(57)【要約】【課題】アグリコン型イソフラボンを利用した素材であって子宮内膜症を改善することのできる子宮内膜症改善用素材およびその製造方法を提供すること。【解決手段】子宮内膜症を改善する作用を備えたアグリコン型イソフラボンを有すること。【選択図】      図１
2018140964.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮内膜症を改善する作用を備えたアグリコン型イソフラボンを有することを特徴とする子宮内膜症改善用素材。
【請求項２】
前記子宮内膜症を改善する作用は、
・子宮内膜症間質細胞の増殖を抑制すること
・子宮内膜症細胞のIL-6、IL-8、アロマターゼおよびCOX-2の遺伝子発現を減少させること
・子宮内膜症細胞のPGE2のタンパクレベルを減少させること
・子宮内膜症細胞のアロマターゼ酵素活性を減少させること
・子宮内膜症細胞において、TNF-αによって促進されるIκBのリン酸化を抑制すること
・子宮内膜症細胞の蛍光免疫染色でp65の核内取り込みを阻害すること
・ERβアンタゴニストであるPHTPPが子宮内膜症細胞に対するアグリコン型イソフラボンによる増殖抑制効果を抑制すること
・ERβノックダウン細胞が子宮内膜症細胞に対するアグリコン型イソフラボンの効果を打ち消すこと
・ERαアンタゴニストのMPPが子宮内膜症細胞に対するアグリマックスの子宮内膜症を改善する作用を打ち消さないこと
・子宮内膜症細胞におけるSGK1の遺伝子発現を減少させること
・子宮内膜症モデルマウスの嚢胞形成を阻害すること
・子宮内膜症細胞におけるKi67染色割合を減少させること
の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１に記載の子宮内膜症改善用素材。
【請求項３】
豆類に麹菌を接種して製麹し、この製麹処理による生成物に加水することにより当該生成物中の蛋白質を加水分解するとともに前記豆類中のイソフラボン化合物の配糖体を分解して、アグリコンを多量に含むイソフラボン化合物を生成して、前記豆類を原料としたアグリコン型イソフラボンを含有する子宮内膜症改善用素材を製造することを特徴とする子宮内膜症改善用素材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮内膜症改善用素材に係り、特に、アグリコン型イソフラボン（「イソフラボンアグリコン」とも称する）を利用した子宮内膜症改善用素材およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、子宮内膜症を改善することは望まれており、例えば、子宮内膜症関連疾患の治療薬（特許文献１参照）等も提案されている。しかしながら、特許文献１に記載の治療薬は女性が多く体内に保有するエストロゲンに対応して治療するものではない。
【０００３】
一方、子宮内膜症は、子宮内膜類似組織が子宮腔外に生着し進展する疾患で、生殖可能年齢の5％から10％の女性が罹患する（非特許文献１）。子宮内膜症の主な症状は骨盤痛および不妊である（非特許文献２）。閉経すると症状が改善することから、エストロゲンが病巣の進展および維持に関わっていることはよく知られている（非特許文献３）。子宮内膜症病巣局所ではエストロゲンは直接サイトカインを誘発することで炎症に関わっている（非特許文献４）。炎症性サイトカインは子宮内膜症病巣局所でエストロゲン合成を促進し結果として正のフィードバックが病巣の進展・維持を助長している（非特許文献５）。このように子宮内膜症はエストロゲン依存性炎症疾患として考えられており、ホルモンと炎症性サイトカイン双方が病巣の進展、維持および臨床症状に関与している（非特許文献６）。
【０００４】
低用量エストロゲン・プロゲスチンやGnRHアゴニスト、プロゲスチンなどの子宮内膜症に対する内分泌治療は病巣進展や骨盤痛に効果がある。しかし、これらは排卵を抑制することから直ちに妊娠を希望する女性には使用できない。副作用が少なく、すべての子宮内膜症患者に使用できる新しい子宮内膜症治療薬が望まれる。
【０００５】
イソフラボンは弱いエストロゲン作用を持つ植物由来の非ステロイド天然物である。イソフラボンはエストロゲンと構造が類似しているのでエストロゲンレセプター(ER)と結合しエストロゲン様作用が発揮可能である。イソフラボンの活性はエストロゲンの1000分の1から10000分の1と非常に弱いので、エストロゲン血中濃度の高い生殖可能年齢の女性に対してイソフラボンは抗エストロゲン作用を持つこともある。大豆にはグリコシド型イソフラボンとして主にゲニスチンおよびダイジンが含まれ、大豆の重量にわずか0.2〜0.3％ほどしかない貴重な機能性成分であり、大豆胚芽のイソフラボン含有量は、大豆全体に比べて約10倍も高い。しかも、胚芽に含まれているイソフラボンの組成は、丸大豆に含まれるイソフラボンの組成と異なり、ダイジンイソフラボンが多く含まれている。しかし、グリコシド型イソフラボンはそのまま体内に吸収されず、腸内細菌の酵素でグリコシド型イソフラボンの糖鎖を分解しアグリコン型イソフラボンになってから吸収される。アグリコン型イソフラボンは、すでに糖鎖が分解されているので、腸内細菌の働きに関係なく、胃や腸ですみやかに吸収される（非特許文献７〜９）。
