(57)【要約】【課題】アレルギー疾患の治療の効果を判定するための判定キット、アレルギー疾患の治療の効果を判定するためのデータの取得方法、アレルギー疾患の治療剤、および、アレルギー疾患の治療剤のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】ＴＡＦＩタンパク質を検出するための試薬を含んでいる、アレルギー疾患の治療の効果を判定するための判定キットを用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＡＦＩタンパク質を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする、アレルギー疾患の治療の効果を判定するための判定キット。
【請求項２】
上記ＴＡＦＩタンパク質は、以下の（１）または（２）のタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の判定キット：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣＣＬ５および／またはＣＣＬ８のｍＲＮＡの発現抑制活性を有するタンパク質。
【請求項３】
上記アレルギー疾患は、花粉症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、または、気管支喘息である、請求項１または２に記載の判定キット。
【請求項４】
上記アレルギー疾患の治療は、免疫療法、薬物療法、外科的手術療法、食事療法、または、運動療法である、請求項１〜３の何れか１項に記載の判定キット。
【請求項５】
生体から取得された試料中のＴＡＦＩタンパク質を検出する検出工程を有することを特徴とする、アレルギー疾患の治療の効果を判定するためのデータの取得方法。
【請求項６】
ＴＡＦＩタンパク質を有効成分として含有していることを特徴とする、アレルギー疾患の治療剤。
【請求項７】
投与剤型が、点眼剤、点鼻剤、軟膏剤、または、吸入剤であることを特徴とする、請求項６に記載の治療剤。
【請求項８】
生体から取得された細胞に、被検物質を接触させる工程と、
上記細胞におけるＴＡＦＩタンパク質の発現を検出する工程と、を有する、アレルギー疾患の治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー疾患の治療の効果を判定するための判定キット、アレルギー疾患の治療の効果を判定するためのデータの取得方法、アレルギー疾患の治療剤、および、アレルギー疾患の治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、世界規模の工業化に伴って、環境の変化、および、生活様式の変化が進み、その結果、アレルギー疾患を患う患者が急増している。
【０００３】
アレルギー疾患は、生体にとって本来無害な外来抗原に対して免疫系が過剰に反応することによって生じる疾患である。スギ花粉症もアレルギー疾患の一種であり、その主な原因は、スギ花粉に含まれる抗原性物質であると言われている。大気中に飛散したスギ花粉がヒトの体内に侵入すると、Ｂ細胞によって、スギ花粉に含まれる抗原性物質に対するイムノグロブリンＥ抗体（ＩｇＥ）が産生される。ＩｇＥが、肥満細胞の細胞膜上に存在する高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）に結合することによって、生体は、スギ花粉に含まれる抗原性物質に対して感作された状態となる。当該生体に再び抗原性物質が侵入し、当該抗原性物質が肥満細胞の細胞膜上に存在するＩｇＥに結合することによって、ＩｇＥとＩｇＥとの間に架橋が生じる。架橋によってシグナルが発生し、当該シグナルが肥満細胞内で伝達されることによって、肥満細胞内に蓄積されているケミカルメディエーター（例えば、ヒスタミン、および、ロイコトリエン等）が放出され（脱顆粒反応）、生体に様々なアレルギー症状を引き起こす。食物アレルギー、気管支喘息、および、アトピー性皮膚炎等の他のアレルギー疾患と同様に、スギ花粉症においても、近年重症化および低年齢化の傾向が見られ、その傾向が今後ますます深刻化していくと予想されている。
【０００４】
現在、スギ花粉症の治療は、抗アレルギー薬を用いる薬物療法が主体である。しかし、薬物療法は、基本的にアレルギーの症状を一時的に緩和する対症療法であり、根治性はないため、症状が続く限り抗アレルギー薬を飲み続ける必要がある。また、抗アレルギー薬には、副作用（例えば、眠気、倦怠感、口喝、吐気、および、消化器症状等）が少なからず存在する。重症患者にはステロイド薬が使用されるが、高い治療効果が期待できる反面、重大な副作用（例えば、緑内障、糖尿病の増悪、および、感染症の再燃等）の懸念もあり、長期に亘るステロイド薬の使用にはリスクが伴う。鼻粘膜を縮小させるレーザー手術、および、鼻汁分泌を抑制する神経切断術等の外科的な治療も行われているが、いずれも根治性はなく、効果の継続は長くても数年程度である。
【０００５】
アレルギー疾患に対して現在唯一、根治治療を望める治療法として、免疫療法がある。免疫療法は、抗原（アレルゲン）を皮下注射、舌下投与または嚥下投与することによって、抗原に対するアレルギー反応を低下させる治療法である。免疫療法は、６〜７割の患者に対して効果を有することが明らかになっている。また、免疫療法では抗原を直接生体に投与することから、過剰なアレルギー反応によるアナフィラキシーショックの発生が懸念されるが、特に、舌下免疫療法ではアナフィラキシーショックの発生頻度は低く、有効な治療法としての免疫療法が確立されつつあり、今後、その他のアレルギー疾患に対しても普及していくと考えられている（例えば、非特許文献１〜４参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Taylor A et al.,“Mechanisms of immune suppression by interleukin-10 and transforming growth factor-beta: the role of T regulatory cells.”, Immunology. 2006 Apr;117(4):433-42.
【非特許文献２】Allam JP et al.,“Phl p 5 resorption in human oral mucosa leads to dose-dependent and time-dependent allergen binding by oral mucosal Langerhans cells, attenuates their maturation, and enhances their migratory and TGF-beta1 and IL-10-producing properties.”, J Allergy Clin Immunol. 2010 Sep;126(3):638-45.
【非特許文献３】Moingeon P et al.,“Induction of tolerance via the sublingual route: mechanisms and applications.”, Clin Dev Immunol. 2012;2012:623474.
