(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片の提供。【解決手段】特定ののアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、および／または重鎖ＣＤＲ２、および／または重鎖ＣＤＲ３、ならびに／あるいは特定のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および／または軽鎖ＣＤＲ２、および／または軽鎖ＣＤＲ３を含む、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片であって、下記を含むアンタゴニスト抗体またはその断片：
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；ならびに／あるいは
配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；ならびに／あるいは
配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む、
請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項３】
マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項４】
ヒト化抗体である、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項５】
配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項６】
配列番号７の重鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一である重鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項７】
配列番号３５、３６、３７および３８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖配列を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項８】
重鎖配列が、配列番号３５、３６、３７または３８からなる群より選択される重鎖配列の重鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一である非ＣＤＲ領域を含む、請求項７に記載の抗体またはその断片。
【請求項９】
配列番号５８、５９、７９および８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項１０】
配列番号５８、５９、７９および８０からなる群より選択される重鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一である重鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項１１】
ＩＧＨＶ２−７０*１０（配列番号１９）、ＩＧＨＶ２−７０*０１（配列番号２０）、ＩＧＨＶ２−７０*１３（配列番号２１）、ＩＧＨＶ２−５*０９（配列番号２２）およびＩＧＨＶ２−７０*１１（配列番号２３）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物で
あるかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項１２】
抗体またはその断片が、ヒト遺伝子ＩＧＨＶ２−７０*１０（配列番号１９）の産物で
あるかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域を含み、重鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項１３】
抗体またはその断片が、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含み、重鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項１４】
アミノ酸改変が、２３位、３５ｂ位、４８位、５０位、６０位および６２位からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに従って示される、請求項１２または１３に記載の抗体またはその断片。
【請求項１５】
アミノ酸改変が、２３Ｓ、３５ｂＧ、４８Ｌ、５０Ｈ、６０Ｎおよび６２Ａからなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに従って示される、請求項１２または１３に記載の抗体またはその断片。
【請求項１６】
配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項１７】
配列番号８の軽鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一である軽鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項１８】
配列番号４５、４６、４７および４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項１９】
軽鎖配列が、配列番号４５、４６、４７または４９からなる群より選択される軽鎖配列の軽鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一である非ＣＤＲ領域を含む、請求項１８に記載の抗体またはその断片。
【請求項２０】
配列番号６０、８６、８７および８９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項２１】
配列番号６０、８６、８７および８９からなる群より選択される重鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一である軽鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項２２】
ＩＧＫＶ３−１１*０１（配列番号２４）、ＩＧＫＶ１−３９*０１（配列番号２５）、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９*０１（配列番号２６）、ＩＧＫＶ３−１１*０２（配列番号２７）およびＩＧＫＶ３−２０*０１（配列番号２８）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産
物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項２３】
抗体またはその断片が、ヒト遺伝子ＩＧＫＶ３−１１*０１（配列番号２４）の産物で
あるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含み、軽鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項２４】
抗体またはその断片が、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含み、軽鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の対応する軽鎖可変フレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその断片。
【請求項２５】
アミノ酸改変が、１位、３３位、３４位、４６位、４７位、５４位、５６位および７１位からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに従って示される、請求項２３または２４に記載の抗体またはその断片。
【請求項２６】
アミノ酸改変が、１Ｑ、３３Ｍ、３４Ｈ、４６Ｐ、４７Ｗ、５４Ｌ、５６Ｓおよび７１Ｙからなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに従って示される、請求項２３または２４に記載の抗体またはその断片。
【請求項２７】
アミノ酸改変が、アミノ酸位置３１位でのアミノ酸欠失を含み、アミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに従って示される、請求項２３または２４に記載の抗体またはその断片。
【請求項２８】
（ａ）配列番号３７または配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖配列と、
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖配列と
を含む、請求項２に記載の抗体またはその断片。
【請求項２９】
（ａ）配列番号５８または配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列と、
（ｂ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列と
を含む、請求項２に記載の抗体またはその断片。
【請求項３０】
重鎖ＣＤＲの少なくとも１つおよび／または軽鎖ＣＤＲの少なくとも１つが、少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項３１】
重鎖および／または軽鎖定常領域をさらに含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項３２】
ヒト重鎖定常領域が、ＩＧＨＧ１、非フコシル化ＩＧＨＧ１およびＩＧＨＧ４からなる、ヒト免疫グロブリンの群から選択される、請求項３１に記載の抗体またはその断片。
【請求項３３】
抗体が、１価抗体である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項３４】
抗体が、全長抗体である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項３５】
抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、２重特異性単鎖Ｆｖ２量体、ダイアボディ、トリアボディおよび同じまたは異なる抗体と遺伝子的に融合したｓｃＦｖからなる群より選択される抗体断片である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項３６】
抗体が、親抗体のＦｃ領域と比べて少なくとも１つのアミノ酸改変を含むバリアントＦｃ領域を含み、バリアントＦｃ領域を含む抗体が、親抗体と比較して変更されたエフェクター機能を示す、請求項１から３１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項３７】
１１０ｎＭ以下の親和性（ＫＤ）でヒトＯＸ４０と結合する、請求項１から３６のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項３８】
対応するキメラ抗体のＯＸ４０結合親和性（ＫD）の少なくとも７５％を保持する、請
求項１から３６のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項３９】
対応するキメラ抗体と比較した場合に、等しいかまたはより高いＯＸ４０結合親和性（ＫD）を有する、請求項１から３６のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項４０】
抗体が、７５℃を超えるＦＡＢ断片耐熱温度を有する、請求項１から３６のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項４１】
ヒトＯＸ４０と結合する抗体またはその断片であって、
請求項１から３６のいずれか一項に記載の抗体と同じエピトープと結合する、
抗体またはその断片。
【請求項４２】
請求項１から３６のいずれか一項に記載の抗体と結合する、ヒトＯＸ４０細胞外ドメイン上のエピトープ。
【請求項４３】
ヒトＯＸ４０細胞外ドメインが、ドメイン２（配列番号７６）である、請求項４２に記載のエピトープ。
【請求項４４】
請求項１から４１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片をコードする単離核酸。
【請求項４５】
配列番号６１もしくは６２の核酸配列を含む、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ；および／または
配列番号６３の核酸配列を含む、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ
を含む、請求項４４に記載の単離核酸。
【請求項４６】
請求項４４または４５に記載の単離核酸を含むベクター。
【請求項４７】
請求項４４もしくは４５に記載の単離核酸または請求項４６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４８】
核酸が発現され、抗体が生成されるように、請求項４７に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、ヒトＯＸ４０と結合する抗体またはその断片を生成する方法。
【請求項４９】
請求項４４または４５に記載の単離核酸によりコードされる、ヒトＯＸ４０と結合する抗体またはその断片。
【請求項５０】
請求項１から４１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項５１】
治療剤に連結した請求項１から４１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を含むイムノコンジュゲート。
【請求項５２】
請求項５１に記載のイムノコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項５３】
別の医薬活性物質をさらに含む、請求項５０または５２に記載の組成物。
【請求項５４】
対象におけるＯＸ４０媒介性障害を処置するための方法であって、対象に治療有効量の請求項１から４１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を投与するステップを含む方法。
【請求項５５】
ＯＸ４０媒介性障害が、感染症（ウイルス、細菌、真菌および寄生虫）、感染症に伴う内毒素ショック、関節炎、関節リウマチ、喘息、ＣＯＰＤ、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒合、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、関節炎、髄膜脳炎、自己免疫性ぶどう膜炎、中枢および末梢神経系の免疫媒介性炎症性障害、例えば多発性硬化症、ループス（例えば全身性エリテマトーデス）およびギラン−バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化胞隔炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫障害、膵炎、外傷（手術）、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、虚血性疾患を含む心血管疾患、例えば心筋梗塞およびアテローム動脈硬化症、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎、低酸症ならびに視神経脊髄炎からなる群より選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ＯＸ４０媒介性障害が、感染症（ウイルス、細菌、真菌および寄生虫）、感染症に伴う内毒素ショック、関節炎、関節リウマチ、喘息、気管支炎、インフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、肺炎、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、原因不明の線維化胞隔炎（ＣＦＡ）、特発性線維化間質性肺炎、肺気腫、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒合、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、関節炎、髄膜脳炎、自己免疫性ぶどう膜炎、中枢および末梢神経系の免疫媒介性炎症性障害、例えば多発性硬化症、ループス（例えば全身性エリテマトーデス）およびギラン−バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化胞隔炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫障害、膵炎、外傷（手術）、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、虚血性疾患を含む心血管疾患、例えば心筋梗塞およびアテローム動脈硬化症、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎、低酸症ならびに視神経脊髄炎からなる群より選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
対象が、低いＯＸ４０発現レベルを有する、請求項５４から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
抗体が、ヒト重鎖定常領域ＩＧＨＧ１を有する抗体と比較して、細胞傷害作用が増進している、請求項５４から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
医薬品としての請求項１から４１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片の使用。
【請求項６０】
ＯＸ４０媒介性障害の処置のための医薬品の調製における、請求項１から４１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片の使用。
【請求項６１】
ＯＸ４０媒介性障害が、ＧＶＨＤであり、抗体またはその断片が、ＧＶＨＤの抑制においてＥｎｂｒｅｌ（登録商標）より効果的である、請求項６０に記載の抗体またはその断片の使用。
【請求項６２】
医薬品として用いるための、請求項１から４１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項６３】
ＯＸ４０媒介性障害を処置するための方法において用いるための、請求項１から４１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項６４】
ＯＸ４０媒介性障害を処置するための方法において用いるための、請求項１から４１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片であって、ＯＸ４０媒介性障害が、ＧＶＨＤであり、抗体またはその断片が、ＧＶＨＤの抑制においてＥｎｂｒｅｌ（登録商標）より効果的である、抗体またはその断片。
【請求項６５】
請求項１から４１のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片、請求項５０、５２もしくは５３に記載の組成物または請求項５１に記載のイムノコンジュゲートを含む、ＯＸ４０媒介性障害の処置のための製造品。
【請求項６６】
請求項１から３０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片、請求項５０、５２もしくは５３に記載の組成物または請求項５１に記載のイムノコンジュゲートを含む、ＯＸ４０媒介性障害の処置のためのキット。
【請求項６７】
ＯＸ４０の発現レベルが低い患者を検出するｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング方法であって、下記を含む方法：
（ａ）患者血液試料から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製するステップ、
（ｂ）ＰＢＭＣをフローサイトメトリー分析に供するステップ、および
（ｃ）ＣＤ４+および／またはＣＤ８+Ｔ細胞中のＯＸ４０陽性細胞の数を決定し、前記数を対照レベルと比較するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年７月１１日に出願された米国仮出願第６１／５０６，４９１号（これらの全ては本明細書に参照によりそれらの全体が組み込まれている）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片に関する。より具体的には、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、ならびに／あるいは配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＯＸ４０は、受容体のＴＮＦＲスーパーファミリーの一員であり、ラットの活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現される５０ｋＤａの糖タンパク質として１９８７年に最初に同定された（Ｐａｔｅｒｓｏｎ  ＤＪら、（１９８７）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：１２８１〜９０頁）。ＯＸ４０の細胞外リガンド結合ドメインは、３つの全長システインリッチドメイン（ＣＲＤ）と部分的な４つ目のＣ末端ＣＲＤとで構成される（Ｂｏｄｍｅｒ  ＪＬら、（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２７：１９〜２６頁）。ＯＸ４０のリガンドは、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）であり、３コピーのＯＸ４０が、３量体リガンドと結合してＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ複合体を形成する（Ｃｏｍｐａａｎ  ＤＭおよびＨｙｍｏｗｉｔｚ  ＳＧ（２００６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１４：１３２１〜１３３０頁）。ＯＸ４０は、膜結合型受容体である。しかし、可溶性のアイソフォームも検出されている（Ｔａｙｌｏｒ  ＬおよびＳｃｈｗａｒｚ  Ｈ（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５５：６７〜７２頁）。ＣＤ２８と違って、ＯＸ４０はナイーブＴ細胞上で構成的に発現されず、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のエンゲージメント後に誘導される。ＯＸ４０は、２次共刺激分子であり、活性化の２４〜７２時間後に発現される。ＯＸ４０のリガンドであるＯＸ４０Ｌも休止抗原提示細胞上で発現されず、それらの活性化の後に発現される。ＯＸ４０は、主に活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞により発現され、そして制限された程度で活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞により発現される（Ｓａｌｅｋ−Ａｒｄａｋａｎｉ  Ｓら、（２００６）Ｃｕｒｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２：３７〜５３頁）。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、全般的に、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片、それらの調製のための方法およびＯＸ４０媒介性障害を処置するための方法を含む使用に関する。ヒトＯＸ４０と結合する本発明のアンタゴニスト抗体またはその断片は、拮抗性抗体であり、アゴニスト作用を示さず、かつ／または結合によりヒトＯＸ４０を活性化しない。
【０００５】
一態様では、本開示は、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片であって、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；ならびに／あるいは配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、アンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。
【０００６】
さらなる態様では、本発明は、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片であって、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列を含む、アンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。さらなる態様では、本発明は、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片であって、ＩＧＨＶ２−７０*１０（配列番号１９
）、ＩＧＨＶ２−７０*０１（配列番号２０）、ＩＧＨＶ２−７０*１３（配列番号２１）、ＩＧＨＶ２−５*０９（配列番号２２）およびＩＧＨＶ２−７０*１１（配列番号２３）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む、アンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。
【０００７】
さらなる態様では、本発明は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含むアンタゴニスト抗体またはその断片であって、重鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、抗体またはその断片を提供する。
【０００８】
さらなる態様では、本発明は、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。さらなる態様では、本発明は、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片であって、ＩＧＫＶ３−１１*０１（配列番号２４）、ＩＧＫＶ１−３９*０１（配列番号２５）、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９*０１（配列番号２６）、ＩＧＫＶ３−１１*０２（配列番号２７）およびＩＧＫＶ３−２０*０１（配列番号２８）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産
物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む、アンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は、ヒト遺伝子ＩＧＫＶ３−１１*０１（配列番号２４）の
産物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含むアンタゴニスト抗体またはその断片であって、軽鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、抗体またはその断片を提供する。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片であって、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７および３８からなる群より選択される重鎖配列を含む、アンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。さらなる態様では、本発明は、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体抗体またはその断片であって、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８および４９からなる群より選択される軽鎖配列を含む、拮抗性抗体またはその断片を提供する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片であって、
（ａ）配列番号３７または３８のアミノ酸配列を含む重鎖配列と、
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖配列と
を含む、アンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、配列番号５８、５９、７９および８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片を提供する。さらなる態様では、本発明は、配列番号６０、８６、８７および８９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片を提供する。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその
断片であって、
（ａ）配列番号５８または５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
（ｂ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と
を含む、アンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片であって、前記抗体が、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含み、前記抗体が、Ｆｃ媒介性細胞傷害活性を有さない、抗体またはその断片を提供する。さらなる態様では、本発明は、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片であって、前記抗体が、ヒトＩＧＨＧ１  Ｆｃ領域を含み、前記抗体が、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）などの細胞傷害作用機序について有能である、抗体またはその断片を提供する。好ましい態様では、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片は、非フコシル化ＩＧＨＧ１  Ｆｃ領域を有し、ＡＤＣＣなどのＦｃ媒介性細胞傷害作用機序が増進している。
【００１５】
別の態様では、本発明の開示は、対応するキメラ抗体と同様の親和性でヒトＯＸ４０と結合する、例えば対応するキメラ抗体のＯＸ４０結合親和性（ＫD）の少なくとも７５％
を保持するか、または対応するキメラ抗体と比較した場合に少なくとも等しいかもしくはより高いＯＸ４０結合親和性（ＫD）を有する、拮抗性ヒト化抗体またはその断片につい
ても記載する。さらなる態様では、本発明は、ヒトＯＸ４０細胞外領域の第２ドメイン内のエピトープと結合するアンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。
【００１６】
本発明の開示は、ヒトＯＸ４０と結合する抗体およびその断片をコードする単離核酸、ベクターならびに前記核酸またはベクターを含む宿主細胞も提供する。アンタゴニスト抗体またはその断片と薬学的に許容される担体とを含む組成物、および治療剤に連結したアンタゴニスト抗体またはその断片を含むイムノコンジュゲートも提供される。
【００１７】
本開示は、ＯＸ４０媒介性障害を処置するための方法も提供する。一態様では、アロ反応性Ｔ細胞活性化および増殖のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル（混合リンパ球反応；ＭＬＲ）において、拮抗性抗体またはその断片は、およそ１００ｎｇ／ｍＬのＥＣ50値で、２の異なる個体（レスポンダー）におけるＭＬＲを効率的に阻害する。さらに、ヒト患者における骨髄移植後に観察される同種間移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）についてのモデルである異種間移植片対宿主反応において、拮抗性抗体またはその断片は、ＧＶＨＤ反応を有力に抑制する。
【００１８】
本開示は、抗体もしくはその断片、組成物またはイムノコンジュゲートを含む、ＯＸ４０媒介性障害の処置のためのキットおよび製造品も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】固定化組換えヒトＯＸ４０−ｈｉｓに対する直接結合ＥＬＩＳＡを示す図である。ヒトＯＸ４０に対するキメラ２Ｆ８および１Ｄ４抗体の結合を、直接ＥＬＩＳＡにより測定した。様々な濃度（１０から０．０１ｍｇ／ｍｌまでの範囲）の１Ｄ４（黒のヒストグラム）および２Ｆ８（白のヒストグラム）を、４℃にて１晩９６ウェルプレート中で、プレートに被覆された２ｍｇ／ｍｌの組換えヒトＯＸ４０−ｈｉｓタグ付加タンパク質とインキュベートした。ＯＸ４０とのそれぞれの抗体の結合を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ヒト抗体により検出した。
