(57)【要約】【課題】本発明は、癌での解糖系代謝を特異的に制御できるような選択的制御物質や、老化を抑制したい細胞、組織の解糖系代謝を特異的に制御できるような選択的制御物質、すなわち解糖系代謝制御物質を見出すことができる、新規なスクリーニング方法を提供することを目的とする。また、このスクリーニング方法により見出された解糖系代謝制御物質を提供することも目的とする。【解決手段】本発明は、被検物質が、ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合を、阻害又は促進する場合に、上記被検物質が解糖系代謝を制御する物質であると評価する、解糖系代謝制御物質のスクリーニング方法である。また、具体的には、本発明のスクリーニング方法は、被検物質の存在下及び非存在下でＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合量を測定し、それぞれの場合における結合量の比から、上記被検物質の解糖系代謝制御活性の有無を判定することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質が、ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合を、阻害又は促進する場合に、上記被検物質が解糖系代謝を制御する物質であると評価する、解糖系代謝制御物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
被検物質の存在下及び非存在下でＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合量を測定し、それぞれの場合における結合量の比から、上記被検物質の解糖系代謝制御活性の有無を判定することを特徴とする、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
以下の工程を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法；
１）ＰＧＡＭ及びＣｈｋ１を含む試料に被検物質を加えた場合のＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合量を測定する工程、
２）上記被検物質を加えていない場合のＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合量を測定する工程及び
３）上記工程１）による測定値と、上記工程２）による測定値とを比較する工程。
【請求項４】
ＰＧＡＭ及びＣｈｋ１が、互いに結合し得るタグで標識されていることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
上記解糖系代謝制御物質が、抗がん剤として用いられる、請求項１から４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
上記解糖系制御物質が、抗老化用組成物に用いられる、請求項１から４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合を阻害又は促進する物質を含む、解糖系代謝制御剤。
【請求項８】
ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合を阻害又は促進する物質が、
ｉ）ＰＧＡＭ遺伝子若しくはＣｈｋ１遺伝子に対するアンチセンス核酸又はｓｉＲＮＡ、ｉｉ）ＰＧＡＭ又はＣｈｋ１に特異的な抗体、及び
ｉｉｉ）ナトリン
からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項７に記載の解糖系代謝制御剤。
【請求項９】
抗がん剤として用いられる、請求項７又は８に記載の解糖系代謝制御剤。
【請求項１０】
抗老化用組成物に用いられる、請求項７又は８に記載の解糖系代謝制御剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、解糖系代謝制御物質のスクリーニング方法及び解糖系代謝制御剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
解糖系代謝とは、細胞が取り込んだグルコースを分解することにより、ＡＴＰという高エネルギー分子を合成する代謝過程の総称である。解糖系代謝には、その中間産物であるピルビン酸から乳酸を合成する過程と、ミトコンドリアでの酸化的リン酸化へと進む過程の、二通りの経路が存在する。前者は、酸素呼吸を必要しないので嫌気的解糖系代謝と呼ばれ、後者はミトコンドリア酸素呼吸によりＡＴＰを合成するので好気的解糖系代謝と呼ばれる。この解糖系代謝は、ほとんどの通常細胞においてエネルギー代謝の重要な役割を担っており、個体が生きていく上で不可欠である。そのため、解糖系代謝の異常は、ヒトの疾患に密接に関連する。
【０００３】
解糖系代謝が低下すると、神経変性疾患、心機能低下、糖尿病、筋肉萎縮、貧血等の原因となる一方、解糖系代謝が亢進する病態もいくつか知られている。解糖系代謝が亢進する病態としては、例えば癌、虚血（血流低下）、局所炎症等が挙げられるが、特に多くの癌細胞では、解糖系代謝が亢進しており（ワールブルグ効果；非特許文献１参照）、癌の細胞生物学的な特徴の一つとして知られている。実際、現在の臨床現場では、この性質を利用して、ＦＤＧ−ＰＥＴが、患者体内の腫瘍の大きさや転移の有無の評価に有用であり、広く普及している。
【０００４】
一方、細胞老化研究では、１９９７年頃より、若い細胞でも酸化ストレスやＤＮＡ障害等の様々なストレスにより老化することが判明し、このような老化は「ストレス老化」の名前で知られるようになった。このストレス老化を誘導するようなストレスを、総称して「ストレス老化シグナル」と呼ぶ場合もある。そして、癌細胞とは、「ストレス老化シグナル」に不応性で、ストレス老化しにくい細胞であると再認識されるようになった。本発明者らは、ストレス老化研究に２００１年頃より従事し、解糖系代謝が亢進すると、ストレス老化しにくくなることを報告した（非特許文献２参照）。すなわち、解糖系代謝亢進が、ストレス老化シグナルへの応答性を低下させることにより、細胞癌化を引き起こす原因の一つとなり得る事を見出した。また、本発明者らはその主な理由の一つがミトコンドリア由来の酸化ストレスの減弱であること（非特許文献３参照）、逆に解糖系代謝が低下すると細胞老化が引き起こされることも見出した（非特許文献２参照）。よって、細胞が「老化」から「癌化」へ、又は「癌化」から「老化」へと転換する重要因子が、解糖系代謝の亢進、低下であるという結論が導き出された。
【０００５】