【非特許文献４】Sakashita M et al.,“Long-term sublingual immunotherapy for Japanese cedar pollinosis and the levels of IL-17A and complement components 3a and 5a.”, Cytokine. 2015 Sep;75(1):181-5.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
免疫療法などに代表されるアレルギー疾患の治療方法は、治療効果を有していることは判ってはいるが、治療効果を発揮するメカニズムに関しては、不明な点が多く残されている。
【０００８】
また、免疫療法などに代表されるアレルギー疾患の治療方法に関して、現在、当該治療方法が特定の患者にとって有効であるか否か簡便に判定する方法が無い。それ故に、治療方法が特定の患者にとって有効であるか否か判らないまま、長年にわたって治療を継続する必要があり、患者に大きな負担を強いるという問題点がある。
【０００９】
また、免疫療法などに代表されるアレルギー疾患の治療方法は、過剰なアレルギー反応によるアナフィラキシーショックを引き起こす危険性が皆無とはいえず、安全性の高い治療方法の開発が望まれている。
【００１０】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、アレルギー疾患の治療の効果を判定するための判定キット、アレルギー疾患の治療の効果を判定するためのデータの取得方法、アレルギー疾患の治療剤、および、アレルギー疾患の治療剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
免疫療法などに代表されるアレルギー疾患の治療方法が、生体内においてどのようなメカニズムで抗アレルギー効果を発揮するのかを解明できれば、抗原を直接生体に投与するというリスクを犯すことなく、花粉症等のアレルギー疾患の根治治療を行うことができる可能性がある。
【００１２】
そこで、本発明者らは、鋭意検討した結果、（ｉ）アレルギー疾患の治療を行い、当該治療が有効である場合、生体内でＴＡＦＩタンパク質の量が増加すること、および、（ｉｉ）ＴＡＦＩタンパク質を投与すると、生体内におけるアレルギー反応を抑制できること、を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係るアレルギー疾患の治療の効果を判定するための判定キットは、ＴＡＦＩタンパク質を検出するための試薬を含んでいることを特徴としている。
【００１４】
本発明の一態様に係る判定キットでは、上記ＴＡＦＩタンパク質は、以下の（１）または（２）のタンパク質であることが好ましい：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣＣＬ５および／またはＣＣＬ８のｍＲＮＡの発現抑制活性を有するタンパク質。
【００１５】
本発明の一態様に係る判定キットでは、上記アレルギー疾患は、花粉症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、または、気管支喘息であることが好ましい。
【００１６】
本発明の一態様に係る判定キットでは、上記アレルギー疾患の治療は、免疫療法、薬物療法、外科的手術療法、食事療法、または、運動療法であることが好ましい。
【００１７】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係るアレルギー疾患の治療の効果を判定するためのデータの取得方法は、生体から取得された試料中のＴＡＦＩタンパク質を検出する検出工程を有することを特徴としている。
【００１８】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係るアレルギー疾患の治療剤は、ＴＡＦＩタンパク質を有効成分として含有していることを特徴としている。
【００１９】
本発明の一態様に係る治療剤では、投与剤型が、点眼剤、点鼻剤、軟膏剤、または、吸入剤であることが好ましい。
【００２０】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係るアレルギー疾患の治療剤のスクリーニング方法は、生体から取得された細胞に、被検物質を接触させる工程と、上記細胞におけるＴＡＦＩタンパク質の発現を検出する工程と、を有していることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の一態様によれば、短期間で、かつ、客観的に、アレルギー疾患の治療方法が患者にとって有効であるか否か判定することができる。このことは、採用している治療方法を続けるべきか、別の治療方法を採用すべきか、短期間で判定することを可能とし、これによって、患者が被る肉体的負担および経済的負担を軽減することができる。
【００２２】
ＴＡＦＩタンパク質は、鼻粘膜線維芽細胞におけるアレルギー反応を誘発する化学物質（サイトカイン）の産生抑制効果、および、肥満細胞の脱顆粒反応によるヒスタミン遊離抑制効果を有しているため、本発明の一態様によれば、アレルギー疾患全般を治療できるのみならず、根治性のある治療方法を提供することができる。
【００２３】
本発明の一態様によれば、抗原（アレルゲン）ではなく、ＴＡＦＩタンパク質を用いるので、安全な治療方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の実施例において、舌下免疫治療法が施されたスギ花粉症患者における、血漿中ＴＡＦＩタンパク質の濃度の経年的変化を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例において、スギ花粉症患者における、補体（Ｃ３ａ）の濃度と、血漿中ＴＡＦＩタンパク質の濃度との相関を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例において、ヒト鼻粘膜繊維芽細胞に対するＴＡＦＩタンパク質の効果を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例において、ヒト肥満細胞の脱下顆粒反応に対するＴＡＦＩタンパク質の効果を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例において、ヒト気道上皮細胞のアレルギー炎症反応に対するＴＡＦＩタンパク質の効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。
【００２６】
〔１．アレルギー疾患の治療の効果を判定するための判定キット〕
本発明者らは、アレルギー患者（具体的には、スギ花粉症患者）を対象として免疫療法（具体的には、舌下免疫療法）によるスギ花粉の投与を行い、当該アレルギー患者の血漿中のタンパク質解析を行った。その結果、本発明者らは、免疫療法を行った後に特異的に血漿中の量が増加するタンパク質として、ＴＡＦＩタンパク質を見出した。更に、本発明者らは、血漿中のＴＡＦＩタンパク質の濃度は、アレルギー症状の病勢を反映する補体（Ｃ３ａ）の濃度との間に有意な逆相関関係を有していることを見出した。すなわち、血漿中のＴＡＦＩ濃度を測定することで、アレルギー疾患の治療の効果を判定することが可能である。
【００２７】
それ故に、本実施の形態のアレルギー疾患の治療の効果を判定するための判定キットは、ＴＡＦＩ（Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor）タンパク質を検出するための試薬を含んでいる。
【００２８】
上記試薬は、ＴＡＦＩタンパク質自体を検出するものであってもよいし、ＴＡＦＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を検出するものであってもよい。
【００２９】
