(57)【要約】【課題】本発明は、内臓リーシュマニア症を治療するための従来型リポソームと長期循環型リポソームを含有する医薬組成物を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、殺リーシュマニア薬物送達システムを有する、従来型リポソームと長期循環型リポソームを会合させることを含むことによって特徴付けられる、内臓リーシュマニア症を治療するための医薬組成物に関する。該組成物は、リーシュマニアの形態（複数）を治療するための薬剤の製造に使用することができ、筋内、皮下、腹腔内又は静脈内に投与することができる。このシステムの使用は、寄生虫によって感染した全ての部位に薬物を効率的に到達させることができ、ＰＥＧ化リポソームは、骨髄及び脾臓における殺リーシュマニア剤のより効果的なターゲッティングを促進し、一方、従来型リポソームは肝臓における薬物のターゲッティングに効率的な寄与する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ又は様々な殺リーシュマニア薬を包含し、従来型リポソームと長期循環型リポソームを会合させることによって特徴付けられる、内臓リーシュマニア症を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
従来型リポソームが、天然及び／又は合成のリン脂質（単数又は複数）及び／又は界面活性剤（単数又は複数）及び／又はコレステロールを含み、５０〜１０００ｎｍの範囲の平均径を有することによって特徴付けられる、請求項１に記載の内臓リーシュマニアを治療するための医薬組成物。
【請求項３】
長期循環型リポソームが、その組成中に、血流中でのリポソームの循環時間の増加をもたらす脂質又は界面活性剤を含むことによって特徴付けられる、請求項１に記載の内臓リーシュマニアを治療するための医薬組成物。
【請求項４】
脂質又は界面活性剤が、エチレングリコールポリマーで形成された極性頭部を有する、請求項１に記載の内臓リーシュマニアを治療するための医薬組成物。
【請求項５】
殺リーシュマニア薬（単数又は複数）が、アンチモン化合物、アンホテリシンＢ、ペンタミジン、ミルテフォシン、アロプリノール、パロモミシン、シタマキン、イミノキモド、フルコナゾール、セトコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、ツカレソール、アジトロミシン、ブパラウバキノア、タモキシフェン、テルビナフィン、フラゾリドン、フルオロキノロン、ドンペリドン、インターロイキン１２、インターロイキン１０、脂質Ａ、アルキル−リソリン脂質の誘導体及びアルキル−リン脂質の誘導体、アザステロール、リコカルコンＡ、マエサバジドＩＩＩ、トリコテセン、ｎ−アセチル−システイン、３置換キノリン及び／又はリーシュマニア症を治療するために通常使用されている別の薬物を含む群から選択されることによって特徴付けられる、請求項１に記載の内臓リーシュマニアを治療するための医薬組成物。
【請求項６】
筋内、皮下、腹腔内及び／又は静脈内経路によって投与され得ることによって特徴付けられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の内臓リーシュマニアを治療するための医薬組成物。
【請求項７】
哺乳動物におけるリーシュマニア症を治療するための医薬を製造するためであることによって特徴付けられる、請求項１〜６にいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、殺リーシュマニア薬物送達システムとして従来型リポソームと長期循環型リポソームの会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を含むことによって特徴付けられる内臓リーシュマニア症を治療するための医薬組成物に関する。この組成物は、リーシュマニア症を治療するための薬剤の調製に使用することができ、筋内、皮下、腹腔内又は静脈内経路によって投与することができる。このシステムの使用は、寄生虫に感染したすべての部位に薬剤を効率的に到達させることができる。従来型リポソームは、肝臓への薬物の指向に対して作用するのに対し、ペグ化リポソームは、骨髄及び脾臓への殺リーシュマニア剤のより効果的なターゲティングを促進する。
【背景技術】
【０００２】
リーシュマニア症は、Ｋｉｎｅｔｏｐｌａｓｔｉｄａ目Ｔｒｉｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅ科Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属に属する鞭毛原生動物類によって引き起こされる、世界中で１，２００万人に影響を及ぼしている寄生虫病である（ＵＮＤＰ／Ｗｏｒｌｄ  Ｂａｎｋ／ＷＨＯ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＴＤＲ）．Ｉｎ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ  Ｒｅｐｏｒｔ，１３；ｐｒｏｇｒｅｓｓ  １９９５−９６；Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：Ｇｅｎｅｖａ，１９９７，ｃｈａｐ．８）。ブラジルでは、細菌の全てのデータは、年に約３０，０００人の新たな症例がこの疾患を発症すると報告している。
【０００３】
リーシュマニア症は、前鞭毛状の寄生虫を逆流するインセットの刺し傷によって脊椎動物の宿主に送達される。これらの寄生虫は、それらが無鞭毛に変わるマクロファージによって貪食される。無鞭毛は、ファゴリソソームの酸性コンパートメント内で自由に増殖し、宿主の防御システムから逃れる。リーシュマニア症は、皮膚、粘膜皮膚及び内臓の形態を含む、様々なタイプの臨床症状を引き起こす様々な異なる種の複合に相当する。ブラジルでは、内臓リーシュマニア症を引き起こす種は、リーシュマニア・チャガシ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｃｈａｇａｓｉ）である。イヌは、皮膚及び内臓の形態の脊椎動物宿主として、特に、内臓リーシュマニア症において見られ、それらは、流行地域における該疾患の保有宿主及び感染源として重要な役割を果たしている。臨床的に治療されない場合において、内臓リーシュマニア症は、１００％の致死率を示す。
【０００４】
１９４０年代に始まって、五価アンチモン複合体（Ｓｂ（Ｖ））はリーシュマニア症の治療に使用され始めた［Ｍａｒｓｄｅｎ，Ｐ．Ｄ．；Ｒｅｖ．Ｓｏｃ．Ｂｒａｓ．Ｍｅｄ．Ｔｒｏｐ．１９８５，１８，１８７；Ｂｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｄ．；Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９７，２４，６８４；Ｒａｔｈ，Ｓ．；Ｔｒｉｖｅｌｉｎ，Ｌ．Ａ．；Ｉｍｂｒｕｎｉｔｏ，Ｔ．Ｒ．；Ｔｏｍａｚｅｌａ，Ｄ．Ｍ．；ｄｅ  Ｊｅｓｕｓ，Ｍ．Ｎ．；Ｍａｒｚａｌ，Ｐ．Ｃ．；Ｊｕｎｉｏｒ  Ｈ．Ｆ．Ａ．；Ｔｅｍｐｏｎｅ，Ａ．Ｇ．；Ｑｕｉｍ．Ｎｏｖａ  ２００３，２６，５５０］。現在の使用における主なアンチモン化合物は、Ｎ−メチル−グルカミン（アンチモン酸メグルミン）及びグルコン酸ナトリウム（スチボグルコン酸ナトリウム）とのＳｂ（Ｖ）複合体である。Ｓｂ（Ｖ）はプロドラッグであることが示唆され、活性及び毒性形態であると言われている、Ｓｂ（ＩＩＩ）に対してｈｏｓ生物において減少された。五価アンチモン化合物は、リーシュマニア症の全ての形態の治療において第一の選択薬であり続けるが、その臨床使用には様々な制限がある。これらの化合物は、２０〜４０日の期間中、毎日、非経口経路（静脈内又は筋内注射）によって投与されなければならない。この文脈では、副作用は頻繁である。治療に対する抵抗性の症例の出現もまた、リーシュマニア症の治療における重大な問題である。内臓リーシュマニア症の制御において直面する別の困難性は、今までのところ、自然に感染したイヌに対して有効な治療がないということである。
