(57)【要約】【課題】本発明は、測定時の温度の影響を受けにくいイムノクロマトグラフ法、特に、測定装置に検量線を記憶させておくような場合でも、正確な測定値を得ることができるイムノクロマトグラフ法、及び該方法に用いる測定試薬を提供することを目的としている。【解決手段】イムノクロマトグラフ法であって、曇点が２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子の存在下、免疫反応を行う前記イムノクロマトグラフ法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イムノクロマトグラフ法であって、
曇点が２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子の存在下、免疫反応を行う前記イムノクロマトグラフ法。
【請求項２】
イムノクロマトグラフ法であって、
（１）サンプルパッドと（２）対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より（１）、（２）の順で配置されたテストストリップを使用し、
（ａ）生物試料及び曇点が２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子を含む溶液をサンプルパッドに添加する工程、
（ｂ）前記メンブレン上に曇点が２０〜４０℃の重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子を含む溶液を存在させた状態で、免疫反応を行う工程、
（ｃ）免疫反応生成物として、生物試料を含む溶液中の対象物質を検出する工程、
を含む、前記イムノクロマトグラフ法。
【請求項３】
生物試料が、全血、血清又は血漿である、請求項１または２に記載の検出方法。
【請求項４】
イムノクロマトグラフ法おける温度依存性の均一化方法であって、曇点が２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子の存在下、免疫反応を行う前記温度依存性の均一化方法。
【請求項５】
イムノクロマトグラフ法における温度依存性の均一化方法であって、
（１）サンプルパッドと（２）対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より（１）、（２）の順で配置されたテストストリップを使用し、
（ａ）生物試料を含む溶液をサンプルパッドに添加する工程、
（ｂ）前記メンブレン上に曇点が２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子を含む溶液を存在させた状態で、免疫反応を行う工程、
（ｃ）免疫反応生成物として、生物試料を含む溶液中の対象物質を検出する工程、
を含む、前記メンブレン上での免疫反応の温度依存性の均一化方法。
【請求項６】
イムノクロマトグラフ法であって、
（１）サンプルパッドと（２）対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より（１）、（２）の順で配置されたテストストリップを使用し、
（ａ）生物試料を含む溶液をサンプルパッドに添加する工程、
（ｂ）前記メンブレン上に曇点が２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子を含む溶液を存在させた状態で、免疫反応を行う工程、
（ｃ）免疫反応生成物として、生物試料を含む溶液中の対象物質を検出する工程、
（ｄ）検出したデータをあらかじめ求めた検量線データをもとに対象物質の量を算出する工程、
を含む前記イムノクロマトグラフ法。
【請求項７】
あらかじめ求めた検量線データが、対象物質の免疫反応温度と２℃以上異なる温度で検出されたものである、請求項６に記載のイムノクロマトグラフ法。
【請求項８】
曇点が２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子を含有するイムノクロマトグラフ用の検体希釈液。
【請求項９】
曇点が２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子を含有するイムノクロマトグラフィー用の検体希釈液と、イムノクロマトグラフ用テストデバイスとを含むイムノクロマトグラフ用試薬キット。
【請求項１０】
