(57)【要約】【課題】シクロプロパンカルボン酸誘導体を分解しうる細菌、該細菌を含む微生物製剤、及びシクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選ばれる１つの塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する、ノボスフィンゴビウム属細菌を提供する。（ａ）配列番号１に記載の塩基配列（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２５塩基以下の塩基配列【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選ばれる１つの塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する、ノボスフィンゴビウム属細菌。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２５塩基以下の塩基配列
【請求項２】
（ａ）の塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する、請求項１に記載のノボスフィンゴビウム属細菌。
【請求項３】
（ｂ）の塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する、請求項１に記載のノボスフィンゴビウム属細菌。
【請求項４】
配列番号２に記載の塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する、請求項１又は３に記載のノボスフィンゴビウム属細菌。
【請求項５】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６として寄託された、ノボスフィンゴビウム属細菌。
【請求項６】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６７として寄託された、ノボスフィンゴビウム属細菌。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のノボスフィンゴビウム属細菌を含む、微生物製剤。
【請求項８】
シクロプロパンカルボン酸誘導体に、ノボスフィンゴビウム属細菌、又はノボスフィンゴビウム属細菌を含む微生物製剤を作用させる工程を有する、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法。
【請求項９】
シクロプロパンカルボン酸誘導体に、請求項１〜７のいずれか一項に記載のノボスフィンゴビウム属細菌若しくは以下Ａ群より選ばれるいずれかのノボスフィンゴビウム属細菌、又はこれらのノボスフィンゴビウム属細菌を含む微生物製剤を、作用させる工程を有する、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法。
Ａ群：Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｔａｒｄａｕｇｅｎｓ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｅｄｉｍｉｎｉｓ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｌｅｎｔｕｍ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ａｑｕｉｔｅｒｒａｅ
【請求項１０】
シクロプロパンカルボン酸誘導体に、請求項１〜７のいずれか一項に記載のノボスフィンゴビウム属細菌又はこれらのノボスフィンゴビウム属細菌を含む微生物製剤を、作用させる工程を有する、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解能を有するノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌、該細菌を含む微生物製剤、及びシクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学工業及び鉄鋼工業等の重化学工業等の活動から生じる排水は、有機物を除去し、ヒト及び環境生物に対する影響を十分に低下させた状態で自然環境中に排出されることが望まれている。
【０００３】
排水に含まれる有機物は工場等によって様々であるが、例えば、シクロプロパンカルボン酸誘導体が含まれることがある。
【０００４】
有機物を除去するための排水処理方法としては、例えば、有機物を含む排水を６００℃以上に加熱したチャンバー内に噴霧して有機物を熱分解・燃焼する排水の処理方法が報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−７３９３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、近年、地球環境に対する意識が社会全体で高まってきており、より環境に与える影響の少ない生物学的処理方法が求められている。
【０００７】
本発明は、シクロプロパンカルボン酸誘導体を分解しうる細菌、該細菌を含む微生物製剤、及びシクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１０］に関する。
［１］以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選ばれる１つの塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する、ノボスフィンゴビウム属細菌。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２５塩基以下の塩基配列
［２］（ａ）の塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する、［１］に記載のノボスフィンゴビウム属細菌。
［３］（ｂ）の塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する、［１］に記載のノボスフィンゴビウム属細菌。
［４］配列番号２に記載の塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する、［１］又は［３］に記載のノボスフィンゴビウム属細菌。
［５］受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６として寄託された、ノボスフィンゴビウム属細菌。
