(57)【要約】【課題】３ヒドロキシ酪酸エステルのＲ体の光学純度を向上させるべく、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを単離する方法を提供する。【解決手段】Ｒ体およびＳ体が混在する３ヒドロキシ酪酸エステルの３位のヒドロキシル基を化学的にアシル化するアシル化工程Ａと、リパーゼによりＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物を脱アシル化してＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを作製する脱アシル化工程Ｂと、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを蒸留によりＳ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物と分離する蒸留工程Ｃと、を有するＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを単離する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒ体およびＳ体が混在する３ヒドロキシ酪酸エステルの３位のヒドロキシル基を化学的にアシル化するアシル化工程と、
リパーゼによりＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物を脱アシル化してＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを作製する脱アシル化工程と、
前記Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを蒸留によりＳ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物と分離する蒸留工程と、を有するＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを単離する方法。
【請求項２】
前記３ヒドロキシ酪酸エステルのエステルが炭素数１〜４のアルキルエステルである請求項１に記載のＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを単離する方法。
【請求項３】
前記アルキルエステルがエチルエステルである請求項２に記載のＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを単離する方法。
【請求項４】
前記脱アシル化工程をアルコールの存在下で行う請求項３に記載のＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを単離する方法。
【請求項５】
Ｒ体およびＳ体が混在する３ヒドロキシ酪酸エステルのうち、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルをリパーゼによりアシル化するアシル化工程と、
Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物およびＳ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを蒸留により分離する蒸留工程と、
分離されたＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物を化学的に脱アシル化する脱アシル化工程と、を有するＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを単離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３ヒドロキシ酪酸エステルのＲ体の光学純度を向上させるべく、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
３ヒドロキシ酪酸やその塩（以下３ＨＢと称する、また、３ＨＢと称する場合、特にその単量体を指すものとする）は、もともと人の体内に存在する物質であるため生体親和性が高く、糖質に代わる画期的なエネルギー源として期待されている。また、３ＨＢは単なるエネルギー源という役割だけでなく、様々な遺伝子の発現やタンパク質の活性に影響するシグナル伝達物質としての作用があることがわかってきた。３ＨＢは、例えば、遺伝子発現調節作用によって、ヒストン脱アセチル化酵素を阻害することによって認知機能や、長期持続記憶を改善することが知られ、アルツハイマーの予防に有効性が確認されている。例えば、ココナツオイルに多く含まれる中鎖脂肪酸の摂取および体内での代謝により生成される３ＨＢが、脳や体内において糖質をうまく利用できないアルツハイマー病、糖尿病の患者の症状を改善させる効果を持つことが知られている。また、３ＨＢは体内において糖質よりも速やかにエネルギーに変換されること、細胞への脂肪や糖の吸収を抑制する効果を有することから、アスリート向けのエネルギー物質、ダイエット・健康食品分野への応用が期待できる。
【０００３】
３ＨＢは、例えば３ＨＢ生産性のハロモナス菌を添加した発酵プロセスを行い、得られた発酵液からハロモナス菌を分離除去し、精製することにより得られる。発酵プロセスは、果汁等の糖質栄養源を含有する原料液に、３ＨＢ生産性のハロモナス菌をそのまま添加し、好気発酵、嫌気発酵を順に行うプロセスとして実施することができる（特許文献１）。これにより、糖質が３ＨＢに変換され、発酵液中に生産されることになる。
【０００４】
また、３ＨＢは、生分解性樹脂や、３ＨＢエステル（例えば３ヒドロキシ酪酸エチル（Ethyl 3-Hydroxybutyrate：ＥＨＢ））の原料として利用可能であることが知られており、工業的用途においても利用価値が高まりつつある。３ＨＢエステルは安全性の高い溶剤、洗浄剤として利用可能であり、医薬、農薬、食品添加物等としての応用も進められている化合物である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１３−０８１４０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
