(57)【要約】【課題】透液性を有する蓋体を用いた細胞培養容器において、スフェロイドをより確実に隔室に閉じ込める。【解決手段】容器本体と、容器本体の内腔に対して出し入れ自在な蓋体１５ａとを備える細胞培養容器。内腔の底面１３には、細胞２０ａを収容するための複数の凹部２１ａが配置されている。蓋体１５ａは、可撓性を有する透液性素材からなる。複数の凹部２１ａを覆うように内腔に挿入された蓋体１５ａが培養液に浸漬されている状態において、蓋体１５ａが底面１３に向かって沈降することで、蓋体１５ａの下面が底面１３に追随するように賦形される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器本体と、前記容器本体の内腔に対して出し入れ自在な蓋体とを備え、前記内腔の底面には細胞を収容するための複数の凹部が配置されており、前記蓋体は可撓性を有する透液性素材からなり、
前記複数の凹部を覆うように前記内腔に挿入された前記蓋体が培養液に浸漬されている状態において、前記蓋体が沈降することで、前記蓋体の下面が前記底面に追随するように前記蓋体の下面が賦形されるとともに、その賦形された形状が保持される、細胞培養容器。
【請求項２】
前記凹部の側面及び底面に内接する仮想的な球の直径が１０〜１５００μｍである、請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項３】
前記透液性素材は水に沈む素材であり、前記状態において、前記蓋体の自重により前記蓋体が前記底面に向かって自由に沈降することで、前記蓋体の下面が前記底面に追随するように前記蓋体の下面が賦形されるとともに、その賦形された形状が保持される、請求項１又は２に記載の細胞培養容器。
【請求項４】
前記容器本体は前記内腔を取り囲む内側面を備え、前記蓋体が培養液に浸漬されている状態において前記蓋体の側面が、前記内側面に接していないことから前記蓋体の沈降を妨げる応力が発生しないこと、又は前記内側面に接していることから前記蓋体の沈降を妨げる応力が発生するものの前記蓋体の重さが前記応力及び前記蓋体に働く浮力に勝ることにより、
前記蓋体の下面が前記底面に追随するように前記底面に接する、請求項３に記載の細胞培養容器。
【請求項５】
前記蓋体が培養液に浸漬されている状態において、
前記内腔及び前記蓋体を平面視すると円形であり、前記蓋体の径は前記内腔の径よりも小さい、又は前記内腔及び前記蓋体を平面視すると長方形であり、前記蓋体の縦及び横の寸法はそれぞれ前記内腔の縦及び横の寸法よりも小さい、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項６】
前記蓋体の厚みが前記凹部の深さよりも大きく、かつ、前記蓋体の厚みが１〜５ｍｍである、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項７】
上蓋をさらに備え、前記上蓋は押さえ部材を備え、前記内腔において前記蓋体の上面が前記押さえ部材で押さえられる、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項８】
上蓋をさらに備え、前記内腔は前記容器本体の上部の開口に連通し、前記開口において前記蓋体の上面が前記上蓋の下面で押さえられる、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項９】
前記蓋体の上面を押さえる重りをさらに備える、請求項１〜８のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項１０】
前記蓋体における前記透液性素材がセルロースからなり、前記セルロースが織物、不織布、又は多孔質を形成している、請求項１〜９のいずれかに記載の細胞培養容器。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞培養容器内でスフェロイドを製造する方法であって、
前記凹部及び前記内腔の前記底面側の領域に培養液が注入されているとともに、前記凹部に細胞が収容されている前記細胞培養容器において前記複数の凹部を前記蓋体で覆うとともに前記領域の前記培養液に前記蓋体を浸漬し、又は前記凹部に細胞が収容されている前記細胞培養容器において前記複数の凹部を前記蓋体で覆うとともに前記内腔の前記底面側の領域に培養液を注入することで、前記領域の前記培養液に前記蓋体を浸漬し、
前記蓋体を沈降させることにより、前記蓋体の下面を前記底面に追随するように賦形するとともにその賦形された形状を保持することで前記細胞を前記蓋体及び前記凹部で囲まれた隔室内に閉じ込め、前記隔室内で前記細胞を培養してスフェロイドを形成する、スフェロイドを製造する方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞培養容器内で細胞を維持する方法であって、
前記凹部及び前記内腔の前記底面側の領域に培養液が注入されているとともに、前記凹部に細胞が収容されている前記細胞培養容器において前記複数の凹部を前記蓋体で覆うとともに前記領域の前記培養液に前記蓋体を浸漬し、又は前記凹部に細胞が収容されている前記細胞培養容器において前記複数の凹部を前記蓋体で覆うとともに前記内腔の前記底面側の領域に培養液を注入することで、前記領域の前記培養液に前記蓋体を浸漬し、
