(57)【要約】【課題】食道癌の予後を予測する方法、特に、食道癌患者の化学放射線療法後の予後を簡便かつ高精度に予測できる方法を提供すること。【解決手段】食道癌患者に由来する遺伝子含有試料を用いて１または２種以上の遺伝子多型部位の塩基の種類を分析し、該分析結果に基づいて食道癌患者の予後を検査する方法であって、  該遺伝子多型部位が、配列番号１〜１０２から選ばれる塩基配列の塩基番号２６番目に相当する部位、又は該部位と連鎖不平衡の関係にある部位である、前記方法。【選択図】図１
2018093764.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
食道癌患者に由来する遺伝子含有試料を用いて１または２種以上の遺伝子多型部位の塩基の種類を分析し、該分析結果に基づいて食道癌患者の予後を検査する方法であって、
該遺伝子多型部位が、配列番号１〜１０２から選ばれる塩基配列の塩基番号２６番目に相当する部位、又は該部位と連鎖不平衡の関係にある部位である、前記方法。
【請求項２】
前記食道癌患者の予後が化学放射線療法を受けた後の予後である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子多型部位が、下記（１）から（６）より選択される１または２種以上であり、当該遺伝子多型部位における塩基の種類がリスクアレルである場合には食道癌患者の予後が良くないと判定される、請求項１または２に記載の方法。
（１）配列番号１７に示す塩基配列における第２６番目に相当する部位
塩基の種類がC（リスクアレル）又はT（非リスクアレル）である一塩基多型
（２）配列番号４３に示す塩基配列の第２６番目に相当する部位
塩基の種類がA（非リスクアレル）又はG（リスクアレル）である一塩基多型
（３）配列番号４５に示す塩基配列の第２６番目に相当する部位
塩基の種類がA（リスクアレル）又はG（非リスクアレル）である一塩基多型
（４）配列番号５５に示す塩基配列の第２６番目に相当する部位
塩基の種類がC（リスクアレル）又はG（非リスクアレル）である一塩基多型
（５）配列番号５９に示す塩基配列の第２６番目に相当する部位
塩基の種類がA（非リスクアレル）又はG（リスクアレル）である一塩基多型
【請求項４】
食道癌患者に由来する遺伝子多型部位における塩基の種類を分析可能なポリヌクレオチドを含む、食道癌予後検査用試薬であって、
該遺伝子多型部位が、配列番号１〜１０２から選ばれる塩基配列の塩基番号２６番目に相当する部位であり、前記ポリヌクレオチドが、前記塩基配列における前記遺伝子多型部位を含む連続した１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する、試薬。
【請求項５】
前記遺伝子多型部位が、配列番号１７，４３，４５，５５および５９から選ばれる１または２種以上の塩基配列の塩基番号２６番目に相当する部位である、請求項４に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食道癌の予後を予測する方法、特に、食道癌患者の化学放射線療法後の予後を予測する方法および該方法に使用される試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本における食道癌罹患数は、2012年には男性で18,583名、女性で3,382名が新たに食道癌と診断されている。2014年には、男性で9,629名、女性で1,947名が食道癌で亡くなっている（国立がん研究センターがん対策情報センター）。他の消化器系の胃癌、結腸・直腸癌と比較して難治性であり、食道癌の５年生存率（2006年から2008年診断例）は、男性で36.0％、女性で43.9％であるが、胃癌（65.3％と63.0％）、大腸癌（72.2％と69.6％）や全部位（59.1％と66.0％）に比べて生存率が低い（国立がん研究センターがん対策情報センター）。
【０００３】
食道癌の治療は、従来は食道切除が唯一の手段であったが、近年では化学放射線療法が進歩し、食道の温存が得られる化学放射線療法はＱＯＬの点からも治療の有望な選択肢の一つとなっている。しかしながら、化学放射線療法を受けた患者の一部では食道癌が再発し、結局は食道切除をせざるを得なくなり、最終的には死に至る場合がある。
このように、もし化学放射線療法が効果を奏しない患者に施された場合には、治療の間に癌が進行し、治癒の機会を逃す可能性もある。従って、治療前に効果が予測でき、あらかじめ、化学放射線療法が効果を奏しない患者を除外することができれば、副作用の問題や無駄な医療費の負担を改善することができ、かつ、その患者個人にあったより有効で最適な別の治療法を選択することが可能となる。それゆえ、化学放射線療法を行う前に、その治療効果を判定しうるバイオマーカーを同定することは、重要な課題である。
