(57)【要約】【課題】蛍光染色試薬が取り込まれにくい植物性プランクトンも簡便かつ短時間で検出することができるバラスト水中の微生物検出方法及びその装置を提供する。【解決手段】試料溶液４の被照射面に励起光を連続的に照射させる光源を備えた励起光源８と、励起光源８からの励起光により蛍光発光された光を検知する受光手段９と、受光手段９により検知した光を電気信号に変換して発光数を検出してカウントし、発光数から試料容器中４の試料に含まれる微生物量を算出する制御手段１０と、制御手段１０に電気的に接続されている操作部３と、を備え、励起光源８は、植物性プランクトンをクロロフィル蛍光発光させる波長域の光を発する光源８ｂと、蛍光染色試薬に染色された微生物を蛍光発光させる波長域の光を発する光源８ａとの異なる２種類の励起光源を用いた。【選択図】図４
2018093758.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液中の微生物量を測定するための微生物の検査装置であって、
光を透過する材質で形成されたバッチ式の試料容器に試料と蛍光染色試薬とを添加して試料溶液の撹拌・混合を行う撹拌混合手段と、
該撹拌混合手段により前記試料溶液を撹拌しつつ前記試料容器の被照射面に励起光を連続的に照射させる光源を備えた励起光源と、
該励起光源からの励起光により蛍光発光された光を検知する受光手段と、
該受光手段により検知した光を電気信号に変換して発光数を検出してカウントし、該発光数から前記試料容器中の試料に含まれる微生物量を算出する制御手段と、
該制御手段に電気的に接続されている操作部と、を備え、
前記励起光源は、植物性プランクトンをクロロフィル蛍光発光させる波長域の光を発する光源と、蛍光染色試薬に染色された微生物を蛍光発光させる波長域の光を発する光源との異なる２種類の励起光源を用いることを特徴とする微生物の検査装置。
【請求項２】
前記励起光源は、前記試料容器の被照射面に対して直交した励起光が入射されるように当該励起光源を配設する一方、前記受光手段は、その受光面が前記励起光源の励起光と直交した角度で蛍光発光が受光されるように配設したことを特徴とする請求項１記載の微生物の検査装置。
【請求項３】
前記制御手段は、クロロフィル蛍光発光によって取得した微生物の個体数ｎ１と、蛍光染色試薬による蛍光発光によって取得した微生物の個体数ｎ２と、クロロフィル蛍光発光及び蛍光染色試薬による蛍光発光の両者で取得した微生物の個体数ｎ３とをそれぞれ求めた後に、バラスト水の排出基準となる許容微生物数Ｎを演算する演算部を備えてなる請求項１又は２記載の微生物の検査装置。
【請求項４】
試料溶液中の微生物量を測定するための微生物の検査方法であって、
バッチ式の試料容器内で試料に蛍光染色試薬を添加した試料溶液の撹拌・混合を行う撹拌混合工程と、
前記試料溶液を撹拌しつつ前記試料容器の被照射面に励起光を連続的に照射する励起工程と、
前記励起工程により蛍光発光した微生物の蛍光をカウントする受光工程と、
該受光工程により検出した発光数から試料容器中の試料に含まれる微生物量を算出する微生物数推定工程とを備え、
前記励起工程は、植物性プランクトンをクロロフィル蛍光発光させる波長域の光を発する光源により励起させるとともに、蛍光染色試薬に染色された微生物を蛍光発光させる波長域の光を発する光源により励起させることを特徴とする微生物の検査方法。
【請求項５】
前記微生物数推定工程は、クロロフィル蛍光発光によって取得した微生物の個体数ｎ１と、蛍光染色試薬による蛍光発光によって取得した微生物の個体数ｎ２と、クロロフィル蛍光発光及び蛍光染色試薬による蛍光発光の両者で取得した微生物の個体数ｎ３とをそれぞれ求めた後に、バラスト水の排水基準となる許容微生物数Ｎを演算してなる請求項４記載の微生物の検査方法。
【請求項６】
前記微生物推定工程は、クロロフィル蛍光発光及び蛍光染色試薬による蛍光発光の両者で取得した微生物の個体数ｎ３から蛍光染色試薬による蛍光発光によって取得した微生物の個体数ｎ２を減算して動物性プランクトンの個体数を演算してなる請求項５記載の微生物の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の検査方法及びその装置に関し、特にバラスト水等に含まれて生存しているプランクトン等の微生物を検出するのに適した微生物の検査方法及びその装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
荷物を積載していない船舶は、当該船舶を安定させるためにバラスト水を搭載して航行し、荷物を積載する海域において前記バラスト水を排出する。
バラスト水は、通常、搭載する海域と異なる海域に排出されるため、該バラスト水に含まれるプランクトンや細菌等の微生物を本来の生息地以外の海域に運び、生態系を破壊する等の問題を引き起こす虞がある。