前記蓋体を沈降させることにより、前記蓋体の下面を前記底面に追随するように賦形するとともにその賦形された形状を保持することで前記細胞を前記蓋体及び前記凹部で囲まれた隔室内に閉じ込める、細胞を維持する方法。
【請求項１３】
前記細胞は、前記隔室内でスフェロイドを形成している、請求項１２に記載の細胞を維持する方法。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の細胞を維持する方法で細胞を維持しながら、前記細胞を搬送する、細胞の搬送方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
引用文献１には、容器本体と、容器本体の内部に配置される蓋体とを備える細胞培養容器が開示されている。係る容器本体の内腔の底面にはマイクロメートルオーダーの凹部が設けられている。凹部は細胞等が培養される隔室（compartment）として機能する。蓋体は、隔室が配置された上記底面を覆うように、容器本体の開口から挿入される。
【０００３】
隔室内で細胞を培養することで、スフェロイドと呼ばれる球状の細胞凝集塊が得られる。隔室の内径の大きさを適切に選択することで、それぞれの隔室に一個ずつスフェロイドを形成するとともに、そのスフェロイドの大きさを制御することができる。
【０００４】
底面には隔室が格子状に多数配置されている。隔室の上面は開口となっており、係る開口からスフェロイドを隔室内外に出し入れすることができる。また上記蓋体が底面を覆うことで、スフェロイドが隔室から飛び出して、他の隔室のスフェロイドに接触することを防止する。このため、各隔室に均一な大きさのスフェロイドを形成することができる。同様の蓋体は特許文献２及び３にも開示されている。
【０００５】
特許文献１に記載の蓋体は、透液性を有している点に特徴がある。係る蓋体は容器本体の内腔に注入された培養液に浸漬される。したがって、培養液は蓋体の上面及び下面の間を自由に循環する。また蓋体に金属製メッシュや板状物を用いているため、蓋体は自重によって撓みにくく、平坦な状態を維持することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１５−０７３５２０号公報
【特許文献２】特開２０１０−１５８２１４号公報
【特許文献３】特許第５７３１７０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、透液性を有する蓋体を用いた細胞培養容器において、スフェロイドまたは細胞をより確実に隔室に閉じ込めることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
［１］  容器本体と、前記容器本体の内腔に対して出し入れ自在な蓋体とを備え、前記内腔の底面には細胞を収容するための複数の凹部が配置されており、前記蓋体は可撓性を有する透液性素材からなり、
前記複数の凹部を覆うように前記内腔に挿入された前記蓋体が培養液に浸漬されている状態において、前記蓋体が沈降することで、前記蓋体の下面が前記底面に追随するように前記蓋体の下面が賦形されるとともに、その賦形された形状が保持される、細胞培養容器。
［２］  前記凹部の側面及び底面に内接する仮想的な球の直径が１０〜１５００μｍである、［１］の細胞培養容器。
［３］  前記透液性素材は水に沈む素材であり、前記状態において、前記蓋体の自重により前記蓋体が前記底面に向かって自由に沈降することで、前記蓋体の下面が前記底面に追随するように前記蓋体の下面が賦形されるとともに、その賦形された形状が保持される、［１］又は［２］の細胞培養容器。
［４］  前記容器本体は前記内腔を取り囲む内側面を備え、前記蓋体が培養液に浸漬されている状態において前記蓋体の側面が、前記内側面に接していないことから前記蓋体の沈降を妨げる応力が発生しないこと、又は前記内側面に接していることから前記蓋体の沈降を妨げる応力が発生するものの前記蓋体の重さが前記応力及び前記蓋体に働く浮力に勝ることにより、
前記蓋体の下面が前記底面に追随するように前記底面に接する、［３］の細胞培養容器。
［５］  前記蓋体が培養液に浸漬されている状態において、
前記内腔及び前記蓋体を平面視すると円形であり、前記蓋体の径は前記内腔の径よりも小さい、又は前記内腔及び前記蓋体を平面視すると長方形であり、前記蓋体の縦及び横の寸法はそれぞれ前記内腔の縦及び横の寸法よりも小さい、［１］〜［４］の細胞培養容器。
［６］  前記蓋体の厚みが前記凹部の深さよりも大きく、かつ、前記蓋体の厚みが１〜５ｍｍである、［１］〜［５］の細胞培養容器。
［７］  上蓋をさらに備え、前記上蓋は押さえ部材を備え、前記内腔において前記蓋体の上面が前記押さえ部材で押さえられる、［１］〜［６］の細胞培養容器。
［８］  上蓋をさらに備え、前記内腔は前記容器本体の上部の開口に連通し、前記開口において前記蓋体の上面が前記上蓋の下面で押さえられる、［１］〜［６］の細胞培養容器。
［９］  前記蓋体の上面を押さえる重りをさらに備える、［１］〜［８］の細胞培養容器。
［１０］  前記蓋体における前記透液性素材がセルロースからなり、前記セルロースが織物、不織布、又は多孔質を形成している、［１］〜［９］の細胞培養容器。
［１１］  ［１］〜［１０］の細胞培養容器内でスフェロイドを製造する方法であって、
