(57)【要約】【課題】簡便且つ再現性に優れた方法により作製されたDNAライブラリーに対応するDNAプローブを提供する。【解決手段】ゲノムDNA及び高濃度のランダムプライマーを含む反応液にて核酸増幅反応を行い、ゲノムDNAを鋳型として当該核酸増幅反応により得られたDNA断片を取得する工程と、得られたDNA断片の塩基配列を決定する工程と、上記工程にて得られたDNA断片の塩基配列に基づいて、当該DNA断片を検出するためのDNAプローブを設計する工程とを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムDNA及び高濃度のランダムプライマーを含む反応液にて核酸増幅反応を行い、ゲノムDNAを鋳型として当該核酸増幅反応により得られたDNA断片を取得する工程と、
得られたDNA断片の塩基配列を決定する工程と、
上記工程にて得られたDNA断片の塩基配列に基づいて、当該DNA断片を検出するためのDNAプローブを設計する工程と
を含むDNAプローブの作製方法。
【請求項２】
上記ランダムプライマーを用いて複数の異なるゲノムDNAからそれぞれDNA断片を取得し、当該DNA断片に関する塩基配列に基づいて、これらゲノムDNAの間で相違する領域を含む上記DNAプローブを設計することを特徴とする請求項１記載のDNAプローブの作製方法。
【請求項３】
上記DNA断片の塩基配列を既知の塩基配列と比較し、既知の塩基配列と異なる領域を含む上記DNAプローブを設計することを特徴とする請求項１記載のDNAプローブの作製方法。
【請求項４】
上記反応液は４〜２００μＭの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする請求項１記載のDNAプローブの作製方法。
【請求項５】
上記反応液は４〜１００μＭの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする請求項１記載のDNAプローブの作製方法。
【請求項６】
上記ランダムプライマーは、９〜３０塩基長のヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載のDNAプローブの作製方法。
【請求項７】
上記DNA断片は、１００〜５００塩基長であることを特徴とする請求項１記載のDNAプローブの作製方法。
【請求項８】
請求項１乃至７いずれか一項記載のDNAプローブの作製方法により作製されたDNAプローブと、解析対象のゲノムDNA由来のDNA断片とを接触させる工程と、
上記DNAプローブと上記DNA断片とのハイブリダイズを検出する工程と
を含むゲノムDNA解析方法。
【請求項９】
上記解析対象のゲノムDNAと上記ランダムプライマーを用いた核酸増幅反応により上記DNA断片を取得する工程を更に含むことを特徴とする請求項８記載のゲノムDNA解析方法。
【請求項１０】
上記ゲノムDNA由来のDNA断片はDNAマーカーであり、上記DNAプローブにより当該DNAマーカーの存否を検出することを特徴とする請求項８記載のゲノムDNA解析方法。
【請求項１１】
請求項１乃至７いずれか一項記載のDNAプローブの作製方法により作製されたDNAプローブと、
当該DNAプローブを固定した担体と、
を有するDNA解析装置。
【請求項１２】
上記担体は基板又はビーズであることを特徴とする請求項１０記載のDNA解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばDNAマーカー解析に利用できるDNAライブラリーの作製方法及びDNAライブラリーを用いた遺伝子解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的にゲノム解析においては、ゲノムに含まれる遺伝情報、例えば塩基配列情報を総合的に解析する。しかし、ゲノム全体の塩基配列を決定する解析には工数及びコストがかかるといった問題がある。また、ゲノムサイズの大きな生物においては、ゲノムの複雑性の問題から塩基配列解析に基づいたゲノム解析には限界がある。
【０００３】
特許文献１には、増幅断片長多型（AFLP）マーカー技術において、アダプタとライゲートした制限酵素処理断片に試料特異的識別子を組み込むこと、制限酵素処理断片の配列の一部のみを決定する方法を開示している。特許文献１に開示された方法では、ゲノムDNAに対する制限酵素処理によってゲノムDNAの複雑性を低減し、制限酵素処理断片の一部を対象として塩基配列を決定することで制限酵素処理断片を十分に同定している。ただし、特許文献１に開示された方法では、ゲノムDNAに対する制限酵素処理やアダプタを用いたライゲーション反応といった工数が必要であり、コストの低減が困難である。
【０００４】
一方、特許文献２には、いわゆるRAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA）法により、米試料から抽出したDNAを適正なプライマー存在下のPCRによって増幅して得られるDNAバンドのうち、食味評価結果と相関の高い識別用DNAマーカーを見いだしたことが開示されている。特許文献２に開示された方法では、特定の配列で限定された複数のSTS（Sequence Tagged Sites）化プライマーを用いることが開示されている。なお、特許文献２に開示された方法では、STS化プライマーを用いて増幅した識別用DNAマーカーを電気泳動により検出している。しかしながら、特許文献２に開示されるようなRAPD法は、PCR増幅の再現性が著しく低く、一般的にDNAマーカー技術として採用することはできない。
【０００５】
また、特許文献３には、ゲノムライブラリーを作製する方法であって、対象のゲノムに比較的よく出現する配列をもとに設計した１種類のプライマーを使用してPCRを行うことにより、ゲノム全領域がほぼ均等に増幅され、その結果、ゲノムライブラリーを作製できることが開示されている。なお、特許文献３には、ランダム配列を含むランダムプライマーを使用してPCRを行うことでゲノムライブラリーを作製できるとの記述があるものの、実際のプロトコル及び実験結果については何ら記載されていない。したがって、特許文献３に記載の方法は、ゲノム出現頻度を特定するためにゲノム塩基配列情報が必要であり、そのための工数及びコストが見込まれる。さらに、特許文献３に記載の方法では、ゲノム全体にわたって増幅を図るためゲノムDNAの複雑性を低減することができないといった問題がある。
【０００６】
ところで、特許文献４には、制限酵素処理によるゲノム複雑性低減と、アレイ技術とを組み合わせたハイスループットなマーカー関連技術が開示されている。特許文献４に開示されたマーカー関連技術では、ゲノムDNAを制限酵素で消化して得られるゲノムDNA断片にアダプタを連結し、その後、アダプタにハイブリダイズするプライマーを用いてDNA断片を増幅し、増幅したDNA断片の塩基配列に基づいて当該DNA断片を検出するためのDNAプローブを設計する。
【０００７】
また、特許文献４に開示された技術を応用して、サトウキビや小麦について数千のDNAマーカーを含む高密度連鎖地図を開発したことが非特許文献１に開示されている。同様に、特許文献４に開示された技術を応用して、ソバについて数千のDNAマーカーを含む高密度連鎖地図を開発したことが非特許文献２に開示されている。
【０００８】
さらに、特許文献５には、プローブを固定したアレイに作用させるサンプルとして、ランダムプライマーを用いる方法が開示されるものの、ランダムプライマーを使用して得られた増幅断片をDNAライブラリーとすることなどは開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第５３８９６３８号公報
【特許文献２】特開２００３−７９３７５号公報
【特許文献３】特許第３９７２１０６号公報
【特許文献４】特許第５７９９４８４号公報
【特許文献５】特開２０１４−２０４７３０号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】DNA RESEARCH 21,555-567(2014)
【非特許文献２】Breeding Science 64:291-299 (2014)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ところで、DNAマーカーを利用した遺伝子連鎖解析等のゲノム情報解析には、より簡便に、且つ再現性に優れた方法でDNAライブラリーを作製することが望まれるとともに、DNAライブラリーに含まれるDNA断片を高精度に検出できるDNAプローブを作製することが望まれている。上述のように、DNAライブラリー及びDNAプローブを作製する方法として様々な方法が知られているが、簡便性及び/又は再現性において十分な方法は知られていないのが現状である。そこで、本発明は、このような実情に鑑みて、より簡便且つ再現性に優れた方法により作製されたDNAライブラリーに対応するDNAプローブの作製方法及びDNAプローブを用いたゲノムDNA解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上述した目的を達成するため鋭意検討した結果、ランダムプライマーを用いたPCRにおいて、反応液中の当該ランダムプライマーの濃度を所定の範囲に規定することで、優れた再現性を達成しながらDNAライブラリーを作製できること、作製するDNAライブラリーの塩基配列に基づいてDNAプローブを簡便に設計できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明は以下を包含する。
（１）ゲノムDNA及び高濃度のランダムプライマーを含む反応液にて核酸増幅反応を行い、ゲノムDNAを鋳型として当該核酸増幅反応により得られたDNA断片を取得する工程と、得られたDNA断片の塩基配列を決定する工程と、上記工程にて得られたDNA断片の塩基配列に基づいて、当該DNA断片を検出するためのDNAプローブを設計する工程とを含むDNAプローブの作製方法。
（２）上記ランダムプライマーを用いて複数の異なるゲノムDNAからそれぞれDNA断片を取得し、当該DNA断片に関する塩基配列に基づいて、これらゲノムDNAの間で相違する領域を含む上記DNAプローブを設計することを特徴とする（１）記載のDNAプローブの作製方法。
（３）上記DNA断片の塩基配列を既知の塩基配列と比較し、既知の塩基配列と異なる領域を含む上記DNAプローブを設計することを特徴とする（１）記載のDNAプローブの作製方法。
（４）上記反応液は４〜２００μＭの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする（１）記載のDNAプローブの作製方法。
（５）上記反応液は４〜１００μＭの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする（１）記載のDNAプローブの作製方法。
（６）上記ランダムプライマーは、９〜３０塩基長のヌクレオチドであることを特徴とする（１）記載のDNAプローブの作製方法。
（７）上記DNA断片は、１００〜５００塩基長であることを特徴とする（１）記載のDNAプローブの作製方法。
（８）上記（１）乃至（７）いずれか記載のDNAプローブの作製方法により作製されたDNAプローブと、解析対象のゲノムDNA由来のDNA断片とを接触させる工程と、上記DNAプローブと上記DNA断片とのハイブリダイズを検出する工程とを含むゲノムDNA解析方法。
（９）上記解析対象のゲノムDNAと上記ランダムプライマーを用いた核酸増幅反応により上記DNA断片を取得する工程を更に含むことを特徴とする（８）記載のゲノムDNA解析方法。
（１０）上記ゲノムDNA由来のDNA断片はDNAマーカーであり、上記DNAプローブにより当該DNAマーカーの存否を検出することを特徴とする（８）記載のゲノムDNA解析方法。
（１１）上記（１）乃至（７）いずれか記載のDNAプローブの作製方法により作製されたDNAプローブと、当該DNAプローブを固定した担体とを有するDNA解析装置。
（１２）上記担体は基板又はビーズであることを特徴とする（１０）記載のDNA解析装置。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係るDNAプローブの作製方法は、高濃度のランダムプライマーを用いた核酸増幅法により作製されたDNA断片の塩基配列に基づいてDNAプローブの塩基配列を設計している。ここで、高濃度のランダムプライマーを用いた核酸増幅法によれば、DNA断片を優れた再現性にて増幅することができる。したがって、本発明によれば、優れた再現性を達成しながら得られるDNA断片に対して、簡便にDNAプローブを作製することができる。
【００１５】
また、本発明に係るDNAプローブの作製方法によれば、優れた再現性を達成しながら得られるDNA断片に対するDNAプローブを作製できるため、当該DNA断片をDNAマーカーとして利用する際のDNAプローブとして遺伝子連鎖解析等の遺伝子解析に使用することが可能となる。
【００１６】
したがって、本発明に係るDNAプローブを用いたゲノムDNA解析方法は、簡便且つ優れた再現性で調整されたDNA断片に対するDNAプローブを使用するため、低コストに且つ高精度なゲノムDNA解析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】DNAライブラリーの作製方法及びDNAライブラリーを利用した遺伝子解析方法を示すフローチャートである。
