(57)【要約】【課題】被検出物質の検出キットおよびそれを備えた検出システムにおいて、被検出物質を高精度に検出する。【解決手段】検出キット１００は、試料に含まれる可能性がある被検出物質を検出光により検出する。検出キット１００は、検出光を透過する基板１３１と、基板１３１上に配置された金属薄膜１３２と、金属薄膜１３２上に配置された導電性ポリマー膜１３３とを備える。金属薄膜１３２および導電性ポリマー膜１３３には、各々の直径が検出光の波長よりも小さい複数の貫通孔１３５が周期的に形成されている。導電性ポリマー膜１３３は、各々が複数の貫通孔１３５のうちの対応する貫通孔につながる複数の窪みを有する。複数の窪みの各々の内壁面１３６は、球欠状の窪みであるボウル型構造を形成する。検出キット１００は、金属からなり、ボウル型構造内の少なくとも一部分に配置された金属薄膜１３４をさらに備える。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれる可能性がある被検出物質を検出光により検出する、被検出物質の検出キットであって、
基板と、
金属からなり、前記基板上に配置された第１の薄膜と、
各々の内壁面がボウル型構造を形成する複数の窪みを有し、前記第１の薄膜上に配置された第２の薄膜と、
金属からなり、前記ボウル型構造内の少なくとも一部分に配置された第３の薄膜とを備える、被検出物質の検出キット。
【請求項２】
前記ボウル型構造は、半球状よりも深い球欠状の窪みであり、
前記ボウル型構造の直径は、前記検出光の波長と同程度である、請求項１に記載の被検出物質の検出キット。
【請求項３】
前記検出光は、可視域から近赤外域までの波長範囲の光であり、
前記ボウル型構造の直径は、ナノメートルオーダーであり、
前記第１および第２の薄膜には、前記複数の窪みの配列によるナノホールアレイが形成されている、請求項２に記載の被検出物質の検出キット。
【請求項４】
前記基板は、前記検出光を透過する材料からなり、
前記ボウル型構造は、球欠状およびロッド状のうちのいずれかの窪みであり、
前記第１の薄膜には、各々が前記複数の窪みのうちの対応する窪みにつながる複数の貫通孔が周期的に形成されており、
前記複数の貫通孔の各々の直径は、前記検出光の波長よりも小さい、請求項１に記載の被検出物質の検出キット。
【請求項５】
前記検出光は、可視域から近赤外域までの波長範囲の光であり、
前記複数の貫通孔の各々の直径は、ナノメートルオーダーであり、
前記第１および第２の薄膜には、前記複数の窪みの配列によるナノホールアレイが形成されている、請求項４に記載の被検出物質の検出キット。
【請求項６】
前記複数の窪みは、ハニカム状に配列されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の被検出物質の検出キット。
【請求項７】
前記ボウル型構造は、前記被検出物質の少なくとも一部を収容可能に構成されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の被検出物質の検出キット。
【請求項８】
前記ボウル型構造は、前記被検出物質を特異的に付着可能なホスト物質により修飾されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の被検出物質の検出キット。
【請求項９】
前記第２の薄膜は、導電性ポリマーからなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の被検出物質の検出キット。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の検出キットと、
前記検出光を発する光源と、
前記検出光による前記検出キットの光応答スペクトルを測定することが可能に構成された分光器と、
前記光応答スペクトルに基づいて前記被検出物質を検出する検出装置とを備える、被検出物質の検出システム。
【請求項１１】
前記検出装置は、前記透過スペクトルにおける前記検出光の異常透過を示すスペクトル成分の変化に基づいて前記被検出物質を検出する、請求項１０に記載の被検出物質の検出システム。
【請求項１２】
前記ボウル型構造の開口部における電場を局所的に増強させる、前記検出光とは異なる波長の光を発する他の光源と、
前記光源および前記他の光源を制御する制御装置をさらに備え、
前記制御装置は、前記検出光を発するように前記光源を制御するのに先立ち、前記異なる波長の光を発するように前記他の光源を制御する、請求項１０または１１に記載の被検出物質の検出システム。
【請求項１３】
試料に含まれる可能性がある被検出物質を検出光により検出するための被検出物質の検出キットの製造方法であって、
基板上に金属により第１の薄膜を形成するステップと、
前記第１の薄膜上に複数の微粒子を周期的に配列させるステップと、
前記複数の微粒子の各々の表面の一部が露出するように第２の薄膜を形成するステップと、
前記複数の微粒子を溶液により除去することで、前記第２の薄膜の表面に各々がボウル型構造を形成する複数の窪みを形成するステップと、
各前記複数のボウル型構造内の少なくとも一部分に金属により第３の薄膜を形成するステップとを含む、被検出物質の検出キットの製造方法。
【請求項１４】
前記ボウル型構造は、半球状よりも深い球欠状の窪みであり、
前記ボウル型構造の直径は、前記検出光の波長と同程度である、請求項１３に記載の被検出物質の検出キットの製造方法。
【請求項１５】
前記基板は、前記検出光を透過する材料からなり、
前記ボウル型構造は、球欠状およびロッド状のうちのいずれかの窪みであり、
前記被検出物質の検出キットの製造方法は、
各々の直径が前記検出光の波長よりも小さく、かつ、各々が前記複数のボウル型構造のうちの対応するボウル型構造から前記第１の薄膜を貫通して前記基板に達する複数の貫通孔を形成するステップをさらに含む、請求項１３に記載の被検出物質の検出キットの製造方法。
【請求項１６】
前記配列させるステップは、前記複数の微粒子の自己組織化を利用して前記複数の微粒子をハニカム状に配列させるステップを含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の被検出物質の検出キットの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、被検出物質の検出キットおよびそれを備えた検出システム、ならびに、被検出物質の検出キットの製造方法に関し、より特定的には、試料に含まれる可能性がある被検出物質を検出光により検出するための検出キットおよびそれを備えた検出システム、ならびに、上記検出キットの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、たとえば医療診断や食品検査の分野において、ウイルスまたは細菌等の被検出物質を迅速かつ高精度に検出するための技術開発が進められている。様々な原理に基づく検出技術が開発されているなかで、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Surface  Plasmon  Resonance）を利用した技術に対する関心が高まっている。
【０００３】
詳細は後述するが、金属薄膜上に複数の微小な貫通孔が周期的に配列された構造体（いわゆるナノホールアレイ）に、各貫通孔の直径（孔径）よりも長波長の検出光を照射すると、表面プラズモン共鳴に起因する光の透過が生じる。この現象は、「異常透過」とも呼ばれる。検出光の照射下で被検出物質が金属薄膜に付着すると、被検出物質が金属薄膜に付着していない状態と比べて、検出光の透過スペクトルが変化する。よって、異常透過を示すスペクトル成分の変化（たとえばピーク波長のシフト量）に基づいて、被検出物質を検出することができる。
【０００４】
たとえば非特許文献１は、乱雑なナノ突起構造（ランダムナノスパイク）が形成された金属薄膜を備えた検出キットを開示する。ランダムナノスパイクに検出光を照射すると、ナノスパイクの先端部分に表面プラズモンが局在する。この現象を利用することで、ランダムナノスパイクが形成されていない場合と比べて、被検出物質（非特許文献１ではウイルス）が検出キットに付着した場合の透過スペクトルのピーク波長のシフト量を最大で約２倍増加させることが可能であることが非特許文献１に記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Takayasu  Yoshikawa、  Mamoru  Tamura、  Shiho  Tokonami、  and  Takuya  Iida、  "Optical  Trap-Mediated  High-Sensitivity  Nanohole  Array  Biosensors  with  Random  Nanospikes"、  The  Journal  of  Physical  Chemistry  Letters、  8、  370-374(2017)
【非特許文献２】Si  Hoon  Lee、  Kyle  C.  Bantz、  Nathan  C.  Lindquist、  Sang-Hyun  Oh、  and  Christy  L.  Haynes、  "Self-Assembled  Plasmonic  Nanohole  Arrays"、  Langmuir  Article  25、  13685-13693(2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１によれば、ランダムナノスパイクを形成することで被検出物質の検出精度（検出感度）を向上させることができる。しかし、検出精度を一層向上させるための技術に対する要望は常に存在する。
【０００７】
また、検出キットの製造においては一般に、ナノホールなどの微小な構造を高精度に形成することが求められる。そのため、フォトリソグラフィまたは電子線リソグラフィなどの精密加工技術が用いられることが多い。しかしながら、これらの精密加工技術には高価な加工装置が必要であるため、検出キットの製造コストが高くなってしまう。よって、より安価に検出キットを製造可能な技術が望まれる。
【０００８】
本開示は上記課題を解決するためになされたものであって、その目的は、被検出物質の検出キットおよびそれを備えた検出システムにおいて、被検出物質を高精度に検出可能な技術を提供することである。また、本開示の他の目的は、被検出物質の検出キットを安価に製造可能な製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（１）本開示のある局面に従う被検出物質の検出キットは、試料に含まれる可能性がある被検出物質を検出光により検出する。被検出物質の検出キットは、基板と、第１〜第３の薄膜とを備える。第１の薄膜は、金属からなり、基板上に配置される。第２の薄膜は、各々の内壁面がボウル型構造を形成する複数の窪みを有し、第１の薄膜上に配置される。第３の薄膜は、金属からなり、ボウル型構造内の少なくとも一部分に配置される。
【００１０】
（２）好ましくは、ボウル型構造は、半球状よりも深い球欠状の窪みである。ボウル型構造の直径は、検出光の波長と同程度である。
【００１１】
（３）より好ましくは、検出光は、可視域から近赤外域までの波長範囲の光である。ボウル型構造の直径は、ナノメートルオーダーである。第１および第２の薄膜には、複数の窪みの配列によるナノホールアレイが形成されている。
【００１２】
（４）好ましくは、基板は、検出光を透過する材料からなる。ボウル型構造は、球欠状およびロッド状のうちのいずれかの窪みである。第１の薄膜には、各々が複数の窪みのうちの対応する窪みにつながる複数の貫通孔が周期的に形成されている。複数の貫通孔の各々の直径は、検出光の波長よりも小さい。
【００１３】
（５）より好ましくは、検出光は、可視域から近赤外域までの波長範囲の光である。複数の貫通孔の各々の直径は、ナノメートルオーダーである。第１および第２の薄膜には、複数の窪みの配列によるナノホールアレイが形成されている。
