(57)【要約】【課題】  ＶＰ２遺伝子を検出することによって試料内のＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃを検出すること。【解決手段】  本発明は、ＶＰ２遺伝子を検出することによって試料内のＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃを検出する方法を開示している。信号は、蛍光検出システムによっても、ラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイによっても検出することができる。本発明の第２の目的は、野生型をワクチン型から識別する方法を提供することである。この目的を達成する第１のアプローチは、蛍光検出システム上でもラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイ上でも使用され得るＳＮＰ３６によって、野生型をワクチン型から識別することである。この目的を達成する第２のアプローチは、ＳＮＰ８９９及びＳＮＰ９６３によって、野生型をワクチン型から識別することである。【選択図】  図２
2018093859.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内のＣＰＶ２ａ、２ｂ又は２ｃのＶＰ２の核酸配列を含む標的核酸を検出する方法であって、
（ａ）前記ＣＰＶ２ａ、２ｂ又は２ｃの標的核酸を含有していると疑われる試料を提供するステップと、
（ｂ）第１のプライマー及び第２のプライマーを含むプライマーの対を提供するステップであり、前記第１のプライマーが、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号２から選択された核酸配列の少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含み、さらに、前記第２のプライマーが、相補的な核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号３から選択された少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含む、ステップと、
（ｃ）鋳型依存性ポリメラーゼを用いて前記標的核酸を増幅させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の間に前記標的核酸に対してプローブをアニールして、ハイブリダイズされた生成物を形成するステップであり、前記プローブの配列が、ＳＥＱ  ＩＤ番号４乃至６を含む群から選択される、ステップと、
（ｅ）前記標的核酸の存在の指標として、前記ハイブリダイズされた生成物から生じる信号を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記プライマー及び／又はプローブは、修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドの化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ハイブリダイズされた生成物から生じる信号は蛍光信号である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブの５´末端は、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣ、ＣＹ５又はＴＥＴを含む群から選択された蛍光レポーターを保有し、さらに、前記プローブの３´末端は、ＴＭＡＲＡ、ＭＧＢ又はＢＨＱを含む群から選択されたクエンチャーを保有している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
蛍光信号の存在は、前記試料内の前記標的核酸の存在を示し、さらに、蛍光信号の欠如は、前記標的核酸の欠如を示す、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ハイブリダイズされた生成物から生じる蛍光信号は、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼの加水分解によって前記標的核酸にハイブリダイズされた前記プローブから切断された前記蛍光レポーターの断片の量によって検出される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ハイブリダイズされた生成物から生じる信号は、ラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイの後で着色された粒子によって視覚的に観察される分析物である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のプライマー又は第２のプライマーの５´末端が、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ、ビオチン、Ｔｅｘａｓ−ｒｅｄ及びＴａｍｒａを含む群から選択された抗原を保有し、さらに、前記プローブの３´末端が、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ、ビオチン、Ｔｅｘａｓ−ｒｅｄ及びＴａｍｒａを含む群から選択された前記第１のプライマー又は第２のプライマーとは異なる抗原を保有している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記着色された粒子は、コロイド金、ラテックス及びカーボンナノ粒子の群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
テストラインにおける分析物信号の存在は、前記試料内の前記標的核酸の存在を示し、さらに、テストラインにおける分析物信号の欠如は、前記標的核酸の欠如を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試料内の野生型の標的核酸をワクチン型から識別する方法であって、
（ａ）前記標的核酸を含有していると疑われる試料を提供するステップと、
（ｂ）第１のプライマー及び第２のプライマーを含むプライマーの対を提供するステップであり、前記第１のプライマーが、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号７から選択された核酸配列の少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含み、さらに、前記第２のプライマーが、相補的な核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号１１、１２又は１３から選択された少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含む、ステップと、
（ｃ）鋳型依存性ポリメラーゼを用いて対象を増幅させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の間に前記標的核酸に対してＳＮＰのプローブをアニールして、ハイブリダイズされた生成物を形成するステップであり、前記ＳＮＰのプローブは、ＣＰＶ２ａ、２ｂ又は２ｃのＶＰ２遺伝子のＳＮＰ３６に特異的であり、さらに、前記ＳＮＰ３６のプローブの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ番号１４又は１５である、ステップと、
（ｅ）前記標的核酸の存在の指標として、前記ハイブリダイズされた生成物から生じる信号を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項１２】
前記第１のプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ番号８乃至１０を含む群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記プライマー及び／又はプローブは、修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドの化合物を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハイブリダイズされた生成物から生じる信号は蛍光信号である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記プローブの５´末端は、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣ、ＣＹ５又はＴＥＴを含む群から選択された蛍光レポーターを保有し、さらに、前記プローブの３´末端は、ＴＭＡＲＡ、ＭＧＢ又はＢＨＱを含む群から選択されたクエンチャーを保有している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
