(57)【要約】【課題】受精卵を侵襲することなく、着床前の授精卵の遺伝子異常の有無を判定すること。【解決手段】本発明は、着床前の授精卵の遺伝子異常の有無を判定する方法であって、（ｉ）インビトロで培養された哺乳動物の授精卵の培養上清に含まれる核酸を調製する工程、（ｉｉ）塩基配列情報取得手段を用いて前記核酸の塩基配列情報を取得する工程、（ｉｉｉ）得られた塩基配列情報の解析によって、遺伝子異常の有無を判定する工程、を含み、ここで、前記培養上清が、授精後の授精卵の透明帯に開口部を設けない授精卵の培養で得られた培養上清である、方法を提供する。さらに、本発明は、着床前の授精卵の遺伝子異常の有無を判定するシステムを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
着床前の授精卵の遺伝子異常の有無を判定する方法であって、
（ｉ）インビトロで培養された哺乳動物の授精卵の培養上清に含まれる核酸を調製する工程、
（ｉｉ）塩基配列情報取得手段を用いて前記核酸の塩基配列情報を取得する工程、
（ｉｉｉ）得られた塩基配列情報の解析によって、遺伝子異常の有無を判定する工程、を含み、
ここで、前記培養上清が、授精後の授精卵の透明帯に開口部を設けない授精卵の培養で得られた培養上清である、方法。
【請求項２】
前記工程（ｉ）が、全ゲノム増幅手段によって核酸を増幅する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記塩基配列情報取得手段が、次世代シークエンサー又はアレイＣＧＨである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養上清が、授精後１〜７日に回収された培養上清である、又は、授精卵の前核期（２ＰＮ）〜胚盤胞期に回収された培養上清である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子異常の有無を判定する工程が、染色体異常の有無を判定する工程及び／又は遺伝性疾患に関連する遺伝子変異の有無を判定する工程である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子異常の有無を判定する工程が、染色体の異数性、転座、同腕染色体、逆位、片親性ダイソミー、モザイク、欠失若しくは倍数性異常を検出して染色体異常症の有無を判定する工程及び／又は先天性代謝異常症、原発性免疫不全症候群、先天性皮膚疾患、遺伝性腫瘍、先天性奇形症候群、先天性血液疾患、先天性神経筋疾患、先天性骨系統疾患若しくはミトコンドリア病に関連する遺伝子異常を検出して、遺伝性疾患に関連する遺伝子変異の有無を判定する工程である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子異常を判定する工程が、ターナー症候群、パトウ症候群、エドワーズ症候群、ダウン症候群、クラインフェルター症候群、トリポＸ（Ｔｒｉｐｏ−Ｘ）症候群、ＸＹＹ症候群、５ｐモノソミー（５ｐ−症候群）、５ｑモノソミー（５ｑ−症候群）及び４ｐモノソミー  ウォルフ・ヒルシュホーン症候群、フェニルケトン尿症、ビオプテリン代謝異常症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、色素性乾皮症、伴性無ガンマグロブリン血症、アデノシンデアミネース欠損症、先天性表皮水疱症、尋常性魚鱗癬、神経線維腫症１型、神経線維腫症２型、家族性大腸ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、アンジェルマン症候群、ウィリアムズ症候群、プラダー・ウィリー症候群、アイカルディ症候群、コルネリア・ド・ランゲ症候群、アペール症候群、血友病、筋ジストロフィー、骨形成不全症、軟骨無発生症、軟骨無形成症、軟骨低形成症、致死性骨異形成症、慢性進行性外眼麻痺症候群、カーンズ・セイヤー症候群、赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群、リー脳症、レーバー病、ミトコンドリア糖尿病及びピアソン病からなる群から選択される１以上の疾患の有無を判定する工程である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
着床前の授精卵の遺伝子異常の有無を判定するシステムであって、
哺乳動物の授精卵の培養上清に含まれる核酸の調製手段と、
前記調製手段によって調製された前記核酸の塩基配列情報を取得する塩基配列情報取得手段と、
前記塩基配列情報取得手段により得られた塩基配列情報を解析して遺伝子異常の有無を判定する手段と、
前記判定する手段により得られた結果を出力する手段と、
を含み、
ここで、前記培養上清が、授精後の授精卵の透明帯に開口部を設けない授精卵の培養で得られた培養上清であることを特徴とする、システム。
【請求項１０】
前記核酸の調製手段が、全ゲノム増幅手段を含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記塩基配列情報取得手段が、次世代シークエンサー又はアレイＣＧＨである、請求項９又は１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記遺伝子異常の有無を判定する手段が、染色体異常の有無を判定する手段及び／又は遺伝性疾患に関連する遺伝子変異の有無を判定する手段である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１３】
前記遺伝子異常の有無を判定する手段が、染色体の異数性、転座、同腕染色体、逆位、片親性ダイソミー、モザイク、欠失若しくは倍数性異常を検出して染色体異常症の有無を判定する手段及び／又は先天性代謝異常症、原発性免疫不全症候群、先天性皮膚疾患、遺伝性腫瘍、先天性奇形症候群、先天性血液疾患、先天性神経筋疾患、先天性骨系統疾患若しくはミトコンドリア病に関連する遺伝子異常を検出して、遺伝性疾患に関連する遺伝子変異の有無を判定する手段である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項９〜１３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１５】
前記遺伝子異常の有無を判定する手段が、ターナー症候群、パトウ症候群、エドワーズ症候群、ダウン症候群、クラインフェルター症候群、トリポＸ（Ｔｒｉｐｏ−Ｘ）症候群、ＸＹＹ症候群、５ｐモノソミー（５ｐ−症候群）、５ｑモノソミー（５ｑ−症候群）及び４ｐモノソミー  ウォルフ・ヒルシュホーン症候群、フェニルケトン尿症、ビオプテリン代謝異常症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、色素性乾皮症、伴性無ガンマグロブリン血症、アデノシンデアミネース欠損症、先天性表皮水疱症、尋常性魚鱗癬、神経線維腫症１型、神経線維腫症２型、家族性大腸ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、アンジェルマン症候群、ウィリアムズ症候群、プラダー・ウィリー症候群、アイカルディ症候群、コルネリア・ド・ランゲ症候群、アペール症候群、血友病、筋ジストロフィー、骨形成不全症、軟骨無発生症、軟骨無形成症、軟骨低形成症、致死性骨異形成症、慢性進行性外眼麻痺症候群、カーンズ・セイヤー症候群、赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群、リー脳症、レーバー病、ミトコンドリア糖尿病及びピアソン病からなる群から選択される１以上の疾患の有無を判定する手段である、請求項１４に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、着床前の授精卵の遺伝子異常の有無を判定する方法に関する。また、本発明は、着床前の授精卵の遺伝子異常の有無を判定するシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、女性の社会進出が増加しており、晩婚化及び晩産化傾向にある。それに伴い、不妊症に悩む女性が増加している。主な不妊治療法として、体外授精に代表される生殖補助医療が挙げられるが、その技術は目覚ましい勢いで発展してきた。しかしながら、晩婚化・晩産化によって卵子が老化していると、生殖補助医療によって授精・初期発生が成立したとしても、着床不全や妊娠初期での流産を引き起こす可能性がある。その原因として、卵子が老化することで卵子の染色体が正常に減数分裂を行えないことによる、染色体数の異常等が考えられる。また、転座、欠失、逆位等の染色体異常、重篤な遺伝子異常により着床不全や流産の原因ともなり、また、出生後も致死性の重篤な遺伝子疾患を発病する原因ともなる。
