(57)【要約】【課題】担体に高効率且つ位置選択的に固定化することが可能なフコース結合性を有するレクチン、当該レクチンの製造方法、当該レクチンを水に不溶性の担体に固定化して得られるフコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着剤を提供すること。【解決手段】システインを１つ以上含むオリゴペプチドを、フコース結合性レクチンのＮ末端側またはＣ末端側に付加したタンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を水に不溶性の担体に固定化して得られる吸着剤により、前記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコース結合性レクチンのＮ末端またはＣ末端に、システインを１つ以上含むオリゴペプチドを有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
フコース結合性レクチンが、
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも２番目のプロリンから１５６番目のグリシンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（Ｂ）上記（Ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたタンパク質である、
請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
システインを１つ以上含むオリゴペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドである、請求項１または２記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項５記載の発現ベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項７】
宿主が大腸菌である、請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
フコース結合性レクチンのＮ末端またはＣ末端に、システインを１つ以上含むオリゴペプチドを有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主に導入して得られた形質転換体を培養する工程と、得られる培養物から前記タンパク質を回収する工程とを含む、タンパク質の製造方法。
【請求項９】
フコース結合性レクチンが、
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも２番目のプロリンから１５６番目のグリシンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（Ｂ）上記（Ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたタンパク質であることを特徴とする請求項８記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のタンパク質が、水に不溶性の担体に固定化されていることを特徴とする、フコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着剤。
【請求項１１】
水に不溶性の担体が、システインのメルカプト基と反応して共有結合を形成する官能基を有することを特徴とする、請求項８または９記載の吸着剤。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の吸着剤を用いることを特徴とする、フコース含有糖鎖および／または複合糖質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担体に高効率且つ位置選択的に固定化することが可能な、フコース含有糖鎖および／または複合糖質に結合性を有するレクチン、当該レクチンをコードするポリヌクレオチド、当該レクチンの製造方法、および当該レクチンを水に不溶性の担体に固定化することにより得られる吸着剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
レクチンは糖類に結合性を有するタンパク質の総称であり、単糖や糖鎖だけでなく、単糖や糖鎖がタンパク質や脂質に結合した複合糖質にも結合することが知られており、また、糖鎖を特異的に認識することから、従来から糖鎖や複合糖質の検出や分離精製に幅広く利用されている。例えば、特許文献１ではレクチンを固定化した基板を用いた糖鎖プロファイリング技術が開示されており、また、非特許文献１ではレクチンを固定化したアガロースを用いた糖タンパク質の分離精製法が開示されている。
【０００３】
近年、糖鎖の機能解析に関する研究が進展するに伴い、糖鎖が糖タンパク質などの生体分子の機能や細胞の分化や認識に重要な役割を果たしていることが明らかになってきている。糖鎖の中でもフコース含有糖鎖は生理機能と関連するものが多く、例えば、非特許文献２に開示されているルイス式血液型抗原や腫瘍マーカーとしてのシアリルルイス糖鎖抗原が知られている。また、特許文献２では、抗体組成物に結合したＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにα１−６結合したフコースを除去することにより、抗体組成物の抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性を促進させる方法が開示されている。
【０００４】
このように多様な生理機能を有するフコース含有糖鎖および複合糖質を高い効率で分離精製する方法としては、フコース結合性レクチンを固定化した担体にフコース含有糖鎖および複合糖質を吸着させたのち、脱着させる方法が一般的である。フコース含有糖鎖に結合するレクチンとしては、例えば、非特許文献３に開示されているα１−２結合したフコース含有糖鎖に結合するヒイロチャワンタケ由来のレクチンや、特許文献３に開示されているα１−６結合したフコース含有糖鎖に結合するスギタケ由来のレクチンが知られている。
【０００５】
レクチンの担体への固定化方法としては、例えば、マンノース結合性レクチンであるコンカナバリンＡをアガロースゲルに固定化したＣｏｎＡ−Ａｇａｒｏｓｅ（Ｊ−オイルミルズ社製）の製品カタログに開示されている還元アミノ化法など、レクチン分子中のリジンのε−アミノ基と、担体に導入したホルミル基やエポキシ基などの官能基を反応させて共有結合により固定化する方法が一般的である。しかしながら、レクチン中のリジンがレクチン分子内に埋没している場合には、レクチンと担体に導入した官能基との反応性が低下するため、担体への固定化率が低下する、あるいは担体に固定化されない場合があることが問題であった。また、レクチン中にリジンが多数存在する場合には、レクチンが担体にランダムに固定化されるため、糖鎖結合領域の一部が担体側に向いた形で固定化されるなど、結果として糖鎖や複合糖質の結合性が損なわれる場合があることが問題であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４８２４１１９号公報
【特許文献２】特許第５５４７７５４号公報
【特許文献３】特許第４５１４１６３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６５（２），７０３−７０７，１９８９
【非特許文献２】蛋白質核酸酵素，４３（１６），２３９４−２４０３，１９９８
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９，２８４１−２８４６，１９８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、フコース含有糖鎖および／または複合糖質に結合性を有するレクチンを担体に固定化する際に、高効率且つ位置選択的に担体に固定化することが可能なタンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を水に不溶性の担体に固定化して得られる吸着剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、フコース含有糖鎖および／または複合糖質に結合性を有するレクチンのＮ末端側またはＣ末端側にシステインを１つ以上含むオリゴペプチドを付加したタンパク質が、高効率且つ位置選択的に担体に固定化できることを見いだした。さらに、本発明のレクチンを水に不溶性の担体に固定化した吸着剤がフコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着剤として優れた性能を持つことを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の（１）から（１３）に記載した発明を提供するものである。
【００１１】
（１）フコース結合性レクチンのＮ末端またはＣ末端に、システインを１つ以上含むオリゴペプチドを有することを特徴とするタンパク質。
（２）フコース結合性レクチンが、
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも２番目のプロリンから１５６番目のグリシンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（Ｂ）上記（Ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたタンパク質である、
（１）記載のタンパク質。
（３）システインを１つ以上含むオリゴペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドである、（１）または（２）記載のタンパク質。
（４）（１）から（３）のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（５）（４）記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（６）（５）記載の発現ベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
（７）宿主が大腸菌である、（６）記載の形質転換体。
（８）フコース結合性レクチンのＮ末端またはＣ末端に、システインを１つ以上含むオリゴペプチドを有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主に導入して得られた形質転換体を培養する工程と、得られる培養物から前記タンパク質を回収する工程とを含む、タンパク質の製造方法。
（９）フコース結合性レクチンが、
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも２番目のプロリンから１５６番目のグリシンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（Ｂ）上記（Ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたタンパク質であることを特徴とする（８）記載のタンパク質の製造方法。
（１０）（８）または（９）に記載のタンパク質が、水に不溶性の担体に固定化されていることを特徴とする、フコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着剤。
（１１）水に不溶性の担体が、システインのメルカプト基と反応して共有結合を形成する官能基を有することを特徴とする、（８）または（９）記載の吸着剤。
（１２）（１０）または（１１）に記載の吸着剤を用いることを特徴とする、フコース含有糖鎖および／または複合糖質の精製方法。
【００１２】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
【００１３】
