(57)【要約】【課題】新たな癌の予後マーカーを提供する。【解決手段】Ｋｉｎｅｓｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ  ２０Ａ（ＫＩＦ２０Ａ）タンパク質又はＫＩＦ２０Ａ遺伝子からなる、癌の予後マーカー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｋｉｎｅｓｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ  ２０Ａ（ＫＩＦ２０Ａ）タンパク質又はＫＩＦ２０Ａ遺伝子からなる、癌の予後マーカー。
【請求項２】
ＫＩＦ２０Ａタンパク質に対する特異的結合物質、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子を増幅可能なプライマーセット又はＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを備える、癌の予後予測用キット。
【請求項３】
生体試料中のＫＩＦ２０Ａタンパク質又は遺伝子の発現量を測定する工程と、
測定されたＫＩＦ２０Ａタンパク質又は遺伝子の発現量が、対照と比較して多い場合に、前記生体試料は、予後が不良な患者由来のものであると判定する工程と、
を備える、生体試料を試験する方法。
【請求項４】
ＫＩＦ２０Ａ阻害剤を有効成分として含有する抗癌剤。
【請求項５】
請求項４に記載の抗癌剤と、薬学的に許容される担体とを含有する、癌治療用医薬組成物。
【請求項６】
被験物質の存在下で、細胞中のＫＩＦ２０Ａタンパク質又は遺伝子の発現量を測定する工程と、
ＫＩＦ２０Ａタンパク質又は遺伝子の発現量が前記被験物質の非存在下における発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質は抗癌剤であると判断する工程と、を備える、
抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
被験物質の存在下で、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の活性を測定する工程と、
ＫＩＦ２０Ａタンパク質の活性が前記被験物質の非存在下における活性と比較して低下していた場合に、前記被験物質は抗癌剤であると判断する工程と、を備える、
抗癌剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の予後マーカー及びその使用に関する。より具体的には、癌の予後マーカー、癌の予後予測用キット、生体試料を試験する方法、抗癌剤、癌治療用医薬組成物及び抗癌剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は現代社会における重大な疾患であり、画期的な診断・治療法の開発による癌の制圧は、保健、医療、福祉の向上、経済産業活力の維持向上のためにも急務である。近年、悪性度が極めて高い、口腔癌、悪性胸膜中皮腫等の難治癌が増加傾向にある（例えば、非特許文献１を参照。）。これらの癌は、社会を支える壮年期から好発し、早期発見が困難であり、根治的手術による治療後も高率に再発し予後が不良な場合がある。
【０００３】
そこで、癌の手術後の集学的治療（化学療法・放射線療法）の適切な選択指標となる、定量的な癌の予後診断法の開発が切望されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Petersen P. E., Oral cancer prevention and control--the approach of the World Health Organization., Oral Oncol. 45 (4-5), 454-460, 2009.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような背景のもと、本発明は、新たな癌の予後マーカーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の態様を含む。
［１］Ｋｉｎｅｓｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ  ２０Ａ（ＫＩＦ２０Ａ）タンパク質又はＫＩＦ２０Ａ遺伝子からなる、癌の予後マーカー。
［２］ＫＩＦ２０Ａタンパク質に対する特異的結合物質、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子を増幅可能なプライマーセット又はＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを備える、癌の予後予測用キット。
［３］生体試料中のＫＩＦ２０Ａタンパク質又は遺伝子の発現量を測定する工程と、測定されたＫＩＦ２０Ａタンパク質又は遺伝子の発現量が、対照と比較して多い場合に、前記生体試料は、予後が不良な患者由来のものであると判定する工程と、を備える、生体試料を試験する方法。
［４］ＫＩＦ２０Ａ阻害剤を有効成分として含有する抗癌剤。
［５］［４］に記載の抗癌剤と、薬学的に許容される担体とを含有する、癌治療用医薬組成物。
［６］被験物質の存在下で、細胞中のＫＩＦ２０Ａタンパク質又は遺伝子の発現量を測定する工程と、ＫＩＦ２０Ａタンパク質又は遺伝子の発現量が前記被験物質の非存在下における発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質は抗癌剤であると判断する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法。
［７］被験物質の存在下で、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の活性を測定する工程と、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の活性が前記被験物質の非存在下における活性と比較して低下していた場合に、前記被験物質は抗癌剤であると判断する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、新たな癌の予後マーカーを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】（ａ）は、実験例Ｉ−１で測定した、口腔癌患者由来の癌組織におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例Ｉ−１で測定した、口腔癌細胞株におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。
【図２】実験例Ｉ−２におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図３】実験例Ｉ−３における免疫細胞染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図４】（ａ）〜（ｄ）は、実験例Ｉ−４における免疫染色の結果を示す代表的な写真である。
【図５】実験例Ｉ−４における口腔癌患者の予後（生存率の推移）を示すグラフである。
【図６】（ａ）及び（ｂ）は、実験例Ｉ−５におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図７】（ａ）及び（ｂ）は、実験例Ｉ−５におけるＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。
【図８】実験例Ｉ−６におけるコロニー形成アッセイの結果を示す写真である。
【図９】（ａ）及び（ｂ）は、実験例Ｉ−７において、細胞周期を解析した結果を示すグラフである。
【図１０】（ａ）は、実験例ＩＩ−１で測定した、悪性胸膜中皮腫患者由来の癌組織におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例ＩＩ−１で測定した、中皮腫細胞株におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。
【図１１】実験例ＩＩ−２におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１２】（ａ）及び（ｂ）は、実験例ＩＩ−３における免疫細胞染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１３】（ａ）〜（ｅ）は、実験例ＩＩ−４における免疫染色の結果を示す写真である。
【図１４】（ａ）〜（ｄ）は、実験例ＩＩ−５における免疫染色の結果を示す写真である。
【図１５】（ａ）及び（ｂ）は、実験例ＩＩ−６におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１６】（ａ）及び（ｂ）は、実験例ＩＩ−６におけるＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。
【図１７】（ａ）及び（ｂ）は、実験例ＩＩ−６におけるコロニー形成アッセイの結果を示す写真である。
【図１８】実験例ＩＩ−７において、細胞周期を解析した結果を示すグラフである。
【図１９】実験例ＩＩ−８におけるＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。
【図２０】（ａ）は、実験例ＩＩ−８における浸潤アッセイの結果を示す顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例ＩＩ−８において、浸潤した細胞の数を測定した結果を示すグラフである。
【図２１】（ａ）は、実験例ＩＩＩ−１において、乳癌患者由来の癌組織におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例ＩＩＩ−１において、乳癌細胞株におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。
【図２２】実験例ＩＩＩ−２におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図２３】実験例ＩＩＩ−３における免疫細胞染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２４】（ａ）〜（ｄ）は、実験例ＩＩＩ−４における免疫染色の結果を示す代表的な写真である。
【図２５】（ａ）は、実験例ＩＩＩ−４における乳癌患者の予後（生存率の推移）を示すグラフである。（ｂ）は、実験例ＩＩＩ−４におけるホルモンレセプター陽性の乳癌患者の予後（生存率の推移）を示すグラフである。
【図２６】（ａ）及び（ｂ）は、実験例ＩＩＩ−５におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図２７】（ａ）及び（ｂ）は、実験例ＩＩＩ−５におけるＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。
【図２８】（ａ）及び（ｂ）は、実験例ＩＩＩ−６におけるコロニー形成アッセイの結果を示す写真である。
