(57)【要約】【課題】オーランチオキトリウム属に属する微細藻類が産生する高度不飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等を含有する油脂を抽出分離する工程を有する油脂の製造方法を提供する。【解決手段】オーランチオキトリウム属に属する微細藻類を塩分含有培養液で培養して得られた培養液を、濃縮・脱水・乾燥等の前処理なしに有機溶媒と混合し、培養液に含まれる培養藻体の細胞膜を破砕すると共にＤＨＡ等を含有する油脂を有機溶媒にて抽出する。油脂は抽出溶媒相として、破砕による藻残渣は脱水固形分相として、培養液は排水相として分離される。抽出溶媒相に含まれる塩分やガム質等の不純物を水で洗浄除去した後、溶媒分離回収装置により抽出溶媒相を処理し、溶媒を油脂から分離・回収して循環使用する。分離された油脂は、残留する溶媒の分離・除去処理、及び脱酸・脱色等の精製処理を経て油脂製品とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドコサヘキサエン酸含有油脂の製造方法であって、
ドコサヘキサエン酸含有油脂を産生するオーランチオキトリウム属に属する微細藻類の塩分を含有する培養液による培養により得られ、ドコサヘキサエン酸含有油脂を有する培養藻体を含む培養液中で、油脂抽出用の有機溶媒の存在下に、前記培養藻体の細胞膜を破砕して、前記ドコサヘキサエン酸含有油脂を前記有機溶媒により抽出して、該ドコサヘキサエン酸含有油脂を含む抽出溶媒相を形成する破砕抽出工程と、
前記破砕抽出工程で得られた抽出溶媒相を分離回収する分離回収工程と、
前記分離回収された抽出溶媒相からドコサヘキサエン酸含有油脂を回収する油脂回収工程と、
を有することを特徴とするドコサヘキサエン酸含有油脂の製造方法。
【請求項２】
破砕抽出工程により、水相と、前記抽出溶媒相を含む二相系の液体が形成され、該二相系の液体全体に、凝集剤を添加し、該二相系の液体に含まれる培養藻体残渣を含む固形分を凝集・フロック化し、水相、抽出溶媒相及び固形分相の三相を形成し、これらの相を互いに分離して回収する分離回収工程を有することを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記分離回収された抽出溶媒相を前記油脂回収工程に供給することを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記油脂回収工程が、前記抽出溶媒相に含有される塩分および油脂中のガム質を含む不純物を水洗除去する水洗浄工程を有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
前記水洗浄工程において、抽出溶媒相が、該抽出溶媒相中の有機溶媒量の２〜２５質量％の量の、塩化物イオン濃度１５０ｍｇ／Ｌ以下の水で洗浄され、該抽出溶媒相に含有される塩分および油脂中のガム質を含む不純物が該抽出溶媒相から除去されることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記油脂回収工程が、前記抽出溶媒相から該抽出溶媒相に含まれる抽出用の有機溶媒を除去して油脂を得る有機溶媒除去工程を有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記有機溶媒除去工程が、一段階目で油脂中の有機溶媒濃度を２〜５０質量％に低減して油脂を濃縮し、二段階目で操作圧力０．０８〜２ｋＰａＡの真空下で油脂中の残留溶媒を更に低減する二段工程を有することを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記一段階目で油脂中の有機溶媒濃度を９〜２５質量％に低減することを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記二段目の操作圧力が０．