(57)【要約】      （修正有）【課題】示差的におよび／またはまれに発現されるリガンドに対して特異的である抗リガンドを特定するために、抗リガンドライブラリーをスクリーニングする方法の提供。【解決手段】（ａ）示差的バイオパンニングを、少なくとも１つの抗リガンドを単離するように抗リガンドのライブラリーに対して行う工程、および、（ｂ）ハイスループット配列決定を工程（ａ）の期間中に単離される抗リガンドに対して行う工程を含む、示差的発現標的リガンドに対する抗リガンドを単離する方法。【選択図】図８
2018154627.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの示差的発現標的リガンドに対する少なくとも１つの抗リガンドを単離する方法であって、下記の工程：
（ａ）示差的バイオパンニングを、少なくとも１つの抗リガンドを単離するように抗リガンドのライブラリーに対して行う工程；および
（ｂ）ハイスループット配列決定を工程（ａ）の期間中に単離される抗リガンドに対して行う工程
を含む方法。
【請求項２】
さらに、下記の工程：
（ｃ）確認スクリーニングを前記示差的発現リガンドに対する抗体特異性について行う工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記示差的バイオパンニング工程が、下記のサブ工程：
（ｉ）抗リガンドのライブラリーを提供するサブ工程；
（ｉｉ）サブトラクターリガンド構築物に固定されるか、または組み込まれるリガンドを含むリガンドの第１の集団を提供するサブ工程；
（ｉｉｉ）標的リガンド構築物に固定されるか、または組み込まれる、工程（ｉｉ）と同じリガンドを含むリガンドの第２の集団を提供するサブ工程；
（ｉｖ）前記集団における前記サブトラクターリガンド構築物および前記標的リガンド構築物の量を、示差的発現標的リガンドに対する抗リガンドの単離を可能にするように、普遍的な質量作用の法則
【数１】
2018154627.tif 000025
（式中：
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは反応における関与物（反応物および生成物）であり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄは、釣り合った化学式のために必要な係数である）
から導かれる１つまたは複数の式を使用して求めるサブ工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）において求められるような前記量のサブトラクターリガンド構築物を提供するサブ工程；
（ｖｉ）工程（ｉｖ）において求められるような前記量の標的リガンド構築物を提供するサブ工程；
（ｖｉｉ）前記標的リガンド構築物に結合する抗リガンドを、サブトラクターリガンド構築物に結合する抗リガンドから単離するための分離手段を提供するサブ工程；
（ｖｉｉｉ）（ｉ）の前記ライブラリーを、リガンドに対する抗リガンドの結合を可能にするために、（ｖ）および（ｖｉ）によって提供される前記リガンド構築物にさらすサブ工程；および
（ｉｘ）前記分離手段を使用して、前記標的リガンド構築物に固定されるか、または組み込まれる前記リガンドに結合する抗リガンドを単離するサブ工程
を含む、いずれかの前記請求項に記載の方法。
【請求項４】
前記ハイスループット配列決定工程が、４５４シーケンシング法、イルミナ法、ＳＯＬｉＤ法またはＨｅｌｉｃｏｓシステムによって行われる、いずれかの前記請求項に記載の方法。
【請求項５】
前記確認スクリーニング工程が、フローサイトメトリー、ＦＭＡＴ、ＥＬＩＳＡ、ＭＳＤまたはＣＢＡによって行われる、いずれかの前記請求項に記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドが、前記標的構築物または前記サブトラクター構築物のどちらか一方において発現されない、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記抗リガンドを前記リガンドから遊離させるさらなる工程を含む、請求項３または６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｉ）〜工程（ｉｘ）が、複数の異なるリガンドに対する複数の抗リガンドを単離するために並行して行われる、請求項３、６または７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉｉ）〜工程（ｉｘ）が１回または複数回繰り返される、請求項３または６〜８に記載の方法。
【請求項１０】
前記サブトラクター構築物または標的構築物の一方の量が前記サブトラクター構築物または標的構築物の他方の量を越えて提供される、請求項３または６〜９に記載の方法。
【請求項１１】
リガンドの過剰が１０倍〜１０００倍の間であり、または、２倍〜１０倍の間であり、または、１０００倍〜１，０００，０００倍の間である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉｖ）の前記式が、
【数２】
2018154627.tif 000026
（式中、
ｂＡ＝結合した抗リガンド
Ａ＝抗リガンドの総数
Ｔ＝リガンドの総数
Ｃ＝アボガドロ定数（６．０２２×１０２３粒子／モル）
Ｖ＝反応体積（リットル）Ｋｄ＝平衡解離定数）
または
【数３】
2018154627.tif 000027
（式中、
ｂＡｐ＝結合した抗リガンド
Ｔｐ＝Ｃｐ上のリガンドの数
Ｔｓ＝Ｃｓ上のリガンドの数
Ｃｐ＝標的リガンド構築物の数
Ｃｓ＝サブトラクターリガンド構築物の数
Ａ＝抗リガンドの総数
Ｔ＝リガンドの総数
Ｃ＝アボガドロ定数（６．０２２×１０２３  粒子／モル）
Ｖ＝反応体積（リットル）
Ｋｄ＝平衡解離定数）
のいずれかである、請求項３または６〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分離手段が、固体担体、細胞膜および／またはその一部分、合成膜、ビーズ、化学的タグおよび遊離型リガンドの少なくとも１つから選択される、請求項３または６〜１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記サブトラクター構築物および標的構築物の前記分離手段が異なる密度を有する、請求項３または６〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記サブトラクター構築物の前記分離手段が膜小胞または完全な細胞膜である、請求項３または６〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｉｘ）が、密度遠心分離、固体担体隔離、磁気ビーズ隔離、化学的タグ結合および水相分配の少なくとも１つによって行われる、請求項３または６〜１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ａ）の前記ライブラリーが、抗リガンドを呈示する複数のライブラリーメンバーを含むディスプレーライブラリーである、いずれかの前記請求項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ライブラリーがファージディスプレーライブラリーである、いずれかの前記請求項に記載の方法。
【請求項１９】
前記リガンドが、抗原；受容体リガンド；ならびに、炭水化物、タンパク質、ペプチド、脂質、ポリヌクレオチド、無機分子およびコンジュゲート化分子からの少なくとも１つを含む酵素標的から選択される少なくとも１つである、いずれかの前記請求項に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗リガンドライブラリーが、抗体、および、その抗原結合性の変化体、誘導体またはフラグメント；操作された可変表面を有する足場分子；受容体；ならびに酵素からの少なくとも１つから構築される、いずれかの前記請求項に記載の方法。
【請求項２１】
前記リガンドおよびその分離手段を、前記リガンド構築物における標的リガンドの発現に影響を及ぼす刺激にさらすさらなる工程を含む、請求項３または６〜２０に記載の方法。
【請求項２２】
所望される特性を有する抗リガンドを、いずれかの前記請求項に記載される方法によって特定した後、前記抗リガンドを医薬的に許容されるキャリアに加えることを含む、医薬組成物を調製するための方法。
【請求項２３】
医療における使用のための、請求項２２に記載される方法によって調製される医薬組成物。
【請求項２４】
疾患の予防、処置、画像化、診断または予後のための医薬品の製造における、請求項２３に記載されるような医薬組成物の使用。
【請求項２５】
実施例および図面を参照して本明細書中に実質的に記載されるような方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善されたスクリーニング方法に関連し、具体的には、抗リガンドライブラリーを、示差的におよび／またはまれに発現されるリガンドに対して特異的である抗リガンドを特定するためにスクリーニングする方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質またはペプチドに基づくライブラリーが多くの場合、特定のリガンドに対する特異性を有する抗リガンド分子を選別するために使用される。
【０００３】
そのようなライブラリーは、タンパク質分子が、特定のタンパク質分子をコードする遺伝情報に何らかの様式で物理的に結びつけられるように構築される。したがって、タンパク質分子がその遺伝子と一緒に呈示される。
【０００４】
一般に使用されているディスプレー形式は、タンパク質分子を提示するために細胞宿主粒子またはウイルス宿主粒子に頼っており、これらには、細菌ディスプレー（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ他、１９９３）およびファージディスプレー（Ｓｍｉｔｈ、１９８５；ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、１９９３；Ｗｉｎｔｅｒ他、１９９４）が含まれる。そのような系は、潜在的な抗リガンド分子を宿主粒子の表面に呈示しており、一方、呈示された分子についての遺伝情報は粒子の内部に隠されており、前記方法が、タンパク質に基づく特異的な抗リガンドを選別するために首尾よく用いられてきた。
【０００５】
インビトロ翻訳に頼る他のディスプレー形式が存在しており、これらには、タンパク質分子への遺伝情報の非共有結合性連結に頼る様々な形態のリボゾームディスプレー（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ他、１９９４；ＨａｎｅｓおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９７；ＨｅおよびＴａｕｓｓｉｇ、１９９７）、および、共有結合性連結が、遺伝情報と、潜在的な抗リガンドタンパク質分子との間に存在する、インビトロ翻訳に同様に頼る他のディスプレー形式、例えば、Ｐｒｏｆｕｓｉｏｎディスプレー技術（Ｗｅｎｇ他、２００２）またはＣｏｖａｌｅｎｔディスプレー技術（Ｇａｏ他、１９９７）が含まれる。
【０００６】
呈示されているペプチドまたはタンパク質性抗リガンドライブラリーは、例えば、ペプチドライブラリーが使用されるときには完全にランダム化される場合があり、あるいは、それらは、可変性を与えるさらなる構造を取り込む定常領域足場構造に基づく場合がある。
【０００７】
多くの場合に使用される足場構造は、抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインに基づいており（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ他、１９９０）、しかし、他の足場、例えば、フィブロネクチン（ＪａｃｏｂｓｓｏｎおよびＦｒｙｋｂｅｒｇ、１９９５；Ｋｏｉｄｅ他、１９９８）、プロテインＡドメイン（Ｓｔａｈｌ他、１９８９）、または、小さい安定なタンパク質ドメイン（例えば、ＢＰＴＩ（Ｍａｒｋｌａｎｄ他、１９９１））などの足場に基づく場合もまたある。
【０００８】
ある種の結合特異性を示す抗リガンドをディスプレーライブラリーから選別することが多くの場合、いわゆる「バイオパンニング」法を使用して行われる。
【０００９】
標的リガンドが固体表面に固定化される場合があり、ライブラリーの特異的な抗リガンドメンバーが、目的とする抗リガンドが標的リガンドに結合することを可能にするために、固定化されている標的リガンドにさらされる。結合していないライブラリーメンバーが続いて洗い流され、目的とする抗リガンドが回収され、増幅される。
【００１０】
抗リガンドライブラリー（例えば、抗体フラグメントを発現するファージ）のメンバーではないタンパク質性粒子が「粘着性」である場合があり、このため、いくつかの標的非特異的な分子の結合および単離がもたらされる。非特異的な結合を、阻止剤として作用させて非特異的抗リガンドのこのバックグランド結合を軽減するために、ある種の化合物を抗リガンドディスプレー構築物／リガンド混合物に加えることによって最小限に抑えられる場合がある（例えば、ミルク、牛血清アルブミン、血清（ヒト／ウシ胎児）、ゼラチン、および、ある種の（非細胞）適用のためには界面活性剤）。
【００１１】
いくつかの洗浄手順が、細胞へのライブラリーメンバーの非特異的な結合を軽減するために、また、混入しているライブラリーメンバーおよび／または非特異的に結合したライブラリーメンバーからの細胞の分離を助けるために、考案されている。
【００１２】
そのような方法には、剪断力を最小限に抑え、かつ、解離したファージの再結合を許すために、磁力により固定される細胞をカラムにおいて洗浄すること（Ｓｉｅｇｅｌ他、１９９７）が含まれる。細胞を洗浄する別の方法が、非特異的で、低親和性の抗リガンドを選択的に除き、かつ、細胞および細胞に結合した抗リガンドを遊離型の抗リガンドおよび非特異的に結合した抗リガンドからさらに空間的に分離するために、より大きい密度の媒体（例えば、ＦｉｃｏｌｌまたはＰｅｒｃｏｌｌなど）における遠心分離によって行われる（Ｃａｒｌｓｓｏｎ他、１９８８；ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＳｈａｒｏｎ、２００２）。
【００１３】
選別プロセスの効率に依存して、数回のパンニングが、非特異的な抗リガンドを取り除くか、または少なくとも十分に望ましいレベルにまで減らすために要求される場合がある（Ｄｏｗｅｒ他、１９９１）。
【００１４】
別の選別方法において、標的リガンドが、溶液中において、特異的な抗リガンドライブラリーメンバーと結合する。結合した抗リガンドがその後、例えば、標的リガンドに取り付けられた回収可能なタグを使用して単離される。最も一般的に使用されているタグがビオチンであり、これは、標的分子と、呈示されている特異的なライブラリーメンバーとの複合体が、固体担体（例えば、磁気ビーズ）につながれるアビジンを使用して回収されることを可能にする（Ｓｉｅｇｅｌ他、１９９７）。
【００１５】
これらの方法は、標的リガンドが十分に知られており、かつ、精製された形態で入手可能であるときに使用される。通常は一度にただ１つだけの標的リガンドに対する選別を行う。数個の明らかにされた標的リガンドのための選別が同時に行われる場合もある。標的リガンドは、小さいハプテン、タンパク質、炭水化物、ＤＮＡおよび脂質のうちの１つまたは複数である場合がある。
【００１６】
多くの適用のために、示差的発現リガンドに対する特異的な抗リガンドが注目されている。例えば、様々なタンパク質が、健康なコントロールに由来する細胞および組織と比較したとき、疾患を有する患者に由来する細胞および組織において示差的に発現される場合がある。そのような疾患には、細菌感染症、ウイルス感染症または寄生虫感染症、喘息、慢性炎症性障害および自己免疫性障害、ガン、神経学的疾患、心臓血管疾患または胃腸疾患が含まれる。同様に、体液（例えば、血漿、脳脊髄液、尿、精液、唾液および粘液）のタンパク質組成が、健康なコントロールと比較して、疾患を有する患者の間で異なる場合がある。
【００１７】
したがって、示差的発現リガンドを特定するための研究ツールとしてのそれらの一般的応用性のほかに、示差的発現リガンドに対して特異的である抗リガンドが、疾患の診断、予防および／または処置における使用のためのツールとして使用される場合がある。
【００１８】
ゲノミクス分野およびプロテオミクス分野における最近の進歩により、多数の未だ明らかにされていない示差的発現分子が存在することが示されてきており、このことは、これらの潜在的な標的リガンドのための特異的な抗リガンドを作製するための方法の重要性を強調している。
【００１９】
これらの示差的発現分子の多くが、細胞表面に存在し、それにより、例えば、生物活性（例えば、細胞毒性）剤にコンジュゲート化される場合がある特異的な抗体を使用する標的療法のための潜在的な標的となることが予想される。
【００２０】