【００１４】
（６）好ましくは、複数の窪みは、ハニカム状に配列されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の被検出物質の検出キット。
【００１５】
（７）好ましくは、ボウル型構造は、被検出物質の少なくとも一部を収容可能に構成されている。
【００１６】
（８）好ましくは、ボウル型構造は、被検出物質を特異的に付着可能なホスト物質により修飾されている。
【００１７】
（９）好ましくは、第２の薄膜は、導電性ポリマーからなる。
（１０）本開示の他の局面に従う被検出物質の検出システムは、上記検出キットと、検出光を発する光源と、検出光による検出キットの光スペクトルを測定することが可能に構成された分光器と、光スペクトルに基づいて被検出物質を検出する検出装置とを備える。
【００１８】
（１１）好ましくは、検出装置は、透過スペクトルにおける検出光の異常透過を示すスペクトル成分の変化に基づいて被検出物質を検出する。
【００１９】
（１２）好ましくは、被検出物質の検出システムは、ボウル型構造の開口部における電場を局所的に増強させる、検出光とは異なる波長の光を発する他の光源と、上記光源および上記他の光源を制御する制御装置をさらに備える。制御装置は、検出光を発するように上記光源を制御するのに先立ち、上記異なる波長の光を発するように上記他の光源を制御する。
【００２０】
（１３）本開示のさらに他の局面に従う被検出物質の検出キットの製造方法は、試料に含まれる可能性がある被検出物質を検出光により検出する。被検出物質の検出キットの製造方法は、第１〜第５のステップを含む。第１のステップは、基板上に金属により第１の薄膜を形成するステップである。第２のステップは、第１の薄膜上に複数の微粒子を周期的に配列させるステップである。第３のステップは、複数の微粒子の各々の表面の一部が露出するように第２の薄膜を形成するステップである。第４のステップは、複数の微粒子を溶液により除去することで、第２の薄膜の表面に各々がボウル型構造を形成する複数の窪みを形成するステップである。第５のステップは、各複数のボウル型構造内の少なくとも一部分に金属により第３の薄膜を形成するステップである。
【００２１】
（１４）好ましくは、ボウル型構造は、半球状よりも深い球欠状の窪みである。ボウル型構造の直径は、検出光の波長と同程度である。
【００２２】
（１５）好ましくは、基板は、検出光を透過する材料からなる。ボウル型構造は、球欠状およびロッド状のうちのいずれかの窪みである。被検出物質の検出キットの製造方法は、各々の直径が検出光の波長よりも小さく、かつ、各々が複数のボウル型構造のうちの対応するボウル型構造から第１の薄膜を貫通して基板に達する複数の貫通孔を形成するステップをさらに含む。
【００２３】
（１６）好ましくは、上記配列させるステップ（第２のステップ）は、複数の微粒子の自己組織化を利用して複数の微粒子をハニカム状に配列させるステップを含む。
【発明の効果】
【００２４】
本開示によれば、被検出物質の検出キットおよびそれを備えた検出システムにおいて、被検出物質を高精度に検出することができる。また、本開示によれば、被検出物質の検出キットを安価に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本開示における被検出物質の検出原理の概要を説明するための概念図である。
【図２】実施の形態１に係るウイルスの検出システムの全体構成を概略的に示す図である。
【図３】実施の形態１における検出キットの斜視図である。
【図４】図３のＩＶ−ＩＶ線に沿う検出キットの断面図である。
【図５】測定ウェルの拡大図である。
【図６】実施の形態１におけるウイルスの検出方法を説明するためのフローチャートである。
【図７】実施の形態１における検出キットの製造方法を説明するためのフローチャートである。
【図８】検出キットの製造方法の概略工程図である。
【図９】金属薄膜の形成後の検出キットの画像である。
【図１０】樹脂ビーズの自己組織化について詳細に説明するための図である。
【図１１】樹脂ビーズの自己組織化により形成された単層膜の観察結果を示す図である。
【図１２】樹脂ビーズを除去後の導電性ポリマー膜の観察結果を示す図である。
【図１３】ウェットエッチング後の導電性ポリマー膜の観察結果を示す図である。
【図１４】実施の形態１におけるシミュレーションモデルを説明するための図である。
【図１５】空隙径および孔間距離のばらつきが生じなかった場合のシミュレーション結果を説明するための図である。
【図１６】一部の孔径が増加した場合のシミュレーション結果を説明するための図である。
【図１７】一部の貫通孔が変位（シフト）した場合のシミュレーション結果を説明するための図である。
【図１８】ボウル型構造の最大厚さを変化させた場合のシミュレーション結果を示す図である。
【図１９】電場分布のシミュレーション条件を説明するための図である。
【図２０】貫通孔に生じた電場分布のシミュレーション結果を示す図である。
【図２１】電場分布の波長依存性に関するシミュレーション結果を示す図である。
【図２２】電場分布の波長依存性に関する他のシミュレーション結果を示す図である。
【図２３】光誘起力のシミュレーション条件を説明するための図である。
【図２４】第１のシミュレーション結果（ウイルスに作用する力の水平方向の位置依存性および波長依存性のシミュレーション結果）の一例を示す図である。
【図２５】第２のシミュレーション結果（ウイルスに作用する力の鉛直方向の位置依存性および波長依存性のシミュレーション結果）の一例を示す図である。
【図２６】被検出物質の検出時における透過スペクトルのシミュレーション条件を説明するための図である。
【図２７】ボウル型構造が抗体により修飾されていない場合の透過スペクトルのシミュレーション結果を示す図である。
【図２８】ボウル型構造が抗体により修飾されている場合の透過スペクトルのシミュレーション結果を示す図である。
【図２９】貫通孔の孔径の影響の検証に用いたシミュレーション条件を説明するための図である。
【図３０】貫通孔の孔径の影響のシミュレーション結果を示す図である。
【図３１】貫通孔の孔径に応じた電場分布のシミュレーション結果を示す図である。
【図３２】実施の形態２における検出キットの製造方法を説明するためのフローチャートである。
【図３３】検出キットの製造方法の概略工程図である。
【図３４】ボウル型構造の開口径の制御手法を説明するための図である。
【図３５】ボウル型構造の開口径の制御結果を示す図である。
【図３６】被検出物質の検出時における吸収スペクトルのシミュレーション条件を説明するための図である。
【図３７】被検出物質の検出時における吸収スペクトルのシミュレーション結果を示す図である。
【図３８】実施の形態２における消衰スペクトルの測定結果の一例を説明するための図である。
【図３９】橋部構造に関する吸収スペクトルのシミュレーション条件を説明するための図である。
【図４０】測定対象とするボウル型構造の位置を変化させた場合の吸収スペクトルの測定結果を示す図である。
【図４１】橋部構造の影響のシミュレーション結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本開示の実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、図中同一または相当部分には同一符号を付してその説明は繰り返さない。
【００２７】
本開示およびその実施の形態において、「試料」とは、被検出物質を含む物質または被検出物質を含む可能性がある物質を意味する。試料は、たとえば動物（たとえばヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、ラット、マウスなど）からの生体試料であり得る。生体試料は、たとえば、血液、組織、細胞、分泌液、体液等を含み得る。なお、「試料」はそれらの希釈物を含んでもよい。
【００２８】
本開示において、「被検出物質」とは、ナノメートルオーダーのサイズを有し、検出キットを用いて検出される物質を意味する。「ナノメートルオーダー」には、１ｎｍから１，０００ｎｍ（＝１μｍ）までの範囲が含まれる。
【００２９】
被検出物質の形状は特に限定されず、たとえば球形、楕円球形、ロッド状等である。被検出物質が楕円球形の場合、楕円球の短軸方向および長軸方向の長さの少なくとも一方がナノメートルオーダーであればよい。被検出物質がロッド状の場合、ロッドの幅および長さの少なくとも一方がナノメートルオーダーであればよい。なお、本開示における「ロッド状」には、円柱状に限らず、多角柱形状が含まれ得る。
【００３０】
被検出物質の例としては、細胞、微生物（細菌、真菌等）、生体高分子（タンパク質、核酸、脂質、多糖類等）、抗原（アレルゲン等）およびウイルスなどが挙げられる。ただし、被検出物質は、生体由来の物質（生体物質）に限定されず、金属ナノ粒子、金属ナノ粒子集合体、金属ナノ粒子集積構造体、半導体ナノ粒子、有機ナノ粒子、樹脂ビーズなどであってもよい。「金属ナノ粒子」とは、ナノメートルオーダーのサイズを有する金属粒子である。「金属ナノ粒子集合体」とは、複数の金属ナノ粒子が凝集することによって形成された集合体である。「金属ナノ粒子集積構造体」とは、たとえば複数の金属ナノ粒子が相互作用部位を介してビーズの表面に固定され、互いに隙間を設けて、金属ナノ粒子の直径以下の間隔で配置された構造体である。「半導体ナノ粒子」とは、ナノメートルオーダーのサイズを有する半導体粒子である。「有機ナノ粒子」とは、ナノメートルオーダーのサイズを有する、有機化合物からなる粒子である。「樹脂ビーズ」とは、ナノメートルオーダーのサイズを有する、樹脂からなる粒子である。
【００３１】
本開示において、「ホスト物質」とは、被検出物質を特異的に付着させることが可能な物質を意味する。被検出物質を特異的に付着させることが可能なホスト物質と被検出物質との組み合わせとしては、たとえば、抗原と抗体、糖鎖とタンパク質、脂質とタンパク質、低分子化合物（リガンド）とタンパク質、タンパク質とタンパク質、一本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡなどが挙げられる。これらの特異的親和性を有する両者のうちのいずれか一方が被検出物質である場合に、他方をホスト物質として用いることができる。すなわち、たとえば抗原が被検出物質である場合には、抗体をホスト物質として用いることができる。逆に抗体が被検出物質である場合には、抗原をホスト物質として用いることができる。また、ＤＮＡのハイブリダイゼーションにおいては、被検出物質がターゲットＤＮＡであり、ホスト物質がプローブＤＮＡである。なお、抗原は、アレルゲン、微生物（細菌、真菌など）、ウイルスなどを含み得る。また、抗体の種類を変えることによって、検出可能なアレルゲンあるいはウイルスの種類を変えることもできる。したがって、本開示により検出可能なアレルゲンまたはウイルスの種類は特に限定されるものではない。また、被検出物質が重金属である場合には、重金属イオンを捕集可能な物質をホスト物質として利用することができる。
【００３２】
本開示において、「ナノホール」とは、直径（孔径）がナノメートルオーダーの窪みを意味する。この窪みは、貫通孔であってもよいし非貫通孔であってもよい。窪み（貫通孔または非貫通孔）の深さは、ナノメートルオーダーであってもよいし、より深くてもよい。また、窪みの形状は、円柱を含むがこれに限定されず、円錐または円錐台であってもよい。なお、貫通孔とは、両端が光学的に透明な材料（または媒質）に達した孔を意味し、両端のうちの一方または両方が固体（たとえばガラス、石英、シリコンなど）に達していてもよい。さらには、貫通孔がスパッタ等による薄膜によって閉塞された状態であっても、その薄膜が十分に薄く透過率を有していれば、光学的には貫通孔とみなすことができる。また、「ナノホールアレイ」との用語は、複数のナノホールが周期的に配列された構造を意味する。
【００３３】
