(57)【要約】【課題】基材と、前記基材の複数の凹部に収容されている生体材料に関する情報を記憶する記憶手段との対応付けが保証されている容器の提供。【解決手段】複数の凹部を有する基材と、基材に設けられ、基材を認識するための認識手段と、基材に、複数の凹部に収容されている生体材料に関する情報を記憶する記憶手段と、を有し、認識手段と記憶手段とが対応付けられている容器である。【選択図】図１
2018093863.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の凹部を有する基材と、
前記基材に設けられ、前記基材を認識するための認識手段と、
前記基材に、前記複数の凹部に収容されている生体材料に関する情報を記憶する記憶手段と、を有し、
前記認識手段と前記記憶手段とが対応付けられていることを特徴とする容器。
【請求項２】
複数の凹部を有する複数の基材と、
前記複数の基材にそれぞれ設けられ、前記複数の基材をそれぞれ認識するための複数の認識手段と、
前記複数の基材に、前記複数の凹部に収容されている生体材料に関する情報を記憶する記憶手段と、を有し、
前記複数の認識手段と前記記憶手段とが対応付けられていることを特徴とする容器。
【請求項３】
前記生体材料が、少なくとも細胞である請求項１から２のいずれかに記載の容器。
【請求項４】
前記生体材料が、少なくとも特定の塩基配列を有するＤＮＡである請求項３に記載の容器。
【請求項５】
前記記憶手段に記憶される前記生体材料に関する情報が、前記特定の塩基配列のコピー数である請求項４に記載の容器。
【請求項６】
前記生体材料の数が計数された既知数である請求項３から４のいずれかに記載の容器。
【請求項７】
前記複数の記憶手段に記憶される前記生体材料に関する情報として、前記複数の凹部毎に、前記生体材料の数が計数された前記既知数である請求項６に記載の容器。
【請求項８】
前記認識手段が、認識部及び認識表示の少なくともいずれかである請求項１から７のいずれかに記載の容器。
【請求項９】
前記基材が、前記認識部及び前記認識表示を有し、
前記認識部及び前記認識表示と前記記憶手段とが対応付けられている請求項８に記載の容器。
【請求項１０】
前記認識部が、バーコード、ＱＲコード（登録商標）及びＲＦＩＤの少なくともいずれかである請求項８から９のいずれかに記載の容器。
【請求項１１】
前記認識表示が、文字、記号、図形、及び色の少なくともいずれかである請求項８から１０のいずれかに記載の容器。
【請求項１２】
前記認識手段が、前記凹部の内側及び前記凹部の外周縁部以外の部位に設けられている請求項１から１１のいずれかに記載の容器。
【請求項１３】
前記認識手段が、前記基材の複数箇所に設けられている請求項１から１２のいずれかに記載の容器。
【請求項１４】
前記記憶手段が、前記基材から着脱可能に設けられている請求項１から１３のいずれかに記載の容器。
【請求項１５】
前記記憶手段が、前記基材に結合部材により取り付けられている請求項１から１４のいずれかに記載の容器。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれかに記載の容器を含むことを特徴とする校正用標準プレート。
【請求項１７】
複数の凹部を有する基材と、
前記基材に、前記複数の凹部に収容されている生体材料に関する情報を記憶する記憶手段と、を有し、
前記生体材料は、特定の塩基配列を含む核酸を含み、前記生体材料に関する情報が前記核酸のコピー数及び前記核酸のコピー数の不確かさの情報を有することを特徴とする容器。
【請求項１８】
前記核酸のコピー数の不確かさの情報が、前記核酸を含む細胞を前記容器に配置する手段、前記細胞の細胞周期、前記容器の凹部内に配置された細胞数、及び前記容器の凹部内の目的の核酸のコンタミネーションの少なくともいずれかである請求項１７に記載の容器。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載の容器を用いて分析装置を校正する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ関連産業、ライフサイエンス産業、及び医療産業等において好適に使用される容器及び校正用標準プレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、生物学的物質及び試料の使用、組織化、保存、追跡、検索、分析、並びにこれらのプロセスの自動化する目的で、生物学的物質及び試料に関連するデータを保存、追跡、及び検索するためのシステムが提案されている（例えば、特許文献１参照）。
また、生物学的物質を保存や分析するＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応；Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）プレートのような容器と、分析された生物学的物質のデータを保存、追跡、及び検索するための読み取り装置などが提案されている。
また、血液パックの内容物を追跡するための情報を記憶する記憶手段を有する血液パック、血液パック容器の成型時には記憶手段を設けておくことが困難であり、血液パック容器が熱等を受けるのを避けるために、記憶手段を着脱可能とする方法が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、基材と、基材の複数の凹部に収容されている生体材料に関する情報を記憶する記憶手段との対応付けが保証されている容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決するための手段としての本発明の容器は、複数の凹部を有する基材と、
基材に設けられ、基材を認識するための認識手段と、
基材に、複数の凹部に収容されている生体材料に関する情報を記憶する記憶手段と、を有し、
認識手段と記憶手段とが対応付けられていることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によると、基材と、基材の複数の凹部に収容されている生体材料に関する情報を記憶する記憶手段との対応付けが保証されている容器を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、本発明の容器の一例を示す概略斜視図である。