１〜１ｋＰａＡであることを特徴とする請求項７または８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記有機溶媒除去工程が、前記水洗浄工程の後に行われる請求項６乃至９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記有機溶媒除去工程で得られた有機溶媒を分離回収して前記破砕抽出工程の油脂抽出用としてリサイクルすることを特徴とする請求項６乃至１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記残留溶媒が除去された油脂を更に精製工程で処理することを特徴とする請求項６乃至１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩分を含む培養液で培養されたオーランチオキトリウム属に属する微細藻類の培養藻体から、この微細藻類が産生するドコサヘキサエン酸等の有用成分を含有する油脂を直接抽出分離する工程を有する、ドコサヘキサエン酸を含む油脂の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１にオーランチオキトリウム属に属する微細藻類の株の増殖速度が非常に速いことが示されている。オーランチオキトリウム属の微細藻類がスクアレン、ドコサヘキサエン酸（以下、「ＤＨＡ」という）などの有用物質を高増殖速度下で大量に産生する能力があることが明らかとなったことから、微細藻類からスクアレン、ＤＨＡなどを含む油脂を効率的、経済的に生産することが可能となる製造方法が検討されてきた。
例えば、特許文献２は、ナビクラ属に属する微細藻類の特定株（JPCC DA0580株）が産生する油分の製造方法に関する。特許文献２では、培養した微細藻類を遠心沈殿やフィルターろ過等にて濃縮回収し回収藻体より有機溶媒にて油分が抽出される。特許文献２では、溶媒による抽出効率を高めるために超音波ホモジナイザー等により藻体を物理的に破壊することが好ましく、抽出した油分の精製は公知の方法で行えば良いとしている。すなわち、特許文献２には、抽出の前処理として、藻類を培養液から分離回収することが示されている。
特許文献３には、細胞内に有機溶媒ジメチルエーテル（ＤＭＥ）を浸透させ減圧気化させて細胞膜を破砕し、その後、破砕した細胞内の含有油脂に別途抽出溶媒を添加・混合して抽出することが示されている。
特許文献４では、対象とする微細藻類を固液分離、即ち、濃縮脱水した後、細胞膜を破壊・溶解処理していない状態で無極性有機溶媒を含有する抽出溶媒で抽出するとしている。
特許文献５には、オーランチオキトリウム属に属する微細藻類等の微生物による炭化水素の製造を最適化する方法が記されている。
また、特許文献６では、凝集剤としてのキトサンを添加して凝集し、回収された微細藻類から含有する油脂を抽出し、油脂抽出後の藻残渣を有効利用するとしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０７７７９９号
【特許文献２】国際公開第２０１０／１１６６１１号
【特許文献３】特開２０１１−３１１７０号公報
【特許文献４】特開２０１４−１４０３０８号公報
【特許文献５】特開２０１５−９６０５０号公報
【特許文献６】特開２０１４−１４２８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献２〜６に記載される方法は製造の経済性を向上させる目的でなされたものである。しかしながら、微細藻類から油脂を抽出、分離、精製する方法については、部分的な処理手段の改善や各工程の有する一般的な機能を示すに留まっており、更なる経済性の改善、安定運転性の向上を図る上でこれらの各工程に内包する技術的な課題を解決する手段は示されていない。特に、オーランチオキトリウム属に属する微細藻類から油脂を抽出分離するために特許文献２〜６に開示される方法を利用する場合には、更なる経済性の改善、安定運転性の向上の余地がある。
即ち、オーランチオキトリウム属に属する微細藻類のように、塩分を含む培養液で培養された微細藻類から油脂を分離回収する場合、その効率的、経済的および安定的製造の観点から微細藻類の脱水・濃縮、有機溶媒による抽出および抽出された油脂の溶媒からの分離を如何なる方法で実施するか、藻残渣の処理を如何にするかが課題である。
オーランチオキトリウム属に属する微細藻類の脱水・濃縮は藻体サイズが数μｍ〜数十μｍと非常に細かく、且つ、藻体濃度（乾燥質量）が３５ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌと大きい為、ろ過等の単純な脱水濃縮操作による藻体の回収が非常に困難となる場合が多い。
