(57)【要約】【課題】  高価な装置や複雑な工程を要することなく、簡単な操作で再現性よく、ゲスト物質を細胞内へ導入することができる新しい技術を提供すること。【解決手段】  細胞構造体の内部へ、ゲスト物質を導入する方法であって、細胞構造体とゲスト物質とが溶媒中に分散した混合分散液を調製する工程、細胞構造体とゲスト物質の混合分散液へ、遠心加速度を与える工程、を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞構造体の内部へ、ゲスト物質を導入する方法であって、
細胞構造体とゲスト物質とが溶媒中に分散した混合分散液を調製する工程、
細胞構造体とゲスト物質の混合分散液へ、遠心加速度を与える工程、
を含む、方法。
【請求項２】
細胞構造体の内部へ、ゲスト物質を導入して、ゲスト物質導入細胞構造体を製造する方法であって、
細胞構造体とゲスト物質とが溶媒中に分散した混合分散液を調製する工程、
細胞構造体とゲスト物質の混合分散液へ、遠心加速度を与える工程、
を含む、方法。
【請求項３】
細胞構造体とゲスト物質とが溶媒中に分散した混合分散液を調製する工程が、
細胞構造体分散液と、ゲスト物質分散液を混合する工程、
によって行われる、請求項１〜２の何れかに記載の方法。
【請求項４】
遠心加速度が、５００ｒｃｆ〜３００００ｒｃｆの範囲である、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
細胞構造体とゲスト物質の混合分散液へ、遠心加速度を与える工程において、
細胞構造体内部へ導入されるゲスト物質の密度ｘと、細胞構造体の密度ｙと、これらが分散している溶媒の密度ｚとが、次の関係を満たす、請求項１〜４の何れかに記載の方法：
ゲスト物質密度ｘ  ＞  溶媒密度ｚ
細胞構造体密度ｙ  ＞  溶媒密度ｚ
１．３０  ≧  ゲスト物質密度ｘ  ／  細胞構造体密度ｙ  ≧  ０．９０  
【請求項６】
細胞構造体とゲスト物質の混合分散液へ、遠心加速度を与える工程において、
細胞構造体の内部液の浸透圧ｐと、これが分散している溶媒（外部液）の浸透圧ｑが、次の関係を満たす、請求項１〜５の何れかに記載の方法：
外部液浸透圧ｑ  ＋  ３．０［ｍＯｓｍ／ｋｇ］  ≧  内部液浸透圧ｐ  ≧  外部液浸透圧ｑ  −  ８５．０［ｍＯｓｍ／ｋｇ］
【請求項７】
ゲスト物質が、流体力学的半径５０〜２００［ｎｍ］の粒子である、請求項１〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
ゲスト物質が、表面に負電荷を帯電した粒子である、請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
細胞構造体が、
細胞構造体の内部液と、細胞構造体が分散している外部液とを、脂質膜で分離された構造を有する、請求項１〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
細胞構造体が、平均粒径２〜１５０［μｍ］の構造体である、請求項１〜９の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞構造体の内部へ、ゲスト物質を導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内への物質導入技術は、細胞工学の基本的な技術のひとつである。細胞内へ導入される外来の物質（ゲスト物質）として、例えばナノ粒子や外来遺伝子がある。細胞内へのナノ粒子の導入技術は、例えばイメージングや癌治療に利用できる。細胞内への外来遺伝子の導入技術は、例えば細胞の形質転換や、未分化状態の細胞の作成に利用できる。
【０００３】
細胞内への物質導入のための従来の技術として、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ソノポレーション、レーザー照射などによる物理的導入法が知られており、あるいは、ウイルスベクターなどによる生物学的導入法が知られている。例えば特許文献１は、エレクトロポレーションを利用した哺乳類の遺伝子改変方法を開示しており、受精卵の細胞へエレクトロポレーションによって核酸分子を導入する技術を開示している。
【０００４】
