(57)【要約】【課題】微生物によるヌートカトンの製造方法を提供すること。【解決手段】ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を含む微生物をバレンセンの存在下で培養することを特徴とする、ヌートカトンの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を含む微生物をバレンセンの存在下で培養することを特徴とする、ヌートカトンの製造方法。
【請求項２】
ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０が、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、および／または置換されたアミノ酸配列であって、配列番号１における２３１−２３５位、２７０−２７３位、および３３５−３４４位に対応する領域にそれぞれ、配列番号１と比べて０個〜数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０が、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
微生物が放線菌である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
微生物がストレプトマイセス属の放線菌である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子が導入された微生物。
【請求項７】
ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０が、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、および／または置換されたアミノ酸配列であって、配列番号１における２３１−２３５位、２７０−２７３位、および３３５−３４４位に対応する領域にそれぞれ、配列番号１と比べて０個〜数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項６記載の微生物。
【請求項８】
ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０が、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項７記載の微生物。
【請求項９】
微生物が放線菌である、請求項６〜８のいずれか１項記載の微生物。
【請求項１０】
微生物がストレプトマイセス属の放線菌である、請求項９記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物によるヌートカトンの製造方法、およびヌートカトン製造能を有する微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヌートカトンは、グレープフルーツの果皮等に存在するセスキテルペンケトン化合物であり、グレープフルーツの香り成分の１つである。ヌートカトンは、植物の二次代謝物であり、バレンセンの酸化により生じることが知られている。一方、今までに、ヌートカトンが微生物の代謝物として見出されたという報告はない。
【０００３】
ヌートカトンは、天然香料としての利用が注目されるが、グレープフルーツ中に少量しか含まれないことや、その生産がグレープフルーツの栽培情況に左右されること等の要因により、ヌートカトンの安定な供給は困難であり、費用もかかる。そこで、ヌートカトンを化学的に合成する方法や、微生物または植物を利用して製造する方法が研究されている。例えば、特許文献１は、土壌から採取された特定の菌学的性質を有するロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物にバレンセンを与えてヌートカトンに変換させている。非特許文献１では、有機相および水相からなる２液相反応系において、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のシトクロムＣＹＰ１０９Ｂ１を発現する組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）により、バレンセンをヌートカトンに変換させている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３２４５２５４号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，  ２００９，  ８：３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
天然香料として利用するためのヌートカトンの製造には、化学合成ではなく、微生物または植物等の生体触媒または天然酵素を用いて製造することが求められる。上記のとおり、微生物を用いてヌートカトンを製造する方法はいくつか報告されているが、いずれも特殊な細菌や反応系を必要とする。したがって、微生物等の生体触媒を用いてより簡便かつ安価にヌートカトンを製造する方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究した結果、驚くべきことに、微生物が元来有する特定のシトクロムＰ４５０酵素系を利用してバレンセンからヌートカトンを製造することが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、
［１］ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を含む微生物をバレンセンの存在下で培養することを特徴とする、ヌートカトンの製造方法、
