(57)【要約】【課題】希少細胞含有液から希少細胞を高収率で回収することが可能な希少細胞回収方法を提供する。【解決手段】希少細胞回収方法は、厚さ方向に複数の貫通孔を有するフィルターにより希少細胞含有液をろ過することにより、フィルターの一方の面上に前記希少細胞含有液に含まれる希少細胞を捕捉する捕捉工程と、前記希少細胞が捕捉された前記フィルターの一方の面上の前記希少細胞の周囲に光硬化性樹脂を導入する樹脂導入工程と、前記希少細胞の周囲に導入された前記光硬化性樹脂を硬化させることで、前記希少細胞を前記光硬化性樹脂に転写する転写工程と、前記転写工程において硬化された前記光硬化性樹脂から、前記希少細胞を回収する回収工程と、を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
厚さ方向に複数の貫通孔を有するフィルターにより希少細胞含有液をろ過することにより、フィルターの一方の面上に前記希少細胞含有液に含まれる希少細胞を捕捉する捕捉工程と、
前記希少細胞が捕捉された前記フィルターの一方の面上の前記希少細胞の周囲に光硬化性樹脂を導入する樹脂導入工程と、
前記希少細胞の周囲に導入された前記光硬化性樹脂を硬化させることで、前記希少細胞を前記光硬化性樹脂に転写する転写工程と、
前記転写工程において硬化された前記光硬化性樹脂から、前記希少細胞を回収する回収工程と、
を含む希少細胞回収方法。
【請求項２】
前記樹脂導入工程において前記フィルターの一方の面上に導入される前記光硬化性樹脂の上面の高さは、前記希少細胞の平均直径に対して、０．５倍〜３０倍である請求項１に記載の希少細胞回収方法。
【請求項３】
前記回収工程において、マイクロダイセクタ又はマイクロマニピュレーターを用いて前記希少細胞を前記光硬化性樹脂から回収する請求項１又は２に記載の希少細胞回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、希少細胞回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は世界各国で死因の上位を占め、わが国においては年間３０万人以上が癌によって死亡している。癌による死亡のほとんどが、癌の転移再発によるものである。癌の転移再発は、癌細胞が原発巣から血管又はリンパ管を経由して、別の臓器組織の血管壁に定着し、血管壁を浸潤して、血管壁に微細転移層を形成することで起こる。このように、血管又はリンパ管を介して体内を循環する癌細胞は、血中循環癌細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ、ＣＴＣ）と呼ばれる。
【０００３】
一方、末梢血液中には循環内皮細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ、ＣＥＣ）が存在する。ＣＥＣは、内皮細胞が代謝によって血管壁から剥がれ落ちた成熟細胞であり、循環器疾患、感染症、免疫疾患及び癌等の多くの疾患によってＣＥＣの数が増加することが知られている。
【０００４】
以上のように、ＣＴＣ及びＣＥＣ等の希少細胞から疾患に関する多くの情報を得られるため、これら希少細胞の存在及びその増加の早期発見が期待される。
【０００５】
しかしながら、血液には、赤血球、白血球及び血小板等の血球成分が多く含まれ、その数は、血液１ｍＬ中に３．５×１０９〜９×１０９個ともいわれている。これに対し、希少細胞は、血液１ｍＬ中に僅か数個程度しか存在しないため、希少細胞の検出及び観察は非常に困難である。血球成分が多く存在する中、希少細胞を効率的に検出するには、希少細胞と血球成分とを分離する必要がある。
【０００６】
血液中の希少細胞を分離する方法として、フィルターを用いる方法がある（例えば、特許文献１〜３）。この方法は、細胞のサイズ及び変形能の違いで希少細胞を分離する方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１３−４２６８９号公報
【特許文献２】特開２０１１−１６３８３０号公報
【特許文献３】国際公開第２０１５／０１２３１５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
