(57)【要約】【課題】蛍光を高感度で検出することができる蛍光標識プローブを提供する。【解決手段】２９塩基以上５０塩基以下の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに結合されたレポーター色素と、前記オリゴヌクレオチドに結合されたクエンチャーと、を含み、前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記レポーター色素と前記クエンチャーとの間の塩基数は、３０塩基以下である、蛍光標識プローブ。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２９塩基以上５０塩基以下の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、
前記オリゴヌクレオチドに結合されたレポーター色素と、
前記オリゴヌクレオチドに結合されたクエンチャーと、
を含み、
前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記レポーター色素と前記クエンチャーとの間の塩基数は、３０塩基以下である、蛍光標識プローブ。
【請求項２】
請求項１において、
前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記レポーター色素と前記クエンチャーとの間の塩基数は、２０塩基以下である、蛍光標識プローブ。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記オリゴヌクレオチドは、２９塩基以上４０塩基以下の塩基配列を有する、蛍光標識プローブ。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記レポーター色素および前記クエンチャーの少なくとも一方は、前記オリゴヌクレオチドの末端には、結合されていない、蛍光標識プローブ。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の蛍光標識プローブを含む、核酸増幅反応用試薬。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸増幅反応用試薬と核酸とを含む反応液に、熱サイクルを付与する、核酸増幅反応方法。
【請求項７】
請求項６において、
前記熱サイクルにおいて、アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間は、１秒以上１０秒以下である、核酸増幅反応方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光標識プローブ、核酸増幅反応用試薬、および核酸増幅反応方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲ法は生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。
【０００３】
ＰＣＲ法は、増幅の対象とする核酸（標的核酸）および試薬を含む溶液（反応液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。熱サイクルは、２段階以上の温度を周期的に反応液に施す処理である。ＰＣＲ法においては、２段階または３段階の熱サイクルを施す手法が一般的である。
【０００４】
例えば非特許文献１には、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定するリアルタイムＰＣＲ法において、蛍光標識プローブとして、約２０塩基からなる塩基配列を有する加水分解プローブを用いることが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＤｙＮＡｍｏ  Ｆｌａｓｈ  Ｐｒｏｂｅ  ｑＰＣＲ  Ｋｉｔ，ＤｙＮＡｍｏ  ＣｏｌｏｒＦｌａｓｈ  Ｐｒｏｂｅ  ｑＰＣＲ  Ｋｉｔ，＃Ｆ−４５５Ｌ：<URL:https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0012908_DyNAmo_Flash_Probe_qPCR_F455L_UG.pdf>
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献１に記載のプローブでは、塩基長が短い（塩基の数が少ない）ため、例えば、ＰＣＲの反応時間（変性反応のための時間や、アニーリング反応／伸長反応のための時間）を短縮させると（ＰＣＲを高速化させると）、核酸と十分にハイブリダイゼーションせず、反応液からの蛍光を高感度で検出することができない場合があった。
【０００７】
本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、蛍光を高感度で検出することができる蛍光標識プローブを提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、蛍光を高感度で検出することができる核酸増幅反応用試薬を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、蛍光を高感度で検出することができる核酸増幅反応方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る蛍光標識プローブは、
２９塩基以上５０塩基以下の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、
前記オリゴヌクレオチドに結合されたレポーター色素と、
前記オリゴヌクレオチドに結合されたクエンチャーと、
を含み、
前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記レポーター色素と前記クエンチャーとの間の塩基数は、３０塩基以下である。
【０００９】
このような蛍光標識プローブでは、蛍光を高感度で検出することができる（後述する「５．  実験例」参照）。
【００１０】
本発明に係る蛍光標識プローブにおいて、
前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記レポーター色素と前記クエンチャーとの間の塩基数は、２０塩基以下であってもよい。
【００１１】
このような蛍光標識プローブでは、蛍光をより高感度で検出することができる。
【００１２】
本発明に係る蛍光標識プローブにおいて、
前記オリゴヌクレオチドは、２９塩基以上４０塩基以下の塩基配列を有していてもよい。
【００１３】
このような蛍光標識プローブでは、より確実に、鋳型核酸の所望の部分にハイブリダイゼーションすることができる。
【００１４】
本発明に係る蛍光標識プローブにおいて、
前記レポーター色素および前記クエンチャーの少なくとも一方は、前記オリゴヌクレオチドの末端には、結合されていなくてもよい。
【００１５】
このような蛍光標識プローブでは、オリゴヌクレオチドが塩基数の多い塩基配列を有していても、オリゴヌクレオチドにおいて、レポーター色素とクエンチャーとの間の塩基数を少なくすることができる。
【００１６】
