(57)【要約】【課題】高い２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有する微生物、組成物、及びポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、形質転換体、当該ポリペプチドの製造方法、並びにクエルシトールの製造方法を提供する。【解決手段】本発明に係る微生物は、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有する。前記微生物は、クリプトコッカス・ポゾリカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ）  ＮＤ−１（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２２８２）であることが好ましい。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有する微生物。
【請求項２】
前記微生物がクリプトコッカス・ポゾリカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ）  ＮＤ−１（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２２８２）である請求項１記載の微生物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の微生物の抽出物を含み、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有する組成物。
【請求項４】
以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のポリペプチド：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチド
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチド。
【請求項５】
以下の（ａ’）から（ｄ’）のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（ａ’）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ’）配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ’）配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ’）配列番号２に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５記載のポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドの上流に連結されたプロモーター配列、及び前記ポリヌクレオチドの下流に連結されたターミネーター配列を含む発現カセット。
【請求項７】
請求項６記載の発現カセットを含有するベクター。
【請求項８】
請求項７記載のベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項９】
請求項１もしくは２記載の微生物、または請求項８記載の形質転換体を培養することを含む、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
請求項１もしくは２記載の微生物、請求項３記載の組成物、請求項４記載のポリペプチド、又は請求項８記載の形質転換体により、２−デオキシ−シロ−イノソースをクエルシトールへ変換することを含む、クエルシトールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−デオキシ−シロ−イノソース（以下、「ＤＯＩ」もいう。）還元活性を有する微生物、特に、ＤＯＩをクエルシトールへ変換する微生物に関する。また、当該微生物の抽出物を含み、ＤＯＩ還元活性を有する組成物、特に、ＤＯＩを還元する粗酵素液を含む組成物、ＤＯＩを還元する酵素並びに当該酵素遺伝子、さらに当該酵素の製造方法に関する。より詳しくは、ＤＯＩを資化するクリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）真菌、当該微生物より単離されたＤＯＩを還元する酵素、及び当該微生物の利用方法、当該微生物を培養することによりＤＯＩを還元する酵素を製造する方法に関する。さらに、当該クリプトコッカス属真菌より単離された当該酵素遺伝子並びに当該酵素遺伝子発現ベクターにより形質転換された当該形質転換体を培養することによりＤＯＩを還元する酵素を製造する方法に関する。加えて、当該微生物、当該組成物、当該酵素、又は当該形質転換体を用いた、クエルシトールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、イノシトール類縁体において様々な生物学的活性が見出されており医薬品としての利用に注目が集まっている。例としてイノシトールの立体異性体の一つであるシロ−イノシトールはマウスの脳においてアミロイドベータの凝集を抑制する働きが報告されており、マウスの記憶障害を回復させアミロイドベータ斑の形成を抑制するという結果が報告されている（非特許文献１）。またＤ−キロ−イノシトールを無月経や不妊の原因疾患である多嚢胞性卵巣症候群の患者に対して経口投与したところインスリン抵抗性および排卵機能の改善がみられたことが報告されている（非特許文献２）。Ｄ−キロ−イノシトールの鏡像異性体であるＬ−キロ−イノシトールはラットを用いた実験により腎臓におけるグルコースの再吸収を抑制する働きがあることが確認されている（非特許文献３）。
【０００３】
イノシトールの水酸基を１つ外した化合物を一般にクエルシトール（デオキシイノシトール）と呼び、近年そのクエルシトールにおいてもイノシトール同様、有用な生物学的活性が見出されている。Ｌ−キロ−イノシトールの６位の水酸基が外れた化合物である（−）−ビボ−クエルシトールは、高血糖状態のマウスに対して経口投与した際に血糖値を下げる働きがあることが報告されている（特許文献１）。さらに（−）−ビボ−クエルシトールを出発原料として合成されるアミノデオキシクエルシトールやアンヒドロクエルシトールにはグルコシダーゼ阻害剤やグルコセレブロシダーゼ阻害剤としての働きが報告されており、ライソゾーム病やゴーシェ病などの難治性疾患の病理解明に役立つことが期待されている（非特許文献４、非特許文献５）。またクエルシトールのような糖アルコールは大量の潜熱を吸熱および放熱することのできる物性を有しており、排熱利用、太陽熱の蓄熱等の技術分野で大きな注目を集めている。特に（−）−ビボ−クエルシトールは高い安全性を有し耐熱性および繰り返し安定性に優れる蓄熱材として利点を有しておりその実用化が試みられている（特許文献２）。
【０００４】
（−）−ビボ−クエルシトールの１位の水酸基が逆向きに配座した化合物であるシロ−イノシトールは、ウラジロガシの樹皮やアカガシの幹に含まれるシロ−イノシトール−ガラートの構成成分である。シロ−イノシトール−ガラートは枯草菌、大腸菌、緑膿菌に抗菌作用を示すことが報告されている（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。
【０００５】
クエルシトールには有用な生理活性や物性を示すものが数多く存在する。さらに、クエルシトールは有用な医薬品、工業品の出発原料となる。しかしながらこれらのクエルシトール異性体は天然には希少であり、一般には入手しづらい傾向にある。
【０００６】
（−）−ビボ−クエルシトールの獲得方法として、ガガイモ科植物の葉１ｋｇからメタノール抽出、クロロホルム抽出、カラムクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィーを経て、２２  ｍｇの（−）−ビボ−クエルシトールしか得られなかったことが報告されている（非特許文献９）。
【０００７】
ミオ−イノシトールにアグロバクテリウム属またはサルモネラ属に属する微生物を作用させ、（＋）−プロト−クエルシトール、（＋）−エピ−クエルシトール、（−）−ビボ−クエルシトールの製造を試みたが、上記３つのクエルシトールの混合物が得られるため、同様な性質のクエルシトールの分離の必要性があった（特許文献１）。
【０００８】
ミオ−イノシトールにエンテロバクター属に属する微生物を作用させ、（−）−ビボ−クエルシトールの製造を試み、４０００ｇのミオ−イノシトールから１０４０ｇの精製（−）−ビボ−クエルシトールを製造した報告がある（特許文献３）。
【０００９】
一方で、ミオ−イノシトールを出発原料として有機合成により（±）−ビボ−クエルシトールを合成する方法（非特許文献１０）、１，４−シクロヘキサジエンを出発原料として有機合成により（±）−ビボ−クエルシトールを合成する方法（非特許文献１１）が報告されているが、大量に製造することは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０００−４８９０号公報