しかし、上述の従来の物理的導入法には、熟練した技術が必要であったり、高価な装置が必要であったり、細胞への損傷が比較的に大きいという問題があった。また、ウイルスベクターの使用では、導入できるゲストが限られており、比較的に工程が複雑であり、ウイルス無毒化の確実な担保が難しいなどの問題があった。さらに、カチオン性の分子を利用した生物学的導入法は、エンドサイトーシス等の細胞固有の機能を活用して導入するために、導入の成否は、その場面での細胞固有の機能の活性の程度に依存し、さらにカチオン性の分子は細胞毒性が発現するという問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第５７７４６５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、細胞内への物質導入技術であって、高価な装置や複雑な工程を要することなく、細胞固有の機能に依存することなく、簡単な操作で、ゲスト物質を細胞内へ導入することができる技術が、求められていた。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、高価な装置や複雑な工程を要することなく、簡単な操作で再現性よく、ゲスト物質を細胞内へ導入することができる新しい技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、細胞内への物質導入技術について、鋭意研究してきたところ、後述の手段によって、上記目的を達成できることを見いだして、本発明に到達した。
【０００９】
したがって、本発明は次の（１）以下を含む。
（１）
細胞構造体の内部へ、ゲスト物質を導入する方法であって、
細胞構造体とゲスト物質とが溶媒中に分散した混合分散液を調製する工程、
細胞構造体とゲスト物質の混合分散液へ、遠心加速度を与える工程、
を含む、方法。
（２）
細胞構造体の内部へ、ゲスト物質を導入して、ゲスト物質導入細胞構造体を製造する方法であって、
細胞構造体とゲスト物質とが溶媒中に分散した混合分散液を調製する工程、
細胞構造体とゲスト物質の混合分散液へ、遠心加速度を与える工程、
を含む、方法。
（３）
細胞構造体とゲスト物質とが溶媒中に分散した混合分散液を調製する工程が、
細胞構造体分散液と、ゲスト物質分散液を混合する工程、
によって行われる、（１）〜（２）の何れかに記載の方法。
（４）
遠心加速度が、５００ｒｃｆ〜３００００ｒｃｆの範囲である、（１）〜（３）の何れかに記載の方法。
（５）
細胞構造体とゲスト物質の混合分散液へ、遠心加速度を与える工程において、
細胞構造体内部へ導入されるゲスト物質の密度ｘと、細胞構造体の密度ｙと、これらが分散している溶媒の密度ｚとが、次の関係を満たす、（１）〜（４）の何れかに記載の方法：
ゲスト物質密度ｘ  ＞  溶媒密度ｚ
細胞構造体密度ｙ  ＞  溶媒密度ｚ
１．３０  ≧  ゲスト物質密度ｘ  ／  細胞構造体密度ｙ  ≧  ０．９０  
（６）
細胞構造体とゲスト物質の混合分散液へ、遠心加速度を与える工程において、
細胞構造体の内部液の浸透圧ｐと、これが分散している溶媒（外部液）の浸透圧ｑが、次の関係を満たす、（１）〜（５）の何れかに記載の方法：
外部液浸透圧ｑ  ＋  ３．０［ｍＯｓｍ／ｋｇ］  ≧  内部液浸透圧ｐ  ≧  外部液浸透圧ｑ  −  ８５．０［ｍＯｓｍ／ｋｇ］
（７）
ゲスト物質が、流体力学的半径５０〜２００［ｎｍ］の粒子である、（１）〜（６）の何れかに記載の方法。
（８）
ゲスト物質が、表面に負電荷を帯電した粒子である、（１）〜（７）の何れかに記載の方法。
（９）
細胞構造体が、
細胞構造体の内部液と、細胞構造体が分散している外部液とを、脂質膜で分離された構造を有する、（１）〜（８）の何れかに記載の方法。
（１０）
細胞構造体が、平均粒径２〜１５０［μｍ］の構造体である、（１）〜（９）の何れかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、高価な装置や複雑な工程を要することなく、簡単な操作で再現性よく、ゲスト物質を細胞内へ導入することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は電場印加用チャンバー概念図である。
【図２】図２はＩＴＯガラスへの脂質フィルム塗付イメージの説明図である。
【図３】図３はＧＵＶ作成チャンバーのイメージの説明図である。
【図４】図４はシリンジと針二本を利用して、チャンバー内部に１００ｍＭスクロース水溶液を充填する模式図である。
【図５】図５は電場印加の説明図である。
【図６】図６はＧＵＶ生成の確認のための位相差顕微鏡による観察に使用したチャンバーの模式図である。
【図７】図７はＧＵＶ内部へポリスチレン粒子が導入されたことを確認する方法の説明図である。
