(57)【要約】【課題】磁性細菌を選択的に集積培養することができる磁性細菌培養用基材の提供。【解決手段】炭酸カルシウム及び炭酸マグネシウムから選ばれる１種以上の炭酸塩と、鉄化合物と、硫黄とを含有する磁性細菌培養用基材。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭酸カルシウム及び炭酸マグネシウムから選ばれる１種以上の炭酸塩と、鉄化合物と、硫黄とを含有する磁性細菌培養用基材。
【請求項２】
形態が粒状物又は塊状物であり、当該各粒状物又は各塊状物中に前記炭酸塩、鉄化合物及び硫黄が含まれている請求項１記載の磁性細菌培養用基材。
【請求項３】
前記鉄化合物が、硫酸第一鉄、塩化第一鉄、硝酸第一鉄及びクエン酸第一鉄から選ばれる１種以上である請求項１又は２記載の磁性細菌培養用基材。
【請求項４】
炭酸カルシウム及び炭酸マグネシウムから選ばれる１種以上の炭酸塩と鉄化合物と硫黄とを含有する混合物を加熱溶融後急冷固化し、次いで得られた固化物を粉砕及び／又は造粒することを特徴とする磁性細菌培養用基材の製造方法。
【請求項５】
得られる磁性細菌培養用基材の形態が粒状物又は塊状物であり、当該各種粒状物又は各塊状物中に前記炭酸塩、鉄化合物及び硫黄が含まれている請求項４記載の磁性細菌培養用基材の製造方法。
【請求項６】
前記鉄化合物が、硫酸第一鉄、塩化第一鉄、硝酸第一鉄及びクエン酸第一鉄から選ばれる１種以上である請求項４又は５記載の磁性細菌培養用基材の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項記載の磁性細菌培養用基材を含有する培地中で、磁性細菌を含有する微生物混合物を培養することを特徴とする磁性細菌の集積方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性細菌培養用基材及びこれを用いた磁性細菌の集積方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁性細菌は、細胞内に単体鉄やフェライトの小粒を作り、磁性を持つ細菌である。この磁性細菌が有する磁性微粒子は、磁気記録材料、医療分野における薬剤キャリア等として期待されている（特許文献１〜３）。また、磁性細菌をバイオレメディエーションに応用しようとする研究もされている。
【０００３】
このような磁性細菌培養用の培地としては、コハク酸、ガラクトース、アミノ酸類、硝酸塩、キナ酸鉄、チオグリコール酸ナトリウムを含有する培地（特許文献１、３）、ＭＳＧＭ培地（非特許文献１、２）等が用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭６２−２９４０８９号公報
【特許文献２】特開昭６３−１２６４８１号公報
【特許文献３】特開平６−２６１７４５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Indiam Journal of Experimental Biology, Vol 48, May 2010, pp.518-523
【非特許文献２】International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 63, 2013, 1824-1833
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の磁性細菌培養培地組成は、複雑でかつ高価な試薬を複数種使用するため、大量培養には応用できず、また磁性細菌の選択性が低く、自然界に他の多くの菌とともに存在する細菌叢の中から磁性細菌を選択的に集積させることは困難であった。
本発明の課題は、磁性細菌を選択的に集積培養することができる磁性細菌培養用基材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、磁性細菌を選択的に増殖させることができる材料について種々検討したところ、全く意外にも、炭酸塩と鉄化合物と硫黄とを含有する基材を用いれば、磁性細菌が選択的に増殖し、多種の菌が存在する菌叢の中から磁性細菌を集積させることができることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔７〕を提供するものである。
【０００９】
〔１〕炭酸カルシウム及び炭酸マグネシウムから選ばれる１種以上の炭酸塩と、鉄化合物と、硫黄とを含有する磁性細菌培養用基材。
〔２〕形態が粒状物又は塊状物であり、当該各粒状物又は各塊状物中に前記炭酸塩、鉄化合物及び硫黄が含まれている〔１〕記載の磁性細菌培養用基材。
〔３〕前記鉄化合物が、硫酸第一鉄、塩化第一鉄、硝酸第一鉄及びクエン酸第一鉄から選ばれる１種以上である〔１〕又は〔２〕記載の磁性細菌培養用基材。