【０００５】
五価アンチモン化合物を代わり得る新しい薬剤の中には以下がある：（１）ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）、内臓リーシュマニア症の治療用に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって最近承認されているリポソームに基づくアムホテリシンＢの製剤  ［Ｍｅｙｅｒｈｏｆｆ  Ａ．１９９９  Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ａｐｐｒｏｖａｌ  ｏｆ  ＡｍＢｉｓｏｍｅ（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２８，４２−４８］；  （２）Ｌ’ｌｍｐａｖｉｄｏ（登録商標）、癌の治療用のＭｉｌｔｅｘ（登録商標）名で初期に開発されたヘキサデシルホスホコリン又はミテホシンであり、インドにおける臨床試験において、内臓リーシュマニア症の治療での経口経路によって高い有効性を示した［Ｓｕｎｄａｒ  Ｓ，Ｊｈａ  ＴＫ，Ｔｈａｋｕｒ  ＣＰ，Ｅｎｇｅｌ  Ｊ，Ｓｅｎｄｅｒｍａｎｎ  Ｈ，Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｃ，Ｊｕｎｋｅ  Ｋ，Ｂｒｙｃｅｓｏｎ  Ａ，Ｂｅｒｍａｎ  Ｊ．２００２  Ｏｒａｌ  ｍｉｌｔｅｆｏｓｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｉａｎ  Ｖｉｓｃｅｒａｌ  Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４７，１７３９−１７４６］；及び（３）パロモミシン（又はアミノシジン）の局所製剤、皮膚リーシュマニア症の実験的治療において有効であることが証明された［Ｇａｍｉｅｒ  Ｔ，Ｃｒｏｆｔ  ＳＬ．２００２  Ｔｏｐｉｃａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ３，５３８−５４４］。しかしながら、これらの薬剤の使用についての可能性は、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）の高コスト、Ｍｉｌｔｅｆｏｓｉｎａの副作用及びパロモマイシン製剤の低い有効性に起因して僅かである。
【０００６】
これらの制限を考慮すると、世界保健機関（ＷＨＯ）はまた、新規な薬剤のリサーチであるＴＤＲのような他の関連した団体への誘因を推奨する［Ｒｅｍｍｅ，Ｊ．Ｈ．Ｆ．；Ｂｌａｓ，Ｅ．；Ｃｈｉｔｓｕｌｏ，Ｌ．；Ｄｅｓｊｅｕｘ，Ｐ．Ｍ．Ｐ．；Ｅｎｇｅｒｓ，Ｈ．Ｄ．；Ｋａｎｙｏｋ，Ｔ．Ｒ．；Ｋａｙｏｎｄｏ，Ｊ．Ｆ．Ｋ．；Ｋｉｏｙ，Ｄ．Ｗ．；Ｋｕｍａｒａｓｗａｍｉ，Ｖ．；Ｌａｓｄｉｎｓ，Ｊ．Ｋ．；Ｎｕｎｎ，Ｐ．Ｐ．；Ｏｄｕｏｌａ，Ａ．；Ｒｉｄｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．；Ｔｏｕｒｅ，Ｙ．Ｔ．；Ｚｉｃｋｅｒ，Ｆ．；Ｍｏｒｅｌ，Ｃ．Ｍ．；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２００２，１８，４２１；Ｒｉｄｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．Ｅｍ  Ｄｒｕｇ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐａｒａｓｉｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ；Ｆａｉｌａｍｂ，Ａ．Ｈ．；Ｒｉｄｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．；Ｖｉａｌ，Ｈ．Ｊ．，ｅｄｓ．；ＵＮＤＰ／Ｗｏｒｌｄ  Ｂａｎｋ／ＷＨＯ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＴＤＲ）：Ｇｅｎｅｖａ，２００３，ｐ．１３］。
【０００７】
本質的には、３つの異なる戦略が、内臓リーシュマニア症治療を改善するため、現時点で検討されている。それらのうちの１つは、相乗作用を有する様々なリーシュマニア剤を組み合わせることからなる。例えば、ゲンタマイシンのパロモマイシンへの会合は、局所適用においてパロモマイシンの有効性を増加させている（ＷＯ９４０６４３９−Ａ１）。アミノシジンとスチボグルコン酸ナトリウムの組み合わせは、順番に、従来の治療に応答しない内臓形の治療に有効な手段であることが判明した。同様に、臨床評価における他の薬剤と、このアンチモンの会合、すなわちアロプリノールは、アンチモンへの抵抗性の場合においてさえ効果的であることが判明した［Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｓ．；Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｍ．；Ｖｅｒｎａｚａ，Ｍ．Ｅ．；Ｃ／ｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９９７，２４，１６５］。免疫調節物質を五価アンチモン化合物に会合させた免疫化学療法は、治療の有効性を保ちながら、アンチモンの適用用量を減少させる一方法であることが判明した［Ｍｕｒｒａｙ，Ｈ．Ｗ．；Ｂｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｄ．；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｓ．Ｄ．；Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９８８，１５７，９７３；Ｍａｃｈａｄｏ−Ｐｉｎｔｏ，Ｊ．；Ｐｉｎｔｏ，Ｊ．；ｄａ  Ｃｏｓｔａ，Ｃ．Ａ．；Ｇｅｎａｒｏ，Ｏ．；Ｍａｒｑｕｅｓ，Ｍ．Ｊ．；Ｍｏｄａｂｂｅｒ，Ｆ．；Ｍａｙｒｉｎｋ，Ｗ．；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００２，４１，７３］。
【０００８】
第２の戦略は、新規な活性物質又は化学修飾を有する既知薬物の計画及び合成を伴う。しかしながら、新規な薬物の開発における長期間と高コストは、この戦略の成功を顕著に制限する。
【０００９】
第３の戦略は、より良好な方法で標的細胞に薬物をもたらし、薬物が毒性を示す望ましくない部位を防止するという寒天で、すでに運搬システムへの使用において薬物の可逆的な戦略を伴う。この戦略は、「薬物の若返り」としても知られ、製品の開発段階での時間において恩恵を与え、これは、すでに薬理学的観点から特徴づけられるためである。現時点で入手可能な薬剤運搬システムの中では、リポソームは、リーシュマニア症の形態の治療に卓越した地位を占めている。
【００１０】
薬物担体としてのリポソームの使用は、製薬産業における傾向であり、新たなリーシュマニア剤の開発のための展望を開いてきた。脂質の１以上の同心の二重層で構成されるこれらの球状のビヒクルは、それらの内部水性コンパートメントにおいて、水溶性活性成分を保存することができ、又はそれらの膜に組み込まれている親油性又は両親媒性の活性成分を有することができる。このように、医薬は、ゆっくりと放出され、生物によるその急速な排出を防止する。結果は、作用の増強及び毒性の減少を伴い、医薬品の生物学的利用能が増加する。