【図８】図８は遠心力に対するゲスト物質粒子取り込み率のグラフである。
【図９】図９はゲスト物質粒子が導入されている枯草菌の透過光と励起光を同時印加した蛍光・位相差顕微鏡像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。
【００１３】
［細胞構造体の内部へのゲスト物質の導入］
本発明による細胞構造体の内部へのゲスト物質の導入は、細胞構造体とゲスト物質とが溶媒中に分散した混合分散液を調製する工程、細胞構造体とゲスト物質の混合分散液へ、遠心加速度を与える工程、を含む方法によって、実施することができる。本発明は、これらの工程を含む方法によって、細胞構造体の内部へゲスト物質が導入された、ゲスト物質導入細胞構造体を製造する方法にもある。
【００１４】
［細胞構造体］
本発明において、細胞構造体とは、細胞と同様に、脂質膜、好ましくは脂質二重膜を境界として、内部液と外部液（外液）とが分離された構造を有する構造体をいう。細胞構造体としては、天然の細胞及び人工の構造体を含む。この細胞構造体は、例えば外液中に分散して分散液として調製することができる。細胞構造体は、例えば略球体の形状をとることができるが、この形状に限られるものではない。天然の細胞は、細胞内構造物を備えており、略球体ではない形状をとることができるが、膜を通過させたゲスト物質の導入という観点からは、同様に扱うことができる。後述する実施例では、細胞構造体として、巨大リン脂質二分子膜ベシクル（以下ＧＵＶ：  Ｇｉａｎｔ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）を使用している。このＧＵＶは人工の細胞であり、膜を通過させたゲスト物質の導入について、天然の細胞のモデルとして使用できるものである。細胞構造体のサイズ及び形状は、導入の対象となる細胞構造体のサイズ及び形状とすることができる。例えば、平均粒径２〜１５０［μｍ］、１５〜１５０［μｍ］のサイズの構造体とすることができる。例えば、球状、楕円体状などの形状とすることができる。後述する実施例ではさらに、細胞構造体として、枯草菌の細胞を使用している。すなわち、細胞構造体として、天然の細胞を使用することができる。
【００１５】
［ゲスト物質］
本発明において、ゲスト物質とは、細胞構造体の内部へ導入される外来物質をいう。このようなゲスト物質として、例えば、天然又は合成の高分子、導体−半導体、酸化物、細胞小器官などがあげられる。天然又は合成の高分子としては、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、カーボンナノチューブ、フラーレン、ポリスチレン、脂質分子、コレステロール、糖脂質、及びこれらの複合体を挙げることができる。導体としては、金ナノ粒子や金ナノロッド、半導体及び酸化物としては、二酸化チタン、二酸化ケイ素などの酸化物粒子があげられる。好適な実施の態様において、後述する密度（比重）の関係を満たすことができるゲスト物質を使用することができる。さらにこれらの形状は、粒子などの固相系に担持されていれば、不定形であっても、固定形でもどちらでもよい。
【００１６】
［ゲスト物質のサイズ］
ゲスト物質のサイズは、上記例示した材質のゲスト物質がとることができて、細胞構造体の内部に導入されて目的の機能を発揮できるサイズであれば、特に制限はない。ゲスト物質として、例えば流体力学的半径１０〜３００［ｎｍ］、５０〜２００［ｎｍ］の粒子を使用することができる。
【００１７】
［ゲスト物質の電荷］
ゲスト物質として、表面に電荷を帯電していない分子又は粒子、さらに正電荷又は負電荷を帯電した分子又は粒子を使用できる。天然の細胞の多くは、表面に負電荷を帯電している分子をしばしば備えており、このために、表面に負電荷を帯電した分子又は粒子は、導入が難しいとされる。本発明によれば、表面に負電荷を帯電した分子又は粒子であっても、何ら困難なく、ゲスト物質として使用することができ、細胞構造体内部へ導入することができる。本発明において、表面に負電荷を帯電しているとは、ゼータポテンシャルが、負の値であることをいう。
【００１８】
［細胞構造体とゲスト物質とが溶媒中に分散した混合分散液の調製］
細胞構造体とゲスト物質とが溶媒中に分散した混合分散液は、例えば、細胞構造体分散液と、ゲスト物質分散液とを混合することによって調製できるが、これに限られるものではない。混合分散液の調製に使用される細胞構造体分散液とゲスト物質分散液とは、混合分散液が適切に調製されるような濃度及び量であれば特に制限はない。
