(57)【要約】【課題】  抗アレルギー作用を呈するフェニルペプチド誘導体を提供する。【解決手段】  目的とするフェニルペプチド誘導体はフェニル基及びロイシンペプチドからなる誘導体である。この誘導体は抗アレルギー作用を発揮し、かつ、皮膚細胞のケラチンを増加させる。また、水素ガスを発生させる。その製造方法は乳酸桿菌、アサイヤシ果実をベニコウジ菌により発酵させた発酵液に分岐シクロデキストリンを添加してプロテアーゼ処理する工程からなる。このフェニルペプチド誘導体は健康食品、化粧料、医薬品、医薬部外品や植物活性化剤に利用できる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）に示される抗アレルギー作用を呈するフェニルペプチド誘導体。
【化１】
2018154567.tif 000005
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は抗アレルギー作用を呈するフェニルペプチド誘導体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーは現代病といわれ、花粉症、アトピー、食物アレルギーの患者は増加している。アレルギーは全身または局所で発生する生体反応であり、痛み、かゆみ、発赤などの炎症を呈する。アレルゲンの侵入や擦傷により生体が刺激された場合に、アレルギー反応が生じる。
【０００３】
アレルギー発症時にはアレルギー性サイトカイン、アレルギー物質などの生体物質が産生され、アレルギー反応を発症させる。アレルギーは日常生活や仕事中において障害になることが多いため、アレルギーを改善する抗アレルギー剤が開発されている。
【０００４】
合成ステロイド剤は炎症とアレルギーを抑制するものの副作用として日和見感染が認められる。また、ＮＡＩＤｓと言われる非ステロイド性抗アレルギー剤にも副作用があり、腸管異常や嘔吐などが認められる。そこで副作用のない天然物由来の抗アレルギー作用を発揮する物質が探索されている。
【０００５】
天然の抗アレルギー剤に関する発明としては甘茶の抽出エキスからなる抗アレルギー剤に関する発明があるものの、より具体的に抗アレルギー作用を発揮する物質が特定されていない。（例えば、特許文献１参照。）
【０００６】
グルテン又はゼイン由来のペプチド型グルタミンを固形換算で３０ｍｇ重量％以上含有する抗アレルギー性を有する乳児用経口栄養組成物の発明があるものの、その作用が不明瞭であり、かつ、有用物質の特定に至っていない。（例えば、特許文献２参照。）
【０００７】
また、ロイシンを含む抗アレルギー剤の発明として新規ロイシン誘導体並びにそれを含有する抗アレルギー剤及び抗炎症剤の発明があるものの、その作用は不明瞭である。（例えば、特許文献３参照。）
【０００８】
このように、抗アレルギー作用を発揮し、副作用の少ない天然物は望まれているものの、有用な物質に関する発明はない。そのため、天然物由来でかつ、抗アレルギー作用を呈する物質が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第３５１５７９３号
【特許文献２】特許第３９７９５４３号
【特許文献３】特願平４−１１４９０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記したように既存の天然物による抗アレルギー作用は軽度であり、産業上への利用が限定されるという課題があり、また、化学合成された物質では安全性に問題があり、利用が限られている。
【００１１】
そのため、副作用が弱く優れた抗アレルギー作用を呈する物質が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は下記の式（１）に示される抗アレルギー作用を呈するフェニルペプチド誘導体に関するものである。
【００１３】
【化１】
2018154567.tif 000002
【発明の効果】
【００１４】
この発明は、上記のように構成されているため、次のような効果を奏する。
【００１５】
請求項１に記載の誘導体によれば、優れた抗アレルギー作用を発揮することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、この発明を具体化した実施形態について詳細に説明する。
