(57)【要約】【課題】画像の取得の高速化および構造化照明または旋回照明による画質の向上を両立する。【解決手段】グレーティングライトバルブの第１から第５までの仮想画素にライン光が入射し、第１から第５までの仮想画素から第１から第５までの光がそれぞれ出射する。第１から第ｎまでの光は、第１から第ｎまでの０次光をそれぞれ含むことができる。第１から第５までの０次光の強度および位相は、それぞれ第１から第５の仮想画素に備えられるサブ画素の配置に応じる。第１から第ｎまでの光から第１から第ｎまでの０次光がそれぞれ抽出され、第１から第ｎまでの０次光が第１から第５までの光シートにそれぞれ変換される。第１から第５までの光シートは、被照明位置に生成される。構造化光シートまたは旋回光シートが被照明位置に生成されるように、第１から第５までの画素に備えられるサブ画素の配置が制御される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎが２以上の整数であり、第１から第ｎまでの画素を備え、前記第１から第ｎまでの画素が第１から第ｎまでのサブ画素群をそれぞれ備え、前記第１から第ｎまでの画素にライン光が入射した場合に前記第１から第ｎまでの画素から第１から第ｎまでの光がそれぞれ出射し、前記第１から第ｎまでの光が第１から第ｎまでの特定次光をそれぞれ含むことができ、前記第１から第ｎまでの特定次光の強度および位相が前記第１から第ｎまでのサブ画素群の配置にそれぞれ応じる空間光変調器と、
前記第１から第ｎまでの光から前記第１から第ｎまでの特定次光をそれぞれ抽出し、前記第１から第ｎまでの特定次光を第１から第ｎまでの光シートにそれぞれ変換し、前記第１から第ｎまでの光シートを被照明位置に生成する光学系と、
構造化光シートまたは旋回光シートが前記被照明位置に生成されるように前記第１から第ｎまでのサブ画素群の配置を制御する処理を行う制御部と、
を備えるライン光を構造化光シートまたは旋回光シートに変換する、変換装置。
【請求項２】
請求項１に記載の変換装置であって、
前記処理は、一時に前記第１から第ｎまでの画素に含まれる２個の画素である第ｉ１および第ｉ２の画素から第ｉ１および第ｉ２の特定次光がそれぞれ出射し、前記構造化光シートが前記被照明位置に生成されるように、前記第１から第ｎまでのサブ画素群の配置を制御する第１の処理を含む、変換装置。
【請求項３】
請求項２に記載の変換装置であって、
前記第１の処理は、前記第ｉ１および第ｉ２の画素から前記第ｉ１および第ｉ２の特定次光がそれぞれ出射している間に前記第ｉ１および第ｉ２の特定次光の間の位相差が変化するように第ｉ１および第ｉ２のサブ画素群の配置を制御する、変換装置。
【請求項４】
請求項１から請求項３の何れか１つの請求項に記載の変換装置であって、
前記処理は、前記第１から第ｎまでの画素に含まれる１個の画素である第ｊ１の画素から第ｊ１の特定次光が出射し、前記第ｊ１の画素が循環的に切り替わり、前記旋回光シートが前記被照明位置に生成されるように、前記第１から第ｎまでのサブ画素群の配置を制御する第２の処理を含む、変換装置。
【請求項５】
請求項１から請求項４の何れか１つの請求項に記載の変換装置であって、
前記第１から第ｎまでの特定次光は、それぞれ第１から第ｎまでの０次光であり、
前記処理は、前記第１から第ｎまでの画素に含まれる第ｋの画素から第ｋの０次光を出射させる場合に、第ｋのサブ画素群が回折格子を構成しないように前記第ｋのサブ画素群の配置を制御し、前記第ｋの画素から前記第ｋの０次光を出射させない場合に、前記第ｋのサブ画素群が回折格子を構成するように前記第ｋのサブ画素群の配置を制御する、変換装置。
【請求項６】
請求項１から請求項４の何れか１つの請求項に記載の変換装置であって、
前記第１から第ｎまでの特定次光は、それぞれ第１から第ｎまでの１次回折光であり、
前記処理は、前記第１から第ｎまでの画素に含まれる第ｋの画素から第ｋの１次回折光を出射させる場合に、第ｋのサブ画素群が回折格子を構成するように前記第ｋのサブ画素群の配置を制御し、前記第ｋの画素から前記第ｋの１次回折光を出射させない場合に、前記第ｋのサブ画素群が回折格子を構成しないように前記第ｋのサブ画素群の配置を制御する、変換装置。
【請求項７】
請求項１から請求項６の何れか１つの請求項に記載の変換装置であって、
ｉが１からｎまでの整数の各々である場合について、第ｉのサブ画素群は、前記ライン光を反射する第ｉの反射面群をそれぞれ有し、
前記処理は、前記第１から第ｎまでの画素に含まれる第ｍの画素から出射する第ｍの特定次光の位相を変化させる場合に、第ｍの反射面群と垂直をなす方向についての第ｍのサブ画素群の位置が変化するように前記第ｍのサブ画素群の配置を制御する、変換装置。
【請求項８】
請求項１から請求項７の何れか１つの請求項に記載の変換装置であって、
前記光学系は、
前記第１から第ｎまでの光を透過させ、前記第１から第ｎまでの特定次光を共通位置に導くフーリエ変換レンズと、
前記共通位置に配置され前記第１から第ｎまでの特定次光を選択的に通過させる通過部が形成される空間フィルターと、
前記第１から第ｎまでの特定次光が前記通過部を通過した後に前記第１から第ｎまでの特定次光を透過させ前記第１から第ｎまでの特定次光を共通方向に進ませる逆フーリエ変換レンズと、
前記第１から第ｎまでの特定次光が前記逆フーリエ変換レンズを透過した後に前記第１から第ｎまでの特定次光をそれぞれ透過させ前記第１から第ｎまでの特定次光をそれぞれフォーカスさせる第１から第ｎまでのシリンドリカルレンズと、
前記第１から第ｎまでの特定次光が前記第１から第ｎまでのシリンドリカルレンズをそれぞれ透過した後に前記第１から第ｎまでの特定次光を透過させ前記第１から第ｎまでの特定次光を前記被照明位置に導く対物レンズと、
を備える、変換装置。
【請求項９】
請求項１から請求項８の何れか１つの請求項に記載の変換装置であって、
前記空間光変調器は、グレーティングライトバルブであり、
ｉが１からｎまでの整数の各々である場合について、第ｉのサブ画素群は、前記ライン光を反射する第ｉのリボン群をそれぞれ備え、前記第ｉのサブ画素群の配置は、それぞれ前記第ｉのリボン群の配置である、変換装置。
【請求項１０】
請求項１から請求項９の何れか１つの請求項に記載の変換装置と、
コヒーレント光を放射する光源と、
前記コヒーレント光を前記ライン光に変換するアナモルフィック光学系と、
を備える構造化光シートまたは旋回光シートを生成する、照明装置。
【請求項１１】
請求項１０に記載の照明装置と、
前記構造化光シートまたは前記旋回光シートにより照明される試料の断層をイメージングするイメージング装置と、
を備える、光シート蛍光顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光シート蛍光顕微鏡およびこれに関連する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ライフサイエンス分野においては、光シート蛍光顕微鏡が広く使用されるようになってきており、光シート蛍光顕微鏡の改良も活発に行われている。
【０００３】
光シート蛍光顕微鏡により生体試料が観察される場合は、生体試料が蛍光色素により標識され、標識された生体試料がシート状の照明光により側方から照明され、照明された部分から発せられる蛍光が受光される。これにより、照明された部分の断層像が高速に取得される。
【０００４】
しかし、試料を側方から照明する技術は、改良すべき点を有する。
【０００５】
第１の改良すべき点は、従来の技術においては、広い実視野（ＦＯＶ）および高いＺ方向分解能を両立できない点である。一般的な光シート蛍光顕微鏡においては、レーザーが光源として用いられ、レーザーにより放射されるレーザービームがシート状にフォーカスされ光シートが生成される。光シートは、回折の効果により、フォーカス位置において厚さ方向に有限の広がりを有する。光シート蛍光顕微鏡の厚さ方向分解能は、光シートのビームウェストサイズで決まるため、光シートのビームウェストを小さくすることにより向上する。しかし、光シートのビームウェストを小さくした場合は、フォーカス位置から離れるにしたがってビームサイズが急激に広がり、その結果として均一な厚さ方向分解能を有するＦＯＶが小さくなる。このため、光シート蛍光顕微鏡においては、通常は、所望のＦＯＶの内部においてビームの広がりが均一になりＺ方向分解能が均一になるように光シートのビームウェストが調整される。したがって、一般的な光シート蛍光顕微鏡においては、Ｚ方向分解能が犠牲にされている。