近年の動向として、分離した希少細胞の遺伝子解析結果を、例えば、最適な薬剤の選定及び予後診断に利用することへの期待が高まっている。遺伝子解析に用いられるＰＣＲ及び次世代シーケンサー（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＮＧＳ）等では、解析の基となる希少細胞の量及び純度が重要となる。
【０００９】
しかしながら、特許文献１〜３のような従来の方法を用いても、フィルター上に捕捉された希少細胞を回収するのが難しく、十分な収率で希少細胞を単離することができなかった。
【００１０】
本発明は、上記の課題を鑑みてなされたものであり、希少細胞含有液から希少細胞を高収率で回収することが可能な希少細胞回収方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するため、本発明に係る希少細胞回収方法は、厚さ方向に複数の貫通孔を有するフィルターにより希少細胞含有液をろ過することにより、フィルターの一方の面上に前記希少細胞含有液に含まれる希少細胞を捕捉する捕捉工程と、前記希少細胞が捕捉された前記フィルターの一方の面上の前記希少細胞の周囲に光硬化性樹脂を導入する樹脂導入工程と、前記希少細胞の周囲に導入された前記光硬化性樹脂を硬化させることで、前記希少細胞を前記光硬化性樹脂に転写する転写工程と、前記転写工程において硬化された前記光硬化性樹脂から、前記希少細胞を回収する回収工程と、を含む。
【００１２】
上記の希少細胞回収方法によれば、希少細胞をフィルターにより捕捉した後に、フィルターの一方の面上の希少細胞の周囲に光硬化性樹脂を導入し、これを硬化させることで、希少細胞を光硬化性樹脂に転写し、回収することができる。このように、希少細胞の周囲に光硬化性樹脂を導入して硬化させることで、希少細胞の移動を抑制しながら、希少細胞を回収することができるため、希少細胞の紛失等を防ぎながら希少細胞を回収することができる。
【００１３】
ここで、前記樹脂導入工程において前記フィルターの一方の面上に導入される前記光硬化性樹脂の上面の高さは、前記希少細胞の平均直径に対して、０．５倍〜３０倍である態様とすることができる。
【００１４】
上記のように、樹脂導入工程においてフィルターの一方の面上に導入される光硬化性樹脂の上面の高さを上記の範囲とすることで、フィルター上に希少細胞を光硬化性樹脂により好適に捕捉することができる。したがって、希少細胞含有液から希少細胞をより高収率で回収することが可能となる。
【００１５】
また、前記回収工程において、マイクロダイセクタ又はマイクロマニピュレーターを用いて前記希少細胞を前記光硬化性樹脂から回収する態様とすることができる。
【００１６】
上記のように、マイクロダイセクタ又はマイクロマニピュレーターを用いることで、光硬化性樹脂からの希少細胞の回収を効率よく行うことができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、希少細胞含有液から希少細胞を高収率で回収することが可能な希少細胞回収方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の一実施形態に係る希少細胞回収方法を含む一連の操作手順を説明するフロー図である。
【図２】細胞捕捉カートリッジの構成を示す模式図である。
【図３】樹脂導入工程、転写工程及び回収工程を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。
【００２０】
本発明の一実施形態に係る希少細胞回収方法は、希少細胞含有液をフィルターでろ過することにより希少細胞をフィルターに捕捉した後、この希少細胞を光硬化性樹脂に転写し、光硬化性樹脂に保持された希少細胞を回収することを特徴とする。
【００２１】
本実施形態に係る希少細胞の単離方法における単離の対象及び希少細胞の遺伝子解析方法における遺伝子解析の対象となる「希少細胞」とは、生体試料に含まれる特定種類の細胞のことであり、通常、その細胞数の割合が希少細胞含有液に含有される全細胞の総数に対して極めて小さいものをいう。希少細胞は、例えば、ＣＴＣ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ）等の癌細胞及びＣＥＣ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ）等の内皮細胞であることができるが、これらに限定されない。
【００２２】