【０００３】
このような問題に対処するため、バラスト水の規制に関する国際的なルールが策定され、「船舶のバラスト水および沈殿物の規制および管理のための国際条約（バラスト水管理条約）」が採択されている。
【０００４】
上記バラスト水管理条約に関連する「バラスト水サンプリングに関するガイドライン（G２）」は、「バラスト水排出基準（D−２）」において、船舶から排出されるバラスト水に含まれて生存している生物の許容個体数を、例えば、最小サイズが５０μｍ以上の生物（以下、「Ｌサイズ生物」という。）については１０個／ｍ３以下、最小サイズが１０μｍ以上５０μｍ未満の生物（以下、「Ｓサイズ生物」という。）については１０個／ｍＬ以下と、前記生物の最小サイズにより区分して規定している。
【０００５】
現在までに、上記バラスト水を排出する際に上記排出基準を満たしているか否かを確認するための手法として、ポンプで汲み上げた海水をフローセルに通水して画像計測するもの（例えば、特許文献１）、ポンプで汲み上げた海水を目開きの異なるフィルタに通水した後にサンプル水として採取し、これに染色試薬を添加して撹拌しながら励起光を照射し、励起光により蛍光発光された光を検知して発光数を計数し、発光数からサンプル水中に含まれる微生物量を算出する装置（例えば、特許文献２、特許文献３）などが知られている。
【０００６】
特許文献１に記載の装置は、液体の検体を流しつつ該検体中に存在する生細胞を持つ生物を染色する染色部と、前記染色が施された検体を流しつつ前記生物の濃度を高めるように濃縮する濃縮部と、前記濃縮された検体中の前記生物を含む個体の画像情報を取得する個体計測部と、前記個体計測部より出力された前記個体の画像情報より前記生物の測定を行う制御手段とを備えたことを特徴とするものである。
これにより、検体の液体中の生物の染色工程、液体中の生物の濃縮工程、液体中の生物の情報取得の工程等をフロー方式で行えるため、各方式をバッチ方式で行う手法と比べて、ひとつの工程を終えた検体の一部が次の工程に進むまでの待機時間を大幅に短縮、または０とすることができ、待機時間での染色の状態の劣化を防ぐ意味で安定した生物の生死の情報を取得することができるといったメリットがある。
【０００７】
しかしながら、上記特許文献１記載の装置にあっては、ポンプで汲み上げた海水を各種工程に順次通水させるものであり、装置が大掛かりとなり、また、製造コスト高となる問題がある。そして、各種工程に順次通水させて待機時間が短縮されるものであるが、測定が完了するには少なくとも数時間かかるといった問題がある。
【０００８】
また、上記特許文献２，３に記載の装置は、光を透過する材質で形成されたバッチ式の試料容器に試料と蛍光染色液とを添加して試料溶液の撹拌・混合を行う撹拌混合手段と、該撹拌混合手段により前記試料溶液を撹拌しつつ前記試料容器の被照射面に励起光を照射させる光源を備えた励起光源と、該励起光源からの励起光により蛍光発光された光を検知する受光手段と、該受光手段により検知した光を電気信号に変換して発光数を検出し、該発光数から前記試料容器中の試料に含まれる微生物量を算出する制御手段とを備えたことを特徴とするものである。
これにより、バッチ式の試料容器に試料と蛍光染色試薬とを添加した後、撹拌混合手段により試料容器の撹拌・混合を行い、次いで、前記試料溶液を撹拌しつつ前記試料容器の被照射面に励起光を入射させ、さらに、受光手段により微生物の蛍光発光を受光するため、撹拌しないで静置して計測するものと比較すれば、極めて短時間で微生物が明るく発光し、バラスト水中の微生物の量を簡便かつ短時間で計測することが可能となる。そして、バッチ式であるために装置を小型化することが可能となり、製造コストも安価となるといったメリットがある。
【０００９】
しかしながら、上記特許文献２，３記載の装置にあっては、一部の植物プランクトンの検出が困難であるという問題があった。植物性プランクトンの藻類の中でも特に細胞の周りに硅（けい）酸質（ガラス質）の殻をもつ硅藻類の一部は、染色剤ＦＤＡ（蛍光染色試薬ＦＤＡ）が取り込まれにくいため、蛍光発光量が少なく検出が困難となっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００９−８５８９８号公報
【特許文献２】特開２０１４−４２４６３号公報