【０００６】
また、光シート蛍光顕微鏡においては、観察用対物レンズの光軸が照明用対物レンズの光軸と垂直をなすように観察用対物レンズが観察用に配置される。この観察用対物レンズの被写界深度（ＤＯＦ）は、通常は、所望のＦＯＶの内部においてＺ方向分解能が均一になるように調整された光シートのビームウェストより小さい。このため、ＤＯＦの外部から発せられる蛍光は、良好に結像せず、サンプルの構造情報を明確に示さないぼけ像を形成し、バックグラウンド光となり、最終的に取得される最終画像のコントラストを劣化させる。
【０００７】
さらに、高い散乱性を有する試料が観察される場合は、ＤＯＦの外部から発せられる蛍光だけでなく散乱光も、バックグラウンド光となり、最終的に取得される画像のコントラストを劣化させる。このため、高い散乱性を有する試料の高コントラスト画像を取得することは困難である。
【０００８】
第２の改良すべき点は、影ができることである。光シート蛍光顕微鏡においては、試料が側方から照明されるため、試料の内部に強い吸収を有する部分が存在する場合は、当該部分の背後に照明光が到達せず、影ができる。影には照明光が到達しないため、影においては蛍光標識が励起されず、最終的に取得される最終画像に当該影がアーティフィクトとして残る。
【０００９】
上記の第１および第２の改良すべき点を改良するために、構造化照明および旋回照明が、これまでに提案され実証されている。特許文献１および２ならびに非特許文献１，２および３は、その例である。
【００１０】
構造化照明を有する光シート蛍光顕微鏡においては、正弦波状の強度分布を有するが互いに異なる３個以上の位相をそれぞれ有する３種類以上の光シートにより試料が照明される。また、３種類以上の光シートにより試料が照明されている間に３個以上の画像がそれぞれ取得される。さらに、取得された３個以上の画像に簡単な画像処理が行われ、ぼけ画像を形成するバックグラウンド光が除去され、高いコントラストを有する最終画像が取得される。非特許文献１および２に記載された技術は、その例である。
【００１１】
旋回照明を有する光シート蛍光顕微鏡においては、互いに異なる伝搬角度を有する２個以上の光シートにより試料が連続的に照明される。これにより、強い吸収を有する部分の背後に照明光が到達し、シャドーの影響が抑制される。特許文献１および非特許文献３に記載された技術は、その例である。旋回照明の技術は、光シート蛍光顕微鏡に特有のものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第８９７０９５０号明細書
【特許文献２】米国特許第９２２３１２５号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】ケラー（Keller）、他５名、「走査光シートに基づく構造化照明顕微鏡による動物の発生の高速で高コントラストなイメージング（Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy）」、ネイチャー・メソッド（Nature Methods）、（米国）、２０１０年、第７巻、第８号、p.637―642
【非特許文献２】チェン（Chen）、他２５名、「格子光シート顕微鏡：高い時空分解能における分子から杯までのイメージング（Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution）」、サイエンス（Science）、（米国）、２０１５年、第３４６巻、第６２０８号、p.1257998-1―1257998-12
【非特許文献３】フイスケン（Huisken）、他１名、「多方向性選択平面照明顕微鏡法（ｍＳＰＩＭ）による均一蛍光励起（Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM)）」、オプティックス・レターズ（Optics Letters）（米国）、２００７年、第３２巻、第１７号、p.2608―2610
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
特許文献２および非特許文献２に記載された技術に代表される構造化照明を有する光シート蛍光顕微鏡においては、正弦波状の強度分布を有する光シートを生成するために、反射型液晶素子空間光変調器（ＬＣＯＳ−ＳＬＭ）が使用される。また、強度分布の位相をシフトさせるために、ガルバノミラーが使用される。したがって、強度分布の位相シフト速度は、ガルバノミラーの走査速度により制限される。一方、ガルバノミラーの走査速度は、せいぜい数１０ｋＨｚである。したがって、当該光シート蛍光顕微鏡においては、画像の取得を高速化することが難しい。
【００１５】
非特許文献１に記載された非コヒーレント構造化照明顕微鏡を有するデジタル走査レーザー光シート蛍光顕微鏡（ＤＳＬＭ−ＳＩ）においては、擬似的な光シートを生成するために、線状にフォーカスされたレーザービームが観察用対物レンズの焦点面においてガルバノミラーにより走査される。また、構造化照明を生成するために、レーザービームの走査と同期してレーザービームが音響光変調器（ＡＯＭ）により高速に時間的強度変調される。ＡＯＭの変調速度は、通常は数ＭＨｚ程度である。構造化照明の周波数は、ＡＯＭの変調速度が高速であっても、フォーカスされたビームウェストのサイズにより制限される。構造化照明の周波数は、断層能力を決定する重要なパラメータであり、構造化照明の周波数が高くなるほど断層能力は向上する。このため、構造化照明の周波数がフォーカスされたビームウェストのサイズにより制限されることは、断層能力の向上を阻害しがちである。また、ＤＳＬＭ−ＳＩにおいては、ＡＯＭによる変調をガルバノミラーによる走査と同期させる必要があること等のために、システムが複雑になりがちである。
【００１６】
非特許文献３に記載された旋回照明に代表される旋回照明においては、光シートの伝搬方向を切り替えるために、ガルバノミラーが使用される。したがって、伝搬方向を切り返る速度は、ガルバノミラーの走査速度により制限される。一方、ガルバノミラーの走査速度は、せいぜい数１０ｋＨｚである。旋回照明においては、画像の取得を高速化することが難しい。
【００１７】
上記のように、従来の構造化照明および旋回照明は、画像の取得を高速化することが難しいという問題を有する。また、従来の構造化照明は、構造化照明の周波数を高くすることが難しいという問題を有する。
【００１８】
本発明は、これらの問題を解決するためになされる。本発明が解決しようとする課題は、画像の取得の高速化および構造化照明または旋回照明による画質の向上を両立できる変換装置、照明装置および光シート蛍光顕微鏡を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、ライン光を構造化光シートまたは旋回光シートに変換する変換装置に関する。
【００２０】
変換装置は、空間光変調器、光学系および制御部を備える。
【００２１】
空間光変調器は、第１から第ｎまでの画素を備える。ｎは、２以上の整数である。第１から第ｎまでの画素は、第１から第ｎまでのサブ画素群をそれぞれ備える。
【００２２】
第１から第ｎまでの画素にライン光が入射した場合には、第１から第ｎまでの画素から第１から第ｎまでの光がそれぞれ出射する。第１から第ｎまでの光は、第１から第ｎまでの特定次光をそれぞれ含むことができる。第１から第ｎまでの特定次光の強度および位相は、第１から第ｎまでのサブ画素群の配置にそれぞれ応じる。
【００２３】
