(57)【要約】【課題】迅速かつ簡便なFXIII活性の測定方法および該測定のための試薬キットの提供。【解決手段】血漿試料中で、FXIIIの活性により、プラスミンインヒビター（α2-PI)またはMycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）にBAPA（5-ビオチンアミドペンチルアミン）が取り込まれることを利用し、ELISAプレートまたは免疫クロマトグラフィ用ストリップ上に抗α2-PI抗体または抗Myc抗体を固相化し、血漿試料中のα2-PIとBAPAの結合体またはα2-PIMycとBAPAの結合体を捕捉し、α2-PIまたはα2-PIMycを定量することにより、FXIIIの活性を測定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体におけるFXIIIの活性を測定する方法であって、
(i)  被験体から採取した血漿  ５〜50μL
(ii)  BAPA（5-ビオチンアミドペンチルアミン）  １〜５mM
(iii)  カルシウム塩 ２〜10mM
(iv)  DTT（ジチオトレイトール）  １〜５mM
(v)  トロンビン  ５〜15U/mL
(vi)  GPRP（Gly-Prp-Arg-Proアミド)  0.5〜1.5mM
(vii)  Mycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）
を混合し反応させ、血漿中のMycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）にBAPAを取り込ませ、Mycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）に取り込まれたBAPAを定量することを含むFXIIIの活性を測定する方法。
【請求項２】
Mycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）に取り込まれたBAPAの定量を抗Myc抗体および標識したストレプトアビジンまたはアビジンを用いたELISAまたは免疫クロマトグラフィで行う請求項１記載のFXIIIの活性を測定する方法。
【請求項３】
FXIIIの活性を測定することにより被験体におけるFXIIIインヒビターを検出または定量する、請求項１または２に記載のFXIIIの活性を測定する方法。
【請求項４】
(a)  BAPA（5-ビオチンアミドペンチルアミン）
(b)  カルシウム塩
(c)  DTT（ジチオトレイトール）
(d)  トロンビン
(e)  GPRP（Gly-Prp-Arg-Proアミド）
(f)  Mycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）
(g)  標識ストレプトアビジン
(h)  発色基質
及び抗Myc抗体を固相化したELISAプレートもしくは免疫クロマトグラフィ用ストリップを含む、被験体におけるFXIIIの活性を測定するためのキット。
【請求項５】
被験体におけるFXIIIの活性を測定する方法であって、
(i)  被験体から採取した血漿  ５〜50μL
(ii)  BAPA（5-ビオチンアミドペンチルアミン）  １〜５mM
(iii)  カルシウム塩 ２〜10mM
(iv)  DTT（ジチオトレイトール）  １〜５mM
(v)  トロンビン  ５〜15U/mL
(vi)  GPRP（Gly-Prp-Arg-Proアミド）   0.5〜1.5mM
を混合し反応させ、血漿中のα2-PIにBAPAを取り込ませ、α2-PIに取り込まれたBAPAを定量することを含むFXIIIの活性を測定する方法。
【請求項６】
α2-PIに取り込まれたBAPAの定量を抗α2-PI抗体および標識したストレプトアビジンまたはアビジンを用いたELISAまたは免疫クロマトグラフィで行う請求項５記載のFXIIIの活性を測定する方法。
【請求項７】
FXIIIの活性を測定することにより被験体におけるFXIIIインヒビターを検出する、請求項５または６に記載のFXIIIの活性を測定する方法。
【請求項８】
(a)  BAPA（5-ビオチンアミドペンチルアミン）
(b)  カルシウム塩
(c)  DTT（ジチオトレイトール）
(d)  トロンビン
(e)  GPRP（Gly-Prp-Arg-Proアミド）
(f)  標識ストレプトアビジン
(g)  発色基質
及び抗α2-PI抗体を固相化したELISAプレートもしくは免疫クロマトグラフィ用ストリップを含む、被験体におけるFXIIIの活性を測定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、FXIII（F13、凝固第XIII因子)（以下、FXIIIと称する）の活性測定法に関し、ELISAまたは免疫クロマトグラフィを利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
FXIIIは、Aサブユニット二量体とBサブユニット二量体からなる異種四量体として血中を循環しており、トロンビンにより活性化される。FXIIIは、血液凝固の最終段階で作用する因子であり、止血凝固系の最終段階でフィブリン間の架橋を促進し、安定化フィブリン塊を保ち、止血の完了維持と創傷治癒作用に働く。FXIIIをフィブリン安定化因子ともいう。
【０００３】
原因不明の出血傾向が認められるときには、FXIIIの活性を測定する。先天性FXIII因子欠乏症、後天性自己免疫性出血病FXIII/13、クローン病、潰瘍性大腸炎、肝不全、播種性血管内凝固、Schonlein-henoch紫斑病等ではFXIIIの活性が低下する。
従って、これらの疾患の診断にはFXIIIの活性測定が不可欠である(非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】一瀬白帝、日本内科学雑誌、第９９巻、第８号、pp.1934-1943, (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、迅速かつ簡便なFXIII活性の測定方法および該測定のための試薬キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは免疫クロマトグラフィやELISAを利用して迅速かつ簡便にFXIIIの活性を測定し得る方法について鋭意検討を行った。
【０００７】
その結果、血漿試料中で、FXIIIの活性により、プラスミンインヒビター（α2-PI）またはMycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）にBAPA（5-ビオチンアミドペンチルアミン）が取り込まれることを利用し、ELISAプレートまたは免疫クロマトグラフィ用ストリップ上に抗α2-PI抗体または抗Myc抗体を固相化し、血漿試料中のα2-PIまたはα2-PIMycを捕捉し、α2-PIまたはα2-PIMycに結合したBAPAを定量することにより、FXIIIの活性を測定し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  被験体におけるFXIIIの活性を測定する方法であって、
(i)  被験体から採取した血漿  ５〜50μL
