(57)【要約】【課題】高感度且つ簡便な尿素の測定方法を提供する。高感度且つ簡便に尿素を検出可能な尿素検出キットを提供する。【解決手段】尿素の測定方法は、反応容器に尿素を含む試料と、アルギニンと、２価のカチオンを含む溶液とを添加して混合する混合工程と、前記混合工程後の試料に、尿素検出試薬を含むｐＨ４．０以下の酸性溶液を添加し、尿素の検出反応を行う検出反応工程と、を備える方法である。尿素検出キットは、アルギニンと、２価のカチオンを含む溶液と、尿素検出試薬を含むｐＨ４．０以下の酸性溶液と、を備える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応容器に尿素を含む試料と、アルギニンと、２価のカチオンを含む溶液とを添加して混合する混合工程と、
前記混合工程後の試料に、尿素検出試薬を含むｐＨ４．０以下の酸性溶液を添加し、尿素の検出反応を行う検出反応工程と、
を備えることを特徴とする尿素の測定方法。
【請求項２】
前記検出反応工程において、前記酸性溶液を添加した前記試料を室温以上１００℃以下で３０分以上加熱し、尿素の検出反応を促進する請求項１に記載の尿素の測定方法。
【請求項３】
前記加熱を遮光下で行う請求項２に記載の尿素の測定方法。
【請求項４】
前記加熱後の前記試料に紫外線を照射する請求項３に記載の尿素の測定方法。
【請求項５】
前記反応容器がマイクロプレートである請求項１〜４のいずれか一項に記載の尿素の測定方法。
【請求項６】
アルギニンと、
２価のカチオンを含む溶液と、
尿素検出試薬を含むｐＨ４．０以下の酸性溶液と、
を備えることを特徴とする尿素検出キット。
【請求項７】
前記２価のカチオンがマンガンである請求項６に記載の尿素検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿素の測定方法及び尿素検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の尿素の測定法としては、例えば、ウレアーゼを用いたウレアーゼ・インドフェノール比色法、ウレアーゼ・グルタミン酸脱水素酵素法等が挙げられる。
【０００３】
また、その他の尿素の測定法としては、例えば、尿素を含む試料、ｏ−フタルアルデヒド及び発色化合物を酸性条件下で混合し、生じた混合物を比色定量することからなる方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。この方法では、反応において気体を生じない、長期の貯蔵において不安定な強い酸化剤や酵素を使用しない、比色定量が可能である等の点から、乾式試験片による尿素定量法に用いられている。
【０００４】
また、その他の尿素の測定法としては、例えば、市販の尿素検出用試薬を用いた方法等が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特公平３−７３８１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のウレアーゼを用いる方法は、尿素のウレアーゼによる酵素変換で生成したアンモニアを適当な試薬系で測定する方法である。そのため、試料中のアンモニアの量により影響を受け、特に測定する試料が尿である場合には、尿中のアンモニアの濃度が高いために、前処理によってアンモニアを除去するか検体ブランクを使用することが必要であり、簡便性、迅速性等に欠ける。
また、特許文献１に記載の乾式試験片を用いた測定では、溶液の尿素検出用試薬を用いた測定と比べ、液体試料中の尿素以外の窒素含有成分の影響を受けやすい（尿素に対する特異性が低い）、液体試料のタンパク質濃度、ｐＨ及び粘度等の物性の影響を受けやすい等の課題がある。
また、市販の尿素検出用試薬を用いた方法では、当該尿素検出用試薬が水難溶性であり、さらに操作が煩雑であるため、数十サンプルの測定が限界であり、サンプル量及び試薬量を多く必要とする。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、高感度且つ簡便な尿素の測定方法を提供する。また、高感度且つ簡便に尿素を検出可能な尿素検出キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る尿素の測定方法は、反応容器に尿素を含む試料と、アルギニンと、２価のカチオンを含む溶液とを添加して混合する混合工程と、前記混合工程後の試料に、尿素検出試薬を含むｐＨ４．０以下の酸性溶液を添加し、尿素の検出反応を行う検出反応工程と、を備える方法である。