【００１９】
［混合分散液の溶媒］
混合分散液の溶媒として、例えばスクロース水溶液、グルコース水溶液、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＣＨＥＳ緩衝液及びこれらの混合溶液を挙げることができる。これらの濃度は、後述する密度（比重）及び浸透圧を満たすことができる範囲で適宜選択することができるが、例えば０ｍＭ〜２０００ｍＭ、１００ｍＭ〜２０００ｍＭ、１００ｍＭ〜４００ｍＭ、１００ｍＭ〜３００ｍＭの範囲とすることができる。好ましい溶媒として、例えば１００ｍＭのスクロース水溶液、１００ｍＭのグルコース水溶液を挙げることができる。
【００２０】
［混合分散液中のゲスト物質］
混合分散液に分散するゲスト物質の濃度は、ゲスト物質を分散可能な範囲な濃度であれば特に制約はなく、導入のために高い濃度で含むことが好ましい。ゲスト物質の濃度（分散液体積あたりの粒子質量）としては、例えば０．０１〜２．５％ｗ／ｖ、０．０００１〜０．０１％ｗ／ｖの範囲とすることができる。
【００２１】
［混合分散液中の細胞構造体］
混合分散液に分散する細胞構造体の濃度は、細胞構造体を分散可能な範囲な濃度であれば特に制約はなく、導入のために高い濃度で含むことが好ましい。細胞構造体の個数密度（分散液体積当たりの粒子の個数）は、例えば１．０×１０4〜１．０×１０6［粒子数／μＬ］の範囲とすることができる。
【００２２】
［遠心加速度］
細胞構造体とゲスト物質の混合分散液へ、遠心加速度を与えることによって、細胞構造体内部へのゲスト物質の導入が行われる。遠心加速度を与える手段に、特に制限はなく、例えば市販の遠心装置を適宜使用でき、例えばエッペンドルフチューブ（商標）用の遠心装置を使用できる。遠心加速度は、例えば５００ｒｃｆ〜１００００ｒｃｆ、５００ｒｃｆ〜５０００ｒｃｆ、１０００ｒｃｆ〜３０００ｒｃｆ、１０００ｒｃｆ〜２４００ｒｃｆ、１２００ｒｃｆ〜２０００ｒｃｆ、５００ｒｃｆ〜３００００ｒｃｆの範囲とすることができる。遠心加速度（遠心力）を与える時間は、与える遠心加速度（遠心力）と混合分散液の体積に応じて、適宜設定することができるが、例えば１分〜３００分、３分〜６０分、１分〜３０分、３分〜１５分、８分〜１５分とすることができる。
【００２３】
［密度（比重）］
好適な実施の態様において、遠心によって細胞構造体（ＧＵＶ）内部へ、ゲスト物質が導入される際に、導入されるゲスト物質の密度ｘと、細胞構造体の密度ｙと、これらが分散している溶媒の密度ｚとは、次の関係を満たすものとすることができる：
ゲスト物質密度ｘ  ＞  溶媒密度ｚ
細胞構造体密度ｙ  ＞  溶媒密度ｚ
１．３０  ≧  ゲスト物質密度ｘ  ／  細胞構造体密度ｙ  ≧  ０．９０  
なお、ＧＵＶ内部に包含される溶液（溶媒）の密度は、膜を含めたＧＵＶ（細胞構造体）そのものの密度と見ることができる。
【００２４】
上記関係は、好ましくは、次の関係を満たすものとすることができる：
ｘ  ＞  ｚ、  ｙ  ＞  ｚ、  １．２０  ≧  ｘ／ｙ  ≧  ０．９６  ；
ｘ  ＞  ｚ、  ｙ  ＞  ｚ、  １．０６  ≧  ｘ／ｙ  ≧  ０．９６  ；
ｘ  ＞  ｚ、  ｙ  ＞  ｚ、  １．０４  ≧  ｘ／ｙ  ≧  １．００  ；
あるいは
ｘ  ＞  ｚ、  ｙ  ＞  ｚ、  ４．３  ≧  ｘ／ｙ  ≧  ０．９６  ；
ｘ  ＞  ｚ、  ｙ  ＞  ｚ、  ４．３  ≧  ｘ／ｙ  ≧  １．００  
【００２５】
好適な実施の態様において、例えば白血球細胞の比重（４℃の水に対する密度の比）は、１．０３〜１．０９であり、グラム陽性菌である枯草菌の比重は１．２２〜１．１５０とされるから、これに対して、上記の関係を満たすように、ゲスト物質及び溶媒を調製することができる。
【００２６】
［浸透圧］
好適な実施の態様において、遠心によって細胞構造体（ＧＵＶ）内部へ、ゲスト物質が導入される際に、細胞構造体の内部液の浸透圧ｐと、これが分散している溶媒（外部液）の浸透圧ｑは、次の関係を満たすものとすることができる：
外部液浸透圧ｑ  ＋  ３．０［ｍＯｓｍ／ｋｇ］  ≧  内部液浸透圧ｐ  ≧  外部液浸透圧ｑ  −  ８５．０［ｍＯｓｍ／ｋｇ］
なお、ＧＵＶ内部に包含される溶液（溶媒）の浸透圧は、ＧＵＶ（細胞構造体）の調整時に包含された溶液（溶媒）の浸透圧と見ることができる。
【００２７】
上記関係は、好ましくは、例えば次の関係を満たすものとすることができる：
