(57)【要約】      （修正有）【課題】特性を改善した神経再生誘導管及びその材料を提供すること。【解決手段】下記（Ａ）〜（Ｃ）が結合しており、且つ、（Ｂ）と（Ｃ）とが隣接した構造を有する化合物：（Ａ）乳酸モノマー、グリコール酸モノマー、及びカプロラクトンモノマーから成る群より選択される少なくとも一種で構成されるオリゴマー（Ｂ）オリゴエチレンオキサイド又は側鎖に親水基を有するエチレンのオリゴマーの構造を有する親水性セグメント、（Ｃ）ＩＫＶＡＶ、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＷＱＰＰＲＡＲＩ、ＥＩＬＤＶＰＳＴ、ＲＥＤＶ、ＬＤＶ、ＧＴＰＧＰＱＧＧＩＡＧＱＲＧＶＶ、ＧＦＯＧＥＲ、ＹＩＧＳＲ、ＲＱＶＦＱＶＡＹＩＩＩＫＡ、ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ、及びＷＲＴＱＩＤＳＰＬＮＧＫから選択される、細胞接着性ペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｃ）が結合しており、且つ、（Ｂ）と（Ｃ）とが隣接した構造を有する化合物：
（Ａ）乳酸モノマー、グリコール酸モノマー、及びカプロラクトンモノマーから成る群より選択される少なくとも一種で構成されるオリゴマー
（Ｂ）下記一般式（１）又は一般式（２）で表される親水性セグメント
【化１】
2018043983.tif 000006
（式中、ｎは１〜１０の整数である）
【化２】
2018043983.tif 000007
（式中、ｍは１〜２０の整数であり、Ｒ１は親水基である）
（Ｃ）ＩＫＶＡＶ（配列番号１）、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ（配列番号２）、ＷＱＰＰＲＡＲＩ（配列番号３）、ＥＩＬＤＶＰＳＴ（配列番号４）、ＲＥＤＶ（配列番号５）、ＬＤＶ、ＧＴＰＧＰＱＧＧＩＡＧＱＲＧＶＶ（配列番号６）、ＧＦＯＧＥＲ（配列番号７）、ＹＩＧＳＲ（配列番号８）、ＲＱＶＦＱＶＡＹＩＩＩＫＡ（配列番号９）、ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号１０）、及びＷＲＴＱＩＤＳＰＬＮＧＫ（配列番号１１）から成る群より選択される、細胞接着性ペプチド。 
【請求項２】
（Ａ）のオリゴマーの重合度が２〜１００である、請求項１に記載の化合物。 
【請求項３】
細胞接着性ペプチドがＩＫＶＡＶ（配列番号１）である、請求項１又は２のいずれかに記載の化合物。 
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物、及び生分解性ポリマーを含む組成物。 
【請求項５】
生分解性ポリマーがポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン及びこれらの共重合体から成る群より選択される一種以上の生分解性ポリマーである、請求項４に記載の組成物。 
【請求項６】
請求項４又は５に記載の組成物からなる生分解性成形体。 
【請求項７】
繊維状、シート状、又はチューブ状である、請求項６に記載の生分解性成形体。 
【請求項８】
成形体の表面に細胞接着性ペプチドが露出している、請求項６又は７に記載の生分解性成形体。 
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載の生分解性成形体を含む、神経再生誘導管。 
【請求項１０】
神経再生誘導管の管内にコラーゲンを含む、請求項９に記載の神経再生誘導管。 
【請求項１１】
請求項６又は７に記載の生分解性成形体を水に浸漬させる工程を少なくとも含む、細胞接着性ペプチドが表面に露出された生分解性成形体の製造方法。 
【請求項１２】
水の温度が生分解性成形体のガラス転移温度（Ｔｇ）を基準に−５℃〜＋１０℃の範囲である、請求項１１に記載の方法。 
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物を含む、生分解性ポリマー成形体の表面改質剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
生分解性オリゴマー、親水性セグメント、及び細胞接着性ペプチドから成る化合物及びその利用に関する技術が開示される。
【背景技術】
【０００２】
事故などによる末梢神経の損傷は修復しきれない例が多い。また、一般的手術に伴って末梢神経を切除せざるを得ない臨床例も多い。末梢神経の損傷は、直接吻合及び自家神経移植が従来の主な治療手段であった。しかし、その成績は決して満足できるものではなかった。
【０００３】
人工的な材料による神経再生誘導管を用いて末梢神経のギャップを連結して神経を再生させようという試みは１９８０年代初め頃から盛んに行われてきた。近年、分解性ポリマーで作製した神経再生誘導かを用いた末梢神経の再生も試みられている。生分解性ポリマーからなる神経再生誘導管は、神経が再生された後には生体内で加水分解又は酵素の働きにより徐々に分解、吸収されるため、神経再生後にそれを取り除く手術が不要であるという大きな利点を有する。
【０００４】
例えば、特許文献１には、複数本の生分解性ポリマーからなる極細繊維で編んだ管状体の外部表面をコラーゲン溶液で複数回塗布することにより被覆し、管状体の内部にコラーゲンを充填して得られる神経再生誘導管が開示されている。特許文献２には、コラーゲンを神経再生の足場として使用する神経再生誘導管において、塩化ナトリウム含有濃度を乾燥状態で２．０重量％以下になるように処理したコラーゲンを使用する神経再生誘導管が開示されている。特許文献３には、生体分解吸収性ポリマーからなる極細繊維を複数本束ねた繊維束で編んだ管状体の外表面にコラーゲンが被覆され、該管状体が主として生体分解吸収性の第１のポリマーと、生体分解吸収性が第１のポリマーよりも高い第２のポリマーとからなる神経再生誘導管が開示されている。特許文献４には、細胞接着性ペプチドとオリゴ乳酸とがペプチド結合により結合した分子を含む樹脂組成物を成型してなる神経誘導管が開示されている。これらの特許文献は引用によって本書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−１３６５７５号
【特許文献２】ＷＯ／２０１０／０８７０１５号
【特許文献３】特開２００９−１５３９４７号
