(57)【要約】      （修正有）【課題】安定性に優れたビオチン化F1106-13-3抗体を提供する。【解決手段】F1106-13-3抗体のアミノ基にビオチン標識剤、ビオチンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル、6-(ビオチニルアミノ)ヘキサン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、6-[6-(ビオチニルアミノ)ヘキサノイルアミノ]ヘキサン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、ビオチンN-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、6-(ビオチニルアミノ)ヘキサン酸N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、6-[6-(ビオチニルアミノ)ヘキサノイルアミノ]ヘキサン酸N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、またはN-[[2-(ビオチニルアミノ)エチル]ジチオプロピニルオキシ]スルホスクシンイミドのナトリウム塩、を結合させたビオチン化F1106-13-3抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
F1106-13-3抗体のアミノ基にビオチンを結合させたことを特徴とするビオチン化F1106-13-3抗体。
【請求項２】
F1106-13-3抗体のアミノ基にビオチン標識剤が結合している、請求項１に記載のビオチン化F1106-13-3抗体。
【請求項３】
ビオチン標識剤が、ビオチンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル、6-(ビオチニルアミノ)ヘキサン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、6-[6-(ビオチニルアミノ)ヘキサノイルアミノ]ヘキサン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、ビオチンN-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、6-(ビオチニルアミノ)ヘキサン酸N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、6-[6-(ビオチニルアミノ)ヘキサノイルアミノ]ヘキサン酸N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、及びN-[[2-(ビオチニルアミノ)エチル]ジチオプロピニルオキシ]スルホスクシンイミドのナトリウム塩からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項２に記載のビオチン化F1106-13-3抗体。
【請求項４】
F1106-13-3抗体のアミノ基にビオチンを結合させる工程を含む、ビオチン化F1106-13-3抗体の製造方法。
【請求項５】
結合させる工程が、前記F1106-13-3抗体のアミノ基に、ビオチン標識剤を結合させることにより行われる、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
ビオチン標識剤が、ビオチンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル、6-(ビオチニルアミノ)ヘキサン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、6-[6-(ビオチニルアミノ)ヘキサノイルアミノ]ヘキサン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、ビオチンN-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、6-(ビオチニルアミノ)ヘキサン酸N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、6-[6-(ビオチニルアミノ)ヘキサノイルアミノ]ヘキサン酸N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、及びN-[[2-(ビオチニルアミノ)エチル]ジチオプロピニルオキシ]スルホスクシンイミドのナトリウム塩からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
F1106-13-3抗体のアミノ基にビオチンを結合させたビオチン化F1106-13-3抗体を含む第１試薬と、
ストレプトアビジン結合固相粒子を含む第２試薬と、
F1106-13-3抗体とは異なるエピトープを認識する抗プレセプシン抗体を含む第３試薬と、
を含む、プレセプシン測定用試薬キット。
【請求項８】