上記のような細胞老化と癌化の接点を担う解糖系代謝酵素として、本発明者らはホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ）を見出した（非特許文献２参照）。解糖系代謝経路は１０個の解糖系酵素の順次反応よりなるが、ＰＧＡＭはその８番目の酵素として、３−Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ（３ＰＧ）から２−Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ（２ＰＧ）への変換反応を触媒する。本発明者らは細胞にＰＧＡＭを強発現させることにより、解糖系亢進と酸化ストレス減弱効果が誘導され細胞は老化しにくくなる一方、ＰＧＡＭを失活するとストレス老化が誘導されることを見出した（非特許文献２参照）。
【０００６】
従来の解釈では、解糖系代謝経路の律速酵素としては、アロステリックな制御を受けるＰＦＫやＧＡＰＤＨが知られており、ＰＧＡＭは律速酵素ではないと考えられていた。そのため、ＰＧＡＭの解糖系代謝における重要性は未知のままだった。さらに低酸素下、即ちミトコンドリア酸素呼吸のできない環境で解糖系代謝を亢進させる転写因子としてＨＩＦ−１が報告されていたが、ＨＩＦ−１ノックアウト細胞での観察において、低酸素下でもＨＩＦ−１の制御を受けない唯一例外の解糖系酵素がＰＧＡＭであることが明らかにされている。しかし、このＰＧＡＭの上流因子については謎のままだった。最近、本発明者らはＰＧＡＭの上流制御機構の解明に取り組み、ストレス老化シグナル活性化により、ＰＧＡＭのユビキチン化依存性たんぱく分解が促進されることを見出した。ＰＧＡＭのユビキチン化を担うユビキチンリガーゼ酵素は、発癌遺伝子Ｍｄｍ２であることも見出した（非特許文献４参照）。よって、ＰＧＡＭが転写因子ＨＩＦ−１で制御されない理由は、転写後制御（この場合はユビキチン化）がより重要であることにあるという見解に達した。同時に、ＰＧＡＭはストレスによりユビキチン化を受けやすい不安定な蛋白であり、ＰＧＡＭタンパク量の増減が解糖系代謝全体に影響しうる可能性も示唆された。実際、ＰＧＡＭがユビキチン化を受けにくい変異体を作製すると、解糖系代謝が亢進しやすくなり、発癌しやすいことも明らかとなった（非特許文献４参照）。以上のように、従来は知られていなかった解糖系酵素ＰＧＡＭの老化・癌化における重要性を、本発明者らは見出してきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｗａｒｂｕｒｇ  Ｏ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９５６，１２４：ｐ.２６９−２７０
【非特許文献２】Ｈ．Ｋｏｎｄｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，６５（１），ｐ．１７７−１８５
【非特許文献３】ｈ．Ｋｏｎｄｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ，２００７，９（３），ｐ．２９３−２９９
【非特許文献４】Ｔ．Ｍｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２０１４，２０４（５），ｐ．７２９−７４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上のように、解糖系代謝は古くより癌での亢進が知られており、抗癌剤の標的の可能性が指摘されていた。実際、解糖系阻害剤は癌培養細胞の多くを増殖抑制できるが、現実的な治療応用はまだ道半ばである。その理由は、解糖系代謝は正常細胞でも生理的必須機能を担っており、単なる代謝阻害は重篤な副作用を引き起こす危険性があり、癌治療としての有効性の確立が難しいことにある。解糖系をターゲットとする癌治療では、この問題の克服が必須であり、例えば正常細胞での解糖系代謝はできる限り温存しつつ、癌での解糖系代謝を特異的に阻害できるような選択的阻害剤の発見が望まれる。
【０００９】
そこで、本発明は、癌での解糖系代謝を特異的に制御できるような選択的制御物質や、老化を抑制したい細胞、組織の解糖系代謝を特異的に制御できるような選択的制御物質、即ち解糖系代謝制御物質を見出すことができる、新規なスクリーニング方法を提供することを目的とする。また、このスクリーニング方法によって、癌での解糖系代謝を特異的に阻害する物質や、細胞老化を抑制したい細胞、組織においては抗老化効果（アンチエイジング効果）を奏する物質等の、新規の解糖系代謝制御物質を見出すことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、細胞内でＰＧＡＭとＣｈｋ１とが結合すること、そしてこれらの物理的な結合が解糖系代謝において重要な役割を果たすこと、これらの物理的結合を制御することで解糖系を制御することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は、以下に示すとおりである。
［１］被検物質が、ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合を、阻害又は促進する場合に、上記被検物質が解糖系代謝を制御する物質であると評価する、解糖系代謝制御物質のスクリーニング方法。
［２］被検物質の存在下及び非存在下でＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合量を測定し、それぞれの場合における結合量の比から、上記被検物質の解糖系代謝制御活性の有無を判定することを特徴とする、［１］に記載のスクリーニング方法。
［３］以下の工程を含むことを特徴とする、［１］又は［２］に記載のスクリーニング方法；
１）ＰＧＡＭ及びＣｈｋ１を含む試料に被検物質を加えた場合のＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合量を測定する工程、
２）上記被検物質を加えていない場合のＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合量を測定する工程及び
３）上記工程１）による測定値と、上記工程２）による測定値とを比較する工程。
［４］ＰＧＡＭ及びＣｈｋ１が、互いに結合し得るタグで標識されていることを特徴とする、［１］から［３］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［５］上記解糖系代謝制御物質が、抗がん剤として用いられる、［１］から［４］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［６］上記解糖系制御物質が、抗老化用組成物に用いられる、［１］から［４］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［７］ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合を阻害又は促進する物質を含む、解糖系代謝制御剤。