【特許文献２】特開２０１０−２１５８７６号公報
【特許文献３】特開２００５−７０号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｍｃｌａｕｒｉｎ等，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ１２，８０１（２００６）
【非特許文献２】Ｎｅｓｔｌｅｒ等，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ３４０，１３１４（１９９９）
【非特許文献３】Ｓｉｌｂｅｒｎａｇｌ等，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，ｖｏｌ２８４，１１８１（２００３）
【非特許文献４】Ｏｇａｗａ等，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ９，１４９３（１９９９）
【非特許文献５】Ｏｇａｗａ等，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ１３，４３０６（２００５）
【非特許文献６】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ等，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ２５，２５９９（１９８６）
【非特許文献７】Ｓｅｒｉｔ等，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ５５，１９（１９９１）
【非特許文献８】Ｓｅｒｉｔ等，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ５５，１８９３（１９９１）
【非特許文献９】Ａｂｅａ等，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ４７，１２９７（１９９８）
【非特許文献１０】ＭｃＣａｓｌａｎｄ等，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ７５，４０２０（１９５３）
【非特許文献１１】Ｓａｌａｍｓｉ等，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，ｖｏｌ２７，２２２３（１９９７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者等は、クエルシトールを製造するための出発原料として、２−デオキシ−シロ−イノソースに着目し、２−デオキシ−シロ−イノソースを効率よく還元することにより、大量のクエルシトールが製造できる可能性があるとの着想を得た。本発明は、上記現状に鑑み、高い２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有する微生物、組成物、及びポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、形質転換体、当該ポリペプチドの製造方法、並びにクエルシトールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、新潟県新潟市西区の土壌より２−デオキシ−シロ−イノソースをクエルシトールへ変換するクリプトコッカス・ポゾリカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ）を単離した。また、本発明者等は、当該クリプトコッカス・ポゾリカスより菌体破砕液、粗酵素液又は精製酵素を含む組成物を製造すること、当該クリプトコッカス・ポゾリカスより２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を宿主細胞で発現させることにより本還元酵素を製造すること、及び当該クリプトコッカス・ポゾリカス、当該組成物、当該還元酵素、または当該宿主細胞を用いて、クエルシトールを製造することに成功した。このようにすることで、本発明者等は、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１０）を提供するものである。
（１）２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有する微生物。
（２）前記微生物がクリプトコッカス・ポゾリカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ）  ＮＤ−１（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２２８２）である（１）記載の微生物。
（３）（１）又は（２）に記載の微生物の抽出物を含み、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有する組成物。
（４）以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のポリペプチド：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチド
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチド
（５）以下の（ａ’）から（ｄ’）のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（ａ’）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ’）配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ’）配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ’）配列番号２に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（６）（５）記載のポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドの上流に連結されたプロモーター配列、及び前記ポリヌクレオチドの下流に連結されたターミネーター配列を含む発現カセット。
（７）（６）記載の発現カセットを含有するベクター。
（８）（７）記載のベクターによって形質転換された形質転換体。
（９）（１）もしくは（２）記載の微生物、または（８）記載の形質転換体を培養することを含む、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチドの製造方法。
（１０）（１）もしくは（２）記載の微生物、（３）記載の組成物、（４）記載のポリペプチド、又は（８）記載の形質転換体により、２−デオキシ−シロ−イノソースをクエルシトールへ変換することを含む、クエルシトールの製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、高い２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有する微生物、組成物、及びポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、形質転換体、当該ポリペプチドの製造方法、並びにクエルシトールの製造方法を提供することができる。より詳しくは、高効率で２−デオキシ−シロ−イノソースをクエルシトールへ変換する微生物を提供することができる。また、当該微生物を用いた高効率な粗酵素液の製造方法を提供することができる。また、当該微生物より２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子を単離し、当該遺伝子を宿主細胞で発現させることによる高効率な当該還元酵素の製造方法を提供することができる。本発明によって、医薬品、工業品の製造原料として広く普及することが期待されているクエルシトールを、簡便かつ大量に効率よく製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ガスクロマトグラフ質量分析機による培養上清中及び細胞抽出液中のクエルシトールの測定を示す図である。Ａは０時間の培養液のクロマトグラムを示し、Ｂは微生物を培地に播種し培養を開始してから１５時間後の培養液のクロマトグラムを示し、Ｃは培養１５時間後の菌体の細胞抽出液のクロマトグラムを示す。
【図２】粗精製酵素を用いた２−デオキシ−シロ−イノソースの変換を示す図である。上段の図は粗酵素液を加えていない反応条件下での結果を示し、中段の図はＤＯＩとＮＡＤＨ、粗酵素液を用いた条件下での結果を示し、下段の図はＤＯＩとＮＡＤＰＨ、粗酵素液を用いた条件下での結果を示す。