本発明の第２態様に係る尿素検出キットは、アルギニンと、２価のカチオンを含む溶液と、尿素検出試薬を含むｐＨ４．０以下の酸性溶液と、を備える。
【発明の効果】
【００１０】
上記態様によれば、高感度且つ簡便に尿素を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施形態に係る尿素の検出方法を示す概略構成図である。
【図２Ａ】実施例１における尿素の測定結果を示す図である。
【図２Ｂ】比較例１における尿素の測定結果を示す図である。
【図３】実施例２における尿素の測定結果を示す図である。
【図４】実施例３における尿素の測定結果を示す図である。
【図５】試験例１における尿素の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
≪尿素の測定方法≫
本発明の一実施形態に係る尿素の測定方法は、反応容器に尿素を含む試料と、アルギニンと、２価のカチオンを含む溶液とを添加して混合する混合工程と、前記混合工程後の試料に、尿素検出試薬を含むｐＨ４．０以下の酸性溶液を添加し、尿素の検出反応を行う検出反応工程と、を備える方法である。
【００１３】
本実施形態の測定方法によれば、高感度且つ簡便に尿素を測定することができる。
【００１４】
図１は、本発明の一実施形態に係る尿素の検出方法を示す概略構成図である。
本実施形態の測定方法について、図を参照しながら以下に詳細を説明する。
【００１５】
＜混合工程＞
まず、反応容器に尿素を含む試料と、アルギニンと、２価のカチオンを含む溶液とを添加し、混合する。
混合する温度及び時間に特別な限定はなく、例えば２０℃以上４５℃以下程度の温度で、均一になるようにピペッティング等して混合すればよい。
本工程において使用する各成分について、以下に詳細を説明する。
【００１６】
［尿素を含む試料］
尿素を含む試料としては、特別な限定はないが、例えば血液、唾液、涙液、汗等の体液、尿などの生体試料、動物細胞（例えば、肝臓細胞等）の懸濁液、動物細胞の破砕液等が挙げられる。尿素を含む試料は、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
【００１７】
［アルギニン］
本実施形態の測定方法に用いられるアルギニンは、Ｌ体であっても、Ｄ体であってもよく、中でも、Ｌ体であることが好ましい。また、アルギニンは、蒸留水等の溶媒に溶解した状態、すなわちアルギニン溶液であってもよい。アルギニン溶液である場合、アルギニンを含む塩又は水和物を蒸留水等の溶媒に溶解することで調製することができる。さらに、アルギニン溶液は、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
アルギニン溶液である場合、測定時の溶液中のアルギニンの濃度としては、例えば１０ｍＭ以上３００ｍＭ以下であってよく、２０ｍＭ以上２００ｍＭ以下であってよく、３０ｍＭ以上１００ｍＭ以下であってよい。
【００１８】
［２価のカチオンを含む溶液］
２価のカチオンとしては、例えばＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋等が挙げられる。中でも、Ｍｎ２＋であることが好ましい。２価のカチオンを含む溶液としては、上記２価のカチオンを含む塩又は水和物等が溶解したものであればよく、特別な限定はない。さらに、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。アルギナーゼを含む試料に、２価のカチオンを含む溶液を添加することにより、アルギナーゼの酵素活性を高めることができる。
溶液中の２価のカチオンの濃度としては、例えば１ｍＭ以上１００ｍＭ以下であってよく、３ｍＭ以上５０ｍＭ以下であってよく、５ｍＭ以上３０ｍＭ以下であってよい。
【００１９】
［反応容器］