蛍光信号の存在は野生型を示し、さらに、蛍光信号の欠如はワクチン型を示す、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ハイブリダイズされた生成物から生じる蛍光信号は、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼの加水分解によって前記標的核酸にハイブリダイズされた前記プローブから切断された前記蛍光レポーターの断片の量によって検出される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ワクチン型の定義は、Ｄｕｒａｍｕｎｅ  ＭＸ５、Ｃａｎｉｖａｃ  ５、Ｖａｎｇｕａｒａｄ  ｐｌｕｓ  ５  Ｌ４  ＣＶ、Ｎｏｂｉｖａｃ  Ｐｕｐｐｙ  ＤＰ、Ｃａｎｉｎｅ  ６ＩＩ−ＳＬ、Ｅｕｒｉｃａｎ５、Ｖｉｒｂａｇｅｎ  ＤＡ２Ｐａｒｖｏを含むワクチン群のうちの１つでワクチン接種された試料である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ハイブリダイズされた生成物から生じる信号は、ラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイの後で着色された粒子によって視覚的に観察される分析物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１のプライマー又は第２のプライマーの５´末端が、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ、ビオチン、Ｔｅｘａｓ−ｒｅｄ及びＴａｍｒａを含む群から選択された抗原を保有し、さらに、前記プローブの３´末端が、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ、ビオチン、Ｔｅｘａｓ−ｒｅｄ及びＴａｍｒａを含む群から選択された前記第１のプライマー又は第２のプライマーとは異なる抗原を保有している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記着色された粒子は、コロイド金、ラテックス及びカーボンナノ粒子の群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
テストラインにおける分析物信号の存在は、前記試料内の前記標的核酸の存在を示し、さらに、テストラインにおける分析物信号の欠如は、前記標的核酸の欠如を示す、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
試料内の野生型の対象をワクチン型から識別する方法であって、
（ｆ）ＶＰ２を含有していると疑われる対象を提供するステップと、
（ｇ）第１のプライマー及び第２のプライマーを含むプライマーの対を提供するステップであり、前記第１のプライマーが、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号１６から選択された核酸配列の少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含み、さらに、前記第２のプライマーが、相補的な核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号２２又は２３から選択された少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含む、ステップと、
（ｈ）鋳型依存性ポリメラーゼを用いて前記対象を増幅させるステップと、
（ｉ）ステップ（ｃ）の間に標的核酸に対してＰ１のプローブもＰ２のプローブもアニールして、ハイブリダイズされた生成物を形成するステップであり、前記Ｐ１のプローブは、ＣＰＶ２ａ、２ｂ又は２ｃのＶＰ２遺伝子のＳＮＰ８９９に特異的であり、さらに、前記Ｐ２のプローブは、ＣＰＶ２ａ、２ｂ又は２ｃのＶＰ２遺伝子のＳＮＰ９６３に特異的であり、前記Ｐ１は、ＳＥＱ  ＩＤ番号２４乃至２７を含む群から選択され、さらに、前記Ｐ２は、ＳＥＱ  ＩＤ番号２９乃至３３を含む群から選択される、ステップと、
（ｊ）前記ハイブリダイズされた生成物から生じる２つの異なる蛍光信号を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項２４】
前記第１のプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ番号１７乃至２１を含む群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｐ１の５´末端も前記Ｐ２の５´末端も、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣ、ＣＹ５又はＴＥＴを含む群から別に選択された蛍光レポーターを保有し、さらに、前記プローブの両方の３´末端が、ＴＭＡＲＡ、ＭＧＢ又はＢＨＱを含む群から選択されたクエンチャーを保有し、Ｐ１のプローブ及びＰ２のプローブの蛍光レポーターは別である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
異なる蛍光信号両方の存在が野生型を示し、前記異なる蛍光信号のうちいずれか１つの存在がワクチン型を示す、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ハイブリダイズされた生成物から生じる２つの異なる蛍光信号は、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼの加水分解によって前記標的核酸にハイブリダイズされた前記プローブから切断された前記蛍光レポーターの断片の量によって検出される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プライマー及び／又はプローブは、修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドの化合物を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ワクチン型は、試料が、Ｄｕｒａｍｕｎｅ  ＭＸ５、Ｃａｎｉｖａｃ  ５、Ｖａｎｇｕａｒａｄ  ｐｌｕｓ  ５  Ｌ４  ＣＶ、Ｎｏｂｉｖａｃ  Ｐｕｐｐｙ  ＤＰ、Ｃａｎｉｎｅ  ６ＩＩ−ＳＬ、Ｅｕｒｉｃａｎ５、Ｖｉｒｂａｇｅｎ  ＤＡ２Ｐａｒｖｏを含むワクチン群のうちの１つでワクチン接種されたということである、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イヌ試料におけるＣＰＶ２ａ、２ｂ、２ｃ検出方法に関する。特に、本発明は、ワクチン型を野生型から識別することに関する。
【背景技術】
【０００２】
イヌパルボウイルス２型（以下ＣＰＶ−２）感染は、重度の白血球減少、嘔吐、体重減少、食欲の欠如（食欲不振）及び血性下痢によって特徴づけられる、イヌに影響を与え且つイヌからイヌへと非常に感染力の高いウイルス性の病気である。感染は、ウイルス含有排泄物との直接の経口又は経鼻接触を介して、又は、ウイルス汚染媒介物との接触を介して間接的に得られる。頻繁に起こるように、イヌは自然感染を介してＣＰＶを得て、さらに、ＣＰＶ感染の例の大部分は、６週間から６カ月の週齢又は月齢の子犬において見られる。ＣＰＶ−２感染は、実験用のイヌ及びペット用のイヌの増加により、最近世界中でイヌの重大な問題であるとして現れている。
【０００３】
