(57)【要約】【課題】新規な腸管バリア機能改善剤の提供。【解決手段】本発明は、ボタンボウフウ（Peucedanum japonicum Thunb.）の植物体またはその溶媒抽出物からなることを特徴とする腸管バリア機能改善剤を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボタンボウフウ（Peucedanum japonicum Thunb.）の植物体またはその溶媒抽出物からなることを特徴とする腸管バリア機能改善剤。
【請求項２】
前記溶媒抽出物が含水エタノール抽出物であることを特徴とする請求項１に記載の腸管バリア機能改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な腸管バリア機能改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸管などの消化管は、食物から必要な栄養素を吸収するのみならず、アレルゲンなどの異物の侵入から防御するよう外界と生体内を隔てるバリアの観点からも重要である（非特許文献１〜４）。
【０００３】
腸管のバリアに障害が起こると本来は排除されるべき有害物質が腸から吸収されてしまい様々な悪影響を及ぼす。このような腸管バリアの障害はリーキーガットとも呼ばれ、食物アレルギー、炎症性腸疾患、感染症肥満、糖尿病、メタボリックシンドロームなどの様々な疾患との関連が示唆されている（非特許文献２〜５）。
【０００４】
さらに、腸管のバリア機能の障害は、各種皮膚疾患と関連することも示唆されている。例えば、小児アトピー性皮膚炎患者では、症状の重症度と腸管透過性が相関するということ(非特許文献６）や、乾癬患者では、健常人と比較して腸管透過性が高い（非特許文献７）ことが記載されている。
【０００５】
近年、人々の腸内環境ケアに対する意識が高まっている。腸管バリア機能を改善し腸の状態を良好にすることで、全身や皮膚の状態の健康維持、疾患の治療や予防、美容効果等が期待されている。そこで、腸管バリア機能を改善するためにオリゴ糖や乳酸菌の摂取等が提案されている（特許文献１〜５）。このような状況の下、腸管バリア機能を改善する効果の高い更なる物質が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１４−１９３８３０号公報
【特許文献２】特開２０１６−１９３８９５号公報
【特許文献３】特開２０１０−８３８８１号公報
【特許文献４】特開２０１１−１７８７６４号公報
【特許文献５】特許第５０４６６８４号公報
【特許文献６】特開２００３−２６６９４号公報
【特許文献７】特開２００４−２６６９７号公報
【特許文献８】国際公開第２００９／１２３２１５号
【特許文献９】特開２００５−１９４２３９号公報
【特許文献１０】特許第３５２１１５５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】T. Suzuki, Cell. Mol. Life Sci. (2013) 70:631-659
【非特許文献２】Teixeira T. et. al., Nutr Hosp. 2014;29(2):269-281
【非特許文献３】Sapone et al., BMC Medicine 2011, 9:23
【非特許文献４】http://www.nhs.uk/conditions/leaky-gut-syndrome/Pages/Introduction.aspx
【非特許文献５】J. R. Kelly, et. al., Front Cell Neurosci. 2015; 9: 392.
【非特許文献６】V. Rosenfeldt et al., The Journal of Pediatrics 145 612-616  2004
【非特許文献７】P. Humbert et al., The Journal of Dermatological Science July 1991, Volume 2, Issue 4, Pages 324-326
【非特許文献８】I. R. Sequeira et al., PLOS ONE, June 2014, Volume 9, Issue 6, e99256
【非特許文献９】S. Noda et al., J Agric Food Chem. 2012. 60(18):4628-33
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、新規な腸管バリア機能改善剤の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、様々な物質について鋭意研究の結果、ボタンボウフウ（Peucedanum japonicum Thunb.）（別名「長命草」）の植物体またはその溶媒抽出物が、腸管バリア機能改善剤として機能することを見出した。
【００１０】