【０００６】
過去の研究によると、体外受精経験患者のイソフラボンの経口摂取は黄体期のプロゲステロンの効果を改善させ、胚移植成功率や臨床妊娠率の上昇の可能性が示唆された（非特許文献１０）。妊娠初期において植物由来イソフラボンは子宮内膜からのプロスタグランジン分泌を制御するとの報告もある（非特許文献１１）。また、190人の閉経後女性のランダム化試験で12週間のアグリマックス経口摂取はホットフラッシュ症状を軽減させた（非特許文献１２）。アグリコン型イソフラボンはグリコシド型より体内吸収が速く、吸収率も高い（非特許文献１３）。ゲニステインはエストロゲン依存性乳癌細胞（MCF-7）の細胞増殖を促進させ（非特許文献１４）、タモキシフェンの抑制効果を減弱させる（非特許文献１５）。一方で、ダイゼインはMCF-7の増殖を抑制し（非特許文献１６）、タモキシフェンの治療効果を改善させた（非特許文献１７）。これらの報告は、イソフラボンの種類により標的細胞への効果が異なることを示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−２０９１５８号公報
【特許文献２】特許第３０１４１４５号掲載公報
【特許文献３】特許第４３９７５２５号掲載公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Giudice LC. Clinical practice. Endometriosis. N Engl J Med 2010; 362:2389-98.
【非特許文献２】Han SJ, Jung SY, Wu SP, Hawkins SM, Park MJ, Kyo S, Qin J, Lydon JP, Tsai SY, Tsai MJ, DeMayo FJ, O'Malley BW. Estrogen receptor β modulates apoptosis complexes and the inflammasome to drive the pathogenesis of endometriosis. Cell 2015; 163:960-974.
【非特許文献３】Mori T, Ito F, Matsushima H, Takaoka O, Tanaka Y, Koshiba A, Kusuki I, Kitawaki J. G protein-coupled estrogen receptor 1 agonist G-1 induces cell cycle arrest in the mitotic phase, leading to apoptosis in endometriosis. Fertil Steril 2015; 103:1228-36.
【非特許文献４】Reis FM, Petraglia F, Taylor RN. Endometriosis: hormone regulation and clinical consequences of chemotaxis and apoptosis. Hum Reprod Update 2013; 19:406-18.
【非特許文献５】Monsivais D, Dyson MT, Yin P, Coon JS, Navarro A, Feng G, Malpani SS, Ono M, Ercan CM, Wei JJ, Pavone ME, Su E, Bulun SE. ERβ- and prostaglandin E2-regulated pathways integrate cell proliferation via Ras-like and estrogen-regulated growth inhibitor in endometriosis. Mol Endocrinol 2014; 28:1304-15.
【非特許文献６】Yamanaka K, Xu B, Suganuma I, Kusuki I, Mita S, Shimizu Y, Mizuguchi K, Kitawaki J. Dienogest inhibits aromatase and cyclooxygenase-2 expression and prostaglandin E2 production in human endometriotic stromal cells in spheroid culture. Fertil Steril 2012; 97:477-82.
