(57)【要約】【課題】骨格筋の初代培養において、筋細胞のみを純粋かつ大量に培養することのできる培養液および培養方法を提供すること。【解決手段】骨格筋初代細胞の培養液であって、血清と基礎培地とを万有し、上記血清濃度が全培養液中１０〜４０体積％であり、上記基礎培地が全培養液中５０〜９０体積％であり、グルコースを実質的に含まない培地である、ことを特徴とする前記培養液。骨格筋初代細胞の培養方法であって、前記培養液中で筋サテライト細胞を培養することを含む、前記培養方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格筋初代細胞の培養液であって、
血清と基礎培地とを含有し、
上記血清が、全培養液中１０〜４０体積％で配合されており、
上記基礎培地が、全培養液中５０〜９０体積％で配合されており、かつグルコースを実質的に含まない培地である
ことを特徴とする、前記培養液。
【請求項２】
前記培養液が、グルコースを１０．６ｍＭ以下の濃度で含有するか、又はグルコースを含まない、請求項１に記載の培養液。
【請求項３】
骨格筋初代細胞の培養方法であって、請求項１または２に記載の培養液中で筋サテライト細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項４】
筋サテライト細胞が、遅筋線維から単離した筋サテライト細胞を含む、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨格筋の体性幹細胞における初代細胞の培養液、および当該培養液を用いる骨格筋初代細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の骨格筋は速筋線維と遅筋線維に大別される。それぞれを構成するミオシン重鎖（MHC）のアイソフォームが異なるだけでなく、代謝特性や収縮特性も違う。しかし、世界中に広く普及している骨格筋培養細胞株C2C12は速筋タイプであり、遅筋タイプの培養細胞はまだ存在しない。骨格筋幹細胞である筋サテライト細胞を用いた初代培養細胞も使用されるが、一般には速筋の長指伸筋が使われている。遅筋タイプのヒラメ筋を初代培養に使用することも可能であるが、筋サテライト細胞以外の細胞混入が避けられないため、純粋に骨格筋細胞だけを培養することは困難である。このような背景から、骨格筋の体性幹細胞を単離して、培養し、増殖させる試みは種々提案されている。そして、通常は、実験動物（マウス）から得られた骨格筋から体性幹細胞（筋サテライト細胞と呼ぶ）を単離し、それを培養して増殖させるに際して、培養液として30％がウシ胎児血清、残りの70％が高濃度グルコース（4.5 g/L）の基礎培地で構成されたものが使用されている。
【０００３】
また、たとえば、特許文献１には、正常レベルのＣＤ５６および抑制されたレベルのデスミンを発現する、分化コンピテントな筋芽細胞が豊富な骨格筋細胞（ＳｋＭＣ）を増殖させる方法として、成人の哺乳動物骨格筋細胞を増殖させる方法であって、筋芽細胞分化を可逆的に抑制するのに有効な量のＴＧＦ−βが補充されたマイトジェンリッチな細胞培養培地において、該細胞を培養する工程を包含する、方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表2008-502310号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、上記の提案にかかる方法やその際に用いられている培養液では、骨格筋線維の周囲には線維芽細胞などの生着力の強い細胞が存在するため、初代培養時には比較的生着力の弱い筋サテライト細胞が他細胞に淘汰されてしまう。その結果、筋細胞を大量精製することは不可能であった。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、骨格筋の初代培養において、筋細胞のみを純粋かつ大量に培養することのできる培養液および培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は上記目的を達成するものであり、一態様において下記発明を提供するものである。
［１］骨格筋初代細胞の培養液であって、
血清と基礎培地とを含有し、
上記血清が、全培養液中１０〜４０体積％で配合されており、
上記基礎培地が、全培養液中５０〜９０体積％で配合されており、かつグルコースを実質的に含まない培地である
ことを特徴とする、前記培養液。
【０００８】
［２］前記培養液が、グルコースを１０．６ｍＭ以下の濃度で含有するか、又はグルコースを含まない、上記［１］に記載の培養液。
［３］骨格筋初代細胞の培養方法であって、上記［１］または［２］に記載の培養液中で筋サテライト細胞を培養することを含む、前記方法。
【０００９】
