(57)【要約】【課題】従来の培養器はプラズマ滅菌、あるいはプラズマ表面処理によりポリスチレンラジカルなどが残存し生育が抑制されていた。【解決手段】プラズマ滅菌、あるいはプラズマ表面処理されたディスポーザブル培養器に残留したラジカル種を洗浄除去することで微生物や細胞の生育を改善する方法、およびこの方法でラジカル種が洗浄所除去され生育が改善された培養器を提供する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラズマ滅菌、あるいはプラズマ表面処理されたディスポーザブル培養器に残留したラジカル種を洗浄除去することで微生物や細胞の生育を改善する方法。
【請求項２】
少なくとも、プラズマ滅菌あるいはプラズマ表面処理されたディスポーザブル培養器を水あるいは培地で洗浄する工程を含む、微生物や細胞の生育が改善された培養器の製造方法。
【請求項３】
ラジカル種が除去された、微生物や細胞の生育が改善された培養器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、生育性に優れた培養容器およびその培養容器の製造方法、生育性の改善方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  微生物や動物細胞の培養容器はかつてはガラス製のものが用いられ、使用前にオートクレーブや感熱滅菌などで滅菌処理して繰り返し使われていたが、近年では作業の効率化や均質化のために、あらかじめ滅菌されたポリスチレンなどのプラスチック製のものがディスポーザブル培養容器として広く用いられている。【０００３】  プラスチック製ディスポーザブル培養器の滅菌方法はかつては放射線滅菌やＥＯＧガスによる滅菌が主流であったが、コストの問題や作業者・環境への配慮および細胞培養時の細胞付着性改善のための表面処理の必要性から現在ではそのほとんどがプラズマ滅菌に置き換わっている。【０００４】  プラズマ滅菌されたディスポーザブル培養器は現在、何の疑いもなく何ら処理がなされることなく、各種の微生物や動物細胞の培養器として使用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  本発明者らは、プラズマ滅菌されたディスポーザブル培養器を用いた培養が従来の熱滅菌、放射線滅菌、ＥＯＧガスによる滅菌による培養器を用いた培養に比べて各種の微生物や動物細胞生育が劣ることを見いだし、その改善方法を検討し、プラズマ滅菌を用いているにもかかわらず従来の熱滅菌、放射線滅菌、ＥＯＧガスによる滅菌に劣らない生育が確保できるディスポーザブル培養器の調整法を見いだし、生育に優れたプラズマ滅菌ディスポーザブル培養器を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  本発明者らは、プラズマ滅菌されたディスポーザブル培養器が従来の熱滅菌、放射線滅菌、ＥＯＧガスによる滅菌がなされた培養器に比べて生育が遅い理由を研究し、プラスチック素材がプラズマ滅菌によりラジカルを生じており、全く意外にもプラズマ滅菌されたディスポーザブル培養器を長期保存してもそのラジカルが消失することなく残留し、培養時に微生物や動物細胞の生育に悪影響を与えていることを見いだした。ここで、ラジカルは通常きわめて短寿命であることが知られており、本系で培養器に当該ラジカルが長期間残留していることは予想だにできなかった。そして、残留したラジカル種の除去法を種々検討し、除去後の培養器で実際の培養試験を行い、良好な培養結果を得て本発明を完成するに至った。【０００７】  すなわち本発明は、プラズマ滅菌ディスポーザブル培養器の残存ラジカルを洗浄除去する、微生物や細胞の生育性の改善方法および残存ラジカルが除去された生育の良好なプラズマ滅菌ディスポーザブル培養器及びその製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００８】  本発明によると、熱滅菌や放射線滅菌、ＥＯＧガスによる滅菌などの従来の滅菌処理に比べて、作業者や環境に優しくコストも安いプラズマ滅菌を用いながら、発生するラジカル種を除去する事で、培養速度に問題がない培養器を提供することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】プラズマ処理を行なったポリスチレン表面に生成されるラジカルを示す模式図である。