重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子を含有する高分子溶液であって、曇点が２０℃〜４０℃である高分子溶液を使用するイムノクロマトグラフ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノクロマトグラフ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野において、操作が簡便で、測定に要する時間が短く、かつ定量を行う場合においても小型で安価な測定装置での測定が可能なイムノクロマトグラフイーを用いた検出方法または測定方法（以下、単にこれらをイムノクロマトグラフ法という）を用いた測定試薬の普及が著しい。
【０００３】
イムノクロマトグラフ法用の測定試薬および定量測定装置においては、簡便、迅速というイムノクロマトグラフ法の特性を損なわないよう、測定の都度、検量線を作成するのではなく、測定試薬のロット毎に、基準となる検量線を測定装置に記憶させておく方式が採用されている。この場合の反応温度の管理方法としては、測定装置搭載の温度計により測定時の室内温度を計測し、測定時の室内温度に対応する係数を測定値に乗じて測定値を補正する方法が知られているが、前記係数を算出するためには大量のデータが必要であり、また試薬のロット間差を完全に補正することは実際上、困難である。
また、測定試薬が測定装置に記憶させてある基準検量線と適合する温度になるまで測定を開始できない機構を測定装置に搭載させる方式も知られているが、測定装置の小型化という要請に応えるため、冷却機能を有さずに、一定温度までの昇温機能のみを有する温度制御装置が搭載されている場合には対応できない。
以上のように、イムノクロマトグラフ法での測定装置を用いた定量測定において、反応温度の管理が重要であるが、測定試薬においてこれを解決しようという試みはなされていなかった。
【０００４】
一方、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の分野において、温度応答性ポリマーをクロマトグラフィー担体の表面に固定化することで温度変化に対する固定相表面の特性を変化させて、移動相を水系などに固定したまま分離を行う方法が開示されている（たとえば特許文献１、非特許文献１）。
しかし、イムノクロマトグラフ法における温度応答性ポリマーの利用例はこれまでにない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2007-69193号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ぶんせき  ２００４  ６，p303-305
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、２０〜４０℃の測定環境下で、測定時の温度の影響を受けにくいイムノクロマトグラフ法、特に、測定装置に検量線を記憶させておくような場合でも、正確な測定値を得ることができるイムノクロマトグラフ法、及び該方法に用いる測定試薬を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題について鋭意検討したところ、測定時の温度の影響が、イムノクロマトグラフの試料の流れの速さの影響であることを見出だし、曇点２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子の存在下で測定を行うと、測定時の温度の影響を受けにくく、装置に検量線を記憶させておくような場合でも、正確な測定値を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、以下の構成を有する。
［１］イムノクロマトグラフ法であって、
曇点が２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子の存在下、免疫反応を行う前記イムノクロマトグラフ法。
［２］イムノクロマトグラフ法であって、
（１）サンプルパッドと（２）対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より（１）、（２）の順で配置されたテストストリップを使用し、
（ａ）生物試料及び曇点が２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子を含む溶液をサンプルパッドに添加する工程、
（ｂ）前記メンブレン上に曇点が２０〜４０℃の重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子を含む溶液を存在させた状態で、免疫反応を行う工程、
（ｃ）免疫反応生成物として、生物試料を含む溶液中の対象物質を検出する工程、
を含む、前記イムノクロマトグラフ法。
［３］生物試料が、全血、血清又は血漿である、［１］または［２］に記載の検出方法。
