(57)【要約】【課題】新規なポリペプチドを提供することを課題とする。【解決手段】以下の（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）のポリペプチド：（Ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（Ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチド；（Ｃ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加したアミノ酸配列からなり、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）のポリペプチド：
（Ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（Ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加したアミノ酸配列からなり、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
下記（１）〜（６）の理化学的性質：
（１）作用：β−ガラクトシダーゼ活性を有する
（２）至適反応ｐＨ：５．０〜６．０
（３）安定ｐＨ：５．０〜９．０
（４）至適反応温度：５０〜７５℃
（５）温度安定性：５〜６０℃
（６）分子量：約１２０ｋＤａ
を有するポリペプチド。
【請求項３】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の微生物に由来する請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ストレプトマイセス属の微生物がストレプトマイセス  サーモビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）である請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を示し、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列表の配列番号２に示す塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、挿入、置換および／または付加した塩基配列からなり、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の微生物に由来する請求項５に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
請求項５または６に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドで処理した乳製品。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドを乳製品原料に添加し、４〜９０℃で保温する工程を含む、乳製品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−ガラクトシダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
乳製品に含まれるラクトース（乳糖）はグルコースとガラクトースからなる二糖である。小腸はラクトースを吸収することができない。ラクトースは、小腸内のβ−ガラクトシダーゼ活性によりグルコースとガラクトースに加水分解されて、はじめて吸収が可能となる。小腸内にβ−ガラクトシダーゼが十分に存在しない場合には、乳糖を十分に分解できず、下痢や腹痛の原因となる。
【０００３】
乳製品の製造工程では、ラクトースを分解するためにβ−ガラクトシダーゼによる処理が行われている。しかし、従来用いられているＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ等に由来するβ−ガラクトシダーゼは至適反応温度が約４０℃であって雑菌の繁殖温度に近いため、ラクトースの分解時に雑菌が繁殖してしまうおそれがあった。
【０００４】
その他、従来、ストレプトマイセス  リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）由来（特許文献１）、ストレプトマイセス  セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来（特許文献２）のβ−ガラクトシダーゼが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許４７１７６６６号公報
【特許文献２】米国特許３８１６２５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
人体に安全な、耐熱性のβ−ガラクトシダーゼを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、検討の結果、新規な耐熱性のβ−ガラクトシダーゼを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）のポリペプチド：
（Ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（Ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加したアミノ酸配列からなり、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチド
に関する。
【０００９】
また、本発明は、下記（１）〜（６）の理化学的性質：
（１）作用：β−ガラクトシダーゼ活性を有する
（２）至適反応ｐＨ：５．０〜６．０
（３）安定ｐＨ：５．０〜９．０
（４）至適反応温度：５０〜７５℃
（５）温度安定性：５〜６０℃
（６）分子量：約１２０ｋＤａ
を有するポリペプチド
に関する。
【００１０】
前記ポリペプチドは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の微生物に由来することが好ましい。
【００１１】
ストレプトマイセス属の微生物がストレプトマイセス  サーモビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）であることが好ましい。
【００１２】
