(57)【要約】      （修正有）【課題】優れた抗腫瘍剤の提供。【解決手段】エリスロポエチン様作用を有するエリスロポエチンミメティックペプチドに由来し、ＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫのアミノ酸配列を有する、Ｎ末端がアシル化、Ｃ末端がアミド化されているペプチド（ＹＳ１２）、及び、それを含有する抗腫瘍剤の提供。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、Ｎ末端のアミノ基がアシル化され、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化されているペプチド。
【請求項２】
Ｎ末端のアミノ基がアセチル化されている請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のペプチドを含有する抗腫瘍剤。
【請求項４】
肺がん、肝臓がん、および卵巣がんからなる群より選択される少なくとも１種のがんの予防または治療に用いられる、請求項３に記載の抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ペプチドおよびこれを含有する抗腫瘍剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチン（Ｅｐｏ）は赤血球前駆細胞表面にあるエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）と結合して、その生存を守り、増殖させ、ヘモグロビン合成を促すサイトカインである。ヒトの血液中の赤血球の寿命は１２０日で、赤血球は1日にその１％が死滅するので、全血液量を５Ｌとした場合、１日に５00万個/ｍｍ３数の赤血球を新生しなくてはならない。通常、ヒトの体では、腎臓がＥｐｏを産生して血液中に分泌し、骨髄の血球幹細胞、赤芽球に作用して造血する。
【０００３】
２００１年頃までは、エリスロポエチン情報は赤血球の産生にのみ寄与していると考えられてきた。本発明者等は、２００２年以後、がんが分泌するＥｐｏを捉えることができる抗Ｅｐｏ抗体および可溶型ＥｐｏＲを用いて、ヒトがん組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏやｅｘ  ｖｉｖｏ実験を行い、Ｅｐｏ情報遮断によるがん組織崩壊の誘導を証明した。同時に、２４種のヒト悪性細胞にＥｐｏ情報伝達系が発現していることを証明した（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
また、エリスロポエチン様作用を有するエリスロポエチンミメティックペプチド（ＥＭＰ１）が報告されており、２５を超えるその誘導体のエリスロポエチン様作用についての評価が報告されている（非特許文献３）。
一方、本発明者等は、ＥＭＰ１の９番目にあるグリシンがアラニンに置換されているＥＭＰ９が、腫瘍増殖抑制作用を有していることを報告した（特許文献１）。
【０００５】
また、ｒｈＥｐｏ（遺伝子組み換えヒトエリスロポエチン）を高濃度で適応するとその作用が消失することが報告されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−２０１２５２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yasuda Y, et al. Carcinogenesis 24, 1021-1029(2003)
【非特許文献２】Yasuda Y, et al. WSEAS Press. Cambridge. 337-348(2010)
【非特許文献３】Johnson, Dana L. et al., Biochemistry 37, 3699-3710 (1998)
【非特許文献４】Abe et al. Cytotechnology 63, 101-109(2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、優れた抗腫瘍活性を有するペプチドおよびそのペプチドを含有する抗腫瘍剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、配列番号１に示される１２アミノ酸からなるペプチドであって、Ｎ末端がアシル化されＣ末端がアミド化されている修飾ペプチドが、強い抗腫瘍作用を有することを見いだし、本発明を完成した。即ち、本発明は下記の態様を包含する。
