(57)【要約】【課題】ピリミジンの前駆体で分裂が盛んな組織や成長が盛んな状態では重要な栄養素であるオロット酸を、安価かつ簡便に摂取しうるプロバイオティクス製品を提供すること。【解決手段】オロット酸産生能を有する納豆菌を、大豆、脱脂大豆粉、全脂大豆粉、大豆タンパク質、おから、大豆ミール、大豆煮汁、籾殻、コーンコブ、豆殻、稲藁、バガス、ソバから、麦皮、モミガラ、米、米糠、小麦、小麦フスマ、麦芽絞り粕、グルテンフィード、小麦粉、トウモロコシ、コーンブラン、コーンミール、ビート、ビート粕、落花生、落花生殻、油粕、魚粉、カニ殻、エビ殻、オキアミ微粉末、鋸屑、パルプ廃材、古紙、デンプン粕、可溶性デンプン、糖類、酵母エキス、脱脂粉乳、骨粉、ピートモス等から選ばれる可食性素材で増殖させた後、増殖した納豆菌（栄養細胞）を乾燥等により芽胞化させると、オロット酸産生能を有する納豆菌の胞子を含むオロット酸含有プロバイオティクス製品を製造できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オロット酸産生能を有する納豆菌の胞子を含む可食性基材からなることを特徴とするプロバイオティクス製品。
【請求項２】
オロット酸産生能を有する納豆菌の培養乾燥物を含む可食性基材であることを特徴とする請求項１記載のプロバイオティクス製品。
【請求項３】
１０６ＣＦＵ／ｇ以上の胞子を含むことを特徴とする請求項１又は２記載のプロバイオティクス製品。
【請求項４】
飼料、食品又はサプリメントであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のプロバイオティクス製品。
【請求項５】
オロット酸産生能を有する納豆菌を可食性基剤に添加・発酵させた後、増殖した納豆菌を芽胞化させることを特徴とする、納豆菌の胞子を含むプロバイオティクス製品の製造方法。
【請求項６】
納豆菌が増殖した可食性基材を乾燥することにより、納豆菌を芽胞化させることを特徴とする請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
プロバイオティクス製品が、１０６ＣＦＵ／ｇ以上の胞子を含むことを特徴とする請求項５又は６記載の製造方法。
【請求項８】
プロバイオティクス製品が、飼料、食品又はサプリメントであることを特徴とする請求項５〜７のいずれか記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オロット酸産生能を有する納豆菌の胞子を含む、飼料、食品、サプリメント等のプロバイオティクス製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
オロット酸は乳清から発見された化合物で、オロト酸、オロチン酸、ウラシル６−カルボン酸、ビタミンＢ１３とも呼ばれ、ピリミジンヌクレオチド生合成系における主要中間物質であり、ジヒドロオロト酸からジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼによって誘導され、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＰＲＰＰ）によってオロチジル酸となる。オロチジル酸は、さらに速やかにウリジン一リン酸(ＵＭＰ)に変換され、その後ウリジン三リン酸、シチジン三リン酸などのピリミジンヌクレオチドが合成される。このように、オロット酸はピリミジンの前駆体で分裂が盛んな組織や成長が盛んな状態では重要な栄養素である。オロット酸は、根菜、小麦胚芽、ビール酵母などの食品に含まれており、肝臓病の治療に用いられる外、葉酸やビタミンＢ１２の代謝に関与し、抗酸化作用や老化予防にも注目され、オロット酸含有飲料（特許文献１）も提案されている。
【０００３】
他方、枯草菌(Bacillus subtilis)に関して、バチルス・ズブチリスSTA−17Eを培養し、培養物中にオロチン酸を生成蓄積させ、これを採取するオロチン酸の製造法（特許文献２）や、枯草菌を培養し、該微生物の菌体内で産生されたビタミンＫが菌体外に放出される前に該微生物菌体を回収することからなる枯草菌の培養方法（特許文献３）や、口内炎の痛みを軽減若しくは解消、又は傷口を矮小化、又は傷口を消失するバチルス・サブチルスＤＢ９０１１菌株の使用（特許文献４）が報告されている。
【０００４】