【００１７】
まず、下記の式（１）に示される抗アレルギー作用を呈するフェニルペプチド誘導体は炭素元素３５個、水素元素４６個、酸素元素６個及び窒素元素２個から構成されている。
【００１８】
【化２】
2018154567.tif 000003
【００１９】
すなわち、Ｃ３５Ｈ４６Ｏ６Ｎ２の化学式である。２分子のＬ−ロイシンと３分子のフェニル基から構成されている。２分子のロイシンは互いにペプチド結合で結合し、ロイシンジペプチドを構成している。
【００２０】
この誘導体の中心に存在するフェニル基部分はロイシンジペプチドとエステル結合している。つまり、ジペプチドのカルボン酸とフェニル基の水酸基とのエステル結合である。ジペプチドのＮ末はフリー状態である。
【００２１】
３分子のフェニル基はエチル基を介したエーテル結合で結合されている。これらのフェニル基の由来はフェニルアラニンと類推される。
【００２２】
この誘導体はアレルギーを発症させるＩｇＥ二量体のマスト細胞への結合を阻害する。また、この誘導体はマスト細胞のヒスタミン遊離を抑制する。つまり、この誘導体はマスト細胞の細胞膜に侵入し、細胞膜を安定化させる。これによりヒスタミン遊離を抑制する。
【００２３】
さらに、この誘導体はアレルギー性サイトカインの産生を抑制する。アレルギー性サイトカインとしてはＩＬ−６（インターロイキン−６）がある。この誘導体はＩＬ−６の産生を抑制することによりアレルギーを改善する。ＩＬ−６の抑制はこの誘導体がＩＬ−６のｍＲＮＡの発現を抑制することにより生じる。
【００２４】
また、この誘導体は炎症性のプロスタグランジン（プロスタグランジンＥ２）の産生を抑制することにより抗アレルギー作用を発揮する。
【００２５】
また、このフェニルペプチド誘導体をフェニル基及びロイシンを原料として有機化学的に合成することができる。この有機合成された誘導体は標準物質として解析や分析に利用される。しかし、化学的な製造にはコストがかかり、かつ、有害な有機溶媒と重金属を使用することから、化粧品や食品分野には利用しにくいという安全性上の欠点がある。
【００２６】
このフェニルペプチド誘導体の構造についてはこの誘導体の重水素化ジメチルスルホキシド中の６００ＭＨｚのＨ−ＮＭＲ（１Ｈ−ＮＭＲ）解析（ブルカー製）により、ピークの位置は０．４５、０．６２、０．７９、０．８６、１．６４、１．７７、１．７８、１．７９、１．９４、２．６７、２．７１、２．８６、３．０１、３．２３、３．５４、３．６７、４．０８、４．０９、４．２０、４．７２、６．７９、６．８０、６．９４、７．０６、７．１３、７．４１、８．３５及び９．３８ｐｐｍに認められる。
【００２７】
また、この誘導体の重水素化ジメチルスルホキシド中のＣ−ＮＭＲ（１３Ｃ−ＮＭＲ）解析ではピークの位置は１８．１、１９．２、１９．３、１９．６、２１．９、３０．２、３０．６、３１．２、３１．７、３３．３、３７．６、４６．６、５３．０、５３．４、６１．５、６１．８、６２．１、１１６．０、１１６．２、１２８．２、１２８．３、１３１．２、１３１．４、１５７．３、１５７．６、１６９．９、１７０．３、１７１．０、１７１．７及び１７２．０ｐｐｍに認められる。
【００２８】
このフェニルペプチド誘導体は天然由来であることから、吸収性と安全性が高い。特に、このフェニルペプチド誘導体は体内酵素、特に、ペプチダーゼやエステラーゼなどによりフェニル基とロイシンに分解される点から、安全性が高い。仮に、この誘導体を大量に摂取した場合でも体内で過剰量は分解されることから安全性が高い。
【００２９】
このフェニルペプチド誘導体は特に、皮膚のアレルギーを抑える働きが強い。その理由は胃における胃酸による分解である。つまり、胃酸の強酸性によって分解される。したがって、経口摂取する場合には耐酸性の製剤化または腸溶性カプセルに充填されるなど胃酸に対する対策が必要である。
【００３０】
さらに、この誘導体は粉末にした場合、水溶液と反応する際に、水素ガスを発生する。発生する水素ガスは活性酸素を除去する働きがあるため、紫外線や酸化物質によって発生した活性酸素を除去して生体を安定に維持できることから好ましい。また、水素ガスはヒドロキシルラジカルを消去し、還元作用を呈し、かつ、抗酸化作用を発揮することから好ましい。
【００３１】
