(57)【要約】      （修正有）【課題】抗炎症及び骨分化促進活性を有するペプチドを提供することを目的とする。【解決手段】特定のアミノ酸配列で構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなる発毛促進活性を有するペプチドを提供する。該ペプチドは、炎症性サイトカインの発現を抑制し、炎症細胞の増殖を抑制することによって、結果的に、抗炎症活性を示し、骨形成に関与するＰＩ３Ｋ、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、及びＳｍａｄ８のリン酸化を増加させ、ＡＬＰ、ＯＰＧ及びＢＳＰの発現を増加させることによって、結果的に、骨分化を促進させる。該ペプチドは、毛嚢細胞及び臍帯静脈内皮細胞の増殖を促進させ、ＥＲＫのリン酸化を増加させ、毛髪成長に関与するタンパク質であるＰＩ３Ｋ、β−カテニン、ＩＧＦ−１、ＫＧＦ、Ｗｎｔ３ａの発現を増加させ、脱毛遺伝子であるＤＫＫ−１の発現を減少させることによって、結果的に、脱毛予防及び発毛促進効能を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなる抗炎症活性を有するペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、炎症性サイトカインの発現を抑制することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドは、炎症細胞の増殖を抑制することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなる骨分化促進活性を有するペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドは、ＰＩ３Ｋ、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、及びＳｍａｄ８のリン酸化を増加させることを特徴とする請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドは、ＡＬＰ、ＯＰＧ、及びＢＳＰの発現を増加させることを特徴とする請求項４に記載のペプチド。
【請求項７】
配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなる発毛促進活性を有するペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドは、毛嚢細胞または臍帯静脈内皮細胞の増殖を促進させることを特徴とする請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドは、ＥＲＫのリン酸化を増加させることを特徴とする請求項７に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドは、ＰＩ３Ｋ、β−カテニン、ＩＧＦ−１、ＫＧＦ、及びＷｎｔ３ａの発現を増加させることを特徴とする請求項７に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドは、ＤＫＫ−１の発現を減少させることを特徴とする請求項７に記載のペプチド。
【請求項１２】
請求項１から３のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む抗炎症用組成物。
【請求項１３】
請求項４から６のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む骨分化促進用組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、骨疾患の改善または治療に用いられることを特徴とする請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記骨疾患は、骨多孔症、少年期骨多孔症、骨形成不全症、骨軟化症、骨壊死症、くる病、骨髄炎、歯槽骨消失、骨ページェット病、高カルシウム血症、原発性副甲状線機能亢進症、転移性骨疾患、骨髄腫、リウマチ性関節炎での骨消失、癌による骨消失、線維性骨異形成症、無形性骨疾患、代謝性骨疾患、または年齢による骨質量の消失を含むことを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項７から１１のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む脱毛防止または発毛促進用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１４年５月１３日付で大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１４−００５７１９１号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参考として組み込まれる。
【０００２】
本発明は、抗炎症、骨形成及び発毛促進活性を有するペプチド及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ−α）は、細菌感染及び腫瘍疾患に対する宿主免疫反応中に活性化された大食細胞及び多くの多様な細胞によって生成される。このサイトカインは、炎症反応の重要な媒介体としても知られているが、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、乾癬性関節炎、クローン病、乾癬、強直性脊髄炎（ＡＳ）のような炎症性疾患に重要な役割を担当している炎症性サイトカインである。例えば、リウマチ性関節炎で、ＴＮＦ−αは、滑液炎症を持続させ、骨と軟骨とを持続的に破壊させる。したがって、ＴＮＦ−αの特異的生物活性を抑制することが要求されるので、ＴＮＦ−αが媒介される細胞反応を防ぎ、炎症前のサイトカインの活性とＴＮＦ−αによって調節される過程を調整するための目的としてＴＮＦ−αを抑制する多様な生物学的製剤が開発されている。
【０００４】
一方、骨は、筋肉や臓器を構造的に支えるだけではなく、体内のカルシウムや他の必須無機質、すなわち、リンやマグネシウムのような物質を貯蔵する人体の重要な部分の１つである。したがって、成長が終わった成人の骨は、止めずに、死ぬまで古い骨は除去し、新たな骨に代替する生成と吸収過程とを非常に躍動的、持続的に繰り返し再生しながら、均衡を保持する。
【０００５】
骨再形成には、大きく２種の細胞が関与すると知られている。２つの細胞のうち、１つは、骨を生成する造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）であり、他の１つは、骨を破壊する破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）である。造骨細胞は、ＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−κＢ  ｌｉｇａｎｄ）と、これの誘導受容体（ｄｅｃｏｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であるＯＰＧ（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）と、を生成する。ＲＡＮＫＬが、破骨前駆細胞（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ）の表面にある受容体であるＲＡＮＫに結合すれば、破骨前駆細胞が破骨細胞に成熟化（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）されて、骨吸収（ｂｏｎｅ  ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）が起こる。しかし、ＯＰＧが、ＲＡＮＫＬと結合すれば、ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫとの間の結合が遮断されて、破骨細胞の形成が抑制され、必要以上の骨吸収が起こらない（非特許文献１〜２）。古い骨の吸収または破壊は、血液細胞（造血母細胞）で生じる破骨細胞によってなされ、これは、骨に穴を開けて少量のカルシウムを血流に放出させて、身体機能の保持に使われる（非特許文献３）。一方、骨細胞から生成された造骨細胞は、膠原質で穴を満たし、カルシウムとリンとの沈積物（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）を覆って、堅い新たな骨を作って骨格を再建する（非特許文献４）。骨が破壊され始めて、再び新たな骨に再形成されるまでは、約１００日程度かかる（非特許文献５）。乳児では、１年内に骨のカルシウムが１００％変わるが、成人では、毎年骨格の約１０〜３０％が、このような過程を通じて再形成され、破骨速度と造骨速度とが同一して初めて、前のような骨密度を保持することができる。このように、重要な骨に均衡が破れる場合、多くの疾病が引き起こされるが、特に、骨多孔症と癌細胞の骨転移（ｂｏｎｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）による骨の損傷と関連した疾患が代表的である。
【０００６】
骨多孔症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）は、さまざまな原因によって骨の質量が減少し、骨組織の微細構造の退化によって骨折の危険が持続的に増加する疾患であって、骨を構成するミネラル（特に、カルシウム）と基質とが減少した状態であり、骨再形成の均衡が破れて、破骨作用が造骨作用よりも増加した状態で発生する（非特許文献６）。正常な骨の内部は、網のように緻密な構造を成しているが、骨多孔症の場合には、構造間の間隔が広くなり、微細構造が薄くなって弱くなることによって、小さな衝撃にも骨が骨折しやすい状態に進行する（非特許文献７）。骨多孔症は、閉経期の開始と同時に急速な骨損失（年間２〜３％）が表われ、脊椎の圧迫及び手首骨が骨折しやすい危険が増加する閉経期以後の骨多孔症（Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、７０歳以上の男女の老人に徐々に発生し（年間０．５〜１％）、骨盤骨（ｈｉｐ  ｂｏｎｅ）と脊椎骨の漸進的な骨損失をもたらす老年期の骨多孔症（Ｓｅｎｉｌｅ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、そして、年齢に関係なく疾病（内分泌疾患、胃腸管疾患、悪性腫瘍）や薬物（副腎皮質ホルモン、坑癌化学療法、甲状腺ホルモン、坑痙攣剤、坑凝固剤、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）、ＧｎＲＨなど）、アルコール、喫煙、事故によって発生する２次骨多孔症（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）に分類される（非特許文献８〜９）。
