(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便な方法で胎盤組織を長期保存しておき、保存した胎盤組織からもＭＳＣなどの幹細胞を分離培養出来る有効な手段を提供する。【解決手段】生体より採取した胎盤組織を最大径が６ｍｍ以下になるように細切する工程、細切した前記胎盤組織を、凍結保護液に、胎盤組織重量／（胎盤組織重量＋凍結保護液重量）が１０〜５０ｗｔ％未満になるように浸漬する工程、胎盤組織と凍結保護液を容器に入れ、−８０℃以下の環境で凍結保存する工程を含む胎盤組織の保存方法、また、保存された胎盤組織を融解後、培養液で洗浄する工程、プロテアーゼ溶液で洗浄する工程、プロテアーゼ溶液中で胎盤組織を消化する工程を含む、凍結胎盤由来の幹細胞を調製する方法、さらに、前記調製された胎盤組織からの幹細胞を培養する方法。幹細胞が間葉系細胞である、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）生体より採取した胎盤組織を最大径が６ｍｍ以下になるように細切する工程
ｉｉ）細切した前記胎盤組織を、凍結保護液に、胎盤組織重量／（胎盤組織重量＋凍結保護液重量）が１０ｗｔ％以上５０ｗｔ％未満になるように浸漬する工程
ｉｉｉ）胎盤組織と凍結保護液を容器に入れ、−８０℃以下の環境で凍結保存する工程
を含む胎盤組織の保存方法。
【請求項２】
ｉｖ）請求項１に記載の方法で得られた凍結胎盤組織を融解後、培養液で洗浄する工程
ｖ）プロテアーゼ溶液で洗浄する工程
ｖｉ）プロテアーゼ溶液中で胎盤組織を消化する工程
を含む、凍結胎盤組織由来の幹細胞を調製する方法。
【請求項３】
プロテアーゼが、コラゲナーゼおよび／またはディスパーゼを含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
幹細胞が間葉系幹細胞である請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載の方法により得られた細胞懸濁液を培養基材に播種し、接着した幹細胞を培養することを特徴とする凍結胎盤組織由来の幹細胞の培養方法。
【請求項６】
前記培養基材が中空糸膜であることを特徴とする請求項５に記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胎盤組織の保存方法および凍結保存した胎盤組織から幹細胞を効率よく調製し、培養する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄液等に含まれている間葉系幹細胞（ＭＳＣ＝Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）は、増殖能が高く、骨、軟骨、筋肉、脂肪、肝細胞、神経細胞、心筋細胞、血管内皮細胞等、種々の細胞に分化することが知られており、再生医療、とくに細胞移植治療用の細胞源として有用性が多く報告され、一部では既に実用化されており、臨床応用が進められている。
【０００３】
ＭＳＣは、従来は主に骨髄液から培養し調製されていた。しかし近年、ＭＳＣの細胞源として骨髄以外の組織が脚光を浴びている。例えば、羊膜は、外胚葉由来の上皮細胞と中胚葉由来の間葉系細胞から構成される胚体外組織であり、多能性幹細胞としての特性を有する細胞群を含有することが確認されており、例えば、ヒト羊膜上皮由来幹細胞の肝細胞やインスリン産生細胞への分化、ヒト羊膜由来間葉系幹細胞の軟骨細胞や心筋細胞への分化が知られている（特許文献１）。また、臍帯は、外層を取り囲む羊膜とワルトンのゼリーと呼ばれる膠様組織及び臍動脈、臍静脈で構成される組織であり、ワルトンのゼリーには間葉系幹細胞が存在し、軟骨細胞、脂肪組織、骨に分化することが知られている（非特許文献１）。さらに、胎盤は、合胞体栄養細胞、Ｌａｎｇｈａｎｓ細胞、線維芽細胞、組織球、脱落膜細胞など多数の細胞が含まれ、これらの中でＣＤ５９陽性を示す細胞が幹細胞として有望である。
【０００４】