【非特許文献７】Chen Y, Chen C, Shi S, Han J, Wang J, Hu J, Liu Y, Cai Z, Yu C. Endometriotic implants regress in rat models treated with puerarin by decreasing estradiol level. Reprod Sci 2011; 18:886-91.
【非特許文献８】Wagner JD, Anthony MS, Cline JM. Soy phytoestrogens: research on benefits and risks. Clin Obstet Gynecol 2001; 44:843-52.
【非特許文献９】Tsuchiya M, Miura T, Hanaoka T, Iwasaki M, Sasaki H, Tanaka T, Nakao H, Katoh T, Ikenoue T, Kabuto M, Tsugane S. Effect of soy isoflavones on endometriosis: interaction with estrogen receptor 2 gene polymorphism. Epidemiology 2007; 18:402-8.
【非特許文献１０】Unfer V, Casini ML, Gerli S, Costabile L, Mignosa M & Di Renzo GC Phytoestrogens may improve the pregnancy rate in in vitro fertilization- embryo transfer cycles: a prospective, controlled, randomized trial. Fertility and Sterility 2004; 82:1509-13.
【非特許文献１１】Woclawek-Potocka I, Bah MM, Korzekwa A, Piskula MK, Wiczkowski W, Depta A, Skarzynski DJ. Soybean-derived phytoestrogens regulate prostaglandin secretion in endometrium during cattle estrous cycle and early pregnancy. Exp Biol Med 2005; 230:189-99.
【非特許文献１２】Khaodhiar L, Ricciotti HA, Li L, Pan W, Schickel M, Zhou J, Blackburn GL. Daidzein-rich isoflavone aglycones are potentially effective in reducing hot flashes in menopausal women. Menopause 2008; 15:125-32.
【非特許文献１３】Izumi T, Piskula MK, Osawa S, Obata A, Tobe K, Saito M, Kataoka S, Kubota Y, Kikuchi M. Soy isoflavone aglycones are absorbed faster and in higher amounts than their glucosides in humans. J Nutr 2000; 130:1695-9.
【非特許文献１４】Ju YH, Allred CD, Allred KF, Karko KL, Doerge DR, Helferich WG. Physiological concentrations of dietary genistein dose-dependently stimulate growth of estrogen-dependent human breast cancer (MCF-7) tumors implanted in athymic nude mice. J Nutr 2001; 131:2957-62.
【非特許文献１５】Ju YH, Doerge DR, Allred KF, Allred CD, Helferich WG. Dietary genistein negates the inhibitory effect of tamoxifen on growth of estrogen-dependent human breast cancer (MCF-7) cells implanted in athymic mice. Cancer Res 2002; 62:2474-7.
【非特許文献１６】Ju YH, Fultz J, Allred KF, Doerge DR, Helferich WG. Effects of dietary daidzein and its metabolite, equol, at physiological concentrations on the growth of estrogen-dependent human breast cancer (MCF-7) tumors implanted in ovariectomized athymic mice. Carcinogenesis 2006; 27:856-63.
【非特許文献１７】Constantinou AI, White BE, Tonetti D, Yang Y, Liang W, Li W, van Breemen RB. The soy isoflavone daidzein improves the capacity of tamoxifen to prevent mammary tumors. Eur J Cancer 2005; 41:647-54.
【非特許文献１８】Saito A, Osuga Y, Yoshino O, Takamura M, Hirata T, Hirota Y, Koga K, Harada M, Takemura Y, Yano T, Taketani Y. TGF-β1 induces proteinase-activated receptor 2 (PAR2) expression in endometriotic stromal cells and stimulates PAR2 activation-induced secretion of IL-6. Hum Reprod 2011; 26:1892-8.
【非特許文献１９】Okubo T, Mok SC, Chen S. Regulation of aromatase expression in human ovarian surface epithelial cells. J Clin Endocrinol Metab 2000; 85:4889-99.
【非特許文献２０】Takai E, Taniguchi F, Nakamura K, Uegaki T, Iwabe T, Harada T. Parthenolide reduces cell proliferation and prostaglandin estradiol synthesis in human endometriotic stromal cells and inhibits development of endometriosis in the murine model. Fertil Steril 2013; 100:1170-8.