［４］イムノクロマトグラフ法おける温度依存性の均一化方法であって、曇点が２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子の存在下、免疫反応を行う前記温度依存性の均一化方法。
［５］イムノクロマトグラフ法における温度依存性の均一化方法であって、
（１）サンプルパッドと（２）対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より（１）、（２）の順で配置されたテストストリップを使用し、
（ａ）生物試料を含む溶液をサンプルパッドに添加する工程、
（ｂ）前記メンブレン上に曇点が２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子を含む溶液を存在させた状態で、免疫反応を行う工程、
（ｃ）免疫反応生成物として、生物試料を含む溶液中の対象物質を検出する工程、
を含む、前記メンブレン上での免疫反応の温度依存性の均一化方法。
［６］イムノクロマトグラフ法であって、
（１）サンプルパッドと（２）対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より（１）、（２）の順で配置されたテストストリップを使用し、
（ａ）生物試料を含む溶液をサンプルパッドに添加する工程、
（ｂ）前記メンブレン上に曇点が２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子を含む溶液を存在させた状態で、免疫反応を行う工程、
（ｃ）免疫反応生成物として、生物試料を含む溶液中の対象物質を検出する工程、
（ｄ）検出したデータをあらかじめ求めた検量線データをもとに対象物質の量を算出する工程、
を含む前記イムノクロマトグラフ法。
［７］あらかじめ求めた検量線データが、対象物質の免疫反応温度と２℃以上異なる温度で検出されたものである、［６］に記載のイムノクロマトグラフ法。
［８］曇点が２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子を含有するイムノクロマトグラフ用の検体希釈液。
［９］曇点が２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子を含有するイムノクロマトグラフィー用の検体希釈液と、イムノクロマトグラフ用テストデバイスとを含むイムノクロマトグラフ用試薬キット。
［１０］重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子を含有する高分子溶液であって、曇点が２０℃〜４０℃である高分子溶液を使用するイムノクロマトグラフ法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により提供されるイムノクロマトグラフ法は、２０〜４０℃の測定環境下で、測定時の温度の影響を受けにくく、装置に検量線を記憶させておくような場合でも、正確な測定値を得ることができる。従って、本発明のイムノクロマトグラフ法を用いれば、温度制御機構が簡易な装置を用いて、冬季あるいは夏季に測定を行う場合であっても正確な測定をすることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のイムノクロマト用デバイスの一態様を示す図である。
【図２】０．１％、０．３％、０．５％のＮＩＰＡＭを含有する検体希釈液を用いて試料中のＣＲＰ濃度を１５℃、２７℃、３０℃で１〜１０分間経時的に測定した結果を示すグラフである。比較としてＮＩＰＡＭを含まない検体希釈液を用いた場合についても測定した。
【図３】０．３％、０．５％のＮＩＰＡＭを含有する検体希釈液を用いて試料中のＣＲＰ濃度を１５℃、２７℃、３０℃で１〜１０分間経時的に測定した結果を示すグラフである。
【図４】０．０２％のＮＩＰＡＭ−５ＭＡを含有する検体希釈液を用いて試料中のＣＲＰ濃度を２０℃、２７℃、３０℃で１〜１０分間経時的に測定した結果を示すグラフである。
【図５】０．０２％のＮＩＰＡＭ−５ＭＡを含有する検体希釈液を用いて試料中のＣＲＰ濃度を２０℃、２７℃、３０℃で１〜１０分間経時的に測定した結果を示すグラフである。
【図６】０．０８％のＮＩＰＡＭ−５ＭＡを含有する検体希釈液を用いて試料中のヘモグロビン濃度を２５℃、３０℃で５〜１０分間経時的に測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（曇点が２０〜４０℃の高分子）
本発明の高分子の曇点は、２０℃〜４０℃であり、好ましくは、２２℃〜３５℃であり、更に好ましくは、２４℃〜３３℃である。