【０００３】
こうした授精卵の染色体の異常を検査する方法として、現在、着床前スクリーニング（ＰＧＳ：Ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が行われている。ＰＧＳは、授精卵を２〜３日間培養し、授精卵が４〜８個の割球に分裂した後、あるいは、４〜７日間培養し、胚盤胞に到達した後に、その割球を１〜３個採取して、授精卵の正常染色体を選択する方法である。これにより、正常な授精卵のみを母体の子宮に移植するため、流産率を下げ、妊娠率を上げることが可能になると考えられる。また、授精卵の遺伝子異常を検査する方法として着床前診断（ＰＧＤ：Ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）が行われている。ＰＧＤは、授精卵を２〜３日間培養し、授精卵が４〜８個の割球に分裂した後、あるいは、４〜７日間培養し、胚盤胞に到達した後に、その割球を１〜３個採取して、正常遺伝子を有する授精卵を選択する方法である。これにより、正常な遺伝子を有する授精卵のみを母体の子宮に移植するため、致死的な遺伝子疾患の予防となることが可能になると考えられる。
【０００４】
しかしながら、授精卵から一部の割球を採取することによる胚や胎児への影響は未知数である。最近、胚盤胞まで発生した胚の囲卵腔や卵割腔から採取した液体に含まれるＤＮＡが胚のＤＮＡと一致することが報告された（非特許文献１及び非特許文献２）。さらに、授精卵の培養の初期の３日目に授精卵を包む透明帯の一部に穴を開け、胚盤胞に達する５〜６日目まで培養を継続、培養液中にＤＮＡを流れ出させることで培養上清から胚由来のＤＮＡが検出できると報告された（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｚｈａｎｇ  Ｙ，Ｌｉ  Ｎ，Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｓｕｎ  Ｈ，Ｍａ  Ｍ，Ｗａｎｇ  Ｈ，Ｘｕ  Ｘ，Ｚｈａｎｇ  Ｗ，Ｌｉｕ  Ｙ，Ｃｒａｍ  ＤＳ，Ｓｕｎ  Ｂ  Ｙａｏ  Ｙ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｂｌａｓｔｏｃｏｅｌｅ  ｆｌｕｉｄ  ｕｓｉｎｇ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｊ  Ａｓｓｉｓｔ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｇｅｎｅｔ．３３（５），６３７−６４５（２０１６）
【非特許文献２】Ｍａｇｌｉ  ＭＣ，Ｐｏｍａｎｔｅ  Ａ，Ｃａｆｕｅｒｉ  Ｇ，Ｖａｌｅｒｉｏ  Ｍ，Ｃｒｉｐｐａ  Ａ，Ｆｅｒｒａｒｅｔｔｉ  ＡＰ，Ｇｉａｎａｒｏｌｉ  Ｌ．，Ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｅｓｔｉｎｇ：ｐｏｌａｒ  ｂｏｄｉｅｓ，ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ，ｔｒｏｐｈｅｃｔｏｄｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ，  ｏｒ  ｂｌａｓｔｏｃｏｅｌｉｃ  ｆｌｕｉｄ？  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．１０５（３），６７６−６８３．ｅ５（２０１６）
【非特許文献３】Ｓｈａｍｏｎｋｉ  ＭＩ，Ｊｉｎ  Ｈ，Ｈａｉｍｏｗｉｔｚ  Ｚ，Ｌｉｕ  Ｌ．，Ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ：ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｍｂｒｙｏ  ｂｉｏｐｓｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｓｐｅｎｔ  ｅｍｂｒｙｏ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．２０１６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｆｅｒｔｎｓｔｅｒｔ．２０１６．０７．１１１２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、従来の着床前スクリーニング方法では、授精卵の割球を一部採取したり、授精卵を包む透明帯の一部に人為的に穴を開けるなど、授精卵及び／又は胚を侵襲してＤＮＡを回収する方法であった。そのため、授精卵及び／又は胚の一部を侵襲することが、その後の胚発生の過程に影響を及ぼす可能性あるいは胚の損傷を引き起こし胚が死滅する可能性を否定できなかった。また、授精卵及び／又は胚の一部を侵襲することに倫理的な問題も有していた。そのため、授精卵の透明帯及び胚の一部を侵襲することなく、着床前に疾患の有無を安全かつ簡便に調べる方法が希求されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、発明者らが検討した結果、従来の方法とは異なり、透明帯及び胚の一部を侵襲することなく、着床前の授精卵の遺伝子異常の有無を判定する方法を見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］  着床前の授精卵の遺伝子異常の有無を判定する方法であって、
（ｉ）インビトロで培養された哺乳動物の授精卵の培養上清に含まれる核酸を調製する工程、
（ｉｉ）塩基配列情報取得手段を用いて前記核酸の塩基配列情報を取得する工程、
（ｉｉｉ）得られた塩基配列情報の解析によって、遺伝子異常の有無を判定する工程、を含み、
ここで、前記培養上清が、授精後の授精卵の透明帯に開口部を設けない授精卵の培養で得られた培養上清である、方法。
［２］  前記工程（ｉ）が、全ゲノム増幅手段によって核酸を増幅する工程を含む、［１］に記載の方法。
［３］  前記塩基配列情報取得手段が、次世代シークエンサー又はアレイＣＧＨである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］  前記培養上清が、授精後１〜７日に回収された培養上清である、又は、授精卵の前核期（２ＰＮ）〜胚盤胞期に回収された培養上清である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］  前記遺伝子異常の有無を判定する工程が、染色体異常の有無を判定する工程及び／又は遺伝性疾患に関連する遺伝子変異の有無を判定する工程である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］  前記遺伝子異常の有無を判定する工程が、染色体の異数性、転座、同腕染色体、逆位、片親性ダイソミー、モザイク、欠失若しくは倍数性異常を検出して染色体異常症の有無を判定する工程及び／又は先天性代謝異常症、原発性免疫不全症候群、先天性皮膚疾患、遺伝性腫瘍、先天性奇形症候群、先天性血液疾患、先天性神経筋疾患、先天性骨系統疾患若しくはミトコンドリア病に関連する遺伝子異常を検出して、遺伝性疾患に関連する遺伝子変異の有無を判定する工程である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
