(57)【要約】      （修正有）【課題】高感度で特異度の高い肝内胆管がんに対する検査方法及び肝内胆管がん用検査試薬を提供する。【解決手段】検体中のナルディライジンを定量する定量工程を含む、肝内胆管がんに対する指標としてナルディライジンを用いる検査方法。前記定量は、免疫学的測定による定量である。前記免疫学的測定による定量は、酵素免疫測定法による定量である。抗ナルディライジン抗体を含む、肝内胆管がん用検査試薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝内胆管がんに対する指標としてナルディライジンを用いる検査方法であって、
検体中の前記ナルディライジンを定量する定量工程を含むことを特徴とする検査方法。
【請求項２】
前記定量は、免疫学的測定による定量である請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
前記免疫学的測定による定量には、ナルディライジンに対するモノクローナル抗体を用いる請求項２に記載の検査方法。
【請求項４】
前記免疫学的測定による定量は、酵素免疫測定法による定量である請求項２又は３に記載の検査方法。
【請求項５】
前記検体は、体液、細胞及び組織からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１〜４に記載の検査方法。
【請求項６】
前記体液は、血液、尿、髄液、唾液、リンパ液、胸水、腹水及び胆汁からなる群から選択される少なくとも１種である請求項５に記載の検査方法。
【請求項７】
前記血液は、血清又は血漿である請求項６に記載の検査方法。
【請求項８】
前記ナルディライジンの定量値を、肝内胆管がんに対する指標となる所定の数値と比較し、前記検体中のナルディライジンの定量値の大小を評価する評価工程をさらに含む請求項１〜７のいずれかに記載の検査方法。
【請求項９】
前記評価工程において、前記検体中のナルディライジンの定量値が、前記所定の数値よりも大きい場合、肝臓の多発性腫瘍に対する検査を行う工程をさらに含む請求項８に記載の検査方法。
【請求項１０】
前記検体中のナルディライジンの定量値の大小の評価に基づき、前記検体の採取元の個体の予後を予測する予後予測工程をさらに含む請求項８に記載の検査方法。
【請求項１１】
肝内胆管がん用検査試薬であって、
抗ナルディライジン抗体を含むことを特徴とする肝内胆管がん用検査試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検査方法及び肝内胆管がん用検査試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝内胆管がん（Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ  Ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＩＣＣ）は原発性肝がんの約１０％を占め、原発性肝がんとしては肝細胞がん（Ｈｅｍａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＨＣＣ）に次いで２番目に多い。肝内胆管がんは、欧米と比較して、日本を含む東アジアで多い症例であることが特徴である。肝内胆管がんは、肝細胞がんと異なりリンパ節転移を起こしやすいこと、有効性が確立された化学療法がないこと等から、その生命予後は極めて不良である。さらに、肝内胆管がんの診断バイオマーカーとしては、その診断能としての感度（陽性者を正しく陽性として捕捉する率）及び特異度（陰性者を正しく陰性と判断する率）が共に良好なものがなく、早期発見が困難なことも予後が悪い原因となっている。
例えば、体外診断用医薬品として薬事承認され、既存の代表的な肝内胆管がんのマーカーであるＣＡ１９−９の診断能は、感度６５％及び特異度６４％であり、感度及び特異度とも充分ではなかった（特許文献１参照）。
また、特許文献１には、レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質を肝内胆管がんのがんマーカーとし、被検試料における該がんマーカーをインビトロで検出することによって肝内胆管がんを検出する肝内胆管がんの検出方法が提案されている。特許文献１に記載の方法では、被検試料における該がんマーカーの存在の検出を、標識化したレクチンＷＦＡを用いた被検細胞のＷＦＡ染色によりインビトロで行うことを特徴とする。
【０００３】
一方で、ナルディライジンは生体内の多くの組織で発現していることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。また、ナルディライジンの免疫測定法としては、ナルディライジンが急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌、クローン病、潰瘍性大腸炎及び急性心筋梗塞からなる群から選ばれる少なくとも１種の疾患に対する指標であるナルディライジンの免疫測定法が知られている（特許文献２参照）が、肝内胆管がんの指標になることは全く知られてなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１５−７６５４号公報
【特許文献２】特開２０１１−１７５５４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．，４７（２）：２３８−２４５，１９９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に記載の方法では、肝内胆管がんの診断能は、感度９０％及び特異度６０％であり、特異度の面で充分ではなく（特許文献１参照）、より高感度で特異度の高い検査方法が求められていた。
【０００７】
本発明は、上記問題点を鑑みてなされた発明であり、本発明の目的は、高感度で特異度の高い肝内胆管がんに対する検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、肝内胆管がんの特異的なバイオマーカーとしてナルディライジンを指標にできることを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、肝内胆管がんに対する指標としてナルディライジンを用いる検査方法であって、検体中の上記ナルディライジンを定量する定量工程を含むことを特徴とする。
