(57)【要約】【課題】幹細胞から誘導された分化細胞の調製時及び移植後の生体内において、分化細胞に影響を与えることなく未分化幹細胞のみを選択的に除去する技術を提供する。【解決手段】以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む、未分化幹細胞除去剤：（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞；（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物；（ｃ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞；及び（ｄ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む、未分化幹細胞除去剤：
（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞；及び
（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物。
【請求項２】
前記（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞が、グリピカン３発現細胞に特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項１に記載の未分化幹細胞除去剤。
【請求項３】
前記（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物が、グリピカン３タンパク質に対する抗体である、請求項１に記載の未分化幹細胞除去剤。
【請求項４】
以下の（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む、未分化幹細胞除去剤：
（ｃ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞；及び
（ｄ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物。
【請求項５】
前記（ｄ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物が、グリピカン３タンパク質若しくはその部分ペプチド、又はそれらの塩である、請求項４に記載の未分化幹細胞除去剤。
【請求項６】
前記（ｄ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物が、グリピカン３タンパク質又はその部分ペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを含むベクターである、請求項４に記載の未分化幹細胞除去剤。
【請求項７】
前記（ｃ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞が、グリピカン３タンパク質の部分ペプチドを細胞表面に提示する樹状細胞である、請求項４に記載の未分化幹細胞除去剤。
【請求項８】
前記未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の未分化幹細胞除去剤。
【請求項９】
未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を、請求項１〜３のいずれか一項に記載の未分化幹細胞除去剤の存在下で培養することを含む、未分化幹細胞除去方法。
【請求項１０】
前記未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項９に記載の未分化幹細胞除去方法。
【請求項１１】
前記分化細胞が心筋細胞である、請求項９又は１０に記載の未分化幹細胞除去方法。
【請求項１２】
以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含む、移植用細胞の製造方法：
（ｉ）未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程；及び
（ｉｉ）前記工程（ｉ）により得られた細胞混合物を、請求項１〜３のいずれか一項に記載の未分化幹細胞除去剤の存在下で培養する工程。
【請求項１３】
前記未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記分化細胞が心筋細胞である、請求項１２又は１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
未分化幹細胞から分化された分化細胞を移植された対象において、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の未分化幹細胞除去剤を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
前記未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記未分化幹細胞から誘導された分化細胞が心筋細胞である、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記医薬組成物が、ＧＰＣ３タンパク質又はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むセンダイウイルスベクターを含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
経鼻的に投与される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未分化幹細胞除去剤及び未分化幹細胞除去方法に関する。また、前記未分化幹細胞除去剤を用いた移植用細胞の製造方法及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性を有する幹細胞についての研究が進められている。これらの細胞は多能性を有することから、分化・誘導して所望の系譜に分化した細胞を作製し、移植医療において使用することが可能になりつつある。
【０００３】
胚性幹細胞や人工多能性幹細胞の分化・誘導は、通常、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、全ての幹細胞に対して目的とする系譜の分化を惹起することは難しく、分化・誘導操作後も一部に未分化幹細胞が残存することがある。このような未分化幹細胞は、増殖活性を有しかつ多種類の細胞に分化できることから、生体内に移植された場合、奇形腫を形成する恐れがある（例えば、非特許文献１）。このような理由から、幹細胞を分化・誘導して作製した細胞集団を、そのまま生体に移植し治療に用いることは困難である。
【０００４】
したがって、幹細胞から分化・誘導した細胞の生体への移植を安全に実行し、理想的な治療効果を得るために、未分化幹細胞を除去することが必要である。また、未分化幹細胞が残存したまま移植されてしまった場合には、生体内における未分化幹細胞の増殖を抑制する必要がある。
【０００５】
幹細胞から分化・誘導した細胞集団において、未分化幹細胞を除去する方法としては、これまでに、特定組成の培地を用いて細胞集団を培養することにより、未分化幹細胞を選択的に除去する方法等が提案されている（例えば、特許文献１〜４、非特許文献２〜４）。
【０００６】
一方、グリピカン３は、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧｓ）ファミリーに属するＧＰＩアンカータンパク質である。グリピカン３は、癌、特に肝臓癌において過剰発現することが知られており、癌の細胞増殖やアポトーシスに関与するとされている。グリピカン３に関しては、これまでに、癌治療用途の抗体（例えば、特許文献５）やペプチドワクチン（特許文献６、７）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００７／０８８８７４号
【特許文献２】国際公開第２００９／０１７２５４号
【特許文献３】国際公開第２０１０／１１４１３６号
【特許文献４】国際公開第２０１６／０１０１６５号
【特許文献５】国際公開第２００６／００６６９３号
【特許文献６】国際公開第２００４／０１８６６７号
【特許文献７】国際公開第２００７／０１８１９９号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Miura et al., (2009) Nature Biotech., 8, 743-745.
【非特許文献２】Ben-David,et al., (2013) Cell Stem Cell, 12, 167-179.
【非特許文献３】Wang,et al., (2009) Science, 325, 435-439.
【非特許文献４】Shiraki,et al., (2014) Cell Metabolism, 19, 780-794.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１〜４及び非特許文献２〜４に記載されるような特定組成の培地により未分化幹細胞を選択的に除去する方法では、アミノ酸等の特定の培地成分を除去した培地を使用するため、分化細胞にも影響を与える恐れがある。また、移植後の生体内において、移植細胞に混在する未分化幹細胞を除去する方法については報告がない。
【００１０】
そこで、本発明は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞の調製時及び移植後の生体内において、分化細胞に影響を与えることなく未分化幹細胞のみを選択的に除去する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、グリピカン３が未分化幹細胞のみで発現し、分化細胞では発現していないことを見出した。そして、グリピカン３を標的とすることにより、未分化幹細胞のみを選択的に除去できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む、未分化幹細胞除去剤：
（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞；及び
（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物。
［２］前記（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害する細胞が、グリピカン３発現細胞に特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞である、［１］に記載の未分化幹細胞除去剤。
［３］前記（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害する化合物が、グリピカン３タンパク質に対する抗体である、［１］に記載の未分化幹細胞除去剤。
［４］以下の（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む、未分化幹細胞除去剤：
（ｃ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞；及び
（ｄ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物。
［５］前記（ｄ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物が、グリピカン３タンパク質若しくはその部分ペプチド、又はそれらの塩である、［４］に記載の未分化幹細胞除去剤。
［６］前記（ｄ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物が、グリピカン３タンパク質又はその部分ペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを含むベクターである、［４］に記載の未分化幹細胞除去剤。
［７］前記（ｃ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞が、グリピカン３タンパク質の部分ペプチドを細胞表面に提示する樹状細胞である、［４］に記載の未分化幹細胞除去剤。
［８］未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、［１］〜［７］のいずれか一つに記載の未分化幹細胞除去剤。
［９］未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を、［１］〜［３］のいずれか一つに記載の未分化幹細胞除去剤の存在下で培養することを含む、未分化幹細胞除去方法。
［１０］前記未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、［９］に記載の未分化幹細胞除去方法。
［１１］前記分化細胞が心筋細胞である、［９］又は［１０］に記載の未分化幹細胞除去方法。
［１２］以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含む、移植用細胞の製造方法：
（ａ）未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程；及び
（ｂ）前記工程（ｂ）により得られた細胞混合物を、［１］〜［３］のいずれか一つに記載の未分化幹細胞除去剤の存在下で培養する工程。
［１３］前記未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、［１２］に記載の製造方法。
［１４］前記分化細胞が心筋細胞である、［１２］又は［１３］に記載の製造方法。
［１５］未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象において、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、［１］〜［８］のいずれか一つに記載の未分化幹細胞除去剤を含む、医薬組成物。
［１６］前記未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、［１５］に記載の医薬組成物。
［１７］前記未分化幹細胞から誘導された分化細胞が心筋細胞である、［１５］又は［１６］に記載の医薬組成物。
［１８］前記医薬組成物が、ＧＰＣ３タンパク質又はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むセンダイウイルスベクターを含む、［１５］〜［１７］のいずれか一つに記載の医薬組成物。
［１９］経鼻的に投与される、［１８］に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、未分化幹細胞から誘導された分化細胞の調製時及び移植後の生体内において、分化細胞に影響を与えることなく未分化幹細胞のみを選択的に除去する技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】多能性幹細胞（ＥＳＣ−１，２、ｉＰＳＣ１，２）、多能性幹細胞由来心筋細胞（ｉＰＳＣ１−ＣＭ）及び正常心臓（Ｈｅａｒｔ，Ｈｅａｒｔ−１）におけるグリピカン３（ＧＰＣ３）の発現解析の結果を示す。（ａ）はマイクロアレイによるＧＰＣ３の発現解析結果であり、（ｂ）はＲＮＡシークエンス解析によるＧＰＣ３の発現解析結果である。
【図２】多能性幹細胞（ｉＰＳＣ１〜３）、多能性幹細胞由来心筋細胞（ｉＰＳＣ１−ＣＭ）及び正常心臓（Ｈｅａｒｔ−１，２）におけるＧＰＣ３の発現解析結果を示す。（ａ）は定量的ＰＣＲによる発現解析結果であり、（ｂ）はＦＡＣＳによる発現解析結果である。
【図３】多能性幹細胞及び多能性幹細胞由来心筋細胞における蛍光免疫染色画像を示す。（ａ）は多能性幹細胞であり、（ｂ）は多能性幹細胞由来心筋細胞である。
【図４】ＧＰＣ３特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）と、ｉＰＳＣ１又はｉＰＳＣ１から分化した心筋細胞（ｉＰＳＣ１−ＣＭ）とを共培養した場合における、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。＊は、ｔ検定において、ｐ＜０．０５であることを示す（以下の図面でも同じである）。
【図５】ｉＰＳＣ１又はｉＰＳＣ１−ＣＭをＧＰＣ３特異的ＣＴＬと４８時間共培養した場合における、生細胞の蛍光観察の結果を示す。（ａ）はｉＰＳＣ１による結果を示し、（ｂ）はｉＰＳＣ１−ＣＭによる結果を示す。図中、「不活化ＣＴＬ」は、熱処理により不活化したＧＰＣ３特異的ＣＴＬである。
【図６】ＧＰＣ３に対するｓｉＲＮＡ（ＧＰＣ３  ｓｉＲＮＡ）によりＧＰＣ３発現をノックダウンしたｉＰＳＣ１において、ノックダウン効果の確認結果を示す。（ａ）は、定量的ＰＣＲによる確認結果であり、（ｂ）はＦＡＣＳによる確認結果である。図中、「ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｉＲＮＡ」は、ＱＩＡＧＥＮ社製のＡｌｌＳｔａｒｓ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡである。
