(57)【要約】【課題】品質の高いジャイアントリポソームを小スケールで効率的に作製する方法を提供することを課題とする。【解決手段】以下のステップ（１）〜（３）を含む、リポソームの作製方法が提供される。（１）両親媒性脂質を油に溶解した脂質溶液と、リポソーム内液となるサンプル溶液とを第１微小容器に入れた後、該微小容器をタッピングによって攪拌し、エマルション化させるステップ、（２）リポソーム外液となる水溶液を第２微小容器に入れ、該水溶液の上に、（１）で形成されたエマルションを重層させた後に遠心処理し、エマルション中の油中水滴を油水界面を通過させるステップ、及び（３）前記水溶液中に形成されたリポソームを回収するステップ。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ（１）〜（３）を含む、リポソームの作製方法：
（１）両親媒性脂質を油に溶解した脂質溶液と、リポソーム内液となるサンプル溶液とを第１微小容器に入れた後、該微小容器をタッピングによって攪拌し、エマルション化させるステップ、
（２）リポソーム外液となる水溶液を第２微小容器に入れ、該水溶液の上に、（１）で形成されたエマルションを重層させた後に遠心処理し、エマルション中の油中水滴に油水界面を通過させるステップ、及び
（３）前記水溶液中に形成されたリポソームを回収するステップ。
【請求項２】
前記両親媒性脂質がリン脂質である、請求項１に記載の作製方法。
【請求項３】
前記油が、流動パラフィン、ミネラルオイル、スクワレン、ヘキサン、ドデカン、テトラデカン、ヘキサデカン、オレイン酸、オリーブオイル、トルエン、クロロホルム、テトラヒドロフラン又はオリーブオイル、或いはこれらの中から選択される二以上の混合物である、請求項１又は２に記載の作製方法。
【請求項４】
前記脂質溶液の量が1 pl〜100μlである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項５】
前記サンプル溶液の量が1 pl〜10μlである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項６】
前記サンプル溶液がスクロースを含有し、前記水溶液がグルコースを含有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項７】
前記サンプル溶液がタンパク質を含有し、前記水溶液がタンパク質を含有しない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項８】
前記水溶液の量が1 pl〜100μlである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項９】
前記第１微小容器及び前記第２微小容器がPCRチューブである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項１０】
前記PCRチューブの容積が200μl〜500μlである、請求項９に記載の作製方法。
【請求項１１】
前記遠心処理の条件が100 g〜20,000 g、1分間〜60分間である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項１２】
前記リポソームの直径が1μm〜1 mmである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリポソーム（人工脂質膜小胞）の作製方法に関する。詳細には、細胞サイズのリポソームの作製方法及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
親水性部分と疎水性脂肪鎖の両方を持つ分子であるリン脂質が水溶液中に存在すると、親水性部分を外側に向けて自己集合することで脂質二重膜を形成する。この脂質二重膜が袋状に閉じることで形成されるのがリポソームであり、生体膜の最も単純化したモデルとして多くの実験・研究に利用されてきた。リポソームは、近年、医薬品や化粧品の素材の一つとしても注目され始めている。直径が数μm〜数十μmのものは、生きた細胞とほぼ同じサイズであり、ジャイアント（巨大）リポソームと呼ばれる。ジャイアントリポソームは光学顕微鏡で直接観察できるという点や、細胞を模した実験モデルの作製に利用出来ること等の利点を有し、生体における膜の制御機構の解明や生体膜に直接作用することで耐性菌が現れ難い新たな抗菌作用を持つ薬剤のスクリーニング等の研究に有用であり、更には、薬剤運搬システムや分子ロボットの材料としてもその応用が期待されている。
【０００３】
油中水滴（w/oエマルション）にリン脂質で覆われた油水界面を通過させることによってジャイアントリポソームを作製する方法（「油中水滴遠心界面通過法」と呼ぶ）が報告されて以来（非特許文献１）、同様の原理を利用したいくつかの方法が開発された（非特許文献２〜５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Pautot, S., Frisken, B. J. and Weitz, D. A. (2003) Langmuir 19, 2870-2879.
【非特許文献２】Noireaux, V. and Libchaber, A. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 17669-17674.