【００１０】
１．配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、Ｎ末端のアミノ基がアシル化され、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化されているペプチド。
２．Ｎ末端のアミノ基がアセチル化されている前記１に記載のペプチド。
３．前記１または２に記載のペプチドを含有する抗腫瘍剤。
４．肺がん、肝臓がん、および卵巣がんからなる群より選択される少なくとも１種のがんの予防または治療に用いられる前記３に記載の抗腫瘍剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のペプチドは、強い抗腫瘍作用を有する。特に、肺がん、肝臓がん、卵巣がんに対して強い抗腫瘍作用を有する。ｒｈＥｐｏ（遺伝子組み換えヒトエリスロポエチン）を高濃度で適応するとその作用が消失するのと同様に、ＥＭＰ９を高濃度で適応すると、腫瘍崩壊効果が得られなかったが、本発明のペプチドは、１２アミノ酸からなる低分子ペプチドであることより、Ｅｐｏ受容体の構造を変化させることなく、高濃度でも好適に効果を発揮することができる。また、短いペプチドであることにより、製剤としての安定性、取り扱い易さ、生産コストの点でも優れている。さらに、Ｎ末端とＣ末端がアシル化およびアミド化されていることにより、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼなどのエキソペプチダーゼによる分解を受けにくい点でも優れている。さらに本発明のペプチドはEpoRの発現量の少ない細胞には結合しない性質を持つ。正常細胞は腫瘍細胞と比べてEpoRｍRNAの発現量が、50分の1から500分の１と少ない（非特許文献２）。従って本発明のペプチドは正常細胞には反応しない安全性の高いペプチドであり抗腫瘍剤として好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１はＹＳ１２、ＥＭＰ９、ＥＭＰ２４、ＥＭＰ２４Ａ及びＥＭＰ２４ＡＮの肺がん由来細胞Ａ５４９に対する致死効果を示すグラフである。（ａ）ＹＳ１２は高濃度で強い致死効果がみられた。（ｂ）ＥＭＰ９（Ｅ９）の致死効果はなかった。（ｃ）ＥＭＰ２４（Ｅ２４）は高濃度で致死効果がみられた。（ｄ）ＥＭＰ２４Ａ（Ｅ２４Ａ）の致死効果はなかった。（ｅ）ＥＭＰ２４ＡＮ（Ｅ２４ＡＮ）は高濃度で致死効果がみられた。致死効果の強さは、ＥＭＰ９＝ＥＭＰ２４Ａ＜ＥＭＰ２４＝ＥＭＰ２４ＡＮ＜ＹＳ１２であった。
【図２】図２はＹＳ１２、ＥＭＰ９、ＥＭＰ２４、ＥＭＰ２４Ａ及びＥＭＰ２４ＡＮの肝臓がん由来細胞ＨｅｐＧ２に対する致死効果を示すグラフである。（ａ）ＹＳ１２は高濃度で強い致死効果がみられた。（ｂ）ＥＭＰ９の致死効果はなかった。（ｃ）ＥＭＰ２４は高濃度で致死効果がみられた。（ｄ）ＥＭＰ２４Ａの致死効果はなかった。（ｅ）ＥＭＰ２４ＡＮの致死効果はなかった。致死効果の強さは、ＥＭＰ９＝ＥＭＰ２４Ａ＝ＥＭＰ２４ＡＮ＜ＥＭＰ２４＜ＹＳ１２であった。
【図３】図３はＹＳ１２、ＥＭＰ９及びＥＭＰ２４の肺がん由来細胞Ａ５４９に対する致死効果を示すグラフである。（ａ）ＹＳ１２は低濃度から致死効果がみられている。（ｂ）ＥＭＰ９は高濃度のみで軽度な致死効果がみられた。（ｃ）ＥＭＰ２４は高濃度のみで中等度の致死効果がみられた。致死効果の強さは、ＥＭＰ９＜ＥＭＰ２４＜＜ＹＳ１２であった。
【図４】図４はＹＳ１２、ＥＭＰ９及びＥＭＰ２４の肝臓がん由来細胞ＨｅｐＧ２に対する致死効果を示すグラフである。（ａ）ＹＳ１２は中濃度から致死効果がみられている。（ｂ）ＥＭＰ９は明確な致死効果はみられていない。（ｃ）ＥＭＰ２４は高濃度のみで軽度な致死効果がみられた。致死効果の強さは、ＥＭＰ９＜ＥＭＰ２４＜ＹＳ１２であった。
