(57)【要約】【課題】ユーグレナ抽出物の新規な利用方法となる新規な脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、脂肪細胞分化抑制用食品組成物、及び脂肪細胞分化抑制用化粧料組成物を提供する。【解決手段】ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有する新規な脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、脂肪細胞分化抑制用食品組成物、及び脂肪細胞分化抑制用化粧料組成物である。例えば、ユーグレナ水性溶媒抽出物は、ユーグレナの水抽出物又は熱水抽出物である。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とする脂肪細胞分化抑制剤。
【請求項２】
前記ユーグレナ水性溶媒抽出物は、ユーグレナ水抽出物であることを特徴とする請求項１に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
【請求項３】
前記ユーグレナ水抽出物は、ユーグレナ熱水抽出物であることを特徴とする請求項２に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
【請求項４】
ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＰＰＡＲγ発現抑制剤。
【請求項５】
ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＣ／ＥＢＰα発現抑制剤。
【請求項６】
ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有し、
脂肪細胞の分化抑制に用いられることを特徴とする脂肪細胞分化抑制用食品組成物。
【請求項７】
ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有し、
脂肪細胞の分化抑制に用いられることを特徴とする脂肪細胞分化抑制用化粧料組成物。
【請求項８】
ユーグレナに、水性溶媒を加えて振盪して分散液を得る分散液調製工程と、
前記分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナの水性溶媒抽出物として得る抽出工程と、を含むことを特徴とする脂肪細胞分化抑制剤の製造方法。
【請求項９】
前記分散液調製工程の後、前記抽出工程の前に、前記分散液を加熱する加熱工程を行うことを特徴とする請求項８記載の脂肪細胞分化抑制剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、脂肪細胞分化抑制用食品組成物、脂肪細胞分化抑制用化粧料組成物及び脂肪細胞分化抑制剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生活習慣病と呼ばれる疾患には、例えば、肥満症、高血圧症、糖尿病、高脂血症、心筋梗塞、脳卒中などが挙げられる。近年、これらの疾患は、個々の原因で発症するのではなく、種々の原因が影響し合って発症することが分かっており、このような複合生活習慣病は、メタボリックシンドロームとも呼ばれている。
【０００３】
「メタボリックシンドローム」とは、インスリン抵抗性を基盤とする２型糖尿病、高脂血症、高血圧、内臓脂肪型肥満、脂肪肝などの一連の病態群を合併した状態を表す。
メタボリックシンドロームは、脂肪細胞、特に、内臓における脂肪細胞（内蔵脂肪）の蓄積によりインスリンの働きの低下が起こり、高血糖、脂質代謝異常、高血圧などの動脈硬化のリスクファクターが、集積している状態である。
【０００４】
脂肪細胞の蓄積は、肥満症、高血圧症、糖尿病、高脂血症、心筋梗塞、脳卒中などにつながることが解明されており、これらの疾病の予防および治療をするために、脂肪細胞の蓄積を防止することが、極めて重要視されている。
ここで、「肥満症」とは、肥満に起因、関連する健康障害を有するか、該健康障害が予測される内臓脂肪が過剰に蓄積した場合で、減量治療を必要とする状態のことである。
【０００５】
また、最近の健康や美容への関心の高まりから、老若男女を問わず、健康的でスリムな身体を維持したいと願う人も増加しており、肥満症でない人の間でも、局所の脂肪蓄積に関して非常に高い関心が持たれている。
【０００６】
従来、肥満症を治療又は予防する抗肥満剤としては、蓄積した脂肪を分解することにより脂肪蓄積抑制効果を示すものが多かった。
肥満症は、前駆脂肪細胞が脂肪細胞（成熟脂肪細胞）へと分化し、その数及びサイズが増大することによるものである。また、脂肪細胞の分化過程における、脂肪細胞分化のマスターレギュレーターとして、ＰＰＡＲγやＣ／ＥＢＰα等の転写因子が知られている。肥満症を予防及び治療するには、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を抑制するのが効果的である。
脂肪細胞分化抑制剤としては、ホップ組織の水抽出物（特許文献１）、酸性ムコ多糖類（特許文献２）、植物抽出物（特許文献３）等が知られている。その中でも、特許文献１には、ホップ組織の水抽出物が、ＰＰＡＲγの発現を抑制し、これを介して脂肪細胞の分化を抑制することが開示されている。
【０００７】
一方で、食糧、飼料、燃料等としての利用が有望視されている生物資源として、ユーグレナ（属名：Euglena、和名：ミドリムシ）が注目されている。
ユーグレナは、ビタミン，ミネラル，アミノ酸，不飽和脂肪酸など、人間が生きていくために必要な栄養素の大半に該当する５９種類もの栄養素を備え、多種類の栄養素をバランスよく摂取するためのサプリメントとしての利用や、必要な栄養素を摂取できない貧困地域での食糧供給源としての利用の可能性が提案されている。
【０００８】
ユーグレナは、食物連鎖の第一次生産者に位置し、捕食者により捕食されることや、光、温度条件、撹拌速度などの培養条件が他の微生物に比べて難しいなどの理由から、大量培養が難しいとされてきたが、近年、本発明者らの鋭意研究によって、大量培養技術が確立され、ユーグレナ及びユーグレナから抽出されるパラミロン等、ユーグレナ由来物質の大量供給の途が開かれた。
ユーグレナは、鞭毛運動をする動物的性質をもちながら、同時に植物として葉緑体を持ち光合成を行うユニークな生物であり、ユーグレナ自体やユーグレナ由来の物質に、多くの機能性があることが期待されている。
そのため、大量供給可能となったユーグレナ及びユーグレナ由来物質の利用法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１０−１７３９４２号公報
【特許文献２】特開２０１４−９１６１号公報
【特許文献３】特開２０１１−６３４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、新規な脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、脂肪細胞分化抑制用食品組成物、脂肪細胞分化抑制用化粧料組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、ユーグレナ水性溶媒抽出物の新規な利用方法となる脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、脂肪細胞分化抑制用食品組成物、脂肪細胞分化抑制用化粧料組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究した結果、ユーグレナ水性溶媒抽出物が、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を抑制する作用を有することを見出した。
より詳細には、前駆脂肪細胞が成熟脂肪細胞へと分化する過程において、鍵となる転写因子群のうち、ＰＰＡＲγおよびＣ／ＥＢＰαの発現を抑制し、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を抑制することを明らかにして、本発明をするに至った。
【００１２】
従って、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とする脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、脂肪細胞分化抑制用食品組成物、脂肪細胞分化抑制用化粧料組成物により解決される。
このとき、前記ユーグレナ水性溶媒抽出物は、ユーグレナ水抽出物又はユーグレナ熱水抽出物であるとよい。
【００１３】
本発明は、これまでに副作用の報告がなく、食品衛生法に合致する水準の安全性を備えたユーグレナの水性溶媒抽出物を有効成分としているため、長期間の継続投与および継続摂取が可能である。
【００１４】
前記課題は、本発明によれば、ユーグレナに、水性溶媒を加えて振盪して分散液を得る分散液調整工程と、前記分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナの水性溶媒抽出物として得る抽出工程と、を含むことを特徴とする脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤の製造方法により解決される。
【００１５】
このとき、前記分散液調製工程の後、前記抽出工程の前に、前記分散液を加熱する加熱工程を行ってもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、新規な脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、脂肪細胞分化抑制用食品組成物、及び脂肪細胞分化抑制用化粧料組成物を提供することができる。
本発明は、これまでに副作用の報告がなく、食品衛生法に合致する水準の安全性を備えたユーグレナの水性溶媒抽出物を有効成分としているため、長期間の継続投与および継続摂取が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】脂肪細胞のライフサイクル及び転写因子である蛋白質発現量を示す概略説明図である。