前記凹部及び前記内腔の前記底面側の領域に培養液が注入されているとともに、前記凹部に細胞が収容されている前記細胞培養容器において前記複数の凹部を前記蓋体で覆うとともに前記領域の前記培養液に前記蓋体を浸漬し、又は前記凹部に細胞が収容されている前記細胞培養容器において前記複数の凹部を前記蓋体で覆うとともに前記内腔の前記底面側の領域に培養液を注入することで、前記領域の前記培養液に前記蓋体を浸漬し、
前記蓋体を沈降させることにより、前記蓋体の下面を前記底面に追随するように賦形するとともにその賦形された形状を保持することで前記細胞を前記蓋体及び前記凹部で囲まれた隔室内に閉じ込め、前記隔室内で前記細胞を培養してスフェロイドを形成する、スフェロイドを製造する方法。
［１２］  ［１］〜［１０］の細胞培養容器内で細胞を維持する方法であって、
前記凹部及び前記内腔の前記底面側の領域に培養液が注入されているとともに、前記凹部に細胞が収容されている前記細胞培養容器において前記複数の凹部を前記蓋体で覆うとともに前記領域の前記培養液に前記蓋体を浸漬し、又は前記凹部に細胞が収容されている前記細胞培養容器において前記複数の凹部を前記蓋体で覆うとともに前記内腔の前記底面側の領域に培養液を注入することで、前記領域の前記培養液に前記蓋体を浸漬し、
前記蓋体を沈降させることにより、前記蓋体の下面を前記底面に追随するように賦形するとともにその賦形された形状を保持することで前記細胞を前記蓋体及び前記凹部で囲まれた隔室内に閉じ込める、細胞を維持する方法。
［１３］  前記細胞は、前記隔室内でスフェロイドを形成している、［１２］の細胞を維持する方法。
［１４］  ［１２］又は［１３］の細胞を維持する方法で細胞を維持しながら、前記細胞を搬送する、細胞の搬送方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、透液性を有する蓋体を用いた細胞培養容器において、スフェロイドまたは細胞をより確実に隔室に閉じ込めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】細胞培養容器の断面図である。
【図２】底面に接した蓋体の模式図である。
【図３】底面の拡大断面図である。
【図４】底面上に静置した蓋体の模式図である。
【図５】底面に追随するように接しない蓋体の断面図１である。
【図６】底面に追随するように接しない蓋体の断面図２である。
【図７】蓋体側面及び内側面のテーパの断面図である。
【図８】押さえ部材を用いない細胞培養容器の断面図である。
【図９】実施例及び参考例に用いた蓋体の像である。
【図１０】実施例１の細胞培養容器を平面視した時の像である。
【図１１】実施例１の細胞培養容器を斜め視した時の像である。
【図１２】実施例１の細胞培養容器に水を注入した時の像である。
【図１３】参考例１の細胞培養容器を平面視した時の像である。
【図１４】参考例１の細胞培養容器を斜め視した時の像である。
【図１５】参考例１の細胞培養容器に水を注入した時の像１である。
【図１６】参考例１の細胞培養容器に水を注入した時の像２である。
【図１７】参考例２の細胞培養容器を平面視した時の像である。
【図１８】参考例２の細胞培養容器を斜め視した時の像である。
【図１９】参考例２の細胞培養容器に水を注入した時の像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、簡略のために本発明を図面に従って説明をするが、本発明は図面に図示した態様にとらわれるものではない。
【００１２】
図１には細胞培養容器１０の断面が示されている。細胞培養容器１０は容器本体１１と、蓋体１５ａとを備える。容器本体１１は内腔１２を有する。容器本体１１は底面１３及び内側面１４ａ，ｂを有する。容器本体１１はさらに上部に開口を有する。内腔１２は底面１３及び内側面１４ａ，ｂ並びに上部の開口に囲まれている。
【００１３】
図１に示す蓋体１５ａは内腔１２に対して挿脱自在である。図中では内腔１２の上部は容器本体１１の開口となっている。かかる開口は容器本体１１の上部に位置する。蓋体１５ａを出し入れするための開口の位置や大きさや形状は限定されない。開口はくびれていてもよく、また細胞培養容器１０の側面に位置していてもよい。
【００１４】
図１に示す蓋体１５ａは底面１３上に配置されている。内腔１２の底面１３側の領域２９には培養液１９が注入されている。領域２９は底面１３に面している。また内腔１２には蓋体１５ａが挿入されている。蓋体１５ａの全体が内腔１２に収容されている。蓋体１５ａは培養液１９に浸漬されている。
【００１５】
図１に示す蓋体１５ａの自重により蓋体１５ａは底面１３に向かって沈降する。一態様において蓋体１５ａの自重により蓋体１５ａは底面１３に向かって自由に沈降する。ここで自由に沈降するとは、重力以外の外力によって強制的に沈降させられることが無いことをいう。蓋体１５ａは大気圧における25℃の水に沈む。また蓋体１５ａは大気圧における25℃の培養液１９に沈む。一態様において大気圧における25℃の培養液の比重は1.00より大きい。一態様において大気圧における25℃の培養液の比重は2.0以下である。大気圧における25℃の培養液の比重は例えば1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.10、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8及び1.9のいずれかでもよい。一態様において蓋体１５ａの比重は培養液の比重よりも大きい。