【図３Ａ】イノシトールデヒドロゲナーゼのアライメント比較を示す図である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８、Ｄｏｔｈｉｓｔｒｏｍａ  ｓｅｐｔｏｓｐｏｒｕｍ  ＮＺＥ１０、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ．  ｇｒｕｂｉｉ  Ｈ９９、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ  ＩＮＤ１０７、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ｍｅｌｏｎｉｓ  ２６４０６、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＣＢＳ  ５１３．８８、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ  ＩＦＯ  ４３０８、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ  Ｃｇ−１４、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ  ＰＨ−１のイノシトールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を用いてアライメント比較を行った。枠線で囲まれた部分はアミノ酸配列の保存性を視覚化するソフトウェアであるＷｅｂｌｏｇｏを用いて図示した領域である。
【図３Ｂ】イノシトールデヒドロゲナーゼにみられるアミノ酸配列の保存領域を示す図である。
【図４】Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ  ＮＤ−１染色体ＤＮＡからクローニングした２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子の全領域を含むＤＮＡ配列を示す図である。
【図５】２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子の完全長ｃＤＮＡ配列を示す図である。先頭と末尾の小文字のアルファベットで記述された塩基配列はそれぞれ５’非翻訳領域と３’非翻訳領域を示す。
【図６】２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子の塩基配列と転写・翻訳後のアミノ酸配列とを示す図である。大文字の塩基配列はエクソン、小文字の塩基配列はイントロンを示す。ＧＣＧＲＭＧはＮＡＤ結合モチーフを示し、ＥＫＰは糖酸化還元酵素にみられる共通配列を示す。
【図７】組換えＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ  ＮＤ−１  ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素（ＤＯＩＲ）の精製に関する１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１：マーカー、レーン２：ＢＬ２１／ｐＴＹＢ１１細胞破砕液上清、レーン３：ＢＬ２１／ｐＴＹＢ１１−ＤＯＩＲ（ＩＰＴＧ−）細胞破砕液上清、レーン４：ＢＬ２１／ｐＴＹＢ１１−ＤＯＩＲ（ＩＰＴＧ＋）細胞破砕液上清、レーン５：キチンビーズカラム非吸着画分、レーン６：Ｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎｅ含有自己切断ｂｕｆｆｅｒによる溶出画分、レーン７：（＋／−）−Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ含有自己切断ｂｕｆｆｅｒによる溶出画分。レーン７にＤＯＩＲの単一バンドが確認できる。
【図８】２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯＩ）還元酵素の至適温度（Ａ）と至適ｐＨ（Ｂ）を示す図である。至適温度は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、５ｍＭ  ＤＯＩ、０．４ｍＭ  ＮＡＤＨ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０の条件で行った。至適ｐＨは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、５ｍＭ  ＤＯＩ、０．４ｍＭ  ＮＡＤＨ、１００ｍＭ  ＮａＣｌの条件で、ｐＨを６．０から９．０まで変動させて、測定を行った。エラーバーは独立した３回の実験による標準誤差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明で製造されるクエルシトールは、好ましくは、包含される数種の立体異性体のうち、下記一般式（ａ）で表される（−）−ビボ−クエルシトール、及び（ｂ）で表されるシロ−クエルシトールからなる群から選ばれるものである。
【００１８】
【化１】
2018000012.tif 000003
【００１９】
（２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有する微生物の単離）
本発明に係る微生物は、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有する微生物、特に、２−デオキシ−シロ−イノソースをクエルシトールへ変換する微生物である。本発明の微生物は土壌、堆肥、活性汚泥、河川、海水などの環境中より単離することができる。微生物の単離には種々の方法が知られており（農芸化学実験書、第２巻）、本発明においては、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有する微生物、特に、２−デオキシ−シロ−イノソースをクエルシトールへ変換する微生物を単離できればどのような単離方法を用いてもよい。一例として、環境から得られた種々のサンプルを滅菌した水や生理的食塩水に懸濁し、菌体懸濁液を作製する。この懸濁液を適当な菌濃度に希釈後、２−デオキシ−シロ−イノソースを唯一または主な炭素源として含有する固体培地上に塗布し、菌株の生育できる温度で培養する。培養温度は微生物が生育できる温度であれば特に制限されない。また、培地中に加える２−デオキシ−シロ−イノソースはどのような形状のものであっても利用できるが、溶液が好適である。加える濃度は特に制限されない。
【００２０】
また、種々のサンプルより調製した菌体懸濁液を、２−デオキシ−シロ−イノソースを唯一または主な炭素源とする培地中に添加し、培養することにより、当該微生物を濃縮することもできる。その後、前記方法によって当該微生物を単離することができる。
【００２１】
本発明に係る、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有する微生物、特に、２−デオキシ−シロ−イノソースをクエルシトールへ変換する微生物の好適な単離例は次のとおりである。
【００２２】
２−デオキシ−シロ−イノソースを主な炭素源とする固体培地（ＭＹ固体培地）に種々のサンプルより調製した菌体懸濁液を塗布し、３０℃で培養し、コロニーを形成させる。炭素源の２−デオキシ−シロ−イノソースは、全培地中、０．１〜１０質量％、好ましくは０．５〜５質量％添加する。
【００２３】
これらのコロニーを２−デオキシ−シロ−イノソースを唯一の炭素源とする最少液体培地（ＳＤｏｉ液体培地）で培養し、その培養上清中や、菌体破砕液中の成分分析をガスクロマトグラフ質量分析計で行い、特にクエルシトールに関する検出を行う。
【００２４】
このようにして、２−デオキシ−シロ−イノソースをクエルシトールへ変換する微生物を１種類単離した。この菌株の同定は、顕微鏡による形態観察、２６ＳリボゾーマルＤＮＡのＤ１／Ｄ２（ドメイン１及び２：可変領域）及びリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ（内部転写スペーサー領域）の配列比較により行うことができる。本菌株を同定した結果、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓであることが明らかになり、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ  ＮＤ−１と命名した（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２２８２）。
【００２５】
（粗酵素液による２−デオキシ−シロ−イノソースのクエルシトールへの変換）
本発明に係る組成物は、本発明に係る微生物の抽出物を含み、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有する。当該組成物の具体例としては、当該微生物から調製される粗酵素液を含む組成物が挙げられる。当該粗酵素液は、例えば、以下の通りにして調整することができる。
【００２６】
２−デオキシ−シロ−イノソースをクエルシトールへ変換する微生物をＳＤｏｉ液体培地で培養し菌体を回収後、菌体を破砕用緩衝液で懸濁し、ガラスビーズを加えて物理的に破砕した。破砕液を遠心し、上清を遠心式限外濾過フィルターで濃縮し、粗酵素液とした。