なお、ナルディライジンは、Ｎ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｉｂａｓｉｃ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ（ＮＲＤ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）とも呼ばれる酵素である。
本発明の検査方法において、定量するナルディライジンは、好ましくはヒトナルディライジンである。
【発明の効果】
【０００９】
ナルディライジンは、肝内胆管がんの特異的なバイオマーカーであり、従来の肝内胆管がんのバイオマーカーよりも感度及び特異度が高い。そのため、検体内のナルディライジンを定量することにより、肝内胆管がんの罹患の指標とすることができる。
また、本発明の検査方法による結果を指標として肝内胆管がんに罹患しているか否かを判断することにより、従来の検査方法では見逃されていた肝内胆管がんを発見することができる。すなわち、偽陰性と判断される症例を減らすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、健常者、肝細胞がん患者及び肝内胆管がん患者の血清中のナルディライジン濃度を示すプロット図である。
【図２】図２は、健常者及び肝内胆管がん患者の血清中のナルディライジン濃度に関するＲＯＣ曲線である。
【図３】図３は、肝細胞がん患者及び肝内胆管がん患者の血清中のナルディライジン濃度に関するＲＯＣ曲線である。
【図４】図４は、ナルディライジン高値の肝内胆管がん患者と、ナルディライジン低値の肝内胆管がん患者との全生存期間を比較した生存曲線である。
【図５】図５は、ナルディライジン高値の肝内胆管がん患者と、ナルディライジン低値の肝内胆管がん患者との無病生存期間を比較した生存曲線である。
【図６】図６は、肝内胆管がん患者の血清中における、ナルディライジン濃度と、ＣＡ１９−９濃度との相関図である。
【図７】図７は、肝内胆管がん患者の血清中における、ナルディライジン濃度と、ＣＥＡ濃度との相関図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の検査方法は、肝内胆管がんに対する指標としてナルディライジンを用いる検査方法であって、検体中の上記ナルディライジンを定量する定量工程を含むことを特徴とする。
【００１２】
ナルディライジンは、肝内胆管がんの特異的なバイオマーカーであり、ＣＡ１９−９（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  １９−９）やＣＥＡ（癌胎児性抗原）のような従来の肝内胆管がんのバイオマーカーよりも感度及び特異度が高い。そのため、検体内のナルディライジンを定量することにより、肝内胆管がんの罹患の指標とすることができる。
また、本発明の検査方法による結果を指標として肝内胆管がんに罹患しているか否かを判断することにより、従来の検査方法では見逃されていた肝内胆管がんを発見することができる。すなわち、偽陰性と判断される症例を減らすことができる。本発明の検査方法は、例えば、肝内胆管がんの判定又は診断するための検査方法として有用である。
さらに、肝内胆管がん切除手術後の再発の指標とすることができる。
【００１３】
本発明の検査方法において、検体は、体液、細胞及び組織からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、体液であることがより好ましい。
また、体液としては、血液、尿、髄液、唾液、リンパ液、胸水、腹水及び胆汁からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、採取の容易さの観点から血液であることがさらに好ましい。
また、検査の精度の観点から、血液としては、血清又は血漿であることが特に好ましい。
【００１４】
本発明の検査方法における定量工程において、定量方法は、特に限定されないが、免疫学的測定による定量であることが好ましい。
免疫学的測定によりナルディライジンを測定することにより、感度よく、正確に、素早く、かつ、簡便にナルディライジンを定量することができる。
【００１５】
本発明の検査方法において、上記免疫学的測定による定量には、ナルディライジンに対するモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体（以下、これら抗体を区別する必要がない場合、これら抗体をまとめて単に「抗ナルディライジン抗体」とも記載する）を用いることができる。
また、ナルディライジンに対する特異性が良好な観点からモノクローナル抗体を用いることが好ましい。
【００１６】
本発明の検査方法において、ナルディライジンに対するモノクローナル抗体は、従来公知の方法で作製したものを使用することができ、例えば細胞融合技術や遺伝子組換え技術等を利用した公知の方法［Ｅｕｒ．Ｊ  ｉｍｍｕｎｏｌ，６，５１１（１９７６）］によって産生されたもの等が使用できる。
ナルディライジンに対するモノクローナル抗体の具体例としては、特開２０１１−１７５５４号公報に記載の抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．２３、抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．２３１、抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．２４６、抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．２５６、抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．３０４、抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．３０７及び抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．３１４が挙げられる。これらのうち好ましくは、測定感度の観点から、ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．２３１及び抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．３０４である。