【非特許文献２１】Vercellini P, Cortesi I, Crosignani PG. Progestins for symptomatic endometriosis: a critical analysis of the evidence. Fertil Steril 1997; 68:393-401.
【非特許文献２２】Bulun SE. Endometriosis. N Engl J Med 2009; 360:268-79.
【非特許文献２３】Kuiper GG, Lemmen JG, Carlsson B, Corton JC, Safe SH, van der Saag PT, van der Burg B, Gustafsson JA. Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor beta. Endocrinology 1998; 139:4252-63.
【非特許文献２４】Monsivais D, Dyson MT, Yin P, Navarro A, Coon JS 5th, Pavone ME, Bulun SE. Estrogen receptor β regulates endometriotic cell survival through serum and glucocorticoid-regulated kinase activation. Fertil Steril 2016; 105:1266-73.
【非特許文献２５】Zhang L, Cui R, Cheng X, Du J. Antiapoptotic effect of serum and glucocorticoid-inducible protein kinase is mediated by novel mechanism activating I・B kinase. Cancer Res 2005; 65:457-64.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
女性のヘルスケアに対してイソフラボンは注目を集めているが、子宮内膜症に対しての効果はわかっておらず、臨床効果や薬理作用を理解するために詳細な分析が必要である。
【００１０】
そこで、本発明は、このような点に鑑みなされたものであり、アグリコン型イソフラボンを利用した素材であって子宮内膜症を改善することのできる子宮内膜症改善用素材およびその製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前述した目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究し、子宮内膜症性嚢胞から分離した子宮内膜症間質細胞および子宮内膜症マウスモデルを使用し、子宮内膜症に対するアグリコン型イソフラボン効果をグリコシド型イソフラボンの効果と比較して以下の本発明である子宮内膜症改善用素材を完成させた。アグリコン型イソフラボンとしては特許文献２並びに特許文献３に基づく製造方法によって製造された素材であるアグリマックス（登録商標）を用いた。
【００１２】
本発明に係る第１の形態の子宮内膜症改善用素材は、子宮内膜症を改善する作用を備えたアグリコン型イソフラボンを有することを特徴とする。
【００１３】
そして、このような構成によれば、アグリコン型イソフラボンを何らかの方法によって投与・適用することによって子宮内膜症が改善される。
【００１４】
また、本発明に係る第２の形態の子宮内膜症改善用素材は、第１の形態において、
前記子宮内膜症を改善する作用が、
・子宮内膜症間質細胞の増殖を抑制すること
・子宮内膜症細胞のIL-6、IL-8、アロマターゼおよびCOX-2の遺伝子発現を減少させること
・子宮内膜症細胞のPGE2のタンパクレベルを減少させること
・子宮内膜症細胞のアロマターゼ酵素活性を減少させること
・子宮内膜症細胞において、TNF-αによって促進されるIκBのリン酸化を抑制すること
・子宮内膜症細胞の蛍光免疫染色でp65の核内取り込みを阻害すること
・ERβアンタゴニストであるPHTPPが子宮内膜症細胞に対するアグリコン型イソフラボンによる増殖抑制効果を抑制すること
・ERβノックダウン細胞が子宮内膜症細胞に対するアグリコン型イソフラボンの効果を打ち消すこと
・ERαアンタゴニストのMPPが子宮内膜症細胞に対するアグリマックスの子宮内膜症を改善する作用を打ち消さないこと