［２］ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０が、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、および／または置換されたアミノ酸配列であって、配列番号１における２３１−２３５位、２７０−２７３位、および３３５−３４４位に対応する領域にそれぞれ、配列番号１と比べて０個〜数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換を含むアミノ酸配列を含む、［１］記載の方法、
［３］ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０が、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む、［２］記載の方法、
［４］微生物が放線菌である、［１］〜［３］のいずれか１項記載の方法、
［５］微生物がストレプトマイセス属の放線菌である、［４］記載の方法、
［６］ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子が導入された微生物、
［７］ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０が、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、および／または置換されたアミノ酸配列であって、配列番号１における２３１−２３５位、２７０−２７３位、および３３５−３４４位に対応する領域にそれぞれ、配列番号１と比べて０個〜数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換を含むアミノ酸配列を含む、［６］記載の微生物、
［８］ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０が、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む、［７］記載の微生物、
［９］微生物が放線菌である、［６］〜［８］のいずれか１項記載の微生物、および
［１０］微生物がストレプトマイセス属の放線菌である、［９］記載の微生物
を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、微生物を用いてより簡便かつ安価にヌートカトンを製造する方法が提供される。本発明の方法によって製造されたヌートカトンは、食品、化粧品を含む幅広い分野において天然香料として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例で使用された遺伝子過剰発現用ベクターを示す模式図である。図中、「ＰＬＤｔｅｒ」はストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来のホスホリパーゼＤ遺伝子ターミネーター領域、「Ｔａｒｇｅｔ  Ｇｅｎｅ」は目的遺伝子領域、「ＳＳＭＰｐｒｏ」はストレプトマイセス・セプタタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｐｔａｔｕｓ）由来のメタロエンドプロテアーゼプロモーター、「ｘｙｌＡｐｒｏ」はストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）由来キシロースイソメラーゼプロモーター、「ｔｓｒ」はチオストレプトン耐性遺伝子、「ｒｅｐ  ｐＩＪ１０１」は放線菌の複製領域を示す。
【図２】ＳＣＯ３７７０過剰発現株のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）／マススペクトロメトリー（ＭＳ）分析結果を示す。
【図３】実施例で使用されたＳＣＯ３７７０遺伝子破壊用ベクターを示す模式図である。図中「ｏｒｉＴ」、「ｏｒｉＶ」は大腸菌の複製起点、「Ｋｍ」はカナマイシン耐性遺伝子、ｍｅｌＣ１Ｃ２はストレプトマイセス・アンチバイオチクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）由来のｍｅｌＣオペロン領域、「ΔＳＣＯ３７７０」はＳＣＯ３７７０遺伝子の部分配列を示す。
【図４】４種の株の培養液上清抽出物のガスクロマトグラフィー分析結果を示す。
【図５】４種の株の菌体抽出物のガスクロマトグラフィー分析結果を示す。
【図６】ＳＬＮＷＴ＿３３３３過剰発現株の培養液上清抽出物のガスクロマトグラフィー分析結果を示す。
【図７】ＳＬＮＷＴ＿３３３３過剰発現株の菌体抽出物のガスクロマトグラフィー分析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
シトクロムＰ４５０は、多種多様な基質の酸化反応を触媒するヘム含有酵素群であり、細菌（一部を除く）、植物および哺乳動物を包含するほとんど全ての生物に存在する。シトクロムＰ４５０はその配列類似性に基づいて多くのファミリーおよびサブファミリーに分類される。本発明では、サブファミリーＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を含む微生物が使用される。サブファミリーＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０のアミノ酸配列または遺伝子配列は、例えば、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  Ｈｏｍｅｐａｇｅ（http://drnelson.uthsc.edu/CytochromeP450.html）に記載があるもの、または該サイト内のＢＬＡＳＴ検索の結果で最上位ヒットしたものから選択することができる。ＢＬＡＳＴ検索をする場合、前提条件として、クエリー配列はシトクロムＰ４５０の配列でなければならない。クエリー配列がシトクロムＰ４５０の配列であるかどうかは、例えば、Ｐｆａｍ（タンパク質ドメインファミリーデータベース：http://pfam.xfam.org/）などで、クエリー配列にシトクロムＰ４５０モチーフ（ＰＦ０００６７）が存在するかどうかを確認することにより決定することができる。
