(57)【要約】      （修正有）【課題】パルミトレイン酸を高含有量で含有し、黄色ブドウ球菌に対する選択的抗菌剤として有用な、脂肪酸組成物の提供。【解決手段】ｓｎ−１位およびｓｎ−３位にパルミトレイン酸を有するトリグリセリドを含有する油脂より、リパーゼによりｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を遊離させ、次いで遊離させた脂肪酸を回収することにより、パルミトレイン酸を５５モル％以上含有する脂肪酸組成物。パルミトレイン酸とオレイン酸の含有量比（パルミトレイン酸／オレイ酸）がモル比にて２．４以上、好ましくは３以上であり、好ましくは多価不飾和脂肪酸を実質的に含有しない脂肪酸組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルミトレイン酸を５５モル％以上含有する、脂肪酸組成物。
【請求項２】
パルミトレイン酸とオレイン酸の含有量比（パルミトレイン酸／オレイン酸）が、モル比にて２．４以上である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
パルミトレイン酸とオレイン酸との含有量比（パルミトレイン酸／オレイン酸）が、モル比にて３以上である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
多価不飽和脂肪酸を実質的に含有しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物を含有する、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対する選択的抗菌剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物を含有する、皮膚外用剤。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物を含有する、医薬部外品。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物を含有する、化粧品。
【請求項９】
（１）ｓｎ−１位およびｓｎ−３位にパルミトレイン酸を有するトリグリセリドを含有する油脂より、リパーゼによりｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を遊離させる工程、および（２）前記工程で遊離させた脂肪酸を回収する工程を含む、パルミトレイン酸を５５モル％以上含有する脂肪酸組成物の製造方法。
【請求項１０】
ｓｎ−１位およびｓｎ−３位にパルミトレイン酸を有するトリグリセリドを含有する油脂が、トリグリセリド全体におけるパルミトレイン酸とオレイン酸の含有量比（パルミトレイン酸／オレイン酸）より、ｓｎ−１位およびｓｎ−３位におけるパルミトレイン酸とオレイン酸の含有量比（パルミトレイン酸／オレイン酸）の方が大きい油脂である、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
ｓｎ−１位およびｓｎ−３位にパルミトレイン酸を有するトリグリセリドを含有する油脂がサッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）により生産された油脂である、請求項９または１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼのＮ末端欠失遺伝子を過剰発現している形質転換株である、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
リパーゼが、トリグリセリドのｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を優先的に遊離させるリパーゼである、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
トリグリセリドのｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を優先的に遊離させるリパーゼが、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物由来のリパーゼまたはアルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する微生物由来のリパーゼである、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物由来のリパーゼによりｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を遊離させる工程が、過剰量のエタノールの存在下に行われる、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
リパーゼが、トリグリセリドのｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を特異的に遊離させるリパーゼである、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
トリグリセリドのｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を特異的に遊離させるリパーゼが、クモノスカビ（Rhizopus）属に属する微生物由来のリパーゼである、請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
リパーゼが、オレイン酸よりもパルミトレイン酸を優先的に遊離させるリパーゼである、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１９】
オレイン酸よりもパルミトレイン酸を優先的に遊離させるリパーゼが、カンジダ（Candida）属に属する微生物由来のリパーゼである、請求項１８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な脂肪酸組成物およびその製造方法に関し、さらには、該脂肪酸組成物を含有する皮膚外用剤、医薬部外品および化粧品に関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎は、日本皮膚科学会ガイドラインによると、表皮、なかでも角層の異常に起因する皮膚の乾燥とバリアー機能異常という皮膚の生理学的異常を伴い、多彩な非特異的刺激反応および特異的アレルギー反応が関与して生じる、慢性に経過する炎症と掻痒をその病態とする湿疹・皮膚炎群の一疾患であるとされる。特に先進国では罹患率が高く、子供の１５〜３０％、成人の５％が罹患しているといわれる。
【０００３】
アトピー性皮膚炎は、アトピー素因（家族歴、アレルギー疾患の既往歴、ＩｇＥ抗体を産生しやすい性質等）、表皮常在細菌叢のバランスの乱れ、栄養的要因（高リノール酸食用油やそれを素材とする食品等）、環境的要因（塵埃、ストレス、不規則な生活等）等の複合的な要因によって発症する。
近年、黄色ブドウ球菌がアトピー性皮膚炎患者の皮膚で高頻度で検出されること、アトピー性皮膚炎患者の炎症部で黄色ブドウ球菌が劇的に増加することが報告され（非特許文献１、２）、表皮の黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の異常増殖がアトピー性皮膚炎の増悪化の原因となっている可能性が示唆されている。これは、黄色ブドウ球菌が生産するプロテインＡ、δトキシン、Ｖ８プロテアーゼなどが炎症の増悪化に関与しているためとされている。
【０００４】
それゆえ、アトピー性皮膚炎患者に対し、ムピロシン、フシジン酸等の外用、ジクロキサシリン、セファレキシン、エリスロマイシン等の内服等、抗生物質による治療も行われている。
しかしながら、上記のような抗生物質は、皮膚の常在細菌であり、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の増殖を阻害し、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の分泌物による炎症の憎悪に対し抑制作用を示す表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）までも殺菌してしまい、表皮常在細菌叢のバランスの乱れが改善されない可能性が高い。
【０００５】
一方、アトピー性皮膚炎患者の皮脂中におけるサピエン酸（（Ｚ）−６−ヘキサデセン酸）の含有量が、健常者に比べて１／１０程度に減少していることが報告され（非特許文献３）、サピエン酸の異性体であり、食経験もあるパルミトレイン酸（（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸）が、黄色ブドウ球菌に対して抗菌活性を有することが報告される（特許文献１）に至って、パルミトレイン酸の皮膚外用剤における利用が検討されてきた。
しかし、食経験があり、安全性が確認されている植物油等で、パルミトレイン酸を多く含有するものは少なく、シーベリー（Hippophae rhamnoides）という植物の果肉に４０質量％程度含有されているものの、シーベリーは栽培地域が限定されており、パルミトレイン酸の実用的な供給源として適するとはいえない。