【図１Ｂ】固定化組換えヒトＯＸ４０−Ｆｃに対する競合ＥＬＩＳＡを示す図である。固定化組換えヒトＯＸ４０−Ｆｃに対する競合ＥＬＩＳＡ。ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用に対するキメラ１Ｄ４および２Ｆ８の阻害効果を、阻止ＥＬＩＳＡにより評価した。様々な濃度（１０から０．０１ｍｇ／ｍｌまでの範囲）の１Ｄ４（黒のヒストグラム）および２Ｆ８（白のヒストグラム）を、４℃にて１晩９６ウェルプレート中で、プレートに被覆された２ｍｇ／ｍｌの組換えヒトＯＸ４０−Ｆｃタグ付加タンパク質とインキュベートした。５分後に、一定濃度のビオチン化組換えヒトＯＸ４０Ｌ（０．０４ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、室温にて３０分間インキュベートした。ＯＸ４０ＬとＯＸ４０との結合を、ストレプトアビジン−ＨＲＰを用いて検出した。
【図２】3Ｈチミジン取り込みにより測定される１方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を示す図である。バーは、少なくとも３重の3Ｈチミジン取り込み（カウント）の平均±標準誤差を示す。アイソタイプ対照（トラスツズマブ）および陽性対照（エファリズマブ）を示す。エフェクターは、エフェクター細胞のみを表す。エフェクター＋標的は、抗体を省いた測定を表す。
【図３Ａ】キメラ１Ｄ４抗体のフローサイトメトリー分析を示す図である。ヒト活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＨＰＢ−ＡＬＬ細胞での染色。ヒストグラムプロットは、蛍光強度（Ｘ軸）および相対的細胞数（最大事象の％、Ｙ軸）を示す。染色された細胞の型を示す。ヒトＰＢＭＣは、測定の前に４８時間にわたってＰＨＡおよびＩＬ−２を用いて活性化した。
【図３Ｂ】キメラ１Ｄ４抗体のフローサイトメトリー分析を示す図である。活性化カニクイザルＰＢＭＣでの染色。キメラ１Ｄ４抗体とカニクイザルＯＸ４０との結合を、フローサイトメトリーにより評価した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、カニクイザルから回収した全血から単離し、３×１０6の細胞を５０時間、１０ｍｇ／ｍｌのＰＨＡおよび１００Ｕ／ｍｌのｒｈｕＩＬ−２の存在下で培養した。活性化ＰＢＭＣを、２５ｍｇ／ｍｌの対照抗体（上のプロファイル（ｉ））またはビオチン化ヒツジ抗ヒトＯＸ４０抗体（真ん中のプロファイル（ｉｉ））またはビオチン化キメラ１Ｄ４抗体（下のプロファイル（ｉｉｉ））のいずれかとインキュベートした。各抗体とカニクイザルＯＸ４０との結合を、ストレプトアビジン−ＡＰＣを用いて検出した。
【図４Ａ】抗ＯＸ４０抗体の表面プラズモン共鳴測定を示す図である。データは、応答数（ＲＵと略記する；Ｙ軸）対時間（Ｘ軸）として表す。Ａ−ＶＨ１／ＶＬ１抗体対１Ｄ４キメラ。
【図４Ｂ】抗ＯＸ４０抗体の表面プラズモン共鳴測定を示す図である。データは、応答数（ＲＵと略記する；Ｙ軸）対時間（Ｘ軸）として表す。ＶＨ１、ＶＨ２およびＶＨ３に基づくヒト化抗体（示すとおり）対１Ｄ４キメラ。
【図４Ｃ】抗ＯＸ４０抗体の表面プラズモン共鳴測定を示す図である。データは、応答数（ＲＵと略記する；Ｙ軸）対時間（Ｘ軸）として表す。乏しい結合体の例：ＶＨ４／ＶＬ４、ＶＨ５／ＶＬ４、ＶＨ５／ＶＬ５およびＶＨ５／ＶＬ６。
【図４Ｄ】抗ＯＸ４０抗体の表面プラズモン共鳴測定を示す図である。データは、応答数（ＲＵと略記する；Ｙ軸）対時間（Ｘ軸）として表す。弱い結合体（ＶＨ５／ＶＬ９およびＶＨ４／ＶＬ９）および良好な結合体（ＶＨ６／ＶＬ９およびＶＨ７／ＶＬ９）の例。
【図４Ｅ】抗ＯＸ４０抗体の表面プラズモン共鳴測定を示す図である。データは、応答数（ＲＵと略記する；Ｙ軸）対時間（Ｘ軸）として表す。ＶＨ７に基づくヒト化抗体。
【図４Ｆ】抗ＯＸ４０抗体の表面プラズモン共鳴測定を示す図である。データは、応答数（ＲＵと略記する；Ｙ軸）対時間（Ｘ軸）として表す。ＶＨ６／ＶＬ９は、１Ｄ４キメラおよびヒト化バリアントＶＨ７／ＶＬ９を超える最良の結合特性を有する。
【図５Ａ】配列アラインメントを示す図である。１Ｄ４の重鎖可変領域と、ＩＭＧＴからの選択された生殖系列フレームワーク（ＩＧＨＶ２−７０*１０（配列番号１９）およびＩＧＫＶ３−１１*０１（配列番号２４））および逆突然変異可変領域バリアント（ＶＨ１（配列番号２９）、ＶＨ２（配列番号７７）、ＶＨ３（配列番号７８）、ＶＨ４（配列番号７９）、ＶＨ５（配列番号８０）、ＶＨ６（配列番号５８）、ＶＨ７（配列番号５９）、（ＶＬ１（配列番号３０）、ＶＬ２（配列番号８１）、ＶＬ３（配列番号８２）、ＶＬ４（配列番号８３）、ＶＬ５（配列番号８４）、ＶＬ６（配列番号８５）、ＶＬ７（配列番号８６）、ＶＬ８（配列番号８７）、ＶＬ９（配列番号６０）ＶＬ１０（配列番号８８）、ＶＬ１１（配列番号８９）とのアラインメント。
【図５Ｂ】配列アラインメントを示す図である。１Ｄ４の軽鎖可変領域と、ＩＭＧＴからの選択された生殖系列フレームワーク（ＩＧＨＶ２−７０*１０（配列番号１９）およびＩＧＫＶ３−１１*０１（配列番号２４））および逆突然変異可変領域バリアント（ＶＨ１（配列番号２９）、ＶＨ２（配列番号７７）、ＶＨ３（配列番号７８）、ＶＨ４（配列番号７９）、ＶＨ５（配列番号８０）、ＶＨ６（配列番号５８）、ＶＨ７（配列番号５９）、（ＶＬ１（配列番号３０）、ＶＬ２（配列番号８１）、ＶＬ３（配列番号８２）、ＶＬ４（配列番号８３）、ＶＬ５（配列番号８４）、ＶＬ６（配列番号８５）、ＶＬ７（配列番号８６）、ＶＬ８（配列番号８７）、ＶＬ９（配列番号６０）ＶＬ１０（配列番号８８）、ＶＬ１１（配列番号８９）とのアラインメント。
【図６】示差走査熱量分析を用いるヒト化抗ＯＸ４０抗抗体ＶＨ６／ＶＬ９  ＦＡＢ断片の耐熱性の測定を示す図である。データは、過剰モル熱容量（Ｃｐ［ｋｃａｌ／ｍｏｌ／℃］と略記する；Ｙ軸）対温度（Ｘ軸）として表す。
【図７】エピトープ特徴決定を示す図である。この図は、実施例７に記載するＥＬＩＳＡアッセイの結果に基づくヒト化抗ＯＸ４０抗抗体ＶＨ６／ＶＬ９エピトープを示す。
【図８Ａ】3Ｈチミジン取り込みにより測定される混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を示す図である。２名の無関係のドナーからの混合リンパ球反応の結果を示す。増殖は、3Ｈチミジン取り込みにより測定した。グラフは、各条件についての絶対カウント値±ＳＥＭを示す。レスポンダー細胞は未処置ＰＢＭＣであり、刺激細胞はマイトマイシン処置ＰＢＭＣであった。試験抗体を用いる全ての条件は、異種刺激ＰＢＭＣと混合したレスポンダー細胞を用いて行った。陽性対照は、エファリズマブ（抗ＬＦＡ−１抗体）であった。
【図８Ｂ】3Ｈチミジン取り込みにより測定される混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を示す図である。２名の無関係のドナーからの混合リンパ球反応の結果を示す。増殖は、3Ｈチミジン取り込みにより測定した。グラフは、各条件についての絶対カウント値±ＳＥＭを示す。レスポンダー細胞は未処置ＰＢＭＣであり、刺激細胞はマイトマイシン処置ＰＢＭＣであった。試験抗体を用いる全ての条件は、異種刺激ＰＢＭＣと混合したレスポンダー細胞を用いて行った。陽性対照は、エファリズマブ（抗ＬＦＡ−１抗体）であった。
【図９】異種間移植片対宿主反応モデルを示す図である。この図は、それぞれ言及される条件についての８匹の動物の群内のパーセント生存を示す。媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）：ＰＢＳのみ。垂直の点線は、処置の最終日を示す。ＰＢＭＣを受けなかった２匹の照射対照動物の群（示さず）において、死亡および症状は観察されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示は、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体およびその断片に関する。
【００２１】
用語「ヒトＯＸ４０」は、本明細書で用いる場合、ヒトＯＸ４０のバリアント、アイソフォームおよび種ホモログを含む。したがって、本開示の抗体は、あるいくつかの場合では、ヒト以外の種からのＯＸ４０と交差反応することがある。あるいくつかの実施形態では、抗体は、１または複数のヒトＯＸ４０タンパク質に完全に特異的であってよく、種またはその他の型の非ヒト交差反応性を示さないことがある。例示的なヒトＯＸ４０の完全アミノ酸配列は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ４３４８９（ＴＮＲ４＿ＨＵＭＡＮ；配列番号１２）を有する。ＯＸ４０は、ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５またはＴＸＧＰ１  Ｌとしても知られる。ヒトＯＸ４０には、Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅによりＧｅｎｅＩＤ：７２９３、およびＨＧＮＣによりＨＧＮＣ：１１９１８が割り当てられている。ＯＸ４０には、ＣＤ１３４（分化クラスター１３４）も割り当てられている。ＯＸ４０は、ＴＮＦＲＳＦ４／ＯＸ４０と表される遺伝子によりコードされ得る。
【００２２】
本明細書における「ヒトＯＸ４０」の使用は、ヒトＯＸ４０の全ての既知またはまだ見出されていない対立遺伝子および多型を包含する。用語「ヒトＯＸ４０」、「ＯＸ４０」または「ＯＸ４０受容体」は、本明細書において等価に用いられ、そうでないと具体的に記載しないならば「ヒトＯＸ４０」を意味する。
【００２３】
用語「ＯＸ４０リガンド」または「ＯＸ４０Ｌ」は、本明細書において等価に用いられ、ＯＸ４０リガンド、特にヒトＯＸ４０リガンドを含む。ＯＸ４０Ｌは、ＴＮＦスーパーファミリーの一員であり、ｇｐ３４またはＣＤ２５２としても知られる。ＯＸ４０Ｌには、ＣＤ２５２（分化クラスター２５２）が割り当てられ、配列データベース受託番号Ｐ２３５１０（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）またはＱ６ＦＧＳ４（Ｕｎｉｐｒｏｔ）を有する。ＯＸ４０Ｌは、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞および内皮細胞の表面上で発現する。
【００２４】
用語「ヒトＯＸ４０と結合する抗体またはその断片」は、本明細書で用いる場合、５００ｎＭ以下、好ましくは２００ｎＭ以下、より好ましくは１５０ｎＭ以下、より好ましくは１２０ｎＭ以下、さらにより好ましくは１１０ｎＭ以下の親和性（ＫD）でヒトＯＸ４
０、例えば単離形のヒトＯＸ４０と結合する抗体またはその断片を含む。用語「ヒトＯＸ４０と結合する抗体またはその断片」は、抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００２５】
用語「拮抗性抗体」または「アンタゴニスト抗体」は、本明細書において等価に用いられ、例えばＯＸ４０とＯＸ４０リガンドとの結合を阻止もしくは実質的に低減し、よってＯＸ４０により引き起こされるシグナル伝達経路を阻害もしくは低減し、かつ／あるいはリンパ球増殖、サイトカイン発現もしくはリンパ球生存のようなＯＸ４０媒介性細胞応答を阻害または低減することにより、ＯＸ４０の生物学的シグナル伝達活性を阻害および／または中和できる抗体を含む。
【００２６】
用語「抗体」は、本明細書で言及する場合、抗体全体およびその任意の抗原結合断片または単鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合で相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖とを含む糖タンパク質またはその抗原結合断片のことをいう。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記する）と重鎖定常領域とで構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記する）と軽鎖定常領域とで構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とよばれる超可変性の領域にさらに細分化でき、ＣＤＲは、配列が超可変性であり、かつ／または抗原認識に関与し、かつ／またはより保存されたフレームワーク領域（ＦＲまたはＦＷ）とよばれる領域に散在している、構造が規定されたループを通常形成する。それぞれのＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＷで構成される：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４。ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４のアミノ酸配列は全て一緒に、本明細書で言及する場合、ＶＨまたはＶＬの「非ＣＤＲ領域」または「非拡張ＣＤＲ領域」を構成する。
【００２７】
用語「重鎖可変フレームワーク領域」は、本明細書で言及する場合、１または複数（例えば１、２、３および／または４つ）の重鎖フレームワーク領域配列（例えばフレームワーク１（ＦＷ１）、フレームワーク２（ＦＷ２）、フレームワーク３（ＦＷ３）および／またはフレームワーク４（ＦＷ４））を含み得る。好ましくは、重鎖可変領域フレームワークは、ＦＷ１、ＦＷ２および／またはＦＷ３、より好ましくはＦＷ１、ＦＷ２およびＦＷ３を含む。用語「軽鎖可変フレームワーク領域」は、本明細書で言及する場合、１または複数（例えば１、２、３および／または４つ）の軽鎖フレームワーク領域配列（例えばフレームワーク１（ＦＷ１）、フレームワーク２（ＦＷ２）、フレームワーク３（ＦＷ３）および／またはフレームワーク４（ＦＷ４））を含み得る。好ましくは、軽鎖可変領域フレームワークは、ＦＷ１、ＦＷ２および／またはＦＷ３、より好ましくはＦＷ１、ＦＷ２およびＦＷ３を含む。
【００２８】
重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定
常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子との結合を媒介できる。
【００２９】
抗体は、定常領域により遺伝子的に決定される、アイソタイプともよばれるクラスに群分けされる。ヒト定常軽鎖は、カッパ（ＣΚ）およびラムダ（Ｃλ）軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）またはイプシロン（ε）として分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。よって、「アイソタイプ」は、本明細書で用いる場合、それらの定常領域の化学的および抗原的特徴により定義される免疫グロブリンのクラスおよび／またはサブクラスのいずれかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）、ＩｇＧ２（ＩＧＨＧ２）、ＩｇＧ３（ＩＧＨＧ３）、ＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）、ＩｇＡ１（ＩＧＨＡ１）、ＩｇＡ２（ＩＧＨＡ２）、ＩｇＭ（ＩＧＨＭ）、ＩｇＤ（ＩＧＨＤ）およびＩｇＥ（ＩＧＨＥ）である。いわゆるヒト免疫グロブリン偽ガンマＩＧＨＧＰ遺伝子は、配列決定されているが、スイッチ領域の変更によりタンパク質をコードしないさらなるヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子を表す（Ｂｅｎｓｍａｎａ  Ｍら、（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６（７）：３１０８頁）。スイッチ領域が変更されているにもかかわらず、ヒト免疫グロブリン偽ガンマＩＧＨＧＰ遺伝子は、全ての重鎖定常ドメイン（ＣＨ１〜ＣＨ３）およびヒンジについてのオープンリーディングフレームを有する。その重鎖定常ドメインについての全てのオープンリーディングフレームは、予測される構造特徴を有する全てのヒト免疫グロブリン定常ドメインと良好に整列されるタンパク質ドメインをコードする。このさらなる偽ガンマアイソタイプは、本明細書において、ＩｇＧＰまたはＩＧＨＧＰという。ヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインイプシロンＰ１およびＰ２偽遺伝子（ＩＧＨＥＰ１およびＩＧＨＥＰ２）などの他の偽免疫グロブリン遺伝子が、報告されている。ＩｇＧクラスは、治療目的のために最も一般的に用いられている。ヒトにおいて、このクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。マウスにおいて、このクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３を含む。
【００３０】
用語「キメラ抗体」は、本明細書で用いる場合、可変領域配列がある種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を含む。
【００３１】
用語「ヒト化抗体」または「ヒト化抗ＯＸ４０抗体」は、本明細書で用いる場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体を含む。さらなるフレームワーク領域改変を、ヒトフレームワーク配列内および別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列内で作製してよい。
【００３２】
用語「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」は、本明細書で用いる場合、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを含む。Ｆａｂは、単離されたこの領域または全長抗体もしくは抗体断片の関係におけるこの領域のことをいうことがある。
【００３３】
用語「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」は、本明細書で用いる場合、第１定常領域免疫グロブリンドメインを除外した抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。よって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインと、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインと、これらのドメインからＮ末端側にあるフレキシブルヒンジとのことをいう。ＩｇＡおよびＩｇＭについて、Ｆｃは、Ｊ鎖を含むことがある。ＩｇＧについて、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインであるＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２およびＣγ３）と、Ｃガンマｌ（Ｃγｌ）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間のヒンジとを含む。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆ
ｃ領域は、残基Ｃ２２６またはＰ２３０をそのカルボキシル末端に含むと通常定義される（番号付けはＥＵ番号付けシステムに従う）。ヒトＩｇＧ１について、Ｆｃ領域は、本明細書において、残基Ｐ２３２をそのカルボキシル末端に含むと定義される（番号付けはＥＵ番号付けシステムに従う）（Ｅｄｅｌｍａｎ  ＧＭら、（１９６９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、６３（１）：７８〜８５頁）。Ｆｃは、単離されたこの領域またはＦｃポリペプチド、例えば抗体の関係におけるこの領域のことをいうことがある。
【００３４】
用語「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」は、本明細書において、抗体の第１定常ドメインと第２定常ドメインとの間のアミノ酸を含むフレキシブルポリペプチドを含む。「ヒンジ領域」は、本明細書で言及する場合、６〜６２アミノ酸長で、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧのみに存在し、２つの重鎖を橋かけするシステイン残基を包含する配列領域である。構造的には、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインは、ＥＵ位２２０にて終了し、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインは、ＥＵ位２３７の残基にて開始する。よって、ＩｇＧについて、抗体ヒンジは、本明細書において、２２１位（ＩｇＧ１におけるＤ２２１）〜２３１位（ＩｇＧ１におけるＡ２３１）を含むと定義される（番号付けはＥＵ番号付けシステムに従う）（Ｅｄｅｌｍａｎ  ＧＭら、既出）。
【００３５】
用語「親抗体」または「親免疫グロブリン」は、本明細書で用いる場合、バリアントを作製するために後で改変される、未改変の抗体を含む。前記親抗体は、自然に存在する抗体、または自然に存在する抗体のバリアントもしくは工学改変バージョンであり得る。親抗体は、抗体自体、親抗体を含む組成物または親抗体をコードするアミノ酸配列のことをいうことがある。「親抗ＯＸ４０抗体」は、本明細書で用いる場合、ヒトＯＸ４０と結合し、バリアントを作製するために改変される抗体または免疫グロブリンを意味する。「対応するマウス抗体」は、本明細書で用いる場合、ヒトＯＸ４０と結合し、バリアントを作製するために改変できるマウス抗体または免疫グロブリン、具体的には本明細書で開示するマウス抗体１Ｄ４を意味する。
【００３６】
用語「バリアント抗体」または「抗体バリアント」は、本明細書で用いる場合、親と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変により親抗体配列のものと異なる抗体配列を含む。バリアント抗体配列は、本明細書において、親抗体配列と好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。抗体バリアントは、抗体自体、抗体バリアントを含む組成物または抗体バリアントをコードするアミノ酸配列のことをいうことがある。
【００３７】
用語「アミノ酸改変」は、本明細書において、ポリペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含む。「アミノ酸置換」または「置換」は、本明細書において、親ポリペプチド配列中の特定の位置での別のアミノ酸へのアミノ酸の置き換えを意味する。例えば、置換Ｒ９４Ｋは、バリアントポリペプチド、この場合、９４位のアルギニンがリシンで置き換えられた重鎖可変フレームワーク領域バリアントのことをいう。前出の例について、９４Ｋは、９４位でのリシンへの置換を示す。本明細書における目的のために、複数の置換は、斜線により典型的に分けられる。例えば、Ｒ９４Ｋ／Ｌ７８Ｖは、置換Ｒ９４ＫおよびＬ７８Ｖを含む２重バリアントのことをいう。「アミノ酸挿入」または「挿入」は、本明細書で用いる場合、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。例えば、挿入−９４は、９４位での挿入を示す。「アミノ酸欠失」または「欠失」は、本明細書で用いる場合、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。例えば、Ｒ９４−は、９４位でのアルギニンの欠失を示す。
【００３８】
本明細書で用いる場合、用語「保存改変」または「保存配列改変」は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴に著しく影響しないかまたは前記特徴を著しく改変しないアミノ
酸改変のことをいうことを意図する。このような保存改変は、アミノ酸置換、挿入および欠失を含む。改変は、本発明の抗体に、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野において知られる標準的な技術により導入できる。保存アミノ酸置換は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基でアミノ酸残基を置き換えるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。よって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内またはフレームワーク領域内の１または複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができ、変化した抗体（バリアント抗体）を、保持された機能について試験できる。
【００３９】
全てのヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインについて、番号付けは、「ＥＵ番号付けシステム」に従う（Ｅｄｅｌｍａｎ  ＧＭら、（１９６９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ
Ｓｃｉ  ＵＳＡ、６３（１）：７８〜８５頁）。
【００４０】
ヒトカッパ免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＩＧＫＣ）について、番号付けは、「ＥＵ番号付けシステム」に従う（Ｅｄｅｌｍａｎ  ＧＭら、既出）。
【００４１】
ヒトラムダ免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６およびＩＧＬＣ７）について、番号付けは、Ｄａｒｉａｖａｃｈ  Ｐら、（１９８７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８４（２４）：９０７４〜８頁およびＦｒａｎｇｉｏｎｅ  Ｂら、（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８２（１０）：３４１５〜９頁により記載されるように、「Ｋａｂａｔ番号付けシステム」に従う（Ｋａｂａｔ  ＥＡら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第５版−ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ出版第９１−３２４２号）。
【００４２】
用語「可変ドメイン」は、抗原結合を媒介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定義するドメインのことをいう。自然に存在する抗体では、抗原結合部位は、特異性を定義する２つの可変ドメイン（一方は重鎖（ＶＨ）中にあり、他方は軽鎖（ＶＬ）中にある）からなる。いくつかの場合では、特異性は、ラクダにおいて見出される重鎖抗体からの単一ドメイン抗体のように、２つのドメインの一方のみにもっぱら帰することがある。Ｖ領域は、通常、約１１０アミノ酸長であり、９〜１２アミノ酸長の「超可変領域」とよばれる非常に可変性のより短い領域で分けられた、１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれる比較的不変のアミノ酸配列の連続からなる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、ループを形成する３つの超可変領域により接続されたビートシート（ｂｅａｔ−ｓｈｅｅｔ）構造を全般的に採用する４つのＦＲを含む。各鎖中の超可変領域は、ＦＲにより接近して一緒にされ、他の鎖からの超可変領域と一緒に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ＥＡら、既出を参照されたい）。用語「超可変領域」は、本明細書で用いる場合、抗原結合を担う、抗体のアミノ酸残基のことをいう。超可変領域は、配列可変性が最高であり、かつ／または抗原認識に関与する「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を一般的に含む。全ての可変ドメインについて、番号付けは、Ｋａｂａｔに従う（Ｋａｂａｔ  ＥＡら、既出）。
【００４３】
いくつかのＣＤＲ定義を本明細書において用い、包含する。Ｋａｂａｔ定義は、配列可変性に基づき、最も一般的に用いられる（Ｋａｂａｔ  ＥＡら、既出）。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造ループの場所に言及する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣおよびＬｅｓｋ  ＡＭ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７頁）。ＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ定義との間の折衷案であり、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより用いられている（Ｍａｒｔｉｎ  ＡＣＲら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：９２６８〜７２頁；Ｍａｒｔｉｎ  ＡＣＲら、（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：１２１〜１５３頁；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ＪＴら、（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、１：１２６〜１３６頁；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  Ｍ．Ｊ．Ｅ．（編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１４１〜１７２頁中のＲｅｅｓ  ＡＲら、（１９９６））。接触による定義（ｃｏｎｔａｃｔ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）は最近導入され（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ＲＭら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２〜７４５頁）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋにおいて入手可能な、入手可能な複合体構造の分析に基づく。ＩＭＧＴ（登録商標）、すなわちｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）によるＣＤＲの定義は、全ての免疫グロブリンおよび全ての種のＴ細胞受容体Ｖ領域についてＩＭＧＴ番号付けに基づく（ＩＭＧＴ（登録商標）、ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰら、（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２７（１）：２０９〜１２頁；Ｒｕｉｚ  Ｍら、（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（１）：２１９〜２１頁；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰ（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（１）：２０７〜９頁；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１）：３０７〜１０頁；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰら、（２００５）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（３）：１８５〜２０３頁；Ｋａａｓ  Ｑら、（２００７）Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ＆Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、６（４）：２５３〜６４頁）。
【００４４】
本発明において論じる全ての相補性決定領域（ＣＤＲ）は、好ましくはＩＭＧＴ（登録商標）に従って定義される。これらのＣＤＲのそれぞれについての可変ドメイン残基は、以下のとおりである（番号付けは、Ｋａｂａｔ  ＥＡら、既出に従う）：ＬＣＤＲ１：２７〜３２、ＬＣＤＲ２：５０〜５２、ＬＣＤＲ３：８９〜９７、ＨＣＤＲ１：２６〜３５、ＨＣＤＲ２：５１〜５７およびＨＣＤＲ３：９３〜１０２。ＶＬ領域の「非ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列：１〜２６（ＦＲ１）、３３〜４９（ＦＲ２）、５３〜８８（ＦＲ３）および９８〜およそ１０７（ＦＲ４）を含む。ＶＨ領域の「非ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列：１〜２５（ＦＲ１）、３６〜５０（ＦＲ２）、５８〜９２（ＦＲ３）および１０３〜およそ１１３（ＦＲ４）を含む。
【００４５】