【０００７】
乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）または多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ）の患者でほぼ常に骨転移が起こり（非特許文献１０）、これら癌患者がどれほど長期間生きているかは、骨転移の有無によって影響を受けると知られている。乳癌患者や前立腺癌患者の死亡率が高くなる理由は、癌細胞が選択的に骨に転移されるためである。乳癌から観察される骨転移は、ほとんど骨を破壊する骨溶解性骨転移（ｏｓｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）であって、乳癌細胞が骨に直接的な影響を及ぼすものではなく、破骨細胞を刺激することで起こると知られている（非特許文献１１）。一方、前立腺癌から観察される骨転移は、骨組成骨転移（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）である。骨組成骨転移も、骨溶解と密接な関連があると知られている。骨に転移した癌細胞は、骨周囲の微細環境で増殖して破骨細胞や造骨細胞の活性を刺激することによって、骨溶解性骨転移に進行するか、骨組成骨転移に進行するかを決定する（非特許文献１２）。乳癌患者の約８０％が癌細胞の骨転移が発生し、転移された乳癌細胞は、破骨細胞を活性化させる（非特許文献１３〜１４）。活性化された破骨細胞は、骨周囲の微細環境の均衡を破壊させて骨溶解（ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ）を引き起こせ、このような現象によって、病的骨折がよく発生するだけではなく、白血球減少症（ｌｅｕｋｏｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ａｎａｅｍｉａ）、骨の奇形、高カルシウム血症（ｈｙｐｅｒｃａｌｃｅｍｉａ）、疼痛（ｐａｉｎ）、神経圧迫症候群（ｎｅｒｖｅｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）などの骨と関連した疾患が発生する（非特許文献１５）。
【０００８】
大韓民国の国民健康保険公団の健康保険政策研究院が、２００１年から２００８年まで健康保険診療費の支給資料を分析した内容によれば、‘脱毛疾患’の実診療患者数が、２００１年１０万３千人から２００５年１４万２千人、そして、２００８年１６万５千人に表われ、最近７年間６０％増加した。年令別には、２０〜４０代の実診療患者数が１１万４千人であって、患者の６９．５％を占め、１０代以下の患者も、２万２千人以上であると表われた。性別の実診療患者数は、２００８年基準に、男性が８万４千人であり、女性は８万人に表われ、男性が女性よりも少し多い実情であり、‘脱毛’疾患の傷病別の国内健康保険の実診療患者数は、２００８年基準に、円形脱毛症（１３万人）、瘢痕性脱毛症（２万人）、アンドロゲン性脱毛症（９千人）、その他の非瘢痕性毛髪損失（８千人）順に表われた。
【０００９】
海外の脱毛患者の有病率を見れば、２００３年６月国際毛髪及び成形美容研究討論会の資料によれば、全世界的に２．５億人が脱毛患者であり、２４〜５０歳で脱毛発病率が３０〜６５％程度に表われた。２００８年基準に、中国の脱毛人口は、約３億人に至り、３０代の男性人口の３０％、そして、５０代の男性人口の５０％程度が脱毛の症状を示しており、毎年脱毛患者数は、１０〜１５％程度増加している。日本人の場合、脱毛発病率が２６．５％であり、推定脱毛患者人口数は、１，２９３万人程度と予想された。
【００１０】
現在、脱毛治療のための製剤は、大きく医薬品と医薬部外品、そして、化粧品に分類される。医師の処方があれば、購入が可能な専門医薬品には、米国Ｍｅｒｃｋ社で開発販売している‘プロペシア’があり、その主成分であるフィナステリド（Ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）は、１９９７年１２月米国ＦＤＡから脱毛治療剤として承認を受けた。フィナステリドは、テストステロンを、ジヒドロテストステロン（ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ、ＤＨＴ）に切り替える５−α−レダクターゼ酵素を抑制する薬剤であって、軟毛を太くて長い毛髪に成長させる役割を果たす。これは、短期的に脱毛改善に効果があるが、勃起不全、性機能減退、男性の乳房肥大のような副作用が報告されている。安全性と有効性とが認められて、医師の処方なしも購入が可能な薬品として、ミノキシジル（Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）があり、１９９７年１２月米国ＦＤＡから最初の塗るタイプの脱毛治療剤として承認された。この薬品は、血液循環を改善させ、カリウムチャネルを開放させることによって、毛髪成長を促進させる効果があるが、痒み、発疹などの局所反応が起こる恐れがあり、頻脈などが起こることもある。
【００１１】
大韓民国の食品医薬品安全庁から脱毛防止と育毛機能とを許可された医薬部外品の製品には、代表的にＣＪライオンの‘毛髪力コンピテント’、モラクルの‘ヘアトニック’、ＬＧ生活健康の‘毛＆ＭＯＲＥ’などがあり、化粧品類としては、シャンプー類または皮膚、毛髪の健康を保持または増進するために、頭皮や毛髪に使われる製品が販売されている。ヒトの脱毛周期は、大きく成長期（ａｎａｇｅｎ）、退行期（ｃａｔａｇｅｎ）、及び休止期（ｔｅｌｏｇｅｎ）に区分される。成長期は、毛乳頭の活動が活発でありながら、細胞分裂が旺盛に起こり、毛髪が迅速に成長する時期である。成長期の寿命は、毛の種類ごとに異なるが、髪の毛の場合、３〜６年程度である。成長期の毛髪は、全体毛髪の８０〜９０％を占め、脱毛が進められているヒトは、成長期が短くなり、休止期が長い毛髪周期を有して、全体毛髪で成長期の毛髪の比重が減少する。退行期は、毛髪の成長期が終わり、毛髪生成が次第に遅くなり、結局、細胞分裂及び成長が止まる時期であって、退行期の寿命は、１〜１．５ヶ月程度であり、全体毛髪の１％程度が、この段階に属する。休止期は、成長の最後の段階であって、毛嚢と毛乳頭とが完全に分離されて、毛嚢は萎縮され、毛根はさらに上側に上がって、髪の毛が抜ける段階である。休止期は、３〜４ヶ月間持続し、全体毛髪の４〜１４％が、この段階に該当する。休止期が終わり、再び毛乳頭の活動が活発になれば、新たな毛髪の毛乳頭が作られながら、休止期にあった毛髪は押し出されて、完全に頭皮外に抜け出る。
【００１２】
本明細書の全般に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、それを全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｔｈｅｉｌｌ  ＬＥ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０：７９５−８２３（２００２）
【非特許文献２】Ｗａｇｎｅｒ  ＥＦ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ．，１１：５２７−５３２（２００１）
【非特許文献３】Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．，４２３：３３７３４２（２００３）
【非特許文献４】Ｓｔａｉｎｓ  ＪＰ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｒｔｈ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  Ｒｅｓ  Ｃ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｔｏｄａｙ．，７５（１）：７２−８０（２００５）
【非特許文献５】Ｓｃｈｗａｒｚ  ＥＭ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ．，１１：３２９−３３５（２０００）
【非特許文献６】Ｉｑｂａｌ  ＭＭ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｍｅｄ  Ｊ．，９３（１）：２−１８（２０００）
【非特許文献７】Ｓｔｅｐａｎ  ＪＪ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｇｕｌ．，３７（４）：２２５−２３８（２００３）
【非特許文献８】Ｒｏｓｅｎ  ＣＪ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．，３５３（６）：５９５−６０３（２００５）
【非特許文献９】Ｄａｖｉｄｓｏｎ  Ｍ．，Ｃｌｉｎｉｃａｉｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．，１２（４）：７５−８２（２００２）
【非特許文献１０】Ｋｏｚｌｏｗ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．，１０（２）：１６９−１８０（２００５）
【非特許文献１１】Ｂｏｙｄｅ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃ．，４：１５３７−１５５４（１９８６）
【非特許文献１２】Ｃｈｏｏｎｇ  ＰＦ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｌａｔ  Ｒｅｓ．，４１５Ｓ：Ｓ１９−Ｓ３１（２００３）
【非特許文献１３】Ｂｅｎｄｒｅ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｌａｔ  Ｒｅｓ．，４１５（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ３９−Ｓ４５（２００３）