さらに、皮膚表皮細胞に働き、皮膚細胞を増殖させ、また、ケラチンを増加させる。このフェニルペプチド誘導体はケラチン合成酵素を活性化してケラチン量を増加させる。ケラチンの増加作用は皮膚や毛髪を強固にすることから好ましい。
【００３２】
このフェニルペプチド誘導体の抽出方法または製造方法としては発酵法、酵素反応法や化学合成法などがある。
【００３３】
このフェニルペプチド誘導体の製造方法としては乳酸桿菌、アサイヤシ果実、コメヌカなどから抽出することができる。この抽出方法ではプロテアーゼやリパーゼなどの消化酵素を利用することは抽出効率が高められることから好ましい。
【００３４】
特に、乳酸桿菌にはもともとペプチドが豊富であることから原料として好ましい。また、酵素反応法の場合、フェニルペプチド誘導体を含有する植物から抽出することができる。または、発酵により微生物に生合成させることができる。
【００３５】
乳酸桿菌をアサイヤシ果実とコメヌカと発酵させることはこのフェニルペプチド誘導体の製造方法として有用である。発酵させる場合には、乳酸桿菌に加えてベニコウジ菌を利用できる。これらの発酵技術は日本では知識が豊富であり、食用としての実績も多く、かつ、安全性も高いことから好ましい。
【００３６】
さらに、高純度の誘導体を得る目的で精製されることは好ましい。精製の方法としては、分離用の樹脂などの精製操作を利用することは好ましい。
【００３７】
例えば、分離用担体または樹脂により分離され、分取されることは好ましい。分離用担体または樹脂としては、表面が後述のようにコーティングされた、多孔性のフェニルペプチド、酸化珪素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン−ビニルベンゼン共重合体等が用いられる。０．１〜３００μｍの粒度を有するものが好ましく、粒度が細かい程、精度の高い分離が行なわれるが、分離時間が長い欠点がある。
【００３８】
例えば、逆相担体または樹脂として表面が疎水性化合物でコーティングされたものは、疎水性の高い物質の分離に利用される。陽イオン物質でコーティングされたものは陰イオン性に荷電した物質の分離に適している。また、陰イオン物質でコーティングされたものは陽イオン性に荷電した物質の分離に適している。特異的な抗体をコーティングした場合には、特異的な物質のみを分離するアフィニティ担体または樹脂として利用される。
【００３９】
アフィニティ担体または樹脂は、抗原抗体反応を利用して抗原の特異的な調製に利用される。分配性担体または樹脂は、シリカゲル（メルク社製）等のように、物質と分離用溶媒の間の分配係数に差異がある場合、それらの物質の単離に利用される。
【００４０】
これらのうち、製造コストを低減することができる点から、吸着性担体または樹脂、分配性担体または樹脂、分子篩用担体または樹脂及びイオン交換担体または樹脂が好ましい。さらに、分離用溶媒に対して分配係数の差異が大きい点から、逆相担体または樹脂及び分配性担体または樹脂はより好ましい。
【００４１】
分離用溶媒として有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒に耐性を有する担体または樹脂が用いられる。また、医薬品製造または食品製造に利用される担体または樹脂は好ましい。これらの点から吸着性担体としてダイヤイオン（三菱化学（株）社製、ＨＰ−２０及びＨＰ−２１）及びＸＡＤ−２またはＸＡＤ−４（ロームアンドハース社製）、分子篩用担体としてセファデックスＬＨ−２０（アマシャムファルマシア社製）、分配用担体としてシリカゲル、イオン交換担体としてＩＲＡ−４１０（ロームアンドハース社製）、逆相担体としてＤＭ１０２０Ｔ（富士シリシア社製）がより好ましい。
【００４２】
これらのうち、ダイヤイオンＨＰ−２０、セファデックスＬＨ−２０及びＤＭ１０２０Ｔはさらに好ましい。
【００４３】
得られた抽出物は、分離前に分離用担体または樹脂を膨潤化させるための溶媒に溶解される。その量は、分離効率の点から抽出物の重量に対して１〜４０倍量が好ましく、４〜２０倍量がより好ましい。分離の温度としては物質の安定性の点から４〜３０℃が好ましく、１０〜２５℃がより好ましい。
【００４４】
分離用溶媒には、水、または、水を含有する低級アルコール、親水性溶媒、親油性溶媒が用いられる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが用いられるが、食用として利用されているエタノールが好ましい。
