(57)【要約】【課題】血中尿酸値低減用組成物を提供する。【解決手段】藤茶抽出物由来のアンペロプシンを含有する血中尿酸値低減用組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンペロプシンを含有する血中尿酸値低減用組成物。
【請求項２】
アンペロプシンを含有するプリン体吸収抑制用組成物。
【請求項３】
アンペロプシンを含有するキサンチンオキシダーゼ阻害用組成物。
【請求項４】
アンペロプシンを含有する尿酸排泄促進用組成物。
【請求項５】
アンペロプシンを含有するＡＢＣＧ２遺伝子活性化用組成物。
【請求項６】
アンペロプシンを一日投与量として１０〜５００ｍｇ含有する請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
アンペロプシンを１０質量％以上含有する請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
アンペロプシンが藤茶由来である請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンペロプシンを含有する血中尿酸値低減用組成物、プリン体吸収抑制用組成物、キサンチンオキシダーゼ阻害用組成物、尿酸排泄促進用組成物、及びＡＢＣＧ２遺伝子活性化用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
尿酸は、ヒトにおいては、核酸・プリン体が代謝された結果、最終代謝産物として排泄される。この尿酸を排泄するための機能の低下や、プリン体の産生過剰によって、血中の尿酸値が７ｍｇ／ｄＬを超えると、高尿酸血症と定義される。高尿酸血症発症者は増加しており、日本国内には潜在的な患者を含めて５００万人程度以上いると言われている。
【０００３】
高尿酸血症状態が慢性化すると、関節炎、尿路結石、痛風腎等の病状を発症する危険性が高まる。特に体温が低い足部などにおいて、尿酸が溶解しきれずに尿酸塩として結晶化して関節包内などに付着すると、白血球群のうち、特に好中球が尿酸結晶を攻撃（捕食活動）を行うことが知られている。好中球による尿酸結晶捕食活動が激化すると、その活動による過大なエネルギーや、尿酸を抱え込んで死亡した好中球の遺骸そのものによる影響などから、血管壁がダメージを受けて大きな炎症を発生する。当然、当該部位周囲の神経組織をも相当に刺激し、患者は「内側からの激痛」を感じることとなる。これが痛風である。
また、近年の疫学研究により、高尿酸血症は、心・脳血管障害の独立した危険因子であることが示唆されてきており、メタボリックシンドロームのバイオマーカーとしての重要性が指摘されてきている。以上のことから、血中尿酸値を適正にコントロールすることは、前記の疾患を予防する観点から重要となり、高尿酸血症を改善する医薬品や食品が強く望まれている。
【０００４】
高尿酸血症の要因として、尿酸産生の過剰、尿酸排泄能の低下があげられる。痛風の症例における尿酸クリアランス試験の結果によると、８５％が尿酸排泄能の低下を示すことが明らかとなっており、高尿酸血症のうち排泄低下型の高尿酸血症の占める割合が高いと考えられている。
【０００５】
これまでに、尿酸値低下用薬剤として、尿酸産生抑制剤のアロプリノールや尿酸排泄促進剤のベンズブロマロン等が提供されている。しかし、これらの薬剤は、効果がある半面、肝障害等の副作用を伴うことが多い。
また、特許文献１には、ケルセチンを含む食品が、キサンチンオキシダーゼ阻害によって高尿酸血症を改善することが記載されている。
特許文献２には、ハマメリスがキサンチンオキシダーゼを阻害し、高尿酸血症を改善することが記載されている。
特許文献３には、エラグ酸を含む組成物が、高尿酸血症のラットにおいて尿酸排泄を促
進することが記載されている。
特許文献４には、わさびの水性溶媒抽出物が高尿酸血症のラットにおいて尿酸排泄を促進することが記載されている。
これらの食品由来の成分は、尿酸産生抑制剤のアロプリノールや尿酸排泄促進剤のベンズブロマロンに比して安全性が高いことが予想されるが、具体的な製品は未だ提供されていない。
【０００６】
このような背景にあって、本発明者らも天然物や天然抽出物を尿酸排泄剤として利用するために探索を行っており、伝統的な食品である藤茶に血中尿酸値低減作用、プリン体吸収抑制作用、キサンチンオキシダーゼ阻害作用、尿酸排泄促進作用及びＡＢＣＧ２遺伝子活性化作用が存在することを発見した。一方、藤茶には様々な薬効が存在することが知られている。その作用は、急性肝炎などの肝臓疾患治療効果（特許文献５）、抗菌効果（特許文献６）、色素退色防止作用（特許文献７）など多岐に渡っている。しかし藤茶に血中尿酸値低減作用、プリン体吸収抑制作用、キサンチンオキシダーゼ阻害作用、尿酸排泄促進作用及びＡＢＣＧ２遺伝子活性化作用が存在することは、食経験の長い食品でありながらこれまでまったく知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−１４５８７５号公報