反応容器としては、尿素を測定することができるものであれば、特別な限定はなく、例えばガラス、金属、プラスチック等が挙げられる。反応容器の形状には、特に制限はなく、例えばスライドガラス状、マイクロプレート状、円盤状等が挙げられる。
中でも、多数の試料を測定することが可能であることから、マイクロプレート状であることが好ましい。マイクロプレートとしては、任意の数のウェルが配置されているものが挙げられる。ウェルの数としては、プレート１枚当たり、例えば、２４、９６、３８４、１，５３６個等が挙げられる。反応容器は、微細な流路を備えたマイクロ流路デバイスを構成していてもよい。反応容器のサイズは、使用する装置に適用できる範囲であれば構わない。
【００２０】
また、混合工程において、アルギナーゼを含む試料を用いて、アルギニンから尿素を生成させて尿素を含む試料を得て、尿素を含む試料とアルギニンと２価の価値を含む溶液との混合溶液としてもよい。
具体的には、まず、反応容器にアルギナーゼを含む試料と２価のカチオンを含む溶液とを添加し、アルギナーゼを活性化させる。アルギナーゼの活性をより高めるために、酵素が失活しない程度の温度（例えば、５５℃以上７０℃未満の温度等）で、１０分程度インキュベートしてもよい。
【００２１】
アルギナーゼを含む試料としては、特別な限定はないが、例えば血液、唾液、涙液、汗等の体液、尿などの生体試料、動物細胞（例えば、肝臓細胞等）の懸濁液、動物細胞の破砕液等が挙げられる。アルギナーゼを含む試料は、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
【００２２】
２価のカチオン及び溶液中の濃度、並びに、使用する反応容器としては、上述したとおりである。
【００２３】
次いで、活性化された状態のアルギナーゼを含む試料に、基質としてアルギニンを添加し、酵素基質反応を行うことで、尿素を含む試料を得る。反応温度は、２０℃以上４５℃以下が好ましく、３０℃以上４０℃以下がより好ましく、３７℃以上４０℃以下が最も好ましい。反応時間は、３０分以上３時間以下が好ましく、２時間が特に好ましい。反応時のｐＨは、ｐＨ８．５以上１０．５以下が好ましく、ｐＨ９．０以上１０．０以下が特に好ましい。
【００２４】
アルギニン及びアルギニン溶液である場合のその濃度としては、上述したとおりである。
【００２５】
＜検出反応工程＞
次いで、混合工程後の試料に、尿素検出試薬を含むｐＨ４．０以下の酸性溶液を添加し、尿素の検出反応を行う。
【００２６】
［尿素検出試薬］
尿素検出試薬としては、尿素を検出できるものであれば、特別な限定はない。例えば、α−ジケトン、ｐ−ジメチルアミノベンツアルデヒド、キサントヒドロール等が挙げられる。中でも、α−ジケトンが好ましい。α−ジケトンとしては、例えば、α−イソニトロソプロピオフェノン、ジアセチルモノオキシム等が挙げられる。中でも、α−イソニトロソプロピオフェノンが好ましい。
【００２７】
酸性溶液中の尿素検出試薬の濃度は、０．０５重量％以上１．００重量％以下であることが好ましく、０．０８重量％以上０．７０重量％以下であることがより好ましく、０．１０重量％以上０．６６重量％以下であることがさらに好ましい。
【００２８】
［酸性溶液］
酸性溶液のｐＨは、室温（２３℃）でのｐＨが４．０以下であればよく、ガラス電極のｐＨメーターでは計測することが難しい酸性度の強い溶液を用いてもよい。酸性溶液のｐＨの上限値として具体的には、ｐＨ４．０以下であることが好ましく、ｐＨ２．０以下であることがより好ましく、ｐＨ１．０以下であることがさらに好ましい。
一方、酸性溶液のｐＨの下限値としては、ｐＨメーターでは測定することが困難な酸性度であってもよいことから特別な限定はないが、例えば−２．０以上程度であればよい。
酸性溶液は、ｐＨを上記範囲に調整できる酸を含む溶液であればよく、特別な限定はない。使用可能な酸として具体的には、例えば、塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、それらの塩又は水和物等が挙げられる。上記酸を２種類以上混合したものでもよい。さらに、酸性溶液は、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
【００２９】