また、乳酸菌、ビフィズス菌、糖化菌、納豆菌、酵母菌のいずれか、もしくはそれらの混合物であるプロバイオティクス（特許文献５）や、ビィフィズス菌、乳酸菌、枯草菌、酪酸生成菌、乳酸利用菌、プロピオン酸生成菌の一種又は二種以上からなるプロバイオティクス（特許文献６）や、乳酸菌、酪酸菌、納豆菌、有胞子性乳酸菌等のプロバイオティクスを有効成分とする成長ホルモン分泌促進剤（特許文献７）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−１２５２８２号公報
【特許文献２】特許第２９２７８８２号公報
【特許文献３】特開２００１−１７５号公報
【特許文献４】特開２００６−１１１５７３号公報
【特許文献５】特開２０１６−２９０６５号公報
【特許文献６】特開２０１０−１２６４５７号公報
【特許文献７】特開２００７−１３１５４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
オロット酸高含有食品や飼料が望まれているが、牛乳の８０ｍｇ／Ｌ（ホエイ中でも０．１５％）が通常の食品では最大の高含有食品であり、オロット酸効果の体感には１日当たり２００ｍｇ程度が望ましいことから、牛乳摂取によりオロット酸補給の要求を満たすことはできない。本発明の課題は、ピリミジンの前駆体で分裂が盛んな組織や成長が盛んな状態では重要な栄養素であるオロット酸の必要量を、合成品としてではなく、いわゆる食品として安価かつ簡便に摂取しうるプロバイオティクス製品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、オロット酸を産生する納豆菌を可食性素材で増殖させた後、増殖した納豆菌を芽胞化させると、オロット酸産生能を有する納豆菌の胞子を含むオロット酸含有プロバイオティクス製品を提供できることを見いだした。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の事項により特定されるとおりのものである。
（１）オロット酸産生能を有する納豆菌の胞子を含む可食性基材からなることを特徴とするプロバイオティクス製品。
（２）オロット酸産生能を有する納豆菌の培養乾燥物を含む可食性基材であることを特徴とする上記（１）記載のプロバイオティクス製品。
（３）１０６ＣＦＵ／ｇ以上の胞子を含むことを特徴とする上記（１）又は（２）記載のプロバイオティクス製品。
（４）飼料、食品又はサプリメントであることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のプロバイオティクス製品。
（５）オロット酸産生能を有する納豆菌を可食性基材に添加・発酵させた後、増殖した納豆菌（栄養細胞）を芽胞化させることを特徴とする、納豆菌の胞子を含むプロバイオティクス製品の製造方法。
（６）納豆菌が増殖した可食性基材を乾燥することにより、納豆菌を芽胞化させることを特徴とする上記（５）記載の製造方法。
（７）プロバイオティクス製品が、１０６ＣＦＵ／ｇ以上の胞子を含むことを特徴とする上記（５）又は（６）記載の製造方法。
（８）プロバイオティクス製品が、飼料、食品又はサプリメントであることを特徴とする上記（５）〜（７）のいずれか記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、オロット酸を飼料、食品、サプリメント等のプロバイオティクス製品として、安全かつ簡易に摂取することができる。また本発明によると、納豆菌を用いて、納豆以外の飼料、食品、サプリメント等のプロバイオティクス製品を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のプロバイオティクス製品としては、オロット酸産生能を有する納豆菌の胞子を含む可食性基材であれば特に制限されず、また本発明の納豆菌の胞子を含むプロバイオティクス製品の製造方法としては、オロット酸産生能を有する納豆菌を可食性基材に添加・発酵（増殖）させた後、乾燥（芽胞化）させる方法であれば特に制限されず、本発明においてプロバイオティクス製品とは人体に良い影響を与える納豆菌の胞子を含む食品や飼料等の可食性基材を意味する。
【００１１】