光学系は、第１から第ｎまでの光から第１から第ｎまでの特定次光をそれぞれ抽出し、第１から第ｎまでの特定次光を第１から第ｎまでの光シートにそれぞれ変換し、第１から第ｎまでの光シートを被照明位置に生成する。
【００２４】
制御部は、構造化光シートまたは旋回光シートが被照明位置に生成されるように第１から第ｎまでのサブ画素群の配置を制御する。
【００２５】
本発明は、上記の変換装置を備え構造化光シートまたは旋回光シートを生成する照明装置にも向けられる。また、本発明は、当該照明装置を備える光シート蛍光顕微鏡にも向けられる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、構造化照明または旋回照明において必要になる照明プロファイルの制御が高速な空間光変調器により実現される。このため、光シート蛍光顕微鏡において、画像の取得の高速化および構造化照明または旋回照明による画質の向上を両立できる。
【００２７】
この発明の目的、特徴、局面、および利点は、以下の詳細な説明と添付図面とによって、より明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡の断面を図示する模式図である。
【図２】第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡に備えられる変換装置を図示する斜視図である。
【図３】第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡に備えられるグレーティングライトバルブ（ＧＬＶ）の断面を図示する模式図である。
【図４】第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡に備えられるサブ画素の無変調時の一断面における配置を図示する模式図である。
【図５】第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡に備えられるサブ画素の位相変調時の一断面における配置を図示する模式図である。
【図６】第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡に備えられるサブ画素の振幅変調時の一断面における配置を図示する模式図である。
【図７】第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡において構造化照明が行われる場合の０次光の光路を図示する斜視図である。
【図８】第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡において構造化照明が行われる場合の一断面における０次光の光路を図示する模式図である。
【図９】第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡において旋回照明が行われる場合の０次光の光路を図示する斜視図である。
【図１０】第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡において旋回照明が行われる場合の一断面における０次光の光路を図示する模式図である。
【図１１】第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡に備えられる仮想画素に印加される電圧による当該仮想画素から出射する０次光の正規化された振幅の変化を図示するグラフである。
【図１２】第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡により取得された試料の画像を図示する図である。
【図１３】第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡により取得された試料の画像における距離による正規化された強度の変化を図示するグラフである。
【図１４】第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡により取得されたＧＦＰ標識されたマウス脂肪組織の光断層像を図示する図である。
【図１５】第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡により取得されたＧＦＰ標識されたマウス脂肪組織の光断層像における距離による正規化された強度の変化を図示するグラフである。
【図１６】第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡によりＧＦＰ標識されたマウス脂肪組織の光断層像を取得する場合の平行移動の仕組みを図示する模式図である。
【図１７】第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡により取得されたＧＦＰ標識されたマウス骨格筋の光断層像を図示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
＜１．光シート蛍光顕微鏡＞
図１は、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡の断面を図示する模式図である。図１は、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡に固定されるｘｙｚ直交座標系を示す座標軸も図示する。
【００３０】
図１に図示される光シート蛍光顕微鏡１０００は、照明装置１０２０、試料室１０２１およびイメージング装置１０２２を備える。光シート蛍光顕微鏡１０００がこれらの構成物以外の構成物を備えてもよい。
【００３１】
光シート蛍光顕微鏡１０００により試料１０４０が観察される場合は、試料１０４０が蛍光色素により標識され、標識された試料１０４０が試料室１０２１に形成される空間１０５０に収容される。また、照明装置１０２０が、収容された試料１０４０をｘｙ平面と平行をなす光シート１０５５によりｘ方向から照明する。光シート１０５５は、シート状の照明光であり、蛍光色素を励起する励起光となる。このため、試料１０４０が光シート１０５５により照明された場合は、試料１０４０の断層が光シート１０５５により照明され、試料１０４０の断層にある蛍光色素が励起され、試料１０４０の断層にある蛍光色素から蛍光１０５７が発せられる。さらに、イメージング装置１０２２が、収容された試料１０４０をｚ方向から撮像し、発せられた蛍光１０５７を受光し、試料１０４０の断層をイメージングする。
【００３２】
光シート１０５５は、構造化光シートまたは旋回光シートである。構造化光シートにおいては、構造化光シートの広がり方向の位置により構造化光シートの強度が変化する。旋回光シートにおいては、旋回光シートの伝搬方向が時間により変化する。
【００３３】
＜２．照明装置＞
照明装置１０２０は、図１に図示されるように、レーザー１０６０、アナモルフィック光学系１０６１および変換装置１０６２を備える。照明装置１０２０がこれらの構成物以外の構成物を備えてもよい。
【００３４】
レーザー１０６０は、レーザービーム１０８０を放射する。アナモルフィック光学系１０６１は、レーザービーム１０８０をライン光１１００に変換する。変換装置１０６２は、ライン光１１００を光シート１０５５に変換する。これにより、照明装置１０２０は、構造化光シートまたは旋回光シートである光シート１０５５を生成し、構造化光シートまたは旋回光シートにより構造化照明または旋回照明をそれぞれ行う。
【００３５】
＜３．レーザー＞
レーザー１０６０は、半導体固体励起レーザーであり、レーザービーム１０８０は、波長４７３ｎｍのコヒーレント光である。波長４７３ｎｍのコヒーレント光を放射する半導体固体励起レーザーであるレーザー１０６０がコヒーレント光を放射する他の種類の光源に置き換えられてもよい。
【００３６】
＜４．アナモルフィック光学系＞
アナモルフィック光学系１０６１は、図１に図示されるように、ミラー１１２０、ミラー１１２１、テレスコープ１１２２、ミラー１１２３およびシリンドリカルレンズ１１２４を備える。テレスコープ１１２２は、球面レンズ１１４０および１１４１を備える。アナモルフィック光学系１０６１がこれらの構成物以外の構成物を備えてもよい。