これらの知見に基づき、以下の発明を完成するに至った。
（１）ボタンボウフウ（Peucedanum japonicum Thunb.）の植物体またはその溶媒抽出物からなることを特徴とする腸管バリア機能改善剤。
（２）前記溶媒抽出物が含水エタノール抽出物であることを特徴とする（１）に記載の腸管バリア機能改善剤。
（３）（１）又は（２）に記載の腸管バリア機能改善剤を有効成分として含む、腸管バリア機能を改善するための組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の腸管バリア機能改善剤の投与により、腸管バリア機能を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ボタンボウフウ抽出物をマスト細胞キマーゼによるインビトロ腸管バリア破壊モデルで評価した結果を示す。群間で対応のないt検定を行い、Bonferroni補正によりp<0.017を有意差とし、＊で示す。
【図２】図２は、図１の結果を経時的に示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ボタンボウフウの植物体又はその抽出物が、腸管バリア機能改善作用を有することは、これまでに一切報告されていない。ボタンボウフウは、長命草とも呼ばれ、沖縄県などで古くから料理や民間薬として利用されてきた食材であり、糖尿病の予防・治療や肥満の解消などに有効であること（特許文献６）、細胞賦活作用、抗酸化作用、メラニン産生抑制作用があること（特許文献７）、ヘペラナーゼ活性抑制作用があり、しわの防止、改善に有効であること（特許文献８）、セラミド合成促進作用があること（特許文献９）、Sirtuin-1遺伝子活性効果があることなどが知られている（特許文献１０）が腸管バリア機能との関連性は知られていなかった。
【００１４】
本発明の腸管バリア機能改善剤の投与により、腸管バリア機能を改善することができる。腸管バリア機能の改善は、大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患、セリアック病などの自己免疫疾患の治療及び／又は予防に有用である。また、腸管バリア機能の改善は、腸管バリア機能の障害に起因する肥満、糖尿病、メタボリックシンドローム、アレルギー性疾患、及び／又は精神障害の治療及び／又は予防にも有用である。
【００１５】
また、本発明は、腸管バリア機能の改善が必要な対象者にボタンボウフウを有効成分として投与することを含む腸管バリア機能を改善する方法、腸管バリア機能の改善に使用するためのボタンボウフウ、腸管バリア機能改善剤を製造するためのボタンボウフウの使用も包含する。
【００１６】
腸管バリア機能とは、外界と生体内を隔てている腸管の上皮細胞がアレルゲンなどの異物や有害物質の侵入を制限する機能のことを言う。例えば、腸管上皮細胞の細胞間隙にはタイトジャンクション（TJ）と呼ばれる構造があり、細胞間の物質の透過を制御することにより腸管バリア機能の維持に寄与している（非特許文献１）。また、糖類や腸内の細菌叢も腸管バリア機能に関与しているとの報告もある（特許文献１〜５、非特許文献５、８）。腸管バリア機能に障害が生じると、望ましくない物質が腸を透過してしまい、炎症等、体内に悪影響を起こし得る（非特許文献４）。
【００１７】
腸管バリア機能の改善とは、上記のような腸管バリア機能の障害を予防及び／又は治療すること、腸管バリアを正常な状態に維持すること、タイトジャンクションを形成／修復／機能調節すること、腸粘膜を保護すること、粘液層の形成を促すこと、等を含むこともある。
【００１８】
腸管バリア機能は、様々な手法で評価することができるが、例えば、腸管易透過性マーカーであるマンニトール（Ｍ）と難透過性マーカーであるラクチュロース（Ｌ）を摂取した後の尿中ラクチュロース濃度とマンニトール濃度を測定し、ラクチュロース／マンニトール（Ｌ／Ｍ）比を比較することで評価できる。摂取後2.5-4h後のＬ／Ｍ比が小腸のバリア機能を反映することが知られている（非特許文献８）。また、Caco-2細胞間の経上皮電気抵抗（Transepithelial Electric Resistance；TEER）を測定することにより、腸管のバリア機能を測定する方法も知られている（非特許文献９）。
【００１９】
本発明で用いられるボタンボウフウ（別名「長命草」）はセリ科（Umbelliferae）カワラボウフウ属（Peucedanum L.）の植物であり、本州石川県、関東地方以西、四国、九州、沖縄等に分布し、海辺の向陽地に生える多年草である（新訂原色牧野和漢薬草大図鑑 368頁 (2002)）。
【００２０】
