａｂフラグメントの何れかとして、ファージ上で機能的に提示され得る。ｓｃＦｖ又はＳＣＡのコード化ファージクローン及びＦａｂコード化ファージクローンは、「Ｆｖファージクローン」又は「Ｆｖクローン」と、別々に又は総称して呼ばれ得る。
【０４３６】
ＶＨとＶＬの遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローン化され、ファージライブラリにおいて無作為に再び組み合わせられ、その後、それは、「Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２：  ４３３−４５５  （１９９４）」に記載されるような抗原結合クローンについて探索され得る。免疫化したソースからのライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に高親和性抗体を提供する。代替的に、本来のレパートリーは、「Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２：  ７２５−７３４  （１９９３）」に記載されるような任意の免疫化無しにヒト抗体の単一のソースを広範囲の非自己に提供するために、自己抗原をクローン化され得る。最終的に、本来のライブラリはまた、幹細胞から再配置されていないＶ遺伝子セグメントのクローン化により、及び、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコード化するため及び「Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２７：  ３８１−３８８  （１９９２）」に記載されるようにインビトロで再配置を達成するためのランダムシーケンスを含むＰＣＲプライマーを使用して、合成的に作ることができる。
【０４３７】
繊維状ファージは、マイナー被覆タンパク質ｐＩＩＩへの融合によって抗体フラグメントを提示するために使用される。タンパク質ｐＩＩＩは、ｐＩＩＩの短縮した形態を含み得る。抗体フラグメントは、単一鎖Ｆｖフラグメント（その中でＶＨ及びＶＬ鎖が柔軟なポリペプチドスペーサーによって同じポリペプチド鎖上で接続される）（例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：  ５８１−５９７  （１９９１）に記載されるように）、又は、Ｆａｂフラグメント（その中で１つの鎖がｐＩＩＩ（例えば、短縮したｐＩＩＩ）に融合し、他の鎖が、Ｆａｂ被覆タンパク質構造のアセンブリが野生型被覆タンパク質の幾つかを移すことにより提示される、細菌の宿主細胞ペリプラズムへと分泌される）（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９：  ４１３３−４１３７  （１９９１）に記載されるように）として、提示され得る。
【０４３８】
核酸コード化抗体可変性遺伝子セグメント（ＶＨとＶＬのセグメントを含む）は、対象の細胞から回収され、組み換えＤＮＡ技術（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ突然変異生成）によって増幅され、又はコピーが作られ得る。例えば、再配置されたＶＨ及びＶＬの遺伝子ライブラリの場合、所望のＤＮＡは、リンパ球からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを分離し、その後、「Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ），  ８６：  ３８３３−３８３７  （１９８９）」に記載されるような再配置されたＶＨ及びＶＬの遺伝子の５’及び３’の末端と一致するプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得られ、それにより、発現のために多様なＶ遺伝子レパートリーを作る。Ｖ遺伝子は、「Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  ａｎｄ  ｉｎ  Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４１：  ５４４−５４６  （１９８９）」に記載されるように、成熟したＶドメインをコード化するエキソンの５’末端にあるバックプライマー、及びＪセグメント内に基づいたフォワードプライマーを有するｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅され得る。ｃＤＮＡからの増幅のため、バックプライマーも、「Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ９：  ８８−８９  （１９９１）」に記載されるようにリーダーエキソンに基づき、「Ｓａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ），  ８６：  ５７２８−５７３２  （１９８９）」に記載されるようなフォワードプライマーは、不変領域内に基づく。相補性を増強する又は最大限にするため、縮退は、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）又はＳａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）に記載されるように、プライマーに組み込まれ得る。ライブラリ多様性は、例えば、「Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：  ５８１−５９７  （１９９１）」の方法、又は「Ｏｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２１：  ４４９１−４４９８  （１９９３）」の方法に記載されるように、免疫細胞核酸サンプルに存在する、利用可能なＶＨ及びＶＬの配列を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーに標的とされたＰＣＲプライマーの使用により、増強又は最大限にされ得る。増幅したＤＮＡの発現ベクターへのクローン化のため、珍しい制限酵素部位は、「Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）」に記載されるように１つの末端にあるタグとして、又は「Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：  ６２４−６２８  （１９９１）」に記載されるようにタグ付けしたプライマーによる更なるＰＣＲ増幅により、ＰＣＲプライマー内に導入され得る。
【０４３９】
合成的に再配列されたＶ遺伝子のレパートリーは、インビトロでＶ遺伝子セグメントに由来し得る。大半のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、クローン化され且つシーケンス解析され（例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２７：  ７７６−７９８  （１９９２）に報告される）、及びマッピングされ（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ，  ３：  ８８−９４  （１９９３）に報告される）；これらクローン化したセグメント（Ｈ１及びＨ２のループのすべての主要な構造を含む）は、「Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２７：  ３８１−３８８  （１９９２）」に記載されるように、多様な配列及び長さのＨ３ループをコード化するＰＣＲプライマーを有する多様なＶＨ遺伝子レパートリーを生じさせるために使用され得る。ＶＨレパートリーも、「Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：  ４４５７−４４６１  （１９９２）」に記載されるように、単一の長さのＨ３ループに集中したすべての配列多様性により作られ得る。ヒトＶκ及びＶλセグメントが、クローン化され且つシーケンス解析され（「Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２３：  １４５６−１４６１  （１９９３）」に報告される）、合成軽鎖レパートリーを作るために使用することができる。ＶＨ及びＶＬフォールドの範囲、及びＬ３とＨ３の長さに基づく、合成のＶ遺伝子レパートリーは、相当な構造多様性の抗体をコード化する。Ｖ遺伝子をコード化するＤＮＡの増幅後、生殖系列Ｖ遺伝子セグメントは、「Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２７：  ３８１−３８８  （１９９２）」の方法に従い、インビトロで再配置され得る。
【０４４０】
抗体フラグメントのレパートリーは、様々な方法で、ＶＨとＶＬの遺伝子レパートリーを共に組み合わせることにより構築され得る。各レパートリーは、異なるベクターにおいて、及び、例えば、「Ｈｏｇｒｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  １２８：  １１９−１２６  （１９９３）」に記載されるようにインビトロで組み換えられたベクターにおいて、又は、インビボでの組み合わせの感染、例えば、「Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２１：  ２２６５−２２６６  （１９９３）」に記載されるｌｏｘＰシステムにより、作成され得る。インビボ組み換え方法は、大腸菌形質転換率によって課されたライブラリの大きさに対する制限を克服するためにＦａｂフラグメントの２重鎖の性質を活用する。未処理のＶＨ及びＶＬのレパートリーは、１つはファージミドへ、もう１つはファージベクトルへと別々にクローン化される。その後、各細胞が異なる組み合わせを含み、ライブラリの大きさが存在する細胞の数（約１０１２のクローン）によってのみ限定されるように、２つのライブラリは、ファージミド含有バクテリアのファージ感染によって組み合わされる。両方のベクターは、インビボの組み換え信号を含み、その結果、ＶＨとＶＬの遺伝子が、単一のレプリコン上で組み換えられ、ファージビリオンに共に包含されるこれら大きなライブラリは、優れた親和性の多くの多様な抗体を提供し得る（約１０−８ＭのＫｄ−１）。
【０４４１】
代替的に、レパートリーは、例えば、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：  ７９７８−７９８２  （１９９１）に記載されるように同じベクターへと連続してクローン化され、又は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：  ６２４−６２８  （１９９１）に記載されるようにＰＣＲによって共に組み立てられ、その後クローン化される。ＰＣＲアセンブリはまた、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成するために柔軟なペプチドスペーサーをコード化するＤＮＡに、ＶＨとＶＬのＤＮＡを結合するために使用され得る。また別の技術において、「細胞内ＰＣＲアセンブリ」は、Ｅｍｂｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２０：  ３８３１−３８３７  （１９９２）に記載されるように、ＰＣＲ、及びその後、結合した遺伝子のクローンレパートリーによって、リンパ球内のＶＨとＶＬの遺伝子を組み合わせるために使用され得る。
【０４４２】
未処理のライブラリ（天然又は合成の何れか）によって生成された抗体は、中程度の親和性（約１０６乃至１０７Ｍ−１のＫｄ−１）のものであるが、前述のＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４），に記載されるように、親和性成熟も、二次的なライブラリからの再構築及び再選択により、インビトロで模倣され得る。例えば、突然変異は、「Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２６：  ８８９−８９６  （１９９２）」の方法又は「Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：  ３５７６−３５８０  （１９９２）」の方法おいて、エラープローンポリメラーゼを使用することによって、インビトロで無作為に導入され得る（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  １：  １１−１５  （１９８９に報告される））。加えて、親和性成熟は、選択された個体のＦｖクローン及び高親和性クローンについてのスクリーニングにおいて、例えば、対象のＣＤＲに広がるランダムシーケンスを支えるプライマーを有するＰＣＲを使用して、無作為に１つ以上のＣＤＲを変異させることにより、行なわれ得る。ＷＯ９６０７７５４には、軽鎖遺伝子のライブラリを作るために免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域において突然変異生成を誘発する方法が記載される。別の効果的な方法は、「Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １０：  ７７９−７８３  （１９９２）」に記載されるように、免疫を付与されていないドナーから得られた、自然発生のＶドメイン変異体のレパートリーを有するファージディスプレイによって選択される、ＶＨ又はＶＬのドメインを再結合すること、及び、数回の鎖の再組み換え（ｃｈａｉｎ  ｒｅｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）における高親和性についてスクリーニングすることである。この技術は、１０−９Ｍの範囲の親和性を有する抗体及び抗体フラグメントの産生を可能にする。
【０４４３】
ファージライブラリサンプルは、ファージ粒子の少なくとも一部の吸着体との結合に適切な条件下で、固定化タンパク質に接触させられる。通常、ｐＨ、イオン強度、温度などを含む条件は、生理学的条件を模倣するために選択される。固相に結合したファージは洗浄され、その後、例えば、「Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：  ７９７８−７９８２  （１９９１）」に記載されるように酸によって、又は、アルカリによって（例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：  ５８１−５９７  （１９９１）に記載されるように）、或いは、抗原競合によって（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：  ６２４−６２８  （１９９１）の抗原競合方法に類似する手順で）、溶出される。ファージは、１回の選択において２０−１，０００倍に集積され得る。さらに、集積されたファージは、細菌培養液において増殖され、更なる回数の選択にさらされ得る。
【０４４４】
選抜効率は、洗浄中の解離の動態を含む多くの因子、及び、単一のファージ上の多数の抗体フラグメントが抗原に同時に連動し得るかに依存する。速い解離動態（及び弱い結合親和性）を有する抗体は、短い洗浄、多価性のファージディスプレイ、及び固相における抗原の高いコーティング密度の使用によって、保持され得る。高密度は、多価性の相互作用を通じてファージを安定させるだけでなく、解離したファージの再結合を好む。遅い分離動態（及び優れた結合親和性）を有する抗体の選択は、「Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ８：  ３０９−３１４  （１９９０）」に記載されるような長い洗浄及び単価のファージディスプレイの使用、並びに、「Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １０：  ７７９−７８３  （１９９２）」、及びＷＯ９２／０９６９０に記載されるような抗原の低いコーティング密度の使用よって促進され得る。
【０４４５】
本明細書に開示される、ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体又はファージディスプレイのＦｖクローンをコード化するＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、ハイブリドーマ又はファージＤＮＡのテンプレートから対象の重鎖及び軽鎖のコード領域を特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチド・プライマーの使用によって）、容易に単離され、シーケンス解析される。一旦単離されると、ＤＮＡは、組み換え宿主細胞において所望のモノクローナル抗体の合成を得るために、発現ベクターに配置され得、その後発現ベクターは、大腸菌細胞、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は、他に免疫グロブリンタンパク質を生成しないミエローマ細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされる。抗体をコード化するＤＮＡのバクテリアにおける組み換え発現は、Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第６，２０４，０２３号に記載されている（例えば、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ５：  ２５６  （１９９３）及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖｓ，  １３０：  １５１  （１９９２）も参照）。
【０４４６】
本明細書に開示されるようなＦｖクローンをコード化するＤＮＡは、重鎖及び又は軽鎖の完全又は部分的な長さをコード化するクローンを形成するために、重鎖及び／又は軽鎖の不変領域をコード化する既知のＤＮＡ配列と組み合わせられ得る（例えば、適切なＤＮＡ配列は、前述の「Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，」から得ることができる）。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥの不変領域を含む任意のアイソタイプの不変領域がこの目的に使用することができ、且つ、そのような不変領域が任意のヒト又は動物の種から得られ得ることが認識されるであろう。１の動物（ヒトなど）の種の可変性ドメインのＤＮＡに由来し、その後、「ハイブリッドの」完全な重鎖及び／又は軽鎖についてのコード配列を形成するために別の動物種の不変領域ＤＮＡに融合される、Ｆｖクローンは、本明細書で使用されるように、「キメラの」及び「ハイブリッドの」抗体の定義に含まれる。好ましいＦｖクローンの実施形態において、ヒト可変性ＤＮＡに由来するＦｖクローンは、全てのヒトの、完全又は部分的な長さの重鎖及び／又は軽鎖についてのコード配列を形成するためにヒト不変領域ＤＮＡに融合される。
【０４４７】
本明細書に開示されるハイブリドーマに由来する超長ＣＤＲ３を含む抗体をコード化するＤＮＡも、例えば、ハイブリドーマクローンに由来する相同のマウス配列の場所において、ヒトの重鎖及び軽鎖の不変領域のためのコード配列を置換することにより、修飾され得る。ハイブリドーマ又はＦｖクローン由来の抗体或いはフラグメントをコード化するＤＮＡは、非免疫グロブリンポリペプチドについての免疫グロブリンコード配列全て又はコード配列の一部に共有結合することにより、さらに修飾され得る。このように、「キメラの」又は「ハイブリッドの」抗体は、本明細書に開示される、Ｆｖクローン又はハイブリドーマのクローン由来の抗体の結合特異性を有するように、調製される。
【０４４８】
抗体遺伝子及びタンパク質
本開示は、超長ＣＤＲ３を含む、例えば、キメラの、組み換えの、設計された、合成の、ハイブリッドの、ウシの、完全なウシの、ウシ化、ヒトの、完全なヒトの、又はヒト化の抗体遺伝子又はタンパク質を含む、抗体遺伝子又はタンパク質を提供する。本明細書に開示される抗体は、標的タンパク質のエピトープに選択的に又は特異的に結合し得る。幾つかの実施形態において、抗体は、アンタゴニスト（例えばブロッキング）抗体又はアゴニスト抗体でもよい。
【０４４９】
重鎖及び軽鎖の可変領域は、非コーディング領域、又はイントロンによって分離された多数の生殖系列遺伝子フラグメントによってコード化され、且つ、しばしば異なる染色体上に存在する。例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖領域についての遺伝子は、およそ６５の可変性（ＶＨ；）遺伝子、２７の多様性（ＤＨ）遺伝子、及び６の結合（ＪＨ）遺伝子を含む。ヒトのカッパ（κ）及びラムダ（λ）の軽鎖も各々、類似の数のＶＬとＪＬの遺伝子セグメントによってコード化されるが、任意のＤ遺伝子セグメントを含まない。典型的なＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、及びＶＬ（Ｖκ又はＶλ）並びにＪＬ（Ｊκ又はＪλ）の生殖系列遺伝子フラグメントは、ＷＯ２０１０／０５４００７において述べられる。
【０４５０】
Ｂ細胞分化中、生殖系列ＤＮＡが再配置され、それによって重鎖位置の１つのＤＨ及び１つのＪＨの遺伝子セグメントが再結合され、その後、ＶＨ鎖をコード化する再配列したＶＤＪ遺伝子を形成する、１つのＶＨ遺伝子セグメントに結合される。再配列は、対立遺伝子排除のプロセスによって単一の重鎖対立遺伝子上でのみ生じる。対立遺伝子排除は、ＶＤＪセグメントの「インフレーム」又は「生産的な」再結合によって調節され、それは、可変性の重鎖のＶＤＪ再結合の約３分の１のみにおいて生じる。そのような生産的な再結合事象が最初に細胞内で生じると、このことは、前Ｂ細胞の表面上で発現され、且つ、さらなる重鎖再結合を止める信号を送信し、それにより対立遺伝子の重鎖位置の発現を防ぐ、μ重鎖の産生を結果として生じる。表面に発現されたμ重鎖はまた、再配列のためのカッパ（κ）位置を活性化するために作用する。ラムダ（λ）位置は、λ再結合が両方の位置の上で非生産的な場合、再配列のためのみに活性化される。軽鎖再配列事象は、ＶＬ及びＪＬのセグメントのみが再結合される以外は、重鎖に類似する。各々の初期の転写の前に、対応する不変的な鎖の遺伝子が加えられる。後の転写及びＲＮＡスプライシングは、無傷の軽鎖又は重鎖に翻訳されるｍＲＮＡに通じる。
【０４５１】
抗体の可変領域は、個々の生殖系列Ｖ、Ｄ、及びＪのセグメントの再結合事象のために抗原結合と特異性を与え、それにより、可変領域ドメインをコード化する、結果として生じる再結合された核酸配列は、抗体の中で異なり、特定の抗体に抗原特異性を与える。しかし、変異は、重（Ｈ）及び（Ｌ）の鎖可変領域のＮ−末端ドメイン内に見出される、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）に限定される。ＣＤＲは、より多くが保存される領域に散在され、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と称される。フレームワーク領域とＣＤＲの範囲が、正確に定義された（例えば、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２，  ａｎｄ  Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７を参照）。各ＶＨ及びＶＬは典型的に、以下の順でアミノ末端からカルボキシ末端まで並べられた、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。ＶＬとＶＨのドメイン中の配列の可変性は一般的に、抗原結合部位を形成する領域であるＣＤＲに限定される。例えば、重鎖について、一般的に、ＶＨ遺伝子は、Ｎ末端の３つのフレームワーク領域をコード化し、最初の２つはＣＤＲ及び第３のＣＤＲの第１部分を達成し、ＤＨ遺伝子は、第３のＣＤＲの中心部をコード化し、ＪＨ遺伝子は、第３のＣＤＲ及び第４のフレームワーク領域の最後の部分をコード化する。軽鎖について、ＶＬ遺伝子は第１のＣＤＲ及び第２のＣＤＲをコード化する。第３のＣＤＲ（ＣＤＲＬ３）は、ＶＬとＪＬの遺伝子セグメントの結合によって形成される。従って、ＣＤＲ１及び２は、生殖系列Ｖ遺伝子セグメント配列によって排他的にコード化される。ＶＨ及びＶＬ鎖のＣＤＲ３は、Ａｇ結合部位の中心を形成し、ＣＤＲ１と２は外部の境界を形成する；ＦＲは、ＨとＬのＣＤＲを配向することによりスキャフォールドを支持する。平均で、抗原結合部位は典型的に、ＣＤＲの少なくとも４つが、抗原のエピトープ、最も可変性のある重鎖及び軽鎖の両方のＣＤＲ３に接触し、及び抗原結合に大半の特異性を寄与することを必要とする（例えば、Ｊａｎｉｓ  Ｋｕｂｙ，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９８，  ｐｐ．  １１５−１１８を参照）。Ｄ遺伝子セグメントの全てを含むＣＤＲＨ３は、Ａｂ−結合部位の最も多様な構成要素であり、典型的にはＡｂの特異性を定義する際に重大な役割を果たす。配列変異に加えて、重鎖と軽鎖の間のＣＤＲの長さにおいて変異が存在する。
【０４５２】
不変領域は、他方で、抗体中により多くが保存される配列によってコード化される。これらドメインは、抗体に機能特性（例えば、病原体の除去を引き起こすために免疫系と血清タンパク質の細胞と相互に作用する能力）を与える。異なるクラスの抗体、例えばＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡは、異なる不変領域を有し、それらが異なるエフェクター機能として機能することを可能にする。
【０４５３】
Ｖ、Ｄ、及びＪのこれら天然の再結合事象は、高親和性と特異性の両方を有する、２×１０７近くの異なる抗体を提供することができる。追加の多様性は、結合セグメントにおけるヌクレオチドの挿入及び欠失、及び、Ｖ領域の体細胞超変異により開始される。結果は、異なる抗原特異性を持った個人に、およそ１０１０の抗体が存在するということである。
【０４５４】
抗体フラグメント
本開示は抗体フラグメントを包含する。特定の状況において、全抗体ではなく、むしろ抗体フラグメントを使用するという利点が存在する。フラグメントのより小さな大きさは、急速なクリアランスを可能にし、固形腫瘍へのアクセスの改善に繋がり得る。抗体フラグメントは、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｖ’、Ｆｄ、Ｆｄ’、ｓｃＦｖ、ｈｓＦｖのフラグメント、及び二重特異性抗体、並びに以下に記載の他のフラグメントを含む。特定の抗体フラグメントのレビューについては、「Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９：１２９−１３４  （２００３）」を参照。ｓｃＦｖフラグメントのレビューについては、「Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ｖｏｌ．  １１３，  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  ｐｐ．  ２６９−３１５  （１９９４）；また、ＷＯ  ９３／１６１８５；並びに米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号を参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、且つインビボの半減期を増加させる、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２のフラグメントの考察に関しては、米国特許第５，８６９，０４６号を参照。
【０４５５】
二重特異性抗体は、二価又は両特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントである。例えば、ＥＰ４０４，０９７；  ＷＯ１９９３／０１１６１；  Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９：１２９−１３４  （２００３）；  及び  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ６４４４−６４４８  （１９９３）を参照。三重特異性抗体及び四重特異性抗体も、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９：  １２９１３４  （２００３）に記載される。
【０４５６】
単一ドメイン抗体は、重鎖可変性ドメインの全て又は一部、或いは軽鎖可変性ドメインの全て又は一部を含む抗体フラグメントである。特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｗａｌｔｈａｍ，  Ｍａｓｓ．；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照）。抗体フラグメントは、本明細書に記載されるように、限定されないが、無傷の抗体のタンパク質分解、同様に再結合宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む、様々な技術によって作ることができる。
【０４５７】
様々な技術は、抗体フラグメントの生産のために開発されてきた。伝統的に、これらフラグメントは、無傷の抗体のタンパク分解に由来した（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７  （１９９２）；及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２９：８１  （１９８５）を参照）。しかし、これらフラグメントは現在、再結合宿主細胞によって直接生成され得る。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びＳｃＦｖの抗体フラグメントはすべて、大腸菌内で発現又はそこから分泌され得、故に、大量のこれらのフラグメントの容易な生産を可能にする（例えば、米国特許第６，２０４，０２３号を参照）。抗体フラグメントは、上述の抗体ファージライブラリから分離され得る。代替的に、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、大腸菌から直接再生され、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントに化学的に結合され得る（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：  １６３−１６７  （１９９２）を参照）。別の方法に従って、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組み換えの宿主細胞培養物から直接分離することができる。インビボの半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントは、サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む（例えば、米国特許第５，８６９，０４６号を参照）。抗体フラグメントの生産のための他の技術は、当業者に明らかとなろう。他の実施形態において、選択された抗体は、単一鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ又は単一鎖抗体（ＳＣＡ））である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；及び第５，５８７，４５８号を参照。ＦｖとｓＦｖは、不変領域を欠く無傷の結合部位を有する唯一の種である；故に、それらはインビボの使用中に減少させられた非特異性の結合に適切である。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかで、エフェクタータンパク質の融合をもたらすように構築され得る。前述のＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ｅｄ．  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，を参照。例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるように、抗体フラグメントは「直鎖状の抗体」でもよい。そのような直鎖状の抗体フラグメントは、単特異性又は両特異性であり得る。
【０４５８】
ヒト化抗体
本開示は、超長ＣＤＲ３を含む、ヒト化抗体を提供する。ヒト化抗体は、ヒト操作抗体を含み得る（例えば、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ７（６）  ８０５−８１４；  及び米国特許第５，７６６，８８６号を参照）。非ヒト抗体をヒト化する様々な方法は当該技術分野にて既知である。例えば、ヒト化抗体は、ヒト又は非ヒトであるソースから導入される１以上のアミノ酸残基を有し得る。ヒト化は、修飾した抗体の可変性ドメインの調製を含む、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａの方法（例えば、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ７（６）  ８０５−８１４；  及び米国特許第５，７６６，８８６号を参照）に従って実行され得る。ヒト化は、ヒト化抗体の対応する配列についての超可変領域配列を置換することにより、Ｗｉｎｔｅｒ及びその同僚の方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）に従って代替的に実行され得る。従って、「ヒト化」又は「ヒト操作」抗体は、キメラ抗体であり、ここで、無傷のヒト可変性ドメインよりもかなり少ないものは、非ヒト種からの対応する配列によって置換され、又はそれに組み込まれてきた。例えば、ヒト化抗体は、幾つかの超可変領域残基及び恐らくは幾つかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体における同族性の部位の残基によって置換される、ヒト抗体でもよい。代替的に、ヒト化又はヒト操作の抗体は、幾つかの残基がヒト抗体における同族性の部位の残基により置換される非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体でもよい（例えば、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ７（６）  ８０５−８１４；及び米国特許第５，７６６，８８６号を参照）。
【０４５９】
ヒト化抗体を作る際に使用される、ヒト可変性ドメイン（軽及び重の両方）の選択は、抗原を減少させるのに重要である。例えば、いわゆる「最良適合」方法のため、げっ歯類抗体の可変性ドメインの配列は、既知のヒト可変性ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングされる。げっ歯類配列に最も近いヒト配列はその後、ヒト化抗体についてヒトフレームワークとして受け入れられる（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１：２２９６；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１）。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体の共通配列に由来する、特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークは、様々な異なるヒト化抗体に使用され得る（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：４２８５；  Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５１：２６２３）。
【０４６０】
抗体が、抗原及び他の好ましい生物学的特性のため高親和性の保持によりヒト化されることは、さらに重要である。この目標を達成するため、１つの方法に従い、ヒト化抗体は、親の及びヒト化配列の３次元モデルを使用して、親の配列及び様々な概念的なヒト化生成物の分析のプロセスによって調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは、共通して入手可能であり、当業者に精通している。選択された候補の免疫グロブリン配列の可能な三次元配座構造を示し且つ提示するコンピュータプログラムが、利用可能である。これらディスプレイの点検は、候補免疫グロブリン配列の機能化における、残基の起こり得る役割の分析（例えば、抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を及ぼす残基の分析）を許容する。このように、ＦＲ残基は、レシピエントと取り込み配列からＦＲ残基を選択され、且つ組み合わられ得、その結果、標的抗原の親和性を増加させるなど、所望の抗体特性が達成される。一般に、超可変領域の残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接、及び最も十分に関係する。
【０４６１】
幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３を含むヒト化抗体は、非免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）され得る。抗体又はタンパク質を免疫化する方法は、当該技術分野にて既知である。抗体などの治療用タンパク質の免疫原性は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を結合し、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞における増殖及びサイトカイン反応を生じさせることができる、Ｔ細胞エピトープの存在に起因すると思われる。その後、これらＣＤ４＋ヘルパー細胞は、治療用タンパク質に対する抗体反応を生じさせるよう、Ｂ細胞と協働する。Ｔ細胞エピトープの除去は、組み換えタンパク質を非免疫化する際に重要な工程であると思われる。Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣを結合するのに必要な残基を同定する、インシリコのアルゴリズムによって予測され得る。代替的に、エピトープは、ヒトドナーのパネルから末梢血単核細胞を利用し、抗原提示細胞と共にインキュベートされた時の治療用タンパク質に対する反応を測定することにより、直接同定され得る。そのようなインシリコ及びインビトロのシステムは、当該技術分野にて周知である（Ｊｏｎｅｓ  ＴＤ，  Ｃｒｏｍｐｔｏｎ  ＬＪ，  Ｃａｒｒ  ＦＪ，  Ｂａｋｅｒ  ＭＰ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００９；５２５：４０５−２３，Ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ  ＴＤ．  Ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｄｅｖ．  ２００７；  （２００７）；  １０（２）：  ２１９−２２７）。ＭＨＣ  ＩＩを結合する、又は他にＣＤ４＋細胞活性化を刺激するペプチドが同定される場合、ペプチドの残基は、一つずつ突然変異され、ＭＨＣ  ＩＩ結合及びＴ細胞活性化を妨害する突然変異が見出されるまで、Ｔ細胞活性化について試験され得る。そのような突然変異は、個々のペプチドに見出される場合、組み換え治療用タンパク質において直接コード化され得る。抗原提示細胞を有する全タンパク質のインキュベーションは、かなりのＣＤ４＋反応を誘発せず、非免疫化の成功を示す。
【０４６２】
ウシ抗体
本開示は、超長ＣＤＲ３を含む、ウシ抗体を提供する。ウシ抗体は、組み換え抗体、設計された抗体、合成抗体、ウシ化抗体、又は完全なウシ抗体でもよい。ウシ化抗体は、ウシ操作抗体を含み得る。ウシ化抗体を生成する方法は、ウシであるソースから、１つ以上のアミノ酸残基を導入する工程を含み得る。幾つかの例においては、ウシ化抗体を生成する方法は、非ウシであるソースから、１つ以上のアミノ酸残基を導入する工程を含み得る。ウシ化は、修飾した抗体の可変性ドメインを調製することにより行なわれ得る。代替的に、ウシ化は、ウシ抗体の対応する配列のため超可変領域配列を置換することにより行なわれ得る。従って、そのような「ウシ化」又は「ウシ操作」抗体は、キメラ抗体である。キメラ抗体は、無傷のウシの可変性ドメインよりもかなり少ないものが、非ウシ種から対応する配列によって置換される又はそれに組み込まれてきた抗体を含み得る。ウシ化又はウシ操作の抗体は、幾つかの超可変領域残基及び不変領域残基が、非ウシ抗体における同族性の部位の残基によって置換される、ウシ抗体でもよい。代替的に、ウシ化、ウシ操作、又は完全なウシの抗体は、幾つかの残基がウシ抗体における同族性の部位の残基によって置換される、非ウシ（例えば、ヒト）抗体でもよい。例えば、ウシの免疫グロブリン領域は、完全なウシの、ウシ化、又はウシ操作抗体を生成するため、非ウシ（例えば、ヒト、げっ歯類）免疫グロブリン領域を置換するために使用することができる。
【０４６３】
二重特異性抗体
二重特異性抗体はモノクローナルであり、好ましくは、少なくとも２つの異なる抗原についての結合特異性を有する、ヒト又はヒト化抗体である。例えば、結合特異性の１つは、第１抗原のためのものであり、他方は任意の他の抗原のためのものでもよい。典型的な二重特異性抗体は、同じタンパク質の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体はまた、特定のタンパク質を発現する細胞に対して細胞毒性薬剤を局在化するために使用され得る。これら抗体は、特定のタンパク質に特異的な結合アーム、及び細胞毒性薬剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート、又は放射性同位体ハプテン）を結合するアームを所有する。二重特異性抗体は、完全な抗体又は抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製され得る。
【０４６４】
二重特異性抗体を作る方法は、当該技術分野にて既知である。伝統的に、二重特異性抗体の組み換え生成は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対の共同発現に基づき、ここで、２つの重鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３０５：  ５３７  （１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のむ際杭の組み合せのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子（その１つのみが、正確な二重特異性構造を有する）の可能な混合物を生成する。アフィニティクロマトグラフィー工程によって通常行われる正確な分子の精製は、むしろ扱いにくく、生成効率は低い。類似の手順は、ＷＯ９３／０８８２９及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １０：  ３６５５  （１９９１）において開示される。
【０４６５】
異なる方法に従って、所望の結合特異性（抗体抗原結合部位）を有する抗体可変性ドメインは、免疫グロブリン不変領域配列に融合される。その融合は好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３の領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖不変領域を有する。融合の少なくとも１つに存在し、軽鎖結合に必要な部位を含む、第１重鎖不変領域（ＣＨ１）を有することが、好ましい。免疫グロブリン重鎖融合、及び、所望される場合に、免疫グロブリン軽鎖をコード化するＤＮＡは、個別の発現ベクターに挿入され、適切な宿主生物に同時にトランスフェクトされる。これは、構造に使用される３つのポリペプチド鎖の不等な比率が、最適な収量を提供する場合、実施形態において３つのポリペプチドフラグメントの相互の比率を調整する際に融通性を提供する。しかし、等しい比率での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収量で結果としてもたらされる場合、又は比率が特に重要でない場合、１つの発現ベクターに２又は全部で３のポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが、可能である。
【０４６６】
この方法の好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、１つのアームにおいて第１結合特異性を有するハイブリッドの免疫グロブリン重鎖、及び、他のアームにおけるハイブリッドの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対（第２結合特異性を提供する）からなる。この非対称構造は、二重特異性分子の半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在が、分離の容易な方法を提供するため、望まれない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離を促進し得る。この方法は、ＷＯ９４／０４６９０に開示される。二重特異性抗体を生成することに関する更なる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １２１：２１０  （１９８６）を参照。
【０４６７】
別の方法に従い、１組の抗体分子間の界面は、組み換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大限にするために設計され得る。好ましい界面は、抗体不変領域のＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第１抗体分子の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）により置換される。大きな側鎖に同一又は類似する大きさの代償性の「穴（ｃａｖｉｔｙ）」は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニン又はトレオニン）に置換することにより、二次抗体分子の界面上で作られる。これは、ホモ二量体などの他の望まれない最終生成物上のヘテロ二量体の産出を増加させるための機構を提供する。
【０４６８】
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロ共役の」抗体を含む。例えば、ヘテロ共役における抗体の１つは、アビジンに結合され、他のものはビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、望まれない細胞に対する免疫系細胞を標的とするため（米国特許第４，６７６，９８０号）、及びＨＩＶ感染の処置のため（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／００３７３、及びＥＰ０３０８９号）、提案された。ヘテロ共役抗体は、任意の都合のよい架橋方法を使用して作られ得る。適切な架橋剤は、当該技術分野にて周知であり、多くの架橋技術とともに、米国特許第４，６７６，９８０号に開示される。
【０４６９】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成する技術も文献に記載されてきた。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を使用して調製され得る。「Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２９：  ８１  （１９８５）」は、無傷の抗体がＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じさせるためタンパク分解性に切断される手順を記載する。これらフラグメントは、隣接のジチオールを安定させ、且つ分子間のジスルフィド形成を防ぐため、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で減少させられる。生成したＦａｂ’フラグメントはその後、チオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。その後、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは、メルカプトエチルアミンによる減少によってＦａｂ’−チオールに再変換され、二重特異性抗体を形成するために別のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合される。生成した二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化用の薬剤として使用され得る。
【０４７０】
最近の進歩は、二重特異性抗体を形成するために化学的に結合され得る、大腸菌からｍｐＦａｂ’−ＳＨフラグメントの直接回収を容易にした。「Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １７５：  ２１７−２２５  （１９９２）」は、完全にヒト化した二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生産について記載する。各Ｆａｂ’フラグメントは、大腸菌から別々に分泌され、二重特異性抗体を形成するためにインビトロでの直接の化学的結合にさらされる。故に形成される二重特異性抗体は、ＨＥＲ２受容体及び標準のヒトＴ細胞を過剰発現する細胞に結合し、同様に、ヒト胸壁腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解作用を引き起こすことが可能であった。
【０４７１】