【図２】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし通常条件のPCRにより増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としアニーリング温度45℃で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としアニーリング温度40℃で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図５】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としアニーリング温度37℃で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図６】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし酵素量2.5 unitで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし酵素量12.5 unitで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としMgCl2濃度2倍で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としMgCl2濃度3倍で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１０】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としMgCl2濃度4倍で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１１】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし8塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１２】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし9塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１３】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし11塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１４】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし12塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１５】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし14塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１６】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし16塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１７】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし18塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１８】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし20塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１９】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度2μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２０】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度4μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２１】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度6μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２２】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度6μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２３】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度8μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２４】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度8μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２５】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度10μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２６】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度10μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２７】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度20μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２８】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度20μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図２９】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度40μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３０】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度40μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３１】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度60μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３２】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度60μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３３】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度100μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３４】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度100μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３５】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度200μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３６】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度200μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３７】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度300μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３８】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度300μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図３９】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度400μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４０】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度400μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４１】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度500μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４２】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度500μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４３】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度600μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４４】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度700μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４５】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度800μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４６】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度900μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４７】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー濃度1000μMで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図４８】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマーで増幅したDNAライブラリーのMiSeq解析結果を示す特性図である。
【図４９】イネ日本晴のDNAを鋳型としランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図５０】イネ日本晴のDNAを鋳型としランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図５１】イネ日本晴のDNAを鋳型としランダムプライマーで増幅したDNAライブラリーのMiSeq解析結果を示す特性図である。
【図５２】MiSeqから得られたリードパターンのイネ日本晴ゲノム情報の位置を示す特性図である。
【図５３】ランダムプライマーとイネゲノムのミスマッチ塩基数の度数分布を示す特性図である。
【図５４】マーカーN80521152におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代のリード数を示す特性図である。
【図５５】PCRマーカーN80521152におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代の電気泳動像を示す写真である。
【図５６】マーカーN80997192におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代のリード数を示す特性図である。
【図５７】PCRマーカーN80997192におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代の電気泳動像を示す写真である。
【図５８】マーカーN80533142におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代のリード数を示す特性図である。
【図５９】PCRマーカーN80533142におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代の電気泳動像を示す写真である。
【図６０】マーカーN91552391におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代のリード数を示す特性図である。
【図６１】PCRマーカーN91552391におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代の電気泳動像を示す写真である。
【図６２】マーカーN91653962におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代のリード数を示す特性図である。
【図６３】PCRマーカーN91653962におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代の電気泳動像を示す写真である。
【図６４】マーカーN91124801におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代のリード数を示す特性図である。
【図６５】PCRマーカーN91124801におけるサトウキビNiF8とNi9、その交雑後代の電気泳動像を示す写真である。
