(57)【要約】【課題】  動物の自然免疫応答を増強するための組成物を提供すること。【解決手段】  真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜のＤＮＡを原材料として用いて、動物の自然免疫応答を増強するための組成物を提供することにより、上記の課題を解決する。特に１００−３５０ｂｐ以下のサイズのＤＮＡが、動物の自然免疫応答を強く活性化することができる。ＤＮＡのサイズが１００−３５０ｂｐ以下になるように処理する際には、超音波処理法等を利用することができる。原料となる野菜は、容易に入手可能であり、安定的な材料供給源として優れ、安全性上の懸念も小さい。野菜のＤＮＡを原材料として用いて、動物の自然免疫応答を増強するための組成物の製造方法も提供される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡを含有する、動物の自然免疫応答を増強するための組成物であって、該ＤＮＡのサイズが１００〜３５０ｂｐである、組成物。
【請求項２】
ＤＮＡが野菜から得られるＤＮＡである、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
野菜が緑豆モヤシ、ブロッコリー、またはアスパラである、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
ＬＬ３７ペプチドをさらに含有する、請求項１〜３のいずれか記載の組成物。
【請求項５】
動物が、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ウマ、ウシ、ヤギ、およびヒツジから成る群より選択される、請求項１〜４のいずれか記載の組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の組成物を含有する、食品組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか記載の組成物を含有する、動物用飼料。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか記載の組成物を含有する、口腔粘膜免疫賦活剤。
【請求項９】
ＤＮＡを含有する動物の自然免疫応答を増強するための組成物の製造方法であって、ＤＮＡを断片化する工程を含む、方法。
【請求項１０】
ＤＮＡが野菜から得られるＤＮＡである、請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
ＤＮＡを断片化するために超音波処理する工程を含む、請求項９または１０記載の製造方法。
【請求項１２】
ＤＮＡのサイズが１００〜３５０ｂｐとなるようにＤＮＡを断片化する工程を含む、請求項９〜１１のいずれか記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物の自然免疫応答を増強するための組成物およびその製造方法に関する。より具体的には真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜から得られるＤＮＡを含有する、動物の自然免疫応答を増強するための組成物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然免疫応答は、異物を排除するために生体に備わっている防御反応である。病原体（ウイルス、細菌）の感染のみならず、発がんや生活習慣病の発症や進展にも自然免疫応答が関与することが近年注目されている。自然免疫応答を引き起こすのはマクロファージに代表される免疫細胞であり、常日頃から組織に常駐している。
【０００３】
自然免疫応答には、パターン認識受容体（ＰＲＲ）と呼ばれる分子が関わっており、これらが微生物の侵入等を察知していることが知られている。ＰＲＲは、特定の細胞小器官で機能するＴＬＲ（Toll like receptors）と細胞質内で機能するＲＩＧ−Ｉ（Retinoic acid inducibel gene-I）などの受容体にわけることができる（非特許文献１〜３）。ＰＲＲのうち、核酸の認識に関わる分子としてはＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＲＩＧ−Ｉなどが知られている。ウイルス由来のＤＮＡは宿主のＤＮＡに比べてＣＧ配列のシトシンがメチル化されている割合が有意に少ない。このような非メチル化ＣｐＧ−ＤＮＡはエンドソームに存在するＴＬＲ９によって認識される。一方、ＴＬＲ３とＴＬＲ７はＲＮＡを認識するセンサー分子である。二本鎖ＲＮＡを感知するＴＬＲ３は、ウエストナイルウイルスなどによる感染によって活性化され、サイトカインの産生を誘導する。ＴＬＲ７はウイルス由来の一本鎖ＲＮＡを認識するセンサー分子であり、ＨＩＶなどのウイルスを感知することが報告されている。また、ＲＩＧ−Ｉなどの細胞質内の受容体は、インフルエンザウイルスなどのＲＮＡを認識する。これらの核酸認識受容体は、Ｉ型インターフェロンの遺伝子やサイトカインの発現を誘導し、細菌感染やウイルス感染防御のために働いている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】S. Akira, K. Takeda, Toll-like receptor signalling, Nat Rev Immunol, 4 (2004) 499-511.
