(57)【要約】【課題】複数の微生物種が存在する系においてもノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を特異的に検出することができるノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の検出方法、及び、そのために用いられるキットを提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、ノボスフィンゴビウム属細菌の検出方法であって、被検ＤＮＡを鋳型に、配列番号１に記載の塩基配列のうち連続した９４塩基以上１３６塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いて、ヌクレオチドを増幅させ、増幅産物を得る第一工程と、  増幅産物を検出する第二工程と、を有する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノボスフィンゴビウム属細菌の検出方法であって、
被検ＤＮＡを鋳型に、配列番号１に記載の塩基配列のうち連続した９４塩基以上１３６塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いて、ヌクレオチドを増幅させ、増幅産物を得る第一工程と、
増幅産物を検出する第二工程と、を有する方法。
【請求項２】
第一工程において用いるプライマーが、配列番号２に記載の塩基配列との相違塩基数が２以下である塩基配列を含む第一のプライマー、及び、配列番号３に記載の塩基配列との相違塩基数が２以下である塩基配列を含む第二のプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一工程において用いるプライマーが、配列番号２に記載の塩基配列を含む第一のプライマー、及び、配列番号３に記載の塩基配列を含む第二のプライマーである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ノボスフィンゴビウム属細菌の検出に用いられるキットであって、
配列番号２に記載の塩基配列との相違塩基数が２以下である塩基配列を含む第一のプライマー、及び、配列番号３に記載の塩基配列との相違塩基数が２以下である塩基配列を含む第二のプライマーからなるプライマーセットを有するキット。
【請求項５】
第一のプライマーが、配列番号２に記載の塩基配列を含むプライマーであり、第二のプライマーが、配列番号３に記載の塩基配列を含むプライマーである、請求項４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノボスフィンゴビウム属細菌の検出方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
排水処理に用いられる活性汚泥には様々な種類の微生物が含まれており、その中でも、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌は、単環芳香族炭化水素や多環芳香族炭化水素を含む油分の分解に寄与することが知られている（特許文献１）。このとき、排水中の油分の量及び排水処理に要求される処理スピードに応じて、活性汚泥中のノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の量をモニタリングし、調節することが望まれている。そのためには、複数の微生物種が存在する活性汚泥からノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌のみを迅速に検出することが課題となる。
【０００３】
非特許文献１では、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の検出のための所定のプライマーが報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−９７９３４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｒｕｔｅｂｅｍｂｅｒｗａ Ａら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ. ２０１４ Ｏｃｔ ２３;９（１０）:ｅ１１１１５０.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、本発明者らが非特許文献１に記載のプライマーを用いて、活性汚泥からノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の検出を試みたところ、必ずしもノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を特異的に検出できるわけではなかった。このような問題が生じると、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の定量性が必ずしも十分ではなく、排水中の油分除去反応を制御することが難しくなる。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑み、複数の微生物種が存在する系においてもノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を特異的に検出することができるノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の検出方法、及び、そのために用いられるキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、活性汚泥に存在するノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の特定の領域が、複数の微生物種が存在する系におけるノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の特異的検出に有用であることを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の［１］から［５］に関する。
［１］ノボスフィンゴビウム属細菌の検出方法であって、
被検ＤＮＡを鋳型に、配列番号１に記載の塩基配列のうち連続した９４塩基以上１３６塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いて、ヌクレオチドを増幅させ、増幅産物を得る第一工程と、
増幅産物を検出する第二工程と、を有する方法。
［２］第一工程において用いるプライマーが、配列番号２に記載の塩基配列との相違塩基数が２以下である塩基配列を含む第一のプライマー、及び、配列番号３に記載の塩基配列との相違塩基数が２以下である塩基配列を含む第二のプライマーである、［１］に記載の方法。