【図６６】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし9塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図６７】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし9塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図６８】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし10塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図６９】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし10塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７０】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし11塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７１】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし11塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７２】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし12塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７３】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし12塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７４】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし14塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７５】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし14塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７６】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし16塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７７】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし16塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７８】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし18塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図７９】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし18塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８０】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし20塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８１】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし20塩基長のランダムプライマーで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８２】サトウキビNiF8のDNAを鋳型とし、8〜35塩基長のランダムプライマーを0.6〜300μMの濃度範囲で使用して増幅したDNAライブラリーについて再現性を検討した結果を示す特性図である。
【図８３】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー1種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８４】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー1種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８５】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー2種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８６】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー2種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８７】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー3種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８８】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー3種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図８９】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー12種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９０】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー12種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９１】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー24種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９２】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー24種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９３】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー48種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９４】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー48種で増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９５】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Bで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９６】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Bで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９７】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Cで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９８】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Cで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図９９】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Dで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１００】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Dで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１０１】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Eで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１０２】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Eで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１０３】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Fで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１０４】サトウキビNiF8のDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Fで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１０５】ヒトゲノムDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Aで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（一回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１０６】ヒトゲノムDNAを鋳型としランダムプライマー10塩基Aで増幅されたDNAライブラリーの電気泳動像（二回目）から得られる増幅断片長と蛍光ユニット(FU)との関係を示す特性図である。
【図１０７】本発明に係るDNAプローブの作製方法を適用してDNAマイクアレイを作製する工程を示すフローチャートである。
【図１０８】NiF8とNi9のゲノムDNAを鋳型とし高濃度ランダムプライマーで増幅したDNAライブラリーについてDNAプローブからのシグナルを測定した結果を示す特性図である。
【図１０９】Ni9のゲノムDNAを鋳型とし高濃度ランダムプライマーで増幅したDNAライブラリーについて反復間でシグナルを比較した結果を示す特性図である。
【図１１０】マーカー名：N80521152に対応するDNAプローブからのシグナル値を測定した結果を示す特性図である。
【図１１１】マーカー名：N80997192に対応するDNAプローブからのシグナル値を測定した結果をを示す特性図である。
【図１１２】マーカー名：N80533142に対応するDNAプローブからのシグナル値を測定した結果をを示す特性図である。
【図１１３】マーカー名：N91552391に対応するDNAプローブからのシグナル値を測定した結果をを示す特性図である。
【図１１４】マーカー名：N91653962に対応するDNAプローブからのシグナル値を測定した結果をを示す特性図である。
【図１１５】マーカー名：N91124801に対応するDNAプローブからのシグナル値を測定した結果をを示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明に係るDNAプローブの作製方法では、任意の塩基配列を有するプライマー（以下、ランダムプライマー）を高濃度となるように調整した反応液で核酸増幅反応を行い、増幅した核酸断片（DNA断片）の塩基配列に基づいて、当該DNA断片を検出するためのDNAプローブの塩基配列を設計する。ここで、高濃度のランダムプライマーを含む反応液で核酸増幅反応を行うと、優れた再現性でDNA断片を増幅することができる。得られたDNA断片を以下、DNAライブラリーと称する。
【００２０】
また、反応液におけるランダムプライマーが高濃度であるとは、通常の核酸増幅反応におけるプライマー濃度と比較して高濃度であることを意味する。すなわち、DNAライブラリーの作製においては、通常の核酸増幅反応におけるプライマー濃度と比較して高濃度のランダムプライマーを使用する。ここで、反応液に含まれる鋳型としては、DNAライブラリーを作製する対象の生物から調整したゲノムDNAを使用することができる。なお、対象の生物種には何ら限定されず、ヒトを含む動物、植物、微生物、ウイルス等いかなる生物種も対象とすることができる。すなわち、如何なる生物種からもDNAライブラリーを作製することができる。
【００２１】
DNAライブラリーを作製するに際して、ランダムプライマーの濃度を上記のように規定することによって、高い再現性で核酸断片（核酸断片群）を増幅することができる。ここで、再現性とは、同一の鋳型及び同一のランダムプライマーを用いて複数回の核酸増幅反応を行った場合に、複数回の核酸増幅反応の間で増幅される核酸断片が一致する程度を意味する。つまり、高い再現性（再現性が高い）とは、同一の鋳型及び同一のランダムプライマーを用いて複数回の核酸増幅反応を行った場合に、複数回の核酸増幅反応の間で増幅される核酸断片の一致度が高いことを意味する。
【００２２】
再現性の高低については、例えば、同一の鋳型及び同一のランダムプライマーを用いて複数回の核酸増幅反応を行い、各回で得られた増幅断片の塩基配列データについてスピアマンの順位相関係数を算出し、当該係数に基づいて評価することができる。スピアマンの順位相関係数とは、一般的にρで表され、一例としてはρ＞０．９をもって再現性有りと評価することができる。
【００２３】
〔ランダムプライマー〕
DNAライブラリーを作製する際に使用できるランダムプライマーとしては、その配列には何ら限定されず、例えば９〜３０塩基長のヌクレオチドを使用することができる。特に、ランダムプライマーとは、任意の配列を有する、９〜３０塩基長のヌクレオチドであって、ヌクレオチドの種類（配列の種類）は特に限定されず、１種類以上のヌクレオチド、好ましくは１〜１００００種類のヌクレオチド、より好ましくは１〜１０００種類のヌクレオチド、より好ましくは１〜１００種類のヌクレオチド、最も好ましくは１〜９６種類のヌクレオチドを意味する。ランダムプライマーとして上述の範囲のヌクレオチド（ヌクレオチド群）を使用することによって、より高い再現性で増幅核酸断片を得ることができる。なお、ランダムプライマーとして、複数のヌクレオチドを含む場合、全てのヌクレオチドが同じ塩基長（９〜３０塩基長）である必要はなく、異なる塩基長の複数のヌクレオチドを含んでいても良い。
【００２４】