【非特許文献３】Pontani, L.-L., van der Gucht, J., Salbreux, G., Heuvingh, J., Joanny, J.-F. and Sykes, C. (2009) Biophys. J. 96, 192-198.
【非特許文献４】Funakoshi, K., Suzuki, H. and Takeuchi, S. (2007) J. Am. Chem. Soc. 129, 12608-12609.
【非特許文献５】Sugiura, S., Kuroiwa, T., Kagota, T., Nakajima, M.,Walde, P., Sato, S., Mukataka, S. and Ichikawa, S. (2007) Langmuir 24, 4581-4588.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
油中水滴遠心界面通過法を利用したリポソーム作製法は画期的な方法であり、ジャイアントリポソームの利用・応用の可能性を飛躍的に高めた。しかしながら、ジャイアントリポソームの潜在的価値や今後の発展を考えれば、これまでに報告された作製法には依然として改良の余地がある。特に、稀少な生体由来分子や薬剤などの封入を行う可能性を考えると、その作製の際に使用するサンプル（リポソームに封入されることになる）の量を少なくすること、即ち、小スケール化が要望される。また、今後の実用化や更なる応用研究に向け、作製効率の向上、得られるリポソームの品質／均質性の向上、更にはサイズ分布を狭くすること等も求められる。
本発明は以上の如き要望に鑑み、品質の高いジャイアントリポソームを小スケールで効率的に作製する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決すべく、小スケール化を目指して鋭意検討した。検討を進める中で、小スケール化に伴い、第１段階である油中水滴の調製工程（エマルション化）に支障が生じ、均一なエマルションを得ることができないという問題に直面した。この問題に対処すべく試行錯誤を繰り返した結果、従来は回転処理や溶液の混合操作によってエマルション化していたところをタッピングによる攪拌に置き換えることにより、均一性の高いエマルションを再現性よく形成させることに成功した。そして、このようにして得られたエマルションを用い、油中水滴遠心界面通過法でリポソームの形成を試みたところ、効率的にかつ再現性よくジャイアントリポソームを得ることができた。
【０００７】
小スケール化に成功したことにより、特に油中水滴遠心界面通過法を実施する際の時間が短くなり、従来よりも短時間でジャイアントリポソームを調製することも可能になった。一方、得られたリポソームのサイズ分布は狭く、開発に成功した新規手法はリポソームの品質／均質性の向上にも有効であることが確認された。
【０００８】
以下の発明は、主として上記の成果及び考察に基づく
［１］以下のステップ（１）〜（３）を含む、リポソームの作製方法：
（１）両親媒性脂質を油に溶解した脂質溶液と、リポソーム内液となるサンプル溶液とを第１微小容器に入れた後、該微小容器をタッピングによって攪拌し、エマルジョン化させるステップ、
（２）リポソーム外液となる水溶液を第２微小容器に入れ、該水溶液の上に、（１）で形成されたエマルジョンを重層させた後に遠心処理し、エマルジョン中の油中水滴に油水界面を通過させるステップ、及び
（３）前記水溶液中に形成されたリポソームを回収するステップ。
［２］前記両親媒性脂質がリン脂質である、［１］に記載の作製方法。
［３］前記油が、流動パラフィン、ミネラルオイル、スクワレン、ヘキサン、ドデカン、テトラデカン、ヘキサデカン、オレイン酸、オリーブオイル、トルエン、クロロホルム、テトラヒドロフラン又はオリーブオイル、或いはこれらの中から選択される二以上の混合物である、［１］又は［２］に記載の作製方法。
［４］前記脂質溶液の量が1 pl〜100μlである、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の作製方法。
［５］前記サンプル溶液の量が1 pl〜10μlである、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の作製方法。
［６］前記サンプル溶液がスクロースを含有し、前記水溶液がグルコースを含有する、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の作製方法。