上記オロット酸産生能を有する納豆菌としては、分類学上納豆菌(Bacillus subtilis var. natto)に分類される細菌であって、かつオロット酸の産生能力を有する細菌をいい、かかるオロット酸産生能を有する納豆菌は、例えば前記特許文献２に開示されているように、親株に紫外線照射等の公知の変異処理を施し、ウリジンヌクレオシドフォスフォリラーゼを欠損しかつピリミジンアナログ耐性を示しウリジン生産能を有する納豆菌として誘導し、次いでかかる納豆菌にニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理等の公知の変異処理を施すことにより、オロチン酸フォスフォリボシルトランスフェラーゼ欠損株か、又はオロチジン５’−モノフォスフェートデカルボキシラーゼ欠損株を誘導することにより、作製することができる。また、納豆菌の親株に、ＮＴＧ処理等の公知の変異処理を施すことにより、６アザウラシルの耐性株を取得し、次いでウリジンとウラシル生産株を選択してＮＴＧ処理等の公知の変異処理を施すことによりウラシル要求性を誘導することにより、オロット酸産生能を有する納豆菌を作製することができる。
【００１２】
上記納豆菌を添加して、発酵・増殖させる可食性基材としては、ヒトや家畜等の動物が食することができる材料であればよく、大豆、脱脂大豆粉、全脂大豆粉、大豆タンパク質、おから、大豆ミール、大豆煮汁、豆乳、籾殻、コーンコブ、豆殻、稲藁、バガス、ソバから、麦皮、モミガラ、米、米糠、小麦、小麦フスマ、麦芽絞り粕、グルテンフィード、小麦粉、トウモロコシ、コーンブラン、コーンミール、ビート、ビート粕、ミカン、カシスなどの果汁、青汁、野菜汁、落花生、落花生殻、油粕、魚粉、カニ殻、エビ殻、オキアミ微粉末、鋸屑、パルプ廃材、古紙、デンプン粕、可溶性デンプン、糖類、酵母エキス、脱脂粉乳、骨粉、ピートモス、食品カス等から選ばれる１種又は２種以上の固形物や液状物を挙げることができる。また、これら可食性基材には、納豆菌の培養に用いられる炭素原、窒素源、ミネラル等を必要に応じて添加・混合することができるが、通常の納豆菌の培養培地成分のみからなる培地は除かれる。
【００１３】
可食性基材上での納豆菌の培養条件としては、培養温度３０〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃、培養ｐＨ６．０〜８．０、好ましくは６．５〜７．５を挙げることができる。また、培養時間は培養条件によって異なるが、通常３時間〜１０日間、好ましくは１２〜６０時間を挙げることができる。
【００１４】
可食性基材上で増殖させた、オロット酸産生能を有する納豆菌（栄養細胞）を芽胞化させて胞子を産生（形成）させる方法としては、公知の芽胞化技術であれば特に制限されず、栄養源の欠乏した状態で可食性基材上での培養を継続する方法や、可食性基材上で増殖した納豆菌（栄養細胞）を乾燥、例えば３５〜５０℃の温風によって風乾させる方法や、可食性基材上で増殖した納豆菌（栄養細胞）を高温処理する方法や、可食性基材上で増殖した納豆菌（栄養細胞）に酸又はアルカリ処理を施す方法等を挙げることができる。
【００１５】
本発明のプロバイオティクス製品には、製品１ｇ当たり１０６ＣＦＵ（Colony Forming Unit）以上、好ましくは１０８ＣＦＵ以上の納豆菌の胞子を含むことが好ましい。本発明のプロバイオティクス製品を食すると、納豆菌の栄養細胞は胃酸で死にやすいのに対して、納豆菌胞子は酸に強く、多くは生きたままで腸に到達すると考えられる。腸に到達した後に胞子は発芽し、栄養細胞となって、オロット酸を産生する可能性がある。
【００１６】
本発明のプロバイオティクス製品の態様・形態としては特に制限されないが、顆粒状、粉末状、バー（棒）状、ブロック状、カプセル状、錠剤状等の種々の態様、形態を挙げることができる。また、本発明のプロバイオティクス製品は包装された態様、形態で提供することができる。
【００１７】
以下、実施例等により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例等により制限されない。
【実施例１】
【００１８】
Bacillus subtilis ver Natto NBRC-3335株をBacillus用培地（Tryptone １％, Yeast Extract ０．３％、ＮａＣｌ ０．５％、ｐＨ７．０）で３０℃にて一夜培養後、同培地に１％（ｖ／ｖ）接種し３０℃にて振盪培養した。対数期（ＯＤ６６０≒０．５）に達した菌体を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分）で集菌し、５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で洗浄後、１００μｇ／Ｌのニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を含む同緩衝液中で３０分処理を行った。洗浄後に、６アザウラシル１ｍｇ／ｍＬを添加した最小寒天培地に塗布し、３７℃にて４日間培養し、６アザウラシルの耐性株を５０株取得した。上記最小寒天培地の組成は、以下の［表１］に示すとおりである。