曇点とは、透明または半透明な液体で温度変化によって相分離が起き、その結果不透明になる温度のことであり、下限臨界溶解(溶液,共溶)温度とも呼ばれる。
本発明に用いられる曇点が２０℃〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子としては、例えば、曇点が２０〜４０℃の温度応答性高分子、曇点が２０〜４０℃の界面活性剤、曇点が２０〜４０℃の親水性高分子等が挙げられる。
上記温度応答性高分子としては、例えば、アルキル（メタ）アクリルアミドの単独重合体、又はアルキル（メタ）アクリルアミド−（メタ）アクリル酸の共重合体であり、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（単独重合体の曇点２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（以下、ＮＩＰＡＭということがある）（同３２℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）等の単独重合体、又は共重合体が挙げられ、好ましくは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの単独重合体、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドと（メタ）アクリル酸を重合性単量体の単位とし、両者が共重合したものであり、更に好ましくは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの単独重合体、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとメタクリル酸を重合性単量体の単位とし、両者が共重合したものである（以下、ＮＩＰＡＭ−ＭＡという。
【００１３】
単独重合体の場合は、重量平均分子量により、共重合体の場合は、重量平均分子量と共重合体の中の(メタ)アクリル酸の含有量によりその特性が決定される。
当該単独重合体、共重合体は、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社より種々の重量平均分子量の単独重合体、又は(メタ)アクリル酸含有量の共重合体を購入することができる。
本発明において単独重合体の重量平均分子量は、５，０００〜５０，０００が好ましく、１０，０００〜４０，０００が更に好ましく、更により好ましくは１２，０００〜４０，０００である。
共重合体の重量平均分子量は、５，０００〜６０，０００が好ましく、２５，０００〜６０，０００が更に好ましく、共重合体中の（メタ）アクリル酸含有量は、０．１〜１０ｍｏｌ％が好ましく、ＮＩＰＡＭと５ｍｏｌ％のメタクリル酸との共重合体（製品名：ＮＩＰＡＭ−５ＭＡ）が好適に用いられる。
【００１４】
本発明のイムノクロマトグラフ法において、曇点２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子を測定系に存在させる方法としては、（Ａ）溶液の状態で予め試料と混合する方法及び（Ｂ）イムノクロマトグラフ用デバイスの部材の１以上に含有させる方法がある。
【００１５】
（Ａ）の方法としては、試料の希釈液に曇点２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子を含有させる方法がある。アルキル（メタ）アクリルアミドの単独重合体、又はアルキル（メタ）アクリルアミド−（メタ）アクリル酸の共重合体の場合、希釈液におけるアルキル（メタ）アクリルアミドの単独重合体、又はアルキル（メタ）アクリルアミドの単独重合体の濃度は、好ましくは、０．１〜1重量％、更に好ましくは０．２〜０．６重量％、最も好ましくは０．３重量％〜０．５重量％であり、アルキル（メタ）アクリルアミド−（メタ）アクリル酸の共重合体の濃度は、好ましくは０．０１〜０．１重量％、更に好ましくは０．０２重量％〜０．０８重量％である。また試料と希釈液の混合比率（希釈倍率）は、試料中の検出対象物質の濃度、イムノクロマトグラフ法の定量上限及びサンプルパッドに添加するサンプル量等を考慮して実験的に設定することができる。例えば全血中のＣＲＰを検出対象物質とし、イムノクロマトグラフ法の定量下限が０．２ｍｇ／ｄＬ、定量上限が１５ｍｇ／ｄＬである場合には、１５１倍希釈が好適である。また、前記希釈液には、試料と希釈液を別々にイムノクロマトグラフに添加するような場合も含まれる。そのような場合、希釈液を展開液ということがある。
【００１６】