このように、臍帯、胎盤、羊膜など、胎児育成に関わる組織は、従来は分娩後に廃棄されていたが、幹細胞の豊富な組織であり、再生医療への応用が期待されている。
【０００５】
中でも胎盤は、大量のＭＳＣが調製可能であり、また胎盤由来ＭＳＣは、骨髄由来ＭＳＣよりも増殖性や免疫調整作用に優れているとされ、良質の幹細胞源として大いに有効利用が期待される。
【０００６】
胎盤からＭＳＣなどの幹細胞を調製する際は、専ら新鮮な組織を使用する。例えば、ＭＳＣの分離培養は、胎盤の洗浄（付着した血液、悪露等の除去）、細切、プロテアーゼ等による酵素処理、フィルターろ過、遠心操作、細胞播種操作等の一連の工程を連続して行い、速やかに細胞の培養工程へと移行する必要がある。
【０００７】
従って、入手した新鮮な胎盤組織が多量の場合、人手や時間が充分に無い場合、または培養の準備が出来ていない場合など、様々な理由により、得られた胎盤を細胞培養工程までの処理を終えることが出来ず、せっかく入手した新鮮な組織が充分利用されずに廃棄せざるを得ないケースが度々発生する。
【０００８】
このため、簡便な方法で胎盤を凍結、長期保存しておき、凍結保存した胎盤組織からもＭＳＣなどの幹細胞を分離培養出来る有効な手段が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００３−２３１６３９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｉｎｇ， １４（５）， ４４８−４５５（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、簡便な方法で胎盤組織を長期保存することができ、保存した胎盤組織からＭＳＣなどの幹細胞を分離培養可能な有効手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下に示す方法により、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
１．  ｉ）生体より採取された胎盤組織を最大径が６ｍｍ以下になるように細切する工程
ｉｉ）細切した前記胎盤組織を、凍結保護液に、胎盤組織重量／（胎盤組織重量＋凍結保護液重量）が１０ｗｔ％以上５０ｗｔ％未満になるように浸漬する工程
ｉｉｉ）胎盤組織と凍結保護液を容器に入れ、−８０℃以下の環境で凍結保存する工程
を含む胎盤組織の保存方法。
２．  ｉｖ）（１）に記載の方法で得られた凍結胎盤組織を融解後、培養液で洗浄する工程
ｖ）プロテアーゼ溶液で洗浄する工程
ｖｉ）プロテアーゼ溶液中で胎盤組織を消化する工程
を含む、凍結胎盤組織由来の幹細胞を調製する方法。
３．前記プロテアーゼが、コラゲナーゼおよび／またはディスパーゼを含む（２）に記載の方法。
４．前記幹細胞が間葉系幹細胞である（２）または（３）に記載の方法。
５．（２）〜（４）のいずれかに記載の方法により得られた細胞懸濁液を培養基材に播種し、接着した幹細胞を培養することを特徴とする凍結胎盤組織由来の幹細胞の培養方法。
６．前記培養基材が中空糸膜であることを特徴とする（５）に記載の培養方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、胎盤組織を安定して長期保存することができ、また凍結保存した胎盤組織から胎盤由来の幹細胞を高効率に分離培養することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】細胞培養装置の一例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において、胎盤組織（たいばんそしき）とは、胎児と母体の複合組織である胎盤を指す。胎盤は、胚および胎児の組織と母体の組織とが緊密に接着した複合組織であり、両者の間で物質の交換や細胞レベルの相互作用などの生理的に重要な役割を果たしている。
【００１７】