【非特許文献１４】Ｐａｌｍｑｖｉｓｔ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９（６）：３３５３−３３６２（２００２）
【非特許文献１５】Ｒｏｏｄｍａｎ  ＧＤ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．，３５０：１６５５−１６６４（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者らは、生物学的に有効な活性を有する優れたペプチドを開発するために努力した結果、配列表の配列番号１、配列表の配列番号２及び配列表の配列番号３のアミノ酸配列で構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなるペプチドが、抗炎症及び骨形成活性を示し、配列表の配列番号１及び配列表の配列番号３のアミノ酸配列で構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなるペプチドが、発毛促進活性を有するということを究明することによって、本発明を完成した。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、抗炎症活性を有するペプチドを提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、骨分化促進活性を有するペプチドを提供することである。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、発毛促進活性を有するペプチドを提供することである。
【００１８】
本発明のさらに他の目的は、抗炎症用組成物を提供することである。
【００１９】
本発明のさらに他の目的は、骨分化促進用組成物を提供することである。
【００２０】
本発明のさらに他の目的は、脱毛防止または発毛促進用組成物を提供することである。
【００２１】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明の一態様によれば、本発明は、配列表の配列番号１、配列表の配列番号２及び配列表の配列番号３のアミノ酸配列で構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなる抗炎症活性を有するペプチドを提供する。
【００２３】
本発明の他の一態様によれば、本発明は、配列表の配列番号１、配列表の配列番号２及び配列表の配列番号３のアミノ酸配列で構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなる骨分化促進活性を有するペプチドを提供する。
【００２４】
本発明の他の一態様によれば、本発明は、配列表の配列番号１及び配列表の配列番号３のアミノ酸配列で構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなる発毛促進活性を有するペプチドを提供する。
【００２５】
本発明者らは、生物学的に有効な活性を有する優れたペプチドを開発するために努力した結果、配列表の配列番号１、配列表の配列番号２及び配列表の配列番号３のアミノ酸配列で構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなるペプチドが、抗炎症及び骨形成活性を示し、配列表の配列番号１及び配列表の配列番号３のアミノ酸配列で構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなるペプチドが、発毛促進活性を有するということを究明した。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ｉ）本発明は、配列表の配列番号１、配列表の配列番号２及び配列表の配列番号３のアミノ酸配列で構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなる抗炎症及び骨分化促進活性を有するペプチドを提供する。
（ｉｉ）本発明は、配列表の配列番号１及び配列表の配列番号３のアミノ酸配列で構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなる発毛促進活性を有するペプチドを提供する。
（ｉｉｉ）本発明の配列表の配列番号１、配列表の配列番号２または配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドは、炎症性サイトカインの発現を抑制し、炎症細胞の増殖を抑制することによって、結果的に、抗炎症活性を示し、骨形成に関与するＰＩ３Ｋ、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、及びＳｍａｄ８のリン酸化を増加させ、ＡＬＰ、ＯＰＧ及びＢＳＰの発現を増加させることによって、結果的に、骨分化を促進させる。
（ｉｖ）本発明の配列表の配列番号１または配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドは、毛嚢細胞及び臍帯静脈内皮細胞の増殖を促進させ、ＥＲＫのリン酸化を増加させ、毛髪成長に関与するタンパク質であるＰＩ３Ｋ、β−カテニン、ＩＧＦ−１、ＫＧＦ、Ｗｎｔ３ａの発現を増加させ、脱毛遺伝子であるＤＫＫ−１の発現を減少させることによって、結果的に、脱毛予防及び発毛促進効能を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１ａ】本発明のペプチドに対するＴＮＦ受容体結合度を測定した結果である。
【図１ｂ】本発明のペプチドに対するＴＮＦ受容体結合度を測定した結果である。
【図１ｃ】本発明のペプチドに対するＴＮＦ受容体結合度を測定した結果である。
【図２ａ】本発明のペプチドによる大食細胞の増殖変化を測定した結果である。
【図２ｂ】本発明のペプチドによる大食細胞の増殖変化を測定した結果である。
【図２ｃ】本発明のペプチドによる大食細胞の増殖変化を測定した結果である。
【図２ｄ】本発明のペプチドによる大食細胞の増殖変化を測定した結果である。
【図２ｅ】本発明のペプチドによる大食細胞の増殖変化を測定した結果である。
【図２ｆ】本発明のペプチドによる大食細胞の増殖変化を測定した結果である。
【図３ａ】ＴＮＦ−α処理によって活性化されたＮＦ−κＢの核内への移動に作用する本発明のペプチドの効果を測定した結果である。
【図３ｂ】ＴＮＦ−α処理によって活性化されたＮＦ−κＢの核内への移動に作用する本発明のペプチドの効果を測定した結果である。
【図３ｃ】ＴＮＦ−α処理によって活性化されたＮＦ−κＢの核内への移動に作用する本発明のペプチドの効果を測定した結果である。
【図４ａ】ＴＮＦ−α処理によって増加したＩＬ−１β発現に作用する本発明のペプチドの効果を測定した結果である。
【図４ｂ】ＴＮＦ−α処理によって増加したＩＬ−１β発現に作用する本発明のペプチドの効果を測定した結果である。
【図４ｃ】ＴＮＦ−α処理によって増加したＩＬ−１β発現に作用する本発明のペプチドの効果を測定した結果である。
【図５ａ】ＴＮＦ−α処理によって増加したＩＬ−８発現に作用する本発明のペプチドの効果を測定した結果である。
【図５ｂ】ＴＮＦ−α処理によって増加したＩＬ−８発現に作用する本発明のペプチドの効果を測定した結果である。
【図５ｃ】ＴＮＦ−α処理によって増加したＩＬ−８発現に作用する本発明のペプチドの効果を測定した結果である。
【図６】本発明のペプチドに対するＨＧＦ受容体結合度を測定した結果である。
【図７】ＨＧＦ受容体の信号刺激によって増加するＰＩ３Ｋリン酸化に作用する本発明のペプチドの効果を測定した結果である。
【図８】本発明のペプチドに対するＢＭＰ受容体結合度を測定した結果である。
【図９】ＢＭＰ受容体の信号刺激によって増加するＳｍａｄ１／５／８リン酸化に作用する本発明のペプチドの効果を測定した結果である。
【図１０ａ】本発明のペプチドに対するＡＬＰ発現変化を測定した結果である。
【図１０ｂ】本発明のペプチドに対するＡＬＰ発現変化を測定した結果である。
【図１０ｃ】本発明のペプチドに対するＡＬＰ発現変化を測定した結果である。
【図１１ａ】本発明のペプチドの骨分化促進による鉱物化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）を測定した結果である。
【図１１ｂ】本発明のペプチドの骨分化促進による鉱物化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）を測定した結果である。
【図１１ｃ】本発明のペプチドの骨分化促進による鉱物化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）を測定した結果である。
【図１２ａ】本発明のペプチドによる骨分化標識因子（ＯＰＧ、ＡＬＰ及びＢＳＰ）の発現変化を測定した結果である。
【図１２ｂ】本発明のペプチドによる骨分化標識因子（ＯＰＧ、ＡＬＰ及びＢＳＰ）の発現変化を測定した結果である。
【図１２ｃ】本発明のペプチドによる骨分化標識因子（ＯＰＧ、ＡＬＰ及びＢＳＰ）の発現変化を測定した結果である。
【図１３ａ】本発明のペプチドによる毛髪真皮乳頭細胞の増殖変化を測定した結果である。
【図１３ｂ】本発明のペプチドによる毛髪真皮乳頭細胞の増殖変化を測定した結果である。
【図１４ａ】本発明のペプチドによる毛髪毛母細胞の増殖変化を測定した結果である。
【図１４ｂ】本発明のペプチドによる毛髪毛母細胞の増殖変化を測定した結果である。
【図１５ａ】本発明のペプチドによる臍帯静脈内皮細胞の増殖変化を測定した結果である。
【図１５ｂ】本発明のペプチドによる臍帯静脈内皮細胞の増殖変化を測定した結果である。
【図１６】本発明のペプチドによるＥＲＫリン酸化、ＰＩ３Ｋ発現及びβ−カテニンの発現変化を測定した結果である。
【図１７】本発明のペプチドによるＩＧＦ−１、ＫＧＦ、及びＷｎｔ３ａの発現変化を測定した結果である。
【図１８】ＤＨＴ処理によって増加したＤＫＫ−１発現に作用する本発明のペプチドの効果を測定した結果である。
【図１９】本発明のペプチドによるＨａ３−ＩＩ及びケラチン１４の発現変化を測定した結果である。