［４］筋サテライト細胞が、遅筋線維から単離した筋サテライト細胞を含む、上記［３］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る骨格筋初代細胞の培養液および培養方法は、骨格筋の初代培養において、筋細胞のみを純粋かつ大量に培養することのできるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、培養状態を示す写真（図面代用写真）である。
【図２】図２は、ＮＧＭとＨＧＭとの培養結果を示す図である。
【図３】図３は、ＮＧＭとＨＧＭとの培養日数と培養細胞数との関係を示すグラフである。
【図４】図４は凍結細胞について示す図である。
【図５】図５は、１回凍結した細胞の培養結果を示す写真（図面代用写真）である。
【図６】図６は、１回凍結した細胞の培養結果を示す写真（図面代用写真）である。
【図７】図７は、２回凍結した細胞の培養結果を示す写真（図面代用写真）である。
【図８】図８は、細胞増殖マーカーKi67の発現を評価した結果を示す写真およびグラフである。左図は、全細胞数をDAPI染色により測定し、Ki67陽性細胞を免疫染色により計測した結果を示す。右図は、Ki67のタンパク質発現量をウェスタンブロッティングで定量した結果を示す。
【図９】図９は、MyoDの発現をウェスタンブロッティングで評価した結果を示す写真およびグラフである。
【図１０】図１０は、Myogeninの発現をウェスタンブロッティングで評価した結果を示す写真およびグラフである。
【図１１】図１１は、マウスの長指伸筋（EDL）の培養について、培養液のグルコース濃度を変化させた場合のKi67の発現量の変化を評価した結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、マウスの長指伸筋（EDL）とヒラメ筋（SOL）の培養について、ＤＧＭで培養した場合の細胞増殖マーカーKi67の発現を評価した結果を示す写真およびグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
【００１３】
＜培養液＞
一態様において、本発明の骨格筋初代細胞の培養液は、血清と基礎培地とを含有し、
上記血清が、全培養液中１０〜４０体積％で配合されており、
上記基礎培地が、全培養液中５０〜９０体積％で配合されており、かつグルコースを実質的に含まない培地である、ことを特徴とする。
【００１４】
別の態様において、本発明の骨格筋初代細胞の培養液は、血清と基礎培地とを含有し、
上記血清が、全培養液中１０〜４０体積％で配合されており、
上記基礎培地が、全培養液中５０〜９０体積％で配合されており、かつグルコースを実質的に含まない培地であり、
ここで上記培養液は、グルコースを１０．６ｍＭ以下の濃度で含有するか、又はグルコースを含まない、ことを特徴とする。
【００１５】
以下、本発明の培養液について説明する。
（血清）
本発明の培養液に含まれる血清の種類は、哺乳動物由来の血清であれば特に限定されないが、好ましくはウシ胎児血清である。
【００１６】
本発明の培養液に含まれる血清は、全培養液中１０〜４０体積％、好ましくは２０〜４０体積％、または２５〜３５体積％で配合する。培養液における血清の配合量を上記範囲内とすることにより、筋細胞のみを純粋かつ大量に培養できる、しかも初代細胞の凍結保存後に、再び解凍して培養することができる。
【００１７】
血清は、グルコースが含まれている血清を用いてもよく、またはグルコースを枯渇させた血清を用いてもよい。血清中のグルコース濃度はロット毎に異なるのが通常である。グルコースが含まれている血清を用いる場合、培養液を調製した際の全培養液中のグルコース濃度が１０．６ｍＭ以下となるものを用いることが好ましい。
【００１８】
（基礎培地）
本発明の培養液に含まれる基礎培地は、全培養液中５０〜９０体積％、好ましくは５０〜７０体積％、５５〜７０体積％、または５５〜６５体積％であり、グルコースを実質的に含まない培地である。基礎培地について「グルコースを実質的に含まない」とは、基礎培地の成分表において「グルコース不含」と記載されているもの、または、基礎培地の成分おけるグルコース濃度が０ｍＭ、もしくはグルコースが検出限界以下であるもの、を意味する。培養液における基礎培地の配合量を上記範囲内とすることにより、筋細胞のみを純粋かつ大量に培養できる、しかも初代細胞の凍結保存後に、再び解凍して培養することができる。
【００１９】
上記基礎培地としては、グルコースを実質的に含まなければ通常培地として用いられるものを特に制限なく用いることができる。例えば、当該技術分野において哺乳動物細胞を培養する際に通常用いられる培地であって、グルコースを実質的に含まない培地であってもよい。そのような培地として好ましい例としては、グルコース不含のＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）等が挙げられる。
【００２０】
（グルコース）