本発明において、フコース結合性レクチンとは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるフコース含有糖鎖および／または複合糖質に結合性を有するレクチンである。本発明のタンパク質は、配列番号１に示したアミノ酸配列からなるフコース結合性レクチンのＮ末端またはＣ末端に、システインを１つ以上含むオリゴペプチド（以下、システインタグという）が付加したタンパク質であることを特徴とする。より具体的には、例えば、配列番号３に示した、配列番号１に示したアミノ酸配列からなるフコース結合性レクチンの少なくとも２番目のプロリンから１５６番目のグリシンまでを含む領域のＣ末端に、配列番号２に示したシステインタグが付加した配列であることを特徴とする。
【００１４】
なお本発明のタンパク質は、フコース含有糖鎖および／または複合糖質と結合性を有する機能と、水に不溶性の担体に導入されたチオール基と反応する官能基と反応可能なシステインを含めばよく、例えば、配列番号１に示したアミノ酸配列のうち、２番目のプロリンから１５６番目のグリシンまでの領域のアミノ酸のうちの１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたタンパク質や、配列番号３１（配列番号１に示したアミノ酸配列の２番目のプロリンから１５６番目のグリシンのＣ末端に、配列番号３２に示したアミノ酸配列からなるリンカーを導入し、そのＣ末端に配列番号２に示したシステインを含むアミノ酸配列が付加した配列）のような、システインタグの前にリンカーやドメインをコードするアミノ酸が付加されたタンパク質も、フコース含有糖鎖および／または複合糖質に結合する機能と、担体に導入されたメルカプト基と反応する官能基と反応可能なシステインを含むため、本発明のタンパク質に含まれる。
【００１５】
また、本発明において、システインタグの長さは当該タグを付加するフコース結合性レクチンが有するフコース含有糖鎖および／または複合糖質との結合性を損なわない限り、１アミノ酸から５０アミノ酸の範囲の中から任意に設定可能であり、特に２アミノ酸から２０アミノ酸の範囲に設定することが好ましい。システインタグに含まれるシステインは１つ以上あればよいが、２つ以上のシステインを含む場合はシステイン同士でＳ−Ｓ結合が形成されないようにシステインタグのアミノ酸配列を設計する必要がある。システインタグを構成するシステイン以外のアミノ酸の種類は、本発明のタンパク質を固定化する水に不溶性の担体の物性を考慮し、本発明のタンパク質が担体と接近しやすい物性を有したアミノ酸を適宜選択すればよい。本発明におけるシステインタグの一例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドをあげることができる。
【００１６】
本発明のフコース結合性タンパク質を遺伝子工学的に製造するために用いるポリヌクレオチドは、本発明のフコース結合性タンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチドであればよい。本発明のフコース結合性タンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチドは公知の方法により調製することが可能である。前記ポリヌクレオチド調製法の一例として、
（Ａ）本発明のタンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（Ｂ）本発明のタンパク質のうちフコース結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、直接人工的に、またはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａのゲノムＤＮＡ等からＰＣＲ法などのＤＮＡ増幅法を用いて調製後、当該調製したポリヌクレオチドの５’末端側または３’末端側に、配列番号２に記載のシステインタグをコードするオリゴヌクレオチドを遺伝子工学的手法により付加する方法、を例示することができる。
【００１７】
なお、当該調製法において、前記ポリヌクレオチド配列を設計する際は、形質転換する宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して設計した方が、宿主を用いた効率的なタンパク質発現ができる点で好ましい。また、前述の調製方法において（Ｂ）で調製したポリヌクレオチドを鋳型に、アミノ酸の置換、および／または欠失、および／または付加するように設計したプライマーセットを用いてＰＣＲ法で増幅を行なう、またはエラープローンＰＣＲ法にて増幅を行なうことで、１残基以上のアミノ酸の置換、および／または欠失、および／または付加された、フコース結合性タンパク質をコードしたポリヌクレオチドを調製することができる。
【００１８】
前記方法により得られた本発明のタンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチドは、通常の遺伝子工学の分野で使用される相応のベクター系に導入することにより、種々の宿主で本発明のタンパク質を発現することができる。宿主としては細菌、酵母、カビ、昆虫細胞、動物細胞又は植物細胞が例示できるが、取扱い易さ、培養の容易性、高密度培養の可否、更には遺伝子操作における宿主／ベクター系が整備されている点で、細菌、特に大腸菌に代表されるエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の細菌が好ましい。形質転換に用いる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）としては、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、ＨＢ１０１、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）といった株が例示できるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
本発明のタンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチドは、制限酵素を用いて適切なプラスミドに挿入することで前記ポリヌクレオチドを有するプラスミドを調製後、宿主（例えば、大腸菌ＪＭ１０９やＨＢ１０１）へ形質転換することで本発明のタンパク質を発現可能な宿主を調製することができる。本発明のタンパク質を発現させるためのプラスミドとして、例えばｐＥＴ−２８a（＋）（メルク社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．Ｕ１３８７２）、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＳＴＶ２９（タカラバイオ社製）、ｐＣＤＦ−１ｂ（メルク社製）、ｐＲＳＦ−１ｂ（メルク社製）が例示できる。
【００２０】
本発明のタンパク質をコードしたポリヌクレオチドを前記プラスミドに挿入する際は、前記ポリヌクレオチドのフレームシフトが生じないようにプラスミド内のマルチクローニングサイトに挿入すればよい。なお、挿入したポリヌクレオチドの５’末端側、または３’末端側に適切なアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドが付加されるように設計されたプラスミドを用いることで、本発明のフコース結合性タンパク質をコードする配列に付加配列をもった配列からなるポリヌクレオチドを作製することもできる。一例として、プラスミドｐＥＴ−２６ｂ（＋）（メルク社製）のマルチクローニングサイト上の制限酵素ＮｃｏＩサイトを利用することで、本発明のタンパク質のＮ末端側にＰｅｌＢシグナル配列（さらに、任意のアミノ酸を付加してもよい）を連結したタンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチドを挿入したプラスミドを調製することができる。別の例として、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．Ｕ１３８７２）の制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを利用することで、本発明のタンパク質のＮ末端側にメチオニンとグルタミン酸（さらに、任意のアミノ酸を付加してもよい）が付加したタンパク質をコードする配列からなるポリヌクレオチドを挿入したプラスミドを調製することができる。
【００２１】
本発明のタンパク質の製造方法は、
（ア）本発明の形質転換体を培養することで本発明のタンパク質を生産する工程、
（イ）工程（ア）で得られた培養物から本発明のタンパク質を回収する工程、
の２工程を含むことを特徴とする。なお、本明細書において、培養物とは、培養された形質転換体の細胞そのものや細胞分泌物のほかに、形質転換体の培養に用いた培地なども含まれる。以下に工程（ア）と工程（イ）の各工程の詳細を説明する。
【００２２】
（ア）本発明の形質転換体を培養することで本発明のタンパク質を生産する工程
本発明におけるタンパク質の製造方法に用いる形質転換体は、対象とする宿主の培養に適した培地で培養すればよく、例えば、宿主が大腸菌の場合は、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地や、必要な栄養源を補ったＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。また、培地には炭素、窒素および無機塩のほかに、当該技術分野において一般的な栄養源を添加してもよい。
【００２３】
なお、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターの導入の有無によって選択的に形質転換体を増殖させるために培地に当該ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養することが好ましく、例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合には、培地にカナマイシンを添加すればよい。さらに、前述の形質転換体から培養液へのタンパク質の分泌を促すため、グリシンなどの試薬を培地に添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加することが好ましい。
【００２４】
培養温度は、当該技術分野において一般的な温度であれば特に制限はなく、例えば宿主が大腸菌の場合、１０℃から４０℃、好ましくは２５℃から３５℃、より好ましくは３０℃前後であり、発現させるタンパク質の特性により適宜選択すればよい。また、培地のｐＨは当該技術分野において一般的な範囲の中から宿主の種類などの諸条件に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌の場合、好ましくはｐＨ６．８からｐＨ７．４の範囲が好ましく、より好ましくはｐＨ７．０前後である。
【００２５】
なお、本発明のタンパク質は発現ベクターによっては誘導剤を添加しなくても発現するため、必ずしも誘導剤が必要ではないが、本発明の発現ベクターに誘導性のプロモータが含まれている場合には、本発明のタンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導剤を添加して、タンパク質発現を誘導することが好ましい。好ましい誘導剤としては、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示することができる。ＩＰＴＧ添加濃度は、０．００５ｍＭから１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよく、好ましくは０．０１ｍＭから０．５ｍＭである。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は、当該技術分野において周知の条件で行えばよく、例えば、宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）が約０．１から１．０のときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、本発明のタンパク質発現を誘導することができる。
【００２６】
（イ）工程（ア）で得られた培養物から本発明のタンパク質を回収する工程