【０００４】
食道癌に対する化学放射線療法の効果は遺伝的要因が寄与していることが示唆され、これまでにいくつかの遺伝子における一塩基多型（SNPｓ）が食道癌に対する化学放射線療法の効果と相関することが報告されている（非特許文献１〜４）。しかしながら、これらのSNPｓでは相関が十分とは言えず、より高い精度で食道癌に対する化学放射線療法の効果を予測することのできるマーカーの開発が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kuwahara et al. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 2010, 29:100
【非特許文献２】Omatsu et al. Int. J. Med. Sci. 2013, Vol. 10(12):1755-1760
【非特許文献３】Pan et al. Cancer. 2012 September 1; 118(17)
【非特許文献４】Michelle et al. J Clin Oncol 2009, 27:857-871
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、食道癌の予後を予測する方法、特に、食道癌患者の化学放射線療法後の予後を簡便かつ高精度に予測できる方法及び該方法に使用される試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討した結果、第11染色体上のSBF2遺伝子のイントロン等に該当する位置に存在する遺伝子多型が、食道癌の予後、特に食道癌患者の
化学放射線療法後の予後と有意に相関することを同定した。そして、これらの多型を調べることにより、食道癌の予後を正確に予測することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］食道癌患者に由来する遺伝子含有試料を用いて１または２種以上の遺伝子多型部位の塩基の種類を分析し、該分析結果に基づいて食道癌患者の予後を検査する方法であって、
該遺伝子多型部位が、配列番号１〜１０２から選ばれる塩基配列の塩基番号２６番目に相当する部位、又は該部位と連鎖不平衡の関係にある部位である、前記方法。
［２］前記食道癌患者の予後が化学放射線療法を受けた後の予後である、［１］に記載の方法。
［３］前記遺伝子多型部位が、下記（１）から（５）より選択される１または２種以上、好ましくは（１）から（５）の全てであり、当該遺伝子多型部位における塩基の種類がリスクアレルである場合には食道癌患者の予後が良くないと判定される、［１］または［２］に記載の方法。
（１）配列番号１７に示す塩基配列における第２６番目に相当する部位
塩基の種類がC（リスクアレル）又はT（非リスクアレル）である一塩基多型
（２）配列番号４３に示す塩基配列の第２６番目に相当する部位
塩基の種類がA（非リスクアレル）又はG（リスクアレル）である一塩基多型
（３）配列番号４５に示す塩基配列の第２６番目に相当する部位
塩基の種類がA（リスクアレル）又はG（非リスクアレル）である一塩基多型
（４）配列番号５５に示す塩基配列の第２６番目に相当する部位
塩基の種類がC（リスクアレル）又はG（非リスクアレル）である一塩基多型
（５）配列番号５９に示す塩基配列の第２６番目に相当する部位
塩基の種類がA（非リスクアレル）又はG（リスクアレル）である一塩基多型
［４］食道癌患者に由来する遺伝子多型部位における塩基の種類を分析可能なポリヌクレオチドを含む、食道癌予後検査用試薬であって、
該遺伝子多型部位が、配列番号１〜１０２から選ばれる塩基配列の塩基番号２６番目に相当する部位であり、前記ポリヌクレオチドが、前記塩基配列における前記遺伝子多型部位を含む連続した１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する、試薬。
［５］前記遺伝子多型部位が、配列番号１７，４３，４５，５５および５９から選ばれる１または２種以上の塩基配列の塩基番号２６番目に相当する部位である、［４］に記載の試薬。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、食道癌患者の予後を正確かつ簡便に予測することができる。特に、治療前に化学放射線療法の効果が予測でき、あらかじめ、化学放射線療法が効かない患者を除外することができるので、副作用や医療費の問題を改善することができ、かつ、その患者個人に合った最適な治療法を選択することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】rs11042574の遺伝子多型による食道癌再発のリスクの解析結果を示すグラフ（化学放射線療法後の無再発生存月数との関係をカプランマイヤー法で検討した）。