［６］受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６７として寄託された、ノボスフィンゴビウム属細菌。
［７］［１］〜［６］のいずれか一つに記載のノボスフィンゴビウム属細菌を含む、微生物製剤。
［８］シクロプロパンカルボン酸誘導体に、ノボスフィンゴビウム属細菌、又はノボスフィンゴビウム属細菌を含む微生物製剤を作用させる工程を有する、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法。
［９］シクロプロパンカルボン酸誘導体に、［１］〜７のいずれか一つに記載のノボスフィンゴビウム属細菌、若しくは以下Ａ群より選ばれるいずれかのノボスフィンゴビウム属細菌、又はこれらのノボスフィンゴビウム属細菌を含む微生物製剤を作用させる工程を有する、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法。
Ａ群：Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｔａｒｄａｕｇｅｎｓ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｅｄｉｍｉｎｉｓ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｌｅｎｔｕｍ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ａｑｕｉｔｅｒｒａｅ
［１０］シクロプロパンカルボン酸誘導体に、［１］〜［７］のいずれか一つに記載のノボスフィンゴビウム属細菌、又はこれらのノボスフィンゴビウム属細菌を含む微生物製剤を作用させる工程を有する、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、環境に与える影響の少ないシクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法を提供する、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有するノボスフィンゴビウム属細菌、該細菌を含む微生物製剤、及び当該シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明のノボスフィンゴビウム属細菌（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６）による、化合物１分解の経時的変化を示す。
【図２】本発明のノボスフィンゴビウム属細菌（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６７）による、化合物１分解の経時的変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１２】
（共通する用語の説明）
本明細書において、「シクロプロパンカルボン酸誘導体」とは、シクロプロパンカルボン酸のシクロプロパン環の化学変化によって生成する化合物であって、シクロプロパンカルボン酸のシクロプロパン環を構成する少なくとも１つの炭素原子が置換基を有する化合物を意味する。
シクロプロパン環の化学変化としては、シクロプロパン環を構成する炭素原子への置換反応、付加反応等が挙げられる。
シクロプロパンカルボン酸誘導体のシクロプロパン環を構成する炭素原子が有する置換基としては、炭素原子数１〜４のアルキル基、及び炭素原子数１〜４のアルケニル基が挙げられる。
ここで、アルキル基及びアルケニル基は、直鎖状であってもよいし、分岐状であってもよい。
シクロプロパンカルボン酸誘導体のシクロプロパン環を構成する炭素原子が有する置換基は、シクロプロパン環の２位の炭素原子に結合する置換基が、いずれもメチル基であり、３位の炭素原子に結合する置換基が、２-メチル-１-プロペニル基であることが好ましい。  シクロプロパンカルボン酸誘導体としては、例えば、（１Ｒ，３Ｒ）−２，２−ジメチル−３−（２−メチルプロップ−１−エン−１−イル）シクロプロパン−１−カルボン酸が挙げられる。
【００１３】
本明細書において、「シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解能」とは、シクロプロパンカルボン酸誘導体を代謝して、シクロプロパンカルボン酸誘導体とは異なる化合物に変換する能力を指す。
【００１４】
（ノボスフィンゴビウム属細菌）
本発明に係るノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌は、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選ばれる１つの塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２５塩基以下の塩基配列
【００１５】
本発明に係るノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の一実施形態としては、配列番号１に記載の塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する。
【００１６】
配列番号１に記載の塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有するノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の代表的な菌株としては、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６、原寄託日：２０１６年５月２６日）として、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ、住所：〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）にブダペスト条約に基づいて寄託されている菌株を挙げることができる。該菌株の菌学的性質については、後述する表１〜４に示す。
【００１７】
本発明のノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の別の実施形態としては、配列番号２に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２５塩基以下の塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する。