上記尿素検出試薬及び上記酸性溶液を予め混合しておくことにより、溶液の添加量を少なくすることができ、さらに尿素検出試薬の添加量のばらつきを低減することができる。また、尿素検出試薬を含み、ｐＨが上記範囲内である酸性溶液と、尿素検出反応を促進するための加熱とを組み合わせることにより、尿素検出反応を十分に行うことができる。
また、混合工程においてアルギナーゼを用いて尿素を含む試料を調製した場合、上記尿素検出試薬及び上記酸性溶液を予め混合しておくことにより、酵素の失活及び尿素の検出を１回の作業で行えるため、作業を効率化することができる。
【００３０】
上記尿素検出試薬を含む酸性溶液は、例えば、以下のような方法で調製することができる。まず、尿素検出試薬と、酸、それらの塩又は水和物と、必要であれば生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等とを混合する。さらに、尿素検出試薬が酸性溶液に比較的溶解しにくい場合、混合時に加熱することが好ましい。加熱することで、尿素検出試薬を完全に溶解させることができ、上記尿素検出試薬を含む酸性溶液を調製することができる。
【００３１】
また、検出反応工程において、酸性溶液を添加した試料を加熱しながらインキュベートすることで尿素検出反応を促進させてもよい。加熱温度としては、室温以上１００℃以下が好ましく、９０℃以上１００℃以下が特に好ましい。加熱時間としては、３０分以上であり、３０分以上１２時間以下が特に好ましい。加熱温度及び加熱時間は尿素の含有量に応じて、適宜調節することができる。また、加熱しながらインキュベートすることで、尿素検出試薬による反応を促進し、より早く検出を行うことができる。
【００３２】
また、加熱を遮光下で行うことが好ましい。加熱時に遮光することで、加熱により尿素と尿素検出試薬との反応が促進された状態を保ちつつ、加熱時間の経過とともに光によって尿素検出試薬の発色が促進され、その後退色することを防ぐことができるため、より高感度に尿素を検出することができる。
【００３３】
また、遮光下で加熱後の試料に紫外線を照射することが好ましい。加熱後に紫外線を照射することで、尿素検出試薬の発色を促進することができる。
紫外線の照射方法については特に限定されず、例えば、白色灯、日光、紫外線照射装置等、紫外線が存在する環境下にさらすことで、反応は促進される。
【００３４】
尿素の検出は、尿素と尿素検出試薬との反応を利用した比色法を用いて行うことができる。反応が進み、十分に発色したら、測定装置にセットして吸光度を測定する。測定装置としては、吸光度を測定できるものであれば、特別な限定はない。例えば、吸光光度計（分光光度計）、マイクロプレートリーダー等が挙げられる。
【００３５】
また、吸光度を測定する際に、試料内のタンパク質濃度を測定し、尿素の測定値を校正してもよい。
【００３６】
タンパク質濃度の測定方法としては、特別な限定はなく、例えば、紫外吸収法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（クマシーブルー法）、Ｌｏｗｒｙ法（フェノール試薬法）、ビシンコニン酸法（ＢＣＡ法）等が挙げられる。
【００３７】
試料内のタンパク質濃度を測定し、測定値を校正することで、より正確なアルギナーゼ活性の測定値を得ることができる。
【００３８】
本実施形態の測定方法は、上記に示したとおり、少量の試料及び試薬を用いて、効率的に測定することが可能である。また、従来では、尿素検出試薬が経時的に変色し、バックグラウンドが高くなってしまう問題があったが、本実施形態の測定方法では、尿素検出試薬を含む上記ｐＨ範囲内の酸性溶液を予め作り置きすることができ、さらに感度良くバックグラウンドが低い状態で測定することが可能である。よって、従来では、一度の分析において、数十サンプルの測定が限界であったのに対し、本実施形態の測定方法では、数百サンプル以上の多数の試料を測定することができる。
【００３９】
≪尿素検出キット≫
本発明の一実施形態に係る尿素検出キットは、アルギニンと、２価のカチオンを含む溶液と、尿素検出試薬を含むｐＨ４．０以下の酸性溶液と、を備える。
【００４０】
本実施形態の検出キットによれば、高感度且つ簡便に尿素を検出することができる。
【００４１】
＜アルギニン＞
