(57)【要約】【課題】アスペルギルス属の微生物由来の糖鎖合成関連遺伝子の機能を欠損させることにより、本来宿主微生物が生産する糖鎖の構造を変化させる。【解決手段】アスペルギルス属微生物に異種タンパク質を発現させる場合において、宿主であるアスペルギルス属微生物のゲノムＤＮＡのうちａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡに改変を加えることにより、前記ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分がコードする糖鎖合成酵素の機能を低減若しくは完全に停止させた宿主微生物を培養する工程を含む前記異種タンパク質の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス・オリゼを宿主として異種タンパク質を発現させることによる異種タンパク質の製造方法であって、アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡのうちａｌｇ２をコードするＤＮＡに改変を加えることにより、前記ａｌｇ２がコードする糖鎖合成酵素の機能を低減若しくは完全に停止させた宿主を培養する工程を含むことによりヘキソース量を低減された異種タンパク質の製造方法。
【請求項２】
アスペルギルス・オリゼを宿主として異種タンパク質を発現させることによる異種タンパク質の製造方法であって、アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡのうちｏｃｈ１をコードするＤＮＡに改変を加えることにより、前記ｏｃｈ１がコードする糖鎖合成酵素の機能を低減若しくは完全に停止させた宿主を培養する工程を含むことによりヘキソース量を低減された異種タンパク質の製造方法。
【請求項３】
改変前のａｌｇ２をコードするＤＮＡが、次の（１）〜（４）のいずれかである、請求項１に記載の方法。
（１）配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（２）配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡであり、かつ、ａｌｇ２の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（３）配列番号６のＤＮＡ
（４）配列番号６のＤＮＡ配列と９０％以上の同一性を有するＤＮＡであり、かつ、ａｌｇ２の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
改変前のｏｃｈ１をコードするＤＮＡが、次の（１）〜（４）のいずれかである、請求項２に記載の方法。
（１）配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（２）配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡであり、かつ、ｏｃｈ１の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（３）配列番号８のＤＮＡ
（４）配列番号８のＤＮＡ配列と９０％以上の同一性を有するＤＮＡであり、かつ、ｏｃｈ１の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項５】
改変が次の（ａ）から（ｃ）のいずれかである、請求項１または２に記載の方法。
（ａ）ａｌｇ２またはｏｃｈ１をコードするＤＮＡの全部または一部を除去する
（ｂ）ａｌｇ２またはｏｃｈ１をコードするＤＮＡに、１または数個の置換、欠失もしくは付加する
（ｃ）ａｌｇ２またはｏｃｈ１をコードするＤＮＡを、改変前のＤＮＡ配列との同一性が８０％未満であるＤＮＡ配列と置き換える
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスペルギルス属微生物が生産する高マンノース型糖鎖の構造を、遺伝子工学的手法により改変する方法に関し、特に、麹菌による生産されるタンパク質のＮ型糖鎖構造を改変させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物、例えば糸状菌、中でも例えばアスペルギルス属微生物（麹菌）は、糖質分解酵素であるアミラーゼやグルコアミラーゼ、タンパク質分解酵素などを大量に分泌生産するため、清酒や味噌などの発酵醸造産業に広く利用されているだけでなく、そのタンパク質分泌能力の高さから、異種タンパク質の発現宿主としても期待されている。
タンパク質を、異種タンパク質の発現宿主で発現させると、その生物活性が変化することがある。この理由は、真核生物において生体内で重要な機能を持つタンパク質の多くは糖鎖を持った糖タンパク質であり、当該タンパク質を異種タンパク質の発現宿主で発現すると、タンパク質に糖鎖が全く結合されなかったり、タンパク質に結合する糖鎖の構造が変化したりするので、本来の生物活性を示さなくなるから、と考えられている。
【０００３】
タンパク質に結合する糖鎖にはタンパク質のアスパラギン残基に結合するＮ型とセリンまたはスレオニンに結合するＯ型の２種類がある。このうち、Ｎ型糖鎖の生合成経路については多くの知見があり、詳しく解析されている。