ＣＰＶ−２のゲノムは、長さが５．２Ｋｂのサイズの一本鎖のマイナスセンスＤＮＡであり、ウイルスｍＲＮＡの選択的スプライシングを介して３つの構造タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）及び２つの非構造タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）の発現をもたらす２つのプロモーターを有する。ＶＰ２（６４ｋＤａ）は、ＶＰ１（８４ｋＤａ）のＮＨ２末端切断型であり、さらに、抗原性の重要要素であるカプシドの主要構成成分（９０％）である。ＣＰＶ−２は１９７０年代後半に現れたが、ここ数年、その抗原変異体に取って代わられた。現在、ＣＰＶ−２の３つの主要な抗原変異体が、２ａ、２ｂ、２ｃ型（以下ＣＰＶ−２ａ、ＣＰＶ−２ｂ及びＣＰＶ−２ｃ）として知られ、さらに、世界中のイヌ集団においてさまざまに分布している。最初の２型は、現場からは消えたけれども、市場で入手可能なＣＰＶ−２ワクチンにおいて依然として存在している。
【０００４】
ウイルスは、感染後４〜５日以内に感染したイヌの排泄物内に排出され、これは、臨床徴候が生じる前であることが多くある。ウイルス排出は、臨床的回復の約１０日後まで、病気の間ずっと検出することができる。従って、排泄物試料は、一般的に、診断テストにおいて使用される。診断テストは、ＨＡ（赤血球凝集）、電子顕微鏡（ＥＭ）、ＭＤＣＫ、ＣＲＦＫ又はＡ７２の細胞株で用いるウイルス単離、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラテックス凝集テスト（ＬＡＴ）、蛍光抗体テスト（ＦＡＴ）、ＣＩＥテスト、ウイルス中和テスト、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸ハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び核酸配列決定を含み、そのそれぞれが、さまざまな程度の感受性及び特異性を有し、さらに、偽陽性の例をもたらす場合がある。上述の診断テストの中でも、ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲが、最も一般的に使用され、且つ、比較的高い精度及び特異性の、ＣＰＶ−２ａ、ＣＰＶ−２ｂ及びＣＰＶ−２ｃの診断方法である。
【０００５】
ＣＰＶ−２ａ、ＣＰＶ−２ｂ及びＣＰＶ−２ｃの感染の発生率は、若い子犬における早期のワクチン接種によって急激に減ってきている。一部の人気のワクチンは、Ｄｕｒａｍｕｎｅ  ＭＸ５、Ｃａｎｉｖａｃ  ５、Ｖａｎｇｕａｒａｄ  ｐｌｕｓ  ５  Ｌ４  ＣＶ、Ｎｏｂｉｖａｃ  Ｐｕｐｐｙ  ＤＰ、Ｃａｎｉｎｅ  ６ＩＩ−ＳＬ、Ｅｕｒｉｃａｎ５、Ｖｉｒｂａｇｅｎ  ＤＡ２Ｐａｒｖｏである。しかし、ＣＰＶ−２ａ、ＣＰＶ−２ｂ及びＣＰＶ−２ｃの診断は、ワクチン接種の数日後に下痢を示すイヌからの糞便試料に対して実行された場合に不明瞭であり得る。実際、ワクチン内に含有された修飾生ウイルスは、非天然の投与経路にもかかわらず、ワクチン接種されたイヌの腸管粘膜内で増殖することができ、さらに、野生型の鎖に関して低い力価で且つ短い期間はあるが、排泄物内に排出され得る。そのような状況において、ワクチン接種されたイヌの排泄物内のＣＰＶ−２ａ、２ｂ及び２ｃの核酸の検出は偽陽性であり得、感染の誤診をもたらし得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＣＮ１０５８３８８２６
【特許文献２】ＣＮ１０５８０３１１２
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｄｅｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｏｏｌｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ  ｐｒｏｂｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎａｌ  ａｎｄ  ｆｉｅｌｄ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｃａｎｉｎｅ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２ｂ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３８（２００６），Ｐ．１０−１６，Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｓｅｐ  ５．
【非特許文献２】Ｄｅｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｖｉｒｅｍｉａ  ａｎｄ  ｆｅｃａｌ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ｉｎ  ｐｕｐｓ  ａｆｔｅｒ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｌｉｖｅ  ｃａｎｉｎｅ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ”Ｖａｃｃｉｎｅ  ３２（２０１４）３８５０−３８５３
【非特許文献３】Ｄｅｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ  ｐｒｏｂｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｙｐｅ  ２−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｆｉｅｌｄ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｃａｎｉｎｅ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ”，ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＶＩＲＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＭＥＴＨＯＤＳ，１３６（２００６），Ｐ．６５−７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述の状況により、ＣＰＶ−２ａ、ＣＰＶ−２ｂ及びＣＰＶ−２ｃを検出するため、及び、野生型をワクチン型から識別するための高い精度及び安定性のアッセイを開発することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、上記の従来技術の不利益を克服する、ＣＰＶ−２ａ、２ｂ及び２ｃのＶＰ２遺伝子の標的核酸の検出方法を提供することである。本発明の目的は、特に、標的核酸が指定のプローブ、標的核酸に特異的なプライマーの対、及び、エキソヌクレアーゼ加水分解の能力を有する鋳型依存性ポリメラーゼを用いて増幅される、標的核酸を検出する方法を提供することである。この目的は、疑わしい試料内の標的核酸を検出する方法によって本発明に従い達成され、当該方法は、以下のステップ、すなわち：
（ａ）ＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃ型のＶＰ２の標的核酸を含有していると疑われる試料を提供するステップと、
（ｂ）順方向プライマー及び逆方向プライマーを含むプライマーの対を提供するステップであり、順方向プライマーが、ＶＰ２遺伝子の核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号２から選択された核酸配列の少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含み、さらに、逆方向プライマーが、相補的な核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号３から選択された少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含む、ステップと、
（ｃ）鋳型依存性ポリメラーゼを用いて標的核酸を増幅させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の間に標的核酸に対してプローブをアニールして、ハイブリダイズされた生成物を形成するステップであり、プローブの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ番号４乃至６を含む群から選択される、ステップと、