【００４５】
セファデックスＬＨ−２０を用いる場合、分離用溶媒には低級アルコールが好ましい。シリカゲルを用いる場合、分離用溶媒にはクロロホルム、メタノール、酢酸またはこれらの混合液が好ましい。
【００４６】
ダイヤイオンＨＰ−２０及びＤＭ１０２０Ｔを用いる場合、分離用溶媒はメタノール、エタノール等の低級アルコールまたは低級アルコールと水の混合液が好ましい。
【００４７】
また、活性を含む画分を採取して乾燥または真空乾燥により溶媒を除去し、粉末または濃縮液として得ることは溶媒による影響を除外できることから、好ましい。
【００４８】
このフェニルペプチド誘導体は優れた抗アレルギー作用を発揮し、特に、皮膚に対して外敵抗原に対するアレルギーを防御できる点から好ましい。たとえば、細菌感染によるアレルギー、ニキビ菌によるアレルギーやアトピー性のアレルギーに対して作用する。さらに、皮膚のケラチンも生合成し、美肌作用、抗アレルギー作用や皮膚再生作用を呈する。また、ケラチン産生を必要とするまつ毛増殖剤、育毛剤、毛髪用化粧料としても利用できる。
【００４９】
フェニルペプチド誘導体に油脂を添加することは、得られる活性部分が油の中で安定に維持することから好ましい。例えば、大豆油、米ぬか油、グレープシード油、オリーブ油、ホホバ油で抽出することは好ましい。この誘導体は水溶性と油溶性の両方の溶媒に溶解する。この両親媒性の性質はこの誘導体の利用を広げることから好ましい。
【００５０】
医薬品として注射剤または経口剤または塗布剤などの非経口剤として利用され、医薬部外品としては、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、石鹸、塗布剤、ゲル剤、歯磨き粉等に配合されて利用される。
【００５１】
経口剤としては錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、ドリンク剤等が挙げられる。上記の錠剤及びカプセル剤に混和される場合には、結合剤、賦形剤、膨化剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤等とともに用いることができる。上記の錠剤は、シェラックまたは砂糖で被覆することもできる。
【００５２】
また、上記のカプセル剤の場合には、上記の材料にさらに油脂等の液体担体を含有させることができる。上記のシロップ剤及びドリンク剤の場合には、甘味剤、防腐剤、色素香味剤等を添加することができる。
【００５３】
非経口剤としては、軟膏剤、クリーム剤、水剤等の外用剤の他に、注射剤が挙げられる。外用剤の基材としては、ワセリン、パラフィン、油脂類、ラノリン、マクロゴールド等が用いられ、通常の方法によって軟膏剤やクリーム剤等とすることができる。
【００５４】
注射剤には、液剤があり、その他、凍結乾燥剤がある。これは使用時、注射用蒸留水や生理食塩液等に無菌的に溶解して用いられる。
【００５５】
食品製剤として抗アレルギー作用を目的とした食品、抗アレルギー作用を目的とした健康食品、ケラチン増加による皮膚保護のための食品などに利用される。また、保健機能食品として栄養機能食品や特定保健用食品に利用することは好ましい。
【００５６】
得られた食品製剤をイヌやネコなどのペットや家畜動物に利用する場合、アレルギー改善する目的として、飼料やペット用サプリメントとして利用される。
【００５７】
化粧料として常法に従って界面活性化剤、溶剤、増粘剤、賦形剤等とともに用いることができる。例えば、クリーム、毛髪用ジェル、洗顔剤、美容液、化粧水等の形態とすることができ、抗アレルギー作用及びケラチンの産生を呈する化粧料となる。化粧料の形態は任意であり、溶液状、クリーム状、ペースト状、ゲル状、ジェル状、固形状または粉末状として用いることができる。この誘導体は水溶性と油溶性の両方の溶媒に溶解する。この両親媒性の性質はこの誘導体の利用を広げることから好ましい。
【００５８】
また、この誘導体は抗アレルギー作用を利用した植物活性化剤としても利用される。すなわち、植物はウイルスや細菌などの外敵に対して局所でアレルギー性反応を起こして生育が抑制される。そこで、この誘導体が植物のアレルギーを抑制することにより植物の生育を活性化し、開花、結実、収穫量の増加をもたらすことは好ましい。