【非特許文献２】M. Yoneyama, M. Kikuchi, T. Natsukawa, N. Shinobu, T. Imaizumi, M. Miyagishi, K. Taira, S. Akira, T. Fujita, The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses, Nat Immunol, 5 (2004) 730-737.
【非特許文献３】J. Rehwinkel, C. Reis e Sousa, Targeting the viral Achilles' heel: recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence, Curr Opin Microbiol, 16 (2013) 485-492.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜のＤＮＡを原材料として用いて、動物の自然免疫応答を増強するための組成物を提供することを目的の一つとする。また、本発明は真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜のＤＮＡを原材料として用いて、動物の自然免疫応答を増強するための組成物の製造方法を提供することを別の目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者らは真核生物から得られるＤＮＡ、特に緑豆モヤシ、ブロッコリー、およびアスパラなどの野菜から得られるＤＮＡを用いて、動物の自然免疫応答を増強することが可能なことを見出した。また、特に１００〜３５０ｂｐのサイズのＤＮＡが、動物の自然免疫応答を強く活性化することを見出した。ＤＮＡのサイズが１００〜３５０ｂｐになるように処理する際には例えば、超音波処理法を利用することができる。本発明は、これらの知見を基礎とするものであり、具体的には以下の事項に関する。
【０００７】
［１］ＤＮＡを含有する、動物の自然免疫応答を増強するための組成物であって、該ＤＮＡのサイズが１００〜３５０ｂｐである、組成物。
［２］ＤＮＡが野菜から得られるＤＮＡである、上記［１］記載の組成物。
［３］野菜が緑豆モヤシ、ブロッコリー、またはアスパラである、上記［１］または［２］記載の組成物。
［４］ＬＬ３７ペプチドをさらに含有する、上記［１］〜［３］のいずれか記載の組成物。
［５］動物が、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ウマ、ウシ、ヤギ、およびヒツジから成る群より選択される、上記［１］〜［４］のいずれか記載の組成物。
［６］上記［１］〜［５］のいずれか記載の組成物を含有する、食品組成物。
［７］上記［１］〜［５］のいずれか記載の組成物を含有する、動物用飼料。
［８］上記［１］〜［５］のいずれか記載の組成物を含有する、口腔粘膜免疫賦活剤。
［９］ＤＮＡを含有する動物の自然免疫応答を増強するための組成物の製造方法であって、ＤＮＡを断片化する工程を含む、方法。
［１０］ＤＮＡが野菜から得られるＤＮＡである、上記［９］記載の製造方法。
［１１］ＤＮＡを断片化するために超音波処理する工程を含む、上記［９］または［１０］記載の製造方法。
［１２］ＤＮＡのサイズが１００〜３５０ｂｐとなるようにＤＮＡを断片化する工程を含む、上記［９］〜［１１］のいずれか記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜のＤＮＡを原材料として用いて、動物の自然免疫応答を増強するための組成物を提供することができる。自然免疫応答の活性化は、様々な疾病の予防や治療に役立つ。原料となる野菜は、容易に入手可能であり、自然免疫応答を活性化するための組成物の安定的な材料供給源として優れ、製造コストを抑制できる。また、野菜を原料とする製品は、安全性上の懸念も少なく、消費者にも受け入れられやすいと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】各種ＤＮＡによるＩＦＮＢ  ｍＲＮＡの誘導活性の比較を示すグラフである。縦軸は、相対的な活性の強さを示す（ブロッコリーＤＮＡによるＩＦＮＢ  ｍＲＮＡの誘導活性を１とした時の値）。横軸は、各種野菜または穀物由来のＤＮＡを示す。