また、シーベリーの果肉油をはじめ、植物油等には、例えばリノール酸、リノレイン酸等、二重結合を２個以上有し、酸化安定性のよくない多価不飽和脂肪酸（二重結合を２個以上有する不飽和脂肪酸）が相当量含有されるため、植物油から得られた脂肪酸組成物については、酸化安定性に問題があり、皮膚外用剤等に利用するには好ましくない。
【０００６】
さらに、病院の集中治療室（ＩＣＵ）などで働く労働者で、手洗いやアルコール消毒を繰り返す者では、４１．２％〜５２．９％において、手に黄色ブドウ球菌が検出されることが報告されている（非特許文献４、５）。
それゆえ、食品工場等の労働者や、家庭で家事に従事する者で、頻繁に手洗いや消毒を繰り返し、手荒れ等の肌荒れが見られる者の皮膚では、同様に黄色ブドウ球菌が増殖している可能性が示唆される。
従って、アトピー性皮膚炎の症状の悪化を防止し、または症状を改善するためのみならず、皮膚の洗浄、消毒に起因する肌荒れの予防または改善のためにも、黄色ブドウ球菌の異常な増殖を防止または抑制し、表皮常在菌叢のバランスを正常な状態に維持、改善する必要性は高い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０１１４８６号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】S. Higaki et al.; International J. Dermatology 38 265 (1999)
【非特許文献２】H. H. Kong et al.; Genome Research 22 8505 (2012)
【非特許文献３】H. Takigawa et al.; Dermatology 211 240 (2005)
【非特許文献４】M. Rosenthal et al.；Pathogens 3 1-13 (2014)
【非特許文献５】P. Horn et al.；Scand. J. Clin. Lab. Invest. 67 165-177 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明は、パルミトレイン酸を高含有量で含有し、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を抑制し、表皮ブドウ球菌を抑制しない選択的抗菌剤、つまり表皮常在細菌叢のバランスを保つ抗菌剤として有用な、脂肪酸組成物を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ｓｎ−１位およびｓｎ−３位にパルミトレイン酸を有するトリグリセリドを含有する油脂より、リパーゼによりｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を遊離させ、次いで遊離させた脂肪酸を回収することにより、パルミトレイン酸を５５モル％以上含有する脂肪酸組成物を得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］パルミトレイン酸を５５モル％以上含有する、脂肪酸組成物。
［２］パルミトレイン酸とオレイン酸の含有量比（パルミトレイン酸／オレイン酸）が、モル比にて２．４以上である、［１］に記載の組成物。
［３］パルミトレイン酸とオレイン酸との含有量比（パルミトレイン酸／オレイン酸）が、モル比にて３以上である、［１］に記載の組成物。
［４］多価不飽和脂肪酸を実質的に含有しない、［１］〜［３］のいずれかに記載の組成物。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の組成物を含有する、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対する選択的抗菌剤。
［６］［１］〜［４］のいずれかに記載の組成物を含有する、皮膚外用剤。
［７］［１］〜［４］のいずれかに記載の組成物を含有する、医薬部外品。
［８］［１］〜［４］のいずれかに記載の組成物を含有する、化粧品。
［９］（１）ｓｎ−１位およびｓｎ−３位にパルミトレイン酸を有するトリグリセリドを含有する油脂より、リパーゼによりｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を遊離させる工程、および（２）前記工程で遊離させた脂肪酸を回収する工程を含む、パルミトレイン酸を５５モル％以上含有する脂肪酸組成物の製造方法。
［１０］ｓｎ−１位およびｓｎ−３位にパルミトレイン酸を有するトリグリセリドを含有する油脂が、トリグリセリド全体におけるパルミトレイン酸とオレイン酸の含有量比（パルミトレイン酸／オレイン酸）より、ｓｎ−１位およびｓｎ−３位におけるパルミトレイン酸とオレイン酸の含有量比（パルミトレイン酸／オレイン酸）の方が大きい油脂である、［９］に記載の製造方法。
［１１］ｓｎ−１位およびｓｎ−３位にパルミトレイン酸を有するトリグリセリドを含有する油脂が、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）により生産された油脂である、［９］または［１０］に記載の製造方法。
［１２］サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼのＮ末端欠失遺伝子を過剰発現している形質転換株である、［１１］に記載の製造方法。
［１３］リパーゼが、トリグリセリドのｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を優先的に遊離させるリパーゼである、［９］〜［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１４］トリグリセリドのｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を優先的に遊離させるリパーゼが、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物由来のリパーゼまたはアルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する微生物由来のリパーゼである、［１３］に記載の製造方法。
［１５］シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物由来のリパーゼによりｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を遊離させる工程が、過剰量のエタノールの存在下に行われる、［１４］に記載の製造方法。
［１６］リパーゼが、トリグリセリドのｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を特異的に遊離させるリパーゼである、［９］〜［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１７］トリグリセリドのｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を特異的に遊離させるリパーゼが、クモノスカビ（Rhizopus）属に属する微生物由来のリパーゼである、［１６］に記載の製造方法。
［１８］リパーゼが、オレイン酸よりもパルミトレイン酸を優先的に遊離させるリパーゼである、［９］〜［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１９］オレイン酸よりもパルミトレイン酸を優先的に遊離させるリパーゼが、カンジダ（Candida）属に属する微生物由来のリパーゼである、［１８］に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対し、選択的な抗菌活性を有するパルミトレイン酸を、従来にない高濃度で含有する脂肪酸組成物を得ることができる。
本発明の脂肪酸組成物は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の生育を抑制し、表皮ブドウ球菌の生育を抑制しない選択的抗菌剤、つまり表皮常在細菌叢のバランスを保つ抗菌剤として、特にアトピー性皮膚炎の症状の悪化を防止し、またはアトピー性皮膚炎の症状を改善するための皮膚外用剤、医薬部外品または化粧品として、好適に利用され得る。
また、本発明の脂肪酸組成物は、アトピー性皮膚炎のみならず、家事や職務上の皮膚の洗浄、消毒等により生じる手荒れ等の肌荒れを予防または改善するための皮膚外用剤、医薬部外品または化粧品としても、好適に利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】皮膚外用剤における脂肪酸組成物の有効量についての試験例３の検討結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、パルミトレイン酸を、組成物の全量に対し５５モル％以上含有する脂肪酸組成物（以下、本明細書において「本発明の脂肪酸組成物」ともいう）を提供する。
【００１５】