［８］ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合を阻害又は促進する物質が、
ｉ）ＰＧＡＭ遺伝子若しくはＣｈｋ１遺伝子に対するアンチセンス核酸又はｓｉＲＮＡ、ｉｉ）ＰＧＡＭ又はＣｈｋ１に特異的な抗体、及び
ｉｉｉ）ナトリン
からなる群より選択される少なくとも１種である、［７］に記載の解糖系代謝制御剤。
［９］抗がん剤として用いられる、［７］又は［８］に記載の解糖系代謝制御剤。
［１０］抗老化用組成物に用いられる、［７］又は［８］に記載の解糖系代謝制御剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の解糖系代謝制御物質のスクリーニング方法は、本発明者らが、細胞内でＰＧＡＭとＣｈｋ１とが結合すること、そしてこれらの結合が解糖系代謝において重要な役割を果たすことを最初に見出したことによって、可能となったものである。このＰＧＡＭとＣｈｋ１による協調的解糖系制御機構には、ＰＧＡＭの酵素活性は関与せず、物理的な結合が重要である。本発明においては、このような解糖系酵素活性とは別のＰＧＡＭの機能を標的とすることで、本来のＰＧＡＭ活性は温存でき、ＰＧＡＭ−Ｃｈｋ１結合制御のみの効果により、解糖系を特異的に阻害できる物質をスクリーニングすることが可能となる。また、この方法によると、解糖系代謝の制御により予防、治療、処置が可能である症状や疾患に有効な物質を見出すことができる。例えば、本発明のスクリーニング方法により見出される解糖系代謝制御物質は、新規の抗がん剤、抗老化用組成物に有効に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＰＧＡＭノックアウトマウスの遺伝子デザインの概略図である。
【図２】図２は、ＰＧＡＭ−ＴＧマウスに対するＩＰＧＴＴ試験の結果を示す図である。
【図３】図３は、ＰＧＡＭヘテロＫＯマウスに対するＩＰＧＴＴ試験の結果を示す図である。
【図４】図４は、ＰＧＡＭヘテロＫＯマウスの皮膚組織における解糖系ｍＲＮＡ発現の低下を示す図である。
【図５】図５は、癌細胞株における解糖系ｍＲＮＡ発現に対する、ＰＧＡＭｓｉＲＮＡ処理の影響を示す図である。
【図６】図６は、ＰＧＡＭ−ＴＧマウスの皮膚での炎症惹起試験の結果を示す図である。
【図７】図７は、ＰＧＡＭ−ＴＧマウスの皮膚での悪性腫瘍惹起試験の結果を示す図である。
【図８】図８は、ＰＧＡＭ−ＴＧマウスの皮膚に形成された悪性腫瘍における解糖系ｍＲＮＡの発現を示す図である。
【図９】図９は、ＰＧＡＭ−ＴＧマウスにおけるリン酸化ｐ５３を示した図である。
【図１０】図１０は、ＰＧＡＭとＣｈｋ１とが物理的に結合することを示した図である。
【図１１】図１１は、Ｃｈｋ１不活性化又は活性化の解糖系ｍＲＮＡ発現に対する影響を示した図である。
【図１２】図１２は、ＰＧＡＭのプロテインフォスフォターゼ活性について解析した結果を示す図である。
【図１３】図１３は、ＰＧＡＭ−Ｒ９０Ｗ変異ＴＧマウスにおけるＣｈｋ１による解糖系亢進効果を示す図である。
【図１４】図１４は、ＰＧＡＭタンパクにおけるＣｈｋ１結合部位、Ｍｄｍ２結合部位を模式的に示す図である。
【図１５】図１５は、ＰＧＡＭとＣｈｋ１の結合に対するナトリンの阻害効果を示す図である。
【図１６】図１６は、癌細胞株Ｈ１２９９のナトリン処理による解糖系ｍＲＮＡの発現抑制効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の解糖系代謝制御物質のスクリーニング方法及び解糖系代謝制御剤について詳細に説明する。
【００１４】
＜解糖系代謝制御物質のスクリーニング方法＞
本発明の解糖系代謝制御物質のスクリーニング方法は、被検物質が、ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合を、阻害又は促進する場合に、上記被検物質が解糖系代謝を制御する物質であると評価することを特徴とする。本発明は、細胞内でＰＧＡＭとＣｈｋ１とが結合すること、そしてこれらの結合が解糖系代謝において重要な役割を果たすことを本発明者らが最初に見出したことによって、可能となったものである。
【００１５】
本発明においてＰＧＡＭとは、ホスホグリセリン酸ムターゼという、解糖系代謝経路における１０個の解糖系酵素の順次反応のうち、その８番目の反応を担う酵素であり、３−Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ（３ＰＧ）から２−Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ（２ＰＧ）への変換反応を触媒する酵素のことをいう。ＰＧＡＭは、細胞の老化と癌化の接点を担う。ＰＧＡＭにはＰＧＡＭ１とＰＧＡＭ２の二つのアイソフォームが存在する。ＰＧＡＭ１とＰＧＡＭ２は組織発現パターンに違いが見られるものの、アミノ酸配列上高い相同性を有しており、機能や酵素活性は同等であると考えられる。ヒトＰＧＡＭ１、ＰＧＡＭ２のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１、配列番号２として、ｃＤＮＡ配列はそれぞれ配列番号３、配列番号４として配列表に示した。
【００１６】
本発明においてＣｈｋ１とは、セリンスレオニンタンパク質キナーゼであり、細胞周期のＧ２期でＤＮＡ損傷チェックポイントの活性化において役割を担うチェックポイントキナーゼである。Ｃｈｋ１は、本発明者らによって解糖系代謝においても重要な役割を担っていることが見出された。ヒトＣｈｋ１のアミノ酸配列は配列番号５として、ｃＤＮＡ配列は配列番号６として配列表に示した。
【００１７】
本発明における解糖系代謝とは、細胞が取り込んだグルコースを分解することにより、ＡＴＰを合成する代謝過程の総称である。解糖系代謝には、グルコースをその中間産物であるピルビン酸に分解し、乳酸を合成する経路と、ミトコンドリアでの酸化的リン酸化へと進む経路の、二通りの経路が存在する。前者は、酸素呼吸を必要しないので嫌気的解糖系代謝と呼ばれ、後者はミトコンドリア酸素呼吸によりＡＴＰを合成するので好気的解糖系代謝と呼ばれる。この解糖系代謝は、ほとんどの通常細胞においてエネルギー代謝の重要な役割を担っており、個体が生きていく上で不可欠である。
【００１８】