【００３７】
レーザー１０６０により放射されるレーザービーム１０８０は、ミラー１１２０に反射され、ミラー１１２０に反射された後にミラー１１２１にさらに反射され、ミラー１１２１に反射された後にテレスコープ１１２２を透過し、テレスコープ１１２２を透過した後にミラー１１２３に反射され、ミラー１１２３に反射された後にシリンドリカルレンズ１１２４を透過する。
【００３８】
テレスコープ１１２２は、ビームエキスパンダとも呼ばれる。レーザービーム１０８０がテレスコープ１１２２を透過する際には、レーザービーム１０８０がテレスコープ１１２２により拡大される。テレスコープ１１２２により拡大された後のレーザービーム１０８０の径は、テレスコープ１１２２により拡大される前のレーザービーム１０８０の径より大きい。例えば、テレスコープ１１２２の倍率が２倍であり、テレスコープ１１２２により拡大される前のレーザービーム１０８０の径が２ｍｍである場合は、テレスコープ１１２２により拡大された後のレーザービーム１０８０の径は４ｍｍである。
【００３９】
シリンドリカルレンズ１１２４は、レーザービーム１０８０がシリンドリカルレンズ１１２４を透過する際に、レーザービーム１０８０を線状にフォーカスさせ、線状のライン光１１００を生成し、レーザービーム１０８０をライン光１１００に変換する。
【００４０】
ミラー１１２０、ミラー１１２１、テレスコープ１１２２およびミラー１１２３が省略されてもよい。
【００４１】
＜５．変換装置＞
図２は、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡に備えられる変換装置を図示する斜視図である。図２は、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡に固定されるｘｙｚ直交座標系を示す座標軸も図示する。図３は、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡に備えられるグレーティングライトバルブ（ＧＬＶ（登録商標））の断面を図示する模式図である。
【００４２】
変換装置１０６２は、図１および図２に図示されるように、ＧＬＶ１１８０、光学系１１８１および制御部１１８２を備える。変換装置１０６２がこれらの構成物以外の構成物を備えてもよい。
【００４３】
変換装置１０６２がライン光１１００を光シート１０５５に変換する場合は、ＧＬＶ１１８０上に線状のライン光１１００が生成されたときに、ＧＬＶ１１８０から０次光１１１５を含む光１１１０が出射する。また、光学系１１８１が、出射した光１１１０から０次光１１１５を抽出し、抽出した０次光１１１５を光シート１１１８に変換し、光シート１１１８を被照明位置１２００に生成する。さらに、制御部１１８２が、構造化光シートまたは旋回光シートである光シート１０５５が被照明位置１２００に生成されるようにＧＬＶ１１８０を制御する処理を行う。ＧＬＶ１１８０から０次光１１１５を含む光１１１０が出射し、光学系１１８１が０次光１１１５を抽出し０次光１１１５を光シート１１１８に変換することに代えて、ＧＬＶ１１８０から０次光以外の特定次光を含む光が出射し、光学系１１８１が特定次光を抽出し特定次光を光シートに変換することも許される。例えば、ＧＬＶ１１８０から互いに異なる方向に進む２個の１次回折光を含む光が出射し、光学系１１８１が２個の１次回折光の一方を抽出し２個の１次回折光の一方を光シートに変換することも許される。
【００４４】
＜６．ＧＬＶ＞
ＧＬＶ１１８０は、位相型の空間光変調器であり、図３に図示されるように、基板１２２０を備え、仮想画素１２４１，１２４２，１２４３，１２４４および１２４５を備える。仮想画素１２４１，１２４２，１２４３，１２４４および１２４５の各々である各仮想画素１２６０は、サブ画素１２８１，１２８２，１２８３，１２８４，１２８５および１２８６を備える。ＧＬＶ１１８０がこれらの構成物以外の構成物を備えてもよい。５個の仮想画素１２４１，１２４２，１２４３，１２４４および１２４５が２個以上４個以下または６個以上の仮想画素に置き換えられてもよい。６個のサブ画素１２８１，１２８２，１２８３，１２８４，１２８５および１２８６からなるサブ画素群が、２個以上５個以下または７個以上のサブ画素からなるサブ画素群に置き換えられてもよい。
【００４５】
仮想画素１２４１，１２４２，１２４３，１２４４および１２４５は、ライン光１１００が延在する方向に配列される。サブ画素１２８１，１２８２，１２８３，１２８４，１２８５および１２８６は、ライン光１１００が延在する方向に配列される。したがって、各仮想画素１２６０には、ライン光１１００が入射し、各仮想画素１２６０に備えられるサブ画素１２８１，１２８２，１２８３，１２８４，１２８５および１２８６の各々である各サブ画素１３００には、ライン光１１００が入射する。
【００４６】
各仮想画素１２６０にライン光１１００が入射した場合には、各仮想画素１２６０が入射したライン光１１００を反射または回折し、各仮想画素１２６０から光が出射する。各仮想画素１２６０から出射する光に含まれる０次光の強度および位相ならびに１次回折光の強度および位相は、各仮想画素１２６０に備えられる各サブ画素１３００の配置に応じたものとなる。
【００４７】
各サブ画素１３００は、リボン１３２０を備える。リボン１３２０の反射面１３４０は、ライン光１１００を反射する。リボン１３２０は、微小な梁であり、リボン１３２０と基板１２２０との間に印加される電位差に応じて反射面１３４０と垂直をなす方向に変位し、変位の大きさに応じて反射面１３４０により反射された光の位相を変化させる。したがって、リボン１３２０は、リボン１３２０と基板１２２０との間に印加される電位差に応じて反射面１３４０により反射された光の位相を変化させる。このため、各仮想画素１２６０から出射する光に含まれる０次光の強度および位相ならびに１次回折光の強度および位相は、各仮想画素１２６０に備えられる６個のリボン１３２０の配置に応じたものとなる。
【００４８】
＜７．サブ画素の配置＞
図４は、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡に備えられるサブ画素の無変調時の一断面における配置を図示する模式図である。図５は、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡に備えられるサブ画素の位相変調時の一断面における配置を図示する模式図である。図６は、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡に備えられるサブ画素の振幅変調時の一断面における配置を図示する模式図である。
【００４９】
図４に図示される無変調時の配置によれば、各仮想画素１２６０に備えられる各サブ画素１３００が無変調時位置１３４７に配置され、サブ画素１２８１，１２８２，１２８３，１２８４，１２８５および１２８６の反射面１３４０が同一平面を構成する。この場合は、サブ画素１２８１，１２８２，１２８３，１２８４，１２８５および１２８６が回折格子を構成せず、各仮想画素１２６０にライン光１１００が入射した場合に各仮想画素１２６０から出射する光１３５０に０次光１３６０が含まれるが１次回折光が含まれない。
【００５０】
図５に図示される位相変調時の配置によれば、各仮想画素１２６０に備えられる各サブ画素１３００が無変調時位置１３４７から変位するが、サブ画素１２８１，１２８２，１２８３，１２８４，１２８５および１２８６の反射面１３４０が同一平面を構成する。この場合も、サブ画素１２８１，１２８２，１２８３，１２８４，１２８５および１２８６が回折格子を構成せず、各仮想画素１２６０にライン光１１００が入射した場合に各仮想画素１２６０から出射する光１３８０に０次光１４００が含まれるが１次回折光が含まれない。０次光１４００の位相は、各サブ画素１３００の無変調時位置１３４７からの変位に応じて変化する。