本発明の、曇点２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子は、適当な緩衝液に溶解して使用するのが好ましい。抗原や抗体等の安定性、感度等、イムノクロマトグラフ法の性能に悪影響を与えないことを限度としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液等イムノクロマトグラフ法に使用される緩衝剤はいずれも使用することができる。この場合の好適なｐＨ範囲は５．５〜８．０である。また、イムノクロマトグラフ法において使用される添加剤（非特異的反応の抑制物質、増感剤、安定化剤、防腐剤）も同様である。
【００１７】
以下、（Ｂ）の方法を、イムノクロマトグラフ用デバイスの説明と合わせて行う。
本発明のイムノクロマトグラフ用デバイスは、（１）サンプルパッド、（２）検出対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より（１）、（２）の順で配置されている。
以下、検出対象物質を抗原、検出対象物質と特異的に結合可能な成分を抗抗原特異抗体（以下、特異抗体ということがある）とし、２以上の特異抗体で抗原−特異抗体複合体を形成させて検出を行うサンドイッチ法を例に、図１を参照しながら説明する。なお、本明細書において「上流」、「下流」とは、サンプルの流れる方向の上流側、下流側という意味で用いる。すなわち、本発明のイムノクロマト用デバイスで上からサンプルパッド、コンジュゲートパッド、サードパッド、不溶性メンブレンが一部で重なるように積層されている場合、サンプルパッドがもっとも上流であり、不溶性メンブレンが下流ということになる。また、不溶性メンブレンの下流側端部が重なるように上にエンドパッドが積層されることがあるが、この場合、エンドパッドがもっとも下流である。
【００１８】
「イムノクトマトグラフ用デバイスの製造方法」
（サンプルパッド）
本発明において、「サンプルパッド」とは、サンプルを受け入れるサンプル供給部を担う部位であり、パッドに成型された状態で液体のサンプルを吸収し、液体と検出対象物の成分とが通り抜けることができる物質及び形態であればいずれのものをも含む。
その場合、曇点２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子は、サンプルパッドの少なくとも一部に含まれていればよく、全部に含ませておくこともできる。
また、サンプルパッドには、緩衝液を含ませておくこともできる。その場合、サンプルパッドの少なくとも一部に含まれていればよく、全部に含ませることもできる。
サンプルパッドに適した材料の具体例として、ガラス繊維（グラスファイバー）、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が含まれるが、これらに限定されない。好適には、グラスファイバー製パッドが用いられる。該サンプルパッドには、後述するコンジュゲートパッドの機能を併せ持たせることも出来る。また、サンプルパッドには、本発明の目的を逸脱せず、反応系に影響のない範囲において、必要に応じ通常使用されるブロッキング試薬を含ませることもできる。
本発明の、曇点２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子は、サンプルパッドにあらかじめ添加して乾燥することで保持させておいてもよい。
【００１９】
（メンブレン）
検出対象物質と特異的に結合可能な成分（抗抗原特異抗体）が固定化されたメンブレンは、特異抗体を含有する溶液を線状に塗布することによって得ることができる。当該線状に塗布された特異抗体は、抗原をメンブラン上に捕捉、濃縮する役割を担う。
使用するメンブレンの材質は、任意の材質のものが使用できる。例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類あるいはセラミックス等が挙げられるがこれらに限定されない。具体的には、メルク社、東洋濾紙社、ワットマン社などより販売されているガラス繊維ろ紙やセルロースろ紙などなどが好適に用いられる。
なお、特異抗体としては、免疫グロブリン分子自体の他、例えば、Ｆ（ａｂ’）2のような断片であってもよい。更に抗体としてはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらを用いてもかまわない。また遺伝子組み換え技術の利用やＤＮＡ免疫法の採用など、取得方法のよる制限を受けない。
【００２０】
（コンジュゲートパッド）