【図７】ＧＰＣ３に対するｓｉＲＮＡによりＧＰＣ３発現をノックダウンしたｉＰＳＣ１を、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬと共培養した場合における、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。
【図８】ｉＰＳＣ１及びｉＰＳＣ１−ＣＭを混合した細胞集団に、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬを添加して４８時間共培養した場合における、細胞集団中でのｉＰＳＣ１の存在比を解析した結果を示す。（ａ）はＦＡＣＳ解析の結果であり、（ｂ）は（ａ）の結果を数値化して示した棒グラフである。
【図９】ｉＰＳＣ１及びｉＰＳＣ１−ＣＭを混合した細胞集団に、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬを添加して４８時間共培養した場合における、蛍光免疫染色画像を示す。（ａ）はＧＰＣ３特異的ＣＴＬを添加しなかった場合であり、（ｂ）は添加した場合である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
≪定義等≫
本明細書において、「未分化幹細胞」は、分化多能性を有する多能性幹細胞を包含する概念として用いられ、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｉＰＳ細胞）、及びこれらの幹細胞から誘導された分化多能性を有する細胞、並びに各種体性幹細胞を含み得る。「未分化幹細胞」は、分化多能性を有する細胞であれば特に限定されず、上記例示したＥＳ細胞やｉＰＳ細胞と同等の性質を有する未知の細胞も包含する。
【００１６】
細胞が未分化幹細胞であることは、未分化幹細胞に特異的な性質の有無や、未分化幹細胞に特異的な各種マーカーの発現等から判断することができる。例えば、未分化幹細胞に特異的な性質としては、自己複製能を有し、未分化幹細胞とは異なる性質を有する別種の細胞へと分化可能である性質が挙げられる。また、テラトーマ形成能やキメラマウス形成能等も未分化幹細胞に特異的な性質として挙げられる。
【００１７】
未分化幹細胞に特異的な各種マーカー（以下、「未分化幹細胞マーカー」という。）とは、未分化幹細胞に特異的に発現する因子であり、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＳＳＥＡ−５、ＧＤＦ３、ＫＬＦ４、ＣＬＤＮ６等を例示することができる。これら未分化幹細胞マーカーの少なくとも１つの発現が観察された場合には、当該細胞を未分化幹細胞と判断することができる。未分化幹細胞マーカーは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。一実施形態として、Ｏｃｔ３／４を発現する細胞を未分化幹細胞と判断してもよい。なお、細胞における未分化幹細胞マーカーの発現は、ＲＴ−ＰＣＲやマイクロアレイ等の公知の方法を用いて確認することができる。
【００１８】
未分化幹細胞は、哺乳類の未分化幹細胞であってもよく、げっ歯類の未分化幹細胞であってもよく、霊長類の未分化幹細胞であってもよく、ヒトの未分化幹細胞であってもよい。一例として、ヒト由来の未分化幹細胞を挙げることができ、より具体な例としては、ヒトｉＰＳ細胞及びヒトＥＳ細胞等を挙げることができる。
【００１９】
本明細書において、「分化細胞」とは、上記「未分化幹細胞」の性質を有しない細胞のことを指す。分化細胞は、未分化幹細胞から誘導・分化された細胞であり得るが、分化多能性を有しない。分化細胞は、例えば、ＥＳ細胞から分化した細胞、ｉＰＳ細胞から分化した細胞であってよい。分化細胞の例としては、心筋細胞、筋細胞、繊維芽細胞、神経細胞、リンパ球等の免疫細胞、血管細胞、網膜色素上皮細胞等の眼細胞、巨核球や赤血球等の血液細胞、その他各組織細胞、及びそれらの前駆細胞等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２０】
グリピカン３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ  ３：ＧＰＣ３）タンパク質は、ＨＳＰＧｓファミリーに属するＧＰＩアンカータンパク質であり、細胞分裂と細胞増殖を制御する機能を有すると考えられている。ＧＰＣ３タンパク質は、ＣＤ２６に結合してＣＤ２６のジペプチジルペプチダーゼ活性を阻害する。また、ＧＰＣ３のノックアウトマウスは巨大化することが知られており、ヒトではＧＰＣ３の変異により巨人症を呈する。肝臓組織では胎児期においてＧＰＣ３を発現するが、出生後発現しなくなる。肝細胞癌を発症すると、肝癌細胞は、ＧＰＣ３を再発現する。また、ＧＰＣ３は、癌において、細胞増殖やアポトーシスに関与すると考えられている。本明細書において、「グリピカン３タンパク質」又は「ＧＰＣ３タンパク質」とは、上記のような性質を有するタンパク質を指す。
【００２１】
ＧＰＣ３タンパク質のアミノ酸配列の例として、ヒトＧＰＣ３タンパク質のアミノ酸配列の例を配列番号２、４、６及び８に示す。これらのアミノ酸配列からなるＧＰＣ３タンパク質は、ヒトＧＰＣ３タンパク質のバリアントであり、いずれも上記のようなＧＰＣ３タンパク質の特徴を有する。ただし、ＧＰＣ３タンパク質は、これらのアミノ酸配列を有するものに限定されず、これらの変異体及び種間相同体を包含する。
【００２２】
前記ヒトＧＰＣ３タンパク質の変異体の例としては、例えば、配列番号２、４、６又は８に記載のアミノ酸配列と比較して、１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、又は１〜１０個程度の変異を有し、かつ上記したＧＰＣ３タンパク質の機能を保持するタンパク質等が挙げられる。なお、変異は、アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び付加のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい。あるいは、前記ヒトＧＰＣ３タンパク質の変異体の他の例としては、配列番号２、４、６又は８に記載のアミノ酸配列と、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列からなり、かつ上記したＧＰＣ３タンパク質の機能を保持するタンパク質等が挙げられる。なお、アミノ酸配列同士の配列同一性は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。
【００２３】
なお、ヒトＧＰＣ３のアミノ酸配列としては、配列番号２、４、６又は８に記載されるアミノ酸配列のほか、ＧｅｎＢａｎｋ等の配列データベースに、ヒトＧＰＣ３タンパク質のアミノ酸配列として登録されているアミノ酸配列も挙げることができる。そのようなアミノ酸配列からなるタンパク質もまた、ヒトＧＰＣ３タンパク質に包含される。また、そのようなヒトＧＰＣ３タンパク質の変異体もまた、ヒトＧＰＣ３タンパク質に包含される。
【００２４】
また、前記ヒトＧＰＣ３タンパク質の種間相同体の例としては、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サル等のヒト以外の哺乳動物が有するＧＰＣ３タンパク質が挙げられる。これらのＧＰＣ３タンパク質のアミノ酸配列としては、ＧｅｎＢａｎｋ等の配列データベースに登録されているもの等を挙げることができる。そのようなアミノ酸配列からなるタンパク質もまた、ＧＰＣタンパク質に包含される。また、そのようなＧＰＣ３タンパク質の変異体もまた、ＧＰＣ３タンパク質に包含される。
【００２５】
本明細書において、「グリピカン３遺伝子」又は「ＧＰＣ３遺伝子」とは、上記のようなＧＰＣ３タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を意味する。ＧＰＣ３遺伝子の塩基配列の例として、上記の配列番号２、４、６及び８に記載のアミノ酸配列をそれぞれコードするポリヌクレオチドの塩基配列の例を、配列番号１、３、５、及び７（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＭ＿００１１６４６１７；ＮＭ＿００１１６４６１８．１；ＮＭ＿００１１６４６１９．１；ＮＭ＿００４４８４．３）に示す。ただし、ＧＰＣ３遺伝子の塩基配列は、これらの配列に限定されず、前記のようなＧＰＣ３タンパク質をコードする塩基配列であれば、どのような塩基配列であってもよい。
【００２６】
本明細書において、「グリピカン３発現細胞」又は「ＧＰＣ３発現細胞」とは、上記のようなＧＰＣ３遺伝子を有し、かつＧＰＣ３タンパク質を発現している細胞を意味する。ＧＰＣ３発現細胞が有するＧＰＣ３遺伝子は、内因性のものであっても外因来のものであってもよいが、内因性のものであることが好ましい。
【００２７】
≪未分化幹細胞除去剤≫
１実施形態において、本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む、未分化幹細胞除去剤を提供する：
（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞；及び
（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物。
【００２８】
また、１実施形態において、本発明は、以下の（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む、未分化幹細胞除去剤を提供する：
（ｃ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞；及び
（ｄ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物。
【００２９】
上記のように、ＧＰＣ３は、癌、特に肝臓癌で発現することが知られていたが、本発明者らは、未分化幹細胞においてもＧＰＣ３が発現していることを見出した。一方、未分化幹細胞から誘導された分化細胞は、ＧＰＣ３を発現しない。そのため、未分化幹細胞から分化・誘導した細胞集団に対して、ＧＰＣ３を標的とした処理を行うことにより、未分化幹細胞のみを選択的に除去することができる。また、生体内の細胞は、通常、分化細胞であり、ＧＰＣ３を発現していない。そのため、未分化幹細胞が残存する細胞集団が生体内に移植された場合であっても、当該生体に対してＧＰＣ３を標的とした処理を行うことにより、生体内の未分化幹細胞を選択的に除去することができる。
【００３０】
ＧＰＣ３を標的とした処理を行うために、本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞；（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物；（ｃ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞；及び（ｄ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物、からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む。（ａ）〜（ｄ）の成分は、単独で使用してもよく、これらを組合せて使用してもよい。また、本実施形態の未分化細胞除去剤は、（ａ）〜（ｄ）の成分のいずれか、又はこれらの組合せと、他の成分とを含むものであってもよい。
以下、（ａ）〜（ｄ）の各成分について、説明する。
【００３１】
＜（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞＞
（ａ）成分は、グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞である。本明細書において、「グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る」とは、ＧＰＣ３発現細胞の増殖を阻害するが、ＧＰＣ３非発現細胞の増殖は阻害しない作用を意味する。また、「グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞」とは、そのような作用を有する細胞を意味する。
【００３２】
ＧＰＣ３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞においては、当該細胞がＧＰＣ３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る限り、その増殖阻害機構は特に限定されない。細胞増殖阻害の典型的な例としては、細胞死の誘導が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３３】
ＧＰＣ３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞は、ＧＰＣ３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る限り、細胞の種類は特に限定されない。ＧＰＣ３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞の例としては、例えば、ＧＰＣ３発現細胞に対して細胞傷害活性を示す免疫細胞等が挙げられる。そのような免疫細胞の好ましい例としては、ＧＰＣ３発現細胞に特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を挙げることができる。
【００３４】
ＧＰＣ３発現細胞に特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬ（以下、「ＧＰＣ３特異的ＣＴＬ」という。）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介してＧＰＣ３発現細胞を認識し、ＧＰＣ３発現細胞に特異的な細胞傷害活性を示す。ここで、「ＧＰＣ３に特異的な細胞傷害活性を示す」とは、ＧＰＣ３発現細胞に対して細胞傷害活性を示すが、ＧＰＣ３非発現細胞に対しては細胞傷害活性を示さないことを意味する。
【００３５】
ＧＰＣ３発現細胞において、ＧＰＣ３遺伝子から転写・翻訳されて生じたＧＰＣ３タンパク質の一部は、ユビキチン化されてプロテアソームによるプロセシングを受けて断片化される。断片化されたＧＰＣ３タンパク質由来ペプチドは、小胞体に取り込まれてＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉとの複合体となり、細胞表面に移行して細胞表面上で提示される。ＧＰＣ３発現細胞に特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬは、自身のＴＣＲを介して、前記細胞表面に提示されたＧＰＣ３タンパク質由来ペプチドと主要組織適合性複合体（Ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＨＣ）  Ｃｌａｓｓ  Ｉとの複合体に結合することができる。当該複合体に結合したＣＴＬは、ＧＰＣ３発現細胞に対してＩＦＮ−γやパーフォリン等の細胞傷害性サイトカインを放出し、ＧＰＣ３発現細胞を傷害する。このようなＣＴＬによる細胞傷害作用により、ＧＰＣ３発現細胞の細胞死が導かれる。したがって、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬは、ＧＰＣ３タンパク質由来ペプチドとＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉとの複合体に対する結合能を有するＣＴＬであるということもできる。
【００３６】
ＧＰＣ３特異的ＣＴＬは、例えば、特許文献６又は７に記載されるような方法により得ることができる。具体的には、ＧＰＣ３由来のＣＴＬ誘導性ペプチドの存在下で、樹状細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞とを共培養することにより、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬを得ることができる。また、樹状細胞をあらかじめＧＰＣ由来のＣＴＬ誘導性ペプチドの存在下で培養した後、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を加えて共培養するようにしてもよい。ここで、「ＧＰＣ３由来のＣＴＬ誘導性ペプチド」とは、ＧＰＣ３タンパク質の部分ペプチドを含み、かつＣＴＬ誘導活性を有するペプチドを意味する。また、「ＣＴＬ誘導活性を有するペプチド」とは、ＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉに結合して複合体を形成することができ、かつ当該複合体が樹状細胞の細胞表面に提示された場合に、当該樹状細胞と共培養されるＣＤ８陽性Ｔ細胞をＣＴＬに成熟させることができるペプチドを意味する。
【００３７】