試薬によって検出されるＴＡＦＩタンパク質としては、例えば、ヒト由来のＴＡＦＩタンパク質、および、ヒト由来のＴＡＦＩタンパク質に変異が生じた変異タンパク質を挙げることができる。また、上記ＴＡＦＩタンパク質としては、例えば、ヒト以外の生物種（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ等の哺乳類）由来のＴＡＦＩタンパク質、および、ヒト以外の生物種由来のＴＡＦＩタンパク質に変異が生じた変異タンパク質を挙げることができる。
【００３０】
より具体的に、上記ＴＡＦＩタンパク質は、以下の（１）または（２）のタンパク質であることが好ましい：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣＣＬ５（換言すれば、ＲＡＮＴＥＳ）および／またはＣＣＬ８（換言すれば、ＭＣＰ−２）のｍＲＮＡの発現抑制活性を有するタンパク質。
【００３１】
なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とは、ヒトのＴＡＦＩタンパク質である。
【００３２】
後述する実施例に示すように、ＴＡＦＩタンパク質は、ＣＣＬ５および／またはＣＣＬ８のｍＲＮＡの発現抑制活性を有している。周知の方法にしたがって、任意のタンパク質のこれらの活性を測定し、任意のタンパク質がこれらの活性を有していれば、当該タンパク質を、ＴＡＦＩタンパク質としての活性を有するタンパク質と判定することができる。
【００３３】
具体的に、鼻粘膜線維芽細胞をＩＬ−４またはＩＬ−８にて刺激すると、ＣＣＬ５および／またはＣＣＬ８のｍＲＮＡの発現が誘導される。任意のタンパク質が加えられた鼻粘膜線維芽細胞、および、任意のタンパク質が加えられていない鼻粘膜線維芽細胞の各々を、ＩＬ−４またはＩＬ−８にて刺激する。任意のタンパク質が加えられていない鼻粘膜線維芽細胞を刺激した時に比べて、任意のタンパク質が加えられた鼻粘膜線維芽細胞を刺激した時に、ＣＣＬ５および／またはＣＣＬ８のｍＲＮＡの発現が抑制されていれば、当該任意のタンパク質を、「ＣＣＬ５および／またはＣＣＬ８のｍＲＮＡの発現抑制活性を有するタンパク質」とみなすことができる。
【００３４】
本明細書において「１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、特に限定されるものではないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により、置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは９個以下、より好ましくは８個以下、より好ましくは７個以下、より好ましくは６個以下、より好ましくは５個以下、より好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下、最も好ましくは１個以下）のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されることを意図する。
【００３５】
試薬によって検出されるＴＡＦＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチドとしては、例えば、ヒト由来のＴＡＦＩタンパク質、および、ヒト由来のＴＡＦＩタンパク質に変異が生じた変異タンパク質、をコードしているポリヌクレオチドを挙げることができる。また、上記ＴＡＦＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチドとしては、例えば、ヒト以外の生物種（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ等の哺乳類）由来のＴＡＦＩタンパク質、および、ヒト以外の生物種由来のＴＡＦＩタンパク質に変異が生じた変異タンパク質、をコードしているポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００３６】
より具体的に、上記ＴＡＦＩタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下の（３）または（４）のポリヌクレオチドであることが好ましい：
（３）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（４）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＣＣＬ５および／またはＣＣＬ８のｍＲＮＡの発現抑制活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００３７】
なお、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとは、ヒトのＴＡＦＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチドである。
【００３８】
本明細書において、用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成され、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成されない条件をいう。換言すれば、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件ともいえる。
【００３９】
例えば、一例を示すと、０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６〜２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う条件を挙げることができる。
【００４０】
他の例としては、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほど、特異性の高いハイブリダイズとなる。ただし、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間等）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。このことは、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（2001）等に記載されている。
【００４１】
本実施の形態の判定キットでは、上記アレルギー疾患は、Ｉ型アレルギーであることが好ましく、より具体的に、花粉症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、または、気管支喘息であることが好ましい。
【００４２】
本実施の形態の判定キットでは、上記アレルギー疾患の治療は、免疫療法、薬物療法、外科的手術療法、食事療法、または、運動療法であることが好ましい。
【００４３】
上記免疫療法は、（ｉ）アレルゲンの舌下投与、嚥下投与または皮下投与により行う減感作療法、または、（ｉｉ）自然免疫リガンドを利用した免疫活性療法であってもよい。これらの免疫療法の中では、アレルゲンの舌下投与または嚥下投与により行う減感作療法が好ましい。その理由は、当該減感作療法は、安全かつ副作用の危険性が低い免疫療法だからである。
【００４４】
上記ＴＡＦＩタンパク質を検出するための試薬は、ＴＡＦＩタンパク質を検出することができるものであればよく、その構成は、特に限定されない。上記試薬は、例えば、ＴＡＦＩタンパク質自体を検出するものであってもよいし、ＴＡＦＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を検出するものであってもよい。
【００４５】
上記試薬がＴＡＦＩタンパク質自体を検出するものである場合、当該試薬は、ＴＡＦＩタンパク質と特異的に相互作用する物質であることが好ましい。
【００４６】
ＴＡＦＩタンパク質と特異的に相互作用する物質としては、例えば、抗ＴＡＦＩタンパク質抗体、または、ＴＡＦＩ結合タンパク質（例えば、プラスミノーゲン）を挙げることができる。
【００４７】