【図２】図２は、本発明の容器の他の一例を示す概略斜視図である。
【図３】図３は、本発明の容器の他の一例を示す概略斜視図である。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の容器の他の一例を示し、表面から見た概略斜視図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明の容器の他の一例を示し、裏面から見た概略斜視図である。
【図５】図５は、本発明の容器の他の一例を示す概略斜視図である。
【図６】図６は、本発明の容器の他の一例を示す概略斜視図である。
【図７】図７は、本発明の容器の他の一例を示す概略斜視図である。
【図８】図８は、本発明の複数の基材に設けられた複数の認識手段と記憶手段とを有する容器の一例を示す概略斜視図である。
【図９】図９は、ＤＮＡ複製済みの細胞の頻度と、蛍光強度との関係の一例を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（容器）
本発明の容器は、第１の形態では、複数の凹部を有する基材と、
基材に設けられ、基材を認識するための認識手段と、
基材に、複数の凹部に収容されている生体材料に関する情報を記憶する記憶手段と、を有し、
認識手段と記憶手段とが対応付けられており、更に必要に応じてその他の部材を有する。
【０００８】
また、本発明の容器は、第２の形態では、複数の凹部を有する複数の基材と、
複数の基材にそれぞれ設けられ、複数の基材をそれぞれ認識するための複数の認識手段と、
複数の基材に、複数の凹部に収容されている生体材料に関する情報を記憶する記憶手段と、を有し、
複数の認識手段と記憶手段とが対応付けられており、更に必要に応じてその他の部材を有する。
【０００９】
本発明の容器は、従来技術では、基材を認識するための認識手段と、基材の凹部に収容されている生体材料に関する情報を記憶する記憶手段との対応付けが保証されていないという知見に基づくものである。
【００１０】
本発明においては、基材に設けられ、基材を認識するための認識手段と、基材に、複数の凹部に収容されている生体材料に関する情報を記憶する記憶手段とが対応付けられているので、基材を分析装置へ、記憶手段を読み取り装置へセットすることにより、両者を確実に対応付けることができ、安全かつ確実に分析や検査などを行うことができる。即ち、例えば、本発明の容器を校正用標準プレートとして用いる場合には、基材と、基材の凹部に収容されている生体材料に関する情報が必ず一致していなければならない。特に、基材を大量生産する場合には、誤った対応付けをしてしまう可能性があるが、そのことを確実に防止することができる。また、本発明の容器を校正用標準プレートとして用いて分析装置の校正を行う場合には、校正データをパソコン（ＰＣ）上で解析できるので、誤った対応付けを確実に防止することができる。
【００１１】
＜認識手段＞
認識手段は、基材に設けられ、基材を認識するための手段である。
認識手段としては、認識部及び認識表示の少なくともいずれかであることが好ましい。
認識部としては、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、及びＲＦＩＤ（Ｒａｄｉｏ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）の少なくともいずれかであることが好ましい。これらの中でも、基材を大量生産する場合には、無線通信で対応付けが行えるＲＦＩＤが好ましい。また、基材を分析装置に挿入した場合にも、無線通信で対応付けが行える点から、ＲＦＩＤが好ましい。
認識手段の数は、基材に１つ設けることもできるが、凹部の数に対応させて複数設けることもできる。
認識手段を設ける位置は、認識手段が無線で通信するＲＦＩＤの場合には、通信距離が数十メートル以内なので、認識手段は読み取り装置に近い位置に設けることが好ましい。
【００１２】
認識表示としては、文字、記号、図形、及び色の少なくともいずれかであることが好ましい。これらの中でも、数字が特に好ましい。認識表示は、認識部に比べて、作成コストが低く、認識部の情報を読取る読み取り装置が必要なく、目視で認識することができる点が好ましい。
認識手段は、凹部の内側以外の部分及び凹部の外周縁部以外の部分に設けられていることが好ましい。
なお、第２の形態の容器のように、複数の基材を用いる場合には、複数の基材をそれぞれ認識するための複数の認識手段が複数の基材にそれぞれ設けられている。
【００１３】
＜記憶手段＞
記憶手段は、基材の測定領域以外の部位に、複数の凹部に収容されている生体材料に関する情報を記憶する手段である。なお、基材の測定領域とは、測定対象物を保持可能な凹部（ウェル）部分（複数の凹部を基材が有する場合はそれら凹部間も含む）である。
記憶手段としては、例えば、メモリ、ＩＣチップなどが挙げられる。
基材の測定領域以外の部位としては、測定する領域以外の部位であれば、基材の内部であっても基材の外部であってもよい。
記憶手段は、基材から着脱可能に設けられていることが好ましい。記憶手段の着脱方法としては、基材と記憶手段の境界部にミシン目を設けておくことにより、必要に応じてミシン目に沿って記憶手段を切り離すことができる。これにより、基材を分析装置に挿入する際には、記憶手段を基材から切り離して、切り離した記憶手段を読み取り装置に入れて、両者を対応付けすることができる。
記憶手段は、結合部材により基材に取り付けられていることが好ましい。これにより、記憶手段の紛失を防止することができる。結合部材としては、例えば、紐、磁石などが挙げられる。
【００１４】
凹部に収容される生体材料に関する情報としては、例えば、分析結果（活性値、発光強度等）、生体材料の数（例えば、細胞の数）、細胞の生死、特定塩基配列のコピー数、複数の凹部のうちどの凹部に生体材料である細胞が収容されているのか、凹部のどの位置に細胞が存在しているか、細胞の種類、測定日時、測定者などが挙げられる。
これらの生体材料に関する情報の中でも、生体材料の数、特定の塩基配列のコピー数が好ましい。
生体材料に関する情報として生体材料の数が計数された既知数であることが好ましい。
生体材料が核酸（や特定の塩基配列を含む核酸）の場合、その核酸の分子数（やコピー数）の既知数の確からしさ（または不確かさ）情報を有することが好ましい。
複数の記憶手段に記憶される生体材料に関する情報として、複数の凹部毎に、生体材料の数が計数された既知数であることが好ましい。