【００１７】
本発明の検査方法において、免疫学的測定の方法の例としては、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）及び免疫クロマト法等が挙げられる。これらの内、測定感度の観点からより好ましいのは、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）及び発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）であり、さらに好ましいのは酵素免疫測定法（ＥＩＡ）である。酵素免疫測定法（ＥＩＡ）の中でも、酵素の基質に化学発光物質を用いた化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）が特に好ましい。
【００１８】
本発明の検査方法において、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）により検体中のナルディライジンを定量する場合、外部から導入するナルディライジン及び／若しくはそのアナログ、抗ナルディライジン抗体、又は、二次抗体に化学発色・発光のための標識を付すことになる。
標識は、特に限定されないが、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、マイクロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ルシフェラーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼであることが好ましい。
また、検出感度等の観点から、化学発色・発光のために用いる標識としてはアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼを使用することがより好ましく、ペルオキシダーゼを使用することがさらに好ましい。
【００１９】
本発明の検査方法において、ナルディライジンを免疫学的測定により定量する場合には、抗ナルディライジン抗体や、ナルディライジン及び／又はそのアナログ等を固相担体に担持し、その固相担体を使用してナルディライジンを定量することになる。
本発明の検査方法で使用する固相担体としては、特に限定されないが、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性シリカ粒子等の磁性粒子、マイクロプレート、ラテックス等が挙げられる。これらのうち、検出感度等の観点から、ガラスビーズ及び／又は磁性シリカ粒子を使用することが好ましい。
【００２０】
本発明の検査方法において、免疫学的測定は、例えば、酵素免疫測定法（１９８７年５月１５日発行、第３版、株式会社医学書院）等に記載の測定が使用でき、非競合的免疫学的測定であってもよく、競合的免疫学的測定であってもよい。これらのうち、検出感度等の観点から、非競合的免疫学的測定が好ましい。
【００２１】
本明細書において、非競合的免疫学的測定とは、外部からナルディライジン及び／又はそのアナログを加えず、競合させずに検体中のナルディライジンと、抗ナルディライジン抗体とを結合させる工程を含む測定を意味する。
本明細書において、競合的免疫学的測定とは、外部からナルディライジン及び／又はそのアナログを加え、検体中のナルディライジンと、外部から導入したナルディライジン及び／又はそのアナログとを競合させて抗ナルディライジン抗体に結合させる工程を含む測定を意味する。
【００２２】
以下に本発明の検査方法に係る非競合的免疫学的測定により検体中の検体中のナルディライジンを定量する検査方法の一例である第１非競合的免疫学的測定を説明する。
【００２３】
（１）検査資材の準備工程
本工程では検査に使用する資材である、抗ナルディライジン抗体を担持させた固相担体、免疫反応用緩衝液、及び、標識抗ナルディライジン抗体を準備する。
【００２４】
抗ナルディライジン抗体を担持させた固相担体の作製について説明する。
固相担体に抗ナルディライジン抗体を担持させる方法は、特に限定されず、従来の方法を採用することができる。
固相担体としては、特に限定されないが、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性シリカ粒子等の磁性粒子、マイクロプレート、ラテックス等が挙げられる。これらのうち、検出感度等の観点から、ガラスビーズ及び／又は磁性シリカ粒子を使用することが好ましい。
【００２５】
次に、免疫反応用緩衝液について説明する。
免疫反応用緩衝液としては、ｐＨ５．０〜１０．０に緩衝作用を有する緩衝液であることが好ましく、ｐＨ６．０〜９．０に緩衝作用を有する緩衝液であることがより好ましい。
このような免疫反応用緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液及びホウ酸緩衝液等が挙げられる。
【００２６】
次に、標識抗ナルディライジン抗体の作製について説明する。
抗ナルディライジン抗体に付す標識は、放射性同位元素の標識であってもよく、化学発色・発光する標識であってもよい。これらの中では、安全性の観点から化学発色・発光する標識であることが好ましい。
これらの標識は、従来の方法により抗ナルディライジン抗体に付すことができる。
【００２７】
（２）検量線作成工程
（２−１）ナルディライジン標準液作製ステップ
上記免疫反応用緩衝液にナルディライジンを加え、複数の異なる濃度のナルディライジン標準液を作製する。
【００２８】
（２−２）固相担体に担持された抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン複合体形成ステップ
まず、各ナルディライジン標準液中のナルディライジンと、固相担体に担持された抗ナルディライジン抗体を反応させる。この際、反応系の緩衝液として、上記免疫反応用緩衝液を用いる。
この反応により、固相担体に担持された抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン複合体を形成させることができる。
その後、未反応のナルディライジンを反応系から除去する。
【００２９】