［３］第一工程において用いるプライマーが、配列番号２に記載の塩基配列を含む第一のプライマー、及び、配列番号３に記載の塩基配列を含む第二のプライマーである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ノボスフィンゴビウム属細菌の検出に用いられるキットであって、
配列番号２に記載の塩基配列との相違塩基数が２以下である塩基配列を含む第一のプライマー、及び、配列番号３に記載の塩基配列との相違塩基数が２以下である塩基配列を含む第二のプライマーからなるプライマーセットを有するキット。
［５］第一のプライマーが、配列番号２に記載の塩基配列を含むプライマーであり、第二のプライマーが、配列番号３に記載の塩基配列を含むプライマーである、［４］に記載のキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、複数の微生物種が存在する系においてもノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を特異的に検出することができるノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の検出方法、及び、そのために用いられるキットを提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１２】
＜共通する用語の説明＞
以下、本明細書で共通して用いられる用語は、特記しない限り、以下の意味である。
Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ.ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６は、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６、原寄託日：２０１６年５月２６日）として、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ、住所：〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）にブダペスト条約に基づいて寄託されている菌株を意味する。
Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ.ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６７は、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６７、原寄託日：２０１６年５月２６日）として、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ、住所：〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）にブダペスト条約に基づいて寄託されている菌株を意味する。
【００１３】
＜ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の検出方法＞
本実施形態のノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の検出方法は、
被検ＤＮＡを鋳型に、配列番号１に記載の塩基配列のうち連続した９４塩基以上１３６塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いて、ヌクレオチドを増幅させ、増幅産物を得る第一工程と、
増幅産物を検出する第二工程と、を有する。
【００１４】
第一工程で被検ＤＮＡから増幅産物が得られ、第二工程でその増幅産物を検出することができた場合、その被検ＤＮＡには、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌由来のＤＮＡが含まれると判定することができる。
なお、特異的に検出されたノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を定量してもよい。
定量することにより、例えば、排水処理において、活性汚泥中のＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の検出量に基づき、排水中の油分除去反応を制御することができる。
【００１５】
［第一工程］
本実施形態に係る被検ＤＮＡとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが挙げられる。これらの被検ＤＮＡは、複数種類の微生物種由来のＤＮＡを含むものであってもよく、活性汚泥から調製したＤＮＡであってもよい。被検ＤＮＡとしては、排水中の油分除去反応を制御する観点から、活性汚泥から調製したＤＮＡが好ましい。これらの被検ＤＮＡの調製方法は、当業者に周知の方法を用いることができる。活性汚泥からＤＮＡを調製する方法としては、例えば、市販されているＤＮＡ抽出キット等を用いることができる。
【００１６】
配列番号１は、配列番号６の５４０番目から６７５番目の塩基配列を示す。配列番号６は、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を示す。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子には、遺伝子上に種間に共通な配列を含む保存領域、及び種・属等によって異なる配列を含む９つの可変領域（Ｖ１からＶ９）が存在する。配列番号６中、５０６番目から５６７番目の塩基配列がＶ４領域であり、５６８番目から７４５番目までが保存領域である。
【００１７】
配列番号１に記載の塩基配列は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４領域の一部と保存領域の一部とを含む領域である。
本実施形態に係る第一工程において、増幅産物は、配列番号１の塩基配列内の連続した９４塩基以上１３６塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅して調製される。
増幅産物は、連続した１１０塩基以上１３６塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅して調製してもよく、連続した１２０塩基以上１３６塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅して調製してもよい。このようなプライマーにより増幅して調製される増幅産物であれば、例えば、配列番号１に記載の塩基配列の対応領域に対して、１から６個の相違するヌクレオチドを有する塩基配列であってもよく、同一のヌクレオチドを有する塩基配列であってもよい。上記塩基配列を含む増幅産物を用いることで、続く第二工程において、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を特異的に検出することができる。