（ｅ）ＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃ型の標的核酸の存在の指標として、ハイブリダイズされた生成物から生じる信号を検出するステップと、
を含む。
【００１０】
本発明によると、ハイブリダイズされた生成物から生じる信号は、蛍光検出システムによってもラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイによっても検出することができる。信号が、蛍光検出システム又はラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイによって検出される場合、信号の存在は、疑わしい試料内のＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃの存在を示し、さらに、信号の欠如は、疑わしい試料内のＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃの欠如を示す。
【００１１】
本発明の第２の目的は、野生型をワクチン型から識別する２つの方法を提供することである。この目的を達成するための第１の方法は、ＳＮＰ３６によって野生型をワクチン型から識別することである。標的核酸は上述のプローブ、標的核酸に特異的なプライマーの対、及び、エキソヌクレアーゼ加水分解の能力を有する鋳型依存性ポリメラーゼを用いて増幅される。この目的は、標的核酸を検出する方法によって本発明に従い達成され、当該方法は、以下のステップ、すなわち：
（ａ）ＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃ型のＶＰ２の標的核酸を含有していると疑われる試料を提供するステップと、
（ｂ）順方向プライマー及び逆方向プライマーを含むプライマーの対を提供するステップであり、順方向プライマーが、ＶＰ２遺伝子の核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号７から選択された核酸配列の少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含み、さらに、逆方向プライマーが、相補的な核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号１１、１２又は１３から選択された少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含む、ステップと、
（ｃ）鋳型依存性ポリメラーゼを用いて標的核酸を増幅させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の間に標的核酸に対してプローブをアニールして、ハイブリダイズされた生成物を形成するステップであり、プローブの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ番号１４及び１５を含む群から選択される、ステップと、
（ｅ）標的核酸の存在の指標として、ハイブリダイズされた生成物から生じる信号を検出するステップと、
を含む。
【００１２】
ハイブリダイズされた生成物から生じる信号は、蛍光検出システムによってもラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイによっても検出することができる。信号が、蛍光検出システム又はラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイによって検出される場合、信号の存在は野生型を示し、さらに、蛍光信号の欠如はワクチン型を示す。
【００１３】
この目的を達成するための第２の方法は、ＳＮＰ８９９及びＳＮＰ９６３によって野生型をワクチン型から識別することである。増幅条件及び検出ステップは、以下の条件を除いて、ＳＮＰ３６と同じである。
（ａ）順方向プライマー：ＶＰ２遺伝子の核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号１６から選択された核酸配列の少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含む。
（ｂ）逆方向プライマー：相補的な核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号２２又は２３から選択された少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含む。
（ｃ）プローブ：第１のプローブはＶＰ２遺伝子のＳＮＰ８９９に特異的であり、さらに、第２のプローブはＶＰ２遺伝子のＳＮＰ９６３に特異的である。第１のプローブは、ＳＥＱ  ＩＤ番号２４乃至２８を含む群から選択され、さらに、第２のプローブは、ＳＥＱ  ＩＤ番号２９乃至３３を含む群から選択される。
【００１４】
ハイブリダイズされた生成物から生じる信号は、蛍光検出システムによって検出することができる。異なる信号両方の存在がワクチン型を示し、異なる蛍光信号のうちいずれか１つの存在がワクチン型を示す。
【００１５】
この概要は、本発明の一部の態様を手短に明らかにするために提供されており、本発明の一部の態様は、以下に詳細な説明においてさらに記載される。この概要は、本開示の鍵となる又は本質的な特徴を明らかにするようには意図されず、又は、特許請求の範囲を限定するようには意図されない。
【００１６】
「態様」という用語は、「少なくとも１つの態様」として読まれることになる。本明細書において記載される本開示の上記の態様及び他の態様は、１つ又は複数の例として例示されており、付随の図面において限定されない。
【００１７】
本発明の上記及び他の目的が、種々の図及び図面において例示されている以下の好ましい実施形態の詳細な説明を読んだ後で、当業者には疑問の余地なく明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】アガロースゲル電気泳動によって実施形態１から得られる増幅生成物を例示した図である。
【図２】実施形態１の動態学的なＰＣＲの増殖曲線を例示した図である。
【図３】アガロースゲル電気泳動によって実施形態２から得られる増幅生成物を例示した図である。番号１〜４は野生型の試料であり、さらに、番号５〜７はワクチン型の試料である。ＮＴＣは、ネガティブコントロールを表している。
【図４】実施形態２の動態学的なＰＣＲの増殖曲線を例示した図である。番号１〜４は野生型の試料であり、さらに、番号５〜７はワクチン型の試料である。ＮＴＣは、ネガティブコントロールを表している。
【図５】実施形態２の動態学的なＰＣＲの増殖曲線を例示した図である。番号１〜４は基準試料であり、さらに、番号５〜６はワクチンバルク由来のものである。ＮＴＣは、ネガティブコントロールを表している。
【図６】実施形態３のＳＮＰ８９９とＳＮＰ９６３との組み合わせの動態学的なＰＣＲの増殖曲線を例示した図である。２０の基準試料は、ＳＮＰ８９９に対してもＳＮＰ９６３に対しても全て陽性である。
【図７】実施形態３のＳＮＰ８９９とＳＮＰ９６３との組み合わせの動態学的なＰＣＲの増殖曲線を例示した図である。ＶａｎｇｕａｒｄのバルクはＳＮＰ９６３に対してのみ陽性であり、さらに、ＤｕｒａｍｕｎｅのバルクはＳＮＰ８９９に対してのみ陽性である。
【図８】アガロースゲル電気泳動によって実施形態４から得られる増幅生成物を例示した図である。
【図９】実施形態４のラテラルフローを例示した図である。
【図１０】アガロースゲル電気泳動によって実施形態５から得られる増幅生成物を例示した図である。
【図１１】実施形態５のラテラルフローを例示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下は、本発明の原理を例示しているだけである。従って、当業者は、種々のアレンジメントを考案することができ、種々のアレンジメントは、本明細書において明確に記載又は示されてはいないけれども、本発明の原理を具体化し且つその真意及び範囲に含まれるということが正しく理解されることになる。
【００２０】
さらに、本明細書において記載される全ての例及び条件としての言葉は、主として、本開示の原理及び本発明者等によって寄与される概念を理解して当技術分野を助成することにおいて読み手に寄与するように教育学的目的のためだけにあるとして明確に意図され、さらに、限定されることなく、特に記載される例及び条件であると解釈されることになる。
【００２１】