［７］  前記哺乳動物が、ヒトである、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］  前記遺伝子異常を判定する工程が、ターナー症候群、パトウ症候群、エドワーズ症候群、ダウン症候群、クラインフェルター症候群、トリポＸ（Ｔｒｉｐｏ−Ｘ）症候群、ＸＹＹ症候群、５ｐモノソミー（５ｐ−症候群）、５ｑモノソミー（５ｑ−症候群）及び４ｐモノソミー  ウォルフ・ヒルシュホーン症候群、フェニルケトン尿症、ビオプテリン代謝異常症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、色素性乾皮症、伴性無ガンマグロブリン血症、アデノシンデアミネース欠損症、先天性表皮水疱症、尋常性魚鱗癬、神経線維腫症１型、神経線維腫症２型、家族性大腸ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、アンジェルマン症候群、ウィリアムズ症候群、プラダー・ウィリー症候群、アイカルディ症候群、コルネリア・ド・ランゲ症候群、アペール症候群、血友病、筋ジストロフィー、骨形成不全症、軟骨無発生症、軟骨無形成症、軟骨低形成症、致死性骨異形成症、慢性進行性外眼麻痺症候群、カーンズ・セイヤー症候群、赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群、リー脳症、レーバー病、ミトコンドリア糖尿病及びピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）病からなる群から選択される１以上の疾患の有無を判定する工程である、［７］に記載の方法。
【０００９】
［９］  着床前の授精卵の遺伝子異常の有無を判定するシステムであって、
哺乳動物の授精卵の培養上清に含まれる核酸の調製手段と、
前記調製手段によって調製された前記核酸の塩基配列情報を取得する塩基配列情報取得手段と、
前記塩基配列情報取得手段により得られた塩基配列情報を解析して遺伝子異常の有無を判定する手段と、
前記判定する手段により得られた結果を出力する手段と、
を含み、
ここで、前記培養上清が、授精後の授精卵の透明帯に開口部を設けない授精卵の培養で得られた培養上清であることを特徴とする、システム。
［１０］  前記核酸の調製手段が、全ゲノム増幅手段を含む、［９］に記載のシステム。
［１１］  前記塩基配列情報取得手段が、次世代シークエンサー又はアレイＣＧＨである、［９］又は［１０］に記載のシステム。
［１２］  前記遺伝子異常の有無を判定する手段が、染色体異常の有無を判定する手段及び／又は遺伝性疾患に関連する遺伝子変異の有無を判定する手段である、［９］〜［１１］のいずれか１項に記載のシステム。
［１３］  前記遺伝子異常の有無を判定する手段が、染色体の異数性、転座、同腕染色体、逆位、片親性ダイソミー、モザイク、欠失若しくは倍数性異常を検出して染色体異常症の有無を判定する手段及び／又は先天性代謝異常症、原発性免疫不全症候群、先天性皮膚疾患、遺伝性腫瘍、先天性奇形症候群、先天性神経筋疾患、先天性骨系統疾患若しくはミトコンドリア病に関連する遺伝子異常を検出して、遺伝性疾患に関連する遺伝子変異の有無を判定する手段である、［９］〜［１１］のいずれか１項に記載のシステム。
［１４］  前記哺乳動物が、ヒトである、［９］〜［１３］のいずれか１項に記載のシステム。
［１５］  前記遺伝子異常の有無を判定する手段が、ターナー症候群、パトウ症候群、エドワーズ症候群、ダウン症候群、クラインフェルター症候群、トリポＸ（Ｔｒｉｐｏ−Ｘ）症候群、ＸＹＹ症候群、５ｐモノソミー（５ｐ−症候群）、５ｑモノソミー（５ｑ−症候群）及び４ｐモノソミー  ウォルフ・ヒルシュホーン症候群、フェニルケトン尿症、ビオプテリン代謝異常症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、色素性乾皮症、伴性無ガンマグロブリン血症、アデノシンデアミネース欠損症、先天性表皮水疱症、尋常性魚鱗癬、神経線維腫症１型、神経線維腫症２型、家族性大腸ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、アンジェルマン症候群、ウィリアムズ症候群、プラダー・ウィリー症候群、アイカルディ症候群、コルネリア・ド・ランゲ症候群、アペール症候群、血友病、筋ジストロフィー、骨形成不全症、軟骨無発生症、軟骨無形成症、軟骨低形成症、致死性骨異形成症、慢性進行性外眼麻痺症候群、カーンズ・セイヤー症候群、赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群、リー脳症、レーバー病、ミトコンドリア糖尿病及びピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）病からなる群から選択される１以上の疾患の有無を判定する手段である、［１４］に記載のシステム。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法及びシステムによれば、これまでに報告されている方法とは異なり、極めて簡便な方法及びシステムにて、着床前の授精卵の遺伝子異常の有無を判定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】２１トリソミーを有する授精卵由来ゲノム（ポジティブコントロール）の異数性を検出した結果を示す図である。常染色体（１番〜２２番）及び性染色体（Ｘ染色体及びＹ染色体）の異数性を解析した。Ｌｏｃｕｓ：染色体の部位、Ｌｅｎｇｔｈ：長さ、Ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ：コピー数、ＣｙｔｏＢａｎｄ：染色体における位置、ＣＮＶ  Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ：異数性の存在の信頼性、ＣＮＶ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ：実験の精度、Ｔｉｌｅｓ：タイル数、を示している。ＣＮＶ  Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅが「０」の場合は、異数性が無いことを示している。ＣＮＶ  Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅが＞１０である場合、異数性が存在し、かつ、そのデータの信頼性が高いことを示している。Ｔｉｌｅｓは、ＮＧＳで得られた断片データを照らし合わせる際に、染色体毎に１Ｍｂ〜２Ｍｂの領域で既に設定されている参照先を示している。
【図１Ｂ】２１トリソミーを有する授精卵由来ゲノム（ポジティブコントロール）の異数性を検出した結果を示す図である。各シークエンスデータを正規化して染色体毎に染色体数をプロットした。縦軸が染色体数を表す。横軸は染色体番号（１番〜２２番）及び性染色体（Ｘ及びＹ）を示している。異数性が無い場合は、ｙ＝２付近にプロットされる。以下、図２〜５において、図１Ａ及び図１Ｂと同様の内容で表されている。
【図２Ａ】授精卵由来ゲノム（６日胚、サンプルＡ）の異数性を検出した結果を示す図である。
【図２Ｂ】授精卵由来ゲノム（６日胚、サンプルＡ）の異数性を検出した結果を示す図である。
【図３Ａ】授精卵の培養上清由来ゲノム（６日胚、サンプルＡ）の異数性を検出した結果を示す図である。
【図３Ｂ】授精卵の培養上清由来ゲノム（６日胚、サンプルＡ）の異数性を検出した結果を示す図である。
【図４Ａ】授精卵由来ゲノム（６日胚、サンプルＨ）の異数性を検出した結果を示す図である。
【図４Ｂ】授精卵由来ゲノム（６日胚、サンプルＨ）の異数性を検出した結果を示す図である。
【図５Ａ】授精卵の培養上清由来ゲノム（６日胚、サンプルＨ）の異数性を検出した結果を示す図である。
【図５Ｂ】授精卵の培養上清由来ゲノム（６日胚、サンプルＨ）の異数性を検出した結果を示す図である。
【図６】授精卵由来ゲノム及び授精卵の培養上清由来ゲノムの異数性を比較した図である。図２〜５の結果を一覧表にしている。数字は検出された推定染色体数を示している。