組み換え細胞培養物から直接、二重特異性抗体フラグメントを作り且つ単離するための様々な技術も、記載されてきた。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して生成されてきた。例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ，  １４８（５）：１５４７−１５５３  （１９９２）を参照。ＦｏｓとＪｕｎのタンパク質からのロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合された。抗体ホモ二量体は、モノマーを形成するためにヒンジ領域にて減少させられ、その後、抗体ヘテロ二量体を形成するために再度酸化された。この方法も、抗体ホモ二量体の生産のために利用され得る。「Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：６４４４−６４４８  （１９９３）」に記載される「二重特異性抗体」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作るための代替的な機構を提供した。フラグメントは、同じ鎖の２つのドメイン間で対合することを可能にするには短すぎるリンカーによって、軽鎖可変性ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変性ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨとＶＬのドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬとＶＨのドメインと共に対になることを強いられ、それにより、２つの抗原結合部位を形成する。単一鎖のＦｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異性抗体フラグメントを作るための別の戦略も、報告された。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５２：５３６８  （１９９４）を参照。
【０４７２】
２より多くの原子価を有する抗体が、考慮される。例えば、三重特異性抗体が、調製され得る。例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：  ６０  （１９９１）を参照。
【０４７３】
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって二価抗体よりも速く内面化（及び／又は分解）され得る。本開示の抗体は、抗体のポリペプチド鎖をコード化する核酸の組み換え発現によって生成され得る、３以上の抗原結合部位（例えば、四価の抗体）を備える、多価抗体（ＩｇＭクラス以外のものである）でもよい。多価抗体は、二量化ドメイン及び３以上の抗原結合部位を含み得る。好ましい二量化ドメインは、Ｆｃ領域又はヒンジ領域を含み得る（又はそれらから成る場合がある）。このシナリオにおいて、抗体は、Ｆｃ領域。及び、Ｆｅ領域への３つ以上の抗原結合部位のアミノ末端を含むであろう。好ましい多価抗体は、３乃至約８、しかし好ましくは４の抗原結合部位を含み得る（又はそれから成り得る）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（及び好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、ここで、ポリペプチド鎖は２以上の可変性ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含み、ここで、ＶＤ１は第１可変性ドメインであり、ＶＤ２は第２可変性ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表わし、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖は、次のものを含み得る：ＶＨ−ＣＨ１−柔軟なリンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖。多価抗体は好ましくは、少なくとも２つの（好ましくは４つの）軽鎖可変性ドメインポリペプチドを更に含む。多価抗体は、例えば、約２乃至約８の軽鎖可変性ドメインポリペプチドを含み得る。軽鎖可変性ドメインポリペプチドは、軽鎖可変性ドメインを含み、随意に、ＣＬドメインを更に含み得る。
【０４７４】
抗体変異体
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるような超長ＣＤＲ３を含む抗体のアミノ酸配列修飾が考慮される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体の、例えば保存的に修飾した変異体を含む、アミノ酸配列変異体は、抗体核酸へ適切なヌクレオチド変更を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は前記残基への挿入、及び／又は前記残基の置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終的なコンストラクトが所望の特徴を持つと仮定して、最終的なコンストラクトに到達するために作られる。アミノ酸変化は、配列が作られる時に、主題のアミノ酸配列に導入され得る。
【０４７５】
特定の残基、又は、突然変異生成に好ましい位置である抗体の領域の有用な同定法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  （１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：１０８１−１０８５に記載されるように、「アラニンスキャニング変異」と呼ばれる。ここで、残基又は標的残基の基は同定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基）、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を及ぼすため、中性又は陰性に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）によって置換される。置換に対する機能感受性を実証するアミノ酸位置はその後、置換の部位にて、又は該部位について、更なる又は他の変異体を導入することにより、洗練される。故に、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決定されていない一方で、突然変異の性質自体は、予め決定する必要はない。例えば、与えられた部位での突然変異のパフォーマンス、ａｌａスキャニング、又はランダム変異導入法の分析は、標的のコドン又は領域で実行され、発現された免疫グロブリンは、所望の活性のためスクリーニングされる。
【０４７６】
アミノ酸配列挿入物は、１つの残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さに及ぶ、アミノ末端機能及び／又はカルボキシ末端融合、同様に、単一又は複数のアミノ酸残基の内部配列（ｉｎｔｒａｓｅｑｕｅｎｃｅ）挿入物を含む。末端挿入物の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体を含み、又は該抗体は、細胞毒性のポリペプチドに融合される。抗体分子の他の挿入物の変異体は、抗体のＮ末端又はＣ末端の、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴについて）又はポリペプチドへの融合を含む。
【０４７７】
ポリペプチドのグリコシル化は典型的にＮ連結又はＯ連結される。Ｎ連結は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である場合、トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニンは、アスパラギン側鎖に対する糖質成分の酵素結合のための認識配列である。故に、ポリペプチドにおけるこれらトリペプチド配列の何れかの存在は、可能な糖鎖付加部位を生成する。Ｏ連結グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの１つの、ヒドロキシアミノ酸への、最も一般的にはセリン又はトレオニンへの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも使用され得る。
【０４７８】
抗体への糖鎖付加部位の追加は、アミノ酸配列を変更することにより都合良く達成され、その結果、それは、上記トリペプチド配列（Ｎ連結糖鎖付加部位について）の１つ以上を含む。変更はまた、本来の抗体（Ｏ連結糖鎖付加部位について）の配列への、１以上のセリン又はトレオニン残基の追加、或いは、それらによる置換によって、行われ得る。
【０４７９】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合した炭水化物は変更され得る。例えば、抗体のＦｃ領域に結合したフコースを欠く、成熟した糖鎖構造を備える抗体が、記載されてきた（例えば、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＵＳ２００４／００９３６２１を参照）。抗体のＦｃ領域に結合した炭水化物において、二分のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する抗体が、記載されてきた（例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８、及び米国特許第６，６０２，６８４号を参照）。抗体のＦｃ領域に結合したオリゴ糖において少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体が、記載される（ＷＯ１９９７／３００８７；また、そのＦｃ領域に結合した、変更された炭水化物を備える抗体に関するＷＯ１９９８／５８９６４及びＷＯ１９９９／２２７６も参照）。修飾したグリコシル化を伴う抗原結合分子が、記載されてきた（例えば、ＷＯ９９／５４３４２、米国特許第６，６０２，６８４号及び第７，５１７，６７０号並びにＵＳ２００４／００７２２９０；また、例えば米国特許第７，２１４，７７５号及び第７，６８２，６１０号を参照）。
【０４８０】
本明細書における、好ましいグリコシル化変異体はＦｃ領域を含み、ここで、Ｆｃ領域に結合した糖鎖構造はフコースを欠く。そのような変異体はＡＤＣＣ機能を向上させた。任意に、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣをさらに改善する、その中の１以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４での置換（残基のＥｕナンバリング）をさらに含む。「脱フコシル化された」又は「フコースが不十分な」抗体に関係する刊行物の例は、次のものを含む：ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；ＵＳ２００３／０１１５６１４（現在、米国特許第６，９４６，２９２号）、ＵＳ２００２／０１６４３２８（現在、米国特許第７，０６４，１９１号）；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２（現在、米国特許第７，７４９，７５３号）；ＵＳ２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３６：１２３９−１２４９  （２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ８７：  ６１４  （２００４）。脱フコシル化した抗体を生成する細胞株の例は、タンパク質フコシル化（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２４９：５３３−５４５  （１９８６）；米国特許出願公開第ＵＳ２００３／０１５７１０８  Ａ１，  Ｐｒｅｓｔａ，  Ｌ；及びＷＯ２００４／０５６３１２  Ａ１，  Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ  ａｔ  ＥＸａｍｐｌｅ  １１）、及び、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などの、ノックアウト細胞株（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ８７：  ６１４  （２００４））を含む。
【０４８１】
別のタイプの変異体は、アミノ酸置換変異体である。これら変異体は、異なる残基により置換される抗体分子において少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換の突然変異生成についての最も大きな対象の部位は、超可変領域を含むが、ＦＲ変更も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」の表題下で、表２に示される。そのような置換が生物活性における変化を結果として生じる場合、その後、「典型的な置換」と称され、又はアミノ酸クラスに関連して以下に更に記載されるような、より多くの置換の変更が導入され、生成物がスクリーニングされ得る。
【０４８２】
【表３】
2018140992.tif 000005
【０４８３】
抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）例えば、シート又はらせん状の構造として、置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位にある分子の荷電又は疎水性、或いは（ｃ）側鎖の大部分を維持することに対する効果において著しく異なる置換を選択することにより、達成される。自然発生のアミノ酸は、一般の側鎖特性に基づいたグループに分けられる：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び（６）芳香性：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０４８４】
非保存的置換は，これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを要する。
【０４８５】
変異体の置換の１つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒトの抗体）の１以上の超可変領域残基を置換することに関係する。一般的に、さらなる開発のために選択された結果として生じる変異体は、それらが生成される親抗体に関する生物学的特性を改善させるであろう。そのような置換の変異体を生成するための都合のよい方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟に関係する。簡潔に、様々な超可変領域部位（例えば、６−７の部位）は、各部位で全ての可能なアミノ酸置換を生成するために突然変異させられる。故に生成される抗体は、各粒子内に包装されるＭ１３の遺伝子ＩＩＩ生成物への融合として、繊維状ファージ粒子から提示される。その後、ファージに提示された変異体は、本明細書に開示されるように、それらの生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニン系統的変異導入法は、抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基を同定するために実行することができる。代替的に又は付加的に、抗体と抗原の間の接触点を同定する抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが、有益であり得る。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書に詳述される技術に従った置換のための候補である。一旦、そのような変異体が生成されると、変異体のパネルは、本明細書に記載されるようにスクリーニングにさらされ、１以上の関連するアッセイにおいて上記の特性を有する抗体は、更なる開発のために選択され得る。
【０４８６】
抗体のアミノ酸配列変異体をコード化する核酸分子は、当該技術分野にて既知の様々な方法によって調製される。これら方法は、限定されないが、自然源（自然発生のアミノ酸配列変異体の場合）からの分離、又は、抗体の以前に調製した変異体又は非変異体バージョンの、オリゴヌクレオチドを媒介とした（又は部位特異的な）突然変異生成、ＰＣＲ突然変異生成、及びカセット式突然変異生成による調製を含む。
【０４８７】
本明細書に開示される免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域に１以上のアミノ酸修飾を導入し、それによってＦｃ領域変異体を生成することが、望ましい場合もある。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステインの位置を含む１以上のアミノ酸位置で、アミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０４８８】
当該技術分野の記載及び教示に従って、幾つかの実施形態において、本明細書に開示される方法で使用される抗体が、例えばＦｃ領域において、野生型カウンターパート抗体と比較して１以上の変更を含み得ることが、考慮される。それにもかかわらず、これら抗体は、それらの野生型カウンターパートと比較して、治療的有用性に必要な同じ特徴を十分に保持するであろう。例えば、特定の変更は、例えばＷＯ９９／５１６４２に記載されるように、変更された（例えば、改善された又は減少されたかの何れか）Ｃｌｑ結合及び／又は補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を結果として生じる、Ｆｃ領域において行われ得ることが、考えられる。また、Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０  （１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及びＦｃ領域変異体の他の例に関するＷＯ９４／２９３５１を参照。ＷＯ００／４２０７２とＷＯ２００４／０５６３１２には、ＦｃＲに対する、改善された又は減少された結合を伴う抗体変異体が記載される。また、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ９（２）：  ６５９１−６６０４  （２００１）を参照。半減期の増加、及び新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合の改善を伴う抗体はまた、胎児への母性ＩｇＧの移動の原因であり（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１７：５８７  （１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：２４９  （１９９４））、ＵＳ２００５／００１４９３４（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載される。これら抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する、１以上の置換と共にＦｃ  ｒｅｇをその中に含む。変更されたＦｃ領域アミノ酸配列、及び増加又は減少したＣｌｑ結合能を有するポリペプチド変異体は、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２に記載される。また、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４：４１７８−４１８４  （２０００）を参照。
【０４８９】
特定の実施形態において、本開示は、エフェクター機能を幾つか持つが、全てをもたない抗体変異体を考慮し、それは、インビボの抗体の半減期が重要であるが特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣなど）が不必要又は有害である、適用のための望ましい候補にする。インビトロ及び／又はインビボの細胞毒性アッセイは、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために実行され得る。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃｙＲ結合を欠く（従って、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確実にするために実行され得る。ＡＤＣＣを媒介するための一次細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃｙＲＩＩＩのみを発現し、一方で単球は、ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩ、及びＦｃｙＲＩＩＩを発現する。造血細胞に関するＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９：４５７−４９２  （１９９１）の４６４ページの表３に要約される。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３  （１９８６）を参照）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２  （１９８５）；  ５，８２１，３３７  （Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６６：１３５１−１３６１  （１９８７）を参照）に記載される。代替的に、非放射性のアッセイ方法が利用され得る（例えば、フローサイトメトリーに関するＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｌ１ｒ１ｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  Ｃａｌｉｆ．）；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．））。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、辺縁の血中単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的に又は付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボ、例えば、「Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６  （１９９８）」に開示されるものなどの動物モデルにおいて評価され得る。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体がＣｌｑに結合することができ、従ってＣＤＣ活性を欠くことを確認するために実行され得る。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイが実行され得る（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３  （１９９６）；  Ｃｒａｇｇ，  Ｍ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２  （２００３）；及びＣｒａｇｇ，  Ｍ．  Ｓ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｊ．  Ｇｌｅｎｎｉｅ，  Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８２７４３  （２００４）を参照）。ＦｃＲｎ結合及びインビボの除去／半減期決定はまた、当該技術分野にて既知の方法を使用して実行され得る（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，  Ｓ．  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ’ｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８（１２）：１７５９−１７６９  （２００６）を参照）。
【０４９０】
減少したエフェクター機能を有する抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９の１以上の置換を伴うものを含む（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ突然変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を伴ういわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む、２以上のアミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７での置換を伴う、Ｆｃ突然変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０４９１】
ＦｃＲへの結合の改善又は減少を伴う特定の抗体変異体が記載される。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ９（２）：  ６５９１−６６０４  （２００１）を参照）。
【０４９２】
特定の実施形態において、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４での置換を伴うＦｃ領域を含む（残基のＥｕナンバリング）。
【０４９３】
幾つかの実施形態において、変更は、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ  ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４：  ４１７８４１８４  （２０００）に記載されるように、変更された（即ち、改善された又は減少された）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を結果として生じる、Ｆｃ領域で行われる。
【０４９４】
半減期の増加、及び新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合の改善を伴う抗体は、胎児への母性ＩｇＧの移動の原因であり（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１７：５８７  （１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：２４９  （１９９４））、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載される。それら抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する、１以上の置換と共にＦｃ領域をその中に含む。そのようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６，３０３，３０５、３０７、３１１，３１２、３１７、３４０，３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、又は４３４の１以上での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を伴うものを含む（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【０４９５】
また、Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０  （１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及びＦｃ領域変異体の他の例に関するＷＯ９４／２９３５１を参照。
【０４９６】
抗体誘導体
本明細書に開示されるような超長ＣＤＲ３を含む抗体は、当該技術分野にて既知であり、容易に利用可能である、付加的な非タンパク質部分を含むようにさらに修飾され得る。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの制限しない例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／マレイン無水物コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーの何れか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール）、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共同ポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセリン）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造において利点を有し得る。ポリマーは任意の分子量であり得、且つ分枝又は非分枝であり得る。抗体に結合したポリマーの数は変わる場合があり、１より多くのポリマーが結合すると、それらは同じ又は異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されないが、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が定義された条件下での治療に使用されるなどを含む考察に基づき、決定され得る。
【０４９７】
ベクター、宿主細胞、及び組み換え法
本明細書に開示されるような抗体又はそのフラグメントの組み換え生成物について、それをコード化する核酸は分離され、さらなるクローン化（ＤＮＡの増幅）又は発現のため複製可能なベクターに挿入される。抗体をコード化するＤＮＡは、従来の手順（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコード化する遺伝子への特異的な結合が可能であるオリゴヌクレオチドプローブの使用による）を使用して、容易に分離且つシーケンス解析される。典型的な実施形態において、超長ＣＤＲ３を含む抗体、超長ＣＤＲ３を含む可変領域、又は超長ＣＤＲ３をコード化する核酸は分離され、さらなるクローン化（ＤＮＡの増幅）又は発現のため複製可能なベクターに挿入される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。一般的に、好ましい宿主細胞は、原核生物又は真核生物（一般的に哺乳動物）の何れかに由来する。任意のアイソタイプの不変領域がＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥの不変領域を含み、そのような不変領域が任意のヒト又は動物の種から得られ得ることが理解されるであろう。
【０４９８】
真核生物ウィルスからの調節要素を含有する発現ベクターは、真核細胞発現ベクター（例えば、ＳＶ４０ベクター、乳頭腫ウィルスベクター、エプスタイン−バーウィルス由来のベクター）において典型的に使用される。他の典型的な真核生物のベクターは、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウィルスｐＤＳＶＥ、及びＣＭＶプロモーターの指導下でタンパク質の発現を可能にする任意のベクター、ＳＶ４０早期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウィルスプロモーター、ラウス肉腫ウィルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は、真核細胞における発現に効果的と示された他のプロモーターを含む。
【０４９９】
幾つかの発現系は、チミジンキナーゼ及びジヒドロ葉酸レダクターゼなどの、遺伝子増幅を提供する標識を有する。代替的に、遺伝子増幅に関しない高収率発現系はまた、昆虫細胞におけるパキュロウィルスベクターの使用などに適切であり、核酸配列は、ポリヘドリンプロモーター又は他の強いバキュロウィルスプロモーターの指導下で部分的にヒト超長ＣＤＲ３抗体鎖をコード化する。
【０５００】
ａ．原核生物又は真核生物の宿主細胞を使用する抗体の生成：
【０５０１】
ｉ．ベクター構築
【０５０２】
本明細書に開示される抗体のポリペプチド構成要素をコード化するポリヌクレオチド配列は、標準の組み換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から分離され、シーケンス解析され得る。代替的に、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドシンセサイザー又はＰＣＲ技術を使用して合成することができる。一旦得られると、ポリペプチドをコード化する配列は、原核生物の宿主において異種のポリヌクレオチドを複製及び発現することができる組み換えベクターに挿入される。当該技術分野にて利用可能であり且つ既知の多くのベクターは、本開示の目的のため使用することができる。適切なベクターの選択は、ベクターに、及びベクターにより変形される特定の宿主細胞に挿入される核酸の大きさに主に依存するであろう。各ベクターは、その機能（異種のポリヌクレオチドの増幅又は発現、又はその両方）、及び、中に存在する特定の宿主細胞とのその適合性に依存する、様々な構成要素を含む。ベクター構成要素は一般的に、限定されないが、以下のものを含む：複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種の核酸挿入物、及び転写終結配列。加えて、超長ＣＤＲ３を含むＶ領域は、不変領域を含む抗体を生成するためにＣ領域に任意に融合され得る。
【０５０３】
一般に、宿主細胞と互換性をもつ種に由来する、レプリコン及び対照配列を含むプラスミドベクターは、これらの宿主に関して使用される。ベクターは通常、複製部位、同様に、形質転換細胞において表現型選択を提供することができるマーキング配列を運ぶ。例えば、大腸菌は典型的に、ｐＢＲ３２２（大腸菌種由来のプラスミド）を使用して変形される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）抵抗性をコード化する遺伝子を含み、故に、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、又は他の微生物のプラスミド或いはバクテリオファージはまた、内因性タンパク質の発現のため微生物の生物体により使用され得るプロモーターを含み得る、又はそれを含むように修飾され得る。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例が記載されてきた（例えば、米国特許第５，６４８，２３７号を参照）。
【０５０４】
加えて、宿主微生物と互換性を持つ、レプリコン及び対照配列を含むファージベクターは、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用される。例えば、λＧＥＭ（商標）−１１などのバクテリオファージは、大腸菌ＬＥ３９２などの感受性宿主細胞を変形するために使用され得る組み換えベクターを作る際に利用され得る。
【０５０５】
本明細書に開示される発現ベクターは、ポリペプチド構成要素の各々をコード化する、２以上のプロモーター−シストロンのペアを含み得る。プロモーターは、その発現を調節するシストロンに対して上流（５’）に位置づけられる、非翻訳調節配列である。原核生物のプロモーターは典型的に、誘発可能及び構成的という２つのクラスに分類される。誘導可能なプロモーターは、培養条件（例えば、栄養素の存在又は不在、或いは温度の変化）における変化に応じたその管理下で、シストロンの転写のレベルの増加を開始する、プロモーターである。
【０５０６】
様々な可能な宿主細胞によって認識された多くのプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化を介してソースＤＮＡからプロモーターを除去し、本明細書に開示されるベクターに分離されたプロモーター配列を挿入することにより、軽鎖及び重鎖をコード化するシストロンＤＮＡに操作可能に連結することができる。本来のプロモーター配列及び多くの異種プロモーターの両方が、標的遺伝子の直接増幅及び／又は発現に使用され得る。幾つかの実施形態において、本来の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、それらが発現した標的遺伝子のより大きな転写及び高い収量を一般的に許容するため、異種プロモーターが利用される。
【０５０７】
原核生物の宿主との使用に適したプロモーターは次のものを含む：ａｒａ  Ｂプロモーター、ＰｈｏＡプロモーター、β−ガラクタマーゼ及びラクトースプロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、及びｔａｃ又はｔｒｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーター。しかし、バクテリアにおいて機能的な他のプロモーター（他の既知の細菌の又はファージのプロモーターなど）は、同様に適切である。それらのヌクレオチド配列が公開され、それにより、任意の必要な制限部位を供給するためにリンカー又はアダプターを使用して、当業者が、標的の軽鎖及び重鎖をコード化するシストロンに対してそれらを操作可能にライゲートすることが可能となる（例えば、Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０）  Ｃｅｌｌ  ２０：  ２６９）。
【０５０８】
適切な細菌のプロモーターは当該技術分野にて周知であり、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ及び前述のＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌなどの科学文献に完全に記載される。組み換えの触媒のポリペプチドの抗体鎖を発現するための細菌発現システムは、例えば、大腸菌、バチルス菌ｓｐ．及びサルモネラにおいて利用可能である（Ｐａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ２２：２２９−２３５  （１９８３）；  Ｍｏｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３０２：５４３−５４５  （１９８３））。
【０５０９】
本明細書に開示される１つの態様において、組み換えベクターの内の各シストロンは、膜にわたって発現されたポリペプチドの転位を導く、分泌シグナル配列構成要素を含む。一般に、シグナル配列は、ベクターの構成要素でもよく、又は、ベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部でもよい。シグナル配列は、宿主細胞によって認識され且つ加工される（例えば、シグナルペプチターゼによって切断される）ものでなくてはならない。異種のポリペプチドに固有のシグナル配列を認識且つ加工しない原核生物の宿主細胞について、シグナル配列は、選択される原核生物のシグナル配列、例えば、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、アルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、又は耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、及びＭＢＰによって置換される。本明細書に開示される１つの実施形態において、発現系の両方のシストロンにおいて使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列又はその変異体である。
【０５１０】
別の態様において、本開示に従った免疫グロブリンの生産は、宿主細胞の細胞質に生じる場合があり、それ故、各シストロン内の分泌シグナル配列の存在を必要としない。その点では、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は、細胞質内の機能的な免疫グロブリンを形成するために発現され、折り重ねられ、組み立てられる。特定の宿主株（例えば、大腸菌ｔｒｘＢ−株）は、ジスルフィド結合形成に好都合な細胞質条件を提供し、それにより、発現タンパク質サブユニットの適切なフォールディング及び組み立てを許容する（例えば、Ｐｒｏｂａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ｇｅｎｅ，  １５９：２０３  （１９９５）を参照）。
【０５１１】
抗体をコード化するベクターのクローン化又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載される原核細胞又は真核細胞を含む。１つの実施形態において、宿主細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、ＹＯ、ＮＳＯ、Ｓｐ２０細胞）である。例えば、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合、抗体は、バクテリアにおいて生成され得る。バクテリアにおける抗体フラグメント及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号、及び第５，８４０，５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体フラグメントの発現を記載する、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ２４８  （Ｂ．Ｋ．Ｃ．  Ｌｏ，  ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．，  ２００３），  ｐｐ．  ２４５−２５４も参照）。発現後、抗体は、可溶性画分における細菌細胞ペーストから分離され得、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌などの真核生物の微生物は、そのグリコシル化経路が「ヒト化」され、部分的又は完全なヒト糖鎖付加パターンによる抗体の産生を結果として生じる菌類及び酵母菌株を含む、抗体をコード化するベクターに適切なクローン化又は発現の宿主である。Ｇｅｍｇｒｏｓｓ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２２：  １４０９−１４１４  （２００４），  ａｎｄ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２４：２１０−２１５  （２００６）を参照。グリコシル化した抗体の発現に適切な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。脊椎がない細胞の例は植物及び昆虫細胞を含む。多数のバキュロウィルス株が、昆虫細胞と共に、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために使用され得ると同定されてきた。これらの例は限定的なものではなく例示的なものである。定義された遺伝子型を有する上述のバクテリアの何れかの誘導体を構築する方法は、当該技術分野にて既知であり、例えば、Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ８：３０９−３１４  （１９９０）に記載される。バクテリアの細胞におけるレプリコンの再現性を考慮して、適切なバクテリアを選択することが一般的に必要とされる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０などの周知のプラスミドがレプリコンを供給するために使用される場合、大腸菌、セラチア、又はサルモネラ種は、宿主として適切に使用することができる。典型的に、宿主細胞は、タンパク質分解酵素の必要最低限量を分泌しなければならず、付加的なプロテアーゼ阻害剤は、細胞培養において望ましいように組み込まれ得る。
【０５１２】
植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５、９７８号、及び第６，４１７，４２９号（遺伝子導入植物において抗体を生成するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載する）を参照。脊椎動物細胞も宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するのに適用される哺乳動物細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）によって変形されるサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎ  ＶｌＩ’０ｌ．  ３６：５９  （１９７７）に記載されるような２９３又は２９３の細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ２３：２４３−２５１  （１９８０）に記載されるようなＴＭ４細胞）；サル腎培養細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（Ｖ  ＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｗ１３８Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  ＮＩ’．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ３８３：４４−６８  （１９８２）に記載されるようなＴＲ１細胞；ＭＲＣ  ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ’ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６  （１９８０））を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及び、ＹＯ、ＮＳＯ、及びＳｐ２／０などのミエローマ細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株のレビューのため、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ２４８  （Ｂ．Ｋ．Ｃ．  Ｌｏ，  ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．］．），  ｐｐ．  ２５５−２６８  （２００３）を参照。
【０５１３】
１つのそのような実施形態において、宿主細胞は次のものを含む（例えば、次のものにより変形される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコード化する核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコード化する核酸を含む第１ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコード化する核酸を含む第２ベクター。
【０５１４】
ｉｉ．抗体産生
【０５１５】
部分的にヒトの超長ＣＤＲ３抗体の組み換え産生のため、超長ＣＤＲ３を含む抗体をコード化する核酸は、宿主細胞におけるさらなるクローン化及び／又は発現のため、１以上の発現ベクターに挿入される。そのような核酸は、従来の手順（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコード化する遺伝子への特異的な結合が可能であるオリゴヌクレオチドプローブの使用による）を使用して、容易に分離且つシーケンス解析され得る。宿主細胞は、そのような発現ベクターにより変形され、プロモーターの誘発、形質転換体の選択、又は所望の配列をコード化する遺伝子の増幅に適切であるとして、修飾された従来の培養液中で培養される。
【０５１６】
形質転換は、原核生物の宿主へＤＮＡを導入し、その結果、ＤＮＡが、細胞質因子として又は染色体の成分によって、複製可能であることを意味する。使用される宿主細胞に依存し、形質転換は、そのような細胞に適切な標準配置法を使用して行われる。塩化カルシウムを使用するカルシウム処理は、相当な細胞壁障壁を含む細菌細胞に一般的に使用される。形質転換のための別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを使用する。使用されるまた別の技術は電気穿孔法である。
【０５１７】
本明細書に開示されるポリペプチドを生成するために使用される原核細胞は、当該技術分野にて既知であり且つ選択された宿主細胞の培養に適切である培地において増殖される。適切な培地の例は、必要な栄養補助剤を加えたルリアブロス（ＬＢ）を含む。幾つかの実施形態において、培地はまた、発現ベクターを含有する原核細胞の増殖を選択的に許容するため、発現ベクターの構築に基づいて選択される、選択剤を含む。例えば、アンピシリンは、アンピシリン抵抗性遺伝子を発現する細胞の増殖のため培地に加えられる。
【０５１８】
炭素、窒素、及び無機リン酸塩のソースに加えた任意の必要な補充はまた、適切な濃度で含まれ、単独で導入される、又は、別の補充又は複合の窒素源など培地と組み合わせて導入される。任意に、培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコール酸塩、ジチオエリトリトール、及びジチオトレイトールから成るグループから選択された１以上の還元剤を含み得る。
【０５１９】
原核生物の宿主細胞は適温で培養される。大腸菌増殖のため、例えば、好ましい温度は、約２０℃乃至約３９℃、より好ましくは約２５℃乃至約３７℃、更により好ましくは約３０℃の範囲にある。培地のｐＨは、主として宿主生物に依存して、約５乃至約９に及ぶ任意のｐＨでもよい。大腸菌について、ｐＨは、好ましくは約６．８乃至約７．４、より好ましくは約７．０である。
【０５２０】
誘導プロモーターが本明細書に開示される発現ベクターに使用される場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に適した条件下で誘発される。例えば、ａｒａ  Ｂ又はｐｈｏＡプロモーターは、ポリペプチドの転写を制御するために使用され得る。様々な誘発因子が、当該技術分野にて既知であるように、利用されるベクターコンストラクトに従って使用され得る。
【０５２１】
本開示の発現されたポリペプチドは、宿主細胞のペリプラズムに分泌され、該ペリプラズムから回収され、又は培地に輸送される。ペリプラズムからのタンパク質回収は典型的に、一般的には浸透圧衝撃、音波処理、又は溶解などの手段によって微生物を妨害することに関係する。一旦細胞が妨害されると、細胞破壊片又は全体の細胞は、遠心分離又は濾過によって取り除かれ得る。タンパク質は、例えば親和性レジンクロマトグラフィーによって、さらに精製され得る。代替的に、培地に輸送されるタンパク質は、その中で分離され得る。細胞は、培養液、生成されるタンパク質のさらなる精製のために濾過及び濃縮される培養液上清から除去され得る。発現されたポリペプチドはさらに、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）及びウェスタンブロットアッセイなどの普通に知られている方法を使用して、分離且つ同定することができる。
【０５２２】