【図２９】（ａ）及び（ｂ）は、実験例ＩＩＩ−７において、細胞周期を解析した結果を示すグラフである。
【図３０】（ａ）は、実験例ＩＶ−１で測定した、肺癌患者由来の癌組織におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例ＩＶ−１で測定した、肺癌細胞株におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。
【図３１】実験例ＩＶ−２におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図３２】実験例ＩＶ−３における免疫細胞染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図３３】（ａ）及び（ｂ）は、実験例ＩＶ−４における免疫染色の結果を示す代表的な写真である。
【図３４】実験例ＩＶ−４における肺癌患者の予後（生存率の推移）を示すグラフである。
【図３５】実験例ＩＶ−５における定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図３６】実験例ＩＶ−５におけるＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。
【図３７】実験例ＩＶ−５におけるコロニー形成アッセイの結果を示す写真である。
【図３８】（ａ）及び（ｂ）は、実験例ＩＶ−６において、細胞周期を解析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［癌の予後マーカー］
１実施形態において、本発明は、ＫＩＦ２０Ａタンパク質又はＫＩＦ２０Ａ遺伝子からなる、癌の予後マーカーを提供する。
【００１０】
ＫＩＦ２０Ａタンパク質は、キネシンファミリー分子の１つである。ＫＩＦ２０Ａタンパク質は、有糸分裂紡錘体の組み立て及び機能のために不可欠な酵素であり、ＡＴＰの加水分解によって放出されるエネルギーを、微小管に沿った細胞積み荷に方向性のある移動を行わせる機械的力に変換する。
【００１１】
ヒトＫＩＦ２０Ａタンパク質のＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＰ＿００５７２４．１である。また、ヒトＫＩＦ２０ＡのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ  ＩＤはＮＭ＿００５７３３である。また、マウスＫＩＦ２０Ａタンパク質のＲｅｆＳｅｑ  ＩＤは、ＮＰ＿００１１５９８７８．１、ＮＰ＿００１１５９８７９．１、ＮＰ＿０３３０３０．１等である。また、マウスＫＩＦ２０ＡのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ  ＩＤは、ＮＭ＿００１１６６４０６、ＮＭ＿００１１６６４０７、ＮＭ＿００９００４等である。
【００１２】
実施例において後述するように、発明者らは、癌患者由来の癌組織や、癌細胞株には、ＫＩＦ２０Ａタンパク質又はＫＩＦ２０Ａ遺伝子を高発現しているものが多いことを見出した。また、癌組織における、ＫＩＦ２０Ａタンパク質又はＫＩＦ２０Ａ遺伝子の発現量が多い癌患者は、予後が有意に不良であることを見出した。
【００１３】
したがって、本実施形態の癌の予後マーカーは、癌の予後の予測や、癌の治療方針の適切な選択指標として有用である。例えば、ホルモンレセプター陽性の乳癌患者は、ホルモン療法により治療される場合がある。しかしながら、実施例において後述するように、ホルモンレセプター陽性の乳癌患者であっても、ＫＩＦ２０Ａの発現が陽性である場合には、予後が不良な傾向がある。そこで、ＫＩＦ２０Ａの発現が陽性である乳癌患者の場合には、ホルモン療法以外の化学療法等を選択することが好ましい場合もある。
【００１４】
本実施形態の癌の予後マーカーにおいて、患者の診断のためには、ＫＩＦ２０Ａタンパク質又はＫＩＦ２０Ａ遺伝子はヒトのものであることが好ましい。すなわち、本実施形態の癌の予後マーカーは、ヒトＫＩＦ２０Ａタンパク質又はヒトＫＩＦ２０Ａ遺伝子であることが好ましい。
【００１５】
本実施形態の癌の予後マーカーにおいて、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子は、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡであってもよいし、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡであってもよい。
【００１６】
また、本実施形態の癌の予後マーカーが対象とする癌としては、特に限定されないが、例えば固形癌が挙げられ、より具体的には、口腔癌、悪性胸膜中皮腫、乳癌、肺癌等が挙げられる。
【００１７】
［癌の予後予測用キット］
１実施形態において、本発明は、ＫＩＦ２０Ａタンパク質に対する特異的結合物質、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子を増幅可能なプライマーセット又はＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを備える、癌の予後予測用キットを提供する。
【００１８】
実施例において後述するように、本実施形態のキットにより、癌患者の予後を予測することができる。また、癌の治療方針の適切な選択指標を得ることができる。本実施形態の癌の予後予測用キットは、癌の予後予測用診断薬であるということもできる。本実施形態の癌予後予測用キットが対象とする癌としては、特に限定されないが、例えば固形癌が挙げられ、より具体的には、口腔癌、悪性胸膜中皮腫、乳癌、肺癌等が挙げられる。
【００１９】
（特異的結合物質）
ＫＩＦ２０Ａタンパク質に対する特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物にＫＩＦ２０Ａタンパク質又はその断片を抗原として免疫することによって作製することができる。あるいは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。
【００２０】
抗ＫＩＦ２０Ａ抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体であってもよい。
【００２１】
アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標的ペプチドに特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標的ペプチドに特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【００２２】
本実施形態の癌の予後予測用キットは、患者由来の血清、血漿等の体液、組織等を試料に用い、試料中のＫＩＦ２０Ａタンパク質を検出するものであってもよい。特に、血清、血漿等は低侵襲で採取可能な生体試料であるため、患者の負担が少ない。
【００２３】
ＫＩＦ２０Ａタンパク質の検出方法としては、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色等が挙げられる。
【００２４】
（プライマーセット）
ＫＩＦ２０Ａ遺伝子を増幅可能なプライマーセットとは、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ等により増幅することができるものであれば特に制限されない。具体的なプライマーセットの例としては、実施例において後述する、市販のプライマーセット（型式「Ｈｓ００９９３５７３」、アプライドバイオシステムズ社製）等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２５】
ＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡは、上述したＩＤで特定されるＲｅｆＳｅｑデータベースのエントリーに記載された塩基配列を有している。なお、ｍＲＮＡにはスプライシングバリアント等が存在する場合があるため、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡは上述したＲｅｆＳｅｑ  ＩＤで特定されるものに限られるものではない。
【００２６】
例えば、患者由来の組織等を試料に用い、本プライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ等を行うことにより、試料中のＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡを検出することができる。
【００２７】
（プローブ）
プローブとしては、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定されない。プローブは、担体上に固定されてＤＮＡマイクロアレイ等を構成していてもよい。例えば、上記のＤＮＡマイクロアレイに、患者由来の組織から抽出したｍＲＮＡを接触させ、プローブにハイブリダイズしたＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより、患者の予後を予測することができる。
【００２８】
［生体試料を試験する方法］
１実施形態において、本発明は、生体試料中のＫＩＦ２０Ａタンパク質又は遺伝子の発現量を測定する工程と、測定されたＫＩＦ２０Ａタンパク質又は遺伝子の発現量が、対照と比較して多い場合に、前記生体試料は、予後が不良な患者由来のものであると判定する工程と、を備える、生体試料を試験する方法を提供する。
【００２９】
本実施形態の方法により、生体試料が、予後が不良な癌患者由来のものであるか否かを判定することができる。すなわち、本実施形態の方法は、癌患者の予後の予測方法であるということもできる。本実施形態の方法において、予後が不良であるとは、生存率がより低いこと、癌を再発する割合が高いこと等を意味する。本実施形態の方法が試験対象とする癌としては、特に限定されないが、例えば固形癌が挙げられ、より具体的には、口腔癌、悪性胸膜中皮腫、乳癌、肺癌等が挙げられる。
【００３０】
本実施形態の方法において、生体試料は、血清、血漿、癌組織試料等が挙げられる。生体試料中のＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量を測定する工程は、上述したＫＩＦ２０Ａタンパク質に対する特異的結合物質を用いた、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色等により行うことができる。
【００３１】
また、生体試料中のＫＩＦ２０Ａ遺伝子の発現量を測定する工程は、上述したプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等により行うことができる。あるいは、上述したプローブを用いたＤＮＡマイクロアレイ解析、ノーザンブロッティング等により、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子の発現量を測定してもよい。