【特許文献２】特開２００３−１７４８５７号公報
【特許文献３】特開２００５−３５０３７５号公報
【特許文献４】特開２００７−２１７３６６号公報
【特許文献５】特開２００３−０２６５８４号公報
【特許文献６】特開２００２−１５９５６６号公報
【特許文献７】特開２００２−０６５２０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
すなわち、本発明の課題はアンペロプシンを含有する血中尿酸値低減用組成物、プリン体吸収抑制用組成物、キサンチンオキシダーゼ阻害用組成物、尿酸排泄促進用組成物、及びＡＢＣＧ２遺伝子活性化用組成物を提供することにある。
【０００９】
本発明者らは、上記のような背景技術のもとに研究を行い、藤茶抽出物が血中尿酸値低減作用、プリン体吸収抑制作用、キサンチンオキシダーゼ阻害作用、尿酸排泄促進作用及びＡＢＣＧ２遺伝子活性化作用を有することを発見した。そして、さらに研究を進めたところ、これらの作用を示す物質が藤茶中に含まれるフラボノイドの一種であるアンペロプシンであることを発見し、本発明をなした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の主な構成は以下の通りである。
（１）アンペロプシンを含有する血中尿酸値低減用組成物。
（２）アンペロプシンを含有するプリン体吸収抑制用組成物。
（３）アンペロプシンを含有するキサンチンオキシダーゼ阻害用組成物。
（４）アンペロプシンを含有する尿酸排泄促進用組成物。
（５）アンペロプシンを含有するＡＢＣＧ２遺伝子活性化用組成物。
（６）アンペロプシンを一日投与量として１０〜５００ｍｇ含有する１〜５のいずれかに記載の組成物。
（７）アンペロプシンを１０質量％以上含有する１〜６のいずれかに記載の組成物。
（８）アンペロプシンが藤茶由来である１〜７のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により新たな血中尿酸値低減用組成物、プリン体吸収抑制用組成物、キサンチンオキシダーゼ阻害用組成物、尿酸排泄促進用組成物、及びＡＢＣＧ２遺伝子活性化用組成物が提供される。本発明により得られた組成物は、高尿酸血症や痛風などの予防治療剤及びこれらの疾患の改善用飲食品組成物とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の組成物を投与した高尿酸血症モデルラットの尿中の一時間当たりの尿酸量を測定した結果を示すグラフである。
【図２】本発明の組成物を投与した高尿酸血症モデルラットの腎臓の尿酸トランスポーターＡＢＣＧ２遺伝子の活性化を示すグラフである。
【図３】ヒト臨床試験における藤茶抽出物投与の血中尿酸値低下効果を確認したグラフである。
【図４】プリン体負荷した後、藤茶抽出物を投与した臨床試験における血中尿酸値上昇が抑制されていることを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、アンペロプシンを含有する血中尿酸値低減用組成物、プリン体吸収抑制用組成物、キサンチンオキシダーゼ阻害用組成物、尿酸排泄促進用組成物、及びＡＢＣＧ２遺伝子活性化用組成物に係る発明である。
藤茶は、ブドウ科ノブドウ属の植物であり、中国名を顕歯蛇葡萄という。学名は、Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａである。主には中国の広西、広東、雲南、貴州、湖南、湖北、江西、福建などの省並びに自治区に分布している。中国の広西、湖南などの省や自治区の壮族や瑶族の人々がこの茎および葉から作った飲料を常用しており、風邪、のどの痛みの予防や治療などにも利用されている。アンペロプシンは、藤茶の示す肝臓疾患の治療作用や抗菌作用の活性本体として特定されている。
【００１４】
アンペロプシンは、下記の式で表される。
【００１５】
【化１】
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【００１６】
アンペロプシンは、例えば、藤茶（学名：Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａ）、大叶蛇葡萄（学名：Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｍｅｇａｌｏｐｈｙｌｌａ）、広東蛇葡萄（学名：Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ  ｃａｎｔｏｎｉｅｎｓｉｓ）、ケンポナシ（学名：Ｈｏｖｅｎｉａ  ｄｕｌｃｉｓ）、オノエヤナギ（学名：Ｓａｌｉｘ  ｓａｃｈａｌｉｎｅｎｓｉｓ）、ヨレハマツ（学名：Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ）及びカツラ（学名：Ｃｅｒｃｉｄｉｐｈｙｌｌｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）から選ばれる植物の抽出物から単離精製することができる。これらの中でも藤茶が好ましい。