本開示およびその実施の形態において、「可視域から近赤外域までの波長範囲」の光とは、たとえば３８０ｎｍ〜２，５００ｎｍの波長範囲の光（連続光またはパルス光）を意味し、好ましくは、たとえば３８０ｎｍ〜１，２００ｎｍの波長範囲の光を意味する。
【００３４】
本開示およびその実施の形態において、「偏光」とは、光電磁波の伝播方向に垂直な電場ベクトルを意味する。
【００３５】
本開示およびその実施の形態において、「光誘起力」との用語は、散逸力、勾配力および物質間光誘起力の総称として用いられる。散逸力とは、光散乱あるいは光吸収といった散逸的過程において、光の運動量が物質に与えられることによって発生する力である。勾配力は、光誘起分極が生じた物質が不均一な電磁場の中に置かれた場合に、電磁気学的なポテンシャルの安定点に物質を移動させる力である。物質間光誘起力とは、光励起された複数の物質中の誘起分極から生じる縦電場による力と横電場（輻射場）による力との和である。
【００３６】
［実施の形態１］
＜検出原理＞
図１は、本開示における被検出物質の検出原理の概要を説明するための概念図である。図１（Ａ）を参照して、金属薄膜９００に形成された単一のナノホール９１０に検出光Ｌが照射された状況を想定する。ナノホール９１０の直径と同程度の波長範囲の光を金属薄膜９００に照射した場合、ナノホール９１０の周囲に近接場光が生じるものの、透過光はほとんど生じない。
【００３７】
一方、図１（Ｂ）を参照して、金属薄膜８００に周期的に形成された複数のナノホール８１０に対して検出光Ｌが照射された状況を想定する。複数のナノホール８１０が周期的に配列された構造を「ナノホールアレイ」とも称する。ナノホールアレイに各ナノホール８１０の直径と同程度の波長範囲の光を照射した場合、ナノホール８１０の直径よりも長波長の光の透過が生じる。この現象は、「異常透過（ＥＯＴ：Extraordinary  Optical  Transmission）」と称される。異常透過は、伝播型表面プラズモン（ＰＳＰ：Propagated  Surface  Plasmon）と局在型表面プラズモン（ＬＳＰ：Localized  Surface  Plasmon）との結合モードに起因するものと考えられている（たとえば非特許文献１参照）。
【００３８】
より詳細には、異常透過では、特定波長の光が選択的にナノホールアレイを透過する。異常透過が生じる波長（表面プラズモンの励起波長）λＥＯＴは、下記式（１）のように表される。
【００３９】
【数１】
2018194550.tif 000003
【００４０】
式（１）では、ナノホールアレイの周期（隣接する２つのナノホール８１０間の距離）をＤで表し、ナノホールアレイ内におけるナノホール８１０の相対位置を示す次数をｍで表している。なお、次数ｍは、自然数に限定されない。また、金属薄膜８００の誘電率をε１で表し、ナノホールアレイの周囲の媒質（たとえば空気または水）の誘電率をε２で表している。式（１）より、被検出物質がナノホールアレイに付着した場合、ナノホールアレイの周囲の誘電率ε２が変化し、それにより波長λＥＯＴが変化することが分かる。
【００４１】
たとえば金属薄膜８００の周囲の媒質が水であり、図１（Ｃ）に示すようにウイルスＶがナノホールアレイに付着した場合、ナノホールアレイの周囲の誘電率ε２は、水の誘電率からウイルスＶの誘電率に変化する。一般にウイルスＶの誘電率の方が水の誘電率よりも高いので、波長λＥＯＴは、長波長側にシフトする。したがって、ナノホールアレイの透過スペクトルを測定し、異常透過を示すスペクトル成分の変化（図１（Ｂ）に示した状態における透過スペクトルと、図１（Ｃ）に示した状態における透過スペクトルとの差）を監視することで、ウイルスＶを検出することができる。なお、異常透過を示すスペクトル成分の変化とは、たとえば波長λＥＯＴのシフトの有無であってもよいし、波長λＥＯＴのシフト量であってもよい。
【００４２】
＜検出システムの全体構成＞
以下では、ウイルスを検出する検出システムの構成について説明する。ただし、ウイルスは被検出物質の例示に過ぎないことを確認的に記載する。以下の説明では、Ｘ方向およびＹ方向は水平方向を表す。Ｘ方向とＹ方向とは互いに直交する。Ｚ方向は鉛直方向を表す。重力の向きはＺ方向下方である。また、Ｚ方向上方を「上方」と略し、Ｚ方向下方を「下方」と略す場合がある。
【００４３】
図２は、実施の形態１に係るウイルスの検出システムの全体構成を概略的に示す図である。図２を参照して、検出システム１は、検出キット１００と、ＸＹＺ軸ステージ２と、調整機構３と、サンプル供給装置４と、レーザ光源５と、分光光源６と、光学部品７と、対物レンズ８１，８２と、分光器９と、制御装置３００とを備える。
【００４４】
検出キット１００は、サンプルＳＰ（図４参照）を保持する。実施の形態１において、サンプルＳＰは、ウイルスＶが含まれる可能性がある液体試料である。検出キット１００の詳細な構成については図３〜図５にて説明する。検出キット１００は、ＸＹＺ軸ステージ２上に載置される。
【００４５】
調整機構３は、制御装置３００からの指令に応じて、ＸＹＺ軸ステージ２と対物レンズ８２との相対的な位置関係を調整する。実施の形態１では、対物レンズ８２の位置が固定されている。そのため、ＸＹＺ軸ステージ２のＸ方向、Ｙ方向およびＺ方向の位置調整により、ＸＹＺ軸ステージ２と対物レンズ８２との相対的な位置関係が調整される。なお、調整機構３としては、たとえば、顕微鏡に付属のサーボモータおよび焦準ハンドルなどの駆動機構（図示せず）を用いることができるが、調整機構３の具体的な構成は特に限定されない。調整機構３は、対物レンズ８２の位置を調整できるように構成されていてもよい。
【００４６】
サンプル供給装置４は、制御装置３００からの指令に応じて、検出キット１００上にサンプルＳＰを供給する。具体的には、たとえばディスペンサをサンプル供給装置４として採用することができる。なお、検出システム１において、調整機構３およびサンプル供給装置４は、必須の構成要素ではない。
【００４７】
レーザ光源５は、制御装置３００からの指令に応じて、たとえば近赤外域の波長範囲のレーザ光Ｌ１を発する。レーザ光Ｌ１は、光誘起力を発生させることでウイルスＶを所望の位置（後述するボウル型構造内）へと誘導するために用いられる。ウイルスＶの誘導については図２０〜図２５にて説明する。なお、レーザ光源５は、本開示に係る「他の光源」に相当する。
【００４８】
分光光源６は、制御装置３００からの指令に応じて、検出キット１００内のサンプルＳＰに照射するための白色光Ｌ２を発する。１つの実施例として、ハロゲンランプを分光光源６として用いることができる。なお、分光光源６は本開示に係る「光源」に相当し、白色光Ｌ２は本開示に係る「検出光」に相当する。
【００４９】
ただし、分光光源６は、実質的に単色光を発する光源であってもよく、たとえばレーザ光源を用いてもよい。単色光の波長は、透過スペクトルにおいて異常透過が生じるピーク波長を含む波長範囲の波長である。なお、単色光の波長は、異常透過が生じるピークの半値全幅の２倍以内の波長範囲内に位置すればよく、単色光自体の線幅は特に限定されない。
【００５０】
光学部品７は、たとえば、ミラー、ダイクロイックミラー、プリズム、光ファイバ等を含んで構成されている。対物レンズ８１は、レーザ光源５からのレーザ光Ｌ１を集光してに検出キット１００に照射するために用いられる。対物レンズ８２は、検出キット１００に照射された白色光Ｌ２を取り込むために用いられる。対物レンズ８２により取り込まれた白色光Ｌ２は、光学部品７により分光器９へと導かれる。
【００５１】
なお、光学部品７および対物レンズ８２は、たとえば倒立型顕微鏡本体または正立型顕微鏡本体（図示せず）に組み込むことができる。検出システム１の光学系は、レーザ光源５からのレーザ光Ｌ１と分光光源６からの白色光Ｌ２とを検出キット１００に照射することが可能であるととともに、検出キット１００に照射された白色光Ｌ２を分光器９に取り込むことが可能であれば、図２に示した構成に限定されない。
【００５２】
分光器９は、制御装置３００からの指令に応じて、検出キット１００の透過スペクトルを測定し、その測定結果を制御装置３００に出力する。分光器９は、可視域から近赤外域までの波長範囲でスペクトルを測定可能な分光器であることが好ましい。また、分光器９の波長分解能は、より小さいほど好ましい。分光器９の波長分解能は、たとえば１０ｎｍ以下、５ｎｍ以下、２ｎｍ以下または１ｎｍ以下であるが、これに限定されない。
【００５３】
制御装置３００は、いずれも図示しないが、ＣＰＵ（Central  Processing  Unit）と、メモリと、入出力ポートとを含んで構成されたマイクロコンピュータである。制御装置３００は、検出システム１内の各機器（調整機構３、サンプル供給装置４、レーザ光源５、分光光源６および分光器９）を制御する。また、制御装置３００は、分光器９により測定された透過スペクトルに基づいて、サンプルＳＰ内のウイルスを検出する。すなわち、制御装置３００は、本開示に係る「検出装置」に相当する。
【００５４】
＜検出キットの構成＞
実施の形態１に係るウイルスの検出システム１は、以下に説明するように、検出キット１００の構成に特徴を有する。
【００５５】
図３は、実施の形態１における検出キット１００の斜視図である。図４は、図３のＩＶ−ＩＶ線に沿う検出キット１００の断面図である。
【００５６】
図３および図４を参照して、検出キット１００は、サンプルＳＰを保持することが可能に構成された容器である。実施の形態１において、検出キット１００にはガラスボトムディッシュが用いられる。より詳細には、検出キット１００は、底部１１０と、壁部１２０と、測定ウェル１３０とを有する。
【００５７】
底部１１０は、円柱形状を有する。底部１１０の直径は、たとえば３５ｍｍである。壁部１２０は、底部１１０から垂直方向（Ｚ方向）に延在する。底部１１０および壁部１２０には、ポリプロピレンなどの樹脂が用いられる。しかし、底部１１０および壁部１２０の材料は、樹脂に限定されるものではなく、他の材料（たとえばガラス、石英、シリコンなど）であってもよい。
【００５８】
なお、底部１１０の形状は、円柱形状に限定されず、任意の形状することができる。また、壁部１２０は必須の構成要素ではなく、検出キット１００は、たとえば平面形状の基板であってもよい。
【００５９】
測定ウェル１３０は、底部１１０の中央に形成された円柱形状の窪みであり、サンプルＳＰを保持する。測定ウェル１３０の直径は、たとえば１４ｍｍである。
【００６０】
図５は、測定ウェル１３０の拡大図である。図５を参照して、測定ウェル１３０は、基板１３１と、金属薄膜１３２と、導電性ポリマー膜１３３と、金属薄膜１３４とを含む。
【００６１】
基板１３１には、レーザ光Ｌ１および白色光Ｌ２に対して透明な材料であるガラスが用いられる。基板１３１の厚みは、たとえば０．１２ｍｍ〜０．１７ｍｍである。なお、基板１３１の材料は、レーザ光Ｌ１および白色光Ｌ２を透過する材料であればガラスに限定されず、石英、シリコンなどであってもよい。
【００６２】
金属薄膜（第１の薄膜）１３２は、金属からなり、基板１３１上に配置された薄膜である。金属薄膜１３２の厚み（膜厚）は、ナノメートルオーダーであり、たとえば数十ナノメートル程度である。金属薄膜１３２の材料には、レーザ光源５からのレーザ光Ｌ１（本実施の形態では近赤外域の光）により表面プラズモン共鳴を起こす材料が用いられる。実施の形態１では、金薄膜が金属薄膜１３２として形成される。
【００６３】
導電性ポリマー膜（第２の薄膜）１３３は、導電性ポリマーからなり、金属薄膜１３２上に配置された膜である。導電性ポリマー膜１３３の厚みは、金属薄膜１３２と同様に、ナノメートルオーダーであり、たとえば数十ナノメートル〜数百ナノメートル程度である。
【００６４】
金属薄膜（第３の薄膜）１３４は、金属からなり、導電性ポリマー膜１３３上に配置された薄膜である。金属薄膜１３４の厚みも、ナノメートルオーダーであり、たとえば数十ナノメートル程度である。金属薄膜１３４の材料にも、レーザ光源５からのレーザ光Ｌ１により表面プラズモン共鳴を起こす材料（本実施の形態では金）が用いられる。