【００３２】
本実施形態の方法では、生体試料中のＫＩＦ２０Ａタンパク質又はＫＩＦ２０Ａ遺伝子の発現量が、対照におけるＫＩＦ２０Ａタンパク質又はＫＩＦ２０Ａ遺伝子の発現量と比較して多い場合に、生体試料は予後が不良な患者由来のものであると判定する。
【００３３】
対照としては、例えば健常人由来の生体試料、患者由来の正常組織等が挙げられる。あるいは、予め健常人由来の生体試料中に存在するＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量に基づいて基準値を設定しておき、当該基準値と比較してＫＩＦ２０Ａタンパク質又はＫＩＦ２０Ａ遺伝子の発現量が多い場合に、生体試料は予後が不良な患者由来のものであると判定してもよい。
【００３４】
［抗癌剤］
１実施形態において、本発明は、ＫＩＦ２０Ａ阻害剤を有効成分として含有する抗癌剤を提供する。
【００３５】
実施例において後述するように、癌細胞におけるＫＩＦ２０Ａの発現をノックダウンすると、癌細胞の増殖、コロニー形成、浸潤を抑制することができる。したがって、本実施形態の抗癌剤により、癌の治療を行うことができる。また、本実施形態の抗癌剤により、癌の予防を行うこともできる。したがって、本実施形態の抗癌剤は、「癌の予防剤」であるということもできる。
【００３６】
また、実施例において後述するように、ＫＩＦ２０Ａは、主な正常臓器では、あまり発現していない。したがって、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子の発現を抑制したり、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の活性を抑制しても悪影響は少ないと考えられる。したがって、ＫＩＦ２０Ａは創薬ターゲットとして好適である。
【００３７】
本実施形態の抗癌剤が治療対象とする癌としては、特に限定されないが、例えば固形癌が挙げられ、より具体的には、口腔癌、悪性胸膜中皮腫、乳癌、肺癌等が挙げられる。
【００３８】
本実施形態の抗癌剤において、ＫＩＦ２０Ａの阻害剤は、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子又はＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現阻害剤であってもよいし、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の活性を抑制する物質であってもよい。
【００３９】
ＫＩＦ２０Ａの発現阻害剤としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、低分子化合物等が挙げられる。
【００４０】
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられる２１〜２３塩基対の低分子２本鎖ＲＮＡである。細胞内に導入されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
【００４１】
ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、９０〜９５℃で約１分程度変性させた後、３０〜７０℃で約１〜８時間アニーリングさせることにより調製することができる。
【００４２】
ＫＩＦ２０Ａの発現を阻害するｓｉＲＮＡとしては、例えば、配列番号１又は２に記載の塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡが挙げられる。
【００４３】
ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡは、ベクターによって細胞に導入し、Ｕ６プロモーター又はＨ１プロモーターで発現させてもよいし、ｓｈＲＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成し、ｓｉＲＮＡと同様の方法によりセルフアニーリングさせることによって調製してもよい。細胞内に導入されたｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、ｓｉＲＮＡへと切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
【００４４】
したがって、本実施形態の抗癌剤は、配列番号１又は２に記載の塩基配列を標的配列とするｓｈＲＮＡを発現可能なＫＩＦ２０Ａ阻害用ベクターであってもよい。
【００４５】
ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）は、ゲノム上にコードされ、多段階的な生成過程を経て最終的に約２０塩基の微小ＲＮＡとなる機能性核酸である。ｍｉＲＮＡは、機能性のｎｃＲＮＡ（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ、非コードＲＮＡ：タンパク質に翻訳されないＲＮＡの総称）に分類されており、他の遺伝子の発現を調節するという、生命現象において重要な役割を担っている。特定の塩基配列を有するｍｉＲＮＡを生体に投与することにより、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子の発現を抑制することができる。
【００４６】
リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡである。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、ＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となっている。リボザイムは、グループＩイントロン型、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡ等の４００ヌクレオチド以上の大きさのものであってもよく、ハンマーヘッド型、ヘアピン型等と呼ばれる４０ヌクレオチド程度のものであってもよい。
【００４７】
アンチセンス核酸は、標的配列に相補的な核酸である。アンチセンス核酸は、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が形成された部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制等により、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
【００４８】
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部をペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成してもよい。
【００４９】
ＫＩＦ２０Ａタンパク質の活性を抑制する物質としては、例えば、キネシンモーターをブロックする阻害剤等の低分子化合物、上述したＫＩＦ２０Ａタンパク質に対する特異的結合物質等が挙げられる。しかしながら、ＫＩＦ２０Ａタンパク質は細胞表面には存在しないため、特異的結合物質の投与により、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の活性を抑制するためには、特異的結合物質を、適切な送達システムと組み合わせて細胞の内部に送達する必要がある。
【００５０】
［癌治療用医薬組成物］
１実施形態において、本発明は、上述した抗癌剤と、薬学的に許容される担体とを含有する、癌治療用医薬組成物を提供する。本実施形態の癌治療用医薬組成物において、抗癌剤は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、既存の抗癌剤と併用して用いてもよい。
【００５１】
上記の医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の形態で非経口的に投与することができる。皮膚外用剤としては、より具体的には、軟膏剤、貼付剤等の剤型が挙げられる。
【００５２】
薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。
【００５３】
医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。
【００５４】
医薬組成物は、上述した抗癌剤、薬学的に許容される担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【００５５】
医薬組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、例えば、投与単位形態あたり０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分（抗癌剤）を投与すればよい。また、注射剤の場合には、例えば、投与単位形態あたり０．０１〜５０ｍｇの有効成分を投与すればよい。
【００５６】
また、医薬組成物の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、例えば、成人１日あたり０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分を１日１回又は２〜４回程度に分けて投与すればよい。
【００５７】
［抗癌剤のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、細胞中のＫＩＦ２０Ａタンパク質又は遺伝子の発現量を測定する工程と、ＫＩＦ２０Ａタンパク質又は遺伝子の発現量が前記被験物質の非存在下における発現量と比較して低下していた場合に、前記被験物質は抗癌剤であると判断する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法を提供する。
【００５８】
本実施形態のスクリーニング方法により得られる抗癌剤が対象とする癌としては、特に限定されないが、例えば固形癌が挙げられ、より具体的には、口腔癌、悪性胸膜中皮腫、乳癌、肺癌等が挙げられる。
【００５９】
本実施形態のスクリーニング方法によれば、ＫＩＦ２０Ａタンパク質又は遺伝子の発現を抑制する物質をスクリーニングすることができる。本実施形態のスクリーニング方法において、細胞としては、例えば癌細胞株を用いることができる。また、被験物質としては、特に制限されず、例えば化合物ライブラリー等を用いることができる。
【００６０】
本実施形態のスクリーニング方法において、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色等により測定することができる。また、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子の発現量は、例えばマイクロアレイ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等により測定することができる。
【００６１】