【００１７】
具体的には、Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ属植物である藤茶（学名：Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ    ｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａ）から、下記のようにして得ることができる。
すなわち、乾燥させた藤茶の枝葉部を含水エタノールで抽出した抽出物を濃縮し、例えば多孔性樹脂（ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０）を用いたカラムクロマトグラフィーにかけ、８０容量％含水メタノールで溶出される分画にアンペロプシンが得られる。これを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーや再結晶により、更に精製することができる。
精製されたアンペロプシンは、試薬としても販売されており、これを用いることもできる。
【００１８】
本発明の組成物は、上記のアンペロプシンを１０質量％以上含有するものであれば使用可能である。このような組成物を得るため、藤茶の抽出は、以下のような操作を行う。
乾燥した藤茶の葉又は茎の粉砕物又は粉末を抽出原料とし、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合溶媒に投入し、室温乃至溶媒の沸点以下の温度で任意の装置を用いて抽出することにより得ることができる。
【００１９】
抽出に用いる有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、イソプロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられる。
これらの中でもエタノールが好ましい。
なお、水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して３０〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１０〜４０質量部、多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１０〜９０質量部添加することが好ましい。
【００２０】
上記のとおり、抽出溶媒を満たした処理槽に、藤茶の乾燥・粉砕物を投入し、必要に応じて時々撹拌しながら、３０分〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物が得られる。抽出溶媒量は、抽出原料の通常５〜１５倍量（質量比）であることが好ましく、抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０〜９５℃で１〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いる場合には、通常４０〜８０℃で３０分〜４時間程度である。
【００２１】
得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られる。更に乾燥すれば、固形の抽出物が得られる。本発明にあっては、アンペロプシンの含有量が１０質量％、好ましくは２０質量％以上であれば、上記抽出液又はその濃縮液の状態であっても良い。これらは、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂、液―液向流分配などの方法により精製してから用いても構わない。
したがって、上記の藤茶抽出物からさらに再抽出やクロマトグラフィーにより再分画し、アンペロプシンの濃度を高めた抽出物も本発明の組成物として使用可能である。
【００２２】
組成物中のアンペロプシンの含有量は、ＨＰＬＣなど公知の分析方法で分析することができる。定量方法の概略は次のとおりである。
・試料溶液の調製
試料（抽出物）約２０ｍｇを精秤し、蒸留水を加えて超音波にて溶解し、正確に５０ｍＬとする。この溶液２ｍＬを５０ｍＬに正確に希釈し、試料溶液とする。  
・標準溶液の調製と検量線作成  
標準品（Ｄｉｈｙｄｒｏｍｙｒｉｃｅｔｉｎ  ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）２．００ｍｇを精秤し、１００％アセトニトリルを適量加えて超音波処理して溶解し、さらにアセトニトリルを加えて正確に２５ｍＬとした、アンペロプシン標準原液８０μｇ／ｍＬを調製する。この標準原液を蒸留水にて正確に５倍希釈して、１６μｇ／ｍＬアンペロプシン標準溶液を調製する。ＨＰＬＣへの注入量を１０、２０、４０μＬとし、アンペロプシンのピークに基づいて検量線を作成する。