本発明のＣＤＲは、上記の定義に基づき、以下の可変ドメイン残基を有する「拡張ＣＤＲ」を含むことがある：ＬＣＤＲ１：２４〜３６、ＬＣＤＲ２：４６〜５６、ＬＣＤＲ３：８９〜９７、ＨＣＤＲ１：２６〜３６、ＨＣＤＲ２：４７〜６５、ＨＣＤＲ３：９３〜１０２。これらの拡張ＣＤＲも、Ｋａｂａｔら、既出に従って番号付けされる。ＶＬ領域の「非拡張ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列：１〜２３（ＦＲ１）、３７〜４５（ＦＲ２）、５７〜８８（ＦＲ３）および９８〜およそ１０７（ＦＲ４）を含む。ＶＨ領域の「非拡張ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列：１〜２５（ＦＲ１）、３７〜４６（ＦＲ２）、６６〜９２（ＦＲ３）および１０３〜およそ１１３（ＦＲ４）を含む。
【００４６】
用語「全長抗体」は、本明細書で用いる場合、可変および定常領域を含む抗体の自然の生物学的な形を構成する構造を含む。例えば、ヒトおよびマウスを含むほとんどの哺乳動物では、ＩｇＧクラスの全長抗体は、４量体であり、２つの免疫グロブリン鎖の２つの同一の対からなり、各対は、１つの軽鎖および１つの重鎖を有し、各軽鎖は、免疫グロブリンドメインＶＬおよびＣＬを含み、各重鎖は、免疫グロブリンドメインＶＨ、ＣＨ１（Ｃγ１）、ＣＨ２（Ｃγ２）およびＣＨ３（Ｃγ３）を含む。いくつかの哺乳動物、例えばラクダおよびラマでは、ＩｇＧ抗体は、２つの重鎖のみからなることがあり、各重鎖は、Ｆｃ領域に付いた可変ドメインを含む。
【００４７】
抗体断片は、それらに限定されないが、（ｉ）Ｆａｂ’およびＦａｂ’−ＳＨを含む、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）単一可変領域からなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ＥＳら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６頁）、（ｖ）２つの連結されたＦａｂ断片を含む２価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｖｉ）ＶＨドメインとＶＬドメインとが、２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成できるようにするペプチドリンカーで連結された単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ＲＥら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３〜４２６頁；Ｈｕｓｔｏｎ  ＪＳら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜８３頁）、（ｖｉｉ）２重特異性単鎖Ｆｖ２量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、（ｖｉｉｉ）遺伝子融合により構築された多価または多重特異性断片である「ダイアボディ」または「トリアボディ」（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ＩおよびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  Ｐ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４６１〜７９頁；ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜４８頁）および（ｉｘ）同じまたは異なる抗体と遺伝子的に融合されたｓｃＦｖ（Ｃｏｌｏｍａ  ＭＪおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５（２）：１５９〜１６３頁）を含む。
【００４８】
用語「エフェクター機能」は、本明細書で用いる場合、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用に起因する生化学的事象を含む。エフェクター機能は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用）およびＡＤＣＰ（抗体依存性細胞媒介性食作用）などのＦｃγＲ媒介性エフェクター機能、ならびにＣＤＣ（補体依存性細胞傷害作用）などの補体媒介性エフェクター機能を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ受容体または補体成分などのエフェクター分子についての抗体の親和性を変更、すなわち増進または低減、好ましくは増進することにより変更できる。結合親和性は、エフェクター分子結合部位を改変することにより一般的に変動され、この場合、対象の部位を置き、前記部位の少なくとも一部を適切な方法で改変することが適当である。エフェクター分子についての抗体の結合部位における変更は、全体的な結合親和性を著しく変更する必要はないが、相互作用の幾何学的配置を変更して、非生産的結合におけるようにエフェクター機序を無効にすることも構想される。エフェクター分子結合に直接関与しないがエフェクター機能の性能に関与する部位を改変することにより、エフェクター機能を変更することもさらに構想される。抗体のエフェクター機能を変更することにより、免疫応答の様々な態様を制御すること、例えば免疫系の様々な反応を増進または抑制することが可能になり、診断および治療において有益な効果を有する可能性がある。
【００４９】
本明細書で用いる場合、用語「ＯＸ４０媒介性障害」は、アレルギー、喘息、ＣＯＰＤ、関節リウマチ、乾癬ならびに自己免疫および炎症に関連する疾患のような状態を含む。
【００５０】
本明細書で用いる場合、用語「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長
類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。好ましくは、対象はヒトである。
【００５１】
抗ＯＸ４０抗体
第１の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、ならびに／あるいは配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む拡張重鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号１４のアミノ酸配列を含む拡張重鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号１５のアミノ酸配列を含む拡張重鎖ＣＤＲ３を含み、かつ／あるいは配列番号１６のアミノ酸配列を含む拡張軽鎖ＣＤＲ１、および／または配列番号１７のアミノ酸配列を含む拡張軽鎖ＣＤＲ２および／または配列番号１８のアミノ酸配列を含む拡張軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【００５３】
好ましくは、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。より好ましくは、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、ならびに配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【００５４】
ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメイン（複数可）とは独立してＣＤＲ３ドメイン単独で同族抗原についての抗体の結合特異性を決定できること、および同じ結合特異性を有する複数の抗体を、共通のＣＤＲ３配列に基づいて予想通りに作製できることが当技術分野においてよく知られている。例えばＫｌｉｍｋａ  Ａら、（２０００）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８３（２）：２５２〜２６０（マウス抗ＣＤ３０抗体Ｋｉ−４の重鎖可変ドメインＣＤＲ３のみを用いるヒト化抗ＣＤ３０抗体の生成について記載している）；Ｂｅｉｂｏｅｒ  ＳＨら、（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３〜８４９頁（親マウスＭＯＣ−３１抗ＥＧＰ−２抗体の重鎖ＣＤＲ３配列のみを用いる組換え上皮糖タンパク質−２（ＥＧＰ−２）抗体について記載している）；Ｒａｄｅｒ  Ｃら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９５：８９１０〜８９１５頁（マウス抗インテグリンαｖβ３抗体ＬＭ６０９の重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ３ドメインを用いる一連のヒト化抗インテグリンαｖβ３抗体であって、それぞれのメンバー抗体が、ＣＤＲ３ドメインの外側に異なる配列を含み、親マウス抗体と同じエピトープに、親マウス抗体と同等以上の親和性で結合できる抗体について記載している）；Ｂａｒｂａｓ  Ｃら、（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１〜６２頁（ＣＤＲ３ドメインが抗原結合に最も著しく寄与することを開示する）を参照されたい。
【００５５】
したがって、本発明は、１または複数の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む、特に配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３および／または配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、ヒトＯＸ４０と結合する抗体およびその断片であって、抗体がヒトＯＸ４０と結合できる、抗体およびその断片を提供する。いくつかの実施
形態では、非ヒト抗体からの１または複数の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むこのような発明の抗体は、対応する親非ヒト抗体、例えばマウス抗体と（ａ）結合について競合でき、（ｂ）前記抗体と同じ機能的特徴を保持し、（ｃ）前記抗体と同じエピトープと結合し、かつ／または（ｄ）前記抗体と同様の結合親和性を有する。
【００５６】
さらなる態様では、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列を含む、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。別の態様では、本発明は、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。いくつかの実施形態では、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列と、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列とを含む。
【００５７】
別の態様では、本発明は、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片のバリアントを提供する。よって、本発明は、例えばそれぞれ配列番号７または配列番号８におけるような重鎖および軽鎖可変領域配列のいずれかの重鎖または軽鎖のいずれかの親アンタゴニスト抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である（少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する）重鎖および／または軽鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を有する抗体またはその断片を提供する。重鎖または軽鎖のいずれかの親アンタゴニスト抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域配列の非拡張ＣＤＲ領域のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である重鎖および／または軽鎖可変領域配列の非拡張ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を有する抗体またはその断片も、本発明により提供される。重鎖および／または軽鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域または非拡張ＣＤＲ領域のアミノ酸配列同一性は、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、特に９６％、より特には９７％、さらにより特には９８％、最も特には９９％（例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％を含む）である。アミノ酸配列に関する同一性または相同性は、本明細書において、配列を整列させ、必要であればギャップを導入して最大限のパーセント配列同一性を達成した後の、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。よって、配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するために一般的に用いられる標準的な方法により決定できる。ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどのコンピュータプログラムを用いて、２つのポリペプチドを、それらのそれぞれのアミノ酸の最適な一致のために整列させる（一方もしくは両方の配列の全長にわたって、または一方もしくは両方の配列の予め決定された部分にわたって）。これらのプログラムは、デフォルトのオープニングペナルティおよびデフォルトのギャップペナルティを提供し、ＰＡＭ２５０（標準的スコア行列；Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第５巻、補遺３号中のＤａｙｈｏｆｆ  ＭＯら、（１９７８）を参照されたい）などのスコア行列をコンピュータプログラムとともに用いることができる。例えば、パーセント同一性は、同一の一致の総数に１００を乗じ、一致したひと続き内の長いほうの配列の長さと、２つの配列を整列させるために長いほうの配列に導入したギャップの数との和で除することにより算出できる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本開示は、よって、配列番号１９、２０、２１、２２もしくは２３のフレームワーク領域配列と少なくとも７０％同一である重鎖可変フレームワーク領域配列ならびに／または配列番号２４、２５、２６、２７および２８のフレームワーク領域配列と少なくとも６０％同一である軽鎖可変フレームワーク領域配列を含む、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片を提供する。いくつかの実施形態では、本開
示は、配列番号１９のフレームワーク領域配列と少なくとも７４％同一である重鎖可変フレームワーク領域配列ならびに／または配列番号２４のフレームワーク領域配列と少なくとも６５％同一である軽鎖可変フレームワーク領域配列を含む、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片を提供する。
【００５９】
別の態様では、本発明は、上記の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含み、ＩＧＨＶ２−７０*１
０（配列番号１９）、ＩＧＨＶ２−７０*０１（配列番号２０）、ＩＧＨＶ２−７０*１３（配列番号２１）、ＩＧＨＶ２−５*０９（配列番号２２）およびＩＧＨＶ２−７０*１１（配列番号２３）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域、好ましくはヒト遺伝子ＩＧＨＶ２−７０*１０
（配列番号１９）の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域をさらに含む、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片を提供する。重鎖可変フレームワーク領域は、これらのヒト遺伝子の産物中に存在するかまたは前記遺伝子に由来する１または複数（例えば１、２、３および／または４つ）の重鎖フレームワーク領域配列（例えばフレームワーク１（ＦＷ１）、フレームワーク２（ＦＷ２）、フレームワーク３（ＦＷ３）および／またはフレームワーク４（ＦＷ４））を含むことがある。好ましくは、重鎖可変領域フレームワークは、ＩＧＨＶ２−７０*１０（配列番号１９）、Ｉ
ＧＨＶ２−７０*０１（配列番号２０）、ＩＧＨＶ２−７０*１３（配列番号２１）、ＩＧＨＶ２−５*０９（配列番号２２）およびＩＧＨＶ２−７０*１１（配列番号２３）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物中に存在するかまたは前記遺伝子に由来するＦＷ１、ＦＷ２および／またはＦＷ３、より好ましくはＦＷ１、ＦＷ２およびＦＷ３を含む。重鎖フレームワーク領域配列は、本明細書で用いる場合、ＦＷ１（１位〜２５位）、ＦＷ２（３６位〜４９位）、ＦＷ３（６６位〜９４位）およびＦＷ４（１０３位〜１１３位）（アミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔに示す番号付けシステムを利用して示す）を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本開示は、抗体またはその断片であって、前記抗体またはその断片が、ヒト遺伝子ＩＧＨＶ２−７０*１０（配列番号１９）の産物であるかまたは前
記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域を含み、重鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、抗体およびその断片を提供する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖配列を含む抗体またはその断片であって、重鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の対応する重鎖可変フレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、抗体およびその断片を提供する。
【００６２】
好ましくは、アミノ酸改変は、２３位、３５ｂ位、４８位、５０位、６０位および６２位からなる群より選択されるアミノ酸位置、より好ましくは２３位、３５ｂ位、５０位、６０位および６２位からなる群より選択されるアミノ酸位置、最も好ましくは３５ｂ位のアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに従って示される。具体的に、アミノ酸改変は、２３Ｓ、３５ｂＧ、４８Ｌ、５０Ｈ、６０Ｎおよび６２Ａからなる群より選択されるアミノ酸置換、好ましくはＴ２３Ｓ、Ｓ３５ｂＧ、Ｉ４８Ｌ、Ｒ５０Ｈ、Ｓ６０ＮおよびＳ６２Ａからなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、Ｓ３５ｂＧが最も好ましいアミノ酸置換である（各群メンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ番号付けに従って示す）。
【００６３】
別の態様では、本発明は、ＩＧＫＶ３−１１*０１（配列番号２４）、ＩＧＫＶ１−３
９*０１（配列番号２５）、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９*０１（配列番号２６）、ＩＧＫＶ３−１１*０２（配列番号２７）およびＩＧＫＶ３−２０*０１（配列番号２８）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワー
ク領域、好ましくはヒト遺伝子ＩＧＫＶ３−１１*０１（配列番号２４）の産物であるか
または前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片を提供する。軽鎖可変領域フレームワーク領域は、これらのヒト遺伝子の産物中に存在するかまたは前記遺伝子に由来する１または複数（例えば１、２、３および／または４つ）の軽鎖フレームワーク領域配列（例えばフレームワーク１（ＦＷ１）、フレームワーク２（ＦＷ２）、フレームワーク３（ＦＷ３）および／またはフレームワーク４（ＦＷ４））を含むことがある。好ましくは、軽鎖可変領域フレームワークは、Ｖ３−１１*０１（配列番号２４）、ＩＧＫＶ１−３９*０１（配列番号２５）、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９*０１（配列番号２６）、ＩＧＫＶ３−１１*０２（配列番号２７）およびＩＧＫＶ３−２０*０１（配列番号２８）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物
中に存在するかまたは前記遺伝子に由来するＦＷ１、ＦＷ２および／またはＦＷ３、より好ましくはＦＷ１、ＦＷ２およびＦＷ３を含む。軽鎖フレームワーク領域配列は、本明細書で用いる場合、ＦＷ１（１位〜２３位）、ＦＷ２（３５位〜４９位）、ＦＷ３（５７位〜８８位）およびＦＷ４（９８位〜１０８位）（アミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔに示す番号付けシステムを利用して示す）を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本開示は、ヒト遺伝子ＩＧＫＶ３−１１*０１（配列番号２
４）の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む抗体またはその断片であって、軽鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、抗体およびその断片を提供する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む抗体またはその断片であって、軽鎖配列の軽鎖可変フレームワーク領域が、対応するマウス抗体の対応する軽鎖可変フレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、抗体およびその断片を提供する。
【００６６】
好ましくは、アミノ酸改変は、１位、３３位、３４位、４６位、４７位、５４位、５６位および７１位からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換、ならびに／または３１位のアミノ酸位置での欠失、より好ましくは３３位、３４位、４６位、４７位、５４位、５６位および７１位からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換、ならびに／または３１位のアミノ酸位置での欠失、最も好ましくは４６位および／または４７位のアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに従って示される。具体的に、アミノ酸改変は、１Ｑ、３３Ｍ、３４Ｈ、４６Ｐ、４７Ｗ、５４Ｌ、５６Ｓおよび７１Ｙからなる群より選択されるアミノ酸置換、ならびに／またはＴ３１での欠失、好ましくは１Ｑ、３３Ｍ、３４Ｈ、４６Ｐ、４７Ｗ、５４Ｌ、５６Ｓおよび７１Ｙからなる群より選択されるアミノ酸置換、より好ましくは３３Ｍ、３４Ｈ、４６Ｐ、４７Ｗおよび７１Ｙからなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、４６Ｐ、４７Ｗが特に好ましい（各群メンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ番号付けに従って示す）。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片は、Ｖ２−７０*１０（配列番号１９）、Ｖ２−７０*０１（配列番号２０）、Ｖ２−７０*１３（
配列番号２１）、Ｖ２−５*０９（配列番号２２）およびＶ２−７０*１１（配列番号２３）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域と、Ｖ３−１１*０１（配列番号２４）、ＩＧＫＶ１−３９*０１（配列番号２５）、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９*０１（配列番号２６）、ＩＧＫＶ３−１１*０２（配列番号２７）およびＩＧＫＶ３−２０*０１（配列番号２８）からなる群より選択さ
れるヒト遺伝子の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域、好ましくはヒト遺伝子Ｖ２−７０*１０（配列番号１９）の産物であるかまたは前記遺
伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域と、ヒト遺伝子Ｖ３−１１*０１（配列番号
２４）の産物であるかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変フレームワーク領域とを含む。上記の異なるヒト遺伝子の産物中に存在するかまたは前記遺伝子に由来する重鎖可変フレームワーク領域、および／または上記の異なるヒト遺伝子の産物中に存在するかまたは前記遺伝子に由来する軽鎖可変領域フレームワーク領域の組み合わせも、本発明に包含される。
【００６８】
ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子についての生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅにてインターネットで利用可能）、ならびにＫａｂａｔ  ＥＡら、既出；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ＩＭら、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜７９８頁およびＣｏｘ  ＪＰＬら、（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７〜８３６頁で見出すことができる。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子についての生殖系列ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースで見出すことができる。
【００６９】
別の態様では、本開示は、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片であって、重鎖ＣＤＲの少なくとも１つおよび／または軽鎖ＣＤＲの少なくとも１つが少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、抗体およびその断片を提供する。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発を行って、改変（複数可）を導入でき、抗体結合またはその他の対象の機能的特性に対する影響を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて評価できる。好ましくは、保存改変を導入する。改変（複数可）は、アミノ酸置換、付加または欠失であり得るが、好ましくは置換である。典型的に、５以下、好ましくは４以下、より好ましくは３以下、さらにより好ましくは２以下、最も好ましくは１以下のアミノ酸改変をＣＤＲ領域内で行う。
【００７０】
あるいくつかの実施形態では、フレームワーク配列を用いて可変領域を工学改変して、バリアント抗体を生成できる。本発明のバリアント抗体は、ＶＨおよび／またはＶＫ内のフレームワーク残基に対して改変を行って、例えば抗体の特性を改良するものを含む。典型的に、このようなフレームワーク改変を行って、抗体の免疫原性を低減する。例えば、あるアプローチは、１もしくは複数のフレームワーク残基を対応するマウス配列に「逆突然変異」させるか、または１もしくは複数のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「逆突然変異」させることである。
【００７１】
よって、さらなる態様では、本開示は、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片であって、ヒト化抗体またはその断片の重鎖可変領域のフレームワーク領域配列の少なくとも１つが、対応するマウス抗体の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、抗体およびその断片を提供する。好ましくは、アミノ酸改変は、アミノ酸置換である。典型的に、６以下、好ましくは５以下、好ましくは４以下、より好ましくは３以下、さらにより好ましくは２以下、最も好ましくは１以下のアミノ酸改変をフレームワーク領域内で行う。いくつかの実施形態では、本開示は、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片であって、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸改変が、２３位、３５ｂ位、４８位、５０位、６０位および６２位からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに従って示される、抗体およびその断片を提供する。重鎖可変領域のフレームワーク領域の好ましいアミノ酸置換は、２３位、３５ｂ位、５０位、６０位および６２位からなる群より選択されるアミノ酸位置である。重鎖可変領域のフレームワーク領域のより好ましいアミノ酸置換は、２３Ｓ、３５ｂＧ、４８Ｌ、５０Ｈ、６０Ｎおよび６２Ａからなる群より選択され、３５ｂＧが重鎖可変領域のフレームワーク領域の最も好ましいアミノ酸置換である。
【００７２】
本開示は、また、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片であって、ヒト化抗体またはその断片の軽鎖可変領域のフレームワーク領域配列の少なくとも１つが、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも１つのアミノ酸改変を含む、抗体およびその断片を提供する。好ましくは、アミノ酸改変は、アミノ酸置換および／またはアミノ酸欠失である。典型的に、６以下、好ましくは５以下、好ましくは４以下、より好ましくは３以下、さらにより好ましくは２以下、最も好ましくは１以下のアミノ酸改変をフレームワーク領域内で行う。いくつかの実施形態では、本開示は、ヒト化抗体またはその断片であって、軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域のアミノ酸改変が、１位、３３位、３４位、４６位、４７位、５４位、５６位および７１位からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換、ならびに／または３１位のアミノ酸位置での欠失を含む、抗体およびその断片を提供する。軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域のより好ましいアミノ酸改変は、Ｙ３１での欠失ならびに／または１Ｑ、３３Ｍ、３４Ｈ、４６Ｐ、４７Ｗ、５４Ｌ、５６Ｓおよび７１Ｙからなる群より選択される置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置がＫａｂａｔ番号付けに従って示される。軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域のより好ましいアミノ酸改変は、Ｔ３１での欠失ならびに／または３３Ｍ、３４Ｈ、４６Ｐ、４７Ｗおよび７１Ｙからなる群より選択される置換を含み、４６Ｐおよび／またはＬ４７Ｗが特に好ましい。いくつかの実施形態では、本発明のヒト化抗体またはその断片は、上記のとおりの重鎖可変領域配列のフレームワーク領域のアミノ酸改変と、上記のとおりの軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域のアミノ酸改変とを含むことがある。
【００７３】
本開示は、配列番号２９、５８、５９、７７、７８、７９および８０からなる群より選択され、好ましくは配列番号５８、５９、７９および８０からなる群より選択され、より好ましくは配列番号５８および５９からなる群より選択される重鎖可変領域を含む、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片も提供する。本開示は、配列番号３０、６０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８および８９からなる群より選択され、好ましくは配列番号６０、８６、８７および８９からなる群より選択され、より好ましくは配列番号６０である軽鎖可変領域を含む、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片も提供する。いくつかの実施形態では、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片は、配列番号２９、５８、５９、７７、７８、７９および８０からなる群より選択される重鎖可変領域と、配列番号３０、６０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８および８９からなる群より選択される軽鎖可変領域とを含む。これらの重鎖および軽鎖可変領域配列のそれぞれがヒトＯＸ４０と結合できることに鑑みて、重鎖および軽鎖可変領域配列を「様々に組み合わせ」て、本発明の抗ＯＸ４０結合分子を創出できる。このような「様々に組み合わせ」た抗体のＯＸ４０結合は、例えば実施例に記載する結合アッセイを用いて試験できる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片は、配列番号５８および５９からなる群より選択される重鎖可変領域と、配列番号６０および８９からなる群より選択される軽鎖可変領域とを含む。より好ましい実施形態では、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号８９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号８９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。最も好ましくは、配列番号５８および５９からなる群より選択される重鎖可変領域と、配列番号６０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片である。