希少細胞含有液は、上記の希少細胞が含まれる液であり、例えば、血液、腹水、胸水及びその他の細胞懸濁液であることができる。細胞懸濁液は、例えば、白血球を含有する液であることができる。なお、希少細胞含有液には、緩衝液又は添加剤がさらに含まれていてもよい。
【００２３】
本実施形態における「捕捉」とは、希少細胞含有液をフィルターでろ過して、希少細胞をフィルター上に残留させることをいう。
【００２４】
また、本実施形態における「転写」とは、フィルターに希少細胞が捕捉された状態から、光硬化性樹脂に希少細胞が保持された状態へと移行することをいう。すなわち、フィルターから光硬化性樹脂に対して希少細胞を転写することで、光硬化性樹脂に希少細胞が保持されている状態となる。
【００２５】
以下、本実施形態に係る希少細胞回収方法について図１〜３を参照しながら、説明する。本実施形態に係る希少細胞回収方法は、図１に示すように、捕捉工程（ステップＳ０１）、洗浄工程（ステップＳ０２）、樹脂導入工程（ステップＳ０３）、転写工程（ステップＳ０４）、回収工程（ステップＳ０５）、及び、解析工程（ステップＳ０６）を含む。
【００２６】
捕捉工程Ｓ０１は、希少細胞含有液をフィルターでろ過して、希少細胞をフィルターの一方の面上に捕捉する工程である。洗浄工程Ｓ０２は、フィルター表面を洗浄液（ウォッシュバッファ）により洗浄する工程である。樹脂導入工程Ｓ０３は、フィルター表面に対して硬化前の光硬化性樹脂を導入する工程である。転写工程Ｓ０４は、フィルター表面上の光硬化性樹脂を硬化させることで、フィルターの面上の希少細胞を、光硬化性樹脂が保持している状態に移行させる工程である。回収工程Ｓ０５は、光硬化性樹脂から希少細胞を回収する工程である。解析工程Ｓ０６は、回収された希少細胞に係る解析（例えば、遺伝子解析等）を行う工程である。各工程の詳細は後述する。
【００２７】
まず、捕捉工程Ｓ０１について説明する。捕捉工程Ｓ０１は、希少細胞含有液をフィルターでろ過して希少細胞をフィルターの面上に捕捉する工程である。希少細胞含有液とは、捕捉対象の希少細胞が含まれている液体であり、例えば、血液又は血液由来の液体等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２８】
ろ過を行うための装置構成は特に限定されないが、ここでは一例として、細胞捕捉カートリッジ（単に「カートリッジ」ともいう。）を用いる場合について、図２を参照しながら説明する。
【００２９】
図２は細胞捕捉カートリッジの構成を示す模式図である。カートリッジ１００は、液体が流入する流入管１２５が接続された流入口１３０と、液体が流出する流出管１３５が接続された流出口１４０とを有する筐体１２０と、フィルター１０５とを備える。フィルター１０５は、上部部材１１０及び下部部材１１５から構成される筐体１２０により固定されている。筐体１２０の形状は直方体又は円筒等であってよく、特に制約はない。
【００３０】
上部部材１１０及び下部部材１１５は、例えばクリップ（図示せず）で互いに固定されており、クリップを外して筐体１２０を解体することで、フィルター１０５を取り出すことができる。
【００３１】
流入管１２５の上流には、例えば、希少細胞含有液又は洗浄液等の処理液が入ったリザーバーが接続される。リザーバーに入った液体は、流入管１２５から筐体１２０の内部に流れ、フィルター１０５を通って、流出管１３５から外部に排出される。このような液体の流れは、流出管１３５の下流に接続されたポンプＰの駆動により作り出すことができる。また、ポンプＰの駆動により、カートリッジ１００内での液体の移動速度（流速）を制御することができる。
【００３２】
フィルター１０５には厚さ方向に貫通する複数の貫通孔１０６が形成されている。例えば、希少細胞含有液として癌細胞を含む血液をカートリッジ１００内に導入すると、血液の血小板及び赤血球等の成分は貫通孔１０６を通過するが、希少細胞及び一部の白血球は貫通孔１０６を通過できず、フィルター１０５表面に残留する。
【００３３】