・子宮内膜症細胞におけるSGK1の遺伝子発現を減少させること
・子宮内膜症モデルマウスの嚢胞形成を阻害すること
・子宮内膜症細胞におけるKi67染色割合を減少させること
の少なくとも１つを含むことを特徴とする。
【００１５】
そして、このような構成によれば、アグリコン型イソフラボンを例えば経口投与することによって子宮内膜症に関連する多くの項目が改善される。
【００１６】
また、本発明に係る子宮内膜症改善用素材の製造方法は、豆類に麹菌を接種して製麹し、この製麹処理による生成物に加水することにより当該生成物中の蛋白質を加水分解するとともに前記豆類中のイソフラボン化合物の配糖体を分解して、アグリコンを多量に含むイソフラボン化合物を生成して、前記豆類を原料としたアグリコン型イソフラボンを含有する子宮内膜症改善用素材を製造することを特徴とする。
【００１７】
そして、このような構成によれば、子宮内膜症改善用素材を確実に製造することができ、子宮内膜症を改善することのできる子宮内膜症改善用素材を確実に提供することができるという優れた作用効果を発揮することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る子宮内膜症改善用素材によれば、アグリコン型イソフラボンを利用した素材によって子宮内膜症を改善することができる。
【００１９】
本発明に係る子宮内膜症改善用素材の製造方法によれば、子宮内膜症を改善することができるアグリコン型イソフラボンを利用した子宮内膜症改善用素材を確実に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ａはアグリマックスによる子宮内膜症間質細胞と正常子宮内膜の増殖についての特性図、Ｂはイソフラボン40（後述）による子宮内膜症間質細胞と正常子宮内膜の増殖についての特性図
【図２】ＡはリアルタイムＰＣＲに基づくＩＬ−６、ＩＬ−８、アロマターゼおよびＣＯＸ―２に関するコントロール、アグリマックス、イソフラボン40についての遺伝子発現の状態を示す特性図、ＢはＰＧＥ２タンパク質レベルに関するコントロール、アグリマックスについての特性図、Ｃはアロマターゼ酵素活性に関するコントロール、アグリマックスについての特性図
【図３】ＡはＴＮＦ−αにより促進されるＩκＢのリン酸化抑制に関するアグリマックスについての特性図、Ｂはｐ６５の取り込み阻害に関するアグリマックスについての特性図
【図４】ＡはアグリマックスとＰＨＴＰＰとの細胞増殖抑制に関する特性図、ＢはアグリマックスとＭＰＰとの細胞増殖抑制に関する特性図、ＣはＳｉＥＲβおよびコントロールに対してのアグリマックスの細胞増殖抑制に関する特性図、ＤはアグリマックスとコントロールとのＳＧＫ１遺伝子発現に関する特性図、Ｅはアグリマックスの薬理機序を示す説明図
【図５】Ａは子宮内膜症様病変を示す写真、ＢはＡの病変の大きさを示す写真、Ｃはコントロール、アグリマックスとイソフラボン40とを投与したマウスにおける嚢胞個数を示す特性図、ＤはＣの場合の嚢胞重量を示す特性図、Ｅはコントロール、アグリマックスとを投与したマウスにおける嚢胞部分のＫｉ６７の染色割合を示す特性図
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明に係る子宮内膜症改善用素材の実施形態について、図１から図５を参照して説明する。
【００２２】
本発明に基づいて、以下の実験等によって子宮内膜症改善用素材であるアグリコン型イソフラボンを検体に投与・適用することによって子宮内膜症が改善されることを確認した。
【００２３】
１  イソフラボンについて
本発明の子宮内膜症改善用素材であるアグリコン型イソフラボンとして前記アグリマックス（ニチモウバイオティックス株式会社製）を用いた。子宮内膜症改善用素材の製造方法を後述する。当該アグリマックスは、特許文献２並びに特許文献３に基づく製造方法によって大豆胚芽を麹菌で発酵させ、抽出・濃縮の過程を経て製造されたアグリコン型イソフラボンであり、ダイゼイン、ゲニステインおよびグリシテインが7:1:2の成分構成となっている。
比較素材としてアグリマックスの前駆物質でグリコシド型イソフラボンであるイソフラボン40（タマ生化学株式会社製）を用いた。
【００２４】
２  検体について