(ii)  BAPA（5-ビオチンアミドペンチルアミン）  １〜５mM
(iii)  カルシウム塩 ２〜10mM
(iv)  DTT（ジチオトレイトール）  １〜５mM
(v)  トロンビン  ５〜15U/mL
(vi)  GPRP（Gly-Prp-Arg-Proアミド)  0.5〜1.5mM
(vii)  Mycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）
を混合し反応させ、血漿中のMycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）にBAPAを取り込ませ、Mycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）に取り込まれたBAPAを定量することを含むFXIIIの活性を測定する方法。
[２]  Mycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）に取り込まれたBAPAの定量を抗Myc抗体および標識したストレプトアビジンまたはアビジンを用いたELISAまたは免疫クロマトグラフィで行う[１]のFXIIIの活性を測定する方法。
[３]  FXIIIの活性を測定することにより被験体におけるFXIIIインヒビターを検出または定量する、[１]または[２]のFXIIIの活性を測定する方法。
[４](a)  BAPA（5-ビオチンアミドペンチルアミン）
(b)  カルシウム塩
(c)  DTT（ジチオトレイトール）
(d)  トロンビン
(e)  GPRP（Gly-Prp-Arg-Proアミド）
(f)  Mycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）
(g)  標識ストレプトアビジン
(f)  発色基質
及び抗Myc抗体を固相化したELISAプレートもしくは免疫クロマトグラフィ用ストリップを含む、被験体におけるFXIIIの活性を測定するためのキット。
[５]  被験体におけるFXIIIの活性を測定する方法であって、
(i)  被験体から採取した血漿  ５〜50μL
(ii)  BAPA（5-ビオチンアミドペンチルアミン）  １〜５mM
(iii)  カルシウム塩 ２〜10mM
(iv)  DTT（ジチオトレイトール）  １〜５mM
(v)  トロンビン  ５〜15U/mL
(vi)  GPRP（Gly-Prp-Arg-Proアミド）   0.5〜1.5mM
を混合し反応させ、血漿中のα2-PIにBAPAを取り込ませ、α2-PIに取り込まれたBAPAを定量することを含むFXIIIの活性を測定する方法。
[６]  α2-PIに取り込まれたBAPAの定量を抗α2-PI抗体および標識したストレプトアビジンまたはアビジンを用いたELISAまたは免疫クロマトグラフィで行う[５]のFXIIIの活性を測定する方法。
[７]  FXIIIの活性を測定することにより被験体におけるFXIIIインヒビターを検出する、[５]または[６]のFXIIIの活性を測定する方法。
[８](a)  BAPA（5-ビオチンアミドペンチルアミン）
(b)  カルシウム塩
(c)  DTT（ジチオトレイトール）
(d)  トロンビン
(e)  GPRP（Gly-Prp-Arg-Proアミド)
(f)  標識ストレプトアビジン
(g)  発色基質
及び抗α2-PI抗体を固相化したELISAプレートもしくは免疫クロマトグラフィ用ストリップを含む、被験体におけるFXIIIの活性を測定するためのキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法により、免疫クロマトグラフィまたはELISAを利用して迅速かつ簡便にFXIIIの活性を測定することができる。さらに、自己免疫性出血病FXIII/13（AHFXIII/13）や先天性FXIII/13欠乏症の同種抗体発生時におけるFXIIIインヒビターの検出も可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】フィブリン形成を抑制するFXIII活性化方法（GPRP濃度）の検討結果を示す図である。図１AはGPRP濃度の検討の結果を示し、図１Bは血漿濃度の検討の結果を示す。
【図２−１】抗α2-PI抗体を固相化したプレートを用いて、BAPAを取り込んだα2-PIを捕捉するELISAの結果を示す図である。
【図２−２】図２−１に結果を示す実験のプロトコールを示す図である。
【図３−１】PI-BAPA反応の飽和に達する時間を示す図である。
【図３−２】図３−１に結果を示す実験のプロトコールを示す図である。
【図４−１】PI-BAPA反応がFXIII依存性であることを示す図である。
【図４−２】図４−１に結果を示す実験のプロトコールを示す図である。
【図５】本発明のPI-BAPAアッセイを利用した方法とMDCアッセイとの相関を示す図である。図５Aはトータルの検体のデータを用いた相関を示し、図５Bはとコントロール（健常人）群と後天性F13欠乏症（AF13D）症例群と自己免疫性出血病13（AH13）症例群を分けた場合のそれぞれの相関を示す図である。
【図６−１】正常血漿をAH13症例血漿にて５段階混合希釈を行ったときの、Aa型のAH13-FXIIIインヒビターによる阻害の結果を示す図である。
【図６−２】正常血漿をAH13症例血漿にて５段階混合希釈を行ったときの、Ab型のAH13-FXIIIインヒビターによる阻害の結果を示す図である。
【図７】AH13症例の1:1交差混合試験における阻害率を示す図である。
【図８】PI-BAPA反応について、抗α2-PI抗体を塗布したストリップを用いた免疫クロマトグラフィによる検出の検討のプロトコールを示す図である。
【図９】FXIII欠乏血漿で段階希釈した正常血漿のPI-BAPA反応について免疫クロマトグラフィを行ったときの正常血漿量との直線性を示す図である。図９Aは反応終了液を100倍希釈したときの結果、図９Bは反応終了液を400倍希釈したときの結果、図９Cは反応終了液を800倍希釈したときの結果を示す。
【図１０】免疫クロマトグラフィによるPI-BAPAアッセイにより、1:1交差混合試験によるFXIIIインヒビターによるAa型の阻害（図１０A)およびAb型の阻害（図１０B)の結果を示す図である。
【図１１】ELISAを利用したMyc-BAPAアッセイのプロトコールを示す図である。
【図１２】ELISAを利用したMyc-BAPAアッセイの結果（正常血漿量依存性）を示す図である。
【図１３】α2-PIあるいはフィブリノーゲンを欠乏した血漿を用いた場合のELISAを利用したMyc-BAPAアッセイ（図１３A)とMDCアッセイ（図１３B)との比較を示す図である。
【図１４】正常血漿をAH13症例血漿にて５段階混合希釈を行ったときの、Myc-BAPAアッセイにより測定した、AH13-FXIIIインヒビターによるAa型およびAb型の阻害の結果を示す図である。
【図１５】PI-BAPAアッセイとMDCアッセイの相関（図１５A)、およびMyc-BAPAアッセイとMDCの相関（図１５B）を示す図である。
【図１６】Myc-BAPAアッセイを行うときの反応組成（図１６Aの上）、ELISAによるMyc-BAPAの結果（図１６Aの下）および免疫クロマトグラフィによるMyc-BAPAアッセイの結果（図１６B)を示す図である。