【００１８】
第一工程において、ヌクレオチドを増幅させ、増幅産物を得る方法としては、特に制限されるものではなく、当業者に周知の方法を用いることができる。このような方法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法が挙げられる。これらの方法の中でも、増幅と同時に、第二工程における検出を行えること、及び、増幅産物の定量を行えることから、リアルタイムＰＣＲ法が好ましい。
【００１９】
第一工程で用いられるプライマーは、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４領域の一部と保存領域の一部とを含む領域を増幅できるように設計することができる。このようなプライマーとしては、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡのアンチセンス鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第一のプライマー（フォワードプライマー）、及びセンス鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第二のプライマー（リバースプライマー）が挙げられる。
【００２０】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相同性を含むヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度及びｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、及びＤＮＡ濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。
「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含むプライマーまたはプローブ」としては、例えば、目的とするヌクレオチドと高イオン濃度下［例えば、６×ＳＳＣ（９００ｍＭ塩化ナトリウム、９０ｍＭクエン酸ナトリウム）などが用いられる。］に６５℃の温度条件でハイブリダイズすることにより、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、低イオン濃度下［例えば、０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム、１．５ｍＭクエン酸ナトリウム）などが用いられる。］に６５℃の温度条件で３０分間洗浄した後でも該ハイブリッドが維持されうるプライマーをあげることができる。
【００２１】
第一及び第二のプライマーは、配列番号１の塩基配列内の連続した連続した９４塩基以上１３６塩基以下の塩基配列を含むヌクレオチドを増幅することができるように設計されていれば、特に制限されるものではない。プライマーの長さは、より十分な特異性を得る観点から、１８塩基以上が好ましく、２０塩基以上が好ましい。プライマーの長さの上限としては、よりアニーリング効率を高める観点から、３０塩基以下が好ましく、２５塩基以下がより好ましい。
【００２２】
１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡのアンチセンス鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第一のプライマーとしては、例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列中の連続した１８塩基以上の塩基配列との相違塩基数が２である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、好ましくは、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列中の連続した１８塩基以上の塩基配列との相違塩基数が１である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、より好ましくは、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列中の連続した１８塩基以上の塩基配列を含むプライマーを挙げることができる。
第一のプライマーとして、例えば、配列番号２に記載の塩基配列との相違塩基数が２以下である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、好ましくは、相違塩基数が１以下である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、より好ましくは、配列番号２に記載の塩基配列を含むプライマーを挙げることができる。
【００２３】
１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡのセンス鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第二のプライマーとしては、例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列に対して相補的な塩基配列中の連続した１８塩基以上の塩基配列との相違塩基数が２以下である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、好ましくは、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列に対して相補的な塩基配列中の連続した１８塩基以上の塩基配列との相違塩基数が１以下である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、より好ましくは、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列に対して相補的な塩基配列中の連続した１８塩基以上の塩基配列を含むプライマーを挙げることができる。
第二のプライマーとして、例えば、配列番号３に記載の塩基配列との相違塩基数が２以下である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、好ましくは、相違塩基数が１以下である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、より好ましくは、配列番号３に記載の塩基配列を含むプライマーを挙げることができる。