【特許文献３】特開２０１４−５５７９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記問題点にかんがみ、蛍光染色試薬が取り込まれにくい植物性プランクトンも簡便かつ短時間で検出することができるバラスト水中の微生物検出方法及びその装置を提供することを技術的課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するため本発明は、試料溶液中の微生物量を測定するための微生物の検査装置であって、光を透過する材質で形成されたバッチ式の試料容器に試料と蛍光染色試薬とを添加して試料溶液の撹拌・混合を行う撹拌混合手段と、該撹拌混合手段により前記試料溶液を撹拌しつつ前記試料容器の被照射面に励起光を連続的に照射させる光源を備えた励起光源と、該励起光源からの励起光により蛍光発光された光を検知する受光手段と、該受光手段により検知した光を電気信号に変換して発光数を検出してカウントし、該発光数から前記試料容器中の試料に含まれる微生物量を算出する制御手段と、該制御手段に電気的に接続されている操作部と、を備え、
前記励起光源は、植物性プランクトンをクロロフィル蛍光発光させる波長域の光を発する光源と、蛍光染色試薬に染色された微生物を蛍光発光させる波長域の光を発する光源との異なる２種類の励起光源を用いる、という技術的手段を講じた。
【００１３】
請求項２記載の発明は、前記励起光源が、前記試料容器の被照射面に対して直交した励起光が入射されるように当該励起光源を配設する一方、前記受光手段は、その受光面が前記励起光源の励起光と直交した角度で蛍光発光が受光されるように配設されていることを特徴とする。
【００１４】
請求項３記載の発明は、前記制御手段が、クロロフィル蛍光発光によって取得した微生物の個体数ｎ１と、蛍光染色試薬による蛍光発光によって取得した微生物の個体数ｎ２と、クロロフィル蛍光発光及び蛍光染色試薬による蛍光発光の両者で取得した微生物の個体数ｎ３とをそれぞれ求めた後に、バラスト水の排出基準となる許容微生物数Ｎを演算する演算部を設けたことを特徴とする。
【００１５】
請求項４記載の発明は、試料溶液中の微生物量を測定するための微生物の検査方法であって、バッチ式の試料容器内で試料に蛍光染色試薬を添加した試料溶液の撹拌・混合を行う撹拌混合工程と、前記試料溶液を撹拌しつつ前記試料容器の被照射面に励起光を連続的に照射する励起工程と、前記励起工程により蛍光発光した微生物の蛍光をカウントする受光工程と、該受光工程により検出した発光数から試料容器中の試料に含まれる微生物量を算出する微生物数推定工程とを備え、
前記励起工程は、植物性プランクトンをクロロフィル蛍光発光させる波長域の光を発する光源により励起させるとともに、蛍光染色試薬に染色された微生物を蛍光発光させる波長域の光を発する光源により励起させることを特徴とする。
【００１６】
請求項５記載の発明は、前記微生物数推定工程が、クロロフィル蛍光発光によって取得した微生物の個体数ｎ１と、蛍光染色試薬による蛍光発光によって取得した微生物の個体数ｎ２と、クロロフィル蛍光発光及び蛍光染色試薬による蛍光発光の両者で取得した微生物の個体数ｎ３とをそれぞれ求めた後に、バラスト水の排水基準となる許容微生物数Ｎを演算することを特徴とする。
【００１７】
請求項６記載の発明は、前記微生物推定工程が、クロロフィル蛍光発光及び蛍光染色試薬による蛍光発光の両者で取得した微生物の個体数ｎ３から蛍光染色試薬による蛍光発光によって取得した微生物の個体数ｎ２を減算して動物性プランクトンの個体数を演算してなる請求項５記載の微生物の検査方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、前記励起光源に、植物性プランクトンをクロロフィル蛍光発光させる波長域の光を発する光源と、蛍光染色試薬に染色された微生物を蛍光発光させる波長域の光を発する光源との異なる２種類の光源を用いてあるので、クロロフィル蛍光発光させる波長域の光を発する光源により蛍光染色試薬が取り込まれにくい植物性プランクトンを検出することが可能となり、これにより、簡便かつ短時間で植物性及び動物性の両者のプランクトンを漏れなく検出することができるようになった。
【００１９】
請求項２記載の発明によれば、前記励起光源が、前記試料容器の被照射面に対して直交した励起光が入射されるように当該励起光源を配設する一方、前記受光手段は、その受光面が前記励起光源の励起光と直交した角度で蛍光発光が受光されるように配設されていて、励起光源からの励起光が直接受光手段の受光面に入射することがなく、また、バックグラウンドと微生物の蛍光発光との光量の差異が極めて明確になり、微生物の検出精度が向上するものとなる。
【００２０】
請求項３記載の発明によれば、前記制御手段が、クロロフィル蛍光発光によって取得した微生物の個体数ｎ１と、蛍光染色試薬による蛍光発光によって取得した微生物の個体数ｎ２と、クロロフィル蛍光発光及び蛍光染色試薬による蛍光発光の両者で取得した微生物の個体数ｎ３とをそれぞれ求めた後、微生物の個体数ｎ３を、補完された数の微生物の許容個体数Ｎとして推定する。この許容個体数Ｎは、適正に微生物の数を評価し、バラスト水排水基準（D-2）を実際と同じように厳密に評価し、適用することができる。
【００２１】