本発明における解糖系代謝制御物質とは、解糖系代謝を抑制又は亢進する物質のことをいう。解糖系代謝の過程でＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合が重要な役割を担っていることが、本発明者らの研究によって見出されたが、本発明における解糖系代謝制御物質は、特にこのＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合に影響を与える物質をいう。本発明における解糖系代謝制御物質は、ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合を抑制・阻害するものであってもよいし、亢進するものであってもよい。本発明における解糖系代謝制御物質は、ＰＧＡＭ及び／又はＣｈｋ１自体に結合してＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合に影響を与える物質であってもよいし、ＰＧＡＭ及び／又はＣｈｋ１の発現に影響を与えることによってＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合を制御する物質であってもよい。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法は、具体的には、被検物質の存在下及び非存在下でＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合量を測定し、両結合量の比から、上記被検物質の解糖系代謝制御活性の有無を判定することを特徴とする。このような本発明のスクリーニング方法は、以下の工程１）〜３）を含むことが好ましい。
【００２０】
１）ＰＧＡＭ及びＣｈｋ１を含む試料に被検物質を加えた場合のＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合量を測定する工程
２）上記被検物質を加えていない場合のＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合量を測定する工程
３）上記工程１）による測定値と、上記工程２）による測定値とを比較する工程
【００２１】
本発明のスクリーニング方法の工程１）においては、まずＰＧＡＭ及びＣｈｋ１を含む試料に被験物質を加えることにより、ＰＧＡＭ及び／又はＣｈｋ１に被験物質を接触させる。
【００２２】
本発明のスクリーニング方法に使用されるＰＧＡＭ及びＣｈｋ１は上述の通りである。本発明のスクリーニング方法に使用されるＰＧＡＭ及びＣｈｋ１には、上記の公知のＰＧＡＭ及びＣｈｋ１と機能的に同等なタンパク質も含まれる。このようなタンパク質には、例えば、ＰＧＡＭ及びＣｈｋ１の変異体、アレル、バリアント、ホモログ、ＰＧＡＭ及びＣｈｋ１の部分ペプチド、他のタンパク質との融合タンパク質、タグによって標識されたものなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００２３】
本発明におけるＰＧＡＭ及びＣｈｋ１の変異体としては、上述のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、既述のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることができる。また、上述の塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のＤＮＡよりコードされるタンパク質であって、既述のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、ＰＧＡＭ及びＣｈｋ１のそれぞれの変異体として挙げることができる。
【００２４】
本発明において、変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えば、アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｗ，Ｙ，Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ，Ｄ，Ｎ，Ｃ，Ｅ，Ｑ，Ｇ，Ｈ，Ｋ，Ｓ，Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ，Ｔ，Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ，Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ，Ｎ，Ｅ，Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ，Ｆ，Ｙ，Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸配列による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することは既に知られている。
【００２５】
本発明において機能的に同等とは、対象となるタンパク質が、ＰＧＡＭ又はＣｈｋ１と同等の生物学的機能や生化学的機能を有することを指す。ＰＧＡＭの生物学的機能や生化学的機能としては、解糖系酵素としての機能であり、具体的には、３−Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ（３ＰＧ）から２−Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ（２ＰＧ）への変換反応を触媒する機能を挙げることができる。また、Ｃｈｋ１の生物学的機能や生化学的機能としては、セリンスレオニンタンパク質キナーゼとしての機能を挙げることができる。
【００２６】
目的のタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを調製するために、当業者に良く知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、ＰＧＡＭ又はＣｈｋ１の塩基配列もしくはその一部をプローブとして、またＰＧＡＭ又はＣｈｋ１に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰＧＡＭ又はＣｈｋ１と高い相同性を有するＤＮＡを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やＰＣＲ技術により単離しうるＰＧＡＭ又はＣｈｋ１と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。
【００２７】
本発明のスクリーニング方法に使用されるタグ標識されたＰＧＡＭ及びＣｈｋ１としては、それらに対する抗体や、特異的に結合できるレジン等が存在する物であることが好ましく、例えば、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ等が挙げられる。