（２−３）固相担体に担持された抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン−標識抗ナルディライジン抗体複合体形成ステップ
次に、反応系に標識抗ナルディライジン抗体を加え、固相担体に担持された抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン複合体と、標識抗ナルディライジン抗体を反応させる。
この反応により固相担体に担持された抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン−標識抗ナルディライジン抗体複合体を形成させることができる。
その後、未反応の標識抗ナルディライジン抗体を反応系から除去する。
【００３０】
（２−４）標識カウントステップ
次に、反応系に残った固相担体に担持された抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン−標識抗ナルディライジン抗体複合体の標識をカウントする。
標識のカウントは、標識の種類に応じ、従来の方法によりカウントすることができる。
【００３１】
（２−５）検量線作成ステップ
各ナルディライジン標準液の濃度、及び、得られた標識のカウント数に基づき、ナルディライジン濃度と標識のカウント数との関係を示す検量線を作成する。
【００３２】
（３）固相担体に担持された抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン複合体形成工程
反応系の緩衝液として上記免疫反応用緩衝液を用い、検体中のナルディライジンと、固相担体に担持された抗ナルディライジン抗体を反応させる。
この反応により、固相担体に担持された抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン複合体を形成させることができる。
その後、未反応のナルディライジンを反応系から除去する。
【００３３】
（４）固相担体に担持された抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン−標識抗ナルディライジン抗体複合体形成工程
次に、反応系に標識抗ナルディライジン抗体を加え、固相担体に担持された抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン複合体と、標識抗ナルディライジン抗体を反応させる。
この反応により固相担体に担持された抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン−標識抗ナルディライジン抗体複合体を形成させることができる。
その後、未反応の標識抗ナルディライジン抗体を反応系から除去する。
【００３４】
（５）標識カウント工程
次に、反応系に残った固相担体に担持された抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン−標識抗ナルディライジン抗体複合体の標識をカウントする。
標識のカウントは、標識の種類に応じ、従来の方法によりカウントすることができる。
【００３５】
（６）定量工程
次に、得られたカウント数及び作成した検量線に基づき検体中のナルディライジンの濃度を算出する。
以上の工程を経て、検体中のナルディライジンを定量することができる。
【００３６】
なお、本発明の検査方法において、非競合的免疫学的測定では、標識抗ナルディライジン抗体を用いずに、標識二次抗体を使用して測定を行ってもよい。
以下に、本発明の検査方法に係る非競合的免疫学的測定により検体中の検体中のナルディライジンを定量する検査方法の一例である第２非競合的免疫学的測定を説明する。
【００３７】
（１）検査資材の準備工程
本工程では検査に使用する資材である、抗ナルディライジン抗体を担持させた固相担体、免疫反応用緩衝液、二次抗体が結合できない第１抗ナルディライジン抗体、二次抗体が結合できる第２抗ナルディライジ抗体、及び、標識二次抗体を準備する。
【００３８】
まず、第１抗ナルディライジン抗体を固相担体に担持する。固相担体の種類は、上記第１非競合的免疫学的測定で説明した固相担体と同じものを使用することができる。
【００３９】
また、二次抗体に標識を付し、標識二次抗体を作製する。
二次抗体に付す標識は、放射性同位元素の標識であってもよく、化学発色・発光する標識であってもよい。これらの中では、安全性の観点から化学発色・発光する標識であることが好ましい。
これらの標識は、従来の方法により二次抗体に付すことができる。
【００４０】
免疫反応用緩衝液としては、上記第１非競合的免疫学的測定で説明した免疫反応用緩衝液と同じものを使用することができる。
【００４１】
（２）検量線作成工程
（２−１）ナルディライジン標準液作製ステップ
上記免疫反応用緩衝液にナルディライジンを加え、複数の異なる濃度のナルディライジン標準液を作製する。
【００４２】
（２−２）第１抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン複合体形成ステップ
各ナルディライジン標準液中のナルディライジンと、固相担体に担持された第１抗ナルディライジン抗体を反応させる。この際、反応系の緩衝液として、上記免疫反応用緩衝液を用いる。
この反応により、第１抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン複合体を形成させることができる。
その後、未反応のナルディライジンを反応系から除去する。
【００４３】
（２−３）第１抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン−第２抗ナルディライジン抗体複合体形成ステップ
次に、反応系に第２抗ナルディライジン抗体を加え、第１抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン複合体と、第２抗ナルディライジン抗体を反応させる。
この反応により第１抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン−第２抗ナルディライジン抗体複合体を形成させることができる。
次に、未反応の第２抗ナルディライジン抗体を反応系から除去する。
【００４４】
（２−４）標識二次抗体結合ステップ