本発明において、生体より採取した胎盤組織は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）等を用いて洗浄した後、血管や結合組織を除去する。その後、前記胎盤組織を適度に細切れにする。細切れにする大きさは、取扱い性や冷却速度の均一化が図れるように全体の大きさを合わせるのが好ましく、本発明においては、最大径が６ｍｍ以下になるように鋏や鉗子を用いて細切れにする。より好ましくは、２〜５ｍｍである。
【００１８】
本発明において、胎盤組織の保存は、細分化した胎盤組織に凍結保護液を加えて凍結保存するのが好ましい。凍結保護液としては、市販のものを使用するのが簡便だが、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）やグリセリン、血清などを用いることも可能である。本発明においては、５ｗｔ％以上２０ｗｔ％未満のＤＭＳＯを含む培養液を用いるのが安価であり好ましい。ＤＭＳＯの添加量は、細胞種等に応じて前記範囲で調整すればよい。ＤＭＳＯは、滅菌済みのものを使用する必要がある。また、凍結保護液には、さらに血清を添加してもよい。胎盤組織と凍結保護液は、胎盤組織重量／（胎盤組織重量＋凍結保護液重量）が１０ｗｔ％以上５０ｗｔ％未満となるように混合するのが好ましい。また、凍結保護液は、胎盤組織に加える前に４℃前後に冷却しておくのが好ましい。
【００１９】
前記調製した凍結保護液を胎盤組織に加えて軽く懸濁した後、バイアル等の容器に移し、冷却を開始する。冷却温度（胎盤組織の保存温度）は、細胞の生存率が高くなるため低い方が好ましいが、設備やコストの面より−８０℃〜−１９６℃が好ましい。冷却速度は特に限定されないが、一例として、下記のような条件が例示される。冷却速度を適性に制御することにより、解凍後の細胞の生存率が高まるため好ましい。
（１）必要により、−２℃／ｍｉｎの速度で４℃まで冷却する。
（２）５〜１５分間、４℃で保持した後、−１℃／ｍｉｎの速度で−３０℃まで冷却する。
（３）５〜１５分間、−３０℃で保持した後、−５℃／ｍｉｎの速度で−８０℃まで冷却する。
（４）−８０℃まで冷却した後、−８０℃のフリーザーまたは液体窒素中で保存する。
【００２０】
このようにして保存された凍結胎盤組織は、必要に応じて解凍し、細胞培養を行い増殖を図ることができる。すなわち、フリーザー等から取り出した容器を予め３７℃前後の恒温槽に浸漬するなどして解凍する。凍結した内容物が溶けたら、恒温槽より取出し、内容物を予め４℃前後に冷却した培養液の入ったシャーレ等の容器に移す。容器を軽く揺すってすすいだ後、アスピレータ等を用いて上清を除去する。再度、容器に培養液を添加し、前記操作を繰返すことにより胎盤組織を洗浄する。なお、解凍操作が遅いと細胞の生存率が低下する原因となるため、前記操作は迅速に行うのが重要である。
【００２１】
続いて、洗浄後の胎盤組織にプロテアーゼ溶液を加えて、容器を軽く揺すってすすいだ後、アスピレータ等を用いて上清を除去する。洗浄した胎盤組織にプロテアーゼ溶液を添加した後、遠心チューブ等に移し、恒温槽中で振盪して胎盤組織を消化する。消化条件としては、３５〜３８℃で３０〜９０分間処理するのが好ましい。
【００２２】
本発明において、プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）は、好ましくは、コラゲナーゼタイプＩＩまたはディスパーゼ、またはコラゲナーゼとディスパーゼの混合液であり、その濃度はそれぞれ、好ましくは１〜２ｍｇ／ｍＬと３０００〜７０００単位／ｍＬ、より好ましくは１．３〜１．８ｍｇ／ｍＬと４０００〜６０００単位／ｍＬである。また、プロテアーゼによる処理温度は、好ましくは３５〜３７℃、処理時間は１〜３時間である。
【００２３】