2-クロロ-5-(メトキシスピロ [1,2-ジオキセタン-3,2'-(5'-クロロ)トリシクロ [3.3.1.13,7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸二ナトリウムを含む第４試薬を更に含む、
請求項７に記載のプレセプシン測定用試薬キット。
【請求項９】
F1106-13-3抗体とは異なるエピトープを認識する抗プレセプシン抗体が、検出可能な標識物質で標識された抗プレセプシン抗体である、請求項７又は８に記載のプレセプシン測定用試薬キット。
【請求項１０】
固相粒子が磁性粒子である、請求項７〜９のいずれか１項に記載のプレセプシン測定用試薬キット。
【請求項１１】
標識物質がアルカリホスファターゼ(ALP)である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のプレセプシン測定用試薬キット。
【請求項１２】
F1106-13-3抗体のアミノ基にビオチンを結合させたビオチン化F1106-13-3抗体と、ストレプトアビジン結合固相粒子とを混合し、ビオチン化F1106-13-3抗体-ストレプトアビジン結合固相粒子複合体(第１の複合体)を得る工程と、
得られた第１の複合体と生体試料とを混合し、プレセプシン-ビオチン化F1106-13-3抗体-ストレプトアビジン結合固相粒子複合体(第２の複合体)を得る工程と、
得られた第２の複合体と、F1106-13-3抗体とは異なるエピトープを認識する抗プレセプシン抗体とを混合し、F1106-13-3抗体とは異なるエピトープを認識する抗プレセプシン抗体-プレセプシン-ビオチン化F1106-13-3抗体-ストレプトアビジン結合固相粒子複合体(第３の複合体)を得る工程と、
得られた第３の複合体中の標的物質から得られるシグナルを測定する工程と
を含む、プレセプシンの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビオチン化F1106-13-3抗体、その製造方法及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
CD14分子は、単核球細胞の膜表面に発現している糖タンパク質であり、LPS (リポポリサッカライド)のレセプターとしての機能を有することが知られている。CD14分子には、細胞表面上に発現している膜結合型CD14 (mCD14)と、可溶型CD14 (sCD14)の２種類が存在する。sCD14として、分子量約55 kDa及び約49 kDaのsCD14 (以下「高分子量sCD14」という。)が知られており、敗血症、後天性免疫不全症候群(AIDS)、急性呼吸促進症候群(ARDS)、全身性エリテマトーデス(SLE)等、多くの疾患における患者の血中で高値を示すことが報告されている。そのため、これらの高分子量sCD14は、疾患特異的なマーカーではないと考えられている。
【０００３】
一方、敗血症患者において特徴的に血中濃度が上昇する、新たなsCD14の分子種として、sCD14-ST (可溶性CD14抗原サブタイプ、プレセプシンともいう)が存在することが報告されている。
【０００４】
sCD14-ST (プレセプシン)とは、sCD14のうち、非還元条件下でのSDS-PAGEにおいて分子量13±2 kDaを示すことを特徴とし、CD14のN端部を保持しているものである。高分子量sCD14と比べると、C端側が大きく欠失したアミノ酸配列を有しており、高分子量sCD14とは異なってLPS結合能を有していない。また、プレセプシンは高分子量sCD14とは異なる免疫原性を示すため、抗体を用いて両者を区別できる。プレセプシンは敗血症患者において特異的に血中濃度が上昇する。また、敗血症との判別が難しい、全身性炎症反応(SIRS)患者と比較しても、敗血症患者の血中で高値を示すという報告があり、プレセプシンは敗血症の特異的な診断マーカーであると考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００４／４４００５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１には、抗プレセプシンモノクローナル抗体であるF1106-13-3抗体が記載されている。しかし、チオール基にビオチンを結合させた際、F1106-13-3抗体が不安定になることについて一切記載が無い。抗体のチオール基やアミノ基にビオチンなどの修飾物質を付加することは周知である。なお、チオール基に修飾物質を付加する方が、ロット間差が少なくなるため、好まれる傾向にある。
【０００７】
本発明者らは、F1106-13-3抗体のチオール基にビオチンを結合させると、保存安定性が低下するという課題を初めて見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
F1106-13-3抗体のアミノ基にビオチンを結合させることで、上記の課題を解決した。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、F1106-13-3抗体のアミノ基にビオチンを結合させたことを特徴とするビオチン化F1106-13-3抗体が提供される。