【００５９】
以下に、乳酸桿菌、アサイヤシ果実とコメヌカを発酵する製造工程によりこの誘導体の製造ついて説明する。つまり、乳酸桿菌とベニコウジ菌によりアサイヤシ果実とコメヌカを発酵させた発酵液に分岐シクロデキストリンを添加してプロテアーゼ処理を行う。
【００６０】
原料となる物質は乳酸桿菌、ベニコウジ菌、アサイヤシ果実、コメヌカ、分岐シクロデキストリン及びプロテアーゼである。
【００６１】
乳酸桿菌はラクトバチルス属の細菌であり、ヒトの腸管内の細菌叢に存在して腸管免疫に関与している。特に、乳幼児の乳酸桿菌はアレルギーの抑制にも関与が深い。用いる乳酸桿菌としては、たとえば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓやＬ５５菌が適している。この乳酸桿菌は市販されているものを用いることもできるが、乳幼児から採取したものも用いられる。
【００６２】
アサイヤシ果実は学名Ｅｕｔｅｒｐｅ  ｏｌｅｒａｃｅａでヤシ科アレカ亜科キャベツヤシ属の果実であり、中央アメリカ、南アメリカにかけて分布する食用果実である。日本にも南米ペルーから輸入されているため、新鮮な果実を利用できる。
【００６３】
原料となるコメヌカは米から得られる外皮と胚芽部分である。日本産のコメヌカはトレーサビリティーが確実であり、生産者が明確である点から好ましい。
【００６４】
このうち、有機栽培や無農薬で栽培されたコメヌカは有害な農薬や金属を含有しないことから、さらに好ましい。
【００６５】
これらの原料は使用に際して株式会社奈良機械製作所製の自由ミル、スーパー自由ミル、サンプルミル、ゴブリン、スーパークリーンミル、マイクロス、減圧乾燥機として東洋理工製の小型減圧乾燥機、株式会社マツイ製の小型減圧伝熱式乾燥機ＤＰＴＨ−４０、エーキューエム九州テクノス株式会社製のクリーンドライＶＤ−７、ＶＤ−２０、中山技術研究所製ＤＭ−６などの粉砕機で乾燥され、粉砕される。これにより発酵の工程が効率的に進行されやすい。
【００６６】
発酵に用いるベニコウジ菌は学名Ｍｏｎａｓｃｕｃ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの糸状菌であり、古くから日本、中国や台湾において紅酒や豆腐ようなどの発酵食品に利用されている。また、沖縄や鹿児島などの日本産、中国や台湾の東南アジア原産の菌種が用いられる。紅麹本舗製のベニコウジ菌は発酵効率に優れている。
【００６７】
上記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により上記の材料を混合することは好ましい。さらに、発酵物は以下の工程により、低分子化され、安定に維持される。
【００６８】
分岐シクロデキストリンは環状ブドウ糖の一つであり、内腔に疎水性部分を有することから疎水性の高い物質を吸着しやすい。塩水港精糖社製の分岐シクロデキストリンは品質が高いことから好ましい。
【００６９】
用いるプロテアーゼとしては天野エンザイム社製の食品加工用プロテアーゼであるプロテアーゼＡ「アマノ」ＳＤ、プロテアーゼＭ「アマノ」ＳＤまたはプロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤの品質が安定し、使用実績が豊富なことから好ましい。
【００７０】
まず、アサイヤシ果実とコメヌカはベニコウジ菌により発酵される。発酵は静置法または撹拌法のいずれでも良いが、発酵を短時間で実施できる点から撹拌法が好ましい。発酵は３９〜４４℃で２４時間から７２時間行われることが好ましい。温度が低く、時間が短い場合には発酵が進まず、温度が高く、時間が長い場合には目的とするフェニルペプチド誘導体が分解されてしまうおそれがある。
【００７１】
この発酵液は濾過布などにより濾過され、ここに乳酸桿菌が添加されてさらなる発酵が行われる。発酵は３８〜４３℃で２４時間から７２時間行われることが好ましい。温度が低く、時間が短い場合には発酵が進まず、温度が高く、時間が長い場合には目的とするフェニルペプチド誘導体が分解されてしまうおそれがある。発酵物はろ過されてろ液が以下の工程に供される。
【００７２】
このろ液に分岐シクロデキストリンが添加される。ブドウ糖が環状に結合し、食品や化粧料に利用されることから好ましい。
【００７３】