【００２７】
上記粗酵素液と、ＤＯＩと、補酵素ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨとを含む溶液を調製し、３０℃の条件で２時間反応させ、ガスクロマトグラフ質量分析機で分析した結果、（−）−ビボ−クエルシトールとシロ−クエルシトールが検出された。
【００２８】
（２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子のクローニング）
１．２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子の探索
目的の酵素は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素として利用する酸化還元酵素、特に、２−デオキシ−シロ−イノソースをクエルシトールへと変換する様式から類似の作用機序を持つイノシトールデヒドロゲナーゼに近縁な酵素である可能性が高いことから、様々な微生物のイノシトールデヒドロゲナーゼのアライメント比較を行い、保存領域を推定する。
【００２９】
２．２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子の部分断片増幅
前記項目１．で推定された保存領域情報から、２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子情報部分のＤＮＡ配列に相補的な縮重プライマーを作製し、調製されたゲノムＤＮＡをもとにＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により、２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子の部分ＤＮＡ断片を増幅する。
【００３０】
３．２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素ゲノムＤＮＡ遺伝子のクローニング
前記項目２．で取得される部分ＤＮＡ配列をもとにインバースＰＣＲ法により、当該部分ＤＮＡ配列の上流と下流のＤＮＡ配列の決定を行う。まず、前記ＮＤ−１株から抽出される染色体ＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩで処理し、断片化したＤＮＡにＴ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅを作用させ自己環化反応を行う。反応液をテンプレートとしてＰＣＲ法により２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅を行う。得られたＰＣＲ反応液をテンプレートとして、ネストＰＣＲ法によりＤＮＡ断片の増幅を行う。その結果、オープンリーディングフレイム（ＯＲＦ）全領域を含む２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子を取得することができる。
【００３１】
４．２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素ｃＤＮＡ遺伝子のクローニング
前記ＮＤ−１株から全ＲＮＡを調製し、逆転写ＰＣＲを応用した３’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）法及び５’ＲＡＣＥ法により、２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素をコードする遺伝子のｃＤＮＡの５’側部位と３’側部位を増幅する。増幅された部位の塩基配列の解析により、完全長２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素ｃＤＮＡ遺伝子を獲得する。
【００３２】
本発明に係る２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子の好適な例として、本発明に係るポリヌクレオチド、即ち、以下の（ａ’）から（ｄ’）のいずれかに記載のポリヌクレオチドが挙げられる。
（ａ’）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（即ち、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ  ＮＤ−１（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２２８２）由来の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子）
（ｂ’）配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ’）配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ’）配列番号２に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００３３】
また、本発明に係る２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素の好適な例として、本発明に係るポリペプチド、即ち、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のポリペプチドが挙げられる。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチド
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、２−デオキシ−シロ−イノソース還元活性を有するポリペプチド。
【００３４】
ここでストリンジェントな条件とは、例えば塩濃度は６ｘＳＳＣ、温度が６８℃、の条件をいう（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ））。また、「１もしくは複数」とは、通常、３アミノ酸以内を指し、好ましくは２アミノ酸以内である。更に、上記相同性は、９０％以上であり、９２％以上が好ましく、９５％以上（９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）がより好ましい。アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
【００３５】
（２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素の製造方法）
１．２−デオキシ−シロ−イノソースをクエルシトールへと変換する微生物からの２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素の製造
本菌株の培養には、種々の炭素源、窒素源、無機塩類および有機栄養源を任意に用いることができる。炭素源としては、例えばグルコース、ショ糖、油脂などが利用できる。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。また、精米時に大量に得られる米糠や砂糖の生産時に副生する糖蜜等も培地として用いることもできる。
【００３６】
培養温度は、その菌が生育可能な温度であればよい。培養時間は菌体を効率よく生産できる時間であれば特に制限はない。このような培養で得られた培養液は菌体製剤として利用することができる。また、菌体培養液を遠心分離などによって培養液と菌体とにそれぞれ分離して利用することもできる。後者は菌体製剤として利用できる。また、培養液より種々の方法によって精製された２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素を利用することもできる。
【００３７】
２．２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子を用いた２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素の製造
クローニングされた２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子を宿主で発現させることにより、当該２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素を製造することができる。前記２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子クローニングで得られた形質転換株は、当該２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素を発現している。本形質転換株を、２−デオキシ−シロ−イノソースをクエルシトールへと変換する菌体製剤として利用することができる。
【００３８】