また、本発明によれば、F1106-13-3抗体のアミノ基にビオチンを結合させる工程を含む、ビオチン化F1106-13-3抗体の製造方法が提供される。
【００１０】
また、本発明によれば、F1106-13-3抗体のアミノ基にビオチンを結合させたビオチン化F1106-13-3抗体を含む第１試薬と、ストレプトアビジン結合固相粒子を含む第２試薬と、F1106-13-3抗体とは異なるエピトープを認識する抗プレセプシン抗体を含む第３試薬と、を含む、プレセプシン測定用試薬キットが提供される。
【００１１】
さらに、本発明によれば、F1106-13-3抗体のアミノ基にビオチンを結合させたビオチン化F1106-13-3抗体と、ストレプトアビジン結合固相粒子とを混合し、ビオチン化F1106-13-3抗体-ストレプトアビジン結合固相粒子複合体(第１の複合体)を得る工程と、得られた第１の複合体と生体試料とを混合し、プレセプシン-ビオチン化F1106-13-3抗体-ストレプトアビジン結合固相粒子複合体(第２の複合体)を得る工程と、得られた第２の複合体と、F1106-13-3抗体とは異なるエピトープを認識する抗プレセプシン抗体とを混合し、F1106-13-3抗体とは異なるエピトープを認識する抗プレセプシン抗体-プレセプシン-ビオチン化F1106-13-3抗体-ストレプトアビジン結合固相粒子複合体(第３の複合体)を得る工程と、得られた第３の複合体中の標的物質から得られるシグナルを測定する工程とを含む、プレセプシンの測定方法が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
安定性に優れたビオチン化F1106-13-3抗体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】本実施形態の試薬キットの一例を示す図である。
【図１Ｂ】本実施形態の試薬キットの一例を示す図である。
【図２】チオール基にアルカリホスファターゼ(ALP)が結合したF1106-13-3抗体を用いて行ったプレセプシン検出の結果を示すグラフである。
【図３】チオール基にビオチンが結合したF1106-13-3抗体を用いて行ったプレセプシン検出の結果を示すグラフである。
【図４】アミノ基にビオチンが結合したF1106-13-3抗体を用いて行ったプレセプシン検出の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本実施形態のビオチン化F1106-13-3抗体は、F1106-13-3抗体のアミノ基にビオチンを結合させたことを特徴とする。
F1106-13-3抗体は、WO2004/44005 A1に記載されているとおり、配列番号１により表されるCD14のN末端より17〜26番のアミノ酸配列(CNFSEPQPDW；配列番号２)に結合する抗体である。一般に、プレセプシンは、CD14の1〜64番目のアミノ酸配列を有するタンパク質(配列番号３)であると考えられている。プレセプシン検出の場面において、F1106-13-3抗体は、プレセプシンの17〜26番目のアミノ酸配列を特異的に認識して結合する。F1106-13-3抗体は、持田製薬株式会社から入手可能である。
【００１５】
あるいは、F1106-13-3抗体は、例えばWO2004/44005 A1に記載されるような、当該技術において公知の方法により取得することもできる。すなわち、CD14の1〜285アミノ酸からなるタンパク質を抗原として、ウマ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、ラット、マウスなどの哺乳動物を免疫し、免疫された動物から血清を採取して抗体を精製する方法を用いて取得することができる。また、免疫されたマウスから採取した抗体産生細胞を、例えばマウスの腫瘍細胞と融合させて得られたハイブリドーマから抗体を得る方法によって取得することもできる。
【００１６】
アミノ基は、-NH2で表される一級アミノ基を意味する。アミノ基は、F1106-13-3抗体中に複数存在すると考えられる。本実施形態において、「F1106-13-3抗体のアミノ基にビオチンを結合させる」とは、F1106-13-3抗体中に複数存在すると考えられるアミノ基の少なくとも１つにビオチンを結合させることを意味する。
【００１７】
ビオチンは、CAS番号58-85-5、IUPAC名5-[(3aS, 4S, 6aR)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル]ペンタン酸の化合物である。
ビオチンをF1106-13-3抗体のアミノ基に結合させる方法は特に限定されず、例えば、架橋剤を用いて、F1106-13-3抗体のアミノ基にビオチンを結合させることによって行うことができる。
【００１８】