【００６５】
金属薄膜１３２および導電性ポリマー膜１３３には、複数の貫通孔１３５が周期的に形成されている。各貫通孔１３５の直径は、白色光Ｌ２の主な波長範囲よりも小さく、たとえば数百ナノメートル程度（たとえば３００ｎｍ〜６００ｎｍ程度）である。
【００６６】
導電性ポリマー膜１３３は、複数の貫通孔１３５のうちの対応する貫通孔につながる複数の窪みを有する。複数の窪みの内壁面１３６の各々は、球欠状の窪みである「ボウル型構造」を形成する。ボウル型構造の直径は貫通孔１３５の直径よりも大きいので、ボウル型構造は、貫通孔１３５につながる底部から上方の開口部に向けて径（直径）が拡がる拡径部を有している。ボウル型構造は、この拡径部において、被検出物質であるウイルスＶの少なくとも一部を収容可能である。測定ウェル１３０の構成の詳細については、検出キット１００の製造方法とともに後述する（図７および図８参照）。
【００６７】
なお、図５および後述する図８等に示す例では、ボウル型構造が球欠状を有するが、ボウル型構造の形状は、これに限定されない。ボウル型構造は、たとえばロッド状（円柱状、角柱状など）、錐形状（円錐状、角錐状）であってもよい。なお、ボウル型構造が球欠状または錐形状の場合、拡径部において径が滑らかに増加するが、ボウル型構造がロッド状の場合には、拡径部において径が急激に増加する。
【００６８】
また、図５および図８等では、ボウル型構造が拡径部を有し、ボウル型構造の径が底部から開口部にかけて単調に増加する例を示す。しかし、ボウル型構造の径は、開口部の近くにおいて一定になってもよいし、逆に開口部の近くでは減少してもよい。
【００６９】
さらに、ボウル型構造は、球欠状、錐形状およびロッド状を組み合わせた形状であってもよい。たとえば、ボウル型構造は、底部側では径が増加する球欠状または錐形状であって、開口側では径が一定の柱状であってもよい。金属薄膜１３４は、このようなボウル型構造の内面の少なくとも一部にも配置されている。
【００７０】
＜被検出物質の検出フロー＞
図６は、実施の形態１におけるウイルスの検出方法を説明するためのフローチャートである。このフローチャートは、所定条件成立時（たとえばユーザが図示しない操作ボタンを操作したとき）に実行される。このフローチャートに含まれる各ステップ（以下、Ｓと略す）は、基本的には制御装置３００によるソフトウェア処理によって実現されるが、その一部または全部が制御装置３００内に作製されたハードウェア（電気回路）によって実現されてもよい。
【００７１】
図２〜図６を参照して、Ｓ１０１において、制御装置３００は、検出キット１００をＸＹＺ軸ステージ２上に設置する。この処理は、たとえば、検出キット１００の送り機構（図示せず）により実現することができる。
【００７２】
Ｓ１０２において、制御装置３００は、適量のサンプルＳＰが測定ウェル１３０内に保持されるように、サンプル供給装置４からサンプルＳＰを滴下させる。サンプルＳＰの滴下量は、たとえば数十μＬ〜数百μＬ程度の微量であってもよいし、より多量であってもよい。
【００７３】
Ｓ１０３において、制御装置３００は、検出キット１００の透過スペクトルを取得するための白色光Ｌ２を発するように分光光源６を制御する。そして、制御装置３００は、分光器９を制御することによって検出キット１００の透過スペクトルＴＳ１を取得する（Ｓ１０４）。
【００７４】
Ｓ１０５において、制御装置３００は、レーザ光Ｌ１を発するようにレーザ光源５を制御する。これにより、被検出物質となるウイルスＶがサンプルＳＰに含まれていた場合、ウイルスＶが光誘起力によりボウル型構造内へと誘導されたりボウル型構造内に捕捉されたりする（詳細は後述）。
【００７５】
Ｓ１０６において、制御装置３００は、分光器９を制御することによって検出キット１００の透過スペクトルＴＳ２を取得する。
【００７６】
Ｓ１０７において、制御装置３００は、Ｓ１０４にて取得された透過スペクトルＴＳ１と、Ｓ１０６にて取得された透過スペクトルＴＳ２とを比較する。より具体的には、制御装置３００は、透過スペクトルＴＳ１のピーク波長λ１と透過スペクトルＴＳ２のピーク波長λ２とを求め、ピーク波長λ１とピーク波長λ２との差分Δλ（＝λ２−λ１）を算出する。そして、制御装置３００は、差分Δλ（の絶対値）が判定値以上であるか否かを判定する。なお、判定値は、サンプルＳＰにウイルスＶが含まれる場合のピーク波長の実測値（シミュレーション値であってもよい）と、サンプルＳＰにウイルスＶが含まれない場合のピーク波長の実測値とを比較することで予め求められ、制御装置３００のメモリ（図示せず）に格納されている。
【００７７】
ピーク波長の差分Δλが判定値以上である場合（Ｓ１０７においてＹＥＳ）、制御装置３００は、ピークシフトが生じたとして、サンプルＳＰからウイルスＶが検出されたと判定する（Ｓ１０８）。一方、差分Δλが判定値未満である場合、すなわちピークシフトが生じなかった場合（Ｓ１０７においてＮＯ）、制御装置３００は、サンプルＳＰからはウイルスＶは検出されなかったと判定する（Ｓ１０９）。
【００７８】
その後、制御装置３００は、白色光Ｌ２の照射を停止するように分光光源６を制御するとともに、レーザ光Ｌ１の照射を停止するようにレーザ光源５を制御する（Ｓ１１０）。これにより、一連の処理が終了する。
【００７９】
なお、図６では、レーザ光Ｌ１の照射位置が予め決定されている場合について説明したが、レーザ光Ｌ１の照射位置を調整するための処理を含めてもよい。たとえば、制御装置３００は、レーザ光Ｌ１の照射位置が適切な位置に調整されるように、調整機構３を制御することによってＸＹＺ軸ステージ２の水平方向の位置を制御する。この水平方向の位置調整は、たとえば、図示しない撮影機器（ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラ）により撮影された画像から、画像処理技術を用いて測定ウェル１３０の外形パターンを抽出することによって実現することができる。また、制御装置３００は、レーザ光Ｌ１のビームウエストが適切な高さ（鉛直方向の位置）に調整されるように、調整機構３を制御することによってＸＹＺ軸ステージ２の鉛直方向の位置を制御する。ビームウエストの高さは、レーザ光Ｌ１の波長および対物レンズ８１の仕様（倍率等）から既知である。よって、ＸＹＺ軸ステージ２の鉛直方向の位置を調整することで狙った高さにビームウエストを調整することができる。
【００８０】
また、白色光Ｌ２およびレーザ光Ｌ１の照射を停止する処理（Ｓ１１０の処理）の順序は、特に限定されない。たとえば、２回目の透過スペクトルＴＳ２の取得後、直ちに白色光Ｌ２およびレーザ光Ｌ１の照射を停止してもよい。
【００８１】
＜検出キットの製造フロー＞
図７は、実施の形態１における検出キット１００の製造方法を説明するためのフローチャートである。図８は、検出キット１００の製造方法の概略工程図である。
【００８２】
図７および図８（Ａ）を参照して、Ｓ２０１において、測定ウェル１３０の基板１３１上に金属薄膜１３２が形成される。より詳細には、まず、基板１３１が洗浄される。たとえば、超純水で満たしたビーカー（図示せず）の中に検出キット１００を沈め、超音波洗浄機（図示せず）を用いて、特定の周波数（たとえば周波数２３ｋＨｚ）の超音波を所定時間（たとえば１０分間）照射することで基板１３１を洗浄することができる。
【００８３】
このような洗浄後に、たとえばイオンスパッタリング法によって基板１３１上に金属薄膜１３２が形成される。実施の形態１において、金属薄膜１３２は、金薄膜である。金属薄膜１３２の膜厚は、たとえば４０ｎｍである。ただし、金属薄膜１３２の材料は金に限定されるものではなく、表面プラズモン共鳴を起こす金以外の金属元素（たとえば銀）などであってもよい。なお、金属薄膜１３２の形成手法は、イオンスパッタリング法に限られず、他の薄膜形成手法（たとえば真空蒸着法または無電解メッキ法）を用いてもよい。
【００８４】
図９は、金属薄膜１３２の形成後の検出キット１００の画像である。図９に示すように、検出キット１００の内面全面に均一な膜厚の金属薄膜１３２を形成することができる。
【００８５】
図７および図８（Ｂ）を参照して、Ｓ２０２において、複数の樹脂ビーズＢが分散した分散液が金属薄膜１３２上に滴下される。たとえば、濃度が１．５×１０９［個／ｍＬ」程度の分散液を１００μＬだけ金属薄膜１３２上に滴下することができる。樹脂ビーズＢとしては、たとえば、粒子径１μｍのポリスチレンビーズを用いることができる。ただし、樹脂ビーズＢの種類は、たとえばアクリル、ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリプロピレン等であってもよい。また、樹脂ビーズＢの粒子径は、１μｍに限定されず、数十ｎｍ〜数百ｎｍであってもよいし、数μｍであってもよい。なお、複数の樹脂ビーズＢは、本開示に係る「複数の微粒子」に相当する。
【００８６】
その後、金属薄膜１３２上に滴下された分散液を室温にて自然乾燥させる。これにより、複数の樹脂ビーズＢの自己組織化を利用して、複数の樹脂ビーズＢが単層状かつ周期的に金属薄膜１３２上に配列する。
【００８７】
図１０は、樹脂ビーズＢの自己組織化について詳細に説明するための図である。図１０（Ａ）〜図１０（Ｃ）は、樹脂ビーズＢの分散液の自然乾燥前、自然乾燥中および自然乾燥後の様子をそれぞれ示す。
【００８８】
図１０（Ａ）参照して、樹脂ビーズＢの分散液（分散媒）は、水性の液体（たとえば純水）である。一方、測定ウェル１３０の壁面には、金薄膜が形成されている（図５および図９参照）。有機物等により汚染されていない金薄膜は、親水性を示す。このため、分散液と測定ウェル１３０の壁面との固液界面では、凹型のメニスカス（分散液と周囲の気体との気液界面に対して凹となるメニスカス）が形成される。
【００８９】
続いて、図１０（Ｂ）を参照して、分散液を室温にて自然乾燥させると、凹型のメニスカスが維持されたまま、時間の経過に伴い、気液界面が徐々に降下していく。まず、気液界面の高さが最も低い測定ウェル１３０の中央部分において、気液界面の高さが樹脂ビーズＢの粒子径よりも低くなる。そうすると、測定ウェル１３０の中央部分に位置する樹脂ビーズＢは、金属薄膜１３２上に固定される。これにより、樹脂ビーズＢからなる薄膜（より詳細には図１１に示すように樹脂ビーズＢの単層膜）が形成される。その後、分散液の乾燥が進むと、気液界面の高さが樹脂ビーズＢの粒子径よりも低い領域が測定ウェル１３０の中央部分から外周方向に向けて広がっていく。これに伴い、樹脂ビーズＢの薄膜が形成された領域が次第に広がっていく。
【００９０】
分散液の乾燥が完了すると、図１０（Ｃ）に示すように、数ミリメートル〜十数ミリメートルの範囲で樹脂ビーズＢの薄膜が形成される。この薄膜は構造色を発現する。このことから、樹脂ビーズＢの薄膜が微細な周期構造を有することが分かる。
【００９１】
図１１は、樹脂ビーズＢの自己組織化により形成された薄膜の観察結果を示す図である。図１１（Ａ）は光学顕微鏡像を示し、図１１（Ｂ）は電界放出型走査電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ：Field  Emission-Scanning  Electron  Microscope）像を示す。
【００９２】
図１１（Ａ）を参照して、光学顕微鏡像において、色が濃く見える部分は多層膜が形成された領域であり、色が薄く見える部分（白く見える部分）は樹脂ビーズＢがほとんどない領域である。これらの領域が存在するものの、ほとんどの領域では、樹脂ビーズＢの単層膜が形成されていることを確認できた。また、ＦＥ−ＳＥＭでの観察結果より、単層膜が形成された領域では、樹脂ビーズＢがハニカム状に配列していることが確認された（図１１（Ｂ）参照）。
【００９３】