［７］前記サンプル溶液がタンパク質を含有し、前記水溶液がタンパク質を含有しない、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の作製方法。
［８］前記水溶液の量が1 pl〜100μlである、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の作製方法。
［９］前記第１微小容器及び前記第２微小容器がPCRチューブである、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の作製方法。
［１０］前記PCRチューブの容積が200μl〜500μlである、［９］に記載の作製方法。
［１１］前記遠心処理の条件が100 g〜20,000 g、1分間〜60分間である、［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の作製方法。
［１２］前記リポソームの直径が1μm〜1 mmである、［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の作製方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】リポソーム作製方法の概略図。
【図２】油中水滴遠心界面通過法の原理。
【図３】作製に成功したカルセイン封入リポソーム。(a) 位相差顕微鏡像、(b) 蛍光顕微鏡像。
【図４】作製に成功したプラスミドDNA封入リポソーム。(a) 位相差顕微鏡像、(b) 偏光顕微鏡像。
【図５】リポソームに封入したチューブリンの重合活性の評価。(a) チューブリン封入リポソームから膜突起が伸長する過程（経時的な変化）、(b) 膜突起長の時間変化。
【図６】ジャイアントリポソーム（細胞サイズリポソーム）の用途・応用の例。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は新規なリポソーム作製方法を提供する。本発明の作製方法では以下のステップ（１）〜（３）がこの順序で行われる。
（１）両親媒性脂質を油に溶解した脂質溶液と、リポソーム内液となるサンプル溶液とを第１微小容器に入れた後、該微小容器をタッピングによって攪拌し、エマルション化させるステップ
（２）リポソーム外液となる水溶液を第２微小容器に入れ、該水溶液の上に、（１）で形成されたエマルションを重層させた後に遠心処理し、エマルション中の油中水滴に油水界面を通過させるステップ
（３）前記水溶液中に形成されたリポソームを回収するステップ
【００１１】
以下、図１、２を参照しつつ、各ステップの詳細を説明する。ステップ（１）はエマルションを形成するステップである。まず、微小容器を用意し、その中に脂質溶液とサンプル溶液を投入する。微小容器とは、容積が非常に少ない容器であり、好ましくは、微量の内容物の混合及び攪拌を容易にすべく、円柱形や円錐形である。底部形状は特に限定されず、例えば、丸底や平底の微小容器を用いることができる。PCRチューブ（微小遠心管）は好適な微小容器の一つである。例えば、容積が200μl〜500μlのPCRチューブを微小容器として採用することが好ましい。該当するPCRチューブは市販されており（例えば理科研株式会社等が提供する）、容易に入手することができる。尚、微小容器に関する以上の説明は、ステップ（２）で使用する微小容器についても当てはまる。
【００１２】
脂質溶液は両親媒性脂質を油に溶解することによって調製される。両親媒性脂質とは、親水性の部分（頭部）と疎水性の脂肪酸が結合したものであり、一分子内に親水性部分と疎水性部分を合わせ持つ。両親媒性脂質の例としてリン脂質を挙げることができる。リン脂質の具体例は、ホスファチジルコリンに加えて、ホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、POホスファチジルコリン（POPC）、POホスファチジルグリセロール（POPG）、ジパルミチルホスファチジルコリン（DPPC）、ホスファチジルイノシトール及びそのリン酸化脂質、などである。二種類以上の両親媒性脂質を併用することにしてもよい。
【００１３】
両親媒性脂質に対する溶媒としての油は、使用する両親媒脂質が溶解するものであれば特に限定されない。例えば、流動パラフィン、ミネラルオイル、スクワレン、ヘキサン、ドデカン、テトラデカン、ヘキサデカン、オレイン酸、オリーブオイル、トルエン、クロロホルム、テトラヒドロフラン又はオリーブオイル等を用いることができる。二種類以上の油を併用することもできる。