実施例において後述するように、ＫＩＦ２０Ａタンパク質又は遺伝子の発現量を低下させる物質は、癌細胞の増殖、コロニー形成、浸潤を抑制することができる。したがって、本実施形態のスクリーニング方法により得られる抗癌剤により、癌の治療を行うことができる。
【００６２】
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の活性を測定する工程と、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の活性が前記被験物質の非存在下における活性と比較して低下していた場合に、前記被験物質は抗癌剤であると判断する工程と、を備える、抗癌剤のスクリーニング方法を提供する。
【００６３】
本実施形態のスクリーニング方法によれば、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の活性を阻害する物質をスクリーニングすることができる。ここで、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の活性としては、例えば、ＡＴＰを分解する活性、微小管と結合する活性、微小管上を移動する活性等が挙げられる。
【００６４】
本実施形態のスクリーニング方法は、細胞レベルで行ってもよく、非細胞レベル（試験管レベル）で行ってもよい。
【００６５】
ＫＩＦ２０Ａタンパク質の活性を低下させる物質は、癌細胞の増殖、コロニー形成、浸潤を抑制することができる。したがって、本実施形態のスクリーニング方法により得られる抗癌剤により、癌の治療を行うことができる。
【００６６】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、癌患者から癌組織試料を採取する工程と、前記試料中のＫＩＦ２０Ａタンパク質又は遺伝子の発現量を測定する工程と、測定されたＫＩＦ２０Ａタンパク質又は遺伝子の発現量が、対照と比較して多い場合に、前記癌患者は予後が悪いと判断する工程とを備える、癌患者の予後の予測方法を提供する。
【００６７】
本実施形態の方法において、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量の測定は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色等により行うことができる。また、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子の発現量の測定は、マイクロアレイ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等により行うことができる。
【００６８】
１実施形態において、本発明は、ＫＩＦ２０Ａ阻害剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、癌の治療方法を提供する。ここで、ＫＩＦ２０Ａ阻害剤としては、上述したものが挙げられる。
【００６９】
１実施形態において、本発明は、癌の治療のためのＫＩＦ２０Ａ阻害剤を提供する。ここで、ＫＩＦ２０Ａ阻害剤としては、上述したものが挙げられる。
【００７０】
１実施形態において、本発明は、抗癌剤を製造するためのＫＩＦ２０Ａ阻害剤の使用を提供する。ここで、ＫＩＦ２０Ａ阻害剤としては、上述したものが挙げられる。
【実施例】
【００７１】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７２】
＜Ｉ．口腔癌の検討＞
［実験例Ｉ−１］
（ＫＩＦ２０Ａ遺伝子の発現量の検討）
早期の口腔癌患者から手術切除された癌組織及び口腔癌細胞株におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＴにより測定した。ＫＩＦ２０ＡのｃＤＮＡの増幅には、市販のプライマーセット（型式「Ｈｓ００９９３５７３」、アプライドバイオシステムズ社製）を使用した。
【００７３】
図１（ａ）は、口腔癌患者由来の癌組織におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。症例１〜８の口腔癌患者由来の癌組織を試料に用いた。対照には舌の正常組織を使用した。グラフの縦軸は、対照におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を１とした相対値を示す。
【００７４】
その結果、多くの口腔癌患者由来の癌組織において、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現が上昇していることが明らかとなった。
【００７５】
また、図１（ｂ）は、口腔癌細胞株におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。口腔癌細胞株としては、ＦａＤｕ、ＳＣＣ９、ＣＡＬ２７、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４及びＣａ９−２２細胞を用いた。対照には舌の正常組織を使用した。グラフの縦軸は、対照におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を１とした相対値を示す。
【００７６】
その結果、多くの口腔癌細胞株において、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現が上昇していることが明らかとなった。
【００７７】
［実験例Ｉ−２］
（ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量の検討）
口腔癌細胞株におけるＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量をウエスタンブロッティングにより測定した。
【００７８】
口腔癌細胞株としては、Ｃａ９−２２、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３及びＨＳＣ４細胞を用いた。また、ローディングコントロールとして、β−アクチン（ＡＣＴＢ）タンパク質を検出した。
【００７９】
図２はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、全ての細胞において、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現が確認された。
【００８０】
［実験例Ｉ−３］
（免疫細胞染色によるＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現の検討）
Ｃａ９−２２及びＨＳＣ４細胞の免疫細胞染色を行い、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現を検討した。また、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて核を染色した。
【００８１】
図３は、免疫細胞染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、ＫＩＦ２０Ａタンパク質が細胞内で発現していることが確認された。
【００８２】
［実験例Ｉ−４］
（口腔癌患者の予後と癌組織におけるＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量との関係の検討）
口腔癌患者由来の癌組織が９６個搭載された組織アレイを免疫染色し、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量を測定した。上記の組織アレイは、熊本大学医学部歯科口腔外科学分野で根治的手術を受けた患者から得られたものであった。上記の組織アレイは、倫理委員会により承認を受けて使用した。
【００８３】
図４（ａ）〜（ｄ）は、免疫染色の結果を示す代表的な写真である。倍率は１００倍である。図４（ａ）はＫＩＦ２０Ａタンパク質を強く発現している癌組織の写真である。図４（ｂ）は、ＫＩＦ２０Ａタンパク質を弱く発現している癌組織の写真である。図４（ｃ）は、ＫＩＦ２０Ａタンパク質を発現していない癌組織の写真である。図４（ｄ）は、対照である正常組織の免疫染色の結果を示す写真である。
【００８４】
図５は、免疫染色の結果、ＫＩＦ２０Ａの発現が陽性であった口腔癌患者６４例と、ＫＩＦ２０Ａの発現が陰性であった口腔癌患者３２例の予後（生存率の推移）を示すグラフである。
【００８５】
その結果、ＫＩＦ２０Ａの発現が陽性であった口腔癌患者は、ＫＩＦ２０Ａの発現が陰性であった口腔癌患者と比較して有意に予後が悪かったことが明らかとなった。この結果は、ＫＩＦ２０Ａが口腔癌の予後マーカーとして有効であることを示す。
【００８６】
続いて、癌組織におけるＫＩＦ２０Ａの発現と口腔癌患者の表現型との関連を検討した。解析結果を表１に示す。表１中、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。
【００８７】
【表１】
2018061481.tif 000002
【００８８】
表１中、Ｔ因子は原発腫瘍の状態を示す。Ｔ因子の分類は次の通りである。
Ｔ１：最大径が２ｃｍ以下の腫瘍
Ｔ２：最大径が２ｃｍを超え、４ｃｍ以下の腫瘍
Ｔ３：最大径が４ｃｍを超える腫瘍
Ｔ４：（口唇）骨髄質、下歯槽神経、口腔底、又は顔面（顎又は鼻）の皮膚に浸潤する腫瘍
【００８９】
また、表１中、Ｎ因子はリンパ節への転移を示す。Ｎ因子の分類は次の通りである。
Ｎ０：所属リンパ節に転移を認めない
Ｎ１：同側の単発性リンパ節転移で、その最大径が３ｃｍ以下のもの
Ｎ２：同側の単発性リンパ節転移で最大径が３ｃｍを超え、６ｃｍ以下のもの；又は同側の多発性リンパ節転移で最大径が６ｃｍ以下のもの；又は両側あるいは対側のリンパ節転移で最大径が６ｃｍ以下のもの
【００９０】
その結果、口腔癌の癌組織におけるＫＩＦ２０Ａの発現は、リンパ節転移と相関していることが示された。
【００９１】
続いて、Ｃｏｘ比例ハザードモデル解析を行った。解析結果を表２に示す。表２中、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。
【００９２】
【表２】
2018061481.tif 000003
【００９３】
その結果、ＫＩＦ２０Ａの発現は、独立した予後因子であることが明らかとなった。この結果から、ＫＩＦ２０Ａの発現そのものが口腔癌の予後（癌の悪性度）に関連していることが考えられた。
【００９４】
［実験例Ｉ−５］
（ＫＩＦ２０Ａ遺伝子のノックダウン）