本発明の脂肪酸組成物に含有されるパルミトレイン酸は、９位に二重結合を１個有する炭素数１６の不飽和脂肪酸（（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸））である。
本発明の脂肪酸組成物は、パルミトレイン酸を組成物の全量に対し、好ましくは５８モル％以上含有し、より好ましくは６０モル％以上含有する。
また、後述するリパーゼを用いた製造方法における効率等を考慮すると、本発明の脂肪酸組成物におけるパルミトレイン酸の含有量は、通常７０モル％以下である。
【００１６】
本発明の脂肪酸組成物は、パルミトレイン酸の他に、炭素数１０〜２０程度の飽和または不飽和脂肪酸を含有していてもよいが、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対する選択的抗菌活性の観点からは、オレイン酸がパルミトレイン酸の抗菌活性に抑制的に作用することから、オレイン酸（（Ｚ）−９−オクタデセン酸）の含有量が少ない方が望ましく、パルミトレイン酸とオレイン酸の含有量比（パルミトレイン酸／オレイン酸）が、モル比にて２．４以上であることが好ましく、３以上であることがより好ましい。
さらに、本発明の脂肪酸組成物は、酸素に対して不安定であり、皮膚外用剤等として製剤化する際に、安定性等品質に悪影響を及ぼすおそれのあるリノール酸（（９Ｚ，１２Ｚ）−９，１２−オクタデカジエン酸）、α−リノレン酸（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）−９，１２，１５−オクタデカトリエン酸）、γ−リノレン酸（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−６，９，１２−オクタデカトリエン酸）等の多価不飽和脂肪酸を実質的に含有しないことが好ましい。
ここで、「多価不飽和脂肪酸を実質的に含有しない」とは、上記多価不飽和脂肪酸の通常の分析方法、たとえばガスクロマトグラフィーによる定量方法等により、上記多価不法脂肪酸が検出されない、すなわち検出限界（０．１モル％）以下であることをいう。
【００１７】
本発明の脂肪酸組成物は、上記の通り、融点が−１℃であるパルミトレイン酸を５５モル％以上含有し、長鎖の飽和脂肪酸の含有量が少ないことから、通常２０℃で液状を呈する。
【００１８】
本発明の脂肪酸組成物は、ｓｎ−１位およびｓｎ−３位にパルミトレイン酸を有するトリグリセリドを含有する油脂より、リパーゼによりｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を遊離させ、遊離した脂肪酸を回収することにより、好適に得ることができる。また、前記の油脂は、トリグリセリド全体におけるパルミトレイン酸とオレイン酸の含有量比（パルミトレイン酸／オレイン酸）より、ｓｎ−１位およびｓｎ−３位におけるパルミトレイン酸とオレイン酸の含有量比（パルミトレイン酸／オレイン酸）の方が大きい油脂であることがより好ましい。
【００１９】
上記したトリグリセリドを含有する油脂としては、植物や、酵母等の微生物等から得られる油脂であって、食経験のある油脂であることが好ましく、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）により生産された油脂であることがより好ましい。
サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）としては、脂質生産能の高い形質転換株を用いることが好ましい。かかる形質転換株としては、特開２０１５−１４６７７８号公報に記載されているようなジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）のＮ末端欠失遺伝子を過剰発現している形質転換株であって、ｓｎ−１位およびｓｎ−３位にパルミトレイン酸を有するトリグリセリドの含有量の高い脂質を生産する能力を有するものを、好ましく用いることができる。さらには、ＤＧＡＴのＮ末端欠失遺伝子をサッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＤＧＡＴの遺伝子（ＤＧＡ１）破壊株で過剰発現させた形質転換株がより好ましい。特に、Ｎ末端の２９残基を欠失したＤＧＡＴを、ＤＧＡ１遺伝子破壊株等の細胞内のヒストンアセチルトランスフェラーゼをコードするＥＳＡ１遺伝子の機能を低下させたサッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）で過剰発現させた形質転換株が好ましく用いられる。
なお、上記ＤＧＡＴのＮ末端欠失遺伝子を過剰発現している形質転換株等の作成、培養等は、神坂ら（Appl. Microbiol. Biotechnol. 99 201-210 (2015)）、特開２０１５−１４６７７８号公報等に記載された方法に従って行うことができる。
【００２０】
本発明の脂肪酸組成物を得るためには、リパーゼとして、トリグリセリドのｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を優先的に遊離させるリパーゼ、またはトリグリセリドのｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を特異的に遊離させるリパーゼを用いることが好ましい。
トリグリセリドのｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を優先的に遊離させるリパーゼとしては、シュードザイマ  アンタークティカ（Pseudozyma antarctica）等、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物、アルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する微生物、シュードモナス（Psudomonas）属に属する微生物およびバークホルデリア（Burkholderia）属に属する微生物等に由来するリパーゼが、好ましいものとして挙げられ、なかでも、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物由来のリパーゼおよびアルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する微生物由来のリパーゼがより好ましい。
トリグリセリドのｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を特異的に遊離させるリパーゼとしては、リゾプス  ジャポニクス（Rhizopus japonicus）やリゾプス  オリゼ（Rhizopus oryzae）等のクモノスカビ（Rhizopus）属に属する微生物、リゾムコール  ミヘイ（Rhizomucor miehei）等のリゾムコール（Rhizomucor）属に属する微生物、サーモミセス  ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus）等のサーモミセス（Thermomyces）属に属する微生物等に由来するリパーゼ、および膵臓リパーゼが、好ましいものとして挙げられる。なかでも、クモノスカビ（Rhizopus）属に属する微生物由来のリパーゼがより好ましい。
【００２１】
また、本発明においては、オレイン酸よりもパルミトレイン酸を優先的に遊離させるリパーゼを用いることもできる。
かかるリパーゼとしては、カンジダ  ルゴサ（Candida rugosa）等のカンジダ（Candida）属に属する微生物、ゲオトリクム  カンディダム（Geotrichum candidum）等のゲオトリクム（Geotrichum）属に属する微生物等に由来するリパーゼが、好ましいものとして挙げられ、カンジダ（Candida）属に属する微生物由来のリパーゼがより好ましい。
【００２２】
上記したリパーゼは、遊離型のリパーゼであってもよく、樹脂等の担体に結合させたり、マイクロカプセルまたはリポソームに内包させたりして、固定化されたものであってもよい。
本発明においては、各社より提供されている市販のリパーゼを用いることができる。
【００２３】
ｓｎ−１位およびｓｎ−３位にパルミトレイン酸を有するトリグリセリドを含有する油脂より、リパーゼによりｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を遊離させる反応は、使用するリパーゼの種類により、反応条件を適宜設定して行うことができる。
リパーゼの添加量としては、基質であるトリグリセリド１００質量部に対し、通常０．０１質量部〜１０質量部であり、好ましくは０．０３質量部〜１．５質量部である。遊離型の酵素の場合は、水系での反応であり、トリグリセリドに対して添加する水の量は、好ましくは０．０１質量％から９９質量％、より好ましくは５質量％から９５質量％である。固定化酵素の場合は、水を添加しても、しなくてもよい。