【００５１】
図６に図示される振幅変調時の配置によれば、各仮想画素１２６０に備えられるサブ画素１２８２，１２８４および１２８６が無変調時位置１３４７に配置され、サブ画素１２８２，１２８４および１２８６の反射面１３４０が同一平面を構成し、各仮想画素１２６０に備えられるサブ画素１２８１，１２８３および１２８５が無変調時位置１３４７から変位し、サブ画素１２８１，１２８３および１２８５の反射面１３４０が当該同一平面から離れた同一平面を構成する。したがって、サブ画素１２８１，１２８２，１２８３，１２８４，１２８５および１２８６の反射面１３４０は、周期的な凹凸を構成する。この場合は、サブ画素１２８１，１２８２，１２８３，１２８４，１２８５および１２８６が回折格子を構成し、サブ画素１２８１，１２８３および１２８５の無変調時位置１３４７からの変位がライン光１１００の波長の４分の１に近づくほど各仮想画素１２６０から出射する光１４２０に含まれる０次光１４４０の強度が小さくなり各仮想画素１２６０から出射する光１４２０に含まれる１次回折光１４４１の強度が大きくなる。
【００５２】
振幅変調時または位相変調時の配置において０次光の強度を微調整するために、各仮想画素１２６０に備えられるサブ画素１２８１，１２８２，１２８３，１２８４，１２８５および１２８６がごく浅い位相深さを有する回折格子を構成してもよい。
【００５３】
＜８．光学系＞
光学系１１８１は、図１および２に図示されるように、球面レンズ１４６０、スリット板１４６１、シリンドリカルレンズ１４６２、レンチキュラーレンズ１４６３、テレスコープ１４６４および照明対物レンズ１４６５を備える。レンチキュラーレンズ１４６３は、レンチキュラーレンズ素子１４８１，１４８２，１４８３，１４８４および１４８５を備える。テレスコープ１４６４は、球面レンズ１５００および１５０１を備える。
【００５４】
仮想画素１２４１，１２４２，１２４３，１２４４および１２４５からは、第１から第５までの光がそれぞれ出射する。出射した第１から第５までの光にそれぞれ含まれる第１から第５までの０次光は、共通方向であるｘ方向に進む。第１から第５までの光は、球面レンズ１４６０を透過した後にスリット板１４６１に入射する。スリット板１４６１からは、第１から第５までの光にそれぞれ含まれる第１から第５までの０次光のみが出射する。第１から第５までの０次光は、シリンドリカルレンズ１４６２を透過し、シリンドリカルレンズ１４６２を透過した後にレンチキュラーレンズ１４６３を透過し、レンチキュラーレンズ１４６３を透過した後にテレスコープ１４６４を透過し、テレスコープ１４６４を透過した後に照明対物レンズ１４６５を透過する。
【００５５】
第１から第５までの光の光路の位置は、ｚ方向については互いに同じであるが、ｙ方向については互いに異なる。第１から第５までの０次光の光路の位置も、ｚ方向については互いに同じであるが、ｙ方向については互いに異なる。
【００５６】
ＧＬＶ１１８０は、球面レンズ１４６０の前側焦点面上に配置される。スリット板１４６１は、球面レンズ１４６０の後側焦点面上に配置される。球面レンズ１４６０は、フーリエ変換レンズであり、第１から第５までの光に対してフーリエ変換を行う。このため、球面レンズ１４６０は、第１から第５までの０次光を球面レンズ１４６０の後側焦点面上にありスリット１５６０が配置される共通位置１５２０に導き、第１から第５までの光にそれぞれ含まれる第１から第５までの高次回折光を共通位置１５２０とは異なる位置に導く。
【００５７】
スリット板１４６１は、遮蔽部１５４０を備える。スリット板１４６１には、スリット１５６０が形成される。スリット１５６０は、遮蔽部１５４０に囲まれる。スリット１５６０は、第１から第５までの０次光が導かれる共通位置１５２０に配置される。このため、第１から第５までの０次光は、球面レンズ１４６０を透過した後にスリット１５６０を通過し、第１から第５までの高次回折光は、球面レンズ１４６０を透過した後に遮蔽部１５４０に遮蔽される。したがって、スリット板１４６１は、共通位置１５２０に導かれる第１から第５までの０次光を抽出し、共通位置１５２０に導かれない第１から第５までの高次回折光を除去する空間フィルターであり、スリット１５６０は、共通位置１５２０に導かれる第１から第５までの０次光を選択的に通過させる通過部である。板状の空間フィルターであるスリット板１４６１が板状でない空間フィルターに置き換えられてもよい。第１から第５までの光にそれぞれ含まれる第１から第５までの１次回折光が抽出される場合は、第１から第５までの１次回折光が導かれる共通位置にスリット１５６０が配置される。
【００５８】
第１から第５までの０次光の強度は、それぞれ仮想画素１２４１，１２４２，１２４３，１２４４および１２４５においてサブ画素１２８１，１２８３および１２８５の無変調時位置１３４７からの変位がライン光１１００の波長の４分の１に近づくほど小さくなる。このため、第１から第５までの光から第１から第５までの０次光がそれぞれ抽出されることにより、ＧＬＶ１１８０により振幅変調された光が得られる。
【００５９】
球面レンズ１４６０およびスリット板１４６１によれば、第１から第５までの０次光が、第１から第５までの光からそれぞれ抽出され、第１から第５までの高次回折光が、第１から第５までの光からそれぞれ除去される。
【００６０】
スリット板１４６１は、シリンドリカルレンズ１４６２の前側焦点面上に配置される。レンチキュラーレンズ１４６３の入射面は、シリンドリカルレンズ１４６２の後側焦点面上に配置される。シリンドリカルレンズ１４６２は、ｙ方向についての逆フーリエ変換レンズであり、第１から第５までの０次光に対して逆フーリエ変換を行う。このため、シリンドリカルレンズ１４６２は、第１から第５までの０次光がスリット１５６０を通過した後に第１から第５までの０次光を透過させ第１から第５までの０次光を共通方向であるｘ方向に進ませる。
【００６１】
シリンドリカルレンズ１４６２によれば、第１から第５までの０次光が再び共通方向であるｘ方向に進むようになる。
【００６２】
レンチキュラーレンズ素子１４８１，１４８２，１４８３，１４８４および１４８５は、仮想画素１２４１，１２４２，１２４３，１２４４および１２４５にそれぞれ対応し、第１から第５までの光にそれぞれ対応する。したがって、第１から第５までの０次光は、レンチキュラーレンズ１４６３を透過する際に、レンチキュラーレンズ素子１４８１，１４８２，１４８３，１４８４および１４８５をそれぞれ透過する。仮想画素１２４１，１２４２，１２４３，１２４４および１２４５は、第１から第５までの０次光の各々が隣接する２個のレンチキュラーレンズ素子にまたがることないように配置される。
【００６３】
レンチキュラーレンズ素子１４８１，１４８２，１４８３，１４８４および１４８５の各々はシリンドリカルレンズである。レンチキュラーレンズ素子１４８１，１４８２，１４８３，１４８４および１４８５は、ｙ方向に配列され、第１から第５までの０次光をｙ方向についてそれぞれフォーカスさせ、ライン状にフォーカスさせる。
【００６４】
互いに結合された５個のシリンドリカルレンズ１４８１，１４８２，１４８３，１４８４および１４８５からなるレンチキュラーレンズ１４６３が、互いに結合されていない５個のシリンドリカルレンズに置き換えられてもよい。
【００６５】
レンチキュラーレンズ１４６３の入射面およびＧＬＶ１１８０は、ｙ方向について結像関係にある。このため、第１から第５までの０次光の各々は、ｚ方向については平行光になっている。
【００６６】
テレスコープ１４６４は、ビームエキスパンダとも呼ばれ、第１から第５までの０次光の各々を拡大する。テレスコープ１４６４が省略されてもよい。
【００６７】
照明対物レンズ１４６５は、第１から第５までの０次光を照明対物レンズ１４６５の後側焦点面上にある被照明位置１２００に導く。照明対物レンズ１４６５は、被照明位置１２００に第１から第５までの０次光がフォーカスさせられるように構成され配置される。