３ＨＢは、Ｒ体およびＳ体の光学異性体が存在しており、微生物による発酵プロセスによって得られた３ＨＢはＲ体が主流である。しかし、当該発酵プロセスによってＲ体の光学純度を向上させるのには限度があった。
また、３ＨＢを精製する際には、３ＨＢをエチル体であるＥＨＢ（３ＨＢエステル）としてから蒸留することがあった。このとき、ＥＨＢにおいてもＲ体およびＳ体の光学異性体が存在しており、ＥＨＢの状態からＲ体の光学純度を向上させることが求められていた。
【０００７】
従って、本発明の目的は、３ヒドロキシ酪酸エステルのＲ体の光学純度を向上させるべく、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを単離する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するための本発明に係るＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを単離する方法の第一特徴構成は、Ｒ体およびＳ体が混在する３ヒドロキシ酪酸エステルの３位のヒドロキシル基を化学的にアシル化するアシル化工程と、リパーゼによりＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物を脱アシル化してＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを作製する脱アシル化工程と、前記Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを蒸留によりＳ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物と分離する蒸留工程と、を有する点にある。
【０００９】
本構成では、まず、Ｒ体およびＳ体が混在する３ヒドロキシ酪酸エステルにおいて、Ｒ体およびＳ体の３ヒドロキシ酪酸エステルの両者における３位のヒドロキシル基を化学的にアシル基に置換するアシル化工程を行う。これにより、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物およびＳ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物が混在する状態となる。この状態において、リパーゼによりＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物を脱アシル化してＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを作製する脱アシル化工程を行う。当該脱アシル化工程では、リパーゼがＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物に選択的に反応することにより、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物を脱アシル化してＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを作製することができる。脱アシル化工程により、脱アシル化工程において作製されたＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルと、アシル化工程において作製されたＳ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物とが混在する状態となる。この状態において、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルとＳ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物とを分離する蒸留工程を行うことにより、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを単離することができる。
【００１０】
従って、本発明では、３ヒドロキシ酪酸エステルのＲ体の光学純度を極めて高いレベル（１００％近い）まで向上せることができるＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを単離する方法を供することができる。
【００１１】
本発明に係るＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを単離する方法の第二特徴構成は、前記３ヒドロキシ酪酸エステルのエステルを炭素数１〜４のアルキルエステルとした点にある。
【００１２】
本構成では、安全性の高い溶剤、洗浄剤として利用可能な３ＨＢエステル、即ち、３ヒドロキシ酪酸メチル、３ヒドロキシ酪酸エチル、３ヒドロキシ酪酸プロピル、３ヒドロキシ酪酸ブチルのＲ体の光学純度を極めて高いレベル（１００％近い）まで向上せることができる。
【００１３】
本発明に係るＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを単離する方法の第三特徴構成は、前記アルキルエステルをエチルエステルとした点にある。
【００１４】
本構成では、特に３ヒドロキシ酪酸エチルのＲ体の光学純度を極めて高いレベル（１００％近い）まで向上せることができる。
【００１５】
本発明に係るＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを単離する方法の第四特徴構成は、前記脱アシル化工程をアルコールの存在下で行う点にある。
【００１６】
本構成によれば、脱アシル化工程において例えばＳ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物のエチルエステルの加水分解を防ぐことができる。
【００１７】