・ＨＰＬＣ条件
下記表１の条件に設定する。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
本発明の組成物は、そのままあるいは各種賦形剤を添加して製剤化する。製剤としては顆粒剤、錠剤、カプセル剤を例示することができる。
また組成物をそのまま、あるいは製剤化したものを飲食品に添加して用いることもできる。
なお製剤化に当たっては、本発明の組成物の目的を阻害しない範囲で使用することができる。具体的には、シクロデキストリン、へミセルロース、リグニン、グァガム、コンニャクマンナン、イサゴール、アルギン酸、寒天、カラギーナン、キチン、カルボキシルメチルセルロース、ポリデキストロースなどの食物繊維や増粘剤、食用油、カルシウム、鉄、ナトリウム、亜鉛、銅、カリウム、リン、マグネシウム、ヨウ素、マンガン、セレンなどのミネラル；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ナイアシン、葉酸、パントテン酸などの脂溶性又は水溶性のビタミン群、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、リン脂質、アラビアガム、キサンタンガム、トラガカントガム、ローカストビーンガムなどの乳化剤や分散剤、増量剤、賦形剤、保存料・酸化防止剤、風味調整剤や香料、塩化ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、グリシン、コハク酸、乳酸ナトリウムなどの呈味料、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、アジピン酸、フマル酸、リンゴ酸などの酸味料、マルチトール、アスパルテームなどの低カロリー甘味料、着色剤などである。
また、本発明の組成物は、アンペロプシンを１０質量％以上含有する。なお、成人１日当たりの投与量はアンペロプシンとして１０〜５００ｍｇ、好ましくは５０〜３００ｍｇ、特に好ましくは１００〜２００ｍｇを含有するように配合する。
【実施例】
【００２５】
以下に本発明の組成物の製造例及びこの組成物を用いた試験例を示し、本発明を説明する。
＜藤茶抽出物の製造例１＞
乾燥藤茶１重量部（２００ｇ）に対して水を１５倍量加え９０℃に加熱し、１時間抽出しろ過を行い、１番抽出液を得た。次いでこの残渣に水を１２倍量加え、９０℃に加熱し、３０分間抽出し、ろ過を行い、２番抽出液を得た。両抽出液を合算し、減圧濃縮し、濃縮液約３００ｍｌを−４０℃で凍結させ、さらに凍結乾燥装置で乾燥させ、乾燥物を得た。これを粉砕し、６０メッシュの篩で篩い分けし、通過物８５ｇを本発明の組成物とした。この組成物中のアンペロプシン含有量は、６８質量％であった。
【００２６】
＜藤茶抽出物の製造例２＞
乾燥藤茶１重量部（２００ｇ）に対して５０％エタノール水溶液を１５倍量加え、還流冷却機を付して加熱し、１時間抽出しろ過を行い、１番抽出液を得た。次いでこの残渣に同様に５０％エタノール水溶液を１２倍量加え、９０℃に加熱し、３０分間抽出し、ろ過を行い、２番抽出液を得た。両抽出液を合算し、減圧濃縮し、濃縮液約３００ｍｌを−４０℃で凍結させ、さらに凍結乾燥装置で乾燥させ、乾燥物を得た。これを粉砕し、６０メッシュの篩で篩い分けし、通過物７８．１を本発明の組成物とした。この組成物中のアンペロプシン含有量は、５２．９質量％であった。
【００２７】
＜藤茶抽出物の製造例３＞  
製造例１と同様に、乾燥藤茶１重量部（２００ｇ）に対して水を１５倍量加え９０℃に加熱し、１時間抽出しろ過を行い、１番抽出液を得た。次いでこの残渣に水を１２倍量加え、９０℃に加熱し、３０分間抽出し、ろ過を行い、２番抽出液を得た。両抽出液を合算し、減圧濃縮し、濃縮液約３００ｍｌを得た。さらにグァガム分解物を、濃縮液あたり７８ｇ添加し、−４０℃で凍結させ、さらに凍結乾燥装置で乾燥させ、乾燥物を得た。これを粉砕し、６０メッシュの篩で篩い分けし、通過物１６３．１ｇを本発明の組成物とした。この組成物中のアンペロプシン含有量は、２４．７質量％であった。
【００２８】
＜藤茶抽出物の製造例４＞  
製造例１と同様に、乾燥藤茶１重量部（２００ｇ）に対して水を１５倍量加え９０℃に加熱し、１時間抽出しろ過を行い、１番抽出液を得た。次いでこの残渣に水を１２倍量加え、９０℃に加熱し、３０分間抽出し、ろ過を行い、２番抽出液を得た。両抽出液を合算し、減圧濃縮し、濃縮液約３００ｍｌを得た。さらにγシクロデキストリンを、濃縮液中に７８ｇ添加し、−４０℃で凍結させ、さらに凍結乾燥装置で乾燥させ、乾燥物を得た。これを粉砕し、６０メッシュの篩で篩い分けし、通過物１５１．４ｇを本発明の組成物とした。この組成物中のアンペロプシン含有量は、２６．４質量％であった。