【００７５】
本開示は、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７および３８からなる群より選
択され、好ましくは配列番号３５、３６、３７および３８からなる群より選択され、より好ましくは配列番号３７および３８からなる群より選択される重鎖配列を含む、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片を提供する。本開示は、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８および４９からなる群より選択され、好ましくは配列番号４５、４６、４７および４９からなる群より選択され、より好ましくは配列番号４７である軽鎖配列を含む、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片も提供する。いくつかの実施形態では、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片は、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７および３８からなる群より選択される重鎖配列と、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８および４９からなる群より選択される軽鎖配列とを含む。これらの重鎖および軽鎖可変領域配列のそれぞれがヒトＯＸ４０と結合できることに鑑みて、重鎖および軽鎖可変領域配列を「様々に組み合わせ」て、本発明の抗ＯＸ４０結合分子を創出できる。このような「様々に組み合わせ」た抗体のＯＸ４０結合は、実施例に記載する結合アッセイを用いて試験できる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片は、配列番号３７および３８からなる群より選択される重鎖配列と、配列番号４７および４９からなる群より選択される軽鎖配列とを含む。より好ましい実施形態では、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖配列と配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖配列、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖配列と配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖配列、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖配列と配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖配列、または配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖配列と配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む。最も好ましくは、配列番号３７および３８からなる群より選択される重鎖配列と、配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖配列とを含む、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片である。
【００７７】
本開示の一実施形態では、アンタゴニスト抗体またはその断片は、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体、好ましくはヒト化抗体、より好ましくはモノクローナルマウス抗体、モノクローナルキメラ抗体またはモノクローナルヒト化抗体である。
【００７８】
本開示は、ヒトＯＸ４０と結合する１価抗体またはその断片、すなわち単一抗原結合腕からなる抗体も提供する。本開示は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、２重特異性単鎖Ｆｖ２量体、ダイアボディ、トリアボディおよび同じまたは異なる抗体と遺伝子的に融合したｓｃＦｖからなる群より選択される、ヒトＯＸ４０と結合する抗体の断片も提供する。好ましい断片は、ｓｃＦｖ、２重特異性単鎖Ｆｖ２量体およびダイアボディである。本開示は、ヒトＯＸ４０と結合する全長抗体も提供する。
【００７９】
本開示は、重鎖および／または軽鎖定常領域、特にヒト重鎖および／またはヒト軽鎖定常領域をさらに含む、ヒトＯＸ４０と結合する抗体またはその断片も提供する。ヒト重鎖定常領域は、ＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）、ＩｇＧ２（ＩＧＨＧ２）、ＩｇＧ３（ＩＧＨＧ３）、ＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）、ＩｇＡ１（ＩＧＨＡ１）、ＩｇＡ２（ＩＧＨＡ２）、ＩｇＭ（ＩＧＨＭ）、ＩｇＤ（ＩＧＨＤ）またはＩｇＥ（ＩＧＨＥ）からなるヒト免疫グロブリンの群より選択でき、ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ、特にＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）が好ましい。ヒト軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域からなるヒト免疫グロブリンの群より選択でき、ヒトカッパ定常領域が好ましい。好ましい実施形態では、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片は、ヒトＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）重鎖定常ドメインとヒト軽鎖カッパ定常ドメインとを含む。
【００８０】
フレームワーク領域またはＣＤＲ領域内に作製する改変に加えてまたは前記改変の代わ
りに、本発明の抗体を、Ｆｃ領域内に改変を含むように工学的に改変して、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞傷害作用のような抗体の１または複数の機能特性を典型的に変更してよい。さらに、本発明の抗体を化学的に改変（例えば１または複数の化学的部分を抗体に付けることができる）またはそのグリコシル化を変更するように改変してよい。これらの実施形態のそれぞれは、以下にさらに詳細に記載する。以下に概説するＦｃ領域内の改変は、Ｆｃ領域中の残基のＥＵ番号付けに従う。一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域を、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変更、例えば増加または減少されるように改変する。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数を変更して、例えば軽鎖と重鎖の集合を容易にするか、または抗体の安定性を増加もしくは減少させる。別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させて、抗体の生物学的半減期を減少させる。より具体的には、抗体のブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合が天然のＦｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比べて損なわれるようにＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域中に１または複数のアミノ酸変異を導入する。このアプローチは、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載されている。別の実施形態では、抗体を改変して、その生物学的半減期を増加させる。様々なアプローチが可能である。例えば、Ｗａｒｄへの米国特許第６，２７７，３７５号に記載されるように、以下の変異の１または複数を導入できる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。代わりに、生物学的半減期を増加させるために、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号および第６，１２１，０２２号に記載されるように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得たサルベージ受容体結合エピトープを含有するようにＣＨ１またはＣＬ領域内で抗体を変更できる。さらなる実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えて、抗体のエフェクター機能（複数可）を変更することによりＦｃ領域を変更する。例えば、エフェクターリガンドに対する抗体の親和性が変更されるが、親抗体の抗原結合能力を抗体が保持するように、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１または複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。親和性が変更されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、ともにＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載されている。別の例では、抗体のＣ１ｑ結合が変更され、かつ／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）が低減もしくは廃止されるようにアミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１または複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。このアプローチは、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。別の例では、ＣＨ２ドメインのＮ末端領域中の２３１位〜２３８位のアミノ酸内の１または複数のアミノ酸残基を変更し、そのことにより、補体と結合する抗体の能力を変更する。このアプローチは、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴパンフレットＷＯ９４／２９３５１にさらに記載されている。なお別の例では、以下の位置での１もしくは複数のアミノ酸を改変することによりＦｃ領域を改変して、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させ、かつ／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させる：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９。このアプローチは、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴパンフレットＷＯ００／４２０７２にさらに記載されている。
【００８１】
本開示は、ヒト重鎖および／または軽鎖定常領域を含むヒトＯＸ４０と結合する拮抗性
抗体またはその断片であって、ヒト重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）からのＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含むアイソタイプバリアントを含み、ヒンジ領域が、２２８位のセリンからプロリンへの置換を含む、抗体またはその断片も提供する。好ましくは、アイソタイプバリアントを含むヒト化抗体は、全長抗体である。ヒトＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）からのＣＨ１と、Ｓ２２８Ｐ置換を有するヒトＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）からのヒンジと、ヒトＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）からのＣＨ２およびＣＨ３とを含むアイソタイプバリアントを含む、ヒトＯＸ４０と結合する特に好ましいヒト化抗体またはその断片は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む重鎖配列と、配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖配列とを含む。アイソタイプバリアントは、ヒトＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）（これは、通常、天然のヒトＩｇＧ１である）からのヒト重鎖定常領域を含む、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片と比較して、すなわち改変された重鎖定常領域に関してアイソタイプバリアントから異なるだけである、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片と比較して、ＡＤＣＣのようなＦｃ媒介性細胞傷害作用機序を示さないことが見出されている。
【００８２】
本開示は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片であって、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域に付いた成熟コア炭水化物構造がフコースを欠く（本明細書において、代わりに「非フコシル化」という）、抗体またはその断片も提供する。好ましくは、抗体は、ヒトＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）Ｆｃ領域を含み、ヒトＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）Ｆｃ領域に付いた成熟コア炭水化物構造は、フコースを欠く。より好ましくは、ヒトＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）Ｆｃ領域に付いた成熟コア炭水化物構造がフコースを欠く、ヒトＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）Ｆｃ領域を含む全長抗体である。ＷＯ０３／０３５８３５から、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域に付いた成熟コア炭水化物構造中のフコースの欠如は、ＡＤＣＣを増進し得ることが知られている。よって、さらなる実施形態では、本開示の拮抗性抗体またはその断片は、ヒトＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）Ｆｃ領域を含み、ヒトＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）Ｆｃ領域に付いた成熟コア炭水化物構造は、フコースを欠き、フコースを欠く抗体は、フコースを欠かない親ヒト化抗体またはその断片と比較して、ＡＤＣＣの増進を示す。フコースを欠く抗体を作製する方法は、例えば（ａ）細胞内で発現されるタンパク質をフコース化する能力が低減される（またはフコース化できない）ようにフコース代謝が欠損している工学改変または変異宿主細胞の使用；（ｂ）フコース化を防止もしくは低減する条件下での細胞の培養；（ｃ）フコースの翻訳後除去（例えばフコシダーゼ酵素を用いて）；（ｄ）例えば非グリコシル化糖タンパク質の組換え発現後の所望の炭水化物の翻訳後付加；または（ｅ）フコース化されていない産物を選択するような糖タンパク質の精製である。好ましく用いられるものは、ＷＯ１０／０９５０３１の実施例１４に記載される方法、例えばＬｏｎｇｍｏｒｅら、（１９８２）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３６５〜９２頁またはＩｍａｉ−Ｎｉｓｈｉｙａら、（２００７）、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：８４頁に記載される方法である。
【００８３】
本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列および／または配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列を含む抗体と同じエピトープと結合する、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片も提供する。本発明は、本発明が提供する抗体、特に配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変配列および／または配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変配列を含む抗体が結合する、ヒトＯＸ４０、特にヒトＯＸ４０受容体細胞外ドメインの特定の領域またはエピトープも提供する。ヒトＯＸ４０ポリペプチドのこの特定の領域またはエピトープは、本発明が提供する抗体のいずれか１つと組み合わせた、当技術分野において知られる任意の適切なエピトープマッピング方法により同定できる。このような方法の例は、ＯＸ４０に由来する様々な長さのペプチドを、本発明の抗体との結合について、抗体により認識されるエピトープの配列を含有する抗体と特異的に結合できる最小の断片を用いてスクリーニングすることを含む。ＯＸ４０ペプチドは、合成により、またはＯＸ４０ポリペプチドのタンパク質分解消化により生成できる。抗
体と結合するペプチドは、例えば質量分析により同定できる。別の例では、ＮＭＲ分光法またはＸ線結晶学を用いて、本発明の抗体と結合するエピトープを同定できる。一端同定されると、本発明の抗体と結合するエピトープ断片を、所望により、免疫原として用いて、同じエピトープと結合するさらなるアンタゴニスト抗体を得ることができる。
【００８４】
抗ＯＸ４０抗体特性
例えばＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ウェスタンブロット、ＲＩＡおよびフローサイトメトリー分析を含む、例えばヒトＯＸ４０に対する抗体の結合能力を評価するための標準的なアッセイは、当技術分野において知られている。適切なアッセイは、実施例に詳細に記載する。抗体の結合動態（例えばＫＤのような結合親和性）も、スキャッチャードまたはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム分析によるなどの当技術分野において知られる標準的なアッセイにより評価できる。相対的結合親和性Ｋiは、当技術分野に
おいて知られる標準的な競合アッセイにより評価できる。
【００８５】
さらなる態様では、本発明は、組換えヒト化抗体エファリズマブよりも高い程度まで用量依存的様式でヒト混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を阻止する、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片を提供する。組換えヒト化抗体エファリズマブは、リンパ球機能関連抗原１のＣＤ１１ａサブユニットと結合する。ＭＬＲは、実施例３に従って行って測定できる。
【００８６】
さらなる態様では、本発明は、カニクイザルＯＸ４０も認識できる、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。ヒトおよびカニクイザル両方の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）との拮抗性抗ＯＸ４０抗体の結合は、実施例４に従ってかつ図３に示すように行って測定できる。抗体は、ヒトおよびカニクイザルの活性化リンパ球の表面上で発現されたＯＸ４０を認識することが見出され、この抗体が交差反応特性を有することが示された。
【００８７】
さらなる態様では、本発明は、例えば、実施例５および６に詳細に記載し、図４で説明するように、分析物として用いる組換え１価ヒトＯＸ４０受容体細胞外ドメイン（配列番号１１）を有するプロテインＡ結合ＣＭ５研究グレードセンサチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；ＢＲ−１０００−１４）上に抗体を捕捉することにより、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される、５００ｎＭ以下、好ましくは２００ｎＭ以下、より好ましくは１５０ｎＭ以下、より好ましくは１２０ｎＭ以下、さらにより好ましくは１１０ｎＭ以下の親和性（ＫD）でヒトＯＸ４０、
特に単離形のヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片を提供する。ＯＸ４０受容体を用いる親和性測定に関する「１価」は、本明細書で用いる場合、例えばドメインがアミノ末端にて免疫グロブリンＦｃ部分と融合する場合のように人工的に２量体化または多量体化されていない、細胞外ドメインのようなヒトＯＸ４０受容体ドメインのことをいう。好ましい態様では、本発明は、対応するキメラ抗体のＯＸ４０結合親和性（ＫD）の
少なくとも７５％を保持するヒト化抗体またはその断片を提供する。好ましくは、ヒト化抗体またはその断片は、対応するキメラ抗体と等価な親和性でヒトＯＸ４０と結合する。「等価な親和性」は、対応するキメラ抗体のＯＸ４０結合親和性の±１０％の範囲内である親和性の値を意味する。より具体的には、本発明は、対応するキメラ抗体より高い親和性でヒトＯＸ４０と結合するヒト化抗体またはその断片を提供する。本発明の好ましい態様では、例えば、実施例５および６に詳細に記載し、図４で説明するように、分析物として用いる組換え１価ヒトＯＸ４０受容体細胞外ドメイン（配列番号１１）を有するプロテインＡ結合ＣＭ５研究グレードセンサチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；ＢＲ−１０００−１４
）上に抗体を捕捉することにより、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される、１１０ｎＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは９０ｎＭ以下、より好ましくは８０ｎＭ以下、さらにより好ましくは７０ｎＭ以下の結合親和性（ＫD）を有する、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗
体またはその断片が提供される。
【００８８】
本発明のさらなる態様は、良好な熱安定性を有する、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片を提供する。好ましい実施形態では、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性ヒト化抗体またはその断片は、７０℃を超え、好ましくは７５℃を超え、より好ましくは８０℃を超え、さらにより好ましくは８５℃を超えるＦＡＢ断片耐熱温度を有する。ＦＡＢ断片耐熱性の分析のために示差走査熱量分析測定を用い、前記測定では、全長ＩｇＧの関係におけるＦＡＢ断片の中間融解温度が同定される。これらの種類の熱量測定は、当業者に知られており、実施例６にさらに記載して図６に示すように、例えばＧａｒｂｅｒおよびＤｅｍａｒｅｓｔ（２００７）、ＢＢＲＣ、３５５：７５１〜７頁に従って行うことができる。
【００８９】
さらなる態様では、本発明は、ヒトＯＸ４０細胞外領域上のエピトープと結合する拮抗性抗体またはその断片について記載する。実施例７に記載して図７に示すように、ＯＸ４０細胞外領域の４つのドメインのうちの１または複数を、ヒト配列とラット配列との間で交換して、Ｆｃ融合タンパク質を作製した。結合ＥＬＩＳＡを次いで行って、ヒトＯＸ４０細胞外領域、ラットＯＸ４０細胞外領域および４つのヒト−ラットキメラタンパク質に対する拮抗性ヒト化抗体の反応性を試験した。よって、本発明は、ヒトＯＸ４０細胞外領域の第２ドメイン内にマッピングされる拮抗性抗体またはその断片を提供する。
【００９０】
本発明は、免疫反応を抑制するために用いることができる拮抗性抗体またはその断片も提供する。拮抗性ヒト化抗ＯＸ４０抗体の効果を、アロ反応性Ｔ細胞活性化および増殖のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとして用いたＭＬＲにおいて（実施例８を参照されたい）試験した（Ｏ’Ｆｌａｈｅｒｔｙ  Ｅら、（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１００（３）：２８９〜９９頁；ＤｕＰｏｎｔ  ＢおよびＨａｎｓｅｎ  ＪＡ（１９７６）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１０７〜２０２頁）。２名の無関係のドナーからのＰＢＭＣを混合して、Ｔ細胞の活性化およびＴリンパ球の増殖をもたらした。さらに、３つの異なるフォーマット、すなわちＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）フォーマット、非フコシル化ＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）フォーマットおよびＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）フォーマットの拮抗性ヒト化抗ＯＸ４０抗体をこのアッセイにおいて試験して、ＭＬＲの阻害に対するＡＤＣＣなどの細胞傷害性機序の寄与をさらに決定した。拮抗性ヒト化抗ＯＸ４０抗体は、２名の異なる個体（レスポンダー）において、およそ１００ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０値でＭＬＲを効率的に阻害した。しかし、結果は、用いた抗体のフォーマットに依存する差を示した。第１個体（レスポンダー１）では、Ｔ細胞反応性は、ＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）およびＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）抗体フォーマットにより効率的に阻害され、このことは、細胞傷害性機序がこの個体にとって重要でないことを示した。第２個体（レスポンダー２）について、ＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）フォーマットは６０％を超える阻害を達成したが、ＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）フォーマットは、ＭＬＲを乏しく阻止しただけであった。両方の個体では、非フコシル化ＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）フォーマットは、ＭＬＲの阻害について非常に効果的であった。これらの結果は、ＭＬＲを阻害するためにＯＸ４０活性化を阻止することがいくらかの個体において十分であり得るが、この効果は、さらなる細胞傷害性機序により大きく増進できることを示す。よって、障害が患者のＯＸ４０共刺激状態とは独立しているとみられるＯＸ４０媒介性障害に罹患している患者、例えばＯＸ４０発現レベルが低い患者の処置のために、細胞傷害性機序が増進している、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片を投与することが特に効果的であり得る。本発明の好ましい実施形態は、ＯＸ４０媒介
性障害に罹患している患者の処置のための、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性ヒト化抗体を提供する。さらに、患者は、ＯＸ４０の発現レベルが低いことがある。好ましくは、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性ヒト化抗体は、ＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）領域を含む。より好ましくは、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性ヒト化抗体は、非フコシル化ＩｇＧ１領域を含む。
【００９１】
本発明のさらなる態様では、拮抗性抗体またはその断片の効果を、ＳＣＩＤマウスがヒトＰＢＭＣで再構築された異種間移植片対宿主反応において実証する。この反応により、ヒト患者において骨髄移植の後に観察される同種間移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）のモデルが得られる。このモデルでは、ヒトＰＢＭＣおよび特にＴリンパ球がマウス宿主細胞に対する強い応答を開始し、これによって重度の炎症症状が生じる。実施例９に記載して図９および表１０に示すように、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性ヒト化抗体は、ＧＶＨＤ反応を１ｍｇ／ｋｇの用量にて有力に抑制した。驚くべきことに、この抗体は、ＧＶＨＤについて認められている治療であるＥｎｂｒｅｌ（登録商標）よりもよい効力を示した（Ｘｈａａｒｄ  Ａら、（２０１１）Ｂｕｌｌ．Ｃａｎｃｅｒ、９８（８）：８８９〜９９頁；Ｓｉｍｐｓｏｎ  Ｄ（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．２（７）：１１０９〜１７頁）。よって、好ましい実施形態では、本発明は、ＧＶＨＤの処置において効果的である、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片を提供する。好ましくは、対象への抗体の投与は、媒体の投与と比較して生存中央値（日）を４倍改善する。より好ましくは、対象への抗体の投与は、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）の投与と比較して生存中央値（日）を２倍改善する。本発明は、よって、ＧＶＨＤの患者の処置および／またはＧＶＨＤの抑制においてＥｎｂｒｅｌ（登録商標）よりも効果的である、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体または断片を提供する。さらに、アゴニスト性抗ＯＸ４０結合抗体が同種間マウスＧＶＨＤモデルにおいてＧＶＨＤを悪化させることが報告されており（Ｖａｌｚａｓｉｎａ  Ｂら、（２００５）Ｂｌｏｏｄ、１０５（７）：２８４５〜５１頁；Ｂｌａｚａｒ  ＢＲら、（２００３）Ｂｌｏｏｄ、１０１（９）：３７４１〜８頁）、よって、実施例９から、このモデルにおいてＧＶＨＤの悪化が観察されなかったので、本発明の拮抗性抗体およびその断片は、ヒトＯＸ４０との結合に対してアゴニスト効果を示さないと結論付けることができる。よって、本発明は、結合に対してアゴニスト活性を示さない、ヒトＯＸ４０と結合するヒト化抗体またはその断片を提供する。
【００９２】
核酸、ベクターおよび宿主細胞
本開示は、ヒトＯＸ４０と結合する抗体およびその断片をコードする単離核酸、ベクターおよび核酸またはベクターを含む宿主細胞も提供する。核酸は、細胞全体、細胞溶解物または部分的に精製もしくは実質的に精製された形で存在することがある。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド分け、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野においてよく知られている他のものを含む標準的な技法により、他の細胞構成成分または他の混入物、例えば他の細胞性核酸またはタンパク質から精製分離された場合に、「単離」または「実質的に純粋に」されている。例えばＦ．Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましい実施形態では、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。
【００９３】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学技法を用いて得ることができ、例えば抗体の軽鎖および重鎖をコードするかまたはＶＨおよびＶＬセグメントをコードするｃＤＮＡは、標準的ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技法により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリー（例えばファージディスプレイ技法を用いて）から得られる抗体について、抗体をコードする１または複数の核酸をライブラリーから回収できる。外因性核