酵素反応は、必要に応じて水、ヘキサン等の溶媒を用い、通常５℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜４０℃、ｐＨ＝３〜９、好ましくはｐＨ＝５〜７にて、通常０．５時間〜１８時間行わせる。反応時間が長くなると、ｓｎ−１位からｓｎ−３位のすべてにおいて脂肪酸の遊離が進行したり、アシル基転移が生じたりするため、反応時間は２時間〜３時間程度とすることが好ましい。リパーゼによる加水分解反応を停止させるには、加熱による失活、エタノールやメタノールなどの短鎖アルコールによる失活、静置や遠心分離による油水分離等を行うことが好ましい。固定化酵素の場合は、静置や濾過により固定化酵素を除くだけでよい。未反応のトリグリセリドは、反応液に水酸化カリウム等のアルカリ剤を加え、遊離脂肪酸を鹸化して水層に移行させた後、ｎ−ヘキサン等の非極性有機溶媒により抽出する等して、除去することができる。
なお、リパーゼとして、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物由来のリパーゼを用いる場合、基質であるトリグリセリド１００質量部に対し、５００質量部くらいの過剰量のエタノールの存在下に反応させると、前記リパーゼが、ｓｎ−１位およびｓｎ−３位に対してほぼ特異的に作用するため、好ましい。かかる場合には、ｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸は、エチルエステルとして遊離するため、通常の方法により鹸化した後、遊離脂肪酸を回収する。
【００２４】
上記リパーゼにより遊離された脂肪酸は、（１）シリカゲルカラム等によるカラムクロマトグラフィーによる分離、（２）反応液に水酸化カリウム等のアルカリ剤を加えて、遊離脂肪酸を鹸化して水層に移行させた後、ｎ−ヘキサン等の低極性有機溶媒による抽出等により未反応のトリグリセリドを除去し、水層に塩酸等の酸を添加して酸性とした後、ｎ−ヘキサン等の低極性有機溶媒で抽出し、溶媒を蒸発させて除去する方法、（３）油水分離等により水を除去した後、蒸留により遊離脂肪酸を回収する方法等、通常の方法により回収することができる。
【００２５】
本発明の脂肪酸組成物は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対して選択的抗菌活性を有するパルミトレイン酸の含有量が高く（脂肪酸組成物の全量に対し５５モル％以上）、パルミトレイン酸の前記選択的抗菌活性を阻害するオレイン酸の含有量が低いため、アトピー性皮膚炎の増悪化に関与する黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の生育を抑制するが、健常な皮膚の常在細菌である表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）の生育は抑制せず、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）を減少させるおそれが少ない。
従って、本発明の脂肪酸組成物は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対する選択的抗菌剤として有用であり、皮膚の常在細菌叢を健常な状態に維持し、または改善して、アトピー性皮膚炎の症状の悪化を防止し、またはアトピー性皮膚炎の症状を改善する上で有効な皮膚外用剤、医薬部外品、化粧品等として、あるいは、家事や職務上の皮膚の洗浄、消毒等により生じる肌荒れを予防または改善する上で有効な皮膚外用剤、医薬部外品、化粧品等として、好ましく利用することができる。
【００２６】
よって、本発明は、本発明の脂肪酸組成物を含有する、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対する選択的抗菌剤（以下、本明細書において、「本発明の抗菌剤」とも称する）を提供する。
本発明の抗菌剤は、本発明の脂肪酸組成物に、必要に応じて、製剤の分野で用いられる一般的な添加剤を加えて、製剤の分野で周知の製剤化手段、たとえば第十七改正日本薬局方製剤総則［３］製剤各条に記載された方法等により、調製することができ、油状；懸濁液状、乳液状等の液状；ゲル状、ペースト状、クリーム状等の半固形状；粉末状、顆粒状、タブレット状、カプセル状等の固形状等の形態とすることができる。
本発明の目的には、本発明の抗菌剤は、皮膚に外用され得る形態とすることが好ましい。
【００２７】
上記添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、被覆剤、基剤、溶剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、安定化剤、粘稠剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、防腐剤、保存剤、矯味剤、甘味剤、香料、着色剤等が挙げられる。
【００２８】
賦形剤としては、無水ケイ酸、ケイ酸カルシウム、ケイ酸アルミン酸マグネシウム、デンプン（トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、コムギデンプン等）、糖類（ブドウ糖、乳糖、白糖等）、糖アルコール（ソルビトール、マルチトール、マンニトール等）が挙げられる。
【００２９】
結合剤としては、ゼラチン、カゼインナトリウム、デンプン（ヒドロキシプロピルスターチ、アルファー化デンプン、部分アルファー化デンプン等）、セルロースおよびその誘導体（結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース等）等が挙げられる。
【００３０】
崩壊剤としては、ポビドン、クロスポビドン、セルロースおよびその誘導体（結晶セルロース、メチルセルロース等）等が挙げられる。
【００３１】
滑沢剤としては、タルク、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。
【００３２】
被覆剤としては、メタクリル酸共重合体（メタクリル酸・アクリル酸エチル共重合体等）、メタクリレート共重合体（アクリル酸エチル・メタクリル酸メチル共重合体、アクリル酸エチル・メタクリル酸メチル・メタクリル酸塩化トリメチルアンモニウムエチル共重合体等）等が挙げられる。
【００３３】
基剤としては、炭化水素（流動パラフィン等）、ポリエチレングリコール（マクロゴール４００、マクロゴール１５００等）等が挙げられる。
【００３４】
溶剤としては、精製水、一価アルコール（エタノール等）、多価アルコール（プロピレングリコール、グリセリン等）等が挙げられる。
【００３５】
乳化剤としては、非イオン性界面活性剤（ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等）、陰イオン性界面活性剤（アルキル硫酸ナトリウム、Ｎ−アシルグルタミン酸塩等）、精製大豆レシチン等が挙げられる。
【００３６】
分散剤としては、アラビアゴム、アルギン酸プロピレングリコール、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール等）、陰イオン性界面活性剤（アルキル硫酸ナトリウム等）等が挙げられる。
【００３７】
懸濁化剤としては、アルギン酸ナトリウム、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレンラウリルエーテル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル等）等が挙げられる。
【００３８】
安定化剤としては、アジピン酸、エチレンジアミン四酢酸塩（カルシウム二ナトリウム塩、二ナトリウム塩等）、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン等が挙げられる。
【００３９】
粘稠剤としては、水溶性高分子（ポリアクリル酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー等）、多糖類（アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、トラガント等）等が挙げられる。
【００４０】
ｐＨ調整剤としては、塩酸、リン酸、酢酸、クエン酸、乳酸、水酸化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等が挙げられる。
【００４１】
抗酸化剤としては、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸、没食子酸プロピル等が挙げられる。
【００４２】
防腐剤としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル（パラオキシ安息香酸メチル等）等が挙げられる。
また、保存剤としては、安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビトール、パラオキシ安息香酸エステル（パラオキシ安息香酸メチル等）、プロピレングリコール等が挙げられる。
【００４３】
矯味剤としては、アスコルビン酸、エリスリトール、５’−グアニル酸二ナトリウム、クエン酸、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、酒石酸、ＤＬ−リンゴ酸等が挙げられる。
また、甘味剤としては、アスパルテーム、カンゾウエキス、サッカリン等が挙げられる。
【００４４】
香料としては、オレンジエッセンス、ｌ−メントール、ｄ−ボルネオール、バニリン、リナロール等が挙げられる。