【図７】本発明の一実施形態のフローチャートを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態に限定されることはない。
【００１３】
本発明において用いられる哺乳動物の授精卵とは、温血脊椎動物の授精卵をいい、例えば、ヒト及びサルなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット及びウサギなどの齧歯類、イヌ及びネコなどの愛玩動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどの家畜等が含まれるが、これらに限定されない。本発明において用いられる授精卵を提供する哺乳動物は、好ましくはヒトである。
【００１４】
本発明において用いられる用語「授精卵」とは、インビトロの環境において人為的に卵子と精子を授精させた後に得られる受精卵、その卵の卵割により得られる胚及びそれを凍結後融解した卵（胚）のいずれも含む意味であり、特に断りのない限り、いずれをも含む意味で用いられる。本発明の一実施形態において、「授精卵」は、例えば、下記に述べる体外授精（ＩＶＦ）又は顕微授精（ＩＣＳＩ）によって得られる。また、本明細書において、用語「受精卵」とは、上述の「授精卵」を含む用語であって、人為的な授精操作の有無にかかわらず、精子及び卵子が結合して形成される最初の細胞及びその卵割により得られる胚及びそれを凍結後融解した卵（胚）のいずれも含む用語である。
【００１５】
哺乳動物の受精卵は、受精後に卵割を繰り返し、２細胞期、４細胞期、８細胞期を経て小さな割球を形成しながら細胞数を増やし、桑実胚を経て胚盤胞を形成する。一般に、卵割は受精後３０分程度で開始され、受精後約３０時間で２細胞期、受精後約４０時間で４細胞期、受精後約６０時間で８細胞期となり、受精後３〜４日で桑実胚、受精後４〜６日で胚盤胞を形成する。受精前の卵子、受精卵及びそれらが卵割して形成する胚（受精胚ともいう）は、透明帯という膜によって覆われており、透明帯が受精卵を保護している。一般に、生体内において、卵管を通って子宮までたどり着いた胚盤胞は、子宮内で浮遊している間に透明帯から孵化（ハッチング）し、子宮内膜へ着床する。それにより妊娠が成立し、発生が進行する。
【００１６】
本発明において用いられる授精卵は、当業者に公知の手段によって得られるものであるが、例えば、体外授精（ＩＶＦ：Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）による媒精又は顕微授精（ＩＣＳＩ：ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｓｐｅｒｍ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって得られる授精卵が好ましい。
【００１７】
体外授精は、主に獣医学及び産婦人科領域で行われる方法であり、通常生体内で成立する受精を、人為的に体外で実施させる方法をいう。典型的には、インビトロにて、卵子を精子が含まれる溶液に暴露させて授精させる。ヒトにおいては、不妊治療の一環として用いられる方法である。具体的には、採卵される女性に性腺刺激ホルモンアナログを使用して排卵を防ぎ、閉経ゴナドトロピン又は精製卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ：Ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）又は合成ＦＳＨを使用して卵胞を成長させ、その後、卵胞が十分に成長したことを確認した後、性腺刺激ホルモンアナログや絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を使用して排卵を誘発させる。細い針を卵巣内卵胞へ刺し、卵胞内の卵子を回収する。採卵された卵子に、男性から回収した精子で媒精し、授精あるいは顕微授精させる方法である。授精後の卵は、培地で洗浄し、体温に近い温度、例えば３７℃付近で培養される。培養に使用される培地は、当業者に公知の培地を使用すればよく、限定されない。また、卵子の前培養、精子の前培養、授精卵の培養に用いられる培地は、それぞれの培養に適した培地を用いれば良く、限定されない。
【００１８】
顕微授精は、体外授精と同様、生体外において人為的に授精を成立させる方法である。典型的には、顕微鏡の下でマイクロマニピュレータ等を用いて、精子１個を卵子の細胞質へ直接注入する方法である。顕微授精は、特に精子の授精能を低下させる障害を有する患者の精子が用いられる場合に利用される。例えば、重症精子減少症、無精子症、精子無力症、精子奇形症、不動精子症などの障害を有する患者由来の精子である。本発明において、授精卵の形成に必要な精子は特に限定されない。顕微授精によって得られた授精卵を培養する培地、培養法の選択は、公知の方法に従えば良く、限定されない。
【００１９】
本発明の方法及びシステムは、生体外で授精して得られた授精卵が発生して個体へと成長した場合に、その個体が遺伝子異常を有するか否かを着床前に判定可能とする。本発明の方法及びそのシステムでは、子宮へ戻す前の授精卵をインビトロで培養する際に使用した培地の廃液（培養上清）が用いられる。本発明において、用語「培養上清」は、培養上清を当業者に公知の方法によって精製し、濃縮して得られたその濃縮物を含む意味で用いられる。本発明において用いられる培養上清を濃縮する手段については特に限定されない。本発明に用いられる培養上清として特に好ましいのは、授精後の授精卵の透明帯に開口部を設けない授精卵の培養で得られた培養上清である。また、本発明に用いられる授精卵の培養上清は、孵化前の授精卵の培養上清が好ましい。本発明者らは、授精後の授精卵をインビトロで培養した場合、授精卵を覆う透明帯を侵襲しなくても、培養上清中には授精卵由来の核酸、特に、授精卵由来のゲノムＤＮＡ又は染色体又はゲノムＤＮＡ若しくは染色体の一部が含まれていることを見出した。また、当該授精卵の培養上清中の核酸は、授精卵が有する核酸と一致することを見出した。従来の方法によれば、授精卵を覆う透明帯を侵襲し、該透明帯に穴を開けなければ、授精卵由来の核酸を調べることはできないとされていた。本発明によれば、授精卵の透明帯を侵襲する必要が無く、また、卵割により生じた割球の一部を利用することなく、授精卵の培養上清を用いることで、授精卵が発生した個体が有する可能性がある疾患や、性別を判定することが可能となる。
【００２０】
本発明で使用される授精卵の培養上清は、使用するまで凍結保存されてもよく、凍結保存されなくてもよい。凍結保存される場合は、例えば、−１０℃〜−２００℃で保存されてもよく、−１５℃〜−１５０℃で保存されてもよく、−２０℃〜−９０℃で保存されてもよい。凍結保存されない場合は、室温（例えば１５℃〜３０℃）であってもよく、０℃〜２５℃であってもよく、０℃〜１０℃であってもよく、２℃〜６℃であってもよい。
【００２１】
本発明で使用される授精卵の培養上清は、好ましくは、使用するまで凍結保存されたものである。凍結保存できれば、使用するまで培養上清中に含まれる核酸を安定的に保存することでき、好ましい。また、授精卵を培養する場所と、授精卵の培養上清を使用して本発明を実施する場所が異なる場合であっても、凍結保存することによって容易かつ安定的に運搬可能となり好ましい。凍結保存された培養上清は、使用直前に室温又は氷上又は４℃で融解して使用することができる。
【００２２】
本発明において、授精卵の培養上清は、授精後１〜７日に回収された培養上清である。好ましくは、授精後２〜６日に回収された培養上清である。より好ましくは、授精後３〜６日に回収された培養上清である。
【００２３】
本発明において、授精卵の培養上清は、授精卵の前核期（２ＰＮ（ｐｒｏｎｕｃｌｅｉ））〜胚盤胞期に回収された培養上清を使用できる。また、本発明において、授精卵の培養上清は、授精卵の４細胞期〜胚盤胞期に回収された培養上清を使用できる。また、本発明において、授精卵の培養上清は、授精卵の８細胞期〜胚盤胞期に回収された培養上清を使用できる。