ランダムプライマーとして複数種類のヌクレオチドを設計する場合、全体の３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは９０％以上が、７０％以下の同一性、好ましくは６０％以下の同一性、より好ましくは５０％以下の同一性、最も好ましくは４０％以下の同一性となるように設計することが好ましい。ランダムプライマーとして複数種類のヌクレオチドを設計する場合であって、上述の範囲のヌクレオチドについて上記範囲の同一性となるように設計することで、対象生物種のゲノムDNA全体に亘って増幅断片を得ることができる。すなわち、増幅断片の均一性を高めることができる。
【００２５】
また、ランダムプライマーとして使用するヌクレオチドは、特に、GC含量が５〜９５％の範囲となるように設計することが好ましく、１０〜９０％の範囲となるように設計することがより好ましく、１５〜８０％の範囲となるように設計することが更に好ましく、２０〜７０％の範囲となるように設計することが最も好ましい。ランダムプライマーとしてGC含量が上述の範囲のヌクレオチドの集合を使用することによって、より高い再現性で増幅核酸断片を得ることができる。なお、GC含量とは、ヌクレオチド鎖全体に含まれるグアニン及びシトシンの割合である。
【００２６】
さらに、ランダムプライマーとして使用するヌクレオチドは、特に、全体の長さに対して連続塩基が８０％以下となるように設計することが好ましく、７０％以下となるように設計することがより好ましく、６０％以下となるように設計することが更に好ましく、５０％以下となるように設計することが最も好ましい。或いは、ランダムプライマーとして使用するヌクレオチドは、特に、連続塩基の数が８個以下となるように設計することが好ましく、７個以下となるように設計することがより好ましく、６個以下となるように設計することが更に好ましく、５個以下となるように設計することが最も好ましい。ランダムプライマーとして連続塩基数が上述の範囲のヌクレオチドの集合を使用することによって、より高い再現性で増幅核酸断片を得ることができる。
【００２７】
さらにまた、ランダムプライマーとして使用するヌクレオチドは、特に、分子内に６塩基長以上、好ましくは５塩基以上、より好ましくは４塩基以上の相補領域を有しないように設計することが好ましい。ヌクレオチドに上記範囲の相補領域を有しないように設計することで分子内における二本鎖形成を防止でき、より高い再現性で増幅核酸断片を得ることができる。
【００２８】
さらにまた、ランダムプライマーとして複数種類のヌクレオチドを設計する場合、特に、複数のヌクレオチド間において６塩基長以上、好ましくは５塩基以上、より好ましくは４塩基以上の相補領域を有しないように設計することが好ましい。複数のヌクレオチド間に上記範囲の相補領域を有しないように設計することでヌクレオチド間の二本鎖形成を防止でき、より高い再現性で増幅核酸断片を得ることができる。
【００２９】
さらにまた、ランダムプライマーとして複数種類のヌクレオチドを設計する場合、特に、３’末端側の６塩基以上、好ましくは５塩基以上、より好ましくは４塩基以上が相補的な配列にならないように設計することが好ましい。複数のヌクレオチドの３’末端側の上記範囲において相補的な配列を有しないように設計することでヌクレオチド間の二本鎖形成を防止でき、より高い再現性で増幅核酸断片を得ることができる。
【００３０】
なお、相補領域及び相補的な配列とは、例えば８０〜１００％の同一性を有する領域及び配列（例えば５塩基長の領域であれば、４塩基又は５塩基が相補的である領域及び配列）、或いは９０〜１００％の同一性を有する領域及び配列（例えば５塩基長の領域であれば５塩基が相補的である領域及び配列）を意味する。
【００３１】
さらにまた、ランダムプライマーとして使用するヌクレオチドは、核酸増幅反応における温度サイクル条件（特に、アニーリング温度）に適したTm値となるように設計することが好ましい。特に限定されないが、Tm値は、最近接塩基対法、Wallace法及びGC％法等の公知の計算方法により算出することができる。具体的に、ランダムプライマーとして使用するヌクレオチドは、特にTm値が１０〜８５℃、好ましくは１２〜７５℃、より好ましくは１４〜７０℃、最も好ましくは１６〜６５℃となるように設計することが好ましい。ヌクレオチドのTm値を上記範囲となるように設計することで、核酸増幅反応における所定の温度サイクル条件（特に、所定のアニーリング温度）下において、より高い再現性で増幅核酸断片を得ることができる。
【００３２】
さらにまた、ランダムプライマーとして複数種類のヌクレオチドを設計する場合、特に、複数のヌクレオチド間において各ヌクレオチドのTm値のばらつきが５０℃以下、好ましくは４５℃以下、より好ましくは４０℃以下、最も好ましくは３５℃以下となるように設計することが好ましい。複数のヌクレオチド間でTm値のばらつきが上記範囲となるように設計することで、核酸増幅反応における所定の温度サイクル条件（特に、所定のアニーリング温度）下において、より高い再現性で増幅核酸断片を得ることができる。
【００３３】
〔核酸増幅反応〕
DNAライブラリーを作製するに際、上述したランダムプライマー及び鋳型としてゲノムDNAを用いた核酸増幅反応によって、多数のDNA断片を取得する。特に、核酸増幅反応において、反応液中のランダムプライマーの濃度を、通常の核酸増幅反応におけるプライマー濃度と比較して高濃度とする。これにより、高い再現性を達成しながら多数のDNA断片をゲノムDNAを鋳型として得ることができる。これにより、得られた多数のDNA断片は、遺伝子型判定等に利用できるDNAライブラリーとして使用することが可能となる。
【００３４】
ここで、核酸増幅反応とは、鋳型となるゲノムDNA、上述したランダムプライマー、DNAポリメラーゼ、基質となるデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP、すなわちdATP、dCTP、dTTP及びdGTPの混合物）及びバッファーからなる反応液で、所定の温度サイクル条件を加えることで増幅断片を合成する反応である。なお、核酸増幅反応には、反応液中に所定濃度のMg2+が必要であり、上述した組成においてバッファーにMgCl2が含まれている。バッファーにMgCl2が含まれていない場合、上記組成に加えてMgCl2が含まれることとなる。
【００３５】
特に核酸増幅反応において、ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーの塩基長に応じて適宜設定することが好ましい。ここで、ランダムプライマーの塩基長は、異なる塩基長の複数種類のヌクレオチドをランダムプライマーとして使用する場合には、その平均値（単純平均でもよいし、ヌクレオチド量を加味した加重平均でもよい）とすることができる。
【００３６】
具体的には、９〜３０塩基長のランダムプライマーを用い、当該ランダムプライマー濃度を４〜２００μＭとする条件、好ましくは４〜１００μＭとする条件で核酸増幅反応を行う。この条件であれば、核酸増幅反応により、高い再現性を達成しながら多数の増幅断片、特に１００〜５００塩基長の多数の増幅断片を得ることができる。
【００３７】
より具体的には、ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが９〜１０塩基長である場合、４０〜６０μＭとすることが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが１０〜１４塩基長である場合、ランダムプライマーの塩基長をｙとし、ランダムプライマーの濃度をｘとしたときに、ｙ＞３Ｅ＋０８ｘ−６．９７４且つ１００μＭ以下を満たすことが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが１４〜１８塩基長の場合、４〜１００μＭとすることが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが１８〜２８塩基長の場合、４μＭ以上であり、且つｙ＜８Ｅ＋０８ｘ−５．５３３を満たすことが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが２８〜２９塩基長の場合、６〜１０μＭとすることが好ましい。ランダムプライマーの濃度を、ランダムプライマーの塩基長に応じて上記のように設定することで、高い再現性を達成しながら多数の増幅断片をより確実に得ることができる。
【００３８】
なお、上述したｙ＞３Ｅ＋０８ｘ−６．９７４及びｙ＜８Ｅ＋０８ｘ−５．５３３の不等式は、後述する実施例で説明するように、ランダムプライマーの長さと濃度との関係を詳細に調べた結果、１００〜５００塩基長の多数のDNA断片を再現性良く増幅できる範囲として算出されたものである。
【００３９】
また、核酸増幅反応において鋳型となるゲノムDNAは、特に限定されないが、反応液の量を５０μｌとしたときに、０．１〜１０００ｎｇとすることが好ましく、１〜５００ｎｇとすることがより好ましく、５〜２００ｎｇとすることが更に好ましく、１０〜１００ｎｇとすることが最も好ましい。鋳型となるゲノムDNAの量をこの範囲とすることで、ランダムプライマーからの増幅反応が阻害されることなく、高い再現性を達成しながら多数の増幅断片を得ることができる。
【００４０】
ゲノムDNAの調整方法は、特に限定されず、従来公知の方法を適用することができる。また、市販されているキットを利用することで、対象の生物種から簡便にゲノムDNAを調整することができる。なお、ゲノムDNAとしては、従来公知の方法や市販のキットにより生物から抽出されたものをそのまま使用しても良いし、生物から抽出したものを精製したものでも良いし、制限酵素処理や超音波処理した後のものを使用しても良い。
【００４１】
また、核酸増幅反応においてDNAポリメラーゼとしては、特に限定されず、核酸増幅反応のための温度サイクル条件下でDNAポリメラーゼ活性を有する酵素を使用することができる。具体的には、通常の核酸増幅反応に使用される耐熱性DNAポリメラーゼを使用することができる。例えば、DNAポリメラーゼとしては、Taq DNAポリメラーゼ等の好熱細菌由来DNAポリメラーゼ、KOD DNA ポリメラーゼやPfu DNAポリメラーゼ等の超好熱Archaea由来DNAポリメラーゼを挙げることができる。特に、核酸増幅反応においては、上述したランダムプライマーとともに、DNAポリメラーゼとしてはPfu DNAポリメラーゼを使用することが好ましい。これらDNAポリメラーゼを使用することで、高い再現性を達成しながら多数の増幅断片をより確実に得ることができる。
【００４２】
さらに、核酸増幅反応において、基質となるデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP、すなわちdATP、dCTP、dTTP及びdGTPの混合物）の濃度は、特に限定されないが、５μＭ〜０．６ｍＭとすることができ、１０μＭ〜０．４ｍＭとすることが好ましく、２０μＭ〜０．２ｍＭとすることがより好ましい。基質となるdNTPの濃度をこの範囲とすることで、DNAポリメラーゼによる誤った取り込みによるエラーの発生を防止し、高い再現性を達成しながら多数の増幅断片を得ることができる。
【００４３】
さらに、核酸増幅反応において、バッファーとしては、特に限定されないが、上述のようにMgCl2を含み、例えばTris-HCl（pH8.3）及びKClを含む溶液を挙げることができる。ここで、Mg2+の濃度としては、特に限定されないが、例えば０．１〜４．０ｍＭとすることができ、０．２〜３．０ｍＭとすることが好ましく、０．３〜２．０ｍＭとすることがより好ましく、０．５〜１．５ｍＭとすることが更に好ましい。反応液中のMg2+濃度をこの範囲に設定することで、高い再現性を達成しながら多数の増幅断片を得ることができる。
【００４４】
さらにまた、核酸増幅反応における温度サイクル条件としては、特に限定されず、通常の温度サイクルを採用することができる。具体的に温度サイクルとは、先ず、鋳型のゲノムDNAを一本鎖に乖離するための最初の熱変性温度、その後、「熱変性温度→アニーリング温度→伸長反応温度」を複数回（例えば、２０〜４０回）行い、最後に必要であれば、所定時間伸長反応温度とし、最後に保存のための温度とするサイクルを例示することができる。
【００４５】
熱変性温度としては、例えば９３〜９９℃、好ましくは９５〜９８℃、より好ましくは９７〜９８℃とすることができる。アニーリング温度としては、上述したランダムプライマーのTm値にもよるが、例えば３０〜７０℃、好ましくは３５〜６８℃、より好ましくは３７〜６５℃とすることができる。伸長反応温度としては、例えば７０〜７６℃、好ましくは７１〜７５℃、より好ましくは７２〜７４℃とすることができる。また、保存のための温度としては例えば４℃とすることができる。
【００４６】
また、最初の熱変性は、上述した温度範囲において、例えば５秒〜１０分、好ましくは１０秒〜５分、より好ましくは３０秒〜２分とすることができる。「熱変性温度→アニーリング温度→伸長反応温度」のサイクルにおける熱変性は、上述した温度範囲において、例えば２秒〜５分、好ましくは５秒〜２分、より好ましくは１０秒〜１分とすることができる。「熱変性温度→アニーリング温度→伸長反応温度」のサイクルにおけるアニーリングは、上述した温度範囲において、例えば１秒〜３分、好ましくは３秒〜２分、より好ましくは５秒〜１分とすることができる。「熱変性温度→アニーリング温度→伸長反応温度」のサイクルにおける伸長反応は、上述した温度範囲において、例えば１秒〜３分、好ましくは３秒〜２分、より好ましくは５秒〜１分とすることができる。
【００４７】
また、DNAライブラリーを作製する際には、ホットスタート法を採用した核酸増幅反応によって増幅断片を取得するものでも良い。ホットスタート法とは、「熱変性温度→アニーリング温度→伸長反応温度」のサイクル前のミスプライミングやプライマーダイマーに由来する非特異増幅を防ぐ方法である。ホットスタート法では、抗DNAポリメラーゼ抗体を結合させたり、化学修飾を行うことで、DNAポリメラーゼ活性を抑制させた状態の酵素を使用する。この状態では、DNAポリメラーゼ活性が抑制され、温度サイクル前の非特異的な反応を防止することができる。ホットスタート法では、最初の温度サイクル時に温度を高く設定することでDNAポリメラーゼ活性が回復し、その後の核酸増幅反応が進行することとなる。
【００４８】
以上のように、上述した９〜３０塩基長のランダムプライマーを使用し、反応液中の当該ランダムプライマー濃度を４〜２００μＭとして核酸増幅反応を行うことで、ゲノムDNAを鋳型としてランダムプライマーが多数の増幅断片を得ることができる。上述した９〜３０塩基長のランダムプライマーを使用し、反応液中の当該ランダムプライマー濃度を４〜２００μＭとした場合、非常に再現性の高い核酸増幅反応となる。すなわち、上述した核酸増幅反応によれば、非常に高い再現性を達成しながら多数の増幅断片を得ることができる。したがって、得られた多数の増幅断片は、ゲノムDNAを対象とした遺伝子解析においてDNAライブラリーとして使用することができる。
