(57)【要約】【課題】公知の方法に比べ、効率よく幹細胞を分化誘導させる方法及びそれに用いられる分化誘導培養用基材を提供すること。【解決手段】幹細胞を分化誘導させる方法は、表面に分化誘導因子が固定化された基材上で幹細胞を培養することを含む。分化誘導培養用基材は、表面に分化誘導因子が固定化されている。【効果】公知の方法に比べ、効率よく幹細胞を分化誘導させる新規な方法及びそれに用いられる新規な分化誘導培養用基材が提供された。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に分化誘導因子が固定化された基材上で幹細胞を培養することを含む、幹細胞を分化誘導させる方法。
【請求項２】
前記基材がデンドリマー化合物で表面修飾された基材であり、前記分化誘導因子は、該デンドリマー化合物に共有結合されている請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記デンドリマー化合物がマレイミド基で修飾されており、前記分化誘導因子が該マレイミド基を介して結合されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞が間葉系幹細胞である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
分化誘導される細胞が平滑筋細胞である請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記分化誘導因子がトランスフォーミング増殖因子−βである請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
表面に分化誘導因子が固定化された、分化誘導培養用基材。
【請求項８】
前記基材がデンドリマー化合物で表面修飾された基材であり、前記分化誘導因子は、該デンドリマー化合物に共有結合されている請求項７記載の分化誘導培養用基材。
【請求項９】
前記デンドリマー化合物がマレイミド基で修飾されており、前記分化誘導因子が該マレイミド基を介して結合されている、請求項８に記載の分化誘導培養用基材。
【請求項１０】
前記分化誘導因子がトランスフォーミング増殖因子−βである請求項７〜９記載の分化誘導培養用基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞を分化誘導させる方法及びそれに用いられる分化誘導培養用基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療の分野のうち、特に血管に関する再生医療分野において、血管平滑筋細胞の利用が鋭意検討されている（特許文献１）。本技術によれば、血管平滑筋細胞が当該細胞の培養により得られることが報告されている。しかしながら、体細胞を細胞供給源としており、患者からの採取の際、患者身体への侵襲性等の問題がある。
【０００３】
一方、近年の再生医療研究の大きな方向性として、何らかの未分化な幹細胞を細胞供給源とし、目的細胞に分化させたのち、目的とする組織や臓器を構築することで失われた機能を再構築することが鋭意検討されている。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は多様な細胞への分化能を有し、また細胞採取源として脂肪組織、骨髄等の多様な採取源があることから、再生医療応用の細胞供給源として期待されている。
【０００４】
特に細胞の分化誘導に関する方法として現在報告されている技術としては、培養基材の表面を化学的に修飾する、三次元的な構造を形成する等の手段により、培養細胞の分化誘導を促進する試みがなされている（特許文献２、３、４）。
【０００５】
培養基材表面の化学的修飾技術の一つとして、デンドリマー化合物を用いる方法が知られている（特許文献４、５、非特許文献１）。この方法で得られる修飾基材表面は、デンドリマー化合物の分子鎖先端にアミン基を持つ、ポリアミンデンドリマーである。この方法によれば、化学的に比較的安定なポリスチレン等の基材表面にデンドリマー化合物による修飾を行うことができる。また、この方法により得られる修飾された基材表面は、動物細胞の接着性を担保し、増殖に悪影響を与えないことが報告されている。また、この方法によれば、Ｄ−グルコース等の還元性官能基を持つ分子を末端のアミン基に結合させることができる。また、この方法によれば、作製した培養面を用いた間葉系幹細胞の培養により、横紋筋・平滑筋への分化および軟骨系細胞・心筋細胞への分化誘導ができることが報告されている。しかしながら、増殖に悪影響がないことが示されているのみであり、分化誘導した細胞の存在割合等詳細な解析がなされていない。
【０００６】