【００２４】
本発明において、「授精後の授精卵の透明帯に開口部を設けない」とは、物理的手段（例えば、針、レーザーなど）又は化学的手段（例えば、タンパク分解酵素、酸処理など）によって、授精後の授精卵の透明帯に人為的に生じさせた穴を有さない状態をいう。すなわち、授精卵を覆う透明帯が裂けたり、薄膜化することによって生じる開口部を有さない状態であり、透明帯の膜の内外は、見かけ上隔離されている状態である。
【００２５】
本発明において、配列情報取得手段として、公知のシークエンサー（シーケンサーとも呼ばれる）又はアレイＣＧＨを用いることができる。
【００２６】
本明細書において、シークエンサーとは、核酸、特にＤＮＡの塩基配列を読み取ることができる装置をいう。本発明において、シークエンサーとしては、ジデオキシ法（サンガー法ともいう）を用いたシークエンサー（いわゆる、第１世代シークエンサー）、逐次ＤＮＡ合成・光検出法を用いて超並列シークエンスを実施するシークエンサー、１分子リアルタイム・シークエンシング法を用いるシークエンサー、又はポスト−ライトシークエンシング法を用いるシークエンサーなどを用いることができる。
【００２７】
本発明の一実施態様において、培養上清に含まれる核酸、特にゲノムの広範囲を構成するＤＮＡの塩基配列を、正確に、短時間に、かつ、大量に読み取る必要性があることから、塩基配列情報取得手段としては、第１世代以降に開発された次世代シークエンサーを用いることが好ましい。本明細書において、第１世代以降に開発されたシークエンサーを総称して次世代シークエンサー（ＮＧＳ：Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）といい、本特許出願の出願時において実用化されていないが、将来開発され、実用化されるシークエンサーも本発明に適用可能であることは、当業者であれば当然理解できる。
【００２８】
本発明に適用できる、逐次ＤＮＡ合成・光検出法を用いた次世代シークエンサーの具体例としては、例えば、イルミナ社のＨｉＳｅｑシステム（ＨｉｓＳｅｑ２０００、ＨｉＳｅｑ３０００、ＨｉＳｅｑ４０００）、ＭｉＳｅｑシステム、ＮｅｘｔＳｅｑシステム及びＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘ（ＧＡＩＩｘ）、Ｒｏｃｈｅ社のＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ、ＧｓＪｕｎｉｏｒ  Ｐｌｕｓ及びＧＳ  ＦＬＸ＋システム（ＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ＸＬ＋、ＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ＸＬＲ７０）、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社のＳｏＬｉＤ（商標）システム、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｖ２．０及びＩｏｎ  ＰＧＭ（商標）システムが挙げられるが、これに限定されない。
【００２９】
また、１分子リアルタイム・シークエンシング法を用いた次世代シークエンサーの例としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＰａｃＢｉｏ（登録商標）ＲＳ  ＩＩ及びＰａｃＢｉｏ（登録商標）Ｓｅｑｕａｌ（商標）システム、などが挙げられるがこれに限定されない。また、ポスト−ライトシークエンシング技術を用いた次世代シークエンサーの例としては、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧｒｉｄＩＯＮ  ｓｙｓｔｅｍなどが挙げられるが、これに限定されない。
【００３０】
本発明の一実施形態として使用される、逐次ＤＮＡ合成・光検出法を用いた次世代シークエンサーは、以下に挙げるいくつか共通した特長を有している。
【００３１】
（１）ライブラリＤＮＡの調製
解析したいサンプルＤＮＡを任意の長さに断片化し、アダプター配列をライゲーションしたＤＮＡライブラリを調製する。ライゲーションされたアダプター配列を介して、ＤＮＡライブラリがシークエンシングにハイブリダイゼーションして固定されることとなる。また、該アダプター配列が、シークエンシングプライマーのユニバーサルプライミング部位となる。
【００３２】
（２）テンプレートの調製
アダプター配列がライゲーションされたライブラリＤＮＡ断片を、該アダプター配列の相補配列のリンカーを有する固体表面（ビーズ又は平らなシリコン素材表面）へハイブリダイズさせる。固体表面上でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、各ライブラリＤＮＡをクローン増幅させ、単一ライブラリ断片に由来するＤＮＡのクラスター群を形成させる。
【００３３】
なお、ビーズに固定させたライブラリＤＮＡを用いる方法では、水滴中の単一のビーズが単一のライブラリＤＮＡ断片を有するように調製し、ＰＣＲ（エマルジョンＰＣＲ）を行うことで、ビーズ状に単一ライブラリＤＮＡ断片由来のクラスター群を形成させる。また、平らなシリコン素材表面を用いた方法では、ブリッジＰＣＲによって、単一ＤＮＡ断片に由来するクラスター群をシリコン素材表面上に形成させる。各クラスターが個々のシークエンシング反応で作用する。
【００３４】
（３）シークエンシング
シークエンサーでは、各クラスターの塩基配列をテンプレート（鋳型）として、核酸を取り込む反応を行わせる。その際、取り込まれた核酸の塩基の種類に応じて、光または蛍光シグナルを産生する。それらのシグナルを読み取り、核酸の塩基配列を情報として取り込む。
【００３５】
（４）データ出力：
それぞれの機器はシークエンシング実行終了時に生データを出力する。この生データは各ライブラリＤＮＡ断片の塩基配列由来の膨大なデータである。任意のソフトウエアを用いて、生データを処理し、所望の解析を行う。
【００３６】
本発明において、核酸を調製する工程は、核酸の任意の塩基配列を挟むフォワード及びリバースプライマーのセット並びにＤＮＡポリメラーゼを用いて、特定の塩基配列領域をＰＣＲで増幅する工程や、全ゲノム増幅（ＷＧＡ：Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）手段、例えば、市販の全ゲノム増幅用試薬又はキットを用いて核酸を増幅する工程を含んでもよい。本発明において、核酸を調製する工程は、全ゲノム増幅手段によって核酸を増幅する工程を含むことが好ましい。本発明において、核酸を増幅する工程は、特に少量の核酸を含むサンプルからゲノムのほぼ全領域をカバーし、かつ、増幅される領域のバイアスが小さくなるような全ゲノム増幅手段を用いることが好ましく、この目的を達成できる全ゲノム増幅手段であれば特に限定されない。本発明において、核酸を調製する工程は、手動の手段で行っても良く、自動装置等を用いた自動手段によって実施してもよく、手動及び自動の手段を混合して実施してもよい。
【００３７】
本発明の一実施形態において、全ゲノム増幅手段として使用可能な市販のキットは、例えば、シグマアルドリッチ社が提供するＧｅｎｏｍｅＰｌｅｘ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ニュー・イングランド・バイオラボ社が提供するＰｉｃｏＰＬＥＸＴＭ  ＷＧＡ  Ｋｉｔ、キアゲン社が提供するＲＥＰＬＩ−ｇ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｋｉｔ、又はシグニス社が提供するＴｒｕｅ  Ｐｒｉｍｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  ＷＧＡ  Ｋｉｔなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明の一実施形態において、核酸を調製する工程は、本発明で使用される塩基配列情報取得手段に応じて、適宜選択される。例えば、塩基配列情報取得手段として、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社が提供するＩｏｎ  ＰＧＭ（商標）システムを用いる場合、核酸を調製する工程は、全ゲノム増幅手段によって核酸を増幅する工程と、増幅された核酸を用いて、さらにライブラリ核酸、特にライブラリＤＮＡを調製する工程を含む必要がある。