請求項４及び請求項５によれば、クロロフィル蛍光発光させる波長域の光を発する光源により蛍光染色試薬が取り込まれにくい植物性プランクトンを検出する方法を実現し、これにより、簡便かつ短時間で植物性及び動物性の両者のプランクトンを漏れなく検出することができる。
【００２２】
請求項６によれば、前記微生物推定工程により、クロロフィル蛍光発光及び蛍光染色試薬による蛍光発光の両者で取得した微生物の個体数ｎ３から蛍光染色試薬による蛍光発光によって取得した微生物の個体数ｎ２を減算し、動物性プランクトンの個体数のみを演算し、計数することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の微生物の検査装置の全体を示す斜視図である。
【図２】同上の測定部の概略平断面図である。
【図３】同上の全体構成を示すブロック図である。
【図４】蛍光染色試薬が取り込まれにくい植物性プランクトンを簡便に検出できる測定部の概略平断面図である。
【図５】平行光変換手段の一実施形態を示す概略断面図である。
【図６】スリットの有無により観察面が狭まることを示す作用図である。
【図７】本発明の一実施形態に係る微生物の検査装置の測定フローを示すフロー図である。
【図８】微生物の個体数ｎ１，ｎ２，ｎ３に係る集合のベン図である。
【図９】図４の測定部の変形例１を示す概略平面図である。
【図１０】同上の変形例２を示す概略平面図である。
【図１１】同上の変形例３を示す概略平面図である。
【図１２】蛍光染色試薬が取り込まれにくい植物性プランクトンが検出できるか否かの試験を示すグラフである。
【図１３】同上の２回目の試験を示すグラフである。
【図１４】変形例２の受光部９Ａ，９Ｂにつき、受光信号を対比したときの説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明を実施するための形態を図面を参照しながら説明する。図１は本発明の微生物の検査装置の全体を示す斜視図であり、図２は同上の測定部の概略平断面図であり、図３は同上の全体構成を示すブロック図である。
【００２５】
図１、図２及び図３に示すように本発明の検査装置１は、ＣＰＵ基板などの制御機構を内蔵して測定結果等の情報処理作業や統計処理作業などを行う本体部２と、該本体部２に並設され、画面上を指でタッチすることで反応する操作ボタン等に相当する操作アイコンなどが配置されるとともに、前記測定結果等を表示するための液晶タッチパネルで形成される表示・操作部３と、光を透過する透明な材質（例えば、ガラスや石英やアクリル樹脂等）で形成されたバッチ式の試料容器４を収容し、試料溶液Ｓ中の微生物数を光学的に計数する測定部５とを主要部として構成されている。
【００２６】
符号６は試料容器４内に収容された試料溶液Ｓを撹拌するための回転子である。前記試料容器４内には、試料、発光試薬（試料と発光試薬とを併せて試料溶液Sとする。）及び回転子６とを収容する。そして、該試料容器４を測定部５に収容したときに、該測定部５内に内蔵されたマグネティックスターラにより回転子６が回転駆動される構成となっている。これにより、試料容器４内の試料溶液Ｓを所定温度で撹拌混合しながら試料溶液Ｓ中の微生物数を計数することができる。すなわち、静置して微生物数を計測するものと比較すれば、極めて短時間で微生物が明るく発光し、バラスト水中の微生物の量を簡便かつ短時間で計測することが可能となる。
【００２７】
図１に示す検査装置１の寸法は、幅が３００ｍｍ、奥行が３５０ｍｍ、高さが１３０ｍｍ、重量は約２〜５ｋｇの範囲に形成されており、手持ちトランクやリュックサック（「バックパック」とも言う。いずれも、図示せず）等に収容することができ、どこにでも持ち運び可能となっている。ＡＣ電源やバッテリーでの駆動も可能に設計されていて、船舶内での測定や、屋外での測定が可能となっている。
【００２８】
そして、試料容器４は、光を透過する透明な材質で形成されていて、底面が５０ｍｍ×５０ｍｍ、高さが６０ｍｍの角柱状に形成されており、水位が４０ｍｍのときの内容量が１００ｍｌ（ミリリットル）に設定されている。試料容器４はこのような角柱状に限定されることはなく、内容量を１００ｍｌ（ミリリットル）程度確保することができれば、円柱状であっても、立方体であってもよい。
【００２９】
前記測定部５は、図１、図２及び図３に示すように、試料容器４を収容して保持する試料容器収容部７と、前記試料容器４に向けて励起光を照射する光源部８と、該光源部８から照射された励起光により試料容器４内で漂っている微生物を観察するための受光部９とを備えている。そして、受光部９からは、試料溶液Ｓ中の微生物数を計数し、測定結果等の情報処理作業や統計処理作業などを行うＣＰＵ基板１０に電気的に連絡されている。
【００３０】
前記試料容器収容部７は、前記試料容器４の少なくとも二面を取り囲む保持プレート７ａ，７ｂにより形成され、前記光源部８からの光の照射を遮断しないように前記試料容器４を収容保持するものである。