また、有機溶媒による抽出操作は当該微細藻類の細胞膜を破砕し内部に産生された油脂と溶媒との混合を充分に行い、抽出そして抽出溶媒相としての分離が効率良くなされねばならない。
更に、抽出溶媒相に分離された溶媒を油脂から分離回収する場合、当該溶媒相に同伴する塩分による影響を考慮して、蒸留装置を含む有機溶媒蒸発処理用の設備の塩分に接触する部分をチタン製や耐海水性ステンレス製にするなど高価な設備が必要となる。ここで塩分濃度を低下することによって通常の金属材料が使用可能となるが、塩分濃度を下げるための追加の工程が必要となる。
また、製品油脂の品質上、溶媒の混入は極小とし、油脂中の不純物ガム質も効率的に除去することが好ましい。
本発明の目的は、塩分を含む培養液で培養されたオーランチオキトリウム属に属する微細藻類が産生するＤＨＡ等の有用成分を含有する油脂を効率的、経済的且つ安定的に抽出分離することができるＤＨＡ含有油脂の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は前述の課題を克服すべく研究を重ねた結果、効率的、経済的且つ安定的にＤＨＡ等の有用成分を含有する油脂を製造可能とする方法を見出し、本発明を完成するに至った。
特に、本発明者等は、オーランチオキトリウム属に属する微細藻類の藻体が微細であり、ろ過等の単純な分離操作では培養液からの分離操作が容易でない点に着目し、培養液中で培養藻体を破砕するとともに、培養液に添加した抽出用の有機溶媒中に油脂を直接抽出する破砕抽出法の油脂生産への適用が可能かどうかについて鋭意検討した。その結果、オーランチオキトリウム属に属する微細藻類の培養藻体は、培養液中における油脂抽出用の有機溶媒の存在下で直接破砕可能であり、且つ、培養藻体の破砕によって培養藻体の細胞膜内に内包された油脂が有機溶媒と接触可能となり培養液中の有機溶媒中に抽出可能であるとの新たな知見を得た。本発明は、かかる本発明者等の新たな知見に基づいて成されたものである。
なお、特許文献３では、ＤＭＥ気化による細胞破砕後、抽出溶媒を添加混合して有機物を抽出溶媒で抽出しており、破砕と抽出を同時に行うものではない。
すなわち、本発明にかかるオーランチオキトリウム属に属する微細藻類からのＤＨＡ含有油脂の製造方法は、
ＤＨＡ含有油脂を産生するオーランチオキトリウム属に属する微細藻類の塩分を含有する培養液による培養により得られ、ＤＨＡ含有油脂を有する培養藻体を含む培養液中で、油脂抽出用の有機溶媒の存在下に、前記培養藻体の細胞膜を破砕して、前記ＤＨＡ含有油脂を前記有機溶媒により抽出して、該ＤＨＡ含有油脂を含む抽出溶媒相を形成する破砕抽出工程と、
前記破砕抽出工程で得られた抽出溶媒相を分離回収する分離回収工程と、
前記分離回収された抽出溶媒相からＤＨＡ含有油脂を回収する油脂回収工程と、
を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明にかかるＤＨＡ含有油脂の製造方法によれば、オーランチオキトリウム属に属する微細藻類が産生するＤＨＡ、スクアレン等の有用成分を含む油脂を効率的、経済的且つ安定的に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の一実施形態に係るオーランチオキトリウム属に属する微細藻類が産生するＤＨＡ、スクアレン等の有用成分を含む油脂の製造方法の構成を示す説明図である。
【図２】本発明の他の実施形態に係る製造方法の構成を示す説明図である。
【図３】圧力式ホモジナイザーによる藻体破砕前後の粒度分布測定結果を示す図である。
【図４】圧力式ホモジナイザーによる藻体破砕前後の粒度分布測定結果を示す図である。
【図５】破砕抽出後の抽出油脂量の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
気水域で生息するオーランチオキトリウム属に属する微細藻類の培養液には塩分が含まれている。塩分を含有する培養液で培養された藻体（培養藻体）から産生されたＤＨＡ等を含む油脂を効率的、経済的且つ安定的に分離することが命題である。収穫された培養液中の微細藻体の濃度、油脂の存在場所、微細藻体のサイズ・形状と物理的強度等が製造方法の決定に大きく関与する。