本発明に係る核酸増幅反応用試薬は、
本発明に係る蛍光標識プローブを含む。
【００１７】
このような核酸増幅反応用試薬では、本発明に係る蛍光標識プローブを含むため、蛍光を高感度で検出することができる。
【００１８】
本発明に係る核酸増幅反応方法は、
本発明に係る核酸増幅反応試薬と核酸とを含む反応液に、熱サイクルを付与する。
【００１９】
このような核酸増幅反応方法では、本発明に係る核酸増幅反応用試薬を用いるため、蛍光を高感度で検出することができる。
【００２０】
本発明に係る核酸増幅反応方法において、
前記熱サイクルにおいて、アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間は、１秒以上１０秒以下であってもよい。
【００２１】
このような核酸増幅反応方法では、ＰＣＲの反応時間の短縮化（ＰＣＲの高速化）を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本実施形態に係る蛍光標識プローブを説明するための図。
【図２】本実施形態に係る蛍光標識プローブを説明するための図。
【図３】本実施形態に係る蛍光標識プローブを説明するための図。
【図４】本実施形態に係る蛍光標識プローブを説明するための図。
【図５】本実施形態に係る核酸増幅反応用カートリッジを模式的に示す断面図。
【図６】本実施形態に係る核酸増幅反応用カートリッジを模式的に示す断面図。
【図７】本実施形態に係る核酸増幅反応用カートリッジを模式的に示す断面図。
【図８】本実施形態に係る核酸増幅反応用カートリッジを模式的に示す断面図。
【図９】本実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す斜視図。
【図１０】本実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す斜視図。
【図１１】本実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す分解斜視図。
【図１２】本実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す断面図。
【図１３】本実施形態に係る核酸増幅反応装置を模式的に示す断面図。
【図１４】本実施形態に係る核酸増幅反応装置の機能ブロック図。
【図１５】本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャート。
【図１６】蛍光標識プローブの塩基配列を変えた場合のＰＣＲ結果を示すグラフ。
【図１７】標準条件および高速条件におけるＰＣＲ結果を示すグラフ。
【図１８】標準条件および高速条件における電気泳動評価の結果を示す写真。
【図１９】蛍光標識プローブの塩基配列を変えた場合のＰＣＲ結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の好適な実施形態について、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００２４】
１．  蛍光標識プローブ
まず、本実施形態に係る蛍光標識プローブについて説明する。図１は、本実施形態に係る蛍光標識プローブ１を説明するための図である。
【００２５】
蛍光標識プローブ１は、ＰＣＲにおいて、核酸の増幅量を定量するために用いられる。具体的には、蛍光標識プローブ１は、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定するリアルタイムＰＣＲに用いられる。蛍光標識プローブ１は、例えば、加水分解プローブである。蛍光標識プローブ１は、図１に示すように、オリゴヌクレオチド２と、レポーター色素４Ｒと、クエンチャー４Ｑと、を含む。
【００２６】
オリゴヌクレオチド２は、複数のヌクレオチドがホスホジエステル結合で重合したものである。オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、ｄＡＴＰ（Ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｄＣＴＰ（Ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｄＧＴＰ（Ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、またはｄＴＴＰ（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）である。
【００２７】
オリゴヌクレオチド２は、標的核酸となる鋳型核酸と相補的塩基対を構成することができる塩基配列を有している。鋳型核酸は、ＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ）、またはＲＮＡ（Ｒｉｂｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）である。
【００２８】
オリゴヌクレオチド２は、２９塩基以上５０塩基以下の塩基配列を有している。すなわち、オリゴヌクレオチド２を構成するヌクレオチドの数は、２９以上５０以下である。好ましくは、オリゴヌクレオチド２は、２９塩基以上４０塩基以下の塩基配列を有している。
【００２９】
レポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑは、オリゴヌクレオチド２に結合している。レポーター色素４Ｒは、例えば、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーション（アニーリング）して二本鎖構造を形成していている間、レポーター色素４Ｒに近接しているクエンチャー４Ｑによって（クエンチング効果によって）、発光が抑制されている。しかし、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって蛍光標識プローブ１が加水分解されると、クエンチング効果が解消し、レポーター色素４Ｒは、発光する。この発光により、核酸の増幅量を定量することができる。
【００３０】
レポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑは、オリゴヌクレオチド２を構成するヌクレオチドのうちｄＴＴＰに結合する。なお、レポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑは、オリゴヌクレオチド２の５´末端および３´末端に限り、ｄＡＴＰにも結合することができる。図示の例では、レポーター色素４Ｒは、オリゴヌクレオチド２のうちレポーター結合ヌクレオチド２Ｒに結合し、クエンチャー４Ｑは、オリゴヌクレオチド２のうちクエンチャー結合ヌクレオチド２Ｑに結合している。
【００３１】
オリゴヌクレオチド２において、レポーター色素４Ｒとクエンチャー４Ｑとの間の塩基数は、３０塩基以下である。すなわち、オリゴヌクレオチド２において、レポーター結合ヌクレオチド２Ｒとクエンチャー結合ヌクレオチド２Ｑとの間には、レポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑが結合していない未結合ヌクレオチドが２８個以下存在し、レポーター結合ヌクレオチド２Ｒと、クエンチャー結合ヌクレオチド２Ｑと、ヌクレオチド２Ｒ，２Ｑ間の未結合ヌクレオチドと、の数の合計は、３０である。好ましくは、オリゴヌクレオチド２において、レポーター色素４Ｒとクエンチャー４Ｑとの間の塩基数は、２０塩基以下である。