【００４５】
着色剤としては、タール色素（食用赤色２号、食用青色１号、食用黄色４号等）、無機顔料（ベンガラ、黄色三二酸化鉄、酸化チタン等）、天然色素（アナトー色素、ウコン色素、カロテノイド等）等が挙げられる。
【００４６】
上記した添加剤は、必要に応じて、１種または２種以上を用いることができる。
【００４７】
本発明の抗菌剤における、本発明の脂肪酸組成物の含有量としては、本発明の抗菌剤の全量に対するパルミトレイン酸の含有量として、通常０．００１質量％〜１０質量％であり、０．００５質量％〜５質量％であることが好ましい。
【００４８】
本発明の抗菌剤の適用量は、本発明の抗菌剤が適用される対象（以下、本明細書において「適用対象」ともいう）の種別、性別、年齢、皮膚の状態、本発明の抗菌剤の剤形、適用経路等により適宜決定されるが、適用対象がヒト成人であり、外用により適用する場合、パルミトレイン酸の適用量として、１回あたり通常０．０２μｇ／ｃｍ２〜２００μｇ／ｃｍ２であり、好ましくは、０．１μｇ／ｃｍ２〜１００μｇ／ｃｍ２である。
上記の量は、１日に１回〜数回、適用することができる。
本発明の抗菌剤の適用期間は、適用対象において観察される皮膚の状態（皮膚常在細菌叢のバランスの状態）等により適宜決定されるが、通常１日間〜３０日間であり、好ましくは３日間〜１５日間である。
なお、本発明の抗菌剤は、安全性の確認された酵母等の脂質より得られるパルミトレイン酸を有効成分とするため安全性が高く、連続した適用に適する。
【００４９】
本発明の抗菌剤の適用対象となる動物（以下、本明細書において「対象動物」ともいう）としては、哺乳動物（ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ、ヒツジ等）等が挙げられる。なお、本発明の抗菌剤をヒト以外の対象動物に適用する場合、本発明の抗菌剤の適用量は、対象動物の種類、性別、体重、皮膚の状態等に応じて適宜設定すればよい。
【００５０】
本発明の抗菌剤は、皮膚常在細菌叢のバランスの乱れを正常な状態に改善し、または皮膚常在細菌叢のバランスを正常な状態に維持して、アトピー性皮膚炎の症状の悪化の防止、またはアトピー性皮膚炎の症状の改善に有効であり、アトピー性皮膚炎患者またはアトピー性皮膚炎の症状を呈する動物に対し、好適に適用することができる。
また、本発明の抗菌剤は、アトピー性皮膚炎患者のみならず、家事や職務上、皮膚の洗浄、消毒等を行う頻度が高く、手荒れ等、肌荒れ症状を呈するおそれのある者または肌荒れ症状を呈する者においても、肌荒れ症状を予防しまたは改善するために好適に適用され得る。
【００５１】
本発明はまた、本発明の脂肪酸組成物を含有する皮膚外用剤（以下、本明細書において「本発明の皮膚外用剤」ともいう）を提供する。
ここで、「皮膚外用剤」とは、皮膚の病変部位に外用にて適用される医薬品をいうが、皮膚を通して有効成分を循環血流に送達させることを目的とした経皮吸収型製剤も含まれる。
本発明の皮膚外用剤は、本発明の脂肪酸組成物に、必要に応じて、皮膚外用剤の製造に際して用いられる一般的な添加剤を加えて、外用散剤等の外用固形剤；リニメント剤、ローション剤（液剤、乳濁液剤、懸濁液剤等）等の外用液剤；外用エアゾール剤、ポンプスプレー剤等のスプレー剤；油脂性軟膏剤、水溶性軟膏剤等の軟膏剤；水中油型または油中水型のクリーム剤；水性ゲル剤、油性ゲル剤等のゲル剤；テープ剤、パップ剤等の貼付剤等の剤形で提供することができる。
本発明の皮膚外用剤は、一般的な皮膚外用剤の製造方法、たとえば、第十七改正日本薬局方製剤総則［３］製剤各条の「１１．皮膚などに適用する製剤」の項に記載された方法に従って、製造することができる。
【００５２】
本発明の皮膚外用剤には、上記した賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、基剤、溶剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、安定化剤、粘稠剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、防腐剤、保存剤、香料、着色剤等の１種または２種以上を用いることができる。
【００５３】
また、本発明の皮膚外用剤には、本発明の特徴を損なわない範囲で、イブプロフェンピコナール、スプロフェン、ブフェキサマク、ベンダザック、ウフェナマート、グリチルレチン酸等の非ステロイド性抗炎症薬；酪酸クロベタゾン等の副腎皮質ステロイド；フシジン酸ナトリウム、ムピロシン等の抗生物質；タクロリムス水和物等の免疫調整外用薬等を含有させることができる。
【００５４】
本発明の皮膚外用剤における、本発明の脂肪酸組成物の含有量は、本発明の抗菌剤について上記した含有量と同様である。
【００５５】
本発明の皮膚外用剤は、アトピー性皮膚炎患者またはアトピー性皮膚炎の症状を呈する動物に対し、炎症の悪化の防止または症状の改善のために、好適に適用することができる。
また、本発明の皮膚外用剤は、皮膚の洗浄、消毒等に起因する手荒れ等、肌荒れ症状を呈するおそれのある者または肌荒れ症状を呈する者においても、肌荒れ症状を予防しまたは改善するために、好適に適用することができる。
本発明の皮膚外用剤の１日あたりの適用量および適用期間は、本発明の皮膚外用剤の適用対象の種別、性別、年齢、皮膚症状の程度、本発明の皮膚外用剤の剤形等により適宜決定される。たとえば、ヒト成人の場合、パルミトレイン酸の適用量として、本発明の抗菌剤について上述した適用量と同程度の量となるように適用することができ、本発明の抗菌剤について上記した回数及び期間にて適用することができる。
【００５６】
さらに本発明は、本発明の脂肪酸組成物を含有する医薬部外品、特に皮膚外用医薬部外品（以下、本明細書において「本発明の医薬部外品」ともいう）または化粧品（以下、本明細書において「本発明の化粧品」ともいう）を提供する。
ここで、「医薬部外品」とは、医薬品よりは人体等に対する効果が緩和であるが、何らかの改善効果を有するものをいい、特に皮膚に外用される医薬部外品を「皮膚外用医薬部外品」という。いわゆる薬用化粧品は、皮膚外用医薬部外品に含まれる。
また、「化粧品」とは、身体を清潔にしたり、見た目を美しくしたりする目的で、皮膚等に適用されるもので、作用の緩和なものをいう。
本発明の医薬部外品または化粧品は、上記した本発明の皮膚外用剤に準じて製造することができ、化粧水、美容液、乳液、クリーム、洗顔料、パック、身体用洗浄料等の形態で提供され得る。
【００５７】
本発明の医薬部外品または化粧品には、本発明の特徴を損なわない範囲で、多価アルコール（グリセリン、１，３−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール等）、アミノ酸またはその塩（アラニン、セリン、プロリン、ＤＬ−ピロリドンカルボン酸ナトリウム等）、タンパク質（ホエイ、水溶性コラーゲン、加水分解エラスチン等）、核酸（デオキシリボ核酸ナトリウム等）、ムコ多糖（コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム等）、ヘパリン類似物質、植物抽出物（アシタバ抽出物、キュウリ抽出物、シラカバ抽出物等）等の保湿剤；アズレン類（アズレン、グアイアズレン、グアイアズレンスルホン酸エチル、グアイアズレンスルホン酸ナトリウム等）、アラントインおよびその誘導体（アラントイン、アスコルビン酸アラントイン、アラントイングリチルレチン酸等）、ビタミン（（アスコルビル／トコフェリル）リン酸カリウム、パンテノール等）、植物抽出物（カミツレ抽出物、カンゾウ抽出物、キダチアロエ抽出物等）、グリチルリチン酸およびその塩（グリチルリチン酸、グリチルリチン酸アンモニウム、グリチルリチン酸二カリウム等）、グリチルレチン酸およびその誘導体（グリチルレチン酸、グリチルレチン酸グリセリル、グリチルレチン酸ピリドキシン、サクシニルグリチルレチン酸二ナトリウム等）等の抗炎症・肌荒れ防止剤等を含有させることができる。
【００５８】
本発明の医薬部外品または化粧品における本発明の脂肪酸組成物の含有量は、本発明の皮膚外用剤に準じて適宜決定することができるが、パルミトレイン酸の１日あたりの適用量が、本発明の抗菌剤について上記した１日あたりの適用量となるように、本発明の脂肪酸組成物が適用されるように設定されることが好ましい。
【００５９】
本発明の医薬部外品または化粧品は、アトピー性皮膚炎患者の皮膚の状態の悪化を防止し、またはアトピー性皮膚炎患者の皮膚の状態を改善するために、あるいは、手荒れ等、肌荒れ症状を呈するおそれのある者または肌荒れ症状を呈する者において、肌荒れ症状を予防しまたは改善するために、好適に用いることができる。
また、本発明の医薬部外品または化粧品は、主としてヒトの皮膚、特にアトピー素因を有するヒト、または、特に皮膚の洗浄、消毒等に起因する肌荒れ症状を呈するヒトの皮膚の常在細菌叢のバランスを、正常な状態に維持するために好適に用いられる。
特に、本発明の医薬部外品または化粧品は、安全性の確認された酵母等の脂質より得られるパルミトレイン酸を有効成分として含有するため安全性が高く、日常的な皮膚の手入れを目的として、長期間にわたり連続して適用することができる。
【００６０】