ＤＨＡ等を産生するオーランチオキトリウム属に属する微細藻類は、収穫された培養液中の藻体濃度（乾燥質量）は３５〜１５０ｇ／Ｌ、藻体サイズは数μｍ〜数十μｍで、油脂は細胞膜の内部に存在する。油脂の藻体からの分離は、通常、藻体の培養液からの分離、分離された藻体からの水分の低減または藻体の乾燥、すなわち藻体の脱水濃縮処理を行った後に、有機溶媒による抽出を行うことが一般的である。しかしながら、当該微細藻類に対しては、収穫培養液中の藻体濃度が高く、藻体サイズが非常に微細であるとの理由から、培養液中の培養藻体のそのままの状態での脱水濃縮は困難である。本願発明者等はかかる当該藻類に特有の技術課題について着目し、培養液から培養藻体を分離せずに、油脂の抽出処理が可能な方法について鋭意検討し、破砕抽出方法が当該微細藻類からの油脂の抽出に利用できるとの新たな知見を得た。すなわち、本発明にかかる破砕抽出工程によれば、収穫培養液を有機溶媒と混合し、破砕装置にて藻体細胞膜を破砕すると同時に有機溶媒と油脂の充分な混合による接触によって油脂を抽出し、抽出後の液体を、抽出溶媒相、抽出残渣藻（固形分相）および培養液排水相に分離することができる。油脂抽出用の有機溶媒としては、少なくともＤＨＡを含む油脂の抽出が可能であり、かつ、蒸発または蒸留操作により油脂と有機溶媒との分離が容易なｎ−ヘキサン等一般的に用いられる無極性有機溶媒が使用できる。
更に、細胞膜の破砕と油脂の抽出は圧力式ホモジナイザー等の破砕装置で同時に実施できること、抽出後の相分離は遠心分離機で効率的に達成できることが判明した。なお、抽出率向上のため破砕及び／又は抽出操作を２回以上繰返しても良い。
培養された藻体を含む培養液をｎ−ヘキサン等の無極性有機溶媒と混合し、そのまま破砕と溶媒抽出を同時に実施することで油脂中の不純物のガム質の大部分は水と充分に接触し水相中に移行し、下流の油脂精製工程でのガム質除去の負荷が低減される。
油脂の抽出操作では、乾燥した藻体の二酸化炭素による超臨界或いは亜臨界抽出法も考えられるが、培養液からの脱塩及び脱水、水分の蒸発除去は大きなエネルギーとコストを要し経済的ではない。
【０００９】
以上の各事項に基づいて成された本発明にかかるＤＨＡ含有油脂の製造方法は、以下の工程を有する。
（１）ＤＨＡ含有油脂を産生するオーランチオキトリウム属に属する微細藻類を、塩分を含有する培養液により培養して得られた培養液に油脂抽出用の有機溶媒を添加し、培養液中で培養藻体の細胞膜を破砕して、有機溶媒によりＤＨＡ含有油脂を抽出し、少なくともＤＨＡ含有油脂を含む有機溶媒相からなる抽出溶媒相と水相を含む液体を得る破砕抽出工程。
（２）破砕抽出工程により得られた抽出溶媒相と水相を含む液体から抽出溶媒相を分離回収する分離回収工程。
（３）分離回収された抽出溶媒相からＤＨＡ含有油脂を回収する油脂回収工程。
破砕抽出工程において処理される培養液には、少なくともＤＨＡを含有する油脂、すなわちＤＨＡ含有油脂を細胞膜内に有する培養藻体が含まれている。培養液中で培養藻体の細胞膜を破砕することで、ＤＨＡ含有油脂は培養液に添加した油脂抽出用の有機溶媒と接触して有機溶媒での抽出が可能となる。従って、培養藻体を含む培養液は、培養操作終了後、濃縮脱水および／又は乾燥処理されることなく、破砕抽出工程に供給される。
溶媒抽出された後の藻体の破砕により生じる残渣（以下、「藻残渣」という）には有用な成分が残されており、飼料や肥料等の添加物等として利用する価値がある。藻残渣は、藻体の破砕装置での破砕によって微細化されており、粒子径サイズ１０μｍ以下が９０体積％以上の微粒子として得ることができる。
そこで、破砕抽出工程、分離回収工程及び油脂回収工程に加えて、必要に応じて、藻残渣を含む固形分を分離回収する工程を追加することができる。
【００１０】
藻残渣の分離回収工程には、凝集剤を用いる分離回収方法が好ましく利用できる。
凝集剤を用いる分離回収工程は、藻残渣の分離回収対象となる相に対して行うことができる。すなわち、破砕抽出工程により形成される水相と抽出溶媒相を含む二相系の液体の水相及び／または抽出溶媒相に対して凝集剤を用いた藻残渣の分離回収工程を適用することができる。
水相及び抽出溶媒相の両方を処理する場合は、破砕抽出工程により形成された水相と抽出溶媒相を含む二相系の液体全体に、凝集剤を添加し、二相系の液体に含まれる藻残渣を含む固形分を凝集・フロック化し、水相、抽出溶媒相及び固形分相の三相を形成し、各相を分離回収する分離回収工程により藻残渣を分離回収することができる。この分離回収工程によって回収された抽出溶媒相は油脂回収工程に供給される。