【００１１】
従来型リポソームは、リーシュマニア症の治療を目的として、殺リーシュマニア剤を担持するために、幅広く研究された  ［Ｆｒｅｚａｒｄ，Ｆ．，Ｄｅｍｉｃｈｅｌｉ，Ｆ．２０１０．Ｎｅｗ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｏｌｄ  ｐｅｎｔａｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｍｏｎｉａｌ  ｄｒｕｇｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．７（１２），１３４３−５８］。従来型リポソームは、典型的には、ホスファチジルコリンなどのリン脂質又は非イオン性界面活性剤から形成される。また、これは、その組成物において、コレステロール、負電荷を有するリン脂質、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ジセチルホスフェート及び／又はステラリルアミンなどの正電荷を有するリン脂質を含んでもよい。単核食細胞系、主に肝臓、脾臓及び骨髄のマクロファージによって、それらは血液循環から迅速に浄化されているため、従来型リポソームは、内臓リーシュマニア症の感染部位に薬物を運搬し、寄生虫と相互作用するために多量の薬物を利用する。
【００１２】
この文脈において、アンホテリシンＢ製剤は、アンチモン剤に応答しなかった患者の治療に成功裏に使用された従来型リポソーム（ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標））［ＷＯ９６４００６０−Ａ１）において開発され、同じことが、ＰＫＤＬ形態を有する患者の治療に起こったが、副作用の報告はない。免疫適格患者に対する１００％の有効性は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）による承認を生じさせ、Ｃａｌａｚａｒ（内臓リーシュマニア症）の治療用に認識されたリポソームに基づく最初の提案であった。
［Ｍｅｙｅｒｈｏｆｆ  Ａ．１９９９  Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ａｐｐｒｏｖａｌ  ｏｆ  ＡｍＢｉｓｏｍｅ（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２８，４２−４８］。
【００１３】
アンチモン化合物の場合、従来型リポソームにおけるカプセル化形態がまた開発された［ＵＳ４１８６１８３Ａ；ＥＰ７２２３４Ａ；ＷＯ９６０４８９０−Ａ１；ＵＳ４５９４２４１］。内臓リーシュマニア症の実験モデルにおいて、これらの調製物は、肝臓における寄生虫の排除における非カプセル化アンチモンと比較して少なくとも２００倍効果的であることが判明した［Ｎｅｗ，Ｒ．Ｒ．；Ｃｈａｎｃｅ，Ｍ．Ｌ．；Ｔｈｏｍａｓ，Ｓ．Ｃ．；Ｐｅｔｅｒｓ，Ｗ．；Ｎａｔｕｒｅ  １９７８，２５，２７２（５６４８），５５；Ａｌｖｉｎｇ，Ｃ．Ｒ．；Ｓｔｅｃｋ，Ｅ．Ａ．；Ｃｈａｐｍａｎ，Ｗ．Ｌ．；Ｗａｉｔｓ，Ｖ．Ｂ．；Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓ，Ｌ．Ｄ．；Ｓｗａｒｔｚ，Ｇ．Ｍ．；Ｈａｎｓｏｎ  Ｗ．Ｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７８，７５，２９５９；Ｂｌａｃｋ，Ｃ．Ｄ．Ｖ．；Ｗａｔｓｏｎ，Ｇ．Ｊ．；Ｗａｒｄ，Ｒ．Ｊ．；Ｔｒａｎｓ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．１９７７，７１，５５０］。マウス及びイヌにおけるアンチモンの生体内分布／薬物動態に関する研究は、従来型リポソーム形態が、遊離形態と比較して、アンチモンの非常に高く長期のレベルを促進し、動物の肝臓及び脾臓において促進することを示した［Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｍ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｋ．Ｃ．，Ｂａｉｌｌｉｅ，Ａ．Ｊ．，Ｏ’Ｇｒａｄｙ，Ｊ．；Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  １９９３，１，１３３；Ｆｒｅｚａｒｄ  ｅ  Ｄｅｍｉｃｈｅｌｉ．２０１０  Ｎｅｗ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｏｌｄ  ｐｅｎｔａｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｍｏｎｉａｌ  ｄｒｕｇｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  ７，１３４３−５８］。しかしながら、これらの最初の製剤の低安定性は、少なくとも部分的に、それらのいずれも市販されるようになっていないことを説明している。
【００１４】
より最近では、より良好な技術的特性を有する従来型リポソームにおけるアンチモン酸メグルミンの新規製剤を得ることを期待して、努力がなされた。したがって、アンチモン溶液を用いて、ホスファチジルコリン、コレステロール及びジセチルホスフェートによって形成された再水素化され、凍結乾燥された空のリポソームからなる新規な製造方法が開発された［Ｆｒｅｚａｒｄ  Ｆ，Ｍｉｃｈａｌｉｃｋ  ＭＳＭ，Ｓｏａｒｅｓ  ＣＦ，Ｄｅｒｍｉｃｈｅｌｉ  Ｃ．２０００．Ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｇｌｕｍｉｎｅ  ａｎｔｉｍｏｎｉａｔｅ  ｉｎ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．Ｂｒａｚ  Ｊ．Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ３３，８４１−６］。慣例の方法と比較して、この製剤を調製する方法の重要な技術的利点は、得られた製剤が凍結乾燥された空のリポソームの形態で保存し得て、再水和が、投与直前に行われ、その保存と輸送を促進することである。
【００１５】
健康的なイヌへのリポソーム製剤の単回静脈内注射は、肝臓及び脾臓におけるアンチモンの高レベルをもたらし、これは、４日間、注射されたイヌの約４０％に対応している。［Ｓｃｈｅｔｔｉｎｉ  ＤＡ，Ｃｏｓｔａ  Ｖａｌ  ＡＰ，Ｓｏｕｚａ  ＬＦ，Ｄｅｍｉｃｈｅｌｉ  Ｃ，Ｒｏｃｈａ  ＯＧＦ，Ｍｅｌｏ  ＭＮ，Ｍｉｃｈａｌｉｃｋ  ＭＳＭ，Ｆｒｅｚａｒｄ  Ｆ．２００３．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｍｏｎｙ  ｉｎ  ｄｏｇｓ．Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ３６，２６９−７２］。一方、骨髄中のアンチモン濃度は非常に低く、約１０倍低かった。さらに、当然に、この製剤の複数回投薬で感染させたイヌの処置後、骨髄中の寄生虫数の有意な減少が観察されたが、その組織中の寄生虫は完全には除去されなかった［Ｓｃｈｅｔｔｉｎｉ  ＤＡ，Ｃｏｓｔａ  Ｖａｌ  ＡＰ，Ｓｏｕｚａ  ＬＦ，Ｄｅｍｉｃｈｅｌｉ  Ｃ，Ｒｏｃｈａ  ＯＧＦ，Ｍｅｌｏ  ＭＮ，Ｍｉｃｈａｌｉｃｋ  ＭＳＭ，Ｆｒｅｚａｒｄ  Ｆ．２００５．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｏｆ  ｄｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｖｉｓｃｅｒａｌ  ３０  ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ  ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｍｅｇｌｕｍｉｎｅ  ａｎｔｉｍｏｎｉａｔｅ．Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ３８，１８７９−８３］。
