(57)【要約】      （修正有）【課題】β−ガラクトシダーゼ発現細胞（ｌａｃＺ発現細胞）を選択的に可視化でき、ＧＦＰと共染色が可能な蛍光イメージングプローブの提供。【解決手段】式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む細胞内滞留性赤色蛍光プローブ。2018000074.tif 000029【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、細胞内滞留性赤色蛍光プローブ：
【化１】
2018000074.tif 000027
（式中、Ａは、酵素によって切断される一価の基を表し；Ｒ１は、水素原子又はベンゼン環に結合する１個ないし４個の同一又は異なる置換基を表し；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、それぞれ独立に−ＣＦＲ１０Ｒ１１又は−ＣＦ２Ｒ１２、若しくは水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を表し、ただし、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６の少なくとも一つは、−ＣＦＲ１０Ｒ１１又は−ＣＦ２Ｒ１２であり；Ｒ２及びＲ７は、それぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に水素原子又はアルキル基を表し；Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアルケニル基を表し；ＸはＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）を表し、ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表し；Ｙは、−Ｃ（＝Ｏ）−又は−ＲｃＣ（＝Ｏ）−であり、ここで、Ｒｃは、炭素数１〜３のアルキレン基である。）。
【請求項２】
前記酵素が、レポーター酵素を含む加水分解酵素である、請求項１に記載の細胞内滞留性赤色蛍光プローブ。
【請求項３】
前記レポーター酵素が、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、又はペルオキシダーゼである、請求項２に記載の細胞内滞留性赤色蛍光プローブ。
【請求項４】
前記酵素が、癌細胞で特異的に発現又は活性化する酵素である、請求項１に記載の細胞内滞留性赤色蛍光プローブ。
【請求項５】
Ａがガラクトピラノシル基である、請求項１に記載の細胞内滞留性赤色蛍光プローブ。
【請求項６】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６の少なくとも一つは、−ＣＦＲ１０Ｒ１１である、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞内滞留性赤色蛍光プローブ。
【請求項７】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６の少なくとも一つは、−ＣＨ２Ｆである、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞内滞留性赤色蛍光プローブ。
【請求項８】
以下の式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩を含む、細胞内滞留性赤色蛍光プローブ：
【化２】
2018000074.tif 000028
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の細胞内滞留性赤色蛍光プローブを含む、特定の酵素が発現している標的細胞を検出するための又は可視化するためのキット。
【請求項１０】
前記標的細胞が、β−ガラクトシダーゼ発現細胞である、請求項９に記載の組成物又はキット。
【請求項１１】
前記標的細胞が、癌細胞である、請求項９に記載の組成物又はキット。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれかに記載の細胞内滞留性赤色蛍光プローブを用いて、特定の酵素が発現している標的細胞を検出する方法。
【請求項１３】
前記細胞内滞留性赤色蛍光プローブと、前記標的細胞において特異的に発現する酵素とを、生体外において接触させる工程、及び、励起光照射を行って蛍光を生じさせる工程を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的細胞が、β−ガラクトシダーゼ発現細胞である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的細胞が、癌細胞である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞に滞留し、当該細胞にて特異的に作用し得る新規な赤色蛍光プローブ、及び当該蛍光プローブを用いて特定の酵素が発現している標的細胞を特異的にイメージングする方法、及び当該プローブを含む検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生命科学の発展に対するレポータータンパク質の寄与は大きなものであり、かかるレポータータンパク質の中で最も汎用されているものがβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）である。近年では老化と細胞のβガラクトシダーゼの発現に関連性があることが示唆されており（非特許文献１）、β−ガラクトシダーゼ酵素特異的なイメージングプローブは、細胞の老化機構を解明するための分子ツールとしても重要である。さらに、ある種の癌細胞においてはβ−ガラクトシダーゼ活性が上昇していることが示されているため（非特許文献２、非特許文献３）、β−ガラクトシダーゼ酵素特異的なイメージングプローブは、癌細胞選択的な蛍光イメージングプローブとしても利用できると考えられる。
【０００３】
従来、Ｘ−Ｇａｌを基質として酵素活性をイメージングする手法が広く利用されているが（非特許文献４）、Ｘ−Ｇａｌは生細胞に適用することができないため、生細胞に適用可能な酵素活性イメージングプローブの開発が望まれている。現在までに多くの生細胞に適用可能なイメージングプローブが開発されてきた。例えば、分子内でスピロ環化反応を制御することにより可視光励起可能である、生細胞および生きた生体組織に適用可能なβガラクトシダーゼ蛍光プローブとして、ＨＭＤＥＲ−βＧａｌ等が開発されている（非特許文献５、特許文献１）。
【０００４】
しかしながら、従来のβガラクトシダーゼ蛍光プローブでは、細胞膜透過性が低い、酵素反応後に生成する蛍光色素の細胞内滞留性が低いなどの問題点から、生細胞等を単一細胞レベルで明確にイメージングすることが困難であった。これに対し、本願発明者らは、キサンテン環にフルオロメチル基を導入したイメージングプローブを開発したが（特許文献２）、当該プローブは、単一細胞レベルで標的細胞を検出可能であるものの、蛍光検出における発光が緑色蛍光領域であるため、ライブイメージングで多用されるＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）との共染色が困難であった
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開２００５／０２４０４９号
【特許文献２】国際公開２０１５／１７４４６０号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇ．  Ｐ．  Ｄｉｍｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９９５，  ９２，  ９３６３−９３６７．
【非特許文献２】Ｈ．  Ｂ．  Ｂｏｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９７４，  ７１，  １８３３−１８３７．
【非特許文献３】Ｓ．  Ｋ．  Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  １９７９，  ３９，  １９４３−１９５１．
【非特許文献４】Ｆ．  Ｄ．−Ｃｈａｉｎｉａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．，  ２００９，  ４，  １７９８−１８０６．
【非特許文献５】Ｍ．Ｋａｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  ２０１１，  １３３，  １２９６０−１２９６３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、β−ガラクトシダーゼを発現している細胞（ｌａｃＺ発現細胞）のような標的細胞を単一細胞レベルでかつ赤色蛍光領域で選択的に可視化でき、ＧＦＰと共染色が可能な蛍光イメージングプローブを提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、ローダミン系蛍光色素におけるキサンテン環の１０位元素を酸素原子からケイ素原子に置換し、またベンゼン環の２位にカルボキシル基に基づく置換基を有する誘導体を用い、さらに当該誘導体に酵素との反応によってキノンメチドに変化させる置換基を導入することによって、β−ガラクトシダーゼ等の酵素との反応によりはじめて赤色蛍光を示し、かつ優れた細胞内滞留性を示す蛍光イメージングプローブが得られることを見出した。これは、当該蛍光プローブが酵素との反応により反応性の高いキノンメチドが産出し、これがタンパク質等の細胞内求核分子と共有結合により不可逆的に結合すること、及び蛍光プローブにおける分子内スピロ環化平衡による蛍光性の制御とを組み合わせることにより、上記課題を解決し、標的細胞のライブイメージを可能とするものである。かかる知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、一態様において、
＜１＞以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、細胞内滞留性赤色蛍光プローブ：
【化１】
2018000074.tif 000002
（式中、Ａは、酵素によって切断される一価の基を表し；Ｒ１は、水素原子又はベンゼン環に結合する１個ないし４個の同一又は異なる置換基を表し；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、それぞれ独立に−ＣＦＲ１０Ｒ１１又は−ＣＦ２Ｒ１２、若しくは水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を表し、ただし、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６の少なくとも一つは、−ＣＦＲ１０Ｒ１１又は−ＣＦ２Ｒ１２であり；Ｒ２及びＲ７は、それぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を表し；Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に水素原子又はアルキル基を表し；Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアルケニル基を表し；ＸはＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）を表し、ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表し；Ｙは、−Ｃ（＝Ｏ）−又は−ＲｃＣ（＝Ｏ）−であり、ここで、Ｒｃは、炭素数１〜３のアルキレン基である。）；
＜２＞前記酵素が、レポーター酵素を含む加水分解酵素である、上記＜１＞に記載の細胞内滞留性赤色蛍光プローブ；
＜３＞前記レポーター酵素が、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、又はペルオキシダーゼである、上記＜２＞に記載の細胞内滞留性赤色蛍光プローブ；