【特許文献４】特開２００９−６６２２７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の神経再生誘導管の特性を改善した神経再生誘導管及びその為の材料を提供することが１つの課題である。例えば、本発明者らは、特許文献４に開示される神経再生誘導管について検討したところ、次のような改善の余地があることを見出した。即ち、特許文献４に開示される神経再生誘導管は、細胞接着性ペプチドを神経再生誘導管の原料に用いることにより、管内での神経の再生を促進することを提案している。しかし、細胞接着性ペプチドの多くは神経再生誘導管の表面の露出しておらず、それを構成する樹脂ないし繊維の内部に埋没していることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記のような現状を踏まえ、鋭意研究を重ねた結果、細胞接着性ペプチドと特定の親水性セグメントとを連結することにより、より多くの細胞接着性ペプチドを樹脂の表面に露出させることができることを見出した。斯かる知見に基づき、更なる検討と改良を重ね、下記に代表される発明を完成するに至った。
【０００８】
項１．
下記（Ａ）〜（Ｃ）が結合しており、且つ、（Ｂ）と（Ｃ）とが隣接した構造を有する化合物：
（Ａ）乳酸モノマー、グリコール酸モノマー、及びカプロラクトンモノマーから成る群より選択される少なくとも一種で構成されるオリゴマー
（Ｂ）下記一般式（１）又は一般式（２）で表される親水性セグメント
【化１】
2018043983.tif 000002
（式中、ｎは１〜１０の整数である）
【化２】
2018043983.tif 000003
（式中、ｍは１〜２０の整数であり、Ｒ１は親水基である）
（Ｃ）ＩＫＶＡＶ（配列番号１）、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ（配列番号２）、ＷＱＰＰＲＡＲＩ（配列番号３）、ＥＩＬＤＶＰＳＴ（配列番号４）、ＲＥＤＶ（配列番号５）、ＬＤＶ、ＧＴＰＧＰＱＧＧＩＡＧＱＲＧＶＶ（配列番号６）、ＧＦＯＧＥＲ（配列番号７）、ＹＩＧＳＲ（配列番号８）、ＲＱＶＦＱＶＡＹＩＩＩＫＡ（配列番号９）、ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号１０）、及びＷＲＴＱＩＤＳＰＬＮＧＫ（配列番号１１）から成る群より選択される、細胞接着性ペプチド。
項２．
（Ａ）のオリゴマーの重合度が２〜１００である、項１に記載の化合物。
項３．
細胞接着性ペプチドがＩＫＶＡＶ（配列番号１）である、項１又は２のいずれかに記載の化合物。
項４．
項１〜３のいずれかに記載の化合物、及び生分解性ポリマーを含む組成物。
項５．
生分解性ポリマーがポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン及びこれらの共重合体から成る群より選択される一種以上の生分解性ポリマーである、項４に記載の組成物。
項６．
項４又は５に記載の組成物からなる生分解性成形体。
項７．
繊維状、シート状、又はチューブ状である、項６に記載の生分解性成形体。
項８．
成形体の表面に細胞接着性ペプチドが露出している、項６又は７に記載の生分解性成形体。
項９．
項６〜８のいずれかに記載の生分解性成形体を含む、神経再生誘導管。
項１０．
神経再生誘導管の管内にコラーゲンを含む、項９に記載の神経再生誘導管。
項１１．
項６又は７に記載の生分解性成形体を水に浸漬する工程を少なくとも含む、細胞接着性ペプチドが表面に露出された生分解性成形体の製造方法。
項１２．
水の温度が生分解性成形体のガラス転移温度（Ｔｇ）を基準に−５℃〜＋１０℃の範囲である、項１１に記載の方法。
項１３．
項１〜３のいずれかに記載の化合物を含む、生分解性ポリマー成形体の表面改質剤。
項１４
下記（Ａ）及び（Ｃ）が結合した化合物、及び生分解性ポリマーを含む組成物からなる成形体を水に浸漬する工程を含む、（Ｃ）が成形体の表面に露出された成形体を製造する方法：
（Ａ）乳酸モノマー、グリコール酸モノマー、及びカプロラクトンモノマーから成る群より選択される少なくとも一種で構成されるオリゴマー
（Ｃ）ＩＫＶＡＶ（配列番号１）、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ（配列番号２）、ＷＱＰＰＲＡＲＩ（配列番号３）、ＥＩＬＤＶＰＳＴ（配列番号４）、ＲＥＤＶ（配列番号５）、ＬＤＶ、ＧＴＰＧＰＱＧＧＩＡＧＱＲＧＶＶ（配列番号６）、ＧＦＯＧＥＲ（配列番号７）、ＹＩＧＳＲ（配列番号８）、ＲＱＶＦＱＶＡＹＩＩＩＫＡ（配列番号９）、ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号１０）、及びＷＲＴＱＩＤＳＰＬＮＧＫ（配列番号１１）から成る群より選択される少なくとも１種の細胞接着性ペプチド。
項１５．
水の温度が生分解性成形体のガラス転移温度（Ｔｇ）を基準に−５℃〜＋１０℃の範囲である、項１４に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
種々の樹脂成型体の表面に細胞接着性ペプチドを効率的に露出させることができる。一実施形態において、細胞接着性ペプチドが表面に露出した樹脂で形成された神経再生誘導管が提供される。このような神経再生誘導管は、細胞接着性ペプチドの機能が効率的に発揮されるため、好適な一実施形態において、神経再生を促進することが可能である。また、神経再生誘導管及び他の樹脂成型体の表面を効率的に細胞接着ペプチドで改質する手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】乳酸をアセチル化する反応を示す。
【図２】ジエチルエーテルと細胞接着性ペプチドを結合させる反応を示す。
【図３】乳酸とジエチルエーテル−細胞接着性ペプチドを結合させる反応を示す。
【図４】エレクトロスピニング法で不織布を作製する模式図を示す。
【図５】実施例において、３種類の不織布について表面に露出された細胞接着性ペプチドを共焦点顕微鏡で検出した結果を示す。「PLA」とは、ポリ乳酸のみで作製した不織布を示す。「PLA-IKVAV」とは、ジエチレングリコールと結合していない細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製した不織布を示す。「PLA-diEG-IKVAV」とは、ジエチレングリコールと結合させた細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製した不織布を示す。
