(57)【要約】【課題】生物発酵由来で得られた３ＨＢやＰＨＢから、より簡易に光学活性の高い製品としての３ＨＢエステルを製造する方法を提供すること。【解決手段】３ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）生産菌から３ＨＢを発酵生成した発酵液を得る発酵工程と、発酵液の溶媒としての水分を留去して、３ＨＢに対するエステル化剤としてのアルコール溶媒に置換することにより３ＨＢを含有するアルコール溶液を得るアルコール置換工程と、アルコール溶液に触媒を添加して加熱還流して３ＨＢエステルを得る反応工程と、を順に行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）生産菌から３ＨＢを発酵生成した発酵液を得る発酵工程と、
前記発酵液の溶媒としての水分を留去して、３ＨＢに対するエステル化剤としてのアルコール溶媒に置換することにより３ＨＢを含有するアルコール溶液を得るアルコール置換工程と、
前記アルコール溶液に触媒を添加し、加熱して３ＨＢエステルを得る反応工程と、
を順に行う３ＨＢエステルの製造方法。
【請求項２】
前記３ＨＢ生産菌が、３ＨＢ生産性のハロモナス菌である請求項１に記載の３ＨＢエステルの製造方法。
【請求項３】
前記発酵工程が、前記ハロモナス菌を好気発酵する好気発酵工程と、好気発酵工程によりポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）を蓄積した前記ハロモナス菌を嫌気発酵する嫌気発酵工程とを含む請求項２に記載の３ＨＢエステルの製造方法。
【請求項４】
前記発酵液から前記３ＨＢ生産菌を除去するろ過工程を行う請求項１〜３のいずれか一項に記載の３ＨＢエステルの製造方法。
【請求項５】
前記発酵液のｐＨをｐＨ１〜６に調整するｐＨ調整工程を行う請求項１〜４のいずれか一項に記載の３ＨＢエステルの製造方法。
【請求項６】
前記エステル化剤としてのアルコール溶媒が、炭素数１〜４のアルコールから選ばれる少なくとも一種以上のアルコールからなる請求項１〜５のいずれか一項に記載の３ＨＢエステルの製造方法。
【請求項７】
前記アルコール置換工程で、前記発酵液中の水分を１０％以下にまで低下させる請求項１〜６のいずれか一項に記載の３ＨＢエステルの製造方法。
【請求項８】
前記アルコール置換工程にて析出したアルコール不溶物を除去する不溶物除去工程を行う請求項１〜７のいずれか一項に記載の３ＨＢエステルの製造方法。
【請求項９】
前記アルコール溶媒がエタノールであり、前記３ＨＢエステルが３ヒドロキシ酪酸エチル（ＥＨＢ）である請求項１〜８のいずれか一項に記載の３ＨＢエステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３ＨＢエステルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
３ヒドロキシ酪酸やその塩（以下３ＨＢと称する、また、３ＨＢと称する場合、特にその単量体を指すものとする）は、例えば、遺伝子発現調節作用によって、ヒストン脱アセチル化酵素を阻害することによって認知機能や、長期持続記憶を改善することが知られ、アルツハイマーの予防に有効性が確認されている物質である。また、アルツハイマー病、糖尿病の患者の症状を改善させる効果を持つことが知られ、また、３ＨＢは体内において糖質よりも速やかにエネルギーに変換されること、細胞への脂肪や糖の吸収を抑制する効果を有することから、アスリート向けのエネルギー物質、ダイエット・健康食品分野への応用が期待されている物質である。
【０００３】
また、これらの用途のほか、３ＨＢは生分解性樹脂や、３ＨＢエステルの原料として利用可能であることが知られており、工業的用途においても利用価値が高まりつつある。なお、３ＨＢエステルは安全性の高い溶剤、洗浄剤として利用可能であり、医薬、農薬、食品添加物等としての応用も進められている化合物である。
【０００４】