なお、ＭＨＣは、生物種毎に異なっており、ヒトのＭＨＣはヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＨＬＡ）と呼ばれる。ＭＨＣはＣｌａｓｓ  ＩとＣｌａｓｓ  ＩＩとに分類されるが、抗原ペプチドと結合してＣＴＬ誘導に関与するのはＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉである。ＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉにも複数のサブタイプが存在し、サブタイプ毎に結合できるペプチドが異なっている。例えば、特許文献６に記載されるＧＰＣ由来のＣＴＬ誘導性ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４（より具体的にはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２）に結合するペプチドであり、ＨＬＡ−Ａ２４陽性のＧＰＣ３発現細胞に特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬを誘導する。また、特許文献７に記載されるＧＰＣ３由来のＣＴＬ誘導性ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２（より具体的にはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６、又はＨＬＡ−Ａ＊０２：０７）に結合するペプチドであり、ＨＬＡ−Ａ２陽性のＧＰＣ３発現細胞に特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬを誘導する。したがって、未分化幹細胞がＨＬＡ−Ａ２４陽性の細胞である場合には、例えば、特許文献６に記載のペプチドを用いて誘導されたＧＰＣ３特異的ＣＴＬを、（ａ）成分の細胞として使用することができる。また、未分化幹細胞がＨＬＡ−Ａ２陽性の細胞である場合には、例えば、特許文献７に記載のペプチドを用いて誘導されたＧＰＣ３特異的ＣＴＬを、（ａ）成分の細胞として使用することができる。なお、本明細書において、「ＨＬＡ−Ａ２陽性のＧＰＣ３発現細胞に特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬ」及び「ＨＬＡ−Ａ２４陽性のＧＰＣ３発現細胞に特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬ」は、それぞれ「ＨＬＡ−Ａ２拘束性のＧＰＣ３特異的ＣＴＬ」及び「ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＧＰＣ３特異的ＣＴＬ」とも表記される。なお、特許文献６及び７に記載のＧＰＣ３由来のＣＴＬ誘導性ペプチドのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９〜２０及び配列番号２１〜２３に示す。ただし、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬの誘導に使用されるＧＰＣ３由来のＣＴＬ誘導性ペプチドは、これらに限定されず、未分化幹細胞が有するＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉの種類毎に、適宜適切なペプチドを使用することができる。
【００３８】
ＧＰＣ３由来のＣＴＬ誘導性ペプチドは、ＧＰＣ３タンパク質の断片ペプチドであり、通常８〜１１のアミノ酸残基で構成される。しかしながら、１２以上のアミノ酸長を有するペプチドであっても、樹状細胞の細胞内に取り込まれてプロテアソームによるプロセシングを受け、８〜１１程度のアミノ酸長のペプチドとなって、ＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉと複合体を形成し得る。そのため、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬの誘導に使用するＣＴＬ誘導性ペプチドは、８〜１１のアミノ酸長を有するものに限られず、８〜１００程度、８〜６０程度、８〜５０程度、又は８〜３０程度のアミノ酸長を有する、ＧＰＣ３タンパク質の断片ペプチドであることもできる。また、そのようなＧＰＣ３タンパク質の断片ペプチドに、変異を含むものであってもよい。そのような変異を含むペプチドとしては、ＧＰＣ３タンパク質の断片ペプチドを構成するアミノ酸残基の総数に対して、例えば、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは３％以下の数のアミノ酸残基が変異したアミノ酸配列を有するもの等を挙げることができる。なお、変異の種類は、アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び付加のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい。
【００３９】
なお、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬの誘導に用いる樹状細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞は、末梢血単核球から公知の方法により調製することができる。樹状細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞の調製に使用する末梢血単核球は、除去対象の未分化幹細胞が有するＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉと同じＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉを有する対象から採取されたものであることが好ましい。
【００４０】
また、（ａ）成分として使用可能なＧＰＣ３特異的ＣＴＬは、上記のようにＧＰＣ３由来のＣＴＬ誘導性ペプチドを用いて誘導されたものに限らず、ＧＰＣ３由来のＣＴＬ誘導性ペプチドとＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉとの複合体への結合能を有するＴＣＲをコードする遺伝子により形質転換されたＣＴＬであってもよい。そのようなＴＣＲをコードする遺伝子は、上記のように誘導されたＧＰＣ３特異的ＣＴＬから公知の方法を用いて得ることができ、形質転換も公知の方法を用いて行うことができる。
【００４１】
また、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬは、ＧＰＣ３タンパク質への結合能を有するキメラ抗原受容体（以下、「ＧＰＣ３特異的キメラ抗原受容体」という。）を発現するように改変されたＣＴＬであってもよい。そのようなＣＴＬは、ＧＰＣ３特異的キメラ抗原受容体をコードする遺伝子で、ＣＴＬを形質転換することにより得ることができる。ＧＰＣ３特異的キメラ抗原受容体をコードする遺伝子は、ＧＰＣ３タンパク質に対する結合能を有する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードする塩基配列を用いて、公知の方法により作成することができる。作成方法の例としては、例えば、ＧＰＣ３タンパク質への結合能を有するｓｃＦＶ、ＣＤ２８等のＴ細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３のζ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインをコードする遺伝子を、前記の順に連結する方法等が挙げられる。
【００４２】
本実施形態の未分化幹細胞除去剤が（ａ）成分を含む場合、未分化幹細胞除去剤は、（ａ）成分のみを含むものであってもよく、後述する（ｂ）〜（ｄ）成分のいずれか１以上の成分を同時に含んでいてもよい。また、未分化幹細胞除去剤は、（ａ）〜（ｄ）成分以外の他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、ＣＴＬの培養に一般的に用いられる培地の成分等が挙げられる。ＣＴＬの培養に一般的に用いられる培地としては、例えば、ＡＩＭ−Ｖ培地、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、及びＸ−ＶＩＶＯ５等を挙げることができる。また、ＣＴＬの培養の際に用い得る成分としては、Ｈｕｍａｎ  ＡＢ  Ｓｅｒｕｍ、ウシ等のヒト以外の動物血清、並びにＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１５などのサイトカイン等を例示することができる。
【００４３】
本実施形態の未分化幹細胞除去剤が（ａ）成分を含む場合、未分化幹細胞除去剤は、例えば、（ａ）成分である細胞の培養物；培地、生理食塩水、リン酸緩衝液等の適切な担体に（ａ）成分である細胞を懸濁した細胞懸濁物；（ａ）成分である細胞を遠心分離等により回収した細胞ペレット；（ａ）成分である細胞を凍結保存した凍結保存細胞等の形態とすることができる。
【００４４】
＜（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物＞
（ｂ）成分は、グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物である。「グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る」の意味は、上記（ａ）成分で述べたとおり、ＧＰＣ３発現細胞の増殖を阻害するが、ＧＰＣ３非発現細胞の増殖は阻害しない作用を意味する。「グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物」とは、そのような作用を有する化合物を意味する。
【００４５】
ＧＰＣ３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物においては、当該化合物がＧＰＣ３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る限り、その増殖阻害機構は特に限定されない。細胞増殖阻害の典型的な例としては、細胞死の誘導が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４６】
ＧＰＣ３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物は、ＧＰＣ３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る限り、化合物の種類は特に限定されない。ＧＰＣ３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物の例としては、例えば、ＧＰＣ３タンパク質への結合能を有する抗体、ＧＰＣ３に対する低分子干渉二本鎖核酸、ＧＰＣ３に対するアンチセンス核酸等が挙げられる。
【００４７】
ＧＰＣ３タンパク質への結合能を有する抗体（以下、「抗ＧＰＣ３抗体」という。）は、これまでに、癌治療用途のものが幾つか報告されている（例えば、特許文献５）。これらの抗体は、ＧＰＣ３を発現する癌細胞に対する増殖抑制効果を有することから、癌治療剤としての開発が進められている。抗ＧＰＣ３抗体は、ＧＰＣ３発現細胞である癌細胞に対する増殖抑制効果が確認されており、ＧＰＣ３発現細胞である未分化幹細胞の増殖抑制にも有効である。したがって、抗ＧＰＣ３抗体は、本実施形態の未分化幹細胞除去剤における（ｂ）成分の好適な例として挙げられる。
【００４８】
抗ＧＰＣ３抗体は、癌治療用途で報告されている公知のものを使用してもよいが、公知の抗体作成方法により、新たに作成したものであってもよい。抗体作成方法としては、例えば、ＧＰＣ３タンパク質により動物を免疫する方法やファージディスプレイ法等を挙げることができる。
【００４９】
また、抗ＧＰＣ３抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。抗ＧＰＣ３抗体が由来する生物は、特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルなどの哺乳類抗体、ニワトリなどの鳥類抗体等を使用することができる。また、ＧＰＣ３タンパク質への結合能を維持する限り、抗体断片や改変抗体であってもよい。そのような抗体断片の例としては、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等を挙げることができる。また、改変抗体の例としては、例えば、キメラ抗体を挙げることができる。キメラ抗体の具体例としては、ヒト抗体の可変領域に異種抗体の可変領域を移植した抗体（すなわち、ヒト抗体定常領域と異種抗体可変領域とを含む抗体）、ヒト抗体の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）に異種抗体のＣＤＲを移植したヒト化抗体（すなわち、ヒト抗体のＣＤＲが異種抗体のＣＤＲに置換された抗体）等を例示することができる。また、抗ＧＰＣ３抗体は、２つ以上の抗原エピトープに結合し得る多重特異性抗体であってもよい。なお、抗ＧＰＣ３抗体は、いずれのクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ等）の抗体であってもよい。
【００５０】
また、抗ＧＰＣ３抗体は、細胞毒性を有する薬剤等を結合したものであってもよい。そのような薬剤として、例えば、抗癌剤として使用されている薬剤等を挙げることできる。より具体的には、イホスファミド、シクロホスファミドなどのアルキル化剤；エノシタビン、カペシタビン、ゲムシタンなどの代謝拮抗剤；ドキタセル、パクリタキセルなどの植物アルカロイド；アクチノマイシンＤ、イダルビシンなどの抗癌性抗生物質；オキサリプラチン、シスプラチンなどのプラチナ製剤等を例示することができる。前記のような薬剤結合抗ＧＰＣ３抗体を用いた場合、抗ＧＰＣ３抗体がＧＰＣ３発現細胞に結合することにより、薬剤をＧＰＣ３発現細胞に効率的に作用させることができる。
【００５１】
ＧＰＣ３に対する低分子干渉二本鎖核酸は、ＧＰＣ３遺伝子のセンス鎖の一部に相補的な塩基配列と、当該塩基配列に相補的な塩基配列とを含み、ＧＰＣ３発現を阻害する機能を有する二本鎖核酸である。ＧＰＣ３に対する低分子二本鎖核酸は、細胞内に取り込まれると、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＮＡ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＩＳＣ）に取り込まれて１本鎖となる。前記ＲＩＳＣに取り込まれた１本鎖核酸は、ＧＰＣ３のｍＲＮＡへとＲＩＳＣを導くガイドとして機能する。前記１本鎖核酸によりＧＰＣ３のｍＲＮＡに結合したＲＩＳＣは、ＲＩＳＣを構成するアルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）と呼ばれるタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性により、ＧＰＣ３のｍＲＮＡを切断する。その結果、ＧＰＣ３の発現が阻害される。
【００５２】
ＧＰＣ３に対する低分子干渉二本鎖核酸は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、及び低分子干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ；ＤＮＡ及びＲＮＡの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）又はＤＮＡ及びＲＮＡの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））のいずれであってもよい。
【００５３】
ｓｉＲＮＡによるＧＰＣ３のノックダウンにより、ＧＰＣ３発現細胞の増殖抑制起こることは、肝癌細胞等において報告されている（例えば、Sun CK et al., Neoplasia. 2011 Aug;13(8):735-47.）。したがって、ＧＰＣ３発現を阻害する機能を有する低分子干渉二本鎖核酸は、ＧＰＣ３発現細胞である未分化幹細胞の増殖抑制にも有効である。
【００５４】
ＧＰＣ３に対する低分子干渉二本鎖核酸において、二本鎖部分は、ＧＰＣ３遺伝子のセンス鎖の部分塩基配列（標的配列）と当該標的配列に相補的な塩基配列とから構成される。標的配列の選択は、ｓｉＲＮＡの標的配列の選択に一般的に用いられる方法（例えば、Tuschl et al. Genes Cev 1999, 13(24):3191-7）により行うことができ、ＧＰＣ３発現阻害能が発現される限り、標的配列は特に制限されない。標的配列の例としては、例えば、本明細書の実施例において使用されたｓｉＲＮＡの標的配列（配列番号２８：５’−ＧＧＡＧＧＣＵＣＵＧＧＵＧＡＵＧＧＡＡＵＧＡＵＡＡ−３’）を挙げることができるが、これに限定されるものではない。なお、低分子干渉二本鎖核酸がＲＮＡである場合、標的配列に含まれるチミジン残基は、低分子干渉二本鎖核酸においてウラシル残基に置き換えられる。
【００５５】