【図１７】「免疫クロマトグラフィによるMyc-BAPAアッセイ」により、1:1交差混合試験によるFXIIIインヒビターによる阻害を示す図である。
【図１８】PI-BAPAアッセイおよびMyc-BAPAアッセイの阻害率、感度及び特異度を示す図である。
【図１９】PI-BAPA反応によるベセスダアッセイの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、FXIIIの活性測定法であり、試料として被験体から採取した血漿または全血、好ましくは血漿を用い、血漿内α2-PI（プラスミンインヒビター）へのアミン取り込み反応（PI-BAPA反応)を利用した方法、及び血漿内Mycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）へのアミン取り込み反応（Myc-BAPA）を利用した方法がある。
【００１２】
公知のFXIIIの活性測定法として、MDC（モノダンシルカタベリン：monodansylcadaverine）取り込みを測定する方法（MDCアッセイ）があった。該方法においては、FXIIIの作用により、MDCが基質であるαカゼインに取り込まれることを利用し、取り込まれたMDCの量を蛍光強度を測定することにより求める。
【００１３】
１．  血漿内α2-PI（プラスミンインヒビター）へのアミン取り込み反応（PI-BAPA反応)を利用した方法
該方法をPI-BAPAアッセイと呼び、例えば、ELISAと組合せた方法をELISAによるPI-BAPAアッセイと呼び、免疫クロマトグラフィを組合せた方法を免疫クロマトグラフィによるPI-BAPAアッセイと呼ぶ。
【００１４】
該方法においては、FXIIIの作用で血漿内のα2-PI（プラスミンインヒビター）にアミンが取り込まれることを利用してFXIIIの活性を測定する際に、抗α2-PI抗体を用いる。
【００１５】
アミンとしては、ビオチンが結合した5-ビオチンアミドペンチルアミン（5-biotinamidopentylamine：BAPA、以下、BAPAと称する)を用いる。
【００１６】
本方法は、最初に
(i)  FXIIIの活性を測定しようとする被験体から採取した血漿
(ii)  BAPA（5-ビオチンアミドペンチルアミン）
(iii)  カルシウム塩
(iv)  DTT（ジチオトレイトール）
(v)  トロンビン
(vi)  GPRP（Gly-Prp-Arg-Proアミド)
を混合し、30〜40℃で５〜60分間反応する。この反応をPI-BAPA反応と呼ぶ。
【００１７】
(i)の血漿は５〜50μL、好ましくは５〜20μL、さらに好ましくは10μL添加する。反応液の総容積に対する容積比は、10〜40(v/v)％、好ましくは15〜25(v/v)％、さらに好ましくは20（v/v)％である。
(ii)のBAPA（5-ビオチンアミドペンチルアミン）の濃度は、１〜５mM、好ましくは１〜３mM、さらに好ましくは２mMである。
(iii)のカルシウム塩としては、塩化カルシウム（CaCl2）、グルコン酸カルシウム等のカルシウム塩を添加して反応液中でCaイオンを生じさせればよい。好ましくはCaCl2を用いる。Ca塩の濃度は、１〜10mM程度であり、例えば、CaCl2を用いる場合、CaCl2の濃度は、２〜10mM、好ましくは３〜７mM、さらに好ましくは５mMである。Caイオンは架橋に必要となる。
(iv)のDTTの濃度は、１〜５mM、好ましくは1.5〜2.5mM、さらに好ましくは２mMである。DTTはFXIIIの活性部位を保護する。DTTの代わりにDTE（ジチオエリトリトール）を用いてもよい。
(v)のトロンビンの濃度は、５〜15U/mL、好ましくは7.5〜12.5U/mL、さらに好ましくは10U/mLである。トロンビンはFXIIIを活性化する。トロンビンはヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の血液由来のものを使用できる。
(vi)のGPRPの濃度は0.5〜1.5mM、好ましくは0.75〜1.25mM、さらに好ましくは１mMである。GPRPはフィブリンの多量体化を抑制する。
【００１８】
反応液の総量は、10〜100μL、好ましくは15〜50μL、さらに好ましくは25μLである。
反応液のpHは、6.5〜8.5、好ましくは７〜８、さらに好ましくは7.5である。pHはトリス、バルビタール、グッドバッファー等の緩衝剤で調整すればよい。
上記の反応条件は、フィブリンのクロットができない条件である。
反応は、EDTAやEGTA等のキレート剤を添加し、Caイオンを除去し停止させる。
【００１９】
反応後、α2-PIに取り込まれたBAPA（α2-PI-BAPA）を定量すればよい。α2-PIに取り込まれたBAPAは抗α2-PI抗体および標識したストレプトアビジンもしくはアビジンを用いた抗原抗体反応を利用して測定することができる。抗α2-PI抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体を用いる。
【００２０】
抗原抗体反応を利用した測定法は、抗α2-PI抗体を固相化し、固相化した抗α2-PI抗体に反応液中のα2-PIに取り込まれたBAPA（α2-PI-BAPA）を結合させる。次いで、発色酵素で標識したアビジンまたはストレプトアビジンを添加し、ビオチンとアビジンの結合反応を利用して固相上に抗α2-PI抗体：α2-PI-BAPA：酵素で標識したアビジンまたはストレプトアビジンの複合体を形成させる（「：」は結合を表す）。発色酵素の基質を加え発色させる。発色の程度を測定することにより、α2-PIに取り込まれたBAPA（α2-PI-BAPA）を定量することができ、定量値によりFXIIIの活性を求めることができる。
【００２１】
酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼを用いることができ、前者の基質としてTMB（3,3',5,5'-テトラメチルベンチジン）等が挙げられ、後者の基質として、NBT（4-ニトロブルーテトラゾリウムクロライド）とBCIP（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸）混合液等が挙げられる。
【００２２】
抗原抗体反応を利用した測定法として、ELISAまたは免疫クロマトグラフィが挙げられる。
ELISAは、例えば以下の工程で行うことができる。
抗α2-PI抗体を固相化したポリスチレン等でできたマイクロタイタープレートにPI-BAPA反応の反応液を添加し、抗原・抗体反応により固相化した抗α2-PI抗体とBAPAが取り込まれたα2-PI（α2-PI-BAPA）の複合体を形成させる。さらに酵素標識したストレプトアビジンまたはアビジンを添加し、BAPAのビオチンとストレプトアビジンまたはアビジンを結合させ、プレート上に抗α2-PI抗体：α2-PI-BAPA：酵素で標識したアビジンまたはストレプトアビジンの複合体を形成させる（「：」は結合を表す）。洗浄後、酵素基質と反応・発色させ、吸光度を測定して反応液中のα2-PI-BAPAを検出することができる。α2-PI-BAPAの定量値から被験血漿中のFXIIIの活性を求めることができる。