架橋剤は、特に限定されず、当業者に公知のものを用いることができる。架橋剤は、それ自体でビオチンを有するビオチン標識剤であってもよい。このようなビオチン標識剤としては、例えばビオチンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル、6-(ビオチニルアミノ)ヘキサン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、6-[6-(ビオチニルアミノ)ヘキサノイルアミノ]ヘキサン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、ビオチンN-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、6-(ビオチニルアミノ)ヘキサン酸N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、6-[6-(ビオチニルアミノ)ヘキサノイルアミノ]ヘキサン酸N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、及びN-[[2-(ビオチニルアミノ)エチル]ジチオプロピニルオキシ]スルホスクシンイミドのナトリウム塩が挙げられる。
【００１９】
本実施形態のビオチン化F1106-13-3抗体は、ELISA測定によるプレセプシン検出に用いることができる。本実施形態のアミノ基にビオチンを結合させたビオチン化F1106-13-3抗体は、従来のチオール基にビオチンを結合させたF1106-13-3抗体よりも安定性に優れているため、プレセプシン検出用試薬の状態で長期間保管することが可能である。
【００２０】
本発明の範囲には、F1106-13-3抗体のアミノ基にビオチンを結合させる工程を含む、ビオチン化F1106-13-3抗体の製造方法も包含される。
【００２１】
本発明の範囲には、F1106-13-3抗体のアミノ基にビオチンを結合させたビオチン化F1106-13-3抗体を含む第１試薬と、ストレプトアビジン結合固相粒子を含む第２試薬と、F1106-13-3抗体とは異なるエピトープを認識する抗プレセプシン抗体を含む第３試薬と、を含む、プレセプシン測定用試薬キットも包含される。
【００２２】
ビオチン化F1106-13-3抗体については上記したとおりである。
ストレプトアビジン結合固相粒子は、固相粒子の表面にストレプトアビジンが結合した粒子である。固相粒子の材料は、免疫測定に用いられる通常の材料であれば特に限定されない。例えば、ラテックス、ゴム、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリメタクリレートなどのポリマー材料；アガロース；ゼラチン；シリカゲル；ガラス、不活性アルミナ、磁性体などの無機材料などが挙げられる。これらの１種又は２種以上を組み合わせてもよい。
【００２３】
固相粒子は、好ましくは磁性粒子である。磁性粒子は、磁性を有する材料を基材として含む粒子である。このような磁性粒子は、当該技術分野において公知であり、基材として例えばFe2O3及び/又はFe3O4、コバルト、ニッケル、フェライト、マグネタイトなどを用いたものが知られている。磁性粒子の表面へのタンパク質などの結合を目的として、基材の表面をポリマーなどで被覆したものなどがより好ましい。
【００２４】
ビオチン化F1106-13-3抗体を、該抗体中のビオチンを介して固相粒子に結合させる方法は、当該技術分野において公知である。例えば、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、これらの組合せなどにより行うことができる。
【００２５】
F1106-13-3抗体とは異なるエピトープを認識する抗プレセプシン抗体は、プレセプシンに特異的に結合する抗体であって、F1106-13-3抗体とは異なるエピトープを認識するものであれば特に限定されない。このような抗体としては、例えばS68ポリクローナル抗体、S68モノクローナル抗体、F1146-17-2抗体が挙げられる。
【００２６】
F1106-13-3抗体とは異なるエピトープを認識する抗プレセプシン抗体は、検出可能な標識物質で標識されている。このような標識物質は、通常の免疫測定法において用い得る標識物質であれば特に限定されず、酵素、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。酵素としては、例えばアルカリホスファターゼ(ALP)、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ルシフェリンなどが挙げられる。放射性同位元素としては、125I、14C、32Pなどが挙げられる。標識物質は、好ましくはアルカリホスファターゼである。
【００２７】
本実施形態では、上記の各種試薬を収容した容器を箱に梱包して、ユーザに提供してもよい。この箱には、試薬キットの添付文書を同梱していてもよい。この添付文書には、たとえば、試薬キットの構成、プレセプシンの測定プロトコールなどが記載されることが好ましい。図１Ａに、本実施形態の試薬キットの外観の一例を示す。図中、１１０は、試薬キットを示し、１１１は、第１試薬を収容した第１容器を示し、１１２は、第２試薬を収容した第２容器を示し、１１３は、第３試薬を収容した第３容器を示し、１１５は、添付文書を示し、１１６は、梱包箱を示す。