また、破砕抽出工程により形成される二相系の液体の水相に藻残渣が分散している場合には、この水相を分取して凝集剤による処理を行い、藻残渣を凝集・フロック化して回収することができる。
このように、凝集剤を添加して藻残渣を凝集・フロック化すれば脱水濃縮でき、藻残渣の有効利用が可能である。
なお、海水分を含む培養液中の藻類の凝集についてはｐＨ調整により可能との報告もあるが、本発明が対象とする微細藻類の藻体の破砕物である藻残渣に対しては効果的でなく、凝集・フロック化が迅速且つ効率的に達成できる凝集剤の添加が適している。
【００１１】
従来、藻残渣の濃縮脱水は、含有油脂抽出後の抽出溶媒相（軽液）と抽出残水相（重液）との二相分離方式の遠心分離機等で分離された抽出残水相に凝集剤を添加し、抽出残水相に含まれる藻残渣を凝集・フロック化し遠心分離やろ過等にて再度濃縮脱水する二段階分離方式が一般的である。
本発明では破砕抽出工程後の二相系液体全体に凝集剤を添加し、三相分離式遠心分離機にて藻残渣を濃縮脱水し固形分相として藻残渣を一段で分離することが可能となった。この一段分離法は、工程数の低減を行う上で特に好ましい。
藻残渣を飼料添加物とする場合、水溶性キトサン等の食品添加物用の凝集剤を用いて、また肥料添加物とする場合にはカチオン変性ポリアクリルアミドやポリシリカ鉄等の一般用の凝集剤を用いて藻残渣を含水率約８５質量％に脱水濃縮できる。
なお、藻残渣を有効活用せず油脂のみを製品とする場合は、凝集剤を添加せず藻残渣を含む抽出残水相を排水とする。
【００１２】
油脂回収工程は、必要に応じて、抽出溶媒相に含有される塩分および油脂中の、ガム質を含む水溶性あるいは水に対して親和性を有する不純物を水洗除去する水洗浄工程を有することができる。
分離された抽出溶媒相には有機溶媒への溶解水分と微量の同伴水が含まれる。この水分は塩分を含み、常温以上の温度域で炭素鋼等の金属材料を腐食させる場合があるため、前記水分中の塩化物イオン濃度を２００ｍｇ／Ｌ（ミリグラム／リットル）以下とするように塩化物イオン濃度１５０ｍｇ／Ｌ以下の水にて抽出溶媒相を洗浄し塩分濃度を下げることが好ましい。
また、抽出溶媒相中の油脂は微量のガム質を含むが、水溶性のガム質は本水洗浄にて洗浄水中に溶解移行するため、油脂中のガム質濃度を更に削減することが可能となる。
抽出溶媒相中の有機溶媒量の２〜２５質量％の量の、塩化物イオン濃度１５０ｍｇ／Ｌ以下の水による混合、沈降等の分離により塩化物イオン濃度を２００ｍｇ／Ｌ以下とすること、およびガム質濃度の更なる削減が可能であることが判明した。
有機溶媒量の２質量％より少ない量では当該溶媒中に同伴する水分中の塩化物イオン濃度が大きくなり、設備の金属材料を腐食するリスクが増大する場合がある。また、有機溶媒量の２５質量％を越える大量の追加水による洗浄は、洗浄分離装置および排水処理設備の容量増大となる。
また、油脂回収工程は、抽出溶媒相から有機溶媒を除去して油脂を得る有機溶媒除去工程を有することができる。抽出溶媒相からの有機溶媒の除去には、有機溶媒を蒸発させ、蒸発した有機溶媒を凝縮させて回収する方法が利用でき、この処理には蒸留法を好適に利用できる。
抽出溶媒相から除去された有機溶媒は、破砕抽出工程における油脂抽出用の有機溶媒としてリサイクルすることができる。
【００１３】
水洗浄工程後に有機溶媒除去工程を組み合わせることによって、より効率よい有機溶媒の分離回収を行うことができる。
塩化物イオン濃度を２００ｍｇ／Ｌ以下としガム質濃度を削減した油脂を含む抽出溶媒相は製品油脂への溶媒の混入を避けるため、二段階の蒸発または蒸留操作にて油脂と溶媒を厳密に分離して、溶媒はリサイクルされることが好ましい。
蒸発または蒸留操作の一段階目では、抽出溶媒相から分離回収された油脂中の溶媒濃度を２〜５０質量％まで、好ましくは９〜２５質量％まで低下させるように有機溶媒を蒸発または蒸留分離する。この条件では、例えば有機溶媒にｎ−ヘキサンを使用した場合、ｎ−ヘキサン供給量の９９質量％以上が凝縮温度２０〜９０℃で分離回収が可能となる。
続いて二段階目の蒸発または蒸留操作は０．０８〜２ｋＰａＡ、より好ましくは０．１〜１ｋＰａＡの高真空下の操作で油脂から残留有機溶媒を厳密に分離除去することができる。二段階目は高真空下の操作であるが、二段階目の蒸留処理供給量を抽出溶媒相中の有機溶媒量の１／１００（質量基準）以下とすることができ、一段階目および二段階目の蒸発または蒸留操作の組合せにて経済的に安定して製造できる方法を確立した。