ｑ  ＋  ２．０［ｍＯｓｍ／ｋｇ］  ≧  ｐ  ≧  ｑ  −  ８５．０［ｍＯｓｍ／ｋｇ］  ；
ｑ  ＋  ３．０［ｍＯｓｍ／ｋｇ］  ≧  ｐ  ≧  ｑ  −  ２．０［ｍＯｓｍ／ｋｇ］  ；
あるいは
ｑ  ＋  ２．０［ｍＯｓｍ／ｋｇ］  ≧  ｐ  ≧  ｑ  −  １．０［ｍＯｓｍ／ｋｇ］  
【００２８】
好適な実施の態様において、例えばＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）細胞の等浸透圧は、２８０±３．３  ｍＯｓｍ／ｋｇで、グラム陽性菌である枯草菌は１７０  ｍＯｓｍ／ｋｇ前後であることから、これに対して、上記の関係を満たすように、ゲスト物質及び溶媒を調製することができる。
【実施例】
【００２９】
以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。
【００３０】
［細胞構造体内へのゲスト物質の導入実験］
［人工細胞分散液］
ゲスト物質を導入する人工細胞の分散液として、以下の手順で細胞構造体分散液（人工細胞分散液）を調製した。
【００３１】
［細胞構造体分散液の調製の材料］
細胞構造体である、巨大リン脂質二分子膜ベシクル（以下ＧＵＶ：  Ｇｉａｎｔ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）を作成するために、脂質分子として粉末ＤＯＰＣ（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから購入）を使用した。
ＧＵＶ内部に充填させる溶液として、スクロース水溶液を使用した。粉末スクロース（ナカライテスク社）を水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に溶解して、１００ｍＭのスクロース水溶液を調製した。溶質であるクロロホルム（関東化学社製）に粉末ＤＯＰＣ  １０ｍＭとなるようにＤＯＰＣクロロホルム溶液を調製して、ＩＴＯガラス基板に脂質フィルムを作成するために使用した。
【００３２】
［細胞構造体分散液の調製の装置と手順］
ＧＵＶはＥＦ法（Ａｎｇｅｌｏｖａ，  Ｍｉｇｌｅｎａ  Ｉ，  ａｎｄ  Ｄｉｍｉｔｅｒ  Ｓ  Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，  ‘Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ’，  Ｆａｒａｄａｙ  Ｄｉｓｃｕｓｓ．  Ｃｈｅｍ．  ＳＯ，  ８１  （１９８６），  ３０３−３１１）によって調製した。
このために、下記の装置及び器具を使用した。電極として酸化インジウムスズ被膜ガラススライド（以下ＩＴＯガラス）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用した。電場印加チャンバーの作成用に厚さ２ｍｍのシリコンシート（アズワン社から購入）を、縦２．５ｃｍ、横２．５ｃｍにカットし、さらに５ｍｍ分だけ枠を残し内側を切り取り中抜きシリコンシートを作成した。図１に電場印加用チャンバー概念図を示す。チャンバーの固定用にダブルクリップを使用した。さらに溶液充填用に２２Ｇ注射針（テルモ社）、２．５ｍｌシリンジ（テルモ社）を使用した。電流の印加装置としてファンクションジェネレーターＡＦＧ−２００５（ＧＷＩＮＳＴＥＫ社製）を利用し下記の手順にてＧＵＶを作成した。
【００３３】
［細胞構造体分散液の調製の手順］
ＩＴＯガラス導電面に、クロロホルム中に溶かしたＤＯＰＣ（１０ｍＭ）を１１．２５μｌ抽出し全体の内の半分側に塗布した。図２にＩＴＯガラスへの脂質フィルム塗付イメージの説明図を示す。干渉縞が形成されるようにＤＯＰＣフィルムを導電面に作成して、真空デシケーター内部で１時間以上乾燥した。
【００３４】
その後、ＤＯＰＣフィルム付ＩＴＯガラス、チャンバー作成用ＩＴＯガラス、中抜き２ｍｍシリコンシートを利用して、フィルム塗付部分にチャンバーを形成させ、最後にシリコンシートをダブルクリップで挟んでチャンバーを固定した。図３にＧＵＶ作成チャンバーのイメージの説明図を示す。
【００３５】
次にシリンジと注射針を利用して、チャンバー内部に１００ｍＭスクロース水溶液４２５μｌをゆっくりと充填した。図４にシリンジと針二本を利用して、チャンバー内部に１００ｍＭスクロース水溶液を充填する模式図を示す。
【００３６】