口腔癌細胞株である、ＨＳＣ４及びＣａ９−２２細胞に、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入してＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンした。ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡとしては、＃１（配列番号１に記載の塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ）及び＃２（配列番号２に記載の塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ）の２種類を使用した。また、対照として、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの代わりにルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（配列番号３に記載の塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ、以下「ＬＵＣ」という場合がある。）又はＥＧＦＰ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（配列番号４に記載の塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ、以下「ＥＧＦＰ」という場合がある。）を導入した。
【００９５】
続いて、ｓｉＲＮＡを導入してから７日後の各細胞におけるＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量を、実験例Ｉ−２と同様にして、ウエスタンブロッティングにより測定した。ローディングコントロールとして、β−アクチン（ＡＣＴＢ）タンパク質を検出した。
【００９６】
図６（ａ）及び（ｂ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図６（ａ）はＨＳＣ４細胞の結果を示し、図６（ｂ）はＣａ９−２２細胞の結果を示す。その結果、いずれの細胞においても、ｓｉＲＮＡの導入により、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現をノックダウンできたことが確認された。
【００９７】
また、ｓｉＲＮＡを導入してから７日後の各細胞の増殖をＭＴＴアッセイにより測定した。図７（ａ）及び（ｂ）は、ＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。図７（ａ）はＨＳＣ４細胞の結果を示し、図７（ｂ）はＣａ９−２２細胞の結果を示す。その結果、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入したＨＳＣ４細胞及びＣａ９−２２細胞は、対照と比較して、細胞増殖が顕著に低下したことが明らかとなった。
【００９８】
［実験例Ｉ−６］
（コロニー形成アッセイ）
実験例Ｉ−５と同様にしてＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンしたＨＳＣ４細胞及びＣａ９−２２細胞を用いて、コロニー形成アッセイを行い、癌の悪性度を検討した。具体的には、１０ｃｍディッシュに播種した各細胞にｓｉＲＮＡを導入し、７日間培養した。続いて、各細胞をギムザ染色し、コロニーの形成を観察した。
【００９９】
図８は、コロニー形成アッセイの結果を示す写真である。その結果、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンすると、細胞のコロニー形成能が低下したことが明らかとなった。
【０１００】
［実験例Ｉ−７］
（細胞周期の検討）
実験例Ｉ−５と同様にしてＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンしたＨＳＣ４細胞及びＣａ９−２２細胞の細胞周期を解析した。ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（＃１）を導入後、各細胞を４８時間培養した。続いて、各細胞をＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）で染色し、フローサイトメーターを用いて細胞周期を解析した。対照として、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの代わりにルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ＬＵＣ）を導入した細胞を使用した。
【０１０１】
図９（ａ）及び（ｂ）は、細胞周期を解析した結果を示すグラフである。図９（ａ）は、ＨＳＣ４細胞の結果であり、図９（ｂ）は、Ｃａ９−２２細胞の結果である。その結果、いずれの細胞においてもＧ２／Ｍ期の細胞の割合が増加していることが明らかとなった。この結果から、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンすることにより、口腔癌細胞の細胞周期がＭ期で停止し、細胞増殖が抑制されたことが明らかとなった。
【０１０２】
＜ＩＩ．悪性胸膜中皮腫の検討＞
［実験例ＩＩ−１］
（ＫＩＦ２０Ａ遺伝子の発現量の検討）
悪性胸膜中皮腫の患者から手術切除された癌組織及び中皮腫細胞株におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を、実験例Ｉ−１と同様にして、定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。
【０１０３】
図１０（ａ）は、悪性胸膜中皮腫患者由来の癌組織におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。症例１〜１３の悪性胸膜中皮腫患者由来の癌組織を試料に用いた。対照として、正常な胸膜の中皮組織を使用した。グラフの縦軸は、対照におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を１とした相対値を示す。
【０１０４】
その結果、多くの悪性胸膜中皮腫患者由来の癌組織において、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現が上昇していることが明らかとなった。
【０１０５】
また、図１０（ｂ）は、中皮腫細胞株におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。中皮腫細胞株としては、ＭＥＳＯ１、ＭＥＳＯ４、Ｈ２０５２、Ｈ２４５２、Ｈ２８及びＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞を用いた。対照として、正常中皮細胞株であるＭＳＯ−１細胞を使用した。グラフの縦軸は、対照におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を１とした相対値を示す。
【０１０６】
その結果、多くの中皮腫細胞株において、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現が上昇していることが明らかとなった。
【０１０７】
［実験例ＩＩ−２］
（ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量の検討）
中皮腫細胞株におけるＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量をウエスタンブロッティングにより測定した。
【０１０８】
中皮腫細胞株としては、ＭＥＳＯ１、ＭＥＳＯ４、Ｈ２０５２、Ｈ２４５２、Ｈ２８及びＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞を用いた。対照として、正常中皮細胞株であるＭＳＯ−１細胞を使用した。また、ローディングコントロールとして、β−アクチン（ＡＣＴＢ）タンパク質を検出した。
【０１０９】
図１１はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、ＭＳＯ−１細胞ではＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現は認められなかった。また、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞以外の中皮腫細胞株において、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現が確認された。
【０１１０】
［実験例ＩＩ−３］
（免疫細胞染色によるＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現の検討）
Ｈ２８及びＨ２４５２細胞の免疫細胞染色を行い、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現を検討した。また、ＤＡＰＩを用いて核を染色した。
【０１１１】
図１２（ａ）及び（ｂ）は、免疫細胞染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１２（ａ）はＨ２８細胞の結果であり、図１２（ｂ）はＨ２４５２細胞の結果である。その結果、ＫＩＦ２０Ａタンパク質が細胞内で発現していることが確認された。
【０１１２】
［実験例ＩＩ−４］
（正常組織におけるＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現の検討）
様々な正常組織及び悪性胸膜中皮腫患者由来の癌組織の組織切片を免疫染色し、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現を検討した。正常組織としては、心臓、肺、肝臓、腎臓及び精巣について検討した。
【０１１３】
図１３（ａ）〜（ｅ）は免疫染色の結果を示す写真である。倍率は４００倍である。図１３（ａ）は心臓の組織切片の写真であり、図１３（ｂ）は肺の組織切片の写真であり、図１３（ｃ）は肝臓の組織切片の写真であり、図１３（ｄ）は腎臓の組織切片の写真であり、図１３（ｅ）は精巣の組織切片の写真である。
【０１１４】
その結果、ＫＩＦ２０Ａタンパク質は、精巣では発現しているものの、その他の正常組織では発現していないか、発現量が低いことが明らかとなった。
【０１１５】
この結果から、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子又はタンパク質を癌の治療標的とした場合に悪影響が出にくいと考えられた。すなわち、ＫＩＦ２０Ａは癌の治療標的として有用である。
【０１１６】
［実験例ＩＩ−５］
（悪性胸膜中皮腫患者由来の癌組織におけるＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現の検討）
悪性胸膜中皮腫患者由来の癌組織の組織切片を免疫染色し、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現を検討した。また、比較のために、胸膜炎の組織及び正常な胸膜の組織の組織切片も免疫染色し、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現を検討した。
【０１１７】