本発明の形質転換体を培養して得られた培養物から本発明のタンパク質を回収するには、当業者が通常用いる方法の中から適宜選択して用いればよく、前述の培養物から本発明のタンパク質を抽出は、発現の形態に応じて実施すればよい。本発明のタンパク質が細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めたのち、酵素処理剤や界面活性剤などを添加することにより菌体を破砕し、本発明のタンパク質を抽出すればよい。一方、培養液中に分泌される場合は、菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のタンパク質を抽出すればよい。
【００２７】
前述の方法で得られた抽出物から、本発明のタンパク質を分離精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、例えば、液体クロマトグラフィーを用いた分離精製をあげることができる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどがあり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて分離精製を行うことにより、本発明のタンパク質を高純度に回収することができる。
【００２８】
本発明のタンパク質を水に不溶性の担体に固定化することにより、本発明のフコース含有糖鎖および／または複合糖質を分離精製するための吸着剤（以下、本発明の吸着剤という）を作製することができる。本発明の吸着剤の作製に用いる水に不溶性の担体に特に制限はなく、シリカゲルや金薄膜を蒸着させたガラスなどの無機系担体、アガロース、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、プルラン、デンプン、アルギン酸塩、カラギーナンなどの多糖類を原料とした多糖系担体およびそれらを架橋剤で架橋した架橋多糖系担体、ポリメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリスチレンなどの合成高分子系担体およびそれらを架橋剤で架橋した架橋合成高分子系担体を例示することができる。これらの担体の中では、親水性が高く分離精製対象物質の非特異的吸着が低い点で、アガロース、セルロース、デキストラン、プルランなどの電荷をもたない多糖系担体および架橋多糖系担体や、ポリメタクリレートや、ポリビニルアルコールなどの親水性合成高分子系担体および架橋親水性合成高分子系担体が好ましい。また、水に不溶性の担体の形状や細孔の有無に特に制限はなく、形状については粒子状、スポンジ状、平膜状、平板状、中空状、繊維状や非粒子状のいずれであってもよく、細孔の有無については多孔性または無孔性のいずれであってもよい。本発明のタンパク質を固定化する水に不溶性の担体としては、本発明のタンパク質を担体に固定化するための活性官能基導入が容易に行える点および分離精製対象であるフコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着量を高められる点で水酸基を有する粒子状担体であることが好ましく、多孔性粒子状担体がより好ましい。さらに、本発明の吸着剤の作製に用いる水に不溶性の担体は市販品を使用してもよく、例えば、ポリメタクリレートを原料としたトヨパール（東ソー社製）や、アガロースを原料としたＳｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア社製）、セルロースを原料としたセルファイン（ＪＮＣ社製）を使用することができる。
【００２９】
前述の水に不溶性の担体に本発明のタンパク質を固定化する方法は、一般的なタンパク質の固定化方法であれば特に制限はされず、例えば、配位結合やアフィニティー結合などを利用し、共有結合を形成せずに本発明のタンパク質を担体に固定化する方法、本発明のタンパク質に導入した固定化用活性官能基と担体を反応させ、共有結合を形成させて担体に固定化する方法、担体に導入した活性官能基と本発明のタンパク質を反応させ、共有結合を形成させて担体に固定化する方法をあげることができる。
【００３０】
本発明のタンパク質は、システインを１つ以上含むシステインタグを有することから、システインのメルカプト基に選択的な反応を利用することにより、本発明のタンパク質を位置選択的に担体に固定化することができる。
【００３１】
共有結合を形成せずに本発明のタンパク質を担体に固定化する方法としては、メルカプト基と金の配位結合を利用し、金薄膜を蒸着させたガラスに本発明のタンパク質を固定化する方法や、アビジン−ビオチンのアフィニティー結合を利用し、ビオチンを導入した本発明のタンパク質をストレプトアビジンセファロースハイパフォーマンス（ＧＥヘルスケア社製）などのアビジンが固定化された担体に固定化する方法を例示することができる。本発明のタンパク質へのビオチンの導入方法としては、例えば、Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−[２−（Ｎ−マレイミド）エチル]ピペラジン塩酸塩などのマレイミド基を有するビオチン化試薬と本発明のタンパク質のメルカプト基を反応させる方法を例示することができる。
【００３２】
また、本発明のタンパク質に導入した固定化用活性官能基と担体を反応させ、共有結合を形成させて固定化する方法としては、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸  ３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルナトリウム塩などのマレイミド基と活性エステル基の双方を有する化合物のマレイミド基と、本発明のタンパク質のメルカプト基をｐＨ７付近の中性条件で反応させて本発明のタンパク質に活性エステル基を導入したのち、トヨパールＡＦ−アミノ−650Ｍ（東ソー社製）などのアミノ基が導入された担体と反応させる方法を例示することができる。
【００３３】
さらに、担体に導入した活性官能基と本発明のタンパク質を反応させ、共有結合を形成させて担体に固定化する方法としては、担体に導入したエポキシ基、マレイミド基、ハロアセチル基、ハロアルキル基、ビニル基、イソシアネート基、イソチオシアネート基などのメルカプト基と反応して共有結合を形成する官能基と、本発明のタンパク質のメルカプト基を反応させる方法を例示することができる。これらのメルカプト基と反応して共有結合を形成する官能基の中では、ｐＨ６．５からｐＨ７．５の範囲、すなわちｐＨが中性付近の水溶液中で、本発明のタンパク質の担体への固定化反応を高効率に行える点で、エポキシ基、マレイミド基、ハロアセチル基、ハロアルキル基、ビニル基が好ましく、より好ましくはエポキシ基、マレイミド基、ハロアセチル基である。
【００３４】
水に不溶性の担体にエポキシ基を導入する方法としては、例えば、水酸基を有する担体と、エピクロロヒドリン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルなどのエポキシ基含有化合物を塩基性条件下で反応させる方法をあげることができる。
【００３５】
水に不溶性の担体にマレイミド基を導入する方法としては、例えば、水酸基および／またはアミノ基を有する担体と、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸などのマレイミド基を有するカルボン酸類を、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などの縮合剤存在下で反応させる方法をあげることができる。さらに、前述のマレイミド基を有するカルボン酸類のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルやＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルを反応させる方法を例示することができる。なお、アミノ基を有する担体は、例えば、前述のエポキシ基を導入した担体と、アンモニア水、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリス（２−アミノエチル）アミンなどのアミノ基を有する化合物を反応させることにより作製することができる。
【００３６】
水に不溶性の担体にハロアセチル基を導入する方法としては、例えば、水酸基を有する担体や、前述の方法によりアミノ基を導入した担体と、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミドなどの酸ハロゲン化物を反応させる方法や、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸などのハロゲン化酢酸をＥＤＣなどの縮合剤存在下で反応させる方法をあげることができる。さらに前述のハロゲン化酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルやＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルを反応させる方法をあげることができる。
【００３７】
前述の活性官能基を導入した担体と、緩衝液に溶解した本発明のタンパク質を反応させることで、本発明のタンパク質を水に不溶性の担体に固定化することができる。本発明のタンパク質を溶解する緩衝液に特に制限はなく、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液を例示することができる。また、固定化反応の効率を高めることを目的として、緩衝液に塩化ナトリウムなどの無機塩類やポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）などの界面活性剤を添加してもよい。本発明のタンパク質を担体に固定化する際の反応温度およびｐＨは、活性官能基の反応性や本発明のタンパク質の安定性を考慮した上で反応温度については０℃以上５０℃以下、ｐＨについてはｐＨ５以上ｐＨ９以下の範囲の中から適宜設定すればよく、タンパク質の失活を抑制する点で、反応温度については１５℃以上４０℃以下、ｐＨについてはｐＨ６以上ｐＨ８以下の範囲が好ましい。
【００３８】
水に不溶性の担体への本発明のタンパク質の固定化量は、分離精製を行なう溶液中のフコース含有糖鎖および／または複合糖質の濃度や量などを考慮した上で適宜設定すればよく、例えば、担体が多孔性粒子状担体の場合、１ｍＬの担体あたり０．０１ｍｇ以上５０ｍｇ以下が好ましく、０．０５ｍｇ以上３０ｍｇ以下がより好ましい。担体への本発明のタンパク質の固定化量は、固定化反応時の本発明のタンパク質の使用量や担体への活性官能基導入量を調節することにより調整することができる。本発明のタンパク質の担体への固定化量は、固定化反応液および反応後の洗浄液を回収して未反応の本発明のタンパク質量を求めたのち、固定化反応に使用した本発明のタンパク質量から未反応の本発明のタンパク質量を差し引くことで算出することができる。
【００３９】
本発明の吸着剤で精製可能なフコース含有糖鎖および／または複合糖質は、フコース含有糖鎖およびフコース含有糖鎖が結合したタンパク質や脂質などの複合糖質であれば特に制限はなく、例えば、α１−２結合したフコースとα１−３結合したフコースを含むＬｅｗｉｓ  Ｙ型糖鎖、α１−２結合したフコースとα１−４結合したフコースを含むＬｅｗｉｓ  ｂ型糖鎖、α１−２結合したフコースを含むＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ２型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、α１−３結合したフコースを含むＬｅｗｉｓ  Ｘ型糖鎖、α１−４結合したフコースを含むＬｅｗｉｓ  ａ型糖鎖、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにα１−６結合したフコースを含むＮ−グリコシド結合型糖鎖およびこれらのフコース含有糖鎖が結合したタンパク質や脂質などの複合糖質や、これらのフコース含有糖鎖および／または複合糖質を細胞表面に有する細胞をあげることができる。
【００４０】