【００３９】
例えば、塩基配列情報取得手段として、次世代シークエンサーであるＩｏｎ  ＰＧＭ（商標）システムを用いる場合、ライブラリＤＮＡは、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社が提供するキット（例えば、Ｉｏｎ  Ｘｐｒｅｓｓ  Ｐｌｕｓ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ及びＩｏｎ  Ｘｐｒｅｓｓ  Ｂａｒｃｏｄｅ  Ａｄａｐｔｅｒｓ  １−１６  Ｋｉｔ）及びそれに付属の説明書に従って調製される。ライブラリＤＮＡを調製するための方法及び試薬等は上記に限定されず、同一の目的を達成可能なものであれば、代替的に利用可能である。より好ましくは、シークエンサーを提供する会社が推奨するキット又は試薬である。
【００４０】
調製されたライブラリＤＮＡは、さらに、次世代シークエンサーで解読するために調製される。例えば、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社が提供するＩｏｎ  ＰＧＭ（商標）シークセンサーを用いる場合、Ｉｏｎ  ＰＧＭ（商標）Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＯＴ２  ２００  Ｋｉｔ、Ｉｏｎ  ＰＧＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ２００  Ｋｉｔ  ｖ２、及びＩｏｎ  ３１６  Ｃｈｉｐ  Ｋｉｔ  ｖ２（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社）を用いて調製し、Ｉｏｎ  ＰＧＭ（商標）シークセンサーを用いて核酸の塩基配列が解読される。本明細書に記載した試薬及びチップは例示であって、用いられるシークエンサーに応じて適宜選択することが可能である。
【００４１】
本発明により、授精卵の培養上清に含まれる核酸の塩基配列情報が得られる。得られた核酸の塩基配列情報は、任意のソフトウエアを用いて解析することによって、生体外で授精させて得られた授精卵が発生して個体へ成長した場合に、その個体が疾患を有するか否か、染色体の異数性又は、遺伝子異常の有無を判定することが可能である。使用されるソフトウエアについては特に限定されない。
【００４２】
本発明の一実施形態において、次世代シークエンサーから出力される塩基配列から信頼性の高い解析結果を導くためには、少なくとも同一の塩基配列を３０回程度カバーするデータ量を用いることが好ましい。次世代シークエンサーから出力される塩基配列の断片をコンピュータ上で統合処理を行い、各種の遺伝子配列が登録されている遺伝子データベース（例えば、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）等）の塩基配列との比較等により、遺伝子変異の有無を判定することが可能である。
【００４３】
本発明の一実施形態において、授精卵の培養上清中に含まれる核酸から得られた塩基配列情報と、データベースに登録されている疾患特異的な遺伝子変異の情報（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）による疾患特異的遺伝子変異）との比較によって、遺伝子異常の有無を判定することが可能である。
【００４４】
本発明において、遺伝子異常とは、遺伝子疾患を引き起こす原因となる遺伝子の異常をいい、例えば、染色体異常、遺伝子突然変異、疾患特異的な一塩基多型（ＳＮＰ）などを含んでいる。本明細書において、染色体異常とは、染色体の異数性、転座、同腕染色体、逆位、片親性ダイソミー、モザイク、欠失又は倍数性異常を含んでいる。本明細書において、遺伝子突然変異とは、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異などを含んでいる。本明細書において、疾患特異的一塩基多型（ＳＮＰ）とは、疾患を引き起こすことが知られている塩基の変異をいう。
【００４５】
本発明の一実施態様において、授精卵の培養上清中に含まれる核酸、特にゲノムＤＮＡの塩基配列情報を基に、常染色体（例えば、ヒトでは１番〜２２番）の異数性や、性染色体（例えば、ヒトではＸ染色体及び／又はＹ染色体）の数を識別することが可能となる。また、本発明の一実施形態において、得られた塩基配列情報を、任意のソフトウエアを用いて解析することによって、染色体の異数性、転座、同腕染色体、逆位、片親性ダイソミー、モザイク、欠失若しくは倍数性異常を検出して染色体異常症の有無を判定することが可能となる。本発明で使用されるソフトウエアの例としては、例えば、Ｉｏｎ（商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒソフトウエア（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いることができるが、これに限定されない。
【００４６】
本明細書において、異数性とは、染色体（または染色体の一部）の数が正常とは異なるものをいう。異数性は、染色体のコピー数が３である場合（「トリソミー」）、又はコピー数が１の場合（「モノソミー」）などが知られている。減数分裂中の染色体の不分離によって起こるこれらの染色体数の変化は、個体発生に影響を及ぼし、種々の疾患（症候群）をもたらす。トリソミー及びモノソミーの染色体を有する個体の多くは、授精障害、着床障害、自然流産の原因となり、出生後早期に死亡する原因ともなる。また、いくつかの染色体の異数性は種々の症候群をもたらす。
【００４７】
よく知られている異数性は、２１番染色体、１８番染色体、１３番染色体トリソミー、及び性染色体数の異常である。２１トリソミーは、ダウン症候群を発症する原因として知られる。１８トリソミーは、エドワーズ症候群を発症する原因として知られる。１３トリソミーは、パトウ症候群（パトー症候群）を発症する原因として知られる。性染色体異数性（ＳＣＡ）は、例えば、Ｘ染色体の欠失（Ｘ−）はターナー症候群、Ｘ染色体の付加はクラインフェルター症候群（ＸＸＹ）又はトリポＸ（Ｔｒｉｐｏ−Ｘ）症候群（ＸＸＸ）、Ｙ染色体の付加はＸＹＹ症候群（ＸＹＹ）を引き起こすことが知られている。さらに、常染色体の異常としては、５ｑモノソミー（５ｑ−症候群）及び４ｐモノソミー  ウォルフ・ヒルシュホーン症候群等が知られている。本明細書において、染色体異常によって引き起こされる疾患を総称して染色体異常症という。染色体異常によって引き起こされる上記の疾患は例示であり、本発明の方法及びシステムによって判定できる疾患は上記の例に限定されない。染色体異常症は、染色体の異数性、転座、同腕染色体、逆位、片親性ダイソミー、モザイク、欠失若しくは倍数性異常によって引き起こされる。本発明の一実施形態において、本発明の方法及びシステムは、着床前の授精卵の染色体の異数性、転座、同腕染色体、逆位、片親性ダイソミー、モザイク、欠失若しくは倍数性異常を判定することが可能である。
【００４８】
本発明によって、上記染色体の異数性を原因とする疾患の有無を、授精卵を侵襲することなく、授精卵の着床前に判定することが可能となる。また、疾患の有無だけでなく、性別、例えば、ＸＸ又はＸＹを判定することも可能となる。
【００４９】