大きい非常に多様化された抗リガンドディスプレーライブラリーにより、炭水化物、タンパク質、脂質またはそれらの複合作用の未知の細胞リガンドに対する特異性を有する抗リガンドを単離する方法が提供される。
【００２１】
現在利用可能なバイオパンニングプロセスには、様々な細胞膜リガンドに対してそれらの生来的形態で特異的である抗リガンドを示すディスプレー構築物の単離を原理的には可能にする細胞全体に基づく方法、細胞の一部分に基づく方法および細胞膜に基づく方法が含まれる。
【００２２】
治療用のヒト抗体およびヒト化抗体が、急性および慢性の炎症性障害、免疫学的障害および中枢神経系障害、ならびに、ガンを含めて、多様な疾患を処置するためにますます使用されている。治療用ヒト抗体は、それらは完全にヒト性であること、および、関連する免疫原性を有しないこと、抗体Ｆｃ依存的な宿主免疫エフェクター機構に関与する最適な能力、ならびに、それらのマウス対応物、キメラ対応物およびヒト化対応物と比較してそれらの優れたインビボ半減期のために、ヒト疾患を処置するための最も魅力的な様式であると見なされる。様々なヒト抗体が今日では、ヒト化マウス抗体ライブラリーおよび非常に多様化されたファージ抗体ライブラリーを含めて、種々の技術によって日常的に作製される。
【００２３】
大きい（１０５を超える非重複の抗体クローンの）ヒト抗体ライブラリーは、事実上すべての種類の自己抗原を含めて、かなりの数の抗原に対して特異的である高親和性抗体を含有するほど十分に多様化されている。自己抗原は、正常な組織成分であるにもかかわらず、自己免疫疾患の場合のように体液性免疫応答または細胞媒介免疫応答の標的となる抗原であり、かつ、治療上とりわけ注目すべき抗原カテゴリーを代表する抗原である。
【００２４】
ヒト抗体ライブラリーはさらに、人間とマウスとの間で構造的に保存される受容体エピトープに結合する抗体について選別するとき、ヒト免疫グロブリン遺伝子を持つ遺伝子組換えマウスと比較して、様々な利点を提供すると考えられている。これは、このカテゴリーの抗体が自己寛容の機構によってインビボのために負に選別されるからである。そのような保存された領域が特に治療的に注目される。このような保存領域が治療上特に注目されるのは、保存された領域は多くの場合、機能的に関連しており（例えば、結合のために、また、リガンド／受容体の誘導される細胞応答の付与のために必要であるリガンド結合ドメイン）、そのような保存されたエピトープを標的とする抗体が、同系の実験的疾患モデル系におけるインビボ治療活性のためにスクリーニングされる場合があるからである。
【００２５】
事実上すべての種類のヒト可溶性抗原（例えば、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、脂質、炭水化物および共役分子など）に対して、同様にまた、細胞表面受容体（例えば、１ＴＭ型、４ＴＭ型、７ＴＭ型および多重ＴＭ型の膜貫通受容体など）に対して特異的である高親和性抗体が、非常に多様化されたヒト抗体ライブラリーから首尾よく単離されてきた。
【００２６】
細胞表面受容体は、治療上とりわけ注目すべき標的の１つのカテゴリーを構成しており、また、様々なガン細胞関連受容体に結合するいくつかの抗体が、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗Ｈｅｒ２）およびセツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）を含めて、ガン治療のために承認されている。
【００２７】
しかしながら、治療効力は抗体の受容体特異性からは容易に予測されない；同じ標的受容体に対する様々な抗体が、それらの結合親和性に関係なく、治療効力において大きく変動する場合があり（Ｂｅｅｒｓ他、２００８；ＣｒａｇｇおよびＧｌｅｎｎｉｅ、２００４）、また、代替分子標的に対する抗体が、有望な、かつ、時には予想外の治療可能性を示す場合がある（Ｂｅｃｋ他、２０１０；ＣｈｅｓｏｎおよびＬｅｏｎａｒｄ、２００８）。例えば、ＣＤ２０抗原に対して類似した親和性で結合し、かつ、同一のマウスＩｇＧ２ａ定常領域を有した様々なＣＤ２０特異的抗体クローンは、Ｂ細胞をインビボで枯渇させる能力において基本的に異なり（Ｂｅｅｒｓ他、２００８；ＣｒａｇｇおよびＧｌｅｎｎｉｅ、２００４）、ＣＤ２０とは異なる腫瘍関連細胞表面受容体に対する抗体が、Ｂ細胞のガンに対する顕著な抗腫瘍活性を有することができる（検討のために、（ＣｈｅｓｏｎおよびＬｅｏｎａｒｄ、２００８）を参照のこと）。
【００２８】
したがって、非常に多様化された抗体ライブラリーにおいて、いずれかの所与タイプのガンに関して最も治療上有効で、よく効き、かつ、最もよく許容される抗体が、いくつかの異なる受容体のどれに対しても特異的であることが考えられ、治療上最適な抗体クローンを非常に多様化されたライブラリーにおいて特定することは、様々な病的細胞関連受容体に対して特異的である多数の、理想的にはすべてのライブラリーメンバーの機能的スクリーニングを必要とする。
【００２９】
本出願人は以前に、ヒトのファージ抗体ライブラリーに由来する１つの細胞集団（標的細胞）において別の細胞集団（非標的細胞）と比較して示差的に発現される種々の表面受容体に結合する抗体クローンの回収を可能にするスクリーニング技術（バイオパンニング法）を開発している（国際公開ＷＯ２００４／０２３１４０、Ｆｒａｎｓｓｏｎ他、２００６；Ｆｒｅｎｄｅｕｓ、２００６）（本明細書中下記では、これは示差的バイオパンニングとして知られている）。国際公開ＷＯ２００４／０２３１４０（およびそれに由来するすべての国内出願物）の開示がその全体において参照によって本明細書中に組み込まれる。
【００３０】
このスクリーニングプロセスは、図１において概略されるように、基本的には６工程からなる。重要なことに、このプロセスでは、スクリーニング工程が下記の順で含まれた：
１）示差的バイオパンニング、その後
２）標的対非標的の特異性についてのスクリーニング、その後
３）より少ない数のクローンのサンガー法による従来の配列決定。
【００３１】
この技術を使用した場合、標的細胞対非標的細胞の示差的発現表面受容体に対する高い特異性を示す抗体のプールを作製することが可能であった。
【００３２】
サンガー配列決定は、非重複の結合体を「ロースループット」様式で特定するために現在使用される技術の一例である。他の例には、特有のサイズを明らかにするために、また、種々の制限酵素に対する異なる感受性により、異なる配列を間接的に明らかにするために、抗体遺伝子ＤＮＡを制限酵素消化の前後においてゲルで泳動することが含まれる。
【００３３】
ガンＢ細胞（標的）対Ｔ細胞（非標的）の示差的発現表面受容体を標的とする抗体を単離すること（「ＢｎｏｎＴ」示差的バイオパンニング）に適用されるとき、このプロセスでは、ＨＬＡ−ＤＲ、表面ＩｇおよびＩＣＡＭ−１を含めて標的細胞の種々の示差的発現表面受容体に対して特異的である抗体が特定された（表１）。
【表１】
2018154627.tif 000003
【００３４】
しかしながら、標的となった受容体はすべてが比較的高く発現され（細胞あたり５０，０００個〜４００，０００個の受容体）、このプロセスによって特定される非重複の抗体配列の数（スクリーニングされた８１個のうちの８個）は限定された。
【００３５】
標的細胞の示差的発現表面受容体に対して特異的である限られた数のクローンのみが配列決定されたものの、１つの抗体クローンの高い頻度は、回収された「ＢｎｏｎＴ」抗体プールにおける限定された抗体多様性を示していた。したがって、この技術は、いくつかの異なる示差的発現受容体に対する治療可能性を有する抗体が、限られたスクリーニング努力によって特定されたという意味で、以前の細胞型パンニング技術と比較して著しい改善を提供した（Ｆｒａｎｓｓｏｎ他、２００６）が、この観測結果は、さらなる改善が必要であることを示した。これは、一般的な共通する見解によれば、このようなパンニングは、限定された多様性を有し、かつ、比較的高発現で、強い示差的発現の表面受容体に対する抗体からなる抗体プールをもたらしていたにすぎなかったからである（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、２００２）（Ｌｉｕ他、２００４；Ｍｕｔｕｂｅｒｒｉａ他、１９９９；Ｏｓｂｏｕｒｎ他、１９９８）。
【００３６】
より初期のバイオパンニング法（国際公開ＷＯ２００４／０２３１４０およびＦｒｅｎｄｅｕｓ、２００６）において教示されるように行われたインシリコ計算は、示差的選別された「ＢｎｏｎＴ」抗体プールは、いくつかの示差的発現表面受容体のそれぞれに対する抗体をはるかにより多く含有しているにちがいないことを示していた（図２）。
【００３７】
当時の配列決定能力は、このプールにおける著しくより多数の抗体クローンの配列決定を極めて困難にしており（事実上、実行不可能にしていた）、したがって、示差的選別された抗体プールは初期のスクリーニングによって明らかであるよりもはるかに多様化されているにちがいないという仮説が、間接的なアプローチを使用して検証された。したがって、組換えＩＣＡＭ−１タンパク質とコンジュゲート化された免疫ビーズ（この場合、ＩＣＡＭ−１は、表１の示差的選別された抗体プールにおける最初の８１個の配列決定されたクローンのうちのただ１つの抗体クローンによって標的化された細胞表面受容体である）を使用して、この示差的選別された「ＢｎｏｎＴ」抗体プールが、さらなるＩＣＡＭ−１特異的抗体クローンの存在についてパンニングされた。組換えＩＣＡＭ−１に対する示差的選別された抗体プールのパンニングの後で回収された１２６０個の抗体クローンのスクリーニングにより、２１個のさらなるＩＣＡＭ−１特異的抗体配列／クローンが特定された。
【００３８】
これらの観測結果は、元の示差的バイオパンニング法により、示差的発現抗原に対する抗体クローンを特定することができたことを明らかにし、しかし、示差的選別された抗体プールは、これらの初期スクリーニングから明らかであったよりもはるかに多様化され、かつ、従来のスクリーニングアプローチによって求められる場合よりも著しく多様化されていたことを明らかにした。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本出願人は今回、目的とするリガンドに対する複数の異なる抗リガンドを検出するための示差的バイオパンニング法の精度を改善する方法を考案している。したがって、本発明は、別の細胞集団と比較して標的細胞集団において低レベル〜高レベルでそれらの生来的な細胞表面形態で示差的に発現される種々のリガンド（例えば、受容体）に対して特異的である高親和性の抗リガンド（例えば、ヒト抗体など）のプールをヒト抗体ライブラリー
（および他の分子ライブラリー）から回収することを可能にする方法論を記載する。
【００４０】
本発明は、これまでに考案されたスクリーニング方法論とはいくつかの点で異なる（図８）。第１に、他にないほど強力な示差的バイオパンニング方法論を、次世代大規模シーケエンシング（ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、および、標的細胞の示差的発現表面受容体に対する抗体特異性についてのその後の確認スクリーニングと組み合わせることによって、すなわち、「リバーススクリーニング」によって、本発明は、１）質的、かつ、２）量的に他に例を見ない抗体プールの作製を可能にする。
【００４１】
重要なことに、本アプローチによって特定される抗リガンド（例えば、抗体クローンなど）は、第１には、ａ）非標的細胞に対して標的細胞において示差的に発現され、かつ、ｂ）それらの生来的な細胞表面形態で標的細胞において発現される受容体に対するそれらの高親和性結合に基づいて、また、第２には、関連のあるインビトロおよびインビボでの実験的疾患モデル系において治療効果を媒介するこれらの性質を有する抗体の記録された能力（Ｂｅｃｋ他、２０１０；Ｆｒａｎｓｓｏｎ他、２００６）に基づいて、すべてが治療可能性を有する場合がある。
【００４２】
したがって、まとめると、本発明は下記のことを可能にする：
１．高レベル、中間的レベルおよび低レベルで発現される示差的発現表面受容体に対して特異的である抗体を含有するための、示差的バイオパンニングによる抗体プールの作製。
２．中間的発現および低発現の表面受容体に対して特異的である抗体を特定するために越えなければならない、配列決定された抗体クローンの数についてのより低い閾値が存在すること。
３．このより低い閾値を超えた場合、増大する数の抗体クローンの配列決定により、中間的発現および低発現の表面受容体に対して特異的である特定された抗体の数が増大する。
４．中間的発現およびより低発現の表面受容体に対して特異的である抗体の、示差的発現の抗体プールにおける包括的特定は、大規模シーケエンシングを必要とする。
【００４３】
したがって、本発明の第１の局面において、少なくとも１つの示差的発現標的リガンドに対する少なくとも１つの抗リガンドを単離する方法であって、下記の工程：
（ａ）示差的バイオパンニングを、少なくとも１つの抗リガンドを単離するように抗リガンドのライブラリーに対して行う工程；および
（ｂ）ハイスループット配列決定を工程（ａ）の期間中に単離される抗リガンドに対して行う工程を含む方法が提供される。
【００４４】
前記方法は、さらに、下記の工程：
（ｃ）確認スクリーニングを前記示差的発現リガンドに対する抗体特異性について行う工程を含むことができる。
【００４５】
前記示差的バイオパンニング工程は、下記のサブ工程：
（ｉ）抗リガンドのライブラリーを提供するサブ工程；
（ｉｉ）サブトラクターリガンド構築物に固定されるか、または組み込まれるリガンドを含むリガンドの第１の集団を提供するサブ工程；
（ｉｉｉ）標的リガンド構築物に固定されるか、または組み込まれる、工程（ｉｉ）と同じリガンドを含むリガンドの第２の集団を提供するサブ工程；
（ｉｖ）前記集団における前記サブトラクターリガンド構築物および前記標的リガンド構築物の量を、示差的発現標的リガンドに対する抗リガンドの単離を可能にするように、普遍的な質量作用の法則
【数１】
2018154627.tif 000004
（式中：
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは反応における関与物（反応物および生成物）であり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄは、釣り合った化学式のために必要な係数である）
から導かれる１つまたは複数の式を使用して求めるサブ工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）において求められるような前記量のサブトラクターリガンド構築物を提供するサブ工程；
（ｖｉ）工程（ｉｖ）において求められるような前記量の標的リガンド構築物を提供するサブ工程；
（ｖｉｉ）前記標的リガンド構築物に結合する抗リガンドを、サブトラクターリガンド構築物に結合する抗リガンドから単離するための分離手段を提供するサブ工程；
（ｖｉｉｉ）（ｉ）の前記ライブラリーを、リガンドに対する抗リガンドの結合を可能にするために、（ｖ）および（ｖｉ）によって提供される前記リガンド構築物にさらすサブ工程；および
（ｉｘ）前記分離手段を使用して、前記標的リガンド構築物に固定されるか、または組み込まれる前記リガンドに結合する抗リガンドを単離するサブ工程を含むことができる。
【００４６】
本発明の各工程はいずれかの特定の順で必ず行われなければならないとは意図されない。
【００４７】
「決定（された）量を提供する」によって、本発明者らは、提供される当該知られていた量が、所望される抗リガンドを単離するために好適であることを確認するために本発明の式が使用されているような既に知られていた量のリガンドを提供するという意味を包含する。
【００４８】
所与の選別プロセスのために利用される反応パラメーターが、質量作用の法則およびこの法則から導かれる式を適用し、かつ、様々なパラメーター（例えば、分子ライブラリーの多様性、抗リガンドのコピー数、アップレギュレーションの所望される検出限界、所望される抗リガンド親和性、および、リガンド濃度など）を考慮に入れての計算によって、本発明に従って最適化される場合がある。
【００４９】
第１の局面の方法のハイスループット配列決定工程が、４５４シーケンシング法、イルミナ法、ＳＯＬｉＤ法、Ｈｅｌｉｃｏｓシステム、または、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＧｅｎｏｍｉｃｓおよびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得られるシステムによって行われる場合がある。
【００５０】
次世代型配列決定の出現により、非常に多数（数千〜数百万）の候補遺伝子をハイスループット様式で配列決定することが可能となっている（以降、これは「大規模シーケエンシング」として示される）。
【００５１】