添加される分岐シクロデキストリンは上記の発酵液１００ｇに対して分岐シクロデキストリンの１００ｇから３００ｇが好ましい。この分岐シクロデキストリンによりリボースとペプチドが結合する。この分岐シクロデキストリンとの懸濁液は攪拌されることが好ましい。
【００７４】
この懸濁液にプロテアーゼが添加される。添加されるプロテアーゼは上記の発酵液１００ｇに対して０．００１ｇから０．３ｇが好ましい。このプロテアーゼは精製水に懸濁して添加されることは反応が進むことから好ましい。
【００７５】
この懸濁液は反応を促進するために加温され、攪拌されることは好ましい。加温としては３７〜４４℃が好ましい。また、攪拌は１分間当り１０〜３０回が好ましい。時間は１時間から６時間が好ましい。
【００７６】
このプロテアーゼ反応液は濾過される。濾紙やメンブランフィルターを用いることにより効率良くろ過される。ろ過してろ液を得ることにより反応していない成分や原料を排除できることから好ましい。
【００７７】
得られた反応物は煮沸滅菌され、プロテアーゼを失活させることは好ましい。さらに、得られた反応物は、凍結乾燥することにより粉末化され、用いられる。
【００７８】
上記の反応物から、目的とするフェニルペプチド誘導体を上記に記載した精製方法により分離し、精製することは純度の高い物質として摂取量を減少させることができる点から好ましい。
【００７９】
フェニルペプチド誘導体を含む画分を採取して乾燥または真空乾燥により溶媒を除去し、目的とするフェニルペプチド誘導体を粉末または濃縮液として得ることは溶媒による影響を除外できることから、好ましい。
【００８０】
また、このフェニルペプチド誘導体を粉末化することは防腐の目的から好ましい。
【００８１】
以下、上記実施形態を実施例及び試験例を用いて具体的に説明する。なお、これらは一例であり、素材、原料や検体の違いに応じて常識の範囲内で条件を変更させることが可能である。
【実施例１】
【００８２】
ブラジルで減農薬栽培されたアサイーの果実を株式会社フルッタフルッタより購入して用いた。果実を水道水で水洗後、天日で乾燥させ、粉砕機（株式会社奈良機械製作所製のスーパー自由ミル）にて粉砕し、アサイーの果実の乾燥粉末粉砕物を１．１ｋｇ得た。
【００８３】
秋田県で無農薬栽培されたコメより得られたコメヌカを農業生産法人シェアふぁーむ秋田五城目より購入して用いた。これをミキサー（クイジナート）に供し、コメヌカ粉砕物１．１ｋｇを得た。上記のアサイーの果実とコメヌカ粉砕物をオートクレーブに供し、１２１℃、２０分間、滅菌した。
【００８４】
これらを清浄な発酵タンク（滅菌された発酵用丸形４０リットルタンク）に入れ、滅菌された水道水１１ｋｇを添加し、攪拌した。
【００８５】
これとは別に、有限会社紅麹本舗より購入したベニコウジ菌の１１ｇを小型発酵タンクに供し、滅菌したコメヌカ粉末と前培養させた培養液を用意した。
【００８６】
上記の前培養したベニコウジ菌の溶液を上記のアサイーの果実粉末とコメヌカ粉末を入れた発酵タンクに添加し、攪拌後、４０〜４１℃の温度範囲で加温し、発酵させた。
【００８７】
発酵過程では、通気によりバブリングと攪拌を行いつつ、発酵液のサンプリングを行った。
【００８８】
発酵の状態は溶解したタンパク質の定量（ビューレット法）によりモニタリングした。
【００８９】
発酵後、得られた発酵液の上清を濾過布により粗濾過してろ液を得た。
【００９０】
このろ液１０リットルを清浄なタンクに移して森永乳業株式会社より乳酸桿菌１０ｇを添加してさらに、発酵させた。発酵温度は３９〜４０℃とし、２４時間発酵させた。
【００９１】
発酵後、発酵液をろ過してろ液を採取した。このろ液に塩水港精糖社製の分岐シクロデキストリン（イソエリート）５０ｇを添加して十分に攪拌した。
【００９２】
さらに、天野エンザイム製のプロテアーゼＭ「アマノ」ＳＤの５ｇを添加し、３７℃に加温して攪拌した。
【００９３】
攪拌は攪拌装置を用いて室温で１０時間実施した。この反応液を短時間、煮沸滅菌し、酵素を失活させた。得られた反応液を東洋濾紙の濾紙（Ｎｏ．２）により吸引ろ過してろ液を得た。
【００９４】
この溶液を凍結乾燥機（タイテック社製のフリーズトラップＶＡ−１４０Ｓ）により凍結乾燥させて目的とする粉末１８ｇを得た。これを検体１とした。
【００９５】