また、本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を示し、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列表の配列番号２に示す塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、挿入、置換および／または付加した塩基配列からなり、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
に関する。
【００１３】
前記ＤＮＡは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の微生物に由来することが好ましい。
【００１４】
また、本発明は、前記ＤＮＡを含むベクターに関する。
【００１５】
また、本発明は、前記ベクターを含む形質転換体に関する。
【００１６】
また、本発明は、前記ポリペプチドで処理した乳製品に関する。
【００１７】
また、本発明は、前記ポリペプチドを乳製品原料に添加し、４〜９０℃で保温する工程を含む、乳製品の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のβ−ガラクトシダーゼは高温条件でも高い活性を維持し、ラクトースを分解できる。高温条件で乳糖を加水分解できるので、乳糖の加水分解に必要な時間を短縮でき、その結果、乳製品の製造時間を短縮できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例２および比較例１の結果（耐熱性）を示す。
【図２】実施例３および比較例２の結果（温度依存性）を示す。
【図３】実施例４および比較例３の結果（ｐＨ安定性）を示す。
【図４】実施例５および比較例４の結果（ｐＨ依存性）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のポリペプチドは、下記（１）〜（６）の理化学的性質を有する。
（１）作用：β−ガラクトシダーゼ活性を有する
（２）至適反応ｐＨ：５．０〜６．０
（３）安定ｐＨ：５．０〜９．０
（４）至適反応温度：５０〜７５℃
（５）温度安定性：５〜６０℃
（６）分子量：約１２０ｋＤａ
を有するポリペプチド。
【００２１】
以下に、理化学的性質を個別に説明する。
（１）作用
β−ガラクトシダーゼ活性は、ラクトースを基質として１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する活性をいう。
【００２２】
（２）至適反応ｐＨ
至適反応ｐＨはｐＨ５．０〜６．０である。至適反応ｐＨは、ラクトースを基質としてｐＨ５．５で反応させた場合と比較して５０％以上の活性を維持するｐＨである。
【００２３】
（３）安定ｐＨ
安定ｐＨはｐＨ５．０〜９．０である。安定ｐＨは、ラクトースを基質としてポリペプチドを３０分間置いた後でも、元の活性の５０％以上が保たれるｐＨである。
【００２４】
（４）至適反応温度
至適反応温度は５０〜７５℃である。至適反応温度は、ラクトースを基質として６５℃で反応させた場合と比較して４０％以上の活性を維持する温度である。
【００２５】
（５）温度安定性
温度安定性は５〜６０℃である。温度安定性は、ラクトースを基質としてポリペプチドを３０分保温した後でも、保温前の活性の５０％以上が保たれる温度である。
【００２６】
（６）分子量
本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において約１２０ｋＤａの分子量を示す。
【００２７】
また、本発明のポリペプチドは、以下の（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）のポリペプチドである。
（Ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（Ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を示し、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加したアミノ酸配列からなり、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチド。
【００２８】
本発明のポリペプチドと、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列との配列同一性は、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがさらにより好ましい。アミノ酸配列の配列同一性は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と、評価対象のアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を総アミノ酸数で除して１００を乗じた値で表される。
【００２９】
欠失、挿入、置換および／または付加されるアミノ酸の個数は、１７９個以下であることが好ましく、１１９個以下であることがより好ましく、５９個以下であることがさらに好ましく、２３個以下であることがさらにより好ましい。特に好ましくは５個、４個、３個、または２個以下である。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、β−ガラクトシダーゼ活性を有する微生物などの生物から単離できる。本発明のポリペプチドの由来生物としては、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、エッシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属等が挙げられ、中でもストレプトマイセス属が好ましい。ストレプトマイセス属の中では、ストレプトマイセス  サーモビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）がより好ましく、ストレプトマイセス  サーモビオラセウス  ＮＢＲＣ  １３９０５株が最も好ましい。
【００３１】
また、本発明のＤＮＡは、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡである。
（ａ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を示し、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列表の配列番号２に示す塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、挿入、置換および／または付加した塩基配列からなり、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００３２】