糖鎖の生合成は、まず小胞体（ＥＲ）で始まり、その後ゴルジ体でさらに糖鎖の修飾が起こる。このうちＥＲで生成する糖鎖は真菌も哺乳類細胞も基本的には同じであることが判明している。その糖鎖は８分子のマンノース（Ｍａｎ）と２分子のＮアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からなるコア構造（Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２）を構成している。このコア構造糖鎖を持つタンパク質はゴルジ体に輸送されて、種々の修飾を受ける。
酵母において、ＥＲでの糖鎖の生成過程は、ａｌｇファミリー遺伝子に基づいて合成される酵素によって制御される。まず、ａｌｇ７，ａｌｇ１３，ａｌｇ１４の働きによってタンパク質にＧｌｃＮＡｃが付加され、次いで、ａｌｇ１，ａｌｇ２，ａｌｇ１１，ａｌｇ３，ａｌｇ９の働きによってマンノースが付加されてコア構造を生成する。次に、ゴルジ体に運ばれた糖タンパク質はｏｃｈ１の働きによって前記コア構造にマンノースが付加された後、Ｍｎｎ１，Ｍｎｎ４，Ｍｎｎ６の働きによってさらに多量のマンノースが付加されて、ハイパーマンノース型の糖鎖となる。
【０００４】
酵母や糸状菌において、遺伝子工学的手法を用いることによって、上述する遺伝子の破壊により、分泌されるタンパク質に結合する糖鎖の構造を改変することが試みられている。例えば、非特許文献１には、糸状菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｒａｎｓにおいてａｌｇ３（ａｌｇＣ）遺伝子を破壊することによって、Ｎ型糖鎖に含まれるヘキソース量が低減することが示されており、ａｌｇ３遺伝子がα１，３マンノシルトランスフェラーゼをコードすることが調べられている。さらに、非特許文献２においては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓにおいて、ｏｃｈ１遺伝子を破壊することによって、糖鎖組成が変化することが調べられている。
他方、糸状菌においては、ａｌｇ１，ａｌｇ２を人為的に破壊したという報告は無い。非特許文献３によると、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ａｌｇ２のＧ３７７Ｒ変異体は温度感受性になり、且つ糖鎖鎖長も大幅に低減することが調べられているが、完全なａｌｇ２破壊株は取得することが出来ないことが言及されている。糸状菌においては、非特許文献４においてＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓにおいて、ａｌｇ２の変異体を取得したことが報告されており、５ｂｐの挿入変異によってａｌｇ２の機能が低下した変異体においてＮ型糖鎖の殆どが、Ｍａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２若しくは、Ｍａｎ２ＧｌｃＮＡｃ２の構造を有することが調べられているが、人為的に遺伝子を破壊して取得した変異体ではない。
また、ａｌｇ１については、非特許文献５において酵母では破壊することによって致死となることが記されており、糸状菌においてもその遺伝子破壊に関する報告は無く、糸状菌において糖鎖組成を改変することは限度があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００８  Ｆｅｂ；７４（４）：１０７６−８６．
【非特許文献２】ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１０  Ｄｅｃ  ２９；５（１２）
【非特許文献３】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００９  Ｍａｙ  １；２８４（１８）：１１９００−１２
【非特許文献４】Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．  １９９９  Ｄｅｃ；９（１２）：１２８７−９３．
【非特許文献５】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９０  Ａｐｒ  ２５；２６５（１２）：７０４２−９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、麹菌においてタンパク質のＮ型糖鎖構造を改変する新たな方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、かかる目的を達成するために鋭意検討した結果、糸状菌の一種である麹菌アスペルギルス・オリゼに分類される微生物を宿主として使用し、この微生物の糖鎖合成関連遺伝子を破壊することにより、分泌タンパク質のＮ型糖鎖が減少し、さらにその糖鎖構造、糖鎖組成が大きく変化することを見出した。
【０００８】
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものであり、以下の（１）〜（２）から構成されるものである。
項１．
アスペルギルス属微生物に異種タンパク質を発現させる場合において、宿主であるアスペルギルス属微生物のゲノムＤＮＡのうちａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡに改変を加えることにより、前記ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分がコードする糖鎖合成酵素の機能を低減若しくは完全に停止させた宿主微生物を培養する工程を含む前記異種タンパク質の製造方法。