【００３２】
なお、図示はしないが、オリゴヌクレオチド２において、レポーター結合ヌクレオチド２Ｒとクエンチャー結合ヌクレオチド２Ｑとは、隣り合っていてもよい。すなわち、レポーター結合ヌクレオチド２Ｒとクエンチャー結合ヌクレオチド２Ｑとの間の塩基数は、ゼロであってもよい。なお、１つのヌクレオチドに、レポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑの両方を結合させてもよいが、このような結合は、蛍光強度の低下の要因になる可能性があるため、好ましくない。
【００３３】
レポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑの少なくとも一方は、オリゴヌクレオチド２の末端には、結合されていない。図示の例では、レポーター色素４Ｒは、オリゴヌクレオチド２の５´末端のヌクレオチドに結合し、クエンチャー４Ｑは、オリゴヌクレオチド２の３´末端のヌクレオチドには結合していない。クエンチャー４Ｑは、オリゴヌクレオチド２において、５´末端のヌクレオチドおよび３´末端のヌクレオチド以外のヌクレオチドに結合している。この場合、オリゴヌクレオチド２の３´末端には、アミノ酸を結合させることが好ましい。これにより、３´末端からの伸長反応を抑制することができる。
【００３４】
なお、図２に示すように、レポーター色素４Ｒは、オリゴヌクレオチド２の５´末端のヌクレオチドには結合せず、クエンチャー４Ｑは、オリゴヌクレオチド２の３´末端のヌクレオチドに結合していてもよい。レポーター色素４Ｒは、オリゴヌクレオチド２において、５´末端のヌクレオチドおよび３´末端のヌクレオチド以外のヌクレオチドに結合している。この場合、オリゴヌクレオチド２の５´末端には、アミノ酸を結合させることが好ましい。これにより、５´末端からの伸長反応を抑制することができる。
【００３５】
また、図３に示すように、レポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑの両方がオリゴヌクレオチド２の末端には、結合されていなくてもよい。レポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑは、５´末端のヌクレオチドおよび３´末端のヌクレオチド以外のヌクレオチドに結合している。この場合、オリゴヌクレオチド２の５´末端および３´末端には、
アミノ酸を結合させることが好ましい。これにより、５´末端および３´末端からの伸長反応を抑制することができる。
【００３６】
レポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑは、１つずつオリゴヌクレオチド２に結合されている。図示はしないが、クエンチャー４Ｑは、オリゴヌクレオチド２に複数結合されていてもよい。これにより、クエンチング効果（消光効果）を高めることができ、蛍光を高感度で検出することができる。また、レポーター色素４Ｒは、オリゴヌクレオチド２に複数結合されていてもよい。これにより、リアルタイムＰＣＲにおいて蛍光を測定した場合に蛍光強度を大きくすることができ、蛍光を高感度で検出することができる。
【００３７】
レポーター色素４Ｒとしては、例えば、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＦＩＴＣ等を用いる。クエンチャー４Ｑとしては、例えば、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ等を用いる。
【００３８】
蛍光標識プローブ１は、例えば、以下の特徴を有する。
【００３９】
蛍光標識プローブ１では、２９塩基以上５０塩基以下の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド２を含む。そのため、蛍光標識プローブ１では、オリゴヌクレオチド２が２９塩基未満の塩基配列を有している場合に比べて、核酸と短時間でハイブリダイゼーションすることができる（後述する「５．  実験例」参照）。
【００４０】
さらに、蛍光標識プローブ１では、オリゴヌクレオチド２において、レポーター色素４Ｒとクエンチャー４Ｑとの間の塩基数は、３０塩基以下である。そのため、蛍光標識プローブ１では、レポーター色素４Ｒとクエンチャー４Ｑとの間の塩基数が３０塩基より多い場合に比べて、クエンチング効果を高めることができる（後述する「５．  実験例」参照）。
【００４１】
以上により、蛍光標識プローブ１では、蛍光を高感度で検出することができる。蛍光標識プローブ１によって、例えば、迅速かつ高感度な検査（臨床診断）を行うことができる。
【００４２】
蛍光標識プローブ１では、オリゴヌクレオチド２において、レポーター色素４Ｒとクエンチャー４Ｑとの間の塩基数は、２０塩基以下である。そのため、蛍光標識プローブ１では、蛍光をより高感度で検出することができる。
【００４３】
蛍光標識プローブ１では、オリゴヌクレオチド２は、２９塩基以上４０塩基以下の塩基配列を有する。そのため、蛍光標識プローブ１では、蛍光をより高感度で検出することができる。
【００４４】
蛍光標識プローブ１では、レポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑの少なくとも一方は、オリゴヌクレオチド２の末端には、結合されていない。そのため、蛍光標識プローブ１では、オリゴヌクレオチド２が塩基数の多い塩基配列を有していても、オリゴヌクレオチド２において、レポーター色素４Ｒとクエンチャー４Ｑとの間の塩基数を少なくすることができる。例えば、オリゴヌクレオチド２が５０塩基の塩基配列を有していても、オリゴヌクレオチド２において、レポーター色素４Ｒとクエンチャー４Ｑとの間の塩基数を、３０塩基以下にすることができる。
【００４５】
なお、レポーター色素４Ｒとクエンチャー４Ｑとの間の塩基数を、３０塩基以下にすることができれば、図４に示すように、レポーター色素４Ｒは、オリゴヌクレオチド２の５´末端のヌクレオチドに結合し、クエンチャー４Ｑは、オリゴヌクレオチド２の３´末端
のヌクレオチドに結合していてもよい。
【００４６】
２．  核酸増幅反応用試薬
次に、本実施形態に係る核酸増幅反応用試薬について説明する。本実施形態に係る核酸増幅反応用試薬は、本発明に係る蛍光標識プローブを含む。本実施形態に係る核酸増幅反応用試薬は、例えば、核酸増幅反応用カートリッジに収容されている。図５は、本実施形態に係る核酸増幅反応用カートリッジ１０を模式的に示す断面図である。
【００４７】
核酸増幅反応用カートリッジ１０は、図５に示すように、容器１２と、キャップ１４と、を含む。
【００４８】