【００２８】
プレセプシン測定用試薬キットは、2-クロロ-5-(メトキシスピロ[1,2-ジオキセタン-3,2'-(5'-クロロ)トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸二ナトリウムを含む第４試薬を更に含んでいてもよい。図１Ｂに、本実施形態の試薬キットの外観の一例を示す。図中、２１０は、試薬キットを示し、２１１は、第１試薬を収容した第１容器を示し、２１２は、第２試薬を収容した第２容器を示し、２１３は、第３試薬を収容した第３容器を示し、２１４は、第４試薬を収容した第４容器を示し、２１５は、添付文書を示し、２１６は、梱包箱を示す。
【００２９】
本発明の範囲には、ビオチン化F1106-13-3抗体を用いるプレセプシンの測定方法も包含される。測定方法は特に限定されず、酵素免疫測定法(EIA)、例えばELISA、ウェスタンブロッティングなどの当業者に公知の方法を用いることができる。
【００３０】
本実施形態では、ビオチン化F1106-13-3抗体を用いるELISAを利用したプレセプシンの測定方法が提供される。より具体的には、F1106-13-3抗体のアミノ基にビオチンを結合させたビオチン化F1106-13-3抗体と、ストレプトアビジン結合固相粒子とを混合し、ビオチン化F1106-13-3抗体-ストレプトアビジン結合固相粒子複合体(第１の複合体)を得る工程と、得られた第１の複合体と生体試料とを混合し、プレセプシン-ビオチン化F1106-13-3抗体-ストレプトアビジン結合固相粒子複合体(第２の複合体)を得る工程と、得られた第２の複合体と、F1106-13-3抗体とは異なるエピトープを認識する抗プレセプシン抗体とを混合し、F1106-13-3抗体とは異なるエピトープを認識する抗プレセプシン抗体-プレセプシン-ビオチン化F1106-13-3抗体-ストレプトアビジン結合固相粒子複合体(第３の複合体)を得る工程と、得られた第３の複合体中の標的物質から得られるシグナルを測定する工程とを含む、プレセプシンの測定方法が提供される。
【００３１】
ビオチン化F1106-13-3抗体、ストレプトアビジン結合固相粒子、F1106-13-3抗体とは異なるエピトープを認識する抗プレセプシン抗体については、上記したとおりである。
生体試料としては、プレセプシン測定に適したものであれば特に限定されないが、血液試料を用いることが好ましい。このような血液試料としては、例えば全血、血清及び血漿などが挙げられる。
【００３２】
標識物質から得られるシグナルの測定方法自体は、当該技術において公知である。本実施形態では、上記の標識物質に由来するシグナルの種類に応じた測定方法を適宜選択すればよい。例えば、標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を反応させることによって発生する光、色などのシグナルを、分光光度計などの公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。
【００３３】
本実施形態の測定方法は、生体試料が敗血症患者のものであるか否かを判定するために用いてもよい。例えば、本実施形態の測定方法により得られるシグナルの測定値(シグナル強度値)から、生体試料中のプレセプシン濃度値を取得し、該濃度値に基づいて、生体試料が敗血症患者のものであるか否かを判定することができる。より具体的には、得られたプレセプシン濃度値が所定の閾値より高い場合には、生体試料が敗血症患者のものであると判定し、所定の閾値より低い場合には、生体試料が敗血症患者のものでないと判定することができる。上記の判定結果は、被検者が敗血症に罹患しているか否かを医師が診断することを補助するために利用することができる。
【００３４】
プレセプシン濃度値としては、例えばシグナル強度値自体又は該強度値から取得される値を用いることができる。シグナル強度値から取得される値としては、例えば、シグナル強度値から陰性対照試料のシグナル強度値又はバックグラウンドの値を差し引いた値が挙げられる。陰性対照試料は適宜選択できるが、例えば、健常者から得た血液試料などが挙げられる。
【００３５】
上記の所定の閾値は特に限定されず、適宜設定できる。例えば、敗血症患者について血液試料中のプレセプシン濃度値を含む敗血症に関連付けられるデータを蓄積することにより、所定の閾値を経験的に設定してもよい。閾値の設定においては、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などを考慮することが好ましい。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例により限定されるものではない。
【００３７】
実施例１：チオール基のアルカリホスファターゼ(ALP)標識
（１）ALP標識抗体を含む試薬の調製
(1-1) プレセプシン検出用試薬