このような３ＨＢエステルは、各種微生物にポリ３ヒドロキシ酪酸（以下ＰＨＢと称する）を生産させたのち、得られたＰＨＢを酵素等により分解することにより得ることができる３ＨＢ（非特許文献１参照）をエステル化して得られる（特許文献１参照）。また、ＰＨＢをそのままアルコリシスによって得ることもできる。また、生物発酵由来でない合成方法としてはアセト酢酸エステルの不斉還元によって合成できることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００５−５２１７１８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｙｕｔａｋａ  Ｔｏｋｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （２００７）  １３２，  ２６４−７２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、純粋にアセト酢酸エステルの還元によって３ＨＢエステルを合成した場合には、光学純度の低い３ＨＢエステルとなってしまうため、医薬、農薬等の用途には利用できず、生分解性樹脂における生分解性等の性能に関してもデメリットが多い。そのため、不斉還元によりＲ体のみを合成する必要が生じるのであるが、高価な不斉還元触媒を用いたとしても、高い光学純度を達成することは困難である。そこで、生物発酵由来で３ＨＢエステルを合成することが有用であるものと考えられるが、生物発酵して得られた発酵液から３ＨＢや、ＰＨＢを分離してさらにエステル化反応を行うには、発酵液から３ＨＢやＰＨＢを大量の有機溶媒にて抽出する必要があるため、多大な労力と費用とを要する。
【０００８】
したがって、本発明は上記実状に鑑み、生物発酵由来で得られた３ＨＢやＰＨＢから、より簡易に光学純度の高い製品としての３ＨＢエステルを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するための本発明の３ＨＢエステルの製造方法の特徴構成は、
３ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）生産菌から３ＨＢを発酵生成した発酵液を得る発酵工程と、発酵液の溶媒としての水分を留去して、３ＨＢに対するエステル化剤としてのアルコール溶媒に置換することにより３ＨＢを含有するアルコール溶液を得るアルコール置換工程と、アルコール溶液に触媒を添加し、加熱して３ＨＢエステルを得る反応工程と、を順に行う点にある。
【００１０】
すなわち、発酵工程により得た３ＨＢを３ＨＢエステル製造の出発原料とするから、３ＨＢエステルは、光学純度がきわめて高い（１００％に近い）ものとして得られるものと考えられる。３ＨＢを発酵生成した発酵液は、有機溶媒等により抽出するのではなく、水分をエステル化剤としてのアルコールに置換することにより３ＨＢを含有するアルコール溶液を得るから、３ＨＢを抽出するための有機溶媒等を用いることなく、そのアルコール溶液を３ＨＢとエステル化剤としてのアルコール溶媒とを反応させるべき溶液として得ることができる。このアルコール溶液に触媒を添加して加熱還流すると、３ＨＢはエステル化剤としてのアルコール溶媒とエステル化（脱水縮合）反応するので３ＨＢエステルが得られる。また、この反応において、３ＨＢの光学純度は低下しないことが知られているから、得られる３ＨＢエステルは極めて光学純度の高いものとなる。
【００１１】
したがって、発酵液から３ＨＢを精製することなく直接的に３ＨＢエステルを製造することができ、光学純度の高い３ＨＢエステルをきわめて簡便な合成方法により製造することができるようになった。
【００１２】
なお、触媒としては、硫酸、塩酸、無機酸、固体酸触媒等の酸触媒が一般的に用いられる。
【００１３】
尚、３ＨＢ生産菌が、３ＨＢ生産性のハロモナス菌であってもよく、この場合、発酵工程が、ハロモナス菌を好気発酵する好気発酵工程と、好気発酵工程によりポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）を蓄積したハロモナス菌を嫌気発酵する嫌気発酵工程とを含むものとすることができる。
【００１４】
また、前記発酵液から前記３ＨＢ生産菌を除去するろ過工程を行ってもよい。
【００１５】