その他の分化誘導方法として一般的に知られている方法は、可溶性の成分として細胞分化因子、主としてサイトカイン類と呼ばれるタンパク質や、デキサメタゾン等の化学物質を培地中に添加する方法が知られており、分化目的とする細胞種により添加物が選択される。特に、平滑筋への分化を目的とする場合は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）が培養液中に添加される（特許文献６）。しかしながら、これらの細胞分化因子を添加する場合、前述のとおり培地への可溶成分としての供給が行われており、培養細胞と細胞分化因子の接触は溶液内の分化因子の拡散に依存し、制御できない。さらに、培養表面に固定化した場合の報告はなされておらず、特に平滑筋を目的とする分化因子を培養表面に固定化した培養基材は報告されていない。
【０００７】
タンパク質を固体表面に固定化する技術は微細な反応場を提供する酵素の固定化や、タンパク質の持つ特異的性質を利用した分離、接着、培養足場材等、多岐に渡って利用されている。基材表面へのタンパク質固定化方法は、物理的吸着や、共有結合を用いる方法等、多くの方法が試みられている。しかしながら、固定化されるタンパク質の割合や活性の維持率等は、タンパク質の性質や基材表面の影響を受けるため、個々の目的物の性質に大きく左右される。
【０００８】
タンパク質固定化技術の一つとして、前記デンドリマー化合物に加え、マレイミド化合物を用いる方法が報告されている（特許文献７、８、非特許文献２）。この方法によれば、例えばシステインのようなチオール官能基を持つタンパク質を、マレイミド官能基との共有結合で固定化することができる。その他、たとえばリジンのような、側鎖にアミノ基を持つアミノ酸残基とマレイミド官能基を共有結合させることもできる。しかしながら、当該技術を用いて細胞分化因子を固定化した培養面を用いた間葉系幹細胞の培養はなされておらず、特に平滑筋への分化誘導については報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−３１２６６３号公報
【特許文献２】特開２０１２−２３５７３０号公報
【特許文献３】特開２０１５−８７０１号公報
【特許文献４】特開２００５−１９２４０６号公報
【特許文献５】特開２０１０−２００７４５号公報
【特許文献６】特開２００４−２９８０８７号公報
【特許文献７】特願２０１５−０７９４６５号公報
【特許文献８】特開２０１３−１７２６５５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】M. Kino-oka et al. Biomaterials 28 (2007) 1680-1688
【非特許文献２】Academic press “Bioconjugate Techniques”940-950
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、公知の方法に比べ、効率よく幹細胞を分化誘導させる方法及びそれに用いられる分化誘導培養用基材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者らは、効率良く幹細胞の分化を誘導できる方法を鋭意研究した結果、分化誘導因子を培養基材表面に固定化することにより、培養液中に分化誘導因子を添加する場合に比べて分化誘導効率が向上することを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下の(1)〜(10)を提供する。
(1)  表面に分化誘導因子が固定化された基材上で幹細胞を培養することを含む、幹細胞を分化誘導させる方法。
(2)  前記基材がデンドリマー化合物で表面修飾された基材であり、前記分化誘導因子は、該デンドリマー化合物に共有結合されている(1)記載の方法。
(3)  前記デンドリマー化合物がマレイミド基で修飾されており、前記分化誘導因子が該マレイミド基を介して結合されている、(2)に記載の方法。
(4)  前記幹細胞が間葉系幹細胞である(1)〜(3)のいずれか１項に記載の方法。
(5)  分化誘導される細胞が平滑筋細胞である(4)記載の方法。
(6)  前記分化誘導因子がトランスフォーミング増殖因子−βである(4)又は(5)に記載の方法。
(7)  表面に分化誘導因子が固定化された、分化誘導培養用基材。
(8)  前記基材がデンドリマー化合物で表面修飾された基材であり、前記分化誘導因子は、該デンドリマー化合物に共有結合されている(7)記載の分化誘導培養用基材。
(9)  前記デンドリマー化合物がマレイミド基で修飾されており、前記分化誘導因子が該マレイミド基を介して結合されている、(8)に記載の分化誘導培養用基材。