【００２８】
本発明のスクリーニング方法に使用されるＰＧＡＭ及びＣｈｋ１の由来となる生物種としては、特定の生物種に限定されるものではない。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、酵母、昆虫等が挙げられる。
【００２９】
本発明のスクリーニング方法に使用されるＰＧＡＭ及びＣｈｋ１の状態としては、特に制限はなく、例えば精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態等であってもよい。
【００３０】
本発明における被験物質は、特に限定されるものではなく、例えば天然化合物、有機化合物、無機化合物、核酸、タンパク質（抗体を含む）、ペプチド等の単一物質；化合物ライブラリー、核酸ライブラリー、ペプチドライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物；細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物又は動物細胞抽出物の抽出物等を挙げることができる。また、本発明における被験物質としては、これらの混合物であってもよい。また、これらの被験物質は必要に応じて標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
【００３１】
また、本発明において接触は、ＰＧＡＭ及びＣｈｋ１の状態に応じて行う。例えば、ＰＧＡＭ及びＣｈｋ１が精製された状態であれば、精製標品に被験物質を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態又は細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液若しくは該細胞抽出液に被験物質を添加することにより、又は実験動物に直接投与することにより行うことができる。被験物質がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターをＰＧＡＭ及びＣｈｋ１が発現している細胞へ導入する、又は該ベクターをＰＧＡＭ及びＣｈｋ１が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母又は動物細胞等を用いた２ハイブリッド法を利用することも可能である。
【００３２】
本発明においては、ＰＧＡＭ及びＣｈｋ１を含む試料に被験物質を加えることにより、ＰＧＡＭ及び／又はＣｈｋ１と被験物質とを接触させてもよい。また、ＰＧＡＭ又はＣｈｋ１のどちらか一方を含む試料に被験物質を加えた後、含んでいなかったもう一方を加えてそれぞれと被験物質とを接触させてもよい。
【００３３】
本発明においては、次に、ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合量を測定する。なお、本発明のスクリーニング方法の工程２）においては、ＰＧＡＭ及びＣｈｋ１を含む試料に被験物質を加えなかった場合のＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合量を測定することとなる。具体的には、被験物質を加えた場合（接触させた場合）と、被験物質を加えなかった場合（接触させなかった場合）のＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合量を測定し、本発明のスクリーニング方法の工程３）において、それらの値を比較する。被験物質を加えた場合に、被験物質を加えなかった場合と比較して、ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合量が増加又は減少していれば、この被験物質はＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合を制御する効果があると判断できる。そして、ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合量を増加させる効果がある被験物質は、解糖系代謝を亢進させる効果があると判定できる。一方、ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合量を減少させる効果がある被験物質は、解糖系代謝を抑制・阻害する効果があると判定できる。
【００３４】
ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合量を測定する方法としては、例えば、具体的に以下のような方法が挙げられる。ＰＧＡＭ２−ＦＬＡＧ及びＣｈｋ１−ｍｙｃ−Ｈｉｓ発現ベクターを共発現させた細胞の蛋白質抽出液から、プロテインＧアガロースにコンジュゲートされたＦＬＡＧタグ抗体により、ＰＧＡＭ２−ＦＬＡＧ蛋白を免疫沈降させる。この時ＰＧＡＭ２−ＦＬＡＧ蛋白に結合して共沈降してくるＣｈｋ１−ｍｙｃ−Ｈｉｓ蛋白をウエスタンブロットにより検出し、定量する。あるいは、同様の蛋白質抽出液からＮｉ−ＮＴＡアガローズビーズにより、Ｃｈｋ１−ｍｙｃ−Ｈｉｓ蛋白を沈降させる。この時Ｃｈｋ１−ｍｙｃ−Ｈｉｓ蛋白に結合して共沈降してくるＰＧＡＭ２−ＦＬＡＧ蛋白をウエスタンブロットにより検出し、定量する。
【００３５】
ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合量を測定する方法としては、上記以外にも例えば、Ｎａｎｏｂｉｔのシステムを利用した以下のような方法が挙げられる。ＮａｎｏｂｉｔではＰＧＡＭとＣｈｋ１にそれぞれルシフェラーゼをベースに作成された発光蛋白質の大サブユニットと小サブユニットをそれぞれタグとして取り付ける。これらのタグは互いに結合し得る構造となっている。それぞれのサブユニットはそれ自体発光しないが、ＰＧＡＭとＣｈｋ１の結合により大サブユニットと小サブユニットが会合し完全な発光蛋白となることで発光シグナルを発する。このときの発光シグナルの強度を測定することで高感度かつ高い定量性をもって結合量を測定することができる。
【００３６】
＜解糖系代謝制御剤＞
本発明における解糖系代謝制御剤は、有効成分として、上述の本発明のスクリーニング方法により見出される解糖系代謝制御物質を含む。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法により見出される解糖系代謝制御物質としては、例えば、
ｉ）ＰＧＡＭ遺伝子若しくはＣｈｋ１遺伝子に対するアンチセンス核酸又はｓｉＲＮＡ、ｉｉ）ＰＧＡＭ又はＣｈｋ１に特異的な抗体、及び
ｉｉｉ）ナトリン等の化合物
が挙げられる。
【００３８】
（ＰＧＡＭ遺伝子若しくはＣｈｋ１遺伝子に対するアンチセンス核酸又はｓｉＲＮＡ）