【００３１】
そして、図２に示すように、試料容器４の被照射面Ｇに対して法線ＡＰによる励起光が入射されるよう光源部８が配置される。光源部８は、試料容器収容部７近傍に配置されたＬＥＤ光源８と、該ＬＥＤ光源８の前面に配置され、拡散光を平行光に変換する平行光変換手段１１（ＬＥＤ素子は素子側からランダム方向に拡散して照射される光であるために、一面に向かって同じ角度で均一に光線が当たるように平行光に変換するもの）と、平行光からなる励起光を試料容器４に照射させる励起光用バンドパスフィルタ１２とを備えている。
【００３２】
図５は平行光変換手段１１の一実施形態を示す概略断面図である。図５（ａ）に示す例は、平行光変換手段１１として所定厚さの平板５０に所定径のねじ切孔５１を穿設して形成したものであり、光路長に合わせて平板５０の厚さＬとねじ切孔５１の孔径とが適宜設定されている。これにより、ＬＥＤ光源８から照射される入射角度θの散乱光は、ねじ切孔５１を通過する際には平行光に変換されるものとなる。図５（ａ）に示す例では、θとＬとの最適条件をＳＮ比の試験により決定しており、例えば、Ｍ３（ネジ孔の外径）×０．５（ピッチ）とすれば、θが９．５°、Ｌが１５ｍｍのときが最適であった。
【００３３】
図５（ｂ）に示す平行光変換手段１１は、ＬＥＤ光源８の前面に凸レンズ５３を設けたものであり、ＬＥＤ光源８から照射された拡散光は、凸レンズ５３内を通過して外部に出射する際には平行光に変換されるものとなる。
【００３４】
なお、本実施形態の光源部８は、光源としてＬＥＤ光源を用いたが、微生物に含まれる蛍光物質を励起させることができれば、ＬＥＤ光源に限らず、平行光の照射が可能な平行光ＬＥＤ光源やレーザ光源や電球を採用することもできる。言うまでもないが、平行光の照射が可能な平行光ＬＥＤやレーザ光源や電球を採用するときは、前述の平行光変換手段１１は不要となる。
【００３５】
そして、図２に示すように、前記受光部９は、光源部８からの法線ＡＰによる励起光と直交した角度を持って受光面Ｆが配置されるように設けられる。また、受光部９は前記ＬＥＤ光源８から試料容器４に向けて励起光が照射される平行光に対し、これと直交する光軸で蛍光が受光されるように配置構成した光電子増倍管（ＰＭＴ）９と、該光電子増倍管（ＰＭＴ）９の前面に配置した蛍光用バンドパスフィルタ１３と、該蛍光用バンドパスフィルタ１３の前面に配置した集光用レンズ１４と、該集光用レンズ１４の前面に配置したスリット１５と、該スリット１５と前記試料容器４との間隙に設置され、微生物に含まれる蛍光物質を励起させ、これにより発光した蛍光を集光し結像させるためのリレーレンズ１６と、を備えたものである。
【００３６】
前記スリット１５は、観察面をスリット状に狭めるものである。すなわち、図６に示すように、図６（ａ）スリットなしの状態では、受光面Ｆが円で形成されるバックグラウンドを監視するのに対し、図６（ｂ）スリットありの状態では、受光面Ｆが斜線を除いた縦長スリットで形成されるバックグラウンドを監視することになる。したがって、観察面Ｆの監視域（監視範囲）が図６（ｂ）のように狭まる結果、ノイズとなるバックグラウンドの蛍光発光の面積も狭まるため、バックグラウンドの蛍光発光に対する微生物の蛍光発光の信号の比が向上し、微生物の蛍光発光の検出精度が向上するのである。
【００３７】
なお、受光部９は、受光センサとして光電子増倍管（ＰＭＴ）を用いた例を示したが、これに限定されることはなく、シリコンフォトダイオード（ＳiＰＤ）や、アヴァランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）など、光電子増倍管（ＰＭＴ）と同様に微生物に含まれる蛍光物質の発光を検知することができる各種の光検出器を採用することができる。
【００３８】
次に、図４を参照して、本発明の要部となる蛍光染色試薬が取り込まれにくい植物性プランクトンを簡便に検出できる構成を説明する。
【００３９】
図４に示す光源部８は、波長領域が異なる２種類のＬＥＤ光源８ａ，８ｂを用いていることに特徴がある。すなわち、ＬＥＤ光源８は、緑青色系の波長域４９０ｎｍ付近の光を発するＬＥＤ光源８ａ（従来と同様の光源）と、青紫色系の波長域４５０ｎｍ付近の光を発するＬＥＤ光源８ｂとをペアで設ける。このＬＥＤ光源８ａ，８ｂは、試料容器４を挟んで対向するように一対設けるとよく、該ＬＥＤ光源８ａ，８ｂと試料容器４との間には、ＬＥＤ光源８ｂ側の光が透過しやすくなるよう、波長域３９５〜５０５ｎｍの光を透過する励起光用バンドパスフィルタ１２Ａ，１２Ａがそれぞれ介装される。なお、これらの波長域はあくまでも一例であり、条件に応じて適宜変更することが可能である。
【００４０】
そして、図４に示す受光部９の前面には、波長域５１０ｎｍ以上の波長を透過させるロングパスフィルタ１７が設けてあり、さらに、該ロングパスフィルタ１７の前後を挟んで配置された集光用レンズ１８が配置されている。