【００１６】
図１に示す蓋体１５ａは透液性素材からなる。透液性素材の組成は細胞の培養を妨げないものである限り特に制限されない。例えばセルロースでもよい。セルロースの他には金属、樹脂、ガラス、天然繊維でもよい。また透液性素材は織物、不織布及び多孔質のいずれかでもよい。多孔質はスポンジでもよい。
【００１７】
図２には断面視した底面１３が拡大して示されている。底面１３には蓋体１５ａが接している。後述するように蓋体１５ａは底面１３に追随するように接する。底面１３には、凹部２１ａをはじめとする複数の凹部が配置されている。これらの凹部には上述の培養液が注入される。凹部のそれぞれには細胞２０ａをはじめとする細胞が収容されている。図中の上方から見た時の、すなわち平面視した時、複数の凹部は格子状に配置されていてもよい。
【００１８】
図２に示す底面１３におけるこれらの凹部の密度は、例えば、10個／ｃｍ２〜106個／ｃｍ２である。係る密度は20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1x103、2x103、3x103、4x103、5x103、6x103、7x103、8x103、9x103、1x104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、及び9x105個／ｃｍ２とすることができる。
【００１９】
図２に示すマイクロウェル状の凹部２１ａは、図１に示す容器本体１１を成形する際に設けてもよく、成形後に設けてもよい。またスタンパの転写により成形した凹部を有するシートを、係る凹部を有しない容器本体の内腔の底面に貼り付けてもよい。容器本体及びシートは合成樹脂からなるものでもよい。
【００２０】
図２には仮想的な球２２が示されている。球２２は凹部２１ａの側面及び底面に内接する。球２２の直径は１０〜１５００μｍとしてもよい。球２２の大きさが凹部２１ａの形状及び大きさを定めるための指標となる。また球２２は凹部２１ａ内で形成されるスフェロイドの大きさの限界を定めている。
【００２１】
図２に示す球２２の直径は20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、600、700、800、900、1000、1200、1300及び1400μｍのいずれかとすることができる。
【００２２】
図２に示す凹部２１ａに囲まれる空間の形状は柱体でも、逆錐台でも、逆錐体でもよい。係る空間を平面視した時の形状は円でも三角形でも、四角形でも、六角形でも、他の多角形でもよい。四角は長方形でもひし形でもよい。長方形は正方形でもよい。凹部２１ａの底面は平面でも曲面でもよい。底面は下に凸でもよい。係る底面は球面の一部でもよく、逆錐形でも逆錐台でもよい。他の凹部の形状及び大きさは凹部２１ａと同じでもよく、異なっていてもよい。凹部２１ａの底部には容器本体１１の下面に通じる孔が設けられていてもよい。また凹部２１ａの底部には孔が無くてもよい。
【００２３】
例えば平面視した時に正方形となる四角柱であれば正方形の一辺の長さは10〜1500μｍとしてもよい。また一辺の長さは20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、600、700、800、900、1000、1200、1300及び1400μｍのいずれかとすることができる。
【００２４】
図２に示す凹部２１ａの深さは10〜5000μｍとしてもよい。凹部２１ａの深さは20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、600、700、800、900、1000、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、3000及び4000μｍのいずれかとすることができる。
【００２５】
図２に示す蓋体１５ａの厚みは凹部２１ａの深さよりも大きくしてもよい。水又は培養液に浸漬した時の蓋体１５ａの厚みは1、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、5、6、7、8、9及び10ｍｍのいずれか以上でもよい。蓋体１５ａの厚みは1〜5ｍｍとしてもよい。
【００２６】
図３は底面１３の構造をさらに拡大して示すための断面図である。底面１３の構造の上端面は凹部２１ａの上部開口２４と、凹部２１ａを区画する壁２３の上端とからなる。壁２３は細胞培養容器の内腔の底部に設けられた凸部である。底面１３は係る上端面と凹部２１ａとをまとめてなる部分である。底面１３は図１に示す通り内腔１２の底部である。
【００２７】
図２に戻る。蓋体１５ａは凹部２１ａをはじめとする凹部を覆う。このとき、蓋体１５ａは図１に示したように培養液に浸漬されている。蓋体１５ａは培養液を吸収することで膨潤していてもよい。
【００２８】
ここで、図２に示す各凹部において蓋体１５ａが覆う場合には、細胞２０ａをはじめとする細胞が各凹部からこぼれない程度に、蓋体１５ａが各凹部と接近していることが好ましい。細胞培養容器を平面視したとき、複数の凹部が形成された領域のうち、このような接近状態で、蓋体１５ａによって覆われる部分の割合が大きいほど、凹部からの細胞の離脱を抑制できる。係る割合は、８０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらにより好ましく、９８％以上がさらにより好ましい。最も好ましくは１００％である。