図７および図８（Ｃ）を参照して、Ｓ２０３において、樹脂ビーズＢの単層膜の隙間（樹脂ビーズＢ間の隙間）を埋め、かつ、各樹脂ビーズＢの表面の一部が露出するように、導電性ポリマー膜１３３が形成される。導電性ポリマー膜１３３の材料としては、ポリチオフェン系、ポリアセチレン系、ポリアニリン系、ポリピロール系などの公知の各種材料を用いることができる。実施の形態１では、ポリピロールが採用される。ポリピロール膜は、たとえば以下のように電解重合法を用いて形成することができる。
【００９４】
まず、蒸留により純度を高めたピロールを準備し、蒸留後のピロールを含むリン酸緩衝液を電解液とした。この電解液により検出キット１００を満たし、リング状の白金電極を陰極として電解液に浸した。そして、金属薄膜１３２を陽極とし、陽極と陰極とを外部電源（図示せず）に接続して所定時間だけ通電した（後述する図３４参照）。これにより、陽極においてピロールの重合反応が進み、金属薄膜１３２上にポリピロール膜が形成された。
【００９５】
電解重合時間（通電時間）の増加に伴い、ポリピロール膜の膜厚は急激に増加し得るところ、実施の形態１におけるポリピロール膜の膜厚は、樹脂ビーズＢの半径程度か、それよりも薄い（たとえば５００ｎｍ以下）ことが望ましい。したがって、電解重合時間は、ポリピロール膜の膜厚が適切な範囲内（たとえば１２０ｎｍ〜２４０ｎｍの範囲内）となるように実験的または計算的に定められる。
【００９６】
なお、前述のように、導電性ポリマー膜は、本開示に係る「第２の薄膜」に相当する。実施の形態１では「第２の薄膜」の形成に電解重合法が用いられるので、「第２の薄膜」の材料が導電性を有することを要する。しかし、「第２の薄膜」の形成に他の手法を採用することも可能であり、採用される手法によっては「第２の薄膜」に導電性は必須ではない。また、「第２の薄膜」の材料は、ポリマーに限定されない。たとえば無電解メッキ法により「第２の薄膜」を形成することも可能である。その場合、「第２の薄膜」の材料には金属（金、銀など）が用いられる。また、無電解メッキ法を用いる場合には、本開示に係る「第１の薄膜」に相当する金属薄膜１３２の形成を省略することも可能である。
【００９７】
導電性ポリマー膜１３３の生成後、Ｓ２０４において、樹脂ビーズＢが除去される（図８（Ｄ）参照）。樹脂ビーズＢの除去は、導電性ポリマー膜１３３の材料よりも樹脂ビーズＢの材料を溶解しやすい溶剤を用いて、樹脂ビーズＢを選択的に溶解することによって実現される。導電性ポリマー膜１３３がポリピロール膜であり、かつ、樹脂ビーズＢがポリスチレンビーズである場合、検出キット１００をクロロホルム溶液に必要な時間（たとえば２４時間）浸すことにより、樹脂ビーズＢを除去することができる。樹脂ビーズＢの除去が完了すると、導電性ポリマー膜１３３には、樹脂ビーズＢを鋳型とするボウル型構造が形成される。ボウル型構造は、水平方向（ＸＹ平面方向）に延在する平面で球（樹脂ビーズＢ）を切った球欠形状を有し、その球欠形状の最下点（Ｚ方向下方の端点）で金属薄膜１３２に当接する。このように、樹脂ビーズＢを除去することにより、複数のボウル型構造がハニカム状に配列された導電性ポリマー膜１３３が形成される。
【００９８】
図１２は、樹脂ビーズＢを除去後の導電性ポリマー膜１３３の観察結果を示す図である。図１２は、電解重合時間が１０秒、２０秒および３０秒の場合について、樹脂ビーズＢを除去後の導電性ポリマー膜１３３のＦＥ−ＳＥＭ像を示す。
【００９９】
電解重合時間が１０秒であった場合（左の画像参照）、導電性ポリマー膜１３３に形成されたボウル型構造の直径（開口部の直径）は、４００ｎｍ〜６００ｎｍの範囲内であった。電解重合時間が２０秒であった場合（中央の画像参照）、ボウル型構造の直径は、９００ｎｍ〜１，０００ｎｍの範囲内であった。電解重合時間が３０秒であった場合（右の画像参照）にも、ボウル型構造の直径は、９００ｎｍ〜１，０００ｎｍの範囲内であった。このように、電解重合時間を適宜設定することで、導電性ポリマー膜１３３の内壁面１３６により形成されるボウル型構造の直径および高さ（後述する最大厚さｔｐ）を所望の値とすることが可能である。
【０１００】
図７および図８（Ｅ）を参照して、Ｓ２０５において、検出キット１００に対してウェットエッチングが施される。これにより、ボウル型構造の下方部分（ボウル型構造と金属薄膜１３２との当接部分）から金属薄膜１３２が浸食され、金属薄膜１３２が部分的に除去される。一方、導電性ポリマー膜１３３は、除去されずに残る。その結果、ボウル型構造の下方部分から金属薄膜１３２を貫通して基板１３１に達する略円柱状の貫通孔１３５が形成される。これにより、複数の貫通孔１３５がハニカム状に配列したナノホールアレイを測定ウェル１３０に形成することができる。
【０１０１】
ウェットエッチングには、たとえばヨウ素系のエッチャント（エッチング液）を用いるができる。膜厚がナノメートルオーダー（たとえば４０ｎｍ）の金属薄膜１３２への微細加工を実現するため、エッチャントには、エッチングレート（エッチング速度）が十分に遅いものを用いることが望ましい。また、エッチャントが静止状態か攪拌状態かによってもエッチングレートは大きく変化し得るところ、エッチングレートが低い静止状態でウェットエッチングを施すことが望ましい。以下に示す結果では、静止状態でのエッチングレートが７６［ｎｍ／分］のエッチャントを用いるとともに、エッチング時間を３０秒に設定した。
【０１０２】
図１３は、ウェットエッチング後の導電性ポリマー膜１３３の観察結果を示す図である。図１３（Ａ）は光学顕微鏡像を示し、図１３（Ｂ）はＦＥ−ＳＥＭ像を示す。
【０１０３】
図１３（Ａ）を参照して、金属薄膜１３２のうちウェットエッチングにより溶解または浸食された領域は、膜厚が薄くなるので、光学顕微鏡像では明るく示される。この領域をＦＥ−ＳＥＭにより観察すると、図１３（Ｂ）に示すように、樹脂ビーズＢを鋳型として形成されたボウル型構造の中央部分に円形の開口を有する貫通孔１３５が確認された。
【０１０４】
図７および図８（Ｆ）を参照して、最後に、導電性ポリマー膜１３３上に金属薄膜１３４がさらに形成される。金属薄膜１３４は、金属薄膜１３２と同様に、たとえばイオンスパッタリング法により形成することができる。金属薄膜１３４の厚みは、ある程度薄い（たとえば数十ｎｍ程度）ことが望ましい。そうすることにより、スパッタされた金属の堆積により貫通孔１３５が閉塞されても、光学的には貫通孔とみなすことが可能になる。なお、金属薄膜１３４の形成には、真空蒸着法または無電解メッキ法を用いてもよい。
【０１０５】
また、金属薄膜１３４の形成に無電解メッキ法を用いる場合、金属薄膜１３２と金属薄膜１３４とが異なる金属であれば、導電性ポリマー膜１３３は必須ではない。より詳細に説明すると、Ｓ２０２における自己組織化による樹脂ビーズＢの単層膜の形成後、導電性ポリマー膜１３３の形成処理（Ｓ２０３の処理）に代えて無電解メッキを行なってもよい。そして、Ｓ２０４における樹脂ビーズＢの除去後のウェットエッチングの処理（Ｓ２０５）では、金属薄膜１３４は溶解せず金属薄膜１３２のみを溶解する溶剤を用いることで、貫通孔１３５を形成することができる。このように一連の処理を行なうことで、導電性ポリマー膜１３３に相当する構造と金属薄膜１３４に相当する構造とを同時に形成しつつ、貫通孔１３５を形成することができる。この場合には、本開示に係る「第２の薄膜」と「第３の薄膜」とが一体的に形成されることになる。
【０１０６】
なお、金属薄膜１３２の厚みが０でよければ、金属薄膜１３２の形成処理（Ｓ２０１の処理）およびウェットエッチング（Ｓ２０５の処理）も不要であり、樹脂ビーズＢの除去処理（Ｓ２０４の処理）によって貫通孔１３５が形成される。
【０１０７】
ナノホールアレイの製造においては、フォトリソグラフィまたは電子線リソグラフィなどの精密加工技術を用いることも考えられる。しかし、これらのリソグラフィ技術は、いわばトップダウン的手法であり、高価な加工装置を必要とする。これに対し、実施の形態１によれば、自己組織化というボトムアップ的な手法を用いることで、高価な加工装置を準備するための初期投資が不要になるため、より安価に検出キット１００を製造することが可能になる。
【０１０８】
また、実施の形態１によれば、室温（常温）での自然乾燥という簡易な手法によって、樹脂ビーズＢの単層膜を金属薄膜１３２上に形成することができる。そのため、たとえば、樹脂ビーズＢを金属薄膜１３２上に固定（接着）するための検出キット１００の加熱などの煩雑な手順を行なわなくてよい。
【０１０９】
さらに、導電性ポリマー膜１３３からなるボウル型構造の表面に、表面プラズモン共鳴を起こし得る金属薄膜１３４を形成することで、導電性ポリマー膜１３３を除去するための処理が不要になる。したがって、より容易かつ安価に検出キット１００を製造することができる。
【０１１０】
＜光学シミュレーション＞
以下、実施の形態１における製造方法により製造された検出キットの光応答のシミュレーション結果（数値実験結果）について説明する。このシミュレーションでは、時間領域差分法（ＦＤＴＤ：Finite-Difference  Time-Domain  method）を用いた。また、水平方向（ＸＹ方向）に周期境界条件を用いるとともに、鉛直方向（Ｚ方向）に検出キット１００から十分に離れた領域で完全吸収境界条件を用いた。
【０１１１】
図１４は、実施の形態１におけるシミュレーションモデルを説明するための図である。図１４（Ａ）は、シミュレーションモデルの斜視図を示す。図１４（Ｂ）は、図１４（Ａ）のＸＩＶＢ−ＸＩＶＢ線に沿うシミュレーションモデルの断面図を示す。なお、図１４（Ａ）では、媒質（サンプルＳＰの分散媒）の図示を省略する一方で、除去前の樹脂ビーズＢ（仮想的な樹脂ビーズＢ）を破線で図示している。また、図１４（Ａ）に示した樹脂ビーズＢの数は例示である。
【０１１２】
図１４（Ａ）および図１４（Ｂ）を参照して、以下では、円柱状の貫通孔１３５の直径を単に「孔径」と称し、φで表す。また、隣接する貫通孔１３５間の距離を「孔間距離」と称し、Ｄで表す。金属薄膜１３２の屈折率ｎｆには、金の複素屈折率を設定した。金属薄膜１３２の膜厚は、４０ｎｍに設定した。なお、このシミュレーションモデルでは、基板１３１は省略されている。
【０１１３】
また、導電性ポリマー膜１３３が金属薄膜１３４により覆われているため導電性ポリマー膜１３３の内部には光が侵入しないものと仮定し、導電性ポリマー膜１３３および金属薄膜１３４の屈折率ｎｐにも金の複素屈折率を設定した。導電性ポリマー膜１３３に形成されたボウル型構造の最大厚さをｔｐと表す。ボウル型構造の最小厚さｔｑは、０ｎｍに設定した。
【０１１４】
サンプルＳＰの屈折率ｎｓｐには、空気または水の屈折率を設定した。そして、水平方向に偏光した平面波である白色光Ｌ２が上方から下方に向かって検出キット１００に垂直に入射される状況を想定した。
【０１１５】
＜貫通孔のばらつきの影響＞
検出キット１００の実際の製造においては、孔径φおよび孔間距離Ｄのばらつきが生じ得る。したがって、孔径φおよび孔間距離Ｄのばらつきの影響をシミュレーションにより評価した。
【０１１６】
以下に図１５〜図１７で説明する３つのシミュレーション結果においては、孔径φを４００ｎｍに設定し、孔間距離Ｄを１，０００ｎｍ（＝１μｍ）に設定した。また、異常透過における貫通孔のばらつきの影響の説明に当たっては、導電性ポリマー膜１３３および金属薄膜１３４が形成されていない簡略化されたモデルを仮定した（言い換えると、ボウル型構造の最大厚さｔｐおよび最小厚さを、いずれも０に設定した）。サンプルＳＰの屈折率ｎｓｐには、空気の屈折率を設定した。
【０１１７】
図１５は、孔径φおよび孔間距離Ｄのばらつきが生じなかった場合のシミュレーション結果を説明するための図である。図１５（Ａ）は、貫通孔１３５の配置を示し、図１５（Ｂ）は、図１５（Ａ）に示した貫通孔１３５の配置でのシミュレーション結果を示す。図１５（Ｂ）において、横軸は透過光の波長を示し、左側の縦軸は透過率を示す。後述する図１６および図１７においても同様である。
【０１１８】
図１５（Ａ）および図１５（Ｂ）を参照して、孔径φが均一であり、かつ、貫通孔１３５の配置も均等であった場合（孔間距離Ｄが均一であった場合）、一般的な近赤外光レーザ（ＹＡＧレーザまたはＹＶＯ４レーザ）の発振波長である１，０６４ｎｍ付近に鋭いピークが生じる。