生体材料の数は、例えば、後述する液滴分注計数装置により測定することができる。
【００１５】
認識手段としての認識表示を基材に書き込む方法としては、例えば、認識表示を基材に直接印字する方法、認識表示を印字したシールを基材に貼り付ける方法などが挙げられる。
認識手段としての認識部に認識情報を書き込む方法としては、例えば、手入力、書き込み装置による記憶などが挙げられる。
記憶手段に基材の凹部に収容されている生体材料に関する情報を書き込む方法としては、手入力、基材の凹部に生体材料を分注すると共に、基材の凹部の生体材料の個数を計数する液滴分注計数装置から直接データを書き込む方法、サーバに保存されているデータの転送、クラウドに保存されているデータの転送などが挙げられる。これらの中でも、液滴分注計数装置から直接データを書き込む方法が好ましい。
液滴分注計数装置における液滴吐出手段の動作方式としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、圧電素子を用いた圧電加圧方式、ヒータを用いたサーマル方式、静電引力によって液を引っ張る静電方式等によるインクジェットヘッドなどが挙げられる。
液滴分注計数装置としては、例えば、特願２０１６−１２２６０号明細書、特願２０１６−１３２０２１号明細書などを参照することができる。
【００１６】
認識手段としての認識表示の読み取りは、目視、基材を分析装置に装着した際に、装置に内蔵している読み取り機構により行うことができる。また、分析装置の外部にある読み取り装置を用いることもできる。
認識手段としての認識部の認識情報の読み取りは、基材を分析装置に装着した際に、分析装置に内蔵している読み取り機構により行うことができる。また、分析装置の外部にある読み取り装置を用いることもできる。
記憶手段に記憶されている情報の読み取りは、外部の情報読み取り装置を用いて行うことができ、基材を分析装置に装着した際に、装置に内蔵している読み取り機構により行うことができる。
【００１７】
認識手段と記憶手段との対応付け方法は、認識手段が認識表示である場合には、記憶手段にも認識手段と同じ認識表示を記憶させることで行われる。記憶手段における認識表示の記憶は、認識表示を直接印字する方法、認識表示を記載したシールを貼り付ける方法などが挙げられる。
一方、認識手段が認識部である場合には、認識部の認識情報を記憶手段が記憶することで行われる。記憶手段における認識部の情報の記憶は、手入力、書き込み装置による書き込みなどが挙げられる。
【００１８】
なお、基材を分析装置に装着した際に読み込んだ認識手段としての認識部の認識情報と、記憶手段に記憶されている基材の情報とを照合させることもできる。これにより、認識手段と記憶手段との対応付けが正確にできているか否かを確認することができる。
【００１９】
−生体材料−
生体材料としては、例えば、（１）微生物、（２）ヌクレオチドを構成成分として含む物質、（３）アミノ酸を構成成分として含む物質、（４）細胞などが挙げられる。
【００２０】
（１）微生物としては、例えば、大腸菌、枯草菌、乳酸菌、好熱性菌等の細菌、ラン藻等の原核生物；酵母（例えば、パン酵母、ビール酵母等）、カビ（例えば、アオカビ等）、藻類（例えば、緑藻、褐藻、紅藻等）等の真核生物；ウイルス（例えば、レトロウイルス、カゼウイルス、アデノウイルス、ノロウイルス等）、ファージ；原虫（例えば、線虫等）等の微小な生物などが挙げられる。これらの中でも、細菌、酵母、藻類、ウイルスが好ましく、酵母がより好ましい。これらは、天然に存在するものであってもよいし、或いは、遺伝子組換技術を利用して製造されたものでもよい。
【００２１】
（２）ヌクレオチドを構成成分として含む物質としては、リボヌクレオチドを構成成分とするＲＮＡ（リボ核酸）、デオキシリボヌクレオチドを構成成分とするＤＮＡ（デオキシリボ核酸）等の核酸、これら核酸の断片、あるいはこれら核酸又はその断片のアナログなどが挙げられる。
これらは、長さや一本鎖及び二本鎖の別を問わず、例えば、プライマー、プローブ、ｓｉＲＮＡｓ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ）などとして使用される比較的短鎖のオリゴ又はポリヌクレオチド；遺伝子（ｍＲＮＡも含まれる）やプラスミド等の長鎖のポリヌクレオチドなどが挙げられる。
核酸又は核酸断片のアナログとしては、核酸又は核酸断片に非核酸成分を結合させたもの、核酸又は核酸断片を蛍光色素や同位元素等の標識剤で標識したもの（例えば、蛍光色素や放射線同位体で標識されたプライマーやプローブ）、核酸又は核酸断片を構成するヌクレオチドの一部の化学構造を変化させたもの（例えば、ペプチド核酸など）などが挙げられる。これらは、生物から得られる天然物であっても又はそれらの加工物であってもよく、或いは、遺伝子組換技術を利用して製造されたものでも、また化学的に合成されたものでもよい。
【００２２】
（３）アミノ酸を構成成分として含む物質としては、アミノ酸を構成成分とするペプチド、蛋白質、又はこれらの誘導体などが挙げられる。ペプチドや蛋白質を構成するアミノ酸の種類、蛋白質の立体構造については、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
蛋白質には、アミノ酸のみから構成される単純蛋白質、単純蛋白質に非タンパク物質が結合した複合蛋白質、複数個の単純蛋白質、及び複合蛋白質がサブユニットとして会合した高分子物質などが挙げられる。単純蛋白質としては、例えば、アルブミン、グロブリン、プロラミン、グルテリン、ヒストン、プロタミン、硬タンパク質などが挙げられる。複合蛋白質としては、例えば、ヘモグロビン等の色素蛋白質、糖質と結合した糖蛋白質、脂
質と結合したリポ蛋白質、核酸と結合した核蛋白質、リンと結合したリン蛋白質、金属と結合した金属蛋白質などが挙げられる。
蛋白質の種類については、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分子の形状により分類される繊維状タンパク質（例えば、ケラチン、コラーゲン、フィブロイン等）や球状タンパク質；局在性により分類される細胞内タンパク質、膜タンパク質、分泌タンパク質、血液タンパク質；機能により分類される酵素タンパク質、ホルモンタンパク質、受容体タンパク質、免疫タンパク質（抗体など）、分子量マーカー蛋白質などが挙げられる。