(10)  前記分化誘導因子がトランスフォーミング増殖因子−βである(7)〜(9)記載の分化誘導培養用基材。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、公知の方法に比べ、効率よく幹細胞を分化誘導させる新規な方法及びそれに用いられる新規な分化誘導培養用基材が提供された。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】下記実施例において作製した、培養用基材の作製スキームを示す図である。
【図２】下記実施例において得られた、７日間培養し、平滑筋アクチンを免疫染色したヒト間葉系幹細胞の蛍光顕微鏡写真である。楕円形の斑点状物は細胞核であり、繊維状に染色されている部分がアクチン線維を示している。
【図３】下記実施例において行った、平滑筋アクチン免疫染色観察における平滑筋アクチンマーカー陽性の細胞存在率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の方法では、表面に分化誘導因子が固定化された基材を用いる。基材表面の材質としては、動物細胞用の培養基材であれば材質は特に限定されないが、たとえばポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネイト等のプラスチックやガラス製の培養容器が挙げられる。本発明では、好ましくはポリスチレン製の培養プレートを用いる。表面にタンパク質吸着防止等の特殊加工をしていないポリスチレン培養プレートが好ましい。
【００１７】
分化誘導因子は、培養基材の表面にそのまま固定化してもよいが、基材表面の単位面積当りの固定化量を大きくするために、基材表面をデンドリマーで表面修飾し、デンドリマー各枝の先端部に分化誘導因子を固定化することが好ましい。デンドリマーによる培養基材の表面修飾方法自体はこの分野において周知であり、例えば特許文献６に記載されており、下記実施例にも具体的に記載されている。また、固定化は、培養中に分化誘導因子が離脱することを防止するために、共有結合により固定化することが好ましい。
【００１８】
デンドリマーで表面修飾する場合、培養面へのデンドリマー形成を開始する方法として、直接固相合成してもよいが、ポリスチレン表面は化学的な修飾を受けにくいため、カリウムｔ−ブトキシド（ｔ−ＢｕＯＫ）によりＯＨ基を導入することがより好ましい（下記実施例参照）。
【００１９】
デンドリマーで表面修飾する場合に用いるデンドリマー化合物としては、特に限定されず、例えば、公知のポリアミドアミンデンドリマーや、先行特許文献１〜３および非特許文献１に示されているポリイミノアミンデンドリマーなどが挙げられる。デンドリマー末端は、タンパク質結合の為の官能基を導入するためにアミノ基であることが好ましく、より好ましくは、トリス（２−アミノエチル）アミンを用いて各枝の末端をアミノ化することができる。また、培養表面に提示したヒドロキシル基と前記トリスアミンを架橋するための物質は、ヒドロキシル基およびアミノ基と反応するものであれば特に限定されないが、特にアルデヒド構造を２か所に持つグルタルアルデヒドが好ましい。
【００２０】
分化誘導因子の多くはポリペプチドであり、ポリペプチドはカルボキシル基を有するのでデンドリマーの各枝の末端のアミノ基にポリペプチドから成る分化誘導因子を共有結合することができる。あるいは、デンドリマーの各枝の末端のアミノ基にマレイミド化合物を共有結合させ、各末端をマレイミド化することも好ましい。マレイミド基は、チオール基と反応して共有結合を形成するので、遊離のチオール基を持つポリペプチドから成る分化誘導因子を共有結合することができる。なお、この場合、必要に応じ、還元状態で反応を行うことにより、-S-S-結合から遊離されたチオール基を共有結合に供することができる。また、マレイミド基は、アミノ基とも共有結合させることができるので、リジンのような側鎖にアミノ基を持つアミノ酸残基と共有結合させることができる。
【００２１】
デンドリマーの末端にマレイミド基を導入するために用いられるマレイミド化合物としては、マレイミド基を有する化合物であれば特に限定されず、マレイミド基を導入する化合物としてはＮ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ− （ε−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酢酸ヒドラジド、２−アミノマレイミド、３−アミノマレイミド、４−アミノマレイミド、６−アミノマレイミド、１−（４−アミノフェニル）マレイミド、１−（３−アミノフェニル） マレイミド、４−（マレイミド）フェニルイソシアナート、２−マレイミド酢酸、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、（ Ｎ−[α―マレイミドアセトキシ]コハク酸イミドエステル）、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、（コハク酸イミジル−４−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボニル−［６−アミノヘキサン酸］）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、Ｎ−スクシンイミジル−３−マレイミドプロピオン酸を例示できる。