図１４（ａ）〜（ｄ）は免疫染色の結果を示す写真である。倍率は４００倍である。図１４（ａ）はＫＩＦ２０Ａの発現が陽性であった癌組織の結果を示す代表的な写真であり、図１４（ｂ）はＫＩＦ２０Ａの発現が陰性であった癌組織の結果を示す代表的な写真であり、図１４（ｃ）は胸膜炎の組織の結果を示す写真であり、図１４（ｄ）は正常な胸膜の組織の結果を示す写真である。その結果、正常な胸膜の組織や、胸膜炎の組織ではＫＩＦ２０Ａの発現は認められないことが明らかとなった。
【０１１８】
［実験例ＩＩ−６］
（ＫＩＦ２０Ａ遺伝子のノックダウン）
実験例Ｉ−５と同様にして、中皮腫細胞株であるＨ２８細胞及びＨ２４５２細胞にｓｉＲＮＡを導入してＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンした。対照として、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの代わりにルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ＬＵＣ）又はＥＧＦＰ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ）を導入した。
【０１１９】
続いて、ｓｉＲＮＡを導入してから７日後の各細胞におけるＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量を、実験例Ｉ−２と同様にして、ウエスタンブロッティングにより測定した。ローディングコントロールとして、β−アクチン（ＡＣＴＢ）タンパク質を検出した。
【０１２０】
図１５（ａ）及び（ｂ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図１５（ａ）はＨ２８細胞の結果であり、図１５（ｂ）はＨ２４５２細胞の結果である。その結果、ｓｉＲＮＡの導入により、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現をノックダウンできたことが確認された。
【０１２１】
また、ｓｉＲＮＡを導入してから７日後の各細胞の増殖をＭＴＴアッセイにより測定した。図１６（ａ）及び（ｂ）は、ＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。図１６（ａ）はＨ２８細胞の結果であり、図１６（ｂ）はＨ２４５２細胞の結果である。その結果、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入したＨ２８細胞及びＨ２４５２細胞は、対照と比較して、細胞増殖が有意に低下したことが明らかとなった。
【０１２２】
また、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンしたＨ２８細胞及びＨ２４５２細胞を用いて、コロニー形成アッセイを行い、癌の悪性度を検討した。具体的には、１０ｃｍディッシュに播種した各細胞にｓｉＲＮＡを導入し、７日間培養した。続いて、各細胞をギムザ染色し、コロニーの形成を観察した。
【０１２３】
図１７（ａ）及び（ｂ）は、コロニー形成アッセイの結果を示す写真である。図１７（ａ）はＨ２８細胞の結果であり、図１７（ｂ）はＨ２４５２細胞の結果である。その結果、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入したＨ２８細胞及びＨ２４５２細胞は、対照と比較して、コロニー形成能が低下したことが明らかとなった。
【０１２４】
［実験例ＩＩ−７］
（細胞周期の検討）
実験例Ｉ−５と同様にしてＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンしたＨ２８細胞の細胞周期を解析した。細胞にＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（＃１）を導入後、４８時間培養した。続いて、細胞をＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）で染色し、フローサイトメーターを用いて細胞周期を解析した。対照として、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの代わりにルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ＬＵＣ）を導入した細胞を使用した。
【０１２５】
図１８は、細胞周期を解析した結果を示すグラフである。その結果、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンしたＨ２８細胞では、Ｇ２／Ｍ期の細胞の割合が増加していることが明らかとなった。この結果から、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンすることにより、口腔癌細胞の細胞周期がＭ期で停止し、細胞増殖が抑制されたことが明らかとなった。
【０１２６】
［実験例ＩＩ−８］
（細胞浸潤能アッセイ）
実験例Ｉ−５と同様にして、Ｈ２８細胞にｓｉＲＮＡを導入してＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンした。対照として、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの代わりにルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ＬＵＣ）を導入した。
【０１２７】
続いて、ｓｉＲＮＡを導入してから２２時間後の各細胞の増殖をＭＴＴアッセイにより測定した。図１９は、ＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。その結果、ｓｉＲＮＡを導入してから２２時間後では、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入しても細胞増殖には影響がないことが確認された。
【０１２８】
そこで、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入してから２２時間後のＨ２８細胞を用いてマトリゲルを用いた浸潤アッセイを行った。対照として、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの代わりにルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ＬＵＣ）を導入してから２２時間後のＨ２８細胞を使用した。
【０１２９】
図２０（ａ）は浸潤アッセイの結果を示す顕微鏡写真である。図２０（ｂ）は浸潤した細胞の数を測定した結果を示すグラフである。その結果、対照と比較して、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入したＨ２８細胞では細胞の浸潤が抑制されたことが明らかとなった。
【０１３０】
＜ＩＩＩ．乳癌の検討＞
［実験例ＩＩＩ−１］
（ＫＩＦ２０Ａ遺伝子の発現量の検討）
乳癌の患者から手術切除された癌組織及び乳癌細胞株におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を、実験例Ｉ−１と同様にして、定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。
【０１３１】
図２１（ａ）は、乳癌患者由来の癌組織におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。症例１〜１０の悪性胸膜中皮腫患者由来の癌組織を試料に用いた。対照として、正常な乳房組織を使用した。グラフの縦軸は、対照におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を１とした相対値を示す。
【０１３２】
その結果、多くの乳癌患者由来の癌組織において、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現が上昇していることが明らかとなった。
【０１３３】
また、図２１（ｂ）は、乳癌細胞株におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。乳癌細胞株としては、ＭＢ４６８、ＭＣＦ７、Ｔ−４７Ｄ、ＨＣＣ−１９３７及びＺＲ−７５−１細胞を用いた。対照として、正常乳腺上皮細胞株である１８４Ａ１細胞を使用した。グラフの縦軸は、対照におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を１とした相対値を示す。
【０１３４】
その結果、多くの乳癌細胞株において、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現が上昇していることが明らかとなった。
【０１３５】
［実験例ＩＩＩ−２］
（ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量の検討）
乳癌細胞株におけるＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量をウエスタンブロッティングにより測定した。
【０１３６】
乳癌細胞株としては、ＭＢ４６８、ＭＣＦ７、Ｔ−４７Ｄ、ＨＣＣ−１９３７及びＺＲ−７５−１細胞を用いた。対照として、正常乳腺上皮細胞株である１８４Ａ１細胞を使用した。また、ローディングコントロールとして、β−アクチン（ＡＣＴＢ）タンパク質を検出した。
【０１３７】
図２２は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、１８４Ａ１細胞ではＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現は認められなかった。また、Ｔ−４７Ｄ細胞では発現が低かったものの、全ての乳癌細胞株において、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現が確認された。
【０１３８】
［実験例ＩＩＩ−３］
（免疫細胞染色によるＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現の検討）
ＭＣＦ７、ＺＲ−７５−１、Ｔ−４７Ｄ及び１８４Ａ１細胞の免疫細胞染色を行い、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現を検討した。また、ＤＡＰＩを用いて核を染色した。
【０１３９】
図２３は、免疫細胞染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、ＭＣＦ７及びＺＲ−７５−１細胞では、ＫＩＦ２０Ａタンパク質が細胞内で発現していることが確認された。
【０１４０】
［実験例ＩＩＩ−４］
（乳癌患者の予後と癌組織におけるＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量との関係の検討）