抗体産生は、発酵プロセスによって大量に実行され得る。様々な大規模な流加回分発酵手順は、組み換えタンパク質の生産に利用可能である。大規模な発酵は、少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは１，０００乃至１００，０００リットルの容量を有する。これらの発酵槽は、酸素と栄養素、特にグルコース（好ましくは炭素／エネルギー源）を分配するためにアジテーターインペラーを使用する。小規模発酵は、容積がおよそ１００リットルのみである発酵槽における発酵を一般的に指すが、約１リットルから約１００リットルまで変動する場合がある。
【０５２３】
発酵プロセスにおいて、タンパク質発現の誘発は典型的に、所望の密度（例えば約１８０−２２０のＯＤ５５０）に適切な条件下で細胞が増殖した後（その段階では、細胞は早期の固定相に存在する）に、開始される。様々な誘発因子が、当該技術分野にて既知であり且つ上記に記載されるように、利用されるベクターコンストラクトに従って使用され得る。細胞は、誘発前のより短い期間で増殖され得る。より長い又はより短い誘導時間が使用され得るが、細胞は通常約１２−５０時間で誘発される。
【０５２４】
本明細書に開示されるポリペプチドの生産収量及び品質を改善させるために、様々な発酵条件を改変することができる。例えば、適切なアセンブリ、及び分泌された抗体ポリペプチドのフォールディングを改善するため、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、又はＤｓｂＧ）又はＦｋｐＡ（ペプチジルプロリルシス、シャペロン活性を伴うトランス−イソメラーゼ））などの、シャペロンタンパク質を過剰発現する付加的なベクターは、宿主原核細胞を共同変形するために使用され得る。シャペロンタンパク質は、細菌の宿主細胞において生成された異種タンパク質の適切なフォールディング及び可溶性を促進するために実証されてきた。（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ２７４：１９６０１−１９６０５；米国特許第６，０８３，７１５号；米国特許第６，０２７，８８８号；  Ｂｏｔｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  （２０００）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：１７１００−１７１０５；  Ｒａｍｍ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  （２０００）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：１７１０６−１７１１３；  Ａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３９：１９９−２１０を参照）。
【０５２５】
発現された異種タンパク質（特に、タンパク分解性に感受性があるもの）のタンパク質分解を最小限にするために、タンパク質分解酵素には不十分な特定の宿主株が、本開示に使用され得る。例えば、宿主細胞株は、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、及びそれらの組み合わせなどの既知の細菌プロテアーゼをコード化する遺伝子において遺伝子突然変異を達成するために修飾され得る。幾つかの大腸菌プロテアーゼが不十分な株が利用可能である（例えば、前述のＪｏｌｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）；  米国特許第５，２６４，３６５号；米国特許第５，５０８，１９２号；  Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，  ２：６３−７２  （１９９６）を参照）。
【０５２６】
タンパク質分解酵素には不十分であり、且つ１以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドにより変形された大腸菌株は、本明細書に開示される発現系において宿主細胞として使用され得る。
【０５２７】
ｉｉｉ．抗体精製
【０５２８】
当該技術分野にて既知の標準タンパク質精製法を利用することができる。以下の手順は、適切な精製法の典型である：免疫親和性又はイオン交換カラム上の分画、エタノール沈澱、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー、クロマト分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿法、及び、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用するゲル濾過。
【０５２９】
１つの態様において、固相上で固定されたプロテインＡは、本明細書に開示される完全な抗体生成物の免疫親和性の精製のために使用される。プロテインＡは、高親和性により抗体のＦｃ領域に結合するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅａｓからの４１ｋＤ細胞壁タンパク質である（例えば、Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ  （１９８３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ６２：１−１３を参照）。プロテインＡが固定される固相は、好ましくはガラス又はシリカの表面を含み、より好ましくは、制御されたポアガラスカラム又はケイ酸カラムを含む。幾つかの適用において、カラムは、汚染物質の非特異的な結合を防ぐために、グリセリンなどの試薬で覆われた。
【０５３０】
精製の第１工程として、上記に記載されるような細胞培養に由来する調製が、対象の抗体のプロテインＡへの特異的結合を可能にするため、プロテインＡに固定された固相上に適用される。その後、固相は、固相に非特異的に結合された汚染物質を取り除くために洗浄される。最終的に、対象の抗体は溶離によって固相から再生される。
【０５３１】
ｂ．真核生物の宿主細胞を使用する抗体の生成：
【０５３２】
ベクター構成要素は一般的に、限定されないが、以下のものの１以上を含む：シグナル配列、複製起点、１以上の標識遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列。
【０５３３】
（ｉ）シグナル配列構成要素
【０５３４】
真核生物の宿主細胞に使用されるベクターはまた、対象の成熟したタンパク質又はポリペプチドのＮ末端にて特異的な切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドを含み得る。選択される異種のシグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識され且つ加工される（例えば、シグナルペプチターゼによって切断される）ものである。哺乳動物細胞発現において、ウィルス分泌リーダー（例えば、単純ヘルペスｇＤ信号）と同様に哺乳動物シグナル配列も、利用可能である。
【０５３５】
そのような前駆物質領域のためのＤＮＡは、抗体をコード化するＤＮＡに対するリーディングフレームにおいてライゲートされる。
【０５３６】
（ｉｉ）複製起点
【０５３７】
一般的に、複製起点の構成要素は、哺乳動物発現ベクターに必要とされない。例えば、ＳＶ４０起点は早期プロモーターを含むという理由だけで、ＳＶ４０起点が使用され得る。
【０５３８】
（ｉｉｉ）選択遺伝子構成要素
【０５３９】
発現ベクター及びクローン化ベクターは、選択可能な標識とも称される、選択遺伝子を含み得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、テトラサイクリンへの耐性を与え、（ｂ）関連する栄養要求性の欠失を捕捉し、又は（ｃ）複合座から利用可能でない重大な栄養素を供給する、タンパク質をコード化する。
【０５４０】
選択スキームの１つの例は、宿主細胞の増殖を阻止するために薬物を利用する。異種遺伝子と共に上手く変形される細胞は、薬物抵抗性を与えるタンパク質を生成し、故に選択レジメンから残存する。そのような支配的な選択の例は、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びヒグロマイシンを使用する。
【０５４１】
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、好ましくは霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどの抗体核酸を取り上げるのに適当な細胞の同定を可能にするものである。
【０５４２】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子により変形された細胞は、メトトレキサート（Ｍｔｘ）、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストを含む培地において、形質転換体の全てを培養することにより最初に同定される。野生型ＤＨＦＲが利用される時の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）が不足しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。
【０５４３】
代替的に、抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの別の選択可能なマーカーをコード化するＤＮＡ配列により変形される又は共に変形される、宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野生型の宿主）は、アミノグリコシドの抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、Ｇ４１８などの選択可能なマーカーのための選択剤を含む培地における細胞増殖によって、選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照。
【０５４４】
（ｉｖ）プロモーター構成要素
【０５４５】
発現ベクター及びクローン化ベクターは通常、宿主生物によって認識され、且つ抗体ポリペプチド核酸に操作可能に連結されるプロモーターを含む。プロモーター配列は真核生物で知られている。事実上全ての真核細胞遺伝子は、転写が開始する部位から上流に、およそ２５乃至３０の塩基に位置づけられるＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の部位から上流におよそ７０乃至８０の塩基で見出される別の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであり得るＣＮＣＡＡＴ領域である。大半の真核細胞遺伝子の３’末端に、コード配列の３’末端へのポリＡテイルの追加のための信号であり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これら配列はすべて、真核細胞発現ベクターに適切に挿入される。
【０５４６】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、鶏痘ウィルス、アデノウィルス（アデノウィルス２など）、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、及びシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）などのウィルスのゲノムから、異種の哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター）から、熱ショックプロモーターから得られたプロモーターによって制御されるが、そのようなプロモーターは、宿主細胞システムと互換性を持つと仮定する。
【０５４７】
ＳＶ４０ウィルスの早期及び後期のプロモーターは、複製物のＳＶ４０ウィルス起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして、都合良く得られる。ヒトサイトメガロウィルスの早急な早期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして都合良く得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを使用する、哺乳動物宿主にＤＮＡを発現するためのシステムは、米国特許第４，４１９，４４６号に開示される。このシステムの改変は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載される。代替的に、ニワトリ肉腫ウィルスの末端反復配列が、プロモーターとして使用され得る。
【０５４８】
（ｖ）エンハンサー要素の構成要素
【０５４９】
高等真核生物による、本開示の抗体ポリペプチドをコード化するＤＮＡの転写は大抵、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加される。多くのエンハンサー配列が現在、哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）から知られている。真核細胞ウィルスのエンハンサーも使用され得る。例は、複製起点（ｂｐ  １００−２７０）の側面（ｌａｔｅ  ｓｉｄｅ）上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウィルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の側面上のポリオーマエンハンサー、及びアデノウィルスエンハンサーを含む。また、真核生物プロモーターの活性化のための要素の増強については、Ｙａｎｉｖ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８  （１９８２）を参照。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード化配列に対する位置５’又は３’でベクターにスプライスされ得るが、好ましくはプロモーターから部位５’に位置付けられる。
【０５５０】
（ｖｉ）転写終結構成要素
【０５５１】
真核生物の宿主細胞において使用される発現ベクターはまた、典型的に、転写の終了に、及びｍＲＮＡを安定させるのに必要な配列を含む。そのような配列は、真核生物又はウィルスＤＮＡ或いはｃＤＮＡの、５’の、及び時には３’の非翻訳領域から共通して利用可能である。これら領域は、抗体をコード化するｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化されたフラグメントとして転写される、ヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結構成要素は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６、及びその中に開示される発現ベクターを参照。
【０５５２】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択及び形質転換
【０５５３】
本明細書のベクターにおいてＤＮＡをクローン化又は発現するのに適切な宿主細胞は、脊椎動物宿主細胞を含む、本明細書に記載される高等真核生物細胞を含む。培養（組織培養）における脊椎動物細胞の伝播が常法となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）によって変形されるサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児腎臓株（２９３細胞又は懸濁培養における増殖のためサブクローン化される２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：５９  （１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６  （１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，  Ｍａｔｈｅｒ，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ２３：２４３−２５１  （１９８０））；サル腎培養細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，  ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ３８３：４４−６８  （１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０５５４】
宿主細胞へ外来のヌクレオチド配列を導入するための周知の手順の何かが使用され得る。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔法、微粒子銃、リポソーム、微量注入、血漿ベクター、ウィルスベクター、及び、クローン化したゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又は他の外来の遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の周知の方法の使用を含む（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌを参照）。使用される特定の遺伝工学的手法が、少なくとも両方の遺伝子を、生殖系列抗体ポリペプチドを発現することができる宿主細胞に上手く導入することができることが、単に必要である。
【０５５５】
宿主細胞は、抗体産生のため上述の発現ベクター又はクローン化ベクターにより変形され、プロモーターの誘発、形質転換体の選択、又は所望の配列をコード化する遺伝子の増幅に適切であるとして、修飾された従来の培養液中で培養される。
【０５５６】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
【０５５７】
本開示の抗体を生成するために使用される宿主細胞は、様々な培地において培養され得る。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）などの市場で入手可能な培地が、宿主細胞を培養するのに適切である。加えて、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．  ５８：４４  （１９７９），  Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０２：２５５  （１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；又は第５，１２２，４６９号；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０３５７７８；或いは、米国再発行特許第３０，９８５号に記載される培地の何れかは、宿主細胞のための培地として使用され得る。これら培地の何れかが、ホルモン及び／又は他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物など）、痕跡元素（ミクロモルの範囲において終末濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、及びグルコース又は等価エネルギーソースに必要なものとして、補充され得る。任意の他の必要な補充も、当業者に知られる適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に使用されたものであり、当業者に明らかとなるであろう。
【０５５８】
（ｉｘ）抗体の精製
【０５５９】
組み換え技術を使用する場合、抗体は、細胞内で生成され得る、又は培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内で生成される場合、第１工程として、微粒子のデブリ、宿主細胞又は溶解されたフラグメントのいずれかが、例えば遠心分離又は限外濾過によって取り除かれる。抗体が培地に分泌される場合、そのような発現系からの上清は一般的に、市販のタンパク濃度フィルター（例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）限外濾過ユニット）を使用して最初に濃縮される。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために前述の工程の何れかにも含まれ得、抗生物質は、外来性の汚染物質の増殖を防ぐために含まれ得る。
【０５６０】
細胞から調製された抗体組成物は、好ましい精製法である親和クロマトグラフィーにより、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和クロマトグラフィーを使用して、精製され得る。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４の重鎖に基づく抗体を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ６２：１−１３  （１９８３））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプ及びヒトγ３のために推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ５：１５６７１５７５  （１９８６））。親和性リガンドが結合されるマトリックスは大抵、アガロースであるが、他のマトリックスが利用可能である。制御されたポアグラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定したマトリクスは、アガロースにより達成され得る、より速い流速且つより短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）レジン（Ｊ．  Ｔ．  Ｂａｋｅｒ，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，  Ｎ．Ｊ．）は精製に役立つ。イオン交換カラム上の分画、エタノール沈澱、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上のヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー上のクロマトグラフィー、クロマト分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法などのタンパク質精製のための他の技術はまた、回収される抗体に依存して利用可能である。
【０５６１】
細胞質に存在する又はペリプラズム空間から放出される抗体又はフラグメントの可溶形態は、当該技術分野にて既知の方法を使用して更に精製され得、例えば、Ｆａｂフラグメントは、浸透圧衝撃技術によって細菌のペリプラズム空間から放出される。
【０５６２】
抗体又はフラグメントを含む封入体が形成された場合、それらは大抵、内部及び／又は外部の細胞膜に結合することができ、故に、遠心分離の後にペレット物質において主に見出される。その後、ペレット物質は、アルカリｐＨでのジチオトレイトール、又は封入体を放出し、分裂し、且つ可溶性にするための酸ｐＨでのトリスカルボキシエチルホスフィンなどの還元剤の存在下で、ｐＨ極端で、洗浄剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、又は尿素誘導体などのカオトロピック剤により、処理され得る。その後、可溶性の抗体又はフラグメントは、ゲル電気泳動、免疫沈降などを使用して分析され得る。可溶化した抗体を分離するのが望ましい場合、抗原結合性フラグメント分離が、以下に説明される及び「Ｍａｒｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．，  １８２：２６４−２７５  （１９９０））」におけるものなどの標準方法を使用して、達成され得る。
【０５６３】
任意の予備の精製工程に従い、対象の抗体及び汚染物質を含む混合物は、約２．５−４．５の間のｐＨで溶出緩衝液を使用する低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにさらされ、好ましくは低塩濃度（例えば、約０−０．２５Ｍの塩）で実行され得る。
【０５６４】
幾つかの場合において、抗体又はフラグメントは、分離後に生物学的に活性ではない場合もある。ポリペプチドを「再フォールディングする」又はその三次構造に変換する、及びジスルフィド連結を生成する様々な方法が、生物活性を回復するために使用され得る。そのような方法は、通常７より上のｐＨにまで、及びカオトロープの特定の濃度の存在下で、可溶化したポリペプチドを晒す工程を含む。カオトロープの選択は、封入体の可溶化に使用される選択に非常に類似するが、通常、カオトロープは、より低い濃度で使用され、必ずしも可溶化に使用されるカオトロープと同じではない。大抵の場合、再フォールディング溶液／酸化溶液はまた、還元剤、及び、タンパク質のシステインブリッジの形成に生じるためのジスルフィドシャフリングを可能にする特定のレドックス電位を生成するために特定の比率でその酸化形態を加えた還元剤を含む。共通して使用されたレドックス対の幾つかは、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ及び２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ｄｉ−チオ−ｂ（ＭＥ）を含む。多くの例において、助溶剤は、再フォールディングの効率を増加させるために使用され得、この目的に使用される一般の試薬は、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどを含む。
【０５６５】
免疫複合体
本開示はまた、免疫複合体（互換的に、「抗体−薬物複合体」又は「ＡＤＣ」と称される）を提供し、該免疫複合体は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、トキシン（例えば、細菌、菌類、植物、又は動物由来の酵素学的に活性なトキシン、又はそのフラグメント）、又は放射性同位体（例えば放射性複合体）などの細胞毒性薬剤に共役される、本明細書に記載されるような超長ＣＤＲ３を含む。代替的に、免疫複合体は、ペプチドに共役される、本明細書に記載されるような超長ＣＤＲ３を含む抗体の何れかを含む。ペプチドは、非抗体ペプチド、治療用ポリペプチド、サイトカイン、ホルモン、又は成長因子でもよい。ペプチドは、非抗体配列によってコード化され得る。
【０５６６】
抗体−薬物複合体は、細胞毒性薬剤又は細胞静止剤の局所送達に使用され得る。例えば、癌の処置に腫瘍細胞を死滅させる又は阻害する薬物（Ｓｙｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ｅｐｅｎｅｔｏｓ  （１９９９）  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：６０５−６１４；  Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  （１９９７）  Ａｄｖ．  Ｄｒｇ  Ｄｅｌ．  Ｒｅｖ．  ２６：１５１−１７２；  米国特許第４，９７５，２７８号）は、薬物部分の腫瘍への標的送達、及びその中での細胞内蓄積を可能にし、ここで、これら非共役薬剤の全身投与は、通常の細胞、同様に排除されるよう求められる腫瘍細胞に対する毒性の許容できないレベルを結果としてもたらし得る（Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｌａｎｃｅｔ  ｐｐ．  （Ｍａｒ．  １５，  １９８６）：６０３−０５；  Ｔｈｏｒｐｅ，  （１９８５）  “Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，”  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａ．  Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄ．ｓ），  ｐｐ．  ４７５−５０６）。最小の毒性による最大限の効果が、それによって求められる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方は、これらの戦略において有用であると報告されてきた（Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，  ２１：１８３−８７）。これらの方法において使用される薬物は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、及びビンデシンを含む（前述のＲｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６））。抗体−トキシン複合体に使用されるトキシンは、ジフテリアトキシンなどの細菌毒素、リシンなどの植物トキシン、ゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （２０００）  Ｊｏｕｒ．  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ９２（１９）：１５７３−１５８１；  Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （２０００）  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：  １０２５−１０２８；  Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １３：７８６−７９１）、マイタンシノイド  （ＥＰ  １３９１２１３；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３）、及びカリチアマイシン  （Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８：２９２８；  Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  （１９９３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５３：３３３６−３３４２）などの小分子トキシンを含む。トキシンは、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、又はトポイソメラーゼ阻害を含む機構により、その細胞毒性効果及び細胞性静止効果を達成し得る。幾つかの細胞毒性薬物は、大きな抗体又はタンパク質受容体リガンドに共役されると、不活性となる又はあまり活性でなくなる傾向がある。
【０５６７】
ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウクセタン、Ｂｉｏｇｅｎ／Ｉｄｅｃ）は、チオ尿素リンカー−キレート剤によって結合される、標準及び悪性のＢリンパ球、並びに１１１Ｉｎ又は９０Ｙの放射性同位体の表面で見出される、ＣＤ２０抗原に対して導かれるマウスＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体から構成される抗体放射性同位体複合体である（Ｗｉｓｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  （２０００）  Ｅｕｒ．  Ｊｏｕｒ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ２７（７）：７６６−７７；  Ｗｉｓｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ｂｌｏｏｄ  ９９（１２）：４３３６−４２；  Ｗｉｔｚｉｇ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２０（１０）：２４５３−６３；  Ｗｉｔｚｉｇ  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２０（１５）：３２６２−６９）。ＺＥＶＡＬＩＮはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対する活性を有するが、投与は、大半の患者において重度の且つ長引く血球減少症を結果としてもたらす。ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標）（ジェムツツマブオゾガミシン、Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、カリチアマイシンに連結されたｈｕ  ＣＤ３３抗体で構成される抗体薬物複合体は、注入による急性骨髄性白血病の処置のため２０００年に承認された（Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  （２０００）  ２５（７）：６８６；米国特許第４，９７０，１９８号；第５，０７９，２３３号；第５，５８５，０８９号；第５，６０６，０４０号；第５，６９３，７６２号；第５，７３９，１１６号；第５，７６７，２８５号；第５，７７３，００１号）。カンツズマブメルタンシン（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、マイタンシノイド薬物部分、ＤＭ１へジスルフィドリンカーＳＰＰを介して連結されたｈｕＣ２４２抗体で構成される抗体薬物複合体は、結腸、膵臓、胃、及び他のものなどのＣａｎＡｇを発現する癌の処置のための第２相試験に進んでいる。ＭＬＮ−２７０４（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．，  ＢＺＬ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、メイタンシノイド薬物部分、ＤＭ１に連結された抗前立腺特異性の膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体で構成される抗体薬物複合体は、前立腺腫瘍の電位治療のために開発中である。オーリスタチンペプチド、オーリスタチンＥ（ＡＥ）、及びモノメチルオーリスタチン（ＭＭＡＥ）、ドラスチンの合成アナログは、キメラ的なモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌腫上でＬｅｗｉｓ  Ｙに特異的）及びｃＡＣ１０（血液悪性腫瘍上でＣＤ３０に特異的）に共役され（Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ  （２００３）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（７）：７７８−７８４）、治療上の開発下にある。
【０５６８】
免疫共役の生成に有用な化学療法剤が本明細書に記載される。使用され得る酵素学的に活性な毒素又はそのフラグメントは、、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌からの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを含む。例えば、１９９３年１０月２８日公開のＷＯ９３／２１２３２を参照。様々な放射性核種は、放射共役した抗体の産生に利用可能である。例は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅを含む。抗体と細胞毒性薬剤の共役は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオールプロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル（アジプイミド酸ジメチルなど）の二官能性の誘導体、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（トルエン２，６−ジイソシアナートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作られる。例えば、リシン抗毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３８：  １０９８  （１９８７）に記載されるように、調製され得る。炭素−１４−標識化１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に対する放射ヌクレオチドの共役のための典型的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照。
【０５６９】
抗体、及びカリケアマイシン、マイタンシノイド、ドラスチン、オーリスタチン（ａｕｒｏｓｔａｔｉｎｓ）、トリコテセン、及びＣＣ１０６５などの１以上の小分子トキシンの複合体、並びにトキシン活性を有するこれらトキシンの誘導体も、本明細書で考慮される。
【０５７０】
ａ．マイタンシン及びマイタンシノイド
【０５７１】
幾つかの実施形態において、免疫共役は、１以上のマイタンシノイド分子に共役される、本明細書に開示されるような超長ＣＤＲ３を含む抗体（完全長又はフラグメント）を含む。
【０５７２】
マイタンシノイドは、チューブリン重合の阻害により作用する有糸分裂（ｍｉｔｏｔｏｔｉｃ）阻害剤である。マイタンシンは、「ｅａｓｔ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｈｒｕｂ  Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａ」から最初に分離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。後に、特定の微生物がまた、マイタンシノール及びマイタンシノールエステルなどのマイタンシノイドを生成することが見出された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成のマイタンシノール及びその誘導体並びにアナログは、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号；第４，２４８，８７０号；第４，２５６，７４６号；第４，２６０，６０８号；第４，２６５，８１４号；第４，２９４，７５７号；第４，３０７，０１６号；第４，３０８，２６８号；第４，３０８，２６９号；第４，３０９，４２８号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３１７，８２１号；第４，３２２，３４８号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６４，８６６号；第４，４２４，２１９号；第４，４５０，２５４号；第４，３６２，６６３号；及び第４，３７１，５３３号に開示される。
【０５７３】
マイタンシノイド薬物部分は抗体−薬物複合体において誘引性の薬物部分であり、なぜならそれらが：（ｉ）発酵又は化学的修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために比較的利用しやすく、（ｉｉ）抗体に対する非ジスルフィドリンカーを介する共役に適切な官能基による誘導体化に適し、（ｉｉｉ）血漿において安定し、及び（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して効果的であるためである。
【０５７４】
マイタンシノイドを含む免疫複合体、それを作る方法、及びその治療上の使用は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号、及びＥＰ０４２５２３５に開示される。「Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３  （１９９６）」には、マイタンシノイドを含む免疫複合体が、ヒト結腸直腸癌に対して導かれるモノクローナル抗体Ｃ２４２に連結されたＤＭ１を指定したことが記載される。複合体は、培養された結腸癌細胞に対して高度に細胞毒性であると見出され、インビボの腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。「Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１  （１９９２）」には、マイタンシノイドが、ヒト結腸癌細胞株上の抗原に結合するマウスＡ７に、又は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕオンコジーンを結合する別のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１にジスルフィドリンカーを介して共役された免疫複合体が記載される。ＴＡ．１−マイタンシノイド複合体の細胞毒性は、１つの細胞当たり３ｘ１０５のＨＥＲ−２表面抗原を発現する、ヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３上でインビトロで試験された。薬物複合体は、１つの抗体分子当たりのマイタンシノイド分子の数を増やすことにより増加され得る遊離マイタンシノイド薬物に類似する、ある程度の細胞毒性を達成した。Ａ７−マイタンシノイド複合体は、マウスにおいて低い全身性の細胞毒性を示した。
【０５７５】
抗体−マイタンシノイド複合体は、抗体又はマイタンシノイド分子のいずれかの生物活性を著しく減らすことなく、抗体をマイタンシノイド分子に化学的に連結することにより調製される。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号を参照。１つの抗体分子につき共役される平均３−４のマイタンシノイド分子は、抗体の機能又は可溶性に負に影響を及ぼすことなく標的細胞の細胞毒性を増強する際に効果を示したが、トキシン／抗体の１つの分子でさえ、ネイキッド抗体の使用にわたって細胞毒性を増強すると予想される。マイタンシノイドは当該技術分野にて周知であり、既知の技術によって合成され、又は自然源から分離され得る。適切なマイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、及び上記に引用された他の特許及び非特許の刊行物に、開示される。好ましいマイタンシノイドは、芳香環において、又は、様々なマイタンシノールエステルなどのマイタンシノール分子の他の位置にて修飾される、マイタンシノール及びマイタンシノールアナログである。
【０５７６】
抗体−マイタンシノイド複合体を作るための、当該技術分野で既知の多くの連結基が存在し、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、第６，４４１，１６３号、又はＥＰ０４２５２３５、Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１  （１９９２）に開示されるものを含む。リンカー構成要素ＳＭＣＣを含む抗体−マイタンシノイド複合体が調製され得る。連結基は、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、感光基、ペプチダーゼ感光基、又はエステラーゼ感光基、不安定な基、上記特許に開示されるように、好ましいジスルフィド及びチオエーテルの基を含む。付加的な連結基は本明細書に記載且つ例証される。
【０５７７】
抗体及びマイタンシノイドの複合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（トルエン２，６−ジイソシアナート２など）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して、作られ得る。特に好ましいカップリング剤は、ジスフィルド連結を提供するため、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  １７３：７２３−７３７  （１９７８））及びＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）を含む。
【０５７８】
リンカーは、連結のタイプに依存して、様々な位置でマイタンシノイド分子に結合され得る。例えば、エステル連結は、従来のカップリング技術を使用するヒドロキシル基との反応によって形成され得る。反応は、ヒドロキシル基があるＣ−３位置、ヒドロキシメチルで修飾されるＣ−１４位置、ヒドロキシル基で修飾されるＣ−１５位置、及びヒドロキシル基があるＣ−２０位置で生じ得る。好ましい実施形態において、連結は、マイタンシノール又はマイタンシノールアナログのＣ−３位置で形成される。
【０５７９】
ｂ．オーリスタチン及びドラスチン
【０５８０】
幾つかの実施形態において、ドラスタチン又はドラスタチンペプチド性アナログ及び誘導体、オーリスタチンに共役される、免疫複合体は、本明細書に開示される抗体を含む（米国特許第５，６３５，４８３号；第５，７８０，５８８号）。ドラスチン及びオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、及び核分裂並びに細胞分裂に干渉し（Ｗｏｙｋｅ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４５（１２）：３５８０−３５８４）、且つ、抗癌性（米国特許第５，６６３，１４９号）及び抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４２：２９６１−２９６５）を有すると示されてきた。ドラスチン又はオーリスタチンの薬物部分は、ペプチドの薬物部分のＮ（アミノ）末端又はＣ（カルボキシル）末端を介して抗体に結合され得る（ＷＯ０２／０８８１７２）。
【０５８１】
典型的なオーリスタチンの実施形態は、Ｎ末端に連結したモノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦを含む（例えば、米国特許第７，４９８，２９８号を参照）。
【０５８２】
典型的に、ペプチドベースの薬物部分は、２以上のアミノ酸及び／又はペプチドフラグメントの間にペプチド結合を形成することにより調製され得る。そのようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成法（例えば、Ｅ．  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｌｕｂｋｅ，  “Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，  ｖｏｌｕｍｅ  １，  ｐｐ  ７６−１３６，  １９６５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照）に従って、調製され得る。オーリスタチン／ドラスチンの薬物部分は、米国特許第５，６３５，４８３号；米国特許第５，７８０，５８８号；Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ  （１９８９）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１１：５４６３−５４６５；Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １３：２４３−２７７；Ｐｅｔｔｉｔ，  Ｇ．  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  １９９６，  ７１９−７２５；及びＰｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  １  ５：８５９−８６３の方法に従って調製され得る。また、Ｄｏｒｏｎｉｎａ  （２００３）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１（７）：７７８−７８４；  米国特許第７，４９８，２８９号，  （リンカーに共役されるＭＭＡＥ及びＭＭＡＦなどのモノメチルバリン化合物を調製するリンカー及び方法を開示する）も参照。
【０５８３】
ｃ．カリチアマイシン
【０５８４】
他の実施形態において、免疫複合体は、１以上のカリチアマイシン分子に共役される、本明細書に開示される抗体を含む。抗生物質のカリチアマイシンファミリーは、ピコモル以下の（ｓｕｂ−ｐｉｃｏｍｏｌａｒ）濃度で二本鎖ＤＮＡ破壊をもたらすことができる。カリチアマイシンファミリーの複合体の調製については、米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号、第５，８７７，２９６号を参照。使用され得るカリチアマイシンの構造アナログは、限定されないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１を含む（例えば、Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２  （１９９３），  Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８  （１９９８）、及び前述の米国特許を参照）。抗体が共役され得る別の抗腫瘍薬物は、抗葉酸剤であるＱＦＡである。カリチアマイシン及びＱＦＡの両方は、細胞内の作用部位の細胞内部位を有し、且つ原形質膜を容易に渡らない。それ故、抗体を媒介とした内在化を通じたこれら薬剤の細胞の取り込みは、それらの細胞毒性を大きく増強する。
【０５８５】
ｄ．他の細胞毒性薬剤
【０５８６】
本明細書に開示される抗体に共役され得る他の抗腫瘍剤は、ＢＣＮＵ、ストレプトゾシン、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、第５，７７０，７１０号に記載されるＬＬ−Ｅ３３２８８複合体であると総称して知られる薬剤のファミリー、同様にエスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６号）を含む。
【０５８７】
使用され得る酵素学的に活性なトキシン及びそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌からの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテシンを含む。例えば、１９９３年１０月２８日公開のＷＯ９３／２１２３２を参照。
【０５８８】
本開示は更に、抗体と、核酸分解活性を伴う化合物（例えば、デオキシリボヌクレアーゼなどのリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ）の間で形成された免疫複合体を考慮する。
【０５８９】