低分子干渉二本鎖核酸において、標的配列は通常１９〜２５塩基対、好ましくは２１〜２３塩基対であるが、ＧＰＣ３発現阻害能を有する限り、長さは特に限定されない。また、低分子干渉二本鎖核酸は、３’末端に、２〜５塩基程度のオーバーハング配列を有することができる。オーバーハング配列は、通常、ウラシル残基又はチミジン残基により構成されるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
ＧＰＣ３に対するアンチセンス核酸は、ＧＰＣ３遺伝子のセンス鎖の少なくとも一部に相補的な配列を有する一本鎖核酸であり、ＧＰＣ３遺伝子から転写されたｍＲＮＡに結合することができる。ＧＰＣ３に対するアンチセンス核酸が、ＧＰＣ３のｍＲＮＡに結合することにより、ＧＰＣ３タンパク質の翻訳が阻害され、ｍＲＮＡの分解が促進される。その結果、ＧＰＣ３の発現が阻害される。
【００５７】
ＧＰＣ３に対するアンチセンス核酸も、ＧＰＣ３に対する低分子干渉二本鎖核酸と同様に、ＧＰＣ３発現阻害能を有するため、ＧＰＣ３発現細胞である未分化幹細胞の増殖抑制に有効である。
【００５８】
ＧＰＣ３に対するアンチセンス核酸は、ＧＰＣ３遺伝子のセンス鎖の一部又は全部に相補的な塩基配列を有するが、当該相補的な塩基配列は、１２残基以上であることが好ましく、通常、１２〜５０残基程度とすることができる。また、当該相補的な塩基配列は、ＧＰＣ３遺伝子のセンス鎖の少なくとも一部に相補的な塩基配列であれば特に限定されない。また、ＧＰＣ３のｍＲＮＡに対する結合能を有する限り、完全に相補的な塩基配列である必要はなく、１〜数個のミスマッチ残基を含み得る。また、アンチセンス核酸は、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよいが、ＲＮＡであることが好ましい。
【００５９】
上記の低分子干渉二本鎖核酸及びアンチセンス核酸は、天然核酸のみならず、塩基部分、リン酸基及び／又は糖部分が修飾された修飾核酸であってもよい。
【００６０】
本実施形態の未分化幹細胞除去剤が、（ｂ）成分を含む場合、（ｂ）成分は上記のような成分のうちの１種であってもよく、２種以上の組合せであってもよい。また、未分化幹細胞除去剤は、（ｂ）成分のみを含むものであってもよく、前記（ａ）成分、後述する（ｃ）成分及び（ｄ）成分のいずれか１以上の成分を同時に含んでいてもよい。また、未分化幹細胞除去剤は、（ａ）〜（ｄ）成分以外の他の成分を含んでいてもよい。他の成分は、特に限定されないが、例えば、薬学的に許容される担体、トランスフェクション促進剤、緩衝剤、賦形剤、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、キレート剤等が挙げられる。
【００６１】
本実施形態の未分化幹細胞除去剤が（ｂ）成分を含む場合、未分化幹細胞除去剤の剤型は特に限定されず、液状物、粉末状物、顆粒状物、ゲル状物、固形物等の種々の形態であり得る。また、（ｂ）成分である化合物をミセル内に封入したエマルション形態や、リポソーム内に封入したリポソーム形態であってもよい。
【００６２】
＜（ｃ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞＞
（ｃ）成分は、グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞である。本明細書において、「グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る」とは、生体内において、ＧＰＣ３発現細胞に対する免疫応答を誘導するが、ＧＰＣ３非発現細胞に対する免疫応答は誘導しない作用を意味する。「グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞」とは、そのような作用を有する細胞である。
【００６３】
ＧＰＣ３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞においては、当該細胞が、生体内において、ＧＰＣ３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る限り、その免疫応答誘導機構は特に限定されない。また、誘導される免疫応答の種類も、特に限定されず、細胞性免疫であってもよく、液性免疫であってもよい。
【００６４】
ＧＰＣ３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞は、ＧＰＣ３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る限り、細胞の種類は特に限定されない。ＧＰＣ３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞の例としては、例えば、ＧＰＣ３発現細胞に対する免疫応答を促進する免疫細胞等が挙げられる。そのような免疫細胞の好ましい例としては、ＧＰＣ３タンパク質の部分ペプチドを細胞表面に提示する樹状細胞等を挙げることができる。
【００６５】
「ＧＰＣ３タンパク質の部分ペプチドを細胞表面に提示する樹状細胞」は、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬを誘導することができる。ここで、「ＧＰＣ３タンパク質の部分ペプチドを細胞表面に提示する樹状細胞」とは、細胞表面に存在するＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉに、ＧＰＣ３タンパク質の部分ペプチドが結合した樹状細胞であって、かつＧＰＣ３特異的ＣＴＬの誘導能を有する樹状細胞を意味する。ここで、樹状細胞が「ＧＰＣ３特異的ＣＴＬの誘導能を有する」とは、当該樹状細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞とを共培養した場合に、ＣＤ８陽性Ｔ細胞をＧＰＣ３特異的ＣＴＬに成熟させることができることを意味する。したがって、ＧＰＣ３タンパク質の部分ペプチドを細胞表面に提示する樹状細胞（以下、「ＧＰＣ３ペプチド提示樹状細胞」という。）を生体に投与した場合、生体内でＧＰＣ特異的ＣＴＬが誘導される。すなわち、ＧＰＣ３発現細胞に対する特異的免疫応答が誘導される。
【００６６】
ＧＰＣ３提示樹状細胞は、例えば、特許文献６又は７に記載されるような方法により得ることができる。具体的には、ＧＰＣ３由来のＣＴＬ誘導性ペプチドの存在下で、樹状細胞を培養することにより、ＧＰＣ３ペプチド提示樹状細胞を得ることができる。なお、ＣＴＬ誘導性ペプチドについては、上記成分（ａ）の項で述べたものを用いることができる。
【００６７】
なお、ＧＰＣ３ペプチド提示樹状細胞の作成に用いる樹状細胞は、末梢血単核球から公知の方法により調製することができる。樹状細胞の調製に使用する末梢血単核球は、本実施形態の未分化幹細胞除去剤を生体に投与する場合、当該投与予定の対象が有するＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉと同じＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉを有する対象から採取されたものであることが好ましい。より好ましくは、樹状細胞の調製に使用する末梢血単核球は、未分化幹細胞除去剤の投与対象から採取された末梢血単核球である。
【００６８】
本実施形態の未分化幹細胞除去剤が（ｃ）成分を含む場合、未分化幹細胞除去剤は、（ｃ）成分のみを含むものであってもよく、前記（ａ）成分、（ｂ）成分、及び後述する（ｄ）成分のいずれか１以上の成分を同時に含んでいてもよい。また、未分化幹細胞除去剤は、（ａ）〜（ｄ）成分以外の他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、樹状細胞の培養に一般的に用いられる培地の成分等が挙げられる。樹状細胞の培養に一般的に用いられる培地としては、例えば、ＡＩＭ−Ｖ培地、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、及びＸ−ＶＩＶＯ５等を挙げることができる。また、樹状細胞の培養の際に用い得る成分としては、Ｈｕｍａｎ  ＡＢ  Ｓｅｒｕｍ、ウシ等のヒト以外の動物血清、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、及びＴＮＦ−αなどのサイトカイン、並びにＰＧＥ２などのプロスタグラジン等を例示することができる。
【００６９】
本実施形態の未分化幹細胞除去剤が（ｃ）成分を含む場合、未分化幹細胞除去剤は、例えば、（ｃ）成分である細胞の培養物；培地、生理食塩水、リン酸緩衝液等の適切な担体に（ｃ）成分である細胞を懸濁した細胞懸濁物；（ｃ）成分である細胞を遠心分離等により回収した細胞ペレット；(ｃ)成分である細胞を凍結保存した凍結保存細胞等の形態とすることができる。
【００７０】
＜（ｄ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物＞
（ｄ）成分は、グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物である。本明細書において、「グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る」の意味は、上記（ｃ）成分で述べたとおり、生体内において、ＧＰＣ３発現細胞に対する免疫応答を誘導するが、ＧＰＣ３非発現細胞に対する免疫応答は誘導しない作用を意味する。「グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物」とは、そのような作用を有する化合物である。
【００７１】
ＧＰＣ３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物においては、当該化合物が、生体内において、ＧＰＣ３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る限り、その免疫応答誘導機構は特に限定されない。また、誘導される免疫応答の種類も、特に限定されず、細胞性免疫であってもよく、液性免疫であってもよい。
【００７２】
ＧＰＣ３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物は、ＧＰＣ３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る限り、化合物の種類は特に限定されない。ＧＰＣ３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物の例としては、例えば、ＧＰＣ３タンパク質又はその部分ペプチド、前記タンパク質又はペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター等が挙げられる。
【００７３】
ＧＰＣ３タンパク質又はその部分ペプチドは、生体に投与された場合、生体内で様々な免疫応答を誘導する。例えば、抗ＧＰＣ３抗体の産生や、ＧＰＣ３ペプチド提示樹状細胞の生成、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬの誘導等が生じる。このような免疫応答によって生じた抗ＧＰ３抗体やＧＰＣ３特異的ＣＴＬは、ＧＰＣ３発現細胞に対する細胞増殖阻害作用を有する。また、ＧＰＣ３ペプチド提示樹状細胞は、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬを誘導する作用を有する。
【００７４】
本実施形態の未分化幹細胞除去剤において、（ｄ）成分として使用されるＧＰＣ３タンパク質は、特に限定されないが、当該未分化幹細胞除去剤の投与対象と同種の対象のＧＰＣ３タンパク質であることが好ましい。この場合、予期せぬ免疫応答の発生を避け、生体内のＧＰＣ３発現細胞に対する免疫応答を効率的に惹起することができる。例えば、ヒトに投与予定の未分化幹細胞除去剤であれば、ヒトＧＰＣ３タンパク質又はその部分ペプチドを用いることが好ましい。
【００７５】
また、ＧＰＣ３発現細胞に対する免疫応答を誘導し得る限り、ＧＰＣ３タンパク質は野生型のものである必要はなく、変異を有するものであってもよい。例えば、野生型のＧＰＣ３タンパク質のアミノ酸配列と比較して、１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、又は１〜１０個程度の変異を有し、かつＧＰＣ３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得るタンパク質もまた、本実施形態の未分化幹細胞除去剤に使用可能である。なお、変異は、アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び付加のいずれであってもよく、これらの組合せであってもよい。あるいは、野生型のＧＰＣ３タンパク質のアミノ酸配列と、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性（相同性）を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＰＣ３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得るタンパク質もまた、本実施形態の未分化幹細胞除去剤に使用可能である。
【００７６】
（ｄ）成分としてＧＰＣ３タンパク質の部分ペプチドを使用する場合、ＧＰＣ３発現細胞に対する免疫応答を誘導し得る限り、その長さは特に限定されない。ＣＴＬ誘導性ペプチドは、一般的に８〜１２アミノ酸長であるので、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬの誘導のためには、８アミノ酸以上であることが好ましい。例えば、ＧＰＣ３タンパク質の部分ペプチドは、８アミノ酸長以上、１５アミノ酸長以上、２０アミノ酸長以上、３０アミノ酸長以上、又は５０アミノ酸長以上等であることができる。
【００７７】
ＧＰＣ３タンパク質の部分ペプチドは、ＧＰＣ３発現細胞に対する免疫応答を誘導し得る限り、その配列は特に限定されない。一例として、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の対象に投与する場合には、特許文献６に記載のペプチド（配列番号９〜２０）を使用してもよく、ＨＬＡ−Ａ２陽性の対象に投与する場合には、特許文献７に記載のペプチド（配列番号２１〜２３）を使用してもよい。また、ＧＰＣ３タンパク質の部分ペプチドは、配列番号９〜２３に記載のアミノ酸配列のいずれか２以上のアミノ酸配列を含むものであってもよい。ただし、ＧＰＣ３タンパク質の部分ペプチドの配列は、これらに限定されるものではない。
【００７８】
また、ＧＰＣ３タンパク質又はその部分ペプチドは、薬学的に許容される塩の形態であってもよい。好ましい塩の例としては、アルカリ金属との塩、アルカリ土類金属との塩、有機塩基との塩、アミンとの塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸など）との塩、及び無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸など）との塩が挙げられるが、これらに限定されない。なお、本明細書において、「薬学的に許容される塩」とは、その化合物の医薬的有効性が保持される塩をいう。
【００７９】
上記のようなＧＰＣ３タンパク質又はその部分ペプチドは、これらをコードするポリヌクレオチドの形態、又は前記ポリヌクレオチドを含むベクターの形態で、本実施形態の未分化幹細胞除去剤に含まれていてもよい。ベクターは、ＧＰＣ３タンパク質又はその部分ペプチドを発現し得る発現ベクターであることが好ましい。ここで、「ＧＰＣ３タンパク質又はその部分ペプチドを発現し得る発現ベクター」とは、当該ベクターが細胞内に導入された場合に、ＧＰＣ３タンパク質又はその部分ペプチドが細胞内で発現されるベクターを意味する。
【００８０】
ＧＰＣ３タンパク質又はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、「ＧＰＣ３」ポリヌクレオチド）を含むベクター（以下、「ＧＰＣ３ベクター」という。）は、ＧＰＣ３ポリヌクレオチドの他に、ＧＰＣ３ポリヌクレオチドの発現を制御するプロモーター等の制御配列を含んでいてもよい。プロモーターとしては、例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。一例としては、ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターとβ−グロビン遺伝子のポリＡシグナル部位を含む）を挙げることができる。
【００８１】
また、ＧＰＣ３ベクターは、プロモーターの他に、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、マーカー遺伝子、複製開始点、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子などの配列を有していてもよい。
【００８２】
ＧＰＣ３ベクターにおいて、ベクターの種類は特に限定さない。ＧＰＣ３ベクターに使用可能なベクターの例としては、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、エピソーマルベクター、人工染色体ベクター等を挙げることができる。