【０１１９】
白色光Ｌ２が異常透過を起こすには、金属表面の自由電子の振動が白色光Ｌ２の振動と結合して伝播型表面プラズモンが励起されることを要するところ、伝播型表面プラズモンは、複数の貫通孔１３５の各々の間において励起される（矢印ＡＲで示す）。図１５（Ａ）に示した構成では、すべての最近接の孔間距離Ｄが等しいので、伝播型表面プラズモンのモードが同一の波長で共鳴する。その結果、鋭いピークが生じたと考えられる。
【０１２０】
また、金属薄膜１３２が完全反射体であると仮定し、金属薄膜１３２における貫通孔１３５の開口率（貫通孔１３５の面積と金属薄膜１３２全体（貫通孔１３５を含む）の面積との比）から幾何学的透過率Ｔｇを算出すると、０．１４であった。幾何学的透過率Ｔｇにより規格化された透過率を図１５（Ｂ）の右側の縦軸に示す。１，０６４ｎｍ付近のピーク波長において、透過率が幾何学的透過率Ｔｇの５倍以上になっていることが分かる。これにより、異常透過が起こっていることが確認された。
【０１２１】
図１６は、一部の孔径φが増加した場合のシミュレーション結果を説明するための図である。図１６（Ａ）を参照して、大部分の孔径φ（貫通孔１３５の孔径）が４００ｎｍであるのに対し、一部の貫通孔１３５Ａの孔径φが６００ｎｍである場合について、シミュレーションを行なった。
【０１２２】
図１６（Ｂ）に示すように、一部の貫通孔１３５Ａの孔径φが他の貫通孔１３５の孔径φよりも大幅に大きい場合であっても、すべての孔径φが均一の場合と同様に、異常透過が起こることが確認された。つまり、孔径φにばらつきが生じた場合であっても異常透過が起こることを確認できた。
【０１２３】
なお、一部の貫通孔１３５Ａの孔径φが大きい場合には、すべての孔径φが均一の場合と比べて、ピークがブロード化する。この理由は以下のように考えられる。すなわち、一部の貫通孔１３５Ａの孔径φが大きくなることで、その貫通孔１３５Ａと他の貫通孔１３５との間の金属薄膜１３２の金属部分の距離が、ある貫通孔１３５と別の貫通孔１３５との間の金属部分の距離よりも短くなる。そうすると、貫通孔１３５Ａと貫通孔１３５との間には、貫通孔１３５間のモードとは別のモードの伝播型表面プラズモンが励起される。よって、図１６（Ｂ）に示した貫通孔１３５，１３５Ａの配置では、２種類のモードが存在する。その結果として、ピークのブロード化が生じたと考えられる。
【０１２４】
図１７は、一部の貫通孔が変位した場合のシミュレーション結果を説明するための図である。図１７（Ａ）を参照して、一部の貫通孔１３５ＢがＸ方向にｄＸだけ変位した場合について、シミュレーションを行なった。
【０１２５】
その結果、図１７（Ｂ）に示すように、変位量ｄＸが増加するに従って、透過スペクトルのピーク波長が短波長側にシフトすることが分かった。また、変位量ｄＸが増加するに従って、ピークがブロード化することでピーク波長における透過率が低下することが分かった。この理由は以下のように考えられる。すなわち、図１７（Ａ）に示した配置では、複数の貫通孔１３５，１３５Ｂから任意の２つの貫通孔が選択された場合に、上記した式（１）において各貫通孔の相対位置を示す次数ｍが様々な値となる。そのため、多数のモードの伝播型表面プラズモンが励起される。変位量ｄＸが増加するに従ってモード間の差異が大きくなるので、各モードに対応するスペクトル形状の違いも大きくなる。その結果、ピークのブロード化が進むものと考えられる。
【０１２６】
また、図１７（Ｂ）では、変位量ｄＸ＝０でのピーク波長よりも長波長側に別のピークが生じることも確認された。このピークは、変位量ｄＸが増加するに従って顕著になる。
【０１２７】
このように、図１５〜図１７に示したシミュレーション結果から、貫通孔１３５の孔径φのばらつきの影響は比較的小さいものの、貫通孔１３５の変位の影響（孔間距離Ｄのばらつきの影響）は比較的大きくなり得ることが分かる。
【０１２８】
＜ボウル型構造の形状の影響＞
続いて、ボウル型構造の形状の影響を評価するために行なったシミュレーション結果について説明する。図１５〜図１７に説明した例では、孔径φが４００ｎｍであり、孔間距離Ｄが１，０００ｎｍである場合に、透過スペクトルのピーク波長は約１μｍであった。しかし、サンプルＳＰとして水を用いる場合、１μｍまたはそれよりも長波長の近赤外光は水による吸収率が比較的高い。したがって、１μｍよりも短波長側にピークが生じるようにボウル型構造および貫通孔１３５を設計することが望ましい。図１７（Ｂ）に示した結果より、孔間距離Ｄが短いほどピーク波長が短くなると考えられることから、以下では、孔間距離Ｄを６００ｎｍに設定した。それに伴い、孔径φを小さくし、３００ｎｍに設定した。また、サンプルＳＰの屈折率ｎｓｐとして、水の屈折率を設定した。
【０１２９】
図１８は、ボウル型構造の最大厚さｔｐ（図１４（Ｂ）参照）を変化させた場合のシミュレーション結果を示す図である。白色光Ｌ２の偏光方向がＸ方向（Ｘ偏光）であった場合のシミュレーション結果を実線で示し、白色光Ｌ２の偏光方向がＹ方向（Ｙ偏光）であった場合のシミュレーション結果を破線で示す。
【０１３０】
図１８を参照して、ボウル型構造の最大厚さｔｐ＝０が付されたスペクトル（点線または破線で示す２つのスペクトル）は、導電性ポリマー膜１３３および金属薄膜１３４がいずれも形成されていない構成（金属薄膜１３２に貫通孔１３５が形成されただけの構成）でのシミュレーション結果に相当する。図１５〜図１７に示したシミュレーション結果に対応する。これらのスペクトルより、検出キット１００の周囲の媒質が水（サンプルＳＰが水性の液体）である場合にも、検出キット１００の周囲の媒質が空気である場合とほぼ同様に、ピークが１μｍ付近（より詳細には９５０ｎｍ付近）に生じることが分かる。
【０１３１】
これに対し、ボウル型構造の最大厚さｔｐが０以外の場合（ｔｐ＝１００ｎｍ〜４００ｎｍの場合）には、最大厚さｔｐ＝０の場合と比べて、ピークが短波長側にシフトすることが分かる。これは、ボウル型構造により貫通孔１３５の深さが深くなることに起因すると考えられる。
【０１３２】
白色光Ｌ２の偏光方向に着目すると、ボウル型構造の最大厚さｔｐ＝０，１００ｎｍ，２００ｎｍの場合には、偏光方向に応じた透過スペクトルの差異はほとんど生じなかった。一方、最大厚さｔｐ＝３００ｎｍ，４００ｎｍの場合には、偏光方向に応じた透過スペクトルの差異が生じた。これは、ボウル型構造での光学応答が白色光Ｌ２の偏光方向によって異なることに起因するが、その詳細については後述する。
【０１３３】
＜電場分布＞
次に、貫通孔１３５およびボウル型構造の周囲に生じる電場分布のシミュレーション結果について説明する。
【０１３４】
図１９は、電場分布のシミュレーション条件を説明するための図である。図１９に示すように、ハニカム状に配列された７つの貫通孔１３５のうちの中央の貫通孔１３５について、ＸＺ断面およびＹＺ断面における電場分布を求めた。
【０１３５】
図２０は、貫通孔１３５に生じた電場分布のシミュレーション結果を示す図である。図２０ならびに後述する図２１および図２２では、横軸および縦軸に、ＸＺ断面またはＹＺ断面における位置を示す。また、白色光Ｌ２の電場の振幅を１とした場合の相対的な光強度（電場の振幅の２乗）を画像の濃淡で示す（各シミュレーション結果の右側に記載のスケールバーを参照）。
【０１３６】
図２０には、ボウル型構造の最大厚さｔｐ＝０、すなわち導電性ポリマー膜１３３および金属薄膜１３４が形成されていないと設定した場合のシミュレーション結果を示す。また、図１８に示したシミュレーション結果に基づき、照射光の波長を９５０ｎｍ（図１８におけるｔｐ＝０でのピーク波長）に設定した。図２０に示すように、照射光の偏光に依存して、貫通孔１３５の上部および下部の各々において、表面プラズモンのモードが発生していることを確認できた。
【０１３７】
図２１は、電場分布の波長依存性に関するシミュレーション結果を示す図である。図２２は、電場分布の波長依存性に関する他のシミュレーション結果を示す図である。図２１および図２２では、導電性ポリマー膜１３３および金属薄膜１３４が形成されているとして、ボウル型構造の最大厚さｔｐを図２１ではｔｐ＝３００ｎｍに設定し、図２２ではｔｐ＝４００ｎｍに設定した。なお、最大厚さｔｐ＝３００ｎｍに設定した場合には、ボウル型構造は、半球状の窪みとなる。一方、最大厚さｔｐ＝４００ｎｍに設定した場合には、最大厚さｔｐの方が樹脂ビーズＢの半径（３００ｎｍ）よりも大きくなる。また、照射光としてはＹ偏光を用いた。そして、照射光の波長λを４００ｎｍ〜１２００ｎｍの範囲で５０ｎｍずつ変えてシミュレーションを行なった。
【０１３８】
図２１を参照して、照射光の波長λ＝９００ｎｍ〜１，０００ｎｍ程度の場合の電場分布は、異常透過が起こる場合に観察される分布であった。よって、電場分布のシミュレーション結果からも、図１８に示した透過スペクトルのシミュレーション結果と同様に、異常透過が波長９００ｎｍ〜１，０００ｎｍ付近で特に強く生じることが確認されたと言える。また、照射光の波長λが、たとえば１，１５０ｎｍ，１，２００ｎｍの電場分布において、ボウル型構造の開口部（ボウル型構造の縁の部分）に電場が局在するモードが確認された。
【０１３９】
図２２を参照して、ボウル型構造の最大厚さｔｐを４００ｎｍに設定した場合にも、ボウル型構造の最大厚さｔｐを３００ｎｍに設定した場合（図２１参照）と同様の電場分布が生じることが確認された。
【０１４０】
サンプルＳＰにウイルスＶが含まれている場合、ウイルスＶは、局所電場が発生している領域（電場が局所的に増強された領域）に向けて誘導される。図２１および図２２に示したように照射光の波長λに応じて電場分布が変化することから、電場が局所的に増強された領域を波長λの切り替え（変更）によって制御可能であることが分かる。このことは、波長λの切り替えによるウイルスＶの誘導制御の可能性を示唆する。
【０１４１】
より具体的に説明すると、たとえば、まず、波長λ＝１，２００ｎｍの照射光を照射する。そうすると、電場が増強されたボウル型構造の開口部に向けてウイルスＶが誘導される。その後、照射光の波長λを、たとえば１，２００ｎｍから９００ｎｍに切り替える。これにより、電場が増強された領域がボウル型構造の開口部から貫通孔１３５の壁面へと変化する。その結果、ウイルスＶがボウル型構造の開口部から貫通孔１３５に向けて誘導され、ボウル型構造内に捕捉される。なお、波長λ＝９００ｎｍの照射光は、異常透過のピーク波長にも一致しているので、ウイルスＶの誘導とともにピークシフトの検出にも好適に用いることができる。
【０１４２】
＜光誘起力＞
続いて、ウイルスＶの誘導制御をより詳細に検証するために、ウイルスＶがボウル型構造の内部または近傍に位置する場合に、検出キット１００への光照射によりウイルスＶに作用する光誘起力のシミュレーションを行なった。
【０１４３】
図２３は、光誘起力のシミュレーション条件を説明するための図である。図２３を参照して、このシミュレーションでは、ウイルスＶの直径を１００ｎｍに設定するとともに、貫通孔１３５の孔径φを３００ｎｍに設定した。ボウル型構造の鋳型となる樹脂ビーズＢの直径を６００ｎｍに設定し、ボウル型構造の最大厚さｔｐを３００ｎｍに設定した。検出キット１００への照射光の波長λとしては、８００ｎｍ，９００ｎｍ，１０００ｎｍ，１，１００ｎｍおよび１，２００ｎｍの５波長を用いた。照射光の照射強度は、１２．７［ｋＷ／ｃｍ２］とした。この照射強度は、直径１μｍの円形領域内に約０．１ｍＷの光が照射された状況に相当する。
【０１４４】
図２３に示すように、ボウル型構造の中心のＹ座標をＹ＝０とする。また、除去前の樹脂ビーズＢが位置した領域の下端のＺ座標をＺ＝０とする。ボウル型構造の上端のＺ座標は、Ｚ＝３００ｎｍである。
【０１４５】