抗ＴＡＦＩタンパク質抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。また、当該抗体は、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような、抗体フラグメントであってもよい。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、完全な抗体のＦｃを欠いており、結合の特異性が向上しているため、好ましい（Wahlら、J. Nucl. Med., 24：316-325（1983））。
【００４８】
抗ＴＡＦＩタンパク質抗体としては、市販の抗体を用いることも可能であるし、周知の方法にて作製した抗体を用いることも可能である。
【００４９】
抗ＴＡＦＩタンパク質抗体は、例えば、ＨａｒＬｏｗらの「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）」、岩崎らの「単クローン抗体  ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ，講談社（１９９１）」に記載の方法にしたがって作製することができる。
【００５０】
上記試薬がＴＡＦＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を検出するものである場合、当該試薬は、（ｉ）ＴＡＦＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ、または、（ｉｉ）ＴＡＦＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーセットであることが好ましい。
【００５１】
上述したように、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとは、ヒトのＴＡＦＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチドである。
【００５２】
例えば、（ｉ）に記載のプローブは、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブであり得、より具体的に、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドの少なくとも一部からなるプローブであり得る。
【００５３】
一方、（ｉｉ）に記載のプライマーセットは、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーセットであり得、より具体的に、（ａ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部からなるフォワードプライマーと、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドの少なくとも一部からなるリバースプライマーと、を含むプライマーセットであり得る。
【００５４】
ＴＡＦＩタンパク質自体の検出（より具体的に、ＴＡＦＩタンパク質の試料中の濃度の検出）には、具体的な方法として、イムノアッセイ法（例えば、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）、または、ＩＲＭＡ（Immunoradiometric assay）等）、または、ウエスタンブロット法を採用すればよい。より感度が高く簡便であるという観点から、上述した方法の中では、イムノアッセイ法を採用することが好ましい。以下に、これらの方法を採用する実施形態の一例を示すが、本発明は、勿論これらの例に限定されない。
【００５５】
（例１）
イムノアッセイ法を採用する場合の一実施形態では、例えば、試料中に含まれるタンパク質を支持体（例えば、マルチウエルプレート、または、ビーズ）上に固定化し、その後、ＴＡＦＩタンパク質と特異的に相互作用する物質（以下、物質Ａと呼ぶ）を、支持体上に固定化されたＴＡＦＩタンパク質に結合させる。次いで、標識（例えば、アルカリフォスファターゼ、または、ペルオキシダーゼ）が付与された抗体を、物質Ａに結合させる。最後に、物質Ａに結合している標識を検出することによって、ＴＡＦＩタンパク質を検出（より具体的には、ＴＡＦＩタンパク質の試料中の濃度を算出）すればよい。
【００５６】
（例２）
イムノアッセイ法を採用する場合の別の実施形態では、例えば、ＴＡＦＩタンパク質と特異的に相互作用する物質（以下、物質Ｂと呼ぶ）を支持体上に固定化する。次いで、当該支持体に生体から取得された試料を加え、支持体上に固定化された物質ＢにＴＡＦＩタンパク質を結合させる。次いで、標識（例えば、アルカリフォスファターゼ、または、ペルオキシダーゼ）が付与された抗体を、ＴＡＦＩタンパク質に結合させる。最後に、ＴＡＦＩタンパク質に結合している標識を検出することによって、ＴＡＦＩタンパク質を検出（より具体的には、ＴＡＦＩタンパク質の試料中の濃度を算出）すればよい。なお、上記抗体および物質Ｂは、各々、ＴＡＦＩタンパク質の異なる部位と相互作用するものである。
【００５７】
（例３）
イムノアッセイ法を採用する場合の別の実施形態では、例えば、ＴＡＦＩタンパク質に結合する抗体を支持体上に固定化する。次いで、当該支持体に生体から取得された試料を加え、支持体上に固定化された抗体にＴＡＦＩタンパク質を結合させる。次いで、標識（例えば、アルカリフォスファターゼ、または、ペルオキシダーゼ）が付与された、ＴＡＦＩタンパク質と特異的に相互作用する物質（以下、物質Ｃと呼ぶ）を、ＴＡＦＩタンパク質に結合させる。最後に、ＴＡＦＩタンパク質に結合している標識を検出することによって、ＴＡＦＩタンパク質を検出（より具体的には、ＴＡＦＩタンパク質の試料中の濃度を算出）すればよい。なお、上記抗体および物質Ｃは、各々、ＴＡＦＩタンパク質の異なる部位と相互作用するものである。
【００５８】
（例４）
イムノアッセイ法を採用する場合の別の実施形態では、例えば、ＴＡＦＩタンパク質と特異的に相互作用する物質（以下、物質Ｄと呼ぶ）を支持体上に固定化する。次いで、当該支持体に取得された試料を加え、支持体上に固定化された物質ＤにＴＡＦＩタンパク質を結合させる。次いで、標識（例えば、アルカリフォスファターゼ、または、ペルオキシダーゼ）が付与された、ＴＡＦＩタンパク質と特異的に相互作用する物質（以下、物質Ｅと呼ぶ）を、ＴＡＦＩタンパク質に結合させる。最後に、ＴＡＦＩタンパク質に結合している標識を検出することによって、ＴＡＦＩタンパク質を検出（より具体的には、ＴＡＦＩタンパク質の試料中の濃度を算出）すればよい。なお、上記物質Ｄおよび物質Ｅは、各々、ＴＡＦＩタンパク質の異なる部位と相互作用するものである。
【００５９】
（例５）
ウエスタンブロット法を採用する場合の一実施形態では、例えば、生体から取得された試料中に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した後、当該タンパク質をニトロセルロース膜等に転写する。次いで、ニトロセルロース膜に転写されたＴＡＦＩタンパク質に、当該ＴＡＦＩタンパク質と特異的に相互作用する物質（以下物質Ｆと呼ぶ）を結合させる。次いで、標識（例えば、アルカリフォスファターゼ、または、ペルオキシダーゼ）が付与された抗体を、物質Ｆに結合させる。最後に、物質Ｆに結合している標識を検出することによって、ＴＡＦＩタンパク質を検出（より具体的には、ＴＡＦＩタンパク質の血液中の濃度を算出）すればよい。
【００６０】
本実施の形態の判定キットには、ＴＡＦＩタンパク質と特異的に相互作用する物質が固定化された支持体が備えられていてもよい。当該支持体としては、例えば、イムノアッセイ用のプレート、および、イムノアッセイ用のビーズを挙げることができる。
【００６１】