【図５】図５はＹＳ１２、ＥＭＰ９及びＥＭＰ２４の卵巣がん由来細胞Ａ２７８０に対する致死効果を示すグラフである。（ａ）ＹＳ１２は中濃度から致死効果がみられている。（ｂ）ＥＭＰ９は高濃度のみで致死効果がみられた。（ｃ）ＥＭＰ２４は高濃度のみで致死効果がみられた。致死効果の強さは、ＥＭＰ９＝ＥＭＰ２４＜ＹＳ１２であった。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、Ｎ末端のアミノ基がアシル化され、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化されているペプチド（本明細書において、「本発明のペプチド」と示すこともある。）に関する。
【００１４】
本発明のペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫ）と同一のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が含まれる。配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドとは、たとえば、１〜２個のアミノ酸がＤ−アミノ酸に置換されているペプチドが挙げられる。
【００１５】
本発明のペプチドは、Ｎ末端のセリン残基のアミノ基がアシル化されている。アシル基はセリン残基のアミノ基の窒素原子に１〜２個結合しており、好ましくは、セリン残基の窒素原子に１個のアシル基が結合している。アシル基としては、Ｃ１−６のアシル基が好ましく、より好ましくは、Ｃ１−３のアシル基、さらに好ましくは、Ｃ１−２のアシル基、最も好ましくはＣ１のアセチル基である。
【００１６】
本発明のペプチドは、Ｃ末端のリシンのカルボキシル基がアミド化され、カルボン酸アミドになっている。１級アミド、２級アミド、３級アミドのいずれでもよく、1級アミドが好ましい。
【００１７】
本発明のペプチドにはシステイン残基が２個含まれている。好ましくは、それらシステイン残基は分子内でジスルフィド結合されている。
【００１８】
本発明のペプチドの好ましい実施形態の一つとして、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、Ｎ末端のアミノ基がアセチル化され、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化されて、１級アミド（-C(=O)-NH2）が形成されているペプチドが挙げられる。さらに、２つのシステインがジスルフィド結合されているペプチドがより好ましいペプチドとして挙げられる。
【００１９】
本発明のペプチドには、分子内のアミノ酸の側鎖上にある、例えば、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨなどが適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているペプチドも含まれる。また、本発明のペプチドには、糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
【００２０】
本発明のペプチドには、本発明のペプチドの塩も含まれる。本発明のペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸など）との塩などが挙げられる。また、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、アルミニウムまたはアンモニウムなど）との塩、有機塩基（例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジンなど）との塩なども挙げられる。
【００２１】
本発明のペプチドは溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
【００２２】
本発明のペプチドは、プロドラッグ化されていてもよい。プロドラッグとしては、生体内における生理条件下で酵素や胃酸等による反応により本発明のペプチドに変換する化合物、すなわち酵素的に酸化、還元、加水分解等を起こして本発明のペプチドに変化する化合物、胃酸等により加水分解等を起こして本発明のペプチドに変化する化合物などが用いられる。具体的には、本発明のペプチドのアミノ基がアシル化、アルキル化、りん酸化された化合物（例えば、エイコサノイル化、アラニル化、ペンチルアミノカルボニル化、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メトキシカルボニル化、テトラヒドロフラニル化、ピロリジルメチル化、ピバロイルオキシメチル化、tert−ブチル化された化合物等）；本発明のペプチドの水酸基がアシル化、アルキル化、りん酸化、ホウ酸化された化合物（例えば、アセチル化、パルミトイル化、プロパノイル化、ピバロイル化、スクシニル化、フマリル化、アラニル化、ジメチルアミノメチルカルボニル化された化合物等）；等が挙げられる。これらの化合物は公知の方法によって本発明のペプチドから製造することができる。