このようなシミュレーション条件下において、実施の形態１では、以下の２通りのシミュレーションを行なった。第１のシミュレーションでは、ウイルスＶの鉛直方向の位置をＺ＝４５０ｎｍ（ボウル型構造の上端から１５０ｎｍの高さ）に固定しつつ、ウイルスＶの水平方向（Ｙ方向）の位置を変化させることで、ウイルスＶに作用する光誘起力の水平方向の位置依存性および波長依存性を求めた。第２のシミュレーションでは、ウイルスＶの水平方向の位置をＹ＝０（ボウル型構造の中心の位置）に固定しつつ、ウイルスＶの鉛直方向（Ｚ方向）の位置を変化させることで、ウイルスＶに作用する光誘起力の鉛直方向の位置依存性および波長依存性を求めた。
【０１４６】
図２４は、第１のシミュレーション結果の一例を示す図である。図２４（Ａ）および図２４（Ｂ）において、横軸は、ウイルスＶの水平方向の位置（Ｙ座標）を示す。図２４（Ａ）の縦軸は光誘起力の水平方向成分Ｆｙを示し、図２４（Ｂ）の縦軸は光誘起力の鉛直方向成分Ｆｚを示す。
【０１４７】
図２４（Ａ）を参照して、照射光の波長λが１，２００ｎｍの場合、光誘起力の水平方向成分Ｆｙは負である。すなわち、光誘起力がボウル型構造の中心に向かう方向に作用する。さらに図２４（Ｂ）を参照して、照射光の波長λが１，１００ｎｍまたは１，２００ｎｍの場合、光誘起力の鉛直方向成分Ｆｚが負である。すなわち、光誘起力がボウル型構造の下方に向けて作用することが分かる。
【０１４８】
図２５は、第２のシミュレーション結果の一例を示す図である。図２５において、横軸は、ウイルスＶの鉛直方向の位置（Ｚ座標）を示す。縦軸は、光誘起力の鉛直方向成分Ｆｚを示す。
【０１４９】
図２５を参照して、照射光の波長λが９００ｎｍまたは１，０００ｎｍの場合に、ボウル型構造の内部（Ｚ＝３００ｎｍ以下の領域）で、光誘起力の鉛直方向成分Ｆｚが負になることが分かる。ただし、すべての鉛直方向の位置で光誘起力の鉛直方向成分Ｆｚが負になる波長は存在しない。これは、ボウル型構造の下部で反射して鉛直方向上方に向かう反射光の影響によるものと考えられる。
【０１５０】
図２４（Ａ）、図２４（Ｂ）および図２５に示す例では、照射光の照射強度を１２．７［ｋＷ／ｃｍ２］に設定した場合に光誘起力の大きさがｆＮ（フェムトニュートン）オーダーとなる。光誘起力は照射強度に比例するため、照射強度を変化させることで光誘起力の制御が可能である。照射強度がたとえば１，０００倍の１２．７［ＭＷ／ｃｍ２］であると想定すると、光誘起力はｐＮ（ピコニュートン）オーダーとなる。このように、光誘起力の大きさは、照射強度の調整によりｆＮからｐＮのオーダーまで容易に制御可能である。ｐＮオーダーの光誘起力は、一般にナノ粒子に作用する重力または粘性力よりも大きく、ブラウン運動も抑制可能な大きさである。したがって、ウイルスＶ等の被検出物質を変位させることが十分に可能である。なお、ここではウイルスＶの直径を１００ｎｍに設定したが、被検出物質が大きくなると、光誘起力の大きさはさらに大きくなり得る。このように、適切な波長および照射強度の光を検出キット１００に照射することで、ウイルスＶをボウル型構造に向けて誘導したりボウル型構造内に捕捉したりすることが可能であることが分かる。
【０１５１】
＜被検出物質の検出＞
最後に、サンプルＳＰ中の被検出物質（この例ではウイルスＶ）の有無に応じた透過スペクトルの変化に関するシミュレーション結果を説明する。
【０１５２】
図２６は、被検出物質の検出時における透過スペクトルのシミュレーション条件を説明するための図である。図２６（Ａ）に示すように、サンプルＳＰの媒質である水中に球形のウイルスＶが存在し、ウイルスＶがボウル型構造内に捕捉された状況を想定する。ウイルスＶの直径は、６００ｎｍに設定した。
【０１５３】
また、金属薄膜１３２の膜厚を４０ｎｍに設定するとともに、ボウル型構造の最大厚さｔｐを０ｎｍ〜４００ｎｍの範囲内の値に設定した。そして、ウイルスＶの屈折率ｎｖを１．３３〜１．５８の範囲で変更し、各屈折率での透過スペクトルを算出した。なお、水の屈折率は１．３３であるので、ｎｖ＝１．３３で示したシミュレーション結果は、ウイルスＶがサンプルＳＰに含まれなかった場合の結果に相当する。一方、一般に、ウイルスは核酸を取り囲むタンパク質の殻を有するため、ウイルスの屈折率は、タンパク率の代表的な屈折率であるｎｖ＝１．５８に近い値である。よって、ｎｖ＝１．５８で示したシミュレーション結果は、ウイルスＶがボウル型構造内に完全に捕捉された場合の結果に相当する。
【０１５４】
さらに、図２６（Ｂ）に示すように、被検出物質であるウイルスＶと特異的に付着可能な抗体（ウイルスとの抗原抗体反応を起こす抗体）１３７がボウル型構造の表面に修飾されている構成についても検討した。ボウル型構造表面に抗体１３７を修飾することで、一旦、ボウル型構造内に捕捉されたウイルスＶを固定する（捕捉された状態を維持する）ことが可能になる。抗体１３７の高さは、２０ｎｍに設定した。なお、抗体１３７は、被検出物質と特異的に付着可能な「ホスト物質」の一例であり、ホスト物質は、被検出物質に応じて適宜変更され得る。
【０１５５】
図２７は、ボウル型構造が抗体１３７により修飾されていない場合の透過スペクトルのシミュレーション結果を示す図である。図２７に示す結果から、ボウル型構造の最大厚さｔｐとウイルスＶの屈折率ｎｖとのいずれの組合せ（ｔｐ，ｎｖ）においても、透過スペクトルのピーク波長がシフトすることが分かる。特に、ボウル型構造の最大厚さｔｐ＝４００ｎｍであり、ウイルスＶの屈折率ｎｖ＝１．５８である場合のピーク波長のシフト量は、１０５ｎｍと算出された。このシフト量は十分に大きな値（たとえば非特許文献１に記載の最大シフト量の約２倍）であり、実施の形態１によればウイルスＶを高感度に検出可能であることが分かる。
【０１５６】
図２８は、ボウル型構造が抗体１３７により修飾されている場合の透過スペクトルのシミュレーション結果を示す図である。ボウル型構造が抗体１３７により修飾されている場合も図２８に示した結果と同様に、透過スペクトルのピーク波長のシフト量が十分に大きいことが確認された。
【０１５７】
以上のように、実施の形態１によれば、自己組織化により単層膜を形成する複数の樹脂ビーズＢを鋳型として、ハニカム状に配列された複数のボウル型構造が形成される。そして、各ボウル型構造から下方に向けて、金属薄膜１３２を貫通する貫通孔１３５がウェットエッチングにより形成される。このように周期的に配列された複数の貫通孔１３５は、ナノホールアレイとして機能する。そのため、ナノホールアレイの構成に応じた波長の光を照射することで、異常透過が生じる。そして、ウイルスＶ、細菌等の被検出物質がボウル型構造内に捕捉された場合には、透過スペクトルの異常透過を示すスペクトル成分の変化（具体的にはピークシフト）が顕著に起こる。したがって、被検出物質を高精度（高感度）に検出することができる。なお、局所的透過スペクトルを複数回測定することにより、ボウル型構造毎に被検出物質が捕捉されていく様子を観測することも可能である。
【０１５８】
また、鋳型となる樹脂ビーズＢの粒子径を適宜変更することで、ボウル型構造のサイズが調整される。これにより、ボウル型構造のサイズを被検出物質に適したサイズに調整することができる。よって、所望のサイズの被検出物質を選択的に捕捉することが可能になる。
【０１５９】
さらに、たとえば非特許文献１のように乱雑なナノ突起構造（ランダムナノスパイク）が形成される構成との比較において、ボウル型構造のサイズは均一性が高い。したがって、被検出物質の検出を繰り返し行なった場合に、被検出物質の検出位置が検出毎に異なったとしても同様の結果が得られる可能性が高い。つまり、高い信頼性および再現性を実現することができる。
【０１６０】
［実施の形態２］
実施の形態１では、金属薄膜１３２を貫通する貫通孔１３５が形成された構成について説明した。しかし、ボウル型構造の下端に貫通孔が形成されていることは必須ではない。実施の形態２においては、まず、貫通孔１３５の孔径φの影響の検証結果について説明した上で、ボウル型構造の下端に貫通孔が形成されていない構成（すなわち非貫通孔が形成された構成）について説明する。なお、実施の形態２に係る検出システムの全体構成は、実施の形態１に係る検出システム１の全体構成（図２参照）と同等である。また、実施の形態２におけるウイルスの検出方法も実施の形態１における検出方法（図６参照）と同等である。
【０１６１】
＜貫通孔の孔径の影響＞
図２９は、貫通孔１３５の孔径φの影響の検証に用いたシミュレーション条件を説明するための図である。図２９を参照して、このシミュレーション例では、金属薄膜１３２の膜厚を４０ｎｍに設定した。また、ボウル型構造の鋳型となる樹脂ビーズＢの直径を１μｍに設定するとともに、ボウル型構造の最大厚さｔｐを９００ｎｍに設定した。このとき、ボウル型構造は、球体に近い球欠状の形状を有している。金属薄膜１３４はボウル型構造内にも形成され得るが、図２９（および後述する図３６）では導電性ポリマー膜１３３の屈折率が金属薄膜１３４の屈折率に等しいと仮定しているため、ボウル型構造内の金属薄膜１３４を省略している。なお、この例では、検出キット１００が空気中に置かれた状態を想定した。
【０１６２】
以上の条件の下、貫通孔１３５の孔径φが０ｎｍから４００ｎｍまでの範囲内の様々な値をとる場合について、反射スペクトル、透過スペクトルおよび吸収スペクトルをシミュレーションにより求めた。なお、これらのスペクトルの各々は、本開示に係る「光応答スペクトル」に相当する。「光応答スペクトル」とは、物質に光照射を行った際に生じる信号光の強度の波長依存性（スペクトル）、または、信号今日の強度変化の波長依存性（スペクトル）を意味する。光応答スペクトルの例としては反射スペクトル、透過スペクトルおよび吸収スペクトル、散乱スペクトル、消衰スペクトルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
図３０は、貫通孔１３５の孔径φの影響のシミュレーション結果を示す図である。図３０（Ａ）〜図３０（Ｃ）は、反射スペクトル、透過スペクトルおよび吸収スペクトルをそれぞれ示す。
【０１６４】
図３０（Ａ）の反射スペクトルおよび図３０（Ｃ）の吸収スペクトルを参照して、波長７２０ｎｍ付近に着目すると、孔径φが３００ｎｍまたは４００ｎｍの場合にはピークは生じない。一方、孔径φが０ｎｍ〜２００ｎｍの場合にはピークが生じ、孔径φが小さくなるに従ってピークが短波長側にシフトするとともにピーク強度が増加することが分かる。このように、貫通孔が形成されていない場合（孔径φが０ｎｍである非貫通孔が形成されている場合）であってもスペクトルのピークシフトを検出することが可能である。
【０１６５】
なお、図２９および図３０に示した例では、照射光の波長範囲が４００ｎｍ〜１，２００ｎｍ程度であるのに対し、ボウル型構造の直径は１μｍである。このようにボウル型構造の直径と照射光の波長とが同じオーダーである場合に、ボウル型構造の直径が照射光の波長と「同程度」であると言える。より具体的には、ボウル型構造の直径が照射光の波長の１０分の１〜１０倍程度の範囲内、好ましくは数分の１〜数倍程度の範囲内、より好ましくは２分の１〜２倍程度の範囲内である場合に、ボウル型構造の直径が照射光の波長と「同程度」であると言うことができる。
【０１６６】
＜電場分布＞
図３１は、貫通孔１３５の孔径φに応じた電場分布のシミュレーション結果を示す図である。図３０（Ａ）および図３０（Ｃ）に示した結果から、照射光の波長λを７２０ｎｍに設定した。図３１（Ａ）は、孔径φが３００ｎｍの貫通孔１３５が形成されている場合のシミュレーション結果を示し、図３１（Ｂ）は、貫通孔１３５が形成されていない場合（孔径φが０ｎｍの非貫通孔の場合）のシミュレーション結果を示す。図３１（Ａ）および図３１（Ｂ）では、電場の絶対値を画像の濃淡で示している。
【０１６７】
図３１（Ａ）および図３１（Ｂ）を参照して、各シミュレーション結果の右側のスケールバーに記載の数値を比較すると、貫通孔１３５が形成されていない場合の方が、貫通孔１３５が形成されている場合と比べて、電場がボウル型構造内に強く閉じ込められた状態であることが分かる。これは、貫通孔１３５が形成されていない場合には、ボウル型構造の内壁面で光と表面プラズモンとの相互作用により光が多重反射して定在波が生じ、ウィスパリングギャラリーモードと同様の共振現象が起こっているためと考えられる。