【図２】実験で行なったポリスチレンラジカルの測定値を示す図である。
【図３】紫外吸収分光法によるポリスチレンラジカルを紫外線分光光度計で測定した結果を示す図である。
【図４】超純水によるポリスチレンラジカルの洗浄効果を示す図である。
【図５】Ｔ２４細胞を用いた洗浄培養器での生育改善を示す図である。
【図６】２５３ＪＢ−Ｖ細胞を用いた洗浄培養器での生育改善を示す図である。
【図７】Ｔ２４細胞を用いた洗浄培養器での生育改善を示す図である。
【図８】２５３ＪＢ−Ｖ細胞を用いた洗浄培養器での生育改善を示す図である。
【図９】ＨＢＥＣ−Ａ細胞を用いた洗浄培養器での生育改善を示す図である。
【図１０】ＨＢＥＣ−Ｄ細胞を用いた洗浄培養器での生育改善を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】  本発明の生育改善方法、生育性に優れた培養容器およびその製造方法は、プラズマ滅菌もしくはプラズマ表面処理後に洗浄により残存しているラジカル種を除去することを特徴とする。
【００１１】  シャーレやペトリ皿などのディスポーザブル培養器は滅菌のためや細胞付着性の改善のためなどにヘリウムプラズマなどによりプラズマ処理される。このプラズマ処理により、スチレンシャーレなどではシャーレ表面にポリスチレンラジカルなどのラジカル種が発生する。その様子を模式して図１に示す。ここで、プラズマ処理後のディスポーザブル培養器の表面は滅菌性を持つ表面となることが知られているが、図１に示すようにその表面にはプラズマ処理により生成されたラジカルが残存し、培養液中に溶け出し細胞死を誘導している。なお、図１では、表面に吸着した細胞の細胞死も誘導していることも模式化した。
【００１２】  ラジカル種は反応性が高く、その寿命は短い。しかしながらプラズマ処理された培養器からラジカル種を抽出し分光光度計（日立ハイテクサイエンスのＵ−３９００）にて測定したところ全く意外にもポリスチレンラジカルなどに特徴的な２００ｎｍ付近の紫外線吸収が確認された。これに対してプラズマ処理されていない培養器からの抽出液からはこの紫外線吸収が全く測定されなかった。測定結果を図２および図３に示す。なお、図２において、図中のグラフは紫外吸収分光方法を用いて行った測定結果であり、プラズマ表面処理を行なったポリスチレン製の培養容器とプラズマ処理を行っていないポリスチレン容器を超純水で洗浄し洗浄水を石英セルに移し紫外線分光光度計測定したスペクトルを示している。
【００１３】  図２及び図３から明らかなように、プラズマ処理を行ったポリスチレン製の培養器を用いて測定した結果、ポリエチレンラジカルが含まれていることが確認された。換言すれば、プラズマ処理がポリスチレンラジカル生成の原因であることが確認された。
【００１４】  本発明における生育改善方法、培養器の製造方法における洗浄工程では、残存しているラジカル種を除去できれば特に制限されないが、コストや環境負荷を考えると水や培地を洗浄液として用いるのが良い。滅菌が目的でプラズマ処理する場合は無菌の洗浄液での洗浄が必要であるが、表面処理が目的のプラズマ処理で洗浄後放射線滅菌など別手法で滅菌する場合はその限りでない。
【００１５】  また、本発明における生育改善方法、培養器の製造方法に係る洗浄工程において、洗浄時間や洗浄回数も残存しているラジカル種が除去されれば特に制限されないが、たとえば静置洗浄の場合だと５分を一回、あるいは１分を二回の洗浄で十分である。混合あるいは流水を用いる場合はさらに短時間での洗浄が可能である。洗浄試験結果を図４に例示する。
【００１６】  図４において、図中左のグラフから明らかなように、水の放置時間（水を容器中に放置した時間）１分から１時間、特に５分以上では放置時間による明確な依存性は見られず同じ程度の吸光度が計測された。一方、図４中右のグラフから明らかなように、放置時間を１分と５分に固定して、超純水を入れ替えながら紫外吸収分光測定を行なった結果、ポリスチレンラジカルによる紫外吸収が消失されていることが確認された。
【００１７】  以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１８】  Ｉｗａｋｉ製のプラズマ滅菌９６ウェルマイクロプレートを用い、ＤＭＥＭ培地で培養前に５分間静置洗浄行ったものと行わないものに横浜市立大学泌尿器科から分譲を受けたヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４細胞を移植し２４時間培養した。