蛋白質の誘導体には、単純蛋白質や複合蛋白質が一部分加水分解を受けたもの、熱により凝固したもの（凝固蛋白質）、上記蛋白質に非蛋白物質を結合させたもの（例えば、蛋白質を蛍光色素や同位元素等で標識したもの）、アミノ酸残基の側鎖の化学構造を変化させたもの等が含まれる。また、ペプチドの誘導体には、ペプチドに非ペプチドを結合させたもの（例えば、ペプチドを蛍光色素や同位元素等で標識したもの）、アミノ酸残基の側鎖の化学構造を変化させたものなどが挙げられる。具体例としては、例えば、抗体と酵素を化学的に架橋して得られる抗体酵素複合体（例えば、抗ジゴケシゲニン（ＤＩＧ）−アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）結合抗体）や抗体蛍光色素複合体などが挙げられる。
これらの蛋白質、ペプチド又はこれらの誘導体は、生物から得られる天然物又はそれらの加工物であってもよく、或いは、遺伝子組換技術を利用して製造されたものでも、また化学的に合成されたものでもよい。これらの中でも、抗体、酵素、血液蛋白質、分子量マーカー蛋白質、抗体酵素複合体、抗体蛍光色素複合体を好適に例示することができる。
【００２３】
（４）細胞としては、生物（動物又は植物）から得られる天然の細胞、株化細胞、及び組換え遺伝子を含む形質転換細胞が含まれる。
動物細胞としては、例えば、遺伝子組換技術で汎用される各種の細胞（例えば、マウス繊維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ、サルＣＯＳ細胞等）、又はこれらの形質転換細胞などが挙げられる。
植物細胞としては、例えば、遺伝子組換技術で汎用される各種の細胞、又はこれらの形質転換細胞などが挙げられる。
【００２４】
これらの生体材料の中でも、細胞、特定の塩基配列を有するＤＮＡが特に好ましい。
【００２５】
＜基材＞
基材としては、その材質、形状、大きさ、構造などについて特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
基材の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、半導体、セラミックス、金属、ガラス、石英ガラス、プラスチックスなどが挙げられる。
基材の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、板状、プレート状などが好ましい。
基材の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、単層構造であっても複数層構造であっても構わない。
基材に設ける凹部の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平底、丸底、Ｕ底、Ｖ底などが挙げられる。
基材に設ける凹部の数は、複数であり、２つ以上が好ましく、５つ以上がより好ましく、５０つ以上が更に好ましい。
基材としては、具体的には、マルチウェルプレートが好適である。マルチウェルプレートとしては、２４、４８、９６、３８４、又は１,５３６のウェルプレートが挙げられる。なお、プレート状ではなく、８連チューブ等の連結タイプのウェルチューブであってもよい。
【００２６】
＜その他の部材＞
その他の部材としては、例えば、複数の凹部を覆蓋する蓋部材、被覆シートなどが挙げられる。
【００２７】
本発明の容器は、基材と、基材の複数の凹部に収容されている生体材料に関する情報を記憶する記憶手段との対応付けが保証されているので、バイオ関連産業、ライフサイエンス産業、及び医療産業等において幅広く使用され、例えば、ＰＣＲプレート、細胞培養プレート、校正用標準プレートなどに好適に用いられる。
【００２８】
（ＰＣＲプレート）
本発明のＰＣＲプレートは、本発明の容器を含み、更に必要に応じてその他の部材を含む。
凹部に収容されている生体材料が、特定の塩基配列を有するＤＮＡであることが好ましい。
ＰＣＲプレートにおいては、基材と、基材の凹部に収容された生体材料に関する情報とが必ず一致しているので、安全かつ確実にＰＣＲを実施することができる。なお、特定塩基配列は、複数種類含んでいてもよい。
【００２９】
（細胞培養プレート）
本発明の細胞培養プレートは、本発明の容器を含み、更に必要に応じてその他の部材を含む。
凹部に収容されている生体材料が、細胞であることが好ましい。
細胞の数が計数されており、既知であることが好ましい。
細胞培養プレートにおいては、基材と、基材の凹部に収容された生体材料に関する情報とが必ず一致しているので、安全かつ確実に細胞培養を実施することができる。なお、細胞種は、複数種類含んでいてもよい。
【００３０】
（校正用標準プレート）
本発明の校正用標準プレートは、本発明の容器を含み、更に必要に応じてその他の部材を含む。
校正用標準プレートにおいては、基材と、基材の凹部に収容された生体材料に関する情報とが必ず一致しているので、安全かつ確実に分析装置を校正することができる。
凹部に収容されている生体材料が、細胞、特定の塩基配列を有するＤＮＡなどであることが好ましい。
凹部に収容された生体材料に関する情報としては、例えば、細胞の数、特定塩基配列のコピー数などが挙げられる。なお、細胞種や特定塩基配列は、それぞれ、複数種類含んでいてもよい。
【００３１】
ここで、本発明の容器の実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。なお、各図面において、同一構成部分には同一符号を付し、重複した説明を省略する場合がある。また、下記構成部材の数、位置、形状等は本実施の形態に限定されず、本発明を実施する上で好ましい数、位置、形状などにすることができる。
【００３２】
＜第１の実施形態＞
図１は、本発明の容器の一例を示す概略図である。この図１の容器１０は、複数の凹部２を有する基材１と、基材１に設けられ、基材１を認識するための認識手段としての認識部３と、基材１の測定領域以外の部位（外部）に、複数の凹部２に収容されている生体材料に関する情報を記憶する記憶手段４と、を有している。
基材１は、１６個の凹部２が設けられたポリプロピレン樹脂製のマルチウェルプレートである。
なお、図１では、１６個のマルチウェルプレートについて説明しているが、ウェルの数が２４個、４８個、９６個、又は３８４個のマルチウェルプレートについても同様に適用することができる。