抗原−特異抗体複合体を検出するためには、標識物質で標識された特異抗体が必要でありこれをコンジュゲートと呼ぶ。標識物質としては、酵素（パーオキシダーゼなど）、発色あるいは発光性の色素（フルオレセインなど）、金属コロイド（金コロイド）、着色された微粒子（カラーラテックスなど）などが好適に用いられる。
このコンジュゲートを溶液状態で使用する場合には、予め試料と混合して使用したり、試料をサンプルパッドに添加後にサンプルパッドに添加したりすることができる（上記した（Ａ）の態様に含まれる）。イムノクロマト用デバイスが、コンジュゲートパッドを有する場合には、これに含浸させておき、イムノクロマト用デバイスを構成することができる。
その場合、曇点２０〜４０℃、重量平均分子量１，０００〜１００，０００の高分子は、コンジュゲートパッドの少なくとも一部に含まれていればよく、全部に含ませておくこともできる。
コンジュゲートパッドの材質としては、紙、セルロース混合物、ニトロセルロース、ポリエステル、アクリロニトリルコポリマー、ガラス繊維またはレーヨンのような不織繊維が挙げられるが、これらに限定されない。好適には、グラスファイバー製パッドが好適に用いられる。
なお、サンプルパッドがコンジュゲートパッドの機能を兼ね備えている場合には、一の部材でサンプルパッド及びコンジュゲートパッドを有するものとみなす。
【００２１】
（３ｒｄパッド）
本発明のイムノクロマト用デバイスには、検体（サンプル）中の非特異抑制物質を補足する目的、全血中の血球を捕捉する目的で３ｒｄパッド（血球分離用パッド）を有していてもよい。３ｒｄパッド（血球分離パッド）を有する場合には、上流からサンプルパッド、コンジュゲートパッド、の順で配置されるのが好ましいが、これに限定されない。３ｒｄパッド（血球分離パッド）の材質はガラス繊維（グラスファイバー）、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が好適である。
【００２２】
（その他）
イムノクロマトグラフ用デバイスの製造方法は、抗原や抗体等の安定性、感度等、イムノクロマトグラフ法の性能に悪影響を与えないことを限度としてイムノクロマトグラフ法に使用される技術（例えばブロッキング）であればいずれも使用することができる。また、イムノクロマトグラフ法において使用される添加剤（非特異的反応の抑制物質、増感剤、保湿剤、安定化剤、防腐剤）も同様である。
【００２３】
(その他）
本発明のイムノクロマトグラフ用デバイスによる検出対象物質の検出方法は、特に制限を受けないが、吸光度や反射光強度を検知する機器を用いた定量法においてその効果を最大に享受することができる。
【００２４】
（検出対象）
本発明における検出対象物質は、抗原抗体反応に利用できるものであれば制限を受けないが、臨床検査において、全血での測定要望が高い、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）、ヘモグロビン、ヒトフィブリノーゲン、ＤＤダイマー、ＢＮＰ、ｈＦＡＢＰ等が好適に挙げられる。
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
［試験例］イムノクロマトグラフ用デバイスの作製
（１）金コロイド標識抗ＣＲＰ抗体（コンジュゲート）の作製
抗ＣＲＰモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ：０８２０７）を２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で抗体濃度２０μｇ／ｍＬの抗体液に調製し、１ ＯＤ／ｍＬの金コロイド粒子（粒径３０ｎｍ）溶液２０ｍＬに対し、１ｍＬの抗体液を添加し、室温で１０分間撹拌した。金コロイド粒子−抗体混合液に対し、５重量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を２ｍＬ添加し、さらに５分間撹拌後、１０℃にて、１０，０００ｒｐｍで４５分間遠心し、沈渣（コンジュゲート）を得た。得られたコンジュゲートに対し、Conjugate Dilution Buffer（Scripps社製）を１．２ｍＬ添加し、コンジュゲートを懸濁させた。各コンジュゲートの最大吸収波長における吸光度を測定した。
なお、抗体は、便宜上、それぞれを産生するハイブリドーマのクローン名で表している（以下同じ）。
【００２６】
（２）コンジュゲートパッドの作製
上記（１）で調製したコンジュゲートを、１５ ＯＤ／ｍＬ、３重量％ＢＳＡ、４重量％スクロースを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈し、コンジュゲート溶液を作製した。これを、一定体積のグラスファイバー製パッド（日本ポール社、Ｎｏ.８９６４）に、該パッド体積の１．２倍容量滲みこませた。ドライオーブン内で７０℃、３０分間加温することにより乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。また、必要に応じ、増感剤などの添加剤を添加する場合には、前記コンジュゲート溶液に必要量を添加した後、同様の操作を行えばよい。