【００１２】
「ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０」としては、例えば、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）由来のＣＹＰ１０７Ｔ１が挙げられる。ＣＹＰ１０７Ｔ１をコードするアミノ酸配列を配列番号１に、ヌクレオチド配列を配列番号４に示す。したがって、本発明における「ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０」の例として、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むシトクロムＰ４５０；配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシトクロムＰ４５０；配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるシトクロムＰ４５０；および配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるシトクロムＰ４５０が挙げられる。
【００１３】
シトクロムＰ４５０のアミノ酸配列は非常に多様であるが、全てのシトクロムＰ４５０に共通して良く保存された領域（コンセンサス配列）が存在することが知られている（例えば、J. Biol. Chem., 2002 Jul 5;277(27), pp.24000-24005）。すなわち、Ｋ−ヘリックスにおけるＥＸＸＲモチーフ（Ｅはグルタミン酸残基、Ｒはアルギニン残基、Ｘはいずれかのアミノ酸残基を示す）、ヘム結合部位におけるシステイン残基およびその上流にある２つのグリシン残基（ヘム結合モチーフ）、およびＩ−ヘリックスにおけるスレオニン残基である。本発明における「ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０」においては、上記コンセンサス配列部位が保存されていることが好ましい。
【００１４】
したがって、本発明における「ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０」として、上記した例の他に、配列番号１で示されるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、および／または置換されたアミノ酸配列であって、配列番号１の２３１−２３５位、２７０−２７３位、および３３５−３４４位に対応する領域にそれぞれ、配列番号１と比べて０個〜数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換を含むアミノ酸配列を含むシトクロムＰ４５０；および配列番号１で示されるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、および／または置換されたアミノ酸配列であって、配列番号１の２３１−２３５位、２７０−２７３位、および３３５−３４４位に対応する領域にそれぞれ、配列番号１と比べて０個〜数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換を含むアミノ酸配列からなるシトクロムＰ４５０が挙げられる。配列番号１で示されるアミノ酸配列において欠失、挿入、付加、および／または置換される「少なくとも１個のアミノ酸」の数は、該欠失、挿入、付加、および／または置換を含むアミノ酸配列がＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする限り、特に限定されない。
【００１５】
さらに、本発明における「ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０」の例として、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号１の２３１−２３５位、２７０−２７３位、および３３５−３４４位に対応する領域にそれぞれ、配列番号１と比べて０個〜数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換を含むアミノ酸配列を含むシトクロムＰ４５０が挙げられる。また、本発明における「ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０」のさらなる例として、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号１の２３１−２３５位、２７０−２７３位、および３３５−３４４位に対応する領域にそれぞれ、配列番号１と比べて０個〜数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換を含むアミノ酸配列からなるシトクロムＰ４５０が挙げられる。
【００１６】