【図２０】本発明のペプチドによるラットのひげの成長変化を測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明のペプチドは、配列表の配列番号１、配列表の配列番号２または配列表の配列番号３のアミノ酸配列を含む。具体的には、本発明のペプチドは、配列表の配列番号１、配列表の配列番号２または配列表の配列番号３のアミノ酸配列で必須的に構成されている。
【００２９】
本発明の一具現例によれば、本発明の配列表の配列番号１、配列表の配列番号２または配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドは、炎症性サイトカインの発現を抑制し、炎症細胞の増殖を抑制することによって、結果的に、抗炎症活性を示す。
【００３０】
本発明の他の具現例によれば、本発明の配列表の配列番号１、配列表の配列番号２または配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドは、骨形成に関与するＰＩ３Ｋ、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、及びＳｍａｄ８のリン酸化を増加させ、ＡＬＰ、ＯＰＧ及びＢＳＰの発現を増加させることによって、結果的に、骨分化を促進させる。
【００３１】
本発明の他の具現例によれば、本発明の配列表の配列番号１または配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドは、毛嚢細胞及び臍帯静脈内皮細胞の増殖を促進させ、ＥＲＫのリン酸化を増加させ、毛髪成長に関与するタンパク質であるＰＩ３Ｋ、β−カテニン、ＩＧＦ−１、ＫＧＦ、Ｗｎｔ３ａの発現を増加させ、脱毛遺伝子であるＤＫＫ−１の発現を減少させることによって、結果的に、脱毛予防及び発毛促進効能を示す。
【００３２】
本明細書で使われる用語“ペプチド”は、ペプチド結合によってアミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。本発明のペプチドは、当業者に公知の化学的合成方法、特に、固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ．ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１（１９８４））または液相合成技術（ＵＳ登録特許第５，５１６，８９１号）によって製造可能である。
【００３３】
本発明の一具現例によれば、前記ペプチドのＮまたはＣ末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で構成された群から選択される保護基が結合されうる。
【００３４】
前述したアミノ酸の変形は、本発明のペプチドの安定性を大きく改善する作用を行う。本明細書で言及される用語“安定性”は、“インビボ”安定性だけではなく、保存安定性（例えば、常温保存安定性）も意味する。前述した保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用を行う。
【００３５】
本発明の他の態様によれば、本発明は、前述した配列表の配列番号１、配列表の配列番号２及び配列表の配列番号３のアミノ酸配列で構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む抗炎症用組成物を提供する。
【００３６】
本発明の組成物は、前述した本発明の配列表の配列番号１、配列表の配列番号２または配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含むために、共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００３７】
下記の実施例から立証されたように、本発明の配列表の配列番号１、配列表の配列番号２または配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドは、炎症性サイトカインの発現を抑制し、炎症細胞の増殖を抑制して、炎症反応を抑制することによって、炎症性疾患の予防または治療に非常に有効である。
【００３８】
本発明の抗炎症用組成物が適用可能な炎症性疾患は、炎症性皮膚疾患（例：喘息、湿疹、乾癬、アレルギー、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、アトピー性皮膚炎、にきび、アトピー性鼻炎（乾草熱）、アレルギー性皮膚炎（湿疹）、慢性副鼻腔炎、または脂漏性皮膚炎（ｓｅｂｏｒｒｈｅｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ））、骨疾患、胃炎、痛風、痛風関節炎、潰瘍、慢性気管支炎、急性肺損傷、肺炎症、気道過敏反応、炎症性腸疾患（例：クローン病、潰瘍性大腸炎）、強直性脊椎炎（ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、敗血症、敗血症性ショック、脈管炎、及び滑液嚢炎のような急性または慢性炎症疾患；ループス、リウマチ性多発性筋肉痛、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、側頭動脈炎、低温型グロブリン血症（ｃｒｙｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）、及び多発性硬化症のような自己免疫疾患；移植拒否；固形癌（例：肺、ＣＮＳ、腸、腎臓及び膵臓）を含む癌；アルツハイマー病；動脈硬化症；ウイルス感染（例：ＨＩＶ  ｏｒ  インフルエンザ）；慢性ウイルス感染（例：エプスタイン−バーウイルス、巨大細胞ウイルス、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）；または毛細管拡張性運動失調症を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
本発明の一具現例によれば、本発明の抗炎症性組成物は、薬剤学的組成物または化粧品組成物として製造可能である。
【００４０】
本発明の組成物は、（ａ）前述した本発明のペプチドの薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物として用いられうる。
【００４１】
本明細書で使われる用語“薬剤学的有効量”は、前述したペプチドの効能または活性を果たすのに十分な量を意味する。
【００４２】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微小結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含みうる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。
【００４３】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口で投与し、非経口投与である場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与などで投与することができる。
【００４４】
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様であり、通常の熟練された医師ならば、所望の治療または予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の望ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．０００１〜２００μｇである。
【００４５】
本発明の薬剤学的組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造可能である。この際、剤型は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳液の形態であるか、エクストラクト剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤またはゲル（例えば、ヒドロゲル）の形態でもあり得るが、分散剤または安定化剤をさらに含みうる。
【００４６】
本発明の組成物は、（ａ）前述した本発明のペプチドの化粧品学的有効量（ｃｏｓｍｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）；及び（ｂ）化粧品学的に許容される担体を含む化粧品組成物として用いられうる。
【００４７】
本明細書で使われる用語“化粧品学的有効量”は、前述した本発明の組成物の効能を果たすのに十分な量を意味する。
【００４８】
本発明の化粧品組成物は、当業者に通常製造される如何なる剤型にも製造可能であり、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、及びスプレーなどに剤型化されうるが、これらに限定されるものではない。より詳細には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダーの剤型に製造可能である。
【００４９】
本発明の剤型が、ペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが用いられうる。
【００５０】
本発明の剤型が、パウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムまたはポリアミドパウダーが用いられ、特に、スプレーである場合には、さらにクロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含みうる。
【００５１】
本発明の剤型が、溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００５２】
本発明の剤型が、懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガまたはトラガントなどが用いられうる。
【００５３】
本発明の剤型が、界面活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホスクシン酸モノエステル、イセチオン酸、イミダゾリウム誘導体、メチルタウリン、サルコシン酸、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられうる。
【００５４】