【００１４】
両親媒性脂質、及び溶媒としての油以外の成分を脂質溶液が含有していてもよい。例えば、コレステロール、タンパク質、ペプチド、糖脂質、核酸（DNA、RNA）、生理活性を有する化合物等を脂質溶液の追加成分として用いることができる。
【００１５】
サンプル溶液はリポソーム内液を構成することになる。従って、リポソームに封入すべき物質を含有するサンプル溶液を用意する。例えば、特定の反応系（例えば、核酸合成、タンパク質合成、タンパク質修飾、タンパク質分解）や代謝系（例えば、薬剤代謝、エネルギー代謝）の構築に必要な成分（例えば、一又は二つ以上の酵素とその基質、各酵素の調節因子、薬剤代謝に必要な酵素群）、特定の運動ないし変形（例えば伸縮）に必要な成分（例えば、微小管の構成要素であるチューブリン、アクチン線維の構成要素であるアクチン、分子モータータンパク質であるダイニン、キネシン又はミオシン）を含むサンプル溶液を用いることができる。
【００１６】
脂質溶液の量は、例えば1 pl〜100μl、好ましくは500 nl〜50μl、更に好ましくは5μl〜20μlである。一方、サンプル溶液の量は、例えば1 pl〜10μl、好ましくは1 nl〜10μl、更に好ましくは0.1μl〜10μlである。このように少量であること（即ち小スケール）は本発明の特徴の一つである。
【００１７】
本発明では、上記のごとき脂質溶液とサンプル溶液を微小容器（説明の便宜上、「第１微小容器」と呼ぶ）に入れた後、当該微小容器をタッピングする。この操作によって脂質溶液とサンプル溶液が激しく攪拌されてエマルション化（乳化）し、エマルション（乳化液）が得られる。従来の方法ではローテーターなどを利用した回転やピペッティングによる液の混合操作によってエマルション化を行っていたのに対し、本発明ではタッピングという特有の攪拌操作を行う。タッピングとは、指や棒などによって微小容器の底部（内容物が存在する部位）を弾くこと、或いは微小容器の上部を把持し、スナップを利かせて底部を壁面等に打ち付けること等によって、内容物に断続的かつ急激な衝撃を与えることをいう。理論に拘泥する訳ではないが、タッピングによって内容物の全体に衝撃が繰り返し加えられる結果、剪断力が加わることで効率的なエマルション化が達成されると考えられる。エマルション化の手段として、簡便な操作ではあるものの従来の方法で採用される操作とは一線を画すタッピングを採用したことが、小スケール化の成功をもたらした最大の要因といえる。
【００１８】
ステップ（１）に続くステップ（２）では、まず、別の微小容器（説明の便宜上、「第２微小容器」と呼ぶ）を用意し、その中に水溶液を入れる。当該水溶液はリポソーム外液を構成することになる。
【００１９】
次に、上記水溶液の上に、ステップ（１）で形成されたエマルションを重層させる。これによって油水界面が形成される。油水界面にはエマルション内の遊離両親媒性脂質が親水性部分を上記水溶液（リポソーム外液）側にして整列する。続く遠心処理によってエマルション中の油中水滴に油水界面を通過させると、通過の際、油水界面に整列した両親媒性脂質に被覆され、脂質二重膜の小胞（即ちリポソーム）がリポソーム外液中に形成される（図２を参照）。
【００２０】
遠心処理の条件は、油中水滴遠心界面通過法の原理に従ってリポソームが形成される限りにおいて特に限定されない。遠心処理の条件を例示すれば、10,000 g〜20,000 g、5分間〜30分間である。
【００２１】
リポソーム外液となる水溶液の量は特に限定されないものの、小スケールであるという本発明の特徴を活かすためには当該水溶液の量も少なくすることが好ましい。そこで、当該水溶液の量を例えば1 pl〜100μl、好ましくは100 nl〜100μl、更に好ましくは10μl〜20μlとする。リポソーム内液となるサンプル溶液の量との関係で示せば、リポソーム内液の量と当該水溶液（リポソーム外液）の量の比を１：２０〜２：２０にするとよい。
【００２２】