培養後ＭＴＴアッセイにより細胞数を評価した。ＭＴＴアッセイとは、テトラゾリウム塩であるＭＴＴが代謝的に活性のある細胞によりホルマザン結晶に切断される事に基づいた測定法で、ホルマザン結晶を可溶化しその発色溶液をマルチウェル分光光度計（ＥＬＩＳＡリーダー）で測定する比色定量法である。本実施例では、ＤＭＥＭ培地で洗浄した群と洗浄していない群の各群に対し、前記ＭＴＴアッセイを２回実施し、その平均値を測定値とした。
前記ＭＴＴアッセイの測定手順としては、先ず培養後の各ウェルに１０ｕｌのＭＴＴ試薬（０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加し１時間インキュベーションした。そののち１００ｕｌのＤＭＳＯを添加した。そして、マイクロプレートリーダーでリファレンス波長；６５０ｎｍ、吸光度；５７０ｎｍにて吸光度を測定した。【００１９】  結果を図５に示す。図５から明らかなように、ＤＭＥＭ培地で洗浄したＩｗａｋｉ社製の９６ウェルマイクロプレートにおいて、ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４細胞の生育改善が確認され、洗浄により生育が回復していることが明らかにわかり、その効果は２日後にも持続していた。
【実施例２】
【００２０】  ＭＤアンダーソンより分与を受けたヒト膀胱癌細胞株２５３ＪＢ−Ｖを用いた以外は実施例１と同様に実験を実施した。その結果を図６に示す。図６から明らかなように、ＤＭＥＭ培地で洗浄したＩｗａｋｉ社製の９６ウェルマイクロプレートにおいて、ヒト膀胱癌細胞株２５３ＪＢ−Ｖの生育改善が確認され、洗浄により生育が回復していることが明らかにわかり、その効果は２日後にも持続していた。上記実施例１及び本実施例２の結果から、細胞種によらず洗浄効果が確認された。
【実施例３】
【００２１】  Ｆａｌｃｏｎ社製のプラズマ滅菌９６ウェルマイクロプレートを用いた以外は実施例１と同様に実験実施した。その結果を図７に示す。図７から明らかなように、ＤＭＥＭ培地で洗浄したＦａｌｃｏｎ社製の９６ウェルマイクロプレートにおいて、ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４の生育改善が確認され、洗浄により生育が回復していることが明らかにわかり、その効果は２日後にも持続していた。上記実施例１及び本実施例３の結果から、培養器のメーカーによらず洗浄効果が確認された。
【実施例４】
【００２２】  Ｆａｌｃｏｎ社製のプラズマ滅菌９６ウェルマイクロプレートを用いた以外は実施例２と同様に実験を実施した。その結果を図８に示す。図８から明らかなように、ＤＭＥＭ培地で洗浄したＦａｌｃｏｎ社製の９６ウェルマイクロプレートにおいて、ヒト膀胱癌細胞株２５３ＪＢ−Ｖの生育改善が確認され、洗浄により生育が回復していることが明らかにわかり、その効果は２日後にも持続していた。
【実施例５】
【００２３】  倉敷紡績株式会社環境メカトロニクス事業部バイオメディカル分野より購入したヒト膀胱上皮細胞株ＨＢＥＣ−Ａを用いた以外は実施例１と同様に実験を実施した。その結果を図９に示す。図９から明らかなように、ＤＭＥＭ培地で洗浄したＩｗａｋｉ社製の９６ウェルマイクロプレートにおいて、ヒト膀胱上皮細胞株ＨＢＥＣ−Ａの生育改善が確認され、洗浄により生育が回復していることが明らかにわかり、その効果は２日後にも持続していた。
【実施例６】
【００２４】  倉敷紡績株式会社環境メカトロニクス事業部バイオメディカル分野より購入したヒト膀胱上皮細胞株ＨＢＥＣ−Ｄを用いた以外は実施例１と同様に実験を実施した。その結果を図１０に示す。図１０から明らかなように、ＤＭＥＭ培地で洗浄したＩｗａｋｉ社製の９６ウェルマイクロプレートにおいて、ヒト膀胱上皮細胞株ＨＢＥＣ−Ｄの生育改善が確認され、洗浄により生育が回復していることが明らかにわかり、その効果は２日後にも持続していた。
【産業上の利用可能性】
【００２５】  微生物や細胞培養などのバイオ、医療の分野でより生育のよい培養器を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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