酸を宿主細胞に導入する方法は、当技術分野においてよく知られており、用いる宿主により変動する。技法は、それらに限定されないが、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、塩化カルシウム処理、ポリエチレンイミン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルスまたはファージ感染、リポソームへのポリヌクレオチド（複数可）の封入、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを含む。哺乳動物細胞の場合、トランスフェクションは一過性または安定性のいずれかであってよい。
【００９４】
本発明の好ましい核酸分子は、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７および３８からなる群より選択される重鎖配列、ならびに／または配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８および４９からなる群より選択される軽鎖配列をコードするものである。本発明の好ましい核酸分子は、配列番号２９、５８、５９、７７、７８、７９および８０からなる群より選択される重鎖可変領域、ならびに／または配列番号３０、６０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８および８９からなる群より選択される軽鎖可変領域をコードするものである。
【００９５】
本発明の好ましい核酸分子は、配列番号８の軽鎖可変領域および／または配列番号７の重鎖可変領域をコードするもの、例えば配列番号９の核酸配列を含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、および／または配列番号１０の核酸配列を含む軽鎖可変領域をコードするＤＮＡである。本発明のより好ましい核酸分子は、配列番号５８もしくは５９の重鎖可変領域および／または配列番号６０の軽鎖可変領域をコードするもの、例えば配列番号６１もしくは６２の核酸配列を含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、および／または配列番号６３の核酸配列を含む軽鎖可変領域をコードするＤＮＡであり、これらが最も好ましい。
【００９６】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が一旦得られると、これらのＤＮＡ断片を、標準的な組換えＤＮＡ技法によりさらに操作して、例えば可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子またはＦａｂ断片遺伝子もしくはｓｃＦｖ遺伝子のような上記の断片に対応する断片遺伝子に変換できる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域またはフレキシブルリンカーのようななどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結している。用語「作動可能に連結する」は、この文脈で用いる場合、２つのＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように２つのＤＮＡ断片をつなぐことを意味する。ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子にＶＨをコードするＤＮＡを作動可能に連結することにより、全長重鎖遺伝子に変換できる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において知られており（例えばＫａｂａｔ  ＥＡら、既出を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）、ＩｇＧ２（ＩＧＨＧ２）、ＩｇＧ３（ＩＧＨＧ３）、ＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）、ＩｇＡ１（ＩＧＨＡ１）、ＩｇＡ２（ＩＧＨＡ２）、ＩｇＭ（ＩＧＨＭ）、ＩｇＤ（ＩＧＨＤ）またはＩｇＥ（ＩＧＨＥ）定常領域であり得るが、最も好ましくはＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子について、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結できる。ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子にＶＬをコードするＤＮＡを作動可能に連結することにより、全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換できる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において知られており（例えばＫａｂａｔ
ＥＡら、既出を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。好ましい実施形態では、軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域、好ましくはカッパ定常領域であり得る。ｓｃＦｖ遺伝子を創出するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片を、フレキシブルリンカーをコードする、例
えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作動可能に連結して、ＶＬおよびＶＨ領域がフレキシブルリンカーによりつながれた連続単鎖タンパク質としてＶＨおよびＶＬ配列が発現できるようにする（例えばＢｉｒｄ  ＲＥら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６頁；Ｈｕｓｔｏｎ  ＪＳら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜８３頁；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  Ｊら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４頁を参照されたい）。抗体の抗体断片生成のために様々な技法が開発されている。伝統的に、これらの断片は、インタクト抗体のタンパク質分解消化により導かれた（例えばＭｏｒｉｍｏｔｏ  Ｋら、（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４：１０７〜１１７頁およびＢｒｅｎｎａｎ  Ｍら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１〜３頁を参照されたい）。しかし、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞により直接生成できる。例えば、抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリーから単離できる。代わりに、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収でき、化学的にカップリングさせてＦ（ａｂ’）2断片を形成できる（Ｃａｒｔｅｒ  Ｐら、（１９９２）Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６３〜１６７頁）。別のアプローチによると、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離できる。抗体断片の生成のための他の技法は、当業者にとって明らかである。別の実施形態では、選択される抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。例えばＷＯ１９９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号および米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に例えば記載される「直鎖抗体」であってもよい。
【００９７】
本発明の抗体をコードする核酸は、タンパク質を発現するためにベクター、好ましくは発現ベクターに組み込むことができる。様々な発現ベクターをタンパク質発現のために利用できる。発現ベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターを含み得る。発現ベクターは、宿主細胞型と適合するように構築される。よって、本発明において用いることができるベクター、好ましくは発現ベクターは、それらに限定されないが、哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞、酵母においておよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ系においてタンパク質発現を可能にするものを含む。当技術分野において知られるように、抗体を発現するために本発明において用いることができる様々な発現ベクターが市販または他の方法で入手可能である。
【００９８】
発現ベクターは、典型的に、制御もしくは調節配列、選択マーカー、任意の融合パートナーおよび／またはさらなるエレメントに作動可能に連結したタンパク質を含む。本明細書において「作動可能に連結」とは、核酸が別の核酸配列と機能的関係にあることを意味する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０））に記載される。一般的に、これらの発現ベクターは、抗体をコードする核酸に作動可能に連結した転写および翻訳調節核酸を含み、タンパク質を発現するために用いる宿主細胞にとって典型的に適当である。一般に、転写および翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含み得る。これもまた当技術分野において知られるように、発現ベクターは、選択遺伝子またはマーカーを典型的に含有して、発現ベクターを含有する形質転換宿主細胞の選択を可能にする。選択遺伝子は当技術分野において知られており、用いる宿主細胞により変動する。例えば、典型的に、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に与える。好ましい選択可能マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅を用いるｄｈｆｒ−宿主細胞において用いるため）
およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を含む。
【００９９】
クローニングまたは本明細書におけるベクター中でのＤＮＡの発現のために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核生物細胞である。この目的のために適切な原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性生物を含む真正細菌、例えばＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えばＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓおよびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢａｃｉｌｌｉ、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、例えばＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓを含む。適切なＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）を含む。原核生物に加えて、糸状菌または酵母のような真核微生物は、適切なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは一般的なパン酵母は、下等真核宿主微生物のうちで最も一般的に用いられる。しかし、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｒｉｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ＷａＩｔＨ（ＡＪＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｍａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓまたはＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２２２６）を含むＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えばＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ；およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、ＴｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍまたはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓもしくはＡ．ｎｉｇｅｒのようなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主を含む糸状菌のなどのいくつかの他の属、種および株が一般的に利用可能であり、有用である。
【０１００】
本発明の抗体の発現のために適切な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例は、プラリル（ｐｌａｒｉｌ）および昆虫細胞を含む。多数のバキュロウイルス株およびバリアント、並びにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ  ａｕｇｙｐｔｉ（カ）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（カ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉなど宿主からの対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えばＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１バリアントおよびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株が公共で利用可能であり、このようなウイルスは、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために用いることができる。ワタ、トウモロコシ、バレイショ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物も宿主として利用できる。
【０１０１】
本発明の組換え抗体の発現のための宿主細胞は、好ましくは哺乳動物宿主細胞であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ  ＧおよびＣｈａｓｉｎ  ＬＡ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ、７７：４２１６〜４２２０頁に記載されるｄｈｆｒ-ＣＨＯ細胞を含む、例えばＫａｕｆｍａｎ  ＲＪおよびＳ
ｈａｒｐ  ＰＡ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、１５９：６０１〜６２１頁に記載されるようにＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに用いられる）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞とともに用いるために、別の好ま
しい発現系は、ＷＯ８７／０４４６２（Ｗｉｌｓｏｎ）、ＷＯ８９／０１０３６（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ）およびＥＰ３３８８４１（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ）に開示されるＧＳ遺伝子発現系である。組換え抗体遺伝子を哺乳動物宿主細胞に導入した場合、抗体は、宿主細胞中での抗体の発現を可能にするためまたはより好ましくは宿主細胞が成長する培養培地への抗体の分泌を可能にするために十分な期間、宿主細胞を培養することにより生成される。ヒトＯＸ４０と結合する抗体を生成するために有用な宿主細胞は、様々な培地で培養できる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、最少必須培地（ＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ
Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）など市販で入手可能な培地は、宿主細胞の培養のために適切である。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培養培地から回収できる。
【０１０２】
抗体は、融合パートナーに作動可能に連結して、発現されたタンパク質の標的化、精製、スクリーニング、ディスプレイなどができるようにしてよい。融合パートナーは、リンカー配列により抗体配列に連結してよい。リンカー配列は、少数、典型的に１０未満のアミノ酸を一般的に含むが、より長いリンカーも用いてよい。典型的に、リンカー配列は、フレキシブルで分解に対して耐性であるように選択される。当業者により認識されるように、多様な配列のいずれもリンカーとして用いることができる。例えば、一般的なリンカー配列は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳを含む。融合パートナーは、抗体および任意の付随する融合パートナーを所望の細胞の場所または細胞外培地に向ける標的化またはシグナル配列であってよい。当技術分野において知られるように、あるいくつかのシグナル配列は、タンパク質を成長培地または細胞の内膜と外膜との間にある細胞膜周辺腔に分泌されるように標的化させることがある。融合パートナーは、精製および／またはスクリーニングを可能にするペプチドまたはタンパク質をコードする配列であってもよい。このような融合パートナーは、それらに限定されないが、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）（例えばＨ６およびＨ１０または固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）系（例えばＮｉ+2親和性カラム）とともに用いるための他のタグ）、ＧＳＴ融合、ＭＢＰ融合、Ｓｔｒｅｐタグ、細菌酵素ＢｉｒＡのＢＳＰビオチン化標的配列、および抗体が標的にするエピトープタグ（例えばｃ−ｍｙｃタグ、ｆｌａｇタグなど）を含む。当業者により認識されるように、このようなタグは、精製、スクリーニングまたはその両方のために有用であり得る。
【０１０３】
抗体の構築および生成
ＯＸ４０ポリペプチドに対して作製された抗体は、よく知られており日常的なプロトコールを用いて、動物の免疫化、すなわち動物、好ましくは非ヒト動物へのポリペプチドの投与によりにより得ることができる。例えばＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｅｉｒ  ＤＭ（編）、第４巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８６）を参照されたい。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダまたはブタなどの多くの温血動物を免疫できる。しかし、マウス、ウサギ、ブタおよびラット、特にマウスは、一般的に最も適切である。抗体は、当業者に知られる組換えＤＮＡ技法によっても生成できる。さらに、抗体は、自然に存在する抗体の酵素または化学的切断により生成できる。本発明のヒト化抗体は、非ヒト動物（例えばマウス）からのＶＨおよび／またはＶＬ領域からの１もしくは複数のＣＤＲまたはその一部を、ヒトＶＨおよび／またはＶＬ領域からの１または複数のフレームワーク領域に移行することにより構築できる。場合によって、このようにＶＨおよび／またはＶＬ領域中に存在するヒトフレームワーク残基は、抗体の免疫原性を減少させ、かつ／または結合親和性を維持するために必要または所望される場合に、対応する非ヒト（例えばマウス）残基で置き換えることができる。場合によ
って、ＣＤＲ中に存在する非ヒトアミノ酸残基は、ヒト残基で置き換えてよい。本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上記のようにして調製した非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づいて調製できる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象の非ヒトハイブリドーマから得て、非マウス（例えばヒト）免疫グロブリン配列を含有するように、標準的な分子生物学的技法を用いて工学改変できる。例えば、キメラ抗体を創出するために、当技術分野において知られる方法を用いて、マウス可変領域をヒト定常領域に連結できる（例えばＣａｂｉｌｌｙらへの米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。ヒト化抗体を創出するために、当技術分野において知られる方法を用いて、マウスＣＤＲ領域をヒトフレームワークに挿入できる（例えばＷｉｎｔｅｒへの米国特許第５，２２５，５３９号、Ｑｕｅｅｎらへの米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照されたい）。
【０１０４】
重鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子を、可能性のあるアクセプター分子可変領域とマウス抗体の重鎖可変領域との間の相同性を考慮して選択して、本発明のヒト化抗体を構築してよい。生殖系列候補ヒトアクセプター分子は、可能性のある免疫原性を低減するので好ましい。生殖系列データベースは、重鎖ＦＷ３領域の端および部分的にＣＤＲ３配列内まで通して読んだ抗体配列でつくられている。ＦＷ４領域の選択のために、選択された生殖系列分子に由来する成熟抗体配列のデータベースを検索できるか、またはヒトドナーからの選択された生殖系列分子に由来する抗体配列を用いることができる。ヒトアクセプター分子は、マウスドナー分子と同じ重鎖クラスから好ましく選択され、マウスドナー分子の可変領域と同じ基準構造クラスのものである。重鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子の選択のための２次的な考慮は、マウスドナー分子とヒトアクセプター分子との間のＣＤＲ長における相同性を逃れる。ヒトアクセプター抗体分子は、Ｖ−ＢＡＳＥデータベースでの相同性検索により選択されることが好ましいが、Ｋａｂａｔおよび公共ＮＣＢＩデータベースなどの他のデータベースも用いてよい。
【０１０５】
軽鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子を、可能性のあるアクセプター分子可変領域とマウス抗体の軽鎖可変領域との間の相同性を考慮して選択して、本発明のヒト化抗体を構築してよい。生殖系列候補ヒトアクセプター分子は、可能性のある免疫原性を低減するので好ましい。生殖系列データベースは、重鎖ＦＷ３領域の端および部分的にＣＤＲ３配列内まで通して読んだ抗体配列でつくられている。ＦＷ４領域の選択のために、選択された生殖系列分子に由来する成熟抗体配列のデータベースを検索できるか、またはヒトドナーからの選択された生殖系列分子に由来する抗体配列を用いることができる。ヒトアクセプター分子は、マウスドナー分子と同じ軽鎖クラスから好ましく選択され、マウスドナー分子の可変領域と同じ基準構造クラスのものである。軽鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子の選択のための２次的な考慮は、マウスドナー分子とヒトアクセプター分子との間のＣＤＲ長における相同性を含む。ヒトアクセプター抗体分子は、Ｖ−ＢＡＳＥデータベースでの相同性検索により選択されることが好ましいが、Ｋａｂａｔおよび公共ＮＣＢＩデータベースなどの他のデータベースも用いてよい。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、以下の実施例６を含んで本明細書に記載する。
【０１０６】
本発明は、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体またはその断片を生成する方法であって、核酸が発現され、抗体が生成されるように、ヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体もしくはその断片をコードする単離核酸またはヒトＯＸ４０と結合する拮抗性抗体もしくはその断片をコードする単離核酸を含むベクターを含む宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。好ましくは、抗体は、単離される。宿主細胞、核酸およびベクターについて、上記のものを用いることができる。核酸の発現は、例えば、当技術分野においてよく知られ（例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ  Ｓ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２頁）、上でさらに概説する組換えＤＮＡ技法と遺伝子トランスフェクション方法との組み合わせにより得ることができる。例えば抗体またはその抗体断片を発現するために、部分また
は全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、標準的な分子生物学的技法を用いて得て（例えばＰＣＲ増幅または対象の抗体を発現するハイブリドーマを用いるｃＤＮＡクローニング）、ＤＮＡを発現ベクターのようなベクターに挿入できる。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いる発現宿主細胞に適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入できるか、またはより典型的には、両方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子を発現ベクターに、標準的な方法により挿入する（例えば抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しないならば平滑端ライゲーション）。本明細書に記載する抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用いて任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を創出でき、このことは、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨ１セグメント（複数可）に作動可能に連結し、ＶＫセグメントがベクター内のＣＫセグメントに作動可能に連結するように、所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域を予めコードする発現ベクターに本明細書に記載する抗体の軽鎖および重鎖可変領域を挿入することによる。
【０１０７】
抗ＯＸ４０抗体の特徴決定および精製
抗体についてのスクリーニングを、ヒトＯＸ４０との結合を測定するためのアッセイおよび／またはＯＸ４０とそのリガンドであるＯＸ４０Ｌとの結合を阻止する能力を測定するためのアッセイを用いて行うことができる。結合アッセイの例は、特に、プレート上に固定化されたヒトＯＸ４０とヒトＦｃとの融合タンパク質を用い、融合タンパク質と結合した抗ＯＸ４０抗体を検出するためのコンジュゲート２次抗体を採用するＥＬＩＳＡである。阻止アッセイの例は、ヒトＣＤ４細胞上のＯＸ４０へのＯＸ４０リガンド融合タンパク質結合の阻止を測定する、フローサイトメトリーに基づくアッセイである。蛍光標識２次抗体を用いて、細胞と結合するＯＸ４０リガンド融合タンパク質の量を検出する。このアッセイは、上清中の抗体が、ＯＸ４０とリガンド融合タンパク質との結合を阻止するにつれてのシグナルの低減を求める。阻止アッセイのさらなる例は、プレートを被覆するＯＸ４０リガンド融合タンパク質が媒介するナイーブヒトＴ細胞の共刺激の阻止を、チミジン取り込みを測定することにより測定するアッセイである。抗ＯＸ４０抗体の機能的活性、例えばＴ細胞活性化の低減を評価するためのアッセイとして、実施例３および８に記載するヒト混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を用いることができる。本発明の抗体は、当業者に知られる様々な方法で単離または精製できる。標準的な精製方法は、大気圧またはＦＰＬＣおよびＨＰＬＣのようなシステムを用いて高圧で行う、イオン交換、疎水性相互作用、親和性、サイズ分けまたはゲルろ過および逆相を含むクロマトグラフィー技法を含む。精製方法は、電気泳動、免疫学的、沈降、透析および等電点電気泳動の技法も含む。タンパク質濃縮とともに限外ろ過およびダイアフィルトレーション技法も有用である。ＯＸ４０抗体を精製するために、選択された宿主細胞を、例えばモノクローナル抗体精製のためにスピナーフラスコ中で成長させることができる。上清をろ過し、濃縮した後に、プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて親和性クロマトグラフィーを行う。溶出された抗体をゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーにより確認して、純度を確認できる。本発明の好ましい抗体は、よって、ヒトＯＸ４０と結合する単離および／または精製抗体である。
【０１０８】
イムノコンジュゲート
別の態様では、本発明は、細胞毒、薬物（例えば免疫抑制剤）または放射性毒素のような治療剤に連結した、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニストＯＸ４０抗体またはその断片を提供する。このようなコンジュゲートは、本明細書において、「イムノコンジュゲート」という。１または複数の細胞毒を含むイムノコンジュゲートは、「免疫毒素」という。細胞毒または細胞傷害性薬剤は、細胞に有害な（例えば死滅させる）任意の薬剤を含む。例は、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサント
ロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにそれらの類似体またはホモログを含む。治療剤は、例えば、代謝拮抗薬（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣならびにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））および有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）も含む。本発明の抗体と連結できる治療用細胞毒の他の例は、デュオカルマイシン、カリチアマイシン、マイタンシンおよびオーリスタチン、ならびにそれらの誘導体を含む。カリチアマイシン抗体コンジュゲートの例は、市販で入手可能である（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｏｍｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）。細胞毒は、本発明の抗体と、当技術分野において利用可能なリンカー技法を用いて連結できる。細胞毒と抗体とをコンジュゲートするために用いられているリンカーの型の例は、それらに限定されないが、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチド含有リンカーを含む。例えばリソソーム区画内の低ｐＨによる切断に感受性またはカテプシン（例えばカテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）のような腫瘍組織において優先的に発現されるプロテアーゼのようなプロテアーゼによる切断に感受性であるリンカーを選択できる。細胞毒の型、リンカーおよび治療剤と抗体をコンジュゲートする方法についてのさらなる議論について、Ｓａｉｔｏ  Ｇら、（２００３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９〜２１５頁；Ｔｒａｉｌ  ＰＡら、（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８〜３３７頁；Ｐａｙｎｅ  Ｇ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、３：２０７〜２１２頁；Ａｌｌｅｎ  ＴＭ（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２：７５０〜７６３頁；Ｐａｓｔａｎ  ＩおよびＫｒｅｉｔｍａｎ  ＲＪ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ、３：１０８９〜１０９１頁；Ｓｅｎｔｅｒ  ＰＤおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ  ＣＪ、（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５３：２４７〜２６４頁も参照されたい。本発明の抗体は、放射活性同位体に連結して、ラジオイムノコンジュゲートともよばれる細胞傷害性放射性医薬品を作製することもできる。診断または治療用に用いるために抗体とコンジュゲートできる放射活性同位体の例は、それらに限定されないが、ヨウ素131、インジウム111、イットリウム90およびルテニウム177を含む。ラジオイムノ