安定した形状のリポソームの形成を可能にするためにはリポソームの内液と外液の浸透圧に大きな差が生じないようにすることが望まれる。従って、特定の目的の下、意図的に浸透圧に差を設ける場合は別にして、通常はリポソームの内液と外液の浸透圧が等しくなるようにリポソーム内液（即ちサンプル溶液）とリポソーム外液（即ち、ステップ（２）で用いる水溶液）の組成を設計する。一方、油中水滴遠心界面通過法の原理を利用することから、通常は、リポソーム内液の比重がリポソーム外液の比重よりも大きくなるようにする。この条件を満足させるため、例えば、リポソーム内液にスクロース（例えば0.1 M〜1 M）を添加する一方でリポソーム外液にグルコース（例えば0.1 M〜1 M）を添加する。この例のように、比重の異なる二つの物質を利用して比重の差を形成するのではなく、溶媒である水よりも比重の大きな物質（例えば、糖（グルコース、スクロース、トレハロース）、タンパク質、ペプチド、核酸等）をリポソーム内液にのみ添加したり、或いはその添加量が異なるようにリポソーム内液とリポソーム外液に添加したりすることによって、比重の差を形成することも可能である。尚、スクロースとグルコースは比重と屈折率が異なるため、リポソーム内液にスクロースをリポソーム外液にグルコースを加えておくと、界面通過の効率が上がり、且つ作製されたリポソームを位相差顕微鏡等で観察し易くなる。
【００２３】
ステップ（３）では、ステップ（２）によって形成されたリポソームを回収する。例えば、上層の脂質溶液を除去した後、第２微小容器の底部に沈降したリポソーム（ペレット）をリポソーム外液とともに別の容器に回収する。回収したリポソームは各種用途への利用に供される。
【００２４】
遠心操作の条件によってはペレットが認められず、形成されたリポソームがリポソーム外液中に浮遊状態で存在する。その場合には、リポソーム外液（リポソームが浮遊している）の回収が即ちリポソームの回収となる。
【００２５】
尚、以上の回収操作では、回収したリポソームを別の容器に移すことにしたが、上層の脂質溶液を除去することによって第２微小容器に残存したリポソームをそのまま利用に供することもできる。このような操作も、形成されたリポソームの取得をもたらすものに相違ないため、回収の一態様である。
【００２６】
本発明の作製方法によって得られるリポソームの直径は、例えば1μm〜1 mm、好ましくは1μm〜100μm、更に好ましくは5μm〜50μmである。尚、細胞のサイズは一般に数μm〜数十μm程度であるとされる。
【００２７】
本発明の作製方法によれば小スケール化が達成される。これによって、必要なサンプル量が少なくなり、稀少サンプルの微量分析が可能になる。また、小スケール化したことにより、リポソーム作製に要する時間が短くなる。この特徴は、時間の経過とともに活性が低下する試料・薬剤などを使用する場合に有利となる。一方、本発明の作製方法はサイズ分布が狭いリポソームの作製を可能にする。言い換えると、本発明の作製方法によれば均一性の高いリポソームを得ることができる。このようなリポソームはそれを利用した実験などにおいて信頼性の高い（例えばS/N比の高い）分析等を可能にする。また、光学顕微鏡による比色分析や形状分析などを容易にする。
【実施例】
【００２８】
＜実施例１＞  低分子化合物の封入（カルセイン）
１．材料
リポソーム内液：500 mM スクロース、0.1 mM カルセイン（分子量 622.53 Da）を含む水溶液
リポソーム外液： 500 mM D-グルコースを含む水溶液
脂質溶液：DOPCを流動パラフィンに10 mMとなるよう溶解したもの
【００２９】
２．封入手順
(1) 脂質溶液20μlを1.5 mlサンプルチューブに入れ、リポソーム内液1μl (100 p mol カルセインを含む）を加えた。
(2) PCRチューブの底を指先で激しく繰返し弾く事で溶液を撹拌し、白濁させた（エマルション化）。
(3) 別のPCRチューブにリポソーム外液20μlを入れ、(2)で得られた白濁液を重層した。
(4) 遠心分離機で17.8 kG、室温(25℃)、10分の条件で遠心した（界面通過）。
(5) 遠心分離機からPCRチューブを取出し、上層の脂質溶液を除去した。
(6) リポソームを含むPCRチューブ底部のペレットをリポソーム外液とともに別のPCRチューブに回収し、PCRチューブの底を軽く弾く事でペレットを分散させた。
(7) 観察までは室温(25℃)で保管した。
【００３０】
３．カルセインが封入された事の確認
リポソーム懸濁液をスライドガラス上に滴下し、リポソームの位相差顕微鏡像および蛍光顕微鏡像を撮影した。位相差像で確認されたリポソームの内部に一様な蛍光信号が分布している事から、カルセインがリポソーム内に封入されている事が確認できた（図３）。
【００３１】
＜実施例２＞  プラスミドDNAの封入
１．材料
リポソーム内液：500 mM スクロース、240 mg/ml pT7BlueプラスミドDNA（2887 bp）(Novagen製)を含む水溶液