【図２】ＬＬ３７とブロッコリーＤＮＡによるＩＦＮＢ  ｍＲＮＡの誘導を示すグラフである。縦軸は、相対的な活性の強さを示す（ブロッコリーＤＮＡによるＩＦＮＢ／ＩＦＮＡ４／ＩＬ６  ｍＲＮＡの誘導活性を１とした時の値）。横軸は、ＬＬ３７およびＤＮＡの量を示す。
【図３】超音波処理によるブロッコリーＤＮＡの断片化を示した電気泳動写真である。レーン左に１Ｋｂ  ＤＮＡラダー、レーン右に１００ｂｐ  ＤＮＡラダーを示す。超音波処理の結果として、各種サイズのＤＮＡ産物を確認することができる。
【図４】超音波処理したブロッコリーＤＮＡによるＩＦＮＢ  ｍＲＮＡおよびＩＬ６  ｍＲＮＡの誘導を示すグラフである。縦軸は、相対的な活性の強さを示す（超音波処理０回のＤＮＡによるＩＦＮＢ  ｍＲＮＡまたはＩＬ６ｍＲＮＡの誘導活性を１とした時の値）。横軸は、超音波処理を行った回数の違いを示す。
【図５】ＤＮａｓｅＩ処理によりＩＦＮＢ  ｍＲＮＡ誘導活性が消失することを示した電気泳動写真とグラフである。左の写真は、ＤＮａｓｅＩ処理によりＤＮＡが分解されたことを示す。右のグラフの縦軸は、相対的な活性の強さを示す（ＤＮａｓｅＩ未処理のＤＮＡによるＩＦＮＢ  ｍＲＮＡの誘導活性を１とした時の値）。横軸は、ＤＮａｓｅＩ処理の有無を示す。
【図６】インフルエンザウイルスに対する抑制効果を示したグラフである。縦軸は、相対的なインフルエンザウイルスＲＮＡ量を示す。横軸は、細胞に対して処理を行ったブロッコリーＤＮＡ濃度を示す。
【図７】シグナル経路の分析結果を示したグラフである。上図の縦軸は、相対的な各種シグナル分子（RIG-I/STING/Myd88）の遺伝子発現量を示す。横軸は、コントロールｓｉＲＮＡまたはシグナル分子のｓｉＲＮＡ（RIG-I/STING/Myd88）を示す。下図の縦軸は、ＩＦＮＢ  ｍＲＮＡの相対的な遺伝子発現の強さを示す。また横軸は、ブロッコリーＤＮＡ刺激の有無および各種ｓｉＲＮＡを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明者らは、上記のように、１００〜３５０ｂｐのサイズを有する真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜由来のＤＮＡが、動物の自然免疫応答を増強できることを見出した。また特に、緑豆モヤシ、ブロッコリー、およびアスパラから抽出したＤＮＡが、動物の自然免疫応答を強く活性化できることを見出した。よって、本発明の一態様は、真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜から得られるＤＮＡを含有する、動物の自然免疫応答を増強するための組成物であって、ＤＮＡのサイズが１００〜３５０ｂｐである組成物に関する。以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
自然免疫応答
免疫とは、動物体内から外来性および内因性の異物を生理的に認識・排除し，自己体として個性と恒常性を維持するための機構の総称をいう。免疫系は、自然免疫（先天性免疫、基本免疫）と獲得免疫（後天性免疫、適応免疫）とに大別される。獲得免疫は、抗体産生を伴う体液性免疫と、リンパ球自身が対象を攻撃する細胞性免疫に大別される。狭義には、あるいは通常は、免疫といえば獲得免疫をさす。
【００１２】
自然免疫による防御は非特異的であり、病原体に対して包括的な応答を行う。近年、自然免疫の機構が分子レベルで解明されてきた。自然免疫では、病原体共通の構造パターンを認識する分子が細胞表面上にあり、病原体の感染により、いち早くこの物質が病原体を認識して、インターフェロン（ＩＦＮｓ）やサイトカインを細胞から分泌させる。
【００１３】