＜４＞前記酵素が、癌細胞で特異的に発現又は活性化する酵素である、上記＜１＞に記載の細胞内滞留性赤色蛍光プローブ；
＜５＞Ａがガラクトピラノシル基である、上記＜１＞に記載の細胞内滞留性赤色蛍光プローブ；
＜６＞Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６の少なくとも一つは、−ＣＦＲ１０Ｒ１１である、上記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の細胞内滞留性赤色蛍光プローブ；
＜７＞Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６の少なくとも一つは、−ＣＨ２Ｆである、上記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の細胞内滞留性赤色蛍光プローブ；及び
＜８＞以下の式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩を含む、細胞内滞留性赤色蛍光プローブ：
【化２】
2018000074.tif 000003
を提供するものである。
【００１０】
また、別の態様において、本発明は、
＜９＞上記＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の細胞内滞留性赤色蛍光プローブを含む、特定の酵素が発現している標的細胞を検出するための又は可視化するためのキット；
＜１０＞前記標的細胞が、β−ガラクトシダーゼ発現細胞である、上記＜９＞に記載の組成物又はキット；
＜１１＞前記標的細胞が、癌細胞である、上記＜９＞に記載の組成物又はキット；
＜１２＞上記＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の細胞内滞留性赤色蛍光プローブを用いて、特定の酵素が発現している標的細胞を検出する方法；
＜１３＞前記細胞内滞留性赤色蛍光プローブと、前記標的細胞において特異的に発現する酵素とを、生体外において接触させる工程、及び、励起光照射を行って蛍光を生じさせる工程を含むことを特徴とする、上記＜１２＞に記載の方法；
＜１４＞前記標的細胞が、β−ガラクトシダーゼ発現細胞である、上記＜１２＞又は＜１３＞に記載の方法；及び
＜１５＞前記標的細胞が、癌細胞である、上記＜１２＞又は＜１３＞に記載の方法
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の細胞内滞留性赤色蛍光プローブは、十分な細胞透過性と細胞内滞留性を有し、β−ガラクトシダーゼ等のレポーター酵素を発現している細胞を単一細胞レベルでライブ検出することが可能であり、さらに、赤色蛍光領域の発光シグナルであるためＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の蛍光シグナルと分離することができ、ＧＦＰとの共染色が可能であるという効果を奏する。したがって、本発明によれば、赤色蛍光性と細胞内滞留性とを兼ね備えた新規な蛍光プローブを用いることによって、生きた細胞及び生きた生体組織における標的細胞の単一細胞レベルでの選択的蛍光イメージングが可能となる。
【００１２】
これにより、個々の細胞の経時的な変化を追跡可能であり、例えば、癌細胞を選択的に蛍光イメージングすることで、癌組織を取り残さずに外科的に切除することも可能となる。さらに、本発明の細胞内滞留性赤色蛍光プローブによるイメージング手法は、通常の細胞イメージングが行える顕微鏡で施行可能であり、特別な機器を必要としない。このように、本発明の細胞内滞留性赤色蛍光プローブの産業上の利用価値、経済効果は、極めて大きいものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の細胞内滞留性赤色蛍光プローブである4-CH2F-SPiDER-RED-βGalと、β−ガラクトシダーゼとの酵素反応によって生じる蛍光の強度（ａ）、吸収スペクトル変化（ｂ）、蛍光スペクトル（ｃ）を示した図である。
【図２】図２は、本発明の細胞内滞留性赤色蛍光プローブである2-CH2F-SPiDER-RED-βGalと、β−ガラクトシダーゼとの酵素反応によって生じる蛍光の強度（ａ）、吸収スペクトル変化（ｂ）、蛍光スペクトル（ｃ）を示した図である。
【図３】図３は、本発明の細胞内滞留性赤色蛍光プローブである4-CH2F-SPiDER-RED-βGalを、β−ガラクトシダーゼと酵素反応させることにより、溶液中に共存するタンパク質ＢＳＡを蛍光ラベル化し得ることを示した図である。（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを波長４８８ｎｍの励起光で励起した際に得られた蛍光画像である。レーン１：10 μM 4-CH2F-SPiDER-RED-βGal、1 mg/mL ＢＳＡ、5 U β−ガラクトシダーゼを含むPBS緩衝液10 μL、レーン２：10 μM  4-CH2F-SPiDER-RED-βGal、1 mg/mL ＢＳＡを含むPBS緩衝液10 μL、レーン３：１０μＭ  4-CH2F-SPiDER-RED-βGalと5 U β−ガラクトシダーゼを含むPBS緩衝液10 μL、レーン４：10 μM 4-CH2F-SPiDER-RED-βGalのみを含むPBS緩衝液10 μL、レーン５： 10 μM 4-CH2OH-SPiDER-REDを含むPBS緩衝液10 μL。（ｂ）上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをクマシー染色した後の画像。
【図４】図４は、本発明の細胞内滞留性赤色蛍光プローブである2-CH2F-SPiDER-RED-βGalを、β−ガラクトシダーゼと酵素反応させることにより、溶液中に共存するタンパク質ＢＳＡを蛍光ラベル化し得ることを示した図である。（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを波長４８８ｎｍの励起光で励起した際に得られた蛍光画像である。レーン１：10 μM 2-CH2F-SPiDER-RED-βGal、1 mg/mL ＢＳＡ、5 U β−ガラクトシダーゼを含むPBS緩衝液10 μL、レーン２：10 μM  2-CH2F-SPiDER-RED-βGal、1 mg/mL ＢＳＡを含むPBS緩衝液10 μL、レーン３：１０μＭ  2-CH2F-SPiDER-RED-βGalと5 U β−ガラクトシダーゼを含むPBS緩衝液10 μL、レーン４：10 μM 2-CH2F-SPiDER-RED-βGalのみを含むPBS緩衝液10 μL、レーン５： 10 μM 2-CH2OH-SPiDER-REDを含むPBS緩衝液10 μL。（ｂ）上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをクマシー染色した後の画像。
【図５】図５は、本発明の細胞内滞留性赤色蛍光プローブである4-CH2F-SPiDER-RED-βGalを用いたライブセル蛍光イメージング画像である。β−ガラクトシダーゼを発現している細胞（HEK-lacZ）と発現していない細胞（HEK、予めCellTracker Greenで染色）を共培養し、4-CHF2-SPiDER-RED-βGalでインキュベートした場合の画像である。左上図は、HEK細胞からの緑色蛍光を観察した画像、右上図は、4-CH2F-SPiDER-RED-βGal由来の赤色蛍光を観察した画像、左下図は、明視野像、右下図は、蛍光像の重ね合わせ画像である。これらは、単一細胞レベルの生細胞蛍光イメージングに利用可能であることを示す図である。
【図６】図６は、本発明の細胞内滞留性赤色蛍光プローブである4-CHF2-SPiDER-RED-βGalと反応させたハエ羽根原基組織の蛍光イメージング画像である。上段の左から、4-CHF2-SPiDER-RED-βGalの蛍光画像、GFPの蛍光画像、Hoechst33342の蛍光画像、下段の左から明視野画像、これらのマージ画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００１５】
１．定義
本明細書中において、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を意味する。
【００１６】
本明細書中において、「アルキル」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなる脂肪族炭化水素基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜２０個（Ｃ１〜２０）、炭素数３〜１５個（Ｃ３〜１５）、炭素数５〜１０個（Ｃ５〜１０）である。炭素数を指定した場合は、その数の範囲の炭素数を有する「アルキル」を意味する。例えば、Ｃ１〜８アルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎｅｏ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル等が含まれる。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を1個以上有していてもよい。当該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルコシ基、アリールアルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
【００１７】
本明細書において、ある官能基について「置換されていてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。このような例として、例えば、ハロゲン化アルキル基、ジアルキルアミノ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００１８】
本明細書中において、「アリール」は単環式又は縮合多環式の芳香族炭化水素基のいずれであってもよく、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含む芳香族複素環であってもよい。この場合、これを「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」と呼ぶ場合もある。アリールが単環及び縮合環のいずれである場合も、すべての可能な位置で結合しうる。単環式のアリールの非限定的な例としては、フェニル基（Ｐｈ）、チエニル基（２−又は３−チエニル基）、ピリジル基、フリ
ル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、ピラゾリル基、２−ピラジニル基、ピリミジニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピリダジニル基、３−イソチアゾリル基、３−イソオキサゾリル基、１，２，４−オキサジアゾール−５−イル基又は１，２，４−オキサジアゾール−３−イル基等が挙げられる。縮合多環式のアリールの非限定的な例としては、１−ナフチル基、２−ナフチル基、１−インデニル基、２−インデニル基、２，３−ジヒドロインデン−１−イル基、２，３−ジヒドロインデン−２−イル基、２−アンスリル基、インダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、１，２−ジヒドロイソキノリル基、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリル基、インドリル基、イソインドリル基、フタラジニル基、キノキサリニル基、ベンゾフラニル基、２，３−ジヒドロベンゾフラン−１−イル基、２，３−ジヒドロベンゾフラン−２−イル基、２，３−ジヒドロベンゾチオフェン−１−イル基、２，３−ジヒドロベンゾチオフェン−２−イル基、ベンゾチアゾリル基、ベンズイミダゾリル基、フルオレニル基又はチオキサンテニル基等が挙げられる。本明細書において、アリール基はその環上に任意の置換基を１個以上有していてもよい。当該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アリール基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アリール部分を含む他の置換基（例えばアリールオキシ基やアリールアルキル基など）のアリール部分についても同様である。