【００４１】
さらに、図３を参照して電気的な制御構成を説明する。本体部２を形成する筐体２０内中央には、ＡＣ電源２１や二次電池２２から電源の供給を受けて、光電子増倍管（ＰＭＴ）９により光から電気に変換された出力信号を解析したり、任意の輝度範囲以上にあるか否かを判定したり、任意の輝度の信号をパルスカウントしたり、前記ＬＥＤ光源８のオン・オフ制御などを行うＣＰＵ基板１０が配置されている。前記ＡＣ電源２１と前記ＣＰＵ基板１０との間には、ＡＣ／ＤＣ変換器２４を介在させてある。
【００４２】
前記ＣＰＵ基板１０には、前記光電子増倍管（ＰＭＴ）９、前記ＬＥＤ光源８、読み出し書き込み用記憶部となるＲＡＭ２５及び読み出し専用記憶部となるＲＯＭ２６がそれぞれ電気的に接続される。また、図１に示す液晶タッチパネル等で形成される表示・操作部３と電気的に接続されている。そして、後述のように、液晶タッチパネルに表示される電源ボタン３ａの押下によりオン・オフの切換制御が行われ、測定開始ボタン３ｂの押下により測定が開始され、外部出力ボタン３ｃの押下により外部のプリンタやパソコンへデータの転送が行われ、設定ボタン３ｄの押下により、測定の種類の切換（Ｌサイズ微生物の測定（３ｄ１）かＳサイズ微生物の測定（３ｄ２）かの切換）が行われ、メニューボタン３ｅの押下により、判定基準の設定の変更や、しきい値の設定の変更や、測定時間の設定の変更を行うことができる構成となっている。
【００４３】
そのほか、前記ＣＰＵ基板１０には、前記回転子６を磁力により回転させるマグネティックスターラ２７、制御機器の冷却用ファン２８、及びＲＳ−２３２Ｃ，ユニバーサル・シリアル・バス（ＵＳＢ）端子などの外部出力端子２９が接続されている。
【００４４】
図７は測定フローを示すフロー図であり、図１乃至図７を参照して上記構成における作用を説明する。
【００４５】
[クロロフィル蛍光の測定]
まず、クロロフィル蛍光の測定から開始する。作業者はピペット等を使用し、バラスト水１００ｍｌ（ミリリットル）を試料として採取し、試料容器４に投入する（図７のステップ１）。次に、検査装置１の測定部５に試料容器４を収容し、測定部５の蓋３０を被着することで測定準備が完了する。
【００４６】
作業者は本体部２にある電源ボタン３ａをオンし、液晶タッチパネルからなる表示・操作部３の設定ボタン３ｄ、メニューボタン３ｅ等を押下して準備を行う。その後、測定開始ボタン３ｂをオンする。これにより、クロロフィル蛍光用のＬＥＤ光源８ｂ，８ｂが点灯するので（図４、図７のステップ２参照）、励起光用バンドパスフィルタ１２Ａ，１２Ａ（図４）を透過した光が試料容器４に照射されることになる。このとき、例えば、波長特性として４５０nmの波長の光が照射され、試料容器４内の検体（微生物）のクロロフィル成分が蛍光発光することになる。そして、このクロロフィル成分による蛍光がロングパスフィルタ１７を透過して光電子増倍管（ＰＭＴ）９により検知されることになる（図７のステップ３）。
【００４７】
光電子増倍管（ＰＭＴ）９では、光電効果の利用により光エネルギが電気エネルギに変換されるとともに、電流増幅機能が付加され、高感度にクロロフィル成分の蛍光発光を検知することができる。検知した電気信号はＣＰＵ基板１０に送られ、一定しきい値以上の受光波形がカウントされることになる（図７のステップ４）。
【００４８】
さらに、ＣＰＵ基板１０では、受光波形カウント値から試料容器４内の水１００ｍｌ（ミリリットル）中に存在する微生物数を推定して、表示・操作部３に表示される（図７のステップ５）。
【実施例１】
【００４９】
植物性プランクトンの一種であるツノフタヒゲムシ（Prorocentrum micansプロロセントルム・ミカンス）を供試微生物となし、クロロフィル蛍光により光電子増倍管（ＰＭＴ）９によって個体数を推定できるか否かを検証した。ツノフタヒゲムシの複数個体を、試料容器４（１００ｍＬ容量）に水とともに収容し、波形のカウント数を検知した（図１２，図１３参照）。その結果、得られた波形のカウント数から、図１２では個体数１０２をカウントし、図１３では個体数１０３をカウントすることができた。つまり、バラスト水１００ｍＬ中に存在する植物性プランクトン、特に、ＦＤＡなどを吸収しにくい植物性プランクトンであっても、ＦＤＡを吸収することなく、クロロフィル蛍光発光によって微生物の個体数が推定できることが分かった。ＣＰＵ基板１０では、このときの微生物の個体数をｎ１として記憶される（図７のステップ５）。
【００５０】
[染色液による蛍光の測定]
次に、図７に戻り染色液による蛍光の測定を説明する。上記クロロフィル蛍光発光の測定後の試料容器４を検査装置１から取出し（図7のステップ６）、取り出した試料容器４内に蛍光染色試薬を添加する（図７のステップ７）。