【００２９】
本実施形態では図２に示すように蓋体１５ａの下面は容器本体１１の内腔２１の底面１３に追随するように賦形される。このため、各凹部を区画する壁２３の上端と蓋体との距離が０μｍとなる箇所、すなわちこれらが接触する箇所があってもよい。
【００３０】
一方で、図２に示す蓋体１５ａの重さにより、蓋体１５ａの下面が底面１３に押し付けられ続ける。このため蓋体１５ａの下面の形状が保持される。すなわち細胞培養容器の使用時には、各凹部を区画する壁２３の上端と蓋体１５ａとは接近する。
【００３１】
具体的には図３に示すように壁２３の上端と蓋体１５ａとの間隙Ｇは、細胞２０ａが凹部２１ａからこぼれない程度の大きさに保たれる。このため、当該隙間Ｇの大きさは１００μｍ以下であれば好ましく、５０μｍ以下であればより好ましく、２０μｍ以下が最も好ましい。蓋体１５ａが、細胞の配置された凹部を覆う範囲において、当該隙間Ｇの大きさが上記範囲にあれば良い。
【００３２】
図２に示す底面１３を巨視的に見れば平面である。しかしながら、底面１３には設計上許容される誤差の範囲で歪みが生じている。図中では左側から順に山と谷が出来ている。係る歪みは巨視的には認識できずとも、細胞の大きさのスケール、すなわちマイクロメートルスケールでは十分に大きく認識され得る。
【００３３】
図２にも示されるように、蓋体１５ａの自重により蓋体１５ａは底面１３に向かって自由に沈降する。このため、蓋体１５ａは底面１３上に静置される。さらに蓋体１５ａは可撓性を有する。蓋体１５ａは培養液を吸収したときに可撓性を呈するものでもよい。
【００３４】
図２に示す蓋体１５ａが前記底面に沈降することで、前記蓋体の下面が前記底面に追随するように前記蓋体の下面が賦形されるとともに、その形状が保持される。一態様において蓋体１５ａが自由に沈降することで、蓋体１５ａの下面は、蓋体１５ａの重さにより、底面１３に追随するように賦形される。一態様において、図２に示す蓋体１５ａの下面が底面１３に追随するように賦形される際、蓋体１５ａが強制的に押し沈められることで、応力により浮き上がる部分等が生じないものでもよい。
【００３５】
図２に示すように蓋体１５ａの下面は、上述のマイクロメートルスケールの歪みに追随するように賦形される。また蓋体１５ａの重さにより、蓋体１５ａの下面が底面１３に押し付けられ続ける。このため蓋体１５ａの下面の形状が保持される。
【００３６】
図３に示すように蓋体１５ａの下面は、少なくとも凹部２１ａの上部開口２４を覆う程度に、底面１３に追随していればよい。以上により、細胞２０ａを蓋体１５ａ及び凹部２１ａで囲まれた隔室２６内に閉じ込める。
【００３７】
本実施形態の一態様は、細胞培養容器内で、スフェロイドを製造する方法である。図３に示す細胞２０ａ及び他の細胞を培養することでスフェロイドを形成する。これにより、それぞれの隔室２６に一個ずつスフェロイドを形成するとともに、そのスフェロイドの大きさを制御することができる。スフェロイドの大きさを仮想的な球２２の大きさでもって、制御してもよい。本明細書においてスフェロイドは球状の細胞凝集塊のことをいう。
【００３８】
本発明において用いる細胞に特に制限は無い。これらの細胞は付着性細胞でもよい。例えば、多能性幹細胞を用いることができる。多能性幹細胞はｉＰＳ細胞でもよい。細胞は１個の細胞のみで存在しなくともよい。例えば数個の細胞が互いにくっ付き合っていてもよい。これらの細胞が凝集して、また増殖してスフェロイドを形成してもよい。
【００３９】
本実施形態ではスフェロイドを製造する際にランダムな大きさのスフェロイドが生じることを防止する。したがって生理機能や分化のステージが異なることが防止される。このため細胞培養容器内のスフェロイドは均一性が高い。
【００４０】
図２に示す凹部２１ａ及び他の凹部にスフェロイドが形成された後は蓋体１５ａを撤去する。これにより、図３に示すような凹部の上部開口２４を経由してスフェロイドを隔室２６の外に出すことができる。
【００４１】
図４は、底面１３上に蓋体２５が静置されている様子を模式的に示す。蓋体２５は、先に示した蓋体１５ａと異なり、自重によって撓みにくく、また平坦な状態を維持することができる。
【００４２】
図４に示すように蓋体２５と底面１３との間には隙間が生じる。係る隙間から細胞２０ａがこぼれる場合がある。図中では細胞２０ａは隣の凹部に入り込もうとしている。細胞２０ｂ及びｃのように他の凹部２１ｂ及びｃに収容されていた細胞も隣の凹部に移動しようとする。細胞２０ｄは隣の凹部に移動した上で、隣の凹部に収容されていた細胞と結合している。
【００４３】
したがって、特許文献１に記載のような、平坦な状態を維持することができる蓋体２５であっても、細胞が隔室からこぼれ出す場合がある。あるいはそもそも隔室を形成できない場合がある。蓋体２５を用いた場合、それぞれの隔室に一個ずつスフェロイドを形成することが困難になる。またスフェロイドの大きさを制御することが困難になる。
【００４４】
これに対して、図２に示す蓋体１５ａは底面１３に追随して接する。このため、それぞれの隔室２６に細胞を閉じ込めることができる。蓋体１５ａを用いた場合、それぞれの隔室２６に一個ずつスフェロイドを形成することができる。また、そのスフェロイドの大きさを凹部の形状及び大きさに基づき制御することができる。