【００２３】
本発明のペプチドは、公知のペプチドの合成法に従って製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。すなわち、本発明のペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（１）〜（３）からに記載された方法が挙げられる。
（１）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９８５年）
（２）実験化学講座第５版、高分子化学、２６巻  丸善(株）(２００７年)
（３）野上靖純著  パートナー薬品製造学、第２版、南江堂（２０１２年）
【００２４】
より具体的には、本発明のペプチドの合成には、通常市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。例えばポリスチレンを基材とした樹脂を用いることができる。Ｃ末端がアミド化されているペプチドを得るには出発原料の樹脂として、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ樹脂（Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ樹脂）、ＭＢＨＡ樹脂、Ｓｉｅｂｅｒ  ａｍｉｄｅ樹脂、ＰＡＬ樹脂、Ｒａｍａｇｅ  ａｍｉｄｅ樹脂ならびにそれらのアミノ官能基とポリスチレンとの間にポリエチレングリコールなどの膨潤剤やリンカーを導入した樹脂等を用いることができる。このような樹脂と、α−アミノ基と側鎖官能基を適当な保護基（例えば、Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ）で保護したアミノ酸を原料として用い、目的とするペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のペプチドを取得する。保護基の除去（脱離）や樹脂からのペプチドの切り離しは、公知の方法（例えば、トリフルオロ酢酸よる酸処理）により行うことができる。なお、Ｎ末端がアシル化されているペプチドは、無水酢酸などで反応することにより得ることができる。樹脂から切り離された粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し所望のペプチド得ることができる。
【００２５】
本発明は、本発明のペプチドを含有する抗腫瘍剤（本明細書において、「本発明の抗腫瘍剤」と示すこともある。）に関する。
【００２６】
本発明の抗腫瘍剤は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）における悪性腫瘍や良性腫瘍（例えば、原発性、転移性または再発性の、乳がん、前立腺がん、すい臓がん、胃がん、肺がん、大腸がん（結腸がん、直腸がん、肛門がん）、食道がん、十二指腸がん、頭頚部がん（舌がん、咽頭がん、喉頭がん、甲状腺がん）、脳腫瘍、神経鞘腫、非小細胞肺がん、肺小細胞がん、肝臓がん、腎臓がん、胆管がん、子宮がん（子宮体がん、子宮頸がん）、卵巣がん、膀胱がん、皮膚がん、血管腫、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、骨腫瘍、血管腫、血管線維腫、網膜肉腫、陰茎がん、小児固形がん、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、子宮筋腫、骨芽細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、がん性の中皮腫瘍、白血病などの腫瘍など）の予防または治療剤として有用である。肺がん、肝臓がん、卵巣がん、すい臓がん、腎臓がん、大腸がん、黒色腫、脳腫瘍、胃がん、および乳がんの予防または治療に好適に用いることができる。特に、肺がん、肝臓がん、および卵巣がんの予防または治療に好適に用いることができる。本発明の抗腫瘍剤は、毒性が低く、安全である。
【００２７】