【００８３】
ウイルスベクターとしては、例えば、センダイウイルスベクター、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シルビスウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、オルソミクソウイルスベクター等が挙げられる。
【００８４】
一例として、ＧＰＣ３ベクターは、センダイウイルスベクターにＧＰＣ３ポリヌクレオチドが挿入されたものであることができる。センダイウイルスは、パラミクソウイルス科、パラミクソウイルス属に属するパラインフルエンザウイルス１型に分類されるウイルスであり、（−）鎖ＲＮＡゲノムを有する。センダイウイルスは、発現ベクターとして利用されており、ウイルス再構成方法が開発されている（国際公開第９７／１６３３８号、国際公開第９７／１６３３９号）。
【００８５】
ＧＰＣ３ベクターとしてセンダイベクターを用いる場合、センダイベクターは、伝搬力に関わるＭ、Ｆ、ＨＮ遺伝子の全ての遺伝子が含まれた複合体を使用してもよい。また、これらの伝搬力に関わる遺伝子を欠失又は機能的に不活化したものを用いてもよい。さらに、複合体は、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着し得るような接着因子、リガンド、受容体等を含むものであってもよい。また、例えば、免疫原性に関与する遺伝子を不活性化したものであってもよく、ＲＮＡの転写効率や複製効率を高めるために、一部の遺伝子を改変したものであってもよい。
【００８６】
ＧＰＣ３ベクターの構築において、ＧＰＣ３ポリヌクレオチドは、センダイウイルスベクターに含まれるＲＮＡの適当な部位挿入することができる。例えば、Ｒ１配列とＲ２配列との間に、６の倍数の塩基数を有する配列としてＧＰＣ３ポリヌクレオチドを挿入することができる。ＧＰＣ３ポリヌクレオチドの発現量は、遺伝子挿入の位置、及び遺伝子の前後のＲＮＡ塩基配列により調製することができる。例えば、センダイウイルスＲＮＡにおいては、挿入位置がＮＰ遺伝子に近いほど、挿入遺伝子の発現量が多くなることが知られている。
【００８７】
センダイウイルスベクターは、適切な宿主細胞を用いて、再構成することができる。再構成の方法は、例えば、国際公開第９７／１６３３８号や国際公開第９７／１６３３９号に記載の方法を使用することができる。例えば、サル腎由来のＣＶ１細胞やＬＬＣＭＫ２細胞、ハムスター腎由来のＢＨＫ細胞等の培養細胞を使って、センダイウイルスの複合体を再構成することができる。なお、再構成した複合体を、発育鶏卵を使って増幅することにより、大量の複合体を得ることができる。鶏卵を使ったベクターの製造は、公知の方法で行うことができる（中西ら編,(1993),「神経科学研究の先端技術プロトコールIII,分子神経細胞生理学」,厚生社,大阪,pp.153-172）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ９〜１２日間３７〜３８℃で培養し、胚を成長させる。センダイウイルスベクターを漿尿膜腔へ接種し、数日間卵を培養してウイルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組換えセンダイウイルスにより変わり得る。その後、ウイルスを含んだ漿尿液を回収する。また、漿尿液からのセンダイウイルスの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人,「ウイルス実験プロトコール」,永井、石浜監修,メジカルビュー社,pp.68-73,(1995)）。
【００８８】
ＧＰＣ３ポリヌクレオチドを含むセンダイウイルスベクターは、生ワクチンとして使うことができる。本明細書において、生ワクチンとは、当該センダイウイルスベクターが、投与された個体の中で増殖し、当該個体にＧＰＣ３発現細胞に対する特異的免疫を獲得させる作用を有するものをいう。このような生ワクチンを接種する対象に制限はなく、ヒト、トリ、ブタ、ウマ、ウシ等のあらゆる動物が含まれる。また、前述の伝播力が欠損したセンダイウイルスベクターを用いれば、生ワクチンであってもベクターが伝播しないワクチンを製造することができる。センダイウイルスベクターを用いた本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、一例として、経鼻ワクチンとして使用することができる。
【００８９】
プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等の、動物細胞発現用プラスミドベクターが挙げられる。
【００９０】
エピソーマルベクターは、染色体外で自律複製可能なベクターである。エピソーマルベクターを用いる具体的手段は、公知である（Yu et al., Science, 324, 797-801 (2009)）。エピソーマルベクターとしては、例えば、ＥＢＶ、ＳＶ４０等に由来する自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。自律複製に必要なベクター要素としては、具体例として、複製開始点と、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。例えば、ＥＢＶにおいては、複製開始点ｏｒｉＰとＥＢＮＡ−１遺伝子が挙げられ、ＳＶ４０においては、複製開始点ｏｒｉとＳＶ４０ＬＴ遺伝子が挙げられる。
【００９１】
人工染色体ベクターとしては、例えば、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、ＰＡＣ（Ｐ１−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター等が挙げられる。
【００９２】
本実施形態の未分化幹細胞除去剤が（ｄ）成分を含む場合、（ｄ）成分は上記のような成分のうちの１種であってもよく、２種以上の組合せであってもよい。また、未分化幹細胞除去剤は、（ｄ）成分のみを含むものであってもよく、前記（ａ）成分、（ｂ）成分、及び（ｃ）成分のいずれか１以上の成分を同時に含んでいてもよい。また、（ａ）〜（ｄ）成分以外の他の成分を含んでいてもよい。他の成分は、特に限定されないが、例えば、薬学的に許容される担体、トランスフェクション促進剤、緩衝剤、賦形剤、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、キレート剤等が挙げられる。
【００９３】
本実施形態の未分化幹細胞除去剤が（ｄ）成分を含む場合、未分化幹細胞除去剤の剤型は特に限定されず、液状物、粉末状物、顆粒状物、ゲル状物、固形物等の種々の形態であり得る。また、（ｄ）成分である化合物をミセル内に封入したエマルション形態や、リポソーム内に封入したリポソーム形態であってもよい。
【００９４】
本実施形態の未分化幹細胞除去剤において、上記（ａ）〜（ｄ）成分の含有量は特に限定されない。例えば、（ａ）〜（ｄ）成分の含有量として、０．０１〜９００μｇ／ｍｇ、０．１〜５００μｇ／ｍｇ、０．５〜３００μｇ／ｍｇ、１〜２００μｇ／ｍｇ等を例示することができる。
【００９５】
本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、後述する未分化幹細胞除去方法、分化細胞製造方法、未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物、及び未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防する方法等に使用することができる。
【００９６】
本実施形態の未分化幹細胞除去剤が、除去の対象とする未分化幹細胞は、特に限定されないが、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であることが好ましく、ｉＰＳ細胞であることがより好ましい。
【００９７】
また、他の態様において、本発明は、未分化幹細胞除去剤の製造のための、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分の使用、を提供する：
（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞；
（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物。
（ｃ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞；及び
（ｄ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物。
【００９８】
<<キット>>
１実施形態において、本発明は、上記実施形態の未分化幹細胞除去剤を備えるキットを提供する。
【００９９】
本実施形態のキットは、上記実施形態の未分化幹細胞除去剤のほか、未分化幹細胞から分化細胞を誘導するための試薬類、培地類、細胞培養器具、使用説明書等をさらに備えるものであってもよい。分化細胞を誘導するための試薬類は、誘導しようとする分化細胞に応じて、定義選択することができる。一例として、心筋細胞を誘導するための試薬類としては、例えば、デメチラーゼ、５−アザシチジン、ＤＭＳＯなどの染色体ＤＮＡ脱メチル化剤；ＰＤＧＦ、線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ−８）、エンドセリン１（ＥＴ１）、ミドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）、骨形成因子４（ＢＭＰ−４）、Ｇ−ＣＳＦなどのサイトカイン；ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンなどの接着分子；レチノイン酸などのビタミン；Ｎｋｘ２．５／Ｃｓｘ、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ−２Ａ、ＭＥＦ−２Ｂ、ＭＥＦ−２Ｃ、ＭＥＦ−２Ｄ、ｄＨＡＮＤ、ｅＨＡＮＤ、ＴＥＦ−１、ＴＥＦ−３、ＴＥＦ−５、ＭｅｓＰ１などの転写因子；心筋細胞由来の細胞外基質；ノギン、コーディン、フェチュイン、フォリスタチン、スクレロスチン、ダン、サーベラス、グレムリン、、ダンテなどのＢＭＰアンタゴニスト等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、培地類としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培養液（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭ培養液（α−ＭＥＭ、ＭＥＭ［Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂｓｓ］等）、ＲＰＭＩ培養液（ＲＰＭＩ  １６４０等）、Ｆ１２培養液、ＳｔｅｍＰｒｅ３４、ｍＴｅＳＲＩ等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、細胞培養器具等としては、細胞培養プレート等を挙げることができるが、これに限定されない。
【０１００】
本実施形態のキットは、後述の未分化幹細胞除去方法に好適に用いることができ、当該未分化幹細胞除去方法を説明する指示書等をさらに備えることができる。未分化幹細胞除去方法に使用する試薬類をキット化することにより、より簡便かつ短時間に未分化幹細胞除去方法を実施することができる。
【０１０１】
≪未分化幹細胞除去方法≫
１実施形態において、本発明は、未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を、未分化幹細胞除去剤の存在下で培養することを含む、未分化幹細胞除去方法を提供する。
【０１０２】
本実施形態の未分化幹細胞除去方法に使用する未分化幹細胞除去剤は、上記実施形態の未分化幹細胞除去剤のうち、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む未分化幹細胞除去剤である：
（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞；及び
（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物。
したがって、本実施形態の未分化幹細胞除去方法は、未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を、上記（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分の存在下で培養することを含む方法であるともいえる。前記（ａ）及び（ｂ）の成分は、上記≪未分化幹細胞除去剤≫で記載したものと同様である。
【０１０３】
本明細書において、「細胞混合物」とは、２個以上の細胞を含む細胞集団を意味する。「細胞混合物」は、２個以上の細胞のほか、培地の成分等を含み得る。「未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物」は、１個以上の未分化幹細胞と１個以上の分化細胞とを含み、任意に培地の成分等を含み得る。未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物の形態は、特に限定されず、集合状態、分散状態、培養容器に接着した状態、細胞外マトリクス等の接着因子へ接着した状態、シート状、塊状、コロニー、胚様体、細胞塊、組織、器官等であり得る。
【０１０４】
未分化幹細胞に、分化・誘導処理を行うと、未分化幹細胞から分化細胞が誘導される。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、全ての未分化幹細胞を分化細胞に誘導することは難しい。そのため、通常、未分化幹細胞が残存し、未分化幹細胞と分化細胞との細胞混合物が形成される。本実施形態の方法によれば、このような未分化幹細胞と分化細胞との細胞混合物から、未分化幹細胞のみを選択的に除去することができる。なお、本実施形態の方法において、未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物は、未分化幹細胞と分化細胞とを混合したものであってもよい。
【０１０５】
本実施形態の方法において、未分化幹細胞は、特に限定されないが、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であることが好ましく、ｉＰＳ細胞であることがより好ましい。
【０１０６】
本実施形態の方法において、分化細胞は、特に限定されないが、混在する未分化幹細胞と同種の未分化幹細胞から分化・誘導されたものであることが好ましい。未分化幹細胞から分化細胞への分化・誘導方法は、これまでに幾つか報告されており、これら公知の方法を用いて分化細胞を誘導することができる。
【０１０７】
未分化幹細胞ではＧＰＣ３を発現しているが、分化が進行した細胞ではＧＰＣ３を発現しなくなる。本実施形態の方法では、この点に着目し、ＧＰＣ３発現細胞を標的とした細胞処理を行うことにより、未分化幹細胞の選択的除去を行う。したがって、本実施形態の方法において、分化細胞は、ＧＰＣ３を発現していない細胞である。ここで、「ＧＰＣ３を発現していない」とは、未分化幹細胞におけるＧＰＣ３発現量と比較して、ＧＰＣ３の発現量が１／５以下、好ましくは１／１０以下、より好ましくは１／２０以下、さらに好ましくは１／３０以下であることをいう。ＧＰＣ３の発現量は、フローサイトメトリー、定量的ＰＣＲ、マイクロアレイ、ノーザンハイブリダイゼーション、抗ＧＰＣ３抗体を用いた免疫組織化学的染色、ウエスタンブロッティング等の公知の方法により確認することができる。
【０１０８】
本実施形態の方法において、ＧＰＣ３を発現していない細胞である限り、分化細胞の種類は特に限定されない。例えば、心筋細胞、筋細胞、繊維芽細胞、神経細胞、リンパ球等の免疫細胞、血管細胞、網膜色素上皮細胞等の眼細胞、巨核球や赤血球等の血液細胞、その他各組織細胞、及びそれらの前駆細胞等であってよい。好適な分化細胞の例としては、例えば、心筋細胞が挙げられる。
【０１０９】
多能性を有する幹細胞から心筋細胞を調製する場合、心筋細胞への分化が進行するにつれて、未分化中胚葉、心臓中胚葉（又は予定心筋細胞）を経て心筋細胞に分化すると考えられている。ここで、未分化中胚葉とは、未分化中胚葉に特異的なＢｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質の発現が認められる段階をいう。一方、心臓中胚葉（又は予定心筋細胞）とは、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ等の未分化中胚葉に特異的なタンパク質の発現が認められ、かつ同一細胞においてＮｋｘ２．５やアクチニン等の心筋細胞特異的タンパク質の発現を認めない細胞であって、培養液に対して新たに物質が加えられることを必要とせず、専ら心筋細胞へ分化する能力を有する細胞を意味する。そして、心筋細胞とは、自律拍動を行っている細胞のことを意味する。心筋細胞は、トロポニン、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、アクチニン等のマーカーを発現する。本明細書において、「心筋細胞」という用語は、心筋細胞及びＧＰＣ３を発現していない心臓中胚葉（又は予定心筋細胞）を包含する概念として用いられる。