本発明は、着床前の授精卵が遺伝性疾患に関連する遺伝子変異を有するか否かを判定することを可能とする。本発明によって判定することが可能な疾患の例としては、例えば、先天性代謝異常症、原発性免疫不全症候群、先天性皮膚疾患、遺伝性腫瘍、先天性奇形症候群、先天性血液疾患、先天性神経筋疾患、先天性骨系統疾患又はミトコンドリア病が挙げられる。本発明によって判定可能な先天性代謝異常症の例としては、例えば、フェニルケトン尿症、ビオプテリン代謝異常症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、色素性乾皮症、白皮症が挙げられる。本発明によって判定可能な原発性免疫不全症候群の例としては、例えば、伴性無ガンマグロブリン血症、アデノシンデアミネース欠損症、複合免疫不全症等が挙げられる。本発明によって判定可能な先天性皮膚疾患の例としては、例えば、先天性表皮水疱症、尋常性魚鱗癬等が挙げられる。本発明によって判定可能な遺伝性腫瘍の例としては、例えば、神経線維腫症１型、神経線維腫症２型、家族性大腸ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス大腸癌等が挙げられる。本発明によって判定可能な先天性奇形症候群の例としては、例えば、アンジェルマン症候群、ウィリアムズ症候群、プラダー・ウィリー症候群、アイカルディ症候群、コルネリア・ド・ランゲ症候群、アペール症候群等が挙げられる。本発明によって判定可能な先天性血液疾患の例としては、例えば、血友病、ファンコニ貧血等が挙げられる。本発明によって判定可能な先天性神経筋疾患の例としては、例えば、筋ジストロフィー、レット症候群等が挙げられる。本発明によって判定可能な先天性骨系統疾患としては、例えば、骨形成不全症、軟骨無発生症、軟骨無形成症、軟骨低形成症、致死性骨異形成症等が挙げられる。本発明によって判定可能なミトコンドリア病の例としては、例えば、慢性進行性外眼麻痺症候群、カーンズ・セイヤー症候群、赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群、リー脳症、レーバー病、ミトコンドリア糖尿病及びピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）病等が挙げられる。本発明によって判定可能な上記の疾患は例示であり、これらに限定されない。
【００５０】
本発明の一実施形態において、塩基配列情報取得手段としてアレイＣＧＨ（比較ゲノムハイブリダイゼーション（マイクロアレイＣＧＨともいう））を用いることもできる。アレイＣＧＨとは、サンプル中の核酸、特にＤＮＡのコピー数変化（過剰又は減少）を検出する手段である。アレイＣＧＨは当業者に公知の手法によって実施することが可能である。具体的には、調査したいサンプル（検体）と、コントロールサンプルとから抽出したＤＮＡとをそれぞれ異なる蛍光色素で標識し、検体とコントロールサンプルのＤＮＡを混ぜ、繰り返し配列をブロックするためのヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡ（Ａｌｕ配列及びＫｐｎファミリー等の繰り返し配列を含む胎盤由来のＤＮＡ）を添加し、得られた混合物を、任意の配列を有するＤＮＡプローブを含むスライド上に暴露してハイブリダイズさせ、当該スライドを落射蛍光顕微鏡及び定量的画像解析を用いて蛍光強度の変化（増加／減少）を検出し、ゲノムＤＮＡに含まれる異常な領域を判定する。アレイＣＧＨに用いられる試薬、機器は当業者に公知のものを使用すればよく、限定されない。アレイＣＧＨを用いることで、上記シークエンサーを用いる場合と同様、ゲノムＤＮＡ、特に染色体の異数性、転座、同腕染色体、逆位、片親性ダイソミー、モザイク、欠失若しくは倍数性異常を検出して染色体異常症の有無を判定することが可能となる。
【００５１】
本発明の一実施形態において、本発明のシステムは、哺乳動物の授精卵の培養上清に含まれる核酸の調製手段と、前記調製手段によって調製された前記核酸の塩基配列情報を取得する塩基配列情報取得手段と、前記塩基配列情報取得手段により得られた塩基配列情報を解析して遺伝子異常の有無を判定する手段と、前記判定する手段により得られた結果を出力する手段と、を含むシステムであって、前記培養上清が、授精後の授精卵の透明帯に開口部を設けない授精卵の培養で得られた培養上清を用いることを特徴としている。本発明のシステムは、前述の本発明の方法を実施するように構成されたものであり、上記本発明の方法で挙げられた構成又は手段は、本発明のシステムに全て適用可能である。
【００５２】
本発明のシステムの一実施形態において、核酸の調製手段は、核酸の任意の塩基配列を挟むフォワード及びリバースプライマーのセット並びにＤＮＡポリメラーゼを用いて、特定の塩基配列領域をＰＣＲで増幅する手段や、全ゲノム増幅（ＷＧＡ：Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）手段、例えば、市販の全ゲノム増幅用試薬又はキットを用いた核酸の増幅手段を含んでもよい。本発明のシステムは、手動の手段で構成されてもよく、自動化された手段で構成されてもよく、手動及び自動の手段が混合された構成であってもよい。
【００５３】
本発明において、塩基配列情報の解析は、任意のソフトウエアがインストールされたローカルサーバ上で行われるものであってもよく、インターネットを介してクラウドサーバ上で行われるものであっても良く、限定されない。
【００５４】
本発明において、遺伝子異常の有無を判定する手段は、染色体異常の有無を判定する手段及び／又は遺伝性疾患に関連する遺伝子変異の有無を判定する手段であってもよい。また、本発明において、遺伝子異常の有無を判定する手段が、染色体の異数性、転座、同腕染色体、逆位、片親性ダイソミー、モザイク、欠失若しくは倍数性異常を検出して染色体異常症の有無を判定する手段及び／又は先天性代謝異常症、原発性免疫不全症候群、先天性皮膚疾患、遺伝性腫瘍、先天性奇形症候群、先天性血液疾患、先天性神経筋疾患、先天性骨系統疾患又はミトコンドリア病に関連する遺伝子異常を検出して、遺伝性疾患に関連する遺伝子変異の有無を判定する手段であってもよい。遺伝子異常の有無を判定する基準については公知の方法に従えばよく、例えば、サンプルに含まれる核酸の任意の塩基配列が、データベース上に登録されている変異を有する疾患特異的遺伝子の塩基配列と合致する場合、遺伝子異常が「有」と判定することができる。
【００５５】
本発明において、遺伝子異常の有無を判定する手段は、例えば、任意のソフトウエアがインストールされたローカルサーバ上で行われるものであってもよく、インターネットを介してクラウドサーバ上で行われるものであっても良く、限定されない。
【００５６】
本発明において、遺伝子異常の有無を判定する手段によって得られた結果を出力する手段としては、例えば、結果を表示するモニタであってもよく、結果を印字して出力するプリンタ等であってもよく、限定されない。
【実施例】
【００５７】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【００５８】
１．授精方法
本実施例では、体外授精（ＩＶＦ：Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）又は顕微授精（ＩＣＳＩ：ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｓｐｅｒｍ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）後に発生が停止又は異常であった卵（廃棄卵）及びその培養液を使用した。以下に授精の手順を示す。
【００５９】
１−１．体外授精（ＩＶＦ）
採卵した卵子は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＩＶＦ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｏｒｉｇｉｏ、１０３１５０６０）を用いて媒精し、翌日授精を確認した。授精した卵子を洗浄後、授精卵培養用培地ｇｌｏｂａｌ  ｔｏｔａｌ（ＬｉｆｅＧｌｏｂａｌ）５０μＬへ移し、５〜６日間、胚盤胞まで培養した。培養は、３７℃、６％ＣＯ2、５％Ｏ2、８９％空気、飽和湿度の気相条件下のインキュベーター（ＥＳＰＥＣ）にて行った。培養には、３５ｍｍのペトリディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ、３５１００８）を使用した。