さらに、本発明は、上記した本発明の脂肪酸組成物の製造方法（以下、本明細書において「本発明の製造方法」とも称する）を提供する。
本発明の製造方法は、（１）ｓｎ−１位およびｓｎ−３位にパルミトレイン酸を有するトリグリセリドを含有する油脂より、リパーゼによりｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を遊離させる工程、および（２）前記工程で遊離させた脂肪酸を回収する工程を含む。
【００６１】
本発明において用い得るｓｎ−１位およびｓｎ−３位にパルミトレイン酸を有するトリグリセリドを含有する油脂、ならびにリパーゼの種類等、本発明において、ｓｎ−１位およびｓｎ−３位の脂肪酸を遊離させるための酵素反応の条件、遊離させた脂肪酸の回収方法等については、本発明の脂肪酸組成物に関して上述した通りである。
【００６２】
本発明の製造方法における各工程においては、本発明の特徴を損なわない範囲で、適宜必要に応じて、再結晶、各種クロマトグラフィー等の精製手段、ろ過、遠心分離等の固液分離手段等を用いることができる。
【実施例】
【００６３】
さらに本発明について、実施例により詳細に説明する。
【００６４】
［参考例１］精製酵母トリグリセリドの調製
神坂ら（特開２０１５−１４６７７８号公報）に記載された方法により、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の形質転換体により生産された油脂を回収した。前記油脂（５ｇ）中に残存する溶媒をエバポレーターで除去し、脱溶媒後の油脂３．５７ｇを、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９８：２（容量比）で平衡化したシリカゲルクロマトグラフィー（２．６ｃｍ×２６ｃｍ）に負荷して、前記溶媒４０ｍＬ×１５本、およびヘキサン：酢酸エチル＝９５：５（容量比）４０ｍＬ×１５本で溶出させた。トリアシルグリセリドを含むフラクションＮｏ．１５〜２５の画分を回収し、エバポレーターで溶媒を除去し、参考例１の精製酵母トリグリセリド２．７４ｇを得た。
【００６５】
参考例１の精製酵母トリグリセリドについて、ｓｎ−１，３位およびｓｎ−２位の脂肪酸組成を、下記の通り、Y. Watanabeらの方法（J. Oleo Sci., 64, 1193 (2015)）に従って測定した。
参考例１の精製酵母トリグリセリド１００ｍｇに、エタノール１ｇおよびシュードザイマ  アンタークティカ（Pseudozyma antarctica）由来の固定化リパーゼ（「ノボザイム（Novozyme）４３５）」（ノボザイムズ（Novozumes）社））０．０４４ｇを加え、３０℃で往復振とうさせながら３時間反応させ、ろ過して上清を回収した。次いで、エバポレーターで溶媒を除去し、全量を、ｎ−ヘキサン：ジエチルエーテル＝８：２（容量比）で平衡化したセプ−パックシリカ（Sep-Pack silica）カートリッジ（「ＷＡＴ０５１９００」（ウォーターズ（Waters）社））に負荷し、前記溶媒３０ｍＬにより、脂肪酸エチルエステルおよびジグリセリドを溶出させて除去した。次に、ジエチルエーテル１０ｍＬでｓｎ−２位にアシル基を一つ有するモノグリセリド（ｓｎ−２モノグリセリド）を溶出させ、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。
【００６６】
メタノール３ｍＬに、参考例１のトリグリセリドおよび前記由来のｓｎ−２モノグリセリド各５μＬ、および２８質量％のナトリウムメトキシドのメタノール溶液を添加し、７５℃で１５分間加熱して、脂肪酸のメチルエステル化を行った。放冷後、ｎ−ヘキサン０．５ｍＬを添加混合し、次いで水３ｍＬを添加混合して、脂肪酸メチルエステルをｎ−ヘキサンにて抽出し、ｎ−ヘキサン層を回収した。
回収したｎ−ヘキサン層を、キャピラリーガスクロマトグラフ（「Ａｇｉｌｅｎｔ  ６８９０Ｎ」（アジレントテクノロジー（Agilent Technologies）社）にて下記の条件下に分析し、脂肪酸の定量を行った。
【００６７】
＜分析条件＞
キャピラリーカラム：ＤＢ−２３（０．２５ｍｍ×３０ｍ）（アジレントテクノロジー（Agilent Technologies）社）
注入口温度：２４５℃
注入量：３μＬ
検出器：水素炎イオン化型検出器（ＦＩＤ）（２５０℃）
カラム温度：
（１）１５０℃で０．５分間保持
（２）１５０℃〜１７０℃；４℃／分にて昇温
（３）１７０℃〜１９５℃；５℃／分にて昇温
（４）１９５℃〜２１５℃；１０℃／分にて昇温
（５）２１５℃で１１分間保持
【００６８】
参考例１の精製酵母トリグリセリド（ｓｎ−１，２，３位の全脂肪酸の組成）およびｓｎ−２モノグリセリドの脂肪酸組成（モル％）から、ｓｎ−１，３位の脂肪酸組成（モル％）を算出した。その結果を表１に示した。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
表１に示されるように、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の形質転換体由来の参考例１の精製酵母トリグリセリドには、従来の植物油脂等に比べてパルミトレイン酸が多く含まれることが認められた。一方、酸化安定性が悪く、製剤安定性の観点から好ましくない多価不飽和脂肪酸がほとんど含まれないことが認められた。
また、表１に示されるように、参考例１の精製酵母トリグリセリドでは、トリグリセリド全体における脂肪酸組成（ｓｎ−１，２，３位の全脂肪酸組成）に比べて、ｓｎ−１，３位におけるパルミトレイン酸含有量が多く、ｓｎ−１，３位におけるオレイン酸含有量が少ない、すなわちパルミトレイン酸とオレイン酸の含有量比（パルミトレイン酸／オレイン酸）が高いことが分かる。
つまり、参考例１の精製酵母トリグリセリドは、パルミトレイン酸を２０モル％以上含むが、リノール酸を１０モル％程度含むシーベリー油や、リノール酸とリノレイン酸をそれぞれ２モル％〜３モル％ずつ含むマカダミアナッツ油に比べて、本発明の脂肪酸組成物を製造するための出発原料として有用である。
【００７１】
［実施例１］シュードザイマ  アンタークティカ（Pseudozyma antarctica）由来の固定化リパーゼを用いた脂肪酸組成物の調製
参考例１の精製酵母トリグリセリド２００ｍｇに、エタノール２ｇおよび上記ノボザイム（Novozyme）４３５（ノボザイムズ（Novozumes）社）０．０８８ｇを加え、３０℃で往復振とうさせながら２．５時間反応させ、ろ過して上清を回収した。次いで、エバポレーターで溶媒を除去し、半量ずつ、ｎ−ヘキサン：ジエチルエーテル＝８：２（容量比）で平衡化したセプ−パックシリカ（Sep-Pack silica）カートリッジ（「ＷＡＴ０５１９００」（ウォーターズ（Waters）社））に負荷し、前記溶媒１０ｍＬで脂肪酸エチルエステルを溶出させた。さらに、前記溶媒３０ｍＬにより、ジグリセリドを溶出させて除去した。次に、ジエチルエーテル１０ｍＬでｓｎ−２モノグリセリドを溶出させ、エバポレーターで溶媒を除去した。
２回分のカラム分画により得られた脂肪酸エチルエステルを混合し、脱溶媒後（推定１３０ｍｇ）、エタノール３ｇおよび５Ｍ水酸化ナトリウム０．２ｇを加え、６０℃で１５分間加熱し、鹸化した。次いで、室温まで冷却して水４ｍＬを添加し、酸性になるまで２Ｍ塩酸を添加した後、ｎ−ヘキサン３ｍＬで２回抽出した。ヘキサン層を回収してエバポレーターで溶媒を除去し、遊離脂肪酸を回収した（実施例１の脂肪酸組成物）。
一方、２回分のカラム分画により得られたｓｎ−２モノグリセリドを混合し、脱溶媒後（推定５０ｍｇ）、エタノール３ｇ、水０．１ｍＬおよび５Ｍ水酸化ナトリウム０．１ｇを加え、６０℃で１５分間加熱し、鹸化した。次いで、室温まで冷却して水４ｍＬを添加し、酸性になるまで２Ｍ塩酸を添加した後、ｎ−ヘキサン３ｍＬで２回抽出した。ヘキサン層を回収してエバポレーターで溶媒を除去し、遊離脂肪酸を回収し、比較例１の脂肪酸組成物とした。
また、ノボザイム（Novozume）４３５を用いた上記の反応を一昼夜行わせると、トリグリセリドのｓｎ−１，２，３位の脂肪酸がすべてエチルエステルに変換されるため、一昼夜反応させて得られる遊離脂肪酸の組成は、出発物質として用いた参考例１の精製酵母トリグリセリドにおける脂肪酸組成と同様であると考えることができる。そこで、比較のため、次のように、一昼夜反応させた場合の脂肪酸組成物を調製した。
参考例１の精製酵母トリグリセリド２００ｍｇに、エタノール２ｇおよび上記ノボザイム（Novozyme）４３５（ノボザイムズ（Novozumes）社）０．０８８ｇを加え、３０℃で往復振とうさせながら２４時間反応させ、ろ過して上清を回収し、エバポレーターで溶媒を除去した。次に、得られたエチルエステル（約２００ｍｇ）に、エタノール６ｇおよび５Ｍ水酸化ナトリウム０．４ｇを加え、６０℃で１５分間加熱し、鹸化した。次いで、室温まで冷却して水１０ｍＬを添加し、酸性になるまで２Ｍ塩酸を添加した後、ｎ−ヘキサン１０ｍＬで２回抽出した。ヘキサン層を回収してエバポレーターで溶媒を除去し、遊離脂肪酸を回収した（２４時間反応生成物）。
【００７２】
［実施例２］リゾプス  ジャポニクス（Rhizopus japonicus）由来のリパーゼを用いた脂肪酸組成物の調製