本発明においては、デンドリマー末端のアミノ基との反応性を担保し、かつマレイミド基を先端に導入できるＮ−スクシンイミジル−３−マレイミドプロピオン酸が特に好ましい。デンドリマー先端のマレイミド化は、単にデンドリマー修飾培養表面に上記マレイミド化合物の溶液を接触させることにより達成することができる。この際の好ましい反応条件としては、例えば、反応温度２５℃〜５０℃、さらに好ましくは３０℃〜４０℃、反応時間２時間〜８時間、さらに好ましくは３時間〜５時間、マレイミド化合物の濃度２mg/mL〜10mg/mL、さらに好ましくは3mg/mL〜7mg/mL、溶媒としては好ましくはジメチルスルホキシドのような非プロトン性極性溶媒を用いることができる。下記実施例にマレイミド化反応の好ましい１例が記載されている。
【００２２】
なお、培養基材の表面をデンドリマー修飾することは、分化誘導因子の固定化量を増大させるために好ましいが、必須的ではなく、表面にアミノ基等の官能基を持つ市販の基材に分化誘導因子を共有結合させることも可能である。
【００２３】
基材表面に共有結合した分化誘導因子は、共有結合に供される部位によっては、分化誘導因子としての活性を失なう分子も出現する可能性が否定できないが、逆に共有結合に供される部位によっては、分化誘導因子としての活性を維持したまま共有結合されるものも一定の確率で出現するので、全体としては、再現性をもって、分化誘導因子としての活性を維持したまま分化誘導因子を共有結合で固定化することが可能である。
【００２４】
培養基材の表面に固定化する分化誘導因子としては、所望の幹細胞に対して所望の分化誘導を惹起することができるものであれば特に限定されず、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、アクチビンＡ、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）等が例示できる。これらのうち、平滑筋への分化誘導を目的とする場合には、トランスフォーミング増殖因子−β３（ＴＧＦβ−３）が好ましい。ＴＧＦ−β３は生体内で潜在型と呼ばれる前駆体で生産され、ＴＧＦ−β受容体において分解を受けて活性型となる。潜在型、活性型のいずれを用いてもよいが、活性型ＴＧＦ−β３が特に好ましい。
【００２５】
培養する幹細胞は、分化誘導因子による分化誘導が可能で、固相培養が可能な幹細胞であれば、特に限定されないが、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞等が例示でき、特に間葉系細胞がより好ましい。間葉系細胞は、その採取源として、たとえば脂肪組織由来、臍帯血由来、骨髄由来の間葉系幹細胞が例示できるが、本発明においては、骨髄由来の間葉系幹細胞がより好ましい。
【００２６】
細胞培養に用いる培地は、動物細胞が培養できる成分を含有するものであれば特に限定されず、培養する細胞について公知の培地を用いることができる。多くの場合、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）が好ましく、また、栄養源供給の観点から、ウシ血清（ＦＢＳ）を含有させてもよい。また、汚染防止を目的としたカナマイシン、ネオマイシン等の抗生物質を含有してもよい。
【００２７】
培養条件は、培養する幹細胞について知られている好ましい条件であればよく、上記した培地中で、通常、室温〜３７℃で培養することができる。培養時間は、分化した細胞が出現する時間であればよく、通常、３日間〜１４日間程度、好ましくは、５日間〜１０日間程度であるがこれに限定されるものではない。
【００２８】
培養により、所望の分化細胞が得られたか否かは、免疫染色等の常法により確認することができる。例えば、蛍光標識抗体を用いた蛍光顕微観察が例示できる。蛍光免疫染色に用いる抗体としては、分化した細胞に特有のマーカータンパク質を認識する抗体が用いられる。例えば、分化した平滑筋細胞の検出のためには、平滑筋アクチンマーカーを認識する抗体が特に好ましい。
【００２９】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３０】
実施例1  マレイミド基導入デンドリマー修飾培養表面の作製