本実施形態のノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号２に記載の塩基配列と比較したときの塩基の相違数が２０塩基以下の塩基配列を有していてもよく、塩基の相違数が１０塩基以下の塩基配列を有していてもよく、塩基の相違数が５塩基以下の塩基配列を有していてもよい。また、本実施形態のＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号２に記載の塩基配列を有していてもよい。
【００１８】
配列番号２に記載の塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有するＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の代表的な菌株としては、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６７、原寄託日：２０１６年５月２６日）として、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ、住所：〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）にブダペスト条約に基づいて寄託されている菌株を挙げることができる。該菌株の菌学的性質については、後述する表５〜８に示す。
【００１９】
本発明に係るノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌は、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有している。
【００２０】
本発明に係るノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌のシクロプロパンカルボン酸誘導体分解活性は、反応条件（シクロプロパンカルボン酸誘導体の種類及び濃度、反応液の組成、温度、ｐＨ、菌体数等）によって変化する。
例えば、上述の本発明に係るノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の代表的菌株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６）を、１００ｍｇ／ｍＬの湿菌体濃度、２０〜３５℃の温度条件下、６．５〜８．０のｐＨ条件下で用いることで、１００ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌを意味する。以下同様とする。）のシクロプロパンカルボン酸誘導体を２日間で、８０％程度分解することができる。
【００２１】
本発明のノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌は、対象微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析、及びシクロプロパンカルボン酸誘導体の分解能の測定により、特定することができる。
具体的には、対象微生物が、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選ばれる１つの塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有していれば、その対象微生物は、本発明のＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌であると特定できる。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２５塩基以下の塩基配列
【００２２】
塩基配列の解析において、対象微生物のＤＮＡから１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅させる方法としては、特に制限されるものではなく、当業者が通常用いることができるユニバーサルプライマーを用いるＰＣＲ法等が挙げられる。ＰＣＲ法により得られた増幅産物を、ＤＮＡシークエンサー等に供し、塩基配列を解析することができる。
【００２３】
シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を調べる方法としては、例えば、対象微生物と、シクロプロパンカルボン酸誘導体とを、適切な培地又は緩衝液中で一定時間反応させた後、培地又は緩衝液中におけるシクロプロパンカルボン酸誘導体の分解を調べる方法が挙げられる。分解を調べる方法としては、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析法（ＭＳ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）等を用いてシクロプロパンカルボン酸誘導体量の減少を検出する方法等が挙げられる。
【００２４】
これらの塩基配列解析及びシクロプロパンカルボン酸誘導体分解能の測定の結果に基づき、対象微生物が本発明のＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌であるかを判断できる。
【００２５】
本発明に係るノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌は、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有することから、シクロプロパンカルボン酸誘導体を多く含む排水の処理等に有用である。
【００２６】
（微生物製剤）
本発明に係る微生物製剤は、上記ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を含む。
【００２７】
微生物製剤は、本発明のノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の他に、必要に応じて、各種添加剤や担体を含むことができる。また、微生物製剤は、本発明のノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌以外の他の細菌を含む微生物製剤でもよいし、実質的に本発明のノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌からなる微生物製剤でもよい。