【００２４】
［第二工程］
第二工程において、増幅産物を検出する方法としては、特に制限されるものではなく、当業者に周知の方法を用いることができる。増幅産物を検出する方法としては、例えば、アガロースゲル電気泳動法、リアルタイムＰＣＲ法、シークエンス解析法、サザンブロッティング法が挙げられる。これらの方法の中でも、特異性に優れるという観点から、プローブを用いる検出方法が好ましい。プローブを用いる検出方法としては、例えば、リアルタイムＰＣＲ法又はサザンブロッティング法が挙げられ、中でも、第一工程の増幅が同時に行え、且つ、特異的に検出でき、定量性にも優れるという観点から、リアルタイムＰＣＲ法が好ましい。
【００２５】
リアルタイムＰＣＲ装置としては、ＤＮＡをＰＣＲにより増幅することができるサーマルサイクラーと、増幅産物を検出するための分光蛍光光度計と、を備えていれば、特に制限されるものではない。リアルタイムＰＣＲ装置としては、例えば、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）が挙げられる。
【００２６】
第二工程で検出した増幅サンプルは定量することもできる。そのため、本実施形態の検出方法は、被検ＤＮＡからノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を検出するだけでなく、被検ＤＮＡに含まれる（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌由来のＤＮＡ量を定量することもできる。例えば、第二工程で増幅産物の検出にリアルタイムＰＣＲを用いた場合、スタンダードサンプルを用いて得られる検量線から、被検ＤＮＡの量を定量することができる。検量線は、増幅産物がある一定値に達した時のサイクル数を示すＣｔ値及び初期鋳型量に基づき、作成することができる。
【００２７】
＜キット＞
本実施形態のノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の検出に用いられるキットは、配列番号２に記載の塩基配列との相違塩基数が２以下である塩基配列を含む第一のプライマー、及び、配列番号３に記載の塩基配列との相違塩基数が２以下である塩基配列を含む第二のプライマーからなるプライマーセットを有する。
【００２８】
第一のプライマー及び第二のプライマーは、上述した検出方法で用いたものと同様のものを用いることができる。第一のプライマー及び第二のプライマーからなるプライマーセットは、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を検出可能なプライマーセットである。
【００２９】
本実施形態のキットには、第一のプライマー及び第二のプライマーからなるプライマーセット以外に、必要に応じて、その他の試薬等を含んでもよい。その他の試薬としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド混合物（ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ）、ＭｇＣｌ２、緩衝液、滅菌水、コントロール用ＤＮＡが挙げられる。その他の試薬等の濃度範囲は、一般的にヌクレオチドを増幅させ、増幅産物を得ることのできる濃度範囲であれば特に制限されないが、例えば、ＤＮＡポリメラーゼであれば０.０１Ｕ /μＬ〜０．１Ｕ /μＬ、デオキシリボヌクレオチド混合物（ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ）であれば１００μＭ〜５００μＭ、ＭｇＣｌ２であれば１ｍＭ〜５ｍＭの範囲が挙げられる。
【００３０】
本実施形態のキットに緩衝液が含まれる場合、緩衝液としては、例えば、一般的なＰＣＲ法で使用する緩衝液が挙げられる。
【実施例】
【００３１】
［実施例１：ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子含有のプラスミドＤＮＡを用いた定量性試験］
（材料）
ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅させるため、プライマーを設計した。１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列番号１で示される領域を増幅するためのプライマーを表１に示す。鋳型ＤＮＡは、表２に示すＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ.ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号６）を導入したプラスミドＤＮＡを用いた。鋳型ＤＮＡは、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ.ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６から抽出したＤＮＡを鋳型に、配列番号８及び配列番号９に記載の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅産物を調製し、調製した増幅産物をプラスミドに導入したものである。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６０℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。
【００３２】
【表１】
2018000071.tif 000002
【００３３】
（方法）
表１記載のプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲ装置（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅を行った。
【００３４】
１０μＬの２×ＳｙｂｒＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、０．２０μＬのフォワードプライマー（５０ｐｍｏｌ／μＬ）、０．２０μＬのリバースプライマー（５０ｐｍｏｌ／μＬ）、７．６０μＬの滅菌水、２．００μＬの鋳型ＤＮＡを、マイクロチューブに加え、混合した。マイクロチューブをリアルタイムＰＣＲ装置に設置し、増幅反応を行った。反応は（１）９５℃、６００秒、（２）９５℃、１５秒、（３）６０℃、６０秒で行い、（２）及び（３）の工程は４０サイクル繰り返し行った。
反応は、４９４ｎｍの励起光を照射し、蛍光物質であるＳｙｂｒＧｒｅｅｎの蛍光（５２１ｎｍ）を測定することで、リアルタイムで進行を確認した。
【００３５】
（結果）