本発明に係るＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを単離する方法の第五特徴構成は、Ｒ体およびＳ体が混在する３ヒドロキシ酪酸エステルのうち、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルをリパーゼによりアシル化するアシル化工程と、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物およびＳ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを蒸留により分離する蒸留工程と、分離されたＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物を化学的に脱アシル化する脱アシル化工程と、を有する点にある。
【００１８】
本構成では、まず、Ｒ体およびＳ体が混在する３ヒドロキシ酪酸エステルにおいて、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを反応の対象とし、当該Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルの３位のヒドロキシル基をアシル基に置換するアシル化工程を行う。当該アシル化工程では、リパーゼがＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルに選択的に反応することにより、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルの３位のヒドロキシル基をアシル基に置換することができる。これにより、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物およびＳ体の３ヒドロキシ酪酸エステルが混在する状態となる。この状態において、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物およびＳ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを蒸留により分離する蒸留工程を行うことにより、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物を単離することができる。そして、蒸留工程によって分離されたＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルのアシル化物を化学的に脱アシル化する脱アシル化工程を行うことにより、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを作製することができる。
【００１９】
従って、本発明では、３ヒドロキシ酪酸エステルのＲ体の光学純度を極めて高いレベル（１００％近い）まで向上せることができるＲ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを単離する方法を供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明のＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを単離する方法を示す概略図である。
【図２】別実施形態のＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを単離する方法を示す概略図である。
【図３】標準品であるＲ−ＥＨＢのガスクロマトグラフによる分析結果を示したグラフである。
【図４】標準品であるＳ−ＥＨＢのガスクロマトグラフによる分析結果を示したグラフである。
【図５】アセチル化後の反応物のガスクロマトグラフによる分析の結果を示したグラフである（Ｒ−ＥＨＢ）。
【図６】アセチル化後の反応物のガスクロマトグラフによる分析の結果を示したグラフである（Ｓ−ＥＨＢ）。
【図７】リパーゼ処理後の反応物のガスクロマトグラフによる分析の結果を示したグラフである（Ｒ−ＥＨＢ）。
【図８】リパーゼ処理後の反応物のガスクロマトグラフによる分析の結果を示したグラフである（Ｓ−ＥＨＢ）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。尚、以下に好適な実施形態を記すが、これら実施形態はそれぞれ、本発明をより具体的に例示するために記載されたものであって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々変更が可能であり、本発明は、以下の記載に限定されるものではない。
【００２２】
本発明は、Ｒ体およびＳ体が混在する３ヒドロキシ酪酸エステルから、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを単離する方法である。３ヒドロキシ酪酸エステルのエステルは炭素数１〜４のアルキルエステルとすることができる。即ち、炭素数１のアルキルエステルの場合は３ヒドロキシ酪酸メチルとなり、炭素数２のアルキルエステルの場合は３ヒドロキシ酪酸エチルとなり、炭素数３のアルキルエステルの場合は３ヒドロキシ酪酸プロピルとなり、炭素数４のアルキルエステルの場合は３ヒドロキシ酪酸ブチルとなる。
【００２３】
本実施形態では、３ヒドロキシ酪酸エステルとして、３ヒドロキシ酪酸エチル（Ethyl 3-Hydroxybutyrate：ＥＨＢ）を使用した場合について説明する。
【００２４】
図１に本発明の概要を示す。図中におけるＲ−ＥＨＢは３ヒドロキシ酪酸エチルのＲ体、Ｓ−ＥＨＢは３ヒドロキシ酪酸エチルのＳ体をそれぞれ示す。
【００２５】
当該方法は、Ｒ体およびＳ体が混在する３ヒドロキシ酪酸エチルの３位のヒドロキシル基を化学的にアシル化するアシル化工程Ａと、リパーゼによりＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物を脱アシル化してＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを作製する脱アシル化工程Ｂと、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを蒸留によりＳ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物と分離する蒸留工程Ｃと、を有する。
【００２６】
（アシル化工程Ａ）