次に、反応系に標識二次抗体を加え、第１抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン−第２抗ナルディライジン抗体複合体と、標識二次抗体とを反応させる。
これにより、第１抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン−第２抗ナルディライジン抗体−標識二次抗体複合体を形成させることができる。
次に、未反応の標識二次抗体を反応系から除去する。
【００４５】
（２−５）標識カウントステップ
次に、反応系に残った第１抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン−第２抗ナルディライジン抗体−標識二次抗体複合体の標識をカウントする。
標識のカウントは、標識の種類に応じ、従来の方法によりカウントすることができる。
【００４６】
（２−６）検量線作成ステップ
各ナルディライジン標準液の濃度、及び、得られた標識のカウント数に基づき、ナルディライジン濃度と標識のカウント数との関係を示す検量線を作成する。
【００４７】
（３）第１抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン複合体形成工程
反応系の緩衝液として上記免疫反応用緩衝液を用い、検体中のナルディライジンと、固相担体に担持された第１抗ナルディライジン抗体を反応させる。
この反応により、第１抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン複合体を形成させることができる。
その後、未反応のナルディライジンを反応系から除去する。
【００４８】
（４）第１抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン−第２抗ナルディライジン抗体複合体形成工程
次に、反応系に第２抗ナルディライジン抗体を加え、第１抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン複合体と、第２抗ナルディライジン抗体を反応させる。
この反応により第１抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン−第２抗ナルディライジン抗体複合体を形成させることができる。
その後、未反応の第２抗ナルディライジン抗体を反応系から除去する。
【００４９】
（５）標識二次抗体結合工程
次に、反応系に標識二次抗体を加え、第１抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン−第２抗ナルディライジン抗体複合体と、標識二次抗体とを反応させる。
これにより、第１抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン−第２抗ナルディライジン抗体−標識二次抗体複合体を形成させることができる。
その後、未反応の標識二次抗体を反応系から除去する。
【００５０】
（６）標識カウント工程
次に、反応系に残った第１抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン−第２抗ナルディライジン抗体−標識二次抗体複合体の標識をカウントする。
標識のカウントは、標識の種類に応じ、従来の方法によりカウントすることができる。
【００５１】
（７）定量工程
次に、得られたカウント数及び作成した検量線に基づき検体中のナルディライジンの濃度を算出する。
以上の工程を経て、検体中のナルディライジンを定量することができる。
【００５２】
以下に本発明の検査方法に係る競合的免疫学的測定により検体中のナルディライジンを定量する検査方法の一例を説明する。
なお、以下の競合的免疫学的測定の説明では、便宜上、標識が付されていないナルディライジンを「非標識ナルディライジン」と記載し、標識が付されたナルディライジンを「標識ナルディライジン」と記載する。
【００５３】
（１）検査資材の準備工程
本工程では検査に使用する資材である、抗ナルディライジン抗体を担持させた固相担体、免疫反応用緩衝液、及び、標識ナルディライジンを準備する。
抗ナルディライジン抗体を担持させた固相担体、及び、免疫反応用緩衝液は、上記第１非競合的免疫学的測定の説明において示したものを使用することができる。
【００５４】
標識ナルディライジンについて説明する。
標識ナルディライジンは、非標識ナルディライジンに標識を付すことにより作製することができる。
標識は、放射性同位元素の標識であってもよく、化学発色・発光する標識であってもよい。これらの中では、安全性の観点から化学発色・発光する標識であることが好ましい。
これらの標識は、従来の方法により非標識ナルディライジンに付すことができる。
【００５５】
（２）検量線作成工程
（２−１）非標識ナルディライジン標準液作製ステップ
上記免疫反応用緩衝液に非標識ナルディライジンを加え、複数の異なる濃度の非標識ナルディライジン標準液を作製する。
【００５６】
（２−２）非標識ナルディライジン−標識ナルディライジン混合液調製ステップ
まず、各非標識ナルディライジン標準液に、一定量の標識ナルディライジンを加えて混合し非標識ナルディライジン−標識ナルディライジン混合液を調製する。
【００５７】
（２−３）抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン複合体形成ステップ
次に、非標識ナルディライジン−標識ナルディライジン混合液中の非標識ナルディライジン及び標識ナルディライジンと、固相担体に担持された抗ナルディライジン抗体を反応させる。この際、非標識ナルディライジンと、標識ナルディライジンとは競合して抗ナルディライジン抗体に結合することになる。
この反応により、抗ナルディライジン抗体−非標識ナルディライジン複合体及び抗ナルディライジン抗体−標識ナルディライジン複合体を形成することができる。
この反応において、非標識ナルディライジン−標識ナルディライジン混合液中の非標識ナルディライジンの量が多ければ、抗ナルディライジン抗体−標識ナルディライジン複合体の量が少なくなる。
また、非標識ナルディライジン−標識ナルディライジン混合液中の非標識ナルディライジンの量が少なければ、抗ナルディライジン抗体−標識ナルディライジン複合体の量が多くなる。
その後、未反応の非標識ナルディライジン及び標識ナルディライジンを除去する。