上記支持体を形成する材料は、ＴＡＦＩタンパク質と特異的に相互作用する物質を支持体上の固定化し得るものであればよく、特に限定されない。支持体を形成する材料としては、例えば、無機系材料（例えば、ガラス、および、シリコンウエハ）、天然高分子（例えば、紙）、合成高分子（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、および、ポリスチレン）、並びに、天然高分子および／または合成高分子によって形成されたゲル、を挙げることができる。
【００６２】
ＴＡＦＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の検出（より具体的に、ＴＡＦＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチドの試料中の濃度の検出）には、具体的な方法として、ＲＴ−ＰＣＲ法、または、ノーザンブロット法を採用すればよい。より感度が高く簡便であるという観点から、上述した方法の中では、ＲＴ−ＰＣＲ法を採用することが好ましい。ＲＴ−ＰＣＲ法、または、ノーザンブロット法は、周知の方法にしたがって行うことができる。
【００６３】
上記判定は、例えば、被験者から採取された試料（例えば、血液、または、血漿）中のＴＡＦＩタンパク質の量と、対照群から採取された試料中のＴＡＦＩタンパク質の量とを比較し、両者の違いを検出することによって行うことができる。
【００６４】
この場合、対照群から採取された試料としては、治療開始前の被験者から採取された試料を用いることが可能である。当該試料としては、（ｉ）バイオプシ等で採取した、治療開始前の、アレルギー疾患に罹患した患者の組織の一部、または、（ｉｉ）治療開始前の、アレルギー疾患に罹患した患者の体液中に存在する細胞等、から常法に従って調製されるタンパク質を用いることができる。なお、ここでいう「アレルギー疾患に罹患した患者」とは、少なくともアレルギー疾患の自覚症状があり、好ましくは、他の検査方法の結果が、例えば、ＩｇＥ（ＲＡＳＴ）値異常、各種特異的ＩｇＥ（ＲＩＳＴ）値異常、皮内テスト陽性、プリックテスト陽性、もしくは鼻汁中、喀痰中、耳漏中好酸球陽性であり、アレルギー疾患であると診断された患者をいう。なお、当該「アレルギー疾患に罹患した患者」を、本明細書では単に患者という場合もある。
【００６５】
スギ花粉症の治療におけるＴＡＦＩタンパク質の量の比較の場合、年間の花粉飛散ピーク時から６箇月前に血液を採取して当該血液を治療開始前の試料とし、当該試料を採取した後に治療を開始し、治療を開始して６箇月後の年間の花粉飛散ピーク時に再び血液を採取して治療開始後の試料とする。または、花粉飛散前後に関わらず、治療開始前、および、治療開始６箇月後〜１年後の血液を採取して、それぞれを治療開始前の試料、および、治療開始後の試料とする。それらを同一の測定条件下で測定して得られたＴＡＦＩタンパク質の量の値を比較すればよい。
【００６６】
治療開始後の被験者から採取された試料中のＴＡＦＩタンパク質のタンパク質レベルが、治療開始前の被検者から採取された試料中のＴＡＦＩタンパク質のレベルと比較して多ければ、好ましくは１．５倍以上多ければ、より好ましくは２．０倍以上多ければ、より好ましくは２．５倍以上多ければ、最も好ましくは３倍以上多ければ、アレルギー疾患の治療効果が（現時点および将来的に）あると判定することができる。
【００６７】
〔２．アレルギー疾患の治療の効果を判定するためのデータの取得方法〕
本実施の形態のアレルギー疾患の治療の効果を判定するためのデータの取得方法は、生体から取得された試料中のＴＡＦＩタンパク質を検出する検出工程を有している。
【００６８】
上記ＴＡＦＩタンパク質、上記アレルギー疾患、上記治療方法、および、上記検出方法については、上述した〔１．アレルギー疾患の治療の効果を判定するための判定キット〕の欄で説明したので、ここでは、その説明を省略する。
【００６９】
アレルギー疾患を罹患した人では、生体中の補体（Ｃ３ａ）の濃度が高い。アレルギー症状が緩和されると、生体中における補体の濃度は緩和前と比べて低くなるため、補体（Ｃ３ａ）の濃度はアレルギー症状の病勢を反映しているといえる。しかしながら、補体の濃度は、アレルギー以外の様々な要因によって変化するため、アレルギー疾患の治療の効果を判定するための指標としては、不十分である。生体中のＴＡＦＩタンパク質の濃度と、アレルギー症状を呈している時の生体中の補体（Ｃ３ａ）の濃度との間には、有意な逆相関関係が存在しているため、生体から取得された試料中のＴＡＦＩタンパク質を検出することによって、アレルギー疾患の治療の効果を判定するための精度の高いデータを取得することができる。
【００７０】
治療中の生体から取得された試料中のＴＡＦＩタンパク質の量が、治療開始以前の生体から取得された試料中のＴＡＦＩタンパク質の量よりも多くなっていれば、施されている治療が生体にとって有効であると判定することができる。
【００７１】
上記検出工程では、生体から取得された試料中の、ＴＡＦＩタンパク質の量を検出してもよいし、ＴＡＦＩタンパク質の濃度を検出してもよい。また、当該試料を取得する生体は、特に限定されず、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ等の哺乳類を挙げることができる。
【００７２】
上記試料は、特に限定されず、例えば血液、唾液、リンパ液、脳脊髄液、尿、および、皮膚が挙げられる。より採取が簡便であり、ＴＡＦＩの存在が確認されているという観点から、血液が好ましい。
【００７３】
血液は、血清であってもよい。なお、血清を調製する場合には、被検体から血液を取得し、当該血液を遠心分離にかけ、遠心分離によって分離した上清を血清として取得すればよい。
【００７４】
本実施の形態のデータの取得方法は、以下のように構成することも可能である。
【００７５】
本実施の形態のデータの取得方法では、上記ＴＡＦＩタンパク質は、以下の（１）または（２）のタンパク質であることが好ましい：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣＣＬ５および／またはＣＣＬ８のｍＲＮＡの発現抑制活性を有するタンパク質。
【００７６】
本実施の形態のデータの取得方法では、上記アレルギー疾患は、花粉症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、または、気管支喘息であることが好ましい。
【００７７】
本実施の形態のデータの取得方法では、上記アレルギー疾患の治療は、免疫療法、薬物療法、外科的手術療法、食事療法、または、運動療法であることが好ましい。
【００７８】
〔３．アレルギー疾患の治療剤〕
本発明者らは、ＴＡＦＩタンパク質の機能（作用）を調べた結果、ＴＡＦＩタンパク質が、（ｉ）ヒト鼻粘膜線維芽細胞における、アレルギー反応を誘導するサイトカインの産生抑制効果、および、（ｉｉ）ヒト肥満細胞の脱顆粒反応抑制効果、を有することを見出した。このことは、ＴＡＦＩタンパク質が、抗アレルギー剤の有効成分として利用可能であることを示している。
【００７９】
それ故に、本実施の形態のアレルギー疾患の治療剤は、ＴＡＦＩタンパク質を有効成分として含有している。
【００８０】
上記ＴＡＦＩタンパク質、および、上記アレルギー疾患については、上述した〔１．アレルギー疾患の治療の効果を判定するための判定キット〕の欄で説明したので、ここでは、その説明を省略する。
【００８１】
本実施の形態のアレルギー疾患の治療剤は、治療効果をもたらす薬剤を意図する。上記治療効果とは、以下に例示される効果を意図するが、これらに限定されるものではない。
【００８２】
（ｉ）治療剤を投与しなかった場合と比較して、アレルギー疾患に係る１つ以上の症状の重症度を低減する。
【００８３】
（ｉｉ）治療剤を投与しなかった場合と比較して、アレルギー疾患に係る１つ以上の症状の重症度の増加、または進行を防止する。
【００８４】
（ｉｉｉ）治療剤を投与しなかった場合と比較して、アレルギー疾患に係る１つ以上の症状の重症度の増加速度、または進行速度を低減する。
【００８５】
なお、上記疾患に係る１つ以上の症状は、全身的なものであってもよいし、局所的なものであってもよい。
【００８６】
上記有効成分は、１つ以上の症状に対して治療効果をもたらすことのできる物質であることが好ましい。