容器１２は、図５に示すように、例えば、円筒状の側壁部１２ａと、半球状の底部１２ｂと、を有している。容器１２は、流路１６を有する。流路１６は、容器１２によって形成されている。流路１６は、円筒状の側壁部１２ａの中心軸（図示せず）に沿って延在している。キャップ１４は、容器１２の底部１２ｂに対向する端部の開口を塞ぐ。キャップ１４は、容器１２に対して、着脱可能である。容器１２およびキャップ１４の材質は、例えば、ガラス、高分子、金属などである。
【００４９】
容器１２の底部１２ｂに、例えば、凍結乾燥された核酸増幅反応用試薬２４が固定されている。このような核酸増幅反応用カートリッジ１０に、図６に示すようにキャップ１４を外してピペット８等を用いて鋳型核酸溶液２２を導入すると、導入された鋳型核酸溶液２２は、図７に示すように底部１２ｂまで沈降し、核酸増幅反応用試薬２４と接触する。核酸増幅反応用試薬２４は、鋳型核酸溶液２２の水分によって凍結乾燥が溶けて鋳型核酸溶液２２に取り込まれ、図８に示すように反応液２０となる。したがって、反応液２０は、鋳型核酸および核酸増幅反応用試薬２４を含むこととなり、核酸の増幅反応を進行させる場となる。
【００５０】
反応液２０は、核酸増幅反応用カートリッジ１０に収容され、流路１６に配置される。反応液２０は、液体３０中に液滴の状態で保持される。図示の例では、反応液２０の形状は、球状である。反応液２０は、例えば、液体３０よりも比重が大きい。反応液２０は、核酸増幅反応用カートリッジ１０の移動に伴い、流路１６を、容器１２に対して相対的に移動する。
【００５１】
鋳型核酸溶液２２は、鋳型核酸を含む溶液である。鋳型核酸溶液２２を容器１２内に導入するときは、キャップ１４は、容器１２から取り外され、鋳型核酸溶液２２の導入後に再び容器１２に取り付けられる。
【００５２】
鋳型核酸溶液２２は、例えば、次のようにして得られる。すなわち、綿棒などの採取具によって、ヒト・細菌などの生物由来の細胞あるいはウイルスなどの検体が採取され、既知の抽出手法を用いて検体から鋳型核酸が抽出される。その後、既知の精製手法を用いて、所定濃度となるように鋳型核酸溶液が精製される。なお、鋳型核酸溶液２２における溶液は、例えば、水（蒸留水、滅菌水）や、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）溶液（ＴＥ）である。
【００５３】
核酸増幅反応用試薬２４は、核酸増幅反応用カートリッジ１０に収容され、例えば、容器１２の底部１２ｂに凍結乾燥（フリーズドライ）されている。核酸増幅反応用試薬２４は、核酸の（標的核酸の）増幅反応に使用される試薬である。核酸増幅反応用試薬２４は、本発明に係る蛍光標識プローブ、プライマー、ポリメラーゼ、およびｄＮＴＰを含む。
【００５４】
蛍光標識プローブとしては、例えば、上記の蛍光標識プローブ１を用いる。反応液２０
に含まれる蛍光標識プローブの濃度は、例えば、０．５μＭ以上５０μＭ以下であり、好ましくは３μＭ以上５０μＭ以下である。
【００５５】
プライマーは、鋳型核酸にアニールするよう設計されている。核酸増幅反応用試薬２４は、二本鎖構造の鋳型核酸（二本鎖ＤＮＡ）が変性した後に、一方の一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングするフォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）と、他方の一本鎖ＤＮＡにアニーリングするリバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）と、を含む。反応液２０に含まれるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの濃度は、それぞれ、例えば、０．４μＭ以上３．２μＭ以下であり、好ましくは０．８μＭ以上３．２μＭ以下である。反応液２０に含まれるフォワードプライマーの濃度とリバースプライマーの濃度とは、例えば、同じである。
【００５６】
ポリメラーゼとしては、特に限定されないが、ＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）ポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングしたプライマーの末端に、鋳型核酸の塩基と相補的なヌクレオチドを重合する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。反応液２０に含まれるポリメラーゼの量は、例えば、０．５Ｕ以上４Ｕ以下であり、好ましくは１Ｕ以上４Ｕ以下である。
【００５７】
ｄＮＴＰは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。すなわち、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの混合物を表す。ＤＮＡポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの末端に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをつなぎ合わせて、新たなＤＮＡを形成する。反応液２０に含まれるｄＮＴＰの濃度は、例えば、０．１２５ｍＭ以上１ｍＭ以下であり、好ましくは０．２５ｍＭ以上１ｍＭ以下である。
【００５８】
なお、反応液２０は、さらに、水や緩衝液を含んでいてもよい。緩衝液に用いられる塩としては、例えば、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が挙げられる。
【００５９】
また、鋳型核酸としてＲＮＡを用いる場合、反応液２０は、さらに、逆転写酵素を含んでいてもよい。逆転写酵素としては、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素を用いる。
【００６０】
液体３０は、核酸増幅反応用カートリッジ１０に収容され、流路１６に配置されている。図示の例では、流路１６は、反応液２０および液体３０で充填されている（満たされている）。液体３０は、反応液２０とは混和しない、すなわち混ざり合わない液体である。液体３０は、さらに鋳型核酸溶液２２および核酸増幅反応用試薬２４とも混和しない。液体３０は、反応液２０とは比重が異なる。具体的には、液体３０は、反応液２０よりも比重が小さい。そのため、反応液２０は、重力の作用によって、重力の作用する方向に移動する。液体３０は、例えば、ジメチルシリコーンオイル、パラフィンオイルなどである。
【００６１】
なお、上記では、凍結乾燥された核酸増幅反応用試薬２４が容器１２の底部１２ｂに固定されおり、鋳型核酸溶液２２を容器１２内に導入して、鋳型核酸溶液２２が核酸増幅反応用試薬２４と接触することにより反応液２０が形成される例について説明した。しかし
ながら、鋳型核酸と核酸増幅反応用試薬２４とを含む溶液を、容器１２外で調製し、該溶液を、液体３０によって充填された容器１２内に導入されることで、容器１２内に反応液２０が配置されてもよい。
【００６２】
核酸増幅反応用試薬２４は、本発明に係る蛍光標識プローブを含む。そのため、核酸増幅反応用試薬２４は、蛍光を高感度で検出することができる。
【００６３】
３．  核酸増幅反応装置