前記消化して得られた組織懸濁液は、ガーゼろ過またはセルストレーナ（１００μｍメッシュ）を通過させ、夾雑成分を除去する。これを遠沈管に移し、１００〜３０００ｒｐｍで１〜１０分間遠心分離を行う。アスピレータ等を用いて上清（プロテアーゼ）を除去した後、残渣にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した培養液を注いで細胞を浮遊させる。添加するＦＢＳ濃度は、１〜２０ｖｏｌ％が好ましい。ＦＢＳ濃度が低すぎると、細胞の生育（増殖）不良が発生し易いため５ｖｏｌ％以上添加するのが好ましい。また、ＦＢＳ濃度が高すぎて問題となることは少ないが、過剰添加はコストアップに繋がるので、１５ｖｏｌ％以下がより好ましい。
【００２４】
これを培養プレートやシャーレ、中空糸膜等の培養基材に播種した後、接着した胎盤組織由来の幹細胞を定法により平面（２次元）培養し、増殖させる。培養基材としては、培養液交換の手間やコンタミのリスクを考慮すると、中空糸膜を用いるのが好ましい。
【００２５】
本発明において、培養液（培地）は、細胞を生育および増殖させるためのものであり、栄養素としてアミノ酸、ビタミン、無機塩および糖などが含まれている、いわゆる基礎培地を指す。このような培地としては、例えば、Minimum Essential Medium（MEM）、Basal Medium Eagle（BME）、Media199、Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）、α−Minimum Essential Medium（α-MEM）、Ham's F-10 Nutrient Mixture（Ham’s F-10）、Ham's F-12 Nutrient Mixture（Ham’s F-12）、RPMI 1640、L-15、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium（IMDM）、ES medium、MCDB 131 Medium、CMRL 1066 Media、DM-160 Medium、Fisher’s Medium、StemSpan Medium、StemPro Medium、Hybridoma Serum Free Medium（Hybridoma SFM）、mTeSR1（modified Tenneille Serum Replacer 1）、Essential 8、Repro FF/FF2/XF、StemSure（登録商標）、CELRENA、S-Mediumなど、市販の細胞培養液およびこれらの混合物を用いることができるが、これらに限定されない。
【００２６】
また、培養液には、血清を添加してもよい。血清は、ウシ血清、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウマ血清、ヒト血清などの血清を用いるのが好ましい。添加量としては、基礎培地に対して１ｖｏｌ％以上が好ましい。添加量が少なすぎると、細胞が生育および増殖しないので、５ｖｏｌ％以上添加するのがより好ましく、１０ｖｏｌ％以上添加するのがさらに好ましい。添加量を必要以上に増やしても培養コストが上昇するだけであり、２０ｖｏｌ％程度を上限とするのが好ましい。
【００２７】
本発明において、培養基材として用いる中空糸膜の材料は、細胞を膜表面に保持でき、溶液や低分子の物質を透過できるものであれば特に限定されず、例えば、酢酸セルロース、再生セルロース、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、エチレンビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル等が挙げられる。また、細胞の接着性や培養液との馴染みを改善するために、ポリビニルピロリドンやヒドロキシアルキルセルロース等の親水性高分子や、コラーゲンやフィブロネクチン等の細胞接着因子を併用しても良い。
【００２８】
培養基材として中空糸膜を用いる他のメリットとして、培養の省スペース化が挙げられる。そのため、中空糸膜の内径は１００〜１０００μｍが好ましく、膜厚は１０〜１５０μｍ程度が好ましい。
【００２９】