本発明の一態様は、上記のように真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜から得られるＤＮＡを含有する、動物の自然免疫応答を増強するための組成物であって、該ＤＮＡのサイズが１００〜３５０ｂｐである組成物に関する。自然免疫応答が増強される動物は、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ウマ、ウシ、ヤギ、またはヒツジでありうるが、これらに限定はされない。上記の動物を含む対象に真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜から得られるＤＮＡを含有する組成物を投与することにより、動物の自然免疫応答を増強することができる。
【００１４】
動物の自然免疫応答の増強または活性化は、例えば、自然免疫に関与する細胞であるマクロファージにおけるインターフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βなど）およびサイトカイン（ＴＮＦ−αなど）の発現上昇を指標として評価することができる。
【００１５】
インターフェロンおよびサイトカインの発現上昇を評価する方法は、当業者に公知であり、例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲやＥＬＩＳＡ法を用いてｍＲＮＡ量、タンパク質量を測定する方法が挙げられるが、これに限定はされない。
【００１６】
ＤＮＡ
本発明者らは真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜由来のＤＮＡがマクロファージにおけるＩＦＮｓまたはサイトカインの遺伝子発現を誘導できることを見出した。よって真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜から得られるＤＮＡを投与することにより、動物における自然免疫応答を活性化し、増強できることが理解される。野菜は、市場で容易に入手可能であり、自然免疫応答を活性化するための組成物の優れた材料供給源となりうる。なお、野菜とは、生食または調理して、主に副食用とする草本作物を指し、食べる部位により、葉菜あるいは葉茎菜・果菜・根菜・花菜に大別される。なお、本願においては、芋類・豆類も野菜に含まれると解釈する。
【００１７】
野菜からＤＮＡを抽出する方法は、当業者に公知であり、例えば、NucleoSpin Plant II Maxi（マッハライ・ナーゲル）を用いる方法、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いる方法などが挙げられるが、これらに限定はされない。野菜からＤＮＡを抽出する際には、一般的な可食部を用いるのが好ましいが、通常は食用としない部位を含めてもよい。なお、本発明に係る組成物の製造の際、必ずしもＤＮＡを高度に精製する必要ははなく、野菜由来の他の栄養素などを含む粗精製が好ましい場合もある。
【００１８】
野菜としては、例えば、ブロッコリー、ニンジン、ピーマン、アスパラ、および緑豆モヤシなどが挙げられるが、これらに限定はされない。利用する野菜は、自然免疫応答の増強活性、価格、入手可能な時期、量など、様々な観点に基づき選択することができる。自然免疫応答の増強活性の観点からは、緑豆モヤシ、ブロッコリー、および／またはアスパラを用いることが好ましい。また、価格や入手可能な時期の観点からは、緑豆モヤシを用いることが選択されうる。
【００１９】
ＤＮＡの供給源は、必ずしも野菜に限定する必要はなく、他の真核生物に由来するＤＮＡを使用してもよい。ＤＮＡの供給源には、例えば、食用に適する動物（哺乳類、鳥類、魚介類など）、植物（草本類、穀類、果物類など）、海藻類、真菌類などの可食の真核生物、より具体的には、玄米などの穀物、米糠などの穀物の種皮、サケなどの魚類の白子や、酵母などが含まれる。ＤＮＡの単離には、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いたＤＮＡの抽出など、当業者に公知の任意の方法を使用できる。また、真核生物のゲノムＤＮＡ配列に基づき化学的に合成し、必要に応じてメチル化やアセチル化などの修飾を加えたＤＮＡも利用されうる。
【００２０】
ＤＮＡのサイズ