次に、本実施形態に係る核酸増幅反応装置について、図面を参照しながら説明する。図９および図１０は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置１００を模式的に示す斜視図であり、図９は、蓋体６０を開いた状態を示し、図１０は、蓋体６０を閉じた状態を示している。図１１は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置１００の本体部５０を模式的に示す分解斜視図である。図１２および図１３は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置１００を模式的に示す図１０のＡ−Ａ線断面図である。図１４は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置１００の機能ブロック図である。
【００６４】
なお、便宜上、図９では、核酸増幅反応用カートリッジ１０を簡略化して図示している。また、図９および図１０では、蛍光測定器８０の図示を省略している。また、図１２および図１３においては、矢印ｇの方向は、重力の作用する方向（重力作用方向）を示し、矢印Ｒの方向は、加熱部５２，５３の回転方向を示している。図１２では、加熱部５２，５３の配置が第１配置である状態を示し、図１３では、加熱部５２，５３の配置が第２配置である状態を示している。なお、図１４では、加熱部５２，５３以外の本体部５０、および蓋体６０の図示を省略している。
【００６５】
核酸増幅反応装置１００は、図９〜図１４に示すように、本体部５０と、蓋体６０と、移動機構７０と、蛍光測定器８０と、処理部９０と、操作部９２と、表示部９４と、記憶部９６と、を含む。核酸増幅反応装置１００は、さらに、核酸増幅反応用カートリッジ１０を含んでもよい。核酸増幅反応装置１００は、例えば、昇降式ＰＣＲ装置である。
【００６６】
本体部５０は、図１１に示すように、例えば、装着部５１と、第１加熱部５２と、第２加熱部５３と、スペーサー５４と、底板５５と、フランジ５６と、固定板５７と、を有している。
【００６７】
装着部５１は、核酸増幅反応用カートリッジ１０を装着可能な構造を有している。具体的には、装着部５１は、図９に示すように、核酸増幅反応用カートリッジ１０を差し込んで（挿入して）装着する構造を有している。図１１に示す例では、装着部５１は、第１加熱部５２の第１ヒートブロック５２ｂ、スペーサー５４、および第２加熱部５３の第２ヒートブロック５３ｂを貫通する貫通孔である。装着部５１の数は、複数であってもよく、図示の例の例では、２０個である。
【００６８】
第１加熱部５２は、核酸増幅反応用カートリッジ１０が装着部５１に装着された場合に、図１２および図１３に示すように、流路１６の第１領域１６ａを第１温度に加熱する。図示の例では、第１加熱部５２は、第２加熱部５３よりも蓋体６０側に位置している。
【００６９】
第１加熱部５２は、例えば、熱を発生させる機構と、発生した熱を核酸増幅反応用カートリッジ１０に伝える部材と、を有している。図１１に示す例では、第１加熱部５２は、第１ヒーター５２ａと、第１ヒートブロック５２ｂと、を有している。第１ヒーター５２ａは、例えば、カートリッジヒーターであり、導線５８によって図示しない外部電源に接続されている。第１ヒーター５２ａは、第１ヒートブロック５２ｂに設けられた穴に挿入されており、第１ヒーター５２ａが発熱することで第１ヒートブロック５２ｂが加熱され
る。第１ヒートブロック５２ｂは、第１ヒーター５２ａから発生した熱を核酸増幅反応用カートリッジ１０に伝える部材である。第１ヒートブロック５２ｂは、例えば、アルミニウム製のブロックである。流路１６の第１領域１６ａは、第１ヒートブロック５２ｂによって囲まれる領域である。
【００７０】
第２加熱部５３は、核酸増幅反応用カートリッジ１０が装着部５１に装着された場合に、流路１６の第２領域１６ｂを、第１温度とは異なる第２温度に加熱する。第２加熱部５３は、第２ヒーター５３ａと、第２ヒートブロック５３ｂと、を有している。第２加熱部５３は、加熱する核酸増幅反応用カートリッジ１０の領域および加熱する温度が第１加熱部５２と異なる以外は、第１加熱部５２と同様の構造および機能を有している。流路１６の第２領域１６ｂは、第２ヒートブロック５３ｂによって囲まれる領域である。
【００７１】
第１加熱部５２および第２加熱部５３の温度は、図示しない温度センサー（例えば熱電対）および処理部９０によって制御される。処理部９０は、例えば、第１加熱部５２を第１温度に、第２加熱部５３を第２温度に制御することで、核酸増幅反応用カートリッジ１０の第１領域１６ａを第１温度に、第２領域１６ｂを第２温度に加熱することができる。
【００７２】
スペーサー５４は、第１加熱部５２と第２加熱部５３との間に設けられている。スペーサー５４は、第１加熱部５２と第２加熱部５３との間を断熱する機能を有している。
【００７３】
底板５５は、核酸増幅反応用カートリッジ１０を保持する部材である。底板５５は、核酸増幅反応用カートリッジ１０の高さ方向の位置を決定する。すなわち、核酸増幅反応用カートリッジ１０を底板５５に接触する位置まで差し込むことで、加熱部５２，５３に対して核酸増幅反応用カートリッジ１０を所定の位置に保持することができる。底板５５には、蛍光測定器８０からの励起光、および反応液２０の蛍光を通すための貫通孔５５ａが設けられている。
【００７４】
フランジ５６および固定板５７は、加熱部５２，５３およびスペーサー５４を固定するための部材である。図示の例では、２枚の固定板５７がフランジ５６に嵌め合わされており、加熱部５２，５３、スペーサー５４、および底板５５は、固定板５７に固定されている。
【００７５】
蓋体６０は、装着部５１を覆っている。図９に示す例では、固定板５７には磁石部６２が設けられ、蓋体６０は、磁石部６２によって本体部５０に固定されることができる。なお、スペーサー５４、底板５５、フランジ５６、固定板５７、および蓋体６０の材質は、例えば、断熱材である。
【００７６】
移動機構７０は、処理部９０からの入力信号に基づいて、本体部５０を回転させる機構である。これにより、移動機構７０は、加熱部５２，５３を第１配置（図１２参照）と第２配置（図１３参照）とに切換えることができる。その結果、移動機構７０は、反応液２０に、核酸を増幅するための熱サイクルを付与するように、反応液２０を移動させることができる。第１配置では、第１加熱部５２が第２加熱部５３よりも、重力作用方向において下方に位置している。第２配置では、第２加熱部５３が第１加熱部５２よりも、重力作用方向において下方に位置している。移動機構７０は、例えば、図示しないモーターおよび駆動軸を有している。駆動軸は、本体部５０のフランジ５６に接続されている。駆動軸は、核酸増幅反応用カートリッジ１０の長手方向に対して垂直に設けられており、モーターを動作させると駆動軸を回転の軸として本体部５０が回転する。
【００７７】
蛍光測定器８０は、核酸増幅反応用カートリッジ１０に収容される反応液２０の蛍光強度（蛍光輝度）を測定する測定器である。蛍光測定器８０は、図１３に示すように第２配