また、当該遺伝子のより効率的な発現を行なうため、種々の宿主・ベクター系を利用することができる。宿主・ベクター系として細菌、酵母、動物細胞等の系を利用することができるが、効率よく当該遺伝子を発現、製造できれば特に制限されない。クローニングされた２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子が当該遺伝子の発現に必要なプロモーター、ターミネーターを有し、かつ宿主内で発現できる場合はそのまま利用することができる。また、２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子をコードするＤＮＡに種々のプロモーターおよびターミネーターを接続した発現カセットを作製し、本発現カセットをベクターに組込むことにより当該発現ベクターを構築することができる。
【００３９】
一例として大腸菌を利用する場合、効率よく遺伝子発現を行なうために種々の発現ベクターが構築されている。ラクトースオペロンのプロモーター、トリプトファンオペロンのプロモーター、前２種類の融合プロモーターおよびλファージのプロモーター等の下流に当該遺伝子を接続し、当該遺伝子の下流にターミネーターを接続した２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素発現カセットを構築することができる。ターミネーターにはｒｒｎターミネーターなどが利用されうるが、特に制限されるものではない。
【００４０】
このようにして作製された発現カセットを宿主内で複製、維持されるベクターに導入することにより２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素発現ベクターを構築することができる。作製された発現ベクターを宿主に形質転換し、２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素形質転換株を作製することができる。
【００４１】
本形質転換株の培養には、種々の炭素源、窒素源、無機塩類および有機栄養源を任意に用いることができる。炭素源としては、例えばグルコース、ショ糖、糖蜜、油脂などが利用できる。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
【００４２】
培養温度は、その形質転換株が生育可能な温度であればよい。培養時間は２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素を効率よく生産できる時間であれば特に制限はない。このようにして２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素を効率よく製造することができる。
【００４３】
（クエルシトールの製造方法）
本発明に係る微生物、組成物、ポリペプチド、又は形質転換体により、２−デオキシ−シロ−イノソースをクエルシトールへ変換することで、クエルシトールを製造することができる。より具体的には、例えば、適当な緩衝液中で、当該微生物、組成物、ポリペプチド、又は形質転換体と２−デオキシ−シロ−イノソースとを接触させて、２−デオキシ−シロ−イノソースの還元反応を促進することにより、２−デオキシ−シロ−イノソースをクエルシトールへ変換することができる。当該還元反応は、反応の効率等から、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等の補酵素の存在下で行うことが好ましい。反応条件は、上記還元反応が進む限り、特に限定されない。例えば、反応温度は、好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは２０〜４５℃、更により好ましくは３０〜４２℃である。反応時のｐＨは、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５である。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によりその技術的範囲を限定されるものではない。なお、実施例において、特に断らない限り、物質の含有量又は添加量を表す「％」は「質量％」を意味する。
【００４５】
（実施例１）２−デオキシ−シロ−イノソースをクエルシトールへ変換する微生物の単離
２−デオキシ−シロ−イノソース（粉末）は新潟バイオリサーチパーク株式会社より提供された。新潟県新潟市西区の土壌より得られた菌体懸濁液をＭＹ固体培地（表１）上に塗布し、３０℃で培養した。コロニーを形成した微生物をＳＤｏｉ液体培地（表２）で３０℃の条件下で培養した。１００μｌの培養液を１８０００×ｇで１分間遠心し、２０μｌの培養上清を遠心濃縮機で乾固させ、培養上清サンプルとして用いた。また、遠心により沈殿した菌体を回収後、菌体濃度が１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように蒸留水で懸濁後、等量のクロロホルムとガラスビーズを用いて菌体を破砕し、菌体破砕液を得た。菌体破砕液を１８０００×ｇで３０分間遠心し上清を回収した。得られた上清５０μｌを乾固させ菌体破砕液サンプルとして用いた。乾固させたそれぞれのサンプルを２００μｌのピリジン（ＷａＫｏ社）で懸濁した。懸濁液に２０μｌのメトキシアミン塩酸塩（シグマ  アルドリッチ社、１０ｍｇ／ｍｌピリジン溶液）を加え、３０℃で９０分間反応させメトオキシム化した。反応液に４０μｌのＢＳＴＦＡ＋ＴＭＣＳ，９９：１（シグマ  アルドリッチ社）を加え８０℃で３０分間反応させトリメチルシリル化した。誘導体化したサンプルをガスクロマトグラフ分析機に１μｌ注入し分析した。ガスクロマトグラフ質量分析機による培養上清中及び菌体破砕液中のクエルシトールの分析にはＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０ＳＥ（島津社）を使用し、カラムはＤＢ−５ＭＳ  ３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５ｍｍ（アジレント・テクノロジー社）、試料の注入にはＡＯＣ−２０ｉ（島津社）を使用し、ＧＣＭＳ  ｓｏｌｕｔｉｏｎソフトウェア（島津）を用いて解析した（表３）。ＧＣＭＳ分析条件は表４に示す。カラムオーブン温度の初発温度は８０．０℃に設定、気化室温度は２８０．００℃に設定した。注入モードは注入した試料の一部をカラムに導入する方法であるスプリット注入法を用いた。キャリアガスの制御は線速度が一定になるように圧力を制御する方式である線速度モードに設定した。線速度はキャリアガスがカラム内を１秒間に進む長さ（線速度）をｃｍ単位で設定した値を示し、４３．０ｃｍ／秒に設定した。圧力はカラム入口圧力の値を示し、全流量はカラム流量とスプリット流量、パージ流量の合計を示す。カラム内の体積流量の設定値を示すカラム流速は１．３６ｍｌ／分に設定した。パージ流量はセプタムパージ流量の設定値を示し５．０ｍｌ／分に設定した。スプリット比はスプリット流量とカラム流量の比の設定値を示し１０：１に設定をした。スプリット流量は試料注入後のスプリットベントへ排出する際の流量を示す。分析中のカラムオーブンの温度制御は表５に示した。ＧＣプログラムの設定値は表６に示した。マイクロスキャン幅はマイクロスキャン測定を行う場合のスキャン幅の設定値を示す。ＳＩＭ測定の場合、設定したｍ／ｚ値にＭＳの制御を固定してデータを採取する。マイクロスキャンは、その質量を中心に、ＭＳを微少範囲スキャンしてデータを採取する測定法である。単位は原子質量単位（ａｍｕ）で示した。イオン源温度は２００．００℃に設定した。イオン源は試料に電子ビームを照射し、イオン化させ、そのイオンを取り出す働きをする。インターフェース���度はＭＳに繋がっているＧＣ温調ポートの温度設定値を示し２８０．００℃に設定した。溶媒溶出時間は試料注入後から溶媒が溶出し終えるまでの時間の設定値を示し、設定時間経過後フィラメントが点灯する。検出器ゲインモードは検出器に印加する電圧値の設定を示し、チューニング結果からの相対値は使用するチューニングファイルの設定電圧からの相対値を設定に用いていることを表す。検出器ゲインは検出器のゲインの設定値を示す。しきい値はノイズカットレベルの設定値を示す。ＭＳ設定値は表７に示した。ＭＳ部はＦａｓｔ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｃａｎ／ＳＩＭ  Ｍｏｄｅ（ＦＡＳＳＴ）を使用して分析を行った。ＦＡＳＳＴモードはスキャンモードとＳＩＭモードの２つを交互に切り替えて測定することができるため、スキャンモードによる定性能とＳＩＭモードによる高感度を両立することができる。試料注入後から３．５０分までを溶媒溶出時間に設定し、３．５０分から１４．００分までを解析時間に設定した。さらに解析時間３．５０分から１０．００分までをグループ１、１０．００分から１４．００分までをグループ２として別々の条件で解析を行った。ＦＡＳＳＴモードでは各グループに対してイベント１とイベント２の２つの測定条件を割り当てることができるため、スキャンモードをイベント１に、ＳＩＭモードをイベントの２に設定し、イベント１の条件で０．１０秒間測定を行いイベント２の条件で０．２０秒間測定を行った。グループ１−イベント１は３５．００ｍ／ｚから７００．００ｍ／ｚをスキャン速度１００００ａｕｍ／秒の条件でスキャンモードによる測定を行った。グループ１−イベント２はチャネル１（Ｃｈ１）を４７９．００ｍ／ｚ、チャネル２（Ｃｈ２）を４４８．００ｍ／ｚ、チャネル３（Ｃｈ３）を２４４．００ｍ／ｚ、チャネル４（Ｃｈ４）を２１７．００ｍ／ｚ、チャネル５（Ｃｈ５）を１９１．００ｍ／ｚ、チャネル６（Ｃｈ６）を１４７．００ｍ／ｚに設定し、各チャネルに設定した質量電荷比を選択的に検出するＳＩＭモードによる測定を行った。グループ２−イベント１はグループ１−イベント１と同様の設定で行った。グループ２−イベント２はチャネル１（Ｃｈ１）を５２４．００ｍ／ｚ、チャネル２（Ｃｈ２）を４１９．００ｍ／ｚ、チャネル３（Ｃｈ３）を３４４．００ｍ／ｚ、チャネル４（Ｃｈ４）を３１８．００ｍ／ｚ、チャネル５（Ｃｈ５）を３０５．００ｍ／ｚ、チャネル６（Ｃｈ６）を２１７．００ｍ／ｚに設定し、各チャネルに設定した質量電荷比を選択的に検出した。得られたクロマトグラムはＧＣＭＳ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎソフトウェアを用いて解析を行った（図１）。