【００４９】
また、上述した９〜３０塩基長のランダムプライマーを使用し、反応液中の当該ランダムプライマー濃度を４〜２００μＭとして核酸増幅反応を行うことで、特に、ゲノムDNAを鋳型として約１００〜５００塩基長の多数の増幅断片を得ることができる。この約１００〜５００塩基長の多数の増幅断片は、例えば次世代シーケンサーによる塩基配列の大量解析に適したサイズであり、高精度な配列情報を得ることができる。すなわち、本発明によれば、約１００〜５００塩基長といったDNA断片を含むDNAライブラリーを作製することができる。
【００５０】
さらに、上述した９〜３０塩基長のランダムプライマーを使用し、反応液中の当該ランダムプライマー濃度を４〜２００μＭとして核酸増幅反応を行うことで、特に、ゲノムDNAの全体に亘って均一に増幅断片を得ることができる。言い換えると、当該ランダムプライマーを用いた核酸増幅反応では、ゲノムDNAの所定の領域に偏ってDNA断片が増幅されるのではなく、ゲノム全体に分散してDNA断片が増幅される。すなわち、本発明によれば、ゲノム全体に対して均一なDNAライブラリーを作製することができる。
【００５１】
〔DNAプローブ〕
本発明においてDNAプローブとは、目的とするDNA断片に対して相補的な塩基配列を有し、当該DNA断片とハイブリダイズできるDNA断片を意味する。DNAプローブとしては、特に、いわゆるオリゴヌクレオチドマイクロアレイに適用されることが好ましい。オリゴヌクレオチドマイクロアレイとは、担体上にて目的の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これをDNAプローブとするマイクロアレイである。ここで、DNAプローブとなる合成オリゴヌクレオチドは、例えば20〜100塩基長、好ましくは30〜90塩基長、より好ましくは50〜60塩基長とする。
【００５２】
なお、本発明において設計したDNAプローブは、いわゆるスタンフォード型マイクロアレイと同様に、上記塩基長を有する合成オリゴヌクレオチドをスポットすることで担体上に固定するタイプのマイクロアレイに適用されてもよい。すなわち、本発明において設計するDNAプローブは、従来公知の如何なるマイクロアレイに対しても適用することができる。したがって、本発明において設計するDNAプローブは、ガラスやシリコーン等の平面基板を担体とするマイクロアレイや、マイクロビーズを担体とするビーズアレイに対しても適用することができる。
【００５３】
本発明に係るDNAプローブの作製方法において、DNAプローブの塩基配列は、上述したDNA断片（DNAライブラリー）の塩基配列に基づいて、当該DNA断片（DNAライブラリー）を検出するものとして設計される。すなわち、先ず、上述のように作製したDNA断片（DNAライブラリー）の塩基配列を決定し、当該塩基配列に基づいてDNAプローブの塩基配列を設計する。DNA断片の塩基配列を決定する方法は、特に限定されず、サンガー法等を適用したDNAシークエンサーや次世代シーケンサー等を使用することができる。ここで、次世代シーケンサーとは、特に限定されないが、第2世代シーケンサーとも呼称され、数千万のDNA断片の塩基配列を同時並行的に決定できる塩基配列決定装置を意味する。次世代シーケンサーにおけるシーケンシング原理としては、特に限定されず、例えばブリッジPCR法とSequencing-by-synthesis法により、フローセル上で目的DNAを増幅させ、合成しながらシーケンシングを行うといった原理、或いは、エマルションPCR法とDNA合成時に放出されるピロリン酸の量を測定することで配列決定を行なうパイロシークエンス法とによりシーケンシングを行うといった原理を挙げることができる。より具体的に、次世代シーケンサーとしては、イルミナ社（Illumina）のMiniSeq、MiSeq、NextSeq、HiSeq及びHiSeq Xシリーズ、ロシュ社のRoche 454 GS FLXシーケンサー等を挙げることができる。
【００５４】
次に、DNAプローブとしては、例えば、上述したDNA断片（DNAライブラリー）の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するように設計する。より具体的には、例えば、上述したDNA断片（DNAライブラリー）より短い塩基長を有し、DNA断片内の少なくとも一部をカバーする１又は複数の領域を特定し、特定した１又は複数の領域を、上述したDNA断片（DNAライブラリー）を検出するためのプローブとして設計する。
【００５５】
ここで、所定のDNA断片について複数の領域を設計した場合には、当該DNA断片を複数のDNAプローブを用いて検出することを意図している。また、あるDNA断片については１の領域を設計し、他のDNA断片については２以上の所定数の領域を設計してもよい。すなわち、DNA断片毎に異なる数の領域、すなわちDNAプローブを設計しても良い。なお、１つのDNA断片に対して、複数のDNAプローブを設計する場合、これら複数のDNAプローブは一部重複した領域を有していても良いし、数塩基離間するように設計しても良い。
【００５６】
また、上述のように設計するDNAプローブの塩基長としては、特に限定されないが、20〜100塩基長とすることができ、特に30〜90塩基長とすることが好ましく、40〜80塩基長とすることがより好ましく、50〜60塩基長とすることが最も好ましい。
【００５７】
特に、塩基配列を決定したゲノムDNA断片の全領域を複数の領域でカバーするように複数の領域を設定することが好ましい。この場合、所定の生物由来のゲノムDNAに関して、制限酵素処理によって得られたゲノムDNA断片に複数のプローブが対応し、これら複数のプローブで当該ゲノムDNA断片を検出することとなる。
【００５８】
さらに、DNAプローブとしては、特に限定されないが、Tm値を60〜95℃とすることができ、特に70〜90℃とすることが好ましく、75〜85℃とすることがより好ましく、78〜82℃とすることが最も好ましい。
【００５９】
ところで、上述したように、ランダムプライマーを用いてゲノムDNAからDNA断片を取得する際に、複数の異なるゲノムDNAからそれぞれDNA断片を取得し、これら由来の異なるDNA断片それぞれについて塩基配列を決定することができる。そして、決定した塩基配列を比較することで、これらゲノムDNAの間で塩基配列が相違する領域を特定することができる。本発明に係るDNAプローブの作製方法では、このように特定したゲノムDNAの間で塩基配列が相違する領域を含むようにDNAプローブを設計することができる。つまり、所定のゲノムDNAについて、他のゲノムDNAと相違する領域に対してDNAプローブを設計し、当該他のゲノムDNAについて、当該所定のゲノムDNAと相違する領域に対してDNAプローブを設計することができる。これら設計した一対のDNAプローブを利用することで、解析対象のゲノムDNAが如何なるタイプのゲノムDNAであるか判定することができる。
【００６０】
また、上述したように、ランダムプライマーを用いてゲノムDNAから増幅したDNA断片の塩基配列を既知の塩基配列と比較し、既知の塩基配列と異なる領域を含むようにDNAプローブを設計することもできる。既知の塩基配列は、従来公知の各種データベースから取得することができる。データベースとしては、特に限定されないが、DNA Data Bank of Japanが提供するDDBJデータベース、European Bioinformatics Instituteが提供するEMBLデータベース、National Center for Biotechnology Informationが提供するGenbankデータベース、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomesが提供するKEGGデータベース又はこれら各種データベースを統合したデータベースを適宜使用することができる。
【００６１】
〔DNA解析装置〕
本発明に係るDNA解析装置は、以上のようにして設計されたDNAプローブを担体に固定化したものである。DNAプローブを担体に固定化してなるDNA解析装置は、DNAマイクロアレイと呼称される場合もある。すなわち、本発明に係るDNA解析装置は、基板にDNAプローブを固定化してなる、所謂DNAチップ（狭義のDNAマイクロアレイ）に限定されず、以上のようにして設計されたDNAプローブを担体上で利用可能な如何なる構成の装置をも含む意味である。
【００６２】
一例として、以上のようにして設計されたDNAプローブを有するDNAマイクロアレイは、従来公知の手法によって作製することができる。例えば、上述した方法で設計されたDNAプローブの塩基配列に基づいて、担体上にて当該塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成することでDNAマイクロアレイを作製することができる。ここで、オリゴヌクレオチドを合成する方法としては、特に限定されず従来公知の手法を適用することができる。例えば、フォトリソグラフィー技術と光照射化学合成技術を組み合わせて担体上にてオリゴヌクレオチドを合成する方法を適用することができる。また、担体表面との親和性の高いリンカー分子を末端に付加したオリゴヌクレオチドを、上述のように設計されたDNAプローブの塩基配列に基づいて別途合成し、その後、担体表面の所定の位置に固定する方法を適用することもできる。また、上述のように設計されたDNAプローブをピンタイプアレイヤーやノズルタイプアレイヤーを用いて担体上にスポットすることでDNAマイクロアレイを作製することもできる。
【００６３】
以上のように作製されたDNAマイクロアレイ（DNA解析装置）は、所定の生物由来のゲノムDNAを高濃度のランダムプライマーを用いて増幅したDNA断片に対して相補的な塩基配列を有するDNAプローブを有するものである。すなわち、以上のように作製されたDNAマイクロアレイは、ゲノムDNAを高濃度のランダムプライマーを用いて増幅したDNA断片をDNAプローブで検出するものである。
【００６４】
なお、DNAマイクロアレイとしては、ガラスやシリコーン等の平面基板を担体とするマイクロアレイや、マイクロビーズを担体とするビーズアレイ、或いは中空繊維の内壁にプローブを固定する３次元マイクロアレイ等の如何なるタイプのマイクロアレイであってもよい。
【００６５】
〔ゲノムDNA解析方法〕
上述のように作製されたDNAプローブを使用することで、遺伝子型解析等のゲノムDNA解析を行うことができる。上述したDNAプローブは、高濃度のランダムプライマーを用いて作製されたDNAライブラリーに対応している。当該DNAライブラリーは、非常に高い再現性を有しており、次世代シーケンサーに適したサイズを有しており、ゲノム全体に亘って均一性を有している。したがって、DNAライブラリーは、DNAマーカー（遺伝マーカー、遺伝子マーカーとも称される）として使用することができる。ここで、DNAマーカーとは、遺伝的形質に関連する目印となるゲノム上の領域という意味である。DNAマーカーは、例えば遺伝子型同定、連鎖地図、遺伝子マッピング、マーカーを利用した選抜工程を含む育種、マーカーを利用した戻し交配、量的形質遺伝子座のマッピング、バルクセグリガント分析、品種識別、又は連鎖不均衡マッピング等に利用することができる。
【００６６】
すなわち、上述のように作製されたDNAプローブを使用することでDNAマーカーを検出することができ、遺伝子型同定、連鎖地図、遺伝子マッピング、マーカーを利用した選抜工程を含む育種、マーカーを利用した戻し交配、量的形質遺伝子座のマッピング、バルクセグリガント分析、品種識別、又は連鎖不均衡マッピング等を行うことができる。
【００６７】
より具体的に、上述したDNAプローブを用いたゲノムDNA解析方法としては、例えば、上述のように作製したDNAプローブと、解析対象のゲノムDNA由来のDNA断片とを接触させる。解析対象のゲノムDNA由来のDNA断片は、DNAライブラリーを作製したときに使用したランダムプライマーを用いて準備しても良い。或いは、塩基配列に基づいて当該DNAマーカーを特異的に増幅する一対のプライマーを設計し、設計した一対のプライマーを使用した核酸増幅反応によりDNA断片を準備しても良い。
【００６８】
次に、定法に従って、DNAプローブとDNA断片とのハイブリダイズを検出する。例えば、増幅したDNA断片に標識を付加することで、標識に基づいて当該ハイブリダイズを検出することができる。標識としては、従来公知の如何なる物質を使用しても良い。標識としては、例えば蛍光分子、色素分子、放射性分子等を使用することができる。なお、DNA断片を増幅する工程において標識を有するヌクレオチドを用いてもよい。
【００６９】
例えば、DNAプローブを有するDNAマイクロアレイを使用する場合、標識を有するDNA断片を所定の条件下で当該DNAマイクロアレイに接触させ、DNAマイクロアレイに固定されたDNAプローブと標識を有するゲノムDNA断片とをハイブリダイズさせる。このとき、DNA断片の一部に対してプローブがハイブリダイズすることとなるが、１塩基のミスマッチが存在する場合にハイブリダイズせず、完全にマッチする場合のみにハイブリダイズするような高いストリンジェンシー条件とすることが好ましい。このような高いストリンジェンシー条件とすることによって、一塩基多型等の僅かな変異を検出することができる。
【００７０】
なお、ストリンジェンシー条件は、反応温度及び塩濃度で調節することができる。すなわち、より高温とすることでより高いストリンジェンシー条件となり、またより低い塩濃度でより高いストリンジェンシー条件となる。例えば、50〜75塩基長のプローブを使用する場合、ハイブリダイゼーション条件としては、40〜44℃、0.21SDS、6×SSCの条件とすることでより高いストリンジェンシー条件とすることができる。
【００７１】
また、DNAプローブと標識を有するDNA断片とのハイブリダイズは、標識に基づいて検出することができる。すなわち、上述した標識を有するDNA断片とDNAプローブのハイブリダイズ反応の後、未反応のDNA断片等を洗浄し、その後、DNAプローブに対して特異的にハイブリダイズしたDNA断片の標識を観察する。例えば、標識が蛍光物質である場合にはその蛍光波長を検出し、標識が色素分子であればその色素波長を検出する。より具体的には、通常のDNAマイクロアレイ解析に使用している、蛍光検出装置やイメージアナライザー等の装置を使用することができる。