【００１６】
これらのデータは、骨髄中のアンチモン濃度の増加が、この製剤を用いた治療を得るために、おそらく重要であることを示唆した。先行技術［Ｃａｒｔｅｒ，Ｋ．Ｃ．；Ｄｏｌａｎ，Ｔ．Ｆ．；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊ．；Ｂａｉｌｌｉｅ，Ａ．Ｊ．；ＭｃＣｏｌｇａｎ，Ｃ．；Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９８９，４１，８７］に基づいて、これらの従来型リポソームの大きなサイズ（平均流体力学的直径は１０００ｎｍより大きい）が、骨髄へのビヒクルの低い経路指定に関し得るという仮説を提起した。
【００１７】
したがって、その後の研究では、上記のリポソームを調製する方法は、サイズ減少させたリポソームを得るように、低温保護糖を導入することによって修飾された［Ｆｒｅｚａｒｄ  Ｆ，１０  Ｄｅｍｉｃｈｅｌｉ  Ｃ，Ｓｃｈｅｔｔｉｎｉ  ＤＡ，Ｒｉｂｅｉｒｏ  ＲＲ，Ｍｅｌｏ  ＭＮ，Ｍｉｃｈａｌｉｃｋ  ＭＳＭ．Ａ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｍｅｇｌｕｍｉｎｅ  ａｎｔｉｍｏｎｉａｔｅ  ｉｎ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ａｎｉｍａｌｓ  ａｔｔａｃｋｅｄ  ｂｙ  ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉ．ＩＮＰＩ  ＰＩ０４０５４８９−０，  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １１，２００４で出願された特許出願］。糖／脂質非（３：１）（ｐ／ｐ）におけるスクロースの使用は、ビヒクルの平均径を１２００ｎｍから４００ｎｍに減少させることができた。異なる大きさの２つの製剤は、脂質及びアンチモンの同用量で、天然に感染したイヌに投与され、骨髄へのアンチモンの経路指定の能力性によって比較された。「中程度の」リポソーム（４００ｎｍの平均径）は、この組織において、「大きな」リポソーム（１２００ｎｍの平均径）を用いて達成された場合と比較して、３〜４倍高いアンチモンレベルを促進した。［Ｓｃｈｅｔｔｉｎｉ  ＤＡ，Ｒｉｂｅｉｒｏ  ＲＲ，Ｄｅｍｉｃｈｅｌｉ  Ｃ，Ｒｏｃｈａ  ＯＧＦ，Ｍｅｌｏ  ＭＮ，Ｍｉｃｈａｌｉｃｋ  ＭＳＭ，Ｆｒｅｚａｒｄ  Ｆ．２００６．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｏｎｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｏｆ  ｄｏｇｓ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｏｆ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｉｚｅ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ３１５，１４０−７］。この結果は、非常に関心があり、それは、動物の骨髄において寄生虫を排除するためのサイズが減少したリポソーム製剤のより高い有効性を示唆しているためである。
【００１８】
より最近の研究［Ｒｉｂｅｉｒｏ  ＲＲ，Ｍｏｕｒａ  Ｐ，Ｐｉｍｅｎｔｅｌ  ＶＭ，Ｓａｍｐａｌｏ  ＷＭ，Ｓｉｌｖａ  ＳＭ，Ｓｃｈｅｔｔｉｎｉ  ＤＡ，Ａｌｖｅｓ  ＣＦ，Ｍｅｌｏ  ＦＡ，Ｄｅｍｉｃｈｅｌｉ  Ｃ，  Ｔａｆｕｒｉ  ＷＬ，Ｍｅｌｏ  ３０  ＭＮ，Ｆｒｅｚａｒｄ  Ｆ，Ｍｉｃｈａｌｉｃｋ  ＭＳＭ．２００８  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐａｒａｓｉｔｉｃ  ｌｏａｄ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｓａｎｄ  ｆｌｉｅｓ  ｉｎ  ｄｏｇｓ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）ｃｈａｇａｓｉ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｇｌｕｍｉｎｅ  ａｎｔｉｍｏｎｉａｔｅ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５２，２５６４−７２］、リーシュマニア・チャガシによって天然に感染したイヌに対する中程度サイズのリポソーム中のアンチモン酸メグルミンの製剤の治療有効性及び毒性を評価した。１２匹の動物群は、静脈内を経由して、リポソームにカプセル化されたアンチモン酸メグルミン（ＧＩ、６．５ｍｇ  Ｓｂ／ｋｇ／投薬）の、空のリポソーム（ＧＩＩ）の、又は生理食塩水溶液（ＧＩＩＩ）の４回投薬（４日間の間隔をおいて）を受けた。処置の前及び治療の直後に評価する場合、腎臓、肝臓及び造血の機能を印すパラメータは、有意な変化を示さなかった。これは、製剤の毒性がないことを指示する。ＧＩの骨髄における寄生虫負荷は、対照群に比べて、処置４日後に有意な減少を示した。処置の５カ月後、皮膚、リンパ節、肝臓、腎臓及び骨髄における寄生虫負荷の免疫細胞化学的な評価は、ＧＩＩ及びＧＩＩＩの動物と比較して、ＧＩの動物のリンパ節、肝臓及び脾臓の有意な減少を示した。処置から５カ月後、異なる群における動物にフレボトミデス・ルツゾミヤ（ルフゾミア（Ｌｕｆｚｏｍｙｉａ））ロンギパルピス（ｆｌｅｂｏｔｏｍｉｄｅｓ  Ｌｕｔｚｏｍｙａ（Ｌｕｆｚｏｍｙｉａ）ｌｏｎｇｉｐａｌｐｉｓ）を与えた場合、有意に低い感染率が、ＧＩＩ及びＧＩＩＩ群と比較して、ＧＩにおいて見られた。この高い治療効果は、従来の処置に使用されるものと比較して、２５倍低いアンチモンの累積投薬量を使用することによって達成されたことが指摘されるべきである。
【００１９】
しかしながら、ＧＩの動物の骨髄の培養を処置から５カ月後に実施したとき、寄生虫の存在が全ての動物において証明された。
【００２０】
ＡｍＢｉｓｏｍｅによる処置は、リーシュマニア・インファンタム（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｉｎｆａｎｔｕｍ）のいずれかで天然で感染されたイヌを治癒することができなかった［Ｏｌｉｖａ  Ｇ，Ｇｒａｄｏｎｉ  Ｌ，Ｃｉａｒａｍｅｌｌａ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ（ＡｍＢｉｓｏｍｅ）ｉｎ  ｄｏｇｓ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｉｎｆａｎｔｕｍ．Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  １９９５；３６：１０１３−１９］。
【００２１】
したがって、従来技術は、従来型リポソームに基づく技術が、影響を受けた動物（主に、内臓リーシュマニア症のイヌ）の感染部位に薬物の経路指定を与えるために現時点で可能であり、決定された感染部位で寄生虫を排除するのに十分なレベルの薬物を到達させることはできないことを示す。より具体的には、骨髄は、重要な組織であると考えられ、そこでは、薬物の濃度を増加させる必要がある。