【００３３】
認識手段としての認識部３は、基材１と記憶手段４とを対応付けるものである。これにより、基材１と、基材１の凹部２に収容されている生体材料に関する情報を記憶する記憶手段４との対応付けを保証することができる。
認識手段としての認識部３としては、例えば、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、ＲＦＩＤなどが挙げられる。これらの中でも、基材１を大量生産する場合などは、無線通信で対応付けが行えるＲＦＩＤが好ましい。また、基材１を分析装置等に挿入する場合にも、無線通信で対応付けられるので、ＲＦＩＤの方が好ましい。
認識手段としての認識部３は、図４Ａに示すように、基材１に設ける凹部２の数に応じて、複数設けることができる。また、図４Ｂに示すように、基材１の裏面にも認識部３を複数個設けることができる。
【００３４】
記憶手段４に生体材料に関する情報を書き込む方法としては、手入力、基材１の凹部２に生体材料を分注すると共に、凹部２内の生体材料の個数を計数する液滴分注計数装置から直接データを書き込む方法、サーバに保存されているデータの転送、クラウドに保存されているデータの転送などが挙げられる。
認識手段と記憶手段との対応付けは、認識手段としての認識部３の情報を記憶手段４が記憶することにより行われる。記憶手段４による認識部３の情報の記憶は、手入力でも自動入力であってもよい。
【００３５】
記憶手段４は、図１に示すように、基材１と記憶手段４とが切り離された状態であっても、図２に示すように、基材１と記憶手段４とが着脱可能に結合されていてもよい。
記憶手段４の着脱方法としては、基材１と記憶手段４の境界部にミシン目８を設け、必要に応じてミシン目８に沿って記憶手段４を切り離すことができる。これにより、基材１を分析装置に挿入する際には、記憶手段４を基材１から切り離して、切り離した記憶手段４を読み取り装置に入れて、両者を対応付けすることができる。
また、図３に示すように、記憶手段４を結合部材５としての紐で基材１に取り付けてもよい。これにより、記憶手段４の紛失を防止することができる。
紐の材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、繊維、樹脂、金属などが挙げられる。
【００３６】
＜第１の実施形態の変形例１＞
図５は、第１の実施形態の変形例１に係る容器の概略図である。この第１の実施形態の変形例１では、容器１０として電子基板を用いている。この場合、容器１０は、電子基板内のＡ領域、Ｂ領域、Ｃ領域、及びＤ領域を認識する認識部３と、Ａ領域、Ｂ領域、Ｃ領域、及びＤ領域に対応する生体材料に関する情報を記憶する記憶手段４とを有しており、認識部３と記憶手段４とを対応付けることができる。
認識部３は、電子基板内のＡ領域、Ｂ領域、Ｃ領域、及びＤ領域ごとに複数設けてもよい。
なお、第１の実施形態の変形例２において、既に説明した第１の実施の形態と同一の構成については、同じ参照符号を付してその説明を省略する。
【００３７】
＜第１の実施形態の変形例２＞
図６は、第１の実施形態の変形例２に係る容器の概略図である。この第１の実施形態の変形例２では、基材１と記憶手段４とを対応付けるために、認識手段として数字等の認識表示６を基材に設けている。数字等の認識表示６は、基材１に直接印字してもよいし、基材１の表面に認識表示６を描いたシールを貼り付けてもよい。
これにより、第１の実施形態に比べて、認識手段の認識部３としてＲＦＩＤを用いる必要が無いため、低コスト化を実現できる。また、第１の実施形態に比べて、認識手段としての認識部３の情報を読み取る装置が必要なく、認識表示６の目視により容易に対応付けを行うことができる。
認識表示６を設ける位置については、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、目視による見やすさの点から、基材１の上面が好ましい。また、複数の基材を重ねて配置する場合には、認識表示６を設ける位置は、側面が好ましい。
なお、第１の実施形態の変形例２において、既に説明した第１の実施の形態と同一の構成については、同じ参照符号を付してその説明を省略する。
【００３８】
＜第１の実施形態の変形例３＞
図７は、第１の実施形態の変形例３に係る容器の概略図である。この第１の実施形態の変形例３は、認識手段としての認識部３と認識表示６とを組み合わせたものである。これにより、認識手段としての認識部３及び認識表示６により、目視及びデータ（無線）での対応付けを保証できる。即ち、第１の実施形態の変形例３の認識表示６では、読み取り装置で読み取らなくても目視により簡易に対応付けができる。一方、第１の実施形態の認識部３では、例えば、基材１を分析装置等に挿入した場合には、目視により対応付けができなくなっても、データ（無線）で対応付けを行うことができる。
なお、第１の実施形態の変形例３において、既に説明した第１の実施の形態と同一の構成については、同じ参照符号を付してその説明を省略する。
【００３９】
＜第２の実施形態＞
図８は、本発明の第２の実施形態に係る容器の概略図である。この第２の実施形態では、複数の凹部２を有する複数の基材１と、複数の基材１にそれぞれ設けられ、複数の基材１をそれぞれ認識するための複数の認識手段３ａ、３ｂ、・・・、３ｚと、複数の基材１の測定領域以外の部位に、複数の凹部２に収容されている生体材料に関する情報を記憶する記憶手段４と、を有し、複数の認識手段３ａ、３ｂ、・・・、３ｚと記憶手段４とが対応付けられている。
【００４０】
図８の第２の実施形態に係る容器は、複数の認識手段３ａ、３ｂ・・・３ｚを有する複数の基材に対して、複数の認識手段をまとめて記憶する一つの記憶手段４を有している。これにより、複数の基材をまとめて販売する場合であっても、記憶手段４が一つで済むため、低コスト化が達成できる。
なお、第２の実施形態において、既に説明した第１の実施の形態と同一の構成については、同じ参照符号を付してその説明を省略する。
【００４１】
＜第３の実施形態＞
第１の実施形態にて、生体材料に関する情報を有する記憶手段付き容器について説明したが、ここでは、生体材料が核酸である場合の実施形態について、以下記載する。
第３の実施形態に係る容器は、核酸のコピー数の情報だけでなく、以下で具体的に記載する「不確かさ」の情報も有することが好ましい。なお、ここで増幅可能な試薬の分子数がコピー数に対応付けられる場合もある。