〔４〕炭酸カルシウム及び炭酸マグネシウムから選ばれる１種以上の炭酸塩と鉄化合物と硫黄とを含有する混合物を加熱溶融後急冷固化し、次いで得られた固化物を粉砕及び／又は造粒することを特徴とする磁性細菌培養用基材の製造方法。
〔５〕得られる磁性細菌培養用基材の形態が粒状物又は塊状物であり、当該各種粒状物又は各塊状物中に前記炭酸塩、鉄化合物及び硫黄が含まれている〔４〕記載の磁性細菌培養用基材の製造方法。
〔６〕前記鉄化合物が、硫酸第一鉄、塩化第一鉄、硝酸第一鉄及びクエン酸第一鉄から選ばれる１種以上である〔４〕又は〔５〕記載の磁性細菌培養用基材の製造方法。
〔７〕〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の磁性細菌培養用基材を含有する培地中で、磁性細菌を含有する微生物混合物を培養することを特徴とする磁性細菌の集積方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の磁性細菌培養用基材を用いれば、磁性細菌を選択的に増殖させることができるため、自然界等の多種の菌を含有する菌叢の中から磁性菌を集積培養できる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の磁性細菌培養用基材は、（Ａ）炭酸カルシウム及び炭酸マグネシウムから選ばれる１種以上の炭酸塩と、（Ｂ）鉄化合物と、（Ｃ）硫黄とを含有する。
【００１２】
本発明に用いられる（Ａ）炭酸塩は、炭酸カルシウム及び炭酸マグネシウムから選ばれる１種以上である。これらの炭酸塩は、１種を用いてもよいし２種を混合して用いてもよい。
（Ａ）炭酸塩としては、これらの炭酸塩を含有する材料、例えば重質炭酸カルシウム、軽質炭酸カルシウム、石灰石粉末、苦灰石粉末、貝化石粉末、炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウムカルシウムを用いることができる。
【００１３】
本発明に用いられる（Ｂ）鉄化合物としては、無機酸第一鉄が好ましく、硫酸第一鉄、塩化第一鉄、硝酸第一鉄及びクエン酸第一鉄から選ばれる１種以上がより好ましい。これらの鉄化合物は、１種を用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
【００１４】
本発明に用いられる（Ｃ）硫黄は、磁性細菌の基質になると考えられる。
【００１５】
本発明の磁性細菌培養用基材は、前記（Ａ）炭酸塩と（Ｂ）鉄化合物と（Ｃ）硫黄とを含有するが、その含有比は磁性細菌の選択的増殖促進効果の点から、重量比（Ａ：Ｂ：Ｃ）で５０〜１５０：０．１〜１０：１５０〜５０が好ましく、８０〜１２０：０．１〜１０：１２０〜８０がより好ましく、９０〜１１０：０．１〜１０：１１０〜９０がさらに好ましい。
【００１６】
本発明の磁性細菌培養用基材中には、磁性細菌の選択的増殖促進効果の点から、前記（Ａ）炭酸塩、（Ｂ）鉄化合物及び（Ｃ）硫黄が均一に分散しているのが好ましく、一粒子中にこれらの３成分を含有しているのがより好ましい。かかる観点から、本発明磁性細菌培養用基材は、粒状物又は塊状物であって、各粒状物又は各塊状物中に前記３成分が含まれている形態が好ましい。
【００１７】
本発明の磁性細菌培養用基材の粒子径は、磁性細菌の選択的増殖促進効果の点から、１０μｍ〜３０ｍｍが好ましく、１００μｍから３０ｍｍがより好ましく、１００μｍから２０ｍｍがさらに好ましい。
【００１８】
本発明の磁性細菌培養用基材は、例えば、（Ａ）炭酸カルシウム及び炭酸マグネシウムから選ばれる１種以上の炭酸塩と、（Ｂ）鉄化合物と、（Ｃ）硫黄とを含有する混合物を加熱溶融後急冷固化し、次いで得られた固化物を粉砕及び／又は造粒することにより製造できる。
【００１９】
前記（Ａ）炭酸塩、（Ｂ）鉄化合物及び（Ｃ）硫黄の混合比は、前記含有比のとおりである。
【００２０】
得られた混合物の加熱溶融条件は、例えば１２０℃〜１５０℃に加熱すればよく、より好ましくは１３０℃〜１４０℃に加熱すればよい。次に急冷固化条件は、例えば１〜１０℃／ｓｅｃの条件で急冷すればよい。具体的には、固化物を２０±５℃の水を使用して冷却すればよい。
【００２１】
得られた固化物の粉砕には、ジョークラッシャー、ジャイレトリークラッシャー、ハンマーミル、ボールミル等を用いることができる。また、造粒は、例えば、パンペレタイザー、ディスクペレッター、ブリケットマシン等を用いることができる。これらの粉砕及び／又は造粒後、さらに必要により篩分けにより、前記の粒子径に調整するのが好ましい。
【００２２】
本発明の磁性細菌培養用基材を用いて、磁性細菌含有水等の微生物混合物を培養すれば、磁性細菌が選択的に増殖するため、磁性細菌を集積することができる。従って、本発明は、前記の磁性細菌培養用基材を含有する培地中で、磁性細菌を含有する微生物混合物を培養することを特徴とする磁性細菌の集積方法を提供する。