【０１１０】
未分化幹細胞から心筋細胞への分化・誘導は、例えば、国際公開第０１／０４８１５１号、国際公開第２００５／０３３２９８号、国際公開第２００８／１５００３０等に記載の方法を用いて行うことができる。例えば、未分化幹細胞を培養する培地に、心筋細胞への分化を惹起する物質を添加することにより、心筋細胞への分化・誘導を行ってもよい。そのような物質としては、例えば、デメチラーゼ、５−アザシチジン、ＤＭＳＯなどの染色体ＤＮＡ脱メチル化剤；ＰＤＧＦ、線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ−８）、エンドセリン１（ＥＴ１）、ミドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）、骨形成因子４（ＢＭＰ−４）、Ｇ−ＣＳＦなどのサイトカイン；ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンなどの接着分子；レチノイン酸などのビタミン；Ｎｋｘ２．５／Ｃｓｘ、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ−２Ａ、ＭＥＦ−２Ｂ、ＭＥＦ−２Ｃ、ＭＥＦ−２Ｄ、ｄＨＡＮＤ、ｅＨＡＮＤ、ＴＥＦ−１、ＴＥＦ−３、ＴＥＦ−５、ＭｅｓＰ１などの転写因子；心筋細胞由来の細胞外基質；ノギン、コーディン、フェチュイン、フォリスタチン、スクレロスチン、ダン、サーベラス、グレムリン、ダンテなどのＢＭＰアンタゴニスト等を挙げることができる。
【０１１１】
本実施形態の方法は、未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を、未分化幹細胞除去剤の存在下で培養する工程を含む。なお、本明細書において、「培養」とは、生体（個体）外において、細胞を維持又は増殖させることを意味し、いわゆるｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を扱うことを含む。そして、前記培養環境を細胞に提供するために使用されるのが「培地」である。
【０１１２】
本実施形態の方法において、細胞混合物の培養に使用する培地は、特に限定されず、従来細胞培養用培地として用いられている一般的な培地を用いることができる。培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培養液（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭ培養液（α−ＭＥＭ、ＭＥＭ［Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂｓｓ］等）、ＲＰＭＩ培養液（ＲＰＭＩ  １６４０等）、Ｆ１２培養液、ＳｔｅｍＰｒｅ３４、ｍＴｅＳＲＩ等を挙げることができる。
【０１１３】
本実施形態の方法における培養工程は、上記のような細胞培養用培地に未分化幹細胞除去剤を添加し、未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を培養することにより、実施することができる。あるいは、未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を培養している培地中に、未分化幹細胞除去剤を添加するようにしてもよい。
【０１１４】
未分化幹細胞除去剤の培地への添加量は、特に限定されないが、培地に添加したときの最終濃度として、例えば、０．０１〜１０００μｇ／ｍＬ、０．０５〜５００μｇ／ｍＬ、０．１〜３００μｇ／ｍＬ等を例示することができる。また、未分化幹細胞除去剤が、（ａ）成分を含む場合には、培地に添加したときの（ａ）成分の細胞の細胞密度の例として、１×１０〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１×１０２〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１×１０３〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１×１０４〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ等を挙げることができる。
【０１１５】
未分化幹細胞除去剤の存在下での細胞混合物の培養は、細胞培養に一般的に用いられる温度で行えばよい。例えば、培養温度として、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３８℃、より好ましくは３０〜３７℃を例示することができる。
【０１１６】
未分化幹細胞除去剤の存在下での細胞混合物の培養時間は、特に限定されないが、好ましくは、２４時間以上、より好ましくは４８時間以上である。必要に応じて、細胞は継代培養されてもよい。継代の前後で、培地の組成は、未分化幹細胞除去剤を含む限りにおいて、同一であってもよく異なっていてもよい。
【０１１７】
未分化幹細胞除去剤の存在下での細胞混合物の培養における細胞密度は、特に限定されないが、１×１０〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが好ましく、１×１０３〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬがより好ましく、１×１０４〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬがさらに好ましい。
【０１１８】
本実施形態の方法により、未分化幹細胞を除去した細胞混合物は、未分化幹細胞の割合が低減され、専ら分化細胞により構成される。そのため、本実施形態の未分化幹細胞除去方法によれば、未分化幹細胞を実質的に含まないか、未分化幹細胞の割合が低減された細胞混合物を得ることができる。したがって、本実施形態の方法で得られた細胞混合物は、生体へと移植される移植用細胞として好適に使用することができる。
【０１１９】
また、他の態様において、本発明は、未分化幹細胞を除去するための、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分の使用、を提供する：
（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞；及び
（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物。
【０１２０】
≪移植用細胞製造方法≫
１実施形態において、本発明は、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含む、移植用細胞の製造方法、を提供する：
（ｉ）未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程；及び
（ｉｉ）前記工程（ｉ）により得られた細胞混合物を、未分化幹細胞除去剤の存在下で培養する工程。
【０１２１】
本実施形態の移植用細胞製造方法に使用する未分化幹細胞除去剤は、上記実施形態の未分化幹細胞除去剤のうち、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む未分化幹細胞除去剤である：
（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞；及び
（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物。
したがって、本実施形態の移植用細胞製造方法における工程（ｉｉ）は、前記工程（ｉ）により得られた細胞混合物を、前記（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分の存在下で培養する工程であるともいえる。前記（ａ）及び（ｂ）の成分は、上記≪未分化幹細胞除去剤≫で記載したものと同様である。
【０１２２】
本実施形態の方法における工程（ｉ）は、未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程である。工程（ｉ）における未分化幹細胞は、特に限定されないが、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であることが好ましく、ｉＰＳ細胞であることがより好ましい。
【０１２３】
工程（ｉ）において、未分化幹細胞から誘導する分化細胞の種類は、特に限定されず、所望の分化細胞に誘導すればよい。未分化幹細胞から分化細胞への誘導方法は、目的とする分化細胞に応じて、公知の方法を適宜選択して用いることができる。未分化幹細胞から誘導する分化細胞の例としては、例えば、心筋細胞、筋細胞、繊維芽細胞、神経細胞、リンパ球等の免疫細胞、血管細胞、網膜色素上皮細胞等の眼細胞、巨核球や赤血球等の血液細胞、その他各組織細胞、及びそれらの前駆細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。好適な分化細胞の例としては、例えば、心筋細胞が挙げられる。未分化幹細胞から心筋細胞への誘導は、上記≪未分化幹細胞除去方法≫で例示したような方法により行うことができる。
【０１２４】
一般的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、全ての未分化幹細胞を分化細胞に誘導することは難しいため、工程（ｉ）で得られる細胞混合物は、通常、未分化幹細胞が残存し、未分化幹細胞と分化細胞との細胞混合物となっている。また、前記細胞混合物は、任意に培地の成分等を含み得る。前記細胞混合物の形態は、特に限定されず、集合状態、分散状態、培養容器に接着した状態、細胞外マトリクス等の接着因子へ接着した状態、シート状、塊状、コロニー、胚様体、細胞塊、組織、器官等であり得る。
【０１２５】
本実施形態の製造方法における工程（ｉｉ）は、前記工程（ｉ）により得られた細胞混合物を、未分化幹細胞除去剤の存在下で培養する工程である。本工程（ｉｉ）における培養は、上記≪未分化幹細胞除去方法≫で例示したような方法により行うことができる。
【０１２６】
本実施形態の製造方法は、上記工程（ｉ）及び（ｉｉ）に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、例えば、分化細胞を精製する工程、分化細胞を回収する工程等が挙げられる。本実施形態の製造方法がこれらの工程を含む場合、これらの工程は、上記工程（ｉｉ）の後に行われる。
【０１２７】
分化細胞の精製工程や回収工程は、分化細胞の種類に応じて、適宜適切な方法を選択することができる。例えば、分化細胞が心筋細胞である場合には、国際公開第２００６／０２２３７７号、国際公開第２００７／０８８８７４号、国際公開２０１６／０１０１６５号に記載の方法等を、精製工程に適用してもよい。また、回収工程としては、遠心分離法等を適用してもよい。
【０１２８】
本実施形態の製造方法において得られる移植用細胞は、例えば、分化細胞／（未分化幹細胞＋分化細胞）×１００で表される分化細胞率は、５０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよい。なお、死細胞は上記細胞数に含めないものとする。
【０１２９】
本実施形態の製造方法により製造された移植用細胞は、未分化幹細胞が選択的に除去されているため、未分化幹細胞の割合が低減されており、専ら分化細胞により構成される。そのため、本実施形態の製造方法によれば、未分化幹細胞を実質的に含まないか、未分化幹細胞の割合が低減された移植用細胞を得ることができる。そのため、生体に移植した場合でも、奇形腫形成等のリスクが低減される。
【０１３０】
また、他の態様において、本発明は、移植用細胞を製造するための、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分の使用、を提供する：
（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞；及び
（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物。
【０１３１】
さらに、他の態様において、本発明は、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含む、移植用細胞の製造方法によって製造された移植用細胞、を提供する：
（ｉ）未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程；及び
（ｉｉ）前記工程（ｉ）により得られた細胞混合物を、未分化幹細胞除去剤の存在下で培養する工程。
【０１３２】
≪医薬組成物≫
１実施形態において、本発明は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象において、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、未分化幹細胞除去剤を含む、医薬組成物を提供する。
【０１３３】
本実施形態の医薬組成物が含む未分化幹細胞除去剤は、上記実施形態の未分化幹細胞除去剤のうち、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む未分化幹細胞除去剤である：
（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞；
（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物；
（ｃ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞；及び
（ｄ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物。
したがって、本実施形態の医薬組成物は、前記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を有効成分として含む、医薬組成物であるともいえる。前記（ａ）〜（ｄ）の成分は、上記≪未分化幹細胞除去剤≫で記載したものと同様である。
【０１３４】
本実施形態の医薬組成物は、上記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を治療的有効量含む。治療的有効量である限り、（ａ）〜（ｄ）成分の含有量は特に制限されないが、例えば、０．０１〜９００μｇ／ｍｇ、０．１〜５００μｇ／ｍｇ、０．５〜３００μｇ／ｍｇ、１〜２００μｇ／ｍｇ等を例示することができる。
【０１３５】
本実施形態の医薬組成物は、上記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される成分の１つを単独で含んでもよく、２以上を組合せて含んでいてもよい。また、本実施形態の医薬組成物は、上記（ａ）〜（ｄ）成分以外の他の成分を含んでいてもよい。他の成分は、特に限定されないが、上記≪未分化幹細胞除去剤≫で記載したもの等を挙げることができる。
【０１３６】
また、本実施形態の医薬組成物は、他の成分として、上記≪未分化幹細胞除去剤≫で記載したもののほかに、アジュバント等の免疫賦活剤を含んでいてもよい。アジュバントの例としては、例えば、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素、ＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧ、Ｏ／Ｗエマルジョン等が挙げられるが、これらに限定されない。また、本実施形態の医薬組成物は、（ａ）〜（ｄ）成分以外の、薬理活性を有する薬剤を含んでいてもよい。他の薬剤の例としては、例えば、抗炎症剤、鎮痛剤、解熱剤、未分化幹細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る他の化合物等が挙げられる。
【０１３７】
本実施形態の医薬組成物の剤型は、特に限定されず、液剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、散剤、懸濁剤、乳剤、エマルション製剤、リポソーム製剤等の種々の剤型とすることができる。（ａ）成分又は（ｃ）成分を含む場合、本実施形態の医薬組成物は、細胞懸濁物、細胞ペレット、凍結保存細胞等の形態とすることもできる。
【０１３８】
本実施形態の医薬組成物は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象において、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するために使用される。一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、全ての未分化幹細胞を分化細胞に誘導することは難しいため、移植用細胞として調製された分化細胞中に、未分化幹細胞が残存してしまう場合がある。未分化幹細胞が残存したまま移植された場合、生体内で未分化幹細胞が増殖し、奇形腫等の疾患を生じる恐れがある。本実施形態の医薬組成物は、そのような疾患を治療又は予防するために、当該分化細胞を移植された対象に投与される。なお、未分化幹細胞の増殖に起因する疾患は、特に限定されないが、奇形腫や癌等を挙げることができる。