４５４シーケンシングがＭａｒｇｕｌｉｅｓ他（２００５）によって記載される（参照によって本明細書中に組み込まれる）。この４５４法では、配列決定されるためのＤＮＡは、分画化され、ＤＮＡのアダプターまたはセグメントとともに供給され、アダプターを含有するプライマーを使用してＰＣＲ増幅することができる。アダプターは、ＤＮＡ捕獲ビーズへの結合のために、また、エマルションＰＣＲ増幅プライマーおよび配列決定用プライマーをアニーリングさせるために要求される２５ｍｅｒのヌクレオチドである。ＤＮＡフラグメントは一本鎖にされ、ただ１つだけのＤＮＡフラグメントが１個のビーズに結合することを許す様式でＤＮＡ捕獲ビーズに結合させられる。次に、ＤＮＡ含有ビーズが油中水型の混合物に乳化させられ、これにより、ちょうど１個のビーズを含有するマイクロリアクターが生じる。
【００５２】
このようなマイクロリアクターの内部において、フラグメントがＰＣＲ増幅され、これにより、ビーズあたり数百万のコピー数がもたらされる。ＰＣＲ後、エマルションは壊され、ビーズがピコタイタープレート（ｐｉｃｏ  ｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ）に負荷される。ピコタイタープレートのそれぞれのウエルが１個だけのビーズを含有することができる。配列決定用酵素がウエルに加えられ、ヌクレオチドが、ある決まった順でウエルを横切って流される。ヌクレオチドの取り込みにより、ピロリン酸塩の遊離がもたらされ、このピロリン酸塩により、化学発光シグナルを引き起こす反応が触媒される。このシグナルがＣＣＤカメラによって記録され、ソフトウエアを使用して、シグナルをＤＮＡ配列に翻訳する。
【００５３】
イルミナ法（Ｂｅｎｔｌｅｙ（２００８））では、一本鎖のアダプター供給フラグメントを、光学的に透明な表面に結合させ、「ブリッジ増幅」に供する。この手法により、非重複のＤＮＡフラグメントのコピー体をそれぞれが含有する数百万個のクラスターがもたらされる。ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーおよび４つの標識された可逆的ターミネーターヌクレオチドが加えられ、表面が、標識の存在位置および性質を求めるためにレーザー蛍光によって画像化される。その後、保護基が除かれ、このプロセスが数サイクルにわたって繰り返される。
【００５４】
ＳＯＬｉＤプロセス（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ（２００５））は４５４シーケンシングと類似しており、ＤＮＡフラグメントがビーズの表面で増幅される。配列決定では、標識されたプローブの連結および検出のサイクルが伴う。
【００５５】
ハイスループット配列決定のためのいくつかの他の技術が現在、開発中である。そのような技術の例には、Ｈｅｌｉｃｏｓシステム（Ｈａｒｒｉｓ（２００８））、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｄｒｍａｎａｃ（２０１０））およびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ（２００８））がある。これは、極めて急速に発達しつつある技術分野であるので、様々なハイスループット配列決定方法が本発明に適用可能であることが当業者には自明であろう。
【００５６】
ＤＮＡの長い範囲（例えば、抗体の可変ドメイン（Ｆｖ）、ｓｃＦｖ配列またはＦａｂ配列をコードする範囲など）を配列決定することができる装置はプロトタイプ段階であるにすぎないが、現在入手可能な装置は、ＤＮＡのより短い範囲（例えば、ｓｃＦｖのＣＤＲＨ１ドメインからＣＤＲＨ３ドメインまでをコードする配列、また、ｓｃＦｖのＣＤＲＨ１ドメインからＣＤＲＨ３ドメインにまで広がる配列など）の配列決定を可能にしている。しかしながら、配列決定技術が、長い範囲のＤＮＡ配列決定が可能になるように改良されるにつれて、これらの技術もまた、本発明の方法の範囲内で十分に機能するであろう。
【００５７】
本発明の方法の確認スクリーニング工程が、単離された抗リガンドプールおよび／または個々の抗リガンドクローンの、サブトラクター構築物に対して標的構築物に対する特異的なリガンド結合を、リガンド／抗リガンドの結合に対処するいずれかのアッセイを使用して、例えば、フローサイトメトリー、ＦＭＡＴ（蛍光微量アッセイ技術）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＭＳＤ（メソスケールディスカバリー）およびＣＢＡ（細胞数計測ビーズアレイ）を使用して検出することによって行われる場合がある。
【００５８】
１つの実施形態において、本方法のリガンドは標的構築物またはサブトラクター構築物のどちらかの一方において発現されない。すなわち、リガンドは標的構築物またはサブトラクター構築物の一方において発現されるだけである。
【００５９】
別の実施形態において、本方法のリガンドは、標的構築物またはサブトラクター構築物のどちらかの一方において、より高いレベルで発現される。
【００６０】
示差的バイオパンニング法は、抗リガンドをリガンドから遊離させるさらなるサブ工程を含むことができる。
【００６１】
好ましくは、示差的バイオパンニング工程の工程（ｉｉ）〜工程（ｉｘ）が、複数の異なるリガンドに対する複数の抗リガンドを単離するために並行して行われる。
【００６２】
示差的バイオパンニング工程の工程（ｉｉ）〜工程（ｉｘ）が１回または複数回繰り返される。
【００６３】
好ましくは、サブトラクター構築物または標的構築物の一方の示差的バイオパンニング工程における量が、サブトラクター構築物または標的構築物のもう一方の量を越えて提供される。リガンドの過剰は１０倍〜１０００倍の間で可能であり、しかし、２倍〜１０倍の間、または、１０００倍〜１００，０００倍の間もまた可能である。
【００６４】
サブトラクターリガンド集団の過剰の大きさにより、検出することができるであろう最も可能性のある「分解能」（すなわち、低くアップレギュレーションされるか、適度にアップレギュレーションされるか、大きくアップレギュレーションされるか、または、比類なく発現されるリガンドに対する特異性を有する抗リガンドをどの程度十分に識別することができるか）、および、示差的発現リガンドをどの程度十分に識別することができるであろうかが決定される。例えば、１００個の標的リガンド特異的な抗リガンドを有するライブラリーをその度毎に使用し、大きい十分な濃度の陽性リガンドを加え、その結果、すべての抗リガンドが平衡状態でリガンドに結合するならば、１０倍のサブトラクターリガンド集団過剰により、普通に発現されるリガンドに対する特異性を有する抗リガンドの頻度を９０％低下させることが可能であろうし、これに対して、２００倍の過剰（抗リガンド特異的な結合体の数の２倍）であれば、ありふれた結合体を除くことができるであろう（このことを示すデータについては、国際公開ＷＯ２００４／０２３１４０、図５および実施例４のまさに最後の段落を参照のこと）。
【００６５】
１つの実施形態において、示差的バイオパンニング工程の工程（ｉｖ）における式は下記の通りである：
【数２】
2018154627.tif 000005
（式中、
ｂＡ＝結合した抗リガンド
Ａ＝抗リガンドの総数
Ｔ＝リガンドの総数
Ｃ＝アボガドロ定数（６．０２２×１０２３粒子／モル）
Ｖ＝反応体積（リットル）
Ｋｄ＝平衡解離定数）
【００６６】
また、代わりの実施形態において、示差的バイオパンニング工程の工程（ｉｖ）における式は下記の通りである：
【数３】
2018154627.tif 000006
（式中、
ｂＡｐ＝結合した抗リガンド
Ｔｐ＝Ｃｐ上のリガンドの数
Ｔｓ＝Ｃｓ上のリガンドの数
Ｃｐ＝標的リガンド構築物の数
Ｃｓ＝サブトラクターリガンド構築物の数
Ａ＝抗リガンドの総数
Ｔ＝リガンドの総数
Ｃ＝アボガドロ定数（６．０２２×１０２３  粒子／モル）
Ｖ＝反応体積（リットル）
Ｋｄ＝平衡解離定数）
【００６７】
示差的バイオパンニング工程の分離手段は、固体担体、細胞膜および／またはその一部分、合成膜、ビーズ、化学的タグおよび遊離型リガンドの少なくとも１つから選択される場合がある。サブトラクター構築物および標的構築物の分離手段は、異なる密度を有する場合がある。サブトラクター構築物の分離手段は好ましくは、膜小胞または完全な細胞膜であることが可能である。
【００６８】
示差的バイオパンニング法の工程（ｉｘ）が、密度遠心分離（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＳｈａｒｏｎ、２００２）、固体担体隔離、磁気ビーズ隔離（Ｓｉｅｇｅｌ他、１９９７）、化学的タグ結合および水相分配の１つである分離方法の少なくとも１つによって行われる場合がある。
【００６９】
より好ましくは、分離方法は、密度勾配（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ；Ｐｅｒｃｏｌｌ；ヨウ化勾配媒体）で行われる密度遠心分離であり、ただし、この場合、遠心分離期間中に、第１および第２の標的リガンドが、第１および第２の標的リガンドをそれらの異なる終点から単離することができる異なる程度にＦｉｃｏｌｌ勾配の中を移動する。
【００７０】
最も好ましくは、分離方法はスクロースポリマーの勾配を使用し、例えば、Ｆｉｃｏｌｌを使用する。
【００７１】
工程（ａ）のライブラリーは好ましくは、抗リガンドを呈示する複数のライブラリーメンバーを含むディスプレーライブラリーである。そのようなライブラリーの一例が、抗リガンドがバクテリオファージの表面に呈示されるファージディスプレーライブラリーである。
【００７２】
バクテリオファージ（ファージ）の表面におけるタンパク質およびポリペプチドの呈示は、タンパク質およびポリペプチドがファージのコートタンパク質の１つに融合される場合、特異的リガンドの選別のための強力なツールを提供する。この「ファージディスプレー」技術は、特定の抗原に対する大きい親和性を有する抗体を選別するという目的のための抗体の大きいライブラリーを作製するために、Ｓｍｉｔｈによって１９８５年に初めて使用された。より近年には、この方法は、所望される性質を有するリガンドを特定するために、ペプチド、タンパク質のドメインおよび無傷のタンパク質をファージの表面に提示するために用いられている。
【００７３】
ファージディスプレー技術の背後にある原理は下記の通りである：
（ｉ）呈示のためのタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸がファージ内にクローン化される；
（ｉｉ）クローン化された核酸が、ファージのコートタンパク質の１つ（典型的には、繊維状ファージの場合にはｐ３コートタンパク質またはｐ８コートタンパク質）のコートアンカー部分に融合して発現し、その結果、外来のタンパク質またはポリペプチドがファージの表面に呈示される；
（ｉｉｉ）所望される性質を有するタンパク質またはポリペプチドを呈示するファージがその後、（例えば、アフィニティークロマトグラフィーによって）選別され、それにより、配列決定し、増殖させ、他の発現系に移すことができる遺伝子型（表現型に関連づけられる遺伝子型）がもたらされる。
【００７４】
代替において、外来のタンパク質またはポリペプチドが、一本鎖の核酸としてバクテリオファージの外被にパッケージングされ得るファージミドベクター（すなわち、ファージおよびプラスミドに由来する複製起点を含むベクター）を使用して発現させられる場合がある。ファージミドベクターが用いられる場合、「ヘルパーファージ」を使用して、ファージミド核酸の複製およびパッケージングの機能を供給する。得られたファージは、（ヘルパーファージによってコードされる）野生型コートタンパク質と、（ファージミドによってコードされる）修飾されたコートタンパク質との両方を発現することになり、これに対して、ファージベクターが使用されるときには、修飾されたコートタンパク質のみが発現される。
【００７５】
生物学的に関連のある分子と結合するリガンドを単離するためのファージディスプレーの使用が、Ｆｅｌｉｃｉ他（１９９５）、Ｋａｔｚ（１９９７）およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ他（１９９８）において検討されている。いくつかのランダム化コンビナトリアルペプチドライブラリーが、異なる標的（例えば、細胞表面受容体またはＤＮＡ）と結合するポリペプチドを選別するために構築されている（ＫａｙおよびＰａｕｌ（１９９６））。
【００７６】
様々なタンパク質および多量体タンパク質が、機能的な分子として首尾よくファージディスプレー化されている（ＣｈｉｓｗｅｌｌおよびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ（１９９２）を参照のこと）。加えて、機能的な抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、単鎖Ｆｖ［ｓｃＦｖ］）が発現されており（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ他（１９９０）；Ｂａｒｂａｓ他（１９９１）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ他（１９９１））、また、ヒトモノクローナル抗体技術の短所のいくつかが、ヒトの高親和性抗体フラグメントが単離されているので解消されている（Ｍａｒｋｓ他（１９９１）、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９２））。
【００７７】
ファージディスプレーの原理および実施に関するさらなる情報が、Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（編者：Ｋａｙ、ＷｉｎｔｅｒおよびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ（１９９６））において提供される（その開示は参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【００７８】
抗リガンドライブラリーを、抗体、および、その抗原結合性の変化体、誘導体またはフラグメント；操作された可変表面を有する足場分子；受容体；ならびに酵素から選択される少なくとも１つから構築することができる。
【００７９】
示差的発現リガンドが、抗原；受容体リガンド；ならびに、炭水化物、タンパク質、ペプチド、脂質、ポリヌクレオチド、無機分子およびコンジュゲート化分子からの少なくとも１つを含む酵素標的から選択される少なくとも１つである場合がある。
【００８０】
本発明の方法はまた、（示差的バイオパンニング工程からの）リガンドおよびその分離手段を、前記リガンド構築物における標的リガンドの発現に影響を及ぼす刺激にさらすさらなる工程を含む場合がある。
【００８１】
本発明によって特定される選別された抗リガンドは続いて、疾患の処置、画像化、診断または予後のために医療において使用されるための医薬組成物の製造において使用される場合がある。抗体に基づく抗リガンド、最も重要には、ヒト抗体に基づく抗リガンドは、大きい治療上の可能性を有する。
【００８２】
したがって、本発明の第２の局面において、所望される特性を有する抗リガンドを、いずれかの前記請求項に記載される方法によって特定した後、前記抗リガンドを医薬的に許容されるキャリアに加えることを含む、医薬組成物を調製するための方法が提供される。
【００８３】
本発明の第３の局面において、医療において使用されるための、第２の局面の方法によって調製される医薬組成物が提供される。この医薬組成物はまた、疾患の予防、処置、画像化、診断または予後のための医薬品の製造において使用される場合がある。
【００８４】
定義
「バイオパンニング」によって、本発明者らは、所望の抗リガンド−リガンド結合対から一方のメンバーを、もう一方のメンバーに対して大きい親和性により結合するその能力に基づいて選別する方法を意味する。
【００８５】
「示差的バイオパンニング」によって、本発明者らは、２つの異なる供給源（例えば、サブトラクター／コントロールおよび標的）の中または表面において異なる量で発現される所望の抗リガンド−リガンド結合対から一方のメンバーを、もう一方のメンバーに対して大きい親和性により結合するその能力に基づいて選別するためのバイオパンニング法を意味する。
【００８６】
「ハイスループット配列決定」によって、本発明者らは、多数の分子を配列決定する速度が実際に実現可能であり、かつ、著しくより迅速かつより安価になるように、多数の配列が（数百万まで）並行して配列決定されるという意味を包含する。
【００８７】
「確認スクリーニング」によって、本発明者らは、単離された抗リガンドプールおよび／または個々の抗リガンドクローンの、サブトラクター構築物に対して標的構築物に対する特異的なリガンド結合を、リガンド／抗リガンドの結合に対処するいずれかのアッセイを使用して、例えば、フローサイトメトリー、ＦＭＡＴ、ＥＬＩＳＡ、ＭＳＤおよびＣＢＡを使用して検出することを意味する。この用語はさらに、抗リガンドが、示差的発現リガンドに結合するとして特定されると、当該リガンドの本質および正体、ならびに、抗リガンドとリガンドとの間における結合相互作用が調査されるという意味を包含する。