【００４５】
上記では隔室に細胞を閉じ込めることの作用効果を説明したが、隔室に閉じ込めるのはスフェロイドであってもよい。本実施形態の一態様は、細胞培養容器内で、スフェロイドを維持する方法である。係る方法では図２に示す凹部２１ａをはじめとする凹部に、細胞２０ａに換えて、スフェロイドを収容し、スフェロイドを隔室２６内に閉じ込める。係る方法ではスフェロイドが隔室２６からこぼれにくい。
【００４６】
本実施形態ではスフェロイドを維持する際にランダムな大きさのスフェロイドが生じることを防止する。したがってスフェロイド間で生理機能や分化のステージが異なることが防止される。このため長期間維持された後もスフェロイドの均一性が低下しにくい。
【００４７】
図１に戻る。蓋体１５ａは端面１６ａ及びｂを有する。前記容器本体は前記内腔を取り囲む内側面１４ａ及びｂを備える。内側面１４ａ及びｂは、図中における内腔１２の高さ方向に延在する面である。蓋体１５ａが培養液１９に浸漬されている状態において、端面１６ａは内腔１２の内側面１４ａに対向する。図に示す断面において蓋体１５ａの幅は内腔１２の幅よりも小さい。また蓋体１５ａは幅方向に圧縮されているわけでもない。したがって、端面１６ａは内側面１４ａに接していない。このため、蓋体１５ａの沈降を妨げる応力は発生しない。したがって蓋体１５ａは自由に沈降する。また蓋体１５ａの下面は底面１３に追随するように底面１３に接する。
【００４８】
図１に示す蓋体１５ａが培養液１９に浸漬されている状態において、蓋体１５ａを平面視した時を考える。また底面１３の全体にわたって凹部が設けられると考える。このとき蓋体１５ａの投影面積の、底面１３の投影面積に対する割合は、９９％以下が好ましく、９８％以下がより好ましい。また係る割合は、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましい。当該面積の割合が９９％以下であると、上述の蓋体１５ａの沈降を妨げる応力を回避しやすい。当該面積の割合が８５％以上であると、凹部２１ａをはじめとする複数の凹部を覆いやすい。後述する実施例では直径３５ｍｍのウェルに、直径３４ｍｍの蓋体を用いている。このためかかる割合を９４％とすることができる。ただし、かかる数値は本願発明を限定するものではない。
【００４９】
図５には底面に密着しない蓋体１５ｂの断面が示されている。蓋体１５ｂの側面は内側面１４ａ及びｂに対向する。図に示す断面において内腔１２に挿入する前の蓋体１５ｂの幅は内腔１２の幅よりも大きい。したがって、蓋体１５ｂの両端の側面は所定の圧力を伴って内側面１４ａ及びｂに接する。このため蓋体１５ｂの沈降を妨げる応力が発生する。図中では蓋体１５ｂの外縁部は底面１３に接しているものの、蓋体１５ｂの中央は浮きあがる。したがって蓋体１５ｂの下面の大部分は、底面１３に追随しなくなる。
【００５０】
図６には底面に密着しない蓋体１５ｃの断面が示されている。蓋体１５ｃの側面は内側面１４ａ及びｂに対向する。図に示す断面において内腔１２に挿入する前の蓋体１５ｃの幅は内腔１２の幅よりも大きい。したがって、蓋体１５ｃの両端の側面は所定の圧力を伴って内側面１４ａ及びｂに接する。このため蓋体１５ｃの沈降を妨げる応力が発生する。蓋体１５ｃの中央部は底面１３に接しているものの、蓋体１５ｃの外縁部は浮きあがる。したがって蓋体１５ｃの下面の大部分は、底面１３に追随しなくなる。
【００５１】
図１に戻る。蓋体１５ａが培養液１９に浸漬されている状態において、端面１６ｂは内腔１２の内側面１４ｂに対向する。さらに、端面１６ｂは内側面１４ｂに接する。このため、上記蓋体１５ｂ及びｃと同様に、蓋体１５ａの沈降を妨げる応力が発生する可能性がある。図中では蓋体１５ａの重さが係る応力と蓋体に働く浮力との合成力に勝っている。あるいは蓋体１５ａの重さが端面１６ｂ及び内側面１４ｂの間に働く摩擦力と浮力との合成力に勝っている。このため蓋体１５ａは自由に沈降する。また蓋体１５ａの下面は底面１３に追随するように底面１３に接する。
【００５２】
なお図１は例示である。すなわち内側面１４ａと端面１６ａとの間に隙間があるのと同様に、その反対側に位置する内側面１４ｂと端面１６ｂとの間に隙間があってもよい。両方に隙間があってもよく、片方に隙間があってもよい。
【００５３】
図７には、蓋体の側面及び内側面に設けたテーパを強調して示している。図の左側に示すように蓋体１５ｄには端面１６ｃに示すテーパを設けてもよい。係るテーパは蓋体１５ｄが上方に向かって細くなるような順テーパである。端面１６ｃにテーパを設けた場合には、これに対向する内側面１４ｃにテーパを設けなくともよい。
【００５４】
また図７の右側に示すように容器本体には内側面１４ｄに示すテーパを設けてもよい。係るテーパは内腔１２が上方に向かって広くなるような順テーパである。内側面１４ｄにテーパを設けた場合には、これに対向する端面１６ｄにテーパを設けなくともよい。
【００５５】
図７に示すように蓋体側面及び内側面の傾きを違えることで、上方に向かってそれらの間の間隔が広くなるようにすることが好ましい。これにより蓋体側面と内側面とは底面１３の近傍でのみ接することができる。したがって、蓋体側面と内側面との間の摩擦力を低減できる。また蓋体に発生する応力を低減できる。また蓋体の下面を可能な限り拡げ、可能な限り蓋体で底面１３を広く覆う場合でも摩擦力及び応力を低減できる。