項２．
改変前のａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡが、次の（１）〜（４）のいずれかである、項１に記載の方法。
（１）配列番号１から４のいずれかのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（２）配列番号１から４のいずれかのアミノ酸配列と６８％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡであり、かつ、ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（３）配列番号５から８のいずれかのＤＮＡ
（４）配列番号５から８のいずれかのＤＮＡ配列と６８％以上の同一性を有するＤＮＡであり、かつ、ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
項３．
改変が次の（ａ）から（ｃ）のいずれかである、項１または２に記載の方法。
（ａ）ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡの全部または一部を除去する。
（ｂ）ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡに、１または数個の置換、欠失もしくは付加する。
（ｃ）ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡを、改変前のＤＮＡ配列との同一性が８０％未満であるＤＮＡ配列と置き換える。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、アスペルギルス属が生産するタンパク質の糖鎖構造を改変することが可能となる。さらに、その糖鎖構造は野生型に比べて鎖長が短く且つ均一性が高いので、精製や品質管理が容易であるという点で優れている。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、各アスペルギルス属のａｌｇ１，ａｌｇ２，ａｌｇ３，ｏｃｈ１オルソログのアミノ酸配列の相同性を比較した図である。
【図２】図２は、アスペルギルス・オリゼのａｌｇ１，ａｌｇ２，ａｌｇ３，ｏｃｈ１遺伝子の破壊方法を示した図である。
【図３】図３は、アスペルギルス・オリゼのａｌｇ１，ａｌｇ２，ａｌｇ３，ｏｃｈ１遺伝子の遺伝子破壊株の生育を比較した図である。
【図４】図４は、アスペルギルス・オリゼのａｌｇ１，ａｌｇ２，ａｌｇ３，ｏｃｈ１遺伝子の遺伝子破壊株を液体培養した時の培養液上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥした図である。
【図５】図５は、アスペルギルス・オリゼのａｌｇ１，ａｌｇ２，ａｌｇ３，ｏｃｈ１遺伝子の遺伝子破壊株が生産する分泌タンパク質の糖鎖組成をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、アスペルギルス属の微生物由来の糖鎖合成関連遺伝子の機能を欠損させることにより、本来宿主微生物が生産する糖鎖の構造を変化させることを特徴とするものである。
【００１２】
具体的には、本発明の方法では、麹菌アスペルギルス・オリゼのａｌｇ１遺伝子、ａｌｇ２遺伝子、ａｌｇ３遺伝子、ｏｃｈ１遺伝子を破壊してその機能を欠失させることにより、分泌生産されるタンパク質の糖鎖構造をより短く、均一な構造に変化させることが可能となる。
【００１３】
さらに本発明によって得られた遺伝子破壊宿主を遺伝子発現の宿主として用いて且つ、所望のタンパク質を高発現させることにより、糖鎖構造が改変された遺伝子組み換えタンパク質を大量に発現させることが可能となる。
【００１４】
本発明の実施形態の一つは、アスペルギルス属微生物に異種タンパク質を発現させる場合において、宿主であるアスペルギルス属微生物のゲノムＤＮＡのうちａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡに改変を加えることにより、前記ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分がコードする糖鎖合成酵素の機能を低減若しくは完全に停止させた宿主微生物を培養する工程を含む前記異種タンパク質の製造方法である。
【００１５】
本発明の方法で用いる、異種タンパク質を発現させる宿主であるアスペルギルス属微生物としては、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ），アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）などが挙げられるが、特に限定されない。好ましくはアスペルギルス・オリゼである。
【００１６】
アスペルギルス属微生物のゲノムＤＮＡのうちａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分は、いずれも、糖鎖合成を司るａｌｇファミリーに属する酵素タンパク質をコードするＤＮＡである。ａｌｇ１はβ１，４マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードし、ａｌｇ２はα１，６、もしくはα１，３マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードし、ａｌｇ３はα１，３マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードし、ｏｃｈ１はα１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードすると予測される。