ここで、実質的に本発明のノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌からなる微生物製剤とは、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解に影響を与えない他の細菌を含むが、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解に影響を与える他の細菌を含まない微生物製剤を意味する。シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解に影響を与える他の細菌であることを確認方法する方法としては、例えば、１００ｍｇ／ｍＬの湿菌体濃度、２０〜３５℃の温度、６．５〜８．０のｐＨ条件下、１００ｐｐｍのシクロプロパンカルボン酸誘導体の減少をＨＰＬＣ、ＭＳ、ＴＬＣ、ＮＭＲ、ＧＣ等を用いて検出する方法が挙げられる。当該方法により、シクロプロパンカルボン酸誘導体が減少していれば、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解に影響を与える他の細菌と判定し、シクロプロパンカルボン酸誘導体が減少していなければ、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解に影響を与えない他の細菌と判定する。
微生物製剤の具体例としては、本発明に係るノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌、添加剤、及び担体を含む微生物製剤を挙げることができる。
【００２８】
担体としては、例えば、無機微粒子担体が挙げられる。
無機微粒子担体としては、金属及びその無機塩類又は酸化物であってもよく、炭素を含有するものであっても化学的に無機物に分類されるものであってもよく、又は有機態炭素の含有量が１％程度未満の純物質又は混合物であってもよい。
無機微粒子担体としては、例えば、アルミナ（酸化アルミニウム）、ヒドロキシアパタイト（カルシウムリン酸ヒドロキシド）等の工業製品（規格外品や副産物、廃品を含む）、活性汚泥等の有機性廃棄物の焼却灰、及び火力発電又はコークス炉の燃えかすである石炭焼却灰等が挙げられる。
【００２９】
無機微粒子担体としては、中でも、安価であり、簡便な操作で得ることができ、また微生物の活性発現が短期間で生じるといった観点から、石炭焼却灰が好ましい。石炭焼却灰の中でも、クリンカアッシュ又はフライアッシュが好ましく、ふるい分け等を行わなくても中心粒子径が１００μｍ以下であることから、フライアッシュがより好ましい。無機微粒子担体としては、クリンカアッシュも粉砕して中心粒子径を調整することで、フライアッシュと同様に用いることができる。クリンカアッシュ又はフライアッシュの組成は、特に制限されるものではない。
【００３０】
無機微粒子担体の中心粒子径は、１μｍ〜１００μｍが好ましく、４μｍ〜７５μｍがより好ましく、１３μｍ〜２５μｍが更に好ましい。中心粒子径がこのような範囲の場合、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する、ノボスフィンゴビウム属細菌を含むバイオマス（活性汚泥等）及び無機微粒子担体を混合した際に、両者が凝集しやすくなり、好適な量のクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する、ノボスフィンゴビウム属細菌を含むバイオマス（活性汚泥等）が無機微粒子担体に担持されやすくなる傾向にある。
【００３１】
無機微粒子担体の比重は、特に制限されないが、１．２〜３．５が好ましい。
【００３２】
無機微粒子担体は、培養初期の歩留まりを向上させることを目的として、必要に応じて、各種凝集剤を用いて凝集させてもよい。凝集剤としては、例えば、ノニオン性、カチオン性、アニオン性の高分子凝集剤等が挙げられる。
【００３３】
微生物製剤の製造方法としては、例えば、本発明のノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を含む培養液又はバイオマス（活性汚泥等）と無機微粒子担体とを混合し、無機微粒子担体上に本発明のノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を担持させ、これを培養して得られる微生物製剤を回収する方法が挙げられる。
【００３４】
培養方法としては、回分、半回分、流加、連続のいずれの方式を用いてもよい。培養方法としては、例えば、増殖が遅く菌体収率の低い微生物を効率的に調製するという観点から、特開平９−１８７２７２号公報に記載されるように、微生物を培養する容器（以下、反応槽という）へ供給する対象化合物の濃度を培養時間の経過に伴い、対数増加させる連続培養方式を用いてもよい。
【００３５】
（シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法）
本発明に係るシクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法は、シクロプロパンカルボン酸誘導体に、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌又はノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を含む微生物製剤を作用させる工程を含む。
【００３６】
シクロプロパンカルボン酸誘導体に、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌又はノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を含む微生物製剤を作用させることによって、シクロプロパンカルボン酸誘導体が分解する。
【００３７】
シクロプロパンカルボン酸誘導体に、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌又はノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌を含む微生物製剤を作用させる工程は、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌が死滅しない、又は当該細菌が有するシクロプロパンカルボン酸誘導体分解能が失われない条件であれば、特に制限されるものではない。
当該工程は、例えば、温度が２０〜３５℃の条件下であってもよく、２５〜３０℃の条件下であってもよく、ｐＨが６．５〜８．０の条件下であってもよく、７．０〜７．５の条件下であってもよい。
【００３８】
当該分解方法におけるノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌は、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌であれば特に制限されず、シクロプロパンカルボン酸誘導体のみ分解が可能なノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌であってもよいし、シクロプロパンカルボン酸誘導体、及びシクロプロパンカルボン酸誘導体以外の化合物の分解が可能なノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌であってもよい。
【００３９】
本発明に係る分解方法において用いるノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌としては、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解活性が良好であることから、上述のノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌、又は以下Ａ群より選ばれるいずれかのノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌であることが好ましく、上述のノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌であることがより好ましい。
Ａ群：Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｔａｒｄａｕｇｅｎｓ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｅｄｉｍｉｎｉｓ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｌｅｎｔｕｍ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｑｕｉｔｅｒｒａｅ
【００４０】
シクロプロパンカルボン酸誘導体に作用させる際のノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌又は微生物製剤の量は、シクロプロパンカルボン酸誘導体の濃度、反応系の容積等を考慮し、適宜設定することができる。
【００４１】
本発明に係る分解方法において、分解がおこなわれていることの確認方法は、特に制限されるものではなく、当業者が通常用いることができる方法により行われる。このような確認方法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＭＳ、ＴＬＣ、ＮＭＲ、ＧＣ等を用いてシクロプロパンカルボン酸誘導体量の減少を検出する方法等が挙げられる。
【実施例】
【００４２】
実施例１．（１Ｒ，３Ｒ）−２，２−ジメチル−３−（２−メチルプロップ−１−エン−１−イル）シクロプロパン−１−カルボン酸（以下、化合物１又は基質と呼ぶことがある）の分解能を有する微生物群の探索
【００４３】
（方法）
化合物１を炭素源とした培地を用いて、活性汚泥中に存在する微生物群を培養することにより、化合物１を分解する微生物を集積培養した。次に、集積培養された微生物群から、数菌株を単離し、単離した数菌株の化合物１分解能を評価した。
【００４４】
（結果）
単離した数菌株のうち、２つの菌株に化合物１分解能が認められた。
【００４５】
実施例２．化合物１の分解能を有するノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング及び塩基配列解析
（材料）
・ＬＢ液体培地：５００ｍＬの超純水に対し、ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，１．１Ｇ  ＰＥＲ  ＴＡＢＬＥＴ（ＳＩＧＭＡ社製）を１０個の割合で溶解し、高圧蒸気滅菌をしたもの。
・ＬＢ寒天培地：ＬＢ  Ａｇａｒ（ＳＩＧＭＡ社製）を１０個の割合で溶解し、高圧蒸気滅菌し、これをプラスチックシャーレに約２５ｍＬずつ分注したもの。
・クローニング用フォワードプライマー（２７ｆ：配列番号３）
・クローニング用リバースプライマー（１４９２ｒ：配列番号４）
・シークエンス解析用プライマー（Ｍ１３Ｆ：配列番号５、Ｍ１３Ｒ：配列番号６、３３９Ｆ：配列番号７、５３６Ｒ：配列番号８、９０７Ｆ：配列番号９）
【００４６】
（方法）
実施例１で化合物１分解能が認められた２つの菌株からＤＮＡを抽出し、クローニングの鋳型ＤＮＡとして用いた。
【００４７】
２５．０μＬの２×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡社製）、１０．０μＬのｄＮＴＰ  ｍｉｘ（２ｍＭ）、１．５μＬのクローニング用フォワードプライマー及びクローニング用リバースプライマー（それぞれ１０ｐｍｏｌ／μＬ）、０．５８μＬの鋳型ＤＮＡ、１０．４μＬの滅菌水、１．０μＬのＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ  ＦＸ、１Ｕ／μＬ、東洋紡社製）を、マイクロチューブに加え、混合した。マイクロチューブをＰＣＲ装置に供し、鋳型ＤＮＡの増幅反応を行った。
反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）５０℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。ＰＣＲ後の増幅産物を精製し、クローニングに用いた。
【００４８】
増幅産物とＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、クローニングを行った。１μＬのｐＣＲＩＩ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ、１μＬの増幅産物、１μＬのＳａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、３μＬの滅菌超純水を加えた反応液を室温で５分間混合後し、これを氷中に保存した。２μＬの上記反応液と５０μＬの大腸菌ＤＨ５α（Ｔａｋａｒａ社製）とを混合し、これを氷中に３０分間静置した。静置後、４２℃で３０秒間インキュベートし、これを氷中に保存した。
この反応液にＳＯＣ培地を４５０μＬ加えた後、得られた混合物を３７℃、２００ｒｐｍ、１時間振盪培養した。ＬＢプレート（カナマイシン終濃度５０μｇ／ｍＬ）に培養液を塗布し、これを培養（３７℃、２０時間）した。
【００４９】
得られた大腸菌ＤＨ５αのコロニーをピックアップし、ピックアップされた大腸菌ＤＨ５αを４ｍＬのＬＢ培地（カナマイシン終濃度５０μｇ／ｍＬ）で３７℃、１６時間培養した。得られた大腸菌ＤＨ５αからプラスミド抽出装置（ＱＩＡｃｕｂｅ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出することにより、プラスミド溶液を得た。
【００５０】