【００５６】
上記テーパは例えば細胞培養容器を成形した際に、細胞培養容器を型から引き抜くために、内側面に設けられたテーパでもよい。
【００５７】
図１に戻る。細胞培養容器１０はさらに上蓋１７ａを備えてもよい。蓋体１５ａの全体が内腔１２に収容されているため、蓋体１５ａは上蓋１７ａに干渉しにくい。上蓋１７ａは押さえ部材１８を備えてもよい。蓋体１５ａの上面を押さえ部材１８で押さえてもよい。押さえ部材１８は上蓋１７ａと一体であってもよく、別体であってもよい。
【００５８】
図１に示す押さえ部材１８の材質は制限されない。細胞を健全な状態に保つため、押さえ部材１８は、蓋体１５ａと細胞培養容器外との間の気体の循環を妨げないことが好ましい。
【００５９】
図１に示す押さえ部材１８によって、意図しない蓋体１５ａの浮き上がりを抑制できる。このような浮き上がりは例えば細胞培養容器１０の振動時に生じる。細胞培養容器１０の振動は、例えば細胞培養容器１０を人手で搬送する時や搬送器具を用いて搬送する時に生じる。
【００６０】
図８に示すように押さえ部材を用いずに蓋体１５ａを押さえてもよい。内腔１２は容器本体１１の上部に開口を連通している。ここで蓋体１５ｅの厚みは内腔１２の高さよりも大きい。したがって任意の部材で図中の上方から蓋体１５ｅを押さえない限り、蓋体１５ｅは開口から突出する。そこで開口において蓋体１５ｅの上面を上蓋１７ｂの下面で押さえる。以上により、意図しない蓋体１５ｅの浮き上がりが抑えられる。
【００６１】
また重りで図１の蓋体１５ａの上面を押さえてもよい。これにより、意図しない蓋体１５ａの浮き上がりが抑えられる。
【００６２】
蓋体が重力を受ける場合、上述の押さえ部材や重りにより、蓋体が培養液に沈降しやすくなる。このように蓋体の沈降を補助することで、上述の蓋体に換えて、単独では培養液に沈降しない蓋体を利用することができる。
【００６３】
本発明の細胞培養容器を用いて細胞を培養する場合、上述の通り、図１に示す容器本体１１に細胞２０ａと培養液１９を配置した後に蓋体１５ａを設置しても良い。また、容器本体１１に細胞２０ａを配置した後に蓋体１５ａと培養液１９を設置しても良い。
【００６４】
具体的には、細胞培養容器において、図２に示す凹部２１ａをはじめとする凹部に細胞が収容されている。また蓋体１５ａの操作中に、細胞を乾燥させないための最低限度の培養液が凹部に注入されている。ここで複数の凹部を蓋体１５ａで覆うとともに、底面側の領域２９に培養液を注入してもよい。これにより領域２９に配置された培養液に蓋体１５ａを浸漬してもよい。
【００６５】
細胞培養容器は円形又は方形のシャーレでもよい。細胞培養容器は２以上のウェルを有するウェルプレートでもよい。ウェル数は６、１２、２４、９６及び３８４のいずれかでもよい。
【実施例】
【００６６】
図９の写真は実施例及び参考例に用いた蓋体を示す。蓋体Ａ〜Ｃは東レ・ファインケミカル社製のセルローススポンジCA107-4Wである。係るセルローススポンジはビスコースをセルロースに戻してなる。係るセルローススポンジには補強用のセルロース繊維が添加されている。
【００６７】
図９に示す蓋体Ａ〜Ｃを水に浸漬した時の厚みは３ｍｍになる。蓋体Ａは実施例１に用いた。蓋体Ａは含水時の直径が３４ｍｍである。蓋体Ｂは参考例１に用いた。蓋体Ｂは含水時の直径が３６ｍｍである。蓋体Ｃは参考例２に用いた。蓋体Ｃは含水時の直径が４０ｍｍである。
【００６８】
図１０では、実施例１の細胞培養容器を平面視している。容器本体は標準的な６ウェルプレートである。ウェルの内腔は図１等に示す内腔１２に相当する。ウェルの内腔及び蓋体を平面視すると円形である。
【００６９】
図１０に示す蓋体Ａはウェル内に載置されている。本実施例に示すように蓋体Ａは底面上に置かれるだけでその機能を発揮する。したがって蓋体Ａの操作は簡便である。ウェルの底面の直径は３５ｍｍである。したがって蓋体Ａの側面とウェルの内側面との間には隙間が生じている。
【００７０】
図１１では、実施例１の細胞培養容器を斜め視している。蓋体Ａを浮き上がらせる強い応力の発生は認められない。また蓋体Ａの側面とウェルの内側面との間に強い摩擦力の発生は認められない。
【００７１】
図１２ではウェル内に水を注入した。蓋体Ａは水に浸漬されている。蓋体Ａは図１に示す蓋体１５ａを模している。浮力による蓋体Ａの浮き上がりは見られなかった。なお蓋体Ａを構成しているセルローススポンジは水に沈むものである。また、ウェルの底面にマイクロメートルオーダーの凹部（マイクロウェル）が設けられていれば、蓋体Ａをこれらに接させることができることが分かった。
【００７２】
また図１２に示すように、培養液を模している水に蓋体Ａが浸漬されている状態において、蓋体Ａの径はウェルの内腔の径よりも小さい。このため、蓋体Ａの側面とウェルの内側面とは強い圧力を伴う接触をしていない。したがって蓋体Ａ内に強い応力は発生しない。また蓋体Ａの側面と容器本体の内側面との間に強い摩擦力は発生しない。
【００７３】
図１３では、参考例１の細胞培養容器を平面視している。容器本体は実施例１の容器本体と同一である。蓋体Ｂはウェル内に載置されている。ウェルの底面の直径は３６ｍｍである。
【００７４】