F1106-13-3抗体は、持田製薬株式会社から入手可能である。F1106-13-3抗体をリン酸緩衝液に溶解させ、得られた溶液のEDTA濃度を1 mMに調整した。抗体溶液に2-メルカプトエチルアミン塩酸塩溶液を適量添加し、37℃で所定時間反応させた。その後、PD-10カラム(GEヘルスケアジャパン)を用いて抗体溶液を脱塩し、所定濃度に調整した。
ALP標識剤としてのマレイミド架橋剤をN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解させ、マレイミド架橋剤溶液を調製した。ALP溶液に、上記のマレイミド架橋剤溶液を適量添加し、37℃で所定時間置き、マレイミド基を導入した。その後、PD-10カラム(GEヘルスケアジャパン)を用いて溶液を脱塩し、所定濃度に調整した。
上記の抗体溶液と、上記のALP溶液とを所定割合で混合し、冷蔵庫に入れ、カップリング反応をさせた。その後、2-メルカプトエチルアミン塩酸塩溶液を添加し、反応を停止させた。ALP抗体溶液をゲル濾過し、所望の画分を回収した。
得られた所望の画分はBSAを含む緩衝液で所定の濃度に溶解し、37℃の恒温槽中に置いた。0、1及び4日目にサンプリングを行い、これらを以下の項目(3-1)に記載するプレセプシン検出用試薬として用いた。
【００３８】
(1-2) インスリン検出用試薬
F1106-13-3抗体に代えて市販の抗インスリンモノクローナル抗体を用いたこと以外は上記(1-1)に記載したとおりにして、市販の抗インスリンモノクローナル抗体をALP標識した。得られたALP標識抗インスリン抗体の画分はBSAを含む緩衝液で所定の濃度に溶解し、40℃の恒温槽中に置いた。0及び4日目にサンプリングを行い、これらを以下の項目(3-2)に記載するインスリン検出用試薬として用いた。
【００３９】
(1-3) pro-GRP検出用試薬
F1106-13-3抗体に代えて市販の抗proGRPモノクローナル抗体を用いたこと以外は上記(1-1)に記載したとおりにして、市販の抗proGRPモノクローナル抗体をALP標識した。得られたALP標識抗proGRP抗体の画分はBSAを含む緩衝液で所定の濃度に溶解し、35℃の恒温槽中に置いた。0及び3日目にサンプリングを行い、これらを以下の項目(3-3)に記載するpro-GRP検出用試薬として用いた。
【００４０】
(1-4) PIVKA-II検出用試薬
F1106-13-3抗体に代えて市販の抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を用いたこと以外は上記(1-1)に記載したとおりにして、市販の抗PIVKA-IIモノクローナル抗体をALP標識した。得られたALP標識抗PIVKA-II抗体の画分はBSAを含む緩衝液で所定の濃度に溶解し、40℃の恒温槽中に置いた。0及び3日目にサンプリングを行い、これらを以下の項目(3-4)に記載するPIVKA-II検出用試薬として用いた。
【００４１】
(1-5) KL-6検出用試薬
F1106-13-3抗体に代えて市販の抗KL-6モノクローナル抗体を用いたこと以外は上記(1-1)に記載したとおりにして、市販の抗KL-6モノクローナル抗体をALP標識した。得られたALP標識抗KL-6抗体の画分はBSAを含む緩衝液で所定の濃度に溶解し、40℃の恒温槽中に置いた。0及び3日目にサンプリングを行い、これらを以下の項目(3-5)に記載するKL-6検出用試薬として用いた。
【００４２】
（２）試料の調製
プレセプシン測定の試料を、BSAを含む緩衝液で組換え抗原（持田製薬）を10000 pg/mLに希釈して調製した。プレセプシン以外の測定項目については、試料として、市販のキャリブレータを用いた。
【００４３】
（３）測定
(3-1) プレセプシン検出
プレセプシン検出にはHISCL 2000i (シスメックス社製)を用いた。
プレセプシン捕捉用抗体として、市販の抗プレセプシン抗体にビオチンが結合したビオチン結合抗プレセプシン抗体を用いた。このビオチン結合抗プレセプシン抗体を含む緩衝液(50μl)と試料(10μL)とを混合し、ビオチン結合抗プレセプシン抗体とプレセプシンとを特異的に反応させた。ここに、ストレプトアビジン結合磁性粒子を含む緩衝液(30μL)を加え、抗体-プレセプシン複合体をストレプトアビジン結合磁性粒子に結合させた。上記の項目(1-1)で得られたプレセプシン検出用試薬(30μL)を加え、ALP標識抗体を、上記の複合体中のプレセプシンと特異的に反応させた。300μLのHISCL洗浄液を用いて9回洗浄することにより未反応液を除去後、2種類のHISCL発光基質セット(それぞれ50μL及び100μL)を添加し、発光強度を測定した。
【００４４】
(3-2) インスリン検出
インスリン検出にはHISCL 2000i (シスメックス社製)を用いた。プレセプシン検出用試薬(30μL)に代えて上記の項目(1-2)で得られたインスリン検出用試薬(100μL)を用いたこと、及び、ビオチン結合抗プレセプシン抗体を含む緩衝液(50μL)に代えて、市販の抗インスリン抗体にビオチンが結合したビオチン結合抗インスリン抗体を含む緩衝液(50μL)を用いたこと以外はプレセプシン検出と同様にして、発光強度を測定した。