【００５８】
（２−４）標識カウントステップ
次に、反応系に残った抗ナルディライジン抗体−標識ナルディライジン複合体の標識をカウントする。
標識のカウントは、標識の種類に応じ、従来の方法によりカウントすることができる。
【００５９】
（２−５）検量線作成ステップ
各非標識ナルディライジン標準液の濃度、及び、得られた標識のカウント数に基づき、非標識ナルディライジン濃度と標識のカウント数との関係を示す検量線を作成する。
【００６０】
（３）非標識ナルディライジン−標識ナルディライジン混合液調製工程
次に、免疫反応用緩衝液に、検体及び一定量の標識ナルディライジンを加えて混合し検体−標識ナルディライジン混合液を調製する。
なお、検体中のナルディライジンには標識が付されていないので、以下の説明で「非標識ナルディライジン」と記載する。
【００６１】
（４）抗ナルディライジン抗体−ナルディライジン複合体形成工程
次に、検体−標識ナルディライジン混合液中の非標識ナルディライジン及び標識ナルディライジンと、固相担体に担持された抗ナルディライジン抗体を反応させる。この際、非標識ナルディライジンと、標識ナルディライジンとは競合して抗ナルディライジン抗体に結合することになる。
この反応により、抗ナルディライジン抗体−非標識ナルディライジン複合体及び抗ナルディライジン抗体−標識ナルディライジン複合体を形成することができる。
その後、未反応の非標識ナルディライジン及び標識ナルディライジンを除去する。
【００６２】
（５）標識カウント工程
次に、反応系に残った抗ナルディライジン抗体−標識ナルディライジン複合体の標識をカウントする。
標識のカウントは、標識の種類に応じ、従来の方法によりカウントすることができる。
【００６３】
（６）定量工程
次に、得られたカウント数及び作成した検量線に基づき検体中のナルディライジン（非標識ナルディライジン）の濃度を算出する。
以上の工程を経て、検体中のナルディライジンを定量することができる。
【００６４】
本発明の肝内胆管がん用検査試薬は、抗ナルディライジン抗体を含む検査試薬である。
本発明の肝内胆管がん用検査試薬は、上記の検査方法に使用することができる。
本発明の肝内胆管がん用検査試薬に含まれる抗ナルディライジン抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また、非標識抗ナルディライジン抗体であっても標識抗ナルディライジン抗体であってもよい。
さらに、本発明の肝内胆管がん用検査試薬は、抗ナルディライジン抗体以外に、抗ナルディライジン抗体を担持させた固相担体、免疫反応用緩衝液、標識ナルディライジン及び／又はそのアナログ、標識二次抗体等を含んでいてもよい。
【００６５】
本発明の検査方法には、上記ナルディライジンの定量値を、肝内胆管がんに対する指標となる所定の数値と比較し、上記検体中のナルディライジンの定量値の大小を評価する評価工程をさらに含んでいてもよい。
上記工程における評価とは、例えば、ナルディライジンの定量値が、肝内胆管がんに対する指標となる所定の数値よりも大きい場合には、その検体の採取元の個体が肝内胆管がんに罹患している可能性が高いと評価し、肝内胆管がんに対する指標となる所定の数値よりも小さい場合には、その検体の採取元の個体が肝内胆管がんに罹患している可能性が低いと評価することである。
【００６６】
肝内胆管がんに対する指標となる所定の数値は、例えば、肝内胆管がんに罹患しているか否かを評価するカットオフ値であってもよい。
この場合、検体中のナルディライジンの定量値が、上記カットオフ値よりも高い場合には、検体の採取元の個体は、肝内胆管がんに罹患している可能性が高いと評価し、上記カットオフ値よりも低い場合には、検体の採取元の個体は、肝内胆管がんに罹患している可能性が低いと評価することができる。
なお、上記カットオフ値は、例えば、健常者の検体中のナルディライジンの定量値と、肝内胆管がん患者の検体中のナルディライジンの定量値とからＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  Ｃｕｒｖｅ）を作成することにより設定することができる。
上記カットオフ値としては、例えば、血清中のナルディライジン濃度において８２０．０〜８７０．０ｐｇ／ｍＬの範囲内のいずれかの値を採用することができ、８４５．５ｐｇ／ｍＬとすることが望ましい。
【００６７】
また、肝内胆管がんに対する指標となる所定の数値は、肝内胆管がんに罹患しているか、肝細胞がんに罹患しているかを評価するカットオフ値であってもよい。
このようなカットオフ値は、例えば、肝細胞がん患者の検体中のナルディライジンの定量値と、肝内胆管がん患者の検体中のナルディライジンの定量値とからＲＯＣ曲線を作成することにより設定することができる。
上記カットオフ値としては、例えば、血清中のナルディライジン濃度において１２９０．０〜１３４０．０ｐｇ／ｍＬの範囲内のいずれかの値を採用することができ、１３０８．０２ｐｇ／ｍＬとすることが望ましい。
【００６８】
また、本発明の検査方法は、上記検体中のナルディライジンの定量値が、上記所定の数値よりも大きい場合、肝臓の多発性腫瘍に対する検査を行う工程をさらに含んでいてもよい。
例えば、肝内胆管がん患者の血清中のナルディライジンの定量値が、１６２７．０ｐｇ／ｍＬよりも大きい場合、その血清の採取元の患者は、肝臓の多発性腫瘍を有している可能性が高い。
そのため、この血清の採取元の患者に対し、肝臓の多発性腫瘍に対する検査を行うことで、多発性腫瘍の有無を確認することができる。
【００６９】
また、本発明の検査方法は、上記検体中のナルディライジンの定量値の大小の評価に基づき、上記検体の採取元の個体の予後を予測する予後予測工程をさらに含んでいてもよい。
例えば、肝内胆管がん患者の血清中のナルディライジンの定量値が、１６２７．０ｐｇ／ｍＬよりも大きい場合、その血清の採取元の患者は、定量値が上記数値未満の肝内胆管がん患者よりも無病生存期間、及び、全生存期間が短い。
そのため、肝内胆管がん患者の血清中のナルディライジンを定量することにより、その患者の予後を予測することができる。
【実施例】
【００７０】
以下、実施例により、本発明の検査方法をさらに説明するが、本発明の検査方法はこれらに限定されるものではない。
【００７１】
（実施例１）
＜検査試薬の調製＞