【図２】rs151269855の遺伝子多型による食道癌死のリスクの解析結果を示すグラフ（化学放射線療法後の食道癌死による生存月数との関係をカプランマイヤー法で検討した）。
【図３】rs111757012の遺伝子多型による食道癌死のリスクの解析結果を示すグラフ（化学放射線療法後の食道癌死による生存月数との関係をカプランマイヤー法で検討した）。
【図４】rs56219350の遺伝子多型による食道癌死のリスクの解析結果を示すグラフ（化学放射線療法後の食道癌死による生存月数との関係をカプランマイヤー法で検討した）。
【図５】rs11022546の遺伝子多型による食道癌死のリスクの解析結果を示すグラフ（化学放射線療法後の食道癌死による生存月数との関係をカプランマイヤー法で検討した）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、食道癌患者に由来する遺伝子含有試料を用いて１または２種以上の遺伝子多型部位の塩基の種類を分析し、該分析結果に基づいて食道癌患者の予後を検査することを特徴とする。
【００１２】
食道癌とは、食道に発生する上皮性由来の腫瘍、例えば、扁平上皮癌、腺癌などを意味する。食道癌は、好ましくは早期食道癌である。早期食道癌とは、原発層の壁深達度が、粘膜層にとどまり、リンパ節転移を認めない食道癌を意味する。
【００１３】
本発明の方法は、いずれの人種の被検者に対しても用いることができるが、特に、日本人等のアジア人の被検者に好適に用いることができる。また、本発明の方法は、いずれの性別の被検者に対しても用いることができる。
【００１４】
化学放射線療法とは、化学療法と放射線療法を併用して癌治療を行う、悪性腫瘍に対する治療法を意味する。
【００１５】
化学療法とは、抗癌剤を用いた癌を治療する方法を意味する。抗癌剤の種類は特に限定されないが、例えば、ＣＤＤＰ（シスプラチン）、５−ＦＵ（フルオロウラシル）、イリノテカン、塩酸ゲムシタビン、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、ＴＳ−１（ＦＴ（テガフール）、ＣＤＨＰ（ギメラシル）及びＯｘｏ（オテラシルカリウム）の３成分を配合）、ニムスチン（ニドラン：登録商標）、ラニムスチン（サイメリン：登録商標）、テモゾロミド（テモダール：登録商標）、カルボプラチン、シクロホスファミド、メトレキサート、ドキソルビシン、オキサリプラチン、テガフール・ウラシル、インターフェロンα、メルファラン（アルケラン：登録商標）、サリドマイド、それらの組み合わせなどが挙げられる。
【００１６】
放射線療法は、放射線を癌に照射して癌を治療する方法を意味する。放射線の種類としては、例えば、Ｘ線、γ線、電子線、陽子線、重粒子線などが挙げられる。
【００１７】
本発明の方法においては、遺伝子多型の分析結果を、食道癌患者の予後と関連付ける。遺伝子多型としては表１に記載の１０２種類の遺伝子多型が挙げられる。
【００１８】
【表１−１】
2018093764.tif 000003
【表１−２】
2018093764.tif 000004
【表１−３】
2018093764.tif 000005
【表１−４】
2018093764.tif 000006
【００１９】
表１について説明する。
左側の数字は配列表の配列番号を示す。
左から２つ目の欄はNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。当該SNPを含む配列情報は、GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）等からも入手できる。
左から３，４つ目の欄は各遺伝子多型が存在する染色体と染色体上の位置を示す。
左から５つ目の欄は各遺伝子多型が存在する染色体上の部位にマップされる遺伝子を示
す。
各配列において、第２６番目の塩基が多型塩基であり、例えば、[A/C]はアデニン（A）／シトシン（C）の多型を意味し、右側の塩基シトシン（C）がマイナーアレルである。
[-/T]は第２６番目には塩基は存在しないか、第２６番目はチミン（T）であるという多型（挿入多型）を意味し、チミン（T）がマイナーアレルである。
