(57)【要約】【課題】酵母においてタンパク質を安定して高発現させる方法を提供する。【解決手段】2μmプラスミドを保持していない酵母において2μmプラスミドを再構成した酵母形質転換体を培養する工程を含み、前記再構成した2μmプラスミドは目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する、タンパク質の生産方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
2μmプラスミドを保持していない酵母において2μmプラスミドを再構成した酵母形質転換体を培養する工程を含み、前記再構成した2μmプラスミドは目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する、タンパク質の生産方法。
【請求項２】
2μmプラスミドを保持していない酵母が協会7号酵母又はその誘導株である、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、酵母でタンパク質を過剰発現させることによりタンパク質を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに酵母宿主による遺伝子工学的なタンパク質の高発現は、様々な方法で行われてきた。例えば、高発現プロモーターの開発や、プラスミドベクターの開発等が挙げられる。
【０００３】
特に、高発現における多コピープラスミドの影響は強く、episomalプラスミド、又は、YEpプラスミドと呼ばれるプラスミド群は、高い発現を示してきた(非特許文献１)。しかしながら、プラスミドは、不安定で、宿主から一定の割合で失われるので、代わりの方法として、染色体へ挿入して発現させることもよく行われる。しかしながら、染色体への挿入は、方法が煩雑であり、またコピー数が高く、さらに安定性の高い発現方法が求められている。
【０００４】
ところで、YEpプラスミドは、ほとんどの酵母が自然状態で保持している2μm(2マイクロメーター)プラスミド(非特許文献２)の複製機構を利用し、その複製起点(2μm origin)の部分だけをプラスミドに組み込んだものである。これは、細胞内で多コピー化し、維持される(YEpプラスミドは2μmプラスミドを保持する株でないと安定に保持されない)ので頻繁に利用されている(非特許文献３)。特に、選択マーカー遺伝子の発現量を、プロモーター領域を削除することで減らした場合、高いコピー数にならない限り選択増殖ができないので、高コピー数が維持できることが知られている(leu2-dマーカー；非特許文献４)。しかしながら、この場合、選択能を与えて増殖させる必要があるので、培地として選択培地を使用することとなり、実際には増殖が遅くなる。また、YEpプラスミドの安定性は完全ではなく、ある程度の頻度で酵母細胞から抜けてしまうので、安定性が十分とは言えない(非特許文献５)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Jane C. Schneider, Methods in Enzymology, 1991年, Vol. 194, pp. 373-388
【非特許文献２】Futcher AB, Yeast, 1988年, Vol. 4, No. 1, pp. 27-40
【非特許文献３】Chen Y, FEMS Yeast Res., 2012年, Vol. 12, No. 5, pp. 598-607
【非特許文献４】Erhart E, J Bacteriol., 1983年, Vol. 156, No. 2, pp. 625-35
【非特許文献５】Schwartz LS, Biotechnol Bioeng., 1988年, Vol. 32, No. 6, pp. 733-40
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上述した実情に鑑み、酵母においてタンパク質を安定して高発現させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、2μmプラスミドを保持していない酵母細胞(例えば、協会7号酵母：K7株)に、目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する2μmプラスミド全体を再構成するようにその断片を使って形質転換することで、当該形質転換体が非常に高く、且つ安定した目的タンパク質の発現を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）2μmプラスミドを保持していない酵母において2μmプラスミドを再構成した酵母形質転換体を培養する工程を含み、前記再構成した2μmプラスミドは目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する、タンパク質の生産方法。