本発明者らは真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜から得られるＤＮＡが一定のサイズ以下となるように処理した場合、特に動物の自然免疫応答を増強できることを見出した。ＤＮＡを小さく断片化する方法は、当業者に公知であり、例えば、超音波処理を用いる方法や、酵素処理を用いる方法が挙げられるが、これらに限定はされない。また、ＤＮＡの大きさを評価する方法は、当業者に公知であり、例えば、電気泳動を用いる方法が挙げられるが、これに限定はされない。
【００２１】
本発明に係る真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜から得られるＤＮＡを含有する、動物の自然免疫応答を増強するための組成物は、ＤＮＡのサイズが例えば、３５０ｂｐ以下、３００ｂｐ以下、２５０ｂｐ以下、２００ｂｐ以下、または１５０ｂｐ以下であることができる。また、本発明に係る真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜から得られるＤＮＡを含有する、動物の自然免疫応答を増強するための組成物は、ＤＮＡのサイズが例えば、１００ｂｐ以上、１５０ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、２５０ｂｐ以上、または３００ｂｐ以上であることができる。よって、本発明に係る真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜から得られるＤＮＡを含有する、動物の自然免疫応答を増強するための組成物は、ＤＮＡのサイズが１００〜３５０ｂｐの範囲のサイズでありうる。
【００２２】
本発明の一態様では、真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜から得られるＤＮＡを含有する、動物の自然免疫応答を増強するための組成物は、ＤＮＡのサイズが１００〜３５０ｂｐである。しかし、小スケールで合成した場合と異なり、大量スケールで製造した場合、１００〜３５０ｂｐのＤＮＡの割合が減る場合も十分想定される。その場合、１００〜３５０ｂｐのＤＮＡの割合が１０％以下になることもありえる。
【００２３】
ＬＬ３７ペプチド
ＬＬ３７ペプチドは、カテリシジンファミリーに属する３７アミノ酸残基から成るペプチドである（ヒトの配列：ＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳ；配列番号１）。ＬＬ３７ペプチドは抗菌活性を有し、また感染などの刺激を受けて上皮細胞などから産生、放出されて生体防御にかかわる。また、ＬＬ３７は、細胞外のＤＮＡを細胞内に導入し、自然免疫応答を活性化することが報告されている（Biochim Biophys Acta. 1798(12):2201-8 2010., Blood 1;120(18):3699-707 2012.） 。本発明者らは、ＬＬ３７ペプチドを用いてＤＮＡをマクロファージ細胞内に導入すると、濃度に依存してＩＦＮＢ  ｍＲＮＡの発現が強く誘導されることを見出した。よって、本発明の一態様において、真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜から得られるＤＮＡを含有する、動物の自然免疫応答を増強するための組成物は、ＬＬ３７ペプチドをさらに含むことができる。使用するＬＬ３７ペプチドの量は、所望の効果や費用の観点から適宜選択することができる。なお、ＬＬ３７ペプチドは、天然の配列に対して１または数個（例えば２個、３個、４個、５個、６個、または７個）のアミノ酸の置換、挿入または欠失を含む変異体も使用されうる。
【００２４】
食品組成物
本発明の一態様は、真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜から得られるＤＮＡを含有する、動物の自然免疫応答を増強するための組成物であって、該ＤＮＡのサイズが１００〜３５０ｂｐである組成物を含有する、食品組成物に関する。このような食品組成物は、例えば、キャンディー、ガム、タブレット、ゼリーなどの口腔内に長時間保持される菓子やとろみや流動性を付与した介護食品でありうるが、それらに限定はされない。
【００２５】
動物用飼料