【００８８】
「リガンド」によって、本発明者らは、リガンド／抗リガンド結合対の一方のメンバーの意味を包含する。リガンドは、例えば、相補的な、ハイブリダイゼーションした核酸二重鎖結合対における核酸鎖の一方、エフェクター／受容体結合対におけるエフェクター分子、または、抗原／抗体結合対もしくは抗原／抗体フラグメント結合対における抗原である場合がある。
【００８９】
「抗リガンド」によって、本発明者らは、リガンド／抗リガンド結合対の反対側のメンバーの意味を包含する。抗リガンドは、相補的な、ハイブリダイゼーションした核酸二重鎖結合対における核酸鎖のもう一方、エフェクター／受容体結合対における受容体分子、または、抗原／抗体結合対もしくは抗原／抗体フラグメント結合対における抗体または抗体フラグメント分子（それぞれ）である場合がある。
【００９０】
「抗原」によって、本発明者らは、抗体と相互作用することができ、しかし、免疫応答を必ずしも生じさせない分子または化学化合物を意味することを包含する。そのような抗原には、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、炭水化物、脂質またはそれらのコンジュゲート体の分子が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
「示差的発現リガンド」によって、本発明者らは、特定の条件／位置においてだけ発現され、他の場合には発現されないリガンド、あるいは、標的リガンドまたはサブトラクターリガンドのどちらかが標的リガンドおよびサブトラクターリガンドからのもう一方の改変型であるリガンドを含めて、標的供給源とサブトラクター供給源との間において異なるレベルで発現されるリガンドを意味する。例えば、いくつかの抗原は病的細胞（例えば、ガン細胞）の細胞表面において高発現し、同等な健常細胞（例えば、非ガン性細胞）においては低いレベルで発現されるか、または、全く発現されない。
【００９２】
「低発現リガンド」によって、本発明者らは、低いレベルで、すなわち、細胞あたり２０，０００コピー未満（例えば、５，０００〜２０，０００の間）で発現されるリガンド（これには、ほとんどの野生型の発現される細胞表面受容体が含まれる）、または、陽性リガンド集団サンプルにおいていずれかの他のより高発現のリガンドの１％未満の頻度で存在するリガンドを意味する。
【００９３】
「リガンド構築物」によって、本発明者らは、分離手段に関連する標的リガンドおよび／またはサブトラクターリガンドを含む系を意味する。
【００９４】
用語「抗体変化体」は、どのような合成抗体、組換え抗体または抗体ハイブリッドをも示すように解釈されなければならない（例えば、免疫グロブリンの軽鎖および／または重鎖の可変領域および／または定常領域のファージディスプレーによって作製される単鎖抗体分子、あるいは、当業者に知られている免疫アッセイ形式で抗原に結合することができる他の免疫相互反応分子などだが、これらに限定されない）。
【００９５】
用語「抗体誘導体」は、当業者に知られている免疫アッセイ形式で抗原に結合することができるどのような修飾された抗体分子をも示し、例えば、抗体のフラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントまたはＦｖフラグメント）、あるいは、別のペプチドもしくはポリペプチドへの、または、大きいキャリアタンパク質への、または、固体支持体への抗体のカップリングを容易にするために１つまたは複数のアミノ酸または他の分子（例えば、とりわけ、チロシン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システインといったアミノ酸およびそれらの誘導体、ＮＨ２−アセチル基またはＣＯＯＨ末端アミド基）の付加によって修飾される抗体分子などを示す。
【００９６】
「密度遠心分離」によって、本発明者らは、様々な物（例えば、細胞、オルガネラおよび巨大分子）をそれらの密度差に従って分離することを意味する。この分離は、分離されつつある物がそれらの密度に基づいて移動する適切な溶液の密度勾配を使用する遠心分離によって達成される。
【００９７】
「質量作用の法則」は、どのような状況のもとでも適用可能である普遍的な自然法則である。この法則は、反応について下記のことを述べており：
ａＡ＋ｂＢ→ｃＣ＋ｄＤ
その系が所与の温度において平衡状態であるならば、下記の比は定数である：
【数１】
2018154627.tif 000007
式中、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、反応における関与物（反応物および生成物）である；
ａ、ｂ、ｃ、ｄは、釣り合った化学式のために必要な係数である；
この場合、定数が、（［  ］によって示される）濃度に関して計算され、ＫはＭｃ＋ｄ−（ａ＋ｂ）の単位を有する。
【００９８】
本発明のある特定の局面を具体化する実施例が次に、下記の図を参照して記載される。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】（Ｆｒａｎｓｓｏｎ他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃ、２００６）に記載される示差的バイオパンニング法の概略。矢印の下の数字は、５つのスクリーニング工程（１〜５）ならびに２つのその後の合成工程および確認工程（（６）および（７））のそれぞれの後においてスクリーニングプロセスで保持されるファージ−ａｂまたは抗体クローンの数を示す。工程は下記の通りである：（１）示差的バイオパンニング、（２）ｓｃＦｖ変換クローンのコロニー採取、（３）単一クローンレベルでのｓｃＦｖクローンの発現、（４）標的細胞の示差的発現表面受容体に対する特異性についてのｓｃＦｖクローンのスクリーニング、（５）非重複Ａｂ配列のＩＤのための配列決定、（６）ＩｇＧ合成、および、（７）インビトロ／インビボでの機能試験。
【図２】ガンＢ細胞対Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の示差的バイオパンニング（「ＢｎｏｎＴ」）に由来する抗体プールが、いくつかの示差的発現表面受容体のそれぞれに対する抗体を、従来の方法を使用して実験的に特定されるよりもはるかに数多く含有するにちがいないことを示すインシリコ計算。（１）計算が、国際公開ＷＯ２００４／０２３１４０に教示されるように行われたことを示す。
【図３】ＤＵ−１４５前立腺ガン細胞対Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の示差的バイオパンニング（「ＤｎｏｎＴ」）に由来するファージ−抗体プールは標的細胞（ＤＵ−１４５）集団に対して非常に特異的である。Ａ）グラフは、ＦＡＣＳによって分析される場合、標的のＤＵ１４５細胞に対する、２回の示差的バイオパンニングの後で得られるファージプールの用量依存的な特異的結合を示す。非標的のＪｕｒｋａｔ細胞に対する検出可能な結合が認められないことに留意すること。Ｂ）グラフは、ＦＭＡＴによって分析される場合、ＤＵ１４５細胞対Ｊｕｒｋａｔ細胞の２回の示差的バイオパンニングの後で得られるプールに由来する１４０８個の個々のランダム選別されたクローンのそれぞれの特異的結合を示す。
【図４】標的のＤＵ−１４５細胞は、非標的細胞表面に対する標的細胞表面におけるそれらの絶対的な標的細胞発現レベルおよびそれらの相対的な発現レベルに基づいて「高示差的発現」、「中間的示差的発現」または「低示差的発現」として分類され得るいくつかの表面受容体を発現する。  標的（ＤＵ１４５）細胞および非標的（Ｊｕｒｋａｔ）細胞を、Ｚｅｎｏｎ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７標識抗体を使用するフローサイトメトリーによって３つの抗原（ＨＥＲ２、ＣＤ２４およびＣＤ１３０）の発現についてスクリーニングした。Ａ）図は、ｚｅｎｏｎ標識抗体により染色された標的細胞および非標的細胞の平均蛍光強度を示す。Ｂ）図は、ＨＥＲ２、ＣＤ２４およびＣＤ１３０を発現する細胞の割合を示す。
【図５】スキャッチャードプロット分析は、示差的バイオパンニングおよび大規模シーケエンシングによって単離された抗体によって標的化される示差的発現表面受容体の発現レベルが細胞あたり６，０００個から４００，０００個の受容体にまで及ぶことを明らかにする。Ａ）飽和曲線Ｂ）ローゼンタールプロット。抗ＣＤ１３０抗体の親和性（ＫＤ）が０．８ｎＭであると推定され、ＣＤ１３０表面受容体の数が６，３００個／細胞であると推定された。抗ＣＤ２４抗体の親和性が５．６ｎＭであると推定され、エピトープの数が８，４００個／細胞であると推定された。抗ＨＥＲ２の親和性が４７ｎＭであると推定され、エピトープの数が１１０，０００個／細胞であると推定された。評価は、ＩＮＦガンマにより刺激されたＤＵ１４５細胞に対する１２５Ｉ−標識抗体の結合のローゼンタールプロットを用いて行われた。
【図６】ＤＵ−１４５前立腺ガン細胞対Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の示差的バイオパンニング（「ＤｎｏｎＴ」）に由来する抗体プールは、高発現、中間的発現および低発現の示差的発現表面受容体に対して特異的である抗体クローンを含有する。  スキャッチャード分析およびＦＡＣＳ分析（図４および図５）に基づいて、ＨＥＲ２、ＣＤ２４およびＣＤ１３０が、様々なレベルで発現されている受容体として特徴づけられた。Ａ）図は、すべての抗原に対して特異的である抗体クローンが、ＥＬＩＳＡによって分析される場合、ＤＵ−１４５細胞対Ｊｕｒｋａｔ細胞の２回の示差的バイオパンニングによって生じる抗体プールに存在することを示す。Ｂ）図は、Ａにおける標的特異的クローンが選別され、結合について再試験されたとき、クローンの大部分が標的抗原について依然として陽性であったことを示す。回収された標的表面受容体特異的な抗体クローンの配列決定により、示差的選別された抗体プールにおける（少なくとも）１２個の非重複抗体の存在が明らかにされた（８個の抗ＨＥＲ２抗体、１個の抗ＣＤ２４抗体および３個の抗ＣＤ１３０抗体）。
【図７】増大する数の示差的選別された抗体クローンの配列決定は、低発現の標的細胞示差的発現表面受容体に対して特異的である増大する数の抗体クローンの特定をもたらす。  増大するサイズの結合体の３つのランダム選別されたプール（９１個のクローン、２５５個のクローンおよび８１３個のクローン、それぞれ）における抗体クローン配列が決定された。その後、３つすべてのプールにおいて見出されたクローン（「高頻度クローン」）、２つの大きい方のプールにおいてのみ見出されたクローン（「低頻度クローン」）、または、最大のプールにおいてのみ見出されたクローン（「希少クローン」）が、ＦＡＣＳによってＤＵ１４５細胞に対する結合について分析され、高頻度クローン、低頻度クローンおよび希少クローンの平均蛍光強度を比較した。  データは、平均受容体発現レベルが高頻度クローン＞中間的頻度クローン＞希少クローンであることを明瞭に明らかにする。したがって、増大する数の示差的選別された抗体クローンの配列決定により、低発現の標的細胞示差的発現表面受容体に対して特異的である増大する数の抗体クローンの特定がもたらされた。Ａ）図は、それぞれの抗体クローンにより染色されたＤＵ−１４５細胞の平均蛍光強度を示す。Ｂ）図は、個々の抗体クローンが結合する標的細胞の割合を示す。  クローンはランダム選別されたので、それらの一部は非結合体であり、これらは分析前に除かれた（結合体は、パーセント陽性染色細胞および幾何平均の両方で陰性コントロールの少なくとも２倍のシグナルを与えるクローンとして、またあるいは、幾何平均において３倍大きいシグナルを与えるクローンとしてのどちらかで定義された）。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、ボンフェローニ補正を多重解析のために使用してＡＮＯＶＡによって計算された場合。
【図８】概略は、以前に記載された示差的バイオパンニングスクリーニング法（Ａ．、上段パネル）および新しい強化された方法（Ｂ．、下段パネル）のスクリーニング工程の比較を示す。  これら２つの方法はいくつかの点で異なる；第１に、逆スクリーニング法では、国際公開ＷＯ２００４／０２３１４０の示差的バイオパンニングの、ファージ−ａｂからｓｃＦｖへの変換工程、ｓｃＦｖ発現工程、および、結合特異性についてのｓｃＦｖスクリーニング工程が省略されている。第２に、逆スクリーニング法では、示差的バイオパンニングのすぐ後に、（大規模）シーケエンシングが続き、これに対して、国際公開ＷＯ２００４／０２３１４０のスクリーニングプロセスでは、プールにおける抗体クローンの配列決定の前に、標的細胞の示差的発現表面受容体の特異性についての個々のｓｃＦｖクローンのスクリーニングが行われる。第３に、そして、最も重要なことであるが、逆スクリーニングプロセスを使用して達成される抗体クローンの数（数万個）および抗体クローンの性状（低発現の示差的発現受容体に対して特異的である抗体の包括的作製を含む）は、Ａの以前に記載された示差的バイオパンニング法の使用では実際的に達成することができない。  工程は下記の通りである：（１）示差的バイオパンニング、（２）ｓｃＦｖ変換クローンのコロニー採取、（３）単一クローンレベルでのｓｃＦｖクローンの発現、（４）標的細胞の示差的発現表面受容体に対する特異性についてのｓｃＦｖクローンのスクリーニング、（５）非重複Ａｂ配列のＩＤのための配列決定、（６）ＩｇＧ合成、（７）インビトロ／インビボでの機能試験、（２’）次世代型大規模シーケエンシング、（３’）ＨＴ  ＩｇＧ合成、（４’）標的細胞の示差的発現表面受容体に対する特異性についてのＩｇＧクローンのスクリーニング、（５’）インビトロ／インビボでの機能試験。
【図９】ＤＵ−１４５前立腺ガン細胞対Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の２回の示差的バイオパンニングに由来する回収されたファージ−抗体プールのインシリコ計算。
【実施例】
【０１００】
実施例１−示差的バイオパンニングをその後のハイスループット配列決定と組み合わせることにより、示差的に発現される標的細胞表面受容体に対して特異的であるこれまでにない数の非重複抗体クローンがもたらされる
ガンＢ細胞対Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の示差的バイオパンニング（「ＢｎｏｎＴ」）による抗体プールの作製
本実験において、およそ１０１０個の遺伝子型非重複結合体を含む非常に多様化されたｎ−ＣｏＤｅＲライブラリーに由来する２×１０１３個のファージ粒子が、Ｂリンパ腫細胞株のＲａｍｏｓ細胞全体と混合され（陽性選別）、また、Ｔ白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔに由来する形質膜または粗膜小胞と混合される（陰性選別）。Ｔ細胞白血病細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）と比較してＢリンパ腫細胞株（Ｒａｍｏｓ）において特有に発現される抗原に対して特異的である結合体が、選択的に単離されるべきものである。
【０１０１】
選別のための陽性細胞および陰性細胞数の計算
異なる選別ラウンドで使用するための細胞数を、（国際公開ＷＯ２００４／０２３１４０）において教示されるように計算した。計算のために使用した反応パラメーターは、図２に示される通りであった。
【０１０２】
陽性細胞および陰性細胞の数を、３回の選別の後で、Ｂ細胞において特有に発現される抗原に対する特異性を有する結合体が、Ｂ細胞およびＴ細胞において等しい密度で発現される抗原よりも１０，０００倍富化されるであろうように選んだ。
【０１０３】
選別ラウンド２および選別ラウンド３における、種々のカテゴリーの抗原（陽性細胞富化抗原、陽性細胞特有抗原または陽性／陰性細胞普通発現抗原）に対して特異的であるファージ結合体の投入数を、選別ラウンド１および選別ラウンド２の後における種々のカテゴリーの抗原に対して特異的である溶出ファージの計算された数に増幅係数（ＡＦ）を乗じることによって計算した。
【０１０４】
増幅係数を、関連の選別ラウンドの後における増幅ファージの総数を同じ選別ラウンドからの溶出ファージの総数で除することによって得た。
【０１０５】
実験方法
細胞培養
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株（クローンＥ６−１）およびＲａｍｏｓ  Ｂリンパ腫細胞株を、１０％のＦＣＳ（Ｒａｍｏｓ細胞のみについては熱不活化された）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムが補充されるＲＰＭＩ１６４０において、加湿雰囲気中、３７℃で培養した。細胞を１〜２×１０６細胞／ｍｌで維持した（Ｊｕｒｋａｔについては１×１０６細胞／ｍｌ未満）。
【０１０６】
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の形質膜調製
Ｊｕｒｋａｔ細胞の培養
Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６−１細胞を、１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、ロット番号：１１２８０１６）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）が補充される、Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉを伴うＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ、＃６１８７０−０１０）において、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃で、１×１０５細胞／ｍｌ〜１×１０６細胞／ｍｌの間の細胞密度で維持した。最後の継代培養において、細胞を２×１０６の最大密度に到達させ、その時点で細胞を集めた。
【０１０７】
細胞の破壊
１．細胞を、チューブアダプターに入れられた５００ｍｌ遠心分離機用チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃４３１１２３）における遠心分離（１５００ｒｐｍ、１５分、４℃）によって培養から集めた。
２．上清を捨て、０．１４５ＭのＮａＣｌにおいて洗浄した。細胞懸濁物をプールし、細胞を計数し（合計で５×１０９個の細胞）、遠心分離を繰り返した。
３．細胞の破壊を、氷上で１０分間〜３０分間、１ｍＭ  ＮａＨＣＯ３／１．５ｍＭ  ＭｇＡｃ（ｐＨ７．４）における低浸透圧ショックによって行い、続く窒素キャビテーションを、０℃で１５分間、４０ｂａｒ（４０００ｋＰａ）でＹｅｄａプレス機において行った。細胞濃度は５×１０７細胞／ｍｌを越えなかった。
４．破壊後、１５０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを、１ｍＭの最終ＥＤＴＡ濃度を得るようにホモジネート懸濁物に加えた（ＥＤＴＡの添加により、膜小胞の凝集が防止される）。
５．Ａ）粗膜単離：ホモジネート（５０ｍｌ）を１９００ｇ（ＳＳ３４ローターにおいて４０００ｒｐｍ）で１０分間遠心分離して、未破壊細胞および核を除き、上清を採取した。脆い核は崩壊しやく、これにより、ＤＮＡの漏出および凝集を引き起こすので、ペレットの洗浄および再度の遠心分離を避けた；または
Ｂ）形質膜単離：１０ｍｌの３７．２％スクロースを３８．５ｍｌのＢｅｃｋｍａｎ超遠心分離チューブ（６本）の底部で層にし、上記工程２からの２７ｍｌ（各チューブ）の細胞ホモジネートを上部に注意深く層にした。チューブを、スィングアウトＳＷ２８ローター（３９ｍｌの公称容量、６本）において２７０００ｒｐｍで、４℃で２時間４５分にわたって遠心分離した。形質膜を、スクロースクッションとサンプル相との相間の白色バンドとしてチューブから単離し、ＰＭをプールし、３５ｍｌチューブ（４本）の間で分割し、ＴＥ緩衝液（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ／０．２５Ｍスクロース／０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ緩衝液）で希釈して３５ｍｌの総体積にした。
６．超遠心分離を、Ｂｅｃｋｍａｎタイプ４５．Ｔｉローター（公称容量、９４ｍｌ  Ｎａｌｇｅｎｅチューブ、６本）において、４℃で１時間、４０，０００ｒｐｍ（およそ２００，０００ｘｇ）で行った。
７．上清を捨て、残留する緩衝液をすべて、１ｍｌのＦｉｎｎピペットを使用して除いた。形質膜ペレットを、金属棒を用いてチューブの底部からかき取り、小型のｄｏｕｎｃｅホモジナイザーに移した。ペレット化された膜を、１０ｍＭのＨｅｐｅｓを含有する２．５ｍｌの総体積のＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／１ｍＭ  Ｔｒｉｓ／０．２５Ｍスクロース／０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ緩衝液）における均質化を、ゆるくはまるＤｏｕｎｃｅガラスピストンによる５回〜１０回のストロークにより行うことによって再懸濁した。大まかには、およそ２×１０９個のＪｕｒｋａｔ細胞に由来する膜を１ｍｌの再懸濁（ＴＥ）緩衝液あたり再懸濁することができる。
【０１０８】
タンパク質濃度の決定
タンパク質濃度の決定を、ＢＣＡキットを製造者の説明書に従って使用して行った。簡単に記載すると、二重でのＢＳＡ標準物を、２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡストック溶液のＰＢＳにおける２倍希釈物（１０μｌサンプル＋１０μｌ緩衝液）によって調製した。標準曲線を、膜サンプルの総タンパク質濃度を求めるために作製し、使用した。
【０１０９】
形質膜の活性（アルカリホスファターゼアッセイによる）
アルカリホスファターゼ溶液
基質溶液：
５０ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２における１０ｍｌのホウ酸塩緩衝液につき１錠のｐ−ＮＰＰ（１．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度）
三連でのサンプルを、５０μｌのサンプルを５０μｌの希釈緩衝液（５０ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２）に移すことによってホウ酸塩／ＭｇＣｌ２緩衝液において希釈した。２００μｌの基質溶液（５０ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２において１．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように１０ｍｌのホウ酸塩緩衝液につき１錠のｐ−ＮＰＰ）を、それぞれの希釈物について３つのサンプルのうちの２つに加えた。その後、サンプルを３７℃で６０分以上インキュベーションした。上清の吸光度を４１０ｎｍで測定し、基質が添加されなかった適切なコントロールウエル（例えば、総窒素キャビテーション細胞ホモジネートで、核および重いミトコンドリアが除かれたもの）からの値を差し引いた。結果をプロットし、分析した。
【０１１０】
選別手順：示差的バイオパンニングプロトコル
反応パラメーター
１回目の選別ラウンド
１．６ｍｌの２％ミルク−ＰＢＳ（ＣａおよびＭｇを含む）において２×１０１３の総ｐｆｕにまで増幅させた、１０１０個の遺伝子型非重複ファージミド粒子（Ａｍｐｒ）を含むｎ−ＣｏＤｅＲ  Ｌｉｂ２０００ファージストック。
総反応体積：２．５ｍｌ
陽性−５×１０７個のＲａｍｏｓ  Ｂ細胞リンパ腫細胞
陰性−２×１０９個の細胞に由来するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の粗膜
【０１１１】
２回目の選別ラウンド
前回の選別ラウンドから溶出され、その後、増幅、沈殿化、および、１００μｌの２％ミルク−ＰＢＳ（ＣａおよびＭｇを含む）における再懸濁が行われた１．５×１０１２個のファージ。
総反応体積：０．５ｍｌ
陽性−５×１０６個のＲａｍｏｓ  Ｂ細胞リンパ腫細胞
陰性−１×１０９個の細胞に由来するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の粗膜小胞
【０１１２】
３回目の選別ラウンド
１００μｌの２％ミルク−ＰＢＳ（ＣａおよびＭｇを含む）に再懸濁される、前回の選別ラウンドから溶出され、増幅させた１×１０１２個のファージ。
総反応体積：０．５ｍｌ
陽性−５×１０６個のＲａｍｏｓ  Ｂ細胞リンパ腫細胞
陰性−１×１０９個の細胞に由来するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の形質膜小胞
【０１１３】
方法
ファージストックを３７℃で１５分間あらかじめ温め、間欠的にボルテックス処理した。ファージストックをエッペンドルフ遠心分離器において最高速度で１５分間遠心分離した。沈殿物が形成されていた場合、上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、無脂肪乳に再懸濁して２％の最終濃度にした。
【０１１４】
２×１０９個の細胞（１×１０９個の細胞、バイオパンニングラウンド２およびバイオパンニングラウンド３）からの、コントロールのＪｕｒｋａｔ細胞の形質膜調製物を氷上で解凍した。（１０μｌがまた、タンパク質濃度決定のために保存された。）解凍された形質膜調製物を、ファージストックを加え、ピペットを用いて混合することによって再懸濁し、続いて、氷上で１５分間インキュベーションした。
【０１１５】
５×１０７個（５×１０６個、バイオパンニングラウンド２およびバイオパンニングラウンド３）のＲａｍｏｓ細胞を、４℃で６分間、１２００ｒｐｍで遠心分離した。
【０１１６】
上清を捨て、Ｒａｍｏｓ細胞をミルク−ファージ−陰性細胞膜のストック溶液に再懸濁し、１０℃でインキュベーションし、４時間にわたる緩速（転倒）回転に供した。
【０１１７】
細胞／細胞膜／ファージのインキュベーション物を、底部における１ｍｌの１００％（トリパンブルー染色された）Ｆｉｃｏｌｌと、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ（ＣａおよびＭｇを含む）における９ｍｌの重層された４０％Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓとを含有する１５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移した。細胞をチューブ壁から取り除くために、チューブを、４℃で１０分間、１５００ｒｐｍで遠心分離し、１８０°回転させ、さらに１分間遠心分離した。
【０１１８】
全Ｒａｍｏｓ細胞および結合ファージを含有する相間物を、シリンジおよびより大きいゲージのニードル（例えば、Ｍｉｃｒｏｌａｎｃｅ３−１９ＧＡ１１／２  １、１×４０  ＴＷ  ＰＭ）を使用して注意深く吸引した。ニードルを、ニードルの傾斜端を上に向けて細胞含有相間物のすぐ下側に挿入した。細胞層を採取し（およそ１５０μｌ）、ニードルを入口穴とは反対側のチューブのプラスチックに突き通した。シリンジの内容物を新しいチューブの中に排出し、（依然として、チューブに突き刺すように位置させて）新鮮なＰＢＳをニードル内に吸い込むことによって２回洗浄した。集めた細胞懸濁物を５００μｌのＰＢＳ−２％ＢＳＡに再懸濁し、洗浄を繰り返し、上清を滴定のために保存した。
【０１１９】
細胞を１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、新しい１５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、このチューブにおいて、細胞を、４℃で１０分間、１２６０ｒｐｍで遠心分離した。上清を、ピペットを使用して取り出し、該上清を滴定のために保存した。
【０１２０】
ファージを、１５０μｌの７６ｍＭクエン酸（ｐＨ２．５）／ＰＢＳを加え、その後、インキュベーションを室温で５分間行うことによって細胞から溶出させた。混合物を、２００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を加えることによって中和した。その後、細胞を遠心分離し、溶出ファージを保存した。
【０１２１】
細胞を１ｍｌのトリプシンに再懸濁し、新しいチューブに移し、１０分間インキュベーションした後、４０μｌの１ｍｇ／ｍｌ  アプロチニンにより不活性化した。細胞を遠心分離し、上清を滴定のために保存した。
【０１２２】
選別ラウンド１および選別ラウンド２の後における大きい平板での増幅
１．１０ｍｌの大腸菌ＨＢ１０１Ｆ’培養を、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する１０ｍｌのＬＢ（溶原培地）に５０μｌの一晩培養物を加えることによって使用の２．５時間前〜３時間前に開始した（１つをそれぞれ選別して増幅するために、そして、１つをＯＤ６００測定のために）。ＯＤをおよそ２．５時間後に１つの培養物について調べた。
２．チューブに、ＯＤ６００＝０．５で、溶出ファージの半分を感染させた。
３．チューブを３７℃および５０ｒｐｍで３０分間インキュベーションし、適切な表現型分類のために、３７℃でさらに３０分間インキュベーションした（２００ｒｐｍ）。
４．細菌を２０６０ｘｇ（３０００ｒｐｍ、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６）での１０分間の遠心分離によって濃縮した（１０ｍｌ）。
５．細菌を上清の一部（およそ３ｍｌ）に再懸濁し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン＋１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン＋１％グルコースを含有する大きい５００ｃｍ２のＬＡ（ルリア寒天）平板に広げた。
６．平板を３０℃で一晩インキュベーションした。
７．細菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する５ｍｌのＬＢを平板あたり加え、かき取ることによって平板から集めた。平板を傾け、溶液を吸引した。
８．平板を、さらに３ｍｌの上記のようなＬＢ培地により洗浄し、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブにおいて最初の細菌懸濁物と一緒にプールした。
９．細菌を室温における２１００ｘｇ／３０００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ６）での１０分間の遠心分離によって濃縮し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する１ｍｌのＬＢに再懸濁した。
１０．５００μｌの５０％グリセロールを１ｍｌの細菌懸濁物に加え、このグリセロールストックを−８０℃で凍結した。
１１．１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する２つの１０ｍｌ  ＬＢに、工程１０のグリセロールストック２．５μｌ（５μｌ）を感染させ、ＯＤ６００＝０．５まで増殖させた。
１２．６×１０９ＰＦＵのＲ４０８ヘルパーファージを１ｍｌの培養物あたり加え、培養物を３７℃および５０ｒｐｍで３０分間インキュベーションした。
１３．ＩＰＴＧ溶液を１００μＭの最終濃度に加え（すなわち、１０ｍｌの培養物あたり、０．５Ｍストックからの２μｌ）、培養物を２５℃および１７５ｒｐｍで一晩インキュベーションした。
【０１２３】
増幅されたファージストックの採取および沈殿化
１．細菌を、室温で１０分間、２１００ｘｇ（３０００ｒｐｍ、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６において）でペレット化し、上清を０．２μｍの無菌フィルターに通して無菌濾過した。
２．同じ選別に由来するチューブをプールし、ファージを１／４量のファージ沈殿緩衝液の添加および４℃における少なくとも４時間のインキュベーションによって沈殿させた。
３．チューブを４℃および１３０００ｘｇで３０分間遠心分離した。
４．ペレットを、４℃で一晩、１００μｌのＰＢＳに完全に再懸濁させた。
【０１２４】
グリセロールストックのための平板での増幅および（選別ラウンド３の後における）ミニプレップのための一晩培養
１．１０ｍｌの大腸菌ＨＢ１０１Ｆ’培養を、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する１０ｍｌのＬＢに５０μｌの一晩培養物を加えることによって使用の２．５時間前〜３時間前に開始した（１つをそれぞれ選別して増幅するために、そして、１つをＯＤ６００測定のために）。ＯＤをおよそ２．５時間後に１つの培養物について調べた。
２．チューブに、ＯＤ６００＝０．５で、溶出ファージの半分を感染させた。
３．チューブを３７℃および５０ｒｐｍで３０分間インキュベーションし、適切な表現型分類のために、３７℃でさらに３０分間インキュベーションした（２００ｒｐｍ）。
４．２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１０ｍｌの温ＬＢ培地を加え、感染させた細菌を、各１０ｍｌの２つの部分に分割した。
５．２つのチューブの一方において、細菌を、室温における２１００ｘｇ／３０００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６）での１０分間の遠心分離によって濃縮し（１０ｍｌ）、小体積で再懸濁し、５００ｃｍ２のＬＡ平板（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン＋１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン＋１％のグルコース）に広げ、３０℃で一晩インキュベーションした。