【００１７】
改変を加える前の、ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡの塩基配列は特に限定されないが、次の（１）〜（４）のいずれかであることが好ましい。
（１）配列番号１から４のいずれかのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（２）配列番号１から４のいずれかのアミノ酸配列と６８％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡであり、かつ、ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（３）配列番号５から８のいずれかのＤＮＡ
（４）配列番号５から８のいずれかのＤＮＡ配列と６８％以上の同一性を有するＤＮＡであり、かつ、ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
上記（１）〜（４）において、配列番号１は、アスペルギルス・オリゼにおけるａｌｇ１タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２はａｌｇ２タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号３はａｌｇ３タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号４はｏｃｈ１タンパク質のアミノ酸配列である。
上記（１）〜（４）において、配列番号５は、アスペルギルス・オリゼにおけるａｌｇ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列である。配列番号６はａｌｇ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列である。配列番号７はａｌｇ３タンパク質をコードするＤＮＡ配列である。配列番号８はｏｃｈ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列である。
上記（２）において、アミノ酸配列の同一性は、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上である。
上記（４）において、塩基配列の同一性は、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上である。
【００１８】
本明細書において、アミノ酸配列や塩基配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列や塩基配列の同一性を算出する。  
【００１９】
本発明の方法において、ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡに加える改変の形態は、前記ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分がコードする糖鎖合成酵素の機能を低減若しくは完全に停止させるような形態であれば特に限定されない。
例えば、次の（ａ）から（ｃ）のいずれかの改変が例示できる。
（ａ）ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡの全部または一部を除去する。
（ｂ）ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡに、１または数個の置換、欠失もしくは付加する。
（ｃ）ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡを、改変前のＤＮＡ配列との同一性が８０％未満であるＤＮＡ配列と置き換える。
【００２０】
本発明の方法では、アスペルギルス属微生物のゲノムＤＮＡのうち、上記で示したように、ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡに改変を加え、前記ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分がコードする糖鎖合成酵素の機能を低減若しくは完全に停止させる。そして、前記アスペルギルス属微生物を宿主微生物として用い、培養することにより異種タンパク質を製造することができる。アスペルギルス属微生物を用いた異種タンパク質の製造法は、既にその技術が確立されており、種々の公知の方法を用いることが可能である。その態様は特に制限されない。
【００２１】
本発明の別の実施形態の一つは、アスペルギルス属微生物に異種タンパク質を発現させる場合において、宿主であるアスペルギルス属微生物のゲノムＤＮＡのうちａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡに改変を加えることにより、前記ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分がコードする糖鎖合成酵素の機能を低減若しくは完全に停止させることによって、宿主微生物が生産する前記異種タンパク質の糖鎖構造を変化させる方法である。