本発明の抗腫瘍剤に含有される本発明のペプチドもしくはその塩、その溶媒和物またはそのプロドラッグは、毒性が低く、医薬製剤の製造法で一般的に用いられている公知の手段に従って、そのままあるいは薬理学的に許容される担体と混合して、例えば錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤等の医薬製剤として、経口的または非経口的（例、局所、直腸、静脈、皮下、筋肉内、経鼻、経膣、経口腔粘膜、経肺粘膜、点眼投与等）に安全に投与することができる。
【００２８】
本発明の抗腫瘍剤の製造に用いられてもよい薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が挙げられ、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤および崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤および無痛化剤等が挙げられる。更に必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。
【００２９】
賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。結合剤としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ショ糖、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等が挙げられる。崩壊剤としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
【００３０】
溶剤としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。懸濁化剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン、等の界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。等張化剤としては、例えばブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。無痛化剤としては、例えばベンジルアルコール等が挙げられる。防腐剤としては、例えばパラヒドロキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。抗酸化剤としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロール等が挙げられる。
【００３１】
調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。投与に当たっては、前記の注射用組成物を慣用の水性希釈剤中で溶解し、液剤として用いることができる。水性希釈剤としてはぶどう糖水溶液、生理食塩水、リンゲル液、栄養補給剤液などが含まれる。
【００３２】
注射剤にリン酸またはその塩が含まれる場合、その注射剤中のリン酸ナトリウムあるいはリン酸カリウムの濃度は約０.１ｍＭないし５００ｍＭであり、約１ｍＭないし１００ｍＭのときが好ましい。無菌製剤にするには、製造全工程を無菌にする方法、ガンマ線で滅菌する方法、防腐剤を添加する方法等が挙げられるが、特に限定されない。
【００３３】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや非ヒト哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
【００３４】
本発明の抗腫瘍剤において、本発明のペプチドもしくはその塩、その溶媒和物またはそのプロドラッグの含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常、製剤全体に対して約０．１〜１００重量％、好ましくは約１０〜９９．９重量％、さらに好ましくは約２０〜９０重量％程度である。本発明の抗腫瘍剤において、本発明のペプチドもしくはその塩、その溶媒和物またはそのプロドラッグ以外の成分の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常、製剤全体に対して約１０〜９９．９重量％、好ましくは約２０〜９０重量％程度である。本発明の抗腫瘍剤の投与量は、投与ルート、症状、患者の年令などによっても異なるが、例えば、腫瘍やがん等の増殖性臓器疾患を治療する目的で静注など非経口的に投与する場合、１日当たり体重１ｋｇあたりペプチドとして約０．００５〜５０ｍｇ，好ましくは約０．０５〜１０ｍｇ、さらに好ましくは約０．２〜４ｍｇを１〜３回に分割投与できる。