また、容器と関連付けされたコピー数とその不確かさ情報は、第１の実施形態で記載した、記憶手段に記録するだけでなく、クラウドなどのネットワークのサーバの記憶手段内に記憶しておくことでもよい。
また、第１の実施形態において、記憶手段と関連付けされる認識手段を容器に有する形態を記載したが、記憶手段自体が遠隔ネットワークのサーバの記憶手段とする場合などは、そのサーバから情報を取得する形態であってもよい。
認識手段（認識部）は、容器そのものに設ける構成としてもよいし、容器に別添としてもよい。
特定塩基配列を含んだ核酸のコピー数とその不確かさの情報を容器と関連付けさせた情報を識別可能になる。これにより、特定塩基配列を含んだ核酸を既知コピー数含んだ容器により分析検査・分析装置の校正や精度保証などを行う場合に、関連付けを行うことが可能となる。
【００４２】
−識別手段−
容器は、既知コピー数の核酸及びその不確かさの情報を識別可能な識別手段を有することが好ましい。
識別手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メモリ、ＩＣチップ、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、Ｒａｄｉｏ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（ＲＦＩＤ）、色分け、印刷などが挙げられる。
識別手段を設ける位置及び識別手段の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４３】
識別手段に情報を書き込む方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、手入力、ウェルに増幅可能な試薬を分注する際に増幅可能な試薬の個数を計数する液滴形成装置から直接データを書き込む方法、サーバに保存されているデータの転送、クラウドに保存されているデータの転送などが挙げられる。
【００４４】
本発明の容器は、少なくとも１つの凹部（ウェル）を有し、少なくとも１つの前記凹部に特定の塩基配列を含んだ核酸のコピー数及び該核酸のコピー数の不確かさの情報を有し、手段、基材を有することが好ましく、更に必要に応じてその他の部材を有する。
【００４５】
「不確かさ」とは、「測定の結果に付随した、合理的に測定量に結びつけられ得る値のばらつきを特徴づけるパラメータ」とＩＳＯ／ＩＥＣ  Ｇｕｉｄｅ９９：２００７［国際計量計測用語−基本及び一般概念並びに関連用語（ＶＩＭ）］に定義されている。
ここで、「合理的に測定量に結びつけられ得る値」とは、測定量の真の値の候補を意味する。即ち、不確かさとは、測定対象の製造に係る操作、機器などに起因する測定結果のばらつきの情報を意味する。不確かさが大きいほど、測定結果として予想されるばらつきが大きくなる。
不確かさとしては、例えば、測定結果から得られる標準偏差であってもよく、真の値が所定の確率以上で含まれている値の幅として表す信頼水準の半分の値としてもよい。
不確かさを算出する方法としては、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ  ｉｎ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ（ＧＵＭ：ＩＳＯ／ＩＥＣ  Ｇｕｉｄｅ９８−３）、及びＪａｐａｎ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  Ｂｏａｒｄ  Ｎｏｔｅ  １０  試験における測定の不確かさに関するガイドラインなどに基づき算出することができる。
不確かさを算出する方法としては、例えば、測定値などの統計を用いたタイプＡ評価法と、校正証明書、製造者の仕様書、公表されている情報などから得られる不確かさの情報を用いたタイプＢ評価法の２つの方法を適用することができる。
不確かさは、操作及び測定などの要因から得られる不確かさを全て標準不確かさに変換することにより、同じ信頼水準で表現することができる。標準不確かさとは、測定値から得られた平均値のばらつきを示す。
不確かさを算出する方法の一例としては、例えば、不確かさを引き起こす要因を抽出し、それぞれの要因の不確かさ（標準偏差）を算出する。さらに、算出したそれぞれの要因の不確かさを平方和法により合成し、合成標準不確かさを算出する。合成標準不確かさの算出において、平方和法を用いるため、不確かさを引き起こす要因の中で不確かさが十分に小さい要因については無視することができる。不確かさは合成標準不確かさを期待値で除した変動係数（ＣＶ値）を用いてもよい。
不確かさを引き起こす要因としてはいくつか考えられ、例えば、目的の核酸（試薬）を細胞に導入し、当該細胞をカウント・分注して作成する場合、各ウェル内の目的の核酸の数の不確かさの要因としては、細胞内の核酸の数、細胞をプレートに配置する手段、配置された細胞がプレートの適切な位置に配置された頻度、細胞が細胞懸濁液中で破壊されることにより増殖可能な試薬が細胞懸濁液中に混入することによるコンタミネーション（夾雑物の混入、以下、「コンタミ」と記載することがある）などが挙げられる。
【００４６】
本発明によると、核酸増幅技術を含む検査に基づく分析検査・分析装置の性能評価を行うことができる特定の核酸を含む容器（検査デバイス）を提供することができる。
【００４７】
＜容器（検査デバイス）の製造方法＞
以下、特定の核酸を有する細胞を保持してなる容器の製造方法について説明する。
本発明の容器の製造方法は、特定の核酸を有する複数の細胞、及び溶剤を含む細胞懸濁液を生成する細胞懸濁液生成工程と、細胞懸濁液を液滴として吐出することにより、容器であるプレートのウェル内に液滴を順次着弾させる液滴着弾工程と、液滴の吐出後、かつ液滴のウェルへの着弾前に、前記液滴に含まれる細胞数をセンサによって計数する細胞数計数工程と、ウェル内の細胞から核酸を抽出する核酸抽出工程と、を含み、各工程の不確かさを算出する工程、出力工程、記録工程を含むことが好ましく、更に必要に応じてその他の工程を含む。
【００４８】