生物発酵により得られた発酵液には、３ＨＢ以外に、３ＨＢを生産した菌体やタンパク質等も含まれている。このような菌体やタンパク質等は、アルコール溶液中に移行しないので、エステル化反応に対して悪影響はないものと考えられるが、夾雑物として存在することにより、エステル化反応の収率を低下させる原因になることが考えられる。また、アルコール溶液の容量を無駄に増量していることにもなる。そこで、反応工程を行うまでのいずれかの段階にて、あらかじめろ過工程を行い、夾雑物を除去したアルコール溶液を得ておけば、菌体を含まず、反応に寄与する成分を濃縮した状態でエステル化反応を行えるから、より効率の良いエステル化反応が行え、３ＨＢエステルの収率を向上することができるものと考えられる。
【００１６】
また、前記発酵液のｐＨをｐＨ１〜６に調整するｐＨ調整工程を行うこともできる。
【００１７】
前記発酵液に含まれる３ＨＢは酸性であるため、中性に近い発酵液中では一部が塩として溶解している。このような形態の３ＨＢは、アルコール溶液中に移行しにくく、３ＨＢの抽出効率を低下させる懸念がある。そこで、アルコール置換工程を行う前の段階で、発酵液のｐＨをｐＨ１〜６に調整するｐＨ調整工程を行えば、３ＨＢを遊離酸として発酵液中に存在させることができ、アルコール溶液中へ３ＨＢが移行しやすくなるため、３ＨＢの抽出効率の向上（３ＨＢエステルの収率の向上）に寄与するものと考えられる。
【００１８】
前記エステル化剤としてのアルコール溶媒としては、炭素数が１〜４のアルコールから選ばれる少なくとも一種以上のアルコールを選択することができる。
【００１９】
このような炭素数が１〜４のアルコール溶媒は、水と混和可能であり、かつ３ＨＢを高濃度に溶解することができるので、アルコール置換工程においてアルコール溶液を作成する際に、操作性がよく、かつ、３ＨＢエステルの溶解度も高く、３ＨＢエステルをさらに精製するような場合に効率が良い。炭素数が１〜４のアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、２−ブタノールｔ−ブタノール等の一価のアルコールの他、１，４−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−プロパンジオール、エチレングリコール等のジアルコールや、セロソルブ（２−エトキシエタノール）等が挙げられる。また、このようなアルコール溶媒であると、たとえばエタノールやブタノールを用いた場合，安全性の高い溶剤として用いることができる３ＨＢエチル（ＥＨＢ）や３ＨＢブチルが得られ、工業的に利用価値が高い。
なお、アルコール溶媒としては、水と混和可能であることが望ましいが、水存在下でも反応工程にて十分な反応性が確保されるものであればこれらに限らず用いることができる。
【００２０】
また、前記アルコール置換工程で、前記発酵液中の水分を１０％以下にまで低下させることが好ましい。
【００２１】
エステル化反応は、水の存在下に進行しにくくなることが知られているので水分量が少ないほど好ましい。そこで発酵液中の水分を１０％以下にまで低下させて、アルコール溶液を作成すれば、反応性がよく収率の高いエステル化反応が行える。また、発酵液中の水分は、より好ましくは、５％以下にまで低下させ、さらに好ましくは、１％以下にまで低下させる。
また、反応工程においては、エステル化反応時に生成する水を反応系外に除去しながら反応を行うことにより、良好な反応性を維持して反応工程を持続することができる。
【００２２】
また、前記アルコール置換工程にて析出したアルコール不溶物を除去する不溶物除去工程を行ってもよい。
【００２３】
生物発酵により得られた発酵液には、３ＨＢや、３ＨＢを生産した菌体、タンパク質等の他に、さらに水溶性の無機塩なども含まれている。このような成分も、アルコール溶液とした場合にアルコール溶液中に移行しないので、エステル化反応に対して悪影響はないものと考えられるが、夾雑物として存在することにより、エステル化反応の収率を低下させる原因になることが考えられる。そこで、反応工程を行うより前に、このような成分を除去することによって、より効率の良いエステル化反応が行え、３ＨＢエステルの収率を向上することができるものと考えられる。
【００２４】
前記アルコール溶媒がエタノールであり、３ＨＢエステルが３ヒドロキシ酪酸エチル（ＥＨＢ）とすることができる。
【００２５】
上記アルコール溶媒のうち、たとえばエタノールを用いた場合，安全性の高い溶剤として用いることができる３ＨＢエチル（ＥＨＢ）が得られ、工業的に利用価値が高い。