得られたプラスミド溶液３．０μＬと、ＥｃｏＲＩを５Ｕ相当量と、１０×Ｈ  ｂｕｆｆｅｒ  １μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１０．０μＬとした混合液を調製した。この混合液を、３７℃にて２時間インキュベーションした。インキュベーションを行った後、ＥｃｏＲＩ処理したサンプルを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子断片がＥｃｏＲＩにより切り出されていることを確認した。
【００５１】
プラスミド溶液１５０ｎｇ相当量と、シークエンス解析用プライマー（１０μＭ）０．３２μＬと、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）８．０μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２０．０μＬとした反応液を調製した。この反応液をＰＣＲ装置に供し、増幅反応を行った。反応は、（１）９６℃、１分間、（２）９６℃、１０秒間、（３）５０℃、５秒間、（４）６０℃、４分間で行い、（２）〜（４）の工程は２５サイクル繰り返し行った。
得られた反応液をＤＮＡシーケンス解析に供して、化合物１の分解能を有する微生物から抽出した鋳型ＤＮＡの塩基配列を決定した。決定した塩基配列はＲＤＰ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒを用いて属レベルで由来を決定した。
【００５２】
（結果）
塩基配列解析の結果、シークエンス解析に供したサンプルは、いずれもノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子であることが示唆された。
このときの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列番号１及び２に示す。このことから、配列番号１及び２に記載の塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌は、化合物１の分解能を持つことが示唆された。以下、配列番号１に記載の塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌を菌株Ａ、配列番号２に記載の塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌を菌株Ｂと表すこともある。
【００５３】
実施例３．配列番号１に記載の塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有するＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の同定試験
（方法）
菌株Ａについて、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析、形態観察及び生理・生化学的性状試験を行った。これらの試験は、光学顕微鏡による形態観察、ＢＡＲＲＯＷらの方法（Ｃｏｗａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｌ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  １９９３、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．）及びＡＰＩ２０ＮＥ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）によって行った。    
【００５４】
（結果）
表１〜４に、形態観察及び生理・生化学的性状試験の試験結果を示す。配列番号１に記載の塩基配列は、基準株の中では、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｒｅｓｉｎｏｖｏｒｕｍ  ＮＣＩＭＢ８７６７の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に対し、９９．９％と高い相同性を示した。しかし、配列番号１に記載の塩基配列と完全に一致する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は存在しなかった。
【００５５】
菌株Ａは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを資化せず、バリンアリルアミダーゼ及びα―グルコシダーゼ活性を示さないが、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の相同性が最も高いＮ．ｒｅｓｉｎｏｖｏｒｕｍ  ＮＣＩＭＢ８７６７にはこのような特徴がみられなかった。そのため、菌株Ａは、従来のＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｒｅｓｉｎｏｖｏｒｕｍとは異なる、新規の株であることが示唆された。菌株ＡをＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６として寄託した。
【００５６】
【表１】
2018000072.tif 000002
＋: 陽性、−: 陰性、＋ｗ:反応弱い
【００５７】
【表２】
2018000072.tif 000003
＋: 陽性、−: 陰性
【００５８】
【表３】
2018000072.tif 000004
＋：陽性、−：陰性
【００５９】
【表４】
2018000072.tif 000005
＋：陽性、−：陰性
【００６０】
実施例４．配列番号２に記載の塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有するノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の同定試験
（方法）
菌株Ｂについて、上記同様に１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析、形態観察及び生理・生化学的性状試験を行った。
【００６１】
（結果）
表５〜８に、形態観察及び生理・生化学的性状試験の試験結果を示す。配列番号２に記載の塩基配列は、基準株の中では、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｏｌｉ ＣＣ−ＴＰＥ−１ の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に対し、９８．２％と最も高い相同性を示した。しかし、配列番号２に記載の塩基配列と完全に一致する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は存在しなかった。