【００３５】
本発明の抗腫瘍剤は、本発明のペプチドもしくはその塩、その溶媒和物またはそのプロドラッグ以外に、適宜、他の医薬と適量配合して、または適量併用して使用することもできる。このような併用薬としては、例えば、種々の抗腫瘍剤や抗がん剤が挙げられる。
【００３６】
以下に、実施例、参考例および試験例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【実施例】
【００３７】
実施例１  ＹＳ１２の合成
下記の構造を有するＹＳ１２を合成した。
【化１】
2018154565.tif 000003
ペプチド自動合成機（ＣＥＭ社製）を使用し、プログラムに従ってＣ端より９‐ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ法（Ｆｍｏｃ法）によりペプチド鎖を逐次延長し、目的の保護ペプチド樹脂の合成を行った。
Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ樹脂（渡辺化学工業）を出発原料として使用し、通常のアミノ酸誘導体をシークエンスにしたがって順次縮合させて保護ペプチド樹脂を構築した。樹脂上へのペプチドの構築が終了した後、保護ペプチド樹脂を乾燥した。得られた保護ペプチドの脱保護基とペプチドの樹脂担体からの切り離しはトリフルオロ酢酸処理により行った。
粗ペプチドを樹脂担体から分離した後、得られた粗ペプチド（還元型）を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社  ｍｏｄｅｌ  ＬＣ−８Ａ）により精製した。
精製ペプチド（還元型）はヨウ素処理により粗ペプチド（酸化型）に変換しジスルフィド結合を形成させた。得られた粗ペプチド（酸化型）をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥した。
精製物は分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ）、質量分析（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社  １１００  ｓｅｒｉｅｓ  ＬＣ−ＭＳＤ）ならびにアミノ酸分析（ＨＩＴＡＣＨＩ社  Ｌ−８９００）により検定し、目的のペプチドＹＳ１２である事を確認した。
結果
アミノ酸分析値：
Ｔｈｒ（１）０．８９，  Ｓｅｒ（１）０．７９，  Ｇｌｙ（１）０．９８，  
Ｃｙｓ（２）１．５１，  Ｖａｌ（１）０．９８，  Ｌｅｕ（１）１．００，  
Ｐｈｅ（１）１．００，  Ｌｙｓ（１）１．００，  ＮＨ３（１）１．５９，  
Ｈｉｓ（１）０．９９，  Ｔｒｐ（１）０．７７，  Ｐｒｏ（１）０．９９
純度（ＨＰＬＣ）：９７．１％
ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝１４１６．３
【００３８】
参考例  
エリスロポエチンミメティックペプチド９（以下ＥＭＰ９）、エリスロポエチンミメティックペプチド２４（以下ＥＭＰ２４）、エリスロポエチンミメティックペプチド２４のグリシン（Ｇ）をアラニン（Ａ）に変換したペプチド（以下ＥＭＰ２４Ａ）、ＥＭＰ２４Ａにアセチル基（Ａｃ基）とアミド基（ＮＨ２）基を付けたペプチド（以下ＥＭＰ２４ＡＮ）を実施例１と同様にして合成し、生成ペプチドが目的のペプチドであることを確認した。以下に各ペプチドの構造を示す。各ペプチドのシステイン残基は分子内でジスルフィド結合を形成している。なお、ＥＭＰ２４ＡＮの合成には、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ樹脂を出発原料として使用し、そのほかのペプチドの合成には、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｗａｎｇ樹脂を出発原料として使用した。