本発明の一態様は、真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜から得られるＤＮＡを含有する、動物の自然免疫応答を増強するための組成物であって、該ＤＮＡのサイズが１００〜３５０ｂｐである組成物を含有する、動物用飼料に関する。このような動物用飼料は、例えば、イヌ、ネコなどのためのペットフード、口腔クリーナーや歯磨き粉およびジェル等の口腔ケア製品でありうるが、それらに限定はされない。なお、本願においては、イヌ用のガムや歯固め用の食品や玩具のような製品も動物用飼料に含まれると解する。
【００２６】
口腔粘膜免疫賦活剤
本発明の一態様は、真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜から得られるＤＮＡを含有する、動物の自然免疫応答を増強するための組成物であって、該ＤＮＡのサイズが１００〜３５０ｂｐである組成物を含有する、口腔粘膜免疫賦活剤に関する。このような口腔粘膜免疫賦活剤は、例えば、咀嚼錠、口腔内崩壊錠、洗口液、口腔粘膜貼付剤、義歯安定剤などの形態をとりうるが、それらに限定はされない。本発明に係る口腔粘膜免疫賦活剤は医薬品として、またはサプリメントとしてみなされうる。口腔粘膜免疫の賦活化の有無は、例えば、公知の手法により、口腔内の自然免疫に関わる細胞（マクロファージなど）の活性化を調べることで評価することができる。
【００２７】
製造方法
本発明の一態様は、真核生物から得られるＤＮＡ、特に野菜から得られるＤＮＡを含有する動物の自然免疫応答を増強するための組成物の製造方法であって、ＤＮＡを断片化する工程を含む方法に関する。ＤＮＡの断片化は例えば、超音波処理や酵素処理を用いて行うことができるが、これらに限定はされない。ＤＮＡの断片化は、動物の自然免疫応答を増強するための組成物に含まれるＤＮＡの大部分、例えば１０％以上が１００〜３５０ｂｐの範囲のサイズとなるように行うことができる。
【００２８】
本発明に係る組成物の製造方法は、より具体的には、例えば、１）ＤＮＡの供給源（野菜、玄米などの穀物、米糠などの穀物の種皮、サケなどの魚類の白子、酵母など）を用意する工程、２）ＤＮＡの抽出のためにＤＮＡの供給源（野菜、玄米などの穀物、米糠などの穀物の種皮、サケなどの魚類の白子、酵母など）を前処理（洗浄、加熱、乾燥、粉砕など）する工程、３）ＤＮＡを抽出する工程、４）ＤＮＡを断片化（超音波処理、酵素処理など）する工程、および５）ＤＮＡと組成物の他の成分とを混合する工程を含むことができる。
【００２９】
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。
【実施例】
【００３０】
実施例１：野菜由来ＤＮＡの調製
市販の野菜を店頭より購入し、ＤＮＡの抽出を行った。野菜からのＤＮＡ抽出は、NucleoSpin Plant II Maxi（マッハライ・ナーゲル）を用いて行った。今回検討を行った５種類の野菜の内訳は、ブロッコリー、ニンジン、ピーマン、アスパラ、および緑豆モヤシである。各種野菜を乳鉢を用いてホモジナイズした。キットに付属のBuffer PL1、RNase Aを加え、６５℃で２０分間インキュベーションを行った。その後、全量をNucleo spin filterに移し遠心し、濾液にBuffer PCを加えて速やかに混ぜた後、NucleoSpin Plant II Maxi Columnへとサンプルを移した。遠心によりＤＮＡをカラムへと吸着させた後、洗浄用バッファーを加えて遠心し、カラムを洗浄した後に溶出バッファーを加えてＤＮＡを回収した。抽出したＤＮＡは、滅菌水を用いて溶解した。
【００３１】
実施例２：野菜由来ＤＮＡによるＩＦＮｓおよびサイトカインの誘導