その後、アルミホイルで作成した導電板をＩＴＯガラスの端に接続し、ファンクションジェネレーター（ＧＭＩＮＳＴＥＫ社製）を利用して、周波数１０〜１ＭＨｚ、振幅０．１〜５Ｖｐｐ、ｏｆｆ  ｓｅｔ  ０．０５〜５Ｖの電場を１２時間印加してＧＵＶを作成した。図５に電場印加の説明図を示す。
【００３７】
［位相差顕微鏡による観察：ＧＵＶ生成の確認］
この後に、チャンバー内部にＧＵＶ分散液が生成していることを、位相差顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス社製）による観察（倍率６０倍）を行って、確認した。図６に、ＧＵＶ生成の確認のための位相差顕微鏡による観察に使用したチャンバーの模式図を示す。位相差顕微鏡による観察によって得られたＧＵＶ分散液中のＧＵＶの個数密度は、１．５×１０5［粒子数／μＬ］であった。ＧＵＶ分散液に分散するＧＵＶの内部には、１００ｍＭスクロース水溶液が封入されており、このＧＵＶが１００ｍＭスクロース水溶液中に分散している。このようにしてＧＵＶ分散液を得た。
【００３８】
このようにして得られたＧＵＶ分散液を、後の実験に使用した。ＧＵＶ分散液は、１００ｍＭのスクロース水溶液が、ＧＵＶの内部に包含されており、そのようなＧＵＶが１００ｍＭのスクロース水溶液中に、分散している。
【００３９】
［ゲスト物質分散液］
細胞構造体内へ導入されるゲスト物質が分散した分散液として、以下の組成のポリスチレン粒子分散液を調製した。
組成：
ポリスチレン粒子平均半径：１００［ｎｍ］
ポリスチレン粒子の密度：１．０５［ｇ／ｍ3］
分散液中のポリスチレン粒子の濃度（分散液体積あたりの粒子質量）：０．００２５％ｗ／ｖ
溶媒：１００ｍＭグルコース水溶液
ポリスチレン粒子は、蛍光ラベルされたＹＧ−Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ（ＹＧ−ＰＰ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃ社製）を希釈して使用した。
【００４０】
［細胞構造体へのゲスト物質導入］
上記のように得た細胞構造体分散液（ＧＵＶ分散液）とゲスト物質分散液（ポリスチレン分散液）を使用して、以下のようにゲスト物質の導入実験を行った。
調製したＧＵＶ分散液１５μＬと、ポリスチレン分散液１５μＬを、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに入れて、ピペッティングにより混合し、ｍｉｎｉＳｐｉｎ（遠心分離機）に混合液チューブとバランサーを装填し、約１６００ｒｃｆで１０分間、遠心力を加えた。
【００４１】
［ゲスト物質導入の確認］
遠心が終了したのちに、軽くタッピングを行ってボトムに凝集したペレットを分散させて、上記ＧＵＶ生成の確認と同様に位相差顕微鏡を使用して観察し、ＧＵＶの内部へポリスチレンの粒子が導入されていることを確認した。
すなわち、位相差顕微鏡の視野内で、球形のＧＵＶを探し、ＧＵＶの中心にピントを合わせて、その状態においてポリスチレンの粒子の蛍光を観察し、中心付近に粒子の蛍光を観察した。このとき粒子の蛍光が見えた場合、顕微鏡の焦点深度が５６０ｎｍであり、ＧＵＶの大きさがそれよりも十分に大きいことからポリスチレン粒子が内部に入っていることを確認した。
図７は、ＧＵＶ内部へポリスチレン粒子が導入されたことを確認する方法の説明図である。図７のａ）はフォーカスをＧＵＶの中心に合わせた時のフォーカス面とＧＵＶ、粒子の位置関係を示す。図７のｂ）は、ａ）の観察を行った際に実際にどのように粒子が観察できるかを示している。
このように、位相差顕微鏡観察で、ゲスト物質（ポリスチレン粒子）がＧＵＶ（細胞構造体）内部へ導入されたことが確認できた。導入されていたＧＵＶの平均直径は１５μｍ以上８０μｍ以下であった。
【００４２】
［密度（比重）］
ＧＵＶ分散液とポリスチレン分散液とを同体積で混合した溶液（混合分散液）の分散媒（外部液）の密度は、１．００［ｇ／ｍ3］であった。ＧＵＶ内部に包含される１００ｍＭグルコース水溶液の密度は１．０１［ｇ／ｍ3］であり、これは膜を含めたＧＵＶ（細胞構造体）そのものの密度と見ることができる。使用したポリスチレン粒子の密度は、１．０５［ｇ／ｍ3］であった。
すなわち、遠心によって細胞構造体（ＧＵＶ）内部へ、ゲスト物質（ポリスチレン粒子）が導入される際に、導入されるゲスト物質の密度ｘと、細胞構造体の密度ｙと、これらが分散している溶媒の密度ｚとは、次の関係を満たすものとなっていた：
ゲスト物質密度ｘ  ＞  溶媒密度ｚ
細胞構造体密度ｙ  ＞  溶媒密度ｚ