【００５１】
この蛍光染色試薬は一般的に知られているカルセインＡＭ（Calcein-AM，ドイツ国Promocell GMBH 社製）や、ＦＤＡなどを使用することができる。カルセインＡＭは、植物性プランクトンに対して染色しやすい傾向がある一方、ＦＤＡは、動物性プランクトンに対して染色しやすい傾向がある。そして、作業者は試料容器４に回転子６を投入後、検査装置１の測定部５に収容し、蓋３０を被着しておくことで測定準備が完了する。
【００５２】
ここで、作業者は表示・操作部３のＳサイズ設定ボタン３ｄ２（又はＬサイズ３ｄ１）を押すとともに、測定開始ボタン３ｂをオンする。すると、測定部５内に内蔵されたマグネティックスターラ２７の駆動により回転子６が回転し、試料溶液Ｓが撹拌されることになる（図７のステップ８）。
【００５３】
次に、ＬＥＤ光源８ａ，８ａが点灯し（図４参照）、励起光用バンドパスフィルタ１２Ａ，１２Ａを透過した光が試料容器４に照射されることになる。このとき、例えば、波長特性として波長域４９０ｎｍ付近の光が照射され、試料容器４内の検体（微生物）が蛍光発光することになる。そして、この蛍光が蛍光用バンドパスフィルタ１５を透過して光電子増倍管（ＰＭＴ）９により検知されることになる（図７のステップ１０）。
【００５４】
光電子増倍管（ＰＭＴ）９により検知した電気信号はＣＰＵ基板１０に送られ、一定しきい値以上の受光波形がカウントされることになる（図７のステップ１１）。さらに、ＣＰＵ基板１０では、受光波形カウント値から試料容器４内の水１００ｍｌ（ミリリットル）中に存在する微生物数を推定し、表示・操作部３に表示する。ＣＰＵ基板１０では、このときの微生物の個体数をｎ２として記憶される（図７のステップ１２）。
【００５５】
[クロロフィル蛍光及び染色液による蛍光の両者の測定]
そして、ＬＥＤ光源８ａ，８ａ及びＬＥＤ光源８ｂ，８ｂの両者を同時照射させ（図７のステップ１３）、蛍光を光電子増倍管（ＰＭＴ）９により検知して、このときの微生物の個体数をｎ３として記憶する（図７のステップ１４）。ここで、前記クロロフィル蛍光発光により検出した微生物の個体数ｎ１と、蛍光染色試薬を用いた蛍光発光により検出した微生物の個体数ｎ２と、２種のＬＥＤ光源８ａ，８ｂを同時照射したときの微生物の個体数ｎ３との関係につき、図８を用いて説明する。
【００５６】
図８は上記工程により取得した微生物の個体数ｎ１，ｎ２，ｎ３に係る集合のベン図である。図８（ａ）は個体数ｎ１と個体数ｎ２の２つの集合を合わせた論理和集合である。従前は、蛍光染色試薬を用いた蛍光発光で検出した微生物の個体数ｎ２のみを評価していたため、従来検出できなかった蛍光染色試薬を吸収しにくい植物性プランクトンの個体数（集合ｎ１の破線部分）を加味していなかった可能性がある。これでは、実際よりも微生物の許容個体数を少なく評価することになり、バラスト水排出基準（D-2）も実際よりも甘く評価することになっていた。
【００５７】
そこで、図８（ｂ）のように、２種のＬＥＤ光源８ａ，８ｂを同時照射したときの微生物の個体数をｎ３とすれば、蛍光染色試薬を吸収しにくい植物性プランクトンの個体数が補完され、適正な微生物の許容個体数とすることができる。ＣＰＵ基板１０は、２種のＬＥＤ光源８ａ，８ｂを同時照射したときの微生物の個体数ｎ３を、補完された数の微生物の許容個体数Ｎとして推定し（図7のステップ１５）、これに基づいて表示・操作部３に対し許容個体数Ｎが表示される（図７のステップ１６）。この許容個体数Ｎは、適正に微生物の数を評価しているから、バラスト水排水基準（D-2）を実際と同じように評価し、適用することができる。
【００５８】
図８（ｃ）は、２種のＬＥＤ光源８ａ，８ｂを同時照射したときの微生物の個体数をｎ３から蛍光染色試薬で検出した微生物の個体数ｎ２を減算したものである。この集合ｎ３−ｎ２は、動物性プランクトン及び植物性プランクトンの混在した集合ｎ３から植物性プランクトンのみの集合ｎ２を減算していて、動物性プランクトンの個体数のみを求めることができるのである。
【００５９】
なお、段落００４２に記載した［クロロフィル蛍光の測定］と段落００４７に記載した［染色液による蛍光の測定］とは、順序を入れ替えて実施してもよい。また、段落００５２に記載した［クロロフィル蛍光及び染色液による蛍光の両者の測定］を一番最初に実施してもよい。
【００６０】
以上のように本実施形態によれば、本体部２と、該本体部２に並設される表示・操作部３と、バッチ式の試料容器４に収容した試料溶液Ｓ中の微生物数を光学的に計数する測定部５とを備えた微生物の検査装置であって、
前記測定部５は、試料容器４を収容して保持する試料容器収容部７と、該試料容器４に向けて励起光を照射する光源部８と、該光源部８から照射された励起光により試料容器４内で漂っている微生物を観察するための受光部９とを備えて構成され、