[-/AAT]は第２６番目には塩基は存在しないか、第２６番目にAATの３塩基が挿入されているという多型（３塩基挿入多型）を意味し、AATがマイナーアレルである。
[A/C/G]はアデニン（A）／シトシン（C）／グアニン（G）の多型を意味し、右側の塩基シトシン（C）およびグアニン（G）がマイナーアレルである。
化学放射線療法後の食道癌再発または食道癌死に関してのリスクアレルは該当塩基多型をボールドと下線により表示した。化学放射線療法後の食道癌再発または食道癌死に関してのリスクアレルは必ずしもマイナーアレルではない。
【００２０】
被検者（食道癌患者）由来の遺伝子（ゲノム）含有試料を分析し、被検患者由来の染色体上の配列で、上記いずれかの塩基配列に相当する塩基配列を解析し、第２６番目の部位に相当する部位の塩基の種類がリスクアレルである場合には、食道癌の予後が良くない、化学放射線療法後の食道癌の再発リスクが高いと判定できる。
【００２１】
表１に記載の塩基配列は複数の染色体に由来するが、そのうちのいくつかは下記の遺伝子に集中している。
SET Binding Factor 2（SBF2）のイントロン（第１１染色体）・・・配列番号１〜３４，４８〜５３，７４〜９７
Amyloid beta A4 precursor protein-binding family B member 2 （APBB2）のイントロン（第４染色体）・・・配列番号５４〜５８、６０〜６３、１０１
TEA Domain Transcription Factor 1（TEAD1）のイントロン（第１１染色体）・・・配列番号５９，９７
【００２２】
以下、代表的な配列について説明する。
【００２３】
rs11042574は、第11染色体の9994795番目の部位（SBF2遺伝子のイントロン上の部位）、すなわち、配列番号１７で表される塩基配列の第２６番目に相当する部位におけるシトシン（C）／チミン（T）の一塩基多型を意味し、この部位の塩基がC（リスクアレル）である場合には、食道癌の予後が良くない、化学放射線療法後の食道癌の再発リスクが高いと判定できる。対立遺伝子も考慮すると、上記リスクアレルのホモ（C/C）である場合に、特に食道癌の予後が良くない、再発の可能性が高いと予測される。これはカプランマイヤー法による治療後の無再発生存月数解析により統計学的有意差を持って裏付けられた。（Logrank p<0.001）（図１）
【００２４】
rs151269855は、第7染色体の97215572番目の部位、すなわち、配列番号４３で表される塩基配列の第２６番目の部位に相当する部位におけるアデニン（A）／グアニン（G）の一塩基多型を意味し、この部位の塩基がG（リスクアレル）である場合には、食道癌の予後が良くない、化学放射線療法後の食道癌の再発リスクが高いと判定できる。対立遺伝子も考慮すると、上記リスクアレルのホモ（G/G）である場合に、特に食道癌の予後が良くない、癌死の可能性が高いと予測される。これはカプランマイヤー法による治療後の食道癌による死亡までの生存月数解析により統計学的有意差を持って裏付けられた。（Logrank p<0.001）（図２）
【００２５】
rs111757012は、第11染色体の38617128番目の部位、すなわち、配列番号４５で表される塩基配列の第２６番目の部位に相当する部位におけるアデニン（A）／グアニン（G）の一塩基多型を意味し、この塩基がA（リスクアレル）である場合には、食道癌の予後が良
くない、化学放射線療法後の食道癌の再発リスクが高いと判定できる。対立遺伝子も考慮すると、上記リスクアレルのホモ（A/A）である場合に、特に食道癌の予後が良くない、食道癌死の可能性が高いと予測される。これはカプランマイヤー法による治療後の食道癌による死亡までの生存月数解析により統計学的有意差を持って裏付けられた。（Logrank p=0.001）（図３）
【００２６】
rs56219350は、第4染色体の41206648番目の部位（APBB2遺伝子のイントロン上の部位）、すなわち、配列番号５５で表される塩基配列の第２６番目の部位に相当する部位におけるシトシン（C）／グアニン（G）の一塩基多型を意味し、この部位の塩基がC（リスクアレル）である場合には、食道癌の予後が良くない、化学放射線療法後の食道癌死の可能性が高いと判定できる。対立遺伝子も考慮すると、上記リスクアレルのホモ（C/C）である場合に、特に食道癌の予後が良くない、食道癌死の可能性が高いと予測される。これはカプランマイヤー法による治療後の食道癌による死亡までの生存月数解析により統計学的有意差を持って裏付けられた。（Logrank p<0.001）（図４）