【００１９】
本明細書中において、「アルコキシ基」とは、前記アルキル基が酸素原子に結合した構造であり、例えば直鎖状、分枝状、環状又はそれらの組み合わせである飽和アルコキシ基が挙げられる。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、シクロプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、シクロブトキシ基、シクロプロピルメトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロプロピルエチルオキシ基、シクロブチルメチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロプロピルプロピルオキシ基、シクロブチルエチルオキシ基又はシクロペンチルメチルオキシ基等が好適な例として挙げられる。
【００２０】
本明細書中において用いられる「アミド」とは、ＲＮＲ’ＣＯ−（Ｒ＝アルキルの場合、アルカミノカルボニル−）及びＲＣＯＮＲ’−（Ｒ＝アルキルの場合、アルキルカルボニルアミノ−）の両方を含む。
【００２１】
本明細書中において用いられる「エステル」とは、ＲＯＣＯ−（Ｒ＝アルキルの場合、アルコキシカルボニル−）及びＲＣＯＯ−（Ｒ＝アルキルの場合、アルキルカルボニルオキシ−）の両方を含む。
【００２２】
本明細書中において、「環構造」という用語は、二つの置換基の組み合わせによって形成される場合、複素環または炭素環基を意味し、そのような基は飽和、不飽和、または芳香族であることができる。従って、上記において定義した、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、及びヘテロアリールを含むものである。例えば、シクロアルキル、フェニル、ナフチル、モルホリニル、ピペルジニル、イミダゾリル、ピロリジニル、及びピリジルなどが挙げられる。本明細書中において、置換基は、別の置換基と環構造を形成することができ、そのような置換基同士が結合する場合、当業者であれば、特定の置換、例えば水素への結合が形成されることを理解できる。従って、特定の置換基が共に環構造を形成すると記載されている場合、当業者であれば、当該環構造は通常の化学反応によって形成することができ、また容易に生成することを理解できる。かかる環構造及びそれらの形成過程はいずれも、当業者の認識範囲内である。
【００２３】
２．細胞内滞留性赤色蛍光プローブ
本発明の細胞内滞留性赤色蛍光プローブは、一態様において、以下の一般式（Ｉ）で表される構造を有する化合物又はその塩を含むことを特徴とする。
2018000074.tif 000004
【００２４】
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１は水素原子又はベンゼン環に結合する１個ないし４個の置換基を示す。かかる置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基は、１以上の置換基によってさらに置換されていてもよく、そのような置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基などを１個又は２個以上有していてもよい。ベンゼン環上に２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。Ｒ１としては、水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基であることがより好ましい。水素原子が特に好ましい。
【００２５】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６はそれぞれ独立に−ＣＦＲ１０Ｒ１１又は−ＣＦ２Ｒ１２、若しくは、水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を表す（当該アルキル基は置換されていてもよい）。Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアルケニル基を表す。さらに、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６の少なくとも一つは、−ＣＦＲ１０Ｒ１１又は−ＣＦ２Ｒ１２を表す。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６の少なくとも一つは、−ＣＦＲ１０Ｒ１１であることが好ましい。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６の少なくとも一つは、−ＣＨ２Ｆであることがさらに好ましい。
【００２６】
Ｒ２及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、又はハロゲン原子を示す。Ｒ２及びＲ７がいずれも水素原子であることが好ましい。
【００２７】
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示す。Ｒ８及びＲ９がともにアルキル基を示す場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。例えば、Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に、メチル基又はエチル基であることが好ましく、Ｒ８及びＲ９がいずれもエチル基である場合がさらに好ましい。
【００２８】
ＸはＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）を表す。ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子又はアルキル基を表し、当該アルキル基は、好ましくは炭素数１〜５のアルキル基であり、置換されていてもよい。好ましくは、Ｒａ及びＲｂは、いずれも水素原子である。
【００２９】
Ｙは−Ｃ（＝Ｏ）−又は−ＲｃＣ（＝Ｏ）−である。ここで、Ｒｃは、炭素数１〜３のアルキレン基である。当該アルキレン基は、直鎖状アルキレン基又は分枝鎖状アルキレン基のいずれであってもよい。例えば、メチレン基（−ＣＨ２−）、エチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、プロピレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）のほか、分枝鎖状アルキレン基として−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−なども使用することができる。好ましくは、Ｙは−Ｃ（＝Ｏ）−である。
【００３０】
基Ａは、酵素によって切断される一価の基を表し、具体的には、例えば、β−ガラクトピラノシル基、α−マンノシル基、β−Ｎ−アセチルグルコサミル基、β−ラクタム環、リン酸エステル、アミノフェノキシ基、ヒドロキシフェノキシ基、γ−グルタミン酸などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００３１】
Ａを切断するための酵素としては、例えば、還元酵素、酸化酵素、又は加水分解酵素などを挙げることができ、レポーター酵素や癌細胞において特異的に発現又は活性化する酵素、より具体的には、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、α−マンノシダーゼ、エステラーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、チトクロームＰ４５０酸化酵素、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、ラクターゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。好ましくは、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、ペルオキシダーゼ、又はγ−グルタミルトランスフェラーゼである。最も好ましくは、β−ガラクトシダーゼである。
【００３２】
上記式（Ｉ）で表される化合物は塩として存在する場合がある。塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。ただし、本発明の式（Ｉ）で表される化合物の塩はこれらに限定されることはない。
【００３３】
式（Ｉ）で表される化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
【００３４】
式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
【００３５】
本明細書の実施例には、式（Ｉ）で表される化合物に包含される代表的化合物についての製造方法が具体的に示されているので、当業者であれば、本明細書の開示を参照することにより、及び必要に応じて、出発原料や試薬、反応条件などを適宜選択することにより、式（Ｉ）に包含される任意の化合物を容易に製造することができる。
【００３６】
本発明の細胞内滞留性赤色蛍光プローブとして用いられる代表的な式（Ｉ）の化合物の具体例としては、以下の化合物を挙げることができる。ただし、これらに限定されるものではない。
【化３】
2018000074.tif 000005
【００３７】
３．本発明の蛍光プローブの蛍光発光および細胞内滞留の機構
本発明の細胞内滞留性赤色蛍光プローブにおける蛍光発光機構及び細胞内滞留機構について以下説明する。
【００３８】
式（Ｉ）で表される化合物を含む細胞内滞留性赤色蛍光プローブを細胞内に取り込ませた場合、Ａで表される基を切断可能な酵素が発現している細胞では、当該細胞内において、Ａで表される基が切断されるとともに、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、又はＲ６のいずれかに位置する−ＣＦＲ１０Ｒ１１又は−ＣＦ２Ｒ１２からフッ化水素が離脱し、キノンメチドが生成される。キノンメチドは急速に周囲の求核剤による攻撃を受けることから、細胞内でキノンメチドを生成した場合、周囲のタンパク質がもつ求核基と速やかに反応し、タンパク質に不可逆的に結合する。
【００３９】
例えば、式（Ｉa）の化合物（式中(Ａ)）の場合には、以下のようにβ−ガラクトシダーゼによって基Ａの切断（式中（Ｂ））とスピロ環の開環が生じ、細胞内タンパク質に共有結合した化合物（式中（Ｃ））が生成する。かかるスピロ環の開環による蛍光発光機構については、国際公開２００５／０２４０４９号にその詳細が記載されている。
【００４０】
【化４】
2018000074.tif 000006
【００４１】
式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、中性領域において例えば５００〜６５０ｎｍ程度の励起光を照射した場合には、ほとんど蛍光を発しないが、酵素活性によって生じた開環化合物は、同じ条件下において極めて強い蛍光を発する性質を有している。したがって、式（Ｉ）で表される細胞内滞留性赤色蛍光プローブを取り込んだ細胞が、基Ａを切断可能な酵素を発現していない場合には、（Ｃ）の開環化合物は生成せず、蛍光物質が当該細胞内で生成することはない。このように式（Ｉ）で表される細胞内滞留性赤色蛍光プローブを用いることにより、Ａで表される基を切断可能な酵素が発現および活性化している細胞のみにおいて、選択的に蛍光が生成される。さらに、（Ｃ）で表される反応生成化合物は、細胞内タンパク質に共有結合することができるため、細胞外への漏出が抑制され、これにより、当該酵素が発現および活性化している細胞を特異的に、単一細胞レベルといった詳細なレベルで可視化することが可能となる。
【００４２】