【００４５】
(3-3) proGRP検出
pro-GRP検出にはHISCL 2000i (シスメックス社製)を用いた。プレセプシン検出用試薬(30μL)に代えて上記の項目(1-3)で得られたpro-GRP検出用試薬(30μL)を用いたこと、ビオチン結合抗プレセプシン抗体を含む緩衝液(50μL)に代えて、市販の抗pro-GRP抗体にビオチンが結合したビオチン結合抗pro-GRP抗体を含む緩衝液(50μL)を用いたこと、及び、試料を30μLとしたこと以外はプレセプシン検出と同様にして、発光強度を測定した。
【００４６】
(3-4) PIVKA-II検出
PIVKA-II検出にはHISCL 2000i (シスメックス社製)を用いた。プレセプシン検出用試薬(30μL)に代えて上記の項目(1-4)で得られたPIVKA-II検出用試薬(120μL)を用いたこと、及び、ビオチン結合抗プレセプシン抗体を含む緩衝液(50μL)に代えて、市販の抗PIVKA-II抗体にビオチンが結合したビオチン結合抗PIVKA-II抗体を含む緩衝液(100μL)を用いたこと以外はプレセプシン検出と同様にして、発光強度を測定した。
【００４７】
(3-5) KL-6検出
KL-6検出にはHISCL 2000i (シスメックス社製)を用いた。プレセプシン検出用試薬(30μL)に代えて上記の項目(1-5)で得られたKL-6検出用試薬(50μL)を用いたこと、ビオチン結合抗プレセプシン抗体を含む緩衝液(50μL)に代えて、市販の抗KL-6抗体にビオチンが結合したビオチン結合抗KL-6抗体を含む緩衝液(100μL)を用いたこと以外はプレセプシン検出と同様にして、発光強度を測定した。
【００４８】
（４）結果
測定結果を図２に示す。図２に示されるように、プレセプシン検出において見られた発光強度は、他の分子の測定において見られたものと類似の強度を示した。このことは、チオール基をALP標識したF1106-13-3抗体が、他のALP標識抗体と同程度に安定であることを示す。
【００４９】
実施例２：チオール基のビオチン標識
（１）試薬の調製
(1-1) プレセプシン捕捉用試薬
アルカリホスファターゼ(ALP)に代えて、F1106-13-3抗体のチオール基をビオチンで標識したこと以外は実施例１と同様にして、ビオチン標識F1106-13-3抗体を得た。
ビオチン標識は、以下のとおりにして行った。まず、F1106-13-3抗体をリン酸緩衝液に溶解させ、EDTA濃度を1 mMに調整した。該溶液に2-メルカプトエチルアミン塩酸塩溶液を適量添加し、37℃で所定時間反応させた。その後、PD-10(GEヘルスケアジャパン)を用いて該溶液を脱塩し、所定濃度に調整した。
ビオチン標識剤をジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解させ、ビオチン標識剤溶液を調製した。
上記のF1106-13-3抗体溶液と、上記のビオチン標識剤溶液とを所定割合で混合し、37℃で置き、マレイミド基を導入した。混合液をゲル濾過し、所望の画分を回収した。
得られた所望の画分はBSAを含む緩衝液で所定の濃度に溶解し、37℃の恒温槽中に置いた。0、1及び4日目にサンプリングを行い、これらを以下の項目(3-1)に記載するプレセプシン捕捉用試薬として用いた。
【００５０】
(1-2) インスリン捕捉用試薬
アルカリホスファターゼ(ALP)に代えて、抗インスリン抗体のチオール基をビオチンで標識したこと以外は実施例１と同様にして、ビオチン標識抗インスリン抗体を得た。得られたビオチン標識抗インスリン抗体を緩衝液に溶解させ、得られた溶液を40℃の恒温槽中に置いた。0及び4日目にサンプリングを行い、これらを以下の項目(3-2)に記載するインスリン捕捉用試薬として用いた。
【００５１】
(1-3) pro-GRP捕捉用試薬
アルカリホスファターゼ(ALP)に代えて、抗pro-GRP抗体のチオール基をビオチンで標識したこと以外は実施例１と同様にして、ビオチン標識抗pro-GRP抗体を得た。得られたビオチン標識抗pro-GRP抗体を緩衝液に溶解させ、得られた溶液を40℃の恒温槽中に置いた。0、1及び3日目にサンプリングを行い、これらを以下の項目(3-3)に記載するpro-GRP捕捉用試薬として用いた。
【００５２】
(1-4) PIVKA-II捕捉用試薬
アルカリホスファターゼ(ALP)に代えて、抗PIVKA-II抗体のチオール基をビオチンで標識したこと以外は実施例１と同様にして、ビオチン標識抗PIVKA-II抗体を得た。得られたビオチン標識抗PIVKA-II抗体を緩衝液に溶解させ、得られた溶液を40℃の恒温槽中に置いた。0及び3日目にサンプリングを行い、これらを以下の項目(3-4)に記載するPIVKA-II捕捉用試薬として用いた。
【００５３】
（２）試料の調製
プレセプシン測定の試料を、BSAを含む緩衝液で組換え抗原（持田製薬）を10000 pg/mLに希釈して調製した。プレセプシン以外の測定項目については、試料として、市販のキャリブレータを用いた。