アシル化工程Ａでは、３ヒドロキシ酪酸エチルのＲ体およびＳ体における３位のヒドロキシル基（−ＯＨ）を化学的にアシル基（ＲＣＯ−）に置換するアシル化を行う。本明細書における「化学的にアシル化する」とは、酵素を使用せず、アシル化剤等の試薬によってアシル化することをいう。本実施形態ではアシル化するための試薬として、アシル化剤である無水酢酸、および、塩基であるトリエチルアミンを使用する場合について説明するが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
Ｒ−ＥＨＢまたはＳ−ＥＨＢに対して、例えば無水酢酸は約１〜３当量、好ましくは２等量となるように添加し、トリエチルアミンは約０．０５〜０．５当量となるように添加すればよく、好ましくは０．１〜０．２等量となるように添加すればよい。
アシル化工程Ａは、４０〜６０℃、好ましくは５５℃で反応させるのがよく、反応時間は５〜１８時間程度とするのがよい。
【００２８】
アシル化工程を行うことにより、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物およびＳ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物が混在する状態となる。
【００２９】
（脱アシル化工程Ｂ）
脱アシル化工程Ｂでは、リパーゼによりＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物を脱アシル化してＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを作製する。当該脱アシル化工程は、アルコールの存在下で行うのがよい。本工程で使用できるアルコールは、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノール等が使用できるがこれらに限定されるものではない。本実施形態ではエタノールを使用する場合について説明する。
【００３０】
また、本工程で使用できるリパーゼは、微生物、動物および植物起源のリパーゼを使用することができる。例えば微生物起源のリパーゼは、真菌もしくは酵母などの真核生物または細菌などの原核生物から単離され得るリパーゼを利用するのがよい。具体的には、バシラス（Bacillus）属もしくはシュードモナス（Pseudomonas）属由来の細菌リパーゼ、アスペルギルス（Aspergillus）などの真菌由来のリパーゼ、またはキャンディダ（Candida）もしくはヤロウィア（Yerrowia）などの酵母由来のリパーゼが特に好適である。
【００３１】
リパーゼの中には市販されているものがあり、例えば、リパーゼＰＳアマノＳＤ，リパーゼＡＳアマノ，リパーゼＡＹＳアマノ，リパーゼＡＫアマノ（天野エンザイム株式会社製）、或いは、Novozyme４３５（ノボザイム社製）等であれば、容易に入手することができるが、これらに限定されるものではない。リパーゼは、液体状のものを使用してもよく、固形状のものを使用してもよい。
【００３２】
本工程では、上記のリパーゼがＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物に選択的に反応することにより、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物を脱アシル化してＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを作製することができる。
【００３３】
脱アシル化工程Ｂは、２０〜４０℃、好ましくは３０℃で反応させるのがよく、反応時間は１〜１８時間程度とするのがよい。
【００３４】
尚、本工程においてエタノールを使用することにより、Ｓ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物のエチルエステルの加水分解を防ぐことができる。また、本工程は、一般的には大気圧下で、適宜窒素またはアルゴンなどの不活性ガスの下で行われるが、これらの条件に限定されるものではない。
【００３５】
脱アシル化工程Ｂを行うことにより、脱アシル化工程Ｂにおいて作製されたＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルと、アシル化工程Ａにおいて作製されたＳ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物とが混在する状態となる。
【００３６】
（蒸留工程Ｃ）
蒸留工程Ｃでは、脱アシル化工程Ｂにおいて作製されたＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルと、アシル化工程Ａにおいて作製されたＳ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物と、を蒸留によって分離する。
【００３７】
本工程により、Ｓ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物の他、反応残渣のリパーゼ、無水酢酸、トリエチルアミン、エタノール、酢酸エチルを分離して、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを単離することができる。
【００３８】
本工程における蒸留は、少なくともＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルおよびＳ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物を分離できる通常の条件の蒸留であれば、その条件は特に限定されるものではない。具体的には、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルの沸点と、Ｓ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物や反応残渣物の沸点とが異なるため、公知の蒸留であれば容易にこれらを分離することができる。
【００３９】
上述したように、アシル化工程Ａ、脱アシル化工程Ｂおよび蒸留工程Ｃを行うことにより、３ヒドロキシ酪酸エチル（ＥＨＢ）のＲ体の光学純度を極めて高いレベル（１００％近い）まで向上せることができるＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを単離する方法を供することができる。