また、式（Ｉ）で表される化合物では、キサンテン環の１０位元素であるＸにケイ素原子を有し、またベンゼン環の２位にカルボキシル基に基づく置換基（Ｙ−Ｏ部分）を有する構造を採用したことにより、スピロ環の開環による蛍光発光を、蛍光ピーク波長が６００〜７５０ｎｍの赤色蛍光とすることができるという特徴を有するものである。これにより、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の蛍光シグナルと分離することができ、ＧＦＰとの共染色が可能となる。
【００４３】
上記特性から、本発明の式（Ｉ）で表される化合物は、細胞を固定処理することなくあるいは固定処理後に、単一細胞レベルで詳細に可視化することを可能とするものであり、ＧＦＰとの共染色可能な蛍光プローブとして細胞系における細胞生物学的研究用のツールに用いる他、癌などの手術現場における迅速な病理検査に用いる検査薬、診断薬などの、幅広い利用用途を有している。
【００４４】
４．本発明の細胞内滞留性赤色蛍光プローブによる選択的細胞可視化方法
上述の特性を示すため、本発明の細胞内滞留性蛍光プローブを、特定の酵素が発現している標的細胞の細胞を特異的に可視化する方法に用いることができる。具体的には、式（Ｉ）の化合物又は塩を含む細胞内滞留性赤色蛍光プローブと標的細胞において特異的に発現するβ−ガラクトシダーゼ等の酵素とを接触させる工程、次いで、励起光照射を行うことで発生する蛍光を検出する工程を行うことによって、β−ガラクトシダーゼ等を発言している標的細胞のみを特異的に赤色蛍光シグナルとして可視化することができる。
【００４５】
本発明の細胞内滞留性蛍光プローブと、標的細胞において特異的に発現する酵素とを接触させる手段としては、代表的には、細胞内滞留性赤色蛍光プローブを含む溶液を試料添加、塗布、或いは噴霧することが挙げられるが、その用途に応じて適宜選択することが可能である。また、本発明の細胞内滞留性赤色蛍光プローブを、動物個体における診断又は診断の補助、若しくは特定の細胞又は組織の検出に適用する際に、当該化合物と、標的細胞又は組織において発現する酵素とを接触させる手段としては、特に限定されることなく、例えば、静脈内投与等、当該分野において一般的な投与手段を用いることができる。
【００４６】
また、標的細胞に行う光照射は、当該細胞に対して光を直接或いは導波管（光ファイバー等）を介して照射することができる。光源としては、酵素切断を受けた後の、本発明の細胞内滞留性赤色蛍光プローブの吸収波長を含む光を照射できるものであれば、任意の光源を用いることができ、本発明の方法を実施する環境等に応じて適宜選択され得る。
【００４７】
本発明の細胞内滞留性赤色蛍光プローブとしては、上記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、一般的には、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供されるが、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用することが可能である。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００４９】
本実施例では以下に示す装置及び条件を用いた。
・NMR測定はULTRASHIELD 400 (BRUKER)を用いて行った。(400 MHz for 1H NMR, 100 MHz for 13C NMR)
・シリカゲルカラムクロマトグラフィーにはシリカゲル60 N (球状、中性、KANTO CHEMICAL Co., Inc.)を用いた。
・逆相HPLCによる精製は、以下の装置およびカラムを使用した。
・ポンプ：PU-2080およびPU-2087 (日本分光株式会社)
・検出器：MD-2010 (日本分光株式会社)
・カラム：Inertsil ODS-3 (20×250 mm, GL Science Inc.)
・逆相HPLCによる精製に際しては、以下の溶媒ＡおよびＢを用いた。
Ａ：100 mM トリエチルアミン酢酸塩
Ｂ：99% アセトニトリル、1% milliQ
・紫外-可視吸光分光分析および蛍光分光分析は、Shimadzu UV-2450（島津製作所）およびHitachi F-7000（日立製作所）を用いて行った。
・蛍光イメージング実験は共焦点蛍光顕微鏡TCS SP5X（Leica）と対物レンズHCX PL APO CS 40x/1.25（Leica）を用いて行った。
【実施例１】
【００５０】
１．プローブ分子の合成
以下に示すとおり、本発明の細胞内滞留性赤色蛍光プローブとして用いられる4-CH2F-SPiDER-RED-βGal及び2-CH2F-SPiDER-RED-βGalをそれぞれ合成した。
【００５１】
（１）4-CH2F-SPiDER-RED-βGalの合成
以下のスキームに従って、本発明の細胞内滞留性赤色蛍光プローブである4-CH2F-SPiDER-RED-βGalを合成した。
【００５２】
2018000074.tif 000007
【００５３】
［化合物１の合成］
2018000074.tif 000008
化合物1は既報（Chemical Communications 47, 4162-4164 (2011)）に則り合成した。具体的には、3-bromoaniline (4.0 mL, 37 mmol) と allyl bromide (11 mL, 131 mmol) をMeCN (40 mL)に溶解した後、potassium carbonate (11 g, 80 mmol)を添加した。反応溶液をアルゴン雰囲気下で80○C で終夜撹拌した。反応液を室温まで冷却した後、不溶物をセライトろ過にて取り除き、ろ液を減圧除去した。得られたオイル状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：AcOEt : hexane = 2.5 : 97.5 to AcOEt : hexane = 10 : 90) により精製し、目的化合物1を透明なオイル状物質として得た (8.6 g, 93%)。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 3.89-3.90 (4H, m), 5.12-5.16 (2H, m), 5.19 (2H, m) 5.76-5.89 (2H, m), 6.57-6.61 (1H, m), 6.77-6.81 (2H, m), 7.03 (1H, t, J = 8.1 Hz).
【００５４】
［化合物２の合成］
2018000074.tif 000009
化合物1 (1.0 g, 4.0 mmol) をDMF (3 mL)に溶解した後、phosphoryl chloride (490 μL, 5.2 mmol)を添加した。反応溶液をアルゴン雰囲気下で終夜撹拌した後、反応溶液に2N NaOH aqを滴下し、CH2Cl2 で分液抽出した。集めた有機層を減圧除去し、得られたオイル状物質をさらにAcOEtに溶解し飽和NH4Cl水溶液で3回洗浄した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧除去して得られた残査を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液： CH2Cl2:hexane = 67:33 to 100:0) で精製し、化合物2を得た (902 mg, 81%)。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 3.98-3.99 (4H, m), 5.15-5.23 (4H, m), 5.81-5.85 (2H, m), 6.64 (1H, dd, J = 8.8 Hz, 2.2 Hz), 6.81 (1H, d, J = 2.9 Hz), 7.77 (1H, d, J = 8.8 Hz), 10.07 (1H, s) 13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ 52.7, 111.0, 115.2, 117.0, 122.4, 129.7, 131.1, 131.6, 153.5, 190.1
【００５５】
［化合物３の合成］
2018000074.tif 000010
化合物2 (3.6 g, 13 mmol) をMeOH (15 mL) に溶解しsodium borohydride をゆっくり添加した。反応液をアルゴン雰囲気下で室温2時間撹拌した。反応液を飽和NaHCO3 水溶液で希釈し、CH2Cl2で2回分液抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧除去して得られたオイル状物質(2.9 g, 10 mmol) をCH2Cl2 (30 mL)に溶解した。3-bromo-N,N,-dimethylaniline (1.4 mL, 10 mmol)とboron trifluoride ethyl ether complex (1.7 mL, 13 mmol) を添加し、アルゴン雰囲気下室温で終夜撹拌した。反応液を飽和NaHCO3水溶液に希釈し、CH2Cl2で2回分液抽出し、集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層を減圧除去し、得られた残査を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液：CH2Cl2 : hexane = 0 : 100 to 50: 50) で精製し、化合物3を得た (3.2 g, 55%)。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 2.91 (6H, s), 3.87 (4H, d, J = 5.1 Hz), 3.98 (2H, s,), 5.16 (4H, dd, J = 1.8, 13.6 Hz), 5.78-5.87 (2H, m), 6.54 (1H, dd, J = 8.8 Hz, 2.9 Hz), 6.59 (1H, dd, J = 8.8 Hz, 2.9 Hz), 6.79 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.87 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.90 (1H, d, J = 2.2 Hz), 6.93 (1H, d, J = 2.9 Hz) 13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ39.8, 40.5, 52.7, 111.6, 111.8, 115.9, 116.2, 116.2, 125.5, 125.6, 126.8, 127.0, 130.7, 130.8, 133.4, 148.1, 150.0
【００５６】
［化合物４の合成］
2018000074.tif 000011
化合物3 (3.3 g, 7.1 mmol) をTHF (15 mL)に溶解し、アルゴン雰囲気下で-78 ○Cで20分間撹拌した。s-BuLi (18 mL, 18 mmol) を滴下した後、30分間アルゴン雰囲気下-78 ○Cで撹拌し、さらにdichlorodimethylsilane (1.3 mL, 11 mmol)を添加した。反応液を徐々に室温に戻し、さらにアルゴン雰囲気下2時間室温で撹拌した。2N 塩酸を滴下した後、飽和NaHCO3水溶液を加え、CH2Cl2で3回分液抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧除去してオイル状残査得た。残査をacetone (30 mL) に溶かし、0 ○Cに冷却した後、Potassium manganite (VII)を添加した。3時間0 ○Cで撹拌した後、さらに3等量のpotassium manganite (VII) (3.4 g, 21 mmol)を添加し、反応液を徐々に室温に戻した。終夜室温で撹拌し後、不溶物をセライトろ過し、ろ液を減圧除去して得られた残査を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液：AcOEt : CH2Cl2 = 0 : 100 to 10: 90)で精製し、化合物4 を黄色固体として得た(1.0 g, 38%).