分離回収されたｎ−ヘキサン等の抽出用の有機溶媒は再度破砕抽出工程にリサイクル使用することができ、また、ロス等による不足分が生じた場合は必要に応じて有機溶媒を新たに補充する。
残留溶媒を除去した油脂は必要により更に精製工程で処理することができる。すなわち油脂に脱ガム・脱酸・脱色の処理を常法に従って行うことにより、精製油脂を製造することができる。なお、通常の精製工程に含まれる脱ガム工程は、破砕抽出工程や必要に応じて追加される水洗浄工程等の前工程でガム質濃度が大幅に削減されているため省略できる場合もある。
【００１４】
以下、本発明にかかる製造方法の一実施形態について説明する。
〈油脂の製造〉
本発明において製造される油脂は、オーランチオキトリウム属に属する微細藻類を培養して得られる。培養した当該微細藻類中に含まれる油脂を抽出分離することにより当該油脂を製造することができる。
〈微細藻類〉
本発明におけるオーランチオキトリウム属に属する微細藻類としては、本発明で目的とするＤＨＡ含有油脂の製造に利用できるものであれば特に限定なく利用できる。例えば、かかる微細藻類が生息する自然環境から常法により採取した株や、公知の株から本発明で目的とするＤＨＡ含有油脂の製造に利用可能な株を選択して用いることができる。かかる微細藻類の株としては、特許第2764572号明細書に記載のSR21株（受託番号FERM BP-5034）、特許第5942197号明細書に記載のオーランチオキトリウム・tsukuba-3株（受託番号FERM BP-11442）等を含む従属栄養性藻類のオーランチオキトリウム属に属する微細藻類の株を挙げることができる。
〈培養条件〉
本発明のオーランチオキトリウム属に属する微細藻類の増殖・培養は、当該微細藻類株を水道水および人工海水で適切に調整した培養液に播種し、常法に従って培養することにより行われる。培養液としては任意の公知のものが使用できる。例えば、炭素源はグルコース、フルクトースなど、窒素源は酵母エキストラクト、コーンスチープリカ、グルタミン酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなど、また前記培養液は適宜ビタミン類等を含むことができ、培養液中の水道水または海水の割合は約５０質量％である。成分調整がなされた培養液は適宜滅菌処理がなされ、冷却後、前培養された当該微細藻類株が投入され、１０〜３０℃の適温で振とう培養又は通気撹拌培養が行われる。
培養液の塩分濃度は、塩化物イオン濃度として６．５ｇ／Ｌ〜１４ｇ／Ｌの範囲から選択することが好ましい。
【００１５】
〈破砕抽出、分離、水洗浄、溶媒分離回収、残留溶媒除去、精製、藻残渣と排水処理〉
培養された微細藻体を含む培養液を有機溶媒と混合し、破砕と抽出を同時に実施し、油脂を抽出溶媒相として分離し水洗浄し、溶媒を回収リサイクルし、分離された油脂を常法により精製して製品とすると共に、藻残渣と排水を分離する処理は、図１又は図２の処理方法の構成にて実施することができる。
培養された微細藻体を含む培養液と、油脂抽出用の有機溶媒の混合比（体積比）は、目的とする油脂抽出効果を得ることができるように設定すればよく、特に限定されないが、例えば、（油脂抽出用の有機溶媒）／（培養された微細藻体を含む培養液）＝０．１〜１．０の範囲から選択することができる。
図１は、本発明の一実施形態に係るオーランチオキトリウム属に属する微細藻類が産生するＤＨＡ、スクアレン等の有用成分を含む油脂の製造方法の構成を工程フロー図で示す説明図である。
図１に示す工程フローを有する製造方法では、まず、培養槽１からのオーランチオキトリウム属に属する微細藻類の培養藻体を含む培養液に、油脂抽出用の有機溶媒が添加され、破砕抽出工程２に供給される。
製造工程の初動時には、油脂抽出用の有機溶媒の供給部８から有機溶媒を供給して培養液に添加する。後述する有機溶媒のリサイクルが可能な状態においては、溶媒分離回収工程５及び６から返送された有機溶媒を油脂抽出用として培養液に添加する。供給部８からの有機溶媒と溶媒分離回収工程５及び６から返送された有機溶媒とを混合して用いてもよい。
破砕抽出工程２では、培養藻体の細胞膜の破砕と培養藻体内に産生されたＤＨＡ含有油脂の有機溶媒での抽出が行われる。