【図２】本発明の一実施例に係る、実施例１及び実施例２〜６のユーグレナ水抽出物又は熱水抽出物の脂肪分化抑制効果を検証した脂肪分化抑制試験の手順を示す説明図である。
【図３】試験例１において検証を行った、本発明の実施例１のユーグレナ熱水抽出物の脂肪分化抑制試験の結果を示すグラフである。
【図４】試験例１において検証を行った、本発明の実施例１のユーグレナ熱水抽出物の脂肪分化抑制試験後の脂肪滴染色の結果を示す写真である。
【図５】試験例２において検証を行った、本発明の実施例２〜６のユーグレナ水抽出物又は熱水抽出物の脂肪分化抑制試験の結果を示すグラフである。
【図６】試験例２において検証を行った、本発明の実施例２〜６のユーグレナ水抽出物又は熱水抽出物の脂肪分化抑制試験後の脂肪滴染色の結果を示す写真である。
【図７】試験例３において検証を行った、本発明の実施例１のユーグレナ熱水抽出物および比較例１のＥＰＡの脂肪分化抑制試験の結果を示すグラフである。
【図８】試験例３において検証を行った、比較例１のＥＰＡの脂肪分化抑制試験後の脂肪滴染色の結果を示す写真である。
【図９】試験例４において検証を行った、本発明の実施例１のユーグレナ熱水抽出物を添加する期間を変えた場合の脂肪分化抑制試験の手順を示す説明図及び、脂肪分化抑制試験の結果を示すグラフである。
【図１０】試験例４において検証を行った、本発明の実施例１のユーグレナ熱水抽出物を添加する期間を変えた場合の脂肪分化抑制試験後の脂肪滴染色の結果を示す写真である。
【図１１】試験例５において検証を行った、本発明の実施例１のユーグレナ熱水抽出物を添加したときのＰＰＡＲγ遺伝子発現量を比較した結果を示すグラフである。
【図１２】試験例５において検証を行った、本発明の実施例１のユーグレナ熱水抽出物を添加したときのＣ／ＥＢＰα遺伝子発現量を比較した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施形態について、図１〜図１２を参照しながら説明する。
本実施形態は、ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分とする、脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤の発明に関するものである。
【００１９】
本明細書において、「肥満」とは、正常な状態と比較して体重が多い状態、又は体脂肪が過剰に蓄積した状態である。肥満の判定基準として、ＢＭＩ（Ｂｏｄｙ  Ｍａｓｓ  Ｉｎｄｅｘ、ボディマス指数）が用いられている。ＷＨＯ（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、世界保健機関）による肥満の判定基準では、ＢＭＩ  ３０以上を肥満とし、一方、日本ではＢＭＩ  ２５以上を肥満としている。日本の判定基準は、日本肥満学会が定義した基準で、日本人はＢＭＩ  ２５を超えたあたりから、耐糖能障害、脂質異常症、高血圧といった合併症の発症頻度が高まることに基づいている。
本明細書において、「肥満症」とは、肥満に起因、関連する健康障害を有するか、該健康障害が予測される内臓脂肪が過剰に蓄積した場合で、減量治療を必要とする状態のことである。肥満症は、脂肪細胞数の増加及び脂肪細胞の肥大化に起因するものであり、前駆脂肪細胞の増殖や分化、肥大化、あるいは脂肪細胞の死および生体からの排除といった脂肪細胞のライフサイクルと関係している。
本明細書において、「抗肥満」とは、上記肥満症を予防又は治療することを意味する。
【００２０】
本明細書において、「メタボリックシンドローム」とは、インスリン抵抗性を基盤とする２型糖尿病、高脂血症、高血圧、内臓脂肪型肥満、脂肪肝などの一連の病態群を合併した状態を表し、シンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群、内臓脂肪症候群、マルチプルリスクファクター症候群などの呼称でも知られている。
本明細書において、「抗メタボリックシンドローム」とは、上記の病態群より選ばれる少なくとも１つ以上の病態を予防又は治療することを意味する。
【００２１】
＜脂肪細胞の概要＞
脂肪細胞とは、細胞質内に脂肪滴を有する細胞のことであり、単胞性脂肪細胞（白色脂肪細胞）と、多胞性脂肪細胞（褐色脂肪細胞）とに分類される。
白色脂肪細胞は、過剰に摂取されて、消費されなかった過剰なエネルギーを中性脂肪へと変換し、エネルギー源として蓄積する。白色脂肪細胞は、人体に広く存在しているが、特に下腹部、臀部、大腿部、背中、上腕部、内臓の周囲などに多く、皮下脂肪や内臓脂肪として蓄積される。
【００２２】
白色脂肪細胞の数は、乳幼児や思春期など、限られた時期にのみ増加し、その時期に生涯の白色脂肪細胞の数が決定すると考えられていた。しかし、最近の研究では、過剰なエネルギー摂取や運動不足などにより、既に存在している白色脂肪細胞が中性脂肪で満たされると、思春期を過ぎてからでも脂肪細胞の数が増え、さらに脂肪を取り込むということがわかった。脂肪細胞の大きさが上限に達し、これ以上脂肪を溜め込めない状態になると、周囲の前駆脂肪細胞がＰＰＡＲγなどによって刺激されることで成熟脂肪細胞となり、順次肥大化し、さらに、成熟脂肪細胞も細胞分裂し、脂肪細胞の数も増加する。
【００２３】
２０歳前後の成人における白色脂肪細胞の数は約４００億個であるが、肥満の人における白色脂肪細胞の数は、４００〜６００億個にもなる。
白色脂肪細胞は、エネルギーが必要となった時に、蓄積している脂肪を分解し、遊離脂肪酸とグリセロールとして全身に供給する。その際に、脂肪を放出した白色脂肪細胞は、前駆脂肪細胞に戻り、再びエネルギーが過剰な状態になると、成熟脂肪細胞となり、脂肪を取り込む。
【００２４】
一方、褐色脂肪細胞は、余分な脂肪を分解することによって熱を生み出す働きがあり、首の後や肩甲骨周囲、脇の下、心臓や腎臓の周囲など、人体の特定の部分に存在している。褐色脂肪細胞の数は、生後すぐのときに最も多く、成人になると加齢に従い減少し、特に４０歳以降で顕著に減少する。この褐色脂肪細胞の数の減少が、中年太りの大きな原因になることが報告されている。
【００２５】
＜脂肪細胞のライフサイクルと転写因子カスケード、及び脂肪細胞分化抑制作用＞
図１に示すように、脂肪細胞のライフサイクルは、（１）間葉系幹細胞が前駆脂肪細胞へ分化することが決定される過程、（２）前駆脂肪細胞の増殖と成熟脂肪細胞へと分化する過程、（３）肥大化した脂肪細胞のアポトーシスと生体から排除される過程に分けて考えることができる。
培養細胞や遺伝子改変個体を用いた系などにより脂肪細胞分化過程に密接に関与する転写因子が、明らかになっている。
【００２６】
ＰＰＡＲ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体）、Ｃ／ＥＢＰ（ＣＣＡＡＴ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質）、及びＳＲＥＢＰ−１／ＡＤＤ１（Ｓｔｅｒｏｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １  または  Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ  １）は脂肪細胞の分化に最も重要な転写因子として知られている。
【００２７】
ＰＰＡＲは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδなどのファミリーが知られており、その中でもＰＰＡＲγは脂肪細胞分化に特に重要である。脂肪芽細胞や前駆脂肪細胞において、ＰＰＡＲγを強制的に発現させると脂肪細胞に分化する。
【００２８】
Ｃ／ＥＢＰは、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、Ｃ／ＥＢＰγ、Ｃ／ＥＢＰε、Ｃ／ＥＢＰζなどのファミリーが知られており、Ｃ／ＥＢＰαがＰＰＡＲγと同じように脂肪細胞分化のマスターレギュレーターとして機能している。また、Ｃ／ＥＢＰβとＣ／ＥＢＰδは分化の初期に発現し、Ｃ／ＥＢＰαとＰＰＡＲγの発現を制御している。
【００２９】
ＳＲＥＢＰ１／ＡＤＤ１は、脂肪細胞の分化を促進することが知られている一方、脂肪細胞の分化過程においてＰＰＡＲγのリガンド生成に関わっている。
【００３０】
これら３種類の転写因子群（ＰＰＡＲ、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＲＥＢＰ１／ＡＤＤ１）が、クロストークすることにより脂肪細胞の分化過程が進行する。
【００３１】
＜ユーグレナ＞
本実施形態において、「ユーグレナ」とは、分類学上、ユーグレナ属（Euglena）に分類される微生物、その変種、その変異種及びユーグレナ科（Euglenaceae）の近縁種を含む。
ここで、ユーグレナ属（Euglena）とは、真核生物のうち、エクスカバータ、ユーグレノゾア門、ユーグレナ藻綱、ユーグレナ目、ユーグレナ科に属する生物の一群である。
【００３２】
ユーグレナ属に含まれる種として、具体的には、Euglena chadefaudii、Euglena deses、Euglena gracilis、Euglena granulata、Euglena mutabilis、Euglena proxima、Euglena spirogyra、Euglena viridisなどが挙げられる。
ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis），特に、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株を用いることができるが、そのほか、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株の変異株ＳＭ−ＺＫ株（葉緑体欠損株）や変種のE. gracilis