【００２７】
（３）抗ＣＲＰ抗体固定化メンブレンの作製
抗ＣＲＰモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ：０８２１０）を１ｍｇ／ｍＬになるように、２．５重量％スクロースを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）として調製し、ニトロセルロースメンブレン（ミリポア社、ＨＦ２４０またはＨＦ１８０）の短辺の一端の内側の位置に抗ＣＲＰモノクローナル抗体（テストライン）を、約５ｍｍの間隔をあけて抗免疫グロブリン抗体（コントロールライン）を、イムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯ  ＤＯＴ社）を用いて、０．７５μＬ／ｃｍとなるようにライン状に塗布した。ドライオーブン内で７０℃、４５分乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。
【００２８】
（４）サンプルパッドの作製
２４ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．５重量％スクロース及び３０ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミンテトラ酢酸を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）を、一定体積に切断したグラスファイバー製パッド（Ｌｙｄａｌｌ社）に、該パッド体積の１．１５倍容量滲みこませた。ドライオーブン内で７０℃、４５分乾燥し、サンプルパッドとした。
【００２９】
（５）テストストリップの作製
プラスチックス製粘着シート（ａ）に上記抗体固定化メンブレン（ｂ）を貼り、展開上流部側に抗ＣＲＰモノクローナル抗体（テストライン）（ｃ）、次いで抗免疫グロブリン抗体（コントロールライン）（ｄ１）の順に塗布部を配置し、さらにグラスファイバー製パッドからなる３ｒｄパッド（ｉ）を装着した。次いで、上記２）で作製したコンジュゲートパッド（ｅ）を配置装着し、さらにこのコンジュゲートパッドに重なるように上記４）で作製したサンプルパッド（ｆ）を配置装着し、反対側の端には吸収パッド（ｇ）を配置装着した。また、最後に抗体固定化メンブレンおよび吸収パッドを被覆するように、上面にポリエステルフィルム（ｈ）を配置装着し、ラミネート加工した。このように各構成要素を重ね合わせた構造物に切断してテストストリップを作製した。該テストストリップは、アッセイの際、プラスチックス製の専用のハウジング（サンプル添加窓部、サンプル検出窓部及びテストライン検出窓部を有する、図１中図示せず）に格納・搭載し、テストデバイスの形態にした。図１にテストストリップの模式構成図を示した。
【００３０】
（６）検体希釈液の作製
Ｔｗｅｅｎ２０を終濃度で０．０１重量％含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に防腐剤を添加し、０．４５μｍフィルターで濾過した液体を本試薬の検体希釈液とした。
【００３１】
［比較例１］ＣＲＰ濃度の測定  
以下の操作を２０℃、２７℃、３０℃の恒温槽内で行った。前記「試験例」で作成したイムノクロマトグラフ用試薬を使用した。全血試料又は血漿試料を検体希釈液でそれぞれ１５１倍希釈し、テストストリップのサンプル滴下窓に滴下して、イムノクロマトグラフ定量装置ラピッドピア（登録商標、積水メディカル社製）でＣＲＰ濃度測定を行った。各試料の測定はｎ＝３で行い平均値を算出した。算出した平均測定値は２７℃での平均測定値を１００として％で表示した。
【００３２】
測定結果を表１に示した。本結果によれば温度依存的に相対測定値の増加が確認された。
【００３３】
【表１】
2018128366.tif 000002
【００３４】
［実施例１］ＣＲＰ濃度の測定
以下の操作を１５℃、２７℃、３０℃の恒温槽内で行った。試験例で作成したイムノクロマトグラフ用試薬を使用した。各血漿試料をそれぞれ０．１％、０．３％、０．５％のＮＩＰＡＭ（重量分子量２０，０００〜４０，０００）（Ｓｉｇｍａ−ＡＬＤｒｉｃｈ社製）（曇点３２℃）を含有する検体希釈液でそれぞれ１５１倍希釈し、テストストリップのサンブル添加窓に添加して、イムノクロマトグラフ定量装置ラピッドピア（登録商標、積水メディカル社製）でＣＲＰ濃度測定を行った。