【００２９】
動物試験
＜１．尿酸排泄促進試験＞
（１）試験試料
製造例１の抽出物を試験試料とした。この抽出物中にはＨＰＬＣ法で測定したとき、固形物重量あたりアンペロプシンが６８質量％含有されていた。
【００３０】
（２）試験方法
１）動物試験投与用試料調製方法
試験試料４４１．１８ｍｇを秤量し、メノウ乳鉢と乳棒で粉砕した。これにカルボキシメチルセルロースナトリウム（関東化学株式会社製）０．５Ｗ／Ｖ％水溶液を加えて３０ｍＬにメスアップしたものを投与試料とした。
【００３１】
２）試験動物
７週齢の雄性ウィスター系ラット（ＳＬＣ）を１群８匹として、試験群、無処置群、対照群の３群に群分けし、予備飼育を１週間行った。
【００３２】
３）飼育条件
温度２２±３℃、湿度５０±２０％、換気回数１３〜１７回／時間（ＨＥＰＡフィルターろ過オールフレッシュ方式）、照明時間８：００〜２０：００（明／暗１２時間）の飼育室内で飼育した。ラットはステンレス製２連ケージに個別収容し、無処置群には飼料（日本クレア株式会社製ＣＥ−２粉末）を自由に与え、試験群、対照群には高尿酸血症誘導飼料を自由に与えた。また飲料水も自由摂取させた。
なお高尿酸血症誘導飼料はＣＥ−２粉末にリボ核酸（酵母由来）を２．５Ｗ／Ｗ％及びオキソ酸カリウム１Ｗ／Ｗ％を粉混合したものを用いた。この飼料はラットの高尿酸血症モデルのために汎用されている。
【００３３】
４）試験試料の投与方法
試験群には、１日１回、７日間連続で、１）で調製した投与試料を、経口ゾンデを用いて、胃内に体重当たり１０ｍＬ／ｋｇ強制投与した。対照群には、カルボキシメチルセルロースナトリウム０．５Ｗ／Ｖ％水溶液を同様に投与した。
【００３４】
５）採尿及び尿酸の測定
投与６日目に採尿ケージにラットを移し、７日目の２４時間尿を採取した。採取した尿は尿酸値の測定まで−２０℃で冷凍保存した。尿酸の測定はＱｕａｎｔｉｃｈｒｏｍ  Ｕｒｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（フナコシ株式会社製）を用いて測定し、１時間当たりの尿酸排泄量を求めた。
【００３５】
６）試験の統計解析は、各群の平均値を求め、スチューデントのｔ検定で危険率０．０５以下を有意と判定した。
（３）試験結果
尿中の１時間当たりの尿酸排泄量を下記表２及び図１に示す。
【００３６】
【表２】
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【００３７】
以上の試験の結果、アンペロプシン６８質量％を含有する藤茶抽出組成物を１日１回１週間投与したところ、高尿酸血症のモデル動物において顕著に尿酸排泄量を増加させることがわかった。したがって、アンペロプシンを含む藤茶抽出物は、尿酸排泄促進作用を有するため、高尿酸血症の治療や予防に有用であるということができる。
【００３８】
＜２．ＡＢＣＧ２遺伝子活性化試験＞
上記の結果により、アンペロプシンに尿中尿酸排泄促進作用が認められたことから、尿酸排出トランスポーターのひとつであるＡＢＣＧ２の遺伝子発現量に対する影響を以下の試験により確認した。
【００３９】
（１）試験方法
上記の尿酸排泄促進試験の最終日にラットから腎臓を摘出した。この腎臓をＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社製）中に入れ使用まで−８０℃保存した。ＲＮＡの抽出にはＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。凍結していた腎臓を解凍し、３０ｍｇ程度に切断しＱＩＡｚｏｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔを入れたマイクロチューブに移し入れた。ハンディマイクロホモジナイザー（マイクロテック株式会社製）を用いて腎臓をホモジナイズし、その後の操作は測定キットに添付のプロトコールに従った。
【００４０】
抽出したＲＮＡの濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて測定し、ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ水で２００ｎｇ／μＬに調製した。０．２ｍＬのＰＣＲチューブにＲＮＡ溶液とＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）を表３のように調製し、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）を用いて反応させ、ｃＤＮＡを得た。ＰＣＲの反応時間は３７℃、１５分間とし、反応停止は８５℃、５秒とした。
【００４１】
【表３】
2018043985.tif 000006
【００４２】