腫瘍の選択的破壊のために、抗体は高放射能原子を含み得る。様々な放射性同位体は、放射共役した抗体の産生に利用可能である。例は、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体を含む。複合体が検出に使用される場合、それは、再びヨウ素１２３のように、シンチグラフ検査のための放射性原子（例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３）、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像法、ｍｒｉとしても知られる）のためのスピン標識（ヨウ素−２３４再度（ａｇａｉｎ）、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、又は鉄など）を含み得る。
【０５９０】
放射性同位体又は他の標識は、既知の方法で複合体に組み込まれ得る。例えば、ペプチドは生合成され得、又は、例えば、水素の場所にあるフッ素−１９に関する適切なアミノ酸前駆物質を使用する化学的アミノ酸合成によって合成され得る。ｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、及びＩｎ１１１などの標識は、ペプチドにおいてシステイン残基を介して結合され得る。イットリウム−９０はリジン残基を介して結合され得る。ＩＯＤＯＧＥＮ方法（Ｆｒａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （１９７８）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ８０：  ４９−５７）は、ヨウ素−１２３を組み込むために使用され得る。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）には、他の方法が記載される。
【０５９１】
抗体及び細胞毒性薬剤の複合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（トルエン２，６−ジイソシアナート２など）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して、作られ得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８  （１９８７）に記載されるように調製され得る。炭素−１４−標識化１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に対する放射ヌクレオチドの共役のための典型的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照。リンカーは、細胞における細胞毒性薬物の放出を促進する「開裂可能なリンカー」でもよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１  （１９９２）；  米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。
【０５９２】
本明細書に開示される化合物は特に、限定されないが、次の架橋剤試薬により調製されたＡＤＣを考慮する：（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌ．，  Ｕ．Ｓ．Ａから）市場で入手可能な、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルフォ−ＥＭＣＳ、スルフォ−ＧＭＢＳ、スルフォ−ＫＭＵＳ、スルフォ−ＭＢＳ、スルフォ−ＳＩＡＢ、スルフォ−ＳＭＣＣ、及びスルフォ−ＳＭＰＢ、並びにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾアート）。２００３−２００４年の出願ハンドブック及びカタログの４６７−４９８ページを参照。
【０５９３】
ｅ．抗体薬物複合体の調製
【０５９４】
本明細書に開示される抗体薬物複合体において、抗体（Ａｂ）は、リンカー（Ｌ）を介して、１以上の薬物部分（Ｄ）、例えば、１つの抗体当たり約１乃至約２０の薬物部分に共役される。式Ｉ［Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ］のＡＤＣは、次のものを含む、当業者に既知の有機化合物反応、条件、及び試薬を使用する、様々な手段によって調製され得る：（１）共有結合を介して、Ａｂ−Ｌを形成するため、二価のリンカー試薬との抗体の求核基の反応、その後、薬物部分Ｄとの反応；及び（２）共有結合を介して、Ｄ−Ｌを形成するため、二価のリンカー試薬との薬物部分の求核基の反応、その後、抗体の求核基の反応。ＡＤＣを調製する更なる方法は本明細書に記載される。
【０５９５】
リンカーは、１以上のリンカー構成要素から構成され得る。典型的なリンカー構成要素は、６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン−シトルリン（「ｖａｌ−ｃｉｔ」）、アラニン−フェニルアラニン（「ａｌａ−ｐｈｅ」）、（ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）（「ＰＡＢ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノアート（「ＳＰＰ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシラート（「ＳＭＣＣ」）、及びＮ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノ安息香酸塩（「ＳＩＡＢ」）を含む。更なるリンカー構成要素は当該技術にて既知であり、その幾つかが本明細書に開示される（例えば、米国特許第７，４９８，２９８号を参照）。
【０５９６】
幾つかの実施形態において、リンカーはアミノ酸残基を含み得る。典型的なアミノ酸リンカー構成要素は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、又はペンタペプチドを含む。典型的なジペプチドは：バリン−シトルリン（ｖｃ又はｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆ又はａｌａ−ｐｈｅ）を含む。典型的なトリペプチドは：グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）及びグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）を含む。アミノ酸リンカー構成要素を含むアミノ酸残基は、シトルリンなどの、アナログを含む小さなアミノ酸及び非自然発生のアミノ酸と同様に、自然に生じるものを含む。アミノ酸リンカー構成要素は、特定の酵素、例えば、腫瘍関連のプロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ、及びＤ、又はプラスミンプロテアーゼにより、酵素切断に関する選択性において設計及び最適化され得る。
【０５９７】
抗体上の求核基は、限定されないが：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化する糖水酸基又はアミノ基を含む。アミン基、チオール基、及びヒドロキシル基は求核性であり、次のものを含むリンカー部分及びリンカー試薬上での求電子基との共有結合を形成するために反応することができる：（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物などの活性エステル；（ｉｉ）アルキル、及びハロアセトアミドなどのハロゲン化ベンジル；（ｉｉｉ）アルデヒド基、ケトン基、カルボキシル基、及びマレイミド基。特定の抗体は、縮小可能な鎖間のジスルフィド、例えばシステインブリッジを有する。抗体は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）などの還元剤による処理によるリンカー試薬との共役のため反応的にされ得る。各システインブリッジは故に、理論上、２つの反応的なチオール求核試薬を形成するであろう。更なる求核基は、アミンのチオールへの転換を結果として生じる、２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔの試薬）とのリジンの反応を通じて、抗体に導入され得る。反応的なチオール基は、１、２、３、４、又はそれ以上のシステイン残基の導入（例えば、１以上の非天然のシステインアミノ酸残基を含む突然変異体抗体を調製する）により、抗体（又はそのフラグメント）に導入され得る。
【０５９８】
本明細書に開示される抗体薬物複合体はまた、リンカー試薬又は薬物上で求核性の置換基と反応し得る求電子部分を導入するため抗体の修飾によって生成され得る。グリコシル化した抗体の糖は、リンカー試薬又は薬物部分のアミン基に反応し得るアルデヒド基又はケトン基を形成するために、例えば、過ヨウ素酸塩酸化剤により酸化され得る。結果として生じるイミンシッフ塩基の基は、安定した連結を形成し、又は、例えば安定したアミン連結を形成するホウ化水素試薬によって還元され得る。１つの実施形態において、グリコシル化した抗体の炭水化物部分と、ガラクトースオキシダーゼ又はメタ過ヨウ素酸ナトリウとの反応は、薬物上で適切な基に反応し得るタンパク質においてカルボニル（アルデヒド及びケトン）基をもたらし得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。別の実施形態において、Ｎ末端セリン又はトレオニン残基を含むタンパク質は、第１アミノ酸の場所においてアルデヒドの生産を結果として生じるメタ過ヨウ素酸ナトリウムに反応することができる（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ  ＆  Ｓｔｒｏｈ，  （１９９２）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ３：１３８−１４６；  米国特許第５，３６２，８５２号）。そのようなアルデヒドは、薬物部分又はリンカー求核試薬に反応され得る。
【０５９９】
同様に、薬物部分上の求核基は、限定されないが：アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシラート、及び、次のものを含むリンカー部分及びリンカー試薬上で求電子基との共有結合を形成するために反応することができるアリールヒドラジドの基を含む：（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物などの活性エステル；（ｉｉ）アルキル、及びハロアセトアミドなどのハロゲン化ベンジル；（ｉｉｉ）アルデヒド基、ケトン基、カルボキシル基、及びマレイミド基。
【０６００】
代替的に、抗体と細胞毒性薬剤を含む融合タンパク質は、例えば、組み換え技術又はペプチド合成によって作られ得る。ＤＮＡの長さは、互いに隣接している、又は、複合体の所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコード化する領域によって分離されている、複合体の２つの部分をコード化する各領域を含み得る。
【０６０１】
また別の実施形態において、抗体は、腫瘍のプレターゲティングにおける利用のため「受容体」（前記ストレプトアビジン）に共役され得、ここで、抗体−受容体の複合体が患者に投与され、その後、未結合の複合体が清澄剤を使用して循環から除去され、次に、細胞毒性薬剤（例えば放射ヌクレオチド）に共役される「リガンド」（例えばアビジン）が投与される。
【０６０２】
設計されたハイブリドーマ
ハイブリドーマ細胞は、不死化細胞株（通常、ミエローマ細胞株）を有する所望の抗体を生成するＢ細胞を融合させることにより生成され得、その結果、結果として生じる融合細胞は、特定の抗体を分泌する不死細胞株となる。同じ原理によって、ミエローマ細胞は最初に、生殖系列抗体Ｖ領域をコード化する核酸とによりトランスフェクトすることができ、生殖系列Ｖ領域の発現のためにスクリーニングされ得る。タンパク質分解性の軽鎖発現の最高水準を有するそれらミエローマ細胞は、所望の標的タンパク質特異性を有する抗体をもたらすＢ細胞にその後融合される場合がある。融合細胞は、２つのタイプの抗体を生成する：１つは、組み換え生殖系列Ｖ領域（重又は軽の何れか）に操作可能に結合された内因性の抗体鎖（重又は軽の何れか）を含む異種抗体であり、もう１つは、親のＢ細胞が分泌する同じ抗体（例えば、内因性の重鎖及び軽鎖の両方）である。操作可能に結合された異種の重鎖及び軽鎖は、クロマトグラフィーなどの従来の方式によって分離され得、同定は、標的タンパク質結合分析、生殖系列ポリペプチドの独特なタグを同定するアッセイ、又は、本開示の他のセクションに記載されるエンドペプチダーゼ活性のアッセイによって確認することができる。幾つかの場合、異種抗体は、２つのタイプの抗体中に多くある主なタイプである場合、そのような分離は必要とされないこともある。ウシハイブリドーマを含むハイブリドーマは、超長ＣＤＲ３配列を含むウシ抗体遺伝子配列のソースでもよい。
【０６０３】
トランスジェニック哺乳動物
本開示の生殖系列抗体ポリペプチドをコード化する核酸配列は、生殖系列抗体ポリペプチドを発現するトランスジェニック動物を生じさせるために非ヒト哺乳動物に導入され得る。より共通して見られるトランスジェニック動物モデルと異なり、本開示のトランスジェニック哺乳動物によって発現した導入遺伝子は、体細胞組換に従い抗体鎖の可変領域に起因する内因性のコード配列の少なくとも１つの対立遺伝子を交換する必要はない。対立遺伝子排除のため、生殖系列Ｖ領域ＤＮＡの外因性の、後体細胞の（ｐｏｓｔ−ｓｏｍａｔｉｃ）再配列バージョンの存在は、前体細胞の（ｐｒｅ−ｓｏｍａｔｉｃ）再配列Ｖ低分子化遺伝子の内因性の対立遺伝子が、体細胞の再配置を受け、且つこの哺乳動物がもたらし得る抗体鎖の組み立てに寄与することを阻害する。故に、特定の抗原にさらされると、哺乳動物は、１つの内生的に再配置された抗体鎖、及び先天的に再配列された１つのトランスジェニック遺伝子を含む異種抗体を生成するであろう。そのような異種抗体は、研究において、及び生きた被験体の特定の疾病を処置する際に非常に貴重である。他方、内因性の対立遺伝子の位置への導入遺伝子の統合を導く方法は、同様に本開示を実行する目的を完全に果たすであろう。
【０６０４】
トランスジェニック動物を生成する一般的な方法が、十分に確立され頻繁に実行されてきた。トランスジェニック動物の生成、及び遺伝子操作の方法に関するレビュー並びにプロトコルについては、例えば、Ｍａｎｓｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３４８−３５２  （１９８８）；  Ｃａｐｅｃｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  ５：７０−７６  （１９８９）；  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−１２９２  （１９８９）；  Ｃａｐｅｃｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｐｐ４５−５２，  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，  Ｍ．Ｒ．  （ｅｄ．），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９）；  Ｆｒｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ５６：  １４５−１４７  （１９８９）；  Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：４４３８−４４４２  （１９８５）；  Ｅｖａｎｓ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６  （１９８１）；  Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：２５５−２５８  （１９８４）；  Ｇｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：９０６５−９０６９  （１９８６）；  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：４４５−４４８  （１９８６）；  Ｊａｅｎｉｓｃｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１４６８−１４７４  （１９８８）；  ａｎｄ  Ｓｉｅｄｅｌ，  Ｇ．  Ｅ．，  Ｊｒ．，  ”Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｔｔｌｅ”  ｉｎ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，  ｐａｇｅ  ３２３，  Ｌ．  Ｍａｓｔｒｏｉａｎｎｉ，  Ｊｒ．  ａｎｄ  Ｊ．  Ｄ．  Ｂｉｇｇｅｒｓ，  ｅｄ．，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８１）を参照。
【０６０５】
本開示の典型的なトランスジェニック動物はマウスであり、一方で多くの他のトランスジェニック動物も、同じ一般的な方法を使用して生成され得る。これら動物は、限定されないが、ウサギ、ヒツジ、畜牛、及びブタを含む（Ｊａｅｎｉｓｃｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１４６８−１４７４  （１９８８）；  Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｎｉｍａｌ．  Ｓｃｉ．  ６３：２６９  （１９８６）；  Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：６８０  （１９８５）；  Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ２１：２９  （１９８４））。
【０６０６】
医薬組成物
本明細書に開示される、超長ＣＤＲ３、抗体フラグメント、核酸、又はベクターを含む抗体は、組成物、特に医薬組成物において処方され得る。超長ＣＤＲ３を含む抗体を伴うそのような組成物は、適切な担体（例えば、薬学的に許容可能な薬剤）と組み合わせた、本明細書に開示される、超長ＣＤＲ３、抗体フラグメント、核酸、又はベクターを含む抗体の、治療上又は予防的に効果的な量を含む。典型的に、本明細書に開示される超長ＣＤＲ３、抗体フラグメント、核酸、又はベクターを含む抗体は、医薬組成物における処方前の投与のために十分に精製される。
【０６０７】
本医薬組成物に使用される、薬学的に許容可能な塩、賦形剤、又はビヒクルは、担体、賦形剤、希釈剤、抗酸化剤、防腐剤、着色剤、着香料及び希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、充填剤、増量剤、バッファー、送達ビヒクル、等張化剤、共溶媒、湿潤剤、錯化剤、緩衝剤、抗菌剤、及び界面活性剤を含む。
【０６０８】
中性の緩衝食塩水又は血清アルブミンと混合された食塩水は、典型的な適切な担体である。医薬組成物は、アスコルビン酸など抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及び、グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩を形成するカウンターイオン；及び／又は、Ｔｗｅｅｎ、ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含み得る。また、一例として、適切な浸透圧増強剤は、アルカリ金属ハロゲン化物（好ましくはナトリウム又は塩化カリウム）、マンニトール、ソルビトールなどを含む。適切な防腐剤は、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸などを含む。過酸化水素も防腐剤として使用され得る。適切な共溶媒は、グリセリン、プロピレングリコール、及びＰＥＧを含む。適切な錯化剤は、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、又はヒドロキシ−プロピル−ベータ−シクロデキストリンを含む。適切な界面活性剤又は湿潤剤は、ソルビタンエステル、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポールなどを含む。バッファーは、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、又はトリス−ＨＣｌなどの従来のバッファーでもよい。緩衝酢酸溶液は約ｐＨ４−５．５でもよく、トリス緩衝液は約ｐＨ７−８．５でもよい。追加の医薬品は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９０」にて説明される。
【０６０９】
組成物は、液体の形態、又は、凍結乾燥或いは冷凍乾燥した形態でもよく、リオプロテクタント、賦形剤、界面活性剤、高分子量の構造的な添加剤、及び／又は増量剤の１以上を含み得る（例えば、米国特許第６，６８５，９４０号、第６，５６６，３２９号、及び第６，３７２，７１６号を参照）。１つの実施形態において、スクロース、ラクトース、又はトレハロースなどの非還元糖であるリオプロテクタントが含まれる。一般的に含まれるリオプロテクタントの量は、再構築後に、結果として生じる製剤が等張になるような量であるが、高張性又はわずかに低張性の製剤も適切である。加えて、リオプロテクタントの量は、凍結乾燥後にタンパク質の崩壊及び／又は凝集の許容できない量を防ぐのに十分でなくてはならない。あらかじめ凍結乾燥された製剤における糖（例えば、スクロース、ラクトース、トレハロース）についての典型的なリオプロテクタント濃度は、約１０ｍＭ乃至約４００ｍＭである。別の実施形態において、界面活性剤が含まれ、該界面活性剤は、例えば、非イオン性界面活性剤、及びポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）などのイオン性界面活性剤；ポロクサマー（例えば、ポロクサマー１８８）；ポリ（エチレングリコール）フェニルエーテル（例えば、トリトン）；硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｌａｕｒｅｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）；ナトリウムオクチル配糖体；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、又はステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、又はステアリル−サルコシン；リノレイル、ミリスチル−、又はセチル−ベタイン；ラウロアミノプロピル−、コカミドプロピル−、リノレアミドプロピル−、ミリストアミドプロピル−、パルミドプロピル−、又はイソステアルアミドプロピル−ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリストアミドプロピル−パルミドプロピル−、又はイソステアルアミドプロピル−ジメチルアミン；ナトリウムメチルココイル−、又はジナトリウムメチルオレイル（ｏｆｅｙｌ）−タウレート；及びＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，  Ｎ．Ｊ．）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、及び、エチレンとプロピレングリコールのコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ，ＰＦ６８など）などである。あらかじめ凍結乾燥された製剤に存在する典型的な量の界面活性剤は、約０．００１−０．５％である。高分子量の構造的な添加剤（例えば、充填剤、結合剤）は、例えば、アカシア、アルブミン、アルギン酸、リン酸カルシウム（二塩基）、セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、デキストラン、デキストリン、デキストラート、スクロース、チロース、α澱粉、硫酸カルシウム、アミロース、グリシン、ベントナイト、マルトース、ソルビトール、エチルセルロース、リン酸水素２ナトリウム、二ナトリウムリン酸塩、二ナトリウムピロ亜硫酸塩、ポリビニルアルコール���ゼラチン、グルコース、グアーガム、液状グルコース、圧縮可能な糖、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、バクガデキストリン、ポリエチレンオキシド、ポリメタクリレート、ポビドン、アルギン酸ナトリウム、トラガカント微結晶性セルロース、デンプン、及びゼインを含み得る。高分子量の構造的な添加剤の典型的な濃度は、０．１重量％乃至１０重量％である。他の実施形態において、増量剤（例えば、マンニトール、グリシン）が含まれ得る。
【０６１０】
組成物は、非経口投与に適するものでもよい。典型的な組成物は、関節内、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、又は損傷内の経路など、当業者に利用可能な任意の経路による動物への注入又は点滴に適している。非経口製剤は典型的に、任意に薬学的に許容可能な防腐剤を含む、無菌の、ピロゲンが無い、等張の水溶液であろう。
【０６１１】
非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルである。水性担体は、食塩水及び緩衝化した培地を含む、水、アルコール／水溶液、乳剤、又は懸濁液を含む。非経口のビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロース、及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル（ｌａｃｔａｔｅｄ  Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ）、又は固定油を含む。静脈内のビヒクルは、液体及び栄養素の補充液、リンゲルのデキストロースに基づくものなどの電解質補充液を含む。防腐剤及び他の添加剤はまた、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどに存在し得る。一般的に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １６ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｅｄｓ．，  １９８０を参照。
【０６１２】
本明細書に記載される医薬組成物は、生成物の局所濃度を提供する様式で制御又は維持された送達（例えば、ボーラス、デポ効果）のため、及び／又は特定の環境における安定性又は半減期を増加させるため、処方され得る。組成物は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの高分子化合物の微粒子の調製を伴う、本明細書に開示される超長ＣＤＲ３、抗体フラグメント、核酸、又はベクターを含む抗体の製剤、同様に、生物分解性のマトリックス、注入可能な微粒子、マイクロカプセル粒子、マイクロカプセル、生体分解可能な粒子のビーズ、リポソームなどの薬剤、及び、デポ注入として後に送達され得る活性薬剤の制御又は維持された放出を提供する注入可能な送達デバイス含む抗体の製剤を含むことができる。そのような維持又は制御された送達手段を処方する技術は既知であり、様々なポリマーが開発され、薬物の制御放出及び送達に使用されてきた。そのようなポリマーは典型的に生物分解性且つ生体適合性である。エナンチオマーのポリマー又はポリペプチド・セグメントの錯体生成によって形成されるものを含む高分子ヒドロゲル、及び熱感受性又はｐＨ感受性の特性を持つヒドロゲルが、生物活性のタンパク物質（例えば、超長ＣＤＲ３を含む抗体）の捕捉に関与する穏やか且つ水性の条件のため、薬物デポ効果を提供するのに望ましい場合がある。例えば、ＷＯ９３／１５７２２における、医薬組成物の送達のための多孔性重合体微小粒子の制御放出の記載を参照。
【０６１３】
この目的に適切な物質は、ポリラクチド（例えば、米国特許第３，７７３，９１９号を参照）、ポリ−（ａ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８Ａ）などのポリ−（Ａ−ヒドロキシカルボン酸）のポリマー、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチルＬ−グルタミン酸塩のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，  ２２：  ５４７−５５６  （１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．，  １５：  １６７−２７７  （１９８１），  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｒ，  Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．，  １２：  ９８−１０５  （１９８２））、エチレン酢酸ビニル、又はポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。他の生分解性ポリマーは、ポリ（ラクトン）、ポリ（アセタール）、ポリ（オルトエステル）、及びポリ（オルトカーボネート）を含む。徐放性の組成物はまた、当該技術分野で既知の様々な方法の何れかによって調製され得るリポソームを含み得る（例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８２：  ３６８８−９２  （１９８５）を参照）。担体自体、又はその分解生成物は、標的組織において無毒でなくてはならず、疾病を更に悪化させてはならない。これは、標的障害の動物モデルにおける、又は、そのようなモデルが利用不可能な場合、通常の動物における、慣習のスクリーニングによって、決定され得る。
【０６１４】
徐放性のための組み換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン−（ｒｈＩＦＮ−）、インターロイキン２、及びＭＮ  ｒｇｐ１２０により、上手く実行されてきた。Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  ２：７９５−７９９  （１９９６）；  Ｙａｓｕｄａ，  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｔｈｅｒ．，  ２７：１２２１−１２２３  （１９９３）；  Ｈｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ８：７５５−７５８  （１９９０）；  Ｃｌｅｌａｎｄ，  “Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，”  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，  ｅｄｓ，  （Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９５），  ｐｐ．  ４３９−４６２；  ＷＯ９７／０３６９２，  ＷＯ９６／４００７２，  ＷＯ９６／０７３９９；  及び米国特許第５，６５４，０１０号。これらタンパク質の徐放性製剤は、その生体適合性及び広範囲の生物分解性の特性のため、ポリ−乳酸−共グリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを使用して開発された。ＰＬＧＡ、乳酸、及びグリコール酸の分解生成物は、人体内で素早く取り除かれ得る。さらに、このポリマーの分解性は、その分子量と組成物に依存し得る。Ｌｅｗｉｓ，  “Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｌａｃｔｉｄｅ／ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ，”  ｉｎ：  Ｍ．  Ｃｈａｓｉｎ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｌａｎｇｅｒ  （Ｅｄｓ．），  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９０），  ｐｐ．  １−４１。徐放性組成物の更なる例は、例えば、ＥＰ５８，４８１Ａ、米国特許第３，８８７，６９９号、ＥＰ１５８，２７７Ａ、カナダ特許第１１７６５６５号、Ｕ．  Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２，  ５４７  ［１９８３］，  Ｒ．  Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．  １２，  ９８  ［１９８２］，  Ｓｉｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌｅａｓｅ  ９０，  ２６１  ［２００３］，  Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８，  ２４  ［２０００］，  及びＤａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ  Ｂ  Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ４１，  １１７  ［２００５］を含む。
【０６１５】
生体接着性ポリマーも、本開示の組成物において又は該組成物との使用のために考慮される。生体接着剤は、拡張した期間に生体基質に結合することができる合成且つ自然発生の物質である。例えば、カルボポール及びポリカルボフィルは両方とも、ポリ（アクリル酸）の合成の架橋誘導体である。自然発生物質に基づく生体接着性送達システムは、例えばヒアルロナンとしても知られるヒアルロン酸を含む。ヒアルロン酸は、Ｄ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの残基から成る、自然発生のムコ多糖類である。ヒアルロン酸は、結合組織、同様に関節液、及び目のガラス液及び眼房液を含む、脊椎動物の細胞外組織マトリックスに見出される。ヒアルロン酸のエステル化した誘導体は、生体適合性且つ生物分解性である、送達における使用のための微粒子を生成するために使用されてきた（例えば、Ｃｏｒｔｉｖｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  （１９９１）  １２：７２７−７３０；  ＥＰ５１７，５６５；  ＷＯ９６／２９９９８；  Ｉｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌ．  （１９９４）  ２９：１３３−１４１を参照）。本開示の典型的なヒアルロン酸含有組成物は、ヒアルロン酸ポリマーに対して超長ＣＤＲ３を含む抗体の約０．１乃至約４０％（ｗ／ｗ）の量で、ヒアルロン酸エステルポリマーを含む。
【０６１６】
生物分解性及び非生物分解性の両方である重合体のマトリックスは、本開示の組成物を送達するために使用され得、そのような重合体のマトリックスは天然又は合成のポリマーを含み得る。生物分解性のマトリックスが好ましい。放出が生じる期間は、ポリマーの選択に基づく。典型的に、数時間と３乃至１２か月の間に及ぶ期間にわたる放出が、最も望ましい。生物分解性の送達システムを形成するために使用され得る典型的な合成ポリマーは、次のものを含む：乳酸及びグリコール酸のポリマー、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハロゲン化物、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリ無水物、ポリウレタン及びその共同ポリマー、ポリ（ブティック酸（ｂｕｔｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリ（吉草酸）、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル酸エステル及びメタクリル酸エステルのポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシルエチルセルロース、三酢酸セルロース、セルロース硫酸ナトリウム塩、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、ポリ（アクリル酸オクタデシル）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリビニルアセテート、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、及びポリビニルピロリドン。典型的な天然ポリマーは、アルギン酸塩、及び、デキストラン及びセルロースを含む他の多糖類、コラーゲン、その化学誘導体（置換、化学基（例えば、アルキル、アルキレン）の追加、ヒドロキシル化、酸化、及び当業者によって慣例的に行われる他の修飾）、アルブミン及び他の親水性タンパク質、ゼイン及び他のプロラミン並びに疎水性タンパク質、コポリマー、及びそれらの混合物を含む。一般に、これら物質は、酵素加水分解又はインビボでの水への暴露によって、表面浸食又はバルク浸食によって、分解される。ポリマーは、水中でその重量の約９０％までを吸収出来るヒドロゲルの形態であり（例えば、ＷＯ０４／００９６６４，  ＷＯ０５／０８７２０１，  Ｓａｗｈｎｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  １９９３，  ２６，  ５８１−５８７を参照）、及び更に、随意に多価イオン又は他のポリマーに架橋される。
【０６１７】
送達システムはまた、コレステロール、コレステロールエステルなどのステロール、又はモノ−、ジ−、及びトリグリセリドなどの脂肪酸又は中性脂肪を含む脂質である非ポリマーシステム；ヒドロゲル放出システム；サイラスティックシステム；ペプチドベースのシステム；ワックス被覆；従来の結合剤及び賦形剤を使用する圧縮錠剤；部分的に融合したインプラントなどを含む具体的な例は、限定されないが、以下のものを含む：（ａ）米国特許第４，４５２，７７５号、第４，６７５，１８９号、及び第５，７３６，１５２号に記載されるものなどのマトリックス内の形態に生成物が含まれている、侵食システム、及び、（ｂ）米国特許第３，８５４，４８０号、第５，１３３，９７４号、及び第５，４０７，６８６号に記載されるもの等のポリマーから制御された速度で生成物が浸透する、拡散システム。生成物を含むリポソームは、例えば、（ＤＥ３，２１８，１２１；  Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８２：  ３６８８−３６９２  （１９８５）；  Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７：  ４０３０−４０３４  （１９８０）；  ＥＰ５２，３２２；  ＥＰ３６，６７６；  ＥＰ８８，０４６；  ＥＰ１４３，９４９；  ＥＰ１４２，６４１；  ＪＰ８３−１１８００８；  米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号；並びにＥＰ１０２，３２４）などの既知の方法によって調製され得る。
【０６１８】
代替的に又は付加的に、組成物は、膜、スポンジ、又は他の適切な物質の影響を受けた領域への移植を介して局所的に投与され得、前述の他の適切な物質の上で、本明細書に開示される超長ＣＤＲ３、抗体フラグメント、核酸、又はベクターを含む抗体が、吸収された又は閉じ込められた。移植デバイスが使用される場合、該デバイスは、任意の適切な組織又は臓器に移植され得、本明細書に開示される超長ＣＤＲ３、抗体フラグメント、核酸、又はベクターを含む抗体の送達は、ボーラスを介して、又は連続投与を介して、或いは持続注入を使用するカテーテルを介して、デバイスを直接通ることができる。
【０６１９】
本明細書に開示される超長ＣＤＲ３、抗体フラグメント、核酸、又はベクターを含む抗体を含む医薬組成物は、例えば乾燥粉末等のように、吸入のために処方され得る。吸入溶液はまた、エアロゾル送達のため液化された推進薬で処方され得る。また別の製剤において、溶液は霧状とされ得る。経肺投与のための追加の医薬組成物は、例えば、化学的に修飾したタンパク質の肺送達を開示するＷＯ９４／２００６９に記載されるものを含む。肺送達のために、粒径は、遠位の肺への送達に適していなければならない。例えば、粒径は１μｍ乃至５μｍでもよい；しかし、例えば、各分子がかなり多孔性である場合、より大きな粒子が使用され得る。
【０６２０】
本明細書に開示される超長ＣＤＲ３、抗体フラグメント、核酸、又はベクターを含む抗体を含む特定の製剤は、経口投与され得る。この様式で投与される製剤は、錠剤又はカプセル等の固形剤形の配合に習慣的に使用される担体と共に、又は該担体無しで処方され得る。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティが最大限にされ、且つ前全身性の崩壊が最小限にされると、胃腸管にある点に、製剤の有効成分を放出するよう設計され得る。追加の薬剤は、選択的結合剤の吸収を促進するために含まれ得る。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤も利用され得る。
【０６２１】
別の調製は、錠剤の製品に適している無毒な賦形剤を伴う混合物中に、本明細書に開示される超長ＣＤＲ３、抗体フラグメント、核酸、又はベクターを含む抗体の効果的な量を含み得る。滅菌水、又は別の適切なビヒクル中で錠剤を溶解することによって、溶液は単位用量の形態で調製され得る。適切な賦形剤は、限定されないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム又は重炭酸ナトリウム、ラクトース、又はリン酸カルシウムなどの不活性な希釈剤；又は、デンプン、ゼラチン、又はアカシアなどの結合剤；或いは、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、又はタルクなどの潤滑剤を含む。
【０６２２】
適切な及び／又は好ましい医薬製剤は、意図される投与経路、送達フォーマット、及び所望の投与量に依存して、本開示及び製剤技術の一般知識を考慮して決定され得る。投与方法にかかわらず、効果的な用量は、患者の体重、体表面積、又は臓器の大きさに従って計算され得る。本明細書に記載される製剤の各々に関する処理に適切な投与量を決定するための計算のさらなる改良が、当該技術分野で慣例的に行われ、且つ、当該技術分野で慣例的に行われるタスクの範囲内にある。適切な投与量は、適切な用量反応のデータの使用を通じて確認され得る。
【０６２３】
幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３又はそのフラグメントを含む抗体は、修飾したＦｃ領域に提供され、ここで、自然発生のＦｃ領域は、生物学的環境における抗体又はフラグメントの半減期、例えば、血清半減期又はインビトロのアッセイにより測定される半減期を増加するために修飾される。ＩｇＧのＦｃ領域の本来の形態を変更する方法はまた、米国特許第６，９９８，２５３号に記載される。
【０６２４】
特定の実施形態において、血清半減期を増加させるために抗体又はフラグメントを修飾すること（例えば、血清半減期を増加させるため抗体に、多糖類ポリマーを含むＰＥＧ又は他の水溶性ポリマーなどの分子を加える）が、望ましい場合がある。これはまた、例えば、サルベージ受容体結合エピトープの抗体フラグメントへの組み込みにより（例えば、抗体フラグメントにおける適切な領域の突然変異により、又は、例えばＤＮＡ又はペプチド合成によって、エピトープを、末端又は中間にて抗体フラグメントに後に融合されるペプチドタグに組み込むことにより）達成され得る（国際公開第ＷＯ９６／３２４７８号を参照）。サルベージ受容体結合エピトープは、ＩｇＧ分子（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のインビボの血清半減期を増加させる原因である、ＩｇＧ分子のＦｃ領域のエピトープを指す。
【０６２５】
サルベージ受容体結合エピトープは、Ｆｃドメインの１又は２のループからの任意の１以上のアミノ酸残基が、抗体フラグメントのアナログの位置に移される領域を含み得る。さらにより好ましくは、Ｆｃドメインの１又は２つのループからの３以上の残基が、移される。さらにより好ましくは、エピトープは、（例えばＩｇＧの）Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから採取され、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、又はＶＨ領域、或いは１より多くのそのような領域に移される。代替的に、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから採取され、抗体フラグメントのＣＬ領域又はＶＬ領域、或いはその両方に移される。また、Ｆｃ変異体及びサルベージ受容体とのそれらの相互作用について記載する、ＷＯ９７／３４６３１及びＷＯ９６／３２４７８を参照。
【０６２６】
Ｆｃ受容体結合部位内の残基の突然変異は、変更されたＡＤＣＣ又はＣＤＣの活性、或いは変更された半減期など、変更されたエフェクター機能を結果としてもたらし得る。可能な突然変異は、アラニンによる置換、保存的置換、非保存的置換、又は、異なるＩｇＧサブクラスからの同じ位置での対応するアミノ酸残基による置換（例えば、その位置でＩｇＧ１残基を対応するＩｇＧ２残基に置換する）を含む、１以上の残基の挿入、欠失、又は置換を含む。例えば、（ＩｇＧ１及びＩｇＧ２における位置で見出される）プロリンに、ＩｇＧ４のアミノ酸位置２４１でセリンを突然変異させることが、均質な抗体の生成、同様に、本来のキメラＩｇＧ４と比較して、血清半減期の拡張、及び組織分布の改善を引き起こしたことが、報告された。（Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３０：１０５−８，  １９９３）。
【０６２７】
幾つかの実施形態において、超長ＣＤＲ３を含む抗体を含む医薬組成物；及び薬学的に許容可能な担体が開示される。抗体は、治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体を含み得る。治療用ペプチドは、非抗体配列でもよい。治療用ポリペプチド、その誘導体或いは変異体は、ＣＤＲ３内にあり得る。幾つかの例において、治療用ポリペプチドは、Ｍｏｋａ１、Ｖｍ２４、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ヒトＥＰＯ、ヒトＦＧＦ２１、ヒトＧＭＣＳＦ、ヒトインターフェロン−ベータ、ヒトＧＣＳＦ、ウシＧＣＳＦ、又はそれらの誘導体或いは変異体である。代替的に、本明細書に記載されるように、抗体は本明細書に記載されるような免疫複合体である。抗体は１以上の免疫グロブリンドメインを含み得る。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、又は免疫グロブリンＭである。免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリン重鎖領域又はそのフラグメントでもよい。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは哺乳動物抗体由来である。代替的に、免疫グロブリンドメインはキメラ抗体由来である。幾つかの例において、免疫グロブリンドメインは、設計された抗体又は組み換え抗体由来である。他の例において、免疫グロブリンドメインは、ヒト化、ヒト操作、又は完全なヒトの抗体に由来する。哺乳動物抗体は、ウシ抗体を含み得る。哺乳動物抗体は、ウシを含み得る。他の実施形態において、哺乳動物抗体はネズミ抗体である。超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部を含み得る。治療用ポリペプチドはノブドメインに結合され得る。代替的に又は付加的に、超長ＣＤＲ３は、ＣＤＲ３Ｈのストークドメインの少なくとも一部を含む。治療用ポリペプチドはストークドメインに結合され得る。幾つかの例において、抗体はさらにリンカーを含む。リンカーは超長ＣＤＲ３の中にあってもよい。リンカーは、免疫グロブリンドメイン又はそのフラグメントに治療用ポリペプチドを結合することができる。他の例において、リンカーは、治療用ポリペプチドをノブドメイン又はストークドメインに結合させる。特定の実施形態において、必要とする被験体の疾患を予防又は処置するための方法が開示され、該方法は、被験体に本医薬組成物を投与する工程を含む。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンコンストラクトを含む医薬組成物が開示され、該免疫グロブリンコンストラクトは、重鎖ポリペプチドであって、該重鎖ポリペプチドは、配列番号２４−４４の何れか１つから選択される配列に基づく又は由来する配列を含み、該ポリペプチド配列は、配列番号２−２２の何れか１つのＤＮＡによりコード化される、重鎖ポリペプチド；及び、軽鎖ポリペプチドであって、該軽鎖ポリペプチドは、配列番号２３から選択される配列を含み、ポリペプチド配列が配列番号１のＤＮＡによりコード化される、軽鎖ポリペプチド；及び、薬学的に許容可能な担体、を含む。特定の実施形態において、必要とする哺乳動物の疾患を予防又は処置する組成物ための方法が開示され、該方法は、哺乳動物に本医薬組成物を投与する工程を含む。幾つかの実施形態において、疾患は、乳腺炎などの感染症である。特定の実施形態において、必要において哺乳動物は、雌牛、ラクダ、ロバ、ヤギ、ウマ、トナカイ、ヒツジ、水牛、オオジカ、及びヤクを含むリストから選択された酪農動物である。幾つかの実施形態において、必要において哺乳動物はウシである。
【０６２８】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、予後の提供、又は診断情報の提供に役立ち得る。
【０６２９】
キット／製造品