更に、破砕抽出工程２では、水相と、抽出されたＤＨＡ含有油脂を含む抽出溶媒相の二相系の液体が形成され、この二相系の液体に凝集剤が添加される。凝集剤の添加により、二相系の液体に含まれる細胞残渣などの微細な固形分が凝集してフロック化されて沈降し、二相系の液体から水相、抽出溶媒相及び固形分相の三相が形成される。
この三相からそれぞれの相を、三相分離式遠心分離機などの分離装置を用いて分離工程３において分離し、水相は排水として、固形分相は藻残渣分として系外へそれぞれ排出する。三相から分離した抽出溶媒相には、洗浄用の水が添加され、水洗浄工程４において水洗浄処理が行われる。水洗浄処理後に得られる水相と抽出溶媒相を分離し、水相は、凝集剤の添加後に形成された三相から分離した水相に合流させて排水として処理される。
水洗浄処理後に得られる抽出溶媒相から有機溶媒を分離回収工程５において分離回収し、回収された有機溶媒は培養液への添加位置に返送されて油脂抽出用として再利用され、油脂抽出用の有機溶媒のリサイクルが可能となる。
溶媒分離回収工程５により油脂を得ることができる。この油脂に含まれる有機溶媒の残留濃度を残留溶媒除去工程６で更に低減し、後段の精製工程７によって油脂を常法により精製する。
溶媒分離回収工程５には先に述べた蒸発または蒸留操作における一段階目の操作条件を、残留溶媒除去工程６には先に述べた蒸発または蒸留操作における二段階目の操作条件を好ましく用いることができる。
精製工程７には、公知の精製方法から目的とする油脂成分を目的とする純度で得るための精製方法を適宜選択して用いることができる。
【００１６】
図２は、本発明の他の実施形態に係るオーランチオキトリウム属に属する微細藻類が産生するＤＨＡ、スクアレン等の有用成分を含む油脂の製造方法の構成を工程フロー図で示す説明図である。
図２に示す製造工程は、凝集剤での処理の導入位置を変えた以外は図１に示す製造工程と同じ構成を有する。図２の製造工程においては、凝集剤による藻残渣成分の分離は、分離工程３から得られた水相（抽出残水相）に対して行われる。凝集剤の添加により得られる藻残渣を含むフロックは藻残渣脱水工程９において脱水処理され、脱水により生じる水分は水洗浄工程４からの排水経路に合流させて系外に排出される。また、脱水された藻残渣分は藻残渣として回収される。
図１及び２に示す製造工程は、バッチ方式、半連続方式または連続方式によって実施することができる。
なお、油脂抽出用の有機溶媒等の各種処理に用いる有機溶媒がそれを用いる処理環境下（例えば処理温度等）において揮発性である場合には、有機溶媒を用いた処理は密閉可能な系内で密閉状態にして行うことが好ましい。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。なお、以下の実施例における各測定値は常法により求めた値である。
（実施例）
１リットル当りグルコース２０ｇ、ポリペプトン１０ｇ、酵母エキストラクト５ｇを含む水溶液を１３０℃で１５分間高温滅菌した後２５℃に冷却し、これとフィルター除菌された海水および水道水を混合して水分中の海水割合約５０質量％に調整した培養液に、少なくともＤＨＡを含む油脂を産生する株として選択したオーランチオキトリウム属に属する微細藻類株の前培養液を投入し、２５℃で４日間、滅菌されたグルコース及びグルタミン酸ナトリウム水溶液を適宜添加すると共に、除菌した空気を通気し撹拌培養した。
なお、少なくともＤＨＡを含む油脂の産生能を有する株としては、SR21株（受託番号FERM BP-5034）、オーランチオキトリウム・tsukuba-3株（受託番号FERM BP-11442）等を含む従属栄養性藻類のオーランチオキトリウム属に属する微細藻類の株を同様に用いることができる。
培養終了後に収穫された培養液は１リットル当り約６０ｇの藻体濃度（乾燥質量）で、微細藻体のサイズは４〜３０μｍ、頻度平均粒径９．９μｍ、体積平均粒径１０．４μｍであった。収穫培養液はそのまま有機溶媒ｎ−ヘキサンと、有機溶媒／収穫培養液＝１．０の体積比で混合し圧力式ホモジナイザーに供給され、収穫培養液に含まれる微細藻体はｎ−ヘキサンの存在下で破砕された。この破砕処理によって、微細藻体の細胞膜も破砕され、細胞膜内に産生された少なくともＤＨＡを含む油脂が放出されｎ−ヘキサンにより抽出された。