１．３０  ≧  ゲスト物質密度ｘ  ／  細胞構造体密度ｙ  ≧  ０．９６  
【００４３】
［浸透圧］
ＧＵＶ分散液とポリスチレン分散液とを同体積で混合した溶液（混合分散液）の分散媒（外部液）の浸透圧は、１０６〜１０９［ｍＯｓｍ／ｋｇ］であった。ＧＵＶ内部に包含される１００ｍＭスクロース水溶液の浸透圧（内部液の浸透圧）は、１０７［ｍＯｓｍ／ｋｇ］であった。
すなわち、遠心によって細胞構造体（ＧＵＶ）内部へ、ゲスト物質（ポリスチレン粒子）が導入される際に、細胞構造体の内部液の浸透圧ｐと、これが分散している溶媒（外部液）の浸透圧ｑは、次の関係を満たすものとなっていた：
外部液浸透圧ｑ  ＋  ２．０［ｍＯｓｍ／ｋｇ］  ≧  内部液浸透圧ｐ  ≧  外部液浸透圧ｑ  −  ８５．０［ｍＯｓｍ／ｋｇ］
【００４４】
［ゼータポテンシャル］
ＧＵＶ及びポリスチレンのゼータポテンシャルを、以下の条件で測定したところ、後述の結果を得た。
測定条件：  Ｍａｌｖｅｒｎ社製のゼータサイザーを使用してＧＵＶ及びポリスチレン粒子のζポテンシャルを測定した。ＧＵＶ分散液のζポテンシャル及び、ポリスチレンのζポテンシャルはすべて脱イオン水中で測定した。（実際の実験条件はスクロースやグルコース中であるが、それらはζポテンシャルに影響を及ぼさない。）
ＧＵＶ  Ｚｅｔａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：  −３３ｍＶ
ポリスチレン  Ｚｅｔａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：  −３６ｍＶ
【００４５】
［浸透圧の検討］
ゲスト物質の導入における浸透圧条件を検討するために、以下の実験を行った。
以下の表１のように浸透圧条件を変えて、上記「細胞構造体へのゲスト物質導入」と同様の手順で、ゲスト物質の導入の実験を行った。
ＧＵＶ内部液の浸透圧、及びゲスト物質分散液（ポリスチレン分散液）の浸透圧は、以下の表１の通りである。
ゲスト物質分散液（ポリスチレン分散液）は、ＧＵＶ分散液と、１：１に混合して、混合分散液としたので、混合分散液の外部液とＧＵＶ内部液との浸透圧差を、以下のように計算した：
「混合分散液の外部液とＧＵＶ内部液との浸透圧差」＝［（「ＧＵＶ分散液の浸透圧」＋「ゲスト物質分散液の浸透圧」）／２］−「ＧＵＶ分散液の浸透圧」
例えば、表１において、ゲスト物質分散液の浸透圧が１０８［ｍＯｓｍ／ｋｇ］、ＧＵＶ内部液の浸透圧が１０７［ｍＯｓｍ／ｋｇ］である場合に、浸透圧差は、（１０７＋１０８）／２−１０７＝０．５［ｍＯｓｍ／ｋｇ］と計算される。
その後、上記「ゲスト物質導入の確認」と同様の手順で、ゲスト物質粒子導入の有無を確認した。この結果を、表１に示す。位相差顕微鏡での探索の後に、視野内にゲスト物質粒子が内部に導入されたＧＵＶを見いだした場合には、ゲスト物質粒子導入を「有り」と判定して、表１において「○」印を付した。
表１に示されるように、実験した浸透圧差の範囲内で、いずれもゲスト物質粒子がＧＵＶ内部に導入されたことを確認できた。
【００４６】
【表１】
2018000171.tif 000002
【００４７】
［遠心加速度の検討］
ゲスト物質の導入における遠心加速度条件を検討するために、以下の実験を行った。
以下の表２のように遠心加速度条件を変えて、上記「細胞構造体へのゲスト物質導入」と同様の手順で、ゲスト物質の導入の実験を行った。
ＧＵＶ内部液の浸透圧は１０７［ｍＯｓｍ／ｋｇ］、混合分散液の外部液の浸透圧は同じく１０７［ｍＯｓｍ／ｋｇ］とした。
その後、上記「ゲスト物質導入の確認」と同様の手順で、ゲスト物質粒子導入の有無を確認した。位相差顕微鏡で１分間の探索の間に、視野内に確認されたＧＵＶの総数と、確認されたＧＵＶのなかでゲスト物質粒子が導入されたＧＵＶの数を計数して、ＧＵＶ総数のなかでゲスト物質粒子が導入されたＧＵＶの割合を取り込み率として、算出した。
「取り込み率」＝「粒子が内部に導入されたＧＵＶ数」／「視野内に確認されたＧＵＶの総数」
この結果を表２に示す。遠心力に対するゲスト物質粒子取り込み率をグラフにして図８に示す。図８の横軸は遠心力、縦軸は取り込み率である。
表２と図８に示されるように、実験した遠心力の範囲内で、高い取り込み率で、ゲスト物質粒子がＧＵＶ内部に導入されたことを確認できた。
【００４８】
【表２】
2018000171.tif 000003
【００４９】
［天然細胞内へのゲスト物質の導入実験］
天然細胞として、枯草菌の細胞を使用して、ゲスト物質の導入実験を以下のように行った。