【００２３】
ELISA法において、抗α2-PI抗体溶液を数百ng〜数十μg/ウェルの濃度でELISA用プレートのウェルに添加し、１時間から十数時間、好ましくは１〜数時間インキュベートし、吸着により固相化する。固相化したウェルに添加する反応液の量は数μL〜数十μLである。
【００２４】
結合反応は４℃〜45℃、好ましくは20℃〜40℃、さらに好ましくは25℃〜38℃で行うことができ、また、反応時間は、10分〜十数時間、より好ましくは10分〜数時間、さらに好ましくは30分〜1時間程度である。
【００２５】
免疫クロマトグラフィは、例えば、以下の工程で行うことができる。
抗α2-PI抗体が固相化された検出領域を有する固相支持体（ストリップ）に反応液を展開させ、抗原・抗体反応により検出領域に固相化した抗α2-PI抗体とBAPAが取り込まれたα2-PI（α2-PI-BAPA）の複合体を形成させる。次いで、酵素標識したストレプトアビジンまたはアビジンを展開させ、BAPAのビオチンとストレプトアビジンまたはアビジンを結合させ、検出領域上に抗α2-PI抗体：α2-PI-BAPA：酵素で標識したアビジンまたはストレプトアビジンの複合体を形成させる（「：」は結合を表す）。洗浄後、酵素基質を展開させ、検出領域で反応・発色させ、発色の強さを定量すればよい。反応液や酵素標識したストレプトアビジンもしくはアビジンはストリップに添加してもよいし、反応液や酵素標識したストレプトアビジンもしくはアビジンを入れた容器にストリップの一端を浸してもよい。
【００２６】
酵素で標識したアビジンまたはストレプトアビジンの代りに、着色ポリスチレン粒子や金コロイド等の着色された標識物質で標識したアビジンまたはストレプトアビジンを用いてもよい。この場合、酵素反応を行わせることなく、検出領域に標識用の着色された標識物質が集積するので発色する。また、標識したアビジンまたはストレプトアビジンはあらかじめストリップ上の検出領域と反応液を添加する領域の間に固相化しておいてもよい。この場合、反応液を展開するときに反応液により標識したアビジンまたはストレプトアビジンが溶解し、反応液と一緒に展開され、検出領域で複合体を形成する。
【００２７】
抗α2-PI抗体等のストリップへの固相化は、抗α2-PI抗体溶液等をストリップ上に塗布し、吸着させることにより行うことができる。
【００２８】
免疫クロマトグラフィは、５〜３５℃、好ましくは室温で行うことができ、試料を添加後数分で判定することができる。
【００２９】
免疫クロマトグラフィで用いる固相支持体の材料は毛管現象により試料が吸収され展開流動し得るものであれば限定されない。例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、ポリスチレン等の天然、合成ポリマー、又はこれらの混合物を用いることができる。固相支持体は好ましくは短冊状のストリップの形状を有する。
免疫クロマトグラフィにおいて、添加する試料の量は数十μL〜数百μLである。
【００３０】
本発明の方法で測定したときに、α2-PIに取り込まれたBAPA量が多いほど、すなわち、α2-PI-BAPAの定量値の定量値が大きいほど、被験血漿中のFXIII活性は高いと判断できる。
【００３１】
２．  Mycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）へのアミン取り込み反応（Myc-BAPA反応)を利用した方法
該方法をMyc-BAPAアッセイと呼び、例えば、ELISAと組合せた方法をELISAによるMyc-BAPAアッセイと呼び、免疫クロマトグラフィを組合せた不法を免疫クロマトグラフィによるMyc-BAPAアッセイと呼ぶ。
【００３２】
該方法においては、FXIIIの作用で、血漿内に添加したc-Mycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）にアミンが取り込まれることを利用してFXIIIの活性を測定する際に、抗Myc抗体を用いる。
【００３３】
アミンとしては、ビオチンが結合した5-ビオチンアミドペンチルアミン（5-biotinamidopentylamine：BAPA、以下、BAPAと称する)を用いる。
【００３４】
Mycタグをα2-PIに付加する際は、α2-PIのコードするcDNAにc-Mycエピトープタグ配列（ATGGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGGAGGACCTG（配列番号１））を連結し、融合タンパク質として発現させればよい。
【００３５】
本方法は、最初に
(i)  FXIIIの活性を測定しようとする被験体から採取した血漿
(ii)  BAPA（5-ビオチンアミドペンチルアミン）
(iii)  カルシウム塩
(iv)  DTT（ジチオトレイトール）
(v)  トロンビン
(vi)  GPRP（Gly-Prp-Arg-Proアミド)
(vii)  Mycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）
を混合し、30〜40℃で５〜60分間反応する。この反応をMyc-BAPA反応と呼ぶ。
【００３６】
(i)の血漿はTBS等の緩衝液で数倍、好ましくは５倍希釈し、２〜20μL、好ましくは2.5〜10μL、さらに好ましくは５μL添加する。反応液の総容積に対する血漿の容積比は、低い方がクロットを生じにくいので好ましい。例えば、５〜30(v/v)％、好ましくは５〜25(v/v)％、さらに好ましくは５〜20（v/v）％である。
(ii)のBAPA（5-ビオチンアミドペンチルアミン）の濃度は、１〜５mM、好ましくは１〜３mM、さらに好ましくは２mMである。
(iii)のカルシウム塩としては、塩化カルシウム（CaCl2）、グルコン酸カルシウム等のカルシウム塩を添加して反応液中でCaイオンを生じさせればよい。好ましくはCaCl2を用いる。Ca塩の濃度は、１〜10mM程度であり、例えば、CaCl2を用いる場合、CaCl2の濃度は、２〜10mM、好ましくは３〜７mM、さらに好ましくは５mMである。Caイオンは架橋に必要となる。
(iv)のDTTの濃度は、１〜５mM、好ましくは1.5〜2.5mM、さらに好ましくは２mMである。DTTはFXIIIの活性部位を保護する。DTTの代わりにDTE（ジチオエリトリトール）を用いてもよい。
(v)のトロンビンの濃度は、５〜15U/mL、好ましくは7.5〜12.5U/mL、さらに好ましくは10U/mLである。トロンビンはFXIIIを活性化する。トロンビンはFXIIIを活性化する。トロンビンはヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の血液由来のものを使用できる。
(vi)のGPRPの濃度は0.5〜1.5mM、好ましくは0.75〜1.25mM、さらに好ましくは1.1mMである。GPRPはフィブリンの多量体化を抑制する。
(vii)のMycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）の添加量は2U/mLの標品を２〜10μL、好ましくは２〜６μL、さらに好ましくは４μLである。すなわち、濃度は４mU/mL〜20mU/mL、好ましくは４mU/mL〜12mU/mL、さらに好ましくは8mU/mLである。