ボタンボウフウは、葉（葉身）、小葉柄、葉柄、茎、花、根、等、又は植物体全体であってもよく、また、乾燥、生、粉末状、小断片状、ペースト状、抽出物等任意の形態であり得る。ボタンボウフウは生のままでも乾燥したものでも使用することができるが、使用性、製剤化等の観点から乾燥粉末あるいは抽出物として用いることが好ましい。植物の全草あるいは各種部位（葉、花、根等）を細断又は粉砕し、その後に乾燥する方法や植物を乾燥した後に細断又は破砕、切断、圧砕、擦り潰し、ホモジナイズ、ミキシングなどの方法で、細分化したもの、任意の方法で抽出した抽出物といった任意の形態であり得る。植物の全草あるいは各種部位（葉、花、根等）を細断又は粉砕し、発酵や酵素処理を施した後、乾燥し、更に必要に応じて所定の粒径にすべく粉砕する方法等を適宜採ることができる。
【００２１】
ここで、破砕とは、切断、圧砕、擦り潰し、ホモジナイズ、ミキシングなど任意の方法で、葉等の植物体を細分化することである。粉末状にしてもよいし、小断片状であってもよい。破砕及び混合は、乾燥した植物体を用いてもよく、乾燥していない生の葉を用いてもよい。
【００２２】
本発明で用いる抽出物の抽出方法は溶媒抽出により行うことができる。溶媒抽出の場合には、植物の若葉を必要に応じて乾燥させ、更に必要に応じて細断又は粉砕した後、水性抽出剤、例えば冷水、温水、又は沸点若しくはそれより低温の熱水、あるいは含水有機溶媒、有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、１，３−ブタンジオール、エーテル等を常温で又は加熱して用いることにより抽出される。しかし、抽出方法は溶媒抽出に限定されず、当業界で知られている常用の手法によってもよい。上記抽出物の形態は、抽出液自体だけでなく、常用の手法により適宜希釈又は濃縮したものであってもよく、更に、抽出液を乾燥することによって得られる粉状あるいは塊状の固体であってもよい。
【００２３】
本発明で用いる抽出物の抽出方法や抽出物の形態は上記と同様に本発明の効果を損なわない限り、任意であるが、本発明に用いられる抽出溶媒は、含水有機溶媒が好ましく、特に含水メタノール、含水エタノール又は含水１，３−ブタンジオール等の含水低級アルコールを選ぶことが好ましく、含水エタノールが最も好ましい。その場合の含水率は、例えば２０〜８０質量％、３０〜７０質量％、５０質量％等のこともある。
【００２４】
ボタンボウフウの摂取量は特に限定されないが、体重60ｋｇのヒトでは、１日あたり、乾燥重量換算で500〜5000ｍｇ摂取するのが好ましく、1000〜4000ｍｇを摂取するのがより好ましく、1500〜4000ｍｇを摂取するのがさらに好ましい。
【００２５】
本発明の腸管バリア機能改善剤および組成物におけるボタンボウフウの含有量は特に限定されないが、乾燥重量換算で１日あたり好ましくは500〜5000ｍｇ、より好ましくは1000〜4000ｍｇ、更に好ましくは1500〜4000ｍｇ摂取される量で配合されている。また、本発明の効果を高めるために、各種乳酸菌、糖類、他の腸管バリア機能改善剤等を併用してもよい。
【００２６】
本発明の腸管バリア機能改善剤の形態は、液体状、固形状、顆粒状、粒状、ペースト状、ゲル状など任意に選択することができる。
【００２７】
本発明の腸管バリア機能改善剤を含む組成物は、乾燥粉末、お茶や清涼飲料水などの飲料、サプリメントなどの錠剤及びカプセル剤、加工食品等の食品組成物であっても、医薬品等の医薬組成物であってもよい。また、本組成物は粉末、錠剤、液状、固形状、顆粒状、ペースト状、ゲル状、乳液状、クリーム状、シート状、スプレー状、泡状等の様々な形態であり得る。
【００２８】
また、本発明の腸管バリア機能改善剤および組成物の投与経路は、経口、経鼻、経腸等を含むが、これらに限定されない。
【００２９】
更に、本発明の腸管バリア機能改善剤および組成物は、必要に応じて添加剤を任意に選択し併用することができる。添加剤としては賦形剤等を含ませることができる。
【００３０】
賦形剤としては、所望の形態としたときに通常用いられるものであれば何でも良く、例えば、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、シクロデキストリンなどのでんぷん類、結晶セルロース類、乳糖、ブドウ糖、砂糖、還元麦芽糖、水飴、フラクトオリゴ糖、乳化オリゴ糖などの糖類、ソルビトール、エリスリトール、キシリトール、ラクチトール、マンニトールなどの糖アルコール類が挙げられる。これら賦形剤は、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。
【００３１】
また、本発明の腸管バリア機能改善剤および組成物は、必要に応じて、その他の成分、例えば、着色剤、保存剤、増粘剤、結合剤、崩壊剤、分散剤、安定化剤、ゲル化剤、酸化防止剤、界面活性剤、保存剤、ｐＨ調整剤、油分、粉末、色材、水、アルコール類、増粘剤、キレート剤、シリコーン類、酸化防止剤、紫外線吸収剤、保湿剤、香料、各種薬効成分、防腐剤、ｐＨ調整剤、中和剤等、公知のものを適宜選択して使用できる。
【実施例】
【００３２】
次に実施例によって本発明を更に詳細に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