【０１６８】
＜検出キットの製造フロー＞
図３２は、実施の形態２における検出キット２００の製造方法を説明するためのフローチャートである。図３３は、検出キット２００の製造方法の概略工程図である。
【０１６９】
図３２および図３３（Ａ）〜図３３（Ｄ）を参照して、Ｓ３０１〜Ｓ３０４の処理は、実施の形態１におけるＳ２０１〜Ｓ２０４の処理とそれぞれ同等である（図７および図８（Ａ）〜図８（Ｄ）参照）。基板２３１および金属薄膜２３２は、実施の形態１における基板１３１および金属薄膜１３２にそれぞれ相当する。よって、詳細な説明は繰り返さない。
【０１７０】
実施の形態２では、樹脂ビーズＢの除去後、Ｓ３０５において、金属薄膜２３２に貫通孔を形成するためのウェットエッチングが行なわれることなく、導電性ポリマー膜２３３上に金属薄膜２３４が形成される（図３３（Ｅ）参照）。金属薄膜２３４は、実施の形態１における金属薄膜１３２と同様に、たとえばイオンスパッタリング法により形成することができる。
【０１７１】
ただし、金属薄膜１３４の形成には、真空蒸着法または無電解メッキ法を用いてもよい。無電解メッキ法を用いる場合には、導電性ポリマー膜２３３は必須ではない。すなわち、Ｓ３０２における自己組織化による樹脂ビーズＢの単層膜の形成後、導電性ポリマー膜２３３の形成処理（Ｓ３０３の処理）に代えて無電解メッキを行なってもよい。これにより、導電性ポリマー膜２３３に相当する構造と、金属薄膜１３４に相当する構造とを同時に形成することができる。この場合には、本開示に係る「第２の薄膜」と「第３の薄膜」とが一体的に形成されることになる。
【０１７２】
＜開口径の制御＞
以上のような検出キット２００の製造方法において、本発明者らは、ボウル型構造の開口部の大きさ（開口径）が制御可能であることを見出した。
【０１７３】
図３４は、ボウル型構造の開口径の制御手法を説明するための図である。なお、図３４には、検出キット２００にポリピロール膜などの導電性ポリマー膜を形成するための工程が示されている。検出キット２００のうち、測定ウェル２３０（より詳細には金属薄膜２３２）以外の構成は、実施の形態１における検出キット１００の対応する構成（図３〜図５参照）と同等である。すなわち、基板２３１、底部２１０および壁部２２０は、実施の形態１に係る検出キット１００の基板１３１、底部１１０および壁部１２０にそれぞれ相当する。
【０１７４】
前述のように、導電性ポリマー膜は、電解重合法を用いて形成することができる。より詳細には、導電性ポリマー膜を形成においては、図７および図８（Ｃ）にて説明したように、モノマー（ピロール等）を含む電解液により検出キット２００が満たされた状態において、陽極としての金属薄膜２３２と、陰極としてのリング状の白金電極２９０との間が通電される。この通電後に、測定ウェル２３０の縁付近（Ａ地点で示す）、測定ウェル２３０の中心付近（Ｃ地点で示す）、および、測定ウェル２３０の縁と中心との間（Ｂ地点で示す）の３地点について、導電性ポリマー膜上に形成されたボウル型構造の形状を比較した。なお、鋳型とする樹脂ビーズＢの粒子径は、１μｍとした。
【０１７５】
図３５は、ボウル型構造の開口径の制御結果を示す図である。図３５（Ａ）〜図３５（Ｃ）は、Ａ地点〜Ｃ地点におけるボウル型構造の形状をそれぞれ示すＦＥ−ＳＥＭ像である。Ａ地点におけるボウル型構造の開口径（直径）は、４１７ｎｍであった。Ｂ地点におけるボウル型構造の開口径は、７４７ｎｍであった。Ｃ地点におけるボウル型構造の開口径は、７０９ｎｍであった。Ａ地点〜Ｃ地点では、導電性ポリマー膜と白金電極２９０との間の距離が互いに異なる。図３５に示した画像によれば、導電性ポリマー膜と白金電極２９０との間の距離を適宜調整することによって、ボウル型構造の開口径を制御可能であることが分かる。
【０１７６】
＜被検出物質の検出＞
図３６は、ウイルスＶ等の被検出物質の検出時における吸収スペクトルのシミュレーション条件を説明するための図である。図３６（Ａ）および図３６（Ｂ）に示すように、サンプルＳＰの媒質としての空気中または水中に球形のウイルスＶが存在し、ウイルスＶがボウル型構造内に捕捉された状況を想定する。ウイルスＶの直径は、５００ｎｍに設定した。また、ボウル型構造の最大厚さｔｐを８５０ｎｍに設定した。
【０１７７】
図３７は、被検出物質の検出時における吸収スペクトルのシミュレーション結果を示す図である。図３７（Ａ）は空気中でのシミュレーション結果を示し、図３７（Ｂ）は水中でのシミュレーション結果を示す。なお、このシミュレーションでは、ボウル型構造の内面が金属薄膜２３２により被覆されており、その金属薄膜２３２によりボウル型構造内の光が全反射されると仮定した。よって、導電性ポリマー膜２３３の屈折率として金属薄膜２３２の材料（具体的には金）の屈折率を設定した。
【０１７８】
図３７（Ａ）および図３７（Ｂ）を参照して、空気中であっても水中であっても、被検出物質の屈折率が高くなるに従って吸収スペクトルのピーク波長が長波長側にシフトする。また、吸収スペクトルのピークは被検出物質の屈折率に応じて互いに明確に区別され、異なる屈折率間でのピークの重なりは十分に小さい。したがって、実施の形態２の構成によっても被検出物質を好適に検出可能であることが分かる。
【０１７９】
図３７（Ａ）および図３７（Ｂ）では吸収スペクトルでのシミュレーション結果の一例を示したが、たとえば反射スペクトルまたは消衰スペクトルにおいても同様の結果を得ることができる。また、これらのシミュレーション結果の妥当性は、以下に説明するように、実際の測定結果によって裏付けられる。なお、反射スペクトルおよび消衰スペクトルの測定時には、対物レンズ８２および分光器９の位置が図２に示した位置から適宜変更される。たとえば、反射スペクトルの測定時には、対物レンズ８２が検出キット１００よりも上方に設置される。このような場合の検出システムの光学系としては、従来公知の光学系を採用することができる。
【０１８０】
図３８は、実施の形態２における消衰スペクトルの測定結果の一例を説明するための図である。図３８では、導電性ポリマー膜２３３の電解重合時間を１０秒〜４０秒で示している。電解重合時間が４０秒の場合には、ボウル型構造の最大厚さｔｐが樹脂ビーズＢの半径よりも大きくなるため、ボウル型構造が半球状よりも大きくなる。このような場合に、消衰スペクトルの波長７４０ｎｍ付近にピークが生じることが図３８から確認された。また、このピーク波長（７４０ｎｍ）は、図３０（Ａ）および図３０（Ｃ）に示したシミュレーション結果でのピーク波長（７２０ｎｍ）と、ある程度一致している。
【０１８１】
＜橋部構造の影響＞
図３６に示したシミュレーションモデルの断面図では、隣接するボウル型構造間の上面（Ｚ方向上方の面）が平坦である。しかしながら、たとえば図３５（Ａ）および図３５（Ｃ）のＦＥ−ＳＥＭ像に明確に示されているように、実際には、隣接するボウル型構造間の形状は、鋳型となる樹脂ビーズＢの形状を反映して曲率を有する。隣接するボウル型構造間の形状の断面を考えると、あるボウル型構造と隣のボウル型構造との間の上面には、橋が架かったような構造が形成されている。この構造を以下では「橋部構造」と称する。吸収スペクトルのシミュレーション精度をさらに向上させるため、橋部構造がシミュレーション結果に与える影響について検討した。
【０１８２】
図３９は、橋部構造に関する吸収スペクトルのシミュレーション条件を説明するための図である。図３９（Ａ）には、橋部構造を考慮しないシミュレーションモデル（図３６に示したモデルと同等のモデル）を比較のために示す。図３９（Ｂ）に示されたシミュレーションモデルが橋部構造を考慮したモデルである。
【０１８３】
図３９（Ｂ）に示されるように、橋部構造は、導電性ポリマー膜２３３Ａと、その上面に形成された金属薄膜２３４Ａとからなる構造である。この例では、導電性ポリマー膜２３３Ａおよび金属薄膜２３４Ａの膜厚を、いずれも４０ｎｍとした。また、金属薄膜２３２の膜厚を４０ｎｍに設定し、導電性ポリマー膜２３３の膜厚を７００ｎｍに設定した。導電性ポリマー膜２３３の上面かつ隣接するボウル型構造の間には、厚さ１００ｎｍの金属薄膜２３４が形成されているとした。さらに、ボウル型構造の直径を１μｍに設定し、隣接するボウル型構造の中心間距離（あるいはボウル型構造の周期）を１．１μｍに設定した。
【０１８４】
このようなシミュレーションモデルの妥当性を検証するため、まず、測定対象とするボウル型構造の位置を変化させ、複数の測定位置における吸収スペクトルを測定した。
【０１８５】
図４０は、測定対象とするボウル型構造の位置を変化させた場合の吸収スペクトルの測定結果を示す図である。ボウル型構造の開口径は、３００ｎｍ〜４００ｎｍの範囲内であった。図４０（Ａ）〜図４０（Ｃ）には、３箇所の測定位置における吸収スペクトルが示されている。図４０（Ｄ）には、図４０（Ａ）〜図４０（Ｃ）の吸収スペクトルを波長毎に平均したものが示されている。図４０に示す測定結果より、測定位置に依らず、波長７４０ｎｍ付近に急峻なピークが存在することが確認された。
【０１８６】
図４１は、橋部構造の影響のシミュレーション結果を示す図である。図４１には、ボウル型構造の開口径を１００ｎｍから９００ｎｍまでの間の様々な値に設定したときの各開口径における吸収スペクトルのシミュレーション結果が示されている。図４１は、図４０と対比される。
【０１８７】
図４１を参照して、ボウル型構造の開口径が２００ｎｍ、３００ｎｍまたは４００ｎｍである場合に、波長７５０ｎｍ付近にピークが確認された。このことから、ボウル型構造の開口径がシミュレーション条件と実測条件とで同等である場合に、シミュレーション結果（ピーク波長：７５０ｎｍ）が実測結果（ピーク波長：７４０ｎｍ）とよく一致していると言える。
【０１８８】
以上のように、実施の形態２によれば、ボウル型構造が半球状よりも大きい場合には、ボウル型構造の下端に貫通孔が形成されていない構成においても、電場がボウル型構造内に強く閉じ込められる。これにより、被検出物質がボウル型構造内に存在する場合と、被検出物質がボウル型構造内に存在しない場合とでは、スペクトルに顕著な変化が生じる。したがって、被検出物質を高精度に検出することができる。
【０１８９】
また、導電性ポリマー膜と白金電極２９０との間の距離を調整することによってボウル型構造の開口径を制御可能であり、ボウル型構造の上面に形成される橋部構造を制御も可能である。橋部構造の影響を考慮することにより、吸収スペクトルのシミュレーション結果を実測結果との一致度合いを一層向上させることができる。このようにシミュレーション精度が向上することで、たとえば、所望の波長にピークを有する吸収スペクトル（透過スペクトル、消衰スペクトルであってもよい）を与えるボウル型構造を高精度に設計することが可能になる。
【０１９０】
今回開示された実施の形態は、すべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本開示の範囲は、上記した実施の形態の説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【符号の説明】
【０１９１】
１  検出システム、２  ＸＹＺ軸ステージ、３  調整機構、４  サンプル供給装置、５  レーザ光源、６  分光光源、７  光学部品、８１，８２  対物レンズ、９  分光器、１００，２００  検出キット、１１０，２１０  底部、１２０，２２０  壁部、１３０，２３０  測定ウェル、１３１，２３１  基板、１３２，１３４，２３２，２３４，２３４Ａ，８００，９００  金属薄膜、１３３，２３３，２３３Ａ  導電性ポリマー膜、１３５，１３５Ａ，１３５Ｂ  貫通孔、１３６，２３６  内壁面、１３７  抗体、３００  制御装置、８１０，９１０  ナノホール、Ｂ  樹脂ビーズ、Ｖ  ウイルス、ＳＰ  サンプル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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