さらに、本開示の原理、態様及び実施形態を記載した本明細書における全ての記述、並びに、その特定の例は、その構造的同等物も機能的同等物も包含するとして意図される。加えて、そのような同等物は現在既知の同等物も、将来開発される同等物、すなわち、後に開発される、構造に関係なく同じ機能を行ういかなる要素も含むということが意図される。
【００２２】
本明細書において特に明確に定めのない限り、図面は一定の縮尺で描かれていない。
【００２３】
上述の疑問を解決するために、本発明は、マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）リガンドが結合したＴａｑＭａｎプローブを使用したＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃの迅速な同定のためのＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲアッセイを提供する。
【００２４】
そのようなアッセイにおいて、異なる蛍光レポーターで型特異的プローブを標識することは、型特異的な蛍光の検出を確実にしてきた。このアッセイにおいて適用されるＴａｑポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ加水分解機能を有したＤＮＡ依存性ポリメラーゼである。ＤＮＡ依存性ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ加水分解によって標的核酸にハイブリダイズされたプローブから切断された蛍光信号は、蛍光レポーターの断片の量によって検出される。プライマー及び／又はプローブは、修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドの化合物を含む。
【００２５】
本発明の一実施形態において、試料内のＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃの核酸配列を含む標的核酸を検出する方法が提供され、当該方法は：
（ａ）ＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃ型のＶＰ２の標的核酸を含有していると疑われる試料を提供するステップと、
（ｂ）順方向プライマー及び逆方向プライマーを含むプライマーの対を提供するステップであり、順方向プライマーが、ＶＰ２遺伝子の核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号２から選択された少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含み、さらに、逆方向プライマーが、相補的な核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号３から選択された少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含む、ステップと、
（ｃ）鋳型依存性ポリメラーゼを用いて標的核酸を増幅させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の間に標的核酸に対してプローブをアニールして、ハイブリダイズされた生成物を形成するステップであり、プローブの配列が、ＳＥＱ  ＩＤ番号４乃至６を含む群から選択される、ステップと、
（ｅ）ＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃ型の標的核酸の存在の指標として、ハイブリダイズされた生成物から生じる信号を検出するステップと、
を含む。
【００２６】
ＶＰ２（ＳＥＱ  ＩＤ番号１）は、ＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃの保存された領域のため、本発明において開示された全てのプライマー及びプローブは、ＶＰ２遺伝子から選択される。より正確に言えば、ＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃの検出のための順方向プライマーは、ＶＰ２遺伝子の一部である核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号２から選択された核酸配列の少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含み、さらに、逆方向プライマーは、相補的な核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号３から選択された少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含む。ＳＥＱ  ＩＤ番号４乃至６の群のうちの１つであるプローブも、ＶＰ２遺伝子に特異的である。蛍光信号の存在は、試料内のＣＰＶ２ａ、２ｂ又は２ｃを示す。
【００２７】
本発明は、ＶＰ２遺伝子のＳＮＰ３６、ＳＮＰ８９９及びＳＮＰ９６３を検出することによって、野生型をワクチンから識別する方法も開示している。ＳＮＰ３６に関して、ヌクレオチドは、野生型に対してはＧであり、さらに、ワクチン型に対してはＡであり、ここで、ワクチン型は、試料が、Ｄｕｒａｍｕｎｅ  ＭＸ５、Ｃａｎｉｖａｃ  ５、Ｖａｎｇｕａｒａｄ  ｐｌｕｓ  ５  Ｌ４  ＣＶ、Ｎｏｂｉｖａｃ  Ｐｕｐｐｙ  ＤＰ、Ｃａｎｉｎｅ  ６ＩＩ−ＳＬ、Ｅｕｒｉｃａｎ５、Ｖｉｒｂａｇｅｎ  ＤＡ２Ｐａｒｖｏを含むワクチン群のうちの１つでワクチン接種されているということを意味している。さらに、ＳＮＰ８９９に対して、ヌクレオチドは、野生型及びＤｕｒａｍｕｎｅ  ＭＸ５に対してはＧであり、さらに、ワクチン型に対してはＣであり、ここで、ワクチン型は、試料が、Ｃａｎｉｖａｃ  ５、Ｖａｎｇｕａｒａｄ  ｐｌｕｓ  ５  Ｌ４  ＣＶ、Ｎｏｂｉｖａｃ  Ｐｕｐｐｙ  ＤＰ、Ｃａｎｉｎｅ  ６ＩＩ−ＳＬ、Ｅｕｒｉｃａｎ５、Ｖｉｒｂａｇｅｎ  ＤＡ２Ｐａｒｖｏを含むワクチン群のうちの１つでワクチン接種されているということを意味している。最後に、ＳＮＰ９６３に関して、ヌクレオチドは、野生型、Ｃａｎｉｖａｃ  ５、Ｖａｎｇｕａｒａｄ  ｐｌｕｓ  ５  Ｌ４  ＣＶ、Ｎｏｂｉｖａｃ  Ｐｕｐｐｙ  ＤＰ、Ｃａｎｉｎｅ  ６ＩＩ−ＳＬ、Ｅｕｒｉｃａｎ５、Ｖｉｒｂａｇｅｎ及びＤＡ２Ｐａｒｖｏに対してはＴであり、さらに、ワクチン型に対してはＡであり、ここで、ワクチン型は、試料が、Ｄｕｒａｍｕｎｅ  ＭＸ５でワクチン接種されているということを意味している。上述のワクチンのＣＰＶのＴＩＣＤ５０は、１０５コピー以上である。従って、本発明の野生型に特異的なプライマー及びプローブが設計される。
【００２８】
【表１】
2018093859.tif 000003
【００２９】
本発明の別の実施形態において、ＳＮＰ３６によって野生型をワクチン型から識別する方法が提供され、当該方法は：
（ａ）標的核酸を含有していると疑われる試料を提供するステップと、
（ｂ）順方向プライマー及び逆方向プライマーを含むプライマーの対を提供するステップであり、順方向プライマーが、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号７から選択された少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含み、さらに、逆方向プライマーが、相補的な核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号１１、１２又は１３から選択された少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含む、ステップと、
（ｃ）鋳型依存性ポリメラーゼを用いて対象を増幅させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の間に標的核酸に対してＳＮＰプローブをアニールして、ハイブリダイズされた生成物を形成するステップであり、ＳＮＰプローブは、ＶＰ２遺伝子のＳＮＰ３６に特異的であり、さらに、ＳＮＰ３６プローブの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ番号１４又は１５である、ステップと、
（ｅ）標的核酸の存在の指標として、ハイブリダイズされた生成物から生じる信号を検出するステップと、
を含む。
【００３０】