本実施形態の検出キットに含まれるアルギニンは、Ｌ体であっても、Ｄ体であってもよく、中でも、Ｌ体であることが好ましい。また、アルギニンは、蒸留水等の溶媒に溶解した状態、すなわちアルギニン溶液であってもよい。アルギニン溶液である場合、アルギニンを含む塩又は水和物を蒸留水等の溶媒に溶解することで調製することができる。さらに、アルギニン溶液は、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
アルギニン溶液である場合、溶液中のアルギニンの濃度としては、例えば１０ｍＭ以上１０００ｍＭ以下であってよく、２０ｍＭ以上８００ｍＭ以下であってよく、３０ｍＭ以上６００ｍＭ以下であってよい。
【００４２】
＜２価のカチオン＞
本実施形態の検出キットに含まれる２価のカチオンとしては、上述の尿素の測定方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、本実施形態の検出キットに含まれる２価のカチオンとしては、Ｍｎ２＋であることが好ましい。２価のカチオンを含む溶液としては、上記２価のカチオンを含む塩又は水和物等が溶解したものであればよく、特別な限定はない。さらに、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。尿素を含む試料に、アルギニン及び２価のカチオンを含む溶液を添加することにより、尿素検出試薬の発色能を高めることができる。
【００４３】
＜尿素検出試薬＞
本実施形態の検出キットに含まれる尿素検出試薬としては、尿素を検出できるものであれば、特別な限定はなく、上述の尿素の測定方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、本実施形態の検出キットに含まれる尿素検出試薬としては、α−イソニトロソプロピオフェノンが好ましい。
【００４４】
＜酸性溶液＞
本実施形態の検出キットに含まれる酸性溶液は、室温（２３℃）でのｐＨが４．０以下であればよく、ガラス電極のｐＨメーターでは計測することが難しい酸性度の強い溶液を用いてもよい。酸性溶液のｐＨの上限値として具体的には、ｐＨ４．０以下であることが好ましく、ｐＨ２．０以下であることがより好ましく、ｐＨ１．０以下であることがさらに好ましい。
一方、酸性溶液のｐＨの下限値としては、ｐＨメーターでは測定することが困難な酸性度であってもよいことから特別な限定はないが、例えば−２．０以上程度であればよい。
酸性溶液は、ｐＨを上記範囲に調整できる酸を含む溶液であればよく、特別な限定はない。使用可能な酸として具体的には、上述の尿素の測定方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、上記酸を２種類以上混合したものでもよい。さらに、酸性溶液は、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
【００４５】
上記尿素検出試薬及び上記酸性溶液が予め混合されていることにより、溶液の添加量を少なくすることができ、さらに尿素検出試薬の添加量のばらつきを低減することができる。また、尿素検出試薬を含み、ｐＨが上記範囲内である酸性溶液と、尿素検出反応を促進するための加熱とを組み合わせることにより、尿素検出反応を十分に行うことができる。
また、アルギナーゼにより調製された尿素を含む試料を用いて検出を行う場合、上記尿素検出試薬及び上記酸性溶液を予め混合しておくことにより、酵素の失活及び尿素の検出を１回の作業で行えるため、作業を効率化することができる。
【００４６】
本実施形態の検出キットは、例えば、血液中又は尿中等の生体試料中の尿素濃度を高感度に検出できることから、腎機能の検査に用いることができる。すなわち、本実施形態の検出キットは、「腎機能の検査キット」として用いることができる。
また、本実施形態の検出キットは、尿素を合成するアルギナーゼの活性を測定するために用いることもできる。すなわち、本実施形態の検出キットは、「アルギナーゼ活性の検出キット」としても用いることができる。
また、本実施形態の検出キットを用いて、アルギナーゼの活性を検出できることから、アルギナーゼ関連疾患を検出するために用いることもできる。すなわち、本実施形態の検出キットは、「アルギナーゼ関連疾患検出キット」としても用いることができる。