【００１９】
【表１】
2018043963.tif 000002
【００２０】
得られた６アザウラシルの耐性株５０株を以下の［表２］に示す種培養培地で培養後、生産培地で４日間、３０℃にて培養を行った結果、Ｎｏ．３９株において、ウリジン３ｇ／Ｌ、ウラシル７ｇ／Ｌの蓄積を認めた。
【００２１】
【表２】
2018043963.tif 000003
【実施例２】
【００２２】
Ｎｏ．３９株について実施例１と同様のＮＴＧ処理を行い、５フルオロウラシル１ｍｇ／ｍＬ、ウラシル５０μｇ／ｍＬを添加した最小寒天培地に塗布し、３７℃にて４日間培養し、得られたコロニーを前記最小寒天培地とウラシル５０μｇ／ｍＬを添加した最小培地にレプリカし、ウラシル要求性を示す株１０株を取得した。これらウラシル要求性株１０株を実施例１の生産培地で培養を行った結果、すべての菌株でオロット酸の生産性が確認され、６株がオロット酸単独、４株がオロット酸とオロチジンの併産株であった。ＴＧ−７株がオロット酸１６ｇ／Ｌと最も高い生産性を示した。この際、保存培養液中にオロット酸の結晶の析出も認められた。
【実施例３】
【００２３】
大豆１００ｇをフライパンで１５分炒った後すり鉢中で軽く粉砕し、１８時間水に浸漬後、圧力鍋で８０分加熱後に自然冷却した。寒天培地で１日生育させたＴＧ−７株を１白金耳でかきとって２ｍＬの殺菌水に懸濁後、蒸した大豆とよく混ぜ、煮沸殺菌したタッパーに入れて４０℃で１８時間醗酵後、冷蔵庫で１日保存し、オロット酸含有ひきわり納豆を調製した。得られた納豆は、やや糸引きが親株よりも弱い感があるものの、十分納豆としての形状や風味を有し、納豆質量１ｇあたり２．５〜３．５ｍｇのオロット酸を含有していた。
【実施例４】
【００２４】
青汁粉末５％、グルコース１０％、ソイビーンミール２％、尿素１％、ウラシル５０ｍｇ／Ｌを含む培地溶液３０ｍＬを２００ｍＬのひだ付きフラスコに入れ、ＴＧ−７株のタネ培養液１ｍＬを添加し、３７℃にて４日間、２２０ｒｐｍで浸透培養を行った。得られた培養液を加熱乾燥した結果、オロット酸を１５質量％含有し、オロット酸生産性納豆菌胞子を５×１０９ＣＦＵ／ｇ含有する粉末が得られた。
【実施例５】
【００２５】
乾燥おから（国産おからパウダー  ヘルシーカンパニー社製）５０ｇに脱イオン水２００ｍＬを添加し、十分に混ぜて含水率８０％としたものを、１２１℃にて２０分殺菌した。４０℃まで自然冷却した後に、ＴＧ−７株の種培養液を２ｍＬ添加したおからと、ＴＧ−７株の親株のＮＢＲＣ−３３３５株の種培養液を２ｍＬ添加したおからについて、それぞれ十分に撹拌後、３７℃にて２日間培養した。乾燥後に得られたＴＧ−７株おから粉末は２×１０９ＣＦＵ／ｇの胞子を含有し、ＮＢＲＣ−３３３５株おから粉末は５×１０９ＣＦＵ／ｇの胞子を含有していた。
【実施例６】
【００２６】
２Ｌの２つのひだ付きフラスコに市販の豆乳２００ｍＬ、グルコース１０ｇ、尿素４ｇ、ウラシル１０ｍｇを添加し、１２１℃にて２０分殺菌した。４０℃まで自然冷却した後に、ＴＧ−７株とＮＢＲＣ−３３３５株の種培養液を２ｍＬ添加し、３７℃、２２０ｒｐｍで３日間培養した。ＮＢＲＣ−３３３５株ではオロット酸の蓄積は無かったが、ＴＧ−７株では１２ｇ／Ｌのオロット酸を含む発酵豆乳が得られた。
【実施例７】
【００２７】
大ヨークシャー種２腹の新生豚１８頭を６頭ずつ３群に分け、実施例６で得た２種類の納豆菌発酵豆乳を凍結乾燥した粉末について、それぞれ納豆菌胞子が５×１０８個／ｍＬになるように生理食塩水で懸濁し、出産後から毎日１ｍＬを母乳摂取後に経口で投与した。コントロールには同量の乾燥おからを懸濁して投与した。
２週齢目での豚糞便中のBacillus群の菌は、コントロールの乾燥おから投与群では１０５ＣＦＵ／ｇ以下であったのに対し、上記納豆菌株おから粉末投与群のいずれにおいても１０６〜１０７ＣＦＵ／ｇと有意に高く、菌株間での差は認められなかった。大腸菌数は３群とも、約１０８ＣＦＵ／ｇで有意な差はなかった。また糞便の状態は、以下の［表３］に示す０から４の５段階で毎日評価した。糞便の平均スコアと２８日目の平均体重を［表４］に示す。
【００２８】
【表３】
2018043963.tif 000004
【００２９】
【表４】
2018043963.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明によると、ピリミジンの前駆体で分裂が盛んな組織や成長が盛んな状態においては重要な栄養素であるオロット酸を提供することができるので、本発明は健康産業、飼育産業で有用である。