【００７２】
特に、ゲノムDNAを鋳型として高濃度のランダムプライマーによって増幅したDNA断片を、上記DNAプローブによって検出することができる。DNAプローブとして、上述のように、複数の異なるゲノムDNAの間で相違する領域を含むDNAプローブを使用した場合、解析対象のゲノムDNA由来のDNA断片がハイブリダイズしたDNAプローブに応じて、解析対象のゲノムDNAを解析することができる。例えば、近縁種のゲノムDNA間に存在する塩基配列の相違を含むDNAマーカーに対応するDNAプローブを使用することで、解析対象のゲノムDNAが如何なる種に属するか特定することができる。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７４】
〔実施例１〕
１．フローチャート
本実施例では、図１に示したフローチャートに従って、各種生物種から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、各種ランダムプライマーセットを用いたPCRによりDNAライブラリーを作製した。また、作製したDNAライブラリーを用いて、所謂、次世代シーケンサーを用いた配列解析を行い、得られたリードデータに基づいて遺伝子型を解析した。
【００７５】
２．材料
本実施例では、サトウキビ品種NiF8、Ni9及びその交雑後代22系統、並びにイネ品種日本晴からDNeasy Plant Mini kit(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを抽出及び精製し、それぞれNiF8由来のゲノムDNA、Ni9由来のゲノムDNA、交雑後代22系統由来のゲノムDNA、日本晴由来のゲノムDNAとして使用した。また、本実施例では、ヒトDNAについてはタカラバイオよりHuman Genomic DNAを購入し、ヒト由来のゲノムDNAとして使用した。
【００７６】
３．方法
３．１  PCR条件とDNA断片のサイズの関係
３．１．１  ランダムプライマーの設計
ランダムプライマーを設計するにあたり、GC含量を20〜70%の範囲とし、連続塩基数が5以下となる条件を設定した。また、塩基長については、8塩基長、9塩基長、10塩基長、11塩基長、12塩基長、14塩基長、16塩基長、18塩基長、20塩基長、22塩基長、24塩基長、26塩基長、28塩基長、29塩基長、30塩基長及び35塩基長の16種類を設定した。各塩基長について、それぞれ96種類の塩基配列を設計し、96種類のランダムプライマーからなるセットを作製した。なお、10塩基長については、6セット（各セットに96種類のランダムプライマーが含まれる）を設計した（これら6セットを、10塩基A〜10塩基Fと称する）。すなわち、本実施例では、21種類のランダムプライマーセットを作製した。
【００７７】
これら21種類のランダムプライマーセットに含まれるランダムプライマーの塩基配列を表１〜２１に示した。
【００７８】
【表１−１】
2018000057.tif 000003
【００７９】
【表１−２】
2018000057.tif 000004
【００８０】
【表２−１】
2018000057.tif 000005
【００８１】
【表２−２】
2018000057.tif 000006
【００８２】
【表３−１】
2018000057.tif 000007
【００８３】
【表３−２】
2018000057.tif 000008
【００８４】
【表４−１】
2018000057.tif 000009
【００８５】
【表４−２】
2018000057.tif 000010
【００８６】
【表５−１】
2018000057.tif 000011
【００８７】
【表５−２】
2018000057.tif 000012
【００８８】
【表６−１】
2018000057.tif 000013
【００８９】
【表６−２】
2018000057.tif 000014
【００９０】
【表７−１】
2018000057.tif 000015
【００９１】
【表７−２】
2018000057.tif 000016
【００９２】
【表８−１】
2018000057.tif 000017
【００９３】
【表８−２】
2018000057.tif 000018
【００９４】
【表９−１】
2018000057.tif 000019
【００９５】
【表９−２】
2018000057.tif 000020
【００９６】
【表１０−１】
2018000057.tif 000021
【００９７】
【表１０−２】
2018000057.tif 000022
【００９８】
【表１１−１】
2018000057.tif 000023
【００９９】
【表１１−２】
2018000057.tif 000024
【０１００】
【表１２−１】
2018000057.tif 000025
【０１０１】
【表１２−２】
2018000057.tif 000026
【０１０２】
【表１３−１】
2018000057.tif 000027
【０１０３】
【表１３−２】
2018000057.tif 000028
【０１０４】
【表１４−１】
2018000057.tif 000029
【０１０５】
【表１４−２】
2018000057.tif 000030
【０１０６】
【表１５−１】
2018000057.tif 000031
【０１０７】
【表１５−２】
2018000057.tif 000032
【０１０８】
【表１５−３】
2018000057.tif 000033
【０１０９】
【表１６−１】
2018000057.tif 000034
【０１１０】
【表１６−２】
2018000057.tif 000035
【０１１１】
【表１６−３】
2018000057.tif 000036
【０１１２】
【表１７−１】
2018000057.tif 000037
【０１１３】
【表１７−２】
2018000057.tif 000038
【０１１４】
【表１７−３】
2018000057.tif 000039
【０１１５】
【表１８−１】
2018000057.tif 000040
【０１１６】
【表１８−２】
2018000057.tif 000041
【０１１７】
【表１８−３】
2018000057.tif 000042
【０１１８】
【表１９−１】
2018000057.tif 000043
【０１１９】
【表１９−２】
2018000057.tif 000044
【０１２０】
【表１９−３】
2018000057.tif 000045
【０１２１】
【表２０−１】
2018000057.tif 000046
【０１２２】
【表２０−２】
2018000057.tif 000047
【０１２３】
【表２０−３】
2018000057.tif 000048
【０１２４】
【表２１−１】
2018000057.tif 000049
【０１２５】
【表２１−２】
2018000057.tif 000050
【０１２６】
【表２１−３】
2018000057.tif 000051
【０１２７】
３．１．２  標準PCR
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、ここで説明した標準PCRを含め、ランダムプライマーを用いたPCRによって得られた多数の核酸断片をDNAライブラリーと称する。
【０１２８】
３．１．３  DNAライブラリーの精製及び電気泳動
３．１．２で得られたDNAライブラリーをMinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)で精製後、Agilent 2100バイオアナライザ(Agient Technologies)で電気泳動し、蛍光ユニット(Fluorescence Unit: FU)を得た。
【０１２９】
３．１．４  アニーリング温度の検討
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、種々のアニーリング温度で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、アニーリング温度として37℃、40℃及び45℃を検討した。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。
【０１３０】
３．１．５  酵素量の検討
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び2.5unit又は125unitのDNA DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。
【０１３１】
３．１．６  MgCl2濃度の検討
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、所定濃度のMgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、MgCl2濃度として、通常の2倍（2.0mM）、3倍（3.0mM）及び4倍（4.0mM）を検討した。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。
【０１３２】
３．１．７  ランダムプライマーの塩基長の検討
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、ランダムプライマーとして、上述した8塩基長（表７）、9塩基長（表８）、11塩基長（表９）、12塩基長（表１０）、14塩基長（表１１）、16塩基長（表１２）、18塩基長（表１３）及び20塩基長（表１４）を検討した。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。
【０１３３】
３．１．８  ランダムプライマー濃度の検討
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に所定濃度のランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、ランダムプライマー濃度として、2、4、6、8、10、20、40、60、100、200、300、400、500、600、700、800、900及び1000μMを検討した。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。また、本実験では、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ＞0.9)。
【０１３４】
３．２  MiSeqによる再現性の確認
３．２．１  DNAライブラリーの作製
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に最終濃度60μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。
【０１３５】
３．２．２  シーケンスライブラリーの作製
３．２．１で得られたDNAライブラリーから、KAPA Library Preparation Kit(Roche)を用いてMiSeq解析用シーケンスライブラリーを作製した。
【０１３６】
３．２．３  MiSeq解析
MiSeq Reagent Kit V2 500 Cycle(Illumina)を用いて、３．２．２で得られたMiSeq解析用シーケンスライブラリーをリード長100塩基のペアエンド条件のもと解析した。
【０１３７】
３．２．４  リードデータ解析
３．２．３で得られたリードデータから、ランダムプライマーの配列情報を削除し、リードパターンを特定した。そしてリードパターンごとにリード数をカウントし、反復間のリード数を比較し、相関係数で再現性を評価した。
【０１３８】
３．３  イネ品種日本晴の解析
３．３．１  DNAライブラリーの作製
２．に記載したゲノムDNA(日本晴由来ゲノムDNA:15ng)に最終濃度60μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。
【０１３９】
３．３．２  シーケンスライブラリー作製、MiSeq解析及びリードデータ解析
日本晴由来ゲノムDNAから作製したDNAライブラリーを用いたシーケンスライブラリーの作製、MiSeq解析及びリードデータ解析は、それぞれ３．２．２、３．２．３及び３．２．４に記載した方法に従った。
【０１４０】
３．３．３  ゲノム均―性の評価
３．３．２で得られたリードパターンについて、日本晴のゲノム情報(NC_008394〜NC_008405)に対してリードパターンをbowde2にてマッピングし、各リードパターンのゲノム位置を特定した。
【０１４１】
３．３．４  非特異的増幅
３．３．３で特定した各リードパターンの位置情報に基づいて、ランダムプライマーの配列と当該ランダムプライマーがアニールするゲノム上の配列を比較し、ミスマッチ数をカウントした。
【０１４２】
３．４  多型検出及び遺伝子型判別
３．４．１  DNAライブラリーの作製
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA、Ni9由来ゲノムDNA、交雑後代由来ゲノムDNA又は日本晴由来ゲノムDNA:15ng)に最終濃度60μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。
【０１４３】
３．４．２  HiSeq解析
３．４．１で作製した各DNAライブラリーを、それぞれ1レーン16サンプル及びリード長100塩基のペアエンド条件でタカラバイオヘ解析を委託し、それぞれからリードデータを取得した。
【０１４４】
３．４．３  リードデータ解析
３．４．２で得られたリードデータからランダムプライマーの配列情報を削除し、リードパターンを特定した。そしてリードパターンごとにリード数をカウントした。
【０１４５】
３．４．４  多型検出及び遺伝子型判別
３．４．３の解析の結果として得られたリードパターンのリード数からNiF8及びNi9特有の多型を検出し、そのリードパターンをマーカーとした。また、リード数をもとに交雑後代22系統の遺伝子型を判別した。遺伝子型判別の精度は、交雑後代2系統の反復データでの再現性をもとに評価した。
【０１４６】
３．５  PCRマーカーによる確認実験
３．５．１  プライマーの設計