計数対象が細胞数ではなく特定のＤＮＡ配列が何個入っているかであってもよい。通常は、特定のＤＮＡ配列は細胞１個につき１つの領域が入っていないものを選択する、あるいは遺伝子組み換えにより導入するため、特定のＤＮＡ配列の数は細胞数と等しいと考えてよい。ただし、細胞は特定の周期で細胞分裂を起こすために細胞内で核酸の複製が行われる。細胞周期は細胞の種類によって異なるが、細胞懸濁液から所定量の溶液を抜き取り複数細胞の周期を測定することによって、細胞１個中に含まれる特定の核酸数に対する期待値及びその不確かさを算出することが可能である。これは、例えば、核染色した細胞をフローサイトメーターによって観測することによって可能である。
不確かさとは、測定対象の製造に係る操作、機器などに起因する測定結果のばらつきの情報を意味する。
算出とは、計算して求める数値を出すことを意味する。
【００４９】
図９は、ＤＮＡ複製済みの細胞の頻度と、蛍光強度との関係の一例を示すグラフである。図９に示すように、ヒストグラム上でＤＮＡの複製有無により２つのピークが現れるため、ＤＮＡ複製済みの細胞がどの程度の割合で存在するかを算出することが可能である。この算出結果から１細胞中に含まれる平均的なＤＮＡ数を算出することが可能であり、前述の細胞数計数結果に乗じることにより、核酸の推定数を算出することが可能である。
また、細胞懸濁液を作製する前に細胞周期を制御する処理を行うことが好ましく、前述のような複製が起きる前、又は後の状態に揃えることによって、特定の核酸の数を細胞数からより精度良く算出することが可能になる。
【００５０】
推定する核酸の数は、不確かさを算出することが好ましい。不確かさを算出することにより、これらの数値に基づき不確かさを分散又は標準偏差として表現して出力することが可能である。複数因子の影響を合算する場合には、一般的に用いられる標準偏差の二乗和平方根を用いることが可能である。例えば、因子として吐出した細胞数の正答率、細胞内のＤＮＡ数、吐出された細胞がウェル内に着弾する着弾率などを用いることができる。これらの中で影響の大きい項目を選択して算出することもできる。
【００５１】
＜＜不確かさ算出工程＞＞
不確かさ算出工程は、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程、及び細胞数計数工程などそれぞれの工程における不確かさを算出する工程である。
当該不確かさの算出は、細胞懸濁液生成工程における不確かさと同様に算出することができる。
なお、不確かさの算出タイミングは、細胞数計数工程の次工程で、纏めて算出してもよいし、細胞懸濁液生成工程、液滴着弾工程、及び細胞数計数工程などの各工程の最後に算出し、細胞数計数工程の次工程で各不確かさを合成して算出してもよい。言い換えれば、上記各工程での不確かさは、合成算出までに適宜算出しておけばよい。
【００５２】
＜＜出力工程＞＞
出力工程は、ウェル内に着弾した細胞懸濁液に含まれる細胞数を、センサにより測定された検出結果に基づいて粒子数計数手段にて計数された値を出力する工程である。
計数された値とは、センサにより測定された検出結果から、粒子数計数手段にて当該ウェルに含まれる細胞数を意味する。
出力とは、原動機、通信機、計算機などの装置が入力を受けて計数された値を外部の計数結果記憶手段としてのサーバに電子情報として送信することや、計数された値を印刷物として印刷することを意味する。
【００５３】
出力工程は、プレートの生成時に、プレートにおける各ウェルの細胞数又は核酸数を観察又は推測し、観測値又は推測値、外部の記憶部に出力する。
出力は、細胞数計数工程と同時に行ってもよく、細胞数計数工程の後に行ってもよい。
【００５４】
＜＜記録工程＞＞
記録工程は、出力工程において、出力された観測値又は推測値を記録する工程である。
記録工程は、記録部において好適に実施することができる。
記録は、出力工程と同時に行ってもよく、出力工程の後に行ってもよい。
記録とは、記録媒体に情報を付与することだけでなく、記録部に情報を保存することも含む意味である。
【００５５】
次に、細胞数既知プレートから得られる結果の信頼性を考慮するために、１細胞数既知プレートを製造し、１細胞数における不確かさを算出する。なお、特定の塩基配列の核酸の数毎に以下に示す方法を用いることにより、様々な核酸の数における不確かさを算出することができる。
【００５６】
−不確かさの算出−
本実施例では、不確かさの要因として、液滴中の細胞数、細胞中の目的の核酸の数、凹部（ウェル）内の目的の核酸のコンタミを用いた。
液滴中の細胞数は、吐出手段より吐出された液滴の画像を解析し計数した液滴中の細胞数と、吐出手段で吐出した液滴をスライドガラスに着弾させ着弾した液滴毎に顕微鏡観察し得られた細胞数とを用いた。
細胞中の目的の核酸の数（細胞周期）は、細胞周期のＧ１期に該当する細胞の割合（９９．５％）、Ｇ２期に該当する細胞の割合（０．５％）とを用いて算出した。
ウェル内の細胞数は、吐出した液滴がウェル内に着弾する数を計数したが、９６サンプルの計数においてすべての液滴がウェル内に着弾していたため、ウェル内の細胞数の要因は不確かさの計算から除外した。
コンタミは、インクのろ液４μＬをリアルタイムＰＣＲで細胞中の目的の核酸以外の核酸がインク液中に混入していないか３回の試行を行い確認した。その結果、３回すべてにおいて検出下限値となったため、コンタミの要因についても不確かさの掲載から除外した。
不確かさは各要因の測定値から標準偏差を求め、感度係数を乗じて測定量の単位に統一した標準不確かさを平方和法により合成標準不確かさを求める。合成標準不確かさでは、正規分布の約６８％の範囲の値しか含まれないため、合成標準不確かさを２倍した拡張不確かさとすることにより正規分布の約９５％の範囲を考慮した不確かさを得ることができる。下記表１のバジェットシートに結果を示す。
【００５７】
【表１】
2018093863.tif 000003
【００５８】
表１中、「記号」とは、不確かさの要因に対応付けた任意の記号を意味する。
表１中、「値（±）」とは、平均値の実験標準偏差であり、算出した実験標準偏差をデータの数の平方根の値で除したものである。
表１中、「確率分布」とは、不確かさの要因がもつ確率分布であり、Ａタイプの不確かさ評価の場合には空欄とし、Ｂタイプの不確かさ評価には、正規分布又は矩形分布のいずれかを記入する。本実施例においてはＡタイプの不確かさ評価のみを行っているため、確率分布の欄は空欄となっている。
表１中、「除数」とは、それぞれ要因から得られる不確かさを正規化する数を意味する。
表１中、「標準不確かさ」とは「値（±）」を「除数」で除した値である。
表１中、「感度係数」とは、測定量の単位に統一するために用いられる値を意味する。