本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分としてのペプチド類と担体成分の以外に、化粧品組成物に通用される成分を含み、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、及び香料のような通常の補助剤を含みうる。
【００５５】
本発明の他の態様によれば、本発明は、前述した配列表の配列番号１、配列表の配列番号２及び配列表の配列番号３のアミノ酸配列で構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む骨分化促進用組成物を提供する。
【００５６】
本発明の組成物は、前述した本発明の配列表の配列番号１、配列表の配列番号２または配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含むために、共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００５７】
下記の実施例から立証されたように、本発明の配列表の配列番号１、配列表の配列番号２または配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む組成物は、骨母細胞株の分化を促進させる。したがって、本発明の組成物は、骨分化を効果的に促進させることができる。
【００５８】
本発明の一具現例によれば、本発明の組成物は、骨分化に関与するＰＩ３Ｋ、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、及びＳｍａｄ８のリン酸化を増加させ、骨分化標識因子であるＯＰＧ、ＡＬＰ及びＢＳＰ遺伝子発現を増加させる。
【００５９】
本発明の他の具現例によれば、本発明の組成物は、骨疾患を改善または治療に用いられうる。
【００６０】
本発明の一具現例によれば、本発明の組成物によって改善または治療される骨疾患は、骨多孔症、少年期骨多孔症、骨形成不全症、骨軟化症、骨壊死症、くる病、骨髄炎、歯槽骨消失、骨ページェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、高カルシウム血症、原発性副甲状線機能亢進症、転移性（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ）骨疾患、骨髄腫、リウマチ性関節炎での骨消失、癌による骨消失、線維性骨異形成症、無形性骨疾患、代謝性骨疾患、及び年齢による骨質量の消失を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
本発明の骨分化促進用組成物は、薬剤学的組成物として製造可能である。
【００６２】
本発明の他の態様によれば、本発明は、前述した配列表の配列番号１及び配列表の配列番号３のアミノ酸配列で構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む脱毛防止または発毛促進用組成物を提供する。
【００６３】
本発明の組成物は、前述した本発明の配列表の配列番号１または配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含むために、共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００６４】
下記の実施例から立証されたように、本発明の配列表の配列番号１または配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む組成物は、毛嚢細胞及び臍帯静脈内皮細胞の増殖を促進させ、ＥＲＫのリン酸化を増加させ、毛髪成長に関与するタンパク質であるＰＩ３Ｋ、β−カテニン、ＩＧＦ−１、ＫＧＦ、Ｗｎｔ３ａの発現を増加させ、脱毛遺伝子であるＤＫＫ−１の発現を減少させることによって、結果的に、脱毛予防及び発毛促進効能を示す。
【００６５】
本発明の脱毛防止または発毛促進用組成物は、薬剤学的組成物または化粧品組成物として製造可能である。
【００６６】
本発明の他の態様によれば、本発明は、有効成分として配列表の配列番号１または配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物を対象に投与する段階を含むメラニン低色素症の改善または治療方法を提供する。
【００６７】
本発明の他の態様によれば、本発明は、有効成分として配列表の配列番号１または配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物を対象に投与する段階を含む肥満の予防または治療方法を提供する。
【００６８】
本発明のメラニン低色素症の改善または治療方法、及び肥満の予防または治療方法は、前述した組成物を用いて実施するものであって、この２つの間の共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００６９】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。
【実施例】
【００７０】
実施例
合成例１：ペプチドの合成
クロロトリチルクロライドレジン（Ｃｈｌｏｒｏ  ｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ；ＣＴＬ  ｒｅｓｉｎ、Ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ  Ｎｏ．０１−６４−００２１）７００ｍｇを反応容器に入れ、メチレンクロライド（ＭＣ）１０ｍｌを加えて３分間撹拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍｌを入れて３分間撹拌した後、再び溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液を入れ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かし、１時間撹拌しながら反応させた。反応後、洗浄し、メタノールとＤＩＥＡ（２：１）とをＤＣＭに溶かして１０分間反応させ、過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去し、ＤＭＦを１０ｍｌ入れて３分間撹拌した後、再び溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピペリジン（Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）／ＤＭＦ）１０ｍｌを反応容器に入れ、１０分間常温で撹拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れ、再び１０分間反応を保持した後、溶液を除去し、それぞれ３分ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄して、Ｃｙｓ−ＣＴＬレジンを製造した。新たな反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れ、Ｆｍｏｃ−  Ｐｒｏ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ  ２００ｍｍｏｌｅ及びＢｏｐ  ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅのＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）を分画で２回に亙って入れた後、あらゆる固体が溶けるまで少なくとも５分間撹拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を脱保護されたレジンがある反応容器に入れ、１時間常温で撹拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で３回５分ずつ撹拌した後、除去した。反応レジンを少量取ってカイザーテスト（Ｎｉｈｙｄｒｉｎ  ｔｅｓｔ）を用いて反応程度を点検した。脱保護溶液で、前記のように同様に２回脱保護反応させて、  Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＣＴＬレジンを製造した。ＤＭＦとＭＣとで十分に洗浄し、もう一度カイザーテストを行った後、前記と同様に、下記のアミノ酸付着実験を行った。選定されたアミノ酸配列に基づいて、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、及びＦｍｏｃ−Ａｌａ順に連鎖反応させた。Ｆｍｏｃ−保護基を脱保護溶液で１０分ずつ２回反応させた後、よく洗浄して除去した。無水酢酸とＤＩＥＡ、ＨｏＢｔ（Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）を入れて１時間アセチル化を行った後、製造されたペプチジルレジンをＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回を洗浄し、窒素空気を徐々に流して乾燥した後、五酸化リン（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ｐｅｎｔｏｘｉｄｅ、Ｐ２Ｏ５）下で真空に減圧して完全に乾燥した後、脱漏溶液［ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）９５％、蒸留水２．５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）２．５％］３０ｍｌを入れた後、常温で時々振りながら２時間反��を保持した。フィルタリングを行ってレジンを濾し、レジンを少量の溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を用いて全体ボリュームが半分程度残るように蒸留し、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、２回さらに冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去し、窒素下で十分に乾燥して、精製前、ＮＨ２−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨペプチド１を０．７９ｇ（収率：８７．７％），ＮＨ２−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨペプチド２を０．７７ｇ（収率：８５．５％），ＮＨ２−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨペプチド３を０．７６ｇ（収率：８４．４％）合成した。分子量測定器を用いて測定時に、ペプチド１の分子量１０３３．３Ｄａ（理論値：１０３３．２Ｄａ）、ペプチド２の分子量１０９６．０Ｄａ（理論値：１０９６．２Ｄａ）、ペプチド３の分子量１０３６．９Ｄａ（理論値：１０３７．１Ｄａ）が得られた。