図１４では参考例１の細胞培養容器を斜め視している。ウェル内に載置される前の蓋体Ｂの直径の方がウェルの内径よりも大きい。蓋体Ｂに可撓性があることから、蓋体Ｂは歪むことなくウェル内に収容される。また蓋体Ｂを浮き上がらせる強い応力の発生は認められない。一方、蓋体Ｂの側面とウェルの内側面との間に生じる摩擦力は、実施例１の蓋体Ａのものよりも大きいと推察される。
【００７５】
図１５ではウェル内に水を注入した。蓋体Ｂは水に浸漬されている。蓋体Ｂは図５に示す蓋体１５ｂを模している。蓋体Ｂを構成しているセルローススポンジは水に沈むものであるにも拘わらず、蓋体Ｂの中央部は浮き上がった。
【００７６】
図１６では図１５に示す蓋体Ｂを側面視している。培養液を模している水に蓋体Ｂが浸漬されている状態において、蓋体Ｂの側面とウェルの内側面とは圧力をもって強く接している。したがって蓋体Ｂ内に応力が発生し蓋体Ｂの中央部が浮き上がったものと推測される。
【００７７】
以上より、ウェルの底面にマイクロメートルオーダーの凹部（マイクロウェル）が設けられていても、蓋体Ｂの中央部において、蓋体Ｂをこれらに密着させることができないことが分かった。
【００７８】
なお、特許文献１には蓋体の側面をウェルの内側面に圧接することで、蓋体の下面をウェルの底面に近付けた状態を維持することが記載されている。しかしながら、係る圧接は特許文献１の記載に反して蓋体Ｂを浮き上がらせることが分かった。
【００７９】
図１７では、参考例２の細胞培養容器を平面視している。容器本体は実施例１の容器本体と同一である。ウェルの底面の直径は３５ｍｍである。蓋体Ｃはウェル内に押し込まれている。
【００８０】
図１８では参考例２の細胞培養容器を斜め視している。ウェル内に押し込まれる前の蓋体Ｃの直径の方がウェルの内径よりも著しく大きい。蓋体Ｃに可撓性はあるものの、ウェル内に収容された蓋体Ｃには歪みが生じている。また蓋体Ｃの中央部をウェル底面に押し付ける強い応力の発生が認められる。蓋体Ｃの側面とウェルの内側面との間に生じる摩擦力は、実施例１の蓋体Ａのものよりもはるかに大きいと推察される。この状態からさらに蓋体Ｃの外縁部をウェル底面に押し付けることは困難であった。
【００８１】
図１９ではウェル内に水を注入した。蓋体Ｃは水に浸漬されている。蓋体Ｃは図６に示す蓋体１５ｃを模している。蓋体Ｃは水を含んで重くなっているにも拘わらず、蓋体Ｃの外縁部は全く沈まなかった。
【００８２】
以上より、ウェルの底面にマイクロメートルオーダーの凹部（マイクロウェル）が設けられていても、蓋体Ｃの外縁部において、蓋体Ｃをこれらに密着させることができないことが分かった。
【００８３】
なお、特許文献１には蓋体の側面をウェルの内側面に圧接することで、蓋体の下面をウェルの底面に近付けた状態を維持することが記載されている。しかしながら、係る圧接は特許文献１の記載に反して蓋体Ｃとウェルの底面との間に大きな隙間を生じる結果となった。
【００８４】
以上よりウェルの内腔に挿入された蓋体が培養液に浸漬されている状態において、蓋体の自重により蓋体がウェルの底面に向かって自由に沈降することが望ましいことが分かった。またこのように蓋体を自由に沈降させた場合でも、前記蓋体の下面が前記底面に追随するように賦形されることを妨げる要因は見いだせなかった。
【００８５】
なお、本発明は上記実施形態又は実施例に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。例えば実施例では円形のウェルを用いたが、ウェルの形状は角形でもよい。例えば、容器本体の内腔及び蓋体を平面視したとき長方形でもよい。
【００８６】
さらに蓋体が培養液に浸漬されている状態において、蓋体の縦及び横の寸法は、それぞれ内腔の縦及び横の寸法よりも小さいことが望ましい。これにより、蓋体の浮き上がりを防ぐことができる。
【００８７】
またウェルを大型化した場合、長方形のウェルは空間の利用効率に優れる。また蓋体を大型化した場合、長方形の蓋体は巻き取りによる操作がしやすい。また蓋体が可撓性を有することから巻取りが可能となる。
【００８８】
図１等では蓋体を完全に培養液中に沈めている。しかしながら、蓋体の上面は培養液の液面から突出していてもよい。係る場合、培養液を交換する際は、ピペットを蓋体の上面に押し当てて培養液を吸い出してもよい。また蓋体の上面に培養液を滴下してもよい。蓋体を構成する材料の比重が、培養液の比重よりも大きい場合は、蓋体の液面から突出した部分の重さで蓋体を底面に向かって沈降させてもよい。
【符号の説明】
【００８９】
１０  細胞培養容器、１１  容器本体、１２  内腔、１３  底面、１４ａ−ｂ  内側面、１４ｃ−ｄ  内側面、１５ａ−ｅ  蓋体、１６ａ−ｄ  端面、１７ａ−ｂ  上蓋、１８  押さえ部材、１９  培養液、２０ａ−ｄ  細胞、２１ａ−ｂ  凹部、２２  仮想的な球、２３  壁、２４  上部開口、２５  蓋体、２６  隔室、２９  領域、Ａ−Ｃ  蓋体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2018000050.tif 000017
【図１６】
2018000050.tif 000018
【図１７】
2018000050.tif 000019
【図１８】
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【図１９】
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