ＳＮＰ３６は、野生型をワクチン型から識別するために単独で適用することができる。ＳＮＰ３６の順方向プライマーは、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号７から選択された核酸配列の少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含むか、又は、ＳＥＱ  ＩＤ番号８乃至１０の群から選択されたものである。逆方向プライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ番号１１乃至１３の群から選択されたものである。プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ番号１４乃至１５の群から選択されたものである。プローブは、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣ、ＣＹ５又はＴＥＴを含む群から選択された蛍光レポーターも保有しており、さらに、プローブの３´末端は、ＴＭＡＲＡ、ＭＧＢ又はＢＨＱを含む群から選択されたクエンチャーを保有している。蛍光信号の存在は野生型を示し、さらに、蛍光信号の欠如はワクチン型を示す。ワクチン型は、イヌが、Ｄｕｒａｍｕｎｅ  ＭＸ５、Ｃａｎｉｖａｃ  ５、Ｖａｎｇｕａｒａｄ  ｐｌｕｓ  ５  Ｌ４  ＣＶ、Ｎｏｂｉｖａｃ  Ｐｕｐｐｙ  ＤＰ、Ｃａｎｉｎｅ  ６ＩＩ−ＳＬ、Ｅｕｒｉｃａｎ５、Ｖｉｒｂａｇｅｎ  ＤＡ２Ｐａｒｖｏを含むワクチン群のうちの１つでワクチン接種されているということを意味している。蛍光信号の存在は野生型を示し、さらに、蛍光信号の欠如はワクチン型を示す。
【００３１】
本発明のさらに別の実施形態において、ＳＮＰ８９９とＳＮＰ９６３との組み合わせによって、野生型をワクチン型から識別する方法が提供され、当該方法は：
（ｆ）ＶＰ２を含有していると疑われる対象を提供するステップと、
（ｇ）順方向プライマー及び逆方向プライマーを含むプライマーの対を提供するステップであり、順方向プライマーが、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号１６から選択された少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含み、さらに、逆方向プライマーが、相補的な核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号２２又は２３から選択された少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含む、ステップと、
（ｈ）鋳型依存性ポリメラーゼを用いて対象を増幅させるステップと、
（ｉ）ステップ（ｃ）の間に標的核酸に対して２つのプローブをアニールして、ハイブリダイズされた生成物を形成するステップであり、２つのプローブのうち１つはＶＰ２遺伝子のＳＮＰ８９９に特異的であり、さらに、もう１つのプローブはＶＰ２遺伝子のＳＮＰ９６３に特異的であり、１つのプローブは、ＳＥＱ  ＩＤ番号２４乃至２７を含む群から選択され、さらに、もう１つのプローブは、ＳＥＱ  ＩＤ番号２９乃至３３を含む群から選択される、ステップと、
（ｊ）ハイブリダイズされた生成物から生じる２つの異なる蛍光信号を検出するステップと、
を含む。
【００３２】
順方向プライマーは、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ番号１６から選択された少なくとも近接している１２のヌクレオチドを含むか、又は、ＳＥＱ  ＩＤ番号１７乃至２１の群から選択されたものである。逆方向プライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ番号２２乃至２３の群から選択されたものである。２つのプローブの５´末端も、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣ、ＣＹ５又はＴＥＴを含む群から選択された異なる蛍光レポーターを保有しており、さらに、プローブの３´末端は、ＴＭＡＲＡ、ＭＧＢ又はＢＨＱを含む群から選択されたクエンチャーを保有している。
【００３３】
ＳＮＰ８９９のプローブは、ＳＥＱ  ＩＤ番号２４乃至２８の群から選択されたものであり、さらに、ＳＮＰ９６３のプローブは、ＳＥＱ  ＩＤ番号２９乃至３３の群から選択されたものである。蛍光信号両方の存在が野生型を示し、蛍光信号のうちいずれか１つの存在がワクチン型を示す。ワクチン型は、イヌが、Ｄｕｒａｍｕｎｅ  ＭＸ５、Ｃａｎｉｖａｃ  ５、Ｖａｎｇｕａｒａｄ  ｐｌｕｓ  ５  Ｌ４  ＣＶ、Ｎｏｂｉｖａｃ  Ｐｕｐｐｙ  ＤＰ、Ｃａｎｉｎｅ  ６ＩＩ−ＳＬ、Ｅｕｒｉｃａｎ５、Ｖｉｒｂａｇｅｎ  ＤＡ２Ｐａｒｖｏを含むワクチン群のうちの１つでワクチン接種されているということを意味している。異なる蛍光信号両方の存在は野生型を示し、さらに、異なる蛍光信号のうちいずれか１つの存在はワクチン型を示す。蛍光信号両方の欠如は、非感染又は低いウイルス負荷の試料を示す。
【００３４】
ＴａｑＭａｎプローブを使用した本発明は従来の方法よりも感受性が高く、ここで、本発明の検出の限界（以下ＬＯＤ）は、ＣＰＶ２ａ、２ｂ、２ｃの検出に対しても、野生型／ワクチン型の識別に対しても１０１コピーに達し得る。さらに、ＣＰＶ２ａ、２ｂ、２ｃの検出及び野生型／ワクチン型の識別の特異性は、識別窓（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）が１０８コピーに達し得るため、比較的高い。従って、本発明は、迅速且つ明確なＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃの検出及び野生型のワクチン型からの識別に適している。
【００３５】
本発明は、ＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃを迅速に同定するラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイも提供する。テスト結果を、着色された粒子によって視覚的に観察することができる。そのようなアッセイにおいて、異なる抗原で型特異的プローブを標識することは、型特異的な分析物の検出を確実にしてきた。順方向プライマー又は逆方向プライマーのプライマー及び／又はプローブのｃ５´末端は、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ、ビオチン、Ｔｅｘａｓ−ｒｅｄ及びＴａｍｒａを含む群から選択された抗原を保有し、さらに、プローブの３´末端は、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ、ビオチン、Ｔｅｘａｓ−ｒｅｄ及びＴａｍｒａを含む群から選択された第１又は第２のプライマーとは異なる抗原を保有している。着色された粒子は、コロイド金、ラテックス及びカーボンナノ粒子の群から選択される。
【００３６】
プライマー及びプローブ両方の配列、検出ステップ及び増幅条件は、順方向プライマーの量が逆方向プライマーよりも少ない、及び、ＰＮＡが増幅ステップに添加され且つ関与するということを除いて、ＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃ検出のＴａｑＭａｎプローブ検出方法と同じである。
【００３７】
増幅ステップが行われた後で、分析物はストライプ上に添加され、イムノクロマトグラフィーアッセイを開始させる。テストライン内の分析物信号の存在は、試料内のＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃの存在を示し、さらに、テストライン内の分析物信号の欠如は、ＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃの欠如を示す。
【００３８】
さらに、本発明は、野生型をワクチン型から識別するラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイも提供する。プライマー及びプローブ両方の配列、検出ステップ及び増幅条件は、順方向プライマーの量が逆方向プライマーよりも少ない、及び、ＰＮＡが増幅ステップに添加され且つ関与するということを除いて、ＳＮＰ３６検出と同じである。増幅ステップが行われた後で、分析物はストライプ上に添加され、イムノクロマトグラフィーアッセイを開始させる。テストライン内の分析物信号の存在は野生型の存在を示し、さらに、テストライン内の分析物信号の欠如はワクチン型を示す。