【００７１】
【表１】
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【００７２】
実施例１：抗炎症活性評価
１−１．受容体結合アッセイ（ＴＮＦＲ）
ＥＬＩＳＡ用プレートに、ペプチド５０μｇ／２５μｌとコーティングバッファ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ９．６）２５μｌとを添加して混ぜ、４℃で一晩培養した。ＰＢＳＴ（３００μｌ）で３回洗浄した後、ブロッキングバッファ（３％ＢＳＡ）２００μｌでブロッキングを２時間室温で実施した。ＰＢＳＴ（３００μｌ）で３回洗浄した後、ＴＧＦＲタイプＩＩ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をウェル当たり０．５μｇ／１ｍｌ添加した後、２時間室温で培養した。ＰＢＳＴ（３００μｌ）ずつ３回洗浄した後、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を１：１，０００で希釈して、ウェル当たり１００μｌずつ添加し、２時間室温で培養した。ＰＢＳＴ（３００μｌ）で３回洗浄した後、ＴＭＢ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を１００μｌずつ添加した後、発色を進行した。停止溶液（３Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）５０μｌを添加して反応を止めた後、Ｏ．Ｄ  ４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００７３】
実験の結果、ＴＮＦＲに対する配列表の配列番号１、配列表の配列番号２及び配列表の配列番号３のペプチドの高い結合親和度（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ）を確認した（陽性対照群：ＴＮＦ−α）（図１ａないし図１ｃ）。
【００７４】
１−２．分化アッセイ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）
マウス大食細胞株であるＲａｗ２６４．７細胞を１ｘ１０４細胞／ウェルの密度で４８ウェルプレートにシーディングした。２４時間安定化した後、６時間無血清培地で培養し、ＴＮＦ−α  １００ｎｇ／ｍｌとペプチド５０μｇ／ｍｌとを同時に処理した後、７２時間培養した。培養が完了した後、培養上澄み液を除去し、エタノールを用いて細胞を固定化した後、細胞固定が終わった後、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ）で３回洗浄した。洗浄溶液を除去した後、比色ＳＲＢ溶液で処理し、１％酢酸で十分に洗浄を行った後、顕微鏡で細胞を観察して、生存細胞の状態を観察し、２０ｍＭトリス（ｔｒｉｓ）で脱染色された溶液に対して紫外線５６０ｎｍで吸光度を測定して、細胞の生存状態を測定した。
【００７５】
実験の結果、ＴＮＦ−α処理によって増加したＲＡＷ２６４．７細胞増殖が、配列表の配列番号１のペプチド処理によって減少することを確認することができた（図２ａないし図２ｆ）。
【００７６】
１−３．ヒト毛母細胞を用いたウェスタンブロッティング
ヒト毛母細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）であるＨａＣａＴ細胞を５ｘ１０５細胞／ウェルで６ウェルプレートにシーディングした後、一晩培養した後、、ペプチドを濃度別に処理し、１時間培養した。細胞を溶解した後、抗ｐＥＲＫ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）と抗ｐ−ｃ−Ｊｕｎ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）とを用いてＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナルであるｐ−Ｅｒｋ、ｐ−ｃ−Ｊｕｎに対するウェスタンブロッティングを行った。
【００７７】
実験の結果、ＴＮＦ−α処理によって活性化されたＮＦ−κＢの核内への移動は、配列表の配列番号１のペプチド処理によって減少した（図３ａないし図３ｃ）。
【００７８】
１−４．ＩＬ−１β及びＩＬ−８に対するＥＬＩＳＡ
ヒト単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）ＴＨＰ−１細胞を２ｘ１０６細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートにシーディングした。一晩培養した後、サンプルを１０μｇ／ｍｌの濃度で３０分間前処理し、５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−αを処理した後、２４時間培養した。細胞培養培地を獲得し、４℃、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液を分離した。ＩＬ−１ｂ及びＩＬ−８ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いてＥＬＩＳＡを行った。
【００７９】
実験の結果、ＴＮＦ−α処理によって増加したＩＬ−１ｂ及びＩＬ−８の発現が、配列表の配列番号１、配列表の配列番号２及び配列表の配列番号３のペプチド処理によって阻害されることをＥＬＩＳＡを通じて確認した（図４ａないし図４ｃ、及び図５ａないし図５ｃ）。
【００８０】
実施例２：骨形成能の評価
２−１．受容体結合アッセイ（ＨＧＦＲ）
ＥＬＩＳＡ用プレートに、ペプチド５０μｇ／２５μｌとコーティングバッファ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ９．６）２５μｌとを添加して混ぜ、４℃で一晩培養した。ＰＢＳＴ（３００μｌ）で３回洗浄した後、ブロッキングバッファ（３％ＢＳＡ）２００μｌでブロッキングを２時間室温で行った。ＰＢＳＴ（３００μｌ）で３回洗浄した後、ＨＧＦＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をウェル当たり０．５μｇ／１ｍｌを添加した後、２時間室温で培養した。ＰＢＳＴ（３００μｌ）で３回洗浄した後、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰを１：１，０００で希釈して、ウェル当たり１００μｌずつ添加した後、２時間室温で培養した。ＰＢＳＴ（３００μｌ）で３回洗浄した後、ＴＭＢ溶液を１００μｌずつ添加した後、発色を進行した。停止溶液（３Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）５０μｌを添加して反応を止めた後、Ｏ．Ｄ  ４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００８１】
実験の結果、ＨＧＦＲに対する配列表の配列番号１及び配列表の配列番号３を有するペプチドの高い結合親和度を確認した（図６）。
【００８２】
２−２．骨母細胞を用いたウェスタンブロッティング（ＰＩ３Ｋリン酸化）
２ｘ１０５細胞／ウェルの細胞密度で６ウェルプレートにＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（マウス骨母細胞株）細胞をシーディングし、一晩培養した細胞を無血清培地で２４時間培養した。ペプチドを５０μｇ／ｍｌの濃度で１５分処理した（陽性対照群：ＨＧＦ  ５０ｎｇ／ｍｌ）。細胞溶解バッファを処理して溶解物を確保した後、タンパク質を定量し、抗ｐＰＩ３Ｋ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）を用いてＰｈｏｓｐｈｏ−ＰＩ３Ｋ（Ｐ−ＰＩ３Ｋ）に対するウェスタンブロッティングを行った。
【００８３】
ＨＧＦＲに対する高い結合親和度を示した配列表の配列番号１及び配列表の配列番号３のペプチド処理時に、ＨＧＦＲ信号刺激によるＰＩ３Ｋリン酸化の増加を確認することができた（図７）。
【００８４】
２−３．受容体結合アッセイ（ＢＭＰＲ）
ＥＬＩＳＡ用プレートに、ペプチド５０μｇ／２５μｌとコーティングバッファ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ９．６）２５μｌとを添加して混ぜ、４℃で一晩培養した。ＰＢＳＴ（３００μｌ）で３回洗浄した後、ブロッキングバッファ（３％ＢＳＡ）２００μｌでブロッキングを２時間室温で進行した。ＰＢＳＴ（３００μｌ）で３回洗浄した後、ＢＭＰＲ−ＩＢ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をウェル当たり０．５μｇ／１ｍｌ添加した後、２時間室温で培養した。ＰＢＳＴ（３００μｌ）ずつ３回洗浄した後、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰを１：１，０００で希釈して、ウェル当たり１００μｌずつ添加した後、２時間室温で培養した。ＰＢＳＴ（３００μｌ）で３回洗浄した後、ＴＭＢ溶液を１００μｌずつ添加した後、発色を進行した。停止溶液（３Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）５０μｌを添加して反応を止めた後、Ｏ．Ｄ  ４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００８５】
実験の結果、ＢＭＰＲに対する配列表の配列番号２のペプチドの高い結合親和度を確認した（陽性対照群：ＢＭＰ４）（図８）。
【００８６】
２−４．骨母細胞を用いたウェスタンブロッティング（Ｓｍａｄ１／５／８リン酸化）