ＡＢＣＧ２の発現量解析はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いたリアルタイムＰＣＲにより行った。９６ウェルプレートにＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ水で１０倍に希釈したｃＤＮＡとＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）を表４のように調製し、反応させた。ＡＢＣＧ２の発現量はハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨにより補正し、ＡＢＣＧ２／ＧＡＰＤＨ比として求めた。各遺伝子の発現量はＥメソッドにより補正した値を用い、ＡＧＣＧ２とＧＡＰＤＨのプライマーは次の配列のものを用いた。
［ＡＢＣＧ２］
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：ＣＴＧＡＣＣＣＴＴＣＣＡＴＣＣＴＣＴＴＣ
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：ＣＧＡＧＧＣＴＧＧＴＧＡＡＴＧＧＡＧＡＡ
［ＧＡＰＤＨ］
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：ＡＴＧＡＴＴＣＴＡＣＣＣＡＣＧＧＣＡＡＧ
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：ＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＴＴ
【表４】
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【００４３】
試験の統計解析は、各群の平均値を求め、ダネットの検定法で危険率０．０５以下を有意と判定した。
【００４４】
（２）結果
試験結果を図２に示す。
試験群（藤茶抽出物投与群）は、対照群に対してＡＢＣＧ２遺伝子発現量が有意に増加していることから、尿酸排泄能が亢進していることが確認された。
【００４５】
＜３．キサンチンオキシダーゼ阻害効果試験＞
尿酸代謝の律速段階であるキサンチンオキシダーゼに及ぼす藤茶の効果を試験した。
尿酸はプリン体の最終代謝産物であり、ヒトの体における尿酸の由来は大きく分けて、体内で合成されるものと、食事中から摂取するものの２つである。この尿酸の産生と排泄の制御により血液中の尿酸濃度は厳密に維持されている。しかしながら産生と排泄のバランスに異常が生じることにより、血液中の尿酸濃度が異常に高くなり、高尿酸血症を発症することがある。そのため、高尿酸血症の改善には、尿酸の合成阻害と排泄促進をターゲットとした医薬品が開発されている。特に体内で合成される尿酸は、食事由来の尿酸よりも数倍多いと言われており、体内における尿酸合成の制御は非常に重要である。藤茶抽出物及びアンペロプシンのキサンチンオキシダーゼ阻害能を測定した。
【００４６】
（１）試験方法
１）試験試料の調製
試験試料として、藤茶の含水エタノール抽出物（アンペロプシン３０．８質量％含有）、精製アンペロプシン（シグマアルドリッチ社製）及びキサンチンオキシダーゼ阻害薬であるアロプリノール（和光純薬工業株式会社製）を用いた。
藤茶抽出物は、１％ＤＭＳＯ溶液（リン酸緩衝液）に溶解した後、３０００×ｇで５分間遠心分離処理し、上清を分取した。これを試験試料として、さらに１％ＤＭＳＯで段階希釈し、試験用の濃度系列の藤茶液を調製した（０．００５〜８０ｍｇ／ｍＬ）。精製アンペロプシン及びアロプリノールは、試験用の濃度系列の１％ＤＭＳＯ溶液を調製した。精製アンペロプシンは、１．９５３〜３２０００μＭ／ｍＬ、アロプリノールは、０．００６〜１００μＭ／ｍＬの濃度系列である。
【００４７】
２）キサンチンオキシダーゼ阻害活性の測定
各濃度の被験物質５０μＬ、７０ｍＭリン酸緩衝液３５μＬ、０．０１ｕｎｉｔｓ／ｍＬのキサンチンオキシダーゼ（Ｘａｎｔｈｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｃｏｗ  ｍｉｌｋ：シグマアルドリッチ社製）３０μＬを混和し、３７℃で１０分間インキュベートした。さらに１００μＭキサンチンを６０μＬ添加し、３７℃で１０分間反応させた。
次いで１Ｎ塩酸２５μＬを添加して、反応を停止させた。この時生成した尿酸を、超高速高分離液体クロマトグラフィー（ウォーターズ社製）を用いて測定した。なお測定の前処理として、以下の操作を行った。
上記の反応液４０μＬに０．３Ｍ過塩素酸６０μＬを混和し、氷上に３０分以上静置し、その後１，８００ｒｐｍで２０分間遠心し、上清３０μＬを分取し、これに０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム３０μＬを加え、混和した。
カラムにはＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｔｒｉａｒｔ  Ｃ１８，１５０×２．０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．Ｓ−１．９μｍ，１２ｎｍ）を使用し、溶離液としてメタノールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ２．２）を用いた。検出は２８４ｎｍの波長で行い、ピーク面積法で濃度を算出した。
【００４８】
３）解析
定量した反応液中の尿酸濃度を用いて、キサンチンオキシダーゼ阻害率（％ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を以下計算式により求め、５０％阻害率（ＩＣ５０）に相当する濃度を得た。
阻害率（％）＝１００−（Ｃ／Ｃｂ×１００）
Ｃ  ：評価サンプル添加時尿酸生成濃度
Ｃｂ：コントロール（サンプル非添加時）尿酸生成濃度
【００４９】
（２）結果
藤茶抽出物のＩＣ５０は１５０μｇ／ｍＬであった。
またアンペロプシンは１３７μｇ／ｍＬ、アロプリノールは０．０４μｇ／ｍＬであった。
この結果から藤茶抽出物はキサンチンオキシダーゼ阻害作用を有しており、その作用は藤茶抽出物のアンペロプシン含有量相当の精製アンペロプシンよりも強いキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有していた。このことから、藤茶抽出物はアンペロプシン単独よりも強いキサンチンオキシダーゼ阻害活性を有していることを見出した。
【００５０】
＜ヒト臨床試験１（血中尿酸値低減効果試験）＞
（１）試験試料
製造例１に基づく抽出物を試験試料とした。この抽出物中にはＨＰＬＣ法で測定したとき、固形物重量あたりアンペロプシンが６８質量％含有されていた。また尿酸排泄に効果があることが知られているアンセリン（β−アラニル−Ｎ−メチルヒスチジン：β−ａｌａｎｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）を陽性対照として使用した。
【００５１】
（２）試験方法
１）ヒト試験用試料
製造例１で調製した藤茶抽出物を充填したカプセル剤（アンペロプシン１５０ｍｇ含有）、アンセリン２００ｍｇ含有カプセル剤、プラセボ（デンプンのみ）を試験用試料（試験用カプセル剤）とした。
【００５２】
２）被験者
日本人男性１１９名（２０歳〜６５歳）を対照にスクリーニング検査を行い、血清尿酸値が６．０ｍｇ／ｄＬ以上８．０ｍｇ／ｄＬ未満の男性３０名を被験者とし、事前にＢＭＩ、血清尿酸値、尿中尿酸値（クレアチニン補正値）を測定した。
なおスクリーニング本試験を含め、試験スケジュールは表５、検査項目は表６のとおりである。また試験はすべて専門の臨床検査施設においてヘルシンキ宣言に則って実施した。
【００５３】
【表５】
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【００５４】
【表６】
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【００５５】
被験者３０名を無作為に各群１０名ずつ割り付けた。各群間には、背景に統計的な有意差がないことを確認した。
なお、被験者の基礎情報は下記表７のとおりである。
【００５６】
【表７】
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【００５７】
３）試験方法
上記の試験用カプセル剤（藤茶、アンセリン、プラセボ）を無作為化二重盲検法で試験した。
投与期間は４週間、１日１回の投与とし、投与開始から２週間目及び４週間経過後に血液及び尿を採取して、血清尿酸値及び尿中尿酸排泄量を測定した。
各項目について、プラセボ群と各試験食品摂取群を対応のないｔ検定で比較した。プラセボと各試験食品との比較における多重性はＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法で有意水準の調整を行った。なお、検査時点間の多重性は考慮しなかった。各項目について、各群において摂取前（スクリーニング）と摂取後各時点の比較を対応のあるｔ検定を使用し、比較した。
統計解析ソフトはＪＭＰ（登録商標）１２．０（ＳＡＳ社製）およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ２０１０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を使用した。
【００５８】
（３）試験結果
１）血清尿酸値
血清尿酸値は、試験開始時の尿酸値からの変化量として図３に示した。
藤茶抽出物の投与によって、血清尿酸値は、２週間経過後、４週間経過後それぞれ投与前と比較して有意に低下し、またプラセボ群と比較して低値であった。一方プラセボ投与では尿酸値は上昇傾向を示した。血清尿酸値低下及び尿酸排泄増加の陽性対照としたアンセリンは、血清尿酸値を低下させなかった。