【００４６】
【表１】
2018000012.tif 000004
【００４７】
【表２】
2018000012.tif 000005
【００４８】
【表３】
2018000012.tif 000006
【００４９】
【表４】
2018000012.tif 000007
【００５０】
【表５】
2018000012.tif 000008
【００５１】
【表６】
2018000012.tif 000009
【００５２】
【表７】
2018000012.tif 000010
【００５３】
（実施例２）変換微生物の同定
ｒＤＮＡ配列を用いた微生物の同定法により、ＮＤ−１株の同定を行った。前記株から染色体ＤＮＡを抽出し（実施例３）、ＩＴＳ４プライマー（配列番号３）、ＩＴＳ５プライマー（配列番号４）を用いてＰＣＲ法によりその菌株の２６ＳリボゾーマルＤＮＡのＤ１／Ｄ２（ドメイン１及び２：可変領域）を増幅した。増幅ＤＮＡをＴ−ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）にクローニング後、同Ｄ１／Ｄ２領域の約６００塩基の配列を決定した。また、染色体ＤＮＡをもとにＮＬ−１プライマー（配列番号５）、ＮＬ−４プライマー（配列番号６）を用いてＰＣＲ法によりその菌株のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ（内部転写スペーサー領域）のＩＴＳ１領域から５．８ＳリボゾーマルＤＮＡ領域を含めたＩＴＳ２領域までを増幅した。増幅ＤＮＡをＴ−ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）にクローニング後、同ＩＴＳ１／５．８Ｓ／ＩＴＳ２領域の約５８０塩基の配列を決定した。それぞれの塩基配列はＤＤＢＪにＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ２６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ，  ｐａｒｔｉａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ，  ｓｔｒａｉｎ：  ＮＤ−１（登録番号ＬＣ１５５９３８）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  １８Ｓ  ｒＲＮＡ，  ＩＴＳ１，  ５．８Ｓ  ｒＲＮＡ，  ＩＴＳ２，  ２８Ｓ  ｒＲＮＡ，  ｐａｒｔｉａｌ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ，  ｓｔｒａｉｎ：  ＮＤ−１（登録番号ＬＣ１５５９３７）として登録されている。
【００５４】
それぞれのｒＤＮＡ塩基配列をもとに、ＮＣＢＩのＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）のプログラムを利用して配列の比較を行った。その結果、ＮＤ−１株はＤ１／Ｄ２領域の比較解析結果からＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ  ＡＴＴ２０４株（ＦＪ７４３６２０）と９９％  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙを示した。また、ＮＤ−１株はＩＴＳ１／５．８Ｓ／ＩＴＳ２領域の比較解析結果からＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ  ＩＭＵＦＲＪ  ５２００８株（アセッション番号ＦＮ４２８９２４）と９９％  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙを示した。以上から、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ  ＮＤ−１と命名した（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２２８２）。
【００５５】
（実施例３）染色体ＤＮＡの調製
Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ  ＮＤ−１（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２２８２）を３ｍｌのＹＰＤ培地（表８）に播種し３０℃で振盪培養を行った。菌体を回収し１ｍｌのＷｅｓｔａｓｅ溶液（表９、表１０）に懸濁した後、３７℃で４５分間穏やかに振盪した。懸濁液を５００×ｇで１０分間遠心後、菌体を回収し２５０μｌの溶解用緩衝液（表１１）を加え混和し７０℃で１５分間恒温した。１０ｍｇ／ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（タカラバイオ社）溶液を１００μｌ加え３７℃で３０分間恒温した。５Ｍ酢酸カリウム（ＷａＫｏ社）を５０μｌ加え氷中で３０分間恒温した。１８０００×ｇで５分間遠心を行い上層を別のチューブへ移し、等量のフェノール／クロロホルムを加えて撹拌した。１８０００×ｇで５分間遠心を行い上層を別のチューブへと移した。等量の２−プロパノールを加え１８０００×ｇで５分間遠心し上清を捨てた。１８０μｌの７０％エタノールを加え１８０００×ｇで２分間遠心し上清を捨て、沈殿したＤＮＡを風乾させた。ＤＮＡを１００μｌの滅菌水で溶解し、ＲＮａｓｅＡ（タカラバイオ社）を１０μｇ／ｍｌになるように加え３７℃で３０分間反応させた。７．５Ｍ酢酸アンモニウム（ＷａＫｏ社）を５０μｌ加え氷中で３０分間恒温した。１８０００×ｇで１５分間遠心し上清を別のチューブに移した。２．５倍量のエタノールを加え混和し１８０００×ｇで５分間遠心を行い上清を捨てた。１８０μｌの７０％エタノールを加え１８０００×ｇで２分間遠心を行い上清を捨てた。沈殿したＤＮＡを風乾し１００μｌの滅菌水に再溶解し、染色体ＤＮＡ溶液とした。
【００５６】
【表８】
2018000012.tif 000011
【００５７】
【表９】
2018000012.tif 000012
【００５８】
【表１０】
2018000012.tif 000013
【００５９】
【表１１】
2018000012.tif 000014
【００６０】
（実施例４）２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有する粗酵素液の調製
Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ  ＮＤ−１（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２２８２）をＳＤｏｉ液体培地（実施例１、表２）で３０℃の条件で４８時間培養し菌体を回収した。菌体をｐＨ７．０に調整した破砕用緩衝液（表１２）で懸濁し等量のガラスビーズを加えて破砕した。破砕液を１８０００×ｇで３０分間、４℃の条件で遠心し、上清を回収した。細胞破砕液上清を遠心式限外濾過フィルターであるアミコンウルトラ（メルクミリポア社）を用いて濃縮し、さらに１０ｋＤａ以下の低分子タンパク質をできる限り除き、粗酵素液とした。得られた粗酵素液を用いてＤＯＩと補酵素ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨを含む反応液（表１３）を調製し３０℃の条件で２時間反応させた。反応液をガスクロマトグラフ質量分析機で分析した結果（−）−ビボ−クエルシトールとシロ−クエルシトールが生じていることが明らかとなった（図２）。すなわち、本粗酵素液は、２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性を有することが明らかとなった。
【００６１】
【表１２】
2018000012.tif 000015