var. bacillaris、これらの種の葉緑体の変異株等の遺伝子変異株、Astaia longa等のその他のユーグレナ類、及びそれらに由来するβ−１，３−グルカナーゼ等の物質であってもよい。
【００３３】
ユーグレナ類は、池や沼などの淡水及び汽水、海水中に広く分布しており、これらから分離して使用しても良く、また、既に単離されている任意のユーグレナ類を使用してもよい。
ユーグレナ類は、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組換え，形質導入，形質転換等により得られたものも含有される。
【００３４】
ユーグレナ細胞の培養において、培養液としては、例えば、窒素源，リン源，ミネラルなどの栄養塩類を添加した培養液、例えば、改変Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４  １．０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４  １．０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．０２ｇ／Ｌ，Ｆｅ２（ＳＯ２）３・７Ｈ２Ｏ  ３ｍｇ／Ｌ，ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  １．８ｍｇ／Ｌ，ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．５ｍｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．４ｍｇ／Ｌ，Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．０２ｇ／Ｌ，チアミン塩酸塩（ビタミンＢ１）  ０．１ｍｇ／Ｌ，シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、（ｐＨ３．５））を用いることができる。なお、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４は、（ＮＨ４）２ＳＯ４やＮＨ３ａｑに変換することも可能である。また、そのほか、ユーグレナ生理と生化学（北岡正三郎編、株式会社学会出版センター）の記載に基づき調製される公知のＨｕｎｔｅｒ培地、Ｋｏｒｅｎ−Ｈｕｎｔｅｒ培地を用いてもよい。
【００３５】
培養液のｐＨは好ましくは２以上、また、その上限は、好ましくは６以下、より好ましくは４．５以下である。ｐＨを酸性側にすることにより、光合成微生物は他の微生物よりも優勢に生育することができるため、コンタミネーションを抑制することができる。
ユーグレナ細胞の培養は、太陽光を直接利用するオープンポンド方式、集光装置で集光した太陽光を光ファイバー等で送り、培養槽で照射させ光合成に利用する集光方式等により行ってもよい。
また、ユーグレナ細胞の培養は、例えば供給バッチ法を用いて行われ得るが、フラスコ培養や発酵槽を用いた培養、回分培養法、半回分培養法（流加培養法）、連続培養法（灌流培養法）等、いずれの液体培養法により行ってもよい。
【００３６】
培養は、オープンポンド型、レースウェイ型、チューブ型等の公知の培養装置や、坂口フラスコ、三角フラスコ、試薬ビンなどの実験用の培養容器を用いて行うことができる。ユーグレナはＣＯ２を資化するため、独立栄養培地であるＣｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地を用いて培養する場合は１〜５％ＣＯ２を含む空気を培地中に通過させることが好ましい。また、さらに、葉緑体を十分に発達させるために、培地１リットルあたり１〜５ｇ程度のリン酸アンモニウムを加えるとよい。培養温度は、通常２０〜３４℃で、特に２８〜３０℃が好適である。また、培養条件にもよるが、ユーグレナは通常、培養開始後２〜３日で対数増殖期となり、４〜５日程度で定常期に到達する。
ユーグレナは、光照射下で培養（明培養）されてもよく、無照射で培養（暗培養）されてもよい。
【００３７】
ユーグレナ細胞の分離は、例えば、培養液の遠心分離または単純な沈降，膜濾過等によって行われる。
ユーグレナの藻体乾燥物は、分離されたユーグレナ細胞を洗浄後、公知の方法で真空凍結乾燥することにより調製される。但し、藻体乾燥物の調整は、噴霧乾燥、加熱真空乾燥等により行ってもよい。
本実施形態の脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、ユーグレナとして、遠心分離、沈降、膜濾過等により培養液から分離したユーグレナの藻体を用いてもよいし、藻体乾燥物を用いてもよい。また、藻体乾燥物を、公知の粉砕機で粉砕したユーグレナの乾燥粉末を用いてもよい。
【００３８】
＜ユーグレナ水性溶媒抽出物＞
本実施形態において、「ユーグレナ水性溶媒抽出物」とは、水性溶媒を用いてユーグレナから抽出される抽出物を意味し、特に、水性溶媒として水を用い、５℃〜６００℃で、数秒〜数十時間抽出したユーグレナの水抽出物又は熱水抽出物を用いることが好ましい。
抽出に使用する水は、必ずしも蒸留水や、純水、又は超純水である必要はなく、例えば、水道水や不純物を含むものであってもよいが、活性成分の抽出を妨げる成分を含まない水が好ましい。
【００３９】
本実施形態において、「水抽出物」とは、０〜５０℃（０℃を除く。）の水による抽出物を意味する。
ここで、「水」とは、０〜５０℃（０℃を除く。）の水を意味する。
水の温度は、活性成分に影響を与えずに、活性成分を十分に抽出できる範囲内であれば特に限定されるものではないが、好ましくは１〜４０℃、より好ましくは５〜３５℃、特に好ましくは１０〜３０℃である。
【００４０】
本実施形態において、「熱水抽出物」とは、５０℃よりも高い温度の水による抽出物を意味し、「温水抽出物」とも呼ぶことができる。
ここで、「熱水」とは、５０℃よりも高温の水を意味し、「熱湯」も含む概念であり、沸騰状態にある水も含まれる。また、液体状態の熱水に限定されることなく、気体状態及び超臨界状態の熱水も含まれる。
熱水の温度は、活性成分に影響を与えずに、活性成分を十分に抽出できる範囲内であれば特に限定されるものではないが、好ましくは５０℃より高く１２０℃以下、より好ましくは５０℃より高く１００℃以下である。
【００４１】
抽出に使用する水のｐＨは、活性成分に影響を与えずに、活性成分を十分抽出できる範囲内であれば特に限定されるものではないが、好ましくはｐＨ４〜１０、より好ましくはｐＨ５〜９、特に好ましくはｐＨ６〜８であるとよい。
【００４２】
なお、本実施形態では、水性溶媒として、水を単独で用いるが、活性成分に影響を与えずに、活性成分を十分抽出できるものであって、通常、抽出に用いることができる溶媒を１種または２種以上選択して用いてもよい。例えば、水、アルコール類、グリコール類などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。アルコール類としては、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール等が挙げられる。グリコール類としては、ブチレングリコール及びプロピレングリコール等が挙げられる。その他の水性溶媒としては、アセトン等が挙げられる。これらの溶媒は単独或いは水溶液として用いても良く、任意の２種または３種以上の混合溶媒として用いてもよい。
【００４３】
抽出に用いる水性溶媒の温度は、例えば、０℃以上であり、活性成分に影響を与えないのであれば特に限定されることはない。沸騰状態又は超臨界状態にある水性溶媒を使用することもできるが、５℃〜６００℃の水性溶媒を使用するのが好ましく、１０℃〜２００℃の水性溶媒を使用するのがより好ましい。
したがって、抽出用の水性溶媒とは、沸騰状態や超臨界状態にある水性溶媒も含むものである。抽出に使用する水性溶媒の量は、ユーグレナ中に含まれる水溶性活性成分を十分に溶解することができる量であることが好ましい。
【００４４】
抽出方法も特に限定されず、例えば、以下に示す方法により抽出を行うことができるが、これに限定されることなく、通常の抽出方法を自由に選択して用いることができる。例えば、ユーグレナの藻体乾燥粉末を水性溶媒に所定時間浸漬した後に遠心分離又は濾過する方法、ユーグレナの藻体乾燥粉末を水性溶媒に加えて震盪して均一に分散させた後に遠心分離又は濾過する方法、などが挙げられる。
また、抽出を促進するために、ユーグレナを添加後の水性溶媒を加熱することも可能である。
【００４５】
ユーグレナの水抽出は、以下に示すような通常の方法で行うことができるが、これに限定されるものではない。例えば、ユーグレナ組織及び水を容器に入れ、適宜攪拌又は震盪しながら所定時間静置し、得られた抽出液は、そのまま水抽出物として使用可能である。また、例えば、そのような抽出液を遠心して得られる上清を水抽出物として使用することもできる。また、そのような抽出液又は上清を濃縮、乾燥して水分を除去し、これを水抽出物として使用することもできる。水抽出は、抽出効率を上げて抽出時間を短縮するために、水に、少量、例えば、１０質量％以下のアルコール、好ましくはエタノールを添加して行ってもよい。
水抽出を行う場合の抽出時間は、活性成分が抽出される時間であれば特に限定されず、数秒〜数十時間の範囲で、抽出の温度に応じて適宜設定することができる。
【００４６】
熱水による抽出は、以下に示すような、通常用いられている方法で行なうことができるが、これに限定されるものではない。ユーグレナを、通常用いられる抽出器に水とともに導入した後に、加熱することで抽出を行う。沸騰水または超臨界状態にある水を使用して抽出する場合には、水の蒸気圧に耐え得る抽出器を使用する必要がある。抽出時の圧力は１〜５０００気圧に設定することができ、６０〜４００気圧に設定するのが好ましい。
高温高圧下で抽出を行なう場合には、抽出時間が長す過ぎると活性成分が分解したり、化学反応を起こすことがある。従って、高温高圧下で抽出を行なうときには、抽出時間を短時間、例えば、３分以内とするのが好ましく、１分以内とするのがより好ましく、３０秒以内とすることが特に好ましい。