【００４７】
なお、本明細書において、「アルギナーゼ関連疾患」としては、例えば心疾患、全身性高血圧症、肺高血圧症、虚血再灌流傷害、末梢血管疾患、末梢動脈疾患、くも膜下出血、勃起機能不全、自己免疫性脳脊髄炎、慢性腎不全、胃腸運動障害、胃癌、肝血流量減少、肝血流量不足（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ）、脳血管攣縮、又はそれらの組み合わせ等が挙げられる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
[実施例１]
（１）尿素溶液の調製
尿素（ナカライテスク社製）を用いて、０、５、１０、２０、４０、８０、１６０μｇ／ｍＬとなるように尿素溶液を調製した。
【００５０】
（２）尿素検出試薬を含む酸性溶液の調製
酸混合液（リン酸：濃硫酸：水＝１：３：７（体積比））に、１／１０量のα−イソニトロソプロピオフェノン（９質量％、１００％エタノールに溶解）（約ｐＨ−１．０）を添加して、９５℃で３０分以上加熱溶解し、尿素検出試薬を含む酸性溶液を調製した。
【００５１】
（３）検出反応工程
１枚のマイクロプレートに、（１）で調製した異なる濃度の尿素溶液を各２０μＬずつ、１０ｍＭのマンガン溶液２０μＬずつ、５００ｍＭのアルギニン溶液４０μＬずつ、各８ウェルずつ（合計５６ウェル×１枚）、マルチピペッターで添加した。続いて、マイクロプレートに、（２）で調製した尿素検出試薬を含む酸性溶液を各１８０μＬずつマルチピペッターで添加した。続いて、９５℃で２、３、４、５、６、８時間加熱した。続いて、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）社製、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ｉ３）を用いて、５４０ｎｍでの吸光度を測定した。結果を表１に示す。
表１において、「ｍｅａｎ」はまず０、５、１０、２０、４０、８０、１６０μｇ／ｍＬの尿素濃度それぞれにおける８ウェルの平均値を算出後、該平均値を標準偏差で割った値（平均値／標準偏差）を算出し、さらに算出された７つの平均値／標準偏差を平均した値を示している。また、「ＳＤ」は前記７つの平均値／標準偏差の標準偏差を示す。
また、８時間加熱したマイクロプレート中の溶液の液色を撮影した画像を図２Ａに示す。
【００５２】
［比較例１］
（１）尿素溶液の調製
尿素（ナカライテスク社製）を用いて、実施例１の（１）と同様の方法により、０、５、１０、２０、４０、８０、１６０μｇ／ｍＬとなるように尿素溶液を調製した。
【００５３】
（２）検出反応工程
１枚のマイクロプレートに、（１）で調製した異なる濃度の尿素溶液を各２０μＬずつ、１０ｍＭのマンガン溶液２０μＬずつ、５００ｍＭのアルギニン溶液４０μＬずつ、各８ウェルずつ（合計５６ウェル×１枚）、マルチピペッターで添加した。続いて、マイクロプレートに、酸混合液（リン酸：濃硫酸：水＝１：３：７（体積比））を各１６２μＬずつマルチピペッターで添加した。続いて、尿素検出試薬としてα−イソニトロソプロピオフェノン（９質量％、１００％エタノールに溶解）を１８μＬずつマルチピペッターで添加した。９５℃で２、３、４、５、６、８時間加熱した。続いて、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）社製、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ｉ３）を用いて、５４０ｎｍでの吸光度を測定した。結果を表１に示す。
また、８時間加熱したマイクロプレート中の溶液の液色を撮影した画像を図２Ｂに示す。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
［実施例１及び比較例１の考察］
表１から、実施例１は比較例１に対して、ｍｅａｎの値が小さい傾向であった。一方、比較例１はｍｅａｎの値が、加熱時間を通してばらついていた。また、実施例１は比較例１に対して、８時間加熱したものを除いて、ＳＤの値も小さい傾向であった。
以上のことから、本発明の測定方法では、測定値のばらつきを低減できることが明らかとなった。