【００６２】
【表１３】
2018000012.tif 000016
【００６３】
（実施例５）２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子のクローニング
Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ  ＮＤ−１（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２２８２）から抽出した粗精製酵素がＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素として利用し、２−デオキシ−シロ−イノソースをクエルシトールへと変換する様式から類似の作用機序を持つイノシトールデヒドロゲナーゼに近縁な酵素である可能性を見出した。そこで多重配列アライメントプログラムであるＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｖｅｒｓｉｏｎ２．１（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）を用いてＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８、Ｄｏｔｈｉｓｔｒｏｍａ  ｓｅｐｔｏｓｐｏｒｕｍ  ＮＺＥ１０、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ．  ｇｒｕｂｉｉ  Ｈ９９、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ  ＩＮＤ１０７、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ｍｅｌｏｎｉｓ  ２６４０６、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＣＢＳ  ５１３．８８、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ  ＩＦＯ  ４３０８、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ  Ｃｇ−１４、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ  ＰＨ−１のイノシトールデヒドロゲナーゼのアライメント比較を行った（図３Ａ）。その結果、Ｎ末端側にみられるロスマンフォールドドメイン内の領域とＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓイノシトールデヒドロゲナーゼにおいて活性に関与しているアミノ酸残基を含む領域がよく保存されていることが明らかとなった（図３Ａ、枠線に囲まれた領域）。そこでイノシトールデヒドロゲナーゼにみられるアミノ酸配列の保存領域をＷｅｂｌｏｇｏ  ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂｌｏｇｏ．ｔｈｒｅｅｐｌｕｓｏｎｅ．ｃｏｍ／ｃｒｅａｔｅ．ｃｇｉ）を用いて図示し（図３Ｂ）、縮重プライマーの設計を行った。染色体ＤＮＡをテンプレートとしてｉｏｌＧプライマー（配列番号７）、ＩＨ−１Ｒｖプライマー（配列番号８）を用いてＰＣＲ法によって２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子の部分ＤＮＡ断片の増幅を行った。さらに前記ＰＣＲ反応液をテンプレートとしてＳＶ−２  Ｆｗプライマー（配列番号９）、ＳＧ−１  Ｒｖプライマー（配列番号１０）のプライマーを用いてネストＰＣＲ法によって２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子の部分ＤＮＡ断片の増幅を行った。得られたＤＮＡ断片をＴ−ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）にクローニング後、同領域の７１２塩基の配列を決定した。さらに得られた部分ＤＮＡ配列をもとにインバースＰＣＲ法により上流と下流のＤＮＡ配列の決定を行った。まず、前記ＮＤ−１株から抽出した染色体ＤＮＡ５μｇに制限酵素ＫｐｎＩを反応させ切断し断片化させた（表１４）。反応液をフェノールクロロホルム抽出しエタノール沈殿後、滅菌水で１００ｎｇ／ｍｌになるように溶解した。次に断片化したＤＮＡにＴ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅを作用させ自己環化反応（表１５）を行った。反応液をテンプレートとして３’Ｆｗ  ｏｕｔプライマー（配列番号１１）、５’Ｒｖ  ｎｅｗ  ｏｕｔプライマー（配列番号１２）を用いてＰＣＲ法により２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅を行った。得られたＰＣＲ反応液をテンプレートとして３’Ｆｗ  ｉｎプライマー（配列番号１３）、５’Ｒｖ  ｎｅｗ  ｏｕｔプライマー（配列番号１４）を用いてネストＰＣＲ法によりＤＮＡ断片の増幅を行った。得られたＤＮＡ断片をＴ−ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）にクローニング後、塩基配列解析を行い、２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子の開始コドンを含む５’末端上流領域７７７ｂｐと終止コドンを含む３’末端下流領域７８２ｂｐのＤＮＡ配列を決定した。これにより２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子の全領域を取得した（図４）。
【００６４】
次に染色体上の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素をコードするＤＮＡ配列から実際にタンパク質をコードする領域であるエキソン部位の特定を行うため、完全長ｃＤＮＡ配列の決定を試みた。前記ＮＤ−１株からＲＮＡ抽出キットであるｉｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡｓｐｉｎ  ｍｉｎｉ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社）を用いて全ＲＮＡの調製を行った。
次にｃＤＮＡの３’領域の配列を決定するために３’ＲＡＣＥ法を行った。全ＲＮＡをテンプレートとしてＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ロシュ社）とｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ａｎｃｈｏｒプライマー（配列番号１５）を用いて逆転写ＰＣＲ法によりｃＤＮＡの合成を行った。前記ｃＤＮＡをテンプレートとしてａｎｃｈｏｒプライマー（配列番号１６）、ＲＡＣＥ  Ｆｗ  ２プライマー（配列番号１７）を使用してＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅した。前記ＤＮＡ断片をテンプレートとしてａｎｃｈｏｒプライマー（配列番号１６）、ＲＡＣＥ  Ｆｗ  ３プライマー（配列番号１８）を使用してネストＰＣＲ法により２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素をコードする完全長ｃＤＮＡの３’領域を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＴ−ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）にクローニング後、同領域のｃＤＮＡの３’領域を含む約８００塩基の配列を決定した。
【００６５】
ｃＤＮＡの５’領域の配列を決定は５’ＲＡＣＥ法により行った。全ＲＮＡをテンプレートとしてＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ロシュ社）とＲＡＣＥ  Ｒｖ１プライマー（配列番号１９）を使用して逆転写ＰＣＲ法によりｃＤＮＡの合成を行った。前記逆転写ＰＣＲ反応液をＦａｓｔＧｅｎｅＴＭ  ゲル  ／ＰＣＲ  抽出キット（日本ジェネティックス社）を用いて精製した。精製したｃＤＮＡを用いてポリアデニル化反応液（表１６、表１７）を調製し９４℃で３分間反応させた後、１μｌ（８Ｕ）のＴｅｒｍｉｎａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ロシュ社）を加えた。３７℃の条件で３０分間反応させた後、７０℃の条件で１０分間反応させ、ポリアデニル化反応を停止した。ポリアデニル化したｃＤＮＡをテンプレートとしてｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ａｎｃｈｏｒｏ２（プライマー配列番号２０）、３’Ｒｖ  ｏｕｔプライマー（配列番号２１）を用いてＰＣＲ法により約５００塩基のＤＮＡ断片の増幅を行った。前記ＤＮＡ断片をテンプレートとしてａｎｃｈｏｒ  ２プライマー（配列番号２２）、３’Ｒｖ  ｉｎプライマー（配列番号２３）を用いてネストＰＣＲ法により約５００塩基のＤＮＡ断片の増幅を行った。得られたＤＮＡ断片をＴ−ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）にクローニング後、同領域のｃＤＮＡの５’領域を含む約５００塩基の配列を決定した。これにより２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子の完全長ｃＤＮＡの全領域の配列を決定した（図５）。