前記光源部８に、波長領域が異なる２種類のＬＥＤ光源８ａ，８ｂ（特に、緑青色系の波長域４９０ｎｍ付近の光を発するＬＥＤ光源８ａ（従来と同様の光源）と、青紫色系の波長域４５０ｎｍ付近の光を発するＬＥＤ光源８ｂとをペアで設ける。）を用いているので、蛍光染色試薬が取り込まれにくい植物性プランクトンを簡便かつ短時間で検出することで、動物性プランクトン及び植物性プランクトンの両者を漏れなく検出することができるようになった。
【実施例２】
【００６１】
図９は図４の測定部の基本例に対し、２種のＬＥＤ光源８ａ，８ｂにそれぞれ専用のバンドパスフィルタ１２Ａ，１２Ｂを備えたことを特徴とする測定部の変形例１である。
図１０は図４の測定部の基本例に対し、分光可能なダイクロイックミラー３１と、分光された波長に特有な感度を有する２個の受光部９Ａ，９Ｂを配設したことを特徴とする測定部の変形例２である。受光部９Ａとダイクロイックミラー３１との間には波長域が６５０ｎｍ以上を透過するロングパスフィルタ３３を介装し、受光部９Ａとダイクロイックミラー３１との間には波長域が５１０〜５５０ｎｍのバンドパスフィルタ３２を介装してある。
図１１は図４の測定部の基本例に対し、単数のロングパスフィルタ１７の代わりに、波長域が５１０〜５５０ｎｍのバンドパスフィルタ３２及び波長域が６５０ｎｍ以上を透過するロングパスフィルタ３３からなるフィルタホイール３４を配置したことを特徴とする測定部の変形例３である。なお、図１１の符号３５はフィルタホイール３４を駆動するステップモータである。
【００６２】
図９に示す測定部の変形例１、図１０に示す測定部の変形例２及び図１１に示す測定部の変形例３にあっても、前記光源部８には、波長領域が異なる２種類のＬＥＤ光源８ａ，８ｂが備えられ、それぞれの光源に特有なフィルタや受光部が設けられているため、蛍光染色試薬が取り込まれにくい植物性プランクトンを簡便かつ短時間で検出することで、動物性プランクトン及び植物性プランクトンの両者を漏れなく検出することができるものである。
【００６３】
また、前述したように、ＣＰＵ基板１０は、クロロフィル蛍光発光によって取得した微生物の個体数ｎ１と、染色液による蛍光発光によって取得した微生物の個体数ｎ２と、クロロフィル蛍光発光及び染色液による蛍光発光の両者で取得した微生物の個体数ｎ３とをそれぞれ求める。
【００６４】
微生物の個体数ｎ３は、蛍光染色試薬を吸収しにくい植物性プランクトンの個体数が補完されたものであり、適正な微生物の許容個体数とすることができる。
ＣＰＵ基板１０は、補完された数の微生物の許容個体数Ｎとして推定する。そして、この許容個体数Ｎは、適正に微生物の数を評価しているから、バラスト水排水基準（D-2）を実際と同じように評価し、適用することができるといった作用・効果がある。
【００６５】
図１０の変形例２の場合、受光部９Ａは主として植物性プランクトンのみの蛍光発光を検知する一方、受光部９Ｂは植物性プランクトン及び動物性プランクトンの両者の蛍光発光を検知することができる。そして、図１４に示すように受光部９Ａと受光部９Ｂとを対比すれば、受光部９Ａでは検知されないが、受光部９Ｂで検知される信号があった場合、これを動物性プランクトンと推定することができる。そして、この信号を計数していけば動物性プランクトンのみの個体数を把握することができるようになる。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明は、バラスト水を排出する際に排出基準を満たしているか否かを確認するための微生物の検査装置に適用することができる。
【符号の説明】
【００６７】
１    検査装置
２    本体部
３    表示・操作部
４    試料容器
５    測定部
６    回転子
７    試料容器収容部
８    光源部
９    受光部
１０    ＣＰＵ基板
１１    平行光変換手段
１２    励起光用バンドパスフィルタ
１３    蛍光用バンドパスフィルタ
１４    集光用レンズ
１５    スリット
１６    リレーレンズ
１７    ロングパスフィルタ
１８    集光用レンズ
２０    筐体
２１    ＡＣ電源
２２    二次電池
２４    ＡＣ／ＤＣ変換器
２５    ＲＡＭ
２６    ＲＯＭ
２７    マグネティックスターラ
２８    冷却用ファン
２９    外部出力端子
３０    蓋
３１    ダイクロイックミラー
３２    バンドパスフィルタ
３３    ロングパスフィルタ
３４    フィルタホイール
３５    ステップモータ
５０    平板
５１    ねじ切孔
５３    凸レンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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