本発明の培養液に含まれるグルコース濃度は、全培養液中１０．６ｍＭ以下、好ましくは１０ｍＭ以下、９．０ｍＭ以下、８．３ｍＭ以下、である。グルコース濃度の下限は特になく、本発明の培養液はグルコースを含まないもの（すなわち０．０ｍＭ）であってもよい。培養液中のグルコース濃度を上記範囲内とすることにより、筋細胞のみを純粋かつ大量に培養できる、しかも初代細胞の凍結保存後に、再び解凍して培養することができる。
【００２１】
（他の成分）
また、本発明においては１〜５体積％程度、通常培養液に用いられる抗生物質や成長因子等を添加して用いることができる。
【００２２】
本発明の培養液のｐＨは、生理学的なｐＨの範囲内であり、例えばｐＨ６．５〜８．０、好ましくは７．０〜７．５の範囲である。
＜培養方法＞
本発明はまた、骨格筋初代細胞の培養方法であって、上記本発明の培養液中で筋サテライト細胞を培養することを含む、前記方法に関する。
【００２３】
筋サテライト細胞は、哺乳動物の骨格筋より単離した体性幹細胞である。当業者に公知の手法を用いて、哺乳動物の骨格筋より筋サテライト細胞を単離することができる。例えば、哺乳動物の骨格筋を摘出し、結合組織分解酵素処理によって筋線維を分散させ、顕微鏡下において単一筋線維を単離し、酵素処理を行うことで、筋サテライト細胞を単離することができる。
【００２４】
本発明の培養方法を用いた培養方法は特に制限がなく、通常用いられる培養方法を用いて培養を行うことができる。培養方法は、例えば、５〜１０％ＣＯ２下で生理学的なｐＨ（例えばｐＨ６．０〜８．０、好ましくはｐＨ７．０〜７．５）を維持しながら培養することを含んでいてもよい。また、培養温度は、例えば３６℃〜３８℃、好ましくは３７℃の範囲であってもよい。
【００２５】
本発明の培養方法により、筋細胞のみが純粋かつ大量に培養できる、しかも初代細胞の凍結保存後に、再び解凍して培養することができる。特に、従来の培養方法では筋サテライト細胞以外の細胞混入が問題となっていた、遅筋線維から単離した筋サテライト細胞についても、本発明の培養方法により筋細胞のみが純粋かつ大量に培養できる点は特筆すべきである。
【００２６】
したがって、一態様において本発明の培養方法は、遅筋線維から単離した筋サテライト細胞を培養することを含んでいてもよい。遅筋線維から単離した筋サテライト細胞は、例えばヒラメ筋から、上述した手法により単離することができる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明について実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら制限されるものではない。
〔実施例１〕ＮＧＭによる骨格筋初代培養細胞の培養
以下の組成で本発明の培養液（以下、ＮＧＭ（No Glucose Medium）という場合がある）を調整した。
ＮＧＭ：６７体積％無グルコースの基礎培地＋３０体積％ＦＢＳ＋１体積％抗生物質・抗真菌剤＋１体積％ニワトリ胚抽出物＋１体積％GlutaMAX：２．１ｍＭ  グルコース（ＦＢＳ由来のグルコースであり、０．３９ｇ／Ｌ）
そして、以下のようにして培養を行った。
【００２８】
マウスのヒラメ筋を傷つけずに摘出し、結合組織分解酵素処理によって筋線維を分散させた。顕微鏡下において単一筋線維を単離し、酵素処理を行って筋サテライト細胞を、上記培養液を用いた増殖培地で培養した。
【００２９】
また、比較対象として、以下のグルコース含有培養液（以下、ＨＧＭ（High Glucose Medium）という場合がある）を調整して、同様に培養を行った。
ＨＧＭ：６８体積％高グルコース（4.5 g/L）DMEM＋３０体積％ＦＢＳ＋１体積％抗生物質・抗真菌剤＋１体積％ニワトリ胚抽出物：１９．１ｍＭ  グルコース（ＦＢＳ由来のグルコースと高グルコースDMEM由来のグルコースの和であり、３．４５ｇ／Ｌ）
それぞれの増殖培地で７日間培養後、分化を誘導した。分化５日目に、骨格筋特異的な発現マーカーα−actininで免疫染色を行った。その結果、ＨＧＭ条件は、α−actininの発現がない細胞が増殖していた。しかし、ＮＧＭ条件では骨格筋以外の細胞の混入が観察されず、ヒラメ筋由来の骨格筋初代培養細胞を純粋に培養することに成功した。
【００３０】
続いて、骨格筋初代培養細胞が生体組織の性質を維持しているかを確認するために、マウス骨格筋組織と長指伸筋（EDL）とヒラメ筋（SOL）から単離した骨格筋初代培養細胞を用いて、収縮タンパク質MHC II（速筋線維）およびMHC I（遅筋線維）タンパク質の発現量をウェスタンブロッティング法によって比較した。収縮タンパク質に関しては骨格筋初代培養細胞においても速筋線維由来のものはMHC IIの発現量が有意に高く、遅筋線維由来のものはMHC Iの発現量が高かった。
【００３１】
増殖培地中のエネルギー基質を無くすことで、これまで困難とされていた遅筋タイプのヒラメ筋から他組織を排除して筋サテライト細胞を培養することが可能となった。また、長指伸筋およびヒラメ筋由来の初代培養細胞はそれぞれ速筋、遅筋の筋線維タイプを呈したことから、異なる筋線維タイプの初代培養細胞を確立することに成功した。