更なる態様として、本開示は、本開示の方法を実行するための使用を促進する様式で包まれた、１以上の化合物又は組成物を含むキットを含む。１つの実施形態において、そのようなキットは、容器に取り付けられる標識又は方法を実行する際の化合物又は組成物の使用を説明する添付文書を伴う容器に包装される、化合物又は組成物（例えば、超長ＣＤＲ３のみを、又は第２薬剤と組み合わせた抗体を含む組成物）を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどを含む。容器は、ガラス又はプラスチックのような様々な材料から形成され得る。容器は、無菌のアクセスポートを有する（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈注射用溶液バッグ又はバイアルでもよい）。製造品は、（ａ）中に含まれる組成物を伴う第１容器であって、該組成物は、本明細書に開示されるように超長ＣＤＲ３を含む抗体を含む、第１容器；及び（ｂ）中に含まれる組成物を備えた第２容器であって、該組成物はさらに治療剤を含む、第２容器、を含み得る。本明細書に開示されるこの実施形態における製造品はさらに、第１及び第２の容器が特定の疾病を処置するために使用され得ることを示す添付文書を含み得る。代替的に又は付加的に、製造品はさらに、制菌性の注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液などの薬学的に許容可能なバッファーを含む、第２（又は第３）容器を含み得る。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及びユーザーの観点から望ましい他の材料を含み得る。好ましくは、化合物又は組成物は単位投与形態で包装される。キットはさらに、特異的な投与経路に従って組成物を投与するのに、又はスクリーニングアッセイを実行するのに適切なデバイスを含み得る。好ましくは、キットは、超長ＣＤＲ３組成物を含む抗体の使用を説明する標識を含む。
【０６３０】
特定の実施形態において、抗体を含む組成物は、ヒト、ウシ、ネコ、イヌ、及びマウスなど哺乳動物への静脈内投与に適用される医薬組成物として、常法に従って処方される。典型的に、静脈内投与用組成物は、無菌の等張の水性バッファーにある溶液である。必要な場合、組成物はまた、注入の部位にて疼痛を緩和するため、リドカインなどの可溶化剤及び局所麻酔薬を含み得る。一般的に、成分は、例えば、活性薬剤の量を示すアンプル又はｓａｃｈｅｔｔｅなどの密封容器において凍結乾燥した粉末又は水の無い濃縮物として、別々に又は単位投与形態と組み合わせての何れかで供給される。組成物が点滴によって投与される場合、それは、無菌の医薬品等級の水又は塩を含む点滴ボトルにより分配され得る。組成物が注入により投与される場合、滅菌注射用蒸留水又は食塩水のアンプルは、成分が投与前に混合され得るように、提供され得る。
【０６３１】
治療用タンパク質の異常の発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害の処置、阻害、及び予防に効果的である、本明細書に記載される組成物の量は、標準の臨床的技術によって決定され得る。加えて、インビトロのアッセイは随意に、最適な用量の範囲を同定するのを助けるために利用され得る。製剤に利用される正確な用量はまた、投与経路、及び疾患又は障害の重症度に依存し、医療従事者の判断及び各患者の状況によって決定されなければならない。効果的な用量は、インビトロの又は動物モデルの試験システムに由来する、用量−反応曲線から推定される。
【０６３２】
以下のものは、本開示の方法及び組成物の例である。様々な他の実施形態が実行され、概要は上記に提供されることが、理解される。
【０６３３】
処置の方法
本明細書にはさらに、必要とする被験体の疾患又は疾病を予防又は処置する方法が開示され、該方法は、前記被験体に、本明細書に開示されるような超長ＣＤＲ３を含む１以上の抗体を含む組成物を投与する工程を含む。組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含み得る。被験体は哺乳動物でもよい。哺乳動物はヒトでもよい。代替的に、哺乳動物はウシである。抗体は、治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体を含み得る。治療用ポリペプチドは、非抗体配列によってコード化され得る。治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は、免疫グロブリンドメインに結合され得る。治療用ポリペプチド、その誘導体或いは変異体は、ＣＤＲ３内にあり得る。代替的に、治療用ポリペプチド、その誘導体或いは変異体は、ＣＤＲ３に共役される。幾つかの例において、治療用ポリペプチドは、Ｍｏｋａ１、Ｖｍ２４、ヒトＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ヒトＥＰＯ、ヒトＦＧＦ２１、ヒトＧＭＣＳＦ、ヒトインターフェロン−ベータ、又はそれらの誘導体或いは変異体である。抗体は、本明細書に記載されるような免疫複合体である。抗体は１以上の免疫グロブリンドメインを含み得る。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、又は免疫グロブリンＭでもよい。免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリン重鎖領域又はそのフラグメントでもよい。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは哺乳動物抗体由来である。代替的に、免疫グロブリンドメインはキメラ抗体由来である。免疫グロブリンドメインは、設計された抗体又は組み換え抗体に由来し得る。免疫グロブリンドメインは、ヒト化、ヒト操作、又は完全なヒトの抗体に由来し得る。哺乳動物抗体は、ウシ抗体を含み得る。哺乳動物抗体は、ウシを含み得る。他の実施形態において、哺乳動物抗体はネズミ抗体である。超長ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３は、少なくとも３以上のシステイン残基を含み得る。超長ＣＤＲ３は、１以上のシステインモチーフを含み得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−１５６に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−９９に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号１００−１３５に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号１３６−１５６に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部を含み得る。ノブドメインは、超長ＣＤＲ３のノブドメイン内の保存モチーフを含み得る。例えば、ノブドメインは、本明細書に開示されるシステインモチーフを含み得る。治療用ポリペプチドはノブドメインに結合され得る。代替的に又は付加的に、超長ＣＤＲ３は、ストークドメインの少なくとも一部を含む。ストークドメインは、超長ＣＤＲ３のストークドメイン内の保存モチーフを含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメイン内の保存モチーフは、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２２４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−１６１に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２２３−２３４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２３５−２３９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２９６−２９９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に由来するものから選択される第１配列に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２３４を含むポリペプチド配列の基礎グループ及び配列番号２３５−３０７及び配列番号３３３−３３６を含むグループから選択される第２配列を含み得る。本明細書に開示される抗体は、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来する、２以上、３以上、４以上、５以上の配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメイン内の保存モチーフは、配列番号３０４−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。例えば、ストークドメインはＴ（Ｓ／Ｔ）ＶＨＱモチーフ（配列番号５０８）を含み得る。治療用ポリペプチドはストークドメインに結合され得る。幾つかの例において、抗体、抗体フラグメント、又は免疫グロブリンコンストラクトはさらにリンカーを含む。リンカーは、免疫グロブリンドメイン又はそのフラグメントに治療用ポリペプチドを結合することができる。他の例において、リンカーは、治療用ポリペプチドをノブドメイン又はストークドメインに結合させる。幾つかの例において、疾患又は疾病は、自己免疫疾患、異種免疫の疾患又は疾病、炎症性疾患、病原性の感染、血栓塞栓障害、呼吸器疾患又は疾病、代謝疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）障害、骨疾患、又は癌である。他の例において、疾患又は疾病は血液障害である。幾つかの例において、疾患又は疾病は、肥満症、糖尿病、骨粗鬆症、貧血、又は疼痛である。
【０６３４】
幾つかの実施形態において、必要とする被験体の疾患又は疾病を予防又は処置する方法が開示され、該方法は、次のものを含む組成物を被験体に投与する工程を含む：配列番号２４−４４から選択される配列にほぼ類似する配列を含む重鎖ポリペプチドを含む免疫グロブリンコンストラクト；及び、配列番号２３の配列にほぼ類似する配列を含む軽鎖ポリペプチド。重鎖ポリペプチド配列は、配列番号２４−４４の何れか１つによって提供される重鎖配列に、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又はそれ以上に同一であるアミノ酸配列を共有し得る。軽鎖ポリペプチド配列は、配列番号２３によって提供される軽鎖配列に、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又はそれ以上に同一であるアミノ酸配列を共有し得る。幾つかの例において、疾患又は疾病は、自己免疫疾患、異種免疫の疾患又は疾病、炎症性疾患、病原性の感染、血栓塞栓障害、呼吸器疾患又は疾病、代謝疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）障害、骨疾患、又は癌である。他の例において、疾患又は疾病は血液障害である。幾つかの例において、疾患又は疾病は、肥満症、糖尿病、骨粗鬆症、貧血、又は疼痛である。
【０６３５】
１つの実施形態において、必要とする被験体の疾患又は疾病を予防又は処置する方法が提供され、該方法は、次のものを含む組成物を被験体に投与する工程を含む：配列番号２−２２から選択された配列にほぼ類似するＤＮＡ配列によってコード化されたポリペプチド配列を含む重鎖ポリペプチドを含む免疫グロブリンコンストラクト；及び、配列番号１の配列にほぼ類似するＤＮＡ配列によってコード化されたポリペプチド配列を含む軽鎖ポリペプチド。重鎖ヌクレオチド配列は、配列番号２−２２の何れか１つによって提供される重鎖配列に対する、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又はそれ以上の相同を共有し得る。軽鎖ヌクレオチド配列は、配列番号１によって提供される軽鎖配列に対する、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又はそれ以上の相同を共有し得る。幾つかの例において、疾患又は疾病は、自己免疫疾患、異種免疫の疾患又は疾病、炎症性疾患、病原性の感染、血栓塞栓障害、呼吸器疾患又は疾病、代謝疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）障害、骨疾患、又は癌である。他の例において、疾患又は疾病は血液障害である。幾つかの例において、疾患又は疾病は、肥満症、糖尿病、骨粗鬆症、貧血、又は疼痛である。
【０６３６】
本明細書には、幾つかの実施形態において、必要とする被験体の自己免疫疾患を予防又は処置する方法が開示され、該方法は、前記被験体に、本明細書に開示されるような超長ＣＤＲ３を含む１以上の抗体を含む組成物を投与する工程を含む。組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含み得る。被験体は哺乳動物でもよい。哺乳動物はヒトでもよい。代替的に、哺乳動物はウシである。抗体は、治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体を含み得る。治療用ポリペプチドは、非抗体配列によってコード化され得る。治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は、免疫グロブリンドメインに結合され得る。治療用ポリペプチド、その誘導体或いは変異体は、ＣＤＲ３内にあり得る。代替的に、治療用ポリペプチド、その誘導体或いは変異体は、ＣＤＲ３に共役される。幾つかの例において、治療用ポリペプチドは、Ｍｏｋａ１、ＶＭ−２４、又はベータ−インターフェロン、或いはそれらの誘導体又は変異体である。抗体は、本明細書に記載されるような免疫複合体である。抗体は１以上の免疫グロブリンドメインを含み得る。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、又は免疫グロブリンＭでもよい。免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリン重鎖領域又はそのフラグメントでもよい。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは哺乳動物抗体由来である。代替的に、免疫グロブリンドメインはキメラ抗体由来である。免疫グロブリンドメインは、設計された抗体又は組み換え抗体に由来し得る。免疫グロブリンドメインは、ヒト化、ヒト操作、又は完全なヒトの抗体に由来し得る。哺乳動物抗体は、ウシ抗体を含み得る。哺乳動物抗体は、ウシを含み得る。他の実施形態において、哺乳動物抗体はネズミ抗体である。超長ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３は、少なくとも３以上のシステイン残基を含み得る。超長ＣＤＲ３は、１以上のシステインモチーフを含み得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−１５６に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−９９に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号１００−１３５に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号１３６−１５６に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部を含む。ノブドメインは、超長ＣＤＲ３のノブドメイン内の保存モチーフを含み得る。例えば、ノブドメインは、本明細書に開示されるシステインモチーフを含み得る。Ｍｏｋａ１、ＶＭ−２４、ベータ−インターフェロン、又はそれらの誘導体又は変異体は、ノブドメインに結合され得る。代替的に又は付加的に、超長ＣＤＲ３は、ストークドメインの少なくとも一部を含む。ストークドメインは、超長ＣＤＲ３のストークドメイン内の保存モチーフを含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメイン内の保存モチーフは、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２２４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−１６１に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２２３−２３４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２３５−２３９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２９６−２９９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に由来するものから選択される第１配列に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２３４を含むポリペプチド配列の基礎グループ及び配列番号２３５−３０７及び配列番号３３３−３３６を含むグループから選択される第２配列を含み得る。本明細書に開示される抗体は、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来する、２以上、３以上、４以上、５以上の配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメイン内の保存モチーフは、配列番号３０４−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。例えば、ストークドメインはＴ（Ｓ／Ｔ）ＶＨＱモチーフ（配列番号５０８）を含み得る。Ｍｏｋａ１、ＶＭ−２４、ベータ−インターフェロン、又はそれらの誘導体又は変異体は、ストークドメインに結合され得る。幾つかの例において、抗体、抗体フラグメント、又は免疫グロブリンコンストラクトはさらにリンカーを含む。リンカーは、Ｍｏｋａ１、ＶＭ−２４、ベータ−インターフェロン、又はそれらの誘導体又は変異体を、免疫グロブリンドメイン又はそのフラグメントに結合させることができる。他の例において、リンカーは、Ｍｏｋａ１、ＶＭ−２４、ベータ−インターフェロン、又はそれらの誘導体又は変異体を、ノブドメイン又はストークドメインに結合させることができる。幾つかの例において、自己免疫疾患は、Ｔ細胞媒介性の自己免疫疾患である。Ｔ細胞媒介性の自己免疫疾患は、限定されないが、多発性硬化症、１型糖尿病、及び乾癬を含む。他の例において、自己免疫疾患は、狼瘡、シェーグレン症候群、強皮症、関節リウマチ、皮膚筋炎、橋本甲状腺炎、アジソン病、セリアック病、クローン病、悪性貧血、尋常性天疱瘡、尋常性白斑、自己免疫溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、オルド（Ｏｒｄ’ｓ）甲状腺炎、グレーブス病、ギラン−バレー症候群、急性散在性脳脊髄膜炎、眼球クローヌスミオクローヌス症候群、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、自己免疫性肝炎、グッドパスチャー症候群、ライター症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎、ヴェグナー肉芽腫症、全身性脱毛症、ベーチェット病、慢性疲労、自律神経異常症、子宮内膜症、間質性膀胱炎、神経性筋緊張病、強皮症、及び外陰部痛を含む。狼瘡は、限定されないが、急性皮膚紅斑性狼瘡、亜急性皮膚紅斑性狼瘡、慢性皮膚紅斑性狼瘡、円板状紅斑性狼瘡、小児期円板状紅斑性狼瘡、全身性円板状紅斑性狼瘡、限局性円板状紅斑性狼瘡、凍瘡状紅斑性狼瘡（ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ）、紅斑性狼瘡扁平苔癬オーバーラップ症候群、紅斑性狼瘡脂肪織炎（深在性紅斑性狼瘡）、誇大の紅斑性狼瘡、疣贅性紅斑性狼瘡（肥厚性紅斑性狼瘡）、補体欠損症症候群、薬剤誘発性紅斑性狼瘡、新生児紅斑性狼瘡、及び全身性紅斑性狼瘡を含み得る。
【０６３７】
本明細書にはさらに、必要とする被験体のカリウム電位型チャネル（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ）の調節から利益を得る疾患又は疾病を予防又は処置する方法が開示され、該方法は、前記被験体に、本明細書に開示されるような超長ＣＤＲ３を含む１以上の抗体を含む組成物を投与する工程を含む。組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含み得る。幾つかの例において、カリウム電位型チャネルはＫＣＮＡ３又はＫｖ１．３のチャネルである。被験体は哺乳動物でもよい。哺乳動物はヒトでもよい。代替的に、哺乳動物はウシである。抗体は、治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体を含み得る。治療用ポリペプチドは、非抗体配列によってコード化され得る。治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は、免疫グロブリンドメインに結合され得る。治療用ポリペプチド、その誘導体或いは変異体は、ＣＤＲ３内にあり得る。代替的に、治療用ポリペプチド、その誘導体或いは変異体は、ＣＤＲ３に共役される。幾つかの例において、治療用ポリペプチドは、Ｍｏｋａ１、ＶＭ−２４、或いはそれらの誘導体又は変異体である。抗体は、本明細書に記載されるような免疫複合体である。抗体は１以上の免疫グロブリンドメインを含み得る。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、又は免疫グロブリンＭでもよい。免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリン重鎖領域又はそのフラグメントでもよい。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは哺乳動物抗体由来である。代替的に、免疫グロブリンドメインはキメラ抗体由来である。免疫グロブリンドメインは、設計された抗体又は組み換え抗体に由来し得る。免疫グロブリンドメインは、ヒト化、ヒト操作、又は完全なヒトの抗体に由来し得る。哺乳動物抗体は、ウシ抗体を含み得る。哺乳動物抗体は、ウシを含み得る。他の実施形態において、哺乳動物抗体はネズミ抗体である。超長ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３は、少なくとも３以上のシステイン残基を含み得る。超長ＣＤＲ３は、１以上のシステインモチーフを含み得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−１５６に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−９９に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号１００−１３５に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号１３６−１５６に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部を含む。ノブドメインは、超長ＣＤＲ３のノブドメイン内の保存モチーフを含み得る。例えば、ノブドメインは、本明細書に開示されるシステインモチーフを含み得る。Ｍｏｋａ１、ＶＭ−２４、或いはそれらの誘導体又は変異体は、ノブドメインに結合され得る。代替的に又は付加的に、超長ＣＤＲ３は、ストークドメインの少なくとも一部を含む。ストークドメインは、超長ＣＤＲ３のストークドメイン内の保存モチーフを含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメイン内の保存モチーフは、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６��基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２２４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−１６１に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２２３−２３４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２３５−２３９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２９６−２９９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に由来するものから選択される第１配列に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２３４を含むポリペプチド配列の基礎グループ及び配列番号２３５−３０７及び配列番号３３３−３３６を含むグループから選択される第２配列を含み得る。本明細書に開示される抗体は、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来する、２以上、３以上、４以上、５以上の配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメイン内の保存モチーフは、配列番号３０４−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。例えば、ストークドメインはＴ（Ｓ／Ｔ）ＶＨＱモチーフ（配列番号５０８）を含み得る。Ｍｏｋａ１、ＶＭ−２４、或いはそれらの誘導体又は変異体は、ストークドメインに結合され得る。幾つかの例において、抗体、抗体フラグメント、又は免疫グロブリンコンストラクトはさらにリンカーを含む。リンカーは、Ｍｏｋａ１、ＶＭ−２４、或いはそれらの誘導体又は変異体を、免疫グロブリンドメイン又はそのフラグメントに結合させることができる。他の例において、リンカーは、Ｍｏｋａ１、ＶＭ−２４、ベータ−インターフェロン、又はそれらの誘導体又は変異体を、ノブドメイン又はストークドメインに結合させることができる。幾つかの例において、疾患又は疾病は自己免疫疾患である。自己免疫疾患は、Ｔ細胞媒介性の自己免疫疾患であり得る。幾つかの例において、カリウム電位型チャネルの調節は、カリウム電位型チャネルを阻害又は閉鎖する工程を含む。幾つかの例において、疾患又は疾病は、発作性運動失調症、発病、又は神経性筋緊張病である。
【０６３８】
本明細書には、必要とする被験体の代謝疾患又は疾病を予防又は処置する方法が提供され、該方法は、前記被験体に、本明細書に開示されるような超長ＣＤＲ３を含む１以上の抗体を含む組成物を投与する工程を含む。組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含み得る。被験体は哺乳動物でもよい。哺乳動物はヒトでもよい。代替的に、哺乳動物はウシである。抗体は、治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体を含み得る。治療用ポリペプチドは、非抗体配列によってコード化され得る。治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は、免疫グロブリンドメインに結合され得る。治療用ポリペプチド、その誘導体或いは変異体は、ＣＤＲ３内にあり得る。代替的に、治療用ポリペプチド、その誘導体或いは変異体は、ＣＤＲ３に共役される。幾つかの例において、治療用ポリペプチドは、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ＦＧＦ２１、或いはそれらの誘導体又は変異体である。ＧＬＰ−１はヒトＧＬＰ−１でもよい。幾つかの例において、ＦＧＦ２１は、ヒトＦＧＦ２１である。抗体は、本明細書に記載されるような免疫複合体である。抗体は１以上の免疫グロブリンドメインを含み得る。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、又は免疫グロブリンＭでもよい。免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリン重鎖領域又はそのフラグメントでもよい。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは哺乳動物抗体由来である。代替的に、免疫グロブリンドメインはキメラ抗体由来である。免疫グロブリンドメインは、設計された抗体又は組み換え抗体に由来し得る。免疫グロブリンドメインは、ヒト化、ヒト操作、又は完全なヒトの抗体に由来し得る。哺乳動物抗体は、ウシ抗体を含み得る。哺乳動物抗体は、ウシを含み得る。他の実施形態において、哺乳動物抗体はネズミ抗体である。超長ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３は、少なくとも３以上のシステイン残基を含み得る。超長ＣＤＲ３は、１以上のシステインモチーフを含み得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−１５６に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−９９に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号１００−１３５に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号１３６−１５６に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部を含む。ノブドメインは、超長ＣＤＲ３のノブドメイン内の保存モチーフを含み得る。例えば、ノブドメインは、本明細書に開示されるシステインモチーフを含み得る。ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ＦＧＦ２１、或いはそれらの誘導体又は変異体は、ノブドメインに結合され得る。代替的に又は付加的に、超長ＣＤＲ３は、ストークドメインの少なくとも一部を含む。ストークドメインは、超長ＣＤＲ３のストークドメイン内の保存モチーフを含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメイン内の保存モチーフは、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２２４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−１６１に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２２３−２３４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２３５−２３９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２９６−２９９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に由来するものから選択される第１配列に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２３４を含むポリペプチド配列の基礎グループ及び配列番号２３５−３０７及び配列番号３３３−３３６を含むグループから選択される第２配列を含み得る。本明細書に開示される抗体は、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来する、２以上、３以上、４以上、５以上の配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメイン内の保存モチーフは、配列番号３０４−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。例えば、ストークドメインはＴ（Ｓ／Ｔ）ＶＨＱモチーフを含み得る。ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ＦＧＦ２１、或いはそれらの誘導体又は変異体は、ストークドメインに結合され得る。幾つかの例において、抗体、抗体フラグメント、又は免疫グロブリンコンストラクトはさらにリンカーを含む。リンカーは、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ＦＧＦ２１、或いはそれらの誘導体又は変異体を、免疫グロブリンドメイン又はそのフラグメントに結合させることができる。他の例において、リンカーは、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ＦＧＦ２１、又はそれらの誘導体又は変異体を、ノブドメイン又はストークドメインに結合させることができる。代謝疾患及び／又は疾病は、糖質代謝異常、アミノ酸代謝、有機酸代謝（有機酸性尿症）、脂肪酸酸化及びミトコンドリア代謝、ポルフィリン代謝、プリン又はピリミジンの代謝、ステロイド代謝、ミトコンドリア作用、ペルオキシゾーム作用、尿素サイクル異常症、尿素回路欠陥、又はリソソーム蓄積症を含み得る。幾つかの例において、代謝疾患又は疾病は糖尿病である。他の例において、代謝疾患又は疾病は、糖原蓄積病、フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症、１型グルタル酸血症、カルバモイル燐酸シンテターゼＩ欠乏症、アルカプトン尿症、中鎖アシルコエンザイムＡ脱水素酵素欠乏症（ＭＣＡＤＤ）、急性間欠性ポルフィリア、レッシュ−ナイハン症状群、リポイド様の先天性副腎皮質過形成、先天性副腎皮質過形成、カーンズ−セイヤ症候群、ツェルウェガー症候群、ゴーシェ病、又はニーマンピック病である。
【０６３９】
本明細書には、必要とする被験体の中枢神経系（ＣＮＳ）障害を予防又は処置する方法が提供され、該方法は、前記被験体に、本明細書に開示されるような超長ＣＤＲ３を含む１以上の抗体を含む組成物を投与する工程を含む。組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含み得る。被験体は哺乳動物でもよい。哺乳動物はヒトでもよい。代替的に、哺乳動物はウシである。抗体は、治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体を含み得る。治療用ポリペプチドは、非抗体配列によってコード化され得る。治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は、免疫グロブリンドメインに結合され得る。治療用ポリペプチド、その誘導体或いは変異体は、ＣＤＲ３内にあり得る。代替的に、治療用ポリペプチド、その誘導体或いは変異体は、ＣＤＲ３に共役される。幾つかの例において、治療用ポリペプチドは、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、或いはそれらの誘導体又は変異体である。ＧＬＰ−１はヒトＧＬＰ−１でもよい。抗体は、本明細書に記載されるような免疫複合体である。抗体は１以上の免疫グロブリンドメインを含み得る。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、又は免疫グロブリンＭでもよい。免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリン重鎖領域又はそのフラグメントでもよい。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは哺乳動物抗体由来である。代替的に、免疫グロブリンドメインはキメラ抗体由来である。免疫グロブリンドメインは、設計された抗体又は組み換え抗体に由来し得る。免疫グロブリンドメインは、ヒト化、ヒト操作、又は完全なヒトの抗体に由来し得る。哺乳動物抗体は、ウシ抗体を含み得る。哺乳動物抗体は、ウシを含み得る。他の実施形態において、哺乳動物抗体はネズミ抗体である。超長ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３は、少なくとも３以上のシステイン残基を含み得る。超長ＣＤＲ３は、１以上のシステインモチーフを含み得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−１５６に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−９９に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号１００−１３５に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号１３６−１５６に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部を含む。ノブドメインは、超長ＣＤＲ３のノブドメイン内に保存モチーフを含み得る。例えば、ノブドメインは、本明細書に開示されるシステインモチーフを含み得る。ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、或いはそれらの誘導体又は変異体は、ノブドメインに結合され得る。代替的に又は付加的に、超長ＣＤＲ３は、ストークドメインの少なくとも一部を含む。ストークドメインは、超長ＣＤＲ３のストークドメイン内に保存モチーフを含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメイン内の保存モチーフは、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２２４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−１６１に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２２３−２３４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２３５−２３９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２９６−２９９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に由来するものから選択される第１配列に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２３４を含むポリペプチド配列の基礎グループ及び配列番号２３５−３０７及び配列番号３３３−３３６を含むグループから選択される第２配列を含み得る。本明細書に開示される抗体は、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来する、２以上、３以上、４以上、５以上の配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３０４−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。例えば、ストークドメインはＴ（Ｓ／Ｔ）ＶＨＱモチーフを含み得る。ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、或いはそれらの誘導体又は変異体は、ストークドメインに結合され得る。幾つかの例において、抗体、抗体フラグメント、又は免疫グロブリンコンストラクトはさらにリンカーを含む。リンカーは、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、或いはそれらの誘導体又は変異体を、免疫グロブリンドメイン又はそのフラグメントに結合させることができる。他の例において、リンカーは、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、又はそれらの誘導体又は変異体を、ノブドメイン又はストークドメインに結合させることができる。幾つかの例において、ＣＮＳ障害はアルツハイマー病（ＡＤ）である。更なるＣＮＳ障害は、限定されないが、脳炎、髄膜炎、熱帯性痙性脊髄麻痺、クモ膜嚢胞、ハンチントン病、閉込め症候群、パーキンソン病、トゥーレット症候群（Ｔｏｕｒｅｔｔｅ’ｓ）、及び多発性硬化症を含む。
【０６４０】
本明細書には、必要とする被験体のＧＬＰ−１Ｒ及び／又はグルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）アゴニストから利益を得る疾患又は疾病を予防又は処置する方法が開示され、該方法は、前記被験体に、本明細書に開示されるような超長ＣＤＲ３を含む１以上の抗体を含む組成物を投与する工程を含む。組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含み得る。被験体は哺乳動物でもよい。哺乳動物はヒトでもよい。代替的に、哺乳動物はウシである。抗体は、治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体を含み得る。治療用ポリペプチドは、非抗体配列によってコード化され得る。治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は、免疫グロブリンドメインに結合され得る。治療用ポリペプチド、その誘導体或いは変異体は、ＣＤＲ３内にあり得る。代替的に、治療用ポリペプチド、その誘導体或いは変異体は、ＣＤＲ３に共役される。幾つかの例において、治療用ポリペプチドは、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、或いはそれらの誘導体又は変異体である。ＧＬＰ−１はヒトＧＬＰ−１でもよい。抗体は、本明細書に記載されるような免疫複合体である。抗体は１以上の免疫グロブリンドメインを含み得る。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、又は免疫グロブリンＭでもよい。免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリン重鎖領域又はそのフラグメントでもよい。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは哺乳動物抗体由来である。代替的に、免疫グロブリンドメインはキメラ抗体由来である。免疫グロブリンドメインは、設計された抗体又は組み換え抗体に由来し得る。免疫グロブリンドメインは、ヒト化、ヒト操作、又は完全なヒトの抗体に由来し得る。哺乳動物抗体は、ウシ抗体を含み得る。哺乳動物抗体は、ウシを含み得る。他の実施形態において、哺乳動物抗体はネズミ抗体である。超長ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３は、少なくとも３以上のシステイン残基を含み得る。超長ＣＤＲ３は、１以上のシステインモチーフを含み得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−１５６に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−９９に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号１００−１３５に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号１３６−１５６に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部を含む。ノブドメインは、超長ＣＤＲ３のノブドメイン内に保存モチーフを含み得る。例えば、ノブドメインは、本明細書に開示されるシステインモチーフを含み得る。ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、或いはそれらの誘導体又は変異体は、ノブドメインに結合され得る。代替的に又は付加的に、超長ＣＤＲ３は、ストークドメインの少なくとも一部を含む。ストークドメインは、超長ＣＤＲ３のストークドメイン内に保存モチーフを含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメイン内の保存モチーフは、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２２４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−１６１に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２２３−２３４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２３５−２３９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２９６−２９９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に由来するものから選択される第１配列に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２３４を含むポリペプチド配列の基礎グループ及び配列番号２３５−３０７及び配列番号３３３−３３６を含むグループから選択される第２配列を含み得る。本明細書に開示される抗体は、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来する、２以上、３以上、４以上、５以上の配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３０４−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。例えば、ストークドメインはＴ（Ｓ／Ｔ）ＶＨＱモチーフ（配列番号５０８）を含み得る。ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、或いはそれらの誘導体又は変異体は、ストークドメインに結合され得る。幾つかの例において、抗体、抗体フラグメント、又は免疫グロブリンコンストラクトはさらにリンカーを含む。リンカーは、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、或いはそれらの誘導体又は変異体を、免疫グロブリンドメイン又はそのフラグメントに結合させることができる。他の例において、リンカーは、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、又はそれらの誘導体又は変異体を、ノブドメイン又はストークドメインに結合させることができる。疾患又は疾病は、代謝疾患又は障害であり得る。幾つかの例において、疾患又は疾病は糖尿病である。他の例において、疾患又は疾病は肥満症である。ＧＬＰ−１Ｒ及び／又はＧＣＧＲアゴニストから利益を得る更なる疾患及び／又は疾病は、限定されないが、脂質異常症、心臓血管の疾患、及び脂肪肝疾患を含む。
【０６４１】
本明細書には、必要とする被験体の血液障害を予防又は処置する方法が提供され、該方法は、前記被験体に、本明細書に開示されるような超長ＣＤＲ３を含む１以上の抗体を含む組成物を投与する工程を含む。組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含み得る。被験体は哺乳動物でもよい。哺乳動物はヒトでもよい。代替的に、哺乳動物はウシである。抗体は、治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体を含み得る。治療用ポリペプチドは、非抗体配列によってコード化され得る。治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は、免疫グロブリンドメインに結合され得る。治療用ポリペプチド、その誘導体或いは変異体は、ＣＤＲ３内にあり得る。代替的に、治療用ポリペプチド、その誘導体或いは変異体は、ＣＤＲ３に共役される。幾つかの例において、治療用ポリペプチドは、エリスロポエチン、ＧＭＣＳＦ、或いはそれらの誘導体又は変異体である。エリスロポエチンはヒトエリスロポエチンでもよい。ＧＭＣＳＦはヒトＧＭＣＳＦでもよい。抗体は、本明細書に記載されるような免疫複合体である。抗体は１以上の免疫グロブリンドメインを含み得る。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、又は免疫グロブリンＭでもよい。免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリン重鎖領域又はそのフラグメントでもよい。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは哺乳動物抗体由来である。代替的に、免疫グロブリンドメインはキメラ抗体由来である。免疫グロブリンドメインは、設計された抗体又は組み換え抗体に由来し得る。免疫グロブリンドメインは、ヒト化、ヒト操作、又は完全なヒトの抗体に由来し得る。哺乳動物抗体は、ウシ抗体を含み得る。哺乳動物抗体は、ウシを含み得る。他の実施形態において、哺乳動物抗体はネズミ抗体である。超長ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３は、少なくとも３以上のシステイン残基を含み得る。超長ＣＤＲ３は、１以上のシステインモチーフを含み得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−１５６に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−９９に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号１００−１３５に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号１３６−１５６に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部を含む。ノブドメインは、超長ＣＤＲ３のノブドメイン内に保存モチーフを含み得る。例えば、ノブドメインは、本明細書に開示されるシステインモチーフを含み得る。エリスロポエチン、ＧＭＣＳＦ、或いはそれらの誘導体又は変異体は、ノブドメインに結合され得る。代替的に又は付加的に、超長ＣＤＲ３は、ストークドメインの少なくとも一部を含む。ストークドメインは、超長ＣＤＲ３のストークドメイン内に保存モチーフを含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメイン内の保存モチーフは、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２２４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−１６１に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２２３−２３４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２３５−２３９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２９６−２９９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に由来するものから選択される第１配列に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２３４を含むポリペプチド配列の基礎グループ及び配列番号２３５−３０７及び配列番号３３３−３３６を含むグループから選択される第２配列を含み得る。本明細書に開示される抗体は、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来する、２以上、３以上、４以上、５以上の配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３０４−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。例えば、ストークドメインはＴ（Ｓ／Ｔ）ＶＨＱモチーフ（配列番号５０８）を含み得る。エリスロポエチン、ＧＭＣＳＦ、或いはそれらの誘導体又は変異体は、ストークドメインに結合され得る。幾つかの例において、抗体、抗体フラグメント、又は免疫グロブリンコンストラクトはさらにリンカーを含む。リンカーは、エリスロポエチン、ＧＭＣＳＦ、或いはそれらの誘導体又は変異体を、免疫グロブリンドメイン又はそのフラグメントに結合させることができる。他の例において、リンカーは、エリスロポエチン、ＧＭＣＳＦ、又はそれらの誘導体又は変異体を、ノブドメイン又はストークドメインに結合させることができる。幾つかの例において、皮膚障害は貧血症である。貧血症の例は、限定されないが、ｈｅｒｄｉｔａｒｙ  ｘｅｒｏｃｙｔｏｓｉｓ、先天性赤血球生成不全性貧血、Ｒｈヌル疾患（Ｒｈ  ｎｕｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、伝染性単核症に関連する貧血症、薬物に関連する貧血症、再生不良性貧血、小球性貧血、大赤血球性貧血症、正球性貧血、溶血性貧血、変形赤血球性貧血、球状赤血球性貧血、鎌状赤血球性貧血、正色素性貧血、高色素性貧血、低色素性貧血、大赤血球性正色素性貧血、小赤血球低色素性貧血、正球性正色素性貧血、鉄欠乏性貧血、悪性貧血、葉酸欠乏性貧血、サラセミア、鉄芽球性貧血、出血後貧血、鎌状赤血球貧血、慢性貧血、非利用性貧血、自己免疫溶血性貧血、クーリー貧血、薬物誘発性免疫溶血性貧血、赤芽球性貧血、再生不良性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、ピアソン貧血、一時的な貧血、ファンコーニ貧血、レデラー貧血、骨髄障害性（ｍｙｅｌｐａｔｈｉｃ）貧血、栄養性貧血、棘細胞性貧血、Ｖｏｎ  Ｊａｋｓｈ貧血、鉄芽球性（ｓｉｄｅｒｏｂｌａｔｉｃ）貧血、鉄欠乏性貧血、アルファサラセミア、ベータ地中海貧血、ヘモグロビンｈ疾患、急性後天性溶血性貧血、温暖自己免疫溶血性貧血、寒冷自己免疫溶血性貧血、初期の寒冷自己免疫溶血性貧血、二次的な寒冷自己免疫溶血性貧血、続発性自己免疫性溶血性貧血、初期の自己免疫溶血性貧血、ｘが連結した鉄芽球性貧血、ピリドキシン反応性貧血、栄養上の鉄芽球性貧血、ピリドキシン欠乏症誘発性鉄芽球性貧血、銅欠乏症誘発性鉄芽球性貧血、シクロセリン誘発性鉄芽球性貧血、クロラムフェニコール誘発性鉄芽球性貧血、エタノール誘発性鉄芽球性貧血、イソニアジド誘発性鉄芽球性貧血、薬物誘発性鉄芽球性貧血、トキシン誘発性鉄芽球性貧血、小赤血球高色素性貧血、大赤血球性高色素性貧血、巨赤血球正色素性貧血、薬物誘発性溶血性貧血、非遺伝性球状赤血球性貧血、遺伝性球状赤血球性貧血、及び先天性球状赤血球性貧血を含む。他の例において、血液障害はマラリアである。代替的に、血液障害は、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、又は骨髄異形成症候群である。幾つかの例において、血液障害は、好中球減少症、シュワヒマン−ダイアモンド症候群、コストマン症候群、慢性肉芽腫症、白血球接着不全症、ミエロペルオキシダーゼ欠乏症、又はチェディアック−東症候群である。