得られた検体１の粉末１０ｇを精製水１００ｍＬに懸濁して５％エタノールで膨潤させたダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学製）５００ｇに供した。５％エタノール１２００ｍＬで洗浄後、２０％エタノールでさらに洗浄した。
【００９６】
これに５０％エタノール５００ｍＬを添加し、目的とするフェニルペプチド誘導体を分画した。得られた分画を減圧乾燥器により乾燥した。この精製操作を４回実施して最終精製物として粉末３ｇを得た。この粉末を検体２とした。
【００９７】
以下に、フェニルペプチド誘導体の構造解析に関する試験方法及び結果について説明する。
（試験例１）
【００９８】
上記のように得られた検体２を精製水に溶解し、濾過後、質量分析器付き高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、島津製作所）で分析した。
【００９９】
さらに、重水素化ジメチルスルホキシド中、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ、ブルカー製）で解析した。構造解析の結果、検体２及び検体１からフェニル基及びロイシンペプチドが結合した目的とする誘導体が検出された。
【０１００】
その結合はフェニル基は３分子であり、２分子のロイシンはジペプチド型であった。
【０１０１】
６００ＭＨｚのＨ−ＮＨＲ分析結果では、０．４５、０．６２、０．７９、０．８６、１．６４、１．７７、１．７８、１．７９、１．９４、２．６７、２．７１、２．８６、３．０１、３．２３、３．５４、３．６７、４．０８、４．０９、４．２０、４．７２、６．７９、６．８０、６．９４、７．０６、７．１３、７．４１、８．３５及び９．３８ｐｐｍにピークが認められた。
【０１０２】
さらに、Ｃ−ＮＭＲ分析結果では、１８．１、１９．２、１９．３、１９．６、２１．９、３０．２、３０．６、３１．２、３１．７、３３．３、３７．６、４６．６、５３．０、５３．４、６１．５、６１．８、６２．１、１１６．０、１１６．２、１２８．２、１２８．３、１３１．２、１３１．４、１５７．３、１５７．６、１６９．９、１７０．３、１７１．０、１７１．７及び１７２．０ｐｐｍにピークが認められた。
【０１０３】
以下に、Ｃ−ＮＭＲの解析結果のチャートを示した。（横軸単位はｐｐｍ、縦軸単位はピーク強度を示す。）
2018154567.tif 000004
【０１０４】
上記の分析値は有機化学合成されたフェニルペプチド誘導体のピークと同一であり、目的とするフェニルペプチド誘導体として同定された。検体２に含まれるこの誘導体は９８．８％、つまり、純度９８．８％であり、一方、検体１の純度は７８．８％であった。
【０１０５】
また、得られた誘導体の粉末０．１ｇを精製水１０ｍＬに溶解した場合、水素ガスの発生が認められた。ガスクロマトグラフィー（島津製作所製）で定量した結果、１．６ｐｐｍの水素ガス濃度を呈した。
【０１０６】
以下に、ヒト由来白血球を用いた抗アレルギー作用の確認試験について述べる。
（試験例２）
【０１０７】
インフォームドコンセプトのもと、スギ花粉に対して花粉症を発症しているアレルギー患者５例（男性３例及び女性２例、年齢２８〜６１歳）よりヘパリン加血液を医師の元で無菌的に採取した。採取した血液からフィコールを用いた遠心分離法により白血球を採取した。この白血球をＲＰＭＩ−１６４０培地（和光純薬製）に懸濁して３７℃、５％炭酸ガス下、炭酸ガス培養器（ＭＧ−７０Ｃ、タイテック製）内で培養した。この細胞を９６孔マイクロプレート（ファルコン製）に播種し、ここにＬＰＳ（リポポリサッカライド、和光純薬製）の溶液を添加した。この最終濃度は０．１ｍｇ／ｍＬとした。
【０１０８】
ここに試験物質として検体２及び対照物質として抗アレルギー剤である塩酸ジフェンヒドラミン（ドリエル、エスエス製薬）を用いた。いずれも生理食塩液に懸濁し、希釈してそれぞれ最終濃度で１ｍｇ／ｍＬになるように添加した。なお、溶媒対照として生理食塩液を用いた。これを３７℃で３日間培養して生細胞数を顕微鏡下で計数した。さらに、上清を採取して含有されるＩＬ−６量（フナコシ製、ＩＤＥＬＩＳＡ  ＥＬＩＳＡキット）及びプロスタグランジンＥ２量をＥＬＩＳＡ法（コスモ・バイオ株式会社）により比色法により定量した。
【０１０９】