【００４７】
抽出したユーグレナ抽出物は、そのままでも本実施形態に係る脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、およびメタボリックシンドローム予防または治療剤の有効成分として用いることができるが、当該抽出物を更に、適当な分離手段（例えば、分配抽出、ゲル濾過法、シリカゲルクロマトグラフィー、逆相若しくは順相の高速液体クロマトグラフィーなど）により活性の高い画分を分画して用いることも可能である。
また、ユーグレナ抽出物やその画分を、濃縮、乾燥して水性溶媒を除去し、これを水性溶媒抽出物として使用することもできる。
【００４８】
＜脂肪細胞分化抑制剤・ＰＰＡＲγ発現抑制剤・Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤＞
本実施形態に係る脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤は、ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分とする。
本実施形態に係る脂肪細胞分化抑制剤は、脂肪細胞分化過程において、脂肪細胞分化のマスターレギュレーターであるＰＰＡＲγ及びＣ／ＥＢＰαの発現を抑制し、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を抑制するものである。
【００４９】
＜抗肥満剤・抗メタボリックシンドローム剤＞
本実施形態に係る抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分とする。
ユーグレナ水性溶媒抽出物は、脂肪細胞分化のマスターレギュレーターであるＰＰＡＲγやＣ／ＥＢＰαの発現を抑制し、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を抑制することにより、脂肪細胞の蓄積を抑制し、その結果、抗肥満やメタボリックシンドロームの予防または治療効果を発揮する。
【００５０】
＜用途＞
実施形態に係るユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、肥満症及び／又はメタボリックシンドロームの確定診断を受けた患者に投与される。
また、本実施形態の脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、医薬組成物、健康食品等として構成され、肥満症及び／又はメタボリックシンドロームの自覚症状を発現した者や、ＢＭＩが増加傾向にある者や、遺伝的に又は生活環境から考慮して肥満症及び／又はメタボリックシンドロームに罹患する可能性の高い者等、肥満症やメタボリックシンドローム予備軍の者に、予防的に投与される。
【００５１】
ユーグレナ水性溶媒抽出物は、食品としても摂取可能で副作用がないため、肥満症及び／又はメタボリックシンドロームの確定診断を受ける前であっても、投与可能である。また、確定診断を受ける前から、確定診断を受けた後の任意の時点、例えば、ＢＭＩ値が２５未満まで低下した時点、脂肪細胞の分化が活発でなくなったと思われる時点や、他の抗肥満剤に切り替える時点などまで、継続して投与可能である。
【００５２】
また、肥満症及び／又はメタボリックシンドロームの治療を完了した人は、肥満症及び／又はメタボリックシンドロームを再発しやすいため、本実施形態の脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤を、肥満症及び／又はメタボリックシンドロームの患者が治療によりＢＭＩ値が２５未満まで低下した後、ＢＭＩ値が２５未満まで低下した患者に対して、症状の再発を抑制することを目的に、肥満症及び／又はメタボリックシンドロームの再発予防、抑制薬として、継続投与することができる。
【００５３】
一般的に、肥満症及び／又はメタボリックシンドロームは、ストレス、食生活、遺伝的要因など、様々な要因によって引き起こされることが知られている。
よって、本実施形態の脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤を、心理的ストレス・社会的ストレスのかかり易い環境にある人、例えば、心因性ストレスのかかりやすい職場、住環境にある人や試験等の準備中の人に対して、長期間継続投与できる。
【００５４】
また、本実施形態の脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤を、食生活や、遺伝的要因により、肥満症及び／又はメタボリックシンドロームに罹患する可能性の高い環境にある人、例えば、食生活の乱れた家庭の人、親などの家族に肥満症及び／又はメタボリックシンドロームに罹患した者がいる家庭の人に対して、長期間継続投与できる。
【００５５】
さらに、本実施形態に係るユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤を投与する対象は、上記症状又は状態の者や、ヒト以外の動物に限定されるものではない。
【００５６】
例えば、白色脂肪細胞が特に増加する、乳幼児期や思春期のヒトのうち、ＢＭＩ  ２５以上の肥満状態のヒトに、ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤および抗メタボリックシンドローム剤を投与し、又は摂取させることができる。
乳幼児期や思春期の年齢のヒトは、白色脂肪細胞が増加し易いが、ユーグレナ水性溶媒抽出物が備える、脂肪細胞分化抑制効果、ＰＰＡＲγ発現抑制効果、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制効果により、白色脂肪細胞の増加を抑制することができる。
【００５７】
ここで、「乳児期」とは、生後から１歳未満の期間であり、「幼児期」とは、１歳以上から６歳未満の期間である。
また、「思春期」とは、二次性徴が始まり、成熟して、身長発育が最終的に停止するまでの期間である。男性に関しては、概ね１２歳〜１７歳の期間であるが、女性に関し、日本産科婦人科学会の定義によれば、「性機能の発育（乳房発育・恥毛発育など）に始まり、初経を経て第二次性徴の完成と月経周期がほぼ順調になるまでの期間で、現在の日本人の場合、平均的には８、９歳から１７、１８歳の間とする」と定義される。ＷＨＯ（世界保健機関）によれば１０〜１９歳と定義されるように、性別や個人差によって、幅を有する概念であるが、８〜１９歳の期間である。
【００５８】
また、４０歳以降の年齢のヒトに、ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤を投与することができる。
４０歳以上のヒトは、余分な脂肪を分解することによって熱を生み出す働きが衰えており、脂肪が蓄積し易く、中年太りになり易くなっているが、ユーグレナ水性溶媒抽出物が備える、脂肪細胞分化抑制効果、ＰＰＡＲγ発現抑制効果、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制効果により、脂肪細胞の蓄積や中年太りを抑制することができる。
【００５９】
また、本実施形態に係るユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、薬理学的に許容され得る添加剤を加え、医薬組成物、化粧料組成物、食品組成物等の組成物等として用いることができる。
【００６０】
（医薬組成物）
本実施形態に係るユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、その優れた脂肪細胞分化抑制効果、ＰＰＡＲγ発現抑制効果、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制効果、抗肥満効果および抗メタボリックシンドローム効果を利用して、医薬組成物に好適に用いることができる。
該医薬組成物は、あらゆる剤型の医薬品又は医薬部外品に適用することができる。例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、丸剤、などの経口剤、外用液剤、外用ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、スプレー剤、点鼻液剤、リニメント剤、ローション剤、ハップ剤、硬膏剤、噴霧剤、エアゾール剤、などの外用剤、または注射剤に適用することができる。
【００６１】
本実施形態に係る医薬組成物には、薬学的に許容される添加剤を１種または２種以上自由に選択して含有させることができる。
例えば、本実施形態に係る医薬組成物を経口剤に適用させる場合、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、保存剤、着色剤、矯味剤、香料、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤等の、医薬製剤の分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。また、ドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）を利用して、徐放性製剤等にすることもできる。
【００６２】
また、本実施形態に係る医薬組成物を外用剤に適用させる場合、基剤、界面活性剤、保存剤、乳化剤、着色剤、矯臭剤、香料、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤、潤沢剤、溶解補助剤、懸濁化剤等の、医薬製剤の分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。
【００６３】
また、本実施形態に係る医薬組成物を注射剤に適用させる場合、例えば、溶剤、安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、保存剤、等張化剤、防腐剤、酸化防止剤等の、医薬製剤の分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。