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.44 (6H, s), 3.10 (6H, s), 4.03 (4H, d, J = 5.1 Hz), 5.17-5.20 (2H, m), 5.23 (2H, br), 5.84-5.93 (2H, m), 6.77-6.85 (4H, m), 8.37 (2H, t, J = 9.5 Hz) 13C-NMR (75 MHz, CDCl3) δ -1.1, 40.0, 52.7, 113.1, 113.4, 114.2, 114.7, 116.5, 129.7, 130.0, 131.6, 133.0, 140.4, 140.4, 150.1, 151.4, 185.1 HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 377.20491; found, 377.20176 (-3.15 mmu).
【００５７】
［化合物５の合成］
2018000074.tif 000012
化合物4 (1.0 g, 2.7 mmol) をCH2Cl2 (35 mL)に溶解し、tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0) (0.31 g, 0.27 mmol) と1,3-dimethylbarbituric acid (0.86 g, 5.4 mmol) を添加し、アルゴン雰囲気下室温で終夜撹拌した。反応液を飽和Na2CO3水溶液で3回抽出した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧除去得られた残査を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液：AcOEt : hexane = 45 : 55 to 67: 33)で精製し、化合物5 を得た(790 mg, 99%)。
1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ 0.42 (6H, s), 3.06 (6H, s), 6.74-6.89 (4H, m), 8.14 (1H, d, J = 8.8 Hz), 8.22 (1H, d, J = 8.8 Hz)13C-NMR (75 MHz, CD3OD) δ -1.2, 40.1, 114.1, 115.6, 116.6, 118.4, 129.9, 130.9, 132.5, 132.7, 142.2, 142.7, 153.1, 153.3, 187.5 HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 297.14231; found, 297.14250 (0.19 mmu)
【００５８】
［化合物６の合成］
2018000074.tif 000013
化合物5 (258 mg, 0.87 mmol) をMeOH (10 mL) と 6N 硫酸(25 mL) の混合溶媒に溶解し、0 ○C に冷却した。H2O (4 mL) に溶解したSodium nitrile (600 mg, 8.7 mmol) を1時間かけて滴下した後、加熱した1N 硫酸(100 mL) に少量ずつ滴下した。10分間撹拌後、室温まで戻し、反応液をCH2Cl2で4回分液抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧除去した。得られた残査を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液：AcOEt : CH2Cl2 = 0 : 100 to 10: 90) で精製し、化合物6 を得た(81 mg, 31%)。
1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ 0.44 (6H, s), 3.09 (6H, s), 6.84-6.89 (2H, m), 6.93 (1H, dd, J = 8.8 Hz, 2.2 Hz), 7.06 (1H, d, J = 2.2 Hz), 8.21-8.26 (2H, m) 13C-NMR (75 MHz, CD3OD) δ-1.3, 40.1, 114.2, 115.6, 118.2, 120.0, 129.6, 132.8, 133.0, 134.1, 142.3, 143.2, 153.5, 161.9, 187.6 HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 298.12633; found, 298.12254 (-3.79 mmu).
【００５９】
［化合物７の合成］
2018000074.tif 000014
化合物6 (1.45 mmol, 431 mg)とhexamethylenetetramine (2.9 mmol, 406 mg)をTFA (2.5 mL)中90℃で3時間加熱した。1N塩酸を加えて室温でさらに1時間撹拌した後、水酸化ナトリウム水溶液で中和し酢酸エチルを加えて3回分液操作を行った。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレーターで溶媒を除去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(Hexane/CH2Cl2/EtOAc = 1/1/0.25)で精製し、目的化合物7を黄色固体として得た (130 mg, 28%)。異性体である化合物7’も同時に得られた(87 mg, 18%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ12.25 (1H, s), 10.45 (1H, s), 8.75 (1H, d, J = 9.5 Hz), 8.37 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.17 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.89 (1H, dd, J = 9.2 Hz, 2.6 Hz), 6.80 (1H, d, J = 2.2 Hz), 3.14 (6H, s), 0,67 (6H, s); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ196.0, 184.0, 165.9, 152.1, 145.3, 139.6, 139.0, 134.5, 131.7, 127.4, 122.4, 120.2, 113.7, 113.6, 40.0, 1.6
【００６０】
［化合物８の合成］
2018000074.tif 000015
化合物7 (0.76 mmol, 247 mg)をMeOH (5 mL)に溶解し、そこに室温でNaBH4 (0.76 mmol, 29 mg)を加えた。5分後飽和塩化アンモニウム水溶液を加え撹拌した後、酢酸エチルを加えて3回分液操作を行った。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレーターで溶媒を除去した。ここにTBSCl (3 mmol, 452 mg)、imidazole (6 mmol, 408 mg)、DMF (1 mL)を加えて60℃で1時間撹拌した。反応後、水を加えてヘキサンで3回分液操作を行った。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレーターで溶媒を除去した。得られた化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(Hexane/EtOAc = 10/1)で精製し目的化合物を淡黄色の粘稠な液体として得た(422 mg, 99%)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.38 (1H, d, J = 8.8 Hz), 8.28 (1H, dd, J = 8.8 Hz, 1.5 Hz), 6.98 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.80-6.83 (2H, m), 4.92 (2H, s), 3.10 (6H, s), 1.02 (9H, s), 0.90 (9H, s), 0.60 (6H, s), 0.28 (6H, s), 0.16 (6H, s); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ186.4, 156.2, 151.9, 143.2, 141.0, 136.3, 135.1, 1331.3, 128.8, 120.5, 113.8, 113.2, 59.2, 40.0, 26.2, 26.1, 18.6, 18.6, 0.6, -3.7, -4.7; HRMS (ESI) exact mass calcd. for: m/z 556.30985 ([M + H]+), found: m/z 556.30757 (-2.28 mmu).