実施例１で調製したＤＮＡによるマクロファージにおけるＩＦＮｓまたはサイトカインの遺伝子発現の誘導をｑＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。実験にはＲａｗ２６４．７細胞または骨髄由来マクロファージを使用した。Ｒａｗ２６４．７細胞は１０％ＦＢＳ、ペニシリン・ストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ社）を含有するＤＭＥＭ培地（ナカライ社）で３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。骨髄由来マクロファージは、以下の手法により調製した。まず、Ｃ５７ＢＬ／６マウス骨髄細胞を大腿骨から常法に従って回収し、赤血球除去処理（eBioscience）を行った。次に、得られた骨髄細胞を１０％ＦＢＳ、ペニシリン・ストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ社）を含有するＲＰＭＩ培地（ナカライ社）に５×１０５個／ｍＬになるように懸濁した。得られた細胞懸濁液に、マクロファージ誘導サイトカインとしてＭ−ＣＳＦ（R&D systems社）を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌで添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。３日後に新しい培地に交換し、さらに３日間培養した。６日後に、マクロファージ細胞をＰＢＳ／ＥＤＴＡで剥がし、１２穴プレートに播種し、植物由来のＤＮＡで細胞を処理した。
【００３２】
細胞内へのＤＮＡの導入には、Lipofectamine 2000（Invitrogen社）またはＬＬ３７ペプチド（INNOVAGEN）を用いた。Lipofectamine 2000とＤＮＡを混合し、最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように調整して細胞へ導入した。また、ＬＬ３７は、最終濃度がＬＬ３７（５０μｇ／ｍｌ）、ＤＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）となるように添加した。ＬＬ３７を用いたＤＮＡの導入には、ＬＬ３７とＤＮＡを２０μｌのＰＢＳ中（室温）で３０分間混合した後、培地へと添加した。遺伝子発現については、ｑＰＣＲ（ＡＢＩ）を用いて解析を行った。
【００３３】
結果として、植物由来のＤＮＡを細胞内へ導入すると、ＩＦＮＢ  ｍＲＮＡの発現が強く誘導された。また、その活性は、モヤシ＞アスパラ＞ブロッコリー＞ニンジン＞ピーマンの順番であった（図１）。さらに、ＬＬ３７ペプチドを用いてブロッコリーＤＮＡを細胞内に導入すると、濃度に依存してＩＦＮＢ  ｍＲＮＡの発現が強く誘導された（図２）。
【００３４】
実施例３：超音波処理した野菜由来ＤＮＡによるＩＦＮｓおよびサイトカインの誘導
実施例１で調製したブロッコリーＤＮＡを超音波装置で破砕した後、ＩＦＮｓまたはサイトカインの遺伝子発現の誘導をｑＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。細胞の調製は、実施例２と同様にして行った。実施例１で抽出したＤＮＡを用いて、超音波破砕装置（ＴＯＭＹ  ＵＤ−１００）でＤＮＡの物理的な破砕をおこなった。ＤＮＡを１．５ｍＬチューブに１０μｇ／２００μＬとなるように調整し、氷上にて１０秒間超音波処理−１０秒間静置の操作を各回数繰り返した。また、破砕したＤＮＡは、アガロースゲルでサイズを確認した後（図３）、細胞内へLipofectamine2000を用いて導入した。
【００３５】
結果として、超音波破砕装置で断片化した植物由来のＤＮＡを細胞内へ導入すると、破砕されたＤＮＡの長さに依存してＩＦＮＢ  ｍＲＮＡの発現が強く誘導された（図４）。その活性は、ＤＮＡの長さを１００−３５０ｂｐまで小さくした場合において、未処理のＤＮＡと比較して約４倍強くＩＦＮＢ  ｍＲＮＡ発現が誘導された。その他のＩＦＮｓ、炎症性サイトカインの発現に関してもＩＦＮＡ４約3.7倍、ＴＮＦ約1.4倍、ＩＬ−６約5.9倍とＤＮＡの長さに依存して強く誘導された。
【００３６】
実施例４：ＤＮＡによる誘導であることの確認
実施例１で調製したブロッコリーＤＮＡをＤＮａｓｅＩで処理した後、ＩＦＮｓまたはサイトカインの遺伝子発現の誘導をｑＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。細胞の調製は、実施例２と同様にして行った。実施例１で抽出したＤＮＡをＤＮａｓｅＩ（invitrogen）で分解処理し、ＤＮＡの分解をアガロースゲルで確認した後（図５）、細胞内へLipofectamine 2000を用いて導入した。