【００２３】
ここで、微生物混合物としては、磁性細菌が含まれている可能性のある水溶液であり、例えば生活排水、産業排水、畜産排水、農業排水、水産養殖排水、地下水、河川水、海水等が挙げられる。
【００２４】
培地には、本発明の磁性細菌培養用基材の他、コハク酸、トリプトファン、グルコース、マルトース等の炭素源、塩化アンモニウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム等の無機塩、微量金属、水等を含有するのが好ましい。なお、ｐＨは６．５〜７．５が好ましい。培地中の本発明磁性細菌培養用基材の含有量は、１５０〜４００ｇ／Ｌが好ましく、２００〜３５０ｇ／Ｌがより好ましく、２５０〜３００ｇ／Ｌがさらに好ましい。
【００２５】
培養条件は、磁性細菌が生育する条件であればよく、例えば濃度が０．１〜５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１〜５ｍｇ／Ｌの条件でｐＨ６．０〜８．０、１０〜４０℃の条件で行えばよい。
【００２６】
なお、本発明における磁性細菌としては、Magnetovibrio blakemorei、Magnetospirillum magnetotacticum、Magnetospirillum gyphiswaldense等が挙げられる。
【実施例】
【００２７】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００２８】
実施例１
（１）試験方法
表１に示す配合で硫黄（粉末硫黄、Ｓ  ２００メッシュ、細井化学工業社製）を１２０℃で加熱して溶融させ、炭酸カルシウム（Ｔ−２００、ニッチツ社製）、鉄化合物（硫酸第一鉄、試薬、関東化学社製）と均一に攪拌混合させた後に冷却水で急冷した。得られた固化物を破砕して篩い分けをし、粒径が５〜２０ｍｍの基材を作製した。５００ｍＬ容三角フラスコに磁性細菌Magnetospirillum magnetotacticum ＮＢＲＣ１５２７２培養液と表１の組成の基材を１００ｇ入れ、表２に示す組成の培地を４００ｍＬ添加して３０℃で２週間静置培養した（ただし比較例４は基材投入無し）。２週間後の培養液中の微生物数を計測した。培養液中の微生物数は、研究用生物顕微鏡Ｎｉ−Ｕ（Ｎｉｋｏｎ社製）を用いて顕微鏡法で計測した。
【００２９】
【表１】
2018093744.tif 000002
【００３０】
【表２】
2018093744.tif 000003
【００３１】
（２）試験結果
試験結果を表３に示す。実施例１〜７はいずれも比較例１及び２に比べて２週間後の細菌数が１オーダー程度高く、磁性細菌の培養基材として適していることを確認した。
【００３２】
【表３】
2018093744.tif 000004
【００３３】
実施例２
（磁性細菌の集積培養）
（１）試験方法
水域環境より試料を採取してＤＮＡを抽出し、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子Ｖ４領域（約２５０ｂｐ）を対象とし、次世代シークエンスを用いた微生物相の解析を実施した。
更に、採取した試料を用いて磁性細菌の集積培養を実施した。５００ｍＬ容三角フラスコに試料１０ｇと培養基材１（実施例２：硫黄：炭カル：硫酸第一鉄＝１００：１００：１）または培養基材２（比較例１：硫黄：炭カル＝１００：１００、硫酸第一鉄は添加無し）のいずれかを１００ｇ入れ、表４に示す組成の培地を４００ｍＬ添加し、３０℃で静置培養した。１週間に１回培養液の半分をデカントして新たに作製した培地を加える半回分式で実施した。集積２ヵ月後の培養基材１および２の表面に付着したバイオフィルムよりＤＮＡを抽出し、同様に次世代シークエンスを用いて微生物相を解析した。
【００３４】
【表４】
2018093744.tif 000005
【００３５】
（２）試験結果
集積培養前の試料中の分析結果を表５に、２ヶ月間の集積培養後の培養基材１の分析結果を表６、２ヶ月間の集積培養後の培養基材２の分析結果を表７に示す。集積培養前は多様な細菌種が存在し、磁性細菌であるMagnetovibrio blakemoreiの検出率は０．１８％と極めて低かった。また硫酸第一鉄を含まない培養基材２を用いて集積しても検出率は３．５３％と低くSulfurimonas denitrificansなどの硫黄脱窒菌が集積されたのに対して、硫酸第一鉄を含む培養基材１を用いた集積では８２．９４％とMagnetovibrio blakemoreiの検出率が非常に高くなり、硫酸第一鉄を含む培養基材１を用いることで磁性細菌が集積されることが確認された。
【００３６】
【表５】
2018093744.tif 000006
【００３７】
【表６】
2018093744.tif 000007
【００３８】
【表７】
2018093744.tif 000008