【００３９】
ラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイを使用した本発明は従来の方法よりも感受性が高く、ここで、本発明の検出限界は、ＣＰＶ２ａ、２ｂ、２ｃの検出に対しても、野生型／ワクチン型の識別に対しても１０１コピーに達し得る。加えて、本発明は、ワクチン力価は比較的高い（１０３コピー）けれどもＣＰＶ２ａ、２ｂ、２ｃ又はＳＮＰ３６を依然として検出することができるため、特異的でもある。従って、ラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイを使用した本発明は、迅速且つ明確なＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃの検出及び野生型のワクチン型からの識別に適している。
【００４０】
実施形態１  ＴａｑＭａｎプローブによるＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃの検出
好ましくは、本発明は、試料調製のステップを含まない。疑わしい試料からの標的核酸を含む核酸の精製又は単離の後で、標的核酸が異なる条件で検出されてもよい。
【００４１】
１つのＣＰＶ２ａ感染試料、１つのＣＰＶ２ｂ感染試料、１つのＣＰＶ２ｃ感染試料及び１つの健康な試料が実施形態１において使用される。ＡＸＹＧＥＮ（登録商標）ＡｘｙＰｒｅｐ  Ｂｏｄｙ  Ｆｌｕｉｄ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡを使用することによってＤＮＡを単離した。ＳＥＱ  ＩＤ番号３４及びＳＥＱ  ＩＤ番号３を有するプライマーを使用して、ＶＰ２  ２ａ、２ｂ及び２ｃの配列を増幅させた。プライマー及びプローブの配列が表２において示されている。プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ番号５又はＳＥＱ  ＩＤ番号６と交換されてもよい。
【００４２】
【表２】
2018093859.tif 000004
【００４３】
増幅反応が実行され、ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ  Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）においてリアルタイムで測定し且つモニターした。それぞれの反応混合物の量は２０μｌであり、以下の条件下で増幅させた。
【００４４】
【表３】
2018093859.tif 000005
【００４５】
反応混合物を、第一に、１分間９５℃にてインキュベートした。実際の増幅反応を、以下のスキームに従って５０サイクル行った。
９５℃  １秒→６５℃  １秒
【００４６】
図１は、アガロースゲルによって、対応する領域、すなわちＶＰ２のＰＣＲ産物を示している。「Ｈ」は健康な試料を表し、さらに、「Ｍ」はマーカーを表している。図１は、所与のプライマーを用いたＰＣＲ反応は、野生型試料及びワクチン型試料両方において非特異的配列の交差反応性又は増幅を示さない又はほとんど示さないということを実証している。
【００４７】
図２は、所与のプライマーの対及びプローブに対する動態学的なＰＣＲの増殖曲線を示している。ＣＰＶ２ａ、ＣＰＶ２ｂ及びＣＰＶ２ｃの増殖曲線が閾値を超える場合、明確且つ特異的な信号がはじめに検出可能である。言い換えると、試料がＶＰ２配列を含有している場合、上昇曲線が、動態学的なＰＣＲの増殖曲線に現れることになる。一方、プライマー及びプローブは健康な試料の配列に特異的ではないため、健康な試料の信号は検出可能ではない。
【００４８】
実施形態２  ＴａｑＭａｎプローブによるＳＮＰ３６を使用することによる野生型のワクチン型からの識別
Ａ．特異性及び感受性のテスト
ＳＮＰ３６を使用することによって野生型をワクチン型から識別するための特異性及び感受性を検証するために、既知のコピー数を有する配列が、テストを行うために必要とされる。配列は、以下のステップ、すなわち：１．ＳＮＰ３６の対応する領域の野生型及びワクチン型を、それぞれ指定されたベクトル内にクローン化するステップ、２．これら２つの要素を大腸菌に形質転換するステップ、３．プラスミドＤＮＡを抽出するステップ、４．ＰＣＲ又は配列決定を用いて配列が正しいということを明らかにするステップによって調製される。
【００４９】
１０４、１０３、１０２、１０１のコピー数を有するＶＰ２のＳＮＰ３６の野生型の４つの連続的な単一の希釈物（以下、野生型試料）が調製され、さらに、１０８、１０７、１０６のコピー数を有するＶＰ２のＳＮＰ３６のワクチン型の３つの連続的な単一の希釈物（以下、ワクチン型試料）が調製される。
【００５０】
順方向プライマーに対してＳＥＱ  ＩＤ番号８を有するプライマー、逆方向プライマーに対してＳＥＱ  ＩＤ番号１１を有するプライマー及びＳＥＱ  ＩＤ番号１３を有するプローブを使用して、上述の野生型試料及びワクチン型試料を増幅させた。プライマー及びプローブの配列が表４において示されている。
【００５１】
順方向プライマーはＳＥＱ  ＩＤ番号９又は１０と交換することができ、逆方向プライマーはＳＥＱ  ＩＤ番号１２又は１３と交換することができ、さらに、プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ番号１５と交換することができる。増幅条件は、実施形態１と同じである。
【００５２】
【表４】
2018093859.tif 000006
【００５３】
【表５】
2018093859.tif 000007
【００５４】
図３は、アガロースゲルによって、対応する領域、すなわちＶＰ２のＳＮＰ３６のＰＣＲ産物を示している。「ＮＴＣ」はネガティブコントロールを表し、さらに、「Ｍ」はマーカーを表している。図３は、所与のプライマーを用いたＰＣＲ反応は、野生型試料及びワクチン型試料両方において非特異的配列の交差反応性又は増幅を示さない又はほとんど示さないということを実証している。
【００５５】
図４は、所与のプライマーの対及びプローブに対する動態学的なＰＣＲの増殖曲線を示している。この実施形態において与えられたプローブは、ＳＮＰ３６の野生型に特異的である。上述のように、ヌクレオチドが野生型に対してＧであるため、プローブは「Ｇ」に相補的である。従って、試料番号１〜４の増殖曲線が閾値を超える場合、明確且つ特異的な信号がはじめに検出可能である。一方、プローブは、「Ａ」に特異的ではなく、ここで、ヌクレオチドはＳＮＰ３６のワクチンに対してＡであるため、試料５〜７の信号は検出可能ではない。
【００５６】
この実施形態のＬＯＤは、野生型のワクチン型からの識別に対して１０１コピーに達し得る。さらに、特異性は、識別窓が１０８コピーに達し得るため、比較的高い。
【００５７】
Ｂ．基準試料のテスト
４つの基準試料及び２つのワクチンバルク（Ｄｕｒａｍｕｎｅ及びＶａｎｇｕａｒｄ）が、この実施形態において使用される。４つの基準試料のウイルスＤＮＡも、ＡＸＹＧＥＮ（登録商標）ＡｘｙＰｒｅｐ  Ｂｏｄｙ  Ｆｌｕｉｄ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡを使用することによって単離される。ワクチンバルクがこの実施形態及び以下の実施形態において使用される理由は、ワクチン接種されたイヌの配列型をシミュレートするためである。
【００５８】
プライマーの配列、プローブの配列及び増幅条件は、特異性及び感受性のテストと同じである。ワクチンバルクは、希釈なしで増幅を実行するために使用される。
【００５９】
【表６】
2018093859.tif 000008
【００６０】
図５において示されているように、４つの基準試料は、その増殖曲線が閾値を超える場合に検出可能である。従って、これら４つの基準試料は、ＶＰ２配列を含有しているため、野生型である。一方、２つのワクチンバルクは、その力価が高い場合でさえも、検出可能ではない。
【００６１】
実施形態３  ＴａｑＭａｎプローブによるＳＮＰ８９９及びＳＮＰ９６３を使用することによる野生型のワクチン型からの識別
それぞれＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃによって感染された２０の基準試料及び２つの異なるワクチンバルク（Ｄｕｒａｍｕｎｅ及びＶａｎｇｕａｒｄ）が、この実施形態において使用される。２０の基準試料のウイルスＤＮＡも、ＡＸＹＧＥＮ（登録商標）ＡｘｙＰｒｅｐ  Ｂｏｄｙ  Ｆｌｕｉｄ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡを使用することによって単離される。
【００６２】
順方向プライマーに対してＳＥＱ  ＩＤ番号１６から選択された３０の近接しているヌクレオチドを含むＳＥＱ  ＩＤ番号１７を有するプライマー、逆方向プライマーに対してＳＥＱ  ＩＤ番号２２を有するプライマー、及び、ＳＮＰ８９９に対してＳＥＱ  ＩＤ番号２４及びＳＮＰ９６３に対してＳＥＱ  ＩＤ番号２９を有するプローブを使用して、上述の野生型試料及びワクチン型試料を増幅させた。プライマー及びプローブの配列が表７において示されている。増幅条件は表８において示されている。ワクチンバルクは、希釈なしで増幅を実行するために使用される。
【００６３】
順方向プライマーはＳＥＱ  ＩＤ番号１８、１９、２０又は２１と交換することができ、逆方向プライマーはＳＥＱ  ＩＤ番号２３と交換することができ、ＳＮＰ８９９に対するプローブは、ＳＥＱ  ＩＤ番号２５、２６、２７又は２８と交換することができ、さらに、ＳＮＰ９６３に対するプローブは、ＳＥＱ  ＩＤ番号３０、３１、３２又は３３と交換することができる。増幅条件は、実施形態１と同じである。
【００６４】
【表７】
2018093859.tif 000009
【００６５】
【表８】
2018093859.tif 000010
【００６６】
図６において示されているように、ＳＮＰ８９９もＳＮＰ９６３も２０の基準試料に対して陽性であり、これらの試料が本当に感染しているということを意味している。図６とは対照的に、図７は、試料がワクチン接種された場合には１つの蛍光信号のみが検出されるであろうということを意味している。図７の左側には、ヌクレオチドが、ＳＮＰ９６３において野生型と同じ「Ｔ」であり、さらに、ヌクレオチドが、野生型と同じではない「Ｃ」であるため、ＳＮＰ９６３は検出可能であり、さらに、ＳＮＰ８９９は検出可能ではないということが示されている。一方、図７の右側には、ヌクレオチドが、ＳＮＰ８９９において野生型と同じ「Ｇ」であり、さらに、ヌクレオチドが、ＳＮＰ９６３において野生型と同じではない「Ａ」であるため、ＳＮＰ８９９は検出可能であり、さらに、ＳＮＰ９６３は検出可能ではないということが示されている。
【００６７】
従って、２つの異なる蛍光信号がどちらも検出可能である場合、野生型を示している。さらに、１つの信号のみが検出可能である場合、ワクチン型を示している。
【００６８】
実施形態４  イムノクロマトグラフィーアッセイによるＣＰＶ２ａ、２ｂ及び２ｃの検出
１つのＣＰＶ２ａ感染試料、１つのＣＰＶ２ｂ感染試料、１つのＣＰＶ２ｃ感染試料及び１つの健康な試料が実施形態４において使用される。ＡＸＹＧＥＮ（登録商標）ＡｘｙＰｒｅｐ  Ｂｏｄｙ  Ｆｌｕｉｄ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡを使用することによってＤＮＡを単離した。ＳＥＱ  ＩＤ番号３４及びＳＥＱ  ＩＤ番号３を有するプライマーを使用して、ＶＰ２  ２ａ、２ｂ及び２ｃの配列を増幅させた。プライマー及びプローブの配列が表２において示されている。プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ番号５又はＳＥＱ  ＩＤ番号６と交換されてもよい。この実施形態において使用されるプライマー及びプローブの標識は、実施形態１とは異なる。順方向プライマーの５´末端がＤＩＧを保有し、さらに、プローブの３´末端がＦＩＴＣを保有している。着色された粒子はコロイド金である。
【００６９】
【表９】
2018093859.tif 000011
【００７０】
増幅反応が実行され、ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ  Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）においてリアルタイムで測定し且つモニターした。それぞれの反応混合物の量は２０μｌであり、以下の条件下で増幅させた。
【００７１】
【表１０】
2018093859.tif 000012
【００７２】
反応混合物を、第一に、１分間９５℃にてインキュベートした。実際の増幅反応を、以下のスキームに従って５０サイクル行った。
９５℃  １秒→６５℃  １秒
【００７３】
図８は、アガロースゲルによって、対応する領域、すなわちＶＰ２のＰＣＲ産物を示している。「Ｈ」は健康な試料を表している。図８は、所与のプライマーを用いたＰＣＲ反応は、野生型試料及びワクチン型試料両方において非特異的配列の交差反応性又は増幅を示さない又はほとんど示さないということを実証している。
【００７４】
図９は、所与のプライマーの対及びプローブに対するラテラルフローを示している。ＣＰＶ２ａ、ＣＰＶ２ｂ及びＣＰＶ２ｃのＤＩＧが抗ＤＩＧ及びコロイド金に会う場合、明確且つ特異的な着色された粒子がはじめに可視である。言い換えると、試料がＶＰ２配列を含有している場合、着色された線が、ストリップ上で可視であり得る。一方、プライマー及びプローブは健康な試料の配列に特異的ではないため、健康な試料の着色された線は可視ではない。
【００７５】
実施形態５  イムノクロマトグラフィーアッセイによるＳＮＰ３６を使用することによる野生型のワクチン型からの識別
３つの野生型試料及び３つのワクチンバルクが、この実施形態において使用される。３つの基準試料のウイルスＤＮＡも、ＡＸＹＧＥＮ（登録商標）ＡｘｙＰｒｅｐ  Ｂｏｄｙ  Ｆｌｕｉｄ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡを使用することによって単離される。ワクチンバルクがこの実施形態及び以下の実施形態において使用される理由は、ワクチン接種されたイヌの配列型をシミュレートするためである。この実施形態において使用されるプライマー及びプローブの標識は、実施形態２とは異なる。順方向プライマーの５´末端がＤＩＧを保有し、さらに、プローブの３´末端がＦＩＴＣを保有している。着色された粒子はコロイド金である。プライマーの配列、プローブの配列及び増幅条件は以下に列挙されたものである。
【００７６】
【表１１】
2018093859.tif 000013
【００７７】
ＰＮＡが、特異性を上げるために増幅に添加される。ワクチンバルクは、希釈なしで増幅を実行するために使用される。
【００７８】
【表１２】
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【００７９】
図１０は、アガロースゲルによって、対応する領域、すなわちＶＰ２のＳＮＰ３６のＰＣＲ産物を示している。試料１、３、５は基準試料であり、さらに、試料２、４、６はワクチンバルク由来である。図１０は、所与のプライマーを用いたＰＣＲ反応は、野生型試料及びワクチン型試料両方において非特異的配列の交差反応性又は増幅を示さない又はほとんど示さないということを実証している。
【００８０】
図１１は、所与のプライマーの対及びプローブに対するラテラルフローを示している。上述のように、プライマー及びプローブはＳＮＰ３６の野生型に特異的である。従って、試料１、３、５のＤＩＧが抗ＤＩＧ及びコロイド金に会う場合、明確且つ特異的な着色された粒子がはじめに可視である。言い換えると、試料がＳＮＰ３６野生型配列を含有している場合、着色された線が、ストリップ上で可視であり得る。一方、ワクチンバルク、すなわち試料２、４、６の着色された線は、プライマー及びプローブはその配列に特異的ではないため、可視ではない。
【００８１】
当業者は、本発明の教示を保持しながら、装置及び方法の多数の修正及び変更を行うことができるということを容易に観察することになる。従って、上記の開示は、付随の特許請求の範囲によってのみ限定されると解釈されるべきである。
【符号の説明】
【００８２】
２Ａ  ＣＰＶ２ａ
２Ｂ  ＣＰＶ２ｂ
２Ｃ  ＣＰＶ２ｃ
Ｈ  健康な試料
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【外国語明細書】
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