【００３７】
結果として、植物由来のＤＮＡをＤＮａｓｅＩで分解処理した後、細胞内へと導入した場合、ＩＦＮＢ  ｍＲＮＡの誘導活性が消失したことから、ＩＦＮＢ  ｍＲＮＡおよび炎症性サイトカインの誘導活性に必要な物質はＤＮＡであることが確認された（図１０）。
【００３８】
実施例５：インフルエンザウイルスに対する抑制効果
実施例１と同様に、lipofectamine2000を用いて細胞内へ各種濃度のブロッコリーＤＮＡを導入した。６時間後、インフルエンザウイルス（ＰＲ８株、０．１ＨＡ）をトリプシンを含む感染用ＭＥＭ培地に懸濁し１時間感染させた後、トリプシンを含むＭＥＭ培地に交換し１８時間培養を行った。その後、ＩＳＯＧＥＮを用いてＲＮＡを精製し、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いてインフルエンザウイルス量を定量的に解析した。ウイルス量の指標としては、Flu NP 由来のRNAを測定した。解析には、以下のプライマー使用した（PR8-NP (F) 5'-GATTGGTGGAATTGGACGAT；配列番号２，PR8-NP (R) 5'-AGAGCACCATTCTCTCTATT；配列番号３）。その結果、細胞内へ導入したＤＮＡの濃度に依存してFlu NPの量が減少したことから、ＤＮＡの細胞内への導入によりウイルス量の減少が誘導されることがわかった（図６）。
【００３９】
実施例６：ＩＦＮｓおよびサイトカイン誘導のシグナル経路の解析
合成ｓｉＲＮＡを用いて自然免疫応答に重要なシグナル分子をノックダウンした後、実施例１で調製したブロッコリーＤＮＡを細胞内へと導入し、ＩＦＮｓまたはサイトカインの遺伝子発現の誘導をｑＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。細胞の調製は、実施例２と同様にして行った。自然免疫応答に重要なシグナル分子であるＲＩＧ−Ｉ／ＳＴＩＮＧ／Ｍｙｄ８８の合成ｓｉＲＮＡ（シグマ）を購入し、Lipofectamine RNAiMax（Invitrogen）を用いて細胞内へと導入し、４８時間培養を行った。その後、実施例１で抽出したＤＮＡを細胞内へ導入した。
【００４０】
結果として、Ｒａｗ細胞において、ＲＩＧ−Ｉ／ＳＴＩＮＧ／ＭｙＤ８８の遺伝子発現が抑制されている状態において、実施例１で抽出したブロッコリーＤＮＡを細胞内へと導入すると、ＲＩＧ−Ｉ／ＳＴＩＮＧのノックダウン経路において、インターフェロンの誘導が抑制されることがわかった。一方、ＭｙＤ８８をノックダウンした細胞においては、インターフェロンの抑制が認められなかったことから、細胞内における核酸認識経路において、野菜ＤＮＡが認識されることが明らかとなった（図７）。
【００４１】
本明細書には、本発明の好ましい実施態様を示してあるが、そのような実施態様が単に例示の目的で提供されていることは、当業者には明らかであり、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、様々な変形、変更、置換を加えることが可能であろう。本明細書に記載されている発明の様々な代替的実施形態が、本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。また、本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む、全ての刊行物に記載の内容は、その引用によって、本明細書中に明記された内容と同様に取り込まれていると解釈すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
核酸、特に野菜に含まれる核酸を利用することにより、抗ウイルス効果（感染予防効果）及び、自然免疫応答に関連した病態の改善・予防が可能である。本発明は、野菜に含まれる核酸による健康の維持・疾患の予防、食品や介護補助製品の加工・製造において有用となりうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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