【００４０】
〔別実施の形態〕
Ｒ体およびＳ体が混在する３ヒドロキシ酪酸エチルから、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを単離する方法は、上述した方法に限定されず、以下の方法によっても行うことができる。
【００４１】
即ち、上述した方法の別実施の方法は、Ｒ体およびＳ体が混在する３ヒドロキシ酪酸エチルのうち、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルをリパーゼによりアシル化するアシル化工程ａと、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物およびＳ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを蒸留により分離する蒸留工程ｂと、分離されたＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物を化学的に脱アシル化する脱アシル化工程ｃと、を有する（図２）。また、本別実施の方法では、脱アシル化工程ｃの後に、再度、蒸留工程ｄを行って、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを精製してもよい。
【００４２】
尚、本実施形態の場合も、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルは炭素数１〜４のアルキルエステルとすることができる。
【００４３】
（アシル化工程ａ）
本別実施の方法では、まず、Ｒ体およびＳ体が混在する３ヒドロキシ酪酸エチルを、リパーゼによりＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルをアシル化するアシル化工程ａを行う。
【００４４】
上述したアシル化工程ＡではＲ体およびＳ体の３ヒドロキシ酪酸エチルにおける３位のヒドロキシル基を化学的にアシル基に置換したのに対して、本アシル化工程ａは、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを反応の対象とし、当該Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルの３位のヒドロキシル基をアシル基に置換する点で異なる。
【００４５】
本工程で使用するリパーゼは、上述した脱アシル化工程Ｂで使用したリパーゼと同様のリパーゼを使用することができる。当該リパーゼがＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルに選択的に反応することにより、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルの３位のヒドロキシル基をアシル基に置換することができる。尚、本工程では、リパーゼと共に酢酸を使用するが、これに限定されるものではない。
【００４６】
アシル化工程ａを行うことにより、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物およびＳ体の３ヒドロキシ酪酸エチルが混在する状態となる。
【００４７】
（蒸留工程ｂ）
蒸留工程ｂでは、アシル化工程ａで作製されたＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物およびＳ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを蒸留により分離する。本工程により、Ｓ体の３ヒドロキシ酪酸エチルの他、反応残渣のリパーゼ、酢酸を分離して、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物を単離することができる。
【００４８】
本工程における蒸留は、少なくともＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物およびＳ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを分離できる通常の条件の蒸留であれば、その条件は特に限定されるものではない。具体的には、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物の沸点と、Ｓ体の３ヒドロキシ酪酸エチルや反応残渣物の沸点とが異なるため、公知の蒸留であれば容易にこれらを分離することができる。
【００４９】
（脱アシル化工程ｃ）
脱アシル化工程ｃでは、蒸留工程ｂによって分離されたＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物を化学的に脱アシル化する。本明細書における「化学的に脱アシル化する」とは、酵素を使用せず、脱アシル化剤等の試薬によって脱アシル化することをいう。本工程では、アルコールを添加することにより、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物を化学的に脱アシル化してＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを作製することができる。当該アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノール等が使用できるがこれらに限定されるものではない。
【００５０】
上述したように、アシル化工程ａ、蒸留工程ｂおよび脱アシル化工程ｃを行うことにより、３ヒドロキシ酪酸エチル（ＥＨＢ）のＲ体の光学純度を極めて高いレベル（１００％近い）まで向上せることができるＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを単離する方法を供することができる。
【００５１】
（蒸留工程ｄ）
脱アシル化工程ｃの後に蒸留工程ｄを行うことで、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを精製する。本蒸留工程ｄでは、反応残渣のエタノール、酢酸、酢酸エチルを分離して、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを精製することができる。