【００６１】
［化合物９の合成］
2018000074.tif 000016
2-bromobenzoic acid (2 mmol, 402 mg)を Et2O (10 mL)に溶解させ、-78 °Cでt-BuLi (1.7 M in pentane, 6 mmol, 3.5 mL)を加えこの温度で3時間撹拌した。キャヌラを用い、この溶液を 化合物8 (0.6 mmol, 331 mg)のTHF溶液(3 mL)を入れた別のフラスコに-78 °Cで滴下した。滴下後室温で12時間撹拌し、1 N 塩酸を加えてさらに30分撹拌した。その後、炭酸水素ナトリウム水溶液で中和しヘキサンを加えて3回分液操作を行った。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレーターで溶媒を除去した。残った粗生成物をDMF (6 mL) に溶解し、1 N LiOH (2 mL)を室温で加えた。5分撹拌したのち、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えてhexane/AcOEt = 3/1の混合溶媒で3回抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレーターで溶媒を除去した。得られた化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(hexane/CH2Cl2 = 1/2, 2% AcOEt)で精製し目的化合物を無色の粘稠な液体として得た (252 mg, 76%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ8.62 (1H, s), 7.94 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.60 (1H, t, J = 7.6 Hz), 7.50 (1H, t, J = 7.6 Hz), 7.22 (1H, d, J = 7.6 Hz), 6.90-6.92 (2H, m), 6.82 (1H, d, J = 9.6 Hz), 6.76 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.59 (1H, d, J = 9.6 Hz), 5.21 (1H, d, J = 12 Hz), 5.17 (1H, d, J = 12 Hz), 2.96 (6H, s), 0,97 (9H, s), 0.71 (3H, s), 0.66 (3H, s), 0.42 (6H, s); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ170.9, 157.0, 155.3, 149.6, 136.4, 135.6, 134.1, 133.4, 131.1, 129.1, 128.8, 128.6, 128.0, 126.1, 125.9, 124.2, 119.0, 116.2, 114.1, 91.8, 66.5, 40.4, 25.9, 18.3, 14.4, 1.4, -5.1; HRMS (ESI) exact mass calcd. for C31H39NO4Si2: m/z 546.24904 ([M + H]+), found: m/z 546.25315 (+4.1 mmu).
【００６２】
［化合物１０の合成］
2018000074.tif 000017
化合物9 (0.46 mmol, 252 mg)、2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-galactopyranosyl bromide (0.92 mmol, 379 mg)、Cs2CO3 (0.92 mmol, 300 mg) を MeCN (3 mL) 中室温で2時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで3回抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレーターで溶媒を除去した。残った粗生成物をTHF (5 mL) に溶解し、Et3N (0.8 mmol, 0.11 mL)、 TFA (0.8 mmol, 60 μL)を加えた後、TBAF (1 M in THF, 1.5 mmol, 1.5 mL) を加え、室温で6時間撹拌した。TLCで反応の完結を確認した後、塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで3回抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレーターで溶媒を除去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(Et2O)で大部分の不純物を取り除いた後、粗精製物をCH2Cl2 (5 mL) に溶解しDAST (0.36 mmol, 48 μL) を 0 °Cで加えた。30分撹拌した後、塩化アンモニウム水溶液を加え、CH2Cl2で3回抽出した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレーターで溶媒を除去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー (CH2Cl2/Et2O = 10/1) による精製で目的化合物が31% 収率 (110.4 mg) で 1:1 のジアステレオ混合物として得られた。
1H NMR (400 MHz, CDCl3, dr = 1:1)δ7.95 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.61 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.51 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.22 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.10 (2H, t, J = 9.2 Hz), 6.94-7.00 (4H, m), 6.87 (2H, dd, J = 9.2 Hz, 2.8 Hz), 6.60 (2H, d, J = 9.2 Hz, 2.8 Hz), 5.81 (1H, t, J = 10.4 Hz), 5.69 (1H, t, J = 10.4 Hz), 5.56 (2H, d, J = 10.4 Hz, 8.0 Hz), 5.42-5.46 (2H, m), 5.09 (2H, td, J = 9.6 Hz, 3.2 Hz), 5.02 (1H, d, J = 8.0 Hz), 4.97 (1H, d, J = 8.0 Hz), 4.01-4.22 (8H, m), 2.98 (12H, s), 1.97-2.19 (24H, m), 0.79 (3H, s), 0.75 (3H, s), 0.72 (3H, s), 0.66 (3H, s); HRMS (ESI) exact mass calcd. for C39H43FNO12Si: m/z 764.25445 ([M + H]+), found: m/z 764.25794 (+3.5 mmu).
【００６３】
［4-CH2F-SPiDER-RED-βGalの合成］
2018000074.tif 000018
化合物10 (0.15 mmol, 114 mg)をMeOH (3 mL) に溶解しNaOMe (2.3 mmol, 124 mg) を加えて室温で3 時間撹拌した。AcOH (2.3 mmol, 0.14 mL)を加えて中和した後、エバポレーターで溶媒を除去した。残った化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2/MeOH = 6/1)で精製し目的化合物が70% 収率 (59 mg) で1:1 のジアステレオ混合物として得られた。
得られたサンプル(10 mg)を逆相HPLC (linear gradient from eluent A : eluent B = 70 : 30 to 0 : 100 in 30 min, eluent A: 100mM triethylamine acetate, eluent B: 99% MeCN + 1% H2O)によりさらに精製した。
1H NMR (400 MHz, CDCl3, dr = 1:1)δ7.82 (2H, t, J = 8.0 Hz), 7.49-7.55 (2H, m), 7.35-7.44 (2H, m), 7.22 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.14 (1H, d, J = 7.6 Hz), 6.91-7.04 (6H, m), 6.75-6.79 (2H, m), 6.54-6.56 (2H, m), 5.67 (2H, br), 5.56 (2H, br), 4.19-4.90 (8H, m), 3.95 (4H, br), 3.38-3.58 (10H, m), 2.95 (12H, s), 0.61 (3H, s), 0.58 (3H, s), 0.54 (3H, s), 0.49 (3H, s); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ170.9, 170.7, 156.2, 154.8, 154.4, 149.7, 139.5, 139.0, 138.8, 136.6, 136.2, 134.4, 130.5, 130.3, 130.2, 129.2, 129.1, 127.9, 126.1, 125.9, 125.7, 124.6, 124.3, 117.1, 116.7, 116.5, 116.4, 113.9, 113.7, 101.7, 91.7, 91.5, 79.7 (d, JC-F = 160 Hz), 77.4, 74.6, 74.4, 73.3, 71.0, 69.0, 61.5, 40.4, 14.3, 1.6, 1.5, 0.9, 0.6; HRMS (ESI) exact mass calcd. for C31H34FNO8Si: m/z 596.21105 ([M + H]+), found: m/z 596.21193 (+0.9 mmu).
【００６４】
（２）2-CH2F-SPiDER-RED-βGalの合成
以下のスキームに従って、本発明の細胞内滞留性赤色蛍光プローブである2-CH2F-SPiDER-RED-βGalを合成した。
【００６５】
2018000074.tif 000019
【００６６】
［化合物７’の合成］
2018000074.tif 000020
化合物7を合成する反応で異性体として収率18%で得られた。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.20 (1H, s), 10.04 (1H, s), 8.77 (1H, s), 8.40 (1H, d, J = 9.2 Hz), 7.22 (1H, s), 6.86 (1H, dd, J = 9.2 Hz, 2.8 Hz), 6.77 (1H, d, J = 2.8 Hz), 3.13 (6H, s), 0.50 (6H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ197.7, 184.4, 162.5, 152.3, 150.5, 140.4, 136.5, 134.1, 132.6, 128.6, 121.9, 121.8, 114.5, 113.7, 40.3, -1.2; HRMS (ESI) exact mass calcd. for C18H19NO3Si: m/z 326.12070 ([M + H]+), found: m/z 326.12119 (+0.5 mmu).
【００６７】
［化合物８’の合成］
2018000074.tif 000021
化合物8と同様の手順により化合物7’ (0.06 mmol, 19 mg)から合成した。PLC (hexane/Et2O = 5/1)により精製し目的化合物が収率31% (10 mg)で得られた。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.61 (1H, s), 8.40 (1H, d, J = 9.2 Hz), 6.93 (1H, s), 6.84 (1H, dd, J = 9.2 Hz, 2.8 Hz), 6.78 (1H, d, J = 2.8 Hz), 4.79 (2H, s), 3.10 (6H, s), 1.03 (9H, s), 0.98 (9H, s), 0.44 (6H, s), 0.28 (6H, s), 0.14 (6H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ185.8, 155.5, 151.9, 140.8, 139.0, 135.3, 134.5, 132.3, 130.1, 129.7, 121.7, 114.5, 113.6, 60.9, 40.4, 26.4, 26.1, 18.9, 18.7, -0.9, -3.7, -4.9; HRMS (ESI) exact mass calcd. for C30H49NO3Si3: m/z 556.30930 ([M + H]+), found: m/z 556.30896 (-0.3 mmu).