１．抗体ビーズ（抗ナルディライジン抗体が担持された固相担体）の作製
１重量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラン含有アセトン溶液２０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶にガラスビーズ１０００個を加え、２５℃で１時間反応させ、反応液をアスピレーターで吸引除去した。
【００７２】
次いで脱イオン水２０ｍＬを加えて蓋をし、ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を３回行った。
次いで、この洗浄後のガラスビーズ１０００個を２重量％グルタルアルデヒド含有水溶液２０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。そして、脱イオン水２０ｍＬを加えて蓋をし、ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌したのち、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を３回行った。
さらにこの洗浄後のガラスビーズ１０００個を抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．２３１（特開２０１１−１７５５４号公報に記載の方法で作製した）を２０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）２０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。
【００７３】
反応後、抗ナルディライジンモノクローナル抗体含有リン酸緩衝液を除去し、ガラスビーズを０．１重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）２０ｍＬに８時間浸漬し、この液を除去した後、ビーズを２０重量％ショ糖含有０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）２０ｍＬに浸漬した。２時間浸漬後、液を除去してビーズを濾紙上で風乾してビーズ表面をショ糖でコーティングし、抗体ビーズを得た。
【００７４】
２．免疫反応用緩衝液の作製
０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍＬに、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｇ、塩化ナトリウム０．８５ｇ及び界面活性剤としてのＴｗｅｅｎ８０  ０．５ｇを添加し、免疫反応用緩衝液を作製した。
【００７５】
３．標識抗ナルディライジン抗体の作製
抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．３０４（特開２０１１−１７５５４号公報に記載の方法で作製した）及び西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼを用い、文献（エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２，１９８２，１４１３−１４２４）に記載の方法でペルオキシダーゼ標識抗ナルディライジン抗体を作製し、作製したペルオキシダーゼ標識抗ナルディライジン抗体を上記免疫反応用緩衝液で抗体濃度として５μｇ／ｍＬとなるように希釈し、標識抗ナルディライジン抗体液を作製した。
【００７６】
４．化学発光用の基質液の作製
ルミノールナトリウム［シグマアルドリッチジャパン（株）製］０．２８ｇ及び４−（シアノメチルチオ）フェノール［三新化学工業（株）製］０．０６ｇを、グッド緩衝液（０．１ＭのＥＰＰＥＳ、ｐＨ８．５）１００ｍＬに溶解し、基質液を作製した。
【００７７】
５．過酸化水素液の調製
３５重量％過酸化水素水［和光純薬工業（株）製］を脱イオン水で１８００倍に希釈し、過酸化水素液とした。
【００７８】
６．測定用試薬の調製
測定用カートリッジ［（株）ベルテックス製］に作製した抗体ビーズ１個、免疫反応用緩衝液１４０μＬ、標識抗ナルディライジン抗体液２２０μＬ、基質液１８０μＬ及び過酸化水素液１２０μＬを入れ、アルミシールで密閉し測定用試薬とした。測定まで２〜１０℃で冷蔵保存した。
【００７９】
＜ナルディライジン標準液及び検体＞
抗原（ヒト全長ナルディライジン組換えタンパク質）を希釈液（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）にて０〜８０，０００ｐｇ／ｍＬ（濃度ポイントは、０、４００、１，６００、４，０００、８，０００、２０，０００、４０，０００及び８０，０００ｐｇ／ｍＬ）の濃度に調整しナルディライジン標準液を作製した。
健常者（ボランティア、１１２名）、がんの切除手術を受けた肝細胞がん患者（２２６名）、及び、がんの切除手術を受けた肝内胆管がん患者（７９名）から血清を検体として採取した。
【００８０】
＜測定操作＞
自動化学発光酵素免疫分析装置ＳｐｈｅｒｅＬｉｇｈｔ  Ｗａｋｏ［アロカ（株）製］を用いて測定を実施した。本装置は検体の分注から測定値の出力まで自動的に行った。測定の概要は次の通りである。
測定用試薬及び試料（ナルディライジン標準液、血清）を所定の位置にセットした。
次に、測定用試薬のアルミシールを開封し、抗体ビーズが１個入った反応槽に免疫反応用緩衝液６０μＬ及び検体８０μＬを加え、３７℃で１４分間免疫反応させた。
次に、１回当たり約３００μＬの洗浄液（リン酸緩衝液）で５回洗浄してＢ／Ｆ分離（Ｂｏｎｄ／Ｆｒｅｅ分離）を行った後、標識抗ナルディライジン抗体液１４０μＬを加え、３７℃で１４分間免疫反応させた。
次に、１回当たり約３００μＬの洗浄液（リン酸緩衝液）で５回洗浄してＢ／Ｆ分離を行った後、基質液１００μＬ及び過酸化水素液４０μＬを加え、３７℃で１分間反応させた後、発光量をカウントした。ナルディライジン標準液の発光量で検量線を作成し、検体の発光量から血清中のナルディライジン濃度を算出した。
【００８１】
（血清中ナルディライジン濃度の比較）
得られた血清中ナルディライジン濃度の測定結果に基づき、健常者、肝細胞がん患者及び肝内胆管がん患者の比較を行った。
図１は、健常者、肝細胞がん患者及び肝内胆管がん患者の血清中のナルディライジン濃度を示すプロット図である。