その結果、溶媒対照の細胞数を１００％として検体２の添加による比率を求めた結果、検体２の添加により１１４％に増加した。一方、塩酸ジフェンヒドラミンでは１０７％となり、検体２の方が白血球の保護に優れていた。
【０１１０】
ＩＬ−６量は溶媒対照を１００％として検体２の添加による比率を求めた結果、検体２の添加により２４％に減少した。一方、塩酸ジフェンヒドラミンでは６４％となり。検体２の方がＩＬ−６量の抑制作用に優れていた。
【０１１１】
プロスタグランジンＥ２量は溶媒対照を１００％として検体２の添加による比率を求めた結果、検体２の添加により１３％に減少した。一方、塩酸ジフェンヒドラミンでは３５％となり、検体２の方がプロスタグランジンＥ２量の抑制作用に優れていた。また、この誘導体はヒト由来白血球に対して障害を与えなかったという結果から安全性は高いと考えられた。
【０１１２】
以下に、ヒト由来皮膚細胞を用いたケラチン産生の確認試験について述べる。
（試験例３）
【０１１３】
コスモ・バイオ株式会社より購入したヒト皮膚由来の初代表皮培養細胞を用いた。細胞を専用の培養液に懸濁し、前培養して細胞を増殖させた。３７℃、５％炭酸ガス下、炭酸ガス培養器内で培養した。その後、増殖期にある細胞をトリプシン含有培地にて剥離して実験に供した。生細胞数をトリパンブルー色素排除法により顕微鏡下で計数した。細胞数を１ｍＬあたり１０００個に調整して５ｍＬずつ培養シャーレに播種してさらに、３７℃、５％炭酸ガス下で培養した。これを紫外線照射装置（ロックタイト、出力８８ＭＨ）により紫外線を照射して細胞にダメージを与えた。照射はシャーレの蓋を外して１時間実施した。
【０１１４】
この紫外線照射により皮膚細胞が障害を受け、この障害に対する回復を試験した。なお、この方法は皮膚に対する試験物質の評価に実施される方法である。
【０１１５】
ここに試験物質として検体２及び対照物質としてヒトＥＧＦ（フナコシ製）をいずれも生理食塩液に懸濁し、希釈して最終濃度で１ｍｇ／ｍＬになるように添加した。なお、溶媒対照として生理食塩液を用いた。これを３７℃で３日間培養して生細胞数を顕微鏡下で計数した。さらに、細胞を精製水に分散して超音波破砕機により細胞分散液を得た。この細胞分散液中に含まれるケラチン量をＥＬＩＳＡ法（コスモ・バイオ株式会社）により定量した。
【０１１６】
その結果、溶媒対照の細胞数を１００％として検体２の添加による比率を求めた結果、検体２の添加により２２６％に増加した。一方、ＥＧＦでは１６６％となり。検体２の方が皮膚細胞の増殖作用に優れていた。ケラチン量については溶媒対照の値を１００％として検体２の添加により３２２％に増加した。一方、ＥＧＦでは２８８％となり、検体２の方がケラチン産生作用に優れていた。また、溶媒中の水素ガス濃度は１．６ｐｐｍであった。また、この誘導体はヒト由来皮膚細胞に対して障害を与えず、細胞数を回復させたという結果から、安全性は高いと考えられた。
【０１１７】
以下に、ヒト由来マスト細胞（肥満細胞）を用いたヒスタミン産生抑制の確認試験について述べる。
（試験例４）
【０１１８】
上述のヒトより採取した白血球よりマスト細胞を採取し、培養液に培養して９６孔マイクロプレートに播種した。これを培養し、アレルゲンとなるスギ花粉（コスモ・バイオ株式会社）を０．１ｍｇ添加した。同時に、試験物質として検体２及び対照物質として塩酸ジフェンヒドラミンをいずれも生理食塩液に懸濁し、希釈して最終濃度で１ｍｇ／ｍＬになるように添加した。なお、溶媒対照として生理食塩液を用いた。これを３７℃で１日間培養して培養上清に遊離されたヒスタミン量をＥＬＩＳＡ法（高感度ヒスタミンＥＬＩＳＡキット、コスモ・バイオ株式会社）により定量した。
【０１１９】
その結果、ヒスタミン量は溶媒対照の値を１００％として検体２の添加により２８％に減少した。一方、塩酸ジフェンヒドラミンでは５２％となり、検体２の方がヒスタミン抑制作用に優れていた。この結果から、検体２はヒスタミン遊離を抑制した。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明で得られるフェニルペプチド誘導体は抗アレルギー作用を呈し、かつ、副作用が少ないことから、治療や予防に利用され、国民のＱＯＬを改善できる。
【０１２１】
本発明で得られるフェニルペプチド誘導体は化粧料としても皮膚改善に利用され、化粧品業界の発展に寄与する。