また、比較のために、ＮＩＰＡＭを含まない検体希釈液についても同様に測定を行った。
【００３５】
測定結果を図２に示した。
ＮＩＰＡＭを含有しない検体希釈液(従来希釈液）を用いた場合は、低値(０．３０ｍｇ／ｄＬ)、中値(２．９０ｍｇ／ｄＬ)、高値(６．９７ｍｇ／ｄＬ)の測定値において温度の影響が見られた。
これに対して、０．１％、０．３％、０．５％ＮＩＰＡＭを含有した検体希釈液を用いた場合は、低値、中値、高値の測定値ともに温度の影響が小さくなり、特に、０．３％、０．５％ＮＩＰＡＭの含有で温度の影響がほとんどなくなった。
【００３６】
［実施例２］ＣＲＰ濃度の測定
１．測定方法
以下の操作を１５℃、２７℃、３０℃の恒温槽内で行った。試験例で作成したイムノクロマトグラフ用試薬を使用した。各血漿試料をそれぞれ０．３％、０．５％ＮＩＰＡＭ（重量分子量２０，０００〜４０，０００）を含有する検体希釈液でそれぞれ１５１倍希釈し、テストテストストリップのサンブル添加窓に添加して、イムノクロマトグラフ定量装置ラピッドピア（積水メディカル社製）でＣＲＰ濃度測定を行った。
【００３７】
２．測定結果
測定結果を図３に示した。０．３％、０．５％ＮＩＰＡＭ含有希釈液を用いることにより、低値、高値の測定値ともに温度の影響を受けなかった。
【００３８】
［実施例３］ＣＲＰ濃度の測定
１．測定方法
以下の操作を２０℃、２７℃、３０℃の恒温槽内で行った。試験例で作成したイムノクロマトグラフ用試薬を使用した。血漿試料を０．０２％ＮＩＰＡＭ−５ＭＡ（重量平均分子量５０，０００、ＭＡ含量５ｍｏｌ％）（Ｓｉｇｍａ−ＡＬＤｒｉｃｈ社製）を含有する検体希釈液でそれぞれ１５１倍希釈し、テストテストストリップのサンブル添加窓に添加して、イムノクロマトグラフ定量装置ラピッドピア（積水メディカル社製）でＣＲＰ濃度測定を行った。
【００３９】
２．測定結果
測定結果を図４に示した。０．０２％のＮＩＰＡＭ−５ＭＡ含有希釈液を用いることにより、測定値が温度の影響を受けなかった。
【００４０】
［実施例４］ＣＲＰ濃度の測定
１．測定方法
以下の操作を２０℃、２７℃、３０℃の恒温槽内で行った。試験例で作成したイムノクロマトグラフ用試薬を使用した。血漿試料を０．０２％ＮＩＰＡＭ−５ＭＡ（重量平均分子量５０，０００、ＭＡ含量５ｍｏｌ％）を含有する検体希釈液でそれぞれ１５１倍希釈し、テストテストストリップのサンブル添加窓に添加して、イムノクロマトグラフ定量装置ラピッドピア（積水メディカル社製）でＣＲＰ濃度測定を行った。
【００４１】
２．測定結果
測定結果を図５に示した。０．０２％ＮＩＰＡＭ−５ＭＡの含有希釈液を用いることにより、測定値が温度の影響を受けなかった。
【００４２】
〔実施例５〕ヘモグロビン濃度の測定
１．測定方法
以下の操作を２５℃、３０℃の恒温槽内で行った。前記試験例の抗ＣＲＰモノクローナル抗体を抗ヘモグロビンモノクローナル抗体に置き換えた以外は同様の方法により作成したイムノクロマトグラフ用試薬を使用した。
全血試料を０．０８％ＮＩＰＡＭ−５ＭＡ（重量平均分子量５０，０００、ＭＡ含量５ｍｏｌ％）を含有する検体希釈液でそれぞれ１５１倍希釈し、テストテストストリップのサンブル添加窓に添加して、イムノクロマトグラフ定量装置ラピッドピア（積水メディカル社製）でヘモグロビン濃度測定を行った。ヘモグロビン濃度は、ブロゾーン以上の減衰領域で測定した
【００４３】
２．測定結果
測定結果を図６に示した。０．０８％ＮＩＰＡＭ−５ＭＡの含有希釈液を用いることにより、測定値が温度の影響を受けなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明のイムノクロマトグラフ法によれば、測定時の温度の影響を受けにくく、装置に検量線を記憶させておくような場合でも、正確な測定値を得ることができる。従って、本発明のイムノクロマトグラフ法を用いれば、温度制御機構が簡易的なものでも、一年中安定して正確な測定をすることが可能になる。
【符号の説明】
【００４５】
（ａ）プラスチックス製粘着シート
（ｂ）抗体固定化メンブレン
（ｃ）抗ＣＲＰモノクローナル抗体（テストライン）
（ｄ１）抗免疫グロブリン抗体（コントロールライン）
（ｅ）コンジュゲートパッド
（ｆ）サンプルパッド
（ｇ）吸収パッド
（ｈ）ポリエステルフィルム
（ｉ）３ｒｄパッド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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