【００６８】
レンチキュラーレンズ１４６３および照明対物レンズ１４６５によれば、第１から第５までの０次光が第１から第５までの光シートにそれぞれ変換され、被照明位置１２００に第１から第５までの光シートが生成される。
【００６９】
＜９．振幅変調および位相変調のための制御＞
制御部１１８２によるＧＬＶ１１８０の制御においては、各仮想画素１２６０から０次光を出射させる場合には、各仮想画素１２６０に備えられるサブ画素１２８１，１２８２，１２８３，１２８４，１２８５および１２８６が回折格子を構成しないように各サブ画素１３００の配置が制御される。また、制御部１１８２によるＧＬＶ１１８０の制御においては、各仮想画素１２６０から０次光を出射させない場合には、各仮想画素１２６０に備えられるサブ画素１２８１，１２８２，１２８３，１２８４，１２８５および１２８６が回折格子を構成するように各サブ画素１３００の配置が制御される。
【００７０】
また、制御部１１８２によるＧＬＶ１１８０の制御においては、各仮想画素１２６０から１次回折光を出射させる場合には、各仮想画素１２６０に備えられるサブ画素１２８１，１２８２，１２８３，１２８４，１２８５および１２８６が回折格子を構成するように各サブ画素１３００の配置が制御される。また、制御部１１８２によるＧＬＶ１１８０の制御においては、各仮想画素１２６０から１次回折光を出射させない場合には、各仮想画素１２６０に備えられるサブ画素１２８１，１２８２，１２８３，１２８４，１２８５および１２８６が回折格子を構成しないように各サブ画素１３００の配置が制御される。
【００７１】
また、制御部１１８２によるＧＬＶ１１８０の制御においては、各仮想画素１２６０から出射する０次光の位相を変化させる場合には、各仮想画素１２６０に備えられる各サブ画素１３００の反射面１３４０と垂直をなす方向についての当該各サブ画素１３００の位置が変化するように当該各サブ画素１３００の配置が制御される。
【００７２】
＜１０．構造化照明のための制御＞
図７は、第１実施形態の光シート顕微鏡において構造化照明が行われる場合の０次光の光路を図示する斜視図である。図８は、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡において構造化照明が行われる場合の一断面における０次光の光路を図示する模式図である。図２に図示される光路も、第１実施形態の光シート顕微鏡において構造化照明が行われる場合のものである。
【００７３】
構造化照明が行われる場合は、図７および８に図示されるように、制御部１１８２によるＧＬＶ１１８０の制御において、一時に仮想画素１２４１，１２４２，１２４３，１２４４および１２４５に含まれる２個の仮想画素１２４２および１２４４から第２の０次光１５８１および第４の０次光１５８２がそれぞれ出射するように、仮想画素１２４２および１２４４に備えられる各サブ画素１３００の配置が制御される。
【００７４】
また、仮想画素１２４２および１２４４から０次光１５８１および１５８２がそれぞれ出射している間に仮想画素１２４１，１２４３および１２４５から第１の０次光、第３の０次光および第５の０次光がそれぞれ出射しないように仮想画素１２４１，１２４３および１２４５に備えられる各サブ画素１３００の配置が制御される。
【００７５】
これにより、２個の光シート１６０１および１６０２が被照明位置１２００に生成される。光シート１６０１および１６０２の伝搬方向は、互いに異なる。光シート１６０１および１６０２は互いに干渉し、干渉パターンが形成される。干渉パターンは光シート１６０１および１６０２の広がり方向の位置による明るさの変化を提供するので、干渉パターンが形成された場合は、構造化光シート１６２０が被照明位置１２００に生成される。
【００７６】
仮想画素１２４２および１２４４から第２の０次光１５８１および第４の０次光１５８２をそれぞれ出射させ、仮想画素１２４１、１２４３および１２４５から第１の０次光、第３の０次光および第５の０次光をそれぞれ出射させない制御が、他の制御に置き換えられてもよい。当該他の制御においては、第１から第５までの仮想画素１２４１，１２４２，１２４３，１２４４および１２４５に含まれる任意の２個の仮想画素である第ｉ１および第ｉ２の仮想画素から第ｉ１および第ｉ２の０次光をそれぞれ出射させ、残余の第ｉ３、第ｉ４および第ｉ５の仮想画素から第ｉ３、第ｉ４および第ｉ５の０次光をそれぞれ出射させない制御が行われる。整数ｉ１およびｉ２の組み合わせは整数２および４の組み合わせと異なる。後述する「１１．旋回照明のための制御」の欄において説明するように第ｉ１および第ｉ２の仮想画素が循環的に切り替えられ、旋回光シートでもある構造化光シートが被照明位置１２００に生成されてもよい。
【００７７】
５個の仮想画素１２４１，１２４２，１２４３，１２４４および１２４５が２個の仮想画素に置き換えられる場合は、構造化照明が行われる場合に０次光を出力しない仮想画素が存在しなくなる。
【００７８】
また、構造化照明が行われる場合は、制御部１１８２によるＧＬＶ１１８０の制御において、仮想画素１２４２および１２４４から０次光１５８１および１５８２がそれぞれ出射している間に０次光１５８１および１５８２の間の位相差が変化するように、仮想画素１２４２および１２４４に備えられる各サブ画素１３００の配置が制御される。これにより、構造化光シート１６２０の強度分布の位相が変化させられる。０次光１５８１および１５８２の間の位相差の変化は、０次光１５８１および１５８２の一方の位相を変化させることにより実現されてもよいし、０次光１５８１および１５８２の両方の位相を変化させることにより実現されてもよい。
【００７９】
構造化光シート１６２０の強度分布の周波数は、０次光１５８１および１５８２をそれぞれ透過させるレンチキュラーレンズ素子１４８２および１４８４の間隔により調整される。
【００８０】
光シート１６０１および１６０２の各々がｚ方向に無限に広がるという単純な仮定が採用された場合は、構造化光シート１６２０の強度分布は、式（１）で表される。
【００８１】
【数１】
2018055082.tif 000003
【００８２】
Ａは、光シート１６０１および１６０２の振幅を示す。ｋ１およびｋ２は、光シート１６０１および１６０２の各々と角度θをなす面に存在する波数ベクトルを示す。角度θは、光シート１６０１が光シート１６０２となす角度２θの半分である。ｋ１およびｋ２は、ｋ１＝（ｋｃｏｓθ，ｋｓｉｎθ，０）およびｋ２＝（ｋｃｏｓθ，−ｋｓｉｎθ，０）でそれぞれ表される。φは、光シート１６０１と光シート１６０２との間の位相差を示す。
【００８３】
式（１）は、構造化光シート１６２０の強度分布の位相が光シート１６０１と光シート１６０２との間の位相差により制御されることを示す。
【００８４】
＜１１．旋回照明のための制御＞
図９は、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡において旋回照明が行われる場合の０次光の光路を図示する斜視図である。図１０は、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡において旋回照明が行われる場合の一断面における０次光の光路を図示する模式図である。
【００８５】
旋回照明が行われる場合は、図９および１０に図示されるように、制御部１１８２によるＧＬＶ１１８０の制御において、第１から第５までの仮想画素１２４１，１２４２，１２４３，１２４４および１２４５に含まれる１個の仮想画素である第ｊ１の仮想画素から第ｊ１の０次光１６４０が出射するように第ｊ１の仮想画素に備えられる各サブ画素１３００の配置が制御される。
【００８６】
また、第ｊ１の仮想画素から０次光１６４０が出射している間に残余の４個の仮想画素の各々である第ｊ２の仮想画素から第ｊ２の０次光が出射しないように第ｊ２の仮想画素に備えられる各サブ画素１３００の配置が制御される。
【００８７】
さらに、第ｊ１の仮想画素が循環的に切り替わるように、仮想画素１２４１，１２４２，１２４３，１２４４および１２４５に備えられる各サブ画素１３００の配置が制御される。