中空糸膜の孔径は、細胞は通過させないが、水、塩類、タンパク質などの培養液成分は通過させる孔径であればよく、培養という面を考慮すると物質交換の効率のよい比較的大きな孔径を有する方が好ましい。具体的には、平均孔径が０．００１〜０．５μｍ程度であることが好ましい。透水性は、好ましくは１０〜５０００ｍＬ／ｍ２／ｈｒ／ｍｍＨｇである。なお、本発明において、中空糸膜の構造は、特に限定されるものではなく、均質構造でもよいし、不均質（非対称）構造でもよい。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明の有効性について実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３１】
（細胞数の計測）
細胞を含む懸濁液を遠心分離操作により最終的に１ｍｌの培養液に懸濁した。この懸濁液とトリパンブルー染色液を１：１で混和した液を血球計算盤に添加し、顕微鏡下で細胞数の計測を行った。
１．血球計算盤およびカバーガラスの表面を７０％イソプロパノールで洗浄し、余分なイソプロパノールをふき取り風乾する。
２．Ｒｅａｇｅｎｔ ｇｒａｄｅ ｗａｔｅｒでカバーガラスの側面を濡らし、血球計算盤に貼りつける。
３．細胞懸濁液をパスツールピペット等でよく撹拌後、すぐに血球計算盤に流し込み、溝の上まで満たす。
４．前記１〜３の操作を別の血球計算盤を使用して行う（２回測定し平均をとる）。
５．顕微鏡に血球計算盤を置き、グリッドラインに焦点を合わせる（１０×対物レンズ）。
６．カウンターを用いて１ｍｍ２エリアの細胞数を速やかに計測する。
※誤差が生じやすいので正確に数えるために１００〜５００細胞になるように懸濁液を調製する。
計算方法：
Ｃ＝Ｎ×１０４
Ｃ：１ｍｌ当たりの細胞数
Ｎ：計測した細胞数の平均
１０４：１ｍｍ２に対する容量の変換値
全体の数＝Ｃ×Ｖ
Ｖ＝細胞を懸濁した液体の容量
【００３２】
（細胞増殖率の測定）
培養終了後の細胞培養容器（中空糸膜モジュール）より回収した生細胞数と初期の播種細胞数（１．０５×１０５）を用いて以下の式により細胞増殖率を算出した。
細胞増殖率（％）＝（回収した生細胞数−播種細胞数）／播種細胞数×１００
【００３３】
［実施例１］
（胎盤組織の凍結）
１．血液や余分な組織を取り除いた胎盤組織３ｇを、予め４℃に冷却した凍結保護液（１０ｗｔ％ＤＭＳＯ＋ＤＭＥＭ）１０ｍｌが入ったφ１００ｍｍのディッシュに入れた。
２．次に、すばやく胎盤組織をハサミで３〜５ｍｍ程度の大きさに細切にした。
３．２５ｍｌのディスポーザブルピペットで胎盤組織が浮遊した凍結保護液を吸引し、凍結保存用チューブ１０本に約１．５ｍｌずつ分注した。このとき、胎盤組織重量／（胎盤組織重量＋凍結保護液重量）は、２２．４ｗｔ％であった。
４．５〜１５分間、４℃で保持した後、−１℃／ｍｉｎの速度で−３０℃まで冷却した。
５．５〜１５分間、−３０℃で保持した後、−５℃／ｍｉｎの速度で−８０℃まで冷却した。
６．−８０℃のディープフリーザーに入れ、凍結保存した。
【００３４】
（凍結胎盤組織の融解、洗浄）
１．凍結保存チューブを−８０℃のディープフリーザーから取り出し、３７℃に温めた温水中ですばやく解凍した。
２．解凍した胎盤組織および凍結保護液を、予め４℃に冷却したＤＭＥＭ１０ｍｌを入れたφ１００ｍｍのディッシュに入れた。ディッシュを軽く揺すってすすいだ後、アスピレータで培地を吸引除去し、組織を洗浄した。
３．もう一度、４℃に冷却した１０ｍｌのＤＭＥＭを添加し、ディッシュを軽く揺すってすすいだ後、アスピレータで培地を吸引除去し、組織を洗浄した。
【００３５】
（凍結胎盤組織の消化）
１．前記洗浄操作に続き、１．５ｍｇ／ｍｌ濃度のコラゲナーゼタイプＩＩを含む５ｍｌのＤＭＥＭをディッシュに添加した。
２．ディッシュを軽く揺すってすすいだ後、アスピレータで培地を吸引除去した。
３．もう一度、１．５ｍｇ／ｍｌ濃度のコラゲナーゼタイプＩＩを含む５ｍｌのＤＭＥＭをディッシュに添加した。
４．得られた胎盤組織浮遊液を５０ｍｌ遠心チューブに移し、３７℃温浴中で６０分振盪し、胎盤組織を消化した。