【００３２】
これらの結果を図１〜７に示す。
〔実施例２〕細胞増殖マーカーKi67の発現
マウスの長指伸筋（EDL）とヒラメ筋（SOL）から単離したサテライト細胞を実施例１と同様にＨＧＭとＮＧＭでそれぞれ６日間培養し、細胞増殖マーカーであるKi67の免疫染色を行った。Ki67は細胞の増殖を休止しているＧ０期以外（Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期）に発現するタンパク質であるため、細胞増殖の指標として用いられる。培養ウェル内における全細胞数をDAPI染色（DNA染色）によって計測し、Ki67陽性細胞数を計測した。Ki67陽性細胞数の割合は、ＨＧＭよりもＮＧＭで有意に高値を示し（図８、左図／ＥＤＬの結果のみ示す）、ＮＧＭで細胞増殖が促進することが示唆された。
【００３３】
また、同様にＨＧＭとＮＧＭで６時間培養した初代細胞を回収し、Ki67のタンパク質発現量をウェスタンブロッティングで定量した。ＨＧＭよりもＮＧＭで培養下条件では、ＥＤＬとＳＯＬともにKi67発現量は有意に増加していた（図８、右図）。
【００３４】
〔実施例３〕筋分化マーカーの発現
マウスの長指伸筋（EDL）とヒラメ筋（SOL）から単離したサテライト細胞を実施例１と同様にＨＧＭとＮＧＭでそれぞれ６日間培養し、細胞を回収した。筋細胞分化に必須な転写因子MyoDおよび、筋管細胞への後期分化を制御するMyogeninの発現量をウェスタンブロッティングで定量した。その結果、MyoDとMyogeninの発現量はＨＧＭよりもＮＧＭで培養した条件で有意に増加していた（図９、図１０）。ＮＧＭの培養は、初代細胞の正常な筋発生を促進させることが示唆された。
【００３５】
〔実施例４〕細胞増殖を促進するグルコース濃度
サテライト細胞の増殖を促進するグルコース濃度の閾値を決定するため、２．０ｍＭから１７．２ｍＭの範囲内でグルコース濃度を変えた培養液を調製した。この培養液でマウスの長指伸筋（EDL）から単離したサテライト細胞を６日間培養し、細胞増殖のマーカーであるKi67の陽性細胞数を計測した。
【００３６】
結果を図１１に示す。培養液のグルコース濃度が１０．６ｍＭを下回ると、Ki67陽性細胞数が増加することが示された。
〔実施例５〕ＤＧＭによる培養
実施例１〜４において、増殖培地の３０％体積量はFBS（ウシ胎児血清）であるため、グルコース不含の基礎培地で調製したＮＧＭにも約２ｍＭのグルコースが含まれている（FBSのグルコース濃度はロットによって異なるため、FBSを含む培養液中のグルコース濃度は若干変動する）。２ｍＭよりグルコース濃度を減少させた際の骨格筋初代細胞増殖能力の変化を検証するために、FBSのグルコースを酵素反応により分解させたＤＧＭ（Glucose Depleted Medium／グルコース枯渇培地）を調製した。
【００３７】
FBSのグルコースの分解は、次のように行った。グルコースオキシダーゼ（GOD）とカタラーゼをリン酸緩衝食塩水（PBS）にそれぞれ100 U/mM、3700 U/mL濃度で溶解し、それを９倍量の水溶性感光性樹脂BIOSURFINE（登録商標）-AWP（東洋合成工業）に溶かした。混合液をスライドガラスに塗布した後、302 nm紫外光を20分間照射することで酵素固定を行った。酵素固定化したスライドガラスをFBSに入れて４℃で３週間浸透させた。酵素分解によってグルコース濃度は7.22 mMから0.56 mMに低下した。さらにグルコース分解によって生成されるＨ２Ｏ２はカタラーゼによって完全に分解された。
【００３８】
ＤＧＭを、グルコースを分解したFBSを用いて以下の組成で調整した。
ＤＧＭ：６７体積％無グルコースの基礎培地＋３０体積％ＦＢＳ（グルコース分解）＋１体積％抗生物質・抗真菌剤＋１体積％ニワトリ胚抽出物＋１体積％GlutaMAX：０．０４〜０．１７ｍＭ  グルコース
また、比較のために、ＤＧＭにグルコースを添加してグルコース濃度を約２ｍＭに調整した培養液を調整した（ＤＧＭ＋グルコース、またはRescuedと記載することがある）。
【００３９】
結果を図１２に示す。ＤＧＭで骨格筋初代細胞を培養すると、６日後の細胞数はＮＧＭ（グルコース濃度約２ｍＭ）と同等であった。すなわち、ＮＧＭよりもグルコース濃度を下げても筋細胞の増殖は亢進されないことが示唆された。また、ＤＧＭにグルコースを添加した培養液においても、ＮＧＭと同等の細胞数であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2018000194.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
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