【００８７】
上記ＴＡＦＩタンパク質は、人工的に製造されたタンパク質でもよい。ヒトまたはヒト細胞への使用を意図する場合には、ヒトＴＡＦＩ遺伝子が発現可能に挿入された発現ベクターをヒト由来の細胞に導入することによって、ＴＡＦＩタンパク質を発現させ、当該ＴＡＦＩタンパク質を精製して使用することが好ましい。また、当該発現ベクター自体を、治療剤の有効成分として用いることも可能である。
【００８８】
また、当該治療剤に含有されるＴＡＦＩタンパク質は、天然のＴＡＦＩタンパク質と識別可能なように、あるいは精製を容易ならしめるために、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｆｌａｇタグ、Ｍｙｃタグ等のエピトープが付加されたＴＡＦＩタンパク質であってもよい。
【００８９】
本実施の形態のアレルギー疾患の治療剤は、ＴＡＦＩタンパク質以外の成分を含有していてよい。上記ＴＡＦＩタンパク質以外の成分は、有効成分として機能するものであってもよいし、有効成分として機能しないものであってもよい。
【００９０】
上記ＴＡＦＩタンパク質以外の成分のうち、有効成分として機能するものは、アレルギー疾患に関連する症状（アレルギー疾患の症状、アレルギー疾患の合併症の症状等）に対する有効成分であってもよいし、アレルギー疾患に関連しない症状に対する有効成分であってもよい。
【００９１】
上記ＴＡＦＩタンパク質以外の成分のうち、有効成分でない成分の類型としては、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、高分子量重合体、賦形剤、担体、希釈剤、溶媒、可溶化剤、安定剤、充填剤、結合剤、界面活性剤、安定化剤等が挙げられる。
【００９２】
上記緩衝剤の例としては、リン酸またはリン酸塩、ホウ酸またはホウ酸塩、クエン酸またはクエン酸塩、酢酸または酢酸塩、炭酸または炭酸塩、酒石酸または酒石酸塩、ε−アミノカプロン酸、トロメタモール等が挙げられる。上記リン酸塩としては、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等が挙げられる。上記ホウ酸塩としては、ホウ砂、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウム等が挙げられる。上記クエン酸塩としては、クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム等が挙げられる。上記酢酸塩としては、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等が挙げられる。上記炭酸塩としては、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられる。上記酒石酸塩としては、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム等が挙げられる。
【００９３】
ｐＨ調整剤の例としては、塩酸、リン酸、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられる。
【００９４】
上記等張化剤の例としては、イオン性等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等）、非イオン性等張化剤（グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、マンニトール等）が挙げられる。
【００９５】
上記防腐剤の例としては、ベンザルコニウム塩化物、ベンザルコニウム臭化物、ベンゼトニウム塩化物、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール等が挙げられる。
【００９６】
上記抗酸化剤の例としては、アスコルビン酸、トコフェノール、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、エリソルビン酸ナトリウム、没食子酸プロピル、亜硫酸ナトリウム等が挙げられる。
【００９７】
上記高分子量重合体の例としては、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、アテロコラーゲン等が挙げられる。
【００９８】
本実施の形態のアレルギー疾患の治療剤は、上に例示した以外にも、当業者に知られている有効成分および／または医薬品用添加剤を含んでいてよい。
【００９９】
本実施の形態の治療剤に含有されている有効成分の量は、特に限定されず、例えば、治療剤を１００重量％とした場合に、０．００１重量％〜１００重量％であってもよく、０．０１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜９５重量％であってもよく、０．１重量％〜９０重量％であってもよく、０．１重量％〜８０重量％であってもよく、０．１重量％〜７０重量％であってもよく、０．１重量％〜６０重量％であってもよく、０．１重量％〜５０重量％であってもよく、０．１重量％〜４０重量％であってもよく、０．１重量％〜３０重量％であってもよく、０．１重量％〜２０重量％であってもよく、０．１重量％〜１０重量％であってもよい。
【０１００】
本実施の形態の治療剤に含有されている有効成分以外の成分の量は、特に限定されず、例えば、治療剤を１００重量％とした場合に、０重量％〜９９．９９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５重量％〜９９．９重量％であってもよく、１０重量％〜９９．９重量％であってもよく、２０重量％〜９９．９重量％であってもよく、３０重量％〜９９．９重量％であってもよく、４０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５０重量％〜９９．９重量％であってもよく、６０重量％〜９９．９重量％であってもよく、７０重量％〜９９．９重量％であってもよく、８０重量％〜９９．９重量％であってもよく、９０重量％〜９９．９重量％であってもよい。
【０１０１】
本実施の形態のアレルギー疾患の治療剤は、他の薬物と併用され得る。併用の態様は、１製剤中に、本実施の形態の治療剤と他の薬物とが配合されていてもよく、また、別々の製剤として、本実施の形態の治療剤と他の薬物とが配合されていてもよく、別々の製剤の場合には、両者を、同時、または、間隔を置いて投与してもよい。
【０１０２】
本実施の形態のアレルギー疾患の治療剤では、投与剤型が、点眼剤、点鼻剤、軟膏剤、または、吸入剤であることが好ましい。
【０１０３】
上記投与剤型の中でも、点眼剤および点鼻剤が好ましい。点眼剤および点鼻剤が好ましい理由としては、有効成分を水晶体および鼻粘膜に送達するまでの経路が短いこと、他の器官を刺激しにくいこと、侵襲がほとんどないこと、全身への影響が小さいこと（点眼後の涙点圧迫によりさらに全身への影響を抑えることができる）、投与が簡便であること、反復投与が可能であること、患者が自己管理できること等が挙げられる。このため、アレルギー疾患の治療の効果を、より迅速にすること、より増大させること等が期待できる。
【０１０４】
本実施の形態のアレルギー疾患の治療剤（例えば、点眼剤）を投与する場合、所望の効果が得られるならば、投与量に制限はない。
【０１０５】
本実施の形態のアレルギー疾患の治療剤（例えば、点眼剤）を投与する場合、所望の効果が得られるならば、投与間隔に制限はない。上記投与間隔は、通常１時間〜６箇月間に１回であり、好ましくは１時間に１回、２時間に１回、３時間に１回、６時間に１回、１２時間に１回、１日間に１回、２日間に１回、３日間に１回、４日間に１回、５日間に１回、６日間に１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１箇月間に１回、２箇月間に１回、３箇月間に１回、４箇月間に１回、５箇月間に１回、６箇月間に１回であり、より好ましくは少なくとも１日に１回、少なくとも２日間に１回、少なくとも３日間に１回、少なくとも４日間に１回、少なくとも５日間に１回、少なくとも６日間に１回、少なくとも１週間に１回である。