【００８８】
これにより、１個の光シート１６６０が被照明位置１２００に生成されるが、生成される１個の光シート１６６０の伝搬方向が時間により変化する。したがって、旋回光シート１６８０が被照明位置１２００に生成される。
【００８９】
＜１２．試料室＞
図１に図示される試料室１０２１においては、試料１０４０が透明なアガロースゲルにより保持される。これにより、照明対物レンズ１４６５および後述する検出対物レンズ１７００の前に試料１０４０が設置される。アガロースゲルの周囲は、水で満たされる。アガロースゲルの屈折率と水の屈折率とは、整合させられる。これにより、照明対物レンズ１４６５および検出対物レンズ１７００から試料１０４０の表面までの区間において屈折率が整合させられた状態が実現される。
【００９０】
また、照明対物レンズ１４６５および検出対物レンズ１７００は、試料室１０２１に差し込まれ、空間１０５０に達する。このため、照明対物レンズ１４６５および検出対物レンズ１７００は、水に浸される水浸レンズである。
【００９１】
＜１３．イメージング装置＞
イメージング装置１０２２は、図１に図示されるように、本体１６９０および画像処理部１６９１を備える。本体１６９０は、検出対物レンズ１７００、ロングパスフィルター１７０１、チューブレンズ１７０２およびＣＭＯＳカメラ１７０３を備える。ＣＭＯＳカメラ１７０３がＣＭＯＳカメラ以外のカメラに置き換えられてもよい。
【００９２】
試料１０４０の断層にある蛍光色素から発せられた蛍光１０５７は、検出対物レンズ１７００を透過し、検出対物レンズ１７００を透過した後にロングパスフィルター１７０１を透過し、ロングパスフィルター１７０１を透過した後にチューブレンズ１７０２を透過し、チューブレンズ１７０２を透過した後にＣＭＯＳカメラ１７０３に受光される。これにより、蛍光１０５７がＣＭＯＳカメラ１７０３にフォーカスさせられる。
【００９３】
ＣＭＯＳカメラ１７０３は、蛍光１０５７をフォーカスさせることにより形成される像をキャプチャーする。
【００９４】
これにより、本体１６９０は、試料１０４０の断層をイメージングし、試料１０４０の断層像である画像を取得する。
【００９５】
画像処理部１６９１は、取得された画像を必要に応じて処理する。
【００９６】
＜１４．構造化照明が行われる場合のイメージング＞
構造化照明が行われる場合は、制御部１１８２が、位相差φがそれぞれ０，２／３πおよび４／３πである第１、第２および第３の構造化光シート１６２０が生成されるように各仮想画素１２６０に備えられる各サブ画素１３００の配置を制御する。
【００９７】
また、本体１６９０が、生成された第１、第２および第３の構造化光シート１６２０により試料１０４０が照明されている間に試料１０４０の断層像であるｒａｗ画像Ｉ１，Ｉ２およびＩ３がそれぞれ取得されるように試料１０４０の断層をイメージングする。
【００９８】
さらに、画像処理部１６９１が、取得されたｒａｗ画像Ｉ１，Ｉ２およびＩ３を式（２）により結合し、再構築画像ＩＳＩを生成する。
【００９９】
【数２】
2018055082.tif 000004
【０１００】
０，２／３πおよび４／３πという３個の位相の組み合わせが、他の３個の位相の組み合わせに置き換えられてもよい。３個の位相の組み合わせが、４個以上の位相の組み合わせに置き換えられてもよい。
【０１０１】
定量的には、薄くてパターン化されデフォーカスされた蛍光シートに対する被検出物の応答は、式（３）で与えられる。
【０１０２】
【数３】
2018055082.tif 000005
【０１０３】
ｆ（ν）は、ｆ（ν）＝１−０．６９ν＋０．００７６ν２＋０．０４３ν３で表される。Ｊ１は、第１の第１種ベッセル関数である。正規化された軸デフォーカスｕは、ｕ＝（８π／λ）ｚｓｉｎ２（α／２）で表される。正規化された周波数νは、ν＝２ｓｉｎθ／ｓｉｎαで表される。λは、放射波長である。ｚは、実デフォーカス座標である。αは、被検出物の集光半値角である。
【０１０４】
最も薄い断層は、半値全幅が最小化されるように、すなわち最小の可能なｕにおいてＩ（ｕ）＝０．５であるようにνを選択することにより得られる。この条件は、断層を薄くすること（低ν化）および構造化照明の周波数の低下（高ν化）を平衡させるν＝１である場合に満たされる。
【０１０５】
＜１５．旋回照明が行われる場合のイメージング＞
旋回照明が行われる場合は、制御部１１８２が、互いに異なる伝搬方向を有し循環的に生成される５個の光シートからなる旋回光シート１６８０が生成されるように各仮想画素１２６０に備えられる各サブ画素１３００の配置を制御する。
【０１０６】
また、本体１６９０が、旋回光シート１６８０により試料１０４０が照明されている間に試料１０４０の断層像が取得されるように試料１０４０の断層をイメージングする。イメージングは、１回のイメージングが行われている間に５個の光シートの全部により試料１０４０が照明されるように行われる。これにより、５個の光シートにより試料１０４０の断層が照明されることによりそれぞれ得られる試料１０４０の５個の断層像が平均化される。このようなイメージングは、光シートの伝搬方向の切り替えを制御するＧＬＶ１１８０が高速で動作することにより可能になる。
【０１０７】
＜１６．第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡の利点＞
第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡１０００によれば、構造化照明において行われる光シートの位相の制御および旋回照明において行われる光シートの伝搬方向の切り替えの制御が、高速で３００ｋＨｚ程度でも動作しうるＧＬＶ１１８０により実現される。このため、光シート蛍光顕微鏡１０００において、画像の取得の高速化および構造化照明または旋回照明による画質の向上を両立できる。
【０１０８】
＜１７．実現されるコントラスト比および位相シフトの実証＞
図１１は、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡に備えられる仮想画素に印加される電圧による当該仮想画素から出射する０次光の正規化された振幅および位相の変化を図示するグラフである。図１１は、実験により得られたものである。
【０１０９】
図１１からは、振幅変調において１：４５のコントラスト比が実現され、位相変調において０から約４．４ラジアンの位相シフトが実現されることを把握できる。
【０１１０】
構造化照明が行われる場合に行われる再構築画像ＩＳＩの生成には、４／３πまたは４．２ラジアンの位相シフトが必要である。したがって、約４．４ラジアンの位相シフトが実現される場合は、再構築画像ＩＳＩの生成が適切に行われる。
【０１１１】
＜１８．構造化照明によるバックグラウンドの除去の実証１＞
屈折率の不整合に起因する散乱および収差を減らすために、水の屈折率に近い屈折率を有するアガロースゲルに蛍光ビーズが閉じ込められた試料を試料１０４０として準備した。アガロースゲルは、１％液体アガロース溶液を加熱し固化させることにより準備した。蛍光ビーズの各々の呼び径は、０．２ｍｍである。
【０１１２】
続いて、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡１０００により、構造化照明が行われなかった場合および構造化照明が行われた場合の試料１０４０の反転画像を取得した。生成した光シートの厚さは、半値全幅において約１２μｍである。実効実視野は、３４０μｍ×２７１μｍである。生成した構造化光シート１６２０の強度分布の周期は、８．９μｍであった。周期８．９μｍは、隣接する２個の光シートを互いに干渉させることにより実現される最も長いものである。互いに干渉させられる２個の光シートがなす角を大きくすることによりさらに短い周期を実現できるが、この実証においては、信号の強度を大きくするために周期８．９μｍを選択した。
【０１１３】