修飾培養面を調製する出発物として、ヌンク社製８ウェル細胞培養プレート１０７０６４を用いた。この平面培養基材表面にヒドロキシル基を提示させるために、５０μｍｏｌ／ｍＬのカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（ｔ−ＢｕＯＫ）水溶液を３．０ｍＬウェルに添加し、室温で１時間静置した。その後、ｔ−ＢｕＯＫ水溶液を除去後、前記ウェルを滅菌水で１ 回洗浄した。次いで、各ウェルに３．０ｍＬの０．３６ｍｏｌ／Ｌグルタルアルデヒド水溶液を添加し、室温で１時間静置した。その後、グルタルアルデヒド水溶液を除去し、３．０ｍＬの滅菌水で３回洗浄した。前記ウェルに０．３６ｍｏｌ／Ｌトリス（２−アミノエチル）アミン水溶液（ｐＨ９．０）を添加して室温で１ 時間静置した。その後、トリス（２−アミノエチル）アミン水溶液を除去し、３．０ｍＬの滅菌水で３回洗浄した。前記ウェルに１．０ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４） を添加して１６時間、室温に静置した。この方法により、デンドリマー修飾培養表面を得た。
【００３１】
デンドリマー修飾培養表面に、マレイミド基を導入するために、５ｍｇ／ｍＬのＮ−スクシンイミジル−３−マレイミドプロピオン酸のジメチルスルホキシド溶液を、各ウェルに３．０ｍＬずつ添加し、４時間、３５℃の恒温器内で静置した。その後、前記マレイミド溶液を除去した後、３．０ｍＬの７０％エタノール水溶液で３回洗浄した。エタノール水溶液を除去したのち、室温で乾燥させた。この方法により、マレイミド基導入デンドリマー修飾培養表面を得た。この方法により調製されるマレイミド化デンドリマー修飾面について、形成過程を図１に示す。
【００３２】
実施例２  トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）を結合したマレイミド化デンドリマー修飾培養表面を用いたヒト間葉系幹細胞の培養
ＴＧＦ−β３の結合反応溶液は次のように調製した。Ｄ−ＰＢＳ（−）、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡの混合液に対して、活性型ＴＧＦ−β３（和光純薬１００−３６Ｅ）を５ｎｇ／ｍＬの濃度となるように溶解した。
【００３３】
実施例１の方法で得られたマレイミド化デンドリマー修飾培養表面を持つ培養ウェルを３．０ｍｌのＤ−ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。その後、前記ＴＧＦ−β３溶液を培養ウェルに３．０ｍＬずつ添加し、室温で１５時間静置した。その後、ＴＧＦ−β３溶液を除去し、３．０ｍＬのＤ−ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。前記ＴＧＦ−β３結合プレートのウェルに対し、α-チオグリセリン １００μｇ／ｍＬ，Ｄ−ＰＢＳ（−）溶液を添加し、室温で３時間静置した。その後、チオグリセリン溶液を除去し、３．０ｍＬのＤ−ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。これにより、ＴＧＦ−β３が結合していないマレイミドにチオグリセリンを結合させて、マレイミド基をブロックした。この方法により、ＴＧＦ−β３結合マレイミド化デンドリマー修飾培養表面を得た。
【００３４】
前記のＴＧＦ−β３結合マレイミド化デンドリマー修飾培養表面を用い、間葉系幹細胞(ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(ＬＯＮＺＡ社より市販）を培養した。培地として、Ｄ−ＭＥＭ培地（シグマアルドリッチ，Ｄ６４２９）に、１０％のウシ血清（Ｇｉｂｃｏ、ＦＢＳ）、２０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（シグマアルドリッチＨ０８８７）、抗生物質（たとえばＧｉｂｃｏ，１５２４０−０６２）を添加した培地を用いた。５×１０３細胞／ｍＬとなるよう調整して、各ウェルに３．０ｍＬずつ播種した。
【００３５】
３７℃で７日間培養し、培地を除去した後、４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝溶液 (和光純薬，１６３−２０１４５)を添加し、１５分間室温にて細胞固定化を行った。Ｄ−ＰＢＳ（−）溶液で洗浄後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）を添加して１５分間室温にて細胞膜透過処理を行った。Ｄ−ＰＢＳ（−）溶液で洗浄後、非特異染色防止の為、４％ブロックエース（ＤＳファーマ，ＵＫＢ８０）でブロッキングを行った。Ｄ−ＰＢＳ（−）溶液で洗浄後、抗平滑筋アクチン抗体（アブカム，ａｂ７８１７）、蛍光標識二次抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック，Ａ−１１００１）、核染色（ＤＡＰＩ）の順で免疫染色を行った。図２に染色した細胞の蛍光顕微鏡像を示す。平滑筋アクチンマーカーで染色された細胞は繊維状にアクチン線維が観察された。平滑筋分化が見られた細胞の数と全細胞数を計数すると、分化した細胞の比率は全体の細胞数に対して５４％に達した。