【００５２】
本工程における蒸留は、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルおよび反応残渣を分離できる通常の条件の蒸留であれば、その条件は特に限定されるものではない。具体的には、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルの沸点と反応残渣物の沸点とが異なるため、公知の蒸留であれば容易にこれらを分離することができる。
【実施例】
【００５３】
以下に、Ｒ体およびＳ体が混在する３ヒドロキシ酪酸エチルの３位のヒドロキシル基を化学的にアシル化するアシル化工程Ａと、リパーゼによりＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物を脱アシル化してＲ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを作製する脱アシル化工程Ｂと、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを蒸留によりＳ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物と分離する蒸留工程Ｃと、を行うことにより、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを単離する方法の実施例について説明する。
【００５４】
標準品としてＲ−ＥＨＢ（シグマアルドリッチ社製）、Ｓ−ＥＨＢ（シグマアルドリッチ社製）、アセチル化剤（アシル化剤）の無水酢酸（和光純薬社製）、塩基としてトリエチルアミン（和光純薬社製）を以下の表１に示した反応組成でバイアル瓶内で混合し、５５℃で一晩反応させた（アシル化工程Ａ）。Ｒ−ＥＨＢ或いはＳ−ＥＨＢに対して、無水酢酸は約２当量添加して反応させ、反応前および反応後の溶液をガスクロマトグラフで分析し、更にＮＭＲにより構造解析を実施した。ＮＭＲは公知の手法により行った。
【００５５】
【表１】
2018154559.tif 000003
【００５６】
ガスクロマトグラフによる分析条件は以下の通り行った。
パックドカラム：Reoplex  400  2％  Chromosorb  G  60−80  Aw  G−1130 
インジェクション温度：１８０℃
カラム温度：１６０℃
検出器ＦＩＤ温度：２００℃
キャリアガス：Ｎ２
注入量：１μＬ
【００５７】
ガスクロマトグラフによる分析の結果、標準品であるＲ−ＥＨＢの保持時間（retention time：Ｒｔ）は２．８６３（図３）であり、Ｓ−ＥＨＢの保持時間は２．８６５（図４）であった。
【００５８】
アセチル化後の反応物のガスクロマトグラフによる分析の結果、Ｒ−ＥＨＢでは、Ｒｔ２．８６３のピークが消失してＲｔ３．４７５にピークが確認された（図５）。また、Ｓ−ＥＨＢではＲｔ２．８６５のピークが消失してＲｔ３．４７６にピークが確認された（図６）。これらの反応物をＮＭＲで構造解析すると３位のヒドロキシル基がアセチル化されていることが判明した（結果は示さない）。
【００５９】
アセチル化された上記Ｒ−ＥＨＢ、Ｓ−ＥＨＢの反応物に対して、リパーゼＰＳアマノＳＤ（天野エンザイム株式会社製）１５０ｍｇを固形状態でそれぞれに添加し、更に、エチル基が脱エチル化をしないようエタノール１．４ｍＬをそれぞれに添加し、３０℃で一晩反応させた（脱アシル化工程Ｂ）。
【００６０】
ガスクロマトグラフによる分析条件は上記と同様で実施した。分析の前処理として、溶解しなかった固形のリパーゼを除去するため、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）を実施し、その上清を１ｍＬ採取し、クロロホルム１ｍＬを添加して、フィルター濾過（０．４５μｍ）を実施した。その溶液をガスクロマトグラフで分析した。
【００６１】
ガスクロマトグラフによる分析の結果、アセチル化−Ｒ−ＥＨＢのリパーゼ反応後の溶液では、リパーゼ反応前のＲｔ．３．４７５（図７におけるＲｔ．３．６６３に対応）のピークが残っていたが、Ｒｔ．２．９９９のピークが検出された。このピークは、ＮＭＲの結果、アセチル化−Ｒ−ＥＨＢが脱アセチル化されたＲ−ＥＨＢ（変換率：３９．５％）であることが判明した（結果は示さない）。
一方、アセチル化−Ｓ−ＥＨＢのリパーゼ反応後の溶液では、リパーゼ反応前のＲｔ．３．４７６（図８におけるＲｔ．３．６６８に対応）のピークが残り、新たなピークは検出されなかった。
この結果、Ｒ体のＲ−ＥＨＢがリパーゼで脱アセチル化されたと認められた。
【００６２】
Ｒ体およびＳ体が混在する３ヒドロキシ酪酸エチルにおいて、上記のアシル化工程Ａおよび脱アシル化工程Ｂを行った後の反応物は、以下のような組成を示すと考えられる。
【００６３】
【表２】
2018154559.tif 000004
【００６４】
即ち、表２に示される組成物を単蒸留（ＥＨＢはバス温１００℃、圧力１０ｍｍＨｇ以下の条件で単離され、塔頂温度は６０〜６５℃であった）することにより（蒸留工程Ｃ）、表２におけるＥＨＢ（Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチル）、および、Ethyl-3-Acetoxybutyrate（Ｓ体の３ヒドロキシ酪酸エチルのアシル化物）や無水酢酸等の反応残渣を分離することができるため、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エチルを単離することができた。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は、３ヒドロキシ酪酸エステルのＲ体の光学純度を向上させるべく、Ｒ体の３ヒドロキシ酪酸エステルを単離する方法に利用できる。
【符号の説明】
【００６６】
Ａ        アシル化工程
Ｂ        脱アシル化工程
Ｃ        蒸留工程
【図１】
2018154559.tif 000005
【図２】
2018154559.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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