【００２２】
異種タンパク質の糖鎖構造の変化は、ＭＳ分析によって明らかにすることができる。本発明において、異種タンパク質の糖鎖がどのように変化するかは限定されないが、例えば、好ましい変化としては、ピークの数を減少させることである。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００２４】
１．アスペルギルス・オリゼ由来糖鎖合成関連遺伝子の選抜
アスペルギルス・オリゼ由来糖鎖合成関連遺伝子の選抜は、糖鎖合成関連遺伝子がよく研究されている、酵母サッカロマイセス・セレビシエの遺伝子情報から相同性が高い配列を選抜することにより行った。選抜した遺伝子がコードすると推定されるアミノ酸をそれぞれ、配列番号１、２、３、４に示す。選抜した遺伝子がコードすると推定されるアミノ酸配列情報を元に、同アスペルギルス属においてホモロジー検索を行った結果を図１に示す。図１によると、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・ニドランスにおいて、６８％から７８％の相同性を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子が存在しており、これら遺伝子群はアスペルギルス属において高度に保存されていると考えられる。
【００２５】
２．アスペルギルス・オリゼ由来糖鎖合成関連遺伝子破壊カセットの作製
１．で示された、アスペルギルス・オリゼ由来糖鎖合成関連遺伝子であるａｌｇ１，  ａｌｇ２，ａｌｇ３，ｏｃｈ１遺伝子の破壊カセットを以下のようにして構築した。
まず、各糖鎖合成関連遺伝子の開始コドンから上流約２ｋｂｐの位置と、各糖鎖合成関連遺伝子の終始コドンから下流約２ｋｂｐの位置にプライマーを設計し、アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲによって増幅されたＰＣＲ産物を東洋紡社製のＴａｒｇｅｔ  ｃｌｏｎｅ  ｐｌｕｓによってＴＡクローニングした。次に、各糖鎖合成関連遺伝子のＯＲＦ部分を除去するため、東洋紡社製のＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔを用いてＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲを行い、さらに、得られたプラスミドを制限酵素処理して、アスペルギルス・ニドランス由来のｓＣマーカー（ＡＴＰスルフリラーゼ）カセットを挿入することにより遺伝子破壊カセットを構築した。ａｌｇ１遺伝子の破壊コンストラクトの作製に用いたプライマー配列を配列番号９，１０、１１、１２に、ａｌｇ２遺伝子の破壊コンストラクトの作製に用いたプライマーを配列番号１３，１４、１５，１６にａｌｇ３遺伝子の破壊コンストラクトの作製に用いたプライマー配列を配列番号１７，１８、１９，２０に、ｏｃｈ１遺伝子の破壊コンストラクトの作製に用いたプライマー配列を２１，２２、２３，２４にそれぞれ示した。
【００２６】
３．糖鎖合成関連遺伝子破壊株の作製
組換え宿主には麹菌アスペルギルス・オリゼ  ＮＳ４株を使用した。本菌株は、独立行政法人酒類総合研究所にて取得された変異体であり、同研究所から分譲されている。ＮＳ４株はＳＯ４資化性とＮＯ３資化性がそれぞれｓＣ遺伝子とｎｉａＤ遺伝子の欠損により失われており、同遺伝子を用いて形質転換を行い、ＳＯ４資化性とＮＯ３資化性によって形質転換体を選抜することが可能である。上述の通り作製した、遺伝子破壊はカセットを用いて、ＮＳ４株を宿主にプロトプラスト−ＰＥＧ法により、形質転換を行った。遺伝子破壊の原理については図２に示す。得られた形質転換体の中から目的の遺伝子破壊株を、ＰＣＲによって確認して選抜した。
【００２７】
４．糖鎖合成関連遺伝子破壊株の生育比較
３で取得した形質転換体から１０５個／ｍｌ濃度に調整した作製し、ＤＰ寒天培地（２％デキストリン、１％ポリペプトン、０．５％リン酸１カリウム、０．１％硫酸マグネシウム７水和物、１．５％寒天、ｐＨ６．０）、ＤＰ＋０．８Ｍ  ＮａＣｌ培地、ＤＰ＋１．４Ｍソルビトール培地にそれぞれの分生子懸濁液を０．０１ｍｌ分植菌して、３０℃で３日間静置培養した。培養の結果を図３に示す。図３に示すとおり、ａｌｇ１破壊株及び、ａｌｇ２破壊株はＤＰ培地上で基底菌糸の生育が見られず、分生子能が大きく低下していた。一方で、ＤＰ培地にＮａＣｌ又はソルビトールを添加した、ＤＰ＋０．８Ｍ  ＮａＣｌ培地及びＤＰ＋１．４Ｍ  ソルビトール培地ではａｌｇ１破壊株及びａｌｇ２破壊株で基底菌糸の生育が回復し、分生子形成能も僅かに回復した。
【００２８】
５．糖鎖合成関連遺伝子破壊株の培養