【図６】実施例において、露出した細胞接着性ペプチドを定量化した結果を示す。１は、細胞接着性ペプチドを配合していないポリL乳酸で作製した、熱処理をしていない不織布（コントロール）である。２は、ジエチレングリコールと結合させていない細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製した、熱処理をしていない不織布である。３は、ジエチレングリコールと結合させた細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製した、熱処理をしていない不織布である。４は、ジエチレングリコールと結合させた細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製し、６０℃で熱処理した不織布である。５は、ジエチレングリコールと結合させた細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製し、７０℃で熱処理した不織布である。６は、ジエチレングリコールと結合させた細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製し、８０℃で熱処理した不織布である。
【図７】細胞接着性ペプチドが表面に露出した成形体のイメージ図である。ａは細胞接着性ペプチドであり、ｂは親水性セグメントであり、ｃはオリゴマーであり、ｄは生分解性ポリマーである。
【図８】実施例において、不織布表面に露出したペプチド密度を測定した結果を示す。１は、細胞接着性ペプチドを配合していないポリL乳酸不織布を室温で処理したサンプル。２は、細胞接着性ペプチドを配合していないポリL乳酸不織布を６０℃で熱処理したサンプル。３は、細胞接着性ペプチドを配合していないポリL乳酸不織布を７０℃で熱処理したサンプル。４は、細胞接着性ペプチドを配合していないポリL乳酸不織布を８０℃で熱処理したサンプルである。５は、ジエチレングリコールと結合させていない細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作成した不織布を室温で処理したサンプル。６は、ジエチレングリコールと結合させていない細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製した不織布を６０℃で熱処理をしたサンプル。７は、ジエチレングリコールと結合させていない細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製した不織布を７０℃で熱処理したサンプル。８は、ジエチレングリコールと結合させていない細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製した不織布を８０℃で熱処理をしたサンプル。９は、ジエチレングリコールと結合させた細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製した不織布を室温で処理したサンプル。１０は、ジエチレングリコールと結合させた細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製し他不織布を６０℃で熱処理したサンプル。１１は、ジエチレングリコールと結合させた細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製した不織布を７０℃で熱処理したサンプル。１２は、ジエチレングリコールと結合させた細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製した不織布を８０℃で熱処理したサンプルである。
【図９】不織布に対する神経細胞の接着性を測定する実験方法の模式図を示す。
【図１０】実施例において、３種類の不織布に接着した神経細胞を定量化した結果を示す。１は、細胞接着性ペプチドを配合していないポリL乳酸不織布を室温で処理したサンプル。２は、細胞接着性ペプチドを配合していないポリL乳酸不織布を６０℃で熱処理したサンプル。３は、細胞接着性ペプチドを配合していないポリL乳酸不織布を７０℃で熱処理したサンプル。４は、細胞接着性ペプチドを配合していないポリL乳酸不織布を８０℃で熱処理したサンプルである。５は、ジエチレングリコールと結合させていない細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作成した不織布を室温で処理したサンプル。６は、ジエチレングリコールと結合させていない細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製した不織布を６０℃で熱処理したサンプル。７は、ジエチレングリコールと結合させていない細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製した不織布を７０℃で熱処理したサンプル。８は、ジエチレングリコールと結合させていない細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製した不織布を８０℃で熱処理をしたサンプル。９は、ジエチレングリコールと結合させた細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製した不織布を室温で処理したサンプル。１０は、ジエチレングリコールと結合させた細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製した不織布を６０℃で熱処理したサンプル。１１は、ジエチレングリコールと結合させた細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製した不織布を７０℃で熱処理したサンプル。１２は、ジエチレングリコールと結合させた細胞接着性ペプチド（IKVAV）をポリ乳酸に混合して作製した不織布を８０℃で熱処理したサンプルである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、上述の代表的な発明を中心に説明する。
【００１２】
オリゴマー（Ａ）は、乳酸モノマー、グリコール酸モノマー、及びカプロラクトンモノマーから成る群より選択される少なくとも一種で構成されていることが好ましい。乳酸モノマーは、Ｄ体及びＬ体のいずれでもよく、それらの両方(ラセミ体)を用いることもできる。オリゴマー（Ａ）は、乳酸モノマー、グリコール酸モノマー、及びカプロラクトンモノマーから成る群より選択される１種のみで構成されていてもよく、乳酸モノマー、グリコール酸モノマー、及び／又はカプロラクトンモノマーの任意の組み合わせで構成されていてもよい。一実施形態において、オリゴマー（Ａ）は、乳酸モノマー単独（オリゴ乳酸）、グリコール酸モノマー単独（オリゴグリコール酸）、又は乳酸モノマー及びグリコール酸モノマーの組み合わせ（オリゴ乳酸−グリコール酸共重合体）によって構成されることが好ましい。