配列番号１における２３１−２３５位、２７０−２７３位、および３３５−３４４位はそれぞれ、上記したＩ−ヘリックス、Ｋ−ヘリックス、およびヘム結合部位におけるコンセンサス配列部位に相当する。上記「配列番号１の２３１−２３５位、２７０−２７３位、および３３５−３４４位に対応する領域」に含まれるアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換の数は、０個〜数個、例えば、０、１、２、３、４、５、６、または７個であり、好ましくは０個である。例えば、配列番号１の２３１−２３５位に対応する領域に含まれるアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換の数は、０、１、２、３、または４個であり、好ましくは０個である。例えば、配列番号１の２７０−２７３位に対応する領域に含まれるアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換の数は、０、１、２、または３個であり、好ましくは０個である。例えば、配列番号１の３３５−３４４位に対応する領域に含まれるアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換の数は、０、１、２、３、４、５、６、または７個であり、好ましくは０個である。さらに好ましくは、本発明における「ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０」が配列番号１で示されるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、および／または置換されたアミノ酸配列を含む場合、あるいは配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む場合は、配列番号１の２３１−２３５位、２７０−２７３位、および３３５−３４４位に対応する領域のいずれの領域にもアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換を含まず、配列番号１の２３１−２３５位、２７０−２７３位、および３３５−３４４位に対応する領域以外の領域にアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換を含む。
【００１７】
配列番号１の２３１−２３５位に対応する領域がアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換を含む場合、配列番号１の２３５位のスレオニン残基（Ｔ）が維持されていることが好ましい。配列番号１の２７０−２７３位に対応する領域がアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換を含む場合、配列番号１の２７０位のグルタミン酸残基（Ｅ）および２７３位のアルギニン残基（Ｒ）が維持されていることが好ましい。配列番号１の３３５−３４４位に対応する領域がアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換を含む場合、配列番号１の３３６位および３３８位のグリシン残基（Ｇ）ならびに３４２位のシステイン残基（Ｃ）が維持されていることが好ましい。
【００１８】
本発明において、アミノ酸の置換は、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸による保存的アミノ酸置換であってもよい。
【００１９】
「ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子」のヌクレオチド配列は、上記「ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０」のアミノ酸配列に基づいて決定すればよい。例えば、限定するものではないが、配列番号４を含むヌクレオチド配列；配列番号４に示されるヌクレオチド酸配列に対して５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列；配列番号４からなるヌクレオチド配列；および配列番号４に示されるヌクレオチド酸配列に対して５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列等が挙げられる。
【００２０】
本発明において使用される微生物の種類は、シトクロムＰ４５０酸化還元系を有する微生物であるかぎり特に限定されない。例えば、放線菌、桿菌、真正細菌、根粒菌、細菌などが挙げられる。好ましくは、ストレプトマイセス属、ノカルディア属、ロドコッカス属、サッカロポリスポラ属、ミクロモノスポラ属、シュードモナス属、ブラジリゾビウム属、マイコバクテリウム属、バシラス属、リゾビウム属等であり、より好ましくは、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ベネズエラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）、ストレプトマイセス・アルブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｓ）、ストレプトマイセス・アズレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｚｕｒｅｕｓ）、ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・アンチバイオチクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・エリスレア（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｒｔｈｒａｅａ）、ストレプトマイセス・フラディエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ）、ロドコッカス・ファシアンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・インコニタ（Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）等の微生物が使用される。