ＥＭＰ９：    ＧＧＴＹＳＣＨＦＡＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ  （配列番号２）
ＥＭＰ２４：          ＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫ          （配列番号３）
ＥＭＰ２４Ａ：        ＳＣＨＦＡＰＬＴＷＶＣＫ          （配列番号４）
ＥＭＰ２４ＡＮ：Ａｃ−ＳＣＨＦＡＰＬＴＷＶＣＫ−ＮＨ２  （配列番号５）
ＹＳ１２：      Ａｃ−ＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫ−ＮＨ２  （配列番号１）
【００３９】
試験例1  
（Ａ）方法
１．がん細胞株
試験１および試験２では、肺がん細胞株Ａ５４９及び肝臓がん細胞株ＨｅｐＧ２を用いた。試験３、試験４および試験５では、肺がん細胞株Ａ５４９及び肝臓がん細胞株ＨｅｐＧ２に加え、卵巣がん細胞株Ａ２７８０を用いた。これら細胞株はＡＴＣＣ，ＨＳＲＲＢまたはＥＣＡＣＣより購入し、近畿大学医学部及び京都大学医学部において継代維持されたものである。
【００４０】
２．被験物
試験１および試験２では、ＥＭＰ９、ＥＭＰ２４、ＥＭＰ２４Ａ、ＥＭＰ２４ＡＮ、およびＹＳ１２を用いた。試験３、試験４および試験５では、ＥＭＰ９、ＥＭＰ２４、およびＹＳ１２を用いた。
【００４１】
３．プレ培養
検査する種々の細胞株の細胞接着性を安定化させる為に、各がん細胞の７×１０４個を１ｍＬの培養液入りの２４穴プレートに撒種して１６−１８時間培養 (３７℃、５％ＣＯ２混入空気) した。
【００４２】
４．被験物質の処置
被験薬入りの培養液５０μLを１時間毎に３回、被験がん細胞株の入った穴(培養液１ｍＬ／ｗｅｌｌ)に入れた。３回処置後、第１回目処置から２４時間、３７℃、５％ＣＯ２混入空気で培養した。
被験物質の濃度は、培養液中の濃度が０．０２５、０．０５及び０．１ｍｇ／ｍＬになる様に調製した。ただし、Ａ５４９細胞株のＹＳ１２処置については、さらに低濃度の０．０１ｍｇ／ｍＬを設けた。
【００４３】
５．培養後の細胞の処置
各ｗｅｌｌにおいて、培養上清と接着被験細胞の処置を行った。すなわち、まず、培養上清（ｓｕｐ）を遠沈（１３，０００ｒｐｍ，１ｍｉｎ）後、上清（ｓｕｐ）を廃棄して沈殿物（３ｓｅｄ）を得た。次いで、各ｗｅｌｌの接着被験細胞に０．５ｍＬのｔｒｙｐｓｉｎ（０．０５％）を加えて、３７℃で２分間静置した。次いで、０．５ ｍＬの培養液を加えｐｉｐｅｔｔｉｎｇにより細胞を剥離後、全液を遠沈し（４０００ｒｐｍ, １ｍｉｎ）、沈殿物 (細胞４ｓｅｄ)と上清（４ｓｕｐ）を得た。
細胞４ｓｅｄに３０μＬの培養液を加えた（５ａ）。また、細胞３ｓｅｄに２０μＬの培養液を加えた（５ｂ）。５ａと５ｂを混和し、死亡細胞を染色するためｎｉｇｒｏｓｉｎｅ液（Ｋａｌｔｅｎｂａｃｈら,１９５８）の最終濃度が１％となるように加え撹拌し、細胞混和液を作成した。
【００４４】
６．細胞の計数
上記の細胞混和液をｃｅｌｌ−ｃｏｕｎｔｅｒ（バイオメデカルサイエンス社製）に注入し、８区画の細胞計数空間における死亡細胞数及び生存細胞を計数した。各区画の死亡率を算出して平均し、１標本の死亡率とした。
【００４５】
７．標本数及び統計処理
試験１および試験２の標本数は基本３標本とし、統計処理は行わなかった。
試験３、試験４および試験５の標本数は９標本とし、分散をＦ検定により行い、次いで等分散あるいは非等分散のＴ検定を実施した。
【００４６】
（Ｂ）結果
試験１．肺がん由来細胞株Ａ５４９を用いた試験
ＹＳ１２、ＥＭＰ９、ＥＭＰ２４、ＥＭＰ２４Ａ及びＥＭＰ２４ＡＮを０．０２５、０．０５及び０．１ｍｇ／ｍＬの濃度でＡ５４９細胞致死効果を確認した。その結果、ＥＭＰ９及びＥＭＰ２４Ａでは０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で致死効果は認められなかった。ＥＭＰ２４暴露では高濃度である０．１ｍｇ／ｍＬにおいて４４．７％と中等度の致死効果が認められた。また、ＥＭＰ２４ＡＮ暴露においても高濃度である０．１ｍｇ／ｍＬにおいて４８．７９％と中等度の致死効果が認められた。一方、ＹＳ１２では高濃度である０．１ｍｇ／ｍＬにおいて６８．３％と明確な致死効果が認められた。
致死効果の強さは、ＥＭＰ９＝ＥＭＰ２４Ａ＜ＥＭＰ２４＝ＥＭＰ２４ＡＮ＜ＹＳ１２であった（図１）。