フィルター１０５は、プラスチック又は金属等の薄膜に、多数の貫通孔が形成されている構造を有するものであれば特に限定されず、従来公知のものを使用することができる。フィルター１０５は、希少細胞含有液から希少細胞以外の成分をろ液とともに取り除き、貫通孔１０６を通過しなかった希少細胞をその表面に捕捉する。例えば、希少細胞含有液として癌細胞を含む血液を使用する場合には、８μｍ（短辺）×１００μｍ（長辺）程度の大きさの略矩形状の貫通孔１０６を有するフィルターを用いることによって、赤血球、白血球、及び血小板等の血液成分をろ液として取り除き、希少細胞である癌細胞をフィルター１０５に捕捉することができる。なお、フィルター１０５に設けられる貫通孔１０６の孔径は、捕捉対象の細胞の種類等に応じて適宜変更することができる。また、貫通孔１０６の形状についても適宜変更することができる。貫通孔１０６形状としては、楕円、正方形、長方形、角丸長方形、多角形等が例示できる。なお、細胞の捕捉効率の観点からは、円、長方形又は角丸長方形が好ましい。角丸長方形とは２つの等しい長さの長辺と２つの半円形からなる形状である。
【００３４】
希少細胞含有液及び洗浄液等の液体が流入管１２５を通過するときの流速は、１００μＬ／分〜８００μＬ／分であることが好ましく、２００μＬ／分〜６００μＬ／分であることがより好ましい。液体の流速が上記範囲以内であると、希少細胞に対するダメージをより低減することができ、希少細胞の単離収率を向上させることができる。
【００３５】
フィルター１０５の貫通孔１０６に対して希少細胞含有液を通過させることが可能であれば、カートリッジ１００の具体的な構成は特に限定されない。
【００３６】
次に、洗浄工程（ステップＳ０２）について説明する。洗浄工程Ｓ０２は、フィルター表面を洗浄液で洗浄する工程である。洗浄工程Ｓ０２は、必要に応じて実施される工程であり、省略してもよい。
【００３７】
まず、カートリッジ１００の流入管１２５から洗浄液を導入し、希少細胞を捕捉したフィルター１０５を洗浄液で洗浄する。洗浄液としては、フィルター１０５上に残留した希少細胞以外の成分を洗い流せるものであれば特に限定されない。洗浄液としては、例えば、リン酸緩衝液等が挙げられる。洗浄液の量は特に制限されないが、希少細胞含有液の量の倍量程度であることができる。
【００３８】
洗浄液でフィルター１０５を洗浄する場合、洗浄液の流速は特に限定されないが、洗浄液の移動に伴って希少細胞が貫通孔１０６内へ移動することを抑制可能な流速とすることが好ましい。
【００３９】
樹脂導入工程（ステップＳ０３）及び転写工程（ステップＳ０４）については、図３を参照しながら説明する。
【００４０】
樹脂導入工程Ｓ０３は、希少細胞が捕捉されたフィルターの面上に対して流動性を有する光硬化性樹脂を導入する工程である。図３（Ａ）は、希少細胞Ｃがフィルター１０５の表面に捕捉されている状態を示している。希少細胞Ｃは、フィルター１０５の貫通孔１０６上やフィルター１０５の表面上に存在した状態でフィルター１０５に捕捉される。この状態で、フィルター１０５の表面に光硬化性樹脂を導入する。フィルター１０５の表面に光硬化性樹脂を導入した状態を図３（Ｂ）に示す。図３（Ｂ）に示すように、フィルター１０５の表面に存在する希少細胞Ｃの周囲が光硬化性樹脂Ｒで覆われた状態となる。
【００４１】
本実施形態における光硬化性樹脂とは、光エネルギーの作用で液状から固体に変化する樹脂を指す。光硬化性樹脂としては、例えば、紫外線の照射により固体に変化する紫外線硬化型樹脂等が挙げられるが、これに限定されるものではない。光硬化性樹脂としては、例えば、生体適合性のあるポリエチレングリコールを有するアクリル樹脂を用いることができる。具体的には、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールアクリレート、エトキシ化エチルヘキシルポリエチレングリコール、ブトキシ化ポリエチレングリコール、メトキシポリプロピレングリコールメタクリレート等が挙げることができる。また、これらの光硬化性樹脂は、光重合性開始剤を含むことが好ましい。
【００４２】
光硬化性樹脂Ｒの導入量は、図３（Ｂ）に示すように、フィルター１０５の表面に光硬化性樹脂を導入した際のフィルター１０５表面を基準とした上面の高さで表すことができる。希少細胞Ｃの高さ方向の大きさよりも高くなるように導入量を設定することが好ましい。光硬化性樹脂Ｒの上面の高さは、希少細胞Ｃの平均直径に応じて異なる。上面の高さは、希少細胞Ｃの平均直径に対して、０．５倍〜３０倍であることが好ましく、１．５倍〜２０倍であることがより好ましく、２倍〜１５倍であることがさらに好ましい。上面の高さが希少細胞Ｃの平均直径に対して０．５倍以上であると、フィルター１０５表面に滞留する希少細胞Ｃの周囲への光硬化性樹脂Ｒの導入が好適に行われるため、光硬化性樹脂Ｒへの希少細胞Ｃの転写を好適に行うことができる。