３．４．４で特定したマーカーのうちNiF8型3マーカー、Ni9型3マーカーの合計6マーカーについて、ペアエンドのマーカー配列情報からプライマーをそれぞれ設計した（表２２）。
【０１４７】
【表２２】
2018000057.tif 000052
【０１４８】
３．５．２  PCR及び電気泳動
TaKaRa Multiplex PCR Assay Kit Ver.2(TAKARA)を用いて、２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA、Ni9由来ゲノムDNA又は交雑後代由来ゲノムDNA:15ng)を鋳型に、1.25μl Multiplex PCR Enzyme Mix、2 X Multiplex PCR Buffer 12.5μl、３．５．１で設計した0.4μMプライマーを加え、最終反応量25μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、94℃で1分とし、その後、94℃で30秒間、60℃で30秒間及び72℃で30秒を1サイクルとして30サイクル行った後、72℃で10分間維持し、その後、4℃で保存する条件とした。増幅したDNA断片は、TapeStation(Agilent Technologies)で電気泳動した。
【０１４９】
３．５．３  遺伝子型データ比較
３．５．２で得られた電気泳動の結果から、バンドの有無によりマーカーの遺伝子型を判別し、マーカーのリード数と比較した。
【０１５０】
３．６  ランダムプライマー濃度と長さの関係
３．６．１  高濃度条件下でのランダムプライマー長の影響
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に最終濃度10μMの所定の長さのランダムプライマー、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。本実験においては、ランダムプライマーの長さとして、9塩基長（表８）、10塩基長（表１、10塩基A）、11塩基長（表９）、12塩基長（表１０）、14塩基長（表１１）、16塩基長（表１２）、18塩基長（表１３）及び20塩基長（表１４）を検討した。PCRの温度サイクル条件は、9塩基長のランダムプライマーを使用する反応系では、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、37℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。PCRの温度サイクル条件は、10塩基長以上の長さのランダムプライマーを使用する反応系では、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。
【０１５１】
３．６．２  ランダムプライマーの濃度と長さの関係
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に、所定の長さのランダムプライマーを所定の濃度となるように加え、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。本実験においては、ランダムプライマーの長さとして、表１〜２１に示した8塩基長から35塩基長のランダムプライマーを検証し、ランダムプライマーの濃度として0.6〜300μMの範囲を検証した。
【０１５２】
PCRの温度サイクル条件は、8塩基長及び9塩基長のランダムプライマーを使用する反応系では、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、37℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。PCRの温度サイクル条件は、10塩基長以上の長さのランダムプライマーを使用する反応系では、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。また、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ＞0.9)。
【０１５３】
３．７  ランダムプライマー数
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に、表１に示した10塩基長からなる96種類のランダムプライマー（10塩基A）から選ばれる1種、2種、3種、12種、24種又は48種のランダムプライマーを最終濃度60μMとなるように加え、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。本実験においては、1種、2種、3種、12種、24種又は48種のランダムプライマーとして、表１のNo.1から順にランダムプライマーを選び検証した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。また、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ＞0.9)。
【０１５４】
３．８  ランダムプライマー配列
２．に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に、表２〜６に示したランダムプライマーの5セットから選ばれる1セットを最終濃度60μMとなるように加え、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は  
３．１．３と同様の方法で行った。また、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ＞0.9)。
【０１５５】
３．９  ヒト由来ゲノムDNAを用いたDNAライブラリー
２．に記載したゲノムDNA(ヒト由来ゲノムDNA:15ng)に、最終濃度60μMのランダムプライマー（10塩基A）、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は３．１．３と同様の方法で行った。また、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ＞0.9)。
【０１５６】
４．結果および考察
４．１  PCR条件とDNAライブラリーのサイズの関係
通常のPCR条件に倣って、ランダムプライマーを利用したPCR（上記３．１．２）では、増幅されたDNAライブラリーのサイズは2kbp以上と高分子であり、目的のサイズとする100bp〜500bpには増幅は見られなかった(図２)。100bp〜500bpのDNAライブラリーが得られなかったのは、ランゲムプライマーが500bp以下の領域でプライマーとし機能する確率が低いためと考えられた。目的のサイズである100bp〜500bpのDNAライブラリーを作製するには、再現性良く非特異的増幅を誘発する必要があると考えられた。
【０１５７】
そこで、PCRの特異性に影響すると考えられるアニーリング温度（上記３．１．４）、酵素量（上記３．１．５）、MgCl2濃度（上記３．１．６）、プライマー長（上記３．１．７）及びプライマー濃度（上記３．１．８）とDNAライブラリーサイズの関係について検討した。
【０１５８】
上記３．１．４に記載した実験において、アニーリング温度を45℃としたときの結果を図３、アニーリング温度を40℃としたときの結果を図４、アニーリング温度を37℃としたときの結果を図５に示した。図３〜５に示すように、アニーリング温度を45℃、40℃及び37℃と下げていくと、高分子DNAライブラリーの増幅量は増加するものの、低分子DNAライブラリーの増幅は見られなかった。
【０１５９】
上記３．１．５に記載した実験において、酵素量を2倍としたときの結果を図６、酵素量を10倍にしたときの結果を図７に示した。図６及び７に示すように、酵素量を通常の2倍、10倍に増やしても高分子DNAライブラリーは増加するものの、低分子にDNAライブラリーの増幅は見られなかった。
【０１６０】
上記３．１．６に記載した実験において、MgCl2濃度を通常の2倍としたときの結果を図８、MgCl2濃度を通常の3倍としたときの結果を図９、MgCl2濃度を通常の4倍としたときの結果を図１０に示した。図８〜１０に示すように、MgCl2濃度を通常の2倍、3倍、4倍に増やしても高分子DNAライブラリーの増幅量は変化するものの、低分子DNAライブラリーの増幅は見られなかった。
【０１６１】
上記３．１．７に記載した実験において、ランダムプライマー長を8塩基長、9塩基長、11塩基長、12塩基長、14塩基長、16塩基長、18塩基長及び20塩基長としたときの結果を、それぞれ図１１〜１８に示した。図１１〜１８に示すように、いずれの長さのランダムプライマーを用いたとしても、図２に示した結果（10塩基長のランダムプライマー）と比較して大きな変化は見られなかった。
【０１６２】
上記３．１．８に記載した実験の結果を表２３に纏めた。
【０１６３】
【表２３】
2018000057.tif 000053
【０１６４】
図１９〜４７に示すように、10塩基長のランダムプライマーを使用した場合、ランダムプライマー濃度が6μMにおいて1kbpのDNA断片について増幅が見られ、濃度が上昇するにつれDNA断片が低分子化していくことが明らかとなった。また、ランダムプライマー濃度が6〜500μMの場合に再現性について検討した結果、通常の10倍の6μMではρが0.889とやや低いものの、通常の13.3倍に相当する8μM以上の場合、さらに833.3倍に相当する500μMの場合では、いずれもρが0.9以上と高い値を示した。この結果から、ランダムプライマーの濃度を通常のPCR条件よりも大幅に高めることで、高い再現性を達成しながら1kbp以下のDNA断片を増幅できることが明らかとなった。ただし、ランダムプライマーの濃度が500μを超えて高すぎる場合には、所望の大きさのDNA断片の増幅が見られなくなる。したがって、再現性に優れ、且つ低分子のDNA断片を増幅するには、ランダムプライマーの濃度を通常のPCRのときよりも高く、且つ所定の値以下という最適な範囲が存在することが明らかとなった。
【０１６５】
４．２  MiSeqによる再現性の確認
上記３．２で説明したように、DNAライブラリー作製の再現性を確認するため、NiF8から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、ランダムプライマーで増幅したDNAライブラリーについて次世代シーケンサーMiSeqにより解析した結果を図４８に示した。なお、上記３．２．４の結果として47,484個のリードパターンが得られた。反復間でリード数を比較した結果、電気泳動の結果と同様、反復間で相関係数r=0.991と高い相関を示した。以上の結果から、ランダムプライマーにより再現性良くDNAライブラリー作製可能と考えられた。
【０１６６】
４．３  イネ品種日本晴の解析
上記３．３で説明したように、ゲノム情報が公開されているイネ日本晴から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、ランダムプライマーによりDNAライブラリーを作製し、電気泳動した結果を図４９及び５０に示した。図４９及び５０に示した結果から、ρが0.979と非常に高い値を示した。また、MiSeqによりリードデータを解析した結果を図５１に示した。図５１に示した結果から、相関係数rは0.992と非常に高い値を示した。これらの結果より、イネを対象としても、ランダムプライマーを使用することで非常に高い再現性を持ってDNAライブラリーを作製できることが明らかとなった。
【０１６７】
また、上記３．３．３で説明したように、得られたリードパターンを日本晴ゲノム情報にマッピングした結果、6.2 kbpにlヶ所の割合で、ゲノムに偏りなく均―にDNA断片を増幅していることが明らかとなった(図５２)。また、ランダムプライマーの配列とゲノム情報を比較した結果、平均3.6個のミスマッチが存在しており、99.0%のプライマーペアで1個以上のミスマッチが発生していた(図５３)。以上の結果から、ランダムプライマーを利用したDNAライブラリーは、ゲノム全体に亘って均一的に、且つ再現性良く、非特異的増幅により作製されていることが明らかとなった。
【０１６８】
４．４  サトウキビ多型検出及び遺伝子型判別
上記３．４で説明したように、サトウキビNiF8、Ni9、及びその交雑後代22系統を用いて、ランダムプライマーによりDNAライブラリーを作製、次世代シーケンサーHiSeqで解析し、リードデータをもとに両親の多型検出及び交雑後代の遺伝子型を判別した。その結果を表２４に示した。
【０１６９】
【表２４】
2018000057.tif 000054
【０１７０】
表２４に示すように、NiF8型は8,683個のマーカー、Ni9型は11,655個のマーカー、合計で20,338個のマーカーを作製することができた。また、交雑後代での遺伝子型判別の再現性が99.97%と高く、極めて遺伝子型判別精度が高いと考えられた。特に、サトウキビは多倍数性(8x+n)で染色体数も100〜130本と極めて多く、ゲノムサイズが10Gbpとヒトの3倍以上と極めて大きい。したがって、ゲノムDNA全体に亘って遺伝子型判別が極めて困難であるといった現状がある。上述のように、ランダムプライマーを使用することで極めて多数のマーカーを作製することができ、サトウキビについて精度の高い遺伝子型判別が可能となる。
【０１７１】
４．５  PCRマーカーによる確認実験
上記３．５で説明したように、表２２に示したプライマーを用い、NiF8とNi9、その交雑後代22系統についてPCRを行い電気泳動で遺伝子型を判別し、リード数と比較した。NiF8型のマーカーN80521152のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図５４及び５５に示した。NiF8型のマーカーN80997192のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図５６及び５７に示した。NiF8型のマーカーN80533142のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図５８及び５９に示した。Ni9型のマーカーN91552391のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図６０及び６１に示した。Ni9型のマーカーN91653962のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図６２及び６３に示した。Ni9型のマーカーN91124801のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図６４及び６５に示した。