【００２１】
本発明において、ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を含む微生物は、内在性のＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を含む微生物であってもよく、または外来性のＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を含む微生物であってもよく、または内在性および外来性の両方を含む微生物であってもよい。本発明においては、好ましくは、ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を過剰発現している微生物（以下、「過剰発現株」と記す場合もある）が使用される。ここで、過剰発現とは、野生株と比べてＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を多く含むこと、またはＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０の発現量が高いことをいう。このような過剰発現株は、自然発生的に生じたものであってもよく、または人為的に作成されたものであってもよい。上記の外来性のＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を含む微生物または外来性および内在性の両方の該遺伝子を含む微生物、あるいは上記の人為的な過剰発現株は、例えば、ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を微生物に導入することによって作成することができる。上記ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子は、例えば、公知の塩基配列情報に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションなどの常法により調製することができる。
【００２２】
上記ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子の導入は、常法により行うことができる。例えば、上記ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を適当なベクター中に挿入し、該ベクターで微生物を形質転換する。ベクターは、プラスミドベクター、ファージベクター、シャトルベクターなどから適宜選択される。上記ベクターは、プロモーター、ターミネーター、オペレーター、エンハンサーなどの適当な調節因子、チオストレプトン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子などの適当な選択マーカーを含んでいてもよい。形質転換は、当該分野で通常用いられる方法で行えばよい。したがって、本発明は、上記ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を含むベクターも提供する。
【００２３】
また、本発明は、ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を微生物に導入することを含む、ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を含む微生物の製造方法も提供する。例えば、ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を微生物に導入することを含む、ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を過剰発現している微生物の製造方法を提供する。
【００２４】
本発明においては、上記ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を含む微生物をバレンセンの存在下で培養することにより、ヌートカトンを製造する（以下、「本培養」と記す場合もある）。ヌートカトンの前駆体として、ヌートカトールが生成される場合もある。本培養における「バレンセンの存在下」とは、培養培地にバレンセンを添加することによって達成してもよく、または上記ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を含む微生物であって、かつ、バレンセンを産生するように遺伝子が導入された微生物を用いることによって達成してもよい。本培養のための培地は、使用される微生物の生育に必要な養分を含む培地であれば、特に限定されない。好ましくは液体培地が使用される。該培地は、微生物の培養に通常用いられる成分、炭素源、窒素源、バレンセンを含み、さらに必要に応じて、ミネラル、ビタミンなどを含んでいてもよい。該培地としては、例えば、ＴＳＢ培地（トリプティックソイブロス培地）などの市販の培地に、炭素源、窒素源、およびバレンセンを添加したものを使用することもできる。炭素源としては、使用される微生物が資化し得る糖類または糖アルコール、例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、デンプン、グリセロールなどを用いることができる。窒素源としては、無機または有機アンモニウム塩、トリプトン、ペプトン、肉汁エキス、酵母エキス、ホエー、カゼイン加水分解物、大豆粉末、フィッシュミールなどを用いることができる。