【０６４２】
本明細書には、必要とする被験体の白血球細胞の産生の刺激又は増加から利益を得る疾患又は障害を予防又は処置する方法が提供され、該方法は、前記被験体に、本明細書に開示されるような超長ＣＤＲ３を含む１以上の抗体を含む組成物を投与する工程を含む。組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含み得る。被験体は哺乳動物でもよい。哺乳動物はヒトでもよい。代替的に、哺乳動物はウシである。抗体は、治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体を含み得る。治療用ポリペプチドは、非抗体配列によってコード化され得る。治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は、免疫グロブリンドメインに結合され得る。治療用ポリペプチド、その誘導体或いは変異体は、ＣＤＲ３内にあり得る。代替的に、治療用ポリペプチド、その誘導体或いは変異体は、ＣＤＲ３に共役される。幾つかの例において、治療用ポリペプチドは、ＧＭＣＳＦ、或いはその誘導体又は変異体である。ＧＭＣＳＦはヒトＧＭＣＳＦでもよい。抗体は、本明細書に記載されるような免疫複合体である。抗体は１以上の免疫グロブリンドメインを含み得る。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、又は免疫グロブリンＭでもよい。免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリン重鎖領域又はそのフラグメントでもよい。幾つかの実施形態において、免疫グロブリンドメインは哺乳動物抗体由来である。代替的に、免疫グロブリンドメインはキメラ抗体由来である。免疫グロブリンドメインは、設計された抗体又は組み換え抗体に由来し得る。免疫グロブリンドメインは、ヒト化、ヒト操作、又は完全なヒトの抗体に由来し得る。哺乳動物抗体は、ウシ抗体を含み得る。哺乳動物抗体は、ウシを含み得る。他の実施形態において、哺乳動物抗体はネズミ抗体である。超長ＣＤＲ３は、長さが３５以上のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３は、少なくとも３以上のシステイン残基を含み得る。超長ＣＤＲ３は、１以上のシステインモチーフを含み得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−１５６に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−９９に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号１００−１３５に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号１３６−１５６に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３は、超長ＣＤＲ３のノブドメインの少なくとも一部を含む。ノブドメインは、超長ＣＤＲ３のノブドメイン内に保存モチーフを含み得る。例えば、ノブドメインは、本明細書に開示されるシステインモチーフを含み得る。ＧＭＣＳＦ、或いはその誘導体又は変異体は、ノブドメインに結合され得る。代替的に又は付加的に、超長ＣＤＲ３は、ストークドメインの少なくとも一部を含む。ストークドメインは、超長ＣＤＲ３のストークドメイン内に保存モチーフを含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメイン内の保存モチーフは、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２２４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−１６１に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２２３−２３４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２３５−２３９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２９６−２９９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に由来するものから選択される第１配列に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２３４を含むポリペプチド配列の基礎グループ及び配列番号２３５−３０７及び配列番号３３３−３３６を含むグループから選択される第２配列を含み得る。本明細書に開示される抗体は、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来する、２以上、３以上、４以上、５以上の配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３０４−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。例えば、ストークドメインはＴ（Ｓ／Ｔ）ＶＨＱモチーフを含み得る。ＧＭＣＳＦ、或いはその誘導体又は変異体は、ストークドメインに結合され得る。幾つかの例において、抗体、抗体フラグメント、又は免疫グロブリンコンストラクトはさらにリンカーを含む。リンカーは、ＧＭＣＳＦ、或いはその誘導体又は変異体を、免疫グロブリンドメイン又はそのフラグメントに結合させることができる。他の例において、リンカーは、ＧＭＣＳＦ、又はその誘導体又は変異体を、ノブドメイン又はストークドメインに結合させることができる。幾つかの例において、疾患又は障害は、好中球減少症、シュワヒマン‐ダイアモンド症候群、コストマン症候群、慢性肉芽腫症、白血球接着不全症、ミエロペルオキシダーゼ欠乏症、又はチェディアック−東症候群である。
【０６４３】
本明細書には、必要とする被験体における赤血球生産の刺激又は増加による疾患又は疾病を防ぐ或いは処置する方法が提供され、該方法は、被験体に本明細書に開示された１以上の超長ＣＤＲ３を含む抗体を含む組成物を投与する工程を含む。組成物は更に薬学的に許容可能な担体を含み得る。被験体は哺乳動物でもよい。哺乳動物はヒトでもよい。代替的に哺乳動物はウシである。抗体は治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体を含み得る。治療用ポリペプチドは非抗体配列によってコード化され得る。治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は免疫グロブリンドメインに結合され得る。治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は超長ＣＤＲ３内にあってもよい。代替的に、治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は超長ＣＤＲ３に共役される。幾つかの例において、治療用ポリペプチドはエリスロポエチン、又はその誘導体或いは変異体である。エリスロポエチンはヒトエリスロポエチンでもよい。抗体は、本明細書に記載されるような免疫複合体でもよい。抗体は１以上の免疫グロブリンドメインを含み得る。免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ又は免疫グロブリンＭでもよい。免疫グロブリンドメインは免疫グロブリン重鎖領域又はそのフラグメントであり得る。幾つかの例において、免疫グロブリンドメインは哺乳動物の抗体に由来する。代替的に、免疫グロブリンドメインはキメラ抗体に由来する。免疫グロブリンドメインは設計された抗体又は組み換え抗体でもよい。免疫グロブリンドメインは、ヒト化、ヒト操作、又は完全なヒト抗体でもよい。哺乳動物の抗体はウシの抗体であり得る。哺乳動物の抗体はヒト抗体でもよい。他の例において、哺乳動物抗体はマウス抗体である。超長ＣＤＲ３は長さが３５以上のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３は少なくとも３以上のシステイン残基を含み得る。超長ＣＤＲ３は１以上のシステインモチーフを含み得る。１以上のシステインモチーフは、又は配列番号４５−１５６に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、又は配列番号４５−９９に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、又は配列番号１００−１３５に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、又は配列番号１３６−１５６に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３は、ノブドメインの少なくとも一部を含む。ノブドメインは、超長ＣＤＲ３のノブドメイン内に保存モチーフを含み得る。例えば、ノブドメインは本明細書に開示されたシステインモチーフを含み得る。エリスロポエチン、又はその誘導体或いは変異体はノブドメインに結合され得る。代替的に、又は付加的に、超長ＣＤＲ３は、ストークドメインの少なくとも一部を含む。ストークドメインは、超長ＣＤＲ３のストークドメイン内に保存モチーフを含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２２４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−１６１に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２２３−２３４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２３５−２３９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２９６−２９９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３由来するものから選択された第一配列に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２３４を含むポリペプチド配列の基礎グループ及び、及び配列番号２３５−３０７及び配列番号：３３３−３３６を含むグループから選択された第２配列を含み得る。本明細書に開示された抗体は、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来する２以上、３以上、４以上、５以上の配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３０４−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。例えば、ストークドメインは、Ｔ（Ｓ／Ｔ）ＶＨＱモチーフ（配列番号５０８）を含み得る。エリスロポエチン、又はその誘導体或いは変異体はストークドメインに結合され得る。幾つかの例において、抗体、抗体フラグメント又は免疫グロブリンコンストラクトは更にリンカーを含む。リンカーは、エリスロポエチン、又はその誘導体或いは変異体を免疫グロブリンドメイン又はそのフラグメントに結合し得る。他の例において、リンカーはエリスロポエチン、又はその誘導体或いは変異体をノブドメイン又はストークドメインに結合する。幾つかの例において、疾病又は疾患は貧血症である。
【０６４４】
本明細書には、必要とする被験体における肥満を防ぐ又は処置する方法が提供され、該方法は、被験体に本明細書に開示された超長ＣＤＲ３を含む１以上の抗体を含む組成物を投与する工程を含む。組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含み得る。被験体は哺乳動物でもよい。哺乳動物はヒトでもよい。代替的に、哺乳動物はウシである。抗体は治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体を含み得る。治療用ポリペプチドは非抗体配列によってコード化され得る。治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は、免疫グロブリンドメインに結合され得る。治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は、超長ＣＤＲ３内にあり得る。代替的に、治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は超長ＣＤＲ３に共役される。幾つかの例において、治療用ポリペプチドは、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ＦＧＦ２１、又はその誘導体或いは変異体である。ＧＬＰ−１はヒトＧＬＰ−１でもよい。幾つかの実施形態において、ＦＧＦ２１は、ヒトＦＧＦ２１である。抗体は本明細書に記載されるような免疫複合体でもよい。抗体は１以上の免疫グロブリンドメインを含み得る。免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ又は免疫グロブリンＭでもよい。免疫グロブリンドメインは免疫グロブリン重鎖領域又はそのフラグメントであり得る。幾つかの例において、免疫グロブリンドメインは哺乳動物の抗体に由来する。代替的に、免疫グロブリンドメインはキメラ抗体に由来する。免疫グロブリンドメインは設計された抗体又は組み換え抗体に由来しても良い。免疫グロブリンドメインはヒト化、ヒト操作又は完全にヒト抗体でもよい。哺乳動物の抗体はウシ抗体であり得る。哺乳動物抗体はヒト抗体でもよい。他の例において、哺乳動物の抗体はマウスの抗体である。超長ＣＤＲ３は長さが３５以上のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３は少なくとも３以上のシステイン残基を含み得る。超長ＣＤＲ３は１以上のシステインモチーフを含み得る。１以上のシステインモチーフは配列番号４５−１５６に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは配列番号４５−９９に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは配列番号１００−１３５に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは配列番号１３６−１５６に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３は、ノブドメインの少なくとも一部を含む。ノブドメインは、超長ＣＤＲ３のノブドメイン内に保存モチーフを含み得る。例えば、ノブドメインは本明細書に開示されたシステインモチーフを含み得る。ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ＦＧＦ２１又はその誘導体或いは変異体はノブドメインに結合され得る。代替的に、又は付加的に、超長ＣＤＲ３はストークドメインの少なくとも一部を含む。ストークドメインは、超長ＣＤＲ３のストークドメイン内に保存モチーフを含み得る。ストークドメインの超長ＣＤＲ３内の保存モチーフは、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。ストークドメインの超長ＣＤＲ３を伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２２４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。ストークドメインの超長ＣＤＲ３を伴う保存モチーフは、配列番号１５７−１６１に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。ストークドメインの超長ＣＤＲ３を伴う保存モチーフは、配列番号２２３−２３４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。ストークドメインの超長ＣＤＲ３を伴う保存モチーフは、配列番号２３５−２３９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。ストークドメインの超長ＣＤＲ３を伴う保存モチーフは、配列番号２９６−２９９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。ストークドメインの超長ＣＤＲ３を有する保存モチーフは、配列番号３００−３０３に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。ストークドメインの超長ＣＤＲ３を伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に由来する配列から選択される第一配列に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２３４を含むポリペプチド配列基礎グループ、及び配列番号２３５−３０７及び配列番号３３３−３３６を含むグループから選択された第２配列を含み得る。本明細書に開示された抗体は、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来する、２以上、３以上、４以上、５つ以上の配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３０４−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。例えば、ストークドメインはＴ（Ｓ／Ｔ）ＶＨＱモチーフを含み得る。ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ＦＧＦ２１、又はその誘導体或いはその変異体はストークドメインに結合され得る。幾つかの例において、抗体、抗体フラグメント又は免疫グロブリンコンストラクトは更にリンカーを含む。リンカーは、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ＦＧＦ２１、又はその誘導体或いは変異体を免疫グロブリンドメイン又はそのフラグメントに結合し得る。他の例において、リンカーは、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４、ＦＧＦ２１、又はその誘導体或いは変異体をノブドメイン又はストークドメインに結合する。
【０６４５】
本明細書には、処置を必要とする被験体における疼痛を防ぐ又は処置する方法が提供され、該方法は、本明細書に記載の１以上の抗体、抗体フラグメント、又は免疫グロブリンコンストラクトを含む組成物を被験体に投与する工程を含む。幾つかの実施形態において、被験体は哺乳動物である。幾つかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。代替的に、哺乳動物はウシである。幾つかの例において、１以上の抗体、抗体フラグメント又は免疫グロブリンは、プロトキシン２、又はその誘導体或いは変異体を含む。代替的に又は付加的に、１以上の抗体、抗体フラグメント、又は免疫グロブリンコンストラクトはＣＤＲ３Ｈの少なくとも一部を含む。ＣＤＲ３Ｈの一部はＣＤＲ３Ｈにおけるストークドメイン又はノブドメインであり得る。幾つかの例において、１以上の抗体、抗体フラグメント又は免疫グロブリンコンストラクトは更にリンカーを含む。リンカーは、ＣＤＲ３Ｈの一部にプロトキシン２、又はその誘導体或いは変異体を結合し得る。
【０６４６】
本明細書には、必要とする被験体におけるナトリウムイオン経路の調節から利益を得る疾患又は疾病を防ぐ又は処置する方法が提供され、該方法は、前記被験体に１以上の本明細書に記載の抗体、抗体フラグメント、又は免疫グロブリンコンストラクトを含む組成物を投与する工程を含む。幾つかの例において、被験体は哺乳動物である。哺乳動物はヒトでもよい。代替的に、哺乳動物はウシである。幾つかの例において、１以上の抗体、抗体フラグメント又は免疫グロブリンコンストラクトは、プロトキシン２又はその誘導体を含む。代替的に、又は付加的に、１以上の抗体、抗体フラグメント、又は免疫グロブリンコンストラクトは、ＣＤＲ３Ｈの少なくとも一部を含む。ＣＤＲ３Ｈの一部は、ＣＤＲ３Ｈにおけるストークドメイン又はノブドメインでもよい。幾つかの例において、１以上の抗体、抗体フラグメント、又は免疫グロブリンコンストラクトは更にリンカーを含む。リンカーはＣＤＲ３Ｈの一部にプロトキシン２、又はその誘導体或いは変異体を結合し得る。幾つかの例において、ナトリウムイオンチャネルはＮａｖチャネルである。幾つかの例において、ＮａｖチャネルはＮａｖ１．７チャネルである。幾つかの例において、ナトリウムイオンチャネルの調節は、ナトリウムイオンチャネルを阻害する又は遮断する工程を含む。幾つかの例において、疾患又は疾病は、Ｄｒａｖｅｔ症候群、熱性けいれん陽性（ＧＥＦＳ＋）を有する全身性癲癇、先天性筋緊張性痙攣又は肢端紅痛症である。幾つかの例において、疾患又は疾病は疼痛である。
【０６４７】
本明細書には、必要とする被験体における酸感受性イオンチャンネル（ＡＳＩＣ）の調節から利益を得る疾患又は疾病を防ぐ又は処置する方法が提供され、該方法は、被験体に本明細書に記載の１以上の抗体、抗体フラグメント、又は免疫グロブリンコンストラクトを含む組成物を投与する工程を含む。幾つかの例において、被験体は哺乳動物である。特定の例では、哺乳動物はヒトである。代替的に、哺乳動物はウシである。幾つかの例において、１以上の抗体、抗体フラグメント、又は免疫グロブリンコンストラクトはプロトキシン２又はその誘導体或いは変異体を含む。代替的に、又は付加的に、１以上の抗体、抗体フラグメント、又は免疫グロブリンコンストラクトはＣＤＲ３Ｈの少なくとも一部を含む。ＣＤＲ３Ｈの一部は、ＣＤＲ３Ｈにおけるストークドメイン又はノブドメインでもよい。幾つかの例において、１以上の抗体、抗体フラグメント、又は免疫グロブリンコンストラクトは更にリンカーを含む。リンカーはプロトキシン２、又はその誘導体或いは変異体をＣＤＲ３Ｈの一部に結合し得る。幾つかの例において、ＡＳＩＣの調節は、ＡＳＩＣを阻害する又は遮断する工程を含む。幾つかの例において、疾患又は疾病は中枢神経系障害である。他の例において、疾患又は疾病は疼痛である。
【０６４８】
本明細書には、必要とする被験体における病原性の感染を防ぐ又は処置する方法が提供され、該方法は、被験体に本明細書に開示された超長ＣＤＲ３を含む１以上の抗体を含む組成物を投与する工程を含む。組成物は更に薬学上許容可能な担体を含み得る。被験体は哺乳動物でもよい。哺乳動物はヒトでもよい。代替的に、哺乳動物はウシである。抗体は治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体を含み得る。治療用ポリペプチドは非抗体配列によってコード化され得る。治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は免疫グロブリンドメインに結合され得る。治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は超長ＣＤＲ３内にあってもよい。代替的に、治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は、超長ＣＤＲ３に共役される。幾つかの例において、治療用ポリペプチドはベータインターフェロン、又はその誘導体或いは変異体である。抗体は本明細書に記載されるような免疫複合体でもよい。抗体は１以上の免疫グロブリンドメインを含むことができる。免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、又は免疫グロブリンＭでもよい。免疫グロブリンドメインは免疫グロブリン重鎖領域又はそのフラグメントであり得る。幾つかの例において、免疫グロブリンドメインは哺乳動物の抗体に由来する。代替的に、免疫グロブリンドメインはキメラ抗体に由来する。免疫グロブリンドメインは設計された抗体又は組み換え抗体に由来し得る。免疫グロブリンドメインはヒト化、ヒト操作、又は完全にヒト抗体でもよい。哺乳動物の抗体はウシの抗体であり得る。哺乳動物の抗体はヒト抗体でもよい。他の例において、哺乳動物の抗体はマウスの抗体である。超長ＣＤＲ３は長さが３５以上のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３は少なくとも３以上のシステイン残基を含み得る。超長ＣＤＲ３は１以上のシステインモチーフを含み得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−１５６に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号４５−９９に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号１００−１３５に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは、配列番号１３６−１５６に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３は、ノブドメインの少なくとも一部を含む。ノブドメインは、超長ＣＤＲ３のノブドメイン内に保存モチーフを含み得る。例えば、ノブドメインは本明細書に開示されたシステインモチーフを含み得る。ベータインターフェロン、又はその誘導体或いは変異体はノブドメインに結合され得る。代替的に、又は付加的に、超長ＣＤＲ３はストークドメインの少なくとも一部を含む。ストークドメインは、超長ＣＤＲ３のストークドメイン内に保存モチーフを含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは配列番号１５７−２２４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−１６１に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２２２−２３４に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２３５−２３９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号２９６−２９９に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に由来するものから選択された第１配列に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２３４を含む基礎配列グループ、及び、配列番号２３５−３０７及び配列番号３３３−３３６を含むグループから選択された第２配列を含み得る。本明細書に開示された抗体は、配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来する２以上、３以上、４以上、５以上の配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３０４−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。例えば、ストークドメインはＴ（Ｓ／Ｔ）ＶＨＱモチーフ（配列番号５０８）を含み得る。ベータインターフェロン、又はその誘導体或いは変異体はストークドメインに結合され得る。幾つかの例において、抗体、抗体フラグメント、又は免疫グロブリンコンストラクトは更にリンカーを含む。リンカーは、ベータインターフェロン、又はその誘導体或いは変異体を免疫グロブリンドメイン又はそのフラグメントに結合し得る。他の例において、リンカーはベータインターフェロン、又はその誘導体或いは変異体をノブドメイン又はストークドメインに結合する。幾つかの例において、病原性の感染はウィルス、細菌、菌類又は寄生虫の感染である。幾つかの例において、ウィルス感染はヘルペスウィルスである。
【０６４９】
本明細書には、必要とする被験体における癌を防ぐ又は処置する方法が提供され、該方法は、被験体に本明細書に開示された超長ＣＤＲ３を含む１以上の抗体を含む組成物を投与する工程を含む。組成物は更に薬学的に許容可能な担体を含み得る。被験体は哺乳動物でもよい。哺乳動物はヒトでもよい。代替的に、哺乳動物はウシである。抗体は治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体を含み得る。治療用ポリペプチドは非抗体配列によってコード化され得る。治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は免疫グロブリンドメインに結合され得る。治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は超長ＣＤＲ３内にあってもよい。代替的に、治療用ポリペプチド、又はその誘導体或いは変異体は超長ＣＤＲ３に共役される。幾つかの例において、治療用ポリペプチドはベータインターフェロン、又はその誘導体或いは変異体である。抗体は本明細書に記載されるような免疫複合体でもよい。抗体は１以上の免疫グロブリンドメインを含み得る。免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ又は免疫グロブリンＭでもよい。免疫グロブリンドメインは免疫グロブリン重鎖領域又はそのフラグメントであり得る。幾つかの例において、免疫グロブリンドメインは哺乳動物の抗体に由来する。代替的に、免疫グロブリンドメインはキメラ抗体に由来する。免疫グロブリンドメインは設計された抗体又は組み換え抗体に由来しても良い。免疫グロブリンドメインはヒト化、ヒト操作、又は完全にヒト抗体でもよい。哺乳動物の抗体はウシ抗体であり得る。哺乳動物の抗体はヒト抗体でもよい。他の例において、哺乳動物の抗体はマウス抗体である。超長ＣＤＲ３は長さが３５以上のアミノ酸でもよい。超長ＣＤＲ３は少なくとも３以上のシステイン残基を含み得る。超長ＣＤＲ３は１以上のシステインモチーフを含み得る。１以上のシステインモチーフは配列番号４５−１５６に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは配列番号４５−９９に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは配列番号１００−１３５に基づく又は由来し得る。１以上のシステインモチーフは配列番号１３６−１５６に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３は、ノブドメインの少なくとも一部を含む。ノブドメインは、超長ＣＤＲ３のノブドメイン内に保存モチーフを含み得る。例えば、ノブドメインは本明細書に開示されたシステインモチーフを含み得る。ベータインターフェロン、又はその誘導体或いは変異体はノブドメインに結合され得る。代替的に、又は付加的に、超長ＣＤＲ３はストークドメインの少なくとも一部を含む。ストークドメインは、超長ＣＤＲ３のストークドメイン内に保存モチーフを含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメイン内の保存モチーフは配列番号１５７−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは配列番号１５７−２２４に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは配列番号１５７−１６１に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは配列番号２２３−２３４に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは配列番号２３５−２３９に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは配列番号２９６−２９９に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは配列番号１３６−１５６に基づく又は由来し得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３００−３０３に由来する配列から選択される第一の配列に基づくか、由来するポリペプチド配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号１５７−２３４及び配列番号２３５−３０７と配列番号３３３−３３６を含むグループから選択された第２配列から選択されたポリペプチド配列基礎グループを含み得る、本明細書に開示された抗体は、２以上、３以上、４以上、５以上の配列番号１５７−３０７配列及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来する配列を含み得る。超長ＣＤＲ３のストークドメインを伴う保存モチーフは、配列番号３０４−３０７及び配列番号３３３−３３６に基づく又は由来するポリペプチド配列を含み得る。例えば、ストークドメインはＴ（Ｓ／Ｔ）ＶＨＱモチーフ（配列番号５０８）を含み得る。ベータインターフェロン、又はその誘導体或いは変異体はストークドメインに結合され得る。幾つかの例において、抗体、抗体フラグメント又は免疫グロブリンコンストラクトは更にリンカーを含む。リンカーはベータインターフェロン、又はその誘導体或いは変異体を免疫グロブリンドメイン又はそのフラグメントに結合され得る。他の例において、リンカーはベータインターフェロン、又はその誘導体或いは変異体をノブドメイン又はストークドメイン結合される。幾つかの例において、がんは血液悪性腫瘍である。血液悪性腫瘍は白血病又はリンパ腫であり得る。幾つかの例において、血液悪性腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病、マントル細胞リンパ腫、結節型リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病又は小リンパ球性白血病である。
【０６５０】
本明細書には、必要とする哺乳動物の疾患を防ぐ又は処置する方法が提供され、該方法は哺乳動物に本明細書に記載の医薬品組成物を投与する工程を含む。幾つかの実施形態において、疾患は感染症である。特定の実施形態において、感染症は乳腺炎である。幾つかの実施形態において、感染症は呼吸器疾患である。特定の実施形態において、呼吸器疾患はウシの呼吸器疾患である輸送熱である。特定の実施形態において、必要において哺乳動物は、乳牛、ラクダ、ロバ、ヤギ、ウマ、トナカイ、ヒツジ、水牛、オオジカ及びヤクを含むリストから選択された酪農動物である。幾つかの実施形態において、必要において哺乳動物はウシである。
【０６５１】
酪農動物の乳腺炎を防ぐ又は処置する方法が開示され、該方法は、配列番号２５及び配列番号２６を含むグループから選択された重鎖ポリペプチドを含む免疫グロブリンコンストラクト、及び配列番号２３を含む軽鎖ポリペプチドを含む組成物の効果的な量を酪農動物に工程を含む。１つの実施形態において、酪農動物の乳腺炎を防ぐ又は処置する方法が提供され、該方法は、配列番号４及び配列番号５から選択されたＤＮＡによってコード化される重鎖ポリペプチドを含む免疫グロブリンコンストラクト、及び配列番号１のＤＮＡによってコード化される軽鎖ポリペプチドを含む組成物の効果的な量を酪農動物に提供する工程を含む。幾つかの実施形態において、酪農動物は乳牛又は水牛である。本明細書に記載される抗体又は医薬組成物の効果的な量の被験体への投与による処置、阻害、及び予防の方法が提供される。抗体は十分に精製され得る（例えば、その効果を制限するか、望まれない副作用を生じる物質をほぼ含まない）。被験体は、乳牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、マウス、等を含む動物であって、これらに限定されない。被験体は哺乳動物であり得る。幾つかの例において、被験体はヒトである。代替的に、被験体はウシである。
【０６５２】
様々な送達システムは既知であり、本明細書に記載の抗体製剤、例えば、リポソームの中への封入、微小粒子、マイクロカプセル、化合物を発現され得る組み換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照）、レトロウィルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築など、を投与するために使用され得る。導入の方法は、限定されないが皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口の経路を含む。化合物又は組成物は、例えば上皮のライニング又は粘膜皮膚のライニングを通じる吸収によって、例えば点滴又は大量注射によって任意の都合のよい経路（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜、等）によって投与され得、他の生理活性物質と一緒に投与され得る。投与は全身性又は局所的であり得る。更に、特定の実施形態において、脳室内及びクモ膜下注入を含む任意の適切な道筋により本明細書に記載されているヘテロ多量体組成物を中枢神経系へ開始することが望ましい。脳室内注入は、例えばオンマイヤリザーバーなどのリザーバに結合される、脳室内のカテーテルによって促進され得る。
【０６５３】
特定の実施形態において、処置を必要とする領域へ局所的に本明細書に記載の抗体又は組成物を投与することが望ましい。これは例えば、限定されない例として、局所の点滴、塗布、例えば、手術後に組み合せて局所に適用される包帯によって、注入によって、カテーテルによって、坐薬によって、或いはインプラント（多孔性、非多孔性又はゼラチン状の物質であるｓｉａｌａｓｔｉｃ膜のような膜或いは繊維を含む）によってもたらされる。好ましくは、本発明の抗体を含むタンパク質を投与する場合、タンパク質を吸収しない材料を使用するよう注意しなければならない。
【０６５４】
別の実施形態において、抗体又は医薬品組成物はベシクル、特に、リポソームにおいて送達される（Ｌａｎｇｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），  Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）、Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，  ｉｂｉｄ．，  ｐｐ．３１７−３２７；一般的な章を参照）。
【０６５５】
更に別の実施形態において、ヘテロ多量体又は組成物は制御放出システムにおいて送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ，  ｓｕｐｒａ；  Ｓｅｆｔｏｎ，  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  １４：２０１（１９８７）、  Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）、Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２１：５７４（１９８９）を参照）。別の実施形態において、高分子材料が使用され得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ  （ｅｄｓ．），  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａ．（１９７４）、  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，  Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ  （ｅｄｓ．），  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）、  Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，  Ｊ．，  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｓｃｉ．  Ｒｅｖ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２３：６１（１９８３）を参照、また、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；  Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２５：３５１（１９８９）；  Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  ７１：１０５（１９８９）も同様に参照）。更に別の実施形態において、制御放出システムは、治療標的、例えば脳、の近位に置くことができ、全身性の用量の一部（ｆｒａｃｔｉｏｎ）のみを必要とする（Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４））を参照）。他の制御放出システムはランガーによるレビューにおいて議論されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０６５６】
本明細書に記載の抗体をコード化する核酸を含む特定の実施形態において、適切な核酸発現ベクターの一部として構築して細胞内となるように投与することにより（例えば、レトロウィルスベクターの使用による（米国特許４，９８０，２８６号を参照））又は直接注入により、又は微小粒子照射（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）或いは脂質又は細胞表面受容体或いは遺伝子導入試薬の被覆の使用により、或いは核酸に侵入すると知られるホメオボックス様ペプチドへの連結において投与することにより、核酸は、そのコード化したタンパク質の発現を促進するためにインビボで投与され得る。
【０６５７】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示された抗体に基づく又は由来する結晶が開示されている。結晶は空間群Ｐ２１２１２１を有し得る。幾つかの例において、結晶は単位胞寸法「ａ」が約４０〜８０オングストロームの間、４５〜約７５オングストロームの間、又は約５０〜約７５オングストロームの間であり、「ｂ」が約４０〜１４０オングストロームの間、約５０〜約１３０オングストロームの間、約５５〜約１３０オングストロームの間であり、「ｃ」が１００〜約３５０オングストロームの間、１２０〜約３４０オングストロームの間、又は約１２５〜約３３０オングストロームの間である。代替的に、結晶は４０、５０、６０、７０、及び８０オングストローム以上のａの単位胞寸法を有しており、ｂは４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０又は１３０オングストローム以上、及びｃは１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０又は３４０オングストローム以上である。
【０６５８】
結晶はウシの抗体又はその一部分を含み得る。結晶は、ウシの抗体に基づく又は由来するＦａｂフラグメントを含み得る。結晶は非抗体配列、リンカー、切断部位、非ウシ配列又はその組合せを含み得る。結晶は分離された結晶でもよい。抗体は配列番号１−４４のいずれかのペプチド配列に基づく又は由来し得る。抗体は、重鎖の少なくとも一部を含み得る。重鎖の一部は、配列番号２４−４４のいずれかのペプチド配列を含み得る。抗体は、重鎖の少なくとも一部を含み得る。重鎖の一部は、配列番号２−２２の何れかのＤＮＡ配列に基づく又は由来するＤＮＡ配列よってコード化され得る。抗体は、軽鎖の少なくとも一部を含み得る。軽鎖の一部は、配列番号２３のペプチド配列を含み得る。抗体は重鎖の、少なくとも一部を含み得る。重鎖の一部は、配列番号１のＤＮＡ配列に基づく又は由来するＤＮＡ配列によってコード化され得る。
【０６５９】
幾つかの実施形態において、配列番号２４及び配列番号２３を含むウシの抗体Ｆａｂフラグメントを含む分離された結晶が開示され、ここで結晶は空間群Ｐ２１２１２１及びａ＝７１．４オングストローム、ｂ＝１２７．６オングストローム及びｃ＝１２７．９オングストロームの単位胞寸法を持つ。
【０６６０】
幾つかの実施形態において、配列番号３４０及び配列番号３４１を含むウシの抗体Ｆａｂフラグメントを含む分離された結晶が開示され、ここで結晶は空間群Ｐ２１２１２１及びａ＝５４．６オングストローム、ｂ＝５３．７オングストローム及びｃ＝３３０．５オングストロームの単位胞寸法をもつ。
【０６６１】
実施例１：超長ＣＤＲ３を含む抗体の精製及び結晶化
【０６６２】
例えば、本明細書に記載のいずれかの実施例により生成された抗体のような超長ＣＤＲ３を含む抗体は、抗体の構造を決定するために精製され、その後に結晶化され得る。
【０６６３】
Ａ：精製
【０６６４】
ＢＬＶ１Ｈ１２とＢＬＶ５Ｂ８の重鎖及び軽鎖のＦａｂ領域をコード化する遺伝子は、遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により生成された。ｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロモーター領域に由来するＤＮＡフラグメントは、オーバーラップＰＣＲによってｇｐ６７のミツバチ・メリチン（ＨＢＭ）シグナルペプチドに融合され、ｇｐ６７及びＨＢＭの上流にヘッドツーヘッド（ｈｅａｄ  ｔｏ  ｈｅａｄ）のｐ１０及びポリへドリンプロモータを有するフラグメント（すなわちＨＢＭ−ｐ１０−ｐＰｏｌｙＨ−ｇｐ６７）が得られた。ウシのＦａｂの重鎖領域及び軽鎖領域は、オーバーラップＰＣＲによってプロモーターシグナルペプチド・カセットに融合され（重鎖はｐＰｏｌｙＨ−ｇｐ６７の下流及び軽鎖はｐ１０−ＨＢＭの下流に）、ｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌの誘導体であるｐＤＣＥ３６１のＳｆｉＩ部位に結合された。次に、Ｈｉｓ６−タグ（配列番号５１１）が精製を促進するために重鎖のＣ末端に導入された。結果として生じるバキュロウィルス移動ベクターはＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、組み換えのｂａｃｍｉｄｓを生じさせるために使用された。また、ウィルスは、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、精製されたｂａｃｍｉｄ  ＤＮＡをＳｆ９細胞へ遺伝子導入することにより救われた。両方のＦａｂタンパク質は、５−１０のＭＯＩで組み換えバキュロウィルスによりＳｆ９細胞の懸濁培養物を感染させ、２８℃、１１０ＲＰＭで震盪することにより生産された。７２時間の後、培養物は４℃で２０００ｇ及び１０，０００ｇでの２回の遠心分離により精製された。分泌された可溶性Ｆａｂを含む上清は、その後、濃縮されバッファーが１ｘ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４へ交換された。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を使用した金属親和性クロマトグラフィーの後、ＦａｂはプロテインＧ親和性クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＭｏｎｏＳ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製された。