【００３６】
（間葉系幹細胞の分離培養）
１．前記消化した胎盤組織液を１００μｍメッシュでろ過し、未消化の大きな組織を取り除き５０ｍｌチューブに入れた。
２．１０００ｒｐｍで５分間、遠心した。
３．上清を吸引除去し、沈渣を１０ｖｏｌ％になるようにＦＢＳを添加したＤＭＥＭに懸濁し、コラーゲンコートしたφ６０ｍｍのディッシュに播種し、７日間幹細胞を培養した。
【００３７】
［実施例２］
（中空糸膜の作製）
ポリエーテルスルホン（４８００Ｐ、住友化学社製）２０ｗｔ％、Ｎメチルピロリドン（三菱化学社製）３６ｗｔ％、トリエチレングリコール（三井化学社製）４４ｗｔ％を均一に溶解し、製膜原液を作製した。この原液を、７０℃に加温した円筒２重管ノズルから、中空形成剤としてＮメチルピロリドン１３．５ｗｔ％、トリエチレングリコール１６．５ｗｔ％、水７０ｗｔ％の水溶液とともに同時に吐出し、３００ｍｍの乾式部を通過させた後、７５℃の水中に浸漬し凝固させ、十分な水洗浄を実施した後に束に巻き取った。糸束は切断後、５０℃、５０％グリセリン水溶液に浸漬した後、過剰のグリセリン液を除き、６０℃にて通風乾燥させた。中空糸膜は、概ね内径２００μｍ、外径３００μｍ、膜厚５０μｍとなるように製膜原液および中空形成剤の吐出量を調整した。
【００３８】
（中空糸膜モジュールの作製）
試験用の中空糸膜モジュールを以下のように作製した。内径４ｍｍ、長さ１０ｃｍの円筒状のアクリル製モジュールケース内に、前記作製したポリエーテルスルホン製中空糸膜（培養基材）を１０本挿入した後、中空糸膜の中空部を閉塞しないようにポリウレタン系ポッティング剤で両末端をモジュールケースに固定し、中空糸膜モジュール（培養容器）を作製した。
【００３９】
（細胞培養の準備）
得られた中空糸膜モジュールを細胞培養容器として用い、図１に示すような細胞培養装置を構成した。まず、中空糸膜に付着しているグリセリンを除去するために、培養液貯留容器４、５に滅菌した注射用蒸留水を入れ、ポンプ６、７を起動し、中空糸膜モジュール内に充分量流して洗浄した。その後、培養液貯留容器４を、ＦＢＳを１０ｖｏｌ％になるように添加したＤＭＥＭが入ったものに交換した。また、培養液貯留容器５を、血清無添加でインスリン０．５μＭ、セレン１０ｎＭ、グルタミン酸２５０μＭを添加したＤＭＥＭが入ったものに交換した。この後、ポンプ６、７を起動してプライミング処理を行い、中空糸膜モジュール３内の水を培養液に置換した。
【００４０】
（細胞培養実験）
実施例１と同様にして得た細胞懸濁液を、中空糸膜の中空部側に充填して１晩放置し、中空糸膜内表面に細胞を接着させた。培養液貯留容器４を培養液のみの容器に交換した後、中空糸膜の中空部側の流速０．３３ｍｍ／ｍｉｎ、中空糸膜の外側の流速３．４６ｍｍ／ｍｉｎで送液を開始した。この時、中空糸膜の中空部側に通液する培養液は、ＦＢＳを１０ｖｏｌ％になるように添加したＤＭＥＭを用い、中空糸膜の外側に通液する培養液は、血清無添加でインスリン０．５μＭ、セレン１０ｎＭ、グルタミン酸２５０μＭを添加したＤＭＥＭを用いた。なお、本細胞培養実験は、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃、７日間行った。
【００４１】
（中空糸膜モジュールからの細胞回収）
７日間培養後、培養液の潅流を停止し、中空糸膜モジュール内にて増殖した細胞を回収した。即ち、培養液の潅流を停止した後、中空糸膜の中空部側および外側に存在する培養液を除去するため、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を一定時間潅流させ、培養液を十分ＰＢＳに置換した。次に、ＰＢＳを除去し、０．２５％トリプシン溶液（ライフテクノロジーズ社製）を中空糸膜の中空部側と外側へ静かに充填し、室温で１５分間インキュベートした。この後、培養液を中空糸膜の中空部側へ流し入れ、流し出した細胞を回収した。
【００４２】
（脂肪細胞への分化）