培地中に含まれる炭素源および窒素源の量または炭素源および窒素源の比率は特に限定されず、適宜決定することができる。培地中に含まれるバレンセンの量もまた、特に限定されない。培地に添加するバレンセンの量は、所望のヌートカトンの生産量や培養環境などに応じて適宜決定することができる。例えば、培地中のバレンセンの濃度が０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）になるような量が挙げられる。なお、上記微生物としてバレンセンを産生するように遺伝子が導入された微生物を用いる場合は、上記培地にバレンセンを添加しなくてもよい。上記微生物としてＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を人為的に導入した微生物を使用する場合は、本培養の培地にさらに、形質転換体の選択のための抗生物質（例えば、チオストレプトン、アンピシリンなど）などを添加してもよい。
【００２５】
本培養の培養条件、例えば、培養開始時の微生物の数、培養時間、培養温度、培地のｐＨなどは、上記微生物が良好に増殖し、ヌートカトンを産生する限り特に限定されず、使用される微生物の種類、所望のヌートカトンの生産量、または培養環境などに応じて適宜決定することができる。本培養は、例えば２０〜３５℃で、好ましくは２８〜３０℃で、例えばｐＨ５〜９で、好ましくはｐＨ６〜８で、例えば３日以上、好ましくは５〜２０日間行われる。
【００２６】
ＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を含む微生物は、本培養の前に、予め培養して細胞数を増大させてもよい（このような本培養前の培養を、以下、「種菌培養」と記す場合もある）。種菌培養では、微生物の増殖用培地として通常用いられる培地が用いられ、該培地にはバレンセンが添加されない。上記微生物としてＣＹＰ１０７Ｔに属するシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を人為的に導入した微生物を使用する場合は、種菌培養の培地に形質転換体の選択のための抗生物質（例えば、チオストレプトン、アンピシリンなど）などを添加してもよい。培養時間、培養温度などの培養条件は、上記微生物が良好に増殖する限り特に限定されず、適宜決定することができる。種菌培養は、例えば、２８〜３０℃で、ｐＨ６〜８で、２〜５日間行われる。
【００２７】
本培養後、培養液を菌体および培養上清に分離し、菌体および／または培養上清からヌートカトン（またはヌートカトン及びヌートカトール等の混合物）を回収する。菌体および培養上清からのヌートカトンの抽出および精製は、常法に従って行えばよい。例えば、遠心分離によって培養液を菌体および培養上清に分離し、メタノール、ヘキサンなどの有機溶媒を用いて菌体または培養上清を処理してヌートカトンを抽出することができる。さらに、クロマトグラフィーなどの公知の手段を用いて上記抽出物を精製し、純度の高いヌートカトンを得ることができる。
【実施例】
【００２８】
以下に実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２９】
実施例１：ヌートカトン産生候補遺伝子群のスクリーニング
（１）遺伝子のクローニング
ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ（３）２）のゲノム情報（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００３８８８）を基に、ＳＣＯ５２２３、ＳＣＯ３０９９、ＳＣＯ３７７０、およびＳＣＯ３６３６遺伝子領域を増幅するためのプライマーを設計した（表１）。ＳＣＯ５２２３、ＳＣＯ３０９９、ＳＣＯ３７７０、およびＳＣＯ３６３６遺伝子領域は各々、ＣＹＰ１７０Ａ、ＣＹＰ１０７Ｕ、ＣＹＰ１０７Ｔ、ＣＹＰ１０７Ｐに属するシトクロムＰ４５０をコードすることが分かった。ストレプトマイセス・コエリカラーのゲノムをテンプレート、設計したプライマーをフォワードプライマーとリバースプライマーとし、東洋紡社のＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（登録商標）キットを用いてＰＣＲ反応を行い、目的遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ反応は、「９４℃にて２分」を１サイクル後、「９８℃にて１０秒、６８℃にて１分３０秒」を３０サイクルの条件で行った。かかる増幅により得たＳＣＯ５２２３、ＳＣＯ３０９９、ＳＣＯ３７７０、ＳＣＯ３６３６に対応する遺伝子の配列は各々、配列番号２、３、４、２０に対応する。
【００３０】
【表１】
2018000195.tif 000002
【００３１】
目的のタンパク質を過剰発現させるために、ストレプトマイセス・セプタタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｐｔａｔｕｓ）由来メタロエンドプロテアーゼ（ＳＳＭＰ）プロモーター（配列番号１１）（特開２００９−６５８３７参照）を利用した。このプロモーターと共に増幅断片を、ｐＩＪ１０１を複製起点として有するベクターに連結し、目的の遺伝子過剰発現ベクターとした。該ベクターの構造を図１に示す。
【００３２】
（２）放線菌の形質転換
ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ６４株（独立法人  製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）：ＮＢＲＣ番号１５６７８）を遺伝子過剰発現ベクターで形質転換した。放線菌の形質転換は、放線菌に関する遺伝子操作技術についての「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ」（Ｈｏｐｗｏｏｄ，  Ｄ．Ａ．ら、１９８５年、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｎｏｒｗｉｃｈ）に記載の方法に従って行った。得られた形質転換株をＳＣＯ５２２３、ＳＣＯ３０９９、ＳＣＯ３７７０、ＳＣＯ３６３６過剰発現株とした。
【００３３】
（３）培養方法
上記の通り作成したＳＣＯ５２３３、ＳＣＯ３０９９、ＳＣＯ３７７０、ＳＣＯ３６３６過剰発現株を、まず種菌培養として、チオストレプトン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＴＳＢ培地（ベクトン・ディッキンソン製  Ｂａｃｔｏ（商標）  Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（Ｓｏｙｂｅａｎ−Ｃａｓｅｉｎ  Ｄｉｇｅｓｔ  Ｍｅｄｉｕｍ）、品番：２１１８２５）５ｍＬ中で２８℃、７２時間、試験管で振とう培養した。その後本培養として、５００ｍＬ容バッフルフラスコにチオストレプトン（１０μｇ／ｍＬ）を含有するＳＳＭＰ培地（表２）５０ｍＬを入れ、種菌培養溶液を３％（１．５ｍＬ）植菌し、２８℃で振とう培養した。培養開始７２時間後に、終濃度１０％になるようにグルコース溶液、および終濃度０．０２５％になるようにバレンセン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製、品番：７５０５６−１０Ｇ−Ｆ）を添加し、さらに１６８時間振とう培養した。
【００３４】
【表２】
2018000195.tif 000003
ｐＨ＝７．０
【００３５】
（４）ヌートカトンの検出方法
培養終了後、菌体培養液を２ｍＬ回収後、遠心（１４，０００ｒｐｍ、２０分）により分離し、菌体を回収した。１．５ｍＬメタノールを加えて振盪で混合した。上清１ｍＬに０．２５ｍＬ蒸留水及び０．５ｍＬヘキサンを加えて振盪で混合した。遠心により分離し、ヘキサン層を回収した。得られたヘキサン溶液中のヌートカトンを、ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＩｎｅｒｔＣａｐ  ５（内径０．２５ｍｍ、長さ３０ｍ、膜厚０．４０μｍ）を用いた株式会社島津製作所製のガスクロマトグラフＧＣ−２０１０および質量分析計ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０Ｐｌｕｓを用いて分析した（表３）。
【００３６】
【表３】
2018000195.tif 000004
【００３７】
ガスクロマトグラフィー／マススペクトロメトリー分析結果から、ＳＣＯ５２２３、ＳＣＯ３０９９、およびＳＣＯ３６３６過剰発現株ではヌートカトンの生成は確認できなかった。一方、ＳＣＯ３７７０過剰発現株のサンプルは、ヌートカトン標品（東京化成工業株式会社製、品番：Ｎ０９２０）と同じ保持時間にガスクロマトグラフィーで溶出されるピークを含み、このピークのマススペクトルがヌートカトン標品と極めて類似していること（図２）から、ＳＣＯ３７７０過剰発現株ではヌートカトン生成が確認できた。
【００３８】
実施例２：ＳＣＯ３７７０の機能の詳細解析
（１）ＳＣＯ３７７０遺伝子破壊株の作製
ＳＣＯ３７７０遺伝子（配列番号４）の９７番目から１０９０番目の領域を増幅するためのプライマーを設計した（表４）。ストレプトマイセス・コエリカラーのゲノムをテンプレート、設計したプライマーをフォワードプライマーとリバースプライマーとし、タカラバイオ社のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキットを用いてＰＣＲ反応を行い、目的遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ反応は、「９８℃にて５分」を１サイクル後、「９８℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、６８℃にて１分」を３０サイクルの条件で行った。かかる増幅により得た配列（以下、「ΔＳＣＯ３７７０配列」と記す場合もある）を配列番号１２に示す。
【００３９】
【表４】
2018000195.tif 000005
【００４０】
ＳＣＯ３７７０遺伝子に対応するストレプトマイセス・リビダンスＴＫ６４ゲノム上の遺伝子を削除するために、増幅断片をｐＧＭ１６０（Ｍｕｔｈ  ｅｔ．ａｌ，  １９８９，  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，  ２１９，  ３４１−３４８）を複製起点として有するベクターに連結し、ＳＣＯ３７７０遺伝子破壊用ベクターとした。該ベクターの構造を図３に示す。該ベクター中のｍｅｌＣオペロン領域の配列を配列番号１５に示す。
【００４１】
ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ６４株をＳＣＯ３７７０遺伝子破壊用ベクターで形質転換した。この結果、相同組換えによりゲノム上のＳＣＯ３７７０遺伝子に対応する遺伝子内へ、ＳＣＯ３７７０遺伝子破壊用配列（ΔＳＣＯ３７７０配列）が挿入され、ＳＣＯ３７７０遺伝子に対応する遺伝子の機能が破壊されたＳＣＯ３７７０破壊株（以下、「ΔＳＣＯ３７７０株」と記す場合もある）が得られた。
【００４２】
（２）ＳＣＯ３７７０遺伝子復帰株の構築
ＳＣＯ３７７０遺伝子の機能を確認するために、実施例２（１）に記載したＳＣＯ３７７０遺伝子破壊株を、実施例１（１）に記載したＳＣＯ３７７０遺伝子過剰発現ベクターで形質転換した。得られた形質転換株を、ＳＣＯ３７７０過剰発現（ΔＳＣＯ３７７０）株とした。