また、上面の高さが希少細胞Ｃの平均直径に対して２倍以上であると、フィルター１０５表面に滞留する希少細胞Ｃの上面にも希少細胞Ｃが存在することになるため、光硬化性樹脂Ｒへの希少細胞Ｃの転写をより確実に行うことができる。また、光硬化性樹脂Ｒの上面の高さが希少細胞Ｃの平均直径に対して３０倍以下とすることで、光硬化性樹脂Ｒを導入した際に希少細胞Ｃが光硬化性樹脂Ｒ中を移動すること等を防ぐことができ、希少細胞Ｃを回収する作業を好適に行うことができる。また、光硬化性樹脂Ｒの上面の高さが希少細胞Ｃの平均直径に対して３０倍以下とすることにより、希少細胞Ｃの回収に係る作業をより好適に行うことができる。
【００４３】
上記の細胞の「直径」とは、顕微鏡で観察した場合の細胞の輪郭上の任意の２点を結ぶ線分のうち最も長い線分の長さのことである。また、希少細胞Ｃの平均直径としては、回収対象の希少細胞Ｃに係る公知の平均直径の情報を用いることができる。
【００４４】
なお、フィルター１０５をカートリッジ１００から取り出した後に光硬化性樹脂をフィルター１０５の表面に導入する構成としてもよいし、カートリッジ１００に取り付けられた状態で光硬化性樹脂をフィルター１０５の表面に導入する構成としてもよい。
【００４５】
転写工程Ｓ０４は、光硬化性樹脂を硬化させる工程である。フィルター１０５の表面に導入された光硬化性樹脂に対して所定の光を照射することで、光硬化性樹脂Ｒが硬化する。この結果、希少細胞Ｃの一部が硬化した光硬化性樹脂Ｒにより保持された状態となる。すなわち、光硬化性樹脂Ｒと希少細胞Ｃとが一体的な状態となる。光硬化性樹脂Ｒに対して照射する光の光量等は、光硬化性樹脂Ｒが硬化可能な条件に応じて適宜設定される。なお、光硬化性樹脂Ｒに対して過剰に光を照射することは、希少細胞Ｃに対しても同等の光を照射することにつながるため、希少細胞Ｃに対して何らかの影響を与える可能性がある。したがって、光硬化性樹脂Ｒが硬化可能な範囲であり且つ光量を少なく設定することが好ましい。具体的には、光硬化性樹脂Ｒに対して照射する光の光量（積算光量）は１０〜１０００ｍＪ／ｃｍ２であることが好ましく、５０〜５００ｍＪ／ｃｍ２であることがより好ましく、１００〜３００ｍＪ／ｃｍ２であることが更に好ましい。
【００４６】
この状態で、光硬化性樹脂Ｒをフィルター１０５上から移動させる。このとき、希少細胞Ｃは、光硬化性樹脂Ｒに保持された状態であるので、図３（Ｃ）に示すように、フィルター１０５から外れ光硬化性樹脂Ｒ側に移動する（転写）。光硬化性樹脂Ｒをフィルター１０５上から移動させる方法は特に限定されない。例えば、フィルター１０５がカートリッジ１００に取り付けられた状態で光硬化性樹脂をフィルター１０５の表面に導入した場合、光硬化性樹脂Ｒが硬化した後に筐体１２０を上部部材１１０及び下部部材１１５に分離すると、光硬化性樹脂Ｒ及びフィルター１０５が上部部材１１０側に付着した状態で下部部材１１５と分離される。このとき、光硬化性樹脂Ｒとフィルター１０５とは表面張力で吸着しているので、光硬化性樹脂Ｒとフィルター１０５とは簡単に分離することができる。フィルターを外すと、光硬化性樹脂Ｒから細胞が露出し、取り出しやすくなっている。また、上記のプロセスの場合には、光硬化性樹脂Ｒが上部部材１１０に付着した状態で後述の回収工程を行ってもよい。また、光硬化性樹脂Ｒとフィルター１０５との境界部分が密着している場合には、光硬化性樹脂Ｒとフィルター１０５との境界部分の端部に治具等を挿入することで、両者を離間させることができる。また、硬化後の光硬化性樹脂Ｒの上面（フィルター１０５側の面とは逆側の面）に対してテープ等を貼付し、このテープを利用して光硬化性樹脂Ｒをフィルター１０５から離間させる方法を用いてもよい。なお、フィルター１０５から離間させた光硬化性樹脂Ｒは、例えばスライドガラス上に移動してもよく、この場合、後述の回収工程における作業性が向上する。
【００４７】
次に、回収工程（ステップＳ０５）は、光硬化性樹脂Ｒから希少細胞Ｃを回収する工程である。必要に応じて顕微鏡を使用しながら、光硬化性樹脂Ｒに保持されている希少細胞Ｃを別容器等へ移動させて回収する。希少細胞Ｃを回収する方法としては、特に限定されないが、マイクロダイセクタ又はマイクロマニピュレーター３００を用いる方法が好ましい。マイクロダイセクタ又はマイクロマニピュレーター３００を用いる方法であれば、希少細胞Ｃを一つ一つ個別に回収することができるため、個別に回収した希少細胞Ｃについて遺伝子解析等を行うことができる。なお、マイクロダイセクタは、細胞を上に飛ばして単離する技術である。また、マイクロマニピュレーター３００は、微細なピンセットのようなもので細胞をつまみ出す技術である。希少細胞の単離に用いるマイクロダイセクタ及びマイクロマニピュレーター３００としては、公知のものを利用することができる。