【００２２】
９０年代、異なる研究者が、長期循環型リポソームが、エチレングリコールポリマー（ＰＥＧ）から構成される極性頭部を有する脂質をビヒクルの膜に組み込むことによって得ることができることを同時に報告した。この場合、この新しいクラスのリポソームは、ＰＥＧ化された、静的（ｆｕｒｔｉｖｅ）な又は立体的に安定したリポソームと呼ばれた［Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅ  Ｃｏｌ．１９９０．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ  ２６８：２３５−２３７；Ａｌｌｅｎ  ｅ  Ｃｏｌ．１９９１．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １０６６，２９−３６；Ｗｏｏｄｌｅ  ＭＣ，Ｌａｓｉｃ  ＤＤ．１９９２  Ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １１１３，１７１−９９］。これらの脂質の非限定的な例は、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ（２０００）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２００）であり、典型的には、全脂質の５〜１０ｍｏｌ％の比率で組み込まれている。
【００２３】
ビヒクル表面のこの化学就床は、その薬物動態に以下の影響を与えた［Ｆｒｅｚａｒｄ  Ｆ，Ｓｃｈｅｔｔｉｎｉ  ＤＡ，Ｒｏｃｈａ  ＯＧＦ，Ｄｅｍｉｃｈｅｌｉ  Ｃ．２００５  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｍｏｎｙ−ｂａｓｅｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｑｕｉｍ  Ｎｏｖａ  ２８，５１１−２０  ５１８］：リポソームのオプソニン化レベルの減少；単核性食細胞系の臓器（肝臓、脾臓、骨髄）のマクロファージによって捕捉する速度の減少；血漿中の長期循環；これらの部位が血管透過性の増大を示すという事実に起因して、炎症／感染部位での好ましい蓄積。この特性は、炎症／感染部位の診断のための放射線標識したリポソームの開発に生かされている［Ｂｏｅｒｍａｎ  ｅ  Ｃｏｌ．１９９７．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ−９９ｍ−ｌａｂｅｌｅｄ  ＰＥＧ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｔｏｉｍａｇｅ  ｆｏｃａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ．Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ３８，４８９−４９３］。
【００２４】
この領域における研究は、ＰＥＧ脂質を含むリポソームの血漿半減期が様々な因子に依存していることを確立した。ＰＥＧ化リポソームの理想的な特性は、ｉ）１５０〜２００の範囲のビヒクルの平均径；ｉｉ）約２０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧの使用；ｉｉｉ）他の脂質と比較して、５ｍｏｌ％の比率でのＰＥＧ−脂質の取り込みである［Ｗｏｏｄｉｅ  ＭＣ，Ｌａｓｉｃ  ＤＤ．１９９２  Ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．ｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １１１３，１７１−９９］。
【００２５】
ＰＥＧを置換し、長期循環特性をリポソームに与え得る他の化学物質は、ポリビニルピロリジン、ポリエチルオキサゾリン、ポリエチル−オキサゾリン、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸及び誘導化されたセルロース、例えば、ヒドロキシメチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロースである［米国特許第７，６６６，６７４号］。部分的にフッ素化又はパーフルオロアルキル化された疎水性鎖を有する脂質の使用は、リポソームの血漿半減期を長期化し得る別の戦略である［Ｓａｎｔａｅｌｌａ  Ｃ，Ｆｒｅｚａｒｄ  Ｆ，Ｖｉｅｒｌｉｎｇ  Ｐ，Ｒｉｅｓｓ  ＪＧ．１９９３  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｌｏｏｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３３６１４８１−４］。
【００２６】
内臓リーシュマニア症において、肝臓、脾臓及び骨髄が主な感染部位であり、これらの組織が、血液循環からリポソームを排除する基本的な役割を果たしていることを考慮すると、影響を受けた動物への投与後の血漿半減期及びＰＥＧ化リポソームの分布は先天的に予期することができない。これは、病理学的状態が、組織マクロファージによって、リポソームのオプソニン化プロセスとその認識に影響を与える可能性があるためである。この点において、ＰＥＧ化リポソームにカプセル化されたカンプトテシンの有効性は、その遊離形態と比較して、内臓リーシュマニア症のマウスモデルにおいて、肝臓における寄生虫負荷に関して有意な改善を示した［Ｐｒｏｕｌｘ，Ｍ．−Ｅ．，Ｄｅｓｏｒｍｅａｕｘ，Ａ．，Ｍａｒｑｕｉｓ，Ｊ．−Ｆ．，Ｏｌｉｖｉｅｒ，Ｍ．，Ｂｅｒｇｅｒｏｎ  Ｍ．Ｇ．２００１  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ２５  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４５，２６２３−７］。これは、ＰＥＧ化リポソームが肝臓に蓄積されず、内臓リーシュマニア症の治療にほんの僅かな見込みがあることを示唆している。
【発明の概要】
【００２７】
本発明は、殺リーシュマニア薬物送達システムとして、従来型リポソームと長期循環型リポソームを会合させることを含むことによって特徴付けられる、内臓リーシュマニア症を治療するための医薬組成物に関する。この組成物は、様々な形態のリーシュマニア症を治療するための薬剤の製造に使用することができ、筋内、皮下、腹腔内又は静脈内経路によって投与されてもよい。従来型リポソームが肝臓への薬物を経路指定する点で作用する一方、このシステムの使用は、ＰＥＧ化リポソームを、骨髄及び脾臓へのリーシュマニア剤のより効果的な経路指定を促進させることができる。
【００２８】
本発明によれば、内臓リーシュマニア症によって天然に影響を受けたイヌへの投与後、カプセル化されたアンチモン酸メグルミンを含むＰＥＧ化リポソームは、中程度サイズ（４１０ｎｍの平均サイズ）と減少サイズ（１７５ｎｍの平均サイズ）の従来型リポソームよりも長い血中の半減期を促進する（表２）。これは、感染したイヌにおけるＰＥＧ化リポソームの長期循環の特性と肝臓以外の組織に薬物を分布するその潜在性を確立する。各製剤の静脈内投与から２４時間後の肝臓、脾臓及び骨髄におけるアンチモンの分布を評価後、ＰＥＧ化リポソームは、骨髄へのより効果的な経路指定を促進し、一方、中程度サイズ（４１０ｎｍの平均サイズ）の従来型リポソームは、動物の肝臓におけるアンチモンの高レベルをもたらした（表３）。
【００２９】
この結果のセットは、天然に感染したイヌモデルにおいて有効とされた。この場合、ＰＥＧ化リポソームは、肝臓以外の感染部位で高濃度のアンチモンを達成することができ、中程度サイズの従来型リポソームは肝臓において高濃度のアンチモンを達成することができる。