本発明の吸着剤を用いたフコース含有糖鎖および／または複合糖質の精製方法に特に制限はないが、フコース含有糖鎖および／または複合糖質の分離精製が効率よく行うことができる点で、本発明の吸着剤と分離精製前のフコース含有糖鎖および／または複合糖質を含む溶液を混合したのち、フコース含有糖鎖および／または複合糖質が吸着した本発明の吸着剤と非吸着成分を分離する方法や、本発明の吸着剤を充填したクロマトグラフィー用カラムに分離精製前のフコース含有糖鎖および／または複合糖質を含む溶液を通液し、フコース含有糖鎖および／または複合糖質を本発明の吸着剤に吸着させる方法が好ましい。また、フコース含有糖鎖および／または複合糖質の分離精製に用いる本発明の吸着剤の使用量は、処理量に応じて適切な量を設定すればよい。
【００４１】
本発明の吸着剤へのフコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着は、例えば、ｐＨ５以上ｐＨ９以下、好ましくはｐＨ６以上ｐＨ８以下の緩衝液で平衡化した吸着剤と、分離精製前のフコース含有糖鎖および／または複合糖質を含む溶液を接触させればよい。本発明の吸着剤へのフコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着に用いる緩衝液に特に制限はなく、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液を例示することができる。また、緩衝液に塩化ナトリウムなどの無機塩類やポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）などの界面活性剤を添加してもよい。
【００４２】
本発明の吸着剤に吸着したフコース含有糖鎖および／または複合糖質は、Ｌ−フコースを含む緩衝液と接触させることにより脱着させることができる。Ｌ−フコースを含む緩衝液としては、例えば、前述のフコースを含む糖鎖および／または複合糖質の吸着に用いた緩衝液に、０．１ｍＭ以上１Ｍ以下、好ましくは１ｍＭ以上１００ｍＭ以下のＬ−フコースを添加した緩衝液をあげることができる。
【００４３】
分離精製前のフコース含有糖鎖および／または複合糖質を含む溶液から、フコース含有糖鎖および／または複合糖質を得たい場合には、前述の吸着および脱着の操作を行うことにより、目的とするフコース含有糖鎖および／または複合糖質を得ることができる。一方、分離精製前のフコース含有糖鎖および／または複合糖質を含む溶液から、フコース含有糖鎖および／または複合糖質を除去したい場合には、前述の吸着の操作のみを行うことにより、目的とするフコース含有糖鎖および／または複合糖質を除去した溶液を得ることができる。
【発明の効果】
【００４４】
本発明のタンパク質は、システインを１つ以上含むシステインタグをフコース結合性レクチンのＮ末端またはＣ末端に有するタンパク質であり、前述のフコース結合性レクチンを位置選択的に担体に固定化することができる。また、本発明のタンパク質を水に不溶性の担体に固定化した、フコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着剤を用いることにより、フコース含有糖鎖および／または複合糖質、細胞表面にフコース含有糖鎖を有する細胞の精製および除去を行うことができる。
【００４５】
また、本発明の吸着剤は前述のフコース結合性レクチンを位置選択的に担体に固定化しており、フコース含有糖鎖および／または複合糖質への結合能を保持しているフコース結合性レクチンの割合が向上していることから、システインタグを付加していないフコース結合性レクチンを担体に固定化して得られる吸着剤に比べて、フコース含有糖鎖および／または複合糖質や、細胞表面にフコース含有糖鎖を有する細胞の吸着量を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明のタンパク質の糖鎖親和性評価の結果を示したものである。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例、比較例および参考例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１  プラスミドｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓの作製
以下（１）から（５）記載の方法により、配列番号３に示したフコース結合性レクチンのアミノ酸配列をコードした配列番号４のポリヌクレオチドを作製した。
【００４８】
（１）以下の試薬組成および反応条件にて、１段階目のＰＣＲ反応を行った。
（試薬組成、総反応液量：５０μＬ）
・０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）
・各３０ｎＭ  配列番号５から２８に示したプライマー
・酵素に付属する緩衝液
（反応条件）
・サーマルサイクラーを用い、９８℃・１０秒間、５５℃・５秒間、７２℃・６０秒間のＰＣＲ反応を５サイクル実施した。
【００４９】
（２）次に、（１）の反応液を用いて、以下の試薬組成および反応条件にて、２段階目のＰＣＲ反応を行った。
（試薬組成、総反応液量：５０μＬ）
・０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（タカラバイオ社製）
・各５００ｎＭ  配列番号２９と３０に示したプライマー
・１μＬ  １段階目のＰＣＲ反応液
・酵素に付属する緩衝液
（反応条件）
・サーマルサイクラーを用い、９８℃・１０秒間、５５℃・５秒間、７２℃・６０秒間のＰＣＲ反応を３０サイクル実施した。
【００５０】
（３）２段階目のＰＣＲ反応後の（２）の反応液をアガロースゲル電気泳動で泳動後、目的物に相当する０．５ｋｂｐのバンドを切り出すことで、ＰＣＲ産物を精製した。
【００５１】
（４）前述の（３）で得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで二重消化し、消化後のＤＮＡをプラスミドｐＥＴ−２８（＋）の制限酵素ＮｃｏＩ−ＸｈｏＩサイトに、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションしてプラスミドを調製後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換し、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを得た。
【００５２】
（５）前述の（４）で得られた組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを培養し、集菌したのち、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（５．６ｋｂｐ）を得た。当該方法で得られたプラスミドｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに挿入されているフコース結合性レクチンをコードする塩基配列を分析した結果、塩基配列は設計どおりであることを確認した。
【００５３】
実施例２  システインタグを付加したフコース結合性レクチンの作製
実施例１で得られた組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓより、以下（１）から（５）記載の方法で、システインタグを付加したフコース結合性レクチンを作製した。
（１）組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ／Ｋｍ液体培地に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行った。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が０．６になるように植菌後、３７℃で培養した。
（２）前培養液を３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ／Ｋｍ液体培地１Ｌに接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が凡そ０．６になったところで、培養温度を２０℃に切り替え、一晩培養した。
（３）培養終了後、培養液を氷冷したのち、遠心分離により集菌した。集めた菌を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加したＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（メルク社製）を用いて処理し、可溶性画分を１５０ｍＬ得た。
【００５４】
（４）前述の（３）で得られた可溶性画分の溶液を、１５０ｍＭの塩化ナトリウムと２０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した担体（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ、メルク社製、担体容積１５ｍＬ）を充填したカラムに通液し、可溶性画分に含まれるシステインタグを付加したフコース結合性レクチンを吸着させた。担体に吸着したシステインタグを付加したフコース結合性レクチンを１５０ｍＭの塩化ナトリウムと２５０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出させることにより、目的のシステインタグを付加したフコース結合性レクチンを含む溶出液を５０ｍＬ得た。
（５）前述の（４）で得られたシステインタグを付加したフコース結合性レクチンを含む溶出液を、Ｄ−ＰＢＳ（−）（和光純薬製）に対して透析することにより、目的のシステインタグを付加したフコース結合性レクチンのＤ−ＰＢＳ（−）溶液を７５ｍＬ得た。
【００５５】
得られたＤ−ＰＢＳ（−）溶液中のシステインタグを付加したフコース結合性レクチン濃度を紫外線吸収法により測定し、２８０ｎｍにおける吸光度が１．０の場合のシステインタグを付加したフコース結合性レクチン濃度を１．０ｍｇ／ｍＬとして濃度を算出した結果、濃度は１．２ｍｇ／ｍＬであった。
実施例３  システインタグを付加したフコース結合性レクチンの糖鎖への親和性評価
実施例２で得られたシステインタグを付加したフコース結合性レクチンのフコース含有糖鎖への親和性を評価するため、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１００（ＧＥヘルスケア社製）を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を行った。親和性を評価するための糖鎖として、α１−２結合したフコースとα１−３結合したフコースを含むＬｅｗｉｓ  Ｙ型糖鎖を用い、ストレプトアビジン（和光純薬社製）を固定化したＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケア社製）に、ビオチン−アビジン結合を利用してビオチン化Ｌｅｗｉｓ  Ｙ型糖鎖（Ｌｅｙ−ＰＡＡ−ｂｉｏｔｉｎ、Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ社製）を固定した。以下にＬｅｗｉｓ  Ｙ型糖鎖の構造を示した。
【００５６】
Ｌｅｗｉｓ  Ｙ型糖鎖
Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ
システインタグを付加したフコース結合性レクチンはＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（ＧＥヘルスケア社製）を用いて希釈し、０から１０１３ｎＭの範囲の１２種類の濃度でカイネティクス解析を行った。ＳＰＲ測定は、各濃度のシステインタグを付加したフコース結合性レクチン溶液を３０μＬ／分の流速で６分間注入し、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ型糖鎖を固定化したセンサーチップにシステインタグを付加したフコース結合性レクチンを結合させた。センサーチップに結合したフコース結合性レクチンのセンサーチップからの解離は、１０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液を３０μＬ／分の流速で３０秒間注入することで行った。得られた結果を、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１００に付属のソフトウェア（バージョン１．１．１）で解析した結果、システインタグを付加したフコース結合性レクチンのＬｅｗｉｓ  Ｙ型糖鎖に対する解離定数（Ｋｄ値）は４６ｎＭであった。