図１２は、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡により取得された試料の画像を図示する図である。図１２（ａ）は、構造化照明が行われなかった場合に取得された最終画像である。図１２（ｂ）は、構造化照明が行われた場合に取得された最終画像である。図１２（ｃ），図１２（ｄ）および図１２（ｅ）は、それぞれ構造化照明が行われ位相差φが０，２／３πおよび４／３πである場合に取得されたｒａｗ画像Ｉ１，Ｉ２およびＩ３である。図１２（ｂ）に図示される最終画像は、図１２（ｃ），図１２（ｄ）および図１２（ｅ）に図示されるｒａｗ画像を式（２）に示される画像処理により結合することにより生成される再構築画像ＩＳＩである。図１２に図示されるスケールバーは、２０μｍの長さを示す。
【０１１４】
図１３は、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡により取得された試料の画像における距離による正規化された強度の変化を図示するグラフである。図１３に図示される破線は、図１２（ａ）に図示される線に沿う変化を図示する。図１３に図示される実線は、図１２（ｂ）に図示される線に沿う変化を図示する。
【０１１５】
図１２（ａ）を図１２（ｂ）と比較し図１３に示される破線と実線とを比較することにより、構造化照明が行われ画像再構築が行われた場合のバックグラウンド光の強度が、構造化照明が行われなかった場合のそれの約１／１０になり、構造化照明が行われ画像再構築が行われた場合の最終画像のコントラストが、構造化照明が行われなかった場合のそれより増加することを把握できる。
【０１１６】
＜１９．構造化照明によるバックグラウンドの除去の実証２＞
蛍光ビーズを用いた上記の実証とは別に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）標識されたマウス脂肪組織がアガロースゲルに閉じ込められた試料を試料１０４０として準備した。準備された試料は、概ね８ｍｍ３の体積を有していた。
【０１１７】
続いて、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡１０００により、複数のＺ方向の位置の各々について、構造化照明が行われなかった場合および構造化照明が行われた場合のＧＦＰ標識されたマウス脂肪組織の光断層像を取得した。
【０１１８】
図１４は、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡により取得されたＧＦＰ標識されたマウス脂肪組織の光断層像を図示する図である。図１４（ａ）から図１４（ｅ）までは、それぞれＺが０，１５，３０，４５および５０μｍである場合の構造化照明が行われなかった場合および構造化照明が行われた場合の反転画像を図示する。図１４（ａ）から図１４（ｅ）までの各々においては、構造化照明が行われなかった場合の光断層像が左側に図示され、構造化照明が行われた場合の光断層像が右側に図示されている。図１４に図示されるスケールバーは、５０μｍの長さを示す。
【０１１９】
図１５は、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡により取得されたＧＦＰ標識されたマウス脂肪組織の光断層像における距離による正規化された強度の変化を図示するグラフである。図１５に図示される破線は、図１４（ｃ）の左側の光断層像中に図示される線に沿う変化を図示する。図１５に図示される実線は、図１４（ｃ）の右側の光断層像中に図示される線に沿う変化を図示する。
【０１２０】
図１５に図示される破線を図１５に図示される実線と比較することにより、構造化照明が行われ画像再構築が行われた場合のバックグラウンド光の強度が、構造化照明が行われなかった場合のそれより劇的に小さくなり、構造化照明が行われ画像再構築が行われた場合の最終画像のコントラストが、構造化照明が行われなかった場合のそれより増加することを把握できる。
【０１２１】
また、図１４（ａ）から図１４（ｅ）までの各々において、左側の光断層像を右側の光断層像と比較することにより、構造化照明が行われなかった場合はインフォーカスの特徴がイメージングされるだけでなくアウトフォーカスの特徴がイメージングされやすいが、構造化照明が行われた場合はインフォーカスの特徴がイメージングされるがアウトフォーカスの特徴がイメージングされにくいことを把握できる。
【０１２２】
図１６は、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡によりＧＦＰ標識されたマウス脂肪組織の光断層像を取得する場合の試料平行移動を図示する模式図である。図１６には、マウス脂肪１７２０および励起光である光シート１７２１が図示されるとともに、試料１０４０の平行移動の方向を示す矢印１７２２、光シート１７２１の伝搬方向を示す矢印１７２３および検出される蛍光の伝搬方向を示す矢印１７２４が図示される。図１６に図示される試料平行移動が行われる場合は、マウス脂肪１７２０の表面が光シート１７２１の伝搬方向から傾斜させられる。これにより、マウス脂肪１７２０がＺ方向に平行移動させられた場合にマウス脂肪１７２０の照明される部分が図１６における左から右へ移動する。
【０１２３】
＜２０．旋回照明による影の抑制の実証＞
第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡１０００により、旋回照明が行わなかった場合および旋回照明が行われた場合のＧＦＰ標識されたマウス骨格筋の光断層像を取得した。旋回照明が行われた場合は、互いに異なる伝搬方向を有する７個の光シートによりＧＦＰ標識されたマウス骨格筋が照明された。隣接する２個の光シートがなす角は、約１．１５°である。ＧＬＶ１１８０のスイッチング周波数は、７個の光シートの切り替えが０．５２ミリ秒で完了するように、１３．５ｋＨｚに設定された。この切り替え時間は、カメラの撮像時間である５０ミリ秒より短いため、平均化が自動的に行われる。
【０１２４】
図１７は、第１実施形態の光シート蛍光顕微鏡により取得されたＧＦＰ標識されたマウス骨格筋の光断層像を図示する図である。図１７（ａ）は、旋回照明が行われなかった場合に取得された光断層像である。図１７（ｂ）は、旋回照明が行われた場合に取得された光断層像である。図１７に図示されるスケールバーは、５０μｍの長さを示す。
【０１２５】
図１７（ａ）に図示される光断層像を図１７（ｂ）に図示される光断層像と比較することにより、旋回照明が行われた場合は、旋回照明が行われない場合と比較して、ストライプ状の影が抑制されることを把握できる。
【０１２６】
この発明は詳細に説明されたが、上記した説明は、すべての局面において、例示であって、この発明がそれに限定されるものではない。例示されていない無数の変形例が、この発明の範囲から外れることなく想定され得るものと解される。
【符号の説明】
【０１２７】
１０００  光シート蛍光顕微鏡
１０２０  照明装置
１０２１  試料室
１０２２  イメージング装置
１０４０  試料
１０６０  レーザー
１０６１  アナモルフィック光学系
１０６２  変換装置
１０８０  レーザービーム
１１００  ライン光
１１８０  ＧＬＶ
１１８１  光学系
１１８２  制御部
１２４１，１２４２，１２４３，１２４４，１２４５  仮想画素
１２８１，１２８２，１２８３，１２８４，１２８５，１２８６  サブ画素
１４６０  球面レンズ
１４６１  スリット板
１４６２  シリンドリカルレンズ
１４６３  レンチキュラーレンズ
１４６５  照明対物レンズ
１４８１，１４８２，１４８３，１４８４，１４８５  レンチキュラーレンズ素子
１６２０  構造化光シート
１６８０  旋回光シート
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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