【００６６】
【表１４】
2018000012.tif 000017
【００６７】
【表１５】
2018000012.tif 000018
【００６８】
【表１６】
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【００６９】
【表１７】
2018000012.tif 000020
【００７０】
（実施例６）２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子の解析
Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ  ＮＤ−１（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２２８２）の２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素遺伝子は、１５５３塩基（ＧＣ含量は５８％）、全塩基配列は第１イントロンから第７イントロンによって８つに区切られており、スプライシング後は１１６７塩基（ＧＣ含量は６０％）である。その遺伝子産物である２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素は３８８アミノ酸からなり、予想分子量は４１．７２ＫＤａであった。Ｇ３１ＣＧＲＭＧ配列はＮＡＤ依存性酸化還元酵素によく保存されているアミノ酸１次配列であり、ＮＡＤ結合モチーフである。このことから２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素はＤＯＩを還元する際にＮＡＤ（Ｐ）Ｈを電子供与体として利用していることが予想される。Ｅ１１７ＫＰ配列は糖酸化還元酵素にみられる保存領域であり、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のミオ−イノシトールデヒドロゲナーゼにおいて活性に重要な役割を果たしていることが報告されている（図６）。
【００７１】
（実施例７）組換えＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ  ＮＤ−１  ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素の生産及び精製
配列番号１で示した２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素を、実施例５で取得したｃＤＮＡをテンプレートとして、ＯＲＦ２  ｓａｐＩ  Ｆｗ（配列番号２４）、ＯＲＦ  ＥｃｏＲＩ  Ｒｖ（配列番号２５）を用いてＰＣＲ法により増幅し、大腸菌組換え蛋白質高発現ベクターｐＴＹＢ１１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に連結し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。このベクターに連結することによりインテイン−ＣＢＤタグ配列と２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素が融合した組換え２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素を生産することができる。組換え蛋白質として２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素を高発現させた大腸菌を遠心により回収後、Ｌｙｓｉｓ    ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁した。懸濁液を超音波破砕機にかけ、大腸菌を破砕後、遠心をすることにより組換え２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素を上清に回収した。上清液とインテイン−ＣＢＤタグ配列と特異的に結合するキチンビーズを混合して、キチンビーズに２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素を結合させた後、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。組換え２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素が結合したキチンビーズに自己切断  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  （＋／−）−Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（あるいはＬ−Ｃｙｓｔｅｉｎｅ））を加えて、組換え２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素を溶出させた。精製度を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検討した結果、単一なバンドが確認できたことから、高純度の組換え２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素を精製することができた（図７）。
【００７２】
（実施例８）Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ  ＮＤ−１  ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素の特性解析
実施例７で精製した組換えＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ  ＮＤ−１  ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素の酵素活性を２−デオキシ−シロ−イノソースを用いてアッセイを行った。アッセイの反応溶液は、緩衝液として５０ｍＭ    Ｔｒｉｓ−ＨＣＬを適応ｐＨ範囲で用い、２−デオキシ−シロ−イノソース溶液、５ｍＭを混合し、目的の温度に恒温した後に組換えＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ  ＮＤ−１  ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素を加え、３４０ｎｍの吸光度の減少を測定した。また、２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素１ｍｇが１分間あたりに還元するＮＡＤＨの量を比活性として緩衝液のｐＨ、反応温度の条件を変え、組換えＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ  ＮＤ−１  ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素アッセイを行い、至適条件を調べたところ、２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素活性における至適温度は４０℃、至適ｐＨは７．０であった（図８）。
【００７３】
（寄託微生物の表示）
本発明において使用される寄託微生物の表示は、以下のとおりである。
【００７４】
Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｄｚｏｌｉｃｕｓ  ＮＤ−１
ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２２８２
１．受領機関名：    独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）
ＮＩＴＥ特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
２．受領日：        平成２８年６月７日
３．受領番号：      ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２２８２
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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