【０１３９】
本実施形態の医薬組成物の投与対象において、移植される分化細胞は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞であれば、特に限定されない。好ましくはｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞から分化されたものであり、より好ましくはｉＰＳ細胞から分化されたものである。一例として、分化細胞は、心筋細胞である。また、分化細胞は、上記≪移植用細胞製造方法≫で記載した方法により製造された移植用細胞であってもよい。
【０１４０】
本実施形態の医薬組成物の投与経路は、有効成分の種類、製剤の形態、移植された分化細胞の種類、分化細胞が移植された場所等に応じて、適宜選択することができる。例えば、経鼻的、経皮的、経気管支的投与や、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内、骨内等への注射等を例示することができる。また、投与は、局所投与であっても全身投与であってもよい。
【０１４１】
例えば、本実施形態の医薬組成物が（ｄ）成分を含み、（ｄ）成分がＧＰＣ３タンパク質又はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むセンダイウイルスベクターである場合、当該医薬組成物は、一例として、経鼻的に投与することができる。
【０１４２】
本実施形態の医薬組成物の投与量及び投与間隔は、移植した分化細胞の種類、量、及び移植した場所等、移植を受けた対象の年齢、性別、体重等、並びに投与方法等により、適宜選択することができる。投与量は、（ａ）〜（ｄ）成分の治療的有効量であることができる。例えば、（ａ）〜（ｄ）成分の治療的有効量として、１回の投与量で体重１ｋｇ当たり、０．００１〜１０００ｍｇ、０．０１〜１００ｍｇ、０．１〜３０ｍｇ、０．１〜１０ｍｇ、０．５〜５ｍｇ等を例示することができる。また、投与間隔は、数日〜数ヶ月に１度、例えば１週間に一度の投与を例示することができる。
【０１４３】
本実施形態の医薬組成物によれば、生体内に移植された細胞に未分化幹細胞が残存していた場合であっても、生体内で未分化幹細胞を選択的に除去することができる。そのため、生体で未分化幹細胞が増殖することに起因する疾患を治療又は予防することができる。
【０１４４】
他の態様において、本発明は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象において、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するため医薬組成物の製造における、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分の使用、を提供する：
（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞；
（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物；
（ｃ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞；及び
（ｄ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物。
【０１４５】
また、他の態様において、本発明は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象において、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するための、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分の使用、を提供する：
（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞；
（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物；
（ｃ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞；及び
（ｄ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物。
【０１４６】
さらに、他の態様において、本発明は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象における、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患の治療又は予防に使用するための、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分、を提供する：
（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞；
（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物；
（ｃ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞；及び
（ｄ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物。
【０１４７】
≪治療方法等≫
１実施態様において、本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象に投与することを含む、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するための方法、を提供する：
（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞；
（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物；
（ｃ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞；及び
（ｄ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物。
【０１４８】
上記（ａ）〜（ｄ）成分は、上記実施形態の医薬組成物の形態で投与されてもよい。上記（ａ）〜（ｄ）成分は、上記≪未分化幹細胞除去剤≫に記載したものと同様である。本実施形態の方法においては、（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される成分の１つを単独で投与してもよく、２以上を組合せて投与してもよい。また、（ａ）〜（ｄ）成分を、（ａ）〜（ｄ）成分以外の他の成分と組み合わせて投与してもよい。他の成分は、特に限定されないが、上記≪未分化幹細胞除去剤≫及び≪医薬組成物≫で記載したもの等を挙げることができる。
【０１４９】
上記（ａ）〜（ｄ）の成分は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象に、治療的有効量投与される。有効量は、移植した分化細胞の種類、量、及び移植した場所等、移植を受けた対象の年齢、性別、体重等、並びに投与方法等により異なるが、成分（ａ）〜（ｄ）の有効量として、例えば、１回の投与量で体重１ｋｇ当たり、０．００１〜１０００ｍｇ、０．０１〜１００ｍｇ、０．１〜３０ｍｇ、０．１〜１０ｍｇ、０．５〜５ｍｇ等を例示することができる。また、投与間隔は、数日〜数ヶ月に１度、例えば１週間に一度の投与を例示することができる。
【０１５０】
投与対象、及び対象疾患は、上記≪医薬組成物≫で記載したものと同様のものを対象とすることができる。また、投与方法は、上記≪医薬組成物≫で記載したものと同様に行うことができる。
【０１５１】
また、１実施態様において、本発明は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含む、移植用細胞の移植方法を提供する：
（ｉ）未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）により得られた細胞混合物を、未分化幹細胞除去剤の存在下で培養し、移植用細胞を得る工程；及び
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉｉ）で得られた移植用細胞を、移植が必要な対象に移植する工程。
【０１５２】
本実施形態の移植方法における工程（ｉ）及び（ｉｉ）は、上記≪移植用細胞の製造方法≫で記載した工程（ｉ）及び（ｉｉ）と同様に行うことができる。また、本実施形態の移植方法の工程（ｉｉ）で使用する未分化幹細胞除去剤は、上記実施形態の未分化幹細胞除去剤のうち、以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む未分化幹細胞除去剤である：
（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞；及び
（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物。
上記（ａ）及び（ｂ）の成分は、上記≪未分化幹細胞除去剤≫に記載したものと同様である。
【０１５３】
本実施形態の移植方法における工程（ｉｉｉ）は、前記工程（ｉｉ）で得られた移植用細胞を、移植が必要な対象に移植する工程である。「移植が必要な対象」とは、当該対象の生体内において、前記工程（ｉｉ）で得られた移植用細胞と同種の細胞に欠陥、損傷等が生じており、前記移植用細胞を移植することにより、当該細胞の欠陥、損傷等に起因する症状の改善が見込める対象である。移植は、一般的な細胞移植の手法により行うことができる。
【０１５４】
本実施形態の移植方法は、上記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、例えば、分化細胞を精製する工程、分化細胞を回収する工程等が挙げられる。本実施形態の移植方法がこれらの工程を含む場合、これらの工程は、上記工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）との間に行われる。このような精製工程や回収工程は、前記≪移植用細胞製造方法≫に記載したように行うことができる。
【０１５５】
本実施形態の移植方法によれば、未分化幹細胞を実質的に含まないか、未分化幹細胞の割合が低減された移植用細胞を生体に移植することができるため、奇形腫形成等のリスクが低減される。
【０１５６】
また、本実施形態の移植方法は、工程（ｉｉｉ）の後に、さらに以下の工程（ｉｖ）を含んでいてもよい。
（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）で移植用細胞を移植した対象に、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を投与する工程：
（ａ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る細胞；
（ｂ）グリピカン３発現細胞の増殖を特異的に阻害し得る化合物；
（ｃ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る細胞；及び
（ｄ）グリピカン３発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導し得る化合物。
【０１５７】
上記工程（ｉｖ）は、上記実施形態の治療又は予防するための方法と同様に行うことができる。工程（ｉｖ）を行うことにより、たとえ移植用細胞に未分化幹細胞が残存したまま移植された場合であっても、奇形腫等の当該未分化幹細胞の増殖に起因する疾患の発症を予防することができる。
【実施例】
【０１５８】
以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【０１５９】
［方法等］
（細胞の培養）
ｉＰＳ細胞株であるｉＰＳＣ１〜３のうち、ｉＰＳＣ１及びｉＰＳＣ２は、京都大学ｉＰＳ細胞研究所から供与を受けた。またｉＰＳＣ３は、健常人末梢血からセンダイウイルスベクターを用いて樹立した。心筋細胞であるＨｅａｒｔ−１，２は、それぞれコスモ・バイオ社及びタカラバイオ社から購入した。
細胞の培養は、３７℃、５％ＣＯ２条件に設定されたインキュベーター内で行った。ヒトｉＰＳ細胞は、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｃａｔ  ３５４２７７）を用いて未分化維持培養を行った。培養液にはｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．ｃａｔ  １１８７５−１１９）を用いた。未分化維持培養液に関してはｍＴｅＳＲ１の他に、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）やＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）など、フィーダーフリー用の培地として一般的に使用されているものであれば使用可能である。またマトリックスとして、マトリゲルの他に、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）やｉＭａｔｒｉｘ−５１１（Ｔａｋａｒａ  ｎｏ．８９２００１）などがあり、その他のフィーダーフリー用のマトリックスとして一般的に使用されているものであれば使用可能である。
植え継ぎに際しては、ＳｔｅｍＰｒｏ  Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｎｏ．１１１０５０１）、３７℃５分にてヒト胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞を分散処理した。細胞の分散処理に関してはＳｔｅｍＰｒｏ  Ａｃｃｕｔａｓｅ以外にＣＴＫ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒｅｐｒｏ  ＣＥＬＬ）やＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ／Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）も使用可能である。
【０１６０】
（未分化幹細胞からの心筋細胞の誘導）
未分化幹細胞から心筋細胞への分化・誘導は、以下の手順により行った。
・心筋分化にあたり、ｉＰＳＣ１が５０〜９０％コンフルエントになったところで、ＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＢ２７（インスリンなし、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ  ｏｒ  Ｗａｋｏ）６μＭを添加したものに培地を交換した（Ｄａｙ  ０）。
・Ｄａｙ  １〜Ｄａｙ  ２は、ＲＰＭＩ／Ｂ２７インスリン（−）培地で培養を行った。
・次いで、Ｄａｙ  ３〜Ｄａｙ  ５は、ＲＰＭＩ／Ｂ２７インスリン（−）培地に、さらにＩＷＰ２  ５μＭあるいはＩＷＲ−１（Ｓｉｇｍａ  Ｉ０１６１）５μＭを添加した培地で培養を行った。
・さらに、Ｄａｙ  ６〜Ｄａｙ  ７は、ＲＰＭＩ／Ｂ２７インスリン（−）培地で培養を行った。
・そして、Ｄａｙ  ８以降は、ＲＰＭＩ／Ｂ２７インスリン（＋）培地で培養を行った（Ｌｉａｎ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，２０１３，８，１６２−１７５）。Ｄａｙ  ８〜Ｄａｙ  １１の段階で、拍動する心筋細胞を確認することができた。
ｉＰＳＣ１−ＣＭは、ｉＰＳＣ１から分化・誘導された心筋細胞である。
【０１６１】
（定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析）
全ＲＮＡ試料は、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、製品添付の説明書に従って単離した。ＲＮＡ試料の濃度及び純度は、ＮＤ−１０００分光測光器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で測定し、ｃＤＮＡの調製は、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡社製）を用いて行った。定量的ＰＣＲ（ＱＴ−ＰＣＲ）は、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用い７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により行った。ｍＲＮＡの量は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量により標準化した。定量的ＰＣＲに用いたプライマーセットのヌクレオチド配列を表１に示す。