（２）2μmプラスミドを保持していない酵母が協会7号酵母又はその誘導株である、（１）記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、酵母において目的のタンパク質を安定して高発現させることができ、当該タンパク質の生産効率を大幅に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】プラスミドYHp17606のマップである。
【図２】プラスミドYCp21477のマップである。
【図３】プラスミドYEpGAP-Cherryのマップである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係るタンパク質の生産方法(以下、「本方法」と称する)は、2μmプラスミドを保持していない酵母において2μmプラスミドを再構成した酵母形質転換体を培養する工程を含む。当該再構成した2μmプラスミドは目的タンパク質をコードする遺伝子を含有し、酵母形質転換体の培養により、再構成した2μmプラスミドから目的タンパク質をコードする遺伝子が安定して高発現され、目的タンパク質を生産することができる。
【００１２】
2μmプラスミドを保持していない酵母(以下、「cir0株」と称する)としては、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に属する酵母株である協会7号酵母又はその誘導株(変異株を含む：例えば、RAK2359株(a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 lys4/lys4, Ano et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 73, 633, 2009)、BY1847株（（SH1847, NA87-11A-H [cir0] ）MATα ho trp1 his3 leu2-3,112 pho3-1 pho5-1 can1[cir0]）、並びにBY21887株（（YAT285, R-2-5D 1-36）MATα ade1 leu2 [cir0] cyh）、およびその他多くの清酒酵母、泡盛酵母（Nakazato et al., Jour. Agri. Sci. Tokyo Univ. of Agric., 47（3）,226-230, 2002）等が挙げられる。協会7号酵母(清酒酵母 協会7号)は、例えば日本醸造協会から市販されている。
【００１３】
また、目的タンパク質をコードする遺伝子としては、いかなるタンパク質やペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
【００１４】
本方法では、先ずcir0株において2μmプラスミドを再構成した酵母形質転換体を準備する。例えば、2μmプラスミド全体及び目的タンパク質をコードする遺伝子を、1つ若しくは複数の(例えば、3つ若しくはそれ以上の)断片又は環状プラスミドとして作製し、当該1つ若しくは複数の断片又は環状プラスミドをcir0株に導入する。目的タンパク質をコードする遺伝子は、制御配列(例えば、プロモーター、ターミネーター等)に機能的に連結されていることが好ましい。
【００１５】
また、上述した断片又は環状プラスミドを導入する方法としては、酵母の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
【００１６】
次いで、本方法では、再構成した2μmプラスミド(以下、「YHp(yeast hyper-copy plasmid)」と称する)を有する酵母形質転換体を、従来公知の酵母の培養条件下で培養する。例えば、培地としてYPD培地(1％酵母エキス、2％ポリペプトン、2％グルコース)を用いて、27〜33℃及びpH5〜7下で振盪培養又は静置培養を行う。
【００１７】
培養後、得られた培養物をそのまま目的タンパク質として使用してもよく、あるいは培養物から目的タンパク質を単離又は精製してもよい。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１９】
以下の実施例において使用するプライマー、酵母(サッカロミセス・セレビシエ)の菌株及びプラスミドをそれぞれ表１〜３に示す。
【００２０】
【表１】
2018093806.tif 000002
【００２１】
【表２】
2018093806.tif 000003
【００２２】
【表３】
2018093806.tif 000004
【００２３】
１．赤色蛍光タンパク質発現YHpプラスミドの作製とK7株の要求性変異株（RAK2359）への導入
１−１．PCRによるDNAフラグメントの作製
2μmプラスミドに赤色蛍光タンパク質yEmRFP遺伝子を組み込む目的で、以下の表４に示すテンプレート及びプライマーを用いてPCRを行った。
【００２４】
【表４】
2018093806.tif 000005
【００２５】