【００１３】
オリゴマー（Ａ）の重合度は特に制限されない。例えば、オリゴマー（Ａ）の重合度は２以上１００以下とすることができる。オリゴマー（Ａ）の重合度の下限は、好ましくは３、５、又は１０であり、上限は好ましくは７５、５０、又は２５である。これらの下限及び上限は任意に組み合わせて範囲とすることができる。例えば、オリゴマー（Ａ）の重合度は、３以上７５以下、５以上５０以下、又は１０以上２５以下であり得る。オリゴマー（Ａ）は、直鎖状であっても分岐鎖を有してもよく、一実施形態においてオリゴマー（Ａ）は直鎖状であることが好ましい。
【００１４】
オリゴマー（Ａ）は、モノマーから任意の手法で得ることができる。例えば、後述する実施例の手法に準じてモノマーを脱水縮合させることにより得ることができる。
【００１５】
親水性セグメント（Ｂ）は、下記一般式（１）又は一般式（２）で表される親水性セグメント
【００１６】
【化１】
2018043983.tif 000004
（式中、ｎは１〜１０の整数である）
【００１７】
【化２】
2018043983.tif 000005
（式中、ｍは１〜２０の整数であり、Ｒ１は親水基である）
であることが好ましい。
【００１８】
親水性セグメントの大きさ（長さ）は、細胞接着性ペプチドを樹脂の表面に露出させることができる限り特に制限されない。例えば、一般式（１）のｎは、２以上、３以上、又は４以上であり得、また１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、又は５以下であり得る。一般式（２）のｍは、２以上、３以上、又は４以上であり得、また２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、又は５以下であり得る。一実施形態において、ｎは、１〜８であり、好ましくは２〜５である。一実施形態において、ｍは、１〜２０であり、好ましくは２〜５である。
【００１９】
一般式（１）で示される親水性セグメントは、オリゴエチレングリコールの両末端の水酸基から水素原子が除かれた二価の基である。一般式（１）で示される親水性セグメントが上記化合物の末端に位置する場合は、両末端の結合基のいずれかは水素原子、アルキル基、又はアセチル基であり得るが、これに限られるものではない。アルキル基としては、例えば、直鎖又は分岐鎖の低級アルキル基（炭素数１〜６）を挙げることができ、具体的には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、１−メチルエチル、tert−ブチル、および２−メチルブチル基等を挙げることができる。
【００２０】
一般式（２）で示される親水性セグメントは、側鎖に親水基を有する二価のビニルオリゴマーである。このような構造を有する親水性セグメントの側鎖構造としては、例えば、カルボキシル基、硫酸基、アミノ基、両性イオン基（ベタイン）を挙げることができる。
【００２１】
細胞接着性ペプチド（Ｃ）は、ＩＫＶＡＶ（配列番号１）、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ（配列番号２）、ＷＱＰＰＲＡＲＩ（配列番号３）、ＥＩＬＤＶＰＳＴ（配列番号４）、ＲＥＤＶ（配列番号５）、ＬＤＶ、ＧＴＰＧＰＱＧＧＩＡＧＱＲＧＶＶ（配列番号６）、ＧＦＯＧＥＲ（配列番号７）、ＹＩＧＳＲ（配列番号８）、ＲＱＶＦＱＶＡＹＩＩＩＫＡ（配列番号９）、ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号１０）、及びＷＲＴＱＩＤＳＰＬＮＧＫ（配列番号１１）から成る群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。細胞接着性ペプチドは１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせてもよい。また、同種の細胞接着性ペプチドを１分子内に複数繰り返して存在させることもできる。一実施形態において好ましい細胞接着性ペプチドは、ＩＫＶＡＶである。
【００２２】
オリゴマー（Ａ）、親水性セグメント（Ｂ）、及び細胞接着性ペプチド（Ｃ）は、任意の並びで結合させることができるが、生分解性ポリマーで形成される樹脂において細胞接着性ペプチドを樹脂表面に露出させるという観点から、親水性セグメント（Ｂ）と細胞接着性ペプチド（Ｃ）とが隣接していることが好ましい。よって、好ましい化合物の構造は、（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）、（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）、及び（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ｂ）であり、より好ましくは（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）である。
【００２３】
オリゴマー（Ａ）、親水性セグメント（Ｂ）、及び細胞接着性ペプチド（Ｃ）の結合は任意の手法で行うことができる。例えば、後述する実施例に準じて、親水性セグメント（Ｂ）の末端水酸基と細胞接着性ペプチドの末端アミノ基とを脱水縮合させて（Ｂ）と（Ｃ）を結合させる。次いで、これに末端アセチル化したオリゴマー（Ａ）を反応させて、（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）構造の化合物を得ることができる。（Ａ）〜（Ｃ）の結合は、リンカーを介して行うことも可能であるが、一実施形態において（Ａ）〜（Ｃ）はリンカーを介さずに直接結合されることが好ましい。従って、上記の好ましい化合物の構造において、「−」は単結合であることが好ましい。
【００２４】
上記のように（Ａ）〜（Ｃ）が連結した化合物（以下、「Ａ−Ｃ化合物」とも称する）は、生分解性ポリマーと混合して組成物とし、これを用いて種々の形状の樹脂を作製することにより、細胞接着性ペプチドが樹脂表面に露出する。よって、当該化合物は、樹脂表面を細胞接着性ペプチドで改質するための、樹脂（好ましくは、生分解性ポリマーで形成された樹脂）の表面改質剤として用いることができる。他の実施形態において、Ａ−Ｃ化合物を含む表面改質剤は、Ａ−Ｃ化合物を含まずに形成された生分解性ポリマー成形体の表面に塗布することによってその表面を改質することもできる。