【００３０】
本発明によれば、アンチモン酸メグルミンをカプセルにした２つのタイプのリポソーム、すなわち、従来型リポソームとＰＥＧ化リポソームの混合物によって特徴付けられる組成物は、別々に投与された各タイプのリポソームの組成物と比較して、リーシュマニア・インファンタム・チャガシで実験的に感染させたマウスの脾臓における寄生虫の排除においてより効果的であった（表４と図２）。一方、全ての組成物は、肝臓において寄生虫負荷を減少させるのと同じ効果を示した。したがって、これらの結果は、初めて、肝臓以外の感染部位における寄生虫負荷の減少において、各タイプのリポソームと比較して、２つのタイプのリポソームの混合物の優位性を証明する。
【００３１】
また、本研究は、初めて、マウスの骨髄における寄生虫負荷の減少において、ＰＥＧ化リポソームの有効性及びそれと従来型リポソームとの混合物の有効性を報告する（図３）。これらの結果は、この組織における寄生虫負荷を減少させることができないことが証明された、アンチモンを含むリポソームとニオソーム（ｎｉｏｓｏｍｅ）を用いた、文献において達成された結果を相違する（Ｃａｒｔｅｒ  ＫＣ，Ｂａｉｌｌｉｅ  ＡＪ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｊ，Ｄｏｌａｎ  ＴＦ．１９８８  Ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓｔｉｂｏｇｌｕｃｏｎａｔｅ  ｉｎ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｉｃｅ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ  ｉｓ  ｏｒｇａｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４０，３７０３７３）。
【００３２】
提案された技術革新は、従来型リポソームからなる［ＵＳ４１８６１８３Ａ；ＥＰ７２２３４Ａ；ＷＯ９６０４８９０−Ａ１；ＵＳ４５９４２４１；ＢＲ０４０５４８９］、又は長期循環型リポソーム［Ｐｒｏｕｌｘ  ｅ  Ｃｏｌ．２００１  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４５，２６２３−７］からなる既存技術と異なる。新しい技術は従来型リポソームに基づくものよりも効果的であり、これは、肝臓以外の他の感染部位の分布を増加させるためである。それはまた、長期循環型リポソームに基づくものよりも効果的であり、これは、肝臓において薬物の高濃度と作用を達成し得るためである。
【００３３】
提案された技術は、イヌとヒトの内臓リーシュマニア症の治療に提供されてもよく、より効果的であり、安全な治療をもたらす。また、この治療に対する患者の大きな執着は、副作用の低い発症率（投与される薬物のより少ない全用量による）、より少ない投薬回数、及び投薬間のより長い間隔の機能として期待されている。それはまた、内臓リーシュマニア症の治療薬についての新たな展望を開き、天然に感染したイヌの寄生虫治癒を達成する可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】リーシュマニア・インファンタムＣ４３菌株で感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓における寄生虫負荷を示す。これは、動物の感染から８週後、及び静脈内経路により単回投薬における異なる製剤を用いた処置後の２週後に限界希釈法によって決定された（ｎ＝８）。*カプセル化されたアンチモン酸メグルミン（ＭＡ／ＡＭ）を含むリポソームを受けた群と対照群（生理食塩水と空のリポソーム）間の比較についてｐ＜０．０５（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験）（ｎ＝８）。
【図２】リーシュマニア・インファンタムＣ４３菌株で感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓における寄生虫負荷を示す。これは、動物の感染から８週後、及び静脈内経路により単回投薬における異なる製剤を用いた処置後の３週後に限界希釈法によって決定された（ｎ＝８）。*カプセル化されたＡＭ／ＭＡを受けた群と対照群（生理食塩水）間の比較についてｐ＜０．０５（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験）（ｎ＝８）。#群ＭＩＸ２００＋４．７と群Ｌｃｏｎｖ  ２００及びＬｐｅｇ  ４．７の比較についてｐ＜０．０５（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験）（ｎ＝８）。
【図３】リーシュマニア・インファンタムＣ４３菌株で感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄における寄生虫負荷を示す。これは、動物の感染から８週後、及び静脈内経路により単回投薬における異なる製剤を用いた処置後の２週後に限界希釈法によって決定された（ｎ＝８）。*群Ｌｐｅｇ４．７及びＭＩＸ２００＋４．７と対照群（生理食塩水と空のリポソーム）の比較についてｐ＜０．０５（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験）（ｎ＝８）。*ＭＩＸ２００＋４．７と群Ｌｃｏｎｖ  ２００の比較についてｐ＜０．０５（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験）（ｎ＝８）。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、殺リーシュマニア薬物送達システムを有する、従来型リポソームと長期循環型リポソームを会合させることを含むことによって特徴付けられる、内臓リーシュマニア症を治療するための医薬組成物に関する。この組成物は、リーシュマニアの形態（複数）を治療するための薬剤の製造に使用することができ、筋内、皮下、腹腔内又は静脈内経路によって投与することができる。この組成物において、従来型リポソームは、天然又は合成のリン脂質及び／又は界面活性剤及び／又はコレステロールを含んでもよく、２０〜１０００ｎｍの範囲の平均流体力学的径を有し得る。
【００３６】
この組成物において、長期循環型リポソームは、血流中でリポソームの循環時間の増加をもたらす１つの脂質又は界面活性剤のリポソームを脂質組成物に含めることによって得ることができる。非限定的な例は、エチレングリコールポリマー（ＰＥＧ）、好ましくはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ（５０００）によって構成される極性頭部を有する脂質又は界面活性剤によって与えられる。
【００３７】
殺リーシュマニア薬（単数又は複数）は、現時点での臨床的使用における下記の薬物からなる群から選択されてもよい。該薬物は、アンチモン複合体、アンホテリシンＢ、ペンタミジン、ミルテフォシン、アロプリノールとパラモミシンを含む。さらに、該殺リーシュマニア薬は、実験的に確立された殺リーシュマニア活性を有する下記の医薬の群から選択されてもよい。該医薬は、シタマキン、イミノキモド、フルコナゾール、セトコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、ツカレソール、アジトロミシン、ブパラウバキノア、タモキシフェン、テルビナフィン、フラゾリドン、フルオロキノロン、ドンペリドン、インターロイキン１０、インターロイキン１２、脂質Ａ、アルキル−リソリン脂質の誘導体及びアルキル−リン脂質の誘導体、アザステロール、リコカルコンＡ、マエサバジドＩＩＩ、トリコテセン、ｎ−アセチル−システイン、３置換キノリンが挙げられる［Ｍｏｎｚｏｔｅ  Ｌ．２００９  Ｔｈｅ  Ｏｐｅｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １，９−１９］。