【００２７】
rs11022546は、第11染色体の12934243番目の部位（TEAD1遺伝子のイントロン上の部位）、すなわち、配列番号５９で表される塩基配列の第２６番目の部位に相当する部位におけるアデニン（A）／グアニン（G）の一塩基多型を意味し、この部位の塩基がG（リスクアレル）である場合には、食道癌の予後がよくない、化学放射線療法後の食道癌の再発リスクおよび食道癌死の可能性が高いと判定できる。対立遺伝子も考慮すると、上記リスクアレルのホモ（G/G）である場合に、特に食道癌の予後が良くない、再発の可能性が高い、および食道癌による死亡の可能性が高いと予測される。これはカプランマイヤー法による治療後の食道癌による死亡までの生存月数解析により統計学的有意差を持って裏付けられた。（Logrank p<0.001）（図５）
【００２８】
表１の他の多型部位についても同様の説明が適用される。
【００２９】
本発明においては、被検者の染色体上の遺伝子配列において、上記各塩基配列の塩基番号２６番目に相当する部位における多型の種類を解析する。なお、塩基番号２６番目に相当する部位としては、染色体上の遺伝子配列が個体差等によりこれらの塩基配列と完全に一致していなくとも、その前後配列に鑑みれば、当該多型部位であると認定できる部位も含む。
【００３０】
また、本発明において解析する多型部位は、上記１０２種類そのものに限定されず、上記１０２種類の塩基配列の26番目の部位と連鎖不平衡にある部位の多型を分析してもよい。ここで、上記の多型部位と連鎖不平衡にある多型部位とは、上記の多型部位とｒ2（連鎖不平衡係数）＞０．５、好ましくはｒ2＞０．８、さらに好ましくはｒ2＞０．９の関係を満たす多型部位をいう。また、上記の多型部位と連鎖不平衡にある多型部位は、例えば、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)等を用いて同定することができる。
【００３１】
上記多型部位の塩基の種類を調べ、得られた結果を上記の基準（リスクアレルを有する被検者は予後が良くない）に基づいて食道癌の予後と関連付けることにより、食道癌の予後を検査することができる。なお、いずれの多型部位も、二本鎖ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のどちらを解析してもよい。
【００３２】
上記多型は単独で解析されてもよいし、上記多型部位の少なくとも１つを含む複数の多型をまとめてハプロタイプ解析してもよい。検査の精度を向上するためには、食道癌の予後と関連する複数の多型をまとめて解析することが好ましい。
【００３３】
遺伝子多型の解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されない。例えば、血液、尿等の体液、口腔粘膜等の細胞、毛髪等の体毛、及び爪などが挙げられる。遺伝子多型の解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離したものを用いて解析することが好ましい。
【００３４】
遺伝子多型の解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
シークエンス解析は、通常の方法により行うことができる。具体的には、遺伝子多型部位から数十塩基５’側に離れた位置にプライマーを設定し、そのプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する遺伝子多型がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンス反応の前に、ＰＣＲなどによって、あらかじめ遺伝子多型部位を含む断片を増幅しておくことが好ましい。
【００３６】
また、遺伝子多型の解析は、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、プライマーの３’末端が各遺伝子多型の位置となるように、プライマーを設計する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号明細書）、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書）、ＩＣＡＮ法（特開２００２−２３３３７９号公報）などによっても増幅の有無を調べることができる。
【００３７】