乳癌患者由来の癌組織が２５７個搭載された組織アレイを免疫染色し、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量を測定した。上記の組織アレイは、神奈川県立がんセンターで根治的手術を受けた患者から得られたものであった。上記の組織アレイは、倫理委員会により承認を受けて使用した。
【０１４１】
図２４（ａ）〜（ｄ）は、免疫染色の結果を示す代表的な写真である。倍率は１００倍である。図２４（ａ）はＫＩＦ２０Ａタンパク質を強く発現している癌組織の写真である。図２４（ｂ）は、ＫＩＦ２０Ａタンパク質を弱く発現している癌組織の写真である。図２４（ｃ）は、ＫＩＦ２０Ａタンパク質を発現していない癌組織の写真である。図２４（ｄ）は、対照である正常組織の免疫染色の結果を示す写真である。
【０１４２】
図２５（ａ）は、免疫染色の結果、ＫＩＦ２０Ａの発現が陽性であった乳癌患者１９５例と、ＫＩＦ２０Ａの発現が陰性であった乳癌患者６２例の予後（生存率の推移）を示すグラフである。
【０１４３】
その結果、ＫＩＦ２０Ａの発現が陽性であった乳癌患者は、ＫＩＦ２０Ａの発現が陰性であった乳癌患者と比較して有意に予後が悪かったことが明らかとなった。この結果は、ＫＩＦ２０Ａが乳癌の予後マーカーとして有効であることを示す。
【０１４４】
続いて、ホルモンレセプター陽性（エストロゲンレセプター陽性又はプロゲステロンレセプター陽性）の乳癌患者に限定して、ＫＩＦ２０Ａの発現と予後の関係を検討した。
【０１４５】
図２５（ｂ）は、ホルモンレセプター陽性の乳癌患者のうち、免疫染色の結果、ＫＩＦ２０Ａの発現が陽性であった乳癌患者１２６例と、ＫＩＦ２０Ａの発現が陰性であった乳癌患者５５例の予後（生存率の推移）を示すグラフである。
【０１４６】
その結果、ホルモンレセプター陽性の乳癌患者においても、ＫＩＦ２０Ａの発現が陽性であった乳癌患者は、ＫＩＦ２０Ａの発現が陰性であった乳癌患者と比較して有意に予後が悪かったことが明らかとなった。
【０１４７】
この結果は、ホルモンレセプター陽性の乳癌患者であっても、ＫＩＦ２０Ａが陽性である場合には、ホルモン療法以外の医学的介入、例えば、再発スクリーニングの頻度を上げる、化学療法を行う等の医学的介入が重要であることを示す。
【０１４８】
続いて、癌組織におけるＫＩＦ２０Ａの発現と乳癌患者の表現型との関連を検討した。解析結果を表３に示す。表３中、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。また、「ＥＲ」はエストロゲンレセプターを意味し、「ＰｇＲ」はプロゲステロンレセプターを意味する。
【０１４９】
【表３】
2018061481.tif 000004
【０１５０】
表３中、Ｔ因子は原発腫瘍の状態を示す。Ｔ因子の分類は次の通りである。
Ｔ１：最大径が２ｃｍ以下の腫瘍
Ｔ２：最大径が２ｃｍを超え、５ｃｍ以下の腫瘍
Ｔ３：最大径が５ｃｍを超える腫瘍
Ｔ４：大きさに関係なく、胸郭に浸潤している状態、及び／又は、皮膚病変が生じている状態
【０１５１】
また、表３中、Ｎ因子はリンパ節への転移を示す。Ｎ因子の分類は次の通りである。
Ｎ０：所属リンパ節に転移を認めない
Ｎ１：可動性の同側腋窩リンパ節転移
Ｎ２：固定または癒着した、同側腋窩リンパ節への転移又は同側胸骨傍リンパ節転移
【０１５２】
その結果、口腔癌の癌組織におけるＫＩＦ２０Ａの発現は、エストロゲンレセプターの発現、プロゲステロンレセプターの発現、Ｈｅｒ２の発現及びリンパ節転移と関連していることが示された。
【０１５３】
続いて、Ｃｏｘ比例ハザードモデル解析を行った。解析結果を表４に示す。表４中、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。
【０１５４】
【表４】
2018061481.tif 000005
【０１５５】
その結果、ＫＩＦ２０Ａの発現は、独立した予後因子であることが明らかとなった。この結果から、ＫＩＦ２０Ａの発現そのものが乳癌の予後（癌の悪性度）に相関していることが考えられた。
【０１５６】
［実験例ＩＩＩ−５］
（ＫＩＦ２０Ａ遺伝子のノックダウン）
実験例Ｉ−５と同様にして、乳癌細胞株であるＭＣＦ７細胞及び７Ｒ−７５−１細胞にｓｉＲＮＡを導入してＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンした。対照として、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの代わりにルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ＬＵＣ）又はＥＧＦＰ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ）を導入した。
【０１５７】
続いて、ｓｉＲＮＡを導入してから７日後の各細胞におけるＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量を、実験例Ｉ−２と同様にして、ウエスタンブロッティングにより測定した。ローディングコントロールとして、β−アクチン（ＡＣＴＢ）タンパク質を検出した。
【０１５８】
図２６（ａ）及び（ｂ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図２６（ａ）はＭＣＦ７細胞の結果を示し、図２６（ｂ）はＺＲ−７５−１細胞の結果を示す。その結果、いずれの細胞においても、ｓｉＲＮＡの導入により、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現をノックダウンできたことが確認された。
【０１５９】
また、ｓｉＲＮＡを導入してから７日後の各細胞の増殖をＭＴＴアッセイにより測定した。図２７（ａ）及び（ｂ）は、ＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。図２７（ａ）はＭＣＦ７細胞の結果であり、図２７（ｂ）はＺＲ−７５−１細胞の結果である。その結果、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入したＭＣＦ７細胞及びＺＲ−７５−１細胞は、対照と比較して、細胞増殖が有意に低下したことが明らかとなった。
【０１６０】
［実験例ＩＩＩ−６］
（コロニー形成アッセイ）
実験例Ｉ−５と同様にしてＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンしたＭＣＦ７細胞及び７Ｒ−７５−１細胞を用いて、コロニー形成アッセイを行い、癌の悪性度を検討した。具体的には、１０ｃｍディッシュに播種した各細胞にｓｉＲＮＡを導入し、７日間培養した。続いて、各細胞をギムザ染色し、コロニーの形成を観察した。
【０１６１】
図２８（ａ）及び（ｂ）は、コロニー形成アッセイの結果を示す写真である。図２８（ａ）はＭＣＦ７細胞の結果を示し、図２８（ｂ）はＺＲ−７５−１細胞の結果を示す。その結果、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンすると、細胞のコロニー形成能が低下したことが明らかとなった。
【０１６２】
［実験例ＩＩＩ−７］
（細胞周期の検討）
実験例Ｉ−５と同様にしてＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンしたＭＣＦ７細胞及び７Ｒ−７５−１細胞の細胞周期を解析した。ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（＃１）を導入後、各細胞を４８時間培養した。続いて、各細胞をＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）で染色し、フローサイトメーターを用いて細胞周期を解析した。対照として、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの代わりにルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ＬＵＣ）を導入した細胞を使用した。
【０１６３】
図２９（ａ）及び（ｂ）は、細胞周期を解析した結果を示すグラフである。図２９（ａ）は、ＭＣＦ７細胞の結果であり、図２９（ｂ）は、７Ｒ−７５−１細胞の結果である。その結果、いずれの細胞においてもＧ２／Ｍ期の細胞の割合が有意に増加していることが明らかとなった。この結果から、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンすることにより、乳癌細胞の細胞周期がＭ期で停止し、細胞増殖が抑制されたことが明らかとなった。
【０１６４】
＜ＩＶ．肺癌の検討＞
［実験例ＩＶ−１］
（ＫＩＦ２０Ａ遺伝子の発現量の検討）
肺癌の患者から手術切除された癌組織及び肺癌細胞株におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を、実験例Ｉ−１と同様にして、定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。
【０１６５】
図３０（ａ）は、肺癌患者由来の癌組織におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。症例１〜１７の肺癌患者由来の癌組織を試料に用いた。対照として、正常な肺組織を使用した。グラフの縦軸は、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の相対値を示す。
【０１６６】
その結果、多くの乳癌患者由来の癌組織において、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現が上昇していることが明らかとなった。
【０１６７】
また、図３０（ｂ）は、肺癌細胞株におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。肺癌細胞株としては、Ａ５４９、Ｈ２３、ＲＥＲＦ、Ｈ１６８８、Ｈ２２６、Ｈ５２０、Ｈ２１７０、ＳＫＭＥＳ１、Ｈ４６０、ＳＢＣ３、ＳＢＣ５及びＤＭＳ１１４細胞を用いた。対照として、正常小気道上皮細胞株であるＳＡＥＣ細胞を使用した。グラフの縦軸は、対照におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を１とした相対値を示す。
【０１６８】
その結果、多くの乳癌細胞株において、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現が上昇していることが明らかとなった。
【０１６９】
［実験例ＩＶ−２］
（ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量の検討）
肺癌細胞株におけるＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量をウエスタンブロッティングにより測定した。
【０１７０】
肺癌細胞株としては、Ａ５４９、Ｈ５２０、ＤＭＳ１１４及びＳＢＣ５細胞を用いた。対照として、正常小気道上皮細胞株であるＳＡＥＣ細胞を使用した。また、ローディングコントロールとして、β−アクチン（ＡＣＴＢ）タンパク質を検出した。