配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡで、かつβ−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【００３３】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法により行うことができる。ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄して得られるＤＮＡをあげることができる。６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄して得られるＤＮＡであることが好ましく、６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄して得られるＤＮＡであることがより好ましく、６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄して得られるＤＮＡであることがさらに好ましい。
【００３４】
本発明のＤＮＡと、配列番号２に示す塩基配列との配列同一性は、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがさらにより好ましい。
【００３５】
塩基配列の配列同一性は、配列表の配列番号２に示した塩基配列と評価したい塩基配列とを比較し、両方の配列で塩基が一致した位置の数を比較総塩基数で除して、さらに１００を乗じた値で表される。
【００３６】
配列表の配列番号２に示した塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、挿入、置換および／または付加した塩基配列からなり、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡは、公知の遺伝子改変方法に準じて調製することができる。
【００３７】
欠失、挿入、置換および／または付加される塩基の数は、５３８個以下であることが好ましく、３５８個以下であることがより好ましく、１７９個以下であることがさらに好ましく、７１個以下であることがさらにより好ましく、特に好ましくは２０個、１０個、５個、４個、３個、または２個以下である。
【００３８】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに挿入することにより、ポリペプチドを発現するベクターを作製できる。また、このベクターで宿主生物を形質転換することにより形質転換体を作製できる。この形質転換体を培養することにより、本発明のポリペプチドを発現させることができる。
【００３９】
ベクターは宿主生物内でポリペプチドを発現できるものであればよく、例えばプラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられる。
【００４０】
宿主は前記ベクターにより形質転換され、ポリペプチドを発現することができる生物であればよい。宿主は、ストレプトマイセス属、エッシェリヒア属、バシラス属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属等が挙げられる。中でもストレプトマイセス属が好ましく、ストレプトマイセス  サーモビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）がより好ましい。
【００４１】
本発明のポリペプチドを発現する細胞を培養し、培養物からポリペプチドを精製することにより、ポリペプチドを生産することができる。細胞は、本発明のポリペプチドを本来発現する細胞であってもよく、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを含む形質転換体であってもよい。培養物としては、細胞若しくは菌体の破砕物、培養上清、培養細胞、培養菌体が挙げられる。
【００４２】
細胞培養のための培地は、細胞が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、細胞の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、キシロース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物が挙げられる。その他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を添加してもよい。
【００４３】
培養条件は、培地の種類、培養方法などにより適宜選択すればよく、細胞が増殖し、ポリペプチドを産生できる条件であれば特に制限はない。通常、液体培地中で振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下で、２５〜３５℃、好ましくは２７℃〜３０℃で２４〜９６時間行われる。ｐＨは、３．０〜９．０、好ましくは５．０〜８．５、より好ましくは６．０〜８．０、さらに好ましくは６．０〜７．０に調節される。ｐＨの調整は、無機酸または有機酸、アルカリ溶液などを用いて行うことができる。
【００４４】
タンパク質が宿主菌体内に蓄積する場合には、培養終了後、遠心分離によって形質転換細胞を回収し、得られた菌体を超音波処理などによって破砕した後、遠心分離などによって無細胞抽出液を得る。これを出発材料とし、塩析法や、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどの一般的なタンパク質精製法により精製することができる。発現したタンパク質が細胞外に分泌される場合には、培養上清から同様に精製することができる。
【００４５】
前記ポリペプチド、または前記形質転換体で乳製品原料を処理することにより、乳製品原料に含まれる乳糖を分解できる。本発明のポリペプチドは耐熱性を有するため、雑菌が繁殖できないような高温条件で、雑菌の繁殖を抑えつつ乳糖を分解できる。乳糖分解時の温度は、４〜９０℃であることが好ましく、４０〜８０℃であることがより好ましく、５０〜７５℃であることがさらに好ましい。
【００４６】
本発明のポリペプチドの至適反応ｐＨは弱酸性〜中性であるため、弱酸性〜中性の乳製品においても効率よく乳糖を分解できる。乳糖分解反応時のｐＨは、ｐＨ５．０〜９．０であることが好ましく、ｐＨ５．０〜８．０であることがより好ましく、ｐＨ５．０〜６．５であることがさらに好ましい。
【００４７】