リポソーム外液：500 mM D-グルコースを含む水溶液
脂質溶液：DOPCを流動パラフィンに10 mMとなるよう溶解したもの
【００３２】
２．封入手順
(1) 脂質溶液20μlを1.5 ml PCRチューブに入れ、リポソーム内液1μlを加えた（240μg DNAを含む）。
(2) PCRチューブの底を指先で激しく繰返し弾く事で溶液を撹拌し、白濁させた（エマルション化）。
(3) 別のPCRチューブにリポソーム外液20μlを入れ、(2)で得られた白濁液を重層した。
(4) 遠心分離機で17.8 kG、室温(25℃)、10分の条件で遠心した（界面通過）。
(5) 遠心分離機からPCRチューブを取出し、上層の脂質溶液を除去した。
(6) リポソームを含むPCRチューブ底部のペレットをリポソーム外液とともに別のPCRチューブに回収し、PCRチューブの底を軽く弾く事でペレットを分散させた。
（７） 観察までは室温(25℃)で保管した。
【００３３】
３．DNAが封入された事の確認
リポソーム懸濁液をスライドガラス上に滴下し、リポソームの位相差顕微鏡像および偏光顕微鏡像を撮影した。位相差像で確認されたリポソームの内部に十字形の暗部を持つ偏光顕微鏡像が観察された事から、濃厚なプラスミドDNAがリポソームに封入され、かつ、リポソーム内部で液晶状態をとっている事が確認できた（図４）。
【００３４】
＜実施例３＞  細胞骨格線維タンパク質（チューブリン、分子量100 kDa）の封入
１．材料
チューブリンはブタ脳より常法に従い精製した。
リポソーム内液：6.8 mg/mlチューブリン、80 mM PIPES-HCl (pH 6.8)、1 mM MgCl2、1 mM EGTA、500 mM スクロースを含む水溶液
リポソーム外液：80 mM PIPES-HCl (pH 6.8)、1 mM MgCl2、1 mM EGTA、500 mM D-グルコースを含む水溶液
脂質溶液：流動パラフィンとスクアレンを体積比9:1で混合したものに、DOPC、コレステロール、DSPE-mPEG(2000)をそれぞれ10 mM、1 mM、0.2 mMとなるように溶解したもの
【００３５】
２．チューブリンの封入手順
(1) 脂質溶液20μlをPCRチューブに入れ、リポソーム内液1μl（6.8μgチューブリンを含む）を加え、氷上に10分置いた。
(2) PCRチューブの底を指先で激しく繰返し弾く事で溶液を撹拌し、白濁させた（エマルション化）。
(3) 別のPCRチューブにリポソーム外液20 μlを入れて氷上で冷やしておき、(2)で得られた白濁液を重層した。
(4) 遠心分離機で17.8 kG、4℃、10分の条件で遠心した（界面通過）。
(5) 遠心分離機からPCRチューブを取出し、チューブ上層の脂質溶液を除去した。
(6) リポソームを含むPCRチューブ底部のペレットをリポソーム外液とともに別のPCRチューブに回収し、PCRチューブの底を軽く弾く事でペレットを分散させた。
(7) 観察までは氷上で保管した。
【００３６】
３．封入されたチューブリンの重合活性の評価
氷上で10分保管したリポソーム懸濁液をスライドガラス上に滴下して室温で保持し、5分毎にリポソームの位相差顕微鏡像を撮影した。初めは球状であったリポソームから双方向性の膜突起が時間と共に伸長した。突起の伸長はリポソーム内部のチューブリンが重合伸長して微小管が形成された事を示しており、チューブリンが重合活性を保持したままリポソームに封入された事が確認できた（図５）。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明の作製方法によれば、ジャイアントリポソームを小スケールで効率的に作製することができる。ジャイアントリポソームは各種用途に有用である（図６を参照）。例えば、細胞膜をターゲットとした抗菌物質のスクリーニング、新規薬剤のチャネル／ポンプ阻害活性の分析、タンパク質／核酸製剤のマイクロリアクターとしての利用、生体適合性の高いマイクロアクチュエータや分子ロボットの開発等に利用・応用が期待される。このように有用性の高いジャイアントリポソームの効率的な作製を可能にする本発明は創薬や微細医療の進展ないし発展に多大な貢献をし得る。
【００３８】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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