【００４７】
試験２．肝臓がん由来細胞株ＨｅｐＧ２を用いた試験
ＹＳ１２、ＥＭＰ９、ＥＭＰ２４、ＥＭＰ２４Ａ及びＥＭＰ２４ＡＮを０．０２５、０．０５及び０．１ｍｇ／ｍＬの濃度でＨｅｐＧ２細胞に暴露して、細胞致死効果を確認した。
その結果、ＥＭＰ９、ＥＭＰ２４Ａ及びＥＭＰ２４ＡＮでは０．１ ｍｇ／ｍＬまでの濃度で致死効果は認められなかった。ＥＭＰ２４暴露では高濃度である０．１ｍｇ／ｍＬにおいて２５．９％と軽度な致死効果が認められた。一方、ＹＳ１２では高濃度である０．１ｍｇ／ｍＬにおいて５８．１％と明確な致死効果が認められた。
致死効果の強さは、ＥＭＰ９＝ＥＭＰ２４Ａ＝ＥＭＰ２４ＡＮ＜ＥＭＰ２４＜ＹＳ１２であった（図２）。
【００４８】
試験１および試験２のまとめ
ＥＭＰ９、ＥＭＰ２４、ＥＭＰ２４Ａ、ＥＭＰ２４ＡＮ、ＹＳ１２について、肝臓がん細胞株ＨｅｐＧ２及び肺がん細胞株Ａ５４９を用いて予備的に細胞致死効果を確認した結果、ＥＭＰ２４Ａでは効果は認められず、ＥＭＰ２４ＡＮにおいても効果はないか中等度であり、ＹＳ１２の効果は明確であった。そこで、以下の試験３〜５では、ＹＳ１２の比較対照として既知のペプチドであるＥＭＰ９とＥＭＰ２４を用いた。
【００４９】
試験３．肺がん由来細胞株Ａ５４９を用いた実験
ＹＳ１２、ＥＭＰ９及びＥＭＰ２４を０．０１（ＹＳ１２のみ）、０．０２５、０．０５及び０．１ｍｇ／ｍＬの濃度でＡ５４９細胞に暴露して、細胞致死効果を確認した。
その結果、ＥＭＰ９では高濃度である０．１ｍｇ／ｍＬにおいてのみ軽度な致死効果がみられ、ＥＭＰ２４においても高濃度である０．１ｍｇ／ｍＬにおいてのみ中等度の致死効果が認められた。一方、ＹＳ１２では最低濃度である０．０１ｍｇ／ｍＬでは効果は認められなかったが、低濃度である０．０２５ｍｇ／ｍＬにおいても有意な細胞致死効果が認められた。これは、ＥＭＰ９及びＥＭＰ２４の４倍の効果を有することを示唆するものである。
致死効果の強さは、ＥＭＰ９＜ＥＭＰ２４＜＜ＹＳ１２であった（図３）。
【００５０】
試験４．肝臓がん由来細胞株ＨｅｐＧ２を用いた実験
ＹＳ１２、ＥＭＰ９及びＥＭＰ２４を０．０２５、０．０５及び０．１ｍｇ／ｍＬの濃度でＨｅｐＧ２細胞に暴露して、細胞致死効果を確認した。
その結果、ＥＭＰ９では高濃度である０．１ｍｇ／ｍＬにおいても致死効果が認められなかった。ＥＭＰ２４では高濃度である０．１ ｍｇ／ｍＬにおいてのみ軽度な致死効果が認められた。一方、ＹＳ１２では中濃度である０．０５ｍｇ／ｍＬで軽度な（統計学的に有意）効果が認められ、高濃度である０．１ｍｇ／ｍＬにおいても中等度の有意な細胞致死効果が認められた。これは、ＥＭＰ９の４倍以上、ＥＭＰ２４の２倍の効果を有することを示唆するものである。
致死効果の強さは、ＥＭＰ９＜ＥＭＰ２４＜ＹＳ１２であった（図４）。
【００５１】
試験５．卵巣がん由来細胞株Ａ２７８０を用いた実験
ＹＳ１２、ＥＭＰ９及びＥＭＰ２４を０．０２５、０．０５及び０．１ｍｇ／ｍＬの濃度でＡ２７８０細胞に暴露して、細胞致死効果を確認した。
その結果、ＥＭＰ９及びＥＭＰ２４では高濃度である０．１ｍｇ／ｍＬにおいてのみ軽度な致死効果が認められた。一方、ＹＳ１２では中濃度である０．０５ｍｇ／ｍＬで軽度な（統計学的に有意）効果が認められ、高濃度である０．１ｍｇ／ｍＬにおいても中等度の有意な細胞致死効果が認められた。これは、ＥＭＰ９及びＥＭＰ２４の２倍の効果を有することを示唆するものである。
致死効果の強さは、ＥＭＰ９＝ＥＭＰ２４＜ＹＳ１２であった（図５）。
【００５２】
試験３〜試験５のまとめ
ＹＳ１２、ＥＭＰ９及びＥＭＰ２４について肺がん細胞株Ａ５４９、肝臓がん細胞株ＨｅｐＧ２および卵巣がん細胞株Ａ２７８０を用いてがん細胞致死効果を確認した結果、ＹＳ１２はＥＭＰ９に比べ、２倍、４倍あるいは４倍以上の効果が確認され、ＥＭＰ２４に比べても２倍あるいは４倍の効果が確認できた。これはＹＳ１２の優れた抗腫瘍作用を示すものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のペプチドは、抗腫瘍剤として、種々のがんや腫瘍の予防および治療に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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