【０１６２】
【表１】
2018093823.tif 000002
【０１６３】
（ＦＡＣＳ解析）
分散処理した細胞をＰＢＳで一回洗浄し、一次抗体ＧＰＣ３抗体［Ｂ００２５Ｒ、Ｂｉｏｍｏｓａｉｃｓ社製］存在下で、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄し、二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８［Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製］とコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体）と４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリー（ＢＤ社製）にて測定を行った。
【０１６４】
（免疫組織化学染色法）
２４黒ウェルプレート（ｐｏｒｖａｉｒ  ｓｃｉｅｎｃｅ社製）上に播種したｉＰＳ細胞若しくはｉＰＳ細胞由来心筋細胞、又はこれらを混合した細胞を、ＰＢＳで一回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（武藤化学社製）で４℃で１５分間固定処理を行った。固定処理した細胞をＰＢＳ中０．５％トリトンＸ−１００で１０分間、室温で透過処理した。その後、２種類の一次抗体Ｏｃｔ３／４抗体［ＭＡＢ１７５９、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製］とＧＰＣ３抗体［Ｂ００２５Ｒ、Ｂｉｏｍｏｓａｉｃｓ社製］、又はＯｃｔ３／４抗体［ＭＡＢ１７５９、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製］と抗Ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ抗体［ａｂ５２８６２、ａｂｃａｍ社製］若しくは抗Ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｔ抗体［１３−１１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製］存在下で、細胞を４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ中１０％ＦＢＳで洗浄し、各々の一次抗体に対応する二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６［Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製］とコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体、抗ウサギＩｇＧ抗体、又は抗ラットＩｇＧ抗体）と室温で９０分間インキュベートし、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で細胞核を染色した後、蛍光顕微鏡（ＢＺ−９０００；キーエンス社製）を用いて蛍光観察を行った。
【０１６５】
［実験例１］ＧＰＣ３の発現解析
図１（ａ）は、ＥＳ細胞株（ＥＳＣ−１，２）、ｉＰＳ細胞株（ｉＰＳＣ−１，２）、及び正常心臓（Ｈｅａｒｔ）における、マイクロアレイによるＧＰＣ３発現解析結果である。ＮＩＨ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄａｔａｂａｓｅのデータを使用した。また、図１（ｂ）は、ｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣ１）、ｉＰＳ細胞から誘導された心筋細胞（ｉＰＳＣ１−ＣＭ）、及び正常心臓の心筋細胞（Ｈｅａｒｔ−１）における、ＲＮＡシークエンスによるＧＰＣ３の発現解析結果である。ＲＮＡシークエンス解析は以下の手順により行った。
ｉＰＳＣ１とｉＰＳＣ１−ＣＭからＲＮＡ抽出キット［ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）］を用いてＲＮＡを抽出し、ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により純度を確認後、ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  ｖ２（ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いてライブラリーを作製し、ＨｉＳｅｑ１５００（ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて解析を行った。ＲＮＡシークエンスより得られたリードカウントデータは正規化を行い、ＦＰＫＭ（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｐｅｒ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｒｅａｄｓ  ｍａｐｐｅｄ）値を算出した。算出式を下記に示す。
【０１６６】
【数１】
2018093823.tif 000003
【０１６７】
図１に示されるように、多能性幹細胞（ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞）においては、ＧＰＣ３の発現が観察された。一方、正常心臓の心筋細胞及びｉＰＳ細胞から分化・誘導された心筋細胞では、ＧＰＣ３の発現はほとんど観察されなかった。
【０１６８】
図２は、ｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣ１〜３）、ｉＰＳＣ１から分化・誘導された心筋細胞（ｉＰＳＣ１−ＣＭ）、及び正常心臓の心筋細胞（Ｈｅａｒｔ−１，２）における、ＧＰＣ３発現解析結果である。図２（ａ）は、定量的ＰＣＲによる解析結果であり、図２（ｂ）はＦＡＣＳ解析の結果である。
【０１６９】
図２に示されるように、ｉＰＳ細胞においては、ＧＰＣ３の発現が観察された。一方、ｉＰＳ細胞から分化・誘導された心筋細胞、及びの正常細胞の心筋細胞では、ＧＰＣ３の発現はほとんど観察されなかった。
【０１７０】
図３は、ｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣ１）及びｉＰＳＣ１から分化・誘導された心筋細胞（ｉＰＳＣ１−ＣＭ）における蛍光免疫染色でのＧＰＣ３染色観察像である。（ａ）はｉＰＳ細胞染色像であり、（ｂ）はｉＰＳＣ１由来心筋細胞染色像である。それぞれの細胞のマーカーとして、（ａ）ではＯｃｔ３／４、（ｂ）ではトロポニンＩを用いた。
【０１７１】
図３に示されるように、ｉＰＳ細胞においては、ＧＰＣ３の発現が観察された。一方、ｉＰＳ細胞から分化・誘導された心筋細胞では、ＧＰＣ３の発現はほとんど観察されなかった。
【０１７２】
［実験例２］ｉＰＳ細胞由来心筋細胞に対するＧＰＣ３特異的ＣＴＬの応答試験
（ｉＰＳ細胞に対するＧＰＣ３特異的ＣＴＬの応答試験）
ＨＬＡ−Ａ２拘束性のＧＰＣ３特異的ＣＴＬは、以前にＧＰＣ３由来ペプチド（配列番号２２：ＦＶＧＥＦＦＴＤＶ）を用いて樹立したクローンを使用した（国際公開第２００７／０１８１９９号）。
ＧＰＣ３特異的ＣＴＬを、ｉＰＳＣ１、又はｉＰＳＣ１から誘導した心筋細胞（ｉＰＳＣ１−ＣＭ）と共培養し、これらの細胞に対するＧＰＣ３特異的ＣＴＬの応答性を試験した。ＧＰＣ３特異的ＣＴＬの応答性は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより確認した。ＩＦＮ−γの検出は、ＥＬＩＳＰＯＴ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  ｓｅｔ（ＢＤ社）を用いて行った。まず、抗ヒトＩＦＮ−γ抗体をＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に１８時間コーティング処理を行った。その後、１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩにて２時間ブロッキングを行った。ＧＰＣ３特異的ＣＴＬ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）とｉＰＳ細胞（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を混合し、３７℃で２２時間培養した。ＧＰＣ３特異的ＣＴＬ／ｉＰＳ細胞比は、５：１で実験を行なった。その後、プレートを滅菌水で洗浄し、ビオチン化抗ヒトＩＦＮ−γ抗体と２時間、さらにストレプトアビジン-ＨＲＰと１時間反応させ、基質溶液にてＩＦＮ−γ陽性のスポットを検出した。スポットのカウントは、ＭＩＮＥ  ＭｉＮＥＲＶＡ  ＴＥＣＨ社の自動解析ソフトを用いて行った。
【０１７３】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を図４に示す。図４に示すように、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬは、ｉＰＳＣ１に対して高い応答性を示した。一方、ｉＰＳＣ１から誘導した心筋細胞であるｉＰＳＣ１−ＣＭに対しては、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬの応答性は顕著に低かった。
【０１７４】
（ｉＰＳ細胞及び心筋細胞に対するＧＰＣ３特異的ＣＴＬの応答試験）
ｉＰＳＣ１、又はｉＰＳＣ１から誘導した心筋細胞（ｉＰＳＣ１−ＣＭ）を、９６ウェルプレートにて培養し、５０〜６０％コンフルエントになったところで、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬを３×１０５ｃｅｌｌｓ添加して、３７℃で４８時間培養した。ＰＢＳで洗浄し、カルセインＡＭを用いて生細胞を蛍光標識後、各ウェルの蛍光強度を検出した。その結果を図５に示す。図５（ａ）は、ｉＰＳＣ１での結果であり、図５（ｂ）は、ｉＰＳＣ１−ＣＭでの結果である。棒グラフは、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬを添加しなかった場合（共培養なし）の蛍光強度を１としたときの、相対蛍光強度を示す。なお、図中、「不活化ＣＴＬ」は、熱処理により不活化したＧＰＣ３特異的ＣＴＬであり、不活化ＣＴＬと共培養した結果をネガティブコントロールとして示した。
【０１７５】
図５に示すように、ｉＰＳＣ１をＧＰＣ３特異的ＣＴＬと共培養したときには、生細胞はほとんど観察されなかったが、一方、ｉＰＳＣ１から誘導した心筋細胞（ｉＰＳＣ１−  ＣＭ）をＧＰＣ３特異的ＣＴＬと共培養したときには、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬを添加しなかった場合と同程度の生細胞が観察された。
【０１７６】
図４及び図５の結果から、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬは、ｉＰＳ細胞に対して応答性を示すが、ｉＰＳ細胞から誘導された心筋細胞に対しては応答性をほとんど示さないことが確認された。
【０１７７】
［実験例３］ＧＰＣ３ノックダウン細胞に対するＧＰＣ３特異的ＣＴＬの応答試験
（ＧＰＣ３ノックダウン細胞の作成）
ＧＰＣ３に対するｓｉＲＮＡであるＧＰＣ３  ｓｉＲＮＡ（配列番号２８：５’−ＧＧＡＧＧＣＵＣＵＧＧＵＧＡＵＧＧＡＡＵＧＡＵＡＡ−３’）を合成し、ｉＰＳ−Ｇ４に導入した。なお、ネガティブコントロールとして、ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｉＲＮＡ［ＡｌｌＳｔａｒｓ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）］を使用した。ＧＰＣ３  ｓｉＲＮＡによるノックダウン効果を定量的ＰＣＲ及びＦＡＣＳにより確認した。定量的ＰＣＲ及びＦＡＣＳによるＧＰＣ３  ｓｉＲＮＡのノックダウン効果の確認結果を図６に示す。図６（ａ）は定量的ＰＣＲによる確認結果であり。図６（ｂ）は、ＦＡＣＳによる確認結果である。図６の結果より、ＧＰＣ３  ｓｉＲＮＡ導入細胞では、ＧＰＣ３のノックダウン効果が確認された。
【０１７８】
（ＧＰＣ３ノックダウン細胞に対するＧＰＣ３特異的ＣＴＬの応答試験）
ＧＰＣ３特異的ＣＴＬを、ＧＰＣ３  ｓｉＲＮＡを導入したｉＰＳＣ１、又はｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｉＲＮＡを導入したｉＰＳＣ１と共培養し、これらの細胞に対するＧＰＣ３特異的ＣＴＬの応答性を試験した。ＧＰＣ３特異的ＣＴＬの応答性は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより確認した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、実験例２と同様に行った。
【０１７９】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を図７に示す。図７に示すように、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬは、ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｉＲＮＡを導入したｉＰＳＣ１に対して高い応答性を示した。一方、ＧＰＣ３  ｓｉＲＮＡを導入したｉＰＳＣ１に対しては、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬの応答性は顕著に低かった。図７の結果から、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬのｉＰＳ細胞に対する応答性は、ＧＰＣ３特異的であることが確認された。
【０１８０】
［実験例４］ｉＰＳ細胞と心筋細胞との細胞混合物に対するＧＰＣ３特異的ＣＴＬの応答試験
ｉＰＳＣ１とｉＰＳＣ１−ＣＭとを１：２０の割合で混合し、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬを３×１０６ｃｅｌｌｓ添加して、３７℃で４８時間、共培養を行った。なお、ｉＰＳＣ１は、ＦＡＣＳ解析のために、ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒＧｒｅｅｎ  ＣＭＦＤＡ［Ｃ７０２５（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）］で染色したものを用いた。共培養後、ＦＡＣＳ解析を行った。
【０１８１】
ＦＡＣＳ解析の結果を図８に示す。図８（ａ）がＦＡＣＳ解析の結果であり、図８（ｂｂ）はＦＡＣＳ解析の結果を数値化したものである。図８に示すように、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬと共培養した場合（共培養あり）には、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬと共培養しなかった場合（共培養なし）と比較して、ｉＰＳＣ１の割合は大きく低下した。
【０１８２】
次に、ｉＰＳＣ１とｉＰＳＣ１−ＣＭとの細胞混合物、及びＧＰＣ３特異的ＣＴＬを共培養した後の細胞を、免疫組織化学染色し、蛍光観察を行った。その結果を図９に示す。図９（ａ）は、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬと共培養した場合であり、図９（ｂ）は、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬと共培養しなかった場合である。図９に示すように、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬと共培養しなかった場合には、Ｏｃｔ３／４を発現するｉＰＳ細胞が観察された。一方、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬと共培養した場合には、Ｏｃｔ３／４を発現するｉＰＳ細胞はほとんど観察されなかった。
【０１８３】
図８及び９の結果から、ＧＰＣ３特異的ＣＴＬは、ｉＰＳ細胞と心筋細胞との細胞混合物において、ｉＰＳ細胞のみを選択的に除去できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１８４】
本発明によれば、未分化幹細胞から誘導された分化細胞の調製時及び移植後の生体内において、分化細胞に影響を与えることなく未分化幹細胞のみを選択的に除去する技術が提供される。本発明の技術は、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の未分化幹細胞から分化・誘導された移植用細胞の調製、及び移植後の奇形腫形成予防や治療に適用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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