脂肪細胞への分化は、Ｇｉｍｂｌｅ ＪＭ., ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ. ５８. ３９３−４０２（１９９５）の記載を参考にして、下記の方法で調べた。
【００４３】
凍結胎盤組織から分離培養した間葉系幹細胞をＤＭＥＭ（１０ｖｏｌ％ＦＢＳ添加）に細胞密度（５０００〜１００００細胞／ｃｍ２）で２４ウェル培養プレートに播種して１晩培養し、細胞をプレートに接着させた。細胞を２群に分け、一方の群の培地を脂肪細胞誘導用基礎培地（Ｌｏｎｚａ社）にインドメタシン（最終濃度６０μＭ）、ＩＢＭＸ（３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ １−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ、最終濃度０．５ｍＭ）、ヒドロコルチゾン（最終濃度０．５μＭ）を添加した脂肪細胞分化誘導培地に入れ換え、３〜４日毎に培地交換をしながら５週間培養を行った。この群を脂肪細胞誘導群とした。もう一方の群については、培地を新しいＤＭＥＭ（１０ｖｏｌ％ＦＢＳ添加）に入れ換え、３〜４日毎に培地交換しながら５週間培養を行った。この群をコントロール群とした。
【００４４】
脂肪細胞に分化した細胞は、細胞内に脂肪滴が観察される。そこで、培養後、両群の細胞をオイルレッドＯ染色（リピットアッセイキット，プライマリーセル社）によって染色して中性脂肪の有無を確認した。しかし、いずれの群においても中性脂肪の染色は認められなかった。また、染色後、抽出液（リピットアッセイキット，プライマリーセル社）を用いてオイルレッドＯ色素を抽出し、抽出液の５４０ｎｍにおける吸光度を両群で比較したが、両群間で有意な差は認められなかった。
【００４５】
次いで、脂肪細胞分化マーカーの１つであるＬｉｐｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｐａｓｅの発現量の変化を調べた。ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）により各群の細胞から全ＲＮＡを抽出して全ＲＮＡ抽出液を調製し、次いでマルチモードプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）を用いて全ＲＮＡ抽出液に含まれるＲＮＡ濃度を測定した。ＲＮＡ濃度測定後、ＴａｑＭａｎＴＭ ＲＮＡ−ｔｏ−ＣＴＴＭ １−Ｓｔｅｐキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてＰＣＲ反応液を調製し、各群の全ＲＮＡ２５ｎｇを鋳型とし、〔（４８℃／１５ｍｉｎ）×１サイクル、（９５℃／１０ｍｉｎ）×１サイクル、（９５℃／１５ｓｅｃ、６０℃／１ｍｉｎ）×４０サイクル〕のＰＣＲ条件下でリアルタイムＰＣＲを行い、Ｌｉｐｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｐａｓｅ遺伝子とβアクチン遺伝子を増幅させた。ＰＣＲプライマーには、Ｌｉｐｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｐａｓｅプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社／Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｈｓ００１７３４２５＿ｍ１）及びβアクチンプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社／Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｈｓ９９９９９９０３＿ｍ１）をそれぞれ用いた。
【００４６】