置において、核酸増幅反応用カートリッジ１０の底部１２ｂに対して、所定距離を隔てて対向して配置されている。蛍光測定器８０は、処理部９０からの入力信号に基づいて、反応液２０に含まれる蛍光標識プローブの蛍光色素に対応する励起光Ｌを反応液２０に照射し、反応液２０で発光する蛍光強度を測定する。なお、蛍光測定器８０は、１つの蛍光色素に対応する蛍光強度を測定してもよいし、複数の蛍光色素に対応する蛍光強度を測定してもよい。
【００７８】
処理部９０は、図１４に示すように、例えば記憶部９６に記憶されているプログラムに従って、移動機構７０や蛍光測定器８０を制御するための処理を行う。処理部９０は、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）などのプロセッサー等により実現される。
【００７９】
操作部９２は、ユーザーによる操作に応じた操作信号を取得し、操作信号を処理部９０に送る処理を行う。操作部９２は、例えば、ボタン、キー、タッチパネル型ディスプレイ、マイク等により実現される。
【００８０】
表示部９４は、処理部９０によって生成された画像を表示する。表示部９４は、例えば、ＬＣＤ（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ）、ＣＲＴ（Ｃａｔｈｏｄｅ
Ｒａｙ  Ｔｕｂｅ）等により実現される。
【００８１】
記憶部９６は、処理部９０が各種の計算処理や制御処理を行うためのプログラムやデータ等を記憶している。また、記憶部９６は、処理部９０の作業領域として用いられ、処理部９０が各種プログラムに従って実行した算出結果等を一時的に記憶するためにも使用される。記憶部９６は、例えば、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）等によって実現される。
【００８２】
４．  核酸増幅反応方法
次に、本実施形態に係る核酸増幅反応方法について、図面を参照しながら説明する。図１５は、本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャートである。以下では、一例として、核酸増幅反応装置１００を用いて、本発明に係る核酸増幅反応用試薬と標的核酸とを含む反応液２０において、核酸を増幅させる方法について説明する。
【００８３】
まず、核酸増幅反応用カートリッジ１０を、核酸増幅反応装置１００の装着部５１に装着する（ステップＳ２）。具体的には、液体３０が充填された容器１２に反応液２０を導入した後、核酸増幅反応用カートリッジ１０を装着部５１に装着する。例えば、装着部５１に核酸増幅反応用カートリッジ１０を装着したら、蓋体６０によって装着部５１を覆う。
【００８４】
ここで、加熱部５２，５３の配置は、図１２に示すように、第１配置である。第１配置においては、重力作用方向における流路１６の最下部に第１領域１６ａが位置する。そのため、液体３０よりも比重の大きい反応液２０は、第１領域１６ａに位置する。
【００８５】
次に、処理部９０は、操作部９２から熱サイクル処理を開始する旨の信号を受けると、加熱部５２，５３を制御して、核酸増幅反応用カートリッジ１０の第１領域１６ａおよび第２領域１６ｂを加熱させ、流路１６に温度勾配を形成する処理を行う（ステップＳ４）。具体的には、処理部９０の処理によって、第１加熱部５２は、第１領域１６ａを第１温度に加熱し、第２加熱部５３は、第２領域１６ｂを第１温度よりも低い第２温度に加熱する。これにより、流路１６の第１領域１６ａと第２領域１６ｂとの間には、第１温度と第２温度との間で温度が漸次変化する温度勾配が形成される。ここでは、加熱部５２，５３は、第１領域１６ａから第２領域１６ｂに向けて温度が低くなる温度勾配を形成する温度
勾配形成部である。
【００８６】
第１温度は、２本鎖ＤＮＡの解離（変性反応）に適した温度であり、例えば、９５℃以上１１０℃以下である。第２温度は、アニーリング反応および伸長反応に適した温度であり、例えば、５０℃以上７５℃以下である。加熱部５２，５３の配置は、第１配置であるので、核酸増幅反応用カートリッジ１０を加熱すると、反応液２０は、第１温度に加熱される。
【００８７】
次に、処理部９０は、第１加熱部５２が第１温度に到達して第１の時間（第１の期間）が経過したら、移動機構７０を制御して、加熱部５２，５３の配置を、第１配置から第２配置へ切換える処理を行う（ステップＳ６）。処理部９０は、タイマーを内蔵していてもよい。第１の時間は、変性反応のための加熱時間であり、例えば、１秒以上１０秒以下である。具体的には、処理部９０は、移動機構７０を制御して本体部５０を１８０°回転させる。これにより、加熱部５２，５３の配置が第１の配置から第２の配置へ切換えられる。
【００８８】
第２の配置は、図１３に示すように、第２領域１６ｂを重力作用方向において流路１６の最下部に位置させる配置である。第２配置では、第１領域１６ａと第２領域１６ｂとの重力作用方向における位置関係が第１配置とは逆になる。そのため、反応液２０は、重力の作用によって第１領域１６ａから第２領域１６ｂへと移動する。処理部９０は、加熱部５２，５３の配置を第２配置とした後に移動機構７０の動作を第２の時間（第２の期間）停止させる。これにより、加熱部５２，５３の配置は、第２の時間、第２配置に保持される。第２の時間は、アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間であり、１秒以上１０秒以下である。
【００８９】
次に、処理部９０は、第１配置から第２配置へ切換えた回数（サイクル数）が、予め記憶部９６に記憶されている所定の回数に達したか否か判定する処理を行う（ステップＳ８）。処理部９０は、第１配置から第２配置への切換えを行うたびに、サイクル数を記憶部９６に記憶させ、該サイクル数と、予め記憶部９６に記憶されている所定の回数と、を比較する。
【００９０】
処理部９０は、ステップＳ８においてサイクル数が所定の回数に達したと判定した場合（図１５において「Ｙｅｓ」の場合）、処理を終了する。
【００９１】
一方、処理部９０は、ステップＳ８においてサイクル数が所定の回数に達していないと判定した場合（図１５において「Ｎｏ」の場合）、ステップＳ１０に移行する。ステップＳ１０では、処理部９０は、移動機構７０を制御して、加熱部５２，５３の配置を、第２配置から第１配置へ切換える処理を行う。処理部９０は、加熱部５２，５３の配置を第１配置とした後に移動機構７０の動作を、第１の時間停止させる。
【００９２】
そして、処理部９０は、再び、ステップＳ６へ移行し、加熱部５２，５３の配置を第１配置から第２配置へ切換える。
【００９３】
以上のように、処理部９０は、サイクル数が所定の回数となるまで、第１配置と第２配置との位置を入れ替えながら加熱部５２，５３を（本体部５０を）回転させることにより、反応液２０を流路１６において往復運動させる。これにより、核酸増幅反応装置１００は、反応液２０に、核酸を増幅するための熱サイクルを付与することができる。
【００９４】
処理部９０は、さらに、上記の熱サイクル処理と同時期に増幅解析処理を行う。これにより、核酸増幅反応装置１００では、リアルタイムＰＣＲを行うことができる。具体的に
は、処理部９０は、加熱部５２，５３の配置を第２配置に保持するごとに蛍光測定器８０に対して測定指示を与えるための信号を入力する。そして、処理部９０は、蛍光測定器８０の測定結果として蛍光測定器８０から蛍光強度を取得し、該蛍光強度を記憶部９６に記憶する。