６．ミニプレップ：もう一方の１０ｍｌを遠心沈殿させ、０．１％のグルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する６ｍｌのＬＢに再懸濁し、３０℃で一晩インキュベーションした（１７５ｒｐｍ）。
７．細菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する５ｍｌのＬＢを平板あたり加え、かき取ることによって平板から集めた。平板を傾け、溶液を吸引した。
８．平板を、さらに３ｍｌの上記のようなＬＢ培地により洗浄し、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブにおいて最初の細菌懸濁物と一緒にプールした。
９．細菌を室温における２１００ｘｇ／３０００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ６）での１０分間の遠心分離によって濃縮し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する１ｍｌのＬＢに再懸濁した。
１０．５００μｌの５０％グリセロールを１ｍｌの細菌懸濁物に加え、このグリセロールストックを−８０℃で凍結した。
１１．精製されたファージ−抗体ＤＮＡを、キット製造者（ＢｉｏＲａｄ）のプロトコルに従って３ｍｌの培養物からミニプレップを調製することによって得た。
【０１２５】
ＢｎｏｎＴ示差的バイオパンニングによって生じたプールにおける抗体多様性を直接に評価するために、本発明者らは４−５−４技術（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ他、２００５）を使用し、抗体多様性を、示差的選別された抗体プールにおける非重複ＣＤＲＨ３変化体の数を求めることによって推定した。
【０１２６】
４−５−４技術による大規模シーケエンシングを、３回の示差的バイオパンニング（「ＢｎｏｎＴ」）の後で得られる精製されたファージ−抗体ＤＮＡに対して行い、これにより、合計で２２，４９７個の非重複配列を特定した（表２）。比較のために、同じＢｎｏｎＴ示差的バイオパンニングからのファージ−抗体ＤＮＡのサンガー配列決定による従来のスクリーニングでは、ほんの８個の非重複抗体クローンが特定されただけであった（表１）。
【表２】
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【０１２７】
この観測結果と、ＢｎｏｎＴ示差的選別されたクローンの大多数（９９％超）がガンＢ細胞の示差的発現表面受容体に対して特異的であったという本発明者らが以前に報告した知見（Ｆｒａｎｓｓｏｎ他、２００６）と併せると、下記のことが明らかにされる：
ａ）示差的選別された抗体プールは実際に、非常に多様化されていた；および、
ｂ）示差的バイオパンニングおよびハイスループット配列決定を組み合わせることによって、特定することができる、示差的発現表面受容体に対して特異的である非重複抗体クローンの数は、従来のスクリーニングアプローチによって達成される桁数よりも大きい桁数である。
【０１２８】
ハイスループット配列決定に続く示差的バイオパンニングが、様々なタイプの標的細胞によって示差的に発現される様々な表面受容体に対して特異的である多数の抗体を生じさせるために再現性よく使用され得ることを明らかにするために、新しい示差的バイオパンニング／大規模シーケエンシング反応を、今回はパンニング反応「ＤｎｏｎＴ」において前立腺ガンＤＵ−１４５細胞を標的細胞として使用し、かつ、Ｔ細胞を非標的細胞として使用して行った。
【０１２９】
再度ではあるが、示差的バイオパンニングは抗体の非常に標的細胞特異的なプールをもたらした（図３）。４−５−４技術による大規模シーケエンシングを、示差的バイオパンニングの２回（ＤＵ−１４５対Ｔ）の後で得られる精製されたファージ−抗体ＤＮＡに対して行い、これにより、合計で６８，０６０個の非重複配列をそれぞれ特定した（表２）。
【０１３０】
これらの抗体配列の大多数が、１４００を越えるランダム採取された抗体クローンの、ＤＵ−１４５細胞対Ｔ細胞に対する結合についてのスクリーニングによって示されるように（図３Ｂ）、また、インシリコ計算によって示されるように（図９）、標的細胞の示差的発現抗原に対して特異的である可能性がある。
【０１３１】
本発明者らは、ａ）非常に多様化されたヒト抗体ライブラリーに対する示差的バイオパンニングの適用、その後、ｂ）示差的バイオパンニングによって生じる抗体プールの大規模シーケエンシングが組み合わされる場合、従来のスクリーニングアプローチによって可能であるよりもはるかに多数の、標的細胞示差的発現表面受容体に対して特異的である抗体クローンが再現性よく生じると結論する。
【０１３２】
実施例２−示差的バイオパンニングをそれに続くハイスループット配列決定と組み合わせることにより、より低発現の示差的発現表面受容体に対して特異的である抗体クローンを含めて、抗体クローンの質的非重複プールがもたらされる
質量作用の法則を適用して国際公開ＷＯ２００４／０２３１４０およびＦｒｅｎｄｅｕｓ（２００６）に記載されるように行われるインシリコ計算は、（ガンＢ細胞または前立腺ガン細胞を標的として使用する実施例１において例示されるように）本出願において行われるような示差的バイオパンニングを適用するとき、選別された抗体プールにおける回収された抗体クローンの頻度が、ａ）標的細胞表面対非標的細胞表面におけるそれらの標的化された受容体の絶対的および相対的な発現、ならびに、ｂ）標的化された表面受容体に対するそれらのそれぞれの親和性の直接的な関数となるであろうことを教示する。
【０１３３】
これらの計算ではさらに、一般的な共通する見解（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、２００２）（Ｌｉｕ他、２００４；Ｍｕｔｕｂｅｒｒｉａ他、１９９９；Ｏｓｂｏｕｒｎ他、１９９８）とは対照的に、（例えば、細胞あたり２０，０００個未満の）より低発現の表面受容体に対して特異的である抗体クローン、同様にまた、（例えば、細胞あたり２０，０００個〜５０，０００個の受容体で発現される）中間的発現の表面受容体に対して特異的である抗体クローンが、本明細書中に記載されるような示差的バイオパンニングによって選別され得るし、また、選別されるであろうし、かつ、高発現の示差的発現表面受容体に対して特異的である抗体クローンと比較して劇的により低い頻度であるにもかかわらず、溶出された抗体プールに存在するであろうことが確認される（図２および図９）。
【０１３４】
いくつかのアプローチが今や、連続した示差的バイオパンニングおよび大規模シーケエンシングによって生じる抗体プールが、低いレベルおよび中間的なレベルで発現される示差的発現表面受容体に対して特異的である抗体クローンを含有するという点で他に例を見ないことを明らかにするために、また、配列決定の深さ（すなわち、分析される抗体クローン配列の数）を増大させることにより、低下する（より低い）レベルで（非標的細胞に対して）標的細胞において発現される示差的発現表面受容体に対して特異的である抗体の特定がもたらされることを明らかにするために使用されている。
【０１３５】
最初に、本発明者らは、示差的バイオパンニングによって選別される抗体プールが、低い示差的発現表面受容体および中間的な示差的発現表面受容体に対して特異的である抗体クローンを本当に含有することを明らかにした（図４、図５および図６）。
【０１３６】
示差的選別された抗体プールを、非標的細胞に対して標的細胞によって示差的に発現されることが確認され、かつ、スキャッチャードプロット分析およびＦＡＣＳ分析（図４および図５ＴＢＧ）によって標的細胞において低レベルから中間的レベルまでで発現されることが確認される表面受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を用いた１つのさらなる選別に供することによって、本発明者らは、種々の低発現の表面受容体および中間的発現の表面受容体に対して特異的であるいくつか（１２個）の抗体クローンを、ＣＤ２４表面受容体、ＣＤ１３０表面受容体およびＨＥＲ２表面受容体に対して特異的である抗体を含む示差的発現抗体プールから単離した（図６）。
【０１３７】
それぞれの受容体に対する１つの単離された抗体をＩｇＧ形式に変換し、スキャッチャード分析およびＦＡＣＳ分析のために使用し、これにより、細胞あたり６，０００個〜１００，０００個の受容体の発現レベルが明らかにされた（表３、図４および図５）。
【表３】
2018154627.tif 000009
【０１３８】
実験方法
表面受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を用いた選別
反応パラメーター
２回の示差的バイオパンニング（ＤＵ−１４５対Ｔ、「ＤｎｏｎＴ」）の後で溶出および増幅されたファージを沈殿させ、ＰＢＳに再懸濁した。１００μｌ（２．４×１０１１個のファージに対応する）を３回目の選別ラウンドにおいて使用した。
総反応体積：１．０ｍｌ
【０１３９】
選別において、ファージを、３つの表面局在化タンパク質（ＣＤ２４、ＣＤ１３０およびＨＥＲ２）に対する結合体について富化した。
【０１４０】
方法−ＥＣＤ選別
５０ｐｍｏｌｅの各タンパク質（上記参照）を使用して、４つのポリスチレン球体（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号：１７１７５−１００）を１ｍｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）の反応体積において被覆した。被覆を、転倒回転とともに室温で１時間、エッペンドルフチューブにおいて行い、そして、続く一晩のインキュベーション工程において、回転を伴うことなく４℃で行った。
【０１４１】
被覆された球体を、１ｍｌのＴＰＢＳＢ−３％（３％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０および０．０２％のＮａＮ３を含有するＰＢＳ）により１回洗浄し、１ｍｌのＴＰＢＳＢ−５％（５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０および０．０２％のＮａＮ３を含有するＰＢＳ）での１時間のインキュベーション工程によって、転倒回転とともに１時間、室温でブロッキング処理した。１ｍｌのＴＰＢＳＢ−３％による洗浄の後、球体を新しいエッペンドルフチューブに移し、ファージをブロッキング処理された球体に（１ｍｌのＴＰＢＳＢ−３％の総体積で）加えた。混合物を転倒回転とともに４℃で一晩インキュベーションした。
【０１４２】
非結合のファージを除くために、球体を１ｍｌのＴＰＢＳＢ−３％により３回洗浄し、その後、１０ｍｌのＴＰＢＳ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０および０．０２％のＮａＮ３を含有するＰＢＳ）による３回の洗浄、および、１０ｍｌのＰＢＳによる３回の洗浄を行った。ＴＰＢＳ洗浄に先立って、球体を、ろ過器を使用して集め、新しい５０ｍｌチューブに移し、このチューブにおいて、すべてのその後の洗浄工程を行った。洗浄手順を容易にするために、各洗浄工程の後に、転倒回転を伴う室温での３分間のインキュベーション工程を行った。
【０１４３】
洗浄された球体を、ろ過器を使用して集め、新しいエッペンドルフチューブに移した。結合したファージを、球体を、転倒回転とともに室温で３０分間、４００μｌの０．５％トリプシンとインキュベーションし、その後、トリプシンを不活性化するために４０μｌのアプロチニン（２ｍｇ／ｍｌ）を加えることによって溶出させた。溶出ファージを含有するトリプシン／アプロチニン混合物をエッペンドルフチューブに移し、球体を２００μｌのＰＢＳにより洗浄し、その後、これを溶出ファージとともにプールし、これにより、６４０μｌの総体積がもたらされた。
【０１４４】
グリセロールストックのための平板での増幅およびミニプレップのための一晩培養
本方法のこれらの局面を実施例１に記載されるように行った。
【０１４５】
ファージ結合形式から可溶性ｓｃＦｖ形式への変換
これは、ｓｃＦｖフラグメントがファージミド（ＡｍｐＲ）から制限され、カナマイシン抵抗性をコードする遺伝子を運ぶベクター（ｐＫｓｃＦｖ−３ｘＦＨ）に挿入される変換方法である。
【０１４６】
材料：
ＡｖｒＩＩ（４Ｕ／μｌ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｒ０１７４）
１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｂ７００２Ｓ）
ＭＱ水
ＳｆｉＩ（２０Ｕ／μｌ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｒ０１２３）
１０×ＢＳＡ（１００×ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｂ９００１Ｓ）、ＭＱ水で１０倍希釈したもの）
ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８１０４）
ＳｆｉＩ／ＡｖｒＩＩ消化のｐＫｓｃＦｖ３ｘＦＨ
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５２２４−０１７）
５×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｐ／Ｎ  Ｙ９０００１）
【０１４７】
ファージミドＤＮＡの消化
・消化反応液を、ファージミドのミニプレップを使用して調製する：
２μｇ  ファージミドのミニプレップ
１μｌ→４Ｕ  ＡｖｒＩＩ
２μｌ→１×  １０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２
ＭＱ  Ｈ２Ｏ  ２０μｌの総体積にまで
・３７℃で２時間インキュベーションする。
・ＳｆｉＩ消化を続ける。上記からの消化ミックスに、下記を加える：
１μｌ→１×  １０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２
３μｌ→１×  １０×ＢＳＡ
１μｌ→２０Ｕ  ＳｆｉＩ
５μｌ    ＭＱ  Ｈ２Ｏ→３０μｌの総体積
・５０℃で２時間インキュベーションする。
【０１４８】
消化ＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを販売者の説明書に従って使用して精製する。５０μｌの水を溶出のために使用する。４０ｎｇ／μｌの総濃度を有するおよそ５０μｌが回収されるであろう（１００％の回収を想定する）。
【０１４９】
連結
・下記のライゲートミックスを組み立てる：
０．６μｌ→６０ｎｇ  ＳｆｉＩ／ＡｖｒＩＩ消化のｐＫｓｃＦｖ３ｘＦＨ
６μｌ→２４０ｎｇ  ＳｆｉＩ／ＡｖｒＩＩ消化／精製されたファージミドのミニプレップ
５μｌ→１×    ５×リガーゼ緩衝液
１μｌ→１Ｕ    Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ
１２．４μｌ    ＭＱ  Ｈ２Ｏ→２５μｌの総体積
・１６℃で一晩インキュベーションする。
・使用まで−２０℃で貯蔵する。
【０１５０】
形質転換
上記で作製されたライゲート体を大腸菌ＴＯＰ１０に形質転換した。
【０１５１】
ライゲート体あたり１つのチューブ（１００μｌ／チューブ）の化学的コンピテントなＴＯＰ１０細胞を氷上で解凍した。１０ｎｇのライゲート体をチューブあたり加え、チューブを氷上で３０分間インキュベーションした。
【０１５２】
その後、チューブを４２℃（水浴）で９０秒間インキュベーションし、さらに氷上で５分間インキュベーションした。
【０１５３】
９００μｌのＬＢをそれぞれのチューブに加え、チューブを３７℃で１時間インキュベーションした（２００ｒｐｍ）。
【０１５４】
それぞれのチューブの内容物を１つの５００ｃｍ２のＬＡ平板（１００μｇ／ｍｌのカナマイシン＋１％グルコース）に広げ、３７℃で一晩インキュベーションした。
【０１５５】
コロニー採取
合計で１１５２個のコロニーを、Ｇｅｎｅｔｉｘ“Ｑ−ｂｏｔ”コロニー採取システムを使用して、大きいＬＡ平板から、選別物あたり３つの３８４ウエルマイクロタイタープレート（合計で９個のプレート）に、それぞれの選別物（ＣＤ２４、ＣＤ１３０およびＨＥＲ２）から採取した。
１．ＬＢ培地（２０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１％のグルコース）を混合する。
２．プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｆｌａｔ  ３８４ウエル、７８１１０１）を培地で満たす（６０μｌ／ウエル）。
３．コロニーを、Ｑ−Ｂｏｔをプロトコルに従って用いて採取する。
【０１５６】
３８４ウエル形式におけるクローンの発現