【００３７】
反応液の総量は、10〜100μL、好ましくは15〜50μL、さらに好ましくは25μLである。
反応液のpHは、6.5〜8.5、好ましくは７〜８、さらに好ましくは7.5である。pHはトリス、バルビタール、グッドバッファー等の緩衝剤で調整すればよい。
上記の反応条件は、フィブリンのクロットができない条件である。
反応は、EDTAやEGTA等のキレート剤を添加し、Caイオンを除去し停止させる。
【００３８】
反応後、Mycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）に取り込まれたBAPAを定量すればよい。Mycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）に取り込まれたBAPAは抗Myc抗体及び標識したストレプトアビジンまたはアビジンを用いた抗原抗体反応を利用して測定することができる。抗Myc抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体を用いる。
【００３９】
抗原抗体反応を利用した測定法は、抗Myc抗体を固相化し、固相化した抗Myc抗体に反応液中のBAPAが取り込まれたMycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）を結合させる。次いで、発色酵素で標識したアビジンまたはストレプトアビジンを添加し、ビオチンとアビジンの反応を利用して固相上に抗Myc抗体：Mycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）：酵素で標識したアビジンまたはストレプトアビジンの複合体を形成させる（「：」は結合を表す）。発色酵素の基質を加え発色させる。発色の程度を測定することにより、Mycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）に取り込まれたBAPAを定量することができ、定量値によりFXIIIの活性を求めることができる。
【００４０】
抗原抗体反応を利用した測定法としては、ELISAまたは免疫クロマトグラフィが挙げられる。これらの方法は、（１）のELISAによるPI-BAPAアッセイ、または免疫クロマトグラフィによるPI-BAPAアッセイにおいて、抗α2-PI抗体の代りに抗Myc抗体を用いればよい。
【００４１】
３．  本発明の方法の用途
（１）  FXIIIの活性測定
本発明のELISAによるPI-BAPAアッセイ、免疫クロマトグラフィによるPI-BAPAアッセイ、ELISAによるMyc-BAPAアッセイ、免疫クロマトグラフィによるMyc-BAPAアッセイにより、被験体から採取した血漿中のFXIII活性を測定することができる。
FXIII因子の活性が低いと止血栓が弱くなり、溶けやすくなる。
【００４２】
被験体において原因不明の出血傾向が認められるとき本発明の方法でFXIII活性を測定すればよく、FXIII活性が低い場合、被験体は先天性FXIII因子欠乏症、後天性自己免疫性出血病FXIII/13、クローン病、潰瘍性大腸炎、肝不全、播種性血管内凝固、Schonlein-henoch紫斑病等に罹患している可能性があると判断することができる。
【００４３】
（２）  FXIIIインヒビターの検出
FXIIIインヒビターとは、FXIIIに対する自己抗体が作られてFXIIIが働かなくなることをいう。FXIIIには、AサブユニットとBサブユニットがあり、どちらに対しても自己抗体が作られる。
【００４４】
本発明のELISAによるPI-BAPAアッセイ、免疫クロマトグラフィによるPI-BAPAアッセイ、ELISAによるMyc-BAPAアッセイ、免疫クロマトグラフィによるMyc-BAPAアッセイにより、被験体におけるFXIIIインヒビターを検出することができる。
【００４５】
特に自己免疫性出血病FXIII/13（AHFXIII/13）はFXIIIインヒビター（自己抗体）によるので、FXIIIインヒビターの検出により、自己免疫性出血病FXIII/13の診断が可能になる。また、自己免疫性出血病FXIII/13においては、自己抗体がFXIIIのＡサブユニット（FXIII-A）を認識してFXIIIの活性化を阻害するAa型や自己抗体が活性化FXIIIを認識してFXIIIの活性を阻害するAb型等に分けられる。
【００４６】
FXIIIインヒビターは患者の血漿と健常人の正常血漿を用いた1:1 交差混合試験により検出することができる。すなわち患者の血漿、正常血漿および患者の血漿と正常血漿を１：１で混合した血漿について、本発明の方法でFXIIIの活性を測定する。患者の血漿と正常血漿を１：１で混合した血漿について、FXIII活性が患者血漿と正常血漿の平均より低くなり、活性の阻害が認められる場合に、患者においてFXIIIインヒビターが検出されたと判断することができる。自己免疫性出血病FXIII/13のAa型、Ab型のいずれについてもFXIIIインヒビターを検出することができる。
【００４７】
さらに、FXIIIインヒビターは患者の血漿と健常人の正常血漿を用いた５段階希釈混合試験によっても検出することができる。５段階希釈混合試験においては、正常人の血漿と患者の血漿とを1:0、1:3、1:1、3:1、0:1で混合し、それぞれについて本発明の方法でFXIIIの活性を測定する。希釈度を横軸にとって、FXIII活性を縦軸にとって、値をプロットしたときに、プロットを結んだ線分が下向きに凸になった場合を「因子欠乏型」ではなくて、「インヒビター型」といい、FXIIIインヒビターが検出されたと判断することができる。すなわち、FXIII活性の低下が「インヒビター型」であるか「因子欠乏型」であるかを区別することもできる。
【００４８】
（３）  FXIIIインヒビター力価の定量
本発明のELISAによるPI-BAPAアッセイ、免疫クロマトグラフィによるPI-BAPAアッセイ、ELISAによるMyc-BAPAアッセイ、免疫クロマトグラフィによるMyc-BAPAアッセイにより、被験体におけるFXIIIインヒビター力価を定量することができる（いわゆるベセスダ法）。
【００４９】
ベセスダ法でインヒビター力価を定量する場合は，段階希釈した被験血漿と正常血漿を１:1で混合し，37℃で2時間加温後に残存FXIII活性を測定する．残存FXIII活性が 50％になる希釈倍率で得られたインヒビター力価に，その希釈倍率を乗じて最終インヒビター力価とする。正確なインヒビター力価を得るためには、残存FXIII活性が25〜75％に入るように被験血漿を段階希釈すると良い。
【００５０】
（４）  FXIII活性測定用キット
本発明は、FXIII活性測定用キットも包含する。該キットは、ELISAによるMyc-BAPAアッセイ、免疫クロマトグラフィによるMyc-BAPAアッセイ、ELISAによるPI-BAPAアッセイ、および免疫クロマトグラフィによるPI-BAPAアッセイを含む。
【００５１】
Myc-BAPAアッセイ用キットは、
(a)  BAPA（5-ビオチンアミドペンチルアミン）
(b)  カルシウム塩
(c)  DTT（ジチオトレイトール）