患者については、24人の卵巣子宮内膜症性嚢胞摘出術を受けた患者（平均年齢36.8歳；24-44歳）から子宮内膜症間質細胞を得た。12人の卵巣良性腫瘍摘出術を受けた患者（平均年齢34.9歳；22-41歳）から正常子宮内膜細胞を得た。少なくとも手術6ヶ月前以降はホルモン治療を受けていない患者の検体を使用した。ヘルシンキ宣言を遵守し、京都府立医科大学倫理審査委員会の承認を得たのちに研究を開始した（ERE-E-306）。全ての患者からインフォームドコンセントによる承諾を得た。
【００２５】
３  実験項目
３−１  子宮内膜症間質細胞の増殖について
（実験方法）
細胞処理および細胞増殖アッセイを次のようにして実行した。
子宮内膜症間質細胞は既報どおりに処置し単離した（非特許文献１８）。96ウェルプレートに１ウェルあたり5000細胞となるように播種した。24時間アグリマックスとDMSOで処理し72時間後にWST-8アッセイで細胞増殖を測定した。マルチウェルmultiplex 9120 (Bio-Rad)により450 nmの波長で測定した。
（実験結果）
アグリマックスは子宮内膜症間質細胞に対して増殖抑制効果を示したが、イソフラボン40ではその効果は認めなかった。
更に説明すると、子宮内膜症間質細胞および正常子宮内膜に対するアグリマックスおよびイソフラボン40の効果をWST-8アッセイで測定した。アグリマックスは濃度依存性に子宮内膜症間質細胞の増殖を抑制した（P<0.01）が、正常子宮内膜では増殖抑制効果は示さなかった（図1A参照）。一方でイソフラボン40は子宮内膜症細胞および正常子宮内膜ともに増殖抑制効果は示さなかった（図1B参照）。これらの結果により以降の研究はアグリマックス濃度を20μMで施行した。
【００２６】
３−２  mRNAおよびcDNA合成、リアルタイムPCRについて
（実験方法）
子宮内膜症間質細胞からのRNA抽出はRNeasy Mini kit (QIAGEN)を使用し、プロトコールに従った。RNA濃度はNanoDrop (Thermo Scientific)で測定した。cDNA合成はReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo) および GeneAmp PCR 9700 (Applied Biosystems)を使用した。リアルタイムPCRはPower SYBR Green and Step One Real-Time PCR System (Applied Biosystems).を使用した。プライマーのターゲット遺伝子はIL-6、IL-8、アロマターゼ、COX-2、SGK1およびGAPDHとした。
（実験結果）
アグリマックスはIL-6、IL-8、アロマターゼおよびCOX-2の遺伝子発現を抑制した。イソフラボン40はそれらの遺伝子発現を抑制しなかった。さらにアグリマックスはPGE2のタンパク発現およびアロマターゼ酵素活性を抑制した。
更に説明すると、リアルタイムPCRで子宮内膜症細胞のIL-6、IL-8、アロマターゼおよびCOX-2の遺伝子発現を調べた。コントロールと比較しアグリマックスは4つの遺伝子発現を減少させた（P<0.05）が、イソフラボン40では遺伝子発現は抑制されなかった（図2A参照）。アグリマックスはPGE2のタンパクレベルを減少させた（P<0.05）（図2B参照）。mRNAレベルと同様に、アグリマックスは子宮内膜症細胞のアロマターゼ酵素活性を減少させた（P<0.05）（図2C参照）。
【００２７】
３−３  ウエスタンブロットおよび蛍光免疫染色について
（実験方法）
細胞タンパク抽出はRIPA buffer (Nacalai Tesque) とpolyacrylamide gels (ATTO)を使用した。1次抗体はphosphorylated inhibitor κB (p-IκB)、total-inhibitor κB (t-IκB)、 ER・(Abcam)、GAPDH (Cell Signaling Technology) 、2次抗体はagainst rabbit IgG (Cell Signaling Technology)を使用した。蛍光免疫染色はカバーガラスに細胞播種後、1次抗体はphosphor-histone H3 (Ser10)、2次抗体はAlexa-conjugated secondary antibodies (Cell Signaling Technology)を使用した。PI (Vector Laboratories)で蛍光し、FV1000 confocal laser scanning microscope と FLUOVIEW software (Olympus)で分析した。