【００３８】
本明細書に記載の本発明は、以下の非限定的な実施例を用いてより良く理解することができる。
【実施例】
【００３９】
実施例１−カプセル化されたアンチモン酸メグルミンを含む従来型リポソームとＰＥＧ化リポソームの懸濁液の調製及び特徴付け
脂質フィルムは、モル比が５：４：１のジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール（ＣＯＬ）及びジセチルホフフェート（ＤＣＰ）（従来型リポソーム）から形成され、又はモル比が４．５３：１：４：０．４７のＤＳＰＣ／ＣＯＬ／ＤＣＰ／ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ（２０００）（ＰＥＧ化リポソーム）から形成された。フィルムを６０℃の温度で蒸留水で水和し、機械的撹拌に供し、多層膜型リポソームを得た。
【００４０】
次に、得られた多層膜リポソーム懸濁液を６０℃の温度で超音波（プローブ型Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ，５００ワット）に供し、小さな単層リポソームとオリゴ膜リポソームを得た。続いて、得られた懸濁液を直径０．２μｍの細孔を有する滅菌フィルターを用いて濾過した。この懸濁液に凍結保護糖の水溶液を１：１（ｍ／ｍ）（ＰＥＧ化リポソームと較正された従来型リポソーム）又は３：１（ｍ／ｍ）（較正されていない従来型リポソーム）のスクロース／脂質比で添加した。直後に、この混合物を液体窒素に浸漬することによって凍結させ、凍結乾燥（フリーズドライヤー、Ｌａｂｃｏｎｃｏ）に供した。この段階では、凍結乾燥した製剤は、製剤のサイズとカプセル化比の最終的な特徴を損なうことなく、−２０℃にて少なくとも６カ月間保存されてもよい。
【００４１】
次に、投与の１日前、８０ｇ／Ｌのアンチモン濃度で、約０．６の質量比Ｓｂ／脂質を用いて、アンチモン酸メグルミンの水溶液で凍結乾燥物を水和した。水和のこの段階では、懸濁液を６０℃で３０分間インキュベートし、時間０と１０分毎に機械的な撹拌（ボルテックスの使用）に供した。
【００４２】
ＰＥＧ化リポソームの場合及び較正された従来型リポソームの場合において、リポソーム懸濁液は、６５℃にて、細孔が２００ｎｍであるポリカーボネート膜（Ｅｘｔｒｕｄｅｒ，Ｌｉｐｅｘ  ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｃａｎａｄａ）を通過させるろ過を繰り返すことによって押出しプロセスに供された。このステップ後、リポソーム懸濁液を滅菌生理食塩水（ＮａＣｌ  ０．９％（ｍ／ｖ））で希釈し、２０，０００×ｇにて４０分間、４℃にて遠心分離に供した。遠心分離の上清を除去し、リポソーム沈殿物を滅菌生理食塩水中で２回洗浄した（滅菌生理食塩水中に再懸濁させ、２０，０００×ｇにて４０分間、４℃で遠心分離した）。リポソーム沈殿物は、最終的に、所望体積の滅菌生理食塩水に再懸濁させ、典型的には、１０ｇ／Ｌアンチモン濃度にした。
【００４３】
カプセル化されたアンチモン比を決定するために、試料を硝酸で消化し、アンチモンを黒鉛炉原子吸光分析（ＥＴＡＳＳ）により投与した。
【００４４】
リポソームの大きさは、粒径分析器（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，ＵＫ）を用いることによって光子相関分光法により決定された。
【００４５】
達成された結果は、アンチモンのカプセル化率とリポソームの平均径を含む、以下の表１に示される。
【００４６】
表１−アンチモン酸メグルミンのカプセル化とビヒクルサイズに関する従来型リポソームとＰＥＧ化リポソームの特徴
【００４７】
【表１】
2018043998.tif 000002
【００４８】
したがって、本実施例は、カプセル化されたアンチモン酸メグルミンを含む従来型リポソームとＰＥＧ化リポソームの懸濁液を得るための簡単なプロセスを示す。
【００４９】
実施例２−従来型リポソームとＰＥＧ化リポソームにおけるアンチモン酸メグルミンの静脈内投与後の内臓リーシュマニア症であるイヌの肝臓、脾臓及び骨髄におけるアンチモンの血漿半減期と濃度
従来型リポソームと長期循環の血漿半減期と、内臓リーシュマニア症を有する動物の脾臓、肝臓及び骨髄へのカプセル化された薬物の経路指定のそれらの能力を決定し、比較することを目的として、カプセル化されたアンチモン酸メグルミンを含むリポソームの懸濁液を実施例１に記載したように調製し、Ｌ．チャガシによって天然に感染されたイヌに対して、静脈内経路によって単回投薬において投与された。
【００５０】
Ｌ．チャガシに感染したことが証明された不定種のイヌ（体重５〜１５ｋｇ）の３群を本実施例に使用した。第１群（３匹の動物）は、静脈内経路によって、４．２ｍｇのＳｂ／ｋｇ体重の投薬量で較正されていない従来型リポソームの製剤を受けた。第２群（５匹の動物）は、静脈内経路によって、６．５ｍｇのＳｂ／ｋｇ体重の投薬量で較正された従来型リポソームの製剤受けた。第３群（４匹の動物）は、静脈内経路によって、３．７ｍｇのＳｂ／ｋｇ体重の投薬量でＰＥＧ化リポソームの製剤を受けた。
【００５１】
投与から２４時間後、血液試料は、黒鉛炉原子吸光分析（ＧＦＡＡＳ）によってアンチモン投薬について異なる時間間隔で採取された。２４時間の期間で、イヌを屠殺し、肝臓、脾臓及び骨髄の試料を取り出した。肝臓及び脾臓を計量し、均質化した。次に、組織試料は、硝酸で消化され、黒鉛炉における原子吸光分析法によるアンチモンの後の決定のために採取された。血中のアンチモンの半減期の結果を表２に示す。臓器において回収されたアンチモン投薬の割合の結果を表３に示す。
【００５２】
表２−従来型リポソームとＰＥＧ化リポソームの製剤の静脈内経路後の内臓リーシュマニア症によって影響を受けたイヌの血中におけるアンチモンの半減期
【００５３】
【表２】
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【００５４】
表３−従来型リポソームとＰＥＧ化リポソームの製剤の静脈投与から２４時間後の内臓リーシュマニア症によって影響を受けたイヌの肝臓、脾臓及び骨髄において見出されたアンチモンの投与された用量の割合（データは平均±ＤＰとして示される）
【００５５】
【表３】
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【００５６】
これらのデータは、ＰＥＧ化リポソーム（表２）と比較して、従来型リポソームが短い半減期を示す。したがって、達成された結果は、従来型リポソームと比較して、天然で感染したイヌにおけるＰＥＧ化リポソームの長期循環の特性を確認する。さらに、中程度の大きさの従来型リポソームは、動物の肝臓へのアンチモンのより大きな経路指定を促進し、一方、ＰＥＧ化リポソームは、脾臓への高い経路指定を保ちながら、骨髄へのより大きな経路指定を示す（表３）。
【００５７】
これらの結果のセットは、天然に感染したイヌにおいて有効であり、このモデルは、ＰＥＧ化リポソームが、それらの長期循環特徴により、肝臓よりも他の感染部位に高濃度のアンチモンを到達させることができ、中程度サイズの従来型リポソームが、肝臓において非常に高濃度のアンチモンを到達させることができることを示した。
【００５８】