【００５７】
図１に、実施例３で行ったＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１００を用いたＳＰＲ測定のセンサーグラムを示した。
実施例４  エポキシ基を導入した担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化および吸着剤としての評価（その１）
以下の実施例４から実施例９は、システインタグを付加したフコース結合性レクチンを担体に固定化することによるフコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着剤の作製と、フコース含有糖鎖およびフコースを含まない糖鎖を用いた吸着剤としての評価に関する。
【００５８】
以下の実施例、比較例および参考例では、フコース含有糖鎖として、還元末端を２−アミノピリジンで蛍光標識したフコース含有糖鎖（ＰＡ−Ｓｕｇａｒ  ｃｈａｉｎ  ０４６、Ｌｅｂ−ｈｅｘａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、タカラバイオ社製、以下、フコース含有糖鎖という）を用いた。また、フコースを含まない糖鎖として、還元末端を２−アミノピリジンで蛍光標識したオリゴマンノース型糖鎖（ＰＡ−Ｓｕｇａｒ  ｃｈａｉｎ  ０１６、Ｍ３Ｂ、タカラバイオ社製、以下、オリゴマンノース型糖鎖という）を用いた。以下に、フコース含有糖鎖およびオリゴマンノース型糖鎖の構造を示した。なお、還元末端の２−アミノピリジンは省略した。
【００５９】
フコース含有糖鎖
Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ
オリゴマンノース型糖鎖
Ｍａｎα１−３（Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ
実施例４は、エポキシ基を導入した合成高分子系担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化と、吸着剤としての評価に関する。
（１）エポキシ基を導入した合成高分子系担体の作製
合成高分子系担体として、水に懸濁したトヨパールＨＷ−６５Ｆ（東ソー社製）をグラスフィルターで吸引ろ過したものを使用した。反応容器（ＰＦＡ製ボトル、１００ｍＬ容積、アズワン社製）に、含水状態のトヨパールＨＷ−６５Ｆ（１０．０ｇ）、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（アルドリッチ社製、２．０ｇ）、水（１５．０ｇ）を添加し、５０℃で３０分間撹拌したのち、４８％水酸化ナトリウム水溶液（関東化学社製、２８０ｍｇ）を添加し、さらに５０℃で８時間撹拌することによりエポキシ化反応を行なった。反応後、グラスフィルターを使用してろ液が中性になるまで多量の水で洗浄することにより、エポキシ基を導入したトヨパールＨＷ−６５Ｆ（以下、エポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆ）を得た。
【００６０】
（２）エポキシ基を導入した合成高分子系担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化（吸着剤１の作製）
（１）で作製したエポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆに水を添加することで調製した５０容積％懸濁液（２００μＬ）を反応容器（ミニバイオスピンクロマトグラフィーカラム、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）に添加し、５００ｍＭの塩化ナトリウム（和光純薬社製）と２０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、同仁化学研究所社製）を含む、リン酸二水素ナトリウム二水和物（和光純薬社製）とリン酸水素二ナトリウム（和光純薬社製）から調製した２００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、２００μＬ）で５回洗浄した。なお、エポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆの５０容積％懸濁液は、水で懸濁したエポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆをメスシリンダー内で沈降させ、時々タッピングを行なって容積が一定になるまで放置したのち、エポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆの容積が５０％となるよう、水を添加することで調製した。
【００６１】
次に、エポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆ（１００μＬ）が入った反応容器に、担体１ｍＬあたりのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの仕込み量を２．２４ｍｇとして、前述の実施例２で作製したシステインタグを付加したフコース結合性レクチンのＤ−ＰＢＳ（−）溶液（濃度２．８０ｍｇ／ｍＬ、８０μＬ）とＤ−ＰＢＳ（−）（２０μＬ）を添加し、４０℃で１５時間撹拌することにより、システインタグを付加したフコース結合性レクチンをエポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆに固定化した。固定化反応後、担体を０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０（シグマ社製）を含むＤ−ＰＢＳ（−）（和光純薬社製）で洗浄することにより、システインタグを付加したフコース結合性レクチンをエポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆに固定化したフコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着剤１を得た。
【００６２】
実施例３に記載した、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ型糖鎖を固定化したＣＭ５センサーチップとＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１００を用いたＳＰＲ測定により、固定化反応液および回収した洗浄液中のシステインタグを付加したフコース結合性レクチン量を算出し、固定化反応に使用したシステインタグを付加したフコース結合性レクチン量から、回収した固定化反応後の洗浄液に含まれる未反応のシステインタグを付加したフコース結合性レクチン量を差し引くことにより、吸着剤１へのフコース結合性レクチンの固定化量と固定化率を算出した結果、固定化量は担体１ｍＬあたり０．９２ｍｇ、固定化率は４１．１％であった。
【００６３】
（３）吸着剤１へのフコース含有糖鎖の吸着率の測定
（２）で作製した吸着剤１にＤ−ＰＢＳ（−）を添加することで調製した２５容積％懸濁液（１００μＬ）を反応容器（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、ミニバイオスピンクロマトグラフィーカラム）に添加し、Ｄ−ＰＢＳ（−）（１００μＬ）で４回洗浄した。なお、吸着剤１Ｅの２５容積％懸濁液は、（２）で作製した吸着剤１（１００μＬ）が入った反応容器に、Ｄ−ＰＢＳ（−）（３００μＬ）を添加することで調製した。
【００６４】
次に、吸着剤１（２５μＬ）が入った反応容器に、フコース含有糖鎖のＤ−ＰＢＳ（−）溶液（濃度５００ｐｍｏｌ／ｍＬ、５０μＬ、添加量２５ｐｍｏｌ）を添加し、２５℃で２時間撹拌することにより、吸着剤１にフコース含有糖鎖を吸着させた。フコース含有糖鎖を吸着させた吸着剤はＤ−ＰＢＳ（−）で洗浄し、洗浄液全量を回収した。
【００６５】
マイクロプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００、ＴＥＣＡＮ社製、Ｅｘｉｔａｔｉｏｎ３２０ｎｍ、Ｅｍｉｓｓｉｏｎ４００ｎｍ）を用い、蛍光標識したフコース含有糖鎖に由来する蛍光強度を測定することにより、吸着処理に使用したフコース含有糖鎖量および洗浄液に含まれるフコース含有糖鎖量を求めたのち、以下に示した計算式から吸着剤１へのフコース含有糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は８８％であった。
吸着率＝（（吸着処理に使用したフコース含有糖鎖量−洗浄液に含まれるフコース含有糖鎖量）／吸着処理に使用したフコース含有糖鎖量）×１００
（４）フコース含有糖鎖が吸着した吸着剤１からのフコース含有糖鎖の回収率の測定
（３）でフコース含有糖鎖を吸着させた吸着剤１（２５μＬ）が入った反応容器に、Ｌ−フコース（和光純薬社製）のＤ−ＰＢＳ（−）溶液（濃度１５ｍＭ、５０μＬ、Ｌ−フコース添加量７５０ｎｍｏｌ）を添加し、２５℃で１時間分間撹拌することにより、吸着剤１に吸着したフコース含有糖鎖を脱着させた。フコース含有糖鎖を脱着させた吸着剤はＤ−ＰＢＳ（−）で洗浄し、洗浄液全量を回収した。
【００６６】
前述の（３）の操作と同様に、マイクロプレートリーダーを用いて吸着剤１から脱着したフコース含有糖鎖の量を求めたのち、以下に示した計算式から吸着剤１からのフコース含有糖鎖の回収率を算出した結果、回収率は８２％であった。
【００６７】
回収率＝（脱着したフコース含有糖鎖の量／吸着処理に使用したフコース含有糖鎖の量）×１００
（５）エポキシ基を導入した合成高分子系担体へのフコース含有糖鎖の吸着率の測定
（２）に記載の方法により、（１）で作製したエポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆの５０容積％懸濁液（２００μＬ）を反応容器に添加し、５００ｍＭの塩化ナトリウムと２０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む２００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、２００μＬ）で５回洗浄した。
【００６８】
次に、エポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆ（１００μＬ）が入った反応容器に、α−チオグリセリン（東京化成社製）とＤ−ＰＢＳ（−）から調製したα−チオグリセリン／Ｄ−ＰＢＳ（−）溶液（濃度１０ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）を添加し、４０℃で１５時間撹拌することにより、エポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆとα−チオグリセリンを反応させた。反応終了後、担体を０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳ（−）で洗浄することにより、エポキシ基をα−チオグリセリンでブロッキングした吸着剤１Ｂを得た。
【００６９】
（３）に記載の方法により、吸着剤１Ｂへのフコース含有糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は５％であった。従って、担体に導入したエポキシ基をα−チオグリセリンでブロッキングした吸着剤１Ｂには、フコース含有糖鎖は吸着しないことが明らかとなった。
【００７０】
（６）吸着剤１へのオリゴマンノース型糖鎖の吸着率の測定
（３）に記載の方法により、吸着剤１の２５容積％懸濁液（１００μＬ）を反応容器に添加し、Ｄ−ＰＢＳ（−）（１００μＬ）で４回洗浄した。次に、吸着剤１（２５μＬ）が入った反応容器に、オリゴマンノース型糖鎖のＤ−ＰＢＳ（−）溶液（濃度５００ｐｍｏｌ／ｍＬ、５０μＬ、添加量２５ｐｍｏｌ）を添加し、２５℃で６０分間撹拌することにより、吸着剤１にオリゴマンノース型糖鎖を吸着させた。オリゴマンノース型糖鎖を吸着させた吸着剤はＤ−ＰＢＳ（−）で洗浄し、洗浄液全量を回収した。
【００７１】