参考例１の精製酵母トリグリセリド２００ｍｇに、水１．８ｍＬおよびリゾプス  ジャポニクス（Rhizopus japonicus）由来のリパーゼ（「リリパーゼＡ−１０Ｄ」（ナガセケムテックス株式会社））（２５ｍｇ／ｍＬ）０．０５３ｍＬを加え、３５℃にて３５０ｒｐｍで撹拌しながら２．５時間反応させた後、エタノール１０ｍＬを添加して反応を停止させ、５０ｍＭ水酸化カリウムで遊離脂肪酸を滴定することにより、加水分解率を求めた。
次に、滴定後の溶液に水１０ｍＬと５Ｍ水酸化カリウム１ｍＬを添加し、ｎ−ヘキサン１５ｍＬで３回抽出して、未反応のトリグリセリドを除去した。次いで、水層に２Ｍ塩酸を酸性になるまで添加し、ｎ−ヘキサン１５ｍＬで２回抽出した。ヘキサン層を回収してエバポレーターで溶媒を除去し、遊離脂肪酸を回収した（実施例２の脂肪酸組成物）。
また、比較のため、次のように、上記リパーゼによる反応を一昼夜行わせて脂肪酸組成物を調製した。
参考例１の精製酵母トリグリセリド２００ｍｇに、水１．５３ｍＬおよびリリパーゼＡ−１０Ｄ（ナガセケムテックス株式会社）（２５ｍｇ／ｍＬ）０．２７ｍＬを加え、３５℃にて３５０ｒｐｍで撹拌しながら２４時間反応させた後、上記と同様の操作を行い、遊離脂肪酸を回収した（２４時間反応生成物）。
【００７３】
［実施例３］カンジダ  ルゴサ（Candida rugosa）由来のリパーゼを用いた脂肪酸組成物の調製
参考例１の精製酵母トリグリセリド１００ｍｇに、水０．９ｍＬおよびカンジダ  ルゴサ（Candida rugosa）由来のリパーゼ（「リパーゼＯＦ」（名糖産業株式会社））（１０ｍｇ／ｍＬ）０．０１１ｍＬを加え、３５℃にて３５０ｒｐｍで撹拌しながら２．５時間反応させた後、エタノール１０ｍＬを添加して反応を停止させ、５０ｍＭ水酸化カリウムで遊離脂肪酸を滴定することにより、加水分解率を求めた。
次に、滴定後の溶液に水１０ｍＬと５Ｍ水酸化カリウム１ｍＬを添加し、ｎ−ヘキサン１５ｍＬで３回抽出して、未反応のトリグリセリドを除去した。次いで、水層に２Ｍ塩酸を酸性になるまで添加し、ｎ−ヘキサン１５ｍＬで２回抽出した。ヘキサン層を回収してエバポレーターで溶媒を除去し、遊離脂肪酸を回収した（実施例３の脂肪酸組成物）。
また、比較のため、次のように、上記リパーゼによる反応を一昼夜行わせて脂肪酸組成物を調製した。
参考例１の精製酵母トリグリセリド１００ｍｇに、水０．８４ｍＬおよびリパーゼＯＦ（名糖産業株式会社）（１０ｍｇ／ｍＬ）０．０６ｍＬを加え、３５℃にて３５０ｒｐｍで撹拌しながら２４時間反応させた後、上記と同様の操作を行い、遊離脂肪酸を回収した（２４時間反応生成物）。
【００７４】
［実施例４］アルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する微生物由来のリパーゼを用いた脂肪酸組成物の調製
参考例１の精製酵母トリグリセリド２００ｍｇに、水１．９７ｍＬおよびアルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する微生物由来のリパーゼ（「リパーゼＱＬＭ」（名糖産業株式会社））（５０ｍｇ／ｍＬ）０．０３ｍＬを加え、３５℃にて３５０ｒｐｍで撹拌しながら２．５時間反応させた後、エタノール１０ｍＬを添加して反応を停止させ、５０ｍＭ水酸化カリウムで遊離脂肪酸を滴定することにより、加水分解率を求めた。
次に、滴定後の溶液に水１０ｍＬと５Ｍ水酸化カリウム１ｍＬを添加し、ｎ−ヘキサン１５ｍＬで３回抽出して、未反応のトリグリセリドを除去した。次いで、水層に２Ｍ塩酸を酸性になるまで添加し、ｎ−ヘキサン１５ｍＬで２回抽出した。ヘキサン層を回収してエバポレーターで溶媒を除去し、遊離脂肪酸を回収した（実施例４の脂肪酸組成物）。
また、比較のため、次のように、上記リパーゼによる反応を一昼夜行わせて脂肪酸組成物を調製した。
参考例１の精製酵母トリグリセリド１００ｍｇに、水０．６ｍＬおよびリパーゼＱＬＭ（名糖産業株式会社）（５０ｍｇ／ｍＬ）０．４ｍＬを加え、３５℃にて３５０ｒｐｍで撹拌しながら２４時間反応させた後、上記と同様の操作を行い、遊離脂肪酸を回収した（２４時間反応生成物）。
【００７５】
［比較例２］鹸化による脂肪酸組成物の調製
参考例１の精製酵母トリグリセリド５０ｍｇに、エタノール３ｇ、水０．１ｍＬおよび５Ｍ水酸化ナトリウム０．１ｇを加え、６０℃で１５分間加熱して鹸化した。次いで室温まで冷却し、水４ｍＬを添加して、酸性になるまで2Ｍ塩酸を添加し、ｎ−ヘキサン３ｍＬで２回抽出した。ヘキサン層を回収し、エバポレーターで溶媒を除去して遊離脂肪酸を回収し、比較例２の脂肪酸組成物とした。
【００７６】
［試験例１］脂肪酸組成の分析
実施例１〜４の各脂肪酸組成物および、各実施例で比較のために２４時間反応させて得られた脂肪酸組成物（２４時間反応生成物）について、脂肪酸組成の分析を行った。
メタノール３ｍＬに、上記各試料５μＬおよび１４質量％の三フッ化ホウ素メタノール錯体のメタノール溶液を添加し、７５℃で１５分間加熱して、脂肪酸のメチルエステル化を行った。放冷後、ｎ−ヘキサン０．５ｍＬを添加混合し、次いで水３ｍＬを添加混合して、脂肪酸メチルエステルをｎ−ヘキサンにて抽出し、ｎ−ヘキサン層を回収した。
回収したｎ−ヘキサン層を、上記参考例１の精製酵母トリグリセリドの脂肪酸組成の分析と同様の条件下、キャピラリーガスクロマトグラフ（「Ａｇｉｌｅｎｔ  ６８９０Ｎ」（アジレントテクノロジー（Agilent Technologies）社）にて分析し、脂肪酸の定量を行った。
脂肪酸組成の分析結果を表２に示した。
【００７７】
【表２】
2018140940.tif 000004
【００７８】
実施例２〜４の脂肪酸組成物の調製時における加水分解率を、表３に示した。なお、実施例１の脂肪酸組成物の調製時（シュードザイマ  アンタークティカ（Pseudozyma antarctica）由来の固定化リパーゼを用いた場合）には、滴定により加水分解率を求めることができなかったため、文献値から推定される加水分解率を記載した。
【００７９】
【表３】
2018140940.tif 000005
【００８０】
表２に示されるように、実施例１の脂肪酸組成物において、参考例１の精製酵母トリグリセリドに比べ、パルミトレイン酸含有量が向上し、かつオレイン酸含有量が低下し、パルミトレイン酸とオレイン酸との含有量比（パルミトレイン酸／オレイン酸）がモル比にて１．６２から３．５２に上昇したことが認められた。また、実施例１の脂肪酸組成物の脂肪酸組成は、参考例１の精製酵母トリグリセリドのｓｎ−１，３位の脂肪酸組成に近く、過剰量のエタノールの存在下に、シュードザイマ  アンタークティカ（Pseudozyma antarctica）由来の固定化リパーゼにより、トリグリセリドのｓｎ−１，３位に結合したパルミトレイン酸が優先的に遊離されることが確認された。
また、表３に示されるように、実施例１の脂肪酸組成物の調製において、２．５時間反応後における加水分解率は約６７％と推定される。すなわち、シュードザイマ  アンタークティカ（Pseudozyma antarctica）由来の固定化リパーゼを用いる方法は、生成された脂肪酸エチルエステルを鹸化する工程を要するものの、収率が高い方法であることが示唆された。
【００８１】
実施例２の脂肪酸組成物は、トリグリセリドのｓｎ−１，３位に特異的に作用するリゾプス  ジャポニクス（Rhizopus japonicus）由来のリパーゼにより得られたため、表２に示されるように、実施例１の脂肪酸組成物よりもパルミトレイン酸含有量が高く、かつオレイン酸含有量が低く、パルミトレイン酸とオレイン酸の含有量比（パルミトレイン酸／オレイン酸）についても、モル比にて３．９９と高い値が認められた。
しかしながら、表３に示されるように、実施例２の脂肪酸組成物の調製において、２．５時間反応後の加水分解率はやや低く、収率がやや低い傾向が認められた。これは、リゾプス  ジャポニクス（Rhizopus japonicus）由来のリパーゼによる反応においては、加水分解とエステル化反応の双方が起こり、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロールおよび遊離脂肪酸が、一定の比率にて平衡になる傾向があるためである。
また、リゾプス  ジャポニクス（Rhizopus japonicus）由来のリパーゼはｓｎ−１，３位に特異的であるものの、反応時間が長くなると、ジグリセリドまたはモノグリセリドのｓｎ−２位とｓｎ−１位またはｓｎ−３位の間で非酵素的なアシル基転移が生じ、ｓｎ−２位の脂肪酸がゆっくりと遊離されるため、２４時間反応させた後のパルミトレイン酸とオレイン酸の含有量比（パルミトレイン酸／オレイン酸）は、２．５時間反応後に比べて低下した。
【００８２】
実施例３の脂肪酸組成物は、トリグリセリドのｓｎ−１，２，３位に均等に作用するが、オレイン酸よりもパルミトレイン酸に対し良好に作用するカンジダ  ルゴサ（Candida rugosa）由来のリパーゼを用いて調製され、前記リパーゼが飽和脂肪酸には作用しにくいことから、表２において、他の実施例の組成物に比べて高いパルミトレイン酸含有量を示した。
また、表３より、実施例３の調製の際に、反応時間を２４時間とした場合には、トリグリセリドの加水分解はほぼ完全に進行することが認められた。
【００８３】