【００２５】
Ａ−Ｃ化合物と組み合わせる生分解性ポリマーの種類は特に制限されない。例えば、生分解性ポリマーとしては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、乳酸−グリコール酸共重合体、乳酸−カプロラクトン共重合体、グリコール酸−カプロラクトン共重合体、ポリジオキサノン、グリコール酸−トリメチレンカルボン酸、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネートアジペート、ポリプロピレンカーボネート、及びポリパラジオキサノン等が挙げることができる。一実施形態において、好ましい生分解性ポリマーは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、及びこれらの共重合体（例えば、乳酸−グリコール酸共重合体、乳酸−カプロラクトン共重合体、及びグリコール酸−カプロラクトン共重合体）から成る群より選択される１種以上であり、より好ましくは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びポリカプロラクトンから成る群より選択される１種以上である。生分解性ポリマーは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。一実施形態において、生分解性ポリマーの重量平均分子量は、好ましくは１０，０００以上、より好ましくは４０，０００以上、特に好ましくは８０，０００以上である。重量平均分子量とは、溶媒としてヘキサフルオロイソプロパノールを用いたゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）換算の重量平均分子量である。ポリ乳酸は、ポリＬ−乳酸でもポリＤ−乳酸でもポリＤＬ−乳酸でもよいが、好ましくはポリＬ−乳酸である。
【００２６】
一実施形態において、生分解性ポリマーは、生体由来の生分解性ポリマーを更に含んでいてもよい。そのような生分解性ポリマーとしては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、キチン、及びキトサンから成る群より選択される１種以上を採用することができ、好ましくはコラーゲンである。このような生体由来の生分解性ポリマーを配合することにより、神経細胞の接着性が向上するだけでなく、血管新生も亢進することが期待される。
【００２７】
Ａ−Ｃ化合物及び生分解性ポリマーを含有する組成物における、Ａ−Ｃ化合物及び生分解性ポリマーの配合比率は特に制限されず、目的に応じて適宜調節することができる。例えば、Ａ−Ｃ化合物は、生分解性ポリマー１００質量部に対して、４０質量部以下、好ましくは３０質量部以下、２０質量部以下、１０質量部以下、又は５質量部以下であり、且つ、０．０１質量部以上、好ましくは０．１質量部以上、又は１質量部以上の割合で配合される。
【００２８】
Ａ−Ｃ化合物及び生分解性ポリマーを含有する組成物は、更に任意の成分を含有してもよい。そのような成分としては、例えば、可塑剤、及び安定化剤等を挙げることができる。また、当該組成物は、Ａ−Ｃ化合物及び生分解性ポリマーが適当な溶媒に溶解したものであってもよい。そのような溶媒の種類は特に制限されないが、例えば、（Ａ）が主に乳酸オリゴマーからなる場合、塩化メチレン、クロロホルム、ベンゼン、アセトン等を挙げることができ、（Ａ）が主にグリコール酸オリゴマーからなる場合、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）やペルフルオロアセトン等を挙げることができる。
【００２９】
Ａ−Ｃ化合物及び生分解性ポリマーを含有する組成物を原料として種々の生分解性成形体を作製することができる。生分解性成形体の形状は、目的に応じて適宜選択でき、特に制限されないが、例えば、繊維状、シート状、及びチューブ状を挙げることができる。これらの成形体を得る方法は特に制限されず、成形体の形状に応じて公知の方法を適宜採用することができる。そのような方法としては、例えば溶融紡糸法、湿式紡糸法、乾式紡糸法、ゲル紡糸法、溶融押出成形法、キャスト成形法、射出成型法、スピンコート法、及びエレクトロスピニング法を挙げることができる。
【００３０】
一実施形態において、成形体が繊維状である場合、取り扱い性及び強度の観点から、繊維の直径は、１〜５０μｍであることが好ましく、より好ましくは３〜４０μｍ、更に好ましくは６〜３０μｍである。
【００３１】
上記生分解性成形体は、その表面に細胞接着性ペプチドが露出していることが好ましい。一実施形態において、当該成形体は、より多くの細胞接着性ペプチドを成形体の表面に露出させるために、水に浸漬する工程を経ていることが好ましい。上述のとおり、Ａ−Ｃ化合物において、細胞接着性ペプチド（Ｃ）は親水性セグメント（Ｂ）に隣接するため、当該成形体を水に浸漬することにより、親水性セグメント（Ｂ）と共に細胞接着性ペプチド（Ａ）を水分子と接する表面に露出させることができる。細胞接着性セグメントが成形体の表面に露出している状態のイメージ図を図７に示す。細胞接着性ペプチドの配列および化学特性によっては、水以外の溶媒中で熱処理する方が効率良く細胞接着性ペプチドを露出させることができることも考えられる。そのような溶媒としては、生分解性ポリマー（例えば、ポリ乳酸）が溶解せず、細胞接着性ペプチドとの親和性が高い溶媒が好ましい。例えば、水とアルコールの混合溶媒、水とアセトンやアセトニトリルとの混合溶媒などが考えられる。
【００３２】
上記の目的で成形体を浸漬する水の温度は特に制限されないが、例えば、生分解性成形体のガラス転移温度（Ｔｇ）を基準として−５℃〜＋１０℃の範囲であることが好ましい。生分解性成形体のガラス転移温度は、任意の手法で測定することができる。例えば、ＪＩＳ  Ｋ７１２１に準拠した手法でガラス転移温度を測定することができる。具体的には、示差走査熱量計を使用して、樹脂サンプル１０ｍｇを−１４０℃〜２５０℃の温度範囲にわたって２０℃／ｍｉｎで昇温させ、ＤＳＣ曲線から得られた補外ガラス転移開始温度をガラス転移温度とすることができる。一実施形態において、生分解性成形体のガラス転移温度を基準として−５℃〜１０℃の範囲とは、５０〜６５℃であり得る。生分解性成形体のガラス転移温度が１０℃以下である場合、成形体を浸漬する水の温度は、生分解性成形体の融点の温度を基準として−１０℃以下であることが好ましい。一実施形態において、５〜３５℃であり得る。