(d)  トロンビン
(e)  GPRP（Gly-Prp-Arg-Proアミド）
(f)  Mycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）
(g)  標識ストレプトアビジン
(h)  発色基質
及び抗Myc抗体を固相化したELISAプレートもしくは免疫クロマトグラフィ用ストリップを含む。
【００５２】
PI-BAPAアッセイ用キットは、
(a)  BAPA（5-ビオチンアミドペンチルアミン）
(b)  カルシウム塩
(c)  DTT（ジチオトレイトール）
(d)  トロンビン
(e)  GPRP（Gly-Prp-Arg-Proアミド)
(f)  標識ストレプトアビジン
(g)  発色基質
及び抗α2-PI抗体を固相化したELISAプレートもしくは免疫クロマトグラフィ用ストリップを含む。
【００５３】
上記キットにおける、各試薬の濃度等は「１．  血漿内α2-PI（プラスミンインヒビター）へのアミン取り込み反応（PI-BAPA反応)を利用した方法」、および「２．  Mycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）へのアミン取り込み反応（Myc-BAPA反応)を利用した方法」に記載のとおりである。
【００５４】
(a)から(h)または(a)から(g)の試薬は、別々の容器に含まれていてもよいし、複数または全ての試薬が同じ容器に含まれていてもよい。
【実施例】
【００５５】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５６】
以下の実施例において、％は、特に断らない場合はw/v％を示す。
本実施例で用いた材料は以下のとおりである。
【００５７】
5-ビオチンアミドペンチルアミン（5-biotinamidopentylamine：BAPA)(EZ-link pentylamine-biotin, Cat. No. 21345)はThermo Scinentific社（Rockford, IL, USA）より購入した。
【００５８】
ヤギ抗ヒトα2-プラスミンインヒビター（α2-PI）抗体（Cat. No. GA2AP-AP）は、Affinity Biologicals社（Ancaster, ON, Canada）より入手した。
【００５９】
西洋わさび由来ペルオキシダーゼ(HRP)標識ストレプトアビジン（Cat. No. RPN1231）は、GE Healthcare社（Bioscience AB, Uppsala, Sweden）から購入した。
【００６０】
アルカリホスファターゼ（AP）標識ストレプトアビジン（Cat. No. AR001）は、R&D Systems社（Minneapolis, MN, USA）から入手した。
【００６１】
テトラメチルベンチジン（Tetramethylbinzidine） (TMB)パーオキシダーゼEIA複合体基質キット（Cat. No. 1721067）および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸（5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate p-toluidine salt (BCIP)）、4-ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（p-nitro blue tetrazolium chloride (NBT)） AP発色キット（Cat. No. 1706432）は、Bio-Rad社（Hercules, CA, USA）より購入した。
【００６２】
Nジメチルカゼイン（N,N-dimethylcasein）(Cat. No. C9801),モノダンシルカタベリン（monodansylcadaverine；MDC, Cat. No. D4008), Gly-Pro-Arg-Pro amide (GPRP, Cat. No. G5779)およびウシ血漿由来トロンビン（Cat. No. T4648）は Sigma-Aldrich社（St. Louis, MO, USA）より購入した。
抗c-Myc抗体（Cat. No. 04362-34）はナカライテスク社（京都、日本）から入手した。
【００６３】
[比較例]  MDC取り込み反応（MDCアッセイ）（Lorand-Urayama法）
10μLの血漿に、50μLの0.4% N,N-dimethylcasein (終濃度 0.2%)、25μL 2 mM MDC(終濃度0.5 mM)、0.2μL 1 M dithiothreitol (DTT, 終濃度 2 mM)、0.5μL 1 M CaCl2(終濃度 5 mM)、1μL 1kU/mLトロンビン（終濃度10 U/mL）を混合し、13.3μLの150 mM NaClを含む20 mM Tris (pH 7.5)(TBS)で全量0.1 mLの反応液とした。37℃で30分間反応し、0.1 mL 10%トリクロロ酢酸を加えて反応を停止した。10,000xgで５分間遠心して沈殿を回収し、0.3 mLのエタノール・エーテル1:1混合液で３回洗浄後、0.3 mLの8 M尿素、1% SDS、50 mM Tris (pH 8.0)に溶解して、360 nmの励起光における520 nmの蛍光を測定した。
【００６４】
[実施例１]  血漿内α2-PIへのアミン取り込み反応（PI-BAPA反応）を利用した方法
[方法]
（１）  血漿内α2-PIへのアミン取り込み反応（PI-BAPA反応）
5μLの血漿に、0.5μL 0.1 M BAPA（終濃度2 mM）、0.5μL 0.1 M DTT (終濃度 2 mM)、1.25μL 0.1 M CaCl2 （終濃度 5 mM）、2.5μL 11 mM GPRP (終濃度 1.1 mM)、0.25μL 1kU/mL トロンビン（終濃度 10 U/mL）と15μL 150 mM NaClを含む20 mM Tris (pH 7.5) (TBS)を加えて全量25μLとし、37℃で５分間インキュベートした．反応は、0.5 mLの 10 mM EDTAを含むTBSを添加して停止させた。
【００６５】
（２）  ELISAによるPI-BAPAアッセイ（図２）
50 mM Na2CO3で2,000倍に希釈した抗α2-PI抗体0.1 mLを96穴プレートに入れ、抗α2-PI抗体を固相化した。PI-BAPA反応終了液10μLを、90μLの2%牛血清アルブミン（BSA）を含むTBSとともに抗α2-PI抗体プレートに入れ、37℃で１時間インキュベートした。0.1% Tween 20を含むTBS (TBS-T)0.15 mLで５回洗浄後、2% BSA-TBSで2,000倍に希釈したHRP標識ストレプトアビジン0.1 mLを入れて、室温で１時間インキュベートした。0.15 mL TBS-Tで５回洗浄後、0.1 mL TMB基質液と37℃で５分間反応させた．50μLの0.3 M 硫酸を入れて反応を停止後、450 nmの吸光度を測定した。
【００６６】
（３）  免疫クロマトグラフィによるPI-BAPAアッセイ