試料の調製：
ボタンボウフウ生葉を送風乾燥し破砕処理して得たボタンボウフウ乾燥粉末を50%エタノールで抽出した。この抽出物を、エバポレーターおよび凍結乾燥により溶媒除去し、50%エタノールに再溶解させ、濃度が250μg/mLであるボタンボウフウ50%エタノールエキスを調製した。このエキスより、ボタンボウフウをさらに10倍に濃縮し最終濃度が2.5mg/mLのボタンボウフウ抽出物を調製し実施例４で使用した。
【実施例２】
【００３４】
細胞と培地の調製：
Caco-2細胞は、DSファーマより購入した。1.0−3.0×105 cells／75cm2の密度でフラスコに播種し、3−7日ごとに継代を行った。透過膜（Transwell（登録商標）；  Corning #3799）上へは、2.0×104 cells／wellの密度で播種した。その際、頂部側（Apical）には200μL、基底外側（Basolateral）には500μLの培地を添加した。フラスコおよび透過膜上での培養、維持には10%FBS、1% Non-Essential Amino Acids（NEAA）（Sigma）およびペニシリン-ストレプトマイシン含有のDMEM培地（Gibco  #11995）を使用した。
【実施例３】
【００３５】
TEERの測定：
実施例２で調製したCaco-2細胞を2−3日に1回の割合で培地交換を行って、Transwell上で2−3週間培養した。透過膜上に培養した細胞間の経上皮電気抵抗（Transepithelial Electric Resistance；TEER）をMillicell-ERS（Millipore）を用いて測定した。Caco-2細胞を、FBS、NEAA、ペニシリン-ストレプトマイシン非含有のDMEM（Gibco  #11995）で一度洗浄した後、同じ培地に変更し、一晩培養した。翌朝、同じ培地（頂部側180μL、基底外側450μL）に交換して、3−5時間後に38℃に加温したホットプレート上でTEERを測定した。TEERが800−1200Ω・cm2程度のCaco-2細胞を実施例４の腸管バリア機能低下抑制試験に使用した。
【実施例４】
【００３６】
腸管バリア機能低下抑制試験：
実施例３のTEERの測定によるTEERの平均値が同程度になるように群分けを行った。ボタンボウフウ試料を添加する群と添加しない群におけるマスト細胞キマーゼによる腸管バリア機能の低下に対する腸管バリア機能改善効果を比較検討した。対照群として、キマーゼを添加しないCaco-2細胞も使用した。
【００３７】
試料は、実施例１で作成した2.5mg/mLのボタンボウフウ抽出物を用いた。このボタンボウフウ抽出物を頂部側に20μL、基底外側に50μL添加した。また、エタノールが含有される試料を用いる場合、エタノールの最終濃度を、これらのCaco-2細胞のTEERに影響を与えないことを事前に確認している0.25%とした。試料の添加後、1-2時間後にTEERを測定（0h）し、基底外側にRecombinant Human Chymase （R&D Sysyems #4099-SE-010）（0.028mg/mL）とヘパリン（Sigma #3149）（5mg/mL）を溶解したDMEMを10μL添加した。以後、0.5、1、2時間後にTEERを測定した。その結果を図１及び図２に示す。
【００３８】
結果・考察：
ボタンボウフウ抽出物をマスト細胞キマーゼによるインビトロ腸管バリア破壊モデルで評価した結果を、図１および図２に示す。図１および図２に見られるように、キマーゼを加えたCaco-2細胞ではキマーゼを加えない対照に対しいずれの時点でもTEERが有意に低く、腸管バリア機能が低下していることがわかる。しかし、図１および図２から明らかなように、ボタンボウフウ抽出物を添加した群では、すべての時間において、キマーゼによるCaco-2細胞のTEER低下、つまり腸管バリア機能の低下が抑制されていたことがわかる。
【００３９】
以上の結果により、マスト細胞キマーゼを添加すると、腸管バリア機能が低下するが、事前にボタンボウフウ抽出物を培地に添加しておくと、このような腸管バリア機能の低下を抑制することができることがわかった。従って、ボタンボウフウ抽出物には、腸管バリア障害を緩和させる効果があり、腸管バリア機能を改善させる作用があることが実証された。
【００４０】
ここで、腸管バリア機能の障害は各種疾患や状態に影響することが示されている（非特許文献２〜７等）。また、本実施例によりボタンボウフウ抽出物には腸管バリア機能改善効果があることが認められた。従って、本発明の腸管バリア機能改善剤は、腸管バリア機能の障害に起因する各種疾患の治療及び／又は予防にも有効である。
【図１】
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【図２】
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