【００３６】
比較例１  非修飾ポリスチレン培養表面を用いたヒト間葉系幹細胞の培養
表面修飾を施していないポリスチレン培養面を用いる他は下記比較例４と同様の方法でヒト間葉系幹細胞を培養した。培養した細胞を蛍光観察すると、平滑筋分化細胞の比率は全体の１４％であった。
【００３７】
比較例２  非修飾ポリスチレン培養表面を用い、細胞分化因子を培養液中に添加したヒト間葉系幹細胞の培養
培養液にＴＧＦ−β３を最終濃度５ｎｇ／ｍＬとなるように添加した他は比較例１と同様の方法でヒト間葉系幹細胞を培養した。実施例２と同様の方法で培養細胞を蛍光観察すると、平滑筋分化細胞の比率は２２％であった。
【００３８】
比較例３  細胞分化因子を結合しないマレイミド化デンドリマー修飾培養表面を用いたヒト間葉系幹細胞の培養
実施例１に示した方法により得られたマレイミド化デンドリマー修飾培養表面に対し、α-チオグリセリン １００μｇ／ｍＬ，Ｄ−ＰＢＳ（−）溶液を添加し、室温で３時間静置した。その後、チオグリセリン溶液を除去し、１．５ｍｌのＤ−ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。これにより、マレイミドにチオグリセリンを結合させて、マレイミド基をブロックした。
【００３９】
実施例２と同様の方法でヒト間葉系幹細胞を培養し、実施例２と同様の方法で平滑筋分化細胞を蛍光観察すると、平滑筋分化細胞は２２％であった。
【００４０】
比較例４  マレイミド化デンドリマー修飾培養表面を用い、細胞分化因子を培養液中に添加したヒト間葉系幹細胞の培養
実施例１に示した方法で得られた培養面を用いて間葉系幹細胞を培養した。培地として、Ｄ−ＭＥＭ培地（シグマアルドリッチ，Ｄ６４２９）に、１０％のウシ血清（Ｇｉｂｃｏ、ＦＢＳ）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（シグマアルドリッチＨ０８８７）、抗生物質（たとえばＧｉｂｃｏ，１５２４０−０６２）を添加した培地を用いた。さらに、前記培養液にＴＧＦ−β３が最終濃度５ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。あらかじめ前培養した間葉系幹細胞を、培養液中濃度が５×１０＾３細胞／ｍＬとなるよう調整して、各ウェルに３．０ｍＬずつ播種した。
【００４１】
３７℃で７日間培養し、培地を除去した後、４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝溶液 (和光純薬，１６３−２０１４５)を添加し、１５分間室温にて細胞固定化を行った。Ｄ−ＰＢＳ（−）溶液で洗浄後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加して１５分間室温にて細胞膜透過処理を行った。Ｄ−ＰＢＳ（−）溶液で洗浄後、非特異染色防止の為、４％ブロックエース（ＤＳファーマ，ＵＫＢ８０）でブロッキングを行った。Ｄ−ＰＢＳ（−）溶液で洗浄後、抗平滑筋アクチン抗体（アブカム，ａｂ７８１７）、蛍光標識二次抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック，Ａ−１１００１）、核染色（ＤＡＰＩ）の順で免疫染色を行った。図２に染色した細胞の蛍光顕微鏡像を示す。平滑筋アクチンマーカーで染色された細胞は繊維状にアクチン線維が観察された。平滑筋分化が見られた細胞の数と全細胞数を計数すると、平滑筋分化細胞の存在率は３８％であった。
【００４２】
実施例２並びに比較例１、２、３及び４の結果を表１に示す。また、計数した平滑筋アクチン陽性細胞の個数について、図３示す。すなわち、前述の方法でマレイミド化デンドリマー修飾した培養面にＴＧＦ−β３を固定化した培養基材を用いて、ヒト間葉系幹細胞を培養することで、平滑筋分化細胞が効率よく得られることが示された。
【００４３】
【表１】
2018000045.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明によれば、幹細胞を細胞源とする分化誘導、例えば、間葉系幹細胞を細胞源とする平滑筋細胞の分化誘導を行うことが可能であり、得られる細胞を再生医療等の細胞源として利用可能であることが期待される。
【図１】
2018000045.tif 000004
【図２】
2018000045.tif 000005
【図３】
2018000045.tif 000006