【００４３】
（３）ヌートカトンの生産量測定
実施例１（３）に記載の手順で４種の株（ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ６４株、ＳＣＯ３７７０過剰発現株、ＳＣＯ３７７０破壊株、ＳＣＯ３７７０過剰発現（ΔＳＣＯ３７７０）株）を培養した後、菌体培養液を２ｍＬ回収後、遠心（１４，０００ｒｐｍ、２０分）により分離し、上清を１ｍＬ、および菌体を別々に回収した。
回収した上清は、１／２量のヘキサンを加えて振盪で混合した。遠心（１４，０００ｒｐｍ、１分）により分離し、ヘキサン層を回収した。一方、回収した菌体は、１．５ｍＬメタノールを加えて振盪で混合した。上清１ｍＬに０．２５ｍＬ蒸留水及び０．５ｍＬヘキサンを加えて振盪で混合した。遠心により分離し、ヘキサン層を回収した。上清と菌体から得られたヘキサン溶液中のヌートカトンの量を、ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＩｎｅｒｔＣａｐ  ５（内径０．２５ｍｍ、長さ  ３０ｍ、膜厚０．４０μｍ）を用いた株式会社島津製作所製のガスクロマトグラフＧＣ−２０１４を用いて分析した（表５）。なお、この条件では、ヌートカトンは１２分付近に溶出される。また、ヌートカトンの量は、上記クロマトグラムにおけるβ−カリオフィレン標準品の検量線により算出される。
【００４４】
【表５】
2018000195.tif 000006
【００４５】
培養液上清および菌体内のヌートカトン量を測定したところ、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ６４株（元株）はヌートカトンを生産していないのに対し、ＳＣＯ３７７０過剰発現株ではヌートカトンの産生が確認できた（図４、図５、表６）。一方、ΔＳＣＯ３７７０株では、ヌートカトンが産生されていなかった。この株に対してＳＣＯ３７７０遺伝子を過剰発現させたＳＣＯ３７７０過剰発現（ΔＳＣＯ３７７０）株では、ヌートカトンの産生が確認できた。これらの結果より、ＳＣＯ３７７０遺伝子産物がバレンセンからヌートカトンへの変換を行っていることが明らかとなった。
【００４６】
【表６】
2018000195.tif 000007
培養液１ｍＬ換算の濃度（ｍｇ／Ｌ）。３検体の平均値。
【００４７】
実施例３：ヌートカトン産生候補遺伝子のスクリーニング
（１）遺伝子のクローニング
ストレプトマイセス・アルブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｓ）（ＡＴＣＣ  ２１８３８株（独立行政法人  製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）：ＮＢＲＣ番号１０７８５８）由来の配列であるＳＬＮＷＴ＿３３３３の配列情報を基に、人工遺伝子合成技術を用いて人工遺伝子を作成した（配列番号１６）。ＳＬＮＷＴ＿３３３３は、ＳＣＯ３７７０（配列番号１）と配列相同性がアミノ酸レベルで６９%であり、かつ、配列番号１における３３５〜３４４位に対応する領域に配列番号１と比べて１つのアミノ酸置換を有し、配列番号１における２３１〜２３５位および２７０〜２７３位は保存されている。さらに、ＳＬＮＷＴ＿３３３３は、配列番号１の３３６位および３３８位のグリシン残基ならびに３４２位のシステイン残基を維持している。
【００４８】
目的のタンパク質を過剰発現させるために、ストレプトマイセス・アベルミチリス由来キシロースイソメラーゼ（ｘｙｌA）プロモーター（配列番号１７）（J. Microbiol. Biotechnol. 2008 May;18(5):837-44に開示）を利用した。このプロモーターと共に人工遺伝子を、ｐＩＪ１０１を複製起点として有するベクターに連結し、目的遺伝子の過剰発現ベクターとした。該ベクターの構造を図１に示す。
【００４９】
（２）放線菌の形質転換
実施例１−（２）と同様の方法で、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ６４株を遺伝子過剰発現ベクターで形質転換した。得られた形質転換株をＳＬＮＷＴ＿３３３３過剰発現株とした。
【００５０】
（３）培養方法
上記の通り作成したＳＬＮＷＴ＿３３３３過剰発現株を、実施例１−（３）と同様の方法で培養した。但し、バレンセン添加後の培養時間を４３２時間とした。
【００５１】
（４）ヌートカトンの生産量測定
培養終了後、実施例２−（３）と同様の方法で、ＳＬＮＷＴ＿３３３３過剰発現株の培養液上清および菌体内のヌートカトン量を測定したところ、ヌートカトンの産生が確認された（図６、図７、表７）。
【００５２】
【表７】
2018000195.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によれば、微生物を用いてより簡便かつ安価にヌートカトンを製造する方法が提供される。本発明の方法によって製造されたヌートカトンは、食品、化粧品を含む幅広い分野において天然香料として利用することができる。
【図１】
2018000195.tif 000009
【図２】
2018000195.tif 000010
【図３】
2018000195.tif 000011
【図４】
2018000195.tif 000012
【図５】
2018000195.tif 000013
【図６】
2018000195.tif 000014
【図７】
2018000195.tif 000015
【配列表】
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