【００５９】
２）尿中尿酸排泄値
尿中尿酸排泄値（尿酸値）は、クレアチニン補正値として測定した。尿酸排泄量には有意差は確認できなかったが、排泄増加の傾向が確認された。 
以上のヒト臨床試験の結果から藤茶抽出物は、血中尿酸値を有意に低下させることが明らかとなった。また尿酸排泄量が増加する傾向が認められた。したがって藤茶抽出物は血清尿酸を低減させる効果を有するということができる。藤茶抽出物摂取による血中尿酸値低減作用は、食事中に含まれるプリン体の吸収阻害、体内での尿酸の合成阻害、尿中への尿酸の排泄促進効果によるものであると考えられる。 
【００６０】
＜ヒト臨床試験２（プリン体負荷試験）＞
プリン体を経口投与しながら本発明品を摂取した場合の血中尿酸値に及ぼす効果を試験した。
（１）試験試料
製造例１に基づく抽出物を試験試料とした。この抽出物中にはＨＰＬＣ法で測定したとき、固形物重量あたりアンペロプシンが６８質量％含有されていた。
【００６１】
（２）試験方法
１）ヒト試験用試料
製造例１で調製した藤茶抽出物を充填したカプセル剤（アンペロプシン１５０ｍｇ含有）、プラセボの２剤を試験に用いた。試験用カプセル剤の組成の概略を下記表８に示す。
【００６２】
【表８】
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【００６３】
２）被験者
日本人男性（２０歳〜６５歳）を対照にスクリーニング検査を行い、男性６名を被験者として選抜した。
なおスクリーニング、本試験を含め、試験スケジュールは表９、検査項目は表１０のとおりである。また試験は、すべて専門の臨床検査施設においてヘルシンキ宣言に則って実施した。
【００６４】
【表９】
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【００６５】
【表１０】
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【００６６】
被験者６名は、２群に割り付けた。両群間には、背景に統計的な有意差がないことを確認した。
【００６７】
３）試験方法
上記の試験用カプセル剤（試験食品、プラセボ）を無作為化二重盲検クロスオーバー法で試験した。なお被験者には、上記表９のスケジュールのとおり試験を実施した。試験開始直前に酵母エキスの摂取によってプリン体負荷を行い、さらに試験食品又はプラセボのカプセルを３粒摂取した。
投与開始から、６０分、１２０分、１８０分、２４０分経過後に血液を採取して、血清尿酸値を測定した。
【００６８】
試験操作手順は次のとおりである。
１）プリン体負荷６０分前（午前９時〜９時半の間）に来所させ、被験者に水３００ｍ
Ｌを摂取させる。
２）プリン体負荷前の採血を行う。
３）水摂取６０分後、全排尿させる。
４）排尿後、プリン体（ビール酵母抽出ＲＮＡ、株式会社エル・エス・ファクトリー
ＢＦ）４．６５ｇ（ＲＮＡとして４ｇ）を２００ｍＬの水で摂取する。
５）プリン体摂取直後に試験食品又はプラセボを１００ｍＬの水とともに摂取させる。
６）プリン体負荷後、蓄尿を開始させ、６０分ごとに２４０分まで尿を回収する。
７）プリン体負荷６０分後、１２０分後、１８０分後、２４０分後に採血を行う。
８）プリン体負荷６０分後、１２０分後、１８０分後に２００ｍＬの水を摂取させる。
【００６９】
統計解析は、対応のあるｔ検定にて行った。統計解析ソフトはＪＭＰ（登録商標）１２．０（ＳＡＳ社製）及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を使用した。 
【００７０】
（３）試験結果
・血清尿酸値
血清尿酸値は、試験開始時の尿酸値からの変化量として図４に示した。
プリン体の投与によって血清尿酸値の増加量は、投与開始から経時的に上昇するが、藤茶抽出物を摂取した場合は、上昇が抑制されており１８０分経過後でピークに達し、２４０分経過後減少に転じた。一方プラセボ投与時は投与開始から２４０分経過まで上昇が続いた。
投与開始から２４０分経過後の血中尿酸量は、藤茶抽出物投与時とプラセボ投与時の間で有意な差が生じた。 
以上のプリン体負荷ヒト臨床試験の結果から、藤茶抽出物は、プリン体摂取によって上昇した血中尿酸値を有意に抑制することが明らかとなった。
したがって藤茶抽出物は、プリン体摂取による血中尿酸値の上昇を抑制する効果を有するということができる。藤茶抽出物による、プリン体摂取による血中尿酸値上昇抑制効果は、藤茶に含まれるアンペロプシンなどが、経口摂取したプリン体の体内への吸収を抑制すること、および藤茶抽出物がキサンチンオキシダーゼを阻害するため、吸収されたプリン体に起因する尿酸の合成が抑制されることで生じているものと考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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