【０１０６】
本実施の形態のアレルギー疾患の治療剤は、以下のように構成することも可能である。
【０１０７】
本実施の形態のアレルギー疾患の治療剤では、上記ＴＡＦＩタンパク質は、以下の（１）または（２）のタンパク質であることが好ましい：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣＣＬ５および／またはＣＣＬ８のｍＲＮＡの発現抑制活性を有するタンパク質。
【０１０８】
本実施の形態のアレルギー疾患の治療剤では、上記アレルギー疾患は、花粉症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、または、気管支喘息であることが好ましい。
【０１０９】
〔４．アレルギー疾患の治療剤のスクリーニング方法〕
本実施の形態のアレルギー疾患の治療剤のスクリーニング方法は、生体から取得された細胞に、被検物質を接触させる工程と、上記細胞におけるＴＡＦＩタンパク質の発現を検出する工程と、を有している。
【０１１０】
上記アレルギー疾患については、上述した〔１．アレルギー疾患の治療の効果を判定するための判定キット〕の欄で説明したので、ここでは、その説明を省略する。
【０１１１】
上記被検物質は、アレルギー疾患の治療剤に含まれる有効成分の候補となる物質であって、その具体的な構成は、限定されない。被検物質は、低分子化合物、または、高分子化合物であってもよい。また、被検物質は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、糖、または、これらの複合体であってもよい。
【０１１２】
上記生体から取得された細胞は、ＴＡＦＩタンパク質を生産、および／または、ＴＡＦＩタンパク質を分泌する細胞であればよく、特に限定されない。取得された細胞は、生体から取得されたままの細胞であってもよいし、生体から取得された後、株化された細胞であってもよい。取得された細胞としては、例えば、肝臓細胞を挙げることができる。
【０１１３】
上記取得された細胞に、被検物質を接触させる工程は、例えば、液体培地中で培養されている細胞に被検物質を添加することによって行うことができる。液体培地は、特に限定されず、用いる細胞に応じて、適宜、選択することができる。液体培地中の被検物質の濃度は、特に限定されず、被検物質に応じて、適宜、選択することができる。
【０１１４】
本実施の形態のアレルギー疾患の治療剤のスクリーニング方法では、生体から取得された細胞に被検物質を接触させた後、必要に応じて当該細胞を更に培養し、その後、当該細胞におけるＴＡＦＩタンパク質の発現を検出する工程を行う。
【０１１５】
また、ＴＡＦＩタンパク質の発現を検出する工程では、例えば、ＴＡＦＩタンパク質自体の発現を検出してもよいし、ＴＡＦＩタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を検出してもよい。ＴＡＦＩタンパク質の発現を検出する場合には、ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法（enzyme-linked immunosorbent assay）、免疫組織化学、または、免疫蛍光抗体法等の周知の方法を用いればよい。ＴＡＦＩタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を検出する場合には、ＰＣＲ法（polymerase chain reaction）、ノーザンブロッティング法、または、in situ hybridization法等の周知の方法を用いればよい。
【０１１６】
ＴＡＦＩタンパク質の発現量が増加すれば、ＣＣＬ５およびＣＣＬ８の発現量、および、ケミカルメディエーターの放出量が低下し、アレルギー疾患の症状が抑制されると考えられる。それ故に、ＴＡＦＩタンパク質の発現を増加させることができる被検物質は、アレルギー疾患の治療剤に含有される有効成分として用いることができる。
【０１１７】
それ故に、ＴＡＦＩタンパク質の発現を検出する検出工程において、被検物質と接触していない細胞におけるＴＡＦＩタンパク質の発現量を１００％とした場合、被検物質と接触させた細胞におけるＴＡＦＩタンパク質の発現量が、１１０％以上、好ましくは１２０％以上、より好ましくは１３０％以上、より好ましくは１４０％以上、より好ましくは１５０％以上、より好ましくは１６０％以上、より好ましくは１７０％以上、より好ましくは１８０％以上、より好ましくは１９０％以上、最も好ましくは２００％以上にまで増加していれば、当該被検物質をアレルギー疾患の治療剤に含有される有効成分として選択することができる。
【０１１８】
本実施の形態のアレルギー疾患の治療剤のスクリーニング方法は、以下のように構成することも可能である。
【０１１９】
本実施の形態のスクリーニング方法では、上記ＴＡＦＩタンパク質は、以下の（１）または（２）のタンパク質であることが好ましい：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣＣＬ５および／またはＣＣＬ８のｍＲＮＡの発現抑制活性を有するタンパク質。
【０１２０】
本実施の形態のスクリーニング方法では、上記アレルギー疾患は、花粉症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、または、気管支喘息であることが好ましい。
【実施例】
【０１２１】
＜実施例１＞
福井大学耳鼻咽喉科・頭頸部外科で舌下免疫療法を行った１０名（男：女＝３：７）の患者に対して、本検討を行った。
【０１２２】
患者としては、血中のスギ特異的ＩｇＥが陽性であり、かつ、スギ花粉飛散時期（２月〜４月）に、くしゃみ、鼻水、鼻閉、および、目のかゆみ等のアレルギー症状を呈している患者を選択した。なお、気管支喘息合併患者、および、抗原特異的面免疫療法をこれまでの受けたことがある患者は、本検討から除外している。
【０１２３】
[抗原エキス（アレルゲンワクチン）]
鳥居薬品のスギ花粉抗原エキスを使用した。
【０１２４】
[投与方法]
決められた量の抗原エキス（アレルゲンワクチン）を、一つまみのパンの上に滴下し、舌下に入れて５分間保持し、その後飲み込んだ。
【０１２５】
[期間]
１０月〜４月の６ヶ月×３年間。
【０１２６】
[投与スケジュール]
投与スケジュールを、以下の表１に示す。
【０１２７】
【表１】
2018194543.tif 000002
【０１２８】
初年度の１ヶ月目は、投与量を毎日漸増させた。その後、所定の投与量に達した時点で、投与は週に１回とした。
【０１２９】
[採血]
毎年１０月と４月とに採血を行い、市販のキット（Human Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI) ELISA ; Kamiya Biomedical Compary ; KT-50885）を用いたＥＬＩＳＡ法により、血清中のＴＡＦＩタンパク質の濃度を測定した。
【０１３０】
図１に、試験結果を示す。具体的に、図１は、本発明の実施例１において、スギ花粉症患者に対する舌下免疫治療法による血漿中ＴＡＦＩタンパク質の濃度の経年的変化を示している。
【０１３１】
図１に示すように、スギ花粉症患者に対する舌下免疫治療法によって、ＴＡＦＩの血中濃度が経年的に増加した。
【０１３２】
＜実施例２＞
毎年１０月と４月とに採血を行い、市販のキット（C3a ELISA kit; BD Biosciences）を用いたＥＬＩＳＡ法により、血清中のＣ３ａタンパク質の濃度を測定した。ＴＡＦＩタンパク質の濃度は実施例１に記載した方法で測定し、ＴＡＦＩとＣ３ａとの相関関係について検討した。
【０１３３】
図２に、試験結果を示す。具体的に、図２は、スギ花粉症患者における、補体Ｃ３ａと血漿中のＴＡＦＩタンパク質濃度との相関を示している。
【０１３４】