得られたデータは、従来型リポソームとＰＥＧ化リポソームの混合物が、骨髄へのアンチモンの経路指定を増強し、内臓リーシュマニア症によって影響を受けた動物の肝臓及び脾臓へのアンチモンの経路指定を保証することができたことを示唆する。したがって、この組み合わせを使用することによって、内臓リーシュマニア症のより効果的な闘いを期待する。
【００５９】
さらに、これらの医薬製剤の静脈内注入が、高用量のアンチモン投与を伴う場合でさえ、動物において十分に寛容であったことを指摘するべきである。
【００６０】
実施例３−アンチモン酸メグルミンを含む従来型リポソームとＰＥＧ化リポソームの製剤の抗リーシュマニア活性及び内臓リーシュマニア症のマウスモデルにおける２つのタイプのリポソームの会合の抗リーシュマニア活性
ＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスにＬ．イオンファンツム・チャガシ（Ｌ．ｉｏｎｆａｎｔｕｍ  ｃｈａｇａｓｉ）（Ｍ２６８２−ＭＨＭ／ＢＲ／７４／ＰＰ７５菌株）を感染させた。尾静脈を介した寄生虫の接種から１４日後、動物は、静脈内経路によって、１０ｍｇ  Ｓｂ／ｋｇの単回投薬において、従来型リポソームとＰＥＧ化リポソームの異なる組成物及びそれらの混合物を受けた。混合物は、５ｍｇ  Ｓｂ／ｋｇの用量である従来型リポソームと５ｍｇ  Ｓｂ／ｋｇの用量であるＰＥＧ化リポソームからなっていた。処置から１４日後、動物を殺傷し、肝臓及び脾臓を限界希釈法によって寄生虫負荷の評価のために採取した。
【００６１】
表４は、肝臓及び脾臓におけるネガティブ化された（ｎｅｇａｔｉｖａｔｅｄ）動物（検出された寄生虫はない）の比率を示す。
【００６２】
表４−リーシュマニア・インファンタム・チャガシに感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるアンチモン酸メグルミンを含む従来型リポソームとＰＥＧ化リポソームの抗リーシュマニア活性データは、静脈内経路によって、１０ｍｇ  Ｓｂ／ｋｇの単回投薬での処置後の肝臓及び脾臓におけるネガティブ化された動物（検出された寄生虫はない）の比率を示す（ｎ＝８／群）。
【００６３】
【表４】
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【００６４】
*−アンチモンを含まない製剤で処置された群に対する有意差。
**−他のグループに対する有意差（Ｐ＜００５、正確なフィッシャー検定）。
【００６５】
表４の結果は、全ての製剤が、対照群（空又は生理食塩水のリポソームで処理）に対して、マウスの肝臓における寄生虫負荷の減少における同等の効力を示したことを示す。しかしながら、脾臓において、従来型リポソームとＰＥＧ化リポソームを会合している製剤だけが寄生虫負荷を有意に減少させ得ることを証明した。
【００６６】
このデータは、動物の脾臓における寄生虫負荷の減少について、２つのタイプのリポソーム（従来型とＰＥＧ化）の相乗効果を明確かつ驚くべきほど実証している。
【００６７】
しがたって、これらの結果は、第一に、肝臓以外の感染部位における寄生虫負荷を減少させ、孤立した各タイプのリポソームと比較して、２つのタイプのリポソームの混合物の優位性を証明する。
【００６８】
実施例４−内臓リーシュマニア症のマウスモデルにおける肝臓、脾臓及び骨髄での寄生虫負荷の減少におけるＰＥＧ化リポソームと従来型リポソームの製剤及びそれらの混合物の製剤の有効性
リーシュマニア（リーシュマニア）インファンタムＣ４３菌株は、症候性イヌの単離物から得られ、ＲＦＬＰによって特徴付けられ、マウスの骨髄に感染するその高い能力のために使用された。
【００６９】
ＢＡＬＢ／Ｃマウス（群あたり８匹）は、リーシュマニア・インファンタム・チャガシの１×１０7前鞭毛形態を用いて尾静脈に接種された。６カ月後、動物は、静脈経路による単回投与で以下の製剤の１つを受けた；
１）２００ｎｍのＰＥＧ化リポソーム中のアンチモン酸メグルミン（ＭＡ）の製剤（Ｌｐｅｇ４．７、１０ｍｇ  Ｓｂ／ｋｇの投薬量）；
２）２００ｎｍの従来型リポソーム中のＭＡの製剤（Ｌｃｏｎｖ２００、１０ｍｇ  Ｓｂ／ｋｇの投薬量）；
３）Ｌｐｅｇ４．７（５ｍｇ  Ｓｂ／ｋｇ）ちＬｃｏｎｖ２００（５ｍｇ  Ｓｂ／ｋｇ）の混合物によって構成されたＭＡの製剤（ＭＩＸ２００＋４．７）；
４）空の従来型リポソームＬｃｏｎｖ２００の製剤；
５）空のＰＥＧ化リポソームＬｐｅｇ４．７の製剤；
６）ＮａＣｌ  ０．１５  ｐＨ７．４を含有する１０ｍＭのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）。
【００７０】
リポソームにおけるＭＡ製剤は、実施例１に記載されるように調製され、特徴付けられた。Ｓｂと脂質の濃度は、ＰＢＳの添加、又は同じ脂質組成と同一のサイズの空のリポソームの懸濁液の添加を用いて、それぞれ、３．７７ｇ／Ｌ及び４９．８ｇ／Ｌに調整された。表５は、投与された製剤の大きさとカプセル化率の特徴付け、並びになされた調整を示す。
【００７１】
リポソーム混合物の調製について、製剤Ｌｃｏｎｖ２００とＬｐｅｇ４．７の等量は、動物への製剤の投与の直前に混合された。
【００７２】
表５−Ｃ４３株を用いた有効性実験についてのリポソーム中にＭＡ／ＡＭ製剤に関するアンチモンカプセル化率となされた体積調整
【表５】
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【００７３】
処置から２週間後（寄生虫の接種から８週間後）、マウスを頸椎変位によって屠殺し、肝臓、脾臓及び骨髄は、限界希釈技術を通じて寄生虫負荷の測定のために回収された。
【００７４】
表６は、Ｌ．インファンタム・チャガシＣ４３株に感染したＢＡＬＢ／ｃマウスへの単回投与で投与されたリポソーム製剤の特徴を示す。全ての製剤は、２００ｎｍに近い平均流体力学的直径を有する単分散ビシクル（多分散率＜０．３）を持つ集団を示した。
【００７５】
表６−リポソーム中のアンチモン酸メグルミンの様々な製剤の投与されたＳｂと脂質のサイズ及び用量の特徴
【表６】
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【００７６】
マウスの肝臓、脾臓及び骨髄における寄生虫負荷の決定は、骨髄における寄生虫負荷のピークと一致させるために、寄生虫の接種から８週間後及び処置投与から２週間後になされた。
【００７７】
図１、図２及び図３は、それぞれ、肝臓、脾臓及び骨髄における寄生虫負荷を示す。
【００７８】
結果は、ＰＥＧ化リポソーム及びＰＥＧ化と従来型の混合物（ＭＩＸ２００＋４．７）におけるＭＡ製剤が、対照処置（生理食塩水又は空のリポソーム）と比較して、評価された全ての臓器における寄生虫負荷の有意な減少を促進したことを示す（図１、２及び図３）。一方、従来型リポソーム中のＭＡ製剤は、動物の肝臓（図１）と脾臓（図２）における寄生虫負荷の有意な減少を促進したが、骨髄（図３）における寄生虫負荷を促進しなかった。
【００７９】
製剤を寄生虫負荷を減少させる能力に関して比較した場合、ＰＥＧ化リポソームと従来型リポソームの混合物中のＭＡ製剤は、ＰＥＧ化又は従来型リポソームの製剤（図２）に関して脾臓において有意により効果的であり、従来型リポソームの製剤（図３）に関して骨髄において有意により効果的であることが証明された。一方、ここでは、肝臓における寄生虫負荷の減少において、ＭＡ／ＡＭ製剤間の有効性において差異がなかった（図１）。
【００８０】
この研究は、内臓リーシュマニア症のモデルでの脾臓及び骨髄における寄生虫荷の減少において、個々の製剤に関するＰＥＧ化リポソーム及び従来型リポソームの混合物の優位性を確立する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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