（３）に記載の方法により、オリゴマンノース型糖鎖に由来する蛍光強度を測定することにより、吸着処理に使用したオリゴマンノース型糖鎖量および洗浄液に含まれるオリゴマンノース型糖鎖量を求めたのち、吸着剤１へのオリゴマンノース型糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は６％であった。従って、吸着剤１にはフコースを含まないオリゴマンノース型糖鎖は吸着しないことが明らかとなった。
【００７２】
実施例５  エポキシ基を導入した担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化および吸着剤としての評価（その２）
実施例５は、エポキシ基を導入した多糖系担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化と、吸着剤としての評価に関する。
【００７３】
（１）エポキシ基を導入した多糖系担体の作製
多糖系担体として、水に懸濁したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製、以下、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦという）をグラスフィルターで吸引ろ過したものを使用し、実施例４の（１）に記載の方法により、エポキシ基を導入したＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ（以下、エポキシ化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦという）を得た。
（２）エポキシ基を導入した多糖系担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化（吸着剤２の作製）
実施例４の（２）に記載の方法により、（１）で作製したエポキシ化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦにシステインタグを付加したフコース結合性レクチンを固定化したフコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着剤２を得た。同じく実施例４の（２）に記載の方法により、吸着剤２へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化量を算出した結果、固定化量は担体１ｍＬあたり１．１３ｍｇ、固定化率は５０．４％であった。
【００７４】
（３）吸着剤２へのフコース含有糖鎖の吸着率の測定
実施例４の（３）に記載の方法により、（２）で作製した吸着剤２へのフコース含有糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は９０％であった。
（４）フコース含有糖鎖が吸着した吸着剤２からのフコース含有糖鎖の回収率の測定
実施例４の（４）に記載の方法により、（３）でフコース含有糖鎖を吸着させた吸着剤２からのフコース含有糖鎖の回収率を算出した結果、回収率は８４％であった。
（５）エポキシ基を導入した多糖系担体へのフコース含有糖鎖の吸着率の測定
実施例４の（５）に記載の方法により、（１）で作製したエポキシ化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦから、エポキシ基をα−チオグリセリンでブロッキングした吸着剤２Ｂを得た。実施例４の（３）に記載の方法により、吸着剤２Ｂへのフコース含有糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は３％であった。従って、吸着剤２Ｂにはフコース含有糖鎖は吸着しないことが明らかとなった。
【００７５】
（６）吸着剤２へのオリゴマンノース型糖鎖の吸着率の測定
実施例４の（６）に記載の方法により、（２）で作製した吸着剤２へのオリゴマンノース型糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は５％であった。従って、吸着剤２にはオリゴマンノース型糖鎖は吸着しないことが明らかとなった。
【００７６】
比較例１  エポキシ基を導入した担体へのシステインタグを付加していないフコース結合性レクチンの固定化および吸着剤としての評価（その１）
比較例１は、エポキシ基を導入した合成高分子系担体へのシステインタグを付加していないフコース結合性レクチンの固定化と、吸着剤としての評価に関する。
システインタグを付加していないフコース結合性レクチンとして、α１−２結合したフコースを含むＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に結合性を有する、市販のフコース結合性レクチン（ＡｉＬｅｃＳ１、和光純薬製、以下、市販フコース結合性レクチンという）を用いた。以下にＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖の構造を示した。
【００７７】
Ｈタイプ１型糖鎖
Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ
Ｈタイプ３型糖鎖
Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ
比較例１では、エポキシ基を導入した合成高分子系担体への市販フコース結合性レクチンの固定化を、実施例１と同様にｐＨ７．４で行なった。
【００７８】
（１）エポキシ基を導入した合成高分子系担体への市販フコース結合性レクチンの固定化（吸着剤３の作製）
実施例４の（１）で作製したエポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆの５０容積％懸濁液（２００μＬ）を反応容器に添加し、５００ｍＭの塩化ナトリウムと２０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む２００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、２００μＬ）で５回洗浄した。
【００７９】
次に、エポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆ（１００μＬ）が入った反応容器に、担体１ｍＬあたりの市販フコース結合性レクチンの仕込み量を２．２４ｍｇとして、前述の市販フコース結合性レクチンのＤ−ＰＢＳ（−）溶液（濃度１．６０ｍｇ／ｍＬ、１４０μＬ）を添加し、４０℃で１５時間撹拌することにより、市販フコース結合性レクチンをエポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆに固定化した。固定化反応後、担体を０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳ（−）で洗浄することにより、市販フコース結合性レクチンをエポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆに固定化したフコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着剤３を得た。
【００８０】
実施例４の（２）に記載の方法により、吸着剤３への市販フコース結合性レクチンの固定化量を算出した結果、反応に使用した市販フコース結合性レクチン量と、未反応の市販フコース結合性レクチン量が同じであったことから、市販フコース結合性レクチンはエポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆに固定化されていないことが明らかとなった。従って、吸着剤３へのフコース含有糖鎖およびオリゴマンノース型糖鎖の吸着率の測定は行わなかった。
【００８１】
比較例２  エポキシ基を導入した担体へのシステインタグを付加していないフコース結合性レクチンの固定化および吸着剤としての評価（その２）
比較例２では、エポキシ基を導入した合成高分子系担体への市販フコース結合性レクチンの固定化をｐＨ８．４で行なったのち、吸着剤としての評価を実施した。
（１）エポキシ基を導入した合成高分子系担体への市販フコース結合性レクチンの固定化（吸着剤４の作製）
実施例４の（１）で作製したエポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆの５０容積％懸濁液（２００μＬ）を反応容器に添加し、５００ｍＭの塩化ナトリウムと２０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．４、２００μＬ）で５回洗浄した。
次に、エポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆ（１００μＬ）が入った反応容器に、担体１ｍＬあたりの市販フコース結合性レクチンの仕込み量を２．２４ｍｇとして、前述の市販フコース結合性レクチンのＤ−ＰＢＳ（−）溶液（濃度１．６０ｍｇ／ｍＬ、１４０μＬ）を添加し、４０℃で１５時間撹拌することにより、市販フコース結合性レクチンをエポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆに固定化した。固定化反応後、担体を０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳ（−）で洗浄することにより、市販フコース結合性レクチンをエポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆに固定化したフコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着剤４を得た。実施例４の（２）に記載の方法により、吸着剤４への市販フコース結合性レクチンの固定化量と固定化率を算出した結果、固定化量は担体１ｍＬあたり０．５３ｍｇ、固定化率は２３．８％であった。
【００８２】
（２）吸着剤４へのフコース含有糖鎖の吸着率の測定
実施例４の（３）に記載の方法により、（１）で作製した吸着剤４へのフコース含有糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は１５％であった。従って、吸着剤４へのフコース含有糖鎖の吸着率は低いことが明らかとなった。吸着剤４の吸着率が低かった原因として、担体への固定化反応時における市販フコース結合性レクチンの失活が考えられた。
【００８３】
（３）フコース含有糖鎖が吸着した吸着剤４からのフコース含有糖鎖の回収率の測定
実施例４の（４）に記載の方法により、（２）でフコース含有糖鎖を吸着させた吸着剤４からのフコース含有糖鎖の回収率を算出した結果、回収率は５％であった。
（４）吸着剤４へのオリゴマンノース型糖鎖の吸着率の測定
実施例４の（６）に記載の方法により、（１）で作製した吸着剤４へのオリゴマンノース型糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は８％であった。従って、吸着剤４にはオリゴマンノース型糖鎖は吸着しないことが明らかとなった。
【００８４】
実施例６  マレイミド基を導入した担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化および吸着剤としての評価（その１）
実施例６は、マレイミド基を導入した合成高分子系担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化と、吸着剤としての評価に関する。
【００８５】
（１）マレイミド基を導入した合成高分子系担体の作製
合成高分子系担体として、水に懸濁したトヨパールＨＷ−６５Ｆ（東ソー社製）をグラスフィルターで吸引ろ過したものを使用し、実施例４の（１）に記載の方法により、エポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆを得た。
【００８６】
次に、得られたエポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆ（２．０ｇ）と、エチレンジアミン（東京化成社製）と水から調製した０．５Ｍのエチレンジアミン水溶液（４．０ｍＬ）を混合し、４０℃で１５時間撹拌することによりアミノ化反応を行なった。反応後、グラスフィルター上でろ液が中性になるまで多量の水で洗浄することにより、アミノ化トヨパールＨＷ−６５Ｆを得た。