４．で作製した各遺伝子破壊株の分生子懸濁液（１０５-個／ｍｌ）を２００ｍｌ容バッフル付三角フラスコを用いて、６０ｍｌのＤＰ＋０．８Ｍ  ＮａＣｌ培地（２％デキストリン、１％ポリペプトン、０．５％リン酸１カリウム、０．１％硫酸マグネシウム７水和物、０．８Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０））に０．６ｍｌ植菌し、３０℃、７２時間培養し、培養液を回収した。培養液を３０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ遠心分離して上清を回収し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ３０Ｋ（メルク・ミリポア社製）にアプライし、３０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ遠心して培養液上清を濃縮した。濃縮液に２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）を１０ｍｌ加えて濃縮し、この操作を３回繰り返すことによって、低分子を除去し、バッファー置換を行って加水濃縮液とした。得られた加水濃縮液を  Ｎｕ−ＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動することにより、分泌タンパク質の分子量を求めた。結果を図４に示す。図４からわかるように、遺伝子組み換え宿主であるＮＳ４株では約５３ｋＤａ付近にαアミラーゼと推測されるバンドが検出されるのに対し、ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３、ｏｃｈ１破壊株では、５０〜５２ｋＤａ程度の位置にαアミラーゼと推測されるバンドが出現しており、ＮＳ４株に比べて糖鎖含量が少ないαアミラーゼが生産されていると考えられた。
【００２９】
６．糖鎖合成関連遺伝子破壊株が生産する分泌タンパク質の糖鎖構造解析
５．で調製した培養液上清の加水濃縮液を用いて、糖鎖構造解析を行った。具体的には、加水濃縮液をｐＮＧａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）により糖鎖を遊離させた後、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）によってタンパク質を分解し、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（住友ベークライト社製）によって遊離糖鎖を精製した。手法については、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏに付属のマニュアルに従って操作し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析用サンプルを調製した。精製した遊離糖鎖をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析した結果を図５に示す。
糖鎖解析の結果、宿主菌株であるＮＳ４株の培養液上清加水濃縮液からは複数のピークが検出された。これらのピークはＨｅｘＮＡｃ２Ｈｅｘ（５〜１１）の構造を有していると推定された。
【００３０】
ａｌｇ１破壊株からはメインピークは１つのみ検出されたが、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ解析の結果からは本ピークの構造を推定することは出来なかった。そこで、ａｌｇ１破壊株から検出された糖鎖の構造を決定するためＭＳ／ＭＳ解析を行ったところ、還元末端からＨｅｘｏｓｅを２つ有する構造であることが推定された。
ａｌｇ２破壊株からはメインピークは２つ検出されたが、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ解析の結果からはこれらのピークの構造を推定することは出来なかった。上記と同様に糖鎖の構造を決定するためＭＳ／ＭＳ解析を行ったところ、ｍ／ｚ＝１４４３のピークに関しては、還元末端からＨｅｘＮＡｃを２つ、Ｈｅｘを少なくとも１つ有する構造であることが推定された。
ａｌｇ３の破壊株からは複数のピークが検出されたが、これらのピークはＨｅｘＮＡｃ２Ｈｅｘ（２〜５）の構造を有していると推定され、ＮＳ４株から取得された糖鎖構造と比較してＨｅｘの数が大幅に低減されていることが推定された。
ｏｃｈ１の破壊株からも複数のピークが検出されたが、これらのピークはＨｅｘＮＡｃ２Ｈｅｘ（５〜１０）の構造を有していると推定され、ＮＳ４株から取得された糖鎖構造と比較してＨｅｘの数がやや低減されていることが推定された。
以上の結果から、麹菌アスペルギルス・オリゼにおいてａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３、ｏｃｈ１遺伝子を破壊した菌株では、宿主株であるＮＳ４株に比べて糖鎖構造が変化し、鎖長が短い糖鎖が付加されたタンパク質が分泌生産されていることが明らかとなった。
【００３１】
なお、本発明の遺伝子破壊株を用いて異種タンパク質を組換え発現させることによっても、改変された糖鎖構造を有する組換えタンパク質を取得することが可能になると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明によれば、麹菌アスペルギルス・オリゼの糖鎖合成関連遺伝子を分子生物学的手法を用いて破壊することによって、糖鎖構造が改変されたタンパク質を発現することが可能である。従って、本発明は、麹菌アスペルギルス・オリゼを用いて糖鎖結合タンパク質を生産するために極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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