【００６０】
１−２．顕微授精（ＩＣＳＩ）
採卵した卵子を授精卵培養用培地ｇｌｏｂａｌ  ｔｏｔａｌ（ＬｉｆｅＧｌｏｂａｌ）へ移し、マイクロマニピュレータを用いて、ガラスピペットで精子１個を直接卵子の細胞質内へ注入した。培養は、ＩＶＦと同じ条件で培養した。
【００６１】
２．サンプル回収手順
上記手順で培養し、発生が停止若しくは異常な胚（廃棄胚）及びそれを培養していた培養上清（５０μＬ全量）をそれぞれＰＣＲチューブに移し、−３０℃にて凍結保存した。
【００６２】
３．全ゲノム増幅手順
＜使用したサンプル＞
・廃棄胚（Ｄａｙ６胚）
・廃棄胚培養上清
【００６３】
＜使用した試薬＞
・ＧｅｎｏｍｅＰｌｅｘ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ社）
【００６４】
各サンプルの全ゲノム増幅手順は、上記キットに添付されている説明書に従って実施した。以下にその手順を簡単に述べる。
【００６５】
各サンプルを新しいＰＣＲチューブに移した。サンプルが入っているＰＣＲチューブにｐｒｅ−ａｍｐ反応溶液を加えた。ｐｒｅ−ａｍｐ反応溶液を加えたＰＣＲチューブをサーマルサイクラーにセットし、ｐｒｅ−ａｍｐ反応を行った。反応後のＰＣＲチューブにＷｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＷＧＡ）反応溶液を加えた。ＷＧＡ反応溶液を加えたＰＣＲチューブをサーマルサイクラーにセットし、ＷＧＡ反応を行った。ＷＧＡ反応後の反応溶液を全量用いて核酸精製を行った。核酸精製後の溶液を用いてゲル電気泳動を行い、泳動後のゲル写真にてＷＧＡ反応を確認した。核酸精製後の溶液に含まれる核酸量の定量を行った。定量にて十分量の核酸が得られたものを、以降ＷＧＡ反応後精製済核酸溶液として扱った。
【００６６】
４．次世代シークエンサー（ＮＧＳ：Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）ライブラリ調製手順
＜使用した試薬＞
・Ｉｏｎ  Ｘｐｒｅｓｓ（商標）Ｐｌｕｓ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、米国）
・Ｉｏｎ  Ｘｐｒｅｓｓ（商標）Ｂａｒｃｏｄｅ  Ａｄａｐｔｅｒｓ  １−１６  Ｋｉｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、米国）
【００６７】
上述の全ゲノム増幅手順にて調製したサンプルを使用してＮＧＳライブラリを調製した。ＮＧＳライブラリは、上記キットに添付されている説明書に従って実施した。以下にその手順を簡単に述べる。
【００６８】
ＷＧＡ反応後精製済核酸溶液を用いて断片化（Ｓｈｅａｒｉｎｇ）反応を行った。断片化反応後溶液に反応停止液を加えた。断片化反応停止後溶液を精製用磁気ビーズで精製した。断片化反応後精製溶出液を用いてアダプターライゲーション（Ａｄａｐｔｅｒ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応を行った。アダプターライゲーション反応後溶液を精製用磁気ビーズで精製した。アダプターライゲーション反応後精製溶液をアガロースゲル電気泳動にかけた。ゲル電気泳動後の泳動パターン及びサイズマーカーから、任意サイズをセレクションし回収した。ゲル電気泳動後回収溶液を用いてライブラリ増幅（Ａｍｐｌｉｆｙ）反応を行う。
ライブラリＡｍｐｌｉｆｙ反応後溶液を精製用磁気ビーズで精製した。ライブラリ増幅反応後精製溶液内の核酸量及び品質をＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザ（アジレント・テクノロジー株式会社）で測定した。測定後の溶液を以降ライブラリ調製済溶液として扱った。
【００６９】
５．ＮＧＳランニング手順
＜使用したキット＞
・Ｉｏｎ  ＰＧＭ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＯＴ２  ２００  Ｋｉｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、米国）
・Ｉｏｎ  ＰＧＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ２００  Ｋｉｔ  ｖ２（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、米国）
・Ｉｏｎ  ３１６  Ｃｈｉｐ  Ｋｉｔ  ｖ２（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、米国）
【００７０】
上述のＮＧＳライブラリ調製手順にて得られたサンプルを使用してＮＧＳランを行った。ＮＧＳランは、上記キットに添付されている説明書に従って実施した。以下にその手順を簡単に述べる。
【００７１】
Ｉｏｎ  ＯｎｅＴｏｕｃｈ（商標）２  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ装置（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、米国）のセットアップを行った。ＮＧＳライブラリ調製済の溶液の濃度を調製した。その後、エマルジョンＰＣＲを行った。
【００７２】
Ｉｏｎ  ＯｎｅＴｏｕｃｈ（商標）ＥＳ装置（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、米国）のセットアップを行った。エマルジョンＰＣＲ後溶液を濃縮し、精製した。
【００７３】
Ｉｏｎ  ＰＧＭ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ装置（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、米国）のセットアップを行った。装置に付属のパーソナルコンピュータ（ＰＣ）上でランニングプランを作成した。
【００７４】
エマルジョンＰＣＲ後の精製濃縮サンプルを専用チップにローディングした。Ｉｏｎ  ＰＧＭ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ装置でＮＧＳランを行った。
【００７５】
ラン終了後、ＰＣ上でデータ取り出し、Ｉｏｎ  ＰＧＭ（商標）システム（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、米国、型番：４４６２９２１）を用いてゲノムマッピングを行った。得られたマッピングデータを、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社が提供するクラウド解析サービス「Ｉｏｎ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ」にアップロードし、解析メニューの１つである「Ｌｏｗ−ｐａｓｓ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ」を使用して、染色体の異数性の解析を行った。
【００７６】
＜結果＞
顕微授精（ＩＣＳＩ）及び対外授精（ＩＶＦ）により得られた授精卵の培養６日後の廃棄胚（Ｄａｙ６胚）及びその培養上清から、ＤＮＡの抽出および増幅を行うことができた。特に、培養上清中のＤＮＡの増幅が確認された２検体（Ａ、Ｈ（いずれもＩＣＳＩ））を用いて、次世代シーケンサーによって染色体の異数性解析を行った。その結果、両者とも、廃棄胚と培養上清中の染色体の異数性がほぼ一致していることが明らかになった（図２〜６）。本結果より、ＤＮＡの増幅が顕著であった培養上清中のＤＮＡは、廃棄胚とほぼ一致していることが明らかになった。
【００７７】
本発明を用いることで、胚に全く侵襲を与えることなく簡便に胚の染色体の異数性を検出することが可能となった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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