【０６６５】
Ｂ：結晶化と構造決定
【０６６６】
ウシのＦａｂを含んでいるゲル濾過画分は、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０及び５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で１０ｍｇ／ｍＬまでに濃縮された。初期の結晶化の試みは、Ｊｏｉｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓにおいて全自動Ｒｉｇａｋｕ  Ｃｒｙｓｔａｌｍａｔｉｏｎロボットシステムを使用してセット・アップされた。幾つかのヒットがＢＬＶ１Ｈ１２とＢＬＶ５Ｂ８について得られ、そして、データ収集に使用された結晶は、０．２７Ｍのクエン酸カリウム、２２％のＰＥＧ  ３３５０（ＢＬＶ１Ｈ１２）、及び０．２Ｍ酒石酸二ナトリウム及び２０％のＰＥＧ  ３３５０（ＢＬＶ５Ｂ８）を含むリザーバ溶液（１００μＬ）を有するシッティングドロップ蒸気拡散法によって成長された。１００ｎＬタンパク質＋１００ｎＬの沈殿剤から構成される液滴は、２０℃でセット・アップされ、そして結晶が３−７日以内に現われた。結果として生じる結晶は１５％のエチレングリコールを添加された溶液を十分に使用することで凍結保護され、そして瞬間冷却され、データ収集まで液体窒素中に保存された。
【０６６７】
回折データは、その後、アルゴンヌ国立研究所のＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  ＳｏｕｒｃｅのＧＭ／ＣＡ−ＣＡＴ  ２３ＩＤ−Ｄビームライン（ＢＬＶ１Ｈ１２）、及びＢＬＶ５Ｂ８のためにはスタンフォード・シンクロトロン放射光源の１１−１ビームラインにおいて収集された。両方のデータセットは空間群Ｐ２１２１２１でインデックス付けされ、ＨＫＬ２０００（ＢＬＶ５Ｂ８；ＨＫＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）又はＸＰＲＥＰ（ＢＬＶ１Ｈ１２；  Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して統合、スケーリング（ｓｃａｌｅ）、結合（ｍｅｒｇｅ）された。ＢＬＶ１Ｈ１２構造はＰｈａｓｅｒ（ＭｃＣｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）を使用して、１．８８オングストロームの分解能に対する分子置換によって解かれた。Ｆａｂは、１ＢＶＫの可変性ドメイン及び２ＦＢ４の不変領域がサーチモデルとして使用され、そして２つの完全なＢＬＶ１Ｈ１２Ｆａｂが非対称単位に見出された。ＢＬＶ５Ｂ８データセットも、リファインされたＢＬＶ１Ｈ１２座標をモデルとして使用して、分子置換（２．２０オングストロームに対して）によって解かれた。リジッドボディリファインメント、シミュレーテッドアニーリング及びレストレイントリファインメント（各Ｉｇドメインについては１つのグループ、及び各ＣＤＲ  Ｈ３については１つでの、ＴＬＳリファインメントを含む）は、Ｐｈｅｎｉｘ  によって実行された（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６６：２１３−２２１）。ライディング水素（Ｒｉｄｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ）は精製において使用され、最終モデルにおいて含まれる。
【０６６８】
複数回の精製の間にモデルは、Ｃｏｏｔを使用して作成され調整された。水はＰｈｅｎｉｘの「ｏｒｄｅｒｅｄ＿ｓｏｌｖｅｎｔ」モデリング機能を使用して自動的に構築された（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６６：２１３−２２１）。構造は、Ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６６：１２−２１）を含むＪＣＳＧ  ＱＣサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｓｍｂ．ｓｌａｃ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｊｃｓｇ／ＱＣ／で公に利用可能）によって認証された。表１。
【０６６９】
【表４】
2018140992.tif 000006
【０６７０】
実施例２：超長ＣＤＲ３を含む抗体をコード化するポリヌクレオチドのライブラリの作成
【０６７１】
ウシの脾臓及びリンパ節は、Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｔｙｌｅｒ，ＴＸ）又はテキサスＡ＆Ｍ大学から得られた。全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、それに続いてＲＮｅａｓｙミニ・キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）によるカラム上で消化された３頭の異なる乳牛（ＭＩＤ１、ＭＩＤ１０及びＭＩＤ１１）のウシの組織から分離された。次に、ＲＮＡの量及び質は、製造者のプロトコルに従いＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｑｕｂｉｔ  ＲＮＡ及びＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で評価された。全ＲＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって触媒されるｃＤＮＡ合成に鋳型として使用された。
【０６７２】
増幅された抗体可変領域のライブラリは、その後、大規模シーケンス解析にさらされた。簡潔に、３頭の乳牛（ＭＩＤ１、ＭＩＤ１０及びＭＩＤ１１）の各々のためのバーコード化プライマー（表２）はウシの脾臓ｃＤＮＡからＶＨを増幅するために使用された。
【０６７３】
【表５】
2018140992.tif 000007
【０６７４】
次に、ＶＨの単位複製配列は２％のアガロースゲルから精製され、ロッシュ４５４  ＧＳ  ＦＬＸの説明書に従って大規模シーケンス解析された。ＭＵＳＣＬＥアルゴリズムによるマルチプルアライメントが行なわれた（Ｅｄｇａｒ（２００４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２：１７９２−１７９７）。配列に観察される多量の不均質性のため、ＭＵＳＣＬＥは比較的高いギャップオープン（−２０．０）及びギャップ拡張（−１０．０）ペナルティの条件で多数の長ＣＤＲ  Ｈ３ヌクレオチドアライメントを作成するため実行された。ローカルアライメントは以下の条件、マッチスコア＝２．０、ミスマッチペナルティ＝−１．０、ギャップオープニングペナルティ＝−２．０及びギャップ拡張ペナルティ＝−０．５で、スミス＝ウォーターマン・アルゴリズムを使用して実行された。ＣＤＲ  Ｈ３は、フレームワーク４の中で保存されたトリプトファンに直ちに先行する残基に、フレームワーク３の中で保存されたシステインに続く第３の残基によって定義された。ＶＨＢＵＬは大規模シーケンス解析によって同定された多数の超長ＶＨ配列を用いたウシのゲノム（ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｂｔａｕ＿４．６．１）のＢＬＡＳＴ探索によって同定された。大規模シーケンス解析は、４４〜６９の間のアミノ酸残基の長さを有する合計１１，７２８の超長ＣＤＲ３配列を同定した。大規模シーケンス解析の結果を下の表３に要約する。
【０６７５】
【表６】
2018140992.tif 000008
【０６７６】
大規模シーケンス解析の結果、超長ＣＤＲ３が３〜１２のシステイン残基間を含むシステインモチーフ（例えばシステイン残基のパターン）を含むことを明らかにした。３頭の異なる乳牛（ＭＩＤ１、ＭＩＤ１０及びＭＩＤ１１）の大規模シーケンス解析ランで見られたシステインパターンの代表的な例は、存在度と同様に示される（表４−６；配列番号４５−１５６）。超長ＣＤＲ３領域におけるシステインは「Ｃ」として記号化される。２つのシステイン間のアミノ酸は「Ｘｎ」として記号化される。追加のシステインモチーフの例は表２３において定義される超長ＣＤＲ３配列で示される。
【０６７７】
【表７】
2018140992.tif 000009
【０６７８】
【表８】
2018140992.tif 000010
【０６７９】
【表９】
2018140992.tif 000011
【０６８０】
ウシのＶＨ領域は、超長ＣＤＲのためにバイアスをかけた抗体可変領域ｃＤＮＡのライブラリを作成するプライマー５’−ＴＴＧＡＧＣＧＡＣＡＡＧＧＣＴＧＴＡＧＧＣＴＧ−３’（配列番号３１４）及び５’−ＣＴＴＴＣＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧ−ＡＧＧＣ−３’（配列番号３１５）を使用して、実施例９で調製されたｃＤＮＡから増幅された。次に、ＶＨ領域の混合物は、ウシのＣＨ１及びヒトＩｇＧＦｃを用いたオーバーラップＰＣＲによって組み立てられた。簡潔に、ＥｃｏＲＩとＮｈｅＩの部位がｐＦＵＳＥ発現ベクターへ組み込まれライゲーションにより哺乳動物細胞の中で発現に備えた完全長重鎖ライブラリを利用可能にされた。ライゲーション生成物は大腸菌に形質転換され、そして５００の単一の大腸菌形質転換体が取得された。その後、形質転換体はそれぞれ、個別の管において一晩増殖させられ、そして、各コロニーからのＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉｎｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ）を使用して抽出され、オリゴ５’−ＡＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣ−３’（配列番号３１６）を使用してＢＡＴＪ社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によってシーケンス解析された。配列はＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して分析された。重複した配列、挿入のない配列及び３５残基より短いＣＤをコード化する配列が除外された。独特の長いＣＤＲの重鎖配列を含んでいる１３２のクローンが選択された。その後、１３２のメンバーのライブラリのそれぞれの重鎖は、小さな空間的にアドレス指定されたライブラリを作成するため、不変量のウシの軽鎖（配列番号：Ｎ）を２９３Ｔ細胞にコード化するｐＦＵＳＥ発現ベクターと平行して、同時に遺伝子導入された（Ｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２８：１１９５−１２０２）。ウェルにつき１３０，０００個の２９３Ｔ細胞は２４ウェルプレートにまかれ、そして１０％のＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む５００ｕｌ  ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７℃及び５％のＣＯ２において一晩増殖された。０．５μｇのＨｃをコード化するｐＦｕｓｅベクター及び０．５μｇのＬｃをコード化するｐＦｕｓｅベクターは２５μＬのｏｐｔｉｍｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に加えられた。１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００又は２９３Ｆｅｃｔｉｎ遺伝子導入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は２５μＬのｏｐｔｉｍｅｍに加えられ、５分間インキュベートされた。次に、ＤＮＡ−ｏｐｔｉｍｅｍ混合物及び遺伝子導入試薬−ｏｐｔｉｍｅｍを組合せた混合物は１５分間インキュベートされ、２９３Ｔ細胞に加えられ、細胞上で４−６時間インキュベートすることが可能になった。その後、培地はウェルから吸引され、新しい培地と取り替えられ、そして細胞は４日間培養され培地へＩｇＧを分泌させることが可能になった。ＩｇＧを含む細胞培養上清はさらなる試験のための９６ウェルの形式に集められた。キメラ抗体は、ヒトＦｃを検出するサンドイッチＥＬＩＳＡによって定量され、ＥＬＩＳＡによってＢＶＤＶに対する結合のためスクリーニングされた���
【０６８１】
その後、抗体は培地へ分泌され、ＥＬＩＳＡによるＢＶＤＶに対する結合のためのスクリーニングを含むさらなる試験のために小さな空間的にアドレス指定されたライブラリを作成するため、９６ウェル形式で集められた。例えば、ＥＬＩＳＡは、ＢＶＤＶ結合のために抗体ライブラリをスクリーニングするために行われた。簡潔に、１００μＬ  ＤＰＢＳにおいて死滅ＢＶＤＶ（０．２μｇ）は、９６−ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）に３７℃で１時間被覆された。次に、プレートは２００μＬのＤＰＢＳＴ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、０．２５％のＴｗｅｅｎ２０）中の３％のＢＳＡ溶液でブロッキングされた。その後、サンプルＤＰＢＳＴ中の３％のＢＳＡでは３７℃で１時間インキュベートされた。その後、ウェルは２００μＬのＤＰＢＳＴで５回洗われた。次に、ブロッキング溶液の中で１：１，０００に希釈されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）−ＨＲＰ結合抗体（ＫＰＬ社）が加えられ、３７℃で１時間インキュベートされた。その後、ウェルは２０μＬのＤＰＢＳＴで十回洗われた。１００μＬのＱｕａｎｔａＢｌｕ（Ｐｉｅｒｃｅ）ワーキング溶液が各々のウェルに加えられ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダーでｅｘ３２５／ｅｍ４２０ｎｍで読まれる前に、室温で５分分間インキュベートされた。幾つかの結合剤の候補は同定された（図１Ｂ、左）。クローンＨ１２は、６つのシステイン残基を有する６３の残基ＣＤＲ３を有しており、用量依存的な様式でＢＶＤＶを強く結合することができた（図１Ｂ右及び１Ｃ）。
【０６８２】
更に、前に述べられたように、ＢＶＤＶ抗原のキメラ組み換え抗体の結合は遺伝子導入されたヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３Ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた免疫サイトメトリー分析によって評価された（例えば、Ｎｊｏｎｇｍｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：１６２４−１６３５を参照）。簡潔に、６−ウェル組織培養プレートのＨＥＫ  ２９３Ａの単層は、ＢＶＤＶ抗原（Ｎｐｒｏ、Ｅ２又は非構造タンパク質ＮＳ２−３）をコード化するプラスミド（ｐＣＤＮＡ３．３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に２μｇ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して遺伝子導入され、そして５％のＣＯ２により３７℃で４８時間インキュベートされた。単層は１０分間氷冷１００％メタノールで固定され、ＰＢＳですすがれ、そして５％のウシ胎児血清を含むＰＢＳ（ブロッキングバッファー）でブロッキングされ、そして単層はブロッキングバッファー中の１０μｇ／ｍｌのマウス抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）複合体（Ｓｉｇｍａ）又は１０μｇ／ｍｌのキメラ組換体抗体Ｈ１２又はＢ８で１時間、室温でインキュベートされた。空ベクターで遺伝子導入された単層を負の対照として用いて同様に反応させ、そして、ブロッキングバッファーでの洗浄後、キメラ組換体抗体と共に調べられた単層は、ブロッキングバッファーで１／２００希釈されたＡＰ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ｍＡｂ（ｓｉｇｍａ）で１時間インキュベートされた。ブロッキングバッファーによる洗浄の後、すべてウェルのＡＰ活性はＦａｓｔ  Ｒｅｄ  ＡＳ−ＭＸ基質（ｓｉｇｍａ）を使用して検出された。染色された細胞は、カメラを装備したＩＳ７０  Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ）を用いて視覚化され、撮影された。Ｈ１２は、ＢＶＤＶのＮＳ２−３非構造タンパク質と共に遺伝子導入されたＨＥＫ２９３Ａ細胞に強く結合するが、遺伝子導入されていない細胞とは弱く結合し、一方、Ｂ８は、ＢＶＤＶのＮＳ２−３非構造タンパク質を遺伝子導入された細胞、遺伝子導入されていない細胞の両方のＨＥＫ２９３Ａ細胞に対する弱い結合を有する（図１Ｄ）。
【０６８３】
実施例３：超長ＣＤＲ３を含む抗体のライブラリの作成及び試験
【０６８４】
超長ＣＤＲ３を含む抗体をコード化するポリヌクレオチドのライブラリは、死滅牛ウィルス性下痢症ウィルス（ＢＶＤＶ）の畜牛への免疫化によって作成される（図１Ａ）。簡潔に、４月齡のホルスタイン種去勢ウシは熱殺菌されたＢＶＤＶ−１及びＢＶＤＶ−２（各々の１００μｇ）混合物の皮内接種によって免疫化された。非活化ウィルス混合物は５００μＬのＰＢＳに懸濁され、二連針（ｄｏｕｂｌｅ  ｂａｒｒｅｌ  ｎｅｅｄｌｅ）に繰り返し通すことにより５００μＬ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  によって乳化された。次に、免疫原は、２６×１／２Ｇ針を使用して頚部に皮内接種をされた（２００μＬ／注入）。その後、去勢ウシは、同じ量の抗原で一ヶ月ごとに３回追加免疫されたが、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔで処方された。セロコンバージョンは、非活化ウィルスで覆われたプレートを使用するＥＬＩＳＡ、及びＢＶＤＶ−１又はＢＶＤＶ−２のいずれかに感染したＭＤＢＫ細胞の免疫サイトメトリー分析によって試験された。去勢ウシはその後頚静脈から採血され、そして血液はヘパリン中に集められた。リンパ球は、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）遠心分離によって精製され、ＲＮＡｌａｔｅｒ中に保存された。ｃＤＮＡライブラリはその後、実施例２に記載されるような複数のリンパ球ＲＮＡから作られた。
【０６８５】
実施例４：哺乳動物細胞における発現のためのＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合タンパク質のベクターの構築
【０６８６】
ウシのＧ−ＣＳＦ（ｂＧＣＳＦ）をコード化する遺伝子は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ＮＪ，  ＵＳＡ）によって合成され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。免疫グロブリンコンストラクトのフォールディング及び安定性を最適化するために、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５０９）（ｎ＝０、１）の柔軟なリンカーはｂＧＣＳＦフラグメントの両末端に付加された。その後、様々な長さのリンカーを有するｂＧＣＳＦのＰＣＲフラグメントは、ＢＬＶ１Ｈ１２の結晶構造において示されるような「ノブ」ドメインを置換するためオーバーラップ拡張ＰＣＲの活用により、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖の相補性決定領域３（ＣＤＲ３Ｈ）に結合された。ＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合タンパク質の発現ベクターは、増幅されたＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合遺伝子のｐＦｕｓｅ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ  バックボーン・ベクター（ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｖｅｃｔｏｒ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＣＡ）に対するインフレームライゲーションによって作成された。同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含まないｐＦｕｓｅベクターへクローン化された。得られた発現ベクターは、シーケンス解析によって確認された。図８のＦ及び８のＧは、ウシのＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖領域のノブドメインに少なくとも一部に挿入される、又はそれを置換するウシのＧ−ＣＳＦの描写を提供する。図１４は、ＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合タンパク質の発現のためのベクターを示す。重鎖及び軽鎖免疫グロブリンコンストラクトをコード化するＤＮＡ配列、Ａｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ０（ｎ＝０）及びＡｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ１（ｎ＝１）は表１９において示される。重鎖及び軽鎖免疫グロブリンコンストラクトをコード化するアミノ酸配列、Ａｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ０及びＡｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ１は表２１に示される。
【０６８７】
実施例５：ＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合抗体の発現及び精製
【０６８８】
ＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合抗体は、ＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合重鎖及びＢＬＶＨ１Ｈ１２軽鎖をコード化するベクターによるｆｒｅｅ  ｓｔｙｌｅ  ＨＥＫ２９３細胞の一過的な遺伝子導入によって発現された。発現されたＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合抗体は培地へ分泌され、遺伝子導入の後、４８時間及び９６時間で採取された。ＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合抗体はプロテインＡ／Ｇクロマトグラフィー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＩＬ）によって精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析された。図１５Ａは、ＨＥＫ２９３細胞から、精製されたａｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ０及びａｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ１融合抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０６８９】
実施例６：マウスＮＦＳ−６０細胞に対するＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合抗体の増殖活性のインビトロの研究
【０６９０】
マウスＮＦＳ−６０細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，ＶＡ）から得られ、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノール及び６２ｎｇ／ｍｌのヒト・マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養された。増殖アッセイのために、マウスＮＦＳ−６０細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗われ、１．５×１０５細胞／ｍｌの密度で１０％のＦＢＳ及び０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁された。９６−ウェルプレートにおいて、１００μＬの細胞懸濁液がそれぞれのウェルに加えられ、その後、様々な濃度のｂＧＣＳＦ、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体及び本明細書に記載の免疫グロブリンコンストラクトが加えられ、等量のＰＢＳバッファーが対照ウェルに加えられた。プレートは７２時間５％のＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で培養された。その後、細胞はＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（細胞懸濁液の１／１０量）で、３７℃で４時間処理された。各々のウェルの５９５ｎｍの蛍光は、細胞の生存率を示すために読み取られた。図９のＡ−９のＥ及び表７−８に見られるように、免疫グロブリンコンストラクトａｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ０及びａｂ−ｂＧＣＳＦ  Ｌ１はウシのＧ−ＣＳＦ及びヒトＧ−ＣＳＦと類似した活性を示す。
【０６９１】
【表１０】
2018140992.tif 000012
【０６９２】
【表１１】
2018140992.tif 000013
【０６９３】
実施例７：ヒト顆粒球前駆細胞に対するＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合抗体の増殖活性のインビトロの研究
【０６９４】
ヒトｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞はＡｌｌＣｅｌｌｓから購入された。細胞は、１×抗生物質及び以下の 組み換えのヒトサイトカイン：トロンボポイエチン、ＩＬ６、Ｆｌｔ３リガンド及び幹細胞刺激因子（１００ｎｇ／ｍＬ，  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加された、ＨＳＣ増殖培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において再懸濁された、その後、ＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合抗体が様々な濃度で９６−ウェルプレート（ウェルにつき１０００細胞）にまかれた。細胞は５％のＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で７日間培養され、そして、ＣＤ４５ｒａとＣＤ４１の細胞数及び発現を測定するためにフローサイトメトリー上で分析された。細胞は、ＰＥＣｙ７抗ＣＤ４５ｒａ及びｅＦｌｕｏｒ４５０抗ＣＤ４１を含む染色培地（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（２％のＦＢＳ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡを添加されたＨＢＳＳ）で一時間、４℃で染色され、その後、染色培地で洗われ、分析された。細胞の表現型分析のマルチカラー分析はＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって行なわれた。図１０のＡ−１０のＥ及び表９−１０は、Ａｂ−ＧＣＳＦ融合抗体のヒト顆粒球始原細胞の増殖活性を示す。
【０６９５】
【表１２】
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【０６９６】
【表１３】
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【０６９７】
実施例８：マウスにおけるＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合抗体の薬物動態
【０６９８】
マウスにおけるＰＫ研究のために、本明細書に記載の７０μｇの免疫グロブリンコンストラクトが１つのグループ当たり３のＢＡＬＢ／ｃマウスに注入された。血液サンプルは、広間隔で時間０〜１４日目に採取され、ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識の抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（ＫＰＬ）、及びＨＲＰ標識の抗６×Ｈｉｓ抗体（配列番号５１１として開示される「６×Ｈｉｓ」）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してＥＬＩＳＡによって分析された。データは、第１時点（３０分）の最高濃度をとることにより標準化された。図１１のＡ−１１のＢ及び表１１で見られるように、本明細書に記載の免疫グロブリンコンストラクトの形態で提供された時、ウシのＧ−ＣＳＦの半減期は有意に増加した。
【０６９９】
【表１４】
2018140992.tif 000016
【０７００】
実施例９：マウスの好中球数
【０７０１】
ＰＫ研究用のマウスへのＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合抗体の注射の後１０日目に、血液サンプルはマウスより採取され、Ｄｉｆｆ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＩＬ）を使用して染色された。好中球と白血球は顕微鏡で計数され、そして好中球のパーセンテージが分析された。図１２のＡ−１２のＢ及び表１２は血液染色され計数された注射後１０日目のマウスにおけるＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合抗体に対する好中球の増殖活性を示す。
【０７０２】
【表１５】
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【０７０３】
実施例１０：ピキア・パストリスにおける発現のためのＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合タンパク質のベクターの構築
【０７０４】
ＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ重鎖及びＢＬＶ１Ｈ１２軽鎖をコード化する遺伝子フラグメントは、ｐＦｕｓｅ発現ベクターから増幅され、その後、同じｐＰＩＣＺαベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へライゲートされた。重鎖及び軽鎖の発現はＡＯＸ１プロモーターの制御下にあった。
【０７０５】
実施例１１：ピキアにおけるＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合抗体の発現及び精製
【０７０６】
ピキアＧＳ１９０細胞は、免疫グロブリンコンストラクトの重鎖及び軽鎖をコード化するｐＰＩＣＺαベクターによるエレクトロポレーションによって遺伝子導入された。陽性の形質転換体はゼオシン耐性により選択され、そしてＰＣＲによって確認された。結合されたＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合遺伝子を有するピキア細胞は、ＯＤ６００＝２〜６までＢＭＧＹ培地において増殖された。細胞はその後、タンパク質発現の誘導のために原体積のうちの１／５の細胞がＢＭＭＹ培地へ移された。２４時間ごとに、終濃度０．５％のメタノールが培地に加えられ、誘導を維持された。分泌された免疫グロブリンコンストラクトを含んでいる培地は、９６時間の誘導の後に収集された。ＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合抗体は、プロテインＡ／ＧクロマトグラフィーＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＩＬ）によって精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析された。図１３のＡ−１３のＣはピキア・パストリスにおけるＢＬＶ１Ｈ１２−ｂＧＣＳＦ融合抗体の発現及び精製を示す。
【０７０７】
実施例１２：哺乳動物細胞における発現のためのＢＬＶ１Ｈ１２−Ｍｏｋａ１融合タンパク質のベクターの構築
【０７０８】
Ｍｏｋａ１をコード化する遺伝子はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ又はＩＤＴによって合成され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。融合タンパク質のフォールディング及び安定性を最適化するために、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５０９）（ｎ＝０、１）の柔軟なリンカーがＭｏｋａ１フラグメントの両末端に付加された。その後、リンカーを有する、及びそのリンカーのないＭｏｋａ１のＰＣＲフラグメントは、オーバーラップ拡張ＰＣＲの活用により、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖（ＣＤＲ３Ｈ）の相補性決定領域３へ移植されＢＬＶ１Ｈ１２の結晶構造において示されるような「ノブ」ドメインを置換した。ＢＬＶ１Ｈ１２−Ｍｏｋａ１融合タンパク質の発現ベクターは、増幅されたＢＬＶ１Ｈ１２−Ｍｏｋａ１融合遺伝子のｐＦｕｓｅ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃバックボーン・ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＣＡ）へのインフレームライゲーションによって作成された。同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含まないｐＦｕｓｅベクターへクローン化された。得られた発現ベクターは、シーケンス解析によって確認された。図８のＦ及び８のＨは、ウシのＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖領域のノブドメインの少なくとも一部に挿入される、又はそれを置換するＭｏｋａ１ペプチドの描写を示す。
【０７０９】
実施例１３：ＢＬＶ１Ｈ１２ａｂ−Ｍｏｋａ１融合抗体の発現及び精製
【０７１０】
ＢＬＶ１Ｈ１２−Ｍｏｋａ１融合抗体は、ＢＬＶ１Ｈ１２−Ｍｏｋａ１融合重鎖及びＢＬＶ１Ｈ１２軽鎖をコード化するベクターによるｆｒｅｅ  ｓｔｙｌｅ  ＨＥＫ２９３細胞の一過的な遺伝子導入によって発現された。ＢＬＶ１Ｈ１２−Ｍｏｋａ１融合抗体は培地へ分泌され、遺伝子導入の後、４８時間及び９６時間で収集された。ＢＬＶ１Ｈ１２−Ｍｏｋａ１融合抗体はプロテインＡ／Ｇクロマトグラフィー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＩＬ）によって精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析された。図１６のＡは、免疫グロブリン融合抗体Ａｂ−Ｍｏｋａ１  Ｌ０（ｎ＝０）及びａｂ−Ｍｏｋａ１  Ｌ１（ｎ＝１）のＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。
【０７１１】
実施例１４：ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）／Ｔ細胞の活性化のＢＬＶ１Ｈ１２−Ｍｏｋａ１融合抗体による阻害活性のインビトロの研究
【０７１２】
ヒトＰＢＭＣは、フィコール勾配遠心分離によって健康なドナーの新鮮な静脈血から分離され、その後、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地の中で再懸濁され、１×１０６細胞／ｍＬの密度で９６−ウェルプレートにまかれた。分離されたＰＢＭＣからＴ細胞濃縮キットを使用して、ヒトＴ細胞が精製された。精製されたＰＢＭＣ及びＴ細胞は、５％ＣＯ２により、３７℃で１時間、様々な濃度の精製されたＢＬＶ１Ｈ１２−Ｍｏｋａ１融合抗体で前処理され、そして、抗ＣＤ３及びＣＤ２８抗体によって活性化された。処置の２４時間後、上清はＥＬＩＳＡキット使用した分泌されたＴＮＦ−αレベルの測定のために集められた。図１７及び表１３は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対するＢＬＶ１Ｈ１２−Ｍｏｋａ１融合抗体による阻害活性を示す。図１６のＢと表１４は、Ｔ細胞活性化に対するＢＬＶ１Ｈ１２−Ｍｏｋａ１融合抗体の阻害活性を示す。
【０７１３】
【表１６】
2018140992.tif 000018
【０７１４】
【表１７】
2018140992.tif 000019
【０７１５】
実施例１５：哺乳動物細胞における発現のためのＢＬＶ１Ｈ１２−ＶＭ２４融合タンパク質のベクターの構築
【０７１６】
Ｖｍ２４をコード化する遺伝子は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ又はＩＤＴによって合成され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。ＢＬＶ１Ｈ１２−ＶＭ２４融合タンパク質のフォールディング及び安定性を最適化するために、ＧＧＧＧＳ（配列番号５０１）又はＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３７）の柔軟なリンカーがＶｍ２４フラグメントの両末端に付加された。その後、様々な長さのリンカーを含むＶＭ２４のＰＣＲフラグメントは、オーバーラップ拡張ＰＣＲの活用によりＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖（ＣＤＲ３Ｈ）の相補性決定領域３へ移植され、ＢＬＶ１Ｈ１２の結晶構造において示されるような「ノブ」ドメインを置換した。ＢＬＶ１Ｈ１２−ＶＭ２４融合タンパク質の発現ベクターは、増幅されたＢＬＶ１Ｈ１２−ＶＭ２４融合遺伝子のｐＦｕｓｅ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃバックボーン・ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＣＡ）へのインフレームライゲーションによって作成された。同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含まないｐＦｕｓｅベクターへクローン化された。得られた発現ベクターは、シーケンス解析によって確認された。図８のＦ及び８のＨは、ウシのＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖領域のノブドメインの少なくとも一部に挿入される、又はそれを置換するＶＭ２４ペプチドの描写を提供する。
【０７１７】
実施例１６：ＢＬＶ１Ｈ１２−ＶＭ２４融合抗体の発現及び精製
【０７１８】
ＢＬＶ１Ｈ１２−ＶＭ２４融合抗体は、ＢＬＶ１Ｈ１２−ＶＭ２４融合重鎖及びＢＬＶ１Ｈ１２軽鎖をコード化するベクターによるｆｒｅｅ  ｓｔｙｌｅ  ＨＥＫ２９３細胞の一過的な遺伝子導入によって発現された。発現されたＢＬＶ１Ｈ１２−ＶＭ２４融合抗体は、培地へ分泌され、遺伝子導入の後に４８時間ごとに２回収集された。ＢＬＶ１Ｈ１２−ＶＭ２４融合抗体はプロテインＡ／Ｇクロマトグラフィー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＩＬ）によって精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析された。図１８のＡは、免疫グロブリンコンストラクトＡｂ−ＶＭ２４  Ｌ１（リンカー＝ＧＧＧＧＳ（配列番号５０１））及びＡｂ−ＶＭ２４  Ｌ２（第１リンカー＝ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３７）及び第２リンカー＝ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３８））のＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。
【０７１９】
実施例１７：Ｔ細胞活性化に対するＢＬＶ１Ｈ１２−Ｖｍ２４融合抗体の阻害活性のインビトロの研究
【０７２０】
ヒトＴ細胞が、Ｔ細胞濃縮キットを使用して分離されたＰＢＭＣから精製された。精製されたＴ細胞は、様々な濃度の精製されたＢＬＶ１Ｈ１２−ＶＭ２４融合抗体で、５％ＣＯ２、３７℃で１時間前処理され、その後、抗ＣＤ３及びＣＤ２８抗体によって活性化された。処理の２４時間後、上清はＥＬＩＳＡキットを使用した分泌されたＴＮＦ−αレベルの測定のため収集された。図１８のＢ−Ｃ及び表１５は、Ｔ細胞活性化に対するＢＬＶ１Ｈ１２−ＶＭ２４融合抗体の阻害活性を示す。
【０７２１】
【表１８】
2018140992.tif 000020
【０７２２】
実施例１８：哺乳動物細胞における発現のためのＢＬＶ１Ｈ１２−Ｅｘ−４融合タンパク質のベクターの構築
【０７２３】
エキセンジン−４（Ｅｘ４）をコード化する遺伝子はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ又はＩＤＴによって合成され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。因子Ｘａの切断部位はエキセンジン−４のＮ末端の前に設けられた。このプロテアーゼ切断部位に加えて、システインに続くＧＧＧＧＳリンカー（配列番号５０１）が、エキセンジン−４フラグメントの両末端に付加された。その後、エキセンジン−４のＰＣＲフラグメントは、オーバーラップ拡張ＰＣＲの活用によりＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖（ＣＤＲ３Ｈ）の相補性決定領域３へ移植され、ＢＬＶ１Ｈ１２の結晶構造において示されるような「ノブ」ドメインを置換した。ＢＬＶ１Ｈ１２−Ｅｘ−４クリップ融合タンパク質の発現ベクターは、増幅されたＢＬＶ１Ｈ１２融合遺伝子のｐＦｕｓｅ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃバックボーン・ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＣＡ）へのインフレームライゲーションによって作成された。同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含まないｐＦｕｓｅベクターへクローン化された。得られた発現ベクターは、シーケンス解析によって確認された。図８のＦ、及び８のＩは免疫グロブリン重鎖領域のノブドメインの少なくとも一部に挿入される、又はそれを置換するエキセンジン−４ペプチドを表現するカートゥーンを示す、図８のＩは同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２エキセンジン−４融合タンパク質のクリップされた型を示し、エキセンジン−４には遊離のＮ末端がある。
【０７２４】
実施例１９：ＢＬＶ１Ｈ１２−Ｅｘ−４クリップ融合タンパク質の発現及び精製
【０７２５】
ＢＬＶ１Ｈ１２−Ｅｘ−４融合抗体は、ＢＬＶ１Ｈ１２−Ｅｘ−４融合重鎖及びＢＬＶ１Ｈ１２軽鎖をコード化するベクターによるｆｒｅｅ  ｓｔｙｌｅ  ＨＥＫ２９３細胞の一過的な遺伝子導入によって発現された。発現されたＢＬＶ１Ｈ１２−Ｅｘ−４融合抗体は培地へ分泌され、遺伝子導入の後に４８時間及び９６時間で収集された。ＢＬＶ１Ｈ１２−Ｅｘ−４融合抗体はプロテインＡ／Ｇクロマトグラフィー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＩＬ）によって精製された。ＢＬＶ１Ｈ１２−Ｅｘ−４融合抗体はＢＬＶ１Ｈ１２抗体のＥｘ−４ペプチドのＮ末端を切り離すために製品のプロトコルに従って因子Ｘａプロテアーゼ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で更に処理された。処理の後、ＢＬＶ１Ｈ１２−Ｅｘ−４融合抗体はプロテアーゼを取り除くためにプロテインＡ／Ｇアフィニティカムによって再精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析された。図１９は、免疫グロブリンコンストラクトａｂ−エキセンジン−４の発現のウェスタンブロットを示す。
【０７２６】
実施例２０：ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）のＢＬＶ１Ｈ１２−Ｅｘ−４クリップ融合抗体の活性化する活性のインビトロの研究
【０７２７】
表面のＧＬＰ−１Ｒ及びｃＡＭＰ反応性のルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＨＥＫ２９３細胞は、ウェルごとに５０００個の密度で３８４ウェルプレートにまかれた。５％ＣＯ２、３７℃で２４時間のインキュベーションの後、細胞は様々な濃度のエキセンジン−４ペプチド及びＢＬＶ１Ｈ１２−Ｅｘ−４クリップ融合抗体で処理され、そして更に２４時間インキュベートされた。その後、製品の説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってＯｎｅ−Ｇｌｏ・ルシフェラーゼ試薬を使用して、ルシフェラーゼアッセイが行われた。図２０及び表１６−１７は、ＧＬＰ−１受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞に対するＡｂ−Ｅｘ４融合抗体の活性を示す。
【０７２８】
【表１９】
2018140992.tif 000021
【０７２９】
【表２０】
2018140992.tif 000022
【０７３０】
実施例２１：哺乳動物細胞における発現のためのＢＬＶ１Ｈ１２−ＧＬＰ−１クリップ融合タンパク質のベクターの構築
【０７３１】
ＧＬＰ−１をコード化する遺伝子は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ又はＩＤＴによって合成され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。融合タンパク質のフォールディング及び安定性を最適化するために、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５０９）（ｎ＝０、１）の柔軟なリンカーはＭｏｋａ１フラグメントの両末端に付加された。ＧＧＧＧＳ（配列番号５０１）又はＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３７）のリンカーはＧＬＰ−１フラグメントの両末端に付加された。因子Ｘａの切断部位はＧＬＰ−１のＮ末端の前に設けられた。このプロテアーゼ切断部位に加えて、システインに続くＧＧＧＧＳリンカー（配列番号５０１）が同様に、ＧＬＰ−１フラグメントの両末端に付加された。その後、ＧＬＰ−１のＰＣＲフラグメントは、オーバーラップ拡張ＰＣＲの活用によりＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖（ＣＤＲ３Ｈ）の相補性決定領域３へ移植され、ＢＬＶ１Ｈ１２の結晶構造において示されるような「ノブ」ドメインを置換した。ＢＬＶ１Ｈ１２−ＧＬＰ−１クリップ融合タンパク質の発現ベクターは、増幅されたＢＬＶ１Ｈ１２−ＧＬＰ−１融合遺伝子のｐＦｕｓｅ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃバックボーン・ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＣＡ）のインフレームライゲーションによって作成された。同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含まないｐＦｕｓｅベクターへクローン化された。得られた発現ベクターは、シーケンス解析によって確認された。図８のＦ及び８のＩは免疫グロブリン重鎖領域のノブドメインの少なくとも一部に挿入される、又はそれを置換するＧＬＰ１ペプチドを表現するカートゥーンを示す。図８のＩは同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２−ＧＬＰ−１融合タンパク質のクリップ型を示し、ＧＬＰ−１には遊離したＮ末端がある。
【０７３２】
実施例２２：ＢＬＶ１Ｈ１２−ＧＬＰ−１クリップ融合抗体の発現及び精製
【０７３３】
ＢＬＶ１Ｈ１２−ＧＬＰ−１融合抗体は、ＢＬＶ１Ｈ１２−ＧＬＰ−１融合重鎖及びＢＬＶ１Ｈ１２軽鎖をコード化するベクターによるｆｒｅｅ  ｓｔｙｌｅ  ＨＥＫ２９３細胞の一過的な遺伝子導入によって発現された。発現されたＢＬＶ１Ｈ１２−ＧＬＰ−１融合抗体は培地へ分泌され、遺伝子導入の後４８時間及び９６時間で収集された。ＢＬＶ１Ｈ１２−ＧＬＰ−１融合抗体は、プロテインＡ／Ｇクロマトグラフィー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  ＩＬ）によって精製された。ＢＬＶ１Ｈ１２−ＧＬＰ−１融合抗体は、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体にＧＬＰ−１ペプチド融合のＮ末端を除くため、更に製品のプロトコルに従って因子Ｘａプロテアーゼ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）処理された。処理の後、ＢＬＶ１Ｈ１２−ＧＬＰ−１クリップ融合抗体はプロテアーゼを取り除くためにプロテインＡ／Ｇアフィニティカムによって再精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析された。図１９は免疫グロブリンコンストラクトＡｂ−ＧＬＰ−１の発現のウェスタンブロットを提供する。