【００５４】
（３）測定
(3-1) プレセプシン検出
プレセプシン検出にはHISCL 2000i (シスメックス社製)を用いた。プレセプシン検出用抗体として、市販の抗プレセプシン抗体をALPで標識したALP標識抗プレセプシン抗体を用いた。抗体のALP標識は、実施例１と同様にして行った。上記(1-1)で得られた、チオール基をビオチン標識したF1106-13-3抗体を含むプレセプシン捕捉用試薬(50μl)と試料(10μL)とを混合し、ビオチン標識F1106-13-3抗体とプレセプシンとを特異的に反応させた。ここに、ストレプトアビジン結合磁性粒子を含む緩衝液(30μL)を加え、抗体-プレセプシン複合体をストレプトアビジン結合磁性粒子に結合させた。上記のALP標識抗プレセプシン抗体を含む緩衝液(30μL)を加え、ALP標識抗プレセプシン抗体を、上記の複合体中のプレセプシンと特異的に反応させた。300μLのHISCL洗浄液を用いて9回洗浄することにより未反応液を除去後、2種類のHISCL発光基質セット(それぞれ50μL及び100μL)を添加し、発光強度を測定した。
【００５５】
(3-2) インスリン検出
プレセプシン捕捉用試薬に代えて、上記の項目(1-2)で得られたインスリン捕捉用試薬を用いたこと、及び、ALP標識抗プレセプシン抗体に代えて、市販の抗インスリン抗体をALPで標識したALP標識抗インスリン抗体を用いたこと以外はプレセプシン検出と同様にして、発光強度を測定した。
【００５６】
(3-3) pro-GRP検出
プレセプシン捕捉用試薬に代えて、上記の項目(1-3)で得られたpro-GRP捕捉用試薬を用いたこと、及び、ALP標識抗プレセプシン抗体に代えて、市販の抗pro-GRP抗体をALPで標識したALP標識抗pro-GRP抗体を用いたこと以外はプレセプシン検出と同様にして、発光強度を測定した。
【００５７】
(3-4) PIVKA-II検出
プレセプシン捕捉用試薬に代えて、上記の項目(1-4)で得られたPIVKA-II捕捉用試薬を用いたこと、及び、ALP標識抗プレセプシン抗体に代えて、市販の抗PIVKA-II抗体をALPで標識したALP標識抗PIVKA-II抗体を用いたこと以外はプレセプシン検出と同様にして、発光強度を測定した。
【００５８】
（４）結果
測定結果を図３に示す。図３に示されるように、プレセプシン検出において見られた蛍光強度は、他の分子の測定において見られたものと比べて著しく減少していた。このことは、チオール基をビオチン標識したF1106-13-3抗体が、他のビオチン標識抗体よりも不安定であることを示す。
【００５９】
実施例３：アミノ基のビオチン標識
（１）アミノ基がビオチン標識されたF1106-13-3を含むプレセプシン検出用試薬の調製
チオール基に代えて、F1106-13-3抗体のアミノ基をビオチンで標識したこと以外は実施例２と同様にしてビオチン標識F1106-13-3抗体を得た。アミノ基のビオチン標識は、ビオチン Labelling Kit - NH2(同仁化学研究所)のTechnical Manualに従って行った。得られたビオチン標識F1106-13-3抗体を緩衝液に溶解させ、得られた溶液を37℃の恒温槽中に置いた。0、2、5、7及び14日目にサンプリングを行い、これらを以下の項目(３)に記載するプレセプシン検出用試薬として用いた。
【００６０】
（２）試料の調製
プレセプシン測定の試料を、BSAを含む緩衝液で組換え抗原（持田製薬）を10000 pg/mLに希釈して調製した。プレセプシン以外の測定項目については、試料として、市販のキャリブレータを用いた。
【００６１】
（３）測定−プレセプシン検出
上記のようにしてアミノ基をビオチン標識したF1106-13-3抗体を含む緩衝液(50μl)を、プレセプシン捕捉用試薬として用いたこと以外は実施例２と同様にして、発光強度を測定した。
【００６２】
（４）結果
測定結果を図４に示す。図４に示されるように、プレセプシン検出において見られた蛍光強度は、他の分子の測定において見られたものと類似の強度を示した。このことは、アミノ基をビオチン標識したF1106-13-3抗体が、他のビオチン標識抗体と同程度に安定であることを示す。以上の結果から、F1106-13-3抗体のチオール基ではなく、アミノ基をビオチン標識することにより、F1106-13-3抗体を安定化させることができることが示された。
【符号の説明】
【００６３】
１１０、２１０    試薬キット
１１１、２１１    第１容器
１１２、２１２    第２容器
１１３、２１３    第３容器
２１４            第４容器
１１５、２１５    添付文書
１１６、２１６    梱包箱
【図１Ａ】
2018140961.tif 000002
【図１Ｂ】
2018140961.tif 000003
【図２】
2018140961.tif 000004
【図３】
2018140961.tif 000005
【図４】
2018140961.tif 000006
【配列表】
2018140961000001.app