１．発現用プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｆｌａｔ  ３８４ウエル、７８１１０１）を、カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を含む培地（５０μｌ／ウエル）で満たす。
２．発現用プレートに、マスタープレートから５μｌ／ウエルを接種する。
３．発現用プレートを、３７℃、６００ｒｐｍで３．５時間インキュベーションする。
４．ｓｃＦｖの産生を、カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）および２．５ｍＭのＩＰＴＧを含む１０μｌ／ウエルの培地により誘導する。
５．発現用プレートを３７℃で１０時間インキュベーションする（６００ｒｐｍ）。
６．発現用プレートを＋４℃で貯蔵する。
【０１５７】
クローン（３８４ウエル）のスクリーニング
材料：
ＣＤ２４−ＧＳＴ（０．１１ｍｇ／ｍｌ）、Ａｂｎｏｖａ、カタログ番号Ｈ０００００９４３−Ｈ０１
ＨＥＲ−２−Ｆｃ（０．１ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳにて）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１１２９−ＥＲ
ＣＤ１３０（０．２ｍｇ／ｍｌ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２２８−ＧＰ
ヒトＩｇＧ（６．２ｍｇ／ｍｌ）、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ２５１１
抗Ｈｉｓ−ＨＲＰ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ０５０Ｈ
抗ＦＬＡＧ−ＡＰ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ９４６９
サカナゼラチン、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ７７６５
Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３７０６９
Ｔｒｏｐｉｘ  ＣＤＰ  Ｓｔａｒ  Ｅｍｅｒａｌｄ  ＩＩ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｔ２３８８Ｃ
【０１５８】
手順：
１日目  被覆
１．プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ３８４ウエルプレート（白色）、ＨＢ７８１０７４）を、０．１Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）に希釈された下記により被覆する（５０μｌ／ウエル）：
ＣＤ２４（０．４ｐｍｏｌｅ／ウエル）
ＨＥＲ２（０．８ｐｍｏｌｅ／ウエル）
ＣＤ１３０（０．９ｐｍｏｌｅ／ウエル）
ｈＩｇＧ（非標的）（１ｐｍｏｌｅ／ウエル）。
プレートを＋４℃で一晩インキュベーションする。
【０１５９】
２日目
２．プレートを１×ＰＢＳ／０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０により３回洗浄する。
３．ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０＋０．４５％サカナゼラチンを加える（４０μｌ／ウエル）。
４．発現させたｓｃＦｖ（１０μｌ／ウエル）を加え、プレートを室温で１時間インキュベーションする。
５．プレートを上記のように洗浄する。
６．ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０＋０．４５％サカナゼラチンで希釈された二次抗体、すなわち、１：４０００で希釈されたα−ＨＩＳ−ＨＲＰを、ＣＤ２４被覆プレート、ＣＤ１３０被覆プレートおよびｈＩｇＧ被覆プレートに、１：２５０００で希釈されたα−ＦＬＡＧ−ＡＰをＨＥＲ２被覆プレートおよびｈＩｇＧ被覆プレートに加え（５０μｌ／ウエル）、プレートを室温で１時間インキュベーションする。注意：ｈＩｇＧについては２倍のプレート。
７．プレートを上記のように洗浄する。プレートを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ９．８）により３回洗浄する。
８．基質を加える；
抗Ｈｉｓ−ＨＲＰを有するプレートには、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ９．８）において１：２０で希釈されるＰｉｅｒｃｅ  Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏを加え（５０μｌ／ウエル）、プレートを室温で１０分間インキュベーションする。
抗Ｆｌａｇを有するプレートには、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ９．８）において１：２０で希釈されるＴｒｏｐｉｘ  ＣＤＰ  Ｓｔａｒ  Ｅｍｅｒａｌｄ  ＩＩを加え（５０μｌ／ウエル）、プレートを室温で３０分間インキュベーションする。
９．プレートを読み取る。
【０１６０】
ＩＦＮ−γ刺激後におけるＤＵ１４５の受容体発現のＦＡＣＳ分析
材料
Ｊｕｒｋａｔ細胞
ＤＵ１４５細胞
トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２５３００−０５４）
ｒｈ−ＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２８５−ＩＦ）
マウスＩｇＧブロック（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号０１５−０００−００２）
ＦＡＣＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０４０、ＣａおよびＭｇを含まないＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ）。
Ｚｅｎｏｎ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７  ヒトＩｇＧ標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｚ２５４０８）
【０１６１】
ＩＮＦ−γ刺激
ＤＵ１４５細胞を２５０ＩＥのＩＮＦ−γにより２４時間刺激した。細胞を、細胞解離緩衝液を用いて集めた。
【０１６２】
方法  フローサイトメーター
細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、ブロッキング処理を、氷上で１０分間、ＦＡＣＳ緩衝液における５０μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧを使用して行った。一方で、抗体を、製造者の説明書に従って、Ｚｅｎｏｎ  ＡＦ６４７により標識した。
【０１６３】
５０μｌの細胞懸濁物（およそ５００，０００個の細胞）をＦＡＣＳチューブに移し、５０μｌの標識抗体を加えた後、氷上で１時間、インキュベーションした。
【０１６４】
その後、ＦＡＣＳ緩衝液を使用して、細胞を洗浄し、得られた懸濁物をフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ）で分析した。
【０１６５】
ＩＦＮ−γ刺激後におけるＤＵ１４５の受容体発現のスキャッチャード分析
ＩＮＦ−γ刺激
ＤＵ１４５細胞を２５０ＩＥのＩＮＦ−γにより２４時間刺激した。細胞を、細胞解離緩衝液を用いて集めた。
【０１６６】
スキャッチャード分析
抗体を、遊離型のヨウ素と、酸化剤試薬Ｉｏｄｏｇｅｎ（１，３，４，６−テトラクロロ−３α，６α−ジフェニルグリコルリ、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により予備被覆された試験管とを製造者の説明書に従って使用して１２５Ｉにより標識した。簡単に記載すると、２００μｇの抗体をＰＢＳ中で１０分間標識し、遊離型のヨウ素を、小さい使い捨て脱塩カラム（ＮＡＰ５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して除いた。標識された抗体は、ペーパークロマトグラフィーにより推定される場合、およそ２．５μＣｉ／μｇ抗体の比活性を有し、１％未満の遊離型のヨウ素を含有した。
【０１６７】
０．５×１０６個の細胞を種々の濃度の１２５Ｉ−標識抗体と（氷浴で）２．５時間インキュベーションした。遊離型の非結合性抗体（Ｆ）を、４０％Ｆｉｃｏｌｌクッションによる遠心分離によって、細胞に結合した抗体（Ｂ）から分離し、サンプルをガンマカウンターで分析した。
【表４】
2018154627.tif 000010
【０１６８】
表は、それぞれの発現表面受容体に対して特異的である回収された抗体クローンの数を、配列決定された抗体クローンの数の関数として示す。個々の抗体クローンの受容体特異性を、図６に記載されるように求めた。
【０１６９】
示差的選別された抗体プールに由来する９６個のクローンの類似したスクリーニングにより、高発現の表面受容体ＩＣＡＭ−１に対して特異的である４７個の配列が特定された（表４）。
【０１７０】
本発明者らは次に、高レベル、中間的レベルおよび低レベルでそれぞれ発現される表面受容体に対して特異的である抗体（配列）が、９１個、２５５個または８１３個のランダム採取された抗体クローンの配列決定によって、または、約２９０，０００個のランダム採取された抗体クローンの大規模シーケエンシングの後で特定されるかどうかを問うた。
【０１７１】
ＣＤ５４が、スキャッチャード分析によって、２５０，０００コピー／細胞を有する高発現の表面受容体として特定された（データは示されず）。示差的選別された抗体プール「ＤｎｏｎＴ」に由来する９６個のクローンのスクリーニングにより、ＣＤ５４に対して特異的である４７個のクローンが特定された（表４）。１００，０００コピー／細胞を有するＨＥＲ２は高発現の表面受容体を表し、８，０００コピー／細胞を有するＣＤ２４、および、６，０００コピー／細胞を有するＣＤ１３０は低発現の表面受容体を表す（図４および図５）。
【０１７２】
高発現の表面受容体ＩＣＡＭ−１に対して特異的である抗体（配列）が、すべてのスクリーニングアプローチによって特定された（表４および示されないデータ）。対照的に、低発現の表面受容体に対して特異的である抗体は、８１３個までのランダム採取されたクローンの従来のスクリーニングでは特定されなかった（表４）。際立つことに、また、全く対照的に、低発現のＣＤ２４表面受容体およびＣＤ１３０表面受容体に対して特異的である抗体が大規模シーケエンシングによって特定された。
【０１７３】
高発現、中間的発現および低発現の示差的発現表面受容体についての回収された抗体の特異性に対する、配列決定深さを増大することの影響を下記のように調べた：
【０１７４】
増大するサイズの結合体の３つのランダム選別されたプール（９１個のクローン、２５５個のクローンおよび８１３個のクローン、それぞれ）に由来する抗体クローン配列を求めた。その後、３つすべてのプールにおいて見出されたクローン（「高頻度クローン」）、２つの大きい方のプールにおいてのみ見出されたクローン（「低頻度クローン」）、または、最大のプールにおいてのみ見出されたクローン（「希少クローン」）を、ＦＡＣＳによってＤＵ１４５細胞に対する結合について分析した。
【０１７５】
高頻度クローン、低頻度クローンおよび希少クローンによって標的化される受容体の平均標的発現レベルが、示差的選別された抗体プールにおける存在数の減少とともに低下した（図７）。このことは、配列深さを増大することにより、低下する（より低い）レベルで（非標的細胞に対して）標的細胞において発現される示差的発現表面受容体に対して特異的である抗体の特定がもたらされることを明らかにする。
【０１７６】
実施例３−示差的バイオパンニングのための式の誘導
普遍的な質量作用の法則（ＬＭＡ）を適用して、低発現リガンドおよび／または示差的発現リガンドに対する抗リガンドを多様性の大きいディスプレーライブラリーから単離するために必要となるリガンドの数を計算することができる。
【０１７７】
ＬＭＡは、抗リガンドＡとその標的リガンドＴとの間、および、それらの複合体ＡＴの間における非共有結合性（水素結合、静電力、ファンデルワールス力または疎水性力）の可逆的結合が、
【数４】
2018154627.tif 000011
の平衡相互作用（ただし、平衡解離定数または
【数５】
2018154627.tif 000012
によって与えられることを述べている。
【０１７８】
標的リガンド（Ｔ）に対する同一の特異性を有する抗リガンド（Ａ）の間における平衡相互作用は、下記のように記載することができる：
【数６】
2018154627.tif 000013
ただし
【数７】
2018154627.tif 000014
【０１７９】
総Ａまたは総Ｔは、遊離型および結合型のＡまたはＴの和であることが知られている。すなわち、［Ａ］（総Ａ）＝［ｆＡ］＋［ｂＡ］、および、［Ｔ］（総Ｔ）＝［ｆＴ］＋［ｂＡ］
【０１８０】
したがって、（Ｉ）において、［ｆＡ］を［Ａ］−［ｂＡ］によって、また、［ｆＴ］を［Ｔ］−［ｂＡ］によって置き換えると、
【数８】
2018154627.tif 000015
これは整理すると、下記の式となる：
【数９】
2018154627.tif 000016
【０１８１】
この連立方程式は下記の解を有する：
【数１０】
2018154627.tif 000017
ただし、負の平方根は下記の平方根である：
【数１１】
2018154627.tif 000018
【０１８２】
濃度を粒子数／モルあたりの粒子の数（Ｃ）／単位体積（Ｖ）に代入すると、
【数１２】
2018154627.tif 000019
となり、これは下記の式に簡略化される：
【数１３】
2018154627.tif 000020
式中、
Ａ＝抗リガンドＡの総数
Ｔ＝リガンドＴの総数
Ｖ＝反応体積（リットル）
Ｃ＝アボガドロ定数（６．０２２×１０２３粒子／モル）
【０１８３】
ＬＭＡが、所与の親和性および特異性をそれらのそれぞれの標的リガンドに対して有する種々の抗リガンドの間におけるそれぞれの反応に当てはまることを考えれば、選別プロセスの後における、リガンドに結合した抗リガンドの数を、ＬＭＡおよび式（ＩＩＩ）を適用することによって計算することができる。
【０１８４】
そのうえ、サブトラクターリガンドまたは標的リガンドの集団と会合した抗リガンドの間に何ら質的違いが存在しないならば、すなわち、当該方法の期間中におけるリガンドの物理化学的性質において何ら変化がないならば、平衡状態で標的リガンドに結合している抗リガンドの数は、リガンド全体（サブトラクターリガンドおよび標的リガンド）に対する標的リガンド構築物上の標的リガンドの比率を乗じた結合している抗リガンドの総数に等しいことになる：
【０１８５】
下記の項を導入する：
ＣＰ＝標的リガンド構築物の数
ＣＳ＝サブトラクターリガンド構築物の数
ＴＰ＝ＣＰ上のＴリガンドの数
ＴＳ＝ＣＳ上のＴリガンドの数
【０１８６】
標的構築物およびサブトラクター構築物が混合されるならば、リガンドの総数は下記のようになる：
【数１４】
2018154627.tif 000021
また、平衡状態で陽性構築物に結合している抗リガンド（Ａ）の数（ｂＡＰ）が次式によって与えられる：
【数１５】
2018154627.tif 000022
【０１８７】
そのうえ、式（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）を組み合わせることにより、次式が得られる：
【数１６】
2018154627.tif 000023
【０１８８】
実施例４−リガンド濃度の最適化
実施例１において例示される式は、第１のサブトラクターリガンドおよび第２の標的リガンドの両方の高い濃度を利用することが、低発現および示差的発現リガンドに対する特異性を有する抗リガンドの効率的な回収において、同様にまた、普通に発現されるリガンドに対する特異性を有する抗リガンドの軽減のために役に立つことを示す。
【０１８９】
リガンド濃度をいくつかの手段によって増大させることができる。すべての場合において、リガンド濃度は、リガンドの二次元カップリング（二次元の固相へのカップリング）から、懸濁状態または溶液において遊離状態のリガンドの使用（三次元的）に変わることによって増大する。
【０１９０】
結合が、例えば、細胞表面リガンドなどについては、リガンドがその生来的形態で使用されることに依存している場合、リガンド濃度は、リガンド構築物体積に対するリガンド構築物表面積の比率を増大することによって最大化される。
【０１９１】
例えば、細胞表面抗原が、２次元表面に固定される細胞全体を使用することとは対照的に、懸濁状態で遊離している小さい形質膜小胞の形態で使用される場合がある。これは、懸濁状態または溶液におけるリガンドの安定性を増大させ、したがって、リガンド−抗リガンドの平衡相互作用を促進させるというさらなる利点を有する。