実施例４の脂肪酸組成物は、トリグリセリドのｓｎ−１，２，３位に均等に作用し、またはｓｎ−１，３位に対して優先的に作用するものの、脂肪酸特異性を示さないアルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する微生物由来のリパーゼを用いて調製されたため、表２に示されるように、パルミトレイン酸含有量は参考例１の精製酵母トリグリセリドよりもやや向上するものの、その程度は、実施例１〜３の脂肪酸組成物のそれぞれに比べてやや低いものであった。
なお、表３より、実施例４の脂肪酸組成物の調製の際に、反応時間を２４時間とした場合には、トリグリセリドの加水分解はほぼ完全に進行することが認められた。
【００８４】
［試験例２］抗菌活性の評価
実施例１〜４の各脂肪酸組成物および、各実施例で比較のために２４時間反応させて得られた脂肪酸組成物（２４時間反応生成物）、ならびに比較例１、２の各脂肪酸組成物について、日本化学療法学会標準法である微量液体希釈法に従って最小発育阻止濃度（minimum inhibitory concentration，ＭＩＣ）を測定し、抗菌活性を評価した。
（１）試験菌株懸濁液
Staphylococcus aureus NBRC13276株およびStaphylococcus epidermidis NBRC100911株をそれぞれＮ．Ｂ．培地（０．５質量％鰹肉エキス（和光純薬工業株式会社）、１質量％ポリペプトン（日本製薬株式会社）、０．５質量％塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．０）３ｍＬに１白金耳植菌し、振とうしながら３７℃で一晩前々培養した。この前々培養液を、植菌量が２０質量％となるように、新しいＮ．Ｂ．培地４ｍＬに植菌し、振とうしながら３７℃で３時間前培養した。６６０ｎｍにおける濁度（ＯＤ６６０）の測定値から、ＯＤ６６０＝１における生菌数が６．４×１０８コロニーフォーミングユニット（colony forming unit，ｃｆｕ）／ｍＬとして生菌数を算定し、この前培養液を、２．０×１０４ｃｆｕ／ｍＬとなるように、Ｎ．Ｂ．培地（ｐＨ＝６．０）で希釈して、試験菌株懸濁液を調製した。
（２）供試試料
実施例１〜４の各脂肪酸組成物および、各実施例で比較のために２４時間反応させて得られた脂肪酸組成物（２４時間反応生成物）、ならびに比較例１、２の各脂肪酸組成物を、それぞれ１０，０００μｇ／ｍＬとなるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、各供試試料とした。
また、対照として、試薬のパルミトレイン酸およびオレイン酸（東京化成工業株式会社）についても、同様に抗菌活性を評価した。
（３）ＭＩＣの測定
試験菌株懸濁液（２．０×１０４ｃｆｕ／ｍＬ）２３４μＬを９６穴丸底マイクロプレートの２列目に分注し、３〜１１列目には１３０μＬずつ分注した。次いで、供試試料（１０，０００μｇ／ｍＬ）２６μＬをマイクロプレートの２列目に添加し、ピペッティングにより十分懸濁し、１０倍に希釈した。次に、この懸濁液１３０μＬをマイクロプレートの３列目に添加して懸濁し、順次２倍ずつ段階的に希釈した。
マイクロプレートを３７℃にて２日間静置して培養した後、試験菌株の生育を、培養液の濁度または沈殿した菌体の有無を目視により確認して判定し、試験菌株の生育が見られなくなる供試試料の最小濃度を、ＭＩＣとした。
【００８５】
抗菌活性の評価結果を、表４に示した。
【００８６】
【表４】
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【００８７】
表４に示されるように、パルミトレイン酸は、低濃度でStaphylococcus aureus NBRC13276株の生育を選択的に抑制したが、オレイン酸は、Staphylococcus aureus NBRC13276株に対して有効な抗菌活性を示さなかった。
パルミトレイン酸含有量が高く、オレイン酸含有量が低く、参考例１の精製酵母トリグリセリドに比べてパルミトレイン酸とオレイン酸との含有量比（パルミトレイン酸／オレイン酸）が向上した実施例１〜３の脂肪酸組成物については、Staphylococcus aureus NBRC13276株に対し良好な抗菌活性が認められた。一方、皮膚の常在細菌であるStaphylococcus epidermidis NBRC100911株の生育には影響を与えないことが認められた。
これに対し、ｓｎ−２モノグリセリド由来で、オレイン酸含有量の高い比較例１の脂肪酸組成物は、Staphylococcus aureus NBRC13276株に対して抗菌活性を示さず、参考例１の精製トリグリセリドの鹸化物で、パルミトレイン酸およびオレイン酸を含む比較例２の脂肪酸組成物では、各実施例の脂肪酸組成物に比べて抗菌活性の低下が認められ、オレイン酸の存在により、パルミトレイン酸のStaphylococcus aureus NBRC13276株に対する抗菌活性が阻害されることが示唆された。
また、他の実施例に比べて、パルミトレイン酸含有量がやや低い実施例４の脂肪酸組成物についても、他の実施例に比べれば低いものの、Staphylococcus aureus NBRC13276株に対する選択的な抗菌活性が認められた。
トリグリセリドの加水分解がほぼ完全に進行した実施例１、３、４の２４時間反応生成組成物は、パルミトレイン酸含有量およびオレイン酸含有量が比較例２の脂肪酸組成物と同程度であり、表４に示されるように、Staphylococcus aureus NBRC13276株に対する抗菌活性は認められなかった。
【００８８】
［試験例３］皮膚外用剤における脂肪酸組成物の有効量について、共培養法による検討
（１）試験菌
Ｎ．Ｂ．寒天培地（０．１質量％鰹肉エキス（和光純薬工業株式会社）、１質量％ポリペプトン（日本製薬株式会社）、７．５質量％塩化ナトリウム、２質量％寒天、ｐＨ＝６．０）の同一プレートに、Staphylococcus aureus NBRC13276株およびStaphylococcus epidermidis NBRC100911株を、それぞれ３，０００ｃｆｕ／ｃｍ２となるように塗布した。
（２）試料
皮膚外用剤のモデルとして、Ｎ．Ｂ．液体培地（０．５質量％鰹肉エキス、１質量％ポリペプトン、０．５質量％塩化ナトリウム、０．４質量％増粘剤（グアーガム）、ｐＨ＝６．０）に、実施例１の脂肪酸組成物を０．５質量％となるように懸濁し、次いで０．００１質量％となるまで、順次２倍ずつ段階的に希釈した。
なお、実施例１の脂肪酸組成物を添加しないものを対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）とした。
（３）脂肪酸組成物の有効量の算出
上記の試料および対照を２ｍｇ／ｃｍ２となるように、上記２種の試験菌を塗布したＮ．Ｂ．寒天培地に塗布した。３７℃で２日間培養後、生育した細菌を綿棒で回収して７．５質量％食塩水に懸濁し、適宜希釈後、卵黄添加マンニット食塩寒天培地（アズワン株式会社）に塗布した。３７℃で１日間培養後、生育したコロニーの形状および色ならびに卵黄反応陽性か陰性かにより、Staphylococcus aureus NBRC13276株とStaphylococcus epidermidis NBRC100911株を判別した。
（３）結果
上記の検討結果を図１に示した。皮膚外用剤のモデルである試料中における実施例１の脂肪酸組成物の含有量が０．０３１３質量％以上で、Staphylococcus aureus NBRC13276株の生育が完全に抑制され、Staphylococcus epidermidis NBRC100911株のみが生育することが認められた。
０．０３１３質量％の脂肪酸組成物を含む皮膚外用剤モデル試料を２ｍｇ／ｃｍ２となるように皮膚に塗布した場合、皮膚における脂肪酸組成物の塗布量は０．６２５μｇ／ｃｍ２であり、パルミトレイン酸の塗布量は、０．３７μｇ／ｃｍ２となる。
従って、本発明の皮膚外用剤を適用する場合、パルミトレイン酸の適用量として、０．３７μｇ／ｃｍ２で黄色ブドウ球菌の生育を抑制し得る可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
以上詳述したように、本発明により、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対し、選択的な抗菌活性を有するパルミトレイン酸を、従来にない高濃度で含有する脂肪酸組成物を得ることができる。
本発明の脂肪酸組成物は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対する選択的抗菌剤として、特にアトピー性皮膚炎の症状の悪化の防止またはアトピー性皮膚炎の症状の改善に有効な皮膚外用剤、医薬部外品または化粧品として、利用することができる。
さらに本発明の脂肪酸組成物は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の検出が報告されている皮膚の洗浄、消毒等に起因する肌荒れの予防または改善に有効な皮膚外用剤、医薬部外品または化粧品として、利用することができる。
【図１】
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