【０１７２】
図５４〜６５に示したように、上記３．５で設計した全てのPCRマーカーの結果も次世代シーケンサーの解析結果と一致したことから、次世代シーケンサーを用いた遺伝子型判別はマーカー技術として利用可能と考えられた。
【０１７３】
４．６  ランダムプライマー濃度と長さの関係
上記３．６．１で説明したように、9塩基長（表８）、10塩基長（表１、10塩基A）、11塩基長（表９）、12塩基長（表１０）、14塩基長（表１１）、16塩基長（表１２）、18塩基長（表１３）及び20塩基長（表１４）のランダムプライマーを用いてDNAライブラリーを作製した結果を図６６〜８１に示した。また、表２５にこれらの結果を纏めた。
【０１７４】
【表２５】
2018000057.tif 000055
【０１７５】
図６６〜８１に示すように、通常の13.3倍に相当する10.OμMの高濃度ランダムプライマーを使用した場合、９塩基長〜２０塩基長の範囲においては、非常に高い再現性を達成しながら低分子のDNA断片を増幅できることが明らかとなった。特に、ランダムプライマーの塩基長が長くなるほど（特に12塩基長以上）、増幅断片が低分子化する傾向が見られた。なお、9塩基長のランダムプライマーを使用した際は、アニーリング温度を37℃に設定することでDNA断片の増幅量を増やすことができた。
【０１７６】
また、上記３．６．２で説明したように、ランダムプライマーの濃度と長さの関係を明確にするため、ランダムプライマーを8〜35塩基長、ランダムプライマー濃度を0.6〜300μMの範囲でPCRを行い、DNAライブラリーの作製を試みた。結果を表２６に示した。
【０１７７】
【表２６】
2018000057.tif 000056
【０１７８】
表２６に示すように、ランダムプライマーの長さが9〜30塩基長であり、且つランダムプライマーの濃度を4.0〜200μMとすることで、低分子（100〜500塩基）のDNA断片を再現性高く増幅できることが明らかとなった。特に、ランダムプライマーの長さが9〜30塩基長であり、且つランダムプライマーの濃度を4.0〜100μMとすることで、低分子（100〜500塩基）のDNA断片を再現性高く確実に増幅できることが明らかとなった。
【０１７９】
また、表２６に示した結果を更に詳細に検討すると、ランダムプライマーの長さと濃度は、図８２に示すように、特に枠で囲った領域内に調整することが好ましいことが判る。より具体的に、ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが9〜10塩基長である場合、40〜60μMとすることが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが10〜14塩基長である場合、ランダムプライマーの塩基長をyとし、ランダムプライマーの濃度をxとしたときに、y>3E+08x-6.974且つ100μM以下を満たすことが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが14〜18塩基長の場合、4〜100ｍＭとすることが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが18〜28塩基長の場合、4μM以上であり、且つy<8E+08x-5.533を満たすことが好ましい。ランダムプライマーの濃度は、ランダムプライマーが28〜29塩基長の場合、4〜10μMとすることが好ましい。なお、これらy>3E+08x-6.974及びy<8E+08x-5.533は、Microsoft Excelの累乗近似に基づいて算出した式である。
【０１８０】
以上のように、ランダムプライマーの塩基長と濃度とを所定の範囲に規定することで、低分子（100〜500塩基）のDNA断片を再現性高く増幅できることが明らかとなった。例えば、次世代シーケンサーにおいては、高分子DNA断片を解析するとデータ精度が著しく低下することが知られている。本実施例に示したように、ランダムプライマーの塩基長と濃度とを所定の範囲に規定することで、次世代シーケンサーの解析に適した分子サイズのDNAライブラリーを再現性良く作製することが可能であり、次世代シーケンサーマーカー解析に適していると言える。
【０１８１】
４．７  ランダムプライマー数
上記３．７で説明したように、1種、2種、3種、12種、24種又は48種のランダムプライマー（濃度は60μM）を用いてDNAライブラリーを作製した結果を図８３〜９４に示した。また、表２７にこれらの結果を纏めた。
【０１８２】
【表２７】
2018000057.tif 000057
【０１８３】
図８３〜９４に示すように、1種、2種、3種、12種、24種又は48種のランダムプライマーのいずれの場合でも、非常に高い再現性を達成しながら低分子のDNA断片を増幅できることが明らかとなった。特に、ランダムプライマーの種類が増えるにつれて、電気泳動像のピークが小さくなり、偏りがなくなる傾向にあることが判る。
【０１８４】
４．８  ランダムプライマー配列
上記３．８で説明したように、表２〜６に示したランダムプライマーのセット（10塩基B、10塩基C、10塩基D、10塩基E及び10塩基F）それぞれを用いてDNAライブラリーを作製した結果を図９５〜１０４に示した。また、表２８にこれらの結果を纏めた。
【０１８５】
【表２８】
2018000057.tif 000058
【０１８６】
図９５〜１０４に示すように、10塩基B、10塩基C、10塩基D、10塩基E及び10塩基Fのいずれのセットを用いた場合でも、非常に高い再現性を達成しながら低分子のDNA断片を増幅できることが明らかとなった。
【０１８７】
４．９  ヒトDNAライブラリー作製
上記３．９で説明したように、ヒト由来ゲノムDNA及び最終濃度60μMのランダムプライマー（10塩基A）を用いてDNAライブラリーを作製した結果を図１０５及び１０６に示した。図１０５は反復実験の一回目の結果を示し、図１０６は反復実験の二回目の結果を示している。図１０５及び１０６に示すように、ヒト由来のゲノムDNAを用いた場合であっても、非常に高い再現性を達成しながら低分子のDNA断片を増幅できることが明らかとなった。
【０１８８】
〔実施例２〕
本実施例２では、図１０７に模式的に示した工程に従って、DNAプローブを設計し、設計したDNAプローブを有するDNAマイクアレイを作製した。そして、本実施例では、当該DNAマイクロアレイを用いてDNAマーカーを検出できるか検証した。
【０１８９】
本実施例では、表１に示した10塩基長のランダムプライマーを使用し、サトウキビ品種NiF8及びNi9のゲノムDNA：30ngを使用した以外は、実施例１の３．２．１と同様にしてDNAライブラリーを作製した。また、本実施例では、実施例１の３．２．２と同様にしてシーケンスライブラリーを作製し、実施例１の３．２．３と同様にしてMiSeq解析を行った。
【０１９０】
本実施例では、MiSeq解析の結果として得られたNiF8及びNi9のDNAライブラリーの配列情報に基づいて、TM値が80℃前後になるよう50〜60塩基のDNAプローブを306,176種類設計した。設計したDNAプローブの配列を双方の配列情報と比較、Ni9のDNAライブラリーには見いだされないNiF8特有のプローブ、NiF8のDNAライブラリーには見いだされないNi9特有のプローブをそれぞれ9,587種類及び9,422種類選抜した。これら合計19,002種類の選抜したDNAプローブをもとにG3CGHアレイ8×60Kのアレイの作製をアジレント社に委託した。
【０１９１】
以上のように作製したDNAマイクロアレイを用いて、NiF8、Ni9及び交雑後代22系統から作製したDNAライブラリーの検出実験を行った。
【０１９２】
まず、NiF8、Ni9及び交雑後代22系統のDNAライブラリーは、実施例１の３．２．１と同様に作製した。なお、Ni9及び交雑後代2系統(Fl_01及びFl_02)については、反復データとしてそれぞれ2つのDNAライブラリーを作製した。また、作製したDNAライブラリーに対しては、NimbleGen Arrays User’s Guideに従い、NimbleGen One-Color DNA Labeling KitによりCy3-Random Nonamersを用い蛍光標識した。
【０１９３】
次に、DNAマイクロアレイと蛍光標識したDNAライブラリーを用い、アジレントIn-situオリゴDNAマイクロアレイキットアレイCGH(aCGH)法に従ってハイブリダイゼーションを行った。その後、SureScanスキャナーを用いて各DNAライブラリーを用いたときのDNAマイクロアレイにおけるシグナルを検出した。
【０１９４】
NiF8、Ni9及び交雑後代22系統について得られたシグナルから、シグナルの強弱が明確なDNAプローブを7,140種類同定した。これらDNAプローブに対応するDNA断片は、NiF8型マーカー及びNi9型マーカーとすることができる。本実施例では、これらNiF8型マーカー及びNi9型マーカーに対応するDNAプローブのシグナルをもとに、それぞれの遺伝子型データを算出したまた、交雑後代2系統(Fl_01及びFl_02)の反復間の遺伝子型データを比較し、両データの再現性から遺伝子型判別の精度を評価した。
【０１９５】
一方、本実施例では、上述したDNAマイクロアレイ実験の結果と比較するため、PCRマーカーにより遺伝子型データを取得した。具体的には、実施例１の３．５に記載したNiF8型の3つのマーカー、Ni9型の3つのマーカーの合計6マーカーについて、同３．５に記載したプライマーを使用した（表２２）。そして、実施例１の３．５．２に記載した方法でPCR及び電気泳動を行い、DNAマイクロアレイからのシグナルと比較した。
【０１９６】
なお、本実施例において、表２２に示した６つのマーカーそれぞれに対して以下のDNプローブを設計した（表２９）。
【０１９７】
【表２９】
2018000057.tif 000059
【０１９８】
＜結果及び考察＞
〔DNAマイクロアレイ解析〕
上述のように作製したDNAマイクロアレイを用い、サトウキビ品種NiF8、Ni9及び交雑後代22系統についてアレイ解析を実施した結果、表３０に示すように、両親間でシグナルが明瞭に異なるマーカーを3,570個同定した（図１０８）。
【０１９９】
【表３０】
2018000057.tif 000060
【０２００】
また、Ni9について反復間でシグナルを比較した結果、両者の間に高い相関関係が見出された(図１０９:r=0.9989)。この結果から、高濃度のランダムプライマーを利用することで、再現性に優れたDNAライブラリーを作製することができ、また、DNAプローブによってDNAライブラリーに含まれるDNA断片（すなわちマーカー）を検出できることが予測できた。
【０２０１】
また、交雑後代22系統を用いたDNAマイクロアレイ解析の結果、合計78,540個の遺伝子型データを取得することができ、すべてのマーカーにおいて欠測値は見られなかった。遺伝子型判別精度を評価するため、Fl_01とF1_02の反復データを比較した結果、NiF8型のマーカーについてはすべて一致した。また、Ni9型のマーカーについては、Fl_01で1つ結果が異なつていたものの、Fl_02ではすべて一致していた。全マーカーでは、遺伝子型データ7,140個のうち7,139個のデータが一致しており、一致率は99,99%と極めて高い再現性を示した。
【０２０２】
〔PCRマーカーによる確認実験〕
NiF8型の3つのマーカー、Ni9型の3つのマーカーの合計6つのマーカーについて、ペアエンドのマーカー配列情報から設計したプライマーを用い、NiF8とNi9、その交雑後代22系統についてPCRを行い電気泳動で遺伝子型を判別し、DNAマイクロアレイのシグナルと比較した。マーカー名：N80521152に対応するDNAプローブからのシグナル値を測定した結果を図１１０に示し、N80997192に対応するDNAプローブからのシグナル値を測定した結果を図１１１に示し、N80533142に対応するDNAプローブからのシグナル値を測定した結果を図１１２に示し、N91552391に対応するDNAプローブからのシグナル値を測定した結果を図１１３に示し、N91653962に対応するDNAプローブからのシグナル値を測定した結果を図１１４に示し、N91124801に対応するDNAプローブからのシグナル値を測定した結果を図１１５に示した。なお、マーカーN80521152についての電気泳動像を図５５に示し、マーカーN80997192についての電気泳動像を図５７に示し、マーカーN80533142についての電気泳動像を図５９に示し、マーカーN91552391についての電気泳動像を図６１に示し、マーカーN91653962についての電気泳動像を図６３に示し、マーカーN91124801についての電気泳動像を図６５に示している。これら電気泳動像の結果と、DNAプローブからのシグナル値を測定した結果を比較すると、すべてのマーカーにおいて結果が一致していることが判る。この結果より、高濃度のランダムプライマーを用いて得られたDNAライブラリーに含まれるDNA断片の塩基配列に基づいてDNAプローブを設計することで、当該DNA断片を高精度に検出できることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４５】
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【図４６】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図６０】
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【図６３】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図７０】
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【図７４】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９７】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１２】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【配列表】
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