その結果、Ｌｉｐｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬｉｐａｓｅのＣｔ値（Ｔｈｒｅａｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）は、コントロール群では３９．３、脂肪分化誘導群では３６．０であり、脂肪分化誘導群ではコントロール群と比較してＬＰＬのＣｔ値が若干低いことが判明した。これらの結果は、脂肪分化誘導群において、細胞内に中性脂肪を蓄積した脂肪球の存在は確認できないものの、脂肪細胞分化マーカーの１つであるＬｉｐｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｐａｓｅの発現量が増加したことを示すものであり、胎盤組織由来の幹細胞（ＭＳＣ）が、脂肪細胞への分化能を弱いながらも有することを示すものである。
【００４７】
（骨芽細胞への分化）
骨芽分化能は、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ ＭＦ．，ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ. ２８４，１４３−７（１９９９），Ｃｏｌｔｅｒ Ｄｃ．，ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ. ９８，７８４１−５（２００１）の記載を参考にして下記の方法で調べた。
【００４８】
上記軟骨分化能の測定で使用したのと同じ手法で調製した凍結胎盤組織から分離培養した間葉系幹細胞を、ＤＭＥＭ（１０ｖｏｌ％ＦＢＳ添加）に細胞密度（５０００〜１００００細胞／ｃｍ２）で４８ウェル培養プレートに播種して１晩培養した。細胞を２群に分け、一方の群の培地を、骨芽細胞分化用基礎培地（Ｌｏｎｚａ社）にデキサメタゾン、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸塩、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＭＣＧＳ、β−グリセロフォスフェートを含む骨芽細胞分化用添加因子セット（Ｌｏｎｚａ社）を添加した骨芽細胞分化誘導培地に入れ換え、３〜４日毎に培地交換しながら３週間分化培養を行った。この群を骨芽細胞誘導群とした。もう一方の群については、培地を新しいＤＭＥＭ（１０ｖｏｌ％ＦＢＳ添加）に入れ換え、３〜４日毎に培地交換しながら３週間培養を行った。この群をコントロール群とした。培養後、細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、各ウェルに０．２ｍＬのＰＢＳと０．２ｍＬの２Ｍ塩酸を添加し３７℃で１時間静置して細胞内に蓄積したカルシウムを細胞から遊離させた。遊離したカルシウム濃度を、カルシウムＥ−テストワコー（和光純薬社）を用いて定量した。その結果、遊離カルシウム濃度は、コントロール群が１．５３ｍｇ／ｄＬであるのに対し、骨芽分化誘導群では２４．８８ｍｇ／ｄＬと高値を示した。
【００４９】
この結果は、凍結胎盤組織から分離培養した間葉系幹細胞が、骨芽細胞分化誘導培地で培養することにより骨芽細胞へ分化して、細胞内にカルシウムが蓄積することを示すものであり、凍結胎盤組織から分離培養した間葉系幹細胞が骨芽細胞への分化能を有することを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明により、簡便な方法で胎盤組織を長期保存しておき、保存した胎盤組織から間葉系幹細胞などの幹細胞が効率よく分離培養可能となる。これにより、再生医療に用いる細胞源として胎盤組織を有効活用することが可能となる。
【符号の説明】
【００５１】
１ａ、１ｂ    出入口（中空部側）
２ａ、２ｂ    出入口（外腔側）
３            細胞培養容器（中空糸膜モジュール）
４、５        培養液貯留容器
６、７        送液ポンプ
８、９    廃液回収容器（細胞回収容器）
【図１】
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