（実験結果）
NF-κB経路の解析とウエスタンブロットおよび蛍光免疫染色の結果が得られた。
更に説明すると、細胞内シグナル伝達経路におけるアグリマックスの効果を調べた。アグリマックスは子宮内膜症細胞において、TNF-αによって促進されるIκBのリン酸化を抑制した(図3A参照)。さらにアグリマックスは蛍光免疫染色でp65の取り込みを阻害することを確認した（図3B参照）。
【００２８】
３−４  ELISAおよびアロマターゼ酵素活性測定について
（実験方法）
PGE2のタンパク濃度はPGE2 highsensitivity enzyme immunoassay (EIA) kit (Enzo Life Science)で測定した。アロマターゼ酵素活性を既報の[3H]-water法により測定した（非特許文献１９）。
（実験結果）
アグリマックスはERβを介して子宮内膜症の細胞増殖を抑制する。さらにSGK１の発現を抑制した。
更に説明すると、ERβアンタゴニストであるPHTPPを加えた培養液で細胞増殖をWST-8アッセイで測定した。PHTPPはアグリマックスの増殖抑制効果を抑制した（図4A）。さらにトランスフェリングsiRNAによりERβをノックダウンし、WST-８アッセイで増殖抑制効果を調べた。ERβノックダウン細胞はアグリマックスの効果を打ち消した（図4B）。ERαアンタゴニストのMPPを加え、同様にWST-8アッセイで測定したが、アグリマックスの効果は打ち消さなかった（図4C参照）。さらにアグリマックスはSGK1の遺伝子発現を減少させた（P<0.05）（図4D参照）。
【００２９】
３−５  子宮内膜症モデルマウスによる検討について
（実験方法）
BALB/cマウス（7週齢）の卵巣摘出後にエストラジオール（E2:0.5・g/マウス/週）を投与してホルモン動態を一定化させた。同型マウスから摘出した子宮組織を細断し腹腔内に投与した（非特許文献２０）。子宮組織移植1週間後からアグリマックスおよびイソフラボン40 をそれぞれ0.6%、0.65％含む餌を与えた。餌投与４週間後に、腹腔内に形成された嚢胞を摘出した。嚢胞個数、嚢胞重量を計測した。Ki67染色により細胞増殖能を評価した。
（実験結果）
アグリマックスは子宮内膜症モデルマウスの嚢胞形成を抑制したが、イソフラボン40は抑制効果を示さなかった。
更に説明すると、子宮内膜症様病変はマウスの腹腔内に生着した（図5A参照）。病変の大きさは２から10 mmであった（図5B参照）。アグリマックスを含む餌を与えたマウスの嚢胞個数(図5C参照)、嚢胞重量（図5D参照）はコントロールおよびイソフラボン40と比較し減少した（P<0.05）。アグリマックスはコントロールと比較しKi67染色割合を減少させた（P<0.05）（図5E参照）。
【００３０】
３−６  統計分析について
統計分析はMann-Whitney U-testを使用し、データは平均±標準誤差で示した。P値は0.05以下を有意差ありとした。
【００３１】
４  作用効果の纏め
この実験は、子宮内膜症間質細胞および正常子宮内膜細胞、子宮内膜症モデルマウスに対するアグリマックスおよびイソフラボン40の薬剤効果を調査した最初の研究である。アグリマックスは子宮内膜症細胞でのみ増殖抑制効果を認めたので、子宮内膜症患者に使用可能であることが示唆される。さらにERβ、-NF-κB経路を介して薬理作用を示すことを確認した。モデルマウスではアグリマックスは嚢胞形成抑制を示したが、イソフラボン40では示さなかった。アグリマックスの濃度は20μMで研究したが、さらに詳細な濃度設定は必要である。
【００３２】
子宮内膜症は局所の骨盤炎症性疾患である（非特許文献２１）。子宮内膜症組織では活動性マクロファージがIL-6、IL-8などの炎症性サイトカインを分泌する。これらのサイトカインは病巣の進展維持に貢献している。アグリマックスはIL-6、IL-8のmRNA発現を抑制した。この結果は細胞増殖抑制に関与している。さらにアロマターゼ、COX-2、PGE2を抑制することから病巣局所のエストロゲン産生抑制や骨盤痛に効果があることが示唆される。まとめると、アグリマックスは子宮内膜症増悪関連因子を抑制した。
【００３３】