コンジュゲートを調製するための方法は、当技術分野において確立されている。ラジオイムノコンジュゲートの例は、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）（ＥＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢｅｘｘａｒ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含んで市販で入手可能であり、同様の方法を用いて、本発明の抗体を用いてラジオイムノコンジュゲートを調製できる。本発明の抗体イムノコンジュゲートを用いて所定の生物学的応答を改変でき、薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってよい。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素もしくはジフテリア毒素のような酵素活性毒素またはその活性断片；腫瘍壊死因子もしくはインターフェロン−γのようなタンパク質；あるいは例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）もしくは他の増殖因子のような生物学的応答改変物質を含むことがある。
【０１０９】
このような治療剤を抗体に連結する技法はよく知られており、例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３〜５６頁（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）中のＡｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３〜５３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）中のＨｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５〜５０６頁（１９８５）中のＴｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３〜１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）中の「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」ならびにＴｈｏｒｐｅ  ＰＥおよびＲｏｓｓ  ＷＣ（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９〜５８頁を参照されたい。
【０１１０】
別の態様では、本発明は、細胞毒、薬物（例えば免疫抑制剤）または放射性毒素のような治療剤と一緒に投与される、ヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニストＯＸ４０抗体またはその断片を提供する。
【０１１１】
医薬組成物
別の態様では、本発明は、本発明のアンタゴニスト抗体またはその断片と薬学的に許容される担体とを含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。このような組成物は、１もしくは組み合わせ（例えば２以上の異なる）抗体、および／または本発明のイムノコンジュゲート、および／または上記のような細胞毒、薬物（例えば免疫抑制剤）もしくは放射性毒素のような治療剤を含むことがある。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープと結合するか、または相補的な活性を有する抗体の組み合わせ（またはイムノコンジュゲート）を含み得る。本発明の医薬組成物は、併用治療において投与することもでき、すなわち他の薬剤と組み合わせることができる。例えば、併用治療は、少なくとも１つの他の抗炎症剤または免疫抑制剤と組み合わせた本発明のアンタゴニストＯＸ４０抗体を含み得る。
【０１１２】
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」は、任意のそして全ての生理的に適合する溶剤、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば注射または注入による）のために適切である。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体またはイムノコンジュゲートをある材料中にコーティングして、化合物を不活性化できる酸およびその他の自然の状態から化合物を保護してよい。薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液または分散液および滅菌注射用液または分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む。医薬活性物質のためのこのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野において知られている。任意の従来の媒体または作用物質が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるこれらの使用が構想される。補助的活性化合物も組成物に組み込むことができる。
【０１１３】
別の態様では、本発明は、治療剤に連結したヒトＯＸ４０と結合するアンタゴニスト抗体またはその断片を含むイムノコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。用いることができるイムノコンジュゲートおよび治療剤については、上で記
載している。
【０１１４】
別の態様では、本発明は、別の医薬活性物質をさらに含む本発明のアンタゴニスト抗体またはその断片を含む組成物を提供する。好ましくは、別の医薬活性物質は、ａ）ヒトＯＸ４０に対する別のアンタゴニスト、ｂ）鎮痛剤およびｃ）免疫抑制剤、例えばプレドニゾンのようなグルココルチコイドの１または複数である。
【０１１５】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤も含んでよい。薬学的に許容される抗酸化剤の例は、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどのような水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアルコール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどのような脂溶性抗酸化剤；および（３）クエン酸、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような金属キレート化剤を含む。本発明の医薬組成物において採用できる適切な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物、オリーブ油のような植物油ならびにオレイン酸エチルのような注射用有機エステルを含む。適当な流動性は、例えばレシチンのようなコーティング材料の使用、分散液の場合に、要求される粒径の維持および界面活性剤の使用により維持できる。これらの組成物は、保存剤、湿潤化剤、乳化剤および分散剤のような補助剤も含有してよい。微生物の存在は、上記の滅菌化手順および様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの添加の両方により確実に防止できる。糖、塩化ナトリウムなどのような等張化剤を組成物に含めることが望ましいこともある。さらに、注射用医薬形の吸収の延長を、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる作用物質を含めることによりもたらしてもよい。
【０１１６】
治療用およびその他の使用
本発明のアンタゴニスト抗体は、ＯＸ４０媒介性障害の診断および処置を含む、多数のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの診断および治療用の利用性がある。例えば、これらの分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏで培養中の細胞に、または例えばｉｎ  ｖｉｖｏでヒト対象に投与して、様々なＯＸ４０媒介性障害を処置、防止および診断できる。好ましい対象はヒトであり、ＯＸ４０活性により媒介される障害（ＯＸ４０媒介性障害）を有する患者を含む。本発明のアンタゴニスト抗体は、患者のＯＸ４０共刺激状態とは独立して、患者を処置するために効果的であり得る。より好ましい対象はヒトであり、低レベルのＯＸ４０を発現する患者を含む。
【０１１７】
本発明の目的のための「患者」は、ヒトおよびその他の動物の両方、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを含む。よって、本発明の抗体は、ヒト治療および獣医学的用途の両方を有する。本発明における用語「処置」または「処置する」は、疾患または障害についての治療的処置および予防的または抑制的措置を含むことを意味する。よって、例えば疾患の発症前の抗体投与の成功は、疾患の処置をもたらす。別の例として、疾患の症状と闘うための疾患の臨床的顕性化の後の抗体の投与の成功は、疾患の処置を含む。「処置」および「処置する」は、疾患を根絶するための疾患の出現の後の抗体の投与も包含する。臨床症状の可能性のある減少およびおそらく疾患の改善を伴う、発症後および臨床症状が生じた後の抗体の投与の成功は、疾患の処置を含む。「処置を必要とする」者は、疾患または障害を既に有する哺乳動物、および疾患または障害を防止しようとする哺乳動物を含む、疾患または障害を有しやすい哺乳動物を含む。
【０１１８】
特定の実施形態では、アンタゴニスト抗体をｉｎ  ｖｉｖｏで用いて、様々なＯＸ４０媒介性障害を処置、防止または診断する。よって、本発明は、対象におけるＯＸ４０媒介
性障害を処置するための方法であって、対象に治療有効量のアンタゴニスト抗体またはその断片を投与するステップを含む方法を提供する。例示的なＯＸ４０媒介性障害は、感染症（ウイルス、細菌、真菌および寄生虫）、感染症に伴う内毒素ショック、関節炎、関節リウマチ、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒合、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、関節炎、髄膜脳炎、自己免疫性ぶどう膜炎、中枢および末梢神経系の免疫媒介性炎症性障害、例えば多発性硬化症、ループス（例えば全身性エリテマトーデス）およびギラン−バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化胞隔炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、膵炎、外傷（手術）、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、虚血性疾患を含む心血管疾患、例えば心筋梗塞およびアテローム動脈硬化症、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎、低酸症ならびに視神経脊髄炎を含む。
【０１１９】
他の例示的なＯＸ４０媒介性障害は、感染症（ウイルス、細菌、真菌および寄生虫）、感染症に伴う内毒素ショック、関節炎、関節リウマチ、喘息、気管支炎、インフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、肺炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、原因不明の線維化胞隔炎（ＣＦＡ）、特発性線維化間質性肺炎、肺気腫、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒合、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、関節炎、髄膜脳炎、自己免疫性ぶどう膜炎、中枢および末梢神経系の免疫媒介性炎症性障害、例えば多発性硬化症、ループス（例えば全身性エリテマトーデス）およびギラン−バレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化胞隔炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、膵炎、外傷（手術）、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、虚血性疾患を含む心血管疾患、例えば心筋梗塞およびアテローム動脈硬化症、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎、低酸症ならびに視神経脊髄炎を含む。
【０１２０】
本発明の抗体を用いて処置される好ましいＯＸ４０媒介性障害は、多発性硬化症、関節リウマチ、大腸炎、乾癬、喘息、ＣＯＰＤ、ＩＰＦ、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、アテローム動脈硬化症および糖尿病からなる群より選択される。本発明の抗体を用いて処置される特に好ましいＯＸ４０媒介性障害は、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）である。
【０１２１】
本発明は、疼痛、特に炎症に伴う疼痛の処置において用いるための抗体も提供する。
【０１２２】
一実施形態では、本発明の抗体を用いて、ＯＸ４０のレベル、または細胞膜表面上にＯＸ４０を含有する細胞のレベルを検出でき、前記レベルは、よって、ある疾患症状につながることができる。代わりに、抗体を用いて、ＯＸ４０機能を阻害または阻止でき、前記機能は、よって、ある疾患症状の防止または改善につながることができ、そのことにより、ＯＸ４０が疾患のメディエーターとして関わる。このことは、試料および対照試料を、ＯＸ４０抗体と、抗体とＯＸ４０との間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより達成できる。抗体とＯＸ４０との間で形成された任意の複合体を検出し、試料および対照において比較する。本発明の抗体とＯＸ４０との特異的結合に鑑みて、本発明の抗体を用いて細胞の表面上のＯＸ４０発現を特異的に検出でき、例えば前記抗体を用いてＯＸ４０の発現レベルが低い患者を検出できる。本発明の抗体を用いて、免疫親和性精製によりＯＸ４０を精製することもできる。
【０１２３】
よって、本発明は、ＯＸ４０の発現レベルが低い患者を検出するｉｎ  ｖｉｔｒｏスク
リーニング方法であって、
（ａ）患者血液試料から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製するステップと、
（ｂ）ＰＢＭＣをフローサイトメトリー分析に供するステップと、
（ｃ）ＣＤ４+および／またはＣＤ８+Ｔ細胞中のＯＸ４０陽性細胞の数を決定し、前記数を対照レベルと比較するステップと
を含む方法も提供する。
【０１２４】
好ましい実施形態では、ＯＸ４０の低い発現レベルは、対照レベルと比較した場合に１０％まで、より好ましくは２０％まで、さらにより好ましくは３０％までのＯＸ４０陽性細胞の発現レベルの増加により示される。ＯＸ４０発現を決定するアプローチは、Ｋｏｔａｎｉ  Ａら、（２００１）Ｂｌｏｏｄ、９８：３１６２〜４頁およびＸｉａｏｙａｎ  Ｚら、（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１１０〜６頁にさらに記載されている。
【０１２５】
別の実施形態では、本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの治療または診断用の使用に付随する結合活性について初期に試験できる。例えば、本発明の組成物は、フローサイトメトリー分析を用いて試験できる。
【０１２６】
本開示は、医薬品としてのアンタゴニスト抗体またはその断片の使用、およびＯＸ４０媒介性障害の処置のための医薬品の調製におけるアンタゴニスト抗体またはその断片の使用をさらに提供する。さらなる実施形態では、本開示は、医薬品として用いるためのアンタゴニスト抗体またはその断片を提供する。本開示は、ＯＸ４０媒介性障害を処置するための方法において用いるためのアンタゴニスト抗体またはその断片も提供する。ＯＸ４０媒介性障害は、上記のものである。本発明のアンタゴニスト抗体は、患者のＯＸ４０共刺激状態とは独立して、ＯＸ４０媒介性障害を処置するために特に有用であり得る。好ましい実施形態では、アンタゴニスト抗体またはその断片は、患者が低レベルのＯＸ４０を発現するＯＸ４０媒介性障害を処置するために用いることができる。
【０１２７】
以前に記載するように、本発明のアンタゴニストＯＸ４０抗体は、１または複数の他の治療剤、例えば細胞傷害性薬剤、放射毒性薬剤または免疫抑制剤と共投与できる。抗体は、薬剤と連結できる（上記のようなイムノコンジュゲートとして）か、または薬剤と分けて投与できる。後者の場合（別の投与）、抗体は、薬剤の前、後もしくは薬剤と同時に投与できるか、または他の既知の治療、例えば抗がん治療、例えば放射線照射と共投与できる。
【０１２８】
抗体の投与のために、投与量は、約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ宿主体重まで、より通常は０．０１から１０ｍｇ／ｋｇ宿主体重までの範囲である。例示的な処置計画は、週１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、１カ月に１回、３カ月ごとに１回または３〜６カ月ごとに１回の投与を必要とする。抗体は、複数の機会に通常投与される。単独投与間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３カ月ごと、または毎年であり得る。間隔は、患者において標的抗原に対する抗体の血中レベルを測定することにより示されるように不定期的でもあり得る。いくつかの方法では、投与量は、約１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法では約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように調整される。代わりに、抗体は、持続放出製剤として投与でき、この場合、要求される投与頻度がより低い。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変動する。投与の投与量および頻度は、処置が予防的または治療的であるかに依存して変動できる。予防的用途では、比較的低い投与量が、長期間にわたって比較的頻繁でない間隔で投与される。残りの寿命にわたって処置を受け続ける患者もいる。治療的用途では、疾患の進行が低減または終結するまで、比較的短い間隔での比較的高い用量が時折要求される。
【０１２９】
本発明の医薬組成物中の活性成分、すなわち抗体の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性にならずに、特定の患者、組成物および投与方法について所望の治療応答を達成するために効果的な活性成分の量を得るように変動できる。選択された投与量レベルは、採用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、採用される特定の抗体の排出速度、処置持続期間、採用される特定の組成物と組み合わせて用いる他の薬物、化合物および／または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康および以前の医療履歴などの、医療の分野においてよく知られている因子を含む様々な薬物動態因子に依存する。
【０１３０】
「治療有効量の」本発明のＯＸ４０抗体は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、無疾患症状期間の頻度および持続期間の増加、ならびに／または疾患の苦痛による障害もしくは機能障害の防止をもたらす。ＯＸ４０媒介性障害の処置についての化合物の能力は、ヒトにおける効力を予測できる動物モデル系において評価できる。代わりに、組成物のこの特性は、細胞成長を阻害する化合物の能力を調べることにより評価でき、このような阻害は、当業者に知られるアッセイによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定できる。当業者は、このような量を、対象のサイズ、対象の症状の重症度および選択される特定の組成物または投与経路のような因子に基づいて決定できる。
【０１３１】
本発明の抗体または組成物は、１または複数の投与経路により、当技術分野において知られる様々な方法の１または複数を用いて投与できる。当業者により認識されるように、投与の経路および／または方法は、所望の結果に依存して変動する。好ましい投与経路は、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または例えば注射もしくは注入による他の非経口投与経路を含む。より好ましい投与経路は、静脈内または皮下である。「非経口投与」との句は、本明細書で用いる場合、通常注射による、経腸および局所投与以外の投与の方法を意味し、限定することなく、静脈内、筋内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入を含む。代わりに、本発明の抗体は、局所、表皮または粘膜投与経路、例えば鼻内、口腔、膣、直腸、舌下または局所によるような非経口でない経路により投与できる。
【０１３２】
製造品およびキット
本開示の別の実施形態では、ＯＸ４０媒介性障害の処置のための、本発明のアンタゴニスト抗体もしくはその断片、組成物またはイムノコンジュゲートを含む製造品が提供される。製造品は、容器と、容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書を含むことがある。適切な容器は、例えば瓶、バイアルまたはシリンジを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から形成してよい。容器は、状態を処置するために効果的であり得る組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有することがある（例えば容器は、皮下注射針が突き刺すことができるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性物質は、本明細書に記載するアンタゴニスト抗体であってよい。ラベルまたは添付文書は、組成物を、がんのような所望の状態を処置するために用いることができることを示してよい。一実施形態では、ラベルまたは添付文書は、アンタゴニスト抗体を含む組成物を用いてＯＸ４０媒介性障害を処置できることを示してよい。
【０１３３】
さらに、製造品は、（ａ）組成物を含有する第１容器であって、組成物が、本明細書のアンタゴニスト抗体を含む第１容器と、（ｂ）組成物を含有する第２容器であって、組成物が、アンタゴニスト抗体以外の治療剤を含む第２容器とを含むことがある。本開示の本実施形態の製造品は、第１および第２組成物を組み合わせて用いて、ＯＸ４０媒介性疾患または障害を処置できることを示す添付文書をさらに含んでよい。このような治療剤は、
先行する項において記載する任意の補助治療であってよい（例えば血栓溶解剤、血小板凝集抑制薬、化学療法剤、血管新生抑制薬、抗ホルモン化合物、心臓保護剤および／またはサイトカインを含む、哺乳動物における免疫機能の調節物質）。代わりにまたはさらに、製造品は、注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝食塩水、リンゲル液およびブドウ糖液のような薬学的に許容される緩衝液を含む第２（または第３）容器をさらに含んでよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針およびシリンジを含む、商業的および使用者の視点から望まれる他の物質をさらに含んでよい。
【０１３４】
本発明の抗体、組成物またはイムノコンジュゲートと使用説明書とを含むキットも本発明の範囲内である。キットは、免疫抑制剤、細胞傷害性薬剤もしくは放射毒性剤、または１もしくは複数の本発明のさらなるアンタゴニスト抗体（例えば、第１アンタゴニスト抗体とは異なるＯＸ４０抗原中のエピトープと結合する、相補的活性を有するアンタゴニスト抗体）のようなもう１つのさらなる試薬をさらに含有できる。
【０１３５】
さらなる記載なしで、当業者は、先行する記載および以下の説明的な実施例を用いて、本開示の薬剤を利用して、特許請求の範囲に記載される方法を実施できると考えられる。以下の実行実施例は、本開示の実施を容易にするために与えられ、残りの本開示をいずれの様式でも限定すると解釈されない。
【実施例１】
【０１３６】
マウス抗ヒトＯＸ４０抗体の作製およびスクリーニング
組換えヒトＯＸ４０−Ｆｃタンパク質を生成するために、ヒトＴＮＦＲＳＦ４についてのｃＤＮＡをｉｍａＧｅｎｅｓ（クローン番号：ＲＺＰＤＢ７３７Ｈ０３２９Ｄ；Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。このｃＤＮＡを鋳型として用いて、ヒトＴＮＦＲＳＦ４細胞外ドメインのＤＮＡコード領域（配列番号１１）をＰＣＲ増幅した。別のＰＣＲ反応では、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（ＥＵ位２２３〜４５１）をＰＣＲにより増幅して、５’ＧＳＧＧＧリンカーおよび３’ＳＡ−６×Ｈｉｓリンカーならびにクローニングのための制限部位を付加した。２つの得られた産物を、次いで、フランキングプライマーを用いるオーバーラップ伸長ＰＣＲを用いて融合して、米国特許第５９２４９３９号に記載されるＩｇドナーアクセプター断片（第１イントロン）を有するヒトＣＭＶプロモーター、ＯｒｉＰ配列（Ｋｏｏｎｓ  ＭＤら、（２００１）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７５（２２）：１０５８２〜９２頁）、ＳＶ４０エンハンサーおよびＫｉｍ  Ｄら、（２００３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１９（５）：１６２０〜２頁に記載されるガストリンターミネーターと融合したＳＶ４０ポリＡを含有する、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐｃＤＮＡ３．１（−）プラスミドに基づく改変哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ７９５−２０）への後続のクローニングのための制限部位を付加した。この組換えプラスミドは、哺乳動物細胞でのヒトＴＮＦＲＳＦ４細胞外ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質の発現と、ヒトＴＮＦＲＳＦ４タンパク質の天然のシグナルペプチドにより駆動される細胞培養培地への分泌とを可能にした。組換えタンパク質生成のために、上記の組換えベクターを懸濁馴化ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）に、ｊｅｔＰＥＩ（商標）トランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓ．Ａ．、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ；流通業者：Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてトランスフェクトした。細胞培養上清を５日後に回収し、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上で操作されるプロテインＡ親和性精製カラム（ＨｉＴｒａｐプロテインＡセファロースカラム；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてさらに精製した。
【０１３７】
組換えヒトＯＸ４０−ｈｉｓタンパク質を生成するために、ヒトＴＮＦＲＳＦ４の細胞
外領域（配列番号１１）をＰＣＲにより増幅して、３’ＧＳＧ−６×Ｈｉｓリンカーおよびクローニングのための制限部位を付加した。ＰＣＲ産物を、その後、上記の改変ｐｃＤＮＡ３．１（−）プラスミドにクローニングした。この組換えプラスミドは、哺乳動物細胞でのヒトＯＸ４０−ｈｉｓタンパク質の発現と、ヒトＴＮＦＲＳＦ４タンパク質の天然のシグナルペプチドにより駆動される細胞培養培地への分泌とを可能にした。タンパク質生成のために、組換えベクターを懸濁馴化ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）に、ｊｅｔＰＥＩ（商標）トランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓ．Ａ．、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ；流通業者：Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてトランスフェクトした。細胞培養上清をトランスフェクションの５日後に回収し、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上で操作されるＮｉ2+−ＮＴＡ親和性精製カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｎｉ2+−ＮＴＡセファロースカラム；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて精製した。組換えヒトＯＸ４０−ＦｃおよびＯＸ４０−ｈｉｓタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判断して９５％純粋であることが見出され、使用前にリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に緩衝液をさらに交換した。
【０１３８】
ＰＢＳ中に溶解した組換えヒトＯＸ４０−Ｆｃタンパク質を、等容量のＳｔｉｍｕｎｅアジュバント（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、ｒｅｆ：７９２５０００）と混合し、乳化液を調製した。乳化液を０．５ｍＬインスリンシリンジ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移し、ＢＡＬＢ／ｃ動物（Ｈａｒｌａｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、５０μｇの乳化タンパク質を用いて後肢の肉趾、尾の基部および首に皮下免疫した。免疫化は、同じ量の抗原および同じ注射経路を用いて２週間後に反復した。
【０１３９】
免疫化マウス血清中の循環抗ヒトＯＸ４０抗体の存在は、組換えヒトＯＸ４０−ｈｉｓタンパク質で被覆したプレートを用いる直接ＥＬＩＳＡにより評価した。異なるマウス血清の系列希釈（１：１０0から１：１０9まで）をプレートに加え、結合した抗体を、ヤギ抗マウスＨ＋Ｌ全分子−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて検出した。アジュバントを含まずに５０μｇの抗原を用いる最後の皮下ブースター注射を、最良の抗ヒトＯＸ４０  ＩｇＧ血清力価を示す動物において行い、３日後に屠殺した。
【０１４０】
動物を安楽死させ、鼠径、腋窩、上腕、膝窩および坐骨リンパ節を回収して、リンパ節の構造を、ＤＮＡｓｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｃｈｗｅｉｚ）ＡＧ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびコラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｃｈｗｅｉｚ）ＡＧ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）溶液中で２本の２５Ｇ針を用いて壊すことにより、単細胞懸濁液を調製した。単細胞懸濁液を、骨髄腫株化細胞Ｘ６３ＡＧ８．６５３（マウスＢＡＬＢ／ｃ骨髄腫株化細胞；ＡＴＣＣ受託番号：ＣＲＬ１５８０；Ｋｅａｒｎｅｙ  ＪＦら、（１９７９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３（４）：１５４８〜１５５０頁）と、７：１の比率（融合パートナー対採集されたリンパ節細胞）で、ポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｃｈｗｅｉｚ）ＡＧ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて融合した。融合細胞を、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、５０μＭβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ
、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）および１％増殖因子（ハイブリドカイン、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ／Ｕｐｔｉｍａ、Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を補ったＤＭＥＭ−１０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中にマウスマクロファージを含有する、９６ウェル平底プレートに播種した。
【０１４１】
融合からのおよそ８００のウェルを、ヒトＯＸ４０を認識し、受容体に対するヒトＯＸ４０Ｌの結合を阻止するマウスＩｇＧの存在について、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。陽性ウェルを増殖させ、２回のサブクローニングに供した。細胞を回収し、重鎖および軽鎖をクローニングして配列決定した。
【実施例２】
【０１４２】
ハイブリドーマ細胞からの抗ＯＸ４０抗体のＶＨおよびＶＬ鎖のクローニングおよび配列決定
陽性選択したそれぞれのハイブリドーマについて、トータルＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡに逆転写し、ＶＨおよびＶＬ遺伝子をそれぞれＰＣＲにより増幅した。これらのＰＣＲ産物を、レスキューベクター（ｐＤｒｉｖｅベクター；ＱＩＡＧＥＮ  ＡＧ、Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２３１１２４）にライゲーションして、個別のＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定および選択したハイブリドーマの単クローン性または多クローン性の決定を可能にした。このベクターにより、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含有するＬＢ寒天プレート上での青／白の選択が可能になった（ＬａｃＺαペプチドによるＸ−ｇａｌの分解のために、挿入断片を有さないコロニーは青色であった）。陽性（白）細菌クローンから組換えプラスミドを調製し、ベクター主鎖に特異的な標準的ＤＮＡ配列決定プライマー（Ｍ１３ｒｅｖ、Ｍ１３ｆｗｄ、Ｔ７またはＳＰ６）を用いて配列決定した。ＤＮＡ配列を、最終的に、哺乳動物細胞での対象の抗体の組換え発現のために発現ベクターにサブクローニングした。
【０１４３】
ＲＮＡ単離
トータルＲＮＡを、２〜１０×１０6細胞から、ＱＩＡＧＥＮからのＲＮｅａｓｙミニ
キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＡＧ、Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｃａｔ．Ｎｏ．７４１０６）を製造者のプロトコールに従って用いて単離した。試料を、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（ＷＩＴＥＣ  ＡＧ、Ｌｉｔｔａｕ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて定量した。
【０１４４】
ワンステップＲＴ−ＰＣＲ
上記のトータルＲＮＡ調製物を、ｃＤＮＡにさらに逆転写し、ＶＨおよびＶＬ断片をＰＣＲにより、縮合プライマーの２つの異なる混合物（それぞれ１つがマウス免疫グロブリン重鎖可変断片および可変重鎖接合領域の全ての異なるサブファミリーの回収、または全てのマウス免疫グロブリン軽鎖カッパ可変断片および可変軽鎖カッパ接合領域の回収を可能にした）を用いて増幅した。逆転写および増幅のために用いたプライマーは、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｂａｌｇａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により合成され、ＨＰＬＣ精製された（表１〜４）。逆転写およびＰＣＲ増幅はともに、ＱＩＡＧＥＮワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＡＧ、Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２１０２１２）を用いて同時に行った。この技法は特異的プライマーを用いたので、それぞれのｍＲＮＡ試料を、次いで、２重に処理して、ＶＨまたはＶＬ断片のいずれかの個別の逆転写および増幅を可能にした。ＲＮアーゼフリー水に３０μｌの最終容量で溶解した２μｇのトータルＲＮＡを、１０μｌのＱＩＡＧＥＮワンステップＲＴ−ＰＣＲ緩衝液の５×ストック溶液、２μｌのｄＮＴＰミックス（１０ｍＭの濃度）、３μｌのプライマーミックス（１０μＭの濃度）および２μｌのＱＩＡＧＥＮワンステップＲＴ−ＰＣＲ酵素ミックスと混合した。最終混合物を、次いで、ＰＣＲチューブ
に入れ、以下の設定を用いてＰＣＲサーモサイクラー（ＢｉｏＲａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒバージョン４．００６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＡＧ、Ｒｅｉｎａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でサイクルにかけた：
５０℃にて３０分
９５℃にて１５分
４０サイクル：９４℃にて３０秒
５５℃にて３０秒
７２℃にて１分
７２℃にて１０分
４℃にて保持
【０１４５】
ｐＤｒｉｖｅクローニング
ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルに泳動させた。ＤＮＡ電気泳動の後に、対象の断片（およそ４５０ｂｐ）をアガロースゲルから切り出し、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＮｕｃｌｏＳｐｉｎ抽出ＩＩキット２５０（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｃａｔ．Ｎｏ．７４０６０９．２５０）を用いてさらに抽出した。ＤＮＡ配列決定のために、抽出したＰＣＲ産物を上記のレスキューベクター（ｐＤｒｉｖｅベクター、ＱＩＡＧＥＮ  ＡＧ、Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２３１１２４）にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ４０４００６）を形質転換した。
【０１４６】
ミニプレップ抽出
陽性コロニーを、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ方形ウェルブロックプレート（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｃａｔ．Ｎｏ．７４０４８８．２４）中に播種し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補った１．５ｍｌのＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で３７℃にて１晩（振とう２５０ＲＰＭ）培養した。次の日に、ＤＮＡミニプレップ抽出を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎマルチ８プラスミドキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｃａｔ．Ｎｏ．７４０６２０．５）を用いて行った。
【０１４７】
配列決定および配列分析
試料を、ＤＮＡ配列決定のために、ＤＮＡ配列決定サービス業者であるＦａｓｔｅｒｉｓ（Ｐｌａｎ−ｌｅｓ−Ｏｕａｔｅｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に送った。標準的なプライマーであるＭ１３ｒｅｖ、Ｍ１３ｆｗｄ、Ｔ７、ＳＰ６を用いた（表５）。ＤＮＡ配列を分析するために、クローンマネージャ９プロフェッショナル版（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＆Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＮＣ、ＵＳＡ）およびＢｉｏＥｄｉｔ配列アラインメントエディタ（Ｈａｌｌ，ＴＡ（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４１：９５〜９８頁）を用いた。
【０１４８】
組換えキメラ抗体発現のための発現ベクターのクローニング
哺乳動物細胞での組換え発現のために、単離マウスＶＨおよびＶＬ断片を、アセンブリベースのＰＣＲ法を用いて、キメラ免疫グロブリンとしてフォーマットした。これらのキメラ抗体は、マウス重鎖可変ドメインがヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（γ１、ヒンジ、γ２およびγ３領域）と融合した重鎖と、マウス軽鎖可変ドメインがヒトカッパ定常ドメイン（Ｃκ）と融合した軽鎖とからなる。ＰＣＲにより集合させたマウス可変およびヒト定常部分を、その後、実施例１にて言及したが、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパリーダーペプチドを採用してタンパク質分泌を駆動したことが異なるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの改変ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターに基づく改変哺乳動物発現ベクターにクローニングした。免疫グロブリン候補のタンパク質生成のために、等量の重鎖および軽鎖ベクターＤ
ＮＡを、懸濁馴化ＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５７３）に同時トランスフェクトした。細胞培養上清を５日後に回収し、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム上で操作されるプロテインＡ親和性精製カラム（ＨｉＴｒａｐプロテインＡセファロースカラム）（ともにＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから）を用いて精製した。
【０１４９】
【表１】
2018093869.tif 000002
【０１５０】
【表２】
2018093869.tif 000003
【０１５１】
【表３】
2018093869.tif 000004
【０１５２】
【表４】
2018093869.tif 000005
【０１５３】
【表５】
2018093869.tif 000006
【実施例３】
【０１５４】
抗ヒトＯＸ４０抗体の生物学的特徴決定
ＯＸ４０特異的抗体検出ＥＬＩＳＡ：
ハイブリドーマおよび組換え抗体候補による抗体力価、特異性および生成を、直接ＥＬＩＳＡにより決定した。簡単に述べると、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ  ＵＳＡ、流通業者ＶＷＲ  ＡＧ、Ｎｙｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をＰＢＳ中２μｇ／ｍｌでの１００μｌの組換えヒトＯＸ４０−ｈｉｓで被覆した（ＯＸ４０−ｈｉｓタンパク質の作製について実施例１を参照されたい）。プレートを４℃にて１晩インキュベートし、次いで、ＰＢＳ２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて室温（ＲＴ）にて１時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、ハイブリドーマ上清または精製抗体を加えた。プレートをＲＴにて３０分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で９回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＨ＋Ｌ検出抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を１：１０００の希釈で加えた。ヒトＦｃを有する組換えキメラ抗体（実施例２を参照されたい）を検出するために、ＨＲＰ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を１：１０００の希釈で検出抗体として用いた。プレートを３０分間室温（ＲＴ）にてインキュベートし、ＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０で９回洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＡＧ、Ｒｅｉｎａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をプレートに加え、６分後にＨ2ＳＯ4を加えることにより反応を停止した。吸光度を次いで４５０ｎｍにてマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、ＵＳＡ；流通業者：ＷＩＴＴＥＣ  ＡＧ、Ｌｉｔｔａｕ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で読み取った。図１Ａは、キメラ１Ｄ４抗体およびキメラ２Ｆ８抗体がＯＸ４０−ｈｉｓ被覆タンパク質を認識することを示す。
【０１５５】
ＯＸ４０Ｌ阻止ＥＬＩＳＡ：
組換えヒトＯＸ４０リガンドタンパク質（ＯＸ４０Ｌ）を以下のようにして作製した：ヒトＴＮＦＳＦ４についてのｃＤＮＡ（クローン名：ＩＯＨ４６２０３）をｉｍａＧｅｎｅｓ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、ヒトＴＮＦＳＦ４リガンドの細胞外部分（アミノ酸５１〜１８３）（番号付けはＵｎｉｐｒｏｔ  Ｑ６ＦＧＳ４配列に従う）を、フランキング制限部位とともに増幅した。ＡＳＡリンカーおよび８−Ｈｉｓタグ配列を５’端に包含する得られたＰＣＲ産物を、その後、ＣＭＶプロモーター、ウシ成長ホルモンポリアデニル化およびマウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドを有して組換えタンパク質の分泌を駆動する、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からの改変バージョンのｐＲＥＰ４ベクターにクローニングした。組換えタンパク質生成のために、組換えベクターを懸濁馴化ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）に、ｊｅｔＰＥＩ（商標）トランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓ．Ａ．、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ；流通業者：Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてトランスフェクトした。細胞培養上清を５日後に回収し、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上で操作されるプロテインＡ親和性精製カラム（ＨｉＴｒａｐプロテインＡセファロースカラム；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて精製した。
【０１５６】
作製された抗ＯＸ４０抗体がＯＸ４０ＬとＯＸ４０受容体との結合を阻止できるかを決定するために、阻止ＥＬＩＳＡを開発した。９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳＡ；流通業者ＶＷＲ  ＡＧ、Ｎｙｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をＰＢＳ中２μｇ／ｍｌでの１００μｌの組換えヒトＯＸ４０−Ｆｃ（実施例１を参照されたい）で被覆した。プレートを４℃にて１晩インキュベートし、次いで、ＰＢＳ２％ＢＳＡを用いてＲＴにて１時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、ハイブリドーマ上清または精製抗体をプレートに加えた。５分後に、５０μｌのビオチン化組換えヒトＯＸ４０Ｌを０．０４ｍｇ／ｍｌにて各ウェルに加えた。プレートをＲＴにて６０分間インキュベートし、次いでＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０で９回洗浄し、ＨＲＰ−ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を１：２０００の希釈で加えた。プレートをＲＴにて３０分間インキュベートし、ＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０で９回洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＡＧ、Ｒｅｉｎａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をプレートに加え、６分後にＨ2ＳＯ4を加えることにより反応を停止した。吸光度を次いで４５０ｎｍにてマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、ＵＳＡ；流通業者：ＷＩＴ
ＴＥＣ  ＡＧ、Ｌｉｔｔａｕ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で読み取った。図１Ｂは、キメラ１Ｄ４抗体がＯＸ４０とＯＸ４０Ｌとの間の相互作用を用量依存的様式で阻止できるが、キメラ２Ｆ８抗体はＯＸ４０とＯＸ４０Ｌとの間の相互作用を阻止できないことを示す。
【０１５７】
ヒト混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
２名の異なるドナーからの血液を、クエン酸塩を抗凝固剤として含む３本の１０ｍＬ  Ｓ−Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に回収した。ドナー第１号からの細胞をエフェクター細胞として用い、ドナー第２号からの細胞を標的細胞として用いた。２名のドナーからのＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を、製造者の使用説明に従って５０ｍＬ  Ｂｌｏｏｄ−Ｓｅｐ−Ｆｉｌｔｅｒチューブ（流通業者：Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて精製した。細胞を、ＦＢＳを含まないロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）培地で２回洗浄した。標的細胞を、５０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と３７℃にて３０分間インキュベートした。細胞を、次いで、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩで３回洗浄し、ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ、Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に１×１０6細胞／ｍＬにて再懸濁した。９６ウェルＵ底マイクロプレ
ート（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中に、５０’０００の標的細胞および８０’０００のエフェクター細胞を、各ウェルに１００μｌの最終容量で分配した。１００μｌの抗体希釈物をウェルに加えた。プレートを３７℃にて５％ＣＯ2インキュベータ中で７日間インキュベートした。ＭＬＲの開始の７日後に、０．５μＣ
ｉの3Ｈチミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で細胞をパルスした。パルスの１８時間
後に、細胞を採集し、取り込まれた放射活性を、Ｗａｌｌａｃベータカウンタで定量した。図２は、キメラ１Ｄ４抗体が陽性対照よりも高い程度までＭＬＲを用量依存的な様式で阻止できることを示す。
【実施例４】
【０１５８】
フローサイトメトリーによる、ヒトおよび他の動物種の活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）との抗ヒトＯＸ４０抗体の結合
ヒト細胞
ヒト白血球を含有するフィルタを、Ｌａ  Ｃｈａｕｘ−ｄｅ−Ｆｏｎｄｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄの血液採取センター（Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓａｎｇｕｉｎｅ  ｅｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  ｄｅ  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｅ、ｒｕｅ  Ｓｏｐｈｉｅ−Ｍａｉｒｅｔ  ２９、ＣＨ−２３００）から回収した。細胞を、１０Ｕ／ｍＬのリケミン（Ｄｒｏｓｓａｐｈａｒｍ  ＡＧ、Ｌｕｃｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有する６０ｍＬのＰＢＳを逆に流すことによりフィルタから取り出した。ＰＢＭＣを、次いで、製造者の使用説明に従って５０ｍＬ  Ｂｌｏｏｄ−Ｓｅｐ−Ｆｉｌｔｅｒチューブ（流通業者：Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて精製した。細胞を、ＦＢＳ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）を含むロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）培地で３回洗浄した。細胞を、３×１０6細胞／ｍｌにて、２４ウェルプレート（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗ
ｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で、ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）、２ｍＭウルトラグルタミン（Ｌｏｎｚａ、Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１０μｇ／ｍ
ｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）＋１００Ｕ／ｍＬのｒＨｕ  ＩＬ−２（プロリュウキン、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に再懸濁した。４８時間後に、細胞を回収し、以下に記載するようにしてフローサイトメトリーにより分析した。
【０１５９】
ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞（Ｔ急性リンパ性白血病株化細胞、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ
ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから）を、ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ中で培養した。２×１０5細胞を、９６ウェルＶ底プレート（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄ
ｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に分配し、１３００ｒｐｍにて３分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を回収し、以下に記載するようにしてフローサイトメトリーにより分析した。
【０１６０】
上記のようにして調製したＰＢＭＣおよびＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を、５μｇ／ｍＬのキメラ１Ｄ４抗体または５μｇ／ｍＬの適当なアイソタイプ対照を含む５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、１０％バーゼン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）、または２０μｌのＰＥ標識した市販の抗ヒトＯＸ４０抗体（クローンＬ１０６、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に再懸濁した。細胞を氷上で３０分間インキュベートし、２回洗浄し、５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。１／２００に希釈した抗ヒトＩｇＧ−フィコエリスリン−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、キメラ１Ｄ４抗体およびアイソタイプ対照抗体を検出した。細胞を氷上で１５分間インキュベートし、１回洗浄し、４００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ装置（Ｃｙａｎ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓ．Ａ．、Ｎｙｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で分析した。
【０１６１】
カニクイザル初代細胞
カニクイザルからの全血（Ｅｒｉｃ  Ｒｏｕｉｌｌｅｒ教授、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｒｉｂｏｕｒｇ、Ｆｒｉｂｏｕｒｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから得た）を、クエン酸塩チューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に回収した。２ｍＬのＰＢＳを３ｍＬの血液と混合し、混合物を、１０ｍｌの８５：１５のフィコール：ＰＢＳ混合物（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の頂部に重層した。試料を室温にて休止せずに２０分間遠心分離した。ＰＢＭＣ層を回収し、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を３×１０6
細胞／ｍＬにてダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）、１０％ＦＢＳ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）、非必須アミノ酸（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）、２ｍＭウルトラグルタミン（Ｌｏｎｚａ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に再懸濁した。１ｍＬの細胞懸濁液を２４ウェルプレート（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に分配し、１０ｕｇ／ｍｌのＰＨＡ（ＰＨＡ／Ｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、１００Ｕ／ｍＬのｒＨｕ  ＩＬ−２（プロリュウキン、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を加えた。細胞を５０時間、３７℃にて、５％ＣＯ2インキュベータ中でインキュベートした。活性化ＰＢＭＣ
を回収し、ＰＢＳ／２．５％ＦＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）に再懸濁した。５０μｌのＦＡＣ
Ｓ緩衝液中の５０００細胞を９６ウェルＶ底プレートに分配し、ビオチン化抗ヒトＯＸ４０−キメラ１Ｄ４抗体またはビオチン化アイソタイプ対照抗体またはビオチン化した、ヒツジで産生させた市販の抗ヒトＯＸ４０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をウェルに２５μｇ／ｍｌにて加えた。試料を氷上で２０分間インキュベートし、次いで、細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１：２０希釈でのストレプトアビジン−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と氷上で１５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、次いで、３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。２μｌの容量のヨウ化プロピジウム（ＰＩ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を各試料に加えて、死滅細胞を除外した。細胞を、フローサイトメトリーにより分析した（Ｃｙａｎ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓ．Ａ．、Ｎｙｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【０１６２】
図３Ａおよび３Ｂは、キメラ１Ｄ４抗体が、それぞれヒトおよびカニクイザル活性化リンパ球の表面上で発現されたＯＸ４０を認識でき、よって、薬物開発のために非常に所望される交差反応特性をもたらすことを示す。
【実施例５】
【０１６３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による、ヒトＯＸ４０受容体細胞外ドメインについてのキメラ１Ｄ４抗体の動的結合親和性定数
動的結合親和性定数（ＫＤ）を、プロテインＡ捕捉抗体上で、実施例１に記載するような組換えヒスチジンタグ付加ヒトＯＸ４０受容体細胞外ドメインを分析物として用いて測定した。測定は、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ−ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で室温にて行い、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ；ｖ４．１）を用いて分析した。
【０１６４】
ＣＭ５研究グレードセンサチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；ＢＲ−１０００−１４）を、３５μｌの１：１Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）／１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）溶液（ｖ／ｖ；５μｌ／分の流速；流路１および２にて）を注入することにより活性化した。プロテインＡ（ｒｅｆ．Ｐ７８３７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、酢酸緩衝液ｐＨ４．５（ＧＥ、ＢＲ−１００３−５０；ｐＩよりも１ｐＨ単位低い）中で５０μｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈し、その後、予め活性化したＣＭ５センサチップ上に、３５μｌを両方の流路１および２に注入することにより（５μｌ／分）（これは、およそ１５００応答単位（ＲＵ）に相当する）固定化した。プロテインＡ−ＣＭ５センサチップを、次いで、３５μｌのエタノールアミン溶液を注入することにより（５μｌ／分）不活性化した。最後に、１０μｌのグリシン溶液（ＧＥ、ｒｅｆ．ＢＲ−１００３−５４；１０ｍＭ；ｐＨ１．５）を２回注入して、架橋されていないプロテインＡ分子を遊離させた。
【０１６５】
親和性測定の前に、一定濃度の分析物を、一定量のプロテインＡ捕捉抗体上に異なる流速（５、１５、３０、５０、７５μｌ／分で２分間）注入することにより、物質移動限界試験を行った。異なる流速での会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）の傾きの分析が物質移動を示した。
【０１６６】