また、遺伝子多型部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによって、どのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法（Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.）が挙げられる。具体的には、まず、目的の遺伝子多型部位を含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの塩基であるかを決定することができる。
【００３８】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００３９】
他に、ＤＮＡチップ等によりハイブリダイゼーションの有無を調べることによって、多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによって、遺伝子多型部位がいずれの塩基であるかを調べることもできる。
【００４０】
また、ＤＮＡ三重鎖構造を特異的に認識して切断するクリベース、インベーダーと呼ばれる遺伝子多型を認識するプローブ、及び、蛍光シグナルを発生するよう設計されたプローブを使用するインベーダー法により、多型解析をしてもよい。
【００４１】
本発明の方法の具体的態様の一例としては、まず被検者由来の試料を用いて上記遺伝子多型部位の塩基の種類を解析し、被検者における塩基の種類を決定する。次に、当該塩基の種類がリスクアレルである場合には食道がんの予後が良くない、非リスクアレルである場合には食道がんの予後が良いと判定し、検査結果として医師等に情報を提供することができる。食道がんの予後の判定は、被検者の塩基の種類がリスクアレルであるか非リスク
アレルであるか機械的に振り分けるものである。従って、本発明の方法に基づく食道がんの予後の判定及びその情報の提供は、医師等による専門的な判断は要さない。
【００４２】
本発明における、食道癌患者の予後は化学放射線療法後の食道癌患者の予後であることが好ましく、例えば、化学放射線療法後に食道癌が再発すること、または化学放射線療法後に食道癌の症状が改善しないこと、により患者が死に至る可能性の予測、例えば、化学放射線療法後の５年生存率が当該患者のrs11022546がA/Aなら100％、リスクアレルのホモ（G/G）であれば５０%であることなど、化学放射線療法の効果の有無を予測することができる。
【００４３】
本発明の方法により化学放射線療法の効果がないと予測される場合は、食道癌患者に化学放射線療法を施さず、食道切除等の他の治療法を選択し、化学放射線療法の効果があると予測される場合は、食道癌患者に化学放射線療法を施すことで、患者にあった治療法を選択することができる。
【００４４】
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明の検査用試薬は、上記遺伝子多型部位の塩基の種類を検出可能なポリヌクレオチドを含む、食道癌の予後を検査するための検査試薬である。当該ポリヌクレオチドとしては、プライマーやプローブなどが含まれる。また、１つの遺伝子多型を検出可能なポリヌクレオチドを、単独で検査試薬に含めてもよいし、複数の遺伝子多型を検出可能な複数のポリヌクレオチドを検査試薬に含めてもよい。検査の精度を向上するために、複数のポリヌクレオチドにより複数の遺伝子多型部位を検査することが好ましい。
【００４５】
上記プローブとしては、上記遺伝子多型部位を含み、ハイブリダイズの有無によって遺伝子多型部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１〜１０２から選ばれる塩基配列において２６番目の部位を含む連続した１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有するプローブが挙げられる。プローブはリスクアレルを含む配列にハイブリダイズして検出するものでもよいし、非リスクアレルを含む配列にハイブリダイズして検出するものでもよいし、その両方でもよい。
プローブの長さは、好ましくは１０〜５０塩基であり、より好ましくは１５〜３５塩基であり、さらに好ましくは２０〜３５塩基である。
【００４６】
プライマーとしては、上記遺伝子多型部位を増幅するためのＰＣＲに用いることのできるプライマー、又は上記遺伝子多型部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１〜１０２から選ばれる塩基配列の２６番目の部位を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜５０塩基がより好ましく、１５〜３５塩基がさらに好ましく、２０〜３５塩基が特に好ましい。
【００４７】