２ｘ１０５細胞／ウェルの細胞密度で６ウェルプレートにＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（マウス骨母細胞株）細胞をシーディングした。一晩培養した細胞を無血清培地で２４時間培養した後、ペプチドを５０μｇ／ｍｌの濃度で１５分、３０分間処理した（陽性対照群：ＢＭＰ４  ５０ｎｇ／ｍｌ）。細胞溶解バッファを処理して溶解物を確保した後、タンパク質を定量し、抗ｐ−Ｓｍａｄ１／５／８抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）を用いてＰｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ１／５／８（Ｐ−ｓｍａｄ１／５／８）に対するウェスタンブロッティングを行った。
【００８７】
ＢＭＰＲに対する高い結合親和度を示した配列表の配列番号２のペプチド処理時に、ＢＭＰＲ信号刺激によるＳｍａｄ１／５／８リン酸化の増加を確認することができた（図９）。
【００８８】
２−５．ＡＬＰ染色
マウス骨母細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を４ｘ１０４細胞／ウェルで２４ウェルプレートにシーディングした後、一晩培養した。５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸＋１０ｍＭ  ｂ−グリセロリン酸を含んだ培地に取り替え後、各ペプチドを１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌの濃度で処理し、１４日間培養して分化を誘導させた。この際、３日に一回ずつ培地交換及びペプチド処理を繰り返した（陽性対照群：ＢＭＰ２  ３０ｎｇ／ｍｌ）。培養完了したプレートウェルをＰＢＳで２回洗浄した後、アセトン、３７％ホルムアルデヒド、クエン酸溶液が混じられた固定バッファで３０秒間細胞固定した。白血球アルカリホスファターゼ染色キット（ＳＩＧＭＡ）を用いて、下記の染色を進行した。
【００８９】
ＦＢＢ−アルカリ溶液、亜硝酸ナトリウム溶液を１：１で混ぜて２分間処理した後、蒸留水とナフトールＡＳ−ＢＩアルカリ溶液からなるバッファを処理して、３７℃培養器で１時間発色させた。
【００９０】
実験の結果、前駆−骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に、配列表の配列番号１のペプチドを濃度別に処理した時、分化促進によるＡＬＰ発現の増加を確認した（図１０ａないし図１０ｃ）。
【００９１】
２−６．アリザリンレッド染色
４ｘ１０４細胞／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートにＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（マウス骨母細胞株）をシーディングした。一晩培養した細胞の培地を５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸を含んだα−ＭＥＭ培地に取り替え後、ペプチドを濃度別（１０、５０μｇ／ｍｌ）に処理し、１４日間３７℃培養器で培養した。この際、３日に一回ずつ培地交換及びペプチド処理を繰り返した（陽性対照群：３０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＢＭＰ２（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ））。培養完了後、プレートウェルをＰＢＳで２回洗浄し、７０％  ＥｔＯＨで１時間処理して固定した。次いで、４０ｍＭアリザリンレッドＳ（ｐＨ４．２）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を処理して１０分間染色した。１０％塩化セチルピリジニウム（１０ｍＭリン酸ナトリウムに溶かす（ｐＨ７．０））を１５分間処理した後、分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて５６０ｎｍで吸光度を測定した。
【００９２】
前駆−骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に、配列表の配列番号１のペプチドを濃度別に処理した時、分化促進による鉱物化の増加をアリザリンレッド染色で確認した（図１１ａないし図１１ｃ）。
【００９３】
２−７．ＲＴ−ＰＣＲ
１ｘ１０５細胞／ウェルの細胞密度で６ウェルプレートにＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（マウス骨母細胞株）をシーディングした。一晩培養した後、ペプチドを濃度別（１０、５０μｇ／ｍｌ）に処理し、３日間３７℃培養器で培養した（陽性対照群：１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ２（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ））。培養完了した細胞を回収した後、ＲＮＡ抽出溶液（Ｅａｓｙ  Ｂｌｕｅ，Ｉｎｔｒｏｎ）を処理してＲＮＡを準備した後、ＲＴプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ）を使ってｃＤＮＡを合成した。各標識因子（ＯＰＧ、ＡＬＰ、ＢＳＰ）に対するプライマーとＰＣＲプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ）とを使ってＰＣＲ進行した。
【００９４】
骨分化標識因子ＰＣＲに用いられたターゲット−特異的プライマー配列は、次の通りである：ＯＰＧ正方向プライマー配列、５’−ＣＴＧＣＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＡＧ−３’及びＯＰＧ逆方向プライマー、５’−ＴＴＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧＡＡＣ−３’（アニーリング温度、６０℃）；ＡＬＰ正方向プライマー配列、５’−ＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣＴＣＴＴＧＧ−３’及びＡＬＰ逆方向プライマー、５’−ＣＴＧＧＧＡＧＲＣＲＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣ−３’（アニーリング温度、６０℃）；ＢＳＰ正方向プライマー配列、５’−ＡＡＡＧＴＧＡＡＧＧＡＡＡＧＣＧＡＣＧＡ−３’及びＢＳＰ逆方向プライマー、５’−ＧＴＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＴＴＣ−３’（アニーリング温度、６０℃）。
【００９５】
１％アガロースゲルにＰＣＲ産物を５μｌずつローディングして電気泳動した後、Ｇｅｌ−Ｄｏｃでバンドを確認した。
【００９６】
マウス骨母細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に、配列表の配列番号１のペプチドを処理し、３日間培養した結果、骨分化標識因子であるＯＰＧ、ＡＬＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ＢＳＰ（Ｂｏｎｅ  Ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）の発現が、陽性対照群ＢＭＰ２  １００ｎｇ／ｍｌ処理群と配列表の配列番号１のペプチド処理群とでいずれも増加することを観察することができた（図１２ａないし図１２ｃ）。
【００９７】
実施例３：発毛能力の評価
３−１．細胞増殖率観察（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）
毛髪主要細胞である真皮乳頭細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｈａｉｒ  Ｆｏｌｌｉｃｌｅ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｐａｐｉｌｌａ  Ｃｅｌｌ）、毛母細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｈａｉｒ  Ｆｏｌｌｉｃｌｅ  Ｇｅｒｍｉｎａｌ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｃｅｌｌ）、臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）に対する細胞増殖の効果を観察するために、各細胞を９６ウェルプレートに３ｘ１０３細胞／ウェルの密度でシーディングした後、２４時間３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。血清を完全に除いた同じ培養液で培地を交換した後、ペプチドを濃度別（１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ）に処理し、前記と同じ条件で７２時間培養した。培養上澄み液を除去し、エタノールを用いて細胞を固定した後、ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄溶液を除去した後、比色ＳＲＢ溶液を処理して染色を進行した。１％酢酸で十分に洗浄した後、顕微鏡で細胞を観察して、生存細胞の状態を観察し、紫外線５９０ｎｍで吸光度を測定して、細胞の生存状態を測定した。
【００９８】
毛髪真皮乳頭細胞（Ｈｕｍａｎ  ＨＦＤＰＣ）、毛髪毛母細胞（Ｈｕｍａｎ  ＨＦＧＭＣ）及び臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に、配列表の配列番号１及び配列表の配列番号３のペプチドを濃度別に処理し、７２時間培養した時、濃度依存的に細胞増殖が増加した（図１３ａないし図１３ｂ、図１４ａないし図１４ｂ、及び図１５ａないし図１５ｂ）。
【００９９】
３−２．細胞信号伝達物質の変化観察
毛髪真皮乳頭細胞で細胞増殖に関与する主要信号伝達物質であるＥＲＫリン酸化及びＰＩ３Ｋに対する発現変化を観察するために、各細胞に、本発明のペプチドを３０分、６０分間処理した後、これについての特異的な抗体でウェスタンブロッティングを行って、ｐＥＲＫ、ＰＩ３Ｋ変化を観察した。抗ｐＥＲＫ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）及び抗ｐＰＩ３Ｋ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）を用いて実験を進行した。