【０１７１】
図３１は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、ＳＡＥＣ細胞ではＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現は認められなかった。また、Ａ５４９細胞では発現が低かったものの、Ａ５４９以外の肺癌細胞株において、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現が確認された。
【０１７２】
［実験例ＩＩＩ−３］
（免疫細胞染色によるＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現の検討）
ＳＢＣ５細胞の免疫細胞染色を行い、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現を検討した。また、ＤＡＰＩを用いて核を染色した。
【０１７３】
図３２は、免疫細胞染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、ＳＢＣ５細胞では、ＫＩＦ２０Ａタンパク質が細胞内で発現していることが確認された。
【０１７４】
［実験例ＩＶ−４］
（肺癌患者の予後と癌組織におけるＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量との関係の検討）
肺癌患者由来の癌組織が３５８個搭載された組織アレイを免疫染色し、ＫＩＦ２０Ａタンパク質の発現量を測定した。上記の組織アレイは、神奈川県立がんセンターで根治的手術を受けた患者から得られたものであった。上記の組織アレイは、倫理委員会により承認を受けて使用した。
【０１７５】
図３３（ａ）及び（ｂ）は、免疫染色の結果を示す代表的な写真である。図３３（ａ）は肺癌組織の写真である。図３３（ｂ）は対照である正常組織の免疫染色の結果を示す写真である。
【０１７６】
図３４は、免疫染色の結果、ＫＩＦ２０Ａの発現が強陽性であった肺癌患者１００例と、ＫＩＦ２０Ａの発現が弱陽性又は陰性であった肺癌患者２５８例の予後（生存率の推移）を示すグラフである。
【０１７７】
その結果、ＫＩＦ２０Ａの発現が強陽性であった肺癌患者は、ＫＩＦ２０Ａの発現が弱陽性又は陰性であった肺癌患者と比較して有意に予後が悪かったことが明らかとなった。この結果は、ＫＩＦ２０Ａが肺癌の予後マーカーとして有効であることを示す。
【０１７８】
続いて、癌組織におけるＫＩＦ２０Ａの発現と肺癌患者の表現型との関連を検討した。解析結果を表５に示す。表５中、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。また、「ＡＤＣ」は肺線癌を意味し、「ＳＣＣ」は扁平上皮癌を意味し、「その他」は肺大細胞癌、多形癌及び大細胞神経内分泌癌を意味する。また、「†」は「ＡＤＣ」対「扁平上皮癌及びその他」の解析結果を示す。
【０１７９】
【表５】
2018061481.tif 000006
【０１８０】
表５中、Ｔ因子は原発腫瘍の状態を示す。Ｔ因子の分類は次の通りである。
Ｔ１：腫瘍径が３ｃｍ以下の腫瘍
Ｔ２：腫瘍径が３ｃｍを超え、７ｃｍ以下の腫瘍
Ｔ３：腫瘍径が７ｃｍを超える腫瘍
Ｔ４：大きさに関係なく、心臓、大血管、気管、反回神経、食道、椎体、同側肺に存在する複数の腫瘍結節に浸潤したもの
【０１８１】
また、表５中、Ｎ因子はリンパ節への転移を示す。Ｎ因子の分類は次の通りである。
Ｎ０：所属リンパ節に転移を認めない
Ｎ１：同側の気管支周囲リンパ節、肺内リンパ節、及び／又は、同側の肺門リンパ節への転移又は直接進展
Ｎ２：同側の縦隔、及び／又は、鎖骨下リンパ節への進展
【０１８２】
その結果、肺癌の癌組織におけるＫＩＦ２０Ａの発現は、腫瘍径及びリンパ節転移と関連していることが示された。
【０１８３】
続いて、Ｃｏｘ比例ハザードモデル解析を行った。解析結果を表６に示す。表６中、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。また、「ＡＤＣ」は肺線癌を意味し、「ＳＣＣ」は扁平上皮癌を意味し、「その他」は肺大細胞癌、多形癌及び大細胞神経内分泌癌を意味する。
【０１８４】
【表６】
2018061481.tif 000007
【０１８５】
その結果、ＫＩＦ２０Ａの発現は、独立した予後因子であることが明らかとなった。この結果から、ＫＩＦ２０Ａの発現そのものが肺癌の予後（癌の悪性度）に相関していることが考えられた。
【０１８６】
［実験例ＩＶ−５］
（ＫＩＦ２０Ａ遺伝子のノックダウン）
実験例Ｉ−５と同様にして、肺癌細胞株であるＳＢＣ５細胞にｓｉＲＮＡを導入してＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンした。対照として、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの代わりにルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ＬＵＣ）又はＥＧＦＰ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ）を導入した。
【０１８７】
続いて、ｓｉＲＮＡを導入してから７日後の各細胞におけるＫＩＦ２０Ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を、実験例Ｉ−１と同様にして、定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。
【０１８８】
図３５は、定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。その結果、ｓｉＲＮＡの導入により、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子の発現をノックダウンできたことが確認された。
【０１８９】
また、ｓｉＲＮＡを導入してから７日後の各細胞の増殖をＭＴＴアッセイにより測定した。図３６は、ＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。その結果、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入したＳＢＣ５細胞は、対照と比較して、細胞増殖が低下したことが明らかとなった。
【０１９０】
また、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンしたＳＢＣ５細胞を用いて、コロニー形成アッセイを行い、癌の悪性度を検討した。具体的には、１０ｃｍディッシュに播種した各細胞にｓｉＲＮＡを導入し、７日間培養した。続いて、各細胞をギムザ染色し、コロニーの形成を観察した。
【０１９１】
図３７は、コロニー形成アッセイの結果を示す写真である。その結果、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入したＳＢＣ５細胞は、対照と比較して、コロニー形成能が低下したことが明らかとなった。
【０１９２】
［実験例ＩＶ−６］
（細胞周期の検討）
実験例Ｉ−５と同様にしてＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンしたＳＢＣ５細胞の細胞周期を解析した。ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（＃１）を導入してから４８時間後及び７２時間後に、各細胞をＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）で染色し、フローサイトメーターを用いて細胞周期を解析した。対照として、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの代わりにルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ＬＵＣ）を導入した細胞を使用した。
【０１９３】
図３８（ａ）及び（ｂ）は、細胞周期を解析した結果を示すグラフである。図３８（ａ）は４８時間後の結果であり、図３８（ｂ）は７２時間後の結果である。その結果、いずれの時間においてもＧ２／Ｍ期の細胞の割合が増加していることが明らかとなった。この結果から、ＫＩＦ２０Ａ遺伝子をノックダウンすることにより、肺癌細胞の細胞周期がＭ期で停止し、細胞増殖が抑制されたことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１９４】
本発明によれば、新たな癌の予後マーカーを提供することができる。
【図１】
2018061481.tif 000008
【図２】
2018061481.tif 000009
【図３】
2018061481.tif 000010
【図４】
2018061481.tif 000011
【図５】
2018061481.tif 000012
【図６】
2018061481.tif 000013
【図７】
2018061481.tif 000014
【図８】
2018061481.tif 000015
【図９】
2018061481.tif 000016
【図１０】
2018061481.tif 000017
【図１１】
2018061481.tif 000018
【図１２】
2018061481.tif 000019
【図１３】
2018061481.tif 000020
【図１４】
2018061481.tif 000021
【図１５】
2018061481.tif 000022
【図１６】
2018061481.tif 000023
【図１７】
2018061481.tif 000024
【図１８】
2018061481.tif 000025
【図１９】
2018061481.tif 000026
【図２０】
2018061481.tif 000027
【図２１】
2018061481.tif 000028
【図２２】
2018061481.tif 000029
【図２３】
2018061481.tif 000030
【図２４】
2018061481.tif 000031
【図２５】
2018061481.tif 000032
【図２６】
2018061481.tif 000033
【図２７】
2018061481.tif 000034
【図２８】
2018061481.tif 000035
【図２９】
2018061481.tif 000036
【図３０】
2018061481.tif 000037
【図３１】
2018061481.tif 000038
【図３２】
2018061481.tif 000039
【図３３】
2018061481.tif 000040
【図３４】
2018061481.tif 000041
【図３５】
2018061481.tif 000042
【図３６】
2018061481.tif 000043
【図３７】
2018061481.tif 000044
【図３８】
2018061481.tif 000045
【配列表】
2018061481000001.app