【発明の効果】
【００２６】
したがって、生物発酵由来で得られた３ＨＢやＰＨＢから、より簡易に光学活性の高い製品としての３ＨＢエステルを製造することができるようになった。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下に、本発明の実施形態にかかる３ＨＢエステルの製造方法を説明する。尚、以下に好適な実施形態を記すが、これら実施形態はそれぞれ、本発明をより具体的に例示するために記載されたものであって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々変更が可能であり、本発明は、以下の記載に限定されるものではない。
【００２８】
本発明の実施形態にかかる３ＨＢエステルの製造方法は、
３ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）生産菌から３ＨＢを発酵生成した発酵液を得る発酵工程と、発酵液の溶媒としての水分を留去して、３ＨＢに対するエステル化剤としてのアルコール溶媒に置換することにより３ＨＢを含有するアルコール溶液を得るアルコール置換工程と、アルコール溶液に触媒を添加し、加熱して３ＨＢエステルを得る反応工程と、を順に行う。
ここで、前記３ＨＢ生産菌として、３ＨＢ生産性のハロモナス菌を用い、発酵工程として、前記ハロモナス菌を好気発酵する好気発酵工程と、好気発酵工程によりポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）を蓄積した前記ハロモナス菌を嫌気発酵する嫌気発酵工程とを行う。
また、前記発酵液から３ＨＢ生産菌を除去するろ過工程を行うとともに、発酵液のｐＨをｐＨ１〜６に調整するｐＨ調整工程を行う。
尚、前記エステル化剤としてのアルコール溶媒としては、Ｃ１〜Ｃ４のアルコールが好適に用いられる。炭素数が１〜４のアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、２−ブタノールｔ−ブタノール等の一価のアルコールの他、１，４−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−プロパンジオール、エチレングリコール等のジアルコールや、セロソルブ（２−エトキシエタノール）等が挙げられる。
また、前記アルコール置換工程で、発酵液中の水分を１０％以下にまで低下させる。発酵液中の水分は、より好ましくは、５％以下にまで低下させ、さらに好ましくは、１％以下にまで低下させる。また、反応工程においては、エステル化反応時に生成する水を反応系外に除去しながら反応を行うことにより、良好な反応性を維持して反応工程を持続することができる。
さらに、アルコール置換工程にて析出したアルコール不溶物を除去する不溶物除去工程を行う。
【００２９】
〔発酵工程〕
発酵工程は、３ＨＢ生産菌から３ＨＢを発酵生成した発酵液を得るものである。具体的には、糖質を含む培養液を収容した発酵容器に３ＨＢ生産性のハロモナス菌を添加して、まず撹拌通気しつつ好気発酵工程を行う。これにより、ハロモナス菌により糖質を資化させ、ＰＨＢを生産させることができ、ハロモナス菌体内にＰＨＢを蓄積する。次に、糖類がほぼ完全に消費されたころに、発酵容器内への通気を停止して嫌気発酵工程を行う。これにより、ハロモナス菌は体内に蓄積したＰＨＢを分解消費して発酵液中に３ＨＢを放出する。その結果、３ＨＢ及び菌体を含有する発酵液が得られる。
【００３０】
〔ろ過工程〕
ろ過工程では、得られた発酵液中の菌体成分を濾過して除去する。具体的には、発酵液は精密ろ過膜（ＭＦ膜）によりろ過する。すると簡便に菌体を除去することができ、主に３ＨＢを含有する発酵液とすることができる。ここで、菌体をろ過するのにＭＦ膜を用いたが、３ＨＢと菌体とを分離可能な手段であれば、種々公知のろ過膜を採用してろ過工程を行うことができる。このろ過工程においては、タンパク質成分等、比較的高分子の溶解成分まで除去することもできるが、本実施例においては、後述の不溶物除去工程を行う関係上、必要以上に精度の高い濾過を行う必要がなく、ＭＦ膜を用いた簡便な濾過操作を行うことで十分な夾雑物除去効果を達成することができた。