ここで、アグリマックスは子宮内膜細胞に対してどのような機序で抗炎症作用や細胞増殖抑制を示すのかを分析する。子宮内膜症細胞は正常子宮内膜と比較しERβの発現が高い（非特許文献２２）。アグリマックスの主な構成イソフラボンであるダイゼインは、ERβに弱く結合する（非特許文献２３）。成績で示したとおり、ERβをブロックすることでアグリマックスの効果は減少した。ERαではアグリマックスの効果は抑制されなかったので、薬理効果はERβを介していることを示した。
【００３４】
NF-κBは子宮内膜症において重要な制御因子である。アグリマックスはTNF-αによって促進されるIκBのリン酸化およびp65の核内取り込みを抑制し、抗炎症作用を示した。子宮内膜症においてSGK1がERβにより制御される（非特許文献２４）。SGK1はIκBのリン酸化を促進し、NF-κB活性を促進する（非特許文献２５）。アグリマックスはSGK1の遺伝子発現も抑制した。アグリマックスはこの経路を抑制することで抗炎症作用を発揮する(図5E参照)。
【００３５】
アグリマックスとイソフラボン40の効果判定を子宮内膜症モデルマウスで評価した。子宮組織移植1週間後からアグリマックスおよびイソフラボン40 をそれぞれ6%、6.5％含む餌を与えた。アグリマックスはコントロールとイソフラボン40と比較し嚢胞個数と嚢胞重量を減少させた。これらの結果はアグリマックスがマウス体内に吸収された時も、in vitroと同様の効果があることを証明している。
【００３６】
結論として、アグリマックスはERβ、-NF-κB経路を介して子宮内膜症の細胞増殖を抑制し、子宮内膜症モデルマウスの病変形成を抑制した。これらの薬理作用は子宮内膜症の病巣進展と骨盤痛の抑制効果が期待される。
【００３７】
５  子宮内膜症改善用素材の製造方法
５−１  製造工程
子宮内膜症改善用素材の製造方法は特許文献２並びに特許文献３に記載の方法によって行うとよい。
【００３８】
具体的には次のようにして行われる。
【００３９】
即ち、特許文献２においては、豆類に麹菌を接種して製麹し、この製麹処理による生成物に加水することにより当該生成物中の蛋白質を加水分解するとともに前記豆類中のイソフラボン化合物の配糖体を分解して、アグリコンを多量に含むイソフラボン化合物を生成して、前記豆類を原料とした子宮内膜症改善用素材を製造する。
この場合、同時に前記豆類中のフィチン酸を除去することも行われる。
【００４０】
また、特許文献３においては、
（１）微生物を用いた発酵により加水分解された大豆を非極性溶媒により脱脂し、得られた脱脂生成物を乾燥させる工程と、
（２）工程（１）で得られた乾燥脱脂生成物を極性溶媒で抽出し、得られたイソフラボン化合物を含有する抽出物を濃縮乾固する工程と、
（３）工程（２）で得られた濃縮乾固抽出物を極性溶媒で溶解し、さらに加水希釈した後に、分離して不溶性物質を得る工程と、
前記極性溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、又はこれらと水との混合物であり、
（４）工程（３）で得られた不溶性物質を、必要に応じて洗浄し、乾燥させて溶媒を除去する工程を実行することによって子宮内膜症改善用素材を製造する。
【００４１】
５−２  原料
特許文献２の実施例においては、原料として豆類中の大豆粕を用いている。
特許文献３の実施例においては、原料として大豆中の大豆胚軸を用いている。
子宮内膜症改善用素材の原料としては、アグリコン型イソフラボンが多量に含有されている大豆胚軸を用いることが好ましい。
【００４２】
５−３  製造結果物としての子宮内膜症改善用素材
大豆胚芽を原料として特許文献２並びに特許文献３に記載の製造方法によって製造された子宮内膜症改善用素材はアグリコン型イソフラボンを多量に含有する。
アグリコン型イソフラボンとしては、ダイゼイン、ゲニステインおよびグリシテインが含有されている。これらの１種でも子宮内膜症改善用素材として利用することができる。
特に、アグリマックスにおいてはダイゼイン、ゲニステインおよびグリシテインが重量比で７：１：２である。
このように本発明の製造方法によれば、子宮内膜症改善用素材を確実に製造することができ、子宮内膜症を改善することのできる子宮内膜症改善用素材を確実に提供することができるという優れた作用効果を発揮することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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