【００６４】
本実施形態に係る脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、経口投与、経皮投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、などにより全身又は局所においてその効果を発揮したり、あるいは投与部位において、局所的に効果を発揮したりする。
【００６５】
本実施形態に係る医薬組成物において、脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤の含有量は特に限定されず、目的に応じて自由に設定することが可能である。
【００６６】
（食品組成物）
本実施形態に係るユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、その優れた脂肪細胞分化抑制効果、ＰＰＡＲγ発現抑制効果、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制効果、抗肥満効果およびメタボリックシンドローム予防または治療効果を利用して、各種食品に配合することにより、当該作用を有する食品組成物を提供することができる。
【００６７】
例えば、飲料（清涼飲料、アルコール飲料、炭酸飲料、乳飲料、果汁飲料、茶、コーヒー、栄養ドリンク等）、醤油などの調味料、スープ類、クリーム類、各種乳製品類、畜肉加工品、農産加工品、アイスクリームなどの冷菓、各種粉末食品（飲料を含む）、濃縮飲料、保存用食品、冷凍食品、パン類、シリアル類、菓子類（キャンディ（のど飴）、クッキー、ビスケット、ガム、グミ、チョコレート等）など、あらゆる食品組成物に用いることができる。
【００６８】
あるいは、保健機能食品（特定保健機能食品、栄養機能食品、機能性表示食品）や、いわゆる健康食品（飲料を含む）、濃厚栄養剤、流動食、乳児・幼児食にも用いることができる。
ここで特定保健用食品とは、生理学的機能等に影響を与える保健機能成分を含む食品であって、消費者庁長官の許可を得て特定の保健の用途に適する旨を表示可能なものである。本実施形態においては、特定の保健用途として、「体脂肪をつきにくくする」、脂肪蓄積の予防、改善、脂肪細胞増殖の抑制、肥満の予防、改善などと表示して販売される食品となる。
また栄養機能食品とは、栄養成分（ビタミン、ミネラル）の補給のために利用される食品であって、栄養成分の機能を表示するものである。栄養機能食品として販売するためには、一日当たりの摂取目安量に含まれる栄養成分量が定められた上限値、下限値の範囲内にある必要があり、栄養機能表示だけでなく注意喚起表示等もする必要がある。
また機能性表示食品とは、事業者の責任において、科学的根拠に基づいた機能性を表示した食品である。販売前に安全性及び機能性の根拠に関する情報などが消費者庁長官へ届け出られたものである。
【００６９】
上記において本実施形態は、ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含み、肥満病患者を対象とした脂肪蓄積予防用特定保健用食品／脂肪細胞分化抑制用特定保健用食品や、脂肪蓄積予防用栄養機能食品／脂肪細胞分化抑制用栄養機能食品、脂肪蓄積予防用機能性表示食品／脂肪細胞分化抑制用機能性表示食品として用いることができる。
また本実施形態は、ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含み、生体、例えば脂肪が蓄積する前のヒト、脂肪が蓄積することによって引き起こされるメタボリックシンドローム予備軍のヒトを対象とした脂肪蓄積予防用特定保健用食品／脂肪細胞分化予防用特定保健用食品や、脂肪蓄積予防用栄養機能食品／脂肪細胞分化予防用栄養機能食品、脂肪蓄積予防用機能性表示食品／脂肪細胞分化予防用機能性表示食品として用いることができる。
【００７０】
本実施形態に係る食品組成物には、本実施形態に係る脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤に加え、通常食品組成物に用いることができる成分を、１種または２種以上自由に選択して配合することが可能である。例えば、各種調味料、保存剤、乳化剤、安定剤、香料、着色剤、防腐剤、ｐＨ調整剤などの、食品分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。
【００７１】
食品組成物における肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤の含有量は特に限定されず、目的に応じて自由に設定することが可能である。
【００７２】
（化粧料組成物）
本実施形態に係るユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、その優れた脂肪細胞分化抑制効果、ＰＰＡＲγ発現抑制効果、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制効果、抗肥満効果およびメタボリックシンドローム予防または改善効果を利用して、化粧料組成物に好適に用いることができる。
該化粧料組成物は、あらゆる形態の化粧料に適用することができる。例えば、ローション、乳液、クリーム、美容液などのスキンケア化粧料、ファンデーション、コンシーラー、化粧下地、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナーなどのメイクアップ化粧料、日焼け止め化粧料などに適用することができる。
【００７３】
本実施形態に係る化粧料組成物には、本実施形態に係る脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤に加え、通常化粧料組成物に用いることができる成分を、１種または２種以上自由に選択して配合することが可能である。
例えば、基材、保存剤、乳化剤、着色剤、防腐剤、界面活性剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、紫外線吸収剤、香料、防腐防黴剤、体質顔料、着色顔料、アルコール、水などの、化粧品分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。
【００７４】
本実施形態に係る化粧料組成物において、脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤の含有量は特に限定されず、目的に応じて自由に設定することが可能である。
【００７５】
＜脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤の製造方法＞
本実施形態の脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、以下の方法で製造される。
まず、ユーグレナに、水性溶媒を加えて撹拌及び／又は振盪して分散液を得る分散液調製工程を行う。この分散液調製工程においてユーグレナとして、ユーグレナ粉末を用いるとよい。
次いで、分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナの水性溶媒抽出物として得る抽出工程を行う。
【００７６】
また、分散液調製工程の後、抽出工程の前に、高圧蒸気滅菌器等の加熱手段を用いて分散液を加熱して、加熱工程を行ってもよい。
具体的には、まず、ユーグレナに、水性溶媒を加えて撹拌及び／又は振盪して分散液を得る分散液調製工程を行う。
次いで、加熱手段を用いて分散液を加熱して、加熱抽出する加熱工程を行う。
さらに、分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナの水性溶媒抽出物として得る抽出工程を行う。
【００７７】
加熱工程において、加熱手段の設定温度を、室温以上、例えば２０℃以上５０℃以下、５０℃以上８０℃以下、８０℃以上１００℃以下、１００℃以上１２０℃以下、１２０℃以上１５０℃以下、１５０℃以上２００℃以下とすることができる。
【００７８】
加熱工程において、ユーグレナ水性溶媒分散液が密閉容器に入れられている場合、加熱手段の設定温度が、ユーグレナ水性溶媒分散液の温度に一致する。
また、加熱工程において、ユーグレナ水性溶媒分散液を開放容器に入れられている場合、開放容器周囲の雰囲気の気圧に応じて、ユーグレナ水性溶媒分散液の温度が決まるが、大気圧の場合、最高で約１００℃となる。
【００７９】
加熱工程において、ユーグレナ水性溶媒分散液が開放容器に入れられている場合には、加熱工程と、ユーグレナ水性溶媒抽出物の濃縮工程が同時に行われることになる。
【００８０】
なお、分散液を遠心分離する代わりに、一般的な分離方法によって、ユーグレナの水性溶媒抽出物を得てもよい。例えば、分散液を濾過することで得られる濾液をユーグレナの水性溶媒抽出物を得てもよい。
さらに、遠心分離や濾過等を行うことなく、水性溶媒を加えて振盪して得られる分散液をそのままユーグレナ水性溶媒抽出物とすることも可能である。
【００８１】
得られたユーグレナ水性溶媒抽出物を更に、適当な分離手段（例えば、分配抽出、ゲル濾過法、シリカゲルクロマトグラフィー、逆相若しくは順相の高速液体クロマトグラフィーなど）により活性の高い画分を分画して得る分画工程を行ってもよい。
また、得られたユーグレナ水性溶媒抽出物又は画分を濃縮する濃縮工程及び／又は、水性溶媒を蒸発させ乾燥する乾燥工程を行ってもよい。
【００８２】
以上により得られたユーグレナの水性溶媒抽出物を、本実施形態の肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤として用いる。
【実施例】
【００８３】
以下、具体的実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下の試験例では、ユーグレナの熱水抽出物（実施例１）、室温および異なる温度（２５℃、５０℃、７５℃、９５℃、１２０℃）で抽出を行ったユーグレナの水抽出物又は熱水抽出物（実施例２〜６）のヒト皮下脂肪由来幹細胞を用いた脂肪細胞への分化に対する影響を確認することにより、脂肪細胞への分化抑制効果が高くなるユーグレナの抽出方法の検討を行った。