表１記載のプライマーは、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ.ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号６）を導入したプラスミドＤＮＡを１ｐｇ／μＬから０．００１ｐｇ／μＬの範囲で検出することができた。
【００３６】
［実施例２：一種類のプラスミドＤＮＡを用いた特異性試験］
（材料）
・表１記載のプライマー
・Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ.ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号６）を導入したプラスミド
・Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ.ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６７由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号７）を導入したプラスミド
・各種細菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミドＤＮＡ（表２に記載の細菌の基準株由来）
【００３７】
（方法）
表２記載のプラスミドＤＮＡのいずれか一種を鋳型ＤＮＡとして用いたこと以外は、実施例１と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行った。
【００３８】
（結果）
表２には、試験に用いたプラスミドＤＮＡに導入された１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の由来となる細菌と、それらのプラスミドＤＮＡの検出結果を示す。表１記載のプライマーによれば、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌以外の細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミドＤＮＡは検出限界（０．００１ｐｇ／μＬ）以下であった。従って表１記載のプライマーは、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を特異的に検出できることが示された。
【００３９】
【表２】
2018000071.tif 000003
【００４０】
［実施例３：複数種の混合プラスミドＤＮＡを用いた定量性試験］
（材料）
・表１記載のプライマー
・Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号６）を導入したプラスミドＤＮＡ
・各種細菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミドＤＮＡ（表３に記載の細菌由来）
【００４１】
（方法）
表３に記載された、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属以外の１１種の細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミドＤＮＡを混合した混合液（各種プラスミドＤＮＡの終濃度はそれぞれ１ｐｇ／μＬ）に、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ.ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミドＤＮＡを終濃度１．０ｐｇ／μＬ、０．１０ｐｇ／μＬ、０．０１０ｐｇ／μＬ又は０．００１０ｐｇ／μＬとなるように混合し、４つのプラスミドＤＮＡ混合液を調製した。調製したプラスミドＤＮＡ混合液を鋳型ＤＮＡとして用いたこと以外は、実施例１と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行った。
【００４２】
（結果）
表４には、リアルタイムＰＣＲにより定量したＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍｓｐ.ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミドＤＮＡの測定値（ｐｇ／μＬ）を示す。表１記載のプライマーは、複数種の細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミドＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしても、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属由来のもののみを特異的に検出することができ、且つ、０．００１ｐｇ／μＬの濃度まで定量することができた。
【００４３】
【表３】
2018000071.tif 000004
【００４４】
【表４】
2018000071.tif 000005
【００４５】
［実施例４：一種類のゲノムＤＮＡを用いた特異性試験］
（材料）
・表１記載のプライマー
・Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ.ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６由来ゲノムＤＮＡ
・Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ.ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６７由来ゲノムＤＮＡ
・各種細菌由来ゲノムＤＮＡ（表５に記載の細菌の基準株由来）
【００４６】
（方法）
表５に記載の細菌由来のゲノムＤＮＡ（１ｎｇ／μＬ）を鋳型ＤＮＡとして用いたこと以外は、実施例１と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行った。
【００４７】
（結果）
配列番号６で示される塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子含むプラスミドＤＮＡ濃度に換算したリアルタイムＰＣＲによる定量の結果を、表５に示す。表１記載のプライマーによれば、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌のゲノムＤＮＡを０．００１ｎｇ／μＬの濃度まで検出することができた。一方、それ以外の細菌由来のゲノムＤＮＡは検出限界（０．００１ｎｇ／μＬ）以下であった。従って、表１記載のプライマーは、ゲノムＤＮＡを用いたとしても、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を特異的に検出できることが示された。
【００４８】