【０７３４】
実施例２３：ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）に対するＢＬＶ１Ｈ１２−ＧＬＰ−１クリップ融合抗体の活性化についてのインビトロの研究
【０７３５】
表面のＧＬＰ−１Ｒ及びｃＡＭＰ反応性ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＨＥＫ２９３細胞は、５０００個の細胞の密度で３８４ウェルプレートにまかれた。５％ＣＯ２による３７℃での２４時間のインキュベーションの後、細胞は様々な濃度のペプチド及びＢＬＶ１Ｈ１２−ＧＬＰ−１クリップ融合タンパク質で処理され、そして更に２４時間インキュベートされた。その後、製品の説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってＯｎｅ−Ｇｌｏ・ルシフェラーゼ試薬を使用してルシフェラーゼアッセイが行われた。図２０及び表１６はＧＬＰ−１受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞に対する抗体ＧＬＰ−１ｆ融合抗体の活性を示す。
【０７３６】
実施例２４：哺乳動物細胞における発現のためのＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＥＰＯ融合タンパク質のベクターの構築
【０７３７】
ヒトＥＰＯをコード化する遺伝子は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ又はＩＤＴによって合成され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。融合タンパク質のフォールディング及び安定性を最適化するために、（ＧＧＧＧＳ（配列番号５０１））の柔軟なリンカーがヒトＥＰＯの両末端に付加された。その後、ｈＥＰＯのＰＣＲフラグメントは、オーバーラップ拡張ＰＣＲの活用によりＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖（ＣＤＲ３Ｈ）の相補性決定領域３へ移植され、ＢＬＶ１Ｈ１２の結晶構造において示されるような「ノブ」ドメインを置換した。ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＥＰＯ融合タンパク質の発現ベクターは、増幅されたＢＬＶ１Ｈ１２融合遺伝子のｐＦｕｓｅ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃバックボーン・ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＣＡ）へのインフレームライゲーションによって作成された。同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含まないｐＦｕｓｅベクターへクローン化された。得られた発現ベクターは、シーケンス解析によって確認された。図８のＦ及び８のＪは、免疫グロブリン重鎖領域のノブドメインに結合されたｈＥＰＯペプチドを表現するカートゥーンを示す。
【０７３８】
実施例２５：ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＥＰＯ融合抗体の発現及び精製
【０７３９】
ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＥＰＯ融合抗体は、ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＥＰＯ融合重鎖及びＢＬＶ１Ｈ１２軽鎖をコード化するベクターによるｆｒｅｅ  ｓｔｙｌｅ  ＨＥＫ２９３細胞の一過的な遺伝子導入によって発現された。発現されたＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＥＰＯ融合抗体は培地へ分泌され、遺伝子導入の後に４８時間及び９６時間で収集された。ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＥＰＯ融合抗体はプロテインＡ／Ｇクロマトグラフィー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  ＩＬ）によって精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析された。
【０７４０】
実施例２６：ＴＦ−１細胞に対するＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＥＰＯ融合抗体の増殖活性のインビトロの研究
【０７４１】
ＴＦ−１細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ，ＶＡ）から得られ、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン、ストレプトマイシン及び２ｎｇ／ｍＬの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養された。増殖アッセイのために、ＴＦ−１細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗われ、１．５×１０５細胞／ｍｌの密度で１０％のＦＢＳ及びペニシリン及びストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁された。細胞は９６ウェルプレートにまかれ、様々な濃度のＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＥＰＯ融合抗体で処理された。５％のＣＯ２による３７℃でのインキュベーションの７２時間後、細胞生存率は、製品の説明書に従って、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）アッセイを使用して測定された。図２１及び表１８は、ＴＦ１細胞に対するａｂ−ｈＥＰＯ融合抗体の増殖活性を示す。
【０７４２】
【表２１】
2018140992.tif 000023
【０７４３】
実施例２７：哺乳動物細胞における発現のためのＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＦＧＦ２１融合タンパク質のベクターの構築
【０７４４】
ヒトＦＧＦ２１（ｈＦＧＦ２１）をコード化する遺伝子は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ又はＩＤＴによって合成され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。融合タンパク質のフォールディング及び安定性を最適化するために、（ＧＧＧＧＳ（配列番号５０１））の柔軟なリンカーがヒトＦＧＦ２１の両末端に付加された。その後、ｈＦＧＦ２１のＰＣＲフラグメントは、オーバーラップ拡張ＰＣＲの活用によりＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖（ＣＤＲ３Ｈ）の相補性決定領域３へ移植され、ＢＬＶ１Ｈ１２の結晶構造において示されるような「ノブ」ドメインを置換した。ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＦＧＦ２１融合タンパク質の発現ベクターは、増幅されたＢＬＶ１Ｈ１２融合遺伝子のｐＦｕｓｅ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃバックボーン・ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＣＡ）へのインフレームライゲーションによって作成された。同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含まないｐＦｕｓｅベクターへクローン化された。得られた発現ベクターは、シーケンス解析によって確認された。
【０７４５】
実施例２８：ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＦＧＦ２１融合抗体の発現及び精製
【０７４６】
ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＦＧＦ２１融合抗体は、ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＦＧＦ２１融合重鎖及びＢＬＶ１Ｈ１２軽鎖をコード化するベクターによるｆｒｅｅ  ｓｔｙｌｅ  ＨＥＫ  ２９３細胞の一過的な遺伝子導入によって発現された。発現されたＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＦＧＦ２１融合抗体は培地へ分泌され、遺伝子導入の後に４８時間ごとに２回収集された。ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＦＧＦ２１融合抗体は、プロテインＡ／Ｇクロマトグラフィー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＩＬ）によって精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析された。
【０７４７】
実施例２９：哺乳動物細胞における発現のためのＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＧＭＣＳＦ融合タンパク質のベクターの構築
【０７４８】
ヒトＧＭＣＳＦ（ｈＧＭＣＳＦ）をコード化する遺伝子は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ又はＩＤＴによって合成され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。融合タンパク質のフォールディング及び安定性を最適化するために、（ＧＧＧＧＳ（配列番号５０１））の柔軟なリンカーがヒトＧＭＣＳＦの両末端に付加された。その後、ｈＧＭＣＳＦのＰＣＲフラグメントは、オーバーラップ拡張ＰＣＲの活用によりＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖（ＣＤＲ３Ｈ）の相補性決定領域３へ移植され、ＢＬＶ１Ｈ１２の結晶構造において示されるような「ノブ」ドメインを置換した。ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＧＭＣＳＦ融合タンパク質の発現ベクターは、増幅されたＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＧＭＣＳＦ融合遺伝子ｐＦｕｓｅ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃバックボーン・ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＣＡ）のインフレームライゲーションによって作成された。同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含まないｐＦｕｓｅベクターへクローン化された。得られた発現ベクターは、シーケンス解析によって確認された。
【０７４９】
実施例３０：ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＧＭＣＳＦ融合抗体の発現及び精製
【０７５０】
ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＧＭＣＳＦ融合抗体は、ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＧＭＣＳＦ融合重鎖及びＢＬＶ１Ｈ１２軽鎖をコード化するベクターによるｆｒｅｅ  ｓｔｙｌｅ  ＨＥＫ  ２９３細胞の一過的な遺伝子導入によって発現され得る。発現されたＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＧＭＣＳＦ融合抗体は培地へ分泌され、遺伝子導入の後４８時間及び９６時間で収集され得る。ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＧＭＣＳＦ融合抗体は、プロテインＡ／Ｇクロマトグラフィー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＩＬ）によって精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析され得る。
【０７５１】
実施例３１：哺乳動物細胞における発現のためのＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＩＦＮ−ｂタンパク質のベクターの構築
【０７５２】
ヒトインターフェロンベータ（ｈＩＦＮ−ｂ）をコード化する遺伝子は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ又はＩＤＴによって合成され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。融合タンパク質のフォールディング及び安定性を最適化するために、（ＧＧＧＧＳ（配列番号５０１））の柔軟なリンカーがヒトインターフェロンベータの両末端に付加された。その後、ｈＩＦＮ−ｂのＰＣＲフラグメントは、オーバーラップ拡張ＰＣＲを用いてＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖（ＣＤＲ３Ｈ）の相補性決定領域３へ移植され、ＢＬＶ１Ｈ１２の結晶構造において示されるような「ノブ」ドメインを置換した。ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＩＦＮ−ｂ融合タンパク質の発現ベクターは、増幅されたＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＩＦＮ−ｂ融合遺伝子のｐＦｕｓｅ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃバックボーン・ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＣＡ）へのインフレームライゲーションによって作成された。同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含まないｐＦｕｓｅベクターへクローン化された。得られた発現ベクターは、シーケンス解析によって確認された。
【０７５３】
実施例３２：ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＩＦＮ−ｂ融合抗体の発現及び精製
【０７５４】
ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＩＦＮ−ｂ融合抗体は、ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＩＦＮ−ｂ融合重鎖及びＢＬＶ１Ｈ１２軽鎖をコード化するベクターによるｆｒｅｅ  ｓｔｙｌｅ  ＨＥＫ２９３細胞の一過的な遺伝子導入によって発現され得る。発現されたＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＩＦＮ−ｂ融合抗体は培地へ分泌され、遺伝子導入の後４８時間及び９６時間で収集され得る。ＢＬＶ１Ｈ１２−ｈＩＦＮ−ｂ融合抗体は、プロテインＡ／Ｇクロマトグラフィー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＩＬ）によって精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析され得る。
【０７５５】
実施例３３：哺乳動物細胞における発現のためのＢＬＶ１Ｈ１２融合タンパク質のベクターの構築
【０７５６】
様々な遺伝子をコード化する遺伝子は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ＮＪ，ＵＳＡ）によって合成され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。免疫グロブリンコンストラクトのフォールディング及び安定性を最適化するために、１以上の柔軟なリンカーの（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５０９）（ｎ＝０、１）、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３７）及び／又はＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３８）が遺伝子フラグメントの両末端に付加された。その後、様々な長さのリンカーを含む遺伝子のＰＣＲフラグメントは、オーバーラップ拡張ＰＣＲの活用によりＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖（ＣＤＲ３Ｈ）の相補性決定領域３へ移植され、ＢＬＶ１Ｈ１２の結晶構造において示されるような「ノブ」ドメインの少なくとも一部を置換した（図８Ａ−８Ｊ）。ＢＬＶ１Ｈ１２融合タンパク質の発現ベクターは、増幅されたＢＬＶ１Ｈ１２融合遺伝子のｐＦｕｓｅ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃバックボーン・ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＣＡ）へのインフレームライゲーションによって作成された。同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含まないｐＦｕｓｅベクターへクローン化された。得られた発現ベクターは、シーケンス解析によって確認された。
【０７５７】
ＢＬＶ１Ｈ１２融合タンパク質の核酸配列は表１９に示される（配列番号：１−１５）。ＢＬＶＨ１２融合タンパク質のペプチド配列は表２１に示される（配列番号：２３−３７）。表１９及び表２１において示されるように、ウシの重鎖配列は太字のフォントである；ヒト重鎖配列は破線の下線によって強調されている；非抗体配列はイタリック体フォントで示す；ストークドメインは太字フォント及び下線で強調されている；ノブドメインは太字フォント及び二重線が引かれている；リンカー配列はイタリック体フォント及び波線で強調されている。
【０７５８】
実施例３４：哺乳動物細胞における発現のためのＢＬＶ１Ｈ１２−ＩＬ８融合タンパク質のベクターの構築
【０７５９】
ヒトＩＬ−８配列（本明細書で指定されたＩＬ−８、例えばＩＬ−８のアミノ酸２６−９９に対応する配列番号３１７を参照）をコード化する遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ）から増幅された。幾つかのコンストラクトでは、リンカー（例えば、ＧＳＧ、或いはＧＳＧの繰り返し（配列番号３４２として開示される「ＧＳＧ」））はＩＬ８フラグメントの一方の又は両末端に付加され得る。その後、リンカーを有する、又はそのリンカーのないＩＬ８のＰＣＲフラグメントは、ＰＣＲによってＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖（ＣＤＲ３Ｈ）の相補性決定領域３へ移植され、ＢＬＶ１Ｈ１２の結晶構造において示されるような「ノブ」ドメインを置換した。ＢＬＶ１Ｈ１２−ＩＬ８融合タンパク質の発現ベクターは、増幅されたＢＬＶ１Ｈ１２−ＩＬ８融合遺伝子のＰＦｕｓｅバックボーン・ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＣＡ）におけるＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３へのインフレームライゲーションによって作成された。ＢＬＶ１Ｈ１２−ＩＬ８重鎖可変領域配列は、配列番号１６（ヌクレオチド）及び配列番号３８（アミノ酸）として示される。同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含まないｐＦｕｓｅベクターへクローン化された。得られた発現ベクターは、シーケンス解析によって確認された。
【０７６０】
実施例３５：ＢＬＶ１Ｈ１２−ＩＬ８融合タンパク質の発現
【０７６１】
ＢＬＶ１Ｈ１２−ＩＬ８融合タンパク質は、ＢＬＶ１Ｈ１２−ＩＬ８重鎖及び軽鎖をコード化するベクターによる２９３Ｔ細胞又はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞の一過的な遺伝子導入によって発現された。発現された融合タンパク質は培地に分泌され、細胞培養の２日後に培養上清が得られた。ＥＬＩＳＡによって、上清中のＢＬＶ１Ｈ１２−ＩＬ８融合タンパク質の発現量は３７．２ｎＭであると決定された。
【０７６２】
実施例３６：ＣＸＣＲ１を発現する細胞に対するＢＬＶ１Ｈ１２−ＩＬ８融合タンパク質の活性のインビトロの研究
【０７６３】
簡潔に、Ｕ２ＯＳ細胞に由来する、機能的に有効になったＣＸＣＲ１を発現する細胞株は、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘから得られ、製造者の説明書（Ｃａｔ＃  ９３−０２２６Ｃ３，  ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）に従って培養された。親の細胞株Ｕ２ＯＳはＡＴＣＣから得られ、ＣＸＣＲ１細胞と同じ条件下で培養された。その後、上記の実施例２からの細胞培養上清は、フローサイトメトリーにより細胞への結合について試験された。付着しているＵ２ＯＳ又はＣＸＣＲ１−Ｕ２ＯＳ細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により分離され、１０％の血清を含んでいる等容積の培地で中和され、１０００ｇで遠心分離機にかけられ、２％のＢＳＡを含むＰＢＳに再懸濁された。次に、細胞は３０，０００〜３００，０００個の細胞を達成するため、マイクロタイタープレートウェルに分配され、再び遠心分離機にかけられ、発現されたＩｇＧを含む細胞培養上清、又はＩｇＧを含む細胞培養上清の希釈物に再懸濁された。蛍光共役抗ヒトＦｃ抗体が、細胞に対して発現されたＢＬＶ１Ｈ１２−ＩＬ８融合タンパク質の細胞への結合を検出するために使用された。その後、細胞の蛍光はフローサイトメトリー（例えばＦＡＣＳ）によって測定され、また、任意の蛍光単位（ＡＦＵ）の中間値が計算され、それらの細胞のＩｇＧ結合の範囲を明らかにした。ＣＸＣＲ１−Ｕ２ＯＳ細胞の蛍光の中央値（ＩｇＧ結合）対Ｕ２ＯＳの親の細胞の比率は、ＢＬＶ１Ｈ１２−ＩＬ８融合タンパク質がＣＸＣＲ１に対する特異性を有していることを示す（表２７）。
【０７６４】
【表２２】
2018140992.tif 000024
【０７６５】
実施例３７：哺乳動物細胞における発現のためのＢＬＶ１Ｈ１２ジコノチド融合タンパク質のベクターの構築
【０７６６】
ジコノチド配列（例えば配列番号３１８を参照）をコード化する遺伝子は、多数のオリゴヌクレオチドから調製され、その後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。幾つかのコンストラクトでは、リンカー（例えば、ＧＳＧ、或いはＧＳＧの繰り返し（配列番号３４２として開示される「ＧＳＧ」））は、ジコノチドフラグメントの一方又は両末端に付加され得る。その後、リンカーを有する、又はそのリンカーのないジコノチドのＰＣＲフラグメントは、ＰＣＲによってＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖（ＣＤＲ３Ｈ）の相補性決定領域３へ移植され、ＢＬＶ１Ｈ１２の結晶構造において示されるような「ノブ」ドメインを置換した。ＢＬＶ１Ｈ１２ジコノチド融合タンパク質の発現ベクターは、増幅されたＢＬＶ１Ｈ１２ジコノチド融合遺伝子のＰＦｕｓｅバックボーン・ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＣＡ）におけるＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３へのインフレームライゲーションによって作成された。ＢＬＶ１Ｈ１２ジコノチド重鎖可変領域配列は、配列番号１７（ヌクレオチド）及び配列番号３９（アミノ酸）として示される。同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含まないｐＦｕｓｅベクターへクローン化された。得られた発現ベクターは、シーケンス解析によって確認された。
【０７６７】
実施例３８：ＢＬＶ１Ｈ１２ジコノチド融合タンパク質の発現
【０７６８】
ＢＬＶ１Ｈ１２ジコノチド融合タンパク質は、ＢＬＶ１Ｈ１２ジコノチド重鎖及び軽鎖をコード化するベクターによる２９３Ｔ細胞又はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞への一過的な遺伝子導入によって発現された。発現された融合タンパク質は培地に分泌され、細胞培養の２日後に培養上清が得られた。上清中のＢＬＶ１Ｈ１２ジコノチド融合タンパク質の発現はＥＬＩＳＡによって測定され、上記の実施例３５のＩＬ８コンストラクトと比較してＩＬ８コンストラクトの９４．７％になるように標準化された。
【０７６９】
実施例３９：哺乳動物細胞における発現のためのＢＬＶ１Ｈ１２ソマトスタチン融合タンパク質のベクターの構築
【０７７０】
ソマトスタチン配列（例えば配列番号３１９を参照）をコード化する遺伝子は、多数のオリゴヌクレオチドから調製され、そして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。幾つかのコンストラクトでは、リンカー（例えば、ＧＳＧ、或いはＧＳＧの繰り返し（配列番号３４２として開示される「ＧＳＧ」））はソマトスタチンフラグメントの１方又は両末端に付加され得る。その後、リンカーを有する、又はそのリンカーのないソマトスタチンのＰＣＲフラグメントは、ＰＣＲによってＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖（ＣＤＲ３Ｈ）の相補性決定領域３へ移植され、ＢＬＶ１Ｈ１２の結晶構造において示されるような「ノブ」ドメインを置換した。ＢＬＶ１Ｈ１２ソマトスタチン融合タンパク質の発現ベクターは、増幅されたＢＬＶ１Ｈ１２ソマトスタチン融合遺伝子のＰＦｕｓｅバックボーン・ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＣＡ）におけるＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３へのインフレームライゲーションによって作成された。ＢＬＶ１Ｈ１２ソマトスタチン重鎖可変領域配列は、配列番号１８（ヌクレオチド）及び配列番号４０（アミノ酸）として示される。同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含まないｐＦｕｓｅベクターへクローン化された。得られた発現ベクターは、シーケンス解析によって確認された。
【０７７１】
実施例４０：ＢＬＶ１Ｈ１２ソマトスタチン融合タンパク質の発現
【０７７２】
ＢＬＶ１Ｈ１２ソマトスタチン融合タンパク質は、ＢＬＶ１Ｈ１２ソマトスタチン重鎖及び軽鎖をコード化するベクターによる２９３Ｔ細胞又はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞の一過的な遺伝子導入によって発現された。発現された融合タンパク質は培地に分泌され、細胞培養の２日後にと培養上清が得られた。上清中のＢＬＶ１Ｈ１２ソマトスタチン融合タンパク質の発現はＥＬＩＳＡによって測定され、上記の実施例３５のＩＬ８コンストラクトと比較して、ＩＬ８コンストラクトの４６．５％となるように標準化された。
【０７７３】
実施例４１：哺乳動物細胞における発現のためのＢＬＶ１Ｈ１２クロロトキシン融合タンパク質のベクターの構築
【０７７４】
クロロトキシン配列（例えば配列番号３２０参照）をコード化する遺伝子は、多数のオリゴヌクレオチドから調製され、そして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。幾つかのコンストラクトでは、リンカー（例えば、ＧＳＧ、或いはＧＳＧの繰り返し（配列番号３４２として開示される「ＧＳＧ」））はクロロトキシンフラグメントの一方に又は両末端に付加され得る。その後、リンカーを有する、又はそのリンカーのないクロロトキシンのＰＣＲフラグメントは、ＰＣＲによってＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖（ＣＤＲ３Ｈ）の相補性決定領域３へ移植され、ＢＬＶ１Ｈ１２の結晶構造において示されるような「ノブ」ドメインを置換した。ＢＬＶ１Ｈ１２クロロトキシン融合タンパク質の発現ベクターは、増幅されたＢＬＶ１Ｈ１２クロロトキシン融合遺伝子のＰＦｕｓｅバックボーン・ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＣＡ）におけるＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３のインフレームライゲーションによって作成された。ＢＬＶ１Ｈ１２クロロトキシン重鎖可変領域配列は、配列番号１９（ヌクレオチド）及び配列番号４１（アミノ酸）として示される。同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含まないｐＦｕｓｅベクターへクローン化された。得られた発現ベクターは、シーケンス解析によって確認された。
【０７７５】
実施例４２：ＢＬＶ１Ｈ１２クロロトキシン融合タンパク質の発現
【０７７６】
ＢＬＶ１Ｈ１２クロロトキシン融合タンパク質は、ＢＬＶ１Ｈ１２クロロトキシン重鎖及び軽鎖をコード化するベクターによる２９３Ｔ細胞又はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆの細胞の一過的な遺伝子導入によって発現された。発現された融合タンパク質は培地に分泌され、細胞培養の２日後に培養上清が得られた。上清中のＢＬＶ１Ｈ１２クロロトキシン融合タンパク質の発現はＥＬＩＳＡによって測定され、上記の実施例３５のＩＬ８コンストラクトと比較し、ＩＬ８コンストラクトの３９．７％になるように標準化された。
【０７７７】
実施例４３：哺乳動物細胞における発現のためのＢＬＶ１Ｈ１２−ＳＤＦ−１（アルファ）融合タンパク質のベクターの構築
【０７７８】
ＳＤＦ−１アルファ配列（例えば配列番号３２１を参照）をコード化する遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ）から増幅された。幾つかのコンストラクトでは、リンカー（例えば、ＧＳＧ、或いはＧＳＧの繰り返し（配列番号３４２として開示される「ＧＳＧ」））は、ＳＤＦ−１（アルファ）フラグメントの一方に又は両末端に付加され得る。その後、リンカーを持った、又はそのリンカーのないＳＤＦ−１（アルファ）のＰＣＲフラグメントは、ＰＣＲによってＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖（ＣＤＲ３Ｈ）の相補性決定領域３へ移植され、ＢＬＶ１Ｈ１２の結晶構造において示されるような「ノブ」ドメインを置換した。ＢＬＶ１Ｈ１２−ＳＤＦ−１（アルファ）融合タンパク質の発現ベクターは、増幅されたＢＬＶ１Ｈ１２−ＳＤＦ−１（アルファ）融合遺伝子のＰＦｕｓｅバックボーン・ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＣＡ）におけるＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３へのインフレームライゲーションによって作成された。ＢＬＶ１Ｈ１２−ＳＤＦ−１（アルファ）重鎖可変領域配列は、配列番号２０（ヌクレオチド）及び配列番号４２（アミノ酸）として示される。同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含まないｐＦｕｓｅベクターへクローン化された。得られた発現ベクターは、シーケンス解析によって確認された。
【０７７９】
実施例４４：ＢＬＶ１Ｈ１２−ＳＤＦ−１（アルファ）融合タンパク質の発現
【０７８０】
ＢＬＶ１Ｈ１２−ＳＤＦ−１（アルファ）融合タンパク質は、ＢＬＶ１Ｈ１２−ＳＤＦ−１（アルファ）の重鎖及び軽鎖をコード化するベクターによる２９３Ｔ細胞又はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞の一過的な遺伝子導入によって発現された。発現された融合タンパク質は培地に分泌され、細胞培養の２日後にと培養上清が得られた。上清中のＢＬＶ１Ｈ１２−ＳＤＦ−１（アルファ）融合タンパク質の発現はＥＬＩＳＡによって測定され、上記の実施例３５のＩＬ８コンストラクトと比較してＩＬ８コンストラクトの３８．９％となるように標準化された。
【０７８１】
実施例４５：哺乳動物細胞における発現のためのＢＬＶ１Ｈ１２−ＩＬ２１融合タンパク質のベクターの構築
【０７８２】
ＩＬ２１配列（例えば配列番号３２２を参照）をコード化する遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ）から増幅された。幾つかのコンストラクトにおいて、リンカー（例えば、ＧＳＧ、或いはＧＳＧの繰り返し（配列番号３４２として開示される「ＧＳＧ」））は、ＩＬ２１フラグメントの一方に又は両末端に付加され得る。その後、リンカーを有する、又はそのリンカーのないＩＬ２１のＰＣＲフラグメントは、ＰＣＲによってＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖（ＣＤＲ３Ｈ）の相補性決定領域３へ移植され、ＢＬＶ１Ｈ１２の結晶構造において示されるような「ノブ」ドメインを置換した。ＢＬＶ１Ｈ１２−ＩＬ２１融合タンパク質の発現ベクターは、増幅されたＢＬＶ１Ｈ１２−ＩＬ２１融合遺伝子のＰＦｕｓｅバックボーン・ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＣＡ）におけるＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３のインフレームライゲーションによって作成された。ＢＬＶ１Ｈ１２−ＩＬ２１重鎖可変領域配列は、配列番号２１（ヌクレオチド）及び配列番号４３（アミノ酸）として示される。同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含まないｐＦｕｓｅベクターへクローン化された。得られた発現ベクターは、シーケンス解析によって確認された。
【０７８３】
実施例４６：ＢＬＶ１Ｈ１２−ＩＬ２１融合タンパク質の発現
【０７８４】
ＢＬＶ１Ｈ１２−ＩＬ２１融合タンパク質は、ＢＬＶ１Ｈ１２−ＩＬ２１の重鎖及び軽鎖をコード化するベクターによる２９３Ｔ細胞又はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞の一過的な遺伝子導入によって発現された。発現された融合タンパク質は培地に分泌され、細胞培養の２日後にと培養上清が得られた。上清中のＢＬＶ１Ｈ１２−ＩＬ２１融合タンパク質の発現はＥＬＩＳＡによって測定され、上記の実施例ＩＬ８コンストラクトと比較して、ＩＬ８コンストラクトの３２．３％となるように標準化された。
【０７８５】
実施例４７：哺乳動物細胞における発現のためのＢＬＶ１Ｈ１２−プロトキシン２融合タンパク質のベクターの構築
【０７８６】
プロトキシン２をコード化する遺伝子は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ又はＩＤＴによって合成され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。融合タンパク質のフォールディング及び安定性を最適化するためにＧＧＧＧＳ（配列番号５０１）の柔軟なリンカーがプロトキシン２フラグメントの両末端に付加された。その後、プロトキシン２（プロトキシン２−Ｌ１と呼ばれる）のＰＣＲフラグメントは、オーバーラップ拡張ＰＣＲの活用によりＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖（ＣＤＲ３Ｈ）の相補性決定領域３へ移植されＢＬＶ１Ｈ１２の結晶構造において示されるような「ノブ」ドメインを置換した。ＢＬＶ１Ｈ１２融合タンパク質の発現ベクターは、増幅されたＢＬＶ１Ｈ１２−プロトキシン２−Ｌ１融合遺伝子（配列番号１５）のｐＦｕｓｅ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃバックボーン・ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＣＡ）へのインフレームライゲーションによって作成された。同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含まないｐＦｕｓｅベクターへクローン化された。得られた発現ベクターは、シーケンス解析によって確認された。
【０７８７】
実施例４８：ＢＬＶ１Ｈ１２−プロトキシン２−Ｌ１融合タンパク質の発現及び精製
【０７８８】
ＢＬＶ１Ｈ１２−プロトキシン２−Ｌ１融合抗体は、ＢＬＶ１Ｈ１２−プロトキシン２融合重鎖及びＢＬＶ１Ｈ１２軽鎖をコード化するベクターによるｆｒｅｅ  ｓｔｙｌｅ  ＨＥＫ２９３細胞の一過的な遺伝子導入によって発現された。発現されたＢＬＶ１Ｈ１２−プロトキシン２−Ｌ１融合抗体は培地へ分泌され、遺伝子導入の後、４８時間及び９６時間で収集された。ＢＬＶ１Ｈ１２−プロトキシン２−Ｌ１融合抗体はプロテインＡ／Ｇクロマトグラフィ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＩＬ）によって精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析された（図１５Ｂ）。
【０７８９】
実施例４９：哺乳動物細胞における発現のためのＢＬＶ１Ｈ１２−ＰｒｏＴｘＩＩ融合タンパク質のベクターの構築
【０７９０】
ＰｒｏＴｘＩＩ配列（例えば配列番号３２３を参照）をコード化する遺伝子は多数のオリゴヌクレオチドから調製され、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。幾つかのコンストラクトでは、リンカー（例えば、ＧＳＧ、又はＧＳＧの繰り返し（配列番号３４２として開示される「ＧＳＧ」））は、ＰｒｏＴｘＩＩフラグメントの１方又は両末端に付加され得る。その後、リンカーを有する、又はそのリンカーのないＰｒｏＴｘＩＩのＰＣＲフラグメントは、ＰＣＲによってＢＬＶ１Ｈ１２抗体の重鎖の相補性決定領域３（ＣＤＲ３Ｈ）へ移植され、ＢＬＶ１Ｈ１２の結晶構造において示されるような「ノブ」ドメインを置換した。ＢＬＶ１Ｈ１２−ＰｒｏＴｘＩＩ融合タンパク質の発現ベクターは、増幅されたＢＬＶ１Ｈ１２ＰｒｏＴｘＩＩ融合遺伝子のＰＦｕｓｅバックボーン・ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＣＡ）におけるＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３へのインフレームライゲーションによって作成された。ＢＬＶ１Ｈ１２−ＰｒｏＴｘＩＩ重鎖可変領域配列は、配列番号２２（ヌクレオチド）及び配列番号４４（アミノ酸）として示される。同様に、ＢＬＶ１Ｈ１２抗体の軽鎖をコード化する遺伝子は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントを含まないｐＦｕｓｅベクターへクローン化された。得られた発現ベクターは、シーケンス解析によって確認された。
【０７９１】
実施例５０：ＢＬＶ１Ｈ１２−ＰｒｏＴｘＩＩ融合タンパク質の発現
【０７９２】
ＢＬＶ１Ｈ１２−ＰｒｏＴｘＩＩ融合タンパク質は、ＢＬＶ１Ｈ１２−ＰｒｏＴｘＩＩ重鎖及び軽鎖をコード化するベクターによる２９３Ｔ細胞又はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞の一過性の遺伝子導入によって発現された。発現された融合タンパク質は培地に分泌され、細胞培養の２日後にと培養上清が得られた。上清中のＢＬＶ１Ｈ１２−ＰｒｏＴｘＩＩ融合タンパク質の発現はＥＬＩＳＡによって測定され、上記の実施例３５のＩＬ８コンストラクトと比較して、ＩＬ８コンストラクトの２．１％になるように標準化された。
【０７９３】
本明細書における開示のため、請求項の範囲に対する同等物の原則の応用範囲をまさに最小に、そして無いように制限する試みとして、数値パラメーターはそれぞれ、少なくとも報告された有効数字の数に照らして、及び慣用の端数整理技術の適用により解釈されるべきである。開示の広い範囲を述べる数値域とパラメーターが概算のものあるにもかかわらず、特異的な実施例で述べられた数値は、できるだけ正確に報告される。任意の数値は、しかしながら、本質的にそれぞれの試験する測定において見出される標準偏差から必ず結果として生じる特定の誤差を含んでいる。
【０７９４】
【表２３−１】
2018140992.tif 000025
【０７９５】
【表２３−２】
2018140992.tif 000026
【０７９６】
【表２３−３】
2018140992.tif 000027
【０７９７】
【表２３−４】
2018140992.tif 000028
【０７９８】
【表２３−５】
2018140992.tif 000029
【０７９９】
【表２３−６】
2018140992.tif 000030
【０８００】
【表２３−７】
2018140992.tif 000031
【０８０１】
【表２３−８】
2018140992.tif 000032
【０８０２】
【表２３−９】
2018140992.tif 000033
【０８０３】
【表２３−１０】
2018140992.tif 000034
【０８０４】
【表２３−１１】
2018140992.tif 000035
【０８０５】
【表２３−１２】
2018140992.tif 000036
【０８０６】
【表２３−１３】
2018140992.tif 000037
【０８０７】
【表２３−１４】
2018140992.tif 000038
【０８０８】
【表２３−１５】
2018140992.tif 000039
【０８０９】
【表２３−１６】
2018140992.tif 000040
【０８１０】
【表２３−１７】
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【０８１１】
【表２３−１８】
2018140992.tif 000042
【０８１２】
【表２４−１】
2018140992.tif 000043
【０８１３】
【表２４−２】
2018140992.tif 000044
【０８１４】
【表２４−３】
2018140992.tif 000045
【０８１５】
【表２５−１】
2018140992.tif 000046
【０８１６】
【表２５−２】
2018140992.tif 000047
【０８１７】
【表２５−３】
2018140992.tif 000048
【０８１８】
【表２５−４】
2018140992.tif 000049
【０８１９】
【表２５−５】
2018140992.tif 000050
【０８２０】
【表２５−６】
2018140992.tif 000051
【０８２１】
【表２６】
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【０８２２】
【表２７−１】
2018140992.tif 000053
【０８２３】
【表２７−２】
2018140992.tif 000054
【０８２４】
【表２７−３】
2018140992.tif 000055
【０８２５】
【表２８−１】
2018140992.tif 000056
【０８２６】
【表２８−２】
2018140992.tif 000057
【０８２７】
【表２８−３】
2018140992.tif 000058
【０８２８】
【表２８−４】
2018140992.tif 000059
【０８２９】
【表２９】
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【０８３０】
【表３０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年5月14日(2018.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換え抗体であって、
組み換え抗体は、抗体の可変性ドメインの２つの隣接するフレームワーク領域の間に位置する治療用ポリペプチドを含む修飾した抗体の可変性ドメインを含み、
治療用ポリペプチドは、随意に、抗体の可変性ドメインの相補性決定領域の1つ以上のアミノ酸を置換する、および
組み換え抗体内の治療用ポリペプチドは、組み換え抗体がそれを必要とする被験体に投与された場合、疾患、障害または疾病を治療、予防、または改善するために機能的である、組み換え抗体。
【請求項２】
抗体は、キメラ抗体、ヒト操作（ｈｕｍａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）抗体、ヒト化抗体、ウシ抗体、ウシ化抗体、ウシ操作（ｂｏｖｉｎｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）抗体、および完全にウシの抗体から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
抗体は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、（ｄｓＦｖ）２、ミニボディ、フレックスミニボディ（ｆｌｅｘ  ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、または二重特異性のフラグメントを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
治療用ポリペプチドは、成長因子、サイトカイン、ホルモン、およびトキシンから選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
成長因子は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）から選択される、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
ＧＣＳＦは、ウシＧＣＳＦおよびヒトＧＣＳＦから選択される、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
治療用ポリペプチドは、ベータ−インターフェロン、エキセンジン−４、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、ソマトスタチン、エリスロポエチン、Ｍｏｋａｔｏｘｉｎ−１（Ｍｏｋａ１）、ＶＭ−２４、およびプロトキシン２から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
治療用ポリペプチドは、配列番号３１７−３３２から選択される配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
リンカー配列を更に含み、リンカー配列は、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３９）、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３８）、および（ＧＳＧ）ｎ（配列番号３４２）、ならびにこれらの組み合わせから選択される配列を含み、ｎは１以上である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
１以上のプロテアーゼ切断部位を更に含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体の可変性ドメインと治療用ポリペプチドの間にプロテアーゼ切断部位を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
１以上のプロテアーゼ切断部位を更に含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１３】
リンカー配列と治療用ポリペプチドの間にある部位、およびリンカー配列と抗体の可変性ドメインの間にある部位から選択される、プロテアーゼ切断部位を含む、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
抗体またはそのフラグメントのライブラリであって、
抗体またはそのフラグメントは、抗体の可変性ドメインの２つの隣接するフレームワーク領域の間に位置する治療用ポリペプチドを含む修飾した抗体の可変性ドメインを含み、
治療用ポリペプチドは、随意に、抗体の可変性ドメインの相補性決定領域の1つ以上のアミノ酸を置換する、および
組み換え抗体内の治療用ポリペプチドは、組み換え抗体がそれを必要とする被験体に投与された場合、疾患、障害または疾病を治療、予防、または改善するために機能的である、ライブラリ。
【請求項１５】
抗体又はそのフラグメントは、キメラ抗体、ヒト操作（ｈｕｍａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）抗体、ヒト化抗体、ウシ抗体、ウシ化抗体、ウシ操作（ｂｏｖｉｎｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）抗体、完全にウシの抗体、またはそれらのフラグメントを含む、請求項１４に記載のライブラリ。
【請求項１６】
抗体又はそのフラグメントは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、（ｄｓＦｖ）２、ミニボディ、フレックスミニボディ（ｆｌｅｘ  ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、又は二重特異性のフラグメントを含む、請求項１４に記載のライブラリ。
【請求項１７】
抗体又はそのフラグメントの何れか１つはリンカーを更に含み、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３３９）、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３３８）、及び（ＧＳＧ）ｎ（配列番号３４２）から選択される配列を含み、及びリンカーは非抗体配列のＣ末端、Ｎ末端、又はＣ末端とＮ末端の両方に結合される、請求項１４に記載のライブラリ。
【請求項１８】
抗体又はそのフラグメントは請求項１乃至１３の何れかに記載される通りである、請求項１４乃至１７のいずれか１項に記載のライブラリ。
【外国語明細書】
2018140992000001.pdf