次に、得られたアミノ化トヨパールＨＷ−６５Ｆ（２．０ｇ）、ジメチルスルホキシド（関東化学社製、２．０ｍＬ、以下ＤＭＳＯという）、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（東京化成社製）とＤＭＳＯから調製した３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルのＤＭＳＯ溶液（濃度１０ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍＬ）を混合し、３５℃で４時間撹拌することにより、マレイミド化反応を行なった。反応後、グラスフィルターを使用してＤＭＳＯと水で順次洗浄することにより、マレイミド基を導入したトヨパールＨＷ−６５Ｆ（以下、マレイミド化トヨパールＨＷ−６５Ｆ）を得た。
【００８７】
（２）マレイミド基を導入した合成高分子系担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化（吸着剤５の作製）
（１）で作製したマレイミド化トヨパールＨＷ−６５Ｆの５０容積％懸濁液（２００μＬ）を反応容器に添加し、５００ｍＭの塩化ナトリウムと２０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む２００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、２００μＬ）で５回洗浄した。
次に、マレイミド化トヨパールＨＷ−６５Ｆ（１００μＬ）が入った反応容器に、担体１ｍＬあたりのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの仕込み量を２．２４ｍｇとして、前述の実施例２で作製したシステインタグを付加したフコース結合性レクチンのＤ−ＰＢＳ（−）溶液（濃度２．８０ｍｇ／ｍＬ、８０μＬ）とＤ−ＰＢＳ（−）（２０μＬ）を添加し、３５℃で４時間撹拌することにより、システインタグを付加したフコース結合性レクチンを、マレイミド化トヨパールＨＷ−６５Ｆに固定化した。固定化反応後、担体を０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳ（−）で洗浄することにより、システインタグを付加したフコース結合性レクチンをマレイミド化トヨパールＨＷ−６５Ｆに固定化したフコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着剤５を得た。
【００８８】
実施例４の（２）に記載の方法により、吸着剤５へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化量と固定化率を算出した結果、固定化量は担体１ｍＬあたり１．０７ｍｇ、固定化率は４７．６％であった。
（３）吸着剤５へのフコース含有糖鎖の吸着率の測定
実施例４の（３）に記載の方法により、（２）で作製した吸着剤５へのフコース含有糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は９０％であった。
（４）フコース含有糖鎖が吸着した吸着剤５からのフコース含有糖鎖の回収率の測定
実施例４の（４）に記載の方法により、（３）でフコース含有糖鎖を吸着させた吸着剤５からのフコース含有糖鎖の回収率を算出した結果、回収率は８８％であった。
（５）マレイミド基を導入した多糖系担体へのフコース含有糖鎖の吸着率の測定
（２）に記載の方法により、（１）で作製したマレイミド化トヨパールＨＷ−６５Ｆの５０容積％懸濁液（２００μＬ）を反応容器に添加し、５００ｍＭの塩化ナトリウムと２０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む２００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、２００μＬ）で５回洗浄した。
【００８９】
次に、マレイミド化トヨパールＨＷ−６５Ｆ（１００μＬ）が入った反応容器に、α−チオグリセリン（東京化成社製）とＤ−ＰＢＳ（−）から調製したα−チオグリセリン／Ｄ−ＰＢＳ（−）溶液（濃度１０ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）を添加し、３５℃で４時間撹拌することにより、マレイミド化トヨパールＨＷ−６５Ｆとα−チオグリセリンを反応させた。反応終了後、担体を０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳ（−）で洗浄することにより、マレイミド基をα−チオグリセリンでブロッキングした吸着剤５Ｂを得た。
（３）に記載の方法により、吸着剤５Ｂへのフコース含有糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は５％であった。従って、吸着剤５Ｂにはフコース含有糖鎖は吸着しないことが明らかとなった。
【００９０】
（６）吸着剤５へのオリゴマンノース型糖鎖の吸着率の測定
実施例４の（６）に記載の方法により、（２）で作製した吸着剤５へのオリゴマンノース型糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は６％であった。従って、吸着剤５にはオリゴマンノース型糖鎖は吸着しないことが明らかとなった。
【００９１】
実施例７  マレイミド基を導入した担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化および吸着剤としての評価（その２）
実施例７は、マレイミド基を導入した多糖系担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化と、吸着剤としての評価に関する。
【００９２】
（１）マレイミド基を導入した多糖系担体の作製
多糖系担体として、水に懸濁したＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦをグラスフィルターで吸引ろ過したものを使用し、実施例６の（１）に記載の方法により、マレイミド基を導入したＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ（以下、マレイミド化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦという）を得た。
（２）マレイミド基を導入した多糖系担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの担体への固定化（吸着剤６の作製）
実施例６の（１）に記載の方法により、（１）で作製したマレイミド化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦにシステインタグを付加したフコース結合性レクチンを固定化したフコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着剤６を得た。実施例４の（２）に記載の方法により、吸着剤６へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化量を算出した結果、固定化量は担体１ｍＬあたり１．１８ｍｇ、固定化率は５２．５％であった。
【００９３】
（３）吸着剤６へのフコース含有糖鎖の吸着率の測定
実施例４の（３）に記載の方法により、（２）で作製した吸着剤６へのフコース含有糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は９５％であった。
（４）フコース含有糖鎖が吸着した吸着剤６からのフコース含有糖鎖の回収率の測定
実施例４の（４）に記載の方法により、（３）でフコース含有糖鎖を吸着させた吸着剤６からのフコース含有糖鎖の回収率を算出した結果、回収率は９０％であった。
【００９４】
（５）マレイミド基を導入した多糖系担体へのフコース含有糖鎖の吸着率の測定
実施例６の（５）に記載の方法により、（１）で作製したマレイミド化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦから、マレイミド基をα−チオグリセリンでブロッキングした吸着剤６Ｂを得た。実施例４の（３）に記載の方法により、吸着剤６Ｂへのフコース含有糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は３％であった。従って、吸着剤６Ｂにはフコース含有糖鎖は吸着しないことが明らかとなった。
（６）吸着剤６へのオリゴマンノース型糖鎖の吸着率の測定
実施例４の（６）に記載の方法により、（２）で作製した吸着剤６へのオリゴマンノース型糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は３％であった。従って、吸着剤６にはフコースを含まないオリゴマンノース型糖鎖は吸着しないことが明らかとなった。
比較例３  マレイミド基を導入した担体へのシステインタグを付加していないフコース結合性レクチンの固定化および吸着剤としての評価
比較例３は、マレイミド基を導入した合成高分子系担体への市販フコース結合性レクチンの固定化と、吸着剤としての評価に関する。
【００９５】
（１）マレイミド基を導入した合成高分子系担体への市販フコース結合性レクチンの担体への固定化（吸着剤７の作製）
実施例６の（１）で作製したマレイミド化トヨパールＨＷ−６５Ｆの５０容積％懸濁液（２００μＬ）を反応容器に添加し、５００ｍＭの塩化ナトリウムと２０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む２００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、２００μＬ）で５回洗浄した。
【００９６】
次に、マレイミド化トヨパールＨＷ−６５Ｆ（１００μＬ）が入った反応容器に、担体１ｍＬあたりの市販フコース結合性レクチンの仕込み量を２．２４ｍｇとして、市販フコース結合性レクチンのＤ−ＰＢＳ（−）溶液（濃度１．６０ｍｇ／ｍＬ、１４０μＬ）を添加し、３５℃で４時間撹拌することにより、市販フコース結合性レクチンをマレイミド化トヨパールＨＷ−６５Ｆに固定化した。固定化反応後、担体を０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳ（−）で洗浄することにより、市販フコース結合性レクチンをマレイミド化トヨパールＨＷ−６５Ｆに固定化したフコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着剤７を得た。
【００９７】
実施例４の（２）に記載の方法により、吸着剤７への市販フコース結合性レクチンの固定化量を算出した結果、反応に使用した市販フコース結合性レクチン量と未反応の市販フコース結合性レクチン量が同じであったことから、市販フコース結合性レクチンはマレイミド化トヨパールＨＷ−６５Ｆに固定化されていないことが明らかとなった。従って、吸着剤７へのフコース含有糖鎖およびオリゴマンノース型糖鎖の吸着率の測定は行わなかった。
【００９８】
実施例８  ハロアセチル基を導入した担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化および吸着剤としての評価（その１）
実施例８は、ハロアセチル基を導入した合成高分子系担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化と、吸着剤としての評価に関する。
【００９９】
（１）ハロアセチル基を導入した合成高分子系担体の作製
合成高分子系担体として、水に懸濁したトヨパールＨＷ−６５Ｆ（東ソー社製）をグラスフィルターで吸引ろ過したものを使用し、実施例４の（１）に記載の方法により、アミノ化トヨパールＨＷ−６５Ｆを得た。
【０１００】
次に、得られたアミノ化トヨパールＨＷ−６５Ｆ（２．０ｇ）、ＤＭＳＯ（関東化学社製、２．０ｍＬ）、ブロモ酢酸Ｎ−スクシンイミジル（東京化成社製）とＤＭＳＯから調製した３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルのＤＭＳＯ溶液（濃度１０ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍＬ）を混合し、３５℃で４時間撹拌することにより、ブロモアセチル化反応を行なった。反応後、グラスフィルターを使用してＤＭＳＯと水で順次洗浄することにより、ブロモアセチル基を導入したトヨパールＨＷ−６５Ｆ（以下、ブロモアセチル化トヨパールＨＷ−６５Ｆ）を得た。