TBSで800倍に希釈したPI-BAPA反応終了液40μLを、抗α2PI抗体を塗布したニトロセルロース膜ストリップ（株式会社キューメイ研究所にて作製）に37℃で５分間展開した。0.1 mLのTBS-Tで５分間、３回洗浄後、TBSで100倍希釈したAP標識ストレプトアビジン 50μLを37℃で10分間展開した。0.1 mLのTBS-Tで５分間、３回洗浄後、0.1 mLのAP基質（NBT-BCIP）を37℃で10分間展開し、発色した。蒸留水で10分間洗浄した後、自動濃度読み取り機にて発色度を測定した。
【００６７】
［結果］
ELISAによるPI-BAPAアッセイの確立
ELISAや免疫クロマトグラフィにて血漿のFXIII活性を測定する際、フィブリン形成に大きく妨害されることが予想された。そこで、まず、フィブリン形成を抑制するFXIII活性化方法について検討した。フィブリン多量体化を抑制するGPRP存在化でトロンビンによる活性化を行った場合、血漿濃度10%の反応液において、GPRP 0.1 mM では反応液がゲル化したが、1 mMではクロットの形成は認められなかった（図１A、MDC取り込み）。1 mM GPRP存在化で、血漿濃度20%までは反応液のゲル化は抑制されたが、50%ではクロット化した（図１B、PI-BAPA反応）。高濃度のカルシウムがトロンビン非依存性にFXIIIを活性化することが知られているが、反応液のゲル化は起こらないものの、トロンビンで活性化させた場合と比べてFXIIIの活性化効率は極めて低かった（図１Aの100 mMのカルシウムを用いた場合）。
【００６８】
血漿中のα2-PIに、FXIII依存性にBAPAが取り込まれ、かつ抗α2-PI抗体でビオチン化したα2-PIが捕捉されるかを、ELISAにて検討した。プロトコールを図２−２に示す。1 mM GPRP存在化、血漿濃度10%の反応液で20分間反応し、抗α2-PI抗体固相化プレートに捕捉されるビオチン標識タンパク質をHRP標識ストレプトアビジンで検出を試みたところ、発色が確認された。正常血漿にトランスグルタミナーゼ阻害剤（iodoacetamide）を添加した反応液、FXIIIあるいはα2-PI欠乏血漿での反応液ではいずれも発色しないことから、FXIIIによるα2-PIへのBAPA取り込みであることが確認された。1μg/mLの抗α2-PI抗体溶液0.1 mLを固相化したプレートにおいて、おおよそ0.3μLまでの正常血漿に含まれるα2-PIを捕捉できることを確認した（図２−１）。また、反応が飽和に達する時間について検討を行った。プロトコールを図３−２に示す。PI-BAPA反応は10分でほぼ飽和に達しており（図３−１）、この結果より、反応時間を５分間と決定した。
【００６９】
上述の検討等から、PI-BAPAの反応およびELISAの反応条件を以下のように決定した。
(a)  反応組成: 20%(v/v)血漿、2 mM BAPA, 2 mM DTT, 5 mM CaCl2, 1 mM GPRP, 10 U/mL トロンビン
通常はトータルの反応液量は25μLであるので、５μLの血漿を用いる。
(b)  反応条件：37℃、５分間
0.5mLの10mM EDTA-TBS添加で反応を停止する（20倍希釈）。
(c)  ELISA条件
(i)  0.1μg/wellでウェルに抗α2PI抗体を添加して１時間インキュベートして固相化を行う。
(ii)  上記の反応停止液（10 mM EDTA-TBS）で20倍希釈した反応液10μLをプレートのウェルに添加する。
(iii)  TBS-Tで５回洗浄後、１％ BSA-TBSで2,000倍希釈したHRP標識ストレプトアビジン0.1mLを添加し、１時間インキュベートする。
(iv)  TBS-Tで５回洗浄後、TMB（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)0.1mLを添加し、５分間反応させる。
(v)  0.3M硫酸を添加し反応を停止し、450nmの吸光度を測定する。
【００７０】
決定した反応条件では、FXIII欠乏血漿で正常血漿を段階的に希釈した場合(図４−２にプロトコールを示す)、正常血漿の濃度に対して直線的な反応を示した（図４−１）。この結果は、PI-BAPA反応がFXIII依存性であることを示す。また、繰り返し反応における変動係数は5.7%と、安定した測定値を示すことを確認した（データは示さない）。また、トータルの検体のデータを用いた場合、従来のMDC法とおおよそ良好な相関を示した(図５A)。しかし、コントロール（健常人）群と後天性F13欠乏症（AF13D）症例群と自己免疫性出血病XIII/13（AH13）症例群を分けた場合、特に自己免疫性出血病XIII/13（AH13）症例群において、より低値を示す傾向にあった（図５B）。
【００７１】
PI-BAPAアッセイによるAH13-FXIIIインヒビターの検出を検討した。正常血漿をAH13症例血漿にて５段階混合希釈を行ったところ、Aa型、Ab型ともに、良好な阻害パターンを示した（図６−１（AH13 Aa型）および図６−２（AH13 Ab型））。
【００７２】
1:1交差混合試験における阻害率を従来の活性測定法と比較したところ、AH13症例全体にアンモニア放出法（AR）とほぼ同等の高い阻害率を示し、特にARでは阻害が検出困難なAb型でも高い阻害率を認めた（図７）。
【００７３】
免疫クロマトグラフィによるPI-BAPAアッセイ
PI-BAPA反応について、抗α2-PI抗体を塗布したストリップを用いた免疫クロマトグラフィによる検出を検討した。プロトコールを図８に示す。展開する反応終了液量（濃度）について、まず10倍ずつ希釈したところ、10倍希釈した場合に強い発色が見られ、1,000倍希釈まで検出可能であった。血漿（FXIII）量に対する直線性を確認するため、FXIII欠乏血漿で段階希釈した正常血漿のPI-BAPA反応について免疫クロマトグラフィを行ったところ、反応終了液800倍希釈(図９C)において、正常血漿量との直線性が示された（図９）。
【００７４】
さらに、1:1交差混合試験によるFXIIIインヒビターの検出を試みたところ、Aa型(図１０A）、Ab型(図１０B)とも、免疫クロマトグラフィにおいても阻害が検出された（図１０）。図１０中、Pは患者の血漿を示し、Cは健常人の正常血漿を示し、１：１は患者の血漿と正常人の血漿を１：１で混合したことを示す。すなわち、1:1交差混合試験によりFXIIIインヒビターを検出することが可能であった。
【００７５】
最終的にPI-BAPAの反応および免疫クロマトグラフィの反応条件を以下のように決定した。
(a)  反応組成: 20%血漿、2 mM BAPA, 2 mM DTT, 5 mM CaCl2, 1 mM GPRP, 10 U/mL トロンビン
通常はトータルの反応液量は25μLであるので、５μLの血漿を用いる。
反応組成は、ELISAを行う方法の場合と同じである。
(b)  反応条件：37℃、５分間
0.5mLの10mM EDTA-TBS添加で反応を停止する。
(c)  イムノクロマトグラフィーの条件
(i)  反応停止液をTBSで800倍希釈する。
(ii)  40μLを抗α2PI抗体を固相化したストリップに展開させる（37℃、10分間）。
(iii)  0.1mL TBS-Tで洗浄する（５分間、３回）。
(iv)  50mL AP標識ストレプトアビジン（100倍希釈液）を展開させる（37℃、10分間)。