上記のPCR(PrimeSTAR GXL(TAKARA-bio社製)、98℃ 10sec、60℃ 15sec、68℃ 2min、30サイクル)により、3つのフラグメントを増幅し、この3つのフラグメントを協会7号酵母(K7酵母)の要求性変異株RAK2359(a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 lys4/lys4, Ano et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 73, 633, 2009)に以下の方法で導入した。
【００２６】
１−２．遺伝子導入
2 mLのYPD培地(1％酵母エキス、2％ポリペプトン、2％グルコース)にRAK2359株を植菌し、30℃で一晩振盪培養した(前培養)。
【００２７】
前培養液1mLをYPD培地9mLに稙菌し、30℃で5h振盪培養した(本培養)。
本培養液10mL全量を3000rpmで1分間遠心して上清を捨て、滅菌水10mLで洗浄した。次いで、酵母菌を滅菌水200μLに懸濁後、形質転換液（60％ポリエチレングリコール3350：2400μL、4M酢酸リチウム：100μL、10mg/mLキャリアDNA：200μL)を500μL加えてコンピテントセルとした。
【００２８】
コンピテントセル100μLにDNAフラグメント各2μLを加えて十分に混合し、42℃、30分インキュベートした。インキュベート後、酵母を含む形質転換液を全量ウラシル欠損（−U）寒天培地(0.17％ Yeast Nitrogen Base、0.5％硫酸アンモニウム、2％グルコース、0.0024％ adenine sulfate、0.1％ L-Histidine HCl、0.2％ L-Leucine、0.1％ L-Lysine HCl、0.1％ L-Methionine、0.1％ L-Tryptophan、2％寒天)に塗布した。30℃で2〜3日培養し、形質転換体YHp(K7)(RAK17606)を得た。
【００２９】
YHp(K7)(RAK17606)株が含有するプラスミドYHp17606のマップを図１に示す。図１において、各略語は以下の通りである。FLP1：部位特異的組換え酵素、repeat_region：リピート配列領域、REP1：複製遺伝子１、Dprotein：RAF1遺伝子、TDH3p:恒常的高発現プロモーター、yEmRFP：赤色蛍光タンパク質yEmRFP遺伝子、URA3：ウラシル要求性相補遺伝子、REP2：複製遺伝子２、D+546c：配列番号１のプライマー、REP2+30c：配列番号２のプライマー、FLP1+30c：配列番号３のプライマー、D+547：配列番号４のプライマー、D+547(+40)c-YEp：配列番号５のプライマー、D+546(-40)-TDH3：配列番号６のプライマー。また、表４に示す各DNAフラグメントは、プラスミドYHp17606における以下の領域に相当する。DNAフラグメント1：REP2の開始部分からFLP1-repeat_region-REP1-Dprotein (D+546c)まで、DNAフラグメント2：URA3の開始部分（D+547）からrepeat_region-REP2-FLP1の開始部分を含むところまで、DNAフラグメント3：TDH3p-yEmRFP-URA3まで。
【００３０】
２．赤色蛍光タンパク質発現遺伝子断片のK7株の要求性変異株（RAK2359）のゲノムへの導入
２−１．PCRによるDNAフラグメントの作製
K7の要求性変異株(RAK2359)のゲノムに赤色蛍光タンパク質yEmRFP遺伝子を組み込む目的で、以下の表５に示すテンプレート及びプライマーを用いてPCRを行った。
【００３１】
【表５】
2018093806.tif 000006
【００３２】
上記第１節と同様の方法でPCR及びフラグメントのRAK2359株への導入を行い、形質転換体Genome(K7)を得た。
【００３３】
３．赤色蛍光タンパク質発現YCpプラスミドの作製とK7株の要求性変異株（RAK2359）への導入
３−１．PCRによるDNAフラグメントの作製
シングルコピープラスミドであるが安定に保持されるYCpプラスミドに赤色蛍光タンパク質yEmRFP遺伝子を組み込む目的で、以下の表６に示すテンプレート及びプライマーを用いてPCRを行った。
【００３４】
【表６】
2018093806.tif 000007
【００３５】
第１節と同様の方法でPCR及びフラグメントのRAK2359株への導入を行い、形質転換体YCp(K7)（RAK21477）を得た。
【００３６】
YCp(K7)（RAK21477）株が含有するプラスミドYCp21477のマップを図２に示す。図２において、各略語は以下の通りである。KmARS7(201-260)：酵母Kluyveromyces marxianusの自律複製起点、EcoliOri：E.coliプラスミドの複製起点、MCS：マルチクローニングサイト、TDH3p:恒常的高発現プロモーター、yEmRFP：赤色蛍光タンパク質yEmRFP遺伝子、URA3：ウラシル要求性相補遺伝子、CEN6/ARSH4：セントロメア6/自律複製起点H4、KanMX：カナマイシン耐性薬剤選択マーカー遺伝子、KanMX-334：配列番号９のプライマー、URA3+771c：配列番号１０のプライマー、KanMX+200c：配列番号１１のプライマー、ScURA3+881(30)：配列番号１２のプライマー、pKS716URA3+881(+31)-TDH3-698：配列番号１３のプライマー、URA3+650：配列番号１４のプライマー。また、表６に示す各DNAフラグメントは、プラスミドYCp21477における以下の領域に相当する。DNAフラグメント1：KanMXの矢印開始部分の少し手前から矢印方向へKanMX-CEN6/ARSH4-URA3の矢印途中まで、DNAフラグメント2：KanMXの矢印途中からKmARS7-E.coli ori-TDH3pの矢印開始部分手前のScURA3+881(30)まで、DNAフラグメント3：TDH3p-yEmRFP-URA3の矢印途中まで。