健常者の血清中ナルディライジン濃度の中央値は、５３９．８ｐｇ／ｍＬであった。
肝細胞がん患者の血清中ナルディライジン濃度の中央値は、９３４．１ｐｇ／ｍＬであった。
肝内胆管がん患者の血清中ナルディライジン濃度の中央値は、１６２７．１ｐｇ／ｍＬであった。
【００８２】
健常者の血清中ナルディライジン濃度と、肝内胆管がん患者の血清中ナルディライジン濃度とを比較すると、肝内胆管がん患者の血清中ナルディライジン濃度の方が有意に高かった（ｐ＜０．００１）。
また、肝細胞がん患者の血清中ナルディライジン濃度と、肝内胆管がん患者の血清中ナルディライジン濃度とを比較すると、肝内胆管がん患者の血清中ナルディライジン濃度の方が有意に高かった（ｐ＜０．００１）。
なお、本明細書の実施例において、有意差の検定方法には、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を用いた。
【００８３】
（血清中ナルディライジン濃度のＲＯＣ解析）
得られた血清中ナルディライジン濃度の測定結果に基づき、健常者ｖｓ肝内胆管がん患者の血清中ナルディライジン濃度に関するＲＯＣ解析、及び、肝細胞がん患者ｖｓ肝内胆管がん患者の血清中ナルディライジン濃度に関するＲＯＣ解析を行った。
それぞれのＲＯＣ曲線を図２及び図３に示す。
図２は、健常者及び肝内胆管がん患者の血清中のナルディライジン濃度に関するＲＯＣ曲線である。
図３は、肝細胞がん患者及び肝内胆管がん患者の血清中のナルディライジン濃度に関するＲＯＣ曲線である。
【００８４】
図２に示すＲＯＣ曲線におけるＡＵＣ（Ａｒｅａ  Ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  Ｃｕｒｖｅ）が、０．９４（ｐ＜０．００１）であり、ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ  ｐｒｅｄｉｃｔａｂｉｌｉｔｙと判定された。
図３に示すＲＯＣ曲線におけるＡＵＣは、ＡＵＣが０．７６（ｐ＜０．００１）であり、ｍｏｄｅｒａｔｅ  ｐｒｅｄｉｃｔａｂｉｌｉｔｙと判断された。なお、ｐ値はロジスティック回帰分析のｐ値である。
【００８５】
これらの結果から、ナルディライジンは、肝内胆管がんの特異的なバイオマーカーであり、高感度で特異度の高い肝内胆管がんに対する指標となることが示された。
【００８６】
また、上記健常者ｖｓ肝内胆管がん患者の血清中ナルディライジン濃度に関するＲＯＣ解析に基づき、健常者であるか、肝内胆管がんに罹患しているかのカットオフ値を、８４５．５ｐｇ／ｍＬに設定すると、感度が８６．１％となり、特異度が９７．３％となる（真陽性率：９５．８％、真陰性率：９０．８％）。
また、上記肝細胞がん患者ｖｓ肝内胆管がん患者の血清中ナルディライジン濃度に関するＲＯＣ解析に基づき、肝細胞がんに罹患しているか、肝内胆管がんに罹患しているかのカットオフ値を、１３０８．２ｐｇ／ｍＬに設定すると、感度が６９．６％となり、特異度が７５．５％となる（真陽性率：５０．５％、真陰性率：８７．４％）。
【００８７】
（血清中ナルディライジン濃度の高低に基づく肝内胆管がん患者の患者背景及び予後の比較）
上記の通り、肝内胆管がん患者の血清中ナルディライジン濃度の中央値は、１６２７．１ｐｇ／ｍＬであった。この値をカットオフ値とし、ナルディライジン高値の肝内胆管がん患者（ＮＲＤｃ  Ｈｉｇｈ）と、ナルディライジン低値の肝内胆管がん患者（ＮＲＤｃ  Ｌｏｗ）とに分けて患者背景、全生存期間及び無病生存期間を比較した。
表１は、ナルディライジン高値の肝内胆管がん患者と、ナルディライジン低値の肝内胆管がん患者との患者背景を比較した表である。
図４は、ナルディライジン高値の肝内胆管がん患者と、ナルディライジン低値の肝内胆管がん患者との全生存期間を比較した生存曲線である。
図５は、ナルディライジン高値の肝内胆管がん患者と、ナルディライジン低値の肝内胆管がん患者との無病生存期間を比較した生存曲線である。
【００８８】
【表１】
2018128378.tif 000002
【００８９】
表１に示すように、ナルディライジン高値の肝内胆管がん患者は、ナルディライジン低値の肝内胆管がん患者と比較して、肝内多発症例を有意に高く含んでいた。
【００９０】
また、ナルディライジン高値の肝内胆管がん患者の全生存期間の中央値は２５．８ヶ月であり、ナルディライジン低値の肝内胆管がん患者の全生存期間の中央値は８５．６ヶ月であった（図４参照）。
また、ナルディライジン高値の肝内胆管がん患者の無病生存期間の中央値は９．４ヶ月であり、ナルディライジン低値の肝内胆管がん患者の無病生存期間の中央値は２５．６ヶ月であった（図５参照）。
以上の結果より、ナルディライジン高値の肝内胆管がん患者は、ナルディライジン低値の肝内胆管がん患者と比較して、全生存期間及び無病生存期間が共に有意に短く、予後不良であった。
【００９１】
（ナルディライジンと、既存の肝内胆管がんバイオマーカーとの比較）
肝内胆管がん患者から採取した血清を用い、既存の肝内胆管がんバイオマーカーであるＣＡ１９−９及びＣＥＡの血清中濃度を電気化学発光法（ＥＣＬＩＡ法）により測定し、ナルディライジンの血清中濃度と比較した。結果を図６及び７に示す。
図６は、肝内胆管がん患者の血清中における、ナルディライジン濃度と、ＣＡ１９−９濃度との相関図である。
図７は、肝内胆管がん患者の血清中における、ナルディライジン濃度と、ＣＥＡ濃度との相関図である。
【００９２】
図６に示すように、肝内胆管がん患者の血清中における、ナルディライジン濃度と、ＣＡ１９−９濃度との相関は、相関係数σが０．２３８であり弱い相関が認められた（ｐ＝０．０４０）。
図７に示すように、肝内胆管がん患者の血清中における、ナルディライジン濃度と、ＣＥＡ濃度との相関は、相関係数σが、０．２２３であり、弱い相関が認められたものの有意ではなかった（ｐ＝０．０５０）。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明は臨床検査、特に肝内胆管がんの疾患を検査する臨床検査に有用である。
【図１】
2018128378.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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