乳製品は、その原料に乳糖を含む乳製品であれば限定されないが、例えば牛乳、ヨーグルト、チーズ、バター、粉ミルク、ミルクジャムの練乳等が挙げられる。
【実施例】
【００４８】
（実施例１）ポリペプチドの発現および精製
配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡを放線菌用の発現ベクター（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２００８；６２：２４４-２４８に記載のｐＴＯＮＡ５ａ）に挿入し、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６株を宿主として、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２００８；６２：２４４-２４８に記載の方法で培養し、ポリペプチドを菌体外に分泌発現させた。この培養上清を、簡易ゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア社製、ＰＤ−１０カラム）に供し、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を含むβ−ガラクトシダーゼを精製した。
【００４９】
（実施例２）耐熱性の検討
前処理として、実施例１で精製したβ−ガラクトシダーゼをリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中で１０〜７０℃で１０分保温した。前処理後のβ−ガラクトシダーゼの加水分解活性を、下記の条件により測定した。
＜加水分解の反応条件＞
ラクトース：５％
反応温度：６０℃
反応時間：１０分間
反応ｐＨ：５．５
【００５０】
β−ガラクトシダーゼ活性の指標として、ラクトースの加水分解で生成されたグルコースの量を、グルコースＣＩＩテストワコー（和光純薬工業株式会社製）で測定した。
【００５１】
前処理をしない場合のβ−ガラクトシダーゼ活性を１００％としたときの、前処理後の残存活性を算出した。結果を図１に示す。
【００５２】
（実施例３）温度依存性の検討
実施例１で精製したβ−ガラクトシダーゼの３０〜８０℃における加水分解活性を、下記の条件により測定した。
＜加水分解の反応条件＞
ラクトース：５％
反応温度：３０〜８０℃
反応時間：１０分間
反応ｐＨ：５．５
【００５３】
β−ガラクトシダーゼによるラクトースの加水分解反応で生成されたグルコースの量を、実施例２に記載の方法で測定した。６５℃で反応させた場合のβ−ガラクトシダーゼ活性を１００％としたときの、各反応温度における相対活性を算出した。結果を図２に示す。
【００５４】
（実施例４）ｐＨ安定性の検討
前処理として、実施例１で精製したβ−ガラクトシダーゼをＢｒｉｔｔｏｎ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液（ｐＨ４．０〜９．０）中で、３０℃の条件で３０分保持した。前処理後のβ−ガラクトシダーゼの加水分解活性を、下記の条件により測定した。
＜加水分解の反応条件＞
ラクトース：５％
反応温度：６０℃
反応時間：１０分間
反応ｐＨ：５．５
【００５５】
β−ガラクトシダーゼによるラクトースの加水分解反応で生成されたグルコースの量を、実施例２に記載の方法で測定した。前処理をしない場合のβ−ガラクトシダーゼ活性を１００％としたときの、前処理後の残存活性を算出した。結果を図３に示す。
【００５６】
（実施例５）ｐＨ依存性の検討
実施例１で精製したβ−ガラクトシダーゼのｐＨ３．０〜９．０における活性を、下記の条件により測定した。
＜加水分解の反応条件＞
ラクトース：５％
反応温度：６０℃
反応時間：１０分間
反応ｐＨ：３．０〜９．０
反応緩衝液：Ｂｒｉｔｔｏｎ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液
【００５７】
β−ガラクトシダーゼによるラクトースの加水分解反応で生成されたグルコースの量を、実施例２に記載の方法で測定した。ｐＨ５．５で反応させた場合のβ−ガラクトシダーゼ活性を１００％としたときの、各反応ｐＨにおける相対活性を算出した。結果を図４に示す。
【００５８】
（比較例１）
実施例１で精製したβ−ガラクトシダーゼに代えて、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓに由来するβ−ガラクトシダーゼを用い、反応ｐＨを６．５、反応温度を３０℃にした以外は、実施例２と同じ操作を行い、耐熱性を測定した。結果を図１に示す。
【００５９】
（比較例２）
実施例１で精製したβ−ガラクトシダーゼに代えて、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓに由来するβ−ガラクトシダーゼを用い、反応ｐＨを６．５とした以外は、実施例３と同じ操作を行い、温度依存性を測定した。結果を図２に示す。
【００６０】
（比較例３）
実施例１で精製したβ−ガラクトシダーゼに代えて、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓに由来するβ−ガラクトシダーゼを用い、反応ｐＨを６．５、反応温度を３０℃にした以外は、実施例４と同じ操作を行い、ｐＨ安定性を測定した。結果を図３に示す。
【００６１】
（比較例４）
実施例１で精製したβ−ガラクトシダーゼに代えて、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓに由来するβ−ガラクトシダーゼを用い、反応温度を３０℃とした以外は、実施例５と同じ操作を行い、ｐＨ依存性を測定した。結果を図４に示す。
【００６２】
（実施例６）牛乳中のラクトース分解の検討
１Ｌの牛乳に、実施例１で精製したβ−ガラクトシダーゼ（３００Ｕ）を添加し、６５℃で１８時間保温した。ここで、１Ｕのβ−ガラクトシダーゼ活性はラクトースを基質として１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する活性である。
【００６３】
Ｆ−キット  乳糖／Ｄ−ガラクトース（（株）Ｊ．Ｋ．インターナショナル製）を用いて保温後の牛乳中のラクトース量を定量し、ラクトースの分解率を算出した。その結果、元の牛乳に含まれていたラクトースの８６％がβ−ガラクトシダーゼにより分解されたことが確認された。
【図１】
2018000084.tif 000002
【図２】
2018000084.tif 000003
【図３】
2018000084.tif 000004
【図４】
2018000084.tif 000005
【配列表】
2018000084000001.app