【００５６】
また、図２Ａ及び図２Ｂから、実施例１においては、８時間ではほとんど尿素検出試薬の変色が見られないのに対し、比較例１においては、８時間において尿素検出試薬の変色が確認された。これは、比較例１では、尿素検出試薬に含まれるエタノール溶媒が分注作業中に蒸発してしまい、α−イソニトロソプロピオフェノンの濃度が濃くなってしまうのに対し、実施例１では、尿素検出試薬を含む酸性溶液を予め混合した後に分注しており、エタノール溶媒が蒸発することなく次の工程へ進めることができるためであると推察される。
よって、従来の測定方法である比較例１ではバックグラウンドが高いのに対し、本実施形態の測定方法では、バックグラウンドが低く、尿素をより正確に検出できることが明らかとなった。
【００５７】
［実施例２］
（１）尿素溶液の調製
尿素（ナカライテスク社製）を用いて、実施例１の（１）と同様の方法により、０、５、１０、２０、４０、８０、１６０μｇ／ｍＬとなるように尿素溶液を調製した。
【００５８】
（２）尿素検出試薬を含む酸性溶液の調製
実施例１の（２）と同様の方法を用いて、尿素検出試薬を含む酸性溶液を調製した。
【００５９】
（３）検出反応工程
１枚のマイクロプレートに、（１）で調製した異なる濃度の尿素溶液を各２０μＬずつ、１０ｍＭのマンガン溶液２０μＬずつ、５００ｍＭのアルギニン溶液４０μＬずつ、各８ウェルずつ（合計５６ウェル×１枚）、マルチピペッターで添加した。続いて、マイクロプレートに、（２）で調製した尿素検出試薬を含む酸性溶液を各１８０μＬずつマルチピペッターで添加した。続いて、遮光条件下又は蛍光灯下で、９５℃で２時間加熱した。続いて、加熱時に遮光条件下であったサンプルを蛍光灯下に移し、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）社製、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ｉ３）を用いて、５４０ｎｍでの吸光度を測定した。結果を図３に示す。図３において、「蛍光灯」とは加熱時に遮光せずに蛍光灯下であったサンプルを示し、「遮光」とは加熱時に遮光条件であったサンプルを示す。
【００６０】
図３から、加熱時に遮光せず蛍光灯下であったサンプルと比較して、加熱時に遮光条件下であったサンプルは、全ての尿素濃度において吸光度値が高くなっていた。特に、尿素濃度が１６０μｇ／ｍＬにおいて、加熱時に遮光せず蛍光灯下であったサンプルと比較して、加熱時に遮光条件下であったサンプルは、吸光度値が約１．５倍であった。
よって、加熱時に遮光することで、尿素の濃度に依存した吸光度の上昇率が高くなり、より高感度で尿素を測定できることが確かめられた。
【００６１】
［実施例３］
（１）尿素溶液の調製
尿素（ナカライテスク社製）を用いて、実施例１の（１）と同様の方法により、０、５、１０、２０、４０、８０、１６０μｇ／ｍＬとなるように尿素溶液を調製した。
【００６２】
（２）尿素検出試薬を含む酸性溶液の調製
実施例１の（２）と同様の方法を用いて、尿素検出試薬を含む酸性溶液を調製した。
【００６３】
（３）検出反応工程
１枚のマイクロプレートに、（１）で調製した異なる濃度の尿素溶液を各２０μＬずつ、１０ｍＭのマンガン溶液２０μＬずつ、５００ｍＭのアルギニン溶液４０μＬずつ、各８ウェルずつ（合計５６ウェル×１枚）、マルチピペッターで添加した。続いて、マイクロプレートに、（２）で調製した尿素検出試薬を含む酸性溶液を各１８０μＬずつマルチピペッターで添加した。続いて、遮光条件下で、９５℃で２時間加熱した。続いて、加熱時に遮光条件下であったサンプルに紫外線を０分、１５分、３０分、１時間又は２時間照射した。なお、紫外線光源としては殺菌灯（照射エネルギー：０．５ｍＪ／ｃｍ２／ｍｉｎ）を用いた。また、サンプルと殺菌灯との距離は、約７０ｃｍであった。続いて、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）社製、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ｉ３）を用いて、５４０ｎｍでの吸光度を測定した。結果を図４に示す。図４において、「ＵＶ  ０ｈ」とは紫外線照射が０分、「ＵＶ  ０．２５ｈ」とは紫外線照射が１５分、「ＵＶ  ０．５ｈ」とは紫外線照射が３０分、「ＵＶ  １ｈ」とは紫外線照射が１時間、「ＵＶ  ２ｈ」とは紫外線照射が２時間であるサンプルを示す。