【００６８】
［化合物９’の合成］
2018000074.tif 000022
化合物9と同様の手順により化合物8’ (0.12 mmol, 67 mg)から合成した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(hexane/CH2Cl2 = 1/2, 2% AcOEt)により精製し収率52% (34 mg)で得られた。
1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ8.17 (1H, s), 7.96 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.61 (1H, t, J = 7.6 Hz), 7.52 (1H, t, J = 7.6 Hz), 7.23 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.16 (1H, s), 6.94 (1H, d, J = 2.8 Hz), 6.84 (1H, d, J = 9.2 Hz), 6.56-6.59 (2H, m), 4.75 (1H, d, J = 13 Hz), 4.69 (1H, d, J = 13 Hz), 2.96 (6H, s), 0.88 (9H, s), 0.63 (3H, s), 0.58 (3H, s), 0.07 (6H, s); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ170.8, 155.7, 154.9, 149.2, 136.5, 135.9, 135.6, 133.9, 131.3, 128.6, 127.9, 125.9, 125.7, 125.2, 125.1, 124.0, 121.4, 116.4, 113.5, 90.8, 65.8, 40.1, 25.6, 17.9, 0.0, -1.2, -5.7; HRMS (ESI) exact mass calcd. for C31H39NO4Si2: m/z 546.24904 ([M + H]+), found: m/z 546.25041 (+1.4 mmu).
【００６９】
［化合物１０’の合成］
2018000074.tif 000023
化合物10と同様の手順により化合物9’ (0.7 mmol, 382 mg)から合成した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(hexane/AcOEt = 1/1)により精製し1:1のジアステレオ混合物が収率14% (76 mg)で得られた。
1H NMR (400 MHz, CDCl3, dr = 1:1)δ 7.99 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.66-7.72 (2H, m), 7.60 (2H, app. t, J = 7.2 Hz), 7.31-7.37 (4H, m), 6.94-6.99 (4H, m), 6.84 (1H, d, J = 9.2 Hz), 6.81 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.54-6.58 (2H, m), 4.96-5.56 (12H, m), 4.11-4.26 (6H, m), 2.97 (12H, s), 2.20 (3H, s), 2.19 (3H, s), 2.11 (3H, s), 2.10 (3H, s), 2.04 (3H, s), 2.03 (3H, s), 2.01 (6H, s), 0.67 (3H, s), 0.66 (3H, s), 0.65 (3H, s), 0.64 (3H, s); HRMS (ESI) exact mass calcd. for C39H42FNO12Si: m/z 764.25331 ([M + H]+), found: m/z 764.25049 (-2.8 mmu).
【００７０】
［2-CH2F-SPiDER-RED-βGalの合成］
2018000074.tif 000024
4-CH2F-SPiDER-RED-βGalと同様の手順により化合物10’ (0.1 mmol, 76 mg)から合成した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2/MeOH = 6/1)により精製し1:1のジアステレオ混合物が収率73% (43 mg)で得られた。
1H NMR (400 MHz, CDCl3, dr = 1:1)δ 7.92 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.83 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.57 (2H, app. t, J = 7.6 Hz), 7.44-7.50 (2H, m), 7.37 (1H, s), 7.36 (1H, s), 7.24 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.21 (1H, d, J = 7.6 Hz), 6.92 (2H, app. s), 6.88 (1H, s), 6.84 (1H, s), 6.81 (1H, d, J = 9.2 Hz), 6.75 (1H, d, J = 9.2 Hz), 6.50-6.57 (2H, m), 5.04-5.30 (4H, m), 4.85 (1H, d, J = 7.6 Hz), 4.78 (1H, d, J = 7.6 Hz), 4.28 (4H, br), 3.89-3.96 (6H, m), 3.48-3.78 (10H, m), 2.95 (6H, s), 2.94 (6H, s), 0.54 (6H, s), 0.53 (3H, s), 0.48 (3H, s); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) 
δ170.8, 170.6, 154.7, 154.1, 153.3, 149.6, 149.5, 140.4, 139.9, 139.4, 136.5, 135.9, 134.4, 134.2, 131.1, 131.0, 129.3, 129.2, 128.3, 126.9, 126.8 (d, JC-F = 16 Hz), 126.6 (d, JC-F = 16 Hz), 126.5, 126.2, 126.1, 124.8, 124.4, 120.7, 120.4, 116.8, 116.7, 113.7, 113.4, 101.9, 101.7, 91.2, 90.9, 80.7 (d, JC-F = 163 Hz), 77.4, 74.9, 74.6, 73.5, 71.1, 69.1, 61.8, 40.3, 0.4, 0.0, -1.2, -1.9; HRMS (ESI) exact mass calcd. for C31H34FNO8Si: m/z 596.21105 ([M + H]+), found: m/z 596.21002 (-1.0 mmu).
【００７１】
（３）4-CH2OH-SPiDER-REDの合成
酵素によって切断される一価の基を有しない酵素反応生成物（または酵素による加水分解生成物）である4-CH2OH-SPiDER-REDを以下の反応により合成した。
【００７２】
2018000074.tif 000025
【００７３】
化合物9 (0.015 mmol, 8 mg)、AcOH (0.015 mmol, 0.9 μL)のTHF (0.5 mL)溶液にTBAF (1.0 M in THF, 0.045 mmol, 45 μL)を室温で加えた。一時間撹拌したあとエバポレーターで溶媒を除き、PLC (hexane/AcOEt = 5/6)で精製したところ、目的物が67%収率で得られた(6.5 mg)。 
1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 7.94 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.60 (1H, t, J = 7.6 Hz), 7.50 (1H, t, J = 7.6 Hz), 7.21 (1H, d, J = 7.6 Hz), 6.92-6.94 (2H, m), 6.83 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.78 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.60 (1H, dd, J = 8.8 Hz, 2.8 Hz), 5.11 (2H, s), 2.96 (6H, s), 0.73 (3H, s), 0.67 (3H, s); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ171.2, 156.6, 155.6, 149.8, 137.2, 135.8, 135.1, 134.4, 130.4, 129.2, 129.1, 128.2, 126.2, 126.1, 124.3, 118.8, 116.5, 114.3, 91.9, 64.4, 40.6, 1.7, 1.6; HRMS (ESI) exact mass calcd. for C25H25NO4Si: m/z 432.16256 ([M + H]+), found: m/z 432.16280 (+0.2 mmu).
【００７４】
（４）2-CH2OH-SPiDER-REDの合成
以下の反応により、酵素によって切断される一価の基を有しない比較例化合物である2-CH2OH-SPiDER-REDを合成した。
【００７５】
2018000074.tif 000026
【００７６】
4-CH2OH-SPiDER-REDと同様の手順により化合物9’ (0.02 mmol, 10 mg)から合成した。PLC (hexane/AcOEt = 5/6))により精製し目的物が収率95% (8.4 mg)で得られた。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.96 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.61 (1H, t, J = 7.6 Hz), 7.53 (1H, t, J = 7.6 Hz), 7.23 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.19 (1H, s), 6.94 (1H, d, J = 2.8 Hz), 6.83 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.62 (1H, s), 6.57 (1H, dd, J = 8.8 Hz, 2.8 Hz), 4.71 (1H, d, J = 13 Hz), 4.66 (1H, d, J = 13 Hz), 2.96 (6H, s), 0.63 (3H, s), 0.58 (3H, s); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ170.8, 155.6, 154.8, 149.3, 137.6, 136.1, 135.8, 134.0, 131.2, 128.8, 128.0, 126.3, 126.0, 125.8, 125.5, 124.1, 121.4, 116.4, 113.5, 90.9, 64.8, 40.2, 0.0, -0.1; HRMS (ESI) exact mass calcd. for C25H25NO4Si: m/z 432.16256 ([M + H]+), found: m/z 432.16085 (-0.2 mmu).