【００３３】
浸漬時間は、特に制限されず、例えば、１０分以上、２０分以上、３０分以上、４０分以上、５０分以上、６０分以上、１．５時間以上、又は２時間以上であり得る。また、浸漬時間の上限は、例えば、１０時間以下、９時間以下、８時間以下、７時間以下、６時間以下、５時間以下、４時間以下、又は３時間以下であり得る。
【００３４】
上記のように水（好ましくは、上記一定温度の水）に浸漬することによって細胞接着性ペプチドを生分解性成形体の表面に露出させる方法において、細胞接着性ペプチドが連結した化合物は、上記Ａ−Ｃ化合物であることが好ましいが、一実施形態において、上記（Ｂ）親水性セグメントを含まない化合物であってもよい。即ち、特許文献４に開示されるような、オリゴペプチド（Ａ）及び細胞接着性ペプチド（Ｃ）のみが結合した化合物であっても、それを含む樹脂成型体を水に浸漬し、好ましくは一定の温度に供することにより、細胞接着性ペプチドを成形体の表面に露出させることができる。
【００３５】
上記成形体は、例えば、神経再生誘導管として利用することができる。チューブ状の成形体は、そのまま神経再生誘導管として利用することができ、それ以外の形状(例えば、繊維状又はシート状)の成形体は、チューブ状に更に成形することによって神経再生管にすることができる。繊維状の成形体は、例えば、繊維を約５〜１００本束ねたものを管状に編むことによってチューブ状に成形することができる。他の方法として、繊維から不織布又は織物もしくは編物を作成し、管状にして縫合又は接着もしくは融着させることによってチューブ状に成形することができる。
【００３６】
神経再生誘導管の内径及び外径は、接合する神経の太さに合わせて設定することができる。管状体の大きさは、例えば、内径０．１〜２０ｍｍ、外径０．１１〜２５ｍｍ、膜厚０．０５〜５ｍｍ、長さ１０〜１５０ｍｍの範囲で設計することができる。膜厚が厚すぎると生体組織の再生の障害となることがあり、膜厚が薄すぎると神経再生誘導管の分解が早過ぎ、神経が再生し終わるまでその形状を維持できないことがある。
【００３７】
一実施形態において、上記神経再生誘導管は、管内にコラーゲンを含有すること（又はコラーゲンが充填されていること）が好ましい。コラーゲンとしては、従来から神経再生の足場として使用されるコラーゲンを用いることができる。例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲンなどが挙げられ、これらを単独で用いてもよいし、複数混合して用いてもよい。また、コラーゲンは、塩化ナトリウム含有濃度を乾燥状態で２．０重量％以下、好ましくは０．１〜１．５重量％に精製したものを使用することが好ましい。一実施形態において、コラーゲンは、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクティン及び成長因子から成る群から選択される１種以上の成分を含むことが好ましい。成長因子としては、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、βＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＩＧＦ−１（インスリン様増殖因子）、及びＴＧＦ−β（トランスフォーミング成長因子）などが挙げられる。
【００３８】
一実施形態において、神経再生誘導管は、その外部表面がコラーゲンで被覆されていることが好ましい。外部表面の被覆は、例えば、公知の手法でコラーゲン溶液を１回又は複数塗布することにより行うことができる。コラーゲンは、上記神経再生誘導管に充填する為に用いるコラーゲンと同じ種類であっても異なっていてもよい。
【００３９】
一実施形態において、コラーゲンを被覆及び／又は充填した神経再生誘導管は、凍結、凍結乾燥、及び／又は架橋処理を施すことが好ましい。凍結は好ましくは−１０〜−１９６℃で３〜４８時間の条件で行うことができる。凍結することによって、コラーゲン分子の間に微細な氷が形成され、コラーゲン溶液が相分離を起こし、スポンジ化する。次に、前記凍結させたコラーゲン溶液を、真空下、好ましくは約−４０〜−８０℃で、好ましくは約１２〜４８時間凍結乾燥することができる。凍結乾燥することによって、コラーゲン分子間の微細な氷が気化するとともに、コラーゲンスポンジが微細化する。架橋は、例えば、γ線架橋、紫外線架橋、電子線架橋、熱脱水架橋、グルタルアルデヒド架橋、エポキシ架橋、及び水溶性カルボジイミド架橋から成る群より選択される手法で行うことができる。
【００４０】
一実施形態において、神経再生誘導管は、滅菌処理されていることが好ましい。滅菌処理の手法は特に制限されないが、例えば、γ線滅菌及び／又は紫外線滅菌を採用することができる。また、神経再生誘導管は、目的に応じて、更なる成形及び／又は表面処理が施されていてもよい。  
【実施例】
【００４１】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００４２】
１．材料
実施例では下記の材料を使用した。
・樹脂：Ｃｌ−Ｔｒｔ（２−ＣＬ）−Ｒｅｓｉｎ（渡辺化学工業）
・安定剤：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）
・カップリング剤：Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）（東京化学工業）
・カップリング剤：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（ＨＯＢＴ）（東京化学工業）
・アミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，  Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，  Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−ＯＨ，  Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ）
【００４３】
２．ＩＫＶＡＶの合成
下記の手順でペプチド（ＩＫＶＡＶ）を合成した。
（１）樹脂（１ｇ）をカラムに入れ、更に塩化メチレンを入れて１０分間撹拌して膨潤させた。