【００３１】
〔ｐＨ調整工程〕
ｐＨ調整工程は、発酵液のｐＨをｐＨ１〜６に調整して、発酵液中の３ＨＢを遊離酸の形態として、アルコール溶液中に移行させやすくするものである。具体的には、ろ過工程で得られた発酵液は、３ＨＢを４．８質量％含有するものであった。ｐＨ調整工程では、この発酵液２０００ｇを１２規定の塩酸を用いてｐＨ＝３．０に調整した。これにより発酵液中で塩として存在する３ＨＢについても遊離酸の形態に変換することができる。尚、本実施形態において３ＨＢの濃度はクロマトグラフ法により決定している（以下も同じ）。
ここで、ｐＨ調整工程には種々の酸を用いることができるが、３ＨＢエステルの精製に悪影響の生じにくい無機酸を用いることが好ましく、さらには、塩酸のような揮発性の酸とすることが好ましい。また、ｐＨは１〜６の酸性領域にまで調整すればよいが、好ましくは、３ＨＢがほぼ遊離酸として存在するｐＨ３程度になるまで酸を添加し、ｐＨを調整することが、３ＨＢの収率の面からは好ましい。
【００３２】
〔アルコール置換工程〕
アルコール置換工程では、発酵液の溶媒としての水分を留去して、３ＨＢに対するエステル化剤としてのアルコール溶媒に置換する。具体的には、ｐＨ調整した発酵液をエバポレーターを用いて水を留去し、濃縮したところ、１８８．６ｇの濃縮液が得られた。この時点での濃縮液の水分率はカールフィッシャー水分計で０．４％であった。続いてこの濃縮液に、３ＨＢに対するエステル化剤としてのエタノール２５４．８ｇを加え濃縮液に含まれる３ＨＢをアルコール中に移行させ、アルコール溶液を得るアルコール置換工程を行った。尚、濃縮液の主成分は不純物を含んでいるために結晶化しなかった３ＨＢであると考えられる。
【００３３】
〔不溶物除去工程〕
得られたアルコール溶液は、アルコールに不溶の種々夾雑物を含有しているので、ろ過して除去する不溶物除去工程を行った。３ＨＢについては、アルコール溶媒に高濃度に溶解可能であるので、アルコール溶媒中に移行しているため、夾雑物としては、発酵液由来の発酵生成物として高分子量のたんぱく質や、無機塩等が含まれる。不要物除去工程を行うと、褐色透明のアルコール溶液が得られた。ろ過には、ＭＦ膜等の簡便な分離膜を用いることができる。
【００３４】
〔反応工程１〕
得られたアルコール溶液に、エステル化反応用触媒としての濃硫酸９．６ｇを加えて還流条件で２時間エステル化を行う反応工程を行った。反応中、生成した水分は、二相分離器を用いて系内から留去した。得られた反応液を蒸留により分留したところ、収率は７８％で（Ｒ）３−ヒドロキシ酪酸エチル（ＥＨＢ）が得られた。得られたＥＨＢの純度をガスクロマトグラフにて測定すると、９９％を超えていた。
【００３５】
尚、上記実施の形態では、エステル化剤としてのアルコール溶媒として、エタノールを用い、ＥＨＢの製造を行ったが、アルコール溶媒としては、他に、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、２−ブタノールｔ−ブタノール等の一価のアルコールの他、１，４−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−プロパンジオール、エチレングリコール等のジアルコールや、セロソルブ（２−エトキシエタノール）等のＣ１〜Ｃ４のアルコールから選ばれる少なくとも一種以上のアルコールが好適に用いられるが、その他のアルコールを用いることもできる。
【００３６】
具体的には、ブタノールを用いた場合、以下のように（Ｒ）３−ヒドロキシ酪酸ブチルを合成することができる。
【００３７】
〔反応工程２〕
アルコール置換工程において、エタノールを２５４．８ｇ用いたのに代えて、ブタノールを４０９．８ｇ用い、以下同様に、不溶物除去工程を経て、反応工程を行った。得られた反応液を蒸留により分留したところ、収率は６５％で（Ｒ）３−ヒドロキシ酪酸ブチルが得られた。得られた生成物の純度をガスクロマトグラフにて測定すると、９９％を超えていた。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の３ＨＢエステルの製造方法は、たとえば安全性の高い溶剤、洗浄剤として利用可能なＥＨＢ等の３ＨＢエステルを製造するのに利用できる。