【００５０】
［枯草菌の抽出］
市販の納豆から枯草菌を抽出した。最初にエッペンドルフチューブ（１．５ｍＬ）に１ｍＬの脱イオン水を加えた。その後、市販の納豆を２００μｌ用ピペットマンチップ（ニチペットＥＸ  Ｐｌｕｓ  ＩＩ）で数回撹拌し、枯草菌が含まれた納豆の粘液をチップ先端に十分に絡ませた。このようにして粘液が付着したチップを、用意したエッペンドルフチューブ１ｍＬの脱イオン水に浸漬し、チップ先端の粘液が溶液中に溶け出すように数分にわたり撹拌することで、枯草菌分散液を作成した。
【００５１】
［枯草菌とゲスト物質の混合］
半径１００ｎｍのＹＧ−Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＹＧ−ＰＰ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を脱イオン水中に０．００２５％（ｗ／ｖ）の粒子濃度となるように調整し、ゲスト物質分散液とした。そのゲスト物質分散液と枯草菌分散液を３０μｌずつ混合して、混合分散液６０μｌを作成した。この条件下の操作で、枯草菌細胞の形状は、破裂するなどの大きな変化を生じなかった。
【００５２】
［枯草菌内部へのゲスト物質導入］
上記作成した混合分散液をエッペンドルフ社製遠心機ｍｉｎｉＳｐｉｎに装填し、さらにバランサーを装填して１６００ｒｃｆで１０分間遠心力を加えて枯草菌にゲスト物質粒子を導入した。
【００５３】
［枯草菌内部へのゲスト物質導入の確認］
上記の操作によって、枯草菌内部へゲスト物質が導入されたことを、以下の手順で確認した。
Ｏｌｙｍｐｕｓ社製  ＩＸ７３位相差顕微鏡及び、同顕微鏡に取り付けられた蛍光顕微鏡を利用して観察した。まず初めに、参考文献（Ｊｏｎｅｓ，  Ｌ．；  Ｃａｒｂａｌｌｉｄｏ−Ｌｏｐｅｚ，  Ｒ；  Ｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｈａｐｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａ：  Ｈｅｌｉｃａｌ，  Ａｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ．Ｃｅｌｌ  ２００１．）（特にこの参考文献のＦｉｇｕｒｅ．１Ａ）を参考にして、枯草菌細胞として知られる形状と類似した構造体を位相差顕微鏡を利用して探索した。観察結果からＪｏｎｅｓらが確認した枯草菌と類似した形状の構造体（枯草菌細胞）を確認できた（図９の（ａ））。さらにこのことから枯草菌が脱イオン水中でも形状が崩れないで維持されていることを確認した。その後、枯草菌の断面が最大面積となる位置（枯草菌の重心位置）にピントを合わせた状態で、構造体（枯草菌細胞）を位相差観察し、その状態において励起光を照射することで、断面の内側にゲスト物質粒子の存在とその運動を確認した。枯草菌の短軸方向の長さは０．５１μｍの長さであり、ゲスト物質粒子に焦点をあわせるとその位置が膜の内側に存在していたことから、細胞構造体内部へのゲスト物質粒子の導入を確認した。
【００５４】
図９の（ａ）は、ゲスト物質粒子が導入されている枯草菌の位相差＋蛍光顕微鏡写真である。ゲスト物質粒子は、蛍光を発して、グレースケールの写真で白色に見えている。写真の上下方向の中央付近で、左右方向の左側に見えている白色粒子は、その周りに輪郭のぼやけている楕円体形状の物体に囲まれている。この楕円形状の物体が枯草菌である。写真中のバーは３μｍを示す。図９の（ｂ）では、図９の（ａ）に示した写真と同視野の写真に、ゲスト物質の白色粒子を示す線分と「半径１００ｎｍナノ粒子」の説明を追加し、さらに、楕円形状の枯草菌の輪郭を点線で囲い、「枯草菌」の説明を追加した。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明によれば、ゲスト物質を細胞内へ導入することができる。本発明は産業上有用な発明である。
【図１】
2018000171.tif 000004
【図２】
2018000171.tif 000005
【図３】
2018000171.tif 000006
【図４】
2018000171.tif 000007
【図５】
2018000171.tif 000008
【図６】
2018000171.tif 000009
【図７】
2018000171.tif 000010
【図８】
2018000171.tif 000011
【図９】
2018000171.tif 000012