【実施例２】
【００７７】
酵素反応による吸収・蛍光スペクトル変化
実施例１で得られた本発明のプローブ化合物である4-CH2F-SPiDER-RED-βGal及び2-CH2F-SPiDER-RED-βGalについて、β−ガラクトシダーゼ添加に伴う吸収スペクトル変化及び蛍光スペクトル変化を測定した。4-CH2F-SPiDER-RED-βGalの測定結果を図１に、2-CH2F-SPiDER-RED-βGalの測定結果を図２にそれぞれ示す。
【００７８】
図１（ａ）は、4-CH2F-SPiDER-RED-βGalについて、酵素反応による蛍光強度の時間変化を示したものである。PBS緩衝液中1 μM に調製した4-CH2F-SPiDER-RED-βGal に 5 U のβ−ガラクトシダーゼを添加して測定を行った。測定条件は、励起波長 610 nm、蛍光波長 638 nm、計測時間 3600 秒、スリット(励起/蛍光) 2.5 nm/2.5 nm、ホトマル電圧: 700 Vである。図１（ｂ）は、5 U のβ−ガラクトシダーゼを添加する前と添加後1時間における1 μM 4-CH2F-SPiDER-RED-βGal PBS緩衝液の吸収スペクトルである。図１（ｃ）は、5 U のβ−ガラクトシダーゼを添加する前と添加後1時間における1 μM 4-CH2F-SPiDER-RED-βGal PBS緩衝液の蛍光スペクトルである。測定条件は、励起波長 610 nm、スリット(励起/蛍光) 2.5 nm/2.5 nm、ホトマル電圧: 700 Vである。
【００７９】
図２（ａ）は、2-CH2F-SPiDER-RED-βGalについて、酵素反応による蛍光強度の時間変化を示したものである。PBS緩衝液中1 μM に調製した2-CH2F-SPiDER-RED-βGal に 5 U のβ−ガラクトシダーゼを添加して測定を行った。測定条件は、励起波長 610 nm、蛍光波長 638 nm、計測時間 3600 秒、スリット(励起/蛍光) 2.5 nm/2.5 nm、ホトマル電圧: 700 Vである。図２（ｂ）は、5 U のβ−ガラクトシダーゼを添加する前と添加後1時間における1 μM 2-CH2F-SPiDER-RED-βGal PBS緩衝液の吸収スペクトルである。図２（ｃ）は、5 U のβ−ガラクトシダーゼを添加する前と添加後1時間における1 μM 2-CH2F-SPiDER-RED-βGal PBS緩衝液の蛍光スペクトルである。測定条件は、励起波長 610 nm、スリット(励起/蛍光) 2.5 nm/2.5 nm、ホトマル電圧: 700である。
【００８０】
これらの結果より、2-CHF2-SPiDER-RED-βGal及び4-CHF2-SPiDER-RED-βGalが、β−ガラクトシダーゼの酵素活性特異的に、蛍光を発生することが示された。なお、2-CHF2-SPiDER-RED-βGalに比べ4-CHF2-SPiDER-RED-βGalがβ−ガラクトシダーゼと高い反応性を示し、高い蛍光増大率を示すことが分かった。
【実施例３】
【００８１】
BSAタンパク質存在下でのβ−ガラクトシダーゼ酵素反応による、BSAタンパク質への蛍光色素のラベル化
実施例１で得られた本発明のプローブ化合物である4-CH2F-SPiDER-RED-βGal及び2-CH2F-SPiDER-RED-βGalについて、β−ガラクトシダーゼによって切断されたこれらの化合物が、溶液中に共存するウシ血清アルブミンタンパク質（ＢＳＡ）を蛍光ラベル化することを確認した。4-CH2F-SPiDER-RED-βGalの測定結果を図３に、2-CH2F-SPiDER-RED-βGalの測定結果を図４にそれぞれ示す。
【００８２】
１）10 μM 4-CH2F-SPiDER-RED-βGal、1 mg/mL ＢＳＡ、5 U β−ガラクトシダーゼを含むPBS緩衝液10 μL、２）10 μM  4-CH2F-SPiDER-RED-βGal、1 mg/mL ＢＳＡを含むPBS緩衝液10 μL、３）１０μＭ  4-CH2F-SPiDER-RED-βGalと5 U β−ガラクトシダーゼを含むPBS緩衝液10 μL、４）10 μM 4-CH2F-SPiDER-RED-βGalのみを含むPBS緩衝液10 μL、５) 10 μM 4-CH2OH-SPiDER-REDを含むPBS緩衝液10 μLを用い、それぞれ反応産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ランニングゲル１０％、スタッキングゲル４％、泳動電圧２００Ｖ）に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたゲルに対して、４８８ｎｍの励起光を照射し、５４０−６００ｎｍの蛍光をＰＭＴ電圧  １０００Ｖにて観察した（図３（ａ））。観察後、当該ゲルをクマシー染色し、ゲル上におけるＢＳＡの位置を確認した（図３（ｂ））。
【００８３】
10 μM 4-CH2F-SPiDER-RED-βGalに替えて、10 μM 2-CH2F-SPiDER-RED-βGalを用いて同様の測定を行った結果を図４（ａ）及び（ｂ）に示す。
【００８４】
本発明のプローブ化合物と、β−ガラクトシダーゼを、ＢＳＡ存在下で反応させることにより、ＳＤＳ泳動後のＢＳＡの位置に蛍光が確認された。一方、β−ガラクトシダーゼを含まない試料及び比較例である4-CH2OH-SPiDER-REDを用いた試料では、蛍光が確認されなかった。
【００８５】
以上の結果は、本発明のプローブ化合物が、βガラクトシダーゼ活性特異的に変化することで、ＢＳＡに共有結合したことを示唆するものであり、本発明の酵素特異的滞留性蛍光化合物を用いることで、酵素活性特異的に、溶液中に共存するタンパク質を蛍光ラベル化し得ることを実証するものである。なお、2-CHF2-SPiDER-RED-βGalを用いた場合も、ＢＳＡが蛍光ラベル化されたが、酵素との反応性の低いため、4-CHF2-SPiDER-RED-βGalよりも蛍光強度は低かった。
【実施例４】
【００８６】
β−ガラクトシダーゼを発現している生細胞の蛍光イメージング
本発明のプローブ化合物が、生細胞の蛍光イメージングに利用可能であることを確認した。
【００８７】
β−ガラクトシダーゼを発現している細胞（HEK-lacZ）と発現していない細胞（HEK）を共培養したディシュに、4-CHF2-SPiDER-RED-βGalを添加し37℃で30分間インキュベーションした。HEK細胞は予めCellTracker（商標） Greenで染色した。蛍光像と透過光像を共焦点顕微鏡(TCS SP5X; Leica社製)で取得した。レーザーは、ホワイトライトレーザー（ＷＬＬ）、対物レンズは40倍(HCX PL APO CS 40x/1.25; Leica社製)を使用した。励起波長：594 nm、蛍光波長： 610-700 nm. スケール：25 μm。得られたライブセル蛍光イメージングを図５に示す。
【００８８】
試験化合物4-CHF2-SPiDER-RED-βGalとインキュベートした後、細胞を培地で洗浄することなく観察した結果、HEK-lacZ細胞においてのみ試験化合物由来の赤色蛍光が観察された。一方、β−ガラクトシダーゼを発現していないHEK細胞では、赤色蛍光シグナルは得られなかった（図５左側）。
【００８９】
この結果は、本発明の蛍光プローブが、生細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性を単一細胞レベルで蛍光検出するのに有効であることを実証するものである。
【実施例５】
【００９０】
β−ガラクトシダーゼ活性をもつ生体組織の非固定蛍光イメージング
次いで、本発明のプローブ化合物である4-CHF2-SPiDER-RED-βGalが生体組織の蛍光イメージングに適用し得ることを、ショウジョウバエ組織を用いて確認した。
【００９１】
（材料と方法）
一部の組織にβ−ガラクトシダーゼとGFPが発現するショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、ｅｎ−ｌａｃＺ/ｄｐｐ−GFP）の羽原基（ｗｉｎｇ  ｄｉｓｃｓ）を、4-CHF2-SPiDER-RED-βGalとHoechst33342で２時間室温にてインキュベーションした後、共焦点顕微鏡(TCS SP8; Leica社製)にて観察した。レーザーは、ホワイトライトレーザー（ＷＬＬ）、対物レンズは40倍(HCX PL APO CS 40x/1.25; Leica社製)を使用した。励起波長：405 nm (Hoechst33342), 488 nm (GFP), 594 nm（4-CHF2-SPiDER-RED-βGal）、蛍光波長： 420-490 nm (Hoechst33342), 490-570 nm (GFP), 601-681 nm (4-CHF2-SPiDER-RED-βGal). スケール：75 μm。得られたライブ組織蛍光イメージングを図６に示す。
【００９２】
（結果）
4-CHF2-SPiDER-RED-βGalを用いて蛍光イメージングを行った場合、酵素反応生成物である蛍光色素は拡散しないため、β−ガラクトシダーゼ活性をもつ部位を選択的に蛍光イメージング可能であった。
【００９３】
以上の結果は、本発明の4-CHF2-SPiDER-RED-βGal等の細胞内滞留性赤色蛍光プローブを用いることで、生体組織におけるβ−ガラクトシダーゼ発現細胞を一細胞レベルで検出可能であること、またGFPやHoechstとの同時観察が可能となることを実証するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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