また、ユーグレナ熱水抽出物が、脂肪細胞分化のマスターレギュレーターであるＰＰＡＲγ遺伝子及びＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現量に対して与える影響を確認することにより、脂肪細胞分化抑制のメカニズムを検討した。
【００８４】
＜実施例１＞
ユーグレナ粉末（ユーグレナ・グラシリス、ＥＵ−１５９３、（株）ユーグレナ製）０．５ｇに、超純水２０ｍｌを加え震盪し、均一に分散された後、乾熱滅菌器を用いて加熱抽出（９５℃、２時間）した。遠心分離（４０００ｒｐｍ、３分、２５℃）により得られた上清を分取し、０．４５μｍ滅菌フィルターにて濾過することで、ユーグレナ熱水抽出物（ユーグレナ熱水抽出液、原液）を調製した。当該抽出液を脂肪細胞分化抑制剤として用いた。
【００８５】
＜実施例２＞
ユーグレナ粉末（ユーグレナ・グラシリス、ＥＵ−１５９３、（株）ユーグレナ製）０．５ｇに、超純水２０ｍｌを加え震盪し、均一に分散された後、室温（２５℃）で２時間抽出した。遠心分離（４０００ｒｐｍ、３分、２５℃）により得られた上清を分取し、０．４５μｍ滅菌フィルターにて濾過することで、ユーグレナ水抽出物（ユーグレナ水抽出液、原液）を調製した。当該抽出液を脂肪細胞分化抑制剤として用いた。
【００８６】
＜実施例３〜５＞
ユーグレナ粉末（ユーグレナ・グラシリス、ＥＵ−１５９３、（株）ユーグレナ製）０．５ｇに、超純水２０ｍｌを加え震盪し、均一に分散された後、乾熱滅菌器を用いて、各温度（実施例３：５０℃、実施例４:７５℃、実施例５:９５℃）で２時間熱水抽出した。遠心分離（４０００ｒｐｍ、３分、２５℃）により得られた上清を分取し、０．４５μｍ滅菌フィルターにて濾過することで、ユーグレナ熱水抽出物（ユーグレナ熱水抽出液、原液）を調製した。当該抽出液を脂肪細胞分化抑制剤として用いた。
【００８７】
＜実施例６＞
ユーグレナ粉末（ユーグレナ・グラシリス、ＥＵ−１５９３、（株）ユーグレナ製）０．５ｇに、超純水２０ｍｌを加え震盪し、均一に分散された後、高圧蒸気滅菌器を用いて加熱抽出（１２０℃、２０分）した。遠心分離（４０００ｒｐｍ、３分、２５℃）により得られた上清を分取し、０．４５μｍ滅菌フィルターにて濾過することで、ユーグレナ熱水抽出物（ユーグレナ熱水抽出液、原液）を調製した。当該抽出液を脂肪細胞分化抑制剤として用いた。
【００８８】
＜試験例１  脂肪由来幹細胞を用いたユーグレナ熱水抽出物の脂肪分化抑制試験＞
（培地）
脂肪由来幹細胞増殖培地（増殖培地）として、ＤＭＥＭ、αＭＥＭ、１％ＦＢＳ、ＩＴＳ−Ｘ、１０ｎｇ／ｍＬｂ−ＦＧＦ、ハイドロコルチゾンを含む培地を用いた。
脂肪細胞分化誘導培地として、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１μＭデキサメタゾン、０．５ｍＭ３−イソブチル−１−メチルキサンチン、０．２ｍＭインドメタシン、１０μｇ／ｍＬインスリン、３３μＭビオチンを含む培地を用いた。
脂肪細胞分化維持培地として、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１０μｇ／ｍＬインスリン、３３μＭビオチンを含む培地を用いた。
【００８９】
（細胞の準備）
１）  １５ｍｌチューブに９ｍｌの増殖培地を入れた。
２）  ヒト皮下脂肪由来幹細胞（Ｌｏｎｚａ社、ＰＴ−５００６；以下、ＡＳＣ）の凍結バイアルを液体窒素から取り出した。
３）  ３７℃の温浴に１〜２分入れ、氷片が指先程度の大きさになるまで溶かした。
４）  アルコールでふき取り、クリーンベンチ内に入れた。
５）  １）内の培地で氷片を溶解し、１）の１５ｍｌチューブに全て回収した。
６）  １２００ｒｐｍで３分間遠心した。
７）  アスピレーターで上清を除き、増殖培地を５００μｌ〜１ｍｌ入れて細胞を懸濁した。
８）  トリパンブルーと細胞懸濁液を１０μｌずつ混合し、ワンセルカウンターに入れた。
９）  顕微鏡を用いて、細胞数を計測した。
１０)  培養用ｄｉｓｈに３〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで細胞を播種した。
１１）  ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ２）で３日間培養した。
【００９０】
上記手順で準備したヒト皮下脂肪由来幹細胞を用い、ユーグレナ熱水抽出物の脂肪分化抑制試験を図２に示す手順で行った。試験の手順を以下に具体的に示す。
【００９１】
（３日前：細胞播種）
１）  細胞を顕微鏡で確認した。
２）  アスピレーターで細胞上清を除き、ＰＢＳ（−）５ｍｌを添加した。
３）  ＰＢＳ（−）をアスピレーターで除去し、トリプシン溶液（０．２５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｙｐｓｉｎ−１ｍＭ  ＥＤＴＡ（和光純薬株式会社製）を１ｍｌ滴下した。
４）  ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ２）で２分間静置した。
５）  顕微鏡で細胞を観察し、細胞が丸く、バラバラになってくることを確認した。
６）  １０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭを２ｍｌ添加し、１５ｍｌチューブに細胞を回収した。
７）  １２００ｒｐｍで３分間、遠心分離を行った。
８）  上清を除いて、増殖培地で再懸濁し、細胞数を血球計算盤でセルカウントした。
９）  ２５０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように増殖培地で調整し、２４ｗｅｌｌプレートに５００μｌずつ播種した。
１０）  ＣＯ２インキュベーターで静置した。
１１）  ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ２）で３日間培養した。
【００９２】
（０日目：脂肪分化誘導／ユーグレナ抽出物添加）
１）  脂肪細胞分化誘導培地に、各実施例のユーグレナ抽出物を添加し、ユーグレナ抽出物を所定濃度含む、ユーグレナ抽出物添加培地溶液を作製した。
２）  アスピレーターで培養上清を除き、１）で調整したユーグレナ抽出物添加培地溶液を５００μｌずつ添加した。
３）  コントロールに脂肪細胞分化誘導培地を添加した。
４）  ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ２）で７日間培養した。
５）  ２〜３日に１回、培地交換を行った。
【００９３】
（７日目：脂肪分化誘導／ユーグレナ抽出物添加）
１）  脂肪細胞分化維持培地に、各実施例のユーグレナ抽出物を添加し、ユーグレナ抽出物を所定濃度含む、ユーグレナ抽出物添加培地溶液を作製した。
２）  アスピレーターで培養上清を除き、１）で調整したユーグレナ抽出物添加培地溶液を５００μｌずつ添加した。
３）  コントロールに脂肪細胞分化維持培地を添加した。
４）  ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ２）で７日間培養した。
５）  ２〜３日に１回、培地交換を行った。
【００９４】
（１４日目：細胞測定および細胞固定）
１）  顕微鏡で細胞を確認した。
２）  ＤＭＥＭ、Ｐ／Ｓ培地：Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８＝２４：１の比でＣＣＫ−８溶液を必要量調製した。ここで、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８は、水溶性テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８を発色試薬として用いた生細胞数測定キット（株式会社同仁化学研究所製）である。
３）  アスピレーターで培養上清を除き、２）で調整したＣＣＫ−８溶液を５００μｌずつ添加した。
４）  ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ２）で１時間静置した。
５）  ９６ｗｅｌｌプレートにそれぞれ上清を１００μ×２ｗｅｌｌずつ移した。
６）  マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ及び６５０ｎｍのそれぞれの波長における吸光度を測定した。
７）  ５）で余った上清をアスピレーターで除き、ＰＢＳ（−）を５００μｌずつ添加した。
８）  ７）を計２回実施した。 
９）  ＰＢＳ（−）を除き、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を５００μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、細胞を固定した。
１０）  アルミホイルで遮光をし、４℃で２４時間以上保存した。
１１）  以下に示す方法でオイルレッドＯ染色を行い、脂肪蓄積率を定量化した。
【００９５】
（染色及び脂肪分化の定量）
Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏストック溶液を、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ：イソプロパノール＝１２０ｍｇ：４０ｍｌの比で５０ｍｌチューブに作成し、室温で保存した。
Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色液は、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏストック溶液：超純水＝３：２の比で混合し、濾過をし、直ちに以下の細胞染色に用いた。