本発明におけるアンチセンス核酸は、ＰＧＡＭ又はＣｈｋ１をコードするＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンス核酸である。アンチセンス核酸が、転写、スプライシング又は翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸であることが好ましい。
【００３９】
本発明で用いられるアンチセンス配列の態様としては、ＰＧＡＭ又はＣｈｋ１のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であるものと考えられる。しかし、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域に相補的な配列も使用しうる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。アンチセンス核酸は標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡの長さは、特に制限されない。
【００４０】
本発明におけるｓｉＲＮＡは、細胞で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖ＲＮＡを意味し、例えば１５〜４９塩基対と、好適には１５〜３５塩基対と、さらに好適には２１〜３０塩基対とすることが出来る。また、ｓｈＲＮＡは、一本鎖のＲＮＡがヘアピン構造を介して二重鎖を構成しているＲＮＡである。
【００４１】
ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の相同性を有する。
【００４２】
ｓｉＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合した二重鎖ＲＮＡの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においてはｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中に、バルジ及びミスマッチの両方が含まれていてもよい。
【００４３】
（ＰＧＡＭ又はＣｈｋ１に特異的な抗体）
本発明におけるＰＧＡＭ又はＣｈｋ１に特異的な抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来の抗体を挙げることが出来る。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、及び遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体はＰＧＡＭ又はＣｈｋ１と結合することにより、ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合を阻害する。
【００４４】
抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用して作製できる。すなわち、ＰＧＡＭ又はＣｈｋ１を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング方法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００４５】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得する方法としては、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。また、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる。
【００４６】
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト（Ｈｕｍａｎ）抗体等を使用できる。これらの改変抗体は、当業者に公知の方法を用いて製造することができる。
【００４７】
（ナトリン等の化合物）
本発明のスクリーニング方法を用いて、化合物ライブラリーについて試験を行ったところ、ナトリンがＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合を有意に阻害することが見出された。このナトリンが解糖系代謝に影響を与えるか否かを確認するために、Ｈ１２９９細胞に添加したところ、解糖系酵素発現が顕著に低下し、解糖系代謝に対して抑制的に機能することが明らかとなった。即ち、ナトリンは解糖系代謝制御物質であり、これを含む組成物は、解糖系代謝制御剤として有効に使用することができる。
【００４８】
同様にして、天然化合物、有機化合物、無機化合物、核酸、タンパク質、ペプチド等の単一物質；化合物ライブラリー、核酸ライブラリー、ペプチドライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物；細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物又は動物細胞抽出物の抽出物等を本発明のスクリーニング方法にかけることで、ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合に影響を与える化合物、即ち解糖系代謝に影響を与える化合物を見出すことが可能である。
【００４９】
本発明の解糖系代謝制御剤は、上記有効成分に加えて、他の任意成分として、製剤上、薬理学的又は生理学的に許容される一種又は二種以上の担体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、分散剤、界面活性化剤、可塑剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤、細菌抑制剤等を含有していてもよい。また、その他低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、糖アルコールを含んでいてもよい。さらに必要に応じて他の有効成分を含有していてもよい。
【００５０】
本発明の解糖系代謝制御剤は、医薬品、医薬部外品、食品等の分野において従来公知の任意の方法により製造することができる。その製造過程において、上記有効成分、その他の任意成分を公知のいかなる方法で添加・混合してもよい。
【００５１】
注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。必要に応じてさらに希釈剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。
【００５２】