【００６２】
菌株Ｂは、硝酸塩を還元せず、インドールを産生せず、ウレアーゼ活性を示さず、エスクリン及びゼラチンを加水分解せず、各基質を資化しなかった。また、菌株Ｂは、４℃及び嫌気条件下で生育せず、アルカリホスファターゼ、リパーゼ（Ｃ１４）、バリン アリルアミダーゼなどの活性を示さず、エステラーゼ（Ｃ４）やエステラーゼリパーゼ（Ｃ８）などの活性を示した。これらの性状は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の相同性が最も高いＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｏｌｉと多くの相違点が認められた。また、菌株Ｂの性状と一致する既知種は認められず、菌株Ｂは、新規の種であることが示唆された。菌株ＢをＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６７として寄託した。
【００６３】
【表５】
2018000072.tif 000006
＋: 陽性、−: 陰性、＋ｗ:生育弱い
【００６４】
【表６】
2018000072.tif 000007
＋: 陽性、−: 陰性
【００６５】
【表７】
2018000072.tif 000008
＋：陽性、−：陰性
【００６６】
【表８】
2018000072.tif 000009
＋：陽性、−：陰性
【００６７】
実施例６．Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６及びＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６７の化合物分解能解析
【００６８】
（材料）
・ＬＢ液体培地：５００ｍＬの超純水に対し、ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，１．１Ｇ  ＰＥＲ  ＴＡＢＬＥＴ（ＳＩＧＭＡ社製）を１０個の割合で溶解し、高圧蒸気滅菌をしたもの。
・化合物１：ＡＬＤＲＩＣＨ社製
【００６９】
（方法）
Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６及びＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６７をＬＢ液体培地４．０ｍLに植菌し、３０℃で前培養した。前培養液４．０ｍＬを１００ｍＬの培地に添加し、本培養を行った。
【００７０】
培養終了後、培養液を６，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、菌体を回収した。回収した菌体を生理食塩液２０ｍＬで洗浄後、湿菌体濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるように５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。懸濁液１．０ｍＬと２００ｐｐｍの化合物１を含むリン酸緩衝液１．０ｍＬとをねじ口試験管に添加して、３０℃、２００ｒｐｍにて反応させた。
【００７１】
反応液２００μＬをサンプリングし、遠心分離により沈殿物を除去し、上清を回収した。回収した上清をフィルターろ過した。得られたろ液１００μＬを、下記の条件による高速液体クロマトグラフィーを用いて解析した。
【００７２】
ＨＰＬＣ条件
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ａ−２１１（４．６ｍｍφ×２５ｃｍ、５μｍ、住化分析センター社製)
移動相：Ａ液０．０１％ＴＦＡ、Ｂ液アセトニトリル
溶出方法：アイソクラティック
溶出条件：Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０分、４０：６０
２０分、４０：６０
流量：１．０ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
検出：２２０ｎｍ
【００７３】
（結果）
図１には、湿菌体濃度１００ｍｇ／ｍＬのＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６６を用いて、終濃度１００ｐｐｍの化合物１を分解した時の、化合物１の残存率（基質残存率）の経時変化を示す。基質残存率は、（各時間経過後における化合物１の濃度［ｐｐｍ］）／１００［ｐｐｍ］）×１００の値を意味する。基質残存率は、反応開始から６５時間後には１８％になった。
【００７４】
図２には、湿菌体濃度１００ｍｇ／ｍＬのＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２２６７を用いて、終濃度１００ｐｐｍの化合物１を分解した時の、基質残存率の経時変化を示す。基質残存率は、反応開始から６５時間後には２４％になった。
【００７５】
実施例７．ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の化合物分解能解析
（材料）
・Ｒ２Ａ培地：１０００ｍＬの超純水に対し、Ｒ２Ａ Ｂｒｏｔｈ, ＤＡＩＧＯ (日本製薬株式会社製) を３.２gの割合で溶解し，高圧蒸気滅菌をしたもの。
・８０２培地：１０ｇポリペプトン、２ ｇ酵母エキス、１ｇ硫酸マグネシウム七水和物を超純水に溶解し、ｐＨを７．０に調節した後、１０００ｍＬに調製し、高圧蒸気滅菌したもの。
【００７６】
（方法）
ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌の湿菌体を調製する際に、表９記載の培地、培養温度を用いたこと以外は、実施例６と同様の方法で化合物分解能解析を行った。
【００７７】
【表９】
2018000072.tif 000010
【００７８】
（結果）
表１０には、湿菌体濃度１００ｍｇ／ｍＬのノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌と化合物１とを1週間反応させた時の基質残存率を示す。ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌であれば特に制限されず、化合物１の分解が可能であった。
【００７９】
【表１０】
2018000072.tif 000011
◎:基質残存率≦50%    〇:50% < 基質残存率 < 95%    ×:基質残存率 ≧ 95%
【図１】
2018000072.tif 000012
【図２】
2018000072.tif 000013
【配列表】
2018000072000001.app