（２）塩化メチレンを除去し、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（８０９．４５ｍｇ）を入れ、再度塩化メチレン（８ｍｌ）を入れて均一に撹拌させた。
（３）更にＤＩＰＥＡ（８３０．８３ｍｌ）を入れ、２分間撹拌して洗浄した。
（４）洗浄を２回繰り返した。
（５）１０ｍｌのＤＣＭ／メタノール／ＤＩＰＥＡ混合溶媒をカラムに入れ、１０分間撹拌した。
（６）更にＤＭＦを入れ１０分間撹拌して樹脂を洗浄した。この洗浄を３回繰り返した。（７）サンプリングし、カイザーテストを行って、保護基（Ｆｍｏｃ）が付いていることを確認した。
（８）２０％ＰＰＤ／ＤＭＦを入れ、１分間撹拌して、溶媒を除去し、再度２０％ＰＰＤ／ＤＭＦを入れ１５分間撹拌して保護基を外した。
（９）ＤＭＦを入れ、１分間撹拌することによる洗浄を５回繰り返した。
（１０）その後、保護基が外れていることをカイザーテストで確認した。
（１１）生成物をガラス瓶に移し、ＤＭＦ（８ｍｌ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（７８５．５２ｍｇ）、ＨＢＴＵ（９０４．５１ｍｇ）、ＨＯＢＴ（３５６．２４ｍｇ）、及びＤＩＰＥＡ（８３０．８３ｍｌ）を入れ、蓋を閉めてＢｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｏｒにセットして反応させた。
（１２）反応終了後、生成物をカラムに入れて、ＤＭＦを入れ、１分間撹拌して洗浄した。この洗浄を５回繰り返した。
（１３）上記（６）〜（１２）を繰り返した、Ｖ→Ａ→Ｖ→Ｋ→Ｉの順でペプチドを合成した。
【００４４】
３．オリゴ乳酸の重縮合及びアセチル化
下記の手順で図１に示す反応によりオリゴ乳酸を重縮合し、更にアセチル化した。
（１）２０ｇの９０％Ｄ−乳酸（武蔵野化学）をナスフラスコに入れ、１５０℃で大気圧で２時間撹拌しながら、水分を飛ばした。
（２）１５０℃で、１００ｍｍＨｇで２時間、３０ｍｍＨｇで１時間、及び２０ｍｍＨｇで２時間減圧しながら反応させた。
（３）反応終了後、減圧乾燥し、塩化メチレンで溶解させ、冷却したジエチルエーテルで再沈殿した。
（４）上澄みを捨て、沈殿物を減圧乾燥した。
（５）ＮＭＲ測定により、重合度を測定した。その結果、平均重合度１８．２のオリゴ乳酸が得られたことが確認された。
（６）重合したオリゴ乳酸に対して１等量の無水酢酸を加え、１３０℃で７６０ｍｍＨｇで１０分間撹拌しながら融解させた。
（７）１３０℃で３３０ｍｍＨｇで１時間、１３０ｍｍＨｇで１時間、３０ｍｍＨｇで３０分間減圧しながら反応させた。
（８）反応終了後、一晩減圧乾燥させた後、塩化メチレンで溶解させ、冷却したジエチルエーテルで再沈殿した。
（９）上澄みを捨て、沈殿物を減圧乾燥した。
（１０）ＮＭＲ測定により、アセチル基の存在を確認した。
【００４５】
４．オリゴ乳酸−ＩＫＶＡＶの合成
上記２で合成したオリゴペプチド（ＩＫＶＡＶ）付き樹脂に対して５倍等量のＨＯＢＴ、同５倍等量のＨＢＴＵ、及び、同１０倍等量のＤＩＰＥＡを加え、溶媒としてＤＭＦを加え、更に上記３．で得たアセチル化オリゴ乳酸を同５倍等量加え、固相上にてカップリングを行った。カップリングが行われたことは、カイザーテストにて確認した。樹脂からの切り離しは、特開２００９−０６６２２７に記載される方法で行った。このようにして、アセチルオリゴ乳酸−ＩＫＶＡＶを得た。
【００４６】
５．オリゴ乳酸−ジエチレングリコール−ＩＫＶＡＶの合成
５−１．ジエチレングリコール−ＩＫＶＡＶの合成
図２に示す反応により、ジエチレングリコールとオリゴペプチド（ＩＫＶＡＶ）を結合させた。上記２で合成して乾燥したオリゴペプチド（ＩＫＶＡＶ）付き樹脂をカラムに入れ、更に塩化メチレンを入れて１０分間撹拌して膨潤させた。塩化メチレンを除去し、ＤＭＦで樹脂を３回洗浄した。樹脂をガラス瓶に移し、溶媒のＤＭＦ（１ｍｌ）、ＩＫＶＡＶ付き樹脂に対して１．５倍等量のＦｍｏｃ−ｄｉＥＧ−ＣＯＯＨ（２３．７ｍｇ）、同１．５倍等量のＨＢＴＵ（２２．５７ｍｇ）、同１．５倍等量のＨＯＢＴ（９．１ｍｇ）及び同３倍等量のＤＩＰＥＡ（２０．７μｌ）を入れ、蓋を閉めてＢｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｏｒにセットして６０℃で１５分間反応させた。反応終了後、生成物をカラムに入れ、更にＤＭＦを入れて１分間撹拌し、洗浄した。この洗浄は５回繰り返した。
【００４７】
５−２．オリゴ乳酸とジエチレングリコール−ＩＫＶＡＶとのカップリング
図３に示す反応により、オリゴ乳酸とジエチレングリコール−ＩＫＶＡＶとを結合した。上記３．で合成したアセチルオリゴ乳酸（７７．８８ｍｇ）をＤＭＦで溶解し、カラムに入れた。そこにＨＢＴＵ（２２．５４ｍｇ）、ＨＯＢＴ（９．１ｍｇ）、及びＤＩＰＥＡ（２０．７μｌ）を入れ、一夜中撹拌しながら反応させた。その後、ＤＭＦを入れ、１分間撹拌して洗浄し、溶媒を除去して乾燥させた。乾燥した樹脂にＴＦＡ（９５）、ＴＩＰＡ（２．５）、イオン交換水（２．５）の混合溶媒を入れ、脱樹脂を行った。残った溶媒を冷却したジエチルエーテルで再沈殿した。沈殿物を乾燥させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ及びＮＭＲにてオリゴ乳酸−ジエチレングリコール−ＩＫＶＡＶが得られたことを確認した。
【００４８】
６．エレクトロスピニング不織布の作製
図４に概略図を示すエレクトロスピニング法を用いて不織布を作成した。ヘキサフルオロイソプロピルアルコール（ＨＦＩＰ）１ｍｌに、ポリＬ乳酸（ＰＬＡ、武蔵野化学、数平均分子量６００００）１３８．５ｍｇ、及び、上記４で得たオリゴ乳酸−ＩＫＶＡＶ又は上記５で得たオリゴ乳酸−ジエチレングリコール−ＩＫＶＡＶ  １．５ｍｇを添加し、ポリマー溶液（１４ｗ／ｖ％）を調製した。このポリマー溶液をプラスチックシリンジ１に取り、高圧電圧供給システム２によって電圧をかけながら押し出し（４ｋＶ、１ｍＬ／ｈ）、ターゲット３に紡糸した。紡糸距離は１０ｃｍとした。ターゲット３にはステンレス製の板を用い１０分間紡糸した。
【００４９】
得られた不織布を５ｍｍ×５ｍｍの大きさに切り取り、イオン交換水を入れたエッペンチューブにいれ、水中で６０℃、７０℃、又は８０℃の温度に１時間さらした。その後、室温に戻して２００μｌのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）溶液（濃度：１ｍｇ／ｍｌ）を入れ、撹拌しながら４時間反応させた。反応後、イオン交換水を置換する洗浄を３回繰り返した。次いで、ＤＭＦを入れ、５分間超音波洗浄を行い、イオン交換水を置換する洗浄を３回繰り返した。その後、共焦点顕微鏡にて不織布を観察して蛍光イメージを撮像して比較した。