【０１９２】
リガンド供給源が球状（または実質的球状）の形態を有するならば、このことは、数学的には下記の式によって記載される：
【数１７】
2018154627.tif 000024
式中、
ＡＰ＝球面積
ＶＰ＝球体積
すなわち、球の半径が小さいほど、リガンド／体積の比率が大きくなり、かつ、リガンドがより粒子状（懸濁物様）になる。
【０１９３】
実施例５−好ましい実施形態
好ましい局面において、本発明は、それらの生来的形態での細胞表面抗原に対する特異性を有し、かつ、それらの性質（タンパク質、炭水化物、脂質、複合体）に依存しない抗リガンドを単離するために使用される。加えて、結合する抗原は、別の細胞タイプ（例えば、形質転換されたガン細胞、ウイルス／細菌／寄生虫／真菌感染細胞、または、コントロール細胞に対して他のアゴニスト刺激細胞もしくは感染活性化細胞）と比較して１つの細胞タイプにおいてアップレギュレーションされるか、または特有に発現される抗原である。
【０１９４】
抗体由来の抗リガンド（例えば、ｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＦｖをコードする抗リガンド）の選別ために利用されるとき、本方法は、スクリーニングプロセスと同時に、その生来的形態での標的抗原と細胞膜において反応する治療用の抗体候補物をもたらす。
【０１９５】
抗原のそのような大きい濃度が必要となるので、抗原は、平衡反応を損なわない形態で使用される。したがって、抗原は、最小限の空間を占め、かつ、粘度および剪断力における増大をほとんど与えない形態で使用される。
【０１９６】
例えば、細胞表面抗原に対する抗リガンドが探索されるとき、標的細胞全体と、非常に多様化された分子抗リガンドライブラリーのメンバーと混合される過剰なサブトラクター細胞膜を利用する競合バイオパンニングプロセスが使用される場合があり、その後に、Ｆｉｃｏｌｌ勾配またはＰｅｒｃｏｌｌ／ウシ血清アルブミン勾配での密度分離、ならびに、標的細胞と、標的細胞のアップレギュレーションされた抗原および標的細胞特有の抗原に対して特異的である抗リガンドとの選択的単離が続く。
【０１９７】
この方法論において、標的リガンド（抗原）集団は細胞全体の形態であり（高密度）、サブトラクターリガンド（抗原）は形質膜小胞または徐核細胞の形態である（低密度）。
【０１９８】
標的抗原集団およびサブトラクター抗原集団が、本明細書中に記載される式に基づく制御された様式で、非常に多様な分子ライブラリーのメンバーと混合される。
【０１９９】
例えば、５×１０７個の標的細胞全体が、１×１０１０個のサブトラクター細胞の細胞膜小胞と混合され、また、非常に多様化されたライブラリーに由来するメンバーと、２００の抗リガンド特異的なコピー数（これは、純粋な抗原に対して選別するとき、典型的には、Ｋｄ＝１０−８Ｍの抗リガンドを生じさせる）で混合され、これにより、標的細胞あたり１０，０００個のような低い密度で発現される抗原を含めて、１０倍以上アップレギュレーションされた抗原に対して特異的である抗リガンドを単離することが予想され得る。
【０２００】
反応液が、平衡に達するようにインキュベーションされる。競合的バイオパンニングの後、標的集団に結合したライブラリーメンバーが、非結合の抗リガンド、および、コントロールのサブトラクター抗原に結合したそのような抗リガンドから、密度遠心分離によって分離され、これにより、調査集団の中に存在する高発現の抗原に対して特異的であるファージの富化がもたらされる。
【０２０１】
所望される標的抗原発現の方がサブトラクター集団において大きい場合、プロセスは逆にされ、その結果、サブトラクターリガンド集団が標的リガンド集団になり、また、逆に、標的リガンド集団がサブトラクターリガンド集団になる。
【０２０２】
示差的に発現され、かつ、特有のリガンドに対する特異性を有する抗リガンドを生じさせることのほかに、密度勾配での種々の密度分離手段の使用により、下記を含めていくつかの利点が提供される：
・非結合の抗リガンド、および、コントロール集団に見出されるリガンドに対する特異性を有する抗リガンドに由来する陽性リガンドに対して複合体化される抗リガンドの物理的かつ空間的な分離。
・Ｆｉｃｏｌｌ洗浄は剪断力を増大させる。したがって、そのような洗浄はより効率的であり、洗浄繰り返し（パンニングラウンド）がそれほど必要とされない；また、目的とする特異的に結合した（より高親和性の）抗リガンドの最小限の解離が存在する。
・細胞表面リガンドの形態／立体配座および／または組成を変化させるかもしれない細胞のタグ化または化学的修飾を必要としない（ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別機）またはＭＡＣＳ（磁気活性化細胞選別機）に基づく競合的バイオパンニングを比較のこと）。
【０２０３】
実施例６−分離手段としてのすべての膜小胞
細胞全体を、より高密度の媒体においてもたらされる膜小胞によって置き換えることができ、これにより、一層より高濃度のリガンドを、平衡反応を損なうことなく利用することが可能になる。
【０２０４】
実施例７−リガンドのアップレギュレーション／ダウンレギュレーションに対する刺激の影響の試験
本発明のさらなる実施形態が、調査対象の細胞集団の中におけるほんの少数の細胞において非常に低い密度で発現される細胞リガンドに対する特異性を有する抗リガンドを単離するために使用される場合がある。
【０２０５】
例えば、ある種の刺激が、血液に存在する未知の細胞亜種団に存在する細胞表面抗原のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを誘引すると疑われる場合がある。
【０２０６】
この刺激にさらされた全血に由来する細胞が、当該刺激および上記のバイオパンニング反応と類似する競合的バイオパンニング反応にさらされる前の全血に由来する形質膜と混合される場合がある。
【０２０７】
実施例８−スクリーニング方法の診断的使用
本発明のさらなる実施例は、生物学的サンプル（例えば、血漿、尿、脳脊髄液）において異なる存在量で存在するリガンドに対する抗リガンドが、非常に多様化された分子ライブラリーから単離されることを可能にする。そのような抗リガンドは続いて、例えば、タンパク質発現分析および潜在的バイオマーカーの特定のために使用される場合がある。
【０２０８】
十分に高濃度のリガンドが使用されるならば、本発明の方法は、２つの異なるサンプルにおけるタンパク質組成を比較するとき、アップレギュレーションされたリガンドまたは特有なリガンドに対する抗リガンドの選択的単離を可能にする。このことは究極的には、別の集団と比較して１つの集団においてより多量に存在するリガンドに対して特異的である抗リガンドの単離を、陽性リガンド集団の中における相対的なリガンド濃度に依存しない様式で可能にする。
【０２０９】
後者を達成するために必要とされるリガンドの極端な濃度のために、リガンドは好ましくは、懸濁状態または溶液で使用されるべきである。例えば、標的集団のリガンドを分割し、いくつかの異なる位置においてタグ化して、関連するリガンドの破壊および根絶を最小限に抑えることができ、一方、サブトラクター集団のリガンドは、タグ化することなく、または、模擬処理されて使用することができる。陽性リガンド集団のタグ化により、陽性集団のリガンドと、陽性集団のリガンドに結合した結合体とのその後の回収のための手段が、例えば、カウンタータグ化された磁気ビーズと複合体されるタグ化リガンドの使用によるだけでもたらされる。
【０２１０】
本方法の適用の１つが、血漿サンプルを、ある特定の病気を有する患者の集団からプールし、コントロール集団からの血漿サンプルと比較することであろう。この場合、患者の血漿サンプルは分割およびタグ化されるであろうし、コントロール集団はタグ化されないであろう。
【０２１１】
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【図１】
2018154627.tif 000028
【図２】
2018154627.tif 000029
【図３】
2018154627.tif 000030
【図４】
2018154627.tif 000031
【図５Ａ】
2018154627.tif 000032
【図５Ｂ】
2018154627.tif 000033
【図６】
2018154627.tif 000034
【図７】
2018154627.tif 000035
【図８】
2018154627.tif 000036
【図９】
2018154627.tif 000037
【手続補正書】
【提出日】平成30年5月14日(2018.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの示差的発現標的リガンドに対する少なくとも１つの抗リガンドを単離する方法であって、
前記示差的発現標的リガンドが低発現リガンドであり、
前記低発現リガンドが細胞あたり２０，０００コピー以下で発現されるリガンドであり、下記の工程：
（ａ）示差的バイオパンニングを、少なくとも１つの抗リガンドを単離するように抗リガ
ンドのライブラリーに対して行う工程；
（ｂ）ハイスループット配列決定を工程（ａ）の期間中に単離される抗リガンドに対して
行う工程；および
（ｃ）確認スクリーニングを前記示差的発現リガンドに対する前記抗リガンドの特異的結
合について行う工程
を含み、
前記示差的バイオパンニング工程が、下記のサブ工程：
（ｉ）抗リガンドのライブラリーを提供するサブ工程；
（ｉｉ）サブトラクターリガンド構築物に固定されるか、または組み込まれるリガンドを
含むリガンドの第１の集団を提供するサブ工程；
（ｉｉｉ）標的リガンド構築物に固定されるか、または組み込まれる、工程（ｉｉ）と同
じリガンドを含むリガンドの第２の集団を提供するサブ工程；
（ｉｖ）前記集団における前記サブトラクターリガンド構築物および前記標的リガンド構
築物の量を、示差的発現標的リガンドに対する抗リガンドの単離を可能にするために、普
遍的な質量作用の法則
【数１】
2018154627.tif 000038
（式中：
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは反応における関与物（反応物および生成物）であり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄは、釣り合った化学式のために必要な係数である）
から導かれる１つまたは複数の式を使用して求めるサブ工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）において求められる前記量のサブトラクターリガンド構築物を提供す
るサブ工程；
（ｖｉ）工程（ｉｖ）において求められる前記量の標的リガンド構築物を提供するサブ工
程；
（ｖｉｉ）前記標的リガンド構築物に結合する抗リガンドを、サブトラクターリガンド構
築物に結合する抗リガンドから単離するための分離手段を提供するサブ工程；
（ｖｉｉｉ）（ｉ）の前記ライブラリーを、リガンドに対する抗リガンドの結合を可能に
するために、（ｖ）および（ｖｉ）によって提供される前記リガンド構築物にさらすサブ
工程；および
（ｉｘ）前記分離手段を使用して、前記標的リガンド構築物に固定されるか、または組み
込まれる前記リガンドに結合する抗リガンドを単離するサブ工程
を含む方法。
【請求項２】
前記標的リガンドが細胞表面抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞表面抗原が、生来的形態である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞表面抗原が、細胞表面受容体である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記ハイスループット配列決定工程が、４５４シーケンシング法、イルミナ法、ＳＯＬｉＤ法またはＨｅｌｉｃｏｓシステムによって行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記確認スクリーニング工程が、フローサイトメトリー、ＦＭＡＴ、ＥＬＩＳＡ、ＭＳＤまたはＣＢＡによって行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドが、前記標的構築物または前記サブトラクター構築物のどちらか一方において発現されない、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗リガンドを前記リガンドから遊離させるさらなる工程を含む、請求項１または７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉｉ）〜工程（ｉｘ）が、複数の異なるリガンドに対する複数の抗リガンドを単離するために並行して行われる、請求項１、７または８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｉｉ）〜工程（ｉｘ）が１回または複数回繰り返される、請求項１または７〜９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サブトラクター構築物または標的構築物の一方の量が前記サブトラクター構築物または標的構築物の他方の量を越えて提供される、請求項１または７〜１０に記載の方法。
【請求項１２】
リガンドの過剰が１０倍〜１０００倍の間であり、または、２倍〜１０倍の間であり、または、１０００倍〜１，０００，０００倍の間である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｉｖ）の前記式が、
【数２】
2018154627.tif 000039
（式中、
ｂＡ＝結合した抗リガンド
Ａ＝抗リガンドの総数
Ｔ＝リガンドの総数
Ｃ＝アボガドロ定数（６．０２２×１０２３粒子／モル）
Ｖ＝反応体積（リットル）Ｋｄ＝平衡解離定数）
または
【数３】
2018154627.tif 000040
（式中、
ｂＡｐ＝結合した抗リガンド
Ｔｐ＝Ｃｐ上のリガンドの数
Ｔｓ＝Ｃｓ上のリガンドの数
Ｃｐ＝標的リガンド構築物の数
Ｃｓ＝サブトラクターリガンド構築物の数
Ａ＝抗リガンドの総数
Ｔ＝リガンドの総数
Ｃ＝アボガドロ定数（６．０２２×１０２３  粒子／モル）
Ｖ＝反応体積（リットル）
Ｋｄ＝平衡解離定数）
のいずれかである、請求項１または７〜１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記分離手段が、固体担体、細胞膜および／またはその一部分、合成膜、ビーズ、化学的タグおよび遊離型リガンドの少なくとも１つから選択される、請求項１または７〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記サブトラクター構築物および標的構築物の前記分離手段が異なる密度を有する、請求項１または７〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記サブトラクター構築物の前記分離手段が膜小胞または完全な細胞膜である、請求項１または７〜１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｉｘ）が、密度遠心分離、固体担体隔離、磁気ビーズ隔離、化学的タグ結合および水相分配の少なくとも１つによって行われる、請求項１または７〜１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ａ）の前記ライブラリーが、抗リガンドを呈示する複数のライブラリーメンバーを含むディスプレーライブラリーである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ライブラリーがファージディスプレーライブラリーである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記リガンドが、抗原；受容体リガンド；ならびに、炭水化物、タンパク質、ペプチド、脂質、ポリヌクレオチド、無機分子およびコンジュゲート化分子からの少なくとも１つを含む酵素標的から選択される少なくとも１つである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗リガンドライブラリーが、抗体、および、その抗原結合性の変化体、誘導体またはフラグメント；操作された可変表面を有する足場分子；受容体；ならびに酵素からの少なくとも１つから構築される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記リガンドおよびその分離手段を、前記リガンド構築物における標的リガンドの発現に影響を及ぼす刺激にさらすさらなる工程を含む、請求項１または７〜２１に記載の方法。
【請求項２３】
所望される特性を有する抗リガンドを、請求項１〜２２のいずれか１項に記載される方法によって特定した後、前記抗リガンドを医薬的に許容されるキャリアに加えることを含む、医薬組成物を調製するための方法。