１）  プレート内の固定液を除いた。
２）  ＰＢＳ（−）５００μｌ／ｗｅｌｌで２回洗浄した。
３）  ６０％イソプロパノール水溶液を５００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温で２分程度なじませた。
４）  ６０％イソプロパノール水溶液を除き、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色液を２５０μｌ／ｗｅｌｌ添加した。
５）  室温で１５分静置した。
６）  Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色液を除き、６０％イソプロパノール水溶液を５００μｌ／ｗｅｌｌ加え、軽く撹拌し洗浄した。
７）  ６０％イソプロパノール水溶液を除き、ＰＢＳ（−）を５００μｌ／ｗｅｌｌ加え、写真を撮影した。
８）  ＰＢＳ（−）を除き、１００％イソプロパノールを５００μｌ／ｗｅｌｌ加え、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏを抽出した。
９）  全て抽出が完了したら、９６ｗｅｌｌプレートに２００μｌ／ｗｅｌｌずつ移した。
１０）  マイクロプレートリーダーを用い、５２０ｎｍで吸光度を測定した。
１１）  吸光度の値を脂肪蓄積量とした。単位細胞あたりの脂肪蓄積量は、脂肪蓄積量（Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ）／細胞の数（ＣＣＫ−８）で換算した値を用いた。
１２）  脂肪細胞分化誘導培地を用いて培養を行ったコントロールにおける脂肪蓄積率を１００％として、脂肪蓄積率を算出した。
【００９６】
（試験例１の結果）
実施例１のユーグレナ熱水抽出物を用いて、上記試験を行った結果を解析して、ユーグレナ熱水抽出物による各濃度（５ｖｏｌ％、１０ｖｏｌ％、２０ｖｏｌ％）の脂肪蓄積率を比較したグラフを図３に示す。
コントロールにおける脂肪蓄積率を１００％としたときの、各濃度における脂肪蓄積率は、順に５６．４％、３２．５％、７．０５％であった。
脂肪蓄積率は、ユーグレナ熱水抽出物の濃度が高くなるにつれて減少した。
なお、これら試験は複数回行い、同様の再現性が得られた。
【００９７】
図４に示す通り、ユーグレナ熱水抽出物の濃度が高くなるにつれて脂肪滴（Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏで染色された部分）が少なくなっていることがわかった。
【００９８】
＜試験例２  異なる温度で抽出したユーグレナ水抽出物の脂肪分化抑制試験＞
実施例１のユーグレナ熱水抽出物の代わりに、実施例２〜６の水抽出物又は熱水抽出物（実施例２：２５℃、実施例３：５０℃、実施例４:７５℃、実施例５:９５℃、実施例６:１２０℃）を用いたこと以外は、試験例１と同様の試験を行った。
【００９９】
（試験例２の結果）
実施例２〜６のユーグレナ水抽出物又は熱水抽出物を用いた試験の結果を解析して、異なる温度で抽出したユーグレナ水抽出物又は熱水抽出物による各濃度（５ｖｏｌ％、１０ｖｏｌ％、２０ｖｏｌ％）の脂肪蓄積率を比較したグラフを図５に示す。
各温度のユーグレナ水抽出物又は熱水抽出物における脂肪蓄積率は、ユーグレナ水抽出物又は熱水抽出物の濃度が高くなるにつれて減少した。
なお、これら試験は複数回行い、同様の再現性が得られた。
【０１００】
一方、抽出温度が高くなっても、脂肪蓄積率が大きく下がることはなかった。以上の結果から、抽出の温度よりも、抽出物の濃度が、脂肪蓄積率の減少に影響を与えることがわかった。このことは、５０℃程度という比較的低い温度の熱水抽出物であっても、脂肪蓄積率の減少に効果があることを示している。
【０１０１】
図６に示す通り、各温度の水抽出物又は熱水抽出物において、ユーグレナ水抽出物又は熱水抽出物の濃度が高くなるにつれて脂肪滴が少なくなっていることがわかった。
【０１０２】
＜試験例３  ユーグレナ熱水抽出物とＥＰＡの脂肪分化抑制試験＞
実施例１のユーグレナ熱水抽出物と、比較例１として脂肪分化抑制作用を有することが知られているエイコサペンタンエン酸（ＥＰＡ）を用いて、試験例１と同様の試験を行った。
【０１０３】
（試験例３の結果）
実施例１のユーグレナ熱水抽出物を用いた試験の結果と、比較例１のＥＰＡを用いた試験の結果を解析して、ユーグレナ熱水抽出物（１０ｖｏｌ％濃度、２０ｖｏｌ％濃度）と、ＥＰＡ（１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ）の脂肪蓄積率を比較したグラフを図７に示す。
なお、本試験のＥＰＡの添加量は、ユーグレナ熱水抽出に含有されるＥＰＡの量よりも６倍以上多くなるように設定した。
比較例１における脂肪蓄積率は、８０％以上であり、実施例１のユーグレナ熱水抽出物の脂肪蓄積率と比較して高かった。
また、図８に示す通り、コントロールと比べて脂肪滴（Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏで染色された部分）が僅かに少なくなっていることがわかった。
この結果から、ユーグレナ熱水抽出物に含まれる成分のうち、ＥＰＡ以外の有効成分、特に未同定の有効成分が、脂肪細胞の分化を抑制する作用をもたらすことが分かった。
【０１０４】
＜試験例４  ユーグレナ熱水抽出物の添加期間を変えた脂肪分化抑制試験＞
実施例１のユーグレナ熱水抽出物を用い、ユーグレナの熱水抽出物を培地に添加する期間を変更した以外は、試験例１と同様の試験を行った。
具体的には、脂肪細胞分化誘導培地を用いて培養を行う０〜７日目までを前半、脂肪細胞分化維持培地を用いて培養を行う７〜１４日目までを後半としたときに、（ｉ）前半および後半にユーグレナ熱水抽出物を添加した場合と、（ｉｉ）前半のみにユーグレナ熱水抽出物を添加した場合と、（ｉｉｉ）後半のみにユーグレナ熱水抽出物を添加した場合とで、脂肪蓄積率を比較した。
【０１０５】
（試験例４の結果）
試験例４の結果を解析して、ユーグレナ熱水抽出物を添加する期間を変えた場合の脂肪蓄積率を比較したグラフを図９に示す。
ユーグレナ熱水抽出物の添加期間が（ｉ）前半および後半の場合と、（ｉｉ）前半のみの場合で、同程度の脂肪蓄積率であることがわかった。一方、（ｉｉｉ）添加期間が後半のみの場合では、脂肪蓄積率が高くなっていることがわかった。この結果は、ユーグレナ熱水抽出物の脂肪分化抑制効果は、脂肪分化誘導の前半に、その効果を発揮していることを示している。
【０１０６】
図１０に示す通り、ユーグレナ熱水抽出物の添加期間が（ｉ）前半および後半の場合と、（ｉｉ）前半のみの場合に、（ｉｉｉ）添加期間が後半のみの場合と比べて、添加脂肪滴が少なくなっていることがわかった。
【０１０７】
＜試験例５  リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現解析＞
脂肪細胞分化のマスターレギュレーターであるＰＰＡＲγ遺伝子及びＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現を調べるために、実施例１のユーグレナ熱水抽出物を用いて試験例１と同様の試験を行った。具体的には、０日目にユーグレナ熱水抽出物を添加して、分化誘導培地を用いて培養を行い、培養１日目、２日目、３日目、６日目、１３日目に、細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応で得られたｃＤＮＡを使用してリアルタイムＰＣＲを用い、ＰＰＡＲγ遺伝子及びＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現量を測定した。
【０１０８】
（ＲＮＡの回収および抽出）
１）  培地を除き、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。
２）  ＰＢＳ（−）を除いた後、全ＲＮＡ抽出試薬（ＲＮＡｉｓｏ  Ｐｌｕｓ、タカラバイオ株式会社製）０．５ｍｌを入れ、１．５ｍｌのマイクロチューブに移した（−８０℃で保存可能）。
３）  クロロホルムを１００μｌ（全ＲＮＡ抽出試薬の０．２倍量）加え、１５秒間ボルテックスミキサーで撹拌後、５分間、室温で静置した。
４）  １２０００ｇ、４℃で、１５分間遠心分離した。
５）  遠心分離の間に、新しい１．５ｍｌのマイクロチューブに、イソプロパノール５００μｌを用意した。
６）  遠心分離後、透明の層を１．５ｍｌのマイクロチューブに移し、１０秒間ボルテックスミキサーで撹拌後、１０分間、室温で静置した。
７）  １２０００ｇ、４℃で、１５分間遠心分離した。
８）  遠心分離の間、７５％エタノール水溶液を作製し、氷上に置いた。
９）  遠心分離後、上清を抜き、７５％エタノールを５００μｌずつ入れて、ボルテックスミキサーで少し撹拌した。
１０）  ７５００ｇ、４℃で、５分間で遠心分離した。
１１）  ペレットを吸わないようにし、可能な限り上清を抜いた。
１２）  室温で、１０分〜３０分間乾燥させた。
１３）  滅菌水２０μｌを加え、数回ピペッティングをしてペレットを溶かし、−２０℃で保存した。
【０１０９】
（ｃＤＮＡ合成）
１）  分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−２０００Ｃ、Ｔｈｅｒｍｏ社製）で濃度を測定した。
２）  ５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘと、２μｌ分のＴｏｔａｌ  ＲＮＡをマイクロチューブに添加し、１０μｌになるように滅菌水を加え、混合した。
３）  サーマルサイクラー（ＴＰ６００、ＴａＫａＲａ社製）に試料を設置し、３７℃で１５分間保持、８５℃で５秒間保持、２５℃に降温することで、逆転写反応を行った。
４）  ９０μｌの滅菌水を加えて１０倍希釈し、−２０℃で保存した。
【０１１０】
（リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現解析）