また、マイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）としたりすることもできる。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明に適用し得る。
【００５３】
本発明の解糖系代謝制御剤をヒトや他の動物の医薬として使用する場合には、これらの物質自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。製剤化する場合には、上記に記載の製剤上許容される成分を添加してもよい。
【００５４】
本発明におけるすべての薬剤は、医薬品の形態で投与することが可能であり、経口的又は非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇの投与量を選ぶことができる。具体的な例としては、体重１ｋｇあたり１ヶ月（４週間）に０．１ｍｇから４０ｍｇ、好ましくは１ｍｇから２０ｍｇを１回から数回に分けて、例えば２回／週、１回／週、１回／２週、１回／４週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射、経口投与等の方法で、投与する。投与スケジュールは、投与後の状態の観察及び血液検査値の動向を観察しながら２回／週あるいは１回／週から１回／２週、１回／３週、１回／４週のように投与間隔を延ばしていくなど調整することも可能である。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００５６】
１．ＰＧＡＭモデルマウスの解析（腹腔内グルコース負荷試験）
ＰＧＡＭのｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を検証するためＰＧＡＭモデルマウス（全身発現型トランスジェニックマウス（ＴＧ）及びノックアウトマウス（ｃＫＯ）マウス）の解析を行った。図１に、ＰＧＡＭノックアウトマウスの遺伝子デザインの概略図を示す。ＣＡＧ−ＣｒｅトランスジェニックマウスとＰｇａｍ１  ｆｌｏｘ／＋マウスとの交配により、グローバルＰｇａｍ１ヘテロ接合体ＫＯマウスを作製し、Ｐｇａｍ１ヘテロ接合性ＫＯマウスの交配後、ホモ接合型及びヘテロ接合型のＫＯマウスの生存可能な子孫を調べた。得られた１５５の子孫の中で、野生型の比率：ヘテロ接合体ＫＯ：同型接合ＫＯは、５２：１０３：０であった（表１）。したがって、Ｐｇａｍ１ホモ接合性ＫＯマウスは胚性致死であり、胚胎日１３．５（Ｅ１３．５）では観察されない。Ｐｇａｍ１−／−マウスの初期致死率は、他の解糖酵素のホモ接合性ＫＯマウスで観察されたものと類似している。なお、ＰＧＡＭホモＫＯマウスは胎生致死であったため（表１）、以下の解析はヘテロＫＯマウスで行った。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
ＰＧＡＭが解糖系酵素であることを考慮し、糖尿病や糖代謝異常の有無を検討するために、ＰＧＡＭ−ＴＧマウス、ＰＧＡＭヘテロＫＯマウス及び野生型マウスを用いて、腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）を行った。即ち、それぞれのマウスについて１６時間絶食後、グルコースを１．５ｇ／ｋｇ体重で腹腔内投与し、０、１５、３０、６０、１２０分後に採血し、全血中のグルコースレベルを解析した。その結果、ＰＧＡＭ−ＴＧマウス（図２）もＰＧＡＭヘテロＫＯマウス（図３）もｉｎ  ｖｉｖｏ糖代謝パラメーターはほぼ正常であった。
【００５９】
２．ＰＧＡＭモデルマウスの解析；解糖系代謝に関連する物質のｍＲＮＡ（解糖系ｍＲＮＡ）の組織別解析
ＰＧＡＭモデルマウス（全身発現型ＴＧ及びｃＫＯマウス）を用いて、臓器別の解糖系ｍＲＮＡプロファイルを解析した。ＰＧＡＭ−ＴＧマウスでは、検証した組織・臓器（皮膚、肝臓、腎臓、筋肉、白色脂肪、肺、心臓）では、ほぼ正常であった。一方、ＰＧＡＭヘテロノックアウトマウスでも多くの臓器（肝臓、腎臓、筋肉、白色脂肪、肺、脳、心臓）で、解糖系ｍＲＮＡプロファイルは正常であったが、皮膚においては、Ｈｋ２、Ｇｐｉ、Ｐｆｋｍ、Ｔｐｉ、Ａｌｄｏａ、Ｇａｐｄｈ、Ｐｇｋ１、Ｐｋｍ１の有意な低下、及びＥｎｏ３の中程度の減少（ｐ＝０．０８）が見られ、解糖系ｍＲＮＡ全般が大きく発現低下していることがわかった（図４）。
【００６０】
３．癌培養細胞におけるＰＧＡＭの解析；ＰＧＡＭｓｉＲＮＡによる解糖系ｍＲＮＡの低下
ＨｅＬａ、Ｈ１２９９、ＨＳＣ１（癌培養細胞）で、ＰＧＡＭｓｉＲＮＡにより、ＰＧＡＭ不活性化を試みた。即ち、ＨｅＬａ、Ｈ１２９９、ＨＳＣ１のそれぞれに、ＰＧＡＭｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたところ、ＰＧＡＭのｍＲＮＡの発現が９５％以上抑制された。これらの細胞においては、多くの解糖系酵素のｍＲＮＡプロファイルの減少が観察された（図５）。
【００６１】
４．ＰＧＡＭ−ＴＧマウスの皮膚での炎症惹起試験
上述のとおりＰＧＡＭ−ＴＧマウスの皮膚では、通常状態での解糖系ｍＲＮＡ発現は正常であった。しかしながら、ＰＧＡＭ−ＴＧマウスの皮膚は野生型マウスと比較して、ＴＰＡ薬剤処理による炎症が起こりやすいことがわかった。即ち、ＰＧＡＭ−ＴＧマウスの耳を１０ｎｇのＴＰＡ（１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート）で処理し、その後８時間に渡って耳の状態を観察したところ、より厚く、赤みを帯びた変化を示した（図６）。また、耳部肥厚の程度を定圧厚み測定器により計測したところ、図６に示すとおり、ＰＧＡＭ−ＴＧマウスでは野生型マウスと比較して、耳部肥厚の程度が顕著であることがわかった。
【００６２】
５．ＰＧＡＭ−ＴＧマウスの皮膚での悪性腫瘍惹起試験
ＰＧＡＭ−ＴＧマウス及び野生型マウスの皮膚に、次のような化学発癌実験を行った。即ち、各マウスの皮膚に１００μｇのＤＭＢＡ（７，１２−ジメチルベンズ（ａ）アントラセン）を塗布し、その後ＴＰＡ１２．５μｇを週２回、合計２０週間繰り返し塗布した。その結果、この処理によって出現した腫瘍の総数はＰＧＡＭ−ＴＧマウスが野生型マウスよりわずかに多い程度であったが、腫瘍のサイズは、ＰＧＡＭ−ＴＧマウスの方が著しく大きかった（図７）。また、野生型マウスでは形成された皮膚腫瘍はすべて良性の乳頭腫であったが、ＰＧＡＭ−ＴＧマウスでは大きな腫瘍（６ｍｍ）が出現し、全体の約１０％は病理的に悪性の診断を受けた（表２）。さらに形成した腫瘍において、解糖系ｍＲＮＡを比較したところ、ＴＧマウスでより優位な亢進が観察された。結論として、ＰＧＡＭ−ＴＧマウスは皮膚がんになりやすく、そのとき解糖系ｍＲＮＡ亢進（ワールブルグ効果）が観察された（図８）。
【００６３】
【表２】
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【００６４】