【００６４】
図４から、加熱後の紫外線照射時間が０分と比較して、１５分、３０分、１時間及び２時間では、尿素の濃度に依存した吸光度値の上昇率が高かった。特に、尿素の濃度が１６０μｇ／ｍＬでは、加熱後の紫外線照射時間が０分と比較して、１時間では、吸光度値が約２．６倍であった。
一方、加熱後の紫外線照射時間が１５分から１時間までは、尿素の濃度に依存した吸光度値の上昇率が高くなる傾向であったが、加熱後の紫外線照射時間が２時間では、吸光度値の上昇率がやや低くなっていた。
このことから、加熱後の紫外線照射時間を０分より長く１時間以下とすることで、尿素の濃度に依存した吸光度の上昇率が高くなり、より高感度で尿素を測定できることが確かめられた。
【００６５】
［試験例１］
（１）尿素溶液の調製
尿素（ナカライテスク社製）を用いて、実施例１の（１）と同様の方法により、０、５、１０、２０、４０、８０、１６０μｇ／ｍＬとなるように尿素溶液を調製した。
【００６６】
（２）尿素検出試薬を含む酸性溶液の調製
実施例１の（２）と同様の方法を用いて、尿素検出試薬を含む酸性溶液を調製した。
【００６７】
（３）検出反応工程
１枚のマイクロプレートに、（１）で調製した異なる濃度の尿素溶液を各２０μＬずつ、１０ｍＭのマンガン溶液２０μＬずつ、５００ｍＭのアルギニン溶液４０μＬずつ、それぞれマルチピペッターで添加した。このとき、各濃度の尿素溶液を含むサンプルにおいて、尿素溶液のみを含むサンプル（２ウェル）、尿素溶液とマンガン溶液とを含むサンプル（２ウェル）、尿素溶液とアルギニン溶液とを含むサンプル（２ウェル）、及び、尿素溶液とマンガン溶液とアルギニン溶液とを含むサンプル（２ウェル）、合計５６ウェル（＝各８ウェル×７種類の濃度）を準備した。続いて、マイクロプレートに、（２）で調製した尿素検出試薬を含む酸性溶液を各１８０μＬずつマルチピペッターで添加した。続いて、９５℃で２時間加熱した。続いて、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）社製、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ｉ３）を用いて、５４０ｎｍでの吸光度を測定した。結果を図５に示す。図５において、「尿素＋Ｍｎ＋アルギニン」とは尿素溶液とマンガン溶液とアルギニン溶液とを含むサンプル、「尿素」とは尿素溶液のみを含むサンプル、「尿素＋Ｍｎ」とは尿素溶液とＭｎ溶液とを含むサンプル、「尿素＋アルギニン」とは尿素溶液とアルギニン溶液とを含むサンプルを示す。
【００６８】
図５から、尿素のみを含むサンプルでは、吸光度値が尿素濃度を反映しなかった。また、尿素溶液とマンガン溶液とを含むサンプルにおいても、吸光度値が尿素濃度をほとんど反映せず、尿素濃度１６０μｇ／ｍＬにおいて、その他の尿素濃度と比較して、わずかに吸光度値の上昇が見られた。
一方、尿素溶液とアルギニン溶液とを含むサンプルでは、尿素濃度が２０ｍｇ／ｍＬまでは、吸光度値が尿素濃度をほとんど反映しなかったが、尿素濃度が４０ｍｇ／ｍＬ以上において、尿素濃度の変化に伴い、吸光度値が上昇していた。
さらに、尿素溶液とマンガン溶液とアルギニン溶液とを含むサンプルでは、吸光度値が尿素濃度を反映していた。
以上のことから、尿素を含む試料に、マンガン溶液とアルギニン溶液とを添加することで、高感度に尿素を測定できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本実施形態によれば、高感度且つ簡便に尿素を測定することができる。
【符号の説明】
【００７０】
１…尿素を含む試料、２…アルギニン溶液、３…２価のカチオンを含む溶液、４…反応容器、５…尿素検出試薬を含むｐＨ４．０以下の酸性溶液、６…測定装置。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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