【０１００】
１ｘ１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートにヒト毛髪真皮乳頭細胞をシーディングし、一晩培養して細胞を安定化した後、濃度別（１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）、時間別（３０分、６０分）にペプチドを処理した。細胞溶解バッファを処理して溶解物を確保した後、タンパク質を定量し、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）、ＰＩ３Ｋ、β−カテニンに対するウェスタンブロッティングを行った。
【０１０１】
毛髪真皮乳頭細胞に、配列表の配列番号１または配列表の配列番号３のペプチドを３０分、６０分処理し、細胞増殖関連信号伝逹物質の変化を観察した結果、細胞増殖に関与するＥＲＫリン酸化、ＰＩ３Ｋレベルと毛髪形成に関与するβ−カテニンの発現が増加した（図１６）。
【０１０２】
３−３．毛髪成長に関与するタンパク質の変化観察
毛髪真皮乳頭細胞で毛根成長に関与するタンパク質であるＩＧＦ１、ＫＧＦ、Ｗｎｔ３ａに対する発現の変化を観察するために、各細胞に、本発明のペプチドを２４時間処理した後、これについての特異的な抗体でウェスタンブロッティングを行って、毛髪成長関連タンパク質の変化を観察した。
【０１０３】
１ｘ１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートにヒト毛髪真皮乳頭細胞をシーディングする。一晩培養して細胞を安定化した後、ペプチドを濃度別（０．１〜５０μｇ／ｍｌ）に２４時間処理した。細胞溶解バッファを処理して溶解物を確保した後、タンパク質を定量し、ＩＧＦ−１、ＫＧＦ、Ｗｎｔ３ａに対するウェスタンブロッティングを行った。
【０１０４】
抗ＩＧＦ−１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）、抗ＫＧＦ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）及び抗Ｗｎｔ３ａ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）を用いて実験を進行した。
【０１０５】
毛髪真皮乳頭細胞に、配列表の配列番号１または配列表の配列番号３のペプチドを２４時間濃度別に処理した結果、毛髪成長に関与するタンパク質であるＩＧＦ−１、ＫＧＦ、Ｗｎｔ３ａの発現が増加した（図１７）。
【０１０６】
３−４．脱毛誘発ホルモンによる関連タンパク質の変化観察
脱毛を誘導するホルモンであるＤＨＴ（Ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）に対するペプチド効能を観察するために、毛髪真皮乳頭細胞にＤＨＴ５μｇ／ｍｌ及び本発明のペプチドを濃度別に処理した後、脱毛関連タンパク質であるＤＫＫ−１の発現変化を観察した。４８時間ＤＨＴとペプチドを処理した後、ＤＫＫ−１に対する特異的な抗体でウェスタンブロッティングを行って、ＤＫＫ−１の発現を測定した。
【０１０７】
１ｘ１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートにヒト毛髪真皮乳頭細胞をシーディングする。一晩培養して細胞を安定化した後、５μｇ／ｍｌ  ＤＨＴ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と共にペプチドを濃度別（１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）に４８時間処理した。細胞溶解バッファを処理して溶解物を確保した後、タンパク質を定量し、抗ＤＫＫ−１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）を用いてＤＫＫ−１に対するウェスタンブロッティングを行った。
【０１０８】
毛髪真皮乳頭細胞に脱毛誘導ホルモンであるＤＨＴ処理時に、脱毛タンパク質であるＤＫＫ−１の発現が増加し、ＤＨＴによって増加したＤＫＫ−１の発現を、配列表の配列番号１または配列表の配列番号３のペプチドが減少させることを確認した（図１８）。
【０１０９】
３−５．ケラチン発現の変化観察
配列表の配列番号１または配列表の配列番号３のペプチドが、角質細胞の分化促進誘導を通じて毛髪成長促進効果を示すか否かを観察するために、細胞分化標識物質であるケラチンの発現変化を測定した。
【０１１０】
１ｘ１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートにヒト角質細胞株ＨａＣａＴ細胞をシーディングし、一晩培養した後、ペプチドを濃度別（０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）に処理し、２４時間３７℃培養器で培養した。培養完了した細胞回収後、ＲＮＡ抽出溶液（Ｅａｓｙ  Ｂｌｕｅ，Ｉｎｔｒｏｎ）を処理してＲＮＡを準備した後、ＲＴプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ）を使ってｃＤＮＡを合成した。各標識因子（Ｈａ３−ＩＩ、ケラチン１４）に対するプライマーとＰＣＲプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ）とを使ってＲＴ−ＰＣＲを行って、これらの発現変化を測定した。
【０１１１】
角質細胞分化標識因子ＰＣＲに用いられたターゲット−特異的プライマー配列は、次の通りである：Ｈａ３−ＩＩ正方向プライマー配列、５’−ＣＡＧＡＡＧＴＡＴＡＧＣＡＧＴＡＡＧＡＣＡＧ−３’及びＨａ３−ＩＩ逆方向プライマー、５’−ＣＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＴＴＡＴＴＡＧＧＣ−３’（アニーリング温度、６０℃）；Ｋｅｒａｔｉｎ１４正方向プライマー配列、５’−ＧＧＡＣＧＣＣＣＡＣＣＴＴＴＣＡＴＣＴＴＣ−３’及びＫｅｒａｔｉｎ１４逆方向プライマー、５’−ＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧ−３’（アニーリング温度、６０℃）。
【０１１２】
１％アガロースゲルにＰＣＲ産物を５μｌずつローディングした後、電気泳動し、Ｇｅｌ−Ｄｏｃでバンドを確認した。
【０１１３】
角質細胞に、配列表の配列番号１または配列表の配列番号３のペプチドを濃度別に処理した後、分化標識因子であるＨａ３−ＩＩとケラチン１４に対するｍＲＮＡ発現程度を確認した結果、２つのペプチドがいずれも角質細胞分化促進効能を示すことを確認した（図１９）。
【０１１４】
３−６．ラットのひげの成長速度の観察
ラットのひげ部位の毛根を分離した後、ペプチドを５０μｇ／ｍｌの濃度で処理して、８日間３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。５日と８日目の毛髪の長さを観察して、ペプチドの効能を確認した。
【０１１５】
ペプチド処理による毛髪の成長変化を観察した結果、５日、８日処理群で、対照群に比べて早い毛髪の成長が観察された（図２０）。
【０１１６】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的な技術は、単に一具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。
【図１ａ】
2018154642.tif 000003
【図１ｂ】
2018154642.tif 000004
【図１ｃ】
2018154642.tif 000005
【図２ａ】
2018154642.tif 000006
【図２ｂ】
2018154642.tif 000007
【図２ｃ】
2018154642.tif 000008
【図２ｄ】
2018154642.tif 000009
【図２ｅ】
2018154642.tif 000010
【図２ｆ】
2018154642.tif 000011
【図３ａ】
2018154642.tif 000012
【図３ｂ】
2018154642.tif 000013
【図３ｃ】
2018154642.tif 000014
【図４ａ】
2018154642.tif 000015
【図４ｂ】
2018154642.tif 000016
【図４ｃ】
2018154642.tif 000017
【図５ａ】
2018154642.tif 000018
【図５ｂ】
2018154642.tif 000019
【図５ｃ】
2018154642.tif 000020
【図６】
2018154642.tif 000021
【図７】
2018154642.tif 000022
【図８】
2018154642.tif 000023
【図９】
2018154642.tif 000024
【図１０ａ】
2018154642.tif 000025
【図１０ｂ】
2018154642.tif 000026
【図１０ｃ】
2018154642.tif 000027
【図１１ａ】
2018154642.tif 000028
【図１１ｂ】
2018154642.tif 000029
【図１１ｃ】
2018154642.tif 000030
【図１２ａ】
2018154642.tif 000031
【図１２ｂ】
2018154642.tif 000032
【図１２ｃ】
2018154642.tif 000033
【図１３ａ】
2018154642.tif 000034
【図１３ｂ】
2018154642.tif 000035
【図１４ａ】
2018154642.tif 000036
【図１４ｂ】
2018154642.tif 000037
【図１５ａ】
2018154642.tif 000038
【図１５ｂ】
2018154642.tif 000039
【図１６】
2018154642.tif 000040
【図１７】
2018154642.tif 000041
【図１８】
2018154642.tif 000042
【図１９】
2018154642.tif 000043
【図２０】
2018154642.tif 000044
【配列表】
2018154642000001.app