【００９５】
さらに、処理部９０は、操作部９２から入力される信号に基づいて、繰り返すべきサイクル数として設定される回数分の蛍光強度を記憶部９６から読み出し、該蛍光強度に基づいてサイクル数に対する蛍光強度の推移を示す増幅曲線を生成してもよい。処理部９０は、該増幅曲線に基づいて核酸の増幅効率に対する良否を判定し、判定結果や増幅曲線を表示部９４に表示させてもよい。
【００９６】
なお、上記では、ステップＳ８において、処理部９０は、サイクル数が所定の回数に達したか否かを判定したが、処理部９０は、取得した蛍光強度が、予め記憶部９６に記憶された所定値に達しか否かを判定してもよい。そして、処理部９０は、取得した蛍光強度が所定値に到達したと判定した場合は、処理を終了し、取得した蛍光強度が所定値に到達していないと判定した場合は、ステップＳ１０に移行してもよい。
【００９７】
また、上記では、第２温度をアニーリング反応および伸長反応のための温度としたが、第２温度を、アニーリング反応および伸長反応のいずれか一方の反応のための温度とし、第２の時間を、アニーリング反応および伸長反応のいずれか一方の反応のための加熱時間としてもよい。この場合、図示はしないが、核酸増幅反応装置１００は、流路１６の第３領域（第１領域および第２領域と異なる領域）を、第３温度（第１温度および第２温度と異なる温度）に加熱する第３加熱部を有している。第３温度は、アニーリング反応および伸長反応の他方の反応のための温度であり、第３の時間は、アニーリング反応および伸長反応の他方の反応のための加熱時間である。ただし、ＰＣＲの高速化のためには、第２温度を、アニーリング反応および伸長反応のための温度とすることが好ましい。
【００９８】
本実施形態に係る核酸増幅反応方法では、本発明に係る核酸増幅反応用試薬（例えば核酸増幅反応用試薬２４）と標的核酸（鋳型核酸）とを含む反応液２０に熱サイクルを付与する。そのため、本実施形態に係る核酸増幅反応方法では、反応液２０からの蛍光を高感度で検出することができる。
【００９９】
本実施形態に係る核酸増幅反応方法では、本発明に係る核酸増幅反応用試薬を用いるので、第２の時間（アニーリング反応および伸長反応のための時間）が１秒以上１０秒以下という高速条件においても（ＰＣＲを高速化させても）、核酸と蛍光標識プローブとが十分にハイブリダイゼーションすることができ、反応液からの蛍光を高感度で検出することができる。したがって、本実施形態に係る核酸増幅反応方法では、高速条件のＰＣＲにおいて、特に有効であるといえる。
【０１００】
さらに、本実施形態に係る核酸増幅反応方法では、第２の時間を１０秒以下とすることで、ＰＣＲの反応時間の短縮化を図ることができる。また、第２の時間を１秒以上とすることで、核酸増幅反応装置や核酸増幅反応用カートリッジの設計が容易となり、設計の自由度を高めることができる。第２の時間を１秒未満とすると、核酸増幅反応装置や核酸増幅反応用カートリッジの設計が困難となる場合がある。
【０１０１】
５．  実験例
以下に実験例を示し、本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実験例によって何ら限定されるものではない。
【０１０２】
５．１．  試料の調製
鋳型核酸として、溶連菌ゲノムＤＮＡを用いた。この鋳型核酸を、核酸増幅反応用試薬に添加して下記の混合試薬溶液を調製した。なお、下記における各試薬の液量（体積）は、混合試薬１０μＬに対する値である。すなわち、例えば、ポリメラーゼは、混合試薬絵容器１０μＬ中に０．４μＬ含まれている。
【０１０３】
＜混合試薬溶液の組成＞
ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ                      ０．４μＬ
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）                                    ０．５μＬ
バッファー                                              ２．０μＬ
溶連菌検出用フォワードプライマー（２０μＭ）            ０．８μＬ
溶連菌検出用リバースプライマー（２０μＭ）              ０．８μＬ
溶連菌検出用蛍光標識プローブ（１０μＭ）                ０．６μＬ
溶連菌ＤＮＡ（テンプレートＤＮＡ）                      １．０μＬ
水                                        ｕｐ  ｔｏ  １０μＬ
【０１０４】
なお、上記の混合試薬溶液において、ポリメラーゼは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製を用いた。ｄＮＴＰは、Ｒｏｃｈｅ社製を用いた。フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製の「Ｓ−Ｐｙｏ２」を用いた。蛍光標識プローブは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた。水は、Ｒｏｃｈｅ社製を用いた。
【０１０５】
バッファー（緩衝液）の組成は、下記のとおりである。
【０１０６】
ＭｇＣｌ２：２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ９．０）：２５０ｍＭ
ＫＣｌ：１２５ｍＭ
【０１０７】
フォワードプライマーおよびリバースプライマーの配列は、下記表１のとおりである。
【０１０８】
【表１】
2018000049.tif 000003
【０１０９】
蛍光標識プローブとしては、塩基配列が異なるものを５種類用意した。すなわち、蛍光標識プローブの塩基配列が異なる混合試薬溶液を、５種理用意した。下記表２は、蛍光標識プローブの配列を示す表である。
【０１１０】
【表２】
2018000049.tif 000004
【０１１１】
なお、表２において、「塩基数」とは、オリゴヌクレオチドの塩基数（ヌクレオチドの数）であり、「色素間塩基数」とは、レポーター色素（ＦＡＭ）とクエンチャー（ＢＨＱ１）との間の塩基数である。実施例２の蛍光標識プローブでは、オリゴヌクレオチドの３´末端にクエンチャーは結合されておらず、オリゴヌクレオチドの３´末端にはアミノ基
が結合されている。
【０１１２】
５．２．  ＰＣＲ結果
上記混合試薬溶液の各々から反応液として、１．６μＬを抽出し、シリコーンオイルが充填されている核酸増幅反応用カートリッジに注入した。そして、第１温度（変性反応のための温度）を１０５℃、第１の時間（変性反応のための期間）を４秒、第２温度（アニーリング反応および伸長反応のための温度）を５６℃、第２の時間（アニーリング反応および伸長反応のための期間）を６秒として、各反応液に対して、核酸増幅反応装置１００のような昇降式ＰＣＲ装置を用いてＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲは、１０５℃で１０秒間加熱させてホットスタートさせた。
【０１１３】