【００３７】
４．赤色蛍光タンパク質発現YEpプラスミド(YEpGAP-Cherry)の作製とK7株の要求性変異株（RAK2359）への導入
先ず、赤色蛍光タンパク質発現YEpプラスミド(YEpGAP-Cherry)を安定的にK7の要求性変異株（RAK2359）に保持させるために、2μmプラスミド全体を含むYHpHIS3プラスミドをK7の要求性変異株（RAK2359）に保持させる目的で以下の表７に示すテンプレート及びプライマーを用いてPCRを行った。
【００３８】
【表７】
2018093806.tif 000008
【００３９】
第１節と同様の方法でPCR及びフラグメントのRAK2359株への導入を行い、ウラシル欠損（−U）寒天培地の代わりにヒスチジン欠損（−H）寒天培地(0.17％ Yeast Nitrogen Base、0.5％硫酸アンモニウム、2％グルコース、0.0024％ adenine sulfate、0.2％ L-Leucine、0.1％ L-Lysine HCl、0.1％ L-Methionine、0.1％ L-Tryptophan、0.1％ Uracil、2％寒天)を用いて形質転換体YHpHIS3(K7)を得た。
【００４０】
次に、YEpGAP-Cherryを組み込む目的で、以下の表８に示すテンプレート及びプライマーを用いてPCRを行った。
【００４１】
【表８】
2018093806.tif 000009
【００４２】
第１節と同様の方法でPCR及びフラグメントのYHpHIS3(K7)株への導入を行い、形質転換体YEp with YHp (K7)を得た。
【００４３】
プラスミドYEpGAP-Cherryのマップを図３に示す。図３において、各略語は以下の通りである。TDH3p:恒常的高発現プロモーター、yEmRFP：赤色蛍光タンパク質yEmRFP遺伝子、URA3：ウラシル要求性相補遺伝子、2 micro ori：2μmプラスミドの複製起点、AmpR：アンピシリン耐性選択マーカー遺伝子、E.coli ori：E.coliプラスミドの複製起点、TDH3-698(50)：配列番号１７のプライマー、URA3+650：配列番号１４のプライマー、URA3+771c：配列番号１０のプライマー、TDH3-545c：配列番号１８のプライマー。また、表８に示す各DNAフラグメントは、プラスミドYEpGAP-Cherryにおける以下の領域に相当する。DNAフラグメント1：TDH3pの矢印開始部分からyEmRFP-URA3の途中まで、DNAフラグメント2：URA3の途中から2micro ori-AmpR-E.coli ori-TDH3pの途中まで。
【００４４】
５．赤色蛍光タンパク質発現YEpプラスミド(YEpGAP-Cherry)の作製とBY4741株への導入
第４節で作製したプラスミドYEpGAP-Cherryのフラグメントを、第１節と同様の方法でBY4741株(2μmプラスミドを保持する株、Brachmann, et al., Yeast, 14, 115, 1998)へ導入し、形質転換体YEpGAP-Cherry(BY4741)を得た。
【００４５】
６．作製した株の評価
第１節〜第５節で得られた遺伝子導入酵母をYPD寒天培地(1％酵母エキス、2％ポリペプトン、2％グルコース、2％寒天)上でシングルコロニーにして、ランダムに選んだ3個のシングルコロニーを赤色蛍光測定し、平均値を求めた。
【００４６】
24wellプレートの1well当たり1mL入れたYPD培地(1％酵母エキス、2％ポリペプトン、2％グルコース)に遺伝子導入酵母を植菌し、30℃で24時間振盪培養を行った。培養液をOD650が0.16-0.26になるように希釈し、96wellプレートに100μLずつ分注し、650nm(菌体による濁度)と588-613nm(赤色)を96well光度計Synergy(Biotek社製)で測定した。
【００４７】
結果を表９に示す。
表９から明らかなように、YHpプラスミドを用いた場合はゲノムに直接導入した場合の50倍以上、YEpプラスミドを用いた場合の5〜7倍の発現を示した。
【００４８】
【表９】
2018093806.tif 000010
【図１】
2018093806.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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