１）  使用するｗｅｌｌ数＋１ｗｅｌｌの容量のプライマーＳＹＢＲ  ｍｉｘを、以下の比で、試薬を混合することで作製した。
ＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）：５μｌ×ｗｅｌｌ数
プライマー：０．６μｌ×ｗｅｌｌ数
滅菌水：１．４μｌ×ｗｅｌｌ数
２）  各試料を９６ｗｅｌｌプレートに３μｌずつ添加した。ネガティブコントロール（ＮＣ）には滅菌水を添加した。
３）  プライマーＳＹＢＲ  ｍｉｘを各７μｌずつ添加し、プレート遠心機（ＰＳ―０２０、ＴＯＭＹ社製）にてスピンダウンした。
４）  リアルタイムＰＣＲ装置（Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、リアルタイムＰＣＲを実行した。
プライマーとして、以下のプライマーを用いた。
・ＰＰＡＲγ遺伝子の発現解析に用いたプライマー
ＰＰＡＲＧ−Ｆ：5'-GAACGACCAAGTAACTCTCCTCAAAT-3'（配列番号１）
ＰＰＡＲＧ−Ｒ：5'-TCTTTATTCATCAAGGAGGCCAGCATT-3'（配列番号２）
・Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現解析に用いたプライマー
ＣＥＢＰＡ−Ｆ：5'-GGGTCTGAGACTCCCTTTCCTT-3'（配列番号３）
ＣＥＢＰＡ−Ｒ：5'-CTCATTGGTCCCCCAGGAT-3'（配列番号４）
内部標準として、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡを同様に増幅した。
・Ｈｏｕｓｅ  Ｋｅｅｐｉｎｇ  Ｇｅｎｅ(ＧＡＰＤＨ)遺伝子の発現解析に用いたプライマー
ＧＡＰＤＨ−Ｆ：5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'（配列番号５）
ＧＡＰＤＨ−Ｒ：5'-TCTTCTGGGTGGCAGTGATG-3'（配列番号６）
【０１１１】
（試験例５の結果）
培養０日目のＰＰＡＲγ遺伝子発現量を１とした場合の、１日目、２日目、３日目、６日目、１３日目のＰＰＡＲγ遺伝子の発現量を比較した結果を図１１に示す。
１日目、２日目、３日目、６日目、１３日目のＰＰＡＲγ遺伝子発現量は、ユーグレナ熱水抽出物を１０ｖｏｌ％及び２０ｖｏｌ％添加した場合、各日数のコントロールに対して、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現量が、有意に減少していることがわかった。
また、ユーグレナ熱水抽出物の濃度が高くなるに従い、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現が抑制されることがわかった。
【０１１２】
培養０日目のＣ／ＥＢＰα遺伝子発現量を１とした場合の、１日目、２日目、３日目、６日目、１３日目のＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現量を比較した結果を図１２に示す。
熱水抽出物添加量が１０ｖｏｌ％及び２０ｖｏｌ％である場合のＣ／ＥＢＰα遺伝子発現量は、脂肪細胞の分化を誘導する培地で培養を行ったコントロールに対してＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現量が、有意に減少していることがわかった。
また、ユーグレナ熱水抽出物の濃度が高くなるに従い、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現が抑制されることがわかった。
【０１１３】
試験例５の結果から、ＰＰＡＲγ遺伝子及びＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現が抑制されることで、脂肪細胞への分化が抑制され、脂肪蓄積量の減少につながったことが示された。
【図１】
2018140967.tif 000003
【図２】
2018140967.tif 000004
【図３】
2018140967.tif 000005
【図４】
2018140967.tif 000006
【図５】
2018140967.tif 000007
【図６】
2018140967.tif 000008
【図７】
2018140967.tif 000009
【図８】
2018140967.tif 000010
【図９】
2018140967.tif 000011
【図１０】
2018140967.tif 000012
【図１１】
2018140967.tif 000013
【図１２】
2018140967.tif 000014
【配列表】
2018140967000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月13日(2017.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーグレナ水抽出物又はユーグレナ熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＰＰＡＲγ発現抑制剤。
【請求項２】
ユーグレナ水抽出物又はユーグレナ熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＣ／ＥＢＰα発現抑制剤。
【請求項３】
ユーグレナ水抽出物又はユーグレナ熱水抽出物を有効成分として含有し、
ＰＰＡＲγ発現抑制に用いられることを特徴とするＰＰＡＲγ発現抑制用食品組成物。
【請求項４】
ユーグレナ水抽出物又はユーグレナ熱水抽出物を有効成分として含有し、
Ｃ／ＥＢＰα発現抑制に用いられることを特徴とするＣ／ＥＢＰα発現抑制用食品組成物。
【請求項５】
ユーグレナ水抽出物又はユーグレナ熱水抽出物を有効成分として含有し、
ＰＰＡＲγ発現抑制に用いられることを特徴とするＰＰＡＲγ発現抑制用化粧料組成物。
【請求項６】
ユーグレナ水抽出物又はユーグレナ熱水抽出物を有効成分として含有し、
Ｃ／ＥＢＰα発現抑制に用いられることを特徴とするＣ／ＥＢＰα発現抑制用化粧料組成物。
【請求項７】
ユーグレナに、水を加えて振盪して分散液を得る分散液調製工程と、
前記分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナの水抽出物として得る抽出工程と、を含むことを特徴とするＰＰＡＲγ発現抑制剤の製造方法。
【請求項８】
前記分散液調製工程の後、前記抽出工程の前に、前記分散液を加熱する加熱工程を行うことを特徴とする請求項７記載のＰＰＡＲγ発現抑制剤の製造方法。
【請求項９】
ユーグレナに、水を加えて振盪して分散液を得る分散液調製工程と、
前記分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナの水抽出物として得る抽出工程と、を含むことを特徴とするＣ／ＥＢＰα発現抑制剤の製造方法。
【請求項１０】
前記分散液調製工程の後、前記抽出工程の前に、前記分散液を加熱する加熱工程を行うことを特徴とする請求項９記載のＣ／ＥＢＰα発現抑制剤の製造方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制用食品組成物、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制用食品組成物、ＰＰＡＲγ発現抑制用化粧料組成物、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制用化粧料組成物、ＰＰＡＲγ発現抑制剤の製造方法及びＣ／ＥＢＰα発現抑制剤の製造方法に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
従って、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナ水抽出物又はユーグレナ熱水抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制用食品組成物、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制用食品組成物、ＰＰＡＲγ発現抑制用化粧料組成物、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制用化粧料組成物により解決される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明は、これまでに副作用の報告がなく、食品衛生法に合致する水準の安全性を備えたユーグレナ水抽出物又はユーグレナ熱水抽出物を有効成分としているため、長期間の継続投与および継続摂取が可能である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
前記課題は、本発明によれば、ユーグレナに、水を加えて振盪して分散液を得る分散液調製工程と、前記分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナの水抽出物として得る抽出工程と、を含むことを特徴とするＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤の製造方法により解決される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明によれば、新規なＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制用食品組成物、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制用食品組成物、ＰＰＡＲγ発現抑制用化粧料組成物、及びＣ／ＥＢＰα発現抑制用化粧料組成物を提供することができる。
本発明は、これまでに副作用の報告がなく、食品衛生法に合致する水準の安全性を備えたユーグレナの水抽出物又は熱水抽出物を有効成分としているため、長期間の継続投与および継続摂取が可能である。