図１６は、各混合試薬溶液から得た反応液のＰＣＲ結果を示すグラフである。図１６において、横軸は、熱サイクルのサイクル数を示し、縦軸は、蛍光測定器で測定した蛍光強度を示している。図１６に示すように、実施例１，２および比較例３の混合試薬溶液においては、２回ずつＰＣＲを行った。
【０１１４】
図１６に示すように、実施例１と比較例１，２とを比べると、熱サイクルを５０回付与した場合において、実施例１は、比較例１，２に比べて蛍光強度が大きかった。
【０１１５】
ここで、図１７は、鋳型核酸をアデノウィルスとしたＰＣＲの結果を示すグラフである。図１７におけるＰＣＲでは、２０塩基の塩基配列を有するアデノウィルス用の蛍光標識プローブを用いた。図１７におけるＰＣＲでは、第１の時間（変性反応のための時間）を５秒、第２の時間（アニーリング反応および伸長反応のための時間）を２０秒とした標準条件と、第１の時間を４秒、第２の時間を６秒とした高速条件と、の２種類の条件において、リアルタイムＰＣＲを行った。図１７に示すように、高速条件および標準条件で４回ずつＰＣＲを行った。
【０１１６】
図１８は、図１７におけるＰＣＲにおいて、高速条件の熱サイクルを５０回付与した反応液と、標準条件の熱サイクルを５０回付与した反応液と、の電気泳動の結果である。
【０１１７】
図１７に示すように、高速条件では、標準条件に比べて、蛍光強度が低下した。一方、図１８に示すように、高速条件と標準条件とにおいて、電気泳動評価における差異は確認できなかった。このことから、高速条件の蛍光強度が標準条件の蛍光強度よりも低いことは、核酸が増幅されていないのではなく、核酸と蛍光標識プローブとが十分にハイブリダイゼーションできていないことが要因であると考えられる。
【０１１８】
しかしながら、図１６に示すように、塩基配列２９塩基以上の塩基配列を有する実施例１の蛍光標識プローブを用いると、高速条件であっても、熱サイクルを５０回した場合の蛍光強度は、３０以上と大きかった。図１６におけるＰＣＲの第１の時間および第２の時間は、それぞれ、図１７における高速条件ＰＣＲの第１の時間および第２の時間と同じである。図１６に示すように、オリゴヌクレオチドの塩基配列が２０塩基、２５塩基、２９塩基、４０塩基と数が多いほど、蛍光強度が大きくなっていることから、塩基配列の数が多いほど、蛍光標識プローブは、核酸と短時間でハイブリダイゼーションすることができることがわかった。
【０１１９】
ただし、オリゴヌクレオチドの塩基配列が５０塩基を超えると、蛍光標識プローブは、が鋳型核酸の意図せぬ部分にハイブリダイゼーションする場合がある。したがって、オリゴヌクレオチドの塩基配列が５０塩基以下、好ましくは４０塩基以下とすることにより、蛍光標識プローブを、鋳型核酸の所望の部分にハイブリダイゼーションさせることができる。
【０１２０】
さらに、図１６に示すように、実施例２と比較例３とを比べると、熱サイクルを５０回付与した場合において、実施例２では、比較例３に比べて蛍光強度が大きかった。さらに、比較例３では、実施例２に比べて、ＰＣＲの増幅曲線に「がたつき」が確認された。
【０１２１】
ここで、図１９は、図１６に示すＰＣＲ増幅曲線を補正する前のＰＣＲ増幅曲線を示すグラフである。すなわち、図１６に示すＰＣＲ増幅曲線は、図１９に示すＰＣＲ増幅曲線において、ベースライン（バックグラウンド）の値を差し引いて補正したものである。ベースラインは、標的核酸が増幅していない状態における蛍光強度（例えば熱サイクルを１回だけ付与した場合の蛍光強度）のことである。
【０１２２】
図１９に示すように、実施例２では、比較例３に比べて、ベースラインが低かった。これは、実施例２では、比較例３に比べて、レポーター色素とクエンチャーとの間の塩基数が少ないので、高いクエンチング効果を有しているためである。クエンチング効果が低いと、比較例３のように、ベースラインが高くなり、さらに、「がたつき」が発生すると考えられる。
【０１２３】
図１６に示すように、レポーター色素とクエンチャーとの間の塩基数が４０塩基である比較例３では、「がたつき」は確認されるが、レポーター色素とクエンチャーとの間の塩基数が２９塩基である実施例１では、「がたつき」は確認されない。したがって、レポーター色素とクエンチャーとの間の塩基数を３０塩基、より好ましくは２９塩基とすることにより、蛍光標識プローブは、高いクエンチング効果を有することがわかった。
【０１２４】
以上の実験例により、２９塩基以上５０塩基以下の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドにおいて、レポーター色素とクエンチャーとの間の塩基数が３０塩基以下である蛍光標識プローブは、核酸と短時間でハイブリダイゼーションすることができ、高いクエンチング効果を有することがわかった。したがって、このような蛍光標識プローブでは、高速条件のＰＣＲにおいても、反応液の蛍光を高感度で検出することができる。
【０１２５】
本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【０１２６】
１…蛍光標識プローブ、２…オリゴヌクレオチド、２Ｑ…クエンチャー結合ヌクレオチド、２Ｒ…レポーター結合ヌクレオチド、４Ｑ…クエンチャー、４Ｒ…レポーター色素、８…ピペット、１０…核酸増幅反応用カートリッジ、１２…容器、１２ａ…側壁部、１２ｂ…底部、１４…キャップ、１６…流路、１６ａ…第１領域、１６ｂ…第２領域、２０…反応液、２２…鋳型核酸溶液、２４…核酸増幅反応用試薬、３０…液体、５０…本体部、５１…装着部、５２…第１加熱部、５２ａ…第１ヒーター、５２ｂ…第１ヒートブロック、５３…第２加熱部、５３ａ…第２ヒーター、５３ｂ…第２ヒートブロック、５４…スペーサー、５５…底板、５５ａ…貫通孔、５６…フランジ、５７…固定板、５８…導線、６０…蓋体、６２…磁石部、７０…移動機構、８０…蛍光測定器、９０…処理部、９２…操作部、９４…表示部、９６…記憶部、１００…核酸増幅反応装置
【配列表フリーテキスト】
【０１２７】
配列番号１は、Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのフォワードプライ
マーの配列である。
配列番号２は、Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのリバースプライマーの配列である。
配列番号３は、Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの蛍光標識プローブの配列である。
配列番号４は、Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの蛍光標識プローブの配列である。
配列番号５は、Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの蛍光標識プローブの配列である。
配列番号６は、Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの蛍光標識プローブの配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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