(v)  0.1mL TBS-Tで洗浄する（５分間、３回）。
(vi)  0.1mL NBS-BCIP基質液を展開させ発色させる（37℃、10分間）。
(vii)  H2Oで10分間洗浄し、発色を確認する。
【００７６】
[実施例２]  血漿内α2-PIMycへのアミン取り込み反応（Myc-BAPA反応）
（１）Mycタグ付加α2-PI（α2-PIMyc）の作製
α2-PI cDNA（開始Met〜Lys-464）は、ヒト肝臓mRNAを鋳型として、プライマーA2PI-BF: 5’-cagcaaggatcccgcagaggaacATGgcgc-3’(配列番号２） (下線はBamHI切断配列、大文字は開始コドン)、A2PI-XR: 5’-cggcctcgagcttggggctgccaaactggg-3’(配列番号３）（下線はXhoI切断配列）を用いてRT-PCRにより増幅した。BamHIとXhoIで切断したcDNA断片をc-Mycエピトープタグ配列とともに発現ベクターpcDNA3に挿入した。発現ベクターを導入したBaby hamster kidney (BHK)細胞をgeneticinで選別し、α2-PIMyc高発現細胞株を樹立した．α2-PIMyc高発現細胞を培養した無血清D-MEM培地を回収し、30%硫安で生じた沈殿を除去後、終濃度70%硫安でα2-PIMycを沈殿させた。TBSに溶解し、透析脱塩した溶液をα2-PIMyc標品とした。段階希釈した正常プール血漿（n=17）を標準（1U/mL）として、Western blottingにより2U/mLと定量した。
【００７７】
（２）血漿中のα2-PIMycへのアミン取り込み反応（Myc-BAPA反応）
TBSで５倍希釈した血漿５μLに、0.5μL 0.1 M BAPA（終濃度2 mM）、0.5μL 0.1 M DTT (終濃度2 mM)、1.25μL 0.1 M CaCl2 （終濃度 5 mM）、2.5μL 11 mM GPRP (終濃度 1.1 mM)、0.25μL 1kU/mL トロンビン（終濃度 10 U/mL）および４μL α2-PIMyc標品を加えて、11μL TBSにて全量25μLの反応液を調製した。37℃で５分間インキュベート後、0.5 mLの 10 mM EDTAを含むTBSを添加して反応を停止させた。
【００７８】
（３）ELISAによるMyc-BAPA測定
50 mM Na2CO3で2,000倍に希釈した抗c-Myc抗体0.1 mLを96穴プレートに入れ、抗c-Myc抗体を固相化した。Myc-BAPA反応終了液0.1 mLを抗c-Myc抗体プレートに入れ、37℃で１時間インキュベートした。0.1% Tween 20を含むTBS(TBS-T) 0.15 mLで５回洗浄後、2% BSA-TBSで2,000倍に希釈したHRP標識ストレプトアビジン0.1 mLを入れて、室温で１時間インキュベートした。0.15 mL TBS-Tで５回洗浄後、0.1 mL TMB基質液と37℃で５分間反応させた．50μLの0.3 M 硫酸を入れて反応を停止後、450 nmの吸光度を測定した。
【００７９】
[結果]
Myc-BAPAアッセイ
PI-BAPAアッセイでは血漿中に内在するα2-PIを基質とするため、血漿α2-PI濃度に大きく影響を受ける。反応における検体毎のα2-PI濃度を一定にし、かつ内在のα2-PIおよびその他の基質タンパク質の影響を低減させるため、Mycタグを付加したα2-PI（α2-PIMyc）を用い、より少量（低濃度）の血漿での反応を検討した（Myc-BAPA反応、図１１）。抗c-Myc抗体を用いたELISAにおいて、FXIII活性およびα2-PIMycに依存した発色が確認された（図１２）。α2-PIあるいはフィブリノーゲンを欠乏した血漿(図１２においては、それぞれ「α2-PI(-)」、「Fbg(-)」で表す）においてもMDCアッセイとよく一致した測定が認められた（図１３）。FXIII-Aを欠乏した血漿では発色は認められなかった(図１２のFXIII-A(-))。
【００８０】
5段階希釈混合試験において、Aa型、Ab型とも阻害パターンが示され（図１４）、PI-BAPAアッセイおよびMDC アッセイともおおよそ良好な相関を示したものの（図１５Aおよび図１５B）、測定のバックグランド値が高く、1:1交差混合試験での阻害率はPI-BAPA アッセイとくらべて低値となった(図７)。
【００８１】
抗c-Myc抗体を塗布したストリップによる免疫クロマトグラフィによるMycアッセイは、図１６Aの上に示す反応組成で行った。図１６Aの下にELISAによるMycアッセイによる測定結果を示し、図１６Bに免疫クロマトグラフィによるMycアッセイの結果を示す。Myc-BAPA反応液を抗α2-PI抗体ストリップでクロマトグラフした場合、PI-BAPA反応と同様正常血漿量に対する良好な直線性が示された（図１６B）。さらに、1:1交差混合試験によるFXIIIインヒビターの検出を試みたところ、FXIIIインヒビターの検出も認められた（図１７）。すなわち、1:1交差混合試験によりFXIIIインヒビターを検出することが可能であった。
【００８２】
以上の検討から、α2-PIを十分量補充し、血漿濃度を低く抑えて反応を行うことで、FXIII活性に完全に依存したα2-PIへのビオチン化（BAPA取り込み）が可能となること、抗α2-PI抗体を用いた免疫クロマトグラフィによる定量的な測定が可能であることが示された。
【００８３】
図１８に、PI-BAPAアッセイおよびMyc-アッセイの阻害率、感度及び特異度を示す。いずれも良好な結果が得られた。
【００８４】
[実施例３]  PI-BAPAによるベセスダアッセイ
[方法]
FXIII欠乏血漿で1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64に希釈した患者血漿５μLを健常者プール血漿５μLと混合し、37℃で２時間インキュベートした。５μLの混合血漿について、PI-BAPA反応を行った。10 mM EDTAを含むTBS 0.5 mLを加えて反応を停止した液10μLについて、ELISAによるPI-BAPA測定を行い、解析ソフトウエア Prism 7を用いてベセスダ単位（BU）を算出した。
【００８５】
[結果]
インヒビター力価を求めるため、PI-BAPA反応によるベセスダアッセイを行った。アンモニア放出(AR)法でのベセスダ単位（BU）がそれぞれ高値（118.5）、中等度の値（20.1）を示した症例17、46について、ELISA測定により検討した。高BUの症例17はPI-BAPA反応でも強い阻害が確認され、そのBUは83.5と算出された（図１９）。AR法でのBUと同様に、症例46検体のPI-BAPA反応でも中程度の阻害が認められたが、算出されたBU値はAR法と比べていずれの症例ともに低値であった。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明の方法により、出血傾向が認められる疾患の原因解明が可能になる。
【配列表フリーテキスト】
【００８７】
配列番号２、３  プライマー
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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