図２に示すように、ＴＡＦＩタンパク質の血漿中の濃度が増すにしたがって、Ｃ３ａの濃度が低下することが明らかになった。
【０１３５】
＜実施例３＞
鼻手術の際に採取した下甲介粘膜（５ｍｍ３程度）を剪刀で細かく裁断し、直径１０ｃｍの培養皿に入れ、培養液（ＲＰＭＩ  １６４０（日水製薬株式会社）、１０％ウシ胎児血清（Gibco社：熱非動化処理済）、グルタミン（０.２９ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ））を用いて、５％ＣＯ２インキュベーターにて培養した。
【０１３６】
細胞が増えた時点で粘膜由来のごみ等を取り除き、細胞の最初の継代を行った。３〜４週間培養して、鼻粘膜の線維芽細胞培養株を確立した。
【０１３７】
線維芽細胞培養株を２４ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルの濃度に播き、培養を開始し、顕微鏡による目視で８割程度に細胞が増えた時点で、サイトカイン（ＩＬ−４（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ社）またはＩＬ−１３（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ社））およびＴＡＦＩタンパク質（１μｇ／ｍｌ；Abcam社；ab81749）を加えた。サイトカインを加えてから２４時間後に、NucleoSpinTM RNA II kitを用いて、ＲＮＡを回収した。ＲＮＡから一本鎖のｃＤＮＡを合成し、ＴａｑＭａｎ法を用いて、ＣＣＬ５遺伝子およびＣＣＬ８遺伝子の発現量を測定した。
【０１３８】
図３に、試験結果を示す。具体的に、図３は、本発明の実施例３において、ヒト鼻粘膜繊維芽細胞に対するＴＡＦＩタンパク質の効果を示す。
【０１３９】
図３に示すように、ＴＡＦＩタンパク質によって、ＣＣＬ５遺伝子およびＣＣＬ８遺伝子の発現量が減少した。
【０１４０】
＜実施例４＞
ヒト末梢血２５０ｍｌをボランティアから採取して、ＣＤ３４＋の血液幹細胞を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、ＭＡＣＳシステム（ミルテニーバイオテク社）を用いて分離した。
【０１４１】
分離したＣＤ３４＋の細胞を、ＳＣＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）、２−メルカプトエタノール（１１μＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有したIscove methylcellulose medium（Stem cell Tecnologies社）中で、５％ＣＯ２インキュベーターにて培養した。４週間の培養の後、ＳＣＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（１０ｍｇ／ｌ）、トランスフェリン（５．５ｍｇ／ｌ）、亜セレン酸ナトリウム（６．７μｇ／ｌ）、２−メルカプトエタノール（５５μＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有した１ｍｌのIscove modified Dulbecco medium（ＩＭＤＭ）を、細胞上に重層した。
【０１４２】
６週間の培養の後、細胞を回収し、当該細胞を、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＳＡ（０.１％）、インスリン（１０ｍｇ／ｌ）、トランスフェリン（５．５ｍｇ／ｌ）、亜セレン酸ナトリウム（６．７μｇ／ｌ）、２−メルカプトエタノール（５５μＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有したＩＭＤＭ中で更に培養し、１週間後に培養液を新しい培養液に置換した後、更に１週間の培養を行った。
【０１４３】
その後、培養液を、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＢＳ（５％）、２−メルカプトエタノール（５５μＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有したＩＭＤＭに変更し、その後は、週に一度、新しい培養液に交換した。この作業によって、ヒト肥満細胞を作製した。
【０１４４】
当該ヒト肥満細胞をヒト骨髄腫ＩｇＥで感作させ、その後、ヒトＩｇＥ特異的抗体を当該ヒト肥満細胞に加えることによって、脱顆粒反応を誘導し、脱顆粒反応の程度をβ−ヘキソサミダーゼ活性測定を行った。ＴＡＦＩタンパク質が脱顆粒反応に与える影響を検討するために、脱顆粒反応を起こす２日前にＴＡＦＩタンパク質（０.１または１μｇ／ｍｌ；Abcam社；ab81749）をヒト肥満細胞に加えて、その後、脱顆粒反応について検討した。
【０１４５】
図４に、試験結果を示す。具体的に、図４は、本発明の実施例４において、ヒト肥満細胞の脱下顆粒反応に対するＴＡＦＩタンパク質の効果を示す。
【０１４６】
図４に示すように、肥満細胞にＴＡＦＩタンパク質を加えることにより、ケミカルメディエーターの放出量が減少した。ＴＡＦＩは、肥満細胞における脱顆粒反応の抑制効果を有することが見出された。
【０１４７】
＜実施例５＞
気管および鼻粘膜の上皮細胞は、様々な刺激によってサイトカインを放出する。放出されたサイトカインは、気管および鼻粘膜などの組織におけるアレルギー炎症反応を引き起こす。気道上皮細胞は、刺激によって、ＴＳＬＰ（thymic stromal lymphopoietin）を産生することが知られている。ＴＳＬＰは、アレルギー炎症反応を強く誘導するサイトカインである。サイトカインであるＩＬ−４の存在下でウイルス感染を起こすと、ＴＳＬＰの産生が促進されることが知られている。実験的には、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）を気道上皮細胞などの細胞に投与することにより、ウイルス感染を模倣することができることが明らかになっている。
【０１４８】
そこで、気道上皮細胞におけるＩＬ−４とｄｓＲＮＡとの共刺激によって産生が促進されるＴＳＬＰの産生量に与えるＴＡＦＩタンパク質の影響（換言すれば、アレルギー炎症反応に与えるＴＡＦＩタンパク質の影響）を確認した。
【０１４９】
ヒト気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ；LONZA社）を、培養液（ＢＥＧＭ；LONZA社）を用いて５％ＣＯ２インキュベーターにて培養した。
【０１５０】
気道上皮細胞を２４ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルの濃度に播き、培養を開始し、顕微鏡による目視で８割程度に細胞が増えた時点で、ＩＬ−４（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ社）、ｄｓＲＮＡ（２５μｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ社）およびＴＡＦＩタンパク質（０、０.１または１μｇ／ｍｌ；Abcam社；ab81749）をヒト気道上皮細胞に加えて、その後、アレルギー炎症反応について検討した。
【０１５１】
図５に、試験結果を示す。具体的に、図５は、本発明の実施例５において、ヒト気道上皮細胞のアレルギー炎症反応に対するＴＡＦＩタンパク質の効果を示す。
【０１５２】
図５に示すように、気道上皮細胞にＴＡＦＩタンパク質を加えることにより、ＴＳＬＰの産生量が減少した。ＴＡＦＩは、気道上皮細胞におけるアレルギー炎症反応の抑制効果を有することが見出された。
【産業上の利用可能性】
【０１５３】
本発明は、アレルギー疾患の治療の効果を判定するための判定キットに利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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