【００４８】
その後、必要に応じて、解析工程（ステップＳ０６）を実施する。解析工程Ｓ０６は、捕捉工程Ｓ０１から回収工程Ｓ０５までの一連の工程によって単離された希少細胞Ｃの遺伝子解析を行う工程である。
【００４９】
単離された希少細胞Ｃに、ＮＧＳ（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）等公知の遺伝子解析法を用いて、希少細胞Ｃの遺伝子情報を得る。得られた遺伝子情報は、各種研究、検査又は診断に利用することができる。また、希少細胞Ｃは、得られた遺伝子情報に基づいて、遺伝子型によって分類されることができる。遺伝子型別に分類された癌細胞を培養して、所定濃度の癌細胞サンプルとして提供することも可能である。このように、本発明は医学及び生物学の分野において幅広く応用可能である。
【００５０】
なお、本実施形態の希少細胞回収方法は、希少細胞とその他の細胞とを判別する観点から、以上の工程の他に、希少細胞を染色する工程をさらに含むこともできる。希少細胞Ｃを染色する工程は、希少細胞Ｃを光硬化性樹脂Ｒから単離して回収するより前であれば特に限定されず、例えば、捕捉工程Ｓ０１の前、洗浄工程Ｓ０２の前、樹脂導入工程Ｓ０３の前等に行うことができる。希少細胞Ｃの染色の方法は、特に限定されないが、例えば、蛍光染色及びギムザ染色であることができる。
【００５１】
本実施形態の希少細胞Ｃの回収方法によれば、フィルター１０５によるろ過によって、希少細胞含有液から希少細胞Ｃを収率良く、且つ、希少細胞Ｃが転写されやすいように平面的に分布された状態で捕捉することができる。そして、フィルター１０５の表面に光硬化性樹脂Ｒを導入して硬化させることにより光硬化性樹脂Ｒに対して希少細胞Ｃを転写することで、希少細胞Ｃへの影響及び希少細胞Ｃの紛失を最小限に抑えながら、希少細胞Ｃを回収することができるため、希少細胞を高収率で回収することが可能となる。特に、光硬化性樹脂Ｒを希少細胞Ｃの周囲に導入し、これを硬化させることで、希少細胞Ｃの移動を規制することができる。したがって、希少細胞の紛失を抑制することができ、収率を高めることができる。
【００５２】
また、従来から、フィルターによる捕捉後の希少細胞を回収する方法として、アガロースゲル法、又は、パラフィン固定法のようにフィルター上の細胞を取り巻く液体を固化させて回収する方法が用いられていたが、光硬化性樹脂を用いる方法は、上記の方法と比較して様々な利点がある。例えば、低融点アガロースを用いて液体全体を凝固させるアガロースゲル法は、簡便で細胞紛失のリスクの低い方法であるが、アガロースの融点が高いために、取扱いが難しく、回収率も低い。また、パラフィン固定法は、古くから用いられているパラフィンを用いることで信用性が高いが、融点が高いため、細胞への影響が懸念される。これに対して、本実施形態に係る希少細胞Ｃの回収方法では、光照射のみにより、希少細胞Ｃを光硬化性樹脂Ｒに対する転写を実現することができる。したがって、操作が簡便であり、且つ細胞紛失のリスクが低くなる。また、希少細胞Ｃへのダメージも抑えることができる。
【００５３】
以上、本発明の実施形態について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、様々な変形態様が可能である。例えば、本実施形態ではカートリッジ１００を使用したろ過について説明したが、カートリッジ１００を使用せずにフィルター１０５を用いたろ過を行うこともできる。
【符号の説明】
【００５４】
１００…カートリッジ、１０５…フィルター、１０６…貫通孔、１１０…上部部材、１１５…下部部材、１２０…筐体、１２５…流入管、１３０…流入口、１３５…流出管、１４０…流出口、Ｃ…希少細胞、Ｒ…光硬化性樹脂。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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