【表５】
2018000071.tif 000006
【００４９】
［実施例５：複数種の混合ゲノムＤＮＡを用いた定量性試験］
（材料）
・表１記載のプライマー
・Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６由来ゲノムＤＮＡ
・各種細菌由来ゲノムＤＮＡ（表６に記載の細菌由来）
【００５０】
（方法）
表６に記載された、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属以外の１１種の細菌由来のゲノムＤＮＡを混合した混合液（各種ゲノムＤＮＡの終濃度はそれぞれ１００ｐｇ／μＬ）に、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６由来のゲノムＤＮＡを終濃度１００ｐｇ／μＬ、１０ｐｇ／μＬ、１．０ｐｇ／μＬ又は０．１０ｐｇ／μＬとなるように混合し、４つのゲノムＤＮＡ混合液を調製した。調製したゲノムＤＮＡ混合液を鋳型ＤＮＡとして用いたこと以外は、実施例１を同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行った。
【００５１】
【表６】
2018000071.tif 000007
【００５２】
（結果）
表７に、表１記載のプライマーを用いて、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ. ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６由来のゲノムＤＮＡを定量した結果を示す。表１記載のプライマーは、複数種の細菌由来のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしても、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｏｇｂｉｕｍ  ｓｐ.由来のゲノムＤＮＡのみを特異的に検出することができ、且つ、０．１ｐｇ／μＬの濃度まで定量することができた。
【００５３】
【表７】
2018000071.tif 000008
【００５４】
［実施例６：活性汚泥中のＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の検出］
（材料）
・表１記載のプライマー
・活性汚泥サンプル１から抽出したゲノムＤＮＡ
【００５５】
（方法）
表１記載のプライマーを用いて、活性汚泥サンプル１由来のゲノムＤＮＡ（２μＬ）を鋳型ＤＮＡとして用いてＰＣＲ反応により増幅産物を調製し、その増幅産物をプラスミド化した後に増幅産物の塩基配列を解読し、解読した塩基配列をデータベース（ＲＤＰ）と照合することにより、解読した塩基配列が由来する細菌属を特定した。
【００５６】
ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６０℃、３０秒間、（４）６８℃、３０秒で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。
【００５７】
（結果）
表８に、表１記載のプライマーを用いて、活性汚泥サンプル１由来のゲノムＤＮＡ混合物から検出された細菌を示す。４種類の配列が合計１２個得られたが、何れの配列も、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌に由来する配列であった。この結果から、表１記載のプライマーは、活性汚泥由来のゲノムＤＮＡ混合物から直接ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を特異的に検出することができることが示された。
【００５８】
【表８】
2018000071.tif 000009
【００５９】
［比較例１：一種類のプラスミドＤＮＡを用いた特異性試験］
非特許文献１記載のノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌検出用プライマーを表９に示す。
【００６０】
【表９】
2018000071.tif 000010
【００６１】
（材料）
・表９記載のプライマー
・各種細菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミドＤＮＡ（表１０に記載の細菌由来）
【００６２】
（方法）
上記プライマーを用いたこと以外は、実施例２と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行った。
【００６３】
（結果）
表１０には、試験に用いたプラスミドＤＮＡに導入された１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の由来となる細菌と、それらのプラスミドＤＮＡの検出結果を示す。表９記載のプライマーは、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌以外の細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミドＤＮＡを一部検出した。従って、表９記載のプライマーは、必ずしもノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を特異的に検出できるものではないことが示された。
【００６４】
【表１０】
2018000071.tif 000011
【００６５】
［比較例２：活性汚泥中のノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の検出］
（材料）
・表９記載のプライマー
・活性汚泥サンプル１から抽出したＤＮＡ
【００６６】
（方法）
上記プライマーを用いたこと以外は、実施例６と同様の方法で、解読した塩基配列が由来する細菌属を特定した。
【００６７】
（結果）
表１１に、表９記載のプライマーを用いて、活性汚泥サンプル１由来のゲノムＤＮＡから検出された細菌を示す。８種類の配列が合計９個得られた。得られた合計９個の配列について、８配列／９配列が、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌以外の配列及びノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌まで確定できない配列であった。この結果から、表９記載のプライマーは、活性汚泥由来のゲノムＤＮＡ混合物から必ずしもノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を特異的に検出できるわけではないことが示された。
【００６８】
【表１１】
2018000071.tif 000012
【配列表】
2018000071000001.app