６．ＰＧＡＭ−ＴＧマウスにおける癌抑制遺伝子ｐ５３のリン酸化
ＰＧＡＭ−ＴＧマウスでの発癌性の機構を検証するため、がん抑制遺伝子ｐ５３に注目した。ｐ５３は、ヒト癌で最も欠失の多い（約５０％）がん抑制遺伝子であり、転写後修飾（リン酸化やユビキチン化）により制御されている。我々は、ＰＧＡＭ−ＴＧ  ＭＥＦ細胞では、恒常活性型変異Ｒａｓ（Ｒａｓ−Ｇ１２Ｖ）発現による発癌ストレス存在下で、ｐ５３活性化リン酸化の一つであるｓｅｒｉｎｅ２３のリン酸化が低下していることを見出した（図９）。次にｓｅｒｉｎｅ２３のリン酸化は、Ｃｈｋ１キナーゼにより担われているので、Ｃｈｋ１キナーゼのプロファイルを検証した。その結果、ＰＧＡＭ−ＴＧ  ＭＥＦ細胞では、Ｃｈｋ１キナーゼの蛋白量や活性化リン酸化に変化はなかったが、ＰＧＡＭとＣｈｋ１が細胞内結合することを見出した（図１０）。
【００６５】
７．ＰＧＡＭとＣｈｋ１の結合
ＰＧＡＭとＣｈｋ１が細胞内結合することの解糖系代謝への影響を検証した。Ｃｈｋ１不活性化（ｓｉＲＮＡや阻害剤ＵＣＮ０１処理）により、ＰＧＡＭ不活性化同様、解糖系ｍＲＮＡが低下することが確認された（図１１Ａ）。一方Ｃｈｋ１活性化により、野生型細胞では解糖系ｍＲＮＡは正常だったが、ＰＧＡＭ−ＴＧ細胞では解糖系ｍＲＮＡの亢進を観察した（図１１Ｂ）。以上より、ＰＧＡＭとＣｈｋ１が協調的に解糖系を制御することがわかった。
【００６６】
８．ＰＧＡＭとＣｈｋ１による協調的解糖系制御への酵素活性の寄与
ＰＧＡＭとＣｈｋ１による協調的解糖系制御の分子機構を解明するための実験を行った。まずＰＧＡＭがプロテインフォスファターゼとして機能する可能性を検証したところ、試験管内反応では否定的な結果となった（図１２）。図１２には、アッセイに利用したリン酸化ペプチドを示した。プロテインフォスファターゼの陽性対照としては、λＰＰａｓｅを使用した。具体的には、上記リン酸化ペプチドをＰＧＡＭリコンビナント蛋白又はλＰＰａｓｅと反応させ、リン酸化ペプチドから解離するリン酸を測定した。図１２に示すとおり、ＰＧＡＭリコンビナント蛋白にはフォスファターゼ活性は認められなかった。
【００６７】
次にＰＧＡＭの解糖系代謝酵素活性の関与を疑い、ＰＧＡＭ−Ｒ９０Ｗ変異ＴＧマウスを作成した。ＰＧＡＭ−Ｒ９０Ｗ変異は、すでにヒト患者家系でＰＧＡＭ活性失活の報告のある変異である（Ｔｓｕｊｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ  Ｓｕｐｐｌ  １９９５）。予想に反し、ＰＧＡＭ−Ｒ９０Ｗ変異ＭＥＦ細胞でも、Ｃｈｋ１発現ベクターの導入によりＣｈｋ１活性化することで、解糖系亢進が観察された（図１３）。
【００６８】
９．ＰＧＡＭとＣｈｋ１による協調的解糖系制御への物理的結合の寄与
ＰＧＡＭとＣｈｋ１の物理的結合が、解糖系代謝亢進に重要である可能性を検証した。我々は、Ｃｈｋ１と結合するＰＧＡＭのＮ末端側に、ナトリン標的配列（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  ２０１４）があることに気づいた（図１４）。ナトリンは、ｐ５３とＭｄｍ２の結合を阻害する化学物質として開発された抗がん剤の一種である。ＰＧＡＭ−ＦＬＡＧとＣｈｋ１−ｍｙｃ−ｈｉｓを発現するＭＥＦ細胞にナトリンを処理し、その蛋白質抽出液からＮｉ−ＮＴＡビーズによりＣｈｋ１−ｍｙｃ−ｈｉｓを回収し、結合しているＰＧＡＭ−ＦＬＡＧの量を検討したところ、ナトリン処理により、ＰＧＡＭとＣｈｋ１の結合が阻害されることを観察した（図１５）。同時に、ナトリン処理により、癌細胞Ｈ１２９９において、解糖系ｍＲＮＡ発現が顕著に低下することが確認された（図１６）。以上より、ＰＧＡＭとＣｈｋ１による協調的解糖系亢進には、ＰＧＡＭのフォスフォターゼ活性や解糖系代謝酵素活性は関与せず、物理的結合が重要という結論を得た。また、本発明のスクリーニング方法を用いることにより、解糖系代謝を特異的に制御できる解糖系代謝制御物質としてナトリンを見出すことができた。
【００６９】
１０．ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合を指標とする解糖系代謝制御物質のスクリーニング
ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合を指標とするスクリーニングを、Ｎａｎｏｂｉｔシステムを用いた以下の方法により行う。ＮａｎｏｂｉｔではＰＧＡＭとＣｈｋ１にそれぞれルシフェラーゼをベースに作成された発光蛋白質の大サブユニットと小サブユニットをそれぞれタグとして取り付ける。それぞれのサブユニットはそれ自体発光しないが、ＰＧＡＭとＣｈｋ１の結合により大サブユニットと小サブユニットが会合し完全な発光蛋白となることで発光シグナルを発する。このときナトリンのようなＰＧＡＭとＣｈｋ１の結合を阻害する物質の存在下では発光シグナルが低下する。よってこの発光シグナルの減少を指標として、薬剤ライブラリーの中からＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合を阻害する化合物のスクリーニングを行うことが可能である。また、この発光シグナルを増強する化合物、即ちＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合を促進する化合物のスクリーニングも可能である。
【００７０】
また、ＰＧＡＭとＣｈｋ１との結合を指標とするスクリーニングを、ＰＧＡＭ−ＦＬＡＧとＣｈｋ１−ｍｙｃ−ｈｉｓを発現する培養細胞の蛋白質抽出液からＮｉ−ＮＴＡビーズによってＣｈｋ１−ｍｙｃ−ｈｉｓを回収し、結合しているＰＧＡＭ−ＦＬＡＧの量をウエスタンブロットで評価する方法により行う。培養中の細胞に対して候補化合物を処理することで、Ｃｈｋ１−ｍｙｃ−ｈｉｓに結合するＰＧＡＭ−ＦＬＡＧの量の減少又は増加を指標とした結合制御化合物のスクリーニングが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の解糖系代謝制御物質のスクリーニング方法は、本発明者らが、細胞内でＰＧＡＭとＣｈｋ１とが結合すること、そしてこれらの結合が解糖系代謝において重要な役割を果たすことを最初に見出したことによって、可能となったものである。この方法によると、解糖系代謝の制御により予防、治療、処置が可能である症状や疾患に有効な物質を見出すことができる。例えば、本発明のスクリーニング方法により見出される解糖系代謝制御物質は、新規の抗がん剤、抗老化用組成物に有効に用いられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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