【００５０】
イソチオシアネート基を持つ水溶性のＦＩＴＣはリジン残基のεアミノ基と反応するので、ＩＫＶＡＶが繊維表面に露出しているときのみ蛍光が観測される。図５に示されるとおり、ジエチレングリコールを導入した不織布はより強い蛍光発光を示した。従って、ＩＫＶＡＶの表面露出率は：オリゴ乳酸−ジエチレングリコール−ＩＫＶＡＶを加えたＰＬＡで作製した不織布＞オリゴ乳酸−ＩＫＶＡＶを加えたＰＬＡで作製した不織布＞ＰＬＡで作製した不織布の順であった。また、６０℃熱処理した後、不織布の蛍光発光は未熱処理のより強くなった。一方、７０℃以上で熱処理すると、蛍光発光が弱くなった。熱処理後のＩＫＶＡＶの表面露出率は：６０℃＞未熱処理＞７０℃＞８０℃となった。
【００５１】
上記不織布を、１００μｌのＨＦＩＰとＰＢＳとの１：１の混合溶媒に溶解した後に、蛍光分光光度計にて蛍光強度を測定することで表面に露出しているペプチド量を定量化した。その結果、図６に示すとおり、蛍光量は［オリゴ乳酸−ジエチレングリコール−ＩＫＶＡＶを加えたＰＬＡで作製した不織布］＞［オリゴ乳酸−ＩＫＶＡＶを加えたＰＬＡで作製した不織布］＞［ＰＬＡで作製した不織布］となり、共焦点顕微鏡で観察した結果と一致した。また、６０℃の熱処理したオリゴ乳酸−ジエチレングリコール−ＩＫＶＡＶを加えたＰＬＡで作製した不織布の蛍光量が一番高く、熱処理の温度を７０又は８０℃に上昇させることによって蛍光量が低下し、この結果についても共焦点顕微鏡で観察した結果と一致した。
【００５２】
７．表面に露出したペプチド密度の定量化
エレクトロスピニング法で得られた不織布を１５ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切り取り、２４ウェルプレートに入れた。それぞれの不織布の重量を測った。各ウェルにイオン交換水を入れ、水中で６０℃、７０℃、又は８０℃の温度に１時間さらした。その後、室温に戻して１００μｌのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）溶液（濃度：１ｍｇ／ｍｌ）を添加して４時間反応させた。反応後、イオン交換水を置換する洗浄を３回繰り返した。次に、ＤＭＦを入れ、５分間超音波洗浄を行い、イオン交換水を置換する洗浄を３回繰り返した。その後、１００μｌのＨＦＩＰとＰＢＳとの１：１の混合溶媒に溶解した後に、蛍光分光光度計にて蛍光強度を測定し、得られた値を不織布の重量で割ることで表面に露出したペプチド密度を定量化した。
【００５３】
その結果、図８に示すとおり、オリゴ乳酸−ＩＫＶＡＶを加えていないＰＬＡで作製した不織布は熱処理により蛍光量の変化がなかった。オリゴ乳酸−ＩＫＶＡＶを加えたＰＬＡで作製した不織布とオリゴ乳酸−ジエチレングリコール−ＩＫＶＡＶを加えたＰＬＡで作製した不織布は６０℃で熱処理した場合に最も多くのＦＩＴＣと反応していることから、最も多くのＩＫＶＡＶペプチドが不織布最表面に露出していることが判った。熱処理温度を７０℃、８０℃と上昇させることにより蛍光量が低下したことは、オリゴ乳酸−ＩＫＶＡＶペプチドが表層から溶出したためと考えられる。
【００５４】
８．不織布上の神経細胞の接着量の定量
エレクトロスピニング法で得られた不織布を１５ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切り取り、図９のように２４ウェルプレートに入れ、金属リングで不織布を固定した。各ウェルにイオン交換水を入れ、水中で６０℃、７０℃、又は８０℃の温度に１時間さらした。その後、不織布を乾燥して、３０分ＵＶ滅菌を２回行った。継代したＰＣ−１２細胞（神経細胞）を、細胞数が１×１０４になるように１ｍＬ培地で調整して滅菌した不織布上に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で３時間培養した。その後、培養した培地を除去し、１ｍＬ新鮮培地と１００μＬ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）をいれ、さらに２時間培養した。培養液を９６ウェルプレートに回収して、プレートリーダーで不織布上の神経細胞の接着量を定量した。
【００５５】
その結果、図１０に示すとおり、神経細胞接着数は［オリゴ乳酸−ジエチレングリコール−ＩＫＶＡＶを加えたＰＬＡで作製した不織布］＞［オリゴ乳酸−ＩＫＶＡＶを加えたＰＬＡで作製した不織布］＞［ＰＬＡで作製した不織布］となり、共焦点顕微鏡で観察した結果と一致した。中でも、６０℃の熱処理したオリゴ乳酸−ジエチレングリコール−ＩＫＶＡＶを加えたＰＬＡで作製した不織布の神経細胞接着数が一番高く、熱処理の温度を７０又は８０℃に上昇させることによって細胞接着数が低下し、表面に露出したペプチド密度や共焦点顕微鏡で観察した結果と一致した。
【００５６】
９．不織布の熱特性の測定
上記のエレクトロスピニング法で作製した不織布の熱特性をＤＳＣにより検討した。ガラス転移温度及び結晶化温度の測定は、室温から２００℃まで１分間１０℃の昇温速度で２回測定を行った。ファーストスキャンでの測定において、得られる融解ピークはＰＬＬＡの融点（約１８０℃）であった。その後、液体窒素で急冷させ、セカンドスキャン測定を行った。セカンドスキャンより求めたガラス転移温度および結晶化温度は、それぞれ、５６℃及び７８℃であった。この結果から７０℃または８０℃で熱処理した場合に蛍光強度が低くなった原因として、温水中で処理することで表面に存在していたオリゴ乳酸−ジエチレングリコール−ＩＫＶＡＶが溶出した可能性、および、ポリ乳酸が再結晶化することにより細胞接着性ペプチドが繊維表面に露出し難くなった可能性が考えられる。
【００５７】
以上の試験結果から、細胞接着性ペプチドと隣接する位置に親水性セグメントルを導入することで、細胞接着性ペプチドを繊維等の成形体の表面により効率的に露出させることができることが確認された。また、成形体をそのガラス転移温度（Ｔｇ）を基準に−５℃〜＋１０℃の温度で熱処理することにより、効率的に細胞接着性ペプチドを表面に露出させることができ、そのような成形体は、細胞接着性に優れることが確認された。      
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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