【００５９】
以上の結果から、得られた拡張不確かさを測定のばらつきの指標として、ウェル毎のデータとして記憶させることで、実験で使用する者が不確かさの指標をウェル毎の測定結果の信頼性の判断基準として用いることができる。上記の信頼性の判断基準を用いることにより、分析検査の性能評価を高精度に行うことができる。
【００６０】
本発明の態様は、例えば、以下のとおりである。
＜１＞  複数の凹部を有する基材と、
前記基材に設けられ、前記基材を認識するための認識手段と、
前記基材に、前記複数の凹部に収容されている生体材料に関する情報を記憶する記憶手段と、を有し、
前記認識手段と前記記憶手段とが対応付けられていることを特徴とする容器である。
＜２＞  複数の凹部を有する複数の基材と、
前記複数の基材にそれぞれ設けられ、前記複数の基材をそれぞれ認識するための複数の認識手段と、
前記複数の基材に、前記複数の凹部に収容されている生体材料に関する情報を記憶する記憶手段と、を有し、
前記複数の認識手段と前記記憶手段とが対応付けられていることを特徴とする容器である。
＜３＞  前記複数の認識手段と一つの記憶手段とが対応付けられている前記＜２＞に記載の容器である。
＜４＞  前記生体材料が、少なくとも細胞である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の容器である。
＜５＞  前記生体材料が、少なくとも特定の塩基配列を有するＤＮＡである前記＜４＞に記載の容器である。
＜６＞  前記記憶手段に記憶される前記生体材料に関する情報が、前記特定の塩基配列のコピー数である前記＜５＞に記載の容器である。
＜７＞  前記生体材料の数が計数された既知数である前記＜４＞から＜５＞のいずれかに記載の容器である。
＜８＞  前記複数の記憶手段に記憶される前記生体材料に関する情報として、前記複数の凹部毎に、前記生体材料の数が計数された前記既知数である前記＜７＞に記載の容器である。
＜９＞  前記認識手段が、認識部及び認識表示の少なくともいずれかである前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の容器。
＜１０＞  前記基材が、前記認識部及び前記認識表示を有し、
前記認識部及び前記認識表示と前記記憶手段とが対応付けられている前記＜９＞に記載の容器である。
＜１１＞  前記認識部が、バーコード、ＱＲコード（登録商標）及びＲＦＩＤの少なくともいずれかである前記＜９＞から＜１０＞のいずれかに記載の容器である。
＜１２＞  前記認識表示が、文字、記号、図形、及び色の少なくともいずれかである前記＜９＞から＜１１＞のいずれかに記載の容器である。
＜１３＞  前記認識表示が、数字である前記＜１２＞に記載の容器である。
＜１４＞  前記認識手段が、前記凹部の内側及び前記凹部の外周縁部以外の部位に設けられている前記＜１＞から＜１３＞のいずれかに記載の容器である。
＜１５＞  前記認識手段が、前記複数の凹部毎に設けられている前記＜１＞から＜１４＞のいずれかに記載の容器である。
＜１６＞  前記認識手段が、前記基材の複数箇所に設けられている前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載の容器である。
＜１７＞  前記記憶手段が、前記基材から着脱可能に設けられている前記＜１＞から＜１６＞のいずれかに記載の容器である。
＜１８＞  前記記憶手段が、前記基材に結合部材により取り付けられている前記＜１＞から＜１７＞のいずれかに記載の容器である。
＜１９＞  前記結合部材が、紐である前記＜１８＞に記載の容器である。
＜２０＞  前記＜１＞から＜１９＞のいずれかに記載の容器を含むことを特徴とするＰＣＲプレートである。
＜２１＞  前記＜１＞から＜１９＞のいずれかに記載の容器を含むことを特徴とする細胞培養プレートである。
＜２２＞  前記＜１＞から＜１９＞のいずれかに記載の容器を含むことを特徴とする校正用標準プレートである。
＜２３＞  特定の塩基配列を含む核酸を既知コピー数含み、該核酸のコピー数及びその不確かさの情報が関連付けられてなることを特徴とする容器である。
＜２４＞  複数の凹部を有する基材と、
前記基材に、前記複数の凹部に収容されている生体材料に関する情報を記憶する記憶手段と、を有し、
前記生体材料は、特定の塩基配列を含む核酸を含み、前記生体材料に関する情報が前記核酸のコピー数及び前記核酸のコピー数の不確かさの情報を有することを特徴とする容器である。
＜２５＞  前記既知コピー数の不確かさの情報が、前記核酸を含む細胞を前記容器に配置する手段、前記細胞の細胞周期、前記容器の凹部内に配置された細胞数、及び前記容器の凹部内の目的の核酸のコンタミネーションの少なくともいずれかである前記＜２３＞または＜２４＞に記載の容器である。
＜２６＞  前記＜２３＞から＜２５＞のいずれかに記載の容器を用いて分析装置を校正する方法である。
【００６１】
前記＜１＞から＜１９＞及び前記＜２３＞から＜２５＞のいずれかに記載の容器、前記＜２０＞に記載のＰＣＲプレート、前記＜２１＞に記載の細胞培養プレート、前記＜２２＞に記載の校正用標準プレート、及び前記＜２６＞に記載の分析装置を校正する方法によると、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。
【符号の説明】
【００６２】
１      基材
２      凹部
３      認識手段（認識部）
４      記憶手段
５      結合部材
６      認識手段（認識表示）
８      ミシン目
１０      容器
【先行技術文献】
【特許文献】
【００６３】
【特許文献１】特表２００９−５１７０８６号公報
【特許文献２】特許第４２０４７５３号公報
【図１】
2018093863.tif 000004
【図２】
2018093863.tif 000005
【図３】
2018093863.tif 000006
【図４Ａ】
2018093863.tif 000007
【図４Ｂ】
2018093863.tif 000008
【図５】
2018093863.tif 000009
【図６】
2018093863.tif 000010
【図７】
2018093863.tif 000011
【図８】
2018093863.tif 000012
【図９】
2018093863.tif 000013