親和性測定のために、１×ＰＢＳ緩衝液中で貯蔵したキメラ１Ｄ４抗体を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ、ｒｅｆ．ＢＲ−１００１−８８；０．０１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ  ３ｍＭ、０．００５％サーファクタントＰ２０、ｐＨ７．４）中で１５ｎＭの最終濃度まで希釈した。１０μｌのこの希釈ストックを、続いて、プロテイ
ンＡ  ＣＭ５チップの流路２に、２００〜２５０ＲＵに達するまで注入した（３０μｌ／分）。この捕捉ステップの後に、組換えヒスチジンタグ付加ヒトＯＸ４０受容体細胞外ドメインを異なる濃度（５０ｎＭ〜０．４μＭ）にて流路１および２（流路１は参照として用いる）に３０μｌ／分の流速で注入した。それぞれの結合事象の後に、表面を、グリシン緩衝液ｐＨ１．５を１分間注入することにより（１０μｌ／分）再生した。
【０１６７】
測定（センサーグラム：ｆｃ２〜ｆｃ１）は、物質移動ありの２：１二価分析物モデルと最もよくフィットした。それぞれの測定の開始時のプロテインＡ捕捉抗体における実験的な変動を説明するために、Ｒｍａｘ値を全てのフィットにおいてローカルに設定した。解離時間は、少なくとも３００〜６００秒程度であった。測定を２重に行い、参照のためのゼロ濃度試料を含めた。カイ２値は、各点での実験データと参照データとの間の差の２乗和を表すが、残差のプロットは、フィットにおけるそれぞれの点の実験データと参照データとの間の差を示す。カイ２および残差の両方の値を用いて、実験データと個別の結合モデルとの間のフィットの質を評価した。
【０１６８】
測定を、プロテインＡセンサチップ上に固定化した捕捉キメラ１Ｄ４抗ヒトＯＸ４０抗体と、分析物としての組換えヒスチジンタグ付加ヒトＯＸ４０受容体細胞外ドメインとを用いて２重に行った。ＫＤ値は、カイ２値＜１．２５で９１から１１６ｎＭまでの間であった。
【実施例６】
【０１６９】
マウスモノクローナル抗体１Ｄ４のヒト化
ヒトアクセプターフレームワーク、逆突然変異ならびにヒトＣＤＲグラフト化アクセプターフレームワークの結合特性を実質的に保持および／または改善する変異の選択を含む、抗ヒトＯＸ４０マウス抗体１Ｄ４のヒト化について本明細書に記載する。
【０１７０】
再整形した可変領域の設計
相同性一致を用いて、１Ｄ４  ＣＤＲにグラフトするヒトアクセプターフレームワークを選択した。データベース、例えばヒトおよびマウスの免疫グロブリン遺伝子座からの生殖系列可変遺伝子のデータベース（ＩＭＧＴデータベース（ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰら、（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７（１）：２０９〜１２頁；Ｒｕｉｚ  Ｍら、（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（１）：２１９〜２１頁；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰ（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（１）：２０７〜９頁；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１）：３０７〜１０頁；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰら、（２００５）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（３）：１８５〜２０３頁；Ｋａａｓ  Ｑら、（２００７）Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＆  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、６（４）：２５３〜６４頁）もしくはＶＢＡＳＥ２（Ｒｅｔｔｅｒ  Ｉら、（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３、データベース版Ｄ６７１〜Ｄ６７４）もしくはＫａｂａｔデータベース（Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｇら、（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２１４〜２１８頁）または出版物（例えばＫａｂａｔ  ＥＡら、既出）を用いて、マウス重鎖および軽鎖Ｖ領域が属するヒトサブファミリーを同定し、アクセプター分子として用いるために最もよくフィットするヒト生殖系列フレームワークを決定できる。アクセプターとして用いるためのこれらのサブファミリー内での重鎖および軽鎖可変配列（ＶＨおよびＶＬ）の選択は、配列相同性および／またはグラフト後に６つのＣＤＲの適当な相対的提示を保存する助けとなるＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域の構造の一致に基づくことができる。
【０１７１】
例えば、ＩＭＧＴデータベースを用いることにより、１Ｄ４重鎖可変ドメインフレーム
ワークとヒト重鎖可変ドメインサブファミリー２のメンバーとの間の良好な相同性が示される。ＣＤＲおよびフレームワーク配列両方の最高の相同性および同一性は、生殖系列配列：ＩＧＨＶ２−７０*１０（配列番号１９）、ＩＧＨＶ２−７０*０１（配列番号２０）、ＩＧＨＶ２−７０*１３（配列番号２１）、ＩＧＨＶ２−５*０９（配列番号２２）およびＩＧＨＶ２−７０*１１（配列番号２３）について観察され、これらは全て、ＣＤＲ３
までの配列全体について７３％を超える配列同一性を有した。ＩＧＨＶ２−７０*１０、
ＩＧＨＶ２−７０*０１およびＩＧＨＶ２−７０*１３は、７４％の配列同一性を有し、ＩＧＨＶ２−５*０９およびＩＧＨＶ２−７０*１１は、それぞれ７３．５％および７３％の配列同一性を有する。
【０１７２】
同じアプローチを用いて、１Ｄ４軽鎖可変ドメイン配列は、ヒト軽鎖可変ドメインカッパサブファミリー３のメンバーと良好な相同性を示した。ＣＤＲおよびフレームワーク配列両方の最高の相同性および同一性は、生殖系列配列：ＩＧＫＶ３−１１*０１（配列番
号２４）（６５．３％同一）、ＩＧＫＶ１−３９*０１（配列番号２５）（６４．９％同
一）、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９*０１（配列番号２６）（６４．９％同一）、ＩＧＫＶ３−１
１*０２（配列番号２７）（６４．２％同一）およびＩＧＫＶ３−２０*０１（配列番号２８）（６２．５％同一）について観察された。
【０１７３】
ヒト化プロセスの開始点として、ヒトＩＧＨＶ２−７０*１０（配列番号１９）および
ＩＧＫＶ３−１１*０１（配列番号２４）可変ドメインを、１Ｄ４  ＣＤＲへのアクセプ
ターとして選択した。ＩＧＨＶ２−７０*１０は、フレームワーク１領域中での１Ｄ４と
の相同性が優れているので、他のヒト重鎖可変ドメインを超えて選択した。
【０１７４】
ヒトガンマ１アイソタイプの第１ヒト化抗体を調製した（以下を参照されたい）。抗体は、ヒト−マウスハイブリッド重鎖可変ドメインおよびヒト−マウスハイブリッド軽鎖可変ドメインを包含した。前記ハイブリッド重鎖可変ドメインは、生殖系列ＣＤＲ１および２がそれぞれ１Ｄ４重鎖ＣＤＲ１および２を置き換えているヒト重鎖可変ドメインＩＧＨＶ２−７０*１０に基づいた。ヒトアクセプターフレームワークと最良に一致するＪＨセ
グメント配列を、上記のＩＭＧＴ検索から同定した。ヒトＩＧＨＶ２−７０*１０フレー
ムワーク領域、１Ｄ４マウスＣＤＲおよびヒトアクセプターと最良に一致するＪＨを有する、得られたヒト−マウスハイブリッド重鎖可変配列を、本明細書において、配列番号２９を有する重鎖可変ドメインＶＨ１という。同様に、この第１ヒト化抗体候補について用いたヒト−マウスハイブリッド軽鎖可変ドメインは、ヒトＩＧＫＶ３−１１*０１フレー
ムワーク領域、１Ｄ４マウスＣＤＲおよびヒトアクセプターと最良に一致するＪＫを有し、本明細書において、配列番号３０を有する軽鎖可変ドメインＶＬ１という。ＶＨ１およびＶＬ１を包含する第１ヒト化抗体は、本明細書において、ＶＨ１／ＶＬ１抗体と略記する。
【０１７５】
第１ヒト化抗体プロトタイプの生成
ＶＨ１およびＶＬ１についてのコードＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）を、ｓｃＦｖフォーマットにおいてＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成して、そのことにより、単一ＤＮＡ配列が両方の可変ドメイン（配列番号３１）を包含することを可能にした。個別の可変ドメインｃＤＮＡは、このｓｃＦｖ構築物からＰＣＲにより引き出し、ＰＣＲアセンブリ技法を用いて、それらのそれぞれの定常ドメインｃＤＮＡ配列（複数可）の上流でさらに組み立てた。最後に、完全重鎖および軽鎖ｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを有する改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）に基づく独立ベクターにライゲーションした。軽鎖特異的ベクターは、対象の軽鎖可変ドメインｃＤＮＡをカッパ軽鎖定常ドメインｃＤＮＡの前にＢａｍＨＩおよびＢｓｉＷＩ制限酵素部位を用いてライゲーションすることにより、ヒトカッパアイソタイプ軽鎖の発現を可能にしたが、重鎖特異
的ベクターは、工学改変して、対象の重鎖可変ドメインｃＤＮＡを、ヒトＩＧＨＧ１  ＣＨ１、ＩＧＨＧ１ヒンジ領域、ＩＧＨＧ１  ＣＨ２およびＩＧＨＧ１  ＣＨ３定常ドメインをコードするｃＤＮＡ配列の前に、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限酵素部位を用いてライゲーションできるようにした。重鎖および軽鎖両方の発現ベクターにおいて、分泌は、ＢａｍＨＩ部位を含有するマウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドにより駆動した。ＢｓｉＷＩ制限酵素部位は、カッパ定常ドメイン中にあり、ＳａｌＩ制限酵素部位は、ＩＧＨＧ１  ＣＨ１ドメイン中で見出される。
【０１７６】
ＶＨ１／ＶＬ１抗体は、等量の重鎖および軽鎖ベクターを懸濁馴化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）カタログ番号：ＣＲＬ−１０８５２）にポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて同時トランスフェクトすることにより一過的に生成した。典型的に、１ｍｌあたり０．８〜１．２百万細胞の密度の１００ｍｌの懸濁された細胞に、５０μｇの重鎖をコードする発現ベクターと５０μｇの軽鎖をコードする発現ベクターとを含有するＤＮＡ−ＰＥＩ混合物をトランスフェクトする。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが宿主細胞に導入されると、細胞を４〜５日の期間さらに培養して、０．１％プルロニック酸、４ｍＭグルタミンおよび０．２５μｇ／ｍｌジェネテシンを補った培養培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ２９３、ＨＥＫ２９３血清フリー培地；Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）への分泌を可能にすることにより、抗体を生成する。
【０１７７】
ＶＨ１／ＶＬ１抗体を、無細胞上清から、組換えプロテインＡストリームライン媒体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて精製し、アッセイの前にリン酸塩緩衝食塩水に緩衝液交換した。ヒトＯＸ４０との結合を、実施例５に記載するようにしてＳＰＲにより測定した。
【０１７８】
グラフト化ヒトフレームワークの逆突然変異
１Ｄ４マウス抗体からのＣＤＲの単純なグラフト化によりヒトＯＸ４０と結合しない候補が得られたので（表６および図４）、ヒト残基がマウス残基で置換される突然変異誘発を開始した。このプロセスは逆突然変異とよばれ、モノクローナル抗体のヒト化において最も予測不可能な手順である。これは、親和性を保存し、同時にヒト化抗体における免疫原性の可能性を最小限にするために、保持する必要があるマウス抗体からの重要なフレームワーク残基の同定および選択を必要とする。表７、表８および図５は、マウス抗体フレームワークとヒト抗体フレームワークとの間で異なる残基（Ｋａｂａｔ番号付け）を示す。ＣＤＲの高次構造または可変ドメイン間充填に影響し得る残基は、抗体親和性に最も高い影響を与え得るので、特に興味の対象である。
【０１７９】
ＣＤＲ高次構造および／または可変ドメイン間充填に最も影響を与え得る残基を同定するために、可変ドメインのＶＨ１−ＶＬ１対の３Ｄモデルを、自動化モードに設定した構造相同性モデル化サーバＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ（Ａｒｎｏｌｄ  Ｋら、（２００６）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２２（２）：１９５〜２０１頁；ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）を用いて算出した。モデル分析により、ＣＤＲ領域および／または重鎖−軽鎖可変ドメイン充填に対する影響の推定に基づく位置の部分集合を選択できた。この位置の部分集合は、可変重鎖位置：２３、３５ｂ、４８、５０、６０および６２、ならびに可変軽鎖位置：１、３３、３４、４６、４７、５４、５６および７１（Ｋａｂａｔ番号付け）からなった。これらの逆突然変異に加えて、ＶＨ１／ＶＬ１抗体中で見出された軽鎖位置Ｙ３１は、いくつかの候補において欠失していた。
【０１８０】
重鎖および軽鎖置換の様々な組み合わせに基づくさらなるヒト化候補を、ＶＨ１／ＶＬ１抗体配列の関係において、標準的な突然変異誘発および上記の方法を用いて調製した。ヒト化抗体候補を、それらの結合親和性について、実施例５に記載するようにしてＳＰＲ
によりアッセイした。
【０１８１】
これらの単一または組み合わせ置換に基づくヒト化抗体のいくつかの生成収率および結合特性を、表６に示す。示した２８の抗体のうち、９つの候補はヒトＯＸ４０に対する結合を全く示さず、９つの別の群は結合が乏しかった。ＶＬ９に基づくヒト化抗体は、ＳＰＲにより、ヒトＯＸ４０との弱い結合を最も一貫して示した。２つの抗体、ＶＨ６／ＶＬ９およびＶＨ７／ＶＬ９だけが、ヒトＯＸ４０との良好な結合を示した。これらの両方のヒト化抗体は、可変重鎖位置：２３、３５ｂ、５０、６０および６２ならびに可変軽鎖位置：３３、３４、４６、４７および７１（Ｋａｂａｔ番号付け）にて逆突然変異を有した。これらの逆突然変異に加えて、ＶＨ６／ＶＬ９およびＶＨ７／ＶＬ９はともに、軽鎖位置３１の除去により利益を受けていた。驚くべきことに、ＶＨ７／ＶＬ９は、１Ｄ４キメラ抗体およびＶＨ６／ＶＬ９バリアントよりも、ヒトＯＸ４０についての親和性が改善されていた。これらのヒト化抗体の結合親和性を、表９にまとめる。
【０１８２】
示差走査熱量分析による、選択されたヒト化抗ＯＸ４０抗体の耐熱性
ヒト化抗体の耐熱性を、示差走査熱量分析（ＤＳＣ）を用いて測定した。モノクローナル抗体融解プロファイルは、それらのアイソタイプの特徴である（Ｇａｒｂｅｒ  ＥおよびＤｅｍａｒｅｓｔ  ＳＪ（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３５５：７５１〜７頁）が、ＦＡＢ断片の中間融解温度は、全長ＩｇＧの関係においてさえ容易に同定できる。ＦＡＢ部分のこのような中間融解温度を用いて、ヒト化候補のモノクローナル安定性をモニタリングした。
【０１８３】
熱量測定を、ＶＰ−ＤＳＣ示差走査微小熱量計（ＭｉｃｒｏＣａｌ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＵＫ）で行った。セル容量は０．１２８ｍｌであり、加熱速度は２００℃／ｈであり、過圧は６５ｐ．ｓ．ｉに維持した。全ての抗体を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１ｍｇ／ｍｌの濃度にて用いた。抗体のモル熱容量は、抗体を除いた同一の緩衝液を含有する２重の試料との比較により見積もった。部分モル熱容量および融解曲線を、標準的な手順を用いて分析した。サーモグラムをベースライン補正し、濃度を標準化した後に、ソフトウェアＯｒｉｇｉｎ  ｖ７．０において非２状態モデルを用いてさらに分析した。
【０１８４】
ヒト化バリアントＶＨ６／ＶＬ９  ＦＡＢ断片は、７６．３℃の単一の移行とともに、密に折りたたまれたＦＡＢ断片について通常観察される協同的アンフォールディングと一貫する形状および振幅を示し、工学改変プロセスが、ＦＡＢ安定性をうまく保持したことを示した。全体的に、ヒト化バリアントは、良好な熱安定性を示した。
【０１８５】
【表６】
2018093869.tif 000007
【０１８６】
【表７】
2018093869.tif 000008
【０１８７】
【表８】
2018093869.tif 000009
【０１８８】
【表９】
2018093869.tif 000010
【実施例７】
【０１８９】
ヒト化抗ＯＸ４０抗体のエピトープ特徴決定。
ヒト化抗ＯＸ４０抗体のエピトープの特徴を決定するために、ＶＨ６／ＶＬ９抗体を、様々なヒト−ラットＯＸ４０キメラタンパク質を用いて、ヒトＯＸ４０細胞外領域の規定されたドメインにマッピングした。
【０１９０】
ヒト−ラットＯＸ４０キメラタンパク質の調製およびＥＬＩＳＡ
ラットおよびヒト−ラットＯＸ４０タンパク質を、実施例１に記載した方法に従ってＦｃ融合タンパク質としてフォーマットした。ＥＬＩＳＡのために、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬのＯＸ４０タンパク質で、４℃にて１晩、高結合９６ウェルプレート（Ｃｏａｓｔａｒ）
を被覆した。プレートを、ＰＢＳ２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした後に、ＶＨ６／ＶＬ９抗体またはアイソタイプ対照抗体とインキュベートした。プレートを、次いで、洗浄し、ヤギ−抗ヒトＩｇ  Ｆ（ａｂ’）２断片特異的−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、ＵＫ）とインキュベートした。洗浄の後に、プレートをＴＭＢ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＡＧ、Ｒｅｉｎａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）とインキュベートして、抗体結合を明らかにした。反応を、２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を加えることにより停止し、光学密度を４５０ｎＭ（ＯＤ  ４５０ｎＭ）にて、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ２分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ、ＵＳＡ；流通業者：ＷＩＴＴＥＣ  ＡＧ、Ｌｉｔｔａｕ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で読み取った。
【０１９１】
結果
その起源に関係なく、ＯＸ４０細胞外領域は、ドメイン１、２、３および４とよばれる４つの構造モジュールに分けられている（Ｃｏｍｐａａｎ  ＤＭおよびＨｙｍｏｗｉｔｚ
ＳＧ（２００６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１４（８）：１３２１〜３０頁）。ヒトＯＸ４０の細胞外領域（ヒトＴＮＦＲＳＦ４のアミノ酸２９〜２１４、番号付けはＵｎｉｐｒｏｔ  Ｐ４３４８９配列に従う）に対応するキメラＯＸ４０タンパク質を、４つのドメインの１または複数をヒト配列とラット配列との間で交換することにより構築した。例えば、キメラＲＨＲＲ  ＯＸ４０タンパク質は、第２ドメインが対応するヒトドメイン配列で置き換えられたラットＯＸ４０細胞外領域に対応する。
【０１９２】
結合ＥＬＩＳＡを行って、ヒトＯＸ４０細胞外領域（配列番号１１を有するＨＨＨＨと略記する）、ラットＯＸ４０細胞外領域（配列番号５２を有するＲＲＲＲと略記する）ならびに４つのヒト−ラットキメラタンパク質：ＲＨＲＲ（配列番号５３）、ＨＲＲＲ（配列番号５４）、ＨＨＲＲ（配列番号５５）およびＲＲＨＨ（配列番号５６）に対するＶＨ６／ＶＬ９抗体の反応性を試験した。このＥＬＩＳＡの結果を図７に示す。このエピトープマッピング実験の必要条件として、ＶＨ６／ＶＬ９抗体は、ヒトＯＸ４０タンパク質との結合を示したが、ラットＯＸ４０タンパク質との結合を示さなかった。これは、ラットＯＸ４０との交差反応性がないことを示す。ＶＨ６／ＶＬ９抗体がＲＨＲＲおよびＨＨＲＲと結合したが、ＨＲＲＲまたはＲＲＨＨと結合しなかったことがわかり、ＶＨ６／ＶＬ９エピトープが、ヒトＯＸ４０細胞外領域の第２ドメイン内にマッピングされることを示した。
【実施例８】
【０１９３】
ＶＨ６／ＶＬ９抗体は、死滅および阻止機序によりヒト混合リンパ球反応を阻止する
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫反応を抑制するＶＨ６／ＶＬ９抗体の効力を、１方向同種混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において試験した。ＭＬＲは、アロ反応性Ｔ細胞活性化および増殖のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルである（Ｏ’Ｆｌａｈｅｒｔｙ  Ｅら、（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１００（３）：２８９〜９９頁；ＤｕＰｏｎｔ  ＢおよびＨａｎｓｅｎ  ＪＡ（１９７６）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１０７〜２０２頁）。２名の無関係のドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を混合した場合に、Ｔ細胞は、同種主要組織適合性（ＭＨＣ）分子の認識により活性化される。この活性化は、Ｔリンパ球の増殖をもたらす。ＭＬＲ反応は、Ｔ細胞標的化免疫抑制薬の効果を実証するために広く用いられている（Ｂｒｏｍｅｌｏｗ  ＫＶら、（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４７（１〜２）：１〜８頁）。シクロスポリンのような免疫抑制薬は、Ｔ細胞活性化を阻害することにより主に働く。ＶＨ６／ＶＬ９抗体による阻止効果を試験することに加えて、ＭＬＲの阻害に対する抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）のような細胞傷害性機序の寄与も調べた。ＶＨ６／ＶＬ９抗体の３つの異なる抗体フォーマット：ＩＧＨＧ１フォーマット（本明細書においてＶＨ６／ＶＬ９という）、非フコシル化ＩＧＨＧ１（ＩｇＧ１）フォーマット（本明細書において非フコシル化ＶＨ６／ＶＬ９という）およびＩＧＨＧ
４（ＩｇＧ４）フォーマット（本明細書においてＶＨ６／ＶＬ９  ＩＧＨＧ４  Ｓ２２８Ｐという）を、このアッセイにおいて試験した。ＩＧＨＧ１（ＩｇＧ１）抗体は、ＡＤＣＣのような細胞傷害作用機序について有能であることが知られている。非フコシル化ＩＧＨＧ１抗体は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）のような細胞傷害性細胞上で発現されるＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性がより高いので、ＡＤＣＣ活性の増進を示すことが知られている（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  Ｔら、（２０１１）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ、１６（１１）：１０７１〜８０頁）。対照的に、ＩＧＨＧ４（ＩｇＧ４）抗体は、ＡＤＣＣのようなＦｃ媒介性細胞傷害作用機序を有さないことが知られている。
【０１９４】
ＶＨ６／ＶＬ９抗体のフォーマット化
ＩＧＨＧ１  ＣＨ１、ＩＧＨＧ１ヒンジ領域、ＩＧＨＧ１  ＣＨ２およびＩＧＨＧ１  ＣＨ３定常ドメインをコードするｃＤＮＡ配列を、実施例６に記載する重鎖特異的ベクター中のＩＧＨＧ４  ＣＨ１、Ｓ２２８Ｐ置換を有するＩＧＨＧ４ヒンジ領域、ＩＧＨＧ４
ＣＨ２およびＩＧＨＧ４  ＣＨ３定常ドメインをコードするｃＤＮＡ配列で置き換えることにより、置換Ｓ２２８Ｐを有するＩＧＨＧ４免疫グロブリンフォーマット化を達成した。置換Ｓ２２８Ｐは、ヒトＩＧＨＧ４重鎖ｃＤＮＡ鋳型に、標準的なＰＣＲ突然変異誘発技法により導入した。得られた重鎖は、配列番号５７を有する。非フコシル化ＶＨ６／ＶＬ９  ＩＧＨＧ１抗体の生成は、ＷＯ２０１０／０９５０３１パンフレットの実施例１４に記載するプロトコールに従った。
【０１９５】
混合リンパ球反応
２名の異なるヒトドナーからの血液を、抗凝固剤としてクエン酸塩を含む３本の１０ｍＬ  Ｓ−Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に回収した。２名のヒトドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造者の使用説明に従って５０ＭＬ  Ｂｌｏｏｄ−Ｓｅｐ−Ｆｉｌｔｅｒチューブ（流通業者：Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて精製した。細胞を、ＦＢＳを含まないロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）培地で２回洗浄した。２名のドナーからの刺激細胞を、５０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）との３７℃にて３０分間のインキュベーションにより調製した。細胞を、次いで、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩで３回洗浄し、ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ、Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に１×１０6細胞／ｍＬにて再懸濁し
た。レスポンダー細胞を、９６ウェルＵ底マイクロプレート（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中でＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン中に再懸濁した。５０’０００の刺激細胞および８０’０００のレスポンダー細胞を、各ウェルに１００μｌの最終容量で分配した。１００μｌの抗体希釈物（または培地のみ）をウェルに加えた。プレートを３７℃にて５％ＣＯ2インキュベータ中で７日間インキュベートした。最後の１
８時間、０．５μＣｉの3Ｈチミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｂａｓｅｌ  Ｓｗｉ
ｔｚｅｒｌａｎｄ）で細胞をパルスした。細胞をフィルタマットフィルタ（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ）上に採集し、取り込まれた放射活性を、Ｗａｌｌａｃベータカウンタ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で定量した。
【０１９６】
結果
図８に示す結果は、ＶＨ６／ＶＬ９抗体が、２名の異なる個体（レスポンダー）についてのＭＬＲを、およそ１００ｎｇ／ｍＬのＥＣ50値で効率的に阻害できることを実証する。結果は、用いる抗体フォーマットに依存して異なる応答も示し、阻止および細胞傷害性
機序の寄与における差が、異なる個体からのＭＬＲにおいて観察される。
【０１９７】
レスポンダー１からのＴ細胞の反応性（図８Ａ）は、ＩＧＨＧ１およびＩＧＨＧ４フォーマットにより効率的に阻害され、このことは、細胞傷害性機序が、レスポンダー１にとって重要でないことを示す。対照的に、ＩＧＨＧ４フォーマットは、レスポンダー２からのＭＬＲを高濃度にて乏しく阻止できただけであり（図８Ｂ）、より低い濃度にてその効果を非常に迅速に喪失したが、ＩＧＨＧ１フォーマットは、６０％を超える阻害を達成でき、このことは、レスポンダー２について、死滅機序が、阻害効果のほとんどの原因であることを意味した。
【０１９８】
作用形態におけるこの差は、ＭＬＲ反応におけるＴ細胞の活性化、増殖および生存が、アレルゲン性の反応性およびおそらく他の共刺激シグナルの程度に依存して、個体間のＯＸ４０共刺激シグナルに様々に依存するという事実により生じる可能性がある。ＯＸ４０由来共刺激シグナルに乏しく依存する個体について、ＡＤＣＣ機序による活性化Ｔ細胞の除外は、ＶＨ６／ＶＬ９の作用の主な機序である。
【０１９９】
驚くべきことに、非フコシル化ＩＧＨＧ１フォーマットは、両方のレスポンダーについてのＭＬＲを阻害する非常に有効な能力を提示した。この観察は、阻止機序がＭＬＲの阻害を達成するために十分であったとしても、死滅機序の付加または増進は、抗ＯＸ４０抗体の阻害効果を改善するという事実を強調する。このような増進は、患者のＯＸ４０共刺激状態に関係なく、例えば患者のＯＸ４０発現レベルが低い場合に、ＯＸ４０媒介性障害を処置するときに特に有用である。
【実施例９】
【０２００】
ＶＨ６／ＶＬ９抗体は、異種間移植片対宿主疾患を阻止する
異種間移植片対宿主（ＧＶＨ）反応は、ヒト患者における骨髄移植後に観察される同種間移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）についてのモデルである。ＧＶＨ反応は、同種または異種ＭＨＣ認識の結果として宿主環境を攻撃する、グラフト化免疫細胞により媒介される急性免疫応答である（Ｍｕｒｐｈｙ  ＷＪら、（１９９６）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（４）：２３３〜４１頁）。Ｔリンパ球は、ＧＶＨ反応の主なエフェクター細胞である。ＶＨ６／ＶＬ９抗体の免疫抑制効力を、ヒトＰＢＭＣを用いるＳＣＩＤマウスの再構築に基づく異種ＧＶＨＤモデルにおいて試験した。このモデルでは、ヒトＰＢＭＣおよび主にＴリンパ球が、マウス宿主細胞に対して強い応答を開始する。この反応は、特に、体重減少を伴う重度の皮膚および腸の炎症を導く。このモデルの最も適当な読出しは、動物の生存である。
【０２０１】
方法
動物（ＳＣＩＤマウス）を、致死量以下で照射した後に、３０百万のヒトＰＢＭＣを用いて腹腔内で再構築した。また、ＴＭベータ１抗体を週２回注射することにより、マウスＮＫ細胞をマウスから枯渇させた。ＶＨ６／ＶＬ９抗体、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）または媒体を用いる処置を、毎週５回の連続する用量をｉ．ｖ．で与え、ＰＢＭＣ注射の２日前に開始した。動物は、媒体（ＰＢＳ）、または１０ｍｇ／ｋｇもしくは１ｍｇ／ｋｇのＶＨ６／ＶＬ９抗体、または８ｍｇ／ｋｇのＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（ヒトＩｇＧ１のＦｃ成分と融合したヒト可溶性ＴＮＦ受容体２の融合タンパク質、Ａｍｇｅｎ−Ｐｆｉｚｅｒ）のいずれかで処置した。動物を、体重減少、下痢、毛皮の外観および全体的な挙動を含むＧＶＨＤ症状について毎週３回確認して評点した。症状が重度すぎると考えられるならば、動物を道徳的に屠殺した。
【０２０２】
結果
図９は、ＶＨ６／ＶＬ９抗体が、より低い１ｍｇ／ｋｇ用量であっても、ＧＶＨＤ反応
を非常に有力に抑制したことを示す。驚くべきことに、ＶＨ６／ＶＬ９抗体は、ヒトにおけるＧＶＨＤについての認識された治療であるＥｎｂｒｅｌ（登録商標）を超える、改善された効力を示した（Ｘｈａａｒｄ  Ａら、（２０１１）Ｂｕｌｌ．Ｃａｎｃｅｒ、９８（８）：８８９〜９９頁；Ｓｉｍｐｓｏｎ  Ｄ（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．２（７）：１１０９〜１７頁）。１または１０ｍｇ／ｋｇのＶＨ６／ＶＬ９抗体で処置した動物の生存時間中央値は、媒体処置群（表１０）と比較して４倍長く、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）と比較して２倍長かった。さらに、この結果は、ＶＨ６／ＶＬ９抗体が、アゴニスト活性を有さないことを強調する。なぜなら、アゴニスト性抗ＯＸ４０抗体は、同種マウスＧＶＨＤモデルにおいてＧＶＨＤを悪化させると報告されているが（Ｖａｌｚａｓｉｎａ  Ｂら、（２００５）Ｂｌｏｏｄ、１０５（７）：２８４５〜５１頁；Ｂｌａｚａｒ  ＢＲら、（２００３）Ｂｌｏｏｄ、１０１（９）：３７４１〜８頁）、この事象は本研究で観察されなかったからである。
【０２０３】
【表１０】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【配列表】
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