別途実施した破砕後の状況について、レーザー回折・散乱式粒子径測定装置および光学顕微鏡で観測した結果、微細藻体の破砕により生成する藻残渣および油脂のサイズは０．３〜３０μｍ、頻度平均粒径１．５〜２．２μｍ、体積平均粒径２．５〜４μｍ、油脂分平均粒径１μｍ、藻残渣（細胞片）平均粒子径５〜８μｍであり、充分な藻体（細胞）の破砕および溶媒と油脂との混合接触がなされ、効率的な溶媒抽出が達成できることが確認できた。
図３（Ａ）〜（Ｃ）及び図４（Ｄ）〜（Ｆ）、並びに表１は圧力式ホモジナイザーの各処理圧力下における細胞破砕前後の粒度分布、頻度および体積平均粒径を示したものである。図５及び表２は破砕抽出後のｎ−ヘキサンによる油脂抽出結果を示したものである。圧力式ホモジナイザーの処理圧力として２０〜６０ＭＰａＧで良好な抽出結果が得られた。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
【表２】
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【００２０】
また、収穫した培養液サンプルを超音波破砕後、クロロホルム／メタノールで含有油脂の全量を抽出した結果は１５．９ｇ／Ｌ（表２）であり、圧力式ホモジナイザーの処理圧力４０ＭＰａＧのｎ−ヘキサンによる抽出油脂量１５．０ｇ／Ｌ（表２）との差はガム質量と推定された。
即ち、微細藻体で産生されたガム質の大部分が、藻体（細胞）が破砕されたことによって培養液の水中に溶け込み、油脂中のガム質含有量は低減したことを示している。
破砕抽出後の培養液は静置すると軽液相（抽出溶媒相）と重液相（水相）の二相に分離する二相系の液体となったが、本実施例の場合、抽出後の藻残渣は両相に均一に分散しており沈降しなかった。そこで、破砕抽出後の二相系の液体全体に食品添加物用水溶性キトサン凝集剤（商品名：フジクリーンＫＴ−２５０、富士エンジニアリング株式会社）を添加し、藻残渣を凝集・フロック化し、三相分離式遠心分離機にて抽出溶媒相（軽液相）、排水相（重液相）、藻残渣（脱水固形分相）に分離した。凝集剤として一般用のカチオン変性ポリアクリルアミドのキースロックＣ−３２９８（商品名、協和産業株式会社）、又はポリシリカ鉄のＰＳＩ−０２５（商品名、水道機工株式会社等）を使用した場合も同様に藻残渣を濃縮脱水できた。
なお、本実施例の場合、破砕抽出により得られた二相系の液体全体に凝集剤を添加せずに遠心分離した場合は、藻残渣等の固形分は軽液相には分散せず、重液相（抽出残水相）に分散された。そこで遠心分離機で二相分離した抽出残水相に凝集剤フジクリーンＫＴ−２５０を添加し、抽出残水相中の藻残渣を凝集・フロック化し回収した。凝集剤として一般用のキースロックＣ−３２９８、又はＰＳＩ−０２５を使用した場合も同様に藻残渣を回収できた。図２は、破砕抽出により得られた二相系液体全体を遠心分離した場合の抽出残水相に凝集剤を添加し、藻残渣を濃縮脱水し回収する方法の構成を示したものである。
分離された抽出溶媒相は溶解及び同伴する水分中の塩化物イオン濃度を２００ｍｇ／Ｌ以下にし、残存するガム質の濃度を更に削減するため、塩化物イオン濃度約１５０ｍｇ／Ｌの水にて洗浄した。
抽出溶媒相に溶解および同伴水分中には塩化物イオン濃度が約８ｇ／Ｌ、抽出された油脂中にガム質が約３ｇ／Ｌ含まれているため、有機溶媒量の２３質量％の量の塩化物イオン濃度約１５０ｍｇ／Ｌの水を注入しインラインミキサーにて混合・洗浄した後、静置沈降分離にて水相を抽出溶媒相から分離除去した。洗浄後の抽出溶媒相中の水分の塩化物イオン濃度は１８０ｍｇ／Ｌ以下、油脂中のガム質濃度は４００ｍｇ／Ｌ以下を確認した。
塩化物イオン濃度を１８０ｍｇ／Ｌ以下としガム質濃度を削減した抽出溶媒相は、一段階目の蒸留分離操作で大気圧下、ｎ−ヘキサン凝縮温度７０℃の条件で分離回収された油脂中の残留ｎ−ヘキサン濃度を９質量％とし、抽出溶媒相中の有機溶媒ｎ−ヘキサンの９９．８％を分離回収した。二段階目では０．１２ｋＰａＡの高真空下で蒸留し、溶媒ｎ−ヘキサンを実質的に含有しない油脂を得た。
溶媒を除去した油脂に対して更に脱酸・脱色操作を行い、精製油脂を製造した。
【符号の説明】
【００２１】
１  培養槽
２  破砕抽出
３  分離
４  水洗浄
５  溶媒分離回収
６  残留溶媒除去
７  精製
８  有機溶媒供給部
９  藻残渣脱水
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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