上記遺伝子多型部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記遺伝子多型部位５’側領域、好ましくは３０〜１００塩基上流の配列を有するプライマーや、上記遺伝子多型部位の３’側領域、好ましくは３０〜１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。ＰＣＲによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
【００４８】
なお、本発明の検査用試薬は、これらのプライマーやプローブに加えて、ＰＣＲ用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬、蛍光色素などを含むものであ
ってもよい。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００５０】
＜遺伝子多型の探索＞
プラチナ製剤を中心とした化学療法を施した９６名の日本人食道癌患者（扁平上皮癌９２名、腺扁平上皮癌患者４名）について、Japonica array（商標）を用いて遺伝子多型の網羅的解析を行い、化学療法後の食道癌の予後（食道癌再発、食道癌死）と相関するSNPを探索した。
１：初期治療後（放射線、抗がん剤）に食道癌の再発の有無で２群に分けP<0.0001で選出されたものが「再発」
２：初期治療後（放射線、抗がん剤）に食道癌による死亡の有無で２群に分けP<0.0001で選出されたものが「食道癌死」
その結果、表２に示すように、食道癌の予後と高い相関性を有する１０２種類のSNPを同定することができた。
【００５１】
【表２】
2018093764.tif 000007
【００５２】
＜多重ロジスティック回帰分析＞
次に、表２で同定された５種類のSNPｓ（rs111757012，rs56219350，rs151269855, rs11042574, rs11022546）を用い、多重ロジスティック回帰分析によって食道癌の予後と多型の関係を解析した。
多重ロジスティック回帰分析は以下の５段階で行った。
Step 1: rs111757012 (AA or AG vs. GG)
Step 2: rs111757012，rs56219350 (CC or CG vs. GG)
Step 3: rs111757012，rs56219350，rs151269855 (AA or AG vs. GG)
Step 4: rs111757012，rs56219350，rs151269855, rs11042574 (CC or CT vs. TT)
Step 5: rs111757012，rs56219350，rs151269855, rs11042574, rs11022546 (AA or AG vs. GG)
【００５３】
結果を表３に示す。５種類のSNPｓを用いた多重ロジスティック回帰分析によって９４％の感度、９０％の特異度で食道癌による死亡が予測できることが分かった。
【表３】
2018093764.tif 000008
【００５４】
＜Kaplan-Meier analysis＞
次に、rs11022546を用い、Kaplan-Meier analysisによって、食道癌のステージごと（表４でTNMと記載されているのがステージ（進行度）である。進行度の国際標準であるUICC[Union for International Cancer Control]のTNM classification of Malignant Tumors,
7th editionに従った）の予後と多型の相関を調べた。その結果、表４に示すように、ステージ１を除き、Gアレルのホモ個体は食道癌の生存率が有意に低いことが示された。
【表４】
2018093764.tif 000009
また、５種類のSNPｓ（rs11042574, rs151269855, rs111757012，rs56219350， rs11022546）を用い、Kaplan-Meier analysisによって、化学放射線療法後の無再発生存月数または食道癌死による生存月数と多型の相関を調べた。その結果、図１〜５に示すように、それぞれのSNPｓは化学放射線療法後の無再発生存月数と有意な相関を示した。
【図１】
2018093764.tif 000010
【図２】
2018093764.tif 000011
【図３】
2018093764.tif 000012
【図４】
2018093764.tif 000013
【図５】
2018093764.tif 000014
【配列表】
2018093764000001.app