【０１０１】
（２）ハロアセチル基を導入した合成高分子系担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化（吸着剤８の作製）
実施例６の（１）に記載の方法により、（１）で作製したブロモアセチル化トヨパールＨＷ−６５Ｆにシステインタグを付加したフコース結合性レクチンを固定化した、フコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着剤８を得た。実施例４の（２）に記載の方法により、吸着剤８へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化量を算出した結果、固定化量は担体１ｍＬあたり１．１０ｍｇ、固定化率は４８．９％であった。
【０１０２】
（３）吸着剤８へのフコース含有糖鎖の吸着率の測定
実施例４の（３）に記載の方法により、（２）で作製した吸着剤８へのフコース含有糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は８９％であった。
（４）フコース含有糖鎖が吸着した吸着剤２からのフコース含有糖鎖の回収率の測定
実施例４の（４）に記載の方法により、（３）でフコース含有糖鎖を吸着させた吸着剤８からのフコース含有糖鎖の回収率を算出した結果、回収率は８６％であった。
（５）マレイミド基を導入した多糖系担体へのフコース含有糖鎖の吸着率の測定
実施例６の（５）に記載の方法により、（１）で作製したブロモアセチル化トヨパールＨＷ−６５Ｆのブロモアセチル基をα−チオグリセリンでブロッキングした吸着剤８Ｂを得た。実施例４の（３）に記載の方法により、吸着剤８Ｂへのフコース含有糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は４％であった。従って、吸着剤８Ｂにはフコース含有糖鎖は吸着しないことが明らかとなった。
【０１０３】
（６）吸着剤８へのオリゴマンノース型糖鎖の吸着率の測定
実施例４の（６）に記載の方法により、（２）で作製した吸着剤８へのオリゴマンノース型糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は５％であった。従って、吸着剤８にはフコースを含まないオリゴマンノース型糖鎖は吸着しないことが明らかとなった。
【０１０４】
実施例９  ハロアセチル基を導入した担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化および吸着剤としての評価（その２）
実施例９は、ハロアセチル基を導入した多糖系担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化と、吸着剤としての評価に関する。
【０１０５】
（１）ハロアセチル基を導入した多糖系担体の作製
多糖系担体として、水に懸濁したＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦをグラスフィルターで吸引ろ過したものを使用し、実施例８の（１）に記載の方法により、ブロモアセチル基を導入したＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ（以下、ブロモアセチル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦという）を得た。
（２）ハロアセチル基を導入した多糖系担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの担体への固定化（吸着剤９の作製）
実施例８の（１）に記載の方法により、（１）で作製したブロモアセチル化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦにシステインタグを付加したフコース結合性レクチンを固定化したフコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着剤９を得た。実施例４の（２）に記載の方法により、吸着剤９へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化量を算出した結果、固定化量は担体１ｍＬあたり１．２１ｍｇ、固定化率は５３．８％であった。
（３）吸着剤９へのフコース含有糖鎖の吸着率の測定
実施例４の（３）に記載の方法により、（２）で作製した吸着剤９へのフコース含有糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は９４％であった。
（４）フコース含有糖鎖が吸着した吸着剤６からのフコース含有糖鎖の回収率の測定
実施例４の（４）に記載の方法により、（３）でフコース含有糖鎖を吸着させた吸着剤９からのフコース含有糖鎖の回収率を算出した結果、回収率は９１％であった。
【０１０６】
（５）マレイミド基を導入した多糖系担体へのフコース含有糖鎖の吸着率の測定
実施例６の（５）に記載の方法により、（１）で作製したマレイミド化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦから、マレイミド基をα−チオグリセリンでブロッキングした吸着剤９Ｂを得た。実施例４の（３）に記載の方法により、吸着剤９Ｂへのフコース含有糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は４％であった。従って、吸着剤９Ｂにはフコース含有糖鎖は吸着しないことが明らかとなった。
（６）吸着剤９へのオリゴマンノース型糖鎖の吸着率の測定
実施例４の（６）に記載の方法により、（２）で作製した吸着剤９へのオリゴマンノース型糖鎖の吸着率を算出した結果、吸着率は４％であった。従って、吸着剤９にはフコースを含まないオリゴマンノース型糖鎖は吸着しないことが明らかとなった。
【０１０７】
比較例４  ハロアセチル基を導入した担体へのシステインタグを付加していないフコース結合性レクチンの固定化および吸着剤としての評価
比較例４は、ハロアセチル基を導入した合成高分子系担体への市販フコース結合性レクチンの固定化と、吸着剤としての評価に関する。
【０１０８】
（１）ハロアセチル基を導入した合成高分子系担体への市販フコース結合性レクチンの担体への固定化（吸着剤１０の作製）
比較例３の（１）に記載の方法により、実施例８の（１）で作製したブロモアセチル化トヨパールＨＷ−６５Ｆに市販フコース結合性レクチンを固定化した、フコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着剤１０を得た。実施例４の（２）に記載の方法により、吸着剤１０への市販フコース結合性レクチンの固定化量を算出した結果、反応に使用した市販フコース結合性レクチン量と未反応の市販フコース結合性レクチン量が同じであったことから、市販フコース結合性レクチンはブロモアセチル化トヨパールＨＷ−６５Ｆに固定化されていないことが明らかとなった。従って、吸着剤１０へのフコース含有糖鎖およびオリゴマンノース型糖鎖の吸着率の測定は行わなかった。
【０１０９】
参考例１  ホルミル基を導入した担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化および吸着剤としての評価
参考例１は、リジンのε−アミノ基を利用した、ホルミル基を導入した合成高分子系担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化と、吸着剤としての評価に関する。
【０１１０】
（１）ホルミル基を導入した合成高分子系担体の作製
合成高分子系担体として、水に懸濁したトヨパールＨＷ−６５Ｆ（東ソー社製）をグラスフィルターで吸引ろ過したものを使用し、実施例４の（１）に記載の方法により、エポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆを得た。
【０１１１】
得られたエポキシ化トヨパールＨＷ−６５Ｆ（２．０ｇ）と、Ｄ−グルカミン（東京化成社製）と水から調製した０．５ＭのＤ−グルカミン水溶液（４．０ｍＬ）を混合し、４０℃で１５時間撹拌することにより担体にＤ−グルカミンを導入した。反応後、グラスフィルター上でろ液が中性になるまで多量の水で洗浄することにより、Ｄ−グルカミン導入トヨパールＨＷ−６５Ｆを得た。
次に、得られたＤ−グルカミン導入トヨパールＨＷ−６５Ｆ（２．０ｇ）と、過ヨウ素酸ナトリウム（関東化学社製）と水から調製した過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍＬ）、水（１．５ｍＬ）を混合し、２５℃で６０分間撹拌することによりホルミル化反応を行なった。反応後、グラスフィルターを使用して多量の水で洗浄することにより、ホルミル基を導入したトヨパールＨＷ−６５Ｆ（以下、ホルミル化トヨパールＨＷ−６５Ｆ）を得た。
【０１１２】
（２）ホルミル基を導入した合成高分子系担体へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化（吸着剤１１の作製）
（１）で作製したホルミル化トヨパールＨＷ−６５Ｆの５０容積％懸濁液（２００μＬ）を反応容器に添加し、５００ｍＭの塩化ナトリウムと２０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０、２００μＬ）で５回洗浄した。
【０１１３】
ホルミル化トヨパールＨＷ−６５Ｆ（１００μＬ）が入った反応容器に、担体１ｍＬあたりのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの仕込み量を２．２４ｍｇとして、前述の実施例２で作製したシステインタグを付加したフコース結合性レクチンのＤ−ＰＢＳ（−）溶液（濃度２．８０ｍｇ／ｍＬ、８０μＬ）とＤ−ＰＢＳ（−）（２０μＬ）を添加し、３０℃で１時間撹拌した。次に、水素化ホウ素ナトリウム（関東化学社製）と水から調製した水素化ホウ素ナトリウム水溶液（５ｍｇ／ｍＬ、１０μＬ）を添加し、さらに３０℃で１時間撹拌することにより、システインタグを付加したフコース結合性レクチンをホルミル化トヨパールＨＷ−６５Ｆに固定化した。固定化反応後、担体を０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳ（−）で洗浄することにより、システインタグを付加したフコース結合性レクチンをホルミル化トヨパールＨＷ−６５Ｆに固定化したフコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着剤１１を得た。
【０１１４】
実施例４の（２）に記載の方法により、吸着剤１１へのシステインタグを付加したフコース結合性レクチンの固定化量を算出した結果、反応に使用したシステインタグを付加したフコース結合性レクチン量と未反応のシステインタグを付加したフコース結合性レクチン量が同じであったことから、システインタグを付加したフコース結合性レクチンはホルミル化トヨパールＨＷ−６５Ｆに固定化されていないことが明らかとなった。従って、吸着剤１１へのフコース含有糖鎖およびオリゴマンノース型糖鎖の吸着率の測定は行わなかった。
【０１１５】
実施例４から実施例９、比較例１から比較例４および参考例１における担体へのフコース結合性レクチンの固定化の結果を表１に示す。
また、実施例４から実施例９および比較例２で作製した吸着剤の、フコース含有糖鎖および／または複合糖質の吸